(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質と内因性の染色体の細胞性クロマチンとの間の複合体を含んでなる細胞であって；
該外因性のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮａｓｅＩを用いた消化に感受性であることが知られている内因性の細胞性クロマチン領域中の標的部位に特異的に結合するように設計および／または選択され、
外因性のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質が標的部位と結合する、細胞。
【請求項２】
外因性のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質が細胞に導入された核酸によりコードされる、請求項１の細胞。
【請求項３】
植物細胞である請求項１または２の細胞。
【請求項４】
動物細胞である請求項１または２の細胞。
【請求項５】
ヒト細胞である請求項４の細胞。
【請求項６】
請求項１ないし５の何れか一項に記載の複合体を含んでなる細胞を形成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
細胞に外因性のジンクフィンガータンパク質を導入することを含み、
外因性のジンクフィンガータンパク質がＤＮａｓｅＩを用いた消化に感受性であることが知られている内因性の細胞性クロマチンの標的部位領域と結合する、方法。
【請求項７】
結合部位が、コード化領域中に存在する、請求項６に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項８】
結合部位が、非コード化領域中に存在する、請求項６に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項９】
請求項１ないし５の何れか一項に記載の複合体を含んでなる細胞を形成するための方法であって、
細胞に外因性のジンクフィンガータンパク質を導入することを含み、
外因性のジンクフィンガータンパク質がＤＮａｓｅＩを用いた消化に感受性であることが知られている内因性の細胞性クロマチンの標的部位領域と結合し、細胞がヒト以外の細胞である方法。
【請求項１０】
結合部位が、コード化領域中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結合部位が、非コード化領域中に存在する、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（技術分野）
本開示は、遺伝子調節、より詳細には、細胞中の内因性遺伝子の調節および外因性分子の結合を通じて内因性遺伝子を調節する方法の分野である。
【０００２】
（背景）
細胞中の遺伝子調節は、しばしば、遺伝子調節タンパク質の配列特異的結合によって媒介される。これらの調節タンパク質は、遺伝子発現のポジティブな調節またはネガティブな調節のいずれかをもたらし得る。一般的に、調節タンパク質は、特定の結合配列、すなわち標的部位への結合についての優先を示す。多くの調節タンパク質（および他の分子）に対する標的部位が、公知であるか、または当業者によって決定され得る。
【０００３】
近年、予め決定されたＤＮＡ標的部位に結合する調節タンパク質を得ることが、可能になってきている。このようなタンパク質は、例えば、特定のアミノ酸残基において配列が完全または部分的に無作為化されたタンパク質のプールからの結合タンパク質の選択のための、特異的ＤＮＡ配列を使用することによって入手し得るか；またはタンパク質のアミノ酸配列を標的部位のＤＮＡ配列に関連付ける設計概念を用いて、特定の標的部位に結合することが公知のアミノ酸配列を有するタンパク質の設計を通して入手し得る。この技術は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）として公知のＤＮＡ結合タンパク質の型について最も高度に開発されている。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；ＷＯ ９５／１９４３１；ＷＯ ９８／５４３１１；ＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８；米国特許出願０９／４４４，２４１（１９９９年１１月１９日出願）；米国特許出願０９／５３５，０８８（２０００年３月２３日出願）；Ｒｅｂａｒら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；Ｊａｍｉｅｓｏｎら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５６８９−５６９５；Ｃｈｏｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１１１６３−１１１６７；ならびにＧｒｅｉｓｍａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７−６６１を参照のこと。
【０００４】
上記の方法によって選択または設計される組換えＺＦＰは、培養細胞において一過性に発現されるレポーター遺伝子および無作為に組込まれた外因性標的遺伝子の発現を調節する能力を有することが報告されている。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４）または転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、またはＳＩＤ）に融合されて、それぞれ、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインについての標的配列に隣接した遺伝子の活性化または抑制を獲得し得る。例えば、Ｃｈｏｏら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６４２−６４５；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３−９６；Ｌｉｕら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５５２５−５５３０；およびＢｅｅｒｌｉら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２８−１４６３３を参照のこと。
【０００５】
Ｋａｎｇら（（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：８７４２−８７４８）は、染色体外レポーター遺伝子および組込まれたレポーター遺伝子の転写に対する、操作されたＺＦＰの細胞配列の影響を報告している。彼らは、操作されたＺＦＰが、ＧＡＬ４−ＶＰ１６融合タンパク質によるレポーター遺伝子の転写活性化を優越し得たことを報告した。これらの著者らは、細胞性クロマチンにおける外因性分子についての結合部位を選択するための方法を開示しなかった。
【０００６】
Ｂｅｅｒｌｉら（（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１４９５−１５００）は、設計されたＺＦＰを有する内因性ｅｒｂＢ２遺伝子およびｅｒｂＢ３遺伝子の調節を報告する。しかし、彼らは、細胞性クロマチンにおける外因性分子についての結合部位を選択するための方法を開示しない。
【０００７】
配列特異的ＤＮＡ結合遺伝子調節タンパク質の選択および設計における進歩にもかかわらず、いくつかの場合、内因性細胞遺伝子の調節に対するこれらの適用は、標的部位へのこのタンパク質の接近が細胞中で制限される場合、限定されされ得る。制限された接近が可能な供給源は、遺伝子のクロマチン構造の１つ以上の局面に関連し得る。
【０００８】
細胞性ＤＮＡ（細胞性ゲノムを含む）は、一般的に、クロマチン（核酸およびタンパク質を含む複合体）の形態で存在する。実際、ほとんどの細胞性ＲＮＡもまた、核タンパク質複合体の形態で存在する。クロマチンの核タンパク質構造は、徹底的な研究の課題であり、同様に当業者に公知である。一般的に、染色体ＤＮＡは、ヌクレオソームにパッケージングされる。ヌクレオソームは、コアおよびリンカーを含む。ヌクレオソームコアは、その周りに染色体ＤＮＡの約１５０塩基対が巻きついた、コアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の各々が２個ずつ）の８量体を含む。さらに、約５０塩基対のリンカーＤＮＡセグメントは、リンカーヒストンＨ１と会合する。ヌクレオソームは、高次のクロマチン繊維に組織化され、そしてクロマチン繊維は、染色体に組織化される。例えば、Ｗｏｌｆｆｅ「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８を参照のこと。
【０００９】
細胞性ＤＮＡ（ゆえに、細胞性遺伝子）がクロマチンにパッケージングされる事実に起因して、細胞性核酸における標的部位の存在は、細胞中で標的部位の配列とそれに結合し得る分子との間で結合が生じることを、必ずしも保証しない。例えば、標的部位がパッケージングされる細胞性クロマチンの構造は、標的部位を閉塞するようにかまたは他の方法でブロックするようにはたらき得、このことは、結合タンパク質（例えば、転写因子）の標的部位への接近可能性を制限する。
【００１０】
従って、細胞性クロマチンにおいて外因性分子についての接近可能な標的部位（すなわち、結合部位）を同定するさらなる方法、ならびに細胞性クロマチン中の目的領域内の結合部位への外因性分子を結合させるためのさらなる方法を有することは、有用である。
【００１１】
（要旨）
細胞性クロマチン中の結合部位へ外因性分子を結合させるための方法が、提供される。結合部位は、細胞性クロマチン中の任意の目的領域（転写される領域、転写されない領域、コード領域および／または非コード領域を含む）であり得る。細胞性クロマチンは、例えば、染色体、エピソーム、または任意の他の細胞性核酸を含み得る。この方法は、細胞性クロマチン中の接近可能な領域の目的領域内における同定、この接近可能な領域内の外因性分子についての標的部位の同定、および細胞への外因性分子の導入を含み、これによって外因性分子は標的部位に結合する。
【００１２】
１つの実施形態において、この方法はまた、例えば、クロマチン免疫沈降および／またはインビボフットプリンティングのような方法を用いて、標的部位への外因性分子の結合について試験する工程を包含する。
【００１３】
細胞性クロマチン中の目的の領域内の外因性分子についての結合部位を同定するための方法がまた、本明細書中に開示され、ここで、この方法は、細胞性クロマチン中の接近可能な領域の同定、およびこの接近可能な領域内の外因性分子についての標的部位の同定を含む。さらなる実施形態において、この方法はさらに、細胞へ外因性分子を導入する工程、およびこの外因性分子の標的部位への結合について試験する工程を包含する。結合について試験する工程は、例えば、クロマチン免疫沈降および／またはインビボフットプリンティングのような方法を用いて実行され得る。
【００１４】
接近可能な領域は、例えば、種々の構造プローブの作用（化学的または酵素学的）に対して高感受性である細胞性クロマチン中の領域を同定することによって決定される。好ましい実施形態において、酵素学的プローブが、使用される。より好ましい実施形態において、酵素学的プローブは、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ Ｉ）である。
【００１５】
多数の異なる型の外因性分子が、本明細書中に開示される方法を用いて、細胞性クロマチン中の標的部位に結合し得る。これらとしては、高分子（例えば、タンパク質、核酸）、低分子、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ−ＲＮＡキメラ、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）、およびタンパク質アナログ（例えば、ポリアミドならびに二本鎖ＤＮＡの主溝および／または副溝に結合するペプチドアナログ（例えば、ジスタマイシンおよびブレオマイシン））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
特定の実施形態において、外因性分子がタンパク質である場合、このタンパク質は、１つ以上の以下のプロセスに関与するタンパク質であり得る：複製、組換え、組込み、ＤＮＡ修復、転写調節またはクロマチンリモデリング。転写調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑制のようなプロセスを含み得る。遺伝子活性化としては、基底レベルを超えた転写における増加、または遺伝子の総転写抑制の軽減が挙げられ得る。同様に、転写抑制としては、活性化遺伝子の転写の低くあるが検出可能なレベルへの減少、または転写の完全なサイレンシングが挙げられ得る。クロマチンリモデリングとしては、以下のようなプロセスが挙げられる：アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化および／またはヒストンのＡＤＰ−リボシル化状態、ならびに／またはヒストンのタンパク質分解に変化をもたらすプロセス。クロマチンリモデリングはまた、酵素または酵素複合体（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ）および複合体（例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体）の作用から生じ得る。変化の場合に関わらず、遺伝子活性におけるいかなる変化も、遺伝子発現の調節として記載され得る。
【００１７】
さらなる実施形態において、外因性分子は、タンパク質であり得、そしてこのタンパク質は、転写因子である。好ましい実施形態において、転写因子は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）である。ＺＦＰ転写因子およびその標的部位は、例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第６，００７，４０８号；米国特許第６，０１３，４５３号；ＰＣＴ ＷＯ９５／１９４３１；ＰＣＴ ＷＯ９８／５４３１１ 共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８ならびにそれらに引用される参考文献；共有に係る米国特許出願０９／４４４，２４１（１９９９年１１月１９日）；および共有に係る米国特許出願０９／５３５，０８８（２０００年３月２３日）に記載される。１つの実施形態において、ＺＦＰについての結合部位は、配列５’−ＮＮｘ ａＮｙ ｂＮｚ ｃ−３’を含み、ここで、（ｘ，ａ）、（ｙ，ｂ）および（ｚ，ｃ）の各々は、（Ｎ，Ｎ）または（Ｇ，Ｋ）であり、そして（ｘ，ａ）、（ｙ，ｂ）および（ｚ，ｃ）のうちの少なくとも１つは、（Ｇ，Ｋ）であり；ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてＫは、ＧまたはＴのいずれかである。
