(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物１（［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソブチル］アミノ］−３−メチルブチルボロン酸）、またはその薬学的に許容されるボロン酸エステルの形態を含む、対象のボルテゾミブ耐性多発性骨髄腫を治療するための組成物であって、ボルテゾミブまたはその薬学的に許容可能なボロン酸エステルの形態と併用投与されるものである、組成物。
【請求項２】
前記ボルテゾミブは薬学的に許容可能なボロン酸エステルの形態として投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ボルテゾミブは静脈内投与されるものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ボルテゾミブは経口投与されるものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ボルテゾミブは０．５ｍｇ／ｍ２〜２ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ボルテゾミブは０．７ｍｇ／ｍ２〜１．３ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与されるものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ボルテゾミブを３〜７日毎に２〜４週間投与した後、前記ボルテゾミブを投与しない７〜２１日間の休薬期間を設ける、計画された投与サイクルに従って前記ボルテゾミブが投与されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ボルテゾミブを２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従って前記ボルテゾミブが投与されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ボルテゾミブを２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従って前記ボルテゾミブが投与されるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記計画されたサイクルを少なくとも１回繰り返す、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物１は薬学的に許容可能なボロン酸エステルの形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物１は、化合物１の薬学的に許容されるエステルの形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は静脈内投与されるものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は経口投与されるものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は０．５ｍｇ／ｍ２〜５ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与されるものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は１ｍｇ／ｍ２〜３ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与されるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物を３〜１４日毎に２〜４週間投与した後、前記組成物を投与しない７〜２１日間の休薬期間を設ける、計画された投与サイクルに従って前記組成物が投与されるものである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物を２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従って前記組成物が投与されるものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物を２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従って前記組成物が投与されるものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物を２１日サイクルの１日目と１５日目に投与する、計画された投与サイクルに従って前記組成物が投与されるものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物を２８日サイクルの１日目と１５日目に投与する、計画された投与サイクルに従って前記組成物が投与されるものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ボルテゾミブが２１日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与され、前記組成物が前記２１日サイクルの３日目、８日目および１２日目に投与されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ボルテゾミブが２８日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与され、前記組成物が前記２８日サイクルの３日目、８日目および１２日目に投与されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が２１日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与され、ボルテゾミブが前記２１日サイクルの３日目、８日目、および１２日目に投与されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が２８日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与され、ボルテゾミブが前記２８日サイクルの３日目、８日目、および１２日目に投与されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
多発性骨髄腫の多剤併用療法。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（ＭＭ）、即ち形質細胞新生物は、血液悪性腫瘍全体の約１０％を構成する（１）。プロテアソーム阻害剤（ＰＩ）であるボルテゾミブのＭＭにおける臨床成果により、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）が薬物開発の有力な標的となることが証明された（２）。プロテアソームは、ミスフォールドし損傷したタンパク質ならびに細胞内シグナル伝達中間体の分解を担う、複数のサブユニットからなるタンパク質複合体である（３）。シグナル伝達経路の調節異常のため、新生物細胞はＵＰＳに大きく依存し、従ってプロテアソーム阻害に対する感受性が特に高い（４）。プロテアソーム阻害後のＭＭ細胞のアポトーシスは、生存促進性ＮＦ−κＢシグナル伝達のダウンレギュレーション、血管新生の阻害、ミスフォールドしたタンパク質によるストレス応答の活性化、内因性および外因性細胞死経路の誘導、ならびに骨髄間質細胞へのＭＭ細胞の接着の阻害を含む複数の機構によって起こる（５−８）。
【０００３】
臨床開発における最初のＰＩであるボルテゾミブ（ＰＳ−３４１または［（１Ｒ）−３−メチル−１−（｛（２Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン−２−イルカルボニル）アミノ］プロパノイル｝アミノ）ブチル］ボロン酸としても知られる）は、再発ＭＭにおける２つの単剤第ＩＩ相臨床試験の成功後、２００３年にＦＤＡによって認可された（９、１０）。ボルテゾミブは他剤と併用した場合でも顕著な活性を示す。前臨床試験において、中毒量未満の（ｓｕｂｔｏｘｉｃ）濃度のボルテゾミブは、メルファラン、ドキソルビシン、またはミトキサントロンを含む化学療法薬に対するＭＭ細胞の耐性を克服した（１１−１３）。さらに、ボルテゾミブは、レナリドミド、三酸化二ヒ素、およびヒストン脱アセチル化酵素またはＰＫＣの阻害剤、ならびに第２世代のＰＩを含む新規なＭＭ治療薬の活性を相乗的に増強する（１４−８）。ボルテゾミブをベースにする併用療法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで相乗作用が認められたが、それを試験する臨床試験においてｉｎ  ｖｉｖｏでも高い有効性が認められた。ボルテゾミブ（Ｖ）を加えた場合または加えない場合のメルファランとプレドニゾンの併用（ＭＰ）を評価する第ＩＩＩ相ＶＩＳＴＡ臨床試験において、ＭＰ療法では３年全生存率が５９％であったのに対し、ＶＭＰでは３年全生存率が７２％という結果が得られた（Ｐ＝０．００３）（１９）。特に、投与計画にボルテゾミブを加えると、場合によっては、奏功しなかった治療薬に対して患者が再び感受性を示すことがある。例えば、第ＩＩ相臨床試験において、メルファランで治療した後に再発したＭＭ患者の６０％は、その後、ボルテゾミブ／メルファラン併用療法に反応した（２０）。同様に、ボルテゾミブをサリドマイドおよびデキサメタゾンと併用すると、再発ＭＭ患者集団（その７３％はサリドマイドによる治療歴があった）において６３％の全奏功率が得られた（２１）。
【０００４】
ボルテゾミブの認可によってＭＭの治療が変化したが、かなりの割合の患者がボルテゾミブ療法に反応しない。最近の研究結果から、プロテアソームの発現や活性レベルの差により、ＰＩでの治療に対するＭＭ腫瘍の感受性が異なり得ることが示唆された（２２）。さらに、最初はボルテゾミブに反応した患者でも、ほぼ確実に再発が起こる。薬物耐性癌幹細胞の小集団が寛解後のＭＭの再発の原因となっている可能性があることを示唆する証拠が増加している（２３−２６）。これらの細胞は、正常な記憶Ｂ細胞の表面抗原特性を発現し、形質細胞マーカーＣＤ１３８が欠損し、抗体を分泌しない（２４）。さらに、一般的に使用されている抗骨髄腫薬（例えば、デキサメタゾン、レナリドミド、シクロホスファミド）で攻撃した場合、ＣＤ１３８陰性幹細胞集団は、残りの悪性細胞集団より高い薬物耐性を示す（２４）。単剤のボルテゾミブは、例えば、多量の免疫グロブリンを産生するＭＭ細胞に対して活性を有するが、ＣＤ１３８陰性ＭＭ細胞の増殖に対してはほとんど効果がない（２４）。これらのデータから、癌幹細胞、ならびに腫瘍集団内の残りの悪性形質細胞サブタイプを標的とする新規なＭＭ療法が必要とされていることが明らかである。
【０００５】
新規で、より強力な、またはより忍容性の高いＰＩの探求の結果、化合物１（［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソブチル］アミノ］−３−メチルブチルボロン酸としても知られる；Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉら、米国特許出願公開第２００５／０１０７３０７号明細書）が合成された。ボルテゾミブと同様に、化合物１はペプチドボロン酸の部類の可逆性ＰＩである（２８）。静脈内（ＩＶ）ボーラス投与されるボルテゾミブとは対照的に、化合物１は、前臨床試験で経口製剤として活性を有している（２８、２９）。さらに、化合物１は、ボルテゾミブと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの初代培養ＭＭ形質細胞とｉｎ  ｖｉｖｏのＲＰＭＩ８２２６ＭＭ異種移植片の両方で、同様のまたはより優れた単剤抗腫瘍活性を示す（２９）。化合物１は、次の化学構造を有する：
【化１】
0005665862.tif 000002
【０００６】
多発性骨髄腫患者に最良の長期結果をもたらし得る治療選択肢が依然として必要とされている。とりわけ、再発または難治性疾患を有する患者に対する新規な療法が緊急に必要とされている。本明細書で研究が開示されるまで、化合物１とボルテゾミブまたはメルファランとの併用療法は研究されなかった。これらの併用療法は、再発または難治性疾患を有する患者を含む、ＭＭ患者に魅力的な治療選択肢を提供する。
引用される参照文献は全て、参照により本明細書に援用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】  Ｂｌｏｏｄ（ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）２００８，１１２，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ８４３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
