(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中の少なくとも１個の分子の量を測定する方法であって、
ａ）前記試料又はその誘導体を１個以上のアプタマーと組み合わせ、そして前記試料中の前記少なくとも１個の分子を前記１個以上のアプタマーと結合させること；
ｂ）結合分子を非結合分子から分離すること；及び
ｃ）前記１個以上のアプタマーに結合した前記少なくとも１個の分子を定量化すること、
を含み、
結合した前記少なくとも１個の分子の定量化は前記１個以上のアプタマーの少なくとも一部の配列決定により行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記少なくとも１個の分子がタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１個の分子の正体が既知であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１個の分子の正体が未知であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は更に前記少なくとも１個の分子の正体を決定することを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１個以上のアプタマーの配列が既知であることを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
各アプタマー配列が固有のタグを有することを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記タグが前記アプタマーの配列であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タグが前記アプタマーの配列の一部であることを特徴とする、請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列決定が単一分子アレイ又は単一クローン分子アレイ上で行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
シークエンシングが合成により行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
シークエンシングが次世代シークエンシングにより行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は前記少なくとも１個の分子に結合した前記１個以上のアプタマーを除去しそして該１個以上のアプタマーを表面に配置することを更に含むことを特徴とする、請求項１ないし請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は配置した１個以上のアプタマーを増幅することを更に含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１個以上のアプタマーは同一分子に結合する異なる配列を含むことを特徴とする、請求項１ないし請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１個以上のアプタマーはアプタマー配列のパネルを含み、各パネルは異なる分子に結合することを特徴とする、請求項１ないし請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１個以上のアプタマーはポリヌクレオチド又はポリペプチドに由来することを特徴とする、請求項１ないし請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１個以上のアプタマーはポリヌクレオチドでありそして３０個ないし６０個の塩基を有することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１個以上のアプタマーは４０個の塩基を有することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１個以上のアプタマーはポリペプチドでありそして３０個ないし６０個のアミノ酸を有することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物試料は体液であることを特徴とする、請求項１ないし請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記体液は血液であるか又は血液に由来することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
体液は血清又は血漿であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法は：
ｄ）第２の生物試料をｃ）で得た定量化されたアプタマーと組み合わせること；
ｅ）結合分子を非結合分子から分離すること；
ｆ）定量化された前記アプタマーに結合した分子を定量化すること；及び
ｇ）ｃ）で得た量をｆ）で得た量と比較すること、
を更に含み、
前記第２の試料中の１個以上の分子に結合した前記１個以上のアプタマーの定量化は、各アプタマーのすくなくとも一部の配列決定により行うことを特徴とする、請求項１ないし請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法は前記１個以上のアプタマーの量を対照又は基準量と比較することを更に含むことを特徴とする、請求項１ないし請求項２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の試料は病気の状態にあると知られた個人から得られたことを特徴とする、請求２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２試料は健康な状態にあると知られた個人から得られたことを特徴とする、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の試料は薬物療法後の個人から得られたことを特徴とする、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１ないし請求項２８のいずれか１項に記載の方法の、１つ以上のバイオマーカーを同定するための使用。
【請求項３０】
請求項１ないし請求項２８のいずれか１項に記載の方法の、１つ以上のバイオマーカーの妥当性を確認するための使用。
【請求項３１】
請求項１ないし請求項２１のいずれか１項に記載の方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける診断法を補助するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合混合物中のタンパク質の同定及び定量化に関する。特に、本発明は複合混合物中のタンパク質及びタンパク質量のタグ又は代用物（ｐｒｏｘｉｅｓ）としてのアプタマーの使用に関する。もう１つの態様において、本発明はプロテオミクスにおける次世代ポリヌクレオチド配列決定方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオームは通常、例えば細胞、組織、体液、臓器又は微生物等の生体系に見出されるタンパク質の総体（ｅｎｔｉｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として記載される。天然のタンパク質の研究は一般的に「プロテオミクス」と呼ばれ、特定の時及び／又は興味深い内的又は外的条件の下で発現されたプロテオームの研究を包含する。プロテオミクスアプローチはしばしばプロテオームの広域的分析を目的とし、多数の、例えば数百又は数千のタンパク質が単一の又は多数の試料から日常的に分解、同定及び定量化され得ることを必要とする。
【０００３】
プロテオミクスから期待される事の中には、新しいバイオマーカー、即ち例えば病気又は治療的介入により変化した生理学的状態を示す生物学的指標としてのタンパク質、を認識する能力がある。バイオマーカーの発見は通常、特徴的な生理学的状態において発現された複数プロテオームを比較すること、及び発生又は発現のレベルが生理学的状態間で常に異なる複数タンパク質を同定することを含む（シュラッテンホルツ  Ａ（Ｓｃｈｒａｔｔｅｎｈｏｌｚ  Ａ）、グローベ  Ｋ（Ｇｒｏｅｂｅ  Ｋ）、電気泳動法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（２００７）６月  ２８（１２）１９７０−９）。
