(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の開始、進行、重症度、症状、攻撃性、グレード、活性、障害、死亡率、罹患率、及び疾患細分類の少なくとも一つに寄与する一つ又は複数の代謝経路を評価するためのマーカーであって、
該マーカーは少なくとも一つのALL1融合タンパク質をコードする一つ又は複数の遺伝子産物を含み、該All1融合タンパク質がALL1/Af4融合タンパク質又はALL1/Af9融合タンパク質を含み、該ALL1融合タンパク質はEphA7転写を誘導する、
前記マーカー。
【請求項２】
マーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチド又はその部分の存在の検出によって評価され、転写されたポリヌクレオチドが、マーカーのコード領域を含む、請求項1に記載のマーカー。
【請求項３】
請求項1に記載のマーカーを含む組成物。
【請求項４】
癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項2に記載の少なくとも一つのマーカーのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記試薬。
【請求項５】
癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーによってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む、前記試薬。
【請求項６】
急性リンパ芽球性白血病(ALL)を予防又は治療する療法の有効性を評価するための方法であって、
少なくとも一つの白血病細胞において、請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーを評価することによって、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の治療又は予防における試験中の治療剤の有効性のレベルを決定するステップを含み、
前記白血病細胞が癌を有する対象由来であるか、またはAll細胞系であり、
All細胞系は、ALL1/AF4キメラ融合タンパク質構築物でトランスフェクトされたK562白血病細胞；t(4; 11)染色体転座を有するプロB白血病SEMK2細胞；t(4; 11)染色体転座を有するプロB白血病RS4細胞；ALL1/AF9キメラ融合タンパク質構築物でトランスフェクトされたK562白血病細胞; t(9; 11)染色体転座を有するプロB白血病SEMK2細胞；及び t(9; 11)染色体転座を有するプロB白血病RS4細胞からなる群から選択される少なくとも一つの白血病細胞である、前記方法。
【請求項７】
候補治療剤が、医薬組成物、栄養補助組成物、及びホメオパシー組成物のうち一つ又は複数を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
評価されている療法が、ヒト対象で使用する療法である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーから選択される癌関連疾患のマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む製品。
【請求項１０】
癌関連疾患を治療するための治療剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーの一つ又は複数の試薬、及び少なくとも一つのマーカーを発現する細胞を含む、前記キット。
【請求項１１】
マーカーの存在が、少なくとも一つのマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
請求項1に記載の一つ又は複数のマーカーをそのようなマーカーの基質及び試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がマーカーの発現を抑制するかどうかを決定するステップとを含む、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路に干渉する作用物質のスクリーニング試験方法。
【請求項１３】
すべての方法のステップがin vitroにおいて実行される、請求項１２に記載のスクリーニング試験方法。
【請求項１４】
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路が、EphA7が関与するシグナル伝達経路であり、マーカーが少なくとも一つのALL1融合タンパク質をコードする一つ又は複数の遺伝子産物及びEphA7転写物から選択される一つ又は複数のマーカーであり、該All1融合タンパク質がALL1/Af4融合タンパク質又はALL1/Af9融合タンパク質を含む、請求項１２に記載のスクリーニング試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年8月22日に出願された米国仮出願第61/965,757号に基づく優先権を主張して2008年8月22日に出願されたPCT/US08/073964の利益を請求し、それらの全開示は参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所助成金第CA128609号及び米国-イスラエル二国間助成金第2003223号の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒト急性白血病のためのバイオマーカーを伴う方法及び組成物に関する。本発明のある態様は、ヒト急性白血病の診断、治療、及び予後判定における適用を含む。
【背景技術】
【０００４】
この節において開示される背景技術が、法律的に、先行技術を構成することを認めるものではない。
【０００５】
ALL1遺伝子(MLLとも称される)は、急性白血病において、具体的には小児急性リンパ芽球白血病(ALL)及び治療関連急性骨髄性白血病において生じる再発性染色体転座へのその関与により単離された(11)。染色体転座は、50を超える異なるパートナー遺伝子のうちの一つとのALL1遺伝子の融合並びにN末端All1配列及びC末端のパートナータンパク質から構成される白血病誘発性タンパク質の産生をもたらす(11)。
【０００６】
Croceら、米国特許第5,633,136号は、参照により、本明細書に明確に組み込まれるが、白血病の検出及び治療のためのそのALL-1ポリヌクレオチドを開示する。Croceら、136は、ALL-1遺伝子座における、第11染色体上の切断点を含む、ヒト白血病の診断及び治療のための方法を提供する。第11染色体上の約8kbの領域であるALL-1切断点領域もまた開示される。ALL-1領域は、急性のリンパ球性、骨髄単球性、単球性、及び骨髄性白血病における転座に関与する。第11染色体上のALL-1切断点領域を含む染色体異常を同定するプローブもまた提供される。第11染色体上のALL-1遺伝子のcDNA配列が提供される。AF-4遺伝子の部分配列もまた、転座の二つの相互最終産物の配列との関連で提供される。全ALL-1遺伝子のcDNA配列及びAF-4遺伝子の部分配列に対応するアミノ酸配列もまた提供される。プローブは、第11染色体上のALL-1遺伝子を含む染色体異常を検出するために提供される。診断及び治療のためのモノクローナル抗体並びに急性白血病の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた記載される。
【０００７】
Croce、米国特許第5,567,586号は、参照により、本明細書に明確に組み込まれるが、ALL-1領域における染色体異常を有する固形腫瘍を同定するための方法を開示する。Croce、'586は、固形腫瘍が、ALL-1遺伝子再構成又はALL-1遺伝子突然変異を有するかどうかを決定するための方法を提供する。この方法は、固形腫瘍のサンプルを得るステップ及び上述のサンプル中の細胞におけるALL-1遺伝子再構成又は突然変異の存在を検出するステップを含む。ALL-1遺伝子再構成及び突然変異は、サザンブロット分析、PCR増幅分析、in situハイブリッド形成分析、ノーザンブロット分析、又はDNA配列分析によって検出される。
【０００８】
Croceら、米国特許第5,633,135号は、参照により、本明細書に明確に組み込まれるが、ALL-1領域染色体異常に起因するキメラ核酸及びキメラタンパク質を開示する。Croceら、'135は、ALL-1遺伝子座における、第11染色体上の切断点を含む、ヒト白血病の診断及び治療のための方法を提供する。第11染色体上の約8kbの領域であるALL-1切断点領域もまた開示される。ALL-1領域は、急性のリンパ球性、骨髄単球性、単球性、及び骨髄性白血病における転座に関与する。第11染色体上のALL-1切断点領域を含む染色体異常を同定するプローブもまた提供される。第11染色体上のALL-1遺伝子、第9染色体上のAF-9遺伝子、及びAF-4遺伝子のcDNA配列並びに対応するアミノ酸配列もまた提供される。プローブは、これらの遺伝子を含む染色体異常を検出するために提供される。転座に関与するキメラ遺伝子が開示される。診断及び治療のためのモノクローナル抗体並びに急性白血病の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた記載される。
【０００９】
Croceら、米国特許第6,040,140号は、参照により、本明細書に明確に組み込まれるが、染色体上のALL-1遺伝子のcDNA配列を記載する。AF-4遺伝子の部分配列もまた、転座の二つの相互最終産物の配列との関連で提供される。全ALL-1遺伝子のcDNA配列並びにAF-4遺伝子の部分配列並びにそれぞれ、第4、9、及び19染色体との染色体転座によって形成されるキメラ遺伝子に関する配列に対応するアミノ酸配列もまた提供される。転座によって生成されるキメラ遺伝子を検出するためのプローブを含むプローブもまた、第11染色体上のALL-1遺伝子を含む染色体異常を検出するために提供される。
【００１０】
ALLにおける最も一般的なALL1再構成は、t(4;11)染色体転座に起因するALL1/AF4キメラ遺伝子である。この再構成は、プロB細胞白血病をもたらし、小児及び成人における非常に不良な予後に関連する(12)。All1融合タンパク質によって調節解除される分子経路(14,21)は、部分的に定められているのみであるが、造血細胞の増殖及び分化に関与する(一つ又は複数の)プロセスをおそらく含むであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
療法についての相当な研究にもかかわらず、ALLは、有効に診断し、治療するのが困難なままであり、患者において観察される死亡率から、疾患の診断、治療、及び予防における改善が必要とされることを示される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第1の態様において、病態又は病態を発症する危険性を評価するための方法が本明細書において提供される。この方法は、対象由来のサンプルにおける一つ又は複数のマーカーの発現プロファイルを測定するステップを含み、対象由来のサンプルにおける発現プロファイル及び正常サンプルの発現プロファイルにおける差異は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)又はALLに対する素因を示す。
【００１３】
特定の実施形態において、マーカーは、(Erk)リン酸化及びALL/Af4融合タンパク質を産生する細胞の増殖に干渉する、一つ又は複数の遺伝子産物を少なくとも含む。
【００１４】
ある実施形態において、対象の病態の評価は、対象におけるALLの発症の素因の予測、ALL対象の診断、ALL対象の予後の評価、又は療法に対するALL対象の応答の評価を含む。
【００１５】
ある実施形態において、t(4;11)白血病細胞における、直接的なEphA7ノックダウン又はAll1/Af4のノックダウン媒介性のEphA7抑制は、Erk1/2リン酸化の減弱をもたらす。
【００１６】
他の態様において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する対象の生存を予測するためのマーカーであって、(Erk)リン酸化及びALL/Af4融合タンパク質を産生する細胞の増殖に干渉する、一つ又は複数の遺伝子産物を含むマーカーが本明細書において提供される。
【００１７】
他の態様において、t(4;11)を持つ白血病細胞の治療のための方法であって、アポトーシス細胞死を誘発する、Erkリン酸化の阻害剤を投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。
【００１８】
他の態様において、EphA7発現を、必要のある対象においてアップレギュレートするための方法であって、EphA7発現をアップレギュレートするAll1融合タンパク質をコードする遺伝子産物を投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。
【００１９】
他の態様において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の開始、進行、重症度、症状、攻撃性、グレード、活性、障害、死亡率、罹患率、疾患細分類、又は他の根本的な病原的若しくは病理学的特徴の少なくとも一つに寄与する一つ又は複数の代謝経路を評価するためのマーカーであって、マーカーは、ALL1融合タンパク質をコードする一つ又は複数の遺伝子産物を含み、ALL1融合タンパク質とEphA7の発現との関連が、非常に統計的に有意であるマーカーが本明細書において提供される。
【００２０】
ある実施形態において、マーカーの発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出することによって評価され、転写されたポリヌクレオチドは、マーカーのコード領域を含む。
【００２１】
他の態様において、本明細書に記載の一つ又は複数のマーカーを含む組成物が本明細書において提供される。
【００２２】
他の態様において、癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項7に記載の少なくとも一つのマーカーのヌクレオチド配列、又はマーカーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む試薬が本明細書において提供される。他の態様において、試薬は、本明細書に記載の少なくとも一つのマーカーによってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことができる。
【００２３】
他の態様において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)を予防、診断、及び/又は治療する療法の有効性を評価するための方法であって、
(1)有効性を評価中の療法を動物に施すステップと、(2)本明細書に記載の少なくとも一つのマーカーを評価することによって急性リンパ芽球性白血病(ALL)の治療又は予防における試験中の治療の有効性のレベルを決定するステップとを含む方法が本明細書において提供される。
【００２４】
ある実施形態において、候補治療剤は、医薬組成物、栄養補助組成物、及びホメオパシー組成物のうち一つ又は複数を含む。ある実施形態において、評価中の療法は、ヒト対象で使用する療法である。
【００２５】
他の態様において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の癌を治療するための医薬組成物であって、少なくとも一つのALL1/Af4融合タンパク質発現阻害化合物、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。ある実施形態において、少なくとも一つの発現阻害化合物は、適切な対照細胞に比べて、癌細胞においてアップレギュレートされる又はダウンレギュレートされる遺伝子産物に特異的である。
【００２６】
他の態様において、本明細書に記載のマーカーの少なくとも一つから選択される、癌関連疾患のマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む製品が本明細書において提供される。
【００２７】
他の態様において、癌関連疾患を治療するための治療剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、本明細書に記載の少なくとも一つのマーカーの一つ又は複数の試薬、及び少なくとも一つのマーカーを発現する細胞を含むキットが本明細書において提供される。ある実施形態において、マーカーの存在は、少なくとも一つのマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される。
【００２８】
他の態様において、本明細書に記載の一つ又は複数のマーカーをそのようなマーカーの基質及び試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がマーカーの活性を調節するかどうかを決定するステップとを含む、急性リンパ芽球性白血病(ALL)のスクリーニング試験が本明細書において提供される。ある実施形態において、すべての方法のステップはin vitroにおいて実行される。
【００２９】
他の態様において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を、必要のある個体において、治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための方法であって、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路に干渉する作用物質を、そのようなシグナル伝達に干渉するのに十分な量で個体に投与するステップを含み、作用物質が、(Erk)リン酸化及びALL/Af4融合タンパク質を産生する細胞の増殖に干渉する少なくとも一つの遺伝子産物を含む方法が本明細書において提供される。
【００３０】
他の態様において、個体において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための医薬の製造のための、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路に干渉する作用物質の使用が本明細書において提供される。ある実施形態において、作用物質は、少なくとも5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む。
【００３１】
他の態様において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を、必要のある個体において、治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための方法であって、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の疾患応答カスケードに干渉する作用物質を個体に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。ある実施形態において、作用物質は、5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む。
