(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の増幅方法であって、
ＲＮＡテンプレートを、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、及びＳａｃ７ｅからなる群から選択されるＲＴ阻害低減剤を含んでなる組成物と混合するステップ；及び
当該ＲＮＡテンプレートの全て又は一部と相補的なＤＮＡ分子を合成し得る条件下で、当該混合物をインキュベートするステップを含んでなり、それにより当該核酸分子を増幅する、方法。
【請求項２】
前記ＲＴ阻害低減剤が、Ｓｓｏ７ｄである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、及びＳａｃ７ｅからなる群から選択されるＲＴ阻害低減剤を含んでなる組成物。
【請求項４】
前記ＲＴ阻害低減剤が、Ｓｓｏ７ｄである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
緩衝剤、ヌクレオチド、塩、安定化剤、プライマー及びヌクレアーゼ不含水からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーをさらに含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、及びＳａｃ７ｅからなる群から選択されるＲＴ阻害低減剤を含んでなる第一溶液混合物；及び
緩衝剤、ヌクレオチド、塩、安定化剤、指示書、プライマー、ＲＮＡテンプレート、色素及びヌクレアーゼ不含水からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを任意に含んでなり、さらに逆転写酵素を含むキットであって、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＴ阻害低減剤の共存下でＲＴ−ＰＣＲを行うための前記キット。
【請求項９】
前記第一溶液混合物が、逆転写酵素をさらに含んでなる、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
逆転写酵素を含んでなる第二溶液混合物をさらに含んでなる、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記ＲＴ阻害低減剤が、Ｓｓｏ７ｄである、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項８に記載のキット。
【請求項１３】
前記逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である、請求項８に記載のキット。
【請求項１４】
前記塩が、マグネシウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載のキット。
【請求項１５】
ヌクレアーゼ不含水をさらに含んでなる、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１１月２７日に出願した、米国仮出願第61/004,516号の優先権を主張し、ここにその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
現在の分子生物学において、核酸の検出、分析、転写、及び増幅は最も重要な方法である。ＲＮＡ分析のためのこのような方法の応用は、いくつか例を挙げると、遺伝子発現の調査、感染性因子又は遺伝性疾患の診断、ｃＤＮＡの作製、及びレトロウイルスの分析において特に重要である。ＲＮＡの逆転写後にポリメラーゼ連鎖反応増幅を行う方法は、一般的にＲＴ−ＰＣＲと呼ばれ、ＲＮＡの検出及び定量のために広く使用されるようになっている。
【０００３】
ＲＴ−ＰＣＲ法には、２つの別々の分子合成が必要であり：（i）ＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの合成；及び（ii）新規に合成されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅による複製、がある。ＲＴ−ＰＣＲは、３つの一般的なプロトコルで行うことができる：（１）２ステップＲＴ−ＰＣＲとも言われる非連結（uncoupled）ＲＴ−ＰＣＲ；（２）単一酵素連結（coupled）ＲＴ−ＰＣＲ（連結ＲＴ−ＰＣＲは、１ステップＲＴ−ＰＣＲ又は連続ＲＴ−ＰＣＲとも言われる）、ここで単一ポリメラーゼが、ＲＮＡからのｃＤＮＡ作製並びに続くＤＮＡ増幅の両方で使用される；及び（３）２つ（又はそれ以上）の酵素連結ＲＴ−ＰＣＲ、ここで少なくとも２つの別々のポリメラーゼが、初期のｃＤＮＡ合成及び続く複製及び増幅で使用される。
【０００４】
非連結ＲＴ−ＰＣＲにおいて、逆転写は、逆転写酵素活性のために最適な緩衝液及び反応条件を用いて、独立のステップとして行われる。ｃＤＮＡ合成の後、ＲＴ反応生成物の一定量を、ＰＣＲ増幅に最低な条件下で、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと共に、ＰＣＲ増幅のためにテンプレートとして用いる。
【０００５】
連結ＲＴ−ＰＣＲにおいて、逆転写及びＰＣＲ増幅は、単一の反応混合物に組み込まれる。単一酵素ＲＴ−ＰＣＲは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等のいくつかのＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を活用し、一方、２つの酵素ＲＴ−ＰＣＲは、レトロウイルス又は細菌性逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ−ＲＴ、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ，ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Carboxydothermus hydrogenoformam）ＤＮＡポリメラーゼ、又はその変異体、変種もしくは誘導体）、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｌｌ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４等、又はその変異体、変種もしくは誘導体）を典型的に用いる。
【０００６】
連結ＲＴ−ＰＣＲは、非連結ＲＴ−ＰＣＲを超える多数の利点を提供する。連結ＲＴ−ＰＣＲは、必要な反応混合試薬及び核酸産物の処理が、非連結ＲＴ−ＰＣＲよりも少ない（例えば、２つの反応ステップの間の、成分又は酵素の添加のために反応管の開封、等）、したがって労力が少なくなり、必要なマンアワーの低減がなされる。連結ＲＴ−ＰＣＲは、必要なサンプルの低減、及びコンタミネーションの危険性の低減もする（Selmer and Turbett, 1998）。
【０００７】
単一酵素連結ＲＴ−ＰＣＲは、これまでで最も単純なＲＴ−ＰＣＲ法である。しかしながら、このシステムは、ＤＮＡポリメラーゼの量が必要であるため、実行するには高価である。さらに、単一酵素連結ＲＴ−ＰＣＲ法は、非連結ＲＴ−ＰＣＲより感度が低いことが判明しており（Cusi et al., 1994）、重合する核酸の長さが１キロベースペア（＞１kb）未満に限定される。２つの酵素ＲＴ−ＰＣＲシステムは、単一反応混合物において組み合わされた場合でも、一般的に単一酵素システムをよりも感度の向上を示す。この効果は、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性と比較して、逆転写酵素の有効性がより高いことに寄与している（Sellner and Turbett, 1998）。
【０００８】