化合物１で対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。一実施形態では、対象に化合物１とボルテゾミブを併用投与する。好ましくは、ボルテゾミブをプロドラッグとして投与する。好ましくは、ボルテゾミブを静脈内投与または経口投与する。
【０００９】
好ましくは、ボルテゾミブを約０．５ｍｇ／ｍ２〜約２ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与する。好ましくは、ボルテゾミブを約０．７ｍｇ／ｍ２〜約１．３ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与する。
【００１０】
好ましくは、ボルテゾミブを３〜７日毎に２〜４週間投与した後、ボルテゾミブを投与しない約７〜２１日間の休薬期間を設ける、計画された投与サイクルに従ってボルテゾミブを投与する。好ましくは、ボルテゾミブを２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従ってボルテゾミブを投与する。好ましくは、ボルテゾミブを２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従ってボルテゾミブを投与する。好ましくは、計画されたサイクルを少なくとも１回繰り返す。
【００１１】
別の実施形態では、対象に化合物１とメルファランを併用投与する。好ましくは、メルファランをプロドラッグとして投与する。好ましくは、メルファランを経口投与または静脈内投与する。
【００１２】
好ましくは、メルファランを約０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与する。好ましくは、メルファランを約０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与する。
【００１３】
好ましくは、メルファランを３〜７日毎に１〜２週間投与した後、メルファランを投与しない約４〜６週間の休薬期間を設ける、計画された投与サイクルに従ってメルファランを投与する。好ましくは、メルファランを１日１回、約４〜約７日間投与した後、約４〜６週間の休薬期間を設ける、計画された投与サイクルに従ってメルファランを投与する。好ましくは、メルファランを１日１回、約４〜約５日間投与した後、約４〜６週間の休薬期間を設ける、計画された投与サイクルに従ってメルファランを投与する。好ましくは、計画されたサイクルを少なくとも１回繰り返す。
【００１４】
好ましくは、化合物１をプロドラッグとして投与する。好ましくは、化合物１のプロドラッグは、化合物１の薬学的に許容されるエステルの形態である。好ましくは、化合物１を静脈内投与または経口投与する。
【００１５】
好ましくは、化合物１を約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与する。好ましくは、化合物１を約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与する。好ましくは、化合物１を３〜１４日毎に２〜４週間投与した後、化合物１を投与しない約７〜２１日間の休薬期間を設ける、計画された投与サイクルに従って化合物１を投与する。
【００１６】
好ましくは、化合物１を２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従って化合物１を投与する。好ましくは、化合物１を、２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与する、計画された投与サイクルに従って化合物１を投与する。好ましくは、化合物１を２１日サイクルの１日目と１５日目に投与する、計画された投与サイクルに従って化合物１を投与する。好ましくは、化合物１を２８日サイクルの１日目と１５日目に投与する、計画された投与サイクルに従って化合物１を投与する。好ましくは、計画されたサイクルを少なくとも１回繰り返す。
【００１７】
好ましくは、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与し、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの３日目、８日目、および１２日目に投与する。好ましくは、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与し、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの３日目、８日目、および１２日目に投与する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】化合物１は、単剤の場合または他の抗ＭＭ治療薬と併用した場合、ＭＭ細胞株の生存率を低下させることを示す図である。Ａ，ＭＭ１Ｓ（三角形）およびＲＰＭＩ８２２６（正方形）を、表示した濃度の化合物１と共に４８時間インキュベートした後、その生存率をＭＴＳアッセイで評価した。Ｂ，ＭＭ１Ｓ細胞を溶媒対照（黒色の棒グラフ）、表示した濃度の化合物１（白色の棒グラフ）、ボルテゾミブ（縞模様の棒グラフ）、または両方の薬剤（線影の付いた棒グラフ）で４８時間処置し、生存率をＭＴＳアッセイで定量化した。Ｃ，ＲＰＭＩ８２２６細胞を溶媒対照（黒色の棒グラフ）、メルファラン（４０μＭ）（白色の棒グラフ）、化合物１（表示した濃度）（縞模様の棒グラフ）、または両方の薬剤（線影の付いた棒グラフ）で４８時間処置し、生存率をＭＴＳアッセイで定量化した。グラフ化したデータは、６つの反復試験を使用した平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。ＢおよびＣでは、線影の付いた棒グラフの上に併用指数（ＣＩ）を示す。０．９未満のＣＩ値は相乗作用を示し；０．９〜１．１のＣＩ値は相加作用を示し、１．１超のＣＩ値は拮抗作用を示す。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】化合物１は、単独の場合またはボルテゾミブと併用した場合、正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生存率を低下させないことを示す図である。Ａ，健常被験者から採取したＰＢＭＣを溶媒対照（黒色の棒グラフ）、化合物１単独（３．０ｎＭ）（白色の棒グラフ）、ボルテゾミブ単独（表示した濃度）（縞模様の棒グラフ）、または化合物１（３．０ｎＭ）＋ボルテゾミブ（表示した濃度）（線影の付いた棒グラフ）と共に４８時間インキュベートした後、細胞生存率をＭＴＳアッセイで測定した。Ｂ，Ａと同じ被験者から採取したＰＢＭＣを溶媒対照（黒色の棒グラフ）、ボルテゾミブ単独（３．０ｎＭ）（白色の棒グラフ）、化合物１単独（表示した濃度）（縞模様の棒グラフ）、または化合物１（表示した濃度）＋ボルテゾミブ（３．０ｎＭ）（線影の付いた棒グラフ）と共にインキュベートした後、細胞生存率をＭＴＳアッセイを使用して測定した。Ｃ，別の被験者から採取したＰＢＭＣを溶媒対照（黒色の棒グラフ）、化合物１単独（３．０ｎＭ）（白色の棒グラフ）、ボルテゾミブ単独（表示した濃度）（縞模様の棒グラフ）、または化合物１（３．０ｎＭ）＋ボルテゾミブ（表示した濃度）（線影の付いた棒グラフ）と共に４８時間インキュベートした後、細胞生存率をＭＴＳアッセイで測定した。Ｄ，３人の健常被験者から採取したＰＢＭＣを様々な濃度の化合物１と共に４８時間インキュベートした後、細胞生存率をＭＴＳアッセイで測定した。各グラフ（Ａ−Ｄ）は３つの独立した実験を表す。
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】化合物１をボルテゾミブと併用すると、ＭＭ細胞のアポトーシスが誘導されることを示す図である。ＲＰＭＩ８２２６細胞を（Ａ）溶媒対照、（Ｂ）化合物１（２．５ｎＭ）、（Ｃ）ボルテゾミブ（２．５ｎＭ）、または（Ｄ）化合物１（２．５ｎＭ）＋ボルテゾミブ（２．５ｎＭ）と共に３０時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰｒＩ）およびアネキシンＶに関して陽性の染色率を、フローサイトメトリー分析を使用して定量化した。初期アポトーシスの細胞は、ＰｒＩ陰性、アネキシンＶ陽性である。
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】化合物１がヒトＭＭ腫瘍の増殖を阻害することを示す図である。Ａ，Ｂ，１４日目から、ヒトＬＡＧκ−１Ａ腫瘍を有するマウスに溶媒対照または表示された用量の化合物１をＩＶ投与によりまたは強制経口投与により試験期間中週２回投与した。その後毎週、血清ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）濃度をＥＬＩＳＡで評価し（Ａ）、腫瘍体積をカリパスで測定した（Ｂ）。Ｃ，２１日目から、ヒトＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍を有するマウスを試験期間中週２回、溶媒対照または表示した濃度の化合物１で処置し、腫瘍体積を毎週評価した。データは、１群当たりマウス７〜８匹の平均値±平均値の標準誤差として表す。
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】化合物１をボルテゾミブまたはメルファランと併用すると、骨髄腫腫瘍の増殖が著しく阻害されることを示す図である。Ａ，Ｂ，化合物１をボルテゾミブと併用すると、ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍の増殖が防止される。７日目から、ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍を有するマウスを週２回、溶媒対照、化合物１単独（１ｍｇ／ｋｇ）、ボルテゾミブ単独（０．５ｍｇ／ｋｇ）、または化合物１（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）＋ボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）で処置した。その後毎週、血清ヒトＩｇＧ濃度（Ａ）および腫瘍体積（Ｂ）を測定した。Ｃ，化合物１をボルテゾミブと併用すると、ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍体積の進行が１００％遅延される。７日目から、ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍を有するマウスを週２回、溶媒対照、化合物１単独（１ｍｇ／ｋｇ）、ボルテゾミブ単独（０．５ｍｇ／ｋｇ）、または化合物１（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）＋ボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）で処置した。その後毎週、腫瘍体積を測定した。Ｄ，Ｅ，化合物１をメルファランと併用すると、ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍の増殖が阻害される。７日目から、ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍を有するマウスを溶媒対照で週２回、化合物１単独で週２回（１ｍｇ／ｋｇ）、メルファラン単独で毎週（１ｍｇ／ｋｇ）、または週２回化合物１（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）＋毎週メルファラン（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）で処置した。その後毎週、血清ヒトＩｇＧ濃度（Ｄ）および腫瘍体積（Ｅ）を測定した。Ｆ，化合物１をメルファランと併用すると、いずれかの薬剤を単独で使用した場合より、ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍体積の減少が大きかった。７日目から、ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍を有するマウスを溶媒対照で週２回、化合物１単独で週２回（１ｍｇ／ｋｇ）、メルファラン単独で毎週（３ｍｇ／ｋｇ）、または週２回化合物１（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）＋毎週メルファラン（３ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）で処置した。その後毎週、腫瘍体積を測定した。Ａ〜Ｆのデータは、１群当たりマウス７〜８匹の平均値±平均値の標準誤差として表す。
