(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者より摘出した転移していない前哨リンパ節から得られるリンパ球を準備し；
（ｂ）ＩＬ−２によって該リンパ球をインビトロにて刺激し、該リンパ球をインビトロにて増殖させて、工程（ｂ）が工程（ａ）で準備されているリンパ球を付加的な活性化シグナルに曝露することをさらに含み、該活性化シグナルがリンパ球を自己腫瘍エキスに曝露することを含む、リンパ球の増殖方法。
【請求項２】
活性化が抗原提示細胞の存在下にてなされる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗原提示細胞がＢ−細胞、マクロファージ、単球、樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
リンパ球がヒトまたは動物の起源から由来される、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リンパ球がコラゲナーゼと一緒にまたはなしで前哨リンパ節より供給される、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｔ−細胞の部分集合が増殖について選択される、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ−細胞がＣＤ４である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
リンパ球が血清および／または抗生物質を含んでいてもよい培地にて培養される、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
培地が最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ−細胞の増殖速度を定期的にモニター観察する、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
さらにＴ−細胞の再活性化および再刺激も含む、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ−細胞の径が小さくなると、Ｔ−細胞が再び活性化かつ刺激される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
再活性化および再刺激を数回繰り返し、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ−細胞の集団をプロモートする、請求項１１ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）がサイトカインの添加を含み、新たな培地を細胞培養物に添加する場合に、培養を行う最初の日からサイトカインの添加を行い、一日おきに添加する、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬ−２が１００Ｕ／ｍＬの最終濃度で利用される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
抗原提示細胞がＭＨＣ分子と併用して用いられる、請求項２または３記載の方法。
【請求項１７】
癌の治療にて用いられる請求項１ないし１６のいずれか一項に記載のインビトロにて増殖させたリンパ球を含み、その増殖に供されるリンパ球が前哨リンパ節を起源とする、組成物。
【請求項１８】
癌の再発を治療および／または防止する、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前哨リンパ節が癌に罹患している患者から由来する、請求項１７または１８記載の組成物。
【請求項２０】
リンパ球がヒトまたは動物起源より由来する、請求項１７ないし１９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、癌免疫療法の新規かつ改良された方法、およびこの方法にて用いるためのキットに関する。具体的には、本発明は癌患者の前哨リンパ節から得られるリンパ球を用意し、それをインビトロにて拡張させる方法に関する。
【０００２】
（従来技術）