２つの酵素連結ＲＴ−ＰＣＲシステムは、非連結プロトコルよりも感度が高いが、ｃＤＮＡの複製の際に逆転写酵素がＤＮＡポリメラーゼを妨害するため、この方法の感度及び有効性を低減することがわかっている（Sellner et al., 1992; Aatsinki et al., 1994; Mallet et al., (1995)）。逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼに対する阻害活性を克服するための様々な解決方法が試みられており、例えば、テンプレートＲＮＡ量の増加、逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼの比率の増加、逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼへの阻害効果を低減できる調節試薬（例えば、非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、硫黄又は酢酸塩含有分子等）の添加、及びＤＮＡポリメラーゼ添加前の逆転写酵素の熱不活性化がある。
【０００９】
しかしながら、これら全ての修正ＲＴ−ＰＣＲ法は重大な欠点を有する。テンプレートＲＮＡの増量は、限られた量のサンプルしか利用できない場合不可能である。ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の比率を個別に最適化することは、１ステップＲＴ−ＰＣＲのためのすぐに使用できる試薬キットとしては実用的でない。現在提案される調整試薬の、ＤＮＡ重合から逆転写酵素阻害を取り除く最終的な効果は、議論の余地があり、未解決である。これらの試薬による正の効果は、ＲＮＡテンプレート量、ＲＮＡ組成に大きく依存するか、特定の逆転写酵素−ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが必要な可能性がある（例えば、Chandler et al, 1998を参照されたい）。最後に、ＤＮＡポリメラーゼ試薬添加前の逆転写酵素の熱不活性化は、結合ＲＴ−ＰＣＲの利点を無効にし、且つ既に議論した非連結ＲＴ−ＰＣＲの全ての不利点がもたらされる。
【００１０】
ＲＴ−ＰＣＲ応用が重要なので、一般化したすぐに使用できる組成物の状態で、ＲＴ阻害を低減した１ステップＲＴ−ＰＣＲシステムであって、高感度を呈し、少量の初期サンプルを必要とし、実行者の操作量を低減し、コンタミネーションの危険性を最小限にし、試薬の費用を最小限にし、特定の反応緩衝液の使用に限定されず、且つ核酸最終産物の量を最大限にするシステムが、当該技術分野で必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
スラミン、Ｓｓｏ７ｄ、ホスホロオリゴデオキシヌクレオチド、ＡｌｕＩメチラーゼ又はポリ（ｒＡ）（ｄＴ）n、又はその任意の組み合わせの存在下でＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写酵素（ＲＴ）阻害が低減できることが発見された。
【００１２】
ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡテンプレート由来の核酸を作製及び複製するために使用される１分子操作である。ＲＴ−ＰＣＲは、本発明の組成物及び方法を活用できる例示的なプロトコルとして本明細書に記載される。本発明が、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ活性の組み合わせを必要とする他の方法において有用であることは、当業者に容易に理解されるはずである。ＲＴ−ＰＣＲには、２つの別々の分子合成が必要であり、（i）ＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡ合成；及び（ii）新規に合成されたＰＣＲ増幅によるｃＤＮＡの複製、である。
【００１３】
ある実施態様によれば、本発明は、ＲＮＡテンプレートを、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｏ７ｅ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン又はポリ（ｒＡ）（ｄＴ）であってもよいＲＴ阻害低減剤を含んでなる組成物と混合するステップを含む、核酸分子を増幅させる方法を提供する。また、本方法は、当該ＲＮＡテンプレートの全て又は一部と相補的なＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下で、当該混合物をインキュベートするステップを含んでなり、それにより当該核酸分子を増幅する、核酸分子を増幅させることを含む。
【００１４】
第二の実施態様によれば、本発明は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｏ７ｅ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン又はポリ（ｒＡ）（ｄＴ）であってもよいＲＴ阻害低減剤を含んでなる組成物を提供する。
【００１５】
第三の実施態様によれば、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｏ７ｅ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン又はポリ（ｒＡ）（ｄＴ）であってもよいＲＴ阻害低減剤を含んでなる第一溶液混合物を含むキットを提供する。本キットは、緩衝剤、ヌクレオチド、塩、安定化剤、指示書、プライマーＲＮＡテンプレート、色素及びヌクレアーゼ不含水の少なくとも１つを任意に含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】図１ａ−１ｆは、配列非特異的二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ＳＳＯ７ｄの添加により、逆転写酵素の阻害が低減し、１ステップＲＴ−ＰＣＲの特異性が向上することを示す。図１ａは、ＳＳＯ７ｄ不存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクル（threshold cycle）を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ＳＳＯ７ｄ不存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図１ｃ】図１ｃは、0.1μM ＳＳＯ７ｄの存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図１ｄ】図１ｄは、0.1μM ＳＳＯ７ｄの存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図１ｅ】図１ｅは、0.2μM ＳＳＯ７ｄの存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図１ｆ】図１ｄは、0.2μM ＳＳＯ７ｄの存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【００１７】
【図２ａ】図２ａ−２ｄは、Ａｌｕメチラーゼの添加により、逆転写酵素の阻害が低減し、１ステップＲＴ−ＰＣＲの特異性が向上することを示す。図２ａは、2.5μM ＡｌｕＩメチラーゼ存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、2.5μM ＡｌｕＩメチラーゼ存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図２ｃ】図２ｃは、ＡｌｕＩメチラーゼ不存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図２ｄ】図２ｄは、ＡｌｕＩメチラーゼ不存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【００１８】
