(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍を診断するためのin vitro法であって、  （ｉ）配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするテンイレブントランスロケーションタンパク質ファミリーメンバー２遺伝子（ＴＥＴ２）の突然変異の存在を検出すること、および／または
（ｉｉ）ＴＥＴ２遺伝子の発現を分析すること
により、該被験体からの生体サンプルを分析する工程を含んでなり、
このようなＴＥＴ２突然変異の検出、ＴＥＴ２の無発現の検出または末端切断型ＴＥＴ２の発現の検出が、骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍を発症している、または発症する疾病素因のある被験体の指標となる、方法。
【請求項２】
診断対象の腫瘍が、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）および骨髄異形成／骨髄増殖性症候群を含む群から選択される骨髄腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨髄腫瘍が骨髄異形成／骨髄増殖性症候群である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨髄腫瘍が慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
診断対象の腫瘍が、リンパ腫からなる群から選択されるリンパ性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
診断対象の腫瘍が、Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択されるリンパ性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が真性赤血球増加症（ＰＶ）または血小板血症（ＥＴ）に罹患しており、ＴＥＴ２の突然変異またはＴＥＴ２の発現不足の検出が骨髄繊維症（ＭＦ）を発症している、または発症する疾病素因のある被験体の指標となる、被験体において骨髄繊維症（ＭＦ）を診断するための請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体が哺乳類である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体がヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記突然変異が、配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするＴＥＴ２遺伝子の片方または両方の対立遺伝子で検出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記突然変異が、欠失、挿入および点突然変異（スプライス部位に影響する突然変異、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異など）からなる群に含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記欠失または挿入が、ＴＥＴ２タンパク質の無発現または末端切断型ＴＥＴ２タンパク質の発現をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記末端切断型ＴＥＴ２タンパク質が、他のＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、またはｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域の少なくとも１つを含まない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記末端切断型ＴＥＴ２タンパク質が、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）を含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ミスセンス突然変異が、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレームに位置する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ミスセンス突然変異が、ＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つに位置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ミスセンス突然変異が、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に位置する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ミスセンス突然変異が、Ｋ１２９９Ｅ、Ｉ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆを含んでなるまたはからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ナンセンス突然変異が、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレーム内に位置する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ナンセンス突然変異が、ＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つの手前または内部に位置する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ナンセンス突然変異が、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）の手前または内部に位置する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナンセンス突然変異が、Ｑ３２１Ｓｔｏｐ、Ｓ３５４Ｓｔｏｐ、Ｒ５４４Ｓｔｏｐ、Ｑ５５７Ｓｔｏｐ、Ｒ１２１６ＳｔｏｐおよびＹ１７２４Ｓｔｏｐを含んでなるまたはからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＥＴ２遺伝子の突然変異が、配列番号２の配列を有するポリペプチドの無発現または発現不足を誘発する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＥＴ２遺伝子の突然変異が、ＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つの無発現または発現不足を誘発する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＥＴ２遺伝子の突然変異が、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）の無発現または発現不足を誘発する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
被験体において骨髄性癌またはリンパ性癌を診断するためのキットであって、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異の存在を検出するため、および／またはＴＥＴ２遺伝子の発現を分析するために請求項１〜２５のいずれか一項で定義された方法において使用することができる、ＴＥＴ２に特異的な少なくとも１つの核酸プローブ、ＴＥＴ２遺伝子の領域の増幅を可能とする少なくとも１つのＰＣＲプライマー、またはＴＥＴ２に特異的な少なくとも１つの抗体を含んでなる、キット。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのＰＣＲプライマーが、ＴＥＴ２遺伝子の領域の増幅を可能とするＰＣＲプライマーのセットである、請求項２６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本願はそれぞれ２００８年６月１２日および２００９年３月１３日に出願された欧州特許出願ＥＰ０８３０５２５５．５およびＥＰ０９１５５１６９．７の優先権を主張するものであり、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、骨髄性新生物を診断するための遺伝子マーカー、より詳細には、新たに同定された腫瘍抑制遺伝子テンイレブントランスロケーション（Ten Eleven Translocation）タンパク質ファミリーメンバー２遺伝子（ＴＥＴ２）に関する。ＴＥＴ２の遺伝子変異は骨髄異形成／骨髄増殖性症候群、ＭＤＳ、ＡＭＬまたはＭＰＤなどの骨髄性腫瘍およびリンパ性腫瘍の診断に有用である。
【０００３】
発明の背景
造血は、造血幹細胞（ＨＳＣ）があらゆる種類の成熟血液細胞へ分化する多能性前駆体を生じる階層的システムにより維持される。多能性、自己再生、休止およびＨＳＣへの方向付けを制御する分子機構が鋭意研究されている。しかしながら、取り組むべき多くの問題が残っており、これらのプロセスを調節する重要な遺伝子はまだ同定されていない。
【０００４】
骨髄性悪性疾患には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および骨髄異形成／骨髄増殖性症候群が含まれ、総て、クローン幹細胞（ＨＳＣ）または前駆体の悪性障害である(TIU et al. Leukemia, vol.21(8), p:1648-57, 2007)。
【０００５】
いくつかの遺伝子突然変異がＡＭＬに関連づけられており、４つの群が認知されている：（ｉ）ＲＵＮＸ１−ＥＴＯ融合遺伝子を含む再発性遺伝子異常ＡＭＬ  ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を有するＡＭＬ；ＣＢＦＢ／ＭＹＨ１１再配列を伴う異常な骨髄好酸球およびｉｎｖ（１６）（ｐ１３；ｑ２２）またはｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）を有するＡＭＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）ＰＭＬ／ＲＡＲＡを有する急性前骨髄球性白血病ＡＰＬ；１１ｑ２３（ＭＬＬ）異常を有するＡＭＬ）；（ｉｉ）ＭＤＳまたはＭＤＳ／ＭＰＤ後またはＭＤＳまたはＭＰＤが先行しない多系列の異形を伴うＡＭＬ；  （ｉｉｉ）ＡＭＬまたはＭＤＳ療法関連、および（ｉｖ）診断がＦＬＴ３−ＩＴＤまたはＮＰＭ１の突然変異などの癌遺伝子の分子分析に基づく、正常な核型を有するＡＭＬ群を含んでなる他の分類不能型ＡＭＬ。
【０００６】
骨髄異形成／骨髄増殖性症候群には、ＷＨＯが１９９９年に分類した４つの骨髄性疾患：慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病（ａＣＭＬ）および分類不能型骨髄異形成／骨髄増殖性症候群（Ｕ−ＭＤＳ／ＭＰＳ）が含まれる。
【０００７】
ＭＤＳには、不応性貧血（ＲＡ）、および多系列異形を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）が含まれる。ＭＤＳは骨髄の１以上の系列における無効な造血を特徴とする。初期のＭＤＳはたいてい過剰なアポトーシスと造血細胞異形を示す(CLAESSENS et al, Blood, vol.99, p:1594-601, 2002; CLASESSENS et al, Blood, vol.105, p:4035-42, 2005)。第三のＭＤＳ患者については、この無効な造血が第二のＡＭＬ（ｓＡＭＬ）への進行に先行する。特定のＭＤＳサブタイプ(ELBERT et al, Nature, vol.451(7176), p:335-9, 2008)または疾病転換(BRAUN et al, Blood, vol.107(3), p:1156-65, 2006)に関連するいくつかの分子事象が特定されているが、基礎にある分子欠陥があまり理解されていない。現在のところ、形態的特徴を除き、生物学的マーカーに初期の診断および予後診断に利用できるものはない。
【０００８】
ここで骨髄増殖性新生物と呼ばれているＭＰＤ(MPN; TEFFERI & VARDIMAN, Leukemia, vol. 22, p:14-22, 2008)は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、真性赤血球増加症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性骨髄繊維症（ＰＭＦ）および特発性骨髄繊維症（ＩＭＦ）を含む慢性骨髄性である。ＭＰＤは１またはいくつかの骨髄性系列の増殖の増大を特徴とする。ほとんどのＭＰＤが散発性疾患であるとすると、正確な罹患率が分かっていないＭＰＤの家族性症例が報告されている(GILBERT, Baillieres Clin. Haematol, vol.11, p:849-858, 1998; KRALOVICS et al, Blood, vol.102, p:3793-3796, 2003; BELLANNE-CHANTELOT et al, Blood, vol.108, p:346-352, 2006)。これらの家族性症例の臨床分析では、それらが散発性症例と表現型が同一であることが示されている。しかしながらやはり、ＭＰＤ家族は臨床および遺伝的ヘテロ性を特徴とする。第一に、単一家族のＭＰＤ症例は、ＭＰＤの同じサブタイプを示すこともあれば違うサブタイプを示すこともある(GILBERT,前掲, 1998; BELLANNE-CHANTELOT et al,前掲, 2006; RUMI et al, Cancer, vol.107, p:2206-2211, 2006)。第二に、約６〜１５％のＰＶ患者、そして３〜５％のＥＴ患者が進行１５年後に血液学的合併症を発症するリスクがある(FINAZZI & HARRISON, Semin. Hematol, vol.42, p:230-238, 2005; KILADJIAN et al, Blood, vol.112, p:1746, 2008; PASSAMONTI et al, Blood, vol.111, p:3383-3387, 2008; PASSAMONTI et al, Haematologica, vol.93, p:1645-1651, 2008)。
【０００９】
ＭＰＤは、散発性症例および家族性症例の双方で共通に、真性赤血球増加症、ほとんどのＰＶ症例ならびにＥＴおよびＰＭＦ症例の半数で、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異により例示される獲得された構成的キナーゼ活性に関連している(MORGAN & GILLIGAND, Annu. Rev. Med., vol.59, p:213-22, 2008; DELHOMMEAU et al, Cell Mol. Life Sci., vol.63(24), p:2939-53, 2006, CAMPBELL & GREEN, N. Engl. J. Med., vol.355(23), p:2452-66, 2006; BELLANNE-CHANTELOT et al,前掲, 2006; JAMES et al, Nature, vol.434, p:1144-1148, 2005; BAXTER et al, Lancet, vol.365, p:1054-1061, 2005; LEVINE et al, Blood, vol.106, p:3377-3379, 2005; KRALOVICS et al, N. Engl. J. Med, vol.352, p:1779-1790, 2005)。ＭＰＤは構成的チロシンキナーゼタンパク質の発現から起こる場合が多い。
・ＣＭＬではＢＣＲ−ＡＢＬ、ＨＥＳではＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲＡ、過好酸球増加症を伴うＣＭＭＬではＴＥＬ−ＰＤＧＦＲＢ、リンパ性増殖と結びついた希なＭＰＤではＺＮＦ１９８−ＦＧＦＲ１、希なＭＰＤ、ＡＭＬおよびＴ細胞リンパ腫ではＰＣＭ１−ＪＡＫ２のような融合による。
