(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボフラビンオペロンのリーダー配列（ｒｉｂリーダー）をコードするポリヌクレオチドであって、
配列番号４２に記載される配列に対応するＤＮＡ配列が、３’末端欠失の導入により改変されており、
改変されたポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号４２に記載されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、配列番号４２に記載されるヌクレオチドの位置１６６〜２６３または１３６〜２６３に相当するポリヌクレオチドから選択される、ｒｉｂリーダーの３’末端の欠失を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）その相補鎖がストリンジェントな条件下で（ａ）で定義されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）で定義されるポリヌクレオチドと少なくとも９８％同一であるポリヌクレオチド、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）で定義されるポリヌクレオチドの相補鎖であるポリヌクレオチド
からなる群から選択され、
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４２に記載されるヌクレオチドの位置３９、４０、４１、８５、およびそれらの組み合わせに相当する位置において１つ以上の突然変異を含んでなり、
リボフラビン生産がそれぞれの非改変ｒｉｂリーダー配列を使用した生産と比較して少なくとも５％増大する、
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号６７、６８、６９、７０および７１に記載のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、リボフラビン産生微生物。
【請求項４】
リボフラビン生産のための請求項１または２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のリボフラビン産生微生物の使用。
【請求項５】
請求項３に記載の微生物を、所定の基質からのリボフラビンの生産を可能にする条件下で水性培地中でインキュベートするステップを含んでなる、リボフラビンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、リボフラビン生合成遺伝子（ｒｉｂオペロン）を含有するオペロンの改変、特に対応するリボフラビン生合成遺伝子（ｒｉｂオペロン）上流のリーダー配列（ｒｉｂリーダー）の改変を通じた、リボフラビン（本明細書ではビタミンＢ２とも称する）の改善された生物工学的生産を提供する。さらに本発明は、前記改変配列を有する遺伝子改変微生物、前記改変配列／微生物を作成する方法、およびリボフラビン生産のためのその使用に関する。
【０００２】
リボフラビンは全ての植物と多数の微生物が合成するが、高等動物では生成されない。炭水化物の酵素的酸化で必要とされるフラビンアデニンジヌクレオチドやフラビンモノヌクレオチドなどの補酵素の前駆物質であることから、リボフラビンは基本的な代謝に必須である。高等動物では、不十分なリボフラビン供給は、脱毛、皮膚炎症、視覚劣化、および成長阻害を引き起こし得る。
【０００３】
リボフラビンの生合成は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびリブロース−５−リン酸から開始する。リボフラビン生合成に関与する遺伝子は、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エレモテシウム・アシュビー（Ｅｒｅｍｏｔｅｃｉｕｍ  ａｓｈｉｂｙｉｉ）、アシュビア・ゴッシピイ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌａｒｅｒｉ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの様々な起源から知られている（例えば欧州特許第４０５３７０号明細書、またはＵｌｌｍａｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第７版，２００７年，Ｖｉｔａｍｉｎｓの章を参照されたい）。
【０００４】
リボフラビン産生（微）生物の一例としての枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中の状況に関しては、リボフラビン生合成に関与する遺伝子として、ｒｉｂＧ（ｒｉｂＤ）、ｒｉｂＢ（ｒｉｂＥ）、ｒｉｂＡ、およびｒｉｂＨが挙げられる。ｒｉｂＡ遺伝子は、リボフラビン生合成の第１段階を触媒するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩと、リブロース−５−リン酸から３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸（ＤＨＢＰ）への変換を触媒する３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）との２つの酵素活性をコードする。デアミナーゼおよび還元酵素は、オペロンの１番目の遺伝子ｒｉｂＧ（ｒｉｂＤ）によってコードされる。リボフラビン生合成中の最後から２番目の段階は、ｒｉｂＨの遺伝子産物であるルマジンシンターゼによって触媒される。経路の最終段階を触媒するリボフラビンシンターゼは、オペロンの２番目の遺伝子ｒｉｂＢ（ｒｉｂＤ）によってコードされる。ｒｉｂオペロンの３’末端に位置するｒｉｂＴの機能は現在のところ明確でないが、その遺伝子産物はリボフラビン合成に必要でない。
【０００５】
ｒｉｂプロモーター（Ｐｒｉｂ）からのリボフラビンオペロンの転写は、リボスイッチによって制御され、オペロンｒｉｂＧの１番目の遺伝子の転写開始と翻訳開始コドンとの間のｒｉｂオペロンの５’領域に位置する、約３００ヌクレオチドの非翻訳制御リーダー領域（以下ｒｉｂリーダーと称される）が関与する。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用した研究から、ｒｉｂリーダー内の少なくとも３つの異なる部分がｒｉｂオペロンの転写調節に関与することが知られている。（ｉ）ｒｈｏ非依存性転写終結または転写減衰構造に特徴的な逆方向反復と、それに続くｐｏｌｙ−Ｔストレッチとを含んでなる、ｒｉｂリーダーの３’末端に位置するｒｈｏ非依存性ターミネーター（Ｋｉｌら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３３，４８３〜４８６頁，１９９２年；Ｍｉｒｏｎｏｖら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４，２５６〜２６１頁，１９９０年）；（ｉｉ）アンチターミネーターとして機能することが示唆される、ターミネーターの５’−ｈａｌｆにおける逆方向反復（Ｍｉｒｏｎｏｖら，Ｃｅｌｌ  １１１，７４７〜７５６頁，２００２年）；（ｉｉｉ）ターミネーターの中央部分に位置して互いに逆相補的であり、抗アンチターミネーターとして機能して、アンチターミネーターとターミネーターとの塩基対合を妨げ、抗転写終結構造形成を妨げることが推測される２つの因子（Ｍｉｒｏｎｏｖら、Ｃｅｌｌ  １１１（５）：７４７〜５６頁、２００２年）。ターミネーターの機能が転写アッセイ中のＦＭＮの存在に依存することが、生体外転写研究によって確認されている（Ｗｉｎｋｌｅｒら、ＰＮＡＳ９９（２５）：１５９０８〜１３頁、２００２年）。例えば配列番号１に記載される枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｉｂオペロンに関しては、それぞれターミネーターは配列番号１のヌクレオチド２３０〜２６３からなり、アンチターミネーターはヌクレオチド３０〜３７からなり、抗アンチターミネーターはヌクレオチド１５７〜１６４からなる。
【０００６】
ｒｉｂ遺伝子発現制御の現行のモデルによれば、ｒｉｂリーダーから転写された新生のｍＲＮＡは２つの代替え構造を取る（いわゆるＦＭＮ  ｒｉｂｏスイッチ）。ＦＭＮがｒｉｂリーダー内に位置するＲＦＮ因子に結合する場合（例えば配列番号１中の位置２５〜１６４のＤＮＡ配列を参照されたい）、抗アンチターミネーターはアンチターミネーターと塩基対合し、したがってそれは転写終結ループの形成を妨げられず、ｒｉｂ遺伝子転写の早期終結がもたらされる。いずれのＦＭＮもＲＦＮ因子に結合しない場合、アンチターミネーターは転写ターミネーターの逆相補的配列と塩基対合して、読み過ごし転写ならびに全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ形成を可能にする。この機序は、ＦＭＮ結合ＲＦＮ因子と非結合形態との比率を決定する細胞内ＦＭＮ濃度と、全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ生産の程度とを結びつける。ＲＦＮ因子はＦＭＮの結合部位としての役割のみを果たし、リボフラビンのためには働かないことが示されている（Ｍｉｒｏｎｏｖら，２００２年；Ｗｉｎｋｌｅｒら，２００２年）。
【０００７】
したがって調節解除、リボフラビン過剰産生、および培養ブロス中への分泌は、以下のいずれによって達成されてもよい（ｉ）ＦＭＮと、ｒｉｂリーダー配列から転写された新生のｍＲＮＡとの結合妨害、（ｉｉ）アンチターミネーターと効果的に塩基対合できないようにする抗アンチターミネーターの改変、または（ｉｉｉ）ターミネーターの改変または除去。
【０００８】
リボフラビン過剰産生枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株の１つのクラスは、ｒｉｂリーダー配列の５’−ｈａｌｆの様々な位置に、ｒｉｂＯ突然変異と称される単一点突然変異を含有することが同定された（Ｋｉｌら，１９９２年）。ｒｉｂＯ突然変異は、ＲＦＮ因子中に位置してＦＭＮ結合を妨げるか、または抗アンチターミネーターＤＮＡ配列中に位置するかのどちらかである。ｒｉｂ遺伝子発現およびリボフラビン分泌の最大調節解除は、究極の因子であるｒｉｂ遺伝子転写が依存する抑制が除去されることから、ターミネーター構造の欠失に際して達成されることが予期され得る。ＲｉｂＯ突然変異は、例えばラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、リューコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）中でさらに同定されている（Ｂｕｒｇｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ５：２４頁，２００６年）。
【０００９】
ｒｉｂＣ変異株と称されるリボフラビン過剰産生枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株の第２のクラスでは、染色体傷害は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムの１４７番目にマッピングされている（ＫｒｅｎｅｖａおよびＰｅｒｕｍｏｖ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２２，４６７〜４６９頁，１９９０年）。ＲｉｂＣ変異株は、ｒｉｂＣ遺伝子にミスセンス突然変異を含有する。ｒｉｂＣ遺伝子は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のフラビンキナーゼ／ＦＡＤシンターゼをコードすることが示されている（Ｍａｃｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：９５０〜９５５頁，１９９８年）。リボフラビン生合成を調節解除する突然変異は、ｒｉｂＣ遺伝子産物のフラボキナーゼ活性を低下させ、リボフラビン制御系のエフェクター分子であるフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の細胞内濃度の低下をもたらす。
【００１０】
さらに古典的変異誘発が使用されて、選択された生物ゲノム中にランダム突然変異を有する変異株を発生させ、例えばプリン類似体に対するより高い抵抗性の選択がそれに続いた。代案としては、例えば天然の（弱い）プロモーターを強力プロモーターによって置き換えることで、または染色体内の発現カセットを増幅することで、リボフラビン生合成に関与する遺伝子が過剰発現され、前記カセットは、例えば抗生物質耐性マーカーなどの増幅可能な選択可能マーカー遺伝子と共に、関心のある遺伝子と作動的に連結する単一プロモーターを含有した。増幅は、染色体中に、発現カセットおよび選択可能なマーカー遺伝子の複数コピーの生産をもたらした。さらに前記宿主細胞の成長からの脱結合リボフラビン産生によって、培養ブロス中へのリボフラビンの分泌増大を達成し得た。
【００１１】
いくつかの不都合が、上述のアプローチに付随する。例えば単一プロモーターによって駆動される遺伝子増幅によって、飽和レベルのｍＲＮＡを達成することは可能でないかもしれない。さらに宿主細胞染色体中の発現カセットおよび選択可能マーカー遺伝子の複数コピーの生成は安定していないかもしれず、またはそれぞれの遺伝子のさらなる発現を妨げることすらあるかもしれない（フィードバック阻害）。
【００１２】
意外にも、ｒｉｂリーダーは、現行のモデルによって推測されるｒｉｂ遺伝子発現の負の制御因子としてのその機能以外にも、全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡの存在量に強い影響力を有することが発見され、５’ｍＲＮＡ安定化機能が示唆された。ｒｉｂリーダー配列中に特定の変異／欠失を導入することは、リボフラビン生産の増大をもたした。
【００１３】
したがって連続的ｒｉｂ遺伝子の発現に対する抑制効果を緩めまたは低下させるようにｒｉｂリーダーが改変されており、完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ転写物の蓄積をもたらす、変異リボフラビン産生株を提供することで、リボフラビン生産の収率および／または生産性を改善することが本発明の目的である。したがって適切な宿主細胞中への改変ｒｉｂリーダー、すなわち野生型ｒｉｂリーダーと比較して改善されたｒｉｂリーダーの導入は、例えばｒｉｂＡなどの連続的ｒｉｂ遺伝子の安定性のより高い全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡへのより高い転写速度、そしてｒｉｂオペロンのさらなる調節解除、すなわちより調節解除されたリボフラビン生産をもたらす。
【００１４】
特に（ｉ）ターミネーター配列またはその機能的部分と、（ｉｉ）ターミネーターの５’隣接領域とを含む、ｒｉｂリーダーの３’末端の欠失は、特異的にリボフラビン生産の収率および／または生産性を改善するのに効果的であることが分かった。ＲＦＮ因子の３’末端からターミネーターの３’末端までのＤＮＡ配列全体が除去されている改変ｒｉｂリーダーは、リボフラビン生産を改善するのに特に有用である。
【００１５】
さらにｒｉｂＯ突然変異と、ターミネーター配列またはその機能的部分を含むｒｉｂリーダー３’末端の欠失との組み合わせは、リボフラビン生産の収率および／または生産性を改善するのに特に効果的であることが分かった。これはターミネーターの５’隣接領域を含めることで、さらに改善し得る。意外にも（ｒｉｂＯ突然変異との組み合わせなしでの）ターミネーター配列全体またはその機能的部分どちらかの欠失または改変は、５’隣接領域と共にターミネーターを含むより大きな欠失、またはターミネーター欠失とｒｉｂＯ突然変異との組み合わせとは対照的に、リボフラビン生産に強力な影響を及ぼさない。事実上、ターミネーター配列またはその機能的部分のみの欠失または改変は、リボフラビン生産の調節解除において、古典的ｒｉｂＯ突然変異よりも明らかに効果が小さかった。１つ以上のｒｉｂＯ突然変異と組み合わさって、ＲＦＮ因子の３’末端からターミネーターの３’末端までのＤＮＡ配列全体が除去されている改変ｒｉｂリーダーは、リボフラビン生産を改善する上で特に有用である。これはＲＦＮ因子のより大きな部分を除去すれば、例えばＲＦＮ因子の３’末端のおよそ５分の１を除去すれば、なおも改善し得る。