癌は、多くは種々の型の悪性腫瘍を表すのに用いられる語であり、ヒトの主たる死亡原因の一つである。現在のところ、癌は世界の死亡全体のおよそ２３％を占め、より多くの命を奪うのは心血管疾患だけである。個々の人生において、癌は、どの器官のどの組織、いずれの年齢においても発生し、その形質転換した細胞は回りの組織に侵入するか、または体内のいくつかの部位に転移する。現在では、内因的因子とは別に、喫煙、食品に含まれる、あるいは工業プロセスで放出される特定の化合物への暴露などの特定の活性化物質および環境条件もまた、特定の型の癌および腫瘍の発生の原因となり、その危険性を増大させている。
癌と診断されれば、治療方法を決定することが最優先事項となる。過去においては、ローカルおよびレジオナル療法の両方が用いられ、具体的には、外科手術および／または放射線療法が、通常、全身性療法、すなわち、抗腫瘍薬の投与と組み合わせて用いられた。
【０００３】
外科手術は癌療法の最も古い形態であるが、種々の欠点を有する。外科手術は腫瘍が未だ原発性腫瘍細胞を拡散し始めていない初期発育段階にて検出された場合に成功するにすぎず、その治療の成功は癌の部位の間で大きく変動する。放射線療法は、外科手術に加えて、あるいは外科的手段により原発性腫瘍とアクセスすることが困難であるような場合、例えば、結節性およびびまん性のホジキンリンパ腫以外のリンパ腫、頭頚部の扁平上皮細胞癌、縦隔胚細胞腫瘍、前立腺癌または初期段階の乳癌などには単独で利用される。
【０００４】
これらの上記した２種の治療方法と一緒に、腫瘍細胞の細胞分裂または拡散を防止するために、抗腫瘍薬が癌患者に投与される（化学療法的処置）。これらの薬剤はその近くにある必然的にすべての増殖の速い細胞に毒性であるとしても、化学療法は、例えば、結腸癌の患者にて、５年以上の追跡で、５１％から４０％への、死亡率の減少という限られた改善をもたらしうる。
【０００５】
最近になって、光線力学療法および腫瘍免疫療法という、２種の付加的な治療方法が開発された。
光線力学療法においては、光感作化合物およびレーザーを用いて腫瘍壊死を生じさせるものである。腫瘍を特定する光感作化合物を患者に全身投与し、つづいてレーザーを用いて活性化させる。感作剤に適当な波長の光を吸収させて励起状態とし、その感作剤と処理される組織内にある酸素分子とを相互作用させて細胞毒性の一重項酸素を発生させ、それを介して細胞障害性を得る。
【０００６】
他方、腫瘍免疫療法は、免疫系が体を物理的に完全に保持する手段として個々に実行する先天的な任務からの利益を得ようとするものである。
原理上、哺乳動物の免疫系は、体を保護するための２つの一般的機構として、非特異的または先天的免疫応答、および特異的または後天的免疫応答を有する。外来の侵入物質と非特異的に戦う先天的応答とは異なり、クローン選択によりなされる、特異的応答は特定の物質（抗原）に応じて調整される。後天的免疫は、特異性細胞、エフェクター分子としての抗体を産生するＢ細胞（体液免疫応答を提供する）により媒介され、細胞そのものを介してその効能を媒介するＴ−細胞（細胞媒介免疫性）により媒介される。
【０００７】
特異的免疫系の細胞は、一般に、体に属しないと、すなわち、異種または「非自己」として認識される各々の存在を攻撃して破壊するが、同時に「自己」を決定すると知られている物質／抗原に対しては攻撃を止める。かくして、内因的物質だけでなく、個々の体内に入る／侵入する外因的生物学的および非生物学的存在も攻撃し、免疫系は「自己」を表すものについて学習することはなく、異種として認識する。
【０００８】
個々において、免疫系は、通常、免疫学的監視を提供し、癌の発生を防止する。癌免疫性は主にＴ−細胞およびＮＫ細胞により媒介され、ここでは形質転換された腫瘍細胞は、（腫瘍関連の）異種物質、すなわち、「自己」に属すると識別されない抗原として認識された後に（Ｔ細胞）またはＭＨＣクラスＩ発現を欠く抗原として認識された後に（ＮＫ細胞）破壊される。
これらの機序を癌の治療に活用する医学的試みにおいて、これまで２つの一般的方法が腫瘍免疫療法にて用いられてきた。第一の方法によれば、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子またはインターフェロンなどの物質を腫瘍患者に投与することにより先天的免疫応答が刺激される。しかし、この方法は完全に成功であるとは言い切れず、その有効濃度で投与物質が示す高い毒性のため、該方法は強い副作用を示した。
