(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、構造的に、炭水化物エステラーゼファミリ７の酵素として分類され、配列番号５または配列番号１０のアミノ酸残基２７７に対する置換が、セリン、トレオニン、バリンおよびアラニンからなる群から選択されることを条件として、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ法のアラインメントに基づいて、配列番号５または配列番号１０と、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、上記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号５または配列番号１０を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
調節配列と作動可能に連結された、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えＤＮＡコンストラクトを含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで細胞を形質転換することを含む、細胞を形質転換するための方法。
【請求項８】
ペルヒドロリシス活性を有し、構造的に、炭水化物エステラーゼファミリ７の酵素として分類される、単離されたポリペプチドであって、配列番号５または配列番号１０のアミノ酸２７７に対する置換が、セリン、トレオニン、バリンおよびアラニンからなる群から選択されることを条件として、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ法のアラインメントに基づいて、配列番号５または配列番号１０と、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、上記単
離されたポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが、配列番号５または配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
カルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を生成させるための方法であって、
（ａ）（１）（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
（式中、
Ｘは、式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、任意選択的にヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｃ２〜Ｃ７であるＲ6は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
Ｒ5は、任意選択的にヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ5の各炭素原子はそれぞれ、１つより多くないヒドロキシル基、または１つより多くないエステル基を含み、そしてここでＲ5は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ5における炭素原子の数である）
を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水に対する溶解度を有する、１つまたはそれ以上のエステルと、
（ii）構造
【化１】
0005665747.tif 000034
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ3およびＲ4は、それぞれＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたはそれ以上のグリセリドと、
（iii）式
【化２】
0005665747.tif 000035
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ2は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である）
を有する１つまたはそれ以上のエステルと、
（iv）１つまたはそれ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類またはアセチル化多糖類と、
（ｖ）（ｉ）〜（iv）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択されるカルボン酸エステルと；
（２）過酸素の源と；
（３）請求項８または９に記載のポリペプチドと；
を含む、一式の反応成分を備えることと：
（ｂ）該反応成分を適した水性反応条件下で混ぜ合わせ、それによって、ペルオキシカルボン酸を生成させることと：
を含む、上記方法。
【請求項１１】
酵素生成ペルオキシカルボン酸組成物を用いて硬表面または無生物対象を殺菌または消毒するための方法であって、
（ａ）（１）（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
（式中、
Ｘは、式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、任意選択的にヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｃ２〜Ｃ７であるＲ6は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
Ｒ5は、任意選択的にヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ5の各炭素原子はそれぞれ、１つより多くないヒドロキシル基、または１つより多くないエステル基を含み、そしてここで、Ｒ5は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ5における炭素原子の数である）
を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水に対する溶解度を有する、１つまたはそれ以上のエステルと、
（ii）構造
【化３】
0005665747.tif 000036
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ3およびＲ4は、それぞれＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたはそれ以上のグリセリドと、
（iii）式
【化４】
0005665747.tif 000037
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ2は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である）
を有する１つまたはそれ以上のエステルと、
（iv）１つまたはそれ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類またはアセチル化多糖類と、
（ｖ）（ｉ）〜（iv）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択されるカルボン酸エステルと；
（２）過酸素の源と；
（３）請求項８または９に記載のポリペプチドと；
を含む、一式の反応成分を備えることと：
（ｂ）該反応成分を適した水性反応条件下で混ぜ合わせ、それによって、ペルオキシカルボン酸生成物を形成させることと：
（ｃ）任意選択的に該ペルオキシカルボン酸生成物を希釈することと：
（ｄ）上記硬表面または無生物対象を、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成したペルオキシカルボン酸と接触させ、それにより該表面または該無生物対象を殺菌または消毒することと：
を含む、上記方法。
【請求項１２】
酵素生成ペルオキシカルボン酸組成物を使用して、漂白、汚れ除去、臭気低減、衛生化または殺菌を目的として衣料品または繊維製品の物品を処理するための方法であって、
（ａ）以下のものを含む反応成分すなわち
（１）（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
（式中、
Ｘは、式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、任意選択的にヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｃ２〜Ｃ７であるＲ6は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
Ｒ5は、任意選択的にヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ5の各炭素原子はそれぞれ、１つより多くないヒドロキシル基、または１つより多くないエステル基を含み、そしてここで、Ｒ5は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ5における炭素原子の数である）
を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水に対する溶解度を有する、１つまたはそれ以上のエステルと、
（ii）構造
【化５】
0005665747.tif 000038
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ3およびＲ4は、それぞれＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたはそれ以上のグリセリドと、
（iii）式
【化６】
0005665747.tif 000039
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ2は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である）
を有する１つまたはそれ以上のエステルと、
（iv）１つまたはそれ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類またはアセチル化多糖類と、
（ｖ）（ｉ）〜（iv）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択されるカルボン酸エステルと；
（２）過酸素の源と；
（３）請求項８または９に記載のポリペプチドと；
を含む、一式の反応成分を備えることと：
（ｂ）該反応成分を適した水性反応条件下で混ぜ合わせ、それによって、ペルオキシカルボン酸生成物を形成させることと：
（ｃ）任意選択的に、該ペルオキシカルボン酸生成物を希釈することと：
（ｄ）衣料品または繊維製品の上記物品を、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成したペルオキシカルボン酸と接触させることと：
を含む、衣料品または繊維製品の該物品を、汚れ除去、脱臭、殺菌、漂白するか、またはこれらの組み合わせである、上記方法。
【請求項１３】
ペルオキシカルボン酸発生システムであって、
（ａ）（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
（式中、
Ｘは、式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、任意選択的にヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｃ２〜Ｃ７であるＲ6は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
Ｒ5は、任意選択的にヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ5の各炭素原子はそれぞれ、１つより多くないヒドロキシル基、または１つより多くないエステル基を含み、そしてここで、Ｒ5は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ5における炭素原子の数である）
を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水に対する溶解度を有する１つまたはそれ以上のエステルと、
（ii）構造
【化７】
0005665747.tif 000040
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ3およびＲ4は、それぞれＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたはそれ以上のグリセリドと、
（iii）式
【化８】
0005665747.tif 000041
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ2は、直鎖または分枝鎖でＣ１〜Ｃ１０の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である）
を有する１つまたはそれ以上のエステルと、
（iv）１つまたはそれ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類またはアセチル化多糖類と、
（ｖ）（ｉ）〜（iv）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択される基質と；
（ｂ）過酸素の源と；
（ｃ）請求項８または９に記載のポリペプチドと；
を含む、ペルオキシカルボン酸発生システム。
【請求項１４】
調合物であって、
（ａ）請求項８または９に記載のポリペプチドを含む酵素触媒と、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステルと、を含む第１の混合物であって、任意選択的に無機緩衝剤または有機緩衝剤、腐食防止剤、湿潤剤またはこれらの組み合わせを含む、該第１の混合物と、
（ｂ）過酸素の源と水とを含む第２の混合物であって、任意選択的に過酸化水素安定剤をさらに含む、該第２の混合物と、
を含む、上記調合物。
【請求項１５】
配合物であって、
（ａ）請求項８または９に記載のポリペプチドを含む酵素触媒と、アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、アセチル化多糖類、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアセチル化糖類と、を含む第１の混合物であって、任意選択的に無機緩衝剤または有機緩衝剤、腐食防止剤、湿潤剤またはこれらの組み合わせをさらに含む、該第１の混合物と、
（ｂ）過酸素の源と水とを含む第２の混合物であって、任意選択的に過酸化水素安定剤を含む該第２の混合物と、
を含む、上記調合物。
【請求項１６】
酵素生成ペルオキシカルボン酸組成物を用いて、衣料品または繊維製品の物品に効果を与えるための方法であって、
（ａ）（１）（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
（式中、
Ｘは、式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ6は、任意選択的にヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｃ２〜Ｃ７であるＲ6は任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
Ｒ5は、任意選択的にヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ5の各炭素原子はそれぞれ、１つよ
り多くないヒドロキシル基、または１つより多くないエステル基を含み、そしてここで、Ｒ5は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ5における炭素原子の数である）
を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水に対する溶解度を有する、１つまたはそれ以上のエステルと、
（ii）構造
【化９】
0005665747.tif 000042
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ3およびＲ4は、それぞれＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である）
を有する１またはそれ以上のグリセリドと、
（iii）式
【化１０】
0005665747.tif 000043
（式中、Ｒ1は、任意選択的にヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ2は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である）
を有する１つまたはそれ以上のエステルと、
（iv）１つまたはそれ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類またはアセチル化多糖類と、
（ｖ）（ｉ）〜（iv）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択されるカルボン酸エステルと；
（２）過酸素の源と；
（３）請求項８または９に記載のポリペプチドと；
を含む、一式の反応成分を備えることと：
（ｂ）該反応成分を適した水性反応条件下で混ぜ合わせ、それによって、ペルオキシカルボン酸生成物を形成させることと：
（ｃ）任意選択的に、該ペルオキシカルボン酸生成物を希釈することと：
（ｄ）衣料品または繊維製品の上記物品を、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成したペルオキシカルボン酸と接触させ、それによって衣料品または繊維製品の該物品が、漂白、汚れ除去、脱臭、殺菌、消毒およびこれらの組み合わせからなる群から選択される効果を受けることと：
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ２００８年１０月３日にファイルされた、米国仮特許出願第６１／１０２，５０５号明細書、同第６１／１０２，５１２号明細書、同第６１／１０２，５１４号明細書、同第６１／１０２，５２０号明細書、同第６１／１０２，５３１号明細書、同第６１／１０２，５３９号明細書（各々全体を参照により本明細書に援用する）の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、酵素的ペルオキシカルボン酸合成およびｉｎ  ｓｉｔｕ酵素触媒作用の分野に関する。特に、ペルヒドロリシス活性が改善された変異酵素触媒に関する組成物および方法が得られる。少なくとも１種類のペルオキシカルボン酸が、表面の殺菌または消毒、医療機器の滅菌、食品加工設備の滅菌に有効かつ、漂白、脱染、脱臭、殺菌または消毒などの繊維製品および洗濯用途で使用するのに適した十分な濃度で生成される。
【背景技術】
【０００３】
ペルオキシカルボン酸組成物は、効果的な抗微生物剤であることが報告されている。望ましくない微生物の成長が生じないように、硬質表面、肉製品、生きた植物組織、医療装置を洗浄、殺菌および／または消毒するための方法が説明されている（特許文献１〜５）。ペルオキシカルボン酸は、洗濯洗剤用途での漂白組成物を調製するにあたって有用であるとも報告されている（特許文献６〜８）。
【０００４】
ペルオキシカルボン酸は、カルボン酸および過酸化水素の化学反応によって調製可能である（非特許文献１を参照のこと）。この反応は通常、濃硫酸などの強い無機酸によって触媒される。過酸化水素とカルボン酸との反応は平衡反応であり、ペルオキシカルボン酸の生成は、過剰濃度のペルオキシドおよび／またはカルボン酸を使用するか、あるいは水を除去することに支えられている。
【０００５】
ペルオキシカルボン酸ベースの殺菌剤または漂白剤の中には、ペルオキシカルボン酸、過酸化水素、対応するカルボン酸の平衡混合物で構成されるものもある。これらの商業的なペルオキシカルボン酸洗浄システムの欠点のひとつに、ペルオキシカルボン酸が、溶液中で経時的に不安定なことが多い点があげられる。安定性の問題を解決するひとつの方法として、別個であれば長時間にわたって安定する複数の反応成分を合わせることで、使用直前にペルオキシカルボン酸を生成することがある。好ましくは、個々の反応成分は、保管が容易で、取り扱いが比較的安全で、混合時に有効濃度のペルオキシカルボン酸をすみやかに生成できるものである。
【０００６】
最近になって、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリがペルヒドロラーゼ活性を持つことが報告された。これらの「ペルヒドロラーゼ」酵素は、過酸素の源と合わせると多岐にわたるカルボン酸エステル基質からペルオキシカルボン酸を生成するのに特に効果的であることが実証されている（特許文献９および１０、１１、１２（各々その内容全体を参照により本明細書に援用する）を参照のこと）。炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリのメンバの中には、アルコール、ジオール、グリセロールのアセチルエステルから、反応成分を混合後１分以内に４０００〜５０００ｐｐｍ、５分〜３０分の間で最大９０００ｐｐｍの過酢酸を生成するのに十分なペルヒドロリシス活性を持つことが示されているものもある（特許文献１２）。
【０００７】
酵素的ペルヒドロリシスに基づいて多くの漂白および／または殺菌生成物を商業化する機能は、酵素触媒製造コストに左右されることがある。ペルヒドロリシス活性が改善された酵素触媒を使用すれば、業務用生成物における酵素触媒の量が低減されることもあり、生成コストが十分に小さくなり得る。それ自体、同定するペルヒドロリシス活性が改善された酵素触媒を同定する必要性が依然としてある。
【０００８】
さらに、酵素的ペルヒドロリシスは一般に、水性反応条件を用いて実施される。ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒は一般に、反応混合物のｐＨを下げることのあるカルボン酸を形成しつつ加水分解活性を呈する。それ自体、エステル対ペルオキシカルボン酸のペルヒドロリシスに対する選択性が、同じエステル対カルボン酸の加水分解の場合よりも高いペルヒドロラーゼを利用するのが望ましい；「Ｐ／Ｈ」比（ペルヒドロリシス率／加水分解率）が、ペルヒドロリシスに対するペルヒドロラーゼの選択性を特徴付けるひとつの方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６８３，７２４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００２６８４６号明細書
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２９６，１６１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６４，５５４号明細書
【特許文献９】ＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．に対する国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０７０６０９号パンフレット
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００８／１７６７８３号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｓｗｅｒｎ，  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ  ３１３〜５１６；  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
解決すべき課題は、改善されたペルヒドロリシス活性を特徴とする酵素触媒を提供することにある。この改善は、ペルオキシカルボン酸をカルボン酸エステルから生成する場合のカルボン酸エステルに対するペルヒドロラーゼ比活性の亢進および／または加水分解に比したペルヒドロリシスに対する選択性の改善であってもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した課題は、ペルオキシカルボン酸をカルボン酸エステルから生成する場合のペルヒドロラーゼ比活性が改善および／または加水分解に比したペルヒドロリシスに対する選択性が改善された酵素触媒を提供することによって解決される。特に、ペルヒドロラーゼ比活性が改善および／または選択性が改善された（すなわちペルヒドロリシス／加水分解活性比が改善された）ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ変異体が得られる。本変異体を含む組成物および方法も得られる。
【００１３】
一態様は、ペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドに向けたものであり、前記ポリペプチドが、構造的に、炭水化物エステラーゼファミリ７の酵素として分類され、（ａ）配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２０または配列番号２５とのアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であり、ただし、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２０または配列番号２５のアミノ酸残基２７７に対する置換が、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択されることを条件とするか、（ｂ）配列番号３０とのアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であり、ただし、配列番号３０のアミノ酸残基２７８に対する置換が、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択されることを条件とする。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、配列番号５、１０、１５、２０、２５または３０を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８または２９を含む。
【００１４】
もうひとつの態様は、ペルヒドロリシス活性を有し、かつ構造的に、炭水化物エステラーゼファミリ７の酵素として分類される、単離されたポリペプチドに向けたものであり、前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２０または配列番号２５とのアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であり、ただし、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２０または配列番号２５のアミノ酸２７７に対する置換が、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択されることを条件とする；または（ｂ）配列番号３０とのアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であり、ただし、配列番号３０のアミノ酸２７８に対する置換が、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択されることを条件とする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号５、１０、１５、２０、２５または３０を含む。
【００１５】
別の態様では、カルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を生成するための方法であって、
（ａ）以下のものを含む反応成分すなわち
（１）カルボン酸エステルであって、
（ｉ）エステルであって、以下の構造すなわち
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、任意選択によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は任意選択により、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である１つ以上のエーテルリンケージを含み、
Ｒ５は、任意選択によりヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、式中、Ｒ５の各炭素原子は個々に、ヒドロキシル基を１つしか含まないかエステル基を１つしか含まず、かつ、式中、Ｒ５は、任意選択により、１つ以上のエーテルリンケージを含み、
ｍは、１からＲ５の炭素原子数である）を有し、
水に対する溶解性が２５℃で少なくとも５ｐｐｍである、１種類以上のエステルと、
（ｉｉ）グリセリドであって、以下の構造すなわち
【化１】
0005665747.tif 000002
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）を有する１種類以上のグリセリドと、
（ｉｉｉ）エステルであって、以下の式すなわち
【化２】
0005665747.tif 000003
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ２は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）を有する１種類以上のエステルと、
（ｉｖ）１種類以上のアセチル化単糖、アセチル化二糖またはアセチル化多糖と、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択されるカルボン酸エステルと、
（２）過酸素の源と、
（３）上述したようなペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドと、
を含む、一組の反応成分を提供し、
（ｂ）前記反応成分同士を好適な水性反応条件下で組み合わせることによって、ペルオキシカルボン酸を生成することを含む、
方法が得られる。
【００１６】
