(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ経路の調節による腫瘍浸潤の阻害のための薬剤の製造のための、ＨＥＲ３タンパク質によるＰＹＫ２の直接的なリン酸化を阻害するＨＥＲ３インヒビターの使用であって、前記腫瘍浸潤が、ＰＹＫ２によって媒介されるＭＡＰキナーゼ経路の活性化によって引き起こされ、そこではＰＹＫ２が、ＨＥＲ３によって活性化される前記使用。
【請求項２】
前記ＨＥＲ３インヒビターは、ＨＥＲ３タンパク質の活性を低減させる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ＨＥＲ３インヒビターは、標的細胞又は標的生物に導入される、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記腫瘍浸潤の阻害は、グリオーマにおける腫瘍浸潤の阻害である、請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
ＨＥＲ３タンパク質によるＰＹＫ２の直接的なリン酸化を阻害可能な物質についてスクリーニングすることを含む、腫瘍浸潤の阻害のためのＭＡＰキナーゼ活性の新規モジュレーターの同定方法であって、
試験されるべき物質とＨＥＲ３リン酸化及び／又はＨＥＲ３キナーゼ活性との相互作用について細胞アッセイ又は分子アッセイを行う工程と、
ＨＥＲ３タンパク質によるＰＹＫ２の直接的なリン酸化を阻害可能な物質を同定する工程と、
を含む前記方法。
【請求項６】
ＰＹＫ２の直接的なリン酸化を阻害可能な物質についてスクリーニングすることを含む、腫瘍浸潤の阻害のための過剰増殖性疾患の新規のモジュレーターの同定方法であって、
試験されるべき物質とＰＹＫ２リン酸化及び／又はＰＹＫ２キナーゼ活性との相互作用について細胞アッセイ又は分子アッセイを行う工程と、
ＰＹＫ２の直接的なリン酸化を阻害可能な物質を同定する工程と、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明はマイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ経路の調節のための標的としての、ＨＥＲ２タンパク質又はそれをコードする核酸の使用に関する。更に、ＭＡＰキナーゼ経路の調節のための標的としての、ＰＹＫ２タンパク質及びそれをコードする核酸の使用を記載している。ＨＥＲ３キナーゼ活性の阻害によって、ＰＹＫ２のリン酸化及び従ってＭＡＰキナーゼ経路の刺激が阻害される。本発明は有利には適用、特に診断的適用又は医学的適用のために適当であり、その際、ＭＡＰキナーゼ経路の阻害が望ましい。このように本発明はＭＡＰキナーゼ関連疾患、例えば腫瘍の診断、治療又は予防のための新規の方法に関する。
【０００２】多形性神経膠芽腫（一次中枢神経系（primary central nervous system）において最も悪性の腫瘍）は膠芽細胞、１型及び２型の星状膠細胞の悪性形質転換から生じる。発生的に、膠芽細胞は脳の副脳室領域から発育期の白質に、分化及び増殖の途上で移行する（１，２）。星状膠細胞のこの固有の移行能力は、形質転換された細胞が周囲組織を浸潤する場合にグリオーマ悪性度の重要な特徴である。
【０００３】  星状膠細胞移行の活性化に関連するマイトジェン及び生存因子、例えばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ｂ−ＦＧＦ及びＥＧＦのなかで、ニューレグリンはＳＨＣ及びホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）を経由するＭＡＰＫ経路の活性化による増殖及び分化に潜在的な効果を有する（３，４）。４腫のニューレグリン（ＮＲＧ１〜ＮＲＧ４）は膜貫通前駆体のタンパク質分解的プロセシングによって産生される構造的に関連した糖タンパク質のファミリーを含む。新規の分化因子（ＮＤＦ）、ニューロン性アセチルコリン受容体誘導性活性タンパク質（ＡＲＩＡ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、感覚誘導因子（ＳＭＤＦ）及びヘレグリン（ＨＲＧ）を含む多くのＮＲＧ１アイソフォーム（１２）は様々な異なる生物学的系におけるその多重の成長調節活性及び分化調節活性を表す。
【０００４】  ＨＲＧの発現は中枢神経系及び末梢神経系で検出され（１３）、そこでＨＲＧは神経筋（neuronal muscle）及び神経シュワン細胞間結合のそれぞれで生物学的活性を及ぼしている。ＨＲＧは受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）ｅｒｂＢファミリーのメンバーであるＨＥＲ３（ｅｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ｅｒｂＢ４）のためのリガンドに相当する。ＨＥＲファミリーはまたＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）及びＨＥＲ２／ニューを含む。ＨＥＲ３は、そのキナーゼドメインにおける２つの突然変異のため恐らくキナーゼ活性が損なわれているＲＰＴＫに相当する（１４）。マイトジェンシグナルの伝達はＨＥＲ３又はＨＥＲ４へのいずれかへのＨＲＧの結合を必要とし、またＨＥＲ２とヘテロダイマー化し、かつ活性化されたＨＥＲ２によってそのＣ末端でリン酸転移される。シグナル分子ＰＩ３−Ｋ、ＳＨＣ及びＧＲＢ７はＨＥＲ３のリン酸化されたＣ末端に結合し、かつＲａｓ／Ｒａｆ経路へのマイトジェンシグナルを媒介する（１６）。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３複合体は、恐らくリガンド結合後にＨＥＲ１のように分解される代わりに循環経路にリダイレクトするためＨＥＲヘテロダイマーの中でも最も高いマイトジェン性を有する（１７）。
【０００５】  ＦＡＫ２、ＣＡＫ−β、ＲＡＦＴＫ又はＣＡＤＴＫとしても呼称されるフォーカルアドヒージョンキナーゼファミリーＰＹＫ２の近年同定されたメンバーはＧタンパク質共役受容体によって誘導されるＭＡＰＫ活性における接点であると示されている（１８，１９，２０）。ＰＹＫ２のリン酸化はＳｒｃ−ファミリーキナーゼの漸増及び細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化をもたらす。ＰＹＫ２は中枢神経系及び造血系列から誘導される細胞及び組織において優勢的に発現され、そこではＰＹＫ２は主に細胞質の至る所に散在し、核周囲領域で濃縮される（２１）。ＰＹＫ２は細胞内カルシウム濃度を増大させる様々な刺激によって活性化でき（２２）、またストレス因子（例えば高浸透圧ショック、ＵＶ、腫瘍壊死因子α）によっても活性化でき、それによりＪｕｎ  Ｎ−末端キナーゼを誘導する（２３，２４）。しかしながらＰＹＫ２活性化のメカニズムの分子的詳細は未知である。
【０００６】  本願においてＨＲＧ刺激後のヒトのグリオーマ細胞系統におけるＰＹＫ２チロシンリン酸化の役割を調査した。ＰＹＫ２がリン酸化されるメカニズム、そのＭＡＰＫ経路における役割及び引き続いての腫瘍浸潤における効果を調査した。ＨＥＲ３のキナーゼ活性はＰＹＫ２を直接リン酸化し、またＭＡＰＫ経路によって媒介されるマイトジェンシグナルを増幅することが示された。本願のデータはグリオーマ細胞の浸潤能力の調節物質としてのＰＹＫ２の重要な役割を示唆している。
【０００７】  このように本発明の第一の態様はＭＡＰキナーゼ経路の調節のための標的としての、ＨＥＲ３タンパク質の使用に関する。
【０００８】  本発明の更なる態様は、ＭＡＰキナーゼ経路の調節のための標的としての、ＨＥＲ３タンパク質をコードする核酸又はそれに相補的な核酸の使用に関する。
【０００９】  本発明の第三の態様はＭＡＰキナーゼ経路の調節のための標的ととしての、ＰＹＫ２タンパク質の使用に関する。
【００１０】  本発明の第四の態様は、ＭＡＰキナーゼ活性の調節のための標的としての、ＰＹＫ２タンパク質をコードする核酸又はそれに相補的な核酸の使用に関する。
【００１１】  本発明の第五の態様はＨＥＲ３リン酸化及び／又はＨＥＲ３キナーゼ活性を阻害可能な物質をスクリーニングすることによるＭＡＰキナーゼ経路活性の新規のモジュレーターを同定するための方法に関する。
【００１２】  本発明の第六の態様はＰＹＫ２リン酸化及び／又はＰＹＫ２キナーゼ活性を阻害可能な物質をスクリーニングすることによるＭＡＰキナーゼ経路活性の新規のモジュレーターを同定するための方法に関する。
【００１３】  本願で使用される用語“ＨＥＲ３”又は“ＰＹＫ２”タンパク質は特に哺乳動物タンパク質、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ブタなどからのタンパク質を包含する。特に有利なタンパク質は：
ａ）ジーンバンクのアクセッション番号Ｍ３４３０９に示されかつ（５１）で公表されているアミノ酸配列又は
ｂ）前記のアミノ酸に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列（前記のアミノ酸配列同一性はＧＣＧ又はＢＬＡＳＴのような適当なコンピュータプログラムによって測定してよい）
を有するＨＥＲ３タンパク質である。
【００１４】  更に特に有利なタンパク質は
ａ）ジーンバンクのアクセッション番号Ｕ３３２８４に示されかつ（１８）で公表されているアミノ酸配列又は
ｂ）前記のアミノ酸に少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、より特に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列（前記のアミノ酸配列同一性はＧＣＧ又はＢＬＡＳＴのような適当なコンピュータプログラムによって測定してよい）
を有するＰＫＹ２タンパク質である。
