(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートであって、α−ＭＳＨ誘導体が式Ｘ：
【化１】
0005751641.tif 000020
で表される構造を有し、かつ、該α−ＭＳＨ誘導体がヒドラジンリンカーを介してＦｃに連結されている、コンジュゲート。
【請求項２】
請求項１に記載のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートであって、Ｆｃが配列番号：２のＩｇＧ１  Ｆｃ又は配列番号：３のＩｇＧ４  Ｆｃに由来する、コンジュゲート。
【請求項３】
製薬上許容される担体と組み合わせた、請求項１に記載のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートを有効成分として含んでなる、メラノコルチン受容体の生物活性を調節するための医薬製剤。
【請求項５】
請求項４に記載の医薬製剤であって、メラノコルチン受容体が、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）、メラノコルチン３受容体（ＭＣ３Ｒ）、メラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）、又はメラノコルチン５受容体（ＭＣ５Ｒ）である、医薬製剤。
【請求項６】
請求項１に記載のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートを有効成分として含んでなる、メラノコルチン受容体が媒介する状態を調節するための医薬製剤。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬製剤であって、メラノコルチン受容体が媒介する状態が、肥満又は２型糖尿病である、医薬製剤。
【請求項８】
請求項６に記載の医薬製剤であって、メラノコルチン受容体が媒介する状態が、男性勃起不全、女性の性的機能不全、炎症状態、又は線維症である、医薬製剤。
【請求項９】
請求項８に記載の医薬製剤であって、炎症状態が、アレルギー性炎、痛風性関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、虚血後の腎損傷、肝炎、虚血脳障害又は末梢神経障害である、医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノコルチン受容体結合コンジュゲート、並びにその製造及び使用の方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、体のサイズに対する過度の脂肪量の割合により明らかになる慢性疾患である。今日、米国人の３分の１は体重超過（ボディマス指数（ＢＭＩ）＞２５ｋｇ／ｍ2）であると見られている。肥満があると、２型糖尿病、うっ血性心不全、変形性関節症、睡眠時無呼吸症、メタボリック症候群、アテローム性脂質異常症、高血圧、及びインスリン抵抗性にかかりやすくなる。体重がわずかに減少するだけで（初期体重の５〜１０％）、肥満関連の疾患を発症する危険因子が有意に低下することがある（Ｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４７：１７４９〜５３（１９８７）；Ｔｕｏｍｉｌｅｈｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１３４３〜５０（２００１）；Ｋｎｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．３４６：３９３〜４０３（２００２）；Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２５：１４８〜９８（２００２））。加えて、ある文化においては、しばしば肥満者に付随する社会的不名誉に起因して、肥満の治療はメンタルヘルスの観点から重要である場合がある。
【０００３】
メラノコルチン系は、エネルギーバランスと食物摂取の調節に主要な役割を果たしている（Ｇａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２０：２０３〜１５（２００９））。ヒト及び齧歯類において、メラノコルチン系の異なる構成成分の突然変異機能の喪失は、肥満及び関連する疾患と密接に相関している。マウスにおいては、メラノコルチン受容体４（ＭＣ４Ｒ）、メラノコルチン受容体３（ＭＣ３Ｒ）又はプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）の内部での突然変異が、肥満、インスリン抵抗性及び過食症をもたらしている（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：８５５〜８３（２００３）；Ｈｕｓｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８：１３１〜４１（１９９７）；Ｙａｓｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１０６６〜７０（１９９９））。ヒトにおいては、ＰＯＭＣ又はＭＣ４Ｒの内部での突然変異が、食物摂取増大に関連する肥満の進行をもたらしている（Ｋｒｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１５５〜７（１９９８）；Ｙｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：１１１〜２（１９９８）；Ｂｒａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１０９６〜１０３（２００３）；Ｖａｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：２５３〜６２（２０００）；Ｈｏ  ａｎｄ  ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３５８１６〜２２（１９９９））。齧歯類においては、ＭＣ４Ｒの薬理学的刺激が、食物摂取量の低下、エネルギー消費の増加、及び重量喪失を引き起こす（Ｐｉｅｒｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：１３３７〜４５（２００２））。ヒトにおいては、ＭＣ４Ｒ作動薬α−ＭＳＨの経鼻投与が、体脂肪量の減少による体重減少をもたらす（Ｆｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂｏｌ．８６：１１４４〜４８（２００１））。野生型α−ＭＳＨは血清半減期が非常に短いため、薬剤としての使用は限定的である。α−ＭＳＨ類似体については記述がなされている（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２６：１４８１〜５，（２００５）；Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：３４１３〜３４１６（１９８９）；Ｋａｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：５００６〜５０１４（１９９８）；Ｎｉｊｅｎｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２４：２７１〜８０，（２００３）；Ｓｃｈｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：１００９〜１３（１９９７）；ＰＣＴ国際公開特許出願第ＷＯ０６／０７３７７２号；米国特許第６，７１６，８１０号）。
【０００４】
α−ＭＳＨは、中枢的に発現したメラノコルチン受容体によって介在される抗炎症効果を有し得る。分子レベルではα−ＭＳＨは、炎症及び保護の調節（例えばＮＦ−ｋＢ活性化）、炎症性サイトカイン及びメディエーター、ＩＬ−１０合成、Ｔ細胞及び炎症細胞の増殖及び活性、炎症細胞の遊走、抗酸化酵素の発現、並びにアポトーシスに影響を与えるさまざまな経路を有利に調節する。α−ＭＳＨの抗炎症性効果は、いくつかの炎症動物モデルにおいて検証されている（論評についてはＢｒｚｏｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．２９：５８１〜６０２（２００８）；Ｇｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ．９：１３９４〜４１４（２００９），Ｍａａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０７２：１２３〜３４（２００６）を参照）。
