(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法において、  （ａ）血液生成の幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団と生体外にてポリヌクレオチドデリバリーシステムを接触させ、前記ポリヌクレオチドデリバリーシステムは関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含む工程と；  （ｂ）１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にてＨＳＰＣ細胞を培養する工程と；  （ｃ）１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団とＨＳＰＣを、ＨＳＰＣの少なくとも２０％がＣＤ１９＋μ＋になるまで共培養する工程と；  （ｄ）前記工程（ｃ）で得られたＣＤ１９＋μ＋細胞とＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団を、１以上のＢ細胞の活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋μ＋細胞の少なくとも２０％が関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで共培養する工程とを含有する方法。
【請求項２】
ＨＳＰＣは、勝帯血からのＣＤ３４＋細胞または一次骨髄細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＢ細胞刺激因子は、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポイエチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、頼粒白血球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒白血球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−７およびＩＬ−１１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＳＰＣを、Ｂ細胞刺激因子ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポイエチン、ＳＣＦおよびＧ−ＣＳＦの存在下にて培養する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＨＳＰＣを、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と、ＨＳＰＣの少なくとも３０％がＣＤ１９＋μ＋になるまで共培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一支持細胞は、間質細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第一支持細胞は、Ｂ系統成長因子ＩＬ−７を発現する間質細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１以上のＢ細胞活性剤は、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、ＩＦＮαおよび抗ＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｂ細胞活性剤は、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＩＬ−２およびＩＬ−１０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｂ細胞活性剤の１つは、ＣｐＧ  ＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）から得られたＣＤ１９＋μ＋細胞の少なくとも４０％は、ＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋プレＢ細胞またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋未成熟Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
関連の抗体を産生するＢ細胞の少なくとも４０％は、抗体分泌形質芽球および形質細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドデリバリーシステムは、レトロウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
レトロウイルスベクターは、Ｂ細胞特異的プロモーターを含むレンチウイルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｂ細胞特異的プロモーターは、ＥＫＫプロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、特許法合衆国法典第３５巻（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．）§１１９（ｅ）の基、２００８年１１月２１日に出願した米国出願第６１／１９９，９３２号を主張し、本明細書に参考文献として明確に組み込むものとする。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子形式にて配列表と共に出願している。配列表は、２００９年１１月１９日に作成され、サイズ４．０ＫｂのＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴと称するファイルとして提供する。配列表の電子形式の情報を、本明細書に参考文献としてそれを完全に組み込むものとする。
【０００３】
技術分野
本出願は、一般的に免疫および遺伝子導入の分野に関する。より詳細には、本出願は、プログラミングヒトＢ細胞が関連のある抗体を生成する生体外におけるヒトＢリンパ球生成培養システムに関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
抗体は、感染症と戦い、病原因子を取り除くことにおいて重要な役割を果たす免疫系によって産生される自然発生のタンパク質である。抗体は、それらの機能を、タンパク質または非タンパク質抗原を結合し、防御反応を誘発することによって発揮する。
【０００５】
Ｂ細胞は、抗体生成にて主要な役割を果たすリンパ球である。正常な血液生成時に、Ｂ細胞集団は、骨髄にて血液生成幹細胞から生成され、活性化されるようになる。活性化に応じて、Ｂ細胞は、抗体分泌形質芽球および形質細胞を含有する、より分化した細胞へと分化し始める。 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、ヒトＢ系統発生を支持し、Ｂ細胞の分化を促進してあらゆる関連の抗体を産生する効率的な生体外培養システムを開発することが、望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本出願は、抗体産生Ｂ細胞を生体外において生成するためのシステム、方法および組成物を提供する。本明細書に記載のシステムおよび方法に従って生成される抗体産生Ｂ細胞は、治療、診断、産業、法医学的および環境への適用を含有する多岐に渡る実用性を有する。いくつかの非制限的例の実用性は、病原体に対する生命体の免疫反応への刺激；特定の疾病または疾患、例えば病原性感染症であり、ＨＩＶ感染等または癌に対する免疫反応の提供；および特定の疾病、疾患の検出および／または特定の疾病、疾患の進行のモニタリングである。本明細書に記載のシステムおよび方法に従って産生された抗体を、例えば法医学的／環境のサンプルにおける生命体および／または抗原（例えば、ポリペプチド、炭水化物、脂質または核酸）の存在の同定、酵素の活性化状態の検出の同定ならびに精製されたタンパク質の産生の同定に、適用して使用することができる。
【０００８】
本出願の一態様において、関連の抗体を血液生成幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団から生体外で産生されるＢ細胞を生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）血液生成の幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団と生体外にてポリヌクレオチドデリバリーシステムを接触させ、前記ポリヌクレオチドデリバリーシステムは関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含む工程と；（ｃ）１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団とＨＳＰＣを、ＨＳＰＣを共培養する工程と；（ｄ）工程（ｃ）で得られたＣＤ１９＋細胞とＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団を、１以上のＢ細胞の活性剤の存在下にて共培養する工程とを含有する。他の実施形態において、方法は、工程（ｂ）ＨＳＰＣを１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて工程（ｃ）の前に培養する工程を、さらに含有する。工程（ｂ）を、例えばＨＳＰＣの少なくとも約２０％がＣＤ１９＋μ＋になるまで実施することができる。同様に、工程（ｄ）を、例えばＣＤ１９＋μ＋細胞の少なくとも約２０％が関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで実施することができる。
【０００９】
本出願の他の態様において、Ｂ細胞の集団を生体外にて生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ｐ）ＨＳＰＣの集団を１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて培養する工程と、（ｑ）１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団とＨＳＰＣを、ＨＳＰＣの少なくとも約２０％がＣＤ１９＋μ＋になるまで共培養する工程と、（ｒ）工程（ｑ）で得られたＣＤ１９＋μ＋細胞とＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団を、１以上のＢ細胞の活性剤の存在下にて、共培養する工程とを含有する。工程（ｒ）を、例えばＣＤ１９＋μ＋細胞少なくとも２０％が、活性化されたＢ細胞になるまで実施することができる。
【００１０】
本出願の他の態様において、標的細胞集団から抗体産生Ｂ細胞を生体外にて生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ｘ）標的の集団と生体外にてポリヌクレオチドデリバリーシステムを接触させ、前記ポリヌクレオチドデリバリーシステムは関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含む工程と；（ｙ）１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と標的細胞を、例えば標的細胞の少なくとも約２０％がＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋になるまで共培養する工程と、（ｚ）工程（ｙ）で得られたＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋とＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団を、１以上のＢ細胞の活性剤の存在下にて、例えばＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋の少なくとも約２０％が関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで共培養する工程とを含有する。いくつかの実施形態において、標的細胞集団の約２５％までが、プレＢ細胞および未成熟Ｂ細胞である。他の実施形態において、標的細胞集団の約２０％までが、プレＢ細胞および未成熟Ｂ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、生体外ヒトＢリンパ球生成培養システムの実施形態を概略的に示す図である。レンチウイルスコンストラクトをＨＳＰＣへ導入して、Ｂ細胞プログラミングを達成した。第１段階の５日目に、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ；１０ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ；１０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５ｎｇ／ｍＬ）およびＧ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ）を、Ｂ系統の関与で、ＨＳＰＣを刺激した。６週目の第２段階は、間質支持（ＭＳ５）を使用し、プレＢおよび未成熟Ｂ細胞の混合物をＣＤ３４＋ＨＳＰＣから発生した。表面マーカー、例えばＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ２７およびＣＤ１３８をＢ細胞発生の異なる段階で示す。  図１Ｂは、ｂ１２−ＩｇＧ1の分泌型をもたらす３つのレンチウイルスコンストラクト（ＦＵＷ−ｂ１２、ＦＭＨＷ−ｂ１２およびＦＥＥＫＷ−ｂ１２）を概略的に示す図である。ｂ１２−ＩｇＧ1の分泌型の発現を、ＦＵＷ−ｂ１２におけるユビキチンＣプロモーター、ＦＭＨＷ−ｂ１２におけるＩｇ重鎖プロモーターおよびＦＥＥＫＷ−ｂ１２におけるＩｇ軽鎖プロモーターによってそれぞれ促進した。ＭＨプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、マトリックス会合領域（ＭＡＲ）によって配置されるｉＥμエンハンサーに先行されるヒトμチェインプロモーター（ＶＨｐ）を含有する。ＥＥＫプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、イントロンエンハンサー（ｉＥκ）、ＭＡＲおよび３’エンハンサー（３’Ｅκ）に先行される軽鎖プロモーター（ＶＫｐ）を含有する。ｂ１２可変領域を有する分泌γ（γｓ）重鎖およびκ軽鎖遺伝子は、Ｆ２Ａ配列で連結される。ベクターの、長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ＨＩＶ−Ｉフラップ因子（Ｆ）およびウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節因子（ＷＲＥ）を示した。３週目の第３段階は、Ｂ細胞の活性化、増殖ならびに抗体分泌形質芽球および形質細胞への分化を、低レベルのＣＤ４０Ｌ（ＭＳ４０Ｌ−低細胞）を安定して発現するＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１０（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣｐＧ（２μＭ）、および低レベルのＣＤ４０Ｌを安定して発現する（ＭＳ４０Ｌ−低細胞）ＭＳ５細胞の存在下にて促進した。
【図２Ａ】レンチウイルスベクターＦＵＧＷ（すなわちＵ−ＧＦＰ）によって達成される高い導入率を示すグラフである。ＨＳＰＣを、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３リガンド（１０ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５ｎｇ／ｍＬ）およびＧ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下にて２４時間インキュベートした。その後１，０００の感染多重度でｍｏｃｋまたはＦＵＧＷウイルスとの２つの経時的な感染を、ＨＳＰＣに与えた。同じサイトカインを、一日おきに感染中添加した。感染細胞を、感染後から３日目（インキュベーション計５日目）に収集し、フローサイトメトリーによって解析した。
