(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えアデノウイルス抗原型３５（ｒＡｄ３５）を産生するに当たり、
（ａ）ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０）を懸濁液中潅流システムで培養する工程と、
（ｂ）前記細胞を密度１０×１０６生存細胞／ｍＬから１６×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度にてｒＡｄ３５で感染させる工程と、
（ｃ）感染細胞を潅流システムでさらに培養して前記ｒＡｄ３５を増殖させ、ｒＡｄ３５ウイルス粒子が少なくとも１×１０１２ＶＰ／ｍＬとなるようにする工程と、
（ｄ）前記ｒＡｄ３５を採取する工程と
を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程ｂ）における細胞をｒＡｄ３５で１０×１０６から１４×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度において感染させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｃ）における潅流システムが、交互接線流（ＡＴＦ）潅流システムである請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｅ）ｒＡｄを精製する工程をさらに備える請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｆ）精製されたｒＡｄ３５を含有する医薬品組成物を調製する工程をさらに備える請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組み換えアデノウイルスが、Ｅ１領域の少なくとも一部を欠如し、異種核酸を含有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ａ）における潅流システムが、交互接線流（ＡＴＦ）潅流システムである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ａ）を第一のバイオリアクター内にて行い、前記工程ｂ）およびｃ）を第二のバイオリアクター内にて行う請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記産生ｒＡｄ３５の物理的粒子に対する感染性粒子（ＶＰ／ＩＵ）の比率が３０：１未満である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養およびアデノウイルス産生に関する。より詳細には、本発明は哺乳類細胞の培養、該細胞のアデノウイルス感染およびそれからのアデノウイルス粒子の産生用の改善した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えウイルスベクターを使用したＤＮＡワクチン接種の分野における最近の開発は、臨床品質材料の大規模な製造のための必要性を生み出した。例えば結核およびマラリアの世界の難問と戦うに十分な量の組み換えアデノに基づくワクチンで途上国および後発発展途上国を支持することができるようにする方法が必要とされる。出生コホートの評価は、１５０，０００，０００を超える出生が途上国および後発発展途上国について２０１０〜２０１５に予想されることを示す。この出生コホートに基づいて、予想される年間需要のワクチンは、年間約１．５×１０１９ウイルス粒子（ＶＰ）に達成することができる（http://esa.un.org/unpp/index.asp?panel=2）。
【０００３】
アデノウイルスの産生用のいくつかの方法を記載する。これら方法は、接着細胞培養をローラーボトル、細胞工場（Ｎｕｎｃ社からのＮｕｎｃｌｏｎまたはＣｏｒｎｉｎｇ社からのＣｅｌｌＳｔａｃｋ）または細胞キューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）において使用する。接着細胞培養の産生方法は、アデノに基づくワクチンの世界的な需要を満たすことができない。従って、接着方法に用いる細胞は、懸濁培養に適している（例えば、ＨＥＫ２９３およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株）。懸濁培養の使用で、産生方法の規模を大規模なバイオリアクターへ拡大することが可能である。アデノウイルス産生の懸濁細胞培養を、通常３から２０Ｌの規模の間にて達成し、良好な規模拡大が最高１００Ｌ（Kamen et al., 2004）および最高２５０Ｌ（Xie et al., 2003）として報告された。最高１０，０００Ｌまでの規模拡大が予期されることが実験で報告された（Xie et al., 2003）。 
【０００４】
しかしながら、１０，０００Ｌまでの規模拡大の主な不利な点は、１０，０００Ｌバイオリアクター設備を設計し、建設するために必要とされる高い設備投資（ＣＡＰＥＸ）である。さらに、１０，０００Ｌ設備建設のＣＡＰＥＸ関与について、ＢＳＬ２条件下、製品が良好かを知る前に認識しなければならない（ＩＶ段階以降）。１０，０００Ｌバイオリアクター施設のための総投資費用は、225.000.000euroから20.000.000euroの間と報告されている（Estape et al., 2006）。したがって、より小さい規模における調製、例えば１０００Ｌ以下のバイオリアクターが、望ましい。
【０００５】
現在既存の方法を用いると、１．５×１０１９ＶＰ／年の目標を達成するためには、年間１０００Ｌ規模で１５０バッチを超えるものを生産する必要がある。従って、アデノウイルスワクチンの世界中の需要を、好ましくは非抑制的な費用にて満たすためには、アデノウイルス産生用のシステムを改良し、アデノウイルス粒子の収率を改善する必要性が存在する。
【０００６】
アデノウイルス産生の最適化に直面する問題の一つは、いわゆる「細胞密度効果」である。バッチモード操作において、いくつかの参考文献がアデノウイルス産生のための感染における最適な細胞密度の存在を示唆する。最適条件は、０．５〜１×１０６細胞／ｍＬの間にある（Maranga et al., 2005; Kamen et al., 2004）。バッチ式撹拌タンクバイオリアクター内におけるアデノウイルス（Ａｄ５）産生について、細胞あたりのウイルス産生率が最高約０．９×１０６細胞／ｍＬまで一定であるが、約１×１０６細胞／ｍＬで急激に低下することを示した（Altaras et al., 2005）。２×１０６細胞／ｍＬを超えると、感染性粒子は検出不可能であった。感染における細胞密度での特定産生低下と関連のあるブレークポイントは、培地に依存している。今まで市販の培地は、特定の産生を１×１０６細胞／ｍＬを超える細胞密度で最適に維持しながら、ウイルス粒子の高収率を支持する可能性を示さなかった（Kamen et al., 2004）。この低下の理由は、依然知られていないが、ウイルス産生のための制限された栄養有効性またはウイルス産生を抑制する代謝物質の高濃度によることがありえる。
【０００７】
グルコース、グルタミンおよびアミノ酸の添加のようなフェドバッチ操作は、最高２×１０６細胞／ｍＬまでの細胞密度で感染を可能とした。しかしながら、高い細胞密度で達成された産生率は、１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度での感染で得れたものより比較的低かった（Kamen et al., 2004）。
【０００８】
潅流処理において、細胞をバイオリアクターに中空繊維、スピンフィルターまたは音響隔離板によって保持する一方、培養培地をバイオリアクター中に潅流した。かかる処理において、１００×１０６細胞／ｍＬを超える細胞密度を時々達成することができる（例えば、Yallop et al., 2005）。 
【０００９】
感染潅流細胞は、中空繊維システムでの潅流中に早期の細胞消失を示した。これはウイルス感染のため一層高いせん断感度と関連し得る（Cortin et al., 2004）。より脆弱な感染細胞に対する管、中空繊維または蠕動ポンプにて誘導された流体力学のストレスが、たいがい前記現象の原因である。感染細胞が一層脆弱なため、潅流を感染相全体にわたって維持する場合、音響隔離板（Henry et al., 2004）が望ましいと特に示唆された。しかしながら、潅流モードで行った感染は、３×１０６細胞／ｍＬまでの細胞密度に関し２体積／日の潅流割合でのみ維持することが可能である。６×１０６細胞／ｍＬの細胞密度における感染は、特定の生産性で５倍の減少を導いた（Henry et al., 2004）。
【００１０】
