(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリ−、テトラ−および２，４ジ−硫酸化二糖が含まれず、７０から９０％の６−硫酸化二糖、８．５から２０％の２，６ジ−硫酸化二糖、０．１から５％の４，６ジ−硫酸化二糖、０．１から５％の非硫酸化コンドロイチンおよび０．１から１％の４−硫酸化二糖からなるサメに類似するコンドロイチン硫酸であって、すべての百分率は、前記サメに類似するコンドロイチン硫酸の総二糖含有量に対して示すものであり、前記二糖は４０から６５ｋＤａの数平均分子量（Ｍｎ）および５０から７０ｋＤａの重量平均分子量（Ｍｗ）を示す、コンドロイチン硫酸。
【請求項２】
２，６ジ−硫酸化二糖および４，６ジ−硫酸化二糖の和が総二糖含有量の１０から２５％に達する、請求項１に記載のサメに類似するコンドロイチン硫酸。
【請求項３】
変形性関節炎の予防もしくは治療において使用するため、または筋骨格系の健康の維持のための、請求項１または２に記載のサメに類似するコンドロイチン硫酸。
【請求項４】
請求項１または２に記載のサメに類似するコンドロイチン硫酸と、医薬としてまたは栄養補助食品として許容される担体とを含む組成物。
【請求項５】
変形性関節炎の予防もしくは治療において使用するため、または筋骨格系の健康の維持のための、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のサメに類似するコンドロイチンを調製するための方法であって、
ａ）水性環境に予め溶解した遊離酸としての非硫酸化コンドロイチンを、テトラメチル−、テトラエチル−およびテトラブチル−アンモニウムまたはピリジニウムからなる群から選択される塩で塩化する段階と、
ｂ）遊離酸および／またはナトリウム塩としての、段階ａ）によって生じた前記塩化された非硫酸化コンドロイチンを、５から１５％の水分含有量になるまで乾燥させる段階と、
ｃ）段階ｂ）によって生じた前記塩化された非硫酸化コンドロイチンを、１００℃から１７０℃の温度で、０．１から３％の水分含有量になるまで乾燥させる段階と、
ｄ）Ｎ−メチルピロリドンまたはジメチルホルムアミド中で可溶化した段階ｃ）によって生じた前記塩化された非硫酸化コンドロイチンの６位を、０℃から３０℃の温度で、１から２当量の三酸化硫黄ピリジン複合体または三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体を、合計２から１５当量の三酸化硫黄ピリジン複合体または三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体が添加されるまで１から３時間の時間間隔で添加することによって、選択的に硫酸化し、得られた溶液を２から２４時間撹拌させておく段階と、
ｅ）段階ｄ）において行われた反応を重炭酸または炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、得られた溶液を濾過および濃縮乾固して、乾燥固体を得る段階と、
ｆ）前記乾燥固体を塩化ナトリウム水溶液に溶解し、得られた溶液を限外濾過および透析する段階と、
ｇ）段階ｆ）によって生じた溶液から生成物を回収する段階と、
ｈ）段階ｇ）によって生じた生成物を精製し、前記生成物を酸性形態でまたはこのナトリウム塩としてのいずれかで得る段階と、
ｉ）段階ｈ）によって生じた前記生成物を回収する段階と
を含む方法。
【請求項７】
段階ａ）における非硫酸化コンドロイチンの塩化が、テトラメチル−、テトラエチル−およびテトラブチル−アンモニウムからなる群から選択される塩で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
段階ａ）における非硫酸化コンドロイチンの塩化が、テトラブチルアンモニウムで行われる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
段階ｂ）における非硫酸化コンドロイチンの乾燥が、フリーズドライまたは噴霧乾燥によって行われる、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｃ）における非硫酸化コンドロイチン塩の乾燥が、０．５から２％の水になるまで行われる、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｃ）によって生じた非硫酸化コンドロイチン塩の可溶化が、ジメチルホルムアミド中で行われる、請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
段階ｄ）における選択的硫酸化が、合計６から１２当量の三酸化硫黄ピリジン複合体を添加して行われる、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
段階ｄ）における選択的硫酸化が、合計６から９当量の三酸化硫黄ピリジン複合体を添加して行われる、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
段階ｄ）における選択的硫酸化が、合計１から９当量の三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体を添加して行われる、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
段階ｄ）における選択的硫酸化が、合計２から４当量の三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体を添加して行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
段階ｄ）における選択的硫酸化が、１０℃から２０℃の温度で行われる、請求項６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
段階ｄ）の終わりに、得られた溶液を２から６時間撹拌させておく、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