【０００９】
免疫系の「自己」と「非自己」を区別する内因的能力を利用する特異的免疫系に別の焦点が当てられた。一般に、形質転換された細胞は異種または「非自己」であると認識される抗原を示すため、免疫系は該形質転換細胞を攻撃する。しかし、場合によっては、腫瘍結合の抗原は免疫応答を惹起する能力を有しないため、またはＴ−細胞を十分に刺激する能力を有しないため、あるいは腫瘍細胞は免疫応答をインビボにてダウンレギュレートする因子を産生するという理由から、腫瘍細胞はいくらかインビボにて免疫系から漏れる可能性がある。
【００１０】
免疫系がその内因的任務を果たすことを補助するために、癌患者の単核細胞を末梢血液から単離し、培養物に移し、そこで該細胞を刺激して拡張させた。拡張後に、該細胞を患者に注入により戻すが、成功した応答割合は３５％までにすぎなかった。不利な点の一つが末梢血液は腫瘍抗原に拮抗する機能的活性を有するリンパ球をわずかな数しか有していないということである。
この欠点を克服するために、インビボにて腫瘍に浸潤させたリンパ球の集団、いわゆる腫瘍浸潤リンパ球を単離して拡張させることを含む、種々の操作が提案された。この方法はまだ、腫瘍発生のかなり後の段階でのみ存在し、数が少ない、特定の型のリンパ球を必要とするという欠点がある。さらには、腫瘍浸潤リンパ球は腫瘍からの物質の免疫抑制剤に供され、最終的にかかるリンパ球の単離が実施において常に容易な操作であるとは限らない。
【００１１】
（発明の開示）
したがって、本発明の問題は従来技術の上記した欠点を克服し、免疫療法の新規かつ改善された方法を提供することである。
この問題は、前哨リンパ節からリンパ球を得、こうして得られたリンパ球をインビトロにて活性化させ、拡張させる行程を含む、癌の再発を治療および／または予防する方法により解決される。
【００１２】
図面において、
図１は前哨リンパ節の術中の同定結果を示す。
図２はリンパ球の特徴化から由来の結果を示す。
図３は転移についての非特異的活性化および細胞内ＦＡＣＳ分析の結果を示す。
図４は、抗原ペプチドの提示およびＴ細胞の活性化が起こる際に、腫瘍からの抗原物質がどのようにしてリンパ管により排液性リンパ節に輸送され、トレーサー色素により同定されるかの仮定となるスキームを示す。
【００１３】
本発明に至る長期にわたる実験の間、発明者らは結腸直腸癌を患っている患者の免疫特性を解析し、意外にも、その患者の末梢血液から、あるいは一般にリンパ系から単離したリンパ球は腫瘍に対して反応的でないとしても、該患者の前哨リンパ節は腫瘍細胞に拮抗する活性を示すリンパ球を宿していることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものであり、細胞性免疫療法における有用な手段が提供される。
【００１４】
本明細書に開示されている方法を実施する場合、第一に前哨リンパ節の位置を特定しなければならない。前哨リンパ節は一般に原発腫瘍域からリンパ排液を受け取るリンパ系の第一リンパ節と定義される。この操作は、原発腫瘍の手術の間に、例えば、好ましくは原発腫瘍を外科的に摘出する前に、トレーサー物質を腫瘍部位の回りにあるいはその周辺に導入することによりなされるのが都合がよい。トレーサーは毛細リンパ管に輸送され、マクロファージの食作用を介して下流にあるリンパ節に蓄積する。通常、前哨リンパ節はトレーサー物質を導入した数分後に一またはそれ以上の強烈な色彩のリンパ節をチェックすることにより肉眼で決定することができる。
トレーサー物質として、例えば、パテントブルー色素、リンファズリンブルー（lymphazurine blue）または９９Ｔｃ標識アルブミンを用いることができる。
【００１５】
前哨リンパ節を同定したならば、それを外科的手段により単離し、そのリンパ節の見本としてのスライスを用いてその組織学的状態を評価してもよい。
次の工程では、残りの前哨リンパ節に存するリンパ球を集め、インビトロ培養に移す。このことは、例えば、コラゲナーゼと一緒にまたはなしでリンパ節がその内容物を放出するようにリンパ節を押圧することで達成することができる。
こうして得られた細胞を、その後、インビトロ培養に供する。
