(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＶＥＧＦを含み、フィブリノンーゲン及び凝固因子ＸＩＩＩを更に含む、医薬的及び／又は化粧的用途のための、血小板成長因子濃縮物であって、無傷な血液細胞又はその破片を含まない、濃縮物。
【請求項２】
血液細胞関連輸血反応のリスクがないことを特徴とする、請求項１に記載の血小板成長因子濃縮物。
【請求項３】
フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド因子、及び凝固因子ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ及びＸＩからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を更に含む、請求項１又２に記載の血小板成長因子濃縮物。
【請求項４】
請求項１に記載の血小板成長因子濃縮物であって、
‐凝固可能な血小板成長因子濃縮物のコレステロール濃度が、１００ｍｇ／ｄｌ未満；及び／又は
‐凝固可能な血小板成長因子濃縮物のトリグリセリド濃度が、１００ｍｇ／ｄｌ未満；及び／又は
‐凝固可能な血小板成長因子濃縮物のＨＤＬ濃度が、３０ｍｇ／ｄｌ未満である。
‐凝固可能な血小板成長因子濃縮物のＬＤＬ濃度が、８０ｍｇ／ｄｌ未満である、血小板成長因子濃縮物。
【請求項５】
血小板成長因子濃縮物の製造法であって、以下のステップ：
ａ）出発血小板濃縮物と溶媒及び／又は界面活性剤とを接触させ、ここで、該溶媒は、ジ又はトリアルキルホスフェート及び異なったアルキル鎖を有するジ-又はトリアルキルホスフェートからなる群から選択され、該界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、デオキシコール酸ナトリウム及びスルホベタインからなる群から選択される、
ｂ）出発血小板濃縮物と溶媒及び／又は界面活性剤とを、少なくとも５分から６時間、６．０から９．０の範囲内に維持されたｐＨ、及び２℃から５０℃の範囲内の温度でインキュベートし、
ｃ）オイル抽出及び／又はクロマトグラフィ法により溶媒及び／又は界面活性剤を除去すること、ここで、オイル抽出は医薬グレードのオイルで行われ、該オイルは、血小板濃縮物と溶媒及び／又は界面活性剤との混合物の重量基準で、２から２０重量％、５から１５重量％又は５から１０重量％の量で用いられる、そして
ｃ’）遠心分離ステップを、細胞破片を除くためのオイル抽出及び/又はクロマトグラフィの後に行うこと
を含む、製造法。
【請求項６】
前記溶媒がトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ ８０である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記溶媒及び／又は界面活性剤の各々の最終濃度が、出発血小板濃縮物の体積に対して、０．２から５％の体積である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
出発血小板濃縮物の体積に対して２％ＴｎＢＰのみ、又は１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５のいずれかを、血小板濃縮物に接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィ法が、疎水性カラムであり、該カラムがＣ１８シリカ充填材、又は溶媒‐界面活性剤除去クロマトグラフィーレジンを含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフィ法が、アニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフィカラムを含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
更なるステップ（ｃ１）を含み、該ステップ（ｃ１）は、少なくとも１つのアニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフィ分離を含む、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カチオン性クロマトグラフィが、強カチオンクロマトグラフィであり、及び／又は前記アニオン性クロマトグラフィが弱アニオンクロマトグラフィである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）が、少なくとも１回のオイル抽出、続いて強カチオン交換体でのクロマトグラフィ及び弱アニオン交換体でのクロマトグラフィを含み、該強カチオン交換体がＳＰ−セファロースであり、該弱アニオン交換体がＤＥＡＥ−セファロースである、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
５０００ダルトン以下の切断値を有する膜での限外ろ過による更なる濃縮のステップ（ｄ）を含む、請求項５〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
１０から７５ｎｍのポアサイズのろ過膜を用いるナノろ過の、更なるステップ（ｅ）を含む、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップａ）の前に、出発血小板濃縮物を調製することからなる予備ステップを含む、請求項５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の血小板成長因子濃縮物を含む、凝集塊を形成するための医薬的及び／又は化粧的組成物であって、該濃縮物がトロンビンと混合されている、組成物。
【請求項１９】
活性が２０ＩＵ／ｍｌから１０００ＩＵ／ｍｌの範囲にある０．１から１体積のトロンビンと、血小板成長因子濃縮物の１体積とを混合する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記トロンビンがヒトトロンビンである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１項に記載の血小板成長因子濃縮物を含む医薬組成物。
【請求項２２】
凝集塊を形成するための医薬及び／又は化粧的組成物を製造するための、請求項１に記載の血小板成長因子濃縮物の使用。
【請求項２３】
骨再生又は軟組織及び硬組織治癒のための医薬及び／又は化粧的組成物を製造するための、請求項１に記載の血小板成長因子濃縮物の使用。
【請求項２４】
インビトロ又はエクスビボでの細胞培養のための医薬的及び／又は化粧的組成物を製造するための、請求項１に記載の血小板成長因子濃縮物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は血小板誘導体の分野に関し、より具体的には血小板から得た成長因子濃縮物に関する。本発明はまた、このような成長因子濃縮物を調製する方法、及び治療及び／又は化粧に応用するための凝固可能な血小板成長因子濃縮物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
組織の創傷治癒と組織再生を支配する機作及び経路は詳細に研究されおり、殊に外傷後に生ずる細胞及び分子現象は、身体の様々な組織で大抵は共有されていることが示されている。共通の機作は従って、初期及び後期の炎症段階、細胞の増殖及び遊走、血管新生、肉芽組織の形成、そして最終的には基質形成と再構築を含む。
【０００３】
興味深いことに、この現象のカスケードは架橋フィブリン及びビトロネクチン、フィブロネクチン及びトロンボスポンジンのような種々の蛋白質を特徴とする血餅形成により受傷直後から開始され、そして更に出血を抑え侵入細胞の基質としての役割を果たすと同時に、病原体の侵入に対するバリアを提供する。更に、この初期の血餅は治癒過程後期に必要とされる細胞誘導体の保存場所としての役割を果たす。
【０００４】
具体的には、組織修復過程のあらゆる段階は、膜貫通受容体の細胞外ドメインと直接物質的な相互作用を通して細胞機能を調節する多様な因子、サイトカイン及び蛋白質によって、仲介、制御されていると思われる。後半の二次シグナル変換機は、それによって細胞内生態の様々な局面を制御する。
【０００５】
組織再生に関する成分全ての役割については、ほんの一部が解明されているにすぎないが、これらの成分の多く、特に血小板誘導体、更に具体的には血小板由来成長因子は潜在的な効果を有することが明らかにされてきている。
【０００６】
血小板由来の成長因子は、特に走化性と遊走性を示すことが知られており、そして走化性、細胞増殖、血管新生、細胞外基質沈着及び再構築のような軟組織及び硬組織の治癒と再生、及び細胞増殖の強化とに直接関わっているように見える。
【０００７】
更に、血小板誘導体は繊維芽細胞、マクロファージ、内皮細胞、又はリンパ球のようなバイスタンダー細胞によるケモカイン及びサイトカイン産生の刺激のように、密接に関連する生物学的機能にも間接的にも関わっている。
【０００８】
血小板に富む製剤、及び血小板のゲル、接着剤及び放出物は、従って、単独又は移植用生体材料との組み合わせでの使用が増加しており、様々な臨床又は治療への応用における血小板誘導体又は血小板成長因子の供給源となっている。
【０００９】
このような血小板含有又は血小板由来製剤は、殊に骨の大欠損、複雑な頭蓋形成、及び慢性的な傷、例えば、口腔及び顎顔面外科、整形外科、歯周外科及び形成外科における傷の治療、及び慢性潰瘍、歯科及び口腔インプラント学における骨及び軟組織の再生治療並びに筋骨格疾患治療において、特に有効であることが見出されている。
【００１０】
更に、血小板放出物は特に、間葉幹細胞の生体外での増殖と分化、及び軟骨細胞、内皮細胞並びに繊維芽細胞の増殖促進に関わることが示され、それによって軟骨再生と創傷治癒のための治療効果を拡大する可能性が裏付けられる。
【００１１】
局所適用のための血小板由来製剤、例えばゲル、接着剤及び放出物は通常、濃厚血小板と血小板顆粒内容を放出させることができる活性剤を混合することにより調製し、血小板の生理学的活性化を再現する。
【００１２】
活性化工程は一般に、血液又は血小板採取の間に添加された抗凝固剤の効果に拮抗する外来性トロンビンを直接添加するか又は塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）を使用することにより行われ、そして凝固カスケードと内因性トロンビンの放出を引き起こす。
【００１３】
内因性及び外因性のトロンビンは又、フィブリノーゲンの重合とフィブリン由来の生体材料（凝集塊）を誘導し、それによって、血小板内に封入されている、種々の血小板成長因子のような成分を含む多面的な混合物の放出へと続く。
【００１４】
ごく最近、レグラネクス（ヒトＰＤＧＦ−ｂｂ）（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｃｉｌａｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔ．）のような従来の発現システムでの組み換え血小板成長因子の製造において、新たな方法が開発された。しかし、入手可能な組み換え成長因子は非常に数が限られている。これらの成長因子の分離、同定、クローン化及び発現が困難なことが１つの理由である。更に、成長因子の併用による相乗効果が観察されるので、血小板由来製剤はそれでも尚、単一の組み換え因子の使用に対して補助的な効果をもたらす。
【００１５】
現行の血小板含有又は血小板由来製剤の主な欠点の１つは、このような製剤の適当な標準化と定義がないことであり、これが様々な治療効果を有する血小板濃縮製品の特性にばらつきを与える結果となる。
【００１６】
実際、血小板濃度から血小板誘導体における成長因子濃度を予測するという単純な仮定は確実ではない。なぜなら、血小板の採取及び／又は活性化に用いられる処理方法は、その技術的特徴として成長因子含有量とその結果の臨床効果に影響を及ぼすからである。その結果得られた製品の不均一性は、例えば、血小板濃度、出発物質中の白血球の存在、種、年齢、及び出発物質の保存条件及び活性化手段と同様に異なるパラメータに依存している。これらの変動が製品間での大きな差を生じ、結果として生物学的特性及び治癒能力のような治療効果の差につながることは明白である。
【００１７】
例えば、無傷の血小板を含む液剤／ゲルを直接創傷部位に適用すると、血小板の活性化に伴いフィブリン塊が素早く形成されるが、血小板が完全に溶解しないものもある。このように様々な量の無傷血小板がフィブリン塊の中に封入されているため、それが放出された成長因子の実際の量の測定を困難している。
【００１８】
更に血小板ゲル及び／又は成長因子製剤が、血小板活性化につながるトロンビン活性過程により得られると、これらの血小板誘導体は完全にフィブリノーゲンが枯渇し、もはや凝固せず、従って創傷部位に適用する前に外来の天然物か合成製品と混合することが必要になる。
【００１９】
更に、治療用の局所血小板製剤は自己を供給源として製造されていることが多い。自己濃厚血小板は手術の数時間又は数日前に患者が提供した血液からポイント・オブ・ケアで応用するために調製されることを意味する。従って、これらの使用は大抵の場合、限られた体積の血小板ゲルを必要とする計画された手術であって、血液を提供できる程度に健康な患者のために用意されるものである。それに加え、手術部位で自己の調製品の製造は、十分に管理されていない状態でしばしば行われるという欠点があり、それゆえ、再現可能な成長因子の放出と臨床効果を確実にするために必要な標準化を欠いている。
【００２０】
従って、期待される血小板誘導体製剤、さらに具体的には標準化された状態での血小板成長因子濃縮物であって、それにより個々の特有な生理病理学的状態に適合した製剤の処方を可能にする製剤を提供する方法が強く望まれている。
【００２１】
更に、現行の血小板由来製品の別の主要な欠点は、無傷の血球細胞又は重要な血球細胞断片の存在が必須なことであり、血小板由来製品の供給源が異種の場合、それによって提供者の抗原に対する抗体による免疫反応の発現を引き起こす。
【００２２】
更に、現行の血小板由来製品の別の主要な欠点は、生物製品の使用に伴う感染リスクが避けられないことである。実際、高度に発展した規制環境と血液採取設備を有する国の最新技術により試験された、単一提供者からのヒト同種異系濃厚血小板は高い安全性を有するにもかかわらず、そしてアフェレーシスやできうる限りの無菌的調製条件を保証する全血からの血小板製剤のように標準的な血液銀行方法であっても、ウイルスや細菌感染はそれでもなお、血小板誘導体の使用で生じやすい。血小板誘導体及び血小板成長因子におけるウイルスの無毒化のために、局所適用の同種異系血小板製剤のウイルスに対する最適な安全マージンを確保することが強く望まれる。
【００２３】
最後に、老齢人口と慢性疾患数の増加は近い将来に何らかの対応をせざるを得ない重要且つ高まる健康問題を提起している。様々な治療方法、例えば手術、抗生物質投与、栄養強化、又は組織移植等が既に存在するが、組織創傷治癒と組織再生に使用される、効率よく且つ経済的に魅力ある成分に対する要求が高まりつつある。
【発明の概要】
【００２４】
驚くべきことに、本発明者は以下に記載された凝固可能な血小板成長因子濃縮物及びそれらの製造方法を用いてこれらの目標を達成し得ることを見出し、徹底して研究を行った。
【００２５】
本発明の方法は、特に簡便で短時間且つ効果的な血小板誘導体製剤、そして更に具体的には出発濃厚血小板又はプールされた濃厚血小板からの凝固可能な血小板成長因子濃縮物を提供できる。更に、本発明の方法は最新技術で開示された他の方法と比べて、全ての、少なくともより重要な血小板成長因子、そしてより具体的には成長因子であるＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β及びＥＧＦの回収を有意に増加する。
【００２６】
更に、本発明の方法は脂質膜の溶解し、従って脂質エンベロープウイルス、そして例えば細菌のようなその他の病原体、原虫のような寄生体の不活化、及び出発濃厚血小板に存在する血漿や血小板脂質の除去を可能にする。
【００２７】
本発明の方法は、治療法又は細胞療法に使用するために効率よく標準化されるウイルスが不活化された凝固可能な血小板板成長因子濃縮物の提供を可能にする。
【００２８】
定量的又は機能的な血小板減少症を是正するために臨床的に静脈内で使用するときは、１つには細菌汚染のリスクを考慮して、血小板の保存期間は５日又は７日とした。５日又は７日を経過した高単位の血小板は毎年廃棄した。保存期間を超えた保存血小板を使用する血小板由来濃縮物調製のために使用できるので、本発明の方法は最終的に経済的には大変有望である。
