(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵β細胞塊を測定する方法であって、
ａ）膵β細胞を標識する対象としてＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームを用いて、膵臓組織中の膵β細胞を可視化する工程、及び
ｂ）前記膵臓組織中の標識されたＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームから膵β細胞の量を定量化する工程を含む、方法。
【請求項２】
膵β細胞関連障害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための診断用組成物の調製における、ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームの使用。
【請求項３】
膵β細胞関連障害のｉｎ  ｖｉｖｏ診断の判断材料を提供する方法であって、
ａ）ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームが標識された被検体を準備する工程、
ｂ）膵臓中の標識されたＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームが存在する膵β細胞集団を、ＰＥＴ、ＰＥＴ−ＣＴ、ＳＰＥＣＴ、又はＭＲＩを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで可視化する工程、
ｃ）前記被験体における膵β細胞の量を定量化する工程、
ｄ）工程ｃ）において得られた膵β細胞塊のデータを健常被験体の膵β細胞塊のデータ、又は同じ被験体の以前の分析の膵β細胞塊のデータと比較する工程、及び
ｅ）工程ｃ）において得られた膵β細胞塊のレベルが、健常被験体の膵β細胞塊のレベルと比較して低下している場合に、該被験体を糖尿病であるか、又は糖尿病を患う危険性があり、かつ工程ｃ）において得られた膵β細胞塊のレベルが、健常被験体の膵β細胞塊のレベル、又は同じ被験体の以前の分析の膵β細胞塊のレベルと比較して上昇している場合に、該被験体を高インスリン血症であるか、又は高インスリン血症を患う危険性がある、と診断する判断材料を提供する工程を含む、方法。
【請求項４】
膵β細胞関連障害が１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、高インスリン血症、又は膵癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
膵β細胞関連障害が１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、高インスリン血症、又は膵癌である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
被験体において膵β細胞塊を特異的に測定するか、及び／又は膵β細胞関連障害を診断するか、及び／又は膵β細胞を精製するためのキットであって、ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォーム及び／又はこれに結合する抗体を含む、キット。
【請求項７】
被験体における膵β細胞移植の成功の判断材料を提供する方法であって、
ａ）ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームを検出する請求項１に記載の方法を使用して、被験体に膵β細胞を移植した後一定期間内の該被験体における膵β細胞の量を測定する工程、及び
ｂ）膵β細胞塊を経時的に比較することにより該移植の成功の判断材料を得る工程を含む、方法。
【請求項８】
膵β細胞を膵臓組織の非膵β細胞と区別し精製又は単離するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標識する対象としてＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームを使用して膵β細胞をタグ付けする工程、及び
ｂ）標識された膵β細胞を、非標識細胞から膵β細胞上のタグによって単離し、それにより実質的に純粋な膵β細胞調製物を得る工程を含む、方法。
【請求項９】
再生された膵β細胞を特定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標識する対象としてＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームを使用して膵β細胞をタグ付けする工程、
ｂ）標識された膵β細胞を、非標識細胞から膵β細胞上のタグによって単離し、それにより実質的に純粋な再生膵β細胞調製物を得る工程、
ｃ）免疫組織化学を実行し、それにより新たに再生された膵β細胞の数を特定すると共に、新たな膵β細胞塊を確定する工程、及び
ｄ）治療戦略を追跡調査すると共に、膵β細胞塊の回復を検出する工程を含む、方法。
【請求項１０】
タグが磁性ビーズ、常磁性ビーズであり、膵β細胞塊がＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）によって測定され得る、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
機能的インスリン発現細胞を誘導するために膵β細胞の幹細胞集団を特定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標識する対象としてＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームを使用して処理した膵β細胞の幹細胞をタグ付けする工程、及び
ｂ）標識した該幹細胞を、非標識細胞から潜在的膵β細胞幹細胞上のタグによって単離し、それにより実質的に純粋な膵β細胞幹細胞調製物を得る工程を含む、方法。
【請求項１２】
ｃ）免疫組織化学を実行し、それにより膵β細胞幹細胞の数を特定すると共に、新たな膵β細胞塊を確定する工程、及び
ｄ）治療戦略を追跡調査すると共に、新たに形成された膵β細胞の量を検出する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞に特異的に結合する新たな膵β細胞特異的トレーサー分子を特定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、候補トレーサー分子をＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞型又は細胞株と接触させると共に、該候補トレーサー分子と該細胞との相互作用を測定する工程、
ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、該候補トレーサー分子をＦＸＹＤ２−γ−ａ陰性細胞型又は細胞株と接触させると共に、該候補トレーサー分子と該細胞との相互作用を測定する工程、及び
ｃ）工程ａ）の該細胞と結合するが、工程ｂ）の該細胞とは結合しない候補トレーサー分子をβ細胞特異的トレーサー分子として保持する工程を含む、方法。
【請求項１４】
ＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞型又は細胞株が、齧歯類膵島、ラットＩＮＳ−１Ｅ、ＡＲ４２Ｊ細胞、及びヒトのＣＡＰＡＮ−２細胞から成る群から選択され、並びにＦＸＹＤ２−γ−ａ陰性細胞型又は細胞株がＰＡＮＣ−１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞に特異的に結合する新たな膵β細胞特異的トレーサー分子を特定するためのキットであって、ＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞型又は細胞株が、齧歯類膵島、ラットＩＮＳ−１Ｅ、ＡＲ４２Ｊ細胞、及びヒトのＣＡＰＡＮ−２細胞から成る群から選択され、並びにＦＸＹＤ２−γ−ａ陰性細胞型又は細胞株がＰＡＮＣ−１である、２つの細胞型又は細胞株を含む、キット。
【請求項１６】
ＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞に特異的に結合する新たな膵β細胞特異的トレーサー分子を特定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、候補トレーサー分子をＦＸＹＤ２−γ−ａ分子と接触させると共に、該候補トレーサー分子と該ＦＸＹＤ２−γ−ａ分子との相互作用を測定する工程、及び
ｂ）工程ａ）の該ＦＸＹＤ２−γ−ａ分子に結合する候補トレーサー分子を、膵β細胞特異的トレーサー分子として保持する工程を含む、方法。
【請求項１７】
膵臓組織試料中の膵β細胞を検出する方法であって、前記組織試料中の膵β細胞の標識としてＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームを使用することによる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療分野、特に膵β細胞塊の画像化及び定量化、糖尿病性障害の病理学及び／又は診断のための膵β細胞の標的化又は可視化、膵島移植の追跡調査、並びに膵β細胞の精製戦略に関する。
【０００２】
政府の権利に関する記載
この研究は、米国国際若年性糖尿病研究財団の助成金（ＪＤＲＦ−４−２００１−４３）により支援を受けた。国際若年性糖尿病研究財団は本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
現在の世界的規模での真性糖尿病の有病率は、罹患者がおよそ１億７０００万人であり、最近の予測では２０２５年までには全世界で３億人に増加すると示唆されている。欧州では罹患者は３０００万人を超える。患者の大半（約８５％）が２型真性糖尿病（Ｔ２Ｄ）であり、１型真性糖尿病（Ｔ１Ｄ）を患う患者は一部（１０％〜１５％）である。糖尿病は重篤な長期合併症及び心理社会的問題を引き起こし、罹患率及び若年死の大きな負担を課している。糖尿病は失明及び視覚障害、手足の切断、末期腎不全、並びに神経障害の主な原因である。これは脳卒中、心筋梗塞、及び心不全を含む心血管疾患の発生率の著しい増加と関連する。心血管疾患は欧州では糖尿病性患者の死者総数の５０％超を占める。Ｔ２Ｄはますます蔓延しており、より若年期に発症するようになり、罹病期間が数十年増加しているので、さらに多くの人々が重篤な糖尿病性合併症を発症し、苦痛によって人々の生活の質及び余命（expectancy）が低下している。
【０００４】
糖尿病は多くのコストを発生させるが、生涯にわたり、重大な医学的問題を引き起こすため特に費用がかかる。これらのコストには、医師の業務及び看護業務、病院業務、研究室業務、医薬品、患者の教育及び訓練による直接コスト、並びに研究時間のロス、長期看護及び全般的な社会経済援助、早期退職、長期化する病的状態及び若年死による間接コストが含まれる。
【０００５】
直接コスト及び間接コストの両方を含む真性糖尿病の全コストは各国で計算されており、莫大である。例えば、１人の患者を２５年の期間にわたって治療するコストは１０００００ユーロ〜２０００００ユーロ程度である。本発明は、早期検出を改善し、糖尿病を予防するか、及び／又は回復させる新規の治療法の開発を助けることにより、満たされていない莫大な要求をかなえ、ヘルスケア業界及び医用画像処理、画像化用のトレーサーの製造販売に従事する企業に絶好の機会を与える。
【０００６】
手のひらほどの大きさの臓器である膵臓は、胃の下部の裏側に位置する。膵臓は形態的にも生理的にも異なる２つの構造、すなわち消化に関与する酵素（アミラーゼ、リパーゼ等）及び重炭酸ナトリウムを産生する膵外分泌部、並びに血糖値の調節に関与するホルモン（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド）を産生する膵内分泌部から成る。膵内分泌部の細胞は、膵臓中に分散する島状の微小器官（ランゲルハンス島又は膵島）として組織化される。各々の膵島は４つの細胞型、すなわちα細胞、β細胞、δ細胞、及びＰＰ細胞で構成されている。α細胞は膵島の周辺部に位置し、グルカゴンを分泌する。β細胞は膵島の中央部に見られ、グルコースに反応してインスリンを分泌可能な唯一の細胞である。δ細胞は周辺部にあり、ソマトスタチンを分泌する。ＰＰ細胞の機能については、さらに議論の余地がある（膵臓ポリペプチドの合成）。
【０００７】
インスリンは、体がグルコースをエネルギーとして使用するのを助けるホルモンである。体が十分なインスリンを作らないか、インスリンを適切に用いることができないか、又はその両方の場合、グルコースが血液中に蓄積され、糖尿病が発症する。自己免疫疾患である１型真性糖尿病（Ｔ１Ｄ）では、膵臓のβ細胞は、体の免疫系によって攻撃され、破壊されているため、もはやインスリンを作ることはない。Ｔ１Ｄ患者は、生きるためにはインスリンを毎日摂取しなければならない。２型真性糖尿病（Ｔ２Ｄ）は通常、体がインスリンを効率的に用いるのが困難となるインスリン抵抗性と呼ばれる状態から始まる。時間とともにインスリン産生が同様に減少し、多くのＴ２Ｄ患者は最終的にはインスリンを摂取することが必要となる。
【０００８】
また、健常被験体と比較してβ細胞数が増加している患者においては、高インスリン血症と呼ばれる状態が起こる。高インスリン血症の患者は発作、精神遅滞、及び永久的脳障害を発症する危険性が高い。グルコースはＣＮＳによって使用される主要な基質であるため、未確認又は管理不良の低血糖症は、永続的で重篤な神経障害につながる可能性がある。一過性高インスリン血症は新生児に比較的よく見られる。糖尿病の母親から生まれた乳児、在胎週数に比べて小さいか若しくは大きい乳児、又は強いストレスを経験した乳児のインスリン濃度は高くなり得る。それに対し、先天性高インスリン血症は稀である。
【０００９】
インスリンの定期的な投与以外の糖尿病に対する治療のうち、糖尿病患者における血糖の生理的制御及び血糖の正常化のための１つのアプローチは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞からのインスリン分泌を回復させることである。動物からのインスリン産生細胞の異種移植、単離幹細胞のインスリン分泌細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化及び患者におけるその再移植、又は別の被験体から単離した膵島の同種移植といった幾つかの戦略が提案されている。
【００１０】
β細胞の研究のための細胞モデルの不足に加えて、このタイプの細胞に適した信頼性のある効果的な細胞選別手段の不足は、β細胞の機能の研究、したがって１型糖尿病及び２型糖尿病の新規の治療方法の開発の妨げとなる。
【００１１】
膵β細胞塊の画像化の現在の試みは、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）を用いるか、又はＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影法）及びＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピュータ断層撮影法）を用いることによって行なわれている。β細胞塊のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化には、非常に高い感度と共に高い空間分解能が必要とされる。ＭＲＩは空間分解能が最も高いが、その主要な問題はｅｘ  ｖｉｖｏ標識化手順及びその半定量的性質にある。ＭＲＩは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＳＰＩＯ（酸化鉄の小粒子）によるヒト膵島の標識化、及びその後の膵島移植によって首尾よく使用されてきた（非特許文献１）。このアプローチを用いると、移植β細胞塊を移植後６ヶ月まで追跡調査することが可能であった。しかしながら、この技法は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの膵島細胞によるマーカーの取り込みに依存するため、移植にしか使用可能でなく、膵臓におけるβ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化に使用することはできない。ＭＲＩは膵臓への糖尿病誘発性ＣＤ８＋Ｔ細胞の動員を追跡調査するため（非特許文献２）、Ｃｙ５．５標識アネキシン５プローブを用いてＴ１Ｄ進行時のアポトーシスを検出するため（非特許文献３）、又はＴ１Ｄ進行時の微小血管変性を検出するため（非特許文献４）にも使用されているが、検出される変化は半定量的である。
【００１２】
ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴは感度が非常に高く、ｅｘ  ｖｉｖｏでの標識化を必要としない。一方で、これらの技法の空間分解能はＭＲＩを下回る。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ画像化は、膵島特異的な受容体に結合する化合物を用いて、又は放射性トレーサーで標識した、膵島において輸送体によって特異的に取り込まれる化合物を用いて達成される。β細胞ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ画像化に使用される現在の基質の大半は、非β細胞、場合によっては膵臓中の外分泌細胞に結合するか又は取り込まれる。これはトレーサーの希釈及び高いバックグラウンドをもたらすため、全膵臓量の１％〜２％にしかならない小さな膵島（直径１００μｍ〜３００μｍ）において膵臓全体に散在するβ細胞を定量化するのは現在は不可能である。このことは、画像化又は標的化に使用することのできるβ細胞に特異的な細胞膜タンパク質を特定することの緊急の必要性を示している。