【００１６】
したがって本発明は、
（ａ）配列番号４２に記載されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）の断片または誘導体を含んでなるｒｉｂリーダー活性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）その相補鎖がストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つで定義されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするｒｉｂリーダー活性を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つで定義されるポリヌクレオチドと８０、８５、９０、９５または９８％など少なくとも７０％同一であるｒｉｂリーダー活性を有するポリヌクレオチド、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で定義されるポリヌクレオチドの相補鎖であるポリヌクレオチド
からなる群から選択される、改変または変異ポリヌクレオチドを対象とし、前記ポリヌクレオチド、特に配列番号４２に記載されるポリヌクレオチドは改変／突然変異を含んでなり、完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ転写物の蓄積が非改変ｒｉｂリーダーと比較して少なくとも５％増大して、さらにリボフラビン生産増大がもたらされ、前記改変／突然変異は、
（ｉ）ターミネーターおよびその５’隣接領域を含むｒｉｂリーダーの３’末端における１つ以上の突然変異、および
（ｉｉ）ｒｉｂリーダーの３’末端の１つ以上の突然変異を伴う１つ以上のｒｉｂＯ突然変異
からなる群から選択される。
【００１７】
例えば配列番号４２に記載される非改変ｒｉｂリーダーは、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離された配列番号１に記載される非改変ｒｉｂオペロンの一部であってもよい。本発明のｒｉｂリーダー配列は、天然のｒｉｂプロモーター、または例えば配列番号５５または５６に記載されるＰｓｐｏ１５またはＰｖｅｇなどの構成的プロモーターのどちらかと共に使用してもよい。
【００１８】
ｒｉｂリーダーに導入されてリーダーの３’末端の改変と組み合わせられ、本明細書で定義される改変ｒｉｂリーダー配列をもたらすｒｉｂＯ突然変異は、Ｋｉｌら（１９９２年）によって定義／特性決定されたＲＦＮ因子を含むｒｉｂリーダーの５’末端のあらゆる箇所に位置して、本明細書で定義される非改変ｒｉｂリーダーを有する株と比較して改善されたリボフラビン生産をもたらす、あらゆる突然変異（塩基置換、欠失、挿入）を指す。
【００１９】
特に本発明は改変ｒｉｂリーダーに関し、それは３’部分で改変されており、Ｋｉｌら（１９９２年）によって定義されるものに相当する１つ以上のｒｉｂＯ突然変異を含有し、または例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個のｒｉｂＯ突然変異、すなわち例えば位置３１、３９、４０、４１、５５、８５、８６、８８、９３、１１６、１２１、および１２８から選択される、配列番号４２に記載される位置に相当する位置の置換などの１つ以上をさらに含有する。好ましくはｒｉｂＯ突然変異は、Ｔ３１Ｇ、Ｇ３９Ａ、Ｇ４０Ａ、Ｇ４１Ａ、Ｃ５５Ｔ、Ｃ８５Ｔ、Ｃ８６Ｔ、Ｇ８８Ａ、Ｃ９３Ｔ、Ａ１１６Ｃ、Ｇ１２１Ａ、Ｃ１２８Ｇ、およびそれらの組み合わせから選択され、ここでヌクレオチドは配列番号４２に記載される位置に相当する。５’末端の天然ｒｉｂプロモーターを含む、このようなｒｉｂＯ突然変異を有するｒｉｂリーダー配列の例は、配列番号４５、４６、および４７に記載される。これらのｒｉｂＯ突然変異はまた、例えばそれぞれ配列番号５７、５８または６０、および配列番号５９に記載される、例えばＰｖｅｇまたはＰｓｐｏ１５などの構成的プロモーターと融合してもよい。好ましくは本明細書で定義される改変ｒｉｂリーダーは、例えば配列番号４２に記載される位置３９、４０、４１、８５または１２１に相当する位置に位置するような単一ｒｉｂＯ突然変異を含んでなり、より好ましくはｒｉｂＯ突然変異はＧ３９Ａ、Ｇ４０Ａ、Ｇ４１Ａ、Ｃ８５Ｔ（「ＲＫ４１」と称される）、Ｇ１２１Ａ（「ＲＫ１ａ」と称される）、およびそれらの組み合わせから選択される。前記ｒｉｂＯ突然変異は、本明細書で定義されるｒｉｂリーダーの３’末端の突然変異とさらに組み合わせられる。
【００２０】
特定の実施態様では、本発明の改変ｒｉｂリーダーは、ｒｉｂリーダーの３’末端における突然変異と組み合わさった、１つを超えるｒｉｂＯ突然変異を有する。好ましいのは３つのｒｉｂＯ突然変異の組み合わせ、より好ましくは配列番号４２の位置３９、４０、および４１に相当する位置にある、なおもより好ましくは「ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ」と称されるｒｉｂＯ突然変異Ｇ３９−Ｇ４０Ａ−Ｇ４１Ａである。ｒｉｂリーダーに導入されるこのようなｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ突然変異の一例は配列番号４７に記載される（天然のｒｉｂプロモーターを含む）。これらのｒｉｂＯ突然変異はまた、例えば配列番号５７に記載される天然の構成的プロモーターを置換することで、構成的プロモーターと融合してもよい。
【００２１】
前記ｒｉｂＯ突然変異は、ｒｉｂリーダーの３’末端の改変とさらに組み合わせられる。ｒｉｂリーダーの３’末端におけるこのような改変は、少なくともターミネーターまたはその機能的部分の欠失を含んでもよく、本発明の改変ｒｉｂリーダーがもたらされ、それを適切な宿主細胞中に導入すると、非改変ｒｉｂリーダーを有する宿主細胞と比較してリボフラビン生成の増大がもたらされる。前記３’末端における改変は、例えばターミネーターの５’隣接領域の欠失、特に例えば配列番号４２のヌクレオチド１６６〜２６３または１３６〜２６３に相当するヌクレオチドなどのＲＦＮ因子の３’末端に相当するヌクレオチドの欠失などの改変をさらに含んでもよい。
【００２２】
好ましい実施態様では、上述のｒｉｂＯ突然変異と組み合わさったｒｉｂリーダーの３’末端における改変は、ＲＦＮ因子の３’末端（すなわちＲＦＮ因子下流に位置する全配列）とｒｉｂリーダーの３’末端との間に位置し、配列全体またはその一部のみが除去されていてもよい。特定の一実施態様では、ターミネーターまたは少なくともその機能性部分が前記欠失に含まれる。
【００２３】
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離されるターミネーター配列の一例は配列番号３９に記載され、それはｒｉｂリーダーから除去されて、天然のｒｉｂプロモーターを含む、例えば配列番号５１または８０に記載される改変ｒｉｂリーダーがもたらされるかもしれない。天然プロモーターはまた、例えばＰｓｐｏ１５およびＰｖｅｇ（例えば配列番号６３または６４参照）などの構成的プロモーターによって置換されていてもよい。したがって配列番号４２のヌクレオチド２３１〜２６３に相当するヌクレオチド中で、本発明の改変ｒｉｂリーダーが除去されていてもよく、すなわち上で定義されるｒｉｂＯ突然変異のいずれかと組み合わさって、「ｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」と称される（隣接領域のない）ターミネーター全体が欠失していてもよい。
【００２４】
ターミネーターの機能性部分の欠失は、１つ以上のステムループおよび／またはその隣接領域の欠失を含んでもよい。上に明記されているｒｉｂＯ突然変異と組み合わさって、ターミネーターの機能性部分のみが除去されているｒｉｂリーダー配列の例は、配列番号４８、４９、５０、７７、７８、および７９に記載される。天然のｒｉｂプロモーターはまた、例えばＰｓｐｏ１５およびＰｖｅｇなどの構成的プロモーターによって置換されていてもよい（例えば配列番号６１または６２参照）。配列番号４２に記載される枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｉｂオペロンを参照配列にすると、前記機能性部分欠失は、「ｄｅｌ  ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ−ｒｉｇｈｔ」と称されるヌクレオチド２５０〜２５７に相当するヌクレオチド欠失、「ｄｅｌ  ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ−ｌｅｆｔ」と称されるヌクレオチド２３１〜２３８に相当するヌクレオチド欠失、または「ｄｅｌ  ｆｌａｎｋ−ｒｉｇｈｔ」と称されるヌクレオチド２３９〜２６３に相当するヌクレオチド欠失を含んでもよい。
【００２５】
上に明記されているｒｉｂＯ突然変異と組み合わさった、ターミネーターおよび５’隣接領域が除去されている改変ｒｉｂリーダー配列の例は、配列番号５２、５３、８１、および８２に記載されている。天然のｒｉｂプロモーターはまた、例えばＰｓｐｏ１５およびＰｖｅｇ（例えば配列番号６５参照）などの構成的プロモーターによって置換されていてもよい。配列番号４２に記載される枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｉｂオペロンを参照配列にすると、本発明の改変ｒｉｂリーダーは、「ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ」と称される配列番号４２のヌクレオチド１６６〜２６３に相当するヌクレオチドの欠失、または「ｄｅｌ  ｍｒｏ１７５」と称されるヌクレオチド１３６〜２６３に相当するヌクレオチドの欠失を含有してもよく、それは上のｒｉｂＯ突然変異のいずれかと組み合わせられる。
【００２６】
本明細書に記載される改変ｒｉｂリーダー配列は、ｒｉｂリーダーの３’末端における突然変異／改変と組み合わさった、上で定義されるｒｉｂＯ突然変異を有し、３’末端の改変は、例えば完全なターミネーターの欠失、機能性部分のターミネーターの欠失、またはターミネーターならびに５’隣接領域の欠失から選択されてもよい。
【００２７】
さらに、そして本発明の一環として、本明細書で定義される改変ｒｉｂリーダー配列は、ｒｉｂリーダーの３’末端に突然変異／改変を有し、改変は、ターミネーターならびにその５’隣接領域の欠失から選択されてもよく、それは例えばターミネーターの最大６０、７０、８０、９０または１００ヌクレオチド上流、特に６４または９４ヌクレオチド上流、好ましくは配列番号４２のヌクレオチド１６６〜２６３または１３６〜２６３に相当するヌクレオチドなどである。
【００２８】
特定の好ましい一実施態様では、上で定義される改変ｒｉｂリーダーを有する宿主細胞は、例えばｒｉｂＯ突然変異Ｔ３１Ｇ、Ｇ３９Ａ、Ｇ４０Ａ、Ｇ４１Ａ、Ｃ５５Ｔ、Ｃ８５Ｔ、Ｃ８６Ｔ、Ｇ８８Ａ、Ｃ９３Ｔ、Ａ１１６Ｃ、Ｇ１２１Ａ、Ｃ１２８Ｇ、およびそれらの組み合わせなど、Ｋｉｌら（１９９２年）によって定義される既知のｒｉｂＯ変異株と比較して、培養養液中に５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００ｍｇ／Ｌ以上のリボフラビン、または１ｇ／Ｌよりなおも多量のリボフラビンなど、２５ｍｇ／Ｌを超えるリボフラビンを蓄積し、ヌクレオチドは、配列番号４２に記載される位置に相当する。当業者はこれらの量が、例えば培養条件、宿主株および／または基質次第で変動することを知っている。
【００２９】
一実施態様では、本発明の改変ｒｉｂリーダーは、ターミネーター全体の欠失、ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎまたはｄｅｌ  ｍｒｏ１７５（上記参照）から選択される３’末端欠失と組み合わさった、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｉｂオペロン（配列番号４２）中のＲＫ１ａ、ＲＫ４１またはｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯから選択されるｒｉｂＯ突然変異に相当する、ｒｉｂＯ突然変異を含有する。好ましい組み合わせは、ＲＫ１ａとｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ、またはｄｅｌ  ｍｒｏ１７５である。ＲＫ４１とｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ、またはｄｅｌ  ｍｒｏ１７５との組み合わせもまた好ましい。さらに好ましいのは、ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯとｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ、またはｄｅｌ  ｍｒｏ１７５との組み合わせである。より好ましくは本発明の改変ｒｉｂリーダーは、ＲＫ４１とｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ＲＫ４１とＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ、ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯとｄｅｌ  ｍｒｏ１７５との組み合わせを含有する。なおもより好ましいのは、例えばＰｓｐｏ１５およびＰｖｅｇ（例えば配列番号６７、６８、６９、７０または７１参照）などの構成的プロモーターと融合した前記改変ｒｉｂリーダー配列である。
【００３０】
本発明に従った改変ｒｉｂリーダーはまた、ｍＲＮＡ安定化因子の導入を通じた改変を含んでもよい。前記因子は、ｒｉｂ遺伝子のプロモーターとコード配列との間に導入してもよい。この様な因子の例としては、配列番号４３（いわゆるａｐｒＥ  ｍＲＮＡ安定化因子）または配列番号４４（いわゆるｇｒｐＥ  ｍＲＮＡ安定化因子）に記載されるもの、そして好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、それにハイブリダイズする配列が挙げられる。
【００３１】
核酸配列、すなわち本発明の改変ｒｉｂリーダー配列は、構成的または誘導性プロモーターのどちらであってもよく、適切なプロモーターと作動可能なように結合してもよい。プロモーターは、天然のプロモーター、または天然ではリボフラビン生合成に関与するそれぞれの遺伝子に元々関係のないプロモーターのどちらかである。当業者は、どのように適切なプロモーターを選択するかを知るであろう。有用な完全プロモーターの例は文献にあり、特に例えば欧州特許第４０５３７０号明細書を参照されたい。
【００３２】
したがって好ましい実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号６５、６７、６８、６９、７０または７１に記載される（改変）ヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、
（ｂ）その相補鎖がストリンジェントな条件下で（ａ）で定義されるポリヌクレオチドとハイブリダイズする改変ｒｉｂリーダー活性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）で定義されるポリヌクレオチドと８０、８５、９０、９５または９８％など少なくとも７０％同一である改変ｒｉｂリーダー活性を有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）で定義されるポリヌクレオチドの相補鎖であるポリヌクレオチド
