(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌の進行の評価のための、体液中における少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子又はその断片を検出及び／又は定量する方法であって、前記ホメオドメイン含有転写因子がＥＮ−２ペプチドである、上記方法。
【請求項２】
前記ペプチド又はその断片が、配列番号４であるか、又はそれから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記断片が、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記断片が配列番号４の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、請求項２又は３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種のＥＮ−２ペプチド又はその断片が試験対象の生物試料中に存在する、請求項２から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記体液が、細胞液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、尿、血液又は唾液である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が血液又は血清である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前立腺癌の発症、進行、安定化、改善及び／又は緩解を検出するための、請求項１から７までのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２回の検出及び／又は定量ステップを、時間的に間隔をおいて行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２回のステップを、数日、数週間、数年又は数カ月間の間隔をおいて行って、ＥＮ−２ペプチド又はその断片のレベルが変化したかどうかを判定することにより、癌の進行が変化したかどうかが示され、これによって、前記少なくとも１種のペプチドのレベルの経時的な上昇は癌の発症又は進行を示し、前記少なくとも１種のペプチドのレベルの減少は癌の改善及び／又は緩解を示す可能性があるので、２回以上採取された試料中のバイオマーカーのレベルの比較が可能となる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験試料中に存在する前記ペプチドのレベルを１種又は複数の対照におけるレベルと比較することを含む、請求項１から１０までのいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
体液中で検出可能な少なくとも１種の、ＥＮ−２ペプチドであるホメオドメイン含有転写因子、又はその断片の量を定量又は検出すること、及び前記試験試料中の前記少なくとも１種のペプチドの量を癌ではない正常対象から得られた対照の正常生物試料中に存在する量と比較することを含み、前記試験試料中に見出される前記少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子又はその断片のレベルの上昇が、前記疾患が進行しているか、又は発症したことを示す、前立腺癌の検出のための方法。
【請求項１３】
「ｔ検定」を使用することによって測定して、信頼区間が少なくとも８０％であれば、前記上昇が統計的に有意である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対照と早期前立腺癌を示す試料との間の上昇が１１０〜２００％の間である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
対照と前記後期前立腺癌を示す試料との間の上昇が５５０〜６２０％の間である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
早期試料又は対照に対する上昇が１００％と３００％との間であることが早期から後期の疾患の癌の進行を示す、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
前立腺癌の治療効果のモニターのための、対象の生物試料中に存在する少なくとも１種の、ＥＮ−２ペプチドであるホメオドメイン含有転写因子、又はその断片を検出及び／又は定量する方法。
【請求項１８】
体液中で検出可能な少なくとも１種の、ＥＮ−２ペプチドであるホメオドメイン含有転写因子、又はその断片の検出及び／又は定量が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＳＥＬＤＩ、１種又は複数のリガンドとの相互作用、１−Ｄ又は２−Ｄゲルをベースにした分析系、ＩＣＡＴ（登録商標）又はｉＴＲＡＱ（登録商標）を含む、液体クロマトグラフィーと質量分析技術を併用する液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー及びＮＭＲ分光法からなる群の１種又は複数によって行われる、請求項３から１７までのいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種の、ＥＮ−２ペプチドであるホメオドメイン含有転写因子、又はその断片の検出及び／又は定量が、サンドイッチ免疫測定法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＡＩ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、及び金、銀若しくはラテックス粒子、磁気粒子又はＱ−ｄｏｔの使用を含む粒子ベースの免疫測定法からなる群の１種又は複数によって行われる、請求項１から１８までのいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の、ＥＮ−２ペプチドであるホメオドメイン含有転写因子、又はその断片の検出及び／又は定量が、マイクロタイタープレート、ストリップフォーマット、アレイ又はチップ上で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の、ＥＮ−２ペプチドであるホメオドメイン含有転写因子、又はその断片の検出及び／又は定量が、前記少なくとも１種のＥＮ−２ペプチド又はその断片に特異的な抗体、あるいは前記抗体がさらにレポーターに結合したものを含むＥＬＩＳＡによる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種のＥＮ−２ペプチド又はその断片の検出及び／又は定量がバイオセンサーによって行われる、請求項１から２１までのいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前立腺癌のバイオマーカーとしての、体液中で検出可能な少なくとも１種の、ＥＮ−２ペプチドであるホメオドメイン含有転写因子、又はその断片の使用。
【請求項２４】
前記ペプチド又はその断片が、ＥＮ−２であるか、又はそれから得られる、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記ペプチド又はその断片が、配列番号４であるか、又はそれから得られる、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記断片が、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記断片が配列番号４の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記使用が、臨床スクリーニング、予後評価、治療結果のモニター、特定の治療的処置に最も応答する可能性が高い患者の同定の方法、並びに薬剤スクリーニング及び薬剤開発からなる群から選択される方法における使用である、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
体液中で検出可能な少なくとも１種のＥＮ−２ペプチド又はその断片に結合する、又は特異的に認識することができるリガンド及びレポーター手段を含む、請求項１から２８のいずれかの記載に応じた使用のためのキット。
【請求項３０】
アレイ又はチップである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記体液試料が細胞を含まない、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者がＰＳＡを検出するアッセイを使用して癌について陰性であると既に診断されている、請求項２８に記載の使用。
【請求項３３】
体液中で検出可能な、前記少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子又はその断片の検出が、１種又は複数のリガンドとの相互作用による間接的な検出によるものであり、前記リガンドが、アプタマー又はオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
体液中におけるホメオドメイン含有転写因子又はその断片をコードするＲＮＡを検出及び／又は定量する方法であって、前記ホメオドメイン含有転写因子がＥＮ−２ペプチドであり、前立腺癌の進行の評価のための、上記方法。
【請求項３５】