・限定された、または単一のヌクレオチド突然変異、すなわち、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ（１８４９Ｇ＞Ｔ）（ＰＶ（９８％）、ＥＴ（７５％）、ＩＭＦ（５０％）および数％のＣＭＭＬ、ＭＤＳ／ＭＰＤおよびＵ−ＭＰＤにおける最近の発見によれば、新しいＭＰＤ分類および診断基準および治療の展望が見込める。さらに、全身性肥満細胞増殖においては、ＫＩＴ突然変異が再発する。
・トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）の受容体における、特に、トリプトファン５１５（ＭＰＬＷ５１５Ｋ／Ｌ／Ａ）の活性化突然変異による(PIKMAN et al, PLoS Med, vol. 3(e270), 2006; CHALIGNE et al, Leukemia, vol. 22, p1557-66, 2008)。
・ｔ（９；２２）（ｐ２４；ｑ１１）によるＢＣＲ／ＪＡＫ２再配列の場合に呈されるＣＭＬの辺縁症例。
【００１０】
染色体９ｐ上のＪＡＫ２遺伝子は１型サイトカイン受容体と結合するチロシンキナーゼをコードする。Ｖ６１７Ｆ突然変異はこのキナーゼの構成的活性化に対するＪＨ２ドメインの自己阻害効果を損なうと推定されている。野生型ＪＡＫ２は、変異タンパク質の活性に対してドミナントネガティブ効果を発揮する。よって、ほとんどのＭＰＤサンプルに見られる。有糸分裂組換えによる変異遺伝子の重複に関連する野生型ＪＡＫ２の欠陥により、変異キナーゼのより高い発現および活性が見込める。
【００１１】
しかしながら、野生型ＪＡＫ２と変異型ＪＡＫ２を同時に発現する真性赤血球増加症、および変異型ＭＰＤから出現するが、芽細胞期にはＪＡＫ２の突然変異を欠いている続発性ＡＭＬの特徴などのいくつかの知見は、ＪＡＫ２の突然変異の前に起こる発癌事象を示唆する。さらに、従前に記載されているように、ＭＰＤ疾患の進行は家族内でも家族間でも実に変動が大きい。よって、ＭＰＤに、より具体的にはそれらの進行に関連するＪＡＫ２以外の少なくとも１つの突然変異が存在するといういくつかの証拠がある。
【００１２】
リンパ性腫瘍はリンパ様の特徴を有する細胞の拡大からなる。急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫はＴ（Ｔ細胞型急性リンパ芽球性白血病；Ｔ−ＡＬＬ）またはＢ（Ｂ前駆細胞型急性リンパ芽球性白血病；ＢＣＰ−ＡＬＬ）起源の、リンパ性分化を遮断された細胞の増殖である。白血病リンパ腫にはナチュラルキラー（ＮＫ）起源のものがある。リンパ腫には、より成熟したリンパ性細胞（ＢまたはＴ）の拡大が含まれる。新生物には慢性のものがあり、Ｔ細胞（前リンパ性白血病）またはＢ細胞（慢性リンパ性白血病）を含み得る。リンパ性新生物の分類は、解剖病理学的分析、分化マーカーおよび病因論データに基づく(Swerdllow S. H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S.,Pileri S.A.,Stein H.,Thiele J.W., Vardiman J. W. (Eds): WHO classification of tumors of haematopoietc and lymphoid tissues. IARC: Lyon 2008)。例えば、未分化大Ｔ細胞リンパ腫はＮＰＭ−ＡＬＫ融合癌遺伝子（およびその変異体）に関連し、濾胞性リンパ腫はｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）染色体転座の後のＢＣＬ２の活性化に関連し、マントル細胞リンパ腫はｔ（１１；１４）（ｑｌ３；ｑ３２）染色体転座の後のＣＣＮＤ１の活性化に関連している。しかしながら、多くのリンパ腫には、病態生理学的メカニズムを示唆する信頼できる分子マーカーが無い。特に、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の５０％、ほとんどの末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）および非濾胞性低悪性度リンパ腫の場合はそうである。
【００１３】
よって、リンパ性および骨髄性新生物、特に、ＭＤＳおよびＭＰＤの同定を、ひいてはそれらの進行の予後診断を可能とする信頼できる診断マーカーの差し迫った必要があった。
【００１４】
テンイレブントランスロケーションタンパク質ファミリーには、最近同定された、機能は未知であるが、それらのＣ末端に２つの保存性の高いドメインを共通に持つことを特徴とするメンバーを含む。本明細書において「ＴＥＴファミリーの遺伝子」とは、最近同定されたテンイレブントランスロケーションファミリーのメンバー、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２またはＴＥＴ３を意味する(Lorsbach et al, Leukemia 2003)。
【００１５】
それらのうちＴＥＴ１は、２つの異なる独立した研究(ONO et al, Cancer Research, vol.62(14), p:4075-80, 2002およびLORSBACH et al, Leukemia, vol.17(3), p:637-41, 2003)において、タンパク質混合型白血病（ＭＬＬ）との融合相手として同定されたことから、唯一研究されている。このタンパク質は、ＬＣＸまたは「Ｎ末端領域にＣＸＸＣドメインを有する白血病関連タンパク質」とも呼ばれ、そのＣ末端領域に［α］らせんコイルドコイル領域を含み、この領域は融合ＭＬＬ−ＴＥＴ１に保持されている。これに対し、ＴＥＴ１のＮ末端ＣＸＸＣドメインは、このタンパク質融合体には存在しない(Ono R, Cancer Research 2002)。この２つの保存性の高いカルボキシ末端領域はＭＬＬ−ＴＥＴ１融合体に含まれる(Lorsbach et al, Leukemia 2003)。一方の保存領域は転座により分断され、他方はＭＬＬと融合される。ＭＬＬ融合相手として７年前に記載されているにもかかわらず、ＴＥＴ１遺伝子の機能および配列分析は、本願の優先日の後に、最近報告されたばかりである。
【００１６】
ＭＬＬ遺伝子はヒト染色体１１ｑ２３に位置し、リンパ性、骨髄性および混合型ヒト白血病の異種の群において再配列されているのが見られる。７０を超える遺伝子座が１１ｑ２３染色体バンドと再配列していることが記載され、これらのうち少なくとも５０がクローニングされ、分子レベルで特性決定が行われている。ＭＬＬ再配列はこれらの遺伝子の８．３ｋｂ塩基にマッピングされている。相手の遺伝子は常に５’部分ＭＬＬとフレーム内で融合され、ＭＬＬそれ自体を含む。ＭＬＬの増幅もまた報告されている。相手の遺伝子は異なる機能を有するタンパク質をコードしている。ＭＬＬ融合では、転写活性化ドメイン、クロマチン改変複合体動員または二量体形成／オリゴマー形成モチーフを提供してもよい。実際、マウスモデルにおいて白血病を誘発するにはＭＬＬ−β−ガラクトシダーゼ（四量体形成可能な細菌タンパク質）または二量体形成ドメインの発現で十分である。よって、そのＭＬＬとの融合からタンパク質の機能または細胞形質転換におけるその非依存的関連を推論することはできない(The versatile mixed lineage leukaemia gene MLL and its many associations in leukaemogenesis. Daser A, Rabbitts TH. Semin Cancer Biol. 2005 Jun;15(3):175-88. Review. Chromosomal rearrangements leading to MLL gene fusions: clinical and biological aspects. Harper DP, Aplan PD. Cancer Res. 2008 Dec 15;68(24):10024-7)。
【００１７】
これに対して、４ｑ２４染色体領域に位置している遺伝子によりコードされているＴＥＴ２タンパク質と、２ｐ１２染色体領域に位置している遺伝子によりコードされているＴＥＴ３タンパク質について知られていることは少ない。
【００１８】
より具体的には、テンイレブントランスロケーション癌遺伝子２（ＴＥＴ２）が最近命名された(Lorsbach et al, Leukemia 2003)。染色体領域４ｑ２４に位置しているＴＥＴ２遺伝子は１３０Ｋｂを超えて散在する１１のエキソンを含んでなり、通常、広く発現される。この遺伝子は受託番号５７７９０で参照され、そのｃＤＮＡ（受託番号ＮＭ＿００１１２７２０８、配列番号１）は２００２アミノ酸のタンパク質（受託番号ＮＰ＿００１１２０６８０、配列番号２）をコードしている。
【００１９】
ＴＥＴ２タンパク質は、オーソロガスショウジョウバエ推定タンパク質と２つの保存性の高い領域を共有する。これらの領域は、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（アミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）と、ｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する第二の８０アミノ酸の領域（アミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）である（これらの領域は図１で強調されている）。ＴＥＴ２の推定配列は特定の機能に相当するモチーフが明らかになっていない。
【００２０】
本発明者らは、本明細書で、テンイレブントランスロケーション 2（ＴＥＴ２）遺伝子の片方または両方のコピーが、ＭＰＤ、ＭＤＳおよびＣＭＭＬ、またリンパ腫でも、後天的突然変異により不活性化／改変されていることが多いことを報告する。これらの事象は造血幹細胞を標的とし、骨髄性またはリンパ性新生物における腫瘍抑制遺伝子としてのＴＥＴ２の重要な機能を示す。
【発明の概要】
【００２１】
第一の態様において、本発明は、被験体において骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍を診断するためのin vitro法であって、
（ｉ）配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするテンイレブントランスロケーションタンパク質ファミリーメンバー２遺伝子（ＴＥＴ２）の突然変異の存在を検出すること、および／または
（ｉｉ）ＴＥＴ２遺伝子の発現を分析すること
により、該被験体からの生体サンプルを分析する工程を含んでなり、
このようなＴＥＴ２突然変異の検出、ＴＥＴ２の無発現の検出または末端切断型ＴＥＴ２の発現の検出、が骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍を発症している、または発症する疾病素因のある被験体の指標となる方法を提供する。
【００２２】
好ましい実施態様では、前記被験体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００２３】
別の好ましい実施態様では、前記骨髄性癌は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）および骨髄異形成／骨髄増殖性症候群からなる群から選択される。
【００２４】
さらに別の好ましい実施態様では、前記リンパ性腫瘍はリンパ腫、より好ましくはＴ細胞リンパ腫からなる群から選択される。
【００２５】
好ましくは、前記突然変異は、配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするＴＥＴ２遺伝子（配列番号３９の配列を有するｃＤＮＡによりコードされる）の各コピーで検出され、欠失、挿入および点突然変異（スプライス部位に影響する突然変異、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異、好ましくは、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異など）からなる群に含まれる。
【００２６】
本発明のより好ましい態様では、該突然変異は、ＴＥＴ２タンパク質の無発現または末端切断型ＴＥＴ２タンパク質の発現をもたらす欠失または挿入である。
【００２７】
いっそうより好ましくは、この末端切断型ＴＥＴ２タンパク質は、他のＴＥＴタンパク質に共有され、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、またはｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つ、好ましくは、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）を含まない。
【００２８】
例えば、これらの欠失または挿入は表Ｉ（核酸配列は配列番号３９、アミノ酸配列は配列番号２参照）に開示されているものを含んでなる、またはからなる群から選択され得る。
【００２９】
【表１】
0005802952.tif 000002
0005802952.tif 000003
0005802952.tif 000004
【００３０】
本発明の別のより好ましい態様では、該突然変異は、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレーム内、好ましくは、ＴＥＴタンパク質により共有されおり、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つの内部、より好ましくは、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）内に位置するミスセンス突然変異である。例えば、これらのミスセンス突然変異は、Ｉ１１７５Ｖ、Ｌ１１９７Ｎ、Ｈ１２１９Ｙ、Ｅ１２３５Ｖ、Ｃ１２７１Ｗ、Ｋ１２９９Ｅ、Ｌ１３４０Ｐ、Ｒ１３０２Ｇ、Ｇ１３７０Ｅ、Ａ１３４４Ｅ、Ｎ１３８７Ｓ、Ｖ１４１７Ｆ、Ｈ１８６８Ｒ、Ｇ１８６９Ｗ、Ｌ１８７２Ｐ、Ｉ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆを含んでなるまたはからなる群から選択することができ、好ましくは、Ｌ１１９７Ｎ、Ｈ１２１９Ｙ、Ｅ１２３５Ｖ、Ｃ１２７１Ｗ、Ｋ１２９９Ｅ、Ｌ１３４０Ｐ、Ｒ１３０２Ｇ、Ｇ１３７０Ｅ、Ａ１３４４Ｅ、Ｎ１３８７Ｓ、Ｈ１８６８Ｒ、Ｇ１８６９Ｗ、Ｌ１８７２Ｐ、Ｉ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆを含んでなるまたはからなる群から選択することができ、より好ましくは、Ｈ１８６８Ｒ、Ｇ１８６９Ｗ、Ｌ１８７２Ｐ、Ｉ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆを含んでなるまたはからなる群から選択することができる。
【００３１】
本発明の別のより好ましい態様では、該突然変異は、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレーム内、好ましくは、ＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つの手前または内部、より好ましくは、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４アミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）の手前または内部に位置するナンセンス突然変異である。例えば、該ナンセンス突然変異は、Ｑ２３２Ｓｔｏｐ、Ｑ３２１Ｓｔｏｐ、Ｓ３５４Ｓｔｏｐ、Ｑ４１７Ｓｔｏｐ、Ｒ５４４Ｓｔｏｐ、Ｒ５５０Ｓｔｏｐ、Ｑ５５７Ｓｔｏｐ、Ｑ５７４Ｓｔｏｐ、Ｑ６３５Ｓｔｏｐ、Ｑ６４２Ｓｔｏｐ、Ｑ６８５Ｓｔｏｐ、Ｌ６９９Ｓｔｏｐ、Ｓ７９２Ｓｔｏｐ、Ｑ８９１Ｓｔｏｐ、Ｑ９４３Ｓｔｏｐ、Ｅ１０２６Ｓｔｏｐ、Ｒ１０６７Ｓｔｏｐ、Ｒ１２１６Ｓｔｏｐ、Ｙ１２２５Ｓｔｏｐ、Ｒ１４０４Ｓｔｏｐ、Ｌ１４５７Ｓｔｏｐ、Ｒ１４６５Ｓｔｏｐ、Ｒ１５１６Ｓｔｏｐ、Ｑ１５２４Ｓｔｏｐ、Ｑ１５４２Ｓｔｏｐ、Ｎ１６２４Ｓｔｏｐ、Ｙ１７２４Ｓｔｏｐ、Ｙ１７５１Ｓｔｏｐ、Ｌ１８１９Ｓｔｏｐ、Ｑ１８３４ＳｔｏｐおよびＷ１８４７Ｓｔｏｐ含んでなるまたはからなる群から選択することができる。
【００３２】