【００１５】  更に用語“ＨＥＲ３”及び“ＰＹＫ２”タンパク質は、生物学的活性を有するその組み換え誘導体又は変異体並びにその断片を含む。これらの誘導体、変異体及び断片はアレル変異体遺伝子又は組み換えにより変更された、例えば改変又は欠損した遺伝子からの発現産物として、かつ／又はタンパク質分解生成物として得ることも可能である。ＨＥＲ３に関連して用語“生物学的活性”は有利にはキナーゼ活性、例えばＰＹＫ２に関する直接的なキナーゼ活性又はインヒビター、例えば低減された又は破壊されたキナーゼ活性を有する本来のＨＥＲ３の拮抗阻害剤として作用する能力を含む。ＨＥＲ３キナーゼ活性のために特に重要な残基はチロシン残基Ｙ１２５７、Ｙ１２７０及び／又はＹ１２８８である。このようにこれらの残基が欠失又は他のアミノ酸残基によって置換されたＨＥＲ３アナログを本来のＨＥＲ３のインヒビターとして使用してよい。ＰＹＫ２に関連して用語“生物学的活性”は有利にはＨＥＲ３によってリン酸化され、かつＭＡＰキナーゼ経路の刺激物質として作用する能力又はインヒビター、例えば低減された又は破壊されたキナーゼ活性を有するＭＡＰキナーゼ刺激のための拮抗阻害剤として作用する能力を含む。ＰＹＫ２キナーゼ活性のために特に重要な残基は位置４５７におけるリジン（Ｋ）（ＡＴＰ結合部位）である。かかる誘導体、変異体及び断片は適当な宿主細胞における該当する核酸の組み換え的発現及び公知法により得られた発現産物を得ることによって得ることができる。得られる発現産物の活性は本願、特に実施例部に記載される方法により測定できる。
【００１６】  ＨＥＲ３タンパク質はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい核酸によってコードされる。有利には該核酸は：
ａ）ジーンバンクのアクセッション番号Ｍ３４３０９で示される核酸配列又はそれに相補的な核酸配列、
ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲内で（ａ）の配列に相応する核酸配列又は
ｃ）配列ａ）及び／又はｂ）とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸配列
を含む。
【００１７】  ＰＹＫ２タンパク質はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい核酸によってコードされる。有利には該核酸は：
ａ）ジーンバンクのアクセッション番号Ｕ３３２８４で示される核酸配列又はそれに相補的な核酸配列、
ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲内で（ａ）の配列に相応する核酸配列又は
ｃ）配列ａ）及び／又はｂ）とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸配列
を含む。
【００１８】  本願による用語“ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション”はSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1,101-1,104に記載されるように使用される。従ってストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、陽性のハイブリダイゼーションシグナルが１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳでの５５℃における、有利には６２℃、より有利には６８℃における１時間の洗浄、特に０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳでの５５℃における、有利には６２℃における、より有利には６８℃における１時間の洗浄の後にも検出される場合に生じる。かかる洗浄条件下に、配列表に示される配列又は相補的ヌクレオチド配列又は遺伝子コードの縮重の範囲内の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列は本発明によって包含される。
【００１９】  本発明の核酸分子は組み換え体法、例えば公知の増幅法、例えばＰＣＲによって生成する組み換え核酸分子であってよい。他方で該核酸分子はまた化学的に合成された核酸であってもよい。有利には核酸分子は、任意の原核性又は真核性のベクターであってよく、そこには核酸配列が適当な発現シグナル、例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサーなどのコントロール下に存在するベクター中に存在する。原核性ベクターのための例は染色体ベクター、例えばバクテリオファージ及び染色体外ベクター、例えばプラスミドであり、その際、環状プラスミドベクターが有利である。真核性ベクターのための例は酵母ベクター又は高等細胞、例えば昆虫細胞又は哺乳動物細胞のために適当なベクター、プラスミド又はウイルスである。
【００２０】  本来のＨＥＲ３タンパク質は直接的にＰＹＫ２をリン酸化し、かつそれによってＭＡＰキナーゼ経路によって媒介されるマイトジェン活性を刺激することが可能である。このようにＨＥＲ３リン酸化の阻害はＭＡＰキナーゼ経路の阻害をもたらすことが可能である。従って本発明の有利な態様は標的細胞又は標的生物におけるＨＥＲ３タンパク質の量及び／又は活性を低減させることを含む。このＨＥＲ３の低減された量及び／又は活性はＨＥＲ３インヒビター、特にＨＥＲ３キナーゼ活性のインヒビターを投与することによって達成できる。このインヒビターは低分子物質又は抗ＨＥＲ３抗体であってよい。用語“抗体”はポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、例えばキメラ抗体、人化抗体、ヒト抗体又は組み換え抗体、例えば単鎖抗体を包含する。更に該用語は抗体断片、例えばタンパク質分解断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ′又は組み換え断片、例えばｓｃＦｖを包含する。更に有利な態様において本発明は標的細胞又は標的生物におけるＨＥＲ３の発現を低下させることを含む。この発現の低下は、例えば本来のＨＥＲ３遺伝子の転写又は翻訳を、例えば適当なアンチセンス核酸分子を投与することによって阻害することによって達成できる。
【００２１】  前記の生物学的活性のゆえに、ＨＥＲ３はＭＡＰキナーゼ経路関連疾患、特にＭＡＰキナーゼ経路過剰活性関連疾患の診断、予防又は治療のための薬剤の製造のための適当な標的である。より有利にはＨＥＲ３はＰＹＫ２リン酸化関連疾患の診断、予防又は治療のための標的である。この疾患は過剰増殖性疾患であり、炎症プロセス及び腫瘍、例えば乳癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び特にグリオーマから選択することができる過剰増殖性疾患であってよい。もっとも有利には本発明は特にグリオーマにおいて腫瘍浸潤を阻害するためにＨＥＲ３キナーゼ活性の阻害を含む。
【００２２】  本発明によれば、ＰＹＫ２タンパク質のリン酸化がＭＡＰキナーゼ経路によって媒介されるマイトジェン性を作動させ、かつ増幅することが判明した。このようにＰＹＫ２タンパク質の阻害、特にＰＹＫ２リン酸化の阻害はＭＡＰキナーゼ経路の阻害をもたらすことが可能である。この阻害は低分子量物質であってよいＰＹＫ２のインヒビター又は前記のような抗ＰＹＫ２抗体（ＨＥＲ３に対する）又は本来のＨＥＲ３のキナーゼ活性を阻害することが可能なＨＥＲ３アナログを投与することによって達成できる。選択的に該阻害は核酸、例えばアンチセンス核酸を投与することによって達成できる。このように標的細胞又は標的生物におけるＰＹＫ２の量及び／又は活性を低減させることができ、かつ／又は標的細胞又は標的生物におけるＰＹＫ２の発現を低下させることができる。特に有利な態様において突然変異したＰＹＫ２タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸が投与され、その際、前記の突然変異したＰＹＫ２タンパク質はリン酸化活性及び／又はキナーゼ活性の少なくとも部分的な損失を示す。
【００２３】  ＨＥＲ３及び／又はＰＹＫ２インヒビターは有利には、付加的に適当な製薬学的に認容性のキャリヤー又は希釈剤を含有する医薬品組成物の形で投与される。該組成物は注入可能な溶液、懸濁液、クリーム、軟膏、錠剤などであってよい。該組成物は診断的又は医学的な、例えば特に癌の分野における予防的適用又は治療的適用のために適当である。用量及び投与経路の様式は治療されるべき疾患の種類及び重度に依存し、かつ当業者によって容易に規定できる。
【００２４】  例えば抗体の投与は公知のプロトコール、例えば（５２）に記載のようなプロトコールによって実施してよい。核酸の形での投与は公知のプロトコール、例えば（５３）に記載されるプロトコールで実施してもよい。
【００２５】  ＨＥＲ３及び／又はＰＹＫ２インヒビターの投与は他の活性剤、特に抗腫瘍剤、例えば細胞毒性物質及びＭＡＰキナーゼインヒビター、例えばＰＤ９８０５９及びＵＯ１２６の投与と組み合わせてよい。
【００２６】  更に本発明による他の態様はＨＥＲ３リン酸化及び／又はＨＥＲ３キナーゼ活性を阻害可能な物質についてスクリーニングすることを含むＭＡＰキナーゼ経路活性の新規のモジュレーターを同定するための方法である。ＨＥＲ３インヒビターは有利には抗ＨＥＲ３抗体及び低分子量化合物から選択される。更に本発明はＰＹＫ２リン酸化及び／又はＰＹＫ２キナーゼ活性を阻害可能な物質についてスクリーニングすることを含むＭＡＰキナーゼ経路活性の新規のモジュレーターを同定するための方法を提供している。ＰＹＫ２インヒビターは有利には低分子量物質から選択される。
【００２７】  該スクリーニング法は高処理量スクリーニングアッセイであってよく、その際、多くの物質が平行して試験される。スクリーニングアッセイは細胞アッセイ又は分子アッセイであってよく、その際、試験されるべき物質とＨＥＲ３及び／又はＰＹＫ２リン酸化又はキナーゼ活性との相互作用が測定される。該タンパク質は細胞系、ＨＥＲ３及び／又はＰＹＫ２を過剰発現する細胞系、ＨＥＲ３及び／又はＰＹＫ２を含有する細胞フラクション又は実質的に単離及び精製されたＨＥＲ３及び／又はＰＹＫ２タンパク質又はその断片に提供してよく、その際、該タンパク質はリン酸化されることが可能であり、かつ／又はキナーゼ活性が可能である。前記の方法によって同定されたいかなる活性物質も、例えば阻害活性を有するいかなる物質も医薬品又は更に変更されて医薬品特性が改善された先導構造として使用してよい。本発明の方法によって同定された物質の任意の医薬品使用又は本発明の方法によって同定されるリード構造から得られる任意の変更された物質も特許請求の範囲の対象物として包含されていることを留意すべきである。