【図２Ｂ】レンチウイルスコンストラクトＵ−ｂ１２またはＭＨ−ｂ１２によってトランスフェクションされた３つの細胞株におけるＩｇＧ発現を示すグラフである。３つの細胞株の何れも内因性ＩｇＧを発現しないため、細胞内ＩｇＧの染色は、トランスジェニックｂ１２−ＩｇＧ１を示した。
【図２Ｃ】２９３Ｔ細胞においてｂ１２の重鎖および軽鎖の発現および集合を、レンチウイルスベクターＦＵＷ−ｂ１２と、還元（（＋β−メルカプトエタノール；すなわちβ−ＭＥ）および非還元状態（−β−ＭＥ）下にてトランスフェクションした示す図である。細胞タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてＩｇＧ−Ｆｃ（γ重鎖／ＨＣ）およびκ軽鎖／ＬＣのウェスタンブロット法を使用して抽出および分析した。
【図２Ｄ】レンチウイルスベクターＦＵＷ−ｂ１２とトランスフェクションした２９３Ｔ細胞によって産生したｂ１２抗体の中和能力を、精製したｂ１２のものと比較して示す。培養上清を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって収集および測定し、ｇｐ１２０への結合の約６μｇ／ｍＬの濃度を得た。精製したｂ１２の濃度は、１２５μｇ／ｍＬであった。培養上清および精製したｂ１２を、偽型ウイルス中和分析の対象としたときに、最初の濃度１．２μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬの５倍にそれぞれ希釈した。
【図３】図３Ａは、前駆細胞マーカーＣＤ３４およびｃ−ｋｉｔの発現を欠如したＨＳＰＣを、レンチウイルスコンストラクトＵ−ＧＦＰまたはＭＨ−ＧＦＰと第２段階中の期間に渡って形成導入したグラフを示す。  図３Ｂは、ＣＤ１３＋骨髄細胞の出現を、第２段階の一週目にて示すグラフを示す。
【図４】図４Ａは、ＧＦＰおよびＣＤ１９マーカーの発現を、Ｕ−ＧＦＰ（上段パネル）またはＭＨ−ＧＦＰ（下段パネル）レンチウイルスコンストラクトのいずれかと形質導入した刺激のＨＳＰＣにて示したグラフを示す。レンチウイルスコンストラクトで刺激および形質導入されたＨＳＰＣを、ＭＳ５間質細胞上にて、示した一定期間培養した。ＧＦＰ発現およびＣＤ１９＋細胞の出現を、フローサイトメトリーを使用して観測した。  図４Ｂは、細胞表面上でＣＤ１９およびＣＤ１０の両方の発現によって観測されるような第２段階の３週目に出現し始めるプロＢ細胞のグラフを示す。ゲート（ｇａｔｅ）を、プロＢ対非プロＢへ適用し、ＧＦＰ発現をこれらゲートにて分析したとき、ＭＨプロモーターはプロＢ細胞特異的発現を示した一方、ユビキチンプロモーターは細胞間にて区別することができなかった。比較的薄い線は、非プロＢ細胞を示し；比較的濃い線は、プロＢ細胞を示す。  図４Ｃは、第２段階における３週目にＭＨ−ＧＦＰ形質導入された前駆細胞に由来するＣＤ１１ｃ＋樹枝細胞におけるＧＦＰ発現およびＣＤ１１ｃ−細胞のものの間における比較のグラフを示す。   図４Ｄは、表面μ重鎖およびＣＤ１９の発現レベルを、第２段階の異なる時点（３週目（中央パネル）および４週目（右パネル）で示す図である。示したパーセンテージは、総生細胞のものである。  図４Ｅは、λおよびκ軽鎖、ＶプレＢ代替軽鎖ならびにμおよびδ重鎖の発現レベルを、ＣＤ１９発現に対して、第２段階６週目で、第２段階の終盤でプレＢおよび未成熟Ｂ細胞の混合物を示すプロットする。示したパーセンテージは、総生細胞のものである。  図４Ｆは、ＣＤ１９＋細胞は、第２段階の終盤（６週目）にて、Ｉｇαに対して陽性であるグラフを示す。ＩｇαおよびＩｇβの双方を検査したとき、Ｉｇα＋細胞およびＩｇβ＋細胞のパーセンテージは、同程度であった。全ての分析にて、ＥＥＫ−ｂ１２をもたらす細胞は、ＭＨ−ｂ１２と同様の表現型を示した。
【図５】図５Ａは、非感染ＨＳＰＣおよび多種のレンチウイルスコンストラクト（空ベクターＦＭＨＷおよびＦＥＥＫＷ；ＧＦＰ含有ベクターＭＨ−ＧＦＰおよびＥＥＫ−ＧＦＰ；およびｂ１２含有ベクターＭＨ−ｂ１２およびＥＥＫ−ｂ１２）と形質導入されたＨＳＰＣに由来するＢ細胞集団のパーセンテージを示す棒グラフである。  図５Ｂは、第２段階の終わり（６週目）にＭＨ−ｂ１２およびＥＥＫ−ｂ１２とトランスフェクションしたＨＳＰＣの培養物における、ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋プレＢおよびＣＤ１９＋ＣＤ１０−未成熟Ｂ細胞の存在を示すグラフである。
【図６Ａ】ＦＵＷ−ＣＤ４０Ｌウイルス（ＭＳ４０Ｌ−高およびＭＳ４０Ｌ−低の細胞株）によって形質導入した２つのＭＳ５細胞株におけるＣＤ４０Ｌの発現レベルを示す図である。斜線部で示したピークは、ＭＳ５親細胞を示し、斜線のないピークは、形質導入された細胞を示す。
【図６Ｂ】可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍＬ）および２つのＭＳ４０Ｌ安定株（ＭＳ４０Ｌ−高およびＭＳ４０Ｌ−低）の性能を、Ｂ支持細胞において示す図である。第２段階由来細胞を、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１０（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＣｐＧ  ＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，２μＭ）の存在下にて１８日間インキュベートした。可溶性ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の生存率を支持せず、ＣＤ１９＋ＧＦＰ＋細胞の検出がほとんどされないものとして導いた。対照的に、ＭＳ４０細胞株双方ともが、Ｂ細胞の生存および拡大を支持した。
【図６Ｃ】ＭＳ４０Ｌ−高の血漿細胞分化の誘導における性能およびＭＳ４０Ｌ−低の性能の間における比較を、減少したＣＤ１９および表面ＩｇＭ発現（上段パネル）、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋細胞（中央パネル）、および増加したＣＤ２７発現（下段パネル）によって示す図である。
【図６Ｄ】血漿細胞分化のフローサイトメトリー分析のグラフを示す。ヒト末梢血から分離されたナイーブＢ細胞を、ＭＳ４０Ｌ−低および示された刺激剤（ＣｐＧ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−６［５０ｎｇ／ｍＬ］）の存在下、９日間培養し、血漿細胞分化のフローサイトメトリー分析で染色した（中央パネル、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋細胞；右パネル、ＣＤ１９−ＣＤ２７＋およびＣＤ１９ｌｏｗＣＤ２７＋／ｈｉｇｈ細胞）。
【図７Ａ】ＣＤ１９およびＣＤ８４の発現の比較を、第３段階の前（比較的薄い線）と後（比較的濃い線）示す図である。第２段階からの細胞をＭＳ４０Ｌ−低の単分子層上に移し、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１０（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＣｐＧ ＤＮＡ（２μＭ）の存在下にて２〜３週間インキュベートした。
【図７Ｂ】異なるプロモーター（ＭＨおよびＥＥＫ）および異なるトランス遺伝子（ＧＦＰおよびｂ１２）を使用して、形質芽球（ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−）および形質細胞（ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋）の生成を示す図である。示したパーセンテージは、総生細胞である。
【図７Ｃ】クラススイッチＢ細胞（表面ＩｇＧ＋）およびメモリＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋）の生成のグラフを示す。示したパーセンテージは、ＣＤ１９＋細胞である。
【図７Ｄ】第３段階中のＢ細胞の増殖およびＭＳ４０Ｌ−低の単分子層の群の形成を、位相差および蛍光画像を示す図である。バーは２５μｍを示す。細胞の群を、ＧＦＰフィルターセットを備えたエピフロレッセンス顕微鏡によって視覚化した。
【図７Ｅ】第３段階の前（比較的濃いしるし）と後（比較的薄いしるし）のＣＤ１９＋細胞の典型的な前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）の散布図である。第３段階後の細胞は、第３段階前のものよりサイズが比較的大きく、粒状であった。
【図７Ｆ】形質芽球および形質細胞の典型的なライト染色画像である。形質芽球および形質細胞を、矢印によって示す。バーは5μｍを示す。
【図７Ｇ】ウイルス非存在またはＧＦＰトランス遺伝子の細胞による第２段階および第３段階の終盤における、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ産生の内因性レベルを示すグラフである。抗体の産生を、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。ＮＤは、検出不可能を示す。
【図８Ａ】第３段階中、ＭＨ−ｂ１２またはＥＥＫ−ｂ１２トランス遺伝子をもたらすＢ細胞にてＧＦＰ発現を示す図である。
【図８Ｂ】第３段階前から第３段階後からの細胞にて、ＣＤ１９およびＣＤ８６の発現における変化を示す図である。
【図８Ｃ】形質芽球（ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−／ｌｏｗ）および形質細胞（ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋）の生成を、第３段階中のトランス遺伝子ＧＦＰにかかわらずに示すグラフである。示したパーセンテージは、総生細胞である。
【図８Ｄ】クラススイッチＢ細胞（表面ＩｇＧ＋）およびメモリＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋）の生成を、第３段階中のトランス遺伝子ＧＦＰにかかわらずに示す図である。示したパーセンテージは、ＣＤ１９−細胞である。
【図９】図９Ａは、第３段階中の正常ヒト骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）からのＣＤ１３８＋増加細胞の集団のグラフを示す。  図９Ｂは、正常ヒト形質芽球および形質細胞の形体を示す図である。
【図１０】ヒトＢ細胞発生にわたって、生体外にて維持するレンチウイルスの安定した組み込みを示す図である。第２段階の２〜４週目（それぞれ前駆およびプレＢ段階を示す）および第３段階の終わり（形質細胞段階に相当する）で細胞からのゲノムＤＮＡを抽出し、ウイルスの組み込みを判定した。細胞あたりの平均プロウイルスのコピー数を、形質導入されていないＣＤ３４＋細胞および異なったレンチウイルスコンストラクトによって最初から形質導入されたＣＤ３４＋細胞にて示す。この結果を、同じトランス遺伝子（ベクターのみ、ＧＦＰまたはｂ１２；Ｕ、ＭＨまたはＥＥＫプロモーターにかかわらず）で実験から得られた統合データからの平均＋ＳＥとして示す。５，３，６および６の生物学的複製が、それぞれウイルス非存在、ベクター、ＧＦＰおよびｂ１２で存在する。形質細胞段階で細胞あたりのプロウイルスコピー数は、平均的に、それらの先祖（Ｐ＝０．２６）のものとスチューデントの両側ｔ検定にて統計学的に異ならなかった。
【図１１】図１１Ａは、第２段階中のＢ１２タンパク質の産生レベルのグラフを示す。Ｂ１２タンパク質レベルを、ｂ１２特異的なＥＬＩＳＡを使用して測定し、週で示す。培養培地を週２回換えたため、データは抗体３〜４日間の蓄積に相当する。その結果は、３つの独立した培養物からの平均±ＳＥである。＊は週２からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。   図１１Ｂは、第３段階の終わりにおけるＩｇ産生レベルのグラフを示す。第２段階から各々処理した総細胞５０，０００を、穴あたり５００μＬの第３段階へ移した。総ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡレベルの合計を測定し、その結果を３つの独立した培養物からの平均＋ＳＥとする。「ベクターまたはＧＦＰ」は、空ベクターの平均効果（ＦＭＨＷおよびＦＥＥＫＷ）、およびＧＦＰを含有するベクター（ＭＨ−ＧＦＰおよびＥＥＫ−ＧＦＰ）を示す。  図１１Ｃは、ｂ１２特異的なＥＬＩＳＡ分析（＊Ｐ＜．０２；＊＊Ｐ＜．００２）を使用して、第３段階の終わりにてｂ１２−ＩｇＧ１の産生レベルのグラフを示す。図６Ｂのように、「ベクターまたはＧＦＰ」は、空ベクター（ＦＭＨＷおよびＦＥＥＫＷ）およびＧＦＰを含有するベクター（ＭＨ−ＧＦＰおよびＥＥＫ−ＧＦＰ）の平均効果を示す。  図１１Ｄは、Ｂ１２−ＩｇＧ１の検出を、トランス遺伝子をもたらすＢ細胞の細胞質にて、それぞれ抗ｇｐ１２０エピトープおよびｂ１２−ＩｇＧ１のγ重鎖定常部と相互作用する蛍光色素標識されたｇｐ１２０ＭＮおよび抗ＩｇＧの細胞内共染色を使用するグラフを示す。ＭＨ−ＧＦＰまたはＭＨ−ｂ１２の形質導入されたＨＳＰＣを、第２および第３段階を通して培養し、抗ＣＤ１９抗体で表面染色し、抗ＩｇＧ抗体および単量体ｇｐ１２０で細胞内染色した。データをフローサイトメトリーの使用によって分析し、ＣＤ１９＋細胞をプリゲート（ｐｒｅｇａｔｅｄ）した。ｇｐ１２０を認識する細胞内タンパク質を、α−ｇｐ１２０として同定された。  図１１Ｅは、非感染、またはＭＨ−ｂ１２もしくはＥＥＫ−ｂ１２ウイルスに感染した細胞における、細胞あたりのプロウイルスコピー数のグラフを示す。非感染、またはＭＨ−ｂ１２もしくはＥＥＫ−ｂ１２ウイルスによって感染したＣＤ３４＋細胞由来の前駆細胞（第２段階の週２）からのゲノムＤＮＡを抽出し、ウイルス組み込みを測定した。細胞あたりのプロウイルス数を、３つの独立した培養物からの平均＋ＳＥとして示す。  図１１Ｆは、Ｕ−ＧＦＰ、ＭＨ−ＧＦＰまたはＥＥＫ−ＧＦＰレンチウイルスによって形質導入されたＤａｋｉｋｉ形質細胞腫細胞における相対的ＧＦＰ強度を示す図である。フローサイトメトリーをインキュベーションから７２時間後に実行し、ＧＦＰ強度の倍率をＵ−ＧＦＰ（１として規定する）の効果に渡って示した。ＭＨ−ＧＦＰおよびＥＥＫ−ＧＦＰの間の差は、スチューデントの両側ｔ検定において著しかった（Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本出願のいくつかの実施形態は、生体外における抗体産生Ｂ細胞の集団を生成するシステム、方法および組成物に関する。抗体産生Ｂ細胞の集団を、標的細胞の集団、好ましくは造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団から生成することができる。いくつかの実施形態において、ヒトＢ系統発生を、ＨＳＰＣから抗体産生Ｂ細胞までで、形質芽球および／または血漿細胞を含有して支持する生体外の培養システムを提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）造血管／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団と、生体外にてポリヌクレオチドデリバリーシステムを接触する工程と、（ｃ）ＨＳＰＣと、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一の支持細胞の集団を共培養する工程と；（ｄ）工程（ｃ）にて得られたＣＤ１９＋μ＋細胞と、ＣＤ４０Ｌの発現を有する第二支持細胞を、１以上Ｂ細胞活性剤の存在下にて共培養する工程とを含有する。工程（ｃ）を、例えばＨＳＰＣの少なくとも約２０％がＣＤ１９＋μ＋になるまで、下記に詳細に説明するように、継続することができる。工程（ｄ）を、例えばＣＤ１９＋μ＋細胞の少なくとも約２０％が、関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで、下記に詳細に説明するように、継続することができる。いくつかの実施形態において、ＨＳＰＣは一次骨髄細胞である。他の実施形態において、ＨＳＰＣは臍帯血からのＣＤ３４＋細胞である。臍帯血からのＣＤ３４＋細胞は、すでにリンパ系統に関与する可能性がある肝細胞および前駆細胞の双方を含有することができることを当業者は認識した。