本発明の別の態様では、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異は、配列番号２の配列を有するポリペプチドの無発現または発現不足を、より好ましくは、ＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つ、より好ましくは、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）の無発現または発現不足を誘発する。
【００３３】
第二の態様において、本発明は、被験体において骨髄性癌を診断するためのキットであって、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異の存在を検出するため、および／またはＴＥＴ２遺伝子の発現を分析するために、これまでに定義されたような方法で使用可能な少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つの抗体を含んでなるキットを提供する。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様では、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＰＣＲプライマー、好ましくはＰＣＲプライマーセットである。
【００３５】
より好ましくは、該プライマーセットは配列番号５〜配列番号３８からなる群から選択される（実施例参照）。
【００３６】
第三の態様において、本発明は、ＴＥＴ２突然変異、ＴＥＴ２の無発現または末端切断型ＴＥＴ２の発現が検出された骨髄性またはリンパ性腫瘍に罹患している患者を処置するための低メチル化剤(hypomethylating agent)の使用を提供する。
【００３７】
最後の態様において、本発明は、腫瘍、ＴＥＴ２突然変異、ＴＥＴ２の無発現または末端切断型ＴＥＴ２の発現が検出された骨髄性またはリンパ性腫瘍に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体に治療上有効な量の低メチル化剤(hypomethylating agent)を投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【発明の具体的説明】
【００３８】
本発明は、ＴＥＴ２対立遺伝子が一般に、リンパ性腫瘍、またはＭＰＤ、ＡＭＬもしくはＭＤＳなどの骨髄性腫瘍に罹患している患者の腫瘍細胞における突然変異および／または欠失により標的とされることが多く、ヒト骨髄性悪性疾患の真の腫瘍抑制遺伝子と考えられるという本発明者らによる発見に基づく。
【００３９】
第一の態様において、本発明者らは、散発性癌に関して、一連の非選抜患者におけるＴＥＴ２突然変異の頻度が、ＭＰＤ患者で１２％、ＭＤＳ患者で１８．５％、ｓＡＭＬ患者で２４％、ＣＭＭＬ患者で５０％までであったことを報告する。また、本発明者らは、突然変異した造血幹細胞が増殖の増強をもたらす成長の優位性を付与することから、ＴＥＴ２が骨髄性悪性障害における腫瘍抑制遺伝子であることを実証した。
【００４０】
第二の態様において、本発明者らは、６１の家族性ＭＰＤ症例（すなわち、ＰＶ、ＥＴおよびＰＭＦ）の分析により、ＴＥＴ２遺伝子の異常が、より高いＰＭＦ罹患率（４２％）を有する３つの主要なＭＰＤ表現型（ＰＶ、ＥＴおよびＰＭＦ）の２０％に見られることを実証した。
【００４１】
ＰＶまたはＥＴを有すると診断されたＴＥＴ２陽性患者のうち７７％が骨髄繊維症（ＭＦ）を発症するが、このことはＴＥＴ２の後天的事象の存在がこの疾患の進行に影響を及ぼすことが示唆される。４人の患者（ＰＶが３人、ＥＴが１人）において、本発明者らは、ＴＥＴ２の欠陥が１〜７年、血液学的合併症を進行させた。ＴＥＴ２に欠陥を有する患者はＭＦを進行しやすい。このことは、ＴＥＴ２の後天的突然変異と疾患の重篤度の間、より具体的には、ＴＥＴ２とＭＦの発症の間の関連の可能性を示唆するところが大きい。
【００４２】
第三の態様において、本発明者らは、散発性癌に関して、Ｔ細胞リンパ性腫瘍に罹患している患者におけるＴＥＴ２突然変異の頻度が〜２０％であったことを報告する。最後に、Ｂ細胞リンパ性腫瘍に罹患している患者ではＴＥＴ２の再配列が見られた。
【００４３】
よって、本発明の第一の態様において、被験体において骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍を診断するためのin vitro法であって、
（ｉ）配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするテンイレブントランスロケーションタンパク質ファミリーメンバー２遺伝子（ＴＥＴ２）の突然変異の存在を検出すること、および／または
（ｉｉ）ＴＥＴ２遺伝子の発現を分析すること
により、該被験体からの生体サンプルを分析する工程を含んでなり、
ＴＥＴ２突然変異の検出、ＴＥＴ２の無発現の検出または末端切断型ＴＥＴ２の発現の検出が、骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍を発症している、または発症する疾病素因のある被験体の指標となる方法が提供される。
【００４４】
最近の証拠では、ＴＥＴファミリーのタンパク質が５−メチルシトシンから５−ヒドロキシメチルシトシンへの変換を担う酵素をコードしており(TAHILIANI et al., Sciencexpress, 2009)、従って、ＣｐＧの脱メチル化および後生的調節に潜在的役割を有することが示されている。さらに、この参照文献では、ほとんどの場合でＴＥＴ２突然変異が見られる、保存されているＴＥＴドメインがこの活性に関連していることが確認されている。
【００４５】
並行して、昨年、いくつかの研究により、ＭＤＳにおける低メチル化剤(hypomethylating agent)の役割が確認された(ITZYKSON & FENAUX, Current Opinion in Hematology, vol.16, p:77-83, 2009)。
【００４６】
今般、本発明者らの結果はさらに、一部のＭＤＳにおいて見られた低メチル化剤(hypomethylating agent)の有効性がＴＥＴ２突然変異を有するＭＤＳにおける脱メチル化欠陥に起因することを示す。
【００４７】
よって、本発明者らの結果は、腫瘍、ＴＥＴ２突然変異、ＴＥＴ２の無発現または末端切断型ＴＥＴ２の発現が検出された、ＭＤＳなどのリンパ性または骨髄性腫瘍に罹患している被験体における低メチル化剤(hypomethylating agent)の使用を示す。
【００４８】
結果として、好ましい実施態様によれば、ＴＥＴ２突然変異の検出、ＴＥＴ２の無発現の検出または末端切断型ＴＥＴ２の発現の検出は、脱メチル化欠陥のある骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍を発症している被験体の指標となり、この被験体はアザシチジン（ＡＺＡ）などの脱メチル化剤で有利に処置することができる。
【００４９】
好ましくは、本発明の方法は骨髄性腫瘍を診断するために特化される。
【００５０】
実際、本発明者らは、骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍に罹患している患者のＴＥＴ２突然変異の頻度が１０％を超えることを確認した。
【００５１】
本発明はさらに、従来の手段によっては病巣または前駆体として検出することができない浸潤性骨髄性新生物または浸潤性リンパ性腫瘍を発達させる可能性を有する細胞の有無を検出するための方法を提供する。
【００５２】
本明細書において「被験体」とは、哺乳類、好ましくはヒトを意味する。
【００５３】
該被験体は健康であり得るが、本発明の方法は骨髄性癌（すなわち骨髄性腫瘍）またはリンパ性腫瘍を発症している、または発症する疾病素因があると思われる被験体を試験するために特に有用である。その場合、本発明の方法は、骨髄性癌（すなわち骨髄性腫瘍）またはリンパ性腫瘍を発症している、または発症する疾病素因があることを確認することができる。
【００５４】
より好ましくは、該リンパ性腫瘍は、ＴまたはＢ細胞リンパ腫などのリンパ腫、より好ましくはＴ細胞リンパ腫からなる群から選択される。
【００５５】
いっそうより好ましくは、該骨髄性癌（すなわち骨髄性腫瘍）は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）および骨髄異形成／骨髄増殖性症候群からなる群から選択される。有利には、該骨髄性癌は骨髄異形成／骨髄増殖性症候群、好ましくは、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。
【００５６】
好ましい実施態様によれば、本発明の方法は被験体において骨髄繊維症（ＭＦ）を診断するためのものであり、該被験体は真性赤血球増加症（ＰＶ）または血小板血症（ＥＴ）に罹患しており、ＴＥＴ２の突然変異またはＴＥＴ２の発現不足の検出は骨髄繊維症（ＭＦ）を発症している、または発症する疾病素因のある被験体の指標となる。
【００５７】
さらに別の好ましい実施態様によれば、被験体は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に罹患しており、ＴＥＴ２の突然変異またはＴＥＴ２の発現不足の検出は良好な予後を有する被験体の指標となる。
【００５８】
本明細書において、良好な予後とは、ＭＤＳに罹患しており、ＡＭＬを発症するリスクの低い患者に相当する。
【００５９】
実際、本発明者らは、５年生存率が非変異患者に比べてＭＤＳに罹患しているＴＥＴ２変異患者で有意に高まったことを確認した（ｐ＜０．０５）。
【００６０】
本明細書において「生体サンプル」とは、例えば、肺生検などの固形組織；例えば、痰、誘発痰、血液、血清、血漿、尿などの口内スワブ、体液および排泄物を意味する。好ましくは、該生体サンプルは骨髄サンプルである。
【００６１】
本発明のこの態様において、該方法は配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするＴＥＴ２遺伝子の突然変異の存在を検出する工程を含んでなる。
【００６２】
本明細書において「突然変異」とは、元の核酸配列の配列におけるいずれかの改変に相当する。これらの突然変異は小規模突然変異または大規模突然変異を含んでなる。小規模突然変異は、ＤＮＡにおける点突然変異、１以上の余分なヌクレオチドの挿入または欠失を含む、１または数個のヌクレオチドで遺伝子に影響を及ぼすものである。点突然変異はサイレント、ミスセンスおよびナンセンス突然変異であり得る。ゲノム構造における大規模突然変異は、遺伝子の重複、欠失、またはその効果が元々離れていたＤＮＡ片を近接させ、可能性としては離れていた遺伝子を一緒にして機能的に異なる融合遺伝子を形成させる突然変異などである。これらの最後の突然変異には、染色体転座、中間部欠失、染色体逆位および異型接合性(heterezygosity)の欠損が含まれる。
【００６３】
好ましくは、試験する被験体からのゲノムＤＮＡ（または場合によりＲＮＡ）を含む細胞を含有する生体サンプルだけが必要とされる。
【００６４】
好ましくは、この検出工程はＴＥＴ２遺伝子の各対立遺伝子上で実現される。実際、この診断は、突然変異が配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするＴＥＴ２の各対立遺伝子で検出される場合にはより信頼性が高い。
【００６５】
特定の実施態様では、本発明のin vitro法は欠失、挿入および点突然変異（スプライス部位に影響する突然変異、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異、好ましくは、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異など）からなる群に含まれる突然変異を検出することを目的とする。
【００６６】
本発明者らは、このような突然変異の存在が骨髄性またはリンパ性癌に関連していることを確認した。さらに、本発明者らは、ＴＥＴ２タンパク質のポリペプチドＣ末端ドメインが好都合にも、検討される患者の有害な突然変異により標的とされることを見出した（実施例参照）。
【００６７】
欠失または挿入については、この欠失または挿入は好ましくは、ＴＥＴ２タンパク質の無発現または末端切断型ＴＥＴ２タンパク質の発現をもたらし、この末端切断型ＴＥＴ２タンパク質は、他のＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、またはｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域の少なくとも１つを含まない。より好ましくは、該末端切断型ＴＥＴ２タンパク質は、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）を含まない。
【００６８】
例えば、これらの欠失または挿入は表１に開示されているものから選択することができる。
【００６９】
ミスセンス突然変異については、このミスセンス突然変異は好ましくは、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレームに、好ましくは、ＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つに位置する。
【００７０】
例としては、このミスセンス突然変異は、Ｉ１１７５Ｖ、Ｌ１１９７Ｎ、Ｈ１２１９Ｙ、Ｅ１２３５Ｖ、Ｃ１２７１Ｗ、Ｋ１２９９Ｅ、Ｌ１３４０Ｐ、Ｒ１３０２Ｇ、Ｇ１３７０Ｅ、Ａ１３４４Ｅ、Ｎ１３８７Ｓ、Ｖ１４１７Ｆ、Ｈ１８６８Ｒ、Ｇ１８６９Ｗ、Ｌ１８７２Ｐ、Ｉ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆを含んでなるまたはからなる群から、好ましくは、Ｉ１１７５Ｖ、Ｌ１１９７Ｎ、Ｈ１２１９Ｙ、Ｅ１２３５Ｖ、Ｃ１２７１Ｗ、Ｋ１２９９Ｅ、Ｌ１３４０Ｐ、Ｒ１３０２Ｇ、Ｇ１３７０Ｅ、Ａ１３４４Ｅ、Ｎ１３８７Ｓ、Ｈ１８６８Ｒ、Ｇ１８６９Ｗ、Ｌ１８７２Ｐ、Ｉ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆを含んでなるまたはからなる群から選択される。
【００７１】
より好ましくは、該ミスセンス突然変異はタンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に位置する。いっそうより好ましくは、該ミスセンス突然変異は、Ｈ１８６８Ｒ、Ｇ１８６９Ｗ、Ｌ１８７２Ｐ、Ｉ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆ、例としてはＩ１８７３Ｔ、Ｒ１８９６ＭおよびＳ１８９８Ｆを含んでなるまたはからなる群から選択される。
【００７２】
ナンセンス突然変異については、このナンセンス突然変異は好ましくは、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレーム内、好ましくは、ＴＥＴ２タンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、またはｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つの手前に停止突然変異の導入をもたらす。
【００７３】
例として、該ナンセンス突然変異は、Ｑ２３２Ｓｔｏｐ、Ｑ３２１Ｓｔｏｐ、Ｓ３５４Ｓｔｏｐ、Ｑ４１７Ｓｔｏｐ、Ｒ５４４Ｓｔｏｐ、Ｒ５５０Ｓｔｏｐ、Ｑ５５７Ｓｔｏｐ、Ｑ５７４Ｓｔｏｐ、Ｑ６３５Ｓｔｏｐ、Ｑ６４２Ｓｔｏｐ、Ｑ６８５Ｓｔｏｐ、Ｌ６９９Ｓｔｏｐ、Ｓ７９２Ｓｔｏｐ、Ｑ８９１Ｓｔｏｐ、Ｑ９４３Ｓｔｏｐ、Ｅ１０２６Ｓｔｏｐ、Ｒ１０６７Ｓｔｏｐ、Ｒ１２１６Ｓｔｏｐ、Ｙ１２２５Ｓｔｏｐ、Ｒ１４０４Ｓｔｏｐ、Ｌ１４５７Ｓｔｏｐ、Ｒ１４６５Ｓｔｏｐ、Ｒ１５１６Ｓｔｏｐ、Ｑ１５２４Ｓｔｏｐ、Ｑ１５４２Ｓｔｏｐ、Ｎ１６２４Ｓｔｏｐ、Ｙ１７２４Ｓｔｏｐ、Ｙ１７５１Ｓｔｏｐ、Ｌ１８１９Ｓｔｏｐ、Ｑ１８３４ＳｔｏｐおよびＷ１８４７Ｓｔｏｐを含んでなるまたはからなる群、好ましくは、Ｑ３２１Ｓｔｏｐ、Ｓ３５４Ｓｔｏｐ、Ｒ５４４Ｓｔｏｐ、Ｑ５５７Ｓｔｏｐ、Ｒ１２１６ＳｔｏｐおよびＹ１７２４Ｓｔｏｐを含んでなるまたはからなる群から選択される。
【００７４】
また、該ナンセンス突然変異は、ＴＥＴ２タンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、またはｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域のうちの少なくとも１つの内部に停止突然変異の導入をもたらし得る。