からなる群から選択される、改変または変異ポリヌクレオチド（ｒｉｂリーダー配列）に関し、
前記ポリヌクレオチド、特に配列番号６５、６７、６８、６９、７０または７１に記載される配列は改変または変異配列と称され、適切な宿主細胞中への導入に際して、対応する非改変配列を有する細胞と比較して、完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ転写物の蓄積が少なくとも５％増大する。
【００３３】
本明細書での用法では、「ｒｉｂリーダー配列」という用語は、１つ以上の下流ｒｉｂ遺伝子と関連付けられており、連続的ｒｉｂ遺伝子発現に影響を与える非翻訳制御因子を含有する、あらゆるＤＮＡ配列を指す。これらの制御因子は、典型的に（ｉ）ＤＮＡ配列３’末端のターミネーター、（ｉｉ）抗ターミネーター、および（ｉｉｉ）ターミネーター上流のＲＦＮ結合部位を含んでなる。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から知られているように、ｒｉｂリーダーは、オペロンｒｉｂＧ中の第１の遺伝子の転写開始と翻訳開始コドンとの間のｒｉｂオペロンの５’領域に位置する約３００個のヌクレオチドを包含する。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｉｂリーダー中のターミネーター配列は、ヌクレオチド２３１と２６３の間に位置する（図１参照）。このようなｒｉｂリーダー配列は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などのその他の真正細菌、特に炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）およびＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）またはＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）でさらに同定されている（参照によって本明細書に援用するＶｉｔｒｅｓｃｈａｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ３０，３１４１〜３１５１頁，２００２年の表１を参照されたい）。
【００３４】
「ＲＦＮ因子」という用語は、本明細書での用法では、ｒｉｂリーダー配列内の高度に保存されたＤＮＡ配列を指す。ｍＲＮＡに転写後、ＲＦＮ因子は、５個のヘアピンがある保存された構造に折り畳まれ、ＦＭＮの結合部位を形成し得る。可能なＲＦＮ因子は、非コードＲＮＡファミリーに相当する複数配列アラインメントおよび共分散モデルの集合であるＲＦＡＭを使用して、同定され得る。（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら：Ｒｆａｍ：ａｎ  ＲＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２００３年，３１：４３９〜４４１頁；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｒｆａｍ／ｇｅｔａｃｃ？ＲＦ０００５０で利用できる）。様々な細菌のゲノム中のＲＦＮ因子の例は、Ｇｅｌｆａｎｄら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５，４３９〜４４２頁，１９９９年によって提供される。異なる生物からのＲＦＮ因子のヌクレオチド配列をはじめとする概要は、Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ３０，３１４１〜３１５１頁，２００２年の図２にある。Ｍｉｒｏｎｏｗら，Ｃｅｌｌ  １１１（５）：７４７〜５６頁，２００２年の定義によれば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｉｂリーダー配列内のＲＦＮ因子は、ヌクレオチド２２と１６５の間に位置する（図１または配列番号４２を参照されたい）。Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋら，２００２年の図２に示すアラインメントの助けを借りて、当業者はこのようなＲＦＮ因子を含有する生物中に改変ｒｉｂリーダーを作り出し、リボフラビン生産増大をもたらすことができる。
【００３５】
「非改変ｒｉｂリーダー」または「非改変ポリヌクレオチド」、および「野生型ｒｉｂリーダー」または「野生型ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で同義的に使用される。非改変ｒｉｂリーダーまたは非改変ポリヌクレオチドは、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で配列番号４２に記載される配列とハイブリダイズする、あらゆるポリヌクレオチドを含んでもよく、そのためにはｒｉｂリーダーの抑制的効果を軽減するため、ｒｉｂ遺伝子ｍＲＮＡの安定性を増大させるため、より調節解除されたｒｉｂオペロンをもたらすため、および／または所定の微生物中でリボフラビンの生産を増大させるために、比活性の増大が望ましい。次にこれらの配列を本発明に従った活性増大がある変異ｒｉｂリーダー配列をデザインするための出発点として使用する。「野生型」は、本発明の文脈では、本発明の教示のいずれかによってより活性にでき得れば、天然由来ならびに合成配列の変異型の双方の配列を含んでもよい。特にこのようなポリヌクレオチドは原核生物起源であり、好ましくは細菌起源、特に例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのグラム陽性またはグラム陰性細菌起源である。
【００３６】
「改変ポリヌクレオチド」または「改変ｒｉｂリーダー」、および「変異ポリヌクレオチド」または「変異ｒｉｂリーダー」という用語は、本明細書で同義的に使用される。変異／改変ポリヌクレオチドまたは改変ｒｉｂリーダーは、本発明の教示に従って（上の定義に従った）所定の野生型ポリヌクレオチド／ｒｉｂリーダーから誘導でき、それぞれの野生型配列よりも活性がより高い（例えば所定の基質から生成するリボフラビンの増大として、またはｒｉｂ  ｍＲＮＡ安定性の増大として測定可能な）あらゆる変異型を含んでもよい。本発明の範囲では、変異体がどのようにして得られるかは関連性がない；このような変異体は、例えば部位特異的変異誘発、飽和変異誘発、ランダム変異誘発／定方向進化、細胞／生物全体の化学またはＵＶ変異誘発、および当該技術分野で知られているその他の方法によって得られてもよい。これらの変異体はまた、例えば合成遺伝子をデザインすることで作り出してもよい。ｒｉｂリーダー配列の改変、およびそれらのｒｉｂ遺伝子発現に対する影響は、当業者に知られている方法によって判定し得る。例えばこれらの方法としては、レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼを使用した、または野生型ｒｉｂリーダー配列の代わりにまたはそれに加えて改変ｒｉｂリーダー配列を含有する微生物の培養ブロス中へのリボフラビン分泌を使用した、アッセイが挙げられる。それぞれのｍＲＮＡレベルに対する改変ｒｉｂリーダーの（ポジティブな）影響はまた、ノーザンブロット法またはリアルタイムＰＣＲを通じて判定してもよい。
【００３７】
当業者はｍＲＮＡ安定化因子の導入および／または天然プロモーターの置換をはじめとして、変異／改変ｒｉｂリーダー配列をどのように作り出すかを知っている。一実施態様では、あらかじめ改変されていないｒｉｂリーダーへのｍＲＮＡ安定化因子の導入を通じて、改変ｒｉｂリーダーを作り出す。このようなｍＲＮＡ安定化因子の導入のための有用な方法の一例を図２に示す。
【００３８】
前記変異／改変ｒｉｂリーダー配列作成は、例えば宿主生物が変異ｒｉｂリーダーを生成するように、それを本明細書に記載されるように遺伝的に改変することで達成されてもよく、ｒｉｂ遺伝子発現に対する抑制効果は非改変ｒｉｂリーダーと比較して緩和され、または低下しており、それは次に完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ転写物の蓄積の増大、ひいてはリボフラビン生産の効率および／または収率の増大をもたらす。したがって改変ｒｉｂリーダーによって、ｒｉｂオペロンは非改変ｒｉｂリーダーを有する株と比較して、制御がより緩やかになりまたはより高度に調節解除される。
【００３９】
「改善された活性」または「強化された活性」とは、本明細書での用法では、リボフラビン産生微生物中のｒｉｂリーダーの抑制効果の（全体または部分的）緩和または低下／制御低下と理解すべきである。したがって本発明の目的では、活性が増大している改変ｒｉｂリーダーは、非改変ｒｉｂリーダーと比較してｒｉｂ遺伝子転写に対する抑制効果がより低く、ｒｉｂオペロンの調節解除をもたらす。さらに本明細書で定義される活性が改善された改変ｒｉｂリーダーは、ノーザンブロット法またはリアルタイムＰＣＲによる測定で、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％または５００％以上にさえ増大した完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡの蓄積をもたらす。これはｒｉｂリーダー抑制／制御が最小化された際のリボフラビン生産増大を通じて、または全長転写物のｍＲＮＡ濃度またはｒｉｂ遺伝子から転写されたリボフラビン生合成酵素濃度の測定を通じて、（間接的に）測定し得る。改変ｒｉｂリーダーは、野生型ｒｉｂリーダーと比較して、ｒｉｂ遺伝子発現に対して少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％または５００％以上にさえ抑制／制御が低下している。したがって活性が改善された改変ｒｉｂリーダーとは、本明細書で定義される非改変ｒｉｂリーダーと比較して、調節解除レベルが少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％または５００％以上にさえ増大しているｒｉｂリーダーを指す。
【００４０】
「ｍＲＮＡ安定化因子」という用語は、本明細書での用法では、例えばそれぞれの遺伝子の転写開始点の下流などの５’非翻訳領域への導入に際して、前記ｍＲＮＡ安定化因子を含んでなるそれぞれの遺伝子から転写されたｍＲＮＡに安定性増大を提供できる、ＤＮＡ配列を指す。ｍＲＮＡ安定化因子は好ましくは１つ以上のステムループを含有するが、またステムループを全く含有しなくてもよい。
【００４１】
好ましくはリボフラビン生産に関与する、１つ以上の標的遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性増大をもたらす、１つ以上のステムループを形成できるあらゆる核酸配列は、本発明の範囲内であってもよい。ｍＲＮＡの安定化はまた、強力リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を通じて可能かもしれず、それは必ずしもループを形成しなくてもよい。
【００４２】
上で定義されるｍＲＮＡ安定化因子は、あらゆる長さであってもよいが、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド、最も好ましくは３９〜８７ヌクレオチドからなり、好ましくは１つ以上のステムループ、特に１つまたは２つのステムループを含んでなる。ステムは、少なくとも４塩基対、好ましくは少なくとも８、１０、１２、１５塩基対（ミスマッチヌクレオチド／内部ループおよび／またはバルジループが恐らく存在する）からなってもよく、ループは例えば３〜３０の非結合ヌクレオチド、好ましくは４、６、８、１０、１１、１４、１５、２５以上のヌクレオチドからなってもよい。内部ループの長さは、好ましくは２、４、６、８、１０、１２非結合ヌクレオチドである。例えば１、２または６個でさえある非結合ヌクレオチドから構成される、１つ以上のバルジループが存在してもよい。計算されるステムループの熱力学的安定性（ΔＧ）は、Ｚｕｋｅｒによって開発されたアルゴリズム（２００３年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４０６〜３４１５頁）に従って計算してもよい。一実施態様では、計算される熱力学の安定性は−２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１５、−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である。本発明の別の実施態様では、ｍＲＮＡ安定化因子はループを全く含まなくてもよい。
【００４３】
ｒｉｂ  ｍＲＮＡ転写物の安定性または完全性は、例えばＡｌｌｅｎｂｙら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０，２６１９〜２６２８頁（２００４年）；またはＳｈａｒｐおよびＢｅｃｈｈｏｆｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７，４８４〜４９５頁（２００５年）に記載されるようなノーザンブロット法および／またはリアルタイムＰＣＲ安定化を使用した、例えばｍＲＮＡ半減期の判定によって判定してもよい。野生型、すなわち本発明の改変ｒｉｂリーダーを含有しないｒｉｂオペロンから転写されたｍＲＮＡの半減期と比較して、前記ｍＲＮＡの半減期が少なくとも１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％または５００％以上にさえ増大すれば、本明細書での用法では、ｍＲＮＡの安定性または完全性は増大している（またはｍＲＮＡ分解が低下／ブロックされている）。
【００４４】
テンプレートＤＮＡは、リボフラビン生産のために使用されるのと同じまたは異なる宿主細胞に由来してもよい。さらに反応のためのテンプレートは、本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでなることが知られている、または疑われる株から調製されたｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであってもよい。ＰＣＲ産物をサブクローンニングし配列決定して、増幅された配列が本明細書に記載される新たな核酸配列の配列、またはその機能的同等物に相当することを確実にしてもよい。さらに本発明に従った核酸配列は、当該技術分野で良く知られている方法を使用して、完全にまたは部分的に合成してもよい。
【００４５】
本発明はまた、ポリヌクレオチド（ｒｉｂリーダー配列）と、リボフラビン生産のためのそれらの使用にも関し、その相補鎖はストリンジェントな条件下で本明細書で定義されるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、またそれは完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ転写物の蓄積を改善できる。
【００４６】
本発明はまた、ポリヌクレオチド、およびそれらのリボフラビン生産のための使用にも関し、前記ポリヌクレオチドは、本明細書で定義されている改変ｒｉｂリーダー活性を有するポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一である。一実施態様では本発明の核酸は、配列番号４２、５５、５６、６７、６８、６９、７０、７１に記載されるポリヌクレオチドまたはその補体と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である。
【００４７】
本発明はまた、プライマー、プローブ、および断片にも関し、それらは本発明に従ったＤＮＡを増幅または検出するのに使用してもよく、このようなｒｉｂリーダー配列を有する関連微生物種または科を同定するのに使用してもよい。