【００３２】
他の態様において、個体において、癌関連疾患を治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための医薬の製造のための、少なくとも一つの急性リンパ芽球性白血病(ALL)の疾患応答カスケードに干渉する作用物質の使用が本明細書において提供される。ある実施形態において、作用物質は、5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む。
【００３３】
本発明の様々な目的及び利点は、添付図面に照らして読むと、好ましい実施形態の以下の詳細な説明から当業者らに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】ALL1融合構築物を形質移入したK562細胞及びt(4;11)異常を有する白血病細胞系中のEphA/エフリン-A転写産物の検出の図である。  図1A:ALL1/AF4又はALL1/AF9構築物を形質移入したK562細胞、プロB t(4;ll)白血病細胞系SEMK2及びRS4;11並びにALL1の異常を欠くプロB系380、及びプレB系697を、半定量的RT-PCR分析に供し、エフリン-A及び/又はEphAの発現レベルを測定した。「空」は、ベクターを用いた形質移入を指す。K562形質移入体における抗HA mAbを用いた組換えAll1融合タンパク質のウェスタンブロット検出を左下に示した。
【図１Ｂ】前述の細胞中のEphA7転写産物の量を、リアルタイムRT-PCRの方法を用いることによって定量した。まず、様々な細胞供給源から合成したcDNAを、GAPDHに関するそれらのサイクルの閾値(ct)について決定した。この手法により、全cDNAと同じような量を示す、15.01+0.11(平均+SD)という値が得られた。EphA7に関して決定されたct値を、EphA7 cDNAの既知の量を使用して確立した標準曲線に従ってフェムトグラム(fg)に変換した(B、左)。
【図２Ａ】SEMK2細胞中のAll1/Af4の抑制が、EphA7の発現をダウンレギュレートする図である。ジャンクション特異的(SEMj)又は対照(MVj)のsiRNAのどちらかを形質移入したSEMK2細胞を、p300 All1(All1)、All1/Af4及びAf4のタンパク質の検出のためにウェスタンブロット分析に供し(図2A)、並びにEphA7及びHoxA9転写産物の検出のために半定量的RT-PCR分析に供した(図2B)。Aにおいて、抗-All1 N-末端及び抗-Af4 C-末端のAbの混合物を、プローブとして使用した。
【図２Ｂ】EphA7及びHoxA9転写産物の検出のために半定量的RT-PCR分析に供した。
【図３Ａ】EphA7ゲノム領域におけるAll1融合タンパク質の発生のChIP分析を示した図である。  ChIP分析に使用した、#1、2及び3とするEphA7遺伝子内のゲノム領域を示す。
【図３Ｂ】ChIPにより濃縮したDNA(抗HA mAbを使用)をPCR増幅し、2%アガロースゲル上で解析した。pMACS 4.1ベクター中のEGFP構築物を、形質移入対照として使用した。mlgGは、対照として使用した正常マウスのIgGを示す。
【図３Ｃ】ChIPにより濃縮したDNAを、さらにリアルタイムPCR分析に供した。サイクル閾値を、全インプット量の0.05%を100%に設定して使用することによって決定し、ChIPにより濃縮したDNAを使用して、アッセイにおいて決定した値をインプットのパーセントに変換する。各列の縦棒は、3回のアッセイにより決定した標準偏差を示す。
【図４Ａ】EphA7が、Erkのリン酸化を媒介することを示す図である。  図4A:EphA7構築物を形質移入したK562及びKGl細胞を、ウェスタンブロットにより、c-Raf、Mekl/2及びErkのリン酸化状態、並びにEphA7タンパク質由来の構築物の検出のために分析した。β-アクチンは、添加量対照としての役割を果たす。
【図４Ｂ】ALL1融合構築物を形質移入したK562細胞において、Erkのリン酸化状態を決定した。
【図４Ｃ】図4C〜4D:EphA7特異的siRNAs(図4C中のsiEphA7の#1及び#2)を用いて処理することによって、又はALL1/AF4特異的siRNA(図4D)を用いて処理することによってEphA7の発現を抑制したSEMK2細胞を、Erkのリン酸化状態に関して分析した図である。EphA7の抑制に関するsiEphA7の#1及び#2の効率を、半定量的RT-PCR(図4C、下)によって決定した。
【図４Ｄ】図４Ｃの続きである。
【図５Ａ】5-ヨードツベルシジンが、Erkのリン酸化及びAll1/Af4融合タンパク質を産生する細胞の増殖を特異的に阻害する図である。溶媒(DMSO)又は5μMの5-ヨードツベルシジン(5-ITU)のどちらかを用いて24時間処理した、t(4;l1)を有するSEMK2細胞を、リン酸化Erkの検出のためにウェスタンブロット分析に供した。SEMK2及びt(4;ll)を有するプロB白血病細胞系のRS4;11並びにALL1の異常を欠くプロB系380及びプレB系697を、1μMの5-ITUを用いて、24、48及び72時間処理した(それぞれ、上段、中段及び下段)。各時点において、細胞を、MTTアッセイ(左)、カスパーゼ3活性アッセイ(中)及びFACS分析(右)に供した。MTTアッセイ及びカスパーゼ3活性アッセイの結果を、DMSO処理細胞についての値に対する比として計算した。各列の縦棒は、3回のアッセイによって決定した標準偏差を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの続きである。
【図５Ｃ】図５Ｂの続きである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本開示の全体にわたって、様々な刊行物、特許、及び公開特許明細書は、引用を明確にすることによって参照される。これらの刊行物、特許、及び公開特許明細書の開示は、本発明が属する技術水準をより完全に記載するために、参照により本開示に組み込まれる。
【００３６】
本明細書における発明者は、ALL1関連白血病における、ある種の受容体及びリガンドの発現の間の相関性をすでに発見した。特に、ALL1関連白血病におけるEphA受容体及びリガンドの発現の間の相関性の発見が本明細書においてすでに記載されている。
【００３７】
Eph受容体チロシンキナーゼ及びそれらの細胞表面結合リガンドであるエフリンは、細胞間相互作用によって引き起こされる特有のシグナル伝達系として機能し、神経発生プロセスを媒介することが示された。さらに、最近の研究は、ヒト悪性腫瘍におけるEph/エフリン遺伝子のうちのいくつかの調節解除を示し、腫瘍形成におけるこのシグナル伝達経路の関与を示唆した。
【００３８】
エリスロポエチン産生肝癌増幅配列(Eph)受容体は、ヒトにおける、八つのEphA受容体及び六つのEphB受容体を含む受容体チロシンキナーゼの大きなファミリーである。EphA及びBの受容体の間の区別は、各グループの細胞外ドメイン配列内の類似性並びにエフリン-A及びエフリン-Bのリガンドに結合するための親和性に基づく。したがって、EphA受容体は、グリコシルホスファチジルイノシトールを介して細胞膜上に固定された、エフリン-A1、-A2、-A3、-A4、及び-A5と称されるリガンドに結合するのに対して、EphB受容体は、膜貫通型分子である、エフリン-B1、-B2、及び-B3と称されるリガンドに結合する。Eph受容体及びエフリンの両方が、細胞表面に局在するので、シグナル伝達は、直接的な細胞間接触の部位に制限され、相互作用している細胞の間の相互の双方向的なイベントを誘発することができる。この特有の特徴は、発生中の神経系の多くの領域において形態的に組織される神経結合を確立するのに重大な役割を果たすことが示された。最近の研究は、動脈静脈の分化、発生中の組織における細胞亜集団の区分をもたらす細胞移動、及び特定の細胞運命を決定し、細胞分化及び細胞パターン形成をもたらし得る適切な胚環境への細胞運動を含む種々様々な発生プロセスにおけるEph-エフリン相互作用の関与をさらに明らかにした(参考文献1において概説される)。そのような生理的役割に加えて、最近の研究は、ヒト悪性腫瘍におけるEph/エフリン遺伝子のうちのいくつかの調節解除を明らかにした。これらは、黒色腫におけるエフリン-A1又は-B2のアップレギュレーション(2,3)、胃癌(4)及び乳癌(5)におけるEphB2のアップレギュレーション、前立腺癌(6)、乳癌(7)、及び食道癌(8)におけるEphA2のアップレギュレーションを含み、これらのうちのいくつかは、腫瘍浸潤又は腫瘍転移と関連すること、そのため、予後不良と関連することが示された。
【００３９】
逆に、EphB2の突然変異性の不活性化が前立腺(9)及び結腸癌(10)において検出され、関連する腫瘍におけるこのEph受容体の腫瘍抑制機能を示唆する。固形腫瘍とは対照的に、血液悪性腫瘍の発症におけるEph/エフリン経路の役割についてそれほど知られていない。
【００４０】
EphA7は、胎児骨髄プロB細胞及びプレB細胞において発現されるが、それは、全系列の成人B系列細胞において発現停止している(13)。今まで、ALL1関連白血病において、EphA受容体及びリガンドの発現の間に相関性はなかった。
【００４１】
本明細書における発明者は、EphA7アップレギュレーションにErkリン酸化が伴うことをすでに実証している。Erkリン酸化遮断薬を用いる細胞の治療に続く、t(4;11)染色体転座を持つ白血病細胞に特異的なアポトーシス細胞死も実証している。
【００４２】
広範囲の側面において、本明細書における発明者は、All1/Af4及びAll1/Af9の融合タンパク質を産生する細胞におけるEphA受容体の発現を調査し、両方のタンパク質がEphA7転写を誘発することを発見した。
【００４３】
クロマチン免疫沈降分析は、融合タンパク質がEphA7プロモーターを占有することを実証し、EphA7が、All1融合タンパク質の直接の標的であることを示す。それらの結果と一致して、All1/Af4依存性のEphA7発現が、t(4;11)を有するプロB細胞系において実証された。
【００４４】
さらに、t(4;11)白血病細胞における、直接的なEphA7ノックダウン又はAll1/Af4のノックダウン媒介性のEphA7抑制は、Erk1/2リン酸化の減弱をもたらした。
【００４５】
さらに、Erkリン酸化の阻害剤を用いる、t(4;11)を持つ白血病細胞の治療は、アポトーシス細胞死を誘発した。
【００４６】
これらの結果は、All1融合タンパク質が、直接、EphA7発現をアップレギュレートすることを示し、これは、明らかに、Erkリン酸化をもたらす。後者の修飾は、悪性の表現型の維持に寄与する可能性が高い。
【実施例】
【００４７】
組換えAll1/Af4融合タンパク質又は組換えAll1/Af9融合タンパク質を産生するK562細胞のスクリーニングは、EphA7の転写のアップレギュレーションを明らかにした。この発見と一致して、t(4;11)染色体転座を持つSEMK2細胞におけるAll1/Af4のsiRNA媒介性の抑制は、EphA7のダウンレギュレーションをもたらした。クロマチン免疫沈降分析は、タグ付きAll1融合タンパク質がEphA7プロモーターを占有することを実証し、EphA7が、All1融合タンパク質の直接の標的であることを示す。
【００４８】
結果
All1融合タンパク質は、EphA7受容体発現を誘発する。
【００４９】
K562細胞においてAll1/Af4及びAll1/Af9を異所的に発現するように形質移入戦略を適用することによって(図1A、下、左)、形質移入体における、八つのEphA受容体及び五つのエフリン-Aリガンドをコードする遺伝子の発現レベルを決定した。半定量的RT-PCR分析は、両方のAll1融合タンパク質が、すべてのEphA受容体遺伝子の転写を誘発したが、それらは、エフリン-A遺伝子の誘発に顕著な影響を及ぼさなかったことを示した(図1A)。
【００５０】
この発見を、ALL1再構成を有する白血病細胞までさらに広げるために、t(4;11)転座を持つSEMK2プロB細胞系及びRS4;11プロB細胞系並びにALL1異常を欠く380プロB細胞系及び697プレB細胞系を、同様の分析に供した(図1B)。
【００５１】
この分析から、t(4;11)白血病細胞系におけるEphA7の一貫した差次的な発現が示された。リアルタイムRT-PCR法の適用によるEphA7転写の続く定量化により、ALL1/AF4又はALL1/AF9を形質移入したK562細胞、SEMK2細胞及びRS4;11細胞における転写の量が、それぞれ0.04+0.01、0.014+0.006、1.97+0.6、及び0.68+0.09(平均+SD、フェムトグラム)であると推定できた。
【００５２】
並行して、ベクターにより形質移入したK562細胞、無傷の380細胞、及び697細胞におけるEphA7
RNAの量は、0.001fg未満であることが決定された(図1C)。
【００５３】
これらの結果は、総合的に、EphA7を、All1融合タンパク質の一貫して応答性の標的として示し、そのアップレギュレーションのさらなる分析を促した。ALL1異常を持つ白血病細胞において産生される内因性のAll1融合タンパク質がEphA7転写を調節することを確認するために、本発明者らは、低分子干渉RNA(siRNA)法を適用することによって、SEMK2細胞において産生されるAll1/Af4を抑制した。本明細書における発明者(14)及び他(15)によって生成されるSEMj
siRNAは、SEMK2細胞特異的ALL1/AF4融合結合部を標的とするように設計し、並行して、MVj siRNAは、他の細胞(MV4;11)において産生される融合結合部を標的とし、したがって、陰性対照として使用した。本発明者らは、最初に、All1/Af4タンパク質を抑制する際のSEMj siRNAの効率を決定し、All1/Af4タンパク質の約80%の低下を発見し、正常なAll1又はAf4の発現レベルに対する影響はなかった(図2A)。
【００５４】
SEMj siRNAで処理したSEMK2細胞は、次いで、半定量的RT-PCR分析に供して、EphA7及びHoxA9の発現レベルを決定した。HoxA9は、All1融合タンパク質の知られている標的であり(16)、したがって、All1融合タンパク質の消失の影響を確認するための陽性対照として使用した。この分析は、SEMK2細胞におけるAll1/Af4の抑制が、EphA7及びHoxA9の発現を減弱することを実証し、EphA7のAll1融合タンパク質媒介性の転写調節についての見解を支持した(図2B)。
【００５５】
All1融合タンパク質は、EphA7ゲノム遺伝子座に結合する。
【００５６】
クロマチン免疫沈降(ChIP)法を適用することによって、本発明者らは、K562細胞において外因的に発現されたHAタグ付きAll1/Af4及びAll1/Af9の占有を決定した。ChIPによって分析したEphA7ゲノム領域は、転写開始部位から約0.7kb上流及び0.6kb下流に並びに3'非コード配列内に位置し、それらは、それぞれ、領域#1、#2、及び#3と称された(図3A)。
【００５７】
この分析は、領域#1及び#2への、All1/Af4キメラタンパク質及びAll1/Af9キメラタンパク質の結合を示したが、領域#3への結合は示さなかった(図3B)。
【００５８】
定量的リアルタイムPCR分析は、前の結果を支持し(図3C)、EphA7が、All1融合タンパク質の直接の標的であることを示した。
【００５９】
EphA7は、Erkリン酸化の誘発における本質的な媒介物質である。
【００６０】
EphA7が関与する(一つ又は複数の)シグナル伝達経路についてほとんど知られていない。最初に、本発明者らは、完全長EphA7構築物を形質移入したK562細胞において、いくつかのタンパク質のリン酸化状態が、共通して、RTKシグナル伝達経路と関連することを試験した。前の結果と一致して(図1A、右を参照されたい)、EphA7タンパク質は、無傷のK562細胞において観察されなかったが、EphA7構築物を形質移入した細胞において用量依存的に検出された(図4A、左)。
【００６１】
本発明者らは、Ras伝達経路の活性化に応じてリン酸化される二つのタンパク質であるc-Raf又はMek1/2のリン酸化の明らかな誘発を発見しなかった(図4A、左)。
【００６２】
対照的に、本発明者らは、過剰発現するEphA7がErkリン酸化と関連することを発見した。これは、抗Erk Abを用い、次に、p-Erkを特異的に検出する、リン酸化Erkに対する抗体を用いて、ウェスタンブロットの一連のプロービングによって決定された(図4A、左)。
【００６３】
Mek1/2は、無傷のK562細胞において高度にリン酸化されることが以前に示された(17)。そのような根本的な高度なMek1/2リン酸化は、過剰発現するEphA7によって誘発されるリン酸化の付加的な変化を不明瞭にした可能性がある。そのため、本発明者らは、KG1 AML細胞系においてEphA7を異所的に発現させた。ここで、本発明者らは、組換えEphA7の発現に続くMek1/2リン酸化の誘発を発見した(図4A、右)。
【００６４】
さらに、本発明者らは、KG1細胞におけるMek1/2リン酸化に、Erk2及びErk1のリン酸化が伴うことに注目した(図4A、右)。
【００６５】
Mekの顕著な機能は、Erkをリン酸化することであるので(18)、本発明者らの結果は、EphA7がこのカスケードの上流に位置することを示す。
【００６６】
本発明者らは、次に、EphA7のように、All1融合タンパク質がErkリン酸化を誘発するかどうかを決定した。実際に、Erkリン酸化の誘発は、ALL1/AF4構築物及びALL1/AF9構築物を形質移入したK562細胞において観察された(図4B)。
【００６７】
これらの形質移入体において、EphA7が、Erkリン酸化の本質的な媒介物質であることを検証するために、SEMK2細胞を、転写内の二つの別個の領域のEphA7 mRNAを標的とするsiRNAsを用いて処理した(図4CのsiEphA7#1及び#2)。
【００６８】
両方のsiRNAsは、約70%の効率でmRNAをダウンレギュレートすることが示された(図4C、下)。EphA7の抑制は、Erk1及びErk2のリン酸化の強力な低下をもたらしたが、全Erkの量に対する影響はなかった(図4C、上)。
【００６９】
これは、EphA7が、All1融合物を発現する細胞におけるErk1/2リン酸化の本質的な媒介物質であることを暗示した。さらに、本発明者らは、SEMK2細胞におけるAll1/Af4ノックダウンが、Erk1/2のリン酸化の低下を同様に引き起こすことを発見した(図4D)。
【００７０】
ERK2リン酸化の阻害剤である5-ヨードツベルシジンは、t(4;11)異常を有する白血病細胞系の細胞死を誘発する。
【００７１】
本発明者らは、Erkリン酸化の阻害剤である5-ヨードツベルシジン(5-ITU)(19)の、細胞増殖に対する影響を試験した。5-ITUの生化学的影響を確認するために、t(4;11)を有し、リン酸化Erk1/2を産生するSEMK2細胞(図4C及びDの「-」及び「si対照」のレーンを参照されたい)をこの化合物で処理し、Erkリン酸化状態をウェスタンブロット分析によって決定した(図5、上、右)。