【００２９】
本発明の目的は治療及び／又は化粧用途の凝固可能な血小板成長因子濃縮物である。好ましい態様において、凝固可能な血小板成長因子濃縮物は成長因子のＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＣＴＧＦ、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを含む。
【００３０】
別の好ましい態様において、凝固可能な血小板成長因子濃縮物は血球関連の輸血反応を引き起こさない。
【００３１】
別の好ましい態様において、凝固可能な血小板成長因子濃縮物はフィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド因子及び凝固因子ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、及びＸＩからなる群から選択される少なくとも１つの蛋白質を含む。
【００３２】
本発明の別の目的は本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物を調製する方法であり、濃厚血小板と溶媒及び／又は界面活性剤とを接触させ、濃厚血小板と溶媒及び／又は界面活性剤を少なくとも５分から６時間、約６．０から９．０の範囲にｐＨを保ち、２から５０℃の範囲、好ましくは２５から４５℃の範囲内の温度でインキュベートし、溶媒及び／又は界面活性剤をオイル抽出及び／又はクロマトグラフィ法で除去する工程を含む。
【００３３】
好ましい態様において、本発明の方法で使用される溶媒はジ又はトリアルキリンホスフェート、異なるアルキル鎖を有するジ又はトリアルキリンホスフェートであり、そして好ましくはトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）である。
【００３４】
好ましい態様において、本発明の方法で使用される界面活性剤は脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、非イオン性界面活性剤、デオキシコール酸ナトリウム及びスルホベタインからなる群において選択され、そしてより好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ‐４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ‐１００、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｗｅｅｎ  ２０からなる群において選択される。
【００３５】
好ましい態様において、本発明の方法で使用される各々の溶媒及び／又は界面活性剤の最終濃度は、出発濃厚血小板の体積に対して、０．２から５％の体積、好ましくは０．２から２％の体積の範囲である。本発明の方法の好ましい態様において、出発濃厚血小板は濃厚血小板の体積に基づいて、２％ＴｎＢＰのみ、あるいは１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ‐４５と接触させる。
【００３６】
更に本発明の好ましい態様において、オイル抽出は医薬品グレードのオイルを用いて行い、血小板濃縮剤と溶媒及び／又は界面活性剤との混合物の重量に基づいて、前記オイルは２から２０重量％、又は５から１５重量％又は５から１０重量％の量で使用されている。
【００３７】
別の好ましい態様において、Ｃ１８シリカ充填剤又はＳＤＲ（溶媒‐界面活性剤除去）ｈｙｐｅｒ  Ｄのような、等を含む手クロマトグラフィ法を使用して溶媒及び／又は界面活性剤を除去する。
【００３８】
好ましい態様において、本発明の方法は、１０から７５ｎｍのポアサイズの濾過膜又は同様なウイルス除去膜を使用し、得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物のナノ濾過を行うことからなる追加の工程を含む。
【００３９】
別の好ましい態様において、本発明の方法は更に、５０００ダルトン又はそれ以下の切断値を有する限外濾過膜を用い、成長因子及び凝固可能なフィブリノーゲンを治療応用又は細胞療法に最適な濃度まで濃縮するように設計された限外濾過工程を含む。
【００４０】
好ましい態様において、本発明の方法は出発濃厚血小板を調製する予備工程を含み、前記出発濃厚血小板は、アフェレーシス又は全血から分離したバフィーコートから調製され、そして新鮮で保存期間を超えて保存された液体、又は期保存期間を超えて凍結保存された液剤のどちらかである。
【００４１】
本発明の別な目的は、本発明又は本発明の方法で得られる血小板成長因子濃縮物をトロンビンと混合することからなる凝集塊を形成するための方法である。凝集塊を形成するために前記方法で使用されたトロンビンはヒト由来が好ましい。特定の態様では、活性が２０ＩＵ／ｍｌから１０００ＩＵ／ｍｌの範囲にあるトロンビンの０．１から１体積と本発明又は本発明の方法で得られる凝固可能な血小板成長因子濃縮物の１体積とを混合する。
【００４２】
別の好ましい態様において、例えばＣ１８シリカ充填剤又はＳＤＲ（溶媒‐界面活性剤除去）ｈｙｐｅｒ  Ｄを含むような疎水性タイプのクロマトグラフィ法を使用して溶媒及び／又は界面活性剤を除去する。ＳＤ及び／又はＤＥＡＥ型のクラロマトグラフィー（アニオン性／カチオン性クラロマトグラフィー）も溶媒及び／又は界面活性剤を除去するために使用できる。
【００４３】
本発明の別な目的は、本発明又は本発明の方法で得られる医薬品又は凝固可能な血小板成長因子濃縮物を含む足場である。
【００４４】
本発明の別な目的は、凝血塊形成、又は骨再生又は創傷治癒、又は創傷は生体内あるいは生体外の細胞培養のために、医薬品又は本発明又は本発明の方法で得られる血小板成長因子濃縮物を使用することである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】研究計画：ドナーアフェレーシス血小板（Ｎ＝８）を２つの小プールに分けた。小プール１はＣａＣｌ2による事前の活性化なしに直接１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５で１時間処理した。小プール２は最初に２３ｍＭ  ＣａＣｌ2及びビーズにより活性化し、血小板ゲルを形成した。１時間のインキュベーション後、凝集塊が除去され放出物が１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５で１時間処理された。（溶媒−界面活性剤）Ｓ／Ｄ処理された両液は、溶媒及び界面活性剤を除去するためにオイルで抽出（３回）した。活性後、及びＳ／Ｄ処理−オイル抽出後に、出発血小板における成長因子の含有量を測定した。
【図２】出発濃厚血小板（ｓｔａｒｔ）、Ｓ／Ｄ直接処理（１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）（Ｓ／Ｄ）後、出発濃厚血小板のＣａＣｌ2による活性化（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ）後及びＣａＣｌ2活性化血小板放出物のＳ／Ｄ（１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）処理（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ＋Ｓ／Ｄ）における（Ａ）ＰＤＧＦ−ＡＢ；（Ｂ）ＴＧＦ−β１；（Ｃ）ＥＧＦ；及び（Ｄ）ＩＧＦの含有量（ｎｇ／ｍｌ）。Ｓ／Ｄ処理は材料及び方法で記載されたように行い、Ｓ／Ｄ剤除去のために３回のオイル抽出を行った。
【図３】出発濃厚血小板（Ｓｔａｒｔ）、出発濃厚血小板のＣａＣｌ2による活性化（Ａｃｔ）に続くウシトロンビン活性化（Ａｃｔ−Ｔ）後及びＳ／Ｄ処理（１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）（ＡｃｔＴ−Ｓ／Ｄ）後（Ａｃｔ−Ｔ）における（Ａ）ＰＤＧＦ−ＡＢ；（Ｂ）ＴＧＦ−β１；及び（Ｃ）ＥＧＦの含有量（ｎｇ／ｍｌ）。Ｓ／Ｄ処理は材料及び方法で記載されたように行い、Ｓ／Ｄ剤除去のために３回のオイル抽出を行った。
【図４】出発濃厚血小板（レーン１）、本発明に係る溶媒‐界面活性剤により処理された同一濃厚血小板（レーン２）及びＣａＣｌ2により活性化された同一濃厚血小板（レーン３）間での蛋白質組成物の比較。４％〜１２％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥでサンプルが分離され、そして蛋白質がクマシー染色で着色された。レーンＭは蛋白質マーカー（キロダルトンにおけるサイズがゲル左側に表示）。
【図５】Ｓ／Ｄ処理（１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）（Ｓ／Ｄ−ＰＣ）、又はＣａＣｌ2活性化（Ａｃｔ−ＰＣ）、又は任意にＣａＣｌ2活性化後Ｓ／Ｄ処理（Ａｃｔ−ＰＣ＋Ｓ／Ｄ）された保存期間を超えた凍結血小板から得られた、それぞれの濃縮物のＰＤＧＦ−ＡＢ（図５ａ）及びＥＧＦ（図５ｂ）組成物の比較。
【図６】Ｓ／Ｄ処理（１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）（Ｓ／Ｄ−ＰＣ）、又はＣａＣｌ2活性化（Ａｃｔ−ＰＣ）された保存期間を超えた凍結血小板から得られた、それぞれの濃縮物のＩＧＦ−Ｉ（図６ａ）及びＴＧＦ−β１（図６ｂ）組成物の比較。
【図７】種々のクロマトグラフィゲル（ＣＭ、ＳＰ及びＤＥＡＥ）上での吸着試験後に上清に残存するＰＤＧＦ−ＡＢ含有量（ｎｇ／ｍＬで表示）。各ゲルに対して左から右に示された結果が、それぞれ１ｍＬのゲル当たり３ｍＬ、６ｍＬ、９ｍＬ又は１０ｍＬのＳＤ−ＰＣに対応する。
【図８】各種のクロマトグラフィゲル（ＣＭ、ＳＰ及びＤＥＡＥ）上でのＶＥＧＦの吸着％。
【図９】各種のクロマトグラフィゲル（ＣＭ、ＳＰ及びＤＥＡＥ）上でのＴＧＦ−β１の吸着％。
【図１０】各種のクロマトグラフィゲル（ＣＭ、ＳＰ及びＤＥＡＥ）上でのＥＧＦの吸着％。
【図１１】ＳＰ−セファロース上で１回のオイル抽出後最初の分離／精製工程を含む本発明の方法における特定の態様での模式図。ＳＰ−セファロースから得られたＰＤＧＦ溶出液はＰＤＧＦ及びＶＥＧＦの両方の成長因子を含む。ＳＰ−セファロースの結果得られたカラム通過画分は更にＤＥＡＥ−セファロース上で分離／精製され、ＴＧＦ−β及びＥＧＦ成長因子の両方を含むＴＧＦ−β溶出液が調製される。
【図１２】出発ＰＣ、溶媒‐界面活性剤で処理されたＰＣ、１回のオイル抽出及び遠心分離後溶媒‐界面活性剤で処理されたＰＣ（ＳＤ−ＰＣ＠）、ＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−ＢＫＴ）上にロード後のカラム通過画分及びＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−Ｅ１Ｍ）から回収した溶出液におけるｎｇ／ｍｌで表示されたＥＧＦ量。
【図１３】１回のオイル抽出及び遠心分離後溶媒‐界面活性剤で処理されたＰＣ（ＳＤ−ＰＣ＠）、ＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−ＢＫＴ）上にロード後のカラム通過画分及びＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−Ｅ１Ｍ）から回収した溶出液におけるｎｇで表示されたＥＧＦ総量。
【図１４】１回のオイル抽出及び遠心分離後溶媒‐界面活性剤で処理されたＰＣ（ＳＤ−ＰＣ＠）、ＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−ＢＫＴ）上にロード後のカラム通過画分及びＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−Ｅ１Ｍ）から回収した溶出液におけるｎｇで表示されたＶＥＧＦ総量。
【図１５】１回のオイル抽出及び遠心分離後溶媒‐界面活性剤で処理されたＰＣ（ＳＤ−ＰＣ＠）、ＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−ＢＫＴ）上にロード後のカラム通過画分及びＤＥＡＥセファロースＦＦ（ＤＥＡＥ−Ｅ１Ｍ）から回収した溶出液におけるｎｇで表示されたＰＤＧＦ−ＡＢ総量。
【図１６】ＭＴＳアッセイの結果。（Ａ）１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加（１０％ＦＢＳ）、ＦＢＳ非添加（ｗ／ｏＦＢＳ）、１０％（ｖ／ｖ）活性化ＰＣ放出物（ＡｃｔＰＣ）添加、及びＣ１８（１０％Ｃ１８）、ｔＣ１８（１０％ｔＣ１８）又はＳＤＲ（１０％ＳＤＲ）上でのクロマトグラフィ後の１０％（ｖ／ｖ）ＨＰＧＦ混合物添加のＤ−ＭＥＭ中；（Ｂ）１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加又はＣ１８後の３、５、７．５、１０、１５、又は２０％（ｖ／ｖ）ＨＰＧＦ混合物添加のＤ−ＭＥＭ中で培養されたＨＥＫ２９３Ａ線維芽細胞。（Ｃ）１０％ＦＢＳ添加、ＦＢＳ非添加（ｗ／ｏ  ＦＢＳ）、又はＣ１８後の０．１、０．５、１、２、３、５、７、１０、１５、又は２０％（ｖ／ｖ）ＨＰＧＦ混合物添加のＤ−ＭＥＭ中で培養されたＳＩＲＣ線維芽細胞。製造者の使用説明書によるＭＴＳ細胞増殖アッセイを用い、５日後に細胞生存率を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本発明の目的は治療及び／又は化粧用途のための凝固可能な血小板成長因子濃縮物である。
【００４７】
本明細書で使用される用語「凝固可能な」は、本発明に係る又は本発明の方法により得られた血小板成長因子濃縮物はフィブリノーゲンと凝固因子ＸＩＩＩの両方を含み、そしてそれによって治療への応用が必要なとき、トロンビンのような適当な活性剤と混合すると凝集塊を生成できることを意味する。
【００４８】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物のフィブリノーゲン濃度は好ましくは１より高く、より好ましくは１，５より高く、より好ましくは２．５ｇ／Ｌより高く、そして凝固因子ＸＩＩＩの濃度は好ましくは０．５より高く、より好ましくは０．７５、さらに好ましくは１．０ｉｕ／ｍｌより高い。
【００４９】
本明細書で使用される用語「化粧的用途」は、人体の様々な表面部分、特に皮膚、髪、爪、唇、外性器、又は歯及び口腔内粘膜との接触を意図する処置を意味し、これらの外観に清潔さ、芳香、保護、変化を与えるか又は良好な状態に保つことを目的とする。
【００５０】
本明細書で使用される用語「治療用途のため」は、薬学、免疫学又は代謝効果によってヒト及び／又は動物の疾患を治療し、それらの生理的機能を回復、修正又は変更するための治療又は予防処置を意味する。
【００５１】
本発明又は本発明の方法により得られる凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、溶媒及び／又は界面活性剤が存在せず及びウイルスに対して安全という２つの理由で、特にヒト及び／又は動物の疾患を治療し、及び／又はそれらの体表面部分と接することに適する。
「溶媒及び／又は界面活性剤がなく」との表現は、凝固可能な血小板成長因子濃縮物中の溶媒及び／又は界面活性剤のレベルは極めて低く、そして好ましくは検出できないことを意味する。実際、当業者は溶媒及び／又は界面活性剤の濃度の増加は長期毒性と直接関連し、そしてより具体的には神経学的疾患の発症（例えばＪ．Ｐ．Ｒ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，  Ｓ．Ｔｒａｎｓｕｅ及びＥ．Ｌ．Ｓｎｙｄｅｒ、「Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１，ｐｐ．２０５−２４２，２００６に記載）と関連することは既知である。
【００５２】
従って、「溶媒がなく」との記載は、本発明において溶媒濃度が１００ｐｐｍ未満であり、好ましくは５０ｐｐｍ未満、好ましくは２０ｐｐｍ未満、好ましくは１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、そして更に好ましくは１ｐｐｍ未満であることを意味する。
【００５３】
更に「界面活性剤がなく」との記載は、本発明において界面活性剤濃度が５００ｐｐｍ未満であり、好ましくは２５０ｐｐｍ未満、より好ましくは１００ｐｐｍ未満、より好ましくは５０ｐｐｍ未満、そして更に好ましくは１０ｐｐｍ未満である。