前記ペプチド又はその断片が、配列番号４であるか、又はそれから得られる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記断片が、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡの検出及び／又は定量が、定量的ＰＣＲ又はオリゴヌクレオチドアレイによる、請求項３４から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌のバイオマーカーとしての、少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子、例えば、ＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、近年男性の癌関連死の主要な原因であり、イギリスだけでも毎年１００００人の男性が亡くなっている。しかし、前立腺癌を非侵襲的に検出するために利用できるバイオマーカーは現在のところ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）にほぼ限られている。血清中ＰＳＡレベルは、前立腺癌患者で有意に上昇し、ＰＳＡ試験は近年、この疾患の進行及び治療に対する応答性を観察するために使用されている。
【０００３】
残念なことに、ＰＳＡ試験にはいくつかの重大な欠点がある。ＰＳＡレベルは前立腺のその他の非癌性症状、例えば、前立腺症及び良性の肥大でも有意に上昇するので、必ずしもＰＳＡレベルの上昇の検出が患者の前立腺癌の真な指標とはならない。さらに、ＰＳＡレベルは、疾患の大きさ又は結節若しくは骨転移の発症に必ずしも関連していない。
【０００４】
全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比及び「ＰＳＡ速度」などの徴候を使用する近年の試みは、擬陽性のレベルが非常に高く、不必要な侵襲性生検が大量に生じるためほとんど成功しないことがわかっている。
【０００５】
実際に、ＰＳＡのレベルは、前立腺癌では非常にゆっくりしか上昇しないと考えられ、したがって、ＰＳＡレベルを測定する場合、陽性の結果が得られる頃には疾患はかなり進行してしまっていることが多い。さらに、ＰＳＡレベルは、年齢及び前立腺の大きさによって変動し得るので、正規化しなければならない。
【０００６】
カリクレイン、つい最近ではｅ−カドヘリンの８０ｋＤａ断片（Ｋｕｅｆｅｒ他、２００５）を含め、前立腺癌の他の有望な化学的マーカーもいくつか存在する。これらのバイオマーカーも、ＰＳＡに関して前述した顕著な欠点の多くを示す傾向がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当業界では信頼できる前立腺癌バイオマーカーが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、ホメオティック転写因子ＨＯＸＣ４が前立腺腫瘍から分泌され、その血清中濃度が前立腺癌の患者で有意に上昇することを発見した。したがって、血清などの体液中におけるＨＯＸＣ４の存在は、早期及び後期前立腺癌の有用な指標となる。
【０００９】
第２のＨＯＸタンパク質ＨＯＸＢ６と第３のタンパク質ＨＯＸＢ５も、類似の結果を示すことも発見した。ＨＯＸＡ３とＨＯＸＤ９も、バイオマーカーとして有用であると考えられる。
【００１０】
前立腺癌由来細胞系ＬＮＣａＰ及びＰＣ３、さらには初代前立腺癌細胞において、ホメオドメイン含有転写因子Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ２（ＥＮ−２）がＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で発現していることをさらに確認した。さらに、ＥＮ−２タンパク質は、この細胞の周囲の培地に分泌され得る。
【００１１】
驚くべきことに、前立腺癌の患者において、ＰＳＡレベルが正常であることが認められていても、これらの癌マーカーすべてのレベルの上昇を検出することができた。これはさらに、本発明のマーカーは、その他のマーカー、例えば、ＰＳＡと比較すると、前立腺癌の診断において信頼性が高いことを示している。
【００１２】
したがって、第１の態様では、本発明は、前立腺癌のバイオマーカーとしての、少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子又はそれらの断片の使用を提供する。ホメオドメイン含有転写因子の例には、ＨＯＸ及びＥＮ−２ペプチドが含まれる。本発明はまた、患者の試料中において少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子を検出することを含む、前立腺癌疾患の診断方法に関する。
【００１３】
少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片は、体液中で検出可能であることが特に好ましい。
【００１４】
好ましくは、バイオマーカーはＨＯＸＣ４単独である。バイオマーカーはＨＯＸＢ５単独が好ましく、又はＨＯＸＢ６単独がより好ましい。バイオマーカーはＥＮ−２単独も好ましい。バイオマーカーはＨＯＸＡ３単独も好ましい。バイオマーカーはＨＯＸＤ９単独も好ましい。しかし、組合せも好ましい。このような組合せには、ＨＯＸＣ４及びＨＯＸＢ５；ＨＯＸＣ４及びＨＯＸＢ６；ＨＯＸＢ５及びＨＯＸＢ６；ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ５及びＨＯＸＢ６；ＥＮ−２及びＨＯＸＣ４；ＥＮ−２及びＨＯＸＢ５；ＥＮ−２及びＨＯＸＢ６；ＥＮ−２、ＨＯＸＣ４及びＨＯＸＢ５；ＥＮ−２、ＨＯＸＣ４及びＨＯＸＢ６；ＥＮ−２、ＨＯＸＢ５及びＨＯＸＢ６；ＥＮ−２、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ５及びＨＯＸＢ６が含まれる。このような組合せにはさらに、ＨＯＸＡ３及び／又はＨＯＸＤ９の１つ又は両方を含めることができる。他の組合せには、ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＤ９；ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＣ４；ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＢ５；ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＢ６；ＨＯＸＡ３及びＥＮ−２；ＨＯＸＤ９及びＨＯＸＣ４；ＨＯＸＤ９及びＨＯＸＢ５；ＨＯＸＤ９及びＨＯＸＢ６；ＨＯＸＤ９及びＥＮ−２が含まれる。マーカーの特に好ましい組合せには、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６及びＥＮ−２の１つ又は複数、好ましくはすべてが含まれる。
【００１５】
好ましくは、体液は血清又は尿である。その他の好ましい体液は以下に説明する。
【００１６】
ＨＯＸ遺伝子は、発生早期に細胞及び組織のアイデンティティを決定するホメオドメイン含有転写因子のファミリーである（Ｍｏｒｇａｎ、２００６の総説）。Ｍｉｌｌｅｒ他、２００３を含む最近の刊行物においては、前立腺癌腫瘍細胞で発現して細胞内に保持されるすべてのタンパク質一つ一つが効率的に同定されたことが報告された。もちろん、これは、ＨＯＸペプチドを含む、全部で約１００００から１２０００個のタンパク質が同定されたことを意味する。
【００１７】
しかし、我々は驚くべきことに、前立腺癌細胞で発現したこれらの数千のタンパク質の中から、例えば、ＨＯＸＣ４タンパク質は細胞外でも認められ、前立腺癌の優秀なバイオマーカーであることを発見した。
【００１８】
これはいくつかの理由によって、驚くべきことである。第１に、ＨＯＸＣ４は、転写因子であり、したがって、血清中で見出すことは予測されなかった。第２に、前立腺癌ではその他のバイオマーカーが知られているが、信頼できるバイオマーカーは依然として発見しにくく、例えば、ＰＳＡに関する前述の問題が参考となる。実際に、ＨＯＸＣ４は、図１に示したように、早期及び後期両方、特に後期のバイオマーカーである。
【００１９】
したがって、このタンパク質は、その他の前立腺癌細胞で発現することが知られていたものの、これまで前立腺癌のバイオマーカーとして同定されていなかった。前立腺癌細胞においては、他にも数千のタンパク質が発現しているのだが、その多くは前立腺癌のバイオマーカーとして記述されることはなかった。このことについては、ＨＯＸＢ５及びＨＯＸＢ６を含むその他のＨＯＸペプチドについても同様である。
【００２０】
ＨＯＸペプチドのように、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ（Ｅｎ）タンパク質はまた、発生中に非常に高い程度の機能保存を示すホメオドメイン含有転写因子である（Ｍｏｒｇａｎ、２００６の総説）。元々のＥｎ遺伝子はショウジョウバエにおいて研究がすすめられ、Ｅｎ変異体は前翅及び後翅の間の境界を形成することができない遺伝子として特徴づけられた（Ｇａｒｃｉａ−Ｂｅｌｌｉｄｏ及びＳａｎｔａｍａｒｉａ、１９７２）。Ｅｎの脊椎動物相同体は同様に発生中調節的役割を担い、それには四肢の発達及び早期の特異化及びその後の神経系の軸索伸長の両方が含まれる（Ｍｏｒｇａｎ  ２００６）。
【００２１】