【００７２】
結果は、5-ITUによるErkリン酸化の阻害を示した。MTTアッセイの適用により、t(4;11)を有する、多くのSEMK2細胞及びRS4;11細胞の低下が示されたが、380対照細胞及び697対照細胞の数の減少はなかった(図5、左)。本発明者らはまた、Erk1/2不活性化を引き起こした(図4Dを参照されたい)、SEMK2細胞におけるAll1/Af4ノックダウンが、対照siRNAを用いて処理した細胞の数(H.Nakanishi、非公開結果)と比較して、細胞数の約25%の低下をもたらしたことを発見した。細胞数の低下の原因を決定するために、5-ITU処理細胞を、アポトーシス細胞死を決定するアッセイ(カスパーゼ3活性アッセイ及びFACS分析)に供した。カスパーゼ3活性の増加は、5-ITU感受性白血病細胞(図5BのSEMK2及びRS4;11)において24時間で実証された。並行して、これらの細胞のうちの高い割合がサブG1期に分布した(図5C)。これらの結果は、Erkリン酸化に対する、All1/Af4融合タンパク質を産生する白血病細胞の依存性を実証し、Erkリン酸化がアポトーシス細胞死を予防していることを実証した。
【００７３】
考察
本研究において、本発明者らは、白血病誘発性All1融合タンパク質All1/Af4及びAll1/Af9のK562細胞における異所的発現が、短い潜伏期間の後に(形質移入の16時間後)、いくつかのEphA RTKの転写を誘発したことを示した。意義深いことに、HoxA9を誘発するためのそのようなアプローチの適用は、うまくいかなかった。したがって、本発明者らは、All1/Af4又はAll1/Af9の異所的発現がHoxA9発現を誘発しなかったこと及びHDAC阻害剤トリコスタチンAを用いる形質移入体のさらなる処理が必要とされたこと(T.Nakamura、非公開データ)を発見した。そのため、転写調節の(一つ又は複数の)付加的な階層が、All1融合タンパク質によるHoxA9の誘発に関与するように思われる。本発明者らは、ALL1関連急性白血病の遺伝子発現プロファイリングに関する従来の研究(20,21)においてEphA7の調節解除が言及されなかったことに注目する。
【００７４】
Eph受容体及びエフリンのシグナル伝達に関する最近の検討(参考文献1)は、単一のEph受容体による、いくつかの異なるシグナル伝達経路の活性化又は阻害の例を含む、多種多様の経路の関与を示した。現在、しかしながら、EphA7 RTKに関与するシグナル伝達経路は決定されていない。本研究において、本発明者らは、二つの外因性All1融合タンパク質又はEphA7のどちらかを発現するK562細胞における、c-Raf、Mek1/2、及びErkを含むMAPK/Erk経路の主な構成成分のリン酸化状態を試験した。これらの三つのタンパク質は、Erkリン酸化を誘発した。EGFP構築物によって誘発されたリン酸化の程度は、All1融合タンパク質によって誘発されたものの1/5未満であるが、本発明者らはまた、EGFP構築物を用いる対照形質移入におけるErkリン酸化に注目した(図4Bを参照されたい)。
【００７５】
さらに、SEMK2細胞における、All1/Af4又はEphA7のいずれかに向けられるsiRNA媒介性の抑制は、Erkリン酸化の著しい低下をもたらした(図4C及び4Dを参照されたい)。これらの結果は、EphA7が、K562形質移入体及びSEMK2細胞におけるErkリン酸化を実際に媒介することを示す。EphA7によるc-Raf及びMek1/2リン酸化の誘発はK562細胞において観察されなかった(図4Aを参照されたい)。しかしながら、KG1細胞を用いるさらなる研究は、EphA7媒介性のMek1/2リン酸化にErk1/2リン酸化の誘発が伴ったことを示した。そのため、おそらく、EphA7が、Mek1/2を活性化して、Erkリン酸化をもたらすのであろう。しかしながら、本発明者らは、K562においてEphA7によって媒介されるErkリン酸化が、古典的MAPK/Erkと異なる経路によって実行されるという可能性を否定することができない。この問題に関して、二つの研究は、MEK非依存的経路の存在を示唆する(22、23)。
【００７６】
リン酸化EphA7の特異的検出のための抗体がなかったので、本発明者らは、異所性All1融合タンパク質によって誘発されたEphA7又はK562における組換えEphA7及びSEMK2細胞における内因性EphA7が、活性リン酸化形態で存在するかどうかを決定することができなかった。in
vitroエフリン-Aリガンド-受容体結合アッセイに関する研究は、EphA7が、エフリン-A3及び-A5のリガンドに対して高度な親和性を示すことを以前に示した(24)。
【００７７】
本研究において、本発明者らは、対照空ベクター又はAll1融合構築物のいずれかを形質移入したK562細胞における安定したレベルのエフリン-A3発現を発見した(図1を参照されたい)。
【００７８】
そのため、おそらく、K562細胞において発現されるEphA7は、同じ細胞において産生されるエフリン-A3リガンドと相互作用し、Eph/エフリン経路の活性化に影響を与えているのであろう。さらに、K562細胞におけるEphA7の過剰発現によって引き起こされるErkリン酸化及びSEMK2細胞におけるEphA7の抑制によって引き起こされるErk1/2リン酸化の低下は、どちらかの環境におけるEphA7タンパク質が活性であることを示唆する。
【００７９】
EphA7を含むEph受容体の発現は、しっかりと調節されている。ヒト造血細胞におけるEphA7/Hek11発現を決定するための以前の研究は、胎児骨髄プロB細胞及びプレB細胞における遺伝子の発現の調節を示したが、同じ分化段階の成人骨髄細胞においては示さなかった(13)。これらの結果と一致して、本発明者らはまた、380プロB細胞系及び697プレB細胞系並びに無傷のK562細胞におけるEphA7発現レベルが、リアルタイムRT-PCR法によってアッセイされたように、検出限界未満(0.001fg>)であったことを発見した。プロB細胞系SEMK2及びRS4;11におけるEphA7の検出は、All1/Af4が、プロB細胞におけるEphA7発現をアップレギュレートすることをさらに立証するであろう。
【００８０】
本発明者らは、5-ITUが、All1/Af4融合タンパク質を産生する白血病細胞の増殖を、アポトーシスを誘発することによって抑制することを発見した。5-ITUは、初め、アデノシンキナーゼ(Ki=30nM)、カゼインキナーゼ1及び2などのようなSer/Thr特異的キナーゼ、並びにインスリン受容体キナーゼ断片の強力な阻害剤として発見された。ERK2リン酸化の阻害のためのKiは、525nMであることが推定された(19)。そのため、1μM 5-ITUを用いる細胞の処理は、Erkの不活性化を引き起こしただけではなく、前述のキナーゼに影響を与えた可能性がある。これとは関係なく、t(4;11)を有する二つの細胞系に対するアポトーシスの影響の違いは明らかであった。
【００８１】
材料及び方法
K562細胞及びKG1細胞における組換えタンパク質発現、RNA干渉、ウェスタンブロット分析、並びにMTTアッセイ、カスパーゼ3活性アッセイ、及びFACS分析を含む方法は、オンラインサポート情報において入手可能である。
【００８２】
細胞系
t(4;11)異常を有するヒト赤白血病細胞系K562、AML細胞系KG1、及びプロB ALL細胞系RS4;11は、ATCCから得た。SEMK2系は、Dr.Johann Greilによって提供された。本研究のために選択した他のALL細胞系(380、697)は、本発明者らの研究所に保存している。細胞系はすべて、10%ウシ胎仔血清を補充したRPMI-1640培地において増殖させた。
【００８３】
半定量的及びリアルタイムRT-PCR分析
全RNAは、メーカーの指示に従って、RNeasyスピンカラムキットを使用することによって、形質移入の16時間後に形質移入体から単離した(Qiagen、Valencia、CA)。5μgの全RNAを、SuperScript(商標)III First-Strand Synthesis Systemを使用することによって、cDNA合成に供した(Invitrogen、Carlsbad、CA)。反応の終わりに、40μLのTE(10mM Tris、1mM EDTA、pH7.6)を追加し、1μLの反応液(1/60容量)をPCRのための鋳型として使用した。半定量的比較を可能にした以下のサイクル数をPCRに適用した:EphA1、2、4、7、8及びエフリン-A1、2、3、4、5については35サイクル;EphA3、5、6については40サイクル;GAPDHについては25サイクル;HoxA9については32サイクル。
【００８４】
EphA7転写は、cDNAの増幅のためのQuantiTect SYBR Green RT-PCRキット(QIAGEN)(60μL反応液のうちの1μL cDNA、これは、0.083μg RNAに相当する)及びPCR産物の検出のためのiCyclerリアルタイムPCR検出システム(BioRad)を使用することによって定量した。量が知られているEphA7 cDNA(100pgから始めて10倍の段階希釈)を使用することによって決定したサイクル閾値(Ct)の値を標準曲線を作製するために使用した。試験したcDNAのCt値は、標準曲線に従って重量に変換した。
【００８５】
クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ
ChIPアッセイは、Upstate
Biotechnology(Lake Placid、NY)のChIPアッセイキットを使用することによって行った。ALL1融合構築物を用いる形質移入の16時間後に、5×106細胞(K562形質移入体)は、架橋し、PBSを用いて洗浄し、1mlのSDS溶解緩衝液中に再懸濁し、超音波処理して、約200〜1000bpのDNA断片を生成した。1/10容量のこの調製物、つまり、25μg DNAを含有する0.1mL分割量を、ChIPごとに使用した。使用した抗体は、Santa Cruz Biotechから購入した抗HA mAbクローンF-7及び正常マウスIgGとした。免疫沈降クロマチンは、脱架橋し、除タンパクし、50μLのTE、pH8.0中に再懸濁し、この調製物の1μL分割量をPCRのための鋳型として使用した。インプット量は、全インプットクロマチンの0.05%を使用するPCR反応液を示し、これは、0.0125μg DNAに相当する。ChIPアッセイにおいて使用したEphA7プライマー配列は次のとおりである。
【００８６】
領域#1 5'-ATGCAGCGAAATGGAAAACT-3'(フォワード) [配列番号4]及び5'-AAAAGGGAGTGGGAAAGGAA-3'(リバース)[配列番号1]。
【００８７】
領域#2 5'-TAGTACCTCAGGCGGGTCAC-3'(フォワード) [配列番号5]及び5'-TTCCGAGCTCATCGAAGTCT-3'(リバース)[配列番号2]。
【００８８】
領域#3 5'-TTGTCGTTGGACGTTCACAT-3'(フォワード) [配列番号6]及び5'-CAATAGCGCCTCATCTGACA-3'(リバース)[配列番号3]。
【００８９】
ChIPにより濃縮したDNAは、「半定量的及びリアルタイムRT-PCR分析」において本質的に記載されるように、リアルタイムPCR分析に同様に供した。結果は、以下の式に従ってインプット量の%として計算した:100/ChIPにより濃縮したDNAの2Ct-インプットDNAのCt(%)。
【００９０】
使用の例
一態様において、本発明は、癌を有する対象の生存を予測する方法を提供する。予測方法は、癌細胞中の複数のバイオマーカーの差次的発現に基づく。いくつかのバイオマーカーが、短期の癌生存者において過剰発現する傾向があり、一方他のバイオマーカーは、長期の癌生存者において過剰発現する傾向があることが発見された。癌を有する対象由来の細胞サンプルにおけるこれらのバイオマーカーの発現の特有のパターンは、その対象に関する相対的生存時間及び最終的に予後の予測に使用できる。
【００９１】
癌を有する対象の生存の一予測方法
本発明の一態様は、癌を有する対象の生存を予測する方法を提供する。この方法は、癌を有する対象由来の細胞サンプルにおける複数のバイオマーカーの差次的発現を決定するステップを含む。癌のバイオマーカー発現サインは、その癌からの生存を予測する危険性スコアを導くために使用できる。このスコアは、対象が長期(即ち、5年より長く)生存できるような低い危険性を示すことができ、又は対象が長期生存できないような(即ち2年未満)高い危険性を示すことができる。
【００９２】
生存関連バイオマーカー
いくつかのバイオマーカーは長期生存者において過剰発現し、いくつかのバイオマーカーは短期生存者において過剰発現する。バイオマーカーは、細胞接着、細胞の運動性又は炎症反応及び免疫応答に作用することによって、癌の転移において役割を果たすことができる。バイオマーカーは、さらにアポトーシスに関与することができる。バイオマーカーは、輸送機序において役目を果たすことができる。バイオマーカーは、さらに他の型の癌における生存にも関連し得る。
【００９３】
複数のバイオマーカー発現の測定
本発明は、癌を有する対象由来の細胞サンプル中の、複数の生存関連バイオマーカーの差次的発現を測定するステップを含む。それぞれの癌における発現の差次的パターン、即ち遺伝子発現サインは、その後、癌の生存を予測する危険性スコアを作成するために使用できる。バイオマーカーの発現レベルは、癌を有する他の対象と比較して、対象において上昇又は低下し得る。バイオマーカーの発現は、長期生存者において、短期生存者より高い可能性がある。又は、バイオマーカーの発現は、短期生存者において、長期生存者より高い可能性がある。
【００９４】
複数のバイオマーカーの差次的発現は、当分野において周知の様々な技術によって測定できる。バイオマーカーのメッセンジャーRNA(mRNA)のレベルの定量化は、バイオマーカーの発現を測定するために使用できる。又は、バイオマーカーのタンパク質産物レベルの定量化は、バイオマーカー発現の測定であり得る。以下に述べる方法に関するさらなる情報は、Ausubelら(2003年)Current
Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、NY又はSambrookら、(1989年)Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NYに見出すことができる。当業者は、どのパラメーターを操作し、mRNA又は対象となるタンパク質の検出を最適化し得るかを知っているであろう。
【００９５】
核酸マイクロアレイを使用して、複数のバイオマーカーの差次的発現を定量化できる。マイクロアレイ分析を、Affymetrix GeneChip(登録商標)技術(Santa Clara、CA)又はlncyte(Fremont、CA)のMicroarray Systemなどを使用することによって、製造業者のプロトコルに従って、市販の装置を使用して実施できる。通常、一本鎖核酸(例えば、cDNA又はオリゴヌクレオチド)を、マイクロチップ基板上に播種又はアレイする。アレイした配列をその後、対象となる細胞由来の、特異的核酸プローブとハイブリッド形成させる。蛍光標識cDNAプローブは、対象となる細胞から抽出したRNAを逆転写することによって、蛍光標識デオキシヌクレオチドを組み込むことを介して作製できる。又は、RNAをin vitroで転写することによって増幅し、ビオチンなどのマーカーで標識できる。標識プローブをその後、非常にストリンジェントな条件下でマイクロチップ上に固定された核酸とハイブリッド形成させる。厳密に洗浄し、非特異的結合プローブを除去した後、チップを共焦点レーザー顕微鏡検査によって、又はCCDカメラなどの他の検出方法によってスキャンする。ハイブリッド形成ファイル中の生の蛍光強度データを、通常ロバストマルチチップアベレージ(robust multichip average)(RMA)のアルゴリズムを用いて前処理し、発現値を得る。
【００９６】
定量的リアルタイムPCR(QRT-PCR)もまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用できる。QRT-PCRにおいて、RNA鋳型は、一般的にcDNAに逆転写され、その後PCR反応を介して増幅される。PCR産物の量は、リアルタイムでサイクルごとに付け足され、mRNAの開始濃度の測定を可能にする。PCR産物の量を測定するために、反応を、SYBRGreenなどの、二本鎖DNAに結合する蛍光色素の存在下で実施できる。反応は、増幅されるDNAに特異的な蛍光レポータープローブを用いてもまた実施できる。蛍光レポータープローブの非限定的な例は、TagMan(登録商標)プローブ(Applied
Biosystems、Foster City、CA)である。蛍光レポータープローブは、消光剤をPCR伸長サイクルの間に除去した時に、蛍光を発する。Muliplex QRT-PCRは、それぞれが様々な蛍光色素分子を含む、複数の遺伝子特異的レポータープローブを使用することによって実施できる。蛍光値を、サイクルごとに記録し、増幅反応のその時点での増幅産物の量を表す。エラーを最小にし、サンプルごとの任意の変動を減らすために、QRT-PCRは、通常参照基準を使用して実施する。望ましい参照基準は、様々な組織において一定レベルで表され、実験処理によって影響を受けない。適切な参照基準は、限定するものではないが、ハウスキーピング遺伝子のグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)、及びβ-アクチンのmRNAを含む。もともとのサンプル中のmRNAレベル又は各バイオマーカーの発現の倍率変化は、当分野において周知の計算を使用して決定できる。
【００９７】
免疫組織染色もまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用できる。この方法は、タンパク質と特異的抗体との相互作用によって、組織切片の細胞においてタンパク質の局在化を可能にする。このために、組織をホルムアルデヒド又は他の適切な固定剤で固定し、ワックス又は樹脂中に包埋し、ミクロトームを使用して薄片(約0.1mmから数mmの厚み)に切断できる。又は、組織を凍結させ、クリオスタットを使用して薄片に切断できる。組織切片は、固体表面に並べ、固定できる(即ち、組織マイクロアレイ)。組織切片を、対象となる抗原に対する一次抗体と共にインキュベートし、その後、結合していない抗体を取り除くために洗浄する。一次抗体は検出系に結合でき、又は一次抗体は、検出系に結合する二次抗体を用いて検出できる。検出系は蛍光色素分子であってもよく、或いはホースラッディシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素であってもよく、これらは、基質を、非色分析の、蛍光性の又は化学発光性の産物に変換できる。染色した組織切片は、一般的に顕微鏡下でスキャンされる。癌を有する対象由来の組織サンプルは異種であり得、即ち、いくつかの細胞が正常細胞であり得、他の細胞が癌細胞であり得るので、組織中で陽性に染色された細胞のパーセントを決定できる。この測定を使用して、染色強度の定量化に加えて、バイオマーカーの発現値を得ることができる。
【００９８】
