(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
うっ血性心不全患者における転帰不良のリスクを決定するための方法であって、
ヒトである患者から得られた心臓組織試料におけるＢＩＮ１発現レベルをアッセイするステップと、
ＢＩＮ１発現レベルを使用して患者の転帰不良のリスクを決定するステップとを含み、ＢＩＮ１発現レベルの減少が、転帰不良のリスクの増加と正に相関している、方法。
【請求項２】
うっ血性心不全患者が心臓移植を受けており、心臓組織試料が移植された心臓のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）患者の心臓が、機械的補助デバイスに接続されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者が、ＣＨＦの治療を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者が、免疫抑制療法を受けている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
アッセイするステップが、ＢＩＮ１  ｍＲＮＡのレベルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アッセイするステップが、ＢＩＮ１タンパク質のレベルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣａＶ１．２発現レベルをアッセイするステップと、アッセイされたＣａＶ１．２発現レベルを使用してＢＩＮ１発現レベルを正規化するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
転帰不良が、心臓病死である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
うっ血性心不全患者における転帰不良のリスクを決定するための方法であって、
ヒトである患者から得られた心臓組織試料におけるＢＩＮ１および内部コントロール遺伝子の発現レベルをアッセイするステップと、
内部コントロール遺伝子発現レベルのＢＩＮ１発現レベルに対する比を計算することによって内因性疾患因子（ＩＤＦ）を決定するステップと、
ＩＤＦを使用して患者の転帰不良のリスクを決定するステップとを含み、ＩＤＦの増加が、転帰不良のリスクの増加と正に相関している、方法。
【請求項１１】
内部コントロール遺伝子が、ハウスキーピング遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
内部コントロール遺伝子が、ＣａＶ１．２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
アッセイするステップが、ＢＩＮ１および内部コントロール遺伝子ｍＲＮＡのレベルを測定するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
うっ血性心不全患者が心臓移植を受けており、心臓組織試料が移植された心臓のものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）患者の心臓が、機械的補助デバイスに接続されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
患者が、ＣＨＦの治療を受けている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
患者が、免疫抑制療法を受けている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
転帰不良が、心臓病死である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００９年４月２４日に出願された米国仮出願番号６１／１７２，６０８に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所、ＮＨＬＢＩから与えられた助成番号ＨＬ０７５４４９による政府の援助を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、心血管疾患およびそれを評定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ここ１０年の間に、うっ血性心不全（ＣＨＦ）は急増して、循環器科において最も突出した公衆衛生問題となった。ＣＨＦは、世界中で２０００万近くの人および約５００万のアメリカ人に影響を及ぼす。米国単独で、年間に約４００，０００のＣＨＦの新しい症例が診断され、この状態は１年当たり約２００，０００件の死亡例の原因となっている。ＣＨＦと診断された約１００，０００患者は、末期心不全を有する。現在、これらの末期の心不全患者の治療は心臓移植である。しかし、毎年わずか２０００の心臓しか心臓移植に利用可能ではない。心臓移植を待っている患者を安定させるために、機械的補助デバイスが使用されることもある。場合によっては、機械的補助デバイスは、心臓移植までの繋ぎとしてよりも治療の選択肢として考えられている。
【発明の概要】
【０００５】
心臓の健康状態を診断するため、および治療の選択肢および治療の有効性を評価するための、診断方法が必要である。
【０００６】
本開示は、うっ血性心不全と診断された患者における転帰不良のリスクの評価における、ＢＩＮ１発現レベルの使用を含む方法を提供する。この方法は、心臓移植候補である患者を評価することにおいて、ならびに療法の選択肢を決定することおよびうっ血性心不全患者における治療の有効性を評定することにおいて、用途が見出される。
【０００７】
したがって、本開示は、うっ血性心不全患者における転帰不良のリスクを決定するための方法であって、患者から得られた心臓組織試料におけるＢＩＮ１発現レベルをアッセイするステップと、ＢＩＮ１発現レベルを使用して患者の転帰不良のリスクを決定するステップとを含み、ＢＩＮ１発現レベルの減少が、転帰不良のリスクの増加と正に相関している、方法を提供する。転帰不良は、例えば、心臓病死、機械的デバイスサポートを必要とすること（例えば、左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）埋込み）、または２５％未満の左室駆出率を包含し得る。ある特定の実施形態では、うっ血性心不全患者は、心臓移植を受けており、心臓組織試料は移植された心臓のものである。関連する実施形態において、うっ血性心不全患者の心臓は、機械的補助デバイスに接続されている。別の実施形態では、患者は、ＣＨＦの治療を受けている。さらなる実施形態において、患者は、免疫抑制療法を受けている。ある特定の実施形態では、参照ＢＩＮ発現レベルと比較したＢＩＮ１発現レベルの減少は、転帰不良のリスクの増加と正に相関している。
【０００８】
例示的な実施形態において、アッセイするステップは、ＢＩＮ１  ｍＲＮＡのレベルを測定するステップを含む。特定の場合において、アッセイするステップは、ＢＩＮ１タンパク質のレベルを測定するステップを含む。さらに別の実施形態において、方法は、ＣａＶ１．２発現レベルをアッセイするステップと、ＣａＶ１．２発現レベルを使用してＢＩＮ１発現レベルを正規化するステップとを含む。
【０００９】
本開示はまた、うっ血性心不全患者における転帰不良のリスクを決定するための方法であって、患者から得られた心臓組織試料におけるＢＩＮ１および内部コントロール遺伝子の発現レベルをアッセイするステップと；内部コントロール遺伝子発現レベルのＢＩＮ１発現レベルに対する比を計算することによって内因性疾患因子（ＩＤＦ：Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆａｃｔｏｒ）を決定するステップと；ＩＤＦを使用して患者の転帰不良のリスクを決定するステップとを含み、ＩＤＦの増加が転帰不良のリスクの増加と正に相関している、方法を提供する。例示的な実施形態において、内部コントロール遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子である。別の例において、内部コントロール遺伝子は、ＣａＶ１．２である。ある特定の実施形態では、アッセイするステップは、ＢＩＮ１および内部コントロール遺伝子ｍＲＮＡのレベルを測定するステップを含む。関連する実施形態において、うっ血性心不全患者は、心臓移植を受けており、心臓組織試料は、移植された心臓のものである。代替の実施形態において、うっ血性心不全患者の心臓は、機械的補助デバイスに接続されている。関連する実施形態において、患者は、ＣＨＦの治療を受けている。ある特定の実施形態では、患者は、免疫抑制療法を受けている。ある特定の実施形態では、患者のＩＤＦ比は、参照ＩＤＦと比較され、参照ＩＤＦ比より大きいＩＤＦ比は、転帰不良のリスクの増加の指標となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒト心臓におけるＣａＶ１．２発現を示す図である。（Ａ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（左）および半定量的ウェスタンブロットは、機能不全でないヒト心臓および機能不全ヒト心臓の両方においてＣａＶ１．２発現の差異を示さない。（Ｂ）０．１μｍのｚステップで取得した１００×共焦点像フレームのスタックから再構成した細胞内ＣａＶ１．２分布の３次元ボリュームビュー。
【図２】ＣａＶ１．２のＴ細管への、ＢＩＮ１により媒介される標的化を示す図である。（Ａ）固定されたマウス心筋細胞および免疫金標識されたＢＩＮ１（φ１０ｎｍの小さい点）およびＣａＶ１．２（φ１５ｎｍの大きい点）の電子顕微鏡画像（スケールバー：２００ｎｍ）。ＢＩＮ１およびＣａＶ１．２は、Ｚ線に近いＴ細管膜上に５０ｎｍ範囲内に密集している。（Ｂ）ＣａＶ１．２は、ＢＩＮ１により免疫沈降する。
【図３】ＣａＶ１．２標的化が、Ｔ細管構造ではなくＢＩＮ１を必要とすることを示す図である。（Ａ）野生型ＢＩＮ１（ＢＩＮ１−ＷＴ）のドメインマップは、Ｎ末端のＢＡＲドメイン、その後に続くエクソン１０によりコードされる１５アミノ酸、コイルドコイル領域およびＣ末端ＳＨ３ドメインを示す。（Ｂ）ＢＩＮ１−ＷＴまたはＢＩＮ１切断型（Ｔ細管形成ドメインを保持しているがＣａＶ１．２結合ドメインを欠くＢＩＮ１−ＢＡＲ＊）のいずれかによりトランスフェクトされたＨＬ−１細胞におけるＣａＶ１．２の表面ビオチン化は、全長ＢＩＮ１が、ＣａＶ１．２の表面発現を誘導するために必要であることを示す。
【図４】心臓およびＴ細管形態におけるＢＩＮ１の発現レベルを示す図である。（Ａ）定量的ｒｔ−ＰＣＲ分析（左）および半定量的ウェスタンブロットは、機能不全ヒト心臓におけるＢＩＮ１発現の顕著な低下を示す。（Ｂ）ＢＩＮ１で染色された単離ヒト心筋細胞の共焦点像（１００×）は、ＢＩＮ１染色によりはっきりと示されるＢＩＮ１の非常に低い発現および非常に薄いＴ細管構造を示す。０．１μｍのｚステップで取得された１００×共焦点像フレームのスタックから再構成されたＷＧＡ標識されたヒト心筋細胞の３Ｄボリュームビューは、機能不全ヒト心筋細胞における、組織化されたＴ細管ネットワークの喪失を明らかにしている。
【図５】ＣａＶ１．２の微小管依存性の前方輸送を示す図である。マウス心筋細胞の表面ビオチン化は、ノコダゾールが表面ＣａＶ１．２発現減少させ、ＣａＶ１．２輸送における微小管の必要性を示していたことを示す。
【図６】ＣａＶ１．２標的化は、ＡＰＣが先端に結合した微小管を伴うことを示す図である。（Ａ）表面ビオチン化は、ドミナントネガティブのＡＰＣ（ＤＮ  ＡＰＣ）が、ＨＬ−１細胞において表面ＣａＶ１．２発現を減少させたことを示す。（Ｂ）ＡＰＣ粒子は、ＢＩＮ１が存在しない場合、より速い速度でより長い距離運ばれる。
【図７】機能不全でない正常な心臓（Ａ）および機能不全心臓（Ｂ）におけるＢＩＮ１発現レベルを示す図である。（Ａ）心疾患以外の理由で死亡した個体の機能不全でない心臓は、左室自由壁（ＬＶＦＷ）および左室心尖部において同等のＢＩＮ１発現レベルを示す。（Ｂ）左室心尖部にＬＶＡＤを入れている末期拡張型心筋症患者の心臓は、左室心尖部心臓組織においてＢＩＮ１発現の回復を示す（ＬＶＦＷと比較して）。
【図８】正常心臓および罹患心臓についての、内因性疾患因子（ＣａＶ１．２  ｍＲＮＡのＢＩＮ１  ｍＲＮＡに対する比として測定した、ＩＤＦＣａＶ）を示す図である。（Ａ）外植されたドナー心臓についての心臓ＩＤＦＣａＶ。心疾患以外の理由で死亡した個体の機能不全でない心臓（黒丸）および末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒四角）についてのＩＤＦＣａＶ。心臓ＩＤＦＣａＶは、末期拡張型心筋症の心臓において顕著に高い。（Ｂ）心臓ＩＤＦＣａＶは、左室駆出率（ＬＶＥＦ）と相関関係を示す。心疾患以外の理由で死亡した正常コントロール個体の機能不全でない心臓（黒四角）および末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒丸）についてのＩＤＦＣａＶ。
【図９】正常心臓および罹患心臓についての、内因性疾患因子（ハウスキーピング遺伝子ｍＲＮＡのＢＩＮ１  ｍＲＮＡに対する比として測定した、ＩＤＦＨＫ）を示す図である。（Ａ）外植されたドナー心臓についての心臓ＩＤＦ（ＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡのＢＩＮ１  ｍＲＮＡに対する比として測定した、ＩＤＦＨＫ）。心疾患以外の理由で死亡した正常コントロール個体の機能不全でない心臓（黒丸）および末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒四角）についてのＩＤＦＨＫ。心臓ＩＤＦＨＫは、末期拡張型心筋症の心臓において顕著に高い。（Ｂ）心臓ＩＤＦＨＫは、左室駆出率（ＬＶＥＦ）と相関関係を示した。心疾患以外の理由で死亡した正常コントロール個体の機能不全でない心臓（黒四角）および末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒丸）についてのＩＤＦＨＫ。
【図１０】ＢＩＮ発現レベル（ＣａＶ１．２に対して正規化された）の心拍出量との相関関係を示す図である。ＢＩＮ１のＣａｖ１．２に対する比は、ＩＤＦＣａＶの逆数である。
【図１１】１１Ａおよび１１Ｂは、例示的なＢＩＮ１ヌクレオチド（転写変異体８）（配列番号１）およびアミノ酸（アイソフォーム８）（配列番号２）配列をそれぞれ示す図である。
【図１２】１２Ａおよび１２Ｂは、例示的なＢＩＮ１ヌクレオチド（転写変異体９）（配列番号３）およびアミノ酸（アイソフォーム９）（配列番号４）配列をそれぞれ示す図である。
【図１３】１３Ａおよび１３Ｂは、例示的なＣａＶ１．２ヌクレオチド（配列番号５）およびアミノ酸（配列番号６）配列をそれぞれ示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明を説明する前に、本発明は記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら異なっていてもよいことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図しないこともまた理解されるべきである。
【００１２】
値の範囲が示される場合、その範囲の上限および下限の間にある各値もまた、文脈により別途明確に規定されない限り下限の単位の１０分の１まで、明確に開示されることが理解される。記載されている範囲における任意の記載されている値または間にある値の間のより小さい各範囲およびその記載されている範囲における任意の別の記載されている値または間にある値は、本発明の範囲内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、それぞれ独立に、その範囲に包含されてもよく、または除外されてもよく、そのより小さい範囲中にいずれかの限界が含まれる、いずれの限界も含まれない、またはいずれの限界も含まれる各範囲もまた、記載されている範囲における任意の明確に除外されている限界を条件として、本発明の範囲内に包含される。記載されている範囲が、限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれている限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１３】