【００５４】
「ウイルスに対して安全」との記載は、凝固可能な血小板成長因子濃縮物は実質上感染性ウイルス、より好ましくは脂質含有ウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ），ＴＴウイルス、デングウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）、サル泡沫ウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス）及びその他の脂質エンベロープ肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、乳酸脱水素酵素ウイルス、ヘルペス群ウイルス、ラブドウイルス、白血病ウイルス、ミクソウイルス、アルファウイルス、アルボウイルス、パラミクソウイルス、アレナウイルス及びコロナウイルスが存在しないことを意味する。
【００５５】
「実質上存在しない」との意味は、凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、その「ウイルスバリデーション試験に関する手引書」（資料ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５）において、欧州医薬品審査庁（ＥＭＥＡ）の欧州医薬品委員会（ＣＰＭＰ）による厳しいウイルス減少工程を特徴とすることが要求されているように、ウイルスの不活性化程度が少なくとも４ｌｏｇ10より大きく、そして好ましくは５ｌｏｇ10より大きく、更に好ましくは６ｌｏｇ10より大きい。従って脂質エンベロープウイルスによる血液感染患者への感染に関与する見込みはない。
【００５６】
本発明に係る又は本発明の方法により得られる凝固可能な血小板成長因子濃縮物は更に以下の機能的な成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ａ及びＢ鎖のヘテロダイマー及び／又はＡ−Ａ及び／又はＢ−Ｂ鎖のヘテロダイマー（ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−Ｂ）としてのどちらか、ＴＧＦ−β１及び／又はＴＧＦ−β２及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーを含む。
【００５７】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物におけるＰＤＧＦ濃度は９０ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１００より高く、好ましくは１２０より高く、好ましくは１５０より高く、好ましくは１８０より高く、そして好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌより高い。
【００５８】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物におけるＴＧＦ−β１濃度は１００ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは１４０より高く、好ましくは１６０より高く、好ましくは１８０より高く、そして好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌより高い。
【００５９】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物におけるＩＧＦ濃度は少なくとも出発濃厚血小板におけるものと同じであり、そして好ましくは６５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは７５より高く、好ましくは８０より高く、そして好ましくは１００ｎｇ／ｍｌより高い。
【００６０】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物におけるＥＧＦ濃度は好ましくは０．５より高く、好ましくは１より高く、好ましくは１．５より高く、好ましくは２より高く、そして好ましくは２．５ｎｇ／ｍｌより高い。
【００６１】
特定の態様において、本発明に係るＳＤ処理及びオイル抽出後の凝固可能な血小板成長因子濃縮物におけるＶＥＧＦ濃度は、０．５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは０．７５、好ましくは１、そして好ましくは１．５ｎｇ／ｍｌより高い。
【００６２】
特定の態様において、本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は低脂質含有量が要求される疾病での使用に適する。本発明で使用されるように、「低脂質含有量が要求される疾病で」との表現は、本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は脂質が枯渇している、即ち、本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物のコレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ及びＬＤＬのレベルは、出発濃厚血小板のレベル又は本技術分野で既知の血小板活性化により得られた成長因子濃縮剤のレベルより優位に低い。本発明の凝固可能な血小板由来成長因子濃縮物の脂質、特にコレステロール、トリグリセリド、及びＬＤＬにおけるきわめて低いレベルのおかげで、この濃縮剤は特定の疾患、例えば心血管合併症の高いリスクを示す患者又は心臓の高リスク疾患に罹患する患者での使用に適する。何故なら治療を受けた患者に供される脂質量は極めて少ないので、動静脈系内でのプラーク形成の結果続いて起きる血管閉塞のリスクは非常に減少するからである。
【００６３】
本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物中のコレステロール量は、１００未満が好ましく、より好ましくは５０未満、そして更に好ましくは３５ｍｇ／ｄｌ未満である。
【００６４】
本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物中のトリグリセリド量は、１００未満が好ましく、より好ましくは５０未満、そして更に好ましくは３０ｍｇ／ｄｌ未満である。
【００６５】
本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物中のＨＤＬ量は、３０未満が好ましく、より好ましくは１５未満、そして更に好ましくは１０ｍｇ／ｄｌ未満である。
【００６６】
本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物中のＬＤＬ量は、８０未満が好ましく、より好ましくは５０未満、更に好ましくは２０未満、そして更に好ましくは５ｍｇ／ｄｌ未である。
【００６７】
更に、本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物中の極少量及び／又は検出限界以下程度の脂質量は、安定性を増し、血小板成長因子の大規模精製時にはそのプロセスを容易にする。これはアニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフィ分離プロセスを実施するときに、特に有用になるだろう。
【００６８】
特定の態様において、本発明又は本発明の方法により得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、血液細胞関連の輸血反応には至らない。
【００６９】
「血液細胞関連輸血反応」は、この凝固可能な成長因子濃縮剤は無傷の生細胞（例えば赤血球、血小板及び白血球など）が存在しないので、患者の免疫学的（例えば同種免疫）及び溶血に伴う合併症を含む様々な既知の輸血反応を回避することができる（例えば、Ｓｔｒｏｎｃｅｋ  ｅｔ  Ｒｅｂｕｌｌａ，”Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ，”Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，Ａｕｇｕｓｔ  ４，２００７；ｖｏｌ．３７０：４２７−４３８を参照）ことを意味する。実際、免疫が保たれているレシピエントはしばしばドナーの血液細胞抗原に対する免疫反応を示し、血液細胞と関連する特異的抗原に依存する種々の臨床的帰結をもたらすことになる。最も一般的に関与する抗原は、次のカテゴリから選択される：（１）血小板及び白血球で共有されるＨＬＡｓクラスＩ、（２）ある種の白血球に存在するＨＬＡｓクラスＩＩ、（３）顆粒球特定的抗原、（４）血小板特異的抗原（例えば、ヒト血小板抗原ＨＰＡ）、そして（５）赤血球特異的抗原。
【００７０】
より具体的には、本発明の調製方法に関して、血液生細胞（赤血球、白血球及び血小板）は溶媒‐界面活性剤処理で破壊／溶解し、それによって患者が外来抗原及び無傷赤血球へ暴露されるリスクを減少し、好ましくは抑制する。従って、本発明の方法は治療を受けた患者から得られた血小板又は同種血小板からの凝固可能な血小板成長因子濃縮物を調製することができる。
【００７１】
特定の態様において、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、更にフィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジンからなる群、及び／又は凝固因子ＩＩ（プロトロンビン）、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、及びフォンビルブランド因子からなる群において選択される少なくとも１つの蛋白質を含む。
【００７２】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物中のフィブロネクチンの濃度は、好ましくは０．２ｇ／Ｌより高く、そして好ましくは約０．３ｇ／Ｌである。
【００７３】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物中の各凝固因子ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＶＩＩ及び／又はＸＩの濃度は、好ましくは０．５  ｉｕ／ｍｌより高く、そして好ましくは約１ｉｕ／ｍｌである。
【００７４】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物中の凝固因子ＶＩＩＩ及び／又はフォンビルブランド因子の濃度は、好ましくは０．５より高く、好ましくは０．９ｉｕ／ｍｌより高く、そして好ましくは約１  ｉｕ／ｍｌである。
【００７５】
特定の態様において、本発明の方法によって得られた凝凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、更にＩｇＧ、ＩｇＭ及び／又はＩｇＡ．のようなイムノグロビンを更に含む。
【００７６】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物中のイムノグロビンＩｇＧの濃度は、好ましくは５ｇ／Ｌより高く、そして好ましくは約１０ｇ／Ｌである。
【００７７】
別の態様において、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、更にＣＣＮファミリーメンバー、結合織活性化プロテイン−３（ＣＴＡＰ−３）、ＰＦ４、血小板由来血管新生因（ＰＤＡＦ）、内皮細胞成長因子、早期妊娠因子（ＥＰＦ）、上皮成長因子（ＥＧＩ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、アンジオポエチン様−６（ＡＮＧＰＴＬ６）、ＩＧＦＢＰ−３、エストロゲン受容体関連蛋白質、繊維芽細胞由来内皮細胞成長因子（ｆ−ＥＣＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヒスタミン放出因子、ヒトコラゲナーゼ阻害剤、血小板殺菌蛋白−１（ＰＭＰ−１）、トロンビン誘導血小板殺菌蛋白−１（ｔ−ＰＭＰ）、トロンボシジン−１（ＴＣ１）及びトロンボシジン−２（ＴＣ２）からなる群から選択される少なくとも１つの成長因子を含む。
【００７８】
別の態様において、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、更にセロトニン、カテプシン、アルブミン、血小板塩基性タンパク質−ＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、好中球活性化タンパク質−２及び−４（ＮＡＰ−２；４）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＴＡＰ−３、胎盤蛋白質１４（ＰＰ１４）、ＳＣＵＢＥｌ、アネクシン１１、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）、及びヒートショックプロテイン６０（ＨＳＰ６０）からなる群から選択される少なくとも１つの蛋白質を含む。
【００７９】
特定の態様において、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物中のアルブミン濃度は、好ましくは３０ｇ／Ｌより高い。
【００８０】
別の態様において、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、更にコラゲナーゼ、スーパーオキシドジスミューターゼ（ＳＯＤ）、ヘパリナーゼ、メタロプロテアーゼＭＭＰ−１、−２、−９、−１３、自己ＥＲＫ（ｅｘｔ．Ｃｅｌｌ．ｒｅｇ．ｋｉｎａｓｅ）、自己分泌及び傍分泌プロテインＣ（ＰＣ）、及び微量の酵素アルドラーゼ、カルボキシペチダーゼ、酸性ホスファターゼ、アリールスルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−グリセロホスファターゼ、α／β−グルコシダーゼ、α／β−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、及びα−アラビアラビノシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含む。
【００８１】
別の態様において、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、更にヒスタミン、ＡＤＡＭＴＳ−１３、α１−α２アンチトリプシン、α２−アンチプラスミン、α２−マクログロブリン、Ｃ１-ＩＮＨ、誘導ＢＭＰ−２、−６、−７（ＴＧＦ−βスーパーファミリー）、ＥＣＭ再構築因子（誘導ＭＭＰ、ＴＮＦ−α、エラスターゼなど）、自己分泌及び傍分泌リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ＨＭＧＢｌ（アンフィレギュリン）、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＧＰＴ、ＧＤＰ、Ｃａ2+、Ｍｇ2+及び／又はＺｎ2+を含む。
【００８２】
本発明の別な目的は、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物を含む医薬品である。
【００８３】
「医薬品」は、血小板ゲル、血小板接着剤、成長因子濃縮フィブリン接着剤及び／又はシーラント、人工足場を意味する。
【００８４】
本発明の別な目的は、培地中での本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物の使用であり、この培地は繊維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、幹細胞及び／又は移植細胞の生体内又は生体外での培養に適する。本発明の別な目的は、生体内又は生体外で繊維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、幹細胞及び／又は移植細胞を培養するのに適する培地で、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物を含む。
【００８５】
