(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＥ誘導体、陰イオン性リン脂質結合タンパク質、陰イオン性リン脂質、およびステロールを含む医薬組成物であって、前記陰イオン性リン脂質結合タンパク質がアネキシンである、医薬組成物。
【請求項２】
輸送される輸送物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ビタミンＥ誘導体がトコフェロールである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記陰イオン性リン脂質がホスファチジルセリンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ステロールがコレステロールまたは６−ケトコレスタノールである、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ビタミンＥ誘導体の量が、脂質二重層を形成することができる成分に対し０．１〜２０％である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記陰イオン性リン脂質の量が、脂質二重層を形成することができる成分に対し５〜２０％である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ステロールの量が、脂質二重層を形成することができる成分に対し１５〜３０％である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
追加のリン脂質をさらに含み、前記追加のリン脂質の量が、脂質二重層を形成することができる成分に対し３０〜８０％である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
追加のリン脂質をさらに含み、各成分の相対量が、脂質二重層を形成することができる成分に対し、以下の通りである、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物：
ビタミンＥ誘導体：０．１〜２０％
陰イオン性リン脂質：５〜２０％
ステロール：１５〜３０％
追加のリン脂質：３０〜８０％。
【請求項１１】
前記輸送物がアルファ−ブンガロトキシンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
対象に輸送物を送達するための組成物を調製する方法であって、
ａ）ビタミンＥ誘導体、陰イオン性リン脂質結合タンパク質、陰イオン性リン脂質、およびステロールからリポソームを形成すること、ならびに
ｂ）リポソーム組成物中に前記輸送物をカプセル化すること
を含む方法であって、前記陰イオン性リン脂質結合タンパク質がアネキシンである、方法。
【請求項１３】
前記陰イオン性リン脂質がホスファチジルセリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記輸送物がカプセル化される場合、リン脂質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記輸送物が、リポソーム形成時に存在することによって、またはエレクトロポレーション、凍結融解、超音波処理、もしくはボルテックスによってカプセル化される、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物を含む治療用医薬組成物であって、前記治療用医薬組成物は、治療的に活性のある作用物質を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物を含む、血液脳関門を通過して、または血液網膜関門を通過して作用物質を送達するための担体。
【請求項１８】
後眼部領域へ送達させる作用物質と組み合わせて用いられる、請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物を含む、後眼部領域送達剤。
【請求項１９】
中枢神経系へ送達させる作用物質と組み合わせて用いられる、請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物を含む、中枢神経系送達剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬作用物質または他の作用物質の眼および中枢神経系への送達のための担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼への局所的薬物送達は、常に魅力的な投与経路であるが、物理的および生理的な障壁を効果的に乗り越えて薬物が前眼部および後眼部に到達できる効果的な担体を見いだすのに、ある程度しか成功していない。本発明者らは、以前の特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００４２３３において、眼への通常の局所的薬物投与経路である点眼剤の使用時に遭遇する問題を記載した。さらに、本発明者らは、直接的な侵襲性投与を必要とすることなく、後眼部への薬物送達を可能にする局所的薬物投与に使用される担体を提供した。
【０００３】
ＡＭＤ（加齢性黄斑変性症）およびＤＲ（糖尿病性網膜症）などの失明に至る状態においてＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）を標的にする治療が出現し、現在その治療は、投与経路として眼内（硝子体内）注射を使用しており、非侵襲性送達系のさらなる需要がある。老齢疾患および糖尿病の罹患率の増加に伴い、治療、特に非侵襲性で、投与が容易で、かつ安価である、治療法の必要性が急激に高まっている。ＶＥＧＦを抑制し、ＡＭＤ、ＤＲ、および他の類似した状態を治療する薬剤の局所的送達のための改善された担体が有用であろう。
【０００４】
中枢神経系（ＣＮＳ）および眼の治療法の開発は、薬物開発において、特に全身投与に関して、最も難しい領域の一つである。その原因は、主として、眼における血液網膜関門（ＢＲＢ）およびＣＮＳにおける血液脳関門（ＢＢＢ）である。最近の進歩にもかかわらず、ＢＢＢの実質的な問題は依然として、多くの可能性のある治療剤がＣＮＳに到達するのを妨げることである。現在の課題は、薬物がＢＢＢを安全かつ効果的に通過することを確実にする薬物送達系を開発することである。
【０００５】
現在までＣＮＳ治療に使用されている薬物は、膜貫通拡散によってＢＢＢを通過する小さな、比較的に脂溶性の化合物でなければならないことによって、限定されている。加えて、アルツハイマー病の場合のように、受動免疫法および能動免疫法が使用されているが、この場合もやはり、主要な困難は抗体がＢＢＢをあまり通過しないことであり、特に、ＩｇＧ分子はそのサイズが大きいため透過しにくい。
【０００６】
本発明者らは、作用物質がＢＢＢおよびＢＲＢを通過するのを可能にする担体を開発した。そのような担体は、静脈内、経鼻的、経皮的、および局所的投与などの様々な方法で投与される医薬品に使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、ビタミンＥ誘導体、陰イオン性リン脂質結合タンパク質、陰イオン性リン脂質、およびステロールを含む医薬組成物が提供される。
【０００８】
この組成物を使用して、生物活性または医薬活性化合物などの輸送物（cargo）を対象の身体の領域に輸送することもできる。特に、この組成物を使用して、そのような輸送物を、ＢＲＢまたはＢＢＢを通過して輸送することもできる。したがって、組成物は、輸送される輸送物も含んでもよい。
【０００９】
ビタミンＥ誘導体、陰イオン性リン脂質、およびステロールは、脂質膜（脂質二重層）を形成することができる。陰イオン性リン脂質結合タンパク質は、脂質二重層の表面に結合することができる。組成物は、脂質二重層を形成することができる成分をさらに含んでもよい。