【図３ａ】図３ａ−３ｆは、スラミンの添加により、逆転写酵素の阻害が低減し、１ステップＲＴ−ＰＣＲの特異性が向上することを示す。図３ａは、スラミン存在下での、サイクルに対するＲＦＵを示す。
【図３ｂ】図３ｂは、スラミン不存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図３ｃ】図３ｃは、スラミン不存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図３ｄ】図３ｄは、4 ng/μlスラミン存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図３ｅ】図３ｅは、4 ng/μlスラミン存在下での、サイクルに対するＲＦＵを示す。
【図３ｆ】図３ｆは、4 ng/μlスラミン存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【００１９】
【図４ａ】図４ａ−４ｈは、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）の添加により、逆転写酵素の阻害が低減し、１ステップＲＴ−ＰＣＲの特異性が向上することを示す。図４ａは、0.1 nM ＳｄＣ存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図４ｂ】図４ｂは、0.1 nM ＳｄＣ存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図４ｃ】図４ｃは、0.5 nM ＳｄＣ存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図４ｄ】図４ｄは、0.5 nM ＳｄＣ存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図４ｅ】図４ｅは、2 nM ＳｄＣ存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図４ｆ】図４ｆは、2 nM ＳｄＣ存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図４ｇ】図４ｇは、10 nM ＳｄＣ存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図４ｈ】図４ｈは、10 nM ＳｄＣ存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【００２０】
【図５ａ】図５ａ−５ｄは、ポリ（ｒＡ）（ｄＴ）の添加により、逆転写酵素の阻害が低減し、１ステップＲＴ−ＰＣＲの特異性が向上することを示す。図５ａは、10 nM ポリ（ｒＡ）（ｄＴ）存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図５ｂ】図５ｂは、10 nM ポリ（ｒＡ）（ｄＴ）存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【図５ｃ】図５ｃは、ポリ（ｒＡ）（ｄＴ）不存在下での、ナノグラム単位のｌｏｇ初期量に対する閾値サイクルを示す。
【図５ｄ】図５ｄは、ポリ（ｒＡ）（ｄＴ）不存在下での、温度に対する−ｄ（ＦＲＵ）／ｄＴを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．核酸分子増幅のための方法
核酸の定量的増幅を行うための様々な方法が知られている。これらの技術には、５'〜３'エキソヌクレアーゼアッセイ、例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブの使用がある（例えば、米国特許第5,210,015号及び第5,487,972号；Heid et al, Genome Res. 6:986-994, 1996；Holland et al, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 88:7276-7280, 1991；及び Lee et al, Nuc. Acids Res. 21:3761-3766, 1993を参照されたい）。他の方法論では、（１又は複数の）オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズされる場合、蛍光の変化が発生するように構築した、１又は複数のプローブオリゴヌクレオチドを使用する。例えば、当該方法の１つでは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する、２つの蛍光色素分子、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）ハイブリダイゼーションプローブ等のアプローチがあり、ここでは２つのオリゴプローブをアニール化してアンプリコンにする（例えば、米国特許第6,174,670号を参照されたい）。当該オリゴヌクレオチドを、有効なエネルギー転移に適合するある距離で分離された蛍光色素分子と、頭−尾（head-to-tail）方向でハイブリダイズするよう設計する。核酸に結合するか、伸長産物に組み込まれる場合、シグナルを放出するように構築される標識されたオリゴヌクレオチドのその他の例には、スコーピオン（Scorpions）（商標）プローブ（例えば、Whitcombe et al, Nature Biotechnology 17:804-807, 1999、及び米国特許第6,326,14号）、サンライズ（Sunrise）（又はアンプリフロア（Ampliflour）（商標））プライマー（例えば、Nazarenko et al, Nuc. Acids Res. 25:2516-2521, 1997、及び米国特許第6,117,635号）、ラックス（LUX）（商標）プライマー及びモレキュラー・ビーコンズ（Molecular Beacons）（商標）プローブ（例えば、Tyagi et al, Nature Biotechnology 14:303-308, 1996、及び米国特許第5,989,823号）がある。
【００２２】
本発明は、核酸分子を増幅するための方法を提供する。本方法には、ＲＮＡテンプレートを、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＴ阻害低減剤を含む組成物と混合することが必要である。ＲＴ阻害低減剤は、Ｓｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｏ７ｅ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン及びポリ（ｒＡ）（ｄＴ）であってもよい。当該混合は混合物を形成し、これをＲＮＡテンプレートの全てもしくは一部と相補的なＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下でインキュベートし、それにより核酸分子を増幅する。
【００２３】