【００２８】  本発明を以下の図面及び実施例でより詳細に説明する。
【００２９】  図面の説明
図１：ＰＹＫ２チロシンリン酸化に対するｃ−ｓｒｃインヒビターＰＰ１及びＨＥＲ２インヒビターＡＧ８２５の効果
ａ．ＰＹＫ２のチロシンリン酸化は、ＩＯＮＯ刺激に対してＨＲＧ刺激後のｃ−ｓｒｃに無関係である。ＳＦ７６７グリオーマを３０分間５μＭのＰＰ１で前処理し、５μｇｍｌ-１のヘレグリン（ＨＲＧ、左区画）又は５μＭのイオノマイシン（ＩＯＮＯ、右区画）のいずれかで２０分間及び５分間それぞれ刺激する。
【００３０】  ｂ．ＨＥＲ３とのＰＹＫ２共沈はＨＥＲ２キナーゼ活性に依存し、かつＰＹＫ２のチロシンリン酸化はＨＥＲ３へのその結合に比例している。ＳＦ７６７グリオーマを１時間１０μＭのＡＧ８２５で前処理し、かつ５μｇｍｌ-１のヘレグリン（ＨＲＧ）で２０分間刺激する。細胞溶解物にポリクローナル抗ＰＹＫ２（α−ＰＹＫ２）又はモノクローナル抗ＨＥＲ３（α−ＨＥＲ３）抗体を使用して免疫沈降（ＩＰ）を行う。チロシンリン酸化レベルをモノクローナル抗ホスホチロシン抗体（α−４Ｇ１０）でのウェスタンブロット（ＷＢ）によって分析する（ａ．上方の区画、及びｂ．上方の区画）。同等のタンパク質ローディングをそれぞれα−ＰＹＫ２及びα−ＨＥＲ３抗体での再ブロッティングによって確認した（ａ．下方区画、及びｂ．中央及び下方の区画）。ＨＥＲ３とのＰＹＫ２の共沈をα−ＰＹＫ２抗体によってメンブレンをプロービングすることによって検出した（ｂ．中央の区画、レーン１〜４）。未刺激の細胞をＮＳで示す。
【００３１】  図２：ＳＦ７６３及びＳＦ７６７グリオーマ細胞系統におけるＰＹＫ２及びＨＥＲ３の局在
ａ，ｂ．ＳＦ７６７細胞（ａ）及びＳＦ７６３細胞（ｂ）において、ＰＹＫ２は細胞質の至る所に点状の分布を示しており、かつ核周囲領域及び幾つかの顕著な細胞突出（緑色）中で富化されている。ＨＥＲ３（赤色）は殆どの点（ｂ．挿入図）においてかつより大きな凝集物（黄色）において２つの染色の重複している分布によって示されるように広範に共局在している。共局在はＨＲＧによる刺激に無関係である。これらの細胞を固定し、かつ未刺激（ＮＳ）又は５μｇｍｌ-１のヘレグリン（ＨＲＧ）での２０分間の刺激の後にＰＹＫ２（緑色）及びＨＥＲ３（赤色）に対して免疫染色した。共焦点レーザ走査型顕微鏡によって得られる光学断面を示す。スケールバーは１０μｍを表す。
【００３２】  図３：ＰＹＫ２とＨＥＲ３のＣ−末端ドメインとの会合
ＨＥＫ２９３繊維芽細胞を、指摘されるように野生型タンパク質（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＹＫ２）及びその優性阻害型変異体（ＨＥＲ２−ＫＭ、ＨＥＲ３−ＫＭ、ＰＹＫ２−ＫＭ）の組合せ（ａ）で、野生型ＨＥＲ３又はその欠損した構築物ＨＥＲ３ΔＣＴと組み合わせた野生型ＨＥＲ２及びＰＹＫ２（ｂ）で、又は野生型ＨＥＲ２及びＰＹＫ２並びにＨＥＲ３のアドバック突然変異体（add-back mutant）（ｃ）でいずれかでトランスフェクションさせた。ＰＹＫ２のチロシンリン酸化はＨＥＲ２及びＨＥＲ３キナーゼ活性（ａ）、及びＨＥＲ３のＣ末端ドメインへの結合（ｂ）に依存している。共沈されたＨＥＲ３を矢印で示す。ＰＹＫ２活性化はＨＥＲ３のＣ−末端ドメインにおけるＹ１２５７、Ｙ１２７０及びＹ１２８８（ｃ）に依存する。ＰＹＫ２はそのＣ末端において水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ）でタギングされて発現された。これらの細胞を５μｇｍｌ-１のヘレグリンで２０分間（ＨＲＧ）刺激し、溶解させ、かつモノクローナル抗ＶＳＶ抗体（α−ＶＳＶ）で免疫沈降を行った。免疫複合体をモノクローナル抗ホスホチロシン抗体でのウェスタンブロット（ＷＢ）によって分析した（α−４Ｇ１０、上方の区画）。同等のタンパク質ローディングはα−ＶＳＶ抗体による再ブロッティングによって測定した（下方の区画）。
【００３３】  図４：ＨＲＧ刺激後のＨＥＲ３によるＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴのリン酸化
ａ，ｂ．ＳＦ７６７グリオーマを５μｇｍｌ-１のヘレグリンで２０分間刺激し（ＨＲＧ）、又は１μＭのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテートで１０分間刺激し（ＰＭＡ）（ａ）、又は３０分間１００ｎＭのウォルトマンニンで前処理した（ＷＴ）（ｂ）。ＰＭＡ刺激をネガティブコントロールとして使用した。ＨＥＲ３のキナーゼ活性は、ＭＢＰを基質として使用する場合にＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴに対して相応のＨＥＲ２活性の１％未満である（ａ）。ＨＲＧ刺激の後に、ＨＥＲ３によるＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴのリン酸化はＨＥＲ２活性に対してアップレギュレートされる。ＷＴの影響は、このようにＰＹＫ２リン酸化におけるＰＩ３−Ｋの介入を除いて無視できる（ｂ）。
【００３４】  ｃ．ＨＥＫ２９３繊維芽細胞を指摘されるように野生型タンパク質（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３）及びその優性阻害型変異体（ＨＥＲ２−ＫＭ、ＨＥＲ３−ＫＭ）の組合せでトランスフェクションさせ、かつ５μｇｍｌ-１のヘレグリンで２０分間刺激した（ＨＲＧ）。ＨＥＲ３のホモダイマー及びＨＥＲ３とＨＥＲ２のヘテロダイマーだけがＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴリン酸化の増大を誘導した（ｃ．上方の区画）。ＨＥＲ３とＨＥＲ２とのヘテロダイマー化は基質のより強力なリン酸化をもたらし、これはＨＥＲ２がＨＥＲ３活性化のために重要であることを示している（ｃ及びｄ）。ＨＥＲ２によるＨＥＲ３のリン酸転移を抗ホスホチロシン抗体α−４Ｇ１０でのメンブレンのプロービングによって確認した（ｃ．上方の中央の区画）。ＨＥＲ３によるＨＥＲ２の共沈を抗ＨＥＲ２抗体α−ＨＥＲ２でのメンブレンのプロービングによって除外した（ｃ．下方の中央の区画）。同等のタンパク質ローディングを抗ＨＥＲ３抗体（α−ＨＥＲ３）でのプロービングによって確認した（ｃ．下方の区画）。リン酸化されたＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴを矢印で示す。
【００３５】  ｄ．図４ｃの上方の区画に示されたキナーゼ活性の定量。
【００３６】  図５：ＰＹＫ２はＨＲＧ刺激後にマイトジェン性を媒介する。
【００３７】  ａ，ｂ．ＳＦ７６７グリオーマを１０μＭのＡＧ８２５で１時間又は１００ｎＭのウォルトマンニンで２０分間のいずれかで前処理し（ＷＴ）、かつ次いで５μｇｍｌ-１のヘレグリンで２０分間刺激した（ＨＲＧ）。ＳＨＣのチロシンリン酸化をＨＲＧによって高め、かつＡＧ８２５での前処理によって減衰させるが、完全には排除しない（ａ）。細胞をＡＧ８２５又はＷＴのいずれかで前処理した場合にＥＲＫ−２活性についても同じことが適用できる（ｂ）。細胞溶解物をポリクローナルの抗ＳＨＣ（α−ＳＨＣ）（ａ）で又はポリクローナルの抗Ｅｒｋ−２（α−ＥＲＫ−２）抗体（ｂ）での免疫沈降のために使用した。α−ＳＨＣ免疫複合体をモノクローナルの抗ホスホチロシン抗体（α−４Ｇ１０）（ａ）でブロットし、一方でα−ＥＲＫ−２免疫複合体にＭＡＰキナーゼアッセイ（ｂ）を行った。リン酸化されたＭＢＰを矢印で示す。
【００３８】  ｃ．安定にＰＹＫ２−ＫＭ（Ｔｅｔ−）又は外因性のＰＹＫ２（Ｔｅｔ＋）のいずれかを発現するテトラサイクリン誘導可能な褐色細胞腫ＰＣ１２細胞を１００ｎｍのウォルトマンニンで３０分間（ＷＴ）又は１０μＭのＡＧ８２５で１時間のいずれかで、５μｇｍｌ-１のヘレグリンでの２０分間の刺激（ＨＲＧ）の前に前処理した。基本的なＥＲＫ−２活性はＨＥＲ２及びＰＩ３−Ｋに無関係であるが、一方でＨＲＧ刺激されたＥＲＫ−２活性はＨＥＲ２、ＰＩ３−Ｋ及びＰＹＫ２に依存している。ＰＹＫ２−ＫＭの過剰発現はＥＲＫ−２活性の一般的な減衰を引き起こす（Ｔｅｔ−をＴｅｔ＋のバンドと比較）。同等のタンパク質ローディングを抗ＥＲＫ−２抗体（α−ＥＲＫ−２）でのプロービングによって確認した。リン酸化されたＭＢＰを矢印で示す。
【００３９】  ｄ．図５ｃに示されたＥＲＫ−２キナーゼ活性の定量。
【００４０】  図６：ＰＹＫ２はＰＩ３−Ｋ活性をＨＲＧ刺激後に増大する。
【００４１】  ａ．安定にＰＹＫ２−ＫＭ（Ｔｅｔ−）又は外因性ＰＹＫ２（Ｔｅｔ＋）だけのいずれかを発現するテトラサイクリン誘導可能な褐色細胞腫ＰＣ１２細胞を１００ｎｍのウォルトマンニンで３０分間（ＷＴ）又は１０μＭのＡＧ８２５で１時間のいずれかで、５μｇｍｌ-１のヘレグリンで２０分間（ＨＲＧ）刺激する前に前処理した。溶解物にα−４Ｇ１０免疫沈降を行い、かつＰＩ３−Ｋアッセイを実施した（方法部を参照のこと）。ＰＩ３−Ｋ活性はＨＲＧ刺激の後にＰＹＫ２に強く依存し、かつＡＧ８２５によって低減される。リン酸化されたホスファチジルイノシトールを指摘する。
【００４２】  ｂ．図６ａに示されるＰＩ３−Ｋキナーゼ活性の定量。
【００４３】  図７：ＰＹＫ２−ＫＭはＨＲＧ刺激後に腫瘍浸潤を阻害する。
【００４４】  ａ．Ｃ６グリオーマをレトロウイルスによりコントロールベクターｐＬＸＳＮ（ｍｏｃｋ）、ＰＹＫ２、優性阻害型ＰＹＫ２突然変異ＰＹＫ２−ＫＭのいずれかで感染させるか、又は３０分間ＭＥＫ１インヒビターのＰＤ９８０５９（２５μＭ）で前処理し、かつ腫瘍浸潤アッセイを実施した（方法部を参照のこと）。
【００４５】  ｂ．浸潤をＰＤ９８０５９によって及びＰＹＫ２−ＫＭの過剰発現によって同じ程度に抑制する（ｐ＞０．９５）。
