(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるＳＢ（スリーピングビューティー）１０トランスポザーゼの配列とアミノ酸が２０個まで異なるアミノ酸配列を含んでおり、変異の以下の組合せ：
バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；または
バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
を少なくとも含んでいるバリアントから選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
変異の以下の組合せ：
バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ
を少なくとも含んでいるバリアントから選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
上記バリアントは、変異の以下の組合せ：
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；または
Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
のみを有していることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる、核酸。
【請求項５】
ＲＮＡもしくはＤＮＡであるか、および／またはプラスミドもしくは組換えウイルスベクターの一部であるか、および／またはオープンリーディングフレームをさらに含んでいるか、および／または遺伝子の調節領域の少なくとも１つをさらに含んでいる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
上記調節領域が転写調節領域である、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
上記調節領域が、プロモータ、エンハンサ、サイレンサ、遺伝子座制御領域、およびボーダー配列からなる群から選択される、請求項５に記載の核酸。
【請求項８】
細胞の内因性ＤＮＡに外来性ＤＮＡを導入する遺伝子導入システムであって、
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドと結合可能な少なくとも２つの反復配列（ＩＲおよび／またはＩＲ／ＤＲ）の間に配置されている核酸を含んでおり、細胞の内因性ＤＮＡに上記核酸または当該核酸の一部を挿入可能であるトランスポゾン；ならびに
（ｉｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、および／または請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、および／または請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸を含んでいる（ｉ）に係るトランスポゾンを含んでいる、遺伝子導入システム。
【請求項９】
（ｉ）に係るトランスポゾンの上記核酸が、オープンリーディングフレームを含んでいるか；
（ｉ）に係るトランスポゾンの上記核酸が、請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、成長ホルモン、［β］ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）もしくはインスリン様成長因子（ＩＧＦ）といったマーカータンパク質をコードする核酸、および／または治療用もしくは診断用の核酸であるか；
上記トランスポゾンがプラスミドの一部であるか；
（ｉ）に係るトランスポゾンの上記核酸が、少なくとも１つの発現調節領域を含んでいるか；
（ｉ）に係るトランスポゾンの上記核酸が、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に作動可能に連結されているプロモータを含んでいるか；
上記細胞が、動物から得られているか；
細胞の上記内因性ＤＮＡが、細胞のゲノムＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡからなる群から選択され、染色体外ＤＮＡがエピソームおよびプラスミドからなる群からさらに選択されるか；および／または
上記反復配列の少なくとも一つが直列反復配列を少なくとも１つ含んでいる、請求項８に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１０】
上記発現調節領域が、プロモータ、エンハンサ、およびサイレンサからなる群から選択される、請求項９に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１１】
上記細胞が脊椎動物または無脊椎動物から得られている、請求項９に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１２】
上記脊椎動物が、魚類、鳥類または哺乳類からなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１３】
上記脊椎動物が、哺乳類からなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１４】
（ｉ）に係るトランスポゾンの上記核酸、またはトランスポザーゼをコードする核酸を含んでいる上記トランスポゾンが、上記細胞のゲノムに挿入されるか；
上記細胞が動物細胞であるか；
細胞の上記内因性ＤＮＡが、細胞のゲノムＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡからなる群から選択され、染色体外ＤＮＡがエピソームおよびプラスミドからなる群からさらに選択されるか；
（ｉ）に係るトランスポゾンの上記核酸が、微粒子銃；エレクトロポレーション；マイクロインジェクション；トランスポゾンと脂質含有小胞またはＤＮＡ縮合剤との組合せ；ならびにウイルスベクター内にトランスポゾンを挿入し、当該ウイルスベクターを細胞と接触させることからなる群から選択される方法を用いて上記細胞にトランスフェクトされる、請求項８または９に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１５】
上記細胞が脊椎動物または無脊椎動物の細胞である、請求項１４に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１６】
上記脊椎動物が、魚類、鳥類または哺乳類からなる群から選択される、請求項１５に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１７】
上記脊椎動物が、哺乳類から選択される、請求項１５に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１８】
上記脊椎動物が、マウス、ラットまたはヒトからなる群から選択される、請求項１５に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成する、細胞。
【請求項２０】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸を含んでいる、細胞。
【請求項２１】
遺伝子のタグ付加、遺伝子の発見またはインビトロにおける遺伝子の転移のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項９〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子導入システムの、使用。
【請求項２２】
遺伝子治療もしくはワクチン接種療法のための治療薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項９〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子導入システムの、使用。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸；および／または
請求項９〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子導入システム
を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、および／または
請求項９〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子導入システムを、使用説明書とともに備えている、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、トランスポゾンシステム−スリーピング  ビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）（ＳＢ）のトランスポザーゼの機能亢進バリアントに関する。本発明は、これらのバリアントを生成する対応する核酸、トランスポゾン−システムスリーピングビューティー（ＳＢ）のトランスポザーゼのこれらの機能亢進バリアントを用いることによって細胞のＤＮＡに核酸を安定に導入する遺伝子導入システム、およびフランキング反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）を有する核酸配列を含んでいる、本発明の遺伝子導入システムに使用されるトランスポゾンにさらに関する。これらのトランスポザーゼバリアント、トランスポゾンまたは遺伝子導入システムの用途（例えば、遺伝子治療、挿入変異誘発、遺伝子の発見（ゲノムマッピングが挙げられる）、遺伝子転移、ライブラリスクリーニング、インビボおよびインビトロにおけるゲノムの機能解析）も開示されている。最後に、本発明にはまた、薬学的組成物およびキットが包含される。
【０００２】
現在の機能的ゲノミクスの時代において、異なる細胞機能における遺伝子の役割を調べる効率的な手法の開発、ならびに必要に応じて、インビトロおよびインビボにおいてこれらの遺伝子を適切に調節する効果的な手法を提供することが、強く求められている。そのような方法は、他の点は別にして、特にＤＮＡを細胞に導入する方法を含んでいる。
【０００３】
ＤＮＡを細胞に導入する典型的な方法としては、ＤＮＡ縮合剤（例えばリン酸カルシウムおよびポリエチレングリコールなど）、脂質含有試薬（例えば、リポゾームおよび多重膜小胞など）、およびウイルス媒介法が挙げられる。しかし、これらの方法にはすべて制限がある。例えば、ＤＮＡ縮合剤およびウイルス媒介法については、サイズの制限がある。さらに、ウイルス法において、細胞内にトランスフェクトされ得る核酸の量が限られている。すべての方法において、送達された核酸が細胞性の核酸内に容易に挿入されるわけではない。ＤＮＡ縮合法を脂質含有試薬は、調製が比較的容易である。ウイルスベクターに核酸を挿入するには、非常な労力を要し得る。さらに、また、ウイルス媒介法は、細胞種または組織型に特異的であり得、インビボにおいて使用する場合、ウイルス媒介法によって免疫学的な問題が引き起こされ得る。
【０００４】
これらの問題の解消に適したツールの一つがトランスポゾンである。トランスポゾン（すなわち転移因子）は、（短い）核酸配列、ならびにその上流および下流に端末反復配列を含んでいる。活性トランスポゾンは、核酸の切り取り、および標的のＤＮＡ配列に対する核酸の挿入を容易にする酵素をコードしている。
【０００５】
現在、トランスポゾンの２つの分類（すなわちクラスＩおよびクラスＩＩ）が知られている。
【０００６】
レトロトランスポゾンまたはレトロポゾンとも呼ばれるクラスＩのトランスポゾンとしては、レトロウイルス様レトロトランスポゾンおよび非レトロウイルス様レトロトランスポゾンが挙げられる。クラスＩのトランスポゾンは、自分自身をコピーすることおよび複数の位置におけるゲノム内にコピーを貼り付けることによって作用する。まず、レトロトランスポゾンは自分自身をＲＮＡとしてコピー（転写）するが、翻訳される代わりにＲＮＡが逆転写酵素（トランスポゾン自身にコードされていることが多い）によってＤＮＡとしてコピーされ、ゲノムに挿入される。クラスＩトランスポゾンの典型的な例としては、例えば、Ｃｏｐｉａ（ショウジョウバエ）、Ｔｙ１（酵母）、ＴＨＥ−１（ヒト）、Ｂｓ１（トウモロコシ）、Ｆ−因子、Ｌ１（ヒト）、Ｃｉｎ４（トウモロコシ）が挙げられる。
【０００７】
第１のステップとして、クラスＩＩのトランスポゾンは、ウイルス感染などのような標準的な方法を用いて細胞にトランスフェクトされる必要がある。これに続いて、クラスＩＩトランスポゾン（“ＤＮＡ型トランスポゾン”とも呼ばれる）は、コピー＆ペースト機構ではなくカット＆ペースト機構によって移動し、この機構においてトランスポザーゼ酵素を使用する。異なるタイプのトランスポザーゼは、異なる様式において作用し得る。あるトランスポザーゼは、ＤＮＡ分子の任意の部分に結合可能であり、標的部位が任意の位置にあり得る。一方で、トランスポザーゼは、他の特定の配列に結合する。それから、トランスポザーゼは、標的部位をカットして粘着末端を生成し、トランスポゾンを放出し、標的部位にトランスポゾンを連結する。クラスＩＩの典型的な例としては、例えば、Ｐ因子（ショウジョウバエ）、Ａｃ−Ｄｓ（トウモロコシ）、ＴＮ３およびＩＳ１（大腸菌）、Ｔａｍ３（キンギョソウ）が挙げられる。
【０００８】
特にクラスＩＩのトランスポゾンの場合、因子によってコードされたトランスポザーゼが、もとの位置からトランスポゾンを切取ることを触媒し、ゲノムの他の位置にトランスポゾンを挿入することを促進する（Ｐｌａｓｔｅｒｋ、１９９６  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０４，  １２５〜１４３）。トランスポゾンファミリーの自律性を有する一員は、転移のためのトランス作用性因子である活性トランスポザーゼを発現可能であり、したがって、それら自身が転移可能である。非自律性のエレメントは、変異トランスポザーゼ遺伝子を有しているが、シス作用性ＤＮＡ配列を保持し得る。これらのシス作用性ＤＮＡ配列は逆方向末端反復配列（ＩＲ）とも呼ばれる。ある逆方向反復配列は、１つ以上の直列反復配列を有し得る。通常、これらの配列は、因子の端末に位置する逆方向反復配列（ＩＲ）に埋め込まれており、他の因子に由来する相補的トランスポザーゼの存在下における転移に必要である。Ｔｏｌ２（下記参照）を除いて、自律性エレメントは脊椎動物から単離されておらず；すべてのトランスポゾン様配列は、おそらく“垂直不活性化（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）”と呼ばれるプロセスの結果として、欠損を有している。（Ｌｏｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １２，  ６２〜７２）。ある系統学モデル（Ｈａｒｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１３，１９７〜２０１）によれば、真核生物のゲノムにおける自律性エレメントに対する非自律性エレメントの比率は、転移のトランス相補性が原因となって増加する。この過程が、トランスポザーゼを生成する活性コピーがゲノムにおいて最終的に消滅することが避けられない状態を引き起こす。その結果、ＤＮＡトランスポゾンは、消滅を避けるために、新しい宿主において自身を定着させる方法を見出さざるを得ない、ゲノムの一過性の構成要素とみなされ得る。実際に、種の間における水平遺伝子伝達は、トランスポゾンの進化における重要な過程一つであると考えられている（Ｌｏｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５  ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  Ｋｉｄｗｅｌｌ，  １９９２．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ．  ２，  ８６８〜８７３）。
【０００９】
水平遺伝子導入の天然の過程は、実験室条件において模倣され得る。植物において、Ａｃ／ＤｓファミリーおよびＳｐｍファミリーのトランスポゾンが、異なる種のなかにごく普通にトランスフェクトされている（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  １９９５  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７，  ４０６〜４１３）。しかし、動物において、１つの種から他の種に活性トランスポゾンシステムを導入するには、自然宿主が生成する因子に対する要求性に起因する、転移の種特異性という大きな障害がある。
【００１０】
上述したトランスポゾンシステムは、脊椎動物および無脊椎動物の系を生じ得る。脊椎動物において、ＤＮＡ中間体を介して転移する転移因子であるＤＮＡトランスポゾンの発見は、比較的最近のことである（Ｒａｄｉｃｅ，  Ａ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４４，  ６０６〜６１２）。その発見以来、真核生物トランスポゾンのｈＡＴ（ｈｏｂｏ／Ａｃ／Ｔａｍ）およびＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒのスーパーファミリーの不活性な高度に変異された一員が、異なる魚の種、アフリカツメガエルおよびヒトのゲノムから単離されている（Ｏｏｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，  ８７３；  Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４７，  ３１２〜３２２；  Ｋｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８３，  ３０；  Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５７，  ３５９〜３６６  ａｎｄ  Ｌａｍ，  Ｗ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３，  １０８７０〜１０８７５）。
【００１１】
無脊椎動物および脊椎動物の両方のトランスポゾンは、モデル生命体における遺伝子導入および挿入変異誘発を実現する可能性を有している。特に、同種における代替トランスポゾンシステムの利用可能性は、遺伝子分析の新しい可能性を開く。例えば、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）トランスポゾンは、安定的に挿入されたＰ因子の存在下において、ショウジョウバエにおいて転移され得る（Ｈａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，  ７７２０−５．）。Ｐ因子およびピギーバックを用いた系が、異なる挿入部位の優先度を示すので（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２，  １０８２４−３０，  Ｈａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，  ７７２０−５）、トランスポゾンの挿入によって不活性化されるハエ遺伝子の数を大幅に増加させ得る。また、Ｐ因子ベクターは、安定な生殖細胞系列の形質転換によってマリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）トランスポゾンの構成要素をキイロショウジョウバエのゲノムに挿入するために使用されている。これらの遺伝子導入ハエにおいて、Ｐ因子の偶発的な転移がない条件において、マリナー転移は研究され得る（Ｌｏｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｌ，  （２００２），  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６０，  ５１９−２６）。
【００１２】
脊椎動物においては、現在、３つの活性トランスポゾン（メダカのＴｏｌ２因子、再構築されたトランスポゾンスリーピングビューティー（ＳＢ）、およびフロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）（ＦＰ））が知られており、使用されている。脊椎動物におけるさらなる興味深いトランスポゾンシステムは、ピギーバックトランスポゾンシステム（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２００５）である。
【００１３】
Ｔｏｌ２因子は、メダカにおけるｈＡＴトランスポゾンファミリーの活性な一員である。Ｔｏｌ２因子は、日本のメダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ、東アジアに生息する小型淡水魚）のアルビノ表現型の原因となる劣勢変異によって発見された。その変異は、チロシナーゼ遺伝子の第５エキソンへの４．７ｋｂ長のＴＥの挿入に起因していることが見出された。この因子（Ｔｏｌ２と命名されている）のＤＮＡ配列は、ｈＡＴファミリーのトランスポゾン（ショウジョウバエのｈｏｂｏ、トウモロコシのＡｃ、およびキンギョソウのＴａｍ３が挙げられる）に類似している。
【００１４】
スリーピングビューティー（ＳＢ）は、魚類から得られるＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ様因子であり、インビボにおけるさまざまな脊椎動物の培養株化細胞、胚性幹細胞、ならびにマウスの体細胞および生殖細胞系列の両方において高い転移活性を示す。
【００１５】
また、フロッグプリンス（ＦＰ）は、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ様因子であり、キタヒョウガエル（ラナ  ピピエンス（Ｒａｎａ  ｐｉｐｉｅｎｓ））のゲノムのトランスポゾンのコピーから最近、再活性化された。オープンリーディングフレームトラップ法が、非断続トランスポザーゼコード領域の同定に使用され、これらの配列の共通する多数決原理によって、活性トランスポザーゼ遺伝子が明らかになった。したがって、ＳＢの“復活”手順とは対照的に、ラナ  ピピエンスにおけるゲノム因子の比較的若い状態によって、単一種に由来するトランスポゾンのコピーにおける共通する多数決原理に基づくことが可能になった。ＳＢトランスポゾンおよびＦＰトランスポゾンは、それらのトランスポザーゼ配列において５０％以下の同一性しか共有しておらず、明確に識別可能である。
【００１６】
