(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）をその順序で実施することを含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
（ａ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３で構成されたゾル組成物を基板上に分注した後、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ（溶液Ｉ）を分注する工程；及び
（ｂ）緩衝液であるＳｏｌＢＳ、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質及び蒸留水を含む溶液ＩＩを基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
（ｉ）ＳｏｌＢ１は、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であり；
（ｉｉ）ＳｏｌＢ２は、３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であり；そして
（ｉｉｉ）ＳｏｌＢ３は、アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であることを特徴とし、
（ｉ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３、ＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳ、または標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を混合する過程；（ｉｉ）前記過程（ｉ）の混合液をボルテックスする過程；及び（ｉｉｉ）前記過程（ｉ）または（ｉｉ）の混合液を安定化する過程からなる群から選択されるいずれか一つの前処理過程を含まないことを特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
前記方法は、アレイヤーなしに手でスポッティングを行うこと、又は非接触型アレイヤーを利用して行うことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３、ＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳ、及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を分注する前に容器に入れて、ノズルを利用して吸い上げる形態で分注することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３、ＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳ及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を分注する前に、予め分注するノズルが連結されている大容量カートリッジに入れて、一回で分注する量が、ノズルを利用して吸い上げる形態での分注と比べて１００倍以上であるため、大量生産が可能になることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記基板は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、プラスチック、シリコン、及びガラスからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質及び細胞からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記基板は、露点より高い温度で最適化され、湿度５０％より高い条件で分注することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ゾル組成物：溶液Ｉ：溶液ＩＩの分注量の比は、３：１：４から１：２：８の間の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ＳｏｌＢＨ及びＳｏｌＢＳの濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記溶液ＩＩは、ＳｏｌＢＳ：蒸留水：標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質の体積比が１：２：１と２：５：１との間の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ＳｏｌＢＳは、ｐＨ３〜８の範囲のリン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記基板は、予めプラズマ表面処理されたり、エッチングされたり、又はＰＤＭＳやシリケート単量体、若しくは高分子物質で処理されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１３】
下記の工程（ａ）〜（ｃ）をその順序で実施することを含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
（ａ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３を含むゾル組成物に、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ（溶液Ｉ）を混合する工程；
（ｂ）緩衝液であるＳｏｌＢＳと蒸留水を工程（ａ）で混合された溶液と混合した後、−２０〜４℃で安定化させる工程；及び
（ｃ）標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を含む溶液を工程（ｂ）で安定化された溶液と混合して基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
（ｉ）ＳｏｌＢ１は、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であり；
（ｉｉ）ＳｏｌＢ２は、３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であり；及び
（ｉｉｉ）ＳｏｌＢ３は、アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法。
【請求項１４】
請求項１又は１３に記載の方法で製造されたバイオチップに前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と相互作用可能な標的生物学的物質を含有する試料を添加する工程を含む標的生物学的物質の分析方法。
【請求項１５】
前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質及び細胞からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的生物学的物質を探知できる放射性同位元素、蛍光染料、染料、または発光性物質で標識された蛋白質、抗体またはアプタマーと追加で反応させる工程を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定溶液を順次混合して製造したゾル組成物を利用するか、または前処理過程なしにこのような特定溶液を順次基板に直接分注して簡単にバイオチップを製造する方法及びバイオチップ製造用ゾル−ゲルキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップは、新しいナノテクノロジー（nanotechnology、ＮＴ）、バイオテクノロジー（biotechnology、ＢＴ）、情報テクノロジー（information technology、ＩＴ）が融合した技術の代表的な例である。バイオチップは、種々の生体物質を固体状支持体の表面に高集積微細配列（high-density microarray）としたもので、表面に付ける生体物質によりＤＮＡチップ、蛋白質チップ、セルチップ、及びニューロンチップなど種々のチップに分けられる。また、バイオチップは、微細流体学技術と併せてＬＯＣ（lab-on-a-chip）として発展している。バイオチップの細部技術としては、生体物質を固定させる技術、固体支持体を生体物質親和的に作る技術、生体物質を微細配列する技術、作られたチップ上で種々の生体反応を実施するアッセイ技術、反応結果を感知する技術、固定化対象である生体物質を作る蛋白質工学、遺伝子組換え技術などがある。
【０００３】
蛋白質チップは、バイオチップ（biochip）の一種であり、種々の蛋白質を単位面積の固体状支持体の表面に高集積微細配列（intense microarray）したものである。最近、既に開発されて商用化されたＤＮＡチップの製作原理及び製作技術要素を導入して蛋白質チップを製作しようとする努力が払われている。一般に、商用化されたＤＮＡチップの多くは、コーティング物質で表面を前処理したガラス板上にＤＮＡを固定化させて製作したものである。ＤＮＡチップの製作に用いられる方法と類似する方法で蛋白質チップを製造する場合、即ちコーティング物質で表面を前処理したガラス板上に蛋白質を固定化して蛋白質チップを製造する場合は、固定される標的蛋白質の物理化学的特性の差によって多様な問題が発生している。
【０００４】