他のものにより報告された細胞密度効果にも関わらず、ある報告書（Yuk et al, 2004）は、ヒト腫瘍細胞の良好な潅流培養を腫瘍崩壊のアデノウイルスベクター用の産生基盤として記載した。該報告書は、交互接線流（ＡＴＦ）技術を使用した高い細胞密度の潅流方法を記載した。感染における９×１０６ＨｅＬａＳ３細胞／ｍＬの平均生細胞密度では、約４×１０１１ＶＰ／ｍＬの平均ウイルス滴定濃度が観測された。該報告書に使用された腫瘍細胞は産生細胞として望ましくない、その理由は産生アデノウイルス粒子をヒトに投与するべき場合に、腫瘍細胞の使用が安全面リスクをもたらし得るからである。該報告書における組み換えアデノウイルスは、Ａｄ５に基づくものである。かかるアデノウイルスは、ワクチンとしての使用の可能性を制限し、その理由はヒト集団の大多数がＡｄ５に対する既存の中和抗体を含み、従って他の抗原型からの組み換えアデノウイルスがワクチンとしての使用に一層適しているからである（例えば、 国際公開００／７００７１号参照）。特に、サブグループＢからの組み換えアデノウイルス、例えばＡｄ３５がワクチンとしての使用に特に有利である（国際公開００／７００７１号）。 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
限られた情報が、例え存在したとしても、Ａｄ５以外の抗原型からの組み換えアデノウイルスの大規模な産生、特に有利な抗原型３５に利用可能である。Ａｄ３５およびＡｄ５の間のいくつかの相違が、その陰イオン交換を用いる精製に関して記載されている（国際公開2005/080556号）。異なる抗原型の組み換えアデノウイルスの若干の異なる物理学的性質が、産生処理または特定の条件下で相違を引き起こす場合がある。かかる潜在的相違が、産業規模で特に重要で、小規模で外見上小さい相違さえもが一年間の世界的な要求の産生に想定される規模で大きな経済結果を有する可能性がある。例えば、Ａｄ５に対して報告された細胞密度効果が他の抗原型に対し類似するか否かはこれまで知られていなかった。従って、ｒＡｄ３５ワクチンの世界的な需要を満たすため、組み換えアデノウイルス抗原型３５（ｒＡｄ３５）産生用のシステムを改良する必要性が存在する。 
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明者らは、産生細胞を潅流培地にて１０×１０６生存細胞／ｍＬを超える密度で感染させた際に、組み換えアデノウイルス抗原型３５（ｒＡｄ３５）の収率がさらに上昇したことを見出した。対照的に、産生細胞を２０×１０６または３０×１０６生存細胞／ｍＬで感染する場合、組み換えアデノウイルス抗原型５（ｒＡｄ５）の収率は１０×１０６生存細胞／ｍＬでの感染と比較して低かった。従って、ｒＡｄ３５は、使用した条件下産生細胞中でｒＡｄ５と異なって増殖する。さらに、本発明者らは、他の抗原型が再度異なって挙動し、最適な結果を得るためには特定のアデノウイルス抗原型に対する処理を各抗原型に対して微調整しなければならないことを示唆することを見出した。本発明は、ｒＡｄ３５産生用の最適なシステムを、収率、得られたｒＡｄ３５の品質および下流処理用採取の取り扱いの容易さに関して提供する。
【００１３】
本発明は、組み換えアデノウイルス抗原型３５（ｒＡｄ３５）の産生方法を提供し、該方法は、ａ）産生細胞を懸濁液中潅流システムで培養する工程と、ｂ）前記細胞をｒＡｄ３５で約１０×１０６生存細胞／ｍＬから１６×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度において感染させる工程と、ｃ）感染細胞を潅流システムで更に培養して前記ｒＡｄ３５を増殖する工程と、ｄ）前記ｒＡ３５を採取する工程とを備える。
【００１４】
特定の実施形態においては、前記工程ｂ）における細胞をｒＡｄ３５で約１０×１０６から１４×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度において感染させる。
【００１５】
特定の好ましい実施形態において、前記工程ｃ）における潅流システムが交互接線流（ＡＴＦ）潅流システムである。他の好ましい実施形態において、前記工程ａ）における潅流システムが交互接線流（ＡＴＦ）潅流システムである。好ましい実施形態において、前記工程ａ）およびｃ）の双方における潅流システムが交互接線流（ＡＴＦ）潅流システムである。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明の方法は、ｅ）ｒＡｄ３５を精製する工程をさらに備える。さらなる実施形態において、該方法は、ｆ）精製されたｒＡｄ３５を含有する医薬品組成物を調製する工程をさらに備える。
【００１７】
特定の実施形態において、前記組み換えアデノウイルスが少なくともＥ１領域の一部を欠如し、異種核酸を含有する。
【００１８】
好ましい実施形態において、産生されたｒＡｄ３５の物理的粒子に対する感染性粒子（ＶＰ／ＩＵ）の比率は、３０：１未満、好ましくは２０：１未満である。
【００１９】
また、本発明の一態様は、少なくとも１×１０１２ｒＡｄ３５ウイルス粒子（ＶＰ）／ｍＬを産生する方法を提供し、該方法が、ａ）産生細胞を懸濁液中潅流システムで培養する工程と、ｂ）前記細胞をｒＡｄ３５で約１０×１０６生存細胞／ｍＬから１６×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度において感染させる工程と、ｃ）感染細胞を潅流システムでさらに培養して前記ｒＡｄ３５を増殖させ、これによりｒＡｄ３５ウイルス粒子濃度が少なくとも１×１０１２ＶＰ／ｍＬを達成する工程と、ｄ）前記ｒＡ３５を採取する工程とを備える。
【００２０】
本発明はまた、培養培地、産生細胞および少なくとも１×１０１２ｒＡｄ３５ウイルス粒子（ＶＰ）／ｍＬを含む２Ｌから１０００Ｌの間の作業容積を有するバイオリアクターを提供する。特定の実施形態において、バイオリアクターは５０Ｌから５００Ｌの間の作業容積を有する。好ましい実施形態において、バイオリアクターをＡＴＦ潅流システムに接続する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】振盪容器におけるｒＡｄ５を用いた高細胞密度での感染を示すグラフである。
【図２】振盪容器および２ＬのバイオリアクターにおけるｒＡｄ３５．ＴＢ−Ｓを用いた高細胞密度での感染を示すグラフである。
【図３】振盪容器におけるｒＡｄ３５．ｅＧＦＰを用いた高細胞密度での感染を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、大量の組み換えアデノウイルス３５の産生用の新規方法を開示する。この最適化方法は、培地を高細胞密度で細胞あたりの高ウイルス産生率の保存とともに感染させる能力に依存する。これによって、高ウイルス濃度を有する採取ウイルス溶液を単一のバイオリアクターで得る方法を提供する。本発明の方法のｒＡｄ３５に対する典型的な収率は、約２〜３×１０１１ＶＰ／ｍＬである。実際、本発明の方法を用いて、非常に大量、例えば少なくとも約５×１０１１ＶＰ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約６，７，８または９×１０１１ＶＰ／ｍＬの量のｒＡｄ３５粒子を産生し得ると考えられる。好ましくは少なくとも１×１０１２ＶＰ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１．５×１０１２ＶＰ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも２×１０１２ＶＰ／ｍＬ、例えば約１×１０１２から５×１０１２ＶＰ／ｍＬの間のｒＡｄ３５を産生する。通常、該方法は約１×１０１３ＶＰ／ｍＬを超えるｒＡｄ３５を産生しない。本発明による方法で得ることができる収率は、１０００Ｌを超える作業容積を有するバイオリアクター施設を必要とすることなく所望量の特定のｒＡｄ３５系ワクチンを世界中で調製するのにおそらく十分なものである。
【００２３】
本発明は、組み換えアデノウイルス抗原型３５（ｒＡｄ３５）の産生方法を提供し、該方法がａ）産生細胞を懸濁液中潅流システムで培養する工程と、ｂ）前記細胞をｒＡｄ３５で少なくとも１０×１０６生存細胞／ｍＬの密度において感染させる工程と、ｃ）感染細胞を潅流システムでさらに培養して前記ｒＡｄ３５を増殖させる工程と、ｄ）前記ｒＡ３５を採取する工程とを備える。 
【００２４】
特定の実施形態において、前記工程（ｂ）における細胞をｒＡｄ３５で約１０×１０６から５０×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度にて感染させる。さらなる実施形態において、前記工程（ｂ）における細胞をｒＡｄ３５で約１０×１０６から２０×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度にて感染させる。またさらに有利な実施形態において、前記工程ｂ）における細胞をｒＡｄ３５で約１０×１０６から１６×１０６生存細胞／ｍＬの間、例えば約１０，１１，１２，１３，１４または１５×１０６生存細胞／ｍＬの密度にて感染させる。 
