(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における炎症応答の阻害の際の使用のための、SEQ ID NO:1における少なくとも6個、多くとも20個の連続するMUC1ペプチドを含み、かつ配列CQCRRK（SEQ ID NO:4）を含む薬学的組成物であって、CQCRRKのアミノ末端システインに、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基が付着している、前記薬学的組成物。
【請求項２】
対象が、炎症性腸疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、初期関節炎、ウイルス性関節炎、多発性硬化症、または乾癬から選択される症状を有する、請求項1に記載の薬学的組成物。 
【請求項３】
炎症応答が、NF-κBにより媒介されるシグナル伝達またはSTATにより媒介されるシグナル伝達により引き起こされる、請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
対象における炎症応答の阻害が炎症応答の阻害または消散を含む、請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
炎症応答の阻害が、MUC1発現細胞における炎症シグナル伝達の阻害に起因する、請求項1に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
炎症シグナル伝達が、NF-κBにより媒介されるシグナル伝達またはSTATにより媒介されるシグナル伝達を含む、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
NF-κBにより媒介される炎症シグナル伝達が、Bcl-xLおよびMUC1からなる群より選択される標的遺伝子のNF-κBによる活性化を含むか、またはSTATにより媒介される炎症シグナル伝達が、サイクリンD1、サバイビン、Idp1、Idp2、Cdkn1C、Lefty1、Mest、Aes1、Zfp57、Zfp3611、Sh3bp1、Ccnd3、およびMUC1からなる群より選択される標的遺伝子のSTAT3による活性化などのSTAT3による活性化を含む、請求項6に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
MUC1陽性細胞が、腫瘍細胞、内皮細胞、または炎症細胞である、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
炎症細胞が、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、NK細胞、もしくは好中球より選択される炎症細胞である、請求項8に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、SEQ ID NO:1における少なくとも7個の連続するMUC1ペプチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドがCQCRRKNを含む、請求項10に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、MUC1の多くとも10個の連続アミノ酸残基、11個の連続アミノ酸残基、12個の連続アミノ酸残基、13個の連続アミノ酸残基、14個の連続アミノ酸残基、15個の連続アミノ酸残基、16個の連続アミノ酸残基、17個の連続アミノ酸残基、18個の連続アミノ酸残基、または19個の連続アミノ酸残基を含有している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドが、ポリD-R、ポリD-P、またはポリD-Kと融合している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、全てLアミノ酸を含む、全てDアミノ酸を含む、またはLアミノ酸とDアミノ酸との混合物を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
第二の抗炎症治療と併用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
第二の抗炎症治療がステロイドまたはCOX-2阻害剤である、請求項15に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
第二の抗炎症治療が、MUC1ペプチド投与の前に、MUC1ペプチド投与の後に、またはMUC1ペプチド投与と同時に行われる、請求項15に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
静脈内投与、動脈内投与、経口投与、腫瘍内投与、皮下投与、局所（topical）投与、または腹腔内投与するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
局所（local）投与、局部投与、全身投与、または連続投与するための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドを、0.1〜500mg/kg/dで投与するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドを、10〜100mg/kg/dで投与するための、請求項21に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドを、毎日投与するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドを、7日間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月間、6週間、8週間、2ヶ月間、12週間、または3ヶ月間、毎日投与するための、請求項23に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
毎週投与するための、請求項1〜22のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、または12週間、毎週投与するための、請求項25に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2009年5月27日出願の米国仮出願第61/181,530号、2009年10月21日出願の米国仮出願第61/253,730号、および2010年2月12日出願の米国仮出願第61/303,997号に基づく優先権の恩典を主張する。以上の出願の各々の内容全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
1. 発明の領域
本発明は、炎症シグナル伝達の調節に関する。特に、MUC1細胞質ドメインの特定の領域に由来するMUC1ペプチドが、MUC1とNF-κBとの相互作用を阻害し、従って、NF-κBにより媒介される炎症シグナル伝達を阻害することが示された。さらに、STAT3により媒介される炎症シグナル伝達に対する類似の効果が証明された。
【背景技術】
【０００３】
2. 関連分野
NF-κBタンパク質（RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-κB1/p50、およびNF-κB2/p52）は、広範に発現されている転写因子である。刺激の非存在下では、NF-κBタンパク質は、IκB阻害タンパク質ファミリーのIκBαおよびその他のメンバーとの複合体として、細胞質に局在している（Hayden & Ghosh,2008）。高分子量IκBキナーゼ（IKKα、IKKβ、IKKγ）複合体によるIκBαのリン酸化は、IκBαのユビキチン化および分解を誘導し、それにより、核移行のためNF-κBの放出を誘導する。次に、NF-κB標的遺伝子の活性化は、炎症応答、細胞の増殖および生存の調節を通して、腫瘍発生に寄与する（Karin & Lin,2002）。NF-κB p65は、ファミリーの他のメンバーと同様に、二量体化およびDNA結合を担うN末端Relホモロジードメイン（RHD）を含有している。RHDは、NF-κB p65核局在シグナル（NLS）を阻止する、IκBαタンパク質内のアンキリンリピートの結合部位としても機能する。NF-κB-IκBα複合体は、核と細胞質との間を往復する（Hayden & Ghosh,2008）。例えば、腫瘍壊死因子α（TNFα）に対する細胞応答における、古典的NF-κB経路の活性化は、IKKβにより媒介されるIκBαのリン酸化およびその分解を誘導し、NF-κB p65のバランスを核へとシフトさせる。核NF-κB二量体は、プロモーター領域およびエンハンサー領域におけるκBコンセンサス配列のみならず、縮重バリアントも受け入れる（Hoffman et al.,2006；Gilmore,2008）。次いで、NF-κB標的遺伝子の活性化は、NF-κB p65の翻訳後修飾および転写コアクチベーターとの相互作用により、さらに調節される（Hayden & Ghosh,2008）。多くのNF-κB標的遺伝子のうちの一つがIκBαであり、その活性化は、IκBαの新規合成およびNF-κB転写応答の終結をもたらす。
【０００４】
ムチンは、上皮細胞により主に発現される、広範囲にO-グリコシル化されたタンパク質である。分泌型ムチンおよび膜結合型ムチンは、毒素、微生物によって誘導される傷害、および外部環境との境界面で起こるその他の型のストレスから、上皮細胞の頂端境界を防御する、物理的障壁を形成する。膜貫通型ムチン1（MUC1）は、細胞質ドメインを通して、細胞の内部へシグナルを伝達することもできる。MUC1は、ウニ精子タンパク質-エンテロキナーゼ-アグリン（sea urchin sperm protein-enterokinase-agrin/SEA）ドメイン（Duraisamy et al., 2006）の存在を除き、他の膜結合型ムチンとの配列類似性を有していない。それに関して、MUC1は、単一のポリペプチドとして翻訳され、次いで、SEAドメインで自己切断を受ける（JBC, 1992; Macao, 2006）。
【０００５】
膜貫通型MUC1 C末端サブユニット（MUC1-C）は、受容体として機能し（Ramasamy et al.,2007）、形質転換を誘導するために十分な、72アミノ酸細胞質ドメイン（MUC1-CD）を含有している（Huang et al.,2005）。また、MUC1-Cサブユニットは、そのオリゴマー化に依存性の過程により、核へとターゲティングされる（Leng et al.,2007）。MUC1-CDは、表皮増殖因子受容体（Li et al. 2001）、c-Src（Li et al.,2001）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（GSK3β）（Li et al.,1998）、およびc-Abl（Ahmad et al.,2006）によるリン酸化の基質として機能する。また、MUC1-CDは、直接相互作用を通して、Wntエフェクターであるβカテニンを安定化し、それにより、形質転換に寄与する（Huang et al.,2005）。他の研究は、MUC1-CDが、IKKβおよびIKKγと直接相互作用し、IKK複合体の活性化に寄与することを証明した（Ahmad et al.,2007）。意義深いことに、MUC1のサイレンシングにより、ヒト癌細胞におけるNF-κB p65の構成性の活性化がダウンレギュレートされ、このことから、MUC1-CDがNF-κB p65経路の調節において機能的な役割を有することが示される（Ahmad et al.,2007）。これらの所見は、癌細胞におけるNF-κBシグナル伝達を破壊するため、低分子により、MUC1-CD機能を標的とし得ることも示唆した。しかしながら、現在までのところ、NF-κBのシグナル伝達に影響を与えるMUC1アンタゴニストの報告は存在しない。
【０００６】
シグナル伝達性転写因子（signal transducer and activator of transcription/STAT）ファミリーのメンバーも、形質転換、腫瘍細胞の生存、侵襲、および転移に関係付けられている（Yu and Jove,2004）。STAT3転写因子は、インターロイキン-6（IL-6）炎症応答のエフェクターとして同定された（Wegenka,1994）。STAT3は、ヤヌス活性化キナーゼ（Janus-activated kinase/JAK）-1によるIL-6受容体のリン酸化、STAT3の動員、次いで、705位の保存されたチロシンにおけるSTAT3のリン酸化により活性化される（Yu and Jove,2004）。表皮増殖因子受容体の活性化も、Tyr-705におけるSTAT3の直接リン酸化に関連している。次に、リン酸化されたSTAT3は、二量体化を受け、核へと移行し、細胞周期進行の調節因子（サイクリンD1およびc-Myc）ならびにアポトーシスの阻害因子（サバイビンおよびBcl-xL）をコードするSTAT3標的遺伝子の活性化を誘導する（Alvarez,2005；Alvarez,2006）。活性化されたSTAT3は、形質転換を誘導する（Bromberg,1999）。さらに、STAT3活性化は、多様な癌腫および血液学的悪性病変において検出されており（Aaronson and Horvath,2002；Bowman,2000；Yu and Jove,2004）、このことは、増殖および生存を制御する遺伝子の転写におけるSTAT3の関与と一致している。これに関して、JAK-1→STAT3経路の低分子阻害剤は、インビトロおよび動物モデルにおいて、抗癌活性を有する（Song,2005；Siddiquee,2007；Ahmad,2008；Germain and Frank,2007）。さらに、STAT3へのEGFRシグナル伝達を阻止するアプタマーは、悪性の上皮細胞および血液細胞の増殖を阻害する（Buerger,2003）。これらの所見は、集合的に、炎症と腫瘍形成との関連におけるSTAT3経路の重要性を支持している。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明によると、MUC1発現細胞における炎症シグナル伝達を阻害する方法を提供し、該方法は、該細胞をMUC1ペプチドと接触させる工程を含み、該MUC1ペプチドは、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインは、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている。該ペプチドは、少なくとも5個、6個、または7個の連続MUC1残基を含んでもよく、該配列は、さらに具体的には、CQCR（SEQ ID NO:54）、CQCRR（SEQ ID NO:50）、CQCRRR（SEQ ID NO:51）、CQCRRRR（SEQ ID NO:52）、CQCRRK（SEQ ID NO:4）、またはCQCRRKN（SEQ ID NO:53）を含み得る。ペプチドは、MUC1の多くとも10個の連続残基、11個の連続残基、12個の連続残基、13個の連続残基、14個の連続残基、15個の連続残基、16個の連続残基、17個の連続残基、18個の連続残基、または19個の連続残基を含有し得る。
【０００８】
MUC1陽性細胞は、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、NK細胞、または好中球のような、腫瘍細胞、内皮細胞、または炎症細胞であり得る。ペプチドは、ポリD-R、ポリD-P、またはポリD-Kのような細胞送達ドメイン（cell delivery domain）と融合していてもよい。方法は、ステロイドまたはCOX-2阻害剤のような第二の抗炎症剤と細胞とを接触させる工程をさらに含み得る。第二の抗炎症剤は、ペプチドの前に接触させられてもよいし、ペプチドの後に接触させられてもよいし、またはペプチドと同時に接触させられてもよい。ペプチドは、全てLアミノ酸を含んでいてもよいし、全てDアミノ酸を含んでいてもよいし、またはLアミノ酸とDアミノ酸との混合物を含んでいてもよい。炎症シグナル伝達は、NF-κBにより媒介されるシグナル伝達、またはSTAT3により媒介されるシグナル伝達のようなSTATにより媒介されるシグナル伝達を含み得る。NF-κBにより媒介される炎症シグナル伝達は、Bcl-xLおよびMUC1からなる群より選択される標的遺伝子のNF-κBによる活性化を含み得る。STAT3により媒介される炎症シグナル伝達は、サイクリンD1、サバイビン、Idp1、Idp2、Cdkn1C、Lefty1、Mest、Aes1、Zfp57、Zfp3611、Sh3bp1、Ccnd3、およびMUC1からなる群より選択される標的遺伝子のSTAT3による活性化を含み得る。
【０００９】
別の態様において、MUC1発現細胞におけるMUC1のNF-κBまたはSTATへの結合を阻害する方法が提供され、該方法は、該細胞をMUC1ペプチドに接触させる工程を含み、該MUC1ペプチドは、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインは、そのNH2末端において、ネイティブMUC1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている。
【００１０】
さらに別の態様において、MUC1発現細胞におけるNF-κBへの結合についてのMUC1とIκBαとの競合を阻害する方法が提供され、該方法は、該細胞をMUC1ペプチドに接触させる工程を含み、該MUC1ペプチドは、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインは、そのNH2末端において、ネイティブMUC1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている。
【００１１】
さらに別の態様において、MUC1発現細胞におけるMUC1により誘導されるNF-κBの核移行を阻害する方法が提供され、該方法は、該細胞をMUC1ペプチドに接触させる工程を含み、該MUC1ペプチドは、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインは、そのNH2末端において、ネイティブMUC1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている。
【００１２】
さらなる態様において、対象における炎症応答を阻害する方法が提供され、該方法は、該対象にMUC1ペプチドを投与する工程を含み、該MUC1ペプチドは、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQC（SEQ ID NO:4）を含み、CQCのアミノ末端システインは、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている。ペプチドは、少なくとも5個、6個、または7個の連続MUC1残基を含み得、より具体的には、CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK、またはCQCRRKNを含み得る。ペプチドは、MUC1の多くとも10個の連続残基、11個の連続残基、12個の連続残基、13個の連続残基、14個の連続残基、15個の連続残基、16個の連続残基、17個の連続残基、18個の連続残基、または19個の連続残基を含有し得る。
【００１３】
炎症応答は、NF-κBにより媒介されるシグナル伝達、またはSTAT3により媒介されるシグナル伝達のようなSTATにより媒介されるシグナル伝達により引き起こされ得る。ペプチドは、ポリD-R、ポリD-P、またはポリD-Kのような細胞送達ドメインと融合していてもよい。投与は、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、腫瘍内投与、皮下投与、局所（topical）投与、もしくは腹腔内投与、または局所（local）投与、局部投与、全身投与、もしくは連続投与を含み得る。阻害は、炎症応答の阻害または消散を含み得る。方法は、ステロイドまたはCOX2阻害剤のような第二の抗炎症治療を対象へ適用する工程をさらに含み得る。第二の抗炎症治療は、ペプチドの前に適用されてもよいし、ペプチドの後に適用されてもよいし、またはペプチドと同時に適用されてもよい。対象はヒトであり得る。ペプチドは、0.1〜500mg/kg/d、またはより具体的には、10〜100mg/kg/dで投与され得る。ペプチドは、例えば、7日間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月間、6週間、8週間、2ヶ月間、12週間、または3ヶ月間、毎日投与され得る。ペプチドは、例えば、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、または12週間、毎週投与されてもよい。ペプチドは、全てLアミノ酸を含んでいてもよいし、全てDアミノ酸を含んでいてもよいし、またはLアミノ酸とDアミノ酸との混合物を含んでいてもよい。
【００１４】
さらなる態様において、（i）少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含むMUC1ペプチドであって、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている、MUC1ペプチドと；（ii）（i）以外の第二の抗炎症剤とを含む薬学的組成物が提供される。第二の抗炎症剤はステロイドまたはCOX-2阻害剤であり得る。
【００１５】
本明細書に記載された任意の方法または組成物は、本明細書に記載された他の任意の方法または組成物に関して実行され得ることが企図される。
【００１６】
特許請求の範囲および／または本明細書において、「含む」という用語と共に使用される場合、「（a）」または「（an）」という単語の使用は、「一つ」を意味するかもしれないが、、それは「一つまたは複数の」、「少なくとも一つの」、および「一つまたは一つより多い」の意味とも一致している。「約」という単語は、明示された数のプラスマイナス5％を意味する。
【００１７】
本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、本発明の本旨および範囲に含まれる様々な変化および修飾が、この詳細な説明から当業者には明白になるため、詳細な説明および具体例は、本発明の特定の態様を示すが、例示として与えられるに過ぎないことが、理解されるべきである。
[本発明1001]
MUC1発現細胞における炎症シグナル伝達を阻害する方法であって、該細胞をMUC1ペプチドに接触させる工程を該方法が含み、該MUC1ペプチドが、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている、方法。
[本発明1002]
前記ペプチドが、少なくとも5個、6個、または7個の連続MUC1残基を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
配列が、CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK、またはCQCRRKNを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記ペプチドが、MUC1の多くとも10個の連続残基、11個の連続残基、12個の連続残基、13個の連続残基、14個の連続残基、15個の連続残基、16個の連続残基、17個の連続残基、18個の連続残基、または19個の連続残基を含有している、本発明1001の方法。
[本発明1005]
MUC1陽性細胞が、腫瘍細胞、内皮細胞、または炎症細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