ＲＴ−ＰＣＲにおいて、反応混合物を、最初に、ＲＮＡテンプレートの少なくとも一部と相補的なＤＮＡ分子を合成するのに十分な温度で（適切な緩衝剤中で）インキュベートする。逆転写反応混合物の成分には、典型的には、ＲＮＡテンプレート及びＤＮＡプライマー（オリゴｄＴ、ランダムヘキサマー、又は遺伝子特異的プライマー）であって、そこから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が作製されるもの；逆転写酵素活性を呈する核酸ポリメラーゼ；及び核酸合成に必要な適切なヌクレオチド構成要素、がある。本発明の目的に応じて、ｃＤＮＡ分子は、その核酸配列がＲＮＡ分子に相補的である、任意のＤＮＡ分子として定義される。ＲＮＡテンプレートは、ｃＤＮＡ分子がそこから合成できる、核酸配列を提供するために使用される任意のＲＮＡ分子として定義される。ＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素活性を呈する核酸ポリメラーゼを活用することにより典型的に達成される。本発明の目的に応じて、逆転写酵素活性とは、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡ分子を重合する酵素の能力のことを言い、逆転写酵素は、広く逆転写酵素活性を有する任意の酵素のことを言う。逆転写は、典型的には約20℃〜約75℃、好ましくは約35℃〜約70℃の範囲の温度で起きる。
【００２４】
ｃＤＮＡ分子を作製するためのＲＮＡテンプレートの逆転写後、当該ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ分子の複製に十分な条件下、（適切な緩衝剤中で）インキュベートする。当該反応混合物は、連結（別名、連続又は１ステップ）ＲＴ−ＰＣＲで使用されるような、従来の逆転写酵素反応混合物のものと同じとすることができ、又は当該反応混合物は、従来の逆転写反応混合物の一定量を含むことができ、且つ、非連結（又は２ステップ）ＲＴ−ＰＣＲのように、核酸複製をさらに修正することができる。複製反応混合物の成分には、典型的には、核酸テンプレート（この例ではｃＤＮＡ）；ＤＮＡプライマー；核酸ポリメラーゼ；及び核酸の合成に必要な適切なヌクレオチド構成要素、がある。核酸複製とは、その配列が別の核酸により決定され、且つその別の核酸と相補的である核酸の重合のことを言う。本明細書で使用されるＤＮＡ複製は、ＤＮＡ増幅と同義語である。好ましくはＤＮＡ増幅は、繰り返し起き、核酸配列の両方の鎖、すなわち、ＲＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡと、その核酸配列がＲＮＡテンプレートと実質的に同一であるＤＮＡを複製することである。反復又は循環式のＤＮＡ複製は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における熱安定性ポリメラーゼを用いて都合よく達成することができる。
【００２５】
ＰＣＲは、当該技術分野で周知の技術である。ＰＣＲは、反応混合物に以下のサイクルを受けさせることにより核酸を増幅するために使用する。サイクルは、（i）核酸変性、（ii）オリゴヌクレオチドプレイマーのアニーリング、及び（iii）核酸重合である。増幅のための好ましい反応条件には、熱サイクル、すなわち、ＰＣＲサイクルの各ステップを促進するように、反応混合物の温度を変化させること、が含まれる。ＰＣＲは、典型的には、変性、アニーリング、及び複製の複数サイクルを通じて伸長され、（任意に及び好ましくは）初期の変性ステップの延長、及び最後の伸長（重合）ステップの延長で増大される。熱サイクルは、典型的には、約23℃〜約100℃、及び好ましくは約37℃〜約95℃の範囲の温度で行う。核酸変性は、典型的には、約90℃〜約100℃で、好ましくは約94℃で起きる。アニーリングは、典型的には、約37℃〜約75℃、好ましくは約60℃で起きる。重合は、典型的には、約55℃〜約80℃、好ましくは約72℃で起きる。熱サイクルの数は、実施者の好み、使用されるＤＮＡテンプレートの量、及び所望のＤＮＡ産物の量により、大きく変動させることができる。好ましくは、ＰＣＲサイクル数は、約５〜約99サイクルの範囲、より好ましくは約20サイクル以上、最も好ましくは約40サイクル以上である。
【００２６】
プライマーは、18〜25ヌクレオチドの長さ、及びＧＣ含量が40〜65％の、標準的ＰＣＲ指針に従って設計すべきである。プライマー設計は、内部二次構造化、及び各プライマーとプライマー対内の３'末端の相補性を回避すべきである。最適な結果には、プライマー濃度100〜500 nMでの滴定を要する可能性がある。プライマー当たり300 nMの終濃度が、反応に最も有効である。一般的には、反応効率及び／又は特異性は、各プライマーを等濃度で使用することにより最適化できる。最良の結果のためには、定量ＲＴ−ＰＣＲで、アンプリコンサイズを50〜200 bpに限定すべきである。
【００２７】
提案するテンプレート投入量としては、0.1 pg〜100 ngの全ＲＮＡ；10 fg〜100 ngのポリＡ（＋）ＲＮＡである。第一の鎖合成は、40℃〜52℃の間で行うことができる。一般的に、50℃で10分のインキュベーションにより、最適な結果が得られる。
【００２８】
Ａ．ＲＮＡテンプレート
テンプレートＲＮＡは、実施者にとって既知又は未知の、注目の任意のリボ核酸とすることができる。テンプレートＲＮＡは、人工的に合成することも、天然供給源から単離することもできる。ある実施態様によれば、ＲＮＡテンプレートは、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡ等のリボ核酸があり得る。好ましくは、当該ＲＮＡはｍＲＮＡである。より好ましくは、ＲＮＡは生物活性であるか、生物活性ポリペプチドをコードする。
【００２９】
ＲＮＡテンプレートは、任意の有用な量で存在させることができる。ある実施態様によれば、ＲＮＡテンプレート濃度は、50 pg/μL以下である。他のＲＮＡテンプレート濃度が、本発明において有用であることは、当業者に容易に理解されるはずである。
【００３０】
Ｂ．逆転写酵素
本発明に有用である逆転写酵素は、逆転写酵素活性を呈する任意のポリメラーゼがあり得る。好ましい酵素には、低減したＲＮａｓｅ Ｈ活性を呈するものがある。いくつかの逆転写酵素は、当業者に既知であり、市販されている（例えば、Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.; Life Technologies, Inc., Rockville, Md.; New England Biolabs, Inc., Beverley, Mass.; Perkin Elmer Corp., Norwalk, Conn.; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ. ; Qiagen, Inc., Valencia, Calif.; Stratagene, La Jolla, Calif等から）。ある実施態様によれば、当該逆転写酵素は、ニワトリ骨髄芽球腫ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、Ｃ．ヒドロゲノフォルマンスＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｉ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ II、及びその変異体、変種もしくは誘導体があり得る。発明又はその好ましい実施態様の範囲を逸脱しない限り、特に上で記載されていない逆転写酵素等の、様々な逆転写酵素を本発明で使用することができる。他の実施態様によれば、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
【００３１】
Ｃ．ＤＮＡポリメラーゼ