上述したようなトランスポゾン（特にＴｏｌ２、ＳＢおよびＦＰ、ならびにピギーバック（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ｌａ．，  Ｃｅｌｌ  ２００５））は相互作用せず、したがって他のトランスポゾンの存在下において遺伝子操作ツールとして使用され得る。当該遺伝子操作ツールよって上記因子の用途が大きく拡がる。これらのトランスポゾンが、非コードＤＮＡと比較して、発現遺伝子に挿入される優先度、および遺伝子内の挿入部位に関する優先度は、大きく異なり得る。これらの優先度が異なる場合には、これらのトランスポゾンシステムの異なる挿入パターンを、相補的な方法において利用し得る。例えば、異なるトランスポゾンシステムを使えば、すでに挿入された導入遺伝子を予想外かつ不要に転移させることなく、いくつかの導入遺伝子を引き続いて細胞内にトランスフェクトできる。さらに、トランスポゾンベクターによって変異誘発され得る標的の遺伝子座の数は、ゲノム全体のスクリーニングに異なるトランスポゾンシステムを組合せることによって劇的に増加する。
【００１７】
また、宿主における転移活性のばらつきおよび標的部位の特異性の差に加えて、種々の因子の異なる構造的性質が、ある特定の用途において利点になり得る。例えば、トランスポゾン挿入を遺伝子の誤発現に利用することによって、機能獲得性の表現型を探し得る。Ｒｏｒｔｈ，  Ｐ．（１９９６，  Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３，  １２４１８−２２．）は、改変Ｐ因子を対象とする誘導性プロモータを有する改変Ｐ因子トランスポゾンを使用して、トランスポゾン挿入部位付近の宿主遺伝子を強制的に発現させ、組織特異的な表現型を検出した。このような実験を実施するための前提条件は、トランスポゾンＩＲが、トランスポゾンＩＲ全体の転写／翻訳を介して読み取り可能なことである。
【００１８】
上述したように、ＤＮＡトランスポゾンは、脊椎動物モデル生物における遺伝子導入ベクターとして、つい最近になって無脊椎動物においても遺伝子導入ベクターとして開発されている。また、ＤＮＡトランスポゾンは、ヒト遺伝子治療におけるレトロウイルス系の強力なライバルになった。上述したように、遺伝子分析および治療方法にとって最も有用な転移因子（ＴＥ）は、実験室における取り扱いの容易さおよび制御可能な性質から、“カット＆ペースト”機構を介して宿主ゲノムにおいて転移するクラスＩＩのＴＥである（図１）。スリーピングビューティー（以後“ＳＢ”と略称）は、“カット＆ペースト”トランスポゾンのＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒファミリーに属する。“カット＆ペースト”ＴＥの転移過程のプロセスの模式的な概要を図１に示す。これらの転移ＤＮＡ因子は、単純な構成を有し、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するゲノム内にトランスポザーゼタンパク質をコードしている。ＩＴＲは転移に必要なトランスポザーゼ結合部位を有している（図１）。ＩＴＲを有する転移性ＤＮＡと、トランスポザーゼ源を分離することによって、ＩＴＲの活性を容易に制御でき、これによって非自律性ＴＥを生成できる。このような２つの構成要素の系において、トランスポゾンは、トランスポザーゼタンパク質をトランス補充する（ｔｒａｎｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）ことによってしか転移できない（図１）。実験上の必要にあわせて、所望の配列のほとんどいずれもがＩＴＲ因子の間に配置され得る。上記転移によって、ベクターＤＮＡからの因子の切取りが生じ、続いて新たな配列環境に単一のコピーが組み込まれる。
【００１９】
一般に、トランスポゾンを介した染色体挿入は、ウイルスを用いた手法よりも有利なようである。これは、ウイルス系と比較した場合に、トランスポゾンが、活性遺伝子および５’調節性領域をそれほど好まず、したがってこれらの遺伝子および領域に変異生成しない傾向にある一方で、所望の遺伝子を染色体に挿入するトランスポゾンの特殊な機構が、より生理的に制御されるからである。
【００２０】
ＳＢは、様々な脊椎動物モデル生物における機能的ゲノミクスにとって有用なツールであることについて証明されている（Ｍｉｓｋｅｙ，  Ｃ．，  Ｉｚｓｖａｋ，  Ｚ．，  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｉｖｉｃｓ，  Ｚ．  （２００５）；  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ．  Ｓｃｉ．  ６２：  ６２９〜６４１）。また、ＳＢは、ヒト遺伝子治療の用途に見込みについて示されている（Ｉｖｉｃｓ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ｉｚｓｖａｋ，  Ｚ．  （２００６）．  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ；  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ６：  ５９３〜６０７）。しかし、これらの応用のすべてにとって、システムの転移活性が有用性および効率の重要な問題である。今日の時点において通常に知られ、かつ説明されているように、機能的かつ有用であるにもかかわらず、トランスポゾン活性は、ＳＢシステムが依然として行き詰まってしまう１つの要因のようである。したがって転移活性の顕著な向上によって、有用性および効率における現在の実験的な障壁が破られ得る。
【００２１】
したがって、ＤＮＡを細胞に導入する方法としてＳＢシステムはすでに有用であるが、ＳＢシステムにはさらに改善する必要性が残っている。そこで、細胞の核酸に対する種々のサイズのトランスポゾンの効率的な挿入、または細胞のゲノムに対するＤＮＡの挿入を増強させることによって、現在の技術状態において可能な程度よりも効率的な転写／翻訳を可能にすることが望まれている。
【００２２】
本発明の基礎を成す目的は、以下のポリペプチドによって達成される。当該ポリペプチドは、配列番号１に示される未処理のＳＢ１０トランスポザーゼの配列とアミノ酸が１から２０個異なるアミノ酸配列を含んでいるＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントから選択されるポリペプチドであって、
上記アミノ酸配列が、以下の変異または変異群：
・Ｋ１４Ｒ、
・Ｋ１３Ｄ、
・Ｋ１３Ａ、
・Ｋ３０Ｒ、
・Ｋ３３Ａ、
・Ｔ８３Ａ、
・Ｉ１００Ｌ、
・Ｒ１１５Ｈ、
・Ｒ１４３Ｌ、
・Ｒ１４７Ｅ、
・Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ、
・Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ、
・Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ、
・Ｍ２４３Ｈ、
・Ｍ２４３Ｑ、
・Ｅ２６７Ｄ、
・Ｔ３１４Ｎ、および
・Ｇ３１７Ｅ
から選択される。
【００２３】
“ＳＢ１０トランスポザーゼ”は、“スリーピングビューティートランスポゾンシステム”の周知のトランスポザーゼである。そのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１に含まれている（図１０）。
【００２４】
本明細書において“１つの変異”または“複数の変異”は、公知のアミノ酸配列の１つ以上を他のアミノ酸配列の１つ以上によってそれぞれ交換することと定義付けられ、また特に断りがある場合には、“１つの変異群”または“複数の変異群”と表示し得る。本明細書において“１つの変異群”または“複数の変異群”は、もとの配列のアミノ酸の群（例えば３または４のアミノ酸）を、それぞれ指定される位置において３または４の他のアミノ酸によって交換することと定義付けられる。定義として、以下の記号を使用して上記変異を特定する。“Ｘ数字Ｚ”は、“数字”の位置におけるもとのアミノ酸配列のアミノ酸“Ｘ”がアミノ酸“Ｚ”と交換されていることを意味する。また、“Ｘ数字Ｙ／Ｘ’数字’Ｚ’／Ｘ’’数字’’Ｚ’’”は、この変異において、“数字”の位置におけるアミノ酸“Ｘ”、“数字’”の位置におけるアミノ酸“Ｘ’”および“数字’’”の位置におけるアミノ酸“Ｘ’’”のそれぞれが、アミノ酸“Ｚ”、“Ｚ’”および“Ｚ’’”と同時に交換されていることを意味する。“変異の組合せ”が定義付けられるとき、“／／”は、この組合せにおける“同時変異”を区別し、示すために使用されるが、他の点において単一のスラッシュ“／”と同じである。
【００２５】
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、１から２０のアミノ酸によって配列番号１と異なっており、上述した変異または変異群の少なくとも一つを含んでいるＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントである。
【００２６】
本発明のポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）、好ましくは後述のように定義付けられる本発明のトランスポゾンと組み合わさられた本発明のポリペプチドは、先行技術の手法と比較して種々の利点を有している。当該利点としては、が天然のＳＢ１０活性と比較して、１００倍増強されたトランスポザーゼ活性を最も顕著に示すことである。
【００２７】
ＳＢトランスポザーゼの活性を増加させるために、組織的変異誘発に関する研究（ＳＢトランスポザーゼのＮ−端末にある９５アミノ酸のアラニンに対する組織的な交換など）がすでに当該分野において実施されている（Ｙａｎｔ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｐａｒｋ，  Ｊ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．，  Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，  Ｊ．ＨＧ．  ａｎｄ  Ｋａｙ，  Ｍ．Ａ．  （２００４）  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  スリーピングビューティー  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ：  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２４：  ９２３９〜９２４７）。これらの置換のうち１０の置換が、基準となるＳＢ１０と比較して、２００〜４００％の間の機能亢進を生じる（Ｙａｎｔ，  ２００４）。これに加えて、さらなるバリアントであるＳＢ１６について、当該分野において説明されている（Ｂａｕｓ，  Ｊ．，  Ｌｉｕ，  Ｌ．，  Ｈｅｇｇｅｓｔａｄ，  Ａ．  Ｄ．，  Ｓａｎｚ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｂ．  Ｓ．  （２００５）  Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  スリーピングビューティー  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：  １１４８〜１１５６）。ＳＢ１６は、天然のＳＢ１０と比較して、１６倍に増強され活性を有していることが報告され、これまでに発表されたなかで最も活性が高いＳＢトランスポザーゼである。ＳＢ１６は、５つの別々の機能亢進変異を組合せて構築されている（Ｂａｕｓ，  ２００５）。
【００２８】
本発明のポリペプチドの好ましい他の実施形態において、上記バリアントは、上述した変異または変異群のうちの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも１から８つ、より好ましくは２から７つ、なおより好ましくは４から７つによって異なっている。
【００２９】
本発明のポリペプチドの好ましい他の実施形態において、ＳＢ１０トランスポザーゼの上記バリアントが、以下の変異の組合せ：
・バリアント１：Ｋ１４Ｒ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント２：Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント４：Ｋ１３Ｄ／Ｋ３３Ａ／Ｔ８３Ａ／／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント５：Ｋ１３Ａ／Ｋ３３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント６：Ｋ３３Ａ／Ｔ８３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント７：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント８：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｉ１００Ｌ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント９：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｒ１４３Ｌ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント１０：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｒ１４７Ｅ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント１１：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｍ２４３Ｑ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１２：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｍ２４３Ｑ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｉ１００Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２２：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２９：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｍ２４３Ｑ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント３０：Ｋ１３Ａ／Ｋ３３Ａ／Ｔ８３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ、
好ましくは
・バリアント１：Ｋ１４Ｒ／Ｒ２１４Ｄ／／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント２：Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント４：Ｋ１３Ｄ／Ｋ３３Ａ／Ｔ８３Ａ／／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント５：Ｋ１３Ａ／Ｋ３３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント６：Ｋ３３Ａ／Ｔ８３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント７：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント８：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｉ１００Ｌ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント９：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｒ１４３Ｌ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント１０：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｒ１４７Ｅ／Ｍ２４３Ｑ；
・バリアント１１：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｍ２４３Ｑ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１２：Ｋ１４Ｒ／Ｔ８３Ａ／Ｍ２４３Ｑ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ、
より好ましくは
・バリアント２：Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
を少なくとも含んでいるバリアントから選択される。
【００３０】
また、ＳＢ１０トランスポザーゼのこれらのバリアントは、上述した群からなる変異の組合せを有するバリアントから、好ましくは、未処理のＳＢ１０トランスポザーゼとこれらのバリアントのアミノ酸配列の差異が変異の上記組合せからなるバリアントから選択され得る。
【００３１】
本発明のポリペプチドの好ましい他の実施形態において、ＳＢ１０トランスポザーゼの上記バリアントは、少なくとも以下の変異群：
・Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ
によって配列番号１に示される未処理のＳＢ１０トランスポザーゼのアミノ酸配列とは異なる、アミノ酸配列を含んでいる。
【００３２】
したがって、ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントは、好ましくは以下の変異の組合せ：
・バリアント１：Ｋ１４Ｒ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント２：Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント５：Ｋ１３Ａ／Ｋ３３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント６：Ｋ３３Ａ／Ｔ８３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｉ１００Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２２：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
より好ましくは、
・バリアント１：Ｋ１４Ｒ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント２：Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント５：Ｋ１３Ａ／Ｋ３３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント６：Ｋ３３Ａ／Ｔ８３Ａ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
なおより好ましくは、
・バリアント２：Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
を含んでいるバリアントから選択される。
【００３３】
また、ＳＢ１０トランスポザーゼのこれらのバリアントは、上述した群からなる変異の組合せを有するバリアントから、好ましくは未処理のＳＢ１０トランスポザーゼとこれらのバリアントのアミノ酸配列の差異が上記変異の組合せからなるバリアントから選択され得る。
【００３４】
本発明の好ましい他の実施形態において、ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントは、配列番号１に示される未処理のＳＢ１０トランスポザーゼとアミノ酸が１から２０個異なっているアミノ酸配列を含んでおり、上記アミノ酸配列が、少なくとも以下の変異および変異群：・Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ、および
・Ｋ１４Ｒ
を含んでいる。
【００３５】
したがって、ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントは、好ましくは以下の変異の組合せ：
・バリアント１：Ｋ１４Ｒ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｉ１００Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２２：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
より好ましくは、
・バリアント１：Ｋ１４Ｒ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ；
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
なおより好ましくは、
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；および
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
最も好ましくは、
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；および
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
を含んでいるバリアントから選択される。
【００３６】
また、ＳＢ１０トランスポザーゼのこれらのバリアントは、上述した群からなる変異の組合せを有するバリアントから、好ましくは未処理のＳＢ１０トランスポザーゼとこれらのバリアントのアミノ酸配列の差異が上記変異の組合せからなるバリアントから選択され得る。
【００３７】
本発明の非常に好ましい他の実施形態において、ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントは、配列番号１に示されるＳＢ１０トランスポザーゼの配列とアミノ酸が１から２０個異なるアミノ酸配列を含んでおり、当該アミノ酸配列が、以下の変異または変異群：
・Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑおよび
・Ｋ１４Ｒ、ならびに
さらなる変異または変異群：
・Ｋ３０Ｒ、
・Ｋ３３Ａ、
・Ｒ１１５Ｈ、
・Ｒ１４３Ｌ、
・Ｒ１４７Ｅ、
・Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ；
・Ｍ２４３Ｈ；
・Ｅ２６７Ｄ；
・Ｔ３１４Ｎ；および
・Ｇ３１７Ｅ
から選択される２から６つ、
好ましくは
・Ｋ３０Ｒ、
・Ｋ３３Ａ、
・Ｒ１１５Ｈ、
・Ｒ１４３Ｌ、
・Ｒ１４７Ｅ、
・Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ；
・Ｍ２４３Ｈ；
・Ｅ２６７Ｄ；
・Ｔ３１４Ｎ；および
・Ｇ３１７Ｅ
から選択される３から５つを少なくとも含んでいる。
【００３８】
