(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
系統グループ１のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプ、及び系統グループ２のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプのヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）のステム領域中のエピトープに対して特異的に結合することができ、且つ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、及びＨ１１サブタイプのＨＡを含むインフルエンザＡ型ウイルスからなる群から選択される、少なくとも１種又は複数種のグループ１のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプ、及び、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１０サブタイプのＨＡを含むインフルエンザＡ型ウイルスからなる群から選択される、少なくとも１種又は複数種のグループ２のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプを中和することができる、単離された抗体又はその抗原結合性の断片であり、
インフルエンザＢ型ウイルスのサブタイプのヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）に対して特異的に結合することもできる
ことを特徴とし、
配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１７４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４７の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、抗体又はその抗原結合性の断片、
配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１７３の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、抗体又はその抗原結合性の断片、
配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１７１の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１６４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１７２の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、抗体又はその抗原結合性の断片、および
配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、抗体又はその抗原結合性の断片、
からなる群から選択される、
単離された抗体又はその抗原結合性の断片。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合性の断片は、赤血球凝集抑制活性を有しない、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性の断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体又はその抗原結合性の断片をコード化する核酸分子。
【請求項４】
医薬用の、請求項１または２に記載の抗体又はその抗原結合性の断片、及び／又は請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
インフルエンザ感染の予防及び／又は治療用の、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合性の断片。
【請求項６】
請求項１または２に記載の抗体若しくはその抗原結合性の断片、及び／又は請求項３に記載の核酸分子、並びに薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬に関する。本発明は、特に、系統グループ１及び系統グループ２の両方のインフルエンザＡ型ウイルスを中和することが可能なヒト結合分子に関する。特に、本発明は、系統グループ１及び系統グループ２のインフルエンザＡ型ウイルス、並びにインフルエンザＢ型ウイルスを中和することが可能なヒト結合分子に関する。本発明は、更に、系統グループ１及び２のインフルエンザＡ型ウイルスに、好適にはインフルエンザＢ型ウイルスにも、起因する感染の、診断、予防、及び／又は治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ感染（「インフルエンザ」又は「フルー」とも称する）は、ヒトに、世界中で毎年、３〜５百万の間の重篤な症例、及び２５０，０００〜５００，０００の死亡を引き起こすことで知られている最も一般的な疾患の１つである。インフルエンザは、人口の５〜１５％に影響を及ぼす季節的流行で急速に広まり、医療費の負担及び生産性の喪失が拡大する（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  （ＷＨＯ））。
【０００３】
ヒト及び動物における感染症状に関わるインフルエンザウイルスには３つの型（Ａ、Ｂ、及びＣ型）がある。Ａ型及びＢ型はヒトにおいて見られるインフルエンザの季節的流行及び大流行に関わるものである。
【０００４】
インフルエンザＡ型ウイルスは、ウイルスの付着及び細胞放出のために必要とされる、表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコード化する２つの遺伝子の抗原性領域における変形に基づいて、インフルエンザウイルスのサブタイプに分類することができる。現在、１６のＨＡのサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）、及び９のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）の抗原変形体が、インフルエンザＡ型ウイルスについて知られている。インフルエンザウイルスのサブタイプは更に、それらの系統学上のグループを参照して分類することができる。系統学上の分析（Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）は、２つの主要なグループ（Ａｉｒ，  １９８１）を含むＨＡの下位区分（サブディビジョン、亜門）を示し、とりわけ、系統グループ１（「グループ１」とも称する）のＨ１、Ｈ２、Ｈ５、及びＨ９サブタイプ、及び、とりわけ、系統グループ２（「グループ２」とも称する）のＨ３、Ｈ４、及びＨ７サブタイプ、を示した。インフルエンザＡ型のサブタイプのいくつか（すなわち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、及びＨ３Ｎ２）だけは、人々の間に循環するが、１６のＨＡ及び９のＮＡのサブタイプの全ての組み合わせは、動物、特に鳥類の種で同定された。インフルエンザＡ型に感染した動物は、しばしばインフルエンザウイルスのための保有宿主として働き、高病原性インフルエンザＡ型株のＨ５Ｎ１等、特定のサブタイプは、ヒトへの種の壁を越えることが示されている。
【０００５】
インフルエンザＢ型ウイルス株はヒトに厳格である。インフルエンザＢ型ウイルス株中のＨＡにおける抗原の変形は、Ａ型株中で見られるものよりも弱い。２つの遺伝学的及び抗原的に異なるインフルエンザＢ型ウイルスの系列がヒトに循環し、Ｂ／山形／１６／８８（Ｂ／山形とも称する）及びＢ／ヴィクトリア／２／８７（Ｂ／ヴィクトリアとも称する）（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）と表される。インフルエンザＢ型ウイルスにより引き起こされる疾患のスペクトルは、一般的にインフルエンザＡ型ウイルスにより引き起こされるものよりも穏やかであるが、入院を要する重篤な病気もインフルエンザＢ型感染でしばしばみられる。
【０００６】
毎年のインフルエンザの流行に対処する現在のアプローチは、毎年のワクチン接種、好適には、ヘテロタイプ（異型）の交差保護を生じさせることが含まれる。しかしながら、ヒトにおけるインフルエンザウイルスの循環は、永続的な抗原の変化に支配され、インフルエンザワクチン株と循環するインフルエンザ株との間での最も近い可能な一致を確実にするために、インフルエンザワクチン製剤を毎年適応させることを必要とする。インフルエンザワクチンの毎年の予防接種は、インフルエンザを予防する最良の方法ではあるが、オセルタミビル（タミフル（商標））等の抗ウイルス薬物も、インフルエンザの予防及び治療に有効であり得る。しかしながら、オセルタミビル等の抗ウイルス薬物に対する耐性を示すインフルエンザウイルス株の数が増加している。
【０００７】
代わりのアプローチは、様々な季節性及び流行性インフルエンザウイルスを中和する抗体ベースの予防又は治療の開発である。インフルエンザウイルス感染に対して保護するほとんどの中和抗体の第一の標的は、受容体結合部位を含むウイルスのＨＡタンパク質の球状頭部（ＨＡ１部分）であるが、これは、抗体結合部位におけるアミノ酸置換を伴う、継続的な遺伝的進化（抗原ドリフト）に支配される。
【０００８】
近年、系統グループ１（例えば、Ｈ１及びＨ５インフルエンザサブタイプを含む）のインフルエンザＡ型ウイルスのヘマグルチニンの保存されたステム領域中のエピトープを認識する、広範に交差中和する抗体（例えば、国際公開第２００８／０２８９４６号参照）、及び、系統グループ２（例えば、Ｈ３及びＨ７サブタイプを含む）のインフルエンザＡ型ウイルスのＨＡのステム領域中の高度に保存されたエピトープを認識する、交差中和抗体（例えば、国際公開第２０１０／１３０６３６号参照）が、同定された。これらの抗体は、グループ１又はグループ２のいずれかに厳格である。加えて、これらの抗体は、インフルエンザＢ型ウイルスの結合及び中和が可能ではない。
【０００９】
更に、国際公開第２０１０／０１０４６６号は、ヘマグルチニンに結合し、グループ１（例えば、Ｈ１及びＨ５サブタイプを含む）及びグループ２（例えば、Ｈ３及びＨ７サブタイプを含む）のインフルエンザＡ型サブタイプの結合及び中和が可能である、ヒト抗体ＦＩ６を開示する。この抗体はまた、インフルエンザＢ型ウイルス由来のＨＡに対しては結合しない。
【００１０】
加えて、米国特許出願公開第２００９／００９６２０号は、Ｈ１及びＨ３サブタイプの両方のヘマグルチニン、並びにＢ／ヴィクトリア及びＢ／山形のグループに属するインフルエンザＢ型ウイルスのヘマグルチニンに存在する抗原構造を認識するマウス抗体を開示する。抗体は、数種類のＨ３Ｎ２株の赤血球凝集活性を阻害し、この抗体がＨＡの球状頭部中のエピトープに対して結合することを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２８９４６号
【特許文献２】国際公開第２０１０／１３０６３６号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０１０４６６号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／００９６２０号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｓｕｂｔｙｐｅ  （Ｈ１６）  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｕｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（５）：２８１４−２８２２．
【非特許文献２】Ａｉｒ  ＭＡ  （１９８１），  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  １２  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８（１２）：７６３９−７６４３．
【非特許文献３】Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３），  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：４２８−４４３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
インフルエンザＡ型及びインフルエンザＢ型ウイルスにより引き起こされる呼吸器の病気の重篤性、季節的流行の大きな経済的インパクトを有すること、並びに大流行についての継続的なリスクを鑑みれば、インフルエンザＡ型及びＢ型サブタイプの予防及び治療のための有効な手段が継続的に必要とされている。このように、結合分子、好適には、系統グループ１及び系統グループ２の両方のインフルエンザＡ型ウイルスを、また好適にはインフルエンザＢ型ウイルスをも交差中和することが可能な、広範に中和するヒト結合分子が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、（例えば、Ｈ１及びＨ５サブタイプのＨＡを含むインフルエンザウイルスを含む）系統グループ１、及び（例えば、Ｈ３及びＨ７サブタイプのＨＡを含むインフルエンザウイルスを含む）系統グループ２の両方に由来するインフルエンザＡ型ウイルス株に対して特異的に結合することができる結合分子を提供する。一実施形態では、結合分子は系統グループ１及び系統グループ２の両方に由来するインフルエンザＡ型ウイルス株に対して中和活性をも有する。一実施形態では、結合分子は、更に、例えば、Ｂ／山形／及び／又はヴィクトリア系統のインフルエンザＢ型ウイルス株を含む、インフルエンザＢ型ウイルス株に対して特異的に結合することができる。一実施形態では、結合分子は、更に、例えば、Ｂ／山形／及び／又はヴィクトリア系統のインフルエンザＢ型ウイルス株を含む、インフルエンザＢ型ウイルス株を中和することができる。一実施形態では、結合分子は、インフルエンザＡ型及び／又はＢ型ウイルス株をインビボで中和することができる。一実施形態では、結合分子は、インフルエンザＡ型及びＢ型ウイルスのＨＡタンパク質のステム領域中の保存的なエピトープに対して結合する。一実施形態では、結合分子は、赤血球凝集抑制（ＨＩ）活性を有しない。
【００１５】
このように、本発明は、系統グループ１内のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプと、系統グループ２のインフルエンザウイルスサブタイプと、インフルエンザＢ型ウイルスサブタイプとの間で共有されるヘマグルチニンタンパク質のステム領域中のエピトープに結合する結合分子を提供し、これにより、グループ１及びグループ２のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプの両方とインフルエンザＢ型ウイルスとの間で交差反応する結合分子に関する。本発明は、少なくともヒト結合分子の結合領域をコード化する核酸分子にも関する。
【００１６】
本発明の結合分子及び／又は核酸分子は、インフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルスについて、更には原因となるインフルエンザのサブタイプによらない、汎用的な予防、診断、及び／又は治療の薬剤としての使用に適している。
【００１７】
本発明に従う結合分子は、抗原ドリフト又はシフトの傾向がないか又は非常に少ない、従来公知の且つ高度に保存的なエピトープに結合することが推測される。特に、このエピトープは、系統グループ１及び系統グループ２の両方並びにインフルエンザＢ型ウイルスに属するインフルエンザウイルス間で共有される。
【００１８】
本発明は、更に、インフルエンザウイルス感染を有するか又は進展する危険のある患者の診断、予防、及び／又は治療における本発明のヒト結合分子及び／又は核酸分子の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＣＲ９１１４による、Ｈ１、Ｈ５、Ｈ９、Ｈ３、及びＨ７ＨＡの構造変化のブロッキングについて示す図であり、（Ａ）は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１）、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５）、Ａ／香港／１０７３／１９９９（Ｈ９）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３）、及びＡ／オランダ／２１９／２００３（Ｈ７）の表面に発現されたｒＨＡの、様々な構造−未切断の前駆体（ＨＡ０）；中性ｐＨ、切断された（ＨＡ）；融合ｐＨ、切断された（融合ＨＡ）−に対するＣＲ９１１４のＦＡＣＳの結合について示し、（Ｂ）は、ｍＡｂ  ＣＲ９１１４が切断されたＨＡｓをｐＨ４．９に曝す前に加えられた点以外は上記の通り表面に発現されたＨＡに対するＣＲ９１１４のＦＡＣＳの結合について示す。
【図２】ｍＡｂ  ＣＲ９１１４は、ＣＲ６２６１及びＣＲ８０２０と、それぞれＨ１及びＨ３に対する結合について競合することを示す図である。１００ｎＭのＣＲ６２６１又はＣＲ９１１４（パネルＡ及びＢ）で飽和された、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）の固定化したＨＡ、又は、１００ｎＭのＣＲ８０２０又はＣＲ９１１４（パネルＣ及びＤ）で飽和された、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）の固定化したＨＡ、に対する図示のｍＡｂの結合の追加的な結合の程度を、バイオレイヤー干渉法を用いて測定した。
【図３】ＣＲ９１１４の予防効果を、インフルエンザＢ（Ｂ／フロリダ／０４／２００６）ウイルスを用いたマウスの致死的攻撃モデルで検証した。Ａ．攻撃１日前、及び０日目の２５ＬＤＬＤ５０のＢ／フロリダ／０４／２００６の攻撃後における、１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ９１１４又はビヒクルコントロールのいずれかを用いて静脈内処理されたマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率曲線。Ｂ．０日目と比較した体重変化の平均（％）。バーは平均の９５％ＣＩを表す。研究中にマウスが死亡又は安楽死した場合、最後に測定した体重を前に延ばした。Ｃ．平均臨床スコア。バーは四分位範囲を表す。臨床スコアの説明：０＝臨床徴候なし；１＝ラフコート、２＝ラフコート、取扱いの間低反応、３＝ラフコート、ロールドアップ、呼吸困難（ｌａｂｏｕｒｅｄ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、取扱いの間低反応、４＝ラフコート、ロールアップ、呼吸困難、操作／取扱いに対して低反応。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において用いられる用語の定義を以下に記載する。
本願明細書における「含まれる」又は「含む」という用語は、「限定されることなく」という語が続くものとみなされる。
【００２１】
本願明細書における「結合分子」という用語は、キメラ、ヒト化、若しくはヒトモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体、又は免疫グロブリンの結合相手（パートナー）、例えば、ＨＡ、に対する特異的な結合について、インタクトな免疫グロブリンと競合する免疫グロブリンの断片（フラグメント）を含む抗原結合性及び／又は可変性領域を指す。構造に関係なく、抗原結合性断片は、インタクトな免疫グロブリンにより認識される同一の抗原と結合する。抗原結合性の断片は、結合分子のアミノ酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２５０の近接（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを含んでよい。
【００２２】
本願明細書における「結合分子」という用語は、当該技術分野において公知の全ての免疫グロブリンクラス及びサブクラスを含む。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従い、結合分子は無傷の抗体の５つの主要な種類に分けることができる。すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、そしてこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に更に分けられることができる。