段階ｇ）において、生成物を、フリーズドライ、噴霧乾燥またはアルコール環境での沈殿によって回収する、請求項６から１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サメに類似するコンドロイチン硫酸およびこの調製のための方法に関する。特に、本発明は、天然コンドロイチン硫酸に匹敵するごく少量の４−硫酸、高電荷密度および生物学的活性を示す、サメに類似するコンドロイチン硫酸に関する。本発明は、前記サメに類似するコンドロイチン硫酸の調製のための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と命名された天然複合多糖のクラスに属するコンドロイチン硫酸（以後ＣＳ）は、ベータ（１→３）によって連結されたＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の別々に硫酸化された残基の交互の二糖配列で構成される。
【０００３】
二糖の性質に応じて、異なる炭水化物骨格を持つＣＳが公知である。実際に、天然および合成の両方の公知のＣＳが主として種々の百分率の二種類の二糖単位で構成される、即ちＧａｌＮＡｃの４または６位で硫酸化されているとしても、硫酸基の数および位置が異なる二糖は、多糖鎖内に種々の百分率で位置付けられていてよい。例えば、非硫酸化二糖はＣＳ骨格中に概して少量で存在するのに対し、ＧｌｃＡの２位およびＧａｌＮＡｃ（二糖Ｄ）の６位等の種々の位置に、またはＧａｌＮＡｃ（二糖Ｅ）の４および６位にＯ−連結された２つの硫酸基を有する二硫酸化二糖は、ＣＳ骨格中に、特定の動物源に関係する種々の百分率で存在し得る［Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６１，１２７１，２００９．Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６，３１６８，２００７］。
【０００４】
ＣＳは、下記の構造式：
【０００５】
【化１】
0005770367.tif 000002
を有する二糖繰り返し単位を示し、式中、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６は、独立に、ＨまたはＳＯ３−のいずれかである。
【０００６】
ＣＳを構成する交互の二糖配列の別々に硫酸化された残基を簡潔に同定するために現在使用されている最も使用頻度の高い頭字語の幾つかの意味を、以下に報告する。
【０００７】
Ｄｉ−０Ｓ  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝Ｈ；Ｒ６＝Ｈ）
Ｄｉ−６Ｓ（Ｃ）  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝Ｈ；Ｒ６＝ＳＯ３−）
Ｄｉ−４Ｓ（Ａ）  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝Ｈ）
Ｄｉ−４，６ｄｉＳ（Ｅ）  （Ｒ２＝Ｈ；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝ＳＯ３−）
Ｄｉ−２，６ｄｉＳ（Ｄ）  （Ｒ２＝ＳＯ３−；Ｒ４＝Ｈ；Ｒ６＝ＳＯ３−）
Ｄｉ−２，４ｄｉＳ（Ｂ）  （Ｒ２＝ＳＯ３−；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝Ｈ）
Ｄｉ−２，４，６ｔｒｉＳ  （Ｒ２＝ＳＯ３−；Ｒ４＝ＳＯ３−；Ｒ６＝ＳＯ３−）
天然および合成の両方のＣＳ試料は、ＣＳの構造的特徴付けおよびパラメータ（例えば、特定の硫酸化基、電荷密度、分子量および純度）ならびに生物学的活性を得ることができる高感度、特異的、検証および公開された分析的アプローチを利用して、特徴付けおよび識別され得る。
【０００８】
天然抽出のＣＳ試料を、構造および特性について特徴付けることができる［Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６１，１２７１，２００９；Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６，３１６８，２００７；Ｍｕｃｃｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４１，３７，２０００；Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７７，１９，２０００］。
【０００９】
ＣＳのトリ−およびテトラ−硫酸化形態（それぞれ「ｔｒｉＳ」および「ｔｅｔｒａＳ」）について、これらの形態は、まれに天然抽出のＣＳ試料中で検出されるが、典型的には合成ＣＳを特徴付けるものであることに留意することができ、Ｄｉ−２，４，６ｔｒｉＳは、他の理論的に可能なｔｒｉＳ形態が天然由来の生成物中に存在しないことから、合成ＣＳ生成物中におけるｔｒｉＳ  ＣＳの存在を評価するための標準として解される。
【００１０】
下記の表１は、種々の臓器および組織、主として軟骨から抽出され精製された天然ＣＳ試料において同定された主な二糖を例証するものである。
【００１１】
【表１】
0005770367.tif 000003
表１は、数種の源から精製された主要な天然ＣＳ試料の特徴付けについての主な構造パラメータを例証するものである。
【００１２】
特に、分子量パラメータは、陸生ＣＳ試料（ウシ、ブタおよびニワトリ試料）についてはかなり似ているが、魚族試料（サメ、エイおよびイカ試料）とはかなり異なっており、魚族試料は陸生ＣＳ試料よりも大きい分子量値を有する。
【００１３】
さらに、魚族ＣＳ試料は、二硫酸化二糖の存在により、約１．０より大きい固有の電荷密度値を有し、二硫酸化二糖の非存在により、約１．０よりも低い電荷密度値を有する陸生試料とは異なる。
【００１４】
すべての天然ＣＳのさらなる特色は、４Ｓまたは６Ｓ硫酸化二糖のいずれかおよび非硫酸化二糖に特異的な加水分解酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣで消化されると、多糖鎖が完全に消化されて二糖単位となることである。この特色は、ＦＡＣＥ（フルオロフォア団補助炭水化物電気泳動法）分析により容易に観察され得る。天然ＣＳの完全消化は、多糖鎖中におけるトリ−およびテトラ−硫酸化構造の非存在によるものである。トリ−およびテトラ−硫酸化二糖は、存在するならば、コンドロイチナーゼＡＢＣによって認識されず、完全な多糖消化を可能にせず、このことにより、ＦＡＣＥ分析において容易に決定される部分的に未消化のオリゴ糖鎖を生成する。
【００１５】
最後に、生合成経路により、すべての公知の天然ＣＳは、源に応じて比率は変化するとしても、ＧａｌＮＡｃの４位および６位においてモノ硫酸化された二糖の同時存在を示す（４−硫酸化二糖が３０％より低くなることはない。）。
【００１６】
