(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−２細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７４）を培養することで細胞が集密的な状態になってからもさらに培養することで培養上清にヒアルロン酸を分泌させることによるヒアルロン酸の製造方法。
【請求項２】
チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−２細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７４）を培養することで細胞が集密的な状態になってからもさらに培養することで培養上清にヒアルロン酸を分泌させることによって得られる、ヒアルロン酸を含有するＳＴＩＰ−２細胞の培養上清。
【請求項３】
請求項１記載の製造方法によって製造されたヒアルロン酸を配合して行うヒアルロン酸配合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンの一種であるヒアルロン酸は、高い保湿性や高い粘弾性などの機能性を有することから、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品などの成分や素材として注目を集めていることは、当業者のみならず一般にも周知の通りである。従来、ヒアルロン酸の製造は、鶏冠、牛の関節、鯨の軟骨などから抽出する方法で行われてきた。しかしながら、ヒアルロン酸は生体内に微量にしか存在せず、しかも、組織中でタンパク質や他のグリコサミノグリカンと複合体を形成しているため分離・精製が困難であるといったことから、生体内からヒアルロン酸を抽出する方法によるヒアルロン酸の大量生産には限界がある。従って、今日、ヒアルロン酸の製造は、ヒアルロン酸産生能を有する乳酸菌などの微生物を培養する方法によって行われているのが一般的である（例えば特許文献１）。けれども、微生物の種類によっては安全性の点でその利用に対して慎重にならざるを得ない場合もあることから、加えて、ヒアルロン酸の需要の増大に伴い、その新規な製造方法の確立が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−１１２２６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、ヒアルロン酸の新規な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ところで、本発明者は、チョウザメ（ｓｔｕｒｇｅｏｎ）由来の株化細胞についての研究をこれまで精力的に行ってきている。チョウザメは、およそ３億年前から生存していた古代種であるが、その卵はキャビアとして珍重されているほか、その肉も食用として利用価値が高いことから、今後の養殖対象魚類として期待されているところ、チョウザメのウィルス感染症への対策として、その診断を行うためにウィルスに感受性を有する株化細胞が必要となるからである。そしてこれまでの研究成果として、チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞から２種類の株化細胞、ＳＴＩＰ−１細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４２１）およびＳＴＩＰ−３細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４２２）の樹立に成功し、特許第４０６５１５０号において報告している。しかしながら、さらなる新規な株化細胞の探索と樹立は、チョウザメの養殖技術の確立のために大変意義深いことである。そこで引き続き鋭意研究を重ねた結果、ベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞から新たな株化細胞としてＳＴＩＰ−２細胞の樹立に成功したが、このＳＴＩＰ−２細胞は、ＳＴＩＰ−１細胞およびＳＴＩＰ−３細胞と異なる性質として、全く意外なことにヒアルロン酸産生能を有することを知見した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−２細胞を培養することで細胞が集密的な状態になってからもさらに培養することで培養上清にヒアルロン酸を分泌させることによるヒアルロン酸の製造方法である。
また、本発明は、請求項２記載の通り、チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−２細胞を培養することで細胞が集密的な状態になってからもさらに培養することで培養上清にヒアルロン酸を分泌させることによって得られる、ヒアルロン酸を含有するＳＴＩＰ−２細胞の培養上清である。
また、本発明は、請求項３記載の通り、請求項１記載の製造方法によって製造されたヒアルロン酸を配合して行うヒアルロン酸配合物の製造方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ヒアルロン酸産生能を有するチョウザメ由来の株化細胞を利用したヒアルロン酸の新規な製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＳＴＩＰ−２細胞の培養上清に含まれる高い粘度を有する透明の物質がヒアルロン酸であることを示す分子マトリックス電気泳動法（ＳＭＭＥ）による分析結果である。
【図２】ＳＴＩＰ−２細胞の顕微鏡写真である。
【図３】各温度におけるＳＴＩＰ−２細胞の増殖曲線である。
【図４】ＳＴＩＰ−２細胞の増殖に対するＦＢＳの影響を示すグラフである。