別の態様では、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸組成物を用いて硬質表面または無生物を殺菌または消毒するための方法であって、
（ａ）以下のものを含む反応成分すなわち
（１）カルボン酸エステルであって、
（ｉ）エステルであって、以下の構造すなわち
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、任意選択によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は任意選択により、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である１つ以上のエーテルリンケージを含み、
Ｒ５は、任意選択によりヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、式中、Ｒ５の各炭素原子は個々に、ヒドロキシル基を１つしか含まないかエステル基を１つしか含まず、かつ、式中、Ｒ５は、任意選択により、１つ以上のエーテルリンケージを含み、
ｍは、１からＲ５の炭素原子数である）を有し、、
水に対する溶解性が２５℃で少なくとも５ｐｐｍである、１種類以上のエステルと、
（ｉｉ）グリセリドであって、以下の構造すなわち
【化３】
0005665747.tif 000004
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）を有する１種類以上のグリセリドと、
（ｉｉｉ）エステルであって、以下の式すなわち
【化４】
0005665747.tif 000005
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ２は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）を有する
１種類以上のエステルと、
（ｉｖ）１種類以上のアセチル化単糖、アセチル化二糖またはアセチル化多糖と、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択されるカルボン酸エステルと、
（２）過酸素の源と、
（３）上述したようなペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドと、
を含む、一組の反応成分を提供し、
（ｂ）前記反応成分同士を好適な水性反応条件下で組み合わせることによって、ペルオキシカルボン酸生成物を形成し、
（ｃ）任意選択により前記ペルオキシカルボン酸生成物を希釈し、
（ｄ）前記硬質表面または無生物を、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成したペルオキシカルボン酸と接触させることで前記表面または前記無生物を殺菌すること
を含む、前記方法が得られる。
【００１７】
もうひとつの態様は、ペルオキシカルボン酸生産システムであって、
（ａ）気質であって、
（ｉ）エステルであって、以下の構造すなわち
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、任意選択によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は任意選択により、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である１つ以上のエーテルリンケージを含み、
Ｒ５は、任意選択によりヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、式中、Ｒ５の各炭素原子は個々に、ヒドロキシル基を１つしか含まないかエステル基を１つしか含まず、かつ、式中、Ｒ５は、任意選択により、１つ以上のエーテルリンケージを含み、
ｍは、１からＲ５の炭素原子数である）を有し、、
水に対する溶解性が２５℃で少なくとも５ｐｐｍである、１種類以上のエステルと、
（ｉｉ）グリセリドであって、以下の構造すなわち
【化５】
0005665747.tif 000006
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）を有する１種類以上のグリセリドと、
（ｉｉｉ）エステルであって、以下の式すなわち
【化６】
0005665747.tif 000007
（式中、Ｒ１は、エステルであって、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ２は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）を有する１種類以上のエステルと、
（ｉｖ）１種類以上のアセチル化単糖、アセチル化二糖またはアセチル化多糖と、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択される基質と、
（ｂ）過酸素の源と、
（ｃ）上述したペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドと、
を含む、ペルオキシカルボン酸生成システムに向けたものである。
【００１８】
別の態様は、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸組成物を使用して、漂白、染み抜き、臭いの低減、消毒または殺菌を目的として衣類または繊維製品の物品を処理するための方法であって、
（ａ）以下のものを含む反応成分すなわち
（１）カルボン酸エステルであって、
（ｉ）エステルであって、以下の構造すなわち
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、任意選択によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は任意選択により、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である１つ以上のエーテルリンケージを含み、
Ｒ５は、任意選択によりヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、式中、Ｒ５の各炭素原子は個々に、ヒドロキシル基を１つしか含まないかエステル基を１つしか含まず、かつ、式中、Ｒ５は、任意選択により、１つ以上のエーテルリンケージを含み、
ｍは、１からＲ５の炭素原子数である）を有し、、
水に対する溶解性が２５℃で少なくとも５ｐｐｍである、１種類以上のエステルと、
（ｉｉ）グリセリドであって、以下の構造すなわち
【化７】
0005665747.tif 000008
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）を有する
１種類以上のグリセリドと、
（ｉｉｉ）エステルであって、以下の式すなわち
【化８】
0005665747.tif 000009
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ２は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）を有する
１種類以上のエステルと、
（ｉｖ）１種類以上のアセチル化単糖、アセチル化二糖またはアセチル化多糖と、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせと、
からなる群から選択されるカルボン酸エステルと、
（２）過酸素の源と、
（３）上述したペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドと、
を含む、一組の反応成分を提供し、
（ｂ）前記反応成分同士を好適な水性反応条件下で組み合わせることによって、ペルオキシカルボン酸生成物を形成し、
（ｃ）任意選択により、前記ペルオキシカルボン酸生成物を希釈し、
（ｄ）衣類または繊維製品の前記物品を、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成したペルオキシカルボン酸と接触させることを含み、
衣類または繊維製品の前記物品を、脱染、脱臭、殺菌、漂白するか、あるいはこれらを組み合わせる、前記方法に向けたものである。
【００１９】
別の態様では、（ａ）上述したペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、これらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステルと、を含む第１の混合物であって、無機緩衝液または有機緩衝液、腐食阻害剤、湿潤剤、これらの組み合わせからなる群から選択される別の成分を任意選択により含む、前記第１の混合物と；（ｂ）過酸素の源と水とを含む第２の混合物であって、過酸化水素安定剤を任意選択によりさらに含む、前記第２の混合物と、を含む、配合物が得られる。
【００２０】
別の態様では、（ａ）上述したペルヒドロリシス活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と、アセチル化単糖、アセチル化二糖、アセチル化多糖、これらの組み合わせからなる群から選択されるアセチル化糖類と、を含む第１の混合物であって、無機緩衝液または有機緩衝液、腐食阻害剤、湿潤剤を任意選択によりさらに含む、前記第１の混合物と、（ｂ）過酸素の源と水とを含む第２の混合物であって、過酸化水素安定剤を任意選択により含む前記第２の混合物と、を含む、配合物が得られる。
【００２１】
もうひとつの態様では、ペルヒドロリシス活性を有するサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）アセチルキシランエステラーゼポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドが得られ、当該ポリペプチドは配列番号３１のＣ末端保存領域を含み、ただし、ポリペプチドが、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択されることを条件とする、配列番号３１のアミノ酸９３に対する置換を有する。
【００２２】
別の態様では、単離されたサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）アセチルキシランエステラーゼポリペプチドが提供され、該ポリペプチドはペルヒドロリシス活性を有し、そして、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択される配列番号３１のアミノ酸９３に対する置換を有することを条件として、配列番号３１のＣ末端保存領域を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）（配列番号３２）由来のアセチルキシランエステラーゼとＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）ＭＳＢ８（配列番号３６）由来のアセチルキシランエステラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷ配列比較である。
【図２ａ】６種類のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種のアセチルキシランエステラーゼ間のＣＬＵＳＴＡＬＷ配列比較である。
【図２ｂ】図２ａの続きである。
【００２４】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ」）に準拠し、Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＣ）の配列表要件、Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（ＰＣＴ）Ｒｕｌｅｓ  ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎのセクション２０８およびＡｎｎｅｘ  Ｃに一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号およびフォーマットは、米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００２５】
配列番号１、２、３、４は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来の変異アセチルキシランエステラーゼコード領域の核酸配列である。
【００２６】
配列番号５は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）のアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来のアセチルキシランエステラーゼ変異体からの推定アミノ酸配列を表し、Ｘａａ残基２７７位は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【００２７】
配列番号６、７、８、９は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来の変異アセチルキシランエステラーゼコード領域の核酸配列である。
【００２８】
配列番号１０は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来のアセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列を表し、Ｘａａ残基２７７位は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【００２９】
配列番号１１、１２、１３、１４は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ（サーモトガ・レッティンガエ）からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来の変異アセチルキシランエステラーゼコード領域の核酸配列である。
【００３０】
配列番号１５は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ（サーモトガ・レッティンガエ）からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来のアセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列を表し、Ｘａａ残基２７７位は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【００３１】
配列番号１６、１７、１８、１９は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ（サーモトガ・ペトロフィラ）からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来の変異アセチルキシランエステラーゼコード領域の核酸配列である。
【００３２】
配列番号２０は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ（サーモトガ・ペトロフィラ）からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来のアセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列を表し、Ｘａａ残基２７７位は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【００３３】
配列番号２１、２２、２３、２４は、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」として説明するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来の変異アセチルキシランエステラーゼコード領域の核酸配列である。
【００３４】
配列番号２５は、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」として説明するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来のアセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列を表し、Ｘａａ残基２７７位は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【００３５】
配列番号２６、２７、２８、２９は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２由来の第２の変異アセチルキシランエステラーゼコード領域の核酸配列である。
【００３６】
配列番号３０は、本明細書で「ＲＱ２（ｂ）」として説明するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２からのアセチルキシランエステラーゼの野生型配列由来のアセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列を表し、Ｘａａ残基２７８位は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【００３７】
配列番号３１は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）アセチルキシランエステラーゼのＣ末端保存領域を表す。
【００３８】
配列番号３２は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＢ７０８６９）からのアセチルキシランエステラーゼである。
【００３９】
配列番号３３および３４は、実施例１に記載のプライマーである。
【００４０】
配列番号３５は、実施例１に記載の増幅およびコドン最適化Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）核酸産物である。
【００４１】
配列番号３６は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ  ２２７８９３．１）由来のアセチルキシランエステラーゼである。
【００４２】
配列番号３７は、実施例１０に記載された増幅Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）核酸産物である。
【００４３】
配列番号３８および３９は、実施例１０に記載のプライマーである。
【００４４】
配列番号４０は、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼのコドン最適化配列である。
【００４５】
配列番号４１は、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼのコドン最適化配列である。
【００４６】
配列番号４２〜１９３は、表１に示すフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
【００４７】
配列番号１９４〜２０１は、表６に示すフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
【００４８】
配列番号２０２は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ（サーモトガ・レッティンガエ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２０３は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ（サーモトガ・ペトロフィラ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２０４は、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」として説明するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２からの第１のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２０５は、本明細書で「ＲＱ２（ｂ）」として説明するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２からの第２のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号２０６および２０７は、実施例１０に記載したようなフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。
【００５３】
配列番号２０８は、プラスミドｐＳＷ２０７の作製に用いた配列番号２０６および２０７によって増幅された核酸産物の核酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本明細書に開示されるのは、構造的にＣＥ−７酵素として分類され、ペルヒドロリシス活性を有する変異酵素である。また、本明細書に開示されるのは、上述した変異酵素を用いてカルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を生成するための方法ならびに、殺菌および洗濯での用途に当該変異体を使用するいくつかの方法でもある。さらに、本明細書に記載したような方法で製造されるペルオキシカルボン酸を含む殺菌剤および／または洗濯用配合物も提供される。
【００５５】
本開示では、多数の用語および略語を使用する。特に明記しないかぎり、以下の定義を適用する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、本発明の要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、当該要素または成分の事例数（すなわち出現数）に関して非限定的であることを想定している。よって、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものとして読むべきであり、要素または成分の単語の単数形は、それが単数であることが明示的に示されている場合を除いて複数形も含む。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という表現は、特許請求の範囲に言及したような表記の特徴、整数、ステップまたは成分が存在することを意味するが、他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群が１つ以上存在したり追加されたりすることを除外するものではない。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という表現は、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）」および「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）」という表現に包含される実施形態を含むことを想定している。同様に、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）」という表現は、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）」という表現に包含される実施形態を含むことを想定している。
【００５８】
本明細書で使用する場合、本発明のまたは使用される成分または反応物の量を修飾する「約」という表現は、たとえば、実世界で濃縮物または溶液を生成するのに用いられる一般的な測定および液体処理手順；これらの手順での不注意による誤差；組成物の生成または方法の実施で用いる成分の製造業者、供給元または純度の差などによって生じ得る、数値量のばらつきを示す。また、「約」という用語は、特定の初期混合物に起因して組成物ごとに異なる平衡条件がゆえに差が出る量についても包含する。「約」という表現で修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には当該量の等価物を含む。
【００５９】
存在する場合、すべての範囲はその上限と下限の値も含み、組み合わせることが可能である。たとえば、「１〜５」の範囲があげられている場合、該当する範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２と４〜５」、「１〜３と５」などの範囲を含むものと理解されたい。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「基質」、「好適な基質」、「カルボン酸エステル基質」という用語は、同義に、具体的に
（ａ）エステルであって、以下の構造すなわち
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、任意選択によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は任意選択により、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である１つ以上のエーテルリンケージを含み、
Ｒ５は、任意選択によりヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、式中、Ｒ５の各炭素原子は個々に、ヒドロキシル基を１つしか含まないかエステル基を１つしか含まず、かつ、式中、Ｒ５は、任意選択により、１つ以上のエーテルリンケージを含み、
ｍは、１からＲ５の炭素原子数である）を有し、、
水に対する溶解性が２５℃で少なくとも５ｐｐｍである、
１種類以上のエステル；または
（ｂ）グリセリドであって、以下の構造すなわち
【化９】
0005665747.tif 000010
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）を有する
１種類以上のグリセリド；または
（ｃ）エステルであって、以下の式すなわち
【化１０】
0005665747.tif 000011
（式中、Ｒ１は、任意選択によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルであり、Ｒ２は、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）を有する
１種類以上のエステル；または
（ｄ）１種類以上のアセチル化単糖、アセチル化二糖またはアセチル化多糖；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
を示す。
【００６１】
前記カルボン酸エステル基質の例は、モノアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；プロピレングリコールジアセテート；エチレングリコールジアセテート；１，２−エタンジオールのモノエステルまたはジエステル；１，２−プロパンジオール；１，３−プロパンジオール；１，２−ブタンジオール；１，３−ブタンジオール；２，３−ブタンジオール；１，４−ブタンジオール；１，２−ペンタンジオール；２，５−ペンタンジオール；１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール；２，５−ヘキサンジオール；１，６−ヘキサンジオール；またはこれらの任意の組み合わせを含むものであってもよい。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）」という用語は、過酸素酸、ペルオキシカルボン酸、過酸（ｐｅｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）、過カルボン酸、ペルオキソ酸と同義である。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「過酢酸」という用語は「ＰＡＡ」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸ならびに、ＣＡＳ登録番号７９−２１−０の他のすべての類義語と同義である。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、グリセリルモノアセテートと同義である。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセテート；グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテートならびに、ＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の他のすべての類義語と同義である。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセテート；グリセロールトリアセテート；グリセリルトリアセテート、１，２，３−トリアセトキシプロパン；１，２，３−プロパントリオールトリアセテートならびに、ＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の他のすべての類義語と同義である。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチレート、グリセリンモノブチレート、グリセリルモノブチレートと同義である。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチレート、グリセリルジブチレートと同義である。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチレート、１，２，３−トリブチリルグリセロールならびに、ＣＡＳ登録番号６０−０１−５の他のすべての類義語と同義である。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオネート、グリセリンモノプロピオネート、グリセリルモノプロピオネートと同義である。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオネート、グリセリルジプロピオネートと同義である。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオネート、グリセロールトリプロピオネート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロールならびに、ＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の他のすべての類義語と同義である。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「酢酸エチル」という用語は、酢酸エーテル、アセトキシエタン、エタン酸エチル、酢酸エチルエステル、エタン酸エチルエステル、エチル酢酸エステルならびに、ＣＡＳ登録番号１４１−７８−６の他のすべての類義語と同義である。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「エチルラクテート」という用語は、乳酸エチルエステルならびに、ＣＡＳ登録番号９７−６４−３の他のすべての類義語と同義である。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「アセチル化糖」および「アセチル化糖類」という用語は、少なくとも１つのアセチル基を有する単糖、二糖、多糖を示す。例として、グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカールがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、「ヒドロカルビル部分」という用語は、単結合、二重結合または三重結合の炭素炭素結合および／またはエーテルリンケージによって結合され、水素原子で置換されている、直鎖、分枝鎖または環状配置の炭素原子を意味する。当該ヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であってもよい。ヒドロカルビル基の例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、フェニルがあげられる。好ましい実施形態では、このヒドロカルビル部分は、炭素炭素単結合および／またはエーテルリンケージによって結合され、水素原子で置換されている、直鎖、分枝鎖または環状配置の炭素原子である。