酵素免疫測定法又はELISAもまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用できる。ELISAアッセイは多くの変形が存在する。すべては、固体表面、一般的にはマイクロタイタープレート上への抗原又は抗体の固定化に基づく。元のELISA法は、対象となるバイオマーカータンパク質を含有するサンプルを調製するステップ、マイクロタイタープレートのウェルをサンプルでコーティングするステップ、各ウェルを、特異的抗原を認識する一次抗体と共にインキュベートするステップ、結合していない抗体を洗い流すステップ及びその後、抗体-抗原複合体を検出するステップを含む。抗体-抗体複合体は、直接検出できる。このために、一次抗体を、検出可能な産物を産生する酵素などの検出系に接合する。抗体-抗体複合体は間接的に検出できる。このために、一次抗体は、上記のような検出系に接合する二次抗体によって検出する。マイクロタイタープレートを、その後スキャンし生の強度データを、当分野において周知の手段を使用して発現値に変換できる。
【００９９】
抗体のマイクロアレイもまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用できる。このために、複数の抗体を並べ、マイクロアレイ又はバイオチップの表面に共有結合する。対象となるバイオマーカーのタンパク質を含有するタンパク質抽出物を、一般的に蛍光色素で標識する。標識バイオマーカータンパク質を、抗体マイクロアレイと共にインキュベートする。洗浄し、結合していないタンパク質を取り除いた後で、マイクロアレイをスキャンする。生の蛍光強度データを、当分野において周知の手段を使用して発現値に変換できる。
【０１００】
Luminexの多重微小球もまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用できる。これらの微小ポリスチレンビーズは、各ビーズが(100までの)特有のスペクトルサインを有するように、蛍光色素で内部に色分けされる。同じサインを有するビーズを、対象となる標的に結合すると思われる、特異的オリゴヌクレオチド又は特異的抗体(即ち、それぞれバイオマーカーmRNA又はタンパク質)でタグ化する。順に、この標的は、蛍光レポーターを用いてもタグ化される。したがって、2種の色供給源があり、一種は、ビーズ由来であり、他は標的上のレポーター分子由来である。ビーズをその後、標的を含有するサンプルと共にインキュベートし、そのうち100までを一つのウェルにおいて検出できる。ビーズの小さなサイズ/表面積及び標的に三次元で晒されていることは、結合反応の間にほぼ溶液相の反応速度論を可能にする。捕捉された標的は、レーザーが、各ビーズを特定する内部色素を刺激するフローサイトメトリーに基づくハイテク流体工学によって検出され、任意のレポーター色素が、アッセイの間にさらに捕捉される。獲得ファイルからのデータは、当分野において周知の手段を使用して発現値に変換できる。
【０１０１】
in situのハイブリッド形成もまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用できる。この方法は、組織切片の細胞において対象となるmRNAの局在化を可能にする。この方法のために、組織を凍結又は固定及び包埋し、その後薄片に切断でき、これらを固体表面にアレイ及び固定する。組織切片を、対象となるmRNAとハイブリッドを形成する標識アンチセンスプローブと共にインキュベートする。ハイブリッド形成及び洗浄のステップは、一般的に非常にストリンジェントな条件下で実施する。プローブは、標識ハイブリッドを検出し、顕微鏡下で視覚化できるような、他のタンパク質又は抗体によって検出できる、蛍光色素分子又は低分子のタグ(ビオチン又はジゴキシゲニンなど)を用いて標識できる。複数のmRNAは同時に検出でき、各アンチセンスプローブは識別可能な標識を提供している。ハイブリッド組織アレイは、一般的には顕微鏡下でスキャンする。癌を有する対象由来の組織サンプルは異種であり得る、即ち、いくつかの細胞が正常細胞であり得、他の細胞が癌細胞であり得るので、組織中で陽性に染色された細胞のパーセントを決定できる。この測定を使用して、染色の強度の定量化に加えて、各バイオマーカーの発現値を作成することができる。
【０１０２】
発現が、癌を有する対象由来の細胞サンプルにおいて測定されるバイオマーカーの数は変動する場合がある。生存の予測スコアはバイオマーカーの差次的発現に基づくので、より多くのバイオマーカーの発現が測定された場合、より高い精度が達成されるはずである。
【０１０３】
癌を有する対象由来の細胞サンプルの取得
複数のバイオマーカーの発現が、癌を有する対象由来の細胞サンプルにおいて測定されるであろう。癌の型及び分類は、変動してよく、また変動するであろう。癌は、早期癌、即ちステージI又はステージIIであってもよく、或いは末期癌、即ちステージIII又はステージIVであってもよい。
【０１０４】
一般的に、細胞サンプル又は組織サンプルは、癌を有する対象から、生検又は外科的切除によって得られるであろう。生検の型は変動してもよく変動すると思われ、癌の位置及び性質に依存する。細胞、組織又は体液のサンプルは、針吸引生検によって取り出すことができる。このために、注射器に取り付けた微細針を、皮膚を介して対象の器官又は組織に挿入する。通常、針を、超音波又はコンピュータ断層撮影(CT)画像を使用して、対象となる領域に導く。組織に針が挿入されたら、細胞又は体液を、針を通して吸引し、注射器に収集できるように注射器を真空にする。細胞又は組織のサンプルはまた、切開生検又はコア生検によって取り出すことができる。このために、円錐、円柱又はほんの少しの組織を、対象となる領域から取り出す。CT画像、超音波又は内視鏡を一般的に使用し、この型の生検を導く。最後に、全癌病巣を、切除生検又は外科的切除によって取り出すことができる。
【０１０５】
細胞サンプル又は組織サンプルを、癌を有する対象から取り出したら、当分野において周知であり、Ausubelら、(2003年)Current
Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、NYなどの標準分子生物学の参考文献中に開示の技術を使用して、RNA又はタンパク質の単離のために処理できる。組織サンプルは、保存又は急速凍結でき、-80℃で後の使用のために保存できる。生検組織サンプルは、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド又は酢酸/エタノールなどの固定化剤を用いて固定できる。固定した組織サンプルは、ワックス(パラフィン)又はプラスチック樹脂中に包埋できる。包埋した組織サンプル(又は凍結組織サンプル)は、薄片に切断できる。RNA又はタンパク質は、固定化又はワックスに包埋した組織サンプルからもまた抽出できる。
【０１０６】
癌を有する対象は、一般的に哺乳動物対象であろう。哺乳動物は、霊長類、家畜動物及びコンパニオンアニマルを含み得る。非限定的な例は以下を含み、霊長類は、ヒト、類人猿、サル及びテナガザルを含むことができ、家畜動物はウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ及びブタを含むことができ、コンパニオンアニマルはイヌ、ネコ、ウサギ及びゲッ歯(マウス、ラット及びモルモットを含む)を含むことができる。例示的実施形態において、対象はヒトである。
【０１０７】
危険性スコアの作成
本発明のバイオマーカーは癌の生存に関する。複数のこれらのバイオマーカーの差次的発現パターンを、癌を有する対象の生存転帰を予測するために使用できる。特定のバイオマーカーは長期生存者において過剰発現する傾向があり、一方他のバイオマーカーは、短期生存者において過剰発現する傾向がある。対象中の複数のバイオマーカーの特有の発現パターン(即ち、発現サイン)を使用して、生存の危険性スコアを作成できる。高い危険性スコアを有する対象は、外科的切除術後短期の生存時間(<2年)を有し得る。低い危険性スコアを有する対象は、切除術後長期の生存期間(>5年)を有し得る。
【０１０８】
複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用する技術にかかわらず、各バイオマーカーの発現は、通常発現値に変換されるであろう。その後、これらの発現値を使用し、当分野において周知の統計的方法を使用して、癌を有する対象の生存の危険性スコアを計算するであろう。危険性スコアは、主成分分析を使用し計算できる。危険性スコアは、単変量Cox回帰分析を使用してもまた計算できる。好ましい実施形態において、危険性スコアは、部分Cox回帰分析を使用して計算できる。
【０１０９】
部分Cox回帰分析によって作成されたスコアは、二つの群:1)正の値を有する群、及び2)負の値を有する群に分けられる。正の値を有する危険性スコアは、短期生存時間に関連し、負の値を有する危険性スコアは長期生存時間に関連する。
【０１１０】
本方法の一実施形態において、組織サンプルは早期癌を有する対象から、外科的切除術によって取り出すことができる。組織サンプルは、RNAを後日単離できるように、RNAlater中に保存又は急速凍結できる。RNAは、複数のバイオマーカーの発現を分析するQRT-PCRのための鋳型として使用でき、発現データは、部分Cox回帰分類法を使用して、危険性スコアを導くために使用される。危険性スコアを使用して、対象が短期の癌生存者であるか又は長期の癌生存者であるかを予測できる。
【０１１１】
本方法の特に好ましい実施形態において、組織サンプルは、早期癌を有する対象から収集できる。RNAは組織から単離でき、核酸マイクロアレイ分析のための標識プローブの作製に使用できる。マイクロアレイ分析から作成した発現値は、部分的Cox回帰分類法を使用して、危険性スコアを導くために使用できる。危険性スコアを使用して、対象が短期の癌生存者であるか又は長期の癌生存者であるかを予測できる。
【０１１２】
癌を有する対象の予後を決定する方法
本発明の別の態様は、癌を有する対象の予後を決定する方法を提供する。この方法は、対象由来の細胞サンプルにおける、一つ又は複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するステップを含む。各バイオマーカーの差次的発現は発現値に変換され、この発現値を使用し、上記のような統計的方法を使用して、その対象に関するスコアを導く。正の値を有するスコアは、予後不良又は不良転帰を示し、一方、負の値を有するスコアは予後良好又は良好な転帰を示す。
【０１１３】
本方法の一実施形態において、早期癌を有する対象に関する発現サインは、核酸マイクロアレイ分析によって作成され、発現値を使用してスコアを計算する。計算したスコアを使用して、対象が、癌転帰の良好な予後又は不良な予後を有するかどうかを予測できる。
【０１１４】
癌を有する対象の治療の選択方法
本発明のさらなる態様において、癌を有する対象の有効な治療の選択方法を提供する。対象について危険性スコアを計算したら、その情報を使用して、対象に関する適切な治療過程を決定できる。正の危険性スコアを有する対象(即ち、短期生存期間又は不良な予後)は、積極的な治療計画から恩恵をうけことができる。積極的な治療計画は、適切な化学療法作用物質又は作用物質を含むことができる。積極的な治療計画は、放射線療法もさらに含むことができる。治療計画は、癌の型及びステージに依存して変動してもよく、変動するであろう。負の危険性スコアを有する対象(長期生存期間又は良好な予後)は、対象に癌の再発は起こらない可能性が高いので、さらなる治療は必要ではないと思われる。
【０１１５】
細胞を、一つ又は複数の作用物質がmicroRNAの発現又は活性を阻害する、microRNAの一つ又は複数の標的遺伝子の発現を阻害する、或いはその組合せを阻害する条件下で維持し、その結果細胞の増殖を阻害する。
【０１１６】
癌細胞の増殖を阻害するために使用できる作用物質を特定する方法もまた提供する。この方法は、一つ又は複数のmicroRNAと評価する作用物質とを接触させるステップ、一つ又は複数の標的遺伝子と評価する作用物質とを接触させるステップ、或いはそれらの組合せを接触させるステップを含む。microRNAの発現が作用物質の存在下で阻害される場合、標的遺伝子の発現が作用物質の存在下で増強される場合、或いはそれらの組合せが作用物質の存在下で起こる場合、その時は、この作用物質を使用して濾胞性甲状腺癌細胞の増殖を阻害できる。
【０１１７】
治療作用物質を特定する方法
さらに、その必要のある患者の治療に使用できる作用物質を特定する方法もまた、本明細書に提供する。この方法は、一つ又は複数のmicroRNAと評価する作用物質とを接触させるステップ、一つ又は複数のmicroRNAの一つ又は複数の標的遺伝子を接触させるステップ、或いはそれらの組合せを接触させるステップを含む。microRNAの発現が作用物質の存在下で阻害される場合、標的遺伝子の発現が作用物質の存在下で増強される場合、或いはそれらの組合せが、作用物質の存在下で起こる場合、その時は、この作用物質を使用して濾胞性甲状腺癌細胞の増殖を阻害できる。
【０１１８】
本明細書で提供する方法において評価できる作用物質は、miRNA阻害剤を含む。このような作用物質の他の例は、医薬品、薬物、化合物、イオン化合物、有機化合物、補因子、単糖類、組換え体及び合成ペプチドを含む有機リガンド、タンパク質、ペプトイド、遺伝子、核酸産物及び抗体を含む核酸配列並びにそれらの抗原結合断片含む。このような作用物質は、本明細書中の方法に従って、個別にスクリーニングでき、又は一つ又は複数の化合物が同時に試験できる。コンビナトリアル化学合成又は他の方法によって作製された、化合物の大型のコンビナトリアルライブラリー(例えば、有機化合物、組換え体又は合成ペプチド、ペプトイド、核酸)を試験できる。コンビナトリアルライブラリーから選択された化合物が特有のタグを担持する場合、クロマトグラフィー法による個々の化合物の特定が可能である。化学ライブラリー、微生物培養液及びファージディスプレイライブラリーもまた、本明細書中の方法に従って試験(スクリーニング)できる。
【０１１９】
癌を有する対象の生存又は予後を予測するキット
本発明のさらなる態様は、癌を有する対象の生存又は予後を予測するキットを提供する。キットは、一つ又は複数のバイオマーカーの差次的発現を測定する複数の作用物質、発現データを発現値に変換する手段及び生存又は予後を予測するスコア作成する発現値を分析する手段を含む。バイオマーカーの発現を測定するためのキット中の作用物質は、バイオマーカーのmRNAに相補的なポリヌクレオチドのアレイを含み得る。別の実施形態において、バイオマーカーの発現を測定するためのキット中の作用物質は、複数のPCRプローブ及び/又はQRT-PCRのためのプライマーを含み得る。
【０１２０】
本発明は、癌を検出するためのキットも対象とし、それぞれは、1)一つ又は複数のmicroRNA、2)一つ又は複数のmicroRNAの一つ又は複数の標的遺伝子、3)標的遺伝子により発現される一つ又は複数のポリペプチド、或いは4)それらの組合せを検出するための一つ又は複数の試薬を含む。例えば、キットはハイブリッド形成プローブ、制限酵素(例えば、RFLP分析用)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド及び標的遺伝子により発現されるポリペプチドに結合する抗体を含むことができる。
【０１２１】
特定の実施形態において、キットは、一つ又は複数のmicroRNAの領域に、実質的に又は完全に相補的な、少なくとも連続するヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、キット中の一つ又は複数の試薬は標識され、したがって、キットはさらに標識を検出できる作用物質を含むことができる。キットはさらに、キットの成分を使用して癌を検出するための取扱説明書を含むことができる。
【０１２２】
核酸アレイ
本発明の別の態様は、本発明のバイオマーカーのmRNAとハイブリッドを形成するポリヌクレオチドを含む核酸アレイを提供する。一般的にいえば、核酸アレイは少なくとも一つのアドレスを有する基板を含む。核酸アレイは、当分野においては一般的に周知であり、さらに核酸アレイを含む基板もまた、当分野において周知である。基板材料の非限定的な例は、ガラス及びプラスチックを含む。基板は、スライド又はチップ(即ち、四角形)のような形状であってよく、或いは基板はウェルのような形状であってもよい。
【０１２３】
本発明のアレイは、少なくとも一つのアドレスを含み、アドレスは、その上に本発明のバイオマーカーのmRNAとハイブリッドを形成できる核酸を配置している。一実施形態において、アレイは複数のアドレスを含み、各アドレスは、その上に肺癌を有する対象の生存を予測するバイオマーカーのmRNAとハイブリッドを形成できる核酸を配置している。アレイはさらに、アドレスが対照の核酸をその上に配置している、一つ又は複数のアドレスを含むことができる。対照は、内部対照(即ち、アレイ自体に対する対照)及び/又は外部対照(即ち、アレイに用いたサンプルに対する対照)であってよい。アレイは、通常約1から約10,000の間のアドレスを含む。一実施形態において、アレイは、約10から約8,000の間のアドレスを含む。別の実施形態において、アレイは500を超えないアドレスを含む。他の実施形態において、アレイは500未満のアドレスを含む。核酸アレイを使用する方法は、当分野において周知である。
【０１２４】
使用の方法
一態様において、対象由来の試験サンプル中の少なくとも一つの遺伝子産物のレベルを測定するステップと、試験サンプル中の遺伝子産物のレベルを、対照サンプル中の対応する遺伝子産物のレベルと比較するステップとを含む、対象が急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有するか又は発症する危険性があるかどうかを診断する方法を、本明細書において提供する。本明細書において使用する場合「対象」という用語は、乳癌を有する又は有する疑いがある、任意の哺乳動物であってよい。特定の実施形態において、対象は、ALLを有する、又は有する疑いがあるヒトである。
【０１２５】
少なくとも一つの遺伝子産物のレベルは、対象から得た生体サンプルの細胞において測定できる。例えば、組織サンプルは、従来の生検技術によりALLを有することが疑われる対象から取り出すことができる。別の例において、血液サンプルを対象から取り出すことができ、白血球を標準的技術によってDNA抽出物から単離できる。血液サンプル又は組織サンプルは、放射線療法、化学療法又は他の治療処置を開始する前の対象から得ることが好ましい。対応する対照の組織サンプル又は血液サンプルは、対象の病気にかかっていない組織から、正常なヒト個体又は正常な個体の集団から、或いは対象のサンプル中の大部分の細胞に対応する培養細胞から得ることができる。その後、対照の組織サンプル又は血液サンプルを、対象のサンプル由来の細胞中の所与の遺伝子から産生される遺伝子産物のレベルを、対照サンプルの細胞由来の対応する遺伝子産物レベルと比較できるように、対象由来のサンプルと共に処理する。
【０１２６】