【００２５】
他の実施形態において、前記工程（ｂ）における細胞をｒＡｄ３５で約２０×１０６から５０×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度にて感染させる。
【００２６】
産生細胞および組み換えアデノウイルス
本発明に係る産生細胞（しばしば従来技術および本明細書にて「パッケージング細胞」、「補体細胞」または「宿主細胞」と称する）は、所望のアデノウイルスを増殖し得るあらゆる産生細胞とすることができる。例えば、組み換えアデノウイルスベクターの増殖が、アデノウイルス欠如を補完する産生細胞にて行われる。かかる産生細胞は、そのゲノムに少なくともアデノウイルスＥ１配列を有するのが好ましく、このことにより組み換えアデノウイルスをＥ１領域における欠失によって補完することができる。さらにアデノウイルスは、Ａｄゲノムに重要でないＥ３領域に欠失を有する場合があり、従ってかかる欠失を補完する必要がない。Ｅ１によって不死化されたヒト網膜細胞のような任意のＥ１補完産生細胞、例えば９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号参照）、Ｅ１形質転換された羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号参照）、Ｅ１形質転換されたＡ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号、米国特許第５，８９１，６９０号参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219）、２９３等を用いることができる。特定の実施形態において、産生細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、９１１細胞、ＩＴ２９３ＳＦ細胞等である。好ましくは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託96022940；米国特許第5,994,12号参照）またはそれに由来する細胞を産生細胞として使用する。
【００２７】
ここでは、組み換えアデノウイルス抗原型３５（ｒＡｄ３５）が高細胞密度感染を適用する方法においてｒＡｄ５と比較してこれまで知られていなく、有利な物性を有することを示す。本発明者らはまた、さらに他の抗原型が同様の方法で再度異なって挙動し、組み換えアデノウイルスの大規模な産生用の最適な条件を異なる抗原型のために確立すべきことを示唆することが分った。それゆえに、特定の好ましい実施形態において、本発明のアデノウイルスはｒＡｄ３５である。
【００２８】
アデノウイルスベクターがＥ１領域、例えばウイルス複製に必要とされるアデノウイルスゲノムのＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの重要な遺伝子機能にて欠如していることが好ましい。特定の実施形態において、ベクターがＥ１領域の少なくとも１つの重要な遺伝子機能および非必須Ｅ３領域の少なくとも一部において欠如している。アデノウイルスベクターが、「多重欠如」しているとすることができ、アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のおのおのにて１つ以上の重要な遺伝子機能に欠如していることを意味する。例えば、上記Ｅ１欠失またはＥ１、Ｅ３欠失アデノウイルスベクターが、Ｅ４領域の少なくとも１つの重要な遺伝子および／またはＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの重要な遺伝子にてさらに欠失している可能性がある。全Ｅ４領域の欠失アデノウイルスベクターは、より低い宿主免疫反応を誘発することができる。適当なアデノウイルスベクターの例としては、（ａ）Ｅ１領域の全部または一部およびＥ２領域の全部または一部；（ｂ）Ｅ１領域の全部または一部、Ｅ２領域の全部または一部およびＥ３領域の全部または一部；（ｃ）Ｅ１領域の全部または一部、Ｅ２領域の全部または一部、Ｅ３領域の全部または一部およびＥ４領域の全部または一部；（ｄ）Ｅ１ａ領域の少なくとも一部、Ｅ２ｂ領域の少なくとも一部、Ｅ２ａ領域の少なくとも一部、Ｅ３領域の少なくとも一部；（ｅ）Ｅ１領域の少なくとも一部、Ｅ３領域の少なくとも一部、Ｅ４領域の少なくとも一部；（ｆ）全ての重要なアデノウイルス遺伝子産物（例えば、ＩＴＲおよびパッケージングシグナルのみを含むアデノウイルス単位複製配列）を欠如するアデノウイルスベクターが挙げられる。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムからの重要な領域の欠失の場合、前記領域によってコード化された機能がトランス、好ましくは産生細胞にて提供されるべきであり、即ちＥ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全体をアデノウイルスから削除したとき、これらが産生細胞にて、例えばゲノム内に組み込まれているか、若しくはいわゆるヘルパーアデノウイルスまたはヘルパープラスミドの形状にて存在すべきである。
【００２９】
複写欠如アデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはキメラアデノウイルスのあらゆる種、菌株、サブタイプまたは種、菌株、サブタイプの混合物を例えば特定の所望の細胞タイプを感染させる能力を有するアデノウイルスベクター提供し得るベクターＤＮＡの給源（例えば、国際公開第９６／２６２８１号、国際公開第００／０３０２９号参照）として用いることにより生成することができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、ｒＡｄ３５をアデノウイルスとして使用する。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明のアデノウイルスはＥ１領域、例えばＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂコード化配列の少なくとも一部を欠如し、また異種核酸をさらに含有する。適当な異種核酸は当業者に周知で、例えばｒＡｄベクターをワクチン接種の目的のために用いる際に免疫反応が望ましいポリペプチド、例えばマラリア（例えば、国際公開第２００４／０５５１８７号参照）、ＨＩＶ、結核（国際公開第２００６／０５３８７１号参照）、特定のウイルス等の当業者の周知のすべてのものに対して免疫反応を生成するのに適したトランス遺伝子をコード化するオープン・リーディング・フレーム、例えばトランス遺伝子オープン・リーディング・フレームを含むことができる。実際、異種核酸の性質は、本発明に重要でなく、あらゆる異種核酸とすることができ、それ故ここでさらなる詳述を必要としない。
【００３２】
当業者は、異なる抗原型のアデノウイルスベクターを特定の宿主細胞にて増殖するのを、例えば米国特許第６，４９２，１６９号または国際公開第０３／１０４４６７号およびそれに関する参考文献に記載されたような方法を用いて可能になるのを認識するだろう。例えば、Ｅ１欠如ｒＡｄ３５の増殖に関して、Ａｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋを発現する特定の産生細胞を、例えば当業者に知られているようなＡｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するＰＥＲ．Ｃ６またはＨＥＫ２９３細胞（米国特許第６，４９２，１６９号参照）のような既存の産生細胞に基づいて作成することができる。或いはまたかつ好ましくは、既存の（Ａｄ５−）補体細胞株、例えばＰＥＲ．Ｃ６またはＨＥＫ２９３を、例えば本明細書で参照して援用する国際公開第０３／１０４４６７号に多岐に渡って開示されたように、細胞の変性なしにＥ１欠如ｒＡｄ３５の増殖用にＡｄ５のＥ４−ｏｒｆ６コード化配列のｒＡｄ３５ベクターへの包含によって使用することができる。従って、あらゆる抗原型のアデノウイルスベクターの増殖を産生細胞上で当業者に周知の手法および方法を用いて行うことができる。アデノウイルスベクター、その作成方法および増幅方法が、当業界で周知であり、例えば米国特許第５，５５９，０９９号、第５，８３７，５１１号、第５，８４６，７８２号、第５，８５１，８０６号、第５，９９４，１０６号、第５，９９４，１２８号、第５，９６５，５４１号、第５，９８１，２２５号、第６，０４０，１７４号、第６，０２０，１９１号および第６，１１３，９１３号、Thomas Shenkの“Adenoviridae and their Replication”, M. S. Horwitzの“Adenoviruses”、 B. N. Fields et al.の 第３版, Raven Press, Ltd., New York (1996)のVirologyにおける６７章および６８章ならびに本明細書に記載の他の参考文献に記載されている。 