上記で例証した通り、ＣＳは、抽出源に応じて可変の構造および特性を有する非常に複雑な異種巨大分子である。
【００１７】
さらに、特定の組織および種に関する生合成過程の結果として、異なる重合度を持つＣＳは、生合成されて、種々の分子量および多分散性を有する巨大分子を生成することができる。
【００１８】
これらの構造変動により、ならびに特定のオリゴ糖配列の存在する可能性および療法用途のためのまたは栄養補助食品中における調製物の純度に加えて、ＣＳは異なる特性および能力を有し得る。
【００１９】
実際に、ＣＳの構造に応じて異なるおよび固有の活性が報告されている［Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３，３０１５，２００２；Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１，９５５，１９９９；Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０，１３５９，１９９９；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４３，７，１９６８］。
【００２０】
天然抽出のＣＳは現在、多数の臨床研究の証拠およびメタ分析に基づいて、欧州リウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）により、欧州での変形性関節症治療用遅効性薬（ＳＹＳＡＤＯＡ）として、膝ＯＡ［Ｊｏｒｄａｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６２，１１４５，２００３］、腰［Ｊｏｒｄａｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６２，１１４５，２００３］および手［Ｚｈａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６６，３７７，２００７］の治療において推奨されている。
【００２１】
この上、ＣＳは、単独でまたは他の原料と組み合わせて、大部分は欧州および米国において、栄養補助食品として多く使用されている［ＭｃＡｌｉｎｄｏｎ  ＴＥ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ２８３，１４６９，２０００．Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌ  Ｍｅｔｈ  １，１９５，２００８．Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃ  １，２２，２００９］。
【００２２】
ＣＳの有効性は、厳密には、ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）等の分解酵素の活性を阻害する能力等、ＣＳの抗炎症活性に関する［Ｒｏｎｃａ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ６  Ｓｕｐｐｌ  Ａ，１４，１９９８．Ｅｇｅａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １８  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ２４，２０１０］。
【００２３】
医薬または栄養補助食品用途において世界中で使用されているＣＳは、ウシおよびブタ［Ｆｕｅｎｔｅｓ  ＥＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｆａｒｍ  Ｂｏｎａｅｒｅｎｓｅ  １７，１３５，１９９８］、鳥類［Ｌｕｏ  ＸＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ８１，１０８６−１０８９，２００２］、軟骨魚類［Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３９，８７１，１９９６．Ｌｉｇｎｏｔ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０３，２８１，２００３］等、数種の動物の組織からの抽出によって得られる。
【００２４】
しかし、これらの製品の動物起源は、ウシの海綿状脳症を引き起こす等の伝染性感染因子が潜在的にありがちな消費者の安全の問題のためまたは宗教的問題のため使用制限されてしまうものである。
【００２５】
加えて、これらの製品の抽出特性は、高まる需要および市場規模の増大を考慮すると、製品の供給を潜在的に信頼できないものにしている。
【００２６】
このような検討事項は、代替的でより信頼性のあるＣＳ源の探索を促進し、ＣＳ源の例は、科学および特許文献において記述されているように、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫ４莢膜多糖から出発する生物工学的生産である。
【００２７】
この文脈において、生物工学的生産という用語は、最終生成物の相当な部分が、微生物によって、または高等生物の単離細胞によって、一般におよび大まかに発酵と称される人工培養系で生成される生産方法を指す。
【００２８】
基本的には、これまでのところ当技術分野において３つの主なアプローチが使用されている。
【００２９】
第一のアプローチは、出発材料としてイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４のＫ４莢膜多糖を使用し、次いでこれを化学転換に供するＣＳに類似する化合物の生成であると同定することができるのに対し、第二のアプローチは、微生物によるＣＳに類似する化合物の直接的生合成であると思われ、第三のアプローチは、非硫酸化コンドロイチンの生合成生成、続いて化学的または生化学的硫酸化であると認識される。
【００３０】
ＥＰ−Ａ−１３０４３３８は、上記第一のアプローチに属しており、液体培地中で生成されたＫ４多糖から出発し、この多糖を最初に抽出および精製し、続いて再溶解し、酸加水分解に供するＣＳの生成について記述しており、この生成の主な効果は、線状ポリマー中に存在するＧｌｃＡ残基に連結されているフルクトース残基の除去である。二次的効果は、より低分子量の生成物につながる多糖鎖の部分加水分解である。続いて、非硫酸化コンドロイチンと同一である脱フルクトシル化したポリマーを、ＧａｌＮＡｃ残基のＣ−４またはＣ−６位において、４または６位における適切な保護基を使用する化学的手段によって様々に硫酸化する。また、該特許の中で、ＣＳが開示されており、このＣＳの含有量の少なくとも７０％がガラクトサミン部分の４および６位においてモノ−および／またはジ−硫酸化されているものからなり、グルクロン酸部分の２位が硫酸化されておらず、６から２５ｋＤａのＭｗおよび０．７から２．０のカルボキシル／硫酸基比（即ち電荷密度）を有する。