本発明で有用であるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子を複製することができる任意のポリメラーゼがあり得る。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、これは特にＰＣＲにとって有用である。熱安定性ポリメラーゼは、様々な好熱細菌から単離され、当該好熱細菌には、例えば、サーマス・アクティクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）、サーマス・ブロキアナス（Thermus brockianus）（Ｔｂｒ）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）（Ｔｆｌ）、サーマス・ルベル（Thermus ruber）（Ｔｒｕ）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（Ｔｌｉ）、及びサーモコッカス属の他の種、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）（Ｔａｃ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）（Ｔｎｅ）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）（Ｔｍａ）、及びサーモトガ属の他の種、プロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Ｐｆｕ）、ピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）（Ｐｗｏ）、及びピロコッカス属の他の種、バチルス・ストロサーモフィラス（Bacillus sterothermophilus）（Ｂｓｔ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）（Ｓａｃ）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）（Ｓｓｏ）、ピロジクチウム・オクルタム（Pyrodictium occultum）（Ｐｏｃ）、ピロジクチウム・アビシ（Pyrodictium abyssi）（Ｐａｂ）、及びメタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス（Methanobacterium thermoautotrophicum）（Ｍｔｈ）、及びその変異体、変種もしくは誘導体等がある。
【００３２】
いくつかのＤＮＡポリメラーゼは、既知であり市販されている（例えば、Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.; Life Technologies, Inc., Rockville, Md; New England Biolabs, Inc., Beverley, Mass.; Perkin Elmer Corp., Norwalk, Conn.; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, N.J.; Qiagen, Inc., Valencia, Calif.; Stratagene, La Jolla, Calif等から）。ある実施態様によれえば、当該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｍ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ4、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）及びその活性変異体、変種および誘導体があり得る。発明又はその好ましい実施態様の範囲を逸脱しない限り、特に上で記載されていないＤＮＡポリメラーゼ等の、様々なＤＮＡポリメラーゼを本発明で使用することができる。他の実施態様によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。他のＤＮＡポリメラーゼが本発明に有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００３３】
本発明の方法において有用である他のＤＮＡポリメラーゼには、限定するものではないが、好熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
【００３４】
逆転写酵素は、ＤＮＡポリメラーゼに対して任意の適切な比率で存在することができる。ある実施態様によれば、活性単位での、ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の比率は、３以上である。ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の他の比率が本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００３５】
Ｄ．ＲＴ阻害低減剤
ＲＴ阻害低減剤は、ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写酵素阻害を低減する任意の部分があり得る。ある実施態様によれば、本発明は、ＲＴ阻害低減剤を提供するが、当該ＲＴ阻害低減剤にはＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｏ７ｅ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン及びポリ（ｒＡ）（ｄＴ）があり得る。他のＲＴ阻害低減剤が本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００３６】
ある実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、任意の温度で機能する。他の実施態様によれば、配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は70℃未満で機能する。他の実施態様によれば、配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は55℃未満で機能する。
【００３７】
別の実施態様によれば、配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ修飾酵素とすることができ、限定するものではないが、Ａｌｕメチラーゼ等のメチラーゼ、二本鎖ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼ又は組み換え体がある。本発明において有用なＤＮＡ修飾酵素は、酵素活性を低減するか、酵素活性がないが、ｄｓＤＮＡ基質に結合する能力は維持している。
【００３８】
他の実施態様によれば、配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｓｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７、Ｓａｃ７ｅ又はＳｓｏ７ｅがあり得る。他の配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００３９】