【００１０】
本明細書では、ビタミンＥ誘導体という用語は、α−トコフェロールに類似した生物活性を有するトコールまたはトコトリエノール誘導体を指すものとして使用される。特に、その用語は、トコフェロールおよびトコトリエノールを指す。８つのビタミンＥ異性体分子がある：４つのトコフェロールは、４’，８’，１２’−トリメチルトリデシルフィトール側鎖を有し、４つのトコトリエノールは、側鎖の３’位、７’位、および１１’位の二重結合の存在によって異なる。その用語はまた、わずかに異なる構造を有するが類似した機能性を有する、トコフェロール誘導体およびトコトリエノール誘導体、またはそれらの分子の変異体である分子も包含する。
【００１１】
ビタミンＥは、「トコフェロール」および「トコトリエノール」と呼ばれる、トコクロマノールの２つの同属の系列で構成される。特に、トコフェロールは、ビタミンＥ活性を有し得る、モノ、ジ、またはトリ−メチルトコールである。その用語は、当技術分野においてよく知られている。トコフェロールの誘導体、特に機能的誘導体、すなわち、親分子の担体機能を保持するものも、本明細書で意図されたトコフェロールの定義に含まれる。トコフェロール誘導体の例は、ＴＰＧＳ（ポリエチレングリコール１０００とエステル結合したコハク酸Ｄ−α−トコフェロール）である。トコトリエノールは、側鎖に３つの二重結合を有するトコール、すなわち、フィチル鎖に３つの追加の二重結合を有し、したがって、６−（３’，７’，１１’，１５’−テトラメチル−２’，６’，１０’，１４’−ヘキサデカテトラエニル）−１，４−ヒドロキノンまたは２−メチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデカ−３，７，１１−トリエニル）クロマン−６−オールである。天然生成物は、クロマノールの５、７、および８位のうちの１以上にメチルを有し、したがって、フィチル様側鎖における不飽和を除いて、トコフェロールと同一である；クロマノール誘導体を形成する環化およびトコトリエノールキノン（またはクロメノール）を形成する酸化も類似している。トコトリエノールという専門用語は、トコールおよびトコエノール（ビタミンＥ様）との関係を示すために使用され、クロマノールという専門用語は、ビタミンＫおよびコエンザイムＱ系列のイソプレノイド化合物との関係を示すために使用される。
【００１２】
上記に示されているように、ビタミンＥ誘導体、陰イオン性リン脂質、およびステロールは、存在してもよい任意の他の脂質二重層形成成分、例えば、追加のリン脂質と共に、脂質膜（脂質二重層）を形成することができる。ビタミンＥ誘導体のモル組成は、好ましくは、脂質二重層成分の０．１％から２０％の間である。より好ましくは、モル組成は、０．１〜１５％のビタミンＥ誘導体、さらにより好ましくは、０．１〜１０％のビタミンＥ誘導体、なおより好ましくは、０．１〜５％のビタミンＥ誘導体、さらにより好ましくは０．１〜５％のビタミンＥ誘導体、なおさらにより好ましくは０．１〜２％のビタミンＥ誘導体、最も好ましくは、約１％のビタミンＥ誘導体である。低い方の濃度範囲において、ビタミンＥ誘導体は、酸化コレステロールを中和する能力が限られており、抗酸化活性も低下している。しかしながら、そのスケールの高い方の末端においては、それは、膜の相（秩序）に干渉する。
【００１３】
陰イオン性リン脂質結合（ＡＰＬＢ）タンパク質という用語は、当技術分野において知られている。本発明に有用なＡＰＬＢタンパク質は、天然であっても組換えであってもよい。ＡＰＬＢタンパク質は、全体であってもよく、機能性断片、すなわち、タンパク質全体と同じ分子に特異的に結合する、タンパク質の断片または領域であってもよい。そのようなタンパク質の機能的誘導体も含まれる。特に、前記用語は、機能的に類似した結合ドメインを含有する分子を包含するとみなされる。アネキシンは、ＡＰＬＢタンパク質の例である。米国特許出願公開第２００６／０１３４００１Ａ号に記載されたものなどの様々なアネキシンが利用可能である。好ましいアネキシンはアネキシンＶであり、それは当技術分野においてよく知られている。他の陰イオン性リン脂質結合タンパク質には、シナプトタグミン、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびラクトアドヘリンが挙げられる。
【００１４】
ＡＰＬＢタンパク質の濃度は、好ましくは、１００μｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの間である。より好ましくは、ＡＰＬＢタンパク質の濃度は、１００μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間、さらにより好ましくは、２００μｇ／ｍｌから４００μｇ／ｍｌの間、最も好ましくは、約３００μｇ／ｍｌである。
【００１５】
脂質二重層成分（すなわち、任意の他の追加の脂質二重層形成成分と共に、ビタミンＥ誘導体、陰イオン性リン脂質、およびステロール）の濃度は、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの間、さらにより好ましくは、１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの間、なおより好ましくは、３ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約５ｍｇ／ｍｌである。
【００１６】
陰イオン性リン脂質（ＡＰＬ）という用語も当技術分野においてよく知られている。例としてホスファチジルセリンが挙げられる。
【００１７】
組成物の調製中、ＡＰＬＢタンパク質の濃度は、陰イオン性リン脂質（ＡＰＬ）より超過していることが好ましい。組成物は、好ましくは、リポソームを形成することによって調製される。ＡＰＬレベルがＡＰＬＢタンパク質と比較して過剰にある場合、リポソームが不十分なコーティングになるであろう。
【００１８】
ＡＰＬのモル組成は、生体膜におけるその正常な生理的レベルに関連している。例えば、ＡＰＬである、ホスファチジルセリンは、哺乳類細胞膜のリン脂質含有量の約１０％を構成している。したがって、ＡＰＬがホスファチジルセリンである場合、組成は、好ましくは、約１０％ホスファチジルセリンを含む。より一般的には、組成は、好ましくは、約１０％の陰イオン性リン脂質を含む。これは、単一の陰イオン性リン脂質で構成することもできるし、１つより多い陰イオン性リン脂質で構成することもできる。
【００１９】
ＡＰＬのモル組成は、好ましくは、脂質二重層成分の１％から３０％の間、より好ましくは、５％から２０％の間、さらにより好ましくは、５％から１５％の間、なおより好ましくは、８％から１２％の間、最も好ましくは、約１０％である。
【００２０】
組成は、ステロール、特にコレステロール、または６−ケトコレスタノールなどの類似した成分を含む。モル組成は、好ましくは、脂質二重層成分に対して５％から４０％の間のステロール、より好ましくは、１０％から３０％の間、さらにより好ましくは、１０％と２０％の間、なおより好ましくは、１３％と１７％の間、最も好ましくは、約１５％である。好ましくは、ステロールはコレステロールである。使用されるコレステロールの量は、輸送物の放出速度に影響するように選択することができ、コレステロールのより高い濃度は、輸送物のより遅い放出をもたらすであろう。
【００２１】
パーセンテージ組成は、モル組成に基づいている。
【００２２】
本発明の組成物は、輸送物の封入の前に、リポソームの形に調製される。その後、輸送物は、好ましくはエレクトロポレーションを使用して、リポソーム組成物中にカプセル化されるが、凍結融解などの代替方法も適切である場合がある。
【００２３】
本発明の組成物はまた、追加の成分を含んでもよい。一実施形態において、組成物はさらに、追加の脂質を含む。組成物は、ホスファチジルコリンなどの１つまたは複数のさらなるリン脂質を含んでもよい。一実施形態において、本発明の脂質二重層成分は、トコフェロールなどのビタミンＥ誘導体、ホスファチジルセリンなどの陰イオン性リン脂質、コレステロールなどのステロール、およびホスファチジルコリンなどの別のリン脂質を含み、これらの成分は以下の割合である：