【００３１】
ＷＯ２００９／１４９１５５は、上記第二のアプローチを例示しており、細菌および真菌両方の数種の微生物によるＣＳに類似する化合物の直接生成について記述している。該特許の中で、ＣＳに類似する陸生化合物も開示されており、ガラクトサミン部分の４および６位両方が硫酸化されており、この化合物は、３００Ｄａから３５ｋＤａの分子量（Ｍｗ）および１未満から１超の範囲の４Ｓ／６Ｓ硫酸比を示すことが報告されている。
【００３２】
上記のアプローチの第三は、非硫酸化コンドロイチンの生成のための数種の異なる戦略を含み、この戦略の主なものは、例えばＥＰ−Ａ−１９５０３０８およびＥＰ−Ａ−１９６４９２４において開示されているような無細胞系におけるポリマーの酵素的合成であり、例えばＷＯ２００８／１３３３５０において記述されている、ＵＤＰ−ＧｌｃＡから生成することができる宿主中に、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ４から抽出される遺伝子ｋｆｏＡおよびｋｆｏＣを発現して得られる組み換え細胞の生合成である。
【００３３】
非硫酸化コンドロイチンの生合成の別の例は、Ｉｔａｌｉａｎ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩ２０１０Ａ００１３００によって開示されており、該特許は、とりわけ、好適な培地中で組み換え微生物、好ましくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ２３６４４を培養する段階と、微生物培養物中に存在する非硫酸化コンドロイチンを回収および精製する段階と、続いて、精製済みコンドロイチンを化学的に硫酸化する段階とを含むコンドロイチンの生物工学的生産のための方法に関する。
【００３４】
これまでに記述したＣＳの生成方法の一般的な特徴は、酸触媒によるフルクトース残基の脱離段階およびＧａｌＮＡｃ残基の硫酸化に必要な化学合成段階での、原材料の分子量の実質的な低減である。
【００３５】
例として、ＥＰ−Ａ−１３０４３３８は、６から２５ｋＤａ分子量のＣＳについて記述しているが、出発材料として使用されるＫ４多糖の分子量は、１５０から４００ｋＤａであることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】欧州特許第１３０４３３８号明細書
【特許文献２】国際公開第２００９／１４９１５５号
【特許文献３】欧州特許第１９５０３０８号明細書
【特許文献４】欧州特許第１９６４９２４号明細書
【特許文献５】国際公開第２００８／１３３３５０号
【特許文献６】伊国特許出願公開第ＭＩ２０１０Ａ００１３００号明細書
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６１，１２７１，２００９
【非特許文献２】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６，３１６８，２００７
【非特許文献３】Ｍｕｃｃｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４１，３７，２０００
【非特許文献４】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７７，１９，２０００
【非特許文献５】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３，３０１５，２００２
【非特許文献６】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１，９５５，１９９９
【非特許文献７】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０，１３５９，１９９９
【非特許文献８】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４３，７，１９６８
【非特許文献９】Ｊｏｒｄａｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６２，１１４５，２００３
【非特許文献１０】Ｚｈａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６６，３７７，２００７
【非特許文献１１】ＭｃＡｌｉｎｄｏｎ  ＴＥ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ２８３，１４６９，２０００
【非特許文献１２】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌ  Ｍｅｔｈ  １，１９５，２００８
【非特許文献１３】Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃ  １，２２，２００９
【非特許文献１４】Ｒｏｎｃａ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ６  Ｓｕｐｐｌ  Ａ，１４，１９９８
【非特許文献１５】Ｅｇｅａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １８  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ２４，２０１０
【非特許文献１６】Ｆｕｅｎｔｅｓ  ＥＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｆａｒｍ  Ｂｏｎａｅｒｅｎｓｅ  １７，１３５，１９９８
【非特許文献１７】Ｌｕｏ  ＸＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ８１，１０８６−１０８９，２００２
【非特許文献１８】Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３９，８７１，１９９６