【００１８】
別の実施形態において、接近可能な領域は、目的領域内で同定され、そしてＺＦＰ標的部位は、接近可能な領域内に配置されている。標的部位に結合するＺＦＰが、設計される。設計されたＺＦＰが、細胞に導入され得るか、または設計されたＺＦＰをコードする核酸が設計され、そしてこの設計された核酸が、細胞に導入され得、ここで、この細胞は、設計されたＺＦＰを発現する。特異的な配列に結合するＺＦＰの設計および／または選択のための方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第６，００７，４０８号；米国特許第６，０１３，４５３号；ＰＣＴ ＷＯ９５／１９４３１；ＰＣＴ ＷＯ９８／５４３１１ 共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８ならびにそれらに引用される参考文献；共有に係る米国特許出願０９／４４４，２４１（１９９９年１１月１９日）；および共有に係る米国特許出願０９／５３５，０８８（２０００年３月２３日）に記載される。選択のための方法としては、ファージディスプレイおよびインビボ選択が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
別の実施形態では、外因性分子がタンパク質である場合、このタンパク質は、１以上の標的配列の検出のために用いられる。
【００２０】
外因性分子は、以下が挙げられるがこれらに限定されない、当業者に公知である任意の方法によって細胞に導入され得る：脂質媒介遺伝子移入（例えば、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、パーティクルボンバードメント、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入およびウイルスベクター媒介遺伝子移入。Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８７および定期補充物（特に第９章）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９（特に第１６章）；ならびに関連の参考文献もまた参照のこと。
【００２１】
さらなる実施形態では、外因性分子がタンパク質である場合、このタンパク質は、外因性核酸によってコードされる。これらの実施形態では、外因性核酸は、細胞中に導入され、ここで、外因性核酸は、外因性タンパク質をコードする。
【００２２】
本明細書中に開示される方法は、以下が挙げられるがこれらに限定されない任意の細胞型に適用可能である：原核生物細胞、真核生物細胞、ＡｒｃｈａｅａおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ。真核生物細胞としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：真菌細胞、植物細胞および動物細胞（哺乳動物細胞、特にヒト細胞が挙げられる）。
【００２３】
多数の異なる種類の外因性分子についての結合部位は、本明細書中に開示される方法を用いて同定され得る。これらとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：高分子（例えば、タンパク質、核酸）、低分子、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ−ＲＮＡキメラ、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、タンパク質アナログ（例えば、二本鎖ＤＮＡの主溝および／または副溝に結合する、ポリアミドおよびペプチドアナログ（例えば、ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）およびブレオマイシン））。
【００２４】
細胞へ外因性分子を導入することおよび結合部位への外因性分子の結合について試験することを含む方法では、接近可能領域内に位置する標的部位に結合するＺＦＰが設計される。設計されたＺＦＰは、細胞へ導入され得るか、または設計されたＺＦＰをコードする核酸が設計され得、そして設計された核酸が細胞に導入され得、ここで、この核酸は、設計されたＺＦＰを発現する。特異的配列を結合するＺＦＰの設計および／または選択のための方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第６００７，４０８号；米国特許第６，０１３，４５３号；ＰＣＴ ＷＯ ９５／１９４３１；ＰＣＴ ＷＯ ９８／５４３１１、共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８およびその中で引用された参考文献；共有に係る米国特許出願第０９／４４４，２４１号（１９９９年１１月１９日出願）；ならびに共有に係る米国特許出願第０９／５３５，０８８号（２０００年３月２３日出願）に開示される。選択のための方法としては、ファージディスプレーおよびインビボ選択が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
別の実施形態では、外因性分子がタンパク質である場合、このタンパク質は、標的配列の検出のために用いられる。
【００２６】
さらなる実施形態では、外因性分子がタンパク質である場合、このタンパク質は、外因性核酸によってコードされる。これらの実施形態では、この外因性核酸は、細胞へ導入され、ここで、この核酸は、外因性タンパク質をコードする。
【００２７】
結合部位を同定するための本明細書中に開示される方法は、以下が挙げられるがこれらに限定されない任意の細胞型における結合部位に適用可能である：原核生物細胞、真核生物細胞、ＡｒｃｈａｅａおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ。真核生物細胞としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：真菌細胞、植物細胞および動物細胞（哺乳動物細胞、特にヒト細胞が挙げられる）。
【００２８】
本明細書中には、外因性分子と結合部位との間の複合体、ならびに外因性分子と結合部位との間の複合体を含む細胞もまた開示され、ここで、この結合部位は、細胞性クロマチン中の目的の領域内に位置し、そしてここで、この結合部位は、本明細書中に開示される方法に従って決定される。
【００２９】
（詳細な説明）
例えば、治療、診断、標的確認および研究の分野の多くの例では、外因性分子を用いて内因性遺伝子を調節する能力が所望される。例えば、多くの病態生理学プロセスは、異常な遺伝子発現の結果である。例としては、慢性関節リウマチにおける炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの不適切な活性化、高コレステロール血症における肝臓ＬＤＬレセプターの過少発現、血管新生誘発性（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）因子の過剰発現、および固形腫瘍の増殖における抗血管新生因子の過少発現が挙げられる。遺伝子発現の制御のための治療方法が存在するならば、これらの病状の多くは、より最適に処置され得る。
【００３０】
細胞性遺伝子発現を調節し得ることの治療的有用性の別の例では、発生的にサイレントかまたはさもなければ不活性な遺伝子は、特定の疾患状態を処置するために活性化される。遺伝子再活性化の、あり得る治療適用の例としては、鎌状赤血球症を処置するための、発生的にサイレントな胎児グロビン遺伝子の活性化、ならびに筋ジストロフィーを処置するための、ジストロフィン遺伝子および／またはユートロフィン（ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子の活性化が挙げられる。さらに、病原性生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌および原生動物）は、遺伝子発現を変更することによって制御され得る。従って、疾患関連遺伝子の配列特異的調節を通して作用する、改善された治療アプローチについての必要性が存在する。
【００３１】
内因性遺伝子の調節が達成され得る１つの方法は、ＤＮＡに結合する転写調節タンパク質の使用を通してである。例えば、転写調節タンパク質（すなわち、標的部位）についての結合配列の存在について目的の遺伝子を含むヌクレオチド配列を検索し得、そしてこのような配列が見出された場合、転写調節タンパク質を細胞へ導入し得る。しかし、遺伝子配列内または遺伝子配列に隣接した標的部位の存在は、その配列を認識するタンパク質が、細胞のクロマチン中に存在するような配列に結合することを常に暗示するわけではない。このようなことがなぜ生じるかについてのいくつかの理由が存在する。第一に、標的部位は、ヒストンまたは他の染色体タンパク質によってブロックされ得る。第二に、標的部位のＤＮＡ配列は、結合と不適合である、二次構造または三次構造を有し得る。例えば、ヌクレオソームの周りのＤＮＡの巻き付きは、ＤＮＡの二次構造および三次構造に影響を与え得る。さらに、特定のＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡを屈曲または湾曲させることが公知である；このような屈曲または湾曲は、ＤＮＡの調節機能が現れるのに必要とされ得る。第三に、調節タンパク質についての結合部位は、核酸表面およびタンパク質表面の両方によって規定され得る。
【００３２】
従って、特定の環境では、結合分子が細胞性クロマチン中のその標的部位と相互作用することが可能であり得るが；他の状況では、その標的部位への分子の結合は、細胞性クロマチン中に存在するように、クロマチン構造の１以上の局面に起因して生じないかもしれない。従って、結合分子についての標的部位が細胞性クロマチン中の結合部位でもあるか否かを決定するための方法は、本明細書中に開示される。
【００３３】
（概論）
本明細書中に記載される方法の実施は、他に示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当該分野の技術範囲内である関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献で充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的な最新版；シリーズＭｅｔｈｏｄｓ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ならびにＷｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，第三版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８を参照のこと。
【００３４】
（定義）
クロマチンは、細胞性ゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞性クロマチンは、核酸（主にＤＮＡ）およびタンパク質（ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む）を含む。
【００３５】
染色体は、当業者に公知であるように、細胞のゲノムの全てまたは一部を含む、クロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしば、その核型によって特徴付けられ、核型は、細胞のゲノムを含む全ての染色体の収集物である。細胞のゲノムは、１以上の染色体を含み得る。
【００３６】
エピソームは、複製する核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造体である。エピソームの例としては、プラスミドおよび特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００３７】
標的部位は、結合が存在するために充分な条件が与えられれば、結合分子が結合する核酸の一部を規定する、核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼについての標的部位である。その標的部位に対する分子の結合は一般に、裸の核酸分子において生じる（例えば、ＥｃｏＲＩは、裸のＤＮＡ中でその標的部位へ結合し（そしてそこで切断する））。しかし、細胞性クロマチン中に存在する標的部位は、クロマチン構造の何らかの局面の結果としてブロッキングされ得、従って、その結合分子に接近できないかもしれない。他の場合には、標的部位に加えて、標的部位での核酸への分子の結合に因子が必要とされ得る。例えば、標的部位を含むポリヌクレオチドへの分子の結合は、標的部位に隣接して、または標的部位の近傍に、特定のヌクレオチド配列および特定のタンパク質組成の両方を必要とし得る。例えば、温度、ｐＨおよびイオン強度のような条件もまた、その標的部位への分子の結合に影響を与え得る。
【００３８】
細胞性クロマチン中の結合部位は、特定の分子（例えば、タンパク質）がクロマチン中の標的部位に結合する領域である。結合部位は一般に標的部位を含むが、あらゆる標的部位が細胞性クロマチン中の結合部位を構成するわけではない。例えば、標的部位は、１以上の染色体成分（例えば、ヒストンもしくは非ヒストンタンパク質）によって閉塞され得るか、またはヌクレオソームもしくはより高次のクロマチン構造によってその結合分子に接近不可能にされ得る。一方、結合部位を規定するためには、標的部位に加えて、１以上の染色体タンパク質の存在が必要とされ得る。
【００３９】
接近可能領域は、染色体、エピソームまたは核酸を含む他の細胞性構造体中の部位であり、ここで、この核酸中に存在する標的部位は、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る。いずれの特定の理論によっても束縛されることを望まないが、接近可能領域は、ヌクレオソーム構造体へとパッキングされていない領域であると考えられる。接近可能領域の明瞭な構造はしばしば、化学的プローブおよび酵素的プローブ（例えば、ヌクレアーゼ）に対するその感受性によって検出され得る。
【００４０】