別途規定されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様のまたは等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、いくつかの潜在的なおよび例示的な方法および材料を、以下に記載する。本明細書において言及されたすべての刊行物は、刊行物が関連して引用された方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する程度まで、組み込まれている刊行物のすべての開示に優先することが理解される。
【００１４】
本明細書で使用される場合および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別途明確に規定されない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つのハウスキーピング遺伝子（ａ  ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ）」への言及は、複数のそのような遺伝子を包含し、「その遺伝子（ｔｈｅ  ｇｅｎｅ）」への言及は、１つまたは複数の遺伝子および当業者に知られているその等価物への言及を包含するなどである。
【００１５】
特許請求の範囲は、任意選択であってもよい任意の要素を除外するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の詳述、または「消極的」限定の使用に関連して、「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語の使用のための先行詞として機能することを意図されている。
【００１６】
本明細書において論じられている刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ示されている。本明細書において、本発明が、先行発明のために、そのような刊行物に先行するという権利を有さないことの承認として解釈されるものはない。さらに、示されている刊行日は、それぞれ独立に確認する必要があるであろう実際の刊行日と異なる場合がある。
【００１７】
定義
「心不全」または「うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）」（ＣＨＦ）、および「うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ）」（ＣＣＦ）という用語は、本明細書において互いに交換可能に使用され、心臓の、全身に十分な量の血液を満たす、または送り出す能力、体の組織における適当な血液循環を維持する能力、または静脈循環によって戻ってきた静脈血を拍出する能力を損なう、任意の構造的または機能的な心臓障害の結果として生じ得る臨床状態を指す。
【００１８】
「末期心不全」という用語は、従来の医学療法に抵抗性のＣＨＦを指す。末期心不全の患者は、高い死亡率を有する。これらの患者は、多数回の頻繁な入院、静脈内薬物療法を頻繁に経験し、大動脈内バルーンポンプ、心室補助デバイス、および心臓移植などの外科的療法を必要とする。
【００１９】
「末期拡張型心筋症」および「末期ＣＨＦ」という用語は、本明細書において互いに交換可能に使用される。
【００２０】
「心筋症」または「心筋疾患」という用語は、任意の理由による、心筋（すなわち、心臓の筋肉）の機能低下を指す。本明細書において使用される場合、「心筋症」という用語は、「外因性心筋症」および「内因性心筋症」を包含する。外因性心筋症において、例えば、虚血性心筋症など、主な病理は心筋自体の外側にある。内因性心筋症において、心筋の衰弱は、例えば、拡張型心筋症（ＤＣＭ）など、特定できる外部の原因によるものではない。ＤＣＭでは、心臓（特に、左心室）が拡張し、ポンプ機能が低下する。
【００２１】
「虚血性心筋症」という用語は、アテローム性動脈硬化症および冠動脈閉塞などの、冠動脈疾患の結果として生じる心筋症を指す。
【００２２】
「非虚血性心筋症」という用語は、冠動脈疾患によるものではない心筋症を指す。
【００２３】
本明細書において使用される「予後」という用語は、ＣＨＦ患者などの心臓疾患患者における心臓病死の見込みなどの、患者における疾患の特定の転帰の見込みの予測を指す。
【００２４】
「転帰不良」は、心臓病患者（例えば、心不全患者）との関連において本明細書で使用される場合、心臓の健康状態の低下に関連した転帰を指す。「転帰不良」は、例えば、所与の期間における、左室駆出率（ＬＶＥＦ）が改善しないこと、または機械的デバイスサポート（例えば、左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）埋込み）の必要性、または心臓移植の必要性、または心臓死を包含する。
【００２５】
状態または疾患を「治療すること」またはその「治療」という用語は、対象に臨床上の利益をもたらすことを包含し、以下を包含する：（１）疾患を阻害すること、すなわち、疾患またはその症状の発症を停止もしくは減少させること、または（２）疾患を軽減すること、すなわち、疾患またはその臨床症状の退行をもたらすこと。
【００２６】
概要
本開示の方法は、ＢＩＮ１発現レベルの減少が、心臓組織の健康状態の悪化と、したがって、うっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する心臓疾患患者における転帰不良の見込みの増加と、正に相関しているという発見に基づいている。例えば、心臓組織におけるＢＩＮ１発現レベルは、正常な心臓組織の正常なＢＩＮ１発現レベルまたは転帰不良を示さないうっ血性心不全の患者の心臓組織のＢＩＮ１発現レベルなどの参照ＢＩＮ１発現レベルと比べて減少するにつれて、患者における心臓病死亡リスクは増加する。「心臓病死」という用語は、本明細書において使用される場合、心臓疾患による患者死亡率を指す。したがって、ＢＩＮ１発現は、心臓組織の健康状態が低下するにつれて低下する発現レベル値を提供するためにアッセイされる、予後診断マーカーとして使用することができる。
【００２７】
本明細書において開示されている方法はまた、内因性疾患因子（ＩＤＦ）を計算するためのＢＩＮ１発現レベルの使用を提供し、これは、心臓組織の健康状態が低下するにつれて値が増加するスコアを提供する。ＩＤＦは、コントロール遺伝子（複数可）発現のＢＩＮ１発現に対する比として計算される。したがって、ＩＤＦは、式：
ＩＤＦ＝［コントロール／ＢＩＮ１］
（式中、「コントロール」は、１つまたは複数の内部コントロール遺伝子、すなわち、正常なヒト心臓組織に対して罹患ヒト心臓組織において有意に示差的に発現されない遺伝子（複数可）についての発現値を表す）によって表される。例示的な内部コントロール遺伝子は、ＣａＶ１．２、および／またはハウスキーピング遺伝子を包含する。したがって、ＩＤＦ値の増加は、転帰不良のリスクの増加と正に相関し、すなわち、ＩＤＦが高いほど、転帰不良のリスクが大きい（例えば、心臓病死、ＬＶＡＤ埋込みの必要性、ＬＶＥＦが重度の機能不全から改善しないことなどのリスクが大きいなど。
【００２８】
ＢＩＮ１発現レベルは、ＢＩＮ１遺伝子産物の検出によって、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、心臓組織試料においてｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの検出によって、）またはＢＩＮ１タンパク質の検出によって、アッセイすることができる。ＢＩＮ１発現をアッセイするための例示的な方法を、以下に示す。
【００２９】
本開示の方法を、以下にさらに詳細に記載する。
【００３０】
ＢＩＮ１
ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）遺伝子は、腫瘍抑制因子の特徴を有するＭｙｃ相互作用タンパク質としてもともと同定された、核内サイトゾルタンパク質をコードする。ＢＩＮ１はまた、アンフィフィシンＩＩ、アンフィフィシン様、およびボックス依存性ＭＹＣ相互作用タンパク質１としても知られている。ＢＩＮ１遺伝子の選択的スプライシングは、１０個の異なるアイソフォームをコードしている転写変異体をもたらす。ＢＩＮ１のアイソフォームは、いたるところで発現されるものもあれば、組織特異的な発現を示すものもある。ＢＩＮ１アイソフォーム１〜７は、ニューロンにおいて発現される。アイソフォーム８は、筋肉特異的であるが、アイソフォーム９および１０は、いたるところに存在する。中枢神経系において発現されるアイソフォームは、シナプス小胞エンドサイトーシスに関与している可能性があり、ダイナニム、シナプトジャニン、エンドフィリン、およびクラスリンと相互作用する可能性がある。腫瘍細胞系において発現される異常型スプライス変異体もまた記載されている。
【００３１】
ＢＩＮ１発現は、ＢＩＮ１転写変異体および／またはアイソフォームの１つまたは複数の検出によってアッセイすることができる。ＢＩＮ１アイソフォームまたは転写変異体１  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３４３．１）およびアイソフォーム１タンパク質（ＮＰ＿６４７５９３．１）、ＢＩＮ１転写変異体２ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３４４．１）およびアイソフォーム２タンパク質（ＮＰ＿６４７５９４．１）、ＢＩＮ１転写変異体３ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３４５．１）およびアイソフォーム３タンパク質（ＮＰ＿６４７５９５．１）、ＢＩＮ１転写変異体４ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３４６．１）およびアイソフォーム４タンパク質（ＮＰ＿６４７５９６．１）、ＢＩＮ１転写変異体５ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３４７．１）およびアイソフォーム５タンパク質（ＮＰ＿６４７５９７．１）、ＢＩＮ１変異体６ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３４８．１）およびアイソフォーム６タンパク質（ＮＰ＿６４７５９８．１）、ＢＩＮ１転写変異体７ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３４９．１）およびアイソフォーム７タンパク質（ＮＰ＿６４７５９９．１）、ＢＩＮ１転写変異体８ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００４３０５．２）およびアイソフォーム８タンパク質（ＮＰ＿００４２９６．１）、ＢＩＮ１転写変異体９ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３５０．１）およびアイソフォーム９タンパク質（ＮＰ＿６４７６００．１）、ならびにＢＩＮ１転写変異体１０ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１３９３５１．１）およびアイソフォーム１０タンパク質（ＮＰ＿６４７６０１．１）配列が、当技術分野において利用可能である。ある特定の実施形態では、ＢＩＮ１発現は、ＢＩＮ１転写変異体８ｍＲＮＡおよび／またはＢＩＮ１アイソフォーム８タンパク質の検出によってアッセイされてもよい。別の実施形態では、ＢＩＮ１発現は、ＢＩＮ１転写変異体９ｍＲＮＡおよび／またはＢＩＮ１アイソフォーム９タンパク質の検出によってアッセイされてもよい。別の実施形態では、ＢＩＮ１発現は、ＢＩＮ１転写変異体８ｍＲＮＡおよびＢＩＮ１転写変異体９ｍＲＮＡの両方の検出および／またはＢＩＮ１アイソフォーム８タンパク質およびＢＩＮ１アイソフォーム９タンパク質の両方の検出によってアッセイされる。例示的な実施形態において、ＢＩＮ１発現は、ＢＩＮ１転写変異体８および９ｍＲＮＡの検出によって、例えば、ＢＩＮ１転写変異体８および９ｍＲＮＡにより共有されている構造的特徴の検出によって、および／またはＢＩＮ１アイソフォーム８タンパク質およびＢＩＮ１アイソフォーム９タンパク質により共有されている構造的特徴の検出によって、アッセイされてもよい。
【００３２】
一般に、ＢＩＮ１発現レベルは、様々なＢＩＮ１転写変異体／アイソフォームの遺伝子産物により共有されている構造の特徴の検出を提供する試薬を使用することによって、例えば、ＢＩＮ１のすべての転写変異体に共通のＢＩＮ１  ｍＲＮＡの領域の検出を提供するプライマーおよび／もしくはプローブ、またはＢＩＮ１アイソフォームにより共有されているエピトープ（複数可）に結合する抗体を使用することによって、アッセイされてもよい。
【００３３】
内部コントロール
本明細書に記載されているアッセイ方法に関連して、様々な異なる内部コントロールを使用することができる。一般に、ＣＨＦ患者の心臓組織および正常な心臓組織において顕著に示差的に発現されないことが知られている遺伝子を、内部コントロールとして使用することができる。以下は、アッセイすることができる例示的な内部コントロール遺伝子を示す。
ＣａＶ１．２
【００３４】
ＣａＶ１．２
ＣＡＣＮＡ１Ｃは、電位依存性カルシウムチャネルのα−１サブユニットであるＣａｖ１．２をコードする。ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＡＣＮＡ１ｃポリペプチドのアミノ酸配列は、当技術分野において知られている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ_０００７１０を参照されたい。ホモ・サピエンスＣＡＣＮＡ１ＣアイソフォームＣＲＡ_ａからＣＲＡ_ｐのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＡＷ８８８９５（アイソフォームＣＲＡ_ａ）；ＥＡＷ８８８９６（アイソフォームＣＲＡ_ｂ）；ＥＡＷ８８８９７（アイソフォームＣＲＡ_ｃ）；ＥＡＷ８８８９８（アイソフォームＣＲＡ_ｄ）；ＥＡＷ８８８９９（アイソフォームＣＲＡ_ｅ）；ＥＡＷ８８９００（アイソフォームＣＲＡ_ｆ）；ＥＡＷ８８８９０１（アイソフォームＣＲＡ_ｇ）；ＥＡＷ８８８９０２（アイソフォームＣＲＡ_ｈ）；ＥＡＷ８８８９０３（アイソフォームＣＲＡ_ｉ）；ＥＡＷ８８８９０４（アイソフォームＣＲＡ_ｊ）；ＥＡＷ８８８９０５（アイソフォームＣＲＡ_ｋ）；ＥＡＷ８８８９０６（アイソフォームＣＲＡ_ｌ）；ＥＡＷ８８８９０７（アイソフォームＣＲＡ_ｍ）；ＥＡＷ８８８９０８（アイソフォームＣＲＡ_ｎ）；ＥＡＷ８８８９０９（アイソフォームＣＲＡ_ｏ）；およびＥＡＷ８８８９１０（アイソフォームＣＲＡ_ｐ）のもとで見られる。対応するヌクレオチド配列（例えば、ＣａＶ１．２をコードしているヌクレオチド配列）は、当技術分野において知られている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ_０００７１９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７１０に示されているアミノ酸配列を有するＣａＶ１．２をコードしている）を参照されたい。
【００３５】
一般に、ＣａＶ１．２発現レベルは、様々なＣａＶ１．２転写変異体／アイソフォームの遺伝子産物により共有されている構造の特徴の検出を提供する試薬を使用することによって、例えば、ＣａＶ１．２のすべての転写変異体に共通するＣａＶ１．２ｍＲＮＡの領域の検出を提供するプライマーおよび／またはプローブまたはＣａＶ１．２アイソフォームにより共有されているエピトープ（複数可）に結合する抗体を使用することによって、アッセイすることができる。ある特定の実施形態では、ＣａＶ１．２転写変異体１８（ＮＭ_０００７１９．６）をアッセイすることができる。
【００３６】
ＣａＶ１．２発現レベルは、ＣａＶ１．２ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出によってアッセイされてもよい。
【００３７】
ハウスキーピング遺伝子