不要な細胞を該培養から除去する場合、および／またはＴ−細胞の特定の部分集合、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌを選択する場合には、選択される細胞に独特な表面マーカーと関連付けられる抗体などの、ポジティブまたはネガティブ選択技法を用いることができる。かかる技法の一例が、選択される細胞上に存在する表面マーカーに対して方向付けられるモノクローナル抗体をキャリアに結合させるところの、磁性免疫粘着法である。細胞の選択はまた、滅菌条件下、フローサイトメトリーにより補助される細胞分類により行うこともできる。
【００１６】
細胞は、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０を含む、リンパ球細胞の増殖に適するいずれかの培地中、通常の条件下で培養することができる。細胞の増殖を促進するために、その増殖および生存に不可欠な、血清、例えばウシ胎児血清またはヒト血清、および抗体、例えばペニシリン、ストレプトマイシンを含む因子を添加してもよい。リンパ球を増殖を支持するのに不可欠な条件下、例えば、約３７℃の適当な温度、および空気に５％ＣＯ２を加えた大気中に維持する。
リンパ球は、培養の間、拡張用刺激剤に、所望により付加的な活性化シグナルに暴露される。
リンパ球の拡張は、細胞を抗−ＣＤ３抗体と接触させること、または細胞を蛋白キナーゼＣ活性化物質（ホルボールエステル）とカルシウムイオノホールとの併用において接触させることによりなされうる。Ｔ−細胞表面上でアクセサリー分子を刺激するために、そのアクセサリー分子と結合するリガンドを利用してもよい。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ−細胞の増殖を刺激するのに適する条件下、抗−ＣＤ３抗体および抗−ＣＤ２８抗体を用いて活性化されうる。
【００１７】
原発および共同刺激シグナルは種々のプロトコルにより得ることができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤を溶液とするか、または固相表面、例えば、培養コンテナにカップリングさせることができる。固相表面にカップリングさせる場合、薬剤を同じ固相表面に（すなわち、「シス」形成にて）カップリングさせるか、または別の表面に（すなわち、「トランス」形成にて）カップリングさせることができる。さらに、一の薬剤を固相表面にカップリングさせ、他の薬剤を溶液にすることもできる。
【００１８】
刺激後のＴ−細胞の集団の刺激を長期間維持するために、Ｔ−細胞をその後に刺激から分離する。けれども、Ｔ−細胞は培養期間を通して共同刺激リガンドと接触状態に維持されていてもよい。Ｔ−細胞の増殖速度を、例えば、Ｔ−細胞の大きさを調べるか、またはその容量を測定することにより、定期的に（例えば、毎日）モニター観察する。Ｔ−細胞の平均径がピークから減少すれば、再び活性化および刺激に付し、さらなる増殖を誘発させる。別法として、活性化Ｔ−細胞上にて制御される、細胞表面分子、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２ＬおよびＭＨＣクラスＩＩの存在をアッセイすることにより、Ｔ−細胞の増殖速度およびＴ−細胞の再刺激時間をモニター観察することもできる。ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ−細胞の集団の長期刺激を誘発するために、Ｔ−細胞を抗−ＣＤ３抗体および抗−ＣＤ２８抗体で数回再活性化および再刺激する必要がありうる。
【００１９】
加えて、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞をＩＦＮ−γ産生Ｔｈ１エフェクター細胞に対して活性化させるために、維持および増殖のためのＩＬ−２ならびにＩＬ−１２、ＩＮＦ−αおよび抗ＩＬ−４抗体などのサイトカインを添加することにより、前哨リンパ節から得られるＴ−細胞を刺激してもよい。十分な程度まで拡張させるためにＴ−細胞培養に添加すべきサイトカインの量は当業者であれば容易に決定することができる。培養を行う最初の日からサイトカインを添加し、Ｔ−細胞の増殖を維持するのに十分な量にて培養の一日おきに添加する。例えば、ＩＬ−２を培養物に添加して最終濃度を約１００Ｕ／ｍｌとし、新たな培地をその細胞培養物に添加する場合、二日毎または三日毎のように隔日にて培養物に添加する。