本発明の別な目的は、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物を調製する方法であり、該方法は出発濃厚血小板を溶媒及び／又は界面活性剤を接触させ、出発濃厚血小板を溶媒及び／又は界面活性剤と少なくとも５分から６時間、約６．０から約９．０の範囲で維持されたｐＨ及び２℃から５０℃の範囲内、好ましくは２５℃から４５℃の範囲内でインキュベートし、そしてオイル抽出及び／又はクロマトグラフィ法により溶媒及び／又は界面活性剤を除去する工程を含む。
【００８６】
好ましい態様において、実施したインキュベーション時間は、例えばｐＨ７．０から７．５（出発血小板が新鮮血小板の場合）又はｐＨ６．８から８．２（出発血小板が保存期間を超えた／又は凍結血小板の場合）の範囲の生理的ｐＨで２から４時間の範囲である。好ましいインキュベーション時間は、約３１℃である。
【００８７】
本発明の方法において使用するのに好適な溶媒は、ジ−又はトリアルキルホスフェート、例えばトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート、トリ−（ｔ−ブチル）ホスフェート、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリ−（ｎ−デシル）ホスフェート、ジ−（ｎ−ブチル）ホスフェート、ジ−（ｔ−ブチル）ホスフェート、ジ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、ジ−（２−エチルヘキシル）ホスフェート、ジ−（ｎ−デシル）ホスフェート及び異なるアルキル鎖を有するジアルキルホスフェートである。異なるアルキル鎖を有するジ又はトリアルキルホスフェートとして例えば、エチルジ−（ｎ−ブチル）ホスフェートを用いることができる。特に好ましいトリアルキルホスフェートはトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴｎＢＰ）である。
【００８８】
本発明の方法において使用するのに適する溶界面活性剤は、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、例えば「ポリソルベート８０」としても知られている、「Ｔｗｅｅｎ８０」という名前で商品化された製品、「Ｔｗｅｅｎ２０」及び非イオン性界面活性剤例えば「ＴｒｉｔｏｎＸ−１００」又は「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５」という名前で売られている．オキシエチレン化アルキルフェノールを含む。
【００８９】
更に好ましい界面活性剤はデオキシコール酸ナトリウム及びＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アンモニウム−ｌ−エタンスルホネートのようなスルホベタイである。特に好ましい界面活性剤は「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５」、「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」、「Ｔｗｅｅｎ８０」及び「Ｔｗｅｅｎ２０」である。
【００９０】
本発明の特定の態様において、出発濃厚血小板は、溶媒及び界面活性剤、好ましくはＴｎＢＰとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５でインキュベートされる。
【００９１】
好ましくは、溶媒又は界面活性剤度の最終濃度、又は溶媒及び界面活性剤の各々の最終濃度は、濃厚血小板の体積に対して０．２から５％の体積、好ましくは０．２から２％の体積の範囲である。好ましい態様では、出発濃厚血小板を２％ＴｎＢＰとインキュベートする。別の好ましい態様では、出発濃厚血小板は、１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５でインキュベートする。
【００９２】
溶媒及び／又は界面活性剤は、医薬品グレードのオイルを用いたオイル抽出及及び／又はカラムクロマトグラフィのような別の方法により生体液中から抽出されるので、残りの濃縮物中に溶媒及び／又は界面活性剤が枯渇する。
【００９３】
医薬品グレードのオイルは、天然オイルでもよく、例えば植物又は動物由来、又は同様な構造の合成化合物でもよい。適当な天然オイルとして、キャスターオイル（ヒマシ油としても知られる）、大豆、ひまわり油、綿実油が挙げられる。好ましい合成化合物は、合成トリグリセリドである。適当な合成トリグリセリドの例はトリオレイン、トリステアリン、トリパルミチン、トリミリスチン及びそれらの組み合わせである。
【００９４】
医薬品グレードのオイルは、脂溶性のプロセス薬品の少なくとも８０％を抽出できる量であり、血小板濃縮剤溶解物の重量に基づいて、オイルは２から２０重量％、好ましくは５から１５重量％、そして更に好ましくは５から１０重量％で使用される。オイル抽出は、特にオイル濃度によって１回、好ましくは２回、そして更に好ましくは３回行ってもよい。
【００９５】
溶媒及び／又は界面活性剤は、カラムクロマトグラフィにより濃厚血小板溶解物から除去してもよい。カラムクロマトグラフィは、オイル抽出に続いて行ってもよく、あるいは溶媒及び／又は界面活性剤処理後に直接行ってもよい。
【００９６】
好適なクロマトグラフィカラムは、逆相（疎水性相互作用）マトリックス、又は例えばイオン交換（アニオン及びカチオン）マトリックス及び親和性（免疫親和性又は固定化ヘパリンのような）マトリックスのような蛋白吸着マトリックス、又はサイズ排除マトリックスを含む。好ましい逆相マトリックスは、Ｃ１８シリカ充填剤、ＳＤＲ（溶媒−界面活性剤除去）ｈｙｐｅｒＤ（Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ポリスチレンソーベント（Ｖａｒｉａｎｔ）及びＡｍｂｅｒｌｙｔｅ（Ｒｏｈｍ）である。Ｃ１８が一般に工業規模のクロマトグラフィに推奨されたとしても、ｔＣ１８シリカ充填剤も考慮される。これらの吸着材は、溶媒及び界面活性剤を結合するのに使用される一方、成長因子はカラム通過画分に溶出する。好ましいアニオン交換マトリックスは、精製される成長因子によるが、アニオン交換体ゲルであり、例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ、ＤＥＡＥ−Ｈｙｐｅｒ  Ｄである。好ましいカチオン交換マトリックスは、精製される成長因子によるが、カチオン交換体ゲル、例えばＳＰ−セファロース及びＣＭ−セファロース（両方ともＦＦグレード以下で入手可能）であり、ＳＰが好ましい。これらの吸着材は、成長因子を結合するのに使用される一方、溶媒及び界面活性剤はカラム通過画分において溶出する。
【００９７】
好ましい態様において、アニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフィは、オイル抽出後に行われる。選択されたクロマトグラフィによって、このような溶媒及び／又は界面活性剤の除去工程は、成長因子の分離も強化することが可能である。この点において、アニオン性クロマトグラフィ（例えばＤＥＡＥ）は、好んでＴＧＦ−β１及びＥＧＦを結合する一方カチオン性クロマトグラフィ（例えばＳＰ）は、好んでＰＤＧＦ（ＡＢ、ＡＡ及びＢＢ）及びＶＥＧＦを結合するだろう。従って、アニオン性及びカチオン性クロマトグラフィの連続使用により、特異的な成長因子（類）の濃厚画分の調製が可能になる。このような態様は図１１に開示されている。
【００９８】
好ましい態様において、オイル抽出後及び／又は疎水性クロマトグラフィ後にアニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフィを行う場合、当業者の一般常識に従って溶出条件を決定する。溶出は０．１５Ｍから２Ｍ塩化ナトリウムを含有する食塩水を用いて行う。溶出に用いる食塩水は、塩化ナトリウム及び０．１５Ｍから２Ｍのアルカリ又はアルカリ土類金属の塩（例えばリン酸塩又はクエン酸塩）の混合物も含んでもよい。
【００９９】
更に、アニオン性クロマトグラフィを行う時、ｐＨは興味のある成長因子（類）の等電点より高くなるように選択する。逆にカチオン性クロマトグラフィを行う時、ｐＨは興味のある成長因子（類）の等電点より低くなるように選択する。興味のある成長因子の安定性及び生理的機能に対応するｐＨ、例えば成長因子の変性が避けられるように実質的には中性のｐＨでのクロマトグラフィによる分離／精製が行えるように、クロマトグラフィの条件を選択することが好ましい。
【０１００】
あるいは、オイル抽出及び／又は疎水性クロマトグラフィ後、アニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフィを行う時、当業者の一般常識に従って溶出条件を設定する。溶出は、成長因子のｐＨｉにより、成長因子を樹脂上への結合させるために使用したバッファとは異なるｐＨのバッファを用いて行ってもよい。成長因子の安定性と生理的機能を維持する条件下で、溶出に使用する溶液のｐＨ範囲は４から１０、好ましくは５から９でもよい。
【０１０１】
好ましい態様において、オイル抽出及び／又はクロマトグラフィ後の溶媒濃度は、１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、好ましくは２０ｐｐｍ未満、より好ましくは１０ｐｐｍ未満、好ましくは５ｐｐｍ未満、そして更に好ましくは１ｐｐｍ未満である。
【０１０２】
好ましい態様において、オイル抽出及び／又はクロマトグラフィ後の界面活性剤濃度は、５００ｐｐｍ未満、好ましくは２５０ｐｐｍ未満、より好ましくは１００ｐｐｍ未満、より好ましくは５０ｐｐｍ未満、そして更に好ましくは１０ｐｐｍ未満である。
【０１０３】
オイル抽出及び／又はクロマトグラフィによる溶媒／界面活性剤の除去に続いて、パルボウイルスＢ１９又は、場合によってはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のような非エンベロープウイルスを不活性化又は除去するために、例えばナノろ過により、より具体的には７５−ｎｍ、３５−ｎｍ、２０−ｎｍ、１５−ｎｍ、又は１０−ｎｍのポアサイズのろ過膜の使用により、追加の工程を加えてもよい。
【０１０４】
別の好ましい態様では、細胞破片の除去ためのオイル抽出及び／又はクロマトグラフィの後に、遠心分離の工程を行う。好ましくは、遠心分離工程は８００から２００００ｘｇで１０から３０分間、そして好ましくは１００００ｘｇで１５分間行う。
【０１０５】
別の特定の態様では、細胞破片を除去するためにオイル抽出及び／又はクロマトグラフィの後に、ろ過による清澄化を行う。好ましくは、ろ過工程は１μｍから０．２μｍのグラデーションを有するフィルタで行い、それによって細菌の除去も可能である。
【０１０６】
特定の態様では、本発明の方法において出発材料として使用される濃厚血小板は単一又はプールされた標準濃厚血小板、例えば輸血用に調製された濃厚血小板に相当する。濃厚血小板は全血のバフィーコート由来でもよい。バフィーコート由来の濃厚血小板１単位は、通常３０から５０ｍｌに相当する。バフィーコート由来濃厚血小板は単一単位として又は単一単位をプールしたもの、例えば４から６の単一単位をプールしたものに相当する治療用単位の形のどちらかを出発物質として使用してもよい（血液成分の調製、使用および品質保証に関する指針  第１３版  欧州評議会編（２００７）に記載）。
【０１０７】
血小板濃縮剤はアフェレーシス、サイタフェレーシス又は血小板アフェレーシスの標準操作（例えば、血液成分の調製、使用および品質保証に関する指針  第１３版  欧州評議会編（２００７）参照）により得てもよく、そしてＭＣＳ＋（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）、Ｔｒｉｍａ  Ａｃｃｅｌｌ又はＣＯＢＥ  Ｓｐｅｃｔｒａ（Ｇａｍｂｒｏ）又はＡｍｉｃｕｓ  （Ｂａｘｔｅｒ）を用いて得てもよい。アフェレーシス操作は、バフィーコート単離操作で得る時と比べて、一般的にドナー当たりの生産量が大きくなる（濃厚血小板３００ｍｌに相当する）。
【０１０８】
好ましい態様において、本発明の方法は、出発濃厚血小板を調製することからなる予備工程を含む。好ましくは、出発濃厚血小板を調製する方法は、アフェレーシスや全血献血からの血小板調製のような標準的な血液銀行による方法、及び血液細胞保存装置／分離装置又は卓上装置を用いるようなポイント・オブ・ケア手順を含むが、それらに限定されない。
【０１０９】
本発明の方法において出発材料として使用される濃厚血小板は、例えば採取後５又は７日未満の新鮮なもの、例えば採取後５又は７日を越えて保存期間を超えたもの、又は保存期間を超え且つ−２０℃またはそれ以下で数週間凍結したものでもよい。
【０１１０】
特定の態様において、本発明の方法において出発材料として使用される濃厚血小板は更に白血球及び／又は赤血球を含んでもよい。出発濃厚血小板は従って、分化しているが活性化していない数種類の白血球、例えばリンパ球、好中球性顆粒球、及び単球を含んでもよい。好中球と単球は特にミエロペルオキシダーゼを含む顆粒に富み、これは塩素の酸化を触媒し、次亜塩素酸とその他の反応性酸素誘導体を生成し、微生物と真菌に毒性のある強力な殺菌性酸化剤として作用する。
【０１１１】
それゆえ、出発濃厚血小板が分化しているが活性化していない数種類の白血球を含んでいる時、本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は、更に白血球由来の抗菌成分を含む。
【０１１２】
好ましい態様において、白血球に含有されるプロテアーゼ及び酸性ヒドロラーゼの炎症促進効果を避けることができるように、好ましくは白血球除去により出発材料として使用された濃厚血小板から白血球を除去する。
【０１１３】
健康人の正常な血小板数は、通常、血液１ｍｍ3当たり１５００００から４０００００個、即ち、１５０から４００ｘ１０9血小板／Ｌの範囲にある。この「正常」な血小板数は健康人の約９５％に見られ、一方残りの５％は統計学上、異常な血小板数（非常に低いか高い）を有するのかもしれない。血小板がアフェレーシスにより採取されると、血小板数は一般に２５０ｍｌのバッグの１ｍｌ当たり１．２ｘ１０9血小板より多く、バッグ（単位）当たり約３ｘ１０11血小板よりも多い血小板数に相当する。好ましい態様では、出発濃厚血小板の血小板数は、通常の血中で見られるよりも３から１０倍多い。
【０１１４】
本発明の別の目的は、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物と、トロンビン、又は活性化ＦＶＩＩ、又はウシ又はヒトトロンボプラスチンのような凝固カスケードの他の活性化因子とを混合することからなる凝集塊を形成する方法である。
【０１１５】
本発明に係る又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物で凝集塊を形成する前に、抗線維素溶解薬を本発明又は本発明に係る方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物に添加し、線溶系の天然蛋白分解酵素（例えばプラスミン）によるフィブリン凝集塊の分解を抑制又は遅らせてもよい。
【０１１６】
特定の態様において、前記抗線維素溶解薬はアプロチニンであるが、トラネキサム酸又はイプシロンアミノカプロン酸も濃度＞１０ｍｇ／ｍｌで、アプロチニンの代替物として使用してもよい。アプロチニンは通常、液体の形で３０００ＫＩＵ又はそれ以下の濃度で提供される。アプロチニンの最終濃度は、通常、凝固可能な血小板成長因子濃縮物とトロンビン成分とを混合した後の出発液体の半分になる。
【０１１７】
本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は更に、例えばコラーゲン、キトサン、セラミクスによって作られた人工足場、又は血漿由来フィブリン接着剤又はフィブリンシーラントと混合されてもよい。
【０１１８】
トロンビンと混合する前に、本発明に係る凝固可能な血小板成長因子濃縮物に追加の化合物を加えてもよい。このような追加の化合物は化学療法剤、抗生物質及び／又はホルモンを含むが、これに限定されない。
【０１１９】
本発明に係る又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物とトロンビンを一緒に混合することにより、凝固カスケードの最終工程を再現し、凝集塊又は不溶性フィブリンを形成するためのフィブリノーゲンの段階的な重合化へと進む。
【０１２０】
本発明で使用される用語「トロンビン」はあらゆる由来のものから得たトロンビンに関し、人の治療に適用する場合は、好ましくはウシ由来、より好ましくはヒト由来に向けたものである。