【００３３】
アデノウイルスベクターの作成は、当業界でよく理解されており、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995)および本明細書に記載の他の参考文献に記載されているような標準の分子生物学技術の使用を伴う。
【００３４】
本発明に係る産生細胞を培養して、細胞およびウイルス数および／またはウイルス滴定濃度を増大する。細胞の培養は、本発明に係る興味あるウイルスを代謝および／または成長および／または分割および／または産生することを可能とするために行う。これは当業者に既知であるような方法によって達成することができ、栄養を細胞に例えば適切な培養培地において付与することを含むが、これに限定されない。異なる培養培地を用いることができ、使用する細胞および環境に最適な培養培地を選択することは、当業者の典型的業務の一部である。従って、本発明の目的に適した培養培地が、当業者に周知で、通常商業用供給源から多量に得るか、または標準のプロトコルに従って特注することができる。培養を、例えばディッシュ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内にてバッチ、フェドバッチ、連続システム等を用いて行うことができる。ウイルスの大規模（連続）な産生を細胞培養によって達成するためには、懸濁液中で成長することができる細胞を有することが技術的に好ましく、また動物またはヒト由来の血清若しくは動物またはヒト由来の血清成分の不在下で培養することができる細胞を有することが好ましい。細胞を培養するための適切な条件が既知である（例えばTissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)およびR.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9を参照）。
【００３５】
細胞培養システムおよび潅流システム
バイオリアクターは、懸濁液依存動物細胞培養から大規模な生物学的産物の産生用に広範囲にて使用されている。本発明によれば、アデノウイルス増殖に用いるバイオリアクターは、例えば撹拌タンク、処理可能なバイオリアクター、エアリフトリアクター等とすることができる。 
【００３６】
本発明の特定の実施形態によれば、バイオリアクターは撹拌タンクである。 
【００３７】
本発明の特定の実施形態によれば、バイオリアクターは約２Ｌおよび２０００Ｌ間の作業容積を有し、本明細書に開示の上下の制限値の間を含むことを意味し、即ち２Ｌが最小の作業容積であり、２０００Ｌが最大の作業容積である。これら値間のあらゆる個々の値の作業容積を有するバイオリアクターが、本発明に含まれることを意味する。ここで用いる「約」という数値の用語は、値±１０％を意味する。特定の好ましい実施形態において、作業容積は１０Ｌから１０００Ｌの間、好ましくは２０Ｌから８００Ｌの間、例えば３０Ｌから６００Ｌの間、５０Ｌから５００Ｌの間、約２５０Ｌまたは約５００Ｌである。本発明に係る作業容積を有するバイオリアクターの使用の利点は、非常に大きい容量のバイオリアクターの使用、即ち２０００Ｌを超える作業容積、好ましくは１０００Ｌを有するものの使用を回避し、従ってかかる非常に大きなバイオリアクターを建設するための莫大な資本および時間投資を必要としないことである。さらに、本発明の方法の使用を行った際に、産生物、即ちｒＡｄをより一層濃縮し、ｒＡｄのバイオリアクターからの採取および／またはさらなる下流の処理における時間および費用を節約する。作業容積は、バイオリアクター内の有効な培養容積である。撹拌されたタンクは、通常１：１から３：１の高さ対直径の比率を有する。培養物を、羽根ディスクまたは船用プロペラパターンに基づく一つ以上の撹拌器で通常混合する。羽根より少ないせん断力を付与する撹拌器システムを記載する。撹拌を磁気的に連結した駆動装置により直接または間接的のいずれかで駆動することができる。間接的な駆動装置は、撹拌器シャフトに対する封止を介して微生物汚染の危険性を減少する。前記バイオリアクターの計装および制御は、撹拌、温度、溶存酸素、ｐＨおよびバイオマスの制御（制限することなく）を含む。細胞培養培地の撹拌、ｐＨ、温度、溶存酸素濃度は、原理上重要でなく、選択した細胞の種類に依存する。好ましくは、撹拌、ｐＨ、温度、溶存酸素濃度を、かかる細胞の成長に最適であるように選択する。当業者は、培養に最適な撹拌、ｐＨ、温度、溶存酸素濃度を見つける方法を知っている。通常、最適な撹拌は５０から３００ｒｐｍ、例えば１００〜２５０ｒｐｍであり、最適なｐＨは６．７から７．７の間であり、最適な温度は３０から３９℃の間、例えば３４，３５，３６，３７または３８℃である。
【００３８】
最大規模の懸濁培養は、操作および拡大するのに最も容易なため、バッチまたはフェドバッチ処理として操作される。しかしながら、潅流原理に基づく連続処理がより一般的になっている。本発明によれば、産生細胞を潅流システムにて培養する。細胞の潅流培養は、技術的に従来の意味を有し、即ち培養中細胞を分離前より低い細胞密度を有する液体の流出と、細胞培養培地の流入とが存在する分離装置によって保持されることを意味する。潅流培養の使用は、細胞を高密度（例えば１０〜５０×１０６生存細胞／ｍＬ）で成長させる課題に応じたものである。密度を２〜４×１０６生存細胞／ｍＬを超えて増大するために、栄養欠損を補い、有毒産生物を除くように培地を新鮮な供給物と常にまたは継続的に入れ替える。潅流はまた、非常に優れた培養環境（ｐＨ、ｄＯ２、栄養濃度等）の制御を可能とする。培養による新鮮な培地の潅流は、細胞を様々な分離装置（例えば、細かいメッシュ回転フィルター、中空繊維または平面プレート膜濾過器、沈降管）で保持することによって達成することができる。本発明方法の好ましい実施形態において、分離装置は中空繊維を含有するフィルターモジュールである。 
【００３９】
「中空繊維」という用語は、管状膜を意味する。管の内径は、好ましくは０．３から６．０ｍｍの間、より好ましくは０．５から３．０ｍｍの間、最も好ましくは０．５から２．０ｍｍの間である。特定の実施形態において、膜のメッシュサイズ（孔サイズ）は、メッシュ中の孔のサイズが細胞の直径に近接して細胞の高い保持力を確実にする一方、細胞破片がフィルターを通過することができるように選択される。他の実施形態において、メッシュサイズは、細胞の直径より非常に小さいものである。好ましくは、メッシュサイズが０．１〜３０μｍの間、例えば０．１から３μｍ、約０．２μｍである。中空繊維を含有するフィルターモジュールが、例えばGeneral Electric（旧Amersham）社から市販されている。相当な量のアデノウイルス粒子は、ウイルス粒子が適用されたメッシュサイズより小さいにも関わらず、本発明の処理中に流出培養培地にて観測されなかった。 
【００４０】
特定の代謝物質の望ましいレベルを維持し、培養培地における不純物を取り除くことによって減少するために、潅流を用いる。潅流割合を、様々な方法、例えば潅流期間中に維持されるべき置換容積／単位時間、または特定の代謝物質のレベルの観点から測定することができる。一般に、潅流を培養中常に実施せず、所要に応じて培養中時々のみに通常行う場合である。例えば、潅流はグルコースのような特定の培地成分が消耗し始めた後取り替える必要があるまで通常開始されない。
【００４１】
いくつかの潅流システムが当業界で既知であり、原則として本発明の方法に適している。「潅流システム」という用語は、分離装置に接続したバイオリアクターの組み合わせを意味する。分離装置は、バイオリアクターに組み込まれている（例えば、微細なメッシュスピンフィルター）か、またはバイオリアクターの外側に残存する（例えば中空繊維）かのいずれかとすることができる。どちらにおいても、上記のように、分離装置は細胞の塊をリアクターから流失することを防止し、培地のリフレッシュメントを可能とする。
【００４２】
本発明は、パイロット実験をいくつかの潅流システムで行ない、交互接線流（ＡＴＦ）潅流システムが最高の結果を与えた。従って、本発明の好ましい実施形態においては、バイオリアクターを（接続した）ＡＴＦ潅流システム（例えば、ATF System, Refine Technology, Co., East Hanover, NJ）で操作する。かかるシステムは、中空繊維ハウジングの一端に搭載したダイアフラムポンプからなる。ハウジングの他端を共同組立物に取り付け、次に利用可能なポートを介してバイオリアクターに接続する。ダイアフラムポンプおよび制御システムは、中空繊維を介して交互接線流を生成するのに役立つ。これは中空繊維の膜表面と同じ方向（即ち、接線方向）への一方流で、往復しているものがあり、また前記フィルター表面に実質的に垂直の方向への他の流れがあることを意味する。接線方向の流れを、当業者に既知で、例えば米国特許第６，５４４，４２４号明細書に記載されているような方法に従って達成することができる。 
