(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子を含み、かつ血清型５、１１ａ、２６、３４、３５、４９、もしくは５０の組換えヒトアデノウイルス、または組換えサルアデノウイルスである、組換えアデノウイルス粒子を含む組成物において、前記組成物中のアデノウイルス粒子の少なくとも９９％のゲノムが５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記組換えアデノウイルスが、血清型５、２６、３５、４９、または５０の組換えヒトアデノウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組換えアデノウイルスが、血清型２６または３５の組換えヒトアデノウイルスである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
医薬組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組換えアデノウイルスが、Ｅ１領域の少なくとも一部を欠失している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１×１０７個の組換えアデノウイルス粒子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
組換えアデノウイルス粒子のバッチであって、前記バッチ中の前記アデノウイルス粒子の少なくとも９９％がそのゲノムの５’末端に同じヌクレオチド配列を有し、かつ前記アデノウイルスが導入遺伝子を含むバッチを調製するための方法であって、
ａ）分子クローニングステップを実施して、アデノウイルスゲノムのＣＴＡＴＣＴＡＴでない天然の５’末端を、末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む改変５’末端と交換するステップと、
ｂ）前記改変５’末端を有する組換えアデノウイルスを宿主細胞中で増殖させるステップと、
ｃ）前記組換えアデノウイルスを回収して、バッチ中のアデノウイルス粒子の少なくとも９９％がそのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを有する、組換えアデノウイルス粒子のバッチを得るステップと
を含む方法。
【請求項８】
組換えアデノウイルス粒子のバッチであって、前記バッチ中の前記アデノウイルス粒子の少なくとも９９％がそのゲノムの５’末端に同じヌクレオチド配列を有し、かつ前記アデノウイルスが導入遺伝子を含むバッチを調製するための方法であって、
ａ）アデノウイルスのプラーク精製を実施して、単一プラークからアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスを単離するステップであって、前記組換えアデノウイルスは、血清型５、１１ａ、２６、３４、３５、４９、もしくは５０の組換えヒトアデノウイルス、または組換えサルアデノウイルスであり、前記アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスが、そのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを有する、ステップと、
ｂ）ステップａ）の単一プラークから得られた組換えアデノウイルスを宿主細胞中で増殖させるステップと、
ｃ）前記組換えアデノウイルスを回収して、バッチ中のアデノウイルス粒子の少なくとも９９％がそのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを有する、組換えアデノウイルス粒子のバッチを得るステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記バッチが少なくとも１×１０７個の組換えアデノウイルス粒子を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えアデノウイルスが、血清型５、２６、３５、４９、または５０の組換えヒトアデノウイルスである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えアデノウイルスが、血清型２６または３５の組換えヒトアデノウイルスである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えアデノウイルスが、Ｅ１領域の少なくとも一部を欠失している、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えアデノウイルスを精製するステップをさらに含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えアデノウイルスを医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）がバイオリアクター中で実施される、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１×１０８個の組換えアデノウイルス粒子を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１×１０９個の組換えアデノウイルス粒子を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも１×１０１０個の組換えアデノウイルス粒子を含む、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療の分野、ならびにワクチン接種および遺伝子治療に適用するための遺伝子送達の分野に関する。より具体的には、本発明は組換えアデノウイルスベクターのバッチに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えヒトおよび動物アデノウイルスは、遺伝子治療およびワクチン接種に適用するために広範囲に使用されている。アデノウイルスベクターは、例えば免疫応答を誘発する所望の抗原をコードする遺伝子またはその一部を発現させるために、宿主細胞に導入する目的遺伝子の担体として使用される。
【０００３】
５０種を超える、異なるヒトアデノウイルスの血清型が同定されている。これらの中で、歴史的には、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）が、遺伝子担体としての使用について最も広範囲に研究されている。最近、ヒトＡｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０などの他の数種の血清型およびサルアデノウイルスが、ヒト母集団の中で、これらの血清型に対する既存の中和抗体のレベルが低いことが考慮されて、ベクターとして研究されている（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレットを参照のこと）。これらの中で有望な例は、組換えＡｄ３５（ｒＡｄ３５）およびｒＡｄ２６であり、これらは臨床試験で研究されている。
【０００４】
約３４〜３８ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを保有するアデノウイルスの分子生物学が詳細に研究されている。アデノウイルスはすべて、サイズが約１００ｂｐの種々の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）により特徴づけられており（Ｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２２：１７５−１７９；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７２：１３１−１６４）、これは、相異なる群の血清型の間で保存されている（Ｓｈｉｎａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ  ５５：８５−９３）。ゲノム末端は、ゲノムの５’末端で末端タンパク質（ＴＰ）に共有結合している。ＩＴＲは、複製起点を包含し、（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６：２１１５−２１２４；Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ  ＆  Ｒａｗｌｉｎｓ，１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：１００−１０４；Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：３０６９−３０７３；Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ｈａｙ，１９８８，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１：５７−６７；Ｈａｙ，１９８５，ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：４２１−４２６；ｖａｎ  Ｂｅｒｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１：１９７５−１９８９；Ｗａｎｇ  ＆  Ｐｅａｒｓｏｎ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：５１７３−５１８７）ＤＮＡ複製にとって重要であり、複製を促進する細胞タンパク質に対する結合部位を含有し、またパンハンドル形成を促進する。ＩＴＲ配列は、ヌクレオチド９〜１８の範囲の高度に保存された短い標準「コア領域」を保有する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。しかしながら、このコア領域の前にある末端８ヌクレオチドは、アデノウイルスの型および分離株の間で異なる（Ａｌｅｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｇｅｎｅ  １８：１９３−１９７；Ｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：３３６１−３３６６；Ｐｕｒｋａｙａｓｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４３：３０８３−３０９４；Ｒａｄｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：５５３−５６２；Ｓｈｉｎａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，上記；Ｓｈｉｎａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２５：４９１−４９５；Ｓｈｉｎａｇａｗａ  ＆  Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：３８３１−３８３５；Ｔｏｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｇｅｎｅ  １８：３２９−３３４；Ｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３５：３８１−３８７）。ほとんどのアデノウイルスの末端８ヌクレオチドはＣＡＴＣＡＴＣＡ配列であるが、いくつかの代替配列の記載もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
組換えアデノウイルスに対する要求は、これらの遺伝子移入ビヒクルを使用する治療または予防が適用可能に見える疾患が多様であることと、多くの人々がこれらの疾患に冒され、世界中でその人数がなお増加していることから、急速に高まっている。
【０００６】