炎症細胞が、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、NK細胞、または好中球である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記ペプチドが細胞送達ドメイン（cell delivery domain）と融合している、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記細胞送達ドメインが、ポリD-R、ポリD-P、またはポリD-Kである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記細胞を第二の抗炎症剤と接触させる工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
第二の抗炎症剤が、ステロイドまたはCOX-2阻害剤である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
第二の抗炎症剤が、前記ペプチドの前に接触させられる、本発明1009の方法。
[本発明1012]
第二の抗炎症剤が、前記ペプチドの後に接触させられる、本発明1009の方法。
[本発明1013]
第二の抗炎症剤が、前記ペプチドと同時に接触させられる、本発明1009の方法。
[本発明1014]
前記ペプチドが全てLアミノ酸を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記ペプチドが全てDアミノ酸を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記ペプチドがLアミノ酸とDアミノ酸との混合物を含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
炎症シグナル伝達が、NF-κBにより媒介されるシグナル伝達またはSTATにより媒介されるシグナル伝達を含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
NF-κBにより媒介される炎症シグナル伝達が、Bcl-xLおよびMUC1からなる群より選択される標的遺伝子のNF-κBによる活性化を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
STATにより媒介される炎症シグナル伝達が、STAT3による活性化を含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
STAT3により媒介される炎症シグナル伝達が、サイクリンD1、サバイビン、Idp1、Idp2、Cdkn1C、Lefty1、Mest、Aes1、Zfp57、Zfp3611、Sh3bp1、Ccnd3、およびMUC1からなる群より選択される標的遺伝子のSTAT3による活性化を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
MUC1発現細胞におけるMUC1のNF-κBまたはSTATへの結合を阻害する方法であって、該細胞をMUC1ペプチドに接触させる工程を該方法が含み、該MUC1ペプチドが、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている、方法。
[本発明1022]
MUC1発現細胞におけるNF-κBへの結合についてのMUC1とIκBαとの競合を阻害する方法であって、該細胞をMUC1ペプチドに接触させる工程を該方法が含み、該MUC1ペプチドが、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている、方法。
[本発明1023]
MUC1発現細胞におけるMUC1により誘導されるNF-κBの核移行を阻害する方法であって、該細胞をMUC1ペプチドに接触させる工程を該方法が含み、該MUC1ペプチドが、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている、方法。
[本発明1024]
対象における炎症応答を阻害する方法であって、該対象にMUC1ペプチドを投与する工程を該方法が含み、該MUC1ペプチドが、少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQC（SEQ ID NO:4）を含み、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされている、方法。
[本発明1025]
前記ペプチドが、少なくとも5個、6個、または7個の連続MUC1残基を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
配列が、CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK、またはCQCRRKNを含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記ペプチドが、MUC1の多くとも10個の連続残基、11個の連続残基、12個の連続残基、13個の連続残基、14個の連続残基、15個の連続残基、16個の連続残基、17個の連続残基、18個の連続残基、または19個の連続残基を含有している、本発明1024の方法。
[本発明1028]
炎症応答が、NF-κBにより媒介されるシグナル伝達またはSTATにより媒介されるシグナル伝達により引き起こされる、本発明1024の方法。
[本発明1029]
前記ペプチドが細胞送達ドメインと融合している、本発明1021の方法。
[本発明1030]
前記細胞送達ドメインが、ポリD-R、ポリD-P、またはポリD-Kである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
投与する工程が、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、腫瘍内投与、皮下投与、局所（topical）投与、または腹腔内投与を含む、本発明1024の方法。
[本発明1032]
投与する工程が、局所（local）投与、局部投与、全身投与、または連続投与を含む、本発明1024の方法。
[本発明1033]
阻害が炎症応答の阻害または消散を含む、本発明1024の方法。
[本発明1034]
第二の抗炎症治療を前記対象へ適用する工程をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1035]
第二の抗炎症治療がステロイドまたはCOX-2阻害剤である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
第二の抗炎症治療が、前記ペプチドの前に適用される、本発明1034の方法。
[本発明1037]
第二の抗炎症治療が、前記ペプチドの後に適用される、本発明1034の方法。
[本発明1038]
第二の抗炎症治療が、前記ペプチドと同時に適用される、本発明1034の方法。
[本発明1039]
前記対象がヒトである、本発明1024の方法。
[本発明1040]
前記ペプチドが0.1〜500mg/kg/dで投与される、本発明1024の方法。
[本発明1041]
前記ペプチドが10〜100mg/kg/dで投与される、本発明1024の方法。
[本発明1042]
前記ペプチドが毎日投与される、本発明1024の方法。
[本発明1043]
前記ペプチドが、7日間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月間、6週間、8週間、2ヶ月間、12週間、または3ヶ月間、毎日投与される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記ペプチドが毎週投与される、本発明1024の方法。
[本発明1045]
前記ペプチドが、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、10週間、または12週間、毎週投与される、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記ペプチドが全てLアミノ酸を含む、本発明1024の方法。
[本発明1047]
前記ペプチドが全てDアミノ酸を含む、本発明1024の方法。
[本発明1048]
前記ペプチドがLアミノ酸とDアミノ酸との混合物を含む、本発明1024の方法。
[本発明1049]
（i）少なくとも4個、多くとも20個の連続MUC1残基でありかつ配列CQCを含むMUC1ペプチドであって、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされているMUC1ペプチドと；（ii）（i）以外の第二の抗炎症剤とを含む薬学的組成物。
[本発明1050]
第二の抗炎症剤がステロイドまたはCOX-2阻害剤である、本発明1049の組成物。
[本発明1051]
少なくとも7残基、多くとも20残基のMUC1ペプチドであって、該MUC1ペプチドが、3〜20個の連続MUC1残基を有しかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされており、該ペプチドが、第一のアミノ酸側鎖に付着した第一の連結部分と第二のアミノ酸側鎖に付着した第二の連結部分とをさらに含み、第一の連結部分と第二の連結部分とが、（a）相互に結合しており、かつ（b）3個の介在アミノ酸残基により分離されている、MUC1ペプチド。
[本発明1052]
8〜20残基長、8〜17残基長、9〜17残基長、10〜17残基長、10〜16残基長、または10〜15残基長である、本発明1051のペプチド。
[本発明1053]
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20残基長である、本発明1051のペプチド。
[本発明1054]
連続MUC1残基の数が、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、または17である、本発明1051のペプチド。
[本発明1055]
前記ペプチドが、第三のアミノ酸側鎖に付着した第三の連結部分をさらに含みかつ少なくとも10残基長であり、第二の連結部分と第三の連結部分とが相互に結合しており、かつ第二のアミノ酸側鎖と第三のアミノ酸側鎖とが3個の介在アミノ酸残基により分離されている、本発明1051のペプチド。
[本発明1056]
0005702371.tif 000002
を含む、本発明1051のペプチド。
[本発明1057]
第一のアミノ酸側鎖および第二のアミノ酸側鎖が、それぞれ、Y4およびA8に位置する、本発明1051のペプチド。
[本発明1058]
第一のアミノ酸側鎖および第二のアミノ酸側鎖が、それぞれ、A8およびR12に位置する、本発明1055のペプチド。
[本発明1059]
0005702371.tif 000003
を含む、本発明1055のペプチド。
[本発明1060]
第一のアミノ酸側鎖、第二のアミノ酸側鎖、および第三のアミノ酸側鎖が、それぞれ、Y4、A8、およびR12に位置する、本発明1059のペプチド。
[本発明1061]
少なくとも10残基、多くとも20残基のMUC1ペプチドであって、該MUC1ペプチドが、3〜20個の連続MUC1残基を有しかつ配列CQCを含み、CQCのアミノ末端システインが、そのNH2末端において、ネイティブMUC-1膜貫通配列に相当しなくてもよい少なくとも1個のアミノ酸残基によりカバーされており、該ペプチドが、第一のアミノ酸側鎖に付着した第一の連結部分と第二のアミノ酸側鎖に付着した第二の連結部分とをさらに含み、第一の連結部分と第二の連結部分とが、（a）相互に結合しており、かつ（b）7個の介在アミノ酸残基により分離されている、MUC1ペプチド。
[本発明1062]
11〜20残基長、11〜19残基長、11〜18残基長、12〜18残基長、12〜19残基長、または12〜18残基長である、本発明1061のペプチド。
[本発明1063]
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20残基長である、本発明1061のペプチド。
[本発明1064]
連続MUC1残基の数が、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、または17である、本発明1061のペプチド。
[本発明1065]
前記ペプチドが、第三のアミノ酸側鎖に付着した第三の連結部分をさらに含みかつ少なくとも18残基長であり、第二の連結部分と第三の連結部分とが相互に結合しており、かつ第二のアミノ酸側鎖と第三のアミノ酸側鎖とが7個の介在アミノ酸残基により分離されている、本発明1061のペプチド。
[本発明1066]
0005702371.tif 000004
を含む、本発明1061のペプチド。
[本発明1067]
第一のアミノ酸側鎖および第二のアミノ酸側鎖が、それぞれ、I2およびQ10に位置する、本発明1067のペプチド。
[本発明1068]
第一のアミノ酸側鎖および第二のアミノ酸側鎖が、それぞれ、A8およびY16に位置する、本発明1067のペプチド。
[本発明1069]
0005702371.tif 000005
を含む、本発明1065のペプチド。
[本発明1070]
第一のアミノ酸側鎖、第二のアミノ酸側鎖、および第三のアミノ酸側鎖が、それぞれ、Y2、R12、およびD20に位置する、本発明1069のペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある種の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、詳細と組み合わせて、これらの図面のうちの一つまたは複数を参照することにより、よりよく理解され得る。
【００１９】
【図１】図1A〜D：MUC1-CはNF-κB p65と会合する。（図1A〜C）示された細胞からの溶解物を、抗p65または対照IgGにより免疫沈降させた。沈降物を抗MUC1-Cおよび抗p65によりイムノブロットした。（図1D）ZR-75-1細胞からの溶解物を、グルタチオンビーズに結合したGSTまたはGST-MUC1-CDと共にインキュベートした。吸着物を抗p65によりイムノブロットした。GSTタンパク質のインプットをクーマシーブルー染色により査定した。
【図２】図2A〜D：MUC1はIκBαとNF-κB p65との結合を減弱させる。（図2A〜C）示されたZR-75-1/ベクター細胞、ZR-75-1/MUC1siRNA細胞（図2A）、HeLa/ベクター細胞、HeLa/MUC1細胞（図2B）、3Y1/ベクター細胞、および3Y1/MUC1-CD細胞（図2C）からの細胞質溶解物を、抗p65または対照IgGにより免疫沈降させた。沈降物をIκBαおよびp65に対する抗体によりイムノブロットした。（図2D）グルタチオンビーズに結合したGSTおよびGST-IκBαを、増加する量のMUC1-CDの非存在下および存在下でp65(186-306)と共にインキュベートした。吸着物を抗p65によりイムノブロットした（上）。MUC1-CDのインプットを、抗MUC1-Cによるイムノブロッティングにより査定した（中央）。GSTタンパク質およびGST-IκBαタンパク質のインプットを、クーマシーブルー染色により査定した（下）。
【図３】図3A〜D：MUC1-CはBcl-xL遺伝子プロモーター上のNF-κB p65の占有を促進する。（図3A）ZR-75-1/ベクター細胞およびZR-75-1/MUC1siRNA細胞を固定し、抗MUC1-C（緑色）および抗NF-κB p65（赤色）により二重染色した。核をTO-PRO-3により染色した。（図3Bおよび3C）ZR-75-1/ベクター細胞、ZR-75-1/MUC1siRNA細胞（図3B）、HeLa/ベクター細胞、およびHeLa/MUC1細胞（図3C）からの可溶性クロマチンを、抗p65または対照IgGにより免疫沈降させた。最終DNA抽出物を、Bcl-xLプロモーター内のNF-κB-RE（-597〜-304）または対照領域（-1001〜-760）をカバーするプライマー対を用いたPCRにより増幅した。（図3D）ZR-75-1細胞からの可溶性クロマチンを、抗MUC1-Cまたは対照IgGにより免疫沈降させ、Bcl-xLのNF-κB-RE配列または対照領域配列について分析した（左）。Re-ChIP実験において、抗MUC1-C沈降物を放出させ、抗p65により再免疫沈降させ、次いで、Bcl-xLプロモーター配列について分析した（右）。
【図４】図4A〜D：MUC1-CはTNFαに対するMCF-10A細胞の応答においてNF-κB p65と相互作用する。（図4A）MCF-10A細胞を、示された時間、20ng/ml TNFαにより刺激した。溶解物を抗MUC1-Cおよび抗βアクチンによりイムノブロットした。（図4B）未処理のMCF-10A細胞または24時間20ng/ml TNFαにより刺激されたMCF-10A細胞からの溶解物を、抗p65または対照IgGによる免疫沈降に供した。沈降物を、示された抗体によりイムノブロットした。（図4C）未処理のMCF-10A細胞または24時間20ng/ml TNFαにより刺激されたMCF-10A細胞からの可溶性クロマチンを、抗MUC1-Cにより免疫沈降させ、次いで、MUC1 NF-κB結合モチーフプロモーター配列について分析した。（図4D）Re-ChIP実験において、抗MUC1-C沈降物を放出させ、抗p65により再免疫沈降させ、次いで、MUC1 NF-κB結合モチーフプロモーター配列について分析した。
【図５】図5A〜D：MUC1-CはNF-κB p65により媒介されるMUC1プロモーターの活性化を促進する。（図5Aおよび5B）MCF-10A細胞を、対照siRNAプールまたはp65 siRNAプールにより72時間トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、未処理のままにするか、またはTNFαにより24時間刺激した。溶解物を、示された抗体によりイムノブロットした（図5A）。次いで、細胞を、NF-κB-LucレポーターまたはMUC1プロモーター-Lucレポーター（pMUC1-Luc）、および対照としてのSV-40-ウミシイタケ-Lucプラスミドを発現するようトランスフェクトした（図5B）。（図5Cおよび5D）MCF-10A細胞を、対照siRNAプールまたはMUC1 siRNAプールにより72時間トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、未処理のままにするか、またはTNFαにより24時間刺激した。溶解物を、示された抗体によりイムノブロットした（図5C）。次いで、細胞を、NF-κB-LucレポーターまたはMUC1プロモーター-Lucレポーター（pMUC1-Luc）、および対照としてのSV-40-ウミシイタケ-Lucプラスミドを発現するようトランスフェクトした（図5D）。トランスフェクションの48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、対照siRNAによりトランスフェクトされ、未処理のままにされた細胞で入手されたもの（1の値を割り当てた）と比較した活性化倍率（3回の別々の実験からの平均値±SD）として表される。
【図６】図6A〜D：MUC1/CQCペプチドはMUC1とNF-κB p65との間の相互作用を阻止する。（図6A）。ポリdArg導入ドメインを含むMUC1/CQC（GO-201）ペプチドおよびMUC1/AQA（CP-1）ペプチドの配列。GST-MUC1-CDを、室温で1時間、MUC1/CQCまたはMUC1/AQAの存在下で、精製されたNF-κB p65と共にインキュベートした。グルタチオンビーズへの吸着物を抗p65によりイムノブロットした（左）。MCF-10A細胞を、未処理のままにするか、または72時間、24時間毎に添加された5μM MUC1/CQCペプチドまたはMUC1/AQAペプチドの存在下で、TNFαにより刺激した。抗p65沈降物を、示された抗体によりイムノブロットした（右）。（図6Bおよび6C）MCF-10A細胞を、未処理のままにするか、または72時間、24時間毎に添加された5μM MUC1/CQCペプチドまたはMUC1/AQAペプチドの存在下で、TNFαにより刺激した。可溶性クロマチンを抗MUC1-C（左）または抗p65（右）により沈降させ、次いで、MUC1 NF-κB結合モチーフプロモーター配列について分析した（図6B）。溶解物を、示された抗体によりイムノブロットした（図6C）。（図6D）自己誘導調節ループにおける、IKKおよびp65との相互作用を通した、NF-κB経路の活性化に対するMUC1-Cの提唱された効果についてのモデル。
【図７】図7A〜E：MUC1-C細胞質ドメインはNF-κB p65およびp65 RHDに結合する。（図7A〜B）示された細胞からの溶解物を、抗p65または対照IgGにより免疫沈降させた。沈降物を、抗MUC1-Cおよび抗p65によりイムノブロットした。（図7C）ZR-75-1細胞からの溶解物を、グルタチオンビーズに結合したGSTまたはGST-MUC1-CDと共にインキュベートした。吸着物を抗p65によりイムノブロットした。GSTタンパク質のインプットをクーマシーブルー染色により査定した。（図7D〜E）GST、GST-MUC1-CD、およびGST-IκBαを、精製されたp65(1-180)（図7D）またはp65(186-306)（図7E）と共にインキュベートした。吸着物およびインプットを抗p65によりイムノブロットした。
【図８】図8：ZR-75-1乳癌細胞におけるMUC1のサイレンシング。BLOCK-iT Target Screening System（Invitrogen）を、MUC1配列（AAGTTCAGTGCCCAGCTCTAC（SEQ ID NO:55））および対照配列（CGCTTACCGATTCAGAATGG（SEQ ID NO:56））を標的とする低分子干渉RNA（siRNA）を生成するために使用した。siRNAカセットを、記載されたようにして（Kawano et al.,2007）、レンチウイルスの生成のために使用した。ポリブレン（Sigma）の存在下で、5という感染多重度で、ZR-75-1細胞にレンチウイルスを感染させた。細胞クローンを、EGFPの発現について選択した。溶解物を、示された抗体によるイムノブロッティングに供した。
【図９】図9A〜D：MUC1-CはSTAT3 DBDに直接結合する。（図9A）ZR-75-1細胞（左）およびMCF-7細胞（右）からの溶解物を、抗STAT3または対照IgGによる免疫沈降に供した。沈降物を、示された抗体によりイムノブロットした。（図9B）ZR-75-1細胞からの溶解物を、グルタチオンビーズに結合したGSTおよびGST-MUC1-CDと共にインキュベートした。吸着物を、抗STAT3によりイムノブロットした。GSTタンパク質およびGST-MUC1-CDタンパク質のインプットをクーマシーブルー染色により査定した。（図9C）MUC1細胞質ドメインのアミノ酸配列が、示されたリン酸化部位および結合部位と共に示される。グルタチオンビーズに結合したGST、GST-MUC1-CD、GST-MUC1-CD(1-45)、およびGST-MUC1-CD(46-72)を、精製された組換えSTAT3と共にインキュベートした。吸着物を抗STAT3によりイムノブロットした。GSTタンパク質およびGST-MUC1-CD融合タンパク質のインプットを、クーマシーブルー染色により査定した。（図9D）STAT3の構造。グルタチオンビーズに結合したGST、GST-STAT3（全長；アミノ酸1〜770）、GST-MUC1-CD（N末端：アミノ酸1〜257）、GST-MUC1-CD（DBD；アミノ酸257〜514）、およびGST-MUC1-CD（C末端；アミノ酸514〜770）を、精製されたMUC1-CDと共にインキュベートした。吸着物を抗MUC1-Cによりイムノブロットした。GSTタンパク質およびGST-STAT3融合タンパク質のインプットをクーマシーブルー染色により査定した。