【００２３】
抗原結合フラグメントは、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、（ポリ）ペプチド、その他に対する特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンフラグメントを少なくとも含む（ポリ）ペプチドが含まれる。上記フラグメントは、合成によって、又は無傷の免疫グロブリンの酵素的又は化学的な開裂によって生産することができ、あるいはそれらを組換えＤＮＡ技術によって遺伝子改変することができる。生産の方法は、この技術においてよく知られ、そしてたとえば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（アンティボディズ）において、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：  Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ、Ｌａｎｅ  （１９８８）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ〔ラボラトリーマニュアル、Ｅ．  ハーロー及びＤ、レーンにより編集（１９８８年）、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク〕に記載され、それを参照することによってここに組み込む。結合分子又はその抗原結合フラグメントは、１つ又は複数の結合部位を有することができる。１より多く（複数）の結合部位があるならば、結合部位は互いに同一である場合があり、あるいはそれらは異なる場合がある。
【００２４】
結合分子は、ネイキッド（裸）又は共役でない結合分子としてよいが、免疫複合体の一部分としてもよい。裸であるか共役でない結合分子は、エフェクター部分又はタグ、例えば、とりわけ、有害物質、放射性物質、リポソーム、酵素等に、共役されない、動作可能に連結される、又はさもなければ物理的に又は機能的に集合する結合分子を指すことを意図する。裸又は共役でない結合分子は、安定化、多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅｄ）、ヒト化、又は他のどの方法によっても、エフェクター部分又はタグの付着による以外で操作された結合分子を除外しないことを理解されたい。従って、全ての翻訳後修飾された裸の及び共役でない結合分子は、修飾が、組換え型の結合分子生成細胞により天然の結合分子を生成する細胞環境中で作成され、その後初期の結合分子の調製後にヒトの手によって導入される場合をも含む。もちろん、そのような相互作用のいくらかは、生物学的効果を及ぼすために必要であるので、裸の又は共役でない結合分子という用語は、体への投与後にエフェクター細胞及び／又は分子との機能的な関係を形成する結合分子の能力を除外しない。従って、関係するエフェクター基又はタグの不足は、インビボはではなくインビトロでの、裸又は共役でない結合分子に対する定義で適用される。
【００２５】
本願明細書における「生物学的サンプル（生物学的試料）」という用語は、血液及び生物起源の他の液状試料、生検標本又は組織培養物等の固形組織試料、又はそこから導き出される細胞、及びその子孫を含む多種多様な試料タイプを包む。この用語はまた、試料で、試薬での処理、可溶化、又はタンパク質又はポリヌクレオチド等の一定の成分に対する濃縮によるような、それらの調達後に何らかの方法で操作された試料が含まれる。この用語は、任意の種から得られた臨床試料の種々の種類を包み、また培養での細胞、細胞上澄み及び細胞溶解物を含む。
【００２６】
本願明細書における「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は、免疫グロブリン等の結合分子の可変領域内の配列を意味し、それは通常、抗原上で認識されるエピトープに対する形状及び電荷分布に相補的な抗原結合部位の大きな拡張に寄与する。ＣＤＲ領域は、線状エピトープ、不連続エピトープ、又はタンパク質又はタンパク質断片の立体的（コンフォメーショナルな）エピトープであり、その本来の立体構造のタンパク質上に存在するものか、又はいくつかのケースでは、タンパク質上に存在する変性、例えば、ＳＤＳにおける可溶化等によるもののかのいずれかについて、特異的であってよい。エピトープはまた、タンパク質の翻訳後修飾からなる場合がある。
【００２７】
本願明細書における「欠失」という用語は、参照、しばしば自然に発生の、分子と比較して、それぞれ、１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド残基が不存在となっている、アミノ酸又はヌクレオチド配列のいずれかの変化を指す。
【００２８】
本願明細書における「発現調節核酸配列」という用語は、特定の宿主生物において動作可能に連結したコード配列の発現に必要な及び／又はそれに影響を与えるポリヌクレオチド配列を指す。とりわけ、適切な転写開始、終結、プロモーター、エンハンサー配列等の発現調節核酸配列；リプレッサー又はアクチベーター配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例は、リボソーム結合部位）、タンパク質の安定性を高める配列；及び所望の場合、タンパク質の分泌を高める配列は、一般に選択の宿主生物で活性を示す任意の核酸配列であってよく、そしてタンパク質をコードする遺伝子から導き出すことができ、それらタンパク質は宿主生物に対し同種又は異種のどちらかでもある。発現調節配列の識別及び採用は、当業者にとって通常の作業である。
【００２９】
本願明細書における「機能的変形体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」は、参照のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数のヌクレオチド及び／又はアミノ酸によって変えられるヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を含み、そして結合相手、すなわちインフルエンザウイルスで、参照の結合分子と結合について競合することが可能である結合分子を指す。言い換えれば、参照の結合分子のアミノ酸及び／又はヌクレオチドの配列の修飾は、ヌクレオチド配列によってコード化されたか、又はアミノ酸配列を含む結合分子の結合特性に著しく影響を及ぼさず、又はそれを変えず、すなわち、結合分子がまだその標的を認識し、それを結合することができる。機能的変形体は、ヌクレオチド及びアミノ酸の置換、付加及び欠失を含む保存的な配列の修飾を有することができる。これらの修飾は、部位特異的変異導入及びランダムＰＣＲ媒介変異誘発等、当該技術分野において公知の標準的な技術によって導入することができ、天然及び非天然のヌクレオチド及びアミノ酸を含んでもよい。
【００３０】
保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の構造的又は化学的な特性を有するアミノ酸残基に置換されているものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、この技術において定められている。これらのファミリーには、以下の側鎖を有するアミノ酸が含まれ、それらは、塩基性側鎖（例は、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例は、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例は、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベーター−分枝側鎖（例は、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）である。上記で用いられるもの以外のアミノ酸残基のファミリーの他の分類もまた用いることができることは当業者には明らかであろう。更に、異形体は、非保存的アミノ酸置換、例は、異なる構造的又は化学的な特性を有するアミノ酸残基とのアミノ酸の置換であってよい。また、同様な軽微な変動は、アミノ酸の欠失若しくは挿入、又はその両方を含んでよい。アミノ酸残基が、置換、挿入、又は免疫学的活性を消滅させることなく削除され得るかを決定するガイダンスは、当該技術分野においてよく知られたコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。
【００３１】
ヌクレオチド配列における変異は、トランジション（移行）又はトランスバージョン（塩基転換）の変異のような、遺伝子座で作られる単一変質（点変異）であることができ、あるいはまた、複数のヌクレオチドは、単一の遺伝子座で、挿入、欠失又は変化する場合がある。加えて、１つ又は複数の変質（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）はヌクレオチド配列内の遺伝子座の任意の数で作られうる。変異は、この技術において既知の任意の適した方法によって実行することができる。
【００３２】
本願明細書における、インフルエンザＡウイルスに関する「インフルエンザウイルスのサブタイプ」という用語は、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）のウイルス表面タンパク質のさまざまな組合せによって特徴付けられるインフルエンザＡ型ウイルスの異形体を指す。本発明によれば、インフルエンザウイルスのサブタイプは、例えば、「Ｈ１又はＨ３サブタイプのＨＡを含むインフルエンザウイルス」、「ＨＡインフルエンザウイルス」又は「Ｈ３インフルエンザウイルス」等のそれらのＨの番号によって、又は例えば、「インフルエンザウイルスサブタイプＨ３Ｎ２」又は「Ｈ３Ｎ２」等のＨの番号及びＮの番号の組み合わせにより、参照することができる。インフルエンザウイルスの「亜型（サブタイプ）」という用語は、具体的には、通常、変異に起因し、及び別の病原性プロファイルを示す各サブタイプ内のすべての個々のインフルエンザウイルス「株」を含む。このような株は、ウイルスのサブタイプの種々の「単離株」として称することができる。従って、本願明細書における「株」及び「単離株」という用語は、互換的に用いることがある。ヒトインフルエンザウイルス株又は単離株の目下の命名法は、最初の単離の地理的な場所、単離の株番号及び年を含み、通常は括弧内に与えられるＨＡ及びＮＡの抗原性の説明を伴い、例は、Ａ／モスクワ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）である。非ヒトの株はまた、命名において起源の宿主も含まれる。
【００３３】
本願明細書における「中和する」という用語は、本発明の結合分子に関して、中和が達成される機構に関係なく、インフルエンザウイルスが標的細胞に複製的に感染するのを抑制する結合分子を指す。このようにして、中和は、例えば、細胞表面へのウイルスの付着又は接着を妨げることによって、又は標的細胞及び同様の他のものに対するウイルスの付着に続くウイルス及び細胞膜の融合を抑制することによって、達成することができる。
【００３４】
本願明細書における「交差中和する」又は「交差中和」という用語は、本発明の結合分子に関して、インフルエンザＡ型ウイルス及び／又はＢ型ウイルスを中和することに関する本発明の結合分子の能力を指す。
【００３５】
本願明細書における「宿主」という用語は、生物又は細胞を指すことを意図し、クローニングベクター又は発現ベクター等のベクターが導入されているものである。生物又は細胞は原核生物又は真核生物としてよい。可能ならば、宿主は、単離された宿主細胞、例は、培養物中の宿主細胞である。「宿主細胞」という用語は、細胞が本発明の結合分子の（過剰）発現のために修飾され、そして元々これらの結合分子を発現するＢ細胞を含み、そしてその細胞は結合分子を不死化、増幅、発現の強化等により過剰発現させるために修飾されることを単に示すのみである。「宿主」という用語が、同様に特定の対象の生物又は細胞のみならず、そのような生物又は細胞の子孫も指すことも意図することを理解されたい。一定の修飾が、変異又は環境の影響のいずれかのために、次の世代に起こる場合があるため、かかる子孫は、実際、親の生物又は細胞と同一でない場合があるものの、本願明細書における「宿主」という用語の範囲に含まれる。
【００３６】
本願明細書における「ヒト」という用語は、結合分子に適用されるとき、直接的にヒトからの由来、又はヒトの配列に基づく分子を指す。結合分子がヒト生殖系配列に由来するか、又はそれに基づき、そしてその後修飾されている場合、本明細書を通して用いるようにそれはヒトであるとみなす。言い換えれば、「ヒト」という用語は、結合分子に適用されるとき、ヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変的及び定常的な領域を有するか、又はヒトにおいて発生するか、又はヒトリンパ球に基づき、そして若干の形態において修飾される結合分子が含まれることを意図する。このように、ヒト結合分子は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコード化されないアミノ酸残基を含んでよく、置換及び／又は欠失（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異により、又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含む。本願明細書における「基づく（ｂａｓｅｄ  ｏｎ）」という用語は、例えば、エラープローンＰＣＲ法によって、又は正確に鋳型に適合させて、若しくは軽微な修飾を伴って合成的にする等、核酸配列が正確に鋳型から又は軽微な変異を伴って複写され得る条件を指す。
【００３７】
「挿入」という用語は、また「付加」という用語としても知られ、アミノ酸における変化又は親配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド残基の付加を、それぞれもたらすヌクレオチド配列を意味する。
【００３８】
本願明細書における「単離された」という用語は、結合分子に適用されるとき、他のタンパク質又はポリペプチドを実質的に含まず、異なる抗原特性を有する他の結合分子を特に含まず、そして他の細胞物質及び／又は化学物質も実質的に含まない結合分子を指す。例えば、結合分子が組換え的に生産された場合、可能ならば、培養媒体成分を実質的に含まず、そして結合分子が化学合成により生産された場合、可能ならば、化学的な前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない、ここで、それらはタンパク質の合成に関与している化学的な前駆体又は他の化学物質から分離される。本願明細書に定義される、「単離された」という用語は、結合分子をコード化する核酸分子に適用された場合、結合分子をコード化するヌクレオチド配列が他のヌクレオチド配列を含まず、特にヌクレオチド配列が他の結合相手を結合する結合分子をコード化する核酸分子を指すことを意図する。更にまた、「単離された」という用語は、他の細胞構成要素から実質的に分離される核酸分子を指し、それらはその自然宿主、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、又はそれが自然に関連するゲノム配列において、天然核酸分子を自然に伴う。更に、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、他の細胞物質、又は組換え技術により生産された場合、培養媒体を実質的に含まず、又は化学的に合成された場合、化学的な前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないものとしてよい。
【００３９】
本願明細書における「モノクローナル抗体」という用語は、単独の特異性の抗体分子の調製を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープのための単独の結合特異性及び親和性を示す。従って、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から導き出されるか、又はそれに基づき、又は完全に合成配列から導き出される可変及び定常領域を有する単独の結合特性を表示する抗体を指す。モノクローナル抗体を調製する方法は、結合特性によらない。
【００４０】
本願明細書における「天然の（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）」という用語は、対象物に適用するとき、対象物又は化合物を天然に見出すことができるという事実を指す。例えば、本来、供給源から分離することができる生物において存在し、そして実験室においてヒトにより故意に修飾されなかったポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然のものである。
【００４１】
本願明細書における「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドの重合体を指し、そしてＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成形態のセンス及びアンチセンス鎖の両方、及び上記の混合したポリマーを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はいずれの種類のヌクレオチドの修飾された形態をも指す。また、この用語は、ＤＮＡの一本及び二本鎖の形態を含む。そのうえ、ポリヌクレオチドは、天然及び／若しくは非天然のヌクレオチド結合により互いに連結された、天然及び／若しくは修飾のヌクレオチドのいずれか又は両方を含んでよい。核酸分子は、化学的に又は生化学的に修飾されてよく、又は当業者により理解されるように、非天然であるか又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでよい。そのような修飾には、例えば、メチル化、１つ又は複数の天然のヌクレオチドのアナログでの置換、及び、非電荷連結（例えば、メチルホスホナート類、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート、など）、荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロチオエート等）、ペンダント部（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（インターカレーター）（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート化剤、アルキル化剤、及び修飾された連結（例えば、アルファアノマー核酸等）等の、ヌクレオチド間修飾を含む。また、上記の語は、一本鎖、二本鎖、部分的な二重、三重、ヘアピン、環状、パドロック（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ）立体構造を含む、任意の位相的な形態を含むことを意図する。水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合するそれらの能力について、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は、当該技術分野において公知であり、例えば、ペプチド結合が、分子の骨格（主鎖）におけるホスフェート結合の代わりになるものを含む。特定の配列を有する核酸分子についての言及は、その相補的な配列を有するその相補的鎖を含むと理解されたい。相補的鎖は、例えば、アンチセンス療法、ハイブリダイゼーションのプローブ、及びＰＣＲプライマーにも有用である。
【００４２】
「動作可能に連結（結合）した」という用語は、通常、物理的に連結され、そして相互に機能的な関係にある２つ以上の核酸配列の要素を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現を開始するか又は調節することができる場合に、そのプロモーターはコード配列に、動作可能に連結され、その場合に、コード配列はプロモーター「の支配下」にあると理解されたい。
【００４３】