【０００５】
近年では、テトラペプチド配列Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐを共通して有するプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）誘導ペプチド（メラノコルチン類、例えばα−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ及びγ−ＭＳＨ、並びに副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ））が、さまざまなメラノコルチン受容体を介した作用によって、性的不能、冷感症、拒食症、悪液質、出血性ショック、心筋梗塞、虚血、神経障害性疼痛、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、神経外傷並びに神経障害など、多数の疾患に関与していることが示されている（論評についてはＢｅｒｔｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ．５９：１３〜４７（２００９）；Ｂｒｚｏｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．２９：５８１〜６０２（２００８）を参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、肥満及びその他のメラノコルチン系介在の病的状態を治療するため、更なるメラノコルチン受容体結合コンジュゲートを開発する必要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートであって、式Ｉ：
Ｂ−（Ｌ）ｎ−（Ｘ）ｍ−（Ｄ）ｐ−ＣＨ２−ＣＨ３            （Ｉ）
式中、Ｂはα−ＭＳＨ誘導体であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｘは天然生成の任意のアミノ酸であり、
Ｄは免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分であり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２定常部位の少なくとも一部分であり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３定常部位の少なくとも一部分であり、
ｎは０又は１であり、
ｍは０〜２０であり、及び
ｐは０又は１である
で示されるコンジュゲートである。
【０００８】
本発明の別の一態様は、製薬上許容される担体と組み合わせた、請求項１に記載のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃを含む医薬組成物である。
【０００９】
本発明の別の一態様は、請求項１に記載の医薬組成物をメラノコルチン受容体と接触させることを含む、メラノコルチン受容体の生物活性を調節する方法である。
【００１０】
本発明の別の一態様は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む、メラノコルチン受容体媒介の状態を調節する方法である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に引用する特許及び特許出願を含むがそれらに限定されないすべての刊行物は、あたかもその全体が記載されているのと同様に本願に参照によって組み入れるものである。
【００１２】
本明細書で使用される用語「α−ＭＳＨ誘導体」は、野生型α−ＭＳＨの断片、同族体、又は類似体を指し、その誘導体内に組み入れられている少なくとも１つの非天然生成アミノ酸を有する。α−ＭＳＨ断片は、野生型α−ＭＳＨ又はその類似体のＮ末端及び／又はＣ末端からの、１つ以上のアミノ酸の切断後に得られるペプチドである。α−ＭＳＨ同族体は、野生型α−ＭＳＨ又はその断片若しくは類似体のＮ末端及び／又はＣ末端に１つ以上のアミノ酸が付加されたペプチドである。α−ＭＳＨ類似体は、野生型α−ＭＳＨ又は断片の１つ以上のアミノ酸が修飾及び／又は置換されているペプチドである。α−ＭＳＨ誘導体は、その類似体が野生型α−ＭＳＨの生物活性を少なくとも部分的に保持している限りにおいて、野生型α−ＭＳＨに対して十分な相同性を有している。α−ＭＳＨ誘導体は、環状ペプチドであり得、又は、少なくとも１つのアミノ酸側基、α−炭素原子、末端アミノ基、若しくは末端カルボン酸基の化学修飾を有する。「野生型α−ＭＳＨ」は前駆体のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）から処理されたアミノ酸１３個のペプチドであり、ＭＣ４Ｒに対して高い親和性で結合し、ＭＣ３Ｒ及びＭＣ５Ｒに対しては低い親和性を有する。「野生型α−ＭＳＨ」は配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する。α−ＭＳＨ誘導体は、野生型α−ＭＳＨの生物活性と実質的に同じか、又はその一部を保持し得る。
【００１３】
本明細書で使用される「メラノコルチン受容体」は、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）（配列番号：５）、メラノコルチン２受容体（ＭＣ２Ｒ）（配列番号：９）、メラノコルチン３受容体（ＭＣ３Ｒ）（配列番号：６）、メラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）（配列番号：７）、及びメラノコルチン５受容体（ＭＣ５Ｒ）（配列番号：８）を含むヒトメラノコルチン受容体群を指す。
【００１４】
用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミド結合により連結された２つ以上のアミノ酸残基を指すのに同じ意味で用いられる。用語は、あらゆる大きさ、構造又は機能のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドを包含するものとする。典型的には、ペプチドは少なくともアミノ酸６個分の長さであり、タンパク質は少なくともアミノ酸５０個分の長さである。
【００１５】
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、抗体のＦｃ部分にα−ＭＳＨ誘導体が共有結合した結果として形成される分子を指す。このα−ＭＳＨ誘導体は、誘導体のＮ末端からＦｃ部分のＣ末端へと結合でき、あるいは、誘導体のＣ末端からＦｃ部分のＮ末端へと結合でき、あるいは、内部アミノ酸から結合できる。α−ＭＳＨ誘導体とＦｃ部分との間に、所望によりリンカーが挿入され得る。α−ＭＳＨとＦｃの代表的な共有結合は、ヒドラゾン又はセミカルバゾン連結によって達成され得る。
【００１６】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ部分」はさまざまなペプチダーゼ（例えばペプシンなど）による抗体の消化によって生成される、十分に特性付けられる断片の１つを指し、抗体のヒンジ領域を含み得、ヒンジ領域ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む。
【００１７】
本明細書で使用される用語「リンカー」（Ｌ）は、α−ＭＳＨ誘導体とＦｃとを例えば１つ以上の共有結合で連結させるのに使用される原子、又は原子の集合を指す。
【００１８】