ヒトに投与することを目的とする臨床バッチの場合、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）の大規模製造は、安全かつ効果的で、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）ガイドラインに準拠しなければならない。この点で重要な１つの側面は、そのように製造されたｒＡｄバッチの均一性である。
【０００７】
ここで、驚くべきことに、特定のｒＡｄに由来するゲノムの５’末端上の最大で８個の末端塩基の配列に変化があることが見出され、その結果、これらの配列に関して不均一性を示すバッチが得られたことを、本明細書に報告する。
【０００８】
したがって、均一性が改善した、大規模なｒＡｄバッチを提供する必要性が依然として存在する。本発明は、そのようなバッチおよびそれを得るための方法を提供する。加えて、本発明のバッチ中のｒＡｄは、製造工程での再現性が改善されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、血清型５、１１ａ、２６、３４、３５、４８、４９、もしくは５０の組換えヒトアデノウイルス、または組換えサルアデノウイルスである、複数の組換えアデノウイルス粒子を含む組成物であって、前記組成物中の基本的にすべてのアデノウイルス粒子のゲノムが５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むことを特徴とする組成物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、そのゲノムの５’末端に基本的にまったく同じヌクレオチド配列を有する、（好ましくは少なくとも１×１０７個の）組換えアデノウイルス粒子のバッチを調製するための方法であって、ａ）分子クローニングステップを実施して、アデノウイルスゲノムの天然の５’末端を、末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む改変５’末端と交換するステップと、ｂ）この改変５’末端を有する組換えアデノウイルスを宿主細胞中で増殖させるステップと、ｃ）この組換えアデノウイルスを回収して、基本的にすべてがその５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む、組換えアデノウイルス粒子のバッチを得るステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、そのゲノムの５’末端に基本的にまったく同じヌクレオチド配列を有する、組換えアデノウイルス粒子のバッチを調製するための方法であって、ａ）アデノウイルスのプラーク精製を実施して、単一プラークからアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスを単離するステップであって、組換えアデノウイルスは、血清型５、１１ａ、２６、３４、３５、４８、４９、もしくは５０の組換えヒトアデノウイルス、または組換えサルアデノウイルスであり、前記アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスは、そのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むステップと、ｂ）ステップａ）の単一プラークから得られた組換えアデノウイルスを宿主細胞中で増殖させるステップと、ｃ）この組換えアデノウイルスを回収して、基本的にすべてがそのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む、組換えアデノウイルス粒子のバッチを得るステップとを含む方法を提供する。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明の組成物または方法における組換えアデノウイルスは、組換えヒトアデノウイルスであり、好ましくはヒトアデノウイルス血清型３、４、７、８、９、１１ｐ、１５、２１、２９、３７でも、５３でもない。特定の実施形態では、本発明の組成物または方法における組換えアデノウイルスは、血清型５、２６、３５、４９、または５０の組換えヒトアデノウイルスである。好ましくは、組換えアデノウイルスは、血清型２６または３５の組換えヒトアデノウイルスである。
【００１３】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１領域の少なくとも一部を欠失している。
【００１４】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは導入遺伝子を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスの組成物またはバッチは、少なくとも１×１０７個、好ましくは少なくとも１×１０８個、好ましくは少なくとも１×１０９個、好ましくは少なくとも１×１０１０個の組換えアデノウイルス粒子を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、好ましくは約２リットル〜２００００リットルの間の容量を有するバイオリアクターで実施される。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の方法は、組換えアデノウイルスを精製するステップをさらに含む。
【００１８】
本発明の組成物または方法の特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは医薬組成物に製剤化される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】代替ＩＴＲ配列の出現を示す図である。詳細については、実施例３を参照されたい。
【図１−２】代替ＩＴＲ配列の出現を示す図である。詳細については、実施例３を参照されたい。
【図２】代替およびオリジナルＩＴＲ配列を有するＡｄ３５およびＡｄ５ベクターの複製カイネティクスを示すグラフである。詳細については、実施例５を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
驚くべきことに、最初は他の末端配列を含有していた種々の組換えアデノウイルスの数回継代後に、特定の５’末端配列（ＣＴＡＴＣＴＡＴ）が見出されること、およびこの配列の存在が、アデノウイルス製造の改善に寄与し得ることを本明細書で説明する。
【００２１】
本発明者らは、その野生型ゲノム中では異なる末端配列を有することが報告されている血清型の組換えアデノウイルスであって、ゲノムが５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む組換えアデノウイルスを得るための積極的な選択ステップを構築および／または包含することにより、この驚くべき観察を実用化する。
【００２２】
したがって、本発明は、組換えアデノウイルスゲノムの末端にある特定の配列（ＣＴＡＴＣＴＡＴ）、および組換えアデノウイルスの製造におけるその使用に関する。この末端配列は、その野生型ゲノムの５’末端にこの配列を含有しない任意のアデノウイルス血清型で使用することができる。
【００２３】
原則として、本発明によるアデノウイルスの組成物（バッチ）は、その５’ゲノム末端の１００％に配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含有することができる（出発アデノウイルスが本発明により積極的に作製および／または選択されているため）。いかなる生物系でも時として、また無作為に起こり得る、いくつかの自然突然変異を考慮すると、実際の数はわずかに１００％を下回る可能性がある。ただし、好ましい実施形態では、ＣＴＡＴＣＴＡＴ以外の末端配列の量は、本発明によるアデノウイルスバッチ中では検出限界以下である。したがって、本発明によれば、組換えアデノウイルス粒子の組成物またはバッチ中のアデノウイルスゲノムは基本的にすべて、５’末端配列としてヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。本明細書で使用する「基本的にすべて」という用語は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％から最大１００％（組成物中のアデノウイルス粒子の）を指す。これは、例えば、１０００個の粒子中の１個を容易に検出することができるＰＣＲなどの方法により決定することができ、本発明の組換えアデノウイルス粒子の組成物では、オリジナル末端配列を有するアデノウイルスは検出できなかった。
【００２４】
本発明によるアデノウイルスの「バッチ」は、単一製造容器において１回の製造作業で製造された組成物を意味するか、あるいは、単一容器（例えば、バイオリアクター、バッグ、フラスコ、ボトル、複数回投与用バイアル、単回投与用バイアル、注射器等）に存在する組成物中の複数のアデノウイルス粒子を指すこともある。本発明によるアデノウイルスのバッチまたは本発明によるアデノウイルスを含む組成物は、好ましくは少なくとも１０７個の組換えアデノウイルス粒子を含み、特定の実施形態では、少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個、またはそれより多くのアデノウイルス粒子から最大１０２０個のアデノウイルス粒子（例えば、単回製造作業にて大規模バイオリアクターで製造する場合）を含む。バッチまたは組成物は、組換えアデノウイルスに加えて、さらなる関連成分を含むことも、含まないこともある。
【００２５】
アデノウイルスに対する「組換え」という用語は、本明細書で使用する場合、アデノウイルスが人為的に修飾されたことを意味し、例えば、アデノウイルスは、その中に積極的にクローニングされた改変末端を有し、かつ／または異種遺伝子を含む、すなわち、天然の野生型アデノウイルスではない。
【００２６】
本明細書の配列は、当技術分野の慣例どおり、５’から３’の方向で提供される。
【００２７】
「アデノウイルスカプシドタンパク質」とは、特定のアデノウイルスの血清型および／またはトロピズムの決定に関与する、アデノウイルスのカプシド上のタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、典型的には、ファイバータンパク質、ペントンタンパク質、および／またはヘキソンタンパク質を含む。本発明による特定の血清型の（「またはそれに基づいた」）アデノウイルスは、典型的には、その特定の血清型のファイバータンパク質、ペントンタンパク質、および／またはヘキソンタンパク質を含み、好ましくは、その特定の血清型のファイバータンパク質、ペントンタンパク質、およびヘキソンタンパク質を含む。これらのタンパク質は、典型的には、組換えアデノウイルスのゲノムによりコードされる。特定の血清型の組換えアデノウイルスは、任意選択で、他のアデノウイルス血清型に由来する他のタンパク質を含み、かつ／またはコードすることがある。
【００２８】
組換えアデノウイルスは、少なくとも配列において、野生型から誘導されることによって、本明細書で使用するアデノウイルス「に基づいて」いる。これは、出発物質として野生型ゲノムまたはその一部を使用して、分子クローニングにより達成することができる。また、ＤＮＡ合成により新たにゲノム（の一部）を生成するために、野生型アデノウイルスゲノムの公知配列を使用することが可能であり、これは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野でビジネスをしているサービス企業によりルーチン的な手法を使用して実施され得る（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）。したがって、非限定例として、ヒトＡｄ４に基づかない組換えアデノウイルスは、ヒトＡｄ４のペントン、ヘキソン、およびファイバーを含まない組換えアデノウイルスであり；Ａｄ３５のヘキソン、ペントン、およびファイバーを含む組換えアデノウイルスは、Ａｄ３５に基づいた組換えアデノウイルスとみなされる等が挙げられる。
【００２９】