初期蛋白質チップは、表面処理されたガラス板上に蛋白質をそのまま付着させた後、簡単な結合分析（binding assay）を行うものであったが、固定化された蛋白質の活性可否により実際作動可否が左右されて、本来の目的を達成するのに困難が多かった（MacBeath and Schreiber, Science 289:1760, 2000）。このような問題点は前述した通り蛋白質が持つ固有な物理化学的特性の差によって発生する蛋白質の変成（denaturation）或いは不活性化、分解（degradation）等から引き起こされる。このような問題点を克服するために、ＤＮＡとは異なる蛋白質の特性に適した蛋白質付着表面処理技術及び蛋白質固定物質などに対する研究が行われている。これに対する研究は、蛋白質チップ表面上に固定反応を起こしながら、同時に蛋白質の活性を維持する方法を提供するのに焦点が合わせたもので、例えばパーキンエルマー（PerkinElmer）に最近買収されたパッカードバイオサイエンス（Packard Bioscience）のヒドロゲル（Hydrogel）ＴＭコーティングスライド、プロリンクス（Prolinx）のバーサリンクス（versalinx）チップ、ザイオミックス（Zyomyx）のバイオチップのＰＤＣチップなどが挙げられる。
【０００５】
一方、ゾル−ゲル工程は、微細加工を介して微細構造を作るのに利用されてきた技術であり、特に無機物質に生体分子を化学的に付着させる代わりに穏やかな工程を介して結合網を形成して、この結合網中に生体分子を共有結合以外の方法で固定化するのに多く利用されてきた技術である（Gill I. and Ballesteros A.,Trends Biotechnol., 18:282, 2000）。
【０００６】
さらに、酵素をはじめとする多くの生体分子が塊状ゾル−ゲルマトリックス中に固定されて生体触媒やバイオセンサーの製作にも利用されており（Reetz, Adv. Mater., 9:943, 1997）、特に透明な光学的性質のために光学的発色検出にも利用されている（Edminston, et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994）。また、生体分子は、ゾル−ゲル反応によって固定化されると、化学的に安定化されるだけでなく、熱的にも非常に安定化されると知られている（Dave, et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994）。
【０００７】
バイオセンサーの場合、前記ゾル−ゲル反応は、単純な固定だけでなく、固体支持体上に微細構造を形成してパターン化（patterning）する方法で利用されている。この時、パターン化方法は、流体力学を利用して液相であるゾル状態でモールドで形を作ってゲル化させた後、モールドを外してパターンを作る。例えば、毛細管内マイクロ−モジュリング（micro-modulingin-capillaries、ＭＩＭＩＣ）（Kim, J. Ferment. Bioeng., 82:239, 1995; Marzolin, Adv. Mater., 10:571, 1998; Schuller, et al., Appl. Optics., 38:5799, 1999）と呼ばれる技術は、メソコスピック（mesoscopic）シリカをパターン化する技術である。前記技術は、微細流体工学の基本的なパターン化に利用できる。
【０００８】
しかし、蛋白質の活性は、ｐＨなどの種々の因子によって影響を受けるため、ゾル−ゲル過程では、ゾル状態から蛋白質を添加して活性を維持する条件を設定することが重要である。このため、中性ｐＨなど種々の穏やかな条件を利用して蛋白質とゾルを共に予め混ぜて蛋白質をパターン化する技術（Kim, et al, Biotehnol. Bioeng., 73:331, 2001）が発表されているが、中性ｐＨではゾル−ゲル過程が急激に進行して、添加剤の選択によって亀裂ができたり不透明になるなどの問題点があった。また、蛋白質とゾルを共に予め混ぜる前処理過程などを経なければならないため、スポットの濃度が不均一になりやすい問題点もあった。
【０００９】
また、ゾル−ゲル工程に関する先行特許として、生体物質を含んだゾル混合物をチップ基材上でゲル化反応させることによって、生体物質がゲルマトリックスによって形成されたフォア中に担持され、ゲルマトリックスで形成されたスポットによってカプセル化された状態で、生体物質の反応性を向上させるゾル−ゲルバイオチップがあり、または、このようなゾル−ゲル工程を利用したバイオチップの製造において、固定された生体物質の変形を防いだり、感度を高めるゾル−ゲルバイオチップ用ゾル組成物のスクリーニング方法に関する特許があるが、製造方法が複雑で、ゾル組成物の製作過程において生体物質の活性低下、破壊などの問題点が生じてきた。
【００１０】
そこで、本発明者等は、ゾル組成物の製造時生体物質の活性低下及び破壊を防止するために鋭意努力した結果、特定シリケート単量体及び添加剤を特定順序で順次混合して基板に分注するか、これらを順次基板に直接分注してゲル化させる場合、従来用いられた製造方法に比べてゲル化時間を遅らせて、より均一なバイオチップを製作できるだけでなく、前記成分によって生体物質の活性低下及び破壊が防止されて感度が非常に優秀なバイオチップを製作できることを確認して本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の主な目的は、ゾルゲル物質をキット化して特別な装備や技術がなくても誰でも簡単にバイオチップを作って分析できるようにするところにある。
本発明の他の目的は、特定ゾル組成物を順次混合して基板に分注するか、又はこれらを順次基板に直接分注するなどの製造方法を確立して、前処理過程なしに均一なバイオチップを製造する方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記バイオチップを利用した標的物質の分析方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、一具現例で、（ａ）ゾル−ゲルキット（ＳｏｌＢキット）でＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３、ＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳで構成されている液体を順次混合して、探知物質（例えば、蛋白質）と混ぜた後基板に分注する製造方法、及び（ｂ）前処理過程なしにバイオチップを製造するためにＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３で構成されたゾル組成物を基板上に分注する工程；ＳｏｌＢＨを分注する工程；ＳｏｌＢＳ、探知蛋白質及び蒸留水を含む溶液を基板上に分注した後、ゲル化させる工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法を提供する。
【００１３】
この時、用いられるバイオチップ製造のためのＳｏｌＢキット中ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、及びＳｏｌＢ３としては、
（ｉ）ＳｏｌＢ１で、メチルトリエトキシシラン（methyltriethoxysilane、ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ethyltriethoxysilane、ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム（Sodium Silicate）、オルトケイ酸テトラメチル（tetramethyl orthosilicate、ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（tetraethyl orthosilicate、ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（tetramethoxysilicate、ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体；
（ｉｉ）ＳｏｌＢ２で、３−アミノトリメトキシシラン（3-aminotrimethoxysilane、３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（diglycerylsilane、ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（methyltrimethoxysilicate、ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（polyglycerylsilicate、ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート（polyvinylacetate）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、グリセリルメタクリレート（glyceryl metaacrylate）、ヒドロキシエチルアクリレート（hydroxyethyl acrylate）、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（N,N’-disuccinimidyl carbonate、ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン（1,3,5-trimethylbenzene）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（cetyltrimethylammonium chloride）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（cetyltrimethylammonium bromide）、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（3-(triethoxysilyl)propyl succinic anhydride)、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（N-(3-triethoxysilyl propyl)-4-hydroxy butylamide、ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（N-(triethoxysilyl propyl)gluconamide、ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１（pluronic L121）及び水酸化テトラメチルアンモニウム（tetramethylammonium hydroxide）からなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体；及び