したがって、ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントは、好ましくは以下の変異の組合せ：
・バリアント３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント１７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント１８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
より好ましくは、
・バリアント１４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２０：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４７Ｅ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；
・バリアント２１：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２３：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３０Ｒ／Ｒ１４３Ｌ／／Ａ２０５Ｋ／Ｈ２０７Ｖ／Ｋ２０８Ｒ／Ｄ２１０Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；および
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
を含んでいるバリアントから選択される。
【００３９】
また、ＳＢ１０トランスポザーゼのこれらのバリアントは、上述した群からなる変異の組合せを有するバリアントから、好ましくは未処理のＳＢ１０トランスポザーゼとこれらのバリアントのアミノ酸配列の差異が上記変異の組合せからなるバリアントから選択され得る。
【００４０】
非常に好ましい本発明の実施形態において、ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントは、配列番号１に示される未処理のＳＢ１０トランスポザーゼとアミノ酸が１から２０個異なっているアミノ酸配列を含んでおり、当該アミノ酸配列が、以下の変異または変異群：
・Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ、
・Ｋ１４Ｒ、ならびに
さらなる変異または変異群：
・Ｋ３３Ａ、
・Ｒ１１５Ｈ、
・Ｒ１４３Ｌ、
・Ｒ１４７Ｅ、
・Ｍ２４３Ｈ；
・Ｅ２６７Ｄ；
・Ｔ３１４Ｎ；および
・Ｇ３１７Ｅ
から選択される３から４つ、
好ましくは、以下の変異または変異群：
・Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ、
・Ｋ１４Ｒ
・Ｋ３３Ａ、
・Ｒ１１５Ｈ、および
・Ｍ２４３Ｈ、ならびに
さらなる変異または変異群：
・Ｒ１４３Ｌ、
・Ｒ１４７Ｅ、
・Ｅ２６７Ｄ；
・Ｔ３１４Ｎ；および
・Ｇ３１７Ｅ
から選択される０から１つ少なくともを含んでいる。
【００４１】
したがって、ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントは、好ましくは以下の変異の組合せ：
・バリアント１９：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２４：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４３Ｌ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２５：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／Ｒ１４７Ｅ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ；
・バリアント２６：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｅ２６７Ｄ；
・バリアント２７：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｔ３１４Ｎ；および
・バリアント２８：Ｋ１４Ｒ／Ｋ３３Ａ／Ｒ１１５Ｈ／／Ｒ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑ／／Ｍ２４３Ｈ／Ｇ３１７Ｅ
を含んでいるバリアントから選択される。
【００４２】
また、ＳＢ１０トランスポザーゼのこれらのバリアントは、上述した群からなる変異の組合せを有するバリアントから、好ましくは未処理のＳＢ１０トランスポザーゼとこれらのバリアントのアミノ酸配列の差異が上記変異の組合せからなるバリアントから選択され得る。
【００４３】
本発明の他の局面は、上述したように定義付けた本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる核酸に関する。本発明に係る核酸は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、またはウイルスＲＮＡ（また、組換えウイルスベクターが挙げられる）を典型的に含んでいる。したがって、本発明に係る核酸の好ましい実施形態において、当該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり、他の好ましい実施形態において、当該核酸はプラスミドまたは組換えウイルスベクターの一部である。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている任意の核酸配列から好ましく選択される。したがって、上述した本発明の変異ＳＢ１０バリアントをコードするすべての核酸バリアントは、遺伝コードの縮重に起因するヌクレオチド配列の変更を有している核酸バリアントを包含する。特に、選択された宿主生物におけるコードされた融合タンパク質の向上した発現を導く、核酸バリアントのヌクレオチド配列が好ましい。宿主細胞の特定の転写／翻訳機構に対して核酸配列を適切に適合させるための表は、当業者にとって周知である。ヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量を特定の宿主細胞の条件に適合させることが一般的に好ましい。ヒト細胞内における発現に関して、Ｇ／Ｃ含有量を、最大のＧ／Ｃ含有量（それぞれ本発明のペプチドバリアントをコードする）の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、５０％、７０％、そしてなおより好ましくは９０％だけ増加させることが好ましい。当該核酸および／または誘導体の調製および精製は、標準的な手法によって通常に実施される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹを参照）。
【００４４】
これらの配列バリアントは、ＳＢ１０の未処理の核酸配列（配列番号１）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有しており、配列番号１に示したアミノ酸配列を含んでいるＳＢ１０トランスポザーゼのバリアントから選択された本発明のポリペプチドまたはタンパク質を好ましく誘導する。したがって、本発明の核酸配列はＳＢ１０の修飾（非天然）バリアントをコードする。さらに、上記ポリペプチド／タンパク質の発現を定量的または組織特異的な様式において制御するために、プロモータなどの発現制御領域が、本発明のポリペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結され得る。
【００４５】
上述のように定義付けられる本発明のポリペプチドは、タンパク質、またはリボ核酸（ｍＲＮＡが挙げられる）、もしくはＤＮＡ（例えば、染色体外ＤＮＡ（これに限定されないが、エピソームＤＮＡが挙げられる）、プラスミドＤＮＡまたはウイルス核酸）として、細胞にトランスフェクトされ得る。さらに、本発明のポリペプチド／タンパク質をコードする本発明の核酸は、核酸ベクター（例えば、プラスミド）または遺伝子発現ベクター（ウイルスベクターが挙げられる）として、細胞にトランスフェクトされ得る。したがって、上記核酸は環状または直鎖状であり得る。本明細書において、ベクターは、本発明のポリペプチドまたはトランスポゾン（詳細は後述）をコードする核酸を組み込み得るプラスミド、ウイルスベクター、またはコスミドを指す。“コーディング配列”または“オープンリーディングフレーム”という用語は、適切な制御の制御下に置かれている場合に、インビボにおいてポリペプチドに転写および／または翻訳可能な核酸の領域を指す。
【００４６】
したがって、本発明に係る核酸の好ましい実施形態において、上記核酸は、さらなるオープンリーディングフレームを少なくとも含んでいる。好ましい他の実施形態において、上記核酸は、さらなる遺伝子の制御領域を少なくとも含んでいる。好ましくは制御領域が転写制御領域であり、より詳細には当該制御領域は、プロモータ、エンハンサ、サイレンサ、遺伝子座制御領域、およびボーダーエレメント（ｂｏｒｄｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）からなるから群から選択される。
【００４７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、細胞のゲノム、または恒常的または誘導可能な発現のためのベクター（好ましくは自律性複製ベクター）に安定的に挿入され得る。本発明のポリペプチド／タンパク質が、細胞にトランスフェクトされるか、または核酸としてベクターに挿入される場合、本発明のポリペプチド／タンパク質（ＳＢ１０トランスポザーゼのバリアント）をコードする配列は、好ましくはプロモータに作動可能に連結されている。使用可能な種々のプロモータとしては、これらに限定されないが、恒常的なプロモータ、組織特異的なプロモータ、誘導性のプロモータなどが挙げられる。プロモータは、細胞内においてＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させる制御シグナルである。ＤＮＡ配列は、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写と翻訳を制御し、調節する場合に、プロモータなどの発現制御配列に対して作動可能に連結されている。“作動可能に連結されている”という用語は、発現されるＤＮＡ配列の上流に適切な開始信号（例えば、ＡＴＧ）を有しており、正しいリーディングフレームを維持することによって、上記発現制御配列の制御下においてＤＮＡ配列の発現を可能にして、所望のタンパク質生成物を生成させることを含んでいる。上記開示を参照すると、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列が本発明の同じポリペプチドをコードしているにもかかわらず、三文字コドンの縮重に起因して変動し得る。えば、種々の特異的ＲＮＡコドン（ＴがＵに置換された対応するＤＮＡコドン）が、交換可能に使用されて特定のアミノ酸をコードすることは、当該分野において公知である。
【００４８】
ＤＮＡおよびタンパク質を操作する方法は、当該技術分野では公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｏｒ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．などの文献において詳細に説明されている。
【００４９】
本発明のもう一つの局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下において本発明に係る核酸に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでいる、アンチセンス核酸に関する。このアンチセンスＲＮＡは、サイレンシングを目的として使用され得る。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、本発明のこのアンチセンスＲＮＡをコードしている。
【００５０】
本発明の他の局面は、少なくとも２つの反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間に配置されている核酸配列を含んでおり、当該核酸配列のいずれかの一端に少なくとも１つの反復配列が配置されているトランスポゾン（本明細書において転移因子とも呼ばれる）に関する。
好ましくは、本発明のトランスポゾンは、少なくとも２つの反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間に配置されている核酸配列を核酸配列を含んでおり、間に挟まれている当該核酸配列のいずれかの一端に少なくとも１つの反復配列が配置されている（ここで、これらの反復配列が上述のように定義付けられる本発明のポリペプチドと結合され得、当該トランスポゾンが細胞のＤＮＡに対して（特に核酸配列または核酸配列の一部を）挿入可能である）。換言すれば、反復配列は、上述のように定義付けられる本発明のポリペプチドによって認識され、結合される配列であると定義付けられる。
【００５１】
本発明のポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）によって結合される本発明のトランスポゾンの基本構造は、１対の反復配列を含んでいる。これらのうち、第１の反復配列は上述した核酸配列の上流に典型的に位置しており、第２の反復配列は当該核酸配列の下流に典型的に位置している。この典型的な構造において、第２の反復配列は第１の反復配列と同じ配列であるが、第１の反復配列と比べて逆向きの読み取方向（相補的二本鎖配列の５’末端と３’末端が交換されている）を示している。これらの反復配列がまったく逆向きに反復される配列であることから、これらの反復配列は、“逆方向反復配列”（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）（ＩＲ）と呼ばれる。
【００５２】
他の構造によって、上述のように定義付けられる反復配列は、上述した核酸配列の上流および下流に複数個が存在し得る。したがって、好ましくは２つ、または最終的に３つ、４つもしくはそれ以上の反復配列が、上述した核酸配列の上流および／または下流に位置している。好ましくは、上述した核酸配列の上流に位置する反復配列の数および下流に位置する反復配列の数が等しい。多コピーのＩＲが上記核酸配列の各末端に存在する場合、各末端におけるこれらの多コピーのＩＲのいくつか、またはより好ましくはすべてが、ＩＲと同じ向きを有していてもよく、本明細書において“同方向反復配列（ｒｅｐｅａｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）（ＲＳＤ）”と呼ばれる。このような好ましい状況において、上記反復配列アセンブリはＩＲ／ＲＳＤと呼ばれる。
【００５３】
ＩＲ／ＲＳＤ構造について、上述した核酸配列の上流および／または下流に位置する複数の反復配列は、例えば互いに直接に連結されるように、配置され得る。また、これらの反復配列はスペーサ配列によって分離され得る。このスペーサ配列は、多くの核酸、好ましくは５０から２００の核酸によって典型的に形成される。
【００５４】
上述のように定義付けられる反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）は、細胞のＤＮＡに挿入される核酸配列に好ましく隣接する。上記核酸配列は、オープンリーディングフレーム、特に遺伝子のオープンリーディングフレーム（すなわちタンパク質コード領域）のすべてまたは一部、１つ以上の発現制御配列（すなわち核酸における制御領域）の単独において、またはオープンリーディングフレームのすべてまたは一部とともに含み得る。好ましい発現制御配列としては、これらに限定されないが、プロモータ、エンハンサ、ボーダー制御エレメント（ｂｏｒｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、遺伝子座制御領域またはサイレンサが挙げられる。好ましい実施形態において、上記核酸配列は、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に対して作動可能に連結されたプロモータを含んでいる。最後に、本発明のトランスポゾンは、直鎖状断片として使用され得るか、または例えばプラスミドにおいて環状化され得る、直鎖状のトランスポゾン（慣例として５’末端から３’末端に向かって延びている）として、好ましく存在する。
【００５５】
本発明のトランスポゾンの代替可能な１つの実施形態において、少なくとも２つの反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間に位置している上記核酸配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる本発明に係る核酸である。また代替可能に、上記トランスポゾンは、トランスポゾンの向上された機能性を有する本発明のポリペプチドにとっての、２つ以上（例えば２つ、３つ、４つまたはそれ以上）のコード領域（共通のプロモータの下におよび／または個々に制御される）を含み得る。
【００５６】
本発明のトランスポゾンの代替可能な他の実施形態において、少なくとも２つの反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間に位置している上記核酸配列は、任意の組換えタンパク質に関する核酸配列であり得る。例えば、上記核酸配列によってコードされるタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、光活性化ＧＦＰ（ＰＡ−ＧＦＰ）、黄色シフト緑色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｈｉｆｔｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｙｅｌｌｏｗ  ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）、キンドリング蛍光タンパク質（ｋｉｎｄｌｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＫＦＰ１）、エクオリン、自己蛍光タンパク質（ＡＦＰ）、または蛍光タンパク質（ＪＲｅｄ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＰｈｉＹＦＰおよびＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔＨｃ−Ｒｅｄ（ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ）、ＰＳ−ＣＦＰ２ならびにＫＦＰ−Ｒｅｄ（ＥＶＲΩＧＥＮからすべて入手可能であり、またｗｗｗ．ｅｖｒｏｇｅｎ．ｃｏｍを参照すればよい））、または他の好適な蛍光タンパク質クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）などのマーカータンパク質であり得る。上記タンパク質は、“所望のタンパク質”からさらに選択され得る。所望のタンパク質としては、例えば、遺伝子導入動物における成長を促進する成長ホルモン、または［β］−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、α−抗トリプシン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、血液凝固系の因子ＶＩＩＩおよびＸＩ、ＬＤＬ−受容体、ＧＡＴＡ−１などに由来する成長ホルモンが挙げられる。上記核酸配列は、例えばアポトーシスまたはアポトーシス関連酵素をコードする自殺遺伝子、および他の遺伝子（ＡＩＦ、Ａｐａｆ（例えばＡｐａｆ−１、Ａｐａｆ−２、Ａｐａｆ−３）、ＡＰＯ−２（Ｌ）、ＡＰＯ−３（Ｌ）、アポパイン、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ｂｉｋ、ＣＡＤ、カルパイン、カスパーゼ（例えばカスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１）、グランザイムＢ、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−９、セラミド、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ＣＰＰ３２、ｃｒｍ  Ａ、チトクロムｃ、Ｄ４−ＧＤＰ−ＤＩ、Ｄａｘｘ、ＣｄＲ１、ＤｃＲ１、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＩＳＣ、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１、ＦＡＫ、Ｆａｓ、Ｆａｓ−リガンドＣＤ９５／Ｆａｓ（受容体）、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ、ＦＬＩＰ、ホドリン、ｆｏｓ、Ｇ−アクチン、Ｇａｓ−２、ゲルゾリン、グルココルチコイド／グルココルチコイド受容体、グランザイム  Ａ／Ｂ、ｈｎＲＮＰｓ  Ｃ１／Ｃ２、ＩＣＡＤ、ＩＣＥ、ＪＮＫ、Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｂ、ＭＡＰ、ＭＣＬ−１、Ｍｄｍ−２、ＭＥＫＫ−１、ＭＯＲＴ−１、ＮＥＤＤ、ＮＦ−ΚＢ、ＮｕＭａ、ｐ５３、ＰＡＫ−２、ＰＡＲＰ、パーフォリン、ＰＩＴＳＬＲＥ、ＰＫＣδ、ｐＲｂ、プレセニリン、ｐｒＩＣＥ、ＲＡＩＤＤ、Ｒａｓ、ＲＩＰ、スフィンゴミエリナーゼ、ＳＲＥＢＰ、単純ヘルペス由来のチミジンキナーゼ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α受容体、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、トランスグルタミナーゼ、Ｕ１  ７０  ｋＤａ  ｓｎＲＮＰ、ＹＡＭＡが挙げられる）であり得る。最後に、本発明のトランスポゾンに位置する核酸配列は、短鎖ＲＮＡヘアピン発現カセットから選択され得る。また、上記核酸配列は、ｓｉＲＮＡ（例えば発現が低減されるか、または抑制される遺伝子のコード領域に対応する、２０から２５、特に２１から２３のオリゴヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ）、またはストリンジェントな条件下において例えば細胞におけるｍＲＮＡ配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでいる（これによって細胞のｍＲＮＡの翻訳を低減するか、または抑制する）アンチセンスＲＮＡであり得る。
【００５７】
さらなる実施形態において、隣接する配列間の領域が、モノシストロンまたはマルチシストロン（ｍａｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎ）であり得る２つ以上（例えば２つ、３つ、４つの）コード領域から構成され得る。治療的、診断的、または科学的な用途に関連し得る少なくとも１つの核酸配列がトランスポゾンのコアに含まれている場合に、さらなるコード領域の少なくとも１つが、トランスポザーゼの向上された機能性を有する本発明のポリペプチドをコードし得る。