【００４８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、およびポリヌクレオチドまたは前記ベクターで遺伝子改変された微生物にも関する。
【００４９】
本発明はまた、本明細書で定義される改変ポリヌクレオチドを有する微生物を作り出す方法、すなわち完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡ転写物の蓄積を増大させるために適切な微生物を遺伝子操作する方法、およびリボフラビン生産の収率および／または効率を改善しおよび／または高めるためのそれらの使用にも関する。
【００５０】
本明細書での用法では、ＤＮＡ配列の導入は、例えば宿主細胞染色体への形質転換、結合、または形質導入によるＤＮＡ配列の付加または挿入であってもよい。前記付加または挿入はＤＮＡ組み換えによって起きてもよく、それは染色体ＤＮＡヌクレオチドの除去または欠失をもたらしても、もたらさなくてもよい。それによって宿主細胞、例えば微生物へのＤＮＡ配列導入を特に部位特異的導入により達成する方法については当該技術分野で良く知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編），１９９５年，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）に記載される。
【００５１】
適切な宿主細胞としては、所定の炭素源をリボフラビンに転換できるような、リボフラビン産生能のある微生物細胞が挙げられ、それらは例えば非改変リーダーまたは同等物またはその相同体を含む非改変ｒｉｂオペロンを有し（次にそれは本明細書に記載されるようなリボフラビン生産増大をもたらすように変異される）、またはその中に前記ｒｉｂオペロン／ｒｉｂリーダーの修正バージョンまたはその同等物が導入される。次にこのような細胞を「組み換え細胞」または「形質転換細胞」と称する。このような非改変ｒｉｂオペロン／ｒｉｂリーダーまたはその同等物を有する適切な微生物は、野生型株として、古典的変異誘発と選択法によって得られる変異株として、または組み換え株として、例えばグラム陰性およびグラム陽性細菌などの細菌から選択されてもよい。ＲＦＮ因子を有する適切な株は、Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ３０，３１４１〜３１５１頁，２００２年の表１および図２に列挙される。このような細菌の例としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デイオノコッカス（Ｄｅｉｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）、およびサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）が挙げられる。好ましくは微生物または宿主細胞は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・セレアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）；またはストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、サーモモノスポラ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａ）、デイオノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｏｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、およびクロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）のような関連性がより低い生物からなる群から選択される。より好ましいのは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、特に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８である。例えば本明細書で開示される枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの調節解除／改変ｒｉｂリーダーを使用して、上述のその他の微生物の１つの中の天然／野生型ｒｉｂリーダー置換することも、または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｉｂオペロンの前で上述の別の生物の改変ｒｉｂリーダーを使用することもまた、本発明の範囲内である。
【００５２】
前記改変ｒｉｂリーダーを有するこのような微生物はまた、遺伝子改変または組み換え微生物または組換え的に生成された／遺伝子改変宿主細胞と称される。
【００５３】
本発明のために使用し得る微生物は、ドイツ国ブラウンシュヴァイクのＩｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ，Ｄ−３８１２４のＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、米国バージニア州マナッサス２０１０８  Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９の米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、米国イリノイ州ピオリアのＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）生物資源センター（ＢＲＣ）（かつての〒５３２−８６８６日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ））、または米国オハイオ州コロンバス４３２１０のオハイオ州立大学（Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＧＳＣ）などの異なる供給元から公的に入手可能かもしれない。
【００５４】
本発明との関連で上述の微生物はまた、国際原核生物命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）によって規定される、同一の生理学的特性を有する種の異名または基礎異名を含むものと理解される。微生物命名法は本明細書での用法では、（優先出願の提出日において）国際微生物連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎにより正式に認可されて、その機関紙媒体であるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＪＳＥＭ）にて公開されたものである。
【００５５】
本発明は改変微生物を対象とし、前記改変は、例えばグルコースのような基質からのリボフラビンの収率、生産および／または効率の増大をもたらす。これは本明細書に記載されるようにｒｉｂリーダーの活性を増大させることで、すなわち制御レベルを低下させることで、実施してもよい。さらに改変がリボフラビン生産の収率、生産および／または効率に直接的影響を及ぼしさえすれば、本発明の微生物はさらなる改変を有してもよい。
【００５６】
したがって一実施態様では、本発明は、本明細書に記載されるような改変ｒｉｂリーダーを有し、例えばｒｉｂオペロンの天然のプロモーターが、例えばＰｓｐｏ１５またはＰｖｅｇなどの強力（構成的または誘導性）プロモーターによって置換されているような追加的改変を有する微生物を対象とする。このような強力プロモーターの導入は、天然プロモーター下流の改変ｒｉｂリーダーを有する微生物と比較して、少なくとも５０％、７５％、１００％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、５００％または１０００％さえ超える、リボフラビン生産の増大をもたらす。これは１つ以上のｒｉｂ遺伝子、特にｒｉｂＡの過剰発現によって、または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０株で実施されたような（例えば欧州特許第４０５３７０号明細書を参照されたい）宿主細胞中のｒｉｂオペロンの複数コピーの導入によって、さらに増大されてもよい。強力プロモーターと融合した、本明細書で定義されるｒｉｂリーダー中の改変を有するように微生物を遺伝的に改変することで、リボフラビン生産は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０中でのリボフラビン生産と比較して少なくとも１００％、２００％、２５０％、５００％、または７５０％さえ超えて増大し得る。任意に強力プロモーターおよび／またはｒｉｂオペロンの複数コピーの導入と組み合わさった、本明細書で定義される改変ｒｉｂリーダーを有する微生物は、例えばビオチンについて欧州特許第１１８６６６４号明細書で記載されるような栄養要求性の導入を通じたリボフラビン生産からの成長の切り離しにより、および／または例えば国際公開第０７／０５１５５２号パンフレットで記載されるような改変トランスケトラーゼ遺伝子の導入をさらに組み合わせることで、さらに改変してもよい。
【００５７】
本発明は、（ｉ）ｒｉｂリーダーの３’末端の改変と共に１つ以上のｒｉｂＯ突然変異を有し、または（ｉｉ）ターミネーターとその５’隣接領域の欠失を有する、本明細書で定義される改変ｒｉｂリーダーを提供し、前記改変ｒｉｂリーダーは例えばＰｓｐｏ１５またはＰｖｅｇなどの強力プロモーターに癒合する。
【００５８】
リボフラビン生産のために特に好ましい株は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。より好ましい株は、強力プロモーターＰｓｐｏ１５で改変されてｒｉｂ遺伝子の転写を増強する、ｒｉｂオペロンをコードするｐＲＦ６９の複数（ｎ）コピー（例えば約５〜約２０コピー）を含有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０：：[ｐＲＦ６９]ｎである（リボフラビン生産をもたらす株の構築および培養条件については、例えば欧州特許第４０５３７０号明細書およびＰｅｒｋｉｎｓら，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：８〜１８頁，１９９９年を参照されたい）。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０およびプラスミドｐＲＦ６９は、それぞれＮＲＲＬ（登録番号Ｂ１８５０２）およびＡＴＣＣ（登録番号ＡＴＣＣ６８３３８）から入手できる。
【００５９】
さらなる本発明の目的に従って、上で定義される改変ポリヌクレオチド、またはこのようなポリヌクレオチドで遺伝子改変された微生物のリボフラビン生産のための使用が提供される。
【００６０】
本発明はまた、微生物中で改変ｒｉｂリーダーを含む（改変）ｒｉｂオペロンを発現させる方法、上で定義される（改変）ポリヌクレオチドを微生物中で生産する方法、およびリボフラビンを産生できるこのような改変微生物を生産する方法にも関する。これらの全ての方法は微生物を改変するステップを含んでなってもよく、「改変する」とはここでの用法では、リボフラビンの収率および／または生産性および完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡの蓄積の双方が、野生型微生物と比較して改善され得るようなやり方で「遺伝的に改変する」過程を包含する。「改変する」という用語はまた、本明細書に記載されるような改変ポリヌクレオチド、特に改変ｒｉｂリーダーを作成することも含む。本明細書での用法では「リボフラビンの改善された収率」とは、野生型／非改変微生物、すなわち遺伝的に改変されていない微生物と比較して、少なくとも５０％、７５％、１００％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、５００％または１００００％または１０００００％（上記参照）さえも超える、増大を意味する。
【００６１】
「遺伝子改変」または「遺伝的に改変された」という用語は、生きている生物中における遺伝物質構造の化学的改変を意味する。それは組み換えＤＮＡの生成と使用を伴う。より具体的には、それは天然生物から遺伝子改変または改変生物を描写する（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）ために使用される。遺伝子操作は、プラスミド、ウィルス、またはその他のベクターを使用した、例えば遺伝子置換、遺伝子増幅、遺伝子破壊、付加、挿入、欠失、形質移入、形質転換などの当該技術分野で知られているいくつかの技術によって行ってもよい。遺伝子改変生物、例えば遺伝子改変微生物はまた、例えば組み換え微生物など、組み換え生物と称されることが多い。遺伝子改変の微生物は、上で定義される改変ｒｉｂリーダーを有する。
【００６２】
本発明に従って、リボフラビンの収率、生産および／または生産効率が改善されるように、本発明に記載される改変ｒｉｂリーダーを有する、遺伝子改変／組換え的に生成された宿主細胞（組み換え細胞または形質転換細胞とも称される）が提供される。宿主細胞は、所定の炭素源からリボフラビンを産生できる微生物、特にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択されてもよい。
【００６３】
「形質転換細胞」または「組み換え細胞」とは、完全な状態の全長ｒｉｂ  ｍＲＮＡの蓄積の増大および／または改善をもたらす本発明に従った核酸が、組み換えＤＮＡ技術の手段によってその中に（またはその祖先中に）導入されている細胞である。それはまた、前記細胞に既在の野生型ｒｉｂリーダー中に、１つ以上の突然変異を導入することも含む。適切な宿主細胞としては、例えば上で定義されるように所定の炭素源をリボフラビンに転換するような、リボフラビンを産生できる微生物の細胞が挙げられる。前記発酵方法を実施するのに有用な株は上に列挙され、当該技術分野で知られている。
【００６４】
本発明の核酸は、好ましくは単離形態で提供され、好ましくは均質になるよう精製される。
【００６５】
「単離された」という用語は、その元の環境（例えばそれが天然であれば天然環境）から物質が取り出されることを意味する。例えば生きている微生物中に存在する天然ポリヌクレオチドは単離されていないが、自然システム中に共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であることができ、および／またはこのようなポリヌクレオチドは組成物の一部であることができてなおも単離され、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部でない。
【００６６】
本明細書での用法では「遺伝子」という用語は、染色体ＤＮＡから単離されてもよい核酸分子を指し、それはタンパク質、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボフラビン生合成経路からの酵素などのリボフラビン合成に関与するタンパク質をコードする読み取り枠を含む。
【００６７】
遺伝子は、コード配列と、例えば誘導されるポリペプチドの適切な発現および安定化に重要なプロモーター領域、制御領域、およびターミネーター領域などの遺伝子コード領域の３’および５’末端に位置する非翻訳配列などの非コード配列とを含んでもよい。
【００６８】
本明細書での用法では、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）と、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）と、ヌクレオチド類似体を使用して作り出されたＤＮＡまたはＲＮＡ類似体とを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成されてもよい。このようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば塩基対合能力が改変されており、またはヌクレアーゼ抵抗性が増大している核酸を調製してもよい。