【非特許文献１９】Ｌｉｇｎｏｔ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０３，２８１，２００３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明の第一の態様は、トリ−、テトラ−および２，４ジ−硫酸化二糖が含まれず、６０から９９％の６−硫酸、０．５から３０％の２，６−２硫酸、０．１から５％の４，６−２硫酸、０．１から５％の非硫酸化コンドロイチンおよび０．１から１％の４−硫酸からなるサメに類似するコンドロイチン硫酸であって、すべての百分率は、サメに類似するコンドロイチン硫酸の総二糖含有量に対して示すものであり、前記二糖は４０から８５ｋＤａの数平均分子量（Ｍｎ）および５０から９５ｋＤａの重量平均分子量（Ｍｗ）を示す、コンドロイチン硫酸である。
【００３９】
好ましくは、本発明のサメに類似するコンドロイチン硫酸は、７０から９０％の６−硫酸、８.５から２０％の２，６−２硫酸、０．１から５％の４，６−２硫酸、０．１から５％の非硫酸化コンドロイチンおよび０.１から１％の４−硫酸からなり、すべての百分率は、サメに類似するコンドロイチン硫酸の総二糖含有量に対して示すものであり、前記二糖は４０から６５ｋＤａの数平均分子量（Ｍｎ）および５０から７０ｋＤａの重量平均分子量（Ｍｗ）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ウシＣＳ、サメから抽出されたＣＳ、およびサメに類似するＣＳのヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）阻害率をインビトロ試験で比較検討した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明のＣＳ対象物は、高分子量によっておよび主として６位における固有の硫酸基によって、ならびにごく少ない量の４−硫酸化二糖によって特徴付けられる。
【００４２】
本発明のＣＳ対象物の特質を調べ、天然抽出のＣＳ試料に関する上記表１において示されている特質と比較すると、本発明のＣＳ対象物はサメＣＳとほぼ類似していることが分かる。
【００４３】
また、本発明のＣＳ対象物はいかなるポリ硫酸化二糖も示さず、特に、トリ−およびテトラ−硫酸化二糖のいずれも示さず、典型的には、先行技術において開示されている合成方法によって得られる検出可能なＣＳをコンドロイチナーゼＡＢＣによる消化後の未分解生成物として特徴付けられる。
【００４４】
さらに、本発明のＣＳ対象物は、高度に精製され（コンドロイチナーゼＡＢＣによる消化後の未分解生成物の量に基づき）、６から２５ｋＤａの分子量および多量の非硫酸化コンドロイチン（１０％超）および幅広い電荷密度（０．７から２）を有するＥＰ−Ａ−１３０４３３８において開示されているＣＳからは明白に区別されるという結果になるのに対し、本発明のＣＳ対象物の電荷密度の範囲はさらに狭く、好ましくは１．０５から１．３０に達する。
【００４５】
ＭｎおよびＭｗはいずれも、当業者に公知の一般的方法、例えば高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）に従って算出することができ、好ましくは、ＭｎおよびＭｗは、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）用の統合専門ソフトウェアを備えたＨＰＳＥＣによって決定され得る。
【００４６】
好ましくは、本発明のＣＳ対象物における２，６−２硫酸および４，６−２硫酸の和は、総二糖含有量の１０から２５％に達する。
【００４７】
別の態様によれば、本発明は、本発明のサメに類似するコンドロイチン硫酸と、例えば、微結晶性セルロース、デキストリン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリン、大豆レシチン、パルミトレイン酸、リポソーム、スクロース脂肪酸エステル等の医薬としてまたは栄養補助食品として許容される担体とを含む組成物に関する。
【００４８】
当業者であれば当分野の共通一般知識に基づいて理解できるように、本発明の組成物は、固体（例えば錠剤、硬カプセル剤、軟ゲルカプセル剤）または液体（例えば液剤または散剤混合物）いずれかの種々の形態で、好ましくは非経口および／もしくは経口医薬ならびに／または栄養補助調製物の形態で製剤化されてよく、他の不活性および／または活性成分をさらに含んでよい。
【００４９】
このようなさらなる原料の中でも、本発明の組成物は、下記の物質：グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ケラチン、デルマチン、メチルスルホニルメタン、フォレートもしくは還元フォレート、ビタミンＢ群、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）、アスコルビン酸またはアスコルビン酸マンガンの少なくとも１つを好ましくは含んでもよく、有効量で、この物質を必要とする対象に、必要性および状況に応じて臨機応変に投与してもよい。
【００５０】
単なる一例として、本発明のサメに類似するＣＳおよび／または組成物は、１００から３０００ｍｇ／日の量、好ましくは１０００から２０００ｍｇ／日の量、より好ましくは１２００から１８００ｍｇ／日の量で、概して１日当たり２／３回用量に分割して投与してもよい。
【００５１】
別の態様によれば、本発明は、変形性関節炎の予防もしくは治療において使用するため、または筋骨格系の健康の維持のための、例えば、薬物または食品添加物または栄養剤のいずれかにおける活性成分としての、本発明のサメに類似するコンドロイチン硫酸または組成物に関する。
【００５２】
単なる一例として、上記で定義された通りの本発明のサメに類似するＣＳまたは組成物は、腰、手および膝の変形性関節炎（ＯＡ）、ならびに疼痛、関節腫脹、炎症、アルツハイマー病、微生物感染、動脈硬化、骨粗しょう症等、ＯＡの主な症状の予防および／または治療用の医薬、食品添加物または栄養剤の調製のために、ならびにがん療法および神経組織再生を含む組織再生におけるアジュバントとして、使用するこができる。
【００５３】
さらに別の態様によれば、本発明は、上記で定義されたサメに類似するコンドロイチンを調製するための方法であって、
ａ）水性環境に予め溶解した遊離酸としての非硫酸化コンドロイチンを、テトラメチル−、テトラエチル−およびテトラブチル−アンモニウムまたはピリジニウムからなる群から選択される塩で塩化する段階と、
ｂ）段階ａ）によって生じた前記塩化された非硫酸化コンドロイチンを、５から１５％の水分含有量になるまで乾燥させる段階と、