【図１０】図10A〜D：MUC1-CはSTAT3転写複合体と会合する。（図10A〜B）STAT結合部位（SBS）の位置付けを含むMUC1プロモーター領域の図。ZR-75-1細胞（図10A）およびMCF-7細胞（図10B）からの可溶性クロマチンを、抗STAT3（左）および抗MUC1-C（右）により免疫沈降させた。最終DNA抽出物を、STAT結合部位（SBS；-689〜-414）および対照領域（CR；MUC1プロモーター内の+4524〜+4745）をカバーするプライマー対を用いたPCRにより増幅した。（図10C〜D）示された細胞からの可溶性クロマチンを、抗STAT3により沈降させ、MUC1プロモーターのSBS配列およびCR配列について分析した。re-ChIP実験において、抗STAT3沈降物を放出させ、抗MUC1-Cにより再免疫沈降させ、次いで、MUC1プロモーター配列について分析した。
【図１１】図11A〜D：MUC1-CはIL-6に対するMCF-10A細胞の応答においてSTAT3と相互作用する。（図11A）MCF-10A細胞を、示された時間、IL-6により刺激した。全細胞溶解物（左）および核溶解物（右）を、示された抗体によりイムノブロットした。（図11B）MCF-10A細胞を、24時間、IL-6により刺激した。溶解物を抗STAT3および対照IgGにより免疫沈降させた。沈降物を、示された抗体によりイムノブロットした。（図11C）示された時間、IL-6により刺激されたMCF-10A細胞からの可溶性クロマチンを、抗STAT3および対照IgGにより沈降させた。沈降物をMUC1プロモーターのSBS配列およびCR配列について分析した。（図11D）対照MCF-10A細胞およびIL-6により刺激されたMCF-10A細胞からの可溶性クロマチンを、抗STAT3により沈降させ、MUC1プロモーターのSBS配列およびCR配列について分析した。re-ChIP実験において、抗STAT3沈降物を放出させ、抗MUC1-Cにより再免疫沈降させ、次いで、MUC1プロモーター配列について分析した。
【図１２】図12A〜D：IL-6によるMUC1プロモーターの活性化はSTAT3により媒介される。（図12AおよびB）MCF-10A細胞を、72時間、対照siRNAプールまたはSTAT3 siRNAプールによりトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、未処理のままにするか、または24時間IL-6により刺激した。溶解物を、示された抗体によりイムノブロットした（図12A）。次いで、細胞をMUC1プロモーター-Lucレポーター（pMUC1-Luc）およびウミシイタケ-Lucプラスミドを発現するようトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの48時間後に測定した（図12B）。結果は、対照siRNAによりトランスフェクトされ、未処理のままにされた細胞で入手されたもの（1の値を割り当てた）と比較した活性化倍率（3回の別々の実験からの平均値±SD）として表される。（図12C）MCF-10Aを、野生型pMUC1-LucまたはSTAT結合部位に変異を有するpMUC1-Luc（mSBS）およびウミシイタケ-Lucを発現するようトランスフェクトした。24時間後、細胞を、未処理のままにするか、または24時間IL-6により刺激し、次いで、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。結果は、野生型pMUC1-Lucによりトランスフェクトされ、未処理のままにされた細胞で入手されたもの（1の値を割り当てた）と比較した活性化倍率（3回の別々の実験からの平均値±SD）として表される。（図12D）MCF-10Aを対照siRNAまたはSTAT3 siRNAにより処理した。24時間後、細胞を、未処理のままにするか、または24時間IL-6により刺激し、次いで、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。結果は、対照siRNAによりトランスフェクトされ、未処理のままにされた細胞で入手されたもの（1の値を割り当てた）と比較した活性化倍率（3回の別々の実験からの平均値±SD）として表される。
【図１３】図13A〜D：MUC1-CはMUC1プロモーターのSTAT3占有を促進する。（図13AおよびB）MCF-10A細胞を、72時間、対照siRNAプールまたはMUC1 siRNAプールによりトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、未処理のままにするか、または24時間IL-6により刺激した。可溶性クロマチンを抗STAT3により沈降させ、MUC1プロモーターのSBS配列およびCR配列について分析した（図13A）。次いで、細胞を、MUC1プロモーター-Lucレポーター（pMUC1-Luc）およびウミシイタケ-Lucプラスミドを発現するようトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した（図13B）。結果は、対照siRNAによりトランスフェクトされ、未処理のままにされた細胞で入手されたもの（1の値を割り当てた）と比較した活性化倍率（3回の別々の実験からの平均値±SD）として表される。（図13C）ZR-75-1/ベクター細胞およびZR-75-1/MUC1siRNA細胞からの可溶性クロマチンを、抗STAT3により沈降させ、MUC1プロモーターのSBS配列およびCR配列について分析した。（図13D）ZR-75-1/ベクターおよびZR-75-1/MUC1siRNA細胞を、pMUC1-Lucおよびウミシイタケ-Lucを発現するようトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、ZR-75-1/MUC1siRNA細胞で入手されたもの（1の値を割り当てた）と比較した活性化倍率（3回の別々の実験からの平均値±SD）として表される。
【図１４】図14A〜D：GO-201はIL-6により刺激されたMCF-10A細胞におけるMUC1-CとSTAT3との相互作用を阻止する。（図14A）GST-STAT3を、室温で1時間、GO-201またはCP-1の存在下で、精製されたMUC1-CDと共にインキュベートした。グルタチオンビーズへの吸着物を、抗MUC1-Cによりイムノブロットした。（図14B〜C）MCF-10A細胞を、72時間、24時間毎に添加された5mM GO-201またはCP-1の存在下で、IL-6により刺激した。抗STAT3沈降物を、示された抗体によりイムノブロットした（図14B）。可溶性クロマチンを、抗STAT3または抗MUC1-Cにより沈降させ、MUC1プロモーターのSBS配列およびCR配列について分析した（図14C）。（図14D）pMUC1-Luc。
【図１５】図15：MUC1-CDステープルドペプチドの配列。
【図１６】図16A：H1650非小細胞肺癌細胞の増殖に対するMUC1-CDステープルドペプチドの効果。MUC1機能の阻害に対する感受性を査定するために、H1650 NSCLC細胞を、7日間、1μMおよび5μM MUC1 CQCステープルドペプチド（GO-200-1B）により処理した。5μM GO-200-1BによるH1650細胞の処理は、増殖の有意な阻害、次いで、細胞数の減少に関連していた。図16B：細胞増殖に対するGO-200-2Bの効果。H-1975非小細胞肺癌細胞株を、100単位/mLペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および2mmol/L L-グルタミンと共に10％熱不活化ウシ胎仔血清を含むDMEMで培養した。細胞を、処理の1日前に再播種した。細胞を、3日間、5μM GO-200-2Bにより処理し、細胞生存能をトリパンブルー排除により決定した。
【図１７】図17：ホルモン依存性乳癌細胞の増殖に対する異なるMUC1-CD CQC領域ペプチドの効果。異なるMUC1-CD CQC領域含有ペプチドへの曝露が、増殖に影響を与えるか否かを決定するため、ZR-75-1乳癌細胞を、4日間、5μMの異なるペプチドにより処理し、細胞増殖についてモニタリングした。意義深いことに、未処理にしておかれた細胞と比較して、実質的な増殖阻害が存在した。
【図１８】図18：非小細胞癌細胞の増殖に対する異なるMUC1-CD CQC領域ペプチドの効果。A549非小細胞肺癌細胞を、7日間、5μM GO-203、GO-203-2、またはGO-203cycにより処理した。7日目の生細胞数をトリパンブルー排除により決定し、未処理細胞の細胞増殖を比較することにより増殖阻害率を計算した。
【図１９】図19：H1975非小細胞癌細胞の増殖に対する異なるMUC1-CD CQC領域ペプチドの効果。H1975非小細胞肺癌細胞を、6日間、5μMの異なるMUC1-CD CQC領域ペプチドにより処理した。6日目の生細胞数をトリパンブルー排除により決定した。結果は、5μMの異なるペプチドによるH1975細胞の処理が、増殖の有意な阻害に関連していたことを証明している。
【図２０】図20：三重陰性乳癌細胞の増殖に対する異なるMUC1-CD CQC領域ペプチドの効果。MDA-MB-231三重陰性乳癌細胞を、6日間、5μMの異なるMUC1-CD CQC領域ペプチドにより処理した。6日目の生細胞数をトリパンブルー排除により決定した。結果は、異なるペプチドによるMDA-MB-231細胞の処理が、増殖の有意な阻害に関連していたことを証明している。
【図２１】図21：ZR-75-1乳癌細胞の増殖に対するより短いGO-203ペプチドの効果。ヒトZR-75-1乳癌細胞を、10％熱不活化ウシ胎仔血清、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンが補足されたRPMI1640で培養した。細胞を、4日間、毎日、5μMの異なるペプチドにより処理し、細胞生存能をトリパンブルー排除により決定した。GO-210とは対照的に、4日間、毎日の5μM GO-203（SEQ ID NO:53）、GO-207（SEQ ID NO:4）、GO-208（SEQ ID NO:50）、およびGO-209（SEQ ID NO:54）によるZR-75-1乳癌細胞の処理は、増殖の有意な阻害に関連していた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
例示的な態様の説明
MUC1は、癌における役割について、本発明者ら他により広範囲に研究されている。上述のように、ヒトMUC1は、単一のポリペプチドとして翻訳され、小胞体においてN末端サブユニットおよびC末端サブユニットへと切断されるヘテロ二量体糖タンパク質である（Ligtenberg et al., 1992；Macao et al., 2006；Levitin et al., 2005）。大部分のヒト癌に見出されるようなMUC1の異常な過剰発現（Kufe et al., 1984）は、足場非依存性の増殖および腫瘍原性を付与する（Li et al., 2003a；Huang et al., 2003；Schroeder et al., 2004；Huang et al., 2005）。他の研究は、MUC1の過剰発現が、酸化ストレスおよび遺伝毒性抗癌剤により誘導されるアポトーシスに対する抵抗性を付与することを証明している（Yin and Kufe, 2003；Ren et al., 2004；Raina et al., 2004；Yin et al., 2004；Raina et al., 2006；Yin et al., 2007）。
【００２１】
繋留型ムチンおよび分泌型ムチンのファミリーは、上皮細胞表面の防護壁の提供において機能する。上皮層に対する傷害により、隣接細胞間の密着結合が破壊され、細胞がヘレグリンにより誘導される修復プログラムを開始するにつれ、極性が失われる（Vermeer et al., 2003）。MUC1-Nは、細胞表面から脱落し（Abe and Kufe, 1989）、細胞の内部への環境ストレスシグナルの伝達物質として機能するようMUC1-Cを残す。これに関して、MUC1-Cは、ErbB受容体ファミリーのメンバーと細胞表面複合体を形成し、MUC1-Cは、ヘレグリン刺激に応答して核へとターゲティングされる（Li et al., 2001；Li et al., 2003c）。MUC1-Cは、MUC1細胞質ドメイン（CD）とカテニンファミリーのメンバーとの間の直接相互作用を通して、ErbB受容体およびWntのシグナル伝達経路の統合においても機能する（Huang et al., 2005；Li et al., 2003c；Yamamoto et al., 1997；Li et al., 1998；Li et al., 2001；Li and Kufe, 2001）。他の研究は、MUC1-CDが、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β、c-Src、プロテインキナーゼCδ、およびc-Ablによりリン酸化されることを証明している（Raina et al., 2006；Li et al., 1998；Li et al., 2001；Ren et al., 2002）。
【００２２】
MUC1-Cの核へのターゲティングを担う機序は不明である。古典的核移行シグナル（NLS）を含有しているタンパク質は、まずインポーチンαと結合し、次いで、インポーチンβと結合することにより、核へ輸入される（Weis, 2003）。カーゴ-インポーチンα/β複合体は、ヌクレオポリンと結合することにより核膜孔へドッキングし、Ran GTPaseに依存する機序により孔を通して輸送される。古典的NLSは、4〜5個の塩基性アミノ酸の単一のクラスタを含む単極性（monopartite）または10〜12アミノ酸のリンカーにより分離された塩基性アミノ酸の2個のクラスタを含む二極性（bipartite）である。MUC1-CDは、原型の単極性NLSに一致しないRRKモチーフを含有している（Hodel et al., 2002）。しかしながら、非古典的NLSを含有しているある種のタンパク質は、インポーチンβと直接結合することにより、核膜孔を通して輸送される（Kau et al., 2004）。インポーチンβは、核膜孔複合体の細胞質面および核質面の両方に位置しているNup62（Percipalle et al., 1997）を含む、いくつかのヌクレオポリンと会合する（Ryan and Wente, 2000）。他の研究は、βカテニンがインポーチンおよびヌクレオポリンに非依存性の機序により核へ輸入されることを示した（Suh and Gumbiner, 2003）。
【００２３】
2006年、本発明者らは、MUC1がNup62との結合を含む機序により核へ輸入されると報告した（Leng et al., 2007）。本発明者らは、MUC1がMUC1細胞質ドメインのCQCモチーフを通してオリゴマーを形成すること、およびMUC1オリゴマー化が核輸入に必要であることも証明している。2007年に、本発明者らは、ヒト癌細胞におけるMUC1の過剰発現がNF-κB p65の構成性の活性化に関連していることも証明した（Ahmad et al. 2007）。MUC1がインビボで高分子量IκBキナーゼ（IKK）複合体と相互作用し、MUC1細胞質ドメインがIKKβおよびIKKγに直接結合することが示された。MUC1のIKKβおよびIKKγの両方との相互作用が、IκBαのリン酸化および分解をもたらすIKKβ活性化に必要である。これらの所見は、MUC1がIKKβの生理学的活性化にとって重要であること、そしてヒト癌において見出されるようなMUC1の過剰発現がIKKβ-NF-κB p65経路の持続性の誘導を付与することを示した。
【００２４】
さらなる未公開の研究において、本発明者らは、CQCモチーフがオリゴマー形成において果たす役割のさらなる解明を包含すべく研究を拡張した。本発明者らは、この領域に相当する短いペプチドが、MUC1オリゴマー形成を破壊し、腫瘍細胞の核への輸送を防止し得ることも証明した。これらのペプチドは、腫瘍細胞増殖を阻害するのみならず、そのような細胞におけるアポトーシスを誘導し、腫瘍組織の壊死すら誘導することができる。
【００２５】
炎症性疾患の状況におけるMUC1の役割の出現のため、本発明者らは、これらの同ペプチドが炎症性障害の処置において有用であるか否かを調査することとした。当研究は、MUC1-CDがNF-κB p65に直接結合し、NF-κB p65とIκBαとの相互作用を阻止することを証明する。本発明者らは、ここで、MUC1-CサブユニットがNF-κB標的遺伝子のプロモーター上でNF-κB p65と会合し、NF-κBにより媒介される転写を促進することを示す。結果は、MUC1-Cオリゴマー化の阻害剤が、MUC1のNF-κB p65との相互作用および炎症性NF-κB経路の構成性の活性化を阻止することも証明する。さらに、別の炎症シグナル伝達因子であるSTAT3との類似の相互作用が証明され、この過程にMUC1が関係していることがさらに示された。
【００２６】
本発明のこれらおよびその他の局面を、以下にさらに詳細に記載する。
【００２７】
I. MUC1
A. 構造
MUC1は、正常分泌上皮細胞の頂端境界に発現されるムチン型糖タンパク質である（Kufe et al., 1984）。MUC1は、単一のポリペプチドとして合成され、小胞体において前駆物質が二つのサブユニットへと切断された後、ヘテロ二量体を形成する（Ligtenberg et al., 1992）。切断は、自己触媒過程により媒介され得る（Levitan et al., 2005）。＞250kDaのMUC1 N末端（MUC1 N-ter、MUC1-N）サブユニットは、高度に保存された変動を含み不完全であり、O結合型グリカンにより修飾されている可変の数の20アミノ酸タンデムリピートを含有している（Gendler et al., 1988；Siddiqui et al., 1988）。MUC1-Nは、58アミノ酸の細胞外領域、28アミノ酸の膜貫通ドメイン、および72アミノ酸の細胞質ドメイン（CD；SEQ ID NO:1）を含む、およそ23kDaのC末端サブユニット（MUC1 C-ter、MUC1-C）との二量体化により細胞表面に繋留される（Merlo et al., 1989）。ヒトMUC1配列を以下に示す：
0005702371.tif 000006
太字の配列はCDを示し、下線部は実施例に記載されるオリゴマー阻害ペプチド（SEQ ID NO:3）である。正常上皮の癌への形質転換により、MUC1は、サイトゾルおよび細胞膜全体に異常に過剰発現される（Kufe et al., 1984；Perey et al., 1992）。細胞膜と会合したMUC1は、クラスリンにより媒介されるエンドサイトーシスによりエンドソームへとターゲティングされる（Kinlough et al., 2004）。さらに、MUC1-Cは、核（Baldus et al., 2004；Huang et al., 2003；Li et al., 2003a；Li et al., 2003b；Li et al., 2003c；Wei et al., 2005；Wen et al., 2003）およびミトコンドリア（Ren et al., 2004）へとターゲティングされるが、MUC1-Nはそうでない。
【００２８】
B. 機能
MUC1は、ErbB受容体ファミリーのメンバー（Li et al., 2001b；Li et al., 2003c；Schroeder et al., 2001）およびWntエフェクターであるβカテニン（Yamamoto et al., 1997）と相互作用する。表皮増殖因子受容体およびc-Srcは、Y-46上のMUC1細胞質ドメイン（MUC1-CD）をリン酸化し、それにより、MUC1とβカテニンとの結合を増加させる（Li et al., 2001a；Li et al., 2001b）。MUC1とβカテニンとの結合は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3βおよびプロテインキナーゼCδによっても調節される（Li et al., 1998；Ren et al., 2002）。MUC1は核内にβカテニンと共存し（Baldus et al., 2004；Li et al., 2003a；Li et al., 2003c；Wen et al., 2003）、Wnt標的遺伝子の転写を同時活性化する（Huang et al., 2003）。他の研究は、MUC1がp53とも直接結合し、p53標的遺伝子の転写を調節することを示した（Wei et al., 2005）。顕著に、MUC1の過剰発現は、足場非依存性の増殖および腫瘍原性を誘導するのに十分である（Huang et al., 2003；Li et al., 2003b；Ren et al., 2002；Schroeder et al., 2004）。
【００２９】
大部分のミトコンドリアタンパク質は核内にコードされ、ミトコンドリア外膜および内膜にある移行複合体によりミトコンドリアへ輸入される。ある種のミトコンドリアタンパク質は、N末端ミトコンドリアターゲティング配列を含有しており、ミトコンドリア外膜にあるTom20と相互作用する（Truscott et al., 2003）。内部ターゲティング配列を含有し、Tom70受容体と相互作用するミトコンドリアタンパク質もある（Truscott et al., 2003）。最近の研究は、内部ターゲティング配列を含まないミトコンドリアタンパク質が、HSP70とHSP90との複合体により、Tom70へ送達されることを示した（Young et al., 2003）。
【００３０】
II. MUC1ペプチド
A. 構造
本発明は、様々なMUC1ペプチドの設計、作製、および使用を企図する。これらのペプチドの構造的特色は、以下の通りである。第一に、該ペプチドはMUC1の多くとも20個の連続残基を有する。従って、「多くとも20個の連続残基を有するペプチド」という用語は、「含む」という用語を含む場合ですら、それより多い数の連続MUC1残基を含むとは理解され得ない。第二に、前記ペプチドは、CQCモチーフを含有し、CQCRモチーフ、CQCRRモチーフ、またはCQCRRKモチーフをさらに含むことができる。従って、前記ペプチドは、少なくとも、MUC1-Cドメインのこれらの4、5、または6個の連続残基を有するであろう。第3に、前記ペプチドは、CQCRRKモチーフ内の最初のC残基のNH2末端側に付着した少なくとも1個のアミノ酸残基を有し、従って、最初のC残基は、それに付着した少なくとも1個のアミノ酸によって「カバー」されているであろう。この残基は、MUC1にネイティブ（即ち、膜貫通ドメイン由来）であってもよいし、ランダムに選択されてもよいし（20種の天然に存在するアミノ酸もしくはそれらのアナログのいずれか）、または別のペプチド配列の一部（例えば、精製のためのタグ配列、安定化配列、もしくは細胞送達ドメイン）であってもよい。
【００３１】
一般に、ペプチドは、MUC1の、50残基以下であり、また、多くとも20個の連続残基を含むであろう。全長は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50残基であり得る。4〜50残基、7〜50残基、4〜25残基、7〜25残基、4〜20残基、7〜20残基、3〜15残基、および7〜15残基のペプチド長の範囲が企図される。連続MUC1残基の数は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20であり得る。4〜20残基、5〜20残基、6〜20残基、7〜20残基、4〜15残基、5〜15残基、6〜15残基、および7〜15残基の連続残基の範囲が企図される。
【００３２】