「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、快適な若しくは便利な剤形を調製するために、薬物、薬剤、又は結合分子等の活性分子と組み合わされるあらゆる不活性物質を意味する。「薬学的に許容可能な賦形剤」は、採用する投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、薬物、薬剤、又は結合分子を含む調剤物の他の成分と適合的である賦形剤である。薬学的に許容可能な賦形剤は、当該技術分野において広く用いられ、公知である。
【００４４】
本願明細書における「特異的に結合する」という用語は、結合分子、例えば、抗体、及びその結合相手、例えば、抗原、の相互作用に関するものであり、相互作用が、特定の構造、例えば、抗原決定基又はエピトープの結合相手上における存在に依存していることを意味する。言い換えれば、抗体は、結合相手が他の分子の混合物又は生物中に存在する場合でも、結合相手を優先的に結合又は認識する。結合は、共有結合又は非共有結合性の相互作用、又はその両方の組み合わせにより仲介されてよい。更に言い換えれば、「特異的に結合する」という用語は、抗原決定基又はエピトープに対する免疫特異的結合を意味し、及び他の抗原決定基又はエピトープに対して免疫特異的結合しはないことを意味する。抗原に対して免疫特異的に結合する結合分子は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、又は当該技術分野における公知の他のアッセイによって決定される、低い親和性で、他のペプチド又はポリペプチドに結合してよい。結合分子、又は抗原に対して免疫特異的に結合するそれらの断片は、同じエピトープを有する関連の抗原と、交差反応性であってよい。好適には、結合分子、又は抗原に対して免疫特異的に結合するそれらの断片は、他の抗原と交差反応しない。
【００４５】
本願明細書における「置換」という用語は、それぞれ、異なるアミノ酸又はヌクレオチドによる１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの置換を指す。
【００４６】
本願明細書における「治療的に有効量」という用語は、インフルエンザＢ型ウイルスによる感染に起因する症状を、予防、寛解、及び／又は治療するのに有効である結合分子の量を意味する。本願明細書における寛解（Ａｍｅｌｏｒｉａｔｉｏｎ）は、可視又は知覚可能な疾患の症状、ウイルス血症（ｖｉｒｅｍａｉａ）、又はインフルエンザの感染の他の測定可能な所見（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）の軽減を指す。
【００４７】
「処置（治療）」という用語は、治療的な処置、及び治癒若しくは停止又は病気の進行を少なくとも遅らせる予防的若しくは防止的な措置を指す。処置が必要な者は、インフルエンザウイルスでの感染により生じた症状で苦しめられている者、及びインフルエンザウイルスでの感染が防止されるべき者を含む。インフルエンザウイルスによる感染から部分的又は完全に回復した被験者も、処置を必要とすることがある。予防は、インフルエンザウイルスの広がりを抑制若しくは低減すること、又はインフルエンザによる感染に関連する症状の１つ又は複数の発症、発達又は進行を抑制又は低減することを含む。
【００４８】
「ベクター」という用語は、核酸分子を指し、その中で、第２の核酸分子が、それが複製される宿主に導入するために挿入され、場合によっては発現されてよいものを指す。言い換えれば、ベクターは、そこに連結された核酸分子を輸送（トランスポート）することが可能である。クローニング及び発現ベクターは、本願明細書における「ベクター」という用語により、表される。ベクターは、特に限定されることなく、プラスミド、コスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びバクテリオファージ、植物、又は動物（ヒトを含む）のウイルスに由来するベクターを含む。ベクターは、提案した宿主により認識される複製起点、プロモーター、及び宿主によって認識される他の調節領域を含む。第２の核酸分子を含むベクターは、形質転換、トランスフェクションにより、又はウイルスの侵入機構を用いることにより、細胞中に導入される。特定のベクターは、それらが導入される宿主において自律的な増殖が可能である（例えば、細菌の複製起点を有するベクターは細菌中で複製することができる）。他のベクターは、宿主への導入時に宿主のゲノムに統合され、これにより宿主のゲノムと共に複製されてよい。
【００４９】
第一の態様では、本発明は、系統グループ１のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプ、及び系統グループ２のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプのヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）に対して特異的に結合することができる結合分子を含む。一実施形態では、系統グループ１及び系統グループ２の両方のＡ型ウイルスのサブタイプを中和することができる。本発明の結合分子は、このように、系統グループ１のＡ型ウイルス株及び系統グループ２のＡ型ウイルス株を交差中和することができる点でユニークである。一実施形態では、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、及びＨ１１サブタイプのＨＡを含むインフルエンザＡ型ウイルスからなる群から選択される、少なくとも１種又は複数種、好適には２種以上、好適には３種以上、好適には四種以上、より更に好適には五種以上の、グループ１のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプ、並びに、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１０サブタイプのＨＡを含むインフルエンザＡ型ウイルスからなる群から選択される、少なくとも１種又は複数種、好適には２種以上、好適には３種以上、のグループ２のインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプを中和することができる。一実施形態では、結合分子は、インフルエンザＢ型ウイルスのサブタイプのヘマグルチニン（ＨＡ）に対して特異的に結合することができる。別の実施形態では、結合分子は、インフルエンザＢ型ウイルスを中和することができる。一実施形態では、欠乏分子は、インビボでインフルエンザＡ型及び／又はＢ型ウイルスを中和することができる。インフルエンザＡ型及びＢ型ウイルス株は、ヒト及び非ヒトインフルエンザウイルス株（すなわち、非ヒト動物、例えば、鳥から得られる株）とすることができる。
【００５０】
好適には、結合分子はヒト結合分子である。好適な実施形態では、結合分子は、ヒト抗体、又はその抗原結合性の断片である。
【００５１】
一実施形態では、結合分子は、ＶＨ１−６９生殖細胞系に由来する。このように、結合分子の全ては、同一のＶＨ１−６９生殖細胞系でコード化されるフレームワークを用いている。
【００５２】
一実施形態では、結合分子、好適には抗体と、ＨＡとの結合の相互作用は、重鎖可変の配列のみにより仲介される。
【００５３】
一実施形態では、結合分子は、配列番号：１３３又は配列番号：１３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４、配列番号：１４０、又は配列番号：１５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１３５、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１５２、配列番号：１６１、又は配列番号：１６２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子である。本発明の結合分子のＣＤＲ領域を、表７に示す。ＣＤＲ領域は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔに記載されるように、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）に従う。
【００５４】
標的細胞の細胞表面上のシアル酸残基と結合し、次いでエンドソーム中に移動することによって、また、それらの膜をエンドソームの膜と融合させ、細胞中にゲノム−転写酵素複合体を放出することによって、インフルエンザウイルスは細胞に感染する。受容体結合及び膜融合の両方のプロセスは、ＨＡ糖タンパク質により仲介される。インフルエンザウイルスＡ型のＨＡは、２つの構造的に異なる領域、すなわち、標的細胞に対するウイルス付着に関わり、ＨＡの血球凝集活性に関わる球状頭部の領域、及び、ウイルスエンベロウプと、細胞のエンドソームの膜との間での膜融合のために必要である融合ペプチドを含むステム領域を含む。ＨＡタンパク質は、三量体であり、各モノマーは、２つのジスルフィド−連結の糖ポリペプチド、ＨＡ１及びＨＡ２からなり、これらは、前駆体（ＨＡ０）のタンパク質分解により感染の間に生産される。分解は、膜融合のためのＨＡを準備し、構造的な変化を可能にするために、必要となるため、ウイルスの感染性のために必要である。準備された分子の活性化は、エンドソームにおける低ｐＨ、ｐＨ５とｐＨ６との間、生じ、ＨＡ構造における広範な変化を必要とする。ＨＡについての、膜融合プロセスにおけるその参加のための、プライミング（準備）、及び活性化における各ステージは、抑制に関して異なる標的を、例えば、モノクローナル抗体により、示す。一実施形態では、結合分子は、膜融合に伴うＨＡにおけるｐＨ誘導の形態変化をブロッキングすることができる。
【００５５】
本発明の結合分子は、生存可能、生存、及び／又は感染性であるか、又は、活性化されていない／弱体化された形式である、インフルエンザウイルスに対して特異的に結合することができる可能性がある。ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスの不活化／弱体化のための方法は、当該技術分野においてよく知られており、特に限定されることなく、ホルマリン、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、マーサイオレート、及び／又は紫外線での処置である。
【００５６】
本発明の結合分子はまた、とりわけ、１種又は複数種のインフルエンザＡ型及び／若しくはＢ型ウイルスのサブタイプに由来するタンパク質及び／若しくは（ポリ）ペプチドの調製物、又は、１種又は複数種の組換え型で生産されたインフルエンザＡ型及び／若しくはＢ型ウイルスのタンパク質及び／若しくはポリペプチド等の１つ又は複数のインフルエンザウイルスの断片に対して特異的に結合することができる可能性もある。様々なインフルエンザＡ型及びＢ型株のタンパク質のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ−ｄａｔａｂａｓｅ、ＮＣＢＩ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ＩＳＤ）、ＥＭＢＬ−ｄａｔａｂａｓｅ、及び／又は他のデータベースにおいて見つけることができる。それぞれのデータベースにおいてそのような配列を見つけることは当業者の通常の創作能力の範囲内である。
【００５７】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、前述のタンパク質及び／又はポリペプチドの断片に対して特異的に結合することができ、ここで、断片は、本発明の結合分子により認識されるエピトープを少なくとも含む。本願明細書において用いられる「エピトープ」とは、検出可能な抗原−結合分子複合体を形成するのに十分に高い親和性を有する、本発明の結合分子に対して結合することができる部分を指す。
【００５８】
本発明の結合分子は、ＨＡの細胞外部分（「可溶性ＨＡ（ｓＨＡ）」とも称する）に対して特異的に結合することができるか又はできない可能性がある。
【００５９】
本発明の結合分子は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体等のインタクトの免疫グロブリン分子とすることができ、又は、結合分子は、特に限定されることなく、重鎖及び軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価の単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、及び、少なくともインフルエンザウイルス株又はその断片に対して結合する特異的な抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの断片を含む（ポリ）ペプチドを含む、抗原結合断片とすることもできる。好適な実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトモノクローナル抗体、及び／又はその抗原結合性の断片である。結合分子は、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ＦＮ３−領域スキャフォールド及びアドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、ダルピン（Ｄａｒｐｉｎｓ）等の（ヒト）リピートタンパク質中の領域に基づく他のスキャフォールド、又は、エピトープ結合配列を含む他のスキャフォールドとしてもよい。
【００６０】
本発明の結合分子は、非単離又は単離された形態で用いられてよい。更に、本発明の結合分子は、単独で、又は、少なくとも一つの本発明の結合分子（又はその変形体若しくは断片）を含む混合物で、及び／又は、インフルエンザに対して結合し、インフルエンザウイルスを阻害する効果を有する他の結合分子と共に、用いられてよい。言い換えれば、結合分子は、例えば、本発明の２種類以上の結合分子、その変形体若しくは断片を含む薬学的組成物として、組み合わせで、用いられてよい。例えば、異なるが、相補的な活性を有する結合分子は、望ましい予防、治療又は診断的効果を達成するために、単一療法で組み合わせられてよいが、代わりに、同一の活性を有する結合分子もまた、望ましい予防、治療又は診断的効果を達成するために、単一療法で組み合わせられてよい。任意選択的に、混合物は、更に、少なくとも一つの他の治療用薬剤を含む。好適には、例えば、Ｍ２インヒビター（例えば、アマンタジン、リマンタジン）及び／又はノイラミニダーゼインヒビター（例えば、ザナミビル、オセルタミビル）等の治療用薬剤は、インフルエンザウイルス感染の予防及び／又は治療に有用である。
【００６１】
一般的に、本発明に従う結合分子は、それらの結合相手、すなわち、グループ１のインフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ１Ｎ１等）、グループ２のインフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ３Ｎ２等）、及び／又はインフルエンザＢ型ウイルス、及び／又はそのフラグメントに対して、０．２×１０−４Ｍ、１．０×１０−５Ｍ、１．０×１０−６Ｍ、１．０×１０−７Ｍ、好適には１．０×１０−８Ｍより低く、より好適には１．０×１０−９Ｍより低く、より好適には１．０×１０−１０Ｍより低く、更により好適には１．０×１０−１１Ｍよりも低く、及び特により一層好適には１．０×１０−１２Ｍより低い親和定数（Ｋｄ−値）で、結合してよい。親和定数は、抗体のアイソタイプごとに異なってよい。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての親和性結合とは、少なくとも約１．０×１０−７Ｍの結合親和性を指す。親和定数は、例えば、表面プラズモン共鳴を用いて、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、測定されてよい。
【００６２】
本発明の結合分子は、中和活性を示す。中和活性は、例えば、本願明細書に記載されるように、測定されてよい。中和活性を測定する代わりのアッセイは、例えば、ＷＨＯ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，  Ｇｅｎｅｖａ：  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，  ２００５，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００２．５に記載される。
【００６３】
一般的に、本発明による結合分子は、例６に記載されるインビトロでのウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）において決定されるように、５０μｇ／ｍＬ以下、好適には２０μｇ／ｍＬ以下の中和活性より好適には１０μｇ／ｍＬ以下、より一層好適には５μｇ／ｍＬ以下の中和活性を有する。
本発明に従う結合分子は、例えば、試料中又は懸濁液中等の可溶性の形態の、インフルエンザウイルス又はその断片に対して結合してよく、又は、例えば、マイクロタイタープレート、膜、及びビーズ等の担体（キャリア）又は基材に対して結合又は付着したインフルエンザウイルス又はその断片に結合してもよい。担体又は基材は、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、又はテフロン等でできていてよい。そのような支持体の表面は、中実（中空でない）又は多孔質、及びあらゆる好便な形状としてよい。更に、結合分子は、精製／単離された、又は未精製／未単離の形態の、インフルエンザウイルスに対して結合してよい。
【００６４】
上記の通り、本発明は、インフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）中のエピトープを認識しそれに対して結合することが可能な単離されたヒト結合分子に関し、ここで、結合分子は系統グループ１のインフルエンザＡ型ウイルス及び系統グループ２のインフルエンザＡ柄ウイルスを中和する活性を有する。本発明によれば、本発明の結合分子は両方の系統グループに属するインフルエンザウイルスのサブタイプを交差中和することが示された。当業者は、本願明細書に開示される事項に基づいて、抗体が実際に異なるサブタイプ由来のＨＡタンパク質と交差反応するかどうかを決定することができ、抗体がインビトロ及び／又はインビボにおいて異なるインフルエンザウイルスのサブタイプを中和することができるかどうか決定することもできる。
【００６５】
一実施形態では、本発明に従う結合分子は、
ａ）配列番号：１３３の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１３５の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
ｂ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４０の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１４１の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
ｃ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
ｄ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５１の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
ｅ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
ｆ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５１の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１６１の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
ｇ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５１の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１６２の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