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】化合物１およびボルテゾミブで処置したＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍が、アポトーシスマーカーであるアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の発現の増加を示すことを示す図である。ＬＡＧκ−１Ｂを有するマウスを溶媒対照（Ａ）、化合物１（１ｍｇ／ｋｇ）単独（Ｂ）、ボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ）単独（Ｃ）、または両方の薬剤（Ｄ）で処置した後、そのマウスから切除した腫瘍を薄切し、ＡＩＦを測定するために染色した。Ｅ〜Ｈ，アイソタイプ対照でのＡ〜Ｄと同じ腫瘍から得られた染色された切片。スライドガラスは同時に染色した。
【図７】経口化合物１がヒトＭＭ腫瘍の増殖を阻害することを示す図である。腫瘍体積の大きさに対する経口投与化合物１の効果。
【図８】経口化合物１がヒトＭＭ腫瘍の増殖を阻害することを示す図である。ＩｇＧ濃度に対する経口投与化合物１の効果。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
量および持続時間等の測定可能な値に言及する場合、本明細書で使用する「約」という用語は、特定の値から±１０％の偏差を包含することを意味する。例えば、「約５０％」という句は、５０の±１０％、即ち、４５％〜５５％を含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、温血動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物を含む。好ましい実施形態では、対象は霊長類である。さらにより好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００２１】
対象の多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。一実施形態では、対象に化合物１とボルテゾミブを併用投与する。化合物１とボルテゾミブを併用する本発明の多発性骨髄腫の治療方法は、多発性骨髄腫の治療効果を相乗的に高めることが分かった。化合物１とボルテゾミブは両方とも、外因性および内因性アポトーシスシグナル伝達経路の活性化により細胞死を誘導する可逆的ボロン酸プロテアソーム阻害剤である（７、２９）ため、これは意外である。さらに、薬剤は両方とも主に、プロテアソームのキモトリプシン様触媒活性を標的とし、カスパーゼ様活性をあまり阻害せず、トリプシン様活性をほとんど阻害しない（２９、３４）。従って、化合物１とボルテゾミブは、類似の作用機構を有するものと思われる。さらに、これらの化合物の化学構造は非常に類似している。
【００２２】
ボルテゾミブ（［（１Ｒ）−３−メチル−１−（｛（２Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン−２−イルカルボニル）アミノ］プロパノイル｝アミノ）ブチル］ボロン酸；Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによりＶｅｌｃａｄｅ（登録商標）の商標名で販売）は、次の化学構造を有する：
【化２】
0005665862.tif 000003
【００２３】
従って、化合物１とボルテゾミブが併用時に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＭ細胞と、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍、特に非分泌性腫瘍に対して高い活性を誘導する手段は不明である。
【００２４】
別の実施形態では、対象に化合物１とメルファランを併用投与する。化合物１とメルファランを併用する本発明の多発性骨髄腫の治療方法は、多発性骨髄腫の治療効果を相乗的に高めることが分かった。
【００２５】
メルファラン（４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによりＡｌｋｅｒａｎ（登録商標）の商標名で販売）は、次の化学構造を有する：
【化３】
0005665862.tif 000004
【００２６】
本発明に使用される化合物１、ボルテゾミブおよび／またはメルファランは、親化合物の薬学的に許容される塩の形態および／または薬学的に許容されるエステルの形態などのプロドラッグを含む任意の適した化学的形態で投与されてもよい。好ましくは、親化合物の薬学的に許容される塩またはエステル誘導体は、投与後直ぐに、親化合物に変換される。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物がその酸塩または塩基塩を生成することにより修飾されている親化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸またはボロン酸などの酸性基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるエステル」は、酸基がそのエステルを生成することにより修飾されている親化合物の誘導体を指す。薬学的に許容されるエステルの例としては、例えば、ボロン酸エステル、即ち、ボロン酸化合物のエステル誘導体、および環状ボロン酸エステルが挙げられる。環状ボロン酸エステルの例としては、ピナンジオールボロン酸エステル、ピナコールボロン酸エステル、１，２−エタンジオールボロン酸エステル、１，３−プロパンジオールボロン酸エステル、１，２−プロパンジオールボロン酸エステル、２，３−ブタンジオールボロン酸エステル、１，１，２，２−テトラメチルエタンジオールボロン酸エステル、１，２−ジイソプロピルエタンジオールボロン酸エステル、５，６−デカンジオールボロン酸エステル、１，２−ジシクロヘキシルエタンジオールボロン酸エステル、ビシクロへキシル−１，１’−ジオール、および１，２−ジフェニル−１，２−エタンジオールボロン酸エステルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
従って、特定の実施形態では、化合物１および／またはボルテゾミブは親化合物のボロン酸エステル誘導体として投与される。一実施形態では、化合物１は化合物１のボロン酸エステル誘導体として投与される。一実施形態では、ボルテゾミブは、ボルテゾミブのボロン酸エステル誘導体として投与される。
【００２８】
任意の適した投与方法を使用してもよい。例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄空内等）、経口投与、吸入、および経皮投与が挙げられる。注射により投与する場合、注射はボーラスであっても、または持続注入であってもよい。化合物１とボルテゾミブは対象に別々に（例えば、順次注射、注射と経口投与、または別々の経口投与として）投与されても、または混合物として一緒に（例えば、単回注射、または、化合物１とボルテゾミブを両方含有する単一錠剤の投与などによる単回経口投与で）投与されてもよい。同様に化合物１とメルファランも対象に別々に投与されても、または混合物として一緒に投与されてもよい。医薬組成物中の本発明の化合物の割合または濃度は、用量、化学的特性（例えば、疎水性）、および投与経路を含む多くの要因によって変わり得る。
【００２９】
例えば、ボルテゾミブは経口投与または静脈内注射に適している。例えば、ボルテゾミブは、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからＶｅｌｃａｄｅ（登録商標）の商標名で、ボルテゾミブ３．５ｍｇおよび増量剤であるマンニトール３５ｍｇを含有する使い捨てバイアルに入った滅菌凍結乾燥粉末として入手可能である。粉末は、臨床医により０．９％ＮａＣｌ３．５ｍＬで注射用に再構成される。ボルテゾミブは、Ｖｅｌｃａｄｅ凍結乾燥製剤中にマンニトールボロン酸エステルとして存在し、再構成後は、親ボロン酸と平衡状態にあるマンニトールボロン酸エステルとして存在する（４２）。従って、一実施形態では、ボルテゾミブは静脈内（ＩＶ）注射により投与される。別の実施形態では、ボルテゾミブは経口投与、好ましくは錠剤またはカプセルで投与される。一実施形態では、ボルテゾミブは、ボロン酸エステルなどのプロドラッグの形態で注射により投与される。一実施形態では、ボルテゾミブは、ボロン酸エステルなどのプロドラッグの形態で経口投与される。
【００３０】
例えば、メルファランは、経口投与または静脈内注射に適している。例えば、メルファランは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅからＡｌｋｅｒａｎ（登録商標）の商標名で、経口投与用のフィルムコート錠または使い捨てバイアルに入った滅菌凍結乾燥粉末として入手可能である。フィルムコート錠は、メルファラン２ｍｇ、ならびに賦形剤であるコロイド状二酸化ケイ素、クロスポピドン、ヒプロメロース、マクロゴール／ＰＥＧ４００、ステアリン酸マグネシウム、微結晶セルロース、および二酸化チタンを含有する。凍結乾燥粉末は、メルファラン５０ｍｇと同等のメルファラン塩酸塩、およびポビドン２０ｍｇを含有する。粉末は、クエン酸ナトリウム０．２ｇ、プロピレングリコール６．０ｍＬ、エタノール（９６％）０．５２ｍＬ、および注射用蒸留水を合計１０ｍＬとなるように含有する、提供される滅菌希釈剤のバイアルを使用して注射用に再構成される（４３）。従って、一実施形態では、メルファランは、塩酸塩として静脈内（ＩＶ）注射により投与される。別の実施形態では、メルファランは経口投与、好ましくは錠剤またはカプセルで投与される。
【００３１】
例えば、化合物１は、ＩＶ注射により、または、錠剤またはカプセルなどの経口剤形で投与するのに適している（２８、２９）。例えば、化合物１は、現在、固形腫瘍または非ホジキンリンパ腫を有する患者で最初のヒト第１相臨床試験で評価中である。第１相臨床試験では、化合物１は、化合物１、４ｍｇ、増量剤であるヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン１９６ｍｇ、および増量剤であるマンニトール１５６．８ｍｇを含有する、使い捨てバイアルに入った滅菌凍結乾燥粉末として提供される。粉末は、注射前に、注射用滅菌水、０．９％ＮａＣｌまたは５％マンニトールのいずれか５ｍＬまたは１０ｍＬ（目的の用量による）で再構成される。従って、一実施形態では、化合物１は静脈内（ＩＶ）注射により投与される。別の実施形態では、化合物１は経口投与、好ましくは錠剤またはカプセルで投与される。一実施形態では、化合物１は、ボロン酸エステルなどのプロドラッグの形態で注射により投与される。一実施形態では、化合物１は、ボロン酸エステルなどのプロドラッグの形態で経口投与される。
【００３２】
化合物１とボルテゾミブ、または化合物１とメルファランは、好ましくは、多発性骨髄腫を治療するのに有効な量で、例えば、疾患の症状を予防、緩和、または寛解する、治療を受ける対象の生存期間を延長する、望ましくない細胞増殖を防止する、または対象の既存の良性細胞塊もしくは悪性腫瘍のサイズを減少させるのに有効な量で、併用投与される。本明細書に記載の詳細な開示内容および実施例に鑑みて、当業者は、併用する各薬剤の有効量をうまく決定することができる。有効量は、処置または阻害される細胞増殖のタイプ、対象のサイズ、癌細胞増殖または腫瘍の重症度、投与頻度（例えば、毎日か数日に１回か）、化合物の投与方式（ｍａｎｎｅｒ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、患者の健康状態および共存症の状態、処方する医師の判断および経験（例えば、同じまたは類似の薬物に関する）、投与方法（ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、投与される剤形のバイオアベイラビリティ特性、選択される投与計画、および併用療法の種類（例えば、他の化学療法剤）などの要因に応じて変わり得る。例えば、米国特許第５，４２７，９１６号明細書は、個々の患者における抗腫瘍療法の有効性を予測する方法を記載し、本発明の治療プロトコルと併用できる特定の方法を説明している。例えば、有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から外挿することができ、患者の表面積に基づいてもよい。
【００３３】
治療は、化合物の最適用量より少ない比較的低用量で開始してもよい。その後、その状況における最適効果が達せられるまで、少しずつ漸増することにより用量を増加してもよい。必要に応じて全１日量を分割し、１日の間に少量ずつ投与してもよい。投与計画を最適化するため、抗癌治療を受けている患者から得られる２つ以上の時点における腫瘍測定値を比較することによって、多発性骨髄腫を治療するための化合物１とボルテゾミブの併用、または化合物１とメルファランの併用の有効性をモニターすることができる。一般に、療法を開始する前の患者の全身腫瘍組織量の初期評価と、治療中の異なる時点での１つ以上の追加の評価を得ることが好ましい。このような使用では、療法を開始する前に全身腫瘍組織量のベースラインを測定した後、療法を行っている間に癌の量の変化を測定する。或いは、治療前の全身腫瘍組織量のベースラインを測定する必要なく、２回以上連続測定を行ってもよい。このような使用では、全身腫瘍組織量の増減を測定するためのベースラインレベルとして、対象の全身腫瘍組織量の最初の評価を行わなければならない。