（ｉｉｉ）ＳｏｌＢ３で、アミノプロピルトリエトキシラン（aminopropyltriethoxysilane、ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（3-glycidoxypropyltrimethoxysilane、ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane、ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤を含むことを特徴とする。
【００１４】
具体的に、本発明は下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
（ａ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３を含むゾル組成物にＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ（溶液Ｉ）を混合する工程；
（ｂ）緩衝液であるＳｏｌＢＳと蒸留水を工程（ａ）で混合された溶液と混合した後、−２０〜４℃で安定化させる工程；及び
（ｃ）標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を含む溶液を工程（ｂ）で安定化された溶液と混合して基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
（ｉ）ＳｏｌＢ１は、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であり；
（ｉｉ）ＳｏｌＢ２は、３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であり；そして
（ｉｉｉ）ＳｏｌＢ３は、アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法を提供する。
【００１５】
本発明は、また下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
（ａ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３で構成されたゾル組成物を基板上に分注した後、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ（溶液Ｉ）を分注する工程；及び
（ｂ）緩衝液であるＳｏｌＢＳ、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質及び蒸留水を含む溶液ＩＩを基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
（ｉ）ＳｏｌＢ１は、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であり；
（ｉｉ）ＳｏｌＢ２は、３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であり；そして
（ｉｉｉ）ＳｏｌＢ３は、アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法を提供する。
【００１６】
本発明は、また前記方法で用いられる、（ｉ）メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であるＳｏｌＢ１を含む第１容器；（ｉｉ）３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であるＳｏｌＢ２を含む第２容器；（ｉｉｉ）アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であるＳｏｌＢ３を含む第３容器；（ｉｖ）ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨを含む第４容器；及び（ｖ）緩衝液であるＳｏｌＢＳを含む第５容器で構成されて、前記ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３を混合したゾル組成物にＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ、緩衝液であるＳｏｌＢＳと蒸留水、探知するための生物学的物質を順に混合することによって、ゾル混合物がゲル化されることを特徴とするバイオチップ製造用キットを提供する。
【００１７】
本発明は、また前記方法及びゾル組成物で製造したバイオチップ及びこれを利用して生体物質である標的物質を分析する方法で、前記方法で製造されたバイオチップに前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と相互作用可能な標的生物学的物質を含有する試料を添加する工程を含む標的生物学的物質の分析方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のゾル組成物（Ｓ−Ｓｏｌ）、溶液Ｉ及び溶液ＩＩで製造したゾル混合溶液をアレイヤーで分注して製作したバイオチップを示す。
【図２】５種のＨＩＶ１抗原を含んだスポットでＨＩＶ患者の血清に対する反応を示す。１、２、３、４、及び５は、ＨＩＶ１抗体診断のための抗原マーカーであり、順にｐ２４、ｐ３１、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、及びｇｐ１６０を示している。
【図３】連続的に希釈した抗原を含んだスポットで連続的に希釈したＨＩＶ患者の血清に対する反応を示しす。
【図４】５種のＨＩＶ１抗原各々を含んだスポットでＨＩＶ  ｓｔａｎｄａｒｄ血清に対する反応を定量化してグラフであり。１、２、３、４、及び５は、ＨＩＶ１抗体診断のための抗原マーカーで、順にｐ２４、ｐ３１、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、及びｇｐ１６０を示している。
【図５】感染後日付毎に採取したＨＩＶ１患者の血清に対して、本発明のバイオチップと既存の診断キットを利用した検出結果を比較した表である。
【図６】ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＹＥＲ  Ｓ１１を利用して製作したチップのＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ｓｃａｎｎｅｒスキャン写真（Ａ）及びカメライメージ写真（Ｂ）である。
【図７】本発明に係るカプセル化構造中に探知蛋白質を含むと共に、表面に微細チャネルを持つバイオチップの形状を図式化したものである。
【図８】本発明に係るバイオチップ（右側）と従来方法によるバイオチップ（左側）の均質度を比較した写真である。
【図９】本発明に係るゾル混合物（Ａ）と任意の順序で溶液を混合した時のゾル混合物（Ｂ）の均質度及びゲル化される速度を比較した写真である。
【図１０】本発明に係る蛋白質チップを利用して特定蛋白質を分析した結果である。
【図１１】本発明に係る蛋白質チップを利用して特定抗原を分析した結果である。
【図１２】本発明に係る蛋白質チップを利用して特定疾病に対する抗体を分析した結果である。
【図１３】本発明に係るゾル−ゲルチップを利用して特定化合物（ビスフェノールＡ）とＤＮＡアプタマーの結合を確認した結果である。
【図１４】本発明に係るゾル−ゲルバイオチップを商用化した製品のイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
一観点において、本発明は、下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
（ａ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３を含むゾル組成物にＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ（溶液Ｉ）を混合する工程；
（ｂ）緩衝液であるＳｏｌＢＳと蒸留水を工程（ａ）で混合された溶液と混合した後、−２０〜４℃で安定化させる工程；及び
（ｃ）標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を含む溶液を工程（ｂ）で安定化された溶液と混合して基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
（ｉ）ＳｏｌＢ１は、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であり；
（ｉｉ）ＳｏｌＢ２は、３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であり；そして
（ｉｉｉ）ＳｏｌＢ３は、アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であることを特徴とする製造方法に関するものである。
【００２０】
本発明において、前記ＳｏｌＢＨの濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭであることを特徴とする。
【００２１】
本発明において、前記ＳｏｌＢＳは、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲のＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４からなる群から選択された１種以上の溶液であってもよい。