ｈ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１４１の重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子、
からなる群から選択される。
【００６６】
好適な実施形態では、結合分子は、配列番号：１３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号：１４５又は配列番号：１５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む。
【００６７】
別の実施形態では、本発明に従うヒト結合分子は、
ａ）配列番号：１３３の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１３５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１３６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３７の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１３８の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｂ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４０の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４１の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｃ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１７４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４７の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｄ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４９の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｅ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５１の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１５３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５５の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｆ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４９の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｇ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１５６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５７の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５８の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｈ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５９の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１６０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｉ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５１の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１６１の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｊ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１５１の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１６２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１６３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１６４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１６５の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｋ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１６６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１６８の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｌ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１６９の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４９の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｍ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４１の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１６９の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１６３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１７０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｎ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１７１の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１６４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１７２の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｏ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１７３の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｐ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
からなる群から選択される。
【００６８】
別の実施形態では、本発明に従うヒト結合分子は、
ａ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１７４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４７の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｂ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１７１の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１６４の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１７２の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｃ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４５の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１７３の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
ｄ）配列番号：１３９の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１３４の重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１５２の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに、配列番号：１４２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号：１４３の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号：１４４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、結合分子、
からなる群から選択される。
【００６９】
別の実施形態では、本発明に従う結合分子は、
ａ）配列番号：２の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｂ）配列番号：６の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｃ）配列番号：１０の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｄ）配列番号：１４の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｅ）配列番号：１８の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｆ）配列番号：２２の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｇ）配列番号：２６の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｈ）配列番号：３０の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｉ）配列番号：３４の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｊ）配列番号：３８の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｋ）配列番号：４２の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｌ）配列番号：４６の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｍ）配列番号：５０の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｎ）配列番号：５４の重鎖可変領域を含む結合分子、
ｏ）配列番号：５８の重鎖可変領域を含む結合分子、及び
ｐ）配列番号：６２の重鎖可変領域を含む結合分子、
からなる群から選択される。
【００７０】
一実施形態では、本発明に従う結合分子は、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：５６、配列番号：６０、及び配列番号：６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００７１】
更に別の実施形態では、結合分子は、
ａ）配列番号：２の重鎖可変領域及び配列番号：４の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｂ）配列番号：６の重鎖可変領域及び配列番号：８の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｃ）配列番号：１０の重鎖可変領域及び配列番号：１２の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｄ）配列番号：１４の重鎖可変領域及び配列番号：１６の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｅ）配列番号：１８の重鎖可変領域及び配列番号：２０の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｆ）配列番号：２２の重鎖可変領域及び配列番号：２４の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｇ）配列番号：２６の重鎖可変領域及び配列番号：２８の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｈ）配列番号：３０の重鎖可変領域及び配列番号：３２の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｉ）配列番号：３４の重鎖可変領域及び配列番号：３６の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｊ）配列番号：３８の重鎖可変領域及び配列番号：４０の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｋ）配列番号：４２の重鎖可変領域及び配列番号：４４の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｌ）配列番号：４６の重鎖可変領域及び配列番号：４８の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｍ）配列番号：５０の重鎖可変領域及び配列番号：５２の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｎ）配列番号：５４の重鎖可変領域及び配列番号：５６の軽鎖可変領域を含む結合分子、
ｏ）配列番号：５８の重鎖可変領域及び配列番号：６０の軽鎖可変領域を含む結合分子、及び
ｐ）配列番号：６２の重鎖可変領域及び配列番号：６４の軽鎖可変領域を含む結合分子、
からなる群から選択される。
【００７２】
一実施形態では、本発明に従う結合分子は、配列番号：１０の重鎖可変領域及び配列番号：１２の軽鎖可変領域を含む結合分子、配列番号：５４の重鎖可変領域及び配列番号：５６の軽鎖可変領域を含む結合分子、配列番号：５８の重鎖可変領域及び配列番号：６０の軽鎖可変領域を含む結合分子、配列番号：６２の重鎖可変領域及び配列番号：６４の軽鎖可変領域を含む結合分子、からなる群から選択される。
【００７３】
好適な実施形態では、本発明に従う結合分子は、医薬として用いられ、好適には、インフルエンザＡ型及び／又はＢ型ウイルスに起因するインフルエンザ感染の、診断、治療、及び／又は予防に用いられる。好適には、インフルエンザ感染を引き起こし、本発明の結合分子を用いて治療することができるインフルエンザウイルスは、系統グループ１及び／若しくは２のインフルエンザウイルスＡ型、並びに／又はインフルエンザＢ型ウイルスである。本発明はまた、少なくとも一つの本発明に従う結合分子、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物に関する。
【００７４】
更に別の実施形態では、本発明は、本発明に従う結合分子の、インフルエンザウイルス感染の診断、予防、及び／又は治療用の医薬の調製物中における使用に関する。かかる感染は、小規模の人口において生じるものでもよく、季節性流行、又はより酷い、何百万もの個人がリスクに晒される地球規模の大流行で、世界中に広がるものでもよい。本発明は、かかる季節性流行、及び可能性のある大流行を引き起こすインフルエンザ株の感染を中和することができる結合分子を提供する。重要なことに、本発明の結合分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、及びＨ１１サブタイプを含む系統グループ１、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１０サブタイプを含む系統グループ２の両方、並びに、インフルエンザＢ型のサブタイプという様々なインフルエンザのサブタイプを交差中和することができるため、保護及び治療は、様々なインフルエンザのサブタイプに関する本発明の結合分子を用いることが想定されてよい。
【００７５】
本発明の別の態様は、本願明細書に記載される結合分子の機能的変形体を含む。機能的変形体がインフルエンザウイルス又はその断片に対する特異的な結合に関して、「親」又は「参照」の結合分子と競合することが可能である場合、その分子は本発明に従う欠乏分子の機能的変形体と考えられる。言い換えれば、機能的変形体がインフルエンザインフルエンザウイルス又はその断片の同一の又はオーバーラップするエピトープに対して結合することが未だ可能である場合に、その分子は本発明に従う結合分子の機能的変形体と考えられる。本願においては、「親」及び「参照」は、参照若しくは親の分子の情報を意味する同意語として用いられるか、又は物理的な分子そのものが変形体の基盤を形成し得る。機能的変形体は、特に限定されることなく、Ｆｃ受容体又はエフェクター機能に関与する他の領域における修飾を有するものを含む、及び／又は、親結合分子において見られない、例えば、インビトロ若しくはインビボでの、化学及び／若しくは生化学的な修飾を含む、一次的構造配列において実質的に類似である誘導体を含む。かかる修飾は、とりわけ、アセチル化、アシル化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、クロスリンク、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク質分解、リン酸化等を含む。
【００７６】
代わりに、機能的変形体は、親の結合分子のアミノ酸配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失又はそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を含む本発明で定義される結合分子としてよい。更に、機能的変形体は、アミノ又はカルボキシル末端のいずれか又は両方でアミノ酸配列のトランケーションを含んでよい。本発明に従う機能的変形体は、親の結合分子と比較して、同一か又は異なるか、高いか又は低いかのいずれかの、結合親和性を有するが、未だインフルエンザウイルス又はそのフラグメントに対して結合することが可能である。例として、本発明に従う機能的変形体は、親の結合分子と比較して増加又は減少された、インフルエンザウイルス又はそのフラグメントに対する結合親和性を有することが可能である。好適には、特に限定されないが、フレームワーク領域、超可変領域、特にＣＤＲ３領域を含む、可変領域のアミノ酸配列は変性される。概して、軽鎖及び重鎖の可変領域は、３つのＣＤＲｓを含む３つの超可変領域、及びより保存された保存された領域、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲｓ）を含む。超可変領域は、ＣＤＲｓ由来のアミノ酸残基、及び超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む。本発明の範囲に該当することが意図される機能的変形体は、少なくとも約５０％〜約９９％、好ましくは少なくとも約６０％〜約９９％、より好ましくは少なくとも約７０％〜約９９％、更により一層好ましくは少なくとも約８０％〜約９９％、最も好ましくは少なくとも約９０％〜約９９％、特に少なくとも約９５％〜約９９％、及び特に少なくとも約９７％〜約９９％のアミノ酸配列の、本願明細書に定義される親の結合分子との同一性及び／又は相同性を有する。当業者に公知のＧａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔ等のコンピュータアルゴリズムは、比較されるアミノ酸配列を最適にアラインするため、及び、類似又は同一のアミノ酸残基を定めるために、用いることができる。機能的変形体は、特に限定されないが、エラープローンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド−ダイレクテッド変異導入、部位特異的変異導入、並びに重鎖及び／又は軽鎖シャッフリングを含む、当該技術分野において公知の一般的な分子生物学的方法により、親の結合分子又はその一部を変更することによって得られる。一実施形態では、本発明の機能的変形体は、グループ１及びグループ２のインフルエンザウイルスＡ型、並びに／又はインフルエンザＢ型ウイルスに対する中和活性を有する。中和活性は、親の結合分子と比較して、同一か又は高いか若しくは低いかのいずれかであってよい。ここ以降、（ヒトの）結合分子という用語が用いられた場合、これは、また（ヒトの）結合分子の機能的変形体をも包含する。変形体の結合分子が中和活性を有するかどうかを検証するためのアッセイは当該技術分野でよく知られている（ＷＨＯ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，  Ｇｅｎｅｖａ：  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，  ２００５  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００２．５  参照）。