転写調節に加えて、ＥＮタンパク質は見かけ上無関係であるが、機能的に重要ないくつかのその他の特性を有する。第１には、細胞から分泌され、その他の因子によって内部に取り入れられる能力である（Ｃｏｓｇａｙａ他、１９９８；Ｊｏｌｉｏｔ他、１９９８；Ｍｏｒｇａｎ、２００６の総説）。この現象の基本となる正確な機構はわかっていないが、ホメオドメインに位置する保存された核外輸送配列に依存することは明らかである（Ｍａｉｚｅｌ他、１９９９；Ｃｈａｔｅｌｉｎ他、１９９６；Ｄｅｒｏｓｓｉ他、１９９６；Ｊｏｌｉｏｔ他、１９９７）。
【００２２】
発生上の役割に加えて、Ｅｎ−２は近年、乳癌において潜在的な癌遺伝子であることが示された（Ｍａｒｔｉｎ他、２００５）。ＥＮ−２を発現するように強制された非腫瘍形成性マウス乳房細胞系はその後、細胞周期の短縮及び細胞と細胞の接触の欠如を含むいくつかの悪性特性を示す。さらに、ＥＮ−２のＲＮＡｉサイレンシングでは、ＥＮ−２はヒト乳癌細胞系において形質転換表現型の維持に必要であることを示している。
【００２３】
我々はＥＮ−２が、細胞系ＬＮＣａＰ由来の前立腺癌及び前立腺癌由来のヒト組織試料中で過剰発現し、分泌されることを発見した。さらに、ＥＮ−２は、腺管細胞及び腺癌腫瘍から分泌され、前立腺癌患者の尿中に存在する。ＥＮ−２が前立腺癌のマーカーであることが示唆されたのはこれが最初である。
【００２４】
好ましくは、少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子、例えば、ＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の有無を検出する。
【００２５】
好ましくは、少なくとも１種のＨＯＸペプチドは、ＨＯＸペプチド又はそれらの断片が血清又は尿などの体液中で検出可能であるならば、以下に挙げたような任意のＨＯＸペプチドから選択される。
【００２６】
好ましくは、少なくとも１種のＨＯＸペプチド又はそれらの断片は、ＨＯＸＡ、ＨＯＸＢ、ＨＯＸＣ又はＨＯＸＤサブファミリー由来である。複数のＨＯＸペプチドを使用する場合、これらは、同一のファミリー由来、又はファミリーの組合せ由来であってよい。同一タンパク質の断片又は異なるタンパク質の断片による断片の組合せも考慮される。異なるペプチドの組合せはより正確な診断を行うことができる。ＨＯＸペプチドは、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ３又はＨＯＸＢ９ではないことが好ましい。
【００２７】
ＨＯＸペプチドは、ＨＯＸＣ４ペプチド、及び／又はＨＯＸＢ６ペプチド及び／又はＨＯＸＢ５ペプチド、及び／又はＨＯＸＡ３ペプチド、及び／又はＨＯＸＤ９ペプチド又はそれらの断片であることが特に好ましい。
【００２８】
好ましくは、ＨＯＸＣ４ペプチドは配列番号１（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０９０１７、ｇｉ：１２３２７９）又はそれらの断片で提供されるものである。好ましくは、ＨＯＸＢ６ペプチドは配列番号２（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１７５０９、ｇｉ：１１６２４２５１５）又はそれらの断片で提供されるものである。好ましくは、ＨＯＸＢ５ペプチドは配列番号３（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０９０６７、ｇｉ：４０００００）又はそれらの断片で提供されるものである。好ましくは、ＥＮ−２ペプチドは配列番号４（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１９６２２、ｇｉ：２１９０３４１５）又はそれらの断片で提供されるものである。好ましくは、ＨＯＸＡ３ペプチドは配列番号５（ｍＲＮＡ  ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０３０６６１、ｇｉ：８４０４３９４６）又はそれらの断片で提供されるものである。好ましくは、ＨＯＸＤ９ペプチドは配列番号６（ｍＲＮＡ  ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１４２１３、ｇｉ：２３３９７６７３）又はそれらの断片で提供されるものである。
【００２９】
ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ４ペプチド又はそれらの断片について記載したが、明記しない限り、これらの用語は同義に使用できることを理解されたい。その他のＨＯＸペプチド及びＥＮ−２も同様である。
【００３０】
さらに、本明細書ではＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＡ３又はＨＯＸＤ９について記載したが、明記しない限り、これはまたその他のＨＯＸペプチド、又はそれらの組合せに適用される。
【００３１】
同様に、本明細書では特定の配列、例えば、参照配列又は配列番号を記載したが、明記しない限り、これは全配列番号及び以下に挙げたＨＯＸ配列のいずれにも適用される。
【００３２】
好ましくは、断片は、参照配列（例、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＤ９又はＥＮ−２）に対して少なくとも８０％の配列相同性、より好ましくは参照配列に対して８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９９％、最も好ましくは９９．９％の配列相同性を含み、又は必要に応じてそれに近い配列相同性を含む。配列相同性を確立するために適切な方法には、ＢＬＡＳＴプログラムが含まれる。
【００３３】
好ましくは、断片は、参照配列（例、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＤ９又はＥＮ−２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を含み、より好ましくは参照配列に対して８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９９％、最も好ましくは９９．９％の配列同一性を含み、又は必要に応じてそれに近い配列同一性を含む。配列同一性を確立するために適した方法には、ＢＬＡＳＴプログラムが含まれる。
【００３４】
本明細書でこの用語を使用したように、ポリペプチドの１つの配列がその他のポリペプチドの配列と十分に高い程度の同一性又は類似性を有するならば、２種類のペプチドは「相同」であると言われる。「同一性」は、整列した配列の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。「類似性」は、整列した配列の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似の種類であることを示す。同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる（「コンピュータによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；「バイオコンピューティング、情報学及び遺伝子プロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及び「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。本明細書で言及したように、パーセント同一性は、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して、ＮＣＢＩ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定された初期設定変数［ブロッサム６２マトリクス；ギャップ開始ペナルティ＝１１及びギャップ伸長ペナルティ＝ｌ］を使用して決定される。
【００３５】
好ましくは、この断片は、配列番号１、２、３、４、５若しくは６などの参照配列から少なくとも４個の連続したアミノ酸、より好ましくはこの参照配列から少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個、より好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２２５個の、及び少なくとも２５０個までのアミノ酸のより長い断片も好ましい。断片にはまた、ｘ個のアミノ酸がＮ末端及び／又はＣ末端から欠失した切断型ペプチドが含まれる。このような切断型では、ｘは１又はそれ以上であってよいが（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上）、好ましくは１５０未満である。
【００３６】
理論に結びつけはしないが、ＨＯＸＣ４は非古典的な経路を介して、シグナル配列を必要とせずに分泌されると考えられる。したがって、配列番号１で挙げた配列は、血清中に見出されるタンパク質と同一であると考えられる。検出されたバンドは、遺伝子配列をベースにして予測された大きさに対応する大きさ（Ｍｗ）であることが観察によって裏付けられている。ＨＯＸタンパク質はまた、細胞溶解などのその他の機構によって細胞から遊離することができる。
【００３７】