【００１４】
いくつかの実施形態において、前記方法は工程（ｂ）ＨＳＰＣを１以上のＢ細胞の刺激因子の存在下にて、工程（ｃ）の約１日前に少なくとも培養する工程を、さらに含有する。ＨＳＰＣを、１以上のＢ細胞の刺激因子の存在下にて、様々な日数で培養することができる。例えば、ＨＳＰＣを、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｃ）の前の、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日で培養することが可能である。さらに他の実施形態において、ＨＳＰＣを、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｃ）の前の、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日で培養することが可能である。さらに他の実施形態において、ＨＳＰＣを、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｃ）の前の、約１から約１０日、約２から約９日、約２から約８日、約２から約７日、約２から約６日、約２から約５日で培養することが可能である。
【００１５】
いくつかの実施形態は、Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法を提供し：（ｐ）造血管／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて約２〜６日間培養する工程と、（ｑ）ＨＳＰＣと１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団を共培養する工程と；（ｒ）工程（ｑ）で得られたＣＤ１９＋μ＋細胞とＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞を、１以上のＢ細胞活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋μ＋細胞の少なくとも約２０％がＢ細胞になるまで共培養する工程とを含有する。工程（ｑ）を、下記に詳細に記載するように、例えばＨＳＰＣの少なくとも約２０％がＣＤ１９＋μ＋になるまで、継続することができる。いくつかの実施形態において、工程（ｑ）で得られたＣＤ１９＋μ＋細胞を、ＣＤ４０Ｌが発現する第二支持細胞と、１以上のＢ細胞活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋μ＋細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％がＢ細胞になるまで、共培養した。いくつかの実施形態において、工程（ｒ）で得られたＢ細胞は、Ｉｇ分泌Ｂ細胞である。
【００１６】
多種のＢ細胞刺激因子を、本明細書に記載の方法およびシステムで使用することができる。Ｂ細胞刺激因子の例は、インターロイキン３（ＩＬ−３）、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒白血球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン（ＩＬ−１１）、抗ホスファターゼ（Ｓｂｆ１）およびメカノ成長因子（ＭＧＦ）を含有するが、これらに限定されない。実施形態において、ＨＳＰＣを、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＧ−ＣＳＦから選択される少なくとも１つのＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｑ）の前に培養した。他の実施形態において、ＨＳＰＣを、少なくとも１つのＢ細胞刺激因子ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＧ−ＣＳＦの存在下にて、工程（ｑ）の前に培養した。いくつかの実施形態において、１以上のＢ細胞刺激因子は、ヒト由来のものである。いくつかの実施形態において、全てのＢ細胞刺激因子は、ヒト由来のものである。いくつかの実施形態において、１以上のＢ細胞刺激因子は、ヒト以外の哺乳類由来のものである。いくつかの実施形態において、全てのＢ細胞刺激因子は、ヒト以外の哺乳類由来のものである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、第一支持細胞は間質細胞である。様々な間質細胞を本明細書に記載のシステムおよび方法で使用することができる。間質細胞株の例は、米国特許第５８７９９４０号明細書に記載されたようなネズミＭＳ５間質細胞株、ネズミ骨髄由来間質細胞株であり、Ｓ１０、Ｓ１７、ＯＰ９およびＢＭＳ２細胞株等を含有するが、これらに限定されない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＨＳＰＣを、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と共培養した。実施形態において、第一支持細胞は、ＩＬ−７を発現することができる。他の実施形態において、第一支持細胞は、ＩＬ−７、ならびにプレプロＢ細胞成長刺激因子（ＰＰＢＳＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、インターロイキン３（ＩＬ−３）Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒白血球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、抗ホスファターゼ（Ｓｂｆ  １）およびメカノ成長因子（ＭＧＦ）から選択される少なくとも１つのＢ系統成長因子を発現することができる。いくつかの実施形態において、１以上のＢ系統成長因子は、ヒト由来のものである。いくつかの実施形態において、全てのＢ系統成長因子は、ヒト由来のものである。いくつかの実施形態において、１以上のＢ系統成長因子は、ヒト以外の哺乳類由来のものである。いくつかの実施形態において、全てのＢ系統成長因子は、ヒト以外の哺乳類由来のものである。
【００１９】
多くの初期Ｂ系統マーカーが、従来技術にて知られている。例えば、プロＢ細胞を、ＣＤ１９およびＣＤ１０の共発現（ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋）、ならびに代替軽鎖の発現の欠如によって同定することができる。プロＢ細胞が分化するにつれて、それらはＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋プレＢ細胞およびＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋κ／λ＋未成熟Ｂ細胞内に発生する。いくつかの実施形態において、ＨＳＰＣを、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と、ＨＳＰＣの、少なくとも約２０％がＣＤ１９＋μ＋細胞になるまで共培養した。他の実施形態において、ＨＳＰＣを、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と、ＨＳＰＣの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％がＣＤ１９＋μ＋になるまで共培養した。他の実施形態において、工程（ｂ）で得られたＣＤ１９＋μ＋細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％は、ＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋プレＢ細胞およびＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋未成熟Ｂ細胞である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、Ｂ細胞刺激因子は、またＢ系統成長因子であることができる。いくつかの実施形態において、Ｂ系統成長因子は、またＢ細胞刺激因子であることができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９＋μ＋細胞を、ＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団と、１以上のＢ細胞活性剤の存在下にて共培養した。実施形態において、第二支持細胞は、間質細胞である。様々なＢ細胞刺激因子を、本明細書に記載の方法およびシステムにて使用することができる。Ｂ細胞活性剤の例は、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−αおよび抗ＣＤ４０Ｌを含有するが、これらに限定されない。実施形態において、Ｂ細胞活性剤はＣｐＧ  ＤＮＡである。他の実施形態において、Ｂ細胞成長因子は、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＩＬ−２およびＩＬ−１０である。さらに他の実施形態において、Ｂ細胞成長因子は、ＣｐＧ  ＤＮＡおよびＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−αおよび抗ＣＤ４０Ｌから選択される少なくとも１つのＢ細胞活性剤である。いくつかの実施形態において、１以上のＢ細胞活性剤は、ヒト由来のものである。いくつかの実施形態において、全てのＢ細胞活性剤は、ヒト由来のものである。いくつかの実施形態において、１以上のＢ細胞活性剤は、ヒト以外の哺乳類由来のものである。いくつかの実施形態において、全てのＢ細胞活性剤は、ヒト以外の哺乳類由来のものである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、工程（ｑ）で得られたＣＤ１９＋細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団と、１以上のＢ細胞成長活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋細胞の少なくとも約２０％が関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで共培養する工程を含有する。他の実施形態において、工程（ｑ）で得られたＣＤ１９＋は、ＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団と、１以上のＢ細胞成長活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋細胞の少なくとも約３０％が関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで共培養する工程を含有する。さらなる他の実施形態において、工程（ｑ）で得られたＣＤ１９＋μ＋細胞を、第二支持細胞の集団と、ＣＤ１９＋μ＋細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％が、関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで共培養する。実施形態において、関連の抗体を産生するＢ細胞は、抗体分泌の形質芽球および形質細胞である。
【００２３】
他の実施形態において、標的細胞の集団から抗体産生Ｂ細胞を生体外にて生成する方法を提供し、この方法は：（ｘ１）標的細胞の集団を生体外にてポリヌクレオチドデリバリーシステムと接触し、前記ポリヌクレオチドデリバリーシステムは関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含有する工程と；（ｙ１）標的細胞と、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団を、標的細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％が、ＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋になるまで共培養する工程と、（ｚ１）工程（ｙ１）で得られたＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋とＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団を、１以上のＢ細胞活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋およびＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋細胞が、抗体産生Ｂ細胞になるまで共培養する工程を含有する。好ましい実施形態において、標的細胞は幹細胞を含む細胞の不均一集団を含有するが、これらに限定されない哺乳類幹細胞である。幹細胞は、例えば造血管細胞であることができる。他の実施形態において、標的細胞は第一骨髄細胞である。さらなる他の実施形態において、標的細胞はＣＤ３４＋細胞である。またさらなる他の実施形態において、標的細胞は臍帯血からのＣＤ３４＋細胞である。またさらなる他の実施形態において、標的細胞集団の、多くても約７５％、多くても約７０％、多くても約６５％、多くても約６０％、多くても約５５％、多くても約５０％、多くても約４５％、多くても約４０％、多くても約３５％、多くても約３０％、多くても約２５％、多くても約２０％、多くても約１５％、多くても約１０％、多くても約５％は、プロＢ、プレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞である。他の実施形態において、その標的細胞集団は、プレＢ細胞および未熟Ｂ細胞である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外において生成する方法を提供し、この方法は、（ｘ２）標的細胞の集団と生体外にて、ポリヌクレオチドデリバリーシステムを接触させ、前記ポリヌクレオチドデリバリーシステムは関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含有する工程と、（ｙ２）標的細胞と、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団を、標的細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％がＣＤ１９＋μ＋になるまで共培養する工程と、（ｚ２）工程（ｙ２）で得られたＣＤ１９＋μ＋細胞とＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞を、１以上のＢ細胞成長活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋μ＋細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％が関連の抗体を生成するＢ細胞になるまで共培養する工程とを含有する。いくつかの実施形態において、前記方法は標的細胞を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｙ２）の前の、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日または少なくとも約７日で培養する工程をさらに含有する。いくつかの実施形態において、標的細胞は造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。他の実施形態において、標的細胞は造血幹細胞である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、標的細胞はプロＢ、プレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞であり、標的細胞を１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と、標的細胞の少なくとも約２０％がＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋になるまで共培養する。他の実施形態において、標的細胞はプロＢ、プレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞であることができ、標的細胞を１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と、標的細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％がＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋および／またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋になるまで共培養した。いくつかの実施形態において、工程（ｙ２）で得られたＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋および／またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋細胞を、ＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞と、１以上のＢ細胞成長活性剤の存在下にて、ＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋および／またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで共培養した。