【００７７】
また更なる態様では、本発明は、免疫複合体、すなわち、本願明細書で定義されるように、少なくとも１つの結合分子を含む分子を含み、更に、とりわけ検出可能な部分/薬剤等の少なくとも１つのタグを含む。また、本発明において意図されるものは、本発明に従う免疫複合体の混合物、又は、本発明に従う少なくとも１つの免疫複合体及び治療用薬剤又は別の結合分子又は免疫複合体等の別の分子の混合物である。更なる実施形態では、本発明の免疫複合体は、１つ又は複数のタグを含んでもよい。これらのタグは、互いに同一又は別異であってよく、結合分子に対して非共有結合で結合（ジョイン）／共役（コンジュゲート）されてよい。代わりに、タグはまた、１つ又は複数の結合化合物により、結合分子に対して直接に接続／共役されてもよい。結合分子に対してタグを共役させるための技術は当業者によく知られている。
【００７８】
本発明の免疫複合体のタグは、治療用薬剤とすることができるが、それらはまた、検出可能な部分／薬剤とすることができる。治療及び／又は予防に適切なタグは、食作用又は免疫刺激を高める、毒素又はその機能的部分、抗生物質、酵素、他の結合分子とすることができる。検出可能な薬剤を含む免疫複合体は、例えば、被験者がインフルエンザウイルスに感染しているかどうかを評価する、又は、例えば、所定の治療法の有効性を決定するための、臨床試験の手法の一部として、インフルエンザウイルス感染の発症又は進行を監視するために、診断的に用いることができる。しかし、それらはまた、他の検出並びに／又は分析及び／若しくは診断の目的のために、用いることができる。検出可能な部分／薬剤は、特に限定されないが、酵素、補欠分子族、蛍光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出及び／若しくは分析及び／若しくは診断の目的のための結合分子を標識するために用いられるタグは、とりわけ（組織）試料の免疫組織化学的染色、フローサイトメトリー検出、走査型レーザーサイトメトリー検出、蛍光イムノアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡアッセイ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、バイオアッセイ（例えば、食作用アッセイ）、ウエスタンブロッティングアプリケーション、等に用いられる、特異的な検出／分析／診断の技術及び／又は方法に依存する。当該技術分野において公知の検出／分析／診断の技術及び／又は方法のための適した標識は、当業者の創作能力の範囲内である。
【００７９】
更に、本発明のヒト結合分子又は免疫複合体は、固体支持体に結合されてもよく、それは特に、インフルエンザウイルス又はそのフラグメントのインビトロでの免疫アッセイ又は精製のために有用である。このような固体支持体は、多孔性又は非多孔性、平面又は非平面であってもよい。本発明の結合分子は、精製を容易にするペプチド等のマーカー配列に融合させることができる。例えば、特に特に限定されることなく、ヘキサヒスチジンタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ｍｙｃタグ、又はフラッグタグが含まれる。また、抗体は、抗体のヘテロコンジュゲートを形成するために、第２の抗体に共役（コンジュゲート）されてもよい。別の態様では、本発明の結合分子は、１つ又は複数の抗原に共役／結合されてもよい。好ましくは、これらの抗原は、結合分子−抗原コンジュゲートが投与される被験者の免疫系により認識される抗原である。抗原は、同一であってよいが、互いに異なっていてもよい。抗原及び結合分子を結合するための共役の方法は、当該技術分野においてよく知られており、特に特に限定されることなく、クロスリンク剤の使用を含む。本発明の結合分子は、インフルエンザウイルスＨＡに対して結合して、結合分子に対して結合する抗原は、コンジュゲート上に強力なＴ細胞攻撃を開始し、それは最終的にインフルエンザウイルスの破壊を導く。
【００８０】
免疫複合体を、直接又は間接的に、例えば、リンカーを介して、共役させることによって、化学的に生産することは別に、免疫複合体を、本発明の結合分子及び適切なタグを含む融合タンパク質として生産することができる。融合タンパク質は、例えば、適切なタグをコード化するヌクレオチド配列と共にフレームにある結合分子をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子を構築し、その後その核酸分子を発現させることによって遺伝子組換え的に行う等といった当該技術で公知の方法によって生産することができる。
【００８１】
本発明に従う少なくとも結合分子、機能的変形体、又は免疫複合体をコード化する核酸分子を提供することは、本発明の別の態様である。かかる核酸分子は、クローニング目的のための、例えば、前述の通り、親和性成熟のプロセスにおける、中間体として用いることができる。好適な実施形態では、核酸分子は、単離されるか、又は精製される。
【００８２】
当業者は、これらの核酸分子の機能的変形体も、本発明の一部であることも意図されることを理解するであろう。機能的変形体は、標準的な遺伝暗号を用いて、直接的に翻訳され、親の核酸分子から翻訳されるのと同一のアミノ酸配列を提供することができる核酸配列である。
【００８３】
好適には、核酸分子は、前述の、ＣＤＲ領域を含む結合分子をコード化する。核酸分子が、２、３、４、５、又は本発明の結合分子の全６つのＣＤＲ領域さえを含む結合分子をコード化することは、更なる実施形態はである。
【００８４】
別の実施形態では、核酸分子は、前述の、可変の重鎖配列を含む重鎖を含む結合分子をコード化する。別の実施形態では、核酸分子は、前述の、可変の軽鎖配列を含む軽鎖を含む結合分子をコード化する。本発明の結合分子の重鎖及び軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、下記に示す。
【００８５】
本発明の別の態様は、本発明に従う１つ又は複数の核酸分子を含むベクター、すなわち、核酸構築物を提供することである。ベクターは、とりわけ、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉ等のプラスミド；コスミド；ラムダ、ラムダ形（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ（ムー）、Ｐ１、Ｐ２２、Ｑβ、Ｔ−偶数系（Ｔ−ｅｖｅｎ）、Ｔ−奇数系（Ｔ−ｏｄｄ）、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７等のファージ；植物ウイルスに由来してよい。ベクターは、本発明の結合分子のクローニング及び／又は発現のために用いることができ、そして、遺伝子治療のためにも用いることができる。動作可能に１つ又は複数の発現調節核酸分子に連結された本発明に従う１つ又は複数の核酸分子を含むベクターも、本発明に含まれる。ベクターの選定は、後の組換え操作及び用いられる宿主に依存する。宿主細胞中のベクターの導入は、とりわけ、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥデキストラン仲介のトランスフェクション、リポフェクタミンのトランスフェクション、又はエレクトロポレーションにより、生じさせることができる。ベクターは、自律的に複製してよく、又は、それらが統合された染色体と共に複製してもよい。好適には、ベクターは、１つ又は複数の選択マーカーを含む。マーカーの選定は、これが当業者によく知られているように本発明において重大ではないが、選定される宿主細胞に依存してよい。それらは、特に限定されることなく、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、マウス由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を含む。前述のように、ヒト結合分子を単離するために用いることができるタンパク質又はペプチドをコード化する１つ又は複数の核酸分子に動作可能に連結される、ヒト結合分子をコード化する１つ又は複数の核酸分子を含むベクターも、本発明に含まれる。これらのタンパク質又はペプチドは、特に限定されことなく、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、マルトース結合タンパク質、金属結合性ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼを含む。
【００８６】
前述のベクターの１つ又は複数のコピーを含む宿主は、本発明の追加の対象である。好適には、宿主は、宿主細胞である。宿主細胞は、特に限定されることなく、哺乳類、植物、昆虫、真菌、又は細菌起源の細胞が含まれる。細菌細胞は、特に限定されることなく、グラム陽性菌又はＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）等のエシェリキア属及びシュードモナス属の数種の等のグラム陰性菌由来の細胞を含む。真菌細胞のグループは、好適には、酵母細胞が用いられる。酵母における発現は、とりわけ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア・パストリス）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母、サッカロマイセス・セレビシエ）、及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンゼヌラ・ポリモーファ）等の酵母菌株を用いることによって達成することができる。更にまた、このようなＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ属）及びＳｆ９由来の細胞等の昆虫細胞も、宿主細胞として用いられてよい。その他に、宿主細胞は、とりわけ、森林植物等の作物植物（作物）由来の細胞、又は穀物用植物若しくは薬用植物等の食物及び原材料を提供する植物由来の細胞、又は観賞植物由来の細胞、又は球根作物（ｆｌｏｗｅｒ  ｂｕｌｂ  ｃｒｏｐｓ）由来の細胞等の、植物細胞としてよい。形質転換された（トランスジェニック）植物又は植物細胞は、例えば、アグロバクテリウム媒介遺伝子移入（導入）、葉片の形質変換、及び、ポリエチレングリコール−誘導ＤＮＡトランスファー、エレクトロポレーション、超音波、マイクロインジェクション、又は遺伝子銃（ｂｏｌｉｓｔｉｃ）ジーントランスファーといった既知の方法によるプロトプラスト形質転換、により生産される。加えて、適切な発現系は、バキュロウイルスシステムとしてよい。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、又はＢｏｗｅｓ（ボウズ）メラノーマ細胞等の、哺乳類細胞を用いた発現系が、本発明において好ましい。哺乳類細胞は、哺乳類起源の天然分子に最も類似する翻訳後修飾を有する発現されたタンパク質を提供する。本発明は、ヒトに対して投与されなければならないかもしれない分子を扱うため、完全なヒト発現系が特に好ましいであろう。従って、より更に好適には、宿主細胞は、ヒト細胞である。ヒト細胞の例としては、とりわけ、ＨｅＬａ（ヒーラ）細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。好適な実施形態では、ヒトのプロデューサー細胞（生成細胞）は、発現可能な形式でアデノウイルスＥ１領域をコード化する核酸配列の少なくとも機能的な部分を含む。より更に好適な実施形態では、前記宿主細胞は、９１１細胞、又はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）（ＣＡＭＲ、ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ）、ウィルトシャー州（Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ）  ＳＰ４  ＯＪＧ、英国）に、番号９６０２２９４０の下で、１９９６年２月２９日付けで寄託され、また、商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＰＥＲ．Ｃ６はＣｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．（クルセル  ホランド  ベー  ヴェー）の登録商標である。）の下で市販される細胞系等のように、ヒト��網膜に由来し、アデノウイルスＥ１配列を含む核酸で不死化される。本願の目的のため、「ＰＥＲ．Ｃ６細胞」は、番号９６０２２９４０の下で寄託した細胞又は祖先、上流若しくは下流の継代物、及び寄託された細胞の祖先由来の子孫、並びに前記のいずれかのものの派生体（誘導体）を指す。宿主細胞における組換えタンパク質の生産は、当該技術分野においてよく知られた方法に従って行ってよい。興味のタンパク質の生産の基盤（プラットフォーム）としての商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の下で市販される細胞の使用については、国際公開第００／６３４０３号に記載されており、その開示はその全体について参照により本願明細書に援用される。
【００８７】
更に別の実施形態では、本発明の結合分子はまた、トランスジェニック、非ヒト、哺乳類、とりわけ、ウサギ、ヤギ、又はウシ等において生産され、例えば、そのミルク中に分泌されてもよい。
【００８８】
更に別の代わりの実施形態では、本発明による結合分子は、好適には、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウス又はウサギ等の、トランスジェニックな非ヒト哺乳動物により生じてもよい。好適には、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、前述のヒト結合分子の全部又は一部をコード化するヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有する。トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、インフルエンザウイルス又はそのフラグメントの精製又は濃縮された調製物で免疫されてよい。非ヒト哺乳動物を免疫するためのプロトコルは、当該技術分野においてよく確立されている。その開示は参照により本願明細書に援用される、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：  Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｄ．  Ｌａｎｅ  （１９９８）、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：  Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａ．Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ  （２００１）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。免疫プロトコルは、しばしば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバントなどのアジュバントを伴うか又は伴わないかのいずれかで複数の免疫を含むが、裸のＤＮＡの免疫をも含む。別の実施形態では、ヒトの結合分子は、Ｂ細胞、プラズマ及び／又はトランスジェニック動物由来のメモリー細胞により生産される。更に別の実施形態では、ヒトの結合分子は、ハイブリドーマにより生産され、それは、前述のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるＢ細胞を不死化細胞に融合することによって製造される。前述のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られる、Ｂ細胞、プラズマ細胞、及びハイブリドーマ、並びに、前述のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、Ｂ細胞、プラズマ及び／又はメモリー細胞、並びにハイブリドーマにより得られるヒトの結合分子ヒトの結合分子も、本発明の一部分である。
【００８９】
また更なる態様では、本発明は、少なくとも本発明に従う結合分子、好適には、ヒトモノクローナル抗体、少なくともその機能的変形体、少なくとも本発明に従う免疫複合体、及び／又はその組み合わせを含む組成物を提供する。それに加えて、組成物は、とりわけ、アルブミン若しくはポリエチレングリコール、又は塩類等の安定化分子を含んでもよい。好適には、用いられる塩類は、結合分子の望ましい生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒物的な影響も与えない、塩類である。必要により、本発明のヒト結合分子は、結合分子を不活性化し得る酸又は他の天然若しくは非天然の条件の作用からそれらを保護するための材料の中又は上に被覆されてよい。
【００９０】
また更なる態様では、少なくとも本発明において定義される核酸分子を含む組成物を提供する。組成物は、塩類（例えばは、ＮａＣｌ又は前述の塩類）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）及び／又は他の適切な成分を含む水溶液等の水性の溶液を含んでよい。
【００９１】
更に、本発明は、少なくとも本発明のヒトモノクローナル抗体等の結合分子（若しくは機能的断片若しくは変形体）、少なくとも発明に従う免疫複合体、少なくとも本発明に従う組成物、又はその組み合わせが含まれる薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む。薬学的に許容可能な賦形剤は、当業者によく知られている。本発明に従う薬学的組成物は更に、少なくとも１種の他の治療用薬剤を含んでよい。適切な薬剤もまた当業者によく知られている。
【００９２】
好適な実施形態では、本発明に従う薬学的組成物は、少なくとも１種の追加の結合分子を含み、すなわち、薬学的組成物は、結合分子のカクテル又は混合物としてよい。薬学的組成物は、本発明に従う少なくとも２種の結合分子を含んでよく、又は、本発明に従う少なくとも１種の結合分子、及び／又は少なくとも１種の、ＨＡタンパク質に対する若しくはＭ２等のインフルエンザウイルス上に存在する他の抗原構造に対する別の抗体等の更なるインフルエンザウイルス結合及び／又は中和分子を含んでよい。別の実施形態では、追加の結合分子は、同時に別回又は連続の投与のために調剤されてよい。
【００９３】
一実施形態では、薬学的組成物は、インフルエンザウイルスＡ型ウイルス及び／又はインフルエンザＢ型ウイルスに対して中和活性を有する２種以上の結合分子を含んでよい。一実施形態では、組み合わせで用いられる場合、結合分子は相乗的な中和活性を示す。本願明細書で用いられる「相乗的」という用語は、個別に用いられた場合の結合分子の相加的効果よりも、組み合わせで用いられた場合のそれらの効果が大きいことを意味する。相乗的に作用する結合分子は、同一又は異なるインフルエンザウイルスの断片上の異なる構造と結合してよい。相乗作用を算出する方法は、組み合わせインデックスによる。組み合わせインデックス（ＣＩ）の概念は、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ  （１９８４）に記載されている。組成物は、例えば、中和活性を有する一つ結合分子、及び一つの非中和の結合分子を含んでよい。非中和及び中和の結合分子も、インフルエンザウイルスを中和する際に相乗的に作用してよい。