ｃ）段階ｂ）によって生じた前記塩化された非硫酸化コンドロイチンを、１００℃から１７０℃の温度で、０．１から３％の水分含有量になるまで乾燥させる段階と、
ｄ）Ｎ−メチルピロリドンまたはジメチルホルムアミド中で可溶化した段階ｃ）によって生じた前記塩化された非硫酸化コンドロイチンの６位を、０℃から３０℃の温度で、１から２当量の三酸化硫黄ピリジン複合体または三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体を、合計２から１５当量の三酸化硫黄ピリジン複合体または三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体が添加されるまで１から３時間の時間間隔で添加することによって、選択的に硫酸化し、得られた溶液を２から２４時間撹拌させておく段階と、
ｅ）段階ｄ）において行われた反応を重炭酸または炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、得られた溶液を濾過および濃縮乾固して、乾燥固体を得る段階と、
ｆ）前記乾燥固体を塩化ナトリウム水溶液に溶解し、得られた溶液を限外濾過および透析する段階と、
ｇ）段階ｆ）によって生じた溶液から生成物を回収する段階と、
ｈ）段階ｇ）によって生じた生成物を精製し、前記生成物を酸性形態でまたはこのナトリウム塩としてのいずれかで得る段階と、
ｉ）段階ｈ）によって生じた前記生成物を回収する段階と
を含む方法に関する。
【００５４】
段階ａ）における非硫酸化コンドロイチンの塩化は、好ましくは、テトラメチル−、テトラエチル−およびテトラブチル−アンモニウムからなる群から選択される塩で、最も好ましくはテトラブチルアンモニウムで行われるのに対し、段階ｂ）における非硫酸化コンドロイチンの乾燥は、フリーズドライまたは噴霧乾燥によって行うことができる。
【００５５】
段階ｃ）における非硫酸化コンドロイチン塩の乾燥は、好ましくは、０．５から２％の水になるまで行われるのに対し、前記段階によって生じた非硫酸化コンドロイチン塩の可溶化は、好ましくはジメチルホルムアミド中で行われる。
【００５６】
段階ｄ）における選択的硫酸化は、好ましくは、合計６から１２当量、より好ましくは６から９当量の三酸化硫黄ピリジン複合体を添加して行われる。
【００５７】
代替として、段階ｄ）における選択的硫酸化が三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体によって行われる場合、合計１から９当量、好ましくは２から４当量が添加される。
【００５８】
さらに、段階ｄ）における選択的硫酸化は、好ましくは１０℃から２０℃の温度で行われるのに対し、段階ｄ）の終わりに、得られた溶液を好ましくは２から６時間撹拌させておく。
【００５９】
本発明の方法のさらに別の好ましい実施形態によれば、段階ｆ）によって生じた溶液からの生成物は、フリーズドライ、噴霧乾燥またはアルコール環境での沈殿によって回収される。
【００６０】
本発明の方法は、天然多糖の分子量を不変のまま維持することを可能にする。
【００６１】
驚いたことに、本発明の方法は、第二級ヒドロキシル基のいずれかを保護することを目的としたいかなる段階も行うことを回避させるが、これはおそらく、ＧａｌＮＡｃの６位における第一級ヒドロキシル基の反応性が、反応の選択性を保証するためであろう。
【００６２】
この上、本発明の方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−１３０４３８８について、硫酸化する段階が０．７から２．０に達するさらに幅広いカルボキシル／硫酸基比をもたらす場合、先行技術と比較して、実質的により高い生産性および生成物の品質のより良好な再現性を得ることを可能にする。
【００６３】
また、本発明の方法は、ごく少量の４−硫酸化二糖およびポリ硫酸化二糖を実質的に含まない生成物を得ることを可能にし、特に、本発明の方法は、ｔｒｉＳまたはｔｅｔｒａＳ糖のいずれも含まない生成物を得ることを可能にする。
【００６４】
典型的には、本発明の方法は、例えば、Ｍａｎｚｏｎｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８，３８３−６，１９９６）およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ（Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７７，１１７−２４，１９８８）によって記述されているように発酵によって得られたＫ４莢膜ポリマーを脱フルクトシル化することによって調製された、遊離酸またはナトリウム塩としての非硫酸化コンドロイチンを、水性環境に溶解することによって行うことができる。
【００６５】
非硫酸化コンドロイチンがナトリウム塩の形態である事例において、この塩の完全溶解後に、得られた溶液を、好都合には０℃から３０℃の温度で、カチオン交換樹脂（例えば、アンバージェット（Ａｍｂｅｒｊｅｔ）１２００Ｈ、ローム（Ｒｏｈｍ）およびハース（Ｈａａｓ）等）を含有するカラム中で溶離し、溶離分を好都合には１．５から４．０のｐＨ、好ましくは１．５から３．０のｐＨで収集し、含水酸性分を回収する。
【００６６】
代替として、この段階は、バッチで行われ得る：好ましくは０℃から３０℃で２０から６０分間撹拌することによって得られる非硫酸化コンドロイチンナトリウム塩の水中への溶解後、カチオン樹脂（アンバージェット１２００Ｈ、ロームおよびハース等）をこの水溶液に添加し、樹脂添加後の溶液のｐＨは、１．５から３．０の間という結果になる。次いで、溶液を濾過し、得られた酸性濾液を収集する。
【００６７】
連続してまたはバッチでのいずれかで、遊離酸としての非硫酸化コンドロイチンを直接溶解するか、または上述した通りの該コンドロイチンのナトリウム塩溶液を精製するか、いずれかで得られた非硫酸化コンドロイチンの酸溶液に、次いで、テトラメチル−、テトラエチル−およびテトラブチル−アンモニウムまたはピリジニウムからなる群から選択されるイオンの水溶液を、好都合には６．０から８．０のｐＨ、好ましくは６．から７．０のｐＨになるまで添加し、例えばフリーズドライまたは噴霧乾燥によって５から１５％の水分含有量になるまで溶液を蒸発乾固させて、対応するコンドロイチン塩を回収する。
【００６８】
得られたコンドロイチン塩を、次いで、１００℃から１７０℃の温度で、０．１から３％の水分含有量になるまで第二の乾燥段階に供して、対応する非硫酸化コンドロイチン塩を最終的に回収する。