【００２６】
いくつかの実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、工程（ａ）標的細胞の集団を生体外にて関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドデリバリーシステムと接触させる工程を含有する。実施形態において、標的細胞は造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。他の実施形態において、標的細胞は造血幹細胞である。さらに他の実施形態において、標的細胞はプロＢ細胞である。また他の実施形態において、標的細胞はプレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞である。またさらなる他の実施形態において、標的細胞はナイーブＢ細胞である。またさらなる他の実施形態において、標的細胞は活性化Ｂ細胞、形質芽球細胞または形質細胞である。いくつかの実施形態において、工程（ｘ２）は、標的細胞の集団と、関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含有するウイルス性または非ウイルス性のベクターをトランスフェクションさせる工程を含む。いくつかの実施形態において、ベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００２７】
いくつかの実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、工程（ｙ２）標的細胞と、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞を、標的細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がＣＤ１９＋μ＋になるまで共培養する工程を含有する。いくつかの実施形態において、標的細胞は関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドデリバリーシステムと接触した細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は関連の抗体とコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターをトランスフェクションした細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は任意のポリヌクレオチドデリバリーシステムと接触した細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。他の実施形態において、標的細胞は造血幹細胞である。さらに他の実施形態において、標的細胞はプロＢ細胞である。また他の実施形態において、標的細胞はプレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞である。またさらなる他の実施形態において、標的細胞はナイーブＢ細胞である。またさらなる他の実施形態において、標的細胞は活性化Ｂ細胞、形質芽球細胞および／または形質細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞を、第一支持細胞の集団と、標的細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％がＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋および／またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋になるまで共培養する。またさらなる他の実施形態において、標的細胞は活性化Ｂ細胞、形質芽球細胞および／または形質細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞を第一支持細胞の集団と、標的細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％がＣＤ１９＋μ＋δ＋になるまで共培養した。
【００２８】
いくつかの実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、前記工程（ｚ２）標的細胞と、ＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞を、１以上のＢ細胞成長因子の存在下にて、標的細胞の、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が関連の抗体を産生するＢ細胞になるまで共培養する。いくつかの実施形態において、標的細胞はＣＤ１９＋μ＋細胞、例えば工程（ｙ２）で得られたＣＤ１９＋μ＋である。他の実施形態において、標的細胞はＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋および／またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋細胞、例えば工程（ｙ２）で得られたＣＤ１９＋μ＋ＶプレＢ＋および／またはＣＤ１９＋μ＋κ／λ＋である。さらに他の実施形態において、標的細胞はＣＤ１９＋μ＋δ＋細胞、例えば工程（ｙ２）で得られたＣＤ１９＋μ＋δ＋である。いくつかの実施形態において、標的細胞はプロＢ細胞である。他の実施形態において、標的細胞はプレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞である。さらなる他の実施形態において、標的細胞はナイーブＢ細胞である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、標的細胞を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて工程（ｙ２）の前に培養する工程を含む。標的細胞を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、様々な日数で培養することができる。例えば、標的細胞を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｙ２）の前の、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日または少なくとも約１０日に培養することができる。さらに他の実施形態において、標的細胞を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｙ２）の前の、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日に培養することができる。また他の実施形態において、標的細胞を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて、工程（ｙ２）の前の、約１から約１０日、約２から約９日、約２から約８日、約２から約７日、約２から約６日または約２から約５日までで培養することができる。いくつかの実施形態において、標的細胞を、関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドデリバリーシステムと接触した細胞、例えば工程（ｘ２）にて産生された標的細胞である。他の実施形態において、標的細胞は関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドレトロウイルスベクターと形質導入された細胞、例えば工程（ｘ２）にて産生された形質導入された標的細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は任意のポリヌクレオチドデリバリーシステムと接触していない細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。他の実施形態において、標的細胞は造血幹細胞である。さらなる他の実施形態において、標的細胞はプロＢ細胞である。また他の実施形態において、標的細胞はプレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を、生体外にて生成する方法は、前記工程（ｘ２）標的細胞の集団を生体外にて、関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドデリバリーシステムと接触させる工程を含有する。他の実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、前記工程（ｙ２）標的細胞と、１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞を共培養する工程を含有しない。さらなる他の実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、前記工程（ｚ２）標的細胞と、ＣＤ４０Ｌを発現する第二支持細胞の集団を、１以上のＢ細胞成長活性剤の存在下にて共培養する工程を含有しない。また他の実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、標的細胞を、１以上のＢ細胞刺激因子の存在下で培養する工程（以下、「工程（ｗ）」ともいう）を含有しない。またさらなる他の実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、工程（ｘ２）、（ｙ２）および（ｚ２）を含有するが、工程（ｗ）は含有しない。他の実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、工程（ｘ２）、（ｙ２）および（ｚ２）を含有するが、工程（ｗ）は含有しない。さらなる他の実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、工程（ｘ２）および（ｚ２）を含有するが、工程（ｙ２）および（ｗ）は含有しない。さらなる他の実施形態において、抗体産生Ｂ細胞の集団を生体外にて生成する方法は、工程（ｙ２）および（ｚ２）を含有するが、工程（ｘ２）および（ｗ）は含有しない。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記工程（ｘ２）標的細胞の集団を生体外にて関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドデリバリーシステムとの接触を、前記工程（ｗ）の標的細胞を１以上のＢ細胞刺激因子の存在下にて培養した後および／または前記工程（ｙ２）標的細胞と１以上のＢ系統成長因子を発現する第一支持細胞の集団と共培養した後に実行した。
【００３２】
Ａ．定義
特に規定しない限り、本明細書において使用した専門的且つ科学的な用語は、本発明が帰属する当業者に一般的に理解されるような同様の意味を有する。例えばSingleton et al., Dictionaiy of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994);Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)を参照とする。本明細書に記載のものと同様または同等のあらゆる方法、装置および成分を、本明細書に開示した実施形態の実施で使用することができる。
【００３３】
本明細書において使用したように、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーとする。ポリペプチドは、様々な長さであることが可能である。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を、ポリペプチドの規定の範囲内に含む。ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基の有無であることができる。ポリペプチドは、翻訳後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含有することができる。「ポリペプチド」の例は、自然発生および自然発生でない双方で、１以上のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸、非コードアミノ酸等）を含有するポリペプチド、置換された結合、融合タンパク質を有するポリペプチド、ならびに従来技術にて知られている他の修飾を有するポリペプチドを含有するが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書において使用したように、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、同じ意味で用いられ、任意の核酸であり、リン酸ジエステル結合または修飾された結合、例えばリン酸トリエステル、アミド亜リン酸エステル、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバミン酸塩、チオエーテル、架橋アミド亜リン酸エステル、架橋メチレンホスホン酸塩、架橋アミド亜リン酸エステル、架橋アミド亜リン酸エステル、架橋メチレンホスホン酸塩、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸塩、ジチオリン酸、架橋スホロチオエートまたはスルトン結合、および上記結合の組合せから構成されているものとする。また「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、とりわけ５つの生物学的に発生する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸を含有する。
【００３５】
本明細書において使用したように、「抗原」とは抗原に特異的なポリペプチドに結合することが可能である任意の分子である。好ましい抗原は、免疫細胞にて発現する抗原に特異的なポリペプチドへの結合に応じて、免疫反応を開始することが可能である。いくつかの実施形態において、抗原は関連の疾病または疾患に関連する。抗原は、あらゆる方法において限定されず、好ましくは所望の免疫反応に基づいて選択される。抗原は、例えばポリペプチド、炭水化物、脂質または核酸であることができる。免疫反応を発生することができる抗原の例は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲンおよび自己抗原を含有するが、これらに限定されない。実施形態において、抗原はウイルス抗原、例えばＨＩＶ抗原である。他の実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。
【００３６】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同様の構造特徴を有する糖タンパクである。抗体が特異的な抗原への結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは抗原特異性を欠如する抗体および他の抗体様分子の双方を含有する。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低レベル、および骨髄腫によって高レベルにて産生される。