【００４３】
ＡＴＦ潅流システムの操作が開示されている（Furey, 2002）。ＡＴＦシステムは、細胞を長時間培養し、高い細胞密度を防止するフィルターを有することなく達成することを可能とする。実際、１００×１０６生存細胞／ｍＬを超える非常に高い細胞密度を、ＡＴＦ潅流システムの使用、例えばＰＥＲ．Ｃ６細胞で得ることができる（Yallopなどを参照）。しかしながら、初期の報告では、潅流システム内のＰＥＲ．Ｃ６細胞を完全に異なる目的のために使用し、アデノウイルスで感染していなかった。
【００４４】
ＡＴＦシステムのさらなる利点は、システムが低い剪断応力を生成することである。エネルギーを液体表面に加えて、低い剪断層流を生成する。これは、特に細胞をアデノウイルスで感染させる本発明に有利である。潅流処理の間、細胞密度の損失がないＡＴＦシステムでの後感染が見出され、早期細胞損失が観測されないが、むしろ安定した細胞成長を観測した。細胞が完全な状態で残存するため、ウイルス増殖のための最適な条件を確立する。
【００４５】
従って、ＡＴＦシステムでの潅流は、非常に高い細胞密度を得ることを可能とするため、予備培養相（本発明に係る工程ａ）中に有利であり、細胞がその後のアデノウイルスでの感染に良好な状態であり、高収率を得るのに寄与する。前記高い細胞密度を達成するためには、特定の実施形態において、培養培地を産生細胞の細胞成長（工程ａ）中の時間の一部の間少なくとも部分的な潅流する。特定の実施形態において、一旦約２×１０６生存細胞／ｍＬから８×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度を達成してから潅流を開始する。
【００４６】
さらに、非常に高いアデノウイルス収率を感染細胞から得ることを可能とするため、ＡＴＦシステムでの潅流が感染段階（本発明に係る工程ｃ）後に有利である。従って、好ましい実施形態において、本発明の方法の予備培養段階および後感染段階の双方がＡＴＦ潅流システムを使用する。ＡＴＦ中に用いる培養培地の容積を、当業者によって容易に確立し、調整することができるので、細胞の必要性によって変えることができ、通常０．５〜５容器容積／日（ｖｏｌ／ｄ）であり、例えば１〜３ｖｏｌ／ｄ、約２ｖｏｌ／ｄである。特定の有利な実施形態において、リフレッシュメント割合は１から２ｖｏｌ／ｄの間であり、これは得られたｒＡｄ３５の収率および品質に関して非常に優れた結果を与える一方、同時に培地の消耗およびそれに伴う関連費用が依然として適切であることを本発明者らはここに示す。
【００４７】
最終的に、ＡＴＦ潅流システムは計測可能なシステムである。異なるサイズのＡＴＦユニットが、入手可能である。空気流を用いて、培養物を中空繊維膜を介して駆動させるため、極めて早く、低い剪断接線方向の流速を発生させて、Ｒ＆Ｄからの製造規模を１０００Ｌまで拡大する技術を使用することを可能とする（Furey, 2002）。おそらく、さらなる開発がＡＴＦ潅流システムのさらなる規模拡大を可能とする。
【００４８】
Ｙｕｋらは、腫瘍細胞株を用いてｒＡｄ５を産生し、その中で完全な処理を産生バイオリアクター内にて約８〜１０日かかる単一のバイオリアクターにて行う。本発明の特定の実施形態においては、２つの異なるバイオリアクターを用い、１つは予備培養（工程ａ；予備培養バイオリアクター）のため、もう１つは細胞の感染（工程ｂ）および後感染培養（工程ｃ；産生バイオリアクター）のためのものである。これら工程用の２つの異なったバイオリアクターの使用の利点は、約１．５〜５日、通常約２〜３日の産生バイオリアクター中での培養のみを必要とし、従って１年あたりより多くの操作を行うことができることである。感染中大量の新鮮な培養培地の添加は、産生バイオリアクターにおける感染中に必要な培養培地の体積を減少するためにさらに有利である。別の実施形態において、本発明の全工程ａ〜ｃを単一つのバイオリアクターにて行うことも可能である。
【００４９】
感染
本発明の方法において、産生細胞を組み換えアデノウイルスで感染させる。通常、ウイルスを適切な産生細胞へ最適な条件下で曝して、ウイルスの取り込みを可能とする。最適条件は、細胞の種類および選択したアデノウイルスの種類に依存する。当業者は、最適な条件、例えば撹拌、ｐＨ、温度、溶存酸素（ｄＯ２またはＤＯ）、感染の多様性（ＭＯＩ）を見つける方法を知っている。通常、最適な撹拌は、約５０から３００ｒｐｍの間、典型的に約１００〜２００、例えば約１５０であり、典型的なＤＯは２０〜６０％、例えば４０％であり、最適なｐＨは６．７から７．７であり、最適な温度は３０から３９℃、例えば３４〜３７℃、最適なＭＯＩは５から１０００の間、例えば約５０〜３００である。一般に、アデノウイルスは産生細胞を自然に感染させ、産生細胞をｒＡｄ粒子と接触させることは、細胞の感染に十分である。通常、アデノウイルスの播種株を培養物に添加して感染を開始し、その後アデノウイルスが産生細胞にて増殖する。これは当業者にとって全て定型的な方法である。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、潅流を感染前に止め、１から２０時間の間の後、例えば３〜１５時間、５時間後に後感染を再度始めた。この遅延は、ウイルス粒子が細胞に侵入し、ウイルス粒子がシステム外へ流出されるのを防止することを可能にする。潅流割合、後感染は、潅流によって維持されるグルコースレベルに関して規定される。例えば、本発明において、培地中のグルコース濃度を約２ｍｍｏｌ／Ｌから２０ｍｍｏｌ／Ｌの間、典型的に約５から１０ｍｍｏｌ／Ｌの間の濃度で通常維持する。 
【００５１】
バイオリアクターをｒＡｄ３５で高い細胞密度、例えば１０×１０６生存細胞／ｍＬを超えるものに、細胞あたり高ウイルス産生の維持と共に感染させることが有利に可能である。特定の実施形態において、特定の産生率が約０．５×１０５から１．５×１０５ＶＰ／細胞で残存する。
【００５２】
さらに本発明において、感染前の細胞培養の生存率は、７５％を超えて残存する。培養物における細胞総量の少なくとも７５％が感染時に生存していることを意味する。特定の実施形態において、感染時の細胞培養物の生存率は、少なくとも８０％、さらなる実施形態において、少なくとも８５％である。生存率を、当業者に使用される定型の方法、例えばトリパンブルー色素排除、Ｃａｓｙ細胞数等を用いて測定することができる。
【００５３】
特定の実施形態において、感染時の細胞密度は約１０×１０６から５０×１０６生存細胞／ｍＬの間、例えば約１０×１０６から２０×１０６生存細胞／ｍＬの間、約１０×１０６から１５×１０６生存細胞／ｍＬの間、約１０×１０６から１４×１０６生存細胞／ｍＬの間、約１２〜１３×１０６生存細胞／ｍＬである。これら細胞密度は、細胞破片および宿主細胞ＤＮＡの制限された蓄積を有する高いウイルス産生を可能とし、これら実施形態の利点をアデノウイルス採取の下流処理に与える。したがって、本発明はｒＡｄ３５産生用の最適化方法を提供し、多数の上質なｒＡｄ３５粒子を得ると同時に、下流処理目的のために依然として対処可能である採取された成分を提供する。
【００５４】
ここに開示した他の実施形態において、感染時の細胞密度は約１５×１０６から５０×１０６生存細胞／ｍＬの間、例えば約１７×１０６から４５×１０６生存細胞／ｍＬの間、約２０×１０６から４０×１０６生存細胞／ｍＬの間、２５×１０６から３５×１０６生存細胞／ｍＬの間、約３０×１０６生存細胞／ｍＬである。これら細胞密度における感染は、高濃度の組み換えアデノウイルス、特にｒＡｄ３５を産生し、これまで開示されたｒＡｄ３５の収率を超えることが可能である。本発明において初めて示すように、高細胞密度（約１０×１０６生存細胞／ｍＬ）におけるｒＡｄ５感染とは対照的に、約１０×１０６生存細胞／ｍＬを超える密度でのｒＡｄ３５による感染は、潅流システムを有する懸濁液中の産生細胞を用いて感染時の細胞密度を少なくとも３０×１０６生存細胞／ｍＬまで増大させたｒＡｄ３５の容積測定生産率を依然として上昇した。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも１×１０１２ｒＡｄ３５ウイルス粒子（ＶＰ）／ｍＬを産生するための方法を提供する。
【００５６】