本発明の方法によれば、既にインビボにて感作がなされており、腫瘍抗原に対する特異性を有するリンパ球が使用されているため、クローン拡張が既に起こっているから、原則として、付加的な活性化／感作は不要である。
【００２０】
しかし、免疫抑制物質を産生する腫瘍の患者においては、Ｔ−細胞において付加的な活性化シグナルを誘因させるのに適する形態にてリンパ球培養物を腫瘍抗原で刺激してもよく、すなわち、シグナルがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してＴ−細胞にて誘因されるように、抗原をＴ−細胞に提示させてもよい。例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞などの抗原提示細胞をＭＨＣ分子と併用することにより抗原をＴ−細胞に提示させることができる。このために、腫瘍細胞、自己腫瘍エキスおよび／または組換え腫瘍抗原をリンパ球の培養物に添加し、付加的な感作に十分な時間インキュベートする。同様に、病原体、例えばウイルスに感染し、その病原体の抗原を提示する細胞を、リンパ球と一緒にインキュベートすることもできる。Ｔ−細胞の集団が抗原特異的に活性化されると、該細胞は本明細書に記載の方法に従ってさらに拡張させることができる。患者の安全を考慮した場合、腫瘍細胞および／または組換え細胞の除去工程を省くことができるため、自己腫瘍エキスを使用することが好ましい。
【００２１】
さらには、腫瘍細胞が前哨リンパ節にある場合、そこから得られたリンパ球は腫瘍細胞不含の前哨リンパ節から得られたリンパ球と比べて腫瘍細胞に拮抗する活性および／または特異性の低いことが見出された。理論に拘束されるつもりはないが、現在のところ、この知見は腫瘍の有する免疫抑制能による可能性があると、すなわち、腫瘍細胞の存在によってアネルギーが機能的状態にある可能性があると考えられている。
リンパ球の培養が所望の程度まで拡張され、刺激された場合に、リンパ球を集め、所望により患者の健康に有害な物質を一掃してもよく、そしてそれを患者に戻す。この操作は約１時間から６時間の間に静脈内注入により行うことができ、その投与される単球の数は増殖工程の間に生成される細胞の数に依存するにすぎない。
【００２２】
もう一つ別の具体例によれば、本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。該キットは色素、好ましくはパテントブルー色素ならびにリンパ球の増殖および拡張を刺激する試薬を含む。
本発明の方法は従来技術に比べて明らかな利点を提供する。リンパ球は前哨リンパ節から集められるから、具体的には既に腫瘍抗原に拮抗する活性および特異性を有するリンパ球が拡張される。この特異性は、そのリンパ球を自己腫瘍エキスの存在下で培養することにより、インビトロにて強化され、クローン選択および拡張を促進することできる。原発腫瘍に対して特異的な反応性を有するＴ−細胞は前哨リンパ節にて同定することができ、これらの細胞は細胞免疫療法にて後の使用のために特異的に拡張させることができる。
次に実施例を用いて本発明を説明するが、これらは何ら本発明を限定するものではなく、単なる例示にすぎない。
【００２３】
実施例１
細胞採集と調製
手術前の遠隔転移またはリンパ節病変の徴候のない５人の結腸癌の患者をこの実験に利用した（図１）。この実験は倫理委員会により承認されており、患者とのインフォームド・コンセントがなされた。
検査を容易にするために腹膜癒着の分離を介して結腸腫瘍部位を移動させた。１ｍｌのパテントブルー色素（Guerbet, Paris）を腫瘍の回りに表面的に注射した。顕微鏡を用いて５分以内に前哨リンパ節としての１ないし３個の青色に変色した腸間膜リンパ節を同定し、それらを縫合でマークした。
前哨および非前哨リンパ節を半分に切断した。厚みが１ｍｍより薄いスライスをフローサイトメトリーおよび増殖分析用にそのリンパ節の中央部および周辺部より切断した。残りのリンパ節を慣用的な組織病理学検査に付した。組織を組織病理学的にデューク段階Ａ−Ｃ（１１）として分類した（表１）。
原発腫瘍の一片（浸潤マージンの部分を含む）をフローサイトメトリー分析用および抗原の供給源として摘出した。
【００２４】