「非天然生成」又は「非天然」アミノ酸は、同じ意味で用いられ、自然から分離されるタンパク質に存在しないアミノ酸を指す。代表的な非天然生成アミノ酸は表１に示されており、更に、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、擬似グルタミン酸塩、γ−アミノブチラート、ホモシステイン、Ｎ−置換アミノ酸（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：９３６７〜７１（１９９２）；ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９１／１９７３５号、米国特許第５，６４６，２８５号）、α−アミノメチレンオキシ酢酸（アミノ酸−Ｇｌｙジペプチド同配体）、並びに、遺伝子にコード化されていない側鎖官能基を有するα−アミノオキシ酸及びその他のアミノ酸誘導体も含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される用語「エチレングリコールユニット」は、エチレンオキシユニットの繰り返しからなる直鎖オリゴマーを指す。エチレンオキシユニットの末端は、アミノ基及びカルボン酸基、並びにその誘導体の追加によって官能化することができる。代表的なアミノ基はヒドラジンである。
【００２０】
「血清半減期の増加」又は「増加したｔ1/2は、修飾された生物活性分子の、その非修飾形に対する循環半減期の正の変化を指す。タンパク質の血清半減期は、ヒト、又は例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）若しくはキイロヒヒなどの動物モデルにおいて測定することができる。血清半減期の代表的な増加は約２倍であるが、これより小さな増加でも有用であり得る。
【００２１】
本発明は、非天然生成アミノ酸又は更なる有機部分をα−ＭＳＨ誘導体内に組み込み、これによりα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの特性改善をもたらし得るような、α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートに関連する。
【００２２】
【表１】
0005751641.tif 000002
【００２３】
本発明の一実施形態は、α−ＭＳＨ−Ｆｃコンジュゲートであって、式Ｉ：
Ｂ−（Ｌ）ｎ−（Ｘ）ｍ−（Ｄ）ｐ−ＣＨ２−ＣＨ３              （Ｉ）
式中、Ｂはα−ＭＳＨであり、
Ｌはリンカーであり、
Ｘは天然生成のアミノ酸であり、
Ｄは免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分であり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２定常部位の少なくとも一部分であり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３定常部位の少なくとも一部分であり、
ｎは０又は１であり、
ｍは０〜２０であり、及び
ｐは０又は１である
で示される前記コンジュゲートである。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＩＩ：
【００２５】
【化１】
0005751641.tif 000003
で示される。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＩＩＩ：
【００２７】
【化２】
0005751641.tif 000004
で示される。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＩＶ：
【００２９】
【化３】
0005751641.tif 000005
で示される。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式Ｖ：
【００３１】
【化４】
0005751641.tif 000006
で示される。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＶＩ：
【００３３】
【化５】
0005751641.tif 000007
で示される。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＶＩＩ：
【００３５】
【化６】
0005751641.tif 000008
で示される。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＶＩＩＩ：
【００３７】
【化７】
0005751641.tif 000009
で示される。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＩＸ：
【００３９】
【化８】
0005751641.tif 000010
で示される。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式Ｘ：
【００４１】
【化９】
0005751641.tif 000011
で示される。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＸＩ：
【００４３】
【化１０】
0005751641.tif 000012
で示される。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＸＩＩ：
【００４５】
【化１１】
0005751641.tif 000013
で示される。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＸＩＩＩ：
【００４７】
【化１２】
0005751641.tif 000014
で示される。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＸＩＶ：
【００４９】
【化１３】
0005751641.tif 000015
で示される。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、α−ＭＳＨ誘導体は式ＸＶ：
【００５１】
【化１４】
0005751641.tif 000016
で示される。
【００５２】
α−ＭＳＨ誘導体は、よく知られた方法を用いて、例えば化学合成又は組換え型発現又はこれらの組み合わせによって、生成することができる。固相ペプチド合成については、ポリアミド又はポリスチレン樹脂上で、Ｎ末端保護基を参照し、ｔ−Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル）及びＦｍｏｃ（フルオレニル−メトキシ−カルボニル）の化学反応を使用することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０４：１６１〜７１（１９６３））。
【００５３】
組換え型生成については、例えばコドン抑制を利用して、α−ＭＳＨ誘導体内の任意の好適な位置にアルデヒド又はケトン官能基を導入し、非天然生成アミノ酸残基を導入することができ、あるいは、シュードモナス宿主細胞内にα−ＭＳＨ誘導体を発現させることによって、導入することができる（ＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ０６／１３２９６９号）。代表的な非天然生成アミノ酸は、前述されている。
【００５４】
機能に必須であるポリペプチド内のアミノ酸は、よく知られた方法によって識別することができ、例えば化学合成を使用するか又は部位特異的突然変異誘発を使用して変異体を生成し、望ましい生物活性（例えば同系受容体を介して下流への信号を誘発する能力）に関してその変異体を試験することができる。
【００５５】