【００５８】
一般に、本発明の治療的用途は、多種多様であって、したがって、本発明のポリペプチド、核酸であり得る。そして、特に本発明に係るトランスポゾンおよび／または遺伝子導入システムは、治療的用途における使用について見出され得る。治療的用途における当該使用において、上記トランスポゾンシステムは、治療用核酸（“所望の治療薬の核酸”）（例えば遺伝子（所望の治療薬の核酸）を標的細胞のゲノムに安定的に組み込むために採用される（すなわち遺伝子治療用途）。また、上記トランスポゾンシステムは、抗原提示細胞に抗原（例えば、腫瘍ワクチン化に特異的な腫瘍抗原（例えばＭＡＧＥ−１））を組み込むワクチン療法、または病原体に由来する感染症、ウイルス感染症もしくは原虫感染症（例えば、マラリアによって生じる）を処置するための病理学的抗原を組み込むワクチン療法所望され得る。病原体に由来する感染症は、例えば、ハンセン氏病、破傷風、百日咳、腸チフス、パラチフス、コレラ、疫病、結核、髄膜炎、細菌性肺炎、炭疽病、ボツリヌス中毒症、細菌性赤痢、下痢、食中毒、梅毒、胃腸炎、塹壕熱、インフルエンザ、猩紅熱、ジフテリア、淋病、毒素性ショック症候群、ライム病、発疹チフス、リステリア症、消化性潰瘍、およびレジオネラ症である。ウイルス感染症は、例えば、後天性免疫不全症候群、アデノウイルス感染症、αウイルス感染症、アルボウイルス感染症、ボルナ病、ブニヤウイルス感染症、カリチウイルス感染症、水痘、尖圭コンジローム、コロナウイルス感染症、コクサッキーウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、ＤＮＡウイルス感染症、膿瘡、感染性脳炎、アルボウイルス、エプスタインバーウイルス感染症、伝染性紅斑、ハンタウイルス感染症、出血熱、ウイルス性肝炎、ヒト単純ヘルペス、帯状ヘルペス、耳帯状疱疹、ヘルペスウイルス感染症、感染性単核球症、トリインフルエンザ、ヒトインフルエンザ、ラッサ熱、麻疹、伝染性軟属腫、流行性耳下腺炎、パラミクソウイルス感染症、パパタシ熱、ポリオーマウイルス感染症、狂犬病、呼吸器系合胞体ウイルス感染症、リフトバレー熱、ＲＮＡウイルス感染症、風疹、遅発性ウイルス感染症、天然痘、亜急性硬化性全脳炎、腫瘍ウイルス感染症、ゆうぜい、西ナイル熱、ウイルス感染症、黄熱病によって生じる。典型的に、本発明のトランスポゾンシステムによって感染症を処置するために使用される抗原は、任意の細菌病原体、ウイルス病原体または原虫病原体の表面抗原を少なくとも１つ含んでいる。
【００５９】
本発明の主題のトランスポゾンシステムが、種々の治療用核酸を送達するために使用され得る。所望の治療用核酸は、標的宿主細胞における欠陥遺伝子（例えば、遺伝子欠損に基づく病的な状態の原因である遺伝子、およびがんの処置において治療的な有用性を有する遺伝子など）を置換する遺伝子を含んでいる。遺伝子欠損に基づく病的な状態の処置に使用する治療遺伝子としては、以下の生成物：因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、［β］−グロビン、低密度タンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリン  ヌクレオシド  ホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通型制御因子、［α］−抗トリプシン、ＣＤ−１８、オルニチンカルバミル転移酵素、アルギノスクシネートシンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖状［α］−ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、グルコース  ６−ホスファターゼ、［α］−Ｌ−フコシダーゼ、［β］−グルクロニダーゼ、［α］−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトース  １−リン酸ウリジル転移酵素をコードする遺伝子が挙げられる。本発明の主題の方法を介して送達し得るがん治療遺伝子は、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、発現生成物が腫瘍細胞の免疫原性を増強する遺伝子、がん抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、複数の薬剤耐性遺伝子およびアンチセンス配列などを含んでいる。本発明の主題の方法は、所望の治療遺伝子だけでなく、任意の発現制御因子（例えばプロモータなど）を導入するために、使用され得る。当該発現制御因子は、上記治療遺伝子の時間的および空間的に所望の発現を実現することを所望され得る。本発明の主題の方法（上述のように遺伝子治療に対する用途）の重要な特徴の一つは、該主題の方法がインビボ遺伝子治療用途に使用され得ることである。インビボ遺伝子治療用途は、治療遺伝子の発現が所望される１つ以上の標的細胞が、トランスポゾンシステムと接触する前に宿主から除去されないことを意味する。一方で、トランスポゾンシステムを含んでいるベクターは、好ましくは注射によって、直接に多細胞生命体に投与され、上記標的細胞によって取り込まれ、それに続いて標的細胞ゲノムに対する遺伝子の組込みが起こる。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明のトランスポゾンにおける核酸配列は、本発明に係る核酸配列、マーカータンパク質をコードする核酸配列、および／または所望される治療用もしくは診断用の核酸である。当該マーカータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）、成長ホルモン、［β］−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、またはインスリン状成長因子（ＩＧＦ）である。
【００６１】
さらに好ましい実施形態において、本発明のトランスポゾンは“サンドイッチ構造”と呼ばれる構造に存在し得る。この“サンドイッチ構造”によって、本発明のトランスポゾンは、２つのコピーとして、が（さらなる）所望の遺伝子（これらの２つのトランスポゾンの間に位置する）に隣接して存在する。２つのトランスポゾンによって隣接された上記遺伝子は、片方または両方のトランスポゾンに対して直接に連結され得る。代替可能に、（複数の）上記活性遺伝子は、スペーサ配列によって片方または両方のトランスポゾンから隔てられ得る。このスペーサ配列は、多くの核酸、好ましくは５０から２００の核酸によって典型的に形成される。さらに、タンパク質、またはサンドイッチ構造を形成する２つの上記トランスポゾンによってコードされる遺伝子は、同じであり得るか、または異なり得る。当該“サンドイッチ構造”を本発明のポリペプチドと組み合わせる場合に、好ましくは、第１のトランスポゾンから始まって第２のトランスポゾンの末端までの配列全体が、本発明のポリペプチドの標的（挿入）部位に挿入される。
【００６２】
以上のことから、さらなる実施形態において、
本発明に係るトランスポゾンは、例えばプラスミドの一部であり；
本発明に係るトランスポゾンにおける上記核酸配列は、オープンリーディングフレームを含んでおり；
本発明に係るトランスポゾンにおける上記核酸配列は、少なくとも１つの発現制御領域を含んでおり；好ましくは当該発現制御領域が、プロモータ、エンハンサまたはサイレンサからなる群から選択されており；
本発明に係るトランスポゾンにおける上記核酸配列は、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に対して作動可能に連結されたプロモータを含んでおり、
本発明に係るトランスポゾンは、動物、好ましくは脊椎動物または無脊椎動物から得られる細胞の一部であり、上記脊椎動物は、好ましくは魚類、鳥類および哺乳類からなる群からから選択され、好ましくは哺乳類であり、
本発明に係るトランスポゾンは、細胞ゲノムまたは染色体外の細胞ＤＮＡ（エピゾームまたはプラスミドからなる群から選択される）からなる群から選択される細胞ＤＮＡに組み込まれるか、または自律性ベクター（例えばプラスミド）の一部として自律的に複製され；および／または
本発明に係るトランスポゾンにおける上記反復配列の少なくとも一つが、少なくとも１つの直列反復配列を含んでいる。
【００６３】
本発明の他の一実施形態は遺伝子導入システムに関連する。上述のように、本発明のポリペプチドは好ましくは本発明のトランスポゾン上における反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）を認識する。したがって、本発明の遺伝子導入システムは、上述のように定義付けられる本発明のポリペプチド（各トランスポザーゼ）、およびクローン化された非自律性（すなわち非自己挿入）の因子またはトランスポゾンの２つの構成要素を含んでいる。ここで、上記因子またはトランスポゾンは、反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間にあるトランスポゾン基質ＤＮＡを含んでいる。なお、本明細書において上記因子またはトランスポゾンは、少なくとも２つの反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）を有するトランスポゾンを指す。本発明の遺伝子導入システムのこれら２つの構成要素を組み合わせた場合に、活性トランスポゾン活性が得られ、トランスポゾン（好ましくは、治療的、科学的または診断的な用途の有する所望の遺伝子または配列を有する）を再配置することが可能になる。使用時に本発明のポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）は、本発明のトランスポゾンの反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）に結合し、後述のように定義付けられる細胞のＤＮＡに対する介在核酸配列の挿入を促進する。より詳細には、本発明の遺伝子導入システムは、上述のように定義付けられる本発明のトランスポゾンを、本発明のポリペプチド（または、細胞にトランスポザーゼ活性を供給するの本発明のポリペプチドをコードする核酸）と組み合わせて含んでいる。本発明のこのような組合せは、細胞のＤＮＡに対する上記核酸配列の挿入を好ましく生じる。代替可能に、種々の生殖機構を介した非相同性組換えによって、細胞のＤＮＡに本発明のトランスポゾンを挿入し得る。いずれの場合においても、本発明のトランスポゾンは、本発明のシステムを使いることによって遺伝子導入に使用され得る。
【００６４】
したがって、本発明のさらに他の局面は、
（ａ）本発明に係るトランスポゾン、ならびに
（ｂ）本発明に係るポリペプチ、および／または本発明に係る核酸（したがって、本発明に係るポリペプチドをコードする）、および／または向上したトランスポザーゼ活性を有する本発明のポリペプチドにとってのコード領域を含んでいる本発明のトランスポゾン
を含んでいる細胞のＤＮＡにＤＮＡを導入する遺伝子導入システムに関する。
【００６５】
自律性システムである上記遺伝子導入システムの他の実施形態において、本発明に係るトランスポゾンにおける少なくとも２つの上記反復配列の間に位置する核酸は、本発明に係るポリペプチドをコードする本発明に係る核酸、および例えば所望の核酸を含んでいる。
【００６６】
本発明の遺伝子導入システムは、本発明のポリペプチドを使用することによって、多様な種類の細胞のＤＮＡおよび多様な種のＤＮＡに対する本発明のトランスポゾンの挿入を媒介する。このような細胞としては、本文中において好適な任意の細胞（これらに限定されないが、動物細胞、または細菌、菌類（例えば酵母）または植物に由来する細胞が挙げられる）が、好ましく挙げられる。好ましい動物細胞は脊椎動物または無脊椎動物であり得る。好ましい無脊椎動物細胞としては、甲殻類または軟体動物に由来する細胞が挙げられる。甲殻類または軟体動物としては、これらに限定されないが、エビ、ホタテガイ、イセエビ、ハマグリまたはカキが挙げられる。好ましい脊椎動物細胞としては、魚類、鳥類および他の動物に由来する細胞（例えば、好ましくは哺乳類に由来する細胞、またはヒト（好ましくはラット、マウスまたはヒト）に由来する細胞）が挙げられる。哺乳類としては、これらに限定されないが、げっ歯類（例えばラットまたはマウス）、有蹄類（例えばウシまたはヤギ）、ヒツジ、ブタが挙げられる。特に好ましい実施形態において、本発明にとって好適な細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【００６７】
さらに、このような細胞（特に上述のように定義付けられる哺乳類由来の細胞）は、多能性細胞（すなわち、その子孫が特定の数種類の細胞（例えば、造血幹細胞などの幹細胞）に分化し得る細胞）、および全能性細胞（すなわち、その子孫が生体における任意の細胞種になり得る細胞（例えば胚性幹細胞））であり得る。このような細胞は、本発明のポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）を安定して確実に発現させるために、または本発明の遺伝子導入システムの構成要素を用いてすでにトランスフェクトされている多くの細胞を得るために使用すると効果的である。さらに、卵母細胞、卵細胞、および１つ以上の胚細胞などの細胞がまた、本発明の伝子導入システムを用いた安定なトランスフェクションの標的であると考えられ得る。
【００６８】
他の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドを生成する細胞または本発明の核酸またはトランスポゾンを含んでいる細胞に関する。
【００６９】
また、本発明のトランスポゾンおよび／または本発明のポリペプチド／タンパク質を受容しており、その細胞のＤＮＡに本発明のトランスポゾンを挿入可能な細胞としては、これらに限定されないが、リンパ球、肝細胞、神経系細胞（例えば神経細胞、グリア細胞）、筋肉細胞、種々の血液細胞、および生体の種々の細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞（例えば（リンパ）造血細胞）、胚、受精卵、精細胞（これらのうちのいくつかはインビトロ環境において操作可能である）が挙げられる。より詳細には、造血系由来の細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、血小板、赤血球、またはこれらの（共通の）前駆細胞（例えば多能性前駆細胞、特に造血系の長期型または短期型のＣＤ３４＋細胞）であり得る。
【００７０】
この文脈において、本発明のトランスポゾンのレシピエントの役割を果たす細胞ＤＮＡとしては、本発明のトランスポゾンが細胞内において本発明のポリペプチドに接触すれ場合には、トランスフェクトされる細胞（上述のような）に存在する任意のＤＮＡなどが挙げられる。例えば、細胞性ＤＮＡは細胞ゲノムの一部であり得るか、またはエピゾーム、プラスミド、環状のＤＮＡ断片または直鎖状のＤＮＡ断片などの染色体外ＤＮＡであり得る。挿入される典型的な標的は、例えば細胞性の二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００７１】
本発明の遺伝子導入システムの上記構成要素（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質（任意の形態（例えば、そのままの形態（タンパク質）、本発明の核酸によってコードされている形態、または本発明のトランスポゾンの構成要素としての形態）において提供される）、およびヌクレオチド配列を含んでいる本発明のトランスポゾン（所望の対象タンパク質をコードしている））は、細胞に、好ましくは上述のように定義付けられる細胞に、さらに好ましくは同一の細胞にトランスフェクトされ得る。これらの構成要素のトランスフェクションは、順次または平行してさらに起こり得る。例えば、本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、またはトランスポゾンを含んでいる本発明の核酸は、ヌクレオチド配列（所望のタンパク質をコードしている）を含んでいる本発明のトランスポゾンのトランスフェクションの前に、当該トランスフェクションと同時に、または当該トランスフェクションに続いて、上述のように定義付けられる細胞にトランスフェクトされ得る。代替可能に、本発明のトランスポゾンは、本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、または本発明の核酸を含んでいるトランスポゾンのトランスフェクションの前に、当該トランスフェクションと同時に、当該トランスフェクションに続いて、上述のように定義付けられる細胞にトランスフェクトされ得る。平行してトランスフェクトされる場合、好ましくは、トランスフェクション前の転移を避けるために、両方の構成要素が、別々の製剤において提供され、および／または投与前に互いを直接に混合される。さらに、遺伝子導入システムの少なくとも１つの構成要素の投与は、例えば、この構成要素の少なくとも１回、２回または複数回の投与量、または両方の構成要素を投与することによって、繰り返し行われ得る。
【００７２】
上記トランスフェクション反応のいずれに関しても、本発明の遺伝子導入システムは、当該分野において公知の好適な方法において調合され得るか、または後述のように定義付けられる薬学的組成物もしくはキットとして調合され得る。
【００７３】
さらに、本発明の遺伝子導入システムの構成要素は、例えば、微粒子銃法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、脂質含有小胞（例えば、陽イオン脂質小胞）と上記構成要素の組合せ、ＤＮＡ縮合剤（例えば、リン酸カルシウム、ポリリシン、ポリエチレンイミン）といった技術、および上記構成要素（すなわち、これらの核酸）をウイルスベクターに挿入し、当該ウイルスベクターを細胞と接触させることによって、１つ以上の細胞に好ましくトランスフェクトされる。ウイルスベクターを使用する場合には、上記ウイルスベクターとしては、当該分野において公知の種々のウイルスベクターのいずれか（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターが挙げられる）が挙げられ得る。
【００７４】
すでに上述したように、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。同様に、本発明のトランスポゾンをコードする本発明の核酸、または本発明のトランスポゾンのいずれかは、単離されたか、またはベクターに挿入された直鎖状または環状の断片（好ましくはプラスミドまたは組換えウイルスＤＮＡ）として、細胞にトランスフェクションされ得る。
【００７５】
さらにこのようにして、本発明のポリペプチド／タンパク質をコードする本発明の核酸、または本発明のトランスポゾンは、細胞内において本発明のポリペプチドの一過性発現または持続発現を容易にするために、宿主細胞のゲノムに安定的または一過的に好ましく挿入される。
【００７６】
本発明は、さらに、本発明の遺伝子導入システムを動物に適用するステップを含んでいる、遺伝子導入動物の効率的な製造方法を提供する。
【００７７】
本発明の他の実施形態は、上記に開示されている当該方法によって（好ましくは本発明の遺伝子導入システムを使用することによって）、製造された遺伝子導入動物に関する。
本発明の遺伝子導入動物は、本発明の遺伝子導入システムによって動物のゲノムに挿入され、これによって遺伝子導入動物が遺伝子産物（例えばタンパク質）を生成可能になる、核酸配列を好ましく含んでいる。本発明の遺伝子導入動物において、このタンパク質は、好ましくは、細胞から単離することを目的とした生成物である。したがって、１つの代替法において、本発明の遺伝子導入動物はバイオリアクターとして使用され得る。本発明のタンパク質は大量の乳、尿、血液または卵において生成され得る。乳、尿、血液または卵における発現を促進するプロモータが使用され得、これらのプロモータとしては、これらに限定されないが、カゼインプロモータ、マウスの尿タンパク質プロモータ、［β］−グロビンプロモータ、オボアルブミンプロモータがそれぞれ挙げられる。組換え成長ホルモン、組換えインスリンおよび種々の他の組換えタンパク質が、細胞においてタンパク質を生成する他の方法を使用して生成されている。これらのタンパク質または他のタンパク質をコードする核酸は、本発明のトランスポゾンに挿入され得、細胞にトランスフェクトされ得る。上述のように定義付けられる本発明のトランスポゾンの細胞のＤＮＡに対する効率的なトランスフェクションが、本発明のポリペプチドが存在している場合に生じる。上記細胞が組織の一部、または遺伝子導入動物の一部である場合に、大量の組換えタンパク質が取得され得る。
【００７８】
本発明の遺伝子導入動物は、脊椎動物および無脊椎動物、例えば魚類、鳥類、哺乳類（これらに限定されないが、ラットもしくはマウスなどの齧歯類、ウシもしくはヤギなどの有蹄類、ヒツジ、ブタまたはヒトが挙げられる）から選択され得る。
【００７９】
本発明は、本発明の遺伝子導入システムを使用することによって、処置を必要とする患者を処置する方法をさらに提供する。ここで、当該方法は、インビボまたはエキソビボの遺伝子治療であり、所望の核酸が使用される。
【００８０】
したがって、本発明は、上述のように定義付けられる細胞に本発明の遺伝子導入システムを導入するステップを含んでいる遺伝子治療のための方法を提供する。したがって、上述のように定義付けられる本発明のトランスポゾンは、細胞または生体に対する遺伝子治療を提供するための遺伝子を好ましく含んでいる。上記遺伝子は、組織特異的プロモータ、偏在プロモータ、または当該遺伝子を必要とする細胞における遺伝子の発現のための１つ以上の他の発現制御領域の制御下に配置されている。あって、その遺伝子を必要とする細胞内で遺伝子が発現する。種々の遺伝子が種々の遺伝子治療のために試験されている。当該遺伝子としては、これらに限定されないが、例を挙げると、嚢胞性線維症に対するＣＦＴＲ遺伝子、免疫系障害に対するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、血液細胞疾患に対する血液凝固に関連する因子（例えば、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、インターロイキン−２（ＩＬ−２））、肺疾患に対するα−１−抗トリプシン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。これらのヒトまたは動物の特異的な遺伝子配列、ならびに種々のヒトまたは動物の特異的な遺伝子配列（マーカータンパク質および組換えタンパク質をコードする遺伝子配列が挙げられる）が、ＧｅｎＢａｎｋなどの公知の遺伝子データベースにおいて利用可能である。
【００８１】
特に遺伝子治療のためだけではなく、他の本発明の目的のために、本発明の遺伝子導入システムは、種々の方法（例えば、マイクロインジェクション、脂質媒介法、ウイルス媒介法）によって細胞にトランスフェクトされ得る。例えば、マイクロインジェクションが使用される場合、本発明のトランスポゾンの介在配列のサイズに関する制限がほとんどない。同様に脂質媒介法はサイズに関して実質的に制限がない。しかし、本発明によれば、遺伝子導入システムを細胞に導入する他の方法（例えば、ウイルスウイルス媒介法）において、反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間に位置する核酸配列の長さが制限され得る。