【００６９】
次いで、上述したように得られた対応する非硫酸化コンドロイチン塩を、６位において、官能部分のいずれも保護する必要なく、０℃から３０℃の温度  、好ましくは１０℃から２０℃の温度でＮ−メチルピロリドンまたはジメチルホルムアミドから選択される溶媒中で可溶化することによって、好都合には、１から２当量の三酸化硫黄ピリジン複合体または三酸化硫黄ジメチルホルムアミド複合体を、合計２から１５当量のピリジンまたはジメチルホルムアミド三酸化硫黄複合体が添加されるまで１から３時間の時間間隔で添加することにより、完全に溶解した非硫酸化コンドロイチン塩を、カチオン交換樹脂（例えば、アンバージェット１２００Ｈ、ロームおよびハース等）を含有するカラム中で溶離することによって、選択的に硫酸化し、得られた溶液を２から２４時間、好ましくは２から６時間撹拌させておく。
【００７０】
得られた反応塊を、この後、重炭酸または炭酸ナトリウム水溶液中でクエンチし、次いで、例えば重炭酸ナトリウムでの処理および得られた不溶性塩の濾過によって回収し、蒸発乾固させ、再度塩化ナトリウム水溶液に溶解し、回収し、最後に、例えば限外濾過および透析によって処理して残りの塩および低分子量不純物を除去し、最後に、例えばフリーズドライ、噴霧乾燥またはアルコール環境での沈殿によって生成物を回収する。
【００７１】
次いで、上記で例証した通りに得た、得られたコンドロイチン６−硫酸を、例えばカチオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーによって精製して酸形態で得、ことによると、続いて例えば水酸化ナトリウムを添加することによってコンドロイチン６−硫酸のナトリウム塩として得られる。
【００７２】
このようにして得られたコンドロイチン６−硫酸を、最終的に、例えばオーブン内、真空下、５０℃から７０℃で乾燥させることによって回収し、またはクロマトグラフィで精製し、トリ−、テトラ−および２，４ジ−硫酸化二糖が含まれず、４０から８５ｋＤａのＭｎ、５０から９５ｋＤａのＭｗを示す、サメに類似するコンドロイチン硫酸を得る。
【実施例】
【００７３】
下記の例は、本発明を例証するものである。
【００７４】
［実施例１］
塩化
Ｍａｎｚｏｎｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８，３８３−６，１９９６）およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ（Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７７，１１７−２４，１９９８）によって記述されているような発酵によって得られたＫ４莢膜ポリマーを脱フルクトシル化することによって調製した、２０ｇのコンドロイチンナトリウム塩を、脱塩水（５００ｍｌ）に溶解した。完全溶解後、得られた溶液を、予め水和させ酸形態で調製したカチオン交換樹脂（１６０ｍｌのアンバージェット１２００Ｈ、ロームおよびハース）を含有するカラム中、５℃で溶離した。溶離分を１．９のｐＨで回収し、含水酸性分を収集し、これにテトラブチルアンモニウムの１６％水溶液を７．０のｐＨになるまで添加し、次いで溶液をフリーズドライによって蒸発乾固させて、２０．８ｇのコンドロイチンをテトラブチルアンモニウム塩として回収した。
【００７５】
次いで、得られた塩を残留湿度が０．２％未満になるまで、静電乾燥機内、１０５℃で４時間、真空下での第二の熱処理に供した。このようにして、１８．５ｇのコンドロイチンをテトラブチルアンモニウム塩として得た。
【００７６】
［実施例２］
塩化
Ｍａｎｚｏｎｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８，３８３−６，１９９６）およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ（Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７７，１１７−２４，１９９８）によって記述されているような発酵によって得られたＫ４莢膜ポリマーを脱フルクトシル化することによって調製した１２ｇの非硫酸化コンドロイチンを、２０ｍｌの脱塩水に溶解し、１Ｍ  ＨＣｌによってｐＨ２．５まで酸性化した後、８０ｍｌのエタノールを添加し、非硫酸化コンドロイチンが遊離酸として沈殿した。
【００７７】
濾過し、エタノールで洗浄した後、１０．３ｇの生成物を白色固体として得、これを真空下５０℃で乾燥させた後、該固体は、生成物自体について算出された９０％の酸滴定量を示し、８％の残留水を含有していた。
【００７８】
得られた固体を２０ｍｌの水に懸濁し、テトラブチルアンモニウム水酸化物の４０％ｗ／ｗ水溶液をｐＨ８になるまで添加した。次いで、得られた溶液を２．５％の残留水になるまでフリーズドライさせて、１５．９ｇの固体コンドロイチンをテトラブチルアンモニウム塩として得た。
【００７９】
次いで、得られた塩を、残留湿度が０．２％未満になるまで静電乾燥機内、１０５℃で４時間、真空下での第二の熱処理に供した。このようにして、１５．４ｇのテトラブチルコンドロイチンを得た。
【００８０】
［実施例３］
硫酸化
実施例１において例証したように得られた１．４ｇのテトラブチルコンドロイチンおよび８４ｍｌのＤＭＦを、不活性雰囲気（Ｎ２）下、機械的に撹拌しながら、泡冷却システム、塩化カルシウムトラップおよび温度計を備えた２５０ｍｌの四口フラスコに投入した。
【００８１】
得られた懸濁液を完全溶解するまで撹拌させておき、続いて温度を２３℃に調整した。
【００８２】
温度が調整されたら、固体の三酸化硫黄ピリジン複合体を小分けにして（１．０７ｇ、３当量）溶液に添加し、反応液を１時間撹拌し続け、次いでさらなる固体の三酸化硫黄ピリジン複合体（１．０７ｇ、３当量）を添加した。同じ温度でさらに１時間撹拌した後、反応混合物を、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液を含有する５００ｍｌのフラスコに移し、１０℃で冷却した。
【００８３】
温度を２０℃まで上昇させた後、ブフナー上での濾過を行い、濾液を回収し、これを真空下で蒸発乾固させた。
【００８４】
得られた乾燥固体（２．３ｇ）を微粉砕し、０．３ＭのＮａＣｌ溶液（１３０ｍｌ）に再溶解し、このようにして得た溶液を、３ｋＤａカットオフ膜を使用する限外濾過に供し、保持液のｐＨを７．０に維持した。次いで、限外濾過した溶液を、塩を除去するために透析し、生成物を凍結乾燥によって回収した。