【００１３】
Paul Harrisのチームは、ヒト膵島において得られたマイクロアレイデータセットを外分泌細胞のデータセットと比較することによって、３５種の膵島組織に限定される膜貫通分子及び膜結合分子を特定した（非特許文献５）。候補の１つである小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）が、特異的リガンドＤＴＢＺを用いた膵β細胞塊の画像化に関するさらなる研究のために選択された。しかしながら、近年では、β細胞が全滅してもＶＭＡＴ２の結合がもたらされることが示されており、ＤＴＢＺは膵β細胞塊画像化の良好なバイオマーカーではないことが示される（非特許文献６）。
【００１４】
これまで特定された幾つかのβ細胞特異的膜タンパク質の１つに、亜鉛輸送体ＺｎＴ８（又はＳＬＣ３０Ａ８）がある（非特許文献７、非特許文献８）。ＺｎＴ８は膵β細胞においてインスリンと共局在化する（非特許文献９）。Avalon（特許文献１及び特許文献２）及びCEA（特許文献３、特許文献４、及び特許文献５）は、このタンパク質がβ細胞特異的であるという事実、並びに癌の療法及び抗体試験での使用のためにＳＬＣ３０Ａ８（又はＺｎＴ８）に対する抗体を利用することを特許に採用している。
【００１５】
近年では、ＳＬＣ３０Ａ８が自己抗原であり、１型糖尿病における自己抗体の標的であるとして特定された（非特許文献１０）。したがって、ＳＬＣ３０Ａ８はβ細胞の検出に有用ではない。
【００１６】
Biogen-IDEC社は、膵島細胞のβ細胞において（非特許文献１１）及び腎臓（非特許文献１２）において特異的に発現される免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子であるＫｉｒｒｅｌ  ２（フィルトリン（filtrin）又はＮＥＰＨ３）を特定した。この候補は発現レベルが非常に低いため、β細胞の検出に有用ではない。近年、デンシン（densin）及びフィルトリンが自己抗原として働くことができ、これらに対する自己抗体がＴ１Ｄ患者において検出されることが示されている（非特許文献１２）。しかしながら、この候補の発現は低過ぎるため、β細胞検出に有用ではない。
【００１７】
β細胞増殖を刺激し（非特許文献１３）、細胞膜から切断され、脱落するβ細胞タンパク質としてＴｍｅｍ２７（又はコレクトリン）が特定された。Ｔｍｅｍ２７は、β細胞よりも膵島非β細胞において高度に発現されるため、本発明者らのバイオマーカーリストに残っていない。
【００１８】
遊離脂肪酸受容体ＧＰＲ４０（ＦＦＡＲ１とも呼ばれる）は、膵島特異的であり、Ｔ２Ｄの治療に対する有力な標的であるとして近年特定されたＧタンパク質共役（G-coupled）受容体である（非特許文献１４）。近年では、膵β細胞の画像化に対する有力な候補バイオマーカーであることが示唆されている。しかしながら、この受容体は膵島β細胞及びα細胞の両方で発現されるため（非特許文献１５）、良好なβ細胞バイオマーカーとしての可能性が妨げられる。
【００１９】
脂肪酸受容体ＧＰＲ１１９はβ細胞特異的受容体として特定されたが（非特許文献１６、非特許文献１７）、オレオイルエタノールアミド（ＯＥＡ）／リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）で活性化されたＧＰＲ１１９は、グルコース誘発性インスリン分泌に関与する。これらの代謝物受容体が、細胞膜の外面でβ細胞塊を画像化するのに十分に高い濃度に達しているか否かを決定する必要がある（非特許文献１８）。ＧＰＲ１１９は近年、膵島非β細胞中で特定されたが（非特許文献１９）、選択的小分子ＧＰＲ１１９アゴニストＰＳＮ６３２４０８が食物摂取を抑制し、体重増加及び白色脂肪組織沈着を減少させたため（非特許文献２０）、ＧＰＲ１１９が他の組織においても発現されることが示される。
【００２０】
ランダムファージディスプレイ２０ｍｅｒペプチドライブラリを、新たに単離したラット膵島に対してスクリーニングしたが、選択したペプチドのいずれも他の組織と比べた膵島への結合に関して、画像化に使用するのに十分に選択的でなかった（非特許文献２１）。
【００２１】
膵臓を研究するＰＥＴ画像化チームはβ細胞を画像化することも試みている。このために、チームは選択的に結合するか、又は膵島特異的輸送体及び受容体により取り込まれると想定される化合物を使用している。これらの化合物の例としては、グリベンクラミド、トルブタミド、セロトニン、Ｌ−ＤＯＰＡ、ドーパミン、ニコチンアミド、フッ化デオキシグルコース、及びフルオロジチゾン（fluorodithizone）が挙げられる。グリベンクラミド及びフルオロジチゾンは、ＰＥＴ画像化によるβ細胞塊の定量化に必要とされる、バックグラウンド比に対して強いシグナルを得るには十分に特異的ではない。Ｆ−デオキシグルコース（ＦＤＧ）は、β細胞塊を首尾よく定量化するために使用することはできなかったが（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４）、局所性インスリン過剰症と、びまん性インスリン過剰症とを区別するために使用することができた（非特許文献２５及び非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０）。
【００２２】
膵β細胞を画像化するためにこれまで使用されてきた中で最も有望な化合物は、Ｆ１８−ＤＯＰＡ及びジヒドロテトラベナジン（ＤＴＢＺ）（どちらもＶＭＡＴ２輸送体によって取り込まれる基質である）（非特許文献３１、非特許文献３２）、並びにグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）又はエキセンディン（ＧＬＰ−１受容体に結合するリガンド）である（非特許文献３３、非特許文献３４）。残念なことに、上記の化合物は全て、過度に高いバックグラウンドレベルをもたらし、他の様々な腹腔内組織、例えば腎臓及び肝臓に非特異的に結合する。
【００２３】
上記のように、Paul Harrisのチームは、β細胞画像化の潜在的ツールとして小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）及びそのリガンドであるＤＴＢＺを特定した。ＤＴＢＺをＣ−１１及びＦ−１８で標識すると、齧歯類及び霊長類において膵臓による高度の取り込みが得られた（非特許文献３５）。残念なことに、β細胞を完全に根絶しても、膵臓によるＤＴＢＺの取り込みは３０％〜４０％しか低下せず、該化合物がβ細胞塊を評価するために使用することが可能なほどには十分なβ細胞に対する特異性を欠くことが示された（非特許文献３６）。
【００２４】
インスリン（Ｋ１４Ｄ１０）、スルファチド（ＩＣ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、又はタンパク質チロシンホスファターゼ（ＩＡ２）に指向性を有する幾つかの自己抗体が特定されている。Ian Sweetのチームは、β細胞の画像化／標的化のためにβ細胞特異抗体（Ｋ１４Ｄ１０）及びそのＦａｂ断片を使用したが、血中クリアランスが最良の抗体断片でも膵臓において優先的に蓄積しなかった。核画像化のために放射性同位体キレート剤で修飾したモノクローナル抗体ＩＣ２（非特許文献３７、非特許文献３８）は、極めて特異的な結合及びβ細胞への蓄積を示し、膵外分泌部又は間質組織には実質的に結合しなかった（非特許文献３９）。しかしながら、スルファチドは膵島細胞を支配するシュワン細胞及び他の神経組織においても発現されるため、β細胞画像化における使用が妨げられ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】欧州特許第１５１３９５１号明細書
【特許文献２】国際公開第０３０９７８０２号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６２４６４４２号明細書
【特許文献４】欧州特許第１５６３０７１号明細書
【特許文献５】国際公開第２００４０４６３５５号パンフレット
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Evgenov et al 2006
【非特許文献２】Moore A et al, 2004
【非特許文献３】Medarova Z. et al, 2006
【非特許文献４】Medarova Z. et al 2007
【非特許文献５】Maffei et al 2004
【非特許文献６】Kung et al 2007
【非特許文献７】Chimienti F et al 2004
【非特許文献８】Seve et al 2004
【非特許文献９】Chimienti et al 2006
【非特許文献１０】Wenzlau JM et al., 2007
【非特許文献１１】Sun C. et al, 2003
【非特許文献１２】Rinta-Valkama J et al 2007
【非特許文献１３】Fukui K et al, 2005
【非特許文献１４】Bartoov-Shifman R et al 2007
【非特許文献１５】Flodgren E et al 2007
【非特許文献１６】Frederiksson R et al, 2003
【非特許文献１７】Chu et al 2007
【非特許文献１８】Madiraju SR et al 2007
【非特許文献１９】Sakamoto Y et al, 2006
【非特許文献２０】Overton HA et al, 2006
【非特許文献２１】Samli KN et al 2005
【非特許文献２２】Malaisse WJ et al. 2000
【非特許文献２３】Ruf J et al. 2006
【非特許文献２４】Nakajo M. et al., 2007
【非特許文献２５】de Lonlay P et al 2005
【非特許文献２６】de Lonlay P et al 2006
【非特許文献２７】Otonkoski T et al 2006
【非特許文献２８】Kauhanen S et al 2007
【非特許文献２９】Ribeiro MJ et al, 2007
【非特許文献３０】Hardy OT., et al 2007
【非特許文献３１】Souza F. et al 2006
【非特許文献３２】Simpson NR. et al. 2006
【非特許文献３３】Gotthardt M. et al, 2002
【非特許文献３４】Wild M. et al. 2006
【非特許文献３５】Souza et al, 2006
【非特許文献３６】Kung et al 2007
【非特許文献３７】Brogren CH et al 1986
【非特許文献３８】Buschard K et al 1988
【非特許文献３９】Moore A et al, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
したがって、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞に対して特異的な、信頼性のあるマーカーが不足しており、信頼性のあるβ細胞塊の定量化は可能ではない。本発明の目的の１つは、かかるマーカーを提供することである。
【００２８】
本発明の候補はβ細胞に特異的であり、β細胞特異的標的化及び非侵襲的画像化に使用することができる。本発明の候補は炎症によって誘発されず、膵臓の周辺組織において発現されない。これらのバイオマーカーに対する標的化戦略の使用は、β細胞塊の低下の早期特定、及び膵島移植、β細胞再生の試み等を含む糖尿病に対する治療法の追跡調査を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、膵β細胞の細胞膜中に位置するバイオマーカー群に関する。これらのバイオマーカーは、ヒト膵島において得られる大規模並列シグネチャー配列決定データセット、並びにヒト膵島、精製したラットの初代β細胞及び非β細胞及びインスリノーマ細胞に関するAffymetrixマイクロアレイデータセットに対するシステム生物学のアプローチによって選択される。一連の特異的な特徴に基づくと、これらのバイオマーカーは、健康及び疾患（Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ、膵癌、又は膵島移植）において膵β細胞塊を研究するための画像化及び標的化戦略に対する特異な候補である。
【００３０】
選択されるバイオマーカーの５つの特異的特徴は以下である：
１）周辺組織（全膵臓／外分泌組織、肝臓、腸、脾臓、胃）と比較して、膵島において選択的に発現されること、
２）膵α細胞又は他の膵島非β細胞よりも膵β細胞において高度に発現すること、
３）膵β細胞における発現レベルが、膵β細胞において特異的に発現される酵素であるグルコキナーゼよりも高いか、又はそれと同程度であること、
４）膜中に位置し、且つそれ自体が画像化、標的化、及び免疫組織化学を可能にする抗体、ペプチド、又は小分子によって標的化可能であること、
５）β細胞塊の炎症過程で発現が誘導されず、且つ該タンパク質はＴ細胞及び樹状細胞、又は炎症過程に関与する他の細胞において富化され（enriched）ないこと。
【００３１】
これらのバイオマーカーに指向性を有する標識抗体、アプタマー、相互作用タンパク質、又はリガンドは、β細胞に特異的な定量化（mass quantification）を可能にし、糖尿病／膵癌の進行を評価し、膵臓疾患の状態のより早期の予測をもたらし、より早期の介入及び糖尿病を治癒又は停止させる機会の増加を可能にし、膵島移植後のβ細胞塊の追跡調査を可能にする。
【００３２】
本発明のバイオマーカーは、他の数多くのβ細胞表面タンパク質と同様、Ｔ１Ｄにおける自己免疫に対する潜在的標的でもある場合があり、したがって自己抗体に対する標的であり得る。これらの自己抗体の検出はＴ１Ｄの予測を可能にし得る。
【００３３】
本発明のバイオマーカーの別の用途は、１型及び２型糖尿病を患い、膵島移植後である患者におけるβ細胞塊の追跡調査である。β細胞の画像化は、糖尿病におけるβ細胞塊の減少を防ぐこと、又はβ細胞塊を再生によって回復させることを目的とした新たな治療法の臨床試験のための代理マーカーとしても有用である。バイオマーカーは、Ｔ１Ｄ又は移植の場合に炎症を止めるために薬剤を送達することも目的とし得る。
【００３４】
本発明はしたがって、膵β細胞塊を特異的に測定するための、ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃから成る群から選択されるマーカーの使用を提供する。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００３５】
代替的な実施の形態では、本発明は、膵β細胞塊を測定する方法であって、
ａ）試料中のβ細胞を、ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及び／又はＦＸＹＤ２−γ−ｃ等の１つ又は複数のＦＸＹＤ２−γアイソフォームに特異的に結合する標識分子を用いて可視化する工程、
ｂ）標識されたβ細胞の量を定量化する工程を含む、方法を提供する。
【００３６】
好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００３７】
さらなる実施の形態では、膵β細胞関連障害のｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための診断用組成物の調製における、ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及び／又はＦＸＹＤ２−γ−ｃ等の１つ又は複数のＦＸＹＤ２−γアイソフォームに特異的に結合する結合分子の使用が提供される。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００３８】
別の実施の形態では、本発明は、β細胞関連障害のｉｎ  ｖｉｖｏ診断を行う方法であって、
ａ）ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃから成る群から選択されるマーカーの１つに特異的に結合する同位体標識トレーサー分子を被験体に導入する工程、
ｂ）膵臓中のβ細胞集団に特異的に位置するトレーサー分子を、ＰＥＴ、ＰＥＴ−ＣＴ、又はＳＰＥＣＴを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで可視化する工程、
ｃ）上記被験体におけるβ細胞の量を定量化する工程、
ｄ）工程ｃ）において得られたβ細胞塊のデータを健常被験体のβ細胞塊のデータと比較する工程、及び