アデノウイルス血清型およびそのゲノム構成に関して実施された広範な研究により、当業者は、アデノウイルスゲノム中のＩＴＲの境界について承知している。配列ＣＴＡＴＣＴＡＴは、本発明による組換えアデノウイルスにおいて、ゲノムの最末端に位置する。例えば、野生型Ａｄ５の左側ＩＴＲの上流鎖は、５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡ．．．−３’で始まるが、この配列は、好ましい配列５’−ＣＴＡＴＣＴＡＴ．．．−３’に本発明に従って変化する。当業者は、右側ＩＴＲでは、５’から３’へのこの配列が下流鎖に位置しているという事実を認識している。
【００３０】
オリジナル（親の）配列を本発明の改変配列に変化させることは、種々の手段により実施することができ、これらの手段はそれ自体、当業者に公知であり、ルーチンとなっている。例としては、配列の直接ＰＣＲ生成、またはその末端で指定の配列を含有すると同定されたオリジナルアデノウイルスゲノムからのサブクローニングが挙げられる。
【００３１】
一方の末端の配列を、例えばプラスミド／コスミド相同組換え手順（例えば、国際公開第９９／５５１３２号パンフレットを参照のこと）に関する分子生物学手法を使用して変化させ、他方の末端を変化させない場合、得られるアデノウイルスは、生成および複製の間、左側ＩＴＲまたは右側ＩＴＲをコピーすることになり、その結果、修正された末端のみを有するアデノウイルスと修正されていない末端のみを有するアデノウイルスとの混合集団が生じる（この混合集団は、本明細書に概説されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し増殖させた場合、末端配列ＣＴＡＴＣＴＡＴにより付与される増殖上の有利性のために、この改変末端をより多く有する集団に向かって発展することになる）。本発明による組換えアデノウイルスは、左側および右側の両方のゲノム末端に配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むゲノムを含むことが好ましい。
【００３２】
したがって、本発明による組換えアデノウイルスは、ゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。
【００３３】
本発明のベクターは、組換えアデノウイルスであり、組換えアデノウイルスベクターとも呼ばれる。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当技術分野で周知である。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能、例えば、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須なＥ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、このベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能および非必須なＥ３領域の少なくとも一部が欠損している。アデノウイルスベクターは、「複合的に欠損している」ことがあり、これは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つまたは複数の必須遺伝子機能を欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１欠損またはＥ１、Ｅ３欠損のアデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子および／またはＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子がさらに欠損していることがある。
【００３５】
アデノウイルスベクター、その構築のための方法、およびそれを増殖させるための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書、および同第６，１１３，９１３号明細書、およびＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、ならびに本明細書に記述された他の参考文献に記載されている。典型的には、アデノウイルスベクターの構築には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２），ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、および本明細書に記述された他の参考文献に記載されるものなど、標準分子生物学手法の使用が含まれる。
【００３６】
本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科に帰属し、好ましくはマストアデノウイルス属に帰属するものである。これは、ヒトアデノウイルスであってもよいが、他の種に感染するアデノウイルス、例えば、これらに限定されないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３もしくは５）、またはサルアデノウイルス（これには、サルアデノウイルスおよびチンパンジーアデノウイルスなどの類人猿アデノウイルスが含まれる）であってもよい。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶまたはＡｄＨｕ；本発明では、種を指定せずにＡｄを指す場合、ヒトアデノウイルスを意味し、例えば、簡単表記「Ａｄ５」は、ＨＡｄＶ５、ヒトアデノウイルス血清型５と同じものを意味する）またはチンパンジーアデノウイルスなどのサルアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）である。
【００３７】
好ましくは、本発明の組換えアデノウイルスは、その野生型が異なる配列（ＣＴＡＴＣＴＡＴ以外、例えば、存在が多い配列ＣＡＴＣＡＴＣＡ）を５’末端に有することが報告されているアデノウイルスである。種々のアデノウイルス血清型の報告または推定された５’末端の８ヌクレオチドを表Ｉに示す。米国特許出願公開第２００９／２２７０００号明細書は、５’末端にＣＴＡＴＣＴＡＴを有するＡｄ１１ｐを報告している。最も高度な研究は、ヒトアデノウイルスを使用して実施されており、本発明の特定の態様によれば、ヒトアデノウイルスが好ましい。特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスに基づくものであるが、ヒトアデノウイルス血清型３、４、７、８、９、１１ｐ、１５、２１、２９、３７にも、５３にも基づくものではない。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型１、２、５、６、１０、１１ａ、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２２、２６、２８、３１、３４、３５、３６、４０、４１、４６、４８、４９、５０、５３、５４、５５、５６または５７に基づくものである。より好ましくは、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１ａ、２６、３４、３５、４８、４９、または５０に基づくものである。本発明の特に好ましい実施形態によると、アデノウイルスは、血清型２６、３５、４８、４９、または５０の中の１つのヒトアデノウイルスである。これらの血清型の利点は、ヒト母集団において、血清有病率が低いこと、および／または既存の中和抗体力価が低いことである。組換えアデノウイルスについての最も好ましい血清型は、ヒト血清型３５またはヒト血清型２６であり、これらは両方とも臨床試験で評価されている。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ  ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ  １５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見られる。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、およびＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７（１５）：８２６３−７１に記載されている。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣ＿００００１９および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６に見られる。
【００３８】
サルアデノウイルスもまた、一般には、ヒト母集団において、血清有病率が低く、かつ／または既存の中和抗体力価が低いため、多くの研究がチンパンジーアデノウイルスベクターを使用して報告されている（例えば、米国特許第６０８３７１６号明細書；国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット；国際公開第２０１０／０８６１８９号パンフレット；国際公開第２０１００８５９８４号パンフレット；Ｆａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１１６０３−１３；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：１５１−５５；Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：３９４−４０１；Ｔａｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５：６０８−１７；Ｂａｎｇａｒｉ  ａｎｄ  Ｍｉｔｔａｌ，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：８４９−６２による総説；およびＬａｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，２００９，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７：１３３３−３９による総説も参照のこと）。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスに基づくものである。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６，４８，４９、５０、またはＳＡ７Ｐ型に基づくものである。
【００３９】
上述のヒトおよび非ヒトアデノウイルスの大部分の配列は公知であり、他者がルーチン的な手順を使用して入手することができる。
【００４０】
本発明による組換えアデノウイルスは、複製能があっても、複製能が欠損していてもよい。
【００４１】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、例えばゲノムのＥ１領域に欠失があるために、複製能が欠損している。当業者には公知であるように、アデノウイルスゲノムから必須領域が欠失している場合には、これらの領域によってコードされる機能は、トランスで、好ましくはプロデューサー細胞により提供されなければならない、すなわち、Ｅ１、Ｅ２、および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失している場合には、それらはプロデューサー細胞中に、例えば、そのゲノムに組み込まれて、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在しなければならない。アデノウイルスはまた、Ｅ３領域中に欠失がある場合もあるが、この領域は複製に必ずしも必要ではなく、したがって、このような欠失は補完する必要がない。
【００４２】