【０００４】
血液中のタンパク質は、病気の状態及び薬物療法のマーカーの同定のための具体的な標的である。血液中のタンパク質の量及び／又は立体配座は、統計的に、本質的な自然のままの可変性に勝る方法でそのような状態と関係しているに違いないと広く推測されている。血液及び他の体液は、それらが病気に冒された組織を浸し、重要なタンパク質を運び、そして医療受診の間に比較的に安価でかつ簡易な方法を用いてテスト用に入手できるため、具体的な標的である。
【０００５】
しかしながら、血液中のタンパク質は濃度の範囲が非常に広く、少数のタンパク質が全タンパク質の９９．９％以上を占めており、残りはミリリットル当たりピコグラムからミリグラムでの分布を占める（キアン  Ｗ．Ｊ．（Ｑｉａｎ  Ｗ．Ｊ．）他、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（１０）１７２７−１７４４））。既存のプロテオミクス技術が限られているため、この存在量範囲は仮説のままである。タンパク質の相対的存在量への阻害を最低限にすることをも目的に、プロテオミクスの科学者はこの範囲に到着するために様々な方法を用いてきた。これは、しばしば、選択的精製による高存在量のタンパク質の排除を必要とする。試料中の全ペプチドのサブセットに選択的に焦点を合わせる事により入手したペプチドの複雑さを減少させる試みもなされてきた。これらの方法は長期にわたり、そして試料、複製物、機械及び研究室間での再現性はバイオマーカータンパク質の統計的発見の必要条件を満たすような状態で実証されてはいない。
【０００６】
バイオマーカーの発見に一般に使用される従来の質量分析（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＳ）に基づくプロテオミクスは、生物試料を分離して調査中の混合物から単一のタンパク質を単離することにより進行する。より最近では、これは２元次ゲルから多元次カラムに基づく高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）へと進歩した。タンパク質は、より短いサブユニット又はぺプチドに分解され得る。単離されたペプチドは次に質量分析計に供給され、該質量分析計はペプチドをイオン化し、さらに分解して、質量／電荷の測定値のラダーを生じる。これらの測定値及びそれらの存在量は通常、何らかの対照に対して様々な方式の下に定量化され得る。その結果得られるスペクトルのラダーは次に既知のペプチド配列に対して又はやみくもに生データから解釈され、そして得られた質量及び配列情報は、それぞれのペプチドが由来するところのタンパク質を同定するための配列データベースを探すために使用される。
【０００７】
しかしながら、複雑な生体試料のタンパク質分解は通常、既知のクロマトグラフシステム及びＭＳシステムの解像能力に勝り得る数十万のペプチドを生成して、構成要素ペプチドの不完全な解像及び同定障害を引起こす。通常、ＭＳに基づくプロテオミクスにおいては、試料から生成されたスペクトルの８０％もが識別力のあるペプチドへと、又はそれ故タンパク質へと、正確に又は一貫して再解釈され得ない。又、ＭＳプロセスでのそれらの破砕挙動と存在量は状況依存する可能性があり、再現性を一層複雑にする（リュウ  Ｈ（Ｌｉｕ  Ｈ）、サジゴヴ  ＲＧ（Ｓａｄｙｇｏｖ  ＲＧ）、エーツ  ＪＲ  三世（Ｙａｔｅｓ  ＪＲ  ３ｒｄ）、分析化学（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ）（２００４）７月１５日７６（１４）４１９３−２０１））。
【０００８】
生体試料のプロテオーム分析を可能にする一つの方法は、そのような試料の分離により生じたペプチド混合物をクロマトグラフ分離及び／又は質量分析（ＭＳ）などの下流での分解及び同定工程に付す前に、該ペプチド混合物の複雑性を減少させる事である。理想的には、タンパク質ペプチド混合物の複雑性を減少させる事は、試料の個々のタンパク質当たりに存在する特徴的なペプチドの平均数を減らすにもかかわらず、ペプチド混合物中に実際に示された試料のタンパク質画分を最大化する。
【０００９】
血液（血清又は血漿）の使用は、ＭＳに基づく確認を複雑にする様々な方法におけるタンパク質の生物学的処理によって更に不明確になる（キアン  Ｗ．Ｊ．（Ｑｉａｎ  Ｗ．Ｊ．）他、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（１０）１７２７−１７４４））。最近の研究は、臨床試料からのタンパク質を同定しそして数えるための著しく矛盾した試みを示してしてきた。従来のＭＳに基づくプロテオミクスでのタンパク質を単離、破砕そして測定する行為そのものがそれらの相対的存在量及び化学的構成を変える。
【００１０】
プロテオミクスに基づく分析のもたらすものは研究中の試料において有意な相関関係をもつタンパク質の「ヒットリスト」である。通常、このリストは変動しうる統計的有意性のある複数タンパク質の選択肢である。このリストの生物学的に方向付けられた研究が通常なされ、各メンバーの潜在的生物学的有意性に関して合理的な選択がなされる。仮説に基づくバイオマーカーのリスト、又は想定した統計的有意性のあるタンパク質、に到達するプロセスは一般に「発見（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」と呼ばれる。
【００１１】
従って、少数の選択された「ヒット」を立証しそして妥当性の確認をことに努力を集中させる。これは、発見されそして選ばれたタンパク質が本物であり偽陽性ではないこと、及びそれらが当該の病気又は薬物の状態に特異的であるということを示す目的で、臨床試料のより広い集団における測定されたタンパク質存在量の確認を含む。より一般化された集団におけるプロテオミクス測定値及び想定したバイオマーカーの定量的有意性を確認するこのプロセスは、通常「妥当性確認（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」といわれる（ゾルグ（Ｚｏｌｇ）、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（１０）１７２０−１７２６））。しばしばこれは発見段階に対する代替え技術の使用を必要とする。
【００１２】
通常、これは精製した想定したタンパク質に対して作られた抗体を使用して成し遂げられる。これらの抗体は次に数百の試料に対するＥＬＩＳＡに基づくアッセイに使用でき、適当な統計が再適応できそしてタンパク質のバイオマーカーとしての妥当性が確立できる。このプロセスの最終的な意図は、抗体が臨床アッセイの一部になることでもある。しかしながら、抗体は生成するのに時間が掛かりかつ高価であり、そして所定のタンパク質に特異的な抗体を作成することは必ずしも可能ではない。更なる厄介な問題は、表面に付着した砂糖分子の外殻及び他の変性物を持つ可能性の有るタンパク質の代替え変異体またはイソフォームの存在である。イソフォームは発見段階のＭＳに基づく同定では明らかではないかもしれず、従って、測定値の統計的有意性および特定の抗体の作成を困難にする（ゾルグ（Ｚｏｌｇ）、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（１０）１７２０−１７２６）；リファイ（Ｒｉｆａｉ）他、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（２００６）２４（８）９７１−８３））。
【００１３】
発見および妥当性確認の両方とも失敗率が高く、そして時間がかかりかつ費用のかかることである。成功及び失敗は通常、妥当性確認段階の後、多くの時間と財政支出の後に始めて判断できる。従って、最近の努力は、発見（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）と妥当性確認（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を加速すること及び臨床生成物をもたらすことの両方のための努力の中で、発見のためのＭＳに基づくアプローチの改良及び抗体の大量の生成に焦点を当てている（アンダーソン及びハンター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ）、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（４）５７３−５８８）；ザンガー（Ｚａｎｇｅｒ）他、プロテオミクスの専門的再検討（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）（２００６）３（１）３７−４４））。