ｅ）工程ｃ）において得られたβ細胞塊のレベルが、健常被験体のβ細胞塊のレベルと比較して低下している場合に、被験体を糖尿病であるか、又は糖尿病を患う危険性があると診断すると共に、工程ｃ）において得られたβ細胞塊のレベルが、健常被験体のβ細胞塊のレベルと比較して上昇している場合に、被験体を高インスリン血症であるか、又は高インスリン血症を患う危険性があると診断する工程を含む、方法を提供する。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００３９】
本発明の方法のいずれかで分析されるβ細胞関連障害が１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、高インスリン血症、又は膵癌であるのが好ましい。
【００４０】
代替的に本発明はさらに、被験体においてβ細胞塊を特異的に測定するか、及び／又はβ細胞関連障害を診断するか、及び／又はβ細胞を精製するためのキットであって、
ａ）ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ及びＦＸＹＤ２−γ−ｃから成る群から選択されるバイオマーカーのいずれか１つと結合する標識分子を含む、キットを提供する。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００４１】
本発明の方法のいずれかにおいて、結合分子が、上記バイオマーカーと特異的に結合する、特異抗体、抗体断片、ナノボディ、アフィボディ（affybody）、アプタマー、フォトアプタマー、小分子、相互作用パートナー、特異的に結合するタンパク質若しくはペプチド、ＤＡＲＰｉｎ、アンキリン、同位体標識トレーサー、又はリガンドである。
【００４２】
好ましい実施の形態では、抗体はＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ又はＦＸＹＤ２−γ−ｃバイオマーカーに指向性を有し、さらにより好ましくは、抗体は配列番号１〜配列番号５、好ましくは配列番号１〜配列番号３、より好ましくは配列番号１のペプチドのいずれか１つに指向性を有する。
【００４３】
本発明はさらに、被験体におけるβ細胞移植の成功を追跡調査する方法であって、
ａ）被験体に膵島を移植した後一定期間内の被験体におけるβ細胞の量を測定する工程、及び
ｂ）β細胞塊を経時的に比較することにより膵島移植の成功を決定する工程を含む、方法を提供する。
【００４４】
代替的に本発明はβ細胞を他の膵非β細胞から精製又は単離する方法であって、
ａ）β細胞を、ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃから成る群から選択されるマーカーの１つに特異的に指向性を有する標識結合分子でタグ付けする工程、及び
ｂ）標識されたβ細胞を、非標識細胞からβ細胞上のタグによって単離し、それにより実質的に純粋なβ細胞調製物を得る工程を含む、方法を提供する。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００４５】
さらなる実施の形態では、本発明は、β細胞の再生を特定する方法であって、
ａ）β細胞を、ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃから成る群から選択されるマーカーの１つに特異的に指向性を有する標識結合分子でタグ付けする工程、
ｂ）標識されたβ細胞を、非標識細胞からβ細胞上のタグによって単離し、それにより実質的に純粋な再生β細胞調製物を得る工程、
ｃ）免疫組織化学を実行し、それにより新たに再生されたβ細胞の数を特定すると共に、新たなβ細胞塊を確定する工程、及び
ｄ）治療戦略を追跡調査すると共に、β細胞塊の回復を検出する工程を含む、方法を提供する。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００４６】
上記方法で使用されるタグが磁性ビーズ又は常磁性ビーズであり得る。それからβ細胞塊をＭＲＩを使用して測定することができる。
【００４７】
さらに、本発明は、機能的インスリン発現細胞を誘導するために幹細胞集団を特定する方法であって、
ａ）処理した幹細胞を、マーカーＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ及びＦＸＹＤ２−γ−ｃに特異的に指向性を有する標識結合分子でタグ付けする工程、及び
ｂ）標識した幹細胞を、非標識細胞から潜在的β幹細胞上のタグによって単離し、それにより実質的に純粋なβ幹細胞調製物を得る工程を含む、方法を提供する。この方法は、ｃ）免疫組織化学を実行し、それによりβ幹細胞の数を特定すると共に、新たなβ細胞塊を確定する工程、及びｄ）治療戦略を追跡調査すると共に、新たに形成されたβ細胞の量を検出する工程をさらに含み得る。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００４８】
別の実施の形態では、本発明はまた、膵β細胞に対する特異的バイオマーカーを特定する方法であって、かかるマーカーを以下の５つの基準：
ａ）全ヒト膵臓と比べてヒト膵島において５０倍〜１００倍超富化されていること、
ｂ）精製ラットβ細胞において精製ラット非β細胞と比較して富化されており、比較的β細胞特異的となっていること、
ｃ）グルコキナーゼと同じか、又はそれよりも高いレベルで発現されること、
ｄ）細胞膜中に位置し、特異的抗体又はペプチドによる標的化に使用することができること、及び
ｅ）選択した遺伝子／タンパク質の発現レベルが炎症時に変化していないことに基づき選択することを含む、方法を提供する。
【００４９】
好ましくは、得られる発現データが、ＭＰＳＳ及び／又は遺伝子発現（ｍＲＮＡ）マイクロアレイ技術に由来するものである。
【００５０】
また、本発明は、本発明の方法によって特定される新たなマーカー、例えばＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃも提供する。好ましい実施の形態では、上記マーカーはＦＸＹＤ２−γ−ａである。
【００５１】
最後に、本発明は膵β細胞塊を特異的に測定するため、又は本発明に記載されるような方法、キット、及び使用のいずれか１つに使用するための、ＧＮＡＳ−ＸＬａｓ、ＧＮＡＳ−Ａｌｅｘ、ＣＤＩＰＴ、ＶＡＴ１、ＣＬＳＴＮ１、ＳＬＣ７Ａ５、ＣＴＴＮ、ＢＡＩＡＰ３、ＬＹＰＤ１、ＡＮＸＡ７、ＤＭＢＴ１、ＫＩＡＡ１５４３、及びＳＬＣ７Ａ８から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの使用も提供するが、ここでＦＸＹＤ２−γマーカー（複数可）を、任意の１つ又は複数の上記マーカー群の他のマーカーで置き換えてもよく、又は上記リストのマーカーの任意の１つ又は複数を、ＦＸＹＤ２−γマーカー（複数可）と組み合わせて使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＦＸＹＤファミリーの成員を示す図である。下線の断片はシグナルペプチドを指す。太字で示されるＦＸＹＤ保存領域に注目されたい。
【図２】Ａ：種々の種におけるＦＸＹＤ２−γ−ａ及びＦＸＹＤ２−γ−ｂスプライシング変異体のＮ末端配列を示す図である。Ｂ：ヒトＦＸＹＤ２−γの３つのスプライシング型であるアイソフォームａ、ｂ及びｃのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図３】ＦＸＹＤ２−γに指向性を有するAbnovaのモノクローナル抗体を用いて、ヒト腎臓明細胞癌の薄片及び正常ヒト膵臓の薄片に対して行った免疫組織化学を示す図である。黒色の矢印は腎臓における染色を指し、白色の矢印は膵臓のランゲルハンス島に特異的な染色を示す。
【図４】ラット膵臓の分散膵島細胞におけるＦＸＹＤ２−γの発現を示す図である。１０００００個のラット分散膵島細胞において、ＦＸＹＤ２−γをウエスタンブロット法により検出するために、ＦＸＹＤ２−γに指向性を有するAbnovaのモノクローナル抗体を使用した。所与の分子量は近似値である。
【図５】ラット腎臓（Ｋ）及びラット膵島（ｐｉ）におけるＦＸＹＤ２−γの発現を示す図である。Ｍは分子量マーカーである。ＦＸＹＤ２−γ−ａのＮ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体（ＳＰＹ３９３及びＳＰＹ３９４）又はＦＸＹＤ２−γ−ｂのＮ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体（ＳＰＹ３４１及びＳＰＹ３４２）をウエスタンブロット法により解析した。抗体は直接アプライした、又はその特異的ペプチドγ−ａ若しくはγ−ｂ又は非特異的起源のペプチド（Ｘｌａｓ  ｐｅｐ）を１０倍オーバーロードして１時間プレインキュベートし、遠心分離してから、ウエスタンブロット法に使用した。
【図６】種々のマウス組織におけるＦＸＹＤ２の検出を示す図である。ＦＸＹＤ２はマウス膵島において特異的に検出される。上パネル：１：マーカー、２：ラット腎臓（陽性対照）、３：マウス脳、４：マウス肝臓、５：マウス脾臓、６：マウス胃、７：マウス腸、８：マウス大腸、９：マウス膵島、１０：マーカー。下パネル：１：ラット腎臓、２：マーカー、３：マウス肺、４：マウス筋肉、５：マウス心臓、６：マウス外分泌腺、７：ＡＲ４２Ｊ細胞株、８：ＩＮＳ−１Ｅ細胞株。
【図７】ＦＸＹＤ２−γ−ａ及びＦＸＹＤ２−γ−ｂはヒト膵島において選択的に発現されるが、インスリノーマにおいては発現されないことを示す図である。ヒト正常膵臓切片を、ＦＸＹＤ２に指向性を有するモノクローナル抗体（Abnova）（Ａ及びＢ、倍率はそれぞれ２００×及び４００×）、及びポリクローナル抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ（ＳＰＹ３９３）（Ｃ及びＤ、倍率はそれぞれ２００×及び４００×）を用いて免疫組織化学により解析した。インスリノーマの連続切片（倍率１００×）を、抗インスリン抗体（Ｅ）及びＳＰＹ３９３（Ｆ）を用いて解析した。膵島。
【図８】ａ：ＦＸＹＤ２発現がヒト膵β細胞に限定されることを示す図である。３μｍの連続切片を採取し、抗インスリン抗体、ＳＰＹ３９３抗体（抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ）又は抗グルカゴン抗体で染色した。２つのパネルは、各々が２つの異なる膵島を示す２回の独立実験を示している。ＦＸＹＤ２及びインスリンの局在性は同様である。ｂ：ＦＸＹＤ２発現がヒト膵β細胞に限定されることを示す図である。３μｍの連続切片を採取し、抗インスリン抗体、ＳＰＹ３９３抗体（抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ）又は抗グルカゴン抗体で染色した。２つのパネルは、各々が２つの異なる膵島を示す２回の独立実験を示している。ＦＸＹＤ２及びインスリンの局在性は同様である。
【図９】ａ：ヒト膵臓切片を免疫蛍光により解析した結果を示す図である。グルカゴンに対するモノクローナル抗体（Ｋ７９ｂＢ１０、Sigma）及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（緑色）に加えて、ＳＰＹ３９３抗体及びＴＲＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（赤色）と共に切片をインキュベートした。ＦＸＹＤ２発現細胞（赤色）とグルカゴン発現α−細胞（緑色）との間に共局在性は見られなかった。ｂ：ヒト膵臓切片を免疫蛍光により解析した結果を示す図である。インスリンに対するモノクローナル抗体（Ｋ３６ａＣ１０、DBS）及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（緑色）に加えて、ＳＰＹ３９３抗体及びＴＲＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（赤色）と共に切片をインキュベートした。ＦＸＹＤ２発現細胞（赤色）とインスリン発現β−細胞（緑色）との間に、非常に良好な共局在性（橙色の染色）が見られた。共局在性の定量化は下記表４及び表５に示す。
【図１０】ラット分散膵島細胞におけるＦＸＹＤ２発現を示す図である。ＦＸＹＤ２は膵島細胞の細胞質中及び膜上の両方で検出される。ラット分散膵島細胞をポリリジンコートスライドガラス上に固定し、２日間インキュベートして、単離手順から回復させた。次いで、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．３％ＴＸ１００で処理し、正常ヤギ血清を用いてブロッキングを行った。ＦＸＹＤ２−γ−ａを検出するＳＰＹ３９３、及びＡＬＥＸＡで標識した二次抗ウサギ抗体を用いて免疫細胞化学を行った。核（灰色部、矢印参照）はＦＸＹＤ２陰性であり、ＦＸＹＤ２（明るく示す）が細胞質及び膜の両方に見られる。
【図１１】ＦＸＹＤ２−γ−ａがヒト、アカゲザル（Macaca mulatta）、及びラットの膵臓のβ細胞において特異的に発現されることを示す図である。ヒト（左欄）、アカゲザル（中央欄）、及びラット（右欄）の膵臓の連続パラフィン切片を、ポリクローナルウサギ抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ（ＳＰＹ３９３）（上列）、抗インスリン抗体（中央列）、又は抗グルカゴン抗体（下列）を用いて免疫組織化学により解析した（倍率４００×）。
【図１２】ＦＸＹＤ２−γ−ａの発現が、１型糖尿病患者（ＣＯ及びＴＥＬＦ（これらのコードは２人の患者を識別するものである）、１型糖尿病の診断からそれぞれ３日後及び５年後に死亡した）に由来する膵島において、正常膵臓（ＣＴＲＬ）と比較して大幅に減少することを示す図である。３μｍの連続切片を採取して、ＳＰＹ３９３抗体、抗インスリン抗体、又は抗グルカゴン抗体で染色した。ＴＥＬＦ膵臓では、インスリン染色を基にβ細胞を検出することはできない。このことはＦＸＹＤ２染色の消失と相関していた。ＣＯ膵臓では、インスリン染色を基にβ細胞を検出することはできないが、非常にかすかなＦＸＹＤ２染色が残されていた（倍率１０００×）。
【図１３】１型糖尿病患者に由来する膵島におけるＦＸＹＤ２−γ−ａの定量化を示す図である。１症例当たり２０個のランゲルハンス島を定量化した（染色組織面積（％）（標識率ＬＩ）及び平均染色度）。上記図１４に見られるように、ＴＥＬＦ膵臓では、ＦＸＹＤ２染色は完全に消失しており、このことはインスリン染色により特定されるように、β細胞の消失と相関していた。ＣＯ膵臓においては、インスリンの染色は消失しており、このことはＣＴＲＬによる標識率（ＬＩ）と比較して、ＦＸＹＤ２−γ−ａの染色の５０倍の減少と相関していた。
【図１４】ＳＴＺ処理アカゲザルにおいて、ＦＸＹＤ２−γ−ａ発現の減少がβ細胞の喪失と相関することを示す図である。対照（Ａ〜Ｃ、ＣＴ）及びＳＴＺ処理アカゲザル（Ｄ〜Ｆ、霊長類１及びＧ〜Ｉ、霊長類２）に由来する膵臓の連続切片を、抗グルカゴン抗体（左欄Ａ、Ｄ、Ｇ）、抗インスリン抗体（中央欄Ｂ、Ｅ、Ｈ）、又はＳＰＹ３９３ポリクローナル抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ（右欄Ｃ、Ｆ、Ｉ）を用いて解析した（倍率４００×）。
【図１５】ＳＴＺ誘発糖尿病アカゲザルにおける、インスリン及びＦＸＹＤ２−γ−ａの発現の有意な減少を示す図である。対照（ＣＴ）及びＳＴＺ誘発糖尿病アカゲザル（霊長類Ｐ１〜Ｐ６）に由来する膵臓切片を解析した。１症例当たり６個の膵島を、試料の同一性を知らない３人の観察者によって計数した。グルカゴン陽性細胞、インスリン陽性細胞、及びＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞を、１個の膵島当たりの相対的割合として算出した。ＣＴにおける値を１００％と見なした。
【図１６】ＦＸＹＤ２−γ−ａ及びＦＸＹＤ２−γ−ｂアイソフォームが齧歯類膵島、ラットＩＮＳ−１Ｅ、ＡＲ４２Ｊ細胞、及びヒトＣＡＰＡＮ−２細胞において発現されるが、ヒトＰＡＮＣ−１細胞においては発現されないことを示す図である。ＦＸＹＤ２−γ−ａ発現は、サイトカインへの２４時間の曝露後でも変化しない。Ａ．  ＦＸＹＤ２−γ−ａ及びＦＸＹＤ２−γ−ｂスプライシング変異体がマウス膵島において検出された。ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォーム（レーン１）、ＦＸＹＤ２−γ−ｂアイソフォーム（レーン２）、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃアイソフォーム（レーン３）を検出するためにプライマーを使用した。マーカー（Ｍ、レーン４）。Ｂ．  ポリクローナル抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ抗体（ＳＰＹ３９３）は、ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームのみを認識する。ラット分散膵島細胞（レーン３、レーン５）及びラット腎臓（レーン１、レーン２、レーン４、レーン６）を解析した。レーン１：ＦＸＹＤ２−γ−ｂブロッキングペプチドとのＳＰＹ３９３、レーン２：非特異的ブロッキングペプチドとのＳＰＹ３９３、レーン３及びレーン４：ＦＸＹＤ２−γ−ａブロッキングペプチドとのＳＰＹ３９３、レーン５及びレーン６：ブロッキングペプチドを用いないＳＰＹ３９３。Ｃ．ウエスタンブロット解析を、ＣＡＰＡＮ−２細胞（レーン１）、ＰＡＮＣ−１細胞（レーン２）、ＡＤ２９３細胞（レーン３）、ＩＮＳ−１Ｅ細胞（レーン４）、及び分散ラット膵島対照（レーン５、レーン８）、及びサイトカインに２４時間曝露した対照（レーン６、レーン９）、マーカー（レーン７）、ラット腎臓陽性対照（レーン１０）の全細胞抽出物に対して行った。下の矢印はＳＰＹ３９３により検出されたＦＸＹＤ２−γ−ａ発現を指し、上の矢印はポリクローナルウサギ抗β−アクチンを用いて検出されたβ−アクチンの発現を指す。Ｄ．  ウエスタンブロット分析を、対照条件（レーン１）、又はＩＬ１β（レーン２）、ＩＬ１β＋ＩＦＮγ（レーン３）、ＩＦＮγのみ（レーン４）に２４時間曝露したＩＮＳ１Ｅ細胞の全細胞抽出物、及び同様に対照条件（レーン５）、又はＩＬ１β（レーン６）、ＩＬ１β＋ＩＦＮγ（レーン７）、ＩＦＮγのみ（レーン８）に２４時間曝露したＡＲ４２Ｊ細胞の全細胞抽出物、マーカー（レーン９）、及びラット腎臓全細胞抽出物（レーン１０）に対して行った。下の矢印はＳＰＹ３９３により検出されたＦＸＹＤ２−γ−ａ発現を指し、上の矢印はポリクローナルウサギ抗β−アクチンを用いて検出されたβ−アクチンの発現を指す。ブロットは３回、４回の独立実験の代表的なものである。