ビタミンＥ誘導体：０．１〜２０％
陰イオン性リン脂質：５〜２０％
ステロール：１５〜３０％
リン脂質：３０〜８０％。
【００２４】
本発明はまた、対象に輸送物を送達するための組成物を調製する方法であって、
ａ）ビタミンＥ誘導体、アネキシンなどの陰イオン性リン脂質結合タンパク質、ホスファチジルセリンなどの陰イオン性リン脂質、およびステロールからリポソームを形成すること、ならびに
ｂ）リポソーム組成物中に輸送物をカプセル化すること
を含む方法を提供する。
【００２５】
好ましくは、輸送物は、リポソーム形成時に存在することによって、またはエレクトロポレーション、凍結融解、超音波処理、もしくはボルテックスによってカプセル化される。より好ましくは、輸送物は、リポソーム形成時に存在することによって、またはエレクトロポレーション、凍結融解、もしくは超音波処理によってカプセル化される。
【００２６】
好ましくは、カプセル化は、リポソームの脂質濃度が比較的高い場合に実行される。これはカプセル化効率を増加させるのに役立ち、より多くの輸送物がリポソーム中にカプセル化される。好ましくは、脂質濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは、脂質濃度は２０ｍｇ／ｍｌ以上、さらにより好ましくは、脂質濃度は３０ｍｇ／ｍｌ以上、最も好ましくは、脂質濃度は４０ｍｇ／ｍｌ以上である。
【００２７】
血液脳関門を通過して、または血液網膜関門を通過して作用物質を送達するための担体としての、特に本発明の組成物の形をとる、ビタミンＥ誘導体の使用も提供される。
【００２８】
本発明による医薬組成物と組み合わせて作用物質を眼に投与することを含む、後眼部領域への作用物質の送達方法がさらに提供される。
【００２９】
本発明はまた、中枢神経系への作用物質の送達方法であって、それを必要とする患者に作用物質をビタミンＥ誘導体と組み合わせて、特に本発明による組成物の形をとって投与することを含む方法も提供される。
【００３０】
後眼部という用語は、例えば、レンズ、線維柱帯網、（毛様体を含む）ブドウ膜、硝子体、および網膜を含む眼の裏側における構造を指す。特に、本発明は、網膜への送達の向上を可能にする。
【００３１】
本発明の組成物を使用して、他の分子、作用物質、または組成物を送達することができる。したがって、組成物は、送達される１つまたは複数の作用物質（輸送物）をさらに含有してもよい。そのような作用物質として、例えば、治療的または生物学的に活性のある作用物質を挙げることができる。特に好ましい作用物質には、神経保護薬（メマンチンなど）、増殖因子および（抗血管新生分子を含む）増殖因子アンタゴニスト、抗体（ＬｕｃｅｎｔｉｓおよびＡｖａｓｔｉｎなど）、アプタマー（Ｍａｃｕｇｅｎなど）、ステロイド（Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅなど）、分子作用物質が挙げられる。一実施形態において、輸送物はアルファ−ブンガロトキシン（αＢＴ）である。これは、網膜における動脈を特異的に標識することが見いだされている。したがって、それは、網膜送達を評価するために使用することができる。αＢＴは、より容易な検出を可能にするために標識されてもよい。αＢＴは、任意の適切なイメージング部分で標識されてもよい。特定の実施形態において、αＢＴはフルオレセインで標識される。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合性があるように製剤化される。投与を達成するための方法は、当業者に知られている。例えば、投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、硝子体内、腔内、皮下、鼻腔内、または局所的であり得る。
【００３３】
皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、典型的には、以下の成分の少なくとも１つを含む：水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤。ｐＨは、酸または塩基で調整することができる。そのような調製物は、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアル中に封入してもよい。
【００３４】
静脈内または硝子体内投与に使用される溶液または懸濁液は、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬＴ””（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、エタノール、またはポリオールなどの担体を含んでもよい。すべての場合において、組成物は、無菌で、かつ注射容易性の液体でなければならない。適切な流動性は、しばしば、レシチンまたは界面活性剤を使用して得ることができる。組成物はまた、製造および保存の条件下で安定でなければならない。微生物増殖の予防は、抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどで達成することができる。多くの場合、等張剤（糖）、ポリアルコール（マンニトールおよびソルビトール）、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれてもよい。組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを加えることによって達成することができる。
【００３５】
本発明による医薬組成物は、好ましくは、局所投与用、すなわち、好ましくは、点眼剤の形または他の局所用の形をとって、眼球の表面に適用される。したがって、医薬組成物は、追加として、塩化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、無水リン酸二ナトリウム、および注射用蒸留水などの他の担体、媒体、または賦形剤を含有してもよい。
【００３６】
ＣＮＳへの少なくとも１つの作用物質の送達のための担体としてのビタミンＥ誘導体の使用も提供される。ビタミンＥ誘導体は、陰イオン性リン脂質結合タンパク質と組み合わせて使用することができ、例えば、上記の医薬組成物を担体として使用することができる。担体は、治療剤、診断剤、または他の作用物質を脳に送達するために使用することができる。そのような作用物質を送達するための方法も提供される。
【００３７】
本発明はまた、対象の網膜血管系を標識するのに使用するアルファ−ブンガロトキシン（αＢＴ）も提供する。これはインビボ標識である。αＢＴは、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）に結合することが知られており、エクスビボで神経筋接合部の終板を標識するのに容易に使用される。αＢＴは、全身性に使用される場合に潜在的な神経筋阻害効果があるため、インビボでの標識に適用されていない。しかしながら、それを眼に直接的に使用する場合、そのような問題は見られない。網膜血管系、特に動脈の壁は、ｎＡＣｈＲを収容する筋肉環境である。それゆえに、αＢＴはそれらを特異的に標識する。眼におけるこのパターン化された標識は、他の方法では達成するのが非常に困難であるようなことである。好ましくは、αＢＴは、眼の網膜血管系へ、例えば硝子体内注射によって、直接投与される。好ましくは、αＢＴは、フルオレセインなどのイメージング部分で標識される。
【００３８】
対象の網膜血管系を標識するための薬剤の製造におけるアルファ−ブンガロトキシン（αＢＴ）の使用も提供される。
【００３９】