さらなる実施態様によれば、本発明は、ＲＴ阻害低減剤としてスルホン酸分子を提供する。ある実施態様によれば、スルホン酸分子は、スルホン酸アンモニウム、スルホン酸マグネシウム、スルホン酸マンガン、スルホン酸カリウム、スルホン酸ナトリウム等のスルホン酸塩があり得る。他の実施態様によれば、スルホン酸分子は、ＡＭＰＳＯ（３−［（１,１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ,Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノメタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ＴＥＳ（２−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−３−プロパンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（ＴＥＳ（３−［［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロ−ヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ,Ｎ'−ビス−２−エタンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−Ｎ,Ｎ'−ビス［２−ヒドロキシ］プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−トリス｛ヒドロキシメチル｝メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＡＣＥＳ（Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ,Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）及びＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］プロパンスルホン酸）等の緩衝剤があり得る。さらに他の実施態様によれば、スルホン酸分子はスラミンである。さらに他の実施態様によれば、スルホン酸分子は、スルホン酸ポリマーがあり得る。他のスルホン酸分子が、本発明のＲＴ阻害低減剤として有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００４０】
他の実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、式：
オリゴデオキシヌクレオチド−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−オリゴデオキシヌクレオチド
のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドがあり得る。
【００４１】
ある実施態様によれば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン（ＳｄＡ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン（ＳｄＴ）又はホスホロチオエートオリゴデオキシグアニン（ＳｄＧ）があり得る。他の実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤はＳｄＣである。本発明のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、任意の大きさがあり得る。本発明で有用なホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、限定するものではないが、１０マー、１２マー、１４マー、１６マー、１８マー、２０マー、２２マー、２４マー、２６マー、２８マー等がある。当業者は、他のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドが本発明で有用であることを理解するはずである。
【００４２】
さらなる実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、ＤＮＡとＲＮＡ尾部を含んでなるＲＮＡとの二重鎖である。二重鎖のＤＮＡ部分は、別々に任意の好適なヌクレオチド配列とすることができ、任意の組み合わせでｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴを含む同種接合及び異種接合型の配列がある。二重鎖のＤＮＡ部分は、別々に任意の好適なヌクレオチド配列とすることができ、任意の組み合わせで、ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ及びｒＴを含む同種接合及び異種接合型の配列がある。ある実施態様によれば、ＤＮＡ部分は、オリゴ（ｄＴ）であり、ＲＮＡ部分はポリ（ｒＡ）である。ＲＮＡ尾部は、ポリ（ｒＡ）、ポリ（ｒＣ）、ポリ（ｒＧ）、又はポリ（ｒＴ）等の任意の適切な尾部があり得る。他の実施態様によれば、ＲＮＡ尾部はポリ（ｒＡ）である。
【００４３】
ＲＴ阻害低減剤は、任意の有用な量で存在することができる。ある実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、約0.01 nM〜約1000 nMの量で存在する。他の実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、約0.1 nM〜約100 nMの量で存在する。さらに他の実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、約1 nM〜約10 nMの量で存在する。当業者は、他の量のＲＴ阻害低減剤が本発明で有用であることを理解するはずである。
【００４４】
Ｅ．プライマー
ある実施態様によれば、本発明の方法は、核酸プライマーを含むことができる。本発明において有用であるオリゴヌクレオチドプライマーは、長さが２以上のヌクレオチドの、任意のオリゴヌクレオチドがあり得る。好ましくは、ＰＣＲプライマーは、長さが約１５〜約３０塩基であり、回文構造（自己相補的）又は反応混合物で使用できる他のプライマーと相補的ではない。限定するものではないが、プライマーは、ランダムプライマー、ホモポリマー、又は標的ＲＮＡテンプレートに特異的なプライマー（例えば、配列特異的プライマー）があり得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、相補的核酸の重合を促進する、標的核酸の領域とハイブリダイズするために使用されるオリゴヌクレオチドである。好ましいＲＴ−ＰＣＲ法においては、プライマーはＲＮＡテンプレートの部分に相補的な第一の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）の逆転写の促進に役立ち、そして核酸の複製（例えば、ＤＮＡのＰＣＲ増幅）の促進にも役立つ。任意のプライマーは、当該技術分野の通常の技能を有する実行者により合成できるか、任意の多数の供給業者（例えば、Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.; New England Biolabs, Inc., Beverley, Mass.; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, N.J.; Integrated DNA Technology, Coralville, Iowa; Eurogentec, San Diego, CA; Sigma Genesys, The Woodlands, TX）から購入できる。多数のアレイのプライマーが本発明で有用である可能性があり、発明の範囲又はその好ましい実施態様から逸脱しない限り、本明細書に具体的に記載されないものが含まれる。他の実施態様によれば、核酸プライマーは、ＲＮＡテンプレート部分と相補的である。
【００４５】
Ｆ．ヌクレオチド塩基
本発明において有用であるヌクレオチド塩基は、核酸の重合において有用である任意のヌクレオチドがあり得る。ヌクレオチドは、天然に存在する、ありふれていない、改変された、誘導体化された、又は人工的なものがあり得る。ヌクレオチドは、未標識であるか、当該技術分野で既知の方法で検出可能に標識することができる（例えば、放射性同位体、ビタミン、蛍光性又は化学発光性部分、ジオキシゲニン）。好ましくは、当該ヌクレオチドは、デオキシヌクレオシド３リン酸、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＮＩＴ、ビオチン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ）である。ｄＮＴＰは、当該技術分野で周知であり、供給業者から市販されている（例えば、Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.; New England Biolabs, Inc., Beverley, Mass.; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, N.J.から）。