使用することができるプロデューサー細胞（時として、当技術分野および本明細書において、「パッケージング細胞」または「補完細胞」または「宿主細胞」とも呼ばれる）は、所望のアデノウイルスを増殖させることができる任意のプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス中の欠損を補完するプロデューサー細胞中で行われる。このようなプロデューサー細胞は、好ましくは、そのゲノム中に少なくともアデノウイルスＥ１配列を有しており、それによってＥ１領域に欠失がある組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１を補完する任意のプロデューサー細胞、例えば、Ｅ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照のこと）、Ｅ１で形質転換された羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照のこと）、Ｅ１で形質転換されたＡ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照のこと）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：２１３−２１９）、２９３等を使用することができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞等である。
【００４３】
亜群ＣアデノウイルスにもＥアデノウイルスにも由来しない、Ｅ１欠損アデノウイルスについては、亜群ＣでもＥでもないアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を、Ａｄ５などの亜群ＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と交換することが好ましい。これにより、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する、例えば２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞など、周知の補完細胞株中でそのようなアデノウイルスが増殖できるようになる（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照のこと）。
【００４４】
代替実施形態では、アデノウイルスベクター中に異種Ｅ４ｏｒｆ６領域（例えば、Ａｄ５の）を配置する必要はないが、その代わり、Ｅ１欠損の亜群ＣでもＥでもないベクターを、Ｅ１および適合性のあるＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞株、例えば、Ａｄ５由来のＥ１およびＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株で増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成について記載する、Ｂｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：６４９７−５０１；それぞれ、このような細胞株を使用する、Ｅ１欠失の非亜群Ｃアデノウイルスベクターの生成について記載する、Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：８９４６−５１およびＮａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：３２６−３６を参照のこと）。
【００４５】
あるいは、増殖させることになる血清型に由来するＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレットを参照のこと）。
【００４６】
Ｅ１領域中に欠失がある、Ａｄ３５などの亜群Ｂアデノウイルスについては、アデノウイルス中にＥ１Ｂ  ５５Ｋ翻訳領域の３’末端、例えば、ｐＩＸ開始コドンの直ぐ上流にある２４３ｂｐ断片など、ｐＩＸ翻訳領域またはこれを含む断片の直ぐ上流にある１６６ｂｐ（Ａｄ３５ゲノム中のＢｓｕ３６Ｉ制限部位により５’末端にマークされている）を保持することが好ましい。というのは、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に一部存在しているため、これがアデノウイルスの安定性を増大させるからである（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００４／００１０３２号パンフレットを参照のこと）。
【００４７】
本発明のアデノウイルス中の「異種核酸」（本明細書において「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、アデノウイルス中に天然には存在しない核酸である。それは、例えば、標準分子生物学手法によりアデノウイルスに導入される。それは、特定の実施形態では、目的のタンパク質またはその一部をコードすることができる。それは、例えば、アデノウイルスベクターの欠失したＥ１またはＥ３領域にクローニングすることができる。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に機能的に連結されている。これは、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に配置することによって行うことができる。さらなる調節配列を加えることもできる。多くのプロモーターを導入遺伝子の発現に使用することができ、それらは当業者に公知である。真核細胞で発現を得るのに適したプロモーターの非限定例としては、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーター由来のｎｔ．−７３５〜＋９５を含む、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）が挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を、導入遺伝子の後に存在させることもできる。
【００４８】
特定の実施形態では、単一アデノウイルスから２種以上のタンパク質を発現させることが望ましい場合があるが、そのような場合には、より多くのコード配列を、単一発現カセットから単一転写物を形成するように連結することも、アデノウイルスゲノムの異なる部分にクローニングした２つの別個の発現カセットに存在させることもできる。
【００４９】
導入遺伝子の本体は、本発明にとって重要ではなく、任意の導入遺伝子を含むアデノウイルスに適したものである。適切な導入遺伝子は、当業者に周知であり、例えば、導入遺伝子の翻訳領域、例えば、遺伝子治療の目的に対して治療効果を有するポリペプチド、またはｒＡｄベクターをワクチン接種の目的で使用したときに免疫応答が望まれるポリペプチドをコードする翻訳領域を含むことができる。特に好ましい異種核酸は、免疫応答をそれに対して惹起させる必要がある抗原決定基をコードする目的遺伝子である。そのような抗原決定基は、典型的には、抗原とも呼ばれる。所望の任意の抗原をアデノウイルスベクターによってコードすることができる。本発明による典型的な実施形態では、抗原は、疾患または症状の原因になり得る、生物由来のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。したがって、さらなる好ましい実施形態では、目的の前記異種核酸は免疫原性決定基をコードする。より好ましくは、前記免疫原性決定基は、細菌、ウイルス、酵母、または寄生生物に由来する抗原である。そのような生物を原因とする疾患は、一般に「感染症」と呼ばれる（したがって、「感染する」生物に限定されることはなく、宿主に侵入し、疾患の原因となる生物も含まれる）。いわゆる「自己抗原」、例えば腫瘍抗原もまた、現況技術の一部を形成し、本発明による組換えアデノウイルス中の異種核酸によりコードすることができる。抗原決定基（または抗原）が得られる非限定例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）などのマラリアの原因生物、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの結核の原因生物、酵母、またはウイルスが挙げられる。他の好ましい実施形態では、フラビウイルス（例えば、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス）、エボラウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびマールブルグウイルスなどのウイルスに由来する抗原を、本発明による組成物中に使用することができる。一実施形態では、前記抗原は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来のＣＳタンパク質またはその免疫原性部分である（ＣＳをコードするアデノウイルスベクターの例については、例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；Ｏｐｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：１４２６−３６；国際公開第２００４／０５５１８７号パンフレットを参照のこと、これらはすべてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、抗原決定基は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、および／またはＴＢ１０．４タンパク質、またはそれらの免疫原性部分など、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の１つの抗原からなるタンパク質または数種の抗原からなる融合タンパク質である（そのようなＴＢ痘瘡ワクチンの構築および製造については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／０５３８７１号パンフレットを参照のこと）。さらに別の実施形態では、前記抗原決定基は、エボラウイルスまたはマールブルグウイル���などのフィロウイルスに由来するＧＰなど、ウイルスの糖タンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２４（６９４９）：６８１−６８４；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ３（６）：ｅ１７７；Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：４２２２−４２３３）。さらにさらなる実施形態では、前記免疫原性決定基は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、またはそれらの変異体などのＨＩＶタンパク質に由来するものである（アデノウイルスベースのＨＩＶワクチンの例については、例えば、国際公開第２００９／０２６１８３号パンフレット、国際公開第２０１０／０９６５６１号パンフレット、国際公開第２００６／１２００３４号パンフレット、国際公開第０２／２２０８０号パンフレット、国際公開第０１／０２６０７号パンフレットを参照のこと）。他の実施形態では、前記抗原決定基は、インフルエンザウイルス由来のＨＡ、ＮＡ、Ｍ、もしくはＮＰタンパク質、またはこれらのいずれかの免疫原性部分である（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：２１８２−９；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １５５：１５６−６２；Ｖｅｍｕｌａ  ａｎｄ  Ｍｉｔｔａｌ，２０１０，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １０：１４６９−８７による総説）。他の実施形態では、抗原決定基は、麻疹ウイルス由来のＨＡタンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、国際公開第２００４／０３７２９４号パンフレット）。他の実施形態では、抗原決定基は、狂犬病ウイルス糖タンパク質である（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：６６２−６７２）。
【００５０】