【００４６】  ｃ．ＳＦ７６７グリオーマをレトロウイルスによりｐＬＸＳＮ又はＰＹＫ２−ＫＭで感染させた。
【００４７】  ｄ．腫瘍浸潤を同じアッセイの使用によって示されるようにＰＹＫ２−ＫＭの過剰発現によって、ＳＦ７６７において抑制し（ｐ＜０．００８）、かつＳＦ７６３細胞系統において抑制した（ｐ＜０．００５）。８μｍのフィルタを１６時間で移行した細胞の代表的な明視野顕微鏡写真を示す。スケールバーは１００μｍ（ａ）及び５０μｍ（ｃ）を表す。
【００４８】  図８：ＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナルにおけるＰＹＫ２の役割。
【００４９】  モデルは新規のシグナル伝達経路を示し、これはＨＲＧ刺激からＭＡＰＫ活性化をもたらし、かつ腫瘍浸潤を誘導する。詳細については考察を参照のこと。ＴＭは膜貫通ドメインを示し、ＪＭは膜近接領域を示している。丸で囲まれたＢ又はＰを有する矢印は結合及びリン酸化をそれぞれ示している。
【００５０】  図９：ＰＹＫ２はＨＥＲ３のＣ末端ドメインと会合する。
【００５１】  ＨＥＫ２９３細胞を野生型の構築物ＨＥＲ２、ＰＹＫ２−ＶＳＶ及びＨＥＲ３のアドバック突然変異体で指摘されるようにトランスフェクションさせた。ＨＲＧ、ＶＳＶ−タギングされたＰＹＫ２及びＨＥＲ３での刺激の後に沈殿、イムノブロットし、かつホスホチロシン（ＰＹ）、ＰＹＫ２（α−ＶＳＶ）又はＨＥＲ３（α−ＨＥＲ３）に対してプロービングした。ＰＹＫ２−ＶＳＶ免疫沈降物において共沈されたＨＥＲ３を検出するために過剰暴露が必要であることを留意する。ＰＹＫ２活性化はＨＥＲ３のＣ末端ドメインにおけるＹ１２５７、Ｙ１２７０及びＹ１２８８に依存している。
【００５２】  図１０：ＨＥＫ２９３繊維芽細胞を野生型タンパク質（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３）及びその優性阻害型変異体（ＨＥＲ２−ＫＭ、ＨＥＲ３−ＫＭ）の組合せで指摘されるようにトランスフェクションさせ、かつＨＲＧで刺激した。ＨＥＲ３のホモダイマー及びＨＥＲ３とＨＥＲ２とのヘテロダイマーだけが増大されたＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴリン酸化を誘導した。ＨＥＲ３とＨＥＲ２とのヘテロダイマー化は基質のより強力なリン酸化を引き起こし、そのことはＨＥＲ２がＨＥＲ３活性化のために重要であることを示している。ＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴのリン酸化量を明瞭にするために、該ブロットをホスホチロシン（α−ＰＹ）、ホスホセリン（α−ＰＳ）又はホスホトレオニン（α−ＰＴ）抗体のいずれかでプロービングした。ＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴはＨＲＧ刺激の後にチロシンリン酸化され、一方で構成的なセリンリン酸化はＨＲＧ刺激の後に検出でき、トレオニンリン酸化はＨＲＧ刺激後に検出できない。
【００５３】  図１１，１２：組み換えｃ−ＳＲＣ、細菌で発現されたＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤ及びＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤを酵素として使用し、かつＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴ（１１）を基質として使用した。クーマシー染色されたゲルを同等のタンパク質ローディングを確認するために示す（１１右側の区画）。（１２）同じ実験手順を（１１）でのように使用したが、但し、ＭＢＰを基質として使用した。ＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤはＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤよりも強力にＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをリン酸化し、一方で基質としてＭＢＰを使用すると逆になり、これはＨＥＲ３の基質特異性を裏付けている。
【００５４】  図１３，１４：ＰＣ１２細胞を未処理にしておくか、又は１０μＭのＡＧ８２５、５０μＭのＰＤ９８０５９のいずれか又は両方で前処理し、かつ引き続きＨＲＧで刺激した。ＨＥＲ２（α−ＨＥＲ２）又はチロシルリン酸化されたタンパク質（α−ＰＹ）の免疫沈降をホスホチロシン抗体（α−ＰＹ）でプロービングした。この実験はＡＧ８２５がＨＥＲ２及びＳＨＣのチロシンリン酸化を完全に阻害することを裏付けている。それというのもＳＨＣはＨＥＲ２又はＨＥＲ３にＡＧ８２５前処理の後に結合することができないからである。該ブロットのＨＥＲ２抗体による再プロービングは同等のタンパク質ローディングを裏付けている。ＳＨＣを矢印で示す。
【００５５】  図１５，１６：Ｃ６グリオーマ細胞の全細胞溶解物（ＷＣＬ）を腫瘍浸潤アッセイと平行して調製し、かつリン酸化されたＥＲＫ−２の含量を特異的なホスホＥＲＫ２抗体でプロービングすることによって評価した（上方の区画）。同等のタンパク質ローディングを確認するために該ブロットをｐａｎ−ＥＲＫ抗体で再プロービングした。（１６）同じ実験手順をＳＦ７６７細胞についての（１５）でのように使用した。リン酸化されたＥＲＫ−２を矢印で示す。優性阻害型ＰＹＫ２−ＫＭはＭＥＫ−１インヒビターＰＤ９８０５９と同量にまでＥＲＫ−２活性を排除する。
【００５６】  実施例
１．方法
１．１  材料及び一般的方法
培地はGibcoから購入し、仔ウシ血清（ＦＢＳ）及びウマ血清をSigmaから購入した。Hybond ECLメンブレン及びγ−３２Ｐ−ＡＴＰをAmershamから購入し、ＰＰ１、ＡＧ８２５（参考文献４５）、ウォルトマンニン（ＷＴ）、ＰＤ９８０５９及びイオノマイシン（ＩＯＮＯ）はCalbiochemから購入した。以下のタンパク質に対して作成された抗体を使用した：ＰＹＫ２（ポリクローナルヤギ抗体Ｎ１９、Santa Cruz及びポリクローナルウサギ抗体（ｐＡｂ）Upstate Biotechnology, Inc.(UBI)）、ＥＲＫ２（ｐＡｂ  Ｃ１４、Ｋ２３、Signal Transduction）、ＳＨＣ（ｐＡｂ（参考文献４６）、ｍＡｂ、Affiniti）、ＨＥＲ３（モノクローナルマウス抗体（ｍＡｂ）２Ｆ１２、ＵＢＩ）、ｐ８５（ｍＡｂ ＵＢ９３−３、ＵＢＩ）、ＶＳＶ（ｍＡｂ Ｐ５Ｄ４、Roche Diagnostics）及びホスホチロシン（ｍＡｂ ４Ｇ１０、ＵＢＩ）。ＨＲＰ結合二次抗体をBiorad
から購入し、フルオロクロム（Flourochrome）結合二次抗体をMolecular Probesから購入した。トランスウェルチャンバー（０．３ｃｍ２、８μｍ）をCostarから購入した。成長因子低減マトリゲル（Growth Factor Reduced Matrigel）（ＧＦＲＭ）をCollaborative Biomedical Productsから購入した。シュウ酸塩でプレコートされた薄層クロマトグラフィープレート（シリカゲル６０）をMerckから購入した。組み換えヒトＧＳＴ−ＨＲＧ融合タンパク質（ＨＲＧ）及びＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをＥ．コリ中で製造し、かつ（４）に記載されるように又は標準的方法を使用して精製した。細胞系統ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ラットＣ６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０７）及びＰＣ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１）及びヒトのＳＦ７６３（Sugen Inc.）、ＳＦ７６７（Sugen Inc.）及びフェニックスＡ（PhoenixA）（ＡＴＣＣ ＳＤ−３４４３）を製造元のプロトコールに従って培養した。ＰＹＫ２−ＫＭ（Ｔｅｔ−オフ）を安定に発現するテトラサイクリンで誘導可能なＰＣ１２系は既に記載された（２５）。
【００５７】  １．２  免疫蛍光研究及び共焦点顕微鏡
簡潔には、ＳＦ７６３及びＳＦ７６７（３×１０５細胞）をカバーガラス上で増殖させ、かつ２４時間飢餓状態にした。５μｇ／ｍｌのＨＲＧでの２０分間の刺激後にこれらの細胞を３．７％のホルムアルデヒドで固定し、かつ３％のＢＳＡ（Sigma）中の０．２％のサポニン（Sigma）で透過性にした。ブロッキングを３％のＢＳＡで１時間実施した。ＰＹＫ２及びＨＥＲ３タンパク質を指摘された一次抗体で標識し、かつＰＹＫ２のためのフルオロクロム結合ロバ抗ヤギα−４８８二次抗体及びＨＥＲ３のためのＴＲＩＴＣ結合ウサギ抗マウス二次抗体（Molecular Probes）を使用して染色した。共焦点顕微鏡検定をＬＳＭ４１０顕微鏡（Zeiss）を使用して（４７）に記載のように実施した。
【００５８】  １．３  プラスミド構築物及び部位特異的突然変異誘発
ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＹＫ２−ＶＳＶ及びｐｃＤＮＡ３．１−ＰＹＫ２−ＫＭ−ＶＳＶ構築物をｐＲＫ５構築物及び標準的方法を用いて作成した。ＰＹＫ２−ＫＭを（２５）のように製造した。ＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをｐＲＫ５構築物を使用して、ＰＣＲによりＰＹＫ２のＣ末端を増幅させることによって作成した（位置７１６〜１００９）。該断片を原核性発現ベクターｐＧＥＸ−５Ｘ１（Pharmacia）にサブクローニングした。ＨＥＲ３におけるチロシンのフェニルアラニンへの突然変異をｐｃＤＮＡ３．１−ＨＥＲ３構築物及びクイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（QuickChange site-directed mutaegnesis kit（Stratagene））を使用して製造者のプロトコールに従って実施した。突然変異の正しい組み込みをＤＮＡ配列決定によって検査した。
