(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定室と、該測定室に隣接して配設される側壁と、該側壁に隣接して配設されるマイクロ流路と、該測定室、該側壁及び該マイクロ流路に配設される梁と、を含み、
上記梁は、上記測定室に浮遊して配置される測定部と、上記マイクロ流路に浮遊して配置されるマイクロ流路接触部と、上記側壁上に配設され上記測定部と上記マイクロ流路接触部とを連結する連結部と、から構成されており、
上記マイクロ流路で発生する熱を上記測定室に配置された梁の温度変化として検知する、熱量センサ。
【請求項２】
前記梁は、同じ材料又は２つ以上の異なる材料からなる、請求項１に記載の熱量センサ。
【請求項３】
前記マイクロ流路は、入口及び出口を有している、請求項１に記載の熱量センサ。
【請求項４】
前記梁の測定部の表面には、さらにミラー層が形成されている、請求項１に記載の熱量センサ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の熱量センサと、
上記熱量センサの温度変化を検知する検知部と、
を備える、熱量センサを用いた熱量検出装置。
【請求項６】
前記測定室を排気する排気部を有している、請求項５に記載の熱量センサを用いた熱量検出装置。
【請求項７】
さらに、前記梁を強制振動するための振動部を有しており、該振動部は、圧電アクチュエータ、静電引力アクチュエータ及び光駆動の何れかを有している、請求項５に記載の熱量センサを用いた熱量検出装置。
【請求項８】
前記振動部は、前記梁を有する自励発振回路を備えている、請求項７に記載の熱量センサを用いた熱量検出装置。
【請求項９】
前記検知部は、レーザードップラー振動計、レーザー干渉計及び光てこ法の何れかにより前記梁の共振周波数を検出するか、又は前記熱量センサと該熱量センサに隣接して配設される電極との間に生じる静電容量からなる発振回路の周波数を検出する、請求項５に記載の熱量センサを用いた熱量検出装置。
【請求項１０】
第１及び第２のガラス基板に、測定室と、該測定室に隣接して配設される側壁と、該側壁に隣接して配設されるマイクロ流路と、を形成する工程と、
上記第１のガラス基板の測定室、側壁及びマイクロ流路を形成した面上にＳｉ基板とＳｉＯ２層と上層Ｓｉ層とからなるＳＯＩ基板の該上層Ｓｉ層を接合する工程と、
上記ＳＯＩ基板のＳｉ基板及びＳｉＯ２層を除去する工程と、
上記上層Ｓｉ層をパターンニングして、測定部とマイクロ流路接触部と連結部とからなる梁を形成する工程と、
上記第２のガラス基板に、上記マイクロ流路の入口及び出口とを形成する工程と、
上記梁が配設された第１のガラス基板と上記第２のガラス基板とを接合する工程と、
を含む、熱量センサの製造方法。
【請求項１１】
前記ＳＯＩ基板のＳｉ基板及びＳｉＯ２層を除去した後に、ミラー層をパターンニングする工程を備える、請求項１０に記載の熱量センサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、生体の細胞１個から発生する熱による温度変化を検出可能な熱量センサ及びそれを用いた熱量検出装置並びに熱量センサの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジー分野において、生体機能の研究が進み、その対象が組織や器官から単一細胞、単一生体分子へと移行している。これらの内、例えば単一細胞レベルでの熱反応の計測が求められている。特に、単一細胞や単一生体分子の熱分析を行う場合、マイクロ体積のサンプルのマイクロ熱量を計測する必要がある。
【０００３】
特許文献１には、水晶振動子温度センサを用いて、発振周波数変化から温度を計測するバイオセンサが開示されている。
【０００４】
従来、卓上式の熱量計が市販されているが、価格が１千万円以上と高価で、また、測定サンプルが１ｃｍ３で、細胞数では１０６個の平均された熱量のデータしか得られない。
【０００５】
近年、バイオテクノロジー分野において、生体現象の解明に関する研究が行われ、ナノデバイスの需要も高まっている。熱は生体にとって重要なパラメータの一つであり、細胞や、蛋白質やＤＮＡなどの生体分子の熱特性が測定されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
しかし、これらの測定はバルク状態、つまり多数の細胞の塊で行われている。単一細胞または単一生体分子レベルでの熱測定が実現すれば、生化学反応を介した生体の熱現象の解明や、異常細胞などのモニタリングへの応用が見込まれる。例えば、褐色脂肪細胞は、発熱機能を有する代表的なサンプルであり、バルク状態における温度や発熱量が計測されている（非特許文献２〜５参照）。その値は一細胞あたり約５ｎＷと見積もられるが、単一細胞の発熱量を実際に計測した報告はない。
【０００７】
一方、微細加工技術を用いて、薄膜上にマイクロヒーターやサーモパイルを集積化した各種のマイクロ熱量センサが報告されている（非特許文献６〜１４参照）。
【０００８】
Olson等は、Ｓｉ３Ｎ４基板に容量３５ｎＬ（１ｎＬ＝１×１０−９リットル）のＳｉ製チャンバーと、温度センサとしても動作する金属ヒーターを作製し、５２ｎＬのインジウムの溶解熱を３μＷの感度で計測した（非特許文献７参照）。
【０００９】
Johannessenらは、Ｓｉ３Ｎ４上面にサーモパイルとヒーターを作製し、マウスの肝細胞一つを加水分解する時の産生熱を計測した（非特許文献８参照）。この時、容量が７２０ｐＬ（１ｐＬ＝１×１０−１２リットル）のポリイミドからなるチャンバーを利用し、その熱量分解能は、１０〜２５ｎＷであった。マイクロ統合分析システム（ＴＡＳ）分野で頻繁に用いられるマイクロ流体チップを用いた熱分析システムも報告されている。
【００１０】
Zhangらは、Ｓｉ３Ｎ４膜上に熱電対列、ヒーターを作製した基板を、ガラス製のマイクロ流路と接合した（非特許文献１１参照）。この時、サンプル容量は大きくなるが、複数の流入口を設けることで複数の流体を制御することが可能になる。その利点を活かし、酵素を用いた触媒反応の熱計測を行った。
【００１１】