【００２２】
ゾル−ゲル法を利用してバイオチップを製作する従来の方法では、ゾル組成物、緩衝液、及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質などを任意の順序で任意に混合して、まずゾル混合溶液を作った後、真空処理などの後処理を経てゲル化させる方法が利用されてきた。また、ゾル組成物と緩衝液及び探知蛋白質を混合する方法は、ボルテックス（vortex）や超音波振動（ultrasonic）を利用する方法などがあり、ゾル−ゲルの形を作る方法も基板用ウェル上にスポットを形成したり、表面をゾル−ゲルでコーティングしたり枠に注ぎ込んだ後、ゲル化させる方法などが利用されてきた。
【００２３】
このような方法は、ゾル組成物混合溶液で形成させたスポット毎に含有している標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質の濃度が一定でない場合があり、また実施者による濃度も違いが生じ、混合する時汚染の可能性が大きく、サンプルによりゾルゲル混合物の粘度が変化したりもするため、スポットの形成程度や形、大きさにおいて差がでる場合がある。従って、このような問題点を解決できる、均質のバイオチップを製造できる方法の必要性がある。
【００２４】
本発明のバイオチップ製作方法によると、ゾル−ケル法を利用して、簡易でありながらも、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質がスポット毎に均一な濃度をなしており、より正確で高い効率で生物学的物質の探知が可能である。
【００２５】
本発明のバイオチップの製造方法の一態様の具体的な説明は下記のとおりである。
まず、第１シリケート単量体であるＳｏｌＢ１、第２シリケート単量体であるＳｏｌＢ２及び添加剤であるＳｏｌＢ３を順に混合してゾル組成物を製造する。
【００２６】
前記ＳｏｌＢ１は、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の物質を用いてもよい。本発明の一実施例では、前記第１シリケート単量体の成分としてＴＥＯＳを選択して用いた。
【００２７】
また、前記ＳｏｌＢ２は、３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の物質を用いてもよい。本発明の一実施例では、前記第２シリケート単量体の成分としてＤＧＳを選択して用いた。
【００２８】
そして、前記ＳｏｌＢ３は、添加剤として、アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の物質を用いてもよい。本発明の一実施例では、前記添加剤としてＰＥＧを選択して用いた。
【００２９】
前記第１シリケート、第２シリケート単量体及び添加剤は、単量体内部生体物質の性質や作ろうとするゾル−ゲルチップの形により必要に応じて適宜選択して用いてもよい。
【００３０】
本発明のバイオチップ製造用ゾル組成物において、第１シリケート単量体は、ゾル組成物の全体積対して約２〜３０体積％、前記第２シリケート単量体は、約２〜８体積％、そして添加剤は、約０〜５体積％で含まれることが好ましい。この時、前記ゾル組成物は、吸入時有害であるため、風通しがいい所で製造する。
【００３１】
本発明の前記バイオチップ製造用前記ゾル組成物は、ゲル化させた時、孔隙による微細チャネルを形成することを特徴とする。即ち、このようなチャネルが分析する標的物質と相互作用を起こすことができるような手段になる。特に、前記（ｉｉｉ）構成要素の添加剤は、ゲル内のチャネルの大きさを調節するために利用される成分である。
【００３２】
本発明において、前記方法は、アレイヤーなしに手でスポッティングを行うこと、又は非接触型アレイヤーを利用して行える。
【００３３】
本発明において、工程（ｃ）で用いられる基板は、用いられる前に予め露点より高い温度で最適化され、ここで、露点より高い温度とは、基板に露を結び始める温度より高い温度を意味するものであり、湿度条件に応じてこのような露点は変わり、例えば、相対湿度５０％以上で大気温度が２０℃の場合、８．６℃であり、通常は湿度７０〜８０％で１４〜１７℃である。
【００３４】
本発明において、前記基板は、ポリメチルメタクリレート（polymethylmethacrylate、ＰＭＭＡ）、プラスチック、シリコン、及びガラスなどであってもよい。
【００３５】
本発明において、前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質及び細胞からなる群から選択されたいずれか一つでありうる。
【００３６】
本発明において、前記工程（ａ）で混合された溶液、ゾル混合物は、温度−２０〜４℃の条件で３０分以上放置して安定化させることができ、アレイヤーでゾル組成物を入れる容器は、露点より高い温度、通常１４〜１７℃（湿度７０〜８０％時露点温度以上）、分注環境は、湿度７０〜８０％、大気温度２０℃の条件を合わせてゾルゲルに最適化させることができる。
【００３７】
このような安定化及び最適化過程を介して、ゾル組成物のゲル化する速度を遅らせてスポット形成を容易にし、ゲル化した後のスポットの割れを防いでチップ内の微細チャネルがよく形成されるようにする。
【００３８】
本発明において、前記ゾル組成物とＳｏｌＢＨとＳｏｌＢＳの混合溶液、蒸留水、及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、各々３：１：４と１：２：８との間の範囲で混合され、前記ＳｏｌＢＨ及びＳｏｌＢＳの濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭであってもよい。
【００３９】
本発明において、前記ＳｏｌＢＳ：蒸留水：標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質の体積比は、１：２：１と２：５：１との間の範囲である。
【００４０】
本発明において、前記緩衝液は、ｐＨ３〜８の範囲のリン酸ナトリウム（sodium phosphate）であってもよい。
【００４１】
本発明において、前記基板は、予めプラズマ表面処理されたり、エッチングされたり、又はＰＤＭＳやシリケート単量体、若しくは高分子物質で処理されることを特徴とする。
【００４２】
他の観点において、本発明は、下記の工程を含む、ゾル組成物のゲル化を利用したバイオチップの製造方法であって、
（ａ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３で構成されたゾル組成物を基板上に分注した後、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ（溶液Ｉ）を分注する工程；及び
（ｂ）緩衝液であるＳｏｌＢＳ、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質及び蒸留水を含む溶液ＩＩを基板上に分注した後、ゲル化させる工程、
ここで、
（ｉ）ＳｏｌＢ１は、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であり；
（ｉｉ）ＳｏｌＢ２は、３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であり；
（ｉｉｉ）ＳｏｌＢ３は、アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であり；
（ｉｖ）ＳｏｌＢＨ溶液は、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲のＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択された１種以上の溶液であり；そして
（ｖ）ＳｏｌＢＳ溶液は、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲のＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４からなる群から選択された１種以上の溶液であであることを特徴とする製造方法に関するものである。
【００４３】
本発明において、工程（ｃ）で用いられる基板は、用いられる前に予め露点より高い温度で最適化され、ここで、露点より高い温度とは、基板に露が結び始める温度より高い温度を意味し、湿度条件に応じてこのような露点は変わり、例えば、相対湿度５０％以上で大気温度が２０℃であると、８．６℃であり、通常は湿度７０〜８０％で１４〜１７℃である。
【００４４】
このような最適化過程を介して、各溶液を順に分注時にゾル組成物のゲル化される速度を遅らせて、スポット形成を容易にし、ゲル化された後、スポットの割れを防いでチップ内の微細チャネルがよく形成されるようにする。
【００４５】
本発明の方法によると、ゾル組成物の分注後、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択された溶液ＩのＳｏｌＢＨをその上に分注する。溶液Ｉは、前記ゾル組成物のゲル化を誘導するためのｐＨ環境を作る役割を果たす。前記ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、またはＣＨ３ＣＯＯＨの濃度は、５〜３０ｍＭが好ましい。ｐＨ１〜３で適正させる。
【００４６】
最後に、緩衝液であるＳｏｌＢＳ、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質、及び蒸留水を含む溶液ＩＩを基板上に分注してゲル化させる。
【００４７】
本発明において、前記ＳｏｌＢＳは、ｐＨ３〜８の範囲のリン酸ナトリウムであってもよい。
【００４８】
