(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスチシンを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤（食品添加剤を除く）。
【請求項２】
カスチシンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤。
【請求項３】
カスチシンを有効成分とする食後血糖値低下剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチンは、脂肪細胞から特異的に産生および分泌される善玉アディポサイトカインであり、循環器系疾患、糖尿病、肥満などの生活習慣病と密接に関連することが知られている。血中でのアディポネクチンの産生を促進する成分の研究・開発が進められている。多数の提案が成されている。
【０００３】
アディポネクチンは分子量約３０ＫＤａの、脂肪細胞で最も豊富に発現している善玉アディポサイトカインである。補体のＣ１ｑと構造上の相同性があり、Ｎ末端よりシグナルペプチド、コラーゲン様ドメイン、球状ドメインよりなる。血中では１２−１８量体の高分子量アディポネクチン、６量体の中分子量アディポネクチン、３量体の低分子量アディポネクチンの３種類の多量体を形成している。
肥満や内臓脂肪蓄積に伴って、アディポネクチンの血中レベルが低下する。アディポネクチンは遺伝子の多型など遺伝的要因によっても低下する。アディポネクチン遺伝子欠損マウスは、インスリン抵抗性、耐糖能異常、脂質異常、高血圧などのメタボリックシンドロームの諸徴候を呈する。アディポネクチンの補充は、インスリン抵抗性やメタボリックシンドロームを改善する。
【０００４】
アディポネクチン産生促進に関し、多数の提案が成されている。  特許文献１（特開２００９−２０９０８０号公報）には、大豆蛋白加水分解物を有効成分とし、特に大豆蛋白加水分解物がジペプチド又は／及びトリペプチドを主成分とするオリゴペプチド混合物であるような組成物が、アディポネクチン分泌促進作用があり、血中アディポネクチン濃度を強く亢進することが開示されている。
特許文献２（特開２００９−２４９３４１号公報）には、紅麹抽出物およびプロアントシアニジンを有効成分とする、アディポネクチン産生促進剤が開示されている。
特許文献３（特開２００８−２５５０４０号公報）には、レスベラトロールを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０９０８０号公報
【特許文献２】特開２００９−２４９３４１号公報
【特許文献３】特開２００８−２５５０４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新規なアディポネクチンの産生・分泌促進剤を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、５１７種の植物抽出物を調査分析した結果、Vitex属植物の抽出物について、アディポネクチンの産生・分泌促進作用があることを知見したので提案する。さらに本発明者はVitex属植物の抽出物の持つアディポネクチン産生・分泌促進作用の中心となる物質を確認したので、この化合物を有効成分とする剤を提案する。
すなわち、本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．カスチシンを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤（食品添加剤を除く）。
２．カスチシンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤。
３．カスチシンを有効成分とする食後血糖値低下剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、Verbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属植物抽出物にアディポネクチンの産生促進作用として有効なカスチシンが含まれていること、インスリン抵抗性改善及び飲食物の摂取後の血糖値を低下させる作用があることを明らかにした。特に、Vitex agnus-castus L.（チェストツリー）抽出物が有効である。
このVerbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属植物抽出物を医薬、飲食品、飼料等の形態で摂取することにより、アディポネクチンの産生促進あるいは血糖値低下をすることができる。これによりアディポネクチンが関与する種々のインスリン抵抗性を改善し、メタボリックシンドロームに基づく種々の病態の治療・予防に役立つことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験方法の概略工程図。
【図２】血中アディポネクチン量を示すグラフ。
【図３】インスリン抵抗改善性を示すグラフ。
【図４】チェストツリーエキス  カスチシン分画分特定を示すグラフ。
【図５】カスチシン分画がアディポネクチン産生作用を示すグラフ。
【図６】体重変化を示すグラフ。