本発明の方法は、ｒＡｄ３５の回収をヒトへ投与すべきアデノウイルスの重要なパラメータである３０：１未満の物理的粒子対感染性粒子の比率で可能とする。これはウイルス粒子（ＶＰ）／感染単位（ＩＵ）比率として、例えばＱＰＡ分析を用いて測定することができる（Wang et al, 2005）。より低い比率が有利である。その理由は、かかる場合により少ないウイルス粒子を投与して同じ数の細胞を感染させる必要があるからである。現在のＦＤＡ規制は、３０：１未満のＶＰ／ＩＵ比率を必要とするため、ここに記載した本発明の方法は、この特定の必要条件を満たす大量の数のｒＡｄ３５を調製するのに適している。Yukら（２００４）は、ここに開示した数より低い絶対数のウイルス粒子を報告し、さらにYukら（２００４）に開示された試料のＶＰ／ＩＵ比率が、約１００（Yuk et al, 2004の図２Ａ／２Ｂ）である。対照的に、本発明者らはより高い絶対数の収率および２０：１未満の著しく優れたＶＰ／ＩＵ比率を報告する。従って、特定の好ましい実施形態において、本発明の方法は、２０：１未満、例えば約２０：１から約５：１のＶＰ／ＩＵ比率を有するｒＡｄ３５のバッチを提供する。
【００５７】
細胞採取および溶解の方法
アデノウイルスの感染後、ウイルスは細胞内にて複製し、その結果増幅される。アデノウイルス感染は、最終的に感染細胞の溶解をもたらす。従って、アデノウイルス溶解特性は、ウイルス産生の２つの異なるモードを可能とする。第一モードは、細胞溶解前にウイルスを採取し、外部因子を用いて細胞を溶解することである。第二モードは、産生細胞による（ほぼ）完全な細胞溶解後にウイルス上清を採取することである（例えば、外部因子による宿主細胞の溶解なしにアデノウイルスを採取することを記載した米国特許第6,485,958号明細書を参照）。後者のモードに関して、完全な細胞溶解、そのためウイルスの高い収率を達成するためには、より長い培養時間を必要とする。さらに、宿主細胞含有量の培地への段階的な流出は、得られたウイルスの質および収率に有害である可能性がある。そのため、本発明によれば、外部因子を使用して、アデノウイルス採取用の細胞を積極的に溶解することが好ましい。
【００５８】
活性な細胞溶解に用いる方法が、当業者に既知で、例えば国際公開第９８／２２５８８号、ｐ．２８〜３５に記載されている。この点に関する有用な方法は、例えば凍結融解、固体剪断、高張および／または低浸透圧溶解、液体剪断、超音波処理、高圧押出、界面活性剤溶解、ならびに上記組み合わせなどである。本発明の一実施形態において、細胞を少なくとも１つの洗浄剤を使用して溶解する。溶解用の洗浄剤の使用は、それが容易な方法であり、また容易に規模の調製をし得る利点を有する。 
【００５９】
使用し得る洗浄剤、およびその使用方法が、当業者に一般的に知られている。いくつかの例は、例えば国際公開第９８／２２５８８号、ｐ．２９〜３３に記載されている。ここで用いるような洗浄剤としては、陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性および非イオン性洗浄剤を挙げることができる。洗浄剤の濃度を、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変えることができるのは、当業者に明白である。一実施形態において、使用する洗浄剤は、トリトンＸ−１００である。 
【００６０】
ヌクレアーゼを用いて、汚染物、即ち主に産生細胞、核酸を取り除くことができる。本発明で用いるのに適したヌクレアーゼの例としては、当業界で通常用いるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍ（登録商標）、または任意の他のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）であり、特定のヌクレオチド間の内部のリン酸ジエステル結合を加水分解することによって核酸を急速に加水分解し、このことにより細胞溶解物の粘度を減少するものである。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社から市販されている（コードW214950）。用いるヌクレアーゼの濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍＬの範囲内である。
【００６１】
産生細胞の培養物からアデノウイルスを採取する方法が、国際公開第２００５／０８０５５６号に広範囲に開示されている。
【００６２】
本発明によれば、採取時間は感染後約２４から１２０時間の間、例えば感染後約４８から９６時間、感染後７２時間である。
【００６３】
精製方法
特定の実施形態において、採取されたアデノウイルスをさらに精製する。アデノウイルスの精製を、例えばここに参考して援用した国際公開第０５／０８０５５６号に記載されたような浄化、限外濾過、膜分離精製またはクロマトグラフィでの分離を含むいくつかの工程にて行うことができる。浄化は、細胞破片および他の不純物を細胞溶解物から取り除く濾過工程によって行うことができる。限外濾過を用いて、ウイルス溶液を濃縮する。限外濾過器を用いる膜分離精製または緩衝剤交換は、塩、糖等の除去および交換のための方法である。当業者は、それぞれの精製工程の最適条件を見つける方法を知っている。また、ここに参照して援用した国際公開第９８／２２５８８号には、アデノウイルスベクターの産生および精製方法を開示する。該方法は、宿主細胞を成長させ、宿主細胞をアデノウイルスで感染し、宿主細胞を採取および溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝剤との交換、溶解物をヌクレアーゼで処理し、さらにクロマトグラフィを用いてウイルスを精製することを含む。
【００６４】
精製は、例えば国際公開第９８／２２５８８号、ｐ．５９〜６１に記載されたような密度勾配遠心分離によって達成することができる。 
【００６５】
しかしながら好ましくは、精製は例えば国際公開第９８／２２５５８８号、ｐ．６１〜７０に記載されたような少なくとも一つのクロマトグラフィ工程を使用する。アデノウイルスのさらなる精製のための多くの方法が開示され、クロマトグラフィ工程が本方法に含まれる。当業者は、これらの方法を認識し、クロマトグラフィ工程を用いて処理を最適化する正確な方法を多様にすることができる。 
【００６６】
例えば、アデノウイルスをアニオン交換クロマトグラフィ工程によって精製することが可能であり、例えば国際公開第０５／０８０５５６号を参照。アデノウイルス精製のためには、少なくとも一つのアニオン交換クロマトグラフィ工程を使用することが好ましい。アニオン交換クロマトグラフィ工程後、ウイルスは十分に純粋である。しかしながら、特定の実施形態においては、サイズ除外クロマトグラフィ工程を行って、本方法のロバスト性を増大させる。この工程は、アニオン交換クロマトグラフィ工程の前後とすることができる。明らかに、他の精製工程を適当にアニオン交換クロマトグラフィ工程と組み合わせることもできる。
【００６７】
アニオン交換クロマトグラフィのアデノウイルス精製への使用が広範囲に記載され、従って該態様が当業者の達成範囲内である。多くの異なるクロマトグラフィマトリックスをアデノウイルスの精製のために用い、また適切であり、当業者は、例えば後述する技術により導かれたウイルス精製用の最適なアニオン交換材料を容易に見つけることができる。 
【００６８】
米国特許第５，８３７，５２０号（またHuyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416を参照）には、宿主細胞溶解物をヌクレアーゼで処理し、アニオン交換および金属イオン親和性クロマトグラフィを続けるアデノウイルスの精製方法が記載されている。
【００６９】
米国特許第６，４８５，９５８号には、組み換えアデノウイルス精製のための強いアニオン交換クロマトグラフィの使用が記載されている。
【００７０】
アニオン交換クロマトグラフィを流動層カラムと共にアデノウイルス粒子の精製のために用い、国際公開第００／５０５７３号を参照。さらに、アデノウイルス粒子の精製のための拡張された層アニオン交換クロマトグラフィおよびアニオン交換クロマトグラフィ用の特定のクロマトグラフィ樹脂が米国特許第６，５８６，２２６号に記載されている。 
【００７１】
アニオン交換カラムに加えて、アニオン交換膜クロマトグラフィ産物、例えばＰａｌｌ社（例えば、Mustang（商標）シリーズ）およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ社（Sartobindシリーズ）により生産されたものが適している。かかるフィルターの使用およびそのアデノウイルス精製における利点に関しては、例えば国際公開第０３／０７８５９２号および国際公開第２００５／０８０５５６号を参照。 
【００７２】
米国特許第６，５３７，７９３号には、アデノウイルス粒子を宿主細胞からイオン交換クロマトグラフィを用いて精製することが記載され、特にこの目的のためにＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬタイプのクロマトグラフィサポートの優先傾向が教示されている。本発明の一実施形態において、アデノウイルスをＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬカラムを使用してさらに精製する。 