α−ＭＳＨ誘導体は更に、例えば分子の薬物動態学的特性を改善するために、少なくとも１つの有機部分の共有結合によって修飾することができる。この有機部分は例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、ポリアルカングリコール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む）、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、又はポリビニルピロリドンであり得る。この脂肪酸及び脂肪酸エステルは、約８〜４０個の炭素原子を含み得る。代表的な脂肪酸は、ラウレート、ミリステート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、ｎ−トリアコンタノエート、ｎ−テトラアコンタノエート、オレエート、アラキドネート、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、及びドコサン二酸である。ポリアルカングリコールは約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有し得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は約１００〜５０００ｋＤ、又は約１００〜５００ｋＤの分子量を有し得る。これらＰＥＧ、脂肪酸及びそのエステルは、末端のアミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、及び／又はカルボキシ基で誘導体化され得る。有機部分は、よく知られた方法を用いてα−ＭＳＨ誘導体に連結することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）；Ｋｏｌｂ，Ｆｉｎｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，「Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｅｗ  Ｇｏｏｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４０：２００４〜２１（２００１）；Ｅｖａｎｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．６０：３８４〜９５（２００７））。ＰＥＧの選択的結合の代表的な方法については記述がなされている（ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９９／４５０２６号、同第ＷＯ９９／０３８８７、米国特許第５，２０６，３４４号、及び同第５，７６６，８９７号）。
【００５６】
本発明のα−ＭＳＨ誘導体−ＦｃコンジュゲートのＦｃ部分は、例えばパパイン開裂後の無傷の天然生成分離抗体から誘導することができ、あるいは、標準的手法を用いて組換え的又は化学的に新たに合成することができる。ヒト及び動物の免疫グロブリンの配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）、あるいはＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）で見出すことができる。ヒト生殖細胞系列の情報から得られる配列、並びに既知の有用な治療用ヒト抗体配列及びその変種は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０５／００５６０４にまとめられている。このＦｃ部分は、任意の免疫グロブリン分類、例えばＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ1、ＩｇＧ２1、ＩｇＧ３1、ＩｇＧ２4、及びＩｇＭ重鎖から誘導され得る。代表的なＦｃ部分は配列番号：２〜３に示されているアミノ酸配列を有する。このＦｃ部分は、Ｆｃを発現することによって、哺乳類においてはグリコシル化形態で、また原核細胞においては非グリコシル化形態で、生成され得る。グリコシル化された抗体は、脱グリコシル化又は非グリコシル化（aglycosylated）又は無グリコシル化（non-glycosylated）された抗体よりもパパイン消化に対してより高い耐性があり、よって脱グリコシル化工程は、天然生成の分離抗体からＦｃ部分を生成するパパイン消化の後で実施すべきである。
【００５７】
Ｆｃ部分は、例えば補体結合及び抗体依存性細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）などの抗体エフェクター機能を媒介する。改変エフェクター機能を備えた、Ｆｃ領域のポリペプチド配列の特定の天然及び合成変異体には、例えば米国特許第５，６２４，８２１号、同第６，５２８，６２４号、同第７，１２２，６３７号、同第７，１８３，３８７号に記述されている変異体ポリペプチドが挙げられる。抗体エフェクター機能はまた、ＣＨ２領域においてＦｃに結合しているグリカンの存在にも依存し得る（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ＆  Ｌｕｎｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ．８２：５７〜６５，（２００２））。エフェクター機能を誘導することができない無グリコシル化Ｆｃ領域は、細菌宿主細胞において組換え的にＦｃ領域を発現することによって生成することができ、あるいは、このグリカンはグリコシダーゼを使用して酵素的に除去することができる。
【００５８】
α−ＭＳＨ誘導体は、所望によりリンカーを介して、免疫グロブリン中の少なくとも１つのＦｃ部分に抱合され得る。相同でないα−ＭＳＨ誘導体は、１つを超えるα−ＭＳＨ誘導体が抱合されているときに、このＦｃ部分に抱合され得る。最終的α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートが望ましい生物活性を呈する限り、抱合は、α−ＭＳＨ誘導体の任意の残基から形成することができる。生物活性は、例えば結合活性についてはインビトロアッセイにより、また例えば動物の疾病モデルにおけるインビボ活性により、あるいは抱合物を投与した後の被験者の反応により、測定することができる。代表的な生物活性は、実施例に記述されているように、ＭＣ４Ｒ刺激に対する細胞内ｃＡＭＰにおける増加を測定する。
【００５９】
α−ＭＳＨ誘導体のＦｃ部分に対する抱合は、例えば、α−ＭＳＨ誘導体に導入された求核基とＦｃ内の反応性カルボニルとの間の還元的アルキル化によって達成することができる。代表的な求核基は、一級アミン基、ヒドラジン基、アシルヒドラジド基、カルバジド基、セミカルバジド基、又はチオカルバジド基である。代表的なカルボニル基は、アルデヒド基又はケトン基である。求核基は、誘導体のＮ末端、誘導体のＣ末端、又はアミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボン酸、若しくはカルボキサミド官能基を含む任意の側鎖、非天然アミノ酸上の類似の基、又はα−ＭＳＨ誘導体に結合する有機部分に結合し得る。Ｆｃ部分に対する抱合のためのα−ＭＳＨ誘導体の活性化は、樹脂からの開裂の前に、最終残基でのｔｒｉ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ酢酸を使用した固相合成中になすことができ、これによりヒドラジン誘導体化されたα−ＭＳＨ誘導体がもたらされ得る。
【００６０】
Ｆｃ部分のＮ末端は、例えばアルデヒド又はケトンから反応性（求電子的）カルボニルを生成することによって抱合のための準備がなされる。Ｎ末端スレオニン（Ｔｈｒ）又はセリン（Ｓｅｒ）を含むＦｃ部分（例えば反応性カルボニル）は、過ヨウ素酸で酸化することによりＮ末端グリオキシル酸（glycoxylic acid）誘導体がもたらされ得る（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８〜４６（１９９２）；米国特許第５，３６２，８５２号；Ｇａｒｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：３８〜４４，（１９９６）；ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９８／０５３６３号；米国特許出願第ＵＳ０９／０１８１０３７号）。Ｆｃ部分は天然にセリン又はスレオニンを有し得、又は、よく知られた方法によってＮ末端でセリン又はスレオニンを呈するように遺伝子工学的又は化学的に改変することができ、この方法は例えば、Ｆｍｏｃ保護されたα，α’−ジアミノ酢酸誘導体（（Ｆｍｏｃ−ＮＨ）2ＣＨＣＯ2Ｈ）を使用したグリオキシリルペプチドの合成によるものである（Ｆａｒ  ａｎｄ  Ｍｅｌｎｙｋ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．１１：４２４〜３０，２００５）。別の方法としては、Ｎ末端Ｓｅｒ又はＴｈｒ残基は、トリプシン又はカルボキシペプチダーゼＹを使用した逆タンパク質分解を利用することによって、タンパク質中に生成することができ（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２１１：６７１〜６（１９８３））、又は、グリオキシルアミノ基転移反応を使用してアルデヒドを生成することができる（Ｄｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：４０９〜１９（１９７９），米国特許第６，０７７，３９３号）。
【００６１】