内因性分子は、細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞内小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム性核酸を含み得る。
【００４１】
外因性分子は、細胞中に天然では存在しないが、１以上の遺伝的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入されている分子である。外因性分子はとりわけ、（例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって作製された）低分子または高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質またはリポタンパク質）であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された、感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、またはその細胞に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞への外因性核酸の導入のための方法は当業者に公知であり、そして例示的な方法は以下に記載される。外因性分子は、例えば、機能性バージョンの機能不全内因性分子または機能不全バージョンの正常機能内因性分子を含み得る。
【００４２】
遺伝子発現の調節とは、遺伝子の活性における変化をいう。発現の調節としては、遺伝子活性化および遺伝子抑制が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００４３】
遺伝子活性化は、遺伝子産物の産生における増加をもたらす、任意のプロセスである。遺伝子産物は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび構造ＲＮＡを含むがこれらに限定されない）またはタンパク質のいずれであってもよい。従って、遺伝子活性化としては、遺伝子の転写および／またはｍＲＮＡの翻訳を増大させるプロセスが挙げられる。転写を増大させる遺伝子活性化プロセスの例としては、転写開始複合体の形成を容易にするプロセス、転写開始速度を増大させるプロセス、転写伸長速度を増大させるプロセス、転写処理性を増大させるプロセス、および転写抑制を解放するプロセス（例えば、転写リプレッサーの結合をブロックすることによる）が挙げられるがこれらに限定されない。翻訳を増大させる遺伝子活性化プロセスの例としては、翻訳開始を増大させるプロセス、翻訳伸長を増大させるプロセスおよびｍＲＮＡ安定性を増大させるプロセスが挙げられる。
【００４４】
遺伝子抑制は、遺伝子産物の産生における減少をもたらす任意のプロセスである。遺伝子産物は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび構造ＲＮＡを含むがこれらに限定されない）またはタンパク質のいずれであってもよい。従って、遺伝子抑制としては、遺伝子の転写および／またはｍＲＮＡの翻訳を減少させるプロセスが挙げられる。転写を減少させる遺伝子抑制プロセスの例としては、転写開始複合体の形成を阻害するプロセス、転写開始速度を減少させるプロセス、転写伸長速度を減少させるプロセス、転写処理性を減少させるプロセスおよび転写活性化を拮抗するプロセス（例えば、転写アクチベーターの結合をブロックすることによる）が挙げられるがこれらに限定されない。翻訳を減少させる遺伝子抑制プロセスの例としては、翻訳開始を減少させるプロセス、翻訳伸長を減少させるプロセスおよびｍＲＮＡ安定性を減少させるプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。転写抑制としては、可逆的遺伝子転写活性化および不可逆的遺伝子転写活性化の両方が挙げられる。
【００４５】
真核生物細胞としては、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
目的の領域は、外因性分子を結合することが望ましい、細胞性クロマチンの任意の領域（例えば、遺伝子または遺伝子中のもしくは遺伝子に隣接した非コード配列）である。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞内小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内に、転写される非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン）内に、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。
【００４７】
（接近可能領域）
細胞性クロマチン中の接近可能領域は一般に、代表的なヌクレオソーム構造を有さない領域である。このために、接近可能領域は、例えば、クロマチン構造をプローブする化学物質および／または酵素の使用によって同定および位置決定され得る。接近可能領域は一般に、バルククロマチンと比較して変更された、プローブに対する反応性を有する。接近可能領域は、バルククロマチンと比較して、プローブに対して感受性であり得るか、またはバルククロマチンによって示される感受性とは異なる感受性パターンを有し得る。接近可能領域は、クロマチン構造をプローブすることに関して当業者に公知の任意の方法によって同定され得る。
【００４８】
１つの実施形態では、クロマチン構造の酵素プローブは、接近可能領域を同定するために用いられる。好ましい実施形態では、酵素プローブは、ＤＮａｓｅ Ｉ（膵臓デオキシリボヌクレアーゼ）である。バルククロマチンと比較して、ＤＮａｓｅ Ｉによる消化に対する感受性の増大を示す細胞性クロマチン領域（すなわち、ＤＮａｓｅ高感受性部位）は、外因性分子の結合に好都合である構造を有する可能性がより高い。なぜなら、バルククロマチンのヌクレオソーム構造が一般に、外因性分子の結合の助けになるからである。さらに、クロマチンのＤＮａｓｅ高感受性領域はしばしば、遺伝子発現の調節に関与するＤＮＡ配列を含む。従って、ＤＮａｓｅ高感受性クロマチン領域に対する外因性分子の結合は、遺伝子調節に影響を有する可能性がより高い。
【００４９】
別の実施形態では、ミクロコッカルヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）は、接近可能領域を同定するためのクロマチン構造のプローブとして用いられる。ＭＮａｓｅは、ヌクレオソーム間に存在するリンカーＤＮＡを、バルククロマチンと比較して優先的に消化する。ヒストン八量体の周囲に巻きついている、ヌクレオソームＤＮＡ中に存在する配列である、このようなリンカーＤＮＡ配列は、外因性分子によって結合されやすいようである。
【００５０】
クロマチン構造のさらなる酵素プローブとしては、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヤエナリヌクレアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：４２４−４２８によって記載される方法は、接近可能領域を同定するために使用され得る。
【００５１】
接近可能領域の同定において有用な、クロマチン構造の化学的プローブとしては、ヒドロキシルラジカル、メチジウムプロピル−ＥＤＴＡ．Ｆｅ（ＩＩ）（ＭＰＥ）および架橋剤（例えば、ソラレン）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔｕｌｌｉｕｓら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５５巻（Ｊ．ＡｂｌｅｓｏｎおよびＭ．Ｓｉｍｏｎ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，５３７−５５８頁；Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３２１３−３２１７；Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３９３４−３９４５；およびＷｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１１９巻（Ｐ．Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１６１−１７３頁を参照のこと。
【００５２】
酵素的プローブおよび化学的プローブに対する反応性がバルククロマチンと比較して変更された配列の位置決定は、当業者に公知の方法によって達成される。例えば、Ｗｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１７０巻（Ｊ．ＡｂｅｌｓｏｎおよびＭ．Ｓｉｍｏｎ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，２６９−２８９頁；およびＣｏｃｋｅｒｉｌｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３０巻（Ｍ．Ｊ．Ｔｙｍｍｓ編），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ，２０００，２９−４６頁を参照のこと。いつの実施形態では、間接的末端標的の技術が用いられる。この方法では、細胞性クロマチン（例えば、単離された核の形態）は、クロマチン構造の酵素的プローブまたは化学的プローブの作用に最初に暴露され、次いで除タンパク質され、そして目的の領域を含む制限フラグメントを生じる制限酵素で消化される。消化後、ＤＮＡフラグメントは、ゲル電気泳動によって分離され、そしてメンブレンにブロッティングされる。次いで、このメンブレンは、目的の領域を含む制限フラグメントの一方の末端で短い領域に相補的な、標識されたハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズされる。接近可能領域の非存在下では、ハイブリダイゼーションプローブは、全長の制限フラグメントを同定する。しかし、接近可能領域が制限フラグメントによって規定される配列中に存在する場合、ハイブリダイゼーションプローブは、制限フラグメントよりも短い１以上のＤＮＡ種を同定する。これらのさらなるＤＮＡ種の大きさは、接近可能領域と、ハイブリダイゼーションプローブが相補的である制限フラグメントの末端との間の距離に対応する。例えば、図１Ａを参照のこと。
【００５３】
（標的部位）
一旦接近可能領域が同定されたら、標的部位についての検索が、接近可能領域のヌクレオチド配列内で行われ得る。結合特異性を有さないかまたは緩やかな特異性もしくは乱雑な特異性を示す外因性分子については、これは、標的部位を同定するために必要でないかもしれない。外因性分子（例えば、タンパク質、特に転写因子）はしばしば、好ましい標的部位を有する。これらの場合、接近可能領域のヌクレオチド配列は、好ましい標的部位の存在について検索され得る。種々の転写因子についての標的部位が公知である。例えば、Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２６５−２６８およびＴＲＡＮＳＦＡＣ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒデータベース（２０００年４月１３日にアクセスした、ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／）を参照のこと。一般に、新たに発見された転写因子についての標的部位、ならびに他の型の外因性分子についての標的部位は、当業者に周知である方法（例えば、結合部位の電気泳動移動度シフトアッセイ、エキソヌクレアーゼ保護、ＤＮａｓｅフットプリンティング、化学的フットプリンティングおよび／または直接ヌクレオチド配列決定）によって決定され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，前出、第１２章を参照のこと。
【００５４】
標的部位は、結合が存在するに充分な条件が提供されれば、結合分子が結合する、核酸の一部を規定する核酸配列である。その標的部位への分子の結合は一般に、裸の核酸分子において生じるが、結合分子は、標的部位が位置するクロマチン構造の何らかの局面の結果として、細胞性クロマチン中のその標的部位に結合できないかもしれない。あるいは、標的部位に加えて、標的部位に対する分子の結合に因子が必要とされ得る。例えば、標的部位を含むポリヌクレオチドへの分子の結合は、特異的なアミノ酸配列および特異的なポリヌクレオチド配列の両方との接触を必要とし得る（またはそれによって強化され得る）。
【００５５】
従って、細胞性クロマチン中の結合部位は、特定の分子（例えば、タンパク質）が、クロマチン中の標的部位に結合する領域である。結合部位は一般に標的部位を含むが、あらゆる標的部位が細胞性クロマチン中の結合部位を構成するわけではない。例えば、標的部位は、１以上の染色体成分（例えば、ヒストンもしくは非ヒストンタンパク質）によって閉塞され得るか、またはヌクレオソームもしくはより高次のクロマチン構造によってその結合分子に接近不可能にされ得る。一方、結合部位を規定するためには、標的部位に加えて、１以上の染色体タンパク質の存在が必要とされ得る。
【００５６】
（外因性分子）
外因性分子は、特定の細胞に関して、通常は細胞中に存在しない任意の分子である。「細胞中に通常存在する」とは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。対照的に、内因性分子は、特定の環境条件下で、特定の発生段階における特定の細胞中に通常存在する細胞である。従って例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して、外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。
【００５７】
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子（例えば、タンパク質または核酸）であり得るが、ただし、これは内因性分子とは異なる配列を有する。外因性分子は、当業者に公知の任意の方法（例えば、脂質媒介性トランスファー（中性脂質およびカチオン性脂質を含む）、エレクトロポレーション、直接注入、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスファー、およびウイルスベクター媒介性トランスファーが挙げられるが、これらに限定されない）によって、細胞に導入され得る。
【００５８】