【００８２】
これに関連して、上述のように定義付けられる本発明の遺伝子導入システムは、ウイルスを介して細胞に送達され得る。上記ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスなど）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスなどが挙げられる。端末反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）に隣接した所望の導入遺伝子、および本発明のポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）をコードする遺伝子を含んでいる本発明のトランスポゾン部分とっての、送達機構の見込みのある組合せがいくつかある。例えば、本発明のトランスポゾンおよび本発明のポリペプチド（もしくはトランスポザーゼ遺伝子）の両者がともに、同じ組換えウイルスゲノム上に含まれ得る。一回の感染によって、本発明の遺伝子導入システムの両方の部分が送達され、それから、トランスポザーゼの発現によって組換えウイルスゲノムからのトランスポゾンの開裂が導かれ、続いて細胞の染色体に挿入される。他の例において、本発明のポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）および本発明のトランスポゾンは、ウイルス系および／または脂質含有試薬などの非ウイルス系の組合せによって個々に送達され得る。これらの場合、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ遺伝子のいずれかは、組換えウイルスによって送達され得る。いずれの場合においても、発現したトランスポザーゼ遺伝子は、染色体ＤＮＡに対する挿入のために、担体ＤＮＡ（ウイルスゲノム）からのトランスポゾンの遊離を導く。
【００８３】
本発明の特定の実施形態において、本発明のトランスポゾンは、挿入変異誘発に使用され得、好ましくは、続いて変異遺伝子の特定が行われる。ＤＮＡトランスポゾン、特に本発明のトランスポゾンは、例えばウイルス法およびレトロウイルス法に関する従来技術の手法と比較して種々の利点を有する。例えば、プロウイルスの挿入とは異なり、トランスポゾンの挿入は、トランスポザーゼ活性をトランスに供給することによって再転移され得る。したがって、本発明によれば、時間を要するマイクロインジェクションを実施する代わりに、上記トランスポゾンシステムの上述した２つの構成要素（本発明のトランスポゾンおよび本発明のポリペプチド）を遺伝導入する株を交配させることによって、新しい遺伝子座においてトランスポゾン挿入を起こすことが可能である。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子導入システムは、生殖細胞を変異誘発させるための、本発明の遺伝子導入システムは実験動物の生殖細胞株を対象とする。代替可能に、トランスポザーゼ発現が、種々の特異的プロモータを使用することによって、特定の組織または器官に対して対象化され得る。さらに、変異誘発性トランスポゾンのその挿入部位からの再転位を使用することによって、復帰体が単離され得、トランスポゾン切取りが隣接するＤＮＡの欠失と関連している場合に、本発明の遺伝子導入システムは、欠失変異の生成に使用され得る。さらに、トランスポゾンがＤＮＡから構成され、単一のプラスミドに維持され得るので、本発明のトランスポゾン、および特に本発明の遺伝子導入システムの使用は、感染性の高いレトロウイルスよりもはるかに安全であり、操作が容易である。トランスポザーゼ活性は、所望の実験的段階において、上述において定義付けられるようにＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の形態において供給され得る。
【００８４】
本発明の遺伝子導入システムを挿入変異誘発スクリーニングに使用する場合には、本発明のトランスポゾンは、好ましくは、変異遺伝子を迅速に同定するために４種類の主なコンストラクト（すなわち、以下で定義付けるエンハンサトラップ、プロモータトラップ、ｐｏｌｙＡトラップ、および遺伝子トラップ（あるいはエキソントラップ））を好ましく含んでいる。これらの本発明のトランスポゾンは、組込みの遺伝子暗号に依存して発現されるべきであるレポータ遺伝子を好ましく含んでいる。
【００８５】
エンハンサトラップにおいて、レポータの発現には、通常、組み込んだコンストラクトにおける減弱プロモータに作用するための、ゲノムのシス制御因子の存在が要求される。
【００８６】
プロモータトラップは、典型的にまったくプロモータを含んでいない。ベクターを確実に発現させるために、ベクターは、エキソン、または発現遺伝子のプロモータのすぐ下流においてイン−フレームであることが好ましい。
【００８７】
ｐｏｌｙＡトラップにおいて、上記マーカー遺伝子は、ｐｏｌｙＡシグナルを欠損しているが、スプライシング供与体（ＳＤ）部位を含んでいることが好ましい。したがって、イントロンに組み込んでいる場合に、トラップされた遺伝子のマーカーおよび下流のエキソンを含んでいる融合転写物が合成され得る。
【００８８】
遺伝子トラップ（あるいはエキソントラップ）は、典型的にプロモータを欠損しているが、マーカー遺伝子の上位にスプライシング受容体（ＳＡ）を含んでいる。上記ベクターが発現遺伝子に組み込まれ、レポータの活性化が生じ、レポータと上流のエキソンとの間においてスプライシングが発生すると、レポータの活性化が生じる。
【００８９】
最後に、遺伝子トラップカセットおよびｐｏｌｙＡトラップカセットは、組み合わせられ得る。この場合、ｐｏｌｙＡトラップ部のマーカーは、ベクターは下流のエキソンをトラップでき、また、トラップされた遺伝子の上流および下流の融合転写物の両方が取得され得るようなプロモータを有する。また、これらのコンストラクトは、ＬａｃＺまたは蛍光タンパク質をマーカー遺伝子として使用することによって、変異遺伝子の空間的および時間的な発現パターンを視覚化する可能性を提供する。
【００９０】
本発明の方法の特定の形態において、本発明は、本発明の遺伝子導入システムを利用してゲノム配列に“タグ”を導入することによって、遺伝子をタギングするの効率的なシステムをさらに提供する。上述した本発明のトランスポゾン（例えば、エンハンサトラップ、プロモータトラップ、ｐｏｌｙＡトラップ、遺伝子トラップ（あるいはエキソントラップ））のうちのいずれもが、使用され得る。
【００９１】
本発明のトランスポゾンは、ゲノム内およびゲノム間において染色体の１つの位置から他の位置に転移するそれらの本来の能力によって、種々の生体における遺伝子操作にとっての遺伝子ベクターとして好適である。一般に、トランスポゾンのタギングは、トランスポゾンが転移して遺伝子に“跳躍”し、したがって挿入変異誘発によって遺伝子を不活性化させる技術である。これらの方法は、例えばＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＩＧ  １９９７  １３，３７０〜３７４において議論されている。本発明のプロセスにおいて、不活性化された遺伝子は、トランスポゾンによって“タグ”付加され、それから変異対立遺伝子を修復するために使用され得る。ヒトゲノムプロジェクトまたは他のゲノムプロジェクトの遺伝子配列を取得する能力は、生物学的機能を新しい遺伝子に割り当てる科学者の能力を超えている。したがって、本発明は、細胞ゲノムにタグを導入する効率的な方法を提供する。上記タグが、特定の表現型に関連するタンパク質の発現を崩壊させるような、細胞における位置に挿入されると、本発明の核酸を含んでいる細胞における改変された表現型の発現によって、本発明のトランスポゾンによって破壊されている特定の遺伝子との特定の表現形の関連が認められる。上述のように定義付けられる本発明のトランスポゾンはタグとして好ましく機能する。本発明トランスポゾンに隣接するゲノムＤＮＡを配列決定するために設計されたプライマーは、破壊された遺伝子の配列情報を得るために使用され得る。
【００９２】
また、さらなる他の実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子導入システムを使用して上述のように定義付けられる本発明のトランスポゾンを遺伝子に導入することによって、遺伝子を発見する（例えばゲノムマッピング）ための効率的なシステムを提供する。１つの例において、所望のタンパク質をコードする本発明のトランスポゾンは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードする核酸、または本発明のポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる本発明のトランスポゾンと組み合わせて、細胞にトランスフェクトされる。所望のタンパク質をコードする上記トランスポゾンは、少なくとも２つの反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間に位置する核酸配列を好ましく含んでおり、ここで、上記反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）が、本発明のポリペプチドに結合し、上記トランスポゾンが、本発明のポリペプチドの存在下において細胞のＤＮＡに挿入される。好ましい実施形態において、上記核酸配列は、例えばＧＦＰといったマーカータンパク質、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位（好ましくは６塩基認識配列）を含んでいる。挿入に続いて、上記細胞ＤＮＡは単離され、制限エンドヌクレアーゼを用いて消化される。６塩基認識配列を採用しており、制限エンドヌクレアーゼが使用される場合に、細胞ＤＮＡは平均して約４０００ｂｐの断片に切断される。これらの断片がクローニングされ得るか、またはリンカーが消化断片の末端に付加され得ることによって、ＰＣＲプライマーに対する相補的配列が提供される。リンカーを付加した場合、リンカーに由来するリンカー、およびトランスポゾンにおける上記反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の直列反復配列に結合するプライマーを用いて断片を増幅するために、ＰＣＲ反応が使用される。それから、増幅された断片は、配列決定され、上記直列反復配列に隣接するＤＮＡを使用して、ＧｅｎＢａｎｋなどのコンピュータデータベースにおいて検索する。
【００９３】
上記に開示されるような方法（例えば、遺伝子の発見および／または遺伝子のタギング）に本発明の遺伝子導入システムを使用することによって、以下のことが可能になる：
（１）挿入変異原としてのトランスポゾンの使用を介した、成長および発生に関与する遺伝子の同定、単離および性質決定（例えば、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ”Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”  Ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  ６９〜１００を参照）．
（２）成長および発生を制御する転写制御配列の同定、単離および性質決定．
（３）マーカーコンストラクトを使用した定量的な形質部位（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ）（ＱＴＬ）分析．
（４）経済的に重要な形質の遺伝子座、ならびに成長および発達（すなわち耐病性）に関する遺伝子座（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｍｏｌ．  Ｍａｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ５，  １０５〜１１３）の同定。１つの例において、本発明のシステムを使用して生殖不能の遺伝子導入魚を生成することができる。不活性化遺伝子を有する親魚の交配によって、生物的封じ込めまたは養殖培養魚の成長速度の最大化を目的とした生殖不能な子孫を発生し得る。
【００９４】
また、本発明の遺伝子導入システムは、組換え配列のライブラリを用いた研究、または組換え配列のライブラリのスクリーニングに用いる方法の一部として使用されて、例えば、上記配列の機能の評価、タンパク質発現に関するスクリーニング、または特定の種類の細胞に対する特定のタンパク質の影響もしくは特定の種類の細胞に対する特定の発現制御領域の影響の評価が行われ得る。この例において、組換え配列のライブラリ（例えば、組合せライブラリまたは遺伝子シャッフリングの生成物）が、所望のタンパク質をコードする本発明のトランスポゾンに挿入されて、定常の反復配列（ＩＲおよび／またはＲＳＤ）の間に配置されている種々の核酸配列を有するトランスポゾンのライブラリを生成し得る。組合せライブラリまたは遺伝子シャッフリングの生成物は、いずれも当該分野において公知の技術であり、本発明の中心をなすものではない。それたか、上記ライブラリは、上述のように、本発明のポリペプチドともに細胞にトランスフェクトされる。
【００９５】
本発明の他の実施形態において、本発明は細胞において核酸配列を転移させる方法を提供する。この方法によれば、本発明のトランスポゾンは上記に開示されているように細胞のＤＮＡに挿入される。また、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードする核酸、または本発明のポリペプチドをコードしている核酸を含んでいるトランスポゾンのそれぞれは、細胞にトランスフェクトされ、上記タンパク質は、細胞のＤＮＡ内の第１の位置から同細胞のＤＮＡ内の第２の位置に上記トランスポゾンを転移可能にする（すなわち転移させる）。上記細胞のＤＮＡは、好ましくはゲノムＤＮまたは染色体外ＤＮＡである。本発明の方法によって、ゲノム内の１つの位置から同ゲノム内の他の位置に転移させ得るか、または例えば、細胞内のプラスミドから当該細胞内のゲノムに転移させ得る。
【００９６】
また、本発明の遺伝子導入システムは、ＲＮＡ干渉技術に関する方法の一部としても使用され得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞のｍＲＮＡ断片または（複数の）遺伝子の断片に対して相補的な外因性の二本鎖ＲＮＡｓ（ｄｓＲＮＡ）が、この細胞に導入されて、特定のｍＲＮＡおよび／または遺伝子に特異的に結合して、これによって遺伝子発現を減少させるか、または消滅させる技術である。この技術は、ショウジョウバエ、線虫、植物、および最近では哺乳類細胞培養において有効であることが証明されている。本発明と関連してこの技術を適応するために、本発明のトランスポゾンは、好ましくは、上記細胞のｍＲＮＡ断片および／または（複数の）遺伝子の断片に対して相補的な短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードする短鎖ヘアピン発現カセットを含んでいる。これらのｓｉＲＮＡは、好ましくは長さが２０から３０の核酸、さらに好ましくは長さが２０から２５の核酸、最も好ましくは長さが２１から２３の核酸である。ｓｉＲＮＡは、上述のように定義付けられる任意のタンパク質をコードする任意のｍＲＮＡおよび／または遺伝子（例えばがん遺伝子）を標的にし得る。この本発明の使用（特にｓｉＲＮＡベクターを宿主ゲノムに組み込むための本発明のトランスポゾンの使用）は、インビトロまたはインビボにおけるｓｉＲＮＡ持続的な発現を提供し、これによって特定の遺伝子産物に対する持続的なサイレンシングを可能にする。
【００９７】
本発明はさらに
・本発明のポリペプチドそのもの、または本発明の核酸によってコードされた本発明のポリペプチド、および／または
・本発明のトランスポゾン、および／または
・タンパク質としての本発明のポリペプチド、また本発明のポリペプチドをコードしている本発明の核酸を、本発明のトランスポゾンと組み合わせて含んでいる上述のように定義付けられる本発明の遺伝子導入システム
のいずれかを含んでいる薬学的組成物に関する。
【００９８】
上記薬学的組成物は、必要に応じて、薬学的に受容可能な担体、補助剤または基剤とともに、提供され得る。これに関連して、本発明の薬学的に受容可能な担体、補助剤または基剤ともに調合されている構成要素の薬理活性を破壊しない無毒な担体、補助剤または基剤を指す。本発明の組成物において使用され得る薬学的に受容可能な担体、補助剤または基剤としては、これらに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性の飽和脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、プロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、蜜蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。
【００９９】
本発明の薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、頬側に、経膣的にまたは埋植型リザーバーによって投与され得る。
【０１００】
本明細書において使用されるときに非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、骨膜内、胸骨内、腱鞘内、肝臓内、病変箇所内、頭蓋内に注射または注入する技術を含む。上記薬学的組成物は経口的、腹膜内的または静脈的に好ましく投与される。本発明の薬学的組成物の無菌注射の形態は水性または油性の懸濁剤であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いた、当該分野において公知の技術にしたがって調合され得る。無菌注射製剤は、無毒の非経口的に投与可能な希釈剤または溶液剤における無菌の注射溶液剤または注射懸濁剤（例えば、１、３−ブタンジオールの溶液剤）であり得る。採用され得る受容可能な基剤および溶媒としては、水、リンガー溶液および等張性の塩化ナトリウム溶液などが挙げられる。さらに、無菌の不揮発性油が従来から溶媒または懸濁培地として用いられている。
【０１０１】
この用途のために、任意の無刺激性不揮発性油（合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドが挙げられる）が使用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に受容可能な油（特にポリオキシエチル化したもの）と同様に、注射剤の調製に有用であり得る。また、これらの油状の溶液剤または懸濁液は、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、または薬学的に受容可能な投与形態の製剤（乳剤および懸濁剤が挙げられる）に一般的に使用される類似の分散剤）を含み得る。一般に使用される他の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓおよび他の乳化剤）、または薬学的に受容可能な固形物、液体もしくは他の投与形式の製造に広く使用される薬学的に受容可能な生物学的に利用可能な賦活剤が調合の目的に使用され得る。
【０１０２】
本発明の薬学的に受容可能な組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液などの経口投与受容可能な任意の投与形態において経口的に投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体としてはラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。また、マグネシウムステアレートなどの潤滑薬剤が典型的に加えられる。カプセル形態における経口投与の場合、活性な希釈剤としてはラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口使用のために必要な場合、活性成分は乳化剤および懸濁剤と組み合わせられる。また、必要であれば、甘味料、人工香味料または着色料が加えられ得る。
【０１０３】
代替可能に、本発明の薬学的に受容可能な組成物は座剤の形態において直腸投与され得る。これらの座剤は、室温において固体であるが、直腸温において液体であり、したがって直腸に融解して薬物を放出する、好適な無刺激性賦形剤と、本発明の遺伝子導入システムまたはその構成要素を混合することによって調製され得る。このような物質としては、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールなどが挙げられる。
【０１０４】
また、本発明の薬学的に受容可能な組成物は、特に処置標的（例えば眼、皮膚または腸管下部の疾患などの領域または器官）が局所塗布によって容易に接触し易い領域または組織を含んでいる場合には、局所的に投与され得る。領域または器官のそれぞれに対して、好適な局所製剤が容易に調製され得る。
【０１０５】
腸管下部への局所塗布は、直腸座剤製剤（上述を参照のこと）または好適な浣腸製剤においてなされ得る。また、局所経皮パッチが使用され得る。
【０１０６】
局所塗布に関して、薬学的に受容可能な組成物は、１つ以上の担体に懸濁または溶解されている本発明の遺伝子導入システムまたはその構成要素を含んでいる好適な軟膏に調合され得る。本発明の構成要素の局所投与に用いる担体としては、これらに限定されないが、鉱物油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン成分、乳化ワックスおよび水が挙げられる。代替可能に、上記薬学的に受容可能な組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能な担体中に懸濁または溶解されている上記活性成分を含んでいる好適なローション剤またはクリーム剤に調合され得る。好適な担体としては、これらに限定されないが、鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられる。
【０１０７】
眼に使用する場合、上記薬学的に受容可能な組成物は、防腐剤（例えば塩化ベンジルアルコニウム）を有するか、または有しない、等張性のｐＨ調節無菌生理食塩水における微粉化した懸濁液、または好ましくは等張性のｐＨ調節無菌生理食塩水の溶液剤として調合され得る。代替可能に、眼に使用する場合、上記薬学的に受容可能な組成物は、ワセリンなどの軟膏に調合され得る。
【０１０８】
本発明の薬学的に受容可能な組成物は、経鼻エアロゾルまたは経鼻吸入によって投与され得る。当該組成物は、薬学製剤分野において公知の技術において調製され、ベンジルアルコールもしくは好適な他の防腐剤、生物学的な利用効率を向上させるための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水の溶液剤として調合され得る。
【０１０９】