「バイオマーカー」という用語は当業界を通じて使用されており、過程、事象又は状態に特有な生物学的指標、又は生物学的に生じた指標を意味する。言い換えると、バイオマーカーは、ある種の生物学的状態、例えば、癌組織の存在の指標である。場合によっては、バイオマーカーの異なる形態がある種の疾患状態の指標となることができるが、理論に結びつけはしないが、体液、例えば、血清中でＨＯＸＣ４ペプチド又はそれらの断片のレベル上昇の存在のみが前立腺癌の指標となると考えられる。例えば、ＨＯＸＣ４ペプチドの異なるグリコフォームが分泌されることは今のところ考えられていないが、それでもこれらは本発明に包含される。例えば、ＨＯＸＣ４では、異なるグリコフォーム、例えば、変化したグリコフォーム構造又は糖含量が測定され得るが、これらは包含され、前立腺癌進行の指標となることもできる。ＨＯＸＣ４ペプチド又はそれらの断片の切断、変異、又は欠失又は連結も考えられる。
【００３８】
しかし、本発明の基礎となる主要な発見は、体液、例えば、血清中において検出可能なＨＯＸＣ４のレベルの有意な増加があることである。ＨＯＸＣ４は分泌されるが、死細胞から漏出するＨＯＸＣ４タンパク質による可能性があることも考えられる。同様に、ＥＮ−２は、障害を受けた、又は死んだ細胞からの漏出によって体液中に分泌し、検出可能になる可能性がある。このようなレベルの上昇は、早期及び後期両方の前立腺癌の指標となる。対照レベル又は正常レベルと早期前立腺癌との間には顕著な上昇があるが、前立腺癌の早期と後期の間にも非常に顕著な上昇がある。概して、前立腺癌の実体及び状態も検出できることが本発明の利点である。これは、予後及び適切な治療の提供に役立つ。
【００３９】
良性の前立腺肥大症ＢＴＨ（ＢＰＨ）などの過剰な状態を区別することができることも本発明の利点である。前立腺の肥大を導くこのような状態は、前立腺癌の存在を決定するための確立された技術、例えば、直腸診（ＤＲＥ）を使用して前立腺癌と誤診される可能性がある。不快で、有害な恐れもあり、不正確でもあり得る侵襲性技術を使用せずに、正確な診断を提供できることは、本発明のもう１つの利点である。さらに、本発明は特に高感度である。好ましくは、本発明の方法は、その他のいかなる検出方法よりも前に、且つ前立腺癌の明白な徴候が出現する前に、前立腺癌の発症を検出することができる。したがって、このような処置に反応性が高く、且つ転移段階に入る可能性が高くないときに、癌を早期に治療することができる。
【００４０】
前立腺癌の異なる型が知られている。最も一般的には前立腺細胞で発生し、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）として知られている。しかし、前立腺癌のその他の型、例えば、肉腫、小細胞癌及び移行上皮癌が存在する。本発明の方法は、腺癌の検出が好ましいが、これらの種類の癌のいずれかの発症を検出するために使用することができる。
【００４１】
癌の進行は、病期変化によってモニターされる。これは、癌がどのくらい進行していて、拡散しているかどうかを示す。スコアは１から４に進み、各病期で予後が段階的に悪くなる。
【００４２】
病期１：悪性細胞が前立腺に限定されている。リンパ節又はその他の器官には広がっていない。グリーソンスコアは、２から４の間で、前立腺の５パーセント未満が腫瘍増殖からなる。
【００４３】
病期２：グリーソンスコアは５以上で、前立腺の５％超が異常な増殖を示す。癌はまだ、前立腺に限定されている。
【００４４】
病期３：悪性細胞が精嚢に広がっているが、リンパ節又はその他の器官には広がっていない。
【００４５】
病期４：リンパ節、骨盤組織又はより遠くの器官に影響が及んでいる。
【００４６】
好ましくは、本発明の方法は、ステージ１又はステージ２の、より好ましくはステージ１の前又は間に前立腺癌の発症を検出する。
【００４７】
本発明のペプチドバイオマーカーは、診断法、例えば、臨床スクリーニングにおいて、及び予後評価、治療結果のモニター、特定の治療的処置に最も応答する可能性が高い患者の同定の方法、並びに薬剤スクリーニング及び薬剤開発において使用することができる。さらに、本発明のバイオマーカー及びそれらの使用は、新規薬剤治療の同定及び薬剤治療の新規標的の発見に役立つ。
【００４８】
したがって、他の態様では、本発明は、少なくとも１種のホメオドメイン含有転写因子、例えば、ＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片を検出及び／又は定量することを含む、前立腺癌の進行の診断又はモニターの方法を提供する。好ましくは、このペプチドは、配列番号１、２、３、４、５又は６によるアミノ酸配列を含むか、又はそれらから成る。好ましくは、少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片は、試験対象の生物試料に存在する。前記生物試料は、好ましくは体液試料である。
【００４９】
体液は、細胞液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、尿、血液、リンパ液又は唾液を含む任意のヒト体液であってよい。しかし、体液は全血、特に血清又は尿であることが特に好ましい。体液は、細胞全体／無傷細胞を実質的に、又は完全に含まないことも好ましい。好ましくは、体液は、血小板及び細胞残渣（例えば、細胞の溶解によって生じたもの）を含まない。好ましくは、体液は、原核細胞及び真核細胞の両方を含まない。
【００５０】
このような体液は、任意の数の当業界で公知の手段、例えば、当業者に明らかな手段によって得ることができる。例えば、尿試料は容易に入手可能で、血液又は血清試料は、例えば、針及びシリンジを使用することによって非経口的に入手することができる。細胞を含まない、又は実質的に細胞を含まない試料は、体液に、限定はしないが、遠心及び濾過を含む当業者に公知の様々な技法を施すことによって得ることができる。
【００５１】
一般的に、非侵襲性技術を使用して試料を得ることが好ましいが、組織ホモジェネート、組織切片及び生検標本などの試料を得ることも依然として好ましい。
【００５２】
本発明のモニター方法は、前立腺癌の発症、進行、安定化、改善及び／又は緩解を検出するために使用することができる。したがって、少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の検出は、医師に特定の治療を指示させるために、疾患の進行を測定するために使用することができる。
【００５３】
好ましくは、少なくとも２回の検出及び／又は定量ステップを、好ましくは時間的に間隔をおいて、例えば、数日間、数週間、数年間又はより好ましくは数カ月間おいて行って、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチド、又はそれらの断片のレベルが変化したかどうかを決定することにより、癌の進行が変化したかどうかが示される。これによって、ペプチドのレベルの経時的な上昇は癌の発症又は進行を示し、ペプチドのレベルの減少は癌の改善及び／又は緩解を示す可能性があるので、２回以上採取された試料中のバイオマーカーのレベルの比較が可能となる。
【００５４】
好ましくは、本発明による診断の、又はモニターの方法は、１種又は複数の対照におけるレベルと試験試料中に存在するペプチドのレベルとを比較することを含む。こうして、発症又は進行をモニターするために、好ましくは、対照は同じ患者の以前の試料から得ることができる。しかし、対照は、集団、特に前立腺癌のない健康な、又は正常な集団で正規化することができることも好ましい。言い換えると、対照は正常な対照の正常な対照試料中で発見されたバイオマーカーのレベルからなることができる。
【００５５】
したがって、少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の量を定量又は検出すること、及び前記試験試料中の前記ペプチドの量を正常対象又は疾患発生前の健康な同対象から得られた対照の正常生物試料中に存在する量と比較することを含む、前立腺癌の診断方法を提供する。試験試料中に少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片のレベルの有意な上昇が認められる場合、疾患が進行しているか、又は発症していることの指標となる。
【００５６】
前述のように、少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片のこの検出方法は、早期前立腺癌の検出に特に有用であり、ＰＳＡレベルを検出する伝統的な試験よりも感受性が高い。したがって、本発明の方法は、患者が従来の方法、例えば、ＰＳＡの検出を使用して癌について陰性であると試験されたときに、癌を確認するために特に有用である。
【００５７】
一般的に、少なくとも１種のＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドの体液中への分泌のレベルは、以下に説明した範囲内である。
【００５８】
「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、特に明記しない限り、本明細書では交換可能であることが理解されよう。
【００５９】
例えば、表１及び図１は、ＨＯＸＣ４血清タンパク質濃度の非常に大きな上昇を示している。表２及び図２は、ＨＯＸＢ６と類似の結果を示している。ＨＯＸＢ６が後期前立腺癌のバイオマーカーであることも示した（データは示さず）。ＨＯＸＢ５はまたバイオマーカーであるが、ＨＯＸＢ６又はＨＯＸＣ４よりも好ましくない（表３及び図７）。その他の代わりのバイオマーカーには、ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＤ９が含まれる（図８参照）。
【００６０】
好ましくは、標準的方法、例えば、「ｔ検定」を使用することによって測定して、信頼区間が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．９５％、最も好ましくは少なくとも９９．９９％であれば、上昇は統計的に有意である。