本発明は、L-配置アミノ酸、D-配置アミノ酸、またはそれらの混合物を利用し得る。L-アミノ酸は、タンパク質に見出されるアミノ酸の大部分を表し、D-アミノ酸は、イモガイ（cone snails）のような外来の海生生物により産生されるいくつかのタンパク質に見出される。それらは、細菌のペプチドグリカン細胞壁の豊富な成分でもある。D-セリンは、脳内で神経伝達物質として作用し得る。アミノ酸配置についてのLおよびDの慣習は、アミノ酸自体の光学活性ではなく、そのアミノ酸が理論上合成され得るグリセルアルデヒドの異性体の光学活性をさす（D-グリセルアルデヒドが右旋性であり；L-グリセルアルデヒドが左旋性である）。
【００３３】
「全D」ペプチドの一つの形態はレトロインバーソ（retro-inverso）ペプチドである。天然に存在するポリペプチドのレトロインバーソ修飾は、ネイティブペプチド配列に対して逆方向の順序の、対応するL-アミノ酸のものと反対のα炭素立体化学を有するアミノ酸、即ち、Dアミノ酸の合成集合体を含む。従って、レトロインバーソアナログは、ネイティブペプチド配列と同様の側鎖のトポロジーをおよそ維持しつつ、逆転した末端、および逆転したペプチド結合の方向（CO-NHではなくNH-CO）を有している。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,261,569号を参照のこと。
【００３４】
上述のように、本発明は、細胞送達ドメイン（細胞送達ベクターまたは細胞導入ドメインとも呼ばれる）の融合または接合を企図する。そのようなドメインは当技術分野において周知であり、複数のリジン残基およびアルギニン残基をしばしば含有している、短い両親媒性または陽イオン性のペプチドおよびペプチド誘導体として一般に特徴決定される（Fischer, 2007）。特に興味深いのは、ポリD-Arg配列およびポリD-Lys配列（例えば、8残基長の右旋性残基）である。
【００３５】
【表１】
0005702371.tif 000007
0005702371.tif 000008
【００３６】
また、上述のように、インビボでのペプチドの残存を容易にするため、アミノ末端および／またはカルボキシル末端へのブロッキング剤の付加により、インビボ使用のために修飾されたペプチドが企図される。これは、ペプチド末端が細胞取り込み前にプロテアーゼにより分解される傾向があるような情況において有用であり得る。そのようなブロッキング剤には、非限定的に、投与されるペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の残基へ付着させられ得る、付加的な関連ペプチド配列または非関連ペプチド配列が含まれ得る。これらの薬剤は、当技術分野において周知の方法により、ペプチドの合成の間に化学的に付加させられてもよいし、または組換えDNA技術により付加させられてもよい。あるいは、当技術分野において公知のピログルタミン酸またはその他の分子のようなブロッキング剤を、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の残基へ付着させてもよい。
【００３７】
B. 合成
固相合成技術（Merrifield, 1963）を使用して、ペプチドを作製することは有利であろう。その他のペプチド合成技術は、当業者に周知である（Bodanszky et al., 1976；Peptide Synthesis, 1985；Solid Phase Peptide Synthelia, 1984）。そのような合成において使用するための適切な保護基は、上記のテキスト、およびProtective Groups in Organic Chemistry, 1973に見出されるであろう。これらの合成法は、一つまたは複数のアミノ酸残基または適当な保護されたアミノ酸残基の、成長中のペプチド鎖への連続的な付加を含む。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを、適当な、選択的に除去可能な保護基により保護する。リジンのような反応性側鎖を含有しているアミノ酸のためには、異なる選択的に除去可能な保護基が利用される。
【００３８】
固相合成を例として使用すると、保護または誘導体化されたアミノ酸を、その保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を通して、不活性の固体支持体へ付着させる。次いで、アミノ基またはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列内の次のアミノ酸を混和し、固体支持体へ既に付着している残基と反応させる。次いで、この新たに付加されたアミノ酸残基からアミノ基またはカルボキシル基の保護基を除去し、次いで、（適当に保護された）次のアミノ酸を付加させる（以下同様）。全ての所望のアミノ酸が適切な配列で連結された後、残りの末端および側鎖の保護基（および固体支持体）を、連続的にまたは同時に除去し、最終的なペプチドを得る。本発明のペプチドは、好ましくは、ベンジル化またはメチルベンジル化されたアミノ酸を欠く。そのような保護基部分は合成の過程で使用されてもよいが、ペプチドが使用される前に除去される。他の箇所に記載されるように、コンフォメーションを制約するための分子内結合を形成するため、付加的な反応が必要であるかもしれない。
【００３９】
使用され得る20種の標準アミノ酸に加えて、莫大な数の「非標準」アミノ酸が存在する。これらのうちの2種は、遺伝暗号によって指定され得るが、タンパク質には極めて稀である。セレノシステインは、通常は終止コドンであるUGAコドンにおいて、いくつかのタンパク質に組み入れられる。ピロリジンは、いくつかのメタン生成古細菌により、メタンを産生するために使用する酵素において使用されている。それはコドンUAGによりコードされる。タンパク質に見出されない非標準アミノ酸の例には、ランチオニン、2-アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、および神経伝達物質γアミノ酪酸が含まれる。非標準アミノ酸は、しばしば、標準アミノ酸のための代謝経路に中間体として存在する。例えば、オルニチンおよびシトルリンは、アミノ酸異化の一部である尿素回路に存在する。非標準アミノ酸は、通常、標準アミノ酸への修飾を通して形成される。例えば、ホモシステインは、含硫基移動経路を通して、または中間代謝物S-アデノシルメチオニンを介したメチオニンの脱メチルにより形成され、ヒドロキシプロリンはプロリンの翻訳後修飾により作成される。
【００４０】
C. リンカー
リンカーまたは架橋剤は、MUC1ペプチドを他のタンパク質性配列と融合させるために使用され得る。二官能性架橋試薬は、アフィニティマトリックスの調製、多様な構造の修飾および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広範囲に使用されている。2個の同一の官能基を保持するホモ二官能性試薬は、同一の高分子または高分子のサブユニットおよび異なる高分子または高分子のサブユニットの間の架橋の誘導、ならびにポリペプチドリガンドの特定の結合部位への連結において高度に効率的であることが判明した。ヘテロ二官能性試薬は、2個の異なる官能基を含有している。2個の異なる官能基の差動的な反応性を活用することにより、架橋は、選択的かつ連続的に制御され得る。二官能性架橋試薬は、官能基、例えば、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、またはカルボキシルに特異的な基の特異性によって分類され得る。これらのうち、遊離アミノ基に対する試薬は、商業的入手可溶性、合成の容易さ、およびそれらが適用され得る温和な反応条件のため、特に人気になっている。二官能性架橋試薬の大多数は、一級アミン反応基およびチオール反応基を含有している。
【００４１】
別の例において、ヘテロ二官能性架橋試薬および架橋試薬を使用する方法は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み入れられる米国特許第5,889,155号に記載されている。架橋試薬は、求核性のヒドラジド残基を求電子性のマレイミド残基と化合させ、一例において、アルデヒドの遊離チオールとのカップリングを可能にする。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するために修飾され得、従って、ポリペプチドを架橋するために有用である。特定のペプチドが、そのネイティブ配列において所定の架橋試薬を受け入れる残基を含有していない場合には、遺伝学的なまたは合成による一次配列内の保存的アミノ酸変化が利用され得る。
【００４２】
D. 設計、バリアント、およびアナログ
ある局面において、本発明は、配列CQCRRKを含むペプチドに焦点を当てる。MUC1オリゴマー形成におけるこのキー構造を同定したため、本発明者らは、CQCRRK配列のバリアントが利用され得ることも企図する。例えば、CQCRRK配列の構造的制約を満たすある種の非天然アミノ酸が、生物学的機能の損失なしに、もしかすると生物学的機能を改善しつつ、置換され得る。さらに、本発明者らは、本発明のペプチドまたはポリペプチドのキー部分を模倣する、構造的に類似している化合物が、製剤化され得ることも企図する。ペプチド模倣体とも呼ばれるそのような化合物は、本発明のペプチドと同様に使用され得、従って、それらも機能的等価物である。
【００４３】
タンパク質の二次構造および三次構造の要素を模倣するある種の模倣体が、Johnson et al. (1993)に記載されている。ペプチド模倣体の使用の基礎をなす原理は、タンパク質のペプチド骨格が、主として、抗体および／または抗原の相互作用のような分子的相互作用を容易にするよう、アミノ酸側鎖を方向付けるよう存在するということである。従って、ペプチド模倣体は、天然分子に類似した分子的相互作用を可能にするために設計される。
【００４４】
特定の構造を生成する方法は、当技術分野において開示されている。例えば、αヘリックス模倣体は、米国特許第5,446,128号；第5,710,245号；第5,840,833号；および第5,859,184号に開示されている。コンフォメーションが制約されたβターンおよびβバルジを生成する方法は、例えば、米国特許第5,440,013号；第5,618,914号；および第5,670,155号に記載されている。他の型の模倣ターンには、逆向ターンおよびγターンが含まれる。逆向ターン模倣体は米国特許第5,475,085号および第5,929,237号に開示されており、γターン模倣体は米国特許第5,672,681号および第5,674,976号に記載されている。
【００４５】
「分子モデリング」とは、三次元的な構造的情報およびタンパク質間相互作用モデルに基づく、タンパク質間の物理的相互作用の構造および機能の定量的かつ／または定性的な分析を意味する。これには、従来の数値に基づく分子動力学およびエネルギー最小化モデル、相互作用コンピュータグラフィックモデル、修飾された分子力学モデル、ディスタンスジオメトリー、およびその他の構造に基づく制約モデルが含まれる。分子モデリングは、典型的には、コンピュータを使用して実施され、公知の方法を使用して、さらに最適化され得る。X線結晶学データを使用するコンピュータプログラムは、そのような化合物を設計するために特に有用である。例えば、RasMolのようなプログラムが、三次元モデルを生成するために使用され得る。INSIGHT（Accelrys, Burlington, MA）、GRASP（Anthony Nicholls, Columbia University）、Dock（Molecular Design Institute, University of California at San Francisco）、およびAuto-Dock（Accelrys）のようなコンピュータプログラムは、さらなる操作および新たな構造を導入する能力を可能にする。方法は、化合物の3D構造のモデルを出力装置へと出力する付加的な工程を含み得る。さらに、候補化合物の3Dデータは、例えば、3D構造のコンピュータデータベースと比較され得る。
【００４６】
本発明の化合物は、その他の構造に基づく設計／モデリング技術（例えば、Jackson, 1997；Jones et al., 1996を参照のこと）を使用して、本明細書に記載された化合物の構造的情報から相互作用的に設計されてもよい。次いで、候補化合物は、当業者に周知の標準的なアッセイにおいて試験され得る。例示的なアッセイは本明細書に記載される。
【００４７】
生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、および脂質）の3D構造は、多様な方法論により入手されたデータから決定され得る。タンパク質の3D構造の査定に最も効率的に適用されているこれらの方法論には、以下のものが含まれる：（a）X線結晶学；（b）核磁気共鳴（NMR）分光法；（c）高分子上の明確な部位の間に形成された物理的な距離の制約、例えば、タンパク質上の残基間の分子内化学的架橋の分析（例えば、PCT/US00/14667（これの開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））、および（d）関心対象のタンパク質の一次構造の知識に基づく分子モデリング法、例えば、ホモロジーモデリング技術、スレッディング（threading）アルゴリズム、またはMONSSTER（Modeling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restraints）（例えば、国際出願第PCT/US99/11913号（これの開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと）のようなコンピュータプログラムを使用したアブイニシオ（ab initio）構造モデリング。その他の分子モデリング技術も、本発明に従って利用され得る（例えば、Cohen et al., 1990；Navia et al., 1992（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。これらの方法は、全て、コンピュータ分析を受け入れるデータを生成する。本発明の方法において有用であり得るが、現在は生体分子に関する原子レベルの構造的詳細を提供していない、その他の分光法には、円二色性分光法、蛍光分光法、および紫外／可視光吸光分光法が含まれる。好ましい分析法は、X線結晶学である。この手法およびNMR分光法の説明を、以下に提供する。
【００４８】
X線結晶学。X線結晶学は、関心対象の分子または分子複合体の結晶における原子核を取り巻く電子雲による特徴的な波長のX線照射の回折に基づく。その技術は、特定の生物学的高分子を構成する原子の近原子（near atomic）分解を決定するため、精製された生物学的高分子または分子複合体（しかし、これらは、しばしば、溶媒成分、補因子、基質、またはその他のリガンドを含んでいる）の結晶を使用する。X線結晶学により3D構造を解析するための必要条件は、X線を強く回折するであろう規則正しい結晶である。方法は、多くの同一分子の規則的な反復するアレイへとX線ビームを差し向けるため、X線があるパターンでアレイから回折され、そのパターンから個々の分子の構造を回収することができる。例えば、球状タンパク質分子の規則正しい結晶は、不規則の表面を有する、大きい、球状または楕円体の物体である。結晶は、個々の分子の間に大きいチャンネルを含有している。通常、結晶の体積の過半を占めるこれらのチャンネルには、無秩序の溶媒分子が充填されており、タンパク質分子は、ほんの少数の小さな領域で相互に接している。これは、結晶内のタンパク質の構造が、溶液中のタンパク質のものと概して同一である、一つの理由である。
【００４９】
関心対象のタンパク質を入手する方法を、以下に記載する。結晶の形成は、pH、温度、生物学的高分子の濃度、溶媒および沈殿剤の性質、ならびに添加されるイオンまたはタンパク質のリガンドの存在を含む、多数の異なるパラメータに依存する。X線回折分析に適した結晶を与える組み合わせのため、これらの全てのパラメータをスクリーニングするためには、多くのルーチンの結晶化実験が必要とされるかもしれない。結晶化ロボットは、多数の結晶化実験を再現性よく設定する作業を自動化し加速することができる（例えば、米国特許第5,790,421号（これの開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【００５０】
ポリペプチド結晶化は、ポリペプチド濃度がその最大溶解度を越えている（即ち、ポリペプチド溶液が過飽和されている）溶液で起こる。そのような溶液は、好ましくは、ポリペプチド結晶の沈殿を通して、ポリペプチド濃度を低下させることにより、平衡状態へと回復し得る。しばしば、ポリペプチドは、結晶化をもたらす会合を促進するため、ポリペプチド表面の電荷を改変するか、またはポリペプチドとバルク水との間の相互作用を妨害する薬剤を添加することにより、過飽和溶液から結晶化するよう誘導され得る。
【００５１】
結晶化は、一般に、4℃〜20℃の間で実施される。「沈殿剤」として公知の物質が、ポリペプチド分子の周りにエネルギー的に不利な沈殿枯渇層（precipitating depleted layer）を形成することにより、濃縮溶液中のポリペプチドの溶解度を減少させるためにしばしば使用される（Weber, 1991）。沈殿剤に加えて、その他の材料が、ポリペプチド結晶化溶液に添加される場合もある。これらには、溶液のpHを調整するための緩衝剤、およびポリペプチドの溶解度を低下させるための塩が含まれる。様々な沈殿剤が当技術分野において公知であり、以下のものを含む：エタノール、3-エチル-2-4ペンタンジオール、およびポリエチレングリコール（PEG）のようなポリグリコールの多く。沈殿溶液は、例えば、13〜24％PEG4000、5〜41％硫酸アンモニウム、および1.0〜1.5M塩化ナトリウム、ならびに5.0〜7.5の範囲のpHを含み得る。その他の添加剤には、0.1M Hepes、2〜4％ブタノール、20〜100mM酢酸ナトリウム、50〜70mMクエン酸、120〜130mMリン酸ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、および1mMジチオスレイトール（DTT）が含まれ得る。これらの薬剤は、緩衝液中で調製され、結晶化緩衝液に様々な組み合わせで滴下にて添加される。結晶化させるタンパク質は、例えば、リン酸化により、またはリン酸模倣体（例えば、タングステン酸、カコジル酸、または硫酸）を使用することにより、修飾されてもよい。
【００５２】
一般的に使用されるポリペプチド結晶化法には、以下の技術が含まれる：バッチ、ハンギングドロップ、種開始（seed initiation）、および透析。これらの方法の各々において、過飽和溶液を維持することにより、核形成後に継続的な結晶化を促進することが重要である。バッチ法においては、過飽和を達成するため、ポリペプチドを沈殿剤と混合し、容器を密封し、結晶が出現するまで放置する。透析法においては、ポリペプチドを、密封した透析膜内に保持し、それを沈殿剤を含有している溶液中に置く。膜を介した平衡化が、ポリペプチドおよび沈殿剤の濃度を増加させ、それにより、ポリペプチドが過飽和レベルに到達するようになる。
【００５３】
好ましいハンギングドロップ技術（McPherson, 1976）においては、濃縮ポリペプチド溶液に沈殿剤を添加することにより、初期ポリペプチド混合物を作出する。ポリペプチドおよび沈殿剤の濃度は、この初期の形態において、ポリペプチドが結晶化しないようなものである。この混合物の小滴を、ガラススライド上に置き、それを、第二の溶液のレザバーの上方に逆さにしてつるす。次いで、系を密封する。典型的には、第二の溶液は、より高い濃度の沈殿剤またはその他の脱水剤を含有している。沈殿剤濃度の差によって、タンパク質溶液は、第二の溶液より高い蒸気圧を有するようになる。二つの溶液を含有している系は密封されているため、平衡状態が確立され、ポリペプチド混合物からの水が第二の溶液に移動する。この平衡状態は、ポリペプチド溶液中のポリペプチドおよび沈殿剤の濃度を増加させる。ポリペプチドおよび沈殿剤の臨界濃度時に、ポリペプチドの結晶が形成され得る。
【００５４】
別の結晶化法は、濃縮ポリペプチド溶液へ核形成部位を導入する。一般に、濃縮ポリペプチド溶液を調製し、ポリペプチドの種晶をこの溶液へ導入する。ポリペプチドおよび沈殿剤の濃度が正確である場合には、種晶が核形成部位を提供し、その周りにより大きい結晶が形成されるであろう。
【００５５】
さらに別の結晶化法は、電極に隣接しているヘルムホルツ層において自己整列するタンパク質高分子の双極子モーメントが使用される結晶電析法である（例えば、米国特許第5,597,457号参照（これの開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【００５６】
結晶化が困難なタンパク質も存在する。しかしながら、結晶化を誘導するためのいくつかの技術が当業者に利用可能である。例えば、タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端のフレキシブルなポリペプチドセグメントの除去は、結晶タンパク質試料の作製を容易にし得る。そのようなセグメントの除去は、分子生物学技術、またはトリプシン、キモトリプシン、もしくはスブチリシンのようなプロテアーゼによるタンパク質の処理を使用してなされ得る。
【００５７】
回折実験においては、狭く平行のX線ビームがX線源から発せられ、回折ビームを生ずるために結晶へ差し向けられる。投射一次ビームは、高分子および溶媒分子の両方に傷害を引き起こす。従って、結晶は、その寿命を延長するために（例えば、-220℃〜-50℃の間に）冷却される。一次ビームは、全ての可能な回折スポットを作製するために多くの方向から結晶に衝突しなければならず、従って、実験中は結晶をビーム内で回転させる。回折スポットは、フィルム上に、または電子検出器により記録される。感光したフィルムは、スキャニング装置においてディジタル化され定量化されなければならないが、電子検出器は、それらが検出するシグナルをコンピュータへ直接送り込む。電子面検出器は、回折データを収集し測定するのに必要とされる時間を有意に低下させる。フィルムまたは検出器プレートの上にスポットとして記録される各回折ビームは、以下の三つの特性により定義される：スポットの強度から測定される振幅；X線源により設定される波長；およびX線実験において失われる位相。回折ビームを与える原子の位置を決定するためには、回折ビームの全てについて、三つの特性全てが必要とされる。位相を決定する一つの方式は、多重同形置換（Multiple Isomorphous Replacement/MIR）と呼ばれ、それは、結晶の単位格子への外因性のX線分散剤（例えば、金属原子のような重原子）の導入を必要とする。MIRのより詳細な説明に関しては、米国特許第6,093,573号（第15カラム）（これの開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【００５８】
原子座標とは、結晶形の関心対象の生物学的高分子の原子（分散中心）によるX線の単色ビームの回折を介して入手されたパターンに由来するデータの、フーリエ合成を含む数学的な方程式に由来するデカルト座標（x位、y位、およびz位）をさす。回折データは、結晶内の反復単位（単位格子）の電子密度マップを計算するために使用される。電子密度マップは、結晶の単位格子内の個々の原子の位置（原子座標）を確立するために使用される。原子座標に割り当てられた絶対値は、原子間の同一の相対的空間的関係を維持しながら、共に、または別々に、x軸、y軸、および／またはz軸に沿って回転運動および／または並進運動により変化し得るため、原子座標の絶対値は、原子間の空間的関係を示唆する。従って、原子座標の絶対値のセットが、別の試料の分析から事前に決定された値のセットと一致するよう、回転または翻訳により調整され得る生物学的高分子（例えば、タンパク質）は、他の試料から入手されたものと同一の原子座標を有すると見なされる。