【００３４】
化合物１とボルテゾミブ、または化合物１とメルファランの投与計画、例えば、投与のタイミングおよび／または順番は、各剤形の薬物動態、処置または阻害される細胞増殖のタイプ、対象のサイズ、癌細胞増殖または腫瘍の重症度、および有効量などの要因によって変わり得る。治療医師は、上記考慮事項および本発明の詳細な開示内容に鑑みて、有効性を最適化し副作用を最小限にするように、化合物１とボルテゾミブ、または化合物１とメルファランの投与のタイミングおよび／または順番を容易に変えることができる
【００３５】
本発明の化合物１、ボルテゾミブ、およびメルファランの投与計画は柔軟性が高い。特定の実施形態では、これらの薬物に適していることが知られている投与計画を改良して投与計画を立ててもよい。例えば、表１に示すように、ボルテゾミブ（１．３ｍｇ／ｍ２）を３〜５秒のボーラスＩＶ注射として、経口メルファラン（９ｍｇ／ｍ２）および経口プレドニゾン（６０ｍｇ／ｍ２）と併用投与する６週間の治療サイクルを９サイクル行うことにより、前治療歴のない多発性骨髄腫を治療することが認可されている。サイクル１〜４では、ボルテゾミブを週２回、１日目、４日目、８日目、１１日目、２２日目、２５日目、２９日目および３２日目に投与する。サイクル５〜９では、ボルテゾミブを週１回、１日目、８日目、２２日目および２９日目に投与する（４２）。
【００３６】
【表１】
0005665862.tif 000005
【００３７】
治療計画中に薬物に関連する著しい毒性（例えば、血液毒性）が認められた場合、その後のボルテゾミブの用量をスキップするおよび／または減少することができる（例えば、１．３ｍｇ／ｍ２から１ｍｇ／ｍ２に減少する、および０．７ｍｇ／ｍ２まで減少することが可能）。さらに、または代わりに、次のサイクルではメルファランの用量を２５％減少させることができる（４２）。
【００３８】
別の例として、ボルテゾミブを３〜５秒のボーラスＩＶ注射として３週間サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与した後、１０日間の休薬期間（１２日目〜２１日目）を設けることにより、再発または難治性多発性骨髄腫を治療することが認可されている。８サイクルを超える長期療法では、ボルテゾミブは、標準的な計画で投与されても、または週１回４週間（１日目、８日目、１５日目および２２日目）投与した後、１３日間の休薬期間（２３日目〜３５日目）を設ける維持計画で投与されてもよい（４２）。
【００３９】
治療計画中に薬物に関連する著しい毒性（例えば、血液毒性、神経因性疼痛および／または末梢神経障害）が認められた場合、その後のボルテゾミブの用量をスキップするおよび／または減少することができる（例えば、１．３ｍｇ／ｍ２から１ｍｇ／ｍ２に減少する、および０．７ｍｇ／ｍ２まで減少することが可能）（４２）。
【００４０】
本発明の併用療法では、ボルテゾミブの投与計画は、前述のものを含む認可された多発性骨髄腫の投与計画と類似していても、または異なっていてもよい。例えば、ボルテゾミブを認可された投与計画より高頻度または低頻度で投与してもよく、任意選択により、比較的高用量または低用量で投与してもよい。
【００４１】
ボルテゾミブは、化合物１と任意の適した用量で併用投与されてもよい。適したボルテゾミブの用量は、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約７ｍｇ／ｍ２の範囲、例えば、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２、例えば、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよい。適したボルテゾミブの用量は、典型的には約０．５ｍｇ／ｍ２〜約２ｍｇ／ｍ２の範囲となるであろう。好ましくは、ボルテゾミブの用量は約０．６ｍｇ／ｍ２〜約１．５ｍｇ／ｍ２の範囲である。より好ましくは、ボルテゾミブの用量は約０．７ｍｇ／ｍ２〜約１．３ｍｇ／ｍ２の範囲である。好ましいボルテゾミブの用量としては、０．７ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、または１．３ｍｇ／ｍ２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前述の用量はどのボルテゾミブ投与方法にも適しており、とりわけ皮下投与または静脈内投与に適しており、静脈内投与が好ましい。ボルテゾミブの経口用量は、典型的には前述の範囲の上限（ｈｉｇｈ  ｅｎｄ）にあり、例えば、約１ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２、または約２ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２となるであろう。
【００４２】
ボルテゾミブは、前述の用量で化合物１と任意の適した計画に従って併用投与されてもよい。ボルテゾミブの投与量は一定であっても、または投与計画内で変えてもよい。薬物に関連する著しい毒性が認められない限り、好ましくはボルテゾミブの用量は投与計画中、一定のレベルに維持されるが、薬物に関連する著しい毒性が認められた場合、その後の用量を例えば約２０〜３０％減少させることができる。ボルテゾミブは、化合物１と同じ日に投与されても、または異なる日に投与されてもよい。一実施形態では、ボルテゾミブと化合物１は、投与計画中、同じ日に投与される。適したボルテゾミブ投与計画は、典型的には１日１回投与〜週１回投与またはさらには月１回投与の範囲となるであろう。好ましくは、ボルテゾミブは１日１回より低頻度で、例えば、２〜１４日に１回投与される。好ましくは、ボルテゾミブは３〜７日毎に、例えば、３〜４日毎に投与される。好ましくは、投与計画は、１週間以上、例えば、２、３または４週間ボルテゾミブで治療した後、ボルテゾミブを投与しない期間を少なくとも５日間、例えば、約７〜２１日間含む。好ましくは、休薬期間は約１０〜１７日間、例えば、約１０日間または約１７日間である。例えば、ボルテゾミブを２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与してもよく、１２〜２１日目は休薬期間である。別の例として、ボルテゾミブを２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与してもよく、１２〜２８日目は休薬期間である。別の例として、ボルテゾミブを週１回４週間（例えば、３５日サイクルの１日目、８日目、１５日目および２２日目に）投与した後、１３日間の休薬期間（例えば、３５日サイクルの２３日目〜３５日目）を設けてもよい。計画された投与サイクルを１回以上繰り返してもよい。例えば、最大反応が認められるまで、１または２サイクル追加して、計画されたサイクルを繰り返してもよい。別の例として、計画されたサイクルを６〜１２サイクル繰り返してもよい。任意選択により、最初のサイクルを完了した後、ボルテゾミブを最初の計画より低頻度で、例えば、週１回または２週間に１回投与する「維持計画」を使用してもよい。維持計画を一定期間、一般的に１〜２年継続しても、または患者が進行の徴候を示さない状態が続き、著しい毒性がなく治療に耐える限り無期限に継続してもよい。
【００４３】
化合物１は、任意の適した用量でボルテゾミブと併用投与されてもよい。適した化合物１の用量は、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２の範囲、例えば、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２、または約０．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよい。適した化合物１の用量は、典型的には約０．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲となるであろう。好ましくは、化合物１の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲である。より好ましくは、化合物１の用量は、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２の範囲である。好ましい化合物１の用量としては、１．５ｍｇ／ｍ２、１．８ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、または２．４ｍｇ／ｍ２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前述の用量はどの化合物１投与方法にも適しており、とりわけ皮下投与または静脈内投与に適しており、静脈内投与が好ましい。化合物１の経口用量は、典型的には前述の範囲の上限にあり、例えば、約１ｍｇ／ｍ２〜約７ｍｇ／ｍ２となるであろう。一実施形態では、化合物１の経口用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約６ｍｇ／ｍ２、例えば、約３ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２である。例示的な化合物１の経口用量としては、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２または６ｍｇ／ｍ２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
化合物１は、前述の用量でボルテゾミブと任意の適した計画に従って併用投与されてもよい。化合物１の投与量は一定であっても、または投与計画内で変えてもよい。薬物に関連する著しい毒性が認められない限り、好ましくは、化合物１の用量は投与計画中、一定のレベルに維持されるが、薬物に関連する著しい毒性が認められた場合、その後の用量を例えば約２０〜３０％減少させることができる。化合物１は、ボルテゾミブと同じ日に投与されても、または異なる日に投与されてもよい。一実施形態では、化合物１とボルテゾミブは、投与計画中、同じ日に投与される。適した化合物１の投与計画は、典型的には１日１回投与〜週１回投与またはさらには月１回投与の範囲となるであろう。好ましくは、化合物１は１日１回より低頻度で、例えば、２〜１４日に１回投与される。好ましくは、化合物１は、３〜２８日毎に、例えば、７〜２１日毎に投与される。例えば、化合物１を週２回投与してもよい。別の例では、化合物１を週１回投与してもよい。別の例では、化合物１を２週間に１回投与してもよい。好ましくは、投与計画は、１週間以上、例えば、２、３または４週間、化合物１で治療した後、化合物１を投与しない期間を少なくとも５日間、例えば、約７〜２１日間含む。好ましくは、休薬期間は約１０〜１７日間、例えば、約１０日間または約１７日間である。例えば、化合物１を２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与してもよく、１２〜２１日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２８日サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与してもよく、１２〜２８日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルの１日目と８日目に投与してもよく、１２〜２１日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２８日サイクルの１日目と８日目に投与してもよく、１２〜２８日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルの１日目と１５日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２８日サイクルの１日目と１５日目に投与してもよい。前述のように、ボルテゾミブは投与計画の同じ日に投与されても、または異なる日に投与されてもよい。