【００７７】
本明細書で使用する場合、１，２−エタンジオール；１，２−プロパンジオール；１，３−プロパンジオール；１，２−ブタンジオール；１，３−ブタンジオール；２，３−ブタンジオール；１，４−ブタンジオール；１，２−ペンタンジオール；２，５−ペンタンジオール；１，６−ペンタンジオール；１，２−ヘキサンジオール；２，５−ヘキサンジオール；１，６−ヘキサンジオール；これらの混合物の「モノエステル」および「ジエステル」という言い回しは、式ＲＣ（Ｏ）Ｏ（式中、ＲはＣ１〜Ｃ７の線状ヒドロカルビル部分である）の少なくとも１つのエステル基を有する前記化合物を示す。一実施形態では、カルボン酸エステル基質が、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＤＧＡ）、これらの混合物からなる群から選択される。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「プロピレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシプロパン、プロピレンジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテートならびに、ＣＡＳ登録番号６２３−８４−７の他のすべての類義語と同義である。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「エチレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシエタン、エチレンジアセテート、グリコールジアセテートならびに、ＣＡＳ登録番号１１１−５５−７の他のすべての類義語と同義である。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「好適な酵素的反応混合物」、「過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）のｉｎ  ｓｉｔｕ生成に適した成分」、「好適な反応成分」、「好適な水性反応混合物」という表現は、反応物と酵素触媒とが接触するようになる材料および水を示す。本明細書では好適な水性反応混合物の成分が得られ、当業者であれば、この方法に適した成分のバリエーションが自明であろう。一実施形態では、好適な酵素的反応混合物を用いることで、反応成分と組み合わせた際にｉｎ  ｓｉｔｕでペルオキシカルボン酸が生成される。そのようなものとして、反応成分は、１種類以上の反応成分が使用時まで別々に維持される多成分系として提供されてもよい。もうひとつの実施形態では、反応成分を先に組み合わせてペルオキシカルボン酸の水溶液を生成し、これをあとから殺菌および／または漂白対象の表面に接触させる。複数の活性成分を分離し、それらを組み合わせるための系および手段の設計は従来技術において周知であり、通常は個々の反応成分の物理的形態に左右されることになる。たとえば、複数の活性流体（液体−液体）系では一般に、マルチチャンバ式の分注ボトルまたは二相系（米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書；米国特許第５，３９８，８４６号明細書；同第５，６２４，６３４号明細書；同第６，３９１，８４０号明細書；欧州特許第０８０７１５６号Ｂ１；米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書；ＰＣＴ公開第ＷＯ００／６１７１３号Ａ１パンフレット）を使用しており、これらは反応性の流体同士を混合すると所望の漂白剤が生産される漂白用途などで見られる。ペルオキシカルボン酸を生成するのに用いられる多成分系の他の形態としては、１種類以上の固体成分または固体−液体成分の組み合わせ、たとえば粉末（米国特許第５，１１６，５７５号明細書など）、多層錠（米国特許第６，２１０，６３９号明細書など）、複数のコンパートメントを有する水溶性のパケット（米国特許第６，９９５，１２５号明細書など）、水の添加時に反応する固体の凝集体（米国特許第６，３１９，８８８号明細書など）として設計されたものがあげられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、２種類の別個の成分として提供されることで、２種類の成分を組み合わせた際にペルオキシカルボン酸殺菌剤が生成される多成分配合物が得られる。もうひとつの実施形態では、
ａ）配合物であって、以下のもの
ｉ）本明細書に開示したような酵素粉末と、
ｉｉ）カルボン酸エステル基質と、
を含む第１の成分であって、無機緩衝液または有機緩衝液、腐食阻害剤、湿潤剤、これらの組み合わせからなる群から選択される別の成分を任意選択により含む前記第１の成分と、
ｂ）過酸素の源および水を含む第２の成分であって、過酸化水素安定剤を任意選択により含む前記第２の成分と、
を含む配合物が得られる。
【００８１】
もうひとつの実施形態では、第１の混合物のカルボン酸エステルが、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、これらの組み合わせからなる群から選択される。もうひとつの実施形態では、第１の混合物のカルボン酸エステルが、アセチル化糖類である。もうひとつの実施形態では、第１の混合物の酵素触媒が微粒子固体である。もうひとつの実施形態では、第１の反応混合物が固体錠剤または粉末である。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「ペルヒドロリシス」という用語は、ペルオキシカルボン酸を形成するための選択された基質とペルオキシドとの反応として定義される。一般に、無機過酸化物は、触媒の存在下にて、選択された基質と反応し、ペルオキシカルボン酸を生産する。本明細書で使用する場合、「化学的なペルヒドロリシス」という表現は、基質（ペルオキシカルボン酸前駆物質）と過酸化水素源とを組み合わせるペルヒドロリシス反応を含み、この場合のペルオキシカルボン酸は酵素触媒の非存在下で形成される。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ペルヒドロラーゼ比活性」または「ペルヒドロラーゼ活性」という用語は、単位質量（ミリグラムなど）のタンパク質、乾燥細胞重量または固定化触媒重量あたりの触媒活性を意味する。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、特定の温度で１分あたり１μｍｏｌのペルオキシカルボン酸生成物を生成するのに必要なペルヒドロラーゼ活性の量として定義される。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は、ペルヒドロリシス活性を有する酵素を含む触媒を示し、微生物細胞全体、透過処理した微生物細胞（単数または複数）、微生物細胞抽出物の１種類以上の細胞成分、部分精製酵素または精製酵素であってもよい。また、酵素触媒は、化学修飾されていてもよい（ペグ化または架橋試薬との反応によるなど）。ペルヒドロラーゼ触媒は、当業者間で周知の方法を用いて可溶性または不溶性支持体に固定化されていてもよい；たとえば、Iｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．  Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，  Ｅｄｉｔｏｒ；  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  ＵＳＡ；  １９９７を参照のこと。本明細書で説明するように、ペルヒドロリシス活性を有する本酵素はいずれも、構造的に酵素の炭水化物ファミリエステラーゼファミリ７（ＣＥ−７ファミリ）のメンバである（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，  Ｂ．  “Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ”  ｉｎ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｈ．Ｊ．  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｇ．  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｂ．  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｄｓ．，  （１９９９）  Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ｐｐ．  ３〜１２を参照のこと）。酵素のＣＥ−７ファミリは、過酸素の源と組み合わせた場合に多岐にわたるカルボン酸エステル基質からペルオキシカルボン酸を生成するのに特に効果的であることが実証されている（ＤｉＣｏｓｉｍｏらによるＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０７０６０９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、同第２００８／１７６７８３号明細書、同第２００９／０００５５９０号明細書（その内容全体を参照により本明細書に援用する）を参照のこと）。ＣＥ−７酵素ファミリは、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）を含む。ＣＥ−７酵素ファミリのメンバには、同じ保存されたシグネチャモチーフがある（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３３０：５９３〜６０６  （２００３））。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「シグネチャモチーフ」、「ＣＥ−７シグネチャモチーフ」、「診断モチーフ」という用語は、定義された活性を有する酵素ファミリ間で共通の保存された構造を示す。このシグネチャモチーフを用いて、定義された基質のファミリと同様の酵素活性を有する構造的に関連する酵素のファミリを定義および／または同定することができる。シグネチャモチーフは、単一の連続したアミノ酸配列でもよいし、一緒になってシグネチャモチーフを形成する不連続な保存されたモチーフの集合であってもよい。一般に、保存されたモチーフ（単数または複数）はアミノ酸配列で表される。ペルヒドロリシス活性を有する本変異酵素（「ペルヒドロラーゼ」）は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのファミリに属する（すなわち、本変異体がすべてＣＥ−７シグネチャモチーフを保持する）。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「構造的にＣＥ−７酵素として分類される」、「構造的に炭水化物エステラーゼファミリ７の酵素として分類される」、「構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして分類される」、「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」とは、ＣＥ−７シグネチャモチーフの存在（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲））を根拠に構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして分類されるペルヒドロリシス活性を有する酵素を示すのに用いられる。ＣＥ−７エステラーゼの「シグネチャモチーフ」は、以下の３つの保存されたモチーフ（残基位置の番号は基準配列である配列番号３２を基準に付与）を含む。
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０；
ｂ）Ｇｌｙ１８６−Ｘａａ１８７−Ｓｅｒ１８８−Ｇｌｎ１８９−Ｇｌｙ１９０；
ｃ）Ｈｉｓ３０３−Ｇｌｕ３０４。
【００８８】
一般に、アミノ酸残基１８７位のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファンまたはトレオニンである。触媒三残基に属する３つのアミノ酸残基のうちの２つが太字である。一実施形態では、アミノ酸残基１８７位のＸａａが、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、トレオニンからなる群から選択される。
【００８９】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリ内の保存されたモチーフをさらに分析すると、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリのメンバをさらに定義するのに使用できるかもしれない別の保存されたモチーフ（配列番号３２のアミノ酸２７２〜２７４位のＬＸＤ）が存在することがわかる。別の実施形態では、上記にて定義したシグネチャモチーフが、以下のように定義される４番目の保存されたモチーフを含む。
Ｌｅｕ２７２−Ｘａａ２７３−Ａｓｐ２７４．
【００９０】
アミノ酸残基２７３位のＸａａは一般に、イソロイシン、バリンまたはメチオニンである。４番目のモチーフは、触媒三残基に属するアスパラギン酸残基（太字）を含む（Ｓｅｒ１８８−Ａｓｐ２７４−Ｈｉｓ３０３）。
【００９１】
いくつかの野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種でＣＥ−７ペルヒドロラーゼとともに見出される保存されたモチーフ。
【００９２】
【表１】
0005665747.tif 000012
【００９３】
本明細書で使用する場合、「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」とは、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６１（６）：２２２４〜２２２９）などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を示す。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「アセチルキシランエステラーゼ」とは、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２；ＡＸＥ）を示す。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）」とは、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告されたＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）の株（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＡＡＢ７０８６９）を示す。このＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を配列番号３２としてあげておく。
【００９６】
本明細書で使用する場合、「Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＮＰ  ２２７８９３．１）を示す。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を配列番号３６としてあげておく。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ（サーモトガ・レッティンガエ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＣＰ０００８１２）を示す。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ（サーモトガ・レッティンガエ）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列を配列番号２０２としてあげておく。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ（サーモトガ・ペトロフィラ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＣＰ０００７０２）を示す。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ（サーモトガ・レッティンガエ）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列を配列番号２０３としてあげておく。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＣＰ０００９６９）を示す。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）種ＲＱ２からは２種類の異なるアセチルキシランエステラーゼが同定されており、本明細書では「ＲＱ２（ａ）」（推定アミノ酸配列を配列番号２０４として示す）および「ＲＱ２（ｂ）」（推定アミノ酸配列を配列番号２０５として示す）と呼ぶ。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「単離された核酸分子」および「単離された核酸フラグメント」は同義に用いられ、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味し、任意選択により、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡのポリマーの形態での単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントで構成されていてもよい。
【０１０１】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基礎となる化学構造単位を示す。本明細書では、特定のアミノ酸を示すのに以下の略語を使用する
【０１０２】
【表２】
0005665747.tif 000013
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「実質的に類似」とは、核酸分子において、１つ以上のヌクレオチド塩基における変化によって、１つ以上のアミノ酸の付加、置換または欠失が生じるが、そのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の機能的特性（すなわちペルヒドロリシス活性）に影響を与えないことを示す。また、本明細書で使用する場合、「実質的に類似」は、本明細書にて報告する配列に対して、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、一層好ましくは少なくとも６０％、一層好ましくは少なくとも７０％、なお一層好ましくは少なくとも８０％、さらになお一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する酵素も示し、ここで、得られる酵素は本発明の機能的特性（すなわちペルヒドロリシス活性）を保持する。また、「実質的に類似」は、ストリンジェントな条件下で本明細書にて報告する核酸分子とハイブリダイズされる核酸分子によってコードされるペルヒドロリシス活性を有する酵素も示す。したがって、本発明は、特定の例示された配列よりも多くの配列を包含する。
【０１０４】
たとえば、所定の部位で化学的に等価なアミノ酸を生じるが、コードされるタンパク質の機能的特性には影響しない遺伝子の変更が一般的であることは、従来技術において周知である。本発明の目的で、置換は、以下の５群のうちのいずれか１つの範囲内の変換であると定義される。
１．非極性またはわずかに極性の小さな脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性で負に荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．非極性の大きな脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【０１０５】
よって、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対応するコドンが、それより疎水性の低い別の残基（グリシンなど）や、それより疎水性の高い残基（バリン、ロイシンまたはイソロイシンなど）をコードするコドンで置換されていてもよい。同様に、負に荷電した残基１つが別の残基で置換される（アスパラギン酸のグルタミン酸での置換など）、あるいは正に荷電した残基１つが別の残基で置換される（リシンのアルギニンでの置換など）変化でも、機能的に等価な産物を得られると想定可能である。多くの場合において、タンパク質分子のＮ末端部分およびＣ末端部分を変化させるヌクレオチドの変化もまた、タンパク質の活性を変えないと想定される。
【０１０６】
上記にて提案された修飾は各々、当該技術分野における常法の範囲内であり、コードされる産物の生物活性が保持されているかどうかの決定も同様である。さらに、実質的に類似の配列も本発明に包含されることは当業者であれば自明であろう。一実施形態では、実質的に類似の配列は、ストリンジェントな条件下（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄）で、本明細書にて例示する配列とハイブリダイズする機能によって定義される。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、第１の分子の一本鎖が別の分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （２００１）に例示されている。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決めるのは、温度およびイオン強度の条件である。ストリンジェンシー条件を調節して、中程度に類似の分子（関連性の遠い生物体由来の相同配列）から、高度に類似の分子（密接に関連した生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子など）をスクリーニングすることができる。一般に、ハイブリダイゼーション後の洗浄によってストリンジェンシー条件が決まる。好ましい条件の一構成として、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温にて１５分間の洗浄から開始して、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃にて３０分間の洗浄を繰り返し、続いて０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃にて３０分間の洗浄を２回繰り返す一連の洗浄を使用する。一層好ましい条件の構成では、さらに高い温度を使用し、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いる最後の３０分間ずつ２回の洗浄時の温度が６０℃に上がったことを除いて、洗浄は上記の洗浄と同一である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の好ましい構成は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ならびに、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、続いて最後に本明細書にて例示した配列を用いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄する。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションでは２種類の核酸が相補的な配列を含む必要があるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第では、塩基間のミスマッチも許容される。核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、従来技術において周知の変数である核酸の長さと相補性の度合いに左右される。２種類のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍ値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応）は、以下の順に低くなる：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドのついては、Ｔｍの計算式が導かれている（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上掲））。短めの核酸すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置の重要性が高くなり、オリゴヌクレオチドの長さによってその特異性が決まる（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上掲））。一態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最短長が、少なくとも約１５ヌクレオチド長、一層好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長、なお一層好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長、なお一層好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド長である。さらに、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて温度と洗浄溶液の塩濃度を調節してもよいことは、当業者であれば自明であろう。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、「同一性（％）」という表現は、配列を比較して求められる、２種類以上のポリペプチド配列間または２種類以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。従来技術において、「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の度合いも意味し、これは、場合によっては当該配列のストリング間のマッチングによって決まることもある。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９８８）；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  （Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９３）；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＪ  （１９９４）；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８７）；  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９１）に記載されているものを含むがこれに限定されるものではない、周知の方法で容易に計算可能である。同一性および類似性を求める方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムで体系化されている。配列アライメントおよび同一性（％）の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．  ７．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ；  Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，  （６）：２７６〜２７７  （２０００））を用いて行ってもよい。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手可能なアライメントのＣｌｕｓｔａｌ法（すなわちＣＬＵＳＴＡＬＷ；たとえばバージョン１．８３）（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ，  ５：１５１〜１５３  （１９８９）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０  （１９９４）；  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１  （１３）：３４９７〜５００  （２００３））をデフォルトのパラメータで用いて、配列のマルチプルアライメントを実施することも可能である。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントの好適なパラメータとして、ＧＡＰ存在ペナルティ＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２���マトリクス＝Ｇｏｎｎｅｔ（Ｇｏｎｎｅｔ２５０など）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、ＫＴＵＰＬＥ＝１があげられる。一実施形態では、ファストアライメントまたはスローアライメントをデフォルトの設定で用いるが、スローアライメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（バージョン１．８３）を用いるパラメータを修正し、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ（ＢＬＯＳＵＭ６４など）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５も使用するようにしてもよい。