静脈血、前哨および非前哨リンパ節および腫瘍を素早く処理して、操作時間を最小とした。末梢血のリンパ球（ＰＢＬ）をフィコール−ハイパキュー（ficoll-hypaque）（Pharmacia, Amersham）で精製した。リンパ節細胞の単細胞懸濁液をルーズ・フィット・ガラス・ホモジナイザーを用いて緩やかな圧力により得た。細胞を懸濁させて２．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）ＤＭＥＭ（Life technologies）中で２回洗浄した。最後に、細胞を再びＲＰＭＩ増殖培地（１０％ヒトＡＢ血清（Sigma）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma）および１％グルタミン（Sigma））に懸濁させた。
【００２５】
腫瘍サンプルをDounceホモジナイザーを用いて５倍容量（Ｗ／ｖ）のリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）中に均一にし、５分後に９７℃で変性させた。顕微鏡で無傷の細胞を見つけることはできなかった。腫瘍ホモジネートを完全な増殖培地中にて１：１０および１：１００に希釈した。３ｘ１０５細胞／ウェルの精製したＰＢＬおよびリンパ節細胞を、希釈腫瘍ホモジネート、コンカナバリンＡ１０μｇ／ｍｌ（Sigma）または癌胎児性抗原１００μｇ／ｍｌ（Sigma）に対する３通りの増殖検定にて使用した。採取する１６時間前に１μＣｉの３Ｈ−チミジン／ウェル（Amersham）を添加することにより５日、６日および７日目に増殖を測定した。サンプルをシンチレーション計数に付した。
【００２６】
１ｘ１０６細胞／サンプルのＰＢＬ、リンパ節細胞および腫瘍細胞の懸濁液をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いる検査に付した。細胞を２％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ３（ＦＡＣＳバッファー）を含有するＰＢＳにて洗浄し、ＣＤ４ＰＥ、ＣＤ８ＰｅｒＣｐおよび極めて速い活性化マーカーＣＤ６９ＦＩＴＣ（Pharmingen）に対する蛍光細胞表面マーカーを用いて直接三重に標識した。細胞内ＦＡＣＳの場合、ＦＡＣＳバッファー中０．３％サポニン（Sigma）を用いて細胞を室温で１５分間透過させ、つづいて３０分間サイトカイン−２０抗体（Dakopatts）と一緒にインキュベートした。洗浄した後、細胞を抗−マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ（Jackson）結合抗体と一緒に３０分間インキュベートした。原発抗体なしで染色した細胞を対照として用いた。染色後、細胞をＦＡＣＳスキャン（Becton Dickinson）を用いて検査し、データをセルクエスト（cellquest）コンピュータソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて解析した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
実施例２
前哨リンパ節の術中同定および病理学的分類
腫瘍の周辺にパテントブルーを注射することで手術中に１ないし３個の前哨リンパ節を検出した（図１）。摘出した試験片を肉眼で解剖して、１８と２９個の間にあるリンパ節（平均２２個）を同定して組織病理学的評価に組み込んだ（図２Ａ、２Ｂ左パネル）。患者２および３（表１）は前哨リンパ節までの転移拡張を有し、組織病理学的にデュークＣに分類された（図２Ｂ左パネル）。他の３人の患者は、腫瘍が腸の筋肉壁を介して増殖している（図２Ａ左パネル）にも拘わらず、前哨リンパ節まで、または他のリンパ節までの転移拡張の徴候を示さなかった。それらをデュークＢに分類した。
【００２９】