本発明はまた、そのゲノムの５’末端に基本的にまったく同じヌクレオチド配列を有する、組換えアデノウイルスのバッチを調製する方法であって、ａ）分子クローニングステップを実施して、アデノウイルスゲノムの天然の５’末端を、末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む改変５’末端と交換するステップと、ｂ）この改変５’末端を有する組換えアデノウイルスを宿主細胞中で増殖させるステップと、ｃ）この組換えアデノウイルスを回収して、基本的にすべてがそのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む、組換えアデノウイルス粒子のバッチを得るステップとを含む方法を提供する。この好ましい態様では、ゲノムの５’末端を、分子クローニング手法により積極的に変化させる。この手法それ自体は、分子生物学の当業者には周知されており、ルーチン的なものである。本明細書においてこの有利なＣＴＡＴＣＴＡＴ末端配列が同定されたことにより、この積極的なステップが可能になる。異なる５’末端配列（すなわち、ＣＴＡＴＣＴＡＴではない）を有するいかなるアデノウイルスであっても、本発明による組換えアデノウイルス（のバッチまたは組成物）の生成のための、例えば、本明細書に示される、本発明の好ましい血清型のいずれかのための出発物質またはベースとして使用する場合には常に、このステップが有利になる。有利性は、ステップｂ）のシードとなるアデノウイルスのすべてのゲノム中に、所望のＣＴＡＴＣＴＡＴ配列が最初から存在しているという制御面および確実性であり、本明細書に報告されるこの配列の安定性を考慮すると、ステップｃ）で得られるアデノウイルスのバッチは、基本的にすべてが同じ所望の５’末端配列を有するアデノウイルス粒子を含むことになる。
【００５１】
しかしながら、分子クローニング経路の代替として、天然に誘導される変異を使用し、その末端に改変配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを有するアデノウイルスを選択して、安定な５’末端を有する必要な出発物質を得、増殖させて所望の任意の規模のアデノウイルスのバッチを得ることもできる。したがって、代替実施形態として、本発明はまた、そのゲノムの５’末端に基本的にまったく同じヌクレオチド配列を有する組換えアデノウイルス粒子のバッチを調製するための方法であって、ａ）ヒトアデノウイルス血清型３、４、７、８、９、１１ｐ、１５、２１、２９、３７でも、５３でも、それらの組換え形態でもないアデノウイルスのプラーク精製を実施して、単一プラークからアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスを単離するステップであって、前記アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスが、そのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むステップと、ｂ）ステップａ）の単一プラークから得られた組換えアデノウイルスを宿主細胞中で増殖させるステップと、ｃ）この組換えアデノウイルスを回収して、基本的にすべてがそのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む、組換えアデノウイルス粒子のバッチを得るステップとを含む方法を提供する。ここで、積極的なステップは、（組換え）アデノウイルスの単一プラークを調製すること、およびそのゲノムがその５’末端に所望の配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むことを試験／確認することである。当業者は、この実施形態のステップａ）をすでに組み換えたアデノウイルスまたはまだ野生型のアデノウイルス分離株のいずれかを用いて実施することができ、後者の場合には、ステップｂ）の前に、組換えアデノウイルスを得るステップを実施する（例えば、クローニングによって、ゲノムに導入遺伝子を導入する）。さらなる研究のための出発物質が均一で単一分離株に由来することを確実にするためのプラーク精製のステップは、アデノウイルス操作の分野の当業者にとってはまったくルーチン的な手順を使用して実施することができる。そのゲノムの５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む（組換え）アデノウイルスを積極的に選択することを記載するものは、以前にはなく、本発明の前には、これは何ら意味をなすものではなかったであろう。逆に、この配列の同定は異例と見なされ、このプラークは、本発明の以前には、遺伝的改変を有するものとして処分されていたであろう。出発物質として、遺伝的安定性を保証するそのようなアデノウイルス（組換え体）を選択することは本発明の利点であり、それによって、基本的にすべてが、そのゲノム中に同じ所望の５’末端ヌクレオチドを含む組換えアデノウイルスのバッチが得られる。本発明の組換えアデノウイルスでは複製特性が改善されている可能性がある。
【００５２】
本発明の方法による宿主細胞は、パッケージング細胞であってもよく、この細胞は、組換えアデノウイルスゲノム中の欠損、例えばＥ１を補完することができる。本発明の方法のステップｂ）およびｃ）は、組換えアデノウイルスのバッチの調製における標準かつルーチンのステップであり、当業者には周知のステップである。
【００５３】
特定の実施形態では、これらの方法のステップｂ）は、バイオリアクター中で実施され、このバイオリアクターは、約１リットル〜約２００００リットルの間の容量を有することができる。これにより、工業規模で使用するのに十分な量の所望のアデノウイルス組成物を得ることが可能になる。本開示で使用する、数値に対する「約」という用語は、値±１０％を意味する。特定の実施形態では、作業容量は、１０Ｌ〜１００００Ｌの間、例えば２０Ｌ〜２０００Ｌの間である。作業容量とは、バイオリアクターにおける有効な培養容量である。バイオリアクターの容量は、実需に応じて当業者により選択され得る。本発明は、最終製品が、そのように製造されたバッチ中の基本的にすべてのアデノウイルス粒子について、同じ末端を有する、すなわち、医薬製品にとって望ましい、遺伝学的に均一であることを保証する。
【００５４】
大抵の大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチまたはフェドバッチ工程として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続工程がより一般的になりつつあり、また適切にもなっている（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／０６０７１９号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０９８５９２号パンフレットを参照のこと、これらは、大量の組換えアデノウイルスを取得および精製するために適切な方法を記載している）。
【００５５】
プロデューサー細胞を培養して、細胞数およびウイルス数、ならびに／またはウイルス力価を増加させる。細胞が代謝および／または増殖および／または分裂および／または本発明による目的ウイルスの産生を行うことが可能になるように、細胞培養を行う。これは、当業者にそれ自体周知の方法により達成することができ、例えば、これに限定されないが、適切な培地中に細胞のための栄養素を供給することを含む。適切な培地は当業者に周知であり、一般に、商用供給源から大量に得ること、または標準プロトコールに従って注文生産することが可能である。培養は、バッチ、フェドバッチ、連続系等を使用して、例えば、ディッシュ、ローラーボトル、またはバイオリアクター中で行うことができる。細胞培養に適した条件は公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３），ａｎｄ  Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９を参照のこと）。
【００５６】
典型的には、アデノウイルスを、培養物中で適切なプロデューサー細胞に曝露し、それによってウイルスの取り込みを可能にする。通常、最適な撹拌は、約５０〜３００ｒｐｍの間、典型的には１００〜２００、例えば約１５０であり、典型的なＤＯは、２０〜６０％、例えば４０％であり、最適ｐＨは６．７〜７．７の間であり、最適温度は３０〜３９℃の間、例えば３４〜３７℃であり、また最適ＭＯＩは５〜１０００の間、例えば約５０〜３００である。典型的には、アデノウイルスはプロデューサー細胞に自然に感染し、プロデューサー細胞をｒＡｄ粒子と接触させることで、細胞感染には十分である。一般には、アデノウイルスのシードストックを培養物に添加して感染を開始させ、続いてプロデューサー細胞中でアデノウイルスを増殖させる。これはすべて、当業者にはルーチン的である。本発明によるそのようなアデノウイルスのシードストックは組換えアデノウイルス粒子を含み、前記シードストック中の基本的にすべてのアデノウイルス粒子のゲノムは、５’末端ヌクレオチドとして配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。
【００５７】
アデノウイルスが感染した後、ウイルスは細胞内部で複製し、それによって増幅する。これは本明細書においてアデノウイルスの増殖と呼ばれるプロセスである。アデノウイルスが感染すると、最終的に感染細胞の溶解が起こる。したがって、アデノウイルスのこの細胞溶解特性により、ウイルス製造の２つの異なる方式が可能になる。第１の方式は、細胞溶解前に、細胞を溶解させる外部因子を使用してウイルスを回収するものである。第２の方式は、生成したウイルスによって（ほとんど）完全に細胞が溶解した後に、ウイルス上清を回収するものである（例えば、外部因子によって宿主細胞を溶解させることなくアデノウイルスを回収することについて記載している、米国特許第６，４８５，９５８号明細書を参照のこと）。アデノウイルスの回収を目的として、外部因子を使用して細胞を積極的に溶解させることが好ましい。
【００５８】
積極的な細胞溶解に使用することができる方法は、当業者に公知であり、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２８−３５に論じられている。この点に関し有用な方法としては、例えば、凍結融解、固体剪断、高張性および／または低張性溶解、液体剪断、超音波処理、高圧押出、界面活性剤による溶解、上記の組合せ等がある。本発明の一実施形態では、細胞は少なくとも１つの界面活性剤を使用して溶解する。溶解のために界面活性剤を使用することには、それが簡単な方法であり、かつ容易にスケールアップ可能であるという利点がある。
【００５９】
使用することができる界面活性剤およびそれらの使用方法は、当業者に一般に公知である。いくつかの例が、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ２９−３３に論じられている。界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、両性イオン性、および非イオン性の界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変化させることができる。一実施形態では、使用される界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００６０】