前記緩衝液及び２次蒸留水は、生体物質（例えば、蛋白質）の破壊を防ぐ機能を持つ。生体物質は、適正範囲から外れたｐＨでは、活性が低下したり破壊されやすく、ゾルのゲル化は、ｐＨが高いほどゆっくり、ｐＨが低いほどはやく進行されるため、生体物質の活性低下及び破壊を防ぎながら適正時間ゲル化を行えるようにｐＨを適正することが重要である。通常、生体物質はｐＨ５〜８の範囲で安定的に存在するため、特に、前記溶液ＩによるｐＨ環境が、生体物質の破壊を防ぐために、前記緩衝液を用いる。用いられる緩衝液は、特に制限されることなく、添加する生体物質に当業者が適切に選択して用いられる。本発明では、ｐＨ３〜８の範囲のリン酸ナトリウムバッファーを用いた。また、溶液ＩＩに含まれている「標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質」または「生体物質」とは、検出しようとする対象物質（例、標的蛋白質）と相互作用できる生体内の物質のことをいい、例えば、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、または細胞などになりうる。このような探知蛋白質、または生体物質を、溶液ＩＩに含ませるために、適当なバッファー（buffer）溶液が用いられる。即ち、実施のための生体物質をバッファー溶液に入れて、検出のためのサンプル溶液（sample solution）を作る。例えば、前記生体物質が蛋白質の場合には、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（phosphate-buffered saline）を混ぜて用いて、酵素反応（enzyme reaction）がある時には、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡなどを必要に応じて適切に濃度を異ならせて混ぜて用いられる。本発明の一実施例では、前記対象物質（標的蛋白質）でＨＩＶ１（Human Immunodeficiency virus 1）患者の抗体を用いて、前記探知蛋白質で前記ＨＩＶ抗体に結合できる５種の抗原マーカーをＰＢＳバッファーに混ぜて用いた。
【００４９】
この時、前記溶液ＩＩで緩衝液であるＳｏｌＢＳ：蒸留水：標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質の混合される体積比は、１：２：１から２：５：１の間の範囲であることが好ましく、最も好ましくは１：２：１である。例えば、溶液ＩＩ全重量基準に緩衝液は約２０〜３０体積％、蒸留水は約４０〜６０％体積％、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は２０〜３０体積％であってもよい。本発明の一実施例では、緩衝液は１０μＬ、蒸留水は２０μＬ、探知蛋白質（標的蛋白質と相互作用する生物学的物質）等を含む溶液１０μＬで混合して用いた。
【００５０】
本発明は、前記ゾル組成物、溶液Ｉ及び溶液ＩＩを正確な量で順次分注することによって均質なバイオチップを製作することを特徴とする。
【００５１】
本発明で分注される、前記ゾル組成物：溶液Ｉ：溶液ＩＩの分注量の比は、３：１：４から１：２：８の間であることを特徴とし、好ましくは３：１：４である。例えば、前記ゾル組成物の分注量は、２５〜３５μＬが好ましく、約３０μＬが最も好ましい。前記溶液Ｉの分注量は、５〜１５μＬが好ましく、約１０μＬが最も好ましい。前記溶液ＩＩの分注量は、３５〜４５μＬが好ましく、約４０μＬが最も好ましい。
【００５２】
本発明に係るバイオチップ製造方法でゾル組成物と溶液Ｉ及び溶液ＩＩを予め混合した後、基板に分注する時は、非接触型アレイヤー（non-contact arrayer）を用いるか、ピペットあるいは他の道具を利用して直接手でスポッティングすることが好ましい。
【００５３】
本発明において、前記製造方法は、前処理過程がないことを特徴とし、前記前処理過程は、（ｉ）ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３、ＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳ、または標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を混合する過程；（ｉｉ）混合した後、ボルテックス（vortexing）する過程；及び（ｉｉｉ）混合した溶液を安定化する過程からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする。
【００５４】
vまた、本発明において、前記ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３、ＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳ及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を分注する前に容器に入れて、ノズルを利用して吸い上げる形態で分注してもよい。
【００５５】
加えて、本発明において、ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、ＳｏｌＢ３、ＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳ及び標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を分注する前に、予め分注するノズルが連結されている大容量カートリッジに入れて、一回で分注する量が、ノズルを利用して吸い上げる形態での分注と比べて１００倍以上であるため、大量生産が可能になる。
【００５６】
前処理過程なしに基板上に直接ゾル組成物と溶液Ｉ及び溶液ＩＩを順次分注してチップを製作する時は、正確な量で分注するアレイヤー（arrayer）を用いて実施されてもよい。この時、前記ゾル組成物、溶液Ｉ、及び溶液ＩＩを正確な体積で分注するのに用いられるアレイヤーとしては、非接触型アレイヤーが好ましい。
【００５７】
バイオチップ上で探知物質を配列（array）させる方式により「接触型」と「非接触型」に分けられるが、接触型アレイヤーは、非常に細い空間が中にあるピン（pin）等を利用して探知蛋白質をチップ表面に配列させる。このような方法は、探知蛋白質が含まれた溶液がピンの外側に少しずつ抜け出して、表面に直接接触して配列する方式で、短い時間に種々の探知蛋白質を配列させることができる長所があるが、溶液の体積を正確に調節できないため、均一性が低くなりうる。それに対して、非接触型アレイヤーは、細い管に探知蛋白質が含まれた溶液を入れて、チップ表面の真上に位置させた後、管に一定圧力を与えることによって直接的な接触なしに表面の上に配列させる方法である。この方法は分注される溶液の体積を正確に決めることが可能な長所がある。従って、前処理過程なしにゾル組成物、溶液Ｉ及び溶液ＩＩを順次分注してチップを製作する時、各溶液の分注される体積を比に合うように調節できるため、本発明ではこのような非接触型アレイヤーを用いることが好ましい。
【００５８】
前記ゾル組成物；ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択された溶液Ｉ；及び前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質、緩衝液及び蒸留水の混合溶液の溶液ＩＩを、正確な体積を分注する非接触型アレイヤーを利用して順次基板用ウェル上に分注させることができる。表面に分注されている小さいスポットに他の溶液が分注される時、溶液の表面張力のために、全溶液は広がることなく、スポットを形成することになるが、溶液が落ちる時発生する表面エネルギーが振動に転換されて、これによってスポット内で物質の流れ（対流）が発生して、二つの溶液が混ざりやすくことになる。このような原理を利用して、本発明では、前処理なしに表面に直接スポッティングを介して、ゾル−ゲルチップを製作する自動化方法を考案した。
【００５９】
例えば、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ  ＡＧ社のマイクロアレイヤー（Microarrayer）を用いることができる。特に、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ  ＡＧ社のデューポイントコントロールテクノロジー（dew point control technology）を利用すると、プレート表面に湿気が凝結されて生じる濃度の不確実性を極力防ぐことができてより正確な体積及び大きさのスポットが製作可能である。本発明の一実施例では、前記アレイヤーとして、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ  Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ  ＡＧ、ドイツ）を用いた。
【００６０】
即ち、本発明では、バイオチップ製作時に、前記非接触型アレイヤーを利用して基板に各々の溶液を正確な体積だけ分注するだけで、バイオチップをより手軽に作ることができて、従来方法のようにゾル−ゲルモノマー（sol-gel monomer）、緩衝液、探知蛋白質サンプルなどを予め混合する（premixing）等の前処理過程が必要ないため、より均質なバイオチップの製作が可能になる。
【００６１】
一方、本発明で用いる基板は、ゾル組成物がゲル化された時、透明になる性質を利用したものであるため、前記基板用ウェル（well）、またはスライドも、良い透明度を維持できる材料で作られたものがよい。例えば、透明性が非常に良いポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）成分と同じプラスチック、シリコンやガラス成分で製作されたものが用いられる。
【００６２】
また、本発明で用いられる基板は、ゾル混合溶液がゲル化されながら基板に固定されるように表面処理されなければならない。本発明のバイオチップの重要な条件中一つは、ゾル混合溶液がゲル化されながら基板に強く固定されて、標的物質が入っている溶液と反応させる時、スポットが落ちてはいけない点である。従って、前記バイオチップを利用した標的物質分析において、標的物質と反応させた後、強い洗浄過程が必要で、従って、このような物理的力を克服するためには、スポットの強い固定が必須で、このために表面処理されなかったプラスチック基板、プラズマで表面処理されたプラスチック基板や表面処理されなかったガラス基板、表面処理されたガラス基板（例えば、エッチング（etching）されたガラス基板など）、あるいは多孔質構造を持つシリコンチップなどを利用することが好ましい。