このＦｃがＮ結合又はＯ結合グリコシル基を含有する場合、炭化水素は、用いられる酸化剤によって酸化を生じ易く、Ｎ末端グリオキサル基の形成に影響を及ぼして、追加の反応性カルボニル種を生成する。炭化水素は、ＰＮＧアーゼを用いて化学結合する前に除去され、続いて、疎水性相互作用ＨＰＬＣで精製することができる。
【００６２】
組み込みのストイキオメトリーは、反応のストイキオメトリーを調節することによって、又は好適な立体化学的相互作用を組み入れて制御することによって、制御することができる。
【００６３】
代表的なα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートは、ＩｇＧ1ＦｃのＮ末端Ｔｈｒを酸化してグリオキシレートを形成し、その酸化したＦｃを、結合した有機部分（ＰＥＧ）のヒドラジン結合を介して式ＩＸのα−ＭＳＨ誘導体と抱合させ、次にＮａＢＨ3ＣＮ還元によりこのコンジュゲートを安定化させることによって形成される。
【００６４】
α−ＭＳＨ誘導体は、リンカーを介してＦｃに抱合され得る。代表的なリンカーには、例えば−ＮＨ−（ＣＨ2）s−Ｃ（Ｏ）−などのアルキルリンカーが挙げられ、式中、ｓ＝２〜２０である。このアルキルリンカーは更に、低級アルキル（例えばＣ1〜Ｃ6）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ2、又はフェニルなどの非立体障害性基で置換されていてもよい。代表的なポリマーリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸類、無水マレイン酸ジビニルエーテル、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを包含するデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、セルロース、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを包含するセルロース誘導体、デンプン及びデンプン誘導体、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリアルキレングリコール類のコポリマー及びその誘導体、ポリビニルエチルエーテル類、並びにα，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド等、又はこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、α−ＭＳＨのＰＥＧ修飾に関して上述したものと同じ特性を有し得る。
【００６５】
このリンカーは生物学的安定性又は生分解性であるポリマー鎖又はユニットを含み得る。例えば、反復結合を有するポリマーは、結合の不安定性に応じて、生理学的条件下での安定度を変化させることができる。そのような結合を有するポリマーは、低分子量類似体類の既知の加水分解速度に基づく生理学的条件下でのその相対的な加水分解速度で分類することができ、例えば、不安定なものからより安定なものまでであって、ポリカーボネート類（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリエステル類（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリウレタン類（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリオルトステル類（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞ポリアミド類（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）であり得る。同様に、水溶性ポリマーを対象分子に結合させる結合系、例えば、より不安定なものからより安定なもの順でカーボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞オルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞アミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）は、生物学的に安定又は生分解性であってよい。
【００６６】
リンカーは、例えばα−ＭＳＨ誘導体の、脱保護されたＮ末端アミノ基、又は側鎖アミノ基を有するその他のアミノ酸（例えばリジン、ジアミノ酪酸、及び４−アミノフェニルアラニン）に対して、保護された二官能基を有するリンカーを結合させることにより、固相合成中にα−ＭＳＨ誘導体に付加することができる。リンカーは、樹脂に対するリンカーの直接希有号によってα−ＭＳＨ誘導体のＣ末端で抱合することができ、次に、このペプチドの集合と、ヒドラジン又はヒドラジン誘導体によるα−ＭＳＨ誘導体−リンカーの樹脂からの開裂が行われる。このペプチドは、例えばＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＥＧ  ＮｏｖａＴａｇ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）などの樹脂上で調製することもできる。結合の方法はよく知られている。
【００６７】
α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートは、式Ｉに示すように、リンカー（Ｌ）とヒンジ（Ｄ）との間に、天然生成アミノ酸（Ｘ）を１つ以上含み得る。リンカーとヒンジとの間のアミノ酸は、典型的に、抗体のさまざまな領域から誘導され、α−ＭＳＨ誘導体とＦｃとの間の距離を増大させるために挿入され、これによってα−ＭＳＨ誘導体の適切な立体配座構造と活性を促進する。α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートにおける天然生成アミノ酸の代表的な例は、配列ＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：４）を有するペプチドであり得る。この配列は、リンカーとの共有結合形成を可能にするよう誘導体化され得る。
【００６８】
治療の方法
本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートは、幅広い疾患及び病的状態の治療に使用することができる。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートは、ＭＣ３Ｒ及び／又はＭＣ４Ｒを刺激することにより、メラノコルチン系を刺激することができる。本発明の方法を用いて、任意の分類に属する被験体を治療することができる。こうした被験体の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明のα−ＭＳＨ−Ｆｃコンジュゲートは肥満、２型糖尿病、及びメタボリック症候群の治療においてメラノコルチン受容体を刺激するのに有用であり、また、そのような治療のための薬剤の調製にも有用であり、その薬剤は、本明細書で定義される用量での投与用に調製される。
【００６９】
本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの投与によって治療され得る疾患及び病的状態には、１型糖尿病、２型糖尿病、脳卒中（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ００／１６７９７号）、心筋梗塞（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９８／０８５３１号）、肥満（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９８／１９６９８号）、手術後の異化（米国特許第６，００６，７５３号）、機能性消化不良及び過敏性腸症候群（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９９／６４０６０号）が挙げられる。耐糖能異常、空腹時血糖異常のある被験体、体重指数（ＢＭＩ）が２５超の体重超過被験体、一部膵切除又は妊娠糖尿病のある被験体、及び急性又は慢性膵炎を有する被験体は、本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートで治療することができる。また、例えば非インスリン依存性糖尿病を発症するリスクのある被験体（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ００／０７６１７号）など、ＭＳＨ化合物での予防的治療が必要な被験体も含まれる。