さらに、本発明は、対象の網膜血管系を標識する方法を提供し、その方法は、対象の眼にαＢＴを投与することを含む。好ましくは、αＢＴは、眼の網膜血管系に、例えば硝子体内注射によって、直接投与される。標識することにより、網膜血管系、特に網膜動脈の画像を作成することが可能になる。
【００４０】
ここで、本発明を、ほんの一例として、図を参照して詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】Ｌｕｃｅｎｔｉｓ４８８のイメージングの図である。ベースラインにおけるイメージング（左に示す）は、９５％強度に設定されたアルゴンレーザーを使用して、弱い固有の４８８自己蛍光があることを示す。ベースライン記録と同じレーザー強度における局所的４８８標識Ｌｕｃｅｎｔｉｓから４０分後の同じ眼のイメージングは、上に示されている（右に示す）。はるかに多い蛍光が見られる−全体の像ははるかに明るい−ことに注目されたい。この蛍光活性における変化は、網膜における４８８フルオロフォアの増加を反映しており、それは４８８標識Ｌｕｃｅｎｔｉｓの眼底への通過に起因するのみであり得る。これは、４８８標識Ｌｕｃｅｎｔｉｓがユニバーサルドラッグデリバリーシステム（ＵＤＤＳ）担体によって輸送され、角膜、前房および後房、レンズ、ならびに硝子体構造を通って眼の網膜神経線維層に到達していることを示している。
【図２】Ｃｙ３標識ＩｇＧのイメージングを示す図である。ベースラインにおけるイメージング（左に示す）は、９５％強度に設定されたアルゴンレーザーを使用して、弱い固有の４８８自己蛍光があることを示す。ベースライン記録と同じレーザー強度における局所的Ｃｙ３標識ＩｇＧから１時間後の同じ眼のイメージングは、上に示されている（右に示す）。はるかに多い蛍光が見られる−全体の像ははるかに明るい−ことに注目されたい。さらに、高蛍光の焦点領域（白色スポット）が見られ、ＩｇＧが網膜上の特定の構造に結合していることを示している。この蛍光活性における変化は、Ｃｙ３標識ＩｇＧの眼底への通過に起因するのみであり得る。
【図３】超遠心についての様々な試料に関連した蛍光を示すチャートである。
【図４】サイズ排除についての様々な試料に関連した蛍光を示すチャートである。
【図５】カプセル化についての様々な試料に関連した蛍光のレベルを示すチャートである。
【図６】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを使用したリポソームおよびＦＩＴＣ−ａＢＴの溶出特性を示す図である。
【図７】図６の溶出特性に関連した蛍光を示すグラフである。
【図８】吸光度に対するリン酸濃度を示すグラフである。
【図９】吸光度に対するホスファチジルコリン濃度を示すグラフである。
【図１０】ＦＰＬＣ  ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５およびｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムから溶出された１．５ｍｌの画分に関連した吸光度を示すグラフである。
【図１１】Ｇ−５０の粗いカラムに流したリポソーム、フルオレセイン、およびα−ＢＴの溶出特性を示す図である。溶出特性は、６００ｎｍにおける濁度および４８８ｎｍにおける蛍光によって、それぞれ、測定された。
【図１２】超遠心についての様々な試料に関連した総タンパク質の量を示すチャートである。
【図１３】脂質濃度を変化させることのカプセル化への効果を示すチャートである。
【図１４】脂質濃度の増加による光散乱の効果を示すチャートである。
【図１５】多くの界面活性剤がある場合のフルオレセインレベルに対する蛍光を示すチャートである。
【図１６】αＢＴが網膜における動脈を特異的に標識することを示す眼の画像である。
【図１７】αＢＴおよびアネキシンＶ−７７６の放出の成功を示す図である。（Ａ）は、リポソームの存在下でのアネキシンの放出を示し、（Ｂ）はカプセル化αＢＴの放出を示し、一方、（Ｃ）および（Ｄ）は、リポソームの存在なしに注射された１ｍｇ／ｍｌのアネキシンＶ−７７６および５０μｇ／ｍｌのαＢＴの効果をそれぞれ、示す。
【図１８】高発現レベルのアネキシンＶ−ＧＳＴを示すゲルの図である。
【図１９】図Ｄ、Ｅ、およびＦに示されているように、図１９はフルオレセインは無傷の血液網膜関門を通過することができず、血管に隔離されたままであることを示す図である。３４分間（Ｂ）においてカプセル化処理された眼に少量の動脈壁蛍光があるものの、網膜血管は、それらがカプセル化材料を含まない場合（Ｄ〜Ｆ）は見えるけれども、カプセル化材料（Ａ〜Ｃ）がある場合は見えなかったことを強調することは重要である。しかしながら、図Ａにおける円によって強調表示されているように、カプセル化材料で処理された眼が、７分後に、網膜において蛍光の焦点パッチまたはスポットを示した。これらの蛍光パッチの頻度は、図Ｃに示されているように７４分後に分散し始める前に、図Ｂに示された３０分後にピークに達するように思われた。
【図２０】ＲＴおよびＨＡＴ低酸素動物におけるＢＢＢ破壊のマーカーとしてのフルオレセインナトリウム（ＮａＦｌ）漏れを示す図である。ＮａＦｌを注射された対照ラット由来の切片は、前頭皮質（上部）および頭頂葉皮質（下部）の脳組織における漏れを示していない。対照的に、ＲＴ低酸素ラットの１日目または２日目の脳由来の切片は、前頭皮質および頭頂葉皮質における中程度の単焦点漏れを示している。ＨＡＴプラス低酸素の１日目または２日目の脳由来の切片は、脳組織におけるＮａＦｌの多焦点領域を示している。スケールバー、１００μｍ。
【図２１】眼におけるカプセル化リポソームからの輸送物の治療的放出を評価するために、眼あたり５００ｎｇの組換えヒトＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ１６５）を使用するＶＥＧＦモデルを開発し、そのモデルは、血管蛇行の増加（Ａ、反射画像）、ＶＥＧＦ注射から２４時間後にとられたフルオレセイン血管造影後に見られる、血管の漏れおよび肥厚（Ｂ、蛍光画像）を示した。これらの効果の逆転は、２．５μｌの治療グレードのＬｕｃｅｎｔｉｓの硝子体内注射を使用して達成された（Ｃ〜Ｄ）。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ処理された眼は、未処理のＶＥＧＦモデルに対して、血管サイズを正常に縮小し（Ｃ、反射画像）、漏れがなく正常な血管組織（Ｄ、蛍光画像）を示している。
【図２２】左硝子体内ＶＥＧＦ処理眼から２４時間（Ａ、Ｃ）および４８時間（Ｂ、Ｄ）時点でとられたフルオレセイン血管造影図の画像である。第一に、ＶＥＧＦと同時のＬｕｃｅｎｔｉｓ処理は、２４時間、激しい漏れ、血管肥厚のような蛇行を含む大きな炎症性変化を誘発したことは明らかである（Ａ、Ｃ）。しかしながら、４８時間で、カプセル化ｌｕｃｅｎｔｉｓ処理動物（Ｂ）は、静脈注射臨床グレードｌｕｃｅｎｔｉｓ動物における大量の漏れ、血管新生、および出血と比較して、血管炎（静脈炎）を示しているが、焦点漏れの領域を示していないという大きな違いがある。
【図２３】カプセル化ｌｕｃｅｎｔｉｓ処理された眼は、蛇行の低下、血管サイズの正常への低下（Ａ、反射画像）、漏れなし、およびより正常な血管組織（Ｂ、蛍光画像）を示している。
【図２４】通常の静脈注射のフルオレセインナトリウムを用いた動物（Ｃ〜Ｄ）と比較した、カプセル化フルオレセインナトリウムの静脈注射を用いた動物（Ａ〜Ｂ）由来の脳における同様の領域から得られたいくつかの画像である。蛍光画像（Ａ、Ｃ）および透過画像（Ｂ、Ｄ）の両方が示されている。明らかに、カプセル化材料のみが蛍光を示し（Ａ）、通常のフルオレセインナトリウム静脈注射を用いた脳からのシグナルは全くない（Ｃ）。
【実施例】
【００４２】
輸送の機構