混入している、すなわち大抵はプロデューサー細胞に由来する核酸を除去するために、ヌクレアーゼを使用することができる。本発明で使用するのに適した例示的なヌクレアーゼとしては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）、または当技術分野内で一般に使用される他の任意のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）であり、これは、特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することにより迅速に核酸を加水分解し、それによって細胞溶解物の粘性を低下させる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（コードＷ２１４９５０）から商業的に入手することができる。ヌクレアーゼの使用濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。代替的にまたはヌクレアーゼ処理に加えて、アデノウイルスの精製中に、ドミフェン臭化物などの選択的な沈澱剤を使用して、アデノウイルス調製物から宿主細胞ＤＮＡを選択的に沈殿除去することも可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；Ｇｏｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９１：１２−２１；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレットを参照のこと）。
【００６１】
プロデューサー細胞の培養物からアデノウイルスを回収するための方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範囲にわたって記載されている。
【００６２】
特定の実施形態では、回収されたアデノウイルスをさらに精製する。アデノウイルスの精製は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０５／０８０５５６号パンフレットに記載されているように、清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、またはクロマトグラフィーによる分離を含むいくつかのステップで実施することができる。清澄化は、細胞溶解物から細胞片および他の不純物を除去する濾過ステップにより行うことができる。限外濾過は、ウイルス溶液を濃縮するために使用される。限外濾過器を使用するダイアフィルトレーションまたは緩衝液交換は、塩、糖等を除去および交換するための方法である。当業者は、各精製ステップの最適条件を見つける方法を知っている。また、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９８／２２５８８号パンフレットは、アデノウイルスベクターの製造および精製のための方法について記載している。この方法は、宿主細胞の増殖、アデノウイルスによる宿主細胞の感染、宿主細胞の回収および溶解、粗溶解物の濃縮、粗溶解物の緩衝液交換、ヌクレアーゼによる溶解物の処理、ならびにクロマトグラフィーを使用するウイルスのさらなる精製を含む。
【００６３】
好ましくは、精製には、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．６１−７０に論じられているように、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが使用される。クロマトグラフィーステップを含む、多くのプロセスがアデノウイルスのさらなる精製のために記載されている。当業者はこれらのプロセスを認識しており、クロマトグラフィーステップを使用するまさにそのやり方を変更して、プロセスを最適化することができる。例えば、アニオン性イオン交換クロマトグラフィーステップによりアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットを参照されたい。多くの他のアデノウイルス精製法が記載されており、それらは当業者が入手可能な範囲内である。アデノウイルスを製造および精製するためのさらなる方法は、例えば、国際公開第００／３２７５４号パンフレット、国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット、米国特許第５，８３７，５２０号明細書、米国特許第６，２６１，８２３号明細書、および国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレットに記載されている。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
ヒトへの投与に対して、本発明は、ｒＡｄおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を使用することができる。本発明との関連において、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、その使用される投与量および濃度において、投与されている被験体に何ら望ましくない作用も有害な作用も引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照のこと）。精製されたｒＡｄを製剤化して、無菌溶液として投与することが好ましいが、凍結乾燥調製物を利用することも可能である。無菌溶液は、濾過滅菌または当技術分野でそれ自体公知の他の方法により調製される。次いで、その溶液を凍結乾燥するか、または医薬品投与容器に充填する。溶液のｐＨは、一般には、ｐＨ３．０〜９．５の範囲、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ｒＡｄは、典型的には、適切な緩衝剤を含む溶液中にあり、ｒＡｄのその溶液は塩を含有することもある。任意選択で、アルブミンなどの安定化剤を存在させることもある。特定の実施形態では、界面活性剤を添加する。特定の実施形態では、ｒＡｄは注射可能な調製物に製剤化することができる。これらの製剤は、有効量のｒＡｄを含有し、無菌の溶液、懸濁液、または凍結乾燥形態のいずれかであって、任意選択で安定剤または賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与のためにエアゾル化することができる（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレットを参照のこと）。
【００６５】
例えば、アデノウイルスは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍａｒｃｈ  ２００２，ｐ．４３−４８）にも使用される緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール中に保存することができる。ヒトへの投与に適した別の有用な製剤用緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、スクロース  １０％ｗ／ｖ、ポリソルベート８０  ０．０２％ｗ／ｖである。言うまでもなく、他の多くの緩衝液を使用することができ、精製された（アデノ）ウイルス調製物の保存および医薬投与に適した製剤のいくつかの例は、例えば、欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、および国際特許出願である国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見つけることができる。
【００６６】
特定の実施形態では、アデノウイルスを含む組成物は１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。アジュバントは、適用された抗原決定基への免疫応答をさらに増強することが、当技術分野では公知であり、アデノウイルスおよび適切なアジュバントを含む医薬組成物が、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレットに開示されている。「アジュバント」および「免疫刺激薬」という用語は、本明細書において互換的に使用され、免疫系の刺激の原因となる、１つまたは複数の物質として定義される。本発明との関連において、アジュバントは本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫応答を増強するために使用される。適切なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照のこと）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照のこと）；細菌または微生物の派生物（この例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその突然変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ等がある）、が挙げられる。また、例えば、Ｃ４−結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインと目的の抗原との融合物をコードする異種核酸を使用することにより、ベクターにコードされたアジュバントを使用することも可能である（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントとしてアルミニウムを、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、またはそれらの組合せの形態で、用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有濃度で含む。
【００６７】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００６８】
アデノウイルス組成物は、被験体、例えばヒト被験体に投与することができる。１回の投与の間に被験体に与えられるアデノウイルスの総用量は、当業者に公知であるように、変動し得るものであり、一般には、１×１０７ウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐの間、好ましくは１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐの間、例えば３×１０８〜５×１０１０ｖｐの間、例えば１０９〜３×１０１０ｖｐの間である。
【００６９】
アデノウイルス組成物の投与は、標準投与経路を使用して実施することができる。非限定的実施形態としては、注射、例えば皮内、筋肉内等、または皮下投与もしくは経皮投与、または粘膜投与、例えば鼻腔内、口腔内等によるものなど、非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は、筋肉内注射によって、例えば、腕の三角筋または腿の外側股筋に投与される。当業者は、組成物、例えばワクチンを、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために投与するための種々の実行可能な手段を知っている。
【００７０】
本明細書で使用する被験体は、好ましくは哺乳動物、例えば、マウスなどのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、被験体はヒト被験体である。
【００７１】
また、１つまたは複数のアデノウイルスワクチンを１回または複数回追加免疫投与することも可能である。追加免疫ワクチン接種を実施する場合には、典型的には、そのような追加免疫ワクチン接種は、最初に組成物を被験体に投与した後（これは、この場合には、「初回ワクチン接種」と呼ばれる）、１週間〜１年の間、好ましくは２週間〜４か月の間の時期に、同じ被験体に投与することになる。代替の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば、異なる血清型の１つもしくは複数のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質を、初回ワクチン接種または追加免疫ワクチン接種として被験体に投与することも可能である。
【００７２】
本発明を、以下の実施例においてさらに詳細に説明する。実施例は、本発明を何ら限定するものではない。実施例は、本発明を単に明確にするためのものである。
【実施例】
【００７３】
方法
プラスミド：