外因性分子としては、高分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質および多糖類）、ならびに低分子（例えば、薬物発見のプロセスまたはコンビナトリアルケミストリーによって生成され得る分子）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＷＯ９３／０６１２１；ＷＯ９４／０８０５１；ＷＯ９５／１２６０８；ＷＯ９５／３０６４２；およびＷＯ９５／３５５０３を参照のこと。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み；一本鎖または二本鎖であり得；直鎖、分枝鎖または環状であり得；そして任意の長さであり得る。核酸としては、二重鎖を形成し得る核酸、および二本鎖ＤＮＡと三重鎖構造を形成し得る核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，４２２，２５１号および米国特許第５，１７６，９９６号を参照のこと。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
好ましい実施形態において、外因性分子は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＰ）である。特定のＺＦＰ、それらの特性およびそれらの結合配列は、上記のように、当該分野で公知である。さらに、任意の特定のヌクレオチド配列について、この配列に結合し得る１つ以上のＺＦＰを設計および／または選択し、そして結合の親和性および特異性を特徴付けることが可能である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第６，００７，４０８号；米国特許第６，０１３，４５３号；ＰＣＴ ＷＯ９５／１９４３１；ＰＣＴ ＷＯ ９８／５４３１１；共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８およびそこで引用される参考文献；共有に係る米国特許出願番号第０９／４４４，２４１号（１９９９年１１月１９日出願）；ならびに共有に係る米国特許出願番号０９／５３５，０８８号（２０００年３月２３日出願）を参照のこと。特定の配列（例えば、Ｇリッチな配列）は、ＺＦＰ結合部位として好ましい。３フィンガーＺＦＰは、一般に、９−または１０−ヌクレオチド標的部位に結合するため、好ましい実施形態において、細胞性クロマチンの目的の領域内に存在する接近可能な領域は、９〜１０ヌクレオチドの１つ以上のＧリッチな配列について検索され、そしてこのように検出された各配列について、ＺＦＰはこれらの配列に結合するように設計され得る。さらに、２つの３フィンガーモジュールは、適切なリンカードメインを介して連結されて、１８〜２０ヌクレオチドの標的部位を認識し得る６フィンガータンパク質を形成し得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４４４１を参照のこと。
【００６０】
上述のカテゴリーの外因性分子は、アナログおよび改変変異体を含む。例えば、核酸は、改変された塩基、糖および／またはヌクレオチド間結合を含み得る。核酸アナログは、ポリアミド（ペプチド）核酸、ならびにＰＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むキメラ分子を含む。例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００；Ｕｈｌｍａｎｎ（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：１０４５−１０５２を参照のこと。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドおよびＤＮＡ／ＲＮＡキメラもまた含まれる。タンパク質アナログとしては、修飾（例えば、アセチル化、リン酸化およびミリスチル化）を含むタンパク質アナログ、ならびに天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸改変体および／または非ペプチドアミノ酸間結合を含むタンパク質アナログが挙げられる。
【００６１】
特定の実施形態において、外因性分子は、細胞における１つ以上のさらなる外因性分子の産生の原因と成り得る。例えば、外因性分子は、細胞中に通常は存在しない遺伝子の発現を誘導する転写因子であり得る。これらの新たに発現された遺伝子は、次いで、この細胞におけるなおさらなる外因性分子の産生の原因となり得る。例えば、中間代謝に関与する酵素の誘導は、細胞における新たな代謝中間体の存在を導く。あるいは、外因性核酸は、外因性タンパク質（例えば、転写因子）の産生の原因となり得る。外因性核酸は、組み込まれるかまたはエピソームであるかのいずれかであり得、そして細胞中に安定に存在するかまたは一時的に存在し得るかのいずれかである。
【００６２】
外因性分子は、通常は細胞中に存在する分子の改変体およびアナログを、いくらこのような改変体またはアナログが得られ得ても、含む。例えば、タンパク質の改変体およびアナログは、アミノ酸の挿入（単数または複数）、欠失（単数または複数）および／または再配列（単数または複数）、あるいは天然に存在しないアミノ酸および／または改変されたアミノ酸の封入を含み得る。タンパク質のこのような改変体およびアナログは、例えば、タンパク質改変体もしくはアナログの設計および合成によって；タンパク質の化学的、酵素的もしくは他の改変によって；またはタンパク質をコードする核酸の、直接かまたはランダムのいずれかの変異誘発によって、得られ得る。適切な選択方法を、当該分野で公知なように使用して、タンパク質または核酸の集団の中から特定の改変体またはアナログを選択し得る。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；Ｇｒｅｉｓｍａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７−６６１；米国特許第６，００７，４０８号；米国特許第６，０１３，４５３号；ＰＣＴ ＷＯ９１／１８９８０；ＰＣＴ ＷＯ９５／１９４３１；ＰＣＴ ＷＯ９８／５４３１１；共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８およびそこで引用される参考文献；ならびに共有に係る米国特許出願番号０９／４４４，２４１号（１９９９年１１月１９日出願）を参照のこと。低分子の改変体および／またはアナログは、例えば、分子骨格上の様々な官能基の置換によって、得られ得る。
【００６３】
（結合についての試験）
特定の実施形態において、外因性分子と結合部位との相互作用は、多数の試験のうちの１つによって確認され得る。クロマチンへの結合の検出のための、当業者に公知の任意の方法が、適用可能である。このような試験の１つは、インビボフットプリンティングであり、ここで、化学的プローブに対する特定のヌクレオチドの接近性が決定される。外因性分子の存在下における特定の配列の接近性の変化は、この配列に対する外因性分子の結合の指標である。例えば、ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＷｏｌｆｆｅ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第３０４巻，Ａｃｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９を参照のこと。
【００６４】
好ましい実施形態において、クロマチンに対する外因性分子の配列特異的結合は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によってアッセイされる。簡潔には、この技術は、対応する抗原を含むクロマチン複合体を免疫沈降させる特異的抗体の使用、およびこの免疫沈降物中に存在するヌクレオチド配列の試験を包含する。この抗体による特定の配列の免疫沈降は、この抗原とこの配列との相互作用を示す。例えば、Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第２７４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９，１８９−１９７頁；Ｋｕｏら，（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄ １９：４２５−４３３；およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出、２１章を参照のこと。
【００６５】
一実施形態において、クロマチン免疫沈降技術は、以下のように用いられる。外因性分子は、細胞に導入され、この外因性分子がその結合部位に結合するのに十分な時間が経過した後、細胞は、この分子が安定に結合する場合、外因性分子をクロマチンに架橋する因子で処理される。外因性分子がタンパク質である場合、これは、例えば、ホルムアルデヒド処理または紫外線照射によって、クロマチンに架橋され得る。架橋に続いて、細胞核酸が単離され、剪断され、そしてこの外因性分子に対する存在下でインキュベートされる。抗体−抗原複合体は、沈降され、架橋は逆転され（例えば、ホルムアルデヒド誘導性ＤＮＡ−タンパク質架橋は、加熱によって逆転される）、そして免疫沈降されたＤＮＡの配列内容物は、特異的配列（例えば、外因性分子の標的部位）の存在について試験される。
【００６６】
好ましい実施形態において、免疫沈降されたＤＮＡは、増幅産物のリアルタイムの検出を可能にする感受性加水分解可能プローブアッセイ（口語的にＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイとして公知）によって、特異的配列の存在について試験される。米国特許第５，２１０，０１５号；Ｌｉｖａｋら（１９９５）ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：３５７−３６２；およびＨｅｉｄら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９９４を参照のこと。簡潔には、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）は、２つの増幅プライマーにより隣接される標的配列にハイブリダイズする様に設計されたプローブを使用して実施される。このプローブは、蛍光団または蛍光クエンチャーで標識され、その結果、その標的配列にハイブリダイズしない場合、このプローブは検出可能な蛍光を放射しない。プローブがその標的にハイブリダイズし、増幅に使用されるポリメラーゼによってプローブが加水分解すると、この蛍光団は、このクエンチャーの付近から放出され、そして蛍光は、増幅産物の濃度に比例して増加する。このアッセイにおいて、コントロールゲノム配列に対して特異的な増幅産物のレベルと比較して増加したレベルの、外因性分子の結合部位に対応する増幅産物の存在は、細胞性クロマチンにおける外因性分子の結合部位に対するこの外因性分子の結合を示す。
【００６７】
クロマチンに対する外因性分子の結合を検出するためのさらなる方法としては、顕微鏡（例えば、スキャニングプローブ顕微鏡）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびＤＮＡメチラーゼドメインと外因性分子との融合が挙げられるが、これらに限定されず、この場合、外因性分子が結合する配列は、メチル化され、そして例えば、メチル化感受性制限酵素およびメチル化依存性制限酵素に対するそれらの感受性を比較することによってか、またはメチル化ＤＮＡに対する抗体を使用することによって、同定され得る。例えば、ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌら、前出を参照のこと。
【００６８】
（適用）
本明細書中に開示される方法は、様々な用途において有用であり、そして現存の方法を越える利点を提供する。これには治療方法が挙げられ、ここで外因性分子は、被験体に投与され、そしてこの被験体内の標的遺伝子の発現を調節するために使用される。例えば、同時継続中のＰＣＴ／ＵＳ００／００４０９を参照のこと。遺伝子発現の調節は、例えば、標的遺伝子が病的に感染する微生物中に存在するか、または被験体の内在性遺伝子（例えば、癌遺伝子またはウイルスレセプター）中に存在する場合、疾患状態に寄与するような抑制形態であり得る。あるいは、調節は、遺伝子（例えば、腫瘍抑制遺伝子）の活性化が疾患状態を改善し得る場合、活性化形態であり得る。このような用途について、外因性分子は、当業者に公知のような薬学的に受容可能なキャリアと共に処方され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５；および共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８を参照のこと。
【００６９】
細胞性クロマチンの結合部位に対する外因性分子の結合は、例えば、診断的用途において、特定の配列の検出のために使用され得る。例えば、ＺＦＰを使用する標的配列の検出のための方法は、共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００３８８に記載される。例えば、外因性分子（例えば、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）は、疾患または患者サンプルにおける特定の表現型に関連する改変体対立遺伝子を検出するため、および臨床的サンプル中の病的微生物の存在を検出するために使用され得る。一実施形態において、改変体対立遺伝子は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む。非相互排他的な実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＺＦＰである。外因性分子はまた、サンプル中の遺伝子のコピー数を定量するために使用され得る。例えば、臨床的サンプル中のｐ５３遺伝子の１コピーの欠失の検出は、癌に対する感受性の指標である。
【００７０】
遺伝子機能の決定のための本発明の方法論は、遺伝子の過剰発現またはその天然の生物学的設定からの遺伝子の除去（すなわち、遺伝子ノックアウト）のいずれか、続いて効果の観察に主に依存する。観察されるこの表現型効果は、生物学的系における遺伝子の役割の指標を提供し得る。しかし、遺伝子発現の段階的なレベルは、これらの方法を使用して得ることは困難である；さらに、早期の開発において要求される遺伝子についての成体の機能を決定するために遺伝子除去（すなわち、ノックアウト）技術を使用することは不可能である。
【００７１】