【図１７Ａ】アカゲザルにおける生体内分布研究を示す図である。動物に１２４Ｉで標識したＳＰＹ３９３抗体を注射した。注射後の種々の時点でＰＥＴスキャンを行った（注射後時間（hours Post Injection）又はＰＩ）：パネルＡ：３時間ＰＩ、パネルＢ：２４時間ＰＩ、パネルＣ：７２時間ＰＩでの胃内容物の解析結果、トレーサー分子が胃に多量に取り込まれており、体の他の部位での可視化が障害されることが示唆される。
【図１７Ｂ】アカゲザルにおける生体内分布研究を示す図である。動物に１２４Ｉで標識したＳＰＹ３９３抗体を注射した。注射後の種々の時点でＰＥＴスキャンを行った（注射後時間（hours Post Injection）又はＰＩ）：パネルＡ：３時間ＰＩ、パネルＢ：２４時間ＰＩ、パネルＣ：７２時間ＰＩでの胃内容物の解析結果、トレーサー分子が胃に多量に取り込まれており、体の他の部位での可視化が障害されることが示唆される。
【図１７Ｃ】アカゲザルにおける生体内分布研究を示す図である。動物に１２４Ｉで標識したＳＰＹ３９３抗体を注射した。注射後の種々の時点でＰＥＴスキャンを行った（注射後時間（hours Post Injection）又はＰＩ）：パネルＡ：３時間ＰＩ、パネルＢ：２４時間ＰＩ、パネルＣ：７２時間ＰＩでの胃内容物の解析結果、トレーサー分子が胃に多量に取り込まれており、体の他の部位での可視化が障害されることが示唆される。
【図１８】ウサギポリクローナル抗体ＳＰＹ３４４によって、ヒトパラフィン膵臓切片中の膵島においてＸＬａｓが特異的に検出されることを示す図である（図の左に示す）。ウサギポリクローナル抗体ＳＰＹ３４５によっては、ヒトパラフィン膵臓切片中の膵島においてＡｌｅｘが特異的に検出される（図の右上に示す）。ＳＰＹ３４６によっても膵島においてＡｌｅｘが特異的に検出されるが、染色はあまり強くない（図Ｂ、右下）。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、膵β細胞の細胞膜中に特異的に位置するバイオマーカー群に関する。これらのバイオマーカーは、ヒト膵島において得られる大規模並列シグネチャー配列決定データセット、並びにヒト膵島、精製ラット初代β細胞及び非β細胞及びインスリノーマ細胞に関するAffymetrixマイクロアレイデータセットに対するシステム生物学のアプローチによって選択される。大規模並列シグネチャー配列決定（Massively parallel signature sequencing）（ＭＰＳＳ）によって、ｍＲＮＡサンプルの３’領域から数百万の短いシグネチャー配列タグが生じるが、その大半を個々の遺伝子に明確に割り当てることができ、各遺伝子にあてられるタグの数は、対応するｍＲＮＡ量のデジタル表示値となる。個々の細胞は、およそ２０００００〜３０００００個の転写産物を含有するため、このレベルでのサンプリングは、細胞株又は組織において発現される全ての異なるｍＲＮＡ種の完全なカタログ化に向かう。種々の組織に由来するＭＰＳＳデータセットの比較によって、組織特異的な遺伝子発現を規定する強力な手段がもたらされる。
【００５４】
選択された候補は外分泌組織と比べて膵島に特異的であるだけでなく、候補をβ細胞の画像化及び標的化での使用にとってより有利にする多数のさらなる選択基準を追加した。バイオマーカーを選択するために、（比較情報の代わりに）定量的情報を含有する独自のデータセットを使用した。選択されるバイオマーカーに与えられる特異な特徴は以下である：
【００５５】
１．選択されるバイオマーカー候補は、全ヒト膵臓と比べてヒト膵島において５０倍〜１００倍超富化されている。マイクロアレイによって得られる比較データを使用する代わりに、１００万個当たりの転写産物（transcripts per million）の数を与えるＭＰＳＳによって得られる定量的データを用いる。これによって、全ヒト膵臓と比べてヒト膵島において富化されている転写産物の量を算出することが可能である。膵島は全膵臓の１％〜２％を占めるため、膵臓と比べて膵島において５０倍〜１００倍富化されていることを選択基準として使用した。定量的データを用いて、発現が周辺ヒト組織（胃、脾臓、腸）又は膵島移植片の配置に使用する組織（肝臓、腎臓）と比べてヒト膵島において何倍富化されるかを、公的に利用可能なヒトＭＰＳＳデータセットを用いた比較に基づき算出することができる。これはバックグラウンドレベルを予想し、膵島特異的な候補を選択するうえで非常に有用な基準である。膵島における富化は全膵臓と比べて、好ましくは５０倍超である。
【００５６】
２．選択された候補は、精製ラット非β細胞と比較して精製ラットβ細胞において富化されており、比較的β細胞に特異的となっている。膵島の組成はＴ１Ｄの進行時に、β細胞の喪失及び非β細胞（主にα細胞）の相対的増加によって変化する。したがって、推定バイオマーカーがβ細胞において特異的に発現されることが、β細胞塊の定量化に不可欠である。本発明の選択は、精製初代非β細胞と比較して精製初代β細胞に対して行ったマイクロアレイによって得られた独自のデータセットに基づいて行われる。かかる選択はこれまで行われていなかった。「富化される」という用語は、同一の条件下で操作した非β細胞と比較した場合に、β細胞においてより高いレベルの発現が得られることを意味する。この分析はマイクロアレイデータ解析に基づいて行われるため、ＦＣ変化は考慮に入れられず（すなわち（f.e.）ＦＸＹＤ２に対する幾つかのプローブは、ヒトにおける以前のデータと比較してマイクロアレイでそれほど良好ではなく、ここでＦＣは１．４である。一方で、幾つかのプローブセット、すなわちＧＮＡＳプローブのスコアは非常に高く（インスリンと同程度）、ここでＦＣは１．３である）、β細胞において非β細胞よりも高く発現される遺伝子を選択したが、ＦＣ基準自体は設定しなかった。
【００５７】
３．選択されたバイオマーカーの発現レベルは、グルコキナーゼの発現レベルと少なくとも同じであり、好ましくはそれよりも高い。画像化のためには、標的は膵β細胞上で検出を可能にするのに十分な量で発現される必要がある。この基準を確認するため、ヒト膵島における定量的データ、並びにヒト膵島及び初代ラットβ細胞における比較データの両方を用意している。これは、β細胞において中程度に発現される酵素であるグルコキナーゼとの比較によって行われる。
【００５８】
４．選択されたバイオマーカーは細胞膜中に位置し、特異的抗体、化学合成、天然化合物、又はペプチドを用いた標的化に使用することができる。これらのタンパク質を標的とする抗体及びペプチドは、画像化／標的化を行うのに十分なほど高い親和性をもって細胞膜タンパク質上に位置する天然構造を検出する。細胞膜における局在性はシステム生物学アプローチ（ＩＰＡ解析、ＧＯ解析、文献（literature）スクリーニング）によって評価されてきたが、この局在性を確認するために免疫組織化学を行う。
【００５９】
５．選択された遺伝子／タンパク質の発現レベルは、炎症時に実質的に変更（例えば誘導）されない。対照条件と炎症が誘発される条件（例えばサイトカインで処理したβ細胞、又はウイルス若しくはｄｓＲＮＡに曝露したβ細胞）とを比較する大量のマイクロアレイデータを用意する。炎症時に、膵β細胞は多くの場合、膵臓に浸潤する免疫細胞（Ｔ細胞、樹状細胞）において見られるものと同様のマーカーを発現する。したがって、β細胞塊を定量化するためには、β細胞においてのみ発現され、且つ炎症時に誘発されないバイオマーカーを選択することは主として重要である。マイクロアレイデータセットを公的に利用可能なＳｙｍａｔｌａｓと比較することによって、これらのデータを確認することができた。この分析はこれまで他のグループによって行われていなかった。文献スクリーニングによって、種々のタイプの膵癌と比較して正常ヒト膵臓における発現を検出し、対照マウスと比べたＮＯＤマウス（Ｔ１Ｄマウスモデル）におけるそれらの発現を検出した。文献スクリーニングにおいて利用可能でない場合、このことは問題を明らかにするために特別に作製したマウスＴＭＥにおいて確認した。「実質的に変更（例えば誘導）されない」という用語は、候補マーカーの発現レベルが非炎症状態と比べて炎症状態で誘導されないことを意味する。これは、糖尿病等の疾患状態によるβ細胞塊の減少と等しい量で発現を増加させる、考え得る炎症の影響に対抗するためである。（すなわち、糖尿病状態におけるβ細胞塊の減少は約３０％であり、マーカーそれ自体が炎症状態による約３０％の発現の増加を有する場合には、上記マーカーに基づくβ細胞塊の変化を検出することは可能ではない）。
【００６０】
次に、本発明のリストのうち、３つの最良の候補をタンパク質レベルで解析し、膵島特異性及びβ細胞特異性を確認するために手順を開発した。候補に対し、利用可能な場合には抗体を選択するか、又はバイオマーカーを特異的に標的とする抗体を調製した。選択された候補及びこれらの候補を標的とする抗体を、（周辺組織と比べた）膵臓に対するそれらの特異性、及び外分泌組織と比べた膵島におけるそれらの特異的発現を確認するヒト組織マイクロアレイにおいて試験した。続いて、バイオマーカーのタンパク質発現を、非β細胞と比べたβ細胞に対するその特異性に関して、正常及び罹患ヒト及び齧歯類膵臓（ヒト膵癌及びＴ１Ｄマウスモデル）の膵臓薄片に対する免疫細胞化学によって検証した。
【００６１】
この一連の基準を用いて、ヒト及び齧歯類の膵β細胞の細胞膜上で選択的に発現される特異なバイオマーカー群を得た。発現レベルは画像化／標的化を行うのに十分なほど高く、それらの発現レベルは炎症状態及び糖尿病状態によって実質的に変更されないか、又はこれらのマーカーは以前に自己抗原として特定されていない。これによって、これらのマーカーはβ細胞の画像化／標的化に対する完全な候補となる。
【００６２】
本発明の大きな利点は、真性糖尿病において膵β細胞塊の決定を可能にすることである（下記参照）。現在、β細胞塊を特異的に測定する他の利用可能な方法はないことに留意されたい。
【００６３】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、体の免疫系が自身のインスリン産生β細胞を攻撃して破壊し、それ自体を破壊する自己免疫疾患である。疾患の進行を解明し、疾患を予防する新規の治療介入の有効性を評価するためのＴ１Ｄの早期検出に対する主要な障害は、β細胞塊を可視化及び測定する直接的な非侵襲的技術の不足である。β細胞塊を決定する信頼性のある方法の不足はまた、膵島移植、及び同様に（Ｔ１Ｄよりも小さい規模ではあるが）β細胞塊の段階的減少が存在する疾患である２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を患う患者の追跡調査を制限する。β細胞画像化の目的を達成するためには、可視化することのできるβ細胞特異的膜タンパク質の緊急の必要性がある。この問題を解決するために、候補β細胞バイオマーカーをシステム生物学アプローチによって選択した。得られた結果は以下のことを示す：
【００６４】
選択された候補はヒトの膵β細胞において極めて富化されている。これらに指向性を有する抗体、小分子、又はペプチドを、ＰＥＴ又はＭＲＩ又はＳＰＥＣＴ画像化に使用されるトレーサーとすることができる。これらのトレーサーはβ細胞に優先的に結合し、非常に良好な特異性及び選択性を可能とする。β細胞数の著しい減少及びα細胞の相対的増加が見られるＴ１Ｄの後期において、β細胞特異的バイオマーカーは、非β細胞からのバックグラウンドのない残存β細胞塊の定量化を可能にする。これらのバイオマーカーは、膵島移植者の追跡調査、２型糖尿病性患者におけるβ細胞塊の段階的減少、又は肥満非糖尿病性患者におけるβ細胞塊の最終的増加（この場合、インスリン抵抗性を補償するβ細胞塊の増加がある）の検査も可能にする。
【００６５】
選択されたバイオマーカーは炎症によって誘発されず、浸潤免疫細胞を標的としない。β細胞は浸潤免疫細胞によって検出される自己抗原を発現する。対照及び炎症性β細胞における選択されたバイオマーカーの発現を比較し、免疫細胞において発現されない膜タンパク質を選択するため、炎症時（膵島炎）のβ細胞塊を追跡調査することが可能である。
【００６６】
選択された候補は、ヒト膵島移植後の膵島移植片の非侵襲的画像化を可能にし、移植片生着を支持するための免疫抑制療法の調整、及び増強された免疫攻撃を受ける移植者を救うことを目的としたより早期の介入を可能にする。
【００６７】
候補を標的とし、Ｔ１Ｄにおける自己免疫過程の一環として生じる内因性抗体は、自己免疫の有益なマーカーであり、疾患を発症する危険性の高い患者の検出に役立つ。
【００６８】
膵臓の画像化に現在使用されている薬剤としては、グリベンクラミド、ドーパミン、フッ化デオキシグルコース、フルオロジチゾン、及びＤＯＰＡ等の試薬が挙げられる。β細胞におけるこれらの薬剤の取り込みは、膵島の膵外分泌部及び非β細胞と比較して、信頼性のあるβ細胞塊の画像化を可能にするには十分ではない（Sweet et al, 2004）。
【００６９】
本発明のバイオマーカーのリストは、ヒト膵島における定量的発現情報（ＭＰＳＳ）、並びに精製初代ラットβ細胞及び初代ラット非β細胞において得られたマイクロアレイデータセットから得た比較発現データを含有する独自のデータセットから選択した。本発明で選択されるバイオマーカーは、以下の基準に当てはまる：
１．  「膵島特異的」の基準は、ヒト膵島の定量的ＭＰＳＳデータと、３２種のヒト組織のＭＰＳＳデータ（全膵臓を含む、公的に利用可能なデータベースであるLICRのＭＰＳＳデータセットから得た）との比較に基づく。本発明では、膵臓と比べて膵島において５０倍超富化された発現を選択した。ヒト膵島に関する定量的ＭＰＳＳデータセットは以前は利用可能でなかったため、これは新たな特徴である。
２．  「β細胞特異的」、すなわちα細胞よりもβ細胞において強く発現されること。この基準は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）等の病的状態におけるβ細胞の画像化に重要である。Ｔ１Ｄの進行過程においてβ細胞は次第に消滅するが、α細胞の数は増加する。したがって、β細胞に特異的であり、α細胞において全く又はあまり発現しないバイオマーカー（複数可）を用意する必要がある。
３．  発現レベルはグルコキナーゼより高いか、又は同程度であるべきである。グルコキナーゼは、β細胞において高度且つ選択的に発現される酵素であり、グルコキナーゼとの比較によって、潜在的バイオマーカーの高度の発現に関する信頼性のある評価が提供される。
４．  本発明のバイオマーカーは細胞膜に位置する。初めに、膜貫通領域を検出するためにＴＭＨＭＭプログラムを使用し、続いて徹底的に文献解析を行なった。ＧＯ解析及びIngenuityのパスウェイ解析は、この基準を補完するために使用した。
５．  発現レベルは炎症によって誘導されない。選択されたバイオマーカーの発現レベルは、ヒト膵島及び精製初代ラットβ細胞で得られたマイクロアレイデータセットにおいて、炎症状態（サイトカインへの曝露又はウイルスによって誘発された）で増大しない。このことは、早期Ｔ１Ｄにおいて一般的な、膵島炎におけるバイオマーカーの発現の変更が誤ったβ細胞塊の評価を導かないことを確かにする。
【００７０】
結論としては、バイオマーカーはβ細胞において優先的に発現され、画像化を可能にするのに十分な量で表面上に発現される。バイオマーカーは細胞外ドメインを有し、これに対して天然のリガンド、ペプチド、及び／又は（or and）抗体（若しくは抗体断片）をトレーサーとして開発することができる。選択されたバイオマーカーは炎症状態において変更されない。これらの特異な特徴はβ細胞塊の臨床解析を可能とする。
【００７１】
本発明のバイオマーカーの目的は、健康な（health）状態及び病的状態（糖尿病又は膵島移植後）での膵β細胞塊の推定及び可視化において使用することである。本発明は、糖尿病状態の予測及び追跡調査、膵島移植の追跡調査のためのツール、及び糖尿病の予防及び／又はβ細胞塊の再生を目的とする治療アッセイのための代理マーカーであるツールの開発を可能にする。これらの候補を用いて行われる非侵襲的画像化は、β細胞塊の増加又は減少の検出を可能にする。
【００７２】