例えば、化合物１とボルテゾミブを両方とも２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１とボルテゾミブを両方とも、２８日サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与し、化合物１を２１日サイクルの１日目と８日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与し、化合物１を２８日サイクルの１日目と８日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与し、化合物１を２１日サイクルの１日目と１５日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２８日サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与し、化合物１を２８日サイクルの１日目と１５日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与し、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの２日目、５日目、９日目および１２日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与し、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの２日目、５日目、９日目および１２日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目と８日目投与し、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの２日目、５日目、９日目および１２日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与し、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの２日目と９日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目と１５日目投与し、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの２日目、５日目、９日目、および１２日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与し、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの２日目と１６日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目と８日目投与し、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの４日目と１１日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目と８日目に投与し、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの４日目と１１日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与し、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの３日目、８日目、および１２日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、５日目および９日目に投与し、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの３日目、８日目、および１２日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目と１５日目に投与し、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目、６日目および１１日目に投与してもよい。別の実施形態では、ボルテゾミブを２１日サイクルまたは２８日サイクルの１日目と１１日目に投与し、化合物１を２１日サイクルまたは２８日サイクルの５日目と１５日目に投与してもよい。計画された投与サイクルを１回以上繰り返してもよい。例えば、最大反応が認められるまで、１または２サイクル追加して、計画されたサイクルを繰り返してもよい。別の例として、計画されたサイクルを６〜１２サイクル繰り返してもよい。任意選択により、最初のサイクルを完了した後、ボルテゾミブと化合物１を最初の計画より低頻度で、例えば、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与する「維持計画」を使用してもよい。維持計画を一定期間、一般的に１〜２年継続しても、または、患者が進行の徴候を示さない状態が続き、著しい毒性がなく治療に耐える限り無期限に継続してもよい。
【００４５】
前述のように、本発明の化合物１とメルファランの投与計画は柔軟性が高い。特定の実施形態では、これらの薬物に適していることが知られている投与計画を改良して投与計画を立てることができる。例えば、上記表１に示すように、経口メルファラン（９ｍｇ／ｍ２）を、ボルテゾミブ（１．３ｍｇ／ｍ２）および経口プレドニゾン（６０ｍｇ／ｍ２）と併用投与する６週間の治療サイクルを９サイクル行うことにより、前治療歴のない多発性骨髄腫を治療することが認可されている。メルファランは各６週間のサイクルの１日目、２日目、３日目、および４日目に投与される（４２）。
【００４６】
経口メルファランは、通常、単剤として毎日６ｍｇの用量で投与される。約１週間の間隔で行われる血球算定に基づき、必要に応じて用量を調節する。２〜３週間治療した後、最大４週間投薬を中止し、その間、血球算定を慎重に追跡しなければならない。白血球数と血小板数が上昇している場合、毎日２ｍｇの維持量を定めてもよい（４３）。
【００４７】
本発明の併用療法では、メルファランの投与計画は、前述のものを含む認可された多発性骨髄腫の投与計画と類似していても、または異なってもよい。例えば、メルファランを認可された投与計画より高頻度または低頻度で投与してもよく、任意選択により、比較的高用量または低用量で投与してもよい。
【００４８】
メルファランは、化合物１と任意の適した用量で併用投与されてもよい。適したメルファランの用量は、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．３ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。適したメルファランの用量は、典型的には約０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．３ｍｇ／ｋｇの範囲となるであろう。好ましくは、メルファランの用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。より好ましくは、メルファランの用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇの範囲である。好ましいメルファランの用量としては、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、または０．２５ｍｇ／ｋｇが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前述の用量は、どのメルファラン投与方法にも適しており、とりわけ皮下投与、静脈内投与または経口投与に適しており、経口投与が好ましい。
【００４９】
メルファランは、前述の用量で化合物１と任意の適した計画に従って併用投与されてもよい。メルファランの投与量は一定であっても、または投与計画内で変えてもよい。薬物に関連する著しい毒性が認められない限り、好ましくは、メルファランの用量は投与計画中、一定のレベルに維持されるが、薬物に関連する著しい毒性が見られた場合、その後の用量を例えば約２０〜３０％減少させることができる。メルファランは、化合物１と同じ日に投与されても、または異なる日に投与されてもよい。適したメルファランの投与計画では、期間中、連日投与した後、休薬期間が設けられるであろう。好ましくは、メルファランを約３〜約７日間、１日１回投与した後、約１〜６週間の休薬期間を設ける。好ましくは、メルファランを約４〜約７日間、１日１回投与した後、約４〜６週間の休薬期間を設ける。好ましくは、メルファランを約４〜約５日間、１日１回投与した後、約４〜６週間の休薬期間を設ける。計画を１回以上繰り返してもよい。
【００５０】
化合物１は、メルファランと任意の適した用量で併用投与されてもよい。適した化合物１の用量は、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２の範囲、例えば、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２、または約０．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよい。適した化合物１の用量は、典型的には約０．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲となるであろう。好ましくは、化合物１の用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の範囲である。より好ましくは、化合物１の用量は、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２の範囲である。好ましい化合物１の用量としては、１．５ｍｇ／ｍ２、１．８ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、または２．４ｍｇ／ｍ２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前述の用量は、どの化合物１投与方法にも適しており、とりわけ皮下投与または静脈内投与に適しており、静脈内投与が好ましい。化合物１の経口用量は、典型的には前述の範囲の上限にあり、例えば、約１ｍｇ／ｍ２〜約７ｍｇ／ｍ２となるであろう。一実施形態では、化合物１の経口用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約６ｍｇ／ｍ２、例えば、約３ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２である。例示的な化合物１の経口用量としては、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２または約６ｍｇ／ｍ２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
化合物１は、前述の用量でメルファランと任意の適した計画に従って併用投与されてもよい。化合物１の投与量は一定であっても、または投与計画内で変えてもよい。薬物に関連する著しい毒性が認められない限り、好ましくは、化合物１の用量は投与計画中、一定のレベルに維持されるが、薬物に関連する著しい毒性が見られた場合、その後の用量を例えば約２０〜３０％減少させることができる。化合物１は、メルファランと同じ日に投与されても、または異なる日に投与されてもよい。適した化合物１の投与計画は、典型的には１日１回投与〜週１回投与またはさらには月１回投与の範囲となるであろう。好ましくは、化合物１を１日１回より低頻度で、例えば、２〜１４日に１回投与する。好ましくは、化合物１を３〜２８日毎に、例えば、７〜２１日毎に投与する。例えば、化合物１を週２回投与してもよい。別の例では、化合物１を週１回投与してもよい。別の例では、化合物１を２週間に１回投与してもよい。好ましくは、投与計画は、化合物１を投与しない期間を少なくとも５日間、例えば、約７〜２１日間含む。好ましくは、休薬期間は約１０〜１７日間、例えば、約１０日間または約１７日間である。例えば、化合物１を２１日サイクルの１日目、４日目、８日目および１１日目に投与してもよく、１２〜２１日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２８日サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与してもよく、１２〜２８日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルの１日目と８日目に投与してもよく、１２〜２１日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２８日サイクルの１日目と８日目に投与してもよく、１２〜２８日目は休薬期間である。別の実施形態では、化合物１を２１日サイクルの１日目と１５日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を２８日サイクルの１日目と１５日目に投与してもよい。一実施形態では、化合物１を４２日サイクルの１日目、４日目、８日目、１１日目、２２日目、２５日目、２９日目および３２日目に投与し、メルファランを４２日サイクルの１日目、２日目、３日目および４日目に投与してもよい。別の実施形態では、化合物１を８４日サイクルの１日目、４日目、８日目、１１日目、２２日目、２５日目、２９日目、３２日目、４３日目、５０日目、６４日目、および７１日目に投与し、メルファランを８４日サイクルの１日目、２日目、３日目、４日目、４３日目、４４日目、４５日目、および４６日目に投与してもよい。別の実施形態では、メルファランを２８日サイクルの１日目、２日目、３日目、および４日目に投与し、化合物１を２８日サイクルの１日目と１５日目に投与してもよい。別の実施形態では、メルファランを４２日サイクルの１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に投与し、化合物１を４２日サイクルの１日目、８日目、２２日目および２９日目に投与してもよい。計画を１回以上繰り返してもよい。