【０１１０】
本発明の一態様では、好適な単離された核酸分子（本発明の単離されたポリヌクレオチド）が、本明細書で報告するアミノ酸配列と少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも６０％、一層好ましくは少なくとも７０％、一層好ましくは少なくとも８０％、なお一層好ましくは少なくとも８５％、なお一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本発明の好適な核酸分子は、上記の相同性を有するだけでなく、一般に、約３００〜約３４０アミノ酸、一層好ましくは約３１０〜約３３０アミノ酸、最も好ましくは約３２５アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「コドンの縮重」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列のばらつきを許容する遺伝コードの性質を示す。したがって、本発明は、本微生物ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全部または相当部分をコードするあらゆる核酸分子に関する。当業者であれば、所定のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用時に特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」のことをよく知っている。よって、宿主細胞における発現が改善された遺伝子を合成する場合、そのコドンの使用頻度が宿主細胞での好ましいコドンの使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「コドン最適化された」という表現は、さまざまな宿主のトランスフォーメーション用の核酸分子のコード領域または遺伝子を示す場合、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変化させることなく宿主細胞の一般的なコドン使用を反映させるような核酸分子のコード領域または遺伝子のコドンの変化を示す。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「合成遺伝子」は、当業者間で周知の手順で化学合成されたオリゴヌクレオチドのビルディングブロックからアセンブル可能なものである。これらのビルディングブロックをライゲートし、アニールして遺伝子のセグメントを形成し、続いてこれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築する。「化学合成された」とは、ＤＮＡ配列に関する場合、成分のヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルされたことを意味する。十分に確立された手順でＤＮＡを手作業で化学合成してもよいし、多数の市販の機械のうちのいずれか１つを用いて自動化学合成を実施してもよい。このように、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現がなされて宿主細胞のコドンバイアスが反映されるように、遺伝子を適合させることが可能である。コドンの使用が宿主にとって好ましいコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する尤度を、当業者であれば理解できよう。好ましいコドンについては、配列情報を入手可能な宿主細胞由来の遺伝子を調査した結果をもとに判断可能である。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」とは、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびコード配列に続く制御配列（３’非コード配列）をはじめとして、特定のタンパク質を発現する核酸分子を示す。「天然遺伝子」とは、自らの制御配列を有し、天然に見られるような遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒に見られない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない遺伝子を意味する。よって、キメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列を含むものであってもよいし、同じ起源由来であるが天然に見られるものとは異なる形で配置された制御配列およびコード配列を含むものであってもよい。「内因性遺伝子」とは、生物体のゲノムで本来の位置に存在する天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子とは、通常は宿主生物で見られないが遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に挿入される天然遺伝子を含むことも可能であるし、キメラ遺伝子を含むものであっても構わない。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングまたは会合コード配列の安定性あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステム−ループ構造を含むものであってもよい。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、天然に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素で構成されていてもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。さまざまなプロモーターが、異なる発達段階で、あるいは異なる環境条件または生理学的条件に応答して遺伝子の発現を指示し得る旨は、当業者であれば理解できよう。最も多くの場合に遺伝子を発現させるプロモーターを一般に「構成的プロモーター」と称する。さらに、ほとんどの場合、制御配列の厳密な境界が完全に定まっているわけではないため、長さの異なるＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有する場合もあることが認識されている。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示し、ポリアデニル化認識配列（通常は真核生物に限定される）ならびに、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響し得る調節シグナルをコードする他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは一般に、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加（通常は真核生物に限定される）に影響を与えることで特徴付けられる。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、「作動的に結合された」という用語は、一方の機能が他方の影響を受けるように単一の核酸分子で核酸配列が会合していることを示す。たとえば、プロモーターがコード配列の発現に影響し得る場合、そのプロモーターは当該コード配列と作動的に結合されているすなわち、そのコード配列がプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合可能なものである。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、本発明の核酸分子由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現は、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を示すこともある。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、「形質転換」とは、核酸分子が宿主生物のゲノムに移入することで遺伝的に安定な遺伝が生じることを示す。本発明では、宿主細胞のゲノムは、染色体遺伝子と染色体外（プラスミドなど）遺伝子を含む。形質転換後の核酸分子を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物体と呼ばれる。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」、「ベクター」、「カセット」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持つことの多い染色体外因子を示し、通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。このような要素は、どのような起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）であってもよく、この場合、多数のヌクレオチド配列が結合されるか組換えられて、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と一緒に細胞に導入できる独特の構成になる。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えてその遺伝子の外来宿主での発現を強化できる要素を有する特定のベクターを示す。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用なコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列解析ソフトウェア」は、市販のものであってもよいし、独立に開発されたものであってもよい。一般的な配列解析ソフトウェアとしては、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ），  ＢＬＡＳＴＰ，  ＢＬＡＳＴＮ，  ＢＬＡＳＴＸ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜４１０  （１９９０）、ＤＮＡＳＴＡＲ  （ＤＮＡＳＴＡＲ，  Ｉｎｃ．  １２２８  Ｓ．  Ｐａｒｋ  Ｓｔ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ），  ＣＬＵＳＴＡＬＷ  （ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８３；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２（２２）：４６７３〜４６８０  （１９９４）、スミス・ウォーターマンアルゴリズムを採用したＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ［Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］  （１９９４），  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，  １１１〜２０．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ｓｕｈａｉ，  Ｓａｎｄｏｒ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：    Ｐｌｅｎｕｍ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  （Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．０５があげられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈の範囲内で、解析に配列解析ソフトウェアを用いる場合、解析結果は、特に明記しないかぎり表記のプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解できよう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」とは、ソフトウェアの製造元が設定した値またはパラメータの組を意味し、このようなデフォルト値は、最初の初期設定時に当該ソフトウェアに実装されるものである。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、「生物学的汚染物質」という用語は、１種類以上の不要および／または病原性の生物学的物体を示し、微生物、胞子、ウイルス、プリオン、これらの混合物があげられるが、これに限定されるものではない。本明細書に開示の方法では、生存可能な生物学的汚染物質の存在を低減および／または排除するのに役立つ有効濃度の少なくとも１種類の過カルボン酸が得られる。好ましい実施形態では、生物学的汚染物質が生存可能な病原性微生物である。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、「殺菌する」という表現は、生物学的汚染物質を破壊したり、その増殖を予防したりする方法を示す。本明細書で使用する場合、「殺菌剤」という用語は、生物学的汚染物質を破壊、中和またはその増殖を阻害することによって殺菌する作用剤を示す。一般に、殺菌剤は、無生物または表面を処理するのに用いられる。本明細書で使用する場合、「殺菌」という用語は、殺菌する行為または方法を示す。本明細書で使用する場合、「防腐剤」という用語は、病気を媒介する微生物の増殖を阻害する化学的作用剤を示す。一態様では、生物学的汚染物質が病原微生物である。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「衛生」という用語は一般に、健康を損ないかねない作用剤を除去、妨害または制御することによって、健康を回復または保つことを意味するまたはこれに関する。本明細書で使用する場合、「消毒する」という用語は、衛生を作り出すことを意味する。本明細書で使用する場合、「消毒剤」という用語は、作用剤を消毒することを示す。本明細書で使用する場合、「消毒」という用語は、消毒の行為またはプロセスを示す。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「殺ウイルス剤」という用語は、ウイルスを阻害または破壊する作用剤を示し、「ｖｉｒｉｃｉｄｅ」と同義である。ウイルスを阻害または破壊する機能を呈する作用剤は、「殺ウイルス」活性を有すると記載される。過酸は殺ウイルス活性を有する可能性がある。本発明での使用に適する可能性がある従来技術において周知の一般的な別の殺ウイルス剤として、たとえば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール、βプロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第４級アンモニウム化合物、酵素、洗剤があげられる。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「殺生物剤」という用語は、微生物を不活性化または破壊する、一般にスペクトルの広い化学的作用剤を示す。微生物を不活性化または破壊する機能を呈する化学的作用剤は、「殺生物」活性を有すると記載される。過酸は殺生物活性を有する可能性がある。本発明での使用に適する可能性がある従来技術において周知の一般的な別の殺生物剤としては、たとえば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール、銅塩、有機硫黄化合物、第４級アンモニウム塩があげられる。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「最小殺生物濃度」という言い回しは、特定の接触時間で、標的微生物の生存可能な個体群を所望の形で致死的かつ回復不能の状態まで減らす殺生物剤の最少濃度を示す。その有効性については、処理後の生存可能な微生物でのｌｏｇ１０の減少によって測定可能である。一態様において、生存可能な微生物を処理後の目標減少量は、少なくとも３対数の減少、一層好ましくは少なくとも４対数の減少、最も好ましくは少なくとも５対数の減少である。別の態様では、最小殺菌濃度が、生存可能な微生物細胞の少なくとも６対数減少である。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「過酸素源」および「過酸素の源」とは、水溶液に入れた場合に約１ｍＭ以上の濃度で過酸化水素を提供できる化合物を示し、たとえば、過酸化水素、過酸化水素アダクト（尿素−過酸化水素アダクト（カルバミドペルオキシド）など）、ペルボーレート、ペルカーボネートがあげられるが、これに限定されるものではない。本明細書で説明するように、水性反応配合物中で過酸素化合物によって得られる過酸化水素の濃度は、反応成分を合わせた際に、最初は少なくとも１ｍＭ以上である。一実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度が少なくとも１０ｍＭである。もうひとつの実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度が少なくとも１００ｍＭである。もうひとつの実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度が少なくとも２００ｍＭである。もうひとつの実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度が５００ｍＭ以上である。さらに別の実施形態では、水性反応配合物中の過酸化水素濃度が１０００ｍＭ以上である。水性反応配合物中での過酸化水素とトリグリセリドなどの酵素基質とのモル比（Ｈ２Ｏ２：基質）は、約０．００２〜２０であればよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５であればよい。
【０１３０】
ペルヒドロリシス活性を有し、構造的にＣＥ−７酵素として分類されるポリペプチド変異体
本発明の目的は、起源となった野生型酵素に比して、殺菌（細菌、ウイルス、胞子の不活性化など）用の有効濃度の過カルボン酸を生成するために、活性が改善されたペルヒドロラーゼを提供することにある。本発明の第２の目的は、野生型酵素に比して活性のｐＨ範囲全体にわたって活性が改善されたペルヒドロラーゼを提供することにあり、この場合の比活性の改善は、有効濃度のペルオキシカルボン酸の生成に必要な酵素量の減少（ならびにこれに付随して生じる、配合物に含まれる酵素のコストの削減）につながる。本発明の第３の目的は、野生型酵素に対するペルヒドロリシス／加水分解比（Ｐ／Ｈ比）が改善されたペルヒドロラーゼを提供することにある。
【０１３１】
Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）ＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼのＸ線結晶構造が刊行物に記されている（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンクを参照のこと）。Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）ＣＥ−７ペルヒドロラーゼのアミノ酸配列は、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼに対する同一性が９１％であることから、これをＴ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｘ線結晶構造にマッピング可能である。正準触媒三残基（Ｈ３０３、Ｓ１８８、Ｄ２７４）に加えて、いくつかの残基もＴ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）の活性部位内にあり、これらの部位での置換を選んで、野生型酵素に比して、得られる変異酵素に、活性部位のｐＫａ、基質およびペルヒドロリシス／加水分解比（Ｐ／Ｈ比）の改善に関してＫｃａｔおよびＫｍ全体の有利な変化があるか否かを判断した。観察されたペルヒドロリシス活性に基づいて、野生型ＣＥ−７酵素に比して過酢酸生成活性が亢進した一連の変異体ＣＥ−７酵素を作製した。
【０１３２】
ペルヒドロリシス活性を改善するプロセスでは、構造的にＣＥ−７酵素として分類されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築し、この酵素コード配列を突然変異誘発し、最後に過酢酸生成活性が亢進した変異体を単離することを伴う。一般に、この手法では、アセテート、トリアセチン、過酸化水素の存在下にて過酢酸生成活性が亢進される変異酵素を作製して単離する必要がある。突然変異誘発の以後のラウンドが望まれる場合は、それによって酵素−コード配列を進化させることが可能である。
【０１３３】
突然変異誘発の開始材料として、野生型（または実質的に類似の）ヌクレオチド配列を用いて、構造的にＣＥ−７酵素として分類されるポリペプチドをコードする変異酵素ライブラリを調製可能である。配列を突然変異させるための方法は、文献にて十分に確立されている。たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発および選択、部位特異的突然変異誘発、変異性ＰＣＲ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７（４）：１０５６−６２  （１９９９））、「遺伝子シャッフリング」または他の手段を用いて、酵素配列の変異を得ることが可能である。これは、たとえば、野生型酵素に比して殺菌用過カルボン酸の生成に対する酸性ｐＨでの活性が改善されたポリペプチド、野生型酵素に比して活性のｐＨ範囲全体の活性が改善されたポリペプチドおよび／または野生型酵素に比してＰ／Ｈ比が改善されたポリペプチドの生成を可能にし得るものである。
【０１３４】
必要であれば、常法の部位特異的突然変異誘発、得られる変異体ポリペプチドの発現、その活性の判断によって、酵素的活性に重要な酵素の領域を判断することも可能である。突然変異体は、欠失、挿入、点変異またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。
【０１３５】
以下の実施例で論じるように、アラニン、バリン、セリンまたはトレオニンに変化すると、特定のアミノ酸置換を欠いた野生型アセチルキシランエステラーゼに比して、変異体ポリペプチドのペルヒドロリシス活性が予想外に亢進されるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）アセチルキシランエステラーゼで、鍵になるシステイン残基が同定された。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）属では全体のアセチルキシランエステラーゼの相同性が高いため、いずれかのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）属でこのシステインがアラニン、バリン、セリンまたはトレオニンで置換されると、作業例で説明したものと類似の結果が得られると想定される。よって、いくつかの実施形態では、当該ポリペプチドをコードする変異体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが、ペルヒドロリシス活性を有する野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）アセチルキシランエステラーゼ由来であり、この場合のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）アセチルキシランエステラーゼは、配列番号３１に示すようなＣ末端領域を含み、変異体ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸９３位のシステイン残基に代えて、アラニン、バリン、セリンまたはトレオニン残基を有する。配列番号３１に示すＣ末端領域は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）アセチルキシランエステラーゼで高度に保存され（６種類のアセチルキシランエステラーゼのアライメントについての図２を参照のこと）、よって、本明細書に開示の鍵となるシステイン残基の変異に従うアセチルキシランエステラーゼのアイデンティファイアとして機能できる。
【０１３６】
配列番号３１のいくつかの残基を「任意の」残基と示したが、これらの残基の多くに見られる一般的なアミノ酸がある。たとえば、配列番号３１のＸａａで示す位置の一般的なアミノ酸は、２位のグリシン、１３位のセリン、１８位のリシン、２０位のリシン、２３位のロイシン、２４位のシステイン、２５位のアスパラギン酸、３２位のフェニルアラニン、３３位のアルギニン、３８位のロイシン、３９位のバリンまたはトレオニン、４１位のトレオニン、４２位のヒスチジン、４５位のアラニン、４８位のトレオニン、４９位のアスパラギン、５０位のフェニルアラニンまたはチロシン、５１位のロイシン、５３位のトレオニン、５５位のアルギニン、５８位のグルタミン酸、６０位のイソロイシン、７５位のアラニンまたはバリン、７９位のイソロイシン、８６位のグリシン、９０位のアルギニン、９１位のイソロイシン、１０４位のヒスチジンまたはチロシン、１０８位のプロリン、１１０位のグルタミン酸、１１２位のアルギニン、１１３位のイソロイシン、１１６位のチロシン、１１８位のアルギニン、１２３位のグリシン、１２６位のグルタミン、１２７位のアラニン、１２８位のイソロイシン、１３０位のグルタミン、１３１位のバリンまたはロイシン、１３２位のリシン、１３４位のロイシン、１３６位のアルギニンまたはリシンである。
【０１３７】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ（サーモトガ）アセチルキシランエステラーゼＣ末端領域における１つ以上のアミノ酸の付加および／または欠失は、当該付加（単数または複数）および／または欠失が酵素の機能的特性に影響しないかぎり、許容される。
【０１３８】
さらに別の特定の実施形態では、本明細書に開示の変異体ポリペプチドは、
（ａ）配列番号５、１０、１５、２０または２５と比較した場合（ただし、配列番号５、１０、１５、２０または２５のアミノ酸２７７に対する置換が、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択されることを条件とする）；または
（ｂ）配列番号３０と比較した場合（ただし、配列番号３０のアミノ酸２７８に対する置換が、セリン、トレオニン、バリン、アラニンからなる群から選択されることを条件とする）に、たとえば、アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法を対アライメントのデフォルトパラメータすなわちＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５で用いると、アミノ酸に対して、配列同一性が少なくとも９５％（あるいは、さまざまな実施形態では、配列同一性が９６％、９７％、９８％または９９％）である。
【０１３９】
特に、ペルヒドロリシス活性が活性化された（ペルヒドロリシス活性および／またはＰ／Ｈ比が増加した）変異体ポリペプチドは、配列番号５、１０、１５、２０、２５または３０を含む。もうひとつの実施形態では、変異体ポリペプチドが、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、式中、それぞれの配列のＸａａは、アラニン、セリン、トレオニン、バリンからなる群から選択される。別の実施形態では、変異体ポリペプチドが、配列番号５および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、式中、それぞれの配列のＸａａは、アラニン、セリン、トレオニン、バリンからなる群から選択される。
【０１４０】
タンパク質工学
本ＣＥ−７エステラーゼ変異体を突然変異誘発によって生成した。本ヌクレオチドを使用し、活性が亢進あるいは変更された遺伝子産物を生成できることが企図される。１）ランダム突然変異誘発、２）ドメインスワッピング（ジンクフィンガードメインまたは制限酵素を使用）、３）変異性ＰＣＲ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７（４）：１０５６〜１０６２  （１９９９））、４）部位特異的突然変異誘発（Ｃｏｏｍｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９９８），  ｐｐ  ２５９〜３１１，  １  ｐｌａｔｅ．  Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，  Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ：  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）、５）「遺伝子シャッフリング」（本明細書に援用する、米国特許第５，６０５，７９３号明細書；同第５，８１１，２３８号明細書；同第５，８３０，７２１号明細書；同第５，８３７，４５８号明細書）を含むが、これに限定されるものではない、天然遺伝子配列を変異させて活性が変更または亢進された遺伝子産物を生成するためのさまざまな方法が周知である。