【００６９】
特に断りのない限り、本明細書でＤＮＡ分子を配列決定して判定された全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定装置を使用して判定された。したがってこの自動化アプローチによって判定されたあらゆるＤＮＡ配列について当該技術分野で知られているように、本明細書で判定されたあらゆるヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含有するかもしれない。自動化によって判定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と、典型的に少なくとも約９０％同一、より典型的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野で良く知られている手動ＤＮＡ配列決定法をはじめとする、その他のアプローチによってより正確に判定してもよい。
【００７０】
当業者はこのような誤って同定された塩基を同定でき、このような誤りをどのように修正するかを知っている。
【００７１】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、それらが改変または非改変であるかどうかに関わりなく、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用してもよい。さらに適切な宿主細胞として、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と近縁関係にあり、上述のようであるその他の生物において、相同的なｒｉｂリーダー配列の機能または活性を高めおよび／または改善するための、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドの使用もまた含まれる。本明細書での用法では、「相同的なｒｉｂリーダー配列」という用語は、Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ３０，３１４１〜３１５１頁，２００２年の図２に記載される異なる生物からのｒｉｂリーダー配列を包含し、異なるＲＦＮ因子は位置合わせされている。この位置合わせによって、当業者は、本明細書に記載される列挙された生物中で改変ｒｉｂリーダー配列を作り出すために、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する本明細書に記載されるものに相当する、ｒｉｂリーダーの部分を容易に同定し得る。
【００７２】
本発明はまた、例えば配列番号４２、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２に記載され、好ましくは配列番号４２、６７、６８、６９、７１、７０から選択されるポリヌクレオチドなどのストリンジェントな条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な単離されたポリヌクレオチドにも関する。有利には、このようなポリヌクレオチドは、リボフラビン産生能のある微生物、特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から得られてもよい。
【００７３】
本明細書での用法では、「ハイブリダイズする」という用語は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％互いに相同的なヌクレオチド配列が、その下で典型的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件について記述することが意図される。
【００７６】
当業者は、ストリンジェントなそして高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、どのような条件が適用されるかを知るであろう。このような条件に関する追加的ガイダンスは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編），１９９５年，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）など当該技術分野で容易に入手できる。
【００７７】
さらに本発明に従ったヌクレオチド配列に相当し、またはそれとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、例えば自動化されたＤＮＡ合成機を使用して、標準合成技術によって調製してもよい。
【００７８】
「相同性」または「％同一性」という用語は、本明細書で同義的に使用される。本発明の目的では、２つの核酸配列の％同一性を判定するために、配列を最適比較目的で位置合わせすることと定義される（例えば第２の核酸配列の最適位置合わせのために、第１の核酸配列中にギャップを導入してもよい）。次に対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の％同一性は、配列により共有される同一の位置数の関数である[すなわち％同一性＝同一の位置数／位置総数（すなわち重複する位置）×１００]。好ましくは、２つの配列は長さが同一である。
【００７９】
当業者は、２つの配列間の相同性を判定するのに、いくつかの異なるコンピュータプログラムを利用できるという事実を承知している。例えば２配列間の配列比較および％同一性の判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されてもよい。好ましい実施態様では２つのアミノ酸配列間の％同一性は、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのどちらかと、１６、１４、１２、１０、８、６または４のｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ、および１、２、３、４、５または６のｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手できる）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４〜４５３頁，１９７０年）アルゴリズムを使用して判定される。当業者は、異なるアルゴリズムを使用した際に、これらの異なる全てのパラメーターがわずかに異なる結果を生じるが、２つの配列の総体的百分率の同一性は、顕著に改変されないことを理解するであろう。
【００８０】
さらに別の実施態様では、２つのヌクレオチド配列間の％同一性が、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０または８０のｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔと、１、２、３、４、５または６のｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手できる）中のＧＡＰプログラムを使用して判定される。別の実施態様では、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１２、およびｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉで入手できる）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７頁、１９８９年）を使用し、２つのヌクレオチド配列間の％同一性を判定する。
【００８１】
本発明の微生物を構築する、すなわちリボフラビン生産に関与する遺伝子の５’非翻訳領域に改変ｒｉｂリーダーを導入する有用な方法は実施例で示され、本明細書で開示される改変ｒｉｂリーダーの導入が、それぞれのｒｉｂ遺伝子からのより完全な状態の全長ｍＲＮＡ転写物をもたらし、それはさらにリボフラビンの収率および／または生産性の増大をもたらす。組み換え微生物の選択は、例えばクロラムフェニコール、ネオマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子の導入を通じて実施し得る。
【００８２】
本発明は、改変ｒｉｂリーダーを有する微生物を使用したリボフラビン発酵生産を対象とする。本明細書での用法では「リボフラビン」という用語は、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ならびに例えばリボフラビン−５−リン酸またはナトリウムリボフラビン−５−リン酸などのリボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤの前駆物質、誘導体、および塩を含むが、これに限定されるものではない。リボフラビン、ＦＭＮ、およびＦＡＤの前駆物質および／または誘導体は、例えばＤＲＡＰＰ；５−アミノ−６−リボシルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’−リン酸；２，５−ジアミノ−６−リビチルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５’−リン酸；５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’−リン酸；５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン；６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）；およびフラボタンパク質から選択されてもよい。「リボフラビン」および「ビタミンＢ２」という用語は、本明細書で同義的に使用される。リボフラビン生合成に関与する遺伝子、ならびにリボフラビンの発酵生産法、特にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株を使用した発酵生産法が知られている（例えば欧州特許第４０５３７０号明細書またはＵｌｌｍａｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第７版，２００７年，Ｖｉｔａｍｉｎｓの章を参照されたい。）。これらの方法はまた、本明細書に記載される改変ｒｉｂリーダー配列を含んでなる変異株を使用した、リボフラビン生産のために応用してもよい。
【００８３】
本発明の方法、すなわち上述のリボフラビン製造法においては、炭素源としていくつかの基質を使用してもよい。特に適切な炭素源は、例えばＤ−グルコース、グリセロール、てん菜濃厚汁、デキストロース、デンプン、スクロースまたはリボースなどの３、５または６個の炭素原子からなる化合物から選択されてもよい。好ましくは炭素源は、Ｄ−グルコースである。「炭素源」、「基質」、および「生産基質」という用語は、上記方法との関連で本明細書では同義的に使用される。
【００８４】
改変微生物を使用する上記方法のための本明細書の用法では、培地はリボフラビン生産のためのあらゆる適切な培地であってもよい。典型的に培地は、例えば塩、基質、および特定のｐＨを含んでなる水性培地である。その中で基質がリボフラビンに転換される培地はまた、生産培地とも称される。
【００８５】
「発酵」または「生産」または「発酵過程」とは、本明細書での用法では、当業者に知られている培地、条件、および手順を使用した増殖細胞の使用、または適切な基質をリボフラビンに転換するのに適した条件下で、当業者に知られている培地、条件、および手順を使用して培養した後の非増殖性のいわゆる休止細胞の使用であってもよい。
【００８６】
生成したリボフラビンは、あらゆる適切な手段によって細胞から回収してもよい。回収とは、例えば生成したリボフラビンを生産培地から分離してもよいことを意味する。任意に、この生成した発酵産物をさらに処理し、例えば精製してもよい。
【００８７】
微生物を使用した上記方法との関連で、一態様では、成長させるステップは、好気性条件下において常態で成長させるための適切な栄養素を添加した水性培地、すなわち増殖培地中で実施し得る。培養は、例えばバッチ、流加、半連続または連続様式で実施してもよく、流加または半連続様式が好ましい。
【００８８】
培養期間は、例えば使用する宿主、ｐＨ、温度、および栄養培地次第で変動してもよく、微生物次第で、例えば約１０時間〜約１０日間、好ましくは約４〜約７日間、より好ましくは約２〜約６日間であってもよい。当業者は、適切な微生物の最適培養条件を知るであろう。
【００８９】
培養は、例えば約７．０、好ましくは約６〜約８、より好ましくは約６．５〜７．５の範囲のｐＨで実施してもよい。培養を実施する適切な温度範囲は、例えば約１３℃〜約７０℃、好ましくは約３５℃〜約３９℃、より好ましくは約３０℃〜約３９℃、最も好ましくは約３６℃〜約３９℃であってもよい。成長のための培地は、通常、例えば、Ｄ−グルコース、グリセロール、てん菜濃厚汁、デキストロース、デンプン、スクロースまたはリボースなどの同化できる炭素源；そして例えばペプトン、酵母抽出物、およびアミノ酸などの有機物質などの可消化窒素源のような栄養素を含有してもよい。培地には、尿素および／またはコーンスティープリカーおよび／またはパン用酵母を添加しても添加しなくてもよい。窒素源として、例えば硝酸およびアンモニウム塩などの様々な無機物質もまた使用してもよい。さらに増殖培地は、通常は例えば硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウム、および炭酸カルシウムなどの無機塩を含有してもよい。次に上述の手順を使用して得られた細胞を上述のような基質存在下で、上述したのと本質的に同一の様式、温度、およびｐＨ条件で、これらの基質を所望の標的発酵産物に転換するようにさらにインキュベートし得る。インキュベートは、例えばペプトン、酵母抽出物、パン用酵母、尿素、アミノ酸、およびコーンスティープリカーなどの有機窒素源；または例えば硝酸塩およびアンモニウム塩などの無機窒素源を含有する窒素に富む培地内で実施し得て、その場合、細胞は所望の発酵産物を産生しながらさらに成長できる。代案としては窒素欠之培地中でインキュベートを実施し得て、その場合、細胞は実質的に成長せず、休止細胞状態、または生体内変換状態になる。全ての場合で、培地はまた、例えば硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウム、および塩化カルシウムなどの無機塩を含有してもよい。リボフラビン生産のための適切な培地の一例は、国際公開第０４／１１３５１０号パンフレット（ＶＦ−培地）に記載され、それはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に関して特に有用である。
【００９０】
「生産」または「生産性」という用語は当分野で認められており、所定時間内に所定発酵体積内で形成されるリボフラビンの濃度を含む（例えば、１Ｌあたり１時間あたりの生成物ｋｇ）。「生産効率」という用語は、達成すべき特定レベルの生産に要する時間を含む（例えば細胞が発酵産物の特定生産速度に達するのにどのくらい時間がかかるか）。「収率」という用語は技術分野で認識され、炭素源から生成物（すなわちリボフラビン）への転換効率を含む。これは一般に例えば１ｋｇの炭素源あたりの生成物ｋｇ数として記述される。化合物の「収率および／または生産／生産性が増大する」とは、所定量培養物中のその化合物の回収された分子の量、または有用な回収された分子の量が、所定時間にわたり増大することを意味する。
【００９１】