したがって、本発明は、被験体のβ細胞塊を検出及び／又は測定するとともに、それを健常被験体のβ細胞塊の基準量と比較することによって、１型真性糖尿病若しくは２型真性糖尿病（Ｔ１Ｄ若しくはＴ２Ｄ）又は高インスリン血症等の糖尿病性障害を診断又は予後診断する非侵襲的方法を提供する。調査対象の被験体のβ細胞塊の増加は、高インスリン血症の状態を指し、一方で調査対象の被験体のβ細胞塊の減少は、１型真性糖尿病又は２型真性糖尿病の状態を指す。
【００７３】
糖尿病性障害を診断又は予後診断する非侵襲的方法は、ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃの群から選択されるβ細胞特異的バイオマーカーの検出によるβ細胞の極めて特異的な検出及び／又は可視化を包含する。
【００７４】
特異的マーカーの検出は、高い特異性をもってバイオマーカーに結合する放射性同位体標識トレーサー分子を使用することによって行われる。トレーサーは例えば、抗体若しくはその断片、一本鎖抗体、ナノボディ、アフィボディ、アプタマー、フォトアプタマー、特異的リガンド若しくは相互作用タンパク質、又は選択されるバイオマーカーに特異的に結合することが示されている任意の小分子等であり得る。
【００７５】
抗体は既知若しくは市販の抗体であっても、又は本発明のバイオマーカーの１つを極めて特異的に検出するように特別に設計してもよい。
【００７６】
これに関し、本発明者らは、以下に指向性を有するポリクローナル抗体調製物を設計した：
ウサギを配列番号１（ＭＴＧＬＳＭＤＧＧＧＳ＋Ｃ−ＫＬＨ）の１１ＡＡペプチド（抗体ＳＰＹ３９３及びＳＰＹ３９４と指定される）、又は配列番号２（ＭＴＧＬＳＭＤＧＧＧＳＰＫＧＤ＋Ｃ−ＫＬＨ）の１５ＡＡペプチド、又は配列番号３（ＭＴＧＬＳＭＤＧＧＧＳＰＫＧＤＶＤＰＦＹＹＤＹＥＴＶＲＮ＋Ｃ−ＫＬＨ）の２８ＡＡペプチドで免疫化することによる、ＦＸＹＤ２のγ−ａスプライシング変異体
ウサギを配列番号４（ＭＤＲＷＹＬＧＧＳ＋Ｃ−ＫＬＨ）のペプチド（抗体ＳＰＹ３４１と指定される）で免疫化することによる、ＦＸＹＤ２のγ−ｂスプライシング変異体、
ウサギを配列番号５（ＧＫＰＧＰＬＲＴＬＰＥＰＳＧＰＬＰＰＳＳＧＬＳＱＰＱＶＨＡＬＣＰＬＳＰＬＶＴＴＧＣＣＧＱＡＡＥＲＤＳＣＷＥＲＰＰＩＰＬＬＬＰＳＬＳＧ＋Ｃ−ＫＬＨ）のペプチドで免疫化することによる、ＦＸＹＤ２のγ−ｃスプライシング変異体。
【００７７】
ヒトＦＸＹＤ２−γ−ａにおいてＳＰＹ３９３及びＳＰＹ３９４抗体によって認識される配列は、サル（アカゲザル）ＦＸＹＤ２−γ−ａの配列と１００％の類似性を有することに注目することが重要である。これによって、アカゲザルにおける標識抗体の特性を試験すること、及び上記サルモデルにおいて得られた結果をヒト状況に外挿することが可能となる。
【００７８】
一実施形態では、本発明の診断又は予後診断方法は、体内の機能過程の三次元画像又はマップを作成する核医学医療画像化法である、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）を使用する。このシステムは、体内に導入されるポジトロン放出放射性同位体によって間接的に放出されるγ線対を、トレーサー分子、例えば特異的バイオマーカー結合分子により検出する。次いで、体内の放射性同位体標識トレーサーの画像を、コンピュータ解析によって再構成する。現代のスキャナでは、ＰＥＴスキャンは、同じ機械で同時に患者に対して行われる、臓器等の構造基準を与えるＸ線ＣＴスキャン（ＰＥＴ−ＣＴ）と組み合わされる。
【００７９】
代替的な一実施形態では、本発明の診断又は予後診断方法において、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像化が使用され得る。ＳＰＥＣＴは、複数の角度からの多重２Ｄ投影画像（projections）を得るためにガンマカメラを使用する。次いで、コンピュータを使用して、トモグラフィー再構成アルゴリズムを多重投影画像に適用し、３Ｄデータセットを得る。このデータセットを次に操作して、任意の選択した体軸に沿って薄片を示す。
【００８０】
ＰＥＴ又はＰＥＴ−ＣＴにおいて使用される好ましい標識は、炭素−１１（約２０分）、窒素−１３（約１０分）、酸素−１５（約２分）、及びフッ素−１８（約１１０分）等の短寿命放射性同位体、又は適切な場合にはヨウ素−１２４（約４日間）等の中寿命放射性同位体である。
【００８１】
本発明に包含される典型的なｉｎ  ｖｉｖｏ診断方法は以下の通りである：
ａ）上記マーカーに特異的に結合する同位体標識トレーサー分子を被験体に導入すること、
ｂ）膵臓においてβ細胞に特異的に結合するトレーサー分子を、ＰＥＴ、ＰＥＴ−ＣＴ、又はＳＰＥＣＴを用いてｉｎ  ｖｉｖｏ可視化すること、
ｃ）上記被験体におけるβ細胞塊を定量化すること、
ｄ）工程ｃ）において得られるβ細胞塊データと、健常被験体のβ細胞塊データとを比較すること、
ｄ）工程ｃ）において得られたβ細胞塊のレベルが、健常被験体のβ細胞塊のレベルと比較して低下している場合に、被験体を糖尿病であるか、又は糖尿病を患う危険性があると診断すると共に、工程ｃ）において得られたβ細胞塊のレベルが、健常被験体のβ細胞塊のレベルと比較して上昇している場合に、被験体を高インスリン血症であるか、又は高インスリン血症を患う危険性があると診断すること。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ診断又は予後診断の方法は、１型真性糖尿病又は２型真性糖尿病、高インスリン血症、及びβ細胞に由来するインスリノーマのような膵臓の神経内分泌腫瘍の発生といった膵癌等のインスリン関連障害を診断するために使用することができる。
【００８３】
インスリン関連障害を治療するうえで、膵島移植は選択肢の１つである。典型的には、特殊化した酵素を使用して、死亡したドナーの膵臓から膵島を取り出すエドモントンプロトコルが適用される。膵島は傷みやすいため、膵島を取り出した直後に移植が行なわれる。典型的には、患者は２つのドナー膵臓から抽出された膵島「等価物」を、体重１ｋｇ当たり少なくとも１００００個与えられる。患者は多くの場合、インスリン非依存性を得るために２回の移植を必要とする。単一の提供膵臓から採取した膵島等価物をより少量しか使用しない移植もある。移植は多くの場合、放射線技師によって行われるが、放射線技師は上腹部から肝臓の門脈へのカテーテルの配置を誘導するためにＸ線及び超音波を使用する。次いで、膵島をカテーテルを介して肝臓にゆっくりと注入する。局所麻酔薬及び鎮痛剤を患者に与える。場合によっては、外科医は全身麻酔を用いた小切開によって移植を行ってもよい。
【００８４】
かかるβ細胞移植治療の成功の鍵は、当然ながら移植に使用されるβ細胞調製物の純度である。本発明は、膵島移植に使用されるβ細胞を特異的に単離する方法、及び移植したβ細胞を追跡調査するためのツールを提供する。
【００８５】
さらなる一実施形態では、本発明は、ＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃの群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーを使用して、β細胞を特異的に可視化又は標識化することにより、膵β細胞を膵臓組織から単離及び／又は精製する方法を提供する。
【００８６】
代替的には、本発明の方法は、機能的インスリン発現細胞を誘導するために幹細胞集団を特定する方法であって、
ａ）処理した該幹細胞を、ＦＸＹＤ２−γマーカーに特異的に指向性を有する標識結合分子でタグ付けする工程、及び
ｂ）標識した幹細胞を、非標識細胞から潜在的β幹細胞上のタグによって単離し、それにより実質的に純粋なβ幹細胞調製物を得る、単離する工程を含む、方法を提供する。
【００８７】
或る特定の実施形態では、本発明の方法は、
ｃ）免疫組織化学を実行し、それによりβ幹細胞の数を特定すると共に、新たなβ細胞塊を確定する、実行する工程、及び
ｄ）治療戦略を追跡調査すると共に、新たに形成されたβ細胞の量を検出する工程をさらに含み得る。
【００８８】
上記の分離方法は、例えば本発明のバイオマーカーの１つ又は複数に指向性を有する標識結合分子の保持に基づく標準的分離技法を用いて、標識細胞を非標識細胞から分離することにより行うことができる。
【００８９】
対象の細胞を小さな磁性粒子又は磁性ビーズでタグ付けすることの選択肢の１つは、本発明のバイオマーカーの１つに指向性を有する抗体、アプタマー、オリゴヌクレオチド、又は他の特異的に結合する薬剤若しくはリガンドを使用することである。このビーズ結合分子複合体は、膵臓細胞調製物においてβ細胞に指向性を有しており、例えば電磁場を用いることによってβ細胞を全膵臓細胞調製物から特異的に精製することができる。幾つかのシステムにおいては、試料はセパレータ装置内に入れた場合に磁場を発生するカラムによって処理され、標識細胞のみが保持される。
【００９０】
他のシステムは、磁性セパレータの簡略版を提供する。カラム及びセパレータ装置の代わりに、これらのシステムは単純な磁石を用いて試験管内で標識細胞を直接保持し、一方で上清を抜き取る。これらのシステムの幾つかは陽性選択法又は陰性選択法において使用することができる。陰性選択又は富化選択とは、対象の細胞を標識しないままに不要な細胞を標識（捕捉）し得ることを意味する。磁性粒子は、Hammondsによるとフローサイトメトリーを妨げることも、細胞増殖を妨げることもないため、かかるシステムを用いて単離した細胞をさらに培養することができる。
【００９１】
磁気分離は非常に強力であり、広範囲に適用可能なことが証明されており、細胞の生存能力を保持しつつ、標的細胞の７０％の回収及び最大で９８％の純度をもたらす場合もある。
【００９２】
代替的には、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）に対する研究に基づく効率的な非磁性分離方法は、試料中の不要な細胞を結合させ、凝集塊を形成することにより機能する。標識化の後、試料をフィコール等の浮遊密度培地上に重層する。標識細胞を遠心分離して（with when）ペレット化し、一方で所望の非標識細胞を界面で回収した。この方法は迅速であり、得られた細胞は抗体で標識されておらず、非接触の状態である。
【００９３】
これらの技法の多くは組み合わせると最も強力となる。しかしながら、当業者は特異的細胞型を選択的に精製する他の方法を知っているだろう。
【００９４】
本発明の方法及びキットにおいて使用される「結合分子」という用語は、本発明のバイオマーカーの１つと特異的に結合又は相互作用し、本発明の方法及びキットにおいて使用することができる全ての好適な結合分子を指す。好適な結合因子の例は、抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、ナノボディ、アフィボディ、抗体断片、アプタマー、フォトアプタマー、オリゴヌクレオチド、リポカリン、特異的相互作用小分子、分子インプリンティングポリマー（ＭＩＰ）、ＤＡＲＰｉｎ、アンキリン、特異的相互作用タンパク質、ペプチド模倣体、生体模倣体又はペプチド、及びバイオマーカーの１つに特異的に結合する他の分子である。本発明のバイオマーカーの１つと結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は一本鎖抗体又はその断片は、本発明の方法及びキットに有用である。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、当該技術分野で既知の方法によって調製することができるが、多くの場合市販されている。
【００９５】
本発明のバイオマーカーに特異的に結合するアプタマーは、いわゆるＳＥＬＥＸ（すなわち指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）を用いて得ることができる。Larry Gold及び共同研究者らによって開発され、米国特許第６，３２９，１４５号明細書に記載されているこのシステムにおいては、複数回の選択及び増幅を使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を選択した標的に対して高い特異性をもって選択することができる。近年、さらに高い特異性を有する通称（co-called）フォトアプタマーを設計する、より精密な方法がLarry Goldのグループによる米国特許第６，４５８，５３９号明細書に記載されている。
【００９６】
相互作用タンパク質及び小分子等の結合因子を特定する方法も当該技術分野で知られている。例としてはツーハイブリッド解析、免疫沈降法等がある。
【００９７】
また、本発明はＦＸＹＤ２−γマーカーを発現するか、又は発現しない細胞若しくは細胞株を用いて、ペプチド又は小分子、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、ナノボディ、アフィボディ、抗体断片、アプタマー、フォトアプタマー、リポカリン、特異的相互作用小分子、分子インプリンティングポリマー（ＭＩＰ）、ＤＡＲＰｉｎ、アンキリン、特異的相互作用タンパク質又はペプチド、及びバイオマーカーの１つに特異的に結合する他の分子等の結合分子を特定するツール及び方法も提供する。この目的で、本発明は、幾つかのＦＸＹＤ２−γ−陽性細胞及び／又は細胞株（齧歯類膵島、ラットＩＮＳ−１Ｅ、ＡＲ４２Ｊ細胞、及びヒトのＣＡＰＡＮ−２細胞）、並びに１つのＦＸＹＤ２−γ陰性細胞株（ヒトＰＡＮＣ−１細胞）を提供する。ＰＥＴ、ＰＥＴ−ＣＴ又はＳＰＥＣＴ解析におけるβ細胞塊の可視化のための新たなトレーサー分子を特定するために、これらの細胞又は細胞株を使用して、ＦＸＹＤ２−γ−陽性細胞に特異的に結合するが、ＦＸＹＤ２−γ陰性細胞には特異的に結合しない結合因子又は化合物をスクリーニングすることができる。
【００９８】
かかる態様の１つでは、本発明は、ＦＸＹＤ２−γ陽性細胞に特異的に結合する新たなトレーサー分子を特定する方法であって、
ａ）候補トレーサー分子をＦＸＹＤ２−γ陽性細胞型又は細胞株と接触させると共に、候補トレーサー分子と細胞との相互作用を測定する工程、
ｂ）候補トレーサー分子をＦＸＹＤ２−γ陰性細胞型又は細胞株と接触させると共に、候補トレーサー分子と細胞との相互作用を測定する工程、及び
ｃ）工程ａ）の細胞と結合するが、工程ｂ）の細胞とは結合しないこれらの候補トレーサー分子をβ細胞塊トレーサー分子として保持する工程を含む、方法を提供する。上記方法の好ましい実施形態では、ＦＸＹＤ２−γ陽性細胞型又は細胞株は、齧歯類膵島、ラットＩＮＳ−１Ｅ、ＡＲ４２Ｊ細胞、及びヒトのＣＡＰＡＮ−２細胞から成る群から選択され、ＦＸＹＤ２−γ陰性細胞型又は細胞株はＰＡＮＣ−１である。
【００９９】
本発明は、ＦＸＹＤ２−γ陽性細胞に特異的に結合する新たなトレーサー分子を特定するためのキットであって、一方がＦＸＹＤ２−γ陽性細胞型又は細胞株であり、一方がＦＸＹＤ２−γ陰性細胞型又は細胞株である２つの細胞型又は細胞株を含む、キットをさらに提供する。好ましい一実施形態では、ＦＸＹＤ２−γ陽性細胞型又は細胞株は、齧歯類膵島、ラットＩＮＳ−１Ｅ、ＡＲ４２Ｊ細胞、及びヒトのＣＡＰＡＮ−２細胞から成る群から選択され、ＦＸＹＤ２−γ陰性細胞型又は細胞株はＰＡＮＣ−１である。
【０１００】
細胞株の使用に加えて、ＦＸＹＤ２−γバイオマーカーを標的として使用する当該技術分野で既知の生化学的結合アッセイも使用することができる。
【０１０１】
「標識」という用語は、ＰＥＴ、ＰＥＴ−ＣＴ又はＳＰＥＣＴ解析に使用される全ての好適な同位体標識、磁性ビーズ又は常磁性ビーズ等の特異的抽出に適した標識、蛍光色素又は当該技術分野で既知の他の発光標識等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断に適した標識を含む。
【０１０２】
本発明の方法又は使用又はキットにおいて述べられる「β細胞関連障害」という用語は、β細胞に関連する全ての障害、例えば１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、高インスリン血症、肥満、神経内分泌腫瘍、又はインスリノーマの発生を包含する。
【０１０３】
また、本発明のバイオマーカーは、生検材料又は細胞株由来の培養物から得られた、細胞培養物中のβ細胞の量又は特性を解析するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法にも使用することができる。本発明のβ細胞特異的マーカーはさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ細胞として分化させた改変幹細胞等の細胞の分化状態を特性化するためにも使用することができる。
【０１０４】
本発明の全ての実施形態において、「ＦＸＹＤ２−γ」という用語は、アイソフォームＦＸＹＤ２−γ−ａ、ＦＸＹＤ２−γ−ｂ、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃを含む。
【０１０５】
実施例
本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【０１０６】
実施例１：β細胞特異的細胞膜タンパク質を特定するための選択戦略