【００１４】
従って、体液から取り出されたタンパク質、特にタンパク質の複合混合物を調べる新しい方法に対する明らかな必要性がある。特に、現在の技術を妨げる技術的な欠点及び科学的及びコスト的な制約条件を克服する、タンパク質の存在量、特に複合混合物中の多数のタンパク質の存在量を同定しそして測定する技術が必要である。具体的には、標的タンパク質を同定しそして妥当性の確認するための高価でかつ時に信頼できない抗体の生成及び使用に代わる手段が必要とされる。そのような手段は、生物試料中の全ての範囲の天然タンパク質を調べるために、十分に多様な抗体の代替物がすばやくかつ安価に生成できる事を条件に、ＭＳのような既存の発見（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に基づく技術に取って変えるために使用することも出来る。
【００１５】
前記の手段に明確に必要とされるものは、試料中において天然形状でのタンパク質の真の呈示があらゆる自然な一時的変異や変異と共に得られるように、混合物の最低限の操作である。かかる手段はまた、高度にそして正確に再現可能でなければならない。
【００１６】
アプタマーは、明確な３次元形状を形成して概念的には抗体に類似する方法で標的分子に結合する、短いポリマー、通常は核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ）である。アプタマーは、高い特異性と親和性、化学的安定性、低い免疫原性、及びタンパク質−タンパク質相互作用を標的にする能力などの、小さい分子及び抗体の最良の特徴を組み合わせる。高い特異性に加えて、アプタマーは標的に対する非常に高い親和性を有する。通常、タンパク質に対して生成されたアプタマーはピコモルないし低ナノモル範囲で親和性を持つ。モノクローナル抗体とは対照的に、アプタマーは生物学的に発現されるのではなく、化学的に合成され、著しいコスト的な利点を提供する。
【００１７】
アプタマーは抗体に対して有用かつ効果的な代替手段を提供する一方、アプタマーを介して如何にタンパク質を定量化するかにまだ問題を残す。タンパク質の複合混合物と生物試料に存在する大きなダイナミックレンジのタンパク質は特定の問題を呈する。通常、アプタマーは放射性標識を使用して定量化される。放射性標識の定量化は許容でき、そして長年許容されているが、定量化を改良かつ促進し、並びに正確さと再現性を改良する必要性が残されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】シュラッテンホルツ  Ａ（Ｓｃｈｒａｔｔｅｎｈｏｌｚ  Ａ）、グローベ  Ｋ（Ｇｒｏｅｂｅ  Ｋ）、電気泳動法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（２００７）６月  ２８（１２）１９７０−９
【非特許文献２】キアン  Ｗ．Ｊ．（Ｑｉａｎ  Ｗ．Ｊ．）他、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（１０）１７２７−１７４４）
【非特許文献３】リュウ  Ｈ（Ｌｉｕ  Ｈ）、サジゴヴ  ＲＧ（Ｓａｄｙｇｏｖ  ＲＧ）、エーツ  ＪＲ  三世（Ｙａｔｅｓ  ＪＲ  ３ｒｄ）、分析化学（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ）（２００４）７月１５日７６（１４）４１９３−２０１）
【非特許文献４】ゾルグ（Ｚｏｌｇ）、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（１０）１７２０−１７２６）
【非特許文献５】リファイ（Ｒｉｆａｉ）他、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（２００６）２４（８）９７１−８３）
【非特許文献６】アンダーソン及びハンター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ）、分子及び細胞プロテオミクス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．）（２００６）５（４）５７３−５８８）
【非特許文献７】ザンガー（Ｚａｎｇｅｒ）他、プロテオミクスの専門的再検討（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）（２００６）３（１）３７−４４））
【発明の概要】
【００１９】
従って、最も広い意味で、本発明は、生物試料中の少なくとも１個の分子の量を測定する方法であって、
ａ）前記試料又はその誘導体を１個以上のアプタマーと組み合わせ、そして前記試料中の１個以上の分子を前記アプタマーと結合させること；
ｂ）結合分子を非結合分子から分離すること；及び
ｃ）当該アプタマー又は各アプタマーに結合した分子を定量化すること、
を含み、
前記結合分子の定量化は当該アプタマー又は各アプタマーの少なくとも一部の配列決定により行われることを特徴とする方法、に関する。
【００２０】
別の言い方をすれば、本発明は、タンパク質分子を定量化するためのタグとしてのアプタマーの使用にあり、ここで、前記アプタマーの配列が前記タグである。アプタマーは、例えばバーコードのような、読むことのできる固有の配列を有することが認識されている。本発明によれば、バーコード（アプタマー）が結合する各タンパク質のためのタグであるのは、この固有のバーコードである。このバーコードを読むこと（アプタマーの配列決定）により、追加タグ及び／又はラベルの必要性はなくなる。
【００２１】
既存の方法と対照的に、アプタマー配列をタグとして使うと、単一の分子的実体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｙ）を使用したタンパク質の同定と定量化を可能にする。実際、１個のアプタマーの配列決定は各々の特徴的な配列の事例又は発生を計数することを可能にし、従って、各アプタマーが結合したタンパク質の直接的な定量化を可能にする。即ち、各アプタマーは、１個のアプタマーが結合する場合の試料やタンパク質混合物内のタンパク質及び個々のタンパク質を直接表示するものである。本発明の方法により、元のタンパク質又は試料の操作が最低限にされ、それによりタンパク質又はタンパク質の混合物の調査ができるだけ自然に近い状態で可能となることが認識されるだろう。このようにして、タンパク質又はタンパク質の集団の実態が得られる。
【００２２】
好ましい実施態様においては、アプタマーの配列決定は、配列決定の前に個々の分子の各々を分離する配列決定装置上、例えば次世代ＤＮＡシーケンサー上の各々の種の発生数を数える事により、増幅なしに、従ってアプタマーの絶対的又はデジタル計数なしに、達成される。各配列の直接の計数が得られ、該計数はと言えば、アプタマーが結合したタンパク質の絶対計数と同等とみなされる。配列のサブセットが計数器上に表示され得、該サブセットは研究中の分子の集団における所定の配列の発生の代表的な実例であるはずである。これも又、結合タグの増幅又はアプタマー分子の増幅を必要としてその相対的存在量のアナログ評価を生ずる現在のアプタマーの定量化方法とは対照的である（米国特許出願公開番号２００７−０１６６７４１に記載される通り）。これは、結合タンパク質を持つアプタマーを同定させるラベル及び更なるタグの使用の限界による。結果として、定量化は実際の存在量、即ちアナログ信号、に比例し、そして絶対的及び個々の発生数は決定できない。
【００２３】
アプタマー配列をタグとして使う更なる利点は、配列が巨大な範囲の有力なタグをもたらすことである。たとえば４個の塩基の配列は２５６個の異なる組合わせを提供し、従って２５６個の有力な固有の識別子又はタグを提供する。従って、全アプタマー配列が入手し得る一方で、配列決定されたヌクレオチドの数は特定のアプタマーを同定するのに十分なだけしか必要としない。即ち、アプタマー配列全体がタグであるか、あるいはタグがアプタマー配列の一部である。
【００２４】