【００５９】  ＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤをｐＲＫ５−ＨＥＲ２構築物を使用し、かつアミノ酸６７６〜９６３部をＰＣＲによって増幅することによって作成した。ＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤをｐｃＤＮＡ３．１−ＨＥＲ３構築物を使用し、ＨＥＲ３のキナーゼドメイン（アミノ酸６４５〜９８１）部を増幅することによって作成した。両者の場合に、５′−ＥｃｏＲＩ及び３′−ＮｏｔＩ制限部位をＰＣＲによってｃＤＮＡ断片に挿入した。これらの断片をｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター（Pharmacia）中にサブクローニングし、かつタンパク質が細菌宿主ＢＬ２１−コドンプラス（BL21-codon plus）中で発現した。
【００６０】  タンパク質精製のために新たに形質転換されたコロニーを一晩で接種し、１／１０希釈し、ＯＤ６００＝０．４５にまで増殖させ、かつＩＰＴＧ（０．１ｍＭの最終濃度）で誘導した。３０℃での３時間の誘導、２２５ｒｐｍでの良好なエアレーションの後に、細胞を回収し、溶解させ、かつタンパク質を標準的なプロトコールに従って精製した。
【００６１】  １．４  真核細胞におけるＰＹＫ２、ＰＹＫ２−ＫＭ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＫＭ、ＨＥＲ３及びＨＥＲ３−ＫＭタンパク質の一過性過剰発現
ＨＥＫ２９３細胞系を一過性のタンパク質発現のために使用した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のＦＣＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ）を補ったＤＭＥＭ中で７．５％のＣＯ２及び３７℃に維持した。トランスフェクションを変更されたリン酸カルシウム法を使用して実施した（４８）。簡潔には２．５×１０５細胞を３ｍｌの増殖培地中で一晩インキュベートした。１μｇのスーパーコイル状のＤＮＡを０．２５ＭのＣａＣｌ２溶液と４００μｌの最終容量で混合した。該混合物を同容量の２×トランスフェクションバッファー（５０ｍＭのＢＥＳ、ｐＨ６．９５、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４）に添加し、かつ室温で１５分間インキュベートしてから細胞に滴加した。３％のＣＯ２下での３７℃での１２時間のインキュベーションの後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、かつ次いで０．１％のＦＣＳを補ったＤＭＥＭ中で２４時間飢餓状態にした。
【００６２】  １．５  ウェスタンイムノブロット
ＳＦ７６３、ＳＦ７６７又はトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を未処理にするか又はＰＰ１（１０μＭ）、ＡＧ８２５（１０μＭ）、ウォルトマンニン（ＷＴ）（１００ｎＭ）及びＰＤ９８０５９（２５μＭ）で３０〜６０分間、３７℃において５μｇ／ｍｌの組み換えのヒトＨＲＧで２０分又は５μＭのＩＯＮＯで５分間の刺激の後に前処理した。ＨＲＧ又はＩＯＮＯ刺激の後に、これらの細胞を氷上で溶解バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１％（ｖ／ｖ）のトライトンＸ−１００、１ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロールホスフェート、１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニンを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）中で溶解させた。粗製溶解物を１２５００ｇで４℃において２０分間遠心分離した。免疫沈降のために適当な抗血清及び３０μｌのプロテインＡセファロース（Pharmacia）を澄明化された溶解物に添加し、かつ４℃で３時間インキュベートした。免疫沈降物を洗浄バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフッ化ナトリウム  １０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１％（ｖ／ｖ）のトライトンＸ−１００を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）で洗浄した。ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを含有するサンプルバッファーを添加し、かつ該試料を９５℃での４分間の加熱によって変性させた。
【００６３】  これらのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、かつ電気泳動によってニトロセルロースフィルタに移した。イムノブロット分析のためにニトロセルロースフィルタをまずマウスのモノクローナル又はウサギのポリクローナルの一次抗体と４℃において３時間インキュベートした。次いでＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体又はヤギ抗ウサギ二次抗体を添加し（Biorad）、引き続き増強化学発光（ＥＣＬ）基質反応（Amersham）を行った。基質反応をコダックのＸ−Ｏｍａｔフィルム上で検出した。異なる抗体で２回以上使用したフィルタを製造元のプロトコールに従ってストリッピングし、ブロッキングし、かつ再プロービングした。
【００６４】  １．６  組み換えレトロウイルスの作成及びレトロウイルスに媒介される遺伝子移送
簡潔には、ｐＬＸＳＮ−ＰＹＫ２及びｐＬＸＳＮ−ＰＹＫ２−ＫＭをＷＴ ＰＹＫ２及びキナーゼ不活性ＰＹＫ２、Ｋ４５７Ｍ（ＰＹＫ２−ＫＭ）のｃＤＮＡをそれぞれ有するｐＲＫ５からのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＬＸＳＮにクローニングすることによって作成した。レトロウイルス発現プラスミドをウイルス産生細胞系統フェニックスＡ（ＡＴＣＣ）に一過性トランスフェクションすることによって作成した両栄養性ウイルス力価をＮＩＨ−３Ｔ３細胞を連続希釈のレトロウイルス含有細胞不含フェニックスＡ上清で感染させ、かつＧ４１８耐性コロニーの数を計数することによって測定した。力価はＰＹＫ２及びＰＹＫ２−ＫＭウイルス上清について約１×１０６ｃｆｕ／ｍｌであった。集密前（subconfluent）のＣ６、ＳＦ７６３及びＳＦ７６７細胞（９×１０５細胞）を高い力価のｐＬＸＳＮ−ＰＹＫ２又はｐＬＸＳＮ−ＰＹＫ２−ＫＭウイルス（１×１０６のＧ４１８ｃｆｕ／ｍｌ）を放出する細胞の上清と一緒にポリブレン（４ｍｇ／ｍｌ、Aldrich）の存在下にインキュベートした。
【００６５】  １．７  インビトロキナーゼアッセイ
ＭＡＰ−キナーゼ及びＰＩ３−キナーゼアッセイを従来記載のように（４９，５０）実施した。
【００６６】  ＨＥＲ３キナーゼアッセイをＨＥＲ２又はＨＥＲ３免疫沈降物又は５００ｎｇの組み換えＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤ又はＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤのいずれかを使用して実施した。免疫沈降物を溶解バッファー中で３回洗浄し、かつキナーゼ反応バッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、７．５ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ３ＶＯ４）中で洗浄した。キナーゼ反応を開始する前に、免疫沈降物又はＧＳＴ融合物を１０μｇのＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴ又はＭＢＰを含む３０μｌのキナーゼ反応バッファーを３０℃で２分間添加することによって平衡化した。キナーゼ反応を１０μＭのＡＴＰ（１０μＣｉのγ３２−Ｐ−ＡＴＰを含む）を添加することによって開始させ、３０℃で３０μｌのレムリバッファー（Laemmli-buffer）を添加することによって３０分間インキュベートした。
【００６７】  １．８  腫瘍浸潤アッセイ
腫瘍浸潤アッセイを従来記載のように（３１）実施した。簡潔には、３×１０５細胞を１００μｇのＧＦＲＭでプレコートされたトランスウェルチャンバ上にプレーティングした。調整されたＮＩＨ−３Ｔ３培地を化学誘引物質として使用した。これらの細胞を５μｇ／ｍｌのＨＲＧで実験の間に刺激した。インキュベーションの１６時間後に非侵入細胞を綿棒で除去し、一方で浸潤細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、かつＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５倒立顕微鏡（Zeiss）を使用して明視野発光下に計数した。各菌株についての４つのフィルタからのカウントを格納し、かつ種々の菌株の間で両側ｔ−検定を使用して比較した。
【００６８】  ２．  結果
２．１  ＰＹＫ２のチロシンリン酸化はＨＥＲ２及びＨＥＲ３に依存している。
【００６９】  ＰＹＫ２はＨＲＧによる刺激の後にヒトのグリオーマ細胞系統ＳＦ７６７においてチロシンリン酸化を受ける（図１ａ）。ＨＲＧに誘導されるＰＹＫ２チロシンリン酸化のメカニズムを評価するために、２つの候補タンパク質チロシンキナーゼのｃ−ｓｒｃ及びＨＥＲ２を阻害した。ｃ−ｓｒｃキナーゼがＨＲＧ刺激の後にＨＥＲ２と会合し、ＧＰＣＲ刺激の後にＰＹＫ２をリン酸化することは以前から報告されている（２０）。ＨＲＧ刺激の前にＰＰ１でのｃ−ｓｒｃの阻害は、ｃ−ｓｒｃがＨＲＧ処理の後にＰＹＫ２チロシンリン酸化を媒介しないことを示している。それに対してＧＰＣＲ刺激に類似してＣａ２＋イオンの流れ込みをもたらすイオノマイシンによる刺激はｃ−ｓｒｃ活性に依存するＰＹＫ２のチロシンリン酸化を誘導する（図１ａ、左対右の区画、レーン３及び４）。