また、ポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane、ＰＤＭＳ）を用いてマイクロ流路、サンプル用チャンバー及びリファレンスチャンバーを形成し、示差走査熱量測定を行った報告もある（非特許文献１４参照）。褐色脂肪細胞の体積が約１．３ｆＬ（１ｆＬ＝１×１０−１５リットル）であること、発熱量が約５ｎＷであることを考慮すると、上記チャンバーの容量、感度ともにさらなる改善が必要である。
【００１２】
また、試薬刺激による応答を観察する場合、溶液置換を容易に行うためにマイクロ流路を設ける必要があるが、マイクロ流体チップを用いた熱量センサで、ｎＷオーダーの感度、ｐＬオーダーのサンプル容量を有するものは報告されていない。
【００１３】
また、細胞の活性を保ったまま、熱計測を行うには細胞が液中にある必要がある。しかし、液中では熱の拡散が生じることが報告されている（非特許文献１５参照）。
【００１４】
本発明者等は、厚さ１７５ｎｍのＳｉ３Ｎ４と厚さ５０ｎｍのＡｕ（金）で作製した薄膜バイメタルカンチレバー型熱センサを集光したレーザーで加熱し、その変位を測定することで空気中における熱の逃げを比較した。真空中を基準として、空気中では８２％の熱の逃げが生じた。液中においては、９６％程度の熱の逃げが生じることが予想される（非特許文献１６参照）。このため、熱の拡散によりセンサへ入力される熱が少なくなり、実際の発熱量よりも小さな値で測定される問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平６−２９４７６３号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】日本熱計測学会編、“熱量測定・熱分析ハンドブック”、丸善、２０１０
【非特許文献２】J. Nedergaard, B. Cannon, O.Lindberg, “Microcalorimetry of isolated mammalian cells”, Nature, Vol.267, p.518-p.520, 1977
【非特許文献３】N. J. Rothwell and M. J. Stock, “Whither Brown Fat”, Biosciqnce Reports, Vol. 6, p.3-p.18, 1986
【非特許文献４】D. G. Clark, M. Brinkman and S. D. Neville, “Microcalorimetric measurements of heat production in brown adipocytes from control and cafeteria-fed rats”, Biochemical Journal, Vol.235, p.337-p.342, 1986
【非特許文献５】K. Inokuma, Y. Ogura-Okamatsu, C. Toda, K. Kimura, H. Yamashita, and M. Saito, “Uncoupling Protein 1 Is Necessary for Norepinephrine-Induced Glucose Utilization in Brown Adipose Tissue”, Diabetes, Vol.54, p.1386-1391, 2005
【非特許文献６】K, Verhaegen, K. Baert, J. Simaels, W. V. Driessche, “A high-throughput silicon microphysiometer”, Sensors and Actuators, Vol.82, p.186-p.190, 2000
【非特許文献７】E. A. Olson, M. Yu. Efremov, A. T. Kwan, S. Lai, V, Petrova, F. Schiettekatte, J. T. Warren, M. Zhang, and L. H. Allen, “Scanning calorimeter for nanoliter-scale liquid samples”, Applied Physics Letters, Vol. 77, No. 17, p.2671-p.2673, 2000
【非特許文献８】E. A. Johannessen and J. M. R. Weaver, P. H. Cobbold, J. M. Cooper, “Heat conduction nanocalorimeter for pl-scale single cell measurements”, Applied Physics Letters, Vol.80, No.11, p.2029-p.2031, 2002
【非特許文献９】J. L. Garden, E. Chateau, and J. Chaussy, “Highly sensitive ac nanocalorimeter for microliter-scale liquids or biological samples”, Applied Physics Letters, Vol.84, No.18, p.3597-p.3599, 2004
【非特許文献１０】E. B. Chancellor, J. P. Wikswo, and F. Baudenbacher, M. Radparvar and D. Osterman, “Heat conduction calorimeter for massively parallel high throughput measurements with picoliter sample volumes”, Applied Physics Letters, Vol.85, No.12, p.2408-p.2410, 2004
【非特許文献１１】(11)Y. Zhang, S. Tadigadapa, “Calorimetric biosensors with integrated microfluidic channels”, Biosensors and Bioelectronics, Vol.19, p.1733-p.1743, 2004