【００７０】
具体的な生物学的効果は、限定的な機能のα−ＭＳＨ誘導体での治療によって誘発され得る。野生型α−ＭＳＨの生物活性の一部を有するα−ＭＳＨ誘導体で被験者を治療することにより、天然生成形態のタンパク質で治療することに比べて、被験者に副作用をほとんど発症させない可能性がある。
【００７１】
投与／医薬組成物
メラノコルチン系の調節が望ましいような病的状態の治療又は予防における、α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの「治療的有効量」は、標準的な研究技法によって決定することができる。例えば、肥満、糖尿病又はインスリン抵抗性の治療又は予防において有効となる薬剤用量は、関連する動物モデルにその薬剤を投与することによって決定することができる。
【００７２】
更に、場合によりインビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子の考慮に基づいて（例えば臨床試験によって）決定することができる。このような因子としては、治療又は予防される疾患、伴う症状、患者の体重、患者の空腹時グルコース及びインスリン、及び当事者により既知の他の因子が挙げられる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。
【００７３】
本発明の方法では、α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートは単独で、又は少なくとも１種類の他の分子と組み合わせて投与することができる。そのような付加的分子としては、他のメラノコルチン受容体作動薬か、又はメラノコルチン受容体のシグナリングによって媒介されない治療的利益を有する分子が可能である。体重を低下させ、又はインスリン抵抗性を改善する小分子は、そのような付加的分子の例である。
【００７４】
本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの治療的使用のための投与方法は、α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートを宿主へと送達するのに好適な任意の経路であり得る。α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの医薬組成物は、例えば経口、直腸、経鼻、下気道、筋肉内、静脈内又は皮下経路を用いて投与することができる。
【００７５】
本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートは、製薬上許容される担体内にα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの有効量を有効成分として含む医薬組成物として調製され得る。「担体」という用語は、活性化合物が一緒に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。こうした医薬用溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌され、粒子状物質を含まないものである。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの、適切な生理学的状態に必要とされるような、製薬上許容できる補助物質を含有し得る。そのような薬学的製剤中の本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの濃度は、幅広く変化することができ、すなわち、約０．５重量％未満から、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％から最高１５又は２０重量％程度まで変化でき、選択された投与の特定の様式に応じて、必要な用量、流体の容積、粘度等に主に基づいて選択される。
【００７６】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の薬学的組成物は、２５０ｍＬの無菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇから約３０ｍｇの、又はより好ましくは、約５ｍｇから約２５ｍｇの本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートを含むように調製されることができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に記載されている。
【００７７】
本発明のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートは、保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中に入れて元に戻すことができる。この技術は他のタンパクの調製において有効であることが示されており、周知の凍結乾燥と再構成の技術を援用することができる。
【００７８】
本発明は一般的な用語で説明したが、本発明の実施形態は、以下の実施例において更に開示される。
【実施例】
【００７９】
（実施例Ｉ）
α−ＭＳＨ誘導体の合成
このペプチドは、ＡＢＩ  ４３３Ａペプチド・シンセサイザにおいて、Ｆａｓｔｍｏｃ  ０．１ｍＭ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｐｒｅｖｉｏｕｓ  Ｐｅａｋソフトウェアにより、Ｆｍｏｃ／ＨＢＴＵ化学用ＳｙｎｔｈＡｓｓｉｓｔ  ２．０  Ｖｅｒｓｉｏｎを用いて調製した。
【００８０】
式ＩＩ〜ＩＶのペプチド。
ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍアミド樹脂（０．１ｍｍｏｌ）が合成に使用された。この合成の最終アミノ酸誘導体２つは、ｔｒｉ−ＢＯＣ−ヒドラジノ酢酸と、Ｏ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）−ウンデカエチレングリコールであった。
【００８１】
合成後、その樹脂に、Ｎ−メチルピロリドンで２分洗浄を３回、塩化メチレン／Ｎ−メチルピロリドンで２分洗浄を１回、塩化メチレンで２分洗浄を３回、メタノールで２分洗浄を３回、エチルエーテルで２分洗浄を１回行い、減圧下で２時間乾燥させた。
【００８２】
ペプチドは、トリフルオロ酢酸（３０ｍＬ）とフェノール（２．２５ｇ）とジチオトリエトール（１．５ｇ）とチオアニソール（１．５ｍＬ）とトリイソプロピルシラン（１．５ｍＬ）と水（１．５ｍＬ）との開裂混合物２０ｍＬを用いてシンチレーションバイアル瓶内で室温において４時間攪拌することによって、樹脂から開裂させた。その樹脂を濾過によって除去し、あらかじめ冷却したエチルエーテル（６００ｍＬ）を加えることでペプチドを沈殿させた。結果として得られた固体を濾過によって分離し、エチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させた。一部のペプチドの合成のため、開裂混合物１５ｍＬが使用され、あらかじめ冷却したエチルエーテル４００ｍＬでこのペプチドを沈殿させた。
【００８３】
ペプチド環化
開裂から得た粗製材料を、微量の酢酸を含んだ５０ｍＬの水に溶かした。水６００ｍＬを、１Ｍ  ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨ８．０に調節した。０．０１Ｍ  Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6の溶液を水中で調製した。４時間かけて、このペプチドのアリコートをこの水に加え、１Ｍ  ＮＨ4ＯＨを用いてｐＨを８．０に調節した。フェリシアニド溶液のアリコートを加えて、薄黄色を維持した。添加後、この溶液を更に１時間攪拌した。この溶液に、５０ｍＬのＢｉｏＲａｄ  ＡＧ−４−Ｘ３（１００〜２００メッシュ、遊離塩基形態）を加えた。この溶液を１時間攪拌し、濾過により樹脂を除去した。濾液を凍結乾燥して、粗製環状ペプチドを得た。
【００８４】