角膜上皮ならびに血液脳関門および血液網膜関門の内皮などの物理的障壁は、密に接着した細胞のシートで構成されている。細胞間の接合部（角膜またはＢＢＢのいずれでも）は、化合物の移動を制限する、タイトジャンクションを形成するタンパク質複合体によって制御される。これらの接合部の選択性は、上皮組織の特定の型に依存するが、一般的には、低分子量（１００〜２００Ｄａ）の親水性薬物またはイオンのみが傍細胞経路を利用することができる。親油性薬物は、ＢＢＢの内皮を透過することができるが、それらの通過は、やはり、４００Ｄａ未満の分子に制限される。角膜において、角膜実質は、親油性薬物にさらなる障壁を与え、それらの後眼部への透過を阻止する。
【００４３】
経細胞輸送は、上皮を通過する分子の選択的輸送を可能にする。それは、使用されるリポソームとの類似性（１００ｎｍのリン脂質閉鎖構造）を示す大きな分子複合体やウイルスでさえも上皮を通過することができる機構であると提案されている。
【００４４】
経細胞輸送は、クラスリン被覆ピットか、またはカベオラと呼ばれる、上皮組織の表面上に存在するフラスコ状陥入部のいずれかを経由して進行する。クラスリン被覆ピットは、受容体媒介性エンドサイトーシスに依存するが、カベオラは、コレステロールおよび膜タンパク質、カベオリンによって媒介される。カベオラにおけるコレステロールの本質的な性質は、担体系における観察されるステロール依存性とよく相関する。
【００４５】
特定の理論にとらわれるものではないが、本発明の組成物は、上皮細胞および内皮細胞を通過するためにカベオラ経細胞輸送経路を刺激／利用し得ることは、本発明者らの確信である。酸化コレステロールの存在も、正常なコレステロールの機能に対抗して、カベオラ機能を阻害することが提案されているが、ビタミンＥ誘導体の存在は、酸化コレステロールの阻害効果を中和する。その仮説は、カベオラ関連タンパク質としてアネキシンＶを同定する最近の報告によってさらに支持される。
【００４６】
ＢＢＢの通過
脳薬物の世界市場は、主に、薬物の大部分がインビボでＢＢＢを通過せず、通過するものは、高脂溶性および４００〜５００ダルトン（Ｄａ）未満の低分子量を有する小分子に限定されるという事実により低開発分野である。これらの化学的性質を有する小分子の数は、全薬物の２％未満である。他の薬物はＢＢＢを通過しない。ＢＢＢの解決がなければ、脳を治療する可能性があり得る全薬物の９８％より多くは、開発されない。これは、神経保護薬を含む新薬が不足している、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、脳卒中、脳脊髄損傷、脳癌、および多発性硬化症などの重篤な疾患における障害となっている。大分子を輸送する能力により、組換えタンパク質、抗体、およびＲＮＡ／ＤＮＡ分子のＣＮＳ内の標的部位への送達も可能となるであろう。
【００４７】
ＢＢＢが問題であるという認識において、化合物を血液から脳へ送達するために多くのストラテジーが使用されている。これらには、非常に侵襲性の、脳室内注入または脳内移植片による脳神経外科に基づいたストラテジーが挙げられ、高張液またはブラジキニンなどの生物活性剤を注入することによる血管内皮のタイトジャンクションの一時的破壊も使用されているが、感染および神経病理学的変化のリスクがあり、問題がある。ＢＢＢを通過しての輸送を可能にするために、水溶性薬物上の極性官能基の脂溶性部分もしくは脂溶性薬物担体とのコンジュゲーション、または脂溶性プロドラッグを作製する薬物再製剤化を通しての脂質化を用い得ることが示唆されている。
【００４８】
本発明の組成物を使用して、神経保護薬および他の活性の作用物質を、ＢＢＢを通過して輸送することができる。
【００４９】
組成物を作製する方法
リポソーム調製
リポソームを、脂質フィルム再水和方法によって調製した。クロロホルム：メタノール（５：１  ｖ／ｖ）中に溶解した関心対象の脂質（ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール、およびα−トコフェロール）を、適切な量で混合し、溶媒を定常窒素流下で除去した。使用範囲は、１５〜３０％のコレステロール（好ましくは１５％）、５〜２０％のＰＳ（好ましくは１０％）、および０．１〜２０％のビタミンＥ誘導体（好ましくは１％）であることが示され、残りはＰＣで構成された。その結果生じた脂質フィルムを、適切な容量の緩衝液（ＰＢＳ±フルオロフォア／輸送物）中で再水和した。５２ｍＭの貯蔵濃度のリポソームを調製し、その後、それをＵＤＤＳに使用するのに６．５ｍＭに希釈した。
【００５０】
Ｌｕｃｅｎｔｉｓまたは任意のタンパク質の蛍光標識
Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ラニビズマブ）は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を標的にするヒト化モノクローナル抗体断片である。その抗体のタンパク質性質により、蛍光色素の特定のアミノ酸へのコンジュゲーションが可能になる。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３中で洗浄し、約２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。標識反応については、タンパク質を任意の一級アミン部位（リシン残基およびＮ末端）で標識する１００μｇのａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８（ＤＭＳＯ中に溶解したスクシンイミジルエステル）を使用して室温で行った。その薬物はまだ特許権下であり、そのタンパク質のアミノ酸配列はパブリックドメインで入手できないため、標識に利用できる一級アミン基の数はわからない。コンジュゲートしていない色素をゲル濾過で除去し、標識されたＬｕｃｅｎｔｉｓを１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４へ溶出した。分光法によるそのタンパク質の分析は以下の結果を生じた。
【００５１】
２８０ｎｍ（０．２１５ＡＵ）および４８８ｎｍ（０．１２８ＡＵ）におけるピークは、標識が十分なレベルであることを示した。しかしながら、実際のタンパク質濃度および標識の化学量は、配列情報がないため確立することができなかった。
【００５２】
エレクトロポレーション（好ましい方法）によるカプセル化
薬物が組成物を使用して眼底へ送達され得るかどうかを決定するために、過剰のＬｕｃｅｎｔｉｓ−４８８を、エレクトロポレーションのプロセスを使用して組成物によってカプセル化した。カプセル化の通常の方法である、凍結／融解は、これまで、タンパク質の変性を引き起こしていた。１５μｌのＬｕｃｅｎｔｉｓを５０μｌの組成物に加え、細菌細胞および哺乳類細胞の形質転換に通常使用する、０．１ｃｍギャップのＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベットに移した。キュベットに、以下の条件：２．５ｋＶ、２５μＦ、および２００Ω下でＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用して電気パルスをかけた。通常の使用において、電気パルスは、小分子（一般的にはプラスミドＤＮＡ）が細胞のリン脂質膜を通過するのを可能にする。リポソームは細胞膜と構造的類似性を有するので、その方法は、凍結／融解に代わる良好なカプセル化方法である可能性が高いと判断された。
【００５３】
凍結融解によるカプセル化
凍結／融解によるカプセル化を、液体窒素中、輸送物の存在下で担体を凍結し、その後、迅速に、温水の定常流下で試料を融解することによって行った。そのプロセスを１０回繰り返して、妥当な時間スケール内で最適なカプセル化がもたらされた。そのプロセスは、単純な分子についてはうまくいくが、タンパク質などの複雑な分子には変性をもたらし得る。
【００５４】
取り込まれなかったフルオロフォアの除去
取り込まれなかったフルオロフォアを、６０，０００×ｇで４５分間の超遠心によって除去した。上清を捨て、ペレットを新鮮なＰＢＳ中に再懸濁した。
【００５５】
陰イオン性リン脂質結合タンパク質の添加