【００９４】
一実施形態では、薬学的組成物は、本発明に従う少なくとも一つの結合分子及び少なくとも一つの更なるインフルエンザウイルス中和結合分子を含んでよい。薬学的組成物中の結合分子は、好適には異なるサブタイプのインフルエンザウイルスと反応することができる。結合分子は、高い親和性のものとすべきであり、広い特異性を有するべきである。好適には、両方結合分子は交差中和分子であり、ここで、それらのそれぞれが異なるサブタイプのインフルエンザウイルスを中和する。加えて、好適には、それらは可能な限り多くの、異なるインフルエンザウイルスのサブタイプの株のそれぞれを中和する。
【００９５】
本発明に従う薬学的組成物は更に、少なくとも一つの他の治療、予防及び／又は診断用の薬剤を含んでよい。好適には、薬学的組成物は、少なくとも一つの他の予防及び／又は治療用の薬剤を含む。好適には、更なる治療及び／又予防用の薬剤は、インフルエンザウイルスの感染及び／又はかかる感染から生じる症状の防止及び／又は処置を可能にする薬剤である。治療及び／又は予防用の薬剤は、特に限定されることなく、抗ウイルス剤を含む。このような薬剤は、結合分子、小分子、有機又は無機化合物、酵素、ポリヌクレオチド配列、抗ウイルス性ペプチド等を含む。現在、インフルエンザウイルスに感染した患者を処置するために用いられる他の薬剤は、Ｍ２インヒビター（例えば、アマンタジン、リマンタジン）及び／又はノイラミニダーゼインヒビター（例えば、ザナミビル、オセルタミビル）である。これらは、本発明の結合分子と組み合わせて用いられてよい。本願明細書において「組み合わせで」とは、別の調剤として若しくは一つの複合調剤として同時に、又は、別の調剤物として任意の順序での連続的な投与計画による、ことを意味する。インフルエンザウイルスでの感染、及び／又は実験段階にあるかかる感染から生じる症状を、防止及び／又は処置することができる薬剤は、本発明において有用な、他の治療及び／又は予防用の薬剤として、用いられ得る。
【００９６】
本発明の結合分子又は薬学的組成物は、ヒトに用いる前に、適切な動物モデル系で試験されてよい。このような動物モデル系は、特に限定されることなく、マウス、フェレット、及びサルを含む。
【００９７】
一般的に、薬学的組成物は、製造及び貯蔵の条件下で、無菌且つ安定でなければならない。本発明の結合分子、免疫複合体、核酸分子、又は組成物は、デリバリー前又は当時に、適切な薬学的に許容可能な賦形剤で再構成するために、粉体の形態としてよい。滅菌注入溶液の調製のための滅菌粉体の場合、好適な調製方法は、前に滅菌フィルターした活性成分及び追加的な所望の成分の溶液からそれらの粉体を得る、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【００９８】
代わりに、本発明の結合分子、免疫複合体、核酸分子、又は組成物は、溶液としてよく、適切な薬学的に許容可能な賦形剤は、一回投与で注入可能な形態を提供するために、デリバリー前又は当時に、追加及び/又は混合してよい。好適には、本発明で用いられる薬学的に許容可能な賦形剤は、高い薬物濃度に適しており、適した流動性を維持することができ、また、必要に応じて、吸収を遅らせることができる。
【００９９】
薬学的組成物の投与の最適な経路の選択は、組成物内の活性分子の物理化学的特性、臨床状況の緊急性、及び所望の治療効果に対する活性分子の血漿中濃度の関係、を含むいくつかの要因により影響される。例えば、必要に応じて、本発明の結合分子は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む、放出制御の製剤等、急速な放出から守る担体と共に調製してよい。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の、生分解性、生体適合性ポリマーは、とりわけ、用いられる。更に、ヒト結合分子の不活性化を防止する材料又は化合物を、結合分子に被覆するか又は結合分子と共に同時投与する必要があり得る。例えば、結合分子は、例えば、リポソーム又は希釈剤等の適切な担体中で、被験者に投与されてよい。
【０１００】
投与経路は、２つの主なカテゴリ、経口及び非経口投与に分けられる。好適な投与経路は、静脈内投与又は吸入による。
【０１０１】
経口の剤形は、とりわけ、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性の懸濁物、分散性粉体又は顆粒、エマルジョン（乳濁液）、硬カプセル、軟ゼラチンカプセル、シロップ又はエリキシル剤、丸剤、ドラジェ（糖衣錠）、液体、ゲル、又はスラリーとして調剤できる。これらの調剤物は、特に限定されることなく、不活性希釈剤、造粒剤及び崩壊剤、結合剤、潤滑剤、保存剤、着色料、香料又は甘味剤、植物又は鉱物油、湿潤剤、及び増粘剤を含む、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでよい。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物はまた、非経口投与用に調剤してもよい。非経口投与用の調剤物は、とりわけ、水性又は非水性の等張性無菌非毒性の注射又は注入の溶液又は懸濁物の形態としてよい。溶液又は懸濁物は、例えば、１，３−ブタンジオール、リンゲル溶液、ハンクス溶液、等張塩化ナトリウム溶液、油、脂肪酸、局所麻酔剤、保存剤、緩衝剤、粘度又は溶解度増加剤、水溶性酸化防止剤、油溶性酸化防止剤及び金属キレート剤等の、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性である薬剤を含んでよい。
【０１０３】
更なる態様では、ヒトモノクローナル抗体等の結合分子（その機能的断片及び変形体）、免疫複合体、組成物、又は本発明の薬学的組成物は、医薬として用いてよい。そのたま、本発明の結合分子、免疫複合体、組成物、又は薬学的組成物を用いるインフルエンザウイルス感染の診断、治療及び／又は予防の方法は、本発明の別の部分である。上記分子は、とりわけ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０及び／又はＨ１１のＨＡを含むインフルエンザウイルスに起因するインフルエンザウイルス感染の、診断、予防、治療又はそれらの組み合わせにおいて、用いることができる。一実施形態では、上記分子は、インフルエンザＢ型ウイルスに起因するインフルエンザウイルス感染の、診断、予防、治療又はそれらの組み合わせにおいて、用いることができる。それらは、インフルエンザウイルス感染を患っている未処置の患者、及びインフルエンザウイルス感染についての処置を受けたか又は受けている患者の治療に適している。
【０１０４】
上記分子又は組成物は、診断、予防及び／又は治療に有用な他の分子と併せて、用いられてよい。それらは、インビトロ、エキソビボ、又はインビボで、用いられてよい。例えば、本発明のヒトモノクローナル抗体（又はその機能体変形体）、免疫複合体、組成物、又は薬学的組成物は、（入手可能な場合には、）インフルエンザウイルスのワクチンと共に同時投与されてよい。代わりに、ワクチンはまた、本発明の分子の投与前又は後に、投与されてもよい。ワクチンの代わりに、抗ウイルス剤も、本発明の結合分子と併せて、用いられてよい。適切な抗ウイルス剤は前述の通りである。
【０１０５】
分子は、一般的に、治療的に又は診断的に有効量で、本発明の組成物及び薬学的組成物で、調剤される。代わりに、それらは、別々に調剤され、投与されてよい。例えば、抗ウイルス剤等の他の分子は、全身に投与されてよいが、本発明の結合分子は静脈内投与されてよい。
【０１０６】
治療は、インフルエンザ感染に感受性がある患者グループを標的としてよい。かかる患者グループは、例えば、特に限定されることなく、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好適には≧６５歳）、若年（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者及び抗ウイルス化合物で処理されているが、不十分な抗ウイルス応答を示している、既に感染した患者を含む。
【０１０７】
投薬計画は、最適な所望の応答（例は、治療反応）を提供するために調節されてよい。適切な投薬量の範囲は、例えば、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好適には１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好適には０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好適には０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重としてよい。更に、例えば、単回ボーラスで投与してよく、数回に分けた投与は時間をかけて投与されてもよく、又は投与量を治療状況の緊急性による示唆に比例させて減少又は増加させてよい。本発明の分子及び組成物は、好適には無菌である。これらの分子及び組成物を無菌にする方法は、当該技術分野においてよく知られている。診断、予防、及び／又は治療に有用な他の分子は、本発明の結合分子に関して提案されたものに類似する投与計画で、投与されてよい。他の分子が別々に投与される場合、本発明の１種又は複数種のヒト結合分子又は薬学的組成物の投与の、前（例えば、２分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、７日間、２週間、４週間、又は６週間前）、同時、又は後（例えば、２分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、７日間、２週間、４週間、又は６週間後）に、患者に投与されてよい。実際の投与計画は、通常、ヒト患者での臨床試験の間に導き出される。
【０１０８】
ヒト結合分子、及びヒト結合分子を含む薬学的組成物は、特に有用であり、投与された抗体に対するレシピエントの免疫反応が、しばしば、モノクローナルのネズミ、キメラ、又はヒト化の結合分子の投与により引き起こされるものよりも相当低くなるため、しばしば、インビボでの治療剤としてヒトに投与されるべき場合に、好適である。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、本発明に従う中和ヒトモノクローナル抗体（その機能的断片及び変形体）等の結合分子、免疫複合体、核酸分子、組成物、又は薬学的組成物の、インフルエンザウイルス感染、特に、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、及び／若しくはＨ１１サブタイプ、並びに／又はインフルエンザＢ型のＨＡを含むインフルエンザウイルスに起因するインフルエンザウイルス感染、の診断、予防、治療、又はその組み合わせのための医薬の調製における使用に関する。
【０１１０】
これとは別に、本発明に従う少なくとも中和ヒトモノクローナル抗体（その機能的断片及び変形体）等の結合分子、少なくとも免疫複合体、少なくとも核酸分子、少なくとも組成物、少なくとも薬学的組成物、少なくともベクター、少なくとも宿主、又はそれらの組み合わせを含むキットも、本発明の一部である。任意選択的に、本発明のキットの上記の構成要素は、適切な容器に詰められ、指定された症状の診断、予防、及び／又は治療のためについてラベルされる。上記の構成要素は、水性の、好適には滅菌の溶液として、又は再構成のための、凍結乾燥の、好適には滅菌の、調剤物として、単回又は複数回投与の容器中で保存されてよい。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてよく、そして無菌のアクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静脈内投与の溶液バッグ、又は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルとしてよい）。キットは更に、薬学的に許容可能な緩衝剤を含む更なる容器を含んでよい。キットは更に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、ニードル（針）、シリンジ、１種又は複数種の適切な宿主のための培養培地、及び、可能ならば、更なる少なくとも一つの他の治療、予防、又は診断用の薬剤を含む、商業的及びユーザー的観点から望ましい他の材料を含んでもよい。キットには、例えば、このような治療、予防、又は診断製品の使用に関する指示、用法、投薬量、製造、投与、禁忌、及び／又は警告についての情報を含む、治療、予防、又は診断製品の商用包装に説明書が、通例で含まれる。
【０１１１】
本発明に従う結合分子はまた、有利には、インフルエンザウイルスの検出のためのインビトロでの方法における診断用薬剤として用いられてもよい。このように、本発明は更に、試料中で、系統グループ１若しくはグループ２のインフルエンザウイルス、又はインフルエンザＢ型のサブタイプのインフルエンザウイルスを検出する方法に関し、ここで、該方法は、（ａ）試料を、診断的に有効量の、本発明に従う結合分子（その機能的断片及び変異体）又は免疫複合体に、接触させるステップ、及び（ｂ）結合分子又は免疫複合体が、試料の分子に対して特異的に結合するかどうかを決定するステップを含む。試料は、特に限定されることなく、血液、血清、便、痰、鼻咽頭（ｎａｓｏｐｈａｒｇｙａｌ、ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）吸引液、気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｌａｖａｇｅｓ）、尿、組織、又は（潜在的に）感染した被験者由来の他の生物学的材料等を含む生物学的試料、又は、水、飲料等の非生物学的試料としてよい。（潜在的に）感染した被験者は、ヒト被験者としてよいが、インフルエンザウイルスのキャリアとして疑われる動物は、本発明のヒトの結合分子又は免疫複合体を用いて、ウイルスの存在について試験されてよい。試料は、最初に、検出の方法により適するように操作されてよい。操作は、とりわけ、ウイルスを含む及び／又は含むことが疑われる試料を、ウイルスがタンパク質、（ポリ）ペプチド、又は他の抗原性断片等の抗原成分に分解するような方法で、処理することを意味する。好適には、本発明のヒト結合分子又は免疫複合体は、ヒトの結合分子と試料中に存在する可能性のあるウイルス又はその抗原成分との間の免疫的複合物（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を可能にする条件下で、試料と接触させる。試料中のウイルスの存在を示す免疫的複合物の形成は、もしあれば、その後、適切な手段により検出され、測定される。このような方法は、とりわけ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、免疫組織化学、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥ、及びウェスタンブロット分析等の、同種及び異種の結合イムノアッセイを含む。
【０１１２】
好適なアッセイ技術、特に、患者の血清及び血液、並びに血液由来の生成物の、大規模な臨床的スクリーニングのための技術は、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法である。ＥＬＩＳＡ試験が、特に好適である。これらのアッセイにおいて試薬として用いるため、本発明の結合分子又は免疫複合体は、マイクロタイターウェルの内側表面に好便に結合される。本発明の結合分子又は免疫複合体は、マイクロタイターウェルに直接的に結合されてもよい。しかしながら、ウェルに対する本発明の結合分子又は免疫複合体の最大限の結合は、本発明の結合分子又は免疫複合体の添加前に、ポリリジンでウェルを前処理することによって、達成させてよい。更に、本発明の結合分子又は免疫複合体は、ウェルに、当技術分野において公知の方法により、注摘されてよい。一般的に、結合分子又は免疫複合体は、被覆のために、０．０１〜１００μｇ／ｍＬの間で用いられるが、より多いまたより少ない量を用いられてよい。その後、試料は、本発明の結合分子又は免疫複合体で被覆されたウェルに加えられる。
【０１１３】
更に、本発明の結合分子は、インフルエンザウイルスの特異的な結合構造を同定するために用いられてよい。結合構造は、タンパク質及び／又はポリペプチド上のエピトープであってよい。それらは、直鎖であってよいが、構造的及び／又は立体的であてもよい。一実施形態では、結合構造は、ＰＥＰＳＣＡＮ分析の手段（とりわけ、ＷＯ８４／０３５６４、ＷＯ９３／０９８７２、Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）により分析されてよい。代わりに、インフルエンザウイルスのタンパク質由来のペプチドを含むランダムペプチドライブラリーは、本発明の結合分子に対して結合することが可能なペプチドをスクリーニングすることができる。
【０１１４】
本発明は、下記の実施例及び図面に更に例示される。実施例は、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１１５】
例１：末梢血単核球から抽出したＲＮＡを用いるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーの構築
末梢血をＥＤＴＡ抗凝固サンプルチューブに静脈穿刺（ｖｅｎａｐｕｎｃｔｕｒｅ、ｖｅｎｉｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって通常の健康なドナーから収集した。参照により本願明細書に援用する国際公開第２００８／０２８９４６号に記載されるようにｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを得た。ＲＮＡを末梢血単核球から単離し、ｃＤＮＡを調製した。表１及び２に示されるプライマーセットを用いて、２ラウンドのＰＣＲ増幅の手法を用いて、免疫グロブリンＶＨ及びＶＬ領域をそれぞれのドナーレパートリーから単離した。
【０１１６】