【００７０】  乳癌細胞系統（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）においてＨＥＲ２とＨＥＲ３との間のヘテロダイマー化によって媒介されるＨＥＲ２のＨＲＧに誘導される活性化はＰＹＫ２のチロシンリン酸化をもたらす（２６）。ＰＹＫ２として同定したＭｒ＝１１３ｋＤａのチロシンリン酸化されたタンパク質はＨＲＧでの刺激の前にＳＦ７６７細胞においてＨＥＲ３と共沈する（図１ｂ、上方の中央の区画、レーン１〜４）。それに対してＨＥＲ２の沈殿はＰＹＫ２との会合を示さない。ＨＲＧ刺激後にＰＹＫ２のチロシンリン酸化は増大するが（図１ｂ、上方の区画、レーン５及び７）、ＨＥＲ２インヒビターＡＧ８２５の存在下に減衰され（図１ｂ、上方の区画、レーン６及び８）、このことはＰＹＫ２のチロシンリン酸化がＨＥＲ２キナーゼ活性に依存していることを示している。ＨＥＲ３と共沈するＰＹＫ２の量はＨＲＧ刺激によって高められないが（図１ｂ、中央の区画、レーン１及び３）、ＡＧ８２５の添加の後に減少する（図１ｂ、中央の区画、レーン２及び４）。同じ結果は神経好手細胞系統ＳＦ７６３において得られ、かつＨＥＲ２キナーゼに依存しているＨＥＲ３とのＰＹＫ２の構成的会合を示唆している。
【００７１】  更にＰＹＫ２及びＨＥＲ３の細胞性共局在を分析するために、レーザ走査型共焦点顕微鏡を使用してＳＦ７６３及びＳＦ７６７細胞系統における免疫蛍光研究を行った（図２）。未刺激の細胞においてＰＹＫ２をは主に核周囲の細胞質に点状のパターンで局在化し、かつＨＥＲ３の分布は広範に一致している。ＨＲＧでの刺激の後に、ＰＹＫ２とＨＥＲ３との共局在は変化しなかった。このように免疫蛍光研究はＰＹＫ２及びＨＥＲ３の間の構成的なＨＲＧに無関係な会合を裏付けている。
【００７２】  ２．２  ＰＹＫ２はＨＥＲ３の細胞内領域と会合する。
【００７３】  本願では異所性過剰発現系を使用して、ＰＹＫ２のチロシンリン酸化がどのようにＨＥＲ３への結合に依存しているのかを詳細に調査した。ＨＥＫ２９３繊維芽細胞を使用して、野生型ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＰＹＫ２又は優性阻害型突然変異構築物ＨＥＲ２−ＫＭ、ＨＥＲ３−ＫＭ及びＰＹＫ２−ＫＭを発現させるが、そこではＡＴＰ結合のために重要なリジンがアラニンに交換され、キナーゼは不活性になっている。ＰＹＫ２のチロシンリン酸化は全ての野生型構築物を発現する細胞のＨＲＧ刺激の後に高められた（図３ａ、レーン１及び２）。しかしながらＨＥＲ３−ＫＭ（図３ａ、レーン３及び４）又はＨＥＲ２−ＫＭ（図３ａ、レーン５及び６）を発現する細胞において、ＨＲＧ刺激はＰＹＫ２チロシンリン酸化を誘導できない。この観察はグリオーマ細胞系統からのデータと一致しており（図１ｂ）、その際、ＨＥＲ２の阻害はＰＹＫ２活性化を排除するが、更にＨＲＧに誘導されるＰＹＫ２活性化はＨＥＲ２及びＨＥＲ３の機能的キナーゼ活性に依存している。
【００７４】  次いで本願ではＣ末端欠失を有するＨＥＲ３の突然変異体（ＨＥＲ３ΔＣＴ）を使用して、該Ｃ末端ドメインの、ＨＲＧに誘導されるＰＹＫ２チロシンリン酸化への寄与を分析した（図３ｂ）。ここでＰＹＫ２免疫複合体においてＭｒ＝１８０ｋＤａの共沈するタンパク質が観察され、これはリン酸化され、かつＨＥＲ３であると確認された（図３ｂ、レーン１及び２）。ＨＥＲ３の欠失突然変異体はＰＹＫ２のチロシンリン酸化及びまたＨＥＲ３の共沈を排除し、このことはＰＹＫ２がＨＥＲ３のＣ末端領域と会合することを示している（図３ｂ、レーン３及び４）。ＨＥＲ３の細胞内ドメインは、ＨＲＧ刺激後に恐らくＨＥＲ２によってリン酸転移される１３個のリン酸化部位を有する。チロシンＹ１０３５、Ｙ１１７８、Ｙ１２０３、Ｙ１２４１、Ｙ１２５７及びＹ１２７０はＰＩ３−Ｋの調節ドメインｐ８５のｓｒｃ−ホモロジー２（ＳＨ２）ドメインのための潜在的なドッキング部位である一方で、Ｙ１３０９はＳＨＣのための結合部位である（２８）。ＨＥＲ３のＣ末端ドメインにおけるＰＹＫ２のための推定の結合部位を同定するために、本願では１３個のアドバック突然変異体を使用して、全てのチロシン残基をフェニルアラニンに置換し、各１つをチロシンに戻す。ＨＥＫ２９３繊維芽細胞において、野生型ＰＹＫ２及びＨＥＲ２及び単一のＨＥＲ３のアドバック突然変異体を使用して過剰発現実験を実施した（図３ｃ）。この試みを使用して、ＨＲＧ刺激後の高められたＰＹＫ２チロシンリン酸化のために重要な３つのチロシン残基Ｙ１２５７、Ｙ１２７０及びＹ１２８８を同定した（図３ｃ、レーン１３〜１８）。これらの考察は、ＰＹＫ２チロシンリン酸化のＨＲＧに誘導される刺激がＨＥＲ３のＣ末端ドメインにおけるＹ１２５７、Ｙ１２７０及びＹ１２８８へのその結合に依存することを示している。
【００７５】  ２．３  ＰＹＫ２のチロシンリン酸化はＨＥＲ３キナーゼ活性に依存している。
【００７６】  ＨＥＲ２に対してＨＥＲ３のキナーゼ活性は損なわれるが（２９）、ＨＥＲ３はＡＴＰ及びそのアナログのＴＮＰ−ＡＴＰを結合できる（３０）ことを示唆している。ＨＲＧ刺激後のＰＹＫ２チロシンリン酸化を招くキナーゼを同定するために、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３のいずれかを沈殿するインビトロキナーゼアッセイをミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及びＰＹＫ２のＣ末端領域のＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴ）を基質として使用して実施した（図４ａ）。ＨＲＧ又はホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）のいずれかによるＳＦ７６７細胞の刺激の後に、ＭＢＰはＨＥＲ２によってリン酸化されるが、ＨＥＲ３によってはリン酸化されない（図４ａ、白色バー）。しかしながら意想外にもＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴはＨＲＧ刺激に依存した様式でＨＥＲ３によってリン酸化されるが、ＨＥＲ２によってはリン酸化されない（図４ａ、黒色バー）。ＰＩ３−ＫがＨＥＲ３の細胞質テールに結合することが示されている場合に、ＰＩ３−Ｋインヒビターのウォルトマンニン（ＷＴ）の存在又は不在下にＨＥＲ２又はＨＥＲ３のいずれかを沈殿させることによってＰＹＫ２リン酸化におけるＰＩ３−Ｋの潜在的な役割を調査した（図４ｂ）。この結果は、ＰＩ３−ＫはＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴの直接的なリン酸化を担わないことを示している。この発見と一致して、同じ実験条件下でのＰＹＫ２の沈殿は、ＨＲＧ刺激後のその高められたチロシンリン酸化がＰＩ３−Ｋに無関係であることを示している。まとめると、これらのデータはＨＥＲ３がＰＹＫ２のＣ末端領域をリン酸化するキナーゼであることを示唆している。
【００７７】  ＨＥＲ３がＰＹＫ２を直接的にリン酸化することを検証するために、ＨＥＲ２とＨＥＲ３のどちらかを別個に、又は一緒に野生型の構築物及び優性阻害型突然変異体の組合せでＨＥＫ２９３細胞において過剰発現させた（図４ｃ）。受容体−免疫複合体にインビトロキナーゼアッセイを行い、かつＨＲＧ刺激後にＨＥＲ３はＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをリン酸化する一方で、ＨＥＲ２はＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをリン酸化しないことが示された（図４ｃ、上方の区画、レーン３、４、５及び６対レーン１及び２）。ＨＥＲ３ホモダイマーはＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをリン酸化するが、トランス活性化されたＨＥＲ３と比較してより低い程度までリン酸化する（図４ｃ、上方の区画、レーン３及び４）。ＨＥＲ３がＨＲＧ刺激の後にＨＥＲ２によってリン酸転移されることを示すために、モノクローナルのホスホチロシン抗体α−４Ｇ１０でプロービングした（図４ｃ、中央の上方の区画）。またこのアッセイ条件下にＨＥＲ３免疫複合体においてＨＥＲ２の重要な共沈が存在しないことが示され、これによりＨＥＲ２はＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをリン酸化するキナーゼではないことが確認される（図４ｃ、中央の下方の区画）。ＨＥＲ３はＨＲＧ刺激後にＰＹＫ２を直接リン酸化すると結論づけられる。
【００７８】  ＰＹＫ２、ＨＥＲ２及び単一のＨＥＲ３のアドバック突然変異体によるＨＥＫ２９３繊維芽細胞の同時トランスフェクションにより３つのチロシン残基Ｙ１２５７、Ｙ１２７０及びＹ１２８８が同定され、これらは高められたＰＹＫ２チロシンリン酸化及びＨＲＧ刺激後のＨＥＲ３へのその結合のために重要である（図９）。このようにＰＹＫ２の前記の部位への結合はそのチロシンリン酸化及びＨＥＲ３との物理的会合のための前提条件であるとみなされる。
【００７９】  付加的にそれらのアミノ酸上でＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴのリン酸化事象が生じることが測定された。リン酸化されたチロシン及びセリン残基は検出されたが、トレオニン残基は検出されなかった。チロシン残基はＨＲＧ刺激に依存してリン酸化される一方で、セリン残基におけるリン酸化は構成的かつＨＲＧ刺激に無関係であり、このことは汚染セリンキナーゼはＨＥＲ３と共沈することを示唆している。