投与前に、負荷されたリポソームを、陰イオン性リン脂質結合タンパク質アネキシンＶと、５ｍｇ／ｍｌのリポソームおよび３００μｇ／ｍｌのアネキシンＶの最終濃度が達成されるように混合した。リポソームおよびアネキシンの濃度のバリエーションを使用して、異なる送達レベルを達成することができる。安定性問題により、最大濃度の２ｍｇ／ｍｌのアネキシンを使用することができるが、２０ｍｇ／ｍｌを超えるリポソームの用量は塞栓形成を増加させるであろう。
【００５６】
インビボでのイメージング
麻酔された動物（ダークアグーチ系（Dark Agouti）ラット）を、共焦点レーザー走査型検眼鏡（ｃＳＬＯ）を使用してイメージングした。各動物の蛍光ベースライン画像をとった。簡単に述べれば、動物を、眼内がイメージングされるようにｃＳＬＯの前に位置づける。４８８ｎｍのアルゴンレーザー波長を小さなスポットへと集中させ、１対のミラーによって網膜にわたってスキャンし、その波長においてフルオロフォアを励起させる。生じた蛍光を、関心対象の深さの面より上または下の面における不要な蛍光を排除する効果を生じる共焦点開口に光学的に集中させる。網膜神経線維層の面においてイメージングを行った。したがって、ベースライン画像は、９５％強度に設定されたアルゴンレーザーでの固有の４８８自己蛍光のみを記録する。
【００５７】
ベースライン画像が記録された後、１０μｌのカプセル化４８８標識Ｌｕｃｅｎｔｉｓを、ラット眼上に局所的に投与した。局所処置から４０分後、ベースラインと同じ設定、すなわち、アルゴンレーザー４８８ｎｍの波長、９５％強度で眼を再びイメージングした。その後、得られた画像は、（ベースラインとしての）固有の４８８自己蛍光、加えて、網膜神経線維層の面に到達した任意の４８８標識Ｌｕｃｅｎｔｉｓを記録する。
【００５８】
Ｃｙ３標識ＩｇＧのイメージング
ベースライン画像が記録された後、１０μｌの本発明のカプセル化Ｃｙ３標識ＩｇＧをラット眼上に局所的に投与した。Ｃｙ３は、アルゴンレーザー励起後、検出することができる、よく知られた蛍光色素である。局所処置から１時間後、ベースラインと同じ設定、すなわち、アルゴンレーザー４８８ｎｍの波長、９５％強度で眼を再びイメージングした。その後、得られた画像は、（ベースラインとしての）固有の４８８自己蛍光、加えて、網膜神経線維層の面に到達した任意のＣｙ３標識ＩｇＧを記録する。
【００５９】
この結果は、後眼部に機能性抗体を送達する系の可能性を例示し、それにより、抗体由来治療剤の送達における可能性を示している。
【００６０】
Ａ．ユニバーサルドラッグデリバリーシステム（ＵＤＤＳ）テクノロジーの開発
１．輸送物を送達するためのＵＤＤＳの改良
輸送物送達の成功のための成分は、ビタミンＥ誘導体、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール、およびアネキシンを含む。異なる輸送物／構成物比を可能にするためのプロセスの改良において、精製方法およびカプセル化方法を、下記のように最適化した：
【００６１】
（ｉ）取り込まれなかった材料の除去
カプセル化の成功を評価することにおける主な課題は、取り込まれなかった材料の除去のための信頼でき、かつ効率的な方法を生み出すことである。下記に概要を示したいくつかの方法が選択されている。
【００６２】
ａ）超遠心
６０，０００ｇでのリポソームの超遠心は、リポソームをペレット化し、それらと共にいかなるカプセル化された材料も沈降するであろう。しかしながら、個々の分子は、この速度ではペレット化する能力がなく、上清中のままである。上清を除去し、ペレットを新鮮な緩衝液中に再懸濁する。試料を洗浄するこのプロセスを、上清がもはや有意な量のカプセル化されなかった材料を含有しなくなるまで、繰り返す。
【００６３】
各洗浄は、４５分間のステップであり、５回の洗浄後でさえも、除去されるべき著しい量のカプセル化されなかった材料がある（図３参照）。図３における∞は、蛍光測定値が飽和度に達している場合を表す。
【００６４】
ｂ）サイズ排除
カラム
試料を、分子をそれらのサイズに基づいて分離するカラムに入れる。リポソームなどの巨大分子構造は、迅速にカラムを通過するが、より小さな分子の進行は遅延する。フルオレセインについて、例えば、５，０００ｄａの分子カットオフを有する使い捨てのＰｄ−１０カラムを用いた。
【００６５】
１回カラムを通すことによって、カプセル化されなかった材料の大部分が除去されるが、精度向上のためには２回目の通過が推奨されることが、これらの方法の最適化によって示されている（図４参照）。
【００６６】
透析
試料を、適切な分子量に対応するポアを含む透析チューブに入れた。リポソームなどのこのカットオフより大きい粒子は、チューブ内に保持され、一方、そのポアより小さい粒子は、より大きいバルク溶液中へ自由に拡散することができる。透析を一晩行い、２回の透析ステップ後でさえも、かなりのバックグラウンド蛍光があった。
【００６７】
ｂ）カプセル化
精製のための最も適切な方法を決定したので、低分子量の化合物のカプセル化のための異なる方法も調べた。これらの方法には、以下の工程を含む：
（ｉ）化合物の存在下でリポソームを作製する工程、
（ｉｉ）ボルテックス工程、
（ｉｉｉ）超音波処理、
（ｉｖ）凍結融解工程、および
（ｖ）エレクトロポレーション。
【００６８】
フルオレセインの高イオン性の性質により、それは、低塩環境に依存するエレクトロポレーションと適合しないことがわかった。
【００６９】
ボルテックスされた試料はほんの少しのカプセル化しか生じなかったが、超音波処理、凍結融解、および予め形成されたリポソームはすべて、顕著なカプセル化を生じた（図５参照）。
【００７０】
２．異なる輸送物のための組成物の最適化
輸送物を分子量によって類別すると、以下の３つのバンドが同定された：低分子量蛍光化合物、例えば、フルオレセインナトリウム（分子量：３７６．２８ｄａ）、中位の分子量、例えば、ａＢＴ（８，０００ｄａ）およびＬｕｃｅｎｔｉｓ（４８，０００ｄａ）、ならびに高分子量、例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（１４９，０００ｄａ）。サイズ排除カラムシステムを使用することの一つの利点は、特定の分子量のカットオフを有する異なる樹脂を使用することが可能であることである。
【００７１】
カプセル化されなかったαＢＴの分離について、本発明者らは、３，０００〜７０，０００ｄａの範囲でタンパク質を分離することができるＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを試しに選んだ。最初に、フルオレセインカプセル化リポソームを使用して、カラムに加え、リポソームがカラムから流出している画分を同定した。リポソームピークは、図６（上部）においてボックスで示されている。その後、カラムにＦＩＴＣ−ａＢＴの試料を入れた。図６（下部）におけるボックスは、αＢＴがカラムから流出している画分を示している。
【００７２】
図７における結果は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムが、カプセル化されたαＢＴとカプセル化されなかったαＢＴの分離のための十分な分割能を与えていることを示している。
【００７３】
特に関心のあるのは、抗体、特に、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（４８，０００ｄａ）およびＡｖａｓｔｉｎ（１４９，０００ｄａ）などの治療剤に関しての抗体などの高分子量タンパク質からリポソームを分離する能力であろう。これは、１０，０００〜６００，０００ｄａの範囲にわたって機能するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して達成可能であるはずである。
【００７４】