【００５２】
他の１種類以上の癌治療薬を、化合物１とボルテゾミブ、または化合物１とメルファランの投与と併用してもよい。このような治療薬としては、ボルテゾミブ、メルファラン、デキサメタゾンおよび他のステロイド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、サリドマイド、レナリドミド、三酸化ヒ素、およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの薬剤の適切な用量は当該技術分野で周知である。本発明の別の態様では、追加的な薬剤はフィルグラスチムなどの顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であってもよい。好ましい実施形態では、フィルグラスチムを６日目から、好中球数がＡＮＣ>１０００に回復するまで約５μｇ／ｋｇ／日の用量でＳＣ投与する。ＡＮＣは、「好中球絶対数」の略語である。
【００５３】
本発明の併用療法は、癌性増殖の一部または全部を外科的に除去する試みをさらに含む治療過程の一部として使用されてもよい。例えば、対象の外科的治療後に、残存する新生物細胞または転移細胞を治療するため、併用療法を施してもよい。また、腫瘍のサイズを小さくし、切除する組織の量を減少させるために手術の前に治療を行い、それによって手術の侵襲性と外傷性を低くしてもよい。
【００５４】
本明細書に開示される対象である併用療法による多発性骨髄腫の治療は、ＤＮＡ損傷を誘導する放射線治療手段を用いた１つ以上の治療過程を含んでもよい。放射線治療手段としては、例えば、γ線照射、Ｘ線、紫外線照射、マイクロ波、電子放出、および放射性同位体等が挙げられる。局在する腫瘍部位に前述の形態の放射線を照射することにより療法を達成することができる。
【００５５】
本発明の別の態様は、骨髄細胞を本発明の併用療法で処置することにより、骨髄をパージする、即ち、骨髄から癌細胞を除去する方法に関する。その後、パージした骨髄を、骨髄を取り出した対象に再移植しても、または異なる対象に移植してもよい。
【００５６】
材料および方法
試薬
化合物１（４ｍｇ；Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｆｒａｚｅｒ，ＰＡ）をプロピレングリコール（８００μＬ）に溶解し、５％マンニトールに添加して、最終保存液濃度１ｍｇ／ｍＬにし；処置直前に化合物１の保存溶液を表示した濃度に希釈した。ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を１ｍｇ／ｍＬで得、０．９％塩化ナトリウムを使用して規定どおり希釈した。メルファラン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を酸−ＥｔＯＨ（酸−ＥｔＯＨ：濃ＨＣｌ４７μＬ＋１００％ＥｔＯＨ１ｍＬ）１００μＬに溶解し、リン酸緩衝生理食塩水で１ｍＬに希釈した。製剤は毎週調製した。
【００５７】
細胞株および初代培養細胞
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からヒト骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６を得た。ＭＭ１Ｓ骨髄腫細胞株は、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｒｏｓｅｎ博士（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）によって提供された。正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配遠心分離法で、製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に従って分離した。骨髄腫細胞株およびＰＢＭＣを、５％二酸化炭素（ＣＯ２）雰囲気中３７℃で、１０％牛胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）中で培養した。
【００５８】
細胞生存率アッセイ（ＭＴＳアッセイ）
細胞を１０５細胞／１００μＬ／ウェルで９６穴プレートに播種し、２４時間インキュベートした。ＲＰＭＩ８２２６細胞およびＭＭ１Ｓ細胞を溶媒、化合物１、ボルテゾミブ、メルファラン、化合物１＋ボルテゾミブ、または化合物１＋メルファランの存在下で４８時間培養した。インキュベート時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して細胞生存率を定量化した。各ウェルをＭＴＳ（３−（４，  ５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩）で１〜４時間処理した後、４９０ｎｍで吸光度を記録した。４９０ｎｍにおける吸光度で測定されるホルマザン生成物の量は、培地内の生細胞数に正比例する。
【００５９】
ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの半有効（ｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔ）法を使用して、化合物１とボルテゾミブまたはメルファランとのｉｎ  ｖｉｔｒｏ相乗作用を評価した（３０）。各組み合わせについて別々に併用指数（ＣＩ）を算出した。薬物相互作用は、ＣＩが０．９未満の場合は相乗的であると判定され、またはＣＩが１．１より大きい場合は拮抗的であると判定された。ＣＩが０．９〜１．１の場合は薬物相加効果を示すものと見なされた（３１）。
【００６０】
アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム染色によるアポトーシスアッセイ
薬物療法に反応したアポトーシスを定量化するため、ＲＰＭＩ８２２６細胞（１ウェル当たり５×１０５細胞）を溶媒またはＰＩと共に３７℃、５％ＣＯ２で３０時間インキュベートした。陽性対照として、細胞をアクチノマイシンＤ２５０ｎｇ／ｍＬと共に２４時間または４８時間インキュベートした。次いで、細胞を２回リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、結合緩衝液（１．４Ｍ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．５）に再懸濁させ、製造業者のプロトコル（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に従って、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合アネキシンＶ、および蛍光色素ヨウ化プロピジウム（ＰｒＩ）で染色した。各薬物療法について、ゲートをかけた１×１０５の事象を記録した。ＰＩ染色とアネキシンＶ染色の両方について陰性の細胞を生存と見なし；アネキシンＶ−陽性、ＰｒＩ−陰性の細胞を初期アポトーシスと見なし；アネキシンＶ−陽性、ＰｒＩ−陽性の細胞を後期アポトーシスと見なした。Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＣＸＰソフトウェアを用いたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００サイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用してフローサイトメトリー分析を行った。
【００６１】
ＳＣＩＤマウス
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から６〜８週齢の雄性ＳＣＩＤマウスを得、動物資源施設の特定病原菌を排除した領域で飼育した。動物試験は全て、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可されたプロトコルに従って行った。手術前にケタミン、キシラジンおよびイソフルランで動物に麻酔をかけ、腫瘍が直径２ｃｍに達したとき安楽死させた。
【００６２】
筋肉内腫瘍異種移植モデル
ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍（ボルテゾミブおよびメルファランに対して感受性）を形成するため、レナリドミドで治療中に進行した女性ＭＭ患者から骨髄生検試料を得た。この生検の直後に、患者はメルファランとボルテゾミブを併用して治療され、反応を示した。麻酔したＳＣＩＤマウスの後肢に生検組織を外科的に移植し、継代した（３２）。ＬＡＧκ−１Ａと同じ患者に由来するＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍（ボルテゾミブおよびメルファランに対して耐性）は、患者がボルテゾミブおよびメルファランで治療中に進行しているときに採取した生検試料から得られた（３２）。
【００６３】
麻酔したドナーマウスから骨髄腫腫瘍（ＬＡＧκ−１ＡまたはＬＡＧκ−１Ｂ）を切除し、２０〜４０ｍｍ３片に薄切し、麻酔した未処置ＳＣＩＤマウスの左浅臀筋に外科的に移植した。免疫活性をさらに抑制するため、レシピエントマウスに毎週、抗アシアロＧＭ１ウサギ血清（Ｗａｋｏ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を注射した。マウスを実験群の１つに無作為に割り付け、腫瘍移植７〜２１日後に処置を開始した。化合物１は、規定通り、週２回（水、金）、静脈内注射（０．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ）または強制経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ）により投与した。メルファラン（１ｍｇ／ｋｇ）は毎週（水）、腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。ボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ）は週２回（火、木）ＩＶ注射により投薬した。対照処置は、化合物１の希釈剤（５％マンニトール３．２ｍＬおよびプロピレングリコール８００μＬ）のみからなった。
【００６４】
ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍により分泌されたｈＩｇＧの血清中濃度（ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍は異常タンパク質を分泌しない）をＥＬＩＳＡにより腫瘍増殖のタンパク質マーカーとして定量化した。毎週、ＭＭ腫瘍を有するマウスの後眼窩静脈叢から採血した。得られた試料を１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、血清を得た。製造業者の仕様書に従って、ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）を使用した。ＫＣ  Ｊｕｎｉｏｒソフトウェアを用いたμＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で、４５０ｎｍにおける吸光度（参照波長５５０ｍｍ）を測定した。グラフ化したデータは、ｎ＝マウス７〜８匹／群での平均値±ＳＥＭである。
【００６５】
腫瘍体積の測定
腫瘍増殖の直接測定として、毎週、カリパスを使用して腫瘍体積を計測し、楕円体の体積に関する式を適用した（４／３π×［幅／２］２×［長さ／２］）。
【００６６】
腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）発現の免疫組織化学分析
ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、５μｍの切片に切断した。  簡潔に言えば、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）および３％ＢＳＡを有するトリス緩衝生理食塩水で、室温で１時間切片をブロッキングした後、ＡＩＦに対するウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に終夜インキュベートした。切片をＴＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＲＨ）結合抗ウサギ抗体（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）をＴＢＳＴで１：５００に希釈したもので、室温で２時間処理した。スライドガラスはＴＢＳＴ中で３回洗浄し、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）緩衝液に５分間入れ、ＡＥＣキット（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して色を検出した。染色はＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を使用して記録し、Ｍｉｃｒｏｓｕｉｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｉｔｅプログラム  （Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１）で分析した。