【００３７】
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常ヘテロ四量体グリコプロテインであり、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成される。それぞれの軽鎖は、重鎖にジスルフィド結合によって結合する。ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖の間にて異なる。それぞれの重鎖は、多様な定常ドメインの数に従う可変ドメイン（ＶＨ）を有する。それぞれの軽鎖は、一端にて可変ドメイン（ＶＬ）、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列して配置され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列して配置される。
【００３８】
本明細書の「抗体」という用語を、最も広い意味において使用して、具体的にはヒト、非ヒト（例えばネズミ科）、ヒト化モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を、それらが所望の生物学的活性を示す限り特に対象とする。様々な抗体が、本明細書に開示のシステムおよび方法に発現することができる。いくつかの実施形態において、抗体はｂ１２であり、ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプの、多くの一次分離株を中和するヒトモノクローナル中和抗体である。
【００３９】
本明細書において使用した「標的細胞」という用語は、活性化Ｂ細胞、形質芽球および形質細胞を含有するが、これらに限定されない抗体産生Ｂ細胞へと分化することができるあらゆる細胞とする。標的細胞は、幹細胞、特に造血幹細胞およびリンパ前駆細胞を含有するが、これらに限定されない。
【００４０】
「哺乳類」という用語は、哺乳類クラスに属する個体として規定すし、ヒト、家畜（domestic and farm animals）ならびに動物園、スポーツまたはペットの動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコまたはウシを含むがこれらに限定されない。好ましくは、本明細書の哺乳類はヒトである。
【００４１】
本明細書において使用したように、「Ｂ細胞刺激因子」を、造血幹細胞および／またはリンパ前駆細胞へのＢ系統の発生の関与を、支持または促進することが可能な、あらゆる化合物とする。化合物は、小分子、ポリペプチド、タンパク質または核酸であることができる。様々なＢ細胞刺激因子を、本明細書に記載の方法およびシステムにて使用することができる。Ｂ細胞刺激因子の例は、インターロイキン３（ＩＬ−３）、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒白血球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、抗ホスファターゼ（Ｓｂｆ１）およびメカノ成長因子（ＭＧＦ）を含有するが、これらに限定されない。当業者は、使用するＢ細胞刺激因子の量を、特定の状態に基づいて選択することができる。一般的にＢ細胞刺激因子の約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬを、本明細書に記載の方法またはシステムで使用することができる；しかしながら、いくつかの状態において、Ｂ細胞刺激因子の約１〜約１００ｎｇ／ｍＬを使用することができる。しかしながら、いくつかの状態にて、多少の量のＢ細胞刺激因子を使用することができる。１以上のＢ細胞刺激因子を使用する状態において、それぞれのＢ細胞刺激因子の量は同一であることができるか、それぞれのＢ細胞刺激因子は互いに異なることができる。
【００４２】
本明細書において使用したように、「Ｂ系統成長因子」という用語は、Ｂ系統発生の間、１以上のＢ細胞分化を促進することができる任意の化合物とする。Ｂ系統成長因子は、小分子、ポリペプチド、タンパク質または核酸であることができる。Ｂ系統発生における段階の非限定的な例は、前駆Ｂ細胞から初期のプロＢ細胞への段階、初期のプロＢ細胞から後期のプロＢ細胞への段階、後期のプロＢ細胞から大きいプレＢ細胞への段階、大きいプレＢ細胞から小さいプレＢ細胞への段階、小さいプレＢ細胞から未成熟Ｂ細胞への段階、および未成熟Ｂ細胞から成熟Ｂ細胞への段階を含む。Ｂ系統成長因子の例は、インターロイキン７（ＩＬ−７）、プレプロＢ細胞成長刺激因子（ＰＰＢＳＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒白血球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、抗ホスファターゼ（Ｓｂｆ１）、およびメカノ成長因子（ＭＧＦ）を含有するが、これらに限定されない。当業者は、Ｂ細胞刺激因子の量を、特定の状態に基づいて選択することが可能であるだろう。一般的に、Ｂ系統成長因子の約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬを本明細書に記載の方法またはシステムにて使用することができる。しかしながら、典型的な状態において、サイトカインＢ細胞活性剤の約１〜約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０〜約１５０ｎｇ／ｍＬを使用することができる。しかしながら、いくつかの状態にて、多少の量のＢ系統成長因子を使用することができる。１以上のＢ系統成長因子を使用する状態において、それぞれのＢ系統成長因子の量は同じであることができるか、またはそれぞれのＢ細胞刺激因子は互いに異なることができる。
【００４３】
本明細書にて使用したように、「Ｂ細胞活性剤」という用語は、ナイーブＢ細胞の活性、好ましくはナイーブＢ細胞の抗原の独立的な活性を促進することができる任意の化合物とする。Ｂ細胞活性剤は、小分子、ポリペプチド、タンパク質または核酸であることができる。従来の方法を、化合物がナイーブＢ細胞の抗原の独立的な活性を刺激することができる性能を有するかどうかを決定するため、使用することができる。例えば、化合物をヒト末梢血から分離されたナイーブＢ細胞の活性に対して検証することができる。Ｂ細胞活性剤の非限定的な例は、ＣｐＧ  ＤＮＡ、サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＦＮα、抗ＣＤ４０Ｌおよび乳酸を含む。当業者は、Ｂ細胞活性剤の量を、特定の状態に基づいて選択することが可能であるだろう。一般的にサイトカインのＢ細胞活性剤の約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬを、本明細書に記載の方法またはシステムに使用することができる；しかしながら、典型的な状態においてＢ細胞活性剤の約１〜約１５０ｎｇ／ｍＬまたは約１〜約１００ｎｇ／ｍＬを使用することができる。しかしながら、いくつかの状態において、多少の量を使用することができる。一般的に、約０．１〜約５μＭのＣｐＧ  ＤＮＡを使用することができる；しかしながら、典型的な状態において、約０．５〜４μＭ、約１〜約３．５μＭ、約１．５〜約３μＭまたは約２〜約２．５μＭのＣｐＧ  ＤＮＡを使用することができる。１以上のＢ活性剤を使用する状態において、それぞれのＢ細胞活性剤の量は同じであることができるか、またはそれぞれのＢ細胞活性剤は互いに異なることができる。
【００４４】
本明細書において使用したように、「支持細胞」という用語は、ＨＳＰＣまたはＢ細胞の成長、増殖、分化または拡大に関する微環境を生成、促進または支持することが可能なあらゆる細胞とする。本明細書に開示のシステムおよび方法において使用することができる適切な支持細胞は、間質細胞および線維芽細胞を含有するが、これらに限定されない。
【００４５】
「ベクター」は、他の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えばウイルス、プラスミド、コスミッドまたはファージであることができる。「発現ベクター」は、それが適切な環境に存在するとき、ベクターによって担持される１以上の遺伝子によってコード化されるタンパク質の発現を導くことができるベクターである。ベクターは、自己複製できることが好ましい。
【００４６】
「調節要素」および「発現制御要素」を、代用して使用することができ、特定の宿主生命体にて影響を実施可能な状態で結合したコード配列の発現に影響を与えることができる核酸分子とする。これらの用語は幅広く使用することができ、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写制御因子の基本的な相互作用に必要なコア要素、上流要素、エンハンサーおよび反応要素を含む転写を促進または調節する全ての要素に適応される（例えば、Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  Ｖ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）ｐａｇｅｓ８４７−８７３を参照とする）。原核生物における例示的な調節要素は、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位を含有する。真核生物の細胞にて使用する調節要素は、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含有するが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書において使用したように、「実施可能に結合」という用語を、調節要素と遺伝子もしくはそれのコード領域との間の関係を記載するために使用する。即ち、遺伝子発現を通常特定の調節要素、限定されないが例えば構成的または誘導可能なプロモーター、組織特異的な調節要素およびエンハンサーの制御下に配置する。遺伝子またはコード領域は、調節要素と「実施可能に結合」、「機能的に結合」または「実施可能に関連」であるといわれ、遺伝子またはコード領域を、調節要素によって制御または影響することを意味する。
【００４８】
本明細書に使用したように、「Ｂ細胞特異的プロモーター」という用語は、特異的トランス遺伝子発現をＢ細胞にて導入可能な任意のプロモーター／エンハンサーの配列とする。例えば、Ｂ細胞特異的プロモーターは、トランス遺伝子発現を、形質芽球および／または形質細胞にて導入可能であることができる。好ましいＢ細胞特異的プロモーターの他の非限定的な例は、Ｂ細胞発生によって一次および二次リンパ臓器における血液生成細胞からトランス遺伝子発現を導くことができるプロモーターである。Ｂ細胞の特異的プロモーターは、トランス遺伝子発現をＢ細胞発生に影響を与えることなく促進可能であることが好ましい。本明細書に開示の方法またはシステムは、Ｂ細胞特異的プロモーターのソースで制限しないことを意味する。Ｂ細胞特異的プロモーターは、通常Ｂ細胞にて発現する遺伝子の発現を制御する、任意のＢ細胞特異的な遺伝子のプロモーター／エンハンサー、および／またはそれの変異体または改変部分であることができ、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ７９ｂ(別名Ｂ２９またはＩｇβ)、ｍｂ−１（別名Ｉｇα）、チロシンキナーゼｂｌｋ、ＶプレＢ、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリンκ軽鎖、免疫グロブリンλ軽鎖、免疫グロブリンＪ鎖等含有するが、これらに限定されない。Ｂ細胞の特異的プロモーターの他の非制限の例は、合成プロモーター、例えばＭＨプロモーターおよびＥＥＫプロモーターを含有する。下記の図１Ｂおよび実施例に詳細に記載するように、ＭＨプロモーターは、マトリックス関連領域によって横に位置されるｉＥμであり、それに先行するμ重鎖プロモーター（ＶＨｐ）を含有し、ＥＥＫプロモーターは、イントロンエンハンサー（ｉＥκ）、ＭＡＲおよび３’エンハンサー（３’Ｅκ）によって先行されるヒトκ軽鎖プロモーター（ＶＫｐ）を含有する。
【００４９】
「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介遺伝子転移、例えば下記のようなポリヌクレオチドデリバリーシステムと細胞によって宿主細胞内への核酸の導入とする。
【００５０】
本明細書に規定するように、「形質転換」は外因性ＤＮＡを標的細胞に入る工程を記載する。形質転換は、原核生物または真核生物宿主細胞に異種核酸配列の挿入するための任意の既知の方法に依存することができる。この方法は形質転換される宿主細胞のタイプに基づいて選択され、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、および微粒子銃を含有するが、これらに限定されない。「形質転換」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自己複製プラスミドまたは宿主染色体の一部のいずれかとして複写することができる安定して形質転換された細胞を含有する。さらに含有されるものは、抗原特異的ポリペプチドを一過的に発現する細胞である。
【００５１】
「トランス遺伝子」という用語は、標的細胞の１以上の染色体中にヒトの介入によって組み込む任意の核酸またはＤＮＡ配列とする。実施形態において、トランス遺伝子は、関連の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含む。抗体をコード化するポリヌクレオチドは、一般的に、関連遺伝子、例えば転写制御配列の、所望の発現を得るために実用的である他の配列に機能的に結合する。他の実施形態において、トランス遺伝子は、それが組み込まれる染色体を示すＤＮＡ配列をさらに含有する。
【００５２】
「レトロウイルス」は、動物細胞の感染が可能であるエンベロープを有するＲＮＡウイルスである。「レンチウイルス」は、分裂および非分裂の細胞を感染することが可能であるレトロウイルスの種類とする。レンチウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶタイプ１およびＨＩＶタイプ２を含む）、ビスナ−マエディ、山羊関節炎脳炎ウイルス、馬伝染性貧血ウイルス、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＰＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。
【００５３】
「２Ａ配列」または要素は、リンカーとして２つのタンパク質の間に導入される小ペプチドであり、ポリタンパク質の自立性リボソーマル内の自己処理を可能とする（例えば、de Felipe. Gnetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) and deFelipe et al. Traffic 5:616-626(2004)）。これら短いペプチドは、複数のタンパク質を、単一ベクターから共発現することを可能とする。多くの２Ａ要素が、従来技術にて知られている。本明細書に開示の方法およびシステムにて使用することができる２Ａ配列の例は、米国特許公開番号２００７０１１６６９０号明細書に記載されるような口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻腔肺炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、ゾーシーアシグナウイルス（Ｔ２Ａ）および豚テシオウイルス１（Ｐ２Ａ）を限定することなく、含有する。
【００５４】
ポリヌクレオチドデリバリーシステム
本明細書に使用したように、「ポリヌクレオチドデリバリーシステム」は、ポリヌクレオチド、特に抗体をコード化するポリヌクレオチドを標的細胞内に導入することが可能であるあらゆるシステムである。ポリヌクレオチドデリバリーシステムは、ウイルス性および非ウイルス性のデリバリーシステムの双方を含有する。当業者は、特定の抗体をコード化するポリヌクレオチドを標的細胞内に効果的に導入ために使用することができるポリヌクレオチドデリバリーシステムの種類を決定することが可能であるだろう。