対照サンプル中の、対応する遺伝子産物のレベルと比較した、対象から得たサンプル中の遺伝子産物のレベルの変化(即ち、増加又は減少)は、対象におけるALLの存在を示す。一実施形態において、試験サンプル中の少なくとも一つの遺伝子産物のレベルは、対照サンプル中の対応する遺伝子産物のレベルより高い(即ち、遺伝子産物の発現が「アップレギュレートされる」)。本明細書において使用する場合、対象由来の細胞サンプル又は組織サンプル中の遺伝子産物の量が、対照の細胞サンプル又は組織サンプル中の同じ遺伝子産物の量より多い場合、遺伝子産物の発現は「アップレギュレートされる」。別の実施形態において、試験サンプル中の少なくとも一つの遺伝子産物のレベルは、対照サンプル中の対応する遺伝子産物のレベルより低い(即ち、遺伝子産物の発現は「ダウンレギュレートされる」)。本明細書において使用する場合、対象由来の細胞サンプル又は組織サンプル中のその遺伝子から産生される遺伝子産物の量が、対照の細胞サンプル又は組織サンプル中の同じ遺伝子から産生される量より少ない場合、遺伝子の発現は「ダウンレギュレートされる」。対照サンプル及び正常なサンプル中の相対的遺伝子発現は、一つ又は複数のRNA発現基準に関して決定できる。基準は、例えば、ゼロ遺伝子発現レベル、基準細胞系における遺伝子発現レベル又は正常なヒト対照の集団に対してあらかじめ得た遺伝子発現の平均レベルを含み得る。
【０１２７】
サンプル中の遺伝子産物のレベルは、生体サンプル中のRNA発現レベルを検出するために適切な任意の技術を使用して測定できる。生体サンプル由来の細胞におけるRNA発現レベルを決定するための適切な技術(例えば、ノーザンブロット分析、RT-PCR、in situのハイブリッド形成)は、当業者に周知である。特定の実施形態において、少なくとも一つの遺伝子産物のレベルは、ノーザンブロット分析を使用して検出される。例えば、全細胞RNAは、核酸抽出緩衝液の存在下で均一化し、その後遠心分離器に供することによって、細胞から精製できる。核酸を沈殿させ、DNaseを用いて処理し沈殿させることによって、DNAを取り除く。その後、RNA分子を、標準的技術に従って、アガロースゲル上でゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。その後、RNAを加熱によってフィルター上に固定する。特異的RNAの検出及び定量化は、問題となるRNAに相補的な、適切に標識したDNA又はRNAプローブを使用して達成される。例えば、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual、J.Sambrookら編、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年、第7章を参照されたく、この全開示は参照により組み込まれる。
【０１２８】
所与の遺伝子産物のノーザンブロットハイブリッド形成のための適切なプローブは、所与の遺伝子産物の核酸配列から作製できる。標識DNA及びRNAプローブの調製方法並びにそれらと標的ヌクレオチド配列とのハイブリッド形成のための条件は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、J.Sambrookら編、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年、第10章及び第11章に記載され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
例えば、核酸プローブは、例えば3H、32P、33P、14C又は35Sなどの放射性核種、重金属又は標識リガンドのための特異的結合ペアのメンバーとして機能できるリガンド(例えば、ビオチン、アビジン又は抗体)、蛍光分子、化学発光分子、酵素などで標識できる。
【０１３０】
プローブは、Rigbyら、(1977年)、J.Mol Biol.113:237〜251のニックトランスレーション法又はFienbergら、(1983年)、Anal.Biochem.132:6〜13のランダムプライミング法のいずれかによって、高い特異的活性に対して標識でき、これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。後者は、一本鎖DNA由来又はRNA鋳型由来の高特異的活性の、32P標識プローブ合成のための選択法である。例えば、既存のヌクレオチドを、放射活性の高いヌクレオチドで、ニックトランスレーション法によって置き換えることによって、108cpm/マイクログラムを超える優れた特異的活性を有する、32P標識核酸プローブの調製が可能である。その後、ハイブリッド形成のオートラジオグラフィーによる検出を、ハイブリッド形成させたフィルターを写真用フィルムに感光させることによって実施できる。ハイブリッド形成させたフィルターによって感光された写真用フィルムのデンシトメトリースキャンは、遺伝子の転写レベルの正確な測定を提供する。別の研究方法を使用して、遺伝子の転写レベルを、Amersham Biosciences、Piscataway、NJから入手できるMolecular Dynamics 400-B 2D
Phosphorimagerなどのコンピュータ化された画像システムによって、定量化できる。
【０１３１】
DNA又はRNAプローブの放射性核種による標識が実用的でない場合、ランダムプライマー法を使用して、アナログ、例えば、dTTPのアナログの5-(N-(N-ビオチニル-ε-アミノカプロイル)-3-アミノアリル)デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子に組み込むことができる。ビオチニル化プローブのオリゴヌクレオチドは、蛍光色素又は呈色反応を起こす酵素と結合した、アビジン、ストレプトアビジン及び抗体(例えば、抗ビオチン抗体)などのビオチン結合タンパク質との反応によって検出できる。
【０１３２】
ノーザン及び他のRNAハイブリッド形成技術に加えて、RNA転写のレベルの決定は、in situのハイブリッド形成技術を使用して達成できる。この技術は、ノーザンブロット技術より必要な細胞が少なく、顕微鏡のカバースリップ上に全細胞を配置するステップ及び放射活性又は標識された核酸(例えば、cDNA又はRNA)プローブを含む溶液を用いて、細胞の核酸成分をプローブするステップを含む。この技術は、対象由来の組織生検サンプルの分析に特に適切である。in situのハイブリッド形成技術の実践は、米国特許第5,427,916号により詳細に記載されており、この全開示は参照により本明細書に組み込まれる。所与の遺伝子産物のin situハイブリッド形成のための適切なプローブは、核酸配列から作製できる。
【０１３３】
細胞中の遺伝子転写産物の相対数は、遺伝子転写産物を逆転写し、次いで逆転写産物をポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により増幅することによっても決定できる。遺伝子転写産物のレベルは、内部標準、例えば、同じサンプル中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子由来のmRNAのレベルとの比較において定量化できる。内部標準としての使用に適切な「ハウスキーピング」遺伝子は、例えば、ミオシン又はグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(G3PDH)を含む。定量的RT-PCR法及びそれらの変形は、当業者の範囲内である。
【０１３４】
場合によっては、サンプル中の複数の様々な遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましいことがある。他の場合には、癌と相関するすべてが周知の遺伝子の転写産物の発現レベルを決定することが望ましいことがある。数百の遺伝子に関する癌特異的発現レベルの評価は、時間がかかり、大量の全RNA(各ノーザンブロットに対して少なくとも20μg)及び放射性同位元素を必要とするオートラジオグラフィー技術を必要とする。
【０１３５】
これらの制限を克服するために、マイクロチップフォーマット(即ち、マイクロアレイ)中に、一連の遺伝子又は遺伝子産物に特異的な、一連のプローブオリゴデオキシヌクレオチドを含む、オリゴライブラリィが構築できる。このようなマイクロアレイを使用して、生体サンプル中の複数のmicroRNAの発現レベルを、RNAを逆転写して一連の標的オリゴデオキシヌクレオチドを作製し、それらをマイクロアレイ上のプローブオリゴデオキシヌクレオチドとハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成又は発現のプロファイルを作成することによって決定できる。試験サンプルのハイブリッド形成のプロファイルは、その後、どのmicroRNAがALLにおいて発現レベルが変わったかを決定するために、対照サンプルのプロファイルと比較できる。本明細書において使用する場合、「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドを指す。「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」は、(例えば、ハイブリッド形成を介して)検出される分子を指す。「特異的プローブオリゴヌクレオチド」又は「遺伝子産物に特異的なプローブオリゴヌクレオチド」は、特異的遺伝子産物とのハイブリッド形成のために、又は特異的遺伝子産物の逆転写のために選択される配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１３６】
特定のサンプルの「発現プロファイル」又は「ハイブリッド形成プロファイル」は、本質的にサンプルの状態のフィンガープリントであり、二つの状態は、任意の特定の遺伝子を同様に発現させるが、多くの遺伝子の同時評価により、細胞の状態に特有の遺伝子発現プロファイルの作成が可能である。即ち、正常細胞とALL細胞とを識別でき、ALL細胞において、様々な予後の状態(例えば、良好又は不良、長期生存の可能性)を決定できる。様々な状態のALL細胞の発現プロファイルを比較することによって、これらの各状態において、どの遺伝子が重要(遺伝子のアップレギュレート及びダウンレギュレートの両方を含む)であるかに関する情報が得られる。ALL細胞又は正常細胞において差次的に発現する配列の同定、並びに様々な予後転帰をもたらす差次的発現が、多くの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の治療計画を評価できる(例えば、化学療法薬が特定の患者において長期予後の改善ために作用するかどうかを決定する)。同様に、周知の発現プロファイルを有する患者サンプルを比較することによって、診断を実行できる又は確認できる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル(又は個々の遺伝子)は、ALLの発現プロファイルを抑制する、又は不良な予後プロファイルをよりよい予後プロファイルに変換する作用物質候補のスクリーニングを可能にする。
【０１３７】
したがって、本発明は、一連の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供するために、対象から得た試験サンプル由来のRNAを逆転写するステップと、試験サンプルに関するハイブリッド形成プロファイルを提供するために、標的オリゴデオキシヌクレオチドと、miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイとをハイブリッド形成させるステップと、試験サンプルのハイブリッド形成プロファイルと、対照サンプルから作製したハイブリッド形成プロファイルとを比較するステップとを含み、少なくとも一つのmiRNAのシグナルの変化が、対象がALLを有するか又は発症する危険性があるかのどちらかであることを示す、対象がALLを有するか又は発症する危険性があるかどうかを診断する方法を提供する。
【０１３８】
本発明はまた、対象由来のALL試験サンプル中の少なくとも一つの遺伝子産物のレベルを測定するステップと、ALL試験サンプル中の少なくとも一つの遺伝子産物のレベルを、対照サンプル中の対応する遺伝子産物のレベルと比較するステップとを含む、一つ又は複数の予後マーカーと関連するALLを診断する方法も提供する。対照サンプルと比較した、試験サンプル中の少なくとも一つの遺伝子産物のシグナルの変化(例えば、増加、減少)は、一つ又は複数の予後マーカーと関連するALLを有するか又は発症する危険性があるかのどちらかの対象を表す。
【０１３９】
ALLは、逆の(即ち、負の)予後と関連するマーカー又はよい(即ち、正の)予後と関連するマーカーを含む、一つ又は複数の予後マーカー又は特徴と関連し得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法を使用して診断されたALLは一つ又は複数の逆の予後の特徴と関連する。
【０１４０】
これらの予後マーカーのそれぞれと関連するALL細胞において、発現が変化する特定のmicroRNAを本明細書に記載する。一実施形態において、少なくとも一つの遺伝子産物のレベルを、一連の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供するために、対象から得た試験サンプル由来のRNAを逆転写し、試験サンプルに関するハイブリッド形成プロファイルを提供するために、標的オリゴデオキシヌクレオチドと、miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイとをハイブリッド形成させ、及び試験サンプルのハイブリッド形成プロファイルと、対照サンプルから作製したハイブリッド形成プロファイルとを比較することにより測定する。
【０１４１】
いかなる一理論にも縛られることを望まないが、細胞中の一つ又は複数の遺伝子産物のレベルの変化は、これらの遺伝子産物に対する一つ又は複数の意図する標的の調節解除をもたらすことができ、これによりALLの形成がもたらされ得ることが考えられる。したがって、遺伝子産物のレベルを変化させることにより(例えば、ALL細胞においてアップレギュレートされる遺伝子産物のレベルを減少させることによって、癌細胞においてダウンレギュレートされる遺伝子産物のレベルを増加させることによって)ALLの治療を成功させることができる。ALL細胞において調節解除される遺伝子産物の、推定遺伝子標的の例を本明細書に記載する。
【０１４２】
したがって、本発明は、対象の癌細胞において少なくとも一つの遺伝子産物を調節解除(例えば、ダウンレギュレート、アップレギュレート)させる、対象においてALLを治療する方法を包含する。少なくとも一つの単離遺伝子産物が、ALL細胞においてダウンレギュレートされる場合、この方法は、対象において癌細胞の増殖を阻害するような、少なくとも一つの単離遺伝子産物の有効量を投与するステップを含む。少なくとも一つの単離遺伝子産物が、癌細胞においてアップレギュレートされる場合、この方法は、ALL細胞の増殖が阻害されるような、少なくとも一つの遺伝子の発現を阻害するための少なくとも一つの化合物、本明細書においては遺伝子発現阻害化合物と称する、の有効量を対象に投与するステップを含む。
【０１４３】
「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」及び「治療(treatment)」という用語は、本明細書において使用する場合、疾患症状の発症の予防又は遅延及び/又は疾患症状又は病態の重症度又は頻度の減少を含む、疾患又は病態、例えばALLに関連する症状の改善を指す。「対象」及び「個体」という用語は、限定するものではないが、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス或いは他のウシ科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、げっ歯類又はネズミ科を含む哺乳動物などの動物を含むことが、本明細書において定義される。好ましい実施形態において、この動物はヒトである。
【０１４４】
本明細書において使用する場合、単離遺伝子産物の「有効量」は、ALLを患う対象において、癌細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、対象のサイズ、体重;疾患の侵食範囲;対象の年齢、健康、性別;投与経路;及び投与が局所的又は全身かどうかなどの因子を考慮に入れることによって、所与の対象に投与する遺伝子産物の有効量を容易に決定できる。
【０１４５】
例えば、単離遺伝子産物の有効量は、治療する対象のおよその又は推定の体重に基づくことができる。好ましくは、このような有効量は、本明細書に記載のように非経口又は経腸的に投与される。例えば、対象に投与する単離遺伝子産物の有効量は、約5〜3000マイクログラム/kg体重、約700〜1000マイクログラム/kg体重又は約1000マイクログラム/kg体重を超える範囲であり得る。
【０１４６】
当業者は、所与の対象への単離遺伝子産物の投与に関する適切な投薬計画もまた、容易に決定できる。例えば、遺伝子産物を、対象に1回投与してもよい(例えば、単回の注射又は沈着)。又は、遺伝子産物を、対象に約3から約28日、より特別には、約7日から約10日の期間、1日に1回又は2回投与してもよい。特定の投薬計画において、遺伝子産物は、7日間、1日に1回投与される。投薬計画が、複数回投与を含む場合、対象に投与する遺伝子産物の有効量は、全投薬計画にわたって投与する遺伝子産物の全量を含み得ると考えることができる。
【０１４７】
本明細書において使用する場合、「単離」遺伝子産物は、合成或いはヒトの介入を経て天然な状態から改変又は取り出したものである。例えば、合成遺伝子産物或いはその天然状態の共存材料から部分的又は完全に分離された遺伝子産物が、「単離」であると考えられる。単離遺伝子産物は、実質的に精製された形態で存在してよく、又は遺伝子産物が送達された細胞中に存在してもよい。したがって、細胞に意図的に送達された遺伝子産物又は細胞中で意図的に発現された遺伝子産物は、「単離」遺伝子産物であると考えられる。前駆体分子から細胞内で産生された遺伝子産物もまた「単離」分子であると考えられる。
【０１４８】
単離遺伝子産物は、多くの標準的技術を使用して得ることができる。例えば、遺伝子産物は、当分野において公知の方法を使用して、化学合成又は組換え技術により産生できる。一実施形態において、遺伝子産物は、適切に保護されたリボヌクレオシドアミド亜リン酸及び従来のDNA/RNA合成装置を使用して化学合成される。合成RNA分子又は合成試薬の市販業者は、例えば、Proligo(Hamburg、Germany)、Dharmacon Research(Lafayette、CO、U.S.A.)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部、Rockford、IL、U.S.A.)、Glen Research(Sterling、VA、U.S.A.)、ChemGenes(Ashland、MA、U.S.A.)及びCruachem(Glasgow、UK)を含む。
【０１４９】
又は、遺伝子産物は、組換えの環状又は直鎖DNAプラスミドから、任意の適切なプロモーターを使用して発現させることができる。プラスミドからRNAを発現させる適切なプロモーターは、例えば、U6又はHl RNA pol IIIプロモーター配列又はサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、癌細胞において遺伝子産物の発現を誘導できる又は制御できるプロモーターもまた含むことができる。