代替ＩＴＲ配列を、Ａｄ３５およびＡｄ５についてそれぞれ、ｐＡｄａｐｔプラスミドへのクローニングによって左側ＩＴＲに、またｐＢｒプラスミドへのクローニングによって右側ＩＴＲに導入した（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；Ｈａｖｅｎｇａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３３５−３３４２を参照のこと）。代替ＩＴＲ配列を左側ＩＴＲに導入するために、ＳｃａＩ部位（ＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣ［配列番号１］）を含有する順方向プライマー、ＡｖｒＩＩ部位（ＧＡＣＣＡＣＣＴＡＧＧＣＴＧＡＣ［配列番号２］）を含有する逆方向プライマー、および代替ＩＴＲ配列を包含する融合順方向および逆方向プライマー（１についての代替ＩＴＲ：
【化１】
0005770952.tif 000002
［配列番号３］、２についての代替ＩＴＲ：
【化２】
0005770952.tif 000003
［配列番号４］、代替ＩＴＲ逆方向：
【化３】
0005770952.tif 000004
［配列番号５］）を使用して、融合ＰＣＲを実施した。２つの部分的にオーバラップするＩＴＲ順方向プライマーを、鋳型中の極端にＡＴリッチな領域上のＰＣＲ効率を増加させるために、融合ＰＣＲ断片の１つについて、このＰＣＲで使用した。融合ＰＣＲ産物を、最初に、サブクローニングを容易にするためにｐＴｏｐｏベクターにサブクローニングし、次いで、指定の導入遺伝子と共にＡｖｒＩＩおよびＳｃａＩの部位を介してｐＡｄａｐｔ３５プラスミドに挿入した。
【００７４】
代替ＩＴＲ配列を右側ＩＴＲに導入するために、ＮｄｅＩ部位を含有する順方向プライマーおよびＮｒｕＩ部位を含有する逆方向プライマー、ならびに代替ＩＴＲ配列を包含する融合順方向および逆方向プライマーを使用し、左側ＩＴＲについて記載のものと同じ融合ＰＣＲ戦略を使用して融合ＰＣＲを実施した。次いで、融合ＰＣＲ産物をｐＴｏｐｏにサブクローニングし、その後、ＮｄｅＩおよびＮｒｕＩを使用して、ｐＢＲ．Ａｄ３５．ＰＲ．ｄＥ３  ｏｒｆ６／７プラスミドにサブクローニングした。
【００７５】
代替ＩＴＲを含むＡｄ５ベクターを生成するために、上記に記載のものと同じ戦略を使用した。
【００７６】
細胞培養：
ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｐ２、ＨｅＬａ、およびＭＲＣ５細胞を、ＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で維持した。
【００７７】
アデノウイルスの生成、感染、および継代：
他に記載がない限り、ウイルスはすべて、以前に記載されているように（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、単一または二重の相同組換えによりＰＥＲ．Ｃ６中で生成した。手短に言えば、プラスミドを、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が提供する説明書に従い、リポフェクタミンを使用して、ＰＥＲ．Ｃ６にトランスフェクトした。細胞を、完全なＣＰＥの１日後に回収し、凍結融解し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で保存した。粗溶解物のうちの３〜５ｍｌを使用して、７０％コンフルエント層のＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有する４×Ｔ１７５三層フラスコに接種した。ウイルスを、２段階ＣｓＣｌ精製法を使用して精製した。最終的に、ウイルスを一定分量に分割して−８５℃に保存した。
【００７８】
オリジナルＩＴＲ配列から代替ＩＴＲ配列への切り替えを検討するために、プラーク精製後の粗ウイルス材料または上記の精製されたウイルスバッチのいずれかを使用して、種々のウイルスを連続的に継代した。この目的のために、細胞にそれぞれのウイルスベクターを感染させた。完全なＣＰＥの１日後に、細胞および上清を回収し凍結した。ウイルス粒子を解凍することにより細胞から放出させ、この粗ウイルス材料を使用して新たな細胞に感染させた。
【００７９】
感染細胞からのウイルスＤＮＡの単離：
ＩＴＲ特異的ＰＣＲのためのＤＮＡ単離を以下のように実施した。ウイルス粒子を、凍結融解サイクルを繰り返して粗ウイルス材料から放出させた。その後、宿主細胞ＤＮＡをＤＮＡｓｅ  Ｉ処理により除去した。ウイルス粒子を１０％ＳＤＳとインキュベートすることにより破壊し、プロテイナーゼＫで処理した。続いて、ウイルスＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｓｐｉｎキット（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して精製し、ＰＣＲ分析に使用した。
【００８０】
粗溶解物を使用してＩＴＲ配列分析のためのＤＮＡを単離した。この目的のために、２０ｍｌの粗細胞溶解物からＰＥＧ単離によりＤＮＡを単離し、連続凍結融解サイクルにより溶解し、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（０．０１ｍｇ／ｍｌ  Ｒｏｃｈｅ）およびＲｎａｓｅ  Ｔ１（１０Ｕ／ｍｌ  Ｒｏｃｈｅ）で処理した後、ＮａＣｌ不活性化（１Ｍ）を行った。ウイルス粒子を、氷上で１時間、１０％ＰＥＧ  ６０００（ＢＤＨ  ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して沈殿させた後、９０００×ｇで遠心分離ステップを行い、１ｍｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．００２％ゼラチン）に再懸濁した。ウイルスカプシドタンパク質を、１０％ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫ処理を使用して破壊し、ＤＮＡをフェノール−クロロホルム沈殿により抽出した。完全長のＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ（Ａｄ２６）、ＳｐｈＩ（Ａｄ４８、Ａｄ５）、ＡｇｅＩ（Ａｄ４９、Ａｄ１１）、ＮｈｅＩ（Ａｄ５０）により消化し、最終的にＢａｓｅｃｌｅａｒ、Ｌｅｉｄｅｎにより配列決定した。
【００８１】
ＩＴＲ特異的ＰＣＲ
ＩＴＲ領域がＡＴリッチであるので、十分なプライマーを鋳型に確実に結合させるために、ロックト核酸（ＬＮＡ）プライマーを使用した。プライマーはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈから購入した。以下のプライマーを使用した。小文字はＬＮＡヌクレオチドを示す。オリジナルＩＴＲ：ＣａｔｃａＴｃａＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ［配列番号６］、Ａｄ３５代替ＩＴＲ：ＣｔａｔｃＴａｔＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ［配列番号７］、Ａｄ３５左側ＩＴＲ逆方向：ＣＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧ［配列番号８］、Ａｄ３５右側ＩＴＲ順方向：ＧＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＡＡ［配列番号９］、Ａｄ５左側ＩＴＲ逆方向：ＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＣ［配列番号１０］、Ａｄ５右側ＩＴＲ順方向：ＣＣＣＡＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＴＣ［配列番号１１］。ＰＣＲ産物はアガロースゲルで分析した。
【００８２】
ｑＰＣＲによる複製カイネティクス
１０００ＶＰ／細胞を使用して２９３細胞およびＰＥＲ．Ｃ６細胞を３時間感染させ、その後洗浄して、複製カイネティクスを分析した。細胞および上清中のウイルス粒子の存在を、感染後の指定時点にＶＰ  ｑＰＣＲにより分析した。この目的のために、感染細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を使用して溶解し、−８０℃で１時間インキュベートし、解凍した。使用したアデノウイルスベクターすべてに存在するＣＭＶプロモーターに特異的なｑＰＣＲを、製造業者が推奨するとおりに、遺伝子発現マスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。プライマー／プローブ組合せ配列は以下のとおりである：ＣＭＶ順方向：ＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡ［配列番号１２］、ＣＭＶ逆方向：ＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧ［配列番号１３］、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したプローブ５’−ＶＩＣ−ＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’［配列番号１４］。個々の試料中のウイルス粒子の量を決定するために、標準曲線を作成した。
【００８３】
配列アラインメント
アデノウイルスＩＴＲ配列をＢＬＡＳＴ検索により入手した。アライメントはＣＬＣソフトウェアを使用して作成した。アライメントは公開された配列に基づくものである。しかしながら、公開された配列の一部については、ＩＴＲが具体的には配列決定されていなかった。その代り、サブタイプにわたる保存を仮定した。これによって、保存されたＣＡＴＣＡＴＣＡ配列が過剰提示される可能性がある。１つのアデノウイルス血清型についていくつかの配列が公開されている場合には、末端８ヌクレオチドにおいて、互いに異なる場合のみそれらの配列を含めた。
【００８４】
実施例１．ＰＥＲ．Ｃ６細胞上でのＡｄ３５ワクチンベクター製造中における代替ＩＴＲ配列の検出
以前に記載された（国際公開第２００６／０５３８７１号パンフレット；Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７５：４１０５−４１１５）ように、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原であるＡｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、およびＴＢ１０．４抗原を発現するＡｄ３５ワクチンベクターの生成のために、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に直鎖状プラスミドをトランスフェクトし、ＰＥＲ．Ｃ６細胞中で複製可能なＡｄ３５．ＴＢＳウイルスを得た。
【００８５】
製造前に、２つの連続したプラーク精製により、単一の遺伝学的に安定なクローンからのウイルスシードを確実に導き出す。得られるウイルスを、製造工程の種々の段階で同定ＰＣＲおよびウエスタンブロットにより特徴づけ、大規模製造のためのシードウィルスとして使用する前に完全に配列決定した。
【００８６】
ゲノム配列は安定であり、したがって左側および右側のＩＴＲにある末端８ヌクレオチドを除いて、レスキュープラスミドによりコードされたゲノムと同一であった。以下においてオリジナルＩＴＲ配列と称されるプラスミドコード配列ＣＡＴＣＡＴＣＡが、代替ＩＴＲ配列と称される配列ＣＴＡＴＣＴＡＴに切り替わった結果、プラスミド配列に比較して、６ヌクレオチドが変化した。アデノウイルスゲノムは高度に安定であり、それがワクチンベクターとしてのその適合性に寄与しているとみなされている以上、この発見は驚くべきことであった。
【００８７】
末端ＩＴＲ配列の不一致をさらに検討するために、ワクチンベクター製造の種々のステップでＩＴＲを配列決定した：この分析により、オリジナルＩＴＲ配列がプラーク精製の５回継代時（ＶＰＮ５）にまだ存在していることが明らかになった。しかしながら、異なる製造プロセスの継代数５においては、混合配列を示すサブピークを有する配列も検出した。末端８ヌクレオチド内のサブピークを除いて、残りの配列は不一致を示さなかった。ＶＰＮ６において、配列は混合し、オリジナル配列および代替配列がほぼ同じ割合の構成になり、ＶＰＮ７において、明確な代替配列に変わるように見える。