これらの実施例において使用される戦略を図１及び図２に示す。膵臓は、外分泌組織中に散在する、１％〜２％の小さな内分泌組織であるランゲルハンス島から構成される。膵外分泌部は、腺房細胞及び網状の管から成る。膵島は、インスリンを分泌するβ細胞、及び非β細胞、例えばグルカゴンを分泌するα細胞、膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞、及びソマトスタチンを分泌するδ細胞を含有する。Ｔ１Ｄでは膵β細胞は自己免疫攻撃によって選択的に破壊される。また、Ｔ１Ｄよりも低いレベルではあるが、長期Ｔ２Ｄでもβ細胞の喪失が起こるという証拠がある。膵島及び膵β細胞に関する遺伝子発現データは、過去８年間に得られたものである。使用した方法は、マイクロアレイ解析及び大規模並列シグネチャー配列決定（発現した配列に由来するシグネチャーの配列決定に基づき、遺伝子発現を検出する手順）である。ＭＰＳＳによって得られたデータは定量的であり（１００万個当たりの転写産物）、アレイ解析（１つのセル当たり転写産物を３コピーまでしか検出することができない）よりも高感度である。β細胞の遺伝子発現プロファイルを得るために、２つの独立したヒト膵島試料に対してＭＰＳＳを行い、一方でＦＡＣＳにより精製ラット初代β細胞及び非β細胞に対してマイクロアレイデータを得た。ＭＰＳＳに使用したヒト膵島は高品質であった（２つの調製物のβ細胞の割合は５３％及び５９％であった）。得られたＭＰＳＳデータは、少なくとも５ｔｐｍのレベルで、試料１において５６６２個の遺伝子、及び試料２において５９２９個の遺伝子を示していた。遺伝子は、膵島におけるそのシグネチャー数が、最低レベル２０ｔｐｍで、検査した他の３２種の組織全体（膵臓を含む）の全シグネチャー数の８０％以上である場合、膵島に対して８０％以上特異的であると見なした。インスリンは平均レベルが１２６７５３ｔｐｍであり、そのリストの一番上にある。これは、ヒト膵島試料中のｍＲＮＡ集団全体の１３％である。上記の基準に従う膵島特異的な転写産物は、膵島において観察される発現レベルを、３２種のヒト組織の公開されたＭＰＳＳデータセット（LICRのＭＰＳＳデータセット：http://mpss.licr.org/）と比較することによって得た。本発明では、膵島に対して比較的特異的な合計９４０個の遺伝子を検出したが、これらの遺伝子のうち３２４個は、ラット膵臓のβ細胞においてα細胞と比較してより高いレベルで発現される。ＴＭＨＭＭプログラムを用いて、膜貫通領域を有するタンパク質を特定し、４４種のタンパク質を確保した。これらの候補を細胞膜位置に関して（文献解析、ＧＯ解析、及びＩＰＡ解析によって）さらに解析し、炎症状態で、すなわちサイトカイン又はウイルスへの曝露後に発現レベルを解析した（独自のマイクロアレイデータ）。ＧＮＦ  ｓｙｍａｔｌａｓのウェブサイト（http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/）に基づき、Ｔ細胞／リンパ球におけるこれらの遺伝子の発現レベルも同様に検査した。マイクロアレイ解析のために、ＦＡＣＳ選別膵島細胞を使用した。β細胞画分における初代β細胞の純度は９０％であり、非β細胞画分は主にα細胞を含有していた（７５％〜８５％）。結果は、６１９０個〜６２７０個の遺伝子がラットのβ細胞、α細胞、及びＩＮＳ−１細胞にお���て発現されたことを示す（閾値平均シグナル強度＝２５０、標的強度＝１５００）。非β細胞に対するβ細胞で発現した遺伝子の差次的発現解析によって、β細胞において富化される９８３個の遺伝子が得られた（倍富化（fold enrichment）≧２、ＦＤＲ：５％）。９７２個の遺伝子が、β細胞において非β細胞と比較してより高度に発現された（倍富化≧２）。
【０１０７】
マイクロアレイによって得られた膵島特異的ＭＰＳＳのリスト及びβ細胞特異的遺伝子のリストを、Ingenuityのパスウェイ解析ソフトウェアに導入した後、「未知」として割り当てられた細胞膜及びタンパク質を選択した。この手順によって、１２１種の細胞膜タンパク質及び２４９種の未知のタンパク質を得た。全膵臓と比べた膵島における発現レベルを比較し、膵島におけるグルコキナーゼの発現レベルが１０ｔｐｍ超であり、全膵臓に対し膵島において５０倍超増幅された発現レベルを有する遺伝子を選択した。それらの発現レベルを３２種の他の組織において確認した。この比較によって、５５種の膵島特異的膜タンパク質が得られた。マイクロアレイデータを用いて、非β細胞よりもβ細胞において発現レベルが高いタンパク質を選択し、１２個の非β細胞特異的遺伝子を特定した（データは示さない）。対照対サイトカイン（５００ｕ／ｍｌのＩＦＮγ＋１００ｕ／ｍｌのＩＬ１β）への２４時間の曝露下で、初代β細胞を用いて得られたマイクロアレイデータを比較することにより、サイトカインへの曝露後に誘導されるか、又は著しく阻害された遺伝子を除外した。Ｓｙｍａｔｌａｓオープンリソース（http://symatlas.gnf.org/SymAtlas）を用いて、膵島炎の過程で膵島に存在するＴ細胞及び免疫系の他の細胞において高度に発現された遺伝子を除外した。全ての候補の文献解析を行い、内因性自己抗体がβ細胞画像化に使用されるトレーサーを妨げ得るため、自己抗原であると以前に特定されている候補を除外した。最終群の１２種のβ細胞特異的膜タンパク質及び２種の新たな膵島特異的膜タンパク質を選択し、下記表１に示す。上記の戦略は図１に概略的に示される。
【０１０８】
表１：ISB（Seattle，USA）との共同研究において選択された候補のリスト
【表１】
0005697995.tif 000002
【０１０９】
実施例２：選択されたバイオマーカーの膵島特異的発現の検証
Ａ．  マーカーＦＸＹＤ２：
LICRのＭＰＳＳデータセットに由来する３２種のヒト組織における発現と比較した、ヒト膵島において得られたＭＰＳＳデータ。５ｔｐｍを超える発現レベルのみを示す。
【０１１０】
Ａ．１  導入：
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのγ−サブユニット（ＦＸＹＤ２、ＡＴＰ１Ｇ１、ＨＯＭＧ２、ＭＧＣ１２３７２）は、その力学的特性を変更することによってＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを調節する１回膜貫通型タンパク質である。γ−サブユニットは、組織特異的に発現される７つのＦＸＹＤタンパク質のファミリーに属する（Cornelius F et al, 2003の図１）。ＦＸＹＤ２は近位尿細管及び遠位尿細管、並びに腎臓のヘンレ係蹄の太い上行脚髄質において多量に発現される（Arystarkhova E et al 2002、Pihakaski-MaunsbachK et al 2006）。２つのスプライシング変異体（γ−ａ（配列番号６）及びγ−ｂ（配列番号７））がラット及びヒトで検出されているが（Arystarkhova E et al 2005）、第３のスプライシング変異体γ−ｃはマウスでしか特性化されていない（Holstead Jones D et al, 2005）。近年、ＦＸＹＤ２のさらなるスプライシング変異体が、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されており（ＮＭ＿００１１２７４８９、２７４７ｂｐ、１４５  ＡＡ＝１４．５ｋＤａ（配列番号８）、ヒトＦＸＹＤ２−γ−ｃスプライシング変異体として指定されている。この新たなスプライシング変異体は、同一の２１個のアミノ酸残基のアミノ末端を有するため、ＦＸＹＤ２−γ−ａタンパク質の選択的スプライシング形態であると思われる（図２Ｂ）。興味深いことに、この新たなγ−ｃ変異体（配列番号８）も、本発明者らによって作製された抗体ＳＰＹ３９３により認識される。
【０１１１】
本発明者らは続いて、この新たなγ−ｃ変異体がヒトのＣＡＰＡＮ２細胞及びヒトの膵島細胞において発現されるかを調査した。また、本発明者らは、ＳＰＹ３９３抗体により一貫して検出された２０ｋＤのタンパク質の配列決定のために、ＳＰＹ３９３Ｆ（ａｂ）２−ビオチン結合因子及びｓｔｒｅｐｔ−Ｄｙｎａビーズを用いたＣＡＰＡＮ２細胞での免疫沈降を使用した。
【０１１２】
本発明者らは続いて、新たなγ−ｃ変異体に特異的に結合する抗体を作製した。
【０１１３】
３つのヒトＦＸＹＤ２スプライシング変異体を特性化した。形態γ−ａ及びγ−ｂはＮ末端の８ａａのみで異なる。γ−ｂペプチドについて、配列はラット、ヒト及びマウス間で保存されている。γ−ａについては配列は保存されていない（図２参照）。この新たなスプライシング変異体は、同一の２１個のアミノ酸残基のアミノ末端、タンパク質の中央の大きい挿入、及び異なるＣ末端を有するため、ＦＸＹＤ２−γ−ａタンパク質の選択的スプライシング形態であると思われる。配列は配列番号８に示される。
【０１１４】
Ａ．２  ＦＸＹＤ２の発現は膵島特異的である
ＦＸＹＤ２−γ−ｂ：
この候補の検証を、Abnovaの全長γ−ｂスプライシング変異体に対する唯一の利用可能な市販のモノクローナル抗体（クローン１Ｃ３−Ｂ３）を用いて開始した。膵臓薄片及び腎臓薄片に対する免疫組織化学によって、腎臓におけるＦＸＹＤ２−γ−ｂの存在を確認した（図３ａ）。膵臓におけるＦＸＹＤ２の発現は、膵島、及び稀に外分泌組織の介在導管に限定される（図３ｂ）。膵臓、より具体的には膵島におけるＦＸＹＤ２の発現は全く示されなかった。
【０１１５】
ウエスタンブロット法によって解析したラット分散膵島において、Abnovaの抗体によってＦＸＹＤ２について２つのバンドが弱く検出された（およそ１９ｋＤａ及びおよそ６．４ｋＤａ、図４参照）。
【０１１６】
ＦＸＹＤ２−γ−ａ：
ヒトγ−ａスプライシング変異体のみを解析するのに利用可能な抗体はないため、γ−ａ及びγ−ｂヒトＦＸＹＤ２スプライシング変異体のＮ末端断片に対するウサギポリクローナル抗体を生成させた（Eurogentecとの共同研究）。
ＭＴＧＬＳＭＤＧＧＧＳ＋Ｃ（配列番号１）＝γ−ａペプチド１、
ＭＴＧＬＳＭＤＧＧＧＳＰＫＧＤ（配列番号２）＝γ−ａペプチド２、
ＭＴＧＬＳＭＤＧＧＧＳＰＫＧＤＶＤＰＦＹＹＤＹＥＴＶＲＮ（配列番号３）＝γ−ａペプチド３、
ＭＤＲＷＹＬＧＧＳ＋Ｃ（配列番号４）＝γ−ｂペプチド、
Ｘｘｘ（配列番号５）＝γ−ｃペプチド
【０１１７】
この目的で、ペプチドごとに２匹のウサギに注射した。ウサギＳＰＹ３９３及びＳＰＹ３９４ポリクローナル抗体は、γ−ａＦＸＹＤ２ペプチドを認識する（ＳＰＹ３９４もより少ない程度でγ−ｂＦＸＹＤ２ペプチドを検出する）。ＳＰＹ３４１抗体はγ−ｂＦＸＹＤ２ペプチドを認識する。これらの抗体はラット、マウス、及びヒトの組織において有効であった。
【０１１８】
抗体産生に関して選択されたγ−ｂペプチドは、ヒト、ラット、及びマウスについて同様であるため、抗体ＳＰＹ３４１及びＳＰＹ３４２はこれらの異なる種においてＦＸＹＤ２を検出可能であるべきである。本発明のヒトγ−ａペプチド（１１ＡＡ）は、ラットγ−ａペプチド（１１ＡＡ）とは４ＡＡ異なる。マウスγ−ａペプチド（１５ＡＡ）は、選択されたヒトγ−ａペプチドより長く、９ＡＡ異なる（図２Ａ参照）。抗体を産生するために使用される、両方の選択されたペプチドのＣ末端部は同様であり、両方のペプチドの抗体検出をもたらすことができる。
【０１１９】
齧歯類（ラット又はマウス）における予想結果に関する生体内分布研究において、抗体ＳＰＹ３９３を使用することができるかを検出するために、抗体をウエスタンブロット法で試験した。ラット全腎臓タンパク質（陽性対照と見なす）及びラット分散膵島細胞に対する、ＳＰＹ３９３及びＳＰＹ３９４抗体を用いたウエスタンブロット法によって、およそ１９ｋＤａの特異的バンドが示された。このシグナルは、１０倍オーバーロードのγ−ａペプチドとのプレインキュベーションによって特異的に阻害された（図５Ａ）。ＳＰＹ３４１及びＳＰＹ３９４抗体を用いて、１０倍オーバーロードのγ−ｂペプチドによって阻害され得る、約６．４ｋＤａの非常に弱いシグナルを検出した（図５Ｂ）。ＳＰＹ３４２は、γ−ａペプチド又はγ−ｂペプチドのいずれかによって阻害され得る特異的結合を検出しなかった（図５Ｃ）。
【０１２０】
ＦＸＹＤ２−γ−ａに対する抗体を産生するために使用される配列はヒトとマウスとで異なるため、種々のマウス組織を単離し、ウエスタンブロット法によってＳＰＹ３９３結合を解析した。解析した全ての組織のうち、マウス膵島のみが特異的ＦＸＹＤ２バンドを示した（図６参照）。
【０１２１】
ウサギポリクローナル抗体が、外分泌細胞への大きな結合（高いバックグラウンドレベルをもたらし得る）なく、膵島において特異的にＦＸＹＤ２を検出するかを決定するために、抗体を正常ヒト膵臓に対する免疫組織化学によって試験した。ＳＰＹ３９３抗体は膵外分泌部においてバックグラウンドなく、膵島を特異的に染色する。ＳＰＹ３９４はＦＸＹＤ２−γ−ａを検出するが、染色はＳＰＹ３９３抗体を用いて観察される染色よりも強くはなく、ウエスタンブロット法において見られた結果が確認される（図７）。ＳＰＹ３４１は膵島においてＦＸＹＤ２−γ−ｂを特異的に検出するが、染色はＳＰＹ３９３において観察される染色よりも強くはない。抗体ＳＰＹ３４２は膵臓を染色しなかった（結果は示さない）。
【０１２２】
ヒト膵島と比較した、他の組織におけるバイオマーカーの発現レベル
ＭＰＳＳデータに基づくと、ＦＸＹＤ２発現は、他の組織において低い発現が検出されるのに対し、膵島、腎臓、及び唾液腺において特異的に検出される（下記表２参照）。副腎、骨髄、脳、下垂体、胎盤、前立腺、小腸、脊髄、甲状腺、気管、大腸、及び単球においては検出されなかった。ＭＰＳＳデータ（表３参照）は、全膵臓と比べて膵島において５００倍超のシグナル増幅を示す。膵島は全膵臓量の１％〜２％であるため、この候補は膵島特異的であるとして選択される。
【０１２３】
ＭＰＳＳデータを確認するために、３５種の異なるヒト組織に対して免疫組織化学を行った（組織マイクロアレイ（又はＴＭＡ）、結果は表２に示す）。これらのＴＭＡを、市販の抗ＦＸＹＤ２抗体及び本発明者らのＳＰＹ３９３抗ＦＸＹＤ２抗体を用いて試験した。本発明者らのＳＰＹ３９３抗体による染色は膵臓の膵島においてのみ示され、他のヒト組織切片のいずれにおいても示されなかった。
【０１２４】
ＦＸＹＤ２−γ−ｃ発現データ
免疫化に使用される配列番号３のペプチド
【０１２５】
表２：市販の抗ＦＸＹＤ２抗体（Abnova）と本発明のＳＰＹ−３９３抗ＦＸＹＤ２抗体との比較
【表２】
0005697995.tif 000003
【０１２６】
表３：ＭＰＳＳデータ：
【表３】
0005697995.tif 000004
【０１２７】
Ａ．３．  ＦＸＹＤ２の発現は膵島においてβ細胞に限定される
他の組織におけるＦＸＹＤ２の発現レベルは、膵島、腎臓、及びＭＯＬＴ４細胞において発現を示すＦＸＹＤ２  ２０５６７４＿ｘ＿ａｔプローブセットに関するマイクロアレイＳｙｍａｔｌａｓデータから得た（ウェブリンク：http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/参照、対応するＭＰＳＳデータに関しては表６を参照）。ＦＸＹＤ２発現がβ細胞において特異的に検出されることを検証するために、ＦＸＹＤ２に指向性を有するＳＰＹ３９３抗体、抗インスリン抗体（β細胞を検出する）、又は抗グルカゴン抗体（α細胞を検出する）を用いて解析した連続膵臓薄片（３μｍの膵臓パラフィン切片）において免疫組織化学を行った（図８参照）。
【０１２８】
ＦＸＹＤ２がβ細胞において特異的に発現されることを検証するために、免疫蛍光（図９、並びに共局在率については表４及び表５を参照）。この目的で、抗ウサギＩｇＧ−ＴＲＩＴＣ標識（赤色）を付けたＳＰＹ３９３抗体を、グルカゴンに対するモノクローナル抗体（Ｋ７９ｂＢ１０、Sigma、図９ａ参照）と組み合わせて、又はインスリンに対するモノクローナル抗体（Ｋ３６ａＣ１０、DBS、図９ｂ参照）と組み合わせて使用した。マウスモノクローナル抗体は、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（緑色）によって検出された。グルカゴン発現α細胞とＦＸＹＤ２との間に共局在性は見られなかったが（表４参照）、インスリン発現β細胞は全てのＦＸＹＤ２と共局在化した（表５参照）。このことは膵β細胞におけるＦＸＹＤ２−γ−ａの優先的発現を示す。
【０１２９】
表４：グルカゴンとＦＸＹＤ２−γ−ａとの共局在率（図１２ａ）
【表４】
0005697995.tif 000005
【０１３０】
表５：インスリン及びＦＸＹＤ２−γ−ａに関する共局在率（図１２ｂ）
【表５】
0005697995.tif 000006
【０１３１】
Ａ．４．  ＦＸＹＤ２の発現レベルは炎症状態において誘導されない
β細胞遺伝子発現バンクは、実験医学研究室において行われたマイクロアレイ実験結果を含有する、本発明者らによって作製されたオープンリソースである。マイクロアレイ発現値はヒトの膵島、ラット初代β細胞、及びＩＮＳ−１Ｅ細胞において、対照と炎症状態（サイトカイン又はウイルスのいずれかへの曝露によって誘発された）とを比較して得た。マイクロアレイデータは、ＩＬ１β（５０Ｕ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）又はコクサッキーウイルス５Ｂ（感染効率３０〜１００、Ylipaasto P et al, 2005）のいずれかに４８時間曝露した単離ヒト膵島に対して得た。ヒトデータセットの解析では、サイトカインに曝露した場合、ＦＸＹＤ２発現の２倍の減少が示され、この減少はＣＢＶ５に曝露した場合より低かった（表６参照）。これらのデータは、４８時間のサイトカインへの曝露の後、ＦＸＹＤ２発現の２倍〜３倍の低下を示すＭＰＳＳデータを確認するものである。ラットマイクロアレイのプローブセットはスコアが低かったが、これはおそらくプローブセットの誤った選択のためである。