【００７３】
精製方法はまた、サイズ排除クロマトグラフィ工程を適切に用いることができる。 
【００７４】
国際公開第９７／０８２９８号には、アニオン交換およびサイズ除外工程を含むウイルスへの損害を防止するための特定のクロマトグラフィマトリックスを用いるアデノウイルスの精製が記載されている。米国特許第６，２６１，８２３号には、アデノウイルス調製にアニオン交換クロマトグラフィを施し、次いでサイズ除外クロマトグラフィを施すアデノウイルスの精製方法が記載されている。サイズ除外工程において、ウイルス粒子の低分子量の不純物からの群分離を達成する。
【００７５】
ヒドロキシアパタイト培地をアデノウイルス精製のために用いることも可能であり、国際公開第０２／４４３４８号を参照。 
【００７６】
例えば、国際公開第０３／０９７７９７号、ｐ．２６に記載されるような逆相吸着工程も用いることができる。 
【００７７】
国際公開第９７／０８２９８号には、アニオン交換およびサイズ除外工程を含むウイルスへの損害を防止するための特定のクロマトグラフィマトリックスを使用するアデノウイルスの精製が記載されている。 
【００７８】
特定の限外濾過方法はまた、国際公開第２００６／１０８７０７号に記載されるようにアデノウイルスの精製に非常に適している。かかる工程を、特定のクロマトグラフィ精製工程に加えて、またはその代わりに行うことができる。
【００７９】
医薬品の調製
特定の実施形態において、精製されたアデノウイルスを医薬品組成物に処方する。これは数々の方法に従って、また全て当業者に知られた一連の方法に従って種々の緩衝剤を使用して実行することが可能である。一般に、アデノウイルス粒子を製薬学的に許容し得る組成物に取り入れることを伴い、該組成物がアデノウイルスおよび少なくとも製薬学的に許容し得る賦形剤を含有する。かかる組成物を当業者に既知の条件下で調製することができ、特定の実施形態ではヒトへの投与に適している。 
【００８０】
例えば、アデノウイルスを群分離中緩衝材で交換し、最終的にAdenovirus World Standard(Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing March 2002, p. 43-48)にも用いる２０ｍＭトリスｐＨ８，２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％のグリセロールの緩衝材に保存することができる。
【００８１】
明らかに、数々の他の緩衝材を用いることができ、精製された（アデノ）ウイルス調製物の保存および製薬学的投与に適したいくつかの処方例が、例えば欧州特許第０８５３６６０号および国際公開第９９/４１４１６号、国際公開第９９／１２５６８号、国際公開第００／２９０２４号、国際公開第０１／６６１３７号および国際公開第０３／０４９７６３号に見出すことができる。 
【００８２】
特定の実施形態において、アデノウイルスベクターをワクチンとして使用し、これらは通常薬学的に許容し得る担体または賦形剤および／または希釈剤に保持される。製薬学的に許容し得る担体または賦形剤および希釈剤が、当業界で周知であり、多岐に渡る治療用製品において使用される。好ましくは、ワクチンに良好に働く担体を適用する。より好ましくは、ワクチンがアジュバントをさらに含有する。アジュバントは、技術的に適応された抗原決定基への免疫反応をさらに高めるために既知で、アデノウイルスおよびリン酸アルミニウムアジュバンドを含有する医薬品組成物が、例えば国際公開第２００７／１１０４０９号に開示されている。 
【００８３】
ヒトへの投与のために、本発明はｒＡｄおよび製薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含有する医薬品組成物を使用することができる。本件において、「製薬学的に許容し得る」という用語は、担体または賦形剤が用いる投薬量および濃度において投与される被検体にあらゆる不要なまたは有害な効果を生起しないことを意味する。かかる製薬学的に許容し得る担体および賦形剤が当業界で周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000];およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]を参照とする）。精製されたｒＡｄを滅菌溶液として調製し、投与するのが好ましいが、凍結乾燥調剤を活用することは本発明の範囲内である。滅菌溶液は、滅菌濾過または当業界でそれ自体既知な他の方法によって調製される。次いで、溶液を凍結乾燥または製薬投薬量容器に充填する。一般に、溶液のｐＨがｐＨ３．０から９．５、例えばｐＨ５．０から７．５の範囲である。通常ｒＡｄは適当な製薬学的に許容し得る緩衝剤を有する溶液であり、ｒＡｄの溶液はまた塩を含有し得る。アルブミンのような安定剤が任意に存在することができる。特定の実施形態において、洗浄剤を添加する。特定の実施形態において、ｒＡｄを注射用製剤に処方することができる。かかる処方は、ｒＡＤの有効量を含有し、無菌液体溶液、液体懸濁液または凍結乾燥物のいずれかであり、安定剤または賦形剤を任意に含有する。
【００８４】
本発明は、アデノウイルスベクター、特にｒＡｄ３５を非常に高い収率にて産生するための方法を開示し、知られている限り、得られた収率および本明細書に開示されたものは依然報告されていない。本発明の方法において、バイオリアクターを使用し、体積あたりのアデノウイルス粒子の非常に高い数を有するバイオリアクターは、本発明の直接的な（中間体）産生物である。従って、本発明はまた、２Ｌから２０００Ｌの間、好ましくは１０Ｌから１０００Ｌの間の作業容積を有し：培養培地、産生細胞および少なくとも１×１０１２ｒＡｄ３５ウイルス粒子（ＶＰ）／ｍＬを含むバイオリアクターを提供する。培養培地は、上記のように、細胞の増殖およびアデノウイルスの感染に適したあらゆる培養培地とすることができる。バイオリアクターの容積、産生細胞、ｒＡｄ３５粒子の数、ＶＰ／ＩＵ比率の態様が、上述したように、本発明の方法のためのものである。好ましい実施形態において、バイオリアクターをＡＴＦ潅流システムに接続する。
【００８５】
また他の態様において、本発明は少なくとも１×１０１２ｒＡｄ３５ウイルス粒子（ＶＰ）／ｍＬを産生するための方法を提供し、該方法がａ）産生細胞を懸濁液中潅流システムで培養する工程と、ｂ）前記細胞を約１０×１０６生存細胞／ｍＬから１６×１０６生存細胞／ｍＬの間の密度にてｒＡｄ３５で感染させる工程と、ｃ）感染細胞を潅流システムで培養して前記ｒＡｄ３５を増殖させ、これによりｒＡｄ３５ウイルス粒子濃度が少なくとも１×１０１２ＶＰ／ｍＬを達成する工程と、ｄ）前記ｒＡ３５を採取する工程とを備える。本開示の前に、ｒＡｄ３５の前記高い収率が常に実現可能であり、言うまでもなく前記高収率を単独に達成する方法であるかは、知られていなかった。本発明は、前記収率が本明細書に開示の方法に従って可能であることを開示する。採取されたｒＡｄ３５の物理的粒子に対する感染性粒子の比率が３０：１未満であることが好ましい。さらなる有利な実施形態は、上述したように、本発明に係る方法のために記載したようなものである。
【００８６】
本発明を以下の実施例にて詳細に説明する。かかる実施例は、本発明をあらゆる方法にて制限するものではない。それらは単に本発明を明確にするために役に立つものである。
【実施例】
【００８７】
実施例１：  高い細胞密度におけるＡｄ５ベクターでの感染
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃、１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。２Ｌバイオリアクターを１．５Ｌの容積および０．２から０．５×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度で接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞をバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。ＡＴＦ潅流処理を４．７×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度にて開始した。ＡＴＦはRefine Technology社,（East Hanover, NJ）からのものである。８９時間後、細胞密度が１２．４×１０６総細胞／ｍＬに達した。この時点において、細胞の一部を採取し、細胞を５分間３００ｇにて遠心分離した。細胞沈殿物を以下の濃度まで新鮮な無血清培地に再懸濁した：