【００８８】
実施例２．ＩＴＲ不均一性は、種々のＡｄ３５ベクターおよび野生型ウイルスについて生じる。
観察された現象が無視できる事象であるか否かを検討するために、またオリジナルＣＡＴＣＡＴＣＡから代替ＣＴＡＴＣＴＡＴ  ＩＴＲ配列への切り替え頻度を調べるために、同じウイルスレスキューに由来する４つのプラークを分析した。すべてのプラークから増殖したウイルスは、継代を繰り返すと、代替ＩＴＲ配列に切り替わった。
【００８９】
さらに、代替ＩＴＲは、種々の導入遺伝子を発現するＡｄ３５ベクターの継代中にも観察され、ｐＩＸプロモーターの部分的な欠失とは無関係であった（表ＩＩ）。
【００９０】
さらに、Ａｄ３５ベースのベクターについてだけでなく、Ａｄ３５野生型ウイルスについても混合配列を観察したので、ベクターアーティファクトの可能性は排除される。
【００９１】
実施例３．代替ＩＴＲ配列は、１０回のウイルス継代にわたりＡｄ３５．ＴＢＳにおいて安定である
代替ＩＴＲ配列への切り換えが数回のウイルス継代にわたり安定であるか否かを検討するために、Ａｄ３５．ＴＢＳ．ｏｒｉ  ＩＴＲおよびＡｄ３５．ＴＢＳ．ａｌｔ  ＩＴＲと命名された、オリジナルＩＴＲ配列または代替ＩＴＲ配列のいずれかを包含するＡｄ３５．ＴＢＳを構築した。これらのウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞での継代に供し、８末端ＩＴＲヌクレオチドの配列をウイルス継代数ごとにＰＣＲ分析することによりモニターした。オリジナル配列と代替配列とを識別するために、オリジナルＩＴＲ配列または代替ＩＴＲ配列のいずれかを特異的に増幅する、異なるＰＣＲプライマーセットを利用した。Ａｄ３５．ＴＢＳ．ｏｒｉ  ＩＴＲの継代の場合、ウイルス継代ごとの分析により、ＶＰＮ３とＶＰＮ６との間でオリジナル配列が減少すること、およびＶＰＮ６において代替配列が出現することが確認された（図１Ａ）。代替配列は、４回の継代にわたり存続した（図１Ａ）。人為的に作製したＡｄ３５．ＴＢＳ．ａｌｔの継代期間中では、代替ＰＣＲ配列のみが１０回のウイルス継代にわたって検出できたため（図１Ｂ）、オリジナル配列への復帰またはゲノムのこの部分内での一般的な不安定性は排除された。
【００９２】
さらに、Ａｄ３５ベクターと代替ＩＴＲ配列またはオリジナルＩＴＲ配列との混合では（これらは、他の点では同一である）、代替ＩＴＲ配列が増殖し、オリジナルＩＴＲ配列よりも代替ＩＴＲ配列が増殖に有利であることが示された。
【００９３】
群ＢベクターであるＡｄ３５において、オリジナルＩＴＲ配列から代替ＩＴＲ配列への切り替えを検出したので、さらに、オリジナルＩＴＲ配列または代替ＩＴＲ配列のいずれかを包含する群Ｃベクターである、Ａｄ５．ｅｍｐｔｙ．ｏｒｉ  ＩＴＲおよびＡｄ３５．ｅｍｐｔｙ．ａｌｔ  ＩＴＲを分析した。Ａｄ３５ベクターによる結果とは対照的に、Ａｄ５は、ＩＴＲ配列の切り換えを示さなかったが、１０回のウイルス継代にわたってオリジナルＩＴＲを保持した（図１Ｃ）（しかしながら、下記の実施例８を参照されたい、さらに継代すると、Ａｄ５にも代替配列が見出されたことがわかる）。さらに、代替ＩＴＲを包含する人為的に作製したＡｄ５は、１０回のウイルス継代にわたって安定であり、オリジナルＩＴＲ配列に戻らなかった（図１Ｄ）。
【００９４】
実施例４．代替ＩＴＲ配列を包含するＡｄ３５は、Ａｄ３５．ｏｒｉ  ＩＴＲに比べ感染後の早期時点でＣＰＥを誘導する。
代替ＩＴＲを有するウイルスゲノムの増殖を観察したので、Ａｄ３５の場合、代替ＩＴＲを有するウイルスは、オリジナルＩＴＲを有するものよりも複製に関し有利なはずであると仮定した。これを試験するために、オリジナルＩＴＲ配列または代替ＩＴＲ配列のいずれかを包含するＡｄ３５ウイルスを使用し、その増殖カイネティクスを分析した。Ｅ１補完細胞株へのアデノウイルス感染により誘導されるＣＰＥが、複製速度に対する良好な指標となるので、最初に２９３細胞を感染させ、１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞のＭＯＩでの感染後２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間（ｈｐｉ）に細胞変性効果を調べた。感染後２４時間では、１００および１０００ＶＰ／細胞のいずれでも、ＣＰＥは観察されなかった。しかしながら、４８ｈｐｉでは、１００および１０００ＶＰ／細胞の両方において、進行したＣＰＥが観察され、９６ｈｐｉでは完全なＣＰＥに発展した。対照的に、Ａｄ３５．ｄＥ１．ｏｒｉ  ＩＴＲの場合には、限定的なＣＰＥのみが、感染後のこれらの時点で認められた。
【００９５】
実施例５．代替ＩＴＲ配列はゲノム複製の有利性を付与する。
想定される複製カイネティクスの差を定量化することができるように、ｑＰＣＲ分析を利用して、感染後の種々の時点でのゲノム複製を測定した。より具体的には、２９３細胞を１０００ＶＰ／細胞で感染させ、溶解させ、ＴａｑＭａｎアッセイを使用するｑＰＣＲ分析に供して、ウイルスベクター中に存在するＣＭＶプロモーターを検出した。図２に示すように、Ａｄ３５．ｏｒｉ  ＩＴＲおよびＡｄ３５．ａｌｔ  ＩＴＲは両方とも、最後の測定時点（９０ｈｐｉ）では約１０１０ＶＰ／ｍｌの同じ力価まで増殖しているが、Ａｄ３５．ｏｒｉ  ＩＴＲの増殖は遅いことが示される。感染後の早期時点では、Ａｄ３５．ａｌｔ  ＩＴＲは、急勾配のゲノム増幅曲線を示し、Ａｄ３５．ｏｒｉ  ＩＴＲよりも早期にプラトー期に到達する（図２Ａ）。これに対して、Ａｄ５の複製カイネティクスは、代替ＩＴＲまたはオリジナルＩＴＲを包含するウイルスについて差がない（図２Ｂ）。
【００９６】
Ａｄ３５．ａｌｔ  ＩＴＲでは観察されるが、Ａｄ５．ａｌｔ  ＩＴＲでは観察されない、このゲノム複製の有利性は、代替ゲノム型の増殖が元々観察されていたＰＥＲ．Ｃ６細胞でも実証された（図２Ｃ〜Ｄ）。
【００９７】
実施例６．代替ＩＴＲ配列は、公開されたヒトアデノウイルス配列に提示されている
代替ＩＴＲ配列が公開されたアデノウイルス配列にも存在するか否かを分析した。そのために、公開されたヒトおよび非ヒトのＩＴＲのヌクレオチド１〜８についてアライメントを実施した。ヒトウイルスは、オリジナルＣＡＴＣＡＴＣＡ配列を主に包含しており、結果として、「保存ヒト配列」として分類した（表１）。
【００９８】
さらに、１〜６ヌクレオチドがＣＡＴＣＡＴＣＡと異なる配列が同定され、「変異ヒトアデノウイルス配列」と命名した。「変異配列」の中で優勢な配列は、本発明者らもＡｄ３５由来ベクターを継代することにより同定した代替配列ＣＴＡＴＣＴＡＴであった。非ヒト配列のアライメント（表Ｉ）により、ＣＡＴＣＡＴＣＡが最も頻度の高い配列であることがわかる。さらに、代替配列、例えば、以前に同定された代替配列ＧＡＴＧＡＴＧＴが見出される。この配列は家禽アデノウイルスで見出されている。公開されたＩＴＲ配列の大多数は、ｄｅ  Ｊｏｎｇ（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７２：１８７−２１１；Ｋｉｎｇ  ＆  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５７８６−５７９２）による複製モデルと一致しており、複製開始中のジャンピングバック機構に必要とされる、小規模な、２、３、または４ヌクレオチドの直列反復配列を有する。
【００９９】
表Ｉに示す公開されたＩＴＲ配列は、天然のＩＴＲ配列のバランスのとれた表現になっていない可能性があることに留意されたい。一部の場合では、ＩＴＲの末端ヌクレオチドは、配列決定されたものではなく、単にＣＡＴＣＡＴＣＡと推定されたものである。さらに、配列決定する前に、診断スワップ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｗａｐ）からアデノウイルスを増殖させることがヌクレオチド変化をもたらし得る数回の複製サイクルを含むことは一般的である。それにもかかわらず、長期間のウイルス宿主の共進化の後にも、オリジナル配列ＣＡＴＣＡＴＣＡが依然として天然に検出されることが注目される。したがって、代替配列ＣＴＡＴＣＴＡＴは天然よりも細胞培養で有益性が高い可能性がある。
【０１００】
実施例７．継代が繰り返されると、種々の細胞株でＩＴＲ配列の切り替えが起こる
オリジナルＩＴＲから代替ＩＴＲへの切り替えの観察が、作製したＥ１補完細胞株に限定された現象であるということを除外するために、オリジナルＩＴＲ配列ＣＡＴＣＡＴＣＡを含有するＡｄ３５野生型ウイルスを種々の細胞型で継代した。したがって、Ａｄ３５野生型を、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｈｅｐ２、ＨｅＬａ、およびＭＲＣ５細胞上で、完全なＡｄ３５野生型ゲノムを含有するプラスミドを使用してレスキューした。広範囲に種々の細胞型を提供するように、特定の細胞株、例えば、種々の組織に由来する、カルシノーマおよび非カルシノーマ起源の細胞株、上皮性および繊維芽細胞性の細胞株、および種々の倍数体（表ＩＩＩ）を選んだ。
【０１０１】
表ＩＩＩの結果から、代替ＩＴＲへの切り換えは、ヘルパー細胞株であるＨＥＫ２９３細胞およびＰＥＲ．Ｃ６細胞について、ＶＰＮ１０で観察されるが、切り換えまたは混合表現型が、後半の継代数とはいえ、他の試験細胞株についても観察されることがわかる。
【０１０２】
実施例８．継代の延長により、試験したアデノウイルスの大多数において、ＩＴＲの不均一性または代替ＩＴＲ配列への完全なシフトが誘導される
種々の血清型に基づくアデノウイルスベクターについて、代替ＣＴＡＴＣＴＡＴ配列への切り替えが一般的であるか否かを検討した。このために、Ａｄ２６、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ１１（ａ）、Ａｄ５０、およびＡｄ５に由来するアデノウイルスベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞上で継代した。プラーク精製後にウイルスベクターをＶＰＮ１５まで継代し、ＶＰＮ１０およびＶＰＮ１５において配列決定により分析した。加えて導入遺伝子の相違による効果を排除するために、２つの異なる導入遺伝子を各ベクター血清型に含めた。
【０１０３】
このセットの実験結果を表ＩＶに示す。驚くべきことに、Ａｄ４８を除くすべての試験ベクターが、代替ＩＴＲ配列に切り替わるか、または混合表現型を示すことが見出され、これらのベクターは、ウイルス継代数が後になると変換されることが示唆された。Ａｄ５については、本発明者らが前に観察したことと一致して、オリジナルＩＴＲ配列は、ＶＰＮ１０においては存続したが、ＶＰＮ１５において混合し始めた。これに対して、Ａｄ４８に由来するベクターは、オリジナルＩＴＲ配列をＶＰＮ１５まで保持する唯一のベクターであった。
【０１０４】
しかしながら、安全策として、本発明者らは、大量培養の間に、または継代の延長後にゲノム末端で生じる突然変異によって起こり得るバッチ不均一性を防止するために、Ａｄ５に基づくものまたはＡｄ４８に基づくものさえ含むすべての組換えアデノウイルスに、本発明による代替ＩＴＲ配列を備えさせることを提案する。これにより、基本的にすべてのアデノウイルス粒子のゲノムが、本発明による５’末端配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む、組換えアデノウイルスのバッチが得られることが保証される。さらに、この代替ＩＴＲ配列を包含するアデノウイルスベクターのレスキューは、ワクチンベクターの製造を加速することができる。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
【表４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【配列表】
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