末梢血（ＰＢＬ）（図示せず）、腫瘍、排液性前哨リンパ節および非排液性リンパ節から別々に集めたリンパ球の単細胞懸濁液を、極めて速い活性化マーカーＣＤ６９およびＴ−細胞マーカーＣＤ４（図２Ａ、Ｂ中央パネル）およびＣＤ８（図示せず）を認識する抗体で３通りに染色し、つづいてフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）に付した。転移の有る（図２Ａ中央パネル）および無し（図２Ｂ中央パネル）に拘わらず、前哨および非前哨リンパ節の両方にて同じ数の活性化ＣＤ４＋リンパ球を見つけた。すべての検査した腫瘍は種々の程度まで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含有し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ−細胞の両方である、これらＴＩＬの大部分はＣＤ６９＋表現型を提示かつ活性化した。末梢血にて、活性化されたＣＤ４＋ＣＤ６９＋リンパ球はなかった（図示せず）。
【００３０】
リンパ球の機能の状態をさらに抗原供給源として均質にした腫瘍細胞エキスを用いる経時変化による増殖アッセイにて特徴付けた（図２Ａ、Ｂ右パネル）。パテントブルー色素による刺激はいずれのケースにおいても増殖を引き起こさなかった（データ図示せず）。転移していないすべての前哨リンパ節において（デュークＢのケース）、リンパ球は自己腫瘍エキスに対して用量依存形式にて増殖した（図２Ａ、右パネル）。ピーク増殖が６日目の最高量の抗原で恒常的に観察された（表１）。非前哨リンパ節またはＴＩＬからのリンパ球の間では抗原依存性増殖は認められなかった。デュークＣのケース（表１、図２Ｂ右パネル）にて、前哨リンパ節は転移細胞を含有し、全くないあるいは非常に小さな増殖応答が同定された。リンパ球の機能の状態を評価するために、Ｔ−細胞受容体を介しての活性化を無視するコンカナバリンＡでＴ−細胞を非特異的に刺激した。すべてのＰＢＬおよび非前哨リンパ節のリンパ球、ならびにデュークＢ患者の前哨リンパ節のリンパ球は強い増殖で答えた（図３Ａ）。しかしながら、デュークＣ患者からの前哨リンパ節のリンパ球はコンカナバリンＡに対する増殖で応答せず、デュークＢまたはＣのケースのＴＩＬでも応答しなかった。１００μｇ／ｍｌの癌胎児性抗原を用いてデュークＢ患者からの前哨リンパ節のリンパ球を刺激することで増殖活性は得られなかった（図示せず）。
【００３１】
自己腫瘍エキスに対して特異的活性を有するリンパ球を選択し、長期培養に置いた。その刺激細胞は主にＣＤ４＋Ｔリンパ球からなり、ＩＬ−２の存在下で拡張してインビトロにて数週間生存した。
腫瘍、前哨および非前哨リンパ節からの細胞をサイトケラチン−２０、上皮癌のマーカーで細胞内染色してからＦＡＣＳにより検査した。本発明者らは細胞のサポニンでの透過が腫瘍中の大部分のサイトケラチン−２０陽性細胞の検出を可能とすることを見出した（図３Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは微小転移巣の前哨リンパ節中の少量のサイトケラチン−２０陽性細胞も検出することができた（図３Ｂ、図２Ｂ左パネル）。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１．  前哨リンパ節の術中での同定。パテントブルー色素（Ａ）を漿膜下注射することで前哨リンパ節の同定を腫瘍（Ｂ）の周囲４カ所で行った。通常、５分以内に１またはそれ以上の青色に変色したリンパ節が腸間膜（Ｃ）にて現れる。
【図２】図２Ａ＋２Ｂ．  リンパ球の特徴化。デュークＢ（Ａ）およびデュークＣ（Ｂ）の患者からのデータ。腫瘍（ＣＣ）、前哨リンパ節（ＳＮ）および前哨リンパ節（ＬＮ）からの試料をヘマトキシリン−エオシン（左パネル）で染色した（ｘ４０）。矢印は前哨リンパ節中の転移結腸癌細胞の存在を示す（Ｂ、左パネル、ＳＮ）。腫瘍（ＣＣ）、前哨リンパ節（ＳＮ）、非排液リンパ節（ＬＮ）からのリンパ球をＣＤ４および活性化マーカーＣＤ６９に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて解析し（中央パネル）、二重陽性ＣＤ４Ｔヘルパー細胞の割合を右上コーナーに示す。腫瘍（ＣＣ）、前哨リンパ節（ＳＮ）およびリンパ節（ＬＮ）からの細胞を１０−または１００−倍に希釈した自己結腸癌エキスと一緒に５−７日の経時変化の実験にてインキュベートした。細胞を１μＣｉ３Ｈ−チミジンを用いて採取する１６時間前にパルス処理に付した。ピーク増殖が５日目に生じた（右パネル）。