【００８５】
得られた生成物を、最終的に５０℃および１０ｍｂａｒで１ｇの物質が得られるまで乾燥させ、９５％の滴定量（グルクロン酸−パルスアンペロメトリック検出「ＰＡＤ」を決定することによって算出された。）を示し、ＧＰＣ用の統合専門ソフトウェアを備えた高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって測定して６０ｋＤａのＭｎおよび６７．３ｋＤａのＭｗを示した。
【００８６】
［実施例４］
硫酸化
実施例１において例証したように得られたテトラブチルアンモニウム塩としての１．２１ｇのコンドロイチンおよび７２ｍｌのＤＭＦを、不活性雰囲気（Ｎ２）下、機械的に撹拌しながら、泡冷却システム、塩化カルシウムトラップおよび温度計を備えた２５０ｍｌの四口フラスコに投入した。
【００８７】
得られた懸濁液を完全溶解するまで撹拌させておき、続いて温度を１０℃に調整した。
【００８８】
温度が調整されたら、固体三酸化硫黄ＤＭＦ複合体（０．８８ｇ、３当量）を溶液に添加し、反応物を１時間撹拌し続けた。炭酸水素ナトリウム（０．９７ｇ、６当量）を同じ温度に保ちながら添加し、撹拌を１時間続けて、温度を２０℃まで上昇させた。得られた懸濁液をブフナー上で濾過し、回収された濾液を真空下で蒸発乾固させた。
【００８９】
得られた乾燥固体（２．０５ｇ）を微粉砕し、０．３ＭのＮａＣｌ溶液（１３０ｍｌ）に再溶解し、このようにして得られた溶液を、３ｋＤａカットオフ膜を使用する限外濾過に供し、保持液のｐＨを７．０に維持した。次いで、限外濾過した溶液を、塩を除去するために透析し、生成物を凍結乾燥によって回収した。
【００９０】
得られた生成物を、最終的に、５０℃および１０ｍｂａｒで０．９５ｇの物質が得られるまで乾燥させ、得られた生成物が９４％の滴定量（グルクロン酸−ＰＡＤを決定することによって算出された。）を示し、ＧＰＣ用の統合専門ソフトウェアを備えた高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって測定して、６２ｋＤａのＭｎおよび６８．３ｋＤａのＭｗを示した。
【００９１】
［実施例５］
コンドロイチン６−硫酸の分析
実施例３および４から得られたＣＳの組成物を、Ｊｏｏｎ−Ｓｏｏ  Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，２００５  ｖｏｌ．８１８，ｐａｇｅｓ１３３−１３９）によって開示されている方法に従い、上述したように得られたＣＳをコンドロイチナーゼＡＢＣで処理することによって、該組成物の消化生成物のＨＰＬＣで検討した。
【００９２】
分析は、カラムＨＰＬＣ−ＳＡＸ、２５０×４．６ｍｍ  １０μｍを使用することにより、３．５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ＝３．５）（１００％）初期位相から出発し、ＨＣｌ３．５ｍＭ中１Ｍ  ＮａＣｌと等しい濃度（ｐＨ＝３．５）（１００％）までの勾配で溶離して行った。
【００９３】
未消化の多糖の存在を指摘するために、コンドロイチナーゼＡＢＣによる消化によって生じた同じ生成物をＦＡＣＥ（フルオロフォア団補助炭水化物電気泳動法）分析において分析した。結果は、９５％を上回る消化率を示す。高い消化率は、得らされたＣＳの構造におけるトリ−および／またはテトラ−硫酸化二糖の実質的な非存在を指示している。
【００９４】
下記の表２は、実施例３および実施例４で調製された生成物について同定された主な二糖を示す。
【００９５】
【表２】
0005770367.tif 000004
上記の表を表１と比較することにより、本発明のＣＳ対象物の組成物はサメＣＳと密接に関係していることを示し、これは本発明のＣＳ対象物がごく少量のＤｉ−４Ｓを示し、大部分がＤｉ−６Ｓで構成されるのに対し、Ｄｉ−０Ｓ、Ｄｉ−２，６ｄｉＳおよびＤｉ−４，６ｄｉＳはサメＣＳについて報告されている値とほぼ重ねることができるという結果になったためであることが分かり、さらに本発明のＣＳ対象物は、１．０よりも大きい電荷密度を示した。また、実施例３および実施例４の両方を行って得らされた生成物は、ＣＳのｔｒｉＳまたはｔｅｔｒａＳ形態のいずれも示さなかった。
【００９６】
この上、本発明のＣＳ対象物は、下記の表３において例証する通り、先行技術において開示されている生成物の幾つかと比較して固有の硫酸含有量を示す。
【００９７】
【表３】
0005770367.tif 000005
【００９８】
［実施例６］
ＣＳの有効性は、厳密には、ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）等の分解酵素の活性を阻害する能力等、ＣＳの抗炎症活性に関するものであるため、本発明のＣＳ対象物を、ＨＬＥのこのような活性を阻害する能力についてインビトロで試験し、ウシＣＳ（ヨーロッパ薬局方初版ＣＳ標準）およびサメ軟骨試料から抽出されたＣＳと比較した。
【００９９】
比較結果を図１に示す。
【０１００】
実施例３において記述した手順に従って得られるように本発明によるサメに類似するＣＳの試料の試料を、バイオイベリカ（Ｂｉｏｉｂｅｒｉｃａ）によって販売されているウシＣＳ（ヨーロッパ薬局方初版ＣＳ標準）およびサメ軟骨から抽出されたＣＳと比較した。
【０１０１】
エラスターゼ活性は、ＨＬＥに特異的な発色人工基質（Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド）を使用することによる分光光度アッセイによって決定した。ＣＳの量を増大させながらの酵素のプレインキュベーション後、発色基質（Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド）とのインキュベーションによって活性を決定した。反応を停止させた後、得られた生成物を分光光度評価によって定量的に決定した。
【０１０２】
【表４】
0005770367.tif 000006
図１は、表４において報告されているデータを例証するものであり、本発明のサメに類似するＣＳは、天然ＣＳ試料によって示されるものに匹敵する有効な様式で、ヒト白血球エラスターゼ活性を有意義に阻害することができることを示す。
【０１０３】
本発明のＣＳ対象物によりインビトロで示される生物学的活性および抗炎症特性は、本発明のＣＳ対象物を天然生成物に匹敵するものにし、従って、医薬調製物および栄養補助食品における薬物として潜在的に有用なものにする。
【図１】
0005770367.tif 000007