【００５５】
ポリヌクレオチドデリバリーシステムは、ウイルス性であることができる。適切なウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスに基づくベクター、例えばレトロウイルス由来ベクター（例えば、モローニマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）および比較的複雑なレトロウイルス由来ベクター（例えば、レンチウイルス由来ベクター）；ならびにＤＮＡウイルスに基づくベクター、例えばアデノウイルスに基づくベクターおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含有するが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドデリバリーシステムは、レトロウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクターを含有する。ウイルスベクターの非限定な例は、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、馬伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびマエディ／ビスナウイルス由来のレンチウイルスベクターを含有する。
【００５６】
実施形態において、変異レトロウイルスを使用して、抗体がコード化されるポリヌクレオチドを、標的細胞に導入する。抗体をコード化するポリヌクレオチドおよび任意の関連遺伝子要素が、宿主細胞のゲノム中にプロウイルスとしてこのように組み込まれる。
【００５７】
ウイルスベクターの生成は、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ塩基配列を含むが、これらに限定されない技術にて知られている任意の適切な遺伝子工学技術を使用して達成することができ、例えばSambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997))および“RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000))に記載される。
【００５８】
ウイルスベクターを、任意の既知の生命体のゲノムから配列を組み込むことができる。前記配列を、それらの本来の形態で組み込むことができるか、または任意の方法において修飾することができる。例えば、前記配列は、挿入、欠失または置換を含むことができる。好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、完全なレトロウイルス５’ＬＴＲおよび自己不活性３’ＬＴＲを含有する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、関連の抗体の、重鎖および軽鎖（例えば抗体の重鎖および軽鎖の可変領域）をコード化するポリヌクレオチドを、単一ポリヌクレオチドデリバリーシステムにおける単一ポリヌクレオチド、または１以上のポリヌクレオチドデリバリーシステムにおける独立したポリヌクレオチドのいずれかとして標的細胞内に導入することができる。好ましくは、単一ポリヌクレオチドデリバリーシステムを、抗体のそれぞれの鎖をコード化するポリヌクレオチドを含有するもので活用する。
【００６０】
例えば、関連の抗体の重鎖をコード化するポリヌクレオチドを導入する場合、関連の抗体の軽鎖をコード化するポリヌクレオチドを導入することがまた有利である。ポリヌクレオチドデリバリーシステムが、十分な性能を有する場合、重鎖および軽鎖を、例えば単一抗体をコード化するポリヌクレオチドとして共に導入することができる。従って、ポリヌクレオチドデリバリーシステムの実施形態は、抗体の重鎖をコード化するポリヌクレオチド、および抗体の軽鎖をコード化するポリヌクレオチドを含む。好ましくは、前記鎖の一つは、それぞれのサブユニットと同等の発現を促進するため、下記のようにＩＲＥＳまたは２Ａ要素によって先行する。選択的に、重鎖および軽鎖をコード化するポリヌクレオチドを、別々に標的細胞内に、それぞれ適切なポリヌクレオチドシステム、例えばそれぞれ別々のレトロウイルス粒子として導入することができる。 
【００６１】
ベクター
ポリヌクレオチドデリバリーシステムは、１以上のベクターを含むことができる。ベクターは、抗体をコード化するポリヌクレオチド配列、コード化配列の発現を導く１以上の制御要素と任意に関連のあるものを含有することができる。真核生物細胞発現ベクターは、従来技術にて知られていて、数々の市販の資源から利用できる。抗体をコード化するポリヌクレオチド配列が実施可能な状態で結合するベクターおよび／または発現制御配列の選択は、従来技術にて良く知られているように、例えばタンパク質発現といった所望の機能的特徴および形質転換される標的細胞に直接依存する。本発明で予測される好ましいベクターは、標的細胞の染色体内に抗体をコード化するポリヌクレオチドの挿入、および抗体をコード化するポリヌクレオチドによってコード化される抗体の発現を導くことができる。
【００６２】
配列をコード化する実施可能な状態で結合した抗原特異的ポリペプチドの発現を調整するために使用することができる発現制御要素が、従来技術にて知られていて、誘導性プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナル、エンハンサーおよび他の調節要素を含有するが、これらに限定されない。
【００６３】
いくつかの実施形態において、抗体をコード化するポリヌクレオチドを含有するベクターは、原核生物レプリコン（即ち、自己複製、および組み換えＤＮＡ分子を染色体外にて維持を導く原核生物宿主細胞にて能力を有するＤＮＡ配列）、例えば細菌宿主細胞を、それと共に形成転換して含有することができる。前記レプリコンが、従来技術にて知られている。さらに原核生物レプリコンを含むベクターが、検出可能なマーカー、例えば薬剤耐性を与える発現の遺伝子をさらに含有することができる。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに耐性を与えるものである。
【００６４】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドデリバリーシステムにて使用されるベクターは、真核生物細胞に効果的である選択的マーカー、例えば薬剤耐性選択マーカーに関する遺伝子を含有することができる。前記遺伝子は、選択的な培養培地において、形質転換宿主細胞の生存または成長のために必要な因子をコード化する。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されない宿主細胞は、培養培地にて生存しないだろう。典型的な選択遺伝子は、抗体または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに耐性を与えるか、栄養要求性欠損を補足するか、または重培地から与えられない様な栄養分を供給してタンパク質をコード化する。選択可能なマーカーは、独立したプラスミドに任意に存在し、共トランスフェクションによって導入される。
【００６５】
ポリヌクレオチドデリバリーシステムにて使用されるベクターは、標的細胞に認識され、抗原に特異的なポリヌクレオチドに機能的に結合するプロモーターを通常含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が生じることを可能とするＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンから上流（５’）に位置し（通常約１００から１０００ｂｐ）、それらが実施可能な状態で結合する抗原に特異的なポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御する翻訳されていない配列である。プロモーターは誘導可能または構成的であることができる。誘導可能なプロモーターは、ＤＮＡからの転写の上昇したレベルを、それらの制御下で、培養条件をいくつかの変化、例えば温度変化に応じて開始する。
【００６６】
当業者は、適切なプロモーターを特定の状況に基づいて選択することが可能である。多くの異なるプロモーターが従来技術に知られ、抗体をコード化するポリヌクレオチドへ実施可能な状態でプロモーターに結合する方法としてである。天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの双方を使用して、抗原に特異的なポリペプチドの発現を導くことができる。しかしながら、異種プロモーターが好ましく、それらが一般的に天然プロモーターと比較して所望のタンパク質の高い転写および高い収率を可能とするためである。プロモーターを、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシの乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得ることができる。またプロモーターを、例えば異種哺乳類プロモーター、例を挙げると免疫グロブリンプロモーター、Ｂ細胞特異的プロモーター（例えば、ＭＨプロモーターおよびＥＥＫプロモーター）または通常天然配列と関連するプロモーターであることができ、前記プロモーターは標的細胞と互換性を有する場合である。
【００６７】
ベクターは、発現が望ましい２以上の配列の場合、第一の他のそれぞれ付加的な配列は、好ましくは共発現を促進する要素、例えば内部リボソーマル侵入配列（ＩＲＥＳ）要素（米国特許第４，９３７，１９０号明細書）または２Ａ要素に結合する。例えば、ＩＲＥＳまたは２Ａ要素を、単一ベクターが、マルチサブユニットタンパク質のそれぞれのサブユニットをコード化する配列を有するとき、好ましく使用する。関連のタンパク質の場合には、所望の特異性、例えば第一コード領域（免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のいずれかをコード化する）がプロモーターから下流に位置する免疫グロブリンである。第二のコード領域（免疫グロブリンの存続した鎖をコード化）は、第一コード領域から位置し、ＩＲＥＳまたは２Ａの要素は、コード化領域の間、好ましくは第二コード化領域のすぐ前に配置される。第一と第二の遺伝子配列（それぞれ重鎖および軽鎖をコード化）の間のＩＲＥＳまたは２Ａの要素の組み込みは、双方の鎖を、ほぼ同じレベルにて標的細胞内で同じプロモーターから発現することを可能とする。 
【００６８】
本明細書に提供した開示を使用して、当業者は、特定のデリバリーシステムの有効性を、レポータータンパク質をコード化する遺伝子を含むベクターと一次骨髄細胞を形質転換し、適切な技術、例えば緑色蛍光タンパク質の結合から蛍光の測定を使用して、発現を測定することによって試験することができることを、認識するであろう。適切なレポーター遺伝子が、従来技術にて知られている。
【００６９】
適切な細胞と本出願のベクターとの形質転換は、よく知られた方法によって達成することができ、使用される方法はいかなる手段であれ限定されない。数々の非ウイルス性デリバリーシステムは従来技術にて知られていて、例えば、エレクトロポレーション；リポソームを含む脂質に基づくデリバリーシステム；「裸」DNAの導入；およびSchatzlein AG. 2001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs.に記載されているようなポリシクロデクストリン化合物を使用する導入を含む。陽イオン性脂質または塩の処理方法を通常使用して、例えばGraham et al., Virol., 1973, 52:456;Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76:1373-1376を参照として典型的に利用する。リン酸カルシウム沈殿法が、好ましい。しかしながら、ベクターを細胞内に導入するための他の方法は、核顕微鏡下注射および細菌原形質体融合を含有するものをさらに使用することができる。
【００７０】
ウイルスベクターを、本明細書に記載の方法またはシステムに使用することができる。ウイルスベクターから産生される組み換えウイルスを、ウイルスが細胞を感染することを可能とする任意の方法で、標的細胞へ導入することができる。ウイルスが細胞膜と、例えばウイルスが含まれる培地にて細胞をインキュベートによって接触することを可能とすることが好ましい。 
【００７１】
標的細胞
標的細胞は、生殖細胞系細胞および細胞株と体細胞およびその細胞株との双方を含有する。標的細胞は、いずれかの複製起点から由来する幹細胞であることができる。標的細胞が生殖細胞系細胞であるとき、標的細胞が単一細胞胚および胚性幹細胞（ＥＳ）からなる群から選択されることが好ましい。標的細胞が体細胞であるとき、細胞は例えばプレＢ、プロＢ、未成熟、ナイーブＢ細胞および活性化Ｂ細胞を含有するが、これらに限定されない未成熟または成熟したリンパ球を含む。
【００７２】
標的細胞は、幹細胞を含む細胞の異質集団を含有するが、これらに限定されない幹細胞または幹細胞株であることができる。 
【００７３】
いくつかの実施形態において、標的細胞は造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。好ましくは、標的細胞は造血幹細胞である。実施形態において、標的細胞は第一骨髄細胞である。他の実施形態において、標的細胞は臍帯血からのＣＤ３４＋細胞である。
【００７４】
標的細胞は、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコおよびモルモットを含有するが、これらに限定されないあらゆる哺乳類生物から由来するものであることができる。標的細胞は従来技術にて知られるあらゆる方法によって得られたものであることができる。
【００７５】
標的細胞を、ポリヌクレオチドデリバリーシステムと、生体内または生体外のいずれかで接触することができる。好ましくは、標的細胞を培養物にて維持し、ポリヌクレオチドデリバリーシステムと生体外にて接触することである。細胞を培養する方法が、従来技術によく知られている。
【００７６】
診断への適用
以下に記載するように、本明細書に開示したような抗体産生Ｂ細胞を生成する方法は、疾病または疾患の検出および／または疾病または疾患の進行の観測に実用的である関連の抗体を生成することができる。本明細書にて使用したように、「診断」という語句は、疾病または疾患の存在または性質を同定することとする。疾病または疾患と関連のある抗原（例えば、抗原タンパク質、抗原核酸配列、抗原ペプチド、抗原脂質、抗原炭水化物および抗原小分子）の検出は、疾病または疾患の診断の手段を提供する。前記検出法を、例えば状態の初期診断で使用して、対象が疾病または疾患を罹るかどうかを決定し、疾病または疾患の進行、治療プロトコルの進行を観測し、疾病または疾患の重症度を評価し、疾病または疾患の予後および／または回復の見込みを予測するか、または対象のための適切な治療を決定の補助することが可能である。検出は生体外または生体内にて発生することができる。
【００７７】
本明細書に記載した実施形態における診断で考えられる疾病は、抗原、例えば疾病と関連のある抗原が特異的に関連の抗体と結合することができる任意の疾病を含む。例えば、抗原は腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲンおよび自己抗原であることができる。実施形態において、抗原はウイルス抗原、例えばＨＩＶ抗原である。他の実施形態において、抗原は腫瘍関連の抗原（ＴＡＡ）である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、診断される疾病は、癌の種類、例えば白血病、癌、リンパ腫、星状細胞腫、肉腫、特にユーイングの肉腫、神経膠腫、網膜芽腫、黒色腫、ウィルム腫瘍、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肝細胞性癌、膵癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、子宮頸癌、精巣癌、腎細胞癌および脳腫瘍等である。 
【００７９】