【００６１】
好ましくは、対照と早期前立腺癌の指標となる試料との間の上昇は、約１１０〜２００％の間、より好ましくは約１２０〜１８０％の間、より好ましくは約１３０〜１６０％の間、より好ましくは約１４０〜１５０％の間、より好ましくは約１１０〜１４０％の間、より好ましくは約１１５〜１３０％の間、より好ましくは約１２０〜１３０％の間、より好ましくは約１２０〜１４０％の間、最も好ましくは約１２５％である。前記終点のその他の組合せも考慮される。
【００６２】
後期癌又は進行癌の測定に関して、対照と前記の後期前立腺癌の指標となる試料との間の上昇は、約４００〜８００％の間、より好ましくは約４５０〜７５０％の間、より好ましくは約５００〜７００％の間、より好ましくは約５２０〜６８０％の間、より好ましくは約５４０〜６４０％の間、より好ましくは約５５０〜６２０％の間、より好ましくは約５６０〜６００％の間、より好ましくは約５７０〜５９０％の間、最も好ましくは約５８０％である。増加はまた、５５０〜８００％又は４００〜６００％の範囲内であってよい。前記終点のその他の組合せも考慮される。
【００６３】
早期癌及び後期癌の間の上昇は、正常な（即ち、癌ではない）対照に対して、又は早期試料に対して、又は同患者の対照に対して測定することができる。早期試料に対しては、約１００％と３００％との間、より好ましくは約１５０％と２５０％との間、より好ましくは約１７５％と２２５％との間、より好ましくは約１８５％と２１５％との間、より好ましくは約１００％と２２０％との間、より好ましくは約１７０％と３００％との間、最も好ましくは約２００％の上昇が好ましい。
【００６４】
前述のように、本明細書で少なくとも１種のホメオドメイン含有ペプチドについて記載している場合、明記しない限り、これはＨＯＸペプチド、例えば、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＤ９並びにＥＮ−２ペプチドに適用される。
【００６５】
本明細書で少なくとも１種のＨＯＸペプチド又は複数のＨＯＸペプチドについて記載している場合、明記しない限り、これはＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＤ９、並びに特に以下に挙げたその他のＨＯＸペプチドに適用される。
【００６６】
体液、好ましくは血清１ｍｌ当たりの少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２タンパク質の絶対量については、これは、対照試料では好ましくは約０．５〜１．５ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約０．７５〜１．２５ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌである。早期癌試料では、好ましい範囲は、約２．０〜５．０ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約２．５〜４．５ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約２．５〜４．０ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約２．７５〜３．５ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは２．７５〜３．０ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約２．０〜３．５ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約２．０〜３．０ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約３．０ｎｇ／ｍｌである。
【００６７】
後期癌試料では、好ましい範囲は、約６．０〜２０ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約８．０〜１５ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約８．５〜１３ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約９．０〜１２ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約９．５％〜１１ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約７〜１３ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくは約８．５〜１６ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌである。
【００６８】
「診断」という用語は、前立腺癌の有無と共に前立腺癌の進行段階、例えば、早期若しくは後期、又は良性若しくは転移性前立腺癌の同定、確認及び又は特徴付けを含む。
【００６９】
癌疾患段階の「早期」及び「後期」の性質は、医師によって決定されることが理解されよう。これらはそれぞれ、非転移性及び転移性と呼ぶことができることも考えられる。
【００７０】
本発明はまた、対象の生物試料中に存在する少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド、又はそれらの断片を検出及び／又は定量することを含む、前立腺癌の治療効果のモニター方法を提供する。前記のように、治療中に何らかの進展があったかどうか、言い換えると、少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片のレベルが上昇又は減少したかどうかを判定するために、２種類の試料を、時間的に間隔をおいて、例えば、２、３カ月おいて得ることが好ましいと考えられる。前記少なくとも１種のＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドのレベルの減少は、疾患が緩解し、したがって、治療計画が成功していることを示す。疾患のこのようなモニターは、患者が治療に反応しているかどうか、又は治療に反応しないかどうかを迅速に示す。後者ならば、他の治療法を提供することができる。したがって、このような方法は、治療計画が効果的であるかどうかの速やかな指標を提供し、患者に効果が認められるまで、医師がこのような治療計画を変更するのを可能にする。
【００７１】
本発明の方法では、試験試料中のペプチド又はそれらの断片の量は、１種又は複数の対照中に、及び／又は前記の同一試験対象の早期に採取した１種又は複数の以前の試験試料中に存在する量と比較することが好ましい。早期と後期の試料間の時間の長さは、ほんの数日であってよいが、数カ月又は数年であってもよく、医師が疾患の進行及び患者の病歴に基づいて決定する。或いは、対照は、疾患のない患者の試験試料であってよい。
【００７２】
ペプチド又はそれらの断片は、前記バイオマーカーの存在を確認することによって検出する。試料中に存在するバイオマーカーの量の定量には、好ましくは、試料中のペプチドバイオマーカーの濃度の測定が含まれる。検出及び／又は定量のステップは、試料に直接的に、又はそれらの抽出物若しくはそれらの希釈物について間接的に実施することができる。
【００７３】
本発明は、バイオマーカーに関し、これらが体液中で検出可能でなければならないことが理解されよう。ＨＯＸファミリーのいくつかの構成要素は体液中では検出不可能で、したがって、本発明によるバイオマーカーではない。
【００７４】
少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の検出可能なレベルは他のところで論じるが、ＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片が検出可能ではない理由はいくつかあり得ることは理解されよう。理論に結びつけることはしないが、ペプチドが体液中で分解され、即ち、「安定」ではないことが１つの理由であり得る。
【００７５】
したがって、少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片は、実質的に分解されず、且つ／又は体の末梢、即ち、より簡単に試料採取できる、好ましくは腕の皮膚表面近くの静脈でも検出可能である（即ち、検出可能な濃度で存在する）ことが好ましい。
【００７６】
このペプチドは、細胞分解若しくは漏出、又は分泌によって体液中に放出され得る。
【００７７】
少なくとも１種のＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の検出及び／又は定量は、生物試料中の特定のタンパク質又はペプチドの存在及び／又は量の検出に適した任意の方法によることができる。これは、バイオマーカーの直接的検出法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ又はＳＥＬＤＩによることが可能である。
【００７８】
しかし、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片が１種又は複数のリガンドとの相互作用によって直接的又は間接的に検出されることも好ましい。このようなリガンドには、抗ＨＯＸ抗体若しくは抗ＥＮ−２抗体又はそれらの結合断片、アプタマー、又はオリゴヌクレオチドを含めることができる。これらのリガンドは、ＨＯＸペプチド、ＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片に特異的に結合することができなければならないことは理解されよう。それは適切に標識され、アフィニティータグを含むことができる。適切な標識は、蛍光、放射活性又はルミネセンスであってよい。標識は、抗体に直接、又はリンカーを介して結合することができる。