【００６３】
本発明において、基板は予めプラズマ表面処理されるか、エッチングされるか、ＰＤＭＳやシリケート単量体、または高分子物質で処理されたものであってもよい。
本発明のバイオチップ製造方法において、アレイヤーを用いるに当たり注意しなければならない事項は下記のとおりである。
【００６４】
第一に、ＤＮＡチップとは異なり、前記バイオチップはゾルという特殊な材料を用いて時間経過に伴ってゲル化される性質があるため、アレイヤーを利用して分注する途中にゾルがゲル化しないようできるだけ早いうちに分注させることが大変重要である。
第二に、湿度と温度である。基板にスポットがつくと同時に周囲の湿気量と温度に応じて前記スポットがゲル化される速度及びスポットの活性が左右されるため、最初の湿度と温度が大変重要になる。従って、常時前記ゾル−ゲルを利用したバイオチップを製作時には、アレイヤー周辺の湿度と温度を事前に整えることが大変重要になる。
【００６５】
本発明で好ましい湿度は、約５０％以上、または、より具体的には７０〜８０％である。そして、好ましい温度は、約２５℃以下、より具体的には常温の範囲と言える１０〜２５℃の範囲である。特に、スポットのゲル化において最初の高い湿度が重要な要因であるため、必ずスポットの配列（arraying）前の湿度を８０％程度に準備しなければならなく、また、温度が２５℃以上の場合には、ゾルのゲル化がはやく進行される傾向があるため、極力低い温度で実験した方が良い。
【００６６】
このように事前の温度、湿度の準備と、早いうちに集積させることができるプログラムを準備した後、各溶液を工程毎に分注するようになる。
本発明において、標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、または細胞であってもよい。
【００６７】
また他の観点において、本発明は、（ｉ）メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、ケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）及びテトラメトキシシリケート（ＴＭＳ）からなる群から選択された１種以上の第１シリケート単量体であるＳｏｌＢ１を含む第１容器；（ｉｉ）３−アミノトリメトキシシラン（３−ＡＴＭＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、グリセリルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、１，３，５−トリメチルベンゼン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＳＩＴ８１８９．５）、Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＳＩＴ８１８９．０）５０％、プルロニックＬ１２１及び水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群から選択された１種以上の第２シリケート単量体であるＳｏｌＢ２を含む第２容器；（ｉｉｉ）アミノプロピルトリエトキシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、Ｎ−トリエトキシシリルプロピル−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１３５０及びＰＥＧ８０００からなる群から選択された１種以上の添加剤であるＳｏｌＢ３を含む第３容器；（ｉｖ）ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨを含む第４容器；及び（ｖ）緩衝液であるＳｏｌＢＳを含む第５容器で構成されて、前記ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２及びＳｏｌＢ３を混合したゾル組成物にＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３及びＣＨ３ＣＯＯＨからなる群から選択されたＳｏｌＢＨ、緩衝液であるＳｏｌＢＳと蒸留水、探知するための生物学的物質を順に混合することによって、ゾル混合物がゲル化されることを特徴とするバイオチップ製造用キットに関するものである。
【００６８】
前記容器は、その材質に制限がなく、このようなキットは、ビン、桶（tub）、小袋（sachet）、封筒（envelope）、チューブ、アンプル（ampoule）等のような形態を取ってもよく、これらは部分的に、または全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイール、ワックスなどから形成されてもよい。容器は、最初は容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって容器に付着することができる、完全に、または部分的に分離可能な栓を取り付けてもよい。前記キットは、外部パッケージを含んでもよく、外部パッケージは、構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。
【００６９】
また他の観点において、本発明は、前記方法で製造されたバイオチップを利用して標的生物学的物質を分析する方法に関するものである。
【００７０】
具体的に、前記方法で製造されたバイオチップに前記標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と相互作用可能な標的生物学的物質を含有する試料を添加する工程を含む標的生物学的物質の分析方法に関するものである。ここで、前記標的生物学的物質は、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、及び細胞からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とし、前記標的生物学的物質を探知できる放射性同位元素、または蛍光染料、あるいは他の種類の標識物質で標識された蛋白質、アプタマーなどの生体物質と、追加で反応させる工程を含んでもよい。
【００７１】
前記で説明したとおり、標的生物学的物質と反応させるバイオチップが準備された後、実際に標的生物学的物質が入っている溶液と反応させる。反応溶液は、９６ウェル（well）タイプの場合、５０〜１００μＬの量が適切で、反応時間は１時間にする。標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と相互作用する標的生物学的物質も生体内物質として、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子物質、または細胞であってもよい。
【００７２】
標的生物学的物質が入っている反応溶液は、スポット内の微細孔隙構造を介してスポット内に浸透し、カプセル構造中に固定されている生物学的物質と接触し、相互作用を介して結合することになる（１ｓｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）。前記反応後、スポット内で標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質と結合した標的生物学的物質を分析するために、前記標的生物学的物質を探知できるように標識因子の標識蛋白質と反応させてもよい。本発明の一実施例では、蛍光染料（Ｃｙ３）が付着した標的蛋白質に対する抗体を用いた（２ｎｄ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）。この時、反応時間は３０分にして、反応溶液の量は５０〜１００μＬにする。前記１ｓｔ、２ｎｄインキュベーション過程は、共に室温で行う。標的生物学的物質が入っている反応溶液が種々の物質が混ざっている混合物の場合に、バイオチップに入っている標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質との非特異的結合を防ぐために、１ｓｔインキュベーション過程前にブロッキング（blocking）過程を行ってもよい。この過程に必要なブロッキング溶液は、スキムミルクやＢＳＡ（bovine serum albumin）、あるいはＩｇＧのようなものを用いてもよい。
【００７３】
前記１ｓｔ、２ｎｄインキュベーションを終えた後には、洗浄過程（washing）を経ることになるが、洗浄液の成分としては、通常のものを用いてもよく、本発明の一実施例では、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれているＰＢＳバッファーを用いた。洗浄機としては、ＥＬＩＳＡ用洗浄機を用いた。１ｓｔ洗浄工程で、４回の洗浄を行って、２ｎｄ洗浄工程で４回の洗浄を実施する。前記洗浄工程を経た後、ウェルで溶液がすべて取り除かれるまで乾燥させる。
【００７４】
乾燥過程が終わった後、蛍光染料を探知できるイメージスキャナを介して反応を起こしたウェルをスキャンして実際反応が合ったか否かがわかり、イメージをソフトウェアを利用して濃さを測定してみることによって、どの程度の反応を起こしたかが分かる。即ち、本発明の標的生物学的物質を分析する方法は、放射性同位元素、蛍光染料、発光性物質、染料、あるいは他の種類の標識物質などで標識された蛋白質、またはアプタマーなどの生体物質と、追加で反応させる工程を含む。この時、アプタマーとは、高い親和性で標的生物学的物質と相互作用する生物学的物質を特異的に認知できる小さい一本鎖オリゴ核酸を称する。
さらに本発明は、前記製造方法によって製造されたバイオチップを含む検出用キットを含む。
【００７５】