単回投与形態の組成物を生成するために担体物質と組み合わせられ得る、本発明の構成要素の量は、処理される宿主、つまり特定の投与の態様に依存して変わる。なお、個々の任意の患者に対する具体的な投与計画および処置法は、種々の要因（例えば、採用した特定の構成要素の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事内容、投与時刻、排出の頻度、薬物の組合せ、ならびに処置している医師の判断および処置される特定の疾患の重篤度）に依存する。また、組成物における本発明の構成要素の量は、組成物における特定の（複数の）構成要素に依存する。
【０１１０】
好ましくは、本発明の薬学的組成物は、疾患（遺伝子の欠損、免疫不全およびがんによって引き起こされる特定の疾患）の処置に適している。遺伝子の欠損によって引き起こされる疾患は、例えば、嚢胞性線維症、高コレステロール血症、血友病（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型またはＸＩＩＩ型）である。免疫不全によって引き起こされる疾患は、例えば、ＨＩＶ、ハンチントン舞踏病、α−抗トリプシン欠乏症である。がんは、結腸がん、黒色腫、腎臓がん、リンパ腫、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、胃腸腫瘍、肺がん、神経膠腫、甲状腺がん、乳がん、前立腺腫瘍、肝臓がん、種々のウイルス性腫瘍（例えば、パピローマウイルス誘導性がん（頚部がんなど）、腺がん、ヘルペスウイルス誘導性腫瘍（バーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘導性Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎誘導性腫瘍（肝細胞がん）、ＨＴＬＶ−１誘導性リンパ腫およびＨＴＬＶ−２誘導性リンパ腫）、内耳神経腫、肺がん、咽頭がん、肛門がん、グリア芽細胞腫、リンパ腫、直腸がん、星状細胞腫、脳腫瘍、胃がん、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、脳がん転移、髄芽細胞腫、膣がん、膵臓がん、精巣がん、黒色腫、膀胱がん、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病、気管支がん、下垂体がん、菌状息肉腫、食道がん、乳がん、神経鞘腫、棘細胞がん、バーキットリンパ腫、喉頭がん、胸腺腫、子宮体がん、骨がん、非ホジキンリンパ腫、尿道がん、ＣＵＰ症候群、乏突起膠腫、外陰がん、腸がん、食道がん、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣がん、卵巣がん、肝臓がん、白血病、皮膚がんまたは眼のがんなどから選択される。
【０１１１】
最後に本発明は、
・本発明のポリペプチドそのもの、または本発明の核酸によってコードされた本発明のポリペプチド、および／または
・本発明のトランスポゾン、および／または
・請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子導入システムを、使用説明書とともに備えており、
必要に応じて、薬学的に受容可能な担体、補助剤または基剤を備えているキットに関する。
【０１１２】
本発明のキットの構成要素のいずれもが、順次にまたは平行して細胞に投与され得るか、および／またはトランスフェクトされ得る。例えば、本発明のポリペプチド／タンパク質、または当該ポリペプチド／タンパク質をコードする核酸は、本発明のトランスポゾンの投与および／またはトランスフェクションの前に、投与および／またはトランスフェクションと同時に、または投与および／またはトランスフェクションに続いて、上述のように定義付けられるような細胞に投与および／またはトランスフェクトされ得る。代替可能に、本発明のトランスポゾンは、本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸のトランスフェクションの前に、トランスフェクションと同時に、またはトランスフェクションに続いて、上述のように定義付けられるような細胞にトランスフェクトされ得る。平行してトランスフェクトする場合、好ましくは、トランスフェクション前の転移を回避するために、２つの構成要素は、投与の前に別々の製剤において供給されるか、および／または互いに直接に混合される。また、本発明のキットの少なくとも１つの構成要素の投与および／またはトランスフェクションは、時間差様式において（例えば、この構成要素の複数回の分量を投与することによって）行われ得る。
【０１１３】
本明細書において引用した参考文献、特許および文献のすべては、参照によって本開示事項に明確に援用される。本発明の特定の実施形態は、詳細に説明される。言及した事項は、本発明の範囲内において可能な変更がなされる。意図される発明を首尾よく実施することを同様に可能にする、当業者に利用可能な種々の代替の技術および手法がある。
【０１１４】
〔図面の簡単な説明〕
（図１）
トランスポザーゼ源をトランスポゾンから切り出すことによって生成された二成分の転移システムである、クラスＩＩのカット＆ペースト型の転移因子（ＴＥ）の模式図。ＩＴＲは逆方向末端反復配列の略である。ＴＥは、“カット＆ペースト”機構によって宿主ゲノムにおいて転移している。転移ＤＮＡ因子は、１つだけ組み込まれており、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するそれらの単一のゲノムにおいてトランスポザーゼタンパク質をコードしている。ＩＴＲは、転移に必要なトランスポザーゼ結合部位を有している。ＩＴＲの活性は、ＩＴＲを有する転移性ＤＮＡからトランスポザーゼ源を分離することによって容易に制御され得、これによって非自律性のＴＥを形成している。このような２つの構成要素からなるシステムにおいて、トランスポゾンは、トランスポザーゼタンパク質をトランス補充することによってのみ転移し得る。実際に、実験的な必要性に応じて、所望される任意の配列が、上記ＩＴＲ因子の間に配置され得る。転移によって、上記因子のベクターＤＮＡから切取り、およびこれに続く新しい配列環境に対する１コピーの組込にが生じる。
【０１１５】
（図２）
ＳＢとの類似性とは無関係にＴｃ１ファミリー全体にしたがった、Ｔｃ１トランスポザーゼ配列のタンパク質アラインメントの一部。（Ａ）例として選択された１つの機能亢進性のアミノ酸置換を有する配列の一部。（Ｂ）当該アラインメントの類似性の樹形図。
【０１１６】
（図３）
ＳＢにより関連性のあるＴｃ１トランスポザーゼ配列のタンパク質アラインメントの一部。（Ａ）例として選択された１つの機能亢進性のアミノ酸置換を有するアラインメントの一部。（Ｂ）当該アラインメントの類似性の樹形図。
【０１１７】
（図４）
シャッフリングのための基礎をなす機能亢進性変異、および野生型配列の含有量を減少させるための特定の制限消化に関するそれらの変異のグループ化。
【０１１８】
（図５）
ＤＮａｓｅＩ処理した単離断片の集団（レーン１とレーン２）を１２％のポリアクリルアミドゲルに流した。Ｍはマーカー。
【０１１９】
（図６）
（Ａ）ＰＣＲリアセンブリ反応（レーン１）；Ｍはマーカー。（Ｂ）希釈したＰＣＲリアセンブリ反応のテンプレートに対してＣＤＳの全長をクローニングする、ＰＣＲの最終ステップ。レーン１には、フォワードおよびリバースのクローニングプライマーが加えられている。レーン２には、フォワードのクローニングプライマーが加えられている。レーン３には、リバースのクローニングプライマーが加えられている。Ｍはマーカー。
【０１２０】
（図７）
選択されていないのライブラリ１におけるクローン集団の分布。
【０１２１】
（図８）
（Ａ）シャッフリングライブラリから単離した最も機能亢進性の高い７クローンに加わっている変異。（Ｂ）ライブラリから選択された機能亢進性クローンの特定の統計的特徴。
【０１２２】
（図９）
シャッフリングライブラリから回収した機能亢進性クローンを手作業によって改良する計画の一覧。
【０１２３】
（図１０）
図１０は、ＳＢ１０のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【０１２４】
（図１１）
例えば図１４〜図２６に示されている実験に使用されるベクターの構成。
【０１２５】
（図１２）
非機能亢進性トランスポザーゼの概略。ＳＢ１０は野性型のトランスポザーゼであり、ＳＢ１１およびＳＢ  ＤＮＧＰは、図示されるようなＳＢ１０に対する変異を有する、他の非機能亢進性トランスポザーゼまたは不活性トランスポザーゼである。ここでは、これらは比較を目的として使用される。ＳＢ１０は、Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  Ｃｅｌｌ  ９１：  ５０１〜５１０（Ｆｉｇ．１０）において最初に公開された。一方でＳＢ１１は、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３），  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：  １０８〜１１７によって最初に公開された。ＳＢ１１は、Ｔ１３６Ｒ、Ｍ２４３Ｑ、ＶＶＡ２５３ＨＶＲの変異を含んでいる。
【０１２６】
（図１３）
機能亢進性突然バリアントトランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａ（Ｋ１３Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｔ８３Ａ、およびＲ２１４Ｄ／Ｋ２１５Ａ／Ｅ２１６Ｖ／Ｎ２１７Ｑの変異をＳＢ１０に対して含んでいるバリアント３０、表２）、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ（バリアント１９、表２）、ＳＢ／６Ａ５（バリアント３、表２）、ＳＢ１００ｘ（バリアント２７、表２）の概略。これらのすべてはＳＢ１０に由来している。好ましいバリアントは、ＳＢ１０の配列に由来するバリアントであり、変異は上記の通りである。
【０１２７】
（図１４）
非機能亢進トランスポザーゼＳＢ１０およびＳＢ１１に対する、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａおよびＳＢ６／Ａ５の、赤血球系統における比較分析。
【０１２８】
（図１５）
機能亢進性トランスポザーゼＭ３ａ、ＳＢ６／Ａ５およびＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒの、赤血球系統における比較分析。
【０１２９】
（図１６）
機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５およびＳＢ１００Ｘの、赤血球系統における比較分析。
【０１３０】
（図１７）
機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５およびＳＢ１００Ｘの、巨核球系統における比較分析。
【０１３１】
（図１８）
機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５およびＳＢ１００Ｘの、顆粒球／マクロファージ／単球系統における比較分析。
【０１３２】
（図１９）
機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５に対するトランスポザーゼＳＢ１００Ｘの相対的遺伝子転移効率。
【０１３３】
（図２０）
野生型のトランスポザーゼＳＢ１０および変異型の非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１１に対する、変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａ、ＳＢ６／Ａ５、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ、およびＳＢ１００Ｘの相対的遺伝子転移活性。
【０１３４】
（図２１）
変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａを使用した、ヒト筋肉前駆体／幹細胞における安定的遺伝子転移効率。
【０１３５】
（図２２）
野生型トランスポザーゼＳＢ１０または変異型の非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１１に対する、変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａまたはＳＢ６／Ａ５を使用した、ヒト筋肉前駆体／幹細胞における遺伝子転移の比較分析。
【０１３６】
（図２３）
非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１１に対する機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１００ｘ、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ、ＳＢ  Ｍ３ａの、筋肉前駆細胞における比較分析。
【０１３７】
（図２４）
変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａを使用した安定なトランスフェクション後の、ヒト筋肉前駆細胞における因子ＩＸの発現レベル。
【０１３８】
（図２５）
変異型の非機能亢進性ＳＢ１１トランスポザーゼまたは不活性コントロールと比較した、変異を有する機能亢進性ＳＢ１００Ｘトランスポザーゼを使用したトランスフェクション後の、マウスの肝臓における因子ＩＸのインビボ発現レベル。
【０１３９】
（図２６）
変異型の機能亢進性ＳＢ１００Ｘトランスポザーゼを使用したトランスフェクション後の、マウスの肝臓における因子ＩＸのインビボ発現レベル。部分的に肝切除した後に安定的に発現していることを示している。
【０１４０】
〔実施例〕
（実験方法の説明）
（Ｉ）シャッフリング用のＳＢトランスポザーゼのコード配列（ＣＤＳ）内における機能亢進性変異の回収
（ａ）ＳＢ  ＣＤＳの全体にわたる変異誘発
（ｂ）活性試験系を使用した機能亢進体の選択
（ＩＩ）ＤＮＡシャッフリングによって選択された変異体のインビトロにおける組換え
（ａ）１００〜３００ｂｐ断片上における点変異の単離
（ｂ）ＤＮａｓｅＩによって３０〜７０ｂｐの断片に切断
（ｃ）ライブラリのＰＣＲシャッフリングおよびクローニング
（ｄ）ライブラリの配列決定
（ＩＩＩ）高い転移活性を示すクローンの検索
（ａ）シャッフリングクローンの大規模精製
（ｂ）ＨｅＬａ細胞において転移活性に関してライブラリクローンの試験
（ｃ）選択された機能亢進性クローンの配列決定データに基づいた、見込みのある新しい組合せの手作業による生成。
【０１４１】
ここに記載されるトランスポザーゼとしての活性に関する試験のすべてにおいて、ＳＢ１０（Ｉｖｉｃｓ，  Ｚ．，  Ｈａｃｋｅｔｔ，  Ｐ．Ｂ．，  Ｐｌａｓｔｅｒｋ，  Ｒ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｉｚｓｖａｋ，  Ｚｓ．  （１９９７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  スリーピングビューティー，  ａ  Ｔｃ１−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ，  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）を比較対象として使用した。
【０１４２】
（Ｉａ）ＳＢコード配列全体にわたる変異誘発
トランスポゾンのＴｃ１ファミリーは、最大のトランスポゾンファミリーであり、これは、比較に利用可能な関連する配列が多く存在することを意味している。第１のステップとして、単一のアミノ酸置換のいくつかが設計された。ＳＢのＣＤＳ（コード配列）において変化する見込みのある位置を見出すために、関連するトランスポザーゼ配列の範囲が整列化された。公知の活性配列から新しいアミノ酸を得ることに重点が置かれていたが、それらの活性について情報がない発生源およびいくつかの公知の不活性配列がまた使用された。よって、他の公知の関連するＴｃ１トランスポゾン（図２）の上記トランスポザーゼＣＤＳは、そのほとんどが活性トランスポザーゼをコードしており、ＳＢ１０を用いて整列化された。その後、上記ＳＢトランスポザーゼ配列と非常に関連性の高い他のＴｃ１トランスポザーゼＣＤＳ（図２Ｂと図３Ｂを比較）を用いて第２の整列化を行った。図１Ａと図２Ａは、第１および第２の整列化のそれぞれを用いたアミノ酸置換のいくつかの設計例を示している。
【０１４３】
（Ｉｂ）活性試験系を使用した機能亢進体の選択
作製された変異体のすべての転移活性が、古典的な二元転移アッセイ（Ｉｖｉｃｓ，  １９９７、上記を参照のこと）を用いて試験された。この試験は、ここで使用したトランスポザーゼ活性の標準的な試験であった。２つの上記構成要素を含むシステムの模式図が図１に示されている。簡単に説明すると、ＨｅＬａ細胞が、ＳＢ逆方向反復配列（ｐＴＮｅｏ）の間にネオマイシン抵抗遺伝子（Ｎｅｏ（登録商標））を有するトランスポゾンベクター、およびポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）発現プラスミドベクターを用いてコトランスフェクトされた。ここで、変異型のＳＢトランスポザーゼの発現は、ＣＭＶプロモータによって促進された。トランスフェクションに続いて、トランスフェクションを受けたＨｅＬａ細胞は、ＨｅＬａ細胞ゲノムにＮｅｏ（登録商標）トランスポゾンが組み込ませるためにＧ４１８を投与して、２週間にわたって選択された。最後に、Ｇ４１８耐性のコロニーが染色され、カウントされた。ＳＢ１０トランスポザーゼのＣＤＳは、活性の閾値のレベルを調整する対照として使用され、上記ＳＢトランスポザーゼの不活性型は、陰性対照として使用された。上記試験は、１２穴の組織培養プレート形態において２組として実施された。
【０１４４】
上記アッセイにおいてＳＢ１０と比較して少なくとも２００％の活性亢進を生じる、本発明に係るポリペプチド（トランスポザーゼバリアント）のすべて（いずれも単一の変異）が、以下のシャッフリング実験にさらに使用するために選択された。これらのバリアントの活性亢進は、典型的に、ＳＢ１０と比較して２００〜４００％の間であった。
【０１４５】
（ＩＩａ）１００〜３００ｂｐの断片における点変異の単離
ＰＣＲシャッフリング法は、関連する親断片の混合に好適な方法である（ＰＣＲシャッフリング法は、Ｓｔｅｍｍｅｒ  Ｗ．Ｐ．Ｃ．によって１９９４年に最初に公開された（Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｗ．Ｐ．Ｃ．  （１９９４）  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９１：１０７４７〜１０７５１））。トランスポザーゼＣＤＳのより小さ部分における機能亢進性変異のすべてが単離された。単離した断片は、高い組換え率を容易に得るために、ＤＮａｓｅＩによって３０〜７０ｂｐの断片集団に切断された。
【０１４６】
４１種の単一の機能亢進性変異が回収され、ＤＮＡシャッフリングにおいてこれらを組み合わせた（図４）。上記ＣＤＳのより小さい断片上における特定の変異は、より高い１クローン当たりの平均変異数を実現するために、制限エンドヌクレアーゼを用いて単離された。同じ消化によって単離された変異の断片サイズおよびグループを図４にまとめた。シャッフリングにおいてＣＤＳの全長が再構築できるように、上記ＣＤＳの５’末端と３’末端において、断片に対するいくつか追加のフランキングＤＮＡが、シャッフリングにおいて全長のＣＤＳを再構築し得るように含められた。クローン化前の変異の予測平均数（図４参照）は、この特定のライブラリ（図４）の場合、約４と算出された。
【０１４７】
（ＩＩｂ）ＤＮａｓｅＩによる３０〜７０ｂｐ断片への切断
次に上記断片が、ＤＮａｓｅＩ消化によって無作為に切断された。大きさの近い断片は、集団全体において同じ比率になるグループにおいて処理された。そして、変異を有する切断されたＤＮＡ分子の混合物が、１２％アクリルアミドゲルにかけられ、３０〜７０ｂｐの断片の集団が単離された。単離した断片の集団の一例を図５に示す。
（ＩＩｃ）ライブラリのＰＣＲシャッフリングとクローニング
単離した断片の集団は、シャッフリングによってＳＢトランスポザーゼＣＤＳに再構築された。ほぼ同じ量のすべての変異が、ＰＣＲリアッセンブリ反応に使用された。また、変異の周囲にあるＣＤＳを短くするための重複のない制限断片集団が使用されたので、隣の断片グループを連結してＳＢトランスポザーゼＣＤＳの全長を最終的に得るには、架橋オリゴ（配列については表１のコネクト１〜３を参照）の付加が必要であった。このＰＣＲリアセンブリ反応は、Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４（上記を参照のこと）と同様に実施された。簡単に説明すると、選択されたすべての機能亢進性変異の単離した３０〜７０ｂｐの断片集団が、ＰＣＲ反応において同じ比率として加えられた。混合物におけるＤＮＡの最終濃度は約２０ｎｇ／μｌであった。さらに、２ｐｍｏｌの架橋オリゴのそれぞれ（表１を参照のこと）が加えられた。フィデリティーの高いポリメラーゼが、ＰＣＲ反応そのものによってさらなる変異の導入を最小化するために、使用された。上記ＰＣＲリアセンブリ用のプログラムは、以下の通りである：１サイクルが（１）９４℃にいて６０秒間、（２）９４℃において３０秒間、（３）５０℃において３０秒間、（４）６８℃において１分間、（５）６８℃において５分間であり、４０サイクルが２〜４回にわたって行われた。より高い分子量へのトランスポザーゼＣＤＳのリアセンブリは、４０サイクルの後に首尾よく可視化された（図６Ａ）。次のステップとして、第２のＰＣＲ反応は、４０倍希釈のアセンブリ反応液をテンプレートとして用い、ＳＢクローニングプライマーＳＢｃｌｎｆｗおよびＳＢｃｌｎｒｅｖ（表１における配列を参照のこと）を用いて実施されて、全長のトランスポザーゼＣＤＳを増幅した。全長のＣＤＳ（１０２３ｂｐ）は、フォワードおよびリバースのクローニングプライマーをともに使用して増幅された、これらのプライマーを単独に加えた場合と比較された（図６Ｂ）。フォワードプライマーは、エンドヌクレアーゼＳｐｅＩ．認識部位およびコザック配列認識部位を有し、リバースプライマーはＡｐａＩ．認識部位を有していた。さらに、両方のプライマーは、トランスポザーゼＣＤＳの最末端の２６ｂｐを有していた。これによって、第２のＰＣＲ反応の１０２３ｂｐの単離した生成物プールが、同し酵素を用いて消化されるライブラリ（データは図示しない）を目的とした設計され、作製された適切なベクターに効率よくクローン化が実現され得る。
【０１４８】
【表１】
0005726522.tif 000002
【０１４９】
（ＩＩ）（ｄ）ライブラリのシーケンシング
次のステップとして、シャッフリングクローン（ＩＩｃを参照のこと）のライブラリが性質決定された。上記ライブラリは、大腸菌ＤＨ５形質転換受容性細胞に形質導入され、それから単離され、４５のリアセンブリしたＣＤＳが完全に配列決定された。