表１に記載されるプライマーセットを用いる、それぞれのｃＤＮＡ上での第１ラウンドの増幅は、それぞれＶＨ、Ｖカッパ及びＶラムダ領域の約６５０塩基対の７、６、９の産物が得られた。ＩｇＭのＶＨ領域の増幅のために、ＯＣＭ定常プライマーを、ＯＨ１からＯＨ７と組み合わせて使用した。最初のラウンドの増幅用のサーマルサイクリングプログラムは次のようであった：２分９６℃（変性ステップ）、３０サイクルの３０秒９６℃／３０秒６０℃／６０秒７２℃、１０分７２℃の最終伸長、及び６℃での冷蔵。産物は、ゲル抽出カラム（マッハライ・ナーゲル）を用いて、１％アガロースゲルにロードし、単離し、５０μＬの５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中に溶出した。第１ラウンドの産物の１０％（３〜５μＬ）を、表２に記載されるプライマーを用いて、第２ラウンドの増幅に供した。これらのプライマーは、ファージディスプレイベクターＰＤＶ−Ｃ０６中への、それぞれＶＬ及びＶＨ領域の定方向クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ）を可能にする制限部位と共に拡張（エクステンション）した。第２ラウンドの増幅のためのＰＣＲプログラムは次の通りであった：２分９６℃（変性ステップ）、３０サイクルの３０秒９６℃／３０秒６０℃／６０秒７２℃、１０分７２℃の最終伸長、及び６℃での冷蔵。第２ラウンドの産物（〜３５０塩基対）を、まず、免疫グロブリン遺伝子産物に見られるＪセグメントのナチュラルオカランスに従ってプールし、ＶＨ、Ｖカッパ及びＶラムダそれぞれの可変領域について、７、６及び９のプールを得た（表３及び４を参照）。免疫ライブラリ中の免疫グロブリン配列の正規分布を得るために、６Ｖカッパ及び９Ｖラムダ軽鎖のプールを、表３に記載される割合に従って混合した。この単一の最終ＶＬプール（３μｇ）を、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いて一晩消化し、マッハライ・ナーゲル抽出カラムを用いて、１．５％アガロースゲルにロードし、単離し（〜３５０塩基対）、そして、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩで切断したＰＤＶ−Ｃ０６ベクター（〜５０００塩基対）に次の条件下で連結した：１０μＬのＰＤＶ−Ｃ０６ベクター（５０ｎｇ／μＬ）、７μＬのＶＬインサート（１０ｎｇ／μＬ）、５μＬの１０×ライゲーションバッファ（ＮＥＢ）、２．５  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μＬ）（ＮＥＢ）、２５．５μＬの超純水（ベクターとインサートとの比は１：２）。ライゲーションは、１６℃の水浴中で一晩行った。次に、液量を水で２倍にし、等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（７５：２４：１）（インビトロゲン社製）で抽出し、次いで、クロロホルム（メルク社製）抽出を行い、そして、１μＬのＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（ペレットペイント）（ノバジェン社製）、１０μＬ酢酸ナトリウム（３Ｍ  ｐＨ５．０）、及び１００μＬのイソプロパノールを用いて、−２０℃で２時間沈殿させた。得られた試料を、その後、４℃で２０．０００×ｇで３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄し、そして室温で２０．０００×ｇで１０分間遠心分離した。エタノールを真空吸引により除去し、ペレットを数分間空気乾燥させ、その後、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む５０��Ｌのバッファに溶解した。２μＬのライゲーション混合物を、１．７ｋＶ、２００オーム、２５μＦ（時定数〜４．５ｍ秒）に設定したＧｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（ジーンパルサー）ＩＩ装置（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて、冷却した０．１ｃｍエレクトロポレーションキュベット（バイオラッド社製）中で、４０μＬのＴＧ−１エレクトロコンピテントセル（アジレント社製）の形質転換のために用いた。パルスの直後、細菌を、５％（ｗ／ｖ）のグルコース（シグマ社製）を含む１０００μＬのＳＯＣ培地（インビトロジェン社製）を用いて、３７℃でキュベットからフラッシュし、１５ｍＬの丸底培養チューブに移した。別の５００μＬのＳＯＣ／グルコースを、キュベットから残った菌をフラッシュするために用い、そして、培養チューブに加えた。菌を、２２０ｒｐｍのシェーカーインキュベーター中で、３７℃で正確に１時間、培養することによって、回収した。形質転換した菌を、の５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、及び５％（ｗ／ｖ）のグルコース（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した、１５０ｍＬの２ＴＹアガー（１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン、１０ｇ／Ｌのバクト酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ  ７．０）を含む、大サイズの２４０ミリメートル四方のペトリ皿（ＮＵＮＣ社製）に亘って、播種した。１〜１０００倍まで希釈液を、計数目的のため、同じ培地を含む１５ｃｍのペトリ皿上に播種した。この形質転換の操作を、連続的に１０回繰り返して、全ての各形質転換体を別々の正方形のペトリ皿上に播種し、３７℃の培養ストーブ中で一晩生育した。典型的に、約１×１０７のｃｆｕ（ペトリ皿当たり１×１０６）が、上記のプロトコルを用いて得られた。穏やかに細菌を擦ることによって、プレートから、中間のＶＬ軽鎖ライブラリを、プレート当たり１０ｍＬの２ＴＹ培地中に、回収した。細胞数をＯＤ６００の測定により決定し、ＯＤ５００の菌２回分を、製造業者の説明書に従って、Ｐ５００  ｍａｘｉｐｒｅｐカラム（マッハライ・ナーゲル）を用いて、マキシプラスミドＤＮＡの調製のために、用いた。
【０１１７】
ＶＬ可変領域に類似して、第２ラウンドのＶＨ−ＪＨ産物を、まず一緒に混合して、通常のＪセグメントの使用分布（表４参照）を得て、そして、ＰＨ１〜ＰＨ７と称する７つのＶＨサブプールを得た。プールを、表４に示されるパーセンテージを用いて、正規化された配列分布を得るために混合し、ＳｆｉＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を用いて消化され、ＳｆｉＩ−ＸｈｏＩで切断した上記の通り得られたＰＤＶ−ＶＬ中間ライブラリに連結された１つのＶＨ画分を得た。ライゲーションの条件、精製方法、その後のＴＧ１の形質転換、及び菌の生育は、２０の形質転換体及び２０の正方形のペトリ皿を用いた以外、実質的にＶＬ中間ライブラリ（上記参照）に関する上記の通りであった。最終的なライブラリ（約１×１０７ｃｆｕ）は、挿入されたＶＨ−ＶＬ領域を挟むプライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、挿入頻度についてチェックした。コロニーの９０％は、正しい長さのインサートを示した。コロニーＰＣＲ産物は、その後ＤＮＡ配列解析に用い、配列の変化をチェックし、そして、完全なＯＲＦを示すコロニーの割合を評価した。それは７６％であった。最後に、ライブラリをレスキューし、ＣＴヘルパーファージ（国際公開第０２／１０３０１２号参照）を用いて、増幅して、下記の通りパニング法により、ファージ抗体セレクションに用いた。
【０１１８】
例２：インフルエンザＡ型及びインフルエンザＢ型ヘマグルチニンに対する単鎖Ｆｖフラグメントを提示するファージのセレクション
抗体フラグメントを、実質的に上記の通り構築した抗体ファージディスプレイライブラリー、及び一般的なファージディスプレイ技術、並びに、実質的に、米国特許第６２６５１５０号明細書、及び国際公開第９８／１５８３３号（その両方を参照により本願明細書に援用する）に記載される、ＭＡＢＳＴＲＡＣＴ（登録商標）技術を用いて、セレクションした。また、国際公開第０２／１０３０１２号（参照により本願明細書に援用する）に記載される方法及びヘルパーファージを、本発明において用いた。
【０１１９】
セレクションは、インフルエンザＡ型サブタイプＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）、Ｈ３（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５）、Ｈ４（Ａ／アヒル／ホンコン／２４／１９７６）、Ｈ５（Ａ／トリ／ベトナム／２８／２００３）、Ｈ７（Ａ／オランダ／２１９／２００３）、及びＨ９（Ａ／ホンコン／１０７３／９９）の組換え型ヘマグルチニン（ＨＡ）に対して行った。ＨＡ抗原を、ＰＢＳで希釈し（５．０μｇ／ｍＬ）、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｕｂｅｓ（ヌンク社製）に加え、回転ホイール上で４℃で一晩インキュベートした。イムノチューブを空にし、ブロックバッファ（ＰＢＳ中２％脱脂粉乳（ＥＬＫ））中で３回洗浄した。その後、イムノチューブを、ブロックバッファで完全に満たし、室温で１〜２時間インキュベートした。ファージディスプレイライブラリーのアリコート（５００〜１０００μＬ、０．５×１０１３〜１×１０１３ｃｆｕ、ＣＴヘルパーファージを用いて増幅されたもの（国際公開第０２／１０３０１２号参照））を、１０％の加熱非働化していないウシ胎仔血清、及び２％のマウス血清を添加したブロッキングバッファー中で、室温で１〜２時間ブロックした。ブロックされたファージライブラリを、イムノチューブに加え、室温で２時間インキュベートし、そして、洗浄バッファ（ＰＢＳ中の０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄して、未結合のファージを除去した。結合したファージを、室温で１０分間、１ｍＬの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いたインキュベーションにより、それぞれの抗原から溶離した。その後、溶離したファージを、ｐＨを中和するために、０．５ｍＬの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５と混合した。この混合物を、約０．３のＯＤ６００ｎｍまで３７℃で生育させた、５ｍＬのＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ培養物に感染させるために用いた。３７℃で３０分間、ファージでＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌を感染させた。その後、混合物を室温で３０００×ｇで１０分間遠心分離し、菌のペレットを０．５ｍＬの２−トリプトン酵母エキス（２ＴＹ）培地中に再懸濁した。得られた菌の懸濁液を、テトラサイクリン、アンピシリン、及びグルコースを添加した２つの２ＴＹ寒天プレートに分けた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーを、実質的に、Ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら（１９９５ａ）、及び国際公開第０２／１０３０１２号により記載される通り、プレートから掻き取り、濃縮したファージライブラリを調製するために用いた。簡単に言えば、掻き取った菌を、アンピシリン、テトラサイクリン、及びグルコースを含む２ＴＹ培地に接種するために用い、〜０．３のＯＤ６００ｎｍまで３７℃の温度で生育した。ＣＴヘルパーファージを加え、菌を感染させ、その後、培地を、アンピシリン、テトラサイクリン、及びカナマイシンを含む２ＴＹに変更した。インキュベーションを３０℃で一晩継続した。翌日、菌を遠心分離により２ＴＹ培地から除去し、その後、培地中のファージを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００／ＮａＣｌを用いて沈殿させた。最後に、ファージを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した２ｍＬのＰＢＳに溶解し、フィルター滅菌し���そして、次のラウンドのセレクションに用いた。セレクションの第２ラウンドを、同じＨＡサブタイプ、及び又は異なるサブタイプのＨＡのいずれかに対して行った。
【０１２０】
セレクションの二連続のラウンドを、個々の単鎖ファージ抗体の単離の前に行った。セレクションの第２ラウンドの後、個々のＥ．ｃｏｌｉのコロニーを、モノクローナルファージ抗体を調製するために用いた。実質的に、個々のコロニーを９６ウェルプレートの形式で、対数期まで生育し、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージで感染させ、その後、ファージ抗体の産生を一晩進行させた。ファージミドを配列解析し、全てのユニークなファージミドを更なる解析のために用いた。ファージ抗体を含む上澄みを、ＨＡの抗原に対する結合のためのＥＬＩＳＡに直接用いた。又はジ抗体を、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させ、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー分析の両方のためにフィルター滅菌した。
【０１２１】
例３：ＨＡ特異的単鎖ファージ抗体の検証
上記のスクリーニングで得られた一本鎖ファージ抗体を含むセレクションされた上澄みを、特異性、すなわち、異なるＨＡの抗原に対する結合についてのＥＬＩＳＡで検証した。この目的のために、バキュロウイルスが発現した、組換え型のＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）、Ｈ３（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５）、Ｈ５（Ａ／トリ／ベトナム／２８／２００３）、Ｈ７（Ａ／オランダ／２１９／２００３）、及びＢ（Ｂ／オハイオ／０１／２００５）ＨＡｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＴ、米国）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレートに対してコーティングした。コーティング後、プレートを、０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡ又は２％ＥＬＫを含むＰＢＳ中で、室温で１時間ブロックした。セレクションされた一本鎖ファージ抗体を、等量の４％ＥＬＫを含むＰＢＳ中で１時間インキュベートして、ブロックされたファージ抗体を得た。プレートを空にし、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ブロックされた一本鎖ファージ抗体をウェルに加えた。インキュベーションを１時間なし、プレートをＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄し、結合したファージ抗体を、抗Ｍ１３抗体コンジュゲートペルオキシダーゼを用いて検出した（ＯＤ４９２ｎｍでの測定を用いた）。コントロールとして、この操作を、一本鎖ファージ抗体なしと、関係のないネガティブコントロールの単鎖ファージ抗体とで、同時に行った。ファージライブラリを用いた異なるＨＡの抗原に対するセレクションから、組換え型のインフルエンザＡ型のＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、及びインフルエンザＢ型のＨＡに特異的に結合する、１３のユニークな一本鎖ファージ抗体を得た（ＳＣ０９−００３、ＳＣ０９−００４、ＳＣ０９−００５、ＳＣ０９−００６、ＳＣ０９−００７、ＳＣ０９−００８、ＳＣ０９−００９、ＳＣ０９−０１０、ＳＣ０９−０１１、ＳＣ０９−０３０、ＳＣ０９−１１２、ＳＣ０９−１１３、及びＳＣ０９−１１４）。表５参照。
【０１２２】
代わりに、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿し、フィルター滅菌したファージ抗体を、ＦＡＣＳ分析により結合及び特異性を検証するために用いた。この目的のために、組換え型インフルエンザＡ型サブタイプＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９）、Ｈ３（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５）、及びＨ７（Ａ／オランダ／２１９／２００３）ＨＡｓを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の表面に発現させた。細胞を一本鎖ファージ抗体と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを用いた洗浄ステップを３回行った。結合したファージをＦＩＴＣコンジュゲートＭ１３−抗体を用いて検出した。ファージライブラリを用いた異なるＨＡの抗原に対するセレクションから、組換え型のインフルエンザＡ型サブタイプのＨ１、Ｈ３、及びＨ７のＨＡに特異的に結合する、１４の一本鎖ファージ抗体を得た（ＳＣ０９−００３、ＳＣ０９−００４、ＳＣ０９−００５、ＳＣ０９−００６、ＳＣ０９−００７、ＳＣ０９−００８、ＳＣ０９−００９、ＳＣ０９−０１０、ＳＣ０９−０１１、ＳＣ０９−０１２、ＳＣ０９−０３０、ＳＣ０９−１１２、ＳＣ０９−１１３、及びＳＣ０９−１１４）。表６参照。
【０１２３】
全ての１６のファージ抗体、ＳＣ０９−００３、ＳＣ０９−００４、ＳＣ０９−００５、ＳＣ０９−００６、ＳＣ０９−００７、ＳＣ０９−００８、ＳＣ０９−００９、ＳＣ０９−０１０、ＳＣ０９−０１１、ＳＣ０９−０１２、ＳＣ０９−０２９、ＳＣ０９−０３０、ＳＣ０９−０３１、ＳＣ０９−１１２、ＳＣ０９−１１３、及びＳＣ０９−１１４、を完全ヒト免疫グロブリンの構築のために用いた。
【０１２４】
例４：セレクションされた単鎖Ｆｖｓからの完全ヒト免疫グロブリン分子（ヒトモノクローナル抗体）の構築
選択された特異的な単鎖ファージ抗体（ｓｃＦｖ）クローンから、プラスミドＤＮＡを取得し、ヌクレオチド及びアミノ酸配列を、標準的な手法に従って決定した。ｓｃＦｖｓの重鎖及び軽鎖の可変領域を、発現のため、ＩｇＧ発現ベクターｐＩｇ−Ｃ９１１−ＨＣガンマ１（配列番号：１７５参照）、ＰＩＧ−Ｃ９０９−Ｃカッパ（配列番号：１７６参照）、又はｐＩｇ−Ｃ９１０−Ｃラムダ（配列番号：１７７参照）中に、制限酵素消化により直接的にクローン化した。ｓｃＦｖｓのうち、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の同一性（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭら、Ｖ−ＢＡＳＥ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ：ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９７））を決定した（表７参照）。
【０１２５】
全ての構築物についてのヌクレオチド配列は、当業者に公知の標準的な手法により確かめた。ヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖をコード化する得られた発現物を、２９３Ｔ細胞中で組合せて一過性で発現させ、ヒトＩｇＧ１抗体を含む上澄みを得て、標準的な精製手順を用いて生産した。
【０１２６】
セレクションされた免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖のＣＤＲｓのアミノ酸配列を、表７に示す。
【０１２７】
全ての重鎖及び軽鎖の可変領域の、アミノ酸の相違数及び同一性％を表８に示す。
【０１２８】
例５：ＩｇＧｓの交差結合反応性
上記の５つのＩｇＧ抗体パネル、ＣＲ９００５、ＣＲ９０３０、ＣＲ９１１２、ＣＲ９１１３、及びＣＲ９１１４を、結合特異性、すなわち、異なるＨＡ抗原に対する結合について、ＥＬＩＳＡで検証した。この目的のために、バキュロウイルスが発現した、組換え型のＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）、Ｈ３（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５）、Ｈ５（Ａ／トリ／ベトナム／２８／２００３）、Ｈ７（Ａ／オランダ／２１９／２００３）、及びＨ９（Ａ／ホンコン／１０７３／９９）ＨＡｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＴ、米国）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレートに対してコーティングした。コーティング後、プレートを、０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡ又は２％ＥＬＫを含むＰＢＳ中で、室温で１時間ブロックした。プレートを空にし、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＩｇＧ抗体をウェルに加えた。インキュベーションを１時間なし、プレートをＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄し、結合したファージ抗体を、抗−ヒトＩｇＧ抗体コンジュゲートペルオキシダーゼを用いて検出した（ＯＤ４９２ｎｍでの測定を用いた）。コントロールとして、関係のないＩｇＧ  ＣＲ４０９８を用いた。
【０１２９】
ＣＲ９００５、ＣＲ９０３０、ＣＲ９１１２、ＣＲ９１１３、及びＣＲ９１１４は、試験された全ての組換え型ＨＡｓに対して、ヘテロサブタイプの交差結合活性を有することが示された。
【０１３０】