【０１３２】
表６：ヒト膵島におけるＦＸＹＤ２発現レベルに対する炎症又はウイルス感染の影響
【表６】
0005697995.tif 000007
【０１３３】
ＦＸＹＤ２のタンパク質レベルをＩＮＳ−１Ｅ及びＡＲ４２Ｊ細胞において、対照条件下及びサイトカイン（ＩＬ１β＋ＩＦＮγ）誘発条件下で、ウエスタンブロット法によって解析したが、ＦＸＹＤ２−γ−ａにおける変化は検出されなかった（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）。
【０１３４】
Ａ．５．  ＦＸＹＤ２は膵β細胞の膜及び細胞質ゾルで検出される
組織化学による解析によって、膜及び細胞質の両方でのＦＸＹＤ２発現が示される（以前の図面及び図１０を参照）。細胞膜を障害することなく（パラホルムアルデヒド及びトリトンＸ１００を使用せずに）、ラット及びマウスの分散膵島に対して行った免疫細胞化は、細胞の膜上でＦＸＹＤ２の検出を示した。
【０１３５】
図１２に、ＦＸＹＤ２−γ−ａの発現が、１型糖尿病患者（ＣＯ及びＴＥＬＦ（これらのコードは２人の患者を識別するものである）、１型糖尿病の診断からそれぞれ３日後及び５年後に死亡した）に由来する膵島において、正常膵臓（ＣＴＲＬ）と比較して大幅に減少することを示す。３μｍの連続切片を採取して、ＳＰＹ３９３抗体、抗インスリン抗体、又は抗グルカゴン抗体で染色した。ＴＥＬＦ膵臓では、インスリン染色を基にβ細胞を検出することはできない。このことはＦＸＹＤ２染色の消失と相関していた。ＣＯ膵臓では、インスリン染色を基にβ細胞を検出することはできないが、非常にかすかなＦＸＹＤ２染色が残されていた（倍率１０００×）。
【０１３６】
図１３に、１型糖尿病患者に由来する膵島におけるＦＸＹＤ２−γ−ａの量を示す。１症例当たり２０個のランゲルハンス島を定量化した（染色組織面積（％）（標識率ＬＩ）及び平均染色度）。上記図１４に見られるように、ＴＥＬＦ膵臓では、ＦＸＹＤ２染色は完全に消失しており、このことはインスリン染色により特定されるように、β細胞の消失と相関していた。ＣＯ膵臓においては、インスリンの染色は消失しており、このことはＣＴＲＬによる標識率（ＬＩ）と比較して、ＦＸＹＤ２−γ−ａの染色の５０倍の減少と相関していた。
【０１３７】
Ｂ．  マーカーＡｌｅｘ及びＸＬａｓ
Ｂ．１．  導入
ＸＬ−エキソンによってコードされる代替的遺伝子産物（Ａｌｅｘ）及びグアニンヌクレオチド結合Ｇ（ｓ）サブユニットαアイソフォームエキストララージ（extra large）（ＸＬａｓ）は、ＧＮＡＳ１遺伝子座によって代替的な第１エクソン及びプロモータを用いてコードされる２つのタンパク質である（Abramowitz J et al, 2004）。Ｇｓ−α及びＸＬａｓは異なるＮ末端ドメインを有するが、カルボキシ末端部は同一である。広範に発現されるＧｓ−αとは異なり、ＸＬａｓは限られた組織分布を有する。ＸＬａｓは主に神経内分泌組織において見られ、下垂体において非常に高いレベルである（Kehlenbach RH et al, 1994、Pasolli H et al, 2000）。ＸＬａｓは、クラスＢ副甲状腺ホルモン受容体１、ＣＲＦ受容体１、ｂ２−アドレナリン受容体、ＴＳＨ受容体等の幾つかのＧｓ共役受容体のシグナル伝達に関与するＧｓタンパク質である（Bastepe M et al, 2002）。
【０１３８】
ＸＬａｓは細胞膜にも位置していた（Pasolli H et al, 2000）。Ａｌｅｘは主として細胞膜ラッフル（ruffles）と関連する、３５６アミノ酸の高プロリン細胞膜タンパク質である。ＡｌｅｘはＸＬａｓのエキストララージＮ末端領域と相互作用する。ＸＬａｓと同様に、Ａｌｅｘも神経内分泌細胞において発現される（Klemke M et al, 2001）。
【０１３９】
Ｂ．２．  Ａｌｅｘ及びＸＬａｓは膵島において発現される
ＭＰＳＳデータにより、膵島において全膵臓と比較した場合に１２００倍に富化されたＧＮＡＳ１遺伝子座の発現が示される。したがって、これら２つのタンパク質をタンパク質検証に選択した。
【０１４０】
ヒトタンパク質に利用可能な市販の抗体はなく、ラット及びヒトの配列は著しく異なるため、ウサギポリクローナル抗体を産生するために特異的ペプチド（Eurogentec）を選択した。
ＸＬａｓ：ＰＡＥＥＭＥＴＥＰＰＨＮＥＰＩ（配列番号９）
Ａｌｅｘ：ＲＲＥＥＫＹＰＬＲＧＴＤＰＬＰ（配列番号１０）
【０１４１】
ペプチドごとに２匹のウサギに注射した。ウサギポリクローナル抗体ＳＰＹ３４３及びＳＰＹ３４４はＸＬａｓを標的とし、抗体ＳＰＹ３４５及びＳＰＹ３４６はＡｌｅｘを標的とする。ヒト及びラットの配列は大いに異なるため、ウエスタンブロット法において抗体を検証することができなかった。抗体は免疫組織化学によってヒト膵臓に対して検証した。ウサギポリクローナル抗体ＳＰＹ３４３及びＳＰＹ３４４はどちらもヒトのパラフィン膵臓切片で、ＸＬａｓを膵島において特異的に検出し、ＳＰＹ３４４が最良の結果であった（図１８参照、倍率は異なる）。
【０１４２】
ヒト組織マイクロアレイを行うことによる、膵臓の周辺組織と比べたヒト膵島における優先的発現を確認するさらなる検証が進められている。
【０１４３】
同様に、膵β細胞に対するＸＬａｓ及びＡｌｅｘの特異的位置を、抗インスリン抗体又は抗グルカゴン抗体を用いた共局在化を行うことによって解析する。
【０１４４】
Ｂ．３．  発現レベルは炎症状態で増加しない
β細胞遺伝子発現バンクは、実験医学研究室において行われたマイクロアレイ実験結果を含有する、本発明者らによって作製されたオープンリソースである。ＩＬ１β（５０Ｕ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）又はコクサッキーウイルス５Ｂ（感染効率３０〜１００、Ylipaasto P. et al, 2005）のいずれかに４８時間曝露した単離ヒト膵島に対して行ったマイクロアレイデータの解析は、炎症状態でＧＮＡＳ遺伝子座を示さなかった。これらの結果は以下のウェブリンクに見ることができる：
http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.127731
【０１４５】
炎症状態におけるＸＬａｓ及びＡｌｅｘのさらなる検証は、ヒトＴ１Ｄの膵臓切片において行った。
【０１４６】
Ｃ．  マーカーＶＡＴ１：小胞アミン輸送タンパク質１ホモログ（Ｈｓ．５１４１９９）
ＶＡＴ１はシナプス小胞において検出される膜タンパク質であり、神経終末における神経伝達物質の貯蔵及び放出の調節に関与する。ＶＭＡＴ１及びＶＭＡＴ２の発現は、膵内分泌部及び膵臓腫瘍において報告されている（Anlauf et al, 2003）。ＶＭＡＴ１に対するウサギポリクローナル抗体は、内分泌導管細胞における発現を示した。しかしながら、この情報は本発者らのＭＰＳＳデータにおいて得られた情報（全膵臓における発現は見られず、膵島において５０７ｔｐｍの発現が見られた）と対立する。精製ラット初代β細胞では発現レベルは高く、β細胞において２倍増加する。炎症状態への曝露はＶＡＴ１発現を減少させる。
【０１４７】
Ｃ１．  独自の結果：ヒト膵島に対するＭＰＳＳデータ、及び非β細胞と比べたラット初代β細胞に対して得られたマイクロアレイデータ：
【０１４８】
【表７】
0005697995.tif 000008
【０１４９】
Ｃ２．  ＶＡＴ１の発現は炎症状態において誘導されない：
以下のウェブリンクの結果を参照されたい：
http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.9118
【０１５０】
Ｃ３．  β細胞遺伝子バンク情報：
遺伝子は脊髄、肺、及び膵β細胞において高度に発現される：以下のウェブリンクを参照されたい：
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=10493
【０１５１】
Ｃ４．  ＧＮＦ  Ｓｙｍａｔｌａｓ情報：http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/（図１６）
【０１５２】
Ｄ．  マーカーＣＤＩＰＴ：ＣＤＰ−ジアシルグリセロール−イノシトール３−ホスファチジルトランスフェラーゼ（Ｈｓ．１２１５４９）
ＣＤＩＰＴ（ＭＧＣ１３２８、ＰＩＳ、ＰＩＳ１、Ｐｉｓ、Ｐｉｓ１）は、ＣＤＰ−ジアシルグリセロールからのホスファチジルイノシトールの形成を触媒する（Saito S et al, 1998）。ＣＤＩＰＴは脳及び網膜において発現される。膵島では分泌顆粒膜において富化される（Rana RS et al, 1986）。本発明者らのＭＰＳＳデータでは、その発現は全膵臓と比べて膵島で富化されている。ラット膵β細胞における発現レベルは高く、非β細胞と比べて２倍富化されている。炎症状態では、ＣＤＩＰＴ発現はヒト膵島に対するＭＰＳＳデータ及びヒト膵島におけるマイクロアレイデータの両方において減少している。
【０１５３】
Ｄ１．  独自の結果：ヒト膵島に対するＭＰＳＳデータ、及び非β細胞と比べたラット初代β細胞に対して得られたマイクロアレイデータ：
【０１５４】
【表８】
0005697995.tif 000009
【０１５５】
Ｄ２．  ＣＤＩＰＴの発現は炎症状態において誘導されない：
β細胞遺伝子バンクの結果を参照されたい：
（http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.10598）
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=10423
【０１５６】
Ｄ３．  ＧＮＦ  ｓｙｍａｔｌａｓ情報：http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/（図１７）
【０１５７】
Ｅ．  マーカーＢＡＩＡＰ３：ＢＡＩ１結合タンパク質３（Ｈｓ．４５８４２７）
ＢＡＩＡＰ３（ＢＡＰ３）は、エキソサイトーシスの調節に関係するタンパク質であり（Palmer RE et al. 2002）、線維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＳＲＣＴ）における新規の転写因子ＥＷＳ−ＷＴ１により誘発されることが報告されている。ＢＡＩＡＰ３は膵島において発現されるとは報告されていない。ラットマイクロアレイに利用可能なプローブセットはない。ヒト膵島では、その発現は全膵臓と比べて膵島において増加しており、ヒト膵島において得られたマイクロアレイデータでは、発現レベルはグルコキナーゼの範囲である。サイトカインへの曝露は、ヒト膵島におけるＢＡＩＡＰ３発現を減少させる（ＭＰＳＳデータ）。
【０１５８】
【表９】
0005697995.tif 000010
【０１５９】
Ｅ１．  独自のマイクロアレイ情報：ＢＡＩＡＰ３は炎症によって影響されず、β細胞において発現されるが、膵臓の周辺組織においては発現されない。
以下のウェブリンクを参照されたい：http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.201777
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=8938
【０１６０】
Ｅ２．  ＧＮＦ  ｓｙｍａｔｌａｓ情報：ＧＮＦ  ｓｙｍａｔｌａｓのプローブセットは、脳及び下垂体において高い発現を示した。http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/（図１８）
【０１６１】
Ｆ．  マーカーＣＬＳＴＮ１：カルシンテニン１（Ｈｓ．２９６６５）
ＣＬＳＴＮ１は、細胞質カルシウム結合ドメインを有するシナプス後１回膜貫通１型膜タンパク質である（Vogt L. et al, 2001）。カルシンテニン−１は輸送小胞（vesicularcargo）をキネシン−１に結合する（Koneca A et al, 2006）。電子顕微鏡法によると、カルシンテニンタンパク質ファミリーは興奮性中枢神経系（ＣＮＳ）シナプスのシナプス後膜に局在化していた。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析によって、ＣＬＳＴＮ１は中枢神経系のほとんどのニューロンにおいて豊富であることが示された（Hintsch G. et al, 2002）。本発明者らのＭＰＳＳデータでは、ＣＬＳＴＮ１発現は膵臓と比べて膵島において富化されており、ラット初代β細胞において高度に発現され、非β細胞と比べてβ細胞において２．５倍富化される。ヒト膵島の炎症状態への曝露によって、ヒト膵島においてＣＬＳＴＮ１発現が減少する（ＭＰＳＳデータ）。
【０１６２】
【表１０】
0005697995.tif 000011
【０１６３】
Ｆ１．  独自のマイクロアレイ情報：
ＣＬＳＴＮ１発現は炎症によって影響されない。以下のウェブリンクを参照されたい：http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.99876
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=22883
【０１６４】
Ｆ２．  ＧＮＦ  ｓｙｍａｔｌａｓ情報：http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/（図１９）
【０１６５】
Ｇ．  マーカーＳＬＣ７Ａ５：溶質輸送体ファミリー７
ＳＬＣ７Ａ５（陽イオン性アミノ酸輸送体、ｙ＋系、メンバー５又はＬＡＴ１）は、分岐又は芳香族側鎖を有する大きな中性アミノ酸の移入に重要な細胞膜輸送体である。本発明者らのＭＰＳＳデータでは、その発現は全膵臓と比べてヒトの膵島において富化される。ＳＬＣ７Ａ５はラット膵β細胞において高度に発現され、非β細胞と比較してβ細胞において２倍超増加する。その発現はサイトカインに曝露したラット初代β細胞においては誘導されない。サイトカインへのヒト膵島の曝露はＬＡＴ１発現を減少させる（ＭＰＳＳデータ）。
【０１６６】
【表１１】
0005697995.tif 000012
【０１６７】
Ｇ１．  ＳＬＣ７Ａ５発現は炎症によって影響されない。以下のウェブリンクを参照されたい：http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.32261
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=8140
【０１６８】
Ｇ２．  Ｓｙｍａｔｌａｓ情報（http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/）：発現は全膵臓よりも膵島において高く、限定された細胞集団において見られる。（図２０）
【０１６９】
Ｈ．  マーカーＣＴＴＮ：コルタクチン（Ｈｓ．６３２１３３）
コルタクチン（ＣＴＴＮ、ＥＭＳ１）は動的アクチンネットワークの調節因子である。コルタクチンは膜内に位置し、小胞輸送及び細胞間接着及び細胞拡散に関与する。近年、頭頸部腫瘍の扁平上皮細胞癌細胞において、コルタクチンの過剰発現はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ゲフィチニブの抵抗性を増進させることが示されている（Timpson P et al, 2007）。コルタクチンは膵島において発現されるとは報告されていない。本発明者らのＭＰＳＳデータでは、ＣＴＴＮは全膵臓と比べて膵島において富化される。初代β細胞における発現レベルは高く、非β細胞と比べてβ細胞において３倍近く富化される。ヒト膵島の炎症状態への曝露は、ＭＰＳＳデータ及びマイクロアレイデータの両方においてＣＴＴＮ発現を減少させる。
【０１７０】
【表１２】
0005697995.tif 000013
【０１７１】
Ｈ１．  ＣＴＴＮの発現は炎症によって誘導されない
以下のウェブリンクを参照されたい：http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.107869
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=2017
【０１７２】
Ｈ２．  ＧＮＦ  ｓｙｍａｔｌａｓ情報（http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/）：Ｓｙｍａｔｌａｓに見られる情報は、ＣＴＴＮが膵島において富化され、プローブセットのスコアが低い（プローブセットの誤った選択のためであり得る）という本発明者らのデータを確認するものではない。
【０１７３】
Ｉ．  マーカーＬＹＰＤ１：ＬＹ６／ＰＬＡＵＲ：ドメイン含有１（Ｈｓ．６５１２５２）
ＬＹＰＤ１（又はＰＨＴＳ推定Ｈｅｌａ腫瘍抑制因子）アンチセンス遺伝子は、中枢神経系全体で高度に発現される（Egerod KL et al, 2007）。ＬＹＰＤ１は、ＧＰＲ３９遺伝子の３’エクソンと重複することが報告されている。ＬＹＰＤ１は、Ｎ末端シグナル配列及び白血球抗原−６（Ｌｙ６）／ｕＰＡＲ（ＰＬＡＵＲ、グリコシルホスファチジルイノシトール結合細胞表面糖タンパク質に特徴的なドメイン）を含有する。ＬＹＰＤ１の過剰発現は、Ｈｅｌａ細胞における細胞生存率を低下させる（Yu D. et al, 2006）。本発明者らのＭＰＳＳデータでは、ＬＹＰＤ１は全膵臓と比べて膵島において富化される。ラット初代β細胞における発現レベルは高くないが、非β細胞と比べてβ細胞において１０倍超富化される。