【００７９】
例えば、検出及び／又は定量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＳＥＬＤＩ、１−Ｄ又は２−Ｄゲルをベースにした分析系、液体クロマトグラフィーと質量分析技術を併用する液体クロマトグラフィーからなる群から選択された１種又は複数の方法によって実施することができる。これらの後者は、好ましくは、ＩＣＡＴ（登録商標）又はｉＴＲＡＱ（登録商標）（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡから入手）を含むことができる。
【００８０】
液体クロマトグラフィー技術は、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）又は低圧液体クロマトグラフィー（ＬＰＬＣ）も含むことができる。さらに、薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲ分光法及び本明細書で説明した任意のその他の方法も好ましい。
【００８１】
ペプチド又はそれらの断片は、免疫学的方法、例えば、サンドイッチ免疫測定法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＡＩ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法を使用して、検出及び／又は定量することができる。また、例えば、金、銀若しくはラテックス粒子、磁石粒子又はＱ−ｄｏｔの使用を含むことができる粒子ベースの免疫測定法が好ましい。このような方法は、例えば、マイクロタイタープレート又はストリップフォーマット又は「チップ」上で実施することができる。
【００８２】
特に好ましいのは、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチドに特異的な抗体を含むＥＬＩＳＡである。１種又は複数の抗ＨＯＸ抗体又は抗ＥＮ−２抗体を、直接又はリンカーを介して、レポーター分子、例えば、放射性同位元素、蛍光分子、ルミネセンス分子又は酵素に結合させることが好ましい。好ましい酵素の一例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＫから市販されているアルカリホスファターゼであるが、その他のレポーターが当業界では知られている。
【００８３】
抗ヒトＨＯＸＣ４抗体の一例は、Ａｂｃａｍ社、ＵＫからカタログ番号ａｂ２４３３８として市販されている。これは、ウサギの抗ヒトＨＯＸＣ４抗体で、したがって、ＨＯＸＣ４抗体複合体を検出するために、レポーター、例えば、アルカリホスファターゼに結合させた抗ウサギＩｇＧ第２抗体を使用することが好ましいことがあり得る。抗ＨＯＸＢ６抗体の一例は、Ａｂｃａｍ社からカタログ番号ａｂ２６０７７として市販されている。抗ＨＯＸＢ５抗体の一例は、Ａｂｃａｍ社からカタログ番号ａｂ２６０７９として市販されている。抗ＨＯＸＡ３抗体の一例は、Ａｂｃａｍ社からカタログ番号ａｂ２８７７１として市販されている。抗ＨＯＸＤ９抗体の一例は、Ａｂｃａｍ社からカタログ番号ａｂ６０７０８として市販されている。その他の抗ＨＯＸ抗体の例が知られている。抗ＥＮ−２抗体の一例は、Ａｂｃａｍ社からカタログ番号ａｂ４５８６７として市販されている。
【００８４】
ウェスタンブロッティング法はまた、特にこれらは濃度測定データをもたらすことができるので、好ましい。
【００８５】
対照、早期癌及び後期癌の間を区別するために十分な少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチドの存在の適切な比較レベル及びそれらの組合せについて前述している。
【００８６】
抗体を使用する場合、これらは、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、ヒト化又はキメラ抗体であってよい。抗体は、１本鎖から構成されていてよいが、少なくとも軽鎖又は重鎖から構成されていることが好ましく、ＨＯＸエピトープ又はＥＮ−２エピトープに結合するためには、少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）が必要であることが理解されよう。
【００８７】
もちろん、１種又は複数のエピトープはリガンド、例えば抗体による結合又は認識に利用可能でなければならないことも理解されよう。抗ＨＯＸ及び抗ＥＮ−２抗体は既に知られているが、異なる特異性を備えた他の抗体又は結合リガンドが必要ならば、これらを得ることができた。抗体の作製方法は当業界では公知である。例えば、ポリクローナル抗体が所望ならば、選択した哺乳類、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ又はウマを選択した抗原、例えば、ヒトＨＯＸ又はＥＮ−２で免疫することができる。免疫した動物の血清をその後収集し、抗体を得るために、例えば、免疫親和性クロマトグラフィーによって処理する。ヒトＨＯＸ又はＥＮ−２は、例えば、ウサギに注射し、ウサギの免疫応答を誘発し、抗ＨＯＸ又は抗ＥＮ−２抗体を生じさせて、標準的方法を使用することによって単離することができる。
【００８８】
もちろん、モノクローナル抗体は当業界で公知の方法によって生成することができ、一般的に好ましい。ハイブリドーマ技術を使用したモノクローナル抗体の一般的な作製方法はよく知られている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ他、７７〜９６  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）参照）。
【００８９】
したがって、本明細書で記載した抗体は、エピトープ結合領域、例えば、ＣＤＲから構成されなければならない。本明細書では、「抗体」という用語は、完全な分子並びにそれらの断片、例えば、エピトープに結合することができるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖを意味する。好ましくは、抗体はまた、エフェクター部分、例えば、Ｆｃ領域を含む。
【００９０】
抗体は、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、特にＩｇＧを含む任意の適切な型であってよい。これらの抗体の様々なサブクラスも考慮される。
【００９１】
したがって、バイオセンサーは少なくとも１種のペプチドバイオマーカー又はそれらの断片の検出に使用されることがまた好ましい。バイオセンサーは、例えばバイオマーカーを検出するために、前述したような免疫学的方法、又は電気的、熱的、磁気的、光学的、例えば、ホログラム、又は音響的手段若しくは技術を組み込むことができる。このようなバイオセンサーを使用して、バイオマーカーは検出及び／又は定量することが考えられる。したがって、他の態様では、本発明は、ペプチド又はそれらの断片を検出及び／又は定量するためのバイオセンサーの使用を提供する。
【００９２】
好ましくは、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２バイオマーカーは、「スマート」ホログラムの使用に基づいたバイオセンサー、又は高周波音響システムを使用して検出することができ、特にこのようなシステム自体は立体配置を整列するのに適している。例えば、Ｓｍａｒｔ  Ｈｏｌｏｇｒａｍｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫから市販されているスマートホログラムセンサーでは、ホログラフィック画像はバイオマーカーと特異的に反応するように感光された薄いポリマーフィルムに保存される。曝露すると、バイオマーカーはポリマーと反応し、ホログラムによって表された画像に変化をもたらす。試験結果を読み取ることによって、画像の光学的な明るさ、画像、色及び／又は位置の変化を見ることができる。これは、肉眼によっても読み取ることができる。
【００９３】
少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２バイオマーカーを検出及び／又は定量できるバイオセンサーは、試料中の前記バイオマーカーの存在、又は定量値の検出を検出可能な信号に変換するための適切な手段を備えた生体分子認識と組み合わせることが好ましいことは理解されよう。例えば、刻印された認識素子、薄層トランジスター技術、磁気音響共鳴装置及びその他の新たな音響−電気系は、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２バイオマーカーの検出及び／又は定量のために本発明のバイオセンサーで好ましく使用できる。好ましくは、本発明によるバイオセンサーは、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＤ９及びＥＮ−２のうちの１つ又は複数、好ましくは２、３、４、５又は６つを検出する。さらに、好ましいバイオセンサーはまたさらに、前述した様なその他のＨＯＸバイオマーカーを検出することができる。
【００９４】