【０１４１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、ヌクレオチドの誤取込みによって多数の変異を同時生成することで、ＤＮＡフラグメントを増幅することが可能である。これは、ｄＮＴＰの比を変えたり反応時にさまざまな量の塩化マンガンを添加するなど、ＰＣＲ条件に手を加えることで達成可能である（Ｆｒｏｍａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２２４（１）：３４７〜５３  （１９９５）；  Ｌｉｎ−Ｇｏｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２３（３）：４０９〜１２  （１９９７））。次に、変異ＤＮＡフラグメントのプールをクローニングして変異プラスミドのライブラリを生成した後、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）などの宿主での発現後にスクリーニング可能である。
【０１４２】
遺伝子シャッフリングの方法は、手軽に実施でき、突然変異誘発率が高く、スクリーニングが容易であるがゆえに特に魅力的である。遺伝子シャッフリングのプロセスは、対象遺伝子と類似および／または相違するＤＮＡ領域の別の個体群の存在下、対象遺伝子から特定のサイズのフラグメントへの制限エンドヌクレアーゼ切断を伴う。その後、このフラグメントのプールを変性・再アニールし、変異遺伝子を生成する。この変異遺伝子を変化した活性についてスクリーニングする。
【０１４３】
本発明の本配列を変異させ、この方法によって変化または亢進された活性についてスクリーニングしてもよい。配列は二本鎖でなければならず、５０ｂｐ〜１０ｋＢの範囲のさまざまな長さのものであり得る。これらの配列は、従来技術において周知の制限エンドヌクレアーゼを用いて、ランダムに消化されて約１０ｂｐ〜１０００ｂｐのフラグメントになり得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ（上掲））。本微生物配列に加えて、配列の全部または一部にハイブリダイズ可能なフラグメントの個体群を加えてもよい。同様に、本配列とハイブリダイズ可能ではないフラグメントの個体群を加えてもよい。一般に、これらの別のフラグメント個体群は、全核酸に対して重量で約１０〜２０倍過剰に加えられる。一般に、このプロセスを採ると、混合物中の異なる特定の核酸フラグメントの数は約１００〜約１０００になる。ランダム核酸フラグメントの混合個体群を変性させ、一本鎖核酸フラグメントを形成した後、再アニールする。他の一本鎖核酸フラグメントと相同な領域を有する一本鎖核酸フラグメントだけが再アニールされる。ランダム核酸フラグメントを加熱によって変性させてもよい。二本鎖核酸を完全に変性させるのに必要な条件を、当業者であれば判断できよう。好ましくは、この温度は約８０℃〜１００℃である。核酸フラグメントを冷却によって再アニールしてもよい。好ましくは、この温度は約２０℃〜７５℃である。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を加えて、復元を加速してもよい。好適な濃度は、０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲であり得る。次に、アニール後の核酸フラグメントを、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の存在下にてインキュベートする。核酸ポリメラーゼは、従来技術において周知のクレノーフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼまたは他の任意のＤＮＡポリメラーゼであればよい。ポリメラーゼをランダム核酸フラグメントに加えるのは、アニーリング前、アニーリングと同時、あるいはアニーリングであればよい。変性、復元、ポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルのサイクルを、所望の回数繰り返す。好ましくは、このサイクルを約２〜５０回繰り返し、一層好ましくは、配列を１０〜４０回繰り返す。得られる核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋＢの範囲の大きめの二本鎖ポリヌクレオチドであり、発現および変化後の活性について標準的なクローニングおよび発現プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ（上掲））でスクリーニングしてもよい。
【０１４４】
さらに、遺伝子シャッフリングを用いる機能ドメインの融合によってハイブリッドタンパク質をアセンブルすることも可能である（Ｎｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ９４：１０６９〜１０７３  （１９９７）など）。本遺伝子の機能ドメインを、他の遺伝子の機能ドメインと組み合わせ、所望の触媒機能を有する新規な酵素を生成してもよい。ハイブリッド酵素については、当業者間で周知の技術を用いて、ＰＣＲオーバーラップ伸長法を用いて構築し、さまざまな発現ベクターにクローニングすればよい。
【０１４５】
カルボン酸エステルおよび過酸化水素からのペルオキシカルボン酸の酵素触媒による調製に適した反応条件
本発明の一態様では、ペルヒドロリシス活性を有する本酵素触媒の少なくとも１種類の存在下、カルボン酸エステルと、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムおよび過炭酸ナトリウムを含むがこれに限定されるものではない過酸素の源とを反応させることによって、ペルオキシカルボン酸を含む水性配合物を生成する方法が得られる。一実施形態では、本酵素触媒は、ペルヒドロリシス活性を有する本酵素変異体を少なくとも１種類を含み、前記酵素が構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリのメンバとして分類される。もうひとつの実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒がセファロスポリンＣデアセチラーゼである。もうひとつの実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒がアセチルキシランエステラーゼである。
【０１４６】
一実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒が、本明細書に開示するペルヒドロリシス活性を有する本ＣＥ−７変異体ポリペプチドを少なくとも１種類含む。
【０１４７】
好適なカルボン酸エステル基質は、以下の式で示されるエステルを含むものであってもよい。
［Ｘ］ｍＲ５
式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は任意選択により、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７での１つ以上のエーテルリンケージを含み、
Ｒ５＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、線状、分枝または環式のＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル部分であり、式中、Ｒ５の各炭素原子は個々に、ヒドロキシル基を１つしか含まないかエステル基を１つしか含まず、かつ、式中、Ｒ５は、任意選択により、１つ以上のエーテルリンケージを含み、
ｍ＝１からＲ５の炭素原子数である）を有し、
前記エステルは、水に対する溶解性が２５℃で少なくとも５ｐｐｍである。
【０１４８】
他の実施形態では、好適な基質は以下の式で表されるエステルを含むものであってもよい。
【化１１】
0005665747.tif 000014
式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキル、Ｒ２＝直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール，（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎＨまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨ、ｎ＝１〜１０である。
【０１４９】
他の実施形態では、好適なカルボン酸エステル基質は、以下の式のグリセリドを含むものであってもよい。
【化１２】
0005665747.tif 000015
式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ７アルキル、Ｒ３およびＲ４は、個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である。
【０１５０】
他の実施形態では、Ｒ６が、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、線状のＣ１〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、任意選択により１つ以上のエーテルリンケージを含む。さらに好ましい実施形態では、Ｒ６が線状のＣ２〜Ｃ７ヒドロカルビル部分であり、任意選択によりヒドロキシル基および／または任意選択により１つ以上のエーテルリンケージである。
【０１５１】
他の実施形態では、好適なカルボン酸エステル基質が、アセチル化一糖、二糖、多糖からなる群から選択されるアセチル化糖類を含むものであってもよい。別の実施形態では、アセチル化糖類が、アセチル化単糖、二糖、多糖を含む。さらに別の実施形態では、アセチル化糖類が、アセチル化キシラン；アセチル化キシランのフラグメント；アセチル化キシロース（キシローステトラアセテートなど）；アセチル化グルコース（グルコースペンタアセテートなど）；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール；アセチル化セルロースからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、アセチル化糖類が、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール；アセチル化セルロースからなる群から選択される。そのようなものとして、アセチル化炭水化物が、本方法およびシステムを用いて（すなわち、過酸素源の存在下）過カルボン酸を生成するのに好適な基質のことがある。
【０１５２】
別の実施形態では、カルボン酸エステル基質が、モノアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシランフラグメント；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；プロピレングリコールジアセテート；エチレングリコールジアセテート；１，２−エタンジオールのモノエステルまたはジエステル；１，２−プロパンジオール；１，３−プロパンジオール；１，２−ブタンジオール；１，３−ブタンジオール；２，３−ブタンジオール；１，４−ブタンジオール；１，２−ペンタンジオール；２，５−ペンタンジオール；１，６−ペンタンジオール；１，２−ヘキサンジオール；２，５−ヘキサンジオール；１，６−ヘキサンジオール；これらの混合物からなる群から選択される。本方法およびシステムの好ましい実施形態では、基質がトリアセチンを含む。
【０１５３】
カルボン酸エステルは、酵素触媒ペルヒドロリシス時に、反応配合物中に、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成できるだけの十分な濃度で存在する。カルボン酸エステルは、反応配合物に対して完全に可溶である必要はないが、ペルヒドロラーゼ触媒によってエステルを対応するペルオキシカルボン酸に変換可能なだけの十分な溶解性を有する。カルボン酸エステルは、反応配合物の０．０５ｗｔ％〜４０ｗｔ％の濃度で、好ましくは反応配合物の０．１ｗｔ％〜２０ｗｔ％の濃度で、一層好ましくは反応配合物の０．５ｗｔ％〜１０ｗｔ％の濃度で、反応配合物中に存在し得る。
【０１５４】
過酸素源は、過酸化水素、過酸化水素アダクト（尿素−過酸化水素アダクト（カルバミドペルオキシド）など）ペルボレート塩およびペルカーボネート塩を含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。反応配合物中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、好ましくは０．０３３ｗｔ％〜約４０ｗｔ％、一層好ましくは０．３３ｗｔ％〜約３０ｗｔ％であればよい。
【０１５５】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（ホールセル、透過処理したホールセル、部分精製したホールセル抽出液）が、カタラーゼ活性（ＥＣ１．１１．１．６）を有することが報告された。カタラーゼは、過酸化水素から酸素および水への変換を触媒する。一態様において、ペルヒドロリシス触媒がカタラーゼ活性を欠いている。もうひとつの態様では、カタラーゼ阻害剤が反応配合物に加えられる。カタラーゼ阻害剤の例としては、ナトリウムアザイドおよび硫酸ヒドロキシアミンがあげられるが、これに限定されるものではない。当業者であれば、カタラーゼ阻害剤の濃度を必要に応じて調節可能である。一実施形態では、カタラーゼ阻害剤の濃度が、約０．１ｍＭ〜約１Ｍ；好ましくは約１約ｍＭ〜約５０ｍＭ；一層好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。一態様において、ナトリウムアザイド濃度は一般に約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であるのに対し、硫酸ヒドロキシアミンは、濃度が一般に約０．５ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの範囲である。
【０１５６】
もうひとつの実施形態では、酵素触媒は、有意なカタラーゼ活性を欠いているあるいは、カタラーゼ活性を低減または排除するよう操作される。宿主細胞のカタラーゼ活性は、トランスポソン突然変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化突然変異誘発、ランダム突然変異誘発を含むがこれに限定されるものではない、周知の技術を用いて、カタラーゼ活性を担う遺伝子（単数または複数）の発現を破壊することで、下方制御または排除可能である。好ましい実施形態では、内因性カタラーゼ活性をコードする遺伝子（単数または複数）が、下方制御または破壊（すなわちノックアウト）される。本明細書で使用する場合、「破壊された」遺伝子は、変性遺伝子でコードされるタンパク質の活性および／または機能がもう存在しないことである。遺伝子を破壊するための手段は従来技術において周知であり、対応するタンパク質の活性および／または機能がもう存在しないかぎり、遺伝子に対する挿入、欠失または変異を含み得るが、これに限定されるものではない。さらに好ましい実施形態では、生成宿主が、ｋａｔＧおよびｋａｔＥからなる群から選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）生成宿主である。もうひとつの実施形態では、生成宿主が、ｋａｔＧおよびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方に下方制御および／または破壊を含むＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）株。ｋａｔＧおよびｋａｔＥのダブルノックアウトを含むＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）株は、本明細書にて、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）株ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号を参照のこと）として説明する。
【０１５７】
水性反応配合物中の触媒の濃度は、触媒の特定の触媒活性に左右され、所望の反応速度が得られるよう選択される。ペルヒドロリシス反応中の触媒の重量は一般に、合計反応容量１ｍＬあたり０．０００１ｍｇ〜１０ｍ、好ましくは１ｍＬあたり０．００１ｍｇ〜２．０ｍｇの範囲である。当業者間で周知の方法を用いて、触媒を可溶性または不溶性固定化してもよい。たとえば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．  Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，  Ｅｄｉｔｏｒ；  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  ＵＳＡ；  １９９７を参照のこと。固定化触媒を用いると、以後の反応で触媒の回収および再利用が可能になる。酵素触媒は、微生物ホールセル、透過処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分的に精製された酵素または精製された酵素、これらの混合物の形であってもよい。
【０１５８】
一態様において、カルボン酸エステルの化学的ペルヒドロリシスおよび酵素的ペルヒドロリシスの組み合わせによって生成されたペルオキシカルボン酸の濃度は、所望のｐＨで、殺菌、漂白、消毒、脱臭または脱染用に有効濃度のペルオキシカルボン酸を提供するのに十分である。もうひとつの態様では、本方法は、所望の有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するための酵素と酵素基質との組み合わせを提供するものであり、この場合、追加の酵素なしで、有意に低い濃度ｍのペルオキシカルボン酸が生成される。場合によっては、無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応による酵素基質の相当な化学的ペルヒドロリシスが生じるが、所望の用途で有効濃度のペルオキシカルボン酸を得られるだけの十分な濃度のペルオキシカルボン酸がない場合もあり、適当なペルヒドロラーゼ触媒を反応配合物に加えることでペルオキシカルボン酸の合計濃度の有意な増加が達成される。
【０１５９】
少なくとも１種類のカルボン酸エステルのペルヒドロリシスによって生成されるペルオキシカルボン酸（過酢酸）の濃度は、ペルヒドロリシス反応開始から（すなわち、反応成分の混合から反応配合物の形成までの間に測定される時間）１０分以内、好ましくは５分以内、最も好ましくは１分以内に、ペルオキシカルボン酸が少なくとも約２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍ、一層好ましくはペルオキシカルボン酸が少なくとも３００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍ、一層好ましくはペルオキシカルボン酸が少なくとも２０００ｐｐｍ、なお一層好ましくは少なくとも３０００ｐｐｍ、最も好ましくは少なくとも４０００ｐｐｍである。ペルオキシカルボン酸を含む生成配合物を、任意選択により、水あるいは主に水からなる溶液で希釈し、所望の低めの濃度のペルオキシカルボン酸を含む配合物を生成してもよい。一態様において、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに必要な反応時間は、約２時間以下、好ましくは約３０分以下、一層好ましくは約１０分以下、最も好ましくは約５分以内またはそれ未満である。ある濃度の生物学的汚染物質（単数または複数）で汚染された硬質表面または無生物を、本明細書に記載の方法に従って形成したペルオキシカルボン酸と接触させる。一実施形態では、硬質表面または無生物を、前記反応成分を合わせてから約５分〜約１６８時間以内に、あるいは前記反応成分を合わせてから約５分〜約４８時間以内または約５分〜２時間以内に、あるいはあいだにあるそのような時間で、記載の方法に従って形成したペルオキシカルボン酸と接触させる。
【０１６０】
もうひとつの態様では、本明細書に記載の方法に従って形成されるペルオキシカルボン酸は洗濯用途で用いられ、この場合、ペルオキシカルボン酸を繊維製品と接触させて、殺菌、漂白、脱染、脱臭および／またはこれらの組み合わせなどの利益を得る。ペルオキシカルボン酸は、繊維製品の前洗い処理、洗濯洗剤、しみ抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、すすぎ剤を含むがこれに限定されるものではない多岐にわたる洗濯用製品で使用できるものである。一実施形態では、標的表面用のペルオキシカルボン酸を生成するための本方法を、ｉｎ  ｓｉｔｕで実施する。
【０１６１】
洗濯用途の文脈で、「衣類または繊維製品の物品を接触させる」という表現は、その衣類または繊維製品の物品を、本明細書に開示の配合物に曝露することを意味する。この目的のために、液体、固体、ゲル、ペースト、バー、錠剤、スプレー、泡沫、粉末または顆粒状を含むがこれに限定されるものではない、衣類または繊維製品の物品の処理に配合物を使用できる多数の形態があり、手で分注、ユニット分注、基質からの分注、洗濯機または乾燥機からの噴霧および自動分注することで、送達可能である。顆粒状の組成物は、コンパクトな形態にもすることが可能である。液体組成物は、濃縮形態にすることも可能である。
【０１６２】
本明細書に開示の配合物を洗濯機で使用する場合、この配合物はさらに、洗濯用洗剤で一般的な成分を含有できる。たとえば、一般的な成分として、界面活性剤、漂白剤、漂白活性化剤、別の酵素、石鹸の泡の抑制剤、分散剤、石灰−石鹸分散剤、土壌懸濁液および再汚染防止剤、柔軟剤、腐食阻害剤、焼け阻害剤、殺菌剤、ｐＨ調節剤、非ビルダアルカリ度源、キレート化剤、有機および／または無機フィラー、溶媒、ハイドロトロープ、蛍光増白剤、染料、香料があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１６３】
本明細書に記載の配合物は、固体または液体形態の洗剤添加製品としても使用可能である。このような添加製品は、従来の洗剤組成物の性能を補うまたは促進することを想定したものであり、洗浄方法のどの段階でも添加可能である。
【０１６４】
漂白、染み抜き、臭いの低減のうちの１つ以上のために過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）が生成される洗濯用の本システムおよび方法に関して、少なくとも１種類のカルボン酸エステルのペルヒドロリシスによって生成される過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）（過酢酸など）の濃度は、過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）が少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍであればよい。殺菌または消毒用に過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）が生成される洗濯用の本システムおよび方法に関して、少なくとも１種類のカルボン酸エステルのペルヒドロリシスによって生成される過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）（過酢酸など）の濃度は、ペルヒドロリシス反応開始の１０分以内、好ましくは５分以内、最も好ましくは１分以内に、過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）が少なくとも約２ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも２００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、一層好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍであればよく、最も好ましくは過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）が少なくとも２０００ｐｐｍであればよい。過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）を含む生成配合物を、任意選択により水または主に水で構成される溶液で希釈して、過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）を所望の低めの濃度で含む配合物を生産してもよい。本方法およびシステムの一態様では、所望の濃度の過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）を生成するのに必要な反応時間は、約２時間以内、好ましくは約３０分以内、一層好ましくは約１０分以内、なお一層好ましくは約５分以内、最も好ましくは約１分以下である。
【０１６５】
反応温度は、酵素触媒活性の安定性と反応速度の両方が制御されるように選択される。反応温度は、反応配合物の凝固点（約０℃）のすぐ上の温度から約９５℃までの範囲であればよく、反応温度の好ましい範囲は約５℃〜約５５℃である。
【０１６６】
ペルオキシカルボン酸を含有する最終反応配合物のｐＨは、約２〜約９、好ましくは約３〜約８、一層好ましくは約５〜約８、なお一層好ましくは約６〜約８、さらになお一層好ましくは約６．５〜約７．５の範囲であればよい。もうひとつの実施形態では、反応配合物のｐＨが酸性（ｐＨ＜７）であってもよい。反応および最終反応配合物のｐＨについては、任意選択により好適な緩衝液を添加することで制御してもよく、このような緩衝液としては、ホスフェート、ピロホスフェート、メチルホスホネート、ビカーボネート、アセテートまたはシトレートならびに、これらの組み合わせがあげられるが、これに限定されるものではない。緩衝液を使用する場合の濃度は一般に０．１ｍＭ〜１．０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである
【０１６７】
もうひとつの態様では、酵素的ペルヒドロリシス反応配合物が、反応混合物中でのカルボン酸エステルの溶解速度を高めるための分散剤として作用する有機溶媒を含有するものであってもよい。このような溶媒としては、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、これらの混合物があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１６８】
もうひとつの態様では、酵素的ペルヒドロリシス産物は、所望の機能を提供する別の成分を含有するものであってもよい。これらの別の成分としては、緩衝液、洗剤ビルダー、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、浸潤剤、腐食阻害剤（ベンゾトリアゾールなど）、酵素安定剤、ペルオキシド安定剤（金属イオンキレート剤など）があげられるが、これに限定されるものではない。別の成分の多くが洗剤業界では周知である（たとえば、本明細書に援用する米国特許第５，９３２，５３２号明細書を参照のこと）。乳化剤の例としては、ポリビニルアルコール、またはポリビニルピロリドンががげられるが、これに限定されるものではない。増粘剤の例としては、ＬＡＰＯＮＩＴＥ（登録商標）ＲＤ、コーンスターチ、ＰＶＰ、ＣＡＲＢＯＷＡＸ（登録商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、ＣＡＢＯＳＩＬ（登録商標）、ポリソルベート  ２０、ＰＶＡ、レシチンがあげられるが、これに限定されるものではない。緩衝系の例としては、リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素ナトリウム；スルファミン酸／トリエタノールアミン；クエン酸／トリエタノールアミン；酒石酸／トリエタノールアミン；コハク酸／トリエタノールアミン；酢酸／トリエタノールアミンがあげられるが、これに限定されるものではない。界面活性剤の例としては、ａ）エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのブロックコポリマー、エトキシル化またはプロポキシル化された線状および分枝状の第１級および第２級アルコールならびに、脂肪族ホスフィンオキシドなどの非イオン界面活性剤；ｂ）第４級アンモニウム化合物、特に、３つのＣ１〜Ｃ２アルキル基が結合した窒素原子にさらにＣ８〜Ｃ２０アルキル基が結合した第４級アンモニウム化合物などのカチオン界面活性剤；ｃ）アルカンカルボン酸（Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸など）、アルキルホスホネート、アルカンスルホネート（ドデシル硫酸ナトリウム「ＳＤＳ」など）または直鎖または分枝状のアルキルベンゼンスルホネート、アルケンスルホネートなどのアニオン界面活性剤；ｄ）アミノカルボン酸、アミノジカルボン酸、アルキベタインなどの両性および双性イオン界面活性剤ならびにこれらの混合物があげられるが、これに限定されるものではない。別の成分が、芳香剤、色素、過酸化水素の安定剤（たとえば、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸といった金属キレート剤（ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）  ２０１０、Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、ＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）  ＳＬ  （ＣＡＳ＃  ２８０９−２１−４）、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）  ０５２０、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）  ０５３１、酵素活性の安定剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）、洗剤ビルダーを含んでいてもよい。