外因性分子の細胞性クロマチンへの結合に関係するアッセイの使用は、これらの困難を克服し得る。例えば、外因性分子がタンパク質である場合、このタンパク質をコードする外因性遺伝子は、細胞に導入され得、そして低分子制御下におかれ得る。このように、外因性分子の発現レベルを制御することによって、外因性分子によって調節される遺伝子の発現レベルを制御することが可能であり、それによって、遺伝子の発現のどのレベル（すなわち、発現の抑制または刺激のいずれかの程度）が、所定の表現型または生化学的効果を達成するために必要とされるかを決定することが可能となる。
【００７２】
このアプローチは、薬物開発のために特に価値を有する。例えば、トランジェニック動物において、低分子制御下に外因性分子の発現を置くことによって、胚性死亡率および発生の補償の問題が、発生の後期の段階における遺伝子発現を活性化または阻害することによって、そして成体動物における効果を観察することによって、回避され得る。例えば、ＺＦＰによって調節される標的遺伝子を有するトランスジェニックマウスは、標的遺伝子に対してトランスで、任意の部位でＺＦＰをコードする核酸の組み込みによって生成され得る。従って、相同組換えは、核酸の組み込みに必要とされない。さらに、組み込まれたＺＦＰをコードする遺伝子はトランス優性であるので、単一の染色体コピーのみが必要とされ、そして所望ならば、機能的なノックアウト動物が、戻し交配することなく、作製され得る。
【００７３】
従って、外因性分子を細胞性クロマチンに結合する方法は、本明細書に開示されるように、遺伝子機能を決定するためのアッセイにおいて、そして遺伝子発現の特定の調節から生じる表現型における変化を決定するためのアッセイにおいて、使用され得る。
【００７４】
細胞性クロマチンにおける目的の領域内の、外因性分子に対する結合部位の同定は、外因性分子が細胞に導入された後に、外因性分子とその結合部位との間の複合体の形成を容易にする。従って、細胞性クロマチンにおける外因性分子とその結合部位との間の複合体が提供される。このような複合体は、転写の活性化または抑制（外因性分子の作用に依存する）のいずれかによる遺伝子発現の調節に有用であり得る。これらの複合体は、一過性であり得るか、または安定であり得、そしてクロマチンの染色体型、エピソーム型、または任意の他の型上に形成され得る。
【００７５】
以下の実施例は、特許請求された対象物の例示のために提供されるが、これを限定するわけではない。
【００７６】
（実施例）
（実施例１：ヌクレアーゼ高感受性の研究のための細胞増殖および核の単離）
形質転換されたヒト胚性腎臓２９３細胞を、ＤＭＥＭ ＋ １０％胎児ウシ血清（ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充された）中で、５％ＣＯ２中、３７℃のインキュベーター中で増殖させた。代表的に、２つの２５５ｃｍ２のプレートの細胞を、実験において使用した。これらの細胞が、９０％よりも高いコンフルエント（プレートあたり約２．５×１０７細胞）に達した時、培地を除去し、そしてこれらの細胞を、５ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で２回リンスした。次いで、細胞を、５ｍｌの氷冷ＰＢＳ中のプレートから取出し、そして５０ｍｌのコニカル遠心管中で合わせた。次いで、これらのプレートを、１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗浄し、そしてこの洗浄液をこの管に加えた。核を、遠心分離（１４００ｒｐｍで５分間）によってペレット化し、そして上清を除去した。このペレットを、ボルテックスによって混合し、そしてボルテックスしながら、２０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＫＣｌ，０．５％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ），１ ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド，１ｍＭジチオトレイトール）を添加した。この細胞ペレットを、ピペッテイングによって溶解緩衝液に再懸濁し、そしてこの管を、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この上清を除去し、そしてこのペレットを、前と同様に、２０ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁し、そして遠心分離した。最終ペレットは、１．５ｍｌの希釈緩衝液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５，６０ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭジチオトレイトール，１０％ グリセロール）に再懸濁し、核を顕微鏡で計数し、そして溶液を、１ｍｌあたり約１０７の核の濃度が得られるように調節した。
【００７７】
（実施例２：核のＤＮａｓｅ処理）
希釈緩衝液中の１ｍｌあたり１０７の濃度の核を、異なる濃度のＤＮａｓｅＩで消化した。ＤＮａｓｅ Ｉ希釈物を、０．４ｍＭ ＣａＣｌ２を補充した希釈緩衝液（先の実施例を参照のこと）中にデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を希釈することによって調製した。１００μｌの再懸濁された核に、２５μｌのＤＮａｓｅ Ｉ希釈物を添加して、３倍づつ濃度が増加する、０．０７ユニット／ｍｌ〜４８６ユニット／ｍｌの範囲の最終ＤＮａｓｅ Ｉ濃度を得た。消化を、室温で５分間行った。次いで、消化反応を、１２５μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙＴＭ Ｔｉｓｓｕｅキット）および１２．５μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙＴＭ Ｔｉｓｓｕｅキット）の２０ ｍｇ／ｍｌ溶液の添加によって停止し、その後、７０℃で１０分間、インキュベートした。消化したＤＮＡを、製造者の説明書に従って、ＤＮｅａｓｙＴＭ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。
【００７８】
精製したＤＮａｓｅ−処置ＤＮＡを、０．４ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａの存在下で、４０ユニットの制限酵素とともに、３７℃で一晩、制限酵素で消化した。図１に示される分析のために、Ｘｂａ Ｉ消化を行った。消化後、ＤＮＡを、０．３Ｍ酢酸ナトリウムからエタノール沈殿した。
【００７９】
（実施例３：核のミクロコッカルヌクレアーゼ処理）
上記のように得られた核の、ミクロコッカルヌクレアーゼを用いる処理を、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ−Ｚａｔｃｈｅｊらによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． １１９， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，３６３−３７８頁に記載されるように行った。
【００８０】
（実施例４：化学プローブでの核の処理）
核を、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら、前出から適合される以下の手順を使用して、ＭＰＥを用いて処理した。０．４Ｍ Ｈ２Ｏ２の新たに希釈されたストックを、３０％ストック溶液の２５倍希釈を作製することによって、調製した。０．５Ｍの硫酸鉄（ＩＩ）アンモニウムの新たに調製したストックを、水で４００倍に希釈した。メチジウムプロピル（ｍｅｔｈｉｄｉｕｍｐｒｏｐｙｌ）ＥＤＴＡ（ＭＰＥ）の溶液を、３０μｌの５ｍＭ ＭＰＥを９０μｌの水に添加することによって、調製する。このＭＰＥ溶液に１２０μｌの硫酸鉄（ＩＩ）アンモニウム希釈物および２．５μｌの１Ｍ ジチオトレイトール（ＤＴＴ、新たに、粉末から調製した）を添加した。上記のように得られた核の懸濁液に、以下を順番に加えた：３．５μｌの０．４Ｍ Ｈ２Ｏ２および３７．５μｌのＭＰＥ／硫酸鉄（ＩＩ）アンモニウム／ＤＴＴ混合物。この反応を、４０μｌの５０ｍＭバソフェナントロリンジスルホネート、０．１ｍｌの２．５％ドデシル硫酸ナトリウム／５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ７．５、および１０μｌのプロテイナーゼＫ（１０〜１４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、適切な期間（経験的に決定される）の後に終結させた。消化を、３７℃で少なくとも８時間行い、次いでこの混合物を、フェノール／クロロホルムで２回、そしてクロロホルムで１回抽出する。核酸を、０．３Ｍまでの酢酸ナトリウムおよび０．７容量のイソプロピルアルコールの添加、氷上での少なくとも２時間のインキュベーション、および遠心分離によって、水相から沈澱する。このペレットを、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ８に再懸濁し、そしてＲＮａｓｅ Ａ（約０．１ｍｇ／ｍｌ）で、３７℃で１５分間処理した。
【００８１】
（実施例５：ブロッティングおよびハイブリダイゼーション）
実施例２、３または４に従って得られた、沈澱され消化されたＤＮＡのペレットを、２２μｌのローディング緩衝液（グリセロールおよびトラッキング色素（「Ｇｅｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む）に再懸濁し、そして５５℃で３〜４時間インキュベートした。２０μｌの再懸濁サンプルを、１Ｘ ＴＡＥ緩衝液および０．５ μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルに充填し、そして電気泳動を、Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液中で、１６時間、２２ボルトで行った。電気泳動後、このゲルを、アルカリで処理し、中和し、Ｎｙｔｒａｎ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）上にブロットし、そしてこのブロットされたＤＮＡを、紫外線照射によって膜に架橋した。
【００８２】
プローブを、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、製造者の説明書に従って、ランダムプライミングによって標識した。代表的な標識反応において、２０〜５０ｎｇのＤＮＡテンプレートを、５０μｌの最終容積で使用した。１０９ｃｐｍ／μｇの特定の活性を、代表的に得た。標識されたプローブを、ＮｕｃＴｒａｐプローブカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＃４００７０２，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で精製した。
【００８３】
この膜を、ハイブリダイゼーションボトルに配置し、そしてＲａｐｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）中で、６５℃で１５分間、プレハイブリダイズした。プローブ（０．１ｋｂ ＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメント、図１Ａを参照のこと）を添加し（約３．３×１０７ｃｐｍを含む約０．０３μｇ）、そしてハイブリダイゼーションを６５℃で２時間行った。ハイブリダイゼーションに続いて、この膜を、２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳで６５℃で１０分間１回洗浄し、そして６５℃で１０分間０．１Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳを用いて、２回洗浄した。次いで、この膜を乾燥し、そしてオートラジオグラフィによってかまたはリン画像化装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いて分析した。
【００８４】
２９３細胞中のヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む１０．５ｋｂ領域内のＤＮａｓｅ高感受性の分析についての結果を、図１Ｂに示す。増加したＤＮａｓｅ濃度は、２つの新規なＤＮＡフラグメント（３．３ｋｂおよび３．９ｋｂ）の生成を生じ、このことは、ＥＰＯコード領域の下流に位置する２つのＤＮａｓｅ高感受性部位の存在を示す。図１Ａを参照のこと。
【００８５】
（実施例６：クロマチン免疫沈降分析のためのレポーター細胞）
安定に組み込まれたルシフェラーゼ遺伝子を含む形質転換されたヒト胚性腎臓細胞株（２９３細胞）を、レポーター細胞株として使用した。レポーター構築物のｐＶＦＲ３−４Ｘは、ＳＶ４０プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）であり、これに、ＶＥＧＦ ３ａ／１ ＺＥＰについての４つの縦列コピーの標的部位を、ＭｕｌＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間のプロモーターの上流に挿入した。ＶＥＧＦ ３ａ／１およびその標的部位の配列については、実施例８を参照のこと。
【００８６】
２９３細胞のゲノムへのレポーター構築物の組込みおよび組込み体の選択を、以下のように達成した。１０μｇのレポータープラスミドｐＶＦＲ３−４Ｘおよび１μｇのｐＳＶ２Ｎｅｏを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）媒介トランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後、細胞をトリプシン処理し、そして１５ｃｍの皿に１：５００の分割比でプレートし、そしてＧ４１８選択下に置いた（５００ｍｇ／ｍｌ）。シングルクローンを、選択の１４日後に単離した。選択されたクローンを、ＰＥ／Ｔｒｏｐｉｘ Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）アッセイシステムを使用して、基準のルシフェラーゼ活性について分析した。細胞抽出物の調製およびルシフェラーゼ活性の測定を、製造業者の指示に従って実施した。クローン４２を選択し、拡大して、以下に記載する実施例のために使用した。
【００８７】
グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％の仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ中で、細胞を１０ｃｍの皿で増殖させた。細胞を５％のＣＯ２中で３７℃で培養し、コンフルエント（１皿当たり、約０．５〜１×１０７細胞）に近づいた時点で、分析のために収集した。
【００８８】
（実施例７：ヒト血管上皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）遺伝子における接近可能な領域）
ヒトＶＥＧＦ遺伝子の上流領域のＤＮａｓｅ高感受性部位の存在（Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１，９４７〜１１，９５４）を、実施例１、２および５（前出）に記載のように、ヒト２９３細胞由来の核のＤＮａｓｅ消化、次いで間接末端標識によって試験した。代表的な結果を図２に示す。ここで、転写開始部位に関して＋１（−１００〜＋１０）および−５５０（−６００〜−５００）の辺りに集中した２つの接近可能な領域の存在を、同定した。Ｌｉｕら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１，３２３〜１１，３３４もまた参照のこと。
【００８９】
（実施例８：ＺＦＰコードプラスミド）
プラスミドを、ヒト血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の転写開始部位の周辺の（すなわち、実施例７に記載の＋１接近可能領域内の）標的部位を認識するように設計されたジンクフィンガードメインを含む転写エフェクタータンパク質をコードするように構築した。この標的部位は、配列５’−ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴ−３’（配列番号１）を有し、ここで、下線を付したＴ残基は、ＶＥＧＦ遺伝子の主要な転写開始部位を示す。６個のジンクフィンガーを含む結合ドメイン（ＶＥＧＦ ３ａ／１と名付けた）を、この２０ヌクレオチドの標的配列に結合するように設計した。３フィンガージンクフィンガードメイン、ＶＥＧＦ１を、配列５’−ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号２）を有する標的部位の１０ヌクレオチド上流に結合するように設計した。配列５’−ＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＡ−３’（配列番号３）に結合するように設計されたコントロールの６フィンガードメイン、ＧＡＴＡ１５．５もまた使用した。これらのジンクフィンガードメインは、以下に記載のように、ＮＶＦベクターにおいて融合タンパク質としてコードされた。
【００９０】
これらのジンクフィンガードメインを、ＳＰ１骨格に構築した。ＶＥＧＦ ３ａ／１、ＶＥＧＦ１およびＧＡＴＡ１５．５の位置−１〜位置＋６の認識ヘリックスの配列、を、表１に示す。
【００９１】
【表１】
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コントロールプラスミドＮＶＦは、核局在化シグナル、ＶＰ１６活性化ドメインおよびＦＬＡＧエピトープ（コードされたタンパク質のアミノ〜カルボキシの順での）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミド骨格中に含む、融合タンパク質をコードする配列を含む。融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの転写は、ＣＭＶプロモーターの制御下であり、そして翻訳開始は、Ｋｏｚａｋ配列によって特定される（Ｋｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）。転写終結は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列によって特定される。ＮＶＦプラスミドは、ジンクフィンガードメインをコードする配列を含まない。このプラスミドは、表１に示したジンクフィンガードメインをコードする配列の挿入のために使用され、そして外因性ＺＦＰが細胞に導入される実験においてコントロールとして使用された。
【００９２】
ＮＶＦプラスミドにコードされる核局在化配列（ＮＬＳ）は、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来であり、そしてアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌをコードする（Ｋａｌｄｅｒｏｎら（１９８４）Ｃｅｌｌ ３９：４９９−５０９）。ＶＰ１６活性化ドメインは、ＶＰ１６タンパク質配列のアミノ酸４１３〜４９０を含む（Ｈａｇｍａｎｎら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：５９５２−５９６２）。ＦＬＡＧエピトープ（Ｋｏｄａｋ）は、プラスミドにコードされたタンパク質の特異的な検出を可能にするために含まれる。ベクターはまた、それぞれ、細菌細胞および哺乳動物細胞における選択のためのアンピシリンおよびネオマイシン耐性についてのマーカーを含む。ＮＶＦプラスミドについてのマップを、図３に示す。
【００９３】
ジンクフィンガー結合ドメインを含むプラスミドの構築のために、ＺＦＰコード配列を、ＮＬＳとＶＰ１６コードドメインとの間のＮＶＦプラスミドに挿入した。このジンクフィンガードメインは、表１に示すように、ＳＰ１骨格中に設計した認識ヘリックスを含んだ。
【００９４】
これらの構築物の合成、コードされたタンパク質の精製、ならびに結合親和性および特異性についての試験に関するさらなる詳細は、共有に係るＰＣＴ／ＵＳ００／００４０９に提供される。
【００９５】
（実施例９：レポーター細胞株へのＺＦＰコードプラスミドのトランスフェクション）
レポーター細胞（実施例６を参照のこと）を、実施例８に記載のように、ＺＦＰコードプラスミドまたはコントロールプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、プレート当たり２．５×１０６の密度で１０ｃｍの皿にプレートした。各トランスフェクションのために、１０μｇのプラスミドＤＮＡを、２．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に希釈し、そして５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を、２．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。希釈したＤＮＡおよび脂質を混合し、そして室温で２０分間インキュベートした。次いで、培地を細胞から除去し、そして脂質／ＤＮＡ混合物で置換した。細胞を、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で３時間インキュベートし、次いで１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを添加した。トランスフェクションの２日後、トランスフェクトされた細胞から培地を除去し、そして細胞を、実施例１１に記載のようにクロマチン免疫沈降のために処理した。
【００９６】
（実施例１０：トランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性の測定）
ＺＦＰコードプラスミドまたはコントロールプラスミドでのトランスフェクションの約４８時間後にレポーター細胞を収集し、そして約１．５〜２×１０６細胞をアッセイに使用した。取り込まれたレポーター遺伝子によってコードされるルシフェラーゼ活性を、ＰＥ／Ｔｒｏｐｉｘ Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）アッセイシステムを使用して測定した。細胞抽出物の調製およびルシフェラーゼ活性の測定を、製造業者の指示に従って実行した。
【００９７】
（実施例１１：クロマチン免疫沈降によってアッセイされる、ヒト血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子に対する外来ＺＦＰの結合）
（架橋）
ホルムアルデヒドの１％（ｖ／ｖ）溶液を、５００ｍｌのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）に１４ｍｌの３７％水溶性ホルムアルデヒドを添加することによって調製した。細胞をトランスフェクトし、そして実施例９に記載されるように培養した。この細胞をトランスフェクトした２日後、培地を吸引し、そして１０ｍｌのＰＢＳ中のホルムアルデヒドの１％（ｖ／ｖ）溶液を添加した。プレートを、５分毎に振りながら、室温で１５分間インキュベートした。次いで、ホルムアルデヒド溶液を除去し、そしてプレートを１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで２回洗浄した。
【００９８】
（溶解および超音波処理）
細胞を、１プレート当たり０．５ｍｌのＷＣＬＢ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、５ｍＭ ＥＤＴＡ）（プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＃１８３６１５３、１０ｍｌ当たり１錠）を含む）＋０．１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムの添加、続く氷上での１０分間のインキュベーションによって溶解させた。この溶解物を、プレートを廃棄することによって除去し、そして微量遠心管に移した。マイクロチップを備えるＶｉｒＳｏｎｉｃソニケーター（Ｖｉｒｔｉｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を４の出力設定で使用して、この溶解物を超音波処理した。超音波処理を、氷上で、合計５分間、５秒間隔で５秒のバーストで実行した。これらの超音波処理条件を使用して生成されたクロマチンフラグメントの大多数のサイズは、１００〜２００ヌクレオチド対の範囲であった。これらの条件は、適切なサイズ分布が得られる限り、変動され得る。
【００９９】
超音波処理後、１ｍｌのＷＣＬＢを添加し、そして超音波処理された溶解物を、微小遠心機で最高速度（約１５，０００ｒｐｍ、１３，０００×ｇ）で、４℃で１０分間の遠心分離に供した。上清を収集し、そして以下の３つの部分に分けた：免疫沈降用のサンプル（０．７ｍｌ）、入力コントロール（０．１ｍｌ）および非抗体コントロール（０．７ｍｌ）。
【０１００】
（免疫沈降）
免疫沈降のためのサンプルを、以下のように処理した。抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ＃Ｆ３１６５）を、最終濃度が１μｇ／ｍｌになるように添加し、そしてこのサンプルを、振盪しながら４℃で２時間インキュベートした。（このタンパク質の他の部分に対して指向される抗体もまた使用され得る。例えば、抗ＶＰ１６抗体もまた使用した）。次いで、ＷＣＬＢで予め平衡化したプロテインＧビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の３０μｌのスラリーを添加し、４℃でのインキュベートを一晩続けた。
【０１０１】
一晩のインキュベートの後、このサンプルを微量遠心管中で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を除去した。このプロテインＧビーズをＷＣＬＢで２回、１Ｍ ＮａＣｌを含むＷＣＬＢで２回、そしてＴＥ（Ｓｉｇｍａ Ｔ−９２８５）で１回、それぞれ３分間ずつ洗浄し、次いで０．１ｍｌのＴＥ中に再懸濁した。２０μｇのＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ Ｒ−６５１３）を添加し、そしてこのサンプルを３７℃３０分間インキュベートした。このビーズを沈降させ、そして上清を除去した。
【０１０２】
免疫沈降した物質を、０．１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）ドテシル硫酸ナトリウムを添加し、そして６５℃で１５分間インキュベートすることによってプロテインＧビーズから溶出させた。この上清を収集し、そしてを第１の溶出と同じ第２の溶出を行った。この溶出物を合わせ、そして０．２ｍｌのＴＥをこの合わせた溶出物に添加し、０．４ｍｌの最終容量を得た。次いでこの溶液を６５℃で少なくとも５時間（一晩のインキュベートを越えないように）インキュベートし、この間にホルムアルデヒド誘導性架橋は除かれた。
【０１０３】
架橋の除去の後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ Ｐ−２３０８）を０．４ｍｇ／ｍｌになるように添加し、そしてこの混合物を５０℃で２時間インキュベートした。このインキュベーションの最後に、２０μｇのグリコーゲンおよび２０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、そしてこの混合物を、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を用いて１回、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１、ｖ／ｖ）を用いて１回抽出した。この水相を保持し、そして２．５容量のエタノールを添加した後に核酸を沈殿させ、続いて微量遠心機中で最高速度で１０分間、遠心分離した。このペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、そして５０μｌのＴＥ中に再懸濁した。
【０１０４】
（リアルタイムＰＣＲによる免疫沈降物質の分析）
免疫沈降物における特定のＤＮＡ配列の存在を、ＰＣＲベースの加水分解可能なプローブアッセイ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）として公知）を使用して試験した。簡単に述べると、挿入物の領域を、２つのオリゴヌクレオチドプライマー：順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって増幅する。第３のオリゴヌクレオチド（プローブオリゴヌクレオチドとして公知）を、増幅される領域中でハイブリダイズするように設計する。このプローブオリゴヌクレオチドは、５’末端に発蛍光団（ＦＡＭ）および３’末端にクエンチ因子（ＴＡＭＲＡ）を含む。この発蛍光団とクエンチャーとの間の共鳴エネルギー伝達に起因して、蛍光は遊離プローブから全く検出されない。その標的配列にハイブリダイズする場合、このプローブは、増幅のために使用されるポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して感受性になり、発蛍光団を放出し、そしてこの発蛍光団をクエンチャーの影響から解放する。従って、増幅が進行するにつれて、蛍光の出力が増加する。