好ましくは、バイオセンサーは前述したようにリガンド及び／又は抗体を含む。バイオセンサーは、バイオセンサーが少なくとも１種のＨＯＸペプチド、又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片に特異的に結合することができ、検出手段を提供するように、適切なアレイ又は「チップ」上に提供することができる。適切な検出手段については前述したが、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の特異的結合が実施されたことを示すために使用者に検出可能な信号、好ましくは、ＨＯＸ若しくはＥＮ−２の濃度又は前記アレイ若しくはチップ上で生じた特異的な結合現象の数の指標を提供することができるレポーター系、例えば、アルカリホスファターゼ又はスマートホログラムを含むことができる。
【００９５】
本発明はさらに、前記検出及び／又は定量のためのキットを提供する。このようなキットは、前立腺癌の診断及び／又はモニターに有用である。したがって、このようなキットは、少なくとも１種のペプチド又はそれらの断片での特異的な結合を可能にするリガンド、好ましくは抗体などのバイオセンサー、及び、例えば本明細書で記載したレポーター系を使用して、使用者に前記特異的な結合を示すための手段を含むことが好ましい。特に言及するならば、キットは、アレイ又はチップを含む。
【００９６】
他の態様では、本発明は、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の発生を抑制することができる物質を同定するために、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片の特異的結合及び認識を可能にするバイオセンサー、好ましくはリガンド、最も好ましくは抗体の使用を提供する。好ましくは、この物質は、前立腺癌によるバイオマーカーの産生を抑制することができる。言い換えると、リガンドは、推定若しくは確立された抗前立腺癌治療の効率又は非効率を測定するために使用することができる。
【００９７】
したがって、推定抗癌治療の効率を検出するための方法は、
（ａ）ＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドを発現する細胞全体をインキュベートして、放出されたＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドの量を検出するステップと、
（ｂ）細胞を推定抗癌治療で処理するステップと、
（ｃ）処理後に放出されたＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドの量を検出するステップと、
（ｄ）推定抗癌治療が放出されたペプチドの量に影響を及ぼすかどうかを確認するために処理前後両方に放出されるＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドの量を比較するステップとを含むことができる。
【００９８】
或いは、方法は、
（ａ）細胞表面上にＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドを発現する細胞全体又はＨＯＸペプチド又はＥＮ−２ペプチドを含有する細胞膜と標識リガンドをインキュベートするステップと、
（ｂ）細胞全体又は細胞膜に結合した標識リガンドの量を測定するステップと、
（ｃ）推定抗癌剤をステップ（ａ）の標識リガンド及び細胞全体又は細胞膜の混合物に添加し、混合物を平衡に到達させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の後、細胞全体又は細胞膜に結合した標識リガンドの量を測定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）及び（ｄ）で結合した標識リガンドの差を比較し、ステップ（ｄ）において結合の減少を引き起こす化合物がＨＯＸ又はＥＮ−２発現の阻害剤であり、したがって抗癌剤であるとみなされるステップとを含むことができる。
【００９９】
例えば、前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰなどの細胞系は、このような測定法で使用することができた。ＬＮＣａＰ細胞は、推定された、又は確立された抗癌剤の存在下又は非存在下で増殖することができ、ＥＮ−２の相対的発現が比較された。ＥＮ−２の発現レベルが低ければ低いほど、抗癌活性が優れていることを示している。発現レベルは、生成されたタンパク質（即ち、最終産物）を検出することによって、又は生成されたＲＮＡ（即ち、中間産物）を検出することによって検出することができた。タンパク質産物の検出方法については前述している。ＲＮＡは、例えば、定量的ＰＣＲ又はオリゴヌクレオチドアレイを使用して検出することができる。
【０１００】
前記はまた、本発明の方法及びキットに関する。
【０１０１】
本発明によるその他の方法又はキットは、当業者には明らかであろう。これらは、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１４３０１号明細書、米国特許出願公開第２００４／０６３２１６号明細書、国際公開第０１／９２８７９号パンフレット及び国際公開第０２／０５４９３６号パンフレットで開示されたバイオマーカー検出系を含むことができる。
【０１０２】
したがって、本発明は、新たな抗前立腺癌治療法を同定するために使用することができ、推定抗癌剤の効率を測定するために、少なくとも１種のＨＯＸ又はＥＮ−２ペプチド又はそれらの断片のレベルを推定抗癌剤の存在下又は非存在下で検出及び／又は定量する。本発明はまた、例えば、アレイフォーマット、例えば、チップ上又はマルチウェルアレイに配列されたハイスループットスクリーニング技術の方法で使用することができる。
【０１０３】
前立腺癌は男性に関連した疾患なので、対象又は患者は男性であることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】血清中のＨＯＸＣ４タンパク質を検索するためのウェスタンブロットの一例の図である。結果はまた、濃度測定によって分析され、各群について全部で６個の試料の平均として示している。エラーバーは平均の標準誤差を示す。これらのデータは、ＨＯＸＣ４が潜在的に、前立腺癌の早期及び後期両方の特異的で正確な診断マーカーであることを示している。
【図２】腫瘍が小さく、前立腺に限定されている早期前立腺癌の患者６人及び同年齢の対照６人におけるＨＯＸＢ６の検出を示した図である。
【図３】（ａ）ＬＮＣａＰ及び原発性腫瘍細胞におけるＥＮ−２発現（βアクチンの一部としての転写レベル）のＲＴ−ＱＰＣＲ分析。（ｂ、ｃ）抗Ｅｎ−２抗体で染色した前立腺癌のコア生検。Ｅｎ２陽性染色（褐色）が腫瘍細胞の細胞質に存在し、最も強い染色が管腔境界に存在する（１）。Ｅｎ２陽性の空胞が管腔境界（２）内に結合しているか、又は管腔内（３）には含まれないことが確認されている。核は青色に染色される。倍率：（ａ）×１００、（ｂ）×６０。
【図４】（ａ）正常な前立腺組織、（ｂ）良性の前立腺肥大、及び（ｃ及びｄ）悪性前立腺腫瘍のＴＭＡコア生検による切片。ＥＮ−２染色（褐色）は間質細胞（白い矢印）に存在し、腺内で最も強い染色は管腔境界（黒い矢印）で認められる。核は青色に染色される。倍率：（ａ〜ｃ）×６０、（ｄ）×１００。
【図５】培地中におけるＥＮ−２タンパク質のウェスタンブロットによる検出を示した図である。
【図６】尿中におけるＥＮ−２タンパク質を示した図である。尿は、前立腺癌と合致した徴候を調べ、ＥＮ−２タンパク質の存在をスクリーニングした個体から収集した。癌の有無は生検によって調べた。ＥＮ−２の予測ＭＷは３０ｋＤａであるが、陽性対照（マウス小脳抽出物）では３３ｋＤａに第２のバンドも検出された。３０ｋＤａのバンドは、生検中に前立腺癌細胞を有する患者の５０％の尿中に限られて存在し（Ｃ  Ｐａ）、陰性生検の患者又は前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）又は高悪性度上皮内新生物（ＨＧＰＩＮ）の患者では存在しなかった。
【図７】腫瘍が小さく、前立腺に限定されている早期前立腺癌の患者３人及び後期前立腺癌の患者３人及び同年齢の対照３人におけるＨＯＸＢ５の検出を示した図である。
【図８】正常な隣接組織と比較した腫瘍組織における様々なＨＯＸＡ及びＨＯＸＤ遺伝子の発現レベルを示した図である。ＤＵ１４５及びＰＣ３は、前立腺腫瘍由来の細胞系である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
（実施例１）
ＨＯＸＣ４
血清は進行したホルモン難治性前立腺癌の患者６人、腫瘍が小さく、前立腺に限定されている早期前立腺癌の患者６人及び同年齢の対照６人から得た。これを脱塩し、１２．５％ＰＡＧＥ／ＳＤＳゲルを使用して分画した。ヒトＨＯＸＣ４タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／スイスプロット登録番号Ｐ０９０１７）は、ウサギの抗ヒトＨＯＸＣ４抗体（Ａｂｃａｍ、ＵＫ、カタログ番号ａｂ２４３３８）と共にアルカリホスファターゼに結合した抗ウサギＩｇＧ第２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用いたウェスタンブロッティングを使用して検出した。この方法を使用して、全前立腺癌患者の血清中では高レベルのＨＯＸＣ４タンパク質が検出されたが、同年齢の対照血清では非常に低いレベルのみしか発見されなかった（図１）。
【０１０６】
結果を以下の表１に示す。
【０１０７】