探知生物学的物質検出用キットは、瓶、筒、小袋、封筒、チューブ、アンプル等のような形態であってもよく、これらは部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイール、ワックスなどから形成される。容器は、最初は容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって、容器に付着できる、完全にまたは部分的に分離可能な栓を取り付けることができる。前記キットは外部パッケージを有することができ、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。
≪実施例１：バイオチップ製造用各構成溶液の製造≫
次の表１に例示された成分ら中各々一つずつを選択したＳｏｌＢ１  ２０μＬ、ＳｏｌＢ２  ６μＬ、及びＳｏｌＢ３  ４μＬを混合してゾル組成物を製造した。尚、溶液Ｉとしては１０μＬのＳｏｌＢＨを準備した。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
次に、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４からなる群から選択された１種以上のＳｏｌＢＳ１０μＬ及び２次蒸留水（double distilled water、ＤＤＷ）２０μＬを混ぜる一方、ＨＩＶ１抗体と相互作用できる５種の探知蛋白質（ｐ２４、ｐ３１、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、及びｇｐ１６０）約１０〜２００ｎｇずつＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒに混ぜてサンプル溶液１０μＬを作り、これを前記混合物に添加した後、５秒の間ボルテックスしてスピン−ダウンして溶液ＩＩを製造した。
【００７９】
【表２】
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【００８０】
≪実施例２：バイオチップの製作≫
（１）基板用ウェルの準備
プラズマ表面処理されて市販されているＰＭＭＡ９６ウェルプレートをＳＰＬ社（韓国）から購入して準備した。
（２）バイオチップ（蛋白質チップ）の製作
蛋白質チップを製作するために、スポッティングする前に、温度１６℃、湿度８０％でアレイヤーをセットし、前記実施例１で取得されたゾル混合溶液を入れるソースウェル（source well）としては、一般３８４ウェルを準備し、標的ウェル（target well）としては、前記（１）のＰＭＭＡ９６ウェルプレートを準備した。そして、設定した通り正確な体積を分注するｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＹＥＲ  Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ社、ドイツ）アレイヤーを準備した。
次に、ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＹＥＲ  Ｓ１１（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ社、ドイツ）アレイヤーのソースプレート（source plate）に、前記実施例１でのＳｏｌＢ１  ２０μＬ、ＳｏｌＢ２  ６μＬ、及びＳｏｌＢ３  ４μＬを混合して製造したゾル組成物３０μＬ、ＳｏｌＢＨ１０μＬ（溶液Ｉ）、及び前記溶液ＩＩ４０μＬずつ各々アレイヤーのソースプレートに入れた。
予め準備したＰＭＭＡ９６ウェルプレート上に、前記ゾル組成物、溶液Ｉ、及び前記溶液ＩＩを順に決まった体積量だけ分注した。分注される量がスポット当たり４５０ｐｌ以下になるようにし、この時、ノズルＰＤＣ９０（ＳｃｉｅｎｉｏｎＡＧ、ドイツ）を用いた。ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙは、５００Ｈｚにした。形成されたスポットの大きさは、約３００ｕｍ程度であった（スポット当たり８ｄｒｏｐｓ）。
【００８１】
図６に５３２ｎｍでＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｘｏｎ社）でスキャンした写真Ａ及びカメラが取り付けられたｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲによるイメージ写真Ｂを図示した。蛋白質チップ上の互いのスポット間隔（dot pitch）は６００ｕｍであった。
【００８２】
≪比較例１：従来の蛋白質チップとの均質度比較≫
本発明の方法に係る蛋白質チップが、既に用いられている蛋白質チップと比較して顕著に優秀な均質度を持っているか否かを確認した。
まず、対照群として公知の既存の方法によって蛋白質チップを製作した。シリケート単量体（Silicate monomer）、ＨＣｌ、ＤＷ、ＳＰ、及びサンプル溶液を順次混合して製造した後、ピンアレイヤー（pin arrayer）を利用してソースプレートに分注された混合溶液をＰＭＭＡ９６ウェルプレートにスポッティングした。ピンアレイヤーとしては、ＯｎｍｉＧｒｉｄ  Ａｃｃｅｎｔ  Ａｒｒａｙｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、米国）を用いた。
【００８３】
尚、実施例１及び２の方法で製作した本発明の方法により製作された蛋白質チップのカメライメージ写真（図６のＢ）と、前記方法により製作された蛋白質チップが顕微鏡で観察される像をデジタルカメラで撮って比較した。
その結果、図８に示した通り、本発明の特定ゾル組成物の使用及び；溶液Ｉ、溶液ＩＩと混合する前処理工程なしに順次分注することによって製作された蛋白質チップの場合には、スポットの形及び大きさが一定に配列されているが、従来方法による場合、スポットの形や大きさが一定でなかった。即ち、本発明に係る蛋白質チップが既存の蛋白質チップよりその均一な程度が顕著に優秀であることを確認することができた。
【００８４】
≪比較例２：順序を異なるようにして混合した時の比較≫
本発明の方法に係る混合順に溶液を混合した時と順序を異なるようにして混合した時ゾル混合物の差を比較した。
本発明の混合順序に従って、ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、及びＳｏｌＢ３からなるゾル組成物に順番どおり、ＳｏｌＢＨとＳｏｌＢＳ及び蒸留水とバッファー溶液を混ぜて混合物を準備し、比較のために同じ溶液を用いたが、ＳｏｌＢＨを一番最後に混ぜて混合物を準備し、二つの混合物の差をデジタルカメラで撮って比較した。
その結果、図９に示された通り本発明の混合順序を守って混合物を準備した時には、溶液が互いに溶解しやすく、透明で長い間ゲル化が進行されなかったが（図９のＡ）、混合順序を異なるようにして準備した時は、溶液が溶けにくく、ゲル化もはやく進行されることを確認することができた（図９のＢ）。
【００８５】
≪実施例３：蛋白質チップを利用したＨＩＶ分析及び診断≫
前記実施例２で製作された蛋白質チップを１０％スキムミルク溶液を利用してブロッキング（blocking）した後、各ウェルに希釈したＨＩＶ患者の血清を５０μＬずつ入れて、室温で１時間１次培養した。１次培養が終わった後、血清を取り除き、ＥＬＩＳＡ用洗浄機を利用して０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれた洗浄液を入れて、５分間ボルテックス（vortex）する工程を４回繰り返した（１次洗浄）。前記１次洗浄後、Ｃｙ３蛍光物質で標識されており、ヒトの抗体を認知する∂−Ｈｕｍａｎ抗体（∂-Human-Cy3、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を希釈して５０μＬを入れて、室温で１時間２次培養した。前記２次培養後、∂−Ｈｕｍａｎ−Ｃｙ３を取り除き、ＥＬＩＳＡ用洗浄機を利用して洗浄液を入れて、５分間ボルテックスする工程を４回繰り返した（２次洗浄）。
【００８６】
前記２次洗浄後、反応が終結したウェルを室温で１０分以上放置して乾燥させ、レーザースキャナであるＦＵＪＩ  ＦＬＡ−９０００イメージスキャナで反応が起きたスポットをスキャンした。また、イメージ分析プログラムであるＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬを利用して反応が起きた各スポットの蛍光信号の強度を測定して定量化して、反応が起きた程度を分析した。
【００８７】
図２に示したとおり、患者血清により５個のマーカー（ｐ２４、ｐ３１、ｇｐ４１、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０（Ａｂｃａｍ社、Ｆｉｔｚｅｒａｌｄ社から入手）が、各々血清に対して反応を示し、抗原マーカーが入らなかった陰性対照群チップは反応を示さなかった。
【００８８】
図３は、５種の抗原中最も反応が起きた４種の抗原（ｐ２４、ｐ３１、ｇｐ４１、ｇｐ１２０）とＨＩＶ１のＯ−ｔｙｐｅ抗原１種を連続的に希釈してウェルにスポッティングして、ＨＩＶ標準血清を順に希釈したものと反応させた結果を示しており、予想通り数量化（quantification）が定量的に行われたことを確認することができた。前記結果を基に、本発明で製作した蛋白質チップ上で抗原−抗体反応が特異的に起きることが分かる。
【００８９】
図４は、５種の抗原を各々含むスポットでＨＩＶ１標準血清に対する反応を定量化した結果を示す。図面のＸ軸は、標準血清を既存のＥＬＩＳＡ診断キットでＨＩＶを診断した時、測定されたタイター（Titer）を示しており、本発明の蛋白質チップの分析結果と既存診断チップで分析した結果が相関性があることを見せる。Ｘ軸のＰＲＢ２０４−００は、Ｂｏｓｔｏｎｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．から購入した患者の血清標準サンプルであり、製品名はＡｎｔｉ−ＨＩＶ１  ｍｉｘｅｄ  ｔｉｔｅｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｐａｎｅｌであり、製品番号はＰＲＢ２０４（Ｍ）である。力価の値は、既存の診断キットで測定したｓ／ｃｏ値であり、ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｃｕｔ−ｏｆｆ（陽性と陰性の基準値）ｒａｔｉｏを示し、１以上である時陽性とする。図面のＹ軸は、スポットの蛍光信号の強度（「ｓｉｇｎａｌ」）値を陰性対照群スポットの蛍光信号の強度（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）値で割った値である。