本発明の方法は１つのアプタマー配列を用いて試料中の単一のタンパク質を定量化するのに使用し得るが、本発明の更なる利点は固有の配列によってもたらされる有力なタグの範囲が多数のタンパク質の定量化を可能にし、同時に、同一試料中での定量化を可能にすることである。従って、既知のアプタマー配列のパネル又はライブラリーが複合混合物中の多数のタンパク質を定量化するのに使用し得、そしてこのようにして、本発明は複合生物試料の調査を可能にする。更に、アプタマーのパネル又はライブラリーは特定のタンパク質、特に試料中に少量存在すると知られたタンパク質、を標的とし得る。既知の方法を使用して試料中の低存在量のタンパク質を同定し定量化する事は殆どできないので、本発明はこれらの少量でかつ今まで見つけ難かった集団を調査するための解決法を提供する。理想的には該ライブラリー又はパネルは試料調査用の過剰量のアプタマー種を含まねばならない。
【００２５】
本発明は、単一のタンパク質（例えば、ゲルで切り取ったタンパク質）を分析し得、そして複合タンパク質混合物等のタンパク質の混合物の分析に特に適している。「タンパク質の混合物」または「タンパク質混合物」という用語は一般的に２つ以上の異なったタンパク質の混合物、例えば２つ以上の異なるタンパク質を含む組成物、を指す。
【００２６】
好ましい実施態様においては、分析されるタンパク質の混合物はおよそ１０個以上、好ましくはおよそ５０個以上、更に好ましくはおよそ１００個以上、更にもっと好ましくはおよそ５００個以上の異なるタンパク質、例えばおよそ１０００個以上又はおよそ５０００個以上の異なるタンパク質を含み得る。典型的な複合タンパク質混合物は、非限定的に、生物試料又はその一部に存在するタンパク質の全て又は画分を含み得る。
【００２７】
ここで使用された「生物試料」又は「試料」という用語は、一般的に、生物学的な供給源から得られた、精製されていない又は精製された形態にある物質を指す。限定ではなく例として、試料は以下のものから入手し得る：ウイルス、例えば原核生物又は真核生物宿主のウィルス；原核細胞、例えばバクテリア又は古細菌胞、例えば自由生活性又は浮遊性原核生物、又は原核生物を含むコロニー又は生物膜；生体内から又はその場で得られた又は生体外で培養された真核細胞等の、真核細胞又はその細胞小器官；真核生物組織又は微生物、例えば真核生物組織又は微生物からの細胞含有試料又は細胞非含有試料；真核生物は原生生物、例えば原虫または藻類、菌類、例えば、イースト又はカビ、植物及び動物、例えば、哺乳動物、ヒト又はヒト以外の哺乳動物を含みうる。「生物試料」は、従って、例えば細胞、組織、微生物、又はそれらの抽出物を包含し得る。生物試料は、好ましくは、生物学的な供給源、例えば哺乳動物、ヒトはヒト以外の哺乳動物などの動物から、好適な方法、例えば非限定的に、尿、唾、痰、精液、乳、粘液、汗、糞便等の収集又は取り出しにより、例えば血液、脳脊髄液、間質液、光学的流体（硝子体液）又は滑液の取り出しにより、又は組織の生検、切除等により、除去し得る。生物試料は更に再分割して、本発明における分析用のタンパク質を入手するために使用される部分を単離するか該部分について濃縮しうる。限定ではなく例として、様々な種類の組織が互いから分離され得；特定の種類の細胞又は細胞表現型が試料から、例えば、ＦＡＣＳ分類、抗体パニング、レーザーキャプチャーダイセクションなどを使用して単離され得；細胞を間質液から分離し得、例えば血液細胞を血液血漿又は血清から分離し得る；などがなし得る。試料は本発明の方法に直接的に適用し得るか、又は使用される前に様々な程度に加工、抽出又は精製され得る。
【００２８】
試料は健康な被験者又は疾患、病気、又は感染症に罹っている被験者から取り出しうる。例えば、限定なしに，被験者は健康な動物、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であるか、あるいは癌、炎症性疾患、自己免疫性疾患、代謝性疾患、ＣＮＳ疾患、眼の疾患、心臓疾患、肺疾患、肝疾患、胃腸疾患、神経変性疾患、遺伝的疾患、伝染性疾患又はウイルス感染、又は他の病気を持つ動物、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であり得る。
【００２９】
好ましくは、生物試料から取り出されたタンパク質混合物は、プロテオーム分析の感度及び性能を増加させるために、処理して、そこから高存在量のタンパク質を枯渇させ得る。一例として、ヒトの血清又は血漿試料などの哺乳動物の試料は多量のタンパク質、とりわけ、アルブミン、ＩｇＧ，抗トリプシン、ＩｇＡ，トランスフェリン、ハプトグロビン及びフィブリノゲン含み得、それらは好ましくは試料からそのように枯渇され得る。多量のタンパク質を除去するための方法及びシステムは、例えば免疫親和性枯渇（ｉｍｍｕｎｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）のように既知であり、そしてしばしば市販されており、例えば、アジラントテクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（カリフォルニア州、サンタクララ）からマルチ親和性除去システム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ＭＡＲＳ−７、ＭＡＲＳ−１４）が市販されている。
【００３０】
本発明はタンパク質の定量化に対し具体的な用途を有するが、本発明は代謝体などの他の分子の定量化や代謝体や潜在的小分子の同定や生物学的治療法のための用途を有することが認識されるべきである。
【００３１】
１つの実施態様において、本発明はアプタマータグを同定しそして定量化するために次世代ポリヌクリオチド配列決定技術（ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を使用する。このように、本発明は、現在利用できる方法に比べて、より感度良くかつ効率的な定量化方法を提供し、そしてプロテオミクスの分野でこのゲノム手法で提供された大きなダイナミックレンジ、特異性及び感度を利用する。
【００３２】
次世代ポリヌクレオチド配列決定技術は、ビーズ又はチップのような表面へのＤＮＡ又はＲＮＡの個々の分子又は他のポリヌクレオチド配列の分離を必要とし、それにより、配列の単一分子アレイを作る。該アレイは、例えば光学顕微鏡法による、各分子の個々の解像を可能にする表面濃度を有する。アレイ上のポリヌクレオチド分子の配列決定は、配列の「デジタル」、つまり絶対的、計数を可能にし、従って、アレイ上に存在する配列の直接的な定量化を可能にする。ある技術では、各配列からの信号を強くし及び／又は解明するために、配列は一旦配置されるとクローン的に増幅され得る。それにも係わらず、定量化は、各単位複製配列から作り出された信号をでなくアレイ上の配列の発生を計数することにより得られる。好適な配列決定技術及び定量化技術の例は国際公開番号第００／００６７７０及びブラントン（Ｂｒａｎｔｏｎ）他（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８）２６  １１４６−１１５３）などの出版物中に見出せる。
【００３３】
従って、好ましい実施態様においては、結合アプタマー配列の定量化は結合配列の単一分子アレイを使用して行われる。あるいは、アプタマー配列はクローンアレイ上で定量化し得、その場合各配列は表面上に配置された後に増幅される。
【００３４】
標的タンパク質に対するアプタマーの高い特異性のため、アプタマーは混合物内でのタンパク質に対する代用物（ｐｒｏｘｙ）として使用することが出来る。タンパク質との結合及びそれに続く溶出後、平行配列決定装置上でその配列の頻度を集計することによるアプタマーの定量化が、試料内の特定のタンパク質の定量化を可能にする。これは、推測結果又は代用物により、タンパク質の代用物としての抗体の使用にある意味では似ているだろう。実際、アプタマー配列又はタグの分布は、タンパク質がそこから得られた生物集団又は試料中の対応するタンパク質の分布の典型となるだろう。
【００３５】
更に、アレイ上のクローン分子の計数は各アプタマータグの量又は割合についての絶対数を提供する。これは「デジタル計数」と呼ばれ、付着した染料の蛍光発光などのパラメーターの間接的アナログ測定に頼る既存のＤＮＡ／ＲＮＡ定量化方法とは異なる。このように、適当な条件下でのアプタマーの暴露を除いて、タンパク質又はタンパク質混合物の操作を必要としない。更に、デジタル計数は、アナログ定量化の多くの曖昧さと信号ノイズ問題を避けるので、優れると考えられている（スミス  ＧＫ（Ｓｍｙｔｈ  ＧＫ）、生物情報学（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）（２００７）９月１９日）。