【０１２１】
ヒトＣａＣｌ2活性化血漿又はバトロキソビン（ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｔｒｏｘ  ｍｏｏｇｅｎｄｉの蛇毒由来の別のフィブリノーゲン凝固プロテアーゼ）、活性化ＦＶＩＩ、ヒト又はウシトロンボプラスチンはトロンビンの代替物として使用されてもよい。好ましい態様において、０．１から１体積のトロンビンを本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物１体積に添加してもよい。
【０１２２】
好ましい態様において、トロンビン濃度は２０ＩＵ／ｍｌから１０００ＩＵ／ｍｌの範囲にある。さらに好ましくは、トロンビンの最終濃度はフィブリノーゲンを可溶化し、それから安定（不溶化）なフィブリンとするための連続的且つ速い重合化を保証する約５００ＩＵ／ｍｌか、あるいはより低濃度（特別な外科手術において遅い重合化が好ましい時には約４から２５ＩＵ／ｍｌ）のどちらかである。
【０１２３】
別の好ましい態様において、トロンビンは、金属又はガラスビーズのような表面活性化剤存在下で１０〜５０ｍＭＣａＣ１2を用い、高フィブリノーゲン成長因子濃縮剤の自動活性（ａｕｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）により得られる。
【０１２４】
２つの成分、即ち、本発明に係る又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物及びトロンビンは、スプレー又は吸収性スポンジによる内視鏡的送達装置の支援の存在下又は非存在下、デュアルシリンジシステムによって連続的又は同時に修復部位に適用できる（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ他，”Ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅａｌａｎｔ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒａｔｉｏｎａｌｅ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ”，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，１９９７，７２：１３３−１４３及びＭａｒｘ  Ｇ，”Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ  ｇｌｕｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｏｒｓ”，Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｖ，２００３；１７（４）：２８７−９８に記載された適用方法はここに参照することにより、本文に組み込まれる）。
【０１２５】
本発明の別の目的は、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物を、治療への応用及び凝集塊の形成又は体内又は体外での細胞培養に使用することである。体内又は体外での細胞培養に使用する場合、本発明又は本発明の方法によって得られた凝固可能な血小板成長因子濃縮物は培地の体積に対し、１％から３０％、好ましくは２％から２０％、そして更に好ましくは３％から１０％の範囲で培地中に存在する。
【０１２６】
濃縮物／トロンビン混合物の主要な治療用途として、口腔外科、インプラント学、整形及び口腔外科、形成外科、軟及び硬組織の治癒と再構築、心血管、胸部、又は消化管手術、神経外科、一般外科／外傷学、眼科、耳鼻咽喉科、泌尿器科、抗凝固療法を受けている患者の手術又は凝固障害のある患者を挙げられるが、これに限定されない。
【０１２７】
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は以下の記載及び添付の図面に対する説明により、更に明らかとなるだろう。
【実施例】
【０１２８】
Ｉ−材料と方法
Ｉ．ｌ−アフェレーシス血小板採集
ボランティアドナーに対するインフォームドコンセントの後で、出発濃厚血小板（ＰＣｓ）はＭＣＳ＋  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＵＳＡ）を用いて採取された。静脈カテーテルにより全血を間欠流及び抗凝固剤（血液１０ｍｌ当たり１ｍｌの抗凝固クエン酸デキストロース溶液処方Ａ）用いて採血した。多血小板血漿（ＰＲＰ）が遠心分離により自動的に他の血液成分から分離され、滅菌された使い捨てバッグに採取され、赤血球と血漿はドナーに戻された。ＰＲＰの所定の体積（約３００ｍｌ）が得られるまで、この手順が繰り返された。出発濃厚血小板は採取後２４時間以内に下記に述べるように処理を行った。
【０１２９】
Ｉ．２−血球数
血小板、白血球（ＷＢＣ）、及び赤血球数はセルカウンター（ＡＢＣ  Ｖｅｔ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｕｎｔｅｒ，ＡＢＸ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。
【０１３０】
Ｉ．３−出発濃厚血小板の処理
ａ−研究計画：
出発濃厚血小板は図１の研究計画に従って処理された。
簡単に説明すると、同一ドナーからの出発濃厚血小板（３００ｍｌ）を穏やかに混合し、等量（１５０ｍｌ）の２つのサブプールに分けた。サブプール１は事前の活性化を行わず、直接Ｓ／Ｄ処理をした。サブプール２は下記のような血小板ゲルを形成する条件で、２３ｍＭＣａＣｌ2及びビーズの存在下で活性化した。その結果得られた放出物がピぺッティングで注意深く回収され（血小板ゲルでの３０ｍｌの損失により平均体積１２０ｍｌに相当）、Ｓ／Ｄ処理後オイル抽出された。出発濃厚血小板、非活性化血小板サブプール１のＳ／Ｄ処理後、血小板サブプール２の活性化後、及び活性化サブプール２のＳ／Ｄ処理後のサンプルが採取された。
【０１３１】
ｂ−血小板活性化：
ビーズの存在下、血小板濃縮剤（サブプール２）に１Ｍ  ＣａＣｌ2（Ｓｉｇｍａ；Ｂａｔｃｈ  ０５６ｋ０６８８）を添加して最終濃度２３ｍＭとして、活性化した。混合物を凝集塊が形成されるまで穏やかに回転混合した。これは通常５から８分以内に生ずる。混合物を更に６０分間活性化させた。これは、これらの実験条件下で、好ましい最適な血小板由来成長因子放出が見られた時間であった。形成されたビーズ／フィブリン凝集塊のデカンテーションにより上清が分離された。回収された上清の平均体積は出発濃厚血小板の体積の約８０％であった。上清は更にＳ／Ｄ処理された。
【０１３２】
ｃ−Ｓ／Ｄ処理：
便宜上、非活性化血小板サブプール１及び活性化サブプール２のＳ／Ｄ処理は、ＥＰ  １６８５８５２に記載されたようにバッグ内で行われた。簡単に説明すると、ＴｎＢＰ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ．）の５０％／５０％混合物を絶え間なく混合して各々のプールへ１５分かけて加え、最終濃度（ｖ／ｖ）が１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５となるようにした。添加終了後、Ｓ／Ｄ−血小板サブプール混合物を１分間激しく振盪した。それから、処理バッグを完全に水槽に浸漬してＳ／Ｄ血小板混合物を２５±０．５℃まで加温し、それから１時間穏やかに連続撹拌した。Ｓ／Ｄ処理の終了時に、大豆油（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）をＳ／Ｄ−血小板サブプールへ最終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるように添加した。バッグを１分間激しく振盪し、それから回転シェーカー上に１５分間置いた。血小板サブプール（下層）がデカンテンーション（２０分）によりオイル（上層）から除去され、第二のバッグに引力により移され、３回のオイル抽出が行われた。このオイル抽出操作はＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５をそれぞれ、１０及び１００ｐｐｍ未満まで減少させた。
【０１３３】
Ｉ．４−遠心分離及び溶解剤の種類による影響
血小板由来成長因子放出に対する血小板内容物及びＳ／Ｄ剤の種類の影響を調べるために、以下のような実験を行った：濃厚血小板（３００ｍｌ）が１５０ｍｌの２つのサブプールに小分けされた。血小板をペレットにするために、１つのサブプールが高速（１００００ｘｇ）で遠心分離され、上清が１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５で処理された。遠心分離処理をしなかった、他方のサブプールは更に、７５ｍｌの２つのサブプールに小分けし、１つは１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５で処理し、他方は２％ＴｎＢＰで処理した。Ｓ／Ｄ処理（インキュベーションとオイル抽出）は上記のように行った。
【０１３４】
Ｉ．５−ウシトロンビン活性化実験
ＣａＣｌ2活性化が血小板を完全に活性化しないという仮説を除外するために、２つの濃厚血小板（１４ｍｌ）を０．２３Ｍ  ＣａＣｌ2及びビーズの存在下で、上記のように活性化した。
【０１３５】
室温で緩やかに６０分間回転撹拌したのち、濃厚血小板放出物の１０ｍｌを回収し、１０００国際単位（ＩＵ）／ｍｌの局所ウシトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＪＭＩ，５２６０４−７１０２−１，Ｊｏｎｅｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．５ｍｌを添加して、最終濃度約４８ＩＵ／ｍｌ．を得た。混合物は室温で６０分間緩やかに回転振盪した。それから、１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５で処理しオイル抽出した。並列実験では、数秒以内で生じたゲル形成の後、２つの濃厚血小板サンプル（１０ｍｌ）を同一のウシトロンビン０．５ｍｌで直接活性化し緩やかに６０分間回混合した。実験過程の色々な段階でサンプルを採取し、１００００ｘｇで遠心分離し血小板由来成長因子の解析まで−８０℃で凍結した。
【０１３６】
Ｉ．６−成長因子アッセイ
手順の各工程で１ｍｌのサンプルを採取した。血小板及び細胞破片がペレットになるまで１００００ｘｇで１５分間遠心分離した（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ（登録商標）２２Ｒ，ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）し、血小板由来成長因子測定のための無細胞上清を得た。並列実験も８００ｘｇで１５分間遠心分離した。上清はすぐに−８０℃で凍結した。
【０１３７】
サンプルは３７℃で解解し、感度及び特異性の高い市販の免疫アッセイを用いて１時間以内に解析した。標準とサンプルはデュプリケートでアッセイされ、平均値が計算された。結果はサンプルに適用した希釈係数を掛けた。
【０１３８】
α−ＰＤＧＦ−ＡＢ
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（＃．ＤＨＤ００Ｂ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、ＰＤＧＦ−ＡＢをアッセイした。サンプルをＣａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  （ＲＤ６−１１）により１００倍希釈した。血小板を２時間インキュベートし、洗浄し、そしてＰＤＧＦ−ＡＢに対する酵素抱合抗体と室温で更に３時間インキュベートした。ウェルを洗浄バファーで洗浄し、基質液を室温で２０〜３０分間添加した。ウェルを光から保護された。停止液が各ウェルに添加され、マイクロタイタープレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸収を測定した。最小検出濃度は１．７ｐｇ／ｍｌであった。
【０１３９】
ｂ−ＴＧＦ−β１
ＴＧＦ−β１はＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（ＤＢ１００Ｂ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定された。サンプルはＣａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  （ＲＤ５−２６）で１００倍に希釈された。ＴＧＦ−β１標準液（８９０２０７）の希釈系列は、ＴＧＦ−β−受容体ＩＩでコートした９６−穴マイクロタイタープレート中に１００μｌの容量で調製された。ＴＧＦ−β１の解析前に、酸による活性及び中和が行われ、潜在的なＴＧＦ−β１を免疫反応型に活性化した。この目的のために、０．５ｍｌのサンプルと１Ｎ  ＨＣｌの０．１ｍｌとを混合して室温で１０分間インキュベートし、１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ０−［２−エタンスルホン酸］）、Ｓｉｇｍａ（Ｈ−７５２３）の０．１ｍｌを添加して中和し、遠心分離した。上清画分をアッセイしてＴＧＦ−β１の総含有量を求めた。アリコート（５０μｌ）をマイクロタイタープレートにデュプリケートで加えてカバーし、２時間室温でインキュベートした。それからウェルを洗浄し、ＴＧＦ−ｂ１に対する酵素抱合ポリクローナル抗体を添加して室温で１．５時間インキュベーションした。測定は上記のように行った。ＴＧＦ−β１の検出限界は４．６１ｐｇ／ｍｌであった。
【０１４０】
ｃ−ＥＧＦ
ＥＧＦはＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（番号ＤＥＧ００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定された。サンプルはＣａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＲＤ６Ｎ）で２０倍希釈された。標準、コントロール、又はサンプル２００μｌをウェルに添加した。プレートは２時間室温でインキュベートした。ウェルを吸引し洗浄バファーを満たして洗浄した。ＥＧＦ抱合体を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄バファーで洗浄し、基質液（２００μｌ）を各ウェルに添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、光から保護した。停止液（５０μｌ）を各ウェルに加えた。４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ（商標）ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を用い、各ウェルの光学密度を３０分以内に測定した。最小検出濃度は０．７ｇ／ｍｌであった。
【０１４１】
ｄ−ＩＧＦ−１
ＩＧＦ−１はＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（ＤＧ１００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて定量された。サンプルはＣａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  （ＲＤ５−２２）で１００倍に希釈した。最小検出濃度は０．００７から０．０５６ｎｇ／ｍｌの範囲にあり、平均ＭＤＤはメーカーの報告のように０．０２６ｎｇ／ｍｌであった。各ウェルにアッセイ希釈剤（ＲＤ  １−５３）１５０μｌを添加し、続いて標準液（８９０７７５）５０μｌを添加した。プレートを粘着片で覆い、２〜８℃で２時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、それから酵素抱合ＩＧＦ−１と２〜８℃で１時間インキュベートした。測定は上記のように行った。
１．７−統計学的解析
全ての実験に対するデータは平均値、標準偏差、及び最小値と最大値として記録される。統計学的比較は両側ｔ検定で行った。０．０５未満のｐ値を用いて、操作の様々な段階での調製血小板間での平均ＰＧＦ濃度に対する有意差を評価した。値は有意差なし（ＮＳ；＜０．０５）として示され、＜０．０１又は０．００１であった。０．００５に近づいたときの正確なｐ値を示す。