ハウスキーピング遺伝子は、典型的には、本明細書において評価される条件すべてにわたって対象とする組織において比較的一定のレベルで転写される、構成的に発現される遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子は、典型的には、核酸合成、代謝、細胞骨格構造などの細胞の維持を容易にする遺伝子産物をコードする。一般に、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルは、機能不全の心臓組織および機能不全でない心臓組織の間で実質的に示差的に発現されない。ハウスキーピング遺伝子の例は、ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、チューブリン、ユビキチン、ＲＰＬ１３Ａ、ＰＰ１Ａ、およびＥＥＦ１Ａ１などを含む。
【００３８】
ハウスキーピング遺伝子発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出によってアッセイされてもよい。
【００３９】
遺伝子発現をアッセイするための方法
遺伝子発現は、ＢＩＮ１  ｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルを定量することによってアッセイされてもよい。試料中のｍＲＮＡ発現の定量のための、当技術分野において知られている一般に使用される方法を、ＢＩＮ１発現レベルをアッセイするために利用してもよい。そのような方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８：２６３〜２６４（１９９２））、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ＆Ｂａｒｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７〜２８３（１９９９））、ノーザンブロット法、およびＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｈｏｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２〜８５４（１９９２））などのＰＣＲに基づく方法を含む。代替として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む配列特異的二本鎖を認識することができる抗体を利用してもよい。ＢＩＮ１ポリペプチドのレベルは、定量的ウェスタンブロット、免疫沈降などによって検出されてもよく、特定の場合において、ＢＩＮ−１発現レベルは、ｉｎ  ｓｉｔｕアッセイによって、例えば、ＢＩＮ−１ｍＲＮＡに特異的な標識したプローブをハイブリダイズさせることまたはＢＩＮ−１抗体を使用することによって、決定されてもよい。
【００４０】
一般に、ＢＩＮ１遺伝子発現は、患者の心臓組織試料において、アッセイすることができる。心臓組織は、通常、生検試料である。心臓組織は、当業者によく知られている様々な手順において生検を実施することができる。心臓組織は、実施されるアッセイに適合する任意の方法によって処理することができる。例えば、心臓組織は、新たに得られてもよく、凍結（例えば、瞬間凍結）されてもよく、ホルマリン固定されてもよく、パラフィン包埋されてもよく、またはそれらの任意の適した組み合わせであってもよい。一般に、方法は、心臓組織中のアッセイされる分析物（例えば、タンパク質および／またはｍＲＮＡ）の実質的な分解を回避するように選択することができる。
【００４１】
定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
第１ステップは、試料からのｍＲＮＡの単離である。出発材料は、典型的には、うっ血性心不全と診断された患者の心臓組織から、および、任意選択により、コントロールとして対応する正常な組織から、単離された全ＲＮＡである。心臓組織は、新たに得られてもよくまたは、凍結された、もしくは保存されたパラフィン包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）された組織試料であってもよい。
【００４２】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当技術分野においてよく知られており、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）を含む分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）において開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、製造業者の使用説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎなどの市販の製造業者の精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを使用して実施することができる。例えば、全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニ−カラムを使用して単離することができる。別の市販されているＲＮＡ単離キットは、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を含む。組織試料の全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離することができる。心臓組織から調製されるＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離することができる。
【００４３】
典型的には、ＲＴ−ＰＣＲにおける第１ステップは、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写であり、その後に、ＰＣＲ反応におけるその指数関数的な増幅が続く。トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）の逆転写酵素を含むがそれらに限定されない、多くの逆転写酵素を使用することができる。逆転写ステップは、典型的には、環境およびＲＴ−ＰＣＲの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴｄＴプライマーを使用することによって開始される。例えば、抽出されたＲＮＡは、製造業者の使用説明書に従って、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して逆転写することができる。次いで、得られたｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応において鋳型として使用することができる。
【００４４】
ＰＣＲステップは、様々な熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、典型的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用する。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、典型的には、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応の典型的なアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。このプローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長されず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素により標識される。レポーター色素からの、レーザーにより誘導される発光は、２つの色素がプローブ上にあるために互いに近接して位置しているとき、消光色素によって消光する。増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的にプローブを切断する。結果として生じるプローブフラグメントは溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルには、第２のフルオロフォアの消光作用はない。合成されるそれぞれの新しい分子につきレポーター色素の１分子が遊離され、消光しないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈のための根拠を提供する。
【００４５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの市販されている装置を使用して実施することができる。好ましい一実施形態において、５’ヌクレアーゼ手順は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）などのリアルタイム定量的ＰＣＲデバイスにおいて行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラーにおいて９６ウェルフォーマット中で試料を増幅する。増幅中、レーザーにより誘導される蛍光シグナルは、すべての９６ウェルについて光ファイバーケーブルによってリアルタイムで集光され、ＣＣＤで検出される。システムは、機器を作動させるためおよびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【００４６】
５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初、Ｃｔ、または閾値サイクルとして表される。上記で論じたように、蛍光値は、毎サイクルの間記録され、増幅反応におけるその時点までに増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが統計学的に有意であると最初に記録される時点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００４７】
エラーおよび試料間の変動の影響を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を使用して実施される。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定のレベルで発現され、実験の処理による影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲ技術の変形形態は、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、これは、二重標識した蛍光性プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、正規化のために各標的配列に対する内部の競合相手が使用される定量的競合ＰＣＲ、およびＲＴ−ＰＣＲのために試料中に含有される正規化遺伝子またはハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの両方に適合性である。さらなる詳細に関しては、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６〜９９４（１９９６）を参照されたい。
【００４９】
アッセイされるＲＮＡの量の差異および使用されるＲＮＡの質の変動性の両方に関して補正する（正規化してしまう（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ  ａｗａｙ））ことが望ましい。したがって、アッセイは、典型的には、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ユビキチンなどのよく知られているハウスキーピング遺伝子を含む特定の参照遺伝子（または「正規化遺伝子」）の発現の分析を組み込む。
【００５０】
代替として、正規化は、アッセイされる遺伝子のすべてまたはその大きい部分集団のシグナル（Ｃｔ）の平均または中央値に基づいて（しばしば、「グローバルノーマライゼーション」手法と称される）いてもよい。遺伝子対遺伝子の原則に基づいて、患者心臓組織ｍＲＮＡの測定され正規化された量を、対応する正常な心臓組織において見出される量と比較することができる。Ｍ．Ｃｒｏｎｉｎら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６４：３５〜４２（２００４）を参照されたい。
【００５１】
プライマーおよびプローブの設計
プライマーおよびプローブ（例えば、ＰＣＲ増幅ベースの方法において使用するための）は、増幅される遺伝子中に存在するエクソン配列、またはイントロン配列に基づいて設計することができる。したがって、プライマー／プローブ設計における第１ステップは、対象とする遺伝子中の標的エクソンまたはイントロン配列の描写である。これは、Ｋｅｎｔ、Ｗ．Ｊ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６〜６４（２００２）によって開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェア、または、その変形形態を含むＢＬＡＳＴソフトウェアなどの公開されているソフトウェアによって行うことができる。その後のステップは、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計の十分に確立されている方法に従う。
【００５２】
非特異的シグナルを回避するために、遺伝子の標的配列中の反復配列は、プライマーおよびプローブを設計するときにマスクすることができる。これは、反復要素のライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復要素がマスクされているクエリ配列を返す、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅからオンラインで利用可能であるＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムを使用することによって容易に達成することができる。次いで、マスクされた配列を使用することにより、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢアッセイごとの設計（ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；プライマー３（Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ、Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、３６５〜３８６ページの、Ｓｔｅｖｅ  ＲｏｚｅｎおよびＨｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）一般ユーザーおよび生物学者プログラマーのためのＷＷＷ上のＰｒｉｍｅｒ３（Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ））などの、任意の市販されている、またはそうでなければ公開されているプライマー／プローブ設計パッケージを使用して、プライマーおよびプローブ配列を設計することができる。
【００５３】
ＰＣＲプライマー設計において考慮される因子は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、Ｇ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、および３’−末端配列を含むことができる。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、長さが１７〜３０塩基であり、約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基（例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基）を含有する。５０℃〜８０℃の間、例えば、約５０℃〜７０℃のＴｍが、典型的には好ましい。
【００５４】
ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計についてのさらなるガイドラインに関しては、その開示全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５、１３３〜１５５ページの、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ,Ｃ．Ｗ．ら、「ＰＣＲプライマー設計に関する一般的概念（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）」；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９４、５〜１１ページの、ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、「ＰＣＲの最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ）」；およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：５２０〜５２７（１９９７）を参照されたい。
【００５５】
マイクロアレイ
マイクロアレイ技術は、罹患心臓組織および正常な心臓組織においてＢＩＮ１の示差的発現を検出するために使用することができる。この方法において、対象とするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）は、マイクロチップ基板上にプレーティングまたはアレイ化される。次いで、アレイ化された配列を、対象とする細胞または組織由来の特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲ法と同様に、ｍＲＮＡの供給源は、典型的には、患者心臓組織、および任意選択により、対応する正常な心臓組織から単離された全ＲＮＡである。
【００５６】
蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、対象とする組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による、蛍光ヌクレオチドの組み込みによって作製することができる。チップ上にアプライされた標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに対して特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、チップを、共焦点レーザー顕微鏡によってまたはＣＣＤカメラなどの別の検出方法によってスキャンする。各アレイ要素のハイブリダイゼーションの定量は、対応するｍＲＮＡ存在量の評価を可能にする。二色蛍光を用いて、２つの供給源のＲＮＡから作製された別々に標識されたｃＤＮＡプローブを、アレイに対ごとにハイブリダイズさせる。したがって、各指定された遺伝子に対応する２つの供給源由来の転写産物の相対的存在量が同時に決定される。マイクロアレイ法は、１細胞当たり数コピーで発現される稀にしか出現しない転写産物を検出するために、および発現レベルの少なくとも約２倍の差異を再現可能に検出するために必要とされる感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２）：１０６〜１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を使用することによってなど、製造業者のプロトコルに従って、市販されている装置によって実施することができる。
【００５７】
アレイ化されたオリゴヌクレオチドは、ＢＩＮ１核酸の特定の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを包含してもよい。ある特定の実施形態では、ＢＩＮ１核酸の第１の領域に対して特異的にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドの多コピーがアレイ化される。ある特定の実施形態では、ＢＩＮ１核酸の第１のおよび第２の領域に特異的にハイブリダイズする第１のおよび第２のオリゴヌクレオチドの多コピーが、それぞれアレイ化される、などである。ある特定の実施形態では、ＢＩＮ１発現レベルは、これらのオリゴヌクレオチドのそれぞれのシグナルの平均値によって決定される。ある特定の実施形態では、アレイはまた、ハウスキーピング遺伝子または正常な心臓組織に対して罹患心臓組織において顕著に示差的に発現されないことが知られている、例えば、ＣａＶ１．２などの別の遺伝子などの正規化遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを包含してもよい。
【００５８】
免疫検出
免疫組織化学的方法もまた、ＢＩＮ１の発現レベルを検出するために適し得る。したがって、ＢＩＮ１に特異的な、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体などの抗体または抗血清を、ＢＩＮ１発現を評定するために使用することができる。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識またはホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素による抗体自体の直接的な標識化によって検出することができる。代替として、一次抗体に特異的な、抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と共に、標識されていない一次抗体が使用される。ある特定の例において、患者の心臓試料におけるＢＩＮ１発現は、正常な心臓試料におけるＢＩＮ１発現と比較され得る。免疫組織化学プロトコルおよびキットは、当技術分野においてよく知られており、市販されている。
【００５９】
特定の場合において、心臓組織試料中に存在するＢＩＮ１タンパク質の量は、ウェスタンブロットによって決定することができる。例えば、心臓試料の全細胞溶解物中に存在するタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＢＩＮ１に特異的な抗体または抗血清を使用することによってＢＩＮ１を検出することができる。少なくとも１つの正規化タンパク質、例えば、Ｃａｖ１．２またはＧＡＰＤＨもしくはβ−アクチンなどのハウスキーピングタンパク質もまた、同時にまたは並行して検出して、ＢＩＮタンパク質発現レベルを正規化するために使用することができる。代替の実施形態において、ＢＩＮ１発現レベルを、過剰の抗ＢＩＮ１抗体を使用してＢＩＮ１免疫沈降を実施し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫沈降物の分離、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ゲルの染色によって、例えば、クマシーブルーまたは銀染色によって検出することによって決定してもよい。ＧＡＰＤＨまたはユビキチンなどのコントロールタンパク質の免疫沈降はまた、同時にまたは並行して行われてもよい。任意選択により、対応する正常な心臓組織に対して同じ手順が行われてもよい。
【００６０】
心臓病死亡リスクの予後予測におけるＢＩＮ１発現レベルの使用
ＢＩＮ１発現は、ＣＨＦ患者における転帰不良のリスクを予測するためにアッセイされる予後診断マーカーとして使用することができる。ＢＩＮ１発現レベルの減少は、心臓病死などの転帰不良のリスクの増加と正に相関している。ＢＩＮ１発現レベルを使用して、心臓病死などの転帰不良のリスクが増加するにつれて値が増加するスコアを提供する内因性疾患因子（ＩＤＦ）を計算することができる。
【００６１】
ＢＩＮ１発現レベルの使用
この方法は、ＣＨＦと診断された患者の心臓組織試料中のＢＩＮ１発現レベルをアッセイするステップを伴うことができる。ＢＩＮ１の分析は、参照ＢＩＮ１発現レベル、例えば、正常なＢＩＮ１発現レベルまたは転帰不良の低いリスクの指標となることが知られているＢＩＮ１発現レベルに対する、ＢＩＮ発現レベルの比較を伴うことができる。
【００６２】
参照ＢＩＮ１発現レベルは、転帰不良の低いリスクの指標となることが知られているＢＩＮ１発現レベルであってもよい。参照ＢＩＮ１発現レベルは、心臓病死、ＬＶＡＤ埋込み、または改善しないＬＶＥＦなどの転帰不良を有さないことが知られているＣＨＦ患者のＢＩＮ１発現レベル（または、患者群のＢＩＮ１発現レベルの平均）であってもよい。参照ＢＩＮ１発現レベルと比較して低いＢＩＮ１発現レベルは、患者が増加した転帰不良の見込みを有することを示す。対照的に、参照値以上のＢＩＮ１発現レベルは、患者が減少した転帰不良の見込みを有することを示す。
【００６３】
正常なＢＩＮ１発現レベルは、一般に、機能不全でない心筋におけるＢＩＮ１発現レベルを指す。正常なＢＩＮ１発現レベルは、心臓の肉眼的形態の検査、左室駆出率、心臓カテーテルから、および／または個々のカルテにおける心臓に関連する状態がないことなどから、その心臓機能が正常であると推定される個体から得られた、機能不全でない心臓組織のＢＩＮ１発現レベルから決定することができる。
【００６４】
参照ＢＩＮ発現レベルと比較して低いＢＩＮ１発現レベルは、患者が増加した心臓病死の見込みを有することを示す。一般に、正常なＢＩＮ発現レベルと比較したＢＩＮ１発現レベルの少なくとも２０％の低下は、患者が増加した心臓病死の見込みを有することを示す。したがって、正常なＢＩＮ発現レベルと比較したＢＩＮ１発現レベルの、２０％の低下、３０％の低下、４０％の低下、５０％の低下、７５％の低下、またはそれ以上の低下を有する患者は、増加した心臓病死亡リスクを有する。
【００６５】
通常、ＢＩＮ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、ハウスキーピング遺伝子またはＣａＶ１．２などの、ＣＨＦにおいて変化しないことが知られている遺伝子などの内部コントロールを参照して正規化される。ある特定の実施形態では、ＢＩＮ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、複数のハウスキーピング遺伝子などの複数の内部コントロールを参照して正規化される。一般に、複数の内部コントロールが使用される場合、これらのコントロールの平均発現レベルが、ＢＩＮ１発現レベルを正規化するために使用される。
【００６６】
ＢＩＮ１発現レベルを使用して、ＢＩＮ１発現レベルの評価後のある期間にわたる転帰不良のリスク、例えば、その次の１日〜２４カ月、例えば、次の６カ月〜１２カ月、または１２カ月〜１８カ月にわたるなどの６カ月〜１８カ月にわたるＣＨＦ患者に関する転帰不良のリスクを予測することができる。
【００６７】
内因性疾患因子（ＩＤＦ）
内因性疾患因子（ＩＤＦ）は、コントロール遺伝子（複数可）発現のＢＩＮ１発現に対する比として計算される。したがって、ＩＤＦは、式：
ＩＤＦ＝［コントロール／ＢＩＮ１］
（式中、「コントロール」は、１つまたは複数の内部コントロール遺伝子、すなわち、正常なヒト心臓組織に対して罹患ヒト心臓組織において顕著に示差的に発現されない遺伝子（複数可）についての発現値を表す）によって表される。例示的な内部コントロール遺伝子は、ＣａＶ１．２、および／またはハウスキーピング遺伝子を含む。
【００６８】
ＩＤＦＣａＶは、ＣａＶ１．２発現のＢＩＮ１発現に対する比として計算されるＩＤＦを指し、式：
ＩＤＦＣａＶ＝［Ｃａｖ１．２／ＢＩＮ１］
によって表される。
【００６９】
ＩＤＦＨＫは、ハウスキーピング（ＨＫ）遺伝子（複数可）発現のＢＩＮ１発現に対する比として計算されるＩＤＦを指し、式：
ＩＤＦＨＫ＝［ＨＫ／ＢＩＮ１］
によって表される。
【００７０】
ＩＤＦＨＫを決定するために使用することができる例示的なハウスキーピング遺伝子は、上述されている。単一のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを使用してＩＤＦＨＫを計算してもよい。代替として、２つ以上のハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルを使用してＩＤＦＨＫを計算してもよい。
【００７１】
ＩＤＦの分析は、参照ＩＤＦ値、例えば、正常なＩＤＦ値または転帰不良の低いリスクの指標となるＩＤＦ値とのＩＤＦ値の比較を伴うことができる。正常なＩＤＦ値は、機能不全でない心臓組織におけるコントロール遺伝子（複数可）発現のＢＩＮ１発現に対する比である。機能不全でない心臓組織は、心臓の肉眼的形態、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、心臓カテーテルなどの心臓の健康状態の１つまたは複数のパラメータの検査から、および／または個々のカルテにおいて心臓に関連する状態がないことなどから、その心臓機能が正常であると推論された個体から得られ、例えば、正常な心臓組織は５５％以上のＬＶＥＦを有する。
【００７２】
ＢＩＮ１発現の減少およびそれに応じて増加するＩＤＦ値は、増加する心臓病死亡リスクと正に相関しており、すなわち、ＩＤＦが高いほど心臓病死亡リスクは大きい。例えば、正常ＩＤＦ値の約１．５倍より大きいＩＤＦ値は、増加した心臓病死亡リスクの指標となる。したがって、正常なＩＤＦ値の、約１．５倍より大きい、または約２倍より大きい、または約３倍より大きい、または約４倍より大きい、または約５倍より大きい、またはそれ以上のＩＤＦ値は、増加した心臓病死亡リスクの指標となる。
【００７３】
患者のＢＩＮ１発現レベルおよびＩＤＦ値はまた、閾値と比べて評定することができる。「閾値」または「リスク閾値」は、比較的高リスクの転帰不良を、比較的低リスクの転帰不良と区別するために使用することができる値である。例えば、ほとんどの場合、閾値は、それより上は転帰不良のリスクが比較的高く、それより下は転帰不良のリスクが比較的低い概算値である。例えば、約０．６５の正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、この閾値よりも低い正規化されたＢＩＮ１発現レベルを有する心臓病患者は比較的増加した転帰不良のリスクを有し、この閾値以上の正規化されたＢＩＮ１発現レベルを有する心臓病患者は比較的減少した転帰不良のリスクを有する、閾値を表す。
【００７４】
ＢＩＮ１発現レベルおよび／またはＩＤＦ値を使用して、評価後のある期間にわたる転帰不良のリスク、例えば、次の６カ月〜１２カ月、または１２カ月〜１８カ月にわたるなどの、次の、例えば、６カ月〜１８カ月にわたるＣＨＦ患者に関する転帰不良のリスクを予測することができる。
【００７５】
臨床応用
ＣＨＦ患者の心臓組織におけるＢＩＮ１発現レベルおよび／またはＩＤＦ値の決定を使用して、心臓移植を受けることについての患者に対する優先レベルを割り当て、ＣＨＦ治療に対する反応の評定を容易にし、および／または治療計画の変更の指針となることができる。
【００７６】
一般に、ＢＩＮ１発現が低いほど、および／またはＩＤＦ値が高いほど、心臓の回復不良の見込みが高く、したがって、患者は心臓移植を受けることについて高い優先レベルに割り当てられる。代替として、ＣＨＦ患者が正常なまたは正常に近いＢＩＮ発現レベルを有していれば、予想される事柄は、心臓が回復する十分な可能性を有することであり、患者は、心臓移植を受けることについて低い優先レベルに割り当てられる可能性がある。一般に、ＢＩＮ１発現レベルが低いほど、および／またはＩＤＦ値が高いほど、心臓移植を受けることに関する患者の優先レベルは高い。
【００７７】
同様に、中程度に減少したＢＩＮ１発現および／または中程度に増加したＩＤＦ値のみを有する患者において、患者回復を助けるために患者を左室補助デバイスに割り当てる優先順位は増加するであろう。左室補助デバイスの取外しは、ＢＩＮ発現および／またはＩＤＦ値の正規化と時期を合わせることができる。左室補助デバイスにもかかわらず、さらにＢＩＮ１発現が減少またはＩＤＦ値が増加することにより、この患者の心臓移植のためのリストへの記載が示される。
【００７８】
心臓病死亡リスクの決定を使用して、ＣＨＦ治療の有効性を評定すること、および治療戦略に対する変更を決定することができる。ＣＨＦ患者は、例えば、手術、機械的補助デバイス、心臓移植、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、βブロッカー、利尿薬などの薬物療法による、治療を受けていてもよい。ＣＨＦ治療の有効性は、ＢＩＮ発現レベルおよび／またはＩＤＦ値についてアッセイすることによって評定することができる。一般に、低いＢＩＮ１発現、および／または高いＩＤＦ値は、心不全の高い見込み、および治療が効果的ではないことを示す。治療有効性のそのような決定を使用して、治療を変更してもよい。例えば、心臓移植に関して高い優先レベルの患者を分類することによって。
【００７９】