【００３６】
具体的な実施態様において及び第一図に示されているように、アプタマーのライブラリーが、生物材料、例えば血清から取り出された折りたたんだタンパク質の生体外セットに対して選別及び選択される。アプタマータグのライブラリーは、ＳＥＬＥＸ及び同時係属中の欧州特許出願公開番号０７０２０６２９．７に記載の方法を含めて、どんな方法でも生成させ得ることが認識されるだろう。
【００３７】
タンパク質と結合しないアプタマーは除去されるか溶出される。これを成し遂げるためには、種々の既知の選択肢がある。例えば、単一のタンパク質又は複合タンパク質試料は固体支持体上に固定され得る。非結合アプタマー及び結合の弱いアプタマーを除去するために厳密な洗浄をしても良い。他の選択肢はタンパク質標的上のアプタマーの可逆性架橋の使用である（フォトアプタマー）。所定の結合特性を有する「スマート」アプタマーを選択するために、平衡混合物（ＥＣＥＥＭ）又は非平衡性変異体（ＮＥＣＥＥＭ）の平衡キャピラリー電気泳動法に基づく非ＳＥＬＥＸアプローチも迅速に用い得る（ドラボヴィチ（Ｄｒａｂｏｖｉｃｈ）他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）７８、３１７１−３１７８））。
【００３８】
残存する結合アプタマーはタンパク質宿主から除去され、そして次世代のシーケンサーに通され、そこで配列決定され及び計数される。
【００３９】
次世代配列決定の具体的な例として、結合アプタマーはビーズ又はチップなどの表面上に無作為に配置される。該アプタマーは所望により増幅されて、該表面上又は個々のビーズ上で別々のｘ及びｙ配位でクローンの一本鎖分子のグループを周期的に生じる。配列がアレイに結合された後、各配列にプライマーが加えられる。そして次にＤＮＡシーケンサーがサイクル毎の各相補配列上の１つの塩基の測定を可能にする試薬からなる段階的化学作用を行う。このように、各結合アプタマー配列を反映する相補配列が構築される。照明及び画像化システムがこのプロセスを写真に撮ることを可能にしそして、この手順を数回繰り返す事により、元のアプタマーの配列を得ることができる。通常、そのような技術はＤＮＡの４０−１００百万個以上のフラグメントを長さで５０個の塩基まで配列決定でき、そしてこれらの数字は急激に増している。このプロセスは、現在試料の調製から配列決定のアウトプットまで１日から３日以下しか必要とせず、これらの時間スケールは短くなっている。
【００４０】
「次世代ポリヌクレオチド配列決定」の範疇に入る他の方法を使用し得ること及び本発明は提供された具体的な例には限定されないことが認識されるであろう。「次世代ポリヌクレオチド配列決定」は２００４年以来登場した記載されたＤＮＡ／ＲＮＡの配列決定プラットフォームに対して一般的に作り出された用語である。それらに共通する特徴は、「サンガー」配列決定法に基づいた古い技術とは異なる配列決定化学作用を用いることである。新しいプラットフォームは新しい化学作用を用いそして一般的に非常に高い処理能力を持ちそして遥かにコストが低い。これは配列決定反応を平行処理する能力により成し遂げられた。新しいプラットフォームは、塩基を切り取ることにより機能する（分解する）サンガー法と異なり、通常、合成又はストランドの延長により進行する（構築）。その上、新しいプラットフォームは、塩基測定比率に対して非常に大きいＤＮＡシーケンサー分子を持つサンガー法と異なり、ごく少数のクローン分子に対して働く。
【００４１】
ＤＮＡ配列決定が参照される一方、ＤＮＡ配列決定技術はＲＮＡ又はＰＮＡ（ペプチド核酸）配列にも使用しうることも認識されるだろう。従って、次世代シーケンサー又は配列決定への言及はＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡ、並びに本発明の方法での使用に適する核酸に基づくポリマーの全ての他の化学変異体及びその類似体を包含する。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様はアプタマー配列の２次元アレイを使用する一方で、本発明は溶液状態でかつ３次元での次世代配列決定を包含する。後者のためには、タグを連結してアレイのダイナミックッレンジを増加しうる。
【００４３】
本発明の重要な利点は、様々なタンパク質に向けられた多数のアプタマーを１つのアッセイ又は実験において複合タンパク質混合物を調べるために使用し得、それによって、１つの試料中の多数のタンパク質の定量化を同時に可能とする。そのような多重化は次世代配列決定などの高い処理能力アッセイに明らかに適している。病気の状態では多数のバイオマーカーが個々にでなく一斉に行動するので、多数のタンパク質が、同時に使われた場合、特定のそして感度の良いバイオマーカーとして行動する力は単一のタンパク質の使用に遥かに勝ると考えられている。
【００４４】
理想的には、ライブラリーアプタマー配列は単一のタンパク質に特異的なアプタマー配列のプールを含む。あるいは、該プールは１個より多いタンパク質に特異的なアプタマー配列を含む。例えば、ライブラリーはタンパク質Ａに特異的であると知られたアプタマー配列ａ１、ａ２及びａ３を含み得る。あるいは、該ライブラリーはアプタマー配列ａ１、ａ２及びａ３、並びにタンパク質Ｂに特異的なｂ１及びｂ２、ｃ１などを含み得る。アプタマー配列ａ１、ａ２及びａ３はタンパク質Ａに特異的であり得る一方、本発明は例えばアプタマー配列ａ２がタンパク質Ｂにも特異的である場合のシナリオを包含する。即ち、アプタマーのライブラリーはあるタンパク質に個々に特異的な配列、並びに１個より多くのタンパク質に結合する配列を含む。後者のシナリオは混合物内のタンパク質の関連するファミリ及びグループを探す場合に有用である。
【００４５】
当該アプタマー又は各アプタマーが結合するタンパク質又は分子の正体が知れている事が望ましいが、そのような特徴は必須ではない。例えば、アプタマーが結合するタンパク質の種類は既知かもしれないが、該種類の具体的なメンバーは病気の状態では変化しうる。タンパク質の正体は一旦定量化が完了した後に解明しうる。例えば、１個以上の特定のアプタマーが、タンパク質混合物に対してアッセイされうる。該アプタマーは興味深いタンパク質に特異的に結合し、該タンパク質は次に混合物から単離されそして精製され得る。本発明の重要な利点は、タンパク質バイオマーカーの実際の同定は調査プロセスの終わりまで確認する必要がないことである。従って、調査の間タンパク質試料の操作は必要とされない。
【００４６】
ポリペプチド配列決定は既知のいずれの方法でも行いうる事が認識されるであろう。例えば、興味深いアプタマーがカラムに固定され得、タンパク質混合物がカラムを通って流され得、そしてカラム上のアプタマーに結合されたタンパク質が従来のＭＳに基づくプロテオミクスを用いて分析され得る。
【００４７】
もう一つの実施態様では、アプタマーは固有の配列タグを持つ。このように、アプタマーが興味深い１個以上のタンパク質に結合しているとして一旦同定されると、タグはアプタマーから取り除かれ、そしてタグは次に配列決定されそして計数される。このように、タグはアプタマーの住所として使われ、そして定量化を提供する別の方法を提供する。
【００４８】
この方法は様々な解決法と答えを提供するために使用しうることが認識されるであろう。特に、この方法は、健康な状態に比べて、病気の状態では特定のタンパク質又は分子が上方制御されているのか又は下方制御されているのかを確かめるために、生物試料を調べるために使用しうる。多数のアプタマーが同時に使用されうるので、本発明は多数の潜在的な及び／又は既知のバイオマーカーの調査を同時に可能にする。放射性標識及び抗体のような間接的タグ及びマーカーでなく、アプタマー配列をタグとして使用することが、上方又は下方制御されている分子の同定、並びに翻訳後の改質、立体配座の変化、変異体の出現等における変更の同定を可能とする。このように、同定できる有力なバイオマーカーの背景は、現在利用できる技術を使って可能なものより遥かに広い。
【００４９】
実際、プロテオームの具体的な領域がアプタマーの集中したセットを用いて選択的に調べうる。更に、アプタマー配列はそのように大きな範囲の有力なタグを提供するので、プロテオームの多くの別々の領域を同時に調べうる。
【００５０】