【０１５０】
組換えプラスミドから発現される遺伝子産物は、標準的技術によって培養細胞の発現系から単離できる。組換えプラスミドから発現される遺伝子産物は、癌細胞に送達することもでき、癌細胞において直接発現させることもできる。遺伝子産物を癌細胞に送達するための組換えプラスミドの使用は、以下に、より詳細に述べる。
【０１５１】
遺伝子産物は、別個の組換えプラスミドから発現させることができ、又はそれらは同じ組換えプラスミドから発現させることができる。一実施形態において、遺伝子産物は、単独のプラスミドからRNA前駆体分子として発現され、前駆体分子は、限定するものではないが、癌細胞内に現存するプロセッシング系を含む適切なプロセッシング系によって、機能性遺伝子産物にプロセッシングされる。他の適切なプロセッシング系は、例えば、in vitroのショウジョウバエ(Drosophila)細胞溶解系(例えば、Tuschlらの米国特許出願公開第2002/0086356号に記載され、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる)及び大腸菌(E.coli)のRNAse III系(例えば、Yangらの米国特許出願公開第2004/0014113号に記載され、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる)を含む。
【０１５２】
遺伝子産物の発現に適切なプラスミドの選択、核酸配列をプラスミド中に挿入し、遺伝子産物を発現させる方法、及び組換えプラスミドを対象となる細胞に送達する方法は、当業者の範囲内である。例えば、Zengら、(2002年)、Molecular Cell 9:1327〜1333;Tuschl(2002年)、Nat.Biotechnol、20:446〜448;Brummelkampら(2002年)、Science 296:550〜553;Miyagishiら、(2002年)、Nat.Biotechnol.20:497〜500;Paddisonら、(2002年)、Genes Dev.16:948〜958;Leeら、(2002年)、Nat.Biotechnol.20:500〜505;及びPaulら、(2002年)、Nat.Biotechnol.20:505〜508を参照されたく、これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
一実施形態において、遺伝子産物を発現するプラスミドは、CMV最初期（intermediate-early）プロモーターの調節のもとで、前駆体RNAをコードする配列を含む。本明細書において使用する場合、プロモーターの「調節のもとで」は、遺伝子産物をコードする核酸配列が、プロモーターが遺伝子産物コード配列の転写を開始できるように、プロモーターの3'に位置することを意味する。
【０１５４】
遺伝子産物は、組換えウイルスベクターからも発現できる。遺伝子産物は、二つの個別の組換えウイルスベクターから発現することもでき、同じウイルスベクターから発現することもできることが意図される。組換えウイルスベクターから発現されるRNAは、培養細胞発現系から標準的技術によって単離する、又は直接癌細胞中に発現させることのどちらかが可能である。遺伝子産物を癌細胞に送達するための組換えウイルスベクターの使用は以下により詳細に述べる。
【０１５５】
本発明の組換えウイルスベクターは、遺伝子産物をコードする配列及びRNA配列を発現するための任意の適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターは、例えば、U6又はHl RNA pol IIIプロモーター配列或いはサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、癌細胞において遺伝子産物の発現を誘導できる又は制御できるプロモーターもまた含むことができる。
【０１５６】
遺伝子産物のためのコード配列を受け入れ可能な任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス(AV);アデノ随伴ウイルス(AAV);レトロウイルス(例えばレンチウイルス(LV)、ラブドウイルス(Rhabdoviruses)、ネズミ白血病ウイルス);ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを使用することができる。ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質又は他のウイルス由来の他の表面抗原を用いてベクターを偽型にすることによって、又は必要に応じてウイルスの様々なカプシドタンパク質を置換することによって、修正できる。
【０１５７】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular
stomatitis virus)(VSV)、狂犬病(rabies)、エボラ(Ebola)、モコラ(Mokola)など由来の表面タンパク質を用いて偽化できる。本発明のAAVベクターは、様々なカプシドタンパク質の血清型を発現するようにベクターを組み換えることによって、様々な標的細胞に対して作製できる。例えば、血清2型のゲノム上で血清2型のカプシドを発現するAAVベクターは、AAV 2/2と呼ばれる。AAV 2/2ベクター中のこの血清2型カプシド遺伝子は、血清5型カプシド遺伝子と置換し、AAV 2/5ベクターを作製できる。様々な血清型のカプシドタンパク質を発現するAAVベクターを構築するための技術は、当業者の範囲内であり、例えば、Rabinowitz,J.E.ら、(2002年)J.Virol.76:791〜801を参照されたく、この全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
本発明の使用に適切な組換えウイルスベクターの選択、RNAを発現する核酸配列をベクター中に挿入する方法、及びウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法及び発現したRNA産物の回収は、当業者の範囲内である。例えば、Dornburg(1995年)、Gene Therap.2:301〜310;Eglitis(1988年)、Biotechniques 6:608〜614;Miller(1990年)、Hum.Gene
Therap.1:5〜14;及びAnderson(1998年)、Nature 392:25〜30を参照されたく、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
特定の実施形態において、適切なウイルスベクターは、AV及びAAVに由来するものである。遺伝子産物を発現する適切なAVベクター、組換えAVベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、Xiaら、(2002年)、Nat.Biotech.20:1006〜1010に記載されており、この全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子産物を発現する適切なAAVベクター、組換えAAVベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、Samulskiら、(1987年)、J.Virol.61:3096〜3101;Fisherら、(1996年)、J.Virol、70:520〜532;Samulskiら、(1989年)、J.Virol.63:3822〜3826;米国特許第5,252,479号、米国特許第5,139,941号;国際特許出願公開WO94/13788;及び国際特許出願公開WO93/24641に記載されており、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
特定の実施形態において、本発明の組換えAAVウイルスベクターは、ヒトU6 RNAプロモーターの調節のもとで、polyT末端配列と動作可能に連結された前駆体RNAをコードする核酸配列を含む。本明細書において使用する場合、「polyT末端配列と動作可能に連結された」は、センス鎖又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、polyT末端シグナルの5'方向にすぐに隣接しているという意味である。ベクター由来の配列の転写中に、polyT末端シグナルが作用し、転写を終了させる。
【０１６１】
本発明の治療方法の他の実施形態において、発現を阻害する少なくとも一つの化合物の有効量を、対象に投与することもできる。本明細書において使用する場合、「遺伝子発現を阻害する」は、治療後の遺伝子産物の活性な成熟形態の産生が、治療前に産生された量より低いことを意味する。当業者は、癌細胞において発現が阻害されているかどうかを、例えば診断方法に関して上で述べた転写レベルの決定のための技術を使用して、容易に決定できる。阻害は、遺伝子発現のレベルにおいて(即ち、遺伝子産物をコードする遺伝子の転写を阻害することによって)、又はプロセッシングのレベルにおいて(例えば、成熟した活性遺伝子産物への前駆体のプロセッシングを阻害することによって)起こり得る。
【０１６２】
本明細書において使用する場合、発現を阻害する化合物の「有効量」は、癌随伴染色体の特徴を伴う癌を患う対象において、癌細胞の増殖を阻害するための十分量である。当業者は、対象のサイズ、体重;疾患の侵食範囲;対象の年齢、健康、性別;投与経路;及び投与が局所的又は全身かどうかなどの因子を考慮に入れることによって、所与の対象に投与する発現阻害化合物の有効量を容易に決定できる。
【０１６３】
例えば、発現阻害化合物の有効量は、治療する対象のおよその又は推定の体重に基づくことができる。このような有効量は、本明細書に記載のように、とりわけ非経口又は経腸的に投与される。例えば、対象に投与する発現阻害化合物の有効量は、約5〜3000マイクログラム/kg体重、約700〜1000マイクログラム/kg体重又は約1000マイクログラム/kg体重を超える範囲であり得る。
【０１６４】
当業者は、所与の対象への発現を阻害する化合物の投与に関する適切な投薬計画もまた、容易に決定できる。例えば、発現阻害化合物を対象に1回投与してもよい(例えば、単回の注射又は沈着)。又は、発現阻害化合物を、対象に約3から約28日、より好ましくは、約7日から約10日の期間、1日に1回又は2回投与してもよい。特定の投薬計画において、発現阻害化合物は、7日間、1日に1回投与される。投薬計画が、複数回投与を含む場合、対象に投与する発現阻害化合物の有効量は、全投薬計画にわたって投与する化合物の全量を含み得ると考えられる。
【０１６５】
発現を阻害する適切な化合物は、二本鎖RNA(短鎖又は低分子干渉RNA或いは「siRNA」)、アンチセンス核酸及びリボザイムなどの酵素RNA分子を含む。これらの各化合物は、所与の遺伝子産物を標的とし、標的遺伝子産物を破壊又は破壊を誘導することができる。
【０１６６】
例えば、所与の遺伝子の発現は、遺伝子産物の少なくとも一部と、少なくとも90%、例えば少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列相同性を有する、単離二本鎖RNA(「dsRNA」)分子を用いて遺伝子のRNA干渉を誘導することによって阻害できる。特定の実施形態において、dsRNA分子は、「短鎖又は低分子干渉RNA」或いは「siRNA」である。
【０１６７】
本方法に有用なsiRNAは、約17ヌクレオチド長から約29ヌクレオチド長、好ましくは約19から約25ヌクレオチド長の短鎖二本鎖RNAを含む。siRNAは、標準的Watson-Crick塩基対相互作用によって一つにアニーリングされたセンスRNA鎖及び相補的アンチセンスRNA鎖(これ以降「塩基対」)を含む。センス鎖は、標的遺伝子産物内に含まれる核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。
【０１６８】
本明細書において使用する場合、標的mRNA内に含まれる標的配列と「実質的に同一」であるsiRNA中の核酸配列は、標的配列と同一である核酸配列又は標的配列と1又は2ヌクレオチドが異なる核酸配列である。siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、二つの相補的な一本鎖RNA分子を含むことができ、又は二つの相補的部分が塩基対であり、一本鎖の「ヘアピン」領域による共有結合である単独の分子を含むことができる。
【０１６９】
siRNAは、一つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は改変により、天然発生RNAと異なる改変RNAであってもよい。このような改変は、siRNAの末端又はsiRNAの一つ又は複数の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド材料の付加、或いはsiRNAをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾、或いはデオキシリボヌクレオチドを有するsiRNAにおける一つ又は複数のヌクレオチドの置換を含むことができる。
【０１７０】
siRNAの一方又は両方の鎖は、3'突出を含むこともできる。本明細書において使用する場合、「3'突出」は、二本鎖RNAの3'末端から伸長した少なくとも一個の不対ヌクレオチドを指す。したがって、特定の実施形態において、siRNAは、(リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む)1から約6ヌクレオチド長の、1から約5ヌクレオチド長の、1から約4ヌクレオチド長の、又は約2から約4ヌクレオチド長の、少なくとも一つの3'突出を含む。特定の実施形態において、3'突出はsiRNAの両方の鎖に存在し、2ヌクレオチド長である。例えば、siRNAの各鎖は、3'ジチミジル酸(「TT」)又はジウリジル酸(「uu」)の3'突出を含むことができる。
【０１７１】
siRNAは、単離遺伝子産物に関して上に記載したように、化学的又は生物学的に作製でき、或いは組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現できる。
【０１７２】
dsRNA又はsiRNA分子を作製し、試験する例示的方法は、Gewirtzの米国特許出願公開第2002/0173478号及びReichらの米国特許出願公開第2004/0018176号に記載され、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
所与の遺伝子の発現はまた、アンチセンス核酸によっても阻害できる。本明細書において使用する場合、「アンチセンス核酸」は、RNA-RNA又はRNA-DNA又はRNA-ペプチド核酸相互作用によって、標的RNAに結合する核酸分子を指し、アンチセンス核酸は標的RNAの活性を改変する。本方法の使用に適切なアンチセンス核酸は、遺伝子産物中の連続した核酸配列に相補的な核酸配列を一般的に含む、一本鎖核酸(例えば、RNA、DNA、RNA-DNAのキメラ、PNA)である。アンチセンス核酸は、遺伝子産物中の連続した核酸配列と、50〜100%相補的、75〜100%相補的、又は95〜100%相補的である核酸配列を含むことができる。遺伝子産物のための核酸配列を、本明細書において提供する。いかなる理論にも縛られることを望まないが、アンチセンス核酸は、RNase H又は遺伝子産物/二本鎖アンチセンス核酸を消化する別の細胞性ヌクレアーゼを活性化すると考えられる。
【０１７４】
アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、分子の有効性に関する、送達又は他の特性を増強するために、核酸骨格又は糖及び塩基部分(又はそれらの同等物)に対する修飾もまた含むことができる。このような修飾は、コレステロール部分、アクリジンなどの二本鎖インターカレーター或いは一つ又は複数のヌクレアーゼ耐性基を含む。
【０１７５】
アンチセンス核酸は化学的又は生物学的に作製でき、或いは単離遺伝子産物に関して上に記載したように、組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現できる。作製及び試験のための例示的方法は、当業者の範囲内であり、例えば、Stein及びCheng(1993年)、Science 261:1004及びWoolfらの米国特許第5,849,902号を参照されたく、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
所与の遺伝子の発現は、酵素核酸によってもまた阻害できる。本明細書において使用する場合、「酵素核酸」は、遺伝子産物の連続した核酸配列に対する相補性を有する基質結合領域を含み、遺伝子産物を特異的に切断できる核酸を指す。酵素核酸の基質結合領域は、例えば、遺伝子産物の連続した核酸配列に対して50〜100%相補的、75〜100%相補的又は95〜100%相補的であってよい。酵素核酸は、塩基、糖及び/又はリン酸基において修飾をさらに含んでもよい。本方法への使用のための例示的酵素核酸は、リボザイムである。
【０１７７】
酵素核酸は、化学的又は生物学的に作製でき、或いは単離遺伝子産物に関して上に記載したように、組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現できる。dsRNA又はsiRNA分子を作製し、試験する例示的方法は、Werner及びUhlenbeck(1995年)、Nucl.Acids Res.23:2092〜96;Hammannら、(1999年)、Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9:25〜31;及びCechらの米国特許第4,987,071号に記載され、これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
少なくとも一つの遺伝子産物又は少なくとも一つの発現を阻害する化合物の投与は、癌随伴染色体の特徴を伴う癌を有する対象において、癌細胞の増殖を阻害するであろう。本明細書において使用する場合、「癌細胞の増殖を阻害する」は、細胞を死滅させる、又は細胞の成長を、永久に又は一時的に停止させる又は遅くさせることを意味する。対象におけるこのような細胞の数が、遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物の投与後に一定を保つ、又は減少する場合、癌細胞の増殖が阻害されたと推測できる。このような細胞の絶対数が増加したが、腫瘍成長率が減少した場合もまた、癌細胞の増殖が阻害されたと推測できる。
【０１７９】
対象の体内における癌細胞の数は、直接測定により、或いは原発腫瘍塊又は転移腫瘍塊のサイズから推定することによって決定できる。例えば、対象における癌細胞の数は、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、又は癌細胞の特有の表面マーカーを検出するための他の技術によって測定できる。