重力送りのＰｄ１０カラムからＦＰＬＣ流動用Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムまで主要なサイズ排除カラムを適応させるにおいて、本発明者らは、試料損失を伴ういくつかの問題に遭遇した。これは、リポソーム破裂などの様々な理由により得る。これを調査するのを可能にするために、本発明者らは、リン脂質レベルを同定するためにリン酸レベルをモニターするアッセイを適応させた。
【００７５】
リン脂質定量化
リン酸濃度に対応する吸光度値を提供するために、試料を５ＭのＨＣｌによって処理し、ローダミンＢおよびヘプタモリブデン酸アンモニウムの混合物とインキュベートすることができる。溶液中のリン酸の量は、存在するリン脂質のレベルに直接反映する。
【００７６】
本発明者らは、リン脂質アッセイを最適化した。図８は、５５５ｎｍにおける吸光度および対応するリン酸濃度を示す。
【００７７】
この方法は、下記に示されたリン脂質分子の「頭部」内のリン酸基を検出するのに適応している。これは、サイズ排除カラムから排出されたどの画分がカプセル化リポソームを含有するかを同定することを可能にするだろう。したがって、それは、カプセル化効率を検出するために使用することができる（図９参照）。
【００７８】
ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５およびＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム
リポソーム試料を、ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５およびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに流し、溶出液を１．５ｍｌの画分に収集した。超遠心された場合、いずれの画分も予想されたリポソームペレットを生じず、リン脂質アッセイは、図１０に示されているように、緩衝液対照と比較して無視できる量のリン酸しか示さなかった。
【００７９】
図１０に表された吸光度値は、感度の下限より下であり、ＦＰＬＣカラムがリポソーム精製と適合しないことを確認している。
【００８０】
Ｇ５０の粗い樹脂
重力送りＰＤ−１０カラムに関する限界は、５，０００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）であり、それは、５，０００Ｄａより大きい任意の化合物間の差を分割することはできないことを意味していた。したがって、３０，０００Ｄａのより高いＭＷＣＯを有するＧ−５０の粗い樹脂などの他の樹脂は、リポソーム破裂を引き起こすことなくリポソームから小タンパク質を分離することができるはずである。
【００８１】
脂質濃度を決定するためのより正確かつより複雑ではない方法を、溶液の濁度に基づいて発案し、その方法により、リポソームの６００ｎｍの光を散乱する能力を使用して、それらの濃度を決定した。
【００８２】
リポソーム、フルオレセイン、およびα−ＢＴの試料を、個々にＧ−５０の粗いカラムに通し、それらの溶出特性を、６００ｎｍにおける濁度および４８８ｎｍにおける蛍光についてそれぞれ、測定した。
【００８３】
図１１に示されているような、フルオレセインを分離するカラムの能力は、カラムが正しくパッキングされ、漏出性ではないことを示しているが、リポソームとαＢＴとの間の分割は、十分な分割を与えていない。この問題は、より長いカラムを使用することによって解決される可能性があり得る。大きなクロマトグラフィーカラムおよびそれに伴う高価な樹脂の量の費用のかかる性質により、分離の方法として超遠心を再考することに決定した。
【００８４】
超遠心
フルオレセインに関して超遠心を用いようと試みたときに遭遇した問題は、主に濃度依存性であった。存在する色素の莫大な量は、プロセスの効率を制限したが、α−ＢＴおよびＬｕｃｅｎｔｉｓなどのタンパク質ははるかに低い濃度で使用されることになっているので、必要とされる洗浄の回数はより少ないはずである。
【００８５】
最初のカプセル化プロトコールは、超音波処理を使用して行われ、ペレットの蛍光は、総カプセル化タンパク質の量を示すように最終容量について補正された。
【００８６】
超遠心は遊離タンパク質を除去し得ること、および約１０％カプセル化の値が、ペレット中に残存する最初に加えられた１０μｇのうちのおよそ１μｇで達成されていたことが見いだされた（図１２参照）。
【００８７】
本発明者らのインビボのα−ＢＴ用量設定の結果に基づいて、０．２５μｇの添加を表す、５０μｇ／ｍｌの５μｌが、最適な用量であった。これらのカプセル化結果から、２００μｌ中に１μｇを有し、それゆえに、５０μｌの点眼剤の１００％透過が必要とされるであろう。
【００８８】
カプセル化効率
より現実的な透過標的を作製するために、本発明者らは、カプセル化効率をさらに増加させようと試みた。これを行うための以下の３つの可能な方法がある：
→最初のα−ＢＴ濃度を増加させる
→脂質濃度を増加させる
→凍結融解およびエレクトロポレーションなどのカプセル化の代替方法を適用する
【００８９】
α−ＢＴの濃度を増加させることだけが、カプセル化においてわずかな向上を示した。
【００９０】
図１３において、Ａ＆ＢからＣ＆Ｄへ、Ｅ＆Ｆへ移動する差が、Ａ＆Ｂ、Ｃ＆Ｄ、またはＥ＆Ｆの２つのバー間の差より顕著であり、脂質濃度を増加させることが、カプセル化の程度の明らかな増加を生じたことを示している。
【００９１】
光散乱
カプセル化の程度の正確な値は計算することが困難であるとはいえ、高脂質溶液の濁度による光散乱の増加が、蛍光測定値に干渉し、蛍光シグナルを低下させる（図１４参照）。
【００９２】
図１４における結果から、より低い脂質値においてさえも、光散乱は蛍光の有意な効果をもたらし、カプセル化効率が、最初に示唆された１０％より大きくあり得ることを示唆していることが示される。
【００９３】
リポソーム破壊
カプセル化値を正確に決定するために、フルオレセインを、緩衝液およびリポソームの両方と、単独で、ならびにＳＤＳ、ＮＰ４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む様々な界面活性剤の存在下で、インキュベートした。
【００９４】
図１５において、界面活性剤の存在は、緩衝液およびフルオレセインを含有する試料において全蛍光シグナルを低下させることが示され、より高い蛍光強度において最も顕著であるという効果であった。界面活性剤、特にＳＤＳの存在は、脂質光散乱による蛍光シグナルの損失を低下させた。１％ＳＤＳを用い、測定される蛍光収率を２０００００ＡＵ未満に制限することによって、本発明者らは、輸送物のカプセル化効率を正確に測定することができた。
【００９５】
Ｂ．ＵＤＤＳのインビボ試験
１．成功した網膜への送達をスクリーニングするための新規な方法
異なるＵＤＤＳ組成物の効力を評価するために、本発明者らは、網膜送達を評価するための新規な標識アルファ−ブンガロトキシン（αＢＴ）を同定した。（Ｓｉｇｍａ（Ｔ９６４１）から入手した）αＢＴは、図１６に示されているように、網膜における動脈を特異的に標識し、それにより、優れたマーカーを代表している。
【００９６】
２．輸送物の放出
カプセル化材料の放出を利用するために、カプセル化αＢＴおよびアネキシンＶ−７７６を含有するリポソームを、硝子体内注射によって投与し、３時間後、眼をイメージングした。
【００９７】
図１７における結果は、αＢＴおよびアネキシンＶ−７７６の放出の成功を示している。（Ａ）は、リポソームの存在下でのアネキシンの放出を示し、（Ｂ）はカプセル化αＢＴの放出を示し、一方、（Ｃ）および（Ｄ）は、リポソームの存在なしに注射された１ｍｇ／ｍｌのアネキシンＶ−７７６および５０μｇ／ｍｌのαＢＴの効果をそれぞれ、示す。カプセル化αＢＴのシグナル強度は、遊離αＢＴと比較して低下しているが、動脈の特異的な標識を誘発するのに十分な放出が見られる。
【００９８】
３．アネキシン産生
本発明者らは、アネキシンについてのコドン最適化配列を入手した。図１８が示しているように、新しい系は、高レベルのアネキシンＶ−ＧＳＴを発現し、静脈内送達のための十分な量のアネキシンの生成を可能にする。