【００６７】
統計解析
腫瘍増殖およびｈＩｇＧ濃度を処置群の平均値および標準誤差に関して解析した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、処置群間の統計学的有意差を検定した。最小有意水準は、Ｐ<０．０５であった。
【実施例】
【００６８】
次の実施例に示すデータから、本発明の併用療法は、化合物１とボルテゾミブまたは化合物１とメルファランを低用量で併用した場合、標準用量の単剤療法と比較して、ＭＭにおける有効性が同様であるかまたは高い可能性があることが示唆された。このようにして、ボルテゾミブに関する末梢神経障害およびメルファランに関する骨髄抑制などの薬物に関連する毒性が低減し得るか、または回避され得る（４０、４１）。本明細書に記載の実験では、併用療法で処置したマウスは処置に対する忍容性が高く、腫瘍の進行がほとんどまたは全くなかった。
【００６９】
実施例１．化合物１はＭＭ細胞に対する細胞毒性があり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＭＭ剤と併用した場合、相乗作用を示す
ＲＰＭＩ８２２６細胞およびＭＭ１Ｓ細胞を増加する濃度（０．１〜１０ｎＭ）の化合物１の存在下で培養した。４８時間後、ＭＴＳアッセイで細胞生存率を評価した。化合物１は、両方の細胞株で濃度依存的な生存率の低下を誘導した（図１Ａ）。細胞を化合物１で２４時間または７２時間処置した場合、結果は同様であった（データ不示）。
【００７０】
次に、化合物１＋ボルテゾミブ（ＰＩ）またはメルファラン（化学療法剤）の存在下における細胞生存率を調べた。まず、ＭＭ１Ｓ細胞を一定濃度の化合物１（１．７５ｎＭ）および増加する濃度（０．５〜２．５ｎＭ）のボルテゾミブと共に４８時間インキュベートした。１．５ｎＭ以下のボルテゾミブ濃度では、化合物１の細胞毒性効果が増強した。例えば、単剤の場合、化合物１（１．７５ｎＭ）と最低濃度（０．５ｎＭ）のボルテゾミブはそれぞれ細胞生存率を約１６％低下させた。しかし、化合物１（１．７５ｎＭ）をボルテゾミブ（０．５ｎＭ）と併用した場合、細胞生存率は約４３％低下した（図１Ｂ）。Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの式を使用して、この組み合わせの相乗作用を確認した（ＣＩ、０．７４〜０．８５）（３０、３１）。ＲＰＭＩ８２２６細胞で実験を繰り返した場合、同様の結果が得られた（データ不示）。
【００７１】
ＲＰＭＩ８２２６細胞をメルファラン（４０μＭ）および６．０ｎＭ以上の濃度の化合物１（ＩＣ５０＝８．５ｎＭ）と共にインキュベートした場合、相乗的な生存率の低下が認められた（ＣＩ、０．７８〜０．８７）。例えば、細胞生存率は単剤のメルファラン（４０μＭ）の存在下では約３０％低下し、単剤の化合物１（９．０ｎＭ）の存在下では６４％低下した。両方の薬物を同時に使用した場合、細胞生存率は９０％低下した（図１Ｃ）。総合的に、これらの結果から、化合物１をボルテゾミブまたはメルファランと併用すると、ＭＭ細胞の生存率を相乗的に抑制できることが分かる。
【００７２】
実施例２．化合物１とボルテゾミブは新生物細胞に対して選択的な細胞毒性を有する
２種類以上のＰＩを用いた療法がｉｎ  ｖｉｖｏで実施可能であるためには、この組み合わせが非新生物細胞に損傷を与えてはならない。従って、正常なＰＢＭＣの生存率に対する化合物１＋ボルテゾミブの効果を試験した。健常なドナーのＰＢＭＣを化合物１単独、ボルテゾミブ単独、または両方の薬剤の存在下で４８時間培養し、細胞生存率をＭＴＳアッセイで定量化した。どちらかのＰＩをそのＩＣ５０付近で用いたＭＭ細胞における単独療法では、ＰＢＭＣの生存率はあまり低下しなかった（ＰＢＭＣを９ｎＭの化合物１と９ｎＭのボルテゾミブでそれぞれ処置した場合、生細胞は約７５％および８５％であった）（図２Ａ、Ｂ）。両方のＰＩと共に共インキュベートした場合、どちらかの薬剤を単独で投与した場合と比較して、細胞生存率はそれ以上低下しなかったか、または僅かに上昇した（ＰＩを両方とも投与した場合、試験した全ての濃度で細胞生存率が３％〜２３％低下した）（図２Ａ、Ｂ）。別の健常なドナーに由来するＰＢＭＣで類似の結果が得られた（図２Ｃ）。ＰＢＭＣが高濃度のＰＩによって損傷を受けるかどうかを調べるため、ＰＢＭＣを１２０ｎＭまでの化合物１と共に培養した。対照と比較した場合、試験したどの濃度でも細胞生存率の顕著な差は認められなかった（図２Ｄ）。ＰＢＭＣを１２０ｎＭまでの濃度のボルテゾミブと共にインキュベートした場合、同様の結果が得られた（データ不示）。従って、本発明の併用療法はＭＭに対する有効性が高く、正常な細胞に対する毒性が増加しない。
【００７３】
実施例３．化合物１とボルテゾミブの併用によりＭＭ細胞のアポトーシスが誘導される
化合物１とボルテゾミブでＭＭ細胞を処置した後に認められる細胞生存率の低下がアポトーシスによるものかどうかを調べるため、ＲＰＭＩ８２２６細胞を両方の薬剤（どちらの薬物も２．５ｎＭ）と共に３０時間インキュベートし、生存率測定用色素であるＰｒＩおよびアポトーシスマーカーであるアネキシンＶで染色された細胞の割合を測定した。初期アポトーシス（ＰｒＩ−／アネキシンＶ＋）の細胞の割合は、どちらかの薬剤単独で処置した後（それぞれ２．５ｎＭの化合物１または２．５ｎＭのボルテゾミブで処置した細胞の１０．４％および１７．５％）より、両方のＰＩで処置した後の方が大きかった（細胞の３８．９％）（図３）。後期アポトーシス（ＰｒＩ＋／アネキシンＶ＋）または壊死（ＰｒＩ＋／アネキシンＶ−）の細胞の割合は、この時点では処置群間で差がなかった。
【００７４】
実施例４．単剤の化合物１はｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＭＭ腫瘍の増殖を阻害した
化合物１は、単剤の場合も併用した場合もｉｎ  ｖｉｔｒｏで強力な抗ＭＭ効果を示すため、次に一連のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を行った。これらの実験では、ＬＡＧκ−１Ａ（ボルテゾミブ感受性およびメルファラン感受性）腫瘍およびＬＡＧκ−１Ｂ（ボルテゾミブ耐性およびメルファラン耐性）腫瘍を有するマウスを使用したが、これらの腫瘍は両方とも元々ＭＭ患者の骨髄生検試料に由来した。これらの腫瘍はヒトのＭＭによく似ており、マウスで継代され、一貫した増殖パターンおよび化学療法抵抗性パターンを有した。腫瘍組織を筋肉内移植した後、化合物１を０．１〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の様々な用量でＩＶ投与することにより、または１０ｍｇ／ｋｇ経口投与することによりマウスを週２回処置した。対照群のマウスには化合物１の希釈剤を投与した。
【００７５】
単剤の化合物１をＩＶ投与すると、ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍からの異常タンパク質の分泌が用量依存的に減少した。比較的低用量の化合物１では腫瘍ｈＩｇＧ分泌が減少し、比較的高用量では血清ｈＩｇＧ濃度が本質的に検出不可能となった（薬物療法の２８日目に対照と比較した場合、ＩＶ化合物１、１ｍｇ／ｋｇではＰ＝０．０００１、３ｍｇ／ｋｇではＰ＝０．０００２）（図４Ａ）。ボルテゾミブと異なり、化合物１は経口製剤としても活性を示す（２８、２９）。経口化合物１で処置して２週間内に、血清ｈＩｇＧ濃度は、対照で処置した動物より著しく低下した（Ｐ＝０．０００７）。経口化合物１で処置して２８日までに、血清ｈＩｇＧ濃度はごく僅かになった（対照で処置した動物と比較した場合、Ｐ＝０．０００１）（図４Ａ）。
【００７６】
異常タンパク質濃度に対する効果に加え、単剤の化合物１は、溶媒で処置したマウスと比較して、ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍体積の増加を遅延させた。４週間薬物療法を行った後、化合物１を１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ投与したものは、対照で処置した異種移植片と比較して同時点で腫瘍体積が約１５倍減少した（対照と比較した場合、各用量でＰ＝０．０００１）（図４Ｂ）。化合物１を経口送達すると、腫瘍増殖も阻害された。経口化合物１で処置してわずか１４日後に、対照で処置した腫瘍と比較して、腫瘍体積の著しい減少が認められ（Ｐ＝０．０００２）、試験期間中ずっとその差があった（図４Ｂ）。
【００７７】
また、腫瘍体積に対する化合物１の効果を、ボルテゾミブ耐性非分泌性ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍を有するマウスでも試験した（図４Ｃ）。ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍の場合と同様に、化合物１は、ＩＶ注射と経口製剤の両方で腫瘍増殖を阻害した。対照で処置したマウスと比較して、３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ化合物１または１０ｍｇ／ｋｇ経口化合物１で処置したマウスの腫瘍は、１４日間処置した後、約８〜１２倍小さかった（それぞれ、Ｐ＝０．０００８およびＰ＝０．００２８）（図４Ｃ）。この実験に使用されるＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍は非分泌性であるため、これらの腫瘍を有するマウスの血清ｈＩｇＧ濃度は試験しなかった。
【００７８】
実施例５．化合物１をボルテゾミブと併用するとボルテゾミブ感受性ＬＡＧκ−１Ａ  ＭＭ腫瘍の増殖が阻害される
化合物１をボルテゾミブと併用するとｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＭ細胞の相乗的アポトーシスが誘導されるため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてヒトＭＭ腫瘍でこの組み合わせを試験した。最適以下の単剤抗腫瘍活性を有する薬物濃度を選択した。単独療法の場合、化合物１（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）とボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）は両方とも、溶媒対照と比較して血清ｈＩｇＧ濃度およびＬＡＧκ−１Ａ腫瘍体積を部分的にしか低減しなかった（図５Ａ、Ｂ）。しかし、異常タンパク質分泌と腫瘍体積の両方で測定した場合、単剤の化合物１またはボルテゾミブで処置したにもかかわらず、腫瘍増殖は徐々に進行し続けた。対照的に、化合物１とボルテゾミブを同じ用量で併用投与すると、検出可能な異常タンパク質分泌および腫瘍体積の増加がなくなった。対照で処置したＬＡＧκ−１Ａ腫瘍と併用療法で処置したＬＡＧκ−１Ａ腫瘍との増殖の差は、まず、療法開始２８日後に顕著になった（血清ｈＩｇＧ濃度ではＰ＝０．００２８、腫瘍体積ではＰ＝０．０２６５）（図５Ａ、Ｂ）。腫瘍の進行は実験期間中ずっと（１１０日間）完全に阻害され続けた。さらに、化合物１＋ボルテゾミブで処置したマウスを安楽死させたとき、切除した後肢を検査すると、筋肉塊だけが認められ、腫瘍組織は認められなかった。試験開始時に移植された腫瘍は完全に退縮していた。特に、併用療法は忍容性が高く、明らかな毒性の徴候は認められなかった。
【００７９】
以前の研究では、ｈＩｇＧ分泌骨髄腫腫瘍体積の変化は、血清ヒト異常タンパク質濃度の変化と密接に相関した（１５、３２）。しかし、これらの実験では、単剤の化合物１またはボルテゾミブで処置した腫瘍からの異常タンパク質分泌はプラトーに達した後、処置６３日目（試験７０日目）から低下し；対照的に、腫瘍体積は試験期間中ずっと増加し続けた（図５Ａ、Ｂ）。従って、単独療法の場合、各薬剤は、腫瘍体積より血清ｈＩｇＧ濃度の上昇をより効果的に抑制した。
【００８０】
これらの結果を検証するため、７０日目以降の試料をＥＬＩＳＡで再試験し、ｈＩｇＧ濃度の低下を確認した。ｈＩｇＧ濃度と腫瘍体積の間の反比例関係は、おそらく癌幹細胞に由来する非分泌性、薬物耐性ＭＭ細胞集団が存在することを示唆する。従って、ボルテゾミブまたは化合物１は単独では、主に、ＭＭの抗体を分泌する成熟形質細胞成分に対して作用し（２２）、腫瘍増殖の遅延の原因となる小さい幹細胞集団に影響を及ぼさない可能性がある（２４）。
【００８１】
対照的に、化合物１とボルテゾミブを併用投与したＬＡＧκ−１Ａを有するマウスは、ｈＩｇＧと腫瘍体積の測定の両方で評価した場合、１１０日間の試験中ずっと、腫瘍増殖の顕著で持続的な抑制が認められた。これらのデータから、単剤のＰＩの存在下で異常タンパク質を産生することなく増殖するＭＭ細胞は、化合物１とボルテゾミブの組み合わせに対して感受性があることが分かる。