他の実施形態において、診断される疾病は、細胞内寄生虫による感染と関連する。例えば、細胞内寄生虫は、ウイルス、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、乳頭腫ウイルス、パーボウイルス、ポリオーマウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス等であることができる。他の実施形態において、細胞内寄生虫は、バクテリア、原生動物、真菌またはプリオンであることができる。より詳細には、細胞内寄生虫は、例えばクラミジア属、リステリア属、サルモネラ属、レジオネラ属、ブルセラ菌、コクシエラ属、リケッチア属、マイコバクテリウム属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、トキソプラズマ属およびプラスモジウム属であることができる。
【００８０】
本明細書に記載した方法およびシステムによって生成される抗体産生Ｂ細胞から産生される抗体は、多様な有用性を有する。抗体での数々の他の使用が、治療的、診断的、法医学的、環境的および市販の応用を含有する従来技術にて知られている。例えば、生体外または生体内のいずれかにおける抗原は、関連の抗体と結合することができる。従って、本明細書に開示した方法を、有機体および／または抗原（例えばポリペプチド、炭水化物、脂質または核酸）の存在を、法医学／環境サンプルまたは組織／細胞で検出するために使用することができる。いくつかの実施形態において、前記方法を、活性化した状態の酵素の検出を可能とすることができる抗体の産生で使用することができる。他の実施形態において、前記方法を使用して、タンパク質を、例えば研究室規模または産業規模にての精製することができる 
【実施例】
【００８１】
さらなる実施形態を、より詳細に以下の実施例で開示し、いかなる方法であれ請求項の範囲を制限することを意図としない。
【００８２】
実験方法
以下の実験方法を下記の実施例１〜４に使用した。
【００８３】
プラスミドコンストラクション
抗ＨＦＶ抗体ｂ１２の軽鎖および重鎖の可変配列を増幅し、ヒトκ鎖定常部および分泌ＩｇＧ１定常部の上流にそれぞれ挿入した。２つの結果として生じる遺伝子は、自己切断Ｆ２Ａペプチドによって結合し、バイシストロニックユニットを形成した。その後結合した遺伝子を、ＦＵＷレンチウイルスベクター内にサブクローンし、ユビキチンＣプロモーター（Ｕ）を含有するレンチウイルスベクターＦＵＷ−ｂ１２（本明細書にて「Ｕ−ｂ１２」ともする）を作成した（図１Ｂ）。また、ＦＭＨＷレンチウイルスベクターを、マトリックス会合領域（ＭＡＲ）の側面に位置されるＥμエンハンサーの前に、ＦＵＷ内のユビキチンＣプロモーターをヒトμ重鎖プロモーター（ＭＨプロモーター）と置換することによって構成した。同様に、ＦＥＥＫＷベクターを、エンハンサーおよびＭＡＲの前に、ＦＵＷ内のユビキチンＣプロモーターを、ヒトκ軽鎖プロモーター（ＥＥＫプロモーター）を置換することによって構成した。その後ｂ１２のバイシストロニックユニットを、ＦＭＨＷおよびＦＥＥＫＷ内にサブクローンし、レンチウイルスベクターＦＭＨＷ−ｂ１２（本明細書において「ＭＨ−ｂ１２」ともする）およびＦＥＥＫＷ−ｂ１２（本明細書において「ＥＥＫ−ｂ１２」ともする）をそれぞれ生成した（図１Ｂ）。さらに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、ＦＵＷ、ＦＭＨＷおよびＦＥＥＫＷ内にサブクローンし、レンチウイルスベクターＦＵＷＧ（本明細書において「Ｕ−ＧＦＰ」ともする）、ＦＭＨＷＧ（また本明細書において「ＭＨ−ＧＦＰ」ともする）およびＦＥＥＫＷＧ（本明細書において「ＥＥＫ−ＧＦＰ」ともする）を生成した。全てのコンストラクトを、Ｎａｌｍ−６（プレＢ）、Ｒａｍｏｓ（ナイーブＢ）、Ｄａｋｉｋｉ（形質細胞腫）およびＪｕｒｋａｔ細胞株にて、ヒトＨＳＰＣ内に導入する前に試験した。
【００８４】
レンチウイルスの形質導入
レンチウイルスを、リン酸カルシウム沈殿物によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成した。高滴定濃度ウイルスを調製するため、ウイルスの上清を超遠心分離によって９０分間、５０００×ｇで濃縮した。ヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを感染の前２４時間未満で、１０％ウシ胎仔血清およびサイトカインを含有するIscove’s modified Dulbecco medium（ＩＭＤＭ）にて保持した。サイトカインは、ヒト組み換え型インターロイキン−３（ＩＬ−３；１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３リガンド（１０ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ；５ｎｇ／ｍＬ）、および顆粒白血球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；５ｎｇ／ｍＬ）を含み、感染中一日おきに与えた。濃縮レンチウイルス粒子による感染多重度で０．３〜０．４×１０６のＨＳＰＣ／穴の１０００の２つの一連の感染を、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ５０μｇ／ｍＬでプレコートした４８穴プレートにて実行した。ＨＳＰＣを感染後３日目に収集し、フローサイトメトリーによって分析した。感染細胞は、それらの前駆表現型を維持した。
【００８５】
酵素に結合した免疫吸着剤の分析
全ヒトＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡを、商業用酵素結合の免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）のキットを使用して分析した。ｂ１２−ＩｇＧ１を検出するためのＥＬＩＳＡを、Selvarajah et al., J Virol., 2005, 79:12148-12163から修正した。分析にて、プレートを、一晩、４℃にて単量体ｇｐ１２０ＭＮ、２μｇ／ｍＬで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内で被覆した。穴を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、１時間、室温にて阻害した。ＢＳＡを吸引後、サンプルの希釈剤、および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔにおけるｂ１２標準を添加し、３７℃にて３時間インキュベートした。ｂ１２標準培地を、２９３Ｔ細胞とＵ−ｂ１２をトランスフェクションすることによって得て、その濃度をＢｉａｃｏｒｅ  ｇｐ１２０結合分析によって測定した。穴を再度洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合するヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２を１：１０００で希釈して添加し、１時間３７℃にてインキュベートした。プレートを３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液の添加によって発現した。２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって、反応を中止し、プレートを４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｒｅａｄｅｒ上にて読み込んだ。
【００８６】
ウイルスの組み込みの検出
プロウイルスのコピー数を、修飾されたＡｌｕ長い末端反復（ＬＴＲ）ネステッド−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプロトコルで測定した。ＰＣＲの最初のラウンドは、Ａｌｕ配列（Alu-fw: 5'- TCCCAGCTACTGGGGAGGCTGAGG-3'）およびウイルスが組み込まれた後の５’ＬＴＲのすぐ下流の配列（PBS-bw: 5'-GAGTCCTGCGTCGAGAGAG-3'）の間で最長３ｋｂまでの増幅を可能とした。第二ラウンドは、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎに基づく定量ＰＣＲを使用して、プロウイルスＬＴＲの１４３ｂｐ配列を検出した（late-RT-fw: 5'-TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT-3'およびlate-RT-bw: 5'- GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC-3'）。検量線を確立するため、組み込まれたｇＤＮＡ標準を、６ヶ月間維持した組み込みＦＵＷで安定なＴＨＰ−Ｉ細胞株からｇＤＮＡを抽出することによって生成し、標準ｇＤＮＡにおけるプロウイルスのコピー数を、線状ＦＵＷプラスミドの連続希釈法をＬＴＲコピーの既知の数で使用して決定した。無関係なベクトルで形質導入されたＴＨＰ−１株のゲノムＤＮＡを、陰性対照として使用した。β−グロビンをローディングコントロールとして使用した。前記Ａｌｕ−ＬＴＲネステッドＰＣＲのプロトコルの検出範囲は、５０ｎｇのｇＤＮＡにつき５００〜６×１０４コピーである。Ｂ細胞発生の異なる段階におけるゲノムＤＮＡの量および細胞数の間の相互関係を、実験的に決定した。
【００８７】
実施例１
第一段階：Ｂ系統関与のための刺激、およびＨＳＰＣのレンチウイルス形質導入によるヒトＢ細胞のプログラミング
この実施例において、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を、前記工程（ａ）にてレンチウイルスコンストラクトとトランスフェクションし、前記工程（ｂ）にて約５日間Ｂ系統発生で刺激して、Ｂ細胞刺激因子、例えばＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン、ＳＣＦおよびＧ−ＣＳＦの存在下で関与した。
【００８８】
ＧＦＰをコード化するレンチウイルスベクターであるＦＵＧＷを使用して、ウイルス性形質導入を試験した。ＣＤ３４＋臍帯血細胞を、ウイルスおよび細胞の間を結合するものとしてＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎと混合した。ＨＳＰＣを、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３リガンド（１０ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（５ｎｇ／ｍＬ）およびＧ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ）を含むＢ細胞系統に、前駆細胞成長の促進および関与を支持する刺激混合物の因子の存在下にてインキュベートした。その後ｍｏｃｋベクターまたはＦＵＧＷウイルスと感染多重度１，０００で、２つの一連の感染を、ＨＳＰＣに与えた。サイトカインの同じ混合物を、一日おきに感染時に添加した。感染細胞を、感染から３日後（インキュベーション合計５日）に収集し、フローサイトメトリーによって分析した。図２Ａに示すように、ＣＤ３４＋細胞の８０％を超える形質導入効率を、インキュベーション５日後、刺激混合物の因子にて達成した。同様の形質導入効率を、珍しく、特にヒト臍帯血におけるＣＤ３４＋細胞の初期の亜細胞であるＣＤ３４＋ＣＤ３８細胞をゲート制御したとき観測した。  
【００８９】
レンチウイルスベクターのＵ−ｂ１２、ＭＨ−ｂ１２、ＥＥＫ−ｂ１２を、ＨＳＰＣを形質導入で用いられる前試験で、２つのヒトＢ細胞株（Ｎａｌｍ−６およびＲａｍｏｓ）および１つのＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）内にトランスフェクションした。３つの細胞株の何れも内因性ＩｇＧを発現しなかったため、細胞内ＩｇＧの染色は、トランスジェニックｂ１２−ＩｇＧ１を示す。ｂ１２−ＩｇＧ１発現でのユビキチンプロモーター（Ｕ）の効果を、ＭＨまたはＥＥＫのＢ細胞特異的プロモーターのいずれかのものと比較した。図２Ｂに示すように、ユビキチンに誘導されるコンストラクトＵ−ｂ１２は、ｂ１２−ＩｇＧ１を、双方のバンドＴ細胞株にて発現する一方、Ｂ細胞特異的プロモーターを含有するＭＨ−ｂ１２は、Ｂ細胞でｂ１２−ＩｇＧ１の高発現を、Ｔ細胞ではほとんど発現しないことを導いた。ｂ１２−ＩｇＧ１発現で同様の効果を、ＥＥＫ−ｂ１２の場合にも観測した。
【００９０】
Ｆ２Ａを含むバイシストロニックレンチベクターから産生されるｂ１２−ＩｇＧ１の相関性を確認するため、ｂ１２の重鎖および軽鎖の発現および集合を、還元および非還元の状態にて測定した。２９３Ｔ細胞を、レンチウイルスベクターＦＵＷ−ｂ１２とトランスフェクションした。細胞タンパク質を還元（＋β−メルカプトエタノール；すなわちβ−ＭＥ）および非還元の状態（−β−ＭＥ）下にて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用し、続いてＩｇＧ−Ｆｃ（γ重鎖／ＨＣ）とκ軽鎖／ＬＣのウェスタンブロット法によって抽出および分析した。９０％を超える重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）が発現し、Ｆ２Ａ部位にて切断され（非切断：Ｈ−２Ａ−Ｌ）、ほとんどの重鎖はホモ二量体を（Ｈ２；１００ｋＤ）、二硫化物結合によって形成し、それらは軽鎖（Ｈ２Ｌ２）を分泌前に、培地へ取り込んだ（図２Ｃ）。
【００９１】
さらに、ｂ１２−ＩｇＧ１のＨＩＶ中和性能を、偽型ウイルスを中和する分析を使用して確認した（図２Ｄ）。２９３Ｔ細胞を、レンチウイルスベクターＦＵＷ−ｂ１２とトランスフェクションした。培養上清を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって収集および測定し、ｇｐ１２０への結合の約６μｇ／ｍＬの濃度を得た。精製したｂ１２の濃度は、１２５μｇ／ｍＬであった。培養上清および精製したｂ１２を、偽型ウイルス中和分析の対象としたとき、最初の濃度１．２μｇ／ｍＬの５倍の２５μｇ／ｍＬまでそれぞれ希釈した。図２Ｄに示すように、ｂ１２を含有する培養培地は、偽型ウイルスのＳＦ１６２菌を、精製したｂ１２−ＩｇＧ１と同程度強力に中和することができた。中和５０％阻害濃度（ＩＣ５０’ｓ）は、培養培地および精製したｂ１２で、それぞれ０．０４０μｇ／ｍＬおよび０．０２６μｇ／ｍＬであった。 
【００９２】
実施例２
第二段階：刺激したＨＳＰＣからＭＳ５間質細胞でヒトＢ細胞の発生
この実施例において、Ｂ系統成長因子ＩＬ−７を発現するネズミの間質ＭＳ５細胞を使用して、工程（ｃ）にて刺激したＨＳＰＣから、ヒトのプロＢ、プレＢおよび未成熟Ｂ細胞の、一連の生成を支持した。刺激したＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、３〜４週間ＭＳ５細胞で培養した後、ＨＳＰＣ２３〜２８％が、プロＢ細胞となった。またインキュベーションから更に２〜３週間後、ＣＤ１９＋細胞６５〜６９％は、プレＢおよび未成熟Ｂ細胞の混合物を示した。
【００９３】
ＭＳ５間質細胞を、３×１０４細胞／穴にて２４穴プレートを一晩播種した。その後、ヒトＨＳＰＣをレンチウイルスベクター（Ｕ−ＧＦＰまたはＭＨ−ＧＦＰ）で形質導入し、非ウイルス性コントロール細胞をＭＳ５単分子上に、５％ウシ胎仔血清を含むIscove modified Dulbecco medium中の穴につき６×１０４細胞／５００μＬでそれぞれ播種した。ＨＳＰＣおよびＭＳ５細胞の共培養を、週２回の供給によって５〜６週間、最初培地５００μＬを添加し、次に弱く撹拌した後、細胞８０％を除去し、培地３００μＬを再度添加して、維持した。
【００９４】
ＭＳ５へさらすことに応じて、ＨＳＰＣはＣＤ３４およびｃ−ｋｉｔの発現を、初期前駆細胞用のマーカーで欠失し、二重陰性細胞（ＣＤ３４−ｃ−ｋｉｔ−）のパーセンテージを時間と共に増加した（図３Ａ）。ｍｏｃｋ感染されたＣＤ３４＋細胞、およびｂ１２発現したレンチウイルスと感染されたＣＤ３４＋細胞の間における明確な差を全く観測しなかった。図３Ｂに示すように、脊髄系統に相当するＣＤ１３＋細胞が、共培養の開始後早くても１週目に現れ始めた。しかしながら、Ｂ細胞系統刺激およびＭＳ５間質支持の組み合わせは、ＣＤ１９＋初期Ｂ細胞の生成を、３から４週目の間に誘導した（図４Ａ）。４週以降、Ｂ細胞は形成を継続し、優勢であった。
【００９５】
