(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸が区分ボックス  Ａ１および区分ボックス  Ａ２を含んでなり、区分ボックス  Ａ１および区分ボックス  Ａ２は中間区分により互いに連結され、そしてボックス  Ａ１およびボックス  Ａ２は互いに個別に、そして独立してＧＧＧＣＧ、ＧＧＧＵＧおよびＧＧＧＡＧを含んでなる群から選択され、
中間区分が、６もしくは７個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Ｚ１、または１２〜２５個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Ｚ２のいずれかからなり、  
核酸が区分ボックス  Ａ１の５’末端で第１区分を含んでなり、そして区分ボックス  Ａ２の３’末端が第２区分を含んでなり、ここで好ましくは両区分が互いに独立して各々の場合で４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２２および配列番号２４を含んでなる群から選択される配列を含んでなることを特徴とするＨＭＧＡ結合核酸。
【請求項２】
ＨＭＧＡタンパク質がＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２からなる群から選択される請求項１記載のＨＭＧＡ結合核酸。
【請求項３】
請求項１ないし２の１項に記載のＨＭＧＡ結合核酸を含んでなるＨＭＧＡの検出用キット。
【請求項４】
ＨＭＧＡタンパク質および請求項１ないし２の１項に記載のＨＭＧＡ結合核酸を含んでなる複合体。
【請求項５】
請求項１ないし２の１項に記載のＨＭＧＡ結合核酸および製薬学的に許容される担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項６】
薬剤を製造するための請求項１ないし２の１項に記載のＨＭＧＡ結合核酸の使用方法。
【請求項７】
薬剤が癌の治療および／または防止のための薬剤である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の１つの観点は、シュピーゲルマーの新規な使用に関する。本発明の別の観点は、ＨＭＧタンパク質に結合するシュピーゲルマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
分子薬剤の進歩により、疾患もしくは疾患状態に関与する標的分子を同定すること、ならびに分子薬剤により疾患もしくは疾患状態を処置または防止し、または少なくともそれらに付随する症状を緩和するようにそれらに特異的に作用させることが可能になった。標的分子は原理的に２つのグループに分けることができる。第１グループは、細胞外に存在し、そして原理的には活性物質を、標的分子を含む体液もしくは体腔に投与することにより活性物質と接触できるようになる標的分子を含む。第１グループの標的分子は、本明細書では細胞外標的分子とも言う。第２グループの標的分子は細胞中に存在する標的分子を含み、これらの細胞は処置する疾患に関与しているか、または疾患に対する素因がある。これに関して標的分子は、疾患状態の直接的な原因である必要はなく、または疾患に対する素因に直接結び付いている必要はない。代わりに、個々の標的分子は作用カスケードに関与していれば十分であり、カスケードの過程は活性物質に影響され、その結果、活性物質は疾患の処置または防止に適している。標的分子の第２グループは、本明細書では細胞内標的分子とも言う。
【０００３】
標的分子、すなわち細胞外もしくは細胞内標的分子の性質は、原理的には結合の種類を定め、これを用いて活性物質、典型的には製薬学的に活性な物質と標的分子との間の治療的または防止的作用に必要な相互作用に効果を生じるための試みを行うことができる。ほとんどすべての場合、いわゆる低分子、すなわち典型的に１０００ダルトン以下の分子量を有する化学化合物を使用することができる。これらの分子は細胞外標的分子と、ならびに細胞内標的分子と所望する様式で直接的に相互作用することができる。
【０００４】
この背景に対して、例えば抗体、特にモノクローナル抗体、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）およびシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）のような新規クラスの活性物質がバイオテクノロジー産業により開発されてきた。これらのクラスの分子の幾つかは臨床的調査の予備段階であるものの、少なくとも抗体およびアンチセンス分子生成物の場合はすでに臨床的に使用されているものもある。しかしこれらの新規クラスの物質は、細胞内標的分子の取り扱いに関して重大な問題もある。すなわち例えば抗体の細胞内の使用は、処置および／または予防の目的で細胞内標的分子に対して向けられた抗体の患者において、少なくとも日常的使用を可能にする程度まで、あるいはそれを可能にする方法および様式では今でも常に可能というわけではない。また、他の新規クラスの活性物質、特にアンチセンス分子およびｓｉＲＮＡ分子は、それらの作用機作のために、標的分子または標的分子をコードする遺伝子を含有する個々の細胞に導入されなければならない。活性物質の標的化された放出は、送達とも呼ぶが、これらのクラスの物質にとって臨床的応用の現在の限定因子でもある。
【０００５】
同じ理由がアプタマーおよびシュピーゲルマー（すなわち個々の標的分子との特異的相互作用を可能にする定められた三次元構造を有する機能的核酸）にもあてはまる。細胞内標的分子に向けるためのアプタマーの使用は、遺伝子技法、より詳細には遺伝子治療を利用する。細胞内標的分子に対して向けられるイントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）とも呼ばれるアプタマーは、個々の標的細胞に遺伝子技術法により取り込まれる。しかしそのような取り組みは、少なくとも遺伝子治療に基づく処置の取り組みの受容の欠如によるものではないかなりの制限にさらされる。特に各アプタマーを細胞内でコードする核酸の細胞内
発現が関与するイントラマーの場合に適合された経路は、シュピーゲルマー、すなわちＬ−核酸からなるアプタマーを合成することができる生物学的系が存在しないので、原理的にシュピーゲルマーには閉ざされている。
【発明の開示】
【０００６】
したがって本発明の目的は細胞内標的分子、すなわち細胞に存在する標的分子と特異的に相互作用することができるクラスの物質を提供することである。
【０００７】
本発明に従い、この目的は添付する独立項の主題により達成される。好適な態様は従属項に開示される。
【０００８】
本発明に従い、基本的目的は独立項の主題により達成される。好適な態様は従属項に開示される。
【０００９】
本発明の第１の観点に従い、目的は細胞内で活性な作用物質としてＬ−核酸の使用により達成される。
【００１０】
第１観点の第１態様では、Ｌ−核酸はシュピーゲルマーである。
【００１１】
第１観点の第２態様では（これはまた第１態様の一態様でもある）、Ｌ−核酸が細胞内受容体と相互作用する。
【００１２】
第１観点の第３態様では（これはまた第２態様の一態様でもある）、細胞内受容体が分子受容体、酵素、シャペロン分子、シグナルペプチド、細胞内構造および代謝中間体を含んでなる群から選択される。
【００１３】
第１観点の第４態様では（これはまた第２態様の一態様でもある）、細胞内受容体がポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質およびその組み合わせを含んでなる群から選択される。
【００１４】
第１観点の第５態様では（これはまた第２、３および４態様の一態様でもある）、Ｌ−核酸が細胞内受容体と細胞内で相互作用する。
【００１５】
第１観点の第６態様では（これはまた第２、３、４および５態様の一態様でもある）、細胞内受容体がＡＴフックを結合する転写因子およびＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる群から選択される。
【００１６】
第１観点の第７態様では（これはまた第６態様の一態様でもある）、細胞内受容体がＨＭＧタンパク質を含んでなる群、好ましくはＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２を含んでなる群から選択される。
【００１７】
本発明の第２観点に従い、この目的は細胞内受容体を結合する方法により達成され、この方法は：
−少なくとも１つの細胞内受容体を含有する細胞を準備し、
−Ｌ−核酸を準備し、そして
−細胞をＬ−核酸とインキュベーションする、
ことを含んでなる。
【００１８】
第２観点の第１態様では、インキュベーションが、Ｌ−核酸が細胞内で細胞内受容体に結合するような条件下で起こる。
【００１９】
第２観点の第２態様では（これは第１態様の一態様でもある）、Ｌ−核酸がシュピーゲルマーである。
【００２０】
第２観点の第３態様では（これは第１および２態様の一態様でもある）、細胞をＬ−核酸とインキュベーションした後に、結合、特にＬ−核酸の細胞内受容体への細胞内結合が起こったかどうかを決定する。
【００２１】
第２観点の第４態様では（これは第１、２および３態様の一態様でもある）、細胞内受容体が分子受容体、代謝中間体および酵素を含んでなる群から選択される。
【００２２】
第２観点の第５態様では（これは第１、２、３および４態様の一態様でもある）、細胞内受容体がポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質およびその組み合わせを含んでなる群から選択される。
【００２３】
第２観点の第６態様では（これは第１、２、３、４および５態様の一態様でもある）、細胞内受容体がＡＴフックを結合する転写因子およびＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる群から選択される。
【００２４】
第２観点の第７態様では（これは第６態様の一態様でもある）、細胞内受容体がＨＭＧタンパク質を含んでなる群から選択され、そして好ましくはＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２を含んでなる群から選択される。
【００２５】
本発明の第３観点に従い、この目的は疾患の処置および／または防止の薬剤を製造するためのＬ−核酸の使用により達成され、薬剤の標的分子が細胞内標的分子である。
【００２６】
第３観点の第１態様では、細胞内受容体が分子受容体、酵素、シャペロン分子、シグナルペプチド、細胞内構造および代謝中間体を含んでなる群から選択される。
【００２７】
第３観点の第２態様では（これは第１態様の一態様でもある）、細胞内受容体がポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質およびその組み合わせを含んでなる群から選択される。
【００２８】
第３観点の第３態様では（これは第１および２態様の一態様でもある）、標的分子がＡＴフックを結合する転写因子およびＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる群から選択される。
【００２９】
第３観点の第４態様では（これは第３態様の一態様でもある）、標的分子がＨＭＧタンパク質を含んでなる群から選択され、そして好ましくはＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２を含んでなる群から選択される。
【００３０】
第３観点の第５態様では（これは第３および４態様の一態様でもある）、疾患が腫瘍疾患、ウイルス感染および動脈硬化症を含んでなる群から選択される。
【００３１】
第３観点の第６態様では（これは第５態様の一態様でもある）、腫瘍疾患が間葉腫瘍、上皮腫瘍、良性腫瘍、悪性腫瘍および転移している腫瘍を含んでなる群から選択される。
【００３２】
第３観点の第７態様では（これは第３、４、５および６態様の一態様でもある）、標的分子がＨＭＧＡであり、そして疾患が前立腺、膵臓、甲状腺、頚、胃、胸、結腸／直腸、卵巣の癌腫；神経芽腫；リンパ腫、子宮平滑筋腫；脂肪腫；子宮内膜ポリープ；肺の軟骨様過誤腫；唾液腺の多形腺腫；血管周囲細胞腫：軟骨腫性の腫瘍；浸潤性血管粘液腫；拡
散星状細胞腫；骨巨細胞腫；皮膚ガン；バーキットリンパ腫；ルイス肺癌；白血病；非−小細胞肺癌腫；ならびに各々の場合でその転移および／または転移している形態を含んでなる群から選択される。
【００３３】
第３観点の第８態様では（これは第６態様の一態様でもある）、動脈硬化症がＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよび／またはＨＭＧＡ２により媒介される動脈硬化性プラーク（ｐｌａｑｕｅ）の形成により誘発または引き起こされる。
【００３４】
第３観点の第９態様では（これは第１、２、３、４、５、６、７および８態様の一態様でもある）、細胞内標的分子が細胞内に存在する。
【００３５】
本発明の第４観点に従い、目的は診断目的の診断薬の製造のためのＬ−核酸の使用により達成され、診断薬の標的分子が細胞内標的分子である。
【００３６】
第４観点の第１態様では、細胞内受容体が分子受容体、酵素、シャペロン分子、シグナルペプチド、細胞内構造および代謝中間体を含んでなる群から選択される。
【００３７】
第４観点の第２態様では（これは第１態様の一態様でもある）、細胞内受容体がポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質およびその組み合わせを含んでなる群から選択される。
【００３８】
第４観点の第３態様では（これは第１および第２態様の一態様でもある）、標的分子がＡＴフックを結合する転写因子およびＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる群から選択される。
【００３９】
第４観点の第４態様では（これは第３態様の一態様でもある）、標的分子がＨＭＧタンパク質を含んでなる群、そして好ましくはＨＭＧＡ、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２を含んでなる群から選択される。
【００４０】
第４観点の第５態様では（これは第３および４態様の一態様でもある）、疾患が腫瘍疾患、ウイルス感染および動脈硬化症を含んでなる群から選択される。
【００４１】
第４観点の第６態様では（これは第５態様の一態様でもある）、腫瘍疾患が間葉腫瘍、上皮腫瘍、良性腫瘍、悪性腫瘍および転移している腫瘍を含んでなる群から選択される。
【００４２】
第４観点の第７態様では（これは第３、４、５および６態様の一態様でもある）、標的分子がＨＭＧＡであり、そして疾患が前立腺、膵臓、甲状腺、頚、胃、胸、結腸／直腸、卵巣の癌腫；神経芽腫；リンパ腫、子宮平滑筋腫；脂肪腫；子宮内膜ポリープ；肺の軟骨様過誤腫；唾液腺の多形腺腫；血管周囲細胞腫；軟骨腫性腫瘍；浸潤性血管粘液腫；拡散星状細胞腫；骨巨細胞腫；皮膚ガン；バーキットリンパ腫；ルイス肺癌；白血病；非−小細胞肺癌腫；ならびに各々の場合でその転移および／または転移している形態を含んでなる群から選択される。
【００４３】
第４観点の第８態様では（これは第５態様の一態様でもある）、動脈硬化症がＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよび／またはＨＭＧＡ２により媒介される動脈硬化性斑の形成により誘発される。
【００４４】
第４観点の第９態様では（これは第１，２，３，４，５、６および７態様の一態様でもある）、細胞内標的分子が細胞内に存在する。
【００４５】
本発明の第５観点に従い、目的は細胞内標的分子に結合するＬ−核酸および送達ベヒク
ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を含んでなる組成物により達成される。
【００４６】
第５観点の第１態様では、送達ベヒクルが、Ｌ−核酸の細胞内送達に適する送達ベヒクルである。
【００４７】
第５観点の第２態様では（これは第１態様の一態様でもある）、送達ベヒクルがベヒクル、コンジュゲートおよび物理的手段を含んでなる群から選択される。
【００４８】
第５観点の第３態様では（これは第２態様の一態様でもある）、送達ベヒクルがリポソーム、ナノ粒子、ミクロ粒子、シクロデキストリンまたはデンドリマーを含んでなる群から選択されるベヒクルであるか、あるいはポリペプチド、ポリエチレンイミンおよび／または両親媒性分子からなる小胞である。
【００４９】
第５観点の第４態様では（これは第２態様の一態様でもある）、送達ベヒクルがコンジュゲートであり、コンジュゲートが受容体−ベヒクル性のエンドサイトーシスのコンジュゲート、フューゾジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペプチドを含むコンジュゲート、シグナルペプチドを含むコンジュゲート、核酸を含むコンジュゲート、好ましくはシュピーゲルマーを含むコンジュゲートであるか、または親油性コンジュゲートである。
【００５０】
第５観点の第５態様では（これは第２態様の一態様でもある）、送達ベヒクルが物理的手段であり、物理的手段が好ましくは電気穿孔法、イオン導入法、圧、超音波およびショック波を含んでなる群から選択される。
【００５１】
第５観点の第６態様では（これは第３態様の一態様でもある）、送達ベヒクルがポリエチレンイミンを含んでなる。
【００５２】
第５観点の第７態様では（これは第６態様の一態様でもある）、ポリエチレンイミンが約２５ｋＤａの分子量を有する分枝ポリエチレンイミンである。
【００５３】
第５観点の第８態様では（これは第６および７態様の一態様でもある）、ポリエチレンイミンがミセルまたはミセル様構造を形成する。
【００５４】
第５観点の第９態様では（これは第１、２、３、４、５、６、７および８態様の一態様でもある）、Ｌ−核酸がシュピーゲルマーである。
【００５５】
第５観点の第１０態様では（これは第９態様の一態様でもある）、シュピーゲルマーが修飾を持ち、該修飾がＰＥＧ残基を含んでなる群から選択される。
【００５６】
第５観点の第１１態様では（これは第１０態様の一態様でもある）、ＰＥＧ残基が約１，０００〜１０，０００Ｄａの分子量、好ましくは約１，５００〜２，５００Ｄａ、そして最も好ましくは約２，０００Ｄａの分子量を有する。
【００５７】
第５観点の第１２態様では（これは第１０および１１態様の一態様でもある）、修飾がＬ−核酸の５’末端または３’末端に結合している。
【００５８】
第５観点の第１３態様では（これは第９、１０、１１および１２態様の一態様でもある）、組成物中、組成物に含まれる核酸のリン酸基の総数に対するポリエチレンイミンの窒素基の総数の比が、約１〜２０、好ましくは約１．５〜１０、より好ましくは約２〜５、そして最も好ましくは約２〜３である。
【００５９】
第５観点の第１４態様では（これは第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３態様の一態様でもある）、組成物がＬ−核酸を細胞内に提供する。
【００６０】
本発明の第６観点に従い、目的は第５観点による組成物および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物により達成される。
【００６１】
第１観点の使用の一態様では、Ｌ−核酸が第５観点による組成物である。
【００６２】
第２観点に従う方法の一態様では、Ｌ−核酸が第５観点による組成物である。
【００６３】
第３観点に従う使用の一態様では、Ｌ−核酸が第５観点による組成物である。
【００６４】
第４観点に従う使用の一態様では、Ｌ−核酸が第５観点による組成物である。
【００６５】
本発明の第７観点に従い、目的は核酸が区分ボックス  Ａ１および区分ボックス  Ａ２を含んでなり、区分ボックス  Ａ１および区分ボックス  Ａ２は中間区分により互いに連結され、そしてボックス  Ａ１およびボックス  Ａ２は互いに個別に、そして独立してＧＧＧＣＧ、ＧＧＧＵＧおよびＧＧＧＡＧを含んでなる群から選択されることを特徴とするＨＭＧＡ結合核酸により達成される。
【００６６】
第７観点の第１態様では、中間区分が、６もしくは７個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Ｚ１、または１２〜２５個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Ｚ２のいずれかからなる。
【００６７】
第７観点の第２態様では（これは第１態様の一態様でもある）、核酸が区分ボックス  Ａ１の５’末端で第１区分を有し、そして区分ボックス  Ａ２の３’末端が第２区分を有し、ここで好ましくは両区分が互いに独立して４〜８個のヌクレオチドを含んでなる。
【００６８】
第７観点の第３態様では（これは第２態様の一態様でもある）、２つの区分が少なくとも一部、または完全に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションが４〜８ヌクレオチド対に延びる。
【００６９】
第７観点の第４態様では（これは第２および３態様の一態様でもある）、核酸が区分ボックス  Ａ１の５’末端で区分ヘリックスＡ１を含んでなり、そして区分ボックス  Ａ２の３’末端で区分ヘリックスＡ２を含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＡ１が４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、そして好ましくは区分ヘリックスＡ２が４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、そしてここで好ましくは区分ヘリックスＡ１が区分ボックスＡ１の５’末端またはその一部に第１区分を形成し、そしてここで好ましくは区分ヘリックスＡ２が区分ボックスＡ２の３’末端またはその一部に第２区分を形成し、区分ヘリックスＡ１の長さが区分ヘリックスＡ２の長さから独立している。
【００７０】
第７観点の第５態様では（これは第４態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２が少なくとも一部、または完全に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションが４〜８ヌクレオチド対に延びる。
【００７１】
第７観点の第６態様では（これは第４および６態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１の３’末端と区分ボックスＡ１の５’末端との間に、区分ヘリックスＢ１が整列され、そして区分ボックスＡ２の３’末端と区分ヘリックスＡ２の５’末端との間に、区分ヘリックスＢ２が整列され、ここで好ましくは区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２の長さが、各々の場合で個別に、そして独立して４〜８個のヌクレオチド長を含んでなる
。
【００７２】
第７観点の第７態様では（これは第６態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２が少なくとも一部、または完全に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションが４〜８ヌクレオチド対に延びる。
【００７３】
第７観点の第８態様では（これは第６および７態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１の３’末端と区分ヘリックスＢ１の５’末端との間に、０〜５個のヌクレオチドが整列される。
【００７４】
第７観点の第９態様では（これは第８態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１の３’末端と区分ヘリックスＢ１の５’末端との間に、２個のヌクレオチドが整列される。
【００７５】
第７観点の第１０態様では（これは第６、７、８および９態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ２の３’末端と区分ヘリックスＡ２の５’末端との間に、０〜６個のヌクレオチドが整列される。
【００７６】
第７観点の第１１態様では（これは好ましくはこれが第９態様の一態様である範囲において第１０態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ２の３’末端と区分ヘリックスＡ２の５’末端との間に、１個のヌクレオチドが整列される。
【００７７】
第７観点の第１２態様では（これは第６、７、８、９、１０および１１態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１および区分ヘリックスＢ１のヌクレオチドの和が１０〜１２ヌクレオチドであり、そして区分ヘリックスＡ２および区分ヘリックスＢ２のヌクレオチドの和が１０〜１２ヌクレオチドである。
【００７８】
第７観点の第１３態様では（これは第１２態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１と区分ヘリックスＡ２との、および区分ヘリックスＢ１と区分ヘリックスＢ２とのハイブリダイゼーションからハイブリダイズしたヌクレオチドの和が、１０〜１２ヌクレオチド対である。
【００７９】
第７観点の第１４態様では（これは第６、７、８、９、１０、１１、１２および１３態様の一態様、好ましくは第６または７態様の一態様である）、核酸が区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２を含まず、これにより区分ヘリックスＢ１が核酸の５’末端に整列され、そしてヘリックスＢ２が３’末端に整列され、ここで好ましくはヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２の長さが各々の場合で個別に、そして独立して、４〜８個のヌクレオチド長を含んでなる。
【００８０】
第７観点の第１５態様では（これは第１４態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２が少なくとも一部、または完全に互いにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションが４〜８ヌクレオチド対に延びる。
【００８１】
第７観点の第１６態様では（これは第４および５態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１の３’末端と区分ボックスＡ１の５’末端との間に１〜５個のヌクレオチドが整列され、そして区分ボックスＡ２の３’末端と区分ヘリックスＡ２の５’末端との間に１〜３個のヌクレオチドが整列される。
【００８２】
第７観点の第１７態様では（これは第６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ１の３’末端と区分ボックスＡ１の５’末端との間に２個のヌクレオチドが整列され、そして区分ボックスＡ２の３’末端
と区分ヘリックスＢ２の５’末端の間に１〜７個のヌクレオチドが整列される。
【００８３】
第７観点の第１８態様では（これが第６、７および８態様の態様の範囲において、第１、２、３、４、５、６、７、８および１０態様の一態様であり、これらが第６、７、８および１０態様の範囲において、第１２および１３態様の一態様であり、これらが第６、７、８、１０、１２および１３態様の範囲において、第１４および１５態様の一態様であり、あるいはこれらが第６、８、１０、１２、１３および１５態様の態様の範囲において、第１７態様の一態様でもある）、各々の場合で本明細書で制限される範囲において、中間区分Ｚ１が６もしくは７個のヌクレオチドを含んでなる。
【００８４】
第７観点の第１９態様では（これは第１８態様の一態様でもある）、中間区分Ｚ１が配列Ｎ１Ｎ２ＧＮ８Ｎ３Ｎ４Ｎ５を含んでなり、ここで
Ｎ１＝Ｕ、Ｃ、ＡまたはＧ；
Ｎ２＝ＧまたはＵ；
Ｎ３＝ＵまたはＣ；
Ｎ４＝ＵまたはＡ；
Ｎ５＝ＧまたはＡ；そして
Ｎ８＝Ｕまたは存在しない
である。
【００８５】
第７観点の第２０態様では（これは第１９態様の一態様でもある）、核酸が区分ボックスＡ１および区分ボックスＡ２を含んでなり、ここで区分ボックスＡ１の３’末端が中間区分Ｚ１の５’末端に直接連結され、そして中間区分Ｚ１の３’末端が区分ボックスＡ２の５’末端に直接連結されている。
【００８６】
第７観点の第２１態様では（これは第１８、１９および２０態様、特に２１態様の一態様でもある）、核酸が区分ヘリックスＢ１および区分ヘリックスＢ２を含んでなる。
【００８７】
第７観点の第２２態様では（これは第２１態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２が各々個別に、そして互いに独立して４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、これらは好ましくは完全に、または部分的に互いにハイブリダイズする。
【００８８】
第７観点の第２３態様では（これは第２１および２２態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ１の３’末端と、区分ボックスＡ１の５’末端との間に、２個のヌクレオチドＮ６、Ｎ７が５’３’方向に整列され、ここでＮ６がＧ、ＡまたはＵであり、そしてＮ７がＧまたはＵである。
【００８９】
第７観点の第２４態様では（これは第２１、２２および２３態様の一態様でもある）、区分ボックスＡ２の３’末端と、区分ヘリックスＢ２の５’末端との間に、ヌクレオチドが無いか、またはヌクレオチド配列ＧＮｙが５’３’方向に整列され、ここでＮｙが０〜６個のヌクレオチド、好ましくは０または６個のヌクレオチドを含んでなる。
【００９０】
第７観点の第２５態様では（これは第１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４態様の一態様でもある）、核酸が区分ヘリックスＡ１および区分ヘリックスＡ２を含んでなる。
【００９１】
第７観点の第２６態様では（これは第２５態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２は完全に、または部分的に互いにハイブリダイズする。
【００９２】
第７観点の第２７態様では（これは第２５および２６態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１の３’末端と区分ヘリックスＢ１の５’末端との間に、ヌクレオチド配列Ｎｘが整列され、ここでＮｘが０〜５個のヌクレオチドを含んでなる。
【００９３】
第７観点の第２８態様では（これは第２５、２６および２７態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＢ２の３’末端と区分ヘリックスＡ２の５’末端との間にヌクレオチド配列Ｎｚが整列され、ここでＮｚは０〜６個のヌクレオチドを含んでなる。
【００９４】