【図７】糖負荷試験による血中グルコースの変化を示すグラフ。
【図８】Vitex属植物のアディポネクチン産生・分泌作用を示すグラフ。
【図９】カスチシンの脂肪細胞分化促進作用を確認した結果を示すグラフ。
【図１０】カスチシンのアディポネクチン産生・分泌促進作用を測定した結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で用いるVerbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属植物抽出物は、アディポネクチン産生作用を調査した５１７種の植物抽出物のなかで、活性を示した１種であり、本抽出物に着目して中性脂肪の変化、体重の変化について、試験した結果、良好な結果を得ることができるまで深化させることができたので、提案する。さらに、この作用を示す成分としてVitex属に含有されるカスチシンという化合物について検討したところ、カスチシン単独で同様の効果を示すことが確認できたので、カスチシンを有効成分とする剤についても提案する。
【００１１】
本発明は、医薬、食品添加物、食品およびペットフード、動物用医薬として利用することができる。剤型は、公知の方法により助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口投与することができる。カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液状として投与できる。
投与量は、投与方法と、患者の年齢、病状や一般状態等によって変化し得るが、動物試験の結果より成人では体重１ｋｇ当たり通常、１日当たりの有効成分として０．４〜６００ｍｇが妥当である。
【００１２】
本発明のアディポネクチン産生促進剤は、一般食品や健康食品に配合することができ、また、食品添加物の成分とすることもできる。配合する食品は特に限定されず、例えば食パン、菓子パン、パイ、デニッシュ、ドーナツ、ケーキ等のベーカリー食品、うどん、そば、中華麺、焼きそば、パスタ等の麺類、天ぷら、コロッケ等のフライ類、カレー、シチュー、ドレッシング等のソース類、ふりかけ類、かまぼこ等の練り製品、ジュース等の飲料、スナック菓子、米菓、飴、ガム等の菓子類を挙げることができる。
犬、猫、ハムスター、リス等の哺乳類の飼料として適している。本発明のペットフードの形態は特に限定されるものではなく、例えばドライタイプ、ウェットタイプ、セミモイストタイプ、ビスケットタイプ、ソーセージタイプ、ジャーキータイプ、粉末、顆粒、カプセルなどが挙げられる。
【００１３】
＜Verbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属植物抽出物スクリーニング試験＞  
図１に示す工程概略にしたがって試験方法を説明する。マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）は定法に従い、１０％ＦＢＳ含有Dulbeccos変法Eagle培地（ＤＭＥＭ）にて継代・培養した。探索のための評価としては、ラット尾コラーゲンＩをコートしたマルチウエルプレート（48ウエル、BD BioCoat、BD  Bioscience社製）に１ウエル当り５×１０４個の３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種し、コンフルエントになるまで培養した（６〜８日）。その後、デキサメタゾンとイソブチルメチルキサンチン、インスリンを含む誘導培地にて３〜４日間培養して前駆脂肪細胞から未熟脂肪細胞へ分化誘導した後、インスリンと被験サンプルとを含む維持培地にて１週間培養した。１週間の培養の後、ボトムは成熟脂肪細胞中の脂肪滴の量をOil Red O染色法にて測定することにより（脂肪細胞分化促進作用）、培養上清は市販のELISAキット（マウス/ラットアディポネクチンELISAキット、大塚製薬）を用いて産生、分泌されたアディポネクチンの量を測定することにより、評価を行った。
【００１４】
多数の被験剤から、被験剤Ｎｏ．Ｅ１０００４についてアディポネクチン産生作用が認められた。図２に示すように、コントロールに比して５．９倍の作用を示し、アディポネクチン産生剤として市販されているPioglitazoneに５０％強の効果が確認できた。
【００１５】
被験剤Ｎｏ．Ｅ１０００４は、Verbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属植物Vitex agnus-castus L.（チェストツリー）抽出物である。２００ｎｇ／ｍｌ以上を示している。Verbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属（ハマゴウ属）植物に属する落葉低木で、Vitex agnus-castus（学名）（英名  Chaste berry、和名  セイヨウニンジンボクあるいはチェストツリー、チェストベリーなど）に注目した。なお、ポジティブコントロールとして、アディポネクチン産生用医薬として使用されているPioglitazoneを使用した。Vitex agnus-castus L.（チェストツリー）抽出物は、ポジティブコントロールの５０％以上の活性を示し、コントロールに対しては約６倍の活性を示した。