【非特許文献１２】中別府  修、坂寄  純一、”MEMSセンサによる少数細胞の代謝熱モニタリング”,Thermal Science & Engineering., Vol. 14, No.4, p.115-p.120, 2006
【非特許文献１３】K. S. Suh, H. J. Kim, Y. D. Park and K. H. Kim, “Development and Characterization of a Microcalorimeter Based on a Si-N Membrane for Measuring a Small Specific Heat with Submicro-Joule Precision”, Journal of the Korean Physical Society, Vol. 49, No. 4, p.1370-1378, 2006
【非特許文献１４】M. Toda, N. Inomata, T. Ono, “Bimorph Cantilevers Actuated by Focused Laser from the Side”, IEEJ Transactions on Sensors and Micromachines, in press
【非特許文献１５】L. Wang, B. Wang, Q. Lin, “Demonstration of MEMS-based differential scanning calorimetry for determining thermodynamic properties of biomolecules”, Sensors and Actuators B, Vol. 134, p.953-p.958, 2008
【非特許文献１６】M.Toda, T. Ono, F.Liu and I. Voiculescu, “Evaluation of biomaterial cantilever beam for heat sensing at atmospheric pressure”, Review of Science Instruments, Vol. 81, 055104, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
細胞や生体分子を扱う場合、活性を保つために液中もしくは気体中にて温度測定等の観察を行う必要がある。従来の熱分析デバイスは、熱伝導率の比較的小さい窒化シリコン薄膜上に金属細線でヒーターや温度センサを設け、その上にマイクロ流体チップを用いてマイクロチャンバーとマイクロ流路を作製したものが多く見られる。しかし、サンプル容量が多く必要であり、数十ｐＬ程度の体積を有する単一細胞や生体分子の測定に適しているとは言い難い。液中では細胞が発熱しても、その周囲に拡散するため、正確な熱量測定が難しい。
【００１８】
マイクロ流体チップを用いず、マイクロチャンバーのみを作製した従来のデバイスも存在する。このデバイスでは、サンプル容量も少なくなり、熱感度も改善されたが、これでもサンプル容量、熱感度が十分であるとも言えない。さらにマイクロ流路を設けないため、細胞刺激に必要な試薬導入が不可能である。また、チャンバーが開放系であるため、液体の蒸発や汚染、外乱が問題となる。
【００１９】
本発明は、上記課題に鑑み、細胞の活性を維持したまま、液体中の細胞からの熱量を高精度に測定することができる熱量センサを提供することを第１の目的とし、熱量センサを用いた熱量検出装置を提供することを第２の目的とし、熱量センサの製造方法を提供することを第３の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者等は、カンチレバー型の熱量センサの一端を真空マイクロチャンバーに封止することで周辺環境への熱の逃げを抑えることにより、液中の測定対象からの発熱として、体積１ｎＬ未満の細胞１個の熱量を、より正確に高感度で測定し得る熱量センサを実現し、本発明に想到した。
【００２１】
上記第１の目的を達成するため、本発明の熱量センサは、測定室と、測定室に隣接して配設される側壁と、側壁に隣接して配設されるマイクロ流路と、測定室、側壁及びマイクロ流路に配設される梁と、を含み、梁は、測定室に浮遊して配置される測定部と、マイクロ流路に浮遊して配置されるマイクロ流路接触部と、側壁上に配設され、測定部とマイクロ流路接触部とを連結する連結部と、から構成されており、マイクロ流路で発生する熱を、梁の温度変化として検知する構成を有している。
【００２２】
上記構成において、梁は、好ましくは、同じ材料からなるが、２つ以上の材料からなっていてもよい。マイクロ流路は、好ましくは、入口及び出口を有している。
前記梁の測定部の表面には、さらにミラー層が形成されている。
【００２３】
上記第２の目的を達成するため、本発明の熱量検出装置は、上記熱量センサと、熱量センサの温度変化を検知する検知部と、を備えている。
【００２４】
上記構成において、好ましくは、測定室を排気する排気部を有している。
さらに、好ましくは梁を強制振動するための振動部を有する。振動部は、好ましくは、圧電アクチュエータ、静電引力アクチュエータ及び光駆動の何れかを有している。振動部は、好ましくは、梁を有する自励発振回路を備えている。
検知部は、好ましくは、熱量センサと該熱量センサに隣接して配設される電極との間に生じる静電容量からなる発振回路の周波数を検出する。検知部は、好ましくは、レーザードップラー振動計、レーザー干渉計及び光てこ法の何れかにより梁の共振周波数を検出する。
【００２５】
上記第３の目的を達成するため、本発明の熱量センサの製造方法は、第１及び第２のガラス基板に、測定室と測定室に隣接して配設される側壁と側壁に隣接して配設されるマイクロ流路とを形成する工程と、第１のガラス基板の測定室、側壁及びマイクロ流路を形成した面上にＳｉ基板とＳｉＯ２層と上層Ｓｉ層とからなるＳＯＩ基板の上層Ｓｉ層を接合する工程と、ＳＯＩ基板のＳｉ基板及びＳｉＯ２層を除去する工程と、上層Ｓｉ層をパターンニングして熱伝導用の梁を形成する工程と、第２のガラス基板に、測定室の排気口とマイクロ流路の入口及び出口とを形成する工程と、梁が配設された第１のガラス基板と第２のガラス基板とを接合する工程と、を含んで構成されている。