第７観点の第２９態様では（これは第２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１と区分ヘリックスＡ２との、および区分ヘリックスＢ１と区分ヘリックスＢ２とのハイブリダイゼーションからハイブリダイズしたヌクレオチドの和（ｔｈｅ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｓｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が１０〜１２個のヌクレオチド対である。
【００９５】
第７観点の第３０態様では（これは第２４、２５、２６、２７、２８および２９態様の一態様でもある）、区分ボックスＡ２の３’末端と、区分ヘリックスＢ２の５’末端との間に、ヌクレオチドＧＮｙが５’−３’方向に整列され、ここでＮｙが０〜６個のヌクレオチド、好ましくは０もしくは６個のヌクレオチドを含んでなる。
【００９６】
第７観点の第３１態様では（これは第３０態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が以下の構造
【００９７】
【化１】
0005766750.tif 000002
【００９８】
ここで
Ｎ１＝Ｕ、Ｃ、ＡまたはＧ；
Ｎ２＝ＧまたはＵ；
Ｎ３＝ＵまたはＣ；
Ｎ４＝ＵまたはＡ；
Ｎ５＝ＧまたはＡ；
Ｎ６＝Ｇ、ＡまたはＵ；
Ｎ７＝ＧまたはＵ；
Ｎ８＝Ｕまたはヌクレオチド無し；
Ｎｘ＝０〜５個のヌクレオチド；
Ｎｙ＝０または６個のヌクレオチド；そして
Ｎｚ＝０〜６個のヌクレオチド；
区分ボックスＡ１および区分ボックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立してＧＧＧＣＧ、ＧＧＧＵＧおよびＧＧＧＡＧを含んでなるヌクレオチド配列の群から選択され；
区分ヘリックスＡ１および区分ヘリックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そして
区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＢ１およびヘ
リックスＢ２は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そしてハイブリダイズする領域が４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、そしてここで区分ヘリックスＡ１と区分ヘリックスＡ２との、および区分ヘリックスＢ１と区分ヘリックスＢ２とのハイブリダイゼーションからハイブリダイズしたヌクレオチドの和が１０〜１２ヌクレオチド対である、
を含んでなる。
【００９９】
第７観点の第３２態様では（これは第３０および３１態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号１３を含んでなる群から選択される配列を含んでなる。
【０１００】
第７観点の第３３態様では（これは第２４、２５、２６、２７、２８および２９態様の一態様でもある）、区分ボックスＡ２の３’末端が区分ヘリックスＢ２の５’末端に直接連結されている。
【０１０１】
第７観点の第３４態様では（これは第３３態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が以下の構造
【０１０２】
【化２】
0005766750.tif 000003
【０１０３】
ここで
Ｎ１＝Ｕ、Ｃ、ＡまたはＧ；
Ｎ２＝ＧまたはＵ；
Ｎ３＝ＵまたはＣ；
Ｎ４＝ＵまたはＡ；
Ｎ５＝ＧまたはＡ；
Ｎ６＝Ｇ、ＡまたはＵ；
Ｎ７＝ＧまたはＵ；
Ｎ８＝Ｕまたはヌクレオチド無し；
Ｎｘ＝０〜５個のヌクレオチド；
Ｎｙ＝０または５個のヌクレオチド；そして
Ｎｚ＝０〜６個のヌクレオチド；
区分ボックスＡ１および区分ボックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立してＧＧＧＣＧ、ＧＧＧＵＧおよびＧＧＧＡＧを含んでなるヌクレオチド配列の群から選択され；
区分ヘリックスＡ１および区分ヘリックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そして
区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２は互いに完全に、または部分的にハイブリダイズし、そしてハイブリダイズする領域が４〜８個のヌクレオチドを含んでなり、そしてここで区分ヘリックスＡ１とヘリックスＡ２との、および区分ヘリックスＢ１と区分ヘリックスＢ２とのハイブリダイゼーションからハイブリダイズしたヌクレオチドの和が１０〜１２ヌクレオチド対である、を含んでなる。
【０１０４】
第７観点の第３５態様では（これは第３３および３４態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が配列番号３を含む配列を含んでなる。
【０１０５】
第７観点の第３６態様では（これは第３１態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が以下の構造
【０１０６】
【化３】
0005766750.tif 000004
【０１０７】
を含んでなる。
【０１０８】
第７観点の第３７態様では（これは第３４態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が以下の構造
【０１０９】
【化４】
0005766750.tif 000005
【０１１０】
を含んでなる。
【０１１１】
第７観点の第３８態様では（これは第３６態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が配列番号１５および配列番号１６を含む群から選択される配列を含んでなる。
【０１１２】
第７観点の第３９態様では（これは第７観点の第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１６の一態様、または第７観点の第１７態様でもある）、
ＨＭＧＡ結合核酸が１２〜２５個のヌクレオチドを含んでなる中間区分Ｚ２を含んでなる。
【０１１３】
第７観点の第４０態様では（これは第３９態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が中間体区分Ｚ２、区分ヘリックスＣ１および区分ヘリックスＣ２を含んでなる。
【０１１４】
第７観点の第４１態様では（これは第４０態様の一態様でもある）、中央区分ＮｃがＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＣ１と区分ヘリックスＣ２との間に整列される。
【０１１５】
第７観点の第４２態様では（これは第４０または４１態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２の長さが同一である。
【０１１６】
第７観点の第４３態様では（これは第４０、４１および４２態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２の長さが個別に、そして独立して３〜６個のヌクレオチドである。
【０１１７】
第７観点の第４４態様では（これは第４０、４１、４２および４３態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２が完全に、または部分的に互いにハイブリダイズする。
【０１１８】
第７観点の第４５態様では（これは第３９、４０、４１、４２、４３および４４態様の
一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の中央区分Ｎｃが３〜５個のヌクレオチドを含んでなる。
【０１１９】
第７観点の第４６態様では（これは第３９、４０、４１、４２、４３、４４および４５態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が区分ボックスＡ１および区分ボックスＡ２を含んでなり、ここで区分ボックスＡ１の３’末端と区分ヘリックスＣ１の５’末端の間にヌクレオチド配列Ｎｂが整列され、そして３個のヌクレオチドを含んでなる。
【０１２０】
第７観点の第４７態様では（これは第３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が区分ボックスＡ１および区分ボックスＡ２を含んでなり、ここで区分ヘリックスＣ２の３’末端と区分ボックスＡ２の５’末端の間にヌクレオチド配列Ｎｄが整列され、そして２〜５個のヌクレオチドを含んでなる。
【０１２１】
第７観点の第４８態様では（これは第３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６および４７態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２を含んでなる。
【０１２２】
第７観点の第４９態様では（これは第４８態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して５〜６個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＡ１および区分ヘリックスＡ２が完全に、または部分的に互いにハイブリダイズする。
【０１２３】
第７観点の第５０態様では（これは第４８および４９態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＡ１の３’末端と区分ボックスＡ１の５’末端の間にヌクレオチド配列Ｎａが整列され、ここでＮａが１〜５個のヌクレオチドを含んでなる。
【０１２４】
第７観点の第５１態様では（これは第４８、４９および５０態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ボックスＡ２の３’末端と区分ヘリックスＡ２の５’末端の間にヌクレオチド配列ＧＮｅが５’−３’方向で整列され、ここでＮｅが１〜２個のヌクレオチド、好ましくはＡまたはＵＵを含んでなる。
【０１２５】
第７観点の第５２態様では（これは第４８、４９、５０および５１態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２が、各々の場合で個別に、そして互いに独立して５もしくは６個のヌクレオチド長を有し、ここで好ましくは区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２が完全に、または部分的に互いにハイブリダイズする。
【０１２６】
第７観点の第５３態様では（これは第５２態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が以下の構造：
【０１２７】
【化５】
0005766750.tif 000006
【０１２８】
ここで
Ｎａ＝１〜５個のヌクレオチド；
Ｎｂ＝３個のヌクレオチド；
Ｎｃ＝３〜５個のヌクレオチド；
Ｎｄ＝２〜５個のヌクレオチド；そして
Ｎｃ＝１〜２個のヌクレオチド、好ましくはＡまたはＵＵ；
区分ボックスＡ１および区分ボックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立してＧＧＧＣＧ、ＧＧＧＵＧおよびＧＧＧＡＧを含んでなる群から選択され；
区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して５もしくは６個のヌクレオチドを含んでなり、そして
区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２は各々の場合で５もしくは６個のヌクレオチドを含んでなり、これらは好ましくは互いに完全に、または部分的にハイブリダイズする、
を有する。
【０１２９】
第７観点の第５４態様では（これは第５３態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号２２および配列番号２４を含んでなる群から選択される配列を含んでなる。
【０１３０】
第７観点の第５５態様では（これは第３９、４０、４１、４２、４３および４４態様の一態様でもある）、核酸がＨＭＧＡ結合核酸の区分ボックス１および区分ヘリックスＣ１を含んでなり、ここでヌクレオチドＡが区分ボックスＡ１の３’末端と区分ヘリックスＣ１の５’末端の間に整列される。
【０１３１】
第７観点の第５６態様では（これは第５５態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が区分ヘリックスＣ２および区分ボックスＡ２を含んでなり、ここでヌクレオチドＧが区分ヘリックスＣ２の３’末端と区分ボックスＡ２の５’末端の間に整列される。
【０１３２】
第７観点の第５７態様では（これは第５５または５６態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の中央区分Ｎｃが４個のヌクレオチドを含んでなり、ここでＮｃが好ましくはＧＡＵＧである。
【０１３３】
第７観点の第５８態様では（これは第５５、５６および５７態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が区分ヘリックスＢ１および区分ヘリックスＢ２を含んでなる。
【０１３４】
第７観点の第５９態様では（これは第５８態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して５個のヌクレオチド長を含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＢ１が区分ヘリックスＢ２にハイブリダイズする。
【０１３５】
第７観点の第６０態様では（これは第５８または５９態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＢ１の３’末端と、区分ボックスＡ１の５’末端の間に、２個のヌクレオチドＮｊを含んでなるヌクレオチド配列が整列され、ここでＮｊが好ましくはＡＧである。
【０１３６】
第７観点の第６１態様では（これは第５８、５９および６０態様の一態様でもある）、ヌクレオチドＧがＨＭＧＡ結合核酸の区分ボックスＡ２の３’末端とヘリックスＢ２の５’末端の間に整列される。
【０１３７】
第７観点の第６２態様では（これは第５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が区分ヘリックスＡ１および区分ヘリックスＡ２を含んでなる。
【０１３８】
第７観点の第６３態様では（これは第６２態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸の区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して６個のヌクレオチドを含んでなり、そして好ましくは区分ヘリックスＡ１および区分ヘリックスＡ２が互いにハイブリダイズする。
【０１３９】
第７観点の第６４態様では（これは第６２および６３態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＡ１の３’末端と区分ヘリックスＢ１の５’末端との間に、２個のヌクレオチドＮｉを含んでなるヌクレオチド配列が整列され、ここでＮｉが好ましくはＣＡである。
【０１４０】
第７観点の第６５態様では（これは第６２、６３および６４態様の一態様でもある）、ヌクレオチドＡが区分ヘリックスＢ２の３’末端と区分ヘリックスＡ２の５’末端との間に整列される。
【０１４１】
第７観点の第６６態様では（これは第５５〜６５態様の一態様でもある）、区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２が各々の場合で３個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２が互いにハイブリダイズする。
【０１４２】
第７観点の第６７態様では（これは第６６態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸が以下の構造：
【０１４３】
【化６】
0005766750.tif 000007
【０１４４】
ここで
Ｎｉ＝２個のヌクレオチド、好ましくはＣＡ；
Ｎｊ＝２個のヌクレオチド、好ましくはＡＧ；
Ｎｃ＝４個のヌクレオチド、好ましくはＧＡＵＧ；
区分ボックスＡ１およびボックスＡ２が各々の場合で個別に、そして互いに独立して配列ＧＧＧＣＧ、ＧＧＧＵＧおよびＧＧＧＡＧを含んでなる群から選択され；
区分ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２が各々の場合で個別に、そして独立して６個のヌクレオチドを含んでなり、これは好ましくは互いにハイブリダイズし；
区分ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２が各々の場合で個別に、そして独立して５個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＢ１および区分ヘリックスＢ２は互いにハイブリダイズし、そして
区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２が各々の場合で個別に、そして独立して３個のヌクレオチドを含んでなり、ここで好ましくは区分ヘリックスＣ１およびヘリックスＣ２が互いハイブリダイズする、
を有する。
【０１４５】
第７観点の第６８態様では（これは第６７態様の一態様でもある）、ＨＭＧＡ結合核酸は列番号１２を含む群から選択される配列を含んでなる。
【０１４６】
第７観点の第６９態様では（これは第２〜６７態様の一態様でもある）、核酸が転写因子、特にＡＴフックを含んでなる転写因子に結合するものである。
【０１４７】
本発明に従い、目的はＡＴフックを含んでなる転写因子に結合する核酸により第８観点で達成され、ここで核酸は第７観点に従う構造を有する。
【０１４８】
第６観点による組成物の態様では、Ｌ−核酸が第７観点に従う核酸である。
【０１４９】
第１観点に従う使用の態様では、Ｌ−核酸が第７観点に従う核酸である。
【０１５０】
第２観点に従う方法の態様では、Ｌ−核酸が第７観点に従う核酸である。
【０１５１】
第３観点に従う使用の態様では、Ｌ−核酸が第７観点に従う核酸である。
【０１５２】
第４観点に従う方法の態様では、Ｌ−核酸が第７観点に従う核酸である。
【０１５３】
本発明に従い、目的は以下の：
−候補ＨＭＧＡアンタゴニストおよび／または候補ＨＭＧＡアゴニストを準備し、
−第７観点に従う核酸を準備し、
−ＨＭＧＡアンタゴニストおよび／またはＨＭＧＡアゴニストの存在下でシグナルを送達する試験系を準備し、そして
−候補ＨＭＧＡアンタゴニストがＨＭＧＡアンタゴニストであるかどうか、および／または候補ＨＭＧＡアゴニストがＨＭＧＡアゴニストであるかどうかを決定する、
工程を含んでなる、ＨＭＧＡアンタゴニストまたはＨＭＧＡアゴニストのスクリーニング法により第９観点で達成される。
【０１５４】
本発明に従い、目的は以下の：
−相、好ましくは固相に固定化されたＨＭＧＡを準備し、
−第７観点に従う核酸、好ましくは標識された第７観点に従う核酸を準備し、
−候補ＨＭＧＡアゴニストおよび／または候補ＨＭＧＡアンタゴニストを加え、そして
−候補ＨＭＧＡアゴニストがＨＭＧＡアゴニストであるかどうか、および／または候補ＨＭＧＡアンタゴニストがＨＭＧＡアンタゴニストであるかどうかを決定する、
工程を含んでなる、ＨＭＧＡアゴニストおよび／またはＨＭＧＡアンタゴニストのスクリーニング法により第１０観点で達成される。
【０１５５】
第１０観点の一態様では、決定が、核酸が候補ＨＭＧＡアゴニストに置き換えられるか、または候補ＨＭＧＡアンタゴニストに置き換えられるかを試験することにより行われることが構想される。
【０１５６】
本発明に従い、目的は第７観点に従う核酸を含んでなるＨＭＧＡの検出用キットにより第１１観点で達成される。
【０１５７】
本発明に従い、目的は第１０観点に従う方法により得ることができるＨＭＧＡアンタゴニストにより第１２観点により達成される。
【０１５８】
本発明に従い、目的は第１０観点に従う方法により得ることができるＨＭＧＡアゴニストにより第１３観点で達成される。
【０１５９】
本発明に従い、目的はＨＭＧＡタンパク質および第７観点に従う核酸を含んでなる複合体により第１４観点により達成される。
【０１６０】
本発明は従来技術で得た見解とは反対に、細胞内標的分子に接近するために、Ｌ−核酸そして特にシュピーゲルマーを使用することが可能であるという驚くべき結果に基づく。細胞内標的分子は好ましくは、細胞内に存在する標的分子である。しかしながらＬ−核酸の標的分子との相互作用の高い特異性、それと同時にＬ−核酸が生物系、そして特に動物
およびヒトの身体で使用される場合の高い安定性、および毒性または免疫学的に活性な分解産物が不存在であるというようなＬ−ヌクレオチドの構造による機能的Ｌ−核酸に固有の特性は、プラスミドまたは通常にはベクターにコードされるＬ−核酸がインタラマーの場合のように細胞性のメカニズムを正しく利用できるようにせず、すなわち細胞内で起こる転写のプロセスにより実際に機能的な核酸を提供する。
【０１６１】
この不可避なジレンマは、本発明により解決される：機能的Ｌ−核酸そして特にシュピーゲルマーは、それらの標的分子に対するそれらの結合に関するそれらの特異性およびそれらの活性を保持しながら、細胞質膜を介して輸送され得る。この機能的Ｌ−核酸の透過性はシュピーゲルマーに固有であり、そして送達ベヒクルまたは送達技法の使用によりさらに強化することができる。この事柄において、これから具体的になることを望まないが、本発明者は機能的Ｌ−核酸自体が細胞質膜を克服でき、そして細胞質膜の克服におけるエンドソーム輸送メカニズムの参加により、機能的核酸とその標的分子との特異的相互作用を可能にする２次元的または３次元的構造の採用により、それらにより形成される小胞構造からＬ−核酸を遊離することができるという仮定から出発する。本明細書に開示する技術的教示により、細胞内にアプタマーを形成するための、細胞内転写メカニズムを利用するアプタマーのために開発された原理を意図的に回避し、そして機能的Ｌ−核酸、そして特にシュピーゲルマーを細胞内で使用するための手段が初めて提供される。
【０１６２】
好適な態様で本明細書に採用するように、機能的核酸という用語は、構造、特に自然に存在するｒＲＮＡのような構造的核酸とは異なるか、あるいはｍＲＮＡのようなコード核酸とは異なる核酸を表す。特に機能的核酸は、それらの２次元的および／または３次元的構造により標的分子に結合することができる核酸である。特に好適な態様では、標的分子への結合は、ハイブリダイゼーションまたはワトソン−クリック塩基対に基づく塩基対合またはフーグスティーン型塩基対によってではなく起こる。特に好適な機能的核酸はアプタマーおよびシュピーゲルマーである。
【０１６３】
好適な態様では、Ｌ−核酸はＬ−ヌクレオチドから完全に、実質的に、または部分的に合成される核酸である。Ｌ−核酸が完全にＬ−ヌクレオチドからなる場合が特に好ましい。これに関して用語「実質的に」とは、標的分子との相互作用の原因であるＬ−核酸のその部分、または標的分子への結合を媒介するその部分が、Ｌ−ヌクレオチドからなるか、またはこれらから合成される態様を表す。
【０１６４】
本明細書で使用する機能的Ｌ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドから完全に、実質的に、または部分的に合成される機能的核酸である。
【０１６５】
Ｌ−核酸の合成はこの分野の当業者には知られており、そして例えばＮｏｌｔｅ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１１１６−１１１９、１９９６；およびＫｌｕｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４，１１１２−１１１５、１９９６に記載されている。
【０１６６】
アプタマーの生産の基本的方法は、例えばＴｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，５０５−５１０，１９９０；またはＥｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２，１９９０に記載されており、一方シュピーゲルマーの生産の基本的方法は、例えばＮｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１１１６−１１１９，１９９６；またはＫｌｕｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４，１１１２−１１１５，１９９６に記載されている。このようにシュピーゲルマーはＤ−ヌクレオチドの代わりにＬ−ヌクレオチドからなるアプタマーである。アプタマーおよびシュピーゲルマーの生産と関連して、標的分子という用語は、アプタマーおよびシュピーゲルマーを生産するための選択法に使用される分子を表すか、
またはアプタマーまたはシュピーゲルマーにより最終的に結合される分子を表す。
【０１６７】
好適な態様では、細胞内で活性な作用物質は、細胞内に存在する時に分子に結合することができる化学的化合物である。これと関連して、細胞は組織または臓器中で隔離されて存在する細胞である場合が特に好ましいが、好ましくはヒトまたは動物体内ではない。細胞内で活性な作用物質がシュピーゲルマーである場合、好ましくはこれが細胞内の標的分子に結合できるならば細胞内で活性な作用物質である。あるいはシュピーゲルマーはその標的分子に細胞内で存在するような条件下で結合できる場合、細胞内で活性な作用物質である。これらの特性を測定するための試験はこの分野の当業者に知られており、そして例えば実施例１に開示するような細胞内に存在するようなバッファー条件（イオン強度および溶質組成、ｐＨ、温度）下での平衡結合アッセイを含む。
【０１６８】
好適な態様では、Ｌ−核酸、特に機能的Ｌ−核酸の標的分子は細胞内受容体である。本明細書で使用する時、細胞内受容体は好ましくは機能的Ｌ−核酸が相互作用する化学的化合物または化学構造またはそれぞれの一部であり、そして好ましくは機能的Ｌ−核酸が結合する化合物または構造であり、ここで細胞内受容体、すなわち化学的化合物または化学構造またはそれぞれの一部は、先行する段落で好ましくは記載したように細胞内的に存在し、すなわち細胞内に存在する。これと関連して、本発明の範囲内で細胞内受容体は、機能的核酸、特に機能的Ｌ−核酸の作成において標的分子となることが可能である。
【０１６９】
１つの態様では、用語「受容体」は任意の相互作用パートナー、好ましくは機能的核酸の特異的に結合する相互作用パートナーを表し、すなわち特異的空間構造、荷電分布、疎水性分布等を有する機能的核酸と相互作用する相互作用パートナーを表す。特に好適な態様では、相互作用パートナーは機能的核酸の作成で使用されるような、機能的核酸の標的分子に対応する。これと関連して、受容体は機能的核酸の作成に使用される標的分子とは異なることができるが、特異的相互作用は、機能的核酸の作成に使用する相互作用パートナーと標的分子との間の機能的核酸の交差反応性によることは本発明の範囲内である。
【０１７０】
好適な態様では、用語「細胞内受容体」は細胞に存在する受容体、または細胞に存在することができる受容体を表し、これは細胞内の自然な状況下で存在するか、またはそのような状況下で細胞に存在する。これと関連して、細胞は組織または臓器中で隔離されて存在する細胞である場合が特に好ましいが、好ましくはヒトまたは動物体内ではない。しかし本明細書で使用する用語「細胞内受容体」は、細胞内に存在するような条件下で存在する受容体も指す。
【０１７１】
好適な態様では、用語「細胞」は原核細胞および真核細胞を含んでなる群から選択される細胞を表す。好ましくは真核細胞は真菌細胞、植物細胞、動物細胞およびヒト細胞を含んでなる群から選択される。別の態様では、細胞という用語は一般に本明細書ではリン脂質二重膜により境界をつけられる区画を表し、これは好適な態様では細胞質膜に対応し、そしてこれは周囲から膜により分けられている。これと関連してこの周囲からの分離は完全な分離ではないが、細胞と周囲との間のエネルギー移動および物質移動（物質交換）を可能とする。物質移動は制限されることが好ましい。細胞が周囲から細胞質膜により、または細胞膜に類似する膜により分離される場合、物質移動の制限は膜の輸送特性により定められる。１つの態様において、本明細書の細胞という用語は、このように本明細書で定めるような原核または真核細胞の小胞および／または区画も含み、これは次に原核または真核細胞の両方に存在するか、または存在することができ、ならびにそのような原核または真核細胞の外側に、例えば小胞または細胞質膜により囲まれた原核または真核細胞の一部として存在してよく、これは１つの態様では体液中に存在することができる。好適な態様では、第２の選択的態様により細胞において、そのような細胞内の条件は、原核または真核細胞中に存在する条件に実質的に匹敵すると認識され、特に機能的核酸のその標的分
子への結合に影響を及ぼす因子についてはそうである。
【０１７２】
好適な態様では、体液は血液、尿、分泌液（解剖学的流体）、リンパ液、血清、血漿、膣分泌物、唾液および精子を含んでなる群から選択される。
【０１７３】
１つの態様では、受容体は細胞中でのその機能により定められる。したがって受容体は分子受容体、酵素、代謝中間体、シグナルペプチド、シャペロン分子、および例えばリボソーム、ミトコンドリアのような細胞内構造、例えばチューブリンおよびアクチンフィラメントのような細胞骨格の要素、エンドソーム粒子、リソソーム、小胞、特に細胞内小胞のような他の細胞内構造を含んでなる群から選択され得る。本明細書で使用する分子受容体という用語は、好適な態様では、情報を受け、そしてこれを細胞、組織、臓器または生物内に伝達する分子を表す。情報は典型的には分子受容体と相互作用する分子により媒介される。相互作用の結果として、分子受容体はシグナルを生成することができる。そのようなシグナルは受容体のコンファメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）および／または活性の変化に基づくことができ、またはその中に現れることができる。シグナル自体は、受けた、またはそれにより処理した情報を別の形態に伝達することができる。分子受容体のコンファメーションまたは活性の変化の結果として、シグナルは好ましくは化学的、生物学的または電気的シグナルであることができる。好ましくは分子受容体は反応カスケードの一部であり、そしてさらに好ましくはシグナルカスケードの一部である。分子受容体により伝達される情報は、定量的かつ／または定量的情報、例えば化合物の存在および／またはその濃度に関する情報であることができる。
【０１７４】
好適な態様では、用語「代謝中間体」は、細胞中での代謝的活性により異化ならびに同化の成分として存在するそれらすべての化合物を表す。
【０１７５】