【００８２】
実施例６．化合物１とボルテゾミブの併用療法はボルテゾミブ耐性ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍の薬物耐性を克服する
ＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍は、ボルテゾミブに対して耐性があり；実際、どちらかのＰＩ単独  （０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶボルテゾミブまたは１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ化合物１）ではこれらの腫瘍の増殖はあまり抑制されない。対照的に、化合物１＋ボルテゾミブで処置したＬＡＧκ−１Ｂを有するマウスは、２１日間処置した後、溶媒で処置したマウスよりも形成した腫瘍が著しく小さかった（Ｐ＝０．００１４）。さらに、２８日間処置した後、併用療法を受けたマウスの腫瘍はまた、どちらかのＰＩ単独で処置したマウスの腫瘍より小さかった（それぞれ化合物１単独およびボルテゾミブ単独と比較した場合、Ｐ＝０．００３９およびＰ<  ０．０００１）（図５Ｃ）。時間対腫瘍の進行について調べるため、併用療法群のマウスの投与を継続した。単剤のＰＩで処置した腫瘍と比較して、併用療法群の腫瘍体積の進行は１００％遅延された（単剤のＰＩで処置したマウスでは腫瘍の進行まで３５日であったのに対して、両方のＰＩで処置したマウスでは腫瘍の進行まで７０日であった）。最後に、各処置群の全生存期間を記録した。溶媒で処置したマウスと比較して、併用療法を受けたマウスは、１５０％長く生存した（データ不示）。どちらかのＰＩ単独で処置したマウスは、溶媒で処置したマウスより２０％長く生存した（データ不示）。他のマウス生存期間データから、両方のＰＩを用いた併用療法の忍容性は単独療法と同様であることが分かった（データ不示）。総合的に、これらのデータから、化合物１をボルテゾミブと併用するとｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒトＭＭのボルテゾミブ耐性を克服できることが分かる。
【００８３】
実施例７．化合物１をメルファランと併用するとＬＡＧκ−１Ａ腫瘍およびＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍の増殖が阻害される
化合物１はメルファランと共同して、培養されたＭＭ細胞の生存率を低下させ、ボルテゾミブは実験室（１１）と臨床試験（３３）の両方でメルファランの抗ＭＭ効果を増強するため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこのアルキル化剤と化合物１の併用の有効性を評価した。低用量（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）での単剤のメルファランによる処置は、ＬＡＧκ−１Ａを有するマウスの血清ｈＩｇＧ濃度または腫瘍体積に対して効果がなかった。同様に、単剤の化合物１（１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）を投与した結果、異常タンパク質分泌と腫瘍体積は両方ともあまり減少しなかった。しかし、３週間処置した後、化合物１とメルファランの両方で処置した腫瘍は、溶媒で処置した腫瘍と比較して、ｈＩｇＧ分泌（Ｐ＝０．００１２）と腫瘍体積（Ｐ＝０．０３２）が両方とも著しく減少した（図５Ｄ、Ｅ）。ボルテゾミブ耐性およびメルファラン耐性のＬＡＧκ−１Ｂ腫瘍を有するマウスで、同様の結果が得られた。３ｍｇ／ｋｇ  ＩＰの単剤メルファラン（ＬＡＧκ−１Ａを有するマウスに投与した用量より３倍高い）または１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶの化合物１（ＬＡＧκ−１Ａを有するマウスに投与したのと同じ用量）では、腫瘍体積の増加が部分的に抑制されたが、化合物１をメルファランと併用した場合、腫瘍体積は事実上検出不可能なレベルまで減少した（図５Ｆ）。  
【００８４】
単剤療法と対照的に、どちらかのタイプの腫瘍を有するマウスで併用療法を継続する限り（ＬＡＧκ−１Ａマウスでは６３日間の処置、およびＬＡＧκ−１Ｂマウスでは４９日間の処置）、腫瘍増殖は防止された。さらに、併用療法の忍容性は、各薬剤単独の忍容性と同様であった（データ不示）。
【００８５】
実施例８．化合物１とボルテゾミブで処置したＬＡＧκ−１Ｂマウスの腫瘍ではアポトーシス誘導因子の高い発現が認められる
ＬＡＧκ−１Ｂを有するマウスの腫瘍を処置後に切除し、アポトーシスマーカーであるＡＩＦに関して染色した。単剤の化合物１またはボルテゾミブで処置した腫瘍では、溶媒で処置した腫瘍と比較して、高いＡＩＦ発現が認められた。しかし、ＡＩＦ発現は、両方のＰＩで処置した動物から採取した腫瘍ではさらに増加する（図６）。化合物１＋ボルテゾミブが投与されたＬＡＧκ−１Ａを有するマウスの腫瘍は、この処置群では腫瘍が完全に退縮した後、使用可能な異種移植片試料がなかったため、組織分析に使用できなかった。
【００８６】
実施例９．単剤の経口化合物１はｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＭＭ腫瘍の増殖を阻害した
これらの実験は、実施例４に記載のように、元々ＭＭ患者の骨髄生検材料に由来するＬＡＧκ−１Ａ腫瘍を有するマウスを使用して行った。腫瘍組織を筋肉内に移植した後、マウスを毎日または週２回化合物１で、経口投与により０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で毎日、または経口投与により５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で週２回、処置した。対照群のマウスには化合物１の希釈剤を投与した。
【００８７】
化合物１は、毎日３ｍｇ／ｋｇ経口投与すると、ヒトＩｇＧ濃度と腫瘍体積の両方に関して中程度の抗骨髄腫活性を有する。化合物１は、５ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与した場合、統計学的に有意な抗骨髄腫活性（ＩｇＧ濃度および腫瘍体積）を有する（図７および８）。この計画および用量（毎日５ｍｇ／ｋｇ）では、マウスの８７％が４２日目まで生存した。また、化合物１を１０ｍｇ／ｋｇで週２回経口投与すると、統計学的に有意な抗骨髄腫活性（ＩｇＧ濃度および腫瘍体積）が得られ、マウスの１００％が４２日目まで生存する（図７および８）。
【００８８】
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２９．Ｐｉｖａ  Ｒ，Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｂ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＣＥＰ−１８７７０：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒａｌｌｙ−ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１１：２７６５−７５．
３０．Ｃｈｏｕ  ＴＣ，Ｔａｌａｌａｙ  Ｐ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇｓ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ  １９８４；２２：２７−５５．
３１．Ｃｈｏｕ  ＴＣ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ２００６；５８：６２１−８１．
３２．Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＲＡ，Ｂｅｒｅｎｓｏｎ  ＪＲ．Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４０，ｕｎｉｔ  ４９．Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；２００８：１４．９．１−２２．
３３．Ｂｅｒｅｎｓｏｎ  ＪＲ，Ｙａｎｇ  ＨＨ，Ｓａｄｌｅｒ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ  ａｎｄ  ｍｅｌｐｈａｌａｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４：９３７−４４．
３４．Ｄｅｍｏ  ＳＤ，Ｋｉｒｋ  ＣＪ，Ａｕｊａｙ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＰＲ−１７１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：６３８３−９１．
３５．Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＬＪ，Ｗａｌｋｅｒ  Ｂ，Ｏｖａａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ＢｚＬＬＬＣＯＣＨＯ，ＰＳ−３４１，ａｎｄ  ＭＧ−１３２．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６：６３７９−８６．
３６．Ｓｕｎｔｅｒｓ  Ａ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ＣＪ，Ｂａｇｓｈａｗｅ  ＫＤ，Ｓｏｕｈａｍｉ  ＲＬ，Ｈａｒｔｌｅｙ  ＪＡ．Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＤＮＡ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｉｌｉｎｅ  ｍｕｓｔａｒｄｓ  ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ  ａｎｄ  ４−［ｂｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９２；４４：５９−６４．
３７．Ａｈｎ  ＫＳ，Ｓｅｔｈｉ  Ｇ，Ｃｈａｏ  ＴＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ  Ａ（ＮＰＩ−００５２）ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１１０：２２８６−９５．
３８．Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｓ  ＰＣ，Ｂｏｕｌｗａｒｅ  Ｄ，Ｈａｚｌｅｈｕｒｓｔ  ＬＡ，Ｄａｌｔｏｎ  ＷＳ．Ｔｈｅ  ＦＡ／ＢＲＣＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｍｅｌｐｈａｌａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｅｌｐｈａｌａｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０６：６９８−７０５．
３９．Ｊａｃｑｕｅｍｏｎｔ  Ｃ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｔ．Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｆａｎｃｏｎｉ  ａｎｅｍｉａ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：７３９５−４０５．
４０．Ｚｗｅｅｇｍａｎ  Ｓ，Ｈｕｉｊｇｅｎｓ  ＰＣ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｍａ：ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２００２；１３：３３９−５１．
４１．Ａｒｇｙｒｉｏｕ  ＡＡ，Ｉｃｏｎｏｍｏｕ  Ｇ，Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ＨＰ．Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：１５９３−９．
４２．ＶＥＬＣＡＤＥＲ（登録商標）Ｆｕｌｌ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
４３．ＡＬＫＥＲＡＮＲ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＡＬＫＥＲＡＮＲ（登録商標）ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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