一方、ＣＨＦ治療は、ＢＩＮ発現レベルを安定化させて、正常なまたは正常に近い発現レベルをもたらすことができる。以下の実施例において記載されているように、機能不全心臓が回復するにつれて、ＢＩＮ１発現レベルは増加する。正常なＢＩＮ１発現、および／または正常なＩＤＦ値は、心不全の減少した見込み、および治療が効果的であることを示す。この情報は、心臓移植を受けることに関して低い優先レベルの患者を分類するために使用されてもよく、大動脈内バルーンポンプ、心室補助デバイス、静脈内心臓療法などの別の療法を示す可能性がある。
【００８０】
正規化されたＢＩＮ１発現またはＩＤＦ値を使用して、療法の選択肢を決定することができる。例えば、約０．６５未満の正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、転帰不良のリスクと正に相関し得る。約０．６５未満の正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、近い将来、例えば、その次の１日〜２４カ月、例えば、１日〜７日、または１週間〜２週間、２週間〜４週間、１カ月〜３カ月、３カ月〜６カ月、６カ月〜８カ月、８カ月〜１２カ月、１２カ月〜１８カ月、１８カ月〜２４カ月における患者の転帰不良と正に相関し得る。転帰不良は、死亡、ＬＶＡＤ埋込み、またはＬＶＥＦの改善なしまたはさらにはＬＶＥＦのさらなる悪化であり得る。この情報は、心臓移植を受けることに関して高い優先レベルの患者を分類するために使用されてもよく、大動脈内バルーンポンプ、心室補助デバイス、静脈内心臓療法などの別の療法を示す可能性がある。
【００８１】
一方、０．６５以上の正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、心臓病死亡リスクと負に相関し得る。０．６５以上の正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、近い将来、例えば、その次の１日〜２４カ月、例えば、１日〜７日、または１週間〜２週間、２週間〜４週間、１カ月〜３カ月、３カ月〜６カ月、６カ月〜８カ月、８カ月〜１２カ月、１２カ月〜１８カ月、１８カ月〜２４カ月における患者の転帰不良がないことと正に相関し得る。この情報は、心臓移植および大動脈内バルーンポンプ、心室補助デバイス、静脈内心臓療法などの別の療法を受けることに関して低い優先レベルの患者を分類するために使用されてもよく、薬物ベースの療法が患者の心臓機能を安定化させ得ることを示す可能性がある。
【００８２】
患者
一般に、本明細書に記載の方法に反応し易い患者は、ＣＨＦと診断されたヒト患者である。
【００８３】
ＣＨＦ患者は、末期ＣＨＦ、または急性電撃性心筋炎、または慢性進行性非虚血性心筋症、もしくは慢性進行性虚血性心筋症と診断された患者、または心臓移植などのＣＨＦの治療を受けているＣＨＦ患者（すなわち、心臓移植後患者）または抵抗性ＣＨＦの患者などであってよい。
【００８４】
キット
本開示の方法において使用するための材料は、よく知られている手順に従って製造されるキットの調製に適している。本開示はしたがって、臨床転帰の予測、治療の選択肢の決定、または治療に対する反応の予測などのためにＢＩＮ１の発現を定量するための、遺伝子特異的または遺伝子選択的プローブおよび／またはプライマーを包含していてもよい作用物質を含むキットを提供する。そのようなキットは、任意選択により、心臓組織試料からのＲＮＡの抽出のための試薬および／またはＲＮＡ増幅のための試薬を含有していてもよい。加えて、キットは、任意選択により、識別のための記述もしくはラベルまたは本開示の方法におけるそれらの使用に関する使用説明書とともに試薬（複数可）を含んでいてもよい。キットは、例えば、作製済み（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）マイクロアレイ、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および１つまたは複数の本開示のプローブおよびプライマーを含む、方法において利用される様々な試薬（典型的には、濃縮された形態で）の１つまたは複数をそれぞれ含む、容器（方法の自動化された実行において使用するのに適したマイクロタイタープレートを含む）を含んでいてもよい。予後のおよび／または予測的な情報を推定または定量するために使用される数学アルゴリズムもまた、当然、キットの潜在的な構成要素である。
【００８５】
本開示により提供される方法はまた、全体または一部分において自動化されていてもよい。
【００８６】
報告
本開示の方法は、ＢＩＮ１の発現レベルをアッセイした結果を要約した報告の作成に適している。ある特定の実施形態では、報告は、ＣＨＦ患者における心臓病死亡リスクの決定を包含していてもよい。本明細書において記載される「報告」は、ＢＩＮ１発現レベルおよび／または心臓病死亡リスクに関する対象とする情報を提供する報告要素を包含する電子文書または有形の文書である。対象報告は、完全にまたは部分的に電子的に作成されてもよく、例えば、電子ディスプレイ（例えば、コンピュータのモニター）上に提示される。報告はさらに、１）試験設備に関する情報；２）サービス提供者情報；３）患者データ；４）試料データ；５）ａ）適応；ｂ）試験データ（試験データは１つまたは複数の対象とする遺伝子の正規化されたレベルを包含し得る）を含む様々な情報を包含し得る解釈レポート、および６）別の特徴のうち１つまたは複数を包含することができる。
【００８７】
本開示は、したがって、報告およびそれに起因する報告を作成する方法を提供する。報告は、患者の心臓組織から得られる細胞におけるＢＩＮ１などの特定の遺伝子についてのＲＮＡ転写産物、またはそのようなＲＮＡ転写産物の発現産物の発現レベルの要約を包含していてもよい。報告は、心臓病死亡リスクの評価を包含していてもよい。報告は、手術単独または療法と組み合わせた手術などの治療モダリティに関する推奨を包含していてもよい。報告は、電子的フォーマットでまたは紙上で提示されてもよい。本明細書において開示されている方法はさらに、報告を作成または出力するステップを包含することができ、この報告は、電子的媒体（例えば、コンピュータのモニター上の電子ディスプレイ）の形態で、または有形媒体（例えば、紙または別の有形媒体上に印刷された報告）の形態で提供することができる。
【００８８】
明確にするために、「クライアント」と互いに交換可能に使用される「ユーザー」という用語は、報告が送信される人または実体を指すことを意味し、以下の、ａ）試料を採取する；ｂ）試料を処理する；ｃ）試料または処理された試料を提供する；およびｄ）心臓病死亡リスク評価において使用するためのデータ（例えば、反応指標遺伝子産物（複数可）のレベル；参照遺伝子産物（複数可）のレベル；反応指標遺伝子産物（複数可）の正規化されたレベル）を作成する、のうち１つまたは複数を行う同じ人または実体とすることができることに留意するべきである。場合によっては、試料採取および／または試料処理および／またはデータ作成を提供する人（複数可）または実体（複数可）、および結果および／または報告を受け取る人は異なる人であってもよいが、混乱を回避するために、本明細書において両者とも「ユーザー」または「クライアント」と称される。ある特定の実施形態では、例えば、この方法が単一のコンピュータにおいて完全に実行される場合、ユーザーまたはクライアントは、データ入力およびデータ出力の検証を提供する。「ユーザー」は、医療専門家（例えば、臨床医、検査技師、医師（例えば、心臓専門医、外科医、かかりつけ医）など）とすることができる。
【００８９】
ユーザーが方法の一部分を実行するのみの実施形態において、本発明の方法によるコンピュータ化されたデータ処理の後、データ出力を検証する（例えば、完全な報告を提供するための発信前の結果、完全な報告、または「不完全な」報告を検証し、手作業による介入および解釈的報告の完了を提供するなど）個体は、本明細書において「レビュアー」と称される。レビュアーは、ユーザーとは遠隔にある位置に（例えば、ユーザーが位置し得る医療施設とは別々に提供されるサービスに）位置していてもよい。
【００９０】
政府の規制または別の制限（例えば、健康状態、医療過誤、または責任保険による要件）が適用される場合、すべての結果は、全面的にまたは部分的に電子的に作成されているかどうかにかかわらず、ユーザーへの発信の前に品質管理ルーチンにかけられる。
【００９１】
コンピュータによるシステムおよび方法
本明細書に記載の方法およびシステムは、非常に多くの方法で実行することができる。特に興味深い一実施形態において、この方法は、通信インフラストラクチャー、例えば、インターネットの使用を伴う。いくつかの本発明の実施形態が、下記に論じられている。本発明は、様々な形態のハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、プロセッサ、またはそれらの組み合わせで実行されてもよいこともまた理解されるべきである。本明細書に記載の方法およびシステムは、ハードウェアとソフトウェアの組み合わせとして実行することができる。ソフトウェアは、プログラム記憶デバイスにおいてタンジブルに組み入れられているアプリケーションプログラム、またはユーザーのコンピュータ使用環境において（例えば、アプレットとして）およびレビュアーが関連付けられたリモートサイトに（例えば、サービス提供者の施設に）位置していてもよいレビュアーのコンピュータ使用環境において実行されるソフトウェアの異なる部分として実行することができる。いくつかの実施形態において、ＢＩＮ１発現レベルを使用してＣＨＦ患者における心臓病死亡リスクを決定するステップは、リスクを計算するためのアルゴリズムを実行するようにプログラムされたコンピュータによって実施される。別の例において、対象方法は、コンピュータに、ＢＩＮ１の発現レベルに基づいてＣＨＦ患者における心臓病死亡リスクを計算するためのアルゴリズムを実行させるステップを包含する。
【００９２】
本明細書に記載のアルゴリズムを実行するためのアプリケーションプログラムは、任意の適したアーキテクチャを備えたマシンによって、アップロードおよび実行することができる。一般に、このマシンは、１つまたは複数の中央処理ユニット（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、および入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース（複数可）などのハードウェアを有するコンピュータプラットホームを伴う。このコンピュータプラットホームはまた、オペレーティングシステムおよびマイクロ命令コードを包含する。本明細書に記載の様々な処理および機能は、オペレーティングシステムを介して実行されるマイクロ命令コードの一部またはアプリケーションプログラムの一部（またはそれらの組み合わせ）のいずれかであってもよい。加えて、様々な別の周辺デバイスが、さらなるデータ記憶デバイスおよび印刷デバイスなどのコンピュータプラットホームと接続されていてもよい。
【００９３】
コンピュータシステムとして、システムは、一般に、プロセッサユニットを包含する。プロセッサユニットは、動作して、試験データ（例えば、反応指標遺伝子産物（複数可）のレベル；参照遺伝子産物（複数可）のレベル；反応指標遺伝子産物（複数可）の正規化されたレベル）を包含し得る；また、患者データなどの別のデータも包含していてもよい情報を受信する。受信したこの情報を、データベースにおいて少なくとも一時的に保管することができ、データを分析して上記の報告を作成する。
【００９４】
入力および出力データの一部またはすべてはまた、電子的に送信することができ、特定の出力データ（例えば、報告）は、電子的にまたは電話によって（例えば、ファクシミリによって、例えば、ファックスバックなどのデバイスを使用して）送ることができる。例示的な出力受信デバイスは、表示要素、プリンタ、ファクシミリデバイスなどを包含することができる。送信および／または表示の電子的形態は、電子メール、対話式テレビなどを包含することができる。特に興味深い一実施形態において、入力データのすべてまたは一部および／または出力データのすべてまたは一部（例えば、通常、少なくとも最終の報告）が典型的なブラウザとのアクセス、好ましくは機密アクセスのためにウェブサーバー上に維持される。データは、必要に応じて、アクセスする、または医療専門家に送ることができる。最終報告のすべてまたは一部を包含する入力および出力データを使用して、医療施設の機密データベース中に存在し得る患者のカルテを追加することができる。
【００９５】
本明細書に記載の方法において使用するためのシステムは、一般に、少なくとも１つのコンピュータプロセッサ（例えば、方法が全体として単一の場所で行われる場合）または少なくとも２つのネットワーク化されたコンピュータプロセッサ（例えば、データがユーザー（本明細書において「クライアント」とも称される）によって入力され、解析のためにリモートサイトの第２のコンピュータプロセッサに送信される場合、このとき、第１および第２のコンピュータプロセッサは、ネットワークによって、例えば、イントラネットまたはインターネットを介して接続されている）を包含する。システムはまた、入力のためのユーザーコンポーネント（複数可）；ならびにデータ、作成された報告、および手作業による介入の検証のためのレビュアーコンポーネント（複数可）を包含することができる。システムのさらなるコンポーネントは、サーバーコンポーネント（複数可）；およびデータを保存するためのデータベース（複数可）（例えば、報告要素、例えば、解釈的報告要素のデータベース、またはユーザーによるデータ入力およびデータ出力を包含することができるリレーショナルデータベース（ＲＤＢ）のような）を包含することができる。コンピュータプロセッサは、パーソナルデスクトップコンピュータ（例えば、ＩＢＭ、Ｄｅｌｌ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈなど）、携帯用コンピュータ、メインフレーム、ミニコンピュータ、または別のコンピュータデバイスにおいて典型的に見出されるプロセッサとすることができる。
【００９６】
ネットワーク化されたクライアント／サーバーアーキテクチャは、必要に応じて選択することができ、例えば、伝統的な２層または３層クライアントサーバーモデルとすることができる。リレーショナルデータベース管理システム（ＲＤＭＳ）は、アプリケーションサーバーコンポーネントの一部または別個のコンポーネント（ＲＤＢマシン）のいずれかとして、データベースにインターフェースを提供する。
【００９７】
一例において、このアーキテクチャは、データベース中心のクライアント／サーバーアーキテクチャとして提供され、このアーキテクチャにおいて、クライアントアプリケーションは、一般に、データベース（または、データベースサーバー）への要求を行い、必要に応じて様々な報告要素と、特に解釈的報告要素、特に解釈テキストおよび警告とともに報告を追加するアプリケーションサーバーからのサービスを要求する。サーバー（複数可）（例えば、アプリケーションサーバーマシンの一部または別個のＲＤＢ／リレーショナルデータベースマシンのいずれかとして）は、クライアントの要求に応じる。
【００９８】
入力クライアントコンポーネントは、最大範囲の能力およびアプリケーションを実行するための特徴を提供する、完全な独立型のパーソナルコンピュータとすることができる。クライアントコンポーネントは、通常、任意の所望のオペレーティングシステムのもとで動作し、通信エレメント（例えば、モデムまたはネットワークに接続するための別のハードウェア）、１つまたは複数の入力デバイス（例えば、キーボード、マウス、キーパッド、または情報またはコマンドを転送するために使用される別のデバイス）、記憶エレメント（例えば、ハードドライブまたは別のコンピュータで読取り可能な、コンピュータで書き込み可能な記憶媒体）、および表示エレメント（例えば、モニター、テレビ、ＬＣＤ、ＬＥＤ、または情報をユーザーに伝達する別の表示デバイス）を包含する。ユーザーは、入力デバイスを介してコンピュータプロセッサに入力コマンドを入力する。一般に、ユーザーインターフェースは、ウェブブラウザアプリケーション用のグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）である。
【００９９】