４５のＣＤＳのすべてが、挿入または欠失のない全長であり、さらに、余分な変異が非常に低い発生率であることが観察された。典型的な点変異が、いくつかのクローンにおいてシャッフリングプロセスそのものによって挿入される位置は、１０２３ｂｐ長のＣＤＳにおいて２つの特定のヌクレオチドの位置のみしか見つからなかった。アミノ酸の変化をもたらす点変異はなく、タンパク質レベルにおいて変化なしのままだった。上記配列をＳＢ１０トランスポザーゼＣＤＳに対して整列化した後、シャッフリングに用いられた４１の変異のクローン分布が同定された。変異の発生率は、選択されていないライブラリにおいては完全に統計的であった。４５の配列決定されたクローンにおいてシャッフリングに導入された変異の４１のうち３１が同定された（データは図示しない）。しかし、予測とは異なり、１クローンあたりの変異の平均数はわずかに約２であった（図４を参照のこと）。この理由は、シャッフリングにおいて個々の変異を有している断片の長さが３０〜７０ｂｐであるからかもしれない。４１の変異のほとんどが、トランスポザーゼＣＤＳにしたがって隣の変異から、７０ｂｐ長未満の配列として分離された。シャッフリングリアセンブリ反応の後に、３０〜７０ｂｐの断片は、任意の鎖の伸張反応から互いに部分的に排除され得、これによって隣接する変異間における組換え率が低下された。シャッフリング設定をわずかに修正して（データは図示しない）２つのライブラリが生成され、ライブラリ１およびライブラリ２のうち２３クローンおよび２２クローンをそれぞれ配列決定した。ライブラリ１は２．２の変異／クローンを有し、ライブラリ２はわずかに１．８個の変異／クローンを有していた。このため、ライブラリ１がさらなる実験に使用された。ライブラリ１の変異のクローン分布を図７に示す。
【０１５０】
（ＩＩＩ）（ａ）シャッフリングクローンの大規模精製
上述の細胞培養系が活性試験に使用された。シャッフリングクローンのプラスミドＤＮＡの大規模な自動精製が、ピペッティングロボットおよびプラスミドキットを用いて実施された。プラスミド調整物は、ほとんど同じ収率を生じ、組織培養に使用可能な品質であった。プラスミドサンプルのすべては、同様の濃度および品質であることを検証するために、アガロースゲルにかけられた。約２０００クローンのプラスミドＤＮＡが精製された。
（ＩＩＩｂ）ＨｅＬａ細胞内におけるライブラリのクローンの転移活性試験
９６穴形式が使用された差異を除いて（Ｉｂ）に記載のように、上記クローンは、ＨｅＬａ細胞における転移アッセイにおいて試験された。すべての試験は、２組において実施された。ＳＢ１６（Ｂａｕｓ、２００５年）が基準としてすべてのプレートに対して用いられた。すべてのクローンは、２組の９６穴試験プレート上において、ＳＢ１６と比較して同様かまたはより高い活性を示し、さらなる処理のために選択された。さらに、１２穴形式におけるの最良の２０クローンの活性が検証された。再試験された２０クローンのうち、７クローン（バリアント１から７）が、ＳＢ１６と比較して明らかに高い活性を示した。最良の２クローン（バリアント２および３）は、ＳＢ１６より約２倍の高い活性を示し、これは、ＳＢ１０と比較して、約３０倍の高い活性を意味する。
【０１５１】
（ＩＩＩｃ）選択した機能亢進性クローンのシーケンシングデータに基づいて手作業で作成した見込みのある新規組合せ
１２穴形式において再試験した最良の２０クローン、およびこの他にＳＢ１６と同程度に高い活性を示した１８クローン（したがって、合計して３８クローン）が、完全に配列決定されて、データプールを収集した。
最良の７クローンの変異含有量を図８Ａに示す。組合せ３Ｄ５および６Ａ５（バリアント２および３）が、ＳＢ１０と比較して３０〜３２倍の高い活性を示し、最良であることが分かった。活性な３８クローンすべての配列決定データプールを分析することによって、（ｉ）１クローン当たりの変異数が活性とともに増加し、最も機能亢進性の高い７クローンのグループにおいて、１クローン当たりの変異数の平均値が３．６に達する（図８Ｂ）ことが分かった。さらにまた、（ｉｉ）クローンのグループの中には、当該グループの増加した転移活性にともなって、変異のいくつかの発生率が増加するものがあることが分かった。この点について最も明らかな例は、２１４ＤＡＶＱ変異の発生率の増加である（図８Ｂ）。さらに、この特定の変異は、ＳＢ１６の活性範囲に達するか、またはそれを超える機能亢進性のほとんどの組合せにおける重要な変異と思われる。
【０１５２】
配列決定された３８の機能亢進性クローンから、４の変異を含んでいる８クローン、および５の変異を含んでいる５クローンのみが、見出された。これは、選択されたライブラリにおいて、４の変異を有するクローンおよび５の変異を有するクローン発生率が、それぞれ２１％および１３％であることを意味している。５を超えて変異を有するクローンは同定されなかった。また、最良の７のバリアントのうち４のバリアントが、４または５の変異をすでに有していた（図８を参照のこと）。選択されていないライブラリにおいて、４の変異を有するクローンの発生率は１０％未満であった。このように、ＳＢ１６の範囲内の活性亢進性は、１クローン当たり４または５の変異を有することと非常に高い相関関係を有する。
【０１５３】
機能亢進性の最も高い３８のシャッフリングクローンの配列決定データの分析後に、３Ｄ５、６Ａ５および１２Ｂ１（バリアント２、３および７）の３クローンが、さらなる変異生成のために選択された（図９）。また、配列決定データに基づいて、“扱い易い（ｆｒｉｅｎｄｌｙ）”６の変異が、選択した３クローンと首尾よく組み合わせられる見込みを有するクローンとして同定された（図９）。生じた組合せ、およびそれらの転移活性が、１２穴形式において測定された。これらの結果を図９に示し、その一覧を表２に示す。さらに、ある特定のクローン（バリアント１）は例外的に２の変異のみを有していた。これらの２クローンが同定された（図８の２Ｇ６および６Ｇ２を参照）。Ｋ１４Ｒ変異および２１４ＤＡＶＱ変異のこの例外的な組合せは、明らかに活性亢進に関して単純に相加的ではなく、むしろ相乗的な組合せであった。この観察に基づいて、Ｋ１４Ｒ変異が最良の組合せ３Ｄ５に導入され、これによって生じたクローンは、Ｋ１４Ｒ変異および２１４ＤＡＶＱ変異の両方を含んでいた。確立されたクローン（バリアント１９）は、大きく増強された活性を示した（図９）。
【０１５４】
【表２】
0005726522.tif 000003
0005726522.tif 000004
【０１５５】
さらに、実施例ＩＶ〜ＩＸは、種々の系統の細胞株における非機能亢進変異体または不活性変異体（コントロール実験）と比較して、種々の機能亢進性トランスポザーゼ突然バリアントの活性を決定するために実施された（図１４〜２６を参照）。これらの実施例に用いられる条件を以下に示す。
【０１５６】
（実験方法の説明）
（実施例ＩＶ〜ＩＸの物質および方法）
（Ａ）スリーピングビューティートランスポゾンシステム
ＳＢトランスポゾンシステムは、（ｉ）所望の遺伝子に隣接する逆方向反復配列／直接反復配列（ＩＲ／ＤＲ）、および（ｉｉ）上記トランスポザーゼをコードする発現カセットからなる二元システムである。この調査では、所望の遺伝子および異なるトランスポザーゼを含んでいる、異なるトランスポゾンがこの研究に使用された（上記も参照のこと）。
【０１５７】
（１）ＳＢトランスポゾンを用いたベクター
（ｉ）ｐＴ２−ＨＢ−ＣＡＧ−ＧＦＰ
ｐＴ２−ＨＢ−ＣＡＧ−ＧＦＰトランスポゾンは、ＧＦＰレポータ遺伝子がＣＡＧプロモータによって転写制御されるＳＢトランスポゾンベクターである。ＣＡＧプロモータは、トリのｂ−アクチン／ウサギのｂ−グロビンのハイブリッドプロモータおよびイントロン（ＣＡＧ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｅｌｓｐｏ．ｂｅ／ｂｃｃｍ／ｌｍｂｐ．ｈｔｍ；  ＬＭＢＰ  ２４５３）；（ｐＡ：  ポリアデニル化シグナル）とつないだ、ＣＭＶ（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；ヒトサイトメガロウイルス）の前初期エンハンサから構成されるキメラプロモータである（図１１）。
【０１５８】
（ｉｉ）ｐＴ２−ＨＢ−ＣＭＶ−ＦＩＸ−ｎｅｏ
Ｔ２−ＨＢ−ＣＭＶ−ＦＩＸ−ｎｅｏトランスポゾンは、ヒト凝固因子ＩＸのｃＤＮＡ（ＦＩＸ）がＣＭＶプロモータによって促進される、ＳＢトランスポゾンベクターである。また、上記ベクターは、安定してトランスフェクトされた細胞においてＧ４１８（ジェネティシン）に対する耐性を与えるネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ（登録商標））を促進するシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータを含んでいる（図１１）。
【０１５９】
（ｉｉｉ）ｐＴ２−ＨＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ｎｅｏ
ｐＴ２−ＨＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ｎｅｏトランスポゾンは、ＧＦＰレポータ遺伝子がＣＭＶプロモータによって転写制御される、ＳＢトランスポゾンベクターである。また、上記ベクターは、安定してトランスフェクトされた細胞においてＧ４１８（ジェネティシン）に対する耐性を与えるネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ（登録商標））を促進するＳＶ４０プロモータを含んでいる（図１１）。
【０１６０】
（ｉｖ）ｐＴ２−ＨＢ−Ａｐｏ／ＡＡＴ−ＦＩＸ
ｐＴ２−ＨＢ−Ａｐｏ／ＡＡＴ−ＦＩＸトランスポゾンは、上記ＦＩＸのｃＤＮＡがＡｐｏＥ  ＨＣＲ／ＡＡＴプロモータによって促進される、ＳＢトランスポゾンベクターである（図１１）。当該ＡｐｏＥ  ＨＣＲ／ＡＡＴプロモータは、アポリポタンパク質  Ｅ  エンハンサ／ａ１−抗トリプシンプロモータ、肝細胞制御領域（ＨＣＲ）、および第１のＦＩＸイントロン（ワシントン大学のＭｉａｏ博士からご提供いただいた）から構成されている。
【０１６１】
（２）トランスポザーゼ
すべてのトランスポザーゼ（活性トランスポザーゼ、不活性トランスポザーゼ、または過剰活性トランスポザーゼ）は、ＣＭＶ発現プラスミドによってコードされており、最初に再構築されたＳＢ１０  スリーピングビューティートランスポザーゼと比較して、ＤＮＡ結合ドメイン、触媒ドメインまたはその両方（図１２および１３）において異なる変異を含んでいる。ＳＢ−ＤＮＧＰは、ＤＤＥ触媒ドメインの欠失に起因する不活性ＳＢトランスポザーゼをコードする。ＳＢ  ＧＦＰプラスミドを生成するために、ＳＢ１００ｘトランスポザーゼ（バリアント２７）が、ＧＦＰを用いて置換された。
【０１６２】
（Ｂ）細胞
臍帯血（ＵＣＢ）の単核細胞が、２４００ｒｐｍおよび２０℃において３０分間にわたって遠心分離することによって、ＵＣＢからフィコール／ヒパークに通して分離され、それから２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ用いて洗浄し、１０００ｒｐｍにおいて１０分間にわたる遠心分離を２回行われた。ＣＤ３４陽性細胞は、さらに製造者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．  ＣＡ，  ＵＳＡ）にしたがって、抗ＣＤ３４抗体に接合された磁性ビーズを使用して、免疫磁気分離によってさらに濃縮された。この免疫磁気細胞分離によって、造血幹細胞／前駆体（ＨＳＣ）細胞が濃縮された、一般に収率９５％を超えるＣＤ３４陽性細胞が得られる。
【０１６３】
初代培養のヒト骨格筋幹細胞／前駆体細胞（筋芽細胞）が、有志者の外側広筋からニードルバイオプシー５によって得られた。筋芽細胞を、製造者（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＭＤ  ＵＳＡ）によって説明されている通りに、ＳｋＧＭ培地において膨張させた。
【０１６４】
（Ｃ）マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、２ｍｌのＰＢＳを用いて希釈した２５μｇのトランスポザーゼプラスミドを有する５０マイクログラムのトランスポゾンを用いて流体力学的にトランスフェクトされ、尾静脈に注射された。注射は、通常、各マウスについて１０秒未満の時間において行われ、当該注射によって効率的な肝臓遺伝子の送達を生じる。
【０１６５】
（Ｄ）トランスフェクション
ＣＤ３４陽性ＨＳＣのヌクレオフェクトは、アマクサバイオシステムによって開発されたヌクレオフェクトキット（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ヒトＣＤ３４陽性細胞の最適化プロトコルにしたがって実施された。アマクサエレクトロポレーター電気穿孔器（ヌクレオフェクターＩ、Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＵ−０１プログラムが採用された。ＰＢＳにおける濃縮されたＣＤ３４陽性細胞を１２００ｒｐｍにおいて１０分間にわたっての遠心分離し、ヌクレオフェクター緩衝液に再懸濁した。通常、キュベットにつき１００μｌのヒトＣＤ３４細胞のヌクレオフェクター緩衝液（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）における１．５×１０５の細胞は、トランスポゾン（１０マイクログラム）およびトランスポザーゼ（５マイクログラム）（濃度：１マイクログラム／マイクロリットル）を含んでいる精製プラスミドとともにエレクトロポレーションにかけられた。
【０１６６】
ヒト筋肉前駆体／幹細胞（筋芽細胞）のヌクレオフェクトは、アマクサバイオシステムによって開発されたヌクレオフェクトキット（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ヒトＣＤ３４陽性細胞の最適化プロトコルにしたがって実施された。アマクサエレクトロポレーター（ヌクレオフェクターＩ、Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＡ−３３プログラムが採用された。ＰＢＳにおける筋芽細胞を１２００ｒｐｍにおいて１０分間にわたっての遠心分離し、ヌクレオフェクター緩衝液に再懸濁した。通常、キュベットにつき１００μｌの初代培養平滑筋細胞のヌクレオフェクター緩衝液（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）における１０６の細胞は、トランスポゾン（３．６マイクログラム）およびトランスポザーゼ（１．４マイクログラム）（濃度：１マイクログラム／マイクロリットル）を含んでいる精製プラスミドとともにエレクトロポレーションにかけられた。トランスフェクトされた筋芽細胞は、Ｇ４１８（４００〜６００マイクログラム／ｍｌ）において選択された。
【０１６７】
（Ｅ）クローン原性アッセイ
（１）ＣＦＵ−Ｍｋ（巨核球／血小板）
１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３−Ｌ、および１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯをを補った５０μｌステムライン培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＳＡ）を、エレクトロポレーションにかけた１００μｌＣＤ３４陽性細胞の懸濁液に加えることによって、巨核球クローン原性アッセイを実施した。そして、最終的な細胞懸濁液５０μｌを、２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２５ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６、および１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ１ｂを補ったミエロカルト（Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ）  Ｈ５１００（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ）に対応する４５０μｌの巨核球分化培地に添加し、２４ウェルプレートの３ウェルに播種した。したがって、各ウェルには５×１０４の細胞が入っている。トランスフェクションから６日後に、プレートを短時間遠心分離にかけて上清を捨て、新しい巨核球分化培地を添加することによって、培地を交換した。１０日後にコロニーをカウントした。オリンパス社製の蛍光倒立顕微鏡を使用してＧＦＰ発現をモニターし、この顕微鏡用いてＣＦＵ−Ｍｋコロニーを記録した。さらに自動化されたツァイス社製の倒立顕微鏡を使用した。
【０１６８】
（２）ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球／単球／マクロファージ）
１％のメチルセルロース（４０００ｃｐｓ）、３０％のウシ胎児血清、１％のウシ血清アルブミン、１０−４Ｍの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−３をイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）ＭＤＭに加えたものからなる半流動性メトカルト（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ）ＧＦ  Ｈ４５３４（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ）に対応する２７０μｌの顆粒球／単球／マクロファージ分化培地に、３０μｌの最終的な細胞懸濁液を添加することによって、顆粒球／単球／マクロファージのクローン原性アッセイを実施した。上記細胞懸濁液を２４ウェルプレートの３ウェルに播種した。したがって、各ウェルには５×１０４の細胞が入っている。１４日後にコロニーをカウントした。オリンパス社製の蛍光倒立顕微鏡を使用してＧＦＰ発現をモニターし、この顕微鏡を用いてＣＦＵ−ＧＭコロニーを記録した。さらに自動化されたツァイス社製の倒立顕微鏡を使用した。
【０１６９】
（３）ＣＦＵ−Ｅ（赤血球）
メチルセルロース、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＩＬ−３、ｒｈＩＬ−６、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒｈ  ＥｐｏをイスコブＭＤＭに加えたものからなる半流動性メトカルト  ＳＦＢＩＴ  Ｈ４４３６（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ）に対応する２７０μｌの赤血球分化培地に、最終的な細胞懸濁液３０μｌを添加することによって、赤血球のクローン原性アッセイを実施した。上記細胞懸濁液を２４ウェルプレートの３ウェルに播種した。したがって、各ウェルには５×１０４の細胞が入っている。７日後にコロニーをカウントしたした。コロニーは、赤血細胞の特徴的なマーカーである約７０％のグリコホリンＡ＋細胞を典型的に含んでいた。オリンパス社製の蛍光倒立顕微鏡を使用してＧＦＰ発現をモニターし、この顕微鏡を用いてＣＦＵ−Ｅコロニーを記録した。さらに自動化されたツァイス社製の倒立顕微鏡を使用した。
【０１７０】
（Ｆ）ＦＩＸの検出
培養上清またはクエン酸化血漿におけるＦＩＸのレベルは、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍｅ  ＩＸ  サンドイッチ  ＥＬＩＳＡ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍｅ／Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，  Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）によって、ＦＩＸ抗原に関して定量化された。血液は眼窩からの採血によって回収された。
【０１７１】
（Ｇ）顕微鏡による観察
落射蛍光顕微鏡画像および明視野顕微鏡画像は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ４．６プログラムおよびＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲ３カメラを使用して、ツァイス社製のＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡によって撮影された。特に断りがない限り、写真は、自動露光時間選択ならびに最小および最大のグレー値または色値の最適表示（Ｍｉｎ／Ｍａｘ選択）によってで撮影された。上記設定は、一連の撮影を通して同じままにし、各画像ごとにリセットしなかった。共焦顕微鏡による観察は、ＡｘｉｏＰｌａｎ  ２  ＬＳＭ  ５１０  バージョン２．８ソフトウェアを使用して、ツァイス社製のＡｘｉｏｖｅｒｔ  １００Ｍ、ＬＳＭ５１０によって実施された。ＧＦＰ発現は、すべての画像において励起波長４８８ｎｍを用いてモニターされた。
【０１７２】
（実施例ＩＶ〜ＩＸ）
（実施例ＩＶ：ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞における転移）
本実施例は、赤血球系統における非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１０およびＳＢ１１に対する、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａおよびＳＢ６／Ａ５のそれぞれの比較分析を目的として実施された。ヒトＣＤ３４陽性ＨＳＣを、実施例ＩＶ〜ＩＸの材料および方法の部分に説明されるように、ｐＴ２−ＨＢ−ＣＡＧ−ＧＦＰ、ならびにＳＢ  Ｍ３ａおよびＳＢ  ６／Ａ５をコードするトランスポザーゼ発現ベクターを使ってヌクレオフェクトによってトランスフェクトした。新たに改変されたこれらのトランスポザーゼの機能は、これらが由来するトランスポザーゼＳＢ１０およびＳＢ１１の機能を比較された。ＣＦＵ−Ｅコロニーの総数、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーの絶対数、およびＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーの％を図１４に示す。
【０１７３】
結果は、トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａおよびＳＢ  ６／Ａ５が、これらが由来するトランスポザーゼＳＢ１０およびＳＢ１１比較して、ＧＦＰ陽性のコロニーの％が顕著に増加したことを示している。一方、触媒部位が変異を有している不活性トランスポザーゼＳＢ  ＤＮＧＰとともにコトランスフェクションした後は、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーは検出不可能であった。よって、本発明のトランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａおよびＳＢ  ６／Ａ５は、ヒトＣＤ３４陽性ＨＳＣにおいて機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１０およびＳＢ１１と比較してより効率的な転移を生じる、本発明の“機能亢進性”トランスポザーゼのグループに該当する。ＣＦＵ−Ｅコロニーの総数は、種々のコンストラクトを用いたエレクトロポレーションの後において変化しなかった。これは、これらの機能亢進性トランスポザーゼの過剰発現と関連する毒性が明らかにないことを示唆しており、この手法の安全性を裏づけている。