【図３】図３．  非特異的活性化および細胞内ＦＡＣＳ転移分析。コンカナバリンＡ刺激（Ａ）に対する増殖応答およびサイトケラチン−２０抗体（Ｂ）を用いる細胞内ＦＡＣＳ解析を示す。末梢血（ＰＢＬ）、腫瘍（ＣＣ）、前哨リンパ節（ＳＮ）およびリンパ節（ＬＮ）からの細胞を１０μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（Ａ）を用いて刺激する経時変化増殖アッセイにて研究した。腫瘍（ＣＣ）、前哨リンパ節（ＳＮ）およびリンパ節（ＬＮ）からの細胞をサポニンと一緒に透過させ、つづいて抗サイトカイン−２０抗体と一緒にインキュベートし、抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ結合抗体（Ｂ）を用いて検出した。点線は第二抗体だけと一緒にインキュベートした対照サンプルを示し、オーバーレイプロットにおいては、第一および第二の両方の抗体を培養器にてインキュベートした。数値はサイトカイン−２０陽性腫瘍細胞の割合を示す。
【図４】図４Ａ＋４Ｂ．  デュークＢ（Ａ）の仮定的スキームを示す。腫瘍には、代謝回転の速い細胞が存在しており、マクロファージおよび樹枝状細胞を攻撃する不利な環境を生じさせる酸素および栄養素を欠く。腫瘍細胞からの残骸はこれら専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）により食され、パテントブルーの腫瘍周辺注射により術中に検出することのできる、排液前哨リンパ節にリンパ管により輸送される。前哨リンパ節において、ＡＰＣはペプチドを負荷し、エンドソーム／リソソーム経路にて処理され、腫瘍抗原から主としてＨＬＡクラスＩＩポケットに誘導される。このクラスＩＩ−腫瘍ペプチド複合体はＡＰＣの表面に輸送され、第一活性化シグナルを付与するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞により認識される。第二活性化シグナルは、ＡＰＣ上に高いレベルで発現される、Ｂ７．１、Ｂ７．２およびＩＣＡＭ−１などの共同刺激分子により付与される。かくして、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は活性化エフェクター細胞となり、リンパ節を離れて胸管を通って血流に戻る。その活性化ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は腫瘍または転移などの炎症および新規な血管形成の領域にて血流を離れる。細胞は腫瘍浸潤リンパ節（ＴＩＬ）となる。しかしながら、腫瘍での局所的な不利な環境のため、およびおそらくは腫瘍より放出される免疫抑制サイトカインにより、ＴＩＬ細胞は免疫抑制され、非反応性となる（アネルギー）。デュークＣ（Ｂ）．  転移細胞の前哨リンパ節中の存在下では、本発明者らはリンパ球が腫瘍エキスに拮抗して、あるいは非特異的アクチベーター、例えば、コンカナバリンＡに拮抗して増殖できないことを見出した。ＡＰＣは食される腫瘍残骸と一緒に存在する可能性があり、該細胞は活性化されるようである。一の説明は転移細胞が免疫抑制因子を産生するということである。もう一つ別の説明はデュークＣ（リンパ節転移の存在）が腫瘍を異種として認識できない免疫性を有する患者にだけ生じるというものである。かくして、リーシュマニア症により攻撃された異なるマウス系統にて見られるような同様の状況は、ある系統では感染を一掃するのに対して、遺伝的な背景の違いから他の系統は死亡する。
【図１−ａ】
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【図１−ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２−ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図３−ａ】
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【図４Ａ】
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【図４−ａ】
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【図４Ｂ】
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