【０１７４】
【表１３】
0005697995.tif 000014
【０１７５】
Ｉ１．  β細胞遺伝子バンク情報：
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=72585
【０１７６】
Ｊ．  マーカーＡＮＸＡ７：アネキシンＡ７（Ｈｓ．６３１８２７）；
アネキシンＡ７（Ａｎｘ７）（又はシネキシン）は、膜と融合するが、電位依存性カルシウムチャネルとして働くことのできるカルシウム依存性膜結合タンパク質である（Caohuy H et al, 1996）。Ａｎｘ７は、マウスランゲルハンス島における遺伝子発現の栄養制御に必要とされる（Srivastava M et al, 1999 and 2002）。ヌル表現型（nullphenotype）は胎生期１０日目に致死であった。ヘテロ接合マウスは生存可能且つ繁殖可能であったが、インスリン分泌異常及び単離した膵島内のインスリン含量増加を示した。これらのマウスは、膵島におけるイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）受容体機能の著しい低下を有する。種々のスプライシング変異体が組織特異的発現によって特性化されている（Magendzo, K et al, 1991）。アネキシン７は脳の小胞体ストアからカルシウムを動員する（Watson WD. Et al, 2004）。Ａｎｘ７は全膵臓と比べて膵島において富化される。ラット初代β細胞では、Ａｎｘ７は高度に発現され、β細胞においてα細胞と比べて富化される。サイトカインへの曝露はヒト膵島においてＡＮＸＡ７発現を増加させない（ＭＰＳＳデータ）。
【０１７７】
Ｊ１．  本発明者らの発現解析：
【０１７８】
【表１４】
0005697995.tif 000015
【０１７９】
Ｊ２．  本発明者らのβ細胞遺伝子バンク情報：
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=310
【０１８０】
Ｊ３．  ＧＮＦ  ｓｙｍａｔｌａｓプローブはヒトにおいて低い発現レベルをもたらし、考慮に入れなかった。
【０１８１】
Ｋ．  マーカーＤＭＢＴ１：悪性脳腫瘍１において欠損している（Ｈｓ．２７９６１１）
肺サーファクタントタンパク質Ｄ（surfactant pulmonary-associated protein D）結合タンパク質とも呼ばれるＤＭＢＴ１（ＧＰ３４０、ｍｕｃｌｉｎ、Ｃｒｐｄ）は、スカベンジャー受容体スーパーファミリーの新規のメンバーである（Holmskov et al 1997）。ＤＭＢＴ１遺伝子の突然変異は、ヒト星細胞グリオーマにおいて報告されている（Mollenhauer, J. et al, 1997及びMueller W. etal, 2002）。種々のアイソフォームが組織特異的発現を有し、肺胞組織及びマクロファージ組織において発現が報告されている。ＤＭＢＴ１発現の喪失又は低下が食道癌、胃癌、肺癌、及び大腸癌において見られた。本発明者らのＭＰＳＳデータでは、ＤＭＢＴ１は全膵臓と比べて膵島において富化される。ラット初代β細胞における発現レベルは高くないが、非β細胞と比べてβ細胞において２倍超富化される。サイトカインへのヒト膵島の曝露は、ＤＭＢＴ１発現を減少させる（ＭＰＳＳデータ）。
【０１８２】
Ｋ１．  本発明の発現解析ＭＰＳＳデータ：
【０１８３】
【表１５】
0005697995.tif 000016
【０１８４】
Ｋ２．  独自のマイクロアレイ情報：ＤＭＢＴ１発現については以下のウェブリンクを参照されたい：
http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.10107
http://dil.t1dbase.org/page/GeneMore/display/?ug_id=Rn.10107
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=1755
【０１８５】
Ｌ．  マーカーＫＩＡＡ１５４３：独立行政法人理化学研究所のｃＤＮＡ  ２３１００５７Ｊ１６遺伝子（Ｈｓ．１７６８６）
ＫＩＡＡ１５４３はヒト脳のｃＤＮＡライブラリからクローニングされたが（Nagase T. et al, 2000）、膵臓においては特定されていない。その機能は未知である。本発明者らのＭＰＳＳデータでは、その発現は全膵臓と比べて膵島において富化される。ヒト及びラットのマイクロアレイに対して利用可能なプローブセットはない。サイトカインへのヒト膵島の曝露はその発現に影響を与えない（ＭＰＳＳデータ）。
【０１８６】
【表１６】
0005697995.tif 000017
【０１８７】
Ｌ１．  β細胞遺伝子バンク情報：
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=57662
【０１８８】
Ｍ．  マーカーＳＬＣ７Ａ８：溶質輸送体ファミリー７（陽イオン性アミノ酸輸送体、ｙ＋系）、メンバー８（Ｈｓ．６３２３４８）
ＳＬＣ７Ａ８又はＬＡＴ２（又はＴ細胞活性化リンカーファミリーのメンバー２（非Ｔ細胞活性化リンカー））（ウィリアムズ・ビューレン症候群染色体領域１５タンパク質）は、Ｎ末端及びＣ末端が細胞質内にある１２個の膜貫通ドメインを有する５３５アミノ酸のタンパク質である。ＳＬＣ７Ａ８と４Ｆ２重鎖との同時発現は、ＳＬＣ７Ａ８を細胞膜に送り、小さな及び大きな双性イオンアミノ酸に対し広い特異性をもってアミノ酸輸送活性を誘導する（Pineda, M et al, 1999）。腎臓において最も高い発現が報告されており、ドーパミン前駆体Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンはＬＡＴ２を介して輸送される（Quinones H. et al, 2004）。腎臓ＬＡＴ１及びＬＡＴ２の過剰発現は、不死化腎近位尿細管細胞におけるＬ−ＤＯＰＡの取り込みを増大する（Pinho LJ. et al, 2003 and 2004）。ＬＡＴ２の発現は全膵臓と比べて膵島において富化される（ＭＰＳＳデータ）。ラット初代β細胞における発現レベルは高く、非β細胞と比べてβ細胞において２倍増加する。
【０１８９】
Ｍ１．  独自のＭＰＳＳヒトデータ発現解析：
【０１９０】
【表１７】
0005697995.tif 000018
【０１９１】
Ｍ２．  β細胞遺伝子発現情報：発現は腎臓及び膵島において最も高い。
http://dil.t1dbase.org/page/GeneOverview/display/?gene_id=23428
【０１９２】
Ｍ３．  Ｓｙｍａｔｌａｓ情報：http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/（図２１）
【０１９３】
結論としては、１２種のβ細胞特異的細胞膜タンパク質及び２種の新たな膵島特異的細胞膜タンパク質の群が特定された。上位の３つ（ＦＸＹＤ２、Ａｌｅｘ、及びＸＬａｓ）を、検証戦略を策定するために選択した。３つの候補は全て膵島において特異的に富化され、膵臓内で膵島に特異的に位置していた。ＦＸＹＤ２のみが膵β細胞において発現され、細胞膜内で検出される。３つの候補は全て炎症状態で誘発されない。
【０１９４】
実施例３：２人の１型糖尿病性患者の膵臓におけるＦＸＹＤ発現の顕著な減少の確認
ＦＸＹＤ２−γ−ａの発現は、１型糖尿病患者（ＣＯ及びＴＥＬＦ（これらのコードは２人の患者を識別するものである）、１型糖尿病の診断からそれぞれ３日後及び５年後に死亡した）に由来する膵島において、正常膵臓（ＣＴＲＬ）と比較して大幅に減少する。３μｍの連続切片を採取して、ＳＰＹ３９３抗体、抗インスリン抗体、又は抗グルカゴン抗体で染色した。ＴＥＬＦ膵臓では、インスリン染色を基にβ細胞を検出することはできない。このことはＦＸＹＤ２染色の消失と相関していた。ＣＯ膵臓では、インスリン染色を基にβ細胞を検出することはできないが、非常にかすかなＦＸＹＤ２染色が残されていた（図１２参照、倍率１０００×）。
【０１９５】
図１３は１型糖尿病患者に由来する膵島におけるＦＸＹＤ２−γ−ａの定量化を示す。１症例当たり２０個のランゲルハンス島を定量化した（染色組織面積（％）（標識率ＬＩ）及び平均染色度）。上記図１１に見られるように、ＴＥＬＦ膵臓では、ＦＸＹＤ２染色は完全に消失しており、このことはインスリン染色により特定されるように、β細胞の消失と相関していた。ＣＯ膵臓においては、インスリンの染色は消失しており、このことはＣＴＲＬによる標識率（ＬＩ）と比較して、ＦＸＹＤ２−γ−ａの染色の５０倍の減少と相関していた。
【０１９６】
図１４は、ＳＴＺ処理アカゲザルにおけるＦＸＹＤ２−γ−ａ発現の減少がβ細胞の喪失と相関することを示す。対照（Ａ〜Ｃ、ＣＴ）及びＳＴＺ処理アカゲザル（Ｄ〜Ｆ、霊長類１及びＧ〜Ｉ、霊長類２）に由来する膵臓の連続切片を、抗グルカゴン抗体（左欄Ａ、Ｄ、Ｇ）、抗インスリン抗体（中央欄Ｂ、Ｅ、Ｈ）、又はＳＰＹ３９３ポリクローナル抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ（右欄Ｃ、Ｆ、Ｉ）を用いて解析した。倍率４００×。
【０１９７】
また、ＳＴＺ誘発糖尿病アカゲザルの膵臓におけるインスリン及びＦＸＹＤ２−γ−ａ発現の有意な減少を実証することができた（図１５）。対照（ＣＴ）及びＳＴＺ誘発糖尿病アカゲザル（霊長類Ｐ１〜Ｐ６）に由来する膵臓切片を解析した。１症例当たり６個の膵島を、試料の同一性を知らない３人の観察者によって計数した。グルカゴン陽性細胞、インスリン陽性細胞、及びＦＸＹＤ２−γ−ａ陽性細胞を、１個の膵島当たりの相対的割合として算出した。ＣＴにおける値を１００％と見なした。ＳＴＺ処理アカゲザル及び非処理対照（ＣＴ）においてインスリン、グルカゴン、及びＦＸＹＤ２−γ−ａについて染色された細胞の割合を、下記表７．に示す。対照霊長類（ＣＴ）の膵臓切片及びＳＴＺ誘発糖尿病アカゲザル（霊長類１〜６）の膵臓を解析した。β細胞の数を全膵臓に占める細胞の割合として計数した。１症例当たり６個の膵島を、試料の同一性を知らない３人の観察者によって計数した。グルカゴン陽性細胞、インスリン陽性細胞、及びＳＰＹ３９３陽性細胞を、１個の膵島当たりの陽性細胞の相対的割合として算出した。
【０１９８】
表７．ＳＴＺ処理アカゲザル及び非処理対照（ＣＴ）においてインスリン、グルカゴン、及びＦＸＹＤ２−γ−ａについて染色された細胞の割合
【表１８】
0005697995.tif 000019
【０１９９】
実施例４：選択された候補が膵β細胞塊画像化に使用可能なことを確認するための齧歯類における生体内分布研究
ＳＰＹ３９３抗体は、生体内分布研究を行うために任意の放射性トレーサーで標識することができる。この特定の実施例においては１２４Ｉを使用した。ＦＸＹＤ２に対するモノクローナル抗体を開発することもでき、検証した後、この抗体及びその断片を同様に生体内分布研究に使用することができる。モノクローナル抗体を作製する方法は当該技術分野で既知である。
【０２００】
アカゲザルにおける第１の生体内分布研究の結果を図１７に示す。動物に１２４Ｉで標識したＳＰＹ３９３抗体を注射した。注射後の種々の時点でＰＥＴスキャンを行った。下記表８．にもこの結果を示す。図面から明らかなように、膵臓は実際に標的とされているが（１日目、図１７Ａ及び２日目、図１７Ｂ）、シグナルは胃内容物の染色によって幾分隠れている（図１７Ｃ参照）。このバックグラウンドを減少させるために新たなスキャンを行う。
【０２０１】
これらの第１実験はどの症例においても、ＦＸＹＤ２−γマーカーが哺乳類の体内でのβ細胞塊の決定及び可視化に対する非常に有望な標的であることを確かに示す。
【０２０２】
表８．Max Lonneux/F. Jamar及びDenisDufraneとのＵＣＬ共同研究で行われた実験。ＳＰＹ３９３はＩ１２４で標識した
【表１９】
0005697995.tif 000020
【０２０３】
実施例５：ＦＸＹＤ２−γ−陽性細胞に特異的に結合する小分子の特定
別の態様では、本発明はＦＸＹＤ２−γ陽性細胞に特異的に結合する小分子を特定する方法を提供する。かかる小分子（例えばペプチド、化学物質等）は、その後β細胞塊を可視化するためのトレーサーとして使用することができる。この目的で、本発明者らはＦＸＹＤ２バイオマーカーを発現するか又は発現しないヒト細胞株を特定した。
【０２０４】
図１６に示すように、ＦＸＹＤ２−γ−ａ及びＦＸＹＤ２−γ−ｂアイソフォームの発現は、齧歯類膵島、ラットＩＮＳ−１Ｅ、ＡＲ４２Ｊ細胞、及びヒトのＣＡＰＡＮ−２細胞において示され得るが、ヒトＰＡＮＣ−１細胞においては示されない。ＦＸＹＤ２−γ−ａ発現はサイトカインへの２４時間の曝露の後も変化せず、β細胞マーカーを選択するために使用される方法が、実際にサイトカインの発現に非依存的であることが確認される。
Ａ  ＦＸＹＤ２−γ−ａ及びＦＸＹＤ２−γ−ｂスプライシング変異体がマウス膵島において検出された。ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォーム（レーン１）、ＦＸＹＤ２−γ−ｂアイソフォーム（レーン２）、及びＦＸＹＤ２−γ−ｃアイソフォーム（レーン３）を検出するためにプライマーを使用した。マーカー（Ｍ、レーン４）。重要なことに、γ−ｃ変異体は検出されなかった。
Ｂ  ポリクローナル抗ＦＸＹＤ２−γ−ａ抗体（ＳＰＹ３９３）は、ＦＸＹＤ２−γ−ａアイソフォームのみを認識する。ラット分散膵島細胞（レーン３、レーン５）及びラット腎臓（レーン１、レーン２、レーン４、レーン６）を解析した。レーン１：ＦＸＹＤ２−γ−ｂブロッキングペプチドとのＳＰＹ３９３、レーン２：非特異的ブロッキングペプチドとのＳＰＹ３９３、レーン３及びレーン４：ＦＸＹＤ２−γ−ａブロッキングペプチドとのＳＰＹ３９３、レーン５及びレーン６：ブロッキングペプチドを用いないＳＰＹ３９３。
Ｃ  ウエスタンブロット解析を、ＣＡＰＡＮ−２細胞（レーン１）、ＰＡＮＣ−１細胞（レーン２）、ＡＤ２９３細胞（レーン３）、ＩＮＳ−１Ｅ細胞（レーン４）、及び分散ラット膵島対照（レーン５、レーン８）、及びサイトカインに２４時間曝露した対照（レーン６、レーン９）、マーカー（レーン７）、ラット腎臓陽性対照（レーン１０）の全細胞抽出物に対して行った。下の矢印はＳＰＹ３９３により検出されたＦＸＹＤ２−γ−ａ発現を指し、上の矢印はポリクローナルウサギ抗β−アクチンを用いて検出されたβ−アクチンの発現を指す。
Ｄ  ウエスタンブロット分析を、対照条件（レーン１）、又はＩＬ１β（レーン２）、ＩＬ１β＋ＩＦＮγ（レーン３）、ＩＦＮγのみ（レーン４）に２４時間曝露したＩＮＳ１Ｅ細胞の全細胞抽出物、及び同様に対照条件（レーン５）、又はＩＬ１β（レーン６）、ＩＬ１β＋ＩＦＮγ（レーン７）、ＩＦＮγのみ（レーン８）に２４時間曝露したＡＲ４２Ｊ細胞の全細胞抽出物、マーカー（レーン９）、及びラット腎臓全細胞抽出物（レーン１０）に対して行った。下の矢印はＳＰＹ３９３により検出されたＦＸＹＤ２−γ−ａ発現を指し、上の矢印はポリクローナルウサギ抗β−アクチンを用いて検出されたβ−アクチンの発現を指す。ブロットは３回、４回の独立実験の代表的なものである。
【０２０５】
ＳＰＹ１バイオマーカーを発現する及び発現しない２つの別個の細胞株又は細胞型を用いることによって、ＳＰＹ１バイオマーカーに特異的に結合し、例えばＰＥＴ、ＰＥＴ−ＣＴ又はＳＰＥＣＴ解析に対するトレーサーとして有用な小分子の特定が可能となる。ＳＰＹ１陰性細胞ではなく、ＳＰＹ１陽性細胞との結合に特異的な小分子をスクリーンニングする手段は、当該技術分野で既知である。
【０２０６】
例えば、ＦＸＹＤ２に結合するペプチドを特定するためにファージディスプレイ実験を行い、これらのペプチドを標識して生体内分布解析を行うのに使用する。代替的には、化学物質ライブラリをＦＸＹＤ２に特異的に結合する化合物に関してスクリーニングし、この化合物を標識して生体内分布解析を行うのに使用する。また、小さな抗体断片「ナノボディ」（Ablynx NV）ライブラリ、ヒト化一本鎖Ｆｖライブラリをスクリーニングしてもよい。
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【図１】
0005697995.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005697995.tif 000032
【図１３】
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【図１４】
0005697995.tif 000034
【図１５】
0005697995.tif 000035
【図１６】
0005697995.tif 000036
【図１７Ａ】
0005697995.tif 000037
【図１７Ｂ】
0005697995.tif 000038
【図１７Ｃ】
0005697995.tif 000039
【図１８】
0005697995.tif 000040
【配列表】
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