【００９９】
４．静脈内送達−血液脳関門（ＢＢＢ）および血液網膜関門（ＢＢＢ）ための意味
Ａ．血液網膜関門（ＢＲＢ）
ａ）フルオレセインナトリウムの網膜への静脈内送達
主要な目的は、血液脳関門および血液網膜関門を通過するカプセル化材料の送達の成功を示すことであった。ＵＤＤＳのために最適化されたカプセル化および放出を確立したので、ＵＤＤＳのフルオレセインナトリウムを網膜および脳へ送達する能力を評価した。
【０１００】
３００μｌの５％フルオレセインナトリウムまたは１ｍｌの０．２％カプセル化フルオレセインナトリウムを、ラットに尾静脈を通して投与し、網膜をモニターした。遊離フルオレセインを、前に概要を示したように、超遠心およびＰＤ−１０カラムを使用することによって除去した。
【０１０１】
上記および図１９（Ｄ、Ｅ、およびＦ）に示されているように、フルオレセインは、無傷の血液網膜関門を通過することができず、血管に隔離されたままである。３４分間（Ｂ）においてカプセル化処理された眼に少量の動脈壁蛍光があるものの、網膜血管は、それらがカプセル化材料を含まない場合（Ｄ〜Ｆ）は見られるけれども、カプセル化材料（Ａ〜Ｃ）が存在する場合には見られない、ことを強調することは重要である。しかしながら、図Ａにおける円によって強調表示されているように、カプセル化材料処理された眼が、７分後に、網膜において蛍光の焦点パッチまたはスポットを示した。これらの蛍光パッチの頻度は、図Ｃに示されているように７４分後に分散し始める前に、図Ｂに示された３０分後にピークに達するように思われた。それらは、カプセル化材料処理されていない眼には存在しなかった。これらの蛍光の焦点パッチは、フルオレセインを含有する無傷リポソームであると考えられる。これらの蛍光パッチの局在化は、無傷リポソームの網膜への送達を示唆する。それはまた、カプセル化フルオレセインのみがＢＲＢを通過したことを確認している。蛍光パッチまたはフルオレセインナトリウムの「単焦点漏れ」の出現は、脳においてＢＢＢ破壊が生じた場合に記載されているものと同様である（Ｎａｔａｈ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０７：１３４８〜１３５６  ２００９からの図２０を参照）。
【０１０２】
ｂ）治療的放出を評価するためのＶＥＧＦモデルの開発
眼におけるカプセル化リポソームからの輸送物の治療的放出を評価するために、眼あたり５００ｎｇの組換えヒトＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ１６５）を使用するＶＥＧＦモデルを開発した。図２１は、血管蛇行の増加（Ａ、反射画像）、ＶＥＧＦ注射から２４時間後にとられたフルオレセイン血管造影後に見られる、血管の漏れおよび肥厚（Ｂ、蛍光画像）を有する眼を示す。これらの効果の逆転は、２．５μｌの治療グレードのＬｕｃｅｎｔｉｓの硝子体内注射を使用して達成された（Ｃ〜Ｄ）。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ処理された眼は、未処理のＶＥＧＦモデルに対して、血管サイズを正常に縮小し（Ｃ、反射画像）、漏れがない正常な血管組織（Ｄ、蛍光画像）を示す。
【０１０３】
ｃ）Ｌｕｃｅｎｔｉｓの網膜への静脈内送達
Ｌｕｃｅｎｔｉｓの分子量が高いため、血液網膜関門を通過することができず、静脈内投与には適しないものとなっている。この研究は、カプセル化ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ｌｕｃｅｎｔｉｓ  ＵＤＤＳ）が、静脈内投与によって、ＢＲＢを通って網膜にうまく送達され得るかどうかを調べるために設計された。１つの眼をＶＥＧＦ処理し、対側眼を未処理のままにしておいた動物を調製した。ＶＥＧＦ処理の時点で、ラットはまた、１ｍｌのカプセル化Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（Ａ、Ｂ）か３００μｌの臨床グレードＬｕｃｅｎｔｉｓ（Ｃ、Ｄ）のいずれかの静脈内注射を受けた。より多い容量のカプセル化材料を投与し、カプセル化効率によるＬｕｃｅｎｔｉｓ濃度の低下を考慮した。
【０１０４】
図２２は、左硝子体内ＶＥＧＦ処理眼から２４時間（Ａ、Ｃ）および４８時間（Ｂ、Ｄ）でとられたフルオレセイン血管造影図を示す。第一に、ＶＥＧＦと同時のｌｕｃｅｎｔｉｓ処理は、２４時間で、激しい漏れ、血管肥厚としての蛇行を含む大きな炎症性変化を誘発したことは明らかである（Ａ、Ｃ）。しかしながら、４８時間で、カプセル化ｌｕｃｅｎｔｉｓ処理動物（Ｂ）は、静脈注射臨床グレードｌｕｃｅｎｔｉｓ動物における大量の漏れ、血管新生、および出血と比較して、血管炎（静脈炎）を示しているが、焦点漏れを示す領域はない大きな違いがある。これは、カプセル化ｌｕｃｅｎｔｉｓが、４８時間までには放出されており、劇的な変化を逆転するという治療効果を生じたことを強く示唆している。これは、ＢＲＢをうまく通過して、その時間にわたるｌｕｃｅｎｔｉｓの持続／遅延放出を意味するものである。
【０１０５】
硝子体内ＶＥＧＦから２４時間後にカプセル化ｌｕｃｅｎｔｉｓを静脈内に与えることの効果も評価した（図２３参照）。ＶＥＧＦ注射から２８時間後にとられたフルオレセイン血管造影（Ｂ、蛍光画像）によれば、ＶＥＧＦ効果の逆転が達成された。カプセル化ｌｕｃｅｎｔｉｓ処理された眼は、蛇行の減少、血管サイズを正常に低下させ（Ａ、反射画像）、漏れがなく、およびより正常な血管組織（Ｂ、蛍光画像）を示している。
【０１０６】
これはすべて、カプセル化ＬｕｃｅｎｔｉｓがＢＲＢを通過して、治療に役立っていることを示唆する。
【０１０７】
Ｂ．血液脳関門
フルオレセインの脳への静脈内送達
３００μｌの５％フルオレセインナトリウムまたは１ｍｌの０．２％カプセル化フルオレセインナトリウムを、ラットに尾静脈を通して投与し、網膜をモニターした。遊離フルオレセインを、前に概要を示したように、超遠心およびＰＤ−１０カラムを使用することによって除去した。２時間後、一般的な麻酔下で、動物は、４％パラホルムアルデヒドでの固定灌流を受けた。脳を４％パラホルムアルデヒド中に一晩、保存し、その後、８００ｕｍのスライスに切断し、共焦点蛍光顕微鏡下で調べた。
【０１０８】
フルオレセインナトリウムは、無傷の血液脳関門を通過することができない。これは、Ｎａｔａｈ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０７：１３４８〜１３５６  ２００９によって以前に言及された研究を含むいくつかの実験の根拠になっている。
【０１０９】
図２４における画像は、通常の静脈注射のフルオレセインナトリウムを用いた動物（Ｃ〜Ｄ）と比較した、カプセル化フルオレセインナトリウムの静脈注射を用いた動物（Ａ〜Ｂ）由来の脳における同様の領域から得られた。蛍光画像（Ａ、Ｃ）および透過画像（Ｂ、Ｄ）の両方が示されている。明らかに、カプセル化材料のみが蛍光を示し（Ａ）、通常のフルオレセインナトリウム静脈注射を用いた脳からのシグナルは全くない（Ｃ）。これは、カプセル化が、フルオレセインナトリウムがＢＢＢを通過するのを可能にするという事実を確認している。
【０１１０】
さらに、対応する透過画像（それぞれ、Ｆ、Ｈ）と共に代表的な蛍光画像（Ｅ、Ｇ）において示されているように、カプセル化材料のみが脳質において明らかな蛍光のパッチを有した。フルオレセインナトリウムの蛍光パッチまたは「単焦点漏れ」の出現は、前に論じられているように（Ｎａｔａｈ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０７：１３４８〜１３５６  ２００９）、脳においてＢＢＢ破壊が生じた場合に記載されているものと同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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