【００７５】
より好ましくは、該ナンセンス突然変異は、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレーム内の、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）の手前に停止突然変異の導入をもたらし得る。例として、該ナンセンス突然変異は、Ｑ２３２Ｓｔｏｐ、Ｑ３２１Ｓｔｏｐ、Ｓ３５４Ｓｔｏｐ、Ｑ４１７Ｓｔｏｐ、Ｒ５４４Ｓｔｏｐ、Ｒ５５０Ｓｔｏｐ、Ｑ５５７Ｓｔｏｐ、Ｑ５７４Ｓｔｏｐ、Ｑ６３５Ｓｔｏｐ、Ｑ６４２Ｓｔｏｐ、Ｑ６８５Ｓｔｏｐ、Ｌ６９９Ｓｔｏｐ、Ｓ７９２Ｓｔｏｐ、Ｑ８９１Ｓｔｏｐ、Ｑ９４３Ｓｔｏｐ、Ｅ１０２６Ｓｔｏｐ、Ｒ１０６７Ｓｔｏｐ、Ｒ１２１６Ｓｔｏｐ、Ｙ１２２５Ｓｔｏｐ、Ｒ１４０４Ｓｔｏｐ、Ｌ１４５７Ｓｔｏｐ、Ｒ１４６５Ｓｔｏｐ、Ｒ１５１６Ｓｔｏｐ、Ｑ１５２４Ｓｔｏｐ、Ｑ１５４２Ｓｔｏｐ、Ｎ１６２４Ｓｔｏｐ、Ｙ１７２４Ｓｔｏｐ、Ｙ１７５１Ｓｔｏｐ、Ｌ１８１９ＳｔｏｐおよびＱ１８３４Ｓｔｏｐを含んでなるまたはからなる群から選択される。
【００７６】
また、該ナンセンス突然変異は、ＴＥＴ２タンパク質のオープンリーディングフレーム内の、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）内に停止突然変異の導入をもたらし得る。例として、該ナンセンス突然変異はＷ１８４７Ｓｔｏｐである。
【００７７】
突然変異の存在を検出するための典型的な技術としては、制限断片長多型、ハイブリダイゼーション技術、ＤＮＡシーケンシング、エキソヌクレアーゼ耐性、マイクロシーケンシング、ｄｄＮＴＰを用いた固相エクステンション、ｄｄＮＴＰを用いた液相エクステンション、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションなどの一塩基多型検出法、連結連鎖反応、ミニシーケンシング、ＤＮＡ「チップ」、ＰＣＲまたはモレキュラービーコンと併合した単一または二重標識プローブを用いた対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションその他を含み得る。
【００７８】
有利には、変更はＰＣＲと配列決定、ＳＮＰ−アレイまたはＣＧＨ（これらは総て、当業者に周知である）のいずれかによりＴＥＴ２遺伝子のｃＤＮＡまたはＤＮＡで検出される。
【００７９】
分子生物学および生物情報科学において、ＳＮＰアレイは集団内に多型を検出するために用いられる一種のＤＮＡマイクロアレイである。ＳＮＰアレイの基本原理はＤＮＡマイクロアレイと同じである。これらはＤＮＡハイブリダイゼーションと蛍光顕微鏡と固相表面ＤＮＡ捕捉を合わせたものである。ＳＮＰアレイの３つの必須成分は、ｉ）固定化された核酸配列または標的を含むアレイ；ｉｉ）１以上の標識対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ；およびｉｉｉ）ハイブリダイゼーションシグナルを記録および解釈する検出系である（Sheils, O., Finn, S. and O'Leary J. (2003) "Nucleic acid microarray: an overview." Current Diagnostic Pathology. 9:155-158参照）。
【００８０】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、腫瘍の遺伝子変異をスクリーニングする分子細胞遺伝学的方法である。この変異はＤＮＡの増分および損失として分類され、染色体レベルおよび染色体下レベルでの突然変異を含む特徴的なパターンを明らかにする。この方法は蛍光標識された腫瘍ＤＮＡ（多くの場合、フルオレセイン（ＦＩＴＣ））および正常ＤＮＡ（多くの場合、ローダミンまたはテキサスレッド）と正常ヒト分裂中期標本とのハイブリダイゼーションに基づく。エピ蛍光顕微鏡と定量的画像解析を用い、対照ＤＮＡに対する増分／欠損の蛍光比の領域的違いを検出し、ゲノムにおける異常な領域を同定するために使用することができる。ＣＧＨはアンバランスな染色体変異だけを検出する。バランスのとれた相互転座または逆位などの構造的な染色体異常は、コピー数を体系的に変化させないので、通常は検出できない(Emanuel BS, Saitta SC. From microscopes to microarrays: dissecting recurrent chromosomal rearrangements. Nat Rev Genet. 2007 Nov;8(11):869-83. Review)。
【００８１】
本発明の別の好ましい実施態様では、該方法はＴＥＴファミリーメンバー２遺伝子（ＴＥＴ２）の発現を分析する工程を含んでなる。
【００８２】
本発明者らにより得られた結果によれば、これまでに開示されているようなＴＥＴ２タンパク質の無発現もしくは発現不足、または末端切断型ＴＥＴ２タンパク質の発現は骨髄性癌に関連している。
【００８３】
遺伝子の発現を分析する方法は当業者に周知である。
【００８４】
本発明の特定の実施態様では、このＴＥＴ２遺伝子の発現は、該遺伝子のｍＲＮＡ転写物、または新生ＲＮＡなどのｍＲＮＡ前駆体の発現を分析することにより評価される。
【００８５】
このような分析は、被験体由来の生体サンプルの細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製し、このｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより評価することができる。調製されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、限定されるものではないが、サザンまたはノーザン分析、定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ）などのポリメラーゼ連鎖反応分析、およびＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ＤＮＡアレイ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）などのプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。
【００８６】
有利には、ＴＥＴ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルの分析は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号に示されている試験実施態様）、リガーゼ連鎖反応(BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991)、自律的配列複製(GUATELLI et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990)、転写増幅系(KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989)、Ｑ−βレプリカーゼ(LIZARDI et al, Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988)、ローリング・サークル・レプリケーション（米国特許第５，８５４，０３３号）または他のいずれかの核酸増幅法などによる核酸増幅のプロセスと、その後の当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少ない数でしか存在しない場合に、このような分子の検出に特に有用である。本明細書において、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）とアニールすることができ、間に短い領域を含む、核酸分子対であると定義される。一般に、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域をフランキングする。適当な条件下で、適当な試薬を用い、このようなプライマーは、プライマーによりフランキングされたヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子の増幅を可能とする。
【００８７】
別の特定の実施態様において、ＴＥＴ２遺伝子の発現は、該遺伝子から翻訳されたＴＥＴ２タンパク質の発現を分析することにより評価される。
【００８８】
このような分析は、抗体（例えば、放射性標識、発色団標識、蛍光団標識または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質、またはタンパク質／リガンド対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質またはタンパク質のリガンドとの抗体コンジュゲート）、またはＴＥＴ２タンパク質と特異的に結合する抗体断片（例えば、単鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）を用いて評価することができる。該分析は、限定されるものではないが、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を含む、当業者に周知の多様な技術により評価することができる。
【００８９】
ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギまたはヤギなどの好適な動物をＴＥＴ２タンパク質（配列番号２）またはその断片（例えば、少なくとも１０または１５アミノ酸）で免疫することにより作製することができる。免疫した動物の抗体力価は、固定化ポリペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるなどの標準的な技術により経時的にモニタリングすることができる。免疫後の適当な時点、例えば、特定の抗体力価が最高になった際に、動物から抗体生産細胞を取得し、最初にKOHLER and MILSTEIN (Nature, vol.256, p:495-497, 1975)により記載されているハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(KOZBOR et al, Immunol, vol.4, p: 72, 1983)、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(COLE et al, In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc, p: 77-96, 1985)またはトリオーマ技術などの標準的な技術により、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するために使用することができる。ハイブリドーマを生産するための技術は周知である（一般に、Current Protocols in Immunology, COLIGAN et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994参照）。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡを用い、ハイブリドーマ培養上清を目的ポリペプチドと結合する抗体に関してスクリーニングすることにより検出される。
【００９０】
これまでに述べたように、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異はＴＥＴ２タンパク質の無発現または発現不足を誘発し得る。
【００９１】
本明細書においてポリペプチドの「発現不足」は、その遺伝子の転写および／または翻訳が突然変異によって影響を受け、生体サンプルにおいて、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差より低い、好ましくは該遺伝子の正常な発現レベルよりも少なくとも２０％劣る、好ましくは該遺伝子の正常な発現レベルよりも少なくとも５０％劣る、最も好ましくは該遺伝子の正常な発現レベルよりも少なくとも１００％劣る発現レベルをもたらす場合に生じる。
【００９２】
よって、本発明の方法は、被験体からの生体サンプルにおけるＴＥＴ２遺伝子の発現レベルを対照におけるその発現レベル（すなわち、正常な発現レベル）と比較することを含み得る。被験体の生体サンプルにおける該遺伝子の発現レベルが正常な発現レベルに比べて有意に低ければ、その患者は骨髄性新生物を発症する可能性があることを示す。
【００９３】
本明細書において「対照」は、好ましくは、非腫瘍細胞を含んでなる対照サンプルに相当する。好ましくは、該対照は末梢血白血球（ＰＢＬ）に、最も好ましくは、エプスタイン・バーウイルスで不死化された末梢血白血球に相当する。
【００９４】
よって、ＴＥＴ２遺伝子の「正常な」発現レベルは、非腫瘍細胞の生体サンプルにおける該遺伝子の発現レベルである。好ましくは、該正常な発現レベルは対照サンプルで評価され、好ましくは、いくつかの対照サンプルで該遺伝子の平均発現レベルが評価される。
【００９５】
ＴＥＴ２遺伝子の正常な発現の分析は、これまでに記載されているように、転写された核酸または翻訳されたタンパク質の発現を検出するための多様な周知の方法のいずれによって評価してもよい。
【００９６】
本発明の好ましい実施態様では、このようなＴＥＴ２遺伝子の突然変異は、ＴＥＴタンパク質により共有されており、ｉ）タンパク質ＴＥＴ２の中央付近に位置する３１０アミノ酸の領域（配列番号３のアミノ酸１１３４〜アミノ酸１４４４）、およびｉｉ）タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）に相当する２つの保存性の高い領域、より好ましくは、タンパク質ＴＥＴ２のカルボキシ末端付近に位置する８０アミノ酸の領域（配列番号４のアミノ酸１８４３からアミノ酸１９２２までに相当する）の無発現または発現不足を誘発する。
【００９７】
第二の態様において、本発明は、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異の存在を検出するため、および／またはＴＥＴ２遺伝子の発現を分析するために、本発明で定義される方法において使用可能な、少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つの抗体を含んでなる、被験体において骨髄性癌またはリンパ性癌を診断するためのキットに関する。
【００９８】
好ましくは、該オリゴヌクレオチド少なくとも１つのＰＣＲプライマーであり、好ましくは、ＴＥＴ２遺伝子またはその断片を増幅することができるＰＣＲプライマーセットが提供される。当業者ならば、ＴＥＴ２の核酸配列が周知であれば（受託番号ＮＭ＿００１１２７２０８、配列番号１）(Current Protocols in Molecular Biology; Fred M. Ausubel et al編,前掲)、ＴＥＴ２遺伝子の領域を増幅することができるオリゴヌクレオチドまたはＰＣＲプライマーセットを容易に準備することができる。
【００９９】
好ましい実施態様では、該キットは、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異の存在を検出するため、および／または該遺伝子の発現を分析するために、配列番号５〜配列番号３８（実施例および配列表を参照）からなる群から選択される少なくとも１つのＰＣＲプライマーを含んでなる。
【０１００】
本明細書において「キット」とは、材料を送達するための任意の送達系を意味する。反応アッセイに関しては、このような送達系は、反応試薬（例えば、適当な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）の貯蔵、輸送またはある場所から別の場所への送達を可能とする系および／または補助材料（例えば、バッファー、アッセイの実施に関する説明書など）を含む。例えば、キットは関連のある反応試薬および／または補助材料を含む１以上の封入物（例えば箱）を含む。本明細書において「断片化キット(fragmented kit)」とは、それぞれ全キット成分の一部分を含む２以上の個別容器を含んでなる送達系を意味する。これらの容器は意図する受容者に一緒にまたは個別に送達することができる。例えば、第一の容器にアッセイに用いる酵素を含有し、第二の容器にオリゴヌクレオチドを含有してもよい。「断片化キット」とは、連邦食品・医薬品・化粧品法の５２０（ｅ）条の下で規制されているアナライト特異的試薬（ＡＳＲ）を含有するキットを包含するものとするが、これに限定されるものではない。実際、それぞれ全キット成分の一部分を含む２以上の個別容器を含んでなるいずれの送達系もこの「断片化キット」という用語に含まれる。これに対し、「組合せキット」とは、単一の容器（例えば、それぞれ所望の成分を収容する単一の箱）に反応アッセイの全成分を含有する送達系を意味する。「キット」とは、断片化キットと組合せキットの双方を含む。