更なる実施態様では、アプタマーパネル又はアプタマープールは複合性試料で挑みうる。結合画分は次に溶出され、そして第２の、異なる試料に対して再調査されうる。遊離の非結合アプタマーが次にタンパク質存在量における差を反映し得る。このように、タンパク質存在量における変化、並びに例えば病気の状態又は治療後の状態の結果として試料に現れるいずれかのタンパク質の出現を測定できる。これ等の実施態様において、複合タンパク質混合物は通常、血、血漿又は血清などの体液から取り出される。
【００５１】
本発明がバイオマーカーの妥当性の確認のために使用しうることが認識されるだろう。具体的には、特徴のあるアプタマーのパネル又は収集物が１人以上の健康な個人からのタンパク質試料に対して選別され得、そして興味深い病気を持つ１人以上の個人から取ったタンパク質試料と比較され得る。
【００５２】
多くのタンパク質が同時に定量化され得るので、本発明は高処理能力の分析に適し、それにより、バイオマーカーの妥当性の確認に通常必要とされるコストと時間を減らす。
【００５３】
タンパク質バイオマーカーの妥当性の確認に関する本発明の利点は、アプタマーを抗体の代りに使用できることである。特定の抗体の生成は高価で、そして常に成功するとは限らない。一方、所定のプロセスに対して選択的なアプタマーを生成する事は一般的に可能であり、そして該プロセスは遥かに早くて安価である。使用の際には、興味深い具体的なタンパク質に特異的な１個以上のアプタマーを複合タンパク質混合物に対してアアッセイする。病気の状態の試料中の結合に比べて、健康な試料中のアプタマー結合の不在（又はその反対）はアプタマーを計数することにより解明できる。ここでも又、タンパク質試料の操作は必要なく、そしてタンパク質それ自体の同定は必要とされない。その上、多数のアプタマーが１つの実験で多数の興味深いタンパク質に対してアッセイされうる。
【００５４】
タンパク質全体を調べることを可能にする事により、本発明の方法は個人におけるタンパク質の立体配座像と豊富性を構築するためにも使える。即ち、患者のタンパク質構成のプロフィル又地図を提供することである。例えば、前立腺特異性抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）（ＰＳＡ）の像を前立腺癌の予後診断及び診断を確立するために使用し得、並びに、病気の経過の兆候を提供する。
【００５５】
他の例では、患者が特定のタンパク質変異体を有することが見出された場合、患者のタンパク質プロフィルに関する情報を病気の予後診断又は罹患性の為に使用すことができ、患者のための個人に合わせた治療計画の開発を補助するために使用する事ができる。例えば、ＣＣＲ５遺伝子中に特定の突然変異を有する人は変異体ＣＣＲ５レセプターを生産する。これらの変異体レセプターはＨＩＶと結合せず、そしてそれ故この変異体を有する人はＨＩＶ＋になりそして結果的にＡＩＤＳに進行する機会がすくない。
【００５６】
本発明は、同じ試料の複製間の差異、並びに様々な個人から得た試料間の差異を確認する事により、タンパク質のような単一分子に対するアプタマーの特異性を決定するために使用しうる。
【００５７】
本発明の使用は診断法にも属する。具体的には、妥当性の確認されたバイオマーカーを同定すると知られた１個以上のアプタマーを個人から採られた血液又は血清などの体液を調べるために簡単に使用しうる。アプタマーの結合がタンパク質の存在を示すので、アプタマーのパネルは異常状態に於いて変化したと知られた単一又は一組のバイオマーカータンパク質を同定するのに使用しうる。例えば、既知の基準値に対して多量の特定のタンパク質の評価するためにプロファイリングが使用しうる。そのような使用の例は妊娠テスト又はＰＳＡレベルのテストとしての使用であろう。他の例では、敗血症が異常状態であり、そこでは多くの要因が敗血症の種類と感染段階に従い上方又は下方制御されると知られている。
【００５８】
そのような診断器具はアプタマーのパネルを含むキットの形態にあり得、その結合は、個人から取り出された生物試料における具体的異常状態に特異的であると知られたバイオマーカの存在を示す。
【００５９】
もう１つの実施態様では、本発明は病気の進行を解明するために使用しうる。例えば、敗血症におけるバイオマーカーのパターンは感染の経過の間に変化する。
【００６０】
敗血症の経過の指標としてのバイオマーカーの同定は適切な治療計画の作成を非常に助けるであろう。
【００６１】
本発明は患者のプロファイリングをも可能にし、該プロファイリングといえば、治療計画と予防的治療の管理に使用しうる。
【００６２】
従って、本発明は様々な活動結果が実現される単一のプラットフォームを提供する。
【００６３】
また更なる態様では、本発明はアプタマーの配列決定及び計数のためのクローン又は単一分子のアレイの使用を包含する。
【００６４】
本発明者等は、アプタマーが次世代ＤＮＡ配列決定プラットフォーム（Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）との適合性を高めるために理想的に適合させうることに気付いた。従って、アプタマーはそのような技術プラットフォームを使用してアプタマーの配列決定と同定を可能にするために強化できる。それゆえ、他の態様から、本発明はアプタマー配列及びアダプター配列を含む配列決定可能なアプタマーを包含する。アダプター配列はアプタマーの配列決定を可能にするための表面へのアプタマーの付着を可能にさせる配列を含む。
【００６５】
配列決定可能なアプタマーは該アプタマーの配列決定用の配列決定プライマーを更に含む。
【００６６】
その様な構築物は１つ以上の配列決定及び付着アダプターを含みうる。例えば、アプタマー配列は該アプタマー配列の各末端にアニールされた複数対の配列決定及び付着アダプターの間に挟まれうる。
【００６７】
配列決定可能なアプタマーは、該アプタマーの視覚化を可能にするために、ラベルをも含みうる。蛍光ラベル又は放射性標識等の、あらゆる好適なラベルを使用しうることが認識されるだろう。
【００６８】
本発明の配列決定可能なアプタマーは上記に記載の方法、使用及び診断キットに使用しうる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】アプタマー配列のライブラリーが血清プロテオームと混合される本発明の方法を説明する。結合アプタマー／タンパク質画分は第２世代シーケンサー上で配列決定されそして計数される前に溶出される。シーケンサーからのアウトプットは結合画分に存在する各配列の数である。
【図２】バイオマーカー発見のための本発明の方法を説明し、該方法においては様々な患者からのプロテオームが基準値又は対照と比較される。
【図３】本発明の別の実施態様を説明し、該実施態様においてはアプタマーのライブラリーが第１の血清プロテオームの試料と混合される。結合画分の定量化後、血清試料内の興味深いタンパク質に結合しているアプタマー集団は増幅されそして第２の血清プロテオーム試料と混合される。第１及び第２それぞれの定量化アウトプットの比較が次になされる。
【図４】１５０ｎＭ  ＩｇＥ及び１００ｎＭ  ＰｒｏＮｕｃ１ＦＲの等容積の３０’の培養後に得た混合物の様々な成分を示すクロマトグラムである。
【図５】一定な（１００ｎＭ）ＰｒｏＮｕｃ１Ｆの濃度（底から頂上まで）で培養した０／２０／４０／．．．２０００ｎＭのＩｇＥのＣＥ−クロマトグラムを示す。
【図６】変化するタンパク質濃度に対してプロットした結合ＰｒｏＮｕｃ１Ｆの画分を示すグラフである。
【図７】アプタマーの次世代配列決定用の適合試料調製プロトコルの略図である。
【図８】２つの異なる分析方法を使用して引き出したＩｇＥアプタマー配列の絶対計数を示すプロットである。
【図９】不適切な（ＰｈｉＸ）配列の混合物に入れた配列の数に対してプロットした次世代配列決定によりれた配列の混合物に存在するＩｇＥアプタマー配列の画分を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明を、ここに以下の非限定的な実施例により記載する。
【００７１】
（実施例１）
本実施例は、アプタマータグのライブラリーを使用した血清試料中のタンパク質の定量化を示す図１に説明されている。既知のアプタマーの種々のライブラリーを血清から取り出されたタンパク質混合物に対して選別する。タンパク質混合物を固体の支持体上に固定しそして厳密な洗浄を行なって、非結合アプタマーおよび結合の弱いアプタマーを除去する。
【００７２】
次に、残存する結合アプタマーをタンパク質宿主から除去し、そして次世代シーケンサー上で配列決しそして計数する。配置された後、シーケンサー上の背景ノイズに対する信号の明確さを増加させるために、結合アプタマー配列はＰＣＲなどの標準的な方法で増幅され得る。