【００５９】
X線結晶学に関するさらなる詳細は、同時係属中の米国出願第2005/0015232号、米国特許第6,093,573号、ならびに国際出願第PCT/US99/18441号、第PCT/US99/11913号、および第PCT/US00/03745号から入手され得る。これらの全ての特許文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００６０】
NMR分光法。X線結晶学は関心対象の高分子の単結晶を必要とするが、NMR測定は近生理的条件下の溶液中で実施される。しかしながら、NMRに由来する構造は、結晶に由来する構造ほど詳細ではない。
【００６１】
NMR分光法の使用は、比較的最近まで、比較的低分子（例えば、100〜150アミノ酸残基のタンパク質）の3D構造の解明に限定されていたが、関心対象の分子の同位体標識および横緩和最適化分光法（transverse relaxation-optimized spectroscopy/TROSY）を含む最近の進歩は、はるかに大きい分子、例えば、110kDaの分子量を有するタンパク質の分析へと方法論を拡張することを可能にした（Wider, 2000）。
【００６２】
NMRは、特定の高周波によりパルス処理された均一磁場において磁性原子核の環境を調査するために高周波照射を使用する。パルスは、スピンがゼロでない核を有する原子の核磁化を混乱させる。系が平衡状態に戻る際に、一過性の時間領域シグナルが検出される。一過性シグナルの周波数領域へのフーリエ変換が、一次元NMRスペクトルを与える。これらのスペクトルにおけるピークは、様々な活性の核の化学シフトを表す。原子の化学シフトは、その局所的な電子環境により決定される。二次元NMR実験は、構造および三次元空間における様々な原子の近接に関する情報を提供することができる。タンパク質構造は、多数の二次元（時には三次元または四次元）NMR実験を実施し、得られた情報を一連のタンパク質折り畳みシミュレーションにおいて制約として使用することにより決定され得る。
【００６３】
NMR実験から入手された生データが高分子の3D構造を決定するために使用され得る方法の詳細な説明を含む、NMR分光法に関するさらなる情報は、Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, (1996)；Gronenborn et al. (1990)；およびWider (2000)（前記）（これらの全ての開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に見出され得る。
【００６４】
ペプチドである本発明の化合物のアミノ酸配列に基づき設計されるペプチド模倣体化合物も、関心対象である。ペプチド模倣体化合物は、選択されたペプチドの三次元コンフォメーションと実質的に同一の三次元コンフォメーション「モチーフ」を有する合成化合物である。ペプチドモチーフは、ペプチド模倣体化合物に、MUC1のオリゴマー化を阻害する能力を提供する。ペプチド模倣体化合物は、増加した細胞透過性および延長された生物学的半減期のような、インビボの利用可能性を増強する付加的な特徴を有することができる。ペプチド模倣体は、典型的には、部分的にまたは完全に非ペプチドである骨格を有するが、そのペプチド模倣体の基となるペプチドに存在するアミノ酸残基の側鎖と同一の側鎖を有する。いくつかの型の化学結合、例えば、エステル結合、チオエステル結合、チオアミド結合、レトロアミド結合、還元カルボニル結合、ジメチレン結合、およびケトメチレン結合が、プロテアーゼ抵抗性のペプチド模倣体の構築において、ペプチド結合の一般に有用な代替物であることが、当技術分野において公知である。
【００６５】
ステープルド（Stapled）／ステッチド（Stitched）ペプチド
治療薬としてのペプチドに関する一つの特定の修飾が、Aileron Therapeuticsのいわゆる「ステープルドペプチド」技術である。ペプチドを「ステープリングする」ための一般的なアプローチは、ペプチド内の2個のキー残基をアミノ酸側鎖を通したリンカーの付着により修飾するものである。合成後、触媒を通してリンカーを接続し、それにより、ペプチドをネイティブαヘリックス形へと物理的に制限するブリッジを作出する。標的分子と相互作用するために必要とされるネイティブ構造の保持を助けることに加えて、このコンフォメーションは、ペプチダーゼに対する安定性も提供し、細胞透過特性も促進する。
【００６６】
より具体的には、「ペプチドステープリング」という用語は、単一の「ステープルド」ポリペプチドを提供するための、そのような反応を容易にするための任意の数の反応条件および／または触媒を使用した、ポリペプチド鎖内に存在し得る2個の二重結合含有側鎖の接合、2個の三重結合含有側鎖の接合、または1個の二重結合含有側鎖と1個の三重結合含有側鎖との接合を包含し得る。具体的な態様において、ステープルの導入は、3個または6個のいずれかの介在残基（i+4またはi+7）により分離されたペプチド鎖上の2個の位置に、αメチルアミノ酸、αアルケニルアミノ酸が導入される、標準的なペプチド合成の修飾を要する。これらの間隔は、1個（i+4）または2個（i+7）いずれかのヘリックスターンにまたがって、αヘリックスの同一のファクト（fact）にステープリングアミノ酸を配置する。完全に伸びた、樹脂に結合したペプチドを、オレフィンメタセシスを通したアルケニル鎖の架橋を促進するルテニウム触媒に曝し、それにより、全て炭化水素の大環状架橋を形成させることができる。この技術を記載している米国特許第7,192,713号および第7,183,059号、ならびに米国特許公開第2005/02506890号および第2006/0008848号は、参照により本明細書に組み入れられる。Schafmeister et al.,Journal of the American Chemical Society,122(24): p. 5891-5892 (2000)；Walensky et al.,Science 305:1466-1470 (2004)も参照のこと。さらに、「ペプチドステッチング」という用語は、「ステッチング」（マルチステープリング）を受けたポリペプチドを提供するための、単一ペプチド鎖内の複数のタンデムの「ステープリング」イベントをさし、それらの各々が、参照により本明細書に組み入れられる。ステッチドペプチド技術の具体例に関しては、WO 2008/121767を参照のこと。
【００６７】
IV. 治療
A. 薬学的製剤および投与経路
臨床的適用が企図される場合、意図された適用にとって適切な形態で医薬組成物を調製することが必要であろう。一般に、これは、発熱性物質、およびヒトまたは動物にとって有害であり得るその他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを要するであろう。
【００６８】
送達ベクターを安定化させ、標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を利用することが一般に望まれるであろう。緩衝剤は、組換え細胞が患者へ導入される場合にも利用されるであろう。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散した、有効な量のベクターから細胞までを含む。そのような組成物は接種物とも呼ばれる。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトへ投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、またはその他の不都合な反応を生じない分子エンティティおよび組成物をさす。本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、全ての任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、本発明のベクターまたは細胞と不適合性でない限り、治療用組成物において使用されることが企図される。補足的な活性成分が、組成物に組み入れられてもよい。
【００６９】
本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれ得る。標的組織がその経路を介して利用可能である限り、本発明に係るこれらの組成物の投与は、任意の一般的な経路を介してなされるであろう。そのような経路には、経口、鼻、頬、直腸、膣、または局所の経路が含まれる。あるいは、投与は、正所、皮内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または静脈内の注射によってもよい。そのような組成物は、通常、前記の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【００７０】
活性化合物は、非経口投与または腹腔内投与されてもよい。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合された水で調製され得る。分散物も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油で調製され得る。保管および使用の通常の条件の下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
【００７１】
注射可能な使用に適している薬学的形態には、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。全ての場合に、型は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に液体でなければならない。それは製造および保管の条件の下で安定していなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、および植物油を含有している溶媒または分散媒であり得る。適切な流動度は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散物の場合には必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能組成物の長期的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によりもたらされ得る。
【００７２】
無菌の注射可能溶液は、必要に応じて、上に列挙されたその他の様々な成分と共に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み入れ、その後、ろ過減菌することにより調製される。一般に、分散物は、基本の分散媒と、上に列挙されたもののうちの必要とされる他の成分とを含有している無菌の媒体に、様々な滅菌された活性成分を組み入れることにより調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製法は、事前に滅菌ろ過された溶液から、活性成分＋付加的な所望の成分の粉末を与える、真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【００７３】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、全ての任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合性でない限り、治療用組成物において使用されることが企図される。補足的な活性成分が、組成物に組み入れられてもよい。
【００７４】
経口投与のため、本発明のポリペプチドは、摂取可能ではない口腔洗浄剤および歯磨剤の形態に賦形剤と共に組み入れられ、使用されてもよい。口腔洗浄剤は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドベル（Dobell）溶液）のような適切な溶媒に必要量の活性成分を組み入れて、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含有している消毒洗浄剤に組み入れられてもよい。活性成分は、ゲル、ペースト、粉末、およびスラリーを含む歯磨剤に分散させられてもよい。活性成分は、水、結合剤、研摩剤、風味剤、発泡剤、および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療的に有効な量で添加されてもよい。
【００７５】
本発明の組成物は、中性型または塩型で製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸により形成された（タンパク質の遊離アミノ基により形成された）酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基により形成された塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来し得る。
【００７６】
製剤化の後、溶液は、剤形と適合性の様式で、かつ治療的に有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、注射可能溶液、薬物放出カプセル等のような多様な剤形で容易に投与される。水性溶液での非経口投与のため、例えば、溶液は、必要であれば、適当に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な生理食塩水またはグルコースにより等張にされるべきである。これらの特定の水性溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に特に適している。この関係において、利用され得る無菌の水性媒体は、本開示を考慮すれば、当業者に公知であろう。例えば、一つの投薬量を等張NaCl溶液1mlに溶解させ、皮下点滴液1000mlに添加するか、または提唱された注入部位に注射する（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences," 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。投薬量のいくらかの変動が、必然的に、処置される対象の条件に依って起こるであろう。投与を担う者は、いかなる場合にも、個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与のため、調製物は、FDA Office of Biologicsの基準により要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
【００７７】
B. 炎症性疾患の状況および状態
i. セプシス
セプシスは、感染により引き起こされた全身炎症状況を特徴とする重篤な医学的状態である。伝統的には、セプシスという用語は、敗血症（「血液中毒」）と交換可能に使用されていた。しかしながら、これらの用語は、もはや同義とは見なされない；敗血症はセプシスのサブセットと見なされている。
【００７８】
セプシスの症状は、しばしば、根底にある感染過程に関係している。感染がセプシスへと交差する時、起こる症状は、全身性炎症反応症候群（SIRS）のもの：全身炎症、発熱、白血球数上昇（白血球増多症）、心拍数増加（頻脈）、および呼吸数増加（多呼吸）である。上記のものに二次的な症状には、インフルエンザ様悪寒も含まれる。
【００７９】
セプシスを引き起こす免疫学的応答は、炎症経路および凝固経路の広範囲の活性化を引き起こす全身炎症応答である。これは循環系の機能障害へと進行することがあり、最適の処置の下ですら、多臓器機能障害症候群をもたらし、最終的には死亡をもたらすことがある。
【００８０】
感染が高度に疑われるかまたは立証されており、かつ以下の全身性炎症反応症候群（SIRS）の基準のうちの二つ以上を満たす場合、セプシスが存在すると見なされる：
＞90/分の心拍数
＜36℃（96.8°F）または＞38℃（100.4°F）の体温
＞20/分の過換気（高い呼吸数）、または血液ガス検査で、32mmHg未満のPaCO2
＜4000細胞/mm3もしくは＞12000細胞/mm3（＜4×109もしくは＞12×109細胞/L）の白血球数、または10％を越える杆状核（未熟白血球）。
しかしながら、コンセンサス定義は進化し続けており、最新のものにおいては、セプシスの兆候および症状のリストが、臨床的な病床での経験を反映するよう拡張されている。
【００８１】
セプシスのより重度のサブセットは、重症セプシス（急性臓器機能障害を伴うセプシス）および敗血症性ショック（難治性動脈性低血圧を伴うセプシス）である。あるいは、感染の証拠なしに全身性炎症反応症候群基準のうちの二つ以上を満たす場合、その患者は単純に「SIRS」と診断され得る。SIRSおよび急性臓器機能障害を有する患者は「重症SIRS」と呼ばれ得る。
【００８２】
患者は、セプシス＋全身性低灌流の兆候；終末臓器機能障害または4mmol/dLを超える血清乳酸のいずれかを有する場合、「重症セプシス」を有すると定義される。患者は、セプシス＋適切な急速輸液（典型的には20ml/kgのクリスタロイド）後の低血圧を有する場合、敗血症性ショックを有すると定義される。セプシスを有する成人を診断するための基準は、1ヶ月齢未満の乳児には当てはまらない。乳児においては、感染の存在＋感染に対する全身性応答と一致する兆候および症状の「集積」のみが、診断に必要とされる。
【００８３】
セプシスの治療は、抗生物質、感染液体貯留の外科的な排液、液体交換、および臓器機能障害のための適切な支持に基づく。これには、腎不全における血液透析、肺機能障害における人工呼吸、血液製剤の注入、ならびに循環器不全のための薬物療法および輸液療法が含まれ得る。遷延性の疾病においては、必要であれば、非経口栄養により、適当な栄養を確保することが重要である。
【００８４】
敗血症患者の適当な管理における問題は、セプシスが認識された後、治療を適用するまでの遅延であった。発表された研究は、適切な抗生物質治療の適用が1時間遅れる毎に、関連して、死亡率が7％上昇することを証明している。「サバイビング・セプシス・キャンペーン（Surviving Sepsis Campaign）」というタイトルの大きな国際的共同研究が、セプシスに関する情報を人々に与え、セプシスを有する患者の予後を改善するために確立された。キャンペーンは、後に完全なガイドラインのセットを発表することを目標に、重症セプシスのための管理戦略の、証拠に基づく概要を発表している。
【００８５】
炎症過程自体に向けられた大部分の治療は、予後を改善することができていないが、ドロトレコギンアルファ（凝固因子のうちの一つ、活性型プロテインC）は、重症セプシスにおいて約31％から約25％へと死亡率を減少させることが示された。ドロトレコギンアルファが適格であるためには、患者は、25以上のAPACHE IIスコアおよび低い出血リスクと共に、重症セプシスまたは敗血症性ショックを有しなければならない。低用量ヒドロコルチゾン処置は、ACTH刺激試験により定義されるような相対的な副腎不全を有する敗血症性ショック患者のための見込みを示した。
【００８６】
セプシスを有すると推測される乳児の標準的な処置は、支持療法、静脈内輸液による液体状態の維持、および（アンピシリンのような）βラクタム系抗生物質とゲンタマイシンのようなアミノグリコシドとの組み合わせからなる。
【００８７】
ii. 外傷
身体的外傷とは、肢の除去のような、重篤な、身体を改変する身体的損傷である。鈍的外傷は、鈍い物体からまたは鈍い物体により加えられた衝撃またはその他の力により引き起こされる身体的外傷の型であり、穿通性外傷は、ある物体が皮膚または組織を穿通する身体的外傷の型である。外傷は、事故のような無計画のものとしても記載され得るし、または手術の場合の計画的なものとしても記載され得る。いずれも、軽度〜重度の組織傷害、血液損失、および／またはショックを特徴とし、いずれも、セプシスを含むその後の感染をもたらし得る。本発明は、前処置（医学的手技の場合）および発生した外傷損傷の後の処置の両方を含む、外傷の処置を提供する。
【００８８】
手術。手術は、疾患もしくは損傷のような病理学的状態を調査しかつ／もしくは処置するため、身体の機能もしくは外観の改善を助けるため、または時にはその他の何らかの理由のため、患者に対して手術的な手動の技術および機器による技術を使用する。本発明は、以下にさらに定義されるような、手術に起因する外傷を扱うことができる。
【００８９】
概して、患者の組織の切除、または以前に被った創傷の閉鎖を含む時、その手技は、外科的であると見なされる。血管形成または内視鏡検査のような、この規程に必ずしも入らない他の手技も、無菌環境、麻酔、消毒条件、典型的な外科用器具、および縫合またはステープリングの使用のような、一般的な外科的な手技または環境を含む場合、手術と見なされ得る。全ての型の手術が、侵襲的手技と見なされる；いわゆる非侵入的手術とは、一般的に、扱われている構造に浸透しない切除（例えば、角膜のレーザーアブレーション）または放射線外科的手技（例えば、腫瘍の照射）をさす。手術の所要時間は数分から数時間であり得る。
【００９０】
外科的手技は、一般的に、緊急性、手技の型、関与する身体系、侵襲性の程度、および特別の機器により分類される。待機手術は、生命を脅かすものではない状態を補正するために行われ、患者の要請により実施されるが、外科医および外科施設の利用可能性の影響を受ける。緊急手術とは、命、肢、または機能的能力を救うために迅速に行われなければならない手術である。診査手術は、診断を補助するかまたは確認するために実施される。治療手術は、以前に診断された状態を処置する。
【００９１】
切断術は、身体の一部分、一般的には、肢または指の切除を含む。再移植は、切断された身体の一部分の再付着を含む。再建手術は、損傷を負った、離断された、または変形した身体の一部分の再構築を含む。美容手術は、他の点については正常である構造の外観を改善するために行われる。切除術は、患者からの臓器、組織、またはその他の身体の一部分の切除である。移植手術は、異なるヒト（または動物）からの臓器または身体の一部分を患者へ挿入することによる、臓器または身体の一部分の交換である。移植において使用するため、生存しているヒトまたは動物から臓器または身体の一部分を除去することも、手術の一つの型である。
【００９２】
手術は、ある臓器系または構造に対して実施される場合、関与している臓器、臓器系、または組織により分類され得る。例には、（心臓に対して実施される）心臓手術、（消化管およびその付属臓器において実施される）胃腸手術、ならびに（骨および／または筋肉に対して実施される）整形外科手術が含まれる。
【００９３】
低侵襲手術は、腹腔鏡手術または血管形成の場合のように、体腔または構造に小型装置を挿入するための比較的小さな外部切開を含む。対照的に、開放外科手技は、関心対象の区域に到達するための大きな切開を必要とする。レーザー手術は、組織を切断するために、メスまたは類似の外科用器具の代わりにレーザーを使用することを含む。顕微鏡下手術は、外科医が小さな構造を見るための手術用顕微鏡の使用を含む。ロボット手術は、外科医の指示の下で機器をコントロールするために、Da VinciまたはZeus手術システムのような手術用ロボットを利用する。
【００９４】