【０１４２】
Ｉ．８−ＰＣ、Ｓ／Ｄ−ＰＣ及びＡｃｔ−Ｐ比較のためのサンプル調製と分離
出発濃厚血小板（ＰＣ）に対応する各サンプル、溶媒／界面活性剤（１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）で処理された出発濃厚血小板（Ｓ／Ｄ−ＰＣ）、及びＣａＣｌ2で活性化された出発濃厚血小板（Ａｃｔ−ＰＣ）は、タンパク含有量を比較するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された。
【０１４３】
各サンプルの２０μｌとＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  サンプルバッファ（４Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＮｕＰＡＧＥ還元剤（１０Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び脱イオン水とを混合し、最終体積を２０μｌ（活性化濃厚血小板に対応するサンプルでは２１μｌ）とする。その結果得られた混合物は、それから１０分間７０℃で加熱され、４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１４４】
タンパク質の分離は２００Ｖの定電圧、１５０ｍＡ／ｇｅｌの予想電流で３５分間行った。得られたゲルはクマシーブルーＲ−２５０で染色された。タンパクマーカーであるＭａｒｋ１２未着色スタンダート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はサンプル中に含まれるタンパクの分子量を測定するために使用された。Ｍａｒｋ１２マーカーをＭＥＳでバッファされたＮｕＰＡＧＥ  ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、分離後クマシーブルーＲ−２５０で染色した。対応する結果を図４に示す。
【０１４５】
溶媒／界面活性剤法で処理された出発濃厚血小板のタンパクの特徴は非処理の出発血小板濃縮剤の特徴と大きな違いはないように見える。一方、活性化濃厚血小板のタンパクの特徴は４０から７０ｋＤａ領域のバンドの欠如から明らかなように非処理の開始時血小板濃縮剤の特徴は著しく異なり、これらのバンドはそれぞれ、フィブリノーゲンの６３．５、５６及び４７ｋＤａのアルファ、ベータ及びガンマサブユニットに一致する。
【０１４６】
Ｉ．９−成長因子活性のアッセイ
血小板のＳ／Ｄ処理（ｌ％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）で得られた成長因子がその活性を維持できたかを知るために、生体外での細胞培養による研究をヒト骨芽細胞様ＭＧ６３細胞株を用いて行った。Ｓ／Ｄ−ＰＣ又はＡｃｔ−ＰＣのどちらからから得られた成長因子濃縮物で処理したＭＧ−６３細胞の反応性を細胞形態と生存能力を調べることにより評価した。
【０１４７】
１０5から１０6の細胞を、２ｍＭグルタミンを添加した９０％イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムで調整したイーグルＢＳＳ（平衡塩類溶）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、及び任意に５％のＳ／Ｄ−ＰＣ又はＡｃｔ−ＰＣ成長因子濃縮物添加した培地を用い、３５−ｍｍのペトリ皿で培養した。３７℃の５％ＣＯ2及び９５％エアを含む加湿雰囲気中でインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＫ）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％トリプシン）で３７℃、５分間剥離し、遠心分離し更に細胞テスト用に懸濁した。
【０１４８】
３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイで、生存／死滅細胞を検出（生存率解析）した。細胞形態を調べるために電子顕微鏡での観察も行った。
【０１４９】
３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイで、細胞増殖をモニタリングした。簡単に説明すると、５００μｌのＭＴＳ（Ｃｅｌｌｉｔｅｒ  ９６  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）を各サンプルに添加した。３７℃、６０分間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度で測定した。
【０１５０】
Ｉ．１０−ウイルス不活性化アッセイ
出発濃厚血小板の溶解に使用した溶媒及び／又は界面活性剤のウイルス検証試験はＥＭＥＡ及びＷＨＯの推奨するような国際ガイドラインに従って小規模実験により行った。５０ｍｌの出発濃厚血小板を関連ウイルス（ＨＩＶ；ヒト免疫不全ウイルス）及び３つのモデルウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、これはＣ型肝炎ウイルスのモデルであり、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、これは別の適当な生体外モデルウイルスがないとＨＢＶのモデルとして使用されることがある、そして水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の懸濁原液に、独立して添加した。これらのウイルスのより高力価の懸濁原液を出発濃厚血小板に加え、そして１％ＴｎＢＰ及び１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の混合物を添加した。ウイルス感染力は溶媒‐界面活性剤処理の前及び処理中の異なる時点で評価され、ウイルス感染力動態を測定した。感染力及びＴＣＩＤ50／ｍｌ値で表されるデータを測定するために、生体外での細胞培養を行った。得られたデータから、Ｓ／Ｄ処理により、処理（最初に評価した時点）から５分以内で残存するウイルス感染力が見いだされなかったので、前記４ウイルスが完全に不活化されることが示された。得られた減少係数は、ＨＩＶは＞５．６ｌｏｇ10、ＢＶＤＶは＞６．６ｌｏｇ10、ＰＲＶは＞６．４ｌｏｇ10、そしてＶＳＶ＞７．０ｌｏｇ10であった。したがって、溶媒及び／又は界面活性剤の溶解処理により、出発濃厚血小板の溶解物に潜在的に存在する脂質−エンベロープウイルスの感染を強力に不活性化することが保証される。
【０１５１】
Ｉ．１１−保存期間を超えた凍結血小板の成長因子組成物
保存期間を超えた（採取後５日を超える）濃厚血小板を−２０℃の冷凍庫に移し、１か月保存した、それから、水槽中で３５℃で解凍し、新鮮血小板で記載されたのと同一の実験が行われた。成長因子の量が種々の調製品で測定された。対応する結果を図５及び６に示す。
【０１５２】
Ｉ．１２−凝集塊形成アッセイ
Ｓ／Ｄ処理した出発濃厚血小板から得た成長因子濃縮物は、溶媒及び界面活性剤をオイル抽出により除去した後に、回収された。得られた成長因子濃縮物５ｍｌを５−ｍｌシリンジに注入した。５００ＩＵ／ｍｌのウシトロンビン５ｍｌが別の５−ｍｌシリンジに注入した。２つのシリンジが単一ノズルに連結されたダブル−シリンジアプリケーターに置かれた。この２成分を強制的にノズルを通過させた。血小板ゲルが５秒以内に形成された。
【０１５３】
ＩＩ−結果
ＩＩ．１−細胞数計測
１０人の異なるドナーからの１０の血小板フェレーシス濃縮物が実験された。血小板フェレーシスから得た濃厚血小板は、平均血小板数が１０６４±２３５．２ｘ１０6／ｍｌ（範囲：７８２〜１３５８ｘ１０6血小板／ｍｌ）、平均白血球数０．１１２５±０．０２５ｘ１０6／ｍｌ（範囲：０．０〜１．５）及び平均赤血球数０．０２１２±０．０２５ｘ１００6／ｍｌであった。
【０１５４】
ＩＩ．２−成長因子量
種々の調製血小板において、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−１の平均濃度±標準偏差（ＳＤ）、最少及び最大値、及びｐ値が表１に示される。実験の各シリーズで得られた個々のデータポイントを図２に示す。
【０１５５】
【表１】
0005770475.tif 000002
【０１５６】
出発濃厚血小板の平均ＰＤＧＦ−ＡＢ含有量は１３．８±１４．３ｎｇ／ｍｌ（Ｎ＝１０）であった。ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５による直接のＳ／Ｄ処理後、含有量は出発濃厚血小板と比べて約１３倍に相当する１８４．４±８０．２ｎｇ／ｍｌ（ｐ＜０．００１）まで有意に増加した。出発濃厚血小板が最初にＣａＣｌ2で活性化されると、含有量は有意に増加（８４．６±３５．５；ｐ＜０．００１したが、その増加は少なく（約６倍の増加）、次のＳ／Ｄ処理の間本質的な変化ではなかった（８８．３±４５．９；ＮＳ）。ＰＤＧＦ−ＡＢ含有量は、活性化及び活性化／Ｓ／Ｄ−処理血小板より非活性化Ｓ／Ｄ−処理血小板のほうが高かった（ｐ＜０．００１）。
【０１５７】
同様のデータがＴＧＦ−β１でも見られた。出発濃厚血小板の平均ＴＧＦ−β１含有量は１６．６±１４．３ｎｇ／ｍｌ（Ｎ＝１０）であった。直接のＳ／Ｄ処理後、ＴＧＦ−β１含有量は、出発濃厚血小板に比べて、およそ１２倍に増加し１９２．２±３７．４ｎｇ／ｍｌ（ｐ＜０．００１）となった。出発濃厚血小板が最初にＣａＣｌ2で活性化されると、含有量は約４倍（６３．８±１４．１ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＜０．００１）に増加し、そして次のＳ／Ｄ処理（６８．６±２７．２ｎｇ／ｍｌ）の間に有意な増加なかった。平均ＴＧＦ−β１含有量は、活性化及び活性化／Ｓ／Ｄ−処理血小板よりＳ／Ｄ−処理血小板のほうが有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【０１５８】
ＥＧＦ（＜０．７ｐｇ／ｍｌ）は出発濃厚血小板中では検出できなかったが、Ｓ／Ｄ処理後、平均ＥＧＦ含有量は（２．２±１．６ｎｇ／ｍｌ；Ｎ＝６）となり検出可能になった。これは、ＣａＣｌ2活性化後（０．９±０．６ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＜０．０５）、又はＣａＣｌ2活性化に続くＳ／Ｄ処理後（１．４±１．０ｎｇ／ｍｌ）の値より有意に（ｐ＜０．０５）に高い。
【０１５９】
出発濃厚血小板の平均ＩＧＦ−１含有量は８３．４±３２．８ｎｇ／ｍｌであった（Ｎ＝８）。他の血小板由来成長因子と反して、Ｓ／Ｄ処理後に有意な増加がみられなかった（８８．４±３３．５；ｐ＝０．０２５）。平均含有量はＣａＣｌ2活性化後の調製血小板（１１７．２±３４．９ｎｇ／ｍｌ）よりわずかに高く（ｐ＜０．００１）、次のＳ／Ｄ処理後安定した（１１２．４±３９．７ｎｇ／ｍｌ）。
【０１６０】
１５０ｍｌの濃厚血小板から回収されたＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−１の総量は血小板ゲル形成（１２０ｍｌ）による２０％の平均体積ロスを考慮すると、それぞれ、Ｓ／Ｄ直接処理後（１５３ｍｌ）、２８２１３、２９４０６、３３６、及び１３５２５ｎｇであり、そしてＣａＣｌ2活性化後１０１５２、７１５６、１０８、そして１４０６４ｎｇであった。これはＣａＣｌ2活性化と比べて、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１及びＥＧＦを放出するＳ／Ｄ処理はより高い効率を示すことを裏付けている。
【０１６１】
表２は、新鮮な出発濃厚血小板（Ａ）、遠心分離（血小板のペレット化及び除去のため）に続く上清のＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５処理後（Ｂ）、及び１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｃ）又は２％ＴｎＢＰ（Ｄ）による出発濃厚血小板のＳ／Ｄ処理後における血小板由来成長因子の含有量の比較を示す。未処理濃厚血小板（Ａ）のＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、及びＩＧＦ−１含有量は、前記データ（表１）と一致した。血小板フリー上清（Ｂ）がＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｂ）で処理されると、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、又はＥＧＦ含有量は低いままか又は検出不可能であった（３．９；１．１；ｐ＜０．００１）。一方、ＩＧＦ−１含有量は高いが、出発濃厚血小板と同じであった（７５．４に対して７２．２ｎｇ／ｍｌ）。従って、Ｓ／Ｄ処理中のＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１及びＥＧＦの放出は血小板の存在によるものであった。１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５又は２％ＴｎＢＰで処理された血小板溶解物における血小板由来成長因子含有量の増加も同様であった。更に、１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５又は１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のどちらかで処理され、その界面活性剤がオイル抽出を伴わないｔＣ１８バッチ吸着（ＳＰｌＴ４５ｔＣ１８及びＳＰｌＴｌ００ｔＣ１８）によって除去された濃厚血小板において、成長因子ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、ＩＧＦ及びＥＧＦの放出は、２％ＴｎＢＰ単独、又は１％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５での処理後に見られる範囲内であったことが示された。従って血小板溶解の程度は、この溶媒及び界面活性剤での組み合わせ又は、溶媒又は界面活性剤単独のどちらかを用いれば、本質的に同じであることが示された。
【０１６２】
サンプルを１００００ｘｇ又は８００ｘｇで遠心分離した場合、本アッセイで測定された血小板成長因子の含有量に影響しないことが、最終的にデータ（図示せず）から明らかになった。
【０１６３】
【表２】
0005770475.tif 000003
【０１６４】
更に、出発濃厚血小板中のＳ／Ｄ処理濃厚血小板及びＣａＣｌ2活性化濃厚血小板の両方から得られた成長因子濃縮物において、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、アルブミン、イムノグロビンＩｇＧの濃度、及び凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ及びＸＩＩＩ及びフォンビルブランド因子の濃度が測定された。これらの結果は表３に示す。
【０１６５】
【表３】
0005770475.tif 000004
【０１６６】
活性化された濃厚血小板はほぼ完全にフィブリノーゲン及び凝固因子が枯渇しているようにみえる。
【０１６７】
ＩＩ．３−ウシトロンビン活性化実験
ＣａＣｌ2／ビーズ処理は血小板の部分的な活性化しか起こさないので、Ｓ／Ｄ溶解物に比べて放出物中のＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、及びＥＧＦ含有量が低くなるのかもしれないという仮説を排除するために、最初にＣａＣｌ2で活性化され、それから更にウシトロンビン（Ａｃｔ−Ｔ）及びＳ／Ｄ処理されたトロンビン（Ａｃｔ−Ｔ−ＳＤ）で、処理された濃厚血小板からの放出物中の血小板由来成長因子の含有量を測定した（図３）。図３に、出発濃厚血小板（ｓｔａｒｔ）、ＣａＣｌ2活性化後（Ａｃｔ）、それに続いてウシトロンビン活性化（Ａｃｔ−Ｔ）、及びＳ／Ｄ処理（Ａｃｔ−Ｔ−ＳＤ）におけるＰＤＧＦ−ＡＢ（Ａ）、ＴＧＦ−β１（Ｂ）、及びＥＧＦ（Ｃ）含有量を示す。ＣａＣｌ2活性化に比べて、追加のウシトロンビン活性化はＰＤＧＦ−ＡＢ（Ａ）、ＴＧＦ−β１（Ｂ）、及びＥＧＦ（Ｃ）の放出を増加しないことが示されている。
【０１６８】