【図５】ＳＴＩＰ−２細胞の染色体数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のヒアルロン酸の製造方法において利用するチョウザメ由来の株化細胞は、チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−２細胞である。ベステル（Ｂｅｓｔｅｒ）は、Ｈｕｓｏ属に属するベルーガ（Ｈ．Ｈｕｓｏ）の雌とＡｃｉｐｅｎｓｅｒ属に属するステールリヤチ（Ａ．ｒｕｔｈｅｎｕｓ）の雄から作出された品種改良種であることは周知の通りである。
【００１０】
ＳＴＩＰ−２細胞の樹立方法は、例えば特許第４０６５１５０号に記載の方法に従って、ベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞から調製した初代培養細胞を継代培養することで行えばよい。培地は、魚類細胞の培養に通常用いられるＬ１５培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたようなものでよい。
【００１１】
ＳＴＩＰ−２細胞は、例えば培養皿が細胞で集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態になるまで培養し、さらに培養を行うと、１００ｋＤａ以上の分子量を有するヒアルロン酸を産生して分泌し、分泌したヒアルロン酸を培養上清（培養液の上清部分）に蓄積する。ＳＴＩＰ−２細胞の培養は、例えば４％〜１０％のＦＢＳを添加したＬ１５培地を用い、１５℃〜２５℃の大気雰囲気中で行えばよい。ＳＴＩＰ−２細胞が分泌したヒアルロン酸の培養上清からの分離・精製は、例えばエタノールなどを用いてヒアルロン酸を沈殿させることで簡易に行うことができる。なお、必要に応じて、予め培養上清中の細胞などの不溶物を濾過や遠心分離などによって除去したり、トリプシンを用いてタンパク質を分解処理したりしてもよい。
【００１２】
本発明の製造方法によって製造されたヒアルロン酸は、各種のヒアルロン酸配合物、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の他、ペットフード、飼料、肥料などの成分や素材として利用することができる。それぞれの形態への製剤化や商品化などは、自体公知の方法に従って行えばよい（必要であれば例えば特許文献１を参照のこと）。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１４】
実施例１：ＳＴＩＰ−２細胞を利用したヒアルロン酸の製造
直径３．５ｃｍプラスチックディシュ（培養皿）に加えた、Ｌｅｉｂｏｖｉｔ’ｓ  Ｌ１５培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製の牛胎児血清）とペニシリン（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）とストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した培地を用い、２０℃のＣＯ２インキュベータ内（但し大気雰囲気）でＳＴＩＰ−２細胞（参考例１および参考例２を参照のこと）を培養した。培養皿が細胞で集密的な状態になってからもさらに培養を行うと、培養上清に高い粘度を有する透明の物質の蓄積が観察された。この現象は、先に樹立したＳＴＩＰ−１細胞およびＳＴＩＰ−３細胞では見られない、ＳＴＩＰ−２細胞に特異的なものであった。そこでこの物質の分析を以下の方法で行った。
ＳＴＩＰ−２細胞を培養皿が細胞で集密的な状態になってからさらに３〜４日培養した後の培養上清１ｍｌをスポイトで吸い取り、３ｍｌのエタノールを添加して４℃で２時間静置した後、１００００ｘｇで５分間遠心分離し、得られた沈殿を回収した。この沈殿を１ｍｌの２Ｍ尿素／０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解し、１００μｇのトリプシンを添加して３７℃で一晩反応させ、タンパク質の分解処理を行った後、分子量が１００ｋＤａ未満の画分をカットオフするフィルターで分子量が１００ｋＤａ以上の画分を５０μｌまで濃縮した。得られた濃縮液を還元アルキル化処理した後、分子マトリックス電気泳動法（ＳＭＭＥ：必要であればＹ．Ｍａｔｓｕｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１（１０），ｐｐ３８１６−３８２３を参照のこと）を用いて分析した。結果を図１に示す（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色による）。図１左の電気泳動写真から、ＳＴＩＰ−２細胞の培養上清には培地には含まれない分子量が１００ｋＤａ以上の物質が含まれていることがわかった。そこで１０μｌの上記の濃縮液に１μｌの０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、さらに、ヒアルロニダーゼの１ｍｇ／ｍｌ水溶液（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来）を１μｌ添加し、６０℃で一晩反応させた後、反応液を分子マトリックス電気泳動法を用いて分析したところ、図１右の電気泳動写真から明らかなように、ヒアルロニダーゼ処理を行う前に存在したスポット（Ｃｏｎｔｒｏｌ）がヒアルロニダーゼ処理によって消失した。以上の結果から、ＳＴＩＰ−２細胞の培養上清に含まれる高い粘度を有する透明の物質は、１００ｋＤａ以上の分子量を有するヒアルロン酸であること、ＳＴＩＰ−２細胞はヒアルロン酸産生能を有し、培養上清にヒアルロン酸を分泌することがわかった。また、ＳＴＩＰ−２細胞の培養上清からヒアルロン酸を濃縮液の形態で取得できることがわかった。