【０１０５】
上記のように得られた免疫沈降したＤＮＡを、リアルタイム増幅アッセイにおけるテンプレートとして使用した。これは、組み込まれるレポーター遺伝子および内因性グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子に特異的なプローブ／プライマーセットを使用し、このレポーター遺伝子は、４つのタンデムなＶＥＧＦ３ａ／１結合部位（ｐＧＬ−ＶＦＲ）を含み、そして内因性グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子は、細胞転写に対する導入されたＺＦＰの非特異的な効果についてのコントロールとして、そして抗体またはプロテインＧビーズによるクロマチンの非特異的沈降についてコントロールするために使用された。これらの遺伝子の検出のためのプライマーおよびプローブとして使用されるこのオリゴヌクレオチドの配列を、表２に示す。標準曲線を、ゲノムＤＮＡテンプレートの希釈シリーズを使用して、それぞれの遺伝子特異的なプローブ／プライマーセットのために構築し、そしてＶＥＧＦ配列およびＧＡＰＤＨ配列の定量を、製造者（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって記載される相対的定量方法を使用して達成した。簡単に述べると、この方法は、テンプレート濃度に対する加水分解可能なプローブ分析によって、任意の単位で得られるＣｔ値に関する。（このＣｔ値は、最初に蛍光が任意の閾値を越えるサイクル数である。）種々のサンプルについて得られたＣｔ値を、標準曲線を使用して任意の単位のテンプレート濃度に変換した。結果を表３に示す。第１列は、細胞中に導入されたプラスミドを同定する。第２列および第３列は、それぞれ組み込まれたレポーター遺伝子および内因性ＧＡＰＤＨ遺伝子に対応する免疫沈降ＤＮＡの相対量についての値（上記に記載されるように決定された任意の単位で）を提供する。第４列において、組み込まれたレポーター遺伝子についての値を、サンプル毎の変動性を制御するために、ＧＡＰＤＨ遺伝子について得られた値に対して標準化する。最後の列において、非ＺＦＰプラスミド（ＮＶＦ）を含む細胞についてのＧＡＰＤＨ標準化の結果を１．０の値を割り当て、ＺＦＰ発現プラスミドを含む細胞について得られた結果を、ＮＶＦプラスミドが導入されている細胞と比較した、免疫沈降物におけるｐＧＬ配列の富化として表す。
【０１０６】
この結果は、組み込まれたレポーター配列が、６−フィンガーＶＥＧＦ−３ａ／１タンパク質をコードする構築物でトランスフェクトされた細胞由来の免疫沈降物において７０倍よりも多く富化され、外因性３−フィンガーＶＥＧＦ１タンパク質が存在する細胞由来の免疫沈降物において１０倍よりも多く富化されることを示す。ＧＡＴＡ １５．５結合ドメインを有するタンパク質を含む細胞において、少しの富化も観察されず、このドメインは、ＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質によって認識される標的部位とは異なる標的部位を認識する。
【０１０７】
【表２】
0005770778.tif 000003
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
（実施例１２：外因性ＺＦＰによって組み込まれたレポーター遺伝子の活性化）
実施例１１で得られたデータを確認するために、組み込まれたレポーター遺伝子の発現を、クロマチン免疫沈降分析を行った同じサンプルにおいてアッセイした。外因性ＺＦＰはＶＰ１６活性化ドメインを含むので、その外因性ＺＦＰの標的部位に結合することは、ルシフェラーゼの発現の増加を生じることが予期される。従って、ルシフェラーゼ活性を、実施例１０に記載するようにして実施例１１に記載のサンプルについて測定し、そして結果を表４に示す。ルシフェラーゼ発現は、外因性ＺＦＰのｐＧＬ−ＶＦＲ配列に対する結合と正に相関していた。例えば、外因性ＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質の存在はルシフェラーゼ発現を１８倍増加させ、そしてＶＥＧＦ１はルシフェラーゼ活性をほぼ３倍増加させた。これらの結果は、クロマチン免疫沈降によって得られたデータと一致し、そして、組み込まれたＺＦＰ標的部位に対するＺＦＰの結合のさらなる証拠を提供した。
【０１１０】
【表４】
0005770778.tif 000005
＊活性は、ＮＶＦ発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞における活性と比較して表される。
【０１１１】
（実施例１３：外因性ＺＦＰによる内因性ＶＥＧＦ遺伝子の活性化）
実施例１０および実施例１１に示されるように、ＶＥＧＦ標的部位を含む組み込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化ならびにＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質によるレポーター配列の免疫沈降は、これらの外因性ＺＦＰが細胞クロマチンにおいてその標的部位に結合するという証拠を提供した。この問題をさらに研究するために、内因性ＶＥＧＦ遺伝子の発現を、外因性ＶＥＧＦ１タンパク質および外因性ＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質を含む細胞中で試験した。従って、実施例１０および実施例１１において分析された同じサンプルを、内因性ＶＥＧＦ ｍＲＮＡについて（逆転写酵素介在ＰＣＲを使用するリアルタイムＰＣＲ分析によって）、およびＶＥＧＦタンパク質について（ＥＬＩＳＡによって）アッセイした。ＮＶＦプラスミドでトランスフェクトした細胞について得られた値に対して標準化した結果を、表５に示し、そしてＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１ＺＦＰの両方が、、ＶＥＧＦのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を活性化することを示した。ＧＡＴＡ １５．５ ＺＦＰによる内因性ＶＥＧＦ遺伝子の明らかな活性化を、以下の実施例１４において得られたデータによって説明する。
【０１１２】
【表５】
0005770778.tif 000006
【０１１３】
（実施例１４：組み込まれたレポーター遺伝子および内因性ＶＥＧＦ遺伝子に対する外因性ＺＦＰの結合ならびに発現に対する効果）
ＶＥＧＦ標的部位を含む組み込まれた遺伝子および内因性遺伝子に対する外因性ＺＦＰの効果を、クロマチン免疫沈降およびレポーター遺伝子発現によって分析した。この実施例において、ＶＥＧＦ標的部位を含む組み込まれた遺伝子および内因性遺伝子の免疫沈降を、同じ実験において分析した。
【０１１４】
（免疫沈降）
実施例１１において記載されるように得られた免疫沈降ＤＮＡを、リアルタイム増幅アッセイにおいてテンプレートとして使用した。３つのＤＮＡ標的をアッセイした：４つのタンデムなＶＥＧＦ３ａ／１結合部位を含む組み込まれたレポーター遺伝子（ｐＧＬ−ＶＦＲ）、内因性ＶＥＧＦ遺伝子、および内因性グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子（これを非特異的な沈降のためのコントロールとして使用した）。
【０１１５】
この分析の結果を、表６に示す。トランスフェクトされた細胞は、内因性ＶＥＧＦ遺伝子およびＶＥＧＦ標的部位を含む組み込まれたレポーター遺伝子（ｐＧＬ−ＶＦＲ）の両方を含んだ。この表の第１列は、細胞中に導入されたＺＦＰコードプラスミドを同定する。第２列、第３列および第４列は、それぞれ内因性ＶＥＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦ標的部位を含む組み込まれたレポーター遺伝子、および内因性ＧＡＰＤＨ遺伝子に対応する免疫沈降ＤＮＡの濃度についての値を（上記のように決定される任意の単位で）提供する。第５列および第６列において、内因性ＶＥＧＦ遺伝子および組み込まれたＶＥＧＦ結合配列について得られた値を、サンプル毎の変動性について制御するために、内因性ＧＡＰＤＨ遺伝子について得られた値で標準化した。
【０１１６】
次いで、内因性ＶＥＧＦ遺伝子（ＶＥＧＦ）およびＶＥＧＦ標的部位を含む組み込まれたレポーター（ｐＧＬ−ＶＦＲ）について得られた値（ＧＡＰＤＨについて得られた値で標準化されている）を、ＮＶＦ（ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを欠く構築物）でトランスフェクトした細胞について得られた値に対して標準化して、ＺＦＰをコードする構築物でトランスフェクトした細胞由来の免疫沈降物においてＶＥＧＦ配列が富化された程度についての値を得た。これらの値を表７に示す。この結果は、６−フィンガーＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質をコードする構築物でトランスフェクトされた細胞由来の免疫沈降物において、内因性ＶＥＧＦ遺伝子由来の配列が、ジンクフィンガー結合ドメインを欠く構築物（ＮＶＦ）でトランスフェクトされた細胞と比較して、約１２倍富化されたことを示す。さらに、ＶＥＧＦ標的配列を含む組み込まれたレポーター遺伝子由来の配列は、ＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質によって１７０倍、そして３−フィンガーＶＥＧＦ１タンパク質によって約８倍富化された。
【０１１７】
（表６：加水分解型プローブアッセイによるクロマチン免疫沈降剤の配列分析）
【０１１８】
【表６】
0005770778.tif 000007
（表７：免疫沈降における配列富化）
【０１１９】
【表７】
0005770778.tif 000008
この実施例において、６−フィンガーＺＦＰおよび３−フィンガーＺＦＰの両方は、ジンクフィンガードメインを欠くタンパク質（ＮＶＦ）と比較した場合、免疫沈降において内在性ＶＥＧＦ配列および融合ＶＥＧＦ配列の両方の有意な富化を促進した。さらに、６−フィンガーＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質は、異なった標的部位（ＧＡＴＡ１５．５）に指向された６−フィンガータンパク質と比較した場合、内在性ＶＥＧＦ標的部位および融合ＶＥＧＦ標的部位の免疫沈降の増大を促進した。このデータ（ｄａｔｅ）はまた、ＶＥＧＦ１およびＧＡＴＡ１５．５ＺＦＰが、内在性のＶＥＧＦ遺伝子に対して等しく良好に結合することを示している。このことは、実施例１３（ここで、ＧＡＴＡ１５．５による内在性ＶＥＧＦの、ｍＲＮＡおよびタンパク質の活性化が観察された）で得られたデータと整合性がある。
【０１２０】
（レポーター遺伝子発現）
ルシフェラーゼ発現分析（表８）は、内在性ＺＦＰが存在していない細胞（ＮＶＦ）と比較した場合、ＶＥＧＦ結合ＺＦＰ（ＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１）がレポーター活性を刺激することを明らかにした。ＧＡＴＡ１５．５ＺＦＰはレポーター活性を刺激しなかった（このことは、ＧＡＴＡ１５．５が、ＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１と比較した場合、レポーター配列の免疫沈降をほとんど示さなかったという観察と一致する（表７））。これらの結果は、ＺＦＰが融合ＺＦＰ標的部位に結合するさらなる証拠を提供した。
【０１２１】
（表８：ＺＦＰをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞中のルシフェラーゼ発現）
【０１２２】
【表８】
0005770778.tif 000009
（内在性ＶＥＧＦ遺伝子の発現）
内在性ＶＥＧＦ遺伝子からのｍＲＮＡおよびタンパク質の産生を、実施例１３に記載したようにアッセイし、そしてこれらの結果を表９に示す。全てのＺＦＰが内在性ＶＥＧＦ遺伝子を活性化し、ＶＥＧＦ１が最も高いレベルの活性化を提供することを観測した。ＧＡＴＡ１５．５による内在性ＶＥＧＦの活性化は、このタンパク質がこの内在性ＶＥＧＦ配列を免疫沈降する能力と矛盾しない（表７）。この結果は、内在性ＶＥＧＦ遺伝子におけるＧＡＴＡ１５．５の効果と融合ＶＥＧＦレポーター遺伝子（ＧＡＴＡ１５．５によって強く沈澱（表７）も活性化もされない）におけるＧＡＴＡ１５．５の効果との間の相違を示している。
【０１２３】
（表９：ＺＦＰをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした細胞中の内在性ＶＥＧＦｍＲＮＡおよびタンパク質の発現）
【０１２４】
【表９】
0005770778.tif 000010
ＶＥＧＦ転写活性化の見かけ上の欠損およびＶＥＧＦ３ａ／１によって誘導されるＶＥＧＦタンパク質産生の低いレベルについての可能な説明は、この６−フィンガーＺＦＰの密な結合が、ある程度、この転写活性化の可能性に逆らうということである。
【０１２５】
（実施例１５：ヒトエストロゲンレセプターα（ＥＲ−α）遺伝子に結合する内在性分子の設計）
本実施例において、ヒトエストロゲンレセプターα（ＥＲ−α）遺伝子のクロマチンにおける接近可能領域を同定し、この接近可能領域に標的化されたジンクフィンガー結合ドメインを含む内在性分子を設計した。この設計された分子を細胞内で発現し、そしてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を使用して、この設計された分子が接近可能領域にあるその標的配列に結合することを実証した。
【０１２６】
（接近可能領域の同定）