【００４６】
本発明のヌクレオチドは、任意の濃度で存在することができる。ある実施態様によれば、ヌクレオチドは、約１μM〜約1000μMの量で存在する。他の実施態様によれば、ヌクレオチドは、約10μ〜約750μMの量で存在する。さらに他の実施態様によれば、ヌクレオチドは、約100μM〜約500μMの量で存在する。他の濃度のヌクレオチドが本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００４７】
Ｇ．緩衝剤及び塩
本発明において有用である緩衝剤及び塩は、核酸合成のため、例えば逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ活性のために、適切で安定なｐＨ及びイオン条件を提供する。本発明において有用であり得る様々な緩衝剤及び塩溶液及び修正緩衝液が既知であり、本明細書に特に開示されていない剤も含まれる。好ましい緩衝剤には、限定するものではないが、ＴＲＩＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＣＡＰＳがある。好ましい援用液には、限定するものではないが、酢酸カリウム、硫酸カリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムがある。
【００４８】
本発明の緩衝剤は、任意の濃度で存在することができる。ある実施態様によれば、緩衝剤は、約0.1 mM〜約1000 mMの量で存在する。他の実施態様によれば、緩衝剤は、約1 mM〜約500 mMの量で存在する。さらに他の実施態様によれば、緩衝剤は、約5 mM〜約250 mMの量で存在する。他の濃度の緩衝剤が本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００４９】
本発明の塩は、任意の濃度で存在することができる。ある実施態様によれば、塩は、約0.01 mM〜約1000 mMの量で存在する。他の実施態様によれば、塩は、約0.1 mM〜約500 mMの量で存在する。さらに他の実施態様によれば、塩は、約1 mM〜約100 mMの量で存在する。他の濃度の塩が本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００５０】
Ｈ．他の添加剤
逆転写、複製、及び／又は両反応の組み合わせを促進できる他の添加剤（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ促進のための剤）、本発明により最初に開示されたもの以外の他のものが、当該技術分野で既知である。本発明の組成物及び方法によれば、リボ核酸テンプレートからの核酸の作製及び複製を最適化するため、１又は複数のこれらの添加剤を本組成物に組み込むことができる。添加剤は、有機又は無機の化合物があり得る。本発明において有用である阻害緩和剤は、限定するものではないが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、アルブマックス（albumax）、カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、グロブリン、リゾチーム、トランスフェリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、α−ラクトアルブミン、フマラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アミログルコシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、β−ラクトグロブリン、アプロチニン、ダイズトリプシン阻害剤、トリプシノーゲン、ホスホリラーゼｂ、ミオシン、アクチン、β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、ダイズトリプシン消化物、トリプトース（tryptose）、レクチン、Ｅ.ｃｏｌｉ一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質等のポリペプチドがある。非ポリペプチド添加剤の例には、限定するものではないが、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、硫酸含有化合物、酢酸含有化合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＴＷＥＥＮ２０非イオン性界面活性剤、ＮＰ４０非イオン性界面活性剤、エクトイン（ectoine）、ポリオール、Ｅ.ｃｏｌｉ（ＳＢＢ）タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ＢＳＡがある。
【００５１】
さらに、増幅産物の検出のための手段を提供する剤の存在下で、増幅を行うことができる。例えば、当該反応容器に、増幅産物の同種リアルタイム検出のための、適切なハイブリダイゼーションプローブをあらかじめ入れておくことができる。好ましくは、これらのプローブを、蛍光部分で適切に標識することができる。他の成分には、二本鎖ＤＮＡと結合する色素がある。ある実施態様によれば、当該色素は、ＳＹＢＲグリーンがあり得る。他の色素が、本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００５２】
II．組成物及びキット
ある実施態様によれば、本発明は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｏ７ｅ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン及びポリ（ｒＡ）（ｄＴ）からなる群から選択されるＲＴ阻害低減剤を含んでなる組成物を提供する。他の実施態様によれば、当該ＲＴ阻害低減剤は、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）である。さらに他の実施態様によれば、組成物は、緩衝剤、ヌクレオチド、塩、安定化剤、プライマー又はヌクレアーゼ不含水のうち少なくとも１つを含むことができる。
【００５３】
別の実施態様によれば、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＳｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｏ７ｅ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシアデニン、ホスホロチオエートオリゴデオキシチミン及びポリ（ｒＡ）（ｄＴ）からなる群から選択されるＲＴ阻害低減剤を含んでなる第一溶液混合物を有するキットを提供する。当該キットは、緩衝剤、ヌクレオチド、塩、安定化剤、指示書、プライマー、ＲＮＡテンプレート、色素及びヌクレアーゼ不含水のうちの少なくとも１つを任意に含む。プライマー及びＲＮＡテンプレートを一緒にした両方の溶液混合物は、選択されたＲＮＡ標的のＲＴ−ＰＣＲを可能にするはずである。任意の緩衝剤、ヌクレオチド、塩、安定化剤、指示書、プライマー、ＲＮＡテンプレート、色素及びヌクレアーゼ不含水のいずれかを、第一溶液に個別に存在させることも、１又は複数の別々の溶液に存在させることもできる。
【００５４】