【００７３】
アプタマーのライブラリーにより示されている通り、シーケンサーからのアウトプットは生物試料中に存在するタンパク質の絶対的定量化であろう。
【００７４】
（実施例２）
バイオマーカーの発見での使用のためそして図２に示される通り、アプタマーライブラリーを様々な個人から取り出された試料に対して選別する。適当数の既知の対照又は健康な試料もまた、基準値又は健康条件を確立するために必要とする。病気の状態を示すと知られた多数の試料もまた選別する。健康対病気の２つの集団の比較により、この２つの集団間の著しい変化を示すアプタマーの同定が可能になる。当該アプタマー又は各アプタマーの配列が一旦解明されると、該アプタマーが結合するタンパク質が次に同定され得る。タンパク質の同定は、次世代配列決定技術によるか又はクロマトグラフィやＭＳなどのプロテオームに基づく方法によってよい。
【００７５】
（実施例３）
本実施例は本発明の別の方法を説明し、そして図３に図示されている。
【００７６】
アプタマーライブラリーを第１生物試料に対して選別する。実施例１または２のように、非結合アプタマーを除去し、そして残存する結合アプタマーを宿主タンパク質から取り除きそして次世代シーケンサー上で配列決定しそして計数する。
【００７７】
次に、第１試料中のタンパク質に結合する配列の集団を第２の生物試料に対して選別する。前記のように、非結合アプタマーを廃棄し、そして残存するアプタマーを配列決定しそして計数する。この２つの試料が健康な被験者から取り出された場合、この２つの試料間のあらゆる変化が正常な集団内の差異に起因しうる。同様に、ある特定の病気を有すると知られた患者から取り出された２つの試料からのアウトプット間のいずれの差異もまた差異に起因しうる。しかしながら、健康と病気の被験者間のあらゆる著しい変異が、興味深い病気の結果としてのタンパク質集団中の変化に起因しうる。そして著しい変化が見出されたアプタマー配列は、アプタマーが結合しているタンパク質を同定するために翻訳され得る。
【００７８】
（実施例４）
本実施例においては、アプタマーライブラリーは１個のタンパク質に特異的アプタマーの少なくとも１つのプールを含む。同様に、パネルは、各プールが異なるタンパク質に特異的である、アプタマーの多数のプールを含み得る。
【００７９】
タンパク質混合物は、単に血液又は血清などの生物試料であり得る。あるいは、タンパク質混合物は、タンパク質画分について生物試料を濃縮して得る事ができる。この実施例では、タンパク質集団への阻害及び該集団の変性を最小化するために注意を払わねばならない。
【００８０】
既知の、選択されたアプタマー配列のライブラリーをタンパク質混合物に対して選別する。１つの例においては、タンパク質混合物をカラムに結合させ、そしてアプタマーのパネルを該カラムを通して流す。結合しないアプタマーは除去する。結合しているアプタマーをタンパク質宿主から除去し、そして次世代シーケンサー上で配列決定しそして計数する。
【００８１】
興味深いタンパク質が本当に病気の状態のためのバイオマーカーである場合、アプタマーは健康な個人から取り出された試料中にでなく病気の試料からの結合画分中に見出される。あるいは、タンパク質のバイオマーカーとしての役割は、健康な被験者と比較した場合、病気の個人におけるタンパク質の上方又は下方制御により明示されうる。
【００８２】
（実施例５）
本実施例においては、アプタマーのライブラリーは１個以上のタンパク質に特異的であると知られた１つ以上の配列を含む。興味深い当該タンパク質又各タンパク質の正体もまた既知である。該ライブラリーは単一のタンパク質に特異的な単一のプールを含みうるか、又はそれはタンパク質のアレイに特異的な多数のプールを含みうる。
【００８３】
アプタマーのライブラリーを、血液などの個人から取り出された生物試料に対して選別する。アプタマーライブラリーは支持体上に保持され得、そして生物試料はアプタマーの上を通過させうる。いずれの非結合のタンパク質も除去し、アプタマー：タンパク質複合体を保持する。保持されたアプタマーをタンパク質宿主から取り除き、そして次世代シーケンサー上で配列決定しそして計数する。
【００８４】
次世代シーケンサー上のアプタマーの存在及び量、又は不在、は特定の病気又は苦境を診断するために使用しうる。
【００８５】
（実施例６）
新規のオリゴヌクレオチドアプタマーを該アプタマーが使用された次世代ＤＮＡ配列決定技術プラットフォームに適合するようにデザインした。
【００８６】
該アプタマーは、３つ、すなわちａ）官能性アプタマー領域；ｂ）アダプター領域；及びｃ）ラベル、の特徴的領域を有する１つのオリゴヌクレオチド配列を有した。
【００８７】
この研究におけるアプタマー領域は、ヒト免疫グロブリン−Ｅに高い親和性を有する十分に研究されたアプタマー（ウィガンド（Ｗｉｅｇａｎｄ）他、免疫学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（１９９６）  １５７  ２２１−２３０）に基づいた。
【００８８】
アダプター領域はイルミナＧＡＩ次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎａｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）の試料調製手順に適合した構築物となり、そして製造業者のプロトコールに従ってデザインした。
【００８９】
ラベルは蛍光性６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、これを含むことは前記構築物の視覚化を可能にするためであった。
【００９０】
構築物は標準的固相ＤＮＡ合成により得られ、そして低誤差率を確保するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製された。
【００９１】
ＦＡＭラベルを有する構築物は以下ＰｒｏＮｕｃ１Ｆと呼ばれ、そして該ラベルを有さないものはＰｒｏＮｕｃ１と呼ばれる。
【００９２】
構築物は、以下を実証するために使用した：
ｉ）そのようなアプタマーより取り出された一本鎖のオリゴヌクレオチド配列は次世代ＤＮＡ配列用途に用いられる試料調製手順に適合する、
ｉｉ）前記配列はイルミナＧＡＩ配列決定技術を用いて配列決定できる、即ち、ＰｒｏＮｕｃ１の正体が引き出される（「読まれる」）；そして
ｉｉｉ）ＰｒｏＮｕｃ１配列全体の計数は、標準イルミナＧＡＩ配列決定実験に従い、試料に入れた調製されたＰｒｏＮｕｃ１配列の数と直接的に相関し、それにより次世代配列決定が本発明によるプロテオミクスに適用し得ることを確認する。
【００９３】
（実施例７）
オリゴヌクレオチド配列が特徴的なタンパク質親和性を示すことを確認するためにキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）を使用した。
【００９４】
（試薬と溶液の調製）
ＤＮＡの材料をＴＧＫ緩衝液（トリス（ヒドロキシアミノ）メタン−グリシン−カリユウム緩衝液）、ｐＨ８．４、に希釈することにより、乾燥アプタマー供給源からＰｒｏＮｕｃＦ１（ママ）の原料１００ｎＭの原液を調製した。希釈に続き、このアプタマー原液を７５℃で１０分間培養し、続いて氷中で冷却及び貯蔵して、マルチマーの不在を確実にした。加熱手順もアプタマーの二次的構造の形成を確実にする。
【００９５】
濃縮された５５００ｎＭのタンパク質の原液からはじめて、ＴＫＧの緩衝液でＩｇＥの希釈系列を調製した（表１）。
【００９６】
【表１】
0005766948.tif 000002
【００９７】
５μＬのＰｒｏＮｕｃＦ１（ママ）原液を５μＬのタンパク質溶液を用いて培養することにより、アプタマー−タンパク質複合混合物の形成を実証するＣＥのための試料を調製した。各タンパク質濃度レベルにつき合計６つの複成物をこのようにして調製した。全ての試料を室温で最低で３０分そして４０分以下の間培養した。
【００９８】
（装置）