ＥＲ陽性乳癌細胞株、ＭＣＦ−７を使用して、エストロゲンレセプターα遺伝子の約５ｋｂｐの領域内にあるＤＮａｓｅＩ過敏性領域（ＤＨＲ）を同定した。簡潔には、細胞を、Ｔ−２５５フラスコ中で約９０％コンフルエントまで増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、回収し、そして透過性緩衝液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、４．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、０．５ｍＭ ＤＤＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ ＩＧＥＰＡＬ）中に再懸濁した。室温における２．５分間のインキュベーション後、細胞を１０００×ｇで２．５分間遠心分離して、そして別々の細胞アリコートを、ＤＮａｓｅＩ（０〜１２単位／ｍｌ、ＤＰＲＦグレード、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）の増大した量を含むＤＮａｓｅＩ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、４．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、０．５ｍＭ ＤＤＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ ＩＧＥＰＡＬ）に再懸濁し、そして５分間室温でインキュベーションした。この反応物を、０．５Ｍ ＥＤＴＡおよび緩衝液ＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥＡＳＹキット、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）の添加（最終濃度を１０ｍＭとなるまで）によってクエンチした。ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥＡＳＹキットを用いて単離し、１％ＴＡＥ−アガロースゲル上に溶解し、ニトロセルロース膜へと移し、そしてエストロゲンレセプター−αに特異的なプローブを用いて探査した。図４によって、この結果を示した。これは、３つのＤＮａｓｅ過敏性領域（開始部位近位に関して第−３２０位、第−２１００位および第−３１８０位に位置する）の存在を示す。
【０１２７】
（ＥＲ−α遺伝子の接近可能領域に対して標的化されたＺＦＰの設計）
操作された融合タンパク質を、−２ｋｂで、ＤＮＡａｓｅＩ過敏性領域中にある独特の９塩基対配列を認識するように設計した。このタンパク質（ＢＯＳ３）は、核局在配列、ジンクフィンガー結合ドメイン、ＫＲＡＢ抑制ドメインおよびＦＬＡＧエピトープを含んだ。このジンクフィンガー結合ドメインを、コード鎖におけるＣＴＣＣＴＣＣＣＣ（配列番号２８）に対して相補的な配列 ＧＧＧＧＡＧＧＡＧ、（配列番号２７）に対して標的化した。ジンクフィンガー配列（アミノ酸について、認識ヘリックスの第−１位から第＋６位）は、ＲＳＤＮＬＴＲ（配列番号２９）、ＲＳＤＮＬＴＲ（配列番号３０）およびＲＳＤＡＬＴＫ（配列番号３１）であった。この融合タンパク質をコードするプラスミドの構築およびこの標的配列に対するジンクフィンガー結合ドメインの結合親和性の決定を、共有に係るＰＣＴ ＷＯ００／４１５６６およびＷＯ００／４２２１９に開示された方法に従って実施した。この解離定数は（Ｋｄ）は３．５ｐＭであると決定した。
【０１２８】
（設計されたＺＦＰの結合についてのアッセイ）
ＭＣＦ−７細胞の培養物を、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ／Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において３７℃で、５０〜６５％コンフルエントまで増殖した。次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、これらをＢＯＳ３融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、この培地を新鮮な培地で置換えた。トランスフェクションの４８時間後、細胞が８０〜９０％コンフルエントに達した場合、ホルムアルデヒドを、この培養培地に最終濃度が１％（ｖ／ｖ）となるまで添加した。３７℃で１０分後、このプレートを、ホルムアルデヒドを除去するためにＰＢＳで洗浄して、細胞をこのプレートから取りだし、そしてプロテアーゼインヒビターのカクテル（０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、２０μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌロイペプチン）を添加したＰＢＳ中に懸濁した。次いで、この細胞懸濁液を１０００×ｇにおいて、４分間、４℃で遠心分離した。ペレットした細胞を、プロテアーゼインヒビター（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．１、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）ナトリウムドデシルサルフェート、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのペプスタチン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン）を添加した０．２ｍｌのＳＤＳ溶解緩衝液で再懸濁した。この再懸濁した細胞を、超音波分解（電力出力４として設定したＶｉｒＳｏｎｉｃ超音波機での５秒間パルスを１０回（パルス間で１０秒間の休止を伴う））し、この細胞を溶解し、そしてクロマチンを剪断して、２００〜５００ヌクレオチド対のＤＮＡ長に平均化した。この超音波分解した溶解物を、１３，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離し、そしてこの上清を回収した。１．８ｍｌのＣｈＩｐ緩衝液（１６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．１、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１６７ｍＭ ＮａＣｌ、１．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０１％ＳＤＳ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのペプスタチン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン）を、この清浄化した上清に添加し、そして０．２ｍｌを前免疫沈降（ｐｒｅ−Ｐ）インプットコントロールとして取り出した。このインプットコントロールサンプルを、アガロースゲル電気泳動で分析して２００〜５００ヌクレオチド対のＤＮＡフラグメントを得たことを確認した。
【０１２９】
残りの超音波分解した溶解物を、０．１ｍｌのプロテインＡアガロースビーズの５０％スラリー（これはまた、サケ精子ＤＮＡを２００μｇ／ｍｌで含む）を添加することによって予め清浄化し、その後９０分間穏やかにかき混ぜた。この溶解物を、１，０００×ｇで５分、４℃における遠心分離によってビーズから分離した。この清浄化した溶解物を２つの等しい部分に分割した。一部分に対して、マウスモノクローナル抗ＦＡＬＧ抗体（ＩｇＧ１アイソタイプ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を、最終濃度２μｇ／ｍｌの溶解物に添加して、そしてこのサンプルを４℃で一晩インキュベーションした。次いで、６０μｌのプロテインＡアガロースビーズ（これはまた、サケ精子ＤＮＡを２００μｇ／ｍｌで含む）の５０％スラリーを添加し、そしてこのサンプルを６０分間、４℃で攪拌した。
【０１３０】
免疫複合体を遠心分離（４分間、４℃において２，０００ｒｐｍ）よって分離し、そして２５０μｌの上清を非結合ＤＮＡコントロールとして維持した。ペレットしたビーズを以下のように洗浄した（４℃で５分間の各洗浄）： 
１．２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．１、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳで１回．
２．２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．１、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳで１回．
３．１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．１、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ ＬｉＣｌ、１％ナトリウムデオキシコレート、０．１％ＮＰ−４０で１回．
４．１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．１、１ｍＭ ＥＤＴＡで２回。
【０１３１】
免疫複合体を、これらを０．２５ｍｌの１％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３で２度洗浄することによって、このビーズから溶出した。各洗浄について、この溶出緩衝液をビーズに添加し、これらをボルテックスによって短時間かき混ぜ、次いで室温で５分間回転させた。この溶出物を合せて、２０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、このサンプルを６５℃で４時間インキュベートし、ホルムアルデヒド架橋をリバースした。次いで、このサンプルの一部をウエスタンブロットによるタンパク質分析のために取り出した。この残りのサンプルに対して、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．５）および５μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いでこのサンプルを６５℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、続くエタノール沈澱によって回収した。精製化したＤＮＡをリアルタイム定量ＰＣＲ、「Ｔａｑｍａｎ（登録商標）」として口語的に知られているアッセイによって分析した。ＤＮＡを２つの配列の関連部分について分析した：（１）ＢＯＳ３結合部位の２３０ヌクレオチド対上流に位置する領域、および（２）１８ＳｒＲＮＡ 遺伝子のコントロール配列。このアッセイに使用したプライマーおよびプローブを表１０に示した。
【０１３２】
（表１０：ＥＲ−α遺伝子のＣｈＩＰ分析についてのプライマーとプローブ）
【０１３３】
【表１０】
0005770778.tif 000011
この結果（図５に示した）は、ＢＯＳ３が発現されなかったＭＣＦ−７細胞と比較した場合、ＭＣＦ−７細胞におけるＢＯＳ３に関連するＥＲ−α配列の約２０倍の富化を示す。従って、クロマチン免疫沈降は、細胞クロマチンの接近可能領域に対して標的化された内在性分子がインビボにおいて標的配列に結合することを示す。
【０１３４】
本方法および組成物をこれらの理解を明瞭にする目的で例示および実施例として幾分詳細に記載してきたが、様々な変化および改変が、本開示の精神および特許請求の範囲からの逸脱することなしに実施することが可能であることは当業者にとって明らかである。従って、前述した記載および実施例は、制限として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ】図１は、２９３細胞中のヒトエリトロポイエチン遺伝子中のＤＮａｓｅ高感受性部位の分析を示す。図１Ａは、この遺伝子の構造の模式図を示し、この図は、転写開始部位（右側を指す矢印）、転写終結部位（ｐＡ）およびマッピングのために使用されるＤＮＡフラグメントを規定するＸｂａＩ部位の位置を示す。線の下に示すのは、プローブ（３２Ｐ標識Ｘｂａ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉフラグメント、線影をつけたボックス）の位置および２つのＤＮａｓｅ高感受性部位（上側を指す矢印）の位置である。
【図１Ｂ】図１は、２９３細胞中のヒトエリトロポイエチン遺伝子中のＤＮａｓｅ高感受性部位の分析を示す。図１Ｂは、１％アガロースゲルのｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）画像を示す。ＸｂａＩフラグメント（１０．５ｋｂ）ならびにＤＮａｓｅ高感受性部位によって規定される２つのフラグメント（３．９ｋｂおよび３．３ｋｂ）の移動位置の位置をゲル画像の右側に示す。
【図２】図２は、２９３細胞中のヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子におけるＤＮａｓｅ高感受性部位の分析を示す。
【図３】図３は、ＮＶＦプラスミドの模式図を示す。ＣＭＶプロモーター（ＰＲＯ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、転写活性化ドメイン（ＶＰ１６）、ＦＬＡＧエピトープ（ＦＬＡＧ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、ならびにネオマイシン（ＮＥＯ）およびアンピシリン（ＡＭＰ）に対する耐性をコードするプラスミド配列領域を示す。矢印は、ＶＥＧＦ １プラスミドおよびＶＥＧＦ ３ａ／１プラスミドを作製するためにＺＦＰコード配列が挿入される領域を示す。この図面は、一定の縮尺比ではない。
【図４】図４は、ＥＲα高感受性部位マッピングを示す。この図の上のゲルは、漸増濃度のＤＮａｓｅ Ｉ（三角によって示される）を用いた、異なる細胞株（ゲルの上に示す通り）由来のクロマチンの消化を示す。分子量マーカーもまた示す。この図の下では、ＥＲα遺伝子の上流領域の模式図は、プロモーター（Ｐによって示される）、ＤＮａｓｅ高感受性領域（−３８１０、−２１００および−３２０）、ならびにＤＮａｓｅ高感受性領域分析のためのプローブとして用いられたＥｃｏ ＲＩフラグメントおよびＸｂａ Ｉフラグメントの位置を示す。
【図５】図５は、ＥＲα遺伝子に対する外因性分子の結合の、クロマチン免疫沈降による分析を示す。実施例１５を参照のこと。
【図１Ａ】
0005770778.tif 000012
【図１Ｂ】
0005770778.tif 000013
【図２】
0005770778.tif 000014
【図３】
0005770778.tif 000015
【図４】
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【図５】
0005770778.tif 000017
【配列表】
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