【００２６】
上記構成において、ＳＯＩ基板のＳｉ基板及びＳｉＯ２層を除去した後に、好ましくはミラー層をパターンニングする工程を備える。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の熱量センサによれば、体積１ｎＬ未満の細胞１個の熱量が測定できる感度の高い低コストの熱量センサを提供することができる。
【００２８】
本発明の熱量センサを用いた熱量検出装置によれば、体積１ｎＬ未満の細胞１個の熱量が測定できる感度の高い低コストの熱量検出装置を提供することができる。
【００２９】
本発明の熱量センサの製造方法によれば、所謂マイクロマシンの製造方法により体積１ｎＬ未満の細胞１個の熱量が測定できる感度の高い熱量センサを低コストで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の熱量センサの構造を示す斜視図である。
【図２】図１の拡大図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線に沿った断面図である。
【図３】本発明の熱量センサの梁の共振周波数の温度変化を示す図である。
【図４】測定室を真空にした際のカンチレバーの温度分布を解析した結果を示す図である。
【図５】測定室を真空又は水にした際のカンチレバーの温度分布を解析した結果を示す図である。
【図６】本発明の熱量センサを用いた熱量検出装置の構成を示すブロック図である。
【図７】レーザードップラー振動計を用いた熱量検出装置のブロック図である。
【図８】カンチレバーの静電容量を用いた熱量検出装置のブロック図である。
【図９】熱量センサの製造方法を、順次に示す模式的な断面図である。
【図１０】熱量センサの梁を異なる材料で形成するときの製造方法を説明する図である。
【図１１】製作した熱量センサの第１のガラス基板とカンチレバーとを示す走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像の図である。
【図１２】製作した熱量センサを示す光学顕微鏡像の図であり、（ａ）は光学顕微鏡像、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ’線に沿った断面図である。
【図１３】カンチレバーのＱ値を示す図であり、（ａ）はマイクロ流路へ溶液を導入する前のＱ値、（ｂ）はマイクロ流路へ溶液を導入した後のＱ値を示す図である。
【図１４】側壁の幅と測定室側のカンチレバーへ伝わる熱量の関係を示す図である。
【図１５】カンチレバーの共振周波数の変動を調べた図である。
【図１６】ノルエピネフリンを添加する前の褐色脂肪細胞の温度変化を示す図である。
【図１７】ノルエピネフリンを添加し、脂肪燃焼による発熱が確認されたときの温度変化を示す図である。
【図１８】アジ化ナトリウムによって不活性(死んだ)細胞の温度変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
（熱量センサ）
図１は、本発明の熱量センサ１の構造を示す斜視図であり、図２は、図１の拡大図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線に沿った断面図である。
図１及び図２に示すように、本発明の熱量センサ１は、測定室２と、測定室２に隣接して配設される側壁３と、側壁３に隣接して配設されるマイクロ流路４と、測定室２、側壁３及びマイクロ流路４に配設される梁５と、を含んで構成されている。梁５は、マイクロカンチレバー又は単にカンチレバーとも呼ぶ。
本発明の熱量センサ１は、さらにマイクロ流路４に流入させる溶液の供給部等を備えて構成してもよい。
【００３２】
マイクロ流路４はガラス等の材料からなり、細胞６や溶液を流すための流路である。このマイクロ流路４の流路は、例えば幅がμｍのオーダーである。マイクロ流路４には、梁５を挟んで溶液や気体からなる媒体の入口４ａと出口４ｂとが備えられている。
【００３３】
梁５は、測定室２内に入り込んでこの内壁とは接触しない、つまり浮遊して配置される測定部５ａと、マイクロ流路４に入り込んでこの内壁とは接触しないで浮遊して配置されるマイクロ流路接触部５ｂと、側壁３上に配設され測定部５ａとマイクロ流路接触部５ｂとを連結する連結部５ｃと、から構成されている。梁５は、Ｓｉ等で作製することができる。以下の説明では、特に断らない限り、梁５をＳｉカンチレバーとして説明する。梁５のマイクロ流路接触部５ｂは、Ｓｉカンチレバー５の一端をマイクロ流路４内に、もう一端、つまり梁５の測定部５ａが真空マイクロチャンバーとなる測定室２に突き出るように設けられる。マイクロ流路接触部５ｂは、マイクロ流路４に流される溶液等の媒体との接触部ｓである。マイクロ流路接触部５ｂ及びその近傍は、媒体に混入されて流入する細胞等の観察物が載置されてもよい。本発明の熱量センサ１では、上記マイクロ流路４で発生する熱を、梁の温度変化として検知する。
【００３４】
本発明の熱量センサ１では、測定室２とマイクロ流路４との間には、例えばガラスからなる壁に仕切りとなる側壁３があり、この側壁３がカンチレバーセンサ５を支えている。測定室２側に配設される梁５の測定部５ａが熱センサとなる。マイクロ流路４側に配設される梁５が、梁５のマイクロ流路接触部５ｂである。溶液よりも熱伝導率の高いＳｉをカンチレバー５の素材として用いて、細胞６からの熱が周囲の溶液へ拡散する前に測定部５ａへと伝達する。
【００３５】
側壁３の幅を小さくすることで熱の逃げを小さくすることはできる。さらに、側壁３と梁５の連結部５ｃとの接着層として、熱伝導率の低いポリマーを用いることで、カンチレバー５からガラスでなる側壁３に逃げる熱量を減少させることができる。
【００３６】
測定室２の真空度つまり圧力は、例えば１Ｐａ〜２００Ｐａ程度とすることができる。梁５の測定部５ａを真空中に配置することで、周囲への熱の逃げを極力小さくすることができる。測定室２内は、図示しない測定室２に設けた排気口２ａから真空ポンプを使用した排気装置で排気してもよい。
【００３７】