【０１０１】
本キットはまた、本方法の実施を容易にするための、１以上の試薬、バッファー、ハイブリダイゼーション媒体、核酸、プライマー、ヌクレオチド、プローブ、分子量マーカー、酵素、固相支持体、データベース、処理順序を計算するためのコンピュータープログラムおよび／またはマルチウェルプレートなどの使い捨て実験器具も含み得る。本キットに含めることができる酵素としては、ヌクレオチドポリメラーゼなどが挙げられる。固相支持体としてはビーズなどが挙げられ、分子量マーカーとしてはコンジュゲート可能なマーカー、例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンなどが挙げられる。
【０１０２】
一つの実施態様では、このキットは、被験体において骨髄性癌またはリンパ性癌を診断するために本明細書に記載される方法を実施するための説明からなる。これらの説明は、紙に印刷したものまたはコンピューターで読み取り可能な媒体などの有形媒体によって理解できる任意の形態で提供することができる。
【０１０３】
本発明のなおさらなる態様は、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異の存在を検出するため、および／またはＴＥＴ２遺伝子の発現を分析するために、定義されたような方法で使用可能な、少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つの抗体を含んでなる上述のキットの、骨髄性癌またはリンパ性癌を診断するための使用に関する。
【０１０４】
有利には、骨髄性癌は骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患および骨髄異形成／骨髄増殖性症候群からなる群から選択される。
【０１０５】
いっそう有利には、該リンパ性癌は、ＴまたはＢ細胞リンパ腫などのリンパ腫、より好都合にはＴ細胞リンパ腫からなる群から選択される。
【０１０６】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍、ＴＥＴ２の突然変異、ＴＥＴ２の無発現または末端切断型ＴＥＴ２の発現が検出された、骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍に罹患している患者を処置するための低メチル化剤(hypomethylating agent)の使用に関する。
【０１０７】
好ましくは、該骨髄性腫瘍はＭＤＳではない。
【０１０８】
低メチル化剤(hypomethylating agent)は当業者に周知であり、例えば、アザシチジンが挙げられる。
【０１０９】
最後の態様において、本発明は、腫瘍、ＴＥＴ２の突然変異、ＴＥＴ２の無発現または末端切断型ＴＥＴ２の発現が検出された、骨髄性腫瘍またはリンパ性腫瘍に罹患している被験体を処置するための方法であって、該被験体に治療上有効な量の低メチル化剤(hypomethylating agent)を投与する工程を含んでなる方法に関する。
【０１１０】
好ましくは、該骨髄性腫瘍はＭＤＳではない。
【０１１１】
好ましくは、該低メチル化剤(hypomethylating agent)はアザシチジンである。
【０１１２】
治療上有効な量の低メチル化剤(hypomethylating agent)は、当業者ならば簡単に決定することができる。リンパ性腫瘍または骨髄性腫瘍を処置するためのアザシチジンの治療上有効な量の例としては、引用することにより本明細書の一部とされるFENAUX et al. (Blood, vol.110, 817, 2007)に開示されている投与計画を引用することができる。
【０１１３】
以下、アミノ酸配列、核酸配列および実施例を参照しながら本発明をより詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例の詳細に限定されるものではない。むしろ、本発明は本明細書の例に明示されていないが、当業者が過度な努力無く見出せる詳細を含んでなるいずれの実施態様にも関する。
【実施例】
【０１１４】
１．ＭＤＳ、ＭＰＤおよびＡＭＬにおけるＴＥＴ２遺伝子突然変異の同定
本発明者らは、に罹患し、かつ、染色体４切断点４ｑ２４近傍にゲノム欠失を伴う後天的染色体転座を持つ骨髄性癌（ＡＭＬ（ｎＡＭＬ１、ｎＡＭＬ２、ｎＡＭＬ３）またはＭＤＳ（ＭＤＳ０１、ＭＤＳ０２およびＭＤＳ０３））に罹患している６人の患者を特定した。これらの欠失は１症例では同型接合性であり、他の症例では異型接合性であり、この領域に腫瘍抑制遺伝子が存在することが示唆され得る。
【０１１５】
まず、ＦＩＳＨ分析で、これらの患者で共通に欠損している領域を〜５００ｋｂ間に狭めることができる（データは示されていない）。コンピューターおよびＲＴ−ＰＣＲを用いた分析により、この領域にある単一の遺伝子テンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ２）の構造が明らかになった（図１）。
【０１１６】
ＴＥＴ２遺伝子は１５０Ｋｂにわたって散在する１１のエキソンを含んでなる。エキソン３〜１１によりコードされている推定ＴＥＴ２タンパク質は、ヒトおよびマウスの３メンバーファミリー（ＴＥＴファミリー）に属す。ＴＥＴファミリーのタンパク質はそれらの中央とカルボキシ末端部分に単一のオーソロガスショウジョウバエタンパク質を有する２つの保存性の高い領域を共通に持っている（図１）。
【０１１７】
図１は、ＴＥＴ２のタンパク質配列（配列番号２）を示し、種間で保存されている領域が強調されている（太字）。
【０１１８】
ＴＥＴ２では、エキソン３の５’末端にある翻訳開始コドン（ｃＤＮＡのヌクレオチド８６２〜８６４またはエキソン３の２７〜２９）は２００２アミノ酸のタンパク質の合成を可能とすると推定された（図１）。エキソン２にある選択的ＡＴＧ（ｃＤＮＡのヌクレオチド７９８〜８００またはエキソン２の１１１〜１１３）は２１多いアミノ酸の合成を命令する。さらなる開始部も排除されない。
【０１１９】
ＴＥＴ２転写物は広く発現され(ONO et ah,前掲, 2002; LORSBACH et ah,前掲, 2003)、利用可能なデータにより示唆されるように、ＴＥＴ２の発現はヒト骨髄および血液組織においてＲＴ−ＰＣＲのより確認された（データは示されていない）。より具体的には、ＴＥＴ２転写物は臍帯血ＣＤ３４＋細胞、健常対照の顆粒球および造血細胞系統において検出された。
【０１２０】
最後に、これら６人の患者は、５人が第４染色体に欠失を有し、ＭＤＳ０１では両コピーとも欠失していた。
【０１２１】
ＭＰＤにおける違うアプローチを用いた場合にも、同じ４ｑ２４領域の関与が見られた。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−多能性前駆体、方向付けされたＣＤ３４＋ＣＤ３８＋前駆体および成熟細胞の分析により、本発明者らは診断において造血拡大速度の異なる２つのＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ  ＭＰＤサブセットを特定するに至った(DUPONT et al, Blood, vol.110(3), p:1013-21, 2007)。第一のサブセットは悪性クローン拡大の遅れを特徴し、すなわち、方向付けされた前駆体の下流である。これに対し、第二のサブセットの患者はクローンが早期に拡大し、方向付けされた前駆体の上流である。本発明者らは、第二のサブセットの患者が悪性クローンの早期拡大を促進することができる分子欠陥を持っているという仮説を立てた。この第二のサブセットの５人の患者（ＭＰＤ０１〜ＭＰＤ０５）を、推定クローン細胞（顆粒球）とポリクローナル細胞（末梢血単核細胞またはリンパ球）ＤＮＡを比較するために、高分解ＣＧＨおよびＳＮＰアレイを用いて分析した。１人の原発性骨髄繊維症（ＰＭＦ）患者（ＭＰＤ０１）と１人の真性赤血球増加症（ＰＶ）患者（ＭＰＤ０４）は、第４染色体のｑ２２からｑｔｅｒの範囲にコピー数の変更なく（片親性ダイソミー；ＵＰＤ（２０））、大きな後天的異型接合性消失（ＬＯＨ）を示した。第三の患者（ＭＰＤ０５）は、この４ｑ２４領域にある後天的欠失を示した。ＭＰＤ０５におけるこの３２５ｋｂの欠失は、患者ＭＰＤ０１およびＭＰＤ０４の４ｑ２４  ＬＯＨ領域に含まれ、単一候補遺伝子としてのＴＥＴ２を含んでいた。この領域は他の２つの検討ＭＰＤサンプル（ＭＰＤ０２およびＭＰＤ０３）では正常であった。
【０１２２】
４ｑ２４領域は骨髄性新生物に罹患している患者では影響を受けており、また、ＴＥＴ２はこの領域に位置していたことから、これらの患者では、ＴＥＴ２遺伝子の完全性が損なわれている可能性がある。さらに、患者ＭＤＳ０１における２コピーのＴＥＴ２の欠失および他の８人のＭＤＳ、ＭＰＤまたはＡＭＬ患者における１コピーの再発欠失により、ＴＥＴ２は候補腫瘍抑制遺伝子であると言える。
【０１２３】
よって、これらの患者においてＴＥＴ２遺伝子の変異を検出するために、ＴＥＴ２遺伝子に対してＰＣＲを行った。重要なこととしては、二対立遺伝子性の改変を検出するために両方の対立遺伝子を分析した。
【０１２４】
２．ＴＥＴ２遺伝子の変異を検出するための試験手順
２．１．ＴＥＴ２の突然変異または欠失の同定に用いるプライマー（表２）
【表２】
0005802952.tif 000005
0005802952.tif 000006
【０１２５】
２．２．ＰＣＲ
ＰＣＲは、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ  ＰＣＲ  ９７００にて、２５〜５０ｎｇのＤＮＡから出発し、２０μＬで行った。
【０１２６】
各サンプルに対して、ＴＥＴ２遺伝子に存在する突然変異／欠失を検出するために１７回のＰＣＲを用いた。混合物は次のように調製した。
【０１２７】
【表３】
0005802952.tif 000007
【０１２８】
本発明者らは次のようなＰＣＲサイクル条件を用いた。
【表４】
0005802952.tif 000008
【０１２９】
２．３．ＰＣＲ産物の配列決定
最後に、Ｂｉｇ  ＤｙｅターミネーターＶ１．１および３１３０ＸＬシーケンシングマシーン（双方ともAPPLIED BIOSYSTEMSから）を用い、EUROFINS MWG Biotech (France, 9, rue de la Laponic, 91967 Les Ulis cedex)または"Departement des services commun de l'Institut Cochin" (Plate forme transcriptomique, Hopital Cochin/Bat G. Roussy/3eme etage, 27 rue du Fg St Jacques, 75014 Paris)によりＰＣＲ産物の配列決定を行った。
【０１３０】
３．異型接合性４ｑ２４欠失を有するＭＤＳまたはＡＭＬに罹患している患者におけるＴＥＴ２遺伝子の突然変異
３．１．腫瘍細胞の場合
ＴＥＴ２遺伝子の完全性は、染色体４切断点４ｑ２４近傍にゲノム欠失を伴う異型接合性後天的染色体転座を有する上記８人の患者の４ｑ２４「完全」コピーで確認した。
【０１３１】
これらの対立遺伝子におけるＴＥＴ２遺伝子の突然変異を同定するため、４ｑ２４の再配列を有する８人の患者の骨髄サンプルから抽出したＤＮＡの８つのコードエキソンとそれらのスプライス部位の配列を、従前に記載されているようなＰＣＲにより調べた。
【０１３２】
表３は、ＭＰＤ、ＭＤＳまたはＡＭＬに罹患し、かつ、１つの対立遺伝子に４ｑ２４欠失を有する患者における、ＴＥＴ２遺伝子の両対立遺伝子の状態を開示している：
【表５】
0005802952.tif 000009
【０１３３】
野生型対応物を有する患者から得られた配列を比較したところ、６人の患者でヌクレオチド変異が同定された（表３）。変異は同定された多型に属するものではなかった。患者ｎＡＭＬ１およびｎＡＭＬ２は一ヌクレオチド変異を有し、患者ｎＡＭＬ２ではＩ１８７３Ｔ、患者ｎＡＭＬ１ではＲ１８９６Ｍとなっていた。患者ＭＤＳ０３は、Ｎ１６２４の代わりに停止コドンを導入するＣＡＧからＴＡＧへの変異を示した。患者ＭＰＤ０１は、ＮＱ５５７の代わりに停止コドンを導入する一ヌクレオチド変異を示した。患者ＭＤＳ０２は４塩基対の挿入を有し、Ｌ５６０の後に停止コドンの６アミノ酸をもたらした。患者ＭＰＤ０４はフレーム内に９ヌクレオチドの欠失を持っていた。患者ｎＡＭＬ３のＤＮＡには注目に値するヌクレオチド変異は見られなかった。患者ＭＤＳ０１はＴＥＴ２遺伝子の二対立遺伝子性の欠失を有する。
【０１３４】
３．２．患者の非腫瘍細胞の場合
見られた変異が体細胞的に獲得されたものであることを確認するために、本発明者らは、入手可能な場合、非腫瘍サンプルのＤＮＡを分析した。
【０１３５】
患者ｎＡＭＬ２では、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞集団のＤＮＡでＴからＣへの変異は見られなかった（図２）。患者ｎＡＭＬ１では、自己骨髄移植後に得られたサンプルを分析したところ、野生型Ｇと変異型Ｔの比率が、診断サンプルに比べて逆転していることが示された（データは示されていない）。同様に、変異型Ｔに相当するシグナルは患者ＭＤＳ０３の刺激されたＰＢＬから抽出されたＤＮＡにはほとんど存在しない（図２）。この分析はまた、非腫瘍細胞において、ＭＰＤ０４では突然変異が存在しないこと、またはＭＰＤ０５では欠失が存在しないことを示した（データは示されていない）。この分析はさらに、患者ＭＰＤ０１からの末梢単核細胞では少量の残留野生型配列が検出されることを示した（データは示されていない）。
【０１３６】
図２は、２人の患者ｎＡＭＬ２とＭＤＳ０３から得られたサンプルに対するＰＣＲの配列決定により得られた配列トレースを示し、突然変異が腫瘍サンプル（Ｒ：リバースプライマーおよびＦ：フォワードプライマー）および非腫瘍サンプル（ＮＴまたはＰＢＬ）にのみ見られることを示している。
【０１３７】
これらの結果を考え合わせると、２コピーのＴＥＴ２遺伝子は多様な骨髄性新生物に罹患している患者において標的とされることを示し、この、欠失および点突然変異を伴う染色体転座という２つの異なる事象により、ＴＥＴ２は腫瘍抑制遺伝子であると確認される。
【０１３８】
４．細胞遺伝学的に検出可能な４ｑ２４欠失の無いＭＤＳまたはＡＭＬに罹患している患者におけるＴＥＴ２遺伝子の変異
ＴＥＴ２の突然変異が染色体異常とは無関係にも起こるかどうかを確認するため、異なるサブタイプＭＤＳ（ｎ＝８１）、ｓＡＭＬ（ｎ＝２１）、ＣＭＭＬ（ｎ＝９）、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性ＭＰＤ（ｎ＝１８１）および既知の４ｑ２４異常を持たないＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性ＭＰＤ（ｎ＝１７）を有するさらに３０９人の患者の骨髄サンプルのＤＮＡを、従前に記載されているようなＰＣＲにより分析した。
【０１３９】
表４は、ＭＤＳまたはＡＭＬに罹患している患者において同定されているＴＥＴ２欠失の状態を開示している：
【表６】
0005802952.tif 000010
【０１４０】
ＲＡ、不応性貧血；ＲＡＲＳ、環状鉄芽球を伴う不応性貧血；ＲＡＲＳ−Ｔ、血小板増多を伴うＲＡＲＳ；ＲＡＥＢ、芽球増多を伴う不応性貧血；ＲＡＥＢ１：芽球５〜９％；ＲＡＥＢ２：芽球１０〜１９％；ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ＦＡＢ、French American British分類；ｄｅｌ、欠失；ＦＳ、フレームシフト；ＮＤ、実施せず。試験した総てのＭＤＳ／ＡＭＬ（２２／２７）はＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性であった。ＭＤＳ０３はＲＡＥＢ１期とＲＡＥＢ２期で試験した。患者ＭＤＳ３４は一連の２サンプルを分析した。試験の初期に分析した選別患者を太字で示す。
【０１４１】
表５は、ＭＰＤに罹患している患者において同定されたＴＥＴ２欠陥の状態を開示している：