第二段階中にＢ細胞発生でトランス遺伝子の効果を測定するため、非感染ＨＳＰＣ（ウイルス非存在）または異なるレンチウイルスコンストラクトと形質導入されたＨＳＰＣを、３〜４週間（プロＢ細胞の段階に相当）または６週間（プレＢおよび未成熟Ｂ細胞の混合物が存在するときの時間に相当）ＭＳ５間質細胞で培養した。その結果は、Ｂ細胞の生成が、トランス遺伝子の発現によって影響しないことを示した（図５Ａ）。またユビキチンプロモーターがＧＦＰ発現の同程度のレベルを、ＣＤ１９−およびＣＤ１９＋細胞の双方で４週にて促進するが、Ｂ細胞特異的なＭＨプロモーターは、ＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現が比較的高かった（図４Ａ右パネル）。
【００９６】
第二段階の終わり（６週目）で、ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋プレＢおよびＣＤ１９＋ＣＤ１０未成熟Ｂ細胞の双方を生成し、それらの割合は導入されるレンチウイルスコンストラクト（ＭＨ−ｂ１２およびＥＥＫ−ｂ１２）に関わらず、同程度であった。これら特定の測定において、総ＣＤ１９＋細胞のパーセンテージは、ＭＨ−ｂ１２の場合、ＥＥＫ−ｂ１２より比較的向上していた。図５Ｂを参照とする。しかしながら、図５Ａに示すように、レンチウイルスコンストラクトの平均的な効果は、統計学的には同程度であった。
【００９７】
第二段階が生体内で正常ヒト骨髄に存在するＢ細胞の部分母集団の代表種を支持するかどうかを測定するため、初期Ｂ系統マーカーの表面発現を評価した。プロＢ細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ１０の共発現によって同定し、３週間後に現れた（図４Ｂ左パネル）。これらの細胞は代替軽鎖の発現に対して陰性であり、それらが実際プロＢ細胞であったことを示した。また、Ｂ細胞特異的プロモーターによって促進されたトランス遺伝子発現を、プロＢ細胞のみで見出されたが、他の細胞にては見出されなかった（図４Ｂ右パネル）。対照的に、ＭＨ−ＧＦＰ形質導入された前駆細胞由来のＣＤ１１ｃ＋樹枝細胞は、ＧＦＰに対して陰性（図４Ｃ）であり、免疫グロブリン転写の樹枝細胞における欠如と一貫していた。これはＭＨプロモーターが、Ｂ細胞系統にて主に活性化であることを示す。
【００９８】
形質導入された細胞およびＭＳ５間質細胞の共培養の４週後、総細胞の２５％から３０％はＣＤ１９＋μ＋であり、３週間で５％から８％であった。６週目にて、ＣＤ１９＋細胞集団は、ＶプレＢ＋プレＢ細胞およびκ／λ＋未成熟Ｂ細胞からなる（図４Ｅ下段の左および上パネル）。これら細胞は、μ＋δ−であり、それらは成熟Ｂ細胞でないことを示す（図４Ｅ下段右パネル）。全ＣＤ１９＋細胞は、またＩｇ（図４Ｆ）ならびにＩｇβに対して陽性であり、それらはそれらのＢ細胞受容体またはプレＢ細胞受容体を介してシグナルを発することが可能であることを示唆する。これらの結果は、プロＢ細胞が第２段階の週３から週４にて産生され、プレＢおよび未成熟Ｂ細胞の混合物が、第２段階の終わりにて産生されたことを示した。
【００９９】
ウイルス非存在のＨＳＰＣ、コントロールベクター（ｍｏｃｋまたはＧＦＰベクター）と形質導入されたＨＳＰＣ、またはｂ１２コンストラクトと形質導入されたＨＳＰＣで開始した実験由来のＢ細胞のパーセンテージにおいて、有意差は全く観測しなかった（図５Ａ）。また、ＭＨ−ｂ１２もＥＥＫ−ｂ１２のいずれも、ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋プレＢおよびＣＤ１９＋ＣＤ１０−未成熟Ｂ細胞の発生を、第２段階６週目で影響を及ぼさなかった（図５Ｂ）。全ての前記結果は、分泌ＩｇＧ発現またはＧＦＰ発現が、骨髄での正常Ｂ細胞発生を妨げないことを示唆した。
【０１００】
実施例３
第三段階：生体外における発生したヒトＢ細胞の活性化および血漿細胞分化
この実施例において、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＣｐＧ  ＤＮＡを含むＢ細胞活性剤を、ＣＤ４０Ｌを発現するＭＳ５細胞と共に使用して、プロＢ、プレＢおよび未成熟Ｂ細胞の活性化および最終分化を形質芽球および形質細胞に支持した。ＭＳ４０Ｌ細胞との共培養２〜３週以内に、第２段階から得たＢ細胞約９０％は、抗体分泌形質芽球（３５〜３７％）および形質細胞（１６〜２３％）を含有する活性化Ｂ細胞内に発生した。
【０１０１】
ヒトＣＤ４０Ｌクローンを、ＦＵＷ内にサブクローンした。ＭＳ５間質細胞を、ＦＵＷ−ＣＤ４０Ｌウイルスによって形質導入し、ＭＳ４０Ｌ単一クローンを、フローサイトメトリーによって選択し、ヒトＣＤ４０Ｌの低いまたは高いレベルを、細胞表面にて発現する安定なＭＳ５細胞株を生成した。その後、第２段階中に生成したプロＢ、プレＢおよび未成熟Ｂ細胞をカウントし、穴あたり５×１０４細胞／５００μＬで、ＭＳ４０Ｌ−低またはＭＳ４０−高の細胞と、ＩＬ−２の１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１０の１００ｎｇ／ｍＬおよびＣｐＧ  ＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の２μＭの存在下で、プレコートした４８穴プレートで播種した。いくつかの実験において、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）、可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍＬ）および架橋性エンハンサー（２μｇ／ｍＬ）を、さらに使用した。
【０１０２】
可溶性ＣＤ４０Ｌは、生体外由来のＢ細胞の生存および分化の促進できなかった。一方で、ＭＳ４０Ｌ−高またはＭＳ４０−低の細胞株によって提供される固定４０Ｌは、可溶性ＣＤ４０Ｌと比較して、生体外由来のＢ細胞の活性化および増殖に有力である。またＭＳ４０Ｌ−低細胞は、形質細胞になる第２段階由来のＢ細胞を誘導するＭＳ４０Ｌ−高より、有力である（図６Ｂ）。形質細胞は、第３段階の終わりにて最も明確であり、表面ＣＤ１９およびＩｇＭの減少したレベル（図６Ｃ上段パネル）、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋細胞の出現（図６Ｃ中央パネル）、およびＣＤ２７の上昇したレベル（図６Ｃ下段パネル）によって規定した。これらの結果は、固定されたＣＤ４０Ｌの適切なレベルが、形質細胞内の生体外由来Ｂ細胞の増殖および末端分化を誘導できることを示した。
【０１０３】
ナイーブＢ細胞の抗原に依存しない活性化を達成するため、ＣｐＧ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、インターフェロン−αおよび抗ＣＤ４０Ｌから選択されるサイトカインを含有する種々の促進剤の組み合わせを、種々の刺激剤の組み合わせを有するヒト末梢血から分離されたナイーブＢ細胞の活性化に対して試験した。一組の実験において、ＩＬ−２／ＩＬ−１０／ＣｐＧおよびＩＬ−２／ＩＬ−１０／ＣｐＧ／ＩＬ−６の組み合わせを使用し、細胞へ３日に一度投与した。その組み合わせの双方とも抗体分泌ＣＤ２０−ＣＤ３８＋およびＣＤ１９−／低ＣＤ２７＋細胞のパーセンテージが上昇した（図６Ｄ）。
【０１０４】
２から３週間、ＭＳ４０Ｌ−低で、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＣｐＧの存在下にて培養した第３段階の細胞の、詳細な表現型評価は、抗体分泌の形質芽球および形質細胞を生成することを明らかにした。第３段階細胞の分化中、ＣＤ１９発現が減少した（図７Ａ左パネル）一方、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋細胞（前駆体および完全な形質細胞）およびＣＤ１３８＋形質細胞は上昇した（図７Ｂ）。ＣＤ８６発現を、第３段階の開始後まもなく評価した（図７Ａ左パネル）；しかしながら、向上したＣＤ８６レベルは、Ｂ細胞が増殖から形質細胞内への分化に切り替わるにつれて、減少した。表面ＩｇＧ発現が現れる一方で、ＣＤ２７＋細胞のパーセンテージは上昇し（図７Ｃ）、内因性ＩｇＭから膜結合性ＩｇＧへのクラスの切り替えの発生およびメモリ細胞表現型の出現を示した。ＧＦＰをもたらすＢ細胞の血漿細胞分化（図８）またはｂ１２レンチウイルスコンストラクトの間の相違を全く観測されず、形質細胞への表現型のＭＨおよびＥＥＫプロモーターの効果は異ならず（図７Ａ〜Ｂ）、分泌ＩｇＧトランス遺伝子の発現は血漿細胞分化を妨害しないことを示唆した。
【０１０５】
第３段階の終わりでＢ細胞は、第２段階から生成される細胞より大きく、顆粒状であり（図７Ｅ）、形質芽球または形質細胞の形態を示し（図７Ｆ；ヒト骨髄からの正常な形質芽球および形質細胞の組織学的な比較、図９参照）、内因性ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡの比較的多い量を産生した（図７Ｇ）。これらの結果は、第２段階由来のＢ細胞が、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＣｐＧおよびＭＳ４０Ｌ−低の組み合わせを使用する形質芽球および形質細胞の段階を達成するため、活性化することができ、これらの抗体分泌細胞が、トランス遺伝子ｂ１２−ＩｇＧ１の存在に関わらず、表現型的且つ機能的に正常であることを示した。
【０１０６】
実施例４
抗ＨＩＶ抗体ｂ１２−ＩｇＧ１を産生するためのヒトＢ細胞のプログラミング
生体外培養システムの異なる時点でＢ細胞のゲノムＤＮＡにおける、組み込まれたレンチウイルスの分析は、プロウイルスがＢ細胞発生を通して存在することを示した（図１０）。明らかに生存し且つ発生した組み込み部位をもたらす細胞は、第３段階の終わりで細胞あたりのプロウイルスコピー数のように、平均的にはそれらの前駆細胞のものから統計学的に異ならなかった（Ｐ＝０．２６）。これは、抗ＨＩＶ中和抗体をコード化するレンチウイルスの安定した組み込みを、ＨＳＰＣから抗体分泌Ｂ細胞まで維持することができることを示唆した。
【０１０７】
ｂ１２特異的ＥＬＩＳＡを使用して、ｂ１２分泌量を、第２段階および第３段階までの間に生成した細胞から測定した。第２段階中、少量のｂ１２−ＩｇＧ１を、ｂ１２トランス遺伝子を細胞に導入した場合、毎週収集した細胞培養上液に検出した（図１１Ａ）。ユビキチンプロモーターは、一定に低いレベルのｂ１２発現を促進した。ＭＨプロモーターへの応答によるｂ１２の発現は、同様に低いが、おそらくプロＢ細胞が発現し始めた時間と一致した。第３段階の終わりで、高レベルの内因性ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡを検出し（図１１Ｂ）；１００ｎｇ／ｍＬを超えるｂ１２を、細胞をＭＨ−ｂ１２と最初に形質導入した場合に検出し、高レベルの約１．５μｇ／ｍＬのｂ１２をＥＥＫ−ｂ１２の場合に検出した。一貫して、ＥＥＫプロモーターは、骨髄腫細胞株におけるＧＦＰ発現の促進において、ＭＨプロモーターより活性化であったが（図１１Ｆ）、Ｎａｌｍ−６またはＲａｍｏｓのいずれかの細胞株ではないが、軽鎖プロモーターがｂ１２の発現を、抗体分泌形質細胞にて好ましく促進できることを示唆した。
【０１０８】
ユビキチンプロモーターは、トランス遺伝子をＢ細胞にて促進することに関して相対的に弱く、従って２つのＢ細胞特異的プロモーターのいずれかと比較してｂ１２−ＩｇＧ１のレベルを誘導することができなかった。形質細胞の抗体分泌機構の性能は、分泌された抗体の総量を制限することができ、ｂ１２−ＩｇＧ１がこれらの細胞から高く産生される場合（図１１Ｃ）、ＥＥＫ−ｂ１２をもたらす細胞からのＩｇＭ産生の減少を導く（図１１Ｂ）。Ｂ１２−ＩｇＧ１は、またトランス遺伝子をもたらすＢ細胞の細胞質にて、抗ｇｐ１２０エピトープおよびｂ１２−ＩｇＧ１の重鎖定常部とそれぞれ相互作用する蛍光色素のラベルされたｇｐ１２０ＭＮおよび抗ＩｇＧの細胞内共染色を使用して、検出可能である（図１１Ｄ）。ＥＥＫ−ｂ１２によって達成した１．５μｇ／ｍＬの濃度は、内因性ＩｇＧ産物と同程度であり（約１μｇ／ｍＬ）、ヒト血清内に使用したとき、該濃度は生体外においてＨＩＶ−Ｉウイルスの９０％を超える中和を達成するのに十分である。全体的に、これらの結果は、ＨＳＰＣをＭＨ−ｂ１２またはＥＥＫ−ｂ１２レンチウイルスコンストラクトと形質導入し、形質導入された細胞をＢ系統で分化し、ヒトＢ細胞をｂ１２−ＩｇＧ１中和抗体を産生するためプログラムすることができることを示した。
【０１０９】
実施例５
刺激されていないＨＳＰＣからのＩｇ分泌ヒトＢ細胞の発生
ヒト臍帯血からのＣＤ３４＋細胞を播種し、Ｂ系統成長因子ＩＬ−７を発現するＭＳ５ネズミ間質細胞単分子層上にて培養した。細胞培養を週２回行い、新鮮な培地を添加したり、次に培養穴からの培地８０％を吸引し、新鮮な培地を添加した。細胞培養を、ＣＤ１９＋細胞の出現に関して観察した。細胞集団の有意なパーセンテージが、ＣＤ３４−ＣＤ１９＋になるとき、長期の培養細胞を収集し、ＭｉｎｉＭａｃｓ細胞分離システムを使用して、ＣＤ１９＋細胞を増加させた。
【０１１０】
その後増加した１９＋細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＣｐＧを含有するＢ細胞活性剤の存在下で、ＣＤ４０Ｌ（例えばＭＳ４０Ｌ−低およびＭＳ４０Ｌ−高）を発現するＭＳ５細胞と共に、実施例３に記載したように培養する。ＭＳ５細胞が、ＣＤ１９＋細胞の活性化および末端分化をＩｇ分泌形質芽球または形質細胞に支持することが予期される。
【０１１１】
実施例６
プロＢ、プレＢおよび／または未成熟Ｂ細胞から抗体産生ヒトＢ細胞への発生
プロＢ、プレＢまたは未成熟Ｂ細胞を播種し、Ｂ系統成長因子ＩＬ−７を発現するＭＳ５ネズミ間質細胞単分子層上で培養した。細胞培養を週に２回行い、新鮮な培地を添加したり、培養穴から培地８０％を吸引し、新鮮な培地を添加した。細胞培養を、ＣＤ１９＋μ＋δ＋細胞の増加に関して観察した。細胞集団の有意なパーセンテージが、ＣＤ１９＋μ＋δ＋になるとき、細胞を収集し、ＭｉｎｉＭａｃｓ細胞分離システムを使用して、ＣＤ１９＋μ＋δ＋細胞を増加した。 
【０１１２】
その後関連の抗体をコード化する遺伝子を、増加したＣＤ１９＋μ＋δ＋細胞内に、従来の遺伝子デリバリー技術、例えば関連の抗体がコード化する遺伝子を含有するレンチウイルスベクターと細胞をトランスフェクションすることによって導入した。関連の抗体をコード化する遺伝子を含有するＣＤ１９＋μ＋δ＋細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＣｐＧ  ＤＮＡを含有するＢ細胞活性剤の存在下で、ＣＤ４０Ｌ（例えばＭＳ４０Ｌ−低およびＭＳ４０Ｌ−高）を発現するＭＳ５細胞と共に、実施例３に記載したように、培養する。ＭＳ５細胞が、関連の抗体を産生する形質芽球または形質細胞に、ＣＤ１９＋μ＋δ＋細胞の活性化および末端分化を支持することが予期される。
【０１１３】
実施例７
ナイーブＢ細胞から抗体産生ヒトＢ細胞への発生
関連の抗体をコード化する遺伝子をもたらすナイーブＢ細胞を播種し、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＣｐＧ  ＤＮＡを含有するＢ細胞活性剤の存在で、ＣＤ４０Ｌ（例えば、ＭＳ４０Ｌ−低およびＭＳ４０Ｌ−高）を発現するＭＳ５細胞と共に、実施例３に記載したように培養した。関連の抗体をコード化する遺伝子を、ナイーブＢ細胞内に、従来の遺伝子デリバリー技術、例えば関連の抗体がコード化される遺伝子を含有するレンチウイルスベクターとナイーブＢ細胞をトランスフェクションすることによって導入した。ＭＳ５細胞は、関連の抗体を産生する形質芽球および形質細胞に、ナイーブＢ細胞の活性化および末端分化を支持すると予期した。
【０１１４】
上記発明を特定の実施形態に関して記載したが、他の実施形態は当業者に明らかである。したがって、他の組合せ、省略、交換および変更が、本明細書の開示を考慮して当業者に明らかある。従って、本出願は、好ましい実施形態の説明を制限する意図するものではないが、添付の特許請求の範囲を参照することによって規定されることを意図する。本明細書に引用される全ての引用文献を、それらを完全に参照することによって組み込む。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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