梁５の各部は、上記したようにＳｉのような単一の材料ではなく、二つ以上の異なる材料で形成してもよい。例えば、測定部５ａ及びマイクロ流路接触部５ｂをＳｉで形成し、連結部５ｃを金属で形成してもよい。
【００３８】
図３は、本発明の熱量センサ１の梁の共振周波数の温度変化を示す図である。
図３では、カンチレバー５の共振周波数の温度依存性を示しており、温度が上昇すると共振周波数が低下することを示している。つまり、熱量センサ１のカンチレバー５の共振周波数は、温度で変化し、温度が上昇すると共振周波数が低下する。本発明の熱量センサ１においては、Ｓｉからなるカンチレバー５の一端が、測定室２に封入され、周囲への熱の逃げがなくなり、カンチレバー５の温度上昇が大きくなることにより大きな共振周波数変化が得られる。また、測定室２を真空又は低圧力にすることで、液体、気体による梁５の振動減衰を著しく低下させることができる。これにより、本発明の熱量センサ１では、温度上昇を正確にかつ、高感度で計測することができる。
【００３９】
（熱量センサの解析）
測定室２の真空封止の有用性を確認するため、有限要素法によるソフトウェア（COMSOL社製、COMSOL Multiphysics）を用いて、解析を行った。
カンチレバー５の材質はＳｉで、幅３０μｍ、長さ１５０μｍ、厚さ１．５μｍとした。マイクロ流路４の材質はガラスとした。測定室２は一辺３００μｍで深さ２０μｍとした。Ｓｉカンチレバー５の途中に幅３０μｍのガラスでなる側壁３と接する領域がある。周囲の温度を２５℃として、水で満たされたマイクロ流路４側にあるマイクロ流路接触部５ｂに４．５μＷの熱量を与え、測定室２が真空の場合と、水で満たされた場合について解析を行った。
【００４０】
図４は、測定室２を真空にした際のカンチレバー５の温度分布を解析した結果を示す図であり、図５は、測定室２を真空及び水にした際のカンチレバー５の各温度分布を解析した結果を示す図である。
カンチレバー５の温度を比較すると、測定室２が真空の場合には３５．７℃で一様であった。測定室２を水にした場合には、カンチレバー５の先端に向かうにつれて温度が下がり、２６．４℃であった。この結果より、測定室２の真空封止又は低圧力とすることで熱をカンチレバー５の測定部５ａへ減衰しないで伝達することができると推測できる。
【００４１】
後述するレーザードップラー振動計では、測定用レーザーをカンチレバー５に照射する。この際、測定用レーザーのカンチレバー５への照射により、温度が上昇する。カンチレバー５の温度変化を測定する場合、定常的な熱の流入は実際の計測にはあまり影響がないが、カンチレバー５の絶対温度が測定結果に影響を及ぼす場合には注意が必要である。カンチレバーの絶対温度を測定する場合には、カンチレバー５の温度上昇がないように、カンチレバーの測定室２側の光を反射するためのミラー層８（図９（ｃ）参照）を設けてもよい。
【００４２】
（熱量検出装置）
次に、本発明の熱量センサ１を用いた熱量検出装置１０について説明する。
図６は、本発明の熱量センサ１を用いた熱量検出装置１０の構成を示すブロック図である。
図６に示すように、本発明の熱量検出装置１０は、熱量センサ１と、熱量センサ１の検知部１２と、を含んで構成されている。
熱量検出装置１０は、熱量センサ１のマイクロ流路４に媒体を供給する媒体供給部１４を備えていてもよく、さらに、測定室２内を排気する排気部１６を有していてもよい。また、測定室２の圧力を制御する圧力制御を備えていてもよい。マイクロ流路４の媒体に細胞６等を供給する場合には、細胞６等を観察する観察部１８を設ける。観察部１８は、各種の顕微鏡、カメラ、撮像素子を用いたモニタ等を使用することができる。
【００４３】
検知部１２は、熱量センサ１の測定部５ａの温度変化を検知するために設けられている。温度変化は、図３で説明したように熱量センサ１の梁５の共振周波数が温度で変化することを利用して検知することができる。梁５の共振周波数の変化を測定するために、レーザードップラー振動計、レーザー干渉計及び光てこ法の何れかを使用することができる。
【００４４】
（レーザードップラー振動計）
レーザードップラー振動計は、参照信号と、振動部となる梁５からの周波数が変化する信号を干渉させ、ビート信号を発生させる。ビート信号は振動部の周波数変化つまり、周波数シフトで変調されているため、振動部の周波数シフトを測定できる。
【００４５】
（レーザー干渉計）
レーザー干渉計は、参照信号となるレーザー光と振動部となる梁５に照射されるレーザー光からの信号を重ね合わせ、位相を比較する。この位相差を測定することで対象物までの距離を計測することができる。この距離から梁５の変位を得、梁５の変位をもとにした振動数の変化から温度変化を算出することができる。レーザー干渉計を用いた場合には、梁５のように振動する測定物以外の非振動、つまり振動しない測定物の温度変化でも測定が可能である。
【００４６】
（光てこ法）
光てこ法は、温度変動に伴う梁５の共振周波数を検出する方法としてよく用いられる方法である。梁５が温度変動により生じる変位は、梁５の測定部５ａに照射したレーザー光の梁５による反射光の位置変化として測定することができる。
【００４７】
検知部１２は、熱量センサ１の梁５と梁５に隣接して配設される電極との間に生じる静電容量を利用した検知部としてもよい。この静電容量変化は、容量変化の測定や静電容量を用いた発振器の周波数を検出してもよい。このような発振器は、梁５に生じる静電容量（Ｃ）と抵抗とからなるＣＲ発振器や、梁５に生じる静電容量とインダクタンス（Ｌ）とからなるＬＣ発振器を用いることができる。梁５の温度変化により静電容量が変化し、静電容量が変化することにより、例えばＬＣ発振器の周波数が変化する。インダクタンスの温度変化が静電容量の温度変化に比較して無視できる場合には、梁５の温度変化と発振周波数の変化の関係を予め調べておけば、ＬＣ発振器の周波数変化から梁５の温度を測定することができる。
【００４８】
さらに、熱量検出装置は、梁５を強制振動するための振動部２２を有していてもよい。振動部２２は、梁５を強制振動するための圧電素子のような圧電アクチュエータ、静電引力アクチュエータ及び光駆動の何れかを使用することができる。振動部２２には、梁５を含む自励発振回路が接続されてもよい。
【００４９】