分離はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｐ／ＡＣＥ２２００  ＣＥ−ＬＩＦシステム（ベックマン−コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）、アメリカ合衆国カリフォルニア州フラートン）を使用して達成した。分離は、検出器を３０ｃｍ距離で、全長４０．２ｃｍの溶融シリカ毛細管（５０μｍ  ＩＤ、３６０μｍ  ＯＤ）を使用して行った。毛細管は、１Ｍ  ＮａＯＨ、脱イオン化されたＨ２Ｏ及び緩衝液を各々１０分間ずつ該毛細管にポンプで送り込むことにより前処理した。各々の電気泳動分離の間に、毛細管を塩基、水及び緩衝液で再びすすいで毛細管壁からいずれの残存試料をも除去した。試料は１ｐｓｉで４秒間圧力を用いて注入した。ＬＩＦ検出器は、励起のために３ｍＷのアルゴン−イオンレーザー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）の４８８ｎｍラインを用い、そして発光を５２０±１０ｎｍのフィルターで集めた。データを記録し、そしてＰ／ＡＣＥソフト（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。
【００９９】
（タンパク質−アプタマー結合）
タンパク質−アプタマー複合物が各試料の培養後に実際に形成されたことをまず確実にするために、各タンパク質濃度レベルでの試料を（表２）に記載された条件を用いてノーマルモードでカラム上を流した。
【０１００】
【表２】
0005766948.tif 000003
【０１０１】
（結果）
一例として、１５０ｎＭのＩｇＥ及び１００ｎＭのＰｒｏＮｕｃ１Ｆを含有する試料についてのノーマルモード注入のためのクロマトグラムを図４に示す。
【０１０２】
アプタマー−タンパク質複合体形成を定量化目的に適用するためには、結合アプタマー画分はタンパク質希釈系列を反映する必要がある。これを証明するために、一定量のＰｒｏＮｕｃ１Ｆを様々なタンパク質濃度で培養した（上記参照）。
【０１０３】
図５から、タンパク質濃度が増えるにつれて（底のトレース「ゼロ」；上方のトレース５０００ｎＭ）、アプタマー−タンパク質複合体のピーク領域が増加することが明らかである。同時に、遊離のＰｒｏＮｕｃ１Ｆの信号が、遊離のアプタマーが検出されないところまで減少する（上方のトレース）。これは、次世代配列決定手順にたいして特異的であるアダプター配列をＩｇＥに対する既知のアプタマー配列に加えることがＰｒｏＮｕｃ１Ｆのアプタマー機能を損なわず−ＰｒｏＮｕｃ１ＦがＩｇＥにたいする高くかつ選択的な親和性を保つことを示す。
【０１０４】
図６は、「結合ＰｒｏＮｕｃ１Ｆ画分」をタンパク質濃度に対してプロットしたグラフに翻訳された図５の情報を示す。このグラフから、定量的なタンパク質情報を「読み出す」ためにＰｒｏＮｕｃ１Ｆアプタマーを使用できることが理解できる。このグラフ（及び他のグラフ）から、ＩｇＥにたいするＰｒｏＮｕｃ１Ｆの親和性に対する洞察を与える平衡解離定数Ｋｄ、即ち７６ないし９２ｎＭ、を推定できる。
【０１０５】
（実施例８）
前記実施例に説明された結合特性は定量化との関連で適用可能であること、即ち、タンパク質濃度における差が結合アプタマーの画分（アプタマー−タンパク質複合体）と相互関係を有すること、を実証するために実験を行った。これらアプタマー−タンパク質複合体の選択は、クリロフ（Ｋｒｙｌｏｖ）他（米国化学協会ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）（２００２）１２４  １３６７４−１３６７５；分析化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（２００３）７５  １３８２−１３８６）によって開発された平衡混合物の非平衡（ＮＥＣＥＥＭ）のキャピラリー電気泳動を用いて達成した。
【０１０６】
（方法）
加えられた配列決定配列（ＰｒｏＮｕｃ１）を含む官能性ＩｇＥアプタマーの配列決定を可能にするために、適合した試料調製プロトコルを開発した。
【０１０７】
図７は、試料調製プロトコルにおける様々な工程の概要を説明する。配列決定プライマー位置１上でプライマー１をアニールした後、Ｔａｑポリメラーゼを用いた延長により二本鎖分子を形成した。アダプターを二本鎖分子に結合してライゲイトして、完全な分子を生成した。
【０１０８】
この研究に使われたＩｇＥアプタマー配列は、３‘末端に配列決定プライマー位置１を有する一本鎖オリゴヌクリオチドであった。補助ストランドを作るために、有尾のプライマーをプライマー１とアニールし、そしてＴｇｑポリメラーズを用いて延長を行った。
【０１０９】
この反応のレシピは以下の通りである：
0005766948.tif 000004
【０１１０】
反応物は混合しそして９４℃まで２分間加熱し、続いて６０℃までの制御された冷却と７２℃で１０分間の培養を行った。反応性生物を、キアゲン・ミンエリュート（Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）カラムを製造業者の指示に従って使用して清浄にし、そして１０μＬの緩衝液で溶出した。
【０１１１】
各々２０μＬのＰｒｏＡｄ１及びＰｒｏＡｄ２アダプターの１００ｎＭ溶液を一緒に９４℃まで２分間加熱すること及び室温までの制御された冷却をすることにより総容量５０μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、中でアニールした。ＰｒｏＡｄ１及びＰｒｏＡｄ２は、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ＧＡＩキットから誘導された合成オリゴヌクレオチドである。
【０１１２】
使用した混合物は以下のものである：
0005766948.tif 000005
【０１１３】
反応物を混合し、そして２％のアガロースでのゲル電気泳動の前に室温で１５分間培養した。おおよその寸法のバンドをゲルから切り取りそしてＤＮＡを抽出して標準イルミナ濃縮ＰＣＲプロタコルに従って増幅した。
【０１１４】
アジレント生物学分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）２１００を使用してＰＣＲアンプリコンを定量化し、そして２ｘの希釈系列を作るために、表３に定められたイルミナＧＡＩのクラスター数／タイルを生成する意図で、これら増幅されたアプタマーを一定量のＰｈｉＸに加えることにより配列決定反応物を調製した。レーン４はアプタマーが加えられてないＰｈｉＸで、対照レーンとしての役を果たす。
【０１１５】
誤解を避けるために説明するが、ＰｈｉＸは５３８６個のヌクレチオドからなる二本鎖ＤＮＡ  ＰｈｉＸ１７４バクテリオファージの円形のゲノムを指す。この研究では、該ゲノムはイルミナＧＡＩ配列決定プロトコルに従って処理されて様々なレーンにおける配列負荷の正常化に役立つ。
【０１１６】
単一端のフローセルをイルミナＧＡＩ上で製造業者の指示に従い調製しそして配列決定した。
【０１１７】
【表３】
0005766948.tif 000006
【０１１８】
（結果）
配列決定データを製造業者の指示に従って処理した。データ分析のために、異なるレーンで得られた配列の読み出しを評価するため異なる戦略を適用した：ａ）アプタマー配列への完全な一致の探索（正確）、ｂ）３つまでの増幅／配列決定誤差が許容される探索（アグレップ（Ａｇｒｅｐ））。他の処理方法も適用しうることが明らかである。図８は、異なるレーンで引き出された正確な一致／３つまでの誤差のある一致、即ち正確なアプタマー配列計数と誤差許容のアプタマー配列計数（アグレップ）、を探すことにより、異なるレーンで計数されたＩｇＥアプタマーの絶対数をプロットする。Ｘ軸での値はレーン８から１にいたるまでのレーンの読み出しに相当する（対照レーン４は除外されている；表３参照）。
【０１１９】
これに対し、図９はＰｈｉＸ配列混合物に入れたアプタマーの数に対して得た全配列中の正確な一致を探すことにより計数されたＩｇＥアプタマーの画分をプロットする。どちらの場合も、強い線形相関関係が示され、アプタマーを定量化するための次世代配列決定の使用を確認している。
【０１２０】
上記のデータは、標準イルミナＧＡＩ配列決定プロタコルに従った場合、ＰｒｏＮｕｃ１配列全体の計数が試料の中に入れらた調製したＰｒｏＮｕｃ１配列の数と直接的に相関し、それにより次世代配列決定を本発明に従い定量化に使用できることを確認している。
【０１２１】
更に、このデータは、調製されたＰｒｏＮｕｃ１配列は次世代配列決定技術を使用して配列決定できることを示す。即ち、ＰｒｏＮｕｃ１の正体を引き出せる（「読める」）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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