この粗製ペプチドを、２本のＶｙｄａｃ  Ｃ−１８カラム（１０ｍｍ、２．５×２５ｃｍ）で、ペプチドに応じて勾配０〜１００％、１０〜９０％又は１０〜８０％とし（緩衝液Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、緩衝液Ｂ＝水中８０％アセトニトリル／２０％水（ＧＡＨ）中の０．１％トリフルオロ酢酸）、流量６ｍＬ／分で６０分間かけて精製した。画分を回収し、ＨＰＬＣで分析し、純粋な画分を蓄積して凍結乾燥した。
【００８５】
式Ｖ〜ＶＩＩのペプチド。式ＩＩ〜ＩＶのペプチドについての記述と同様に、ただし環化工程を削除して、合成と精製を行った。
【００８６】
式ＶＩＩＩ及びＩＸのペプチド。０．２５ｍｍｏｌのＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍアミド樹脂が合成に使用された。Ｌｙｓ5については、ＤＤＥ−Ｌｙｓ（ＦＭＯＣ）が使用された。ＤＤＥ−Ｌｙｓ（ＦＭＯＣ）を結合させた後、ｔｒｉ−ＢＯＣ−ヒドラジノ酢酸とＯ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）−ウンデカエチレングリコールを加えた。手動浸透器中で、２分間×４回、２％無水ヒドラジンのＤＭＦ溶液で樹脂を処理することにより、ＤＤＥ基を除去した。この樹脂を合成器に戻し、最後の４つのアミノ酸を結合させ、Ｎ末端ＦＭＯＣ基を除去した。
【００８７】
シンチレーションバイアル瓶中で、２０ｍＬのトリフルオロ酢酸、３ｇのフェノール、６ｍＬのエタンジチオール、１ｍＬのチオアニソール及び１ｍＬの水の混合物１５ｍＬを用いて、室温で４時間攪拌することにより、ペプチドを樹脂から開裂させた。この樹脂を濾過により除去し、あらかじめ冷却したエチルエーテル（２００ｍＬ）を加えることによってこのペプチドを沈殿させ、このペプチドは上述のように精製された。
【００８８】
式Ｘのペプチド。０．５０ｇの０．２０ｍｅｑ／ｇ  ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍアミド樹脂が使用された。使用した保護基は、Ｎ−末端ＦＭＯＣ、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｌｙｓ（ＢＯＣ）及びＬｙｓ（ＤＤＥ）であった。脱保護は、ＦａｓｔＭｏｃプログラムに従って希釈されたピペラジン中５％  ＤＢＵで行われた。残基を結合させ、Ｓｅｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−Ｔｙｒ（ＢＯＣ）−Ｓｅｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−Ｎｌｅ−Ｌｙｓ（ＤＤＥ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｒｐ（ＢＯＣ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−Ｐｒｏ−Ｖａｌ樹脂を得た。この樹脂を、１ｍＬ無水酢酸、９ｍＬ  ＤＭＦ、及び０．１ｍＬ  ＤＩＥＡの溶液で１０分間処理することにより、手動でアセチル化した。ＤＭＦで洗浄した後、手動浸透器中で、２分間×４回、２％無水ヒドラジンのＤＭＦ溶液で樹脂を処理することにより、ＤＤＥ基を除去した。この樹脂を合成器に戻し、上記のプロトコルに従って最終アミノ酸を結合させた。
【００８９】
ペプチド樹脂（０．７４８ｇ）を、ＴＦＡ／フェノール／エタンジチオール／チオアニソール／水（１０ｍＬ／１．５ｇ／３ｍＬ／０．５ｍＬ／０．５ｍＬ）の１０ｍＬの混合物で、室温で４時間攪拌することにより、脱保護と樹脂からの開裂を同時に行った。この樹脂を濾過によって除去し、濾液を２００ｍＬのジエチルエーテルに加え、半時間攪拌した。結果として得られた固体を遠心分離により分離し、エーテルでよく洗い、減圧下で乾燥させて、白色固体０．２６ｇを得た。
【００９０】
粗製材料を２本のＶｙｄａｃ  Ｃ−１８（２５×２５０ｍｍ、１０μ）カラムを縦一列にして、３つの等量のアリコートに分けて注入し、２０〜１００％（水中８０％アセトニトリル／２０％０．１％トリフルオロ酢酸）を用い、流量５ｍＬ／分で１２０分間かけて溶出させた。ペプチドの収量は典型的に３６〜６５ｍｇであった。実測分子量と計算分子量は良好に一致した。合成されたα−ＭＳＨ誘導体の特性は表２に示されている。
【００９１】
【表２】
0005751641.tif 000017
【００９２】
式ＸＩ〜ＸＶのペプチド。１．２５ｇの０．２０ｍｅｑ／ｇ  ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍアミド樹脂が使用された。使用した保護基は、Ｎ末端ＦＭＯＣ、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｔｙｒ（ＢＯＣ）、Ｌｙｓ（ＢＯＣ）、Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）及びＡｓｐ（Ｏ−Ｄｍｂ）であった。脱保護は、ＦａｓｔＭｏｃプログラムに従って、ピペリジンで行われた。残基を結合させ、残基を結合させ、例えばＦＭＯＣ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｄｍｂ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−Ｔｙｒ（ＢＯＣ）−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）樹脂を得た。この樹脂を塩化メチレン中１％  ＴＦＡで２０分間、手動で処理し、次に塩化メチレン及びＮＭＰでよく洗浄した。部分的に脱保護された樹脂ペプチドを、室温で３０分間、ＤＭＦとＮＭＰの混合物中のＨＡＴＵで処理し、ラクタムの形態を形成した。ラクタムの形成後、この樹脂を合成器に戻し、ＦＭＯＣ−Ｎｌｅ、ＦＭＯＣ−ＰＥＧ12−ＣＯ2Ｈ、及びＢＯＣ3−ヒドラジノ酢酸の最終結合を行った。ペプチド樹脂（２．１５ｇ）を、ＴＦＡ／フェノール／エタンジチオール／チオアニソール／水（１０ｍＬ／１．５ｇ／３ｍＬ／０．５ｍＬ／０．５ｍＬ）の１０ｍＬの混合物で、室温で４時間攪拌することにより、脱保護と樹脂からの開裂を同時に行った。この樹脂を濾過によって除去し、濾液を４００ｍＬのジエチルエーテルに加え、半時間攪拌した。結果として得られた固体を遠心分離により分離し、エーテルでよく洗い、減圧下で乾燥させて、白色固体０．４８ｇを得た。
【００９３】
粗製材料を２本のＶｙｄａｃ  Ｃ−１８（２５×２５０ｍｍ、１０μ）カラムを縦一列にして、３つの等量のアリコートに分けて注入し、２０〜１００％（水中８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸）を用い、流量５ｍＬ／分で１２０分間かけて溶出させた。ペプチドの収量は典型的に１５〜１８ｍｇであった。観察分子量と算出分子量は良好に一致した。
【００９４】
（実施例２）
一置換又は二置換のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの調製
７Ｅ３  ＩｇＧ  Ｆｃの脱グリコシル化
７Ｅ３  ＩｇＧ  Ｆｃは、標準的方法を用いてアブシキシマブ（ＣＡＳ登録番号１４３６５３−５３−６）を生成するために、パパイン消化によって調製されたＩｇＧのＦｃ部分である。Ｆｃ１３５ｍＬ（５ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ７．５の１０ｍＭトリスに透析した。この透析液に、ＰＮＧアーゼＦ（５００，０００μ／ｍＬ）を１００μＬを加え、結果として得られた溶液を３７°で３日間インキュベートした。脱グリコシル化されたＦｃを、ＴｏｓｏＨａａｓフェニル５ＰＷカラム（５．５×２００ｍｍ、１０μｍ）において緩衝液Ｂ０〜５０％の勾配、流量１１ｍＬ／分で溶出させて精製した（緩衝液Ａ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５；緩衝液Ｂ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）。分子量：計算値：４９，８６４．４。測定値：４９，８６８．４。
【００９５】
脱グリコシル化Ｆｃの酸化