【０１６９】
ペルヒドロラーゼ触媒を用いるペルオキシカルボン酸のＩｎ  Ｓｉｔｕ生成
セファロスポリンＣデアセチラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１；分類名セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ；ＣＡＨ）は、セファロスポリンＣ、７−アミノセファロスポラン酸、７−（チオフェン−２−アセトアミド）セファロスポラン酸などのセファロスポリンに結合したアセチルエステルを加水分解機能を有する酵素である（Ａｂｂｏｔｔ，
Ｂ．  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｄ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０（３）：４１３〜４１９  （１９７５））。ＣＡＨは、炭水化物エステラーゼファミリ７（「ＣＥ−７」；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，  Ｂ．（上掲）を参照のこと）と称される、構造的に関連する酵素の大きめのファミリに属する。本明細書で使用する場合、「ＣＥ−７」、「ＣＥ−７エステラーゼ」、「ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ」、「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」、「ＣＥ−７酵素」という用語は同義に用いられ、構造的に炭水化物エステラーゼファミリ７のメンバとして分類される酵素を示す。
【０１７０】
ＣＥ−７酵素ファミリのメンバは、植物、菌類（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（セファロスポリジウム・アクレモニウム）など）、酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ロドトルラ・トルロイデス）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ（ロドトルラ・グルチニス）など）さらには、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（サーモアナエロバクテリウム）種；Ｎｏｒｃａｒｄｉａ  ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ（ノカルジア・ラクタムジュランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属のさまざまなメンバなどの細菌（Ｐｏｌｉｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６３（１２）：４８０７〜４８１１  （１９９７）；  Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８５：５３〜５７  （１９９８）；  Ｌｏｒｅｎｚ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｗｉｅｇｅｌ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：５４３６〜５４４１  （１９９７）；  Ｃａｒｄｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５４（３）：４０６〜４１２  （２０００）；  Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６１（６）：２２２４〜２２２９；  Ａｂｂｏｔｔ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｄ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０（３）：４１３〜４１９  （１９７５）；  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲），  Ｔａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＲ，  ２８（２１）：４３１７〜４３３１  （２０００）；  Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，  ５（１０）：  ａｒｔｉｃｌｅ  ７７  （２００４）；  Ｄｅｇｒａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，  １４６：１５８５〜１５９１  （２０００）；米国特許第６，６４５，２３３号明細書；同第５，２８１，５２５号明細書；同第５，３３８，６７６号明細書；国際特許出願公開第ＷＯ  ９９／０３９８４号パンフレットに見られる。ＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．による国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０７０６０９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、同第２００８／１７６７８３号明細書、同第２００９／０００５５９０号明細書には、過酸素の源と合わせたときに、多岐にわたるカルボン酸エステル基質から有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに適したペルヒドロリシス活性を有する、構造的にＣＥ−７酵素として分類されるさまざまな酵素が開示されている。
【０１７１】
ＣＥ−７ファミリは、ＣＡＨとアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）の両方を含む。ＣＥ−７ファミリのメンバには、共通の構造的モチーフがあり、一般にアセチル化キシロオリゴ糖およびセファロスポリンＣのどちらに対してもエステル加水分解活性を呈することから、ＣＥ−７ファミリが、さまざまな小さな基質に対して多機能のデアセチラーゼ活性を有する単一のタンパク質クラスを示すことが示唆される（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲））。
【０１７２】
Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．は、このファミリのメンバにおける構造的な類似性を分析し、ＣＥ−７ファミリに特徴的なシグネチャモチーフを定義している。このシグネチャモチーフは、以下に示すような少なくとも３つの高度に保存されたモチーフの組み合わせである。配列ナンバリングはいずれも、基準配列（この場合、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）ペルヒドロラーゼ；配列番号３２）に対する相対的なものである。
【０１７３】
基準配列である配列番号３２のアミノ酸残基のナンバリングのように、ＣＥ−７シグネチャモチーフは、以下のように定義される３つの保存されたモチーフを含む。
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０；
ｂ）Ｇｌｙ１８６−Ｘａａ１８７−Ｓｅｒ１８８−Ｇｌｎ１８９−Ｇｌｙ１９０；
ｃ）Ｈｉｓ３０３−Ｇｌｕ３０４。
【０１７４】
一般に、アミノ酸残基１８７位のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファンまたはトレオニンである。触媒三残基に属する３つのアミノ酸残基のうちの２つが太字である。一実施形態では、アミノ酸残基１８７位のＸａａが、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、トレオニンからなる群から選択される。
【０１７５】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリ内の保存されたモチーフをさらに分析すると、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリに属するペルヒドロラーゼをさらに定義するのに使用できるかもしれない別の保存されたモチーフ（配列番号３２のアミノ酸２７２〜２７４位のＬＸＤ）が存在することがわかる（図１および図２）。別の実施形態では、上記にて定義したシグネチャモチーフが、以下のように定義される４番目の保存されたモチーフを含む。
Ｌｅｕ２７２−Ｘａａ２７３−Ａｓｐ２７４。
【０１７６】
アミノ酸残基２７３位のＸａａは一般に、イソロイシン、バリンまたはメチオニンである。４番目のモチーフは、触媒三残基の３つ目のメンバであるアスパラギン酸残基（太字）を含む（Ｓｅｒ１８８−Ａｓｐ２７４−Ｈｉｓ３０３）。
【０１７７】
２つ以上のアミノ酸配列（ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を示す）をアラインし、本シグネチャモチーフの存在を判断するには、周知のグローバルアライメントのアルゴリズム（すなわち配列解析ソフトウェア）のどれを使用してもよい（たと、ＣＬＵＳＴＡＬＷまたはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３〜４５３  （１９７０））。アライメントされた配列（単数または複数）は、基準配列（配列番号３２）と比較される。一実施形態では、基準アミノ酸配列
（本明細書で用いられるように、（本明細書で使用する場合、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）由来のＣＡＨ配列（配列番号３２））を用いたＣＬＵＳＴＡＬアライメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷ）を用いて、ＣＥ−７エステラーゼファミリに属するペルヒドロラーゼを同定する。保存されたアミノ酸残基の相対的な番号は、表Ａに示すようなアライメントされた配列内の小さな挿入または欠失（一般にアミノ酸５〜６個以下）を考慮に入れるために、基準アミノ酸配列における残基の番号をもとにしている。
【０１７８】
【表３】
0005665747.tif 000016
【０１７９】
ペルヒドロリシス活性を有する本ＣＥ−７変異体は各々、表Ａに示す野生型ペルヒドロラーゼ配列のうちの１つに由来していた。本変異体は各々、ＣＥ−７シグネチャモチーフを保持している（すなわち、野生型配列に導入された変化が、表Ａに示す保存されたモチーフに対する変化を含まない）。特に、活性が改善された本ペルヒドロラーゼは、アミノ酸残基２７７に対する置換を有し、野生型システインが、セリン、トレオニン、バリンまたはアラニンで置換されている（配列番号３２、３６、２０２、２０３、２０４の番号付けによる）。同じ置換が配列番号２０５のアミノ酸残基２７８でも生じる（すなわち、配列番号２０５が、相対的な残基番号を１ずつシフトする単一のアミノ酸挿入を含む）。
【０１８０】
本変異体は各々、ペルヒドロラーゼ比活性［Ｕ／ｍｇタンパク質］、反応混合物中での酵素容積活性［Ｕ／ｍＬ］および／またはペルヒドロリシス活性対加水分解活性の比（すなわち「Ｐ／Ｈ比」）の改善を含む。一実施形態では、活性の改善が、起源となった野生型配列と比較した場合の活性（ペルヒドロラーゼ比活性［Ｕ／ｍｇタンパク質］、反応混合物中でのペルヒドロリシス容積活性［Ｕ／ｍＬ］および／またはＰ／Ｈ比）の増加率として測定される。もうひとつの実施形態では、配列番号５に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％である変異体ＣＥ−７酵素での酵素活性（ペルヒドロリシス比活性、ペルヒドロリシス容積活性および／またはＰ／Ｈ比の増加）の改善率が、配列番号３２で測定した活性に対する相対的なものである。配列番号１０に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％である変異体ＣＥ−７酵素での活性の改善率が、配列番号３６で測定した活性に対する相対的なものである。配列番号１５に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％である変異体ＣＥ−７酵素での活性の改善率が、配列番号２０２で測定した活性に対する相対的なものである。配列番号２０に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％である変異体ＣＥ−７酵素での活性の改善率が、配列番号２０３で測定した活性に対する相対的なものである。配列番号２５に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％である変異体ＣＥ−７酵素での活性の改善率が、配列番号２０４で測定した活性に対する相対的なものである。配列番号３０に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％である変異体ＣＥ−７酵素での活性の改善率が、配列番号２０５で測定した活性に対する相対的なものである。
【０１８１】
一実施形態では、本変異体のペルヒドロラーゼ比活性の増加率が、実質的に類似の条件下での野生型配列の活性と比較した場合に、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１１、１２または１３倍である。
【０１８２】
もうひとつの実施形態では、本変異体のＰ／Ｈ比の増加率が、実質的に類似の条件下での野生型配列のＰ／Ｈ比と比較した場合に、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０または１０倍である。
【０１８３】
本方法は、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリに属する変異酵素のペルヒドロラーゼ活性を利用して、水性反応条件下で、工業的に有用な有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するものである。一実施形態では、本方法は、有効濃度の１種類以上のペルオキシカルボン酸をｉｎ  ｓｉｔｕで生成するものである。
【０１８４】
過酸および過酸化水素の濃度を求めるためのＨＰＬＣアッセイ法
本方法では、滴定、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、Ｕ．  Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ６９（１７）：３６２３〜３６２７  （１９９７））に記載の分析手順、本例に記載したような２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）アッセイ（Ｓ．  Ｍｉｎｎｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７８：２９３〜２９８  （１９９９）および国際特許出願公開第ＷＯ  ２００４／０５８９６１  Ａ１号パンフレット）を含むがこれに限定されるものではない、多岐にわたる分析方法を用いて、反応物および生成物を分析することが可能である。
【０１８５】
過酸の最小殺生物濃度の判定
Ｊ．  Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：  ６３〜７３  （２００２））によって説明されている方法を用いて、過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度（ＭＢＣ）を求めることが可能である。このアッセイ法は、ＸＴＴ還元の阻害に立脚したものであり、この場合、ＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、一ナトリウム塩）が、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定される光学密度（ＯＤ）の変化によって微生物の呼吸活性を指示する酸化還元色素である。しかしながら、殺菌剤および防腐剤の活性を試験するのに利用可能な方法には、生存可能なプレートの計数、直接的な顕微鏡計数、乾燥質量、濁度測定、吸光度および生物発光を含むがこれに限定されるものではない、多岐にわたる他の方法がある（たとえば、Ｂｒｏｃｋ，  Ｓｅｍｏｕｒ  Ｓ．，  Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ＵＳＡ；  ２００１を参照のこと）。
【０１８６】
酵素的に調製されたペルオキシカルボン酸組成物の使用
本方法に従って製造される酵素触媒で生成されるペルオキシカルボン酸は、多岐にわたる硬質表面／無生物での用途において、医療機器（内視鏡など）、繊維製品（衣類、カーペットなど）、調理に使われる表面、食品保存および食品包装設備、食品の包装に用いられる材料、ニワトリの孵化場および飼育施設、動物の囲い、微生物および／または殺ウイルス活性を有する使用済みプロセス水の汚染除去など、生物学的汚染物質の濃度を下げるために使用可能である。酵素で生成されるペルオキシカルボン酸を、プリオンを不活性化するよう設計された製剤（特定のプロテアーゼなど）に用いて、さらに殺生物活性を高めてもよい。好ましい態様では、本ペルオキシカルボン酸組成物が、オートクレーブ処理のできない医療機器や食品包装設備用の殺菌剤として特に有用である。ペルオキシカルボン酸含有製剤は、ＧＲＡＳまたは食品グレードの成分（酵素、酵素基質、過酸化水素、緩衝液）を用いて調製できるものであるため、酵素で生成される過酸（ｐｅｒａｃｉｄ）をさらに、動物の死体、肉、果物および野菜の汚染除去用、あるいは加工食品の汚染除去用に使用してもよい。酵素で生成されるペルオキシカルボン酸を、最終的な形態が、粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアロゾルである製品に取り入れてもよい。酵素で生成されるペルオキシカルボン酸を、有効な汚染除去効果が得られる濃度に希釈してもよい。
【０１８７】
有効濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物を用いて、生物学的汚染物質で汚染された（または汚染の疑いのある）表面および／または物体を、その表面または物体に本方法によって生成される生成物を接触させて、殺菌することが可能である。本明細書で使用する場合、「接触させる」とは、病気を引き起こす物体での汚染の疑いのある表面または無生物を、有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含む殺菌用組成物と、洗浄・殺菌に十分な時間だけ接触状態におくことを示す。「接触させること」には、噴霧、処理、浸漬、フラッシング、表面または中に流し込むこと、混合、組み合わせ、ペイント、コーティング、塗布、付着させるか、そうでなければ他の方法で、有効濃度のペルオキシカルボン酸を含むペルオキシカルボン酸溶液または組成物、あるいは有効濃度のペルオキシカルボン酸を形成する溶液または組成物と、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染されている疑いのある表面または無生物とを連通させることを含む。殺菌剤組成物を洗浄用組成物と組み合わせ、洗浄および殺菌の両方を提供してもよい。あるいは、洗浄剤（界面活性剤または洗剤など）を配合物に取り入れて、洗浄と殺菌をひとつの組成物で達成するようにしてもよい。
【０１８８】
有効濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、少なくとも１種類の別の抗微生物剤、プリオン分解プロテアーゼの組み合わせ、殺ウイルス剤、殺胞子剤または殺生物剤を含有するものであっても構わない。これらの作用剤と特許請求の範囲に記載の方法で生成されるペルオキシカルボン酸とを組み合わせることで、微生物、胞子、ウイルス、菌類および／またはプリオンなどの生物学的汚染物質で汚染された（または汚染の疑いのある）表面および／または物体の洗浄および殺菌に用いる場合に、高い効果および／または相乗効果を提供することができる。好適な抗微生物剤としては、微生物から所望の程度保護できるだけの十分な量で、カルボン酸エステル（ｐ−ヒドロキシアルキルベンゾエート、アルキルシンナメートなど）；スルホン酸（ドデシルベンゼンスルホン酸など）；ヨード化合物または活性ハロゲン化合物（元素ハロゲン、ハロゲン酸化物（ＮａＯＣｌ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ＣｌＯ２など）、ヨウ素、インターハライド（一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素または二臭化ヨウ素など）；ポリハライド；次亜塩素酸塩；次亜塩素酸；次亜臭素酸塩；次亜臭素酸；クロロヒダントインおよびブロモヒダントイン；二酸化塩素；亜塩素酸ナトリウムなど）、過酸化ベンゾイル、過酸化アルキルベンゾイル、オゾン、一重項酸素発生剤およびこれらの混合物などの有機過酸化物、フェノール誘導体（ｏ−フェニルフェノール、ｏ−ベンジル−ｐ−クロロフェノール、ｔｅｒｔ−アミルフェノール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルヒドロキシベンゾエートなど）、第４級アンモニウム化合物（塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、これらの混合物など）；このような抗微生物剤の混合物があげられる。抗微生物剤の有効量としては、抗微生物剤約０．００１ｗｔ％〜約６０ｗｔ％、抗微生物剤約０．０１ｗｔ％〜約１５ｗｔ％または抗微生物剤約０．０８ｗｔ％〜約２．５ｗｔ％があげられる。
【０１８９】
一態様では、本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸を用いて、ある場所の表面および／またはその場に塗布すると、生存可能な生物学的汚染物質（生存可能な微生物個体群など）の濃度を下げることが可能である。本明細書で使用する場合、「場所」とは、殺菌または漂白に適した標的表面の一部または全部を含む。標的表面としては、生物学的で汚染される可能性があるあらゆる表面があげられる。非限定的な例として、食品または飲料産業で見られる設備の表面（タンク、コンベヤ、床、ドレーン、クーラー、冷凍庫、設備表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、ドレーン、ジョイント、クレバス、これらの組み合わせなど）；建造物の表面（壁、床、窓など）；水処理施設、プールおよびスパ、発酵タンクなどの食品業界以外で使われるパイプおよびドレーン；病院または動物病院の表面（壁、床、ベッド、設備（内視鏡など）、衣類、スクラブ、靴をはじめとする病院／動物病院または他の医療現場で着用される衣類、病院または動物病院の他の表面）；レストランの表面；浴室の表面；トイレ；衣服および靴；家禽、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマ、ブタなどの家畜のための納屋または家畜小屋の表面；家禽またはエビのための孵化場；薬剤または生物薬剤の表面（薬剤または生物薬剤の製造設備、薬剤または生物薬剤の成分、薬剤または生物薬剤の賦形剤など）があげられる。また、別の硬質表面として、牛肉、鶏肉、豚肉、野菜、果物、海産物、これらの組み合わせなどの食料品もあげられる。上記の場所としては、感染したリネンまたは他の繊維製品などの水分を吸収する材料も挙げられる。また、上記の場所としては、種子、球茎、塊茎、果実および野菜、発芽植物、特に作物の発芽植物（穀草、葉野菜、サラダ用作物、根野菜、豆類、ベリー類、柑橘類、硬い果物など）をはじめとする収穫された植物または植物製品もあげられる。
【０１９０】
硬質表面材料の非限定的な例としては、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、クロム、チタン、鉄、銅、黄銅、アルミニウム、これらの合金など）、鉱物（コンクリートなど）、ポリマーおよびプラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン）、アクリロニトリルブタジエンなどのポリオレフィン；ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル；ナイロンなどのポリアミドなど）があげられる。別の表面としては、レンガ、タイル、セラミック、磁器、木材、ビニル、リノリウム、カーペットがあげられる。
【０１９１】
本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸を用いて、殺菌、消毒、漂白、脱染、脱臭を含むがこれに限定されるものではない、衣類または繊維製品の物品に対する利点を提供することもできる。また、繊維製品の前洗い処理、洗濯洗剤、しみ抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、すすぎ剤を含むがこれに限定されるものではない洗濯用製品に、本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸を使用してもよい。
【０１９２】
組換え微生物の発現
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、特に微生物宿主の細胞で生成できるものである。本遺伝子および核酸分子を発現させるための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリに見出すことが可能で、広範囲にわたる温度、ｐＨ値、溶媒耐性で増殖する微生物宿主である。たとえば、細菌、酵母、糸状菌のいずれかが、本核酸分子の発現の適切な宿主となり得ることが企図される。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外または細胞内と細胞外の両方の組み合わせで発現し得るものであり、この場合、細胞内での発現で産生されたタンパク質を回収する方法よりも、細胞外で発現させるほうが、所望のタンパク質を発酵産物から回収しやすい。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞のバイオマスを生成するのに用いられる細胞原料と比較して変わっていないにもかかわらず、機能的な遺伝子は発現される。宿主株の例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（トリコデルマ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）、Ｐｉｃｈｉａ（ピキア）、Ｐｈａｆｆｉａ（赤色酵母）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（クリベロマイセス）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（ハンゼヌラ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ（ヤロウイア）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（サルモネラ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アシネトバクター）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ（ザイモモナス）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ（エリスロバクター）、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ（クロロビウム）、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ（クロマチウム）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（フラボバクテリウム）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ（サイトファーガ）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ（ロドバクター）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトマイセス）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ブレビバクテリウム）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ（コリネバクテリウム）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ（ディノコッカス）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）、Ｅｒｗｉｎｉａ（エルウィニア）、Ｐａｎｔｏｅａ（パンテア）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（スフィンゴモナス）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ（メチロモナス）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ（メチロバクター）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（メチロコッカス）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ（メチロサイナス）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ（メチロマイクロビウム）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ（メチロシスチス）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（アルカリゲネス）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（シネコシスティス）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（シネココッカス）、Ａｎａｂａｅｎａ（アナベナ）、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ（チオバチルス）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（メタノバクテリウム）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ（ミキソコッカス）などの細菌、真菌、酵母種があげられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、細菌宿主株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（クリベロマイセス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）があげられる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０１９３】