さらに、マイクロ流路４に供給する細胞６等の測定物に、刺激を与える試薬等の反応物を注入する反応物注入部２４を備えていてもよい。図示の場合には、反応物注入部２４が、媒体供給部１４に接続されている。
【００５０】
（レーザードップラー振動計を用いた熱量検出装置）
図７は、レーザードップラー振動計２８を用いた熱量検出装置１０のブロック図である。この図に示すように、熱量センサ１を用いた温度測定装置１０は、熱量センサ１を収容する容器２６と、カンチレバー５上に配設されるレーザードップラー振動計２８と、レーザードップラー振動計２８に接続される位相シフター３２及び位相同期回路３４（ＰＬＬ回路とも呼ぶ）と含んで構成されている。熱量センサ１の下部には、振動部２２として圧電材料からなる板が配設されている。圧電材料としては、ＰＺＴ板２２ａを用いることができる。振動部２２はＰＺＴ板２２ａとして説明する。ＰＺＴ板２２ａは、位相シフター３３に接続される利得が調整可能な増幅器３５に接続されている。レーザードップラー振動計２８は、カンチレバー５の振動周波数を電圧信号として出力する。このレーザードップラー振動計２８の出力は、位相シフター３２とＰＬＬ回路３３に入力される。
【００５１】
位相シフター３２に出力されたレーザードップラー振動計２８の出力は、位相シフター３２で位相を９０度ずらして、さらに増幅器３５で適切な電圧振幅となるように利得調整がされて、ＰＺＴ板２２ａに入力される。ＰＺＴ板２２ａがカンチレバー５を強制振動させることによって、カンチレバー５が自励発振する。
【００５２】
ＰＬＬ回路３４は、位相比較器３６と、位相比較器３６に接続されるローパスフィルタ３７と、ローパスフィルタ３７に接続される電圧制御発振器３８とから構成されている。ローパスフィルタ３７の出力の一部が、周波数シフト信号（ｄＦ）３９として出力される。ローパスフィルタ３７の出力信号は、電圧制御発振器３８で交流信号となり、位相比較器３６に参照信号３８ａとして出力される。
【００５３】
レーザードップラー振動計２８を用いた熱量検出装置１０によれば、梁５の共振周波数の温度変化をレーザードップラー振動計２８で検出することができる。
【００５４】
（熱量センサの静電容量を用いた熱量検出装置１０Ａ）
図８は、カンチレバー５の静電容量４１を用いた熱量検出装置１０Ａを示すブロック図である。
図８に示すように、熱量センサ１を用いた温度測定装置１０Ａは、熱量センサ１と、カンチレバー５に接続されるインダクタンス４２と、周波数混合器４３と、局部発振器４４と、ＦＭ復調器４５と、周波数カウンター４６と、ＦＭ復調器４５に接続される位相シフター３２と、位相シフター３２に接続される利得が調整可能な増幅器３５と、熱量センサ１の下部に配設されるＰＺＴ板２２ａと、を含んで構成されている。位相シフター３２に接続される利得が調整可能な増幅器３５は、ＰＺＴ板２２ａに接続されている。熱量センサ１のカンチレバー５に生じる静電容量４１とインダクタンスＬ４２とからＬＣ発振器が構成されている。ＬＣ発振器の出力信号と局部発振器４４の出力信号とが周波数混合器４３に入力され、ＬＣ発振器の出力信号と局部発振器４４の出力信号との周波数差が、中間周波数信号（ＩＦ信号）として、ＦＭ復調器４５に出力される。ＩＦ信号の周波数は例えば、１００Ｈｚから１０ＭＨｚ程度である。
【００５５】
本発明の熱量センサ１によれば、周辺環境への熱の逃げを極力小さくすることができる。また、測定室２を真空とすることにより、周辺環境へ熱が逃げる前に梁５の測定部５ａへ熱を伝えることができる。
【００５６】
本発明の熱量センサ１を用いた熱量検出装置１０、１０Ａによれば、熱感度を高めるために、カンチレバー５を用いた熱量センサ１を用いることにより、従来は細胞６の発熱による溶媒の温度上昇を計測していたが、細胞６を熱量センサ１に接触又は近傍に配設させることで直接発熱を計測できる。
また、熱量センサ１はマイクロ流路４を備えているので、マイクロ流路４への溶液置換を容易にし、溶液の外乱や汚染、蒸発を防止することができる。
【００５７】
（熱量センサの製造方法）
図９は、熱量センサ１の製造方法を、順次に示す模式的な断面図である。
図９（ａ）に示すように、最初にガラス基板に、測定室２と側壁３とマイクロ流路４となる領域をエッチングで形成する。このガラス基板を１組つまり、第１及び第２のガラス基板５１、５２（図９（ｅ）参照）を作成する。
図９（ｂ）に示すように、ＳＯＩ基板６０を用意し、陽極接合により上記第１のガラス基板５１に接合する。ＳＯＩ基板６０は、Ｓｉ基板６１上にＳｉＯ２層から成る犠牲層６２と上層Ｓｉ層６３が順に積層されている。具体的には、例えば、厚さが２００μｍのシリコン基板４１の表面に、厚さ０．５μｍのＳｉＯ２から成る犠牲層６２を介して、厚さ１．５μｍの上層Ｓｉ層６３が形成されている。ＳＯＩ基板６０の上層Ｓｉ層６３の面と、第１のガラス基板５１の測定室２及びマイクロ流路４が形成される領域の面と、が対向するように陽極接合がされる。
次に、図９（ｃ）に示すように、シリコン基板４１と犠牲層６２とが除去され、上層Ｓｉ層６３だけにする。ミラー層８を形成する場合には、この段階で上層Ｓｉ層６３にミラー層８を形成する。ミラー層８の形成は、ミラー層８となるＣｒ、Ａｕ等の金属薄膜を蒸着法やスパッタリング法で堆積した後、フォトリソグラフィーによるパターンニングで形成することができる。
次に、図９（ｄ）に示すように、上層Ｓｉ層６３をパターンニングしてカンチレバー５を形成する。さらに、第１のガラス基板５１上には、後述する陽極接合の接着層６６となるパターンも形成している。
次に、図９（ｅ）に示すように、第２のガラス基板５２の一方に、マイクロ流路４の入口４ａ及び出口４ｂの形成を行う。このガラスのエッチングには、サンドブラストを使用することができる。この段階で、測定室の排気口２ａを設けてもよい。
最後に、図９（ｆ）に示すように、図９（ｂ）〜（ｄ）で加工した第１のガラス基板５１と、図９（ｅ）で加工した入口４ａ及び出口４ｂの形成された第２のガラス基板５２とを陽極接合により接合する。陽極接合の雰囲気は、測定室２の圧力を制御して行えばよい。陽極接合の条件の一例として、温度が４５０℃で、５００Ｖの電圧を１０分印加して行うことができる。
以上で、熱量センサ１が作製される。