リボフラビンの収率／生産性を判定するための分析法は、当該技術分野で知られている。このような方法としては、ＨＰＬＣまたは指標株の使用が挙げられるが、これに限定されるものではない（例えばＢｒｅｔｚｅｌら，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１９〜２６頁，１９９９年を参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】５’および３’隣接領域を含む枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｉｂリーダーを示す。ｒｉｂリーダーは、ヌクレオチド位置５６２〜８５７の間に位置する。（Ａ）５’制御因子（それぞれ「ｔｔｇｃｇｔ」および「ｔａｔａａｔ」）、ならびに配列番号４２に記載されるｒｉｂリーダーの第１のヌクレオチドに相当する転写開始（「Ａ」）が太字で示される、野生型ｒｉｂオペロン。（Ｂ）ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ、ＲＫ４１、およびＲＫ１などのｒｉｂＯ突然変異の位置が太字で示されるｒｉｂリーダー。（Ｃ）〜（Ｉ）ｆｌａｎｋ−ｒｉｇｈｔ、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ−ｒｉｇｈｔ、ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ−ｌｅｆｔ、ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ、ｄｅｌ  ｍｒｏ１７５、および全ｒｉｂリーダーの位置が、それぞれ下線で示されるｒｉｂリーダー。より詳しい説明は本文、特に実施例を参照されたい。
【図２−Ａ】ＬＦＨ−ＰＣＲを通じて、遺伝子ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｒｉｂＡを含んでなるｒｉｂオペロンの５’末端に位置する、強力構成的Ｐｓｐｏ１５プロモーター下流のｍＲＮＡ安定化因子（Ｓｔ）を有する、遺伝的に改変された微生物を構築するための異なるステップを示す。組み換え微生物の選択のために、クロラムフェニコール（Ｃｍ）抗生物質耐性カセットが使用される。（Ａ）ＬＦＨ−ＰＣＲを使用した、強力プロモーターによる天然プロモーターの置換。（Ｂ）ｍＲＮＡ安定化因子の導入。より詳しい説明は実施例を参照されたい。
【図２−Ｂ】ＬＦＨ−ＰＣＲを通じて、遺伝子ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｒｉｂＡを含んでなるｒｉｂオペロンの５’末端に位置する、強力構成的Ｐｓｐｏ１５プロモーター下流のｍＲＮＡ安定化因子（Ｓｔ）を有する、遺伝的に改変された微生物を構築するための異なるステップを示す。組み換え微生物の選択のために、クロラムフェニコール（Ｃｍ）抗生物質耐性カセットが使用される。（Ａ）ＬＦＨ−ＰＣＲを使用した、強力プロモーターによる天然プロモーターの置換。（Ｂ）ｍＲＮＡ安定化因子の導入。より詳しい説明は実施例を参照されたい。
【００９３】
以下の実施例は単に例証を目的とし、本発明の範囲をどのようにも限定することは意図されない。本明細書全体を通じて引用した、参考文献、特許出願、特許、および公開特許公報、特に欧州特許第４０５３７０号明細書、国際公開第０４／１０６５５７号パンフレット、国際公開第０７／０５１５５２号パンフレット、および欧州特許第１１８６６６４号明細書は、その内容を参照によって本明細書に援用する。
【００９４】
［実施例］
実施例で言及される以下の培地については、国際公開第０４／１０６５５７号パンフレットに記載されている。
トリプトース血液寒天ブロス（ＴＢＡＢ）培地、仔ウシ肉浸出液−酵母抽出物ブロス（ＶＹ）培地、１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩および最少培地（ＭＭ）。
さらに、以下の培養液を使用した。
１００×微量元素溶液Ａ：１２．５ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．５５ｇのＣａＣｌ２；１．３５ｇのＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；０．１７ｇ／ＬのＺｎＣｌ２；０．０４３ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０６ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．０６ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；１ＬのＨ２Ｏを添加し、オートクレーブ。
【００９５】
５×最小塩溶液：０．０５７ＭのＫ２ＳＯ４；０．３１ＭのＫ２ＨＰＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．２２ＭのＫＨ２ＰＯ４；０．０１７ＭのＮａ−クエン酸・７Ｈ２Ｏ；０．００４ＭのＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０、オートクレーブ。
【００９６】
１００×微量元素溶液Ｂ：０．５５ｇのＣａＣｌ２；０．１７ｇのＺｎＣｌ２；０．０４３ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０６のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．０６ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；１ＬのＨ２Ｏを添加し、オートクレーブ。
【００９７】
リボフラビンスクリーニング培地（ＲＳＭ）：２００ｍｌの１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩；１０ｍｌの１００×微量元素溶液Ａ；２ｍｌの５０％グルコース；３６ｍｌの２５％ラフィノース；１０ｍｌの１０％酵母抽出物；１ＬのＨ２Ｏを添加。
【００９８】
Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最少培地（ＳＭＭ）：１００ｍｌの１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩；１０ｍｌの５０％グルコース；１ｍｌの４０％グルタミン酸ナトリウム；１０ｍｌの微量元素溶液Ａ；１ＬのＨ２Ｏを添加。
【００９９】
振盪フラスコ内のリボフラビン生産は、次のように実施した。菌株を凍結グリセロール保存液から５ｍｌのＶＹ富栄養培地に接種し、２８０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で一晩生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、１ｍｌのＲＳＭ（上記参照）に再懸濁した。２５０μｌの細胞懸濁液を使用して、２５０ｍｌの邪魔板付き振盪フラスコ内の２５ｍｌのＲＳＭに接種した。２２０ｒｐｍで撹拌しながら３９℃で４８時間の培養後、５００μｌの培養物を取り出し、サンプルと３５μｌの４Ｎ  ＮａＯＨを室温で１分間混合して、リボフラビンの結晶を溶解させた。４６５μｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）の添加によってサンプルを中和し、遠心分離（５分間、１３２００ｒｐｍ）によってペレット化した。上清を使用して、リボフラビン濃度と、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）およびオキソルマジンの２つの副生物濃度をＨＰＬＣ測定した。さらに第２の培養物サンプルを取り出して、遠心分離（５分間、１３２００ｒｐｍ）後に上清を使用して培地中の残留グルコースおよびラフィノース濃度を測定し、炭素源に対するリボフラビン収率を計算した。
【０１００】
振盪フラスコ培養物からのサンプルをＨＰＬＣによって分析した。サーモスタットで調温されるオートサンプラー、ダイオードアレー、および蛍光検出器を装着したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム上でクロマトグラフィーを実施した。４ｍｍ  ＬＣ−８ＤＢガードカラムを装着したＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−８ＤＢ−５μカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）上で分離を実施した。０．１Ｍ酢酸とメタノールとの混合物を移動相として使用した。２％メタノール（５分間にわたり一定）で開始して、１５分以内に５０％メタノールにまで上昇させる勾配溶出を行った。カラムは２０℃に保った。シグナルを２８０ｎｍでＵＶによって記録した。リボフラビンは不純物（例えば副生物であるＤＭＲＬおよびオキソルマジン）から良好に分離し、１５．２分で溶出した。較正はＦｌｕｋａから得られる標準物質を基準にした。方法は１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのリボフラビンで較正した。
【０１０１】
さらにクォータナリー・ポンプ、オートサンプラー、ＵＶおよび屈折率検出器を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムによって、培養ブロス中のグルコースおよびラフィノース濃度を分析した。分離は、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＮＨ２  ＵＧ８０カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μ）（資生堂）上で達成した。最適カラム温度は３５℃であった。移動相は、６５／３５の比率のアセトニトリルとＤＩ水との混合物であった。流速は１．０ｍｌ／分であり、注入量は５μｌに設定した。屈折率シグナルをモニターして、検出のために使用した。各化合物の較正範囲は０．５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌである。
【０１０２】
［実施例１：リボフラビン栄養要求株の作成］
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のリボフラビンオペロンのオリジナルのリーダーおよびプロモーター配列を操作するために、リボフラビンプロモーター、ＲｉｂＤのデアミナーゼ領域をコードするｒｉｂＤ（ｒｉｂＧ）の５’リーダー配列および５’部分をプラスミドｐＵＢ１１０から得られたネオマイシン抵抗性（ｎｅｏ）カセットによって置換し（Ｉｔａｙａら，１９８９年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：４４１０頁）、リボフラビン栄養要求枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ３８１３株を作り出した。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（ｔｒｐＣ２）の誘導体である、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７株（ＳＰβｃ、原栄養株）に由来するゲノムＤＮＡは、米国オハイオ州４３２１０コロンバスのオハイオ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。
【０１０３】
株構築のためには、Ｌｏｎｇ  Ｆｌａｎｋｉｎｇ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＦＨ−ＰＣＲ）を使用して、天然Ｐｒｉｂプロモーター（ｆｌａｎｋ  ５’）の５２６ｂｐの上流領域とｒｉｂＤ遺伝子の５０２ｂｐの３’末端（ｆｌａｎｋ  ３’）とに挟まれた、１２３６ｂｐのｎｅｏ抵抗性カセットを含有するＤＮＡ断片を作り出した。したがってｆｌａｎｋ  ５’、ｎｅｏ抵抗性カセット、およびｆｌａｎｋ  ３’の３個のＤＮＡ断片を最初にＰＣＲによって増幅した。ｆｌａｎｋ  ５’とｆｌａｎｋ  ３’とに挟まれたＤＮＡ断片は、次のようにして作り出した。１００μＭのプライマーｐ５０（配列番号６）ならびにｐ５１（配列番号７）溶液１μｌ、または１００μＭのプライマーｐ４４（配列番号４）ならびにｐ４５（配列番号５）溶液１μｌを１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、および０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を含有する５０μｌの反応体積中の０．１μｇの枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７染色体ＤＮＡに添加した。ｎｅｏ抵抗性カセットを含有するＤＮＡ断片を作り出すために、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、および０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を含有する５０μｌ反応体積中のｎｅｏ抵抗性カセットを含有する０．０５μｇのｐＵＢ  １１０  ＤＮＡに、１００μＭのプライマーｐ９（配列番号２）ならびにｐ１０（配列番号３）の溶液１μｌを添加した。ＰＣＲ反応は、（ｉ）９４℃で３０秒間の変性ステップ、（ｉｉ）５２℃で３０秒間のアニーリングステップ、（ｉｉｉ）７２℃で１分間の伸長ステップの３つの逐次段階、３５サイクルで実施した。ＰＣＲサイクルには、９５℃で３分間の変性ステップが先行した。３つのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してゲルから抽出した。最終ＬＦＨ−ＰＣＲ反応では、３つの精製ＰＣＲ産物（ｆｌａｎｋ  ５’、ｎｅｏ抵抗性カセット、およびｆｌａｎｋ  ３’）をアセンブルした。１μｌの１００μＭプライマーｐ４５およびｐ５１溶液、１μｌのｆｌａｎｋ  ５’ＰＣＲ産物（５０ｎｇ）、１μｌのｆｌａｎｋ  ３’ＰＣＲ産物（５０ｎｇ）、および１μｌのｎｅｏ抵抗性カセット（１００ｎｇ）を添加して、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、および０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を含有する最終反応体積５０μｌを得た。ＬＦＨ−ＰＣＲ反応は、（ｉ）９４℃で３０秒間の変性ステップ、（ｉｉ）５２℃で３０秒間のアニーリングステップ、（ｉｉｉ）７２℃で２．５分間の伸長ステップの３つの逐次段階、３５サイクルで実施した。ＰＣＲサイクルには、９５℃で３分間の変性ステップが先行した。ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して、アセンブルされたＬＦＨ−ＰＣＲ産物を精製した。精製されたＬＦＨ−ＰＣＲ産物（２μｇ）をコンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７細胞の形質転換のために使用した。２ｍｇ／Ｌネオマイシンおよび１００ｍｇ／Ｌリボフラビンを含有するＴＢＡＢプレー���上で、ネオマイシン−抵抗性（Ｎｍｒ）形質転換体を選択した。得られたリボフラビン栄養要求株およびＮｍｒＢＳ３８１３株の正確な遺伝子型は、プライマーｐ４５ならびにｐ１０、およびプライマーｐ５１ならびにｐ９、およびテンプレートＤＮＡとして形質転換体の染色体ＤＮＡを使用した２回のＰＣＲ反応によって確認した。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ断片ｆｌａｎｋ  ５’およびｆｌａｎｋ  ３’の作成について上述した標準反応条件を使用して実施した。さらに配列決定によって、ＢＳ３８１３からのｒｉｂＤの配列を確認した。
【０１０４】
国際公開第０７／０５１５５２号パンフレット（実施例６参照）に記載される方法に従って、ＰＢＳ−１ファージを用いて欠失コンストラクトの形質導入を実施し、そこではトランスケトラーゼ遺伝子に突然変異を有するリボフラビン過剰産生枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ３５３４株に形質導入するために、ＢＳ３８１３の溶解産物が使用される（ＢＳ３５３４の構築については国際公開第０７／０５１５５２号パンフレットを参照されたい）。ＢＳ３５３４は、欧州特許第４０５３７０号明細書に詳細に記載され供託番号ＮＲＲＬＢ−１８５０２の下に入手できる、リボフラビン過剰産生枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０株をベースとする。Ｎｍｒ被形質導入体は、２ｍｇ／Ｌネオマイシンおよび１００ｍｇ／Ｌリボフラビンを含有するＴＢＡＢ寒天プレート上で選択される。単離された被形質導入体の遺伝子型は、上述のようにＰＣＲによって確認した。得られた株をＢＳ３７９８と命名した。