さらなる態様では、受容体はその化学的性質により定められる。好ましくは受容体はポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質およびその組み合わせを含んでなる群から選択される。本明細書で使用するように、ポリペプチドという用語は、好ましくは２以上のアミノ酸からなる任意のポリマーを表す。好ましくはアミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸も態様の範囲内で使用してよい。本明細書で使用する用語「核酸」は、好ましくはこの分野の当業者には知られている２以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のポリマーを表し、ここでヌクレオチドはＤ−ヌクレオチドまたはＬ−ヌクレオチドまたはその混合物である。好適な組み合わせにはグリコシル化ポリペプチドおよびグリコシル化脂質がある。
【０１７６】
細胞内受容体の特定の群は、ＡＴフックを結合する転写因子およびＤＮＡ結合タンパク質である。転写因子の例を以下の表１に与える：
【０１７７】
【表１】
0005766750.tif 000008
【０１７８】
【表２】
0005766750.tif 000009
【０１７９】
【表３】
0005766750.tif 000010
【０１８０】
【表４】
0005766750.tif 000011
【０１８１】
【表５】
0005766750.tif 000012
【０１８２】
【表６】
0005766750.tif 000013
【０１８３】
【表７】
0005766750.tif 000014
【０１８４】
【表８】
0005766750.tif 000015
【０１８５】
【表９】
0005766750.tif 000016
【０１８６】
細胞内受容体のさらなる群は、以下の表２に掲げる細胞内標的分子である。
【０１８７】
【表１０】
0005766750.tif 000017
【０１８８】
【表１１】
0005766750.tif 000018
【０１８９】
【表１２】
0005766750.tif 000019
【０１９０】
さらに特に好適な細胞内受容体群は、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／００７１６号明細書に記載されているようなＨＭＧタンパク質、特にＨＭＧＡタンパク質である。本明細書で使用する用語、ＨＭＧＡタンパク質は好ましくは以下のタンパク質全体を表す：ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２。
【０１９１】
ＨＭＧＡタンパク質はモジュラー構造を有し、そして各々が３つのＤＮＡ結合ドメインを含んでなり、これらは“ＡＴフック”と呼ばれ、そして図２においてＤＢＤ１〜ＤＢＤ３として表され、ならびに大変酸性のＣ−末端領域を含んでなる。本分野の当業者には“ＡＴフック”の１つに結合するアンタゴニストがＨＭＧＡ１タンパク質およびこの２つのスプライスバリアントＨＭＧＡ１ＡおよびＨＭＧＡ１Ｂを認識するだけでなく（図２参照）、ＨＭＧＡ２のような類似のＤＮＡ−結合分子とも交差反応性を表すことが明白である。ＨＭＧＡ２とは別に、多くのさらなるタンパク質も”ＡＴフック”に類似する配列を有し、そして各々の場合でさらなる受容体を形成する。そのようなタンパク質をとりわけ表３に掲げる：
【０１９２】
【表１３】
0005766750.tif 000020
【０１９３】
【表１４】
0005766750.tif 000021
【０１９４】
この背景に対して、本発明はまたＬ−核酸、そして特にシュピーゲルマーにも関し、これらは表１〜３に挙げた任意の標的分子に向けられている。
【０１９５】
Ｌ−核酸は細胞内で活性な作用物質として特に細胞内のそこで細胞内受容体に結合するために使用されるので、細胞内受容体とその相互作用パートナーとの間の相互作用の様々な細胞の形態が影響を受け得る。細胞内受容体の相互作用パートナーの型に依存して、Ｌ−核酸の細胞内的使用は、このようなタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、またはタンパク質、核酸、脂質、炭水化物と互いの組み合わせ、および互いの間で相互作用の影響を受けることができるようにする。
【０１９６】
細胞内的な作用物質および細胞内受容体に結合する方法としてＬ−核酸、特にシュピーゲルマーの本発明による使用との関連では、これは好ましくはインビトロの応用、そしてインビトロの方法に関連することに注目すべきである。
【０１９７】
疾患の処置および／または防止のための薬剤の生産に、および／または診断目的のための薬剤の生産に、Ｌ−核酸、特にシュピーゲルマーの本発明による使用と関連して、標的分子は細胞内標的分子である。これと関連して、細胞内標的分子は防止、処置または診断されるべき疾患または病気に原因として、または原因としてではなく関与するものであるが、いかなる場合でも標的分子に特異的に結合するそのＬ−核酸への結合は、薬剤の場合
に疾患が軽減され、防止され、または治癒され、および／または診断薬の場合は疾患またはそれらに対する素因が確立されるか、または診断され得ることを意味する。本明細書で使用するように、診断の概念には、早期診断ならびにその後の診断、特に例えば疾患の進行または疾患の段階を追跡または測定するための診断または調査を含む。標的分子は本明細書に記載するような細胞内受容体、特に転写因子、細胞内標的分子またはＨＭＧタンパク質であることが本発明の範囲内である。本発明の範囲内で、標的分子が細胞内に存在し（すなわち細胞内）、そして疾患および／または診断に影響を有する相互作用がＬ−核酸、そして特にシュピーゲルマーと標的分子、すなわち受容体との間で細胞内で起こることが最も特別に好適である。また標的分子が細胞の外側に存在し、そしてＬ−核酸、そして特にシュピーゲルマーと標的分子、すなわち受容体との間の相互細胞が細胞外で起こることも本発明の範囲内である。
【０１９８】
核酸が細胞内標的分子に向けられているＬ−核酸を使用して生産した薬剤の使用するための適応症は、適応症が基づく各々の病原的メカニズムにおいて、細胞内標的分子の関与から当業者の見識に従う。すなわち例えばＨＭＧＡタンパク質は、これらが癌腫（とりわけ胸部、肺、皮膚、甲状腺）ならびに白血病およびリンパ腫および他の悪性腫瘍、中でも肉腫（横紋筋肉腫、骨肉腫）に関与していることが知られている。またＨＭＧＡタンパク質は、とりわけ過誤腫（胸部および肺）、脂肪組織腫瘍（脂肪腫）、唾液腺の多態性腺癌、子宮平滑筋腫、血管粘液腫、胸部の線維腺腫、子宮内膜のポリープおよびアテローム硬化性斑を含む多くの種類の間葉腫瘍で発現される。ＨＭＧＡは興味深い治療薬である。ＨＭＧＡの遮断は、癌を制御し、そしてその転移性の広がりを防止するための適切な出発点となり得る。本明細書に詳細に記載するように、ＨＭＧＡタンパク質に向けられたＬ−核酸は、多数のウイルス遺伝子の転写の調節におけるＨＭＧＡタンパク質の関与、または新内膜、脈管平滑筋細胞、マクロファージおよび新血管に関連するアテローム硬化症により影響を受ける組織におけるＨＭＧＡ、そして特にＨＭＧＡ１の顕著な発現により、ウイルス性疾患およびアテローム硬化症の診断および／または処置にも適切である。
【０１９９】
驚くべきことに本発明者により見いだされたのだが、核酸、好ましくはＬ−核酸そして特にシュピーゲルマーは、それ自体が細胞質膜のようなリン脂質二重膜を貫通し、そして細胞内受容体との特異的相互作用という意味で細胞内で機能的になることができるので、Ｌ−核酸の浸潤の効力は影響を受け、そして特に種々の技術の使用により強化することができる。これらの技術には化学的化合物または分子の使用、ならびに物理的手段の使用を含む。種類にかかわらず、これらの技術は本明細書では一般に送達ベヒクルを指す。本発明の範囲内で、本発明者は同様にアプタマーもこの特性を現し、そしてシュピーゲルマーのように基本的に同じ目的、応用および用途のために本発明による組成物と一緒に関連させて同様に使用することができることを確立した。
【０２００】
化学的化合物および分子の使用において、さらなる相違は送達するために核酸が修飾される必要があるかどうかである。送達ベヒクルを使用する目的のための修飾は、一般に送達ベヒクルが例えばリポソームの場合のような小胞、ポリペプチドベヒクル、シクロデキストリン、デンドリマー、ナノ粒子およびミクロ粒子、そしてまたポリエチレンイミンであるか、それを含む場合、必要ではない。一方、送達ベヒクルを使用する目的のための修飾は、送達ベヒクルが受容体媒介型のエンドサイトーシス、膜融合（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペプチド、シグナルペプチドまたは親油性コンジュゲートを使用する場合、通常、必要である。物理的技術の群には特に電気穿孔およびイオン導入法がある。化合物を細胞質膜のようなリン脂質二重膜を通して輸送するためのさらなる技術は、この分野の当業者には知られており、これは原理的には例えばアプタマーおよび／またはシュピーゲルマーのような機能的核酸の輸送にも適すると認識されるだろう。
【０２０１】
本発明のさまざまな観点の範囲内で使用できる個々の送達ベヒクルを、これからさらに
詳細に記載する。
【０２０２】
リポソームは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムサルフェート（ＤＯＴＡＰ）のような人工的カチオン性脂質からなり、ここでカチオン性基は負に荷電した核酸と相互作用し、そしてそれらの負電荷を中和する。輸送はエンドサイトーシス（ＰＮＡＳ，９３：１１４９３−１１４９８，１９９６）を介して起こる。しかしカチオン性リポソームは細胞障害性であり、特により高濃度ではそうであり、これはそれらのインビトロおよびインビボでの使用を制限する（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９７：８１８，１９９３；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１３７２：５５−６８，１９９８）。一方、両親媒性のピリジニウムに基づく脂質であるＳＡＩＮＴ−２は、非毒性製剤である（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９：２０７９−２０８７，２００１）。またｐＨ感受性リポソームも可能な選択であり、これはコレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような両親媒性分子からなる（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２９７：１１２９−１１３６，２００１）。リポソームの広く様々な製剤をＤａｓｓ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉによる総説文献に見いだすことができる（薬剤送達（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ），９：１６９−１８０，２００２；Ｎａｔ  Ｒｅｖ
Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ，４：１４５−１６０，２００５）。
【０２０３】
受容体媒介型のエンドサイトーシス（ＲＭＥ）を用いて、細胞膜にすでに存在する輸送メカニズムが利用される。このために、核酸は例えばポリ−Ｌ−リシン（ＰＰＬ）リンカーを介して輸送体タンパク質に共有的にカップリングされる（「担体タンパク質」）。これに関連して輸送体タンパク質の選択は、細胞膜の特異的受容体に結合し、そしてエンドサイトーシスにより細胞内に蓄積する能力に依存する。このように細胞特異的輸送は実現され得る。例えばｃ−ｍｙｃに向けられたアンチセンスホスホロチオエートは、Ｍ−１４ヒトメラノーマ細胞に導入できた（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１７：２９−３５，１９９７）。しかしＲＭＥによる効果的輸送は、この場合リガンドに対する受容体の親和性に依存するだけではなく、特にインビボでは細胞に関して選択された受容体の制限にも依存する。さらに選択したリガンドは輸送ベヒクルにあり得る毒性を回避するために、不活性であるか、または治療的成果に関して強化された効果を持たなければならない。このように、選択および選択した受容体のインビボでの偏在的広がりは、成功裏のＲＭＥに基づく輸送に決定的である。さらにエンドソーム区画で核酸の封鎖がＲＭＥに基づく輸送で観察され、これはこの方法を細胞内輸送または細胞内放出もしくは送達のためのそれほど有望ではない方法にすると思われる。すべての中で最も重要であるのは、一方またはもう一方の機能が、受容体と核酸との間のカップリングを減少しないように選択されなければならない点である（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９２（８）：１５５９−１５７３，２００３）。
【０２０４】
フューゾジェニックペプチドは、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが細胞膜と融合し、そしてこれが細胞中への輸送を行うことを可能とするために使用された（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，９：４６６−４７５，１９９８；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，６：４３−５３，１９９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：２７３０−２７３６，１９９７）。
【０２０５】
細胞質ゾルから核への核タンパク質の選択された輸送は、短いペプチド配列により媒介され、これは核局在化シグナル（ＮＬＳ）と呼ばれている。すなわち種々のＮＬＳペプチド誘導体が核酸を核に輸送するために使用され得る（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，１０：１００５−１０１２，１９９９；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，１０：５９８−６
０６，１９９９；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，６：１０１−１０８，１９９５）。さらにいわゆるシグナル輸送ペプチド（ＩＰ）もあり、これらは核酸の細胞性の取り込みを促進することができ、そして例えばカポジの繊維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）から誘導することができた（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，４４：３５−４９，２０００）。
【０２０６】
ウイルスキャプシドに類似する小胞は、ポリペプチドのブロックにより形成することができ、これは細胞内輸送のための可能な輸送ベヒクルとして役立つことができる（Ｎａｔ
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，３（４）：２４４−８，２００４）。
【０２０７】
オリゴヌクレオチドの親水性特徴、およびアニオン性のホスホジエステル骨格は、細胞の透過を下げる。したがって親油性コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドがリポタンパク質へ結合する能力を増し、これにより細胞内への送達を改善する１つの可能な方法である。最も広く調査されてきたコンジュゲートはコレステロールである（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２：１０３−１２８，２００２）。
【０２０８】
シクロデキストリンは環式オリゴ糖であり、これは中心の疎水性空洞および外面に多数のヒドロキシル基を有する。したがってシクロデキストリンはすでにヒトＴ細胞株にアンチセンスオリゴヌクレオチドを輸送するために使用され（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ，５：１８５−１９２，１９９５）、そしてまた免疫原性ＣｐＧ配列の細胞内輸送に、および細胞内放出もしくは送達にインビボでも使用された（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５２：１５３７−１５４４，１９９６）。シクロデキストリンの広い様々な製剤がＤａｖｉｓ  ｕｎｄ  Ｂｒｅｗｓｔｅｒによる総説文献で与えられている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ３：１０２３−１０３５，２００４）。
【０２０９】
デンドリマーは高度に分枝した高分子であり、これらは典型的にはポリアミドの反復単位からなる。分子はそれらの表面上に１級アミノ基のような官能基を持ち、これらは静電的相互作用により他の分子と相互作用する。複雑な構造の形成はこのように迅速かつ高度に再現性のある様式で起こり、これが低い細胞傷害性の複合体を導く（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８：４２２５−４２３１，２０００；Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７：３６０６−３６１２，２００１）。
【０２１０】
シアンアクリレートナノ粒子は、１９９０年代の初期からオリゴヌクレオチドの放出または送達に関して試験されてきた。オリゴヌクレオチドとナノ粒子との相互作用は、オリゴヌクレオチドのアニオン性電荷と種々の疎水性カチオン、特に荷電したナノ粒子とのイオン対を介して起こる。ポリイソヘキシルシアノアクリレート（ＰＩＨＣＡ）、ポリイソブチルシアノアクリレート（ＰＩＢＣＡ）またはポリヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）はナノ粒子の形成に一般的に使用されているが、多数の親油性カチオン−オリゴヌクレオチド対も試験されてきた（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，１：１３７０−１３７８，１９９４；ＰＮＡＳ，９１：１０４６０−１０４６４，１９９４；Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，９：４４１−４４９，１９９２）。またナノ粒子はインビボでの使用にすでに採用されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２７９：４０１−４０６，２０００；Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１３：３８−４３，１９９６）。
【０２１１】
ミクロ粒子またはいわゆる微小球は、典型的にはポリ（ｄ，１−ラクチド−コ−グリコライド）［Ｐ（ＬＡ−ＧＡ）］のような生分解性ポリマーから形成され、そしてオリゴヌクレオチドの遅延型放出に使用される（Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９１：７９０−７９９；２０００；Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６９：１９７−２０７，２０
００；Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５：２９１−３０２，１９９８）。
【０２１２】
電気穿孔は、脂質二重膜を不安定化するために強い電場を使用し、そしてこれにより細胞膜を透過性とし、そしてこれが投与されるべき物質の細胞への輸送を行う輸送技術であり、物質はまたイオン化形態で存在することもできる（イオン導入法）。電気穿孔はオリゴヌクレオチドの経皮的輸送をエクスビボならびにインビボで行うためにもすでに成功裏に使用された（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，１８４；１４７−１５６，１９９９；Ｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒａｇｅｔ，５：２７５−２８９，１９９８；Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１５：１５９６−１６０２，１９９８；Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，８５：２６０−２６６，２０００；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２１２：２８６−２９２，１９９５；Ｂｌｏｏｄ，８８：７３１−７４１，１９９６）。
【０２１３】
「裸」のオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みは、高圧の使用によりインビトロおよびエクスビボで改善することができる。この技術を使用するために閉鎖系の必要性は、これがエクスビボの応用にのみ使用できることを意味する（ＰＮＡＳ，９６：６４１１−６４１６，１９９９；Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１０：２３５５−２６６４，１９９９）。
【０２１４】
またショク波、聴音性高圧パルスの使用は、オリゴヌクレオチドの細胞への輸送をを行う（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，７９：３０６−３１３，２００１：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５８：２１９−２２１，１９９８）。超音波はショク波に匹敵する聴音性技術であるが、より高い周波数（ＨｚのかわりにＭＨｚ）およびより短い適応時間（秒から分）を使用し、そしてすでに遺伝子治療技術を支持する役割で使用されてきた（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，７：１３３９−１３４６，１９９６；Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ，３２：７２３−７２７，１９９７；Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏ，２５：１４５１−１４５７，１９９９）。
【０２１５】
本発明のさらなる観点では、新規送達ベヒクルが提供され、これはアプタマーのような特に機能的核酸、好ましくは機能的Ｌ−核酸、そして最も特に好ましくはシュピーゲルマーの輸送に適している。送達ベヒクルはこの場合、ポリエチレンイミンに基づくミセル様またはリポソーム様構造である。以下の記載において特別となることを望まないが、本発明者は核酸がミセル様またはリポソーム様の構造中に包埋または含まれているという仮定から出発する。ポリエチレンイミンは原理的には直線状または分岐ポリエチレンイミンとして存在し、そしてまた使用されることができ、分岐した状態のポリエチレンイミンが特に好適である。さらにポリエチレンイミンは高分子量または低分子量ポリエチレンイミンとしても存在し、そしてまた使用されることができる。好ましくは高分子量ポリエチレンイミンは約８００ｋＤａの分子量を有し、そして低分子量ポリエチレンイミンは約３ｋＤａの分子量を有する。本発明の範囲内で、約２５ｋＤａの平均分子量を有するポリエチレンイミンが好適であり、約２５ｋＤａの分子量を有する分岐ポリエチレンイミンが特に好適である。
【０２１６】
効果的な手段に必須ではないが、それでも本発明による送達ベヒクルにおいて、送達される核酸自体が修飾を有すれば好適である。これと関連して、修飾がＰＥＧ残基を含んでなる群から選択されるならば好適である。さらにＰＥＧ残基が約１００〜１００００Ｄａ、好ましくは約１２００〜５０００Ｄａ、さらに好ましくは約１５００〜２５００Ｄａ、そして最も特別に好ましくは約２０００Ｄａの分子量を有する場合、好適である。
【０２１７】
核酸を送達ベヒクルと混合して本発明の組成物を生成する場合、送達ベヒクルにを介して、またはそれに包装されて送達される核酸のリン酸基の総数に対するポリエチレンイミンの窒素基の総数の比は、約１〜２０、好ましくは約１．５〜１０、より好ましくは２〜
５、そして最も特に好ましくは約２〜３に調整される。
【０２１８】
本発明による送達ベヒクルはこのように荷電した粒子または試薬との縮合またはパッキング、および複合体全体の荷電の随伴する変化を介して、核酸の細胞内輸送のメカニズムがアプタマーのような機能的核酸、そして特にシュピーゲルマーのようなＬ−核酸にも使用できるようにする。この複合体はエンドサイトーシスを介して容易に取り込まれ、そしてこれにより細胞の細胞質ゾルを通過する。この方法の欠点は、ＤＮＡ／ＲＮＡの安定性およびエンドソーム区画から核酸の放出である。細胞の細胞質ゾルでは、プロテアーゼまたはヌクレアーゼの導入により、そして区画のプロトン化により強固に収縮したエンドソームからリソソームが迅速に形成される。そこでヌクレアーゼは核酸を分解する。しかしシュピーゲルマーの非天然の立体配置によりヌクレアーゼ−安定性であるために、これはシュピーゲルマーには適応されない。また核酸はリソソームの酸性環境では安定ではない。しかしこれはＤＮＡから合成された核酸にさらによくあてはまり、ＲＮＡからの核酸にはそれほどあてはまらない。複合体全体がエキソサイトーシスにより再び迅速に細胞から輸出され、そしてゴルジ装置内で分解され、したがってわずかな核酸だけが細胞を通過する。適切なトランスフェクション系が克服しなければならない１つの困難は、この安定化ならびにエンドソームから細胞質ゾルへの核酸の放出である。安定性に関しては、ＲＮＡシュピーゲルマーは酵素により分解されないエナンチオマーであるので、真核細胞のトランスフェクションに理想的な特性を有する。
【０２１９】
本発明によるＬ−核酸の使用、そして特に本発明による組成物と関連しての使用は、Ｌ−核酸の作用機作が触媒的な取り組みではなく、わずか２、３の分子の細胞内放出が所望の効果を達成するためにすでに十分である化学量論的取り組みに基づくので、このクラスの活性物質に特に重要である。この程度で、本発明は従来技術の技法によりこれまでに満たされなかった必要性を満たす。
【０２２０】
本発明による送達ベヒクルにより提供され、そして作り上げられたトランスフェクション系は、核酸および分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）からのミセルの形成に基づく。核酸のホスホジエステル骨格は、ＰＥＩの遊離窒素位と相互作用し、そして架橋結合を介して小さいミセルを形成し、これはＰＥＩにより正電荷を有する。これらのミセルは形質膜の収縮により細胞からエンドソームとして容易に取り込まれる。ここで今ＰＥＩは流入するプロトンを緩衝し、この結果、エンドソーム内部の多くのクロライドイオンが浸透圧により区画の膨潤を導く。このＰＥＩの効果はプロトンスポンジ効果として文献に記載され、そして最終的にはエンドソームの崩壊およびシュピーゲルマーの細胞質ゾルへの放出を導く。（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２２（３）：３７３−８０，２００５；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８３（３）：９７−１１１，２００４；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９（２４）：１７００−７，２００２）。
【０２２１】
本発明の組成物をエーロゾルとして適用することは本発明の範囲内である。
【０２２２】
加えて、シュピーゲルマーは細胞内ならびに核内送達のために、そしてまた臓器−特異的送達のためにシグナルペプチドで誘導化することができる。シグナルペプチドのポリエチレンイミンへの直接的なカップリングは、臓器内または細胞中の標的化された局在化に使用することができる。
【０２２３】
さらに別の観点では、本発明はＬ−核酸、特にシュピーゲルマー、そしてより好ましくはＲＮＡシュピーゲルマーに関し、これらはＨＭＧＡタンパク質に向けられている。ＨＭＧＡタンパク質に向けられた本明細書に開示するシュピーゲルマーは、Ｌ−核酸そして特にシュピーゲルマーが細胞のリン脂質二重膜または細胞形質膜を克服でき、そしてそれらが選択された特異的結合のために、細胞内で細胞内受容体と結合するということと同様に
本発明を形成する知識の特定の例である。ＨＭＧＡタンパク質およびそれに向けられたＬ−核酸の立体配置に関して、Ｌ−核酸の細胞内使用について本明細書で言及するコメントは、本発明のこの観点と関連しても応用し（そしてその逆にも応用する）、そして不必要な反復を回避するためにここもこの点に原因があるとみなす。
【０２２４】
ＤＮＡに結合するホスホタンパク質のＨＭＧ（高い運動性の群）ファミリーは、哺乳動物細胞全体にクロマチンの非ヒストン成分として存在する（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ
ａｌ．，１９９４）。塩基性ＨＭＧタンパク質は、３つの異なるファミリー−ＨＭＧＢ（正式にはＨＭＧ−１／−２）、ＨＭＧＮ（正式にはＨＭＧ−１４／−１７）およびＨＭＧＡファミリーは、（正式にはＨＭＧ−Ｉ／Ｙ／Ｃ）に細分類される。各ＨＭＧファミリーは、その特徴的な機能的配列モチーフを有する：「ＨＭＧボックス」（ＨＭＧＢファミリー）、「ヌクレオソーム結合ドメイン」（ＨＭＧＮファミリー）、および「ＡＴフック」（ＨＭＧＡファミリー）。
【０２２５】
現状の知識に従い、ＨＭＧＡファミリーは２つの遺伝子、ＨＭＧＡ１およびＨＭＧＡ２を含んでなる。３つの異なるタンパク質はＨＭＧＡ１による選択的スプライシングにより発現され得るが（ＨＭＧＡ１ａ［正式には：ＨＭＧ−Ｉ］、ＨＭＧＡ１ｂ［正式には：ＨＭＧ−Ｙ］、ＨＭＧＡ１ｃ［正式には：ＨＭＧ−Ｉ／Ｒ］）、一つのタンパク質（ＨＭＧＡ２［正式には：ＨＭＧＩ−Ｃ］）だけがＨＭＧＡ２により発現され得る。ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂおよびＨＭＧＡ２は約１００アミノ酸長のポリペプチドであり、そしてモジュラー配列組織を有する：それらは３つの強い塩基性領域（「ＡＴフック」）を有し、これらは２重鎖ＡＴ−リッチＤＮＡの狭く小さい溝に結合する（Ｒｅｅｖｅｓ  ＆  Ｎｉｓｓｅｎ  １９９０）。一方、Ｃ−末端は多くの酸性アミノ酸を有する。タンパク質は溶液中、遊離している場合に安定な２次構造を持たず、そしてそれらはＤＮＡまたは他のタンパク質との複合体で存在する場合に定めた立体配置を選択するだけである（Ｈｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）。ＨＭＧＡタンパク質は哺乳動物の細胞核中で最も強力に修飾されたタンパク質に属し、そしてリン酸化され、アセチル化され、そしてメチル化される（Ｒｅｅｖｅｓ  ＆  Ｂｅｃｋｅｒｂａｕｅｒ  ２００１）。
【０２２６】