【００５８】
（熱量センサの製造方法の変形例）
熱量センサ１の製造方法の変形例として、梁５を異なる材料で形成するときの製造方法について説明する。
図１０は、熱量センサ１の梁５を異なる材料で形成するときの製造方法を説明する図である。
図１０（ａ）に示すように、図９（ｃ）に示されたＳＯＩ基板６０のシリコン基板４１と犠牲層６２とが除去され、ＳＯＩ基板６０の上層Ｓｉ層６３において、連結部５ｃとなる上層Ｓｉ層６３をエッチングする。
次に、図１０（ｂ）に示すように、上層Ｓｉ層６３に連結部５ｃとなる金属層６５を堆積する。
次に、図１０（ｃ）に示すように、連結部５ｃを除いた金属層６５をエッチングで除去する。これにより、連結部５ｃが金属層６５で形成される。さらに、上層Ｓｉ層６３をパターンニングして、連結部５ｃ以外の梁５となる測定部５ａ及びマイクロ流路接触部５ｂを形成する。この工程は、図９（ｄ）と同一の工程である。
上記工程の後で、図９（ｅ）及び（ｆ）の工程を行うことにより、Ｓｉからなる測定部５ａ及びマイクロ流路接触部５２ｂと、金属層６５からなる連結部５ｃとからなる梁５が形成された熱量センサ１を製造することができる。
【００５９】
（熱量センサの製作）
図９で説明した製造方法で、熱量センサ１を作製した。材料としてはガラス板とＳＯＩ基板６０を用いた。カンチレバー５の材質はＳｉで、幅３０μｍ、長さ１５０μｍ、厚さ１．５μｍとした。測定室２は、一辺が３００μｍの正方形で深さ２０μｍとした。マイクロ流路４の幅は１００μｍで深さは、２０μｍとした。測定室からマイクロ流路４との間の側壁３の厚さは、１５０μｍ、１００μｍ、５０μｍ、３５μｍ、１５、１０μｍと変えた。パターンニングは、紫外線による光露光で行い、Ｓｉ等のエッチングはプラズマエッチングで行った。
図１１は、製作した熱量センサ１の第１のガラス基板５１とカンチレバー５とを示す走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像の図である。この図に示すように、図８（ａ）〜（ｄ）の工程により、第１のガラス基板５１の側壁３上にカンチレバー５が形成されていることが分かる。
【００６０】
図１２は、製作した熱量センサ１を示す光学顕微鏡像の図であり、（ａ）は光学顕微鏡像、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ’線に沿った断面図である。図１２に示すように、さらに図８（ｅ）〜（ｆ）の工程により、第１のガラス基板５１に第２のガラス基板５２が接合され、説明のための側面図に示すように、梁５の測定部５ａが測定室２に浮遊状態で、梁５のマイクロ流路接触部５ｂがマイクロ流路４に浮遊状態で配設されていることが分かる。さらに、梁５の測定部５ａにはＡｕからなるミラー層８が形成されていることが分かる。
【００６１】
（液体を導入した際のＱ値の変化）
次にマイクロ流路４に液体（水）を導入し、カンチレバー５のＱ値の変化を比較した。図１３は、カンチレバー５のＱ値を示す図であり、（ａ）はマイクロ流路４へ溶液を導入する前のＱ値、（ｂ）はマイクロ流路４へ溶液を導入した後のＱ値を示す図である。縦軸はカンチレバーの振動の振幅（ｍｍ）、横軸は共振周波数（ｋＨｚ）である。
先ず、液体を入れる前に、測定室２、マイクロ流路４共に真空の状態でＱ値を測定したところ、４２００であった。マイクロ流路４に水を導入した後、Ｑ値を測定すると、測定室２の場合、４１８８と変化はなかった。
【００６２】
液体の導入前後において、測定室２側のカンチレバー５のＱ値に変化はなかった。これは、液体導入後も真空状態が維持されていることを示している。カンチレバー５の測定感度は、Ｑ値に依存する。カンチレバー５の片側を液体に晒しても、もう一方のカンチレバー５の感度を維持できるため、液中のサンプルの熱量をより高感度に測定できる可能性を示唆している.
【００６３】
（カンチレバーのガラス壁を介した熱伝導）
このとき、カンチレバー５を支持するガラス壁からなる側壁２の幅の依存性も検証した。Ｓｉカンチレバー５だけでなく、側壁２への熱の逃げも十分考えられる。
一方、Ｓｉカンチレバー５に優先的に伝熱するのであれば、カンチレバー５への伝熱は側壁２の幅に依存しない。マイクロ流路接触部５ｂをレーザーで加熱し、測定室２側のカンチレバー５の共振周波数変化を測定し、温度変化に換算した。レーザーを照射したマイクロ流路接触部５ｂもカンチレバー５構造を有するので、同様にして温度変化を求めた。ここで、伝熱効率を(カンチレバーセンサの温度変化)／(マイクロ流路接触部５ｂの温度変化)と定義し、伝熱効率を評価した。
【００６４】
図１４は、側壁３の幅と測定室２側のカンチレバー５への伝熱効率の関係を示す図である。図１４の横軸は側壁３の幅（μｍ）、縦軸は伝熱効率である。
図１４に示すように、側壁３の幅が広くなるほど、センサ側への伝熱効率は減少した。本発明の熱量センサ１において、伝熱効率の最大値は５５％で、その際の側壁３の幅は１０μｍであった。Ｓｉカンチレバー５に優先的に伝達しているわけではなく、側壁３にも熱が逃げていることが推測できる。伝熱効率５５％は決して高い値とは言えないが、大気中においても８２％の熱が拡散することを考慮すると、十分改善できていると言える。
また、マイクロ流路４に液体を流した際もその効率は維持することができた。伝熱が側壁３に依存する原因として、カンチレバー５を支持する側壁３、その間の接着層のＳｉへの熱の逃げが考えられる。接着層として、熱伝導率の低いポリマーを用いることで、カンチレバー５からガラス製の側壁３に逃げる熱量を減少させることができる。
【００６５】
さらに、マイクロ流路４に脱イオン水(ＤＩ水)からなる液体を導入し、同様の実験を行った。
マイクロ流路接触部５ｂの伝熱効率は４８％であった。真空中における伝熱と比較すると、若干下がっている。この原因として、入力した温度変化は、液中で入力した温度変化が測定できなかったため、真空中における値を用いた。さらに、真空中に比べ、液中ではレーザーの集光が上手くできなかったので、真空中での入力熱量よりも実際に液中で入力された熱量の方が小さいと考えられる。以上により、液中における伝熱が真空中での伝熱よりも小さくなった理由は、実際の入力熱量が小さかったためという可能性が高く、水への散乱が大きかったとは言えない。また、伝熱効率の４８％という値は、絶対値としては大きいとは言えないが、従来研究の９４％という値を考慮すれば、大きく改善されたと言える。