【０１８０】
遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物は、対象の癌細胞にこれらの化合物を送達するために適切な任意の方法によって、対象に投与できる。例えば、遺伝子産物又は発現阻害化合物は、対象の細胞にこれらの化合物、又はこれらの化合物をコードする配列を含む核酸を形質移入するために適した方法で投与できる。一実施形態において、細胞に少なくとも一つの遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含むプラスミド又はウイルスベクターを形質移入する。
【０１８１】
真核細胞のための形質移入方法は、当分野において周知であり、例えば、細胞の核又は前核への核酸の直接注入、エレクトロポレーション、リポソーム転移又は親油性材料により仲介される転移;レポーター仲介核酸送達:生物弾道(bioballistic)又は粒子加速;リン酸カルシウム沈殿及びウイルスベクターにより仲介される形質移入を含む。
【０１８２】
例えば、細胞にリポソーム転移化合物、例えば、DOTAP(N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルスルファート、(Boehringer-Mannheim)又はLIPOFECTINなどの同等物を形質移入できる。使用する核酸の量は、本発明の実践に重要でなく、許容可能な結果は、0.1〜100マイクログラムの核酸/105細胞により達成できる。例えば、約0.5マイクログラムのプラスミドベクター/3マイクログラムのDOTAP/105細胞の比率で使用できる。
【０１８３】
遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物は、任意の適切な腸内又は非経口の投与経路によって、対象に投与できる。本方法の適切な腸内投与経路は、例えば、経口、直腸又は鼻腔内送達を含む。適切な非経口投与経路は、例えば、血管内投与(例えば、静脈内ボーラス注入、静脈内注射、動脈内ボーラス注入、動脈内注射及び血管へのカテーテル点滴);周囲組織及び組織内注入(例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注入、網膜内注入、又は網膜下注入);皮下注射又は皮下注入を含む沈着(浸透圧ポンプによってなど);例えば、カテーテル又は他の配置装置(例えば、網膜ペレット又は坐薬又は多孔性、無孔性又はゼラチン質の材料を含むインプラント)による、対象となる組織への直接適用、;及び吸入剤を含む。特に適した投与経路は、患者への注入、注射及び静脈内投与である。
【０１８４】
本方法において、遺伝子産物又は遺伝子産物発現阻害化合物は、送達試薬と組み合わせた裸のRNAとして、又は遺伝子産物又は発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸(例えば、組換えプラスミド又はウイルスベクター)としてのどちらかで対象に投与できる。適切な送達試薬は、例えば、Mirus Transit TKO親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン(例えば、ポリリシン)及びリポソームを含む。
【０１８５】
遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含む組換えプラスミド及びウイルスベクター及びこのようなプラスミド及びベクターを癌細胞に送達する技術を本明細書において述べる。
【０１８６】
特定の実施形態において、リポソームを使用し、遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物(又はそれらをコードする配列を含む核酸)を対象に送達する。リポソームはまた、遺伝子産物又は核酸の血中半減期を延長できる。本発明の使用に適切なリポソームは、標準的小胞形成脂質から形成でき、一般的に中性又は負に帯電したリン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は、所望のリポソームサイズ及び血流中のリポソームの半減期などの因子を考慮して導かれる。リポソームの調製に関する様々な方法が、Szokaら、(1980年)、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467;及び米国特許第4,235,871号、米国特許第4,501,728号、米国特許第4,837,028号及び米国特許第5,019,369号に記載のように公知であり、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
本方法に使用のリポソームは、リポソームを標的とする、癌細胞に対するリガンド分子を含むことができる。腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体などの、癌細胞中に多く存在する受容体に結合するリガンドが好ましい。
【０１８８】
本方法に使用のリポソームは、単核マクロファージ系(「MMS」)及び細網内皮系(「RES」)によるクリアランスを避けるように修飾されていてもよい。このような修飾リポソームは、リポソーム構造の表面又は内部に組み込まれたオプソニン化阻害部分を有する。特定の好ましい実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分及びリガンドの両方を含むことができる。
【０１８９】
本発明のリポソームの調製に使用のオプソニン化阻害部分は、通常リポソーム膜に結合する大型の親水性ポリマーである。本明細書において使用する場合、オプソニン化阻害部分が化学的又は物理的に、例えば、膜それ自体への脂溶性アンカーのインターカレーションによって、又は膜脂質の活性基に直接結合することによって膜に結合している場合、オプソニン化阻害部分はリポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えば、米国特許第4,920,016号に記載のように、MMS及びRESによるリポソームの取り込みを実質的に減少させる保護表面層を形成し、米国特許第4,920,016号の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
リポソームの修飾に適切なオプソニン化阻害部分は、数平均分子量が約500から約40,000ダルトン、より好ましくは約2,000から約20,000ダルトンの水溶性ポリマーが好ましい。このようなポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコール(PPG)誘導体;例えば、メトキシPEG又はメトキシPPG及びステアリン酸PEG又はステアリン酸PPG;ポリアクリルアミド又はポリN-ビニルピロリドンなどの合成ポリマー;直鎖、分枝型又は樹状のポリアミドアミン;ポリアクリル酸;ポリアルコール、例えばカルボン酸基又はアミノ基が化学的に連結するポリビニルアルコール及びポリキシリトール;並びにガングリオシドGM1などのガングリオシドを含む。PEGのコポリマー、メトキシPEG又はメトキシPPG或いはそれらの誘導体もまた適している。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、PEGとポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであってもよい。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボン酸、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナンを含む天然の多糖類;アミノ化された多糖類又はオリゴ糖(直鎖又は分枝型));或いは例えば、カルボン酸基の連結を起こす炭酸の誘導体と反応した、カルボキシル化多糖類又はオリゴ糖であってもよい。好ましくは、オプソニン化阻害部分は、PEG、PPG又はそれらの誘導体である。PEG又はPEGの誘導体により修飾されたリポソームは、時として「PEG化リポソーム」と呼ばれる。
【０１９１】
オプソニン化阻害部分は、多くの周知の技術の任意の一つによって、リポソーム膜に結合できる。例えば、PEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル-エタノールアミン脂溶性アンカーと結合でき、その後膜に結合する。同様に、デキストランポリマーは、ステアリルアミン脂溶性アンカーを用いて、Na(CN)BH3及び溶媒混合物、例えばテトラヒドロフラン及び水を30:12の比で60℃において使用した、還元的アミノ化を介して誘導体化できる。
【０１９２】
オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、血液循環中で未修飾のリポソームより長く維持される。この理由のために、このようなリポソームは時として「ステルス」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔性又は「漏れやすい」微小血管系によって供給され、組織中に蓄積されることが知られている。したがって、このような微小血管系の障害を特徴とする組織、例えば固体腫瘍はこれらのリポソームを効果的に蓄積するであろう。Gabizonら、(1988年)、Proc.Natl.Acad.Sci、U.S.A.、18:6949〜53を参照されたい。さらに、RESによる取り込みが減少することで、肝臓及び脾臓におけるリポソームの有意な蓄積が妨げられることによって、ステルスリポソームの毒性が低くなる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物(又はそれらをコードする配列を含む核酸)を腫瘍細胞に送達するために特に適している。
【０１９３】
遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物は、医薬組成物として処方でき、当分野において公知の技術に従って、対象にそれらを投与する前は、時として「薬剤」と呼ばれる。したがって、本発明は、ALLの治療用医薬組成物を包含する。一実施形態において、この医薬組成物は、少なくとも一つの単離遺伝子産物及び薬学的に許容できる担体を含む。特定の実施形態において、少なくとも一つの遺伝子産物は、適切な対照細胞と比較して、ALL細胞において発現レベルが減少する遺伝子産物に相当する。
【０１９４】
他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、少なくとも一つの発現阻害化合物を含む。特定の実施形態において、少なくとも一つの遺伝子発現阻害化合物は、対照細胞よりALL細胞において発現が多い遺伝子に特異的である。
【０１９５】
本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり、ピロゲンを含まないことを特徴とする。本明細書において使用する場合、「医薬製剤」は、ヒト及び獣医の使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物の調製方法は、当業者の範囲内であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.(1985年)に記載されており、この全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
本医薬製剤は、少なくとも一つの遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物(又は、それらをコードする配列を含む少なくとも一つの核酸)(例えば、重量で0.1から90%)、或いは生理的に許容できるそれらの塩を、薬学的に許容できる担体と混合して含む。本発明の医薬製剤は、リポソームによってカプセル化された、少なくとも一つの遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物(又は、それらをコードする配列を含む少なくとも一つの核酸)及び薬学的に許容できる担体もまた含むことができる。
【０１９７】
特に適切な薬学的に許容できる担体は、水、緩衝用水、生理食塩水、0.4%食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸などである。
【０１９８】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性である、少なくとも一つの遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物(又は、それらをコードする配列を含む少なくとも一つの核酸)を含む。当業者は、ヌクレアーゼ耐性である核酸を、例えば、2'-位において修飾されている一つ又は複数のリボヌクレオチドを遺伝子産物に組み込むことによって、容易に合成できる。適切な2'-修飾リボヌクレオチドは、2'位において、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ及びO-アリルで修飾された2'-修飾リボヌクレオチドを含む。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、従来の医薬賦形剤及び/又は添加剤もまた含むことができる。適切な医薬賦形剤は、安定剤、酸化防止剤、オスモル濃度調整剤、緩衝液及びpH調整剤を含む。適切な添加剤は、例えば、生理的に生体適合性の緩衝液(例えば、トロメタミン塩酸塩)、キレート剤の添加(例えば、DTPA又はDTPA-ビスアミドなど)又はカルシウムキレート複合体(例えば、カルシウムDTPA、CaNaDTPA-ビスアミドなど)或いは場合によりカルシウム塩又はナトリウム塩(例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム)の添加を含む。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装でき、又は凍結乾燥できる。
【０２００】
本発明の固体医薬組成物のために、従来の非毒性固体の薬学的に許容できる担体:例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを使用できる。
【０２０１】
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記の任意の担体及び賦形剤並びに、10〜95%、好ましくは25%〜75%の少なくとも一つの遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物(又は、それらをコードする配列を含む少なくとも一つの核酸)を含むことができる。エアロゾル(吸入用)投与用医薬組成物は、重量で0.01〜20%、好ましくは重量でl%〜10%の、上記のようにリポソーム中にカプセル化された少なくとも一つの遺伝子産物又は遺伝子発現阻害化合物(又は、それらをコードする配列を含む少なくとも一つの核酸)及び噴射剤を含むことができる。担体、例えば鼻腔内送達用レシチンもまた、必要に応じて含むことができる。
【０２０２】
本発明は、試験作用物質を細胞に提供するステップ及び細胞中の少なくとも一つの遺伝子産物のレベルを測定するステップを含む、抗ALL作用物質を特定する方法もまた包含する。一実施形態において、本方法は、試験作用物質を細胞に提供するステップ及びALL細胞における発現レベルの減少に関連する少なくとも一つの遺伝子産物のレベルを測定するステップを含む。適切な対照細胞と比較して、細胞において遺伝子産物のレベルが増加することが、試験作用物質が抗ALL作用物質であることを示す。
【０２０３】
他の実施形態において、本方法は、試験作用物質を細胞に提供するステップ及びALL細胞における発現レベルの増加に関連する少なくとも一つの遺伝子産物のレベルを測定するステップを含む。適切な対照細胞と比較して、細胞において遺伝子産物のレベルが減少することが、試験作用物質が抗ALL作用物質であることを示す。
【０２０４】
適切な作用物質は、限定するものではないが、作用物質(例えば低分子ペプチド)及び生体高分子(例えば、タンパク質、核酸)を含む。この作用物質は、組換え的、合成的に作製でき、又は天然供給源から単離(即ち、精製)できる。このような作用物質を細胞に提供する(即ち、形質移入)ための様々な方法は、当分野において周知であり、このような方法のいくつかは、これより上に記載してある。少なくとも一つの遺伝子産物の発現の検出方法(例えば、ノーザンブロット、in situのハイブリッド形成、RT-PCR、発現プロファイリング)もまた、当分野において周知である。
【０２０５】
定義
用語「アレイ」は、用語「マイクロアレイ」と区別なく本明細書において使用される。
【０２０６】
用語「癌」は、本明細書において使用されるように、調節されていない細胞増殖及びそれらの細胞が他の組織に浸潤する能力によって典型的に特徴づけられる、哺乳動物における生理的状態を指す。
【０２０７】
用語「発現」は、本明細書において使用されるように、メッセンジャーRNA(mRNA)又はタンパク質へのDNA配列情報の変換を指す。発現は、完全長mRNA、mRNA断片、完全長タンパク質、又はタンパク質断片のレベルを測定することによってモニターされてもよい。
【０２０８】
用語「融合タンパク質」は、作動可能に連結される、典型的に異なる供給源からの、少なくとも二つのポリペプチドを記載することが意図される。ポリペプチドに関して、作動可能に連結されるという用語は、それぞれのポリペプチドがその意図される機能を果たすことができるように、二つのポリペプチドがつながれることを意味するように意図される。典型的には、二つのポリペプチドは、ペプチド結合を通して共有結合している。融合タンパク質は、好ましくは、標準的な組換えDNA技術によって産生される。例えば、第1のポリペプチドをコードするDNA分子は、第2のポリペプチドをコードする他のDNA分子にライゲーションされ、結果として生じたハイブリッドDNA分子は、宿主細胞において発現され、融合タンパク質が産生される。DNA分子は、ライゲーションの後に、コードポリペプチドの翻訳フレームが変わらないように、5'から3'の向きで互いにライゲーションされる(つまり、DNA分子は、互いに、インフレームでライゲーションされる)。
【０２０９】
句「遺伝子発現サイン」は、本明細書において使用されるように、細胞、特に癌細胞における、特有のパターンの遺伝子発現を指す。
【０２１０】