サーバーコンポーネント（複数可）は、パーソナルコンピュータ、ミニコンピュータ、またはメインフレームとすることができ、データ管理、クライアント間の情報共有、ネットワーク管理運営およびセキュリティを提供する。アプリケーションおよび使用される任意のデータベースは、同じまたは異なるサーバー上にあってよい。
【０１００】
メインフレームなど単一のマシン、マシンの集合体、または別の適当な構成における処理を含む、クライアントおよびサーバー（複数可）のための別のコンピュータの配置が想定される。一般に、クライアントおよびサーバーマシンは、一緒に作動して、本開示の処理を達成する。
【０１０１】
使用される場合、データベース（複数可）は、通常、データベースサーバーコンポーネントと接続されており、データを保持する任意のデバイスとすることができる。例えば、データベースは、コンピュータ（例えば、ＣＤＲＯＭ、内蔵ハードドライブ、テープドライブ）用の磁気記憶デバイスまたは光学記憶デバイスであってよい。データベースは、サーバーコンポーネントの遠隔（ネットワーク、モデムなどを介するアクセスによって）に、またはサーバーコンポーネントのローカルに位置することができる。
【０１０２】
システムおよび方法において使用される場合、データベースは、データ項目間の関係に従って構成およびアクセスされるリレーショナルデータベースとすることができる。リレーショナルデータベースは、一般に、複数のテーブル（実体）で構成される。テーブルの行は、レコード（別個の項目についての情報の集合）を表し、列は、フィールド（レコードの特定の属性）を表す。その最も単純な概念において、リレーショナルデータベースは、少なくとも１つの共通フィールドを介して互いに「関連付けられる」データエントリーの集合である。
【０１０３】
コンピュータおよびプリンタを備え付けたさらなるワークステションが、データを入力するための、および、いくつかの実施形態において、所望であれば、適切な報告を作成するための、サービスの時点で使用されてもよい。コンピュータ（複数可）は、アプリケーションを起動するためのショートカット（例えば、デスクトップ上の）を有することにより、必要に応じて、データエントリー、送信、解析、報告の受取などの開始を容易にすることができる。
【０１０４】
コンピュータで読取り可能な記憶媒体
本開示はまた、コンピュータ使用環境において実行されるときに、本明細書において記載されている通りに心臓病死亡リスクの計算のすべてまたは一部を行うためのアルゴリズムの実行を提供するプログラムが保存されている、コンピュータで読取り可能な記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、メモリーキー、フラッシュメモリーカード、ディスケットなど）を想定する。コンピュータで読取り可能な媒体が本明細書に記載の方法を行うための完全なプログラムが入っている場合、プログラムは、出力を収集、解析、および作成するためのプログラム使用説明書を包含し、一般に、本明細書に記載の通りユーザーと情報交換するため、解析情報とともにそのデータを処理するため、そのユーザーのための独自の印刷媒体または電子的媒体を作成するための、コンピュータで読取り可能なコードデバイスを包含する。
【０１０５】
記憶媒体が、本明細書に記載の方法の一部の実行を提供するプログラム（例えば、本方法のユーザー側の態様（例えば、データ入力、報告受取能力など））を提供する場合、プログラムは、遠隔地のコンピュータ使用環境への、ユーザーによるデータ入力の送信（例えば、インターネットを介して、イントラネットを介して、など）を提供する。データの処理または処理の完了を、遠隔地で行い、報告を作成する。報告および完全な報告を提供するための任意の必要とされた手作業による介入の完了の検証後、次いで、完全な報告が、電子文書または印刷文書（例えば、ファックスまたは郵送される紙の報告）としてユーザーに送り返される。本発明に従うプログラムの入っている記憶媒体は、適した基板またはそのような使用説明書を得ることができるウェブアドレス上に記録された使用説明書（例えば、プログラムインストール、使用に関するものなど）とともにパッケージ化することができる。コンピュータで読取り可能な記憶媒体はまた、対象方法のアッセイステップを行うための１つまたは複数の試薬（例えば、プライマー、プローブ、アレイ、または別のそのようなキットコンポーネント）と組み合わせて提供することもできる。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例は、本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載され、本発明者らが本発明者らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図せず、以下の実験がすべての実施された実験である、または実施された実験が以下の実験だけであることを表すこともまた意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験的誤差および偏差が計上されるべきである。別途指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度である。
【０１０７】
材料および方法
プラスミド、細胞培養、およびトランスフェクション。ヒトＢＩＮ１（アイソタイプ８）ｃＤＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎｅから入手した。次いで、全長ＢＩＮ１〜８（１〜４５４ａａ）およびＢＩＮ１−ＢＡＲ＊（１〜２８２ａａ）を増幅し、Ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰクローニングを使用してｐＤＯＮＲ／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、エントリークローンを作製した。その後遺伝子を、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲクローニングによってｐＤｅｓｔ−ｅＧＦＰ−Ｎ１、ｐＤｅｓｔ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１（もとはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手した、変換されたベクター）、およびｐｃＤＮＡ３．２−Ｖ５−Ｄｅｓｔ中に挿入した。ヒトＣａＶ１．２は、Ｏｒｉｇｅｎｅから入手した。ヒトβ２ｂおよびウサギα２δ１は、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓａｎｇｕｎｅｔｔｉ博士により提供された。ＡＰＣ−ＧＦＰは、Ｔｏｒｓｔｅｎ  Ｗｉｔｔｍａｎｎ博士により提供された。Ｎ末端ＧＦＰ−ＣａＶ１．２は、Ｋｕｒｔ  Ｂｅａｍ博士により提供され、Ｃ末端ＣａＶ１．２−ＧＦＰは以前に記載されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００４）。ドミナントネガティブＡＰＣ（ＡＰＣ１〜１４５０ａａ）は、Ｋｅｎ  Ｋａｐｌａｎ博士により提供された。
【０１０８】
ＨｅＬａ細胞およびマウス心房ＨＬ−１細胞を、ＤＭＥＭおよびＣｌａｙｃｏｍｂ培地中で標準的な哺乳動物細胞条件下で培養した。ＨｅＬａ細胞におけるｃＤＮＡトランスフェクションには、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。ＨＬ−１細胞におけるｃＤＮＡトランスフェクションには、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、プラス試薬と共に使用した。
【０１０９】
免疫染色および電子顕微鏡法。以前に記述されているＷＧＡ標識化（４％ＰＦＡ、室温）を除き、すべての免疫細胞化学で、冷メタノール固定（Ｓｈａｗら、２００７）を使用した。免疫組織化学のために、凍結切片を氷冷したアセトン中で１０分間固定した。ＥＭタンニン酸標識化のために、細胞を１．２％グルタルアルデヒドで、０．５  １ｍｇ／ｍｌタンニン酸の存在下で固定した。免疫標識化のために、マウス心筋細胞懸濁液を、２％パラホルムアルデヒド中で、０．１％グルタルアルデヒドで２時間、室温で固定し、次いで、１２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で洗浄し、ペレットにした。次いで、ペレットをＰＶＰスクロース中に浸透させ、マウントし、液体窒素中で凍結させた。凍結切片の免疫金標識化は、記載されている通り実施した（Ｂｕｔｌｅｒら、１９９７）。マウス抗ＢＩＮ１抗体は、Ｓｉｇｍａから入手した。ＣａＶ１．２では、Ａｌａｍｏｎｅのウサギ抗ＣａＶ１．２を使用した。
【０１１０】
広視野の落射蛍光、ＴＩＲＦおよび回転ディスク共焦点顕微鏡法。すべての画像化を、１００×１．４９ＮＡ  ＴＩＲＦ対物レンズを有するＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡およびＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアにおいて実施した。広視野の落射蛍光画像のデコンヴォリューションは、Ａｕｔｏｑｕａｎｔソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して実施した。ＤＰＳＳレーザー（４８６,５６１,６４７ｎｍ）とともにレーザーマージモジュール５（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＡ）を、ＴＩＲＦおよび共焦点（Ｙｏｋｏｇａｗａ、ＣＳＵ−Ｘ１）画像化の光源として使用した。多波長ＴＩＲＦは、Ｄｕａｌ−Ｖｉｅｗエミッションスプリッター（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）によって達成した。ＡＰＣおよびＢＩＮ１の微速度連続撮影は、ＢＩＮ１およびＡＰＣについてそれぞれ１フレーム当たり２００ｍｓおよび４００ｍｓの曝露で、１秒当たり２フレームの連続的な速度で取得した。高解像度Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ＨＱ２カメラおよび高感度Ｃａｓｃａｄｅ  ＩＩ  ５１２カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を、画像取込みのために使用した。
【０１１１】
ヒト組織採取および心筋細胞単離。カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）治験委員会の承認を得て、ＵＣＳＦで移植時に切除された心臓由来の、または心臓が移植されない臓器ドナー由来の組織を得た。すべてのＵＣＳＦ移植レシピエントから、手術の前に完全なインフォームドコンセントを得た。カリフォルニア移植ドナーネットワーク（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｄｏｎｏｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＣＴＤＮ）は、使用されないドナー心臓を提供し、それらの使用に関して近親者からインフォームドコンセントを得た。
【０１１２】
冷却心筋保護液によりすぐに灌流した後、左室自由壁の全層試料を、すべての心外膜脂肪から取り除き、後のタンパク質およびｍＲＮＡ解析のために液体窒素中に瞬間凍結した。免疫組織化学のために、さらなる切片を、ＯＣＴ培地中に包埋し、液体Ｎ２冷却されたイソペンタン中で凍結させた。心筋細胞単離では、以前に報告された方法（Ｂｅｕｃｋｅｌｍａｎｎら、１９９１）を変更して、予め加温したコラゲナーゼＩＩ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）による３７℃でカルシウムを含まないＫＨＢ溶液（１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、１１ｍＭグルコース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＢＤＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）（Ｄｉｐｌａら、１９９８）中での消化のために、心室自由壁試料を約１ｍｍ３切片に切断した。解離した心筋細胞を、免疫細胞化学のための固定の前に、ラミニンをプレコートされたガラス製カバースリップに接着させた。
【０１１３】
成体マウス心筋細胞の単離および培養。以前に記述されている方法（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、２００７）によるコラゲナーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を用いた解離の後、マウス心室筋細胞を、雄の成体Ｃ５７／黒色マウス（８〜１２週；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から単離した。表面ビオチン化実験では、心筋細胞を、ラミニンをプレコートされた培養皿に接着させ、初代心筋細胞用培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて終夜、３０μＭノコダゾールありまたはなしで２０μＭ  Ｄｙｎａｓｏｒｅの存在下で培養した。
【０１１４】
ＣａＶ１．２の表面ビオチン化。処理の後、細胞を迅速に洗浄し、氷冷した１ｍｇ／ｍｌ  ＥＺ−ｌｉｎｋＴＭ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに２５分間インキュベートした。２×５分間の、１００μＭグリシンによる結合していないビオチンの失活の後、細胞を洗浄し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、２ｍＭ  ＮａＦ、２００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４）中で溶解させた。総タンパク質濃度を決定し、試料間で正規化した。次いで溶解物を、予洗したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコートビーズとともに４℃で終夜インキュベートした。洗浄後、結合している表面タンパク質を溶出し、変性させ、ＮｕＰａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、ウサギ抗ＣａＶ１．２抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ）でプローブした。
【０１１５】
共免疫沈降。Ｈｅｌａ細胞を、制御β２ｂおよびａ２δ１サブユニットならびにＢＩＮ１−Ｖ５に加えて、ヒトＣａＶ１．２とともに同時トランスフェクトし、回収し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  Ｃｏ−ＩＰ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮａＦ、１００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で溶解させた。次いで溶解物を、ｒｅｃ−タンパク質−Ｇ−セファロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による１時間のプルダウンの前に、マウス抗Ｖ５抗体（２μｇ）または等量の非特異的マウスＩｇＧのいずれかとともに２時間インキュベートした。洗浄したビーズに結合している物質を溶出し、変性させ、分離し、ＣａＶ１．２（Ａｌｏｍｏｎｅ）またはＶ５（Ｓｉｇｍａ）に対するウサギ抗体でプローブした。
【０１１６】