【００９０】
図５は、ＨＩＶ感染した患者から日毎に採血したｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐａｎｅｌに対する反応を既存の診断キットと比較した表である。患者の血清は、Ｂｏｓｔｏｎｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．から購入した標準サンプルであり、既存の診断キットを利用した検出結果も、標準サンプルと共に提供を受けた。このサンプルの製品名は、Ａｎｔｉ−ＨＩＶ１  ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐａｎｅｌ  Ｖで、製品番号はＰＲＢ９２２である。
感染してから間もない時には、既存の抗体診断ＥＬＩＳＡ診断キットでは、ＨＩＶ感染を検出できなかったが、本発明の蛋白質チップでは抗原検出キット同様に感染初期から陽性と検出できることが分かる。
従って、前記バイオチップが、既存の抗体診断ＥＬＩＳＡよりはるかに向上した感度を持っていることが分かる。
【００９１】
≪実施例４：蛋白質チップを利用したウェスタンブロット方法の代替≫
ウェスタンブロットと免疫染色法は、種々の蛋白質の混合物からある特定蛋白質を捜し出す技法で、探そうとする蛋白質に対する抗体を用いて抗原−抗体反応を起こすことによって、特定蛋白質の存在可否を明らかにする方法である。
一般に、ウェスタンブロット（western blot）で特定蛋白質を捜し出す過程は、蛋白質混合物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して大きさ毎に分離させた後、ニトロセルロース、またはナイロンメンブレンに移して、蛋白質を移されたメンブレンで抗原−抗体反応を利用して特定抗体に対する抗原を捜し出すが、この時用いる抗体は、放射性同位元素で標識するか、特定の酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅなど）、または蛍光を示す色素が結合していて、探そうとする蛋白質を可視化することができる。
【００９２】
前記の通りに、複雑な工程を経なければならないウェスタンブロットの代りに、前記実施例２で製作された蛋白質チップを利用して、蛋白質混合物を固定化した後、蛍光を示す色素が結合している抗体でアッセイして、手軽に蛋白質混合物内で特定蛋白質を捜し出すことができた。
また、一般に、蛋白質を電気泳動する際に還元状態下で実施するため、蛋白質が変性（denature）された状態で、抗体と結合をさせることになるが、特定抗体が蛋白質の本来の（native）形態だけを認識するならば、一般的なウェスタンブロット（western blot）では、蛋白質を捜し出すことができなくなる問題があるが、本発明に係るゾル−ゲル蛋白質チップは、蛋白質を本来の形態で固定化させることができるため、より有用である。
【００９３】
前記実施例２で製造されたゾル−ゲルチップを利用して、下記の実験を行った。
（１）ｐ２４蛋白質のネイティブフォーム（Native form）及び変性フォーム（denature form）に係る結合比較実験
（ｉ）先に、ネイティブ形態にだけ結合して、変性形態には結合しない抗体を利用して実験した。その結果、ウェスタンブロットではバンドが見られなく、ゾル−ゲル蛋白質チップだけで陽性と示された。
（ｉｉ）同じ抗原に対する抗体であるが、変性形態に結合する抗体を利用してウェスタンブロットとゾル−ゲル蛋白質チップに実験した結果、全部陽性と示された。
従って、本発明に係るゾル−ゲルチップは、変性及びネイティブ形態共に確認できることが明らかになった。
（２）ｐ２４蛋白質が発現したＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物を利用した実験
（ｉ）ｐ２４蛋白質が発現しているＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物をゾル−ゲル蛋白質チップに濃度毎に（ライセート１、２、３）固定した後、発現した蛋白質に対する抗体でアッセイした結果、ゾル−ゲル蛋白質チップで陽性と示された（図１０）。
（ｉｉ）特定蛋白質が発現していなかったＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物（Ｎ）をゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後、前記抗体でアッセイした結果、図１０に示したように、ゾル−ゲル蛋白質チップで陰性と示された（図１０）。
【００９４】
図１０で、Ｎは陰性対照群で、特定蛋白質が発現していなかったＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物を固定したものであり、ライセート１は、特定蛋白質が０．０９ｕｇ／ｕｌの濃度で発現しているＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物、ライセート２は、特定蛋白質が０．１８ｕｇ／ｕｌの濃度で発現しているＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物、ライセート３は特定蛋白質が０．２７ｕｇ／ｕｌの濃度で発現しているＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物を固定したものである。Ｐは、陽性対照群で、Ｃｙ３蛍光物質を固定したものである。
【００９５】
（３）（ｉ）ｐ２４蛋白質に対する抗体を濃度毎にゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後サンドイッチアッセイ方法を利用して、ｐ２４蛋白質が過発現しているＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物でアッセイして、再度抗体を結合させて確認した結果、ゾル−ゲルチップでは陽性と示された（図１１）。
（ｉｉ）探索しようとする抗原に対する抗体を濃度毎にゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後、サンドイッチアッセイ方法を利用して特定抗原が発現しなかったＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物でアッセイして、再度抗体を結合させて確認した結果、ゾル−ゲルチップでは陰性と示された（図１１）。
図１１で、Ｎは陰性対照群で、抗体を固定しなかったチップであり、Ａｂ１及びＡｂ２は、抗体を濃度毎に（０．０６３ｕｇ／ｕｌ、０．１２５ｕｇ／ｕｌ）固定したものである。Ｐは陽性対照群で、Ｃｙ３蛍光物質を固定したものである。
（４）（ｉ）探索しようとする疾病（ＡＩＤＳ）の抗体に対する抗原（ｐ２４、ｐ３１、ｇｐ４１、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０）をゾル−ゲル蛋白質チップに固定した後、患者血清等特定抗体が含まれている物質（陽性血清）でアッセイして確認した結果、ゾル−ゲルチップで陽性と示された（図１２）。
（ｉｉ）探索しようとする抗体に対する抗原をゾル−ゲルチップに固定した後、血清等特定抗体が含まれていなかった物質（陰性血清）でアッセイして確認した結果、ゾル−ゲルチップで陰性と示された（図１２）。
【００９６】
≪実施例５：化合物と結合する蛋白質、または特定物質の探索≫
図１３に示された通り、特定化合物（ビスフェノールＡ）を実施例２で製作したゾル−ゲルチップに固定して、陰性対照群として化合物を溶解するのに用いるバッファー溶液だけをチップに固定した。そして、蛍光物質（ｃｙ３）で標識されており、ビスフェノールＡと結合できる１本鎖ＤＮＡアプタマー（ピーシエル（株）社から購入）を利用して分析した。
【００９７】
蛋白質−蛋白質の結合は、酵母ツーハイブリッド法（yeast two hybrid）や免疫沈降（ＩＰ）等で確認できるが、化合物と蛋白質の結合、または化合物とＤＮＡの結合を手軽に確認できる方法は多くない。前記実験結果、実施例２で製作された蛋白質チップは、化合物やＤＮＡをはじめとする低分子物質から蛋白質、抗体に至るまで様々な物質を固定することができ、種々の物質の結合を手軽に確認することができる。
【００９８】
本発明に係る前記ゾル組成物のゲル化を利用して、バイオチップを製造する場合、ＳｏｌＢ１、ＳｏｌＢ２、及びＳｏｌＢ３で構成されるゾル組成物とＳｏｌＢＨ、ＳｏｌＢＳ、ＤＷとバッファー溶液を順に混合した後、低温で安定化させることによって、ゾル組成物のゲル化時間を遅らせて安定化されたゲル化（gelation）を導いて、ゾル溶液の分注が容易で、スポットの活性を維持することができる。また、事前に混合（premixing）する前処理過程なしにアレイヤーを利用した表面スポッティングだけ利用して手軽に均質なバイオチップ製作が可能であるという有利な効果があって有用である。
【００９９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記術は単に望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求範囲及びその等価物によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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