【００６６】
（ミラー層の効果検証）
カンチレバー５の共振周波数を、レーザードップラー振動計２８を用いて測定すると、測定用レーザーにより温度が上昇することが確認された。これは温度を測定する際の外乱となる。Ａｕからなるミラー層２８は測定用レーザーによるカンチレバー５の温度上昇抑制に効果があることがわかった。以上により、測定用レーザーを用いた共振周波数測定により温度を正確に測定するには、ミラー層８が必要になると言える。
【００６７】
（カンチレバー５の共振周波数の変動）
図１５は、カンチレバー５の測定部５ａの共振周波数の変動を調べた図である。図１５の横軸は信号積分時間（秒）、左縦軸は周波数変動（×１０−２ｐｐｍ）、右縦軸はアラン分散（Ｈｚ）である。
図１５に示すように、本デバイスの安定性を評価するため、アラン分散を求めたところ、その値は０．０５〜０．２０Ｈｚとなった。
ここで、褐色脂肪細胞の発熱量(約５ｎＷ)を例とすると、１秒間の発熱で５ｎＪとなる。Ｓｉの密度、比熱よりマイクロ流路接触部５ｂの温度上昇に必要な熱量は約８ｎＪとなる。細胞６からの熱量が全てカンチレバー５に伝わり、マイクロ流路４に液体を流した状態でも５０％の伝熱効率を維持できると仮定すると、カンチレバー５に伝わる熱量は、４ｎＪである。
図１５に示すように、アラン分散の最小値の０．０１５Ｈｚを基に、Ｓ／Ｎ比が１以上（Ｓ／Ｎ＞１）となるマイクロ流路接触部５ｂ側の熱分解能を求めると、１．６ｍＫであり、熱量は５．２ｐＪであった。これらの値は、褐色脂肪細胞の熱量を測定するには十分な分解能である。
【００６８】
上記測定結果から、カンチレバー５の支持部となるガラス壁による伝熱の影響を測定した結果、伝熱効率は５０％程度であった。マイクロ流路４側に液体を流して、カンチレバー５のＱ値の変化を測定したところ、測定室２側のカンチレバー５のＱ値は４０００のまま変化はなかった。ミラー層８を設けることで、温度上昇を改善できることを確認した。以上より、カンチレバー型の熱量センサ１を測定室２に低圧力又は真空で封止することで、液中のサンプルからの発熱を計測できた。
【００６９】
（褐色脂肪細胞の温度測定）
実際に、液中にある単一の褐色脂肪細胞からの発熱量を計測することに成功した。褐色脂肪細胞は試薬（ノルエピネフリン）の添加により、自身の脂肪を燃焼し、発熱現象を起こす細胞である。
図１６は、ノルエピネフリンを添加する前の褐色脂肪細胞の温度変化を示す図である。横軸は時間（分）であり、縦軸は温度変化（℃）である。図に示すように、ノルエピネフリンを添加する前の褐色脂肪細胞の場合には、数分毎に急激な温度変化が観測された。
【００７０】
図１７は、ノルエピネフリンを添加し、脂肪燃焼による発熱が確認されたときの温度変化を示す図である。横軸及び縦軸は図１６と同じである。
図１７に示すように、発熱は数分間観察されその後減少した。つまり約２０分の発熱が観察された。ノルエピネフリンを添加する前は数分毎に急激な温度変化が観察され、ノルエピネフリンの添加後は緩やかな温度変化が確認された。不活性の褐色脂肪細胞では、このような事象は観察されなかったので、急激な温度変化も生体反応の一部であると推測できる。
【００７１】
熱量センサ１を用いた熱量検出装置１０による温度の分解能は１．６ｍＫであり、５．２ｐＪの発熱量を観察できた。この発熱量は細胞１個の発熱量に相当している。ノルエピネフリンを添加する前は数分毎に急激な温度変化が、添加後は緩やかな温度変化が確認された。不活性の褐色脂肪細胞では、このような事象は観察されなかったので、急激な温度変化も生体反応の一部であると推測できる。
【００７２】
図１８はアジ化ナトリウムによって不活性(死んだ)細胞の温度変化を示す図である。横軸及び縦軸は図１６と同じである。図１８に示すように、アジ化ナトリウムによって不活性にされた褐色脂肪細胞の場合には、温度変化がないことが分かった。
【００７３】
図１７に示したように、ノルエピネフリンを添加した褐色脂肪細胞においては脂肪燃焼による緩やかな発熱現象だけでなく、図１６に示すとおり、褐色脂肪細胞においては急激な発熱現象も観測された。アジ化ナトリウムで不活性にされた褐色脂肪細胞(図１８参照)では、図１６に示すような温度変化は観測されなかったので、この急激な発熱現象も生命活動の一環であると言える。
【００７４】
以上の結果から、従来は細胞の発熱によって温められた溶媒の温度を計測していたため、時定数が高くなかったが、時定数の高いカンチレバー熱量センサ１に細胞を接触させ、直接温度上昇を測ることが可能である。また、マイクロ流路４を用いることで、開放系で問題となる液体の蒸発や汚染、外乱の問題が解決できた。
【００７５】
本発明は、上記実施例に限定されることなく、特許請求の範囲に記載した発明の範囲内で種々の変形が可能であり、それらも本発明の範囲内に含まれることはいうまでもない。
【符号の説明】
【００７６】
１：熱量センサ  ２：測定室
２ａ：排気口
３：側壁
４：マイクロ流路
４ａ：入口
４ｂ：出口
５：梁
５ａ：測定部
５ｂ：マイクロ流路接触部
５ｃ：連結部
６：細胞
８：ミラー層
１０、１０Ａ：熱量検出装置
１２：検知部
１４：媒体供給部
１６：排気部
１８：観察部
２２：振動部
２２ａ：ＰＺＴ板
２４：反応物注入部
２６：容器
２８：レーザードップラー振動計
３２：位相シフター
３３：位相同期回路
３５：増幅器
３６：位相比較器
３７：ローパスフィルタ
３８：電圧制御発振器
３８ａ：参照信号
４１：静電容量
４２：インダクタンス４３：周波数混合器
４４：局部発振器
４５：ＦＭ復調器
４６：周波数カウンター
５１：第１のガラス基板
５２：第２のガラス基板
６０：ＳＯＩ基板
６１：Ｓｉ基板
６２：犠牲層
６３：上層Ｓｉ層
６５：金属層
６６：接着層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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