脱グリコシル化Ｆｃ（８．９ｍｇ／ｍＬ）５５ｍＬを、ｐＨ８．４の１％  ＮａＨＣＯ3に透析し、８．６ｍｇ／ｍＬの濃度で５６．３ｍＬを得た。この濃度を、１％  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．４を４０．６ｍＬ加えることによって、５．１ｍｇ／ｍＬ（タンパク質１０-4ｍｍｏｌ／ｍＬ、Ｎ末端スレオニン２×１０-4ｍｍｏｌ／ｍＬに等価）に調製した。１％  ＮａＨＣＯ3中メチオニン１２．５ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ８．４）の１１．９ｍＬを、Ｆｃ溶液に加えた。２０ｍｇ／ｍＬ水中ＮａＩＯ4の２．１２ｍＬ（４２．４ｍｇ）を、Ｆｃに加えた。この反応混合物を、室温で１５分間穏やかに攪拌した。エチレングリコール（２．８ｇ、２．３ｍＬ）を加えて、反応物を更に２０分間穏やかに攪拌した。この溶液を０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）に透析して、４．０ｍｇ／ｍＬを１２０ｍＬ得た。この溶液は２．５ｍＬのアリコートに分け、−２０℃に冷凍して、それ以上精製せずに使用した。
【００９６】
一置換及び二置換のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの調製
式ＩＩ〜ＸＶを有するペプチド０．５〜１０ｍｇを、Ｆｃアルデヒド（通常３．０ｍＬ、２．６８ｍｇ／ｍＬ）に加えた。この試験管を４℃で一晩保管した。１００μＬの水中１０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＢＨ3ＣＮをこの反応混合物に加え、この反応物を４℃で一晩保管した。１００〜２００ｍｇの硫酸アンモニウムを加えた後、このサンプルをＴｏｓｏＨａａｓフェニル又はエーテル５ＰＷカラム（２１．５×１５０ｍｍ、１０μ）に注入し、０〜１００％の勾配（緩衝液Ａ＝０．１Ｍリン酸ナトリウム／１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５；緩衝液Ｂ：０．１Ｍリン酸ナトリウム／１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５）で１８０分間かけて溶出させ、６ｍＬの画分を収集した。
【００９７】
カラム画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８０  Ｋｉｔを用いてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００で分析し、メーカーの説明書に従って処理を行った。望ましい生成物を含む画分を蓄積し、１０ｋＤａ分子量カットオフでＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルターデバイスを用いて濃縮し、１０ｋＤａ分子量カットオフでＰｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットを用いてＰＢＳへと透析を行った。典型的な収量は１．２〜１２ｍｇであった。実測分子量と計算分子量は良好に一致した。表３は、調製したα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートを示す。
【００９８】
【表３】
0005751641.tif 000018
【００９９】
（実施例３）
一置換又は二置換α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの生物活性
環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ
アッセイのため、ウェル当たり細胞数６５，０００個の密度でＣＨＯ細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％  ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｌ−グルタミン中、ウェル当たり１００μＬ中、９６ウェル組織培養プレートに入れ、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、この培地を細胞培養プレートから吸引し、代わりに、温めた無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び１ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ  Ｉ７０１８）９０μＬを入れて、３７℃で１５分間インキュベートした。それぞれのα−ＭＳＨ誘導体−ＦｃコンジュゲートをＰＢＳ中０．５％  ＢＳＡで希釈した連続希釈１０μＬ（４０μＭ〜４ｎＭ）を、ＩＢＭＸ培地及び細胞９０μＬに加え、３７℃で１５分間刺激した。この刺激済み培地を吸引し、代わりに、キット中に提供されている溶出緩衝液（Ｔｒｏｐｉｘ  ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（商標）システム化学ルミネセンスイムノアッセイシステム（Ａｐｐｌｅｒａ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから販売））１００μＬを入れ、３７℃で３０分間インキュベートした。ｃＡＭＰ標準（６０μＬ／ウェル）の細胞可溶化物をアッセイプレートに加えた。ｃＡＭＰ標準の濃度は、６０μＬ当たりｃＡＭＰが０．００６〜６０００ｐｍｏｌであった。このｃＡＭＰ−ＡＰコンジュゲートを、コンジュゲート希釈緩衝液で１：１００に希釈し、Ｔｒｏｐｉｘキット中に提供されている抗マウス抗体でコーティングされたプレートの各ウェルに３０μＬ加え、次に、抗ｃＡＭＰ抗体６０μＬ／ウェルを加えた。このプレートを、穏やかに振盪しながら室温で６０分間インキュベーションした後、提供されている洗浄用緩衝液で６回（３００μＬ／ウェル）洗浄した。１００μＬ／ウェルの基質／エンハンサー溶液を加え、プレートをホイルで覆い、穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベーションした。このプレートを、ルミネセンス測定を用いて、Ｖｉｃｔｏｒ3Ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
【０１００】
試験を行ったα−ＭＳＨ誘導体−ＦｃコンジュゲートのＥＣ50値を表３に示す。アシル化α−ＭＳＨ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒａｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（Ａｃ−ＮＨ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＣＯ−ＮＨ2）が参照として用いられた。この参照は、Ｓ字状の用量−反応曲線を呈し、ＥＣ50値は０．１５４９ｎＭであった。
【０１０１】
α−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲート一置換の式Ｖ−Ｆｃ、二置換の式Ｖ−Ｆｃ、及び一置換の式ＸＩＶ−Ｆｃコンジュゲートが、ｃＡＭＰアッセイにおいて、０．２６μＭの単回用量で検査された。これらのコンジュゲートで刺激されたｃＡＭＰの濃度は、平均でそれぞれ、３５．６６３ｐｍｏｌ／ウェル、１２．８７９ｐｍｏｌ／ウェル、及び４８．７１７ｐｍｏｌ／ウェルであった。
【０１０２】
（実施例４）
一置換又は二置換のα−ＭＳＨ誘導体−Ｆｃコンジュゲートの選択性
式Ｘ−Ｆｃコンジュゲート及び式ＶＩＩ−Ｆｃコンジュゲートの受容体選択性が、ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒアッセイキットと、メーカーの説明書に従いＭＣ１Ｒ（配列番号：５）、ＭＣ３Ｒ（配列番号：６）、ＭＣ４Ｒ（配列番号：７）、又はＭＣ５Ｒ（配列番号：８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を過剰発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞株とを用いて、分析が行われた。受容体活性化に伴うｃＡＭＰの増加は、環状ＡＭＰ反応エレメント（ＣＲＥ）の制御下で、β−ラクタマーゼレポーター遺伝子を用いて評価された。
【０１０３】
この分析のＥＣ５０値が表４に示されている。
【０１０４】
【表４】
0005751641.tif 000019
【配列表】
0005751641000001.app