【００１６】
Vitex agnus-castusは、南ヨーロッパから中央アジアを原産とするクマツヅラ科の植物である。高さは２〜３メートルになり、全体にかすかな芳香があり、披針形の葉は掌状複葉で、５〜７個の小葉があり、７月から９月ごろ、枝の先端に円錐花序をつけ、淡い紫色の小さな花を咲かせる。ヨーロッパでは果実を香料にしたり、生理不順や更年期障害などの治療薬として用いられてきた。主に果実部分を利用し、チェストベリーとも呼ばれる果実のエキスには女性ホルモンの一種である黄体ホルモンの分泌を促進し、月経不順をはじめとした女性特有の病気の改善作用を持つとされる。
Verbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属（ハマゴウ属）植物として、Vitex agnus-castus（学名）（英名  Chaste berry、和名  セイヨウニンジンボク）、Vitex cannabifolla Sieb. et. Zucc.  （ニンジンボク）、Vitex negundo L.（タイワンニンジンボク）、Vitex rofundifolia L. fill.（ハマゴウ）の抽出物を使用することができる。
Vitex cannabifolla Sieb. et. Zucc.（ニンジンボク）は、クマツヅラ科の落葉低木であり、中国に広く分布している。高さ３〜５メートル、枝は四角形で葉を対生し、葉は掌状複葉。７〜８月になると、淡紫色の小さい唇形花が長さ２０センチメートルほどの円錐花序をなして階段状に集まって咲く。漢名ではニンジンボクを牡荊（ぼけい）、果実を牡荊子、葉を牡荊葉という。牡荊子は、鎮咳（ちんがい）、鎮痛、健胃、止瀉（ししゃ）剤として喘息、感冒、胃病、消化不良、腸炎などの治療に用いる。中国では葉、茎、根もほぼ果実と同様に用いる。
Vitex negundo L.（タイワンニンジンボク）は、ニンジンボク（Vitex cannabifolla Sieb. et. Zucc.）の近縁で小葉が全縁であるものをタイワンニンジンボク（V. negundo L.）と呼び、台湾、中国、東南アジア、インド、マダガスカル島、アフリカに分布する。漢名では黄荊（おうけい）といい、前種のニンジンボクと同様に用いる。
Vitex rofundifolia L. fill.（ハマゴウ）は、日本、朝鮮、中国、オーストラリアなどの温暖な海岸の砂地に自生するつる性低木である。花や葉には香りがあり、和名のハマゴウは「浜香」の意味。この植物の成熟乾燥した果実は蔓荊子（Viticis Fructus）と称され、解熱、鎮痛、強壮、消炎薬として、頭痛、感冒、眼病、胃痛、関節痛などに用いられる。また、漢製剤として蔓荊子散、菊花散などに処方される。
その他Vitex属植物には、ミツバハマゴウ（Vitex trifolia L.）、ヤエヤマハマゴウ（Vitex trifolia L. var. bicolor (Willd.) Moldenke）などがある。前者は、奄美大島以南の琉球、旧世界の熱帯に広く分布する3出葉の常緑潅木であり、後者は、東南アジア、ミクロネシア、オーストラリア、その他、熱帯に広く分布。日本では、西表島、石垣島のみに生息している。
【００１７】
＜インスリン抵抗改善＞
インスリン抵抗改善作用を示すグラフを図３に示す。コントロールに比して３．２〜６．５倍の改善性を濃度依存的に発揮している。ポジティブコントロールPioglitazoneに対して、４０〜８０％の挙動を示している。
【００１８】
＜カスチシン検出試験＞
チェストツリーエキスを酢酸エチル及び水を用いて液-液分配を行ったところ、酢酸エチル層に脂肪細胞分化促進作用が認められた。
チェストツリーエキスをG3000Sカラムクロマトグラフィーに供し、異なる濃度のエタノール溶媒を用いて溶出を行ったところ、７０％含水エタノール及び１００％エタノール溶出画分に、脂肪細胞の分化促進作用が認められた。
チェストツリーエキスの酢酸エチル層をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム及びメタノールの混合比率を変えた溶出溶媒を用いて溶出させたところ、図４に示すようにFraction２、３及び４（カスチシンを含む画分）に脂肪細胞分化促進作用が認められた。
カスチシン（Casticin）（慣用名）は、分子式：C19H18O8、分子量：374.345、3’,5-Dihydroxy-3,4’,6,7-tetramethoxyflavoneビテキシカルピン（Vitexicarpin）3,4',6,7-Tetramethoxy-3',5-dihydroxyflavone である。
チェストツリー分画物Fraction２、３及び４について、アディポネクチン産生剤として市販されているPioglitazoneを指標として、アディポネクチン産生作用の再現性試験を行った。その結果を図５に示す。コントロールに対して約１５０％の産生増強作用を示し、Pioglitazoneに対しては、７５％の作用を示すことが確認された。
これは、チェストツリーエキスが、アディポネクチン産生剤として、緩効性を期待できることを示しており、チェストツリーエキスを日常的に安全に服用することができることを示す内容である。