【０１７４】
（実施例Ｖ：ヒトＣＤ３４／造血幹細胞／前駆細胞における転移）
この比較分析は、機能亢進性トランスポザーゼＭ３ａ、ＳＢ６／Ａ５およびＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒの赤血球系統における結果を判断するために設計された。ヒトＣＤ３４陽性ＨＳＣを、上述のように、ｐＴ２−ＨＢ−ＣＡＧ−ＧＦＰ、ならびにＳＢ  Ｍ３ａ、ＳＢ  ６／Ａ５またはＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒをコードするトランスポザーゼ発現ベクターを使ってヌクレオフェクトによってトランスフェクトした。ＣＦＵ−Ｅコロニーの総数、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーの絶対数、およびＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーの％を図１５に示す。
【０１７５】
結果は、トランスポザーゼＳＢ  ６／Ａ５およびＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒが、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａと比較して、ＧＦＰ陽性の％が有為に増加（２倍および４．８倍）したことを示す。一方、触媒部位が変異を有している不活性トランスポザーゼＳＢ  ＤＮＧＰとともにコトランスフェクションした後は、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーが検出不可能であった。このことは、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒが、機能亢進性のトランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａおよびＳＢ  ６／Ａ５よりもさらに顕著な転移を生じることを示している。よって、図１４および１５のデータは、ＳＢ  Ｍ３ａ、ＳＢ  ６／Ａ５、およびＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒが、非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１０およびＳＢ１１と比較して、ヒトＣＤ３４陽性ＨＳＣにおいてより効率的な遺伝子導入を生じる、上記“機能亢進性”トランスポザーゼのグループに該当することを示している。ＣＦＵ−Ｅコロニーの総数は、種々のコンストラクトを用いてエレクトロポレーションした後において変化しなかった。これは、これらの機能亢進性トランスポザーゼの過剰発現と関連する毒性が明らかにないことを示唆しており、この手法の安全性を裏づけている。
【０１７６】
（実施例ＶＩ：ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞における転移）
本実施例は、赤血球、巨核球、および顆粒球の／マクロファージ単球／系統における、ＳＢ１００Ｘ（バリアント２７）に対する、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５（バリアント３）の比較分析することを目的として実施された。ヒトＣＤ３４陽性ＨＳＣを、上述のように、ｐＴ２−ＨＢ−ＣＡＧ−ＧＦＰ、ならびにＳＢ  ６／Ａ５またはＳＢ１００ｘをコードするトランスポザーゼ発現ベクターを使ってヌクレオフェクトによってトランスフェクトした。ＣＦＵ−Ｅコロニーの総数、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーの絶対数、およびＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅコロニーの％を図１６に示す。ＣＦＵ−Ｍｋコロニーの総数、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｍｋコロニーの絶対数、およびＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｍｋコロニーの％を図１７に示す。また、ＣＦＵ−ＧＭコロニーの総数、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−ＧＭコロニーの絶対数、およびＧＦＰ陽性のＣＦＵ−ＧＭコロニーの％を図１８に示す。ＳＢ１００による転移後およびＳＢ  ６／Ａ５による転移後のＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍｋ、およびＣＦＵ−ＧＭコロニーの％の相対的増加（％）を比較して図１９に示す。
【０１７７】
結果は、トランスポザーゼＳＢ１００ｘ（バリアント２７）は、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  ６／Ａ５と比較して、すべての系統（ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍｋ、ＣＦＵ−ＧＭ）においてＧＦＰ陽性のコロニーの％が顕著に増加したことを示している。ＧＦＰ  ＣＦＵの％の増加は、ＳＢを介した転移の後に安定な遺伝子導入効率の同時の増加を反映しており、異なる系統の間において一致していた。そして、このことは純粋な造血幹細胞／前駆細胞が、このトランスポゾン技術を用いて、安定かつ効率的にトランスフェクトされていることを示す有力な証拠である。一方、触媒部位が変異を有している不活性トランスポザーゼＳＢ  ＤＮＧＰを用いてコトランスフェクションした後には、ＧＦＰ陽性のＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍｋ、およびＣＦＵ−ＧＭコロニーは検出不可能であった。ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍｋ、およびＣＦＵ−ＧＭコロニーの総数は、種々のコンストラクトを用いてエレクトロポレーションした後に変化しなかった。これは、これらの機能亢進性トランスポザーゼの過剰発現と関連する毒性が明らかにないことを示唆しており、この手法の安全性を裏づけている。
【０１７８】
赤血球系統における異なるトランスポザーゼの比較分析から、本発明の機能亢進性トランスポザーゼ（ＳＢ  Ｍ３ａ、ＳＢ  ６Ａ５、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４ＲおよびＳＢ  １００ｘ）のすべてのが、これらが由来するトランスポザーゼＳＢ１０およびその誘導体ＳＢ１１を使用した場合（図２０）と比較して、ＣＤ３４陽性ＨＳＣにおけるより効率的な安定な遺伝子導入、およびしたがってより高いＧＦＰ陽性のコロニーの％を生じることが示される。ＳＢ１００ｘは、ＳＢ１０と比較して、〜１００倍の増加したＧＦＰ発現および安定な遺伝子導入効率を生じる、最も効率的なトランスポザーゼである。これは、初代培養細胞、特にリンパ造血細胞（幹細胞が挙げられる）、さらには造血幹細胞／前駆細胞において生じる、トランスポゾン技術を用いたこのように非常に安定な遺伝子導入の初めての実証である。これまで、幹細胞、特にＣＤ３４陽性ＨＳＣにおいて、非ウイルス性遺伝子導入手法を使用した、このような高度に安定な遺伝子導入効率は報告されていない。これらのデータは、非機能亢進性トランスポザーゼがクローン原性アッセイにおける低い％のＧＦＰ発現をともなって使用される場合に、わずかなＣＤ３４陽性ＨＳＣのみが安定してトランスフェクトされ得るという最近の実例と一致している（Ｈｏｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００６  Ｏｃｔ；  ３４（１０）：  １３３３−４３）。これは、ここで提供されるような機能亢進性トランスポザーゼの発展を保証し、その根拠を示す。
【０１７９】
（実施例ＶＩＩ：ヒト筋肉幹細胞／前駆細胞における転移）
本実施例は、本発明の機能亢進性トランスポザーゼＳＢＭ３ａおよびＳＢ６／Ａ５の有効性を確認することを目的として実施された。ヒト筋肉幹細胞／前駆細胞（筋芽細胞）を、ｐＴ２−ＨＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｎｅｏ（図１１参照）、およびに機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａをコードするトランスポザーゼ発現ベクターを使って、上述のようにヌクレオフェクトによってトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＧ４１８による選択の後に濃縮した。安定な高レベルのＧＦＰ発現が得られ、ほとんどの細胞がＧ４１８による選択を得た後に生存した（図２１）。一方、触媒部位が変異を有している不活性トランスポザーゼＳＢ  ＤＮＧＰを用いてコトランスフェクションした後には、ＧＦＰ陽性の細胞は、ごく限られた数しか検出されなかった。これらの細胞は、安定な遺伝子導入効率の低さにしたがって、Ｇ４１８による選択によって最終的に生存できなかった。機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａの、これらが由来するＳＢ１０およびその誘導体ＳＢ１１との比較によって、トランスフェクトされたＧＦＰ陽性の細胞における顕著な増加にしたがって、ＳＢ  Ｍ３ａの優れた転移効率が確認される。よって、機能亢進性トランスポザーゼを用いて得られる優れた遺伝子導入効率は、特定の初代培養細胞に対して特異的ではなく、他の細胞種（他の幹細胞／前駆細胞（例えば、筋肉幹細胞／前駆細胞（筋芽細胞））が挙げられる）にまで拡大して適用され得る。本発明の機能亢進性トランスポザーゼのこの優れた遺伝子導入能は、ヒト凝固因子ＩＸなどの治療関連タンパク質の効率的かつ安定的な生成につながる（図２２）。
【０１８０】
（実施例ＶＩＩＩ：ヒト筋肉幹細胞／前駆細胞の転移）
本実施例は、非機能亢進性のＳＢ  １１と比較して、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  １００ｘ、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ、とＳＢ  Ｍ３ａの有効性を確認することを目的として実施される。ヒト筋肉幹細胞／前駆細胞（筋芽細胞）は、ｐＴ２−ＨＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｎｅｏ、ならびに機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  １００ｘ、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ、およびＳＢ  Ｍ３ａをコードするトランスポザーゼ発現ベクター、これに対しｐＴ２−ＨＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−Ｎｅｏ、および非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ（ＳＢ１１）をコードするトランスポザーゼ発現ベクターをそれぞれ用いて、上述したようにヌクレオフェクトによってトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞をＧ４１８による選択（７日間の選択）後に濃縮した。安定な高レベルのＧＦＰ発現が得られ、ほとんどの細胞がＧ４１８による選択の後に生存した（図２３）。一方、触媒部位が変異を有している不活性トランスポザーゼＳＢ  ＤＮＧＰまたはＳＢ（“不活性コントロール”）を用いてコトランスフェクションした後には、ＧＦＰ陽性の細胞は、ごく限られた数しか検出されなかった。これらの細胞は、安定な遺伝子導入効率の低さにしたがって、Ｇ４１８による選択によって最終的に生存できなかった。非機能亢進性のトランスポザーゼＳＢ１１を使用したときには、ＧＦＰ陽性の細胞の％が抑えられた。
【０１８１】
ＳＢ１０の誘導体ＳＢ１１との機能亢進性ＳＢトランスポザーゼの比較によって、トランスフェクトされたＧＦＰ陽性の細胞の％の顕著な増加にしたがって、ＳＢ  １００ｘ、ＳＢ  ３Ｄ１５−Ｋ１４Ｒ、およびＳＢ  Ｍ３ａの優れた転移効率が確認される。トランスポザーゼＳＢ１００ｘは、最も高い％のＧＦＰ陽性の細胞をもたらした。ＧＦＰ細胞の％に反映されるような安定な遺伝子導入効率は、ＳＢ１００ｘと比較して、トランスポザーゼＳＢ  ３Ｄ１５が使用される場合に低かった。ＧＦＰ細胞の％に反映されるような安定な遺伝子導入効率は、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒと比較して、トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａを用いた場合に低かった。したがって、ヒト筋肉前駆体／幹細胞において異なるトランスポザーゼを用いて得られる転移／安定な遺伝子導入の相対的な差は、他の初代培養の細胞種、特にＣＤ３４ヒト造血幹細胞／前駆細胞における遺伝子導入における相対的な差と相関した（図２０）。よって、機能亢進性トランスポザーゼによって得られる優れた遺伝子導入効率は、特定の初代培養細胞に特異的ではなく、他の細胞種（他の幹細胞／前駆細胞（例えば、筋肉幹細胞／前駆細胞（筋芽細胞））が挙げられる）にまで拡大して適用され得る。機能亢進性トランスポザーゼのこの優れた遺伝子導入能は、治療関連タンパク質（ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒトランスポザーゼ、およびＦＩＸを含んでいるＳＢトランスポゾンを用いたトランスフェクション後のヒト凝固因子ＩＸなど）の効率的かつ安定的な生成につながる（図２４）。
【０１８２】
（実施例ＩＸ：インビボ転移）
本実施例は、本発明の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１００Ｘの有効性を確認することを目的として実施された。機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１００ｘがまた、非機能亢進性トランスポザーゼを使用した場合と比較して、インビボにおいて顕著な遺伝子導入を生じるか否かを評価するために、向肝臓性の遺伝子導入実験を上述したように実施した。これを実現するために、肝臓特異的な強力なプロモータ（ｐＴ２−ＨＢ−Ａｐｏ／ＡＡＴ−ＦＩＸ）（図１１参照）に由来する、トランスポゾン発現因子ＩＸ（ＦＩＸ）を含んでいるプラスミドは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの尾静脈に素早く注射することによって、上記トランスポザーゼコンストラクト（機能亢進性ＳＢ  １００ｘ、非機能亢進性ＳＢ  １１、不活性ＳＢ  ＤＮＧＰまたはＳＢ  ＧＦＰ）とともに、流体力学的にトランスフェクトされた。機能亢進性ＳＢ  １００ｘを使用した場合に安定な高レベルの治療的な因子ＩＸが得られた（図２５）。一方、上記不活性トランスポザーゼコントロールを採用した場合、発現が徐々に減衰した（ＳＢ  ＧＦＰ）。また、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  １００ｘとともに、インビボにおいてＦＩＸトランスポゾンをコトランスフェクションした後のＦＩＸの発現は、非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  １１を使用した場合よりもはるかに顕著であった。実際に、ＳＢ１１を介した転移によって、ＦＩＸの発現は、欠損トランスポザーゼ（ＳＢ  ＤＮＧＰ）をコードする対照プラスミドの発現よりわずかに高いレベルにまで徐々に減衰した。これらの結果は、インビボにおけるＳＢ  １００ｘのトランスフェクションに続くＦＩＸの発現の延長が、効率的な安定な転移によるものであり、これによって、ＳＢ  １００ｘのインビボにおける機能亢進の転移特性を裏付けていることを示している。
【０１８３】
上記ＦＩＸトランスポゾンが、インビボ遺伝子導入に続いて肝細胞ゲノムに安定して組み込まれていることを確認するために、部分的肝切除（Ｐｈｘ）（図２６）に続いて肝細胞の細胞周期が誘導された。この手順は、肝臓の６０％を外科的に除去することからなる。Ｐｈｘ後の数週間において、肝臓は、正常な肝臓の質量が回復されるまで肝細胞が新規増殖することによって再生する。ＳＢ  １００ｘを使用した場合にＰｈｘによってＦＩＸレベルが低下しなかったので、これは、導入遺伝子がインビボでトランスフェクトされた肝細胞のゲノムに組み込まれたことを示す決定的な証拠である。一方、不活性トランスポザーゼ（ＳＢ−ＤＮＧＰ、不活性コントロール）をコードする発現プラスミド、またはトランスポザーゼ（ＡＡＶ−ＭＣＳ）をコードしない発現プラスミドとともに、ＦＩＸトランスポゾンを流体力学的に同時トランスフェクションした後にゲノムに対して安定な組み込まれないので、ＦＩＸの発現が減少した。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】トランスポザーゼ源をトランスポゾンから切り出すことによって生成された二成分の転移システムである、クラスＩＩのカット＆ペースト型の転移因子（ＴＥ）を示す模式図である。
【図２】（Ａ）は、Ｔｃ１トランスポザーゼ配列の１つの機能亢進性のアミノ酸置換を有する配列の一部を示す図であり、（Ｂ）は、当該アラインメントの類似性を示す樹形図である。
【図３】（Ａ）は、ＳＢにより関連性のあるＴｃ１トランスポザーゼ配列の１つの機能亢進性のアミノ酸置換を有するアラインメントの一部を示す図であり、（Ｂ）当該アラインメントの類似性を示す樹形図である。
【図４】シャッフリングのための基礎をなす機能亢進性変異、および野生型配列の含有量を減少させるための特定の制限消化に関するそれらの変異のグループ化
【図５】ＤＮａｓｅＩ処理した単離断片の集団を１２％のポリアクリルアミドゲルにかけた結果を示す図である。
【図６】（Ａ）は、ＰＣＲリアセンブリ反応の結果を示す図であり、（Ｂ）は、希釈したＰＣＲリアセンブリ反応のテンプレートに対してＣＤＳの全長をクローニングする、ＰＣＲの最終ステップ
【図７】選択されていないライブラリ１におけるクローン集団の分布
【図８】（Ａ）は、シャッフリングライブラリから単離した最も機能亢進性の高い７クローンに加わっている変異を示す図であり、（Ｂ）は、ライブラリから選択された機能亢進性クローンの特定の統計的特徴を示す図である。
【図９】シャッフリングライブラリから回収した機能亢進性クローンを手作業によって改良する計画の一覧を示す図である。
【図１０】ＳＢ１０のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図１１】図１４〜図２６に示されている実験に使用されるベクターの構成を示す図である。
【図１２】非機能亢進性トランスポザーゼの概略を示す図である。
【図１３】機能亢進性突然バリアントトランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａ、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ、ＳＢ／６Ａ５、およびＳＢ１００ｘの概略を示す図である。
【図１４】非機能亢進トランスポザーゼＳＢ１０およびＳＢ１１に対する、機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａおよびＳＢ６／Ａ５の、赤血球系統における比較分析の結果
【図１５】機能亢進性トランスポザーゼＭ３ａ、ＳＢ６／Ａ５およびＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒの、赤血球系統における比較分析の結果を示す図である。
【図１６】機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５およびＳＢ１００Ｘの、赤血球系統における比較分析の結果を示す図である。
【図１７】機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５およびＳＢ１００Ｘの、巨核球系統における比較分析の結果を示す図である。
【図１８】機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５およびＳＢ１００Ｘの、顆粒球／マクロファージ／単球系統における比較分析の結果を示す図である。
【図１９】機能亢進性トランスポザーゼＳＢ６／Ａ５に対するトランスポザーゼＳＢ１００Ｘの相対的遺伝子転移効率
【図２０】野生型のトランスポザーゼＳＢ１０および変異型の非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１１に対する、変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａ、ＳＢ６／Ａ５、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ、およびＳＢ１００Ｘの相対的遺伝子転移活性を示す図である。
【図２１】変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａを使用した、ヒト筋肉前駆体／幹細胞における安定的遺伝子転移効率を示す図である。
【図２２】野生型トランスポザーゼＳＢ１０または変異型の非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１１に対する、変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａまたはＳＢ６／Ａ５を使用した、ヒト筋肉前駆体／幹細胞における遺伝子転移の比較分析の結果を示す図である。
【図２３】非機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１１に対する機能亢進性トランスポザーゼＳＢ１００ｘ、ＳＢ  ３Ｄ５−Ｋ１４Ｒ、ＳＢ  Ｍ３ａの、筋肉前駆細胞における比較分析の結果を示す図である。
【図２４】変異型の機能亢進性トランスポザーゼＳＢ  Ｍ３ａを使用した安定なトランスフェクション後の、ヒト筋肉前駆細胞における因子ＩＸの発現レベルを示す図である。
【図２５】変異型の非機能亢進性ＳＢ１１トランスポザーゼまたは不活性コントロールと比較した、変異を有する機能亢進性ＳＢ１００Ｘトランスポザーゼを使用したトランスフェクション後の、マウスの肝臓における因子ＩＸのインビボ発現レベルを示す図である。
【図２６】変異型の機能亢進性ＳＢ１００Ｘトランスポザーゼを使用したトランスフェクション後の、マウスの肝臓における因子ＩＸのインビボ発現レベルを示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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