【表７】
0005802952.tif 000011
【０１４２】
ＴＥＴ２コード配列の明白な異常が４５人の患者に見られ、保存的アミノ酸置換、フレーム内停止コドンの生成またはフレームシフトが起こっていた（表４および５）。さらに１人の患者（ＭＤＳ０７）では、いくつかの条件およびプライマー対を用いたにもかかわらず、エキソン１１の５’部分の増幅だけが微量のＰＣＲ断片を生じた（データは示されていない）が、これはこの領域に影響を及ぼす未同定の構造的ゲノム再配列によるものであった。ＭＤＳ（２２／１１１）およびＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆを伴うＢＣＲ−ＡＢＬ陰性（２１／１８１）、またはＭＰＬ  Ｗ５１５Ｌ／Ｋ（１／６）またはこれらの突然変異の無いもの（２／１１）の総ての種類でＴＥＴ２の欠陥が見られた。
【０１４３】
これらの結果は、ＴＥＴ２欠陥は、高い罹患率を有する、選別していない多様な骨髄性障害で確認することができる（４６／３０９＝１７％）。例として、患者ＭＤＳ０４はＫ１２９９ＤおよびＲ５４４Ｓｔｏｐをもたらす２つの変異を示した。患者ＭＤＳ１０は２つの突然変異Ｙ１７２４ＳｔｏｐとＱ３２１Ｓｔｏｐを持っていた。患者ｓＡＭＬ２はＳ１８９８Ｆをもたらす点突然変異を持っていた。見られたこれらの突然変異はＴＥＴ２タンパク質の部分的または全面的機能欠失をもたらし得る。ＴＥＴ２遺伝子の欠失などの他の欠陥は見逃された可能性があり、従って、これらの悪性疾患におけるＴＥＴ２欠陥の頻度は過小評価されていると考えることができる。
【０１４４】
全体的に見て、ＴＥＴ２欠陥を有する患者の１９／５５では、おそらくＴＥＴ２の両コピーを標的とする２つの異なる突然変異が検出された。この点は、患者ＭＤＳ４２から得られたＰＣＲ断片をサブクローニングした後に個々の分子を配列決定することにより確認した。３５／５５サンプルで単一の欠陥が見られ、ＴＥＴ２がハプロ不全的にこれらの悪性疾患に役割を果たしている可能性があることを示唆する。
【０１４５】
５．ＴＥＴ２突然変異はＭＤＳの初期の前駆体を標的とする
ＭＤＳはＨＳＣに起源する骨髄性悪性疾患である。もしＴＥＴ２に見られる突然変異が原因であれば、それらはＨＳＣにおいても見られるはずである。これを検討するため、本発明者らはまず、４人のＭＤＳ患者（ＭＤＳ０３、ＭＤＳ０９、ＭＤＳ２８、ＭＤＳ３５）からのＨＳＣおよび造血前駆体を含むＣＤ３４＋細胞におけるＴＥＴ２欠陥の存在を分析した。
【０１４６】
図３ａは、ＲＡＥＢ１期およびＲＡＥＢ２期の患者ＭＤＳ０３からの選別したＣＤ３４＋細胞の配列ヒストグラムを示す。比較のために無選別骨髄サンプルと野生型対照に見られる配列を示す。アスタリスクは突然変異ヌクレオチドを示す。
【０１４７】
図３ｂは、ＲＡＥＢ１期の選別ＭＤＳ０３  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４−ＣＤ３８＋細胞から単離されたＤＮＡのＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を示す。増幅された断片をＴａｓ１で消化し、アガロース泳動によりサイズ分画した。突然変異ＴＥＴ２の割合は、両対立遺伝子（ｗｔ＋ｍｕｔ）により生じたシグナルに対する変異型（ｍｕｔ）または野生型（ｗｔ）シグナルの強度を測定することにより評価した。消化無し（−）および消化（＋）。（ｃｔｌ）は対照ＤＮＡからのＰＣＲ産物に相当する。ＭＷ：分子量。
【０１４８】
図３ｃは、ＢｓｅＬＩエンドヌクレアーゼを用い、ＭＤＳ０９患者の選別ＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞から直接行ったＴＥＴ２のＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を示す。
【０１４９】
図３ｄは、１ウェル当たり１細胞で増殖させた患者ＭＤＳ０９の選別ＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞の、ＢｓｅＬＩを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰによる遺伝子型分析を示す。注釈はｂの場合と同様である。ヒストグラムは野生型（グレー）または変異型（黒）ＴＥＴ２を有するクローンの画分を表す。アスタリスクで示されるＣＤ３４＋ＣＤ３８＋クローンに野生型断片が存在しないことに注意。
【０１５０】
総ての場合で、変異型ＴＥＴ２配列が検出できた（図３）。これらの患者のうち１人（ＭＤＳ０３）で、芽球増多を伴う不応性貧血１（ＲＡＥＢ１）およびＲＡＥＢ２期でＣＤ３４＋細胞を分析することができた。興味深いことに、ＲＡＥＢ１期では野生型配列が検出されたが、ＲＡＥＢ２期には検出されず（図３ａ）、このことは疾患の進行とともにＴＥＴ２変異前駆体が拡大することを示唆する。
【０１５１】
本発明者らは次に、これら４人の患者からのＣＤ３４＋を、ＦＡＣＳＤｉｖａセルソーター(BECTON DICKINSON)にてＣＤ３４−ＰｅＣｙ５およびＣＤ３８−ＦＩＴＣ抗体(IMMUNOTECH)を用い、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−（ＨＳＣおよび多能性前駆体に相当する）とＣＤ３４＋ＣＤ３８＋（より成熟した前駆体に相当する）細胞集団に分画した。２人の患者（ＭＤＳ０３およびＭＤＳ０９）では、変異型ＴＥＴ２配列と野生型ＴＥＴ２配列を識別するためにＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を用いた。両患者とも、変異型ＴＥＴ２の存在量はＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞からＣＤ３４＋ＣＤ３８＋へと増加していた（ＭＤＳ０３では１６％から５４％、ＭＤＳ０９では２６％から４８％）（図３ｂ、ｃ）。ＭＤＳ０９からの単一の造血前駆体を播種することにより、細胞レベルでさらなる分析を行った。
【０１５２】
ＭＤＳ０９骨髄からの選別ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を、１０％ＦＢＳ(STEM CELL TECHNOLOGIES)、および前期サイトカインカクテル（トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、インターロイキン−３（ＩＬ３）、ＦＬＴ３−Ｌ、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ６））を添加したＭＥＭα培地中のＭＳ５細胞系統の密集層に上に１ウェル当たり１細胞で播種した。ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞も、メチルセルロース培養(DUPONT et al,前掲, 2007)で用いたものと同じ「後期」サイトカイン（ＳＣＦ、ＩＬ３、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））の組合せを用いて、１ウェル当たり１細胞で播種した。３週間後（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）または１０日後（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）に、個々のクローンをさらなる遺伝子型分析のために回収した。
【０１５３】
これらの結果は、ＴＥＴ２突然変異がＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞およびＣＤ３４−ＣＤ３８＋細胞由来のそれぞれ３２クローンのうち８（２５％）、そして３０クローンのうち１８（６０％）で同定されたことを示す（図３ｄ）。興味深いことに、ＴＥＴ２の野生型コピーは変異型ＴＥＴ２を有するクローンから常に増幅されるわけではなく、このことは大多数の細胞におけるその欠損を示唆する。
【０１５４】
他の２人の患者（ＭＤＳ２８、ＭＤＳ３５）では、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−サンプルからＣＤ３４＋ＣＤ３８＋サンプルへのＴＥＴ２突然変異の存在量の増加を、配列グラフを用いて評価した。より厳密にするために、ＭＤＳ２８サンプルからの増幅断片をサブクローニングし、個々の細菌クローンの配列決定を行った。変異型コピーは、ＭＤＳ２８のＣＤ３４＋ＣＤ３８−集団ではまれにしか検出できなかったが、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋集団ではＴＥＴ２配列の３２％に相当した（データは示されていない）。これらのデータは、ＴＥＴ２突然変異がＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を標的とすること、そしてＭＤＳでは、ＴＥＴ２変異の存在量が未熟前駆体から成熟前駆体へと増加することを示し、これは造血系分化の初期段階での変異細胞の選択的優位性を示唆する。
【０１５５】
３つのｓＡＭＬサンプル（ｓＡＭＬ２、ｓＡＭＬ４、ｓＡＭＬ５）でも、ＣＤ３４＋細胞でＴＥＴ２の突然変異が見られた（データは示されていない）。分析したところ、ｓＡＭＬ４、ｓＡＭＬ５選別細胞では、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−集団とＣＤ３４＋ＣＤ３８＋集団の間に変異型ＴＥＴ２の存在量に著しい変化は見られなかった。
【０１５６】
６．ＭＤＳにおけるＴＥＴ２突然変異の罹患率および予後への影響
ＭＤＳにおいてＴＥＴ２突然変異の罹患率および予後への影響を確認するために、本発明者らは、ＧＦＭ多施設共同治験に登録されている２０４件のＭＤＳおよびＭＤＳ後ＡＭＬ（ＲＡ／ＲＣＭＤ／ＭＤＳ−Ｕ／５ｑ−が４１件、ＲＣＭＤが１８件、ＲＡＲＳ／ＲＣＭＤ−ＲＳ／ＲＡＲＳ−Ｔが２８件、ＲＡＥＢ  １が４３件、ＲＡＥＢ  ２が３２件、ＭＤＳ後ＡＭＬが４４件）において、ＴＥＴ２突然変異とそれらの予後価の後向き分析を行った。ＴＥＴ２突然変異分析は従前に記載されているように行い、結果を表６に示す。
【０１５７】
表６は、ＭＤＳまたはＡＭＬに罹患している患者において同定されたＴＥＴ２欠陥の状態を開示している：
【表８】
0005802952.tif 000012
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【０１５８】
本発明者らは、４３／２０４  ｐｔｓにおいて、エキソン３〜１１の直接配列決定によりＴＥＴ２遺伝子の５９の突然変異（保存されたドメインにおいて、フレームシフトが２７、ナンセンス突然変異が２１およびミスセンス突然変異が１１）を見出した（表６）。ＷＨＯサブタイプによる頻度は、ＲＡが２１．８％、ＲＣＭＤが５．２％、ＲＡＲＳ／ＲＡＲＳ−Ｔ／ＲＣＭＤ−ＲＳが２１．４％、ＲＡＥＢ１が３４．９％、ＲＡＥＢ２が１５．６％、ＭＤＳ後のＡＭＬが１９％であった。４ｑ２４領域の異常は、ＣＧＨで分析した場合の１／４６ｐｔｓにおける欠失、ＳＮＰアレイで分析した場合の３／２２患者における３つのＬＯＨ、ＳＮＰアレイで分析した場合の５／２３ｐｔｓにおける２つの欠失などが見られた。よって、４ｑ２４異常の全体的な罹患率は患者の２１．６％（４４／２０４）であった。２０人の患者は、直接配列決定（１７人）または配列決定とＳＮＰアレイ（３人）により同定された２つのＴＥＴ２異常を有しており、変異を有する患者の４３．５％でこの２コピーの遺伝子が標的となっていた。
【０１５９】
次に、ＴＥＴ２突然変異の予後への影響を確認するために、コックスハザード比例モデルを用いて単変量および多変量生存分析を行った。ＴＥＴ２コード配列の突然変異を有する４３人の患者と非変異患者を比較したところ、性別、年齢、化学療法または放射線療法歴、Ｈｂレベル、ＷＢＣ数、ＡＮＣ、血小板数、％骨髄芽細胞、多系列異形、ＷＨＯおよびＦＡＢサブタイプ、核型ならびにＩＰＳＳに関する最初の特徴には有意差は見られなかった。
【０１６０】
この分析により、５年生存率（カプラン−マイヤー曲線）は、ＴＥＴ２変異患者では非変異患者に比べて有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【０１６１】
７．ＳＮＰまたはＣＧＨアレイ分析により検出された４ｑ２４異常を有するＭＰＤに罹患している患者におけるＴＥＴ２遺伝子の再配列
３５のＭＰＤサンプルのうち、４人の患者がＳＮＰアレイによりＬＯＨを有しており、両対立遺伝子上のＴＥＴ２遺伝子内の突然変異を分析した。４サンプルのうち３つで、明確な突然変異または欠失が見られた。
【０１６２】
表７は、ＭＰＤに罹患している患者におけるＴＥＴ２遺伝子の両対立遺伝子の状態を開示している：
【表９】
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【０１６３】
表７において、「ＰＭＦ」は原発性骨髄繊維症を、「ＰＶ」は真性赤血球増加症を、「ＥＶ」は本態性血小板増多症を表す。これらの疾患は総て、クラスＩＩのＭＰＤである。
【０１６４】
患者ＩＧＲ−２は、３つのアミノ酸Ｐ１２３７、Ｌ１２３８、Ｓ１２３９の欠損をもたらす９塩基対フレーム内欠失を有していた。ＳＮＰ分析および配列トレースの分析により示されたように、患者ＩＧＲ−１およびＩＧＲ−２他方のＴＥＴ２コピーに欠損を有していた。患者の非腫瘍細胞にはこれらの突然変異は見られなかった。これらのデータから、不活性化ＴＥＴ２がＭＰＤの発症に関与していることが確認される。
【０１６５】
他の１７人の患者でＴＥＴ２遺伝子を体系的に配列決定したところ、２人の患者が１つの対立遺伝子に停止コドンを有し（ＩＧＲ１７：Ｓ３５４Ｓｔｏｐ、ＩＧＲ−１８：Ｒ１２１６Ｓｔｏｐ）、１人の患者がエキソン１１にフレームシフトをもたらす１ヌクレオチド欠失を有することが明らかになった。
【０１６６】
８．ＴＥＴ２再配列の獲得に関する分析
最近では、いくつかのＭＰＤでＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆは誘発事象ではない可能性があることを示す証拠がある。従って、本発明者らはＭＰＤサンプルを用いて、これらの疾患におけるＴＥＴ２欠陥およびＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異の相対的役割を評価し、突然変異の一連の獲得への洞察を得た。本発明者らはまず、患者ＩＧＲ２などの、両遺伝子に突然変異を有する５人のＭＰＤ患者からの造血系前駆体を分析した。
【０１６７】
ＭＰＤサンプルでは、未熟ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、記載されているように(DUPONT et al.,前掲, 2007)、Ｂ、ＮＫおよび顆粒球分化（リンパ−骨髄性分化）の刺激を可能とする条件で、４〜６週間、１ウェル当たり１細胞で播種し、一方、より成熟したＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞は赤血球／顆粒球メチルセルロースアッセイで増殖させた。個々のクローンをフローサイトメトリーおよび遺伝子型分析によるＢ、ＮＫおよび顆粒球分化の分析のために回収した。ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞は、３７％ＦＢＳ(STEM CELL TECHNOLOGIES)および記載されているようなサイトカインカクテル(DUPONT et al.,前掲, 2007))を添加した２％標準メチルセルロース中、培養ディッシュ当たり１，５００〜３，０００細胞を播種した。赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）および顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）から増殖させた個々のコロニーを１４日目に採取した。得られたクローンの、両分子欠陥の存在を分析した。
【０１６８】
これらの結果は、試験した総ての患者で、配列分析が、リンパ−骨髄性前駆体に由来するクローンにはＴＥＴ２およびＪＡＫ２の両方の欠陥が存在していたことを明らかにしたことを示した（データは示されていない）。興味深いことに、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異はＴＥＴ２欠陥が存在しない場合には見られなかったが、ＴＥＴ２突然変異はＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆが存在しない場合にも見られた。これらの結果は、ＭＤＳの場合と同様、ＴＥＴ２突然変異はＭＰＤ患者の未熟な前駆体に存在し、疾患の発症時にＴＥＴ２欠陥がＪＡＫ２突然変異に先行することを示唆する。