遺伝子発現の定量。ヒトＣａＶ１．２のリアルタイムＰＣＲのためのＴａｑＭａｎプライマー／プローブセット（５’ＦＡＭ／３’ＢＨＱ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＢＩＮ１、遺伝子は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して得た。全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出、その後のＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ  ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による精製およびＴｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）での処理によって左室自由壁から単離および精製した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）およびオリゴｄＴプライマーを使用して実施した。定量的リアルタイムＰＣＲ反応を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｑＰＣＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して３８４ウェルフォーマットにおいて、１０μｌの全反応体積でＡＢＩ  ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実施した。絶対的遺伝子発現は、ＰＰ１Ａ、ユビキチン、ＥＥＦＡ１、ＰＲＬ１３Ａ、およびＨＲＰＴ１をコントロール遺伝子として（Ｄｏｌｇａｎｏｖら、２００１）（Ｂｕｔｌｅｒら、１９９７）使用するＤｏｌｇａｎｏｖらの方法を使用して定量した。ＢＩＮ１およびＣａＶ１．２のプライマープローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＢＩＮ１発現レベルの定量では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、アッセイＩＤ  Ｈｓ０１１２０８９８＿ｍ１を使用した。このアッセイは、ＢＩＮ１転写変異体８および９を検出する。ＣａＶ１．２発現レベルの定量では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ、アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６７６８１＿ｍ１を使用した。ハウスキーピング遺伝子では、以下のプローブを使用した：ＲＰＬ１３Ａ−ＴＭＰ：ＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＴ（配列番号７）、ユビキチン−ＴＭＰ：ＴＧＡＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧ（配列番号８）、ＥＥＦ１Ａ１−ＴＭＰ：ＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＧＧＧ（配列番号９）、およびＰＰＩＡ−ＴＭＰ：ＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡ（配列番号１０）。
【０１１７】
心臓駆出率の定量。患者の胸部に置かれたプローブからの超音波を使用することからなる、心臓における経胸壁心エコーを実施した。超音波を使用して、心臓の１次元の断面および２次元の断面を構築した。臨床用心エコーマシン（例えば、Ａｃｕｓｏｎ）における標準的なボリュームレンダリングソフトウェアは、この断面から左心室の体積をコンピュータ計算する。駆出率は、心収縮中および心弛緩中の体積の差異を心弛緩時の体積で割ったものである。正常な駆出率は、約５５〜６０％である。
【実施例１】
【０１１８】
ＣａＶ１．２は、機能不全心臓において細胞内分布を有する
それぞれの拍動に必須のプロセスである心臓興奮収縮（ＥＣ）連関は、筋細胞の電気的興奮をその機械的な収縮に結び付ける。ＥＣ連関は、ＣａＶ１．２チャネルを介する局所的なカルシウムの流入から始まり、次いで、これは細胞内筋小胞体によるカルシウムの多量の放出を引き起こす（Ｆａｂｉａｔｏ、１９８３）。筋小胞体（ＳＲ）上のリアノジン受容体は、局所的なカルシウムセンサーおよび放出チャネルである（Ｃｈｅｎｇら、１９９３；Ｉｎｕｉら、１９８７；Ｐｅｓｓａｈら、１９８５）。心室の心筋細胞において、効率のよいカルシウム誘導性カルシウム放出（ＣＩＣＲ）のためにＣａＶ１．２チャネルとリアノジン受容体の密接な会合が必要である（Ｂｅｒｓ、２００２）。同時ＣＩＣＲは、１０〜２５のＬ型カルシウムチャネルおよび１００〜２００のリアノジン受容体が同時に生じ、互いに協調するＥＣ連関においてに起こる（Ｂｅｒｓ、２００１）。ＳＲに結合したリアノジン受容体に局所的に接近するために、ＣａＶ１．２チャネルは、筋繊維鞘のＴ細管陥入上に必然的に集中する（Ｓｃｒｉｖｅｎら、２０００）。ＣａＶ１．２チャネルの位置がＴ細管に集中することが明らかに必要であるにもかかわらず、ＣａＶ１．２チャネルが、膜のこれらの領域に輸送および局在化される機構はほとんど知られていない。
【０１１９】
機能不全心臓において、心室心筋細胞の細胞内カルシウム過渡現象は、低振幅および緩やかな下降を有し（Ｂｅｕｃｋｅｌｍａｎｎら、１９９２；Ｇｗａｔｈｍｅｙら、１９８７；Ｓｉｐｉｄｏら、１９９８）、収縮の障害をもたらす（Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９４）。カルシウム除去における機能障害（Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ、１９９８；Ｈａｓｅｎｆｕｓｓら、１９９９）、より最近では、リアノジン放出チャネルのリン酸化および機能障害（Ｌｅｈｎａｒｔら、２００５；Ｍａｒｘら、２０００）を含む、ＣａＶ１．２によるカルシウム流入の下流の多数の因子が、カルシウム過渡現象の変化に寄与する機能不全の筋肉において特定されている。非同時性ＣＩＣＲが、機能不全の心筋細胞において存在し、機能不全心臓における不完全なＥＣ連関の増進に寄与する可能性があるという報告もまた存在している（Ｇｏｍｅｚら、１９９７；Ｌｉｔｗｉｎら、２０００）。
【０１２０】
拡張型心筋症筋肉におけるＣａＶ１．２チャネル発現の報告は、ＣａＶ１．２が変化しないものから減少しているものまで大きく異なる（Ｈｕｌｌｉｎら、１９９９；ＭｅｗｅｓおよびＲａｖｅｎｓ、１９９４；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、１９９８）。末期の非虚血性拡張型心筋症を有する移植レシピエントの新たに外植された心臓および移植に使用することができない臓器ドナーの機能不全でない心臓を得た。心筋保護液ですぐに灌流後、心室切片を凍結し、心室心筋細胞もまた単離した。凍結切片の免疫組織化学は、ＣａＶ１．２およびＴ細管のマーカー、Ｔ細管形成タンパク質ＢＩＮ１）の染色を示す（Ｌｅｅら、２００２）。機能不全でない心筋では、ＣａＶ１．２分布は、ＢＩＮ１で印を付けたＴ細管に沿ってよく組織化されている。しかし、機能不全の心筋では、Ｔ細管のＢＩＮ１分布は、ＣａＶ１．２に沿って妨害されている。興味深いことに、図１Ａに示しているデータは、ＣａＶ１．２発現は、機能不全の心筋においてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で変化していないことを示す。これらのデータは、機能不全の心筋において、発現レベルではなくＣａＶ１．２の細胞分布が変化していることを示す。
【０１２１】
ＣａＶ１．２の細胞分布をよりよく理解するために、単離ヒト心筋細胞を染色し、回転ディスク共焦点顕微鏡で０．１μｍのＺ深度増分で画像化した。心筋細胞のＺ軸断面図を、もとのｚスタックから作成し、側面画像で示した。細胞端から２μｍ以内の細胞周辺の蛍光強度を定量し、全細胞蛍光強度に対して正規化し、下部右のパネルに示した。周辺蛍光シグナルは、機能不全の心筋細胞において顕著に減少した。３次元ボリュームビューおよびＺ軸断面図を、図１Ｂに示している。機能不全でない心筋細胞（左）の小区画において見られるように、ＣａＶ１．２はＴ細管に集中しており、一方、罹患心筋細胞においてＣａＶ１．２は細胞内分布を有し、特徴的なＴ細管の陥入はなくなっている。周辺ＣａＶ１．２の定量は、ＣａＶ１．２の周辺（Ｔ細管の集中している細胞端から２μｍ以内）の割合が、機能不全の心筋細胞において顕著に減少していることを示す。機能不全の心筋細胞におけるＣａＶ１．２細胞内取込みもまた、完全な３６０度回転で見ることができる。ＣａＶ１．２タンパク質およびｍＲＮＡが変化していない（図１Ａ）とすれば、機能不全の心筋細胞におけるＬ型カルシウムチャネルの細胞内取込みは、チャネルの不適切なポストゴルジ輸送を示す。
【実施例２】
【０１２２】
ＢＩＮ１はＣａＶ１．２をＴ細管に標的化させる
Ｔ細管膜へのＣａＶ１．２標的化の機構を調査した。単離された機能不全でないヒト心筋細胞およびマウス心筋細胞の両方におけるＢＩＮ１およびＣａＶ１．２の共染色は、ＢＩＮ１がＴ細管の輪郭を示し、ＣａＶ１．２がそのような陥入に沿って集中し、ＢＩＮ１と共局在化することを示す。より高解像度で画像化するために、二重免疫金標識化を用いる透過型電子顕微鏡法を使用して、成体マウス心筋細胞のＴ細管超微細構造においてＣａＶ１．２およびＢＩＮ１を特定した。図２Ａの代表的な画像は、ＢＩＮ１（小さい１０ｎｍの点）およびＣａＶ１．２（大きい１５ｎｍの点）が互いに１０〜５０ｎｍの範囲内に集中および密集し、Ｔ細管膜構造において生じていることを示す。
【０１２３】
ＣａＶ１．２が、Ｔ細管で細管形成タンパク質ＢＩＮ１と密接に会合しているとすれば、ＢＩＮ１がＣａＶ１．２のＴ細管への送達を特異的に誘引することが可能である。この可能性を、Ｔ細管形成能を有さないが内因性のＣａＶ１．２（＊）を発現する心房筋細胞細胞型ＨＬ−１細胞、およびＴ細管もＣａＶ１．２も有さない非筋細胞Ｈｅｌａ細胞におけるＢＩＮ１とＣａＶ１．２の間の会合を研究する還元主義者の手法を使用して試験した。両方の細胞系において、外因性ＢＩＮ１は、発生期のＴ細管様膜陥入を誘導することができる。ＨＬ−１細胞において、固定細胞の免疫細胞化学は、内因性ＣａＶ１．２が、外因性ＢＩＮ１と共局在化することを示す。また、ＢＩＮ１は、Ｔ細管様構造と一致する線状のトラックを形成する（Ｌｅｅら、２００２）。
【０１２４】
同様な共局在化の結果が、外因性ＢＩＮ１およびＣａＶ１．２でトランスフェクトされた非筋細胞Ｈｅｌａ細胞で得られた。ＣａＶ１．２の表面発現を、画像化深度をカバーガラスの５０〜１００ｎｍ以内に限定する全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法を使用して評価した。スペクトルの異なるフルオロフォアでタグ付けしたＣａＶ１．２およびＢＩＮ１を使用して、短時間の低速度撮像を実施した。結果は、膜表面で、ＢＩＮ１に誘導される構造が表面ＣａＶ１．２を誘引し、それによりカルシウムチャネルの局所的な集中を引き起こすことを示す。ＨｅＬａ細胞データは興味深く、別の筋細胞構造の非存在下、ならびに内因性ＣａＶ１．２の非存在下において、膜アンカリングタンパク質ＢＩＮ１およびＣａＶ１．２は過剰発現されたときにもやはり集まるであろうことを示す。Ｈｅｌａ細胞におけるＢＩＮ１とＣａＶ１．２の間の密接な生化学的会合は、Ｖ５タグ付きＢＩＮ１およびＣａＶ１．２に対してプローブされたものの明白な共免疫沈降によってさらに支持される（図２Ｂ）。
【実施例３】
【０１２５】
ＣａＶ１．２はＴ細管ではなくＢＩＮ１に標的化される
ＣａＶ１．２標的化のために十分であるのはＢＩＮ１タンパク質またはＴ細管構造であるかどうかを決定した。野生型ＢＩＮ１（ＢＩＮ１−ＷＴ、１−４５４ａａ）は、Ｎ末端ＢＡＲドメイン、その後に、リン脂質結合およびＴ細管形成のために必要とされるエクソン１０によってコードされている１５アミノ酸（ａａ）、コイルコイルド連結ドメイン、およびタンパク質間相互作用のためのＣ末端ＳＨ３ドメインを有する（図３Ａ）（Ｌｅｅら、２００２；Ｎｉｃｏｔら、２００７）。膜陥入を誘導する能力を保持する、以前に公開されているＣ末端切断型ＢＩＮ１−ＢＡＲ＊（１〜２８２ａａ、ＢＡＲ＋エクソン１０）を作製した（Ｌｅｅら、２００２）。ＢＩＮ１−ＢＡＲ＊は、内因性ＣａＶ１．２を、ＨＬ−１細胞のものなどの発生期のＴ細管構造に誘引することができない。ＢＩＮ１−ＷＴでトランスフェクトされたＨＬ−１細胞において、内因性ＣａＶ１．２は、ＢＩＮ１構造に沿って分布している。対照的に、ＢＩＮ１−ＢＡＲ＊でトランスフェクトされた細胞において、ＣａＶ１．２は、ＢＩＮ１構造との不十分な共局在化を示す。ＣａＶ１．２表面標的化に対するＢＩＮ１−ＷＴおよびＢＩＮ１−ＢＡＲ＊の影響を、生化学的表面ビオチン化アッセイによってさらに試験した。図３Ｂのデータが示すように、ＢＩＮ１−ＢＡＲ＊とは異なり、ＢＩＮ１−ＷＴはＣａＶ１．２の表面発現を誘導する。アッセイは、ＣａＶ１．２のＴ細管標的化が完全長ＢＩＮ１を必要とし、ＢＩＮ１−ＢＡＲ＊により誘導されるＴ細管構造は、ＣａＶ１．２を誘引するのに十分ではないことを示す。
【実施例４】
【０１２６】
機能不全の心筋細胞はＢＩＮ１の発現量が少なく、薄いＴ細管を有する
ＢＩＮ１はＴ細管を発生させ、ＣａＶ１．２をＴ細管に標的化する（図３）ので、機能不全の心筋細胞におけるＣａＶ１．２の細胞内取込み（図１）が異常なＢＩＮ１発現の結果であるかどうかを決定した。ＢＩＮ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を、機能不全ヒト心臓において定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによって、それぞれ測定した。機能不全でない心臓組織と比較して、機能不全の心筋は、顕著により低いＢＩＮ１のメッセージおよびタンパク質レベルを有する（図４Ａ）。単離ヒト心筋細胞をまた使用して、細胞レベルでＢＩＮ１発現も評価した。断面図においてＢＩＮ１染色によって示された細管のＢＩＮ１発現およびＴ細管の深さを定量し、まとめた（図４Ｂ）。断面図において示されるように、ヒト機能不全心筋細胞は、Ｔ細管に沿ってはるかに低いＢＩＮ１発現を有する。Ｔ細管におけるＢＩＮ１シグナルの定量は、機能不全の心筋細胞が、少ないＢＩＮ１シグナルおよびより薄いＴ細管を有することを示す。小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）による膜標識化の３次元再構成は、機能不全の心筋細胞におけるＴ細管ネットワークの崩壊を裏付ける。断面図は、機能不全の心筋細胞が、より薄い縮小したＴ細管を有することを示す（図４Ｂ、下の列）。要約すると、図１〜４のデータは、ＢＩＮ１がＴ細管形成を誘導し、ＣａＶ１．２をＴ細管膜に標的化し、機能不全の心筋細胞において、ＢＩＮ１が減少し、薄いＴ細管および減少した膜結合ＣａＶ１．２をもたらすことを示す。
【実施例５】
【０１２７】
ＣａＶ１．２標的化は、ＡＰＣが先端に結合した微小管を伴う
ＣａＶ１．２の輸送における微小管の役割を評価するために、内因性のＬ型カルシウムチャネル（ＣａＶ１．２）を、固定した心房ＨＬ−１細胞においてα−チューブリンで共染色し、高解像度画像化（デコンヴォルーション後処理を含む）により検査した。結果は、ＣａＶ１．２が、核周囲のゴルジに濃縮されており、微小管ネットワークに沿って分布していることを示す。微小管と結合しているＣａＶ１．２チャネルが膜に輸送されていること（すなわち前方向への輸送）を裏付けるために、ＨＬ−１生細胞および成人心筋生細胞を、エンドサイトーシスを妨害するダイナミンＧＴＰａｓｅ阻害剤である（Ｍａｃｉａら、２００６）Ｄｙｎａｓｏｒｅの存在下で、微小管破壊物質ノコダゾールに曝露させた。表面ＣａＶ１．２の発現を、表面ビオチン化によってアッセイした。図５における成人心筋細胞の結果は、微小管破壊が、ＣａＶ１．２の膜への前方向輸送の減少をもたらすことを示す。同様な結果が、ＨＬ−１細胞における内因性ＣａＶ１．２の表面発現について得られた。
【０１２８】
次に、＋ＴＩＰタンパク質が、Ｔ細管でのＢＩＮ１へのＣａＶ１．２送達と関連しているかどうかを評価した。心筋細胞におけるＥＢ１分布は、Ｔ細管ではなく介在板において濃縮されていることが見出された。ＥＢ１は、典型的には、細胞間境界領域と会合している（Ｓｈａｗら、２００７）が、＋ＴＩＰタンパク質ＡＰＣは異なる細胞分布を有し（Ｂａｒｔｈら、２００２）、移動細胞の伸長している膜とより多く会合している（Ｅｔｉｅｎｎｅ−ＭａｎｎｅｖｉｌｌｅおよびＨａｌｌ、２００３；Ｎｅｕｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ、１９９７）。さらに重要なことに、ＡＰＣは、上皮の細管形成に関与している（Ｐｏｌｌａｃｋら、１９９７）。したがって、心筋細胞におけるＡＰＣの分布を調査した。マウス心筋細胞におけるα−チューブリン、ＡＰＣ、およびＣａＶ１．２の三重染色により、ＡＰＣが、Ｔ細管およびＺ線の領域に存在すること、およびＡＰＣが先端に結合した微小管が、ＣａＶ１．２の集中している領域に頻繁に密集することが明らかとなった。ＡＰＣが先端に結合した微小管が内因性ＣａＶ１．２の送達に関与しているかどうかを試験するために、ＡＰＣのドミナントネガティブ（Ｇｒｅｅｎら、２００５）を、心房ＨＬ−１細胞において使用した。表面ビオチン化は、ＡＰＣ機能を妨害することにより、ＣａＶ１．２の表面発現が減少することを示した（図６Ａ）。したがって、ＡＰＣは、ＣａＶ１．２チャネルの筋繊維鞘への送達において役割を有する。