ＨＭＧＡタンパク質自体は転写活性を持たないが、いわゆる構成的な（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｏｎｉｃ）転写因子であり、それらはそれらのタンパク質−タンパク質およびタンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して核タンパク質−ＤＮＡ転写複合体の形成を組織する（Ｗｏｌｆｆｅ  １９９４）。それらはこのように多数の遺伝子の発現に調節活性化または阻害の影響を発揮する。正の調節の最も顕著な例は、ＩＦＮ−βの調節におけるＨＭＧＡ１の関与である（Ｔｈａｎｏｓ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９９２）。すなわち例えばＩＦＮ−βプロモーターの場合、ＨＭＧＡ１ｂがＮＦ−κＢおよびＡＴＦ−２のＤＮＡ二重ヘリックスへの結合を刺激し、そして同時にＤＮＡ構造をＮＦ−κＢおよびＡＴＦ−２が互いに、そして恐らくは転写機構の残りとも相互作用できるように改変する（Ｔｈａｎｏｓ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ  １９９２，Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）。アテローム硬化症の病原と関連して、さらなる転写活性化効果はＨＭＧＡ１により誘導されるＣＤ４４遺伝子調節である（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）。ＣＤ４４は細胞表面の糖タンパク質であり、そして内皮損傷後の平滑筋細胞の移動および増殖に関与している（Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９６，Ｃｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。ＣＤ４４の転写調節は、ＣＤ４４プロモーター内のｃ−Ｆｏｓおよびｃ−ＪｕｎのＡＰ−１結合部位への結合により誘導され、そしてＨＭＧＡ１の結合により強化される。ラットでの調査は、ＣＤ４４の過剰発現により、平滑筋細胞の強化された集合があり、これはアテローム硬化性損傷の形成に直接的な影響を有する（Ｐｅｌｌａｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９９；Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；２０００）。
【０２２７】
染色体バンド６ｐ２１．３に局在するＨＭＧＡ１遺伝子、および領域１２ｑ１４−１５
に局在するＨＭＧＡ２遺伝子の発現に関する調査では、これらが主に細胞分化のプロセスで活性であることが示された。したがってこれら遺伝子の強い発現は、胚の発生中および未分化細胞（Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）ならびに増殖因子が刺激する細胞（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９３；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９０；Ｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９５；Ｈｏｌｔｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）に見いだすことができる。成体の分化した組織では、ＨＭＧＡ１は網膜でのみ強力に発現し、一方、ＨＭＧＡ２はすべての他の組織中で見いだされず、そしてＨＭＧＡ１は大変低濃度で見いだされるだけである（Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９１；Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ  １９９６；Ｒｏｇａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ  １９９６；Ｚｈｏｕ
ｅｔ  ａｌ  １９９５；Ｃｈａｕ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）。分化した正常組織中のＨＭＧＡタンパク質の再活性化発現は、脂肪細胞の成長および分化を伴う時期（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  １９９５；Ａｎａｎｄ  ＆  Ｃｈａｄａ  ２０００；Ｍｅｌｉｌｌｏ  ｅｔ
ａｌ  ２００１）、脈管損傷後の血管の平滑筋細胞の増殖（Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）、炎症反応における免疫応答（Ｐｅｌｌａｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）、ならびにアポトーシスプロセス（Ｄｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ  ２００１；Ｓｇａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）と同時である。これと関連してＨＭＧＡ１の量は、細胞の増殖速度に依存して変動する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）。
【０２２８】
胚発生の過程で、ＨＭＧＡ１発現は外胚葉、中胚葉または内胚葉起源の特異的臓器で濃縮され、一方、ＨＭＧＡ２は間葉組織に限定されている。現在まで、ＨＭＧＡ１ノックアウトマウスの表現型に関する情報は存在せず、これは恐らくこの因子の欠損が胚の発生を大変深刻に損傷したからであろう。一方、ＨＭＧＡ２ノックアウトマウスは少人症を現し、そして特に少ない脂肪組織を有し（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）、そしてさらに食事が誘導する肥満に抵抗する（Ａｎａｎｄ  ＆  Ｃｈａｄａ  ２０００）。
【０２２９】
最後にＨＭＧＡ２およびＨＭＧＡ１ｂ発現は正常マウスの脂肪組織中で検出可能ではないが、太ったまたは糖尿病マウスの脂肪で劇的に増加し（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２００４）、これは脂肪過多／肥満症とＨＭＧＡ発現との間の関連を指摘する。
【０２３０】
ＨＭＧＡ１の過剰発現は特に：
・  細胞サイクルおよびｃｄｃ２５Ａのような増殖レギュレーター
・  サイトケラチン１型のような中期フィラメントマーカー
・  ＴＲＡＲ１５のようなアポトーシスレギュレーター
・  発癌遺伝子およびＭＥＴのような腫瘍抑制遺伝子
・  ＤＮＡ修復およびＤＮａｓｅ  Ｘのような組換えに関する遺伝子
・  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５のような細胞運命および発生レギュレーター
・  ＦＧＦＲ１のような受容体
・  コラーゲン１型のような細胞接着、運動性および浸襲遺伝子
・  ＦＧＦＲ２のような新脈管形成レギュレーター
・  ＭＭＰ−１６のような浸襲レギュレーター
・  Ｒｈｏファミリーの小ＧＴＰａｓｅおよびＲｈｏＣのようなそれらのレギュレーター・  カドヘリン１２のような細胞−細胞相互作用遺伝子
・  増殖因子およびＩＬ−１１のようなサイトカイン
に影響する（Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。
【０２３１】
したがってＨＭＧＡ１の異常な調節は、遺伝子発現の一般的改変を導き、そしてそれにより形質転換した、かつ／または転移性の表現型の形成に十分に寄与する。
【０２３２】
ＨＭＧＡタンパク質は間葉および上皮腫瘍で異なる役割を果たすと思われる：悪性の上皮腫瘍では、ＨＭＧＡ発現はむしろ発癌の後期段階に関連し、一方、良性腫瘍は（より頻
繁に間葉腫瘍に転換することはめったにない）、すでに早期に過形成中でＨＭＧＡを発現する。これは異なる胚起源の組織中でＨＭＧＡタンパク質が異なる機能を満たすという事実を指摘し、これからまた、今後さらに詳細に具体的に説明されるように、対応する疾患の診断および／または処置における本発明によるＬ−核酸の対応する用途が直接的に追随する。
【０２３３】
種々のヒトおよび動物の新生物中のＨＭＧＡ１の発現を動物モデルで調査した。ＨＭＧＡ１の役割は、腫瘍形成（Ｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００３；Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）ならびに新生物の進行（Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９１；Ｎｅｓｔｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００１；Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）の動物モデルにおいて証明された。
【０２３４】
ＨＭＧＡ１遺伝子の上昇した発現が、以下の癌腫で示された
・  前立腺（Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９１；Ｔａｍｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ
１９９６，Ｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００３；Ｎｅｓｔｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）・  膵臓（Ｎｅｓｔｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００１；Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０００，２００２；Ｔａｒｂｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）
・  甲状腺（Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ  １９９８，１９９５）
・  頸部（Ｂａｎｄｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）
・  胃（Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）
・  胸部（Ｈｏｌｔｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００３；Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００１；Ｎｅｓｔｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００１；Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９３；Ｄｏｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）
・  結腸／直腸（Ｆｅｄｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９６；Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９９；Ｃｈｉａｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）
・  卵巣（Ｍａｓｃｉｕｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）
・  
およびさらに
・  神経芽腫（Ｇｉａｎｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０００；１９９９）ならびに
・  リンパ腫（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ  ２０００ａ；ｂ）。
【０２３５】
腫瘍の病原および転移のプロセスにおけるＨＭＧＡ１遺伝子の増加した発現および役割の正確な理由は、未だに完全に解明されていない。しかし様々な実験で、予後マーカーとして各腫瘍によるＨＭＧＡ１発現の強度が、その転移の潜在性と相関し、そしてこれは悪性の形質転換した細胞の独自な特徴を表すことを示す（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ
１９８７）。
【０２３６】
さらにＨＭＧＡ１に関連する（この場合、良性、間葉腫瘍）腫瘍は、染色体のＨＭＧＡ１領域６ｐ２１．３での染色体の変化が特徴である。そのような異常型はこれまでに中でも以下で記載された
・  子宮平滑筋腫（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ  １９８８；Ｏｚｉｓｉｋ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）
・  脂肪腫（Ｓｒｅｅｋａｎｔａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）
・  子宮内膜ポリープ（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９２；Ｄａｌ  Ｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）ならびに
・  肺の軟骨様過誤腫（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９１；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ
ｅｔ  ａｌ  １９９２，１９９３）．
【０２３７】
成長および増殖を制御する遺伝的メカニズムにおける異常が、発癌の主たる原因である。ＨＭＧＡタンパク質の発現は、多くの論文および文献で示されてきたように腫瘍の発生
と強力に関連する（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，１９８９，１９９３）。このように有意なＨＭＧＡ２発現が化学的またはウイルスで引き起こされた腫瘍ならびに自発的に生じる腫瘍で見いだされたが、このタンパク質は非形質転換細胞または健康な組織中では検出できなかった。（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。これと調和して、ＨＭＧＡ２発現の合成が特異的に遮断された発癌性レトロウイルスに感染した細胞の場合、形質転換に関する種々の表現型マーカーは存在しなかった（Ｂｅｒｌｉｎｇｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
【０２３８】
正常ならびに病的成長におけるＨＭＧＡタンパク質の重要な役割が、マウスのモデルで解明された：ＨＭＧＡ２ノックアウトマウスは発育が妨げられた成長を表し、すなわち動物は野生型のマウスよりも約６０％小さい。しかしこれらの小人（コビト）マウスは化学的に誘導された皮膚腫瘍に高い耐性を有する。
【０２３９】
この数年で、ＨＭＧＡ２遺伝子を含む染色体領域１２ｑ１４−１５の構造的異常が、間葉起源の良性腫瘍の全数に関する細胞遺伝学的調査により見いだされ、これらはヒトにおいて最大群の無害な新生物であった。多数の異常にもかかわらず（Ｓｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９５；Ｋｏｔｔｉｃｋａｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９８；Ｋｌｏｔｚｂｕｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）、改変された形は常に共通する特徴を表し：それらはすべての３つのＤＮＡ結合ドメインを保持するが、同時に酸性Ｃ−末端ドメインならびにＲＮＡレベルで３’ＵＴＲの情報を失っている。
【０２４０】
そのような変化は多くの（ほとんどが良性の）間葉ＨＭＧＡ関連腫瘍ですでに見いだされた：
・  子宮平滑筋腫、女性に最も多い腹部の腫瘍であり、そして米国で年間２００，０００例以上の子宮摘出の理由である（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ  １９８８；Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９８６；Ｖａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ  １９８８）
・  脂肪腫（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ  １９８８；Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ  １９８６；Ｍａｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ  １９８７；Ｓｒｅｅｋａｎｔａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９１；Ｂｅｌｇｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９２）
・  子宮内膜ポリープ（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９８９；Ｖａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ
１９９３；Ｄａｌ  Ｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）
・  肺の軟骨様過誤腫（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９１，１９９５；Ｄａｌ  Ｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）
・  唾液腺の多形性腺腫（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ  １９８０，１９８６；Ｂｕｌｌｅｒｄｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ  １９８７）
・  血管周囲細胞腫（Ｍａｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）
・  軟骨性腫瘍（Ｍａｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ  １９８９；Ｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９２）
・  胸部の良性腫瘍（Ｂｉｒｄｓａｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９２；Ｒｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ
１９９５；Ｓｔａａｔｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）
・  浸潤性血管粘液腫（Ｋａｚｍｉｅｒｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）
・  拡散星状細胞腫
・  骨巨細胞腫（Ｎｕｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ  １９８９）
【０２４１】
癌患者における死亡率および罹患率の主な原因は、体内での１次新生物の転移性の広がりである。転移は、散在性の新生物細胞による遠い臓器の成功裏のコロニー形成が、多くの段階を通して進まなければならないので単純なプロセスではない。新生物細胞は、１次新生物から放出され、血流に乗り、遠い部位に遊出され、そして最後に対応する臓器の実質で再度増殖しなければならない。プロテアーゼ、接着分子、運動性因子および脈管形成因子のようなタンパク質を発現する多くの遺伝子は、この高度に複雑な転移性カスケード
の様々な段階に関与している。
【０２４２】
これらの遺伝子のどれが最終的に転移に関して決定的であるのかは知られていない。ＨＭＧＡ１遺伝子はこのプロセスを制御する最も重要な因子の１つであるが、有望な候補である。ＨＭＧＡ１の遺伝子産物は、成功裏の転移に重要な多くの遺伝子の転写に影響を及ぼす。例えば他の転移に関係する遺伝子は、それら自体がＨＭＧＡ１発現の抑制で減少したレベルで発現されることがすでに示された（Ｂａｔｔｉｓｔａ  １９９８；  Ｖａｌｌｏｎｅ  １９９７）。
【０２４３】
したがってＨＭＧＡ１は、重要な治療用標的分子である。このようにＨＭＧＡ１の遮断は原理的に癌を制御し、そしてその転移性の広がりを防ぐために適している（Ｅｖａｎｓ
２００４；Ｓｇａｒｒａ  ２００４）。すなわち例えばＨＭＧＡ転写産物に向けられたアンチセンスＲＮＡを使用することにより、癌細胞中の細胞増殖はインビトロで減少するか、または細胞はアポトーシスをも受けた（Ｍａｓｃｉｕｌｌｏ  ２００３；Ｓｃａｌａ
２０００；Ｃｈａｕ  ２００３）。動物モデルでは、種々の膵臓癌外移植片の成長が遺伝子治療により劇的に減少されることが示された（ＨＭＧＡ転写産物に向けられたアンチセンスＲＮＡのアデノウイルス発現）（Ｔｒａｐａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００４）。
【０２４４】
ＨＭＧＡ１はさらに、どの患者が浸潤性癌の処置から利益を受けるかを決定するために、予後の診断マーカーとして使用することができた。悪性形質転換の程度と、発現されたＨＭＧＡ１の量との間に緊密な相関がある。これは次いで前立腺癌（Ｔａｍｉｍｉ  １９９６；Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓ  １９９１）および結腸直腸癌腫（Ａｂｅ  １９９９）および神経芽腫（Ｇｉａｎｎｉｎｉ  ２０００）のようなヒトの癌の多くの型で良くない予後と相関し得る。
【０２４５】
ＨＭＧＡタンパク質は多くのウイルスにより、ならびにウイルス遺伝子の発現のために宿主細胞により提供される制御因子により、またはコ−ファクターとして使用され、とりわけ
・  ヒト  パポバウイルス  ＪＣ（Ｌｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）
・  エプスタイン−バーウイルス（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）
・  単純ヘルペスウイルス（Ｐａｎａｇｉｏｔｉｄｉｓ  １９９９；Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ
ａｌ  １９９６）
・  ＨＩＶ−１  ウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）．
により使用される。
【０２４６】
特にＨＭＧＡタンパク質は、宿主細胞中で多数のウイルス遺伝子の転写の調節に関与する。この例はヒト  パポバウイルス  ＪＣ  （Ｌｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）の初期および後期発現遺伝子の発現の調節、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のＥＢＮＡ１（エプスタイン−バーウイルスの核抗原１）遺伝子の調節（これは連帯的にウイルスの潜伏を制御する原因である（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９７））、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）をＩＥ−３（前初期）遺伝子の調節（これは未熟に発現されるタンパク質ＩＣＰ４をコードする（Ｐａｎａｇｉｏｔｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９９））、潜伏期中に活性であるＨＳＶ−１のプロモーター２の調節（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）、およびヒトＨＩＶ−１  ウイルスのＬＴＲ（長い末端反復）プロモーターの調節（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）である。
【０２４７】
ウイルス性疾患の内容において、宿主細胞によるＨＭＧＡの要求はウイルス遺伝子の調節に限定されるだけではない。ＨＭＧＡ１はまた、ＨＩＶ−１ウイルスの、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬｖ）の、および肉腫トリインフルエンザウイルス（ＡＳＶ）のウイルスＤＮＡのヒトゲノムへの組み込みにおいて、構成的コ−ファクターと
して決定的な役割を果たすようであり、したがって抗ウイルス処置において興味深い治療的取り組みになると思われる（Ｖａｎ  Ｍａｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｌｉ  ｅｔ
ａｌ  １９９８，Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
【０２４８】
ゆえにＨＭＧＡタンパク質のインヒビターも、ウイルス感染の処置及び診断に適している（Ｒｅｅｖｅｓ  ＆  Ｂｅｃｋｅｒｂａｕｅｒ  ２００２）。
【０２４９】
これまでに示したＨＭＧＡタンパク質の種々の疾患における関与、およびそれらの診断用マーカーとしての適性の結果として、Ｌ−核酸そして特にこれらのタンパク質に向けられたシュピーゲルマーは、上記疾患の防止、処置および診断に使用することができる。これに関連して特に好適なシュピーゲルマーが本明細書に記載される。これとの関連で、当業者は個々のシュピーゲルマーが特異的ＨＭＧＡタンパク質に開発されてきたが、実施例２で具体的に説明するドメインへの取り組みの結果として、これらは他のＨＭＧＡタンパク質と交差反応性も可能とすることを認識し、これは図２に具体的に説明するアライメントから分かる。
【０２５０】
さらにこの分野の当業者は、本発明による核酸が多数の構造的モチーフを含み、これが細胞内受容体としてＨＭＧＡタンパク質に結合するシュピーゲルマーのクラスを定めると認識するだろう。種々の構造的モチーフを実施例１でさらに詳細に具体的に説明する。
【０２５１】
本発明による核酸は、好適な態様において本明細書で具体的に開示する配列に実質的に相同的な核酸も含んでなる。用語「実質的に相同的」という用語は、この内容においては好ましくは相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５、９６、９７、９８または９９％より高いと理解すべきである。
【０２５２】
さらに本発明による核酸という用語、または本発明による核酸は、本明細書に記載されるような核酸配列、またはその一部を、好ましくは核酸またはその該一部がＨＭＧＡタンパク質への結合に関与する程度まで含んでなるような核酸も含むと理解されるべきである。そのような核酸は本明細書に開示するものから、例えば短縮化（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）もしくは先端を切る（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）ことにより誘導化することができる。短縮化は本明細書に開示するように核酸の一または両端のいずれかが関与し得る。また短縮化はヌクレオチドの内部配列も関与し、すなわち５’と３’末端のヌクレオチドの間のヌクレオチド（１もしくは複数）が関与できる。さらに短縮化という用語は、本明細書に開示する核酸の配列からわずか１つの個別のヌクレオチドの削除も指すと理解されるべきである。また短縮化は本発明による核酸（１もしくは複数）の１領域より多くが関与することもでき、これとの関連でこれら各領域は、わずか１ヌクレオチド長でもよい。
【０２５３】
さらに本発明の核酸は、Ｄ−核酸またはＬ−核酸のいずれかでよい。好ましくは本発明の核酸はＬ−核酸である。加えて、核酸の１もしくは複数の部分がＤ−核酸として存在するか、あるいは少なくとも核酸の１もしくは複数の部分がＬ−核酸であることも可能である。核酸の「部分」という用語は、わずか１ヌクレオチドを表すと理解される。そのような核酸は一般に本明細書では、Ｄ−核酸またはＬ−核酸を指す。したがって好適な態様では、本発明の核酸はＬ−ヌクレオチドからなり、そして少なくとも１つのＤ−ヌクレオチドを含む。そのようなＤ−ヌクレオチドは、好ましくは本発明による核酸を定める領域（１もしくは複数）とは異なる部分に固定され、そして好ましくは核酸の他の部分との相互作用に関与するそのような部分に固定化されている。好ましくはそのようなＤ−ヌクレオチドは本発明の各領域の末端、または各核酸に固定化されている。好適な態様では、そのようなＤ−ヌクレオチドはスペーサーまたはリンカーとして作用することができ、これは好ましくはＰＥＧおよびＨＥＳのような修飾を本発明の核酸に結合する。
【０２５４】
本発明の範囲内において、１つの態様では本発明の核酸はより長い核酸の部分であるそのような酸も含み、ここでこれらのより長い核酸は数個の部分を含むことができ、少なくとも一つの部分は本発明による核酸またはその部分である。これらのより長い核酸の他の部分（１もしくは複数）は、Ｄ−核酸またはＬ−核酸のいずれかであることができる。任意の組み合わせを本発明と一緒に、そして本発明の核酸用に本明細書に記載したような目的および用途に使用することができる。より長い核酸の他の部分（１もしくは複数）は、結合機能、そして特にＨＭＧＡタンパク質への結合とは異なる機能を有することができる。可能な機能は、例えば固定化、架橋結合、検出、増幅、修飾または分子量を上げる目的のために他の分子との相互作用を可能にすることである。
【０２５５】
特にこれとの関連で本明細書で使用するＬ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなる、そして好ましくはＬ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【０２５６】
したがって、特に本明細書で使用するＤ−核酸は、Ｄ−ヌクレオチドからなる、そして好ましくはＤ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【０２５７】
本発明の核酸がＤ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドまたは２つの組み合わせからなるかどうかにかかわらず、組み合わせは例えば無作為な組み合わせであるか、または少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなる定めた配列の領域であり、核酸は１もしくは複数のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびそれらの組み合わせからなることができる。
【０２５８】