【００８０】  会合性キナーゼが非特異的に本願の哺乳動物系においてＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴをリン酸化する可能性を排除するために、ＨＥＲ２のキナーゼドメインの細菌により発現される組み換えＧＳＴ融合物（ＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤ）及びＨＥＲ３のキナーゼドメインの細菌により発現される組み換えＧＳＴ融合物（ＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤ）を精製した。ここでインビトロキナーゼアッセイを酵素としてＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤ又はＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤのいずれかを使用して、ポジティブコントロールとして組み換えｃ−ＳＲＣを使用して、かつ基質としてＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴを使用して実施した（図１０）。組み換えｃ−ＳＲＣがＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴの最強のリン酸化シグナルを示す一方で（図１０、左の区画、レーン１）、またＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤ及びＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤによりＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴのリン酸化が観察されるが、ＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤを使用するとより強力である（図１０、左の区画、比較レーン２及び３）。キナーゼ反応の特異性を示すために、基質としてＭＢＰを使用する実験を繰り返した（図１１、左の区画）。再度、ｃ−ＳＲＣによって最強のリン酸化シグナルが観察されるが（図１０、左の区画、レーン１）、更にＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤはＭＢＰをリン酸化する一方で、ＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤはＭＢＰをリン酸化しないことが観察された（図１１、左の区画、比較レーン２及び３）。この実験は明らかに、ＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴがＨＥＲ３の特異的な基質であることを裏付けており、かつＳＦ７６７及びＨＥＲ２９３細胞から得られたデータを裏付けている。
【００８１】  更に平行してＥＲＫ−２リン酸化事象を測定し、かつ同じ程度までのＥＲＫ−２リン酸化における低減をＰＤ９８０５９又は発現するＰＹＫ２−ＫＭのいずれかを使用して両方の細胞系統で測定した（図１５、１６、上方の区画、レーン６、７と５との比較）。
【００８２】  ２．４  ＰＹＫ２はＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナル経路のマイトジェン性を増幅する。
【００８３】  ＨＥＲ３及びＨＥＲ２の刺激の後に、ＰＩ３−Ｋ及びＳＨＣはＨＥＲ３のＣ末端に結合し、かつＲａｓ／Ｒａｆ経路を経由してマイトジェン性を媒介する（１５）。ＭＡＰＫ活性化におけるＨＥＲ２及びＰＩ３−Ｋの影響を試験するために、それらの特異的インヒビターＡＧ８２５及びウォルトマンニン（ＷＴ）のそれぞれをＳＦ７６７細胞にＨＲＧ刺激の前に添加した。次いでＳＨＣを沈殿させ、かつＭＡＰキナーゼアッセイを実施した。ＨＲＧ刺激されたＳＨＣのチロシンリン酸化及びＥＲＫ−２活性は低減されるが、ＨＥＲ２の阻害によって完全には排除されない（図５ａ、５ｂ、左の区画）。ＰＩ３−Ｋの阻害についてのＷＴを使用する類似の実験は、ＥＲＫ−２活性がＷＴによって低減されることを示している（図５ｂ、右の区画）。これらの発見は、ＨＲＧに誘導されるマイトジェン性がＨＥＲ２及びＰＩ３−Ｋに部分的に依存していることを示している。
【００８４】  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３のシグナル下流におけるＰＹＫ２の役割をより詳細に特徴付けるために、褐色細胞腫細胞系統ＰＣ１２においてテトラサイクリンにより誘導可能な系（Ｔｅｔ−オフ）を使用した。ＰＣ１２細胞はＰＹＫ２が豊富なので、Ｔｅｔの存在下に外因性ＰＹＫ２は優勢的に発現する一方で、その除去は優性阻害型ＰＹＫ２、ＰＹＫ２−ＫＭの過剰発現をもたらす。ＨＥＲ２又はＰＩ３−ＫをＡＧ８２５及びＷＴのどちらかによってＨＲＧでの刺激の前に阻害し、ＥＲＫ−２を沈殿させ、かつ免疫複合体にＭＡＰキナーゼアッセイを実施した（図５ｃ）。基底のＥＲＫ−２活性はＡＧ８２５及びＷＴによって影響されないが、ＰＹＫ２−ＫＭ発現によって排除された。しかしながらＨＲＧにより刺激されるＥＲＫ−２活性は前記の２つのインヒビターによって減衰され、かつＰＹＫ２−ＫＭ発現によっても排除された。これらの発見はＳＦ７６７で得られた結果と一致している（図５ｂ）。まとめると、これらの結果は構成的なＥＲＫ−２活性がＰＹＫ２に依存しており、かつＨＥＲ２及びＰＩ３−Ｋに無関係である一方で、ＨＲＧに刺激されるＥＲＫ−２活性がＨＥＲ２及びＰＩ３−Ｋ、またＰＹＫ２にも依存していることを示している。
【００８５】  細胞増殖及びアポトーシスの抑止におけるその役割の他に、癌腫浸潤におけるＰＩ３−Ｋの影響は従来において示されている（３１）。従ってＰＹＫ２及びその優性阻害型突然変異体ＰＹＫ２−ＫＭがＨＲＧ刺激後にＰＩ３−Ｋ活性化を制御する能力を調査した。ＰＣ１２細胞においてＴｅｔオフ系を使用して、細胞溶解物にＰＩ３−Ｋアッセイを行い、その際、ＨＲＧ刺激の後にＰＹＫ２−依存性ＰＩ３−Ｋ活性化が観察された（図６、上方の区画、レーン１対２と７及び８）。ＨＥＲ２キナーゼ活性の阻害はＰＩ３−Ｋ活性を完全には排除せず、これはＰＩ３−Ｋ活性化のＨＥＲ２に無関係なメカニズムを示している（図６、上方の区画、レーン８及び１２）。これらの結果はＭＡＰＫシグナル経路へのマイトジェン性の媒介及びＨＲＧ刺激後のＰＩ３−Ｋ活性化におけるＰＹＫ２の重要な役割を暗示している。
【００８６】  ２．５  ＰＹＫ２−ＫＭはＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナル経路のマイトジェン性をブロッキングすることによって腫瘍浸潤を阻害する。
【００８７】  グリオーマは粗悪な予後を伴う高度に悪性の脳腫瘍表現型を表す（３２）。ＰＩ３−Ｋはα６β４−インテグリンシグナルを胸部腫瘍細胞の浸潤的挙動に結びつけることが示されている（３１）。更にα６β４−インテグリンを経由するＭＡＰＫの活性化は移行におけるその重要性及びミオシン軽鎖キナーゼをリン酸化させる能力のため浸潤に関連していることが報告されている。腫瘍浸潤のためのモデルとしてＣ６グリオーマを使用して（３４）、ＰＹＫ２の優性阻害型突然変異体、ＰＹＫ２−ＫＭがＭＡＰＫ経路をブロッキングすることによって腫瘍浸潤を阻害できるかを試験した。レトロウイルスによって細胞をＰＹＫ２−ＫＭでＨＲＧでの刺激の前に感染させ、また該細胞をＭＥＫ１インヒビターのＰＤ９８０５９で前処理した（図７ａ）。ＭＥＫ１阻害は浸潤性を強く減衰し、かつ浸潤性の表現型の匹敵する排除がＰＹＫ２−ＫＭでの細胞の感染後に観察された。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ダイマーのマイトジェン性シグナルはＰＹＫ２−ＫＭによってダウンレギュレートされるように見えるが、Ｃ６細胞におけるＰＹＫ２の過剰発現はその浸潤性表現型を変更しない（図７ｂ）。Ｃ６細胞におけるＰＹＫ２発現はＳＦ７６３又はＳＦ７６７細胞におけるよりも比較的弱いが、これはその浸潤能力を害するようには見えない。またグリオーマ細胞系統ＳＦ７６３及びＳＦ７６７を腫瘍浸潤アッセイにおいて、ＰＹＫ２−ＫＭ構築物によるウイルス感染後に試験した。再度、ＰＹＫ２−ＫＭによる腫瘍細胞の浸潤性挙動の強力な阻害が観察された（図７ｄ）。これらの結果はＰＹＫ２がＭＡＰＫ経路を経由してマイトジェン性を媒介できることを裏付けており、それはＨＲＧ刺激の後のグリオーマの浸潤性挙動において重要な役割を有する。
【００８８】  ３．考察
細胞質性タンパク質チロシンキナーゼＰＹＫ２は刺激されたインテグリン、Ｇタンパク質結合受容体及びＰＴＫ受容体からのシグナルを下流のエフェクターに伝達する伝達経路の集束点である。ＰＹＫ２を活性化する重要な刺激はＨＲＧである（２５）。ＰＹＫ２及びＨＲＧの両者は中枢神経系で優勢的に発現し、かつこれらの２つのタンパク質をコードする遺伝子は互いに第８染色体に近接して局在化している（３４）。ＨＲＧはＨＥＲ３及びＨＥＲ４、ＲＰＴＫのｅｒｂＢのメンバーのための無差別のリガンドであり、かつｅｒｂＢシグナルモジュールはマイトジェン性の最も能力のあるインデューサーの１つである（３５）。ＨＲＧの結合はＨＥＲ２／ＨＥＲ３及びＨＥＲ２／ＨＥＲ４ヘテロダイマーの形成をもたらし、それによってＨＥＲ３又はＨＥＲ４をリン酸転移するＨＥＲ２を活性化させる（３５）。シグナル分子ＳＨＣ及びＰＩ３−ＫはＨＥＲ３のＣ末端領域に結合し、かつマイトジェン性を促進することが知られている（４，１５，３５）。幾つかのモデル系で得られたこれらの情報の断片は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３及びＰＹＫ２に関連したＨＥＲ４を欠損した神経膠芽細胞腫細胞系統におけるＨＲＧ刺激されるシグナル経路を調査することを駆り立てた。存在するデータを基に、ＰＹＫ２がＨＥＲ３によってＨＲＧ刺激後にリン酸化され、かつＭＡＰＫ経路を経由して浸潤性を誘導するモデルが提案される。