加えて、セレクションされた抗体を、ヘテロサブタイプの結合をＦＡＣＳ分析により試験するために用いた。この目的のため、完全長の組換え型インフルエンザＡ型サブタイプＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９）、Ｈ３（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５）、Ｈ７（Ａ／オランダ／２１９／２００３）ＨＡｓを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の表面上に発現させた。細胞をＩｇＧ抗体と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを用いた洗浄ステップを３回行った。結合した抗体をＰＥコンジュゲート抗−ヒト抗体を用いて検出した。コントロールとして、形質転換されていないＰＥＲ，Ｃ６細胞を用いた。ＣＲ９００５、ＣＲ９０３０、ＣＲ９１１２、ＣＲ９１１３、及びＣＲ９１１４は、インフルエンザＡ型サブタイプＨ１、Ｈ３、及びＨ７ＨＡに対して交差結合活性を示したが、野生型のＰＥＲ．Ｃ６細胞は示さなかった。表９参照。
【０１３１】
例６：ＩｇＧｓの交差中和活性
セレクションされたＩｇＧｓが、複数のインフルエンザＡ型株をブロックすることが可能であったかどうかを決定するために、追加のインビトロでのウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）を行った。ＶＮＡを、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）上で行った。ＭＤＣＫ細胞を、ＭＤＣＫ細胞培養培地（抗生物質、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び０．１５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウムを添加し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清を添加した、ＭＥＭ培地（完全ＭＥＭ培地））中で培養した。アッセイで用いた、Ｈ１（Ａ／ＷＳＮ／３３、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９、Ａ／ソロモン諸島／ＩＶＲ−１４５（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９の高増殖の再集合体））、Ｈ２（Ａ／Ｅｎｖ／ＭＰＵ３１５６／０５）、Ｈ３（Ａ／ホンコン／１／６８、Ａ／ヨハネスブルク／３３／９４、Ａ／パナマ／２０００／１９９９、Ａ／広島／５２／２００５、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５、及びＡ／ブリスベン／１０／２００７）、Ｈ４（Ａ／ＷＦ／ＨＫ／ＭＰＡ８９２／０６）、Ｈ５（ＰＲ８−Ｈ５Ｎ１−ＨＫ９７（Ａ／ホンコン／１５６／９７とＡ／ＰＲ／８／３４との６：２の再集合体）、及びＡ／ユーラシアンウィジョン／ＭＰＤ４１１／０７）、Ｈ７（ＮＩＢＲＧ−６０（Ａ／マドリード／オランダ／１２／２０００の６：２の再集合体）、及びＰＲ８−Ｈ７Ｎ７−ＮＹ（Ａ／ニューヨーク／１０７／２００３（Ｈ７Ｎ７）とＡ／ＰＲ／８／３４）との７：１の再集合体））、Ｈ８（Ａ／ユーラシアンウィジョン／ＭＰＨ５７１／０８）、Ｈ９（Ａ／ホンコン／１０７３／９９、及びＡ／ニワトリ／ＨＫ／ＳＳＰ１７６／０９）、Ｈ１０（Ａ／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／４９）、及びＨ１４（ＰＲ８−Ｈ１４Ｎ５（Ａ／マドリード／アストラカン／２６３／１９８２（Ｈ１４Ｎ５）、及びＡ／ＰＲ／８／３４の６：２の再集合体）株は、全て、Ｓｐｅａｒｍａｎ及びＫａｒｂｅｒの方法に従って計算された力価で、５，７×１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（ｍＬ当たり５０％組織培養感染量）の力価となるように希釈した。４つ一組のウェルにおいて、完全ＭＥＭ培地中で、ＩｇＧ調製物（２００μｇ／ｍＬ）を連続的に２倍に希釈した（１：２〜１：５１２）。それぞれのＩｇＧ希釈物の２５μＬを、２５μＬのウイルス懸濁液（１００  ＴＣＩＤ５０／２５μＬ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。この懸濁液をその後、５０μＬの完全ＭＥＭ培地中のコンフルエントのＭＤＣＫ培養物を含む、９６ウェルプレート上に４つ一組で移した。使用前に、ＭＤＣＫ細胞を、ウェル当たり３×１０４細胞で、ＭＤＣＫ細胞培養培地に播種し、細胞がコンフルエントに達するまで生育させ、３００〜３５０μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、最後に、５０μＬの完全ＭＥＭ培地を各ウェルに加えた。播種した細胞を、３７℃で３〜４日間培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）の進展について、毎日観察した。ＣＰＥをポジティブコントロールと比較した。
【０１３２】
ＣＲ９００５、ＣＲ９０３０、ＣＲ９１１２、ＣＲ９１１３、及びＣＲ９１１４は、全ての試験されたインフルエンザＡ型サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、及びＨ１０ウイルスの代表的な株に対して、交差結合活性を示した。表１０参照。
【０１３３】
例７：汎用インフルエンザ抗体のＨＡの融合前の形態に対する結合
選択されたＩｇＧがＨＡ分子の融合前又は後の形態に結合することが可能かどうかを決定するために、インビトロのｐＨシフト実験を行った。この目的のため、インフルエンザＡ型サブタイプＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）、Ｈ３（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５）、Ｈ５（Ａ／ベトナム／１２０３／０４）、Ｈ７（Ａ／オランダ／２１９／０３）、及びＨ９（Ａ／ホンコン／１０７３／９９）のＨＡを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞上に発現した。異なる構造のＨＡの形態に対して結合するｍＡｂを測定するため、細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いてプラスチック氏辞退から剥離し、その後、トリプシン（ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ｇｉｂｃｏ）で室温で５分間処理し、洗浄（１％のＢＳＡのＰＢＳ溶液）し、クエン酸−リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．９）中で１５分間インキュベートした。各処理ステップ（トリプシン処理せず／ＨＡ０；トリプシン処理／ＨＡ１−ＨＡ２；ｐＨ４．９／融合ＨＡ）の後、細胞試料を確保、各処理の画分をｍＡｂ  ＣＲ９１１４で１時間インキュベートした。細胞をその後、１％ＢＳＡ中のフィコエリトリン−コンジュゲート−抗−ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で３０分間インキュベートした。染色した細胞を、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  ソフトウェアを備えたＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。ＨＡが発現された表面に対するＩｇＧのＦＡＣＳでの結合は、トリプシン及びｐＨ４．９緩衝培地による連続的処理後のものとし、未処理のＨＡに（Ａ）に対する結合の割合として表した。図１Ａ参照のこと。
【０１３４】
ＣＲ９１１４は、ｐＨシフト後の結合において顕著な減少を示し、低ｐＨで誘導されるＨＡ分子の形態変化前のみに存在するエピトープに対する特異性が示唆された。
【０１３５】
代わりに、ＩｇＧが、低ｐＨで誘導されるＨＡ分子の形態変化をブロックすることができるかどうかを試験するために、抗体ＣＲ９１１４を、低ｐＨステップの前に加えた。連続的処理の試料を分け、フィコエリトリン−コンジュゲート−抗−ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  ソフトウェアを備えたＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。図１Ｂ参照のこと。抗体ＣＲ９１１４は、ｐＨシフトの後に様々なＨＡに対する高いレベルでの結合が残ることを示し、これらの結合がＨＡ分子に結合したときには、ｐＨで誘導されるＨＡ分子の形態変化が生じることが示唆された。
【０１３６】
例８：様々なインフルエンザＡ及びＢのＨＡにおけるＦａｂｓの親和性測定
昆虫細胞中でバキュロウイルスベクターを用いて生産された、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（Ｂ）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（Ｂ）、及びＢ／マレーシア／２５０６／２００４（Ｂ）の組換え型可溶性ＨＡを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ（ＣＴ、米国）から購入し、ＥＺ−ｌｉｎｋ  ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ  （Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、室温（ＲＴ）で４０分間ビオチン化した。バッファをＰＢＳに交換するステップを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った。ビオチン化したＨＡを３７℃で１２００秒間ストレプトアビジンセンサーに結合させた。センサーを１×キネティックバッファ中の１００ｎＭ抗体に曝すことによって、ＣＲ９００５、ＣＲ９１１２、ＣＲ９１１３、及びＣＲ９１１４のＦａｂ断片の集合を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で、３７℃で７００秒間測定した。ＣＲ９００５、ＣＲ９１１２、ＣＲ９１１３、及びＣＲ９１１４のＦａｂ断片の全てが、Ｈ１、Ｈ２及びインフルエンザＢのＨＡに対してマイクロ〜ピコモラーの親和性で結合した。
【０１３７】
例９：他のステム結合抗体との結合の競合
昆虫細胞中でバキュロウイルスベクターを用いて生産された、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、及びＡ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）の組換え型可溶性ＨＡを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ（ＣＴ、米国）から購入し、ＥＺ−ｌｉｎｋ  ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ  （Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、室温（ＲＴ）で４０分間ビオチン化した。バッファをＰＢＳに交換するステップを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った。ビオチン化したＨＡを３７℃で１２００秒間ストレプトアビジンセンサーに結合させた。センサーを１×キネティックバッファ中の１００ｎＭ抗体に曝すことによって、抗体ＣＲ９１１４及びＣＲ６２６１のＨ１のＨＡに対する集合を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で、３７℃で７００秒間測定し、その後、追加的結合の程度を、センサーを一次抗体（１００ｎＭ）の存在下で、二次抗体（１×キネティックバッファ中で１００ｎＭ）に、３７℃で７００秒間曝すことによって評価した。コントロールとして、Ｈ１の球状頭部に対して結合する、ｍＡｂ  ＣＲ９０２０を共に用いた。抗体ＣＲ９１１４及びＣＲ８０２０のＨ３のＨＡに対する集合を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で、３７℃で９００秒間測定し、その後、追加的結合の程度を、センサーを一次抗体（１００ｎＭ）の存在下で、二次抗体（１×キネティックバッファ中で１００ｎＭ）に３７℃で９００秒間曝すことによって評価した。コントロールとして、Ｈ３の球状頭部に対して結合する、ｍＡｂ  ＣＲ８０５７を共に用いた。
【０１３８】
ＣＲ９１１４は、Ｈ１のＨＡに対する結合に関してＣＲ６２６１と競合し、Ｈ３のＨＡに対する結合に関してＣＲ８０２０と競合した。そのため、ＣＲ９１１４は、ＨＡのステム領域中のＣＲ６２６１及びＣＲ８０２０のエピトープの両方とオーバーラップするエピトープに結合する可能性がある（図２参照）。
【０１３９】
例１０：インビボにおけるヒトＩｇＧモノクローナル抗体ＣＲ９１１４のインフルエンザＢの致死的攻撃に対する予防活性
インビボにおけるヒトＩｇＧモノクローナル抗体ＣＲ９１１４のインフルエンザＢの致死的攻撃に対する予防活性を試験するための研究を行った。ＭＡｂ  ＣＲ９１１４を、インフルエンザＢ／フロリダ／０４／２００６ウイルス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＣＶＩ），  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に罹患させたマウスを用いたマウス致死的攻撃モデルにおいて、予防活性について試験した。Ｂ／フロリダ／０４／２００６ウイルスを、５回の肺対肺（ｌｕｎｇ−ｔｏ−ｌｕｎｇ）継代後、マウスに罹患させた。マウスに罹患させたインフルエンザＢの５継代目のウイルスは、ＣＶＩ’ｓラボラトリーで、孵化鶏卵において増殖させた。全てのマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌、６〜８週齢、グループ当たりｎ＝１０）を、実験の開始前少なくとも４日間順応させ、維持した。ＭＡｂ  ＣＲ９１１４を、攻撃１日前に、尾静脈（ｖｅｎａ  ｃｏｃｃｙｇｅｕｓ）において静脈内に１５ｍｇ／ｋｇで投与した。マウス当たり平均重量１８ｇであり、所定投与量は０．２ｍＬであった。共に用いるコントロールグループにはビヒクルコントロールを投与した。マウスを、その後、経鼻接種により、２５ＬＤ５０のＢ／フロリダ／０４／２００６インフルエンザウイルスで、０日目に攻撃した。臨床的徴候及び体重を、攻撃１日前から８日目まで毎日測定した。臨床的徴候は、スコアリングシステム（０＝臨床徴候なし；１＝ラフコート、２＝ラフコート、取扱いの間低反応、３＝ラフコート、ロールドアップ、呼吸困難（ｌａｂｏｕｒｅｄ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、取扱いの間低反応、４＝ラフコート、ロールアップ、呼吸困難、操作／取扱いに対して低反応。）を用いてスコアした。
【０１４０】
全てのマウスは、順応期間の間疾患の徴候を示すことなく、活動的であり健康に見られた。図３Ａは、ｍＡｂ投与後の、マウスの生存率を示す。１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ＣＲ９９１１４を投与したマウスは、１００％の生存率を示したが、コントロールのｍＡｂグループは５０％の生存であった。
【０１４１】
図３Ｂでは、ｍＡｂ投与後の８日間の研究期間の間のマウスの体重変化の平均を示す。ｍＡｂ  ＣＲ９１１４のグループではマウスは、８日の研究期間に亘って体重減少はなかったが、ビヒクルコントロールのグループでは、体重減少が観察された。マウスの平均臨床スコアを図３Ｃに表す。攻撃１日前に１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ＣＲ９１１４で処理したマウスでは、全てが生存し、全てが観察期間（０日目〜感染後８日目）の間、いかなる臨床的徴候も示さなかった。これらの結果は、本願明細書に開示される通り同定され開発された、ヒト抗インフルエンザ抗体ＣＲ９１１４が、インビボにおいて、インフルエンザＢウイルスの致死的投与に対する保護を与えることができることを示している。感染１日前に、１５ｍｇ／ｋｇ以上の容量で投与された場合、ｍＡｂ  ＣＲ９１１４はマウスでのインフルエンザＢ感染の臨床的徴候を完全に予防することができた。
【０１４２】
【表１】
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【０１４３】
【表２−１】
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【０１４４】
【表２−２】
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【０１４５】
【表３−１】
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【０１４６】
【表３−２】
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【０１４７】
【表３−３】
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【０１４８】
【表４−１】
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【０１４９】
【表４−２】
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【０１５０】
【表５】
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【０１５１】
【表６】
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【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
【表８Ａ】
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【０１５４】
【表８Ｂ】
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【０１５５】
【表９】
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【０１５６】
【表１０】
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【０１５７】
（参考文献）
（１）Ａｉｒ  ＭＡ  （１９８１），  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  １２  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８（１２）：７６３９−７６４３．
（２）Ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５），  Ｒａｐｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：３９３８．
（３）Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３），  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：４２８−４４３．  
（４）Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｓｕｂｔｙｐｅ  （Ｈ１６）  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｕｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（５）：２８１４−２８２２．
（５）Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （２００５），  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ５Ｎ１  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ａｓｉａ．  Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １１：１５１５−１５２１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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