【００１５】
実施例２：ＳＴＩＰ−２細胞が産生したヒアルロン酸を利用した保湿クリームの製造
実施例１で取得したヒアルロン酸の濃縮液を市販のクリーム基材にその含量が１％となるように配合して保湿クリームを製造した。
【００１６】
参考例１：ＳＴＩＰ−２細胞の樹立
（１）ベステル眼球からの虹彩色素上皮細胞の分離
体長約１５ｃｍのベステル３０尾から眼球を摘出して７０％エタノール中で殺菌処理した後、殺菌処理した眼球をペニシリンとストレプトマイシンを添加したＰＢＳ（−）中でよく洗浄した。その後、眼球から角膜とレンズを取り除いて虹彩を切り出した。こうして得られた虹彩を０．０５％ＥＤＴＡで約４０分間処理し、虹彩色素上皮細胞と、虹彩のストローマや強膜などの結合組織との分離を容易にした後、これらの結合組織を取り除き、分離したシート状の虹彩色素上皮細胞を０．１２５％トリプシンで酵素処理してシングルセル状態の細胞（初代細胞）を得た。
【００１７】
（２）初代培養
上記のようにして得られた初代細胞を、直径３．５ｃｍプラスチックディシュ（培養皿）に加えた、Ｌｅｉｂｏｖｉｔ’ｓ  Ｌ１５培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製の牛胎児血清）とペニシリン（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）とストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した培地を用い、２０℃のＣＯ２インキュベータ内（但し大気雰囲気）で培養した。初代細胞の中から増殖性の優れた細胞を選択し、継代培養を繰り返した。
【００１８】
（３）継代培養
培養皿が細胞で集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態になったら、０．０５％ＥＤＴＡと０．１２５％トリプシンを含有する溶液で細胞を培養皿から剥離し遠心分離により細胞を回収し、別の培養皿に移し、上記の初代培養の培養条件で培養を継続した。これを繰り返すことによって、長期間培養可能な株化細胞としてＳＴＩＰ−２細胞を得た。このＳＴＩＰ−２細胞は、継代培養の際、コラーゲンなどの細胞外基質を培養皿底面にコーティングするといったような添加をしなくても培養皿に着定した。なお、このＳＴＩＰ−２細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２０１０年８月９日に寄託されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７４）。この特許出願の時点において、ＳＴＩＰ−２細胞の継代培養回数は３００回を超えている。
【００１９】
参考例２：ＳＴＩＰ−２細胞の性質
（１）細胞の形態
ＳＴＩＰ−２細胞は典型的な敷石状の上皮性の細胞である（図２参照：培養開始後１６日目の顕微鏡写真。スケールバーは５０μｍ）。
【００２０】
（２）細胞の温度特性
図３に示したように、ＳＴＩＰ−２細胞は１５℃〜２５℃で良好な増殖性を示したが、２５℃を超えるとその増殖性は阻害された。２０℃での培養開始後１９日目における細胞の倍化時間（指数関数的に細胞が増殖する時間）は約８０時間であり、培養皿への細胞の定着効率（培養皿に定着した細胞数を細胞皿に添加した全細胞数で割った値を百分率で表したもの）は約８８％であった。
【００２１】
（３）細胞増殖に対するＦＢＳの影響
図４に示したように、ＳＴＩＰ−２細胞を増殖せしめるために必要なＬ１５培地に添加されるＦＢＳの濃度は４％で足りた（ＦＢＳ濃度以外は上記の初代培養の培養条件と同じ）。よって、ＳＴＩＰ−２細胞を増殖せしめるために必要なＦＢＳは少量であることから、ＳＴＩＰ−２細胞の大量培養は経済的に有利であることがわかった。
【００２２】
（４）細胞の染色体数
ＳＴＩＰ−２細胞の染色体数を、継代培養２００回以上の細胞について、培養６日目の対数増殖期の細胞にコルヒチン処理を行う常法にて調べた。具体的には、細胞に最終濃度が０．２０μｇ／ｍｌになるようにコルヒチンを加え、１８時間培養した後に培地を取り除いてから細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した。次に、０．０５％ＥＤＴＡと０．１２５％トリプシンを含有する溶液で細胞を培養皿から剥離し遠心分離により細胞を回収した。こうして回収した細胞に０．０７５ＭのＫＣｌを添加して室温にて２０分間静置して低張処理を行った。低張処理した細胞懸濁液はカルノア液を用いて２０分間氷中で固定した後、フレームドライ法によって染色体標本とした。これをギムザ染色し、顕微鏡（倍率１０００倍）で染色体を計数した。その結果、ＳＴＩＰ−２細胞の染色体数は１９６．５±１．７本でモードは１９９本であった。この染色体数はベステルの染色体数である１１７本の約１．７倍であり、株化細胞の特徴を示すものであった（図５参照）。染色体の核型分析によれば、マイクロクロモゾームが最も多く、全体の約５３％を占めていた。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、ヒアルロン酸産生能を有するチョウザメ由来の株化細胞を利用したヒアルロン酸の新規な製造方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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