血小板成長因子の放出、及び特にＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、及びＥＧＦは、血小板がカルシウム及び／又はトロンビンで活性化された時より、Ｓ／Ｄ処理が行われた時のほうが有意に高いことが初めて示される。Ｓ／Ｄ処理は高脂質血小板膜の溶解を起こし、そして細胞内アルファ顆粒から血小板由来成長因子を放出することが考えられる。これらの血小板由来成長因子の放出はトロンビン活性が最初に行われると低くなるという事実は、おそらく凝集血小板及び一部の放出された血小板由来成長因子が、出発濃厚血小板に存在するフィブリノーゲンのトロンビン誘導重合によって形成されたフィブリンネットワーク（血小板ゲルとして知られている）内に捕捉される結果起きるのだろう。実際、ＣａＣｌ2は部分的な活性と内因性トロンビンにより不完全な凝集塊形成を起こす可能性は、約４８ＮＩＨ単位／ｍｌのウシトロンビンを活性化血小板放出物に更に添加しても、血小板由来成長因子の放出を増加しなかったという事実により除外される。血小板の完全な活性化は上記表３に記載したように、極めて低濃度（又は検出不可能）のフィブリノーゲン及び凝固因子によっても裏付けられる。
【０１６９】
同様に（ここに示さないが）、ウシトロンビンで濃厚血小板を活性化すると、放出物中の血小板成長因子含有量が同じになることがわかった。また、ＩＧＦ−１含有量はＳ／Ｄ処理後でも本質的に変わらず、カルシウム／トロンビン活性後にわずかに増加することも分かった。この結果は、おそらく殆どのＩＧＦはフリーの循環形で血漿中に存在し、ほんの少量が血小板に存在しているという事実を反映しているのだろう。
【０１７０】
我々のデータから、Ｓ／Ｄ処理による血小板溶解は、トロビン活性化、凍結−解凍サイクル及び／又は凍結乾燥のような他で使用される方法よりも、細胞内血小板顆粒から血小板成長因子を浸出液中に放出するために最も効果的な手段であるように見える。初期の研究では、ヒト全血血清における平均ＰＤＧＦレベルは、１７．５ｎｇ／ｍｌ及び０．０６ｎｇ／１０6血小板であることが示されている。これは我々の研究で用いたアフェレーシス濃厚血小板中のおよそ６０ｎｇ／ｍｌに相当する一方、Ｓ／Ｄ処理濃厚血小板では平均値が約３倍高いことがわかる。更に、我々のデータにより血小板からのＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、及びＥＧＦの増強された放出はＳ／Ｄ処理が１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の組み合わせ、２％ＴｎＢＰ、又は１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５又は１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のどちらかを用いておこなわれるかどうかにより得られ、そしてＳ／Ｄ剤を除去するためのオイル抽出処理は血小板溶解物で評価された４つの血小板成長因子の含有量を減少しないことが示される。
【０１７１】
ＩＩ．４−成長因子濃縮物の脂質含有量の比較
表４に記載したように、出発濃厚血小板のＳ／Ｄ処理又はＣａＣｌ2活性化による血小板成長因子濃縮物の脂質含有量を測定し、出発濃厚血小板の含有量と比較した
【０１７２】
【表４】
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【０１７３】
脂質含有量は日立臨床技術分析装置で測定した。各試験サンプルはｐＨ７．２、８８６ｘ１０3血小板／μｌ、０．１ｘ１０3白血球（ＷＢＣ）／μｌ及び０．０８ｘ１０6赤血球（ＲＢＣ）／μｌの同一出発濃厚血小板から調製された。
【０１７４】
表４に記載されているように、Ｓ／Ｄ処理に続くオイル抽出によって調製されたＳ／Ｄ−ＰＣ成長因子濃縮物のＬＤＬ（低密度リポプロテイン）、ＨＤＬ（高密度リポプロテイン）、トリグリセリド及びコレステロールの量は、Ｔｒｉｔｏｎ処理血小板又は活性化血小板と比べると、有意に低い。更に、Ｓ／Ｄ処理によって溶解された血小板を１回又は３回オイル抽出すると、有意な差は見られなかった。
【０１７５】
本発明の成長因子濃縮物におけるコレステロール、トリグリセリド及びＬＤＬの枯渇は、臨床及び治療目的として重要である。トリグリセリド、及びＬＤＬ−コレステロールの組み合わせの役割は動静脈系でのプラーク形成によるアテローム性動脈硬化及び心血管疾患の発症においてよく知られており、それによって心臓麻痺、脳卒中及び抹消血管疾患へとつながる。
【０１７６】
１１．５−成長因子活性
顕微解析により細胞の形、大きさ及び数の変化が明らかになった：細胞をＳ／Ｄ処理又は出発濃厚血小板のＣａＣｌ2活性化から得られた血小板由来成長因子濃縮物とインキュベートすると、多数の紡錘形細胞が特に観察された。更に、細胞をＳＤ−ＰＣ成長因子濃縮物とインキュベートすると、Ａｃｔ−ＰＣ又は成長因子濃縮物とインキュベートしなかった細胞に比べて、細胞計数から時間及び濃度依存性にＭＧ−６３骨芽細胞数が有意に増加しているこことが示された。ＭＴＴ解析でも、Ａｃｔ−ＰＣ処理細胞に比べて、ＳＤ−ＰＣ成長因子存在下インキュベートされた細胞の細胞活性が増加していることが示された。Ｓ／Ｄ−ＰＣ  又はＡｃｔ−ＰＣ成長因子濃縮物のどちらもＭＧ−６３骨芽細胞に対する細胞毒性は示さなかった。
【０１７７】
従って、この研究からＳ／Ｄ処理血小板又は活性化血小板から得られた成長因子は、選択された抽出方法の後でも活性を有していることが示される。しかし、我々の実験で、細胞をＳ／Ｄ処理で得られた成長因子濃縮物とインキュベートすると、細胞反応は有意に増加することが示された。ＭＧ−６３細胞に関する本発明の方法で得られた濃縮物の改善効果は、成長因子、特にＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β１、及びＥＧＦ（創傷治癒及び組織再生において、これらの因子の重要性は知られている）の含有量の増加、及び／又は活性化濃厚血小板の非存在下又はごく少量の存在下で更に生物学的活性物質量の増加することで生じるのかもしれない。
【０１７８】
細胞増殖を刺激するウイルス不活化ＨＰＧＦ混合物の能力も、ヒト胎児腎繊維芽細胞（ＨＥＫ２９３Ａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）及びＳｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ウサギ角膜繊維芽細胞（ＳＩＲＣ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６０，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、シンシュー、台湾）を用いて評価された。細胞株を３７℃、５パーセントＣＯ2含有の制御された雰囲気下で維持した。平底の９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，東京、日本）を用い、１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中、ウェル当たり２ｘ１０3細胞の密度で培養した。
【０１７９】
細胞を１８時間接着させ、それから無血清培地で６時間培養した。細胞を無血清培地で２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、活性化血小板放出物、又はＨＰＧＦ（Ｓ／Ｄ処理、オイル抽出及び疎水性クロマトグラフィ処理をしたＰＣから調製）を添加したＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で最長５日間培養した。細胞毒性の可能性を検出するため、及びＦＢＳ非存在下での細胞増殖促進の最適濃度を見つけるために、様々な濃度のＨＰＧＦ画分を用いて細胞培養を行った。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）のＭＴＳテトラゾリウム化合物を用い、メーカーの使用説明書に従って細胞増殖を測定した。
【０１８０】
ＨＥＫ２９３Ａ細胞から得られたＭＴＳアッセイの結果を図１６に示す。細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤ−ＭＥＭ中で培養すると、高い生存率を示した。ＦＢＳ非存在下（Ｂ）では、細胞増殖は見られなかった。ｔＣ１８、Ｃ１８、又はＳＤＲでそれぞれ処理した後の活性化ＰＣ及びＨＰＧＦ混合物の１０％（ｖ／ｖ）存在下で培養すると、高い細胞生存率を示した。これは細胞増殖作用を有し且つ無毒性であることを示唆する。図１６は、ＨＰＧＦ濃度を３  から２０％に増加すると、ＭＴＳは濃度依存性に改善することを示す。ＳＩＲＣ細胞から得たＭＴＳデータを図１６に示す。ＨＰＧＦはＳＩＲＣの増殖を刺激した。面白いことに、テストしたＨＰＧＦの全濃度（最大２０％）で、細胞は増殖したが、１０％ＦＢＳに匹敵する最適濃度は０．１から０．５％ＨＰＧＦであることがわかった。
【０１８１】
ＨＰＧＦは細胞増殖を強化し細胞生存率を維持する。Ｄ−ＭＥＭ培地中の１０％（ｖ／ｖ）ＨＰＧＦはヒトＨＥＫ２９３Ａ繊維芽細胞株の増殖を刺激する。細胞増殖作用は、１０％活性化ＰＣ放出物又は１０％ＦＢＳを用いた場合と同じであった。これにより、ＨＰＧＦの生理活性はウイルス不活化及びＳ／Ｄ除去処理の間に変化しないこと、そして最終調製物は細胞毒性がないこと示された。ＭＴＳ値は３％から２０％（ｖ／ｖ）のＨＰＧＦ濃度と共に増加した。ＨＰＧＦはＦＢＳに相当するような方法で、ウサギＳＩＲＣ細胞株の増殖も強化した。面白いことに、５日目の最も効果的なＨＰＧＦ濃度は０．３から０．５％のような低濃度であった。ＨＰＧＦは毒性を示さないことは正常な細胞増殖及び形態から明らかであった。更に、このアッセイで、血小板放出物含有濃縮成長培地はＦＢＳに比べて、細胞増殖の強化及び細胞生存率の維持、及び生体外でのヒトＭＳＣの増殖を可能にし、それらの骨形成、軟骨形成及び脂質生成分化能を増強し、コンフルエントに達する時間を短縮し、ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔのサイズを増加することが裏付けられる。
【０１８２】
これらの結果はまた、本発明又は本発明の治療における方法によって得られた成長因子濃縮物、及び改善された細胞培養培を調製するための、重要な可能性を確認するものである。実際、本発明の成長因子濃縮物は、毒性を生じることなしに血小板放出物の細胞増殖刺激活性を維持する。従って、細胞療法及び再生医療において、ＦＢＳ及び活性化血小板放出物の代替候補として考慮することができる。
【０１８３】
ＩＩ．６-フィブリノーゲン枯渇ＧＦ濃縮物の調製
ａ．ＧＦ混合物の調製
ＰＣ（約３００ｍｌ）を採取後２４時間以内に処理した。最初に、１％トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）（総量＝６ｍＬ）の組み合わせを用いて、イン−バッグ（ｉｎ−ｂａｇ）で溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理を行った。Ｓ／Ｄ−ＰＣ混合物を完全に混合するために１分間激しく振盪し、それから一定の緩やかな撹拌条件下で、３１℃の水槽に少なくとも１時間浸漬した。Ｓ／Ｄ処理終了、Ｓ／Ｄ−ＰＣ混合物を３０ｍＬ（１０％ｖ／ｖに相当）の大豆オイル（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で１回抽出した。オイル添加後、バッグを１分間激しく振盪し、それから２０分間回転シェーカー上に置いた。混合物を３０分間デカンテーションし、ＰＣフェーズからオイルフェーズを分離した。ＰＣ（下層；約２８０ｍｌ）が重力により回収された。オイル抽出終了時、Ｓ／Ｄ−ＰＣを１０，５００ｒｐｍ（１０，４００  ｘ  ｇ）で１５分間、室温（２０〜２５℃）で遠心分離した。
【０１８４】
３０ｍｌの上清をオクタデシル（Ｃ１８；ｂａｔｃｈ  ＷＡＴ０２０５９４，ドライパウダー；１２５Å  ポロシティ；５５〜１０５μｍの顆粒サイズ）充填剤を用いて、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）カラムにより無希釈で処理した。クロマトグラフの材料をカラムに充填し、５体積の１Ｍ塩化ナトリウムと２０％エタノールで洗浄し、２０ｍＭクエン酸バッファ５体積、ｐＨ７．４で平衡化した。ＳＤ−ＰＣをＨＩＣ吸着剤ｍｌ当たり７ｍｌの割合及び２２．６ｃｍ／ｈｒの線速度で注入した。２８０ｎｍでの吸収が増加し、そしてその吸収がベースラインに戻るとすぐに、Ｃ１８流出液（Ｃ１８−ＧＦ）を回収した。用いた実験条件下で、カラム通過画分の体積は６０〜８０ｍＬであり、注入されたＳＤ−ＰＣ体積に比べて２から３倍の希釈係数に相当した。
【０１８５】
研究過程で、他の２つのＨＩＣ吸着剤も上記と同様な実験条件下で評価した：ｔＣ１８吸着剤（ｂａｔｃｈ  ＷＡＴ０３６８１０；ドライパウダー；１２５Åポロシティ；３６．１〜５４．２μｍの顆粒サイズ；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ  吸着剤（ｂａｔｃｈ  ２００３３−０２２３，４０〜１００μｍ顆粒サイズ；Ｐａｌｌ−ＢｉｏＳｅｐｒａ，  Ｃｅｒｇｙ  Ｓａｉｎｔ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）．
【０１８６】
ｂ．トロンビン活性化によるフィブリノーゲンの除去
フィブリノーゲン（及び他の凝固因子）は、（ａ）０．３ｍｌの１Ｍ  ＣａＣｌ2（最終濃度２３ｍＭ）及びガラスビーズ（内因性ヒトトロンビン生成のため）又は（ｂ）最終濃度約５０ＩＵ／ｍｌとするための１０００ＩＵウシトロンビンのどちらかを添加することにより、Ｃ１８クロマトグラフィ後に得られた成長因子混合物１０ｍｌの活性化によって除去された。フィブリン塊ができるまで混合物を緩やかな回転混合（６０ｒｐｍ）下においた。上清を回収し、分注し、そして測定した。
【０１８７】
ｃ．フィブリノーゲンの測定
【０１８８】
【表５】
0005770475.tif 000006
【０１８９】
このデータにより、フィブリノーゲンはＣａＣｌ2又は外来性トロンビンを用いて活性化した後、完全に除去されることが示される。
【０１９０】
ｄ．成長因子の測定
【０１９１】
【表６】
0005770475.tif 000007
【０１９２】
成長因子はフィブリノーゲン除去後、尚上清に存在することがデータから示される。
従って、フィブリノーゲンが（上記方法により）除去されたウイルス不活化成長因子混合物は細胞培養、特に幹細胞培養の添加剤として、使用できる可能性がある。
【０１９３】
ＩＩ．７−ウイルス不活化
更に、ここで使用されたＳ／Ｄ処理条件は血液感染性エンベロープウイルス、特にＨＩＶ、ＨＢＶ及びＨＣＶの不活化に効果的であるという証拠が多数ある。
【０１９４】
上記材料及び方法で述べたように、３１℃での１％ＴｎＢＰ−１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の組み合わせは５分以内の処理において、ＨＩＶ、ＢＶＤＶ及びＰＲＶに対して減少係数、＞５．６、＞６．６、及び＞６．４ｌｏｇ10を保証し、そして＞７．０ｌｏｇ10で急速にＶＳＶ及びＳｉｎｄｂｉｓモデルウイルスを不活化する。ＨＡＶ及びパルボウイルスＢ１９のような非エンベロープウイルスはＳ／Ｄ処理で不活化されないかもしれないが、それらは免疫機能の変化した数名患者にのみ病原性を示す。単一ドナーの同種異系の血小板由来成長因子調製品ではプールしていない場合、統計学上、汚染リスクが極めて減少するだろう。しかし、更に非エンベロープウイルスによる汚染リスクを減少するために、ナノ濾過を実行してもよい。
【０１９５】
明らかに、ここに記載されたように、血小板由来成長因子は将来、適正製造基準、医薬品製造管理および品質管理基準（ＧＭＰ）の条件下、例えば血液施設（ヒト由来血漿分画製剤のウイルス安全性の確保のためのウイルス不活化及び除去処理工程に係るガイドラインｗｗｗ．ＷＨＯ．ｉｎｔ．Ｇｅｎｅｖａ，２００３：１−７２）によって製造しなければならだろう。このような血小板製剤のＳ／Ｄ処理は、局所適用として実用面で利点を多数提供することができる。第一に、同種異系での提供におけるウイルスに関する安全性が改善され、このような製剤の臨床的可能性がより広がるだろう。第二に、Ｓ／Ｄ処理により放出される、より高力価の血小板由来成長因子は血小板放出物を用いる方法の費用対効果の改善が可能になるだろう。第三に、組み換え血小板由来成長因子の使用が承認されないような適用において、又は、天然の血小板由来成長因子の組み合わせが有効な相乗的結果をもたらす可能性がある時、もし承認されれば（数種の下肢の糖尿病性潰瘍の治療に関し）、このウイルス不活化方法により、同種異系の血小板由来成長因子が簡便に使用することができるだろう。最後に、十分に特徴づけられたウイルス不活化血小板由来成長因子は、ウシ胎仔血清又は細胞工学研究のための組み換え血小板由来成長因子の代替物として、治癒過程を促進するので局所に適用するフィブリンベースの足場か又は人工の足場に組み込むんで使用可能であり、又は生体外での間葉幹細胞の増殖、及びそれらの骨細胞、又は軟骨細胞への分化のためにも使用可能であろう。