外傷性出血。外傷性出血は、多くの人々の死亡を引き起こし、負傷者における高い罹患率を作出する、損傷の広範な国際的な影響の多くの原因となっている。入院前医療の差にも関わらず、外傷性出血の急性管理は、世界中で類似しており、よく認められている発表されたガイドラインに従う。重度の損傷を負った患者の医療は、四つのしばしばオーバーラップするセグメントとして行われる：蘇生医療期、手術医療期、および救命医療期。診断および出血のコントロールは、外傷医療の全ての期において最優先されるべきであり、出血性ショック中の患者において特に重要である。出血コントロールのための初期の試みには、直接圧迫、圧迫包帯、または止血帯による可視の重度出血源の直接のコントロール；長骨および骨盤の骨折の安定化；ならびに患者の保温が含まれる。蘇生期には、加温輸液の静脈内投与、出血の外科的コントロールの前の低血圧蘇生、ならびに血液および血液製剤の適切な輸液が提供される。手術期には、出血およびその他の損傷の外科的コントロール、ならびに付加的な輸液が提供される。最後に、救命医療期は、術後の支持および組織灌流を提供する。
【００９５】
iii. 急性膵炎
急性膵炎は、膵臓の急性発症型の炎症である。その重度に依っては、処置にも関わらず、重度の合併症および高い死亡率を有することがある。軽症例は、保存的措置または腹腔鏡検査により成功裡に処置されることが多いが、重症例は、疾患過程を抑えるための侵襲的な手術（しばしば、複数回の介入）を必要とする。
【００９６】
iv. 急性呼吸窮迫症候群
呼吸窮迫症候群（RDS）または（IRDSに対して）成人型呼吸窮迫症候群としても公知の急性呼吸窮迫症候群（ARDS）は、肺への様々な型の損傷に対する重篤な反応である。これは、透過性の増加した肺水腫をもたらす最も重要な障害である。
【００９７】
ARDSは、多様な直接的および間接的な傷害により引き起こされる重度の肺疾患である。それは、炎症、低酸素血症を引き起こし、多臓器不全を高頻度にもたらす、炎症メディエーターの同時の全身放出を伴う、ガス交換障害をもたらす肺柔組織の炎症を特徴とする。この状態は、命を脅かし、しばしば致死であり、人工呼吸および集中治療室への入院を一般的に必要とする。比較的軽度の型は急性肺損傷（ALI）と呼ばれる。
【００９８】
ARDSは、損傷または急性疾病の発作の24〜48時間以内に発生し得る。そのような症例において、患者は、一般的に、息切れ、多呼吸、および根底にある原因、即ち、ショックに関係した症状を呈する。マラリアのような、長期の疾病によって誘発されることもある。その場合、ARDSは、特に急性の感染症例の発症の後、何れかの時点で発生し得る。
【００９９】
動脈血ガス分析および胸部X線が、上記の基準を使用した推論により、正式な診断を可能にする。重度の低酸素血症が一般に含まれるが、異常なPaO2を定義する適切な閾値は系統的には研究されていない。肺水腫の心原性の原因は排除されるべきである。これは、肺動脈楔入圧を測定するため、肺動脈カテーテルを配置することにより行われ得る。しかしながら、これは必要ではなく、肺動脈カテーテルの使用がARDSを含む重度疾病において患者の予後を改善しないことを証明する豊富な証拠が出現しているため、現在は、ほとんど行われない。胸部単純X線は、症例の大多数において両側肺胞浸潤物を立証するのに十分である。CTスキャンは、ARDSにおける肺柔組織のより正確な画像をもたらすが、ARDSを有する患者の臨床的管理における利用可能性はほとんどなく、概して研究道具のままである。
【０１００】
急性呼吸窮迫症候群は、一般的に、集中治療室において人工呼吸により処置される。換気は、一般的には、経口気管内挿管を通して送達され、または長期的な換気（≧2週間）が不可避であると見なされる場合には必ず、気管開口術を通して送達される。非侵襲的な換気の可能性は、疾患の極初期に限られ、または、より良好には、疾患発症のリスクを有する個体（非定型肺炎、肺挫傷、大手術患者）における防止に限られる。ARDS像を維持する傾向があるため、根底にある原因の処置が不可避である。微生物学的培養結果が入手可能となるや否や、適切な抗生物質治療が適用されなければならない。局所的な微生物学的サーベイランスが効率的である場合には、経験的治療が適切である可能性もある。60％を越えるARDS患者が、肺損傷の発症の前または後に（院内）肺感染を経験する。感染源が外科的に処置可能な場合には、手術されなければならない。セプシスと診断された場合には、適切な局所プロトコルが実行されるべきである。
【０１０１】
v. 虚血再灌流損傷
再灌流損傷とは、虚血の期間の後に、血液供給が組織に戻る時に引き起こされる、組織に対する傷害をさす。血液からの酸素および栄養素の欠如は、循環の回復が、正常機能の回復よりむしろ、酸化ストレスの誘導を通して炎症および酸化的傷害をもたらす条件を作出する。
【０１０２】
再灌流損傷の傷害は、一部分、傷害を負った組織の炎症応答による。新たに戻った血液によりその区域に運ばれた白血球は、組織傷害に応答してインターロイキンのような多数の炎症因子およびフリーラジカルを放出する。回復した血流は、細胞タンパク質、DNA、および原形質膜に傷害を与える酸素を細胞内に再導入する。次に、細胞膜に対する傷害が、さらなるフリーラジカルの放出を引き起こす。そのような反応性種は、アポトーシスを起こさせるよう酸化還元シグナル伝達においても間接的に作用するかもしれない。白血球が、小さな毛細血管において増大し、閉塞を起こし、さらなる虚血をもたらすこともある。
【０１０３】
再灌流損傷は、発作および頭部外傷に関与している脳の虚血カスケードにおいて役割を果たす。虚血および再灌流損傷の反復は、褥瘡および糖尿病性足部潰瘍のような慢性創傷の形成および治癒不全をもたらす因子でもあると考えられる。継続的な圧力は、血液供給を限定し、虚血を引き起こし、再灌流中に炎症が発生する。この過程が反復されると、最終的には、創傷を引き起こすのに十分な傷害が組織に与えられる。
【０１０４】
長期虚血（60分以上）においては、ヒポキサンチンがATP代謝の分解産物として形成される。酵素キサンチンデヒドロゲナーゼが、より高い酸素の利用可能性の結果として、キサンチンオキシダーゼに変換される。この酸化によって、分子状酸素が、高度に反応性の過酸化物およびヒドロキシルラジカルに変換される。キサンチンオキシダーゼは、酸化促進物質としても過酸化亜硝酸のような反応性種のスカベンジャーとしても作用し得る尿酸も生成する。再灌流中に生成された過剰の一酸化窒素は、過酸化物と反応し、強力な反応性種である過酸化亜硝酸を生成する。そのようなラジカルおよび活性酸素種は、細胞膜脂質、タンパク質、およびグリコサミノグリカンを攻撃し、さらなる傷害を引き起こす。それらは、酸化還元シグナル伝達により特定の生物学的過程も開始させ得る。
【０１０５】
vi. 心血管疾患
心血管疾患とは、心臓または血管（動脈および静脈）が関与する疾患のクラスをさす。この用語は、技術的には、心血管系に影響を与える任意の疾患をさすが、一般的には、アテローム性動脈硬化症に関係したもの（動脈疾患）をさすために使用されている。これらの状態は、類似の原因、機序、および処置を有する。心血管疾患の処置は、各患者における疾患の特定の型に依るが、効果的な処置には、上述の防止的な生活様式変化が常に含まれる。血圧を低下させる薬物治療、アスピリン、およびスタチンコレステロール降下薬のような薬物治療が有益であり得る。いくつかの情況においては、傷害を負った血管を再開させるか、修復するか、または交換するため、手術または血管形成が正当化されるかもしれない。
【０１０６】
大部分の西洋諸国が、心血管疾患の高い、増加中の率に直面している。毎年、心疾患で死亡するアメリカ人は、癌より多い。心臓単独の疾患が全ての死亡の30％を引き起こし、心血管系のその他の疾患が、実質的なさらなる死亡および能力障害を引き起こしている。2005年まで、それは、米国および大部分のヨーロッパ諸国において死亡および能力障害の原因の第一位であった。大規模な組織学的研究（PDAY）は、血管損傷が青年期から蓄積することを示しており、従って、一次予防努力は小児期から必要である。
【０１０７】
いくつかのバイオマーカーが、心血管疾患のより詳細なリスクを提示すると考えられている。しかしながら、これらのバイオマーカーの臨床的価値には疑問の余地がある。現在、心血管疾患のより高いリスクを反映するバイオマーカーには、以下のものが含まれる：
より高いフィブリノーゲンおよびPAI-1の血中濃度
ホモシステインの上昇、または正常範囲の上半分であっても
非対称ジメチルアルギニンの血中レベルの上昇
C反応性タンパク質により測定されるような高度の炎症
B型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）の血中レベルの上昇
心血管疾患の様々な型には、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心筋症、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、冠動脈疾患、拡張型心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、肥大型心筋症、僧帽弁逸脱、心筋梗塞、および静脈血栓塞栓症が含まれる。
【０１０８】
vii. 自己免疫疾患／炎症性疾患
本発明は、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、初期関節炎、ウイルス性関節炎、多発性硬化症、または乾癬のような、多様な自己免疫疾患および／または炎症性疾患の状況の処置を企図する。これらの疾患の診断および処置は、文献においてよく立証されている。
【０１０９】
viii. 化学療法、放射線療法、およびサイトカイン治療の毒性
化学療法、放射線、およびサイトカインを含む様々な型の癌治療は、癌患者における、重度であることもある毒性に関連している。毒性が、少なくとも一部分、ヒストンの細胞外作用により引き起こされるという程度に、本発明は、本発明の薬学的組成物を使用して、この毒性を低下させ、それにより、患者側の不快を低下させるかまたは軽減し、より高用量の治療を可能にすることを求める。
【０１１０】
ix. 熱傷
医学的に、熱傷とは、熱、低温、電気、化学物質、摩擦、または放射線により引き起こされた損傷であり得る。第一度熱傷は、一般的に、損傷の部位における発赤（紅斑）、白色斑、および軽微な疼痛に限定される。これらの熱傷は、一般的に、表皮にのみ及ぶ。第二度熱傷は、さらに、透明な液体が充満し、皮膚の表在性の水疱を有し、神経関与のレベルに依る多少の疼痛を含み得る。第二度熱傷には、真皮の表層（乳頭層）が関与するが、深部（網状）真皮層が関与することもある。第三度熱傷は、さらに、皮膚の炭化を有し、硬い革様の痂皮を生ずる。痂皮は、身体の影響を受けていない部分から分離した瘡蓋である。高頻度に、紫色の液体も存在する。熱傷を負った区域においては神経終末が破壊されているため、これらの型の熱傷は無痛であることが多い。重篤な熱傷は、特に、大きな体表面積をカバーする場合には、死亡を引き起こし得る；（例えば、煙吸入を通した）肺への熱傷の暗示は、医学的な緊急事態である。
【０１１１】
筋肉または骨のような皮膚の下にある組織に損傷を与える熱傷は、第四度熱傷として分類されることがある。これらの熱傷は、さらに三つの程度に分けられる：第四度熱傷は、回復不能な皮膚の喪失をもたらし、第五度熱傷は、回復不能な筋肉の喪失をもたらし、第六度熱傷は骨の炭化をもたらす。
【０１１２】
「表在性」、「分層性」（浅達性カテゴリーおよび深達性カテゴリーに分類される）、ならびに「全層性」という、より新しい分類は、皮膚の表皮層、真皮層、および皮下層により正確に関係しており、処置をガイドし、予後を予測するために使用される。
【０１１３】
化学的熱傷は、一般的に、水酸化ナトリウム（灰汁）、硝酸銀、および（硫酸のような）より重篤な化合物のような化学的化合物により引き起こされる。中程度〜重度の化学的熱傷を引き起こし得る大部分の化学物質（全てではない）は、強酸または強塩基である。酸化剤としての硝酸は、恐らく、最悪の熱傷を引き起こす化学物質のうちの一つである。フッ化水素酸は骨まで腐食することができ、その熱傷は直ちには顕性でないことが多い。中程度〜重度の化学的熱傷を引き起こし得る大部分の化学物質は、腐蝕性と呼ばれる。
【０１１４】
電気的熱傷は、一般に、雷光に打たれた時、伝導性ゲルなしに除細動を受けるかまたは電気除細動器を使用した時等の電気ショックの症状である。被った内部損傷は、見える「熱傷」のサイズとは不釣り合いであるかもしれないが、それは、これらが電流の射入創および射出創に過ぎないためである。
【０１１５】
熱傷は、分層性または全層性の熱傷（表在性熱傷は計数されない）により影響を受けた全体表面積（TBSA）に関して査定される。9の法則が、影響を受けたTBSAを推定するための迅速で有用な方式として使用される。熱傷を有する者の管理における第一段階は、燃焼過程を止めることである。乾燥閃光熱傷では、まず火薬を払い落とすべきである。その他の熱傷では、異物を除去し、燃焼過程を止めるのを助けるために、影響を受けた区域を、大量の清潔な水で濯ぐべきである。冷水は、熱傷犠牲者の温度状態を重度に損なうことがあるため、広範囲の熱傷を有する者には適用するべきでない。管理のこの段階で、気道状態を査定することも重大である。患者が火に巻き込まれていたならば、そうでないことが立証されるまで、その者が吸入損傷を被ったと仮定しなければならず、それに応じて処置を管理するべきである。
【０１１６】
燃焼過程が止まり、気道状態が保証されたなら、患者はParklandの式に従って、容量（volume）蘇生を受けるべきである。この式は、損傷の時点から最初の24時間以内に送達すべき乳酸リンゲル液の量を指令する：
液体＝4cc×％TBSA×体重（kg）
％TBSAには第一度熱傷は含まれない。
【０１１７】
この液体の半分が損傷後の最初の8時間に与えられるべきであり、その残りがその後の16時間に与えられるべきである。式は指針に過ぎず、輸液は尿量および中心静脈圧によって調整されなければならない。不十分な輸液蘇生は腎不全および死亡を引き起こす。全層熱傷における重度の浮腫は、焼痂切開術により処置され得る。
【０１１８】
x. 癌
癌は、組織からのクローン細胞集団の増殖に起因する。発癌と呼ばれる癌の発生は、多数の方式でモデル化され、特徴決定され得る。癌の発生と炎症との間の関連は、長い間、認識されてきた。炎症応答は、微生物感染に対する宿主の防御に関与し、組織の修復および再生も駆動する。相当の証拠が、炎症と癌発症のリスクとの間のつながりを指摘している。即ち、慢性炎症は異形成をもたらし得る。
【０１１９】
研究は、世界中の癌のほぼ15％が、微生物感染に関連していると推定した。ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIV、およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のような生物は、全て、癌との関係が示されている。その他の場合において、タバコの煙、石綿、およびシリカを含む、慢性の刺激およびその後の炎症を引き起こす環境条件も、癌の素因を与えることがある。
【０１２０】
いくつかの型のウイルス感染の場合、ウイルスによりコードされた遺伝子は、細胞形質転換に寄与することができる。例はHPVオンコプロテインE6およびE7である。しかしながら、形質転換性でないため、この様式では作用しない癌関連微生物もある。例えば、H.ピロリのある種の株は、宿主細胞シグナル伝達に影響を与える因子を含有しているが、癌遺伝子は含有していない。興味深いことに、H.ピロリはMUC1を誘導することが観察されている。
【０１２１】
慢性炎症状況がゲノム損傷および腫瘍開始をもたらし得るその他の方式は、化学的なものである。例えば、宿主細胞は、フリーラジカルの産生により微生物感染に対抗する。抗微生物効果に加えて、これらの分子は、宿主細胞においてさえDNA変異のリスクを増加させるDNA塩基の酸化的傷害およびニトロ化をもたらす。
【０１２２】
細胞調節不全へのさらに別の経路は、感染またはその他の炎症性傷害において発生する細胞死に起因するかもしれない。失われた細胞は、他の細胞、時には、組織幹細胞のような未分化前駆細胞の拡大により補充されなければならない。多くの炎症経路が生存および増殖を媒介するために機能することは、驚くべきことではない。従って、組織修復を媒介しようとして、炎症応答が、過度の生存シグナルおよび増殖シグナルを細胞に誤って提供し、従って、腫瘍形成をもたらすことはあり得る。
【０１２３】
癌と炎症との間の関係のため、炎症シグナル伝達経路を低下させる本発明のペプチドおよびペプチドアナログの能力は、形成異常性増殖の発症を防止するかまたは遅延させるため、前癌情況または癌リスク情況において活用され得る。
【０１２４】
C. 処置方法
MUC1オリゴマー形成を阻害するペプチドまたはアナログは、一般に、抗炎症剤として有用である。それらは、哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）に、単独で、または炎症を調節する他の薬物と共に投与され得る。化合物は、遺伝学的に、かつ／または例えば生理学的要因および／または環境要因のために炎症への感受性が高い対象、例えば、炎症性疾患の家族歴を有する対象、または慢性炎症を有するかもしくは慢性ストレスを受けている対象にも投与され得る。
【０１２５】
必要とされる投薬量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の疾病の性質；対象のサイズ、体重、表面積、年齢、および性別；投与される他の薬物；ならびに主治医の判断に依る。適当な投薬量は、0.0001mg/kg〜100mg/kgの範囲にある。利用可能な化合物の多様性および様々な投与経路の異なる効率を考慮すると、必要投薬量の広い変動が予想される。例えば、経口投与は、静脈注射による投与より高い投薬量を必要とすると予想されるであろう。これらの投薬量レベルの変動は、当技術分野においてよく理解されているような最適化のための標準的な経験的なルーチンを使用して調整され得る。投与は、単回であってもよいし、または複数回（例えば、2回、3回、4回、6回、8回、10回、20回、50回、100回、150回、もしくはそれ以上）であってもよい。適当な送達媒体（例えば、ポリマー性微粒子または埋め込み可能装置）へのポリペプチドの封入は、特に、経口送達のため、送達の効率を増加させ得る。
【０１２６】
D. 組み合わせ治療
複数の治療モダリティにより疾患を処置することは、医学の多くの領域において一般的であり、「組み合わせ治療」と呼ばれることが多い。炎症性疾患も例外でない。
【０１２７】
本発明の方法および組成物を使用して炎症性障害を処置するためには、一般に、MUC1アンタゴニストおよび少なくとも一つのその他の治療と、標的細胞または対象とを接触させるであろう。これらの治療は、一つまたは複数の疾患パラメーターの低下を達成するのに効果的な組み合わせ量で提供されるであろう。この過程は、例えば、両方の薬剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤を使用して、細胞／対象を、両方の薬剤／治療と同時に接触させることを含んでいてもよいし、または細胞／対象を、二つの別個の組成物もしくは製剤（一方の組成物はMUC1アンタゴニストを含み、他方は他の薬剤を含む）と同時に接触させることを含んでいてもよい。
【０１２８】
あるいは、MUC1アンタゴニストは、数分から数週までの範囲の間隔で、他の処置と前後してもよい。一般に、治療が、有利に組み合わせられた効果を細胞/対象に対して発揮することができるよう、各送達の時点の間に有意な期間が空かないことが確実にされるであろう。そのような状況においては、相互の約12〜24時間以内、相互の約6〜12時間以内、または約12時間のみの遅延時間で、細胞を両方のモダリティと接触させることが企図される。しかしながら、いくつかの情況においては、それぞれの適用の間に数日（2日、3日、4日、5日、6日、または7日）〜数週（1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、または8週）が経過するよう、処置のための期間を有意に延長することが望ましいかもしれない。
【０１２９】
MUC1アンタゴニストまたは他の治療のいずれかの複数回の適用が望まれるであろうことも想像される。以下に例示されるような、様々な組み合わせが利用され得る（ここで、MUC1アンタゴニストが「A」であり、他の治療が「B」である）：
0005702371.tif 000009
その他の組み合わせも企図される。
【０１３０】
炎症性障害に対する組み合わせ治療において使用するのに適している薬剤または因子には、ステロイド、グルココルチコイド、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID；COX-1阻害剤およびCOX-2阻害剤を含む）、アスピリン、イブプロフェン、ならびにナプロキセンが含まれる。鎮痛薬は、一般的に、抗炎症効果を有しない抗炎症薬に関連している。一例は、米国においてアセトアミノフェンと呼ばれ、Tylenolの商品名で販売されているパラセタモールである。COX酵素を阻害することにより疼痛および炎症を低下させるNSAIDSとは対照的に、パラセタモールは、疼痛のみを低下させる内在性カンナビノイドの再取り込みを阻止することが最近示された。それが、炎症に対して最小限の効果を有する理由である可能性が高い。
【０１３１】
当業者は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33, in particular pages 624-652の指示を受ける。投薬量のいくらかの変動が、必然的に、処置される対象の条件に依って起こるであろう。投与を担う者は、いかなる場合にも、個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与のため、調製物は、FDA Office of Biologicsの基準により要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
【０１３２】
上記の治療のいずれかが、炎症の処置において単独で有用であると判明するかもしれないことも、指摘されるべきである。
【実施例】
【０１３３】
VI. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することが本発明者らにより発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると見され得ることが、当業者により認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、開示された特定の態様に多くの変化を施しても、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を入手することが可能であることを認識するべきである。
【０１３４】
実施例1−材料および方法
細胞培養。ヒトZR-75-1乳癌細胞およびU-937白血病細胞を、10％熱不活化ウシ胎仔血清（FBS）、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有しているRPMI1640培地で培養した。ヒトHeLa子宮頚癌細胞およびMCF-7乳癌細胞を、10％FBS、抗生物質、およびL-グルタミンを含むダルベッコ修飾イーグル培地で培養した。ヒトMCF-10A乳房上皮細胞を、乳房上皮細胞増殖培地（MEGM；Lonza,Walkersville,MD）で培養し、20ng/ml TNFα（BD Biosciences,San Jose,CA）により処理した。siRNAプール（Dharmacon,Lafayette,CO）によるMCF-10A細胞のトランスフェクションを、リポフェクタミン2000（Invitrogen,Carlsbad,CA）の存在下で実施した。細胞を、MIT Biopolymer Laboratory（Cambridge,MA）により合成された、5μMのMUC1/CQCペプチドおよびMUC1/AQAペプチドにより処理した。
【０１３５】