【０１０５】
［実施例２：改変ｒｉｂリーダー配列有株の作成］
２つのタイプの突然変異をｒｉｂリーダー中に導入してｒｉｂ遺伝子の転写を調節解除し、そこではＩ型はｒｉｂＯ突然変異を指し、ＩＩ型はｒｉｂリーダーの（部分的）欠失を指す（図１参照）。
【０１０６】
３つのｒｉｂＯ突然変異、すなわち「ＲＫ４１」と称されるＣ８５Ｔ、「ＲＫ１ａ」と称されるＧ１２１Ａ、および「ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ」と称される三つ組みＧ３９ＡＧ４０Ａ−Ｇ４１Ａを作り出した。ＩＩ型変異株では以下の部分がｒｉｂリーダーから除去され、ここでヌクレオチドの番号は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離された配列番号４２に記載されるｒｉｂリーダー配列を指す。「ｄｅｌ  ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ−ｒｉｇｈｔ」と称されるヌクレオチド２５０〜２５７（配列番号３６）の欠失、「ｄｅｌ  ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ−ｌｅｆｔ」と称されるヌクレオチド２３１〜２３８（配列番号３７）の欠失、「ｄｅｌ  ｆｌａｎｋ−ｒｉｇｈｔ」と称されるヌクレオチド２３９〜２６３（配列番号３８）の欠失、「ｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」と称されるヌクレオチド２３１〜２６３（配列番号３９）の欠失、「ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ」と称されるヌクレオチド１６６〜２６３（配列番号４０）の欠失、「ｄｅｌ  ｍｒｏ１７５」と称されるヌクレオチド１３６〜２６３（配列番号４１）の欠失、および完全なリーダーの欠失、すなわち「ｌｅａｄｅｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ」と称されるヌクレオチド１〜２６３（配列番号４２）の欠失。ｍｒｏ１７５欠失の場合、４個のヌクレオチドの挿入も起きた（５’−ＡＴＧＧ−３’）。
【０１０７】
ｒｉｂプロモーター（配列番号４５〜５４）と共に改変ｒｉｂリーダー配列を有する株の構築は、実施例１で概説したプロトコル／条件に従って、基本的に２つのＰＣＲ反応を通じて実施し、第１のＰＣＲ反応では枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７からの染色体ＤＮＡを使用して、ｆｌａｎｋ  ５’およびｆｌａｎｋ  ３’と称される２つのＤＮＡ断片を作り出した。実施例１で記載されるプロトコル／条件に従った第２のＰＣＲ反応では、プライマーｐ４５およびｐ５１を使用してこれらの２つのＰＣＲ断片をアセンブルした。所望の変異／欠失（上記参照）をもたらす、第１のＰＣＲ反応のためのそれぞれのプライマーのペア、すなわちｆｌａｎｋ  ５’作成のためのプライマーおよびｆｌａｎｋ  ３’作成のためのプライマーをそれぞれ表１の２および３欄に列挙する。ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用した精製後、コンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ３８１３細胞を形質転換するために２μｇの精製された全長ＰＣＲ産物を使用した（実施例１参照）。細胞をＳＭＭプレート上に播種した。リボフラビン原栄養株形質転換体を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁した。オリジナル細胞懸濁液の５００倍希釈の１００μｌをＴＢＡＢ寒天プレート上に播種した。単一コロニーは、新鮮なＴＢＡＢ寒天プレート上に、および２ｍｇ／ＬのＮｍと１００ｍｇ／Ｌのリボフラビンを添加したＴＢＡＢ寒天プレート上に移した。正しい形質転換体はネオマイシンに感応性であり、したがってＴＢＡＢ寒天プレート上のみで生育し、ネオマイシンを添加したプレート上では生育しなかった。さらに新たに導入されたｒｉｂプロモーターおよびｒｉｂＤの配列決定によって、遺伝子型を確認した。ｒｉｂリーダー中にそれぞれの突然変異／欠失を含有する、新たに作り出された枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は表１の４欄に示すように命名された。
【０１０８】
新たに作り出された株からＰＢＳ−１溶解産物を調製し、ＢＳ３７９８（実施例１で作成）の形質導入のために使用した。形質導入細胞は、ＳＭＭプレート上で選択した。リボフラビン原栄養株枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）被形質導入体を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁した。オリジナル細胞懸濁液の５００倍希釈の１００μｌをＴＢＡＢ寒天プレート上に播種した。単一コロニーを新鮮なＴＢＡＢ寒天プレート、および２ｍｇ／ＬのＮｍと１００ｍｇ／Ｌのリボフラビンを添加したＴＢＡＢ寒天プレートの上に移した。正しい被形質導入体はＴＢＡＢ寒天プレート上でのみ生育し、したがってネオマイシン感応性である。新たに形質導入された株を表１の５欄に示すように命名した。
【０１０９】
【表１】
0005787089.tif 000002
【０１１０】
新たに作り出された株を上述の振盪フラスコスクリーニングにおいて、リボフラビン生産について試験した。４８時間後に、４Ｎ  ＮａＯＨの添加によって５００μｌサンプルのリボフラビンを溶解し、中和して遠心分離後、処理済サンプルのリボフラビンの濃度をＤＭＲＬとＤＭＲＬの分解産物であるオキソルマジンの濃度と共に、ＨＰＬＣによって測定した。炭素源からのリボフラビン収率の計算のために、全炭素源の開始および残留濃度をＨＰＬＣによって測定した。
【０１１１】
結果を表２に示す。野生型株（１Ａ７４７）バックグラウンド中の天然ｒｉｂオペロンが、基本的にいかなるリボフラビンも培地中に分泌しないのに対し、リボフラビン過剰産生（ＲＢ５０）について選択された株バックグラウンド中の同一ｒｉｂオペロンは、測定可能量のリボフラビンを分泌した。最良の結果は、それぞれ野生型（ＢＳ３９５８）およびＲＢ５０バックグラウンド（ＢＳ３９８７）の双方において、ｒｉｂＯ変異株ＲＫ４１で得られた。ターミネーターの欠失は、特に野生型バックグラウンド（ＢＳ３８１５）では、予期された結果をもたらさなかった。野生型バックグラウンドでは、第２の最良の結果がＲＫ１ａ  ｒｉｂＯ変異株（ＢＳ３８３３）で得られたのに対し、ＲＢ５０バックグラウンドにおける第２の最良の結果は、ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ＢＳ３９００およびＢＳ３９１６）で達成され、それはリーダー欠失株よりもさらにより高いリボフラビン収率を示した。
【０１１２】
【表２】
0005787089.tif 000003
【０１１３】
【表３】
0005787089.tif 000004
【０１１４】
［実施例３：強力構成的プロモーターによる天然ｒｉｂプロモーターの置換］
強力プロモーターと組み合わさったｒｉｂリーダー突然変異の可能な相乗効果を評価するために、新たに作り出されたコンストラクトのオリジナルのｒｉｂプロモーター（実施例２参照）を強力構成的プロモーターＰｖｅｇまたはＰｓｐｏ１５のどちらかで置換した。構築方法は実施例２のアプローチと極めて類似していた。ＤＮＡ断片ｆｌａｎｋ  ３’およびｆｌａｎｋ  ５’の作成のために、１００μｌのプライマーｐ６０（配列番号１２）ならびにｐ５１（Ｐｖｅｇ構築のため）溶液、またはプライマーｐ６２（配列番号１４）ならびにｐ５１（Ｐｓｐｏ１５構築のため）溶液、および１００μｌのプライマーペアｐ４５ならびにｐ６１（配列番号１３）（Ｐｖｅｇ構築のため）溶液またはプライマーｐ４５ならびにｐ６３（配列番号１５）（Ｐｓｐｏ１５構築のため）溶液の１μｌを１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、および０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を含有する５０μｌ反応体積中の０．１μｇの１Ａ７４７染色体ＤＮＡに添加した。ＰＣＲ反応は、（ｉ）９４℃で３０秒間の変性ステップ、（ｉｉ）５２℃で３０秒間のアニーリングステップ、（ｉｉｉ）７２℃で１分間の伸長ステップの３つの逐次段階、３５サイクルで実施した。サイクルには９５℃で３分間のＤＮＡ変性ステップが先行した。２つのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（キアゲン）を使用してゲルから抽出した。最終ＰＣＲ反応では、２つの精製ＰＣＲ産物（ｆｌａｎｋ  ５’およびｆｌａｎｋ  ３’）をアセンブルした。１μｌの１００μＭプライマーｐ４５およびｐ５１溶液、１．０μｌのｆｌａｎｋ  ５’ＰＣＲ産物（５０ｎｇ）および１．０μｌのｆｌａｎｋ  ３’ＰＣＲ産物（５０ｎｇ）を混合して、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、および０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を含有する最終反応体積５０μｌにした。ＰＣＲ反応を（ｉ）９４℃で３０秒間の変性ステップ、（ｉｉ）５２℃で３０秒間のアニーリングステップ、（ｉｉｉ）７２℃で２．５分間の伸長ステップの３つの逐次ステップ、３５サイクルで実施した。ＰＣＲサイクルには、９５℃で３分間の変性ステップが先行した。アセンブルされたＰＣＲ生成物は、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して精製した。精製された全長ＰＣＲ産物（２μｇ）をコンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ３８１３細胞の形質転換のために使用した。細胞をＳＭＭプレート上に播種した。リボフラビン原栄養株バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）形質転換体を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁した。オリジナル細胞懸濁液の５００倍希釈の１００μｌをＴＢＡＢ寒天プレート上に播種した。単一コロニーを新鮮なＴＢＡＢ寒天プレート上に移し、ＴＢＡＢ寒天プレートに２ｍｇ／ＬのＮｍおよび１００ｍｇ／Ｌのリボフラビンを添加した。正しい形質転換体はＴＢＡＢ寒天プレート上のみで生育し、したがってネオマイシン感応性であった。さらに新たに組み込まれたプロモーター、ｒｉｂリーダー、およびｒｉｂＤの配列決定によって遺伝子型を確認した。Ｐｖｅｇによって駆動されるｒｉｂオペロンのあ���株をＢＳ３８１１と称し、Ｐｓｓｐｏ１５によって駆動されるｒｉｂオペロンのある株をＢＳ３８１７と称した。
【０１１５】
強力プロモーターとリーダー改変とを組み合わせるために、実施例２の記載されたＰＣＲ反応の全てで、１Ａ７４７株のｇＤＮＡをＢＳ３８１１株（Ｐｖｅｇプロモーター）およびＢＳ３８１７株（Ｐｓｐｏ１５プロモーター）のｇＤＮＡによってそれぞれ置換した。プライマーペアの使用をはじめとする各ＰＣＲ反応のその他の条件は、全て同じままであった。最終ＰＣＲ産物をＢＳ３８１３に形質転換して、得られた形質転換体を記載されるように検証した（実施例２）。コンストラクトＰｓｐｏ１５_ｌｅａｄｅｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎの場合、表４に示すようにｆｌａｎｋ  ５’ＰＣＲ産物のためのプライマーペアｐ４５／ｐ９５、およびｆｌａｎｋ  ３’ＰＣＲ産物のためのｐ９６／ｐ５１を使用した。全てのその他のステップは、上述のように実施した。以下のコンストラクトを作り出し、そのコンストラクトで形質転換して得られる枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の名称を括弧内に示す。Ｐｖｅｇｄｅｌ  ｆｌａｎｋ−ｒｉｇｈｔ（ＢＳ３８４０）、Ｐｓｐｏ１５＿ｄｅｌ  ｆｌａｎｋ−ｒｉｇｈｔ（ＢＳ３８３１）、Ｐｖｅｇ＿ｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＢＳ３８４４）、Ｐｓｐｏ１５＿ｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＢＳ３８７１）、Ｐｓｐｏ１５＿ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ＢＳ３８７４）、Ｐｓｐｏ１５＿ｌｅａｄｅｒ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ＢＳ３９４４）、Ｐｖｅｇ＿ＲＫ４１（ＢＳ３８８７）、Ｐｖｅｇ＿ＲＫ１ａ（ＢＳ３９５３）、Ｐｓｐｏ１５＿ＲＫ１ａ（ＢＳ３８８４）、Ｐｖｅｇ＿ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ（ＢＳ３９１２）。
【０１１６】
上述の株からＰＢＳ−１溶解産物を調製して、ＢＳ３７９８に形質導入した。形質導入細胞をＳＭＭプレート上で選択した。リボフラビン原栄養株枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁した。オリジナル細胞懸濁液の５００倍希釈の１００μｌをＴＢＡＢ寒天プレート上に播種した。単一コロニーを新鮮なＴＢＡＢ寒天プレート上に移し、ＴＢＡＢ寒天プレートに２ｍｇ／ＬのＮｍおよび１００ｍｇ／Ｌリボフラビンを添加した。正しい形質転換体はＴＢＡＢ寒天プレート上のみで生育し、したがってネオマイシン感応性であった。以下の株を作り出した。ＢＳ３９５３からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３９７０およびＢＳ３９７１；ＢＳ３８８４からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３９０５およびＢＳ３９０７；ＢＳ３８８７からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３９０３およびＢＳ３９１４；ＢＳ３９１２からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３９８１−８３；ＢＳ３８４０からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３８９０；ＢＳ３８４４からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３８８０およびＢＳ２８８２；ＢＳ３８１７からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３８５０およびＢＳ３８５１；ＢＳ３９４４からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ５０２６およびＢＳ５０４１；ＢＳ３８３１からのＰＢＳ−１溶解産物で形質導入されたＢＳ３８５３；ＢＳ３８７４からの溶解産物で形質導入されたＢＳ３８９７およびＢＳ３９５６。
【０１１７】