ＨＯＸＣ４は、ＥＬＩＳＡなどの標準的アッセイ技術を使用することによって、前立腺癌の診断及び／又は予後試験の基礎として使用することができた。これには、患者血清試料中のＨＯＸＣ４タンパク質の量を定量するために、アルカリホスファターゼなどのレポーターに結合させた抗ＨＯＸＣ４抗体を使用することが含まれる。ウェスタンブロッティングを含むその他の方法も使用することができた。ＨＯＸＣ４タンパク質の量は、疾患が存在するかどうか、及びどの病期に達しているかに関しての指標となるだろう。
【表１】
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表１
【化１】
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【０１０８】
（実施例２）
ＨＯＸＢ６
これらの試料中におけるＨＯＸＢ６の検出は、第１抗体がウサギの抗ヒトＨＯＸＢ６（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２６０７７）であること以外はＨＯＸＣ４の通りに実施した。ＨＯＸＢ６タンパク質の相対値は、Ｘ線フィルムの濃度測定によって評価した（予測分子量に位置したバンドを使用した）。これらの値は、特定の位置の背景に対するバンドの光学的密度である。したがって、同年齢の対照（ＡＭＣ）で示されるように相対的な濃度測定値が負の値となりえることが理解されようが、これはＨＯＸＢ６タンパク質の量が負の値であることを意味するのではないことも理解されよう。
【０１０９】
これらのデータを図２で図示する。
表２
【表２】
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【化２】
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【０１１０】
（実施例３）
ＥＮ−２
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使用して、ＥＮ−２の発現レベルをヒト前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰにおいて試験した（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ他、１９８３）。これは、ヒト前立腺癌の転移病変から得られた細胞系で、この癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして広く使用されている。さらに、ＥＮ−２の発現を、前立腺腫瘍の生検から得られた組織において試験した。両試料でＥＮ−２が発現していた。原発性の腫瘍細胞ではまた、タンパク質としてＥＮ−２が発現していた。これは、前立腺癌の切片で検出することができた（図３ａ）。これらの切片でのＥＮ−２染色は、細胞質及び核画分の両方に存在するが、最も強いのは管腔境界及び管腔に入る分泌空胞（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｂｌｅｂ）である（図３ｂ、ｃ）。
【０１１１】
ＥＮ−２が正常な前立腺、良性肥大及び悪性腫瘍の組織に存在する範囲をさらに調べるため、それぞれから代表的な部分を含有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を抗ＥＮ−２抗体で染色した。これによって、ＥＮ−２は悪性化した腺、特に管腔境界で強く発現しているが（図４）、正常組織及び肥大組織の腺ではいくらか染色することが確認された。全組織ではまた、間質細胞においてＥＮ−２の染色が見られた（図４）。腺における染色を定量するために、各組織を０から３まで記録した。ここで、０は染色しないことを表し、３は最も強い染色を表す。これに基づいて、正常な組織の腺（図４ａ）のスコアの平均値は０．５（ｎ＝１０、ｓｄ＝０．５２）で、良性肥大（図４ｂ）では０．６７（ｎ＝６、ｓｄ＝０．５１）で、悪性腫瘍（図４ｃ＆ｄ）は２．３（ｎ＝６、ｓｄ＝０．５２）であった。
【０１１２】
これらのデータは、ＥＮ−２がこれらの前立腺癌細胞で発現していることを明白に示している。
【０１１３】
（実施例４）
ＬＮＣａＰ及び原発性前立腺腫瘍細胞の周囲の培地を、ＥＮ−２がこれらの細胞から分泌され得るかどうかを確証するために調べた。両方の種類の細胞を２時間培養し、その際に使用した培地を脱塩して濃縮した。この濃縮物中に含有されるタンパク質を、その後アクリルアミドゲルで分離した。ウェスタンブロッティングによって、両方の種類の細胞の周囲の培地にＥＮ−２特異的バンドが存在することが明らかになり（図５）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写されたＥＮ−２タンパク質の標準量を使用した定量によって、ＬＮＣａＰ細胞を培養するために使用した培地中のＥＮ−２の量は３ｎｇ／ｍｌであり、一方、原発性腫瘍細胞は４８時間で１．７５ｎｇ／ｍｌを産生することが示された。
【０１１４】
（実施例５）
尿試料は、最近前立腺生検及びマッサージを受けた個体１７人から入手した。これらの個体のうち、１０人で生検に癌があることが発見された。その他のうち、２人は高悪性度前立腺上皮細胞内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）を有し、３人は良性肥大の徴候を示し、２人は生検部分に癌細胞がなかった。癌と診断された患者のうち５人は、尿中のＥＮ−２の量が多く、癌と診断されなかった個体の尿試料ではＥＮ−２タンパク質の有意な量の含有はなかった（図６）。
【０１１５】
（実施例６）
ＨＯＸＢ５
これらの試料中におけるＨＯＸＢ５の検出は、第１抗体がウサギの抗ヒトＨＯＸＢ５（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２６０７９）であったこと以外はＨＯＸＣ４及びＨＯＸＢ６の通りに実施した。ＨＯＸＢ５タンパク質の相対値は、Ｘ線フィルムの濃度測定によって評価した（予測分子量に位置したバンドを使用した）。これらの値は、特定の位置の背景に対するバンドの光学密度である。
表３
【表３】
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これらのデータは図７に図示される。
【０１１６】
（実施例７）
尿試料は、前立腺癌の疑いがあり、その後この疾患と診断された個体１７人から入手した。尿試料中のＥＮ２のタンパク質レベルは、前述のように評価した。これらの個体の８人（４７％）の尿試料で、ＥＮ２レベルの上昇が見られた。対照的に、前立腺癌が疑われたが、その後癌が確認されなかった患者１５人から得られた尿試料中では、ＥＮ２レベルの上昇はなかった（０％）。尿試料中のＥＮ２レベルの上昇が見られ、前立腺癌と診断された患者のうち３人ではＰＳＡレベルの上昇がなかったことは注目に値する。これは、本発明の方法が、従来の検出方法では不十分であった癌の検出に有効であることを示している。
【０１１７】
（実施例８）
正常組織及び腫瘍組織におけるＨＯＸ遺伝子発現の検出
ＲＮＡ抽出：腫瘍及び正常な隣接組織のＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡから購入した。細胞培養物のＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）を使用して抽出した。
【０１１８】
ｃＤＮＡ合成：ＲＮＡは、まず、６５℃で５分間加熱することによって変性させた。ＲＮＡ１〜５ｍｇを５０ｍｌの量で、ＤＴＴ１０ｍＭ、ｄＮＴＰミックス１ｍＭ、並びにｐｏｌｙＴプライマー１００ｍｇ／ｍｌ、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）２００単位及びＲＮＡＳＥｏｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）４０単位の最終濃度で３７℃で１時間インキュベートした。ｃＤＮＡ合成反応は、試験管に６５℃で５分間静置することによって終了させた。
【０１１９】
リアルタイムＰＣＲ：半定量ＲＴ−ＰＣＲは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ４０００リアルタイムＰＣＲ機器を使用して実施した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ４０００は、増幅が限られた試薬及び周期の変動に脆弱になる前に、対数反応期中のＰＣＲ産物蓄積を測定する。蛍光は、ＰＣＲ産物レベルの上昇に応じて増加する。各転写物の相対量は、各試料中のベータアクチン転写物の量との比として測定された。
【０１２０】
使用したプライマーは以下の表４に挙げた。
【表４】
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【０１２１】
結果は図８に示す。この方法を用いることによって、ＨＯＸＡ３及びＨＯＸＤ９の遺伝子は、腫瘍組織試料で明らかに過剰発現しているので、これらは前立腺癌の潜在的バイオマーカーとして同定された。
【化３】
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【化４】
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（参考文献）
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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