【００１９】
＜マウス摂取試験＞
［動物試験・飼料］
試験には、５週齢のKKAｙ/TaJclマウス（日本クレア）、雄を用いた。  試験食としては高脂肪・高ショ糖食（オリエンタル酵母工業製、F2HFHSD 粉末飼料、以下HFSとする）、HFSにチェストツリーエキス（アスク薬品製、５０％含水エタノール抽出、賦形剤を４０％含む、以下ＶＡとする）をエキス相当量として０．５％、１．０％、２．０％となるように添加した。動物は、各群６匹とした。
１週間の馴化の後、上記の各試験食を３週間摂餌させた。期間中、摂餌量及び体重を測定した（２回／週）。３週間の摂餌の後に非絶食下で血糖値を測定し、その後絶食下で経口ブドウ糖負荷耐糖能試験（ＯＧＴＴ)を行った。
【００２０】
体重増加について図６に示す。高脂肪・高ショ糖食（ＨＦＳ）に比べて、チェストツリーエキスを添加した試験群において、体重増加が抑制されていることが示されている。そして、その体重抑制作用は概ね濃度依存的に現れている。
【００２１】
［糖負荷耐糖能試験（ＯＧＴＴ)結果］
試験結果を図７に示す。
高脂肪・高ショ糖食（ＨＦＳ）に比べて、チェストツリーエキスを添加した試験群において、血中グルコース量の低下が促進されていることが示されている。そして、その低減作用は、試験添加量では濃度依存が認められない。したがって、微量でも食後の血中糖濃度を減少させることが可能である。
【００２２】
『メタボリックシンドロームup to date』（日本医師会編）によると糖尿病、脂質代謝異常の原因はインスリン抵抗性によるものと報告がなされている。すなわち、インスリン抵抗性の改善によりメタボリックシンドローム改善がされる。メタボリックシンドロームは代表的パラメーターとして血糖値、体重が指標とされる。本発明は体重増加、糖負荷耐糖能試験（ＯＧＴＴ)において実証されていることからインスリン抵抗性改善作用を有するといえる。
【００２３】
＜アディポネクチン産生・分泌促進作用試験＞
前記［００１３］及び図１に記載したアディポネクチンの量を測定する方法により、更に下記５種のVerbenaceae科（クマツヅラ科）Vitex属植物の評価を行った。
アディポネクチン産生・分泌促進作用を示すグラフを図８に示す。
Vitex agnus-castus（セイヨウニンジンボク）、Vitex rofundifolia L. fill. （ハマゴウ）、Vitex cannabifolla Sieb. et. Zucc.  （ニンジンボク）、Vitex negundo L.（タイワンニンジンボク）の種子、Vitex negundo L.（タイワンニンジンボク）の葉から抽出した５種類の抽出物について、アディポネクチン産生・分泌促進作用試験を行った。
コントロールに比していずれも高い数値が認められ、濃度に依存して高くなっている。ポジティブコントロールPioglitazoneに対して、高濃度では５０〜９０％の挙動を示している。タイワンニンジンボクの種子抽出物（黄荊子）と葉の抽出物（黄荊葉）では、高濃度において、種子抽出物に優れた効果が認められた。
【００２４】
＜カスチシンの脂肪細胞分化促進試験＞
市販されている精製カスチシン（フナコシ販売  ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）を用いて脂肪細胞分化促進試験を行った。段落[００１３]のスクリーニング試験の手法を用いて脂肪細胞への分化促進活性を測定した。測定結果を図９に示す。カスチシン処理を行わなかった場合に比してカスチシン投与群は明らかに脂肪細胞分化促進作用を示した。
カスチシンは濃度依存的に未熟脂肪細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導した。
【００２５】
＜カスチシンのアディポネクチン産生・分泌促進作用の測定＞
市販されている精製カスチシン（フナコシ販売  ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）のアディポネクチン産生・分泌促進作用を測定した。測定結果を図１０に示す。カスチシン処理を行わなかった場合に比してカスチシン投与群は明らかにアディポネクチンの産生分泌促進作用を示した。
カスチシンは０．１μｇ／ｍｌの低濃度でアディポネクチンの産生・分泌を促進することが明らかとなった。また細胞毒性も認められなかった。
したがってカスチシンを安全なアディポネクチン産生・分泌促進剤、インスリン抵抗性改善剤、食後血糖低下剤として利用できることが確認できた。
【図１】
0005770504.tif 000002
【図２】
0005770504.tif 000003
【図３】
0005770504.tif 000004
【図４】
0005770504.tif 000005
【図５】
0005770504.tif 000006
【図６】
0005770504.tif 000007
【図７】
0005770504.tif 000008
【図８】
0005770504.tif 000009
【図９】
0005770504.tif 000010
【図１０】
0005770504.tif 000011