大規模な微生物の増殖および機能的な遺伝子の発現では、単純または複雑な広範囲にわたる炭水化物、有機酸およびアルコールあるいは、メタンなどの飽和炭化水素または二酸化炭素を利用する場合があり、光合成または化学的独立栄養宿主の場合、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素またはあらゆる微量栄養素（小さな無機イオンなど）の形態と量を利用することもある。増殖率の調節が、特定の調節分子を培養に添加するか否かに影響される場合もあり、これらは一般に、栄養塩またはエネルギ源とはみなされない。
【０１９４】
好適な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、従来技術において周知。一般に、ベクターまたはカセットは、関連する遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を含む。好適なベクターは、転写開始の制御を担う遺伝子の５’領域、転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域を含む。両方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同な遺伝子および／または生成宿主に対して天然の遺伝子から誘導されるのが最も好ましいが、このような制御領域は、そのようにして誘導されていなくてもよい。
【０１９５】
所望の宿主細胞で本セファロスポリンＣデアセチラーゼコード領域を発現させるのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。事実上、これらの遺伝子を発動できればどのようなプロモーターでも本発明に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）における発現に有用）；ＡＯＸ１（Ｐｉｃｈｉａ（ピキア）における発現に有用）；ｌａｃ、ａｒａＢ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）における発現に有用）ならびに、ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおける発現に有用なさまざまなファージプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０１９６】
終結制御領域も、好ましい宿主細胞に対して天然のさまざまな遺伝子から誘導できる。一実施形態では、終結制御領域を含むかどうかは任意選択による。もうひとつの実施形態では、キメラ遺伝子が、好ましい宿主細胞由来の終結制御領域を含む。
【０１９７】
工業的な製造
多岐にわたる培養方法を用いて、本ペルヒドロラーゼ触媒を生成することができる。たとえば、組換え微生物宿主から過発現させた特定の遺伝子産物の大規模な生成物を、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法によって製造できる。バッチ培養および流加培養の方法は一般的かつ従来技術において周知であり、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ  （１９８９）  ａｎｄ  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３６：２２７〜２３４（１９９２）に一例が見られる。
【０１９８】
連続培養を用いて、所望のペルヒドロラーゼ触媒を量産してもよい。連続培養は、規定の培地がバイオリアクターに連続投入され、同時に等量の馴化培地がプロセシング用に除去される、開放系である。連続培養では通常、主に対数増殖期にある細胞が一定の高い液相密度に維持される。あるいは、固定化した細胞を用いて連続培養を実施してもよく、この場合は炭素と栄養塩を連続的に添加し、価値のある生成物、副産物または廃棄物を細胞塊から連続的に除去する。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される、多岐にわたる固相支持体を用いて実施すればよい。
【０１９９】
バッチ発酵、流加培養発酵または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者間で周知の任意の方法で実施すればよい。たとえば、酵素触媒が細胞内で生成されたら、遠心分離または膜濾過によって細胞ペーストを培養液から分離し、任意選択により水または所望のｐＨの水性緩衝液で洗浄した後、所望のｐＨの水性緩衝液中の細胞ペースト懸濁液をホモジナイズして、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出液を生成する。この細胞抽出液を任意選択によりセライトまたはシリカなどの適切なフィルタエイドで濾過し、熱処理ステップの前に細胞デブリを除去して、望ましくないタンパク質を酵素触媒溶液から沈殿させてもよい。次に、所望の酵素触媒を含む溶液を、膜濾過または遠心分離によって沈殿細胞デブリおよびタンパク質から分離し、得られた部分精製酵素触媒溶液をさらに膜濾過して濃縮した後、任意選択により適切な賦形剤（マルトデキストリン、トレハロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはこれらの混合物など）と混合し、噴霧乾燥させて所望の酵素触媒を含む固体粉末を生成してもよい。
【０２００】
量、濃度または他の値もしくはパラメータが、範囲、好ましい範囲または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられている場合、これは、上限の限界値または好ましい値と、下限の限界値または好ましい値の任意の対から形成されるあらゆる範囲を、範囲が別途開示されているか否かとは関係なく、具体的に開示しているものとして理解されたい。本明細書において一定範囲の数値が明記される場合、特に指定のないかぎり、当該範囲は両端値および範囲内の全整数と分数を含むものとする。範囲を規定する際にも、範囲を表記の特定値に限定することは想定していない。
【０２０１】
好ましい実施形態を実証するにあたり、以下の実施例を示す。以下の実施例に開示の技術は、本発明者らによって本明細書に開示の方法を実施する上で十分に機能することが判明した技術を示し、その実施に好ましいモードを構成するものとみなせる旨は、当業者であれば自明であろう。しかしながら、当業者であれば、本開示を踏まえて、ここに開示の特定の実施形態に多くの変更をほどこしても、なお本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得られることは自明であろう。
【０２０２】
特に明記しないかぎり、試薬および材料は、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手したものである。
【０２０３】
明細書中の以下の略語は、以下のとおり測定、技術、特性または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間（単数または複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットル（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（単数または複数）を意味し、「Ｌ」はリットル（単数または複数）を意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「M」はモルを意味し、「ｍｍol」はミリモル（単数または複数）を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率（単数または複数）を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラム（単数または複数）を意味し、「μｇ」はマイクログラム（単数または複数）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（単数または複数）を意味し、「ｇ」は重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｄｄ  Ｈ２Ｏ」は蒸留・脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位（単数または複数）を意味し、「ｒｐｍ」は１分あたりの回転数（単数または複数）を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
【実施例】
【０２０４】
実施例１
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）からのアセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび発現
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＢ７０８６９、配列番号３２）からのアセチルキシランエステラーゼをコードするコード領域を、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）での発現に合わせて最適化したコドンを用いて合成した。続いて、配列番号３３および配列番号３４として同定したプライマーを使用して、コード領域をＰＣＲ増幅した（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分間、７０℃で１分、３０サイクル）。得られた核酸産物（配列番号３５）をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にサブクローニングし、ｐＳＷ１９６として同定されるプラスミドを生成した。このプラスミドｐＳＷ１９６を使用して、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８を形質転換し、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（として同定した株を生成した（内容全体を参照により本明細書に援用する、ＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書を参照のこと）。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６を、最大ＯＤ６００nm＝０．４〜０．５で振盪しながらＬＢ培地で３７℃にて成長させ、その時点で最終濃度１ｍＭになるようＩＰＴＧを加え、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を遠心分離によって回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０２０５】
実施例２
Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼを発現するＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８形質転換体の発酵
２Ｌ容の振盪フラスコに、酵母エキス（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（１．０ｇ／Ｌ）、クエン酸第二鉄アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含有する０．５Ｌの種培地を仕込んで、発酵槽種培養を調製した。培地のｐＨを６．８に調節し、培地をフラスコ内で滅菌した。滅菌後添加物には、グルコース（５０ｗｔ％、１０．０ｍＬ）および１ｍＬアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）ストック溶液を含んでいた。種培地にＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（実施例１）の１ｍＬ培養を２０％グリセロール中にて播種し、３５℃および３００ｒｐｍで培養した。種培養を、約１〜２ＯＤ５５０で、ＫＨ２ＰＯ４（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２二水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有（３５℃）する８Ｌの培地の入った１４Ｌ容の発酵槽（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）およびＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有していた。滅菌後添加物には、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ、８０．０ｇ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）ストック溶液（１６．００ｍＬ）を含んでいた。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌまで低下したら、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）を流加培養に使用した。０．３１ｇ供給／分で開始して、徐々に時間ごとに０．３６、０．４２、０．４９、０．５７、０．６６、０．７７、０．９０、１．０４、１．２１、１．４１および１．６３ｇ／分まで上げて、グルコースの供給を開始した；その後は速度を一定に保った。培地のグルコース濃度をモニタし、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えたら、供給速度を落とすか一時的に停止させた。ＯＤ５５０＝５６とＯＤ５５０＝８０の間で、さまざまな株に対して１６ｍＬのＩＰＴＧ（０．５Ｍ）を加えることで、誘導を開始した。溶存酸素（ＤＯ）濃度を空気飽和の２５％で制御した。まずはインペラの攪拌速度（４００〜１４００ｒｐｍ）、続いて通気速度（２〜１０ｓｌｐｍ）によって、ＤＯを制御した。ｐＨについては６．８に制御した。ＮＨ４ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）およびＨ２ＳＯ４（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ制御に用いた。頭部圧力を０．５バールとした。ＩＰＴＧ付加の１６時間後に細胞を遠心分離によって回収した。
【０２０６】
実施例３
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼのモデリング
Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）（配列番号３２）およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）ＭＳＢ８（配列番号３６）由来のアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（図１）を用いてアライメントした。Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ（１ＶＬＱ）のＸ線結晶構造を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンク（ＰＤＰ）から得た（Ｈ．Ｍ．  Ｂｅｒｍａｎ，  Ｊ．  Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，  Ｚ．  Ｆｅｎｇ，  Ｇ．  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，  Ｔ．Ｎ．  Ｂｈａｔ，  Ｈ．  Ｗｅｉｓｓｉｇ，  Ｉ．Ｎ．  Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ，  Ｐ．Ｅ．  Ｂｏｕｒｎｅ：  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２８  ｐｐ．  ２３５〜２４２  （２０００）およびＨ．Ｍ．  Ｂｅｒｍａｎ，  Ｋ．  Ｈｅｎｒｉｃｋ，  Ｈ．  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ａｎｎｏｕｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０  （１２），  ｐ．  ９８０  （２００３）を参照のこと。対応するＴ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アミノ酸とは異なるＴ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アミノ酸はいずれも、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＳＴＵＤＩＯ（登録商標）  ２．０ソフトウェア（プロトコール＞タンパク質モデリング＞ビルド突然変異体；Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いてＴ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アミノ酸と置き換えた。また、セレノメチオニンをメチオニンと置き換えた。出力用に選択したモデル数は３であり、最適化レベルを「高」に設定し、Ｕｓｅ  ＤＯＰＥ法を「真（ｔｒｕｅ）」に設定した。構造の重層および可視化については、ＰｙＭｏｌ（商標）バージョン０．９９（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ，  （Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ））で実施した。触媒三残基（Ｈ３０３、Ｓ１８８，およびＤ２７４）が正しい位置に残ったかどうか、全体としての構造が元のモデルに対して維持されたか否かによって、モデル品質を判断した。
【０２０７】
実施例４
飽和突然変異誘発用のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼにおけるアミノ酸残基の同定
正準触媒三残基（Ｈ３０３、Ｓ１８８、Ｄ２７４）に加えて、モデルに基づくとアセチルキシランエステラーゼ活性部位にはいくつかの残基も存在する。これらの残基１つ以上が別のアミノ酸で置換されると、酵素の機能性が変化すると想定されよう。しかしながら、このような置換の特異的効果は、ａ  ｐｒｉｏｒｉでは未知である。配列番号３２の残基Ｆ２１３（Ｐｈｅ２１３）、Ｉ２７６（Ｉｌｅ２７６）、Ｃ２７７（Ｃｙｓ２７７）およびＮ９３（Ａｓｎ９３）を、部位飽和突然変異誘発用に選択した。残基Ｙ９２（Ｔｙｒ９２）は、ＣＥ−７ファミリ全体でこの残基の保存レベルが高いため、選択しなかった。
【０２０８】
実施例５
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸残基Ｆ２１３、Ｉ２７６、Ｃ２７７、Ｎ９３位での飽和突然変異誘発
４つの選択した残基（Ｆ２１３、Ｉ２７６、Ｃ２７７、Ｎ９３）各々を他の可能な１９のアミノ酸各々に個々に変化させるために、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼ（プラスミドｐＳＷ１９６の配列番号３５（上記の実施例１および米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書を参照のこと））のコドン最適化配列に基づいてプライマー対（表１）を設計した。
【０２０９】
【表４】
0005665747.tif 000017
【０２１０】
【表５】
0005665747.tif 000018
【０２１１】
【表６】
0005665747.tif 000019
【０２１２】
【表７】
0005665747.tif 000020
【０２１３】
【表８】
0005665747.tif 000021
【０２１４】
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）キットを使用して、製造業者の指示に従って変異を生み出した。増幅プラスミドを１ＵのＤｐｎＩで３７℃にて１時間処理した。処理後のプラスミドを使用して、化学的にコンピテントなＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（残基２１３、２７６、２７７）または化学的にコンピテントなＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）（残基９３）を形質転換した。形質転換体を、０．１ｍｇアンピシリン／ｍＬ加ＬＢ寒天に蒔き、一晩３７℃で増殖させた。最大５つの個々のコロニーを選び、プラスミドＤＮＡを配列決定して想定変異を確認した。
【０２１５】
実施例６
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼ突然変異体のペルヒドロラーゼ活性アッセイ
突然変異体の個々のコロニーを、０．１ｍｇアンピシリン／ｍＬを含む０．１ｍＬのＬＢを入れた９６ウェルのプレートに取り、振盪せずに一晩３７℃で増殖させた。一晩培養（０．００３ｍＬ）を、０．３ｍＬのＬＢ、０．５ｍＭのＩＰＴＧおよび０．１ｍｇのアンピシリン／ｍＬの入った「誘導プレート」（９６ディープウェル）に移した。誘導プレートを一晩３７℃で振盪しながら増殖させた。０．０１ｍＬの誘導培養を、０．０９ｍＬの５６ｍｇ／ｍＬ  ＣＥＬＹＴＩＣ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の入った「細胞溶解プレート」（９６ウェル）に移した。プレートをまずわずかに攪拌した上で、２５℃で３０分間インキュベートした。約０．０１ｍＬの細胞溶解培養を、０．０９ｍＬの「アッセイ溶液ｐＨ５．０」（１００ｍＭトリアセチン、１００ｍＭ過酸化水素、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）の入った「アッセイプレート」（９６ウェル）に移した。約０．０１ｍＬの細胞溶解培養も、０．０９ｍＬの「アッセイ溶液ｐＨ７．５」（１００ｍＭトリアセチン、１００ｍＭ過酸化水素、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の入った「アッセイプレートｐＨ７．５」（９６ウェル）に移した。プレートを３０秒間静かに攪拌した上で、周囲温度で１０分間インキュベートした。「停止緩衝液」（１００ｍＭオルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．０）０．１ｍＬを加えてアッセイをクエンチした。プレートを３０秒間静かに攪拌した上で、２５℃で３０分間インキュベートした。４５８ｎｍで蓋を使用せずに、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）  Ｐｌｕｓ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ））で吸光度を読み取った。結果を分析したところ、未変性酵素に比して有意に大きなペルヒドロラーゼ活性を呈する４種類の突然変異体が示された（表２および３）。４つともペルヒドロラーゼ活性を高めた残基２７７でのシステインの変化である（Ｃ２７７Ａ、Ｃ２７７Ｖ、Ｃ２７７Ｓ、Ｃ２７７Ｔ；配列番号５参照）。
【０２１６】
【表９】
0005665747.tif 000022
【０２１７】
【表１０】
0005665747.tif 000023
【０２１８】
実施例７
Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８におけるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の発現
確認済みのアセチルキシランエステラーゼ変異を有するプラスミドを使用して、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８（実施例１）を形質転換した。形質転換体をＬＢ−アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレートに蒔き、一晩３７℃でインキュベートした。２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを加えた２．５ｍＬのＬＢ培地を用いてプレートから細胞を回収し、得られた細胞懸濁液の１．０ｍＬのアリコートを−８０℃で冷凍した。１ｍＬの解凍細胞懸濁液を、ＫＨ２ＰＯ４（５．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（１．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２二水和物（０．１ｇ／Ｌ）、ＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有する０．７Ｌの培地を入れた１Ｌ容のＡＰＰＬＩＫＯＮ（登録商標）  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  （Ａｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ））に移した。微量元素溶液には、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）、ＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有させた。滅菌後の添加物には、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ、６．５ｇ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）ストック溶液（２．８ｍＬ）を含めた。グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）も流加培養に使用した。グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌ未満になった４０分後に、０．０３ｇ供給／分からグルコースの供給を開始し、時間ごとに０．０４、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１２、０．１４ｇ／分まで徐々に増加させた；その後は速度を一定に保った。培地のグルコース濃度をモニタし、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えたら、供給速度を落とすか一時的に停止させた。０．８ｍＬのＩＰＴＧ（０．０５Ｍ）を加えて、ＯＤ５５０＝５０で誘導を開始した。まず攪拌（４００〜１０００ｒｐｍ）した後、通気（０．５〜２ｓｌｐｍ）して、溶存酸素（ＤＯ）濃度を空気飽和の２５％に制御した。温度を３７℃に制御し、ｐＨを６．８に制御した；ＮＨ４ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）およびＨ２ＳＯ４（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ制御に使用した。ＩＰＴＧ添加の２０時間後に、細胞を遠心分離によって回収した（５，０００×ｇで１５分間）。
【０２１９】
実施例８
半精製Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼまたはＴ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）変異アセチルキシランエステラーゼの細胞可溶化物の調製
Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型ペルヒドロラーゼ）の細胞培養を実施例２で説明したようにして増殖させた。得られた細胞ペーストを、１．０ｍＭのＤＴＴを加えた５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁細胞をフレンチプレス細胞破砕機に２回通し、＞９５％細胞溶解させた。溶解細胞を３０分間１２，０００×ｇで遠心処理し、上清を７５℃で２０分間加熱した後、氷浴中で２分間クエンチした。沈殿したタンパク質を１０分間１１，０００×ｇで遠心除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、熱処理済みの抽出上清にてＣＥ−７酵素が全タンパク質の約８５〜９０％をなすことが示された。
【０２２０】
Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｖ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｖ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ａ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ａ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）の細胞培養を、各々実施例７で説明したようにして増殖させた。得られた細胞ペーストを、１．０ｍＭのＤＴＴを加えた５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁細胞をフレンチプレス細胞破砕機に２回通し、＞９５％細胞溶解させた。溶解細胞を３０分間１２，０００×ｇで遠心処理し、上清を７５℃で２０分間加熱した後、氷浴中で２分間クエンチした。沈殿したタンパク質を１０分間１１，０００×ｇで遠心除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、熱処理済みの抽出上清にてＣＥ−７酵素が全タンパク質の約８５〜９０％をなすことが示された。
【０２２１】
実施例９
Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびＣ２７７エステラーゼ変異体の比活性およびペルヒドロリシス／加水分解比
反応（４０ｍＬ合計容量）を、トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）、以下のアセチルキシランエステラーゼ突然変異体すなわち、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ａ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ａ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１２５ｍｇ／ｍＬ）、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｖ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｖ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１２５ｍｇ／ｍＬ）（実施例８で説明したようにして調製）のうちの１種類を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中にて２５℃で実施した。反応物を反応開始時の３０秒間だけ攪拌し、最初に反応物と酵素とを混合した。
【０２２２】
Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型アセチルキシランエステラーゼ（実施例１）を発現）から単離した０．０５０ｍｇ／ｍＬの熱処理抽出全タンパク質を用いて、すぐ上で説明したものと同じ条件で反応を実施した。この場合、熱処理抽出上清については、実施例８の手順で調製した。
【０２２３】
各反応の最初の１分後と、以後は２分ごとに１５分間、上述した各々の反応混合物から得られる２種類の試料を同時に抜き取り、２種類の試料のうちの一方を過酢酸で分析し、第２の試料をトリアセチンの酵素的加水分解と、それに続くメチル−ｐ−トリルスルフィド（ＭＴＳ、下記参照）との反応による試料中の過酢酸から酢酸への変換で生成された全酢酸について分析した。
【０２２４】
Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）によって説明されている方法を改変したものを用いて、反応混合物における過酢酸生成率を測定した。反応混合物の試料（０．０４０ｍＬ）をあらかじめ定められた時点で除去し、水中で０．９６０ｍＬの５ｍＭリン酸とすみやかに混合し、希釈試料のｐＨをｐＨ４未満まで調節することで反応を終了させた。得られた溶液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）  ＭＣフィルタユニット（３０，０００公称分画分子量（ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；カタログ番号ＵＦＣ３ＬＫＴ  ００）にて２分間１２，０００ｒｐｍで遠心処理して濾過した。得られた濾液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水が入った１．５ｍＬのスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；番号５１８２−０７１５）に移した後、０．１００ｍＬの２０ｍＭ  ＭＴＳ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）のアセトニトリル溶液を加え、バイアルにキャップをし、遮光下約２５℃での１０分間のインキュベーション前に中身を軽く混合した。次に、このバイアルに０．４００ｍＬのアセトニトリルと０．１００ｍＬのトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、４０ｍＭ）のアセトニトリル溶液とを加え、バイアルに再びキャップをし、得られた溶液を混合し、約２５℃で３０分間、遮光下でインキュベートした。次に、このバイアルに０．１００ｍＬの１０ｍＭＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ；ＨＰＬＣ外部標準）を加え、得られた溶液をＨＰＬＣでＭＴＳＯ（メチル−ｐ−トリルスルホキシド）について分析し、ＭＴＳと過酢酸との反応によって化学量論的な酸化生成物を生成した。抽出タンパク質またはトリアセチンを加えることなく対照反応を実施し、バックグラウンドＭＴＳ酸化についての過酢酸生成率の補正用に、アッセイ混合物中での過酸化水素によるＭＴＳの酸化率を求めた。ＨＰＬＣ方法：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（カタログ番号５６９４２２−Ｕ）とＳｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８プレカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号５９５９０−Ｕ）の併用；１０マイクロリットル注入容量；ＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号２７０７１７）および脱イオン水で１．０ｍＬ／分および周囲温度での勾配法（表４）。
【０２２５】
【表１１】
0005665747.tif 000024
【０２２６】
反応におけるペルヒドロラーゼ触媒酢酸生成率を判断するために、反応混合物の試料（０．９００ｍＬ）をあらかじめ定められた時点で除去し、０．０４０ｍＬの０．７５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４が入った１．５ｍＬ容の微小遠心管にすみやかに加え、得られた溶液を軽く混合してｐＨ３．０〜４．０で反応を停止させた。次に、この管に１０ｍｇ／ｍＬのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ３５１５）を５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ（７．２）に入れた溶液０．０２０ｍＬに加え、得られた溶液を混合し、周囲温度で１５分間反応させて、未反応の過酸化水素を水と酸素に分けた。次に、この管に０．０４０ｍＬの０．７５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加え、得られた溶液を混合し、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）  ＭＣフィルタユニット（３０，０００公称分画分子量（ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、カタログ番号ＵＦＣ３ＬＫＴ  ００）にて２分間１２，０００ｒｐｍで遠心処理して濾過した。得られた濾液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．１５０ｍＬの２０ｍＭ  ＭＴＳ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）のアセトニトリル溶液と混合し、得られた溶液を遮光下約２５℃で１０分間インキュベートした。トリアセチンの酵素的加水分解と、ＭＴＳとの反応による過酢酸から酢酸への変換の両方で生成された試料中での酢酸濃度を、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）およびＤＢ−ＦＦＡＰカラム（長さ１５ｍ；ＩＤ、０．５３０ｍｍ；膜厚、１．００μｍ）を装着したガスクロマトグラフ（ＧＣ）で求めた；速度判断ごとに新しい注入ポートライナを使用（合計で８種類の試料を分析）し、経時的に注入ポートライナにリン酸が蓄積するのを回避した。
【０２２７】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼ変異体は、野生型エステラーゼよりもトリアセチンのペルヒドロリシスに対する比活性が有意に高かった（表５）。ＰＡＡ生成率（ペルヒドロリシス率）を、トリアセチンから酢酸への加水分解率（加水分解率）（ＰＡＡおよび酢酸の両方から、このアッセイ法での全酢酸生成率から算出し、過酢酸生成率について補正した）で割って、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のペルヒドロリシス／加水分解比を求めた；Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のＰ／Ｈ比は、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型アセチルキシランエステラーゼのＰ／Ｈ比とほぼ等しいか、これより大きかった（表５）。
【０２２８】
【表１２】
0005665747.tif 000025
【０２２９】
実施例１０
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）からのアセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＮＰ  ２２７８９３．１）に報告されているようなＴ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子を合成した（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）。次に、配列番号２０６および配列番号２０７として同定したプライマーを使用して、この遺伝子をＰＣＲで増幅した（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分間、７０℃で１分、３０サイクル）。得られた核酸産物（配列番号２０８）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａｌで切断し、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩとＸｂａＩ部位の間にサブクローニングして、ｐＳＷ２０７として同定したプラスミドを生成した。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＮＰ  ２２７８９３．１；配列番号３６）に報告されているようなＴ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）  ＭＳＢ８由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子を、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）での発現に合わせて最適化したコドンを用いて合成した。次に、配列番号３８および配列番号３９として同定したプライマーを使用して、この遺伝子をＰＣＲで増幅した（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分間、７０℃で１分、３０サイクル）。得られた核酸産物（配列番号３７）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  受託番号Ｍ２２７４４）のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ部位の間にサブクローニングして、ｐＳＷ２２８として同定したプラスミドを生成した（コドン最適化Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）コード配列  配列番号４１を含む）。プラスミドｐＳＷ２０７およびｐＳＷ２２８を使用して、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９）を形質転換し、それぞれＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８として同定した株を生成した。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８をＬＢ培地で振盪しながら最大ＯＤ６００nm＝０．４〜０．５まで３７℃で増殖させ、その時点でＩＰＴＧを加えて最終濃度を１ｍＭとし、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を遠心分離によって回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の２０〜４０％のペルヒドロラーゼ発現を確認した。
【０２３０】
実施例１１
残基Ｃ２７７でのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の構築
プラスミドｐＳＷ２２８におけるＴ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号４１）のコドン最適化配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマー対（表６）を用いて、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼのＣ２７７（Ｃｙｓ２７７）位を、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒの各々に変更した。ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、製造業者の指示に従って変異を生み出した。増幅プラスミドを１ＵのＤｐｎＩで３７℃にて１時間処理した。処理後のプラスミドを使用して、化学的にコンピテントなＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。形質転換体を、０．１ｍｇアンピシリン／ｍＬ加ＬＢ寒天に蒔き、一晩３７℃で増殖させた。最大５つの個々のコロニーを選び、プラスミドＤＮＡを配列決定して想定変異を確認した。
【０２３１】
【表１３】
0005665747.tif 000026
【０２３２】
実施例１２
Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８におけるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の発現
アセチルキシランエステラーゼ変異が確認されたプラスミドを用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８（実施例１）を形質転換した。形質転換体をＬＢ培地で３７℃にて振盪しながら最大ＯＤ６００nm＝０．４〜０．５まで増殖させ、その時点でＩＰＴＧを加えて最終濃度を１ｍＭにし、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を遠心分離によって回収し、ＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の２０〜４０％のアセチルキシランエステラーゼ発現を確認した。
【０２３３】
実施例１３
半精製Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ突然変異体を含有する細胞可溶化物の調製
細胞培養（実施例１２で説明したようにして調製）を、実施例７で説明したものと類似の発酵プロトコールを用いて、１Ｌスケール（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）にて増殖させた。細胞を５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって回収した後、１．０ｍＭのＤＴＴを加えた５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁細胞をフレンチプレス細胞破砕機に２回通し、＞９５％細胞溶解させた。溶解細胞を３０分間１２，０００×ｇで遠心処理し、上清を７５℃で２０分間加熱した後、氷浴中で２分間クエンチした。沈殿したタンパク質を１０分間１１，０００×ｇで遠心除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＣＥ−７酵素が調製物中の全タンパク質の約８５〜９０％をなすことが示された。
【０２３４】
実施例１４
Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびＣ２７７エステラーゼ変異体の比活性およびペルヒドロリシス／加水分解比
反応（４０ｍＬ合計容量）を、トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）、以下のアセチルキシランエステラーゼ変異体すなわち、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ａ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ａ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１２５ｍｇ／ｍＬ）、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｖ変異体ペルヒドロラーゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｖ由来の熱処理抽出全タンパク質０．０１２５ｍｇ／ｍＬ）（実施例１３で説明したようにして調製）のうちの１種類を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中にて２５℃で実施した。反応物を反応開始時の３０秒間だけ攪拌し、最初に反応物と酵素とを混合した。
【０２３５】
Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）野生型アセチルキシランエステラーゼ（実施例１０）を発現）から単離した０．０５０ｍｇ／ｍＬの熱処理抽出全タンパク質を用いて、すぐ上で説明したものと同じ条件で反応を実施した。この場合、熱処理抽出上清については、実施例１３の手順で調製した。
【０２３６】
各反応の最初の１分後と、以後は２分ごとに１５分間、上述した各々の反応混合物から得られる２種類の試料を同時に抜き取り、Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）が説明している方法に手を加えたものを用いて２種類の試料のうちの一方を過酢酸で分析し、第２の試料をトリアセチンの酵素的加水分解と、それに続くメチル−ｐ−トリルスルフィド（ＭＴＳ、実施例９参照）との反応による試料中の過酢酸から酢酸への変換で生成された全酢酸について分析した。
【０２３７】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ突然変異体は、野生型エステラーゼよりもトリアセチンのペルヒドロリシスに対する比活性が有意に高かった（表７）。ＰＡＡ生成率（ペルヒドロリシス率）を、トリアセチンから酢酸への加水分解率（加水分解率）（ＰＡＡおよび酢酸の両方から、このアッセイ法での全酢酸生成率から算出し、過酢酸生成率について補正した）で割って、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のペルヒドロリシス／加水分解比を求めた；Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のＰ／Ｈ比は、Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型アセチルキシランエステラーゼのＰ／Ｈ比とほぼ等しいか、これより大きかった（表７）。
【０２３８】
【表１４】
0005665747.tif 000027
【０２３９】
実施例１５
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸生成
トリアセチン（２ｍＭ）、過酸化水素（１０ｍＭ）、０．１μｇ／ｍＬ〜２．０μｇ／ｍＬの熱処理細胞抽出タンパク質（上述したように調製、熱処理は８５℃で２０分間実施）を含有する反応（１００ｍＬ合計容量）を、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）にて２０℃で実施した。反応混合物中の過酢酸濃度を、Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）が説明している方法で求めた。１分、５分、２０分、４０分、６０分の時点での過酢酸濃度を表８にあげておく。
【０２４０】
【表１５】
0005665747.tif 000028
【０２４１】
実施例１６
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸生成
トリアセチン（２ｍＭ）、過酸化水素（１０ｍＭ）、０．１μｇ／ｍＬ〜２．０μｇ／ｍＬの熱処理細胞抽出タンパク質（上述したように調製、熱処理は８５℃で２０分間実施）を含有する反応（１００ｍＬ合計容量）を、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）にて２０℃で実施した。反応混合物中の過酢酸濃度を、Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）が説明している方法で求めた。１分、５分、２０分、４０分、６０分の時点での過酢酸濃度を表９にあげておく。
【０２４２】
【表１６】
0005665747.tif 000029
【０２４３】
実施例１７
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸生成
トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）、１０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの熱処理Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）またはＴ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）野生型またはＣ２７７変異体ペルヒドロラーゼ（上述したように調製した熱処理細胞抽出液タンパク質として。熱処理は７５℃で２０分間実施）を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、２５℃で反応（４０ｍＬ合計容量）を実施した。反応物を反応開始時の３０秒間だけ攪拌し、最初に反応物と酵素とを混合した。反応混合物中の過酢酸濃度を、Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）が説明している方法で求めた。１分、５分、３０分の時点での過酢酸濃度を表１０にあげておく。
【０２４４】
【表１７】
0005665747.tif 000030
【０２４５】
実施例１８
ペルヒドロラーゼを用いる過酢酸生成
トリアセチン（１００ｍＭまたは１５０ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ、２５０ｍＭまたは４２０ｍＭ）、熱処理Ｔ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）またはＴ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）野生型、Ｃ２７７ＳまたはＣ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（上述したように調製した熱処理細胞抽出液タンパク質として。熱処理は７５℃で２０分間実施；濃度は表１１に示すとおりである）を含有する重炭酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、初期ｐＨ６．０）中、２５℃で反応（１０ｍＬ合計容量）を実施した。さらに５００ｐｐｍのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬを含有する４２０ｍＭ過酸化水素を用いて反応を実施した。反応物を反応開始時の３０秒間だけ攪拌し、最初に反応物と酵素とを混合した。反応混合物中の過酢酸濃度を、Ｋａｒｓｔ  ｅｔ
ａｌ．（上掲）が説明している方法で求めた。１分、５分、３０分の時点での過酢酸濃度を表１１にあげておく。
【０２４６】
【表１８】
0005665747.tif 000031
【０２４７】
実施例１９
Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）およびＴ．  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型および変異体ペルヒドロラーゼを用いるプロピレングリコールジアセテートまたはエチレングリコールジアセテートのペルヒドロリシス
細胞ペースト（２０ｗｔ％湿細胞重量）を、ジチオトレイトール（１ｍＭ）を含有する０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に入れた懸濁液に、作業圧１６，０００ｐｓｉ（約１１０ＭＰａ）のフレンチプレスで２回通して、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）野生型ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔ）を発現する形質転換体の細胞抽出液を各々調製した。溶解した細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心処理し、清澄化した細胞抽出液を生成した。これを全可溶性タンパク質についてアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）した。上清を７５℃で２０分間加熱した後、氷浴で２分間クエンチした。沈殿したタンパク質を１０分間１１，０００×ｇで遠心除去した。得られた熱処理抽出タンパク質上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＣＥ−７酵素が調製物中の全タンパク質の約８５〜９０％をなすことが示された。熱処理抽出タンパク質上清をドライアイスで冷凍し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０２４８】
プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）またはエチレングリコールジアセテート（ＥＧＤＡ）（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）ならびに、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ  （Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）（上述したようにして調製）由来の２５μｇ／ｍＬの熱処理抽出タンパク質を含有する１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中、第１の組の反応（１０ｍＬ合計容量）を２０℃で実施した。各反応条件の対照反応を実施して、抽出タンパク質を加えることなく過酸化水素によってトリアセチンの化学的ペルヒドロリシスで生じた過酢酸の濃度を求めた。１分、５分、３０分の時点で反応をサンプルし、Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲））およびＨＰＬＣ分析法（上掲）を用いて過酢酸について試料を分析した。１分、５分、３０分の時点での過酢酸濃度を表１２にあげておく。
【０２４９】
【表１９】
0005665747.tif 000032
【０２５０】
プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）またはエチレングリコールジアセテート（ＥＧＤＡ）（２ｍＭ）、過酸化水素（１０ｍＭ）ならびに、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ  （Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）野生型ペルヒドロラーゼ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ），およびＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）（上述したようにして調製）由来の１０μｇ／ｍＬの熱処理抽出タンパク質を含有する１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中、第２の組の反応（１０ｍＬ合計容量）を２０℃で実施した。各反応条件の対照反応を実施して、抽出タンパク質を加えることなく過酸化水素によってトリアセチンの化学的ペルヒドロリシスで生じた過酢酸の濃度を求めた。５分の時点で反応をサンプルし、Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲））およびＨＰＬＣ分析法（上掲）を用いて過酢酸について試料を分析した。５分の時点での過酢酸濃度を表１３にあげておく。
【０２５１】
【表２０】
0005665747.tif 000033
【図１】
0005665747.tif 000044
【図２ａ】
0005665747.tif 000045
【図２ｂ】
0005665747.tif 000046
【配列表】
0005665747000001.app