本発明のさらなる観点は、１もしくは複数の他の核酸と組み合わせた本発明の少なくとも１つの核酸からなる製薬学的組成物に関し、ここで他の核酸（１もしくは複数）は好ましくはＨＭＧＡタンパク質以外の標的分子に結合するか、または本発明による核酸の機能とは異なる機能を発揮する。
【０２５９】
Ｌ−核酸として本発明の核酸の構造は、幾つかの理由から有利である。Ｌ−核酸は自然に存在する核酸のエナンチオマーである。しかしＤ−核酸は水溶液中で、そしてヌクレアーゼの広範囲での存在により特に生物学的系内および生物学的サンプル中でそれほど安定ではない。自然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞に由来するヌクレアーゼは、Ｌ−核酸を分解することができない。この結果、ヒトおよび動物体内を含むそのような系内でのＬ−核酸の生物学的半減期は有意に上昇する。Ｌ−核酸の分解性の欠如により、ヌクレアーゼ分解産物は生成されず、したがって生じる副作用も観察されない。この観点は実際、疾患および／または障害の処置に使用され、そしてＨＭＧＡの存在またはその原因となる関与を含むすべての他の化合物とＬ−核酸をはっきりと区別する。ワトソン−クリック塩基対合とは異なるメカニズムを介して標的分子に特異的に結合するＬ−核酸、またはＬ−核酸から部分的に、もしくは完全になるアプタマー、特にアプタマーの標的分子への結合に関与するアプタマーのそのような部分は、シュピーゲルマーと名付ける。
【０２６０】
本発明の核酸について、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸またはＤ−Ｌ−核酸として存在するかどうか、そしてそれらがＤＮＡまたはＲＮＡであるかどうかにかかわらず、一本鎖または二本鎖核酸の状態であることも本発明の範囲内である。典型的には、本発明の核酸は一本鎖核酸であり、これは１次配列により定まる２次構造を含み、それゆえに３次構造も形成することができる。しかし本発明の核酸は、互いに相補的または一部相補的である二本鎖は互いにハイブリダイズするという意味で二本鎖でもよい。これは核酸に安定性を付与し、これは核酸がＬ−形の代わりに自然に存在するＤ−形で存在する場合に特に重要となる。
【０２６１】
本発明の核酸は修飾することができる。そのような修飾には核酸の個々のヌクレオチド
が関与でき、そして当該技術分野では周知である。そのような修飾の例はとりわけＶｅｎｋａｔｅｓａｎ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｏｃｔ；１０（１９）：１９７３−９１；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｗ．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４：２７−３８；Ａｕｒｕｐ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２２，２０−４；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２３，２０１９−２４；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２，６３３−８；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２，６８３−９５；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，３６，８３１−４１；Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７８３２−８；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，４６９，２１３−４３に記載されている。そのような修飾は、例えば核酸に含まれる個々のヌクレオチドの２’位のＨ原子、Ｆ原子またはＯ−ＣＨ３基またはＮＨ２基でよい。さらに本発明の核酸は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むことができる。１つの態様では、本発明の核酸は、ＬＮＡヌクレオチド、そして好ましくは完全にＬＮＡヌクレオチドからなる。
【０２６２】
１つの態様では、本発明の核酸は、複数部分（ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔ）の核酸であることができる。本明細書で使用する複数部分の核酸は、少なくとも２つの核酸鎖からなる核酸である。これら少なくとも２つの核酸鎖は機能的単位を形成し、機能的単位は標的分子に対するリガンドである。少なくとも２つの核酸鎖は、２つの鎖を生成するために核酸の開裂により、または全核酸（すなわち本発明による核酸）の第１部分に対応する核酸、そしてさらに全核酸の第２部分に対応する核酸からの合成のいずれかにより、本発明の核酸の１つから誘導することができる。開裂ならびに合成は、例として上記の２より多くの鎖が存在することができる複数部分の核酸を生成するために使用できると認識される。換言すると、少なくとも２つの核酸鎖は好ましくは、互いに相補的であり、そして互いにハイブリダイズする２つの鎖とは異なるが、ある程度の相補性が種々の核酸部分間に存在することができる。
【０２６３】
本発明者は、本発明の核酸が大変有利なＫＤ値範囲または解離値範囲を有し、ゆえに大変有利な結合定数を有することを確立した。結合定数を決定する１つの方法は、実施例１に記載するような平衡結合アッセイを使用することである。
【０２６４】
本発明の核酸のＫＤ値は、好ましくは１μＭ未満である。約１μＭのＫＤ値が核酸と標的との非特異的結合の特徴となるはずである。当業者には認識されているように、例えば本発明の核酸のような化合物群のＫＤ値は、特定の範囲内で変動する。上に挙げた約１μＭのＫＤは、ＫＤ値に関して好適な上限の値である。標的分子を結合する核酸のＫＤに関して好適な下限値は、約ピコモル以下であることができる。ＨＭＧＡに結合する個々の核酸のＫＤ値が、好ましくはこの範囲内にあることは本発明の範囲内である。好適な範囲は第１の数をこの範囲内で選び、そして第２の数をこの範囲内で選ぶことにより選択することができる。好適な上の値は０．２５μＭ、０．１μＭであり、そして好適な下の値は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．０５ｎＭである。
【０２６５】
本発明の核酸は実施例２に具体的に説明するように、好ましくはＨＭＧＡ１ｂに溶液中、３７℃で解離定数ＫＤ＜２０ｍＭで結合する。
【０２６６】
本発明による核酸は、それらが標的分子に結合できるならば任意の長さであることができる。従来技術では本発明の特異的な長さの核酸が好適であると認識される。典型的には長さは１５から１２０ヌクレオチドの間である。また当業者には１５から１２０の間の任意の全数が本発明の核酸に好適な可能な長さであると認識されている。本発明の核酸の長
さについて好適な範囲は、約２０から１００ヌクレオチド、約２０から８０ヌクレオチド、約２０から６０ヌクレオチド、約２０から５０ヌクレオチド、そして約３０から５０ヌクレオチドの長さである。
【０２６７】
１つの態様では、本発明の核酸は修飾された形態で存在する。特に好適な修飾形態はペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）である。これには本発明の核酸の修飾にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の基とのカップリングが関与する。
【０２６８】
本発明の核酸、特にこれらがＬ−核酸として存在する核酸の高い安定性により、本発明の核酸をそのような処置を必要とする患者に直接投与することが可能である。好ましくは本発明の核酸は、局所的および全身的適用に生理学的溶液として調製される。
【０２６９】
本明細書に記載する疾患の処置、防止および診断に本発明の核酸を直接使用することとは別に、これらは製薬学的組成物中で個別に、または他と組み合わせて存在し、または使用されることができる。したがって本発明の製薬学的組成物は、本発明の少なくとも１つの核酸および好ましくは製薬学的に許容され得る結合剤を含んでなる。そのような結合剤は任意の結合剤または当該技術分野で知られているものでよい。特にそのような結合剤は、本明細書に開示するように薬剤の生産と関連して記載されるような任意の結合剤である。さらなる態様では、製薬学的組成物はさらに製薬学的に活性な作用物質を含む。本明細書に記載する薬剤が、本明細書に記載するような製薬学的組成物を構成することは本発明の範囲内である。
【０２７０】
好ましくは製薬学的組成物は静脈内投与を意図している。しかしそのような製薬学組成物が筋肉内、腹腔内または皮下投与されることも本発明の範囲内である。他の投与経路は経口的または鼻内であり、これとの関連でその投与の形態は少なくとも侵襲的であるが、同時に製薬学的組成物および製薬学的に活性な作用物質の効力を保持することが好適である。
【０２７１】
本発明の核酸は好ましくはそのままで含まれるか、または製薬学的に許容され得る溶媒に溶解された本発明による製薬学的組成物と共に含まれる。そのような溶媒は特に水、生理学的塩水、ＰＢＳまたはグルコース溶液、特に５％グルコース溶液を含んでなる群から選択される。そのような担体は例えば水、バッファー、ＰＢＳ、グルコース溶液、好ましくは５％グルコース溶液（等張性）、澱粉、糖、ゼラチンまたは任意の他の許容され得る担体物質であることができる。そのような担体は一般に本分野の当業者に知られている。
【０２７２】
製薬学的組成物が本発明の少なくとも１つの核酸を、限定するわけではないが本明細書に記載するコンジュゲートとしての核酸を含め、その様々な態様で含むことは本発明の範囲内である。
【０２７３】
さらなる態様では、薬剤はさらに製薬学的に活性な作用物質を含んでなる。そのようなさらに製薬学的に活性な作用物質は、例えばプロテアーゼインヒビター、増殖インヒビターおよび脈管形成インヒビターおよび／または細胞増殖抑制効果を有する作用物質である。あるいはまたは加えて、そのようなさらなる製薬学的に活性な作用物質はさらに本発明の核酸である。あるいは薬剤は、ＨＭＧＡとは異なるか、または本発明による核酸の１つとは異なる機能を有する、標的分子に結合する少なくとも１もしくは複数の核酸を含んでなる。
【０２７４】
本発明の製薬学的組成物は、本明細書に記載する疾患または障害の各々を処置、診断および／または防止するために使用することができる。
【０２７５】
本発明のさらなる観点は、そのような処置が必要な生きている生物の処置法に関し、ここで方法には本発明による少なくとも１つの核酸の製薬学的に有効な量の投与を含む。１つの態様では、生きている生物は罹患しているか、またはそのような疾患に罹る危険性があり、疾患は本明細書に挙げる疾患であり、特に薬剤を生産するために本発明の核酸の１つを使用することと関連して記載した疾患である。
【０２７６】
本発明の核酸の使用は様々な疾患および状態におけるＨＭＧＡタンパク質の上記に具体的に説明した関与にすでに従うが、この観点をこれから具体的に説明する目的でさらに検討する。
【０２７７】
ＨＭＧＡタンパク質およびそれらの遺伝子は、特に新生物疾患の診断および予後にますます関与するようになり、そして有力なバイオマーカーとして提案された。健康な組織では、ＨＭＧＡ１ａ／ｂタンパク質の発現レベルは検出可能であったとしても大変低い。上昇したＨＭＧＡ１ａ／ｂタンパク質発現は、多数の腫瘍の表現型および大変多くの種類の癌の転移の特徴である（Ｓａｒｈａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｂａｌｃｅｒｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｂｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃｈｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｄｏｎａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃｚｙｚ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｋｅｔｔｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｂｌａｃｅｒｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｆｌｏｈｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｍａｓｃｉｕｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｐｉｅｒａｎｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。高いＨＭＧＡタンパク質発現は、良くない予後および転移の形成と有意に相関する。生検およびその組織学的特性決定におけるＨＭＧＡ１ａ／ｂ発現レベルの検出は特にこれまでに検討した疾患および状態における、早期の検出、予後および新生物疾患の同定に対する診断的取り組みである。
【０２７８】
さらにＨＭＧＡ１タンパク質とアテローム硬化症斑との間の関連が文献に記載されている（Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５．）。ＨＭＧＡ１はＣＤ４４、斑の形成に関する主要な標的遺伝子の１つを調節する。これに関連して、周辺組織と比較して、新内膜（ｎｅｏ−ｉｎｔｏｍａｌ）、脈管平滑筋細胞、マクロファージおよび新血管のような影響を受けた領域がＨＭＧＡ１の高い発現を有することが分かった。したがってＨＭＧＡ１は斑の形成におけるメディエーターの１つになると考えられ、すなわち診断目的の標的分子である。
【０２７９】
本明細書に記載するＬ−核酸、そして特にＨＭＧＡ１ａ／ｂに結合するシュピーゲルマーは当業者に知られている方法の範囲内であることができ、抗体と類似の方法に使用される。今まで、ＨＭＧＡ１に対して大変わずかに特異的（に区別し）であり、かつアフィン（ａｆｆｉｎｅ）な抗体が同定され、そして工業的に得ることが可能である。これはＨＭＧＡ１の存在しない２次構造によるものと思われ、これは抗体の生成におけるＭＨＣ複合体の適切な標的とはならない。
【０２８０】
しかしこの背景に対して、驚くべきことにビオチン化ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合シュピーゲルマー  ５’−ビオ−ＮＯＸ−Ａ５０が、ウエスタンブロット法でＨＭＧＡ１ａ／ｂを癌細胞株中で個別のバンドとして認識することが判明した。さらに実施例２に記載するように、組換えで発現したＨＭＧＡ１ｂタンパク質を検出することができた。ビオチン化シュピーゲルマーの検出は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された抗−ビオチン抗体により行われる。
【０２８１】
ＨＭＧＡ１ａ／ｂのインビボ診断はさらなる取り組みであり、ここでは本発明の核酸を使用することができる。腫瘍および転移は壊死腫瘍細胞に埋め込まれていることが多く、これが周辺組織にＨＭＧＡ１ａ／ｂを放出する。細胞外ＨＭＧＡ１ａ／ｂの検出は、健康な組織に埋め込まれている腫瘍および転移の診断に対する１つの取り組みである。
【０２８２】
本明細書で好ましく使用するように、診断ツールまたは診断薬または診断手段は、直接的または間接的のいずれかでＨＭＧＡタンパク質、好ましくはＨＭＧＡ１ａ／ｂを本明細書に記載するように、種々の障害および疾患と関連して検出することができる。診断ツールは本明細書に記載する任意の疾患および状態を検出および／または調査するために適する。そのような検出は本発明の核酸をＨＭＧＡ１ａ／ｂに結合させることにより可能となる。そのような結合は直接的または間接的のいずれかで検出することができる。対応する方法および手段は本分野の当業者に知られている。本発明の核酸はとりわけ標識されることができ、これは本発明の核酸、好ましくはＨＭＧＡタンパク質そして好ましくはＨＭＧＡ１ａ／ｂに結合された、または結合することができる核酸の検出を可能とする。そのような標識化は好ましくは放射性、酵素的および蛍光標識化を含んでなる群から選択される。原理的には抗体に関して開発されたすべての既知の試験を本発明の核酸に適合させることができ、標的分子に結合する抗体は標的分子に結合する核酸に置き換えられる。非標識化の標的分子に結合する抗体を使用する抗体試験では、検出は好ましくは放射性、酵素的または蛍光標識で修飾され、そして標的分子に結合する抗体にそのＦｃフラグメントで結合する２次抗体を用いて行われる。核酸、好ましくは本発明の核酸の場合、核酸はそのような標識を用いて修飾され、該標識は好ましくはビオチン、ＣＹ−３およびＣＹ−５からなる群から選択され、そしてそのような標識はそのような標識に対して向けられた抗体、例えば抗−ビオチン抗体、抗−ＣＹ−３抗体、または抗−ＣＹ−５抗体により検出され、あるいは標識がビオチンである場合、標識はビオチンに自然に結合するストレプトアビシンもしくはアビジンにより検出される。そのような抗体、すなわちストレプトアビシンもしくはアビジンは、次いで２次抗体に類似して好ましくは対応する標識、例えば放射性、酵素的または蛍光標識で修飾される。
【０２８３】
さらなる態様では、本発明の核酸は第２検出剤により検出または分析され、この検出剤は分子ビーコンである。分子ビーコンの技法は本分野の当業者には既知である。簡単に述べると、これらの分子ビーコンは検出されるべき核酸プローブの逆相補的な核酸プローブであり、したがって検出されるべき核酸プローブの一部とハイブリダイズする。核酸プローブの結合後、分子ビーコンの蛍光基が互いに分離され、これが蛍光シグナルに変化を、好ましくは強度に変化を導く。この変化は存在する核酸プローブの量に相関する。
【０２８４】
本発明の核酸が本明細書に開示する様々な観点の範囲内でＬ−核酸として正しく使用され得ることは本発明の範囲内である。
【０２８５】
本発明の核酸は、さらに製薬学的に活性な物質の設計に出発物質として使用され得る（ドラックデザイン）。原理的には、この問題に対して２つの可能な取り組みがある。１つの取り組みは化合物のライブラリーをスクリーニングすることからなり、ここでそのような化合物のライブラリーは好ましくは低分子量化合物（低または小分子）のライブラリーである。そのようなライブラリーは本分野の当業者には知られている。１つの態様では、スクリーニングは高処理量スクリーニングである。好ましくは高処理量スクリーニングは迅速、効率的であり、そして標的分子に基づくアッセイにおいて活性物質のトライ−アンド−エラー評価として行われる。
【０２８６】
あるいは本発明に従い、核酸は活性物質の合理的設計に使用され得る。好ましくは活性物質の合理的設計は、製薬学的に活性な物質の候補の設計である。通常、Ｘ−線構造分析または核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）のような方法により測定される標的分子の３次元的構
造から出発して、コンピュータープログラムを使用して多数の異なる化学化合物の構造を含有するデータバンクを通して調査する。選択はコンピューターにより行われる。選択された化合物は、さらに研究室で試験される。
【０２８７】
活性物質の合理的設計は、その出発点として本発明の任意の核酸を取り、そして構造、特に３次元構造を含んでなり、これは本発明の核酸（１もしくは複数）の構造に類似するか、またはＨＭＧタンパク質への結合を媒介する本発明の核酸（１もしくは複数）の構造と同一もしくはその一部である。どのような場合でも、そのような構造は本発明の核酸（１もしくは複数）と同じか、または少なくとも類似する結合挙動をも現す。さらなる段階、または別の段階のいずれかにおいて、活性物質の合理的設計では、好ましくはＨＭＧタンパク質へ結合する核酸のこれら部分の３次元的構造は、好ましくはヌクレオチドおよび核酸とは異なる化学基により模倣される。物まねともよばれるこの模倣により、活性物質の合理的設計に出発物質として使用した核酸（１もしくは複数）とは異なる化合物が構築され得る。そのような化合物または活性物質は好ましくは小分子またはペプチドである。
【０２８８】
本分野の当業者に知られている競合試験を使用して化合物のライブラリーをスクリーニングする場合、適切なＨＭＧ類似体、ＨＭＧアゴニストおよびＨＭＧアンタゴニストを見いだすことができる。そのような競合アッセイは以下のように設計することができる。本発明の核酸、好ましくはシュピーゲルマー、すなわち標的分子を結合するＬ−核酸は、好ましくは固相にカップリングされる。ＨＭＧ類似体を同定するために、標識化ＨＭＧタンパク質を試験系に加える。あるいはＨＭＧタンパク質も固相にカップリングされ、そして本発明の核酸を標識化することができる。有望な類似体または有望なアゴニストもしくはアンタゴニストは、シュピーゲルマーに結合するＨＭＧ分子と競合し、これが対応する標識から受けるシグナルに減少を生じる。アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングには、本分野の当業者に知られている細胞培養試験系の使用を含むことができる。
【０２８９】
さらなる観点では、本発明の核酸はそれらのＨＭＧタンパク質への独自の結合挙動により、標識（標識分子）の確認に使用することができる。本発明の核酸はＨＭＧタンパク質の機能を研究するために、エクスビボの臓器モデルで使用することができる。原理的には、ＨＭＧアゴニスト／アンタゴニストが試験され得るエクスビボモデルが存在する。
【０２９０】
本発明によるキットは、本発明の少なくとも１もしくは複数の核酸を含んでなることができる。さらにキットは少なくとも１もしくは複数の陽性または陰性対照を含むことができる。本発明の核酸に対してスクリーニングされたか、またはこれに好ましくは液体状態で結合するＨＭＧタンパク質を陽性対照として使用することができる。陰性対照として、とりわけその生物物理学的特性としてＨＭＧタンパク質に類似して挙動するが、本発明の核酸により認識されないペプチド、あるいはＨＭＧタンパク質に対して同じアミノ酸組成であるが、異なる配列を有するペプチドを使用することができる。
【０２９１】
さらにキットは１もしくは複数のバッファーを含むことができる。キットには種々の成分が乾燥もしくは凍結乾燥状態で、または液体に溶解された存在することができる。キットは１もしくは複数の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含むことができ、これは次いで１もしくは複数のキットの成分を含むことができる。好ましくは容器（ｖｅｓｓｅｌ）はキットの１もしくは複数の成分を使用する１回の実験を実施するために必要となるような反応バッチを含む。
【０２９２】
正反対に言及されない限り、本明細書に列挙する配列は５’−３’方向で与えられることが認められている。さらに用語「２つの区分が互いにハイブリダイズする」は、本明細書では区分がインビトロで一般的な塩基対合の法則に基づきハイブリダイズできることを意味するか、または区分が使用の条件下でハイブリダイズするか、またはハイブリダイズ
できるが、必ずしも互いにハイブリダイズする必要はなく、または使用の条件下でハイブリダイズした状態で存在する必要がないことを意味すると理解されることがわかる。
【０２９３】
本明細書に開示する核酸の様々な配列番号、化学構造、および本明細書で使用する標的分子ＨＭＧＡ１ａ／１ｂ、実際の配列および内部参照を以下の表にまとめる。
【０２９４】
【表１５】
0005766750.tif 000022
【０２９５】
【表１６】
0005766750.tif 000023
【０２９６】
【表１７】
0005766750.tif 000024
【０２９７】
【表１８】
0005766750.tif 000025
【０２９８】
本発明の核酸の個別の区分に例示的に与えられる配列が無い場合、本明細書に開示する
技術的教示に従い自由に選択することができ、すなわちそれらが個々の標的分子に対して必要な結合挙動を現し、かつ／または構造、特に本明細書に記載する２次構造を形成できるように選択できることは、本発明の範囲内である。
【０２９９】
さらに、ＲＮＡ配列と同定される配列において、ＴがＵに代わって与えられている場合、ＴはＵを表すことになることは本発明の好適な態様の範囲内である。
【０３００】
本発明はこれから以下の図面および実施例を用いてさらに詳細に記載され、これはさらなる特徴、態様および利点を開示する。これに関連して：
図１Ａは、２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂドメインに結合するＤ−２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂに対してインビトロ選択により生成されたアプタマーを示す。
【０３０１】
図１Ｂは、２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂドメインに結合するＤ−２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂに対してインビトロ選択により生成されたアプタマーの同定された反復して存在する配列領域の表示である。
【０３０２】
図２は、ＨＭＧＡ１ａ／ｂとＨＭＧＡ２との配列比較である。
【０３０３】
図３は、ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合アプタマー  ＮＯＸ−ｆの短縮化である。
【０３０４】
図４は、短縮化ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合アプタマー  ＮＯＸ−ｆの結合特性を表す。
【０３０５】
図５は、マルチウェルプレートアッセイにおいて二重鎖天然標的ＤＮＡへのＨＭＧＡの結合を測定するための競合アッセイを示す；シュピーゲルマーの結合は、組換えＨＭＧＡ１ｂのビオチン化ｄｓＤＮＡ（ＡＴフックモチーフ）への結合と競合する。結合したＨＭＧＡ１ｂの検出は、ニッケルＨＲＰを介してＨｉｓ−タグを通して行われ、これは基質を蛍光シグナルに転換する。
【０３０６】
図６は、競合的マルチウェルプレートアッセイにおいて、シュピーゲルマーＮＯＸ−ＡとシュピーゲルマーＮＯＸ−ｆの比較を表す（４８ｎｔ；３３ｎｔ）；プレートアッセイでは、シュピーゲルマーＮＯＸ−ＡならびにシュピーゲルマーＮＯＸ−ｆおよびその短縮化バリアントシュピーゲルマーＮＯＸ−ｆ３３は、低いナノモル範囲で組換えＨＭＧＡ１ｂがその天然に存在する結合パートナーへの結合を防止する。
【０３０７】
図７は、競合的マルチ−ウェルプレートアッセイにおいて、２ｋＤａ−ＰＥＧ−カップリング化シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａならびに非機能的対照シュピーゲルマーの活性を示す：ペグ化シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａは、組換えＨＭＧＡ１ｂのｄｓＤＮＡのＡＴフックモチーフへの結合を１５ｎＭのＩＣ５０で競合し；ＮＯＸ−Ａのインバース対照シュピーゲルマーは、高いシュピーゲルマー濃度でＨＭＧＡ１ｂとの非特異的相互作用を示す。
【０３０８】
図８は、ウエスタンブロットを表す；固定化ＨＭＧＡ１ｂのビオチン化シュピーゲルマーによる検出；組換えＨＭＧＡ１ｂは２０ｋＤａの大きなタンパク質のように電気泳動の場を移動し、そしてビオチン化シュピーゲルマーにより低濃度（３ｎＭ）で認識され得る（ここではＮＯＸ−Ａの例を用いて）；インバース対照シュピーゲルマーはＨＧＭＧＡ１ｂを認識できなかった。。
【０３０９】
図９は、競合マルチ−ウェルプレートアッセイにおける遊離およびペグ化シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａの活性を表す。
【０３１０】
図１０は、“リボグリーン排除アッセイ（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  
ａｓｓａｙ）”におけるミセル中へのペグ化シュピーゲルマーのパッキングの調査である。
【０３１１】
図１１は、“リボグリーン排除アッセイ”におけるＰＥＩシュピーゲルマーミセルの安定性を示す。  
【０３１２】
図１２は、ＰＥＩミセルにパックされたシュピーゲルマーの効率的取り組みを示し、特にミセルにパックされたシュピーゲルマーに比べて「裸」のシュピーゲルマーのトランスフェクションの比較を、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ−３’ＰＥＧ２ｋＤａの例を用いて示す：シュピーゲルマーミセルでトランスフェクトされた細胞は、低いカメラ感度の設定で（カメラ  ゲイン）、純粋なシュピーゲルマーのみとインキュベーションした細胞に比べて細胞質中に強い蛍光を現した；両トランスフェクション法の効率＞９５％である。
【０３１３】
図１３は、エンドソーム区画からのシュピーゲルマーの放出を表す；シュピーゲルマーミセルは、純粋なシュピーゲルマーに比べて有意に高い蛍光を現した；シュピーゲルマーミセルは点様の核周辺、およびまた細胞質分布パターンを現した；点様の分布はエンドソーム区画の局在化を示し；細胞質ゾル中および形質膜上における拡散分布は、エンドソームから放出されたシュピーゲルマーを示す。
【０３１４】
図１４は、「裸」のシュピーゲルマーを用いた増殖アッセイである；細胞培養基中、２日後に高いシュピーゲルマー濃度でＭＣＦ−７細胞増殖の用量依存的阻害（リザズリンを介する定量）。
【０３１５】
図１５は、ＮＯＸ−Ａ−２ｋＤａ  ＰＥＧでパックしたＰＥＩで処置した後のＨ１２９９細胞（「非小細胞肺ガン」）の増殖を表す；ＰＥＩ−シュピーゲルマーミセル（Ｎ／Ｐ２．５）として適用した１μＭのシュピーゲルマーでＨ−１２９９細胞の増殖の阻害；ＮＯＸ−Ａは対照シュピーゲルマーに比べて増殖のわずかな阻害を表した。
【０３１６】
図１６は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出されたＨＭＧＡ１ａ／ｂ誘導型ｃｄｃ２５ａ遺伝子発現の阻害を表す；１μＭ  ＮＯＸ−Ａシュピーゲルマーミセル（Ｎ／Ｐ２．５）によるＨ−１２９９細胞におけるｃｄｃ２５ａ  ｍＲＮＡ発現の特異的阻害のＲＴ−ＰＣＲによる測定。
【０３１７】
図１７は、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａによるｃｄｃ２５ａ  ｍＲＮＡ発現の用量依存的阻害を表す：Ｈ−１２９９細胞におけるｃｄｃ２５ａ  ｍＲＮＡ発現の用量依存阻害のＲＴ−ＰＣＲによる定量；ＮＯＸ−Ａシュピーゲルマーミセル（Ｎ／Ｐ２．５）は、２５０ｎＭで出発して、ｃｄｃ２５ａ  ｍＲＮＡ発現の特異的阻害を表した；濃度＞４μＭでは、対照シュピーゲルマーの非特異的効果が見いだされ、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）による毒性効果＞１０μＭが見いだされた（データは示さず）。
【０３１８】