【０１６９】
悪性クローンの増幅におけるＴＥＴ２突然変異の役割をさらに定義するために、本発明者らは未熟（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）前駆体に由来するコロニーの遺伝子型を方向付けされた（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）前駆体に由来する赤血球および顆粒球コロニーの遺伝子型と比較した。
【０１７０】
これらの結果は、３人のＭＰＤ患者（ＭＰＤ０１、ＭＰＤ０４、ＭＰＤ３５）において、種々の造血系分化段階のコロニーはほとんど総てＴＥＴ２突然変異を有していたことを示し、ＴＥＴ２変異型クローンは造血の初期段階で拡大したことが示唆される（データは示されていない）。他の２人の患者（ＭＰＤ０５、ＭＰＤ２０）では、最も未熟な前駆体は野生型であり、最も方向付けされた前駆体はＴＥＴ２が変異していた。これら２人の患者のＪＡＫ２野生型前駆体で、本発明者らは、ＴＥＴ２欠陥を有するクローンの割合が、未熟前駆体（それぞれ２／３７と０／３４）から方向付けされた前駆体（それぞれ１０／２３と９／５４）へと高くなっていることを見出した。本発明者らの結果を考え合わせると、初期の分化段階でのＴＥＴ２変異クローンの選択的優位性がＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異に依存しないことを示唆される。
【０１７１】
全体的に見て、ＭＰＤサンプルからのこれらのデータは、ＴＥＴ２欠陥が（ｉ）造血系分化の初期段階で起こりこと、（ｉｉ）それらがＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異の発生に先行し得ること、および（ｉｉｉ）それらが、クローンが骨髄性分化を始める際にそのクローンに選択的優位性を与えることを示している。
【０１７２】
９．in vivoにおいてＴＥＴ２変異細胞の移植および増殖
本発明者らは、ＴＥＴ２の機能欠失が造血幹細胞に増殖的優位性を与えると推論した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ再増殖能を有するＨＳＣにおいてＴＥＴ２突然変異が存在することを実証するために、本発明者らは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、ＴＥＴ２突然変異を有するＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ  ＭＰＤ患者から単離されたＣＤ３４＋細胞を注射することによる異種移植アッセイを用いた。
【０１７３】
ＴＥＴ２突然変異を有するＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ  ＭＰＤ患者からのＣＤ３４＋細胞（１〜１０×１０５細胞）を、事前に２００μｇの抗ＣＤ１２２抗体(JAMES et al., Blood, vol. 112(6), p:2429-36, 2008)で処理し、致死量以下の照射を行った（３．５Ｇｙ）ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静注した。移植後３、６および１２週目に右大腿かヘパリン処理シリンジで骨髄を得、１５週目にマウスを屠殺した。ヒト細胞移植片は、フローサイトメトリーにより評価される、ヒト白血球集団（ＣＤ４５＋）と赤血球集団（ＣＤ４５−ＣＤ３６＋およびＣＤ４５−ＣＤ３６−グルコホリンＡ＋）の合計により評価した。骨髄細胞は、JAMES et al,(前掲, 2008)に記載されているように、ヒト細胞の選択的増殖を可能とするメチルセルロースアッセイおよび長期培養誘導細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイ用にそれぞれ培養ディッシュおよび９６ウェルプレートに播種した。その後、個々のコロニーを採取し、遺伝子型分析を行った。
【０１７４】
本発明者らはまず、これらのＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ  ＭＰＤ患者からのＣＤ３４＋細胞の移植後のキメラ現象の速度を、ＴＥＴ２欠陥の無い３人のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ  ＭＰＤ（ＭＰＤ０９、ＭＰＤ１１、ＭＰＤ２７）のＴＥＴ２突然変異と比較した。
【０１７５】
図４ａは、移植後３、６、１２および１５週目にモニタリングしたマウス骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞のパーセンテージを示す。ＭＰＤ０１およびＭＰＤ０４はＴＥＴ２欠陥を有する患者であり、ＭＰＤ０９、ＭＰＤ１１およびＭＰＤ２７は同定されるＴＥＴ２欠陥が無い対照患者である。
【０１７６】
図４ｂは、患者ＭＰＤ０４およびＭＰＤ０９からのＣＤ３４＋細胞３×１０５個を移植して１５週間後のＮＯＤ−ＳＣＩＤ骨髄に存在するヒト細胞のフローサイトメトリー分析を示す。ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）陽性骨髄性細胞およびリンパ性細胞のパーセンテージは抗ＣＤ４５−ＰＣ７、抗ＣＤ３３−ＡＰＣおよび抗ＣＤ１９−ＰＥ抗体を用いて測定した。
【０１７７】
これらの結果は、ＴＥＴ２突然変異の無い３人の患者からのヒト細胞は時間が経つにつれて消失したことを示す（図４ａ）。
【０１７８】
これに対して、２人のＴＥＴ２変異患者からの細胞を移植したマウスの骨髄中のヒト細胞のパーセンテージは時間が経つにつれて増加した（図４ａ）。これらのマウスでは、分化は、リンパ分化が好ましい正常ＨＳＣで見られるものとは異なり、ＣＤ３３およびＣＤ１９抗原フローサイトメトリー分析から判断されるように（図４ｂ）、リンパ性前駆体を犠牲にして骨髄性前駆体へとゆがめられた(ROBERT-RICHARD et al., Haematologica, vol.17(3), p:637-41, 2003)。
【０１７９】
移植１５週間後（Ｗ１５）のマウス骨髄に存在するヒト細胞をin vitro前駆体およびＬＴＣ−ＩＣアッセイで試験し、ＴＥＴ２およびＪＡＫ２の突然変異の存在を分析した。ＭＰＤ０１およびＭＰＤ０４サンプルの双方からのプールしたＷ１５  ＦＵ由来コロニー、ならびにマウス中に存在する個々のヒトＬＴＣ−ＩＣおよび前駆体の総てでＴＥＴ２欠陥が見られた（データは示されていない）。これらの結果を移植直前（Ｄ０）に行った前駆体アッセイと比較した。患者の方向付けされた前駆体細胞（Ｄ０  ＣＦＵ）から生じたコロニーは総てＴＥＴ２突然変異を持っていた。
【０１８０】
これらの結果は、ＴＥＴ２突然変異がＨＳＣに見られることを示す。興味深いことに、これらの結果はさらに、移植時にＴＥＴ２突然変異のみを有する前駆体細胞の割合はＴＥＴ２およびＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの両突然変異を有する細胞を犠牲にして増加したことを示した。これらの細胞は元のＨＳＣ集団を反映すると思われる。よって、これらの知見は、野生型ＪＡＫ２を有するＴＥＴ２変異ＨＳＣはＴＥＴ２／ＪＡＫ２二重変異体ＨＳＣよりも数が多いことを示し、さらにこれらの患者における「−プレＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ」事象としてのＴＥＴ２の突然変異が確認される。
【０１８１】
よって、本発明者らのデータは、ＴＥＴ２欠陥がＨＳＣにＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆとは非依存的に選択的移植優位性を付与するという仮説に適合する。
【０１８２】
１０．同定された突然変異のＴＥＴ２遺伝子上の位置
本発明者らは、ＴＥＴ２の不活性化はヒトＭＤＳ、ＭＰＤおよびｓＡＭＬに共通の初期事象であり、無選別の一連の患者におけるＴＥＴ２突然変異の頻度が、ＭＤＳで１５／８１＝１８．５％、ＣＭＭＬで２／９＝２２％、ＭＰＤで２４／１９８＝１２％、ｓＡＭＬで５／２１＝２４％であったことを報告する。これらの分析において、本発明者らは、保存されているドメインの外側に存在するアミノ酸変異を考えなかったことを注記しておかなければならない。表１に示されるプライマー対を用いたＴＥＴ２遺伝子の配列決定により、ＴＥＴ２遺伝子の突然変異の数を特定することができる（図５）。
【０１８３】
図５は、タンパク質配列に沿って分布している、ＴＥＴ２遺伝子の同定された突然変異のいくつかの位置を示す。
【０１８４】
ＴＥＴ２配列に対する、同定されたＴＥＴ２突然変異のマッピングは、このタンパク質の機能におけるカルボキシ末端保存領域（アミノ酸１８６０番〜１９５０番）の必須の役割を示唆する。
【０１８５】
最後に、変異を有する５５人の患者のうち１９人で、２つのＴＥＴ２コピーを標的化する後天的遺伝子欠陥が検出されたことで、この遺伝子はヒト骨髄性悪性疾患の真の腫瘍抑制遺伝子であることが確認される。ＴＥＴ２欠陥は、２つの異なる骨髄性疾患であるＭＤＳおよびＭＰＤの双方で見られた。よって、それらの特徴的な臨床的および生物学的表現型には少なくとも別のさらなる協働事象が必要である可能性がある。ＴＥＴ２およびＪＡＫ２双方の突然変異を有するＭＰＤサンプルでは、ＴＥＴ２突然変異はおそらく、本来の病歴の最初に、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異の発生に先立って起こる。
【０１８６】
１１．家族性ＭＰＤにおけるＴＥＴ２遺伝子突然変異の同定
ＭＰＤに罹患している少なくとも２人の患者を有する家族を、これまでに記載されているような国内ネットワーク(BELANNE-CHANTELOT et al.,前掲, 2006)から採集した。ＭＰＤの診断は、２００８年世界保健機関基準１に基づいて再検証した。全患者から書面にてインフォームド・コンセントを得た。
【０１８７】
第一工程において、本発明者らは常染色体優性遺伝に適合する家族の１５人の発端者を、これらの家族性症例を説明する体質性の事象に関する検索で分析した。選抜した発端者はほぼＰＶまたはＥＴに罹患していた。第二工程において、この分析を血液学的合併症を有する患者に、そしてＴＥＴ２変異体を有する患者の親族に拡大した。
【０１８８】
本発明者らは、４２のＭＰＤ家族（ヨーロッパ４０家族、アフリカ２家族：家族Ｆ３およびＦ４）から、求めに応じられる少なくとも２人のＭＰＤ患者を含む、合わせて６１人の患者の、ＴＥＴ２遺伝子の６００９ｂｐコード配列における突然変異を分析した。３６人の患者は、ＰＶ（１５）、ＥＴ（１２）またはＰＭＦ（７）のいずれかからなる単純な表現型を示し、１２年の追跡期間の後にも疾患の血液学的進行は見られなかった。他の２７人の患者はそれらのＭＰＤ表現型に進行を受けており、すなわち、ＰＶは骨髄繊維症（ＰＶ後ＭＦ、５）またはＡＭＬ（１２）へ進行し、ＥＴはＭＦ（４）またはＡＭＬ（５）へ進行し、あるいはＰＭＦはＡＭＬとなった（１）。
【０１８９】
この分析は、頬側スワブから抽出したゲノムＤＮＡにて、ゲノムＤＮＡを放出されるために９５℃で１０分間加熱した後にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行った。精製したＰＣＲ産物を、ＢＩＧＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(APPLIED BIOSYSTEMS)を用い、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ３１００キャピラリーシーケンサーにて配列決定した。
【０１９０】
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異の状態は、従前にBELANNE-CHANTELOT et al. (前掲, 2006)で報告されているように決定した。
【０１９１】
ＴＥＴ２遺伝子の全コード領域を従前に記載されているように配列決定した。各ＴＥＴ２エキソンのコピー数を評価するため、単鎖蛍光断片（ＱＭＰＳＦ）法(CHARBONNIER et al, Cancer Res., vol.60, p:2760-2763, 2000)の定量的マルチプレックスＰＣＲを用いて２種類のマルチプレックスＰＣＲを設定したＦ９遺伝子かＤＳＣＲ１遺伝子のいずれかの短い配列を増幅する２つの付加的プライマー対を内部対照として用いた。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡジェネティックアナライザー（ＡＢＩ  ３１００）を用いたキャピラリー電気泳動により分離した。この分析は、供試ＤＮＡサンプルと対照ＤＮＡから生じたピークの高さの比較に基づく。ピークの高さの定量的評価は、市販の分析ソフトウエア(GENEMAPPER VERSION 4.0, APPLIED BIOSYSTEMS)を用いて行った。
【０１９２】
表８は、１２人のＭＰＤ患者で同定されたＴＥＴ２突然変異を示す：
【表１０】
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【０１９３】
患者は最初に第二列に示されている表現型を持つと診断され、その後、第三列に示されている血液学的進行を有した。いくつかのサンプルで測定したところ、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ対立遺伝子の存在量は一定の範囲を示した。
【０１９４】
図６は、本研究で同定された突然変異を示すＴＥＴ２遺伝子およびタンパク質の模式図である。斜線の四角はエキソンを示す。末端切断型突然変異は黒星印で、ミスセンス突然変異は黒逆三角▼で示される。保存されている機能的ドメインはこのタンパク質スキームに四角で示されている。ｆｓ：フレームシフト。
【０１９５】
この分析に従い、本発明者らは、１人の患者でＴＥＴ２の完全な欠失と、全部で３９の点突然変異を同定した。これらの変異体を検討したところ、それらのうちの１５（１２人の患者で同定）が有害な異型接合性の突然変異であったことが示された。それらは、遺伝子全体の欠失が１つ、末端切断型突然変異が１１（ナンセンス突然変異が３、out-of-frame挿入／欠失が６、スプライス部位突然変異が２）およびミスセンス突然変異が３という分布であった（図６、表８）。
【０１９６】
さらに、３つのミスセンス突然変異は総て民族的に一致する集団の１６５の対照個体には存在せず、それらの有害な作用が確認された。ｐ．Ｌｅｕ１３４０Ｐｒｏおよびｐ．Ｈｉｓ１８６８Ａｒｇの２つは、保存性の高いＴＥＴ２機能的ドメイン（１１３４〜１４４４および１８４２〜１９２１）内に位置していた。末端切断型突然変異はこのコード配列にランダムに分布しているものと思われた（図６）。
【０１９７】
患者Ｐ４、Ｐ６およびＰ９では、ＴＥＴ２突然変異が同定された。前者では、エキソン３に位置する２つの突然変異の複対立遺伝子特異的増幅が、これら２つの分子事象が異なる対立遺伝子に起こっていて、ＴＥＴ２の二対立遺伝子性の不活性化をもたらしていることを示した（データは示されていない）。このように、これらの患者でＴＥＴ２の二対立遺伝子性の不活性化が見られたことは、発癌の２ヒット劣性モデルの基準を満たし、ＴＥＴ２が腫瘍抑制遺伝子として働くという仮説を裏付ける。
【０１９８】
他の２５の変異体はＴＥＴ２のコード配列上に同定され、短い近傍のイントロン領域は多型であった。７つは非コード領域（イントロンまたは３’ＵＴＲ）における置換であり、１つはイントロンショートタンデムリピート（縦列反復）の変種であり、４つはコード配列内のサイレント変種であり、１３はミスセンス多型であった。それらは総て、公開データベースにおけるそれらの存在、またはそれらが無症候性の家族員で見られたという事実、または対照集団におけるそれらの属性に基づいて多型として分類された。機能的ドメインのいずれのものにもミスセンス多型は存在しないことに着目することが興味深い。
【０１９９】
１２．ＴＥＴ２突然変異は２つの突然変異を有する患者で連続的に獲得された
家族Ｆ３の患者Ｐ４に関して、最近の三段階の進行ＰＶ、ＭＦおよびＡＭＬの７つの血液サンプルを入手できた。これらのサンプルを配列決定したところ、臨床事象および分子事象の時間性を決定することができた。
【０２００】