【０１９６】
ＩＩＩ．成長因子の分離：ＳＤの除去及び成長因子画分の分離のためのイオン交換クロマトグラフィ実験
１．適切なクロマトグラフ支持体の選択及び各種成長因子の結合能力決定のためのバッチ吸着工程の予備試験
ａ．  Ａ  ＰＤＧＦ−ＡＢの吸着テスト
先に記載したように、ＳＤ−ＰＣを得た。ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の量を減少するため、１回のオイル抽出が行われた。５ｍｌのＳＰ−セファロースＦＦゲル、ＣＭ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦをカラム中で洗浄し、ゲルを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍ  ＮａＣｌバッファで、ｐＨ７．５で平衡化した（流出液のｐＨと伝導度は出発バッファと同じ）。ゲルをカラムから出してビーカーの中に回収した。希釈ＮａＯＨで、ＳＤ−ＰＣのｐＨを７．５に調製した。各ゲルの１ｇを別々のチューブに入れて余剰バッファを除いた。様々な量のＳＤ−ＰＣを各種のゲルに加えた。チューブを低速で３０分間回転させ、約５〜１０分間ゲルを沈殿させた。可能な限り多くの上清を回収し、成長因子含有量を測定するためにサンプルを採取した。
【０１９７】
出発ＳＤ−ＰＣは２８０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＡＢを含んでいた。カチオン交換ゲルであるＳＰ−セファロースＦＦ及びＣＭ−セファロースＦＦのゲル１ｍｌ当たり３から１０ｍｌのＳＤ−ＰＣの割合で使用した時、ＰＤＧＦ−ＡＢの最大吸着を得た。ゲル１ｇに対してＳＤ−ＰＣ１０ｍｌの割合で、ＳＰ−セファロースＦＦと接触させた後、上清中に少量のＰＤＧＦ−ＡＢしか存在しないということから明らかなように、ＳＰ−セファロースＦＦを用いると特に高い吸着が得られた。反対に、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（約２５０ｎｇ／ｇ）でＳＤ−ＰＣを吸着した後に得られた上清には、多量のＰＤＧＦ−ＡＢが存在した。これらのデータは図７に示す。
【０１９８】
ｂ．ＶＥＧＦの吸着テスト
先に記載したように、ＳＤ−ＰＣを得た。ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の量を減少するため、１回のオイル抽出が行われた。５ｍｌのＳＰ−セファロースＦＦゲル、ＣＭ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦをカラム中で洗浄し、ゲルを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍ  ＮａＣｌバッファで、ｐＨ７．５で平衡化した（流出液のｐＨと伝導度は出発バッファと同じ）。ゲルをカラムから出してビーカーの中に回収した。希釈ＮａＯＨで、ＳＤ−ＰＣのｐＨを７．５に調整した。各ゲルの１ｇを別々のチューブに入れて余剰バッファを除いた。様々な量のＳＤ−ＰＣを各種のゲルに加えた。チューブを低速で３０分間回転させ、約５〜１０分間ゲルを沈殿させた。可能な限り多くの上清を回収し、成長因子含有量を測定するためにサンプルを採取した。
【０１９９】
図８に、ゲルに対するＳＤ−ＰＣの割合に基づいた各種レジンにおけるＶＥＧＦの吸着％を示す。ＶＥＧＦは本質的に吸着されなかったので、アニオン交換体ＤＥＡＥ−セファロースＦＦを特にゲル１ｇにたいして１０ｍｌのＳＤ−ＰＣの割合で使用すると、ＶＥＧＦの吸着が限定されることがデータにより示される。反対に、ＶＥＧＦは高い割合（約６０％）でＳＰ−セファロースＦＦ及びＣＭ−セファロースＦＦにより吸着された。
【０２００】
ｃ．  ＴＧＦ−β１の吸着テスト
先に記載したように、ＳＤ−ＰＣを得た。ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の量を減少するため、１回のオイル抽出が行われた。５ｍｌのＳＰ−セファロースＦＦゲル、ＣＭ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦをカラム中で洗浄し、ゲルを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍ  ＮａＣｌバッファで、ｐＨ７．５で平衡化した（流出液のｐＨと伝導度は出発バッファと同じ）。ゲルをカラムから出してビーカーの中に回収した。希釈ＮａＯＨで、ＳＤ−ＰＣのｐＨを７．５に調整した。各ゲルの１ｇを別々のチューブに入れて余剰バッファを除いた。様々な量のＳＤ−ＰＣを各種のゲルに加えた。チューブを低速で３０分間回転させ、約５〜１０分間ゲルを沈殿させた。可能な限り多くの上清を回収し、成長因子含有量を測定するためにサンプルを採取した。
【０２０１】
図９はゲルに対するＳＤ−ＰＣの割合に基づいた各種レジンにおけるＴＧＦ−β１の吸着％を示す。アニオン交換体ＤＥＡＥ−セファロースＦＦのゲル１ｍｌ当たり３ｍｌのＳＤ−ＰＣの割合で使用すると、７０％を超えるＴＧＦ−β１が吸着され、最大吸着を得た。反対に、少量（約２０％又はそれ以下）のＴＧＦ−β１がＣＭ−セファロースＦＦ及びＳＰ−セファロースＦＦに吸着された。
【０２０２】
ｄ．ＥＧＦの吸着テスト
先に記載したように、ＳＤ−ＰＣを得た。ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の量を減少するため、１回のオイル抽出が行われた。５ｍｌのＳＰ−セファロースＦＦゲル、ＣＭ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦをカラム中で洗浄し、ゲルを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍ  ＮａＣｌバッファで、ｐＨ７．５で平衡化した（流出液のｐＨと伝導度は出発バッファと同じ）した。ゲルをカラムから出してビーカーの中に回収した。希釈ＮａＯＨで、ＳＤ−ＰＣのｐＨを７．５に調整した。各ゲルの１ｇを別々のチューブに入れて余剰バッファを除いた。様々な量のＳＤ−ＰＣを各種のゲルに加えた。チューブを低速で３０分間回転させ、約５〜１０分間ゲルを沈殿させた。可能な限り多くの上清を回収し、成長因子含有量を測定するためにサンプルを採取した。
【０２０３】
図１０はゲルに対するＳＤ−ＰＣの割合に基づいた各種レジンにおけるＥＧＦの吸着％を示す。アニオン交換体ＤＥＡＥ−セファロースＦＦのゲルのｇ当たり３ｍｌのＳＤ−ＰＣの割合で使用すると、７０％を超えるＥＧＦが吸着され、最大吸着を得た。反対に、少量（１５から３０％）がＳＰ−セファロースＦＦに吸着され、ＣＭ−セファロースＦＦを用いると更に少量（５から２０％）が吸着された。
【０２０４】
ｅ．結論
カチオン交換ＳＰ−セファロースＦＦ及びＣＭ−セファロースＦＦは、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＶＥＧＦの吸着に適合することが分かった。一方、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦはＴＧＦ−β１及びＥＧＦの吸着に対して満足な結果が得られた。
【０２０５】
２．ＳＰ−セファロース  ＦＦカラムクロマトグラフィ実験
イオン交換体を使用したときＳＤが除去されているかどうかを確認するため、更に以下の実験を行った。
【０２０６】
ａ．ＳＤ−ＰＣの調製
この実験では、ＳＤ−ＰＣに対し１回のオイル抽出が行われた。使用されたＳＰ−セファロース  ＦＦの量は、バッチ吸着実験で測定されたように、１回のオイル抽出が行われたＳＰ−ＰＣの１００ｍｌに対して１０ｍｌ（約１０ｇ）だった。
【０２０７】
ｂ．カラムの平衡化
ＳＰ−セファロースＦＦをカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。カラムに充填後、ＳＰ−セファロースＦＦを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍ  ＮａＣｌバッファで、ｐＨ７．５で平衡化した。流出液のｐＨと伝導度が平衡バッファと同じになるまで、平衡バッファを５０ｃｍ／ｈｒの線速度でカラムに流した。２８０ｎｍでの流出液の吸収が記録された。
【０２０８】
ｃ．ＳＤ−ＰＣ注入とカラム通過液の収集
希釈ＮａＯＨでＳＤ−ＰＣのｐＨを７．５に調節し、それから５０ｃｍ／ｈｒの線速度でカラムに注入した。Ａ２８０ｎｍが増加し始めたらすぐに流出液を収集した。
【０２０９】
ｄ．ベースラインへの戻りと成長因子溶出
全ＳＤ−ＰＣを注入し、Ａ２８０ｎｍが初期のベースラインに戻るまで、カラムを平衡バッファで洗浄した。その後、ＳＰ−セファロースＦＦを２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌバッファで、ｐＨ７．５及び５０ｃｍ／ｈｒで平衡化した。Ａ２８０ｎｍが増加し始め、ベースラインＡ２８０ｎｍのレベルへ戻ると、すぐに溶出液を収集した。
【０２１０】
ｅ．カラム再生と保存
カラムはその後、２Ｍ塩化ナトリウムの２カラム体積、続いて０．５Ｎ  ＮａＯＨの２カラム体積で再生された。
【０２１１】
ｆ．結果
表６はカラム溶出液中の成長因子含有量を、表７は溶媒及び界面活性剤含有量を示す。
【０２１２】
【表７】
0005770475.tif 000008
【０２１３】
表６は、ＳＰ−溶出液はＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢが濃縮され、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＶＥＧＦの両方を分離可能なことを示す。一方、ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５カラム通過（流出）画分で見られた（表７参照）。１Ｍ  ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＶＥＧＦ溶出液では、これらウイルス不活性化剤の混入は検出できなかった。
【０２１４】
【表８】
0005770475.tif 000009
【０２１５】
３．ＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムクロマトグラフィ実験
ａ．ＳＤ−ＰＣの調製
ＰＣ（約３００ｍｌ）を採取後２４時間以内に処理した。最初に、１％トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）（総量＝６ｍＬ）の組み合わせを用いて、イン−バッグ（ｉｎ−ｂａｇ）で溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理を行った。Ｓ／Ｄ−ＰＣ混合物を完全に混合するために１分間激しく振盪し、それから一定の緩やかな撹拌条件下で、３１℃の水槽に少なくとも１時間浸漬した。Ｓ／Ｄ処理終了、Ｓ／Ｄ−ＰＣ混合物を３０ｍＬ（１０％ｖ／ｖに相当）の大豆オイル（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で１回抽出した。オイル添加後、バッグを１分間激しく振盪し、それから２０分間回転シェーカー上に置いた。混合物を３０分間デカンテーションし、ＰＣフェーズからオイルフェーズ分離した。ＰＣ（下層；約２８０ｍｌ）が重力により回収された。オイル抽出終了時、Ｓ／Ｄ−ＰＣを１０，５００ｒｐｍ（１０，６００ｘｇ）で１５分間、室温（２０〜２５℃）で遠心分離した。
【０２１６】
ｂ．Ｈｉ−Ｔｒａｐ（商標）ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ
２０ｍＬの上清を充填済みですぐに使用できる（直ちに使用できるように予備包装されている）カラムを用いアニオン交換クロマトグラフィによる希釈を行わずに処理した。Ｈｉ−Ｔｒａｐ（商標）ＤＥＡＥ−セファロースＦＦの使用量は、２０ｍｌのＳＤ−ＰＣサンプルに対して５ｍｌであった。カラムを５体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５Ｍ  ＮａＣｌバッファ、ｐＨ７．５で平衡化した。ＳＤ−ＰＣ（２０ｍＬ）が流速５０ｃｍ／ｈｒで注入され、続いて平衡バッファが注入された。２８０ｎｍでの吸収が増加し、そしてそれがベースラインへ戻るとすぐに、カラム通過画分（ＤＥＡＥ−ＢＫＴ）を回収した。カラム通過画分の体積は４９．７ｍＬであった。それから更に５体積の平衡バッファでカラムを洗浄して完全にＳＤをカラム通過画分中へ洗い流した。カラムはそれから２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌバッファ、ｐＨ７．５、線速度５０ｃｍ／ｈｒで溶出された。２８０ｎｍでの吸収が増加し、そしてそれがベースラインへ戻るとすぐに、この溶出液を収集した（体積：１０ｍＬ）。
【０２１７】
図１２及び１３は調製工程中にｎｇ／ｍｌ及び総ｎｇで表示されたＥＧＦ含有量を示す。対応する溶出液は２８０ｎｍでの吸収が増加し、そしてそれがベースラインへ戻るとすぐに、収集された。収集された体積は１７．９ｍＬであった。カラム通過画分及び溶出液のＳＤ剤及び成長因子が測定された（表８参照）。
【０２１８】
【表９】
0005770475.tif 000010
【０２１９】
データはＤＥＡＥクロマトグラフィの工程により、１回のオイル抽出後にＳＤ−ＰＣ中に存在したＳ／Ｄ剤が除去されたことを示す。Ｓ／Ｄ剤をカラム通過画分及び１Ｍ  ＮａＣｌ溶出液中で収集したが、検出不可能な量であることがわかった。
【０２２０】
ｃ．成長因子ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＡＢ含有量
カラム通過画分及び溶出液中の成長因子ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＡＢの含有量について解析した。図１４及び１５は総ｎｇで表示された成長因子の含有量を示す。ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＶＥＧＦはＤＥＡＥ−セファロースマトリックスに結合せず、カラム通過画分中に存在した（この適用での文脈では、用語ゲルとマトリックスは同じ意味である）。反対に、ＥＧＦはゲルに吸着され、カラムからＳＤ剤が存在せずに溶出された。
【０２２１】
上記のアニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフによる処理は、上記に例示したように、オイル抽出されたＳＤ−ＰＣで行うことができるが、オイル抽出を伴わないＳＤ−ＰＣに直接応用することもできる。ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の混入量が減るので、カラム洗浄に必要なバッファ体積が減り、ベースラインへの戻りがより早くなるので、オイル抽出を行うことが好ましい。オイル抽出は、クロマトグラフ材料の目詰まりとそれによる分離技術の効率低下を招きやすい脂質量も減少する。しかし、オイル抽出は除外されてもよい。
【０２２２】
上記のアニオン性及び／又はカチオン性クロマトグラフによる処理は、従ってＳ／Ｄ処理後直接行ってもよいが、オイル抽出後、又はＳ／Ｄ処理後又はオイル抽出後に使用されるなら、疎水性カラムの通過画分で行われることが好ましい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ）】
0005770475.tif 000015
【図５ｂ）】
0005770475.tif 000016
【図６ａ）】
0005770475.tif 000017
【図６ｂ）】
0005770475.tif 000018
【図７】
0005770475.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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