他の実施態様によれば、当該キットは、逆転写酵素も含む。他の実施態様によれば、逆転写酵素は、第一溶液中にある。さらに他の実施態様によれば、キットは、逆転写酵素を有する第二溶液を含む。さらに他の実施態様によれば、第一溶液は、緩衝剤、ヌクレオチド及び塩、をさらに含んでなり、第三溶液は、ヌクレアーゼ不含水を含んでなる。さらに他の実施態様によれば、第一溶液は、緩衝剤、ヌクレオチド、色素及び塩をさらに含んでなり、第三溶液は、ヌクレアーゼ不含水を含んでなる。
【００５５】
ある実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、Ｓｓｏ７ｄ、ＡｌｕＩメチラーゼ、スラミン、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）、及びポリ（ｒＡ）（ｄＴ）からなる群から選択されるメンバーである。他の実施態様によれば、ＲＴ阻害低減剤は、ホスホロチオエートオリゴデオキシシトシン（ＳｄＣ）である。他の実施態様によれば、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑである。さらに他の実施態様によれば、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。さらに他の実施態様によれば、塩は、マグネシウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩又はその組み合わせのいずれかがあり得る。さらに他の実施態様によれば、当該キットは、ヌクレアーゼ不含水をさらに含むことができる。
【００５６】
本発明において有用である安定化剤には、限定するものではないが、ポリオール（グリセロール、トレイトール等）、環状ポリエーテル等のポリエーテル、ポリエチレングリコール、有機もしくは無機の塩、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、有機スルホン酸塩等、糖、ポリアルコール、アミノ酸、ペプチド、又はカルボン酸、消光剤及び／又はスカベンジャー、例えば、マンニトール、グリセロール、還元グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はゼラチン、スペルミジン、ジチオトレイトール（又はメルカプトエタノール）及び／又は洗浄剤、例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００［オクトフェノール（エチレングリコールエーテル）］、ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）［ポリオキシエチレン９ラウリルエーテル（Ｃ12Ｅ9）］、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート２０，ＮＰ４０）及びＢＲＩＪ（登録商標）−３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）がある。他の安定化剤が本発明で有用であることは、当業者に理解されるはずである。
【００５７】
本発明の組成物及びキットは、ハイブリダイゼーションプローブも含むことができる。ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡ及びＲＮＡサンプルにおけるヌクレオチド配列の存在を検出するために使用されるＤＮＡ断片である。当該プローブは、一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の相補部分とハイブリダイズする。本発明で有用であるハイブリダイゼーションプローブを、検出を促進するために、例えば、放射活性又は蛍光色素分子で標識することができる。
【実施例】
【００５８】
III．実施例
実施例１：ＲＴ−ＰＣＲにおけるＲＴ阻害の低減
逆転写酵素以外の全ての成分を室温で溶解させる。穏やかに、しかし完全に混合し、その後、４℃で遠心分離し、管の底に内容物を集める。使用前に氷上で冷却する。必要ならば、４℃で再び短時間の遠心分離をする。
【００５９】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、塩化マグネシウム、安定化剤及びＳｄＣの混合物に、順方向プライマー、逆方向プライマー、ヌクレアーゼ不含水及び逆転写酵素を添加する。サンプルテンプレート（全ＲＮＡ）以外の全ての必要な成分を有する反応カクテルを集め、各反応管に同量ずつ分注する。最終段階として、標的サンプル（ＲＮＡテンプレート）を各反応物に５〜10μlの量で添加する。
【００６０】
その後、反応混合物を、リアルタイム熱検出システムで以下の通りにインキュベートした。
ｃＤＮＡ合成：50℃で10分、
逆転写酵素不活性化：95℃で５分、
ＰＣＲサイクル及び検出（30〜45サイクル）：95℃で10秒、その後、55℃〜60℃で30秒。
【００６１】
実施例２：キット
以下の濃度に従ってキットを調製できる。
【００６２】
【表１】
0005702148.tif 000002
【００６３】
本明細書に添付の請求の範囲において、「１つの（a、an）」なる用語は、「１又は複数」を意味することにする。「含んでなる（comprise）」なる用語、及び「含んでなる（comprises）」及び「含むこと（comprising）」等のその変形は、ステップ又は要素の記載の前にある場合、さらなるステップ又は要素の追加が、任意であり且つ排除されないことを意味することにする。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び他の発行文献は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される任意の文献と、本明細書の明らかな教示との間の任意の不一致は、本明細書の教示を優先して解消することにする。これは、単語又は用語の技術的に理解される定義と、同じ単語又は用語について本明細書で明らかに提供される定義との間の任意の不一致にも適用される。
【図１ａ】
0005702148.tif 000003
【図１ｂ】
0005702148.tif 000004
【図１ｃ】
0005702148.tif 000005
【図１ｄ】
0005702148.tif 000006
【図１ｅ】
0005702148.tif 000007
【図１ｆ】
0005702148.tif 000008
【図２ａ】
0005702148.tif 000009
【図２ｂ】
0005702148.tif 000010
【図２ｃ】
0005702148.tif 000011
【図２ｄ】
0005702148.tif 000012
【図３ａ】
0005702148.tif 000013
【図３ｂ】
0005702148.tif 000014
【図３ｃ】
0005702148.tif 000015
【図３ｄ】
0005702148.tif 000016
【図３ｅ】
0005702148.tif 000017
【図３ｆ】
0005702148.tif 000018
【図４ａ】
0005702148.tif 000019
【図４ｂ】
0005702148.tif 000020
【図４ｃ】
0005702148.tif 000021
【図４ｄ】
0005702148.tif 000022
【図４ｅ】
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【図４ｆ】
0005702148.tif 000024
【図４ｇ】
0005702148.tif 000025
【図４ｈ】
0005702148.tif 000026
【図５ａ】
0005702148.tif 000027
【図５ｂ】
0005702148.tif 000028
【図５ｃ】
0005702148.tif 000029
【図５ｄ】
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