免疫沈降およびイムノブロッティング。記載されたようにして（Ren et al.,2004）、コンフルエンスになる前の細胞からの溶解物を調製した。可溶性タンパク質を、抗NF-κB p65（Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA）により沈降させた。免疫沈降物および細胞溶解物を、抗p65、抗p65(180-306)（Millipore,Billerica,MA）、抗MUC1-C（Ab5；Lab Vision,Fremont,CA）、抗IκBα（Santa Cruz Biotechnology）、抗Bcl-xL（Santa Cruz Biotechnology）、および抗αアクチン（Sigma,St. Louis,MO）によるイムノブロッティングに供した。免疫複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体（GE Healthcare Biosciences,Piscataway,NJ）および増強化学発光（GE Healthcare）により検出した。
【０１３６】
インビトロ結合アッセイ。GST、GST-MUC1-CD、GST-MUC1-CD(1-45)、およびGST-MUC1-CD(46-72)を、記載されたようにして（Ahmad et al.,2007）調製し、p65およびある種のp65欠失変異体と共にインキュベートした。精製されたGST-MUC1-CDを、GST部分を除去するため、トロンビンにより切断した。GST-IκBα（Millipore,Billerica,MA）を、精製されたMUC1-CDの非存在下および存在下で、25℃で2時間、p65(186-306)と共にインキュベートした。グルタチオンとコンジュゲートしたビーズへの吸着物を、イムノブロッティングにより分析した。
【０１３７】
免疫蛍光共焦点顕微鏡検。記載されたようにして（Raina et al.,2006）、細胞を固定し、透過性化した。ブロッキング緩衝液中での抗MUC1-Cおよび抗NF-κB p65とのインキュベーションを、4℃で一夜、実施した。細胞を10％ヤギ血清によりブロッキングし、抗MUC1-Cにより染色し、続いて、FITCとコンジュゲートした二次抗ハムスター抗体により染色した。次いで、細胞を抗NF-κB p65と共にインキュベートし、続いて、テキサスレッドとコンジュゲートした抗マウスIgコンジュゲート（Jackson Immuno-Research Laboratories,West Grove,PA）と共にインキュベートした。核を2μM TO-PRO-3により染色した。1024×1024分解能のZeiss LSM510共焦点顕微鏡により画像を捕獲した。
【０１３８】
ChIPアッセイ。可溶性クロマチンを、記載されたようにして（Wei et al.,2006）調製し、抗p65、抗MUC1-C、または対照非免疫IgGにより沈降させた。Re-ChIPアッセイのため、一次ChIPからの複合体を10mM DTTにより溶出させ、Re-ChIP緩衝液で希釈し、抗p65により再免疫沈降させた。PCRのため、50μl DNA抽出物からの2μlを、25〜35サイクルの増幅に使用した。
【０１３９】
ルシフェラーゼアッセイ。細胞を、リポフェクタミンの存在下で、NFκB-Luc（Ahmad et al.,2007）またはpMUC1-Luc（Yin et al.,2003）およびSV-40-ウミシイタケ-Luc（Promega,Madison,WI）によりトランスフェクトした。48時間後、細胞を受動溶解緩衝液で溶解させた。溶解物を、dual luciferase assay kit（Promega）を使用して、ホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。
【０１４０】
実施例2−結果
MUC1-CはNF-κB p65と会合する。MUC1がNF-κBと相互作用するか否かを決定するため、ZR-75-1乳癌細胞からの抗NF-κB p65沈降物を、MUC1-Cサブユニット細胞質ドメインに対する抗体によりイムノブロットした。結果は、MUC1-CがNF-κB p65と共沈降することを証明している（図1A）。やはり内在性MUC1を過剰発現しているMCF-7乳癌細胞からの溶解物でも、類似の所見が入手された（図1B）。MUC1-Nサブユニットが会合に必要であるか否かを決定するため、外来性MUC1-Cを安定的に発現し、MUC1-Nは発現しないU-937細胞（Agata et al.,2008）に対して、研究を実施した。これらの細胞におけるNF-κB p65とMUC1-Cとの共沈降は、MUC1-Nが相互作用にとって不可欠でないことを証明した（図1C）。GST、または72アミノ酸MUC1-CDを含有しているGST融合タンパク質とのZR-75-1細胞溶解物のインキュベーションは、MUC1-CDがNF-κB p65と会合することをさらに証明した（図1D）。これらの所見は、MUC1-Cサブユニットがヒト乳癌細胞においてNF-κB p65と構成性に会合していること、そしてその相互作用がMUC1-C細胞質ドメインにより媒介されることを示した。
【０１４１】
MUC1-CDはNF-κB p65に直接結合する。MUC1がNF-κBに直接結合するか否かを決定するため、本発明者らは、GST、GST-MUC1-CD、またはGST-MUC1-CD欠失変異体（図7A、上パネル）を、精製された組換えNF-κB p65と共にインキュベートした。吸着物の分析は、GST-MUC1-CDがNF-κB p65に結合し、GSTは結合しないことを証明した（図7A、下パネル）。MUC1-CD欠失変異体のインキュベーションは、この相互作用がMUC1-CD(46-72)により媒介されMUC1-CD(1-45)によっては媒介されないことをさらに証明した（図7A、下パネル）。NF-κB p65は、N末端Relホモロジードメイン（RHD）およびC末端トランスアクチベーションドメイン（TAD）を含む、551アミノ酸タンパク質である（図7B、上パネル）。精製されたNF-κB欠失変異体とのGST-MUC1-CDのインキュベーションは、p65(1-306)には結合するが、p65(354-551)には結合しないことを証明した（図7B、下パネル）。相互作用を担うNF-κB領域をさらに画定するため、本発明者らは、GST-MUC1-CDをp65(1-180)およびp65(186-306)と共にインキュベートした。結果は、MUC1-CDがp65(1-180)に結合することを示す（図7C）。対照として、GST-IκBαとp65(1-180)との検出可能な相互作用は存在しなかった（図7C）。それに関して、IκBαは、アミノ酸301〜304（Jacobs et al.,1998；Huxford et al.,1998）のNLSの直ぐ上流の配列に結合する。しかしながら、注目すべきことに、MUC1-CDおよびIκBαの両方が、p65(186-306)との複合体を形成した（図7D）。これらの所見は、IκBαと同様に、MUC1-CDがNF-κB p65 RHDに直接結合することを示した。
【０１４２】
MUC1-CDはNF-κB p65への結合についてIκBαと競合する。保存されたRHDは、DNA結合、二量体化、およびIκB阻害タンパク質との会合を担う（Ghosh et al.,1998；Chen and Greene,2004）。RHD領域へのMUC1の結合が、IκBαとの会合に影響を与えるか否かを決定するため、本発明者らは、まず、MUC1 siRNAによりMUC1について安定的にサイレンシングされているZR-75-1細胞を研究した（図8）。MUC1のサイレンシングは、NF-κB p65とIκBαとの結合の増加に関連していた（図2A）。さらに、HeLa細胞における外来性MUC1の安定的発現（Ahmad et al.,2007）は、NF-κB p65とIκBαとの間の相互作用を減少させた（図2B）。3Y1細胞（Huang et al.,2005）におけるMUC1-CDの安定的な発現も、NF-κB p65とIκBαとの結合を阻止するのに十分であり（図2C）、このことから、MUC1-C細胞質ドメインが相互作用を担い、このサブユニットの他の領域はそうでないことが確認された。MUC1がNF-κB p65とIκBαとの結合に直接影響を与えるか否かを決定するため、本発明者らは、MUC1-CDの存在下でIκBαのp65(186-306)への結合を査定する競合研究を実施した。予想通り、MUC1-CDの非存在下では、IκBαのp65(186-306)への結合は検出可能であった（図2D）。しかしながら、意義深いことに、増加する量のMUC1-CDの添加は、IκBαとp65(186-306)との相互作用の進行性の減少に関連していた（図2D）。これらの所見は、NF-κB p65が、IκBαおよびMUC1-CDと相互に排他的な複合体を形成することを示す。
【０１４３】
MUC1-Cは核においてNF-κB p65と会合する。ZR-75-1細胞の共焦点分析は、MUC1-CとNF-κB p65との核における共局在を示した（図3A）。さらに、MUC1-CDがNF-κB p65への結合について競合することと一致して、ZR-75-1細胞におけるMUC1のサイレンシングは、核のNF-κB p65の細胞質への局在に関連していた（図3A）。以前の研究は、MUC1がBcl-xL発現のアップレギュレーションに寄与すると証明した（Ahmad et al.,2007）。MUC1-CがNF-κB p65転写複合体に影響を与えるか否かを決定するため、本発明者らは、抗p65によるChIPアッセイを実施した。Bcl-xL遺伝子のプロモーター内のNF-κB応答要素（RE）（GGGACTGCCC（SEQ ID NO:59）；-366〜-356）（Grillot et al.,1997）の免疫沈降を、半定量的PCRにより分析した。ZR-75-1細胞において、NF-κB p65によるBcl-xLプロモーターの占有は、MUC1のサイレンシングにより減少した（図3B）。対照として、非免疫IgGにより実施された免疫沈降物には、検出可能なシグナルが存在しなかった（図3B）。NF-κB-REの上流のBcl-xLプロモーターの対照領域（CR；-1001〜-760）の検出可能なNF-κB p65占有も存在しなかった（図3B）。HeLa細胞の分析は、外来性MUC1の発現がBcl-xLプロモーターのNF-κB p65占有の増加に関連していることをさらに証明した（図3C）。MUC1-CがNF-κB転写複合体内に存在するか否かを決定するため、抗MUC1-CによるChIPアッセイを実施した。ZR-75-1細胞からのクロマチンを使用したところ、MUC1-C占有は、NF-κB-RE上に検出可能であったが、対照領域上には検出可能でなかった（図3D、左）。Re-ChIPアッセイにおいて、抗MUC1-C複合体を放出させ、抗p65により再免疫沈降させ、次いで、PCRにより分析した。抗p65は、抗MUC1-Cからの放出の後、NF-κB-RE領域を沈降させ（図3D、右）、このことから、MUC1-Cが、NF-κB転写複合体により占有されるBcl-xLプロモーター領域に構成性に存在することが示された。
【０１４４】
MCF-10A乳房上皮細胞におけるNF-κB p65とMUC1-Cとの誘導可能な相互作用。非悪性MCF-10A乳房上皮細胞（Soule et al.,1990；Muthuswamy et al.,2001）は、内在性MUC1を発現するが、乳癌細胞に見出されるものよりレベルは低い（Ahmad et al.,2007）。しかしながら、本発明者らは、TNFαによるMCF-10A細胞の刺激が、MUC1発現の実質的なアップレギュレーションに関連していることを見出した（図4A）。乳癌細胞とは対照的に、MCF-10A細胞は、NF-κB p65とMUC1-Cとの間の構成性の相互作用を、示したとしても、ほとんど示さなかった（図4B）。次に、TNFαによるMCF-10A細胞の刺激は、NF-κB p65とMUC1-Cとの間の相互作用を誘導した（図4B）。NF-κBは、コンセンサス配列および縮重κB結合配列（5'-GGGRNWYYCC-3'（SEQ ID NO:57）（Rはプリンであり、Nは任意の塩基であり、Wはアデニンまたはチミンであり、かつYはピリミジンである）を受け入れる。MUC1プロモーターは、NF-κB結合のためのそのような可能性のある配列（5'-GGAAAGTCC-3'；-589〜-580）を含有している（Lagow et al.,2002）（図4C）。TNFαにより刺激されたMCF-10A細胞のChIP分析は、MUC1プロモーターNF-κB結合モチーフのMUC1-C占有を証明したが、未刺激のMCF-10A細胞では証明されなかった（図4C）。Re-ChIP分析は、NF-κB p65とMUC1-Cとが、MUC1プロモーターの同一の領域を占有することをさらに証明した（図4D）。これらの所見は、乳癌細胞とは対照的に、NF-κB p65とMUC1-Cとの間の相互作用、およびMUC1プロモーター内のNF-κB結合モチーフの占有が、MCF-10A細胞において誘導可能であることを示す。
【０１４５】
NF-κB p65により媒介される転写活性化に対するMUC1の効果。MUC1がNF-κBにより媒介される転写の活性化に影響を与えるか否かを決定するため、本発明者らは、対照細胞およびTNFαにより刺激されたMCF-10A細胞においてNF-κB p65をサイレンシングした（図5A）。MUC1遺伝子転写の活性化におけるNF-κB p65の可能性のある役割と一致して、NF-κB p65のサイレンシングは、TNFαにより誘導されるMUC1-C発現増加を減弱させた（図5A）。予想通り、NF-κB p65のサイレンシングは、TNFαにより誘導されるNF-κB-Lucレポーターの活性化を減弱させた（図5B、左）。意義深いことに、TNFαにより誘導されるMUC1プロモーター-Luc（pMUC1-Luc）の活性化も、NF-κB p65のサイレンシングにより減弱した（図5B、右）。MUC1-Cの効果を査定するため、本発明者らは、MUC1siRNAによりMCF-10A細胞におけるMUC1発現をサイレンシングした（図5C）。NF-κB-REのNF-κB p65占有に対するMUC1の効果と一致して、MUC1のサイレンシングは、TNFにより誘導されるNF-κB-Lucレポーターの活性化を減弱させた（図5D、左）。さらに、MUC1のサイレンシングは、pMUC1-Lucレポーターの活性化を減弱させた（図5D、右）。これらの所見は、MUC1が、MUC1プロモーターのNF-κB p65により媒介される転写活性化を促進することを示す。
【０１４６】
MUC1-CDのターゲティングはNF-κB p65機能を阻止する。NF-κB p65機能におけるMUC1の役割をさらに画定するため、本発明者らは、MUC1-C細胞質ドメインのオリゴマー化を阻止し、それにより機能を阻止する、MUC1-CD(1-15)に相当するペプチドを合成した（Leng et al.,2007）。さらに、CQCモチーフをAQAに変異させた対照ペプチドを合成した（図6A）。細胞へのペプチドの侵入を容易にするため、ポリD-アルギニン導入ドメインを合成中に含めた（Fischer,2007）（図6A）。MUC1/CQCペプチドは、インビトロでMUC1-CDとNF-κB p65との間の相互作用を阻止した（図6A、左）。対照的に、MUC1/AQAペプチドには、この相互作用に対する効果が、あったとしても、ほとんどなかった（図6A、左）。MUC1/CQCペプチドによるMCF-10A細胞の処理も、TNFαにより誘導されるMUC1-CとNF-κB p65との間の相互作用を阻止したが、MUC1/AQAペプチドは阻止しなかった（図6A、右）。MUC1プロモーターのChIP分析は、MUC1/CQCペプチドによる処理が、TNFαにより誘導されるMUC1-CおよびNF-κB p65によるNF-κB結合モチーフの占有を減少させることをさらに示した（図6B）。これらの結果と協調的に、MUC1/CQCペプチドによる処理は、TNFαにより誘導されるMUC1発現を減少させた（図6C）。MUC1/CQCペプチドは、TNFαにより誘導されるBcl-xL発現も減弱させた（図6C）。これらの所見は、MUC1/CQCペプチドによるMUC1-C機能の破壊が、（i）MUC1-Cの核ターゲティング、ならびに（ii）NF-κBp65により媒介されるMUC1およびBcl-xLの発現の活性化を減弱させることを示す。
【０１４７】
MUC1-CはSTAT3と直接相互作用する。MUC1-Cサブユニットは、p53を含む、ある種の転写因子と相互作用する（Wei,2005；Wei,2006；Wei,2007）。MUC1-CがSTAT3と会合するか否かを決定するため、ZR-75-1乳癌細胞からの抗STAT3沈降物を、MUC1-Cに対する抗体によりイムノブロットした。結果は、MUC1-CがSTAT3と構成性に会合することを証明する（図9A、左）。やはり内在性MUC1を発現するMCF-7乳癌細胞に対して共沈降研究を実施した場合にも、類似の結果が入手された（図9A、右）。GSTまたはGST-MUC1-CD融合タンパク質とのZR-75-1細胞溶解物のインキュベーションは、MUC1-CDがSTAT3と相互作用することをさらに証明した（図9A）。相互作用が直接的であるか否かを決定するため、精製された組換えSTAT3を用いた研究を実施した。GST-MUC1-CDはSTAT3と会合したが、GSTは会合しなかった（図9C）。MUC1-CD欠失変異体とのインキュベーションは、MUC1(46-72)はSTAT3と直接結合するが、MUC1-CD(1-45)はそうでないことをさらに証明した（図9C）。STAT3の構造は、N末端の二量体化ドメイン、中央のDNA結合ドメイン（DBD）、およびC末端のトランスアクチベーションドメインを含む（Yu and Jove,2004）（図9D）。STAT3欠失変異体とのMUC1-CDのインキュベーションは、DBDドメインへの結合を示し、二量体化ドメインまたはトランスアクチベーションドメインへの結合は示さなかった（図9D）。これらの所見は、MUC1-Cが乳癌細胞においてSTAT3と会合すること、そしてその相互作用がMUC1-C細胞質ドメインとSTAT3 DBDとの直接結合により媒介されることを示す。
【０１４８】
STAT3およびMUC1-Cは乳癌細胞においてMUC1プロモーターを構成性に占有する。MUC1-Cは、乳癌細胞の核に局在する（Wei,2006）。MUC1-Cが核においてSTAT3と会合するか否かを決定するため、本発明者らは、MUC1プロモーター内のコンセンサスSTAT結合部位（SBS；-575〜-564；
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）に対してクロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイを実施した（Gaemers,2001）。抗STAT3によるZR-75-1細胞からのクロマチンの沈降は、STAT3がSTAT結合モチーフ上に存在し、対照領域（CR；+4524〜+4745）には存在しないことを示した（図10A、左）。ChIP分析は、MUC1-CがSTAT結合部位を構成性に占有することも証明した（図10A、右）。MCF-7細胞におけるMUC1プロモーターのChIP分析は、STAT3およびMUC1-Cの両方がSTAT結合部位を構成性に占有し、対照領域は占有しないことをさらに証明した（図10B）。さらに、Re-ChIPアッセイは、MUC1-CがZR-75-1細胞およびMCF-7細胞の両方においてSTAT3と共にMUC1プロモーターを占有することを証明した（図10C）。MUC1 siRNAによりMUC1について安定的にサイレンシングされているMCF-7細胞の分析は、MUC1-CがMUC1プロモーターSBSのSTAT3占有を促進することをさらに示した（図10D）。これらの所見は、MUC1-CがSTAT3転写複合体と会合することを示す。
【０１４９】
IL-6はMCF-10A乳房上皮細胞におけるMUC1発現を誘導する。非悪性MCF-10A乳房上皮細胞は内在性MUC1を発現するが、ZR-75-1乳癌細胞およびMCF-7乳癌細胞よりレベルは低い（Ahmad,2007）。しかしながら、STAT3経路の活性化因子であるIL-6（Yu and Jove,2004）によるMCF-10A細胞の刺激は、MUC1-C発現のアップレギュレーション（図11A、左）、および核へのMUC1-Cのターゲティング（図11B、右）に関連していた。乳癌細胞とは対照的に、MCF-10A細胞にはMUC1-CのSTAT3との構成性の会合はほとんど存在しなかった（図11B）。さらに、IL-6による刺激は、MUC1-CとSTAT3との結合を誘導した（図11B）。MUC1プロモーターのChIP分析は、IL-6がSTAT結合部位のSTAT3およびMUC1-Cの両方による占有を誘導することをさらに示した（図11C）。さらに、re-ChIP研究は、MUC1-CがIL-6依存性の機序によりMUC1プロモーター上のSTAT3と会合することを証明した（図11D）。これらの所見は、MCF-10A細胞において、MUC1-CとSTAT3との間の相互作用、およびMUC1プロモーター上のそれらの占有が、IL-6により誘導可能であることを示す。
【０１５０】
IL-6はSTAT3依存性の機序によりMUC1プロモーターを活性化する。STAT3が、IL-6により誘導されるMUC1のアップレギュレーションを担うことを確認するため、本発明者らは、MCF-10A細胞においてSTAT3をサイレンシングした（図12A）。結果は、IL-6がIL-6依存性の機序によりMUC1発現を誘導することを証明する（図12A）。MCF-10A細胞のIL-6による刺激は、RT-PCRにより決定されるようなMUC1 mRNAレベルのアップレギュレーションに関連している（図12B）。IL-6がMUC1プロモーターを活性化するか否かを決定するため、MCF-10A細胞をMUC1プロモーター-ルシフェラーゼ構築物（pMUC1-Luc）を発現するようトランスフェクトした。IL-6刺激は、pMUC1-Luc発現の活性化に関連していた（図12C）。対照的に、STAT3による活性化と一致して、pMUC1-LucにおけるSTAT結合部位の変異は、IL-6により誘導されるレポーターの活性化を減弱させた（図12C）。さらに、STAT3のサイレンシングは、IL-6に応答して起こるpMUC1-Lucの活性化を阻止した（図12D）。これらの所見は、IL-6によるMUC1プロモーターの活性化が、STAT3依存性であることを証明する。
【０１５１】
MUC1-CはSTAT3のMUC1プロモーターへのターゲティングを促進する。STAT3転写複合体におけるMUC1-Cの効果を査定するため、本発明者らは、MCF-10A細胞においてMUC1をサイレンシングし（図13A、左）、次いで、MUC1プロモーターのChIPアッセイを実施した。結果は、MUC1のサイレンシングにより、IL-6により誘導されるSTAT3のMUC1プロモーターへのターゲティングが減弱することを証明する（図13A、右）。これらの結果と協調的に、MUC1のサイレンシングは、IL-6により誘導されるpMUC1-Lucレポーターの活性化も減弱させた（図13B）。ZR-75-1細胞において、MUC1のサイレンシング（図13C、左）は、MUC1プロモーターのSTAT3占有の減少に関連していた（図13C、右）。さらに、ZR-75-1細胞におけるMUC1のサイレンシングは、pMUC1-Lucレポーターの構成性の活性化を減少させた（図13D）。これらの所見は、MUC1がSTAT3のMUC1プロモーターへのターゲティングに寄与し、それにより、STAT3により媒介される活性化に寄与することを示す。
【０１５２】