用語「ハイブリッド形成」は、本明細書において使用されるように、2本の単鎖核酸の間の結合、アニーリング、又は塩基対合のプロセスを指す。「ハイブリッド形成のストリンジェンシー」は温度及びイオン強度の条件によって決定される。核酸ハイブリッドの安定性は、融解温度又はTmとして表現され、これは、ハイブリッドが、定義された条件下で50%変性する温度である。等式は、所与のハイブリッドのTmを推定するために導かれた。等式は、核酸のG+C含有量、ハイブリッド形成プローブの長さなどを考慮に入れる(例えばSambrookら、1989)。その標的とのプローブのアニーリングの率を最大限にするために、ハイブリッド形成は、Tmより約2025℃下の温度で、高イオン強度の溶液(6×SSC又は6×SSPE)中で一般に実行される。ハイブリッド形成されることとなる配列が同一でない場合、ハイブリッド形成温度を、1%のミスマッチごとに1〜1.5℃低下させる。一般に、洗浄条件は、可能な限りストリンジェントとするべきである(つまり、計算したTmより約12〜20℃下の温度で低イオン強度)。例として、高度にストリンジェントな条件は、典型的に、6×SSC/5×デンハート溶液/1.0%SDS中での68℃でのハイブリッド形成及び65℃での0.2×SSC/0.1% SDS中での洗浄を含む。最適なハイブリッド形成条件は、一般に、溶液中で実行されるハイブリッド形成及び固定された核酸を使用するハイブリッド形成の間で異なる。当業者は、ハイブリッド形成を最適化するためにどのパラメーターを操作するべきであるかを十分に理解するであろう。
【０２１１】
用語「核酸」は、本明細書において使用されるように、連結されたヌクレオチドの配列を指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであってもよく、それらは、標準的な又は非標準的なヌクレオチドであってもよく、それらは、修飾ヌクレオチド又は誘導ヌクレオチドであってもよく、それらは、合成類似体であってもよい。ヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合又は非加水分解性結合によって連結されてもよい。核酸は、少数のヌクレオチド(つまりオリゴヌクレオチド)を含んでいてもよく、又は核酸は、多くのヌクレオチド(つまりポリヌクレオチド)を含んでいてもよい。核酸は、単鎖又は二本鎖であってもよい。
【０２１２】
本明細書において使用される用語「予後」は、癌の可能性の高い経過及び結果、特に回復の見込みを指す。
【０２１３】
本発明は、様々な好ましい実施形態に関して記載されるが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされてもよく、等価物が、その要素の代わりに用いられてもよいことが当業者らによって理解されるべきである。さらに、その本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の教示に特定の状況又は材料を適応させるために、多くの改変がなされてもよい。
【０２１４】
そのため、本発明は、本発明を実行するために企図される、本明細書において開示される特定の実施形態に限定されないが、本発明は、特許請求の範囲内にある実施形態をすべて含むことが意図される。
【０２１５】
参考文献
本発明を説明する又は本発明の実施を考慮する付加的な詳細を提供するために本明細書において使用される特許、刊行物、及び他の資料は、本明細書において参照により組み込まれ、便宜上、以下の参考文献一覧において提供される。
【０２１６】
本明細書において引用される文献のいずれの引用も、先のもののいずれかが関連する先行技術であることを認めるものではない。日付に関する記述又はこれらの文献の内容に関する説明はすべて、出願人に入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さに関するいずれの承認ともならない。
参考文献
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出願時の特許請求の範囲
〔請求項１〕
対象における病態又は病態を発症する危険性を評価するための方法であって、
対象由来のサンプルにおける一つ又は複数のマーカーの発現プロファイルを測定するステップを含み、
対象由来のサンプルにおける発現プロファイル及び正常サンプルの発現プロファイルにおける差異が、急性リンパ芽球性白血病(ALL)又はALLに対する素因を示し、
マーカーが、(Erk)リン酸化に干渉する、一つ又は複数の遺伝子産物を少なくとも含み、マーカーが、少なくとも一つのALL1融合タンパク質を含む、前記方法。
〔請求項２〕
対象の病態の評価が、一つ又は複数の、対象におけるALLの発症の素因の予測、対象におけるALLの診断、ALL対象の予後の評価、又は療法に対するALL対象の応答の評価を含む、請求項1に記載の方法。
〔請求項３〕
マーカーが、ALL1/Af4融合タンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
〔請求項４〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の開始、進行、重症度、症状、攻撃性、グレード、活性、障害、死亡率、罹患率、及び疾患細分類又は他の根本的な病原的又は病理学的特徴の少なくとも一つに寄与する一つ又は複数の代謝経路を評価するためのマーカーであって、
少なくとも一つのALL1融合タンパク質をコードする一つ又は複数の遺伝子産物を含み、
ALL1融合タンパク質とEphA7発現との関連が統計的に有意である、前記マーカー。
〔請求項５〕
マーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチド又はその部分の存在の検出によって評価され、転写されたポリヌクレオチドが、マーカーのコード領域を含む、請求項4に記載のマーカー。
〔請求項６〕
All1融合タンパク質が、ALL1/Af4融合タンパク質を含む、請求項4に記載のマーカー。
〔請求項７〕
請求項4に記載の一つ又は複数のマーカーを含む組成物。
〔請求項８〕
癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項5に記載の少なくとも一つのマーカーのヌクレオチド配列、又は請求項4に記載のマーカーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記試薬。
〔請求項９〕
癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項4に記載の少なくとも一つのマーカーによってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む、前記試薬。
〔請求項１０〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)を予防、診断及び/又は治療する療法の有効性を評価するための方法であって、
(1)有効性を評価中の療法を動物に施すステップと、
(2)請求項4に記載の少なくとも一つのマーカーを評価することによって、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の治療又は予防における試験中の治療の有効性のレベルを決定するステップ
とを含む、前記方法。
〔請求項１１〕
候補治療剤が、医薬組成物、栄養補助組成物、及びホメオパシー組成物のうち一つ又は複数を含む、請求項10に記載の方法。
〔請求項１２〕
評価されている療法が、ヒト対象で使用する療法である、請求項11に記載の方法。
〔請求項１３〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の癌を治療するための医薬組成物であって、少なくとも一つのALL1融合タンパク質発現阻害化合物、及び薬学的に許容できる担体を含む、前記医薬組成物。
〔請求項１４〕
少なくとも一つの発現阻害化合物が、適切な対照細胞に比べて、癌細胞においてアップレギュレートされる又はダウンレギュレートされる遺伝子産物に特異的である、請求項13に記載の医薬組成物。
〔請求項１５〕
融合タンパク質が、ALL1/Af4融合タンパク質を含む、請求項13に記載の医薬組成物。
〔請求項１６〕
請求項4に記載の少なくとも一つのマーカーから選択される、癌関連疾患のマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む製品。
〔請求項１７〕
癌関連疾患を治療するための治療剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、請求項4に記載の少なくとも一つのマーカーの一つ又は複数の試薬、及び少なくとも一つのマーカーを発現する細胞を含む、前記キット。
〔請求項１８〕
マーカーの存在が、少なくとも一つのマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される、請求項17に記載のキット。
〔請求項１９〕
請求項4に記載の一つ又は複数のマーカーをそのようなマーカーの基質及び試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がマーカーの活性を調節するかどうかを決定するステップとを含む、急性リンパ芽球性白血病(ALL)のスクリーニング試験。
〔請求項２０〕
すべての方法のステップがin vitroにおいて実行される、請求項19に記載のスクリーニング試験。
〔請求項２１〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を、必要のある個体において、治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための方法であって、
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路に干渉する作用物質を、そのようなシグナル伝達に干渉するのに十分な量で個体に投与するステップを含み、
マーカーが、(Erk)リン酸化に干渉する、一つ又は複数の遺伝子産物を少なくとも含み、マーカーが、少なくとも一つのALL1融合タンパク質を含む、前記方法。
〔請求項２２〕
個体において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための医薬の製造のための、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路に干渉する作用物質の使用であって、作用物質が、少なくとも5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む、前記使用。
〔請求項２３〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を、必要のある個体において、治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための方法であって、
少なくとも急性リンパ芽球性白血病(ALL)の疾患応答カスケードに干渉する作用物質を個体に投与するステップを含み、
作用物質が、5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む、前記方法。
〔請求項２４〕
個体において、癌関連疾患の合併症を治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための医薬の製造のための、少なくとも一つの急性リンパ芽球性白血病(ALL)の疾患応答カスケードに干渉する作用物質の使用であって、
作用物質が、5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む、前記方法。
〔請求項２５〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する対象の生存を予測するためのマーカーであって、(Erk)リン酸化に干渉する、一つ又は複数の遺伝子産物を含む、前記マーカー。
〔請求項２６〕
t(4;11)染色体転座を持つ白血病細胞の治療のための方法であって、アポトーシス細胞死を誘発する、Erkリン酸化の阻害剤を投与するステップを含む、前記方法。
〔請求項２７〕
EphA7発現を、必要のある対象において、アップレギュレートするための方法であって、EphA7発現をアップレギュレートするALL1融合タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子産物を投与するステップを含む、前記方法。
平成２３年８月３日付け手続補正書の「手続補正５」の特許請求の範囲
〔請求項１〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の開始、進行、重症度、症状、攻撃性、グレード、活性、障害、死亡率、罹患率、及び疾患細分類又は他の根本的な病原的又は病理学的特徴の少なくとも一つに寄与する一つ又は複数の代謝経路を評価するためのマーカーであって、少なくとも一つのALL1融合タンパク質をコードする一つ又は複数の遺伝子産物を含み、ALL1融合タンパク質とEphA7発現との関連が統計的に有意である、前記マーカー。
〔請求項２〕
マーカーの発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチド又はその部分の存在の検出によって評価され、転写されたポリヌクレオチドが、マーカーのコード領域を含む、請求項1に記載のマーカー。
〔請求項３〕
All1融合タンパク質が、ALL1/Af4融合タンパク質を含む、請求項1に記載のマーカー。
〔請求項４〕
請求項1に記載の一つ又は複数のマーカーを含む組成物。
〔請求項５〕
癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項2に記載の少なくとも一つのマーカーのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記試薬。
〔請求項６〕
癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーによってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む、前記試薬。
〔請求項７〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)を予防、診断及び/又は治療する療法の有効性を評価するための方法であって、 (1)有効性を評価中の療法を動物に施すステップと、
(2)請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーを評価することによって、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の治療又は予防における試験中の治療の有効性のレベルを決定するステップとを含む、前記方法。
〔請求項８〕
候補治療剤が、医薬組成物、栄養補助組成物、及びホメオパシー組成物のうち一つ又は複数を含む、請求項7に記載の方法。
〔請求項９〕
評価されている療法が、ヒト対象で使用する療法である、請求項8に記載の方法。
〔請求項１０〕
請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーから選択される、癌関連疾患のマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む製品。
〔請求項１１〕
癌関連疾患を治療するための治療剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、請求項1に記載の少なくとも一つのマーカーの一つ又は複数の試薬、及び少なくとも一つのマーカーを発現する細胞を含む、前記キット。
〔請求項１２〕
マーカーの存在が、少なくとも一つのマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される、請求項11に記載のキット。
〔請求項１３〕
請求項1に記載の一つ又は複数のマーカーをそのようなマーカーの基質及び試験作用物質と接触させるステップと、試験作用物質がマーカーの活性を調節するかどうかを決定するステップとを含む、急性リンパ芽球性白血病(ALL)のスクリーニング試験。
〔請求項１４〕
すべての方法のステップがin vitroにおいて実行される、請求項13に記載のスクリーニング試験。
〔請求項１５〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を、必要のある個体において、治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための方法であって、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路に干渉する作用物質を、そのようなシグナル伝達に干渉するのに十分な量で個体に投与するステップを含み、作用物質が(Erk)リン酸化に干渉する一つ又は複数の遺伝子産物を少なくとも含み、作用物質が少なくとも一つのALL1融合タンパク質を含む、前記方法。
〔請求項１６〕
個体において、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための、急性リンパ芽球性白血病(ALL)の応答シグナル伝達経路に干渉する作用物質であって、作用物質が、少なくとも5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む、前記作用物質。
〔請求項１７〕
急性リンパ芽球性白血病(ALL)の合併症を、必要のある個体において、治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための方法であって、少なくとも急性リンパ芽球性白血病(ALL)の疾患応答カスケードに干渉する作用物質を個体に投与するステップを含み、作用物質が5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む、前記方法。
〔請求項１８〕
個体において、癌関連疾患の合併症を治療する、予防する、反転させる、又はその重症度を抑えるための、少なくとも一つの急性リンパ芽球性白血病(ALL)の疾患応答カスケードに干渉する作用物質であって、作用物質が5-ヨードツベリシジン(5-ITU)を含む、前記作用物質。
〔請求項１９〕
EphA7発現を、必要のある対象において、アップレギュレートするための方法であって、EphA7発現をアップレギュレートするALL1融合タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子産物を投与するステップを含む、前記方法。
〔請求項２０〕
癌関連疾患を試験するための試薬であって、請求項1に記載のマーカーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、前記試薬。
【図１Ａ】
0005770472.tif 000002
【図１Ｂ】
0005770472.tif 000003
【図２Ａ】
0005770472.tif 000004
【図２Ｂ】
0005770472.tif 000005
【図３Ａ】
0005770472.tif 000006
【図３Ｂ】
0005770472.tif 000007
【図３Ｃ】
0005770472.tif 000008
【図４Ａ】
0005770472.tif 000009
【図４Ｂ】
0005770472.tif 000010
【図４Ｃ】
0005770472.tif 000011
【図４Ｄ】
0005770472.tif 000012
【図５Ａ】
0005770472.tif 000013
【図５Ｂ】
0005770472.tif 000014
【図５Ｃ】
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【配列表】
0005770472000001.app