大部分の株は、上述のように振盪フラスコ内でリボフラビン生産について試験した。４８時間後、ＮａＯＨの添加によって５００μｌサンプルのリボフラビンを溶解し、中和して遠心分離後、処理済サンプルのリボフラビン濃度をＤＭＲＬおよびオキソルマジンの濃度と共に、ＨＰＬＣによって測定した。炭素源からのリボフラビン収率の計算のために、全ての炭素源の開始および残留濃度をＨＰＬＣによって測定した。結果を表３に示す。
【０１１８】
【表４】
0005787089.tif 000005
【０１１９】
【表５】
0005787089.tif 000006
【０１２０】
ｒｉｂリーダーまたはｒｉｂプロモーターに対して行われた操作は全て、リボフラビン生産の増大をもたらした。実施例２に記載される結果（表２参照）によれば、ｒｉｂＯ突然変異ＲＫ４１はまた、天然プロモーターをより強力な構成プロモーターで置換した場合に最も効果的であった。強力プロモーターを使用することにより、ＰｖｅｇとＲＫ４１との組み合わせで最大４．２％の収率が達成された。意外にもＰｓｐｏ１５とＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎとの組み合わせは２番目に最良の収率３．８％を示し、それは２．４％の収率をもたらしたＰｓｐｏ１５とｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒとの組み合わせよりもはるかに良い。
【０１２１】
ｒｉｂリーダーまたはｒｉｂプロモーターに対して行われた全ての操作は、リボフラビン生産の増大をもたらした。実施例２に記載される結果（表２参照）によれば、ｒｉｂＯ突然変異ＲＫ４１はまた、天然プロモーターをより強力な構成プロモーターで置換した際に、最も効果的であった。強力プロモーターを使用することにより、ＰｖｅｇとＲＫ４１との組み合わせで最大４．２％の収率が達成された。意外にもＰｓｐｏ１５とＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎとの組み合わせは２番目に最良の収率３．８％を示し、それは２．４％の収率をもたらしたＰｓｐｏ１５とｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒとの組み合わせよりもはるかに良い。
【０１２２】
［実施例４：ｒｉｂＯ突然変異とリーダー欠失との組み合わせ、および強力構成的プロモーターによる天然ｒｉｂプロモーター置換］
典型的な調節解除ｒｉｂＯ突然変異とリーダー欠失との組み合わせが、リボフラビン生産を増大できるかどうかを見るために、実施例２および３で作り出した突然変異のいくつかを組み合わせた。構築は上で概説したプロトコルに従った。ｆｌａｎｋ  ５’および３’ＰＣＲのテンプレートおよびプライマーペアを表４に示す（より詳しくは実施例１もまた参照されたい）。ＰＣＲのアセンブルおよびＢＳ３８１３への形質転換は、実施例２および３に記載されるように実施した。配列決定は、２つの追加的突然変異、すなわちＴ２５ＧおよびＣ１０１Ｔが、コンストラクトＰｓｐｏ１５＿ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ＿ｄｅｌ  ｍｒｏ１７５およびＰｖｅｇ＿ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ＿ｄｅｌ  ｍｒｏ１７５中に存在することを明らかにし、ここで番号付けは配列番号４２に関連する。新たに作り出されたコンストラクトを有する新たな株の名称を表４の４欄に示す。
【０１２３】
新たに作り出された株からＰＢＳ−１溶解産物を調製して、ＢＳ３７９８（実施例１で作成）の形質導入のために使用した。ＳＭＭプレート上での形質導入細胞の選択は、実施例２に記載されるように実施した。新たに形質導入された株は、表４の５欄で示すように命名される。
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
新たに作り出された株のリボフラビン生産に関する試験は、上述の振盪フラスコスクリーニングによって実施した。表５に示す結果は、実施例３（表４参照）に示す結果と比較して、リボフラビン生産のさらなる増大を示す。ｒｉｂＯ突然変異ＲＫ４１およびｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯのそれぞれと、強力プロモーターおよびｒｉｂリーダー欠失との組み合わせは、振盪フラスコスクリーニングにおいて、リーダー欠失のない最良の組み合わせであるＰｖｅｇプロモーターとｒｉｂＯ突然変異ＲＫ４１（表４参照）との組み合わせで達成される４．２％と比較して、７．６％を超えるリボフラビン収率をもたらす。本明細書に記載される特定のリーダー欠失は、調節解除（ｒｉｂＯ突然変異構成的プロモーター）ｒｉｂリーダーとプロモーターとの組み合わせの収率をほぼ倍増した。「ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ」以外には、「ｄｅｌ  ｍｒｏ１７５」もまた、欠失のないコンストラクトに比べてＲＢ５０バックグラウンド中でリボフラビン収率を意外にも改善できた。ターミネーターの欠失（「ｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」）はまた、ポジティブであるがあまりはっきりしない効果も有した。ｒｉｂＤのシャイン−ダルガノ配列の直前にＰｓｐｏ１５が配置されるリーダー欠失コンストラクトは、最良のｔｒｉｐｌｅコンストラクト（ＢＳ５０２６、表４および６参照）よりも３．６倍より低い収率を示した。これらの結果は、ｒｉｂリーダーが全長転写物の調節のためだけでなく、安定化のためにも必要であることを示す。
【０１２６】
【表７】
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【０１２７】
［実施例５：天然ｒｉｂリーダーをｍＲＮＡ安定化因子で置換する］
ａｐｒＥ  ｍＲＮＡのＤＮＡ配列安定化因子を２つのＰＣＲ産物全体に分配する。ａｐｒＥ  ｍＲＮＡ安定化因子の５’末端にｒｉｂオペロンの５’領域を含有するＰＣＲ産物１を増幅するために、標準ＰＣＲ条件下でプライマーｐ４５ならびにｐ１４３’（配列番号３３）およびＢＳ３８１７株からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用した。ａｐｒＥ  ｍＲＮＡ安定化因子の３’末端にｒｉｂＤを含有するＰＣＲ産物２を増幅するために、標準ＰＣＲ条件下でプライマーｐ５１ならびにｐ１４２（配列番号３２）およびＢＳ３８１７株からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用した。標準ＬＦＨ−ＰＣＲ反応では、既述したようにゲル精製されたＰＣＲ産物１および２を１つのＤＮＡ断片にアセンブルした。ＢＳ３８１７株からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして、最初の２回のＰＣＲのためにプライマーペアｐ４５／ｐ１４５’（配列番号３５）およびプライマーペアｐ５１／ｐ１４４（配列番号３４）を使用して、同一方法をｇｒｐＥ  ｍＲＮＡ安定化因子に使用し、上述の条件下でプライマーペアｐ４５／ｐ５１を使用したＰＣＲのアセンブルがそれに続いた。精製されたＬＦＨ−ＰＣＲ産物をリボフラビン栄養要求枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ３８１３株のコンピテント細胞に再度形質転換し、その中でリボフラビンプロモーター領域およびｒｉｂＤの５’部分をネオマイシン抵抗性カセットによって置換した。リボフラビン原栄養株形質転換体をＳＭＭプレート上で選択した。単離された形質転換体を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁した。オリジナル細胞懸濁液の５００倍希釈の１００μｌをＴＢＡＢ寒天プレート上に播種した。単一コロニーを新鮮なＴＢＡＢ寒天プレート上に移し、ＴＢＡＢ寒天プレートに２ｍｇ／ＬのＮｍおよび１００ｍｇ／Ｌのリボフラビンを添加した。正しい形質転換体はＴＢＡＢ寒天プレートのみの上で生育し、したがってネオマイシン感応性であった。さらに新たに導入されたＤＮＡストレッチの配列決定によって遺伝子型を確認した。得られた株は、それぞれＢＳ５１９３（Ｐ１５ΩαｐｒＥｒｉｂＤＥＡＴＨＴを有するコンストラクト）およびＢＳ５１９６（Ｐ１５ΩｇｒｐＥｒｉｂＤＥＡＴＨＴを有するコンストラクト）と称される。
【０１２８】
ＢＳ５１９３株およびＢＳ５１９６株からのＰＢＳ−１溶解産物を調製して、ＢＳ３７９８（実施例１で作成）の形質導入のために使用した。ＳＭＭプレート上での形質導入細胞の選択は、実施例２に記載されるように実施した。ＢＳ５１９３株をベースとする新たな形質導入株は、それぞれＢＳ５２６０およびＢＳ５２６２と称され、ＢＳ５１９６株をベースとする新たな形質導入株はＢＳ５２４４と称された。
【０１２９】
リボフラビン生産を上述のように振盪フラスコ実験で試験した。結果を表６に示す。
【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
ｒｉｂプロモーターをPｓｐｏ１５のような非制御的構成的プロモーターで置換することは、制御的野生型ｒｉｂオペロンと比較して、振盪フラスコスクリーニングにおけるリボフラビン収率を野生型バックグラウンドで４１倍、ＲＢ５０バックグラウンドで３．４倍増大させた。ｒｉｂリーダーを除去してPｓｐｏ１５プロモーターをｒｉｂＤの直前に配置させると、リボフラビン収率は再度、野生型宿主株で７倍に、ＲＢ５０バックグラウンドで１．４倍増大した。ｒｉｂリーダーをａｐｒＥ  ｍＲＮＡ安定化因子で置換しても、上の２つの株バックグラウンドにおける収率に対する影響を示さなかった。しかし、ｒｉｂリーダーをｇｒｐＥ  ｍＲＮＡ安定化因子で置換することにより、リボフラビン収率は野生型宿主で３．７倍、ＲＢ５０バックグラウンドで１．４４倍増大した。
【０１３３】
改変ｒｉｂオペロン性能に関する宿主株の影響を調べるために、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７（野生型ｒｉｂオペロン）、ＢＳ５１９３、ＢＳ５１９６、およびＢＳ３９４４からの溶解産物をＢＳ５１７８（ｓｐｏ０Ａ−，ｒｉｂ：：ｎｅｏ，ｒｉｂＣ１，ｂｐｒ：：ｃａｍ，ｔｋｔｍｕｔ）と称される別のＲＢ５０変異株にも形質導入した。振盪フラスコスクリーニングを上述のように実施した。新たに構築された株の名称を含む結果を表７に示す。
【０１３４】
【表１０】
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【０１３５】
新しい株バックグラウンドでは、振盪フラスコ様式で試験すると、安定化因子の好ましい効果がより明白であった。ここではａｐｒＥ  ｍＲＮＡ安定化因子もまた、リーダーのないｒｉｂオペロンを有する株と比較してリボフラビン収率を４０％増大させた。ｇｒｐＥ  ｍＲＮＡ安定化因子は、ｒｉｂリーダーのないコンストラクトと比較して収率に２．７倍の増大さえも示した。
【０１３６】
新しい株バックグラウンドでは、振盪フラスコ様式で試験すると、安定化因子の好ましい効果がより明白であった。ここではａｐｒＥ  ｍＲＮＡ安定化因子もまた、リーダーのないｒｉｂオペロンを有する株と比較してリボフラビン収率を４０％増大させた。ｇｒｐＥ  ｍＲＮＡ安定化因子は、ｒｉｂリーダーのないコンストラクトと比較して収率に２．７倍の増大さえも示した。
【０１３７】
［実施例６：追加的ｒｉｂＯ突然変異のリーダー欠失と強力構成的プロモーターとの組み合わせ］
ｒｉｂＯ突然変異ＲＫ４１（＝ＲＫ６１ａ）と同様に、Ｋｉｌら，１９９２年のｒｉｂＯ突然変異ＲＫ４、ＲＫ８、ＲＫ５（＝ＲＫ２）が組み合わさったＲＫ１ａおよび「ｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ」をｒｉｂリーダーに導入し、代案の最適化されたｒｉｂリーダー作成のために、Ｋｉｌら，１９９２年に記載される追加的ｒｉｂＯ突然変異を使用した。突然変異の番号付けは、配列番号４２に記載されるｒｉｂリーダー配列を参照する。記載されている突然変異ＲＫ１１１ａ（Ｇ５９Ａ）、ＲＫ１１６ａ（Ｇ５６Ａ）、ＲＫ６２ａ（Ｇ６０Ａ；ＲＫ８２ａと同一である）、ＲＫ９３ａ（Ｃ８７Ｔ）、およびＲＫ２７ａ（Ｃ１２８Ｔ）は、ｆｌａｎｋ  ５’およびｆｌａｎｋ  ３’作成のために使用されるテンプレート次第で、強力構成的プロモーターＰｓｐｏ１５またはＰｖｅｇと共に、ｄｅｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎおよびｄｅｌ  ｍｒｏ１７５（上記参照）と組み合わせられる。ｒｉｂＯ突然変異として有効なあらゆる突然変異が、このようにして記載されるプロモーターおよびリーダー欠失と組み合わせ得る。
【０１３８】
ｒｉｂＯ突然変異構築のために、以下のプライマーペアを使用した。プライマーペアｐ１１１ａ_ｆ／ｐ１１１ａ_ｒ（配列番号８３および８４）の構築のためにＲＫ１１１ａ、プライマーペアｐ１１６ａ_ｆ／ｐ１１６ａ_ｒ（配列番号８５および８６）の構築のためにＲＫ１１６ａ、プライマーペアｐ６２ａ_ｆ／ｐ６２ａ_ｒ（配列番号８７および８８）の構築のためにＲＫ６２ａ、プライマーペアｐ９３ａ_ｆ／ｐ９３ａ_ｒ（配列番号８９および９０）の構築のためにＲＫ９３ａ、およびプライマーペアｐ２７ａ_ｆ／ｐ２７ａ_ｒ（配列番号９１および９２）の構築のためにＲＫ２７ａ。これらのプライマーを実施例２で記載されるように、ＰＣＲ反応で使用する。ｆｌａｎｋ  ５’の作成のためには、アンチセンスプライマーと共にプライマーｐ４５を応用する。ｆｌａｎｋ  ３’の作成のためには、プライマーｐ５１と共にセンスプライマーを応用する。Ｆｌａｎｋ  ５’および３’は、プライマーｐ４５およびｐ５１を使用して３回目のＰＣＲでアセンブルする（実施例２参照）。株の形質転換および形質導入は、実施例２で記載されるように実施する。天然プロモーターの代替では実施例３に記載の指示、ｒｉｂＯ突然変異とリーダー突然変異との組み合わせでは実施例４に記載の指示に従った。
【０１３９】
【表１１】
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【０１４０】
表９に列挙する全てのコンストラクトで生じたＰＣＲ産物をＢＳ３８１３に形質転換する。選択は実施例２に記載されるように行い、確認された株の溶解産物をＢＳ３７９８の形質導入のために使用する。上述のフラスコ振盪実験で得られるリボフラビンの収率は、コンストラクトＲＫ４１_ＳＷＩＴＣＨ  ｄｅｌｅｔｉｏｎまたはｔｒｉｐｌｅ  ｒｉｂＯ＿ｄｅｌ  ｍｒｏ１７５（表５参照）の範囲と同様である。これらの量は、例えば実施例５に記載される別の株バックグラウンドを使用すると、なおも増大する。
【０１４１】
［実施例７：枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）以外の改変ｒｉｂリーダー配列有株の作成］
上の実施例で記載されるコンストラクトを使用して、定位置にｒｉｂｏスイッチを有することが知られており、リボフラビン生産の適切な宿主株であるその他の株からのｒｉｂリーダー配列中に、対応する改変を同定／作成し得る。
【０１４２】
Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ３０，３１４１〜３１５１頁，２００２年の図２に描写されるアラインメントに従って、非改変ｒｉｂリーダーの対応部分をその他の生物中で同定した。欠失突然変異を上述のように生じさせて、任意に（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で同定されたものと相同的な）ｒｉｂＯ突然変異と組み合わせる。コンストラクトは、当業者に知られている適切な培養条件下でリボフラビン生産を増大させるために、強力プロモーター、または上述のような宿主株のその他の既知の改変とさらに組み合わせ得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【配列表】
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