図１８は、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａによる裸のマウスを対象とした異種移植片モデルでの腫瘍成長の阻害を表す；２ｍｇ／ｋｇのシュピーゲルマーミセル（Ｎ／Ｐ２．５）によるＰＳＮ−１細胞の皮下注射後の腫瘍成長の阻害。シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａは腫瘍の成長に有意な低下を生じた。
【０３１９】
図１９は、異種移植片実験からのデータの統計的分析を表す；２ｍｇ／ｋｇのシュピーゲルマーミセル（Ｎ／Ｐ２．５）によるＰＳＮ−１細胞の皮下注射後の腫瘍成長の阻害；エンドポイント分析および箱ヒゲ図としての表示。ＮＯＸ−Ａは腫瘍の成長に高度に有意な低下を生じた（ＰＢＳに比べてｐ＝０．００９８およびインバース対照シュピーゲルマーに比べてｐ＝０．０２２）。
【０３２０】
図２０は、異種移植片実験でのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａの組織分布を表す：血漿および組織におけるシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａの分布の定量的分析；高濃度のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａは、他の組織および血漿にくらべて腫瘍組織で検出することができた。
【０３２１】
図２１は、異種移植片実験で最後に注射されてから２４および９６時間後のミセルにパックされたシュピーゲルマーおよびパックされていないシュピーゲルマーの組織分布を表す：血漿および組織での非機能的シュピーゲルマーの分布の定量的分析；他の組織および血漿に比べて腫瘍組織では、２４時間および９６時間後に、有意に増加した濃度のシュピーゲルマーをミセルにパックされたシュピーゲルマーの場合に検出することができた。
【０３２２】
図２２は、異種移植片実験で最後に注射されてから２４および９６時間後の、ミセルにパックされたシュピーゲルマーおよびパックされていないシュピーゲルマーの血漿および腫瘍における分析を表す：血漿および腫瘍での非機能的シュピーゲルマーの分布の定量的分析；腫瘍組織では、２４時間および９６時間後に、有意に増加した濃度のシュピーゲルマーは、パックされていないシュピーゲルマーに比べてミセルにパックされたシュピーゲルマーの場合に検出することができた。
【実施例】
【０３２３】
実施例１：ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合シュピーゲルマー  
１．１  ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合配列
ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合ＲＮＡシュピーゲルマーは、Ｄ−２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂに対するインビトロ選択、そして引き続いて短縮化工程により生成した。２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂドメインに結合する生じたアプタマーは図１Ａに表す。
【０３２４】
１．１．１  ランキングおよびアプタマーレベル
種々のクローン（図１Ａを参照）は、標準的なホスホロアミダイト合成によりアプタマー（Ｄ−ＲＮＡ）として調製し、そしてキナージング（ｋｉｎａｓｉｎｇ）により５’末端で放射性標識した（以下参照）。次いでクローンはそれらの親和性およひ活性に関して、２種類の濃度のＤ−バイオ−２１ａａ  ＨＭＧＡ１ａ／ｂで平衡結合アッセイにより分析した。
【０３２５】
キナージングによる放射性標識化：
物質                                                ［最終］
ＲＮＡ                                              ５μＭ
Ｔ４フォワード反応バッファー（インビトロジェン）    １ｘ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（インビトロジェン）    １０Ｕ／１０μｌ反応バッチ
［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ                              １μｌ／１０μｌ反応バッチ
【０３２６】
反応は３７℃で１時間行い、そして次いで加熱（６５℃で１０分）により止めた。標識化オリゴヌクレオチドから放射性ヌクレオチドの分離は、分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により行った（以下を参照）。次いで「クラッシュ−アンド−ソーク（ｃｒｕｓｈ−ａｎｄ−ｓｏａｋ）」ゲル溶出を酢酸アンモニウムで、そして沈殿をエタノールで行った（以下を参照）。切り出した片の放射性と比較して、精製したＲＮＡの量は、ペレットの放射性から推定された（沈殿後）。
【０３２７】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
オリゴヌクレオチドの調製用精製には、変性ＰＡＧＥ用の１／２から２容量の濃縮化サンプルバッファーを反応バッチに加えた。加えて、大規模標準を必要に応じて調製し（各２５０ｐｍｏｌ）、そしてサンプルバッファーに溶解した。バッチを５分間、９５℃で変
性させ、そして氷上で冷却した。調製用の変性７％または１０％ＰＡＡゲル（２００ｘ２００ｘ１．５ｍｍ）は、６００Ｖを４０〜５０Ｗの最大電圧でかけることにより前加熱した（約１時間）。１ｘＴＢＥでカップをすすいだ後、サンプルをプロットした。分離が完了した後（５０Ｗで５０分）、ゲルは透明フィルムで保護された蛍光化薄層クロマトグラフィープレートに配置した（色素６０Ｆ２５４）。バンドはＵＶ光（２５４ｎｍ）により影として（“ＵＶシャドーイング”）視覚化し、そして小刀で切り出した。次いで酢酸アンモニウムによる「クラッシュ−アンド−ソーク」ゲル溶出を行った。
【０３２８】
「クラッシュ−アンド−ソーク」ゲル溶出
ＰＡＡゲルからオリゴヌクレオチドを溶出するために、ＰＡＡゲル片を細分した後、５００μｌの酢酸アンモニウム（２Ｍ）をピペットチップまたはスパチュラを使用して加えた。「クラッシュ−アンド−ソーク」溶出は、サーモシェーカー（１０００ｒｐｍ）中で６８℃で２×１．５時間行った。上清は、「ウルトラフリー（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ）−ＭＣ」小カラム（ミリポア／アミコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ａｍｉｃｏｎ）、シュバルバッハ、ドイツ）により卓上遠心機（１６，１００×ｇ）でゲル残渣を除いた。次いでＲＮＡはこのようにして溶出し、次いでエタノール沈殿により脱塩した。
【０３２９】
エタノール沈殿
エタノール沈殿には、１〜２μｌのグリコーゲンを沈殿助剤として使用した。２．５容量の無水エタノールを加え、そしてボルテックスで混合した後、オリゴヌクレオチドを３０分間、−８０℃で沈殿させ、そして１６，０００ｇ、４℃で３０分間遠心した。ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、そして４℃で１６，１００ｇにて５分間遠心した。
【０３３０】
平衡結合アッセイで結合する等温線の記録
２ｐｍｏｌの各５’放射標識化アプタマーは、ビーケム（Ｂａｃｈｅｍ、ヴァイル  アム  ライン、ドイツ）により生産されたビオチン化−Ｄ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂ−２１ｍｅｒ（ＥＰＳＥＶＰＴＰＫＲＰＲＧＲＰＫＧＳＫＮＫ  ［配列番号１７］；  図２参照）中で複合化させた。濃度範囲１〜３０００ｎＭの溶液（または２点測定には、３００ｎＭおよび３０ｎＭまたは１００ｎＭおよび１０ｎＭペプチド）を、選択バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ）中で３７℃で１時間インキュベーションした。ビオチン化Ｄ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂ−２１ｍｅｒを含まない溶液をバックグラウンド対照とした。次いでペプチドおよび複合体を３０分以内、３７℃で１０μｌのストレプトアビジンＵｌｔｒａＬｉｎｋゲルで固定化した。  懸濁液の放射性を測定した。上清を除去した。次いでマトリックスは１回、１００μｌの選択バッファーで洗浄し、次いで選択バッファーを用いて沈殿させた。放射性を測定することにより、複合体中、ビオチン化−Ｄ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂ−２１ｍｅｒと一緒に存在するアプタマー画分を、各ペプチド濃度について測定した。活性種の解離定数および活性分子の比率は、グラフのプロットおよび適合により決定した（ＧｒａＦｉｔ、４．０．１０バージョン、Ｅｒｉｔｈａｃｕｓソフトウェア）。
【０３３１】
結果
アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ）として合成したすべてのクローンに関して、８〜２２ｎＭのＨＭＧＡ１ａ／ｂ（ビオチン化−Ｄ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂ−２１ｍｅｒ）の２１アミノ酸長Ｄフラグメントに対する結合の解離定数を、平衡結合アッセイで決定した（図１Ａ）。
１．１．２  実施例１３２−Ｂ３における短縮化
すべての選択候補は、繰り返し存在する配列モチーフＧＧＧＣＧ  または  ＧＧＧＵＧ
または  ＧＧＧＡＧを現し、これはヘリックス／幹（ｓｔｅｍ）モチーフにより５’末端および３’末端で安定化される（図３）。
【０３３２】
Ｚｕｋｅｒ  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００３  Ｊｕｌ  １；３１
（１３）：３４０６−１５）に従い、ＲＮＡアプタマーの有望な構造および沈殿の分析は、予め定めた幹／ヘリックス構造が幾つかの場合で延ばされていることが示された（１３２−Ｃ３、１３２−Ｂ３、１３２−Ｃ４、１３２−Ｅ２、１３２−Ａ２、１３２−Ｈ１、１３２−Ｆ１、１２２−Ｇ２、１２２−Ｅ２、図１Ａ参照）。この幹−ヘリックス構造は、これら候補のさらなる短縮化の基礎を形成した。この候補のさらなる短縮化は、ＨＭＧＡ１ａ／ｂフラグメントへの結合に関して、合成Ｄ−ＲＮＡ沈殿分析、続いて削除分析により、最小結合モチーフを同定し、そして安定化することにより行った。これらの結合特性は、平衡結合アッセイにより決定された。示す図３は候補ＮＯＸ−ｆ（１３２−Ｂ３）での例により、幹構造の安定化に基づくアプタマーの短縮化を表し、これは候補１３２−Ｃ３、１３２−Ｂ３、１３２−Ｃ４、１３２−Ｅ２、１３２−Ａ２、１３２−Ｈ１、１３２−Ｆ１、１２２−Ｇ２、１２２−Ｅ２  （図１Ａを参照）における延長化形態に見い出すことができる。６個のヌクレオチド長の幹を有するＮＯＸ−ｆの３２ヌクレオチド長アプタマーバリアント（ＮＯＸ−ｆ  ３２ｎｔ）の短縮化は、２１ａａ  ＨＭＧＡ１ａ／ｂフラグメントに対する結合特性に損失を導かなかった（図３および４）。５’−位の幹の第３位にアデノシンの人工的挿入は、ループアウト領域無しに７ヌクレオチド長の幹の理論的形成を導き、そして３’領域における幹の完成に役立った（ＮＯＸ−ｆ  ３３ｎｔ、図３および４）。ＨＭＧＡ１ａ／ｂの２１アミノ酸長ドメインに関する平衡結合アッセイによる結合特性（親和性および活性）の測定は、これらの変化に影響されなかった。
【０３３３】
一方、配列１３２−Ｇ２、１２２−Ａ１、１２２−Ｃ１、１２２−Ｂ２および１２２−Ｂ４は、繰り返し存在する配列モチーフ（ＧＧＧＣＧまたはＧＧＧＵＧまたはＧＧＧＡＧ）の５’および３’末端に、有意に短い幹構造を有する。幹構造の短縮化は、結合の損失を導く。これらの配列で、反復配列モチーフ間（ＧＧＧＣＧまたはＧＧＧＵＧまたはＧＧＧＡＧ）の、より長い中央領域で可能な短縮化は行わなかった。
【０３３４】
本明細書で開示するＨＭＧＡに結合する核酸のアプタマー配列の配列番号は以下の通りである：
【０３３５】
【表１９】
0005766750.tif 000026
【０３３６】
本明細書ですでに検討し、そして本分野の当業者には知られているように、Ｌ−ヌクレオチドからなるアプタマーのエナンチオマー、すなわちＤ−ペプチドに対して生成されたＤ−核酸は、Ｄ−ペプチドの鏡像エナンチオマー、すなわち自然に存在するＬ−ペプチドに結合する。このＬ−核酸は本明細書ではシュピーゲルマーとも呼び、そしてそうでなけ
ればアプタマーと原理的に同じ結合特性を現す。
【０３３７】
１．２  ＨＭＧＡ／ｂ結合シュピーゲルマーの独自な特性
１．２．１  反復配列要素：ボックスＡ１およびボックスＡ２
配列ＧＧＧＣＧまたはＧＧＧＵＧまたはＧＧＧＡＧの反復配列要素は、ＨＭＧＡ１ａ／ｂに結合するすべてのシュピーゲルマーの特徴である。この配列要素は、ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合シュピーゲルマーに２回現れる（図１Ａおよび１Ｂ）。シュピーゲルマーの５’末端付近にある配列要素を本明細書ではボックスＡ１と呼ぶ。一方、シュピーゲルマーの３’末端付近にある配列要素を本明細書ではボックスＡ２と呼ぶ。ボックスＡ１およびボックスＡ２およびそれらの共通アライメントは、恐らくＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合シュピーゲルマーの決定的特徴を表している。
【０３３８】
１．２．２  ボックスＡ１とボックスＡ２との間の配列区分
ボックスＡ１とボックスＡ２との間に、６〜７個の核酸または１２〜２２個のヌクレオチドの長さを有するいずれかの配列区分がある  （図１Ａおよび１Ｂ）。これらの配列区分はそれらの長さが異なるだけではないので、それらを個別に検討する。
【０３３９】
第１例：６〜７個のヌクレオチドを含んでなる配列区分
ボックスＡ１とボックスＡ２との間にある配列区分が６個のヌクレオチド長を有する場合、配列区分は配列ＵＧＧＵＵＧ、ＵＧＧＣＵＧ、ＣＧＧＵＵＧ、ＡＧＧＵＵＧまたはＧＵＧＵＡＡを現す。１個のヌクレオチド（ウラシル）の配列ＣＧＧＵＵＧへの挿入（これは配列ＣＧＧＵＵＵＧを導く）は、負または正のどちらの影響もシュピーゲルマーの結合特性に及ぼさない。
【０３４０】
第２例：１２〜２２個のヌクレオチドを含んでなる配列区分
ボックスＡ１とボックスＡ２との間にある配列区分が１２〜２２個のヌクレオチド長を有する場合、この配列区分は等しい長さの２つの配列領域を含んでなり、これは恐らく互いにハイブリダイズすることができる（ヘリックスＣ）。この場合、ハイブリダイゼーションは各々の場合で３〜６個のヌクレオチドにより起こる。３〜５個の非対合ヌクレオチドは、ヘリックスＣを形成するヌクレオチド間に位置する。１〜３個のヌクレオチドが、ボックスＡ１の３’末端とヘリックスＣの５’末端との間に非対合で存在する。１〜５個のヌクレオチドが、ヘリックスＣの３’末端とボックスＡ２の５’末端との間に非対合で存在することができる。
【０３４１】
１．２．３  シュピーゲルマーの５’末端および３’末端の螺旋構造
すべてのＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合シュピーゲルマーは、互いにハイブリダイズすることができる配列区分によりそれらの５’および３’末端に特徴がある（ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２、（図１Ａおよび１Ｂ）。各々の場合で互いにハイブリダイズするヌクレオチドの数は、４〜８個に変動することができる。これと関連して、この恐らくは二重鎖領域が、ボックスＡ１の５’末端およびボックスＡ２の３’末端に延長することができる。そうはならないならば、ボックスＡ１およびボックスＡ２はさらに互いにハイブリダイズするヌクレオチドにより平滑化され得る（ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２）。これには各々の場合で４〜８個のヌクレオチドの領域が関与し得る（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０３４２】
本出願の基礎を形成する本発明の範囲内で、様々な種類の核酸、そして特に標的分子に結合するＬ−核酸が同定された。これらの種類の以下の具体的説明および記載は、本明細書でも事例として名付けるが、この程度まで本発明の必須な部分となる。各種類に関して、それらの主要な構造およびこの種類の例示的Ｌ−核酸は、Ｌ−核酸の個々の略号を使用してこれから特定する。
【０３４３】
事例１：１３２−Ｃ３、１３２−Ｂ３、１３２−Ｃ４、１３２−Ｅ２、１３２−Ａ２、１３２−Ｈ１、１３２−Ｆ１、１２２−Ｇ２、１３２−Ｂ３、３２ｎｔ、１３２−Ｂ３  ３３ｎｔ
【０３４４】
【化７】
0005766750.tif 000027
【０３４５】
Ｎ１  ＝  Ｕ，Ｃ，Ａ，Ｇ；
Ｎ２  ＝  Ｇ，Ｕ；
Ｎ３  ＝  Ｕ，Ｃ；
Ｎ４  ＝  Ｕ，Ａ；
Ｎ５  ＝  Ｇ，Ａ；
Ｎ６  ＝  Ｇ，Ａ，Ｕ；
Ｎ７  ＝  Ｇ，Ｕ；
Ｎ８  ＝  Ｕまたはヌクレオチド無し；
Ｎｘ  ＝  ０〜５個のヌクレオチド；
Ｎｙ  ＝  ０〜６個のヌクレオチド；
Ｎｚ  ＝  ０〜６個のヌクレオチド；
【０３４６】
【化８】
0005766750.tif 000028
【０３４７】
＝ＧＧＧＣＧまたはＧＧＧＵＧまたはＧＧＧＡＧ；
ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２＝各々の場合で４〜８個のヌクレオチド、これは互いに完全に、または一部ハイブリダイズし、ここで各場合で、ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２、ならびにヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２の相互にハイブリダイズするヌクレオチドの和は、１０〜１２ヌクレオチドである；
ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２＝各々の場合で４〜８個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズし、ここで各場合で、ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２、ならびにヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２の相互にハイブリダイズするヌクレオチドの和は、１０〜１２ヌクレオチドである。
【０３４８】
分子は５’末端および３’末端での短縮化後でも活性である。ヘリックスＡ１およびＡ２ならびに領域Ｎ６Ｎ７およびＧＮｙの除去後、短縮化分子はそれらの結合特性を保持する。これは短縮化バリアント１３２−Ｂ３  ３２ｎｔ（ＮＯＸ−ｆ  ３２ｎｔ）および１３２−Ｂ３  ３３ｎｔ（ＮＯＸ−ｆ  ３３ｎｔ）について示された（図３および４を参照）。
【０３４９】
事例２Ａ：１３２−Ｇ２、１２２−Ａ１、１２２−Ｃ１、１２２−Ｂ２、１２２−Ｂ４
【０３５０】
【化９】
0005766750.tif 000029
【０３５１】
Ｎａ  ＝１〜５個のヌクレオチド
Ｎｂ  ＝３個のヌクレオチド
Ｎｃ  ＝３〜５個のヌクレオチド
Ｎｄ  ＝２〜５個のヌクレオチド
Ｎｅ  ＝１〜２個のヌクレオチド、好ましくはＡまたはＵＵ
【０３５２】
【化１０】
0005766750.tif 000030
【０３５３】
＝ＧＧＧＣＧまたはＧＧＧＵＧまたはＧＧＧＡＧ
ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２＝各々の場合で５〜６個のヌクレオチド、これは互いに完全に、または一部ハイブリダイズし、
【０３５４】
【化１１】
0005766750.tif 000031
【０３５５】
＝各々の場合で５〜６個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズする。
事例２Ｂ：１２２−Ｅ２
【０３５６】
【化１２】
0005766750.tif 000032
【０３５７】
Ｎｉ  ＝２個のヌクレオチド、好ましくはＣＡ
Ｎｊ  ＝２個のヌクレオチド、好ましくはＡＧ
Ｎｃ  ＝４個のヌクレオチド、好ましくはＧＡＵＧ
【０３５８】
【化１３】
0005766750.tif 000033
【０３５９】
＝ＧＧＧＣＧまたはＧＧＧＵＧまたはＧＧＧＡＧ
ヘリックスＡ１およびヘリックスＡ２  ＝  各々の場合で６個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズし、
ヘリックスＢ１およびヘリックスＢ２  ＝  各々の場合で５個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズし、
【０３６０】
【化１４】
0005766750.tif 000034
【０３６１】
＝各々の場合で３個のヌクレオチド、これは互いにハイブリダイズする。
【０３６２】
実施例２：ドメインからの取り組み
２．１  競合アッセイにおけるＨＭＧＡ１ａ／ｂシュピーゲルマーと組換えＨＭＧＡ１ｂとの相互作用の測定
実施／方法
Ｈｉｓ６−標識化ＨＭＧＡ１ｂのクローニング
ＨＭＧＡ１ｂをコードする配列を有するＢＤ−ＦｒｅｅｄｏｍＴＭ  ＯＲＦクローンＧＨ００５５２Ｌ１．０（高移動性群ＡＴフック１）をバイオカット（ＢｉｏＣａｔ）ハイデルベルグから購入した。配列はＣ−末端の融合を可能にするために、終止コドンがロイシンをコードするコドンに変換されるようにその中ですでに変更されていた。クローンの配列は一般に、ＲｅｆＳｅｑデータバンクにＮｏ．ＮＭ００２１３１で保存されている配列に対応する。ＨＭＧＡ１ｂをコードする配列を、標準的ＰＣＲにより、プライマーＨＭＧ＿ｆｗｄ１（ＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＴＣ、配列番号３４）およびＨＭＧ＿ｒｅｖ１（ＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＣＴＧ、配列番号３５）を用いて増幅した。これと関連して、これによりＮｃｏＩ境界を導入するためにＡＴＧ後の塩基をＡからＧに変えた。ＰＣＲ産物は製造元の使用説明に従い制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（両方ともＮＥＢ、フランクフルト  アム  メイン、ドイツ）で開裂し、そしてアガロースゲルを介して精製した。ベクターｐＨＯ２ｄ（Ｆａｓｓｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８０３６−２８０４１））を同様にＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、そしてアガロースゲルを介して精製した。ベクターｐＨＯ２ｄは、Ｔ７−プロモーターの制御下で６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ６−タグ）の配列を用いてＣ−末端に融合したタンパク質の発現を可能とする（Ｆａｓｓｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＪＢＣ  ２７２：２８０３６）。
【０３６３】
精製し、そして開裂したＰＣＲ産物は、製造元の使用説明に応じて（ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、セント  レオン−ロス、ドイツ）、調製したベクターに一晩、１５℃でＴ４リガーゼを使用してライゲーションした。バクテリアＤＨ５□株を、ライゲーション生成物で形質転換した。得られたコロニーからのプラスミドの正確さは、シークエンシングにより検査した。ｐＨＯ２ｄ／ＨＭＧＡ１ｂによりコードされる融合タンパク質ＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６は、自然なＨＭＧＡ１ｂタンパク質に比べて、２位にセリン（Ｓ）の代わりにグリシン（Ｇ）が、そしてＣ−末端グルタミン（Ｑ）の後にロイシン（Ｌ）（上記参照）、続いて５個のさらなるアミノ酸（Ｇ  Ｓ  Ｌ  Ｎ  Ｓ）（ベクターによりコードされる）を有し、これに６個のヒスチジン（Ｈ）が結合する。
【０３６４】
ＨＭＧ１ｂ−Ｈｉｓ６の発現および精製
融合タンパク質の発現には、バクテリアＢＬ２１株をプラスミドｐＨＯ２ｄ／ＨＭＧＡ１ｂで形質転換した。融合タンパク質の発現は、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。４時間後、バクテリアを１５分間、１０，０００×ｇで遠心し、そしてペレットをさらに使用するまで−２０℃で保存した。
【０３６５】
融合タンパク質の抽出には、２５ｍｌの抽出バッファー（５０ｍＭ  ＮａｘＰＯ４バッファー、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾールおよびＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｓｅインヒビター錠剤（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、マンハイム、ドイツ）中の１％ｎ−オクチル−β，Ｄ−チオグルコピラノシド（ＯＴＧ）（５時間／５０ｍｌ））を、５００ｍｌのカルチャーからの凍結バクテリアペレットに加え、続いて５μｌのベンゾナーゼ（グレード１；メルク（ＭＥＲＣＫ）、ダルムシュタット、ドイツ）を加え、ピペットで入れたり出したりしながら均一化し、そして５分間、室温でインキュベーションした。これに続いて１５分間、１０，０００  ｘ  ｇ（室温）で遠心した。上清は溝付きの
（ｆｌｕｔｅｄ）フィルターを通して濾過し、次いで洗浄バッファー（５０ｍＭ  ＮａｘＰＯ４バッファー、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、すべてメルク、ダルムシュタット、ドイツから）で平衡化したＨＩＳ−セレクトカラム（ＨＩＳ−セレクトカートリッジ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ダイゼンホーヘン、ドイツ）に加えた。カラムを１０−１５ｍｌの洗浄バッファーで洗浄した後、融合タンパク質を溶出バッファー（洗浄バッファー中に２５０ｍＭイミダゾール）で０，５−１ｍｌサイズの画分で溶出した。タンパク質を含有する画分は、純度をゲル電気泳動（Ｓｃｈｅａｇｅｒ  ＆  Ｊａｇｏｗ，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３６８−３７９に従い１６％ポリアクリルアミドゲル）により精製を検査した。融合タンパク質を含む画分を精製し、必要ならば適切なバッファーを使用して透析し、そしてタンパク質測定後に再度、純度について試験した。精製された融合タンパク質はアリコートで−２０℃に保存した。
【０３６６】
ＨＭＧＡ１ａ／ｂシュピーゲルマーとＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６との相互作用の測定
ＨＭＧＡ１ｂに対するＨＭＧＡ１ａ／ｂシュピーゲルマーの親和性のさらに詳細な分析のために、９６−ウェル形式に基づく試験を使用した。この試験では、ＨＭＧＡ１ａ／ｂシュピーゲルマーのＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６への結合が、ＨＭＧＡ１ａ／ｂへの結合部位を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドとの相互作用を防ぐ。このＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ  ＡＴフック）（Ｆａｓｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）は、ビオチン分子で１つの鎖を標識され、これを介してストレプトアビジンで被覆したプレートに結合することができる。ＤＮＡに結合したＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６の検出は、ニッケルで修飾した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｎｉｃｋｅｌ−ＨＲＰ）を用いて行い、これは蛍光基質を変換する。このアッセイでは、シュピーゲルマーが組換えＨＭＧＡ１ｂをその自然な結合パートナーと置き換わる。シュピーゲルマー／ｒＨＭＧＡ１ｂ／ｄｓＤＮＡ  ＡＴフックの１：１：１の化学量論により、ＨＭＧＡ１ｂに関するシュピーゲルマーの親和性に関する直接的な予測を行うことができる。アッセイの原理は図５で具体的に説明する。
【０３６７】
この試験を行うために、１００μｌの全容量中に様々な濃度のシュピーゲルマーおよびＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６（０．３６μｇ／ｍｌ；約３０ｎＭ）を振盪しながら室温で１０分間、テーパー付床板（ｔａｐｅｒｅｄ  ｆｌｏｏｒ）プレート中でインキュベーションする。またインキュベーション溶液は：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．０（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、オースチン、テキサス州、米国）、１４０ｍＭ  ＫＣｌ（アンビオン、オースチン、テキサス州、米国）、１２ｍＭ  ＮａＣｌ（アンビオン、オースチン、テキサス州、米国）、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２（アンビオン、オースチン、テキサス州、米国）、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ロッシュ、マンハイム、ドイツ）、１ｍＭ  ＤＴＴ（インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ）、１８−２０μｇ／ｍｌ  ポリ（ｄＧｄＣ）（シグマ、ダイゼンホーヘン、ドイツ）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ロッシュ、マンハイム、ドイツ）を含む。２μｌのビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドｄｓＤＮＡ  ＡＴフック（５’ビオチン−ＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣ（３４ｎｔ）および５’ＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴ（３１ｎｔ）の等モル混合物；次いで１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（アンビオン、オースチン、テキサス州、米国）中の７５μＭ）を加え、そして振盪しながら室温でさらに１０分間インキュベーションする。次いでバッチは、ストレプトアビジン（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）からのＲｅａｃｔｉＢｉｎｄ、ボン、ドイツ）で被覆した黒い９６ウェルプレートに移し、そして穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベーションする。この後、プレートのウェルを各回、２００μｌのＴＢＳＴＣＭ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．６（アンビオン、オースチン、テキサス州、米国）；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（アンビオン、オースチン、テキサス州、米国）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（アンビオン、オースチン、テキサス州、米国）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（シグマ、ダイゼンホーヘン、ドイツ）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ロッシュ、マンハイム、ドイツ））で３回洗浄する。５０μｌの希釈ニッケル−ＨＲＰ溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＤｅｔｅｃｔｏ
ｒ  ニッケル−ＨＲＰ、（メダック（Ｍｅｄａｃ）、ハンブルグ、ドイツ）（ＴＢＳＴＣＭ中、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ロッシュ、マンハイム、ドイツ）中の１：１０００）を各ウェルに加え、そして穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベーションする。次いでウェルを再度３回、各回２００μｌのＴＢＳＴＣＭで洗浄する。次いで１００μｌの蛍光性ＨＲＰ基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕｅ、ピアス、ボン、ドイツ）を各ウェルに加え、そして蛍光を１５分後に測定する（ｅｘ：３４０／ｅｍ：４０５ｎｍ）。
【０３６８】
結果
シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ（５０ｎｔ）、ＮＯＸ−ｆ（３３ｎｔ）およびＮＯＸ−ｆ（４８ｎｔ）は、濃度依存的様式でＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６のビオチン化ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドへの結合と競合することが示された（図６）。約１５ｎＭのＩＣ５０がシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａについて見いだされる。
【０３６９】
活性シュピーゲルマーとは対照的に、ＮＯＸ−Ａに対するインバース配列を含む対照シュピーゲルマーは、最高０．５μＭの濃度までＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６のＤＮＡオリゴヌクレオチドへの結合に効果を表さず、そしてＨＭＧＡ１ｂ−Ｈｉｓ６との非特異的相互作用は、１μＭより上の濃度で生じるだけである。（図７）。
【０３７０】
２．２  ウエスタンブロットによりＨＭＧＡ１ｂを検出するためのシュピーゲルマーの使用
実施／方法
組換えで発現したＨＭＧＡ１ｂは、１６％ＰＡＡ−トリシンゲルでのゲル電気泳動により分離し、そしてエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜へ移した。次いで膜を５％スキムミルクおよび１ｘＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ７．６、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ）中、１００ｎＭの非特異的シュピーゲルマーで１時間ブロックし、そして３回、１０分間、１ｘＴＢＳＴで洗浄した。組換えＨＭＧＡ１ｂの検出は、５’末端でビオチン化されたシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ（５’ｂｉｏＮＯＸ−Ａ）．を用いて行った。５’ｂｉｏＮＯＸ−Ａは、１ｍＭの各カルシウムおよびマグネシウム（ＴＢＳＴ＋Ｃａ／Ｍｇ）および１００ｎＭの非特異的シュピーゲルマーを含む１ｘＴＢＳＴで希釈し、そして１．５時間インキュベーションした。次いでブロットを３回、１０分間、１ｘＴＢＳＴ＋Ｃａ／Ｍｇで洗浄し、そして結合したビオチン化シュピーゲルマーを抗−ビオチン抗体とＴＢＳＴ＋Ｃａ／Ｍｇ中で４５分間インキュベーションした。次いでブロットを５回、１０分間、１ｘＴＢＳＴ＋Ｃａ／Ｍｇで洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にカップリングした２次抗体を、ＬｕｍｉＧＬＯ検出試薬（セルシグナリングテクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））により検出した。
【０３７１】
結果
５’−末端ビオチン化シュピーゲルマーの組換えで発現したＨＭＧＡ１ｂへの結合は、前記方法により証明された。抗体に基づく検出と同様に、５μｇのＨＭＧＡ１ｂを３ｎＭのｂｉｏ−ＮＯＸ−Ａを用いてブロット膜に移した後に検出した。ＮＯＸ−ＡのインバースシュピーゲルマーはＨＭＧＡ１ｂを認識できなかったが、これはＮＯＸ−Ａの特異的結合を確認する（図８）。
【０３７２】
実施例３：ＰＥＩ−シュピーゲルマー製剤
３．１  シュピーゲルマーのポリエチレンイミン−媒介性トランスフェクションの原理
標的分子ＨＭＧＡ１ａ／ｂは細胞質ゾルで発現され、そして転写因子としてその自然な結合パートナーである二本鎖ＤＮＡを細胞核中に見いだす。ＨＭＧＡ１ａ／ｂ−媒介性の細胞応答は、シュピーゲルマーの細胞質ゾル中のＨＭＧＡ１ａ／ｂへの結合により、そして細胞核中のＤＮＡに対するＡＴフックにより結合されたＨＭＧＡ１ａ／ｂとの競合によ
りアンタゴナイズされるはずである。形質膜の負電荷により、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子は細胞からの受動輸送により容易に取り込まれない。核酸による細胞内輸送に対する取り組みの１つは、全複合体の荷電を生じる荷電した粒子または試薬の縮合またはパッキングである。この複合体はエンドサイトーシスを通して容易に取り込まれ、すなわち細胞の細胞質ゾルを通過する。この方法の欠点は、ＤＮＡ／ＲＮＡの安定性であり、そしてエンドソーム区画から核酸の放出である。細胞の細胞質ゾル中でリソソームは、プロテアーゼまたはヌクレアーゼの導入により収縮したエンドソームから、そして区画のプロトン化により迅速に形成される。ヌクレアーゼはそこで核酸を消化し、そしてさらに核酸は酸性媒質中で安定ではない。全複合体はエキソサイトーシスにより細胞から再度、迅速に輸出され、そしてゴルジ装置中で分解され、したがってわずかな核酸が細胞に入るだけである。適切なトランスフェクション系のための前調整の１つは、このように安定化ならびにエンドソームから細胞質ゾルへの核酸の放出である。安定性に関して、ＲＮＡシュピーゲルマーは非天然のエナンチオマーであり、それらは酵素により分解されないので、真核細胞のトランスフェクションに理想的な特性を有する。
【０３７３】
選択したトランスフェクション系は、分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と核酸のミセルの形成に基づく。核酸のリン酸骨格は、ＰＥＩの遊離窒素位と相互作用し、そして架橋分岐により小さいミセルを形成し、これはＰＥＩによる正電荷を有する。これに関連して３〜８００ｋＤａの分子量を持つＰＥＩを使用する。ＰＥＩが小さいほど、形成されるミセルも小さい。２５ｋＤａの架橋分岐化ＰＥＩ（シグマ−アルドリチッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．４０；８７２−７）の使用は、１００ｎｍから最高５００ｎｍのサイズのポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘｅ）の形成に核酸の付加を導くが、典型的なポリプレックスのサイズは１００〜２００ｎｍである。原則として２：１〜５：１の窒素／ホスフェート比、場合により最高２０：１が使用される。ミセル中の核酸のパッキングは、複合体のゼータ電位の変化を３のＮ／Ｐ比で〜（＋）２１ｍＶまで生じる。複合体の正のゼータ電位を上げると、培養細胞に対する毒性が上がることが知られている。しかしこれらのミセルは、形質膜の収縮により細胞によりエンドソームとして容易に取り込まれる。ここでＰＥＩは流入するプロトンを緩衝し、その結果、エンドソーム内部の多くのクロライドイオンが浸透圧による区画の膨潤を導く。このＰＥＩの効果は、プロトンのスポンジ効果として文献に記載され（Ｓｏｎａｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２００３，Ｖｏｌ．２７８；  Ｎｏ．４５（７）ｐｐ．４４８２６−４４８３１）、そして最終的にはエンドソームの破壊、そしてシュピーゲルマーの細胞質ゾルへの放出を導く。
【０３７４】
核酸−ＰＥＩ複合体は、強い正の荷電により血清タンパク質との相互作用および凝集の傾向を有し、そしてまた前記の細胞毒性も現す。このように文献では高用量の核酸−ＰＥＩミセルは、ラットにおける皮下および静脈内注射後に迅速な肺への蓄積、そしてこのように塞栓症／梗塞を導く恐れがある。この問題の解決は、核酸を２ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導化することである。これらの残基は、シールドのようにミセルを囲み、そして血清タンパク質への結合を防止する（Ｏｇｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，６（５９５−６０５）。さらにゼータ電位が＋／−０ｍＶに下げられ、これがより低い細胞毒性を導くと同時に、プロトンスポンジ効果に関するＰＥＩの緩衝能を保持する。
【０３７５】
３．２  ＰＥＧ２０００を含むシュピーゲルマー活性
リード候補ＮＯＸ−ＡおよびＮＯＸ−ｆは、３’末端のアミノ基を有するアプタマーおよびシュピーゲルマーとして人工的に生産され、次いでアミノ基を介してペグ化された。平衡結合アッセイによりペグ化はアプタマーのＨＭＧＡ１ａ／ｂフラグメントへの結合特性に影響を及ぼさないことが示された。さらに組換え完全長ＨＭＧＡ１ａ／ｂとの競合アッセイによりシュピーゲルマーの完全長ＨＭＧＡ１ａ／ｂへの結合も３’末端のペグ化に非依存的であることが示された（図９）。
【０３７６】
３．３  シュピーゲルマーのパッキング
滅菌されたペグ化シュピーゲルマーのパッキングは、ＰＢＳ中で２５ｋＤａの架橋分岐化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（アルドリッチ、Ｃａｔ：４０，８７２−７）を、２．５：１（Ｎ／Ｐ  ２．５）の骨格のリボ核酸の絶対ホスフェートに対するＰＥＩの絶対窒素画分の比率で加えることにより行った。滅菌されたオートクレーブ処理済ＰＥＩ溶液は、２００ｍＭの遊離窒素基濃度を有し、そして１Ｍ塩酸でｐＨ７．４に調整された。滅菌濾過したシュピーゲルマーを最高７００μＭの濃度にＣａ／Ｍｇを含む１ｘＰＢＳ中に取り、そして滅菌濾過したＰＥＩの添加後、室温で３０〜６０分間インキュベーションした。理想的には複合体の形成は、高濃度のシュピーゲルマーが無作為に大きな凝集物を導くので、加えるシュピーゲルマー濃度を出来る限り小さく調整して形成する。シュピーゲルマーミセルの形成は、色素排除アッセイにより測定した。このために、どのくらいのシュピーゲルマーがミセルにパッキングされる前後の色素により検出できるかを測定した。リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）（Ｍ．プローブズ（Ｐｒｏｂｅｓ））を色素として使用し、そして蛍光をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。各場合で１μＭのシュピーゲルマーを１００μｌの１ｘＰＢＳに加え、そしてＰＥＩの量を上げながら加え。１００μｌの０．２μｇ／μｌリボグリーンを、蛍光に適した９６ウェルのマイクロタイタープレートに配置し、そしてミセルバッチを室温で３０分間インキュベーションした後、１０μｌをマイクロタイタープレートにピペットで入れた。２のＮ／Ｐ比から出発して、９０％より多くのシュピーゲルマーがミセルとして存在した（図１０）。これと関連して、ＰＥＩ単独では色素の蛍光に影響を及ぼさなかった。
【０３７７】
３．４  シュピーゲルマーミセルの安定性
１μＭのシュピーゲルマーミセルを、図１１に特定した条件下で保存した。シュピーゲルマーミセルの安定性は、３．３章に記載した色素排除アッセイにより測定した。ミセルの安定性実験は、異なる媒質中ならびに異なる温度でのミセルの保存がシュピーゲルマーミセルに影響を及ぼさないことを示した。リボザイムの特性を喪失しないリボザイム／ＰＥＩ複合体の凍結乾燥も文献に記載されている（Ｂｒｕｓ−Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００４，Ｆｅｂ，２０，９５（１），１９９−３１）。
【０３７８】
３．５  シュピーゲルマーミセルの取り込み
シュピーゲルマーミセルの細胞内取り込みは、ＨＳ５７８Ｔ細胞の細胞培養系で樹立された。１ｘ１０４のＨＳ５７８Ｔ細胞は、滅菌された２０ｍｍサイズのカバークラス上で３０〜４０％の集密度まで成長させた。５’−標識シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ−３’−ＰＥＧは２．５：１のＮ／Ｐ比でミセルにパックされ、１μＭの濃度で細胞に加え、そして３７℃で１６時間インキュベーションした。シュピーゲルマーの受動的取り込みの対照として、１μＭの純粋な蛍光標識シュピーゲルマーを各々の場合で細胞とインキュベーションした。次いで細胞を３回、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして３％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。調製物を再度３回、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、さらに１０〜２０秒間、ＤＡＰＩ溶液（１０ｍｌの１ｘＰＢＳに対する１μｌストック）とインキュベーションして、細胞核中のクロマチン（ｃｈｏｍａｔｉｎ）を染色し、もう一度洗浄し、そして溶液を乗せて覆った。このように調製した調製物を蛍光顕微鏡で分析した（発光４８８ｎｍ／吸光  ５１４−５２２ｎｍ）。
【０３７９】
シュピーゲルマーミセルは、「裸」の非パックシュピーゲルマーと比べて高いトランスフェクション率を有することが示された（図１２）。
【０３８０】
これと関連してトランスフェクション効率は、すべての細胞で９５％より高く、そして細胞の形態に影響を及ぼさなかった。５’−ＦＩＴＣ−カップリングシュピーゲルマーは主に細胞質ゾルで見いだされ、そして形質膜に付随した。点様の分布は、区画内への包含
および放出されたシュピーゲルマーの拡散パターン点を示す。わずかなシュピーゲルマーのシグナルが細胞核で検出できただけであった。
【０３８１】
３．６  シュピーゲルマーの放出
Ｈ５７８Ｔ細胞の細胞質ゾルおよび核周辺空間におけるシュピーゲルマーの点様の分布は、細胞の区画、例えばエンドソームにおける蓄積を指摘する。これらの区画からシュピーゲルマーの放出を検査するために、個々の大きく拡大した細胞の分布パターンを分析した（図１３）。シュピーゲルマーの点様の局在化に加えて、細胞質ゾルおよび形質膜上の拡散分布パターンが検出され、これはシュピーゲルマーのエンドソーム放出を指摘する。このパターンは「裸」のシュピーゲルマーの場合には見いだされなかった。
【０３８２】
実施例４：インビボでの生物活性
４．１ＰＥＩ無しでの増殖アッセイ
ＭＣＦ−７細胞の増殖に及ぼす効果
細胞分割におけるＨＭＧＡ１ａ／ｂの有力な役割は、増殖アッセイにより調査した。最初に、シュピーゲルマーを高用量で「裸」の核酸として細胞培養基に加え、そして細胞の成長を経時的に追跡した。乳癌細胞株ＭＣＦ−７は、ＨＭＧＡ１ａ／ｂの小さい（アンタゴナイジング）発現が見いだされ、そしてこれら細胞の増殖におけるＨＭＧＡ１ａ／ｂの役割が既に文献に記載されたので、モデルとしてこれらの細胞を使用した。Ｒｅｅｖｅｓ
ｅｔ  ａｌ（Ｒｅｅｖｅｓ−Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ  ２００１，ｐ５７５−５９４）は、ＭＣＦ−７細胞でのＨＭＧＡ１ａ／ｂの過剰発現が上昇した増殖を導き、そして発現したアンチセンス構築物によるＨＭＧＡ１ａ／ｂの阻害がＭＣＦ−７細胞の増殖を阻害することを示した。
【０３８３】
実施／方法
０．５ｘ１０４のＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ）を平らな透明基材の９６−ウェルプレート（コースター：Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、そして１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中で１６〜２４時間培養した。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてさらに４８時間、標準細胞培養基で培養し、滅菌濾過したシュピーゲルマーを直接添加した。これに続いて１０μｌのレザズリン溶液（ＰＢＳ中の０．４４ｍＭ）を各バッチに加え、そしてさらに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞の代謝によるレザズリンの変換は、細胞数と直接的に相関する。色の変化をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーディングデバイス（ＢＭＧ）で測定した（発光５４４ｎｍ、吸光５９０ｎｍ）。各値は、実験毎に３回測定し、そして未処理対照細胞の値を参照とした。
【０３８４】
結果
ＮＯＸ−Ａは２日後、用量依存的様式でＭＣＦ−７細胞の増殖を阻害した（ｎ＝１２）（図１４）。４０μＭで未処理細胞の約３０％の値まで増殖の最大阻害が見いだされた。
【０３８５】
４０μＭの濃度まで、インバース対照シュピーゲルマーの非特異的効果は見いだされなかった。
【０３８６】
４．２  ＰＥＩを用いた増殖アッセイ
Ｈ−１２９９細胞の増殖に及ぼすシュピーゲルマーミセルの効果
実施／方法
１ｘ１０４個のＮＣＩ−Ｈ−１２９９細胞（肺癌腫細胞；ＡＴＣＣ）を平らな透明基材の２４−ウェルプレート（コースター）に播種し、そして１０％のＦＣＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中で１６〜２４時間培養した。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてさらに３日間、１％ＦＣＳおよびシュピーゲルマーミセルを含有する細胞培養基で
培養した。滅菌したペグ化シュピーゲルマーのパッキングは、２５ｋＤａの架橋分岐化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（シグマ）を、２．５：１（Ｎ／Ｐ  ２．５）のリボ核酸骨格の絶対ホスフェートに対するＰＥＩの絶対窒素画分の比率で予めＰＢＳ中で加えることにより行った。滅菌されたシュピーゲルマーを３０μＭの濃度で使用し、そしてＰＥＩの添加後、室温で３０〜６０分間インキュベーションした。次いでシュピーゲルマーミセルは１μＭに１％ＦＣＳを含有する細胞培地で希釈し、洗浄した細胞に直接加え、そして３７℃で３日間インキュベーションした。
【０３８７】
これに続いて１００μｌのレザズリン溶液を各バッチに加え、そしてさらに３７℃で２時間インキュベーションした。細胞の代謝によるレザズリンの変換は、細胞数と直接的に相関する。バッチから１００μｌを取り出し、９６−ウェルプレートに移し、そして色の変化をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーディングデバイス（ＢＭＧ）で測定した（発光５４４ｎｍ、吸光５９０ｎｍ）。各値は、実験毎に２回測定し、そして未処理対照細胞の値を参照とした。
【０３８８】
結果
１μＭのシュピーゲルマーとのＰＥＩ（Ｎ／Ｐ  ２．５）の使用は、細胞増殖に最初は何の効果もなかった。細胞培養基中のＦＫＳの量を１％未満に減少させることにより、シュピーゲルマーミセルによるトランスフェクションはＨ−１２９９細胞の増殖に影響を及ぼし、これは以前に１０％ＦＫＳでは目で見ることはできなかった（図１５）。恐らくＦＫＳはわずかな効果が観察できなくなる程度まで増殖を刺激したのであろう。ＭＣＦ−７細胞中のＦＫＳ濃度の減少は、３日間にわたり細胞死を導く。
【０３８９】
４．３  腫瘍マーカーｃｄｃ２５ａの阻害（ＰＥＩを用いて）
有力な発癌遺伝子ｃｄｃ２５ａの例において、細胞周期因子のＨＭＧＡ１ａ／ｂ−媒介性の調節に及ぼす効果。
【０３９０】
Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ  ２００１，ｐ５７５−５９４）は、ＭＣＦ−７細胞におけるＨＭＧＡ１ａ／ｂの過剰発現を介するｃＤＮＡアレイにより、ＨＭＧＡ１ａ／ｂが多数の遺伝子の発現を誘導することを示した。同時に、細胞周期因子および例えばｃｄｃ２５ａのような増殖因子（細胞周期のＧ１期からＳ期への転移の制御において決定的な役割を果たす有力な発癌遺伝子（細胞分割周期２５ａホスファターゼ）として同定された）は、最高１００の因子まで過剰発現する。そのような制御点の活性化は、細胞周期の進行を阻害した後、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子の転写まで、あるいはＤＮＡ損傷が不可逆的である場合、アポトーシスの誘導までのいずれかを導く。Ｈ−１２９９細胞はＨＭＧＡ１ａ／ｂの増加した発現をすでに現したので、細胞培養試験系としてＨ−１２９９細胞がこの目的に選択された。
【０３９１】
実施／方法
１ｘ１０４個のＨ−１２９９細胞を、平らな透明基材の床面の２４−ウェルプレート（コースター）に播種し、そして１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で１６〜２４時間培養した（１ｍｌ容量）。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてさらに３日間、１０％ＦＣＳを含有するシュピーゲルマーミセルを含む細胞培養基で培養した。滅菌したペグ化シュピーゲルマーのパッキングは、２５ｋＤａの架橋分枝化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（シグマ）を、２．５：１（Ｎ／Ｐ  ２．５）のリボ核酸骨格の絶対ホスフェートに対するＰＥＩの絶対窒素画分の比率で加えることにより予めＰＢＳ中で行った。滅菌されたシュピーゲルマーを３０μＭの濃度で使用し、そしてＰＥＩの添加後、室温で３０〜６０分間インキュベーションした。次いでシュピーゲルマーミセルは１％ＦＣＳを含有する細胞培養基で個々の濃度に希釈し、洗浄した細胞に直接加え、そして３７℃で３日
間インキュベーションした。細胞を２回、ＰＢＳで洗浄し、そして細胞スクレーパーにより回収した。次いで細胞のｍＲＮＡは細胞からＲｏｔｉ−Ｑｕｉｃｋ−キット（ロス（Ｒｏｔｈ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．９７９．１）により単離し、そして０．２−１μｇの全ＲＮＡをｃｄｃ２５ａおよびＧＡＰＤＨのＰＣＲ用の鋳型として使用した。
【０３９２】
ＧＡＰＤＨの増幅用プライマーは、以下の通りであった：５１℃のアニーリング温度で、フォワードプライマー：５’−ＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＣＣ−３’およびリバースプライマー：５−ＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＡＧ−３’、ならびにｃｄｃ２５ａの増幅には５９℃のアニーリング温度で、フォワードプライマー：５’−ＧＡＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡ−３’およびリバースプライマー５’−ＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＴＡＡ−３’。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：０．２−０．７５μＭのプライマー、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ。各２回のＰＣＲサイクルで５μｌのアリコートをＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより定量し、そして負荷対照としてＧＡＰＤＨとの相関により評価した：このために各々の調査したサンプルに関する第１段階で、いわゆる参照遺伝子の「交差点」値（ＣＰ）を、調査した遺伝子のＣＰ値から差し引く（ｄＣＰ＝ＣＰ標的遺伝子−ＣＰ参照遺伝子）。ＣＰは定常的に定めた蛍光値に達するために必要なＰＣＲサイクルの数と定める。同量の新たに合成されたＤＮＡがすべての反応容器中のＣＰで見いだされる。この標準化後、対照（この場合ＧＡＰＤＨ）のｄＣＰ値を、実験で試験したサンプルのｄＣＰ値から差し引く；１つはいわゆる「デルタ−デルタＣＴ」計算モデルに達する。参照遺伝子に対して標準化され、そして標準サンプルと呼ばれる処置と対照との間のサンプルの相対的な発現の差異（比）は、計算式２−ｄｄＣＰから見いだされる。
【０３９３】
ｄＣＰ＝ＣＰ（ｃｄｃ２５ａ）−ＣＰ（ＧＡＰＤＨ）
ｄｄＣＰ＝ｄＣＰ（処理シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ）−ｄＣＰ（対照：ＰＢＳまたはＮＯＸ−Ａインバース）
比＝２−ｄｄＣＰ
【０３９４】
結果
ｃｄｃ２５ａおよびＨＭＧＡ１ａ／ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによりＭＣＦ−７およびＨ−１２９９細胞で検出された。ＨＭＧＡ１ａ／ｂの低い発現を示したＭＣＦ−７細胞は、ｃｄｃ２５ａの発現も低く、一方、ＨＭＧＡ１ａ／ｂおよびｃｄｃ２５ａはＨ−１２９９細胞で強く発現した。ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合シュピーゲルマーで２日間トランスフェクトしたＨ−１２９９細胞は、ｃｄｃ２５ａ  ｍＲＮＡの発現の有意な用量依存的減少を導いた（図１６および図１７）。
【０３９５】
４μＭの濃度まで、対照シュピーゲルマーはＧＡＰＤＨにもｃｄｃ２５ａ  ｍＲＮＡ発現にも非特異的効果を現さなかった。これから、有力な発癌遺伝子ｃｄｃ２５のＨＭＧＡ１ａ／ｂ誘導型の過剰発現は、シュピーゲルマーにより阻害することができると結論づけることができる。
【０３９６】
実施例５．効力実験：異種移植モデル
インビボでの腫瘍成長に及ぼすシュピーゲルマーの効果
ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合シュピーゲルマーがインビボでの腫瘍の成長を阻害するという仮説を試験するために、強力にＨＭＧＡ１ａ／ｂを発現する膵臓癌腫細胞ＰＳＮ−１について異種移植モデルを開発した。このモデルに基づき、治療実験は２．５のＮ／Ｐで２ｍｇ／ｋｇのＮＯＸ−Ａシュピーゲルマーミセルを用いて行った（実施例３、３．３項を参照されたい）。
【０３９７】
実施／方法
オスの裸マウス（ＮＭＲＩ：ｎｕ／ｎｕ）（群のサイズ  ｎ＝８）には、各々の場合で脇に１０７のＰＳＮ−１細胞（ＥＣＡＣＣ）が皮下注射され、そして腫瘍の成長が２２日にわたり観察された。動物は２５〜２７ｇの平均体重を有し、そして６〜８週齢であった。ＩＮＶ−３’ＰＥＧ中の活性シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ−３’ＰＥＧおよびインバース対照シュピーゲルマーは、２．５のＮ／Ｐ比でＰＥＩを加えることにより上記のようにミセルにパックされた。１００μｌのシュピーゲルマーミセル懸濁液（３．４６ｎｍｏｌ／動物または２ｍｇ／ｋｇに相当する）は、各々の場合で毎日、腫瘍の付近に皮下注射された。腫瘍容積および体重を１週間に３回測定した。動物は２２日に屠殺され、そして血漿、肝臓、腎臓および腫瘍中のＮＯＸ−Ａ分布が定量された。
【０３９８】
このために、組織をハイブリダイゼーションバッファー（０．５×ＳＳＣ  ｐＨ  ７．０；０．５（重量／容量）％  ＳＤサルコシン酸）中で均一化し、そして１０分間、４０００×ｇで遠心した。得られた上清を−２０℃でさらに使用するまで保存した。
【０３９９】
血漿サンプル中および組織ホモジネート中のシュピーゲルマーの量は、ハイブリダイゼーションアッセイにより調査した（Ｄｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１７：１５０３）。ハイブリダイゼーションアッセイは以下の原理に基づく：検出すべきシュピーゲルマー（Ｌ−ＲＮＡ分子）を、固定化Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（＝捕捉プローブＮＯＸ−Ａ；この場合：５’−ＣＣＣＡＴＡＴＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＮＨ２−３’；ＨＭＧＡ１ａ／ｂ−ＮＯＸ−Ａの５’末端に相補的）にハイブリダイズさせ、そしてビオチン化検出Ｌ−ＤＮＡプローブ（＝検出用プローブＮＯＸ−Ａ；この場合：５’ビオチン−ＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＧＧ−３’；ＨＭＧＡ１ａ／ｂ−ＮＯＸ−Ａの３’末端に相補的）で検出する。このために、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートをさらなる工程で複合体に結合させる。化学発光物質を加えた後、光が生じ、そしてルミノメーターで測定する。