MCF-10A細胞においてMUC1-C機能の阻害はIL-6により誘導されるSTAT3のMUC1プロモーターへのターゲティングを阻止する。STAT3の調節におけるMUC1-Cの役割をさらに査定するため、本発明者らは、MUC1-Cオリゴマー化および細胞質ドメインの機能のペプチド阻害剤GO-201を合成した（Raina,2009）。MUC1-C機能に対する効果を有しない対照CP-1ペプチドも合成した（Raina,2009）。GO-201は、インビトロでMUC1-CDとSTAT3との間の相互作用を阻止したが、CP-1は阻止しなかった（図14A）。GO-201によるMCF-10A細胞の処理は、IL-6により誘導されるMUC1-CとSTAT3との間の相互作用も阻止したが、CP-1は阻止しなかった（図14B）。さらに、GO-201は、IL-6により誘導されるSTAT3およびMUC1-CのMUC1プロモーターへのターゲティングを阻害した（図14C）。これらの結果と一致して、GO-201は、IL-6により誘導されるpMUC1-Lucレポーターの活性化を減弱させた（図14C）。これらの所見は、MUC1-C機能の阻害が、STAT3により媒介されるMUC1転写の活性化を阻止することを証明する。
【０１５３】
MUC1-C末端CQCステープルドペプチド。多くの生物学的経路を支配する細胞内タンパク質間相互作用は、高頻度に、タンパク質のαヘリックス構造により媒介される。ヘリックス状ペプチドも、タンパク質間相互作用に干渉するかまたはタンパク質間相互作用を安定化させることができる。ネイティブのヘリックス状ペプチドは、低い効力、不安定性、および細胞への非効率的な送達のため、治療剤としての主要な欠点を有する。最近の研究は、炭化水素ステープリングと名付けられたαヘリックス状ペプチドの化学的修飾により、これらの問題が克服され得ることを示した。
【０１５４】
本発明者らは、MUC1-C末端内在性ペプチド配列
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を使用し、炭化水素ステープリングを使用して、2種のαヘリックス状ペプチドGO-200-1BおよびGO-200-2Bを作成した。
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【０１５５】
GO-200-1Bへの曝露が、非小細胞肺癌細胞の増殖に影響を与えるか否かを判定するため、H-1650細胞を、7日間、1μMおよび5μM GO-200-1Bにより処理し、増殖についてモニタリングした。結果は、5μM GO-200-1Bによる細胞の処理が、増殖の有意な阻害に関連していたことを証明している（図16A）。さらに、別の非小細胞肺癌細胞株H-1975を、3日間、5μM GO-200-2Bにより処理し、細胞増殖および細胞死についてモニタリングした。結果は、3日間のGO-200-2BによるH-1975細胞の処理が、細胞増殖の80％を越える阻害に関連していたことを証明している。さらに、GO-200-2Bは、細胞死の有意な誘導にも関連していた（図16B）。これらの所見は、ステープルドMUC1-Cペプチドが、ヒトMUC1陽性癌細胞の増殖停止および死滅の誘導において有効であることを示している。
【０１５６】
GO-203アナログ。本発明者らの最近の研究は、MUC1 C末端ペプチド
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が、複数の癌細胞株の増殖を阻害する活性を有することを示した。本発明者らは、より短いMUC1 C末端ペプチドCQCRRKNを腫瘍細胞を死滅させる活性を有することを証明した。しかしながら、これらのMUC1-C末端ペプチドはL-アミノ酸からなる。重要なことに、L-アミノ酸を含むペプチドは、タンパク分解酵素による分解への感受性が高く、D-アミノ酸を含有しているものは、より安定していることが示されている。従って、本発明者らは、L-アミノ酸をD-アミノ酸に変化させた、上記のより短いMUC1 C末端ペプチドの全右旋性型（GO-203）を作成した。さらに、細胞死滅活性を保持するために必要とされる、MUC1-C末端領域からの最低アミノ酸残基を決定するため、図15に記載されるようなGO-203の多くの異なるバージョンも作成した。
【０１５７】
複数の腫瘍細胞株（ZR-75-1ホルモン依存性乳癌；MDA-MB-231三重陰性乳癌；A549非小細胞肺癌；H-1975非小細胞肺癌）を、10％熱不活化ウシ胎仔血清、100単位/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン、ならびに2mmol/L L-グルタミンが補足されたRPMI-1640で培養した。細胞を、3〜7日間、5μMのGO-203の異なるアナログ（図15）により別々に処理し、生存能をトリパンブルー排除により決定した。異なる細胞株の増殖を、媒体のみにより処理された細胞と比較した。結果は、5μMのGO-203の異なるアナログによる複数の腫瘍細胞株の処理が、増殖の有意な阻害に関連していたことを証明している（図17〜21）。
【０１５８】
実施例3−考察
以前の研究。MUC1の過剰発現は、足場非依存性の増殖および腫瘍原性の誘導のために十分である（Li et al.,2003a；Huang et al.,2003；Huang et al.,2005）。しかしながら、注目すべきことに、MUC1の形質転換機能は、細胞質ドメイン内のCQCモチーフのAQAへの変異により排除される（Leng et al.,2007）。MUC1はオリゴマーを形成し、CQCモチーフはこのオリゴマー化に必要である（Leng et al.,2007）。さらに、オリゴマー形成は、MUC1-Cサブユニットの核へのターゲティングに必要である（Leng et al.,2007）。本発明者らは、CQCモチーフと、細胞への侵入のためのポリArg細胞送達ドメインとを含有しているMUC1由来ペプチドを合成した。このMUC1/CQCペプチドによる初期の研究は、それがインビトロでMUC1-CDのオリゴマー化を阻害するが、MUC1/AQAは阻害しないことを示した。意義深いことに、MUC1の核ターゲティングがオリゴマー化に依存性であることと一致して（Leng et a1,2007）、MUC1/CQCペプチドの取り込みは、核におけるMUC1-Cレベルのダウンレギュレーションと関連していた。さらに、注目すべきことに、細胞のMUC1/CQCへの曝露は、増殖停止および壊死の誘導に関連していたが、MUC1/AQAはそうでなかった。その他の所見は、MUC1/CQCペプチドに対する感受性が、MUC1の過剰発現、および悪性表現型に関連したMUC1の機能に依存性であることを示す。従って、MUC1/CQCペプチドは、MUC1を過剰発現する癌細胞に選択的なドミナントネガティブ活性を有するようである。最後に、本発明者らは、21日間の10および30mg/kg/dでのMUC1/CQCペプチドの腫瘍保持マウスへの投与が、明白な急性毒性なしによく耐容され、これらの用量での処理が腫瘍増殖の排除において効果的であることを見出した。7日間の50mg/kg/dでのMUC1/CQCペプチドの投与は、処理後、長期にわたり腫瘍増殖が阻止され続けることも証明した。
【０１５９】
MUC1はNF-κB p65に結合しIκBα相互作用を阻止する。NF-κBタンパク質は、DNA結合、二量体化、およびIκBタンパク質への結合を付与する保存された300アミノ酸RHDを含有している（Hayden & Ghosh,2008）。当研究は、MUC1-Cサブユニットが細胞においてNF-κB p65と会合すること、そしてMUC1-C細胞質ドメインがp65に直接結合することを証明する。より詳細な結合研究は、MUC1-CDがp65(1-306)と複合体を形成し、p65(354-551)とは複合体を形成しないことを示し、このことから、MUC1-CDがRHDと相互作用することが示された。この観察は、MUC1-CDのp65(1-180)およびp65(186-306)への結合により確認された。NF-κBおよびIκBαの共結晶の構造分析は、IκBαアンキリンリピートが、NF-κB p65 RHDのC末端に存在するNLSの直前のアミノ酸残基と相互作用することを証明した（Jacobs et al.,1998；Huxford et al.,1998）。NF-κB p65 RHDのこの領域へのIκBαの結合は、NLS（アミノ酸287〜300）を立体的に遮蔽し、それにより、NF-κB p65の核へのターゲティングを遮蔽する。IκBαと同様に、MUC1-CDがp65(186-306)に結合するという所見は、MUC1-Cサブユニットが、IκBαとNF-κB p65との間の相互作用に干渉する可能性を提起した。実際、MUC1発現の増加および減少を有する細胞における研究は、MUC1が、NF-κB p65への結合についてIκBαと競合すること、そしてMUC1-CDがそのような競合に十分であることを示した。これらの結果と協調的に、ZR-75-1細胞における内在性MUC1のサイレンシングは、核のNF-κB p65の細胞質へのターゲティングに関連していた。さらに、精製されたタンパク質を用いた直接結合研究は、MUC1-CDがNF-κB p65とIκBαとの間の相互作用を阻止することを確認した。NF-κB p65は、DNA結合および転写に影響を与える複数のタンパク質と相互作用する（Natoli et al.,2005）。しかしながら、本発明者らの知る限り、NF-κB p65 RHDと相互作用し、IκBαの結合に干渉するタンパク質の報告は存在しない。従って、これらの所見に基づき、ヒト悪性病変におけるMUC1-Cの過剰発現は、NF-κB p65-IκBα相互作用を競合的に阻止することにより、NF-κB p65の細胞質保持を妨害し得る。
【０１６０】
MUC1はNF-κB標的遺伝子上のNF-κB p65の占有を増加させる。核のNF-κBは、新たなNF-κB-IκBα複合体の形成およびNF-κBの細胞質への帰還を促進するネガティブフィードバックループにおいてIκBα発現を活性化する（Hayden & Ghosh,2008）。この情況において、MUC1-CのNF-κB p65との会合は、IκBαとの相互作用を阻止することにより、NF-κBシグナル伝達のダウンレギュレーションを減弱させ得る。当結果は、MUC1-CのNF-κB p65との結合がNF-κB標的遺伝子のプロモーターへのNF-κB p65のターゲティングをもたらすというモデルについての支持を提供する（図6D）。TNFαによるMCF-10A上皮細胞の刺激は、MUC1-CのNF-κB p65との結合およびBcl-xL遺伝子プロモーター内のNF-κB-RE上のこれらの複合体の占有に関連していた。ZR-75-1細胞において、Bcl-xL NF-κB-REのNF-κB p65占有は、構成性に検出可能であり、MUC1のサイレンシングにより減少した。Bcl-xL NF-κB-REについて入手された所見と協調的に、NF-κB p65およびMUC1-CによるMUC1 NF-κB結合モチーフの占有は、ZR-75-1乳癌細胞において構成性に検出可能であり、MCF-10A上皮細胞において誘導可能であった。これらの所見と、NF-κB p65と同様に、MUC1のサイレンシングがNF-κB-LucレポーターおよびpMUC1-Lucレポーターの活性化を減弱させるという証明とは、MUC1-CがNF-κB p65転写機能の活性化にとって重要であることを示す。以前の研究は、NF-κBシグナル伝達のダウンレギュレーションがIκBαの非存在下で遅延することを示しており（Gerondakis et al.,2006；Pasparakis et al.,2006）、従って、ヒト腫瘍におけるMUC1の過剰発現は、NF-κB p65-IκBα相互作用を阻害することにより、類似の効果を付与し得る。
【０１６１】
MUC1阻害剤によるNF-κB p65-MUC1-C相互作用の破壊。MUC1-Cサブユニットは、細胞質ドメイン内のCQCモチーフに依存性の機序によりオリゴマーを形成する（Leng et al.,2007）。MUC1-Cオリゴマー化は、インポーチンβとの相互作用および核へのターゲティングに必要である（Leng et al.,2007）。上述のように、CQCモチーフを含むMUC1細胞質ドメインに対応する15残基ペプチドは、インビトロのMUC1-CDのオリゴマー化を阻止し、細胞におけるMUC1-Cのオリゴマー化を阻止する。当結果は、同MUC1/CQCペプチドがインビトロのMUC1-CDとNF-κB p65との直接結合を阻止することを示し、このことは、MUC1-CDオリゴマー化が、少なくとも一部分、相互作用に必要であることを示している。MCF-10A細胞におけるTNFαにより誘導されるNF-κB p65とMUC1-Cとの会合も、MUC1/CQCペプチドによる処理により阻止された。MUC1/CQCペプチドの特異性は、インビトロおよび細胞内のMUC1-CDとNF-κB p65との間の相互作用に対する変異型MUC1/AQAペプチドの効果の欠如によってさらに支持される。MUC1/CQCペプチドによるNF-κB p65-MUC1-C相互作用の阻止は、MUC1プロモーター内のNF-κB結合モチーフ上のNF-κB p65の占有の減少およびMUC1発現の減少に関連していた。MUC1/CQCペプチドはBcl-xL発現も減少させた。従って、これらの所見は、NF-κB標的遺伝子のプロモーターへのNF-κB p65のターゲティングにおけるNF-κB p65-MUC1-C相互作用の可能性のある重要性についての支持を提供する。
【０１６２】
MUC1-C-NF-κB p65相互作用はヒト腫瘍により活用される生理学的防御機序に寄与するか？TNF受容体1のTNFαによる刺激は、（i）NF-κBおよび生存、あるいは（ii）カスパーゼ-8およびアポトーシスの活性化をもたらす細胞膜複合体の形成を誘導する（Micheau & Tschopp,2003；Schneider-Brachert et al.,2004）。ヒト乳癌に見出されるような（Kufe et al.,1984）MUC1の過剰発現は、TNFαおよびその他のデスレセプターリガンドに応答して起こるカスパーゼ-8およびアポトーシスの活性化を阻止する（Agata et al.,2008）。MCF-10A細胞において、MUC1-Cは、デスレセプター刺激に対する誘導された応答としてカスパーゼ-8およびFADDと相互作用し、デスレセプター複合体へのカスパーゼ-8の動員を阻止する（Agata et al.,2008）。他の研究は、MUC1-CがIKK複合体と会合し、それを活性化することを証明した（Ahmad et al.,2007）（図6D）。当研究において示されるように、MCF-10A細胞におけるTNFαにより誘導されるMUC1-C発現のアップレギュレーションは、直接、NF-κB p65の活性化に寄与する。従って、MUC1-CはIKKおよびp65の両方との相互作用を通してNF-κB経路を活性化し、それにより、生存応答を促進することができる（図6D）。さらに、MUC1-Cのアップレギュレーションは、カスパーゼ-8活性化を阻止することにより、アポトーシスの誘導に対して防御する。当所見は、MUC1-Cが、NF-κB p65との結合を通して、自己誘導ループにおけるMUC1遺伝子の活性化に寄与し、結果として、可逆的にとはいえ、生存を延長し得ることを示す。これに関して、MUC1は、デスレセプター刺激に対する誘導可能な応答における、細胞の運命の一時的な指令において、生理学的役割を果たし得る。反対に、MUC1-C-NF-κB p65調節ループを通した癌細胞におけるMUC1発現の不可逆的な活性化は、持続性のNF-κB p65の活性化およびカスパーゼ-8の阻害を通して、細胞死に対して安定的に抵抗性である表現型を付与し得る。不可逆的なMUC1-C-NF-κB p65ループの活性化および生存促進性NF-κB標的遺伝子のアップレギュレーションは、遺伝毒性ストレス、酸化ストレス、および低酸素ストレスに対するヒト癌細胞のアポトーシス応答の、MUC1により誘導される阻止にも寄与し得る（Ren et al.,2004；Yin et al.,2003；Raina et al.,2004；Yin et al.,2004；2007）。従って、デスレセプター刺激中に上皮細胞を防御するよう設計された生理学的機序は、悪条件の下での生存のため、ヒト癌により活用されている可能性がある。
【０１６３】
MUC1-CはSTAT3と直接相互作用する。STAT3の構成性の活性化は、乳癌を含む多様なヒト癌およびある種の血液悪性病変において同定されている（Aaronson,2002；Bowman,2000；Yu,2004）。MUC1が乳癌およびその他の癌において構成性に過剰発現されるという所見は、MUC1経路とSTAT3経路との間の相互作用についての可能性を提起した。当結果は、ZR-75-1乳癌細胞およびMCF-7乳癌細胞においてMUC1-CサブユニットがSTAT3と会合することを証明する。さらに、MUC1-CとSTAT3との間の相互作用は、IL-6刺激に対する非悪性MCF-10A乳房上皮細胞の応答において誘導される。結果は、MUC1-C細胞質ドメインがSTAT3 DBDに直接結合することも証明する。STAT3 DBDと相互作用する他のタンパク質に関する洞察は、ほとんど入手されていない（Shuai,2000）。c-JunのC末端領域は、STAT3コイルドコイルドメインおよびDBDに結合し、それにより、転写の駆動におけるSTAT3とc-Junとの間の協力に寄与する（Zhang,1999）。他の研究は、STAT3 DBDがNF-κB p65との相互作用を媒介するために必須であることを証明した（Yu,2004）。さらに、STAT3により媒介されるNF-κB p65のアセチル化がSTAT3 DBDを必要とし、従って、NF-κB活性の維持がSTAT3 DBDを必要とする（Lee,2009）。従って、MUC1-CのSTAT3 DBDとの結合は、STAT3のc-JunまたはNF-κB p65との相互作用、および遺伝子転写の調節に影響を与えるかもしれない。この情況において、ChIP分析は、MUC1-Cが可溶性クロマチン内のSTAT3と会合し、MUC1プロモーター内のSTAT結合部位上にSTAT3と共に検出可能であることを証明した。MUC1-CおよびSTAT3によるMUC1プロモーターSTAT結合部位のこの占有は、乳癌細胞において構成性であり、MCF-10A乳房上皮細胞においてIL-6により誘導可能であることが見出された。STAT3は、MUC1プロモーターと相互作用し、MUC1遺伝子転写を活性化することが以前に示されている（Gaemers,2001）。しかしながら、本発明者らの知る限り、MUC1-CがSTAT3転写複合体の一部を構成するとの報告は存在していない。
【０１６４】
MUC1-CはSTAT3により媒介される転写を促進する。STAT3転写複合体に対するMUC1-Cの効果を査定するため、本発明者らは、IL-6に対するMCF-10A細胞の応答におけるMUC1プロモーターの活性化が実際STAT3により媒介されること、およびMUC1プロモーター内のSTAT結合部位上のSTAT3の占有をまず示した。しかしながら、驚くべきことに、MCF-10A細胞におけるMUC1のサイレンシングは、IL-6により誘導されるSTAT3のSTAT結合部位へのターゲティングを減弱させ、このことから、その部位のSTAT3占有の開始またはSTAT3潜伏の遅延においてMUC1-Cが役割を果たすかもしれないことが示された。MUC1-CがSTAT3により媒介されるMUC1プロモーターの活性化も促進するという証明は、MUC1遺伝子の発現を活性化するためにMUC1-CおよびSTAT3が協力的に作用する、自己誘導ループの誘導についてのさらなる支持を提供した。これらの観察と協調的に、乳癌細胞におけるMUC1のサイレンシングは、（i）STAT結合部位上の構成性のSTAT3占有、および（ii）MUC1プロモーターの構成性の活性化の減少に関連していた。自己誘導ループについてのさらなる支持を提供するため、MUC1-Cオリゴマー化の阻害剤GO-201を用いた研究を実施した（Raina,2009）。GO-201は、インビトロおよびIL-6により刺激されたMCF-10A細胞において、MUC1-C細胞質ドメインとSTAT3との間の相互作用を阻止したが、不活性CP-1変異体は阻止しなかった。意義深いことに、GO-201は、IL-6により誘導されるMUC1-CおよびSTAT3のMUC1プロモーターへのターゲティングも阻止し、このことから、MUC1-CがSTAT結合部位のSTAT3占有を促進することが再び示された。さらに、GO-201は、IL-6により誘導されるMUC1プロモーターの活性化を阻止した。GO-201が、MUC1-CおよびSTAT3によるMUC1プロモーターの構成性の占有、ならびにMUC1プロモーターの構成性の活性化を阻害することの証明により、IL-6により刺激されたMCF-10A細胞から入手された結果は、乳癌細胞において確認された。従って、これらの所見は、MUC1プロモーターへのSTAT3のターゲティング、および自己誘導ループにおけるMUC1遺伝子の活性化の促進における、MUC1-C-STAT3相互作用の可能性のある重要性についての支持を提供する（図7D）。
【０１６５】
MUC1-C-STAT3相互作用はヒト腫瘍により活用される生理学的防御機序に寄与するか。上皮細胞関門は、腫瘍壊死因子α、インターフェロン-γ、およびIL-6のようなサイトカインの産生に関連した炎症環境を含む、多様な型のストレスに曝される。従って、上皮細胞は、そのような傷害の存在下で生存するための頑強な防御機序を必要とする。これに関して、MUC1-Cサブユニット、特に、その細胞質ドメインは、遺伝毒性ストレス、酸化ストレス、および低酸素ストレスを含む複数の傷害に応答して起こる死に対する抵抗性を付与するのに十分である（Ren,2004；Raina,2004；Yin,2003；Yin,2004；Yin,2007）。当結果は、IL-6により媒介されるSTAT3経路の活性化が、炎症応答中の上皮傷害に対して防御するための可能性のある機序として、MUC1発現を誘導することを示唆する。このモデルにおいて、MUC1は、細胞の運命の一時的な指令において生理学的役割を果たし得る。反対に、MUC1-C-STAT3自己誘導ループを通したMUC1発現の不可逆性の活性化は、細胞死に対して安定的に抵抗性である表現型を付与し得る。従って、炎症応答中に上皮細胞を防御する生理学的機序は、悪条件の下で生存するため、ヒト乳癌により活用されている可能性がある。当結果は、MUC1-C機能のターゲティングが、乳癌細胞におけるSTAT3経路の構成性の活性化に影響を与え得ることをさらに示す。
【０１６６】
本明細書に開示され特許請求の範囲に記載された組成物および／または方法は、全て、本開示を考慮すれば、過度の実験なしに作成され実行され得る。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して記載したが、本発明の概念、本旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された組成物および／または方法、方法の工程、または方法の工程の順序に、変動が適用され得ることは、当業者には明白であろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連しているある種の薬剤を、本明細書に記載された薬剤の代わりに用いても、同一または類似の結果が達成され得ることが、明白であろう。当業者に明白なそのような類似の代替物および修飾は、全て、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の本旨、範囲、および概念に含まれると見なされる。
【０１６７】
VIII. 参照
以下の参照は、本明細書に示されたものを補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する程度に、参照により具体的に本明細書に組み入れられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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