【０１２９】
ＥＢ１が先端に結合した微小管をアドヘレンスジャンクション構造に固定し（ＬｉｇｏｎおよびＨｏｌｚｂａｕｒ、２００７）、イオンチャネルの送達（Ｓｈａｗら、２００７）を容易にすることができると仮定して、生細胞画像化を使用して、ＡＰＣが先端に結合した微小管をＢＩＮ１によって係留することができるかどうかを評価した。Ｈｅｌａ細胞を、ＢＩＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙおよびＡＰＣ−ＧＦＰでトランスフェクトし、１２０秒間画像化し、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰシグナルの両方を２．５秒の平均フレーム速度で交互に捕捉した。ＡＰＣが先端に結合した微小管は、典型的には、細胞の前縁部に集中する。画像化の合間の、ＡＰＣが先端に結合した６つの個々の微小管の経路の手作業によるトレースを得た。ＡＰＣがＢＩＮ１付近にあるとき、ＡＰＣが先端に結合した微小管は、ＢＩＮ１構造の周囲にとどまる。対照的に、ＢＩＮ１構造の存在しない細胞端では、ＡＰＣが先端に結合した微小管は、係留されることなく、より速い速度でより長い距離運ばれる。ＡＰＣ粒子の経路長および速度の完全なデータ（図６Ｂ）は、ＡＰＣは、微小管をＢＩＮ１に係留し、ＣａＶ１．２の膜含有ＢＩＮ１への送達を容易にすることを示す。
【実施例６】
【０１３０】
ＬＶＡＤを装着した心臓におけるＢＩＮ１発現レベル
左室心尖部に左室補助デバイス（ＬＶＡＤ）を入れている末期拡張型心筋症患者の心臓を分析して、ＢＩＮ１発現レベルを決定した。患者のＬＶ−ＦＷおよびＬＶ−ＡＰＥＸの心筋においてＢＩＮ１発現レベルを決定した。この患者は、約６カ月間ＬＶＡＤを装着していた。心疾患以外の理由で死亡した個体の対応する組織におけるＢＩＮ１発現レベルもまた決定した。ＢＩＮ１発現レベルを図７に示している。図７は、心疾患以外の理由で死亡した個体の機能不全でない心臓が、左室自由壁（ＬＶＦＷ）および左室心尖部（Ａ）において匹敵するＢＩＮ１発現レベルを示し、一方、左室心尖部にＬＶＡＤを入れている末期拡張型心筋症患者の心臓が、左室心尖部心臓組織におけるＢＩＮ１発現の回復（ＬＶＦＷと比較して）を示す（Ｂ）ことを示す。
【実施例７】
【０１３１】
ＩＤＦＣａＶ１．２値および／またはＩＤＦＨＫ値ならびに心臓の健康状態
ＩＤＦＣａＶは、ＣａＶ１．２ｍＲＮＡ発現レベルのＢＩＮ１  ｍＲＮＡ発現レベルに対する比である。ＩＤＦＨＫは、ＨＰＲＴ１（または別のハウスキーピング遺伝子）発現レベルのＢＩＮ１  ｍＲＮＡ発現レベルに対する比である。ＩＤＦＣａＶ値およびＩＤＦＨＫ値を、機能不全心臓および機能不全でない心臓について決定した。ＩＤＦＣａＶ値の分析の結果を、図８に示す。図８は、心臓ＩＤＦＣａＶが末期拡張型心筋症の心臓において顕著に高いことを示す。図８（Ａ）は、心疾患以外の理由で死亡した個体の機能不全でない心臓（黒丸）についておよび末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒四角）についてのＩＤＦＣａＶを示す。図８（Ｂ）は、心臓のＩＤＦＣａＶが左室駆出率（ＬＶＥＦ）と相関していることを示す。心疾患以外の理由で死亡した正常コントロール個体の機能不全でない心臓（黒四角）についておよび末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒丸）についてのＩＤＦＣａＶを示す。
【０１３２】
ＩＤＦＨＫ値の解析結果（ＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡのＢＩＮ１  ｍＲＮＡに対する比として測定された）を、図９に示している。図９は、心臓ＩＤＦＨＫが末期拡張型心筋症の心臓において顕著に高いことを示す。図９（Ａ）は、心疾患以外の理由で死亡した正常コントロール個体の機能不全でない心臓（黒丸）についておよび末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒四角）についてのＩＤＦＨＫ値を示す。図９（Ｂ）は、心臓ＩＤＦＨＫが左室駆出率（ＬＶＥＦ）と相関していることを示す。心疾患以外の理由で死亡した正常コントロール個体の機能不全でない心臓（黒四角）についておよび末期拡張型心筋症患者の機能不全心臓（黒丸）についてのＩＤＦＨＫを示す。
【実施例８】
【０１３３】
心不全患者においてＢＩＮ１発現は心拍出量と相関している
心内膜心筋生検材料を、臨床評価中、病因不明の心不全の１４人の患者の右心室の中隔から得た。これらの患者は、特発性非浸潤性心筋症および減少した心拍出量（４．５Ｌ／分未満）を示した。心臓生検材料を、ＢＩＮ１について、および、試料正規化のために、ＣａＶ１．２含有量について定量的免疫組織化学によって分析した。各生検試料について、個々の心筋細胞断面図を、ＢＩＮ１およびＣａＶ１．２の細胞レベルの測定（少なくとも１試料当たり１０個の心筋細胞）のために概略した。図１０において見られるように、正規化されたＢＩＮ１レベルと心拍出量の間には強い相関関係がある。
【実施例９】
【０１３４】
ＢＩＮ１発現は心不全患者における転帰を予測する
心内膜心筋生検材料を入手し、正規化されたＢＩＮ１レベルが決定された１４人の患者（上記の実施例８を参照されたい）を、６〜１８カ月後に追跡調査して、正規化されたＢＩＮ１レベルが転帰を予測したかどうかを確かめた。
【０１３５】
死亡、ＬＶＡＤ埋込み、または２５％未満のＬＶＥＦは、転帰不良とみなされる。結果を、下記の表１に示す。
【０１３６】
【表１】
0005802197.tif 000002
【０１３７】
低い正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、転帰不良と正に相関している（表１）。表１は、低いＢＩＮ１発現レベルを有する患者が、概して、療法に反応せず、転帰不良を有した、すなわち、死亡、ＬＶＥＦの改善がなかった、またはＬＶＡＤ埋込みを必要としたことを示す。一方、高いＢＩＮ１発現レベルを有する患者は、概して、転帰不良を示さなかった。
【０１３８】
追跡調査データに基づいて、０．６５未満の正規化されたＢＩＮ１値を、カットオフ値であると決定した。０．６５未満の正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、転帰不良について陽性基準を示し、０．６５以上の正規化されたＢＩＮ１発現レベルは、転帰不良について陰性基準を示した。
【０１３９】
表２の２×２ボックスを使用して、真の試験陽性（４）を、真の陽性と偽陰性の和（４＋２＝６）で割ることによって感度を得る。真の試験陰性（７）を、真の陰性と偽陽性の和（７＋１＝８）で割ることによって特異性を得る。真の試験陽性（４）を、真の陽性と偽陽性の和（４＋１＝５）で割ることによって陽性予測値を得る。真の試験陰性（７）を、真の陰性と偽陰性の和（７＋２＝９）で割ることによって陰性予測値を得る。
【０１４０】
【表２】
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【０１４１】
表２において見られるように、陽性基準は、上記の通り転帰不良の６７％を予測する（正規化されたＢＩＮ１レベル＜０．６５）。陰性基準（正規化されたＢＩＮ１レベル≧０．６５）は、８８％の特異性（心臓が少なくとも次の６〜１８カ月以内に転帰不良を有さないであろう可能性が８８％と解釈される陰性基準）を有する。転帰不良についてのＢＩＮ１発現レベルの陽性予測値（ＰＰＶ）は８０％であり、転帰不良なしに関するＢＩＮ１発現レベルの陰性予測値（ＮＰＶ）は７８％であった。
【実施例１０】
【０１４２】
機械的補助デバイスを装着した心臓の健康状態の評定
末期拡張型心筋症の患者は、心臓ポンプ機能を援助するために埋め込まれたＬＶＡＤを有する。患者の心臓が療法により回復しているのかどうか、およびＬＶＡＤを安全に除去することができるかどうか、または心臓が悪化し続けるかどうかを決定することは、臨床的に困難である。患者は、循環器科の入院患者または循環器チームの治療を受けている外来患者のいずれであってもよいが、心臓カテーテル検査室での心室生検が予定されている。６時間の絶食後、患者をカテーテル検査室に呼び、軽い意識下鎮静ならびに内頸静脈（首）または大腿深静脈（鼠蹊）のアクセスポイントへの局所麻酔薬（リドカイン）をかけた。心臓用バイオトームを導入し、蛍光透視ガイド下で右心室まで進めた。バイオトームを使用して、右心室の単一の生検材料を得て、これを直ちに液体窒素中で瞬間凍結させる。２〜４時間のモニタリングの後、患者は、病室に戻されるか、またはカテーテル検査室から自宅へ退院する。代替として、心臓のバイオトームを、左心室まで進め、次いで、使用して左心室の生検材料を得ることができる。
【０１４３】
組織試料は、摂氏−８０度冷凍庫で保存するか、または直ちに処理する。ＲＮＡ抽出のための標準的な実験技術を使用して組織を処理し、定量的ＲＴＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）によって遺伝子発現を決定する。ｑＲＴＰＣＲを使用して、心臓ＢＩＮ１および／もしくはＢＩＮ１および心臓ＣａＶ１．２、ならびに／またはＢＩＮ１およびＨＰＲＴ１の発現レベルを測定する。
【０１４４】
ＬＶ−ＦＷと比較した、ＬＶ−Ａｐｅｘにおける心臓ＢＩＮ１の増加した発現は、患者がＬＶＡＤ治療に反応していることを示す。ＢＩＮ１発現レベルのその後の決定により、ＢＩＮ１発現レベルが安定化したことが示されると、患者は治療されたと診断され、ＬＶＡＤは除去される。
【０１４５】
心臓の健康状態のさらなる指標として、内因性疾患因子（ＩＤＦ）もまた決定され、臨床的判断のために使用される。ＩＤＦＣａＶは、ＣａＶ  ｍＲＮＡ発現レベルのＢＩＮ１  ｍＲＮＡ発現レベルに対する比である。ＩＤＦＨＫは、ＨＰＲＴ１（または別のハウスキーピング遺伝子）発現レベルのＢＩＮ１  ｍＲＮＡ発現レベルに対する比である。大幅に上昇したＩＤＦ（例えば、３０より大きいＩＤＦＣａＶ（図７）または１５より大きいＩＤＦＨＫ（図８）または、コントロールＩＤＦの１．５倍より大きい任意の同様な正規化されたＩＤＦ）は、心臓が重度の心不全を有することを示す。大幅に上昇したＩＤＦを有する患者は、長期のＬＶＡＤ療法を必要とすると診断される。ＩＤＦのその後の決定において、高いＩＤＦにより決定されるＬＶＡＤ療法による改善がないと、心臓移植が勧められる。対照的に、正常なまたは少し上昇したＩＤＦを有する患者（コントロールＩＤＦの１．５倍未満の正規化されたＩＤＦ）は、心臓機能の潜在的な回復および、最終的に、ＬＶＡＤの除去の成功を示す。
【０１４６】
ＢＩＮ１発現を、心臓組織の生検において、約１カ月の定期的な間隔で測定し、心臓の回復（または悪化）の割合を評定するための傾向を確立する。
【０１４７】
したがって、ＢＩＮ１発現レベルおよび／またはＩＤＦを、ＬＶＡＤ療法によって回復することができる心臓とできない心臓を区別することができる。
【実施例１１】
【０１４８】
末期ＣＨＦ患者におけるＢＩＮ１発現レベルの分析
現在利用可能な方法を使用した予後診断は、末期うっ血性心不全の患者には極めて困難である。ＢＩＮ１発現レベルならびにＩＤＦは、個々の心筋細胞における疾患に関連した変化の程度を定量するため、重度の心不全患者の部分集合における予後のデータを提供する。具体的なの部分集合は、急性劇症心筋炎、慢性進行性非虚血性心筋症、慢性進行性虚血性心筋症、および心臓移植後患者を包含する。
【０１４９】
患者のこれらの４つの部分集合由来の心内膜心筋組織生検材料を得て、後ろ向き研究を実施する。各患者について、心臓病診断、左室駆出率、年齢、性別、および生検後の生存期間などの心臓病転帰に関するデータを得る。臨床的データが不完全な患者の心臓組織は、研究に含まれていない。
【０１５０】
生検により得られた組織を、液体窒素中で瞬間凍結させ、上述した通りｑＲＴＰＣＲを実施する。ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料として保存された保存心臓組織を、ｑＲＴＰＣＲまたは免疫組織化学のいずれかによって分析する。免疫組織化学のために、ＢＩＮ１および／またはＢＩＮ１およびＣａＶ１．２ならびに／またはＢＩＮ１およびハウスキーピングタンパク質に対する一次抗体を使用する。遺伝子発現の減少は、免疫組織化学により得られる蛍光の減少に対応する。上述したｑＲＴＰＣＲデータにより得られた比と同様にして、タンパク質レベルの定量的免疫組織化学によってＩＤＦも得る。
【０１５１】
４つのデータセットのそれぞれならびにこれらのデータセットの組み合わせについて、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線などの生存曲線を導く。患者群における生存を追跡し、生検時のＢＩＮ１発現レベルまたはＩＤＦと比較する。上昇したＩＤＦ（例えば、心臓疾患のないコントロールの１．５より大きい最初の値）を有する患者は、心臓疾患のないコントロールの１．５未満のＩＤＦを有する患者より低い予期される生存率を有する。
【実施例１２】
【０１５２】
心臓の健康状態の診断におけるＢＩＮ１発現レベルの使用
急性劇症心筋炎の患者は、心内膜心筋生検に強い適応を有する（巨細胞性心筋炎および好酸球性心筋炎を除外するため）。同様に、末期の虚血性および非虚血性心筋症の患者もまた、移植精密検査の一部として頻繁に生検を受ける。ＬＶＡＤ、右室補助デバイス（ＲＶＡＤ）、または両心室補助デバイス（ＢｉＶＡＤ）などの心室補助デバイスを入れている患者は、デバイスを挿入するために除去された心室中心部の大きな生検材料を生じる。さらに、生検材料は、心臓移植後の患者から前臨床の拒絶についての年１回のスクリーニングとして、または急性拒絶を排除する急性代償不全期間中、頻繁に得られる。
【０１５３】
内因性疾患因子（ＩＤＦ）は、内部コントロールのＢＩＮ１に対する比から得られ、両者はｑＲＴＰＣＲによってアッセイされる。内部コントロールは、ＨＰＲＴ１などのハウスキーピング遺伝子（ＨＫ）の標準的なセット、またはＣａＶ１．２である。ＨＫ遺伝子およびＣａＶ１．２遺伝子発現レベルは、心不全において影響を受けない。
【０１５４】
ＢＩＮ１発現レベルおよび／またはＢＩＮ１由来のＩＤＦは、心筋の健康状態の臨床用スナップショットである。大幅に高いＩＤＦ（１．５より大きいコントロールＩＤＦと推定された）は、心筋の健康状態不良とともに予後の低い回復を示す。上記の実施例９において論じているように、ＩＤＦは、最初の値に基づいて死亡率を予測する（コントロールＩＤＦの１．５より大きいＩＤＦは、高い死亡率と対応する）。心血管治療薬および機械的補助デバイスなどの療法の開始の後に、週に１回または月１回の生検を続けて、回復の進行を追跡することができる。ＩＤＦはまた、拒絶反応についてのスクリーニングを必要とする移植後患者においても有用である。現在の生検検査は、生検試料が炎症の徴候および健康な心臓に存在し、かつ拒絶反応を起こしている心臓の特定の試料において存在しない可能性がある免疫細胞について試験されるため、感受性および特異性が比較的低い。心筋細胞自体の細胞生物学的プロセスをアッセイすることによって、ＢＩＮ発現レベルおよびＢＩＮ１に導かれるＩＤＦは、移植片拒絶反応の検出の感受性および特異性の両方を向上させる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１】
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【図１２Ａ−２】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ａ−３】
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【図１３Ａ−４】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【配列表】
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