【００８９】  免疫沈降アッセイは、ＨＥＲ２活性によって促進されるＰＹＫ２とＨＥＲ３との構成的会合を示している（図１）。免疫蛍光研究は構成的会合を裏付けており、このことは２つのタンパク質が、ＨＲＧ刺激に無関係に細胞質の至る所に点状のパターンで共局在していることを示している（図２）。ＨＥＲ３がクラスリンに媒介されるエンドサイトーシス経路を経由して取り込まれることは公知である（１７）。類似の点状の分布は最近ではこの経路に関連した幾つかのタンパク質、例えばｍＨｉｐ１ｒ及びＥＧＦＲについて示されている（３６，３７）。数分間の時間スケールで生じる核周囲の領域に対するクラスリン被覆された小胞の向心的移動は直接、タマホコリカビ細胞及びＣＯＳ−１細胞におけるＧＦＰ−クラスリン融合を使用することによって証明されている（３８，３９）。循環の間のエンドソーム内のＨＥＲ３／ＰＹＫ２複合体の延長された活性化状態は他のシグナル分子の会合の再発を可能にし、こうして開始シグナルの増幅を提供する。ＨＥＲ３／ＰＹＫ２複合体の延長されたアクセス性及びＭＡＰＫ活性の部位に対するその輸送はｅｒｂＢファミリーの他のメンバーと比較してＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーの非常に強力なマイトジェン性を説明できた（３５）。正に、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーは循環される一方で、ＨＥＲ１含有ダイマーはユビキチン化経路を介して分解されることが示されている。
【００９０】  ＰＹＫ２とＨＥＲ３との会合及びその再循環はＨＲＧに依存していると見られるが、ＰＹＫ２のチロシンリン酸化はＨＲＧ刺激によって誘導される。ＰＹＫ２がＨＲＧ刺激の後に活性化されるというメカニズムの評価は、ＨＥＲ３のインタクトなキナーゼ活性がＰＹＫ２活性化のために重要であるということを示している（図３）。特にＨＥＲ３のＣ末端領域におけるチロシン残基Ｙ１２５７、Ｙ１２７０及び／又はＹ１２８８はＰＹＫ２活性化のために重要であると示される。最後にインビトロキナーゼアッセイはＨＥＲ３がＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴを直接的にリン酸化することを示した（図４）。阻害実験によって、ＨＥＲ２、ｃ−ｓｒｃ及びＰＩ３−ＫはＰＹＫ２を直接リン酸化するタンパク質として排除できる。ＨＥＲ３キナーゼ活性はもしかすると、従来の研究は人工的な基質を使用していたので今まで解明されていなかったと考えられる（２８）。
【００９１】  ＭＡＰＫ活性化における優性阻害型ＰＹＫ２、ＰＹＫ２−ＫＭの負の作用が示され、このことはマイトジェン性がＰＹＫ２活性に依存していることを裏付けている（図５）。ＰＹＫ２を過剰発現する細胞は高められたチロシルリン酸化されたＳＨＣ及び引き続きＥＲＫ−２活性を示すことが示されている（４０）。ＰＹＫ２及びＳＨＣの間に直接的な相互作用は観察されないが、最近ではＳＨＣがＰＹＫ２と血小板中のＧＲＢ２を介してａＩＩｂβ３インテグリンに依存して会合することが提案され、こうして細胞外シグナルとＲａｓ／Ｒａｆ経路が連係している（４１）。ＧＲＦ２が活性化されたＰＹＫ２に結合することは可能であり、これはＳＨＣの引き続いてのチロシンリン酸化をもたらし、そうしてマイトジェン性の増大に寄与する。またＰＹＫ２−ＫＭがＰＩ３−Ｋ活性を減衰することを示している（図６）。ＨＥＲ３はＰＩ３−Ｋサブユニットｐ８５のＳＨ２ドメインのために６個の潜在的なドッキング部位及びｐ８５のＳＨ３ドメインのためのコンセンサス結合部位を形成する１つのプロリンリッチな配列を有し、全ては潜在的にＨＥＲ３とｐ８５との会合に寄与している（２６）。またＰＹＫ２及びｐ８５の血小板における構成的会合は報告されており（４２）、そこではＰＹＫ２中の１つのＹＸＸＭモチーフはｐ８５のＳＨ２ドメインへの結合のために提供できる。正に、ｐ８５の免疫沈降は、Ｍｒ＝１１３ｋＤａ及び１８０ｋＤａのチロシルリン酸化されたタンパク質のＨＲＧに依存した会合を示している。これらのタンパク質はＰＹＫ２及びＨＥＲ３として同定され、このことはＨＥＲ３、ＰＹＫ２及びＰＩ３−Ｋが多タンパク質複合体の構成成分であることを示唆している。
【００９２】  本願のモデルにおいて、ＰＹＫ２はＨＲＧに誘導されるマイトジェン性を伝達するにあたっての重要な要素であると提案する。ＰＹＫ２からのＥＲＫ−２へのシグナルの一部はＰＩ３−Ｋ及びＳＨＣを介して伝達されるように見えるが、より直接的な経路も存在する（図８）。またＰＹＫ２に依存するＥＲＫ−２活性化はＨＥＲ２に部分的に無関係であるようにも見える（図５）。これらの発見は、ＰＹＫ２が多数の下流エフェクターの制御に関連しており、また全てがＭＡＰＫ経路に影響を及ぼすことをを示唆している（図８）。
【００９３】  優性的なＰＹＫ２突然変異体ＰＹＫ２−ＫＭが３つのグリオーマ細胞系統において腫瘍浸潤性を抑制することが示された（図７）。この結果はＥＲＫ−２活性におけるその影響と関連している（図６）。またＰＹＫ２−ＫＭがＭＥＫ−１の阻害と同等の程度にまで浸潤性を排除した。これらの結果は、ＰＹＫ２がグリオーマでの浸潤性をＭＡＰＫ経路を介して調節していることを強く示している。ＥＲＫ活性はミオシンリン酸化を調節し、これはアクチン−ミオシン会合及びＥＣＭの細胞収縮をもたらすことを示しており（４３）、かつＥＲＫが細胞浸潤を促進しかつこれらの細胞をアポトーシスから保護することを示している（４４）。増大されたＭＡＰＫ活性は本願のケースにおいては浸潤性挙動の増大を示している。まとめると、ＰＹＫ２がＨＥＲ３の直接的な基質であり、ＰＩ３−Ｋ活性を増強し、かつＥＲＫ２を経由してグリオーマにおいてマイトジェン性を増強し、これにより強く浸潤性の表現型がもたらされることが初めて示された。
【００９４】［外１］
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【００９５】［外２］
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【００９６】［外３］
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【００９７】［外４］
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【００９８】［外５］
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はＰＹＫ２チロシンリン酸化に対するｃ−ｓｒｃインヒビターＰＰ１及びＨＥＲ２インヒビターＡＧ８２５の効果を示すウェスタンブロット図である。
【図２】  図２はＳＦ７６３及びＳＦ７６７グリオーマ細胞系統におけるＰＹＫ２及びＨＥＲ３の局在を示す共焦点レーザ走査型顕微鏡によって得られる図である。
【図３】  図３はＰＹＫ２とＨＥＲ３のＣ−末端ドメインとの会合を示すウェスタンブロット図である。
【図４】  図４はＨＲＧ刺激後のＨＥＲ３によるＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴのリン酸化を示す一連のデータである。
【図５】  図５はＰＹＫ２がＨＲＧ刺激後にマイトジェン性を媒介することを示す一連のデータである。
【図６】  図６はＰＹＫ２がＰＩ３−Ｋ活性をＨＲＧ刺激後に増大することを示す一連のデータである。
【図７】  図７はＰＹＫ２−ＫＭがＨＲＧ刺激後に腫瘍浸潤を阻害することを示す明視野電子顕微鏡写真と細胞密度を表すグラフを示している。。
【図８】  図８はＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナルにおけるＰＹＫ２の役割を示すモデルである。
【図９】  図９はＰＹＫ２がＨＥＲ３のＣ末端ドメインと会合することを示すウェスタンブロット図である。
【図１０】  図１０は酵素としてＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤ又はＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤのいずれかを使用して、ポジティブコントロールとして組み換えｃ−ＳＲＣを使用して、かつ基質としてＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴを使用するインビトロキナーゼアッセイの結果を示している。
【図１１】  図１１は組み換えｃ−ＳＲＣ、細菌で発現されたＧＳＴ−ＨＥＲ２−ＫＤ及びＧＳＴ−ＨＥＲ３−ＫＤを酵素として使用し、かつＧＳＴ−ＰＹＫ２−ＣＴを基質として使用したウェスタンブロット図を示している。
【図１２】  図１２はキナーゼ反応の特異性を示すために、基質としてＭＢＰを使用したウェスタンブロット図を示している。
【図１３】  図１３はＰＣ１２細胞を未処理にしておくか、又は１０μＭのＡＧ８２５、５０μＭのＰＤ９８０５９のいずれか又は両方で前処理し、かつ引き続きＨＲＧで刺激し、次いでＨＥＲ２（α−ＨＥＲ２）の免疫沈降をホスホチロシン抗体（α−ＰＹ）及びα−ＨＥＲ２でプロービングしたウェスタンブロット図を示している。
【図１４】  図１４はＰＣ１２細胞を未処理にしておくか、又は１０μＭのＡＧ８２５、５０μＭのＰＤ９８０５９のいずれか又は両方で前処理し、かつ引き続きＨＲＧで刺激し、次いでチロシルリン酸化されたタンパク質（α−ＰＹ）の免疫沈降をホスホチロシン抗体（α−ＰＹ）及びα−ＳＨＣでプロービングしたウェスタンブロット図を示している。
【図１５】  図１５はＣ６グリオーマ細胞の全細胞溶解物（ＷＣＬ）を調製し、かつリン酸化されたＥＲＫ−２の含量を特異的なホスホＥＲＫ２抗体でプロービングし、ｐａｎ−ＥＲＫ抗体で再プロービングしたウェスタンブロット図を示している。
【図１６】  図１６はＳＦ７６７細胞の全細胞溶解物（ＷＣＬ）を調製し、かつリン酸化されたＥＲＫ−２の含量を特異的なホスホＥＲＫ２抗体でプロービングし、ｐａｎ−ＥＲＫ抗体で再プロービングしたウェスタンブロット図を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１２】
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【図１３−１４】
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【図１５−１６】
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