図７は、患者Ｐ４（Ｆ３）におけるＴＥＴ２およびＪＡＫ２の一連の研究を示す。ＴＥＴ２突然変異およびＪＡＫＶ６１７Ｆのそれぞれに関して一連の電気泳動図が示されている。左の図は診断からの時間経過（年）と各サンプルの相当する表現型（白：ＥＴ；グレー：ＰＶ；斜線：ＥＴ後のＭＦ；黒：ＡＭＬ）を示す。
【０２０１】
これらの結果は、ＪＡＫ２Ｖ６１７ＦおよびＴＥＴ２  ｐ．Ａｒｇ５５０Ｘ突然変異は、その患者がＰＶに罹患していた場合には、最初のサンプルにすでに存在していた。第二の突然変異ｐ．Ａｓｎ８５７ｆｓは、７年後でＭＦ診断の５か月前の第二のサンプルで検出可能であった。この一連の分析は、これらの各突然変異の存在量が経時的に、疾患の発症と並行して増えていたことを示した。
【０２０２】
最後に、ＴＥＴ２突然変異はＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性および陰性患者で同等の割合で見られたが、このことは両遺伝子における分子事象が互いに独立に生じる可能性があることを示唆している。
【０２０３】
１３．ＴＥＴ２分子事象は主としてＰＭＦを有する患者または血液学的転換に向かって２番目の進行を受けたＰＶもしくはＥＴを有する患者で見られた
合わせて１２人の患者が少なくとも１つのＴＥＴ２突然変異を有することが分かった。それらは試験した全ＭＰＤ患者の２０％を閉めた。
【０２０４】
図８は、少なくとも１つのＴＥＴ２突然変異を有するこれら１２人の患者の臨床状態を図で示したものである。白い四角はＥＴ段階を、グレーはＰＶを、斜線は骨髄繊維症（原発性（左上がり）またはＰＶ後／ＥＴ（右上がり）のいずれか）を示し、ＡＭＬは黒い四角で示されている。分子分析を示す各矢印の上にはＴＥＴ２に相当する突然変異の注釈がある。疾病期間（年）がバーの下に示され、「０」点は診断時を示す。死亡時点は必要な際に右端に垂直の線で示す。
【０２０５】
この分析は、これらのＴＥＴ２欠陥は３つの主要なＭＰＤ表現型、ＰＶ（４／３２）、ＥＴ（５／２１）およびＰＭＦ（３／８）を有すると診断された患者において同定されたことを示す。ＴＥＴ２突然変異は、新生ＡＭＬおよび全身肥満細胞症を含む希な血液学的表現型を有する親族で見られた（データは示されていない）。総ての患者がＴＥＴ２欠陥を有していたが、２人はＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異陽性であった。対立遺伝子の存在量は３３から９５％まで変動した（表６）。陰性例は、極めて活発なＡＭＬを発症したＥＴ患者と早期に死亡したＥＴ患者であった（Ｐ５およびＰ６、データは示されていない）。本発明者らは、調査時にＰＶ後またはＥＴ後ＭＦを発症していなかったＰ３およびＰ７の２人の患者は、高レベルのＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ対立遺伝子存在量（それぞれ８２および３９％を、表６）を特徴とした。
【０２０６】
本発明者らの結果を考え合わせると、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性患者の２０％（１０／４９）がＴＥＴ２に関して突然変異しており、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陰性患者では１７％（２／１２）であったことが分かった。
【０２０７】
総ての患者がＴＥＴ２突然変異を有したが、２人は、発症時に起こった、またはＰＶもしくはＥＴ、または二次的なＡＭＬの後に二次的に獲得された骨髄繊維症を有した。従って、ＰＶまたはＥＴ後にＰＭＦまたは血液学的合併症を有する患者の２９％（１０／３４）はＴＥＴ２が変異していたのに対し、１２年の平均疾病期間の後にも血液学的合併症と診断されなかった患者では７．４％（２／２７）であったことが分かった。しかしながらやはり、ＴＥＴ２突然変異を有し、血液学的転換を示さずにＰＶまたはＥＴを呈する両患者は疾病の活動経過を持っていた。
【０２０８】
臨床像、血液学的データまたはさらに患者の疾病経過と突然変異の種類および場所の間、または単一の異型接合性ＴＥＴ２突然変異を有する患者と２つのそれを有する患者の間に相関は無かった。図８に示されるように、ＴＥＴ２突然変異は診断時（Ｐ９）から２０年後（Ｐ８）まで、患者ごとに疾病進行の異なる時点で見られ、すなわち、進行時期も様々であった［１〜１６年］。
【０２０９】
１４．ＴＥＴ２突然変異は初期の造血前駆体に存在し、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆとは無関係に獲得された
家族Ｆ３の患者Ｐ４と家族Ｆ２のＰ２とＰ３の３人の患者がそれらの前駆体細胞の分析に応じることができた。これらの患者から血液前駆体細胞は、ＰＶ段階およびＭＦ後の芽細胞段階の、疾病の異なる二段階で入手できた。
【０２１０】
図９は、患者Ｐ２、Ｐ３およびＰ４の方向付けされた前駆体におけるＴＥＴ２およびＪＡＫ２遺伝子型を開示している。ヒストグラムは、ＪＡＫＶ６１７ＦＴＰ突然変異と２つのＴＥＴ２突然変異を有するクローン（斜線）、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異と１つのＴＥＴ２突然変異（白）、野生型ＪＡＫ２と２つのＴＥＴ２突然変異を有するクローン（薄いグレー）、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異と野生型ＴＥＴ２を有するクローン（グレー）および２つの遺伝子のいずれにも突然変異の無いクローン（黒）の画分を示す。患者Ｐ４については２つのサンプルを分析し、各バーの下に相当する段階を示す。分析されたクローンの数が示されている。
【０２１１】
これらの結果は、診断から８年後のＰＶ段階に、内因性の赤血球コロニーはすでにｐ．Ａｒｇ５５０Ｘ突然変異を有しているが（５／２９）、ｐ．Ａｓｎ８５７ｆｓは見られなかった（０／２９、図９）。
【０２１２】
９年後の白血病転換後、２つを除き、遺伝子型分析をした総ての赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）および総ての顆粒球マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）がＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆと両ＴＥＴ２の突然変異を有していた（図９）。従って、前駆体分析によりこれらの事象の時間性を確認したところ、患者Ｐ４では、ｐ．Ａｒｇ５５０Ｘは疾病の最も初期に獲得され、最も後の段階はｐ．Ａｒｇ５５０Ｘおよびｐ．Ａｓｎ８５７ｆｓの双方の存在を特徴とした。興味深いことに、２つのＣＦＵ−ＧＭは両ＴＥＴ２突然変異を有し、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異は無かった。患者Ｐ２では、ＪＡＫ２およびＴＥＴ２双方の突然変異でも、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異単独でも、突然変異無しでもコロニーが見られた（図９）。このことは、この患者に関して、すでにＪＡＫ２が変異したクローンにおいてＴＥＴ２突然変異が見られたことを示す。ＰＶと診断された患者Ｐ３からのＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭは総てＪＡＫ２とＴＥＴ２双方の突然変異を有しており、ＪＡＫ２事象とＴＥＴ２事象に関する結論は得られなかった。
【０２１３】
１５．ＴＥＴ２分子事象は主としてＣＭＭＬを有する患者に見られた
ＴＥＴ２における体細胞突然変異の性質および頻度もまた、ＷＨＯ基準に従ってＣＭＭＬ１（ｎ＝７０）またはＣＭＭＬ２（ｎ＝１８）を有する８８人の患者から採取した骨髄または末梢血、ならびに事前に同定されたＣＭＭＬの１４の急性芽細胞転換において試験した。現行の倫理規制に従い、患者からインフォームド・コンセントを得た。慢性期のＣＭＭＬを有する患者は新たに診断されたか（ｎ＝４３）、または造血系疾患が知られており、３か月ごとに治療回避、支援治療または細胞傷害性治療（ほとんどの場合でヒドロキシ尿素による）に関して追跡調査を行った（ｎ＝４５）。
【０２１４】
血液および骨髄サンプルをＥＤＴＡに採取し、フィコール・ハイパークにより単核細胞を選別した。市販のキット(QIAGEN)を用いてＤＮＡを抽出した。従前に記載されているようにＴＥＴ２遺伝子のエキソン３〜エキソン１１にわたるコード配列を増幅するよう設計された遺伝子特異的プライマーとともに標準的条件を用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および直接配列決定反応を行った。各ＰＣＲ反応について、２０ｎｇのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅に用い、その後、磁性ビーズ精製と、ＡＢＩ  ３３００キャピラリーシーケンサー(AGENCOURT BIOSCIENCE)を用いた二方向配列決定を行った。Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ(SOFTGENETICS)を用い、１１３４〜１４４４および１８４２〜１９２１にわたる保存領域に存在するナンセンスおよびミスセンス突然変異を検出し、配列を手動で再検証してフレームシフト突然変異を検出した。ＴＥＴ２異常はＦＭ  ９９２３６９  ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベースに従ってナンバリングした。
【０２１５】
ＴＥＴ２において同定された突然変異を表１０に挙げている。
【０２１６】
【表１１】
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【０２１７】
これらの結果は、ＴＥＴ２遺伝子の変異状態が８８人（５０％）の患者のうち４４人で検出されたことを明らかにした。診断時に検討した４３人の患者で、ＴＥＴ２遺伝子の変異状態は１８症例（４２％）で確認された。このような変異状態は、疾病の経過に沿って検討した４５人の患者のうち２６人（５８％）で確認された。従って、これらの結果は、ＴＥＴ２突然変異率が試験された他の骨髄性疾患のいずれよりもＣＭＭＬで高いことを示唆する。
【０２１８】
さらに、二対立遺伝子性の遺伝子変異を示唆するＴＥＴ２配列の２つの異なる突然変異は、４４人の慢性期ＣＭＭＬを有する変異患者のうち１８人（４０％）（診断時に突然変異が確認された１８人の患者のうち５人（２７％）を含む）、および疾病の経過に沿って検討された２６人の変異患者のうち１３人（５０％）で確認された。フレームシフト突然変異３、ナンセンス突然変異１９、ミスセンス突然変異１４およびスプライス部位の突然変異３を含む、合わせて６９のＴＥＴ２突然変異が確認された。これらの突然変異は最も頻繁にエキソン３（２２件）、エキソン１０（９件）およびエキソン１１（１０件）を含んだ。
【０２１９】
少なくとも２か月の追跡調査で診断時にＴＥＴ２の状態が判定された４３人の患者のうち４０人で全生存率の分析を行い、ＴＥＴ２突然変異を有するこのコホートの１６人の患者よりも１年短い全生存率を示したが、その差は有意に達しなかった。全生存率分析をＷＨＯ分類に従い、少なくとも２か月の追跡調査で、ＣＭＭＬ１を有する２９人の患者に限定したところ、その差は有意となった（ｐ＜０．０１）。年齢、性別およびＦＡＢ分類を含む他の試験パラメーターに生存率に影響を及ぼしたものは無かった。最後に、これらの結果により、ＴＥＴ２突然変異が生存率を有意に引き下げる傾向を有するＣＭＭＬ１を有する２９人の患者に関連していたことが確認された。
【０２２０】
１６．リンパ性癌に罹患している患者におけるＴＥＴ２遺伝子の変異
Ｂ細胞リンパ腫に罹患している１５７人の患者のＣＧＨ分析を行ったところ、２例で第４染色体全体の欠損、４例でＴＥＴ２遺伝子を欠いた染色体４ｑ配列の部分的欠失、および１例でＴＥＴ２の下流側の重複を伴ったＴＥＴ２の上流側の欠失が示された。これらの再配列はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（１０７例）で見られたが、濾胞性リンパ腫（５０例）では再配列は見られなかった。
【０２２１】
本発明者らは、ＴＥＴ２のコード配列内のバリエーションに関して９３人の患者を分析した。それらは３３人がＴ細胞リンパ腫であり、６０人がＢ細胞リンパ腫であった。
【０２２２】
Ｔ細胞リンパ腫からの１０サンプルでは、フレームシフト１０とナンセンス突然変異２とミスセンス突然変異２を含む１４の突然変異が見られた。
【０２２３】
表９は、１０人のＴ細胞リンパ腫患者で同定されたＴＥＴ２突然変異を示す：
【表１２】
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【０２２４】
よって、これらの結果により、Ｔ細胞リンパ性腫に罹患している患者のＴＥＴ２突然変異の頻度が３０％であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】ＴＥＴ２のタンパク質配列（配列番号２）を示す。種間で保存されている領域が強調されている（太字）。
【図２】２人の患者ＡおよびＥから得られたサンプルに関して得られたＰＣＲ産物の配列決定により得られた配列トレースを示す。突然変異は腫瘍サンプルのみに存在し、非腫瘍サンプル（ＮＴ）および末梢血リンパ球（ＰＢＬ）には存在しないことが示されている。Ｒはリバースプライマーで得られた配列に相当し、Ｆはフォワードプライマーで得られた配列に相当する。ＷＴは健常個体で得られた配列に相当する。
【図３】ＭＤＳサンプルにおいて、変異型ＴＥＴ２が未熟ＣＤ３４＋細胞に見られ、で得られ、変異型クローンのin vivo拡大に関連していることを示す。
【図４】ＴＥＴ２欠陥を伴うＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性ＭＰＤ造血幹細胞は、高いＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖能を呈することを示す。
【図５】タンパク質配列に沿って分布したＴＥＴ２遺伝子の同定された突然変異のいくつかを示す。保存された領域をグレーの斜線で示す。矢印はエキソン境界の位置を示す。ＦＳ：フレームシフト。
【図６】家族性骨髄増殖性新生物で同定された突然変異を示すＴＥＴ２遺伝子およびタンパク質の模式図を示す。斜線の四角はエキソンを示す。末端切断突然変異は黒星印で、ミスセンス突然変異は黒逆三角▼で示す。保存されている機能的ドメインはタンパク質スキームに四角で示されている。ｆｓ：フレームシフト。
【図７】患者Ｐ４（Ｆ３）におけるＴＥＴ２およびＪＡＫ２の一連の研究を示す。ＴＥＴ２突然変異およびＪＡＫＶ６１７Ｆの各々に関する一連の電気泳動図を示す。左の図は診断からの時間経過（年）と各サンプルに関する対応する表現型を示す（白：ＥＴ；グレー：ＰＶ；斜線：ＥＴ  ＭＦ後；黒：ＡＭＬ）。
【図８】少なくとも１つのＴＥＴ２突然変異を有する１２人の患者の臨床状態の模式図を示す。白い四角はＥＴ段階、グレーはＰＶ、斜線は原発性（左上がり）またはＰＶ後／ＥＴ（右上がり）のいずれかの骨髄繊維症を示し、ＡＭＬは黒い四角で示される。分子分析を示す各矢印の上にはＴＥＴ２に相当する突然変異の注釈がある。疾病期間（年）がバーの下に示され、「０」点は診断時を示す。死亡時点は必要な際に右端に垂直の線で示す。
【図９】患者Ｐ２、Ｐ３およびＰ４の方向付けされた前駆体におけるＴＥＴ２およびＪＡＫ２遺伝子型を示す。ヒストグラムは、ＪＡＫＶ６１７Ｆと２つのＴＥＴ２突然変異（斜線）、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆと１つのＴＥＴ２突然変異（白）、野生型ＪＡＫ２と２つのＴＥＴ２突然変異（薄いグレー）、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆと野生型ＴＥＴ２（グレー）および２つの遺伝子のいずれにも突然変異無し（黒）を有するクローンの画分を示す。患者Ｐ４に関して２つのサンプルを分析した（相当するステージを各バーの下に示す）。分析したクローンの数を示す。
【図１０】ＭＤＳ患者における臨床状態とＴＥＴ２遺伝子型を示す。白い四角は低／ｉｎｔ−１段階のＭＤＳを示し、斜線の四角はｉｎｔ−２／高段階のＭＤＳを示し、グレーは続発性のＡＭＬを示す。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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