【０４００】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化：１００μｌの捕捉プローブ（カップリングバッファー中０．７５ｐｍｏｌｅ／ｍｌ：５００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ８．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）をＤＮＡ−ＢＩＮＤプレート（コーニング  コースター）内の各ウェルに移し（プレート中に押し下げる）、そして４℃で一晩インキュベーションした。次いでプローブを３回、各回２００μｌのカップリングバッファーで洗浄し、そして３７℃で１時間、各々の場合で２００μｌのブロッキングバッファー（カップリングバッファー中、０．５（重量／容量）％ＢＳＡ）とインキュベーションした。再度２００μｌのカップリングバッファー、および３×２００μｌのハイブリダイゼーションバッファーで洗浄した後、プレートを検出に使用することができる。
【０４０１】
ハイブリダイゼーションおよび検出：１０μｌのＥＤＴＡ血漿または組織ホモジネートを、９０μｌの検出バッファー（ハイブリダイゼーションバッファー中、２ｐｍｏｌｅ／μｌの検出用プローブ）と混合し、そして遠心した。さらなる精製は必要に応じて行った。次いでバッチを１０分間、９５℃で変性させ、適切に調製されたＤＮＡ−ＢＩＮＤウェル（上記参照）に移し、そして約４０℃で４５分間インキュベーションした。次いで以下の洗浄工程を行った：２×２００μｌのハイブリダイゼーションバッファー、そして３×２００μｌの１×ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．６、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．１（容量／容量）％のＴｗｅｅｎ２０）。１μｌのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を５ｍｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した。１００μｌの希釈したコンジュゲートを各ウェルに加え、そして室温で１時間インキュベーションした。次いで以下の洗浄工程を行った：２×２００μｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０、そして２×２００μｌのアッセイバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ９．８、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。次いで１００μ
ｌのＣＳＰＤ  ”レディ−−トゥ−ユース−基質（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｕｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）”（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を加え、室温で３０分間インキュベーションし、そして化学発光をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーディングデバイス（ＢＭＧ）で測定した。
【０４０２】
結果
予備実験では、移植後にＨ−１２９９細胞は腫瘍がＰＳＮ−１よりもなかりゆっくりと成長し、そして個々の動物を比べると不均一な腫瘍の成長を現したので、処置実験の異種移植モデルには適当でないようであることが示された。ＰＳＮ−１細胞は、２２日までに活発な腫瘍の成長を現した。ＮＯＸ−Ａミセルは、ＰＢＳ対照と比べて２ｍｇ／ｋｇの用量でＰＳＮ−１腫瘍の成長を有意に減少させることが示された（図１８）。動物の体重は、シュピーゲルマーミセルでの処置による影響を受けなかった。対照シュピーゲルマーは腫瘍成長の非特異的阻害を現さず、そして同様に動物の体重に効果を及ぼさなかった。腫瘍サイズの差異は、ＮＯＸ−Ａ３’ＰＥＧミセルでの処置の１０日目から、未処理動物と比べて有意、または高度に有意であった（ＰＢＳ対照（スチューデントのｔ−検定）。２２日後の終点分析では、腫瘍の成長に高度に有意な特異的減少が示された（ＰＢＳに比べてｐ＝０．００９８、そしてインバース対照シュピーゲルマーに比べてｐ＝０．０２２）（図１９）。ＰＢＳで処置したマウスは、２．５ｃｍ３の平均腫瘍成長を示し、対照シュピーゲルマーで処置した動物は、２．６ｃｍ３の平均腫瘍容積を有し、そしてＮＯＸ−Ａで処置した動物は、２２日後に１．２ｃｍ３の平均腫瘍容積を有した（箱ヒゲ分析）。これは５０％より高い腫瘍成長の減少に相当する。
【０４０３】
ＮＯＸ−Ａの組織分布の分析は、腫瘍中の高濃度を示した（図２０）。
【０４０４】
実施例６：パックされた、およびパックされていないシュピーゲルマーのインビボ組織分布の比較
シュピーゲルマーミセルの効率的取り込みを検査するために、非機能的シュピーゲルマー（プルーフ  オブ  コンセプト：Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  Ｃｏｎｃｅｐｔ＝ＰＯＣ）を３’末端でＰＥＧ２ｋＤａによりペグ化し、そして２．５の窒素／ホスフェート比（Ｎ／Ｐ）でミセルにパックした。（実施例３、３．３項を参照）。実施例５に記載するプロトコールに準じて、この取り組みはミセルにパックされたシュピーゲルマー、ならびに遊離のミセルにパックされていないシュピーゲルマーに採用した。
【０４０５】
実施／方法
オスの裸マウス（ＮＭＲＩ：ｎｕ／ｎｕ）（群のサイズｎ＝８）を各々の場合で脇に１０７個のＰＳＮ−１細胞（ＥＣＡＣＣ）を皮下注射し、そして腫瘍の成長を２５日にわたり観察した。動物は２５〜２７ｇの平均体重を有し、そして６〜８週齢であった。非機能的シュピーゲルマーＰＯＣ−３’ＰＥＧは、上記のようにＰＥＩを２．５のＮ／Ｐ比で加えることによりミセルにパックした。ミセルにパックしなかったシュピーゲルマーＰＯＣ−３’ＰＥＧは、ＰＥＩにより媒介されない取り込みの対照として役立てた。１００μｌのシュピーゲルマー−ミセル懸濁液またはシュピーゲルマー溶液（１５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇおよび２０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇに相当）は毎日、腫瘍の付近に皮下注射した。腫瘍容積および体重を１週間に３回測定した。最後の注射から２４および９６時間後、各群から２匹の動物を屠殺し、そして血漿、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、胆嚢、膵臓および腫瘍中のＰＯＣ−３’ＰＥＧ（パックした／非パック）の分布を定量した。
【０４０６】
このために、組織をハイブリダイゼーションバッファー（０．５×ＳＳＣ  ｐＨ  ７．０；０．５（重量／容量）％ＳＤサルコシネート）で均一化し、そして４０００ｘ  ｇで１０分間、遠心した。生じた上清はさらに使用するまで−２０℃で保存した。
【０４０７】
血漿サンプル中および組織ホモジネート中のシュピーゲルマーの量は、ハイブリダイゼーションアッセイ（Ｄｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１７：１５０３）により調査した。このアッセイは以下の原理に基づく：検出するシュピーゲルマー（Ｌ−ＲＮＡ分子）を、固定化Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（＝捕捉プローブＰＯＣ；ここで：５’−ＮＨ２（Ｃ７）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴ−３’；ＰＯＣの３’末端に相補的）上にハイブリダイズさせ、そしてビオチン化検出Ｌ−ＤＮＡプローブ（＝検出用プローブＰＯＣ；ここで：５’−ＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴ−ビオチン−３’；ＰＯＣの５’末端に相補的）で検出する。このために、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートをさらなる工程で複合体に結合させた。化学発光基質を加えた後、光が生じ、そしてルミノメーターで測定する。
【０４０８】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化：１００μｌのＰＯＣ捕捉プローブ（カップリングバッファー中０．７５ｐｍｏｌｅ／ｍｌ：５００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８．５，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、ＤＮＡ−ＢＩＮＤプレート（コーニング  コスター）中の各ウェルに移し（プレート中に押し下げる）、そして４℃で一晩インキュベーションした。次いでプローブを３回、２００μｌのカップリングバッファーで洗浄し、そして３７℃で１時間、２００μｌのブロッキングバッファー（カップリングバッファー中、０．５（重量／容量）％のＢＳＡ）とインキュベーションした。再度、２００μｌのカップリングバッファーおよび３×２００μｌのハイブリダイゼーションバッファーで洗浄した後、プレートを検出に使用することができる。
【０４０９】
ハイブリダイゼーションおよび検出：１０μｌのＥＤＴＡ血漿または組織ホモジネートを、９０μｌの検出バッファー（ハイブリダイゼーションバッファー中、２ｐｍｏｌｅ／μｌのＰＯＣ検出用プローブ）と混合し、そして遠心した。さらなる精製は必要に応じて行った。次いでバッチを１０分間、９５℃で変性させ、適切に調製したＤＮＡ−ＢＩＮＤウェル（上記参照）に移し、そして約４０℃で４５分間、インキュベーションした。次いで以下の洗浄工程を行った：２×２００μｌのハイブリダイゼーションバッファー、そして３×２００μｌの１×ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．６，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１（容量／容量）％のＴｗｅｅｎ２０）。１μｌのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート（プロメガ）を５ｍｌの１×ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した。１００μｌの希釈したコンジュゲートを各ウェルに加え、そして室温で１時間インキュベーションした。次いで以下の洗浄工程を行った：２×２００μｌの１×ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０、そして２×２００μｌの１ｘアッセイバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ９．８，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。次いで１００μｌのＣＳＰＤ  ”レディ−トゥ−ユース基質”（アプライドバイオシステムズ）を加え、室温で３０分間インキュベーションし、そして化学発光をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーディングデバイス（ＢＭＧ）で測定した。
【０４１０】
結果
ミセルにパックされた非機能的シュピーゲルマーＰＯＣ−３’ＰＥＧの重量分布の分析は、２４時間後に、非パックシュピーゲルマー（０．８４０  ＋／−  ０．２５５ｐｍｏｌｅ／ｍｇ）に比べて腫瘍組織（２４．９２５＋／−１３．３０１ｐｍｏｌｅ／ｍｇ）中で有意に高い濃度を示した（図２１Ａ）。一方、パックされたシュピーゲルマーの濃度はさらに３日後に（９６時間）半分となり（１１．３２５  ＋／−７．０５０ｐｍｏｌｅ／ｍｇ）、大変少量の非パックシュピーゲルマーを検出することができただけであった（０．１２０  ＋／−  ０．０５７ｐｍｏｌｅ／ｍｇ）。
【０４１１】
２４時間後の非パックシュピーゲルマーの血漿レベル（２．９５０  ＋／−０．４３８ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）は、ＰＥＩ−パックシュピーゲルマーのレベルに匹敵した（１．９３
０  ＋／−  ２．７２９ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）。９６時間後、明確な差異が見いだされ、ここで非パックシュピーゲルマーに比べて約４倍量のパック化シュピーゲルマーが検出された。
【０４１２】
両製剤について、腎臓におけるわずかな蓄積が２４時間後に観察され、一方、肝臓および胆嚢におけるわずかな蓄積が非パックシュピーゲルマーで見いだされた。両製剤について９６時間後、わずかな量のシュピーゲルマーが肝臓および腎臓で検出されただけであった。一方、非パックシュピーゲルマーに比べてパックされたシュピーゲルマーについて胆嚢および膵臓でわずかに上昇した値が見いだされた（しかし高い標準偏差であった）。
【０４１３】
まとめると、ＰＥＩの存在および不存在下で、シュピーゲルマーの重量分布に比べて（最後の注射から２４および９６時間後）、シュピーゲルマーミセルは非パック材料と比べて血漿および腫瘍中で有意に延長された滞在時間を有することが見いだされ（図２１Ｂ）、したがってこれは細胞内標的分子に対して向けられたシュピーゲルマーの使用に対する有望な取り組みであることを表す。
【０４１４】
以下を引用は参照により本明細書に編入する。
Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００３；３８，１１４４−９Ａｂｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１１６９−１１７４
Ａｂｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：３１１７−３１２２
Ａｂｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ（２００２）．Ｐａｎｃｒｅａｓ  ２５：１９８−２０４
Ａｎａｎｄ  Ａ  ＆  Ｃｈａｄａ  Ｋ（２０００）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４
Ｂａｌｃｅｒｃａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｏｓｔｅｐｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５；５１（３）：２６１−９
Ｂａｌｃｅｒｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ  ２００３；  １９９，６４１−６
Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ（２００３）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：２２２５−２２３８
Ｂａｎｄｉｅｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：４２６−４３１
Ｂａｔｔｉｓｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：３７７−３８５
Ｂｅｌｇｅ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  Ｒｅｐ  １６Ｂｅｒｌｉｎｇｉｅｒｉ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：１５４５−１５５３
Ｂｉｒｄｓａｌ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎ  Ｃｙｔｏｇｅｎ  ６０：７４−７７
Ｂｒｉｄｇｅ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  １６：２１５−２１９
Ｂｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ  Ｇｙｎｅｖｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００６  Ｊａｎ，６５−９
Ｂｕｌｌｅｒｄｉｅｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  ４５
Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓ  ＭＪＧ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５１
Ｃｈａｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ（２００４）．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，７５６，３５５
Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ，２００５  Ｏｃｔ，１７６４−７０Ｃｈａｕ  ＫＹ  ｅｔ  ａｌ（２０００）．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０
Ｃｈａｕ  ＫＹ  ｅｔ  ａｌ（２００３）．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ９
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ２００４  Ｊａｎ，３０−３
Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ｎｏｖ，７６３４−４４
Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：１３０７−１３１４
Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：２４３９−２４４６
Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：４１９３−４１９８
Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９１：１４７−１５１
Ｃｈｉｎ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３１
Ｃｈｕｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｋｅｉｏ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４  Ｊｕｎ，９０−７
Ｃｕｆｆ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０８
Ｃｚｙｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ  Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  ２００４，Ｊｕｎ，１９３−７
Ｄａｌ  Ｃｉｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：１３１−１３３
Ｄａｌ  Ｃｉｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：１５６５−１５６８
Ｄｉａｎａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６
Ｄｏｌｄｅ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ（２００２）．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ７１
Ｄｏｎａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２００４  Ｊｕｎ，１２０９−１３
Ｄｕ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）．Ｃｅｌｌ  ７４
Ｅｖａｎｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ８８
Ｆｅｄｅｌｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：１８９６−１９０１
Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １３８：１１９９−１２０７
Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２
Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２２０−２２３
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Ｓａｒｈａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｍａｒ  ６  ２００６，Ｅｐｕｐ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ
Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ，２００５；２０１，３３３−９
Ｓｃａｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（２０００）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７
Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７，８７３−８６Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ，２００５；２０１，１０１−７
Ｓｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ  ＥＦＰＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ
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Ｓｇａｒｒａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２００４）．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７４
Ｓｒｅｅｋａｎｔａｉａｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ４５
Ｓｒｅｅｋａｎｔａｉａｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５
Ｓｔａａｔｓ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ３８
Ｔａｍｉｍｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７４
Ｔａｐａｓｓｏ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１
Ｔａｒｂｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：３２２１−３２２８
Ｔｈａｎｏｓ  Ｄ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ（１９９２）．Ｃｅｌｌ  ７１：７７７−７８９
Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ２３
Ｖａｌｌｏｎｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）．ＥＭＢＯ  Ｊ  １６：５３１０−５３２１
Ｖａｎ  Ｍａｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２００６，９８−１０５
Ｖａｎｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ３２：３３−３４
Ｖａｎｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ６８：３２−３３
Ｗａｌｔｅｒ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ４１
Ｗｏｌｆｆｅ  ＡＰ（１９９４）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１１００−１１０１
Ｗｏｏｄ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ（２０００ａ）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：４２５６−４２６１
Ｗｏｏｄ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ（２０００ｂ）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０
Ｘｉａｎｇ  ＹＹ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７４
Ｚｈｏｕ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）．Ｎａｔｕｒｅ  ３７６
【０４１５】
前述の説明、請求の範囲および図面で開示された本発明の特徴は、様々なその態様で本発明を実施するために個別に、ならび組み合わせた両方で本質的となる。
【図面の簡単な説明】
【０４１６】
【図１Ａ】２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂドメインに結合するＤ−２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂに対してインビトロ選択により生成されたアプタマーを示す。
【図１Ｂ】２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂドメインに結合するＤ−２１ＡＳ−ＨＭＧＡ１ａ／ｂに対してインビトロ選択により生成されたアプタマーの同定された反復して存在する配列領域の表示である。
【図２】ＨＭＧＡ１ａ／ｂとＨＭＧＡ２との配列比較である。
【図３】ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合アプタマー  ＮＯＸ−ｆの短縮化である。
【図４】短縮化ＨＭＧＡ１ａ／ｂ結合アプタマー  ＮＯＸ−ｆの結合特性を表す。
【図５】マルチウェルプレートアッセイにおいて二重鎖天然標的ＤＮＡへのＨＭＧＡの結合を測定するための競合アッセイを示す。
【図６】競合的マルチウェルプレートアッセイにおいて、シュピーゲルマーＮＯＸ−ＡとシュピーゲルマーＮＯＸ−ｆの比較を表す（４８ｎｔ；３３ｎｔ）。
【図７】競合的マルチ−ウェルプレートアッセイにおいて、２ｋＤａ−ＰＥＧ−カップリング化シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａならびに非機能的対照シュピーゲルマーの活性を示す。
【図８】ウエスタンブロットを表す。
【図９】競合マルチ−ウェルプレートアッセイにおける遊離およびペグ化シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａの活性を表す。
【図１０】“リボグリーン排除アッセイ（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）”におけるミセル中へのペグ化シュピーゲルマーのパッキングの調査である。
【図１１】“リボグリーン排除アッセイ”におけるＰＥＩシュピーゲルマーミセルの安定性を示す。
【図１２】ＰＥＩミセルにパックされたシュピーゲルマーの効率的取り組みを示す。
【図１３】エンドソーム区画からのシュピーゲルマーの放出を表す。
【図１４】「裸」のシュピーゲルマーを用いた増殖アッセイである。
【図１５】ＮＯＸ−Ａ−２ｋＤａ  ＰＥＧでパックしたＰＥＩで処置した後のＨ１２９９細胞（「非小細胞肺ガン」）の増殖を表す。
【図１６】定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出されたＨＭＧＡ１ａ／ｂ誘導型ｃｄｃ２５ａ遺伝子発現の阻害を表す。
【図１７】シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａによるｃｄｃ２５ａ  ｍＲＮＡ発現の用量依存的阻害を表す。
【図１８】シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａによる裸のマウスを対象とした異種移植片モデルでの腫瘍成長の阻害を表す。
【図１９】異種移植片実験からのデータの統計的分析を表す。
【図２０】異種移植片実験でのシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａの組織分布を表す。
【図２１】異種移植片実験で最後に注射されてから２４および９６時間後のミセルにパックされたシュピーゲルマーおよびパックされていないシュピーゲルマーの組織分布を表す。
【図２２】異種移植片実験で最後に注射されてから２４および９６時間後の、ミセルにパックされたシュピーゲルマーおよびパックされていないシュピーゲルマーの血漿および腫瘍における分析を表す。
【図１Ａ】
0005766750.tif 000035
【図１Ｂ】
0005766750.tif 000036
【図２】
0005766750.tif 000037
【図３】
0005766750.tif 000038
【図４】
0005766750.tif 000039
【図５】
0005766750.tif 000040
【図６】
0005766750.tif 000041
【図７】
0005766750.tif 000042
【図８】
0005766750.tif 000043
【図９】
0005766750.tif 000044
【図１０】
0005766750.tif 000045
【図１１】
0005766750.tif 000046
【図１２】
0005766750.tif 000047
【図１３】
0005766750.tif 000048
【図１４】
0005766750.tif 000049
【図１５】
0005766750.tif 000050
【図１６】
0005766750.tif 000051
【図１７】
0005766750.tif 000052
【図１８】
0005766750.tif 000053
【図１９】
0005766750.tif 000054
【図２０】
0005766750.tif 000055
【図２１】
0005766750.tif 000056
【図２２】
0005766750.tif 000057
【配列表】
0005766750000001.app