１．３×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
１．０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
２０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
３０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
【００８８】
振盪容器をＡｄ５．ＣＳ（ｒＡｄ５ベクター；Shott et al, 2008）で９０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、１０％ＣＯ２および１００ｒｐｍにて培養した。感染後１から２日目、培地リフレッシュメントを１０，２０および３０×１０６生存細胞／ｍＬにて感染させた振盪容器に対して行った。この培地リフレッシュメントを５分間、３００ｇでの遠心分離工程により行い、細胞沈殿物を振盪容器あたり３０ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した。感染後３日目、振盪容器を採取し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析用の試料とした。採取物の細胞溶解を、１ｍＬ試料体積の各振盪容器を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃で３０分間培養することにより行った。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後次の培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇの遠心分離の工程後、ＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析を行って産生ウイルス粒子数（ＶＰ／ｍＬ）を測定するまで、試料を−６５℃未満で保存した。結果を図１に示す。 
【００８９】
１０×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度における感染の体積収率は、１×１０６生存細胞／ｍＬにおけるものより１０倍高い。以前の報告書で報告された細胞密度効果が一層低い密度（即ち、約０．５〜３×１０６細胞／ｍＬ、例えばMaranga et al., 2005; Kamen et al., 2004; Altaras et al., 2005）で与えられたのに較べて、これは多少予想外である。しかしながら、１０×１０６細胞／ｍＬを超えて細胞密度効果が観測され、体積収率が減少した。 
【００９０】
従って、組み換えＡｄ５での細胞密度効果が潅流システムにて観測される。
【００９１】
実施例２：  低い細胞密度（１〜１．６×１０６生存細胞／ｍＬ）におけるｒＡｄ３５での感染
実施例１ではｒＡｄ５を使用した。しかしながら、異なるアデノウイルス抗原型が既知であり、異なる目的のために記載されている。かかる抗原型は、異なる性質を有するため、一つの抗原型に有用な処理が他の抗原型に必ずしも常に適切なものではない。これは特に産業規模の処理に関連し、一見小さい相違が経済的に非常に重要である可能性がある。例えば、ワクチンの使用の特に有利な一つの抗原型はＡｄ３５であり、本発明者らは以下の例においてｒＡｄ３５の収率を改善して大量に得るための実現可能性を試験した。本例は、低い細胞密度におけるｒＡｄ３５ベクターでの感染を、細胞をより高い細胞密度にて感染させた後述の例との比較として示す。
【００９２】
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿インキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃および１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。１０Ｌバイオリアクターを５Ｌの体積および０．２から０．３５×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度で接種するのに十分な細胞密度を達成するまで二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞をバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。接種後４日目（細胞密度が２から３．５×１０６生存細胞／ｍＬの間に達したとき）、細胞懸濁液を５Ｌの新鮮な培地で希釈し、その後ｒＡｄ３５．ＴＢ−Ｓ（ｒＡｄ３５ベクター；Radosevic et al, 2007）で７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させた。ウイルス増殖を３６℃、ｐＨ７．３およびＤＯ４０％にて行った。感染後３日目、バイオリアクターを細胞数およびウイルス産生測定のために試料抽出した。ウイルスを放出するために、各バイオリアクターの１ｍＬ試料を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃で３０分間培養した。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後次の培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇにて遠心分離した工程後、試料を−６５℃未満の温度にてＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析をするまで保存した。計１０個のバイオリアクター実験を行い、上記方法に従って分析し、これら実験が一貫した結果を与えた（図示せず）。平均ウイルス粒子産生は、２．３×１０１１ＶＰ／ｍＬである。 
【００９３】
約１．５×１０１９ＶＰの年間の需要のため、かかる収率で約６５０００Ｌを処理しなければならない。これは大きい施設、それに伴う莫大な先行投資をワクチン開発中に必要とする。
【００９４】
実施例３：  高い細胞密度（＞１０×１０６生存細胞／ｍＬ）におけるｒＡｄ３５の感染処理の実現可能性の検討
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃、１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。２Ｌバイオリアクターを１．５Ｌの体積および０．２から０．５×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞をバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。培地潅流を６．８×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度でＡＴＦシステムを使用して開始した。７０時間後、細胞密度が３６．８×１０６総細胞／ｍＬまで達した。この時点にて、以下の感染を行った： 
・振盪容器中の感染における細胞密度： 
１．３×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
１．０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
２０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
３０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
・８．７×１０６総細胞／ｍＬ（８４％生存）における２Ｌバイオリアクター規模の感染
バイオリアクターの感染の１時間後、試料をバイオリアクターから回収し、２つの２５０ｍＬ振盪容器に３０ｍＬ／振盪容器で移した。
【００９５】
２５０ｍＬ振盪容器における感染処理に関し、２Ｌバイオリアクターからの細胞懸濁液の一部を採取し、この懸濁液を５分間３００ｇにて遠心分離した。細胞沈殿物を上記濃度まで新鮮な無血清培地に再懸濁した。振盪容器をＡｄ３５．ＴＢ−Ｓで７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、１０％ＣＯ２および１００ｒｐｍにて培養した。感染後１から２日目、培地リフレッシュメントを１０，２０および３０×１０６生存細胞／ｍＬにて感染させた振盪容器に対して行った。この培地リフレッシュメントを５分間３００ｇにおける遠心分離工程により行い、細胞沈殿物を振盪容器あたり３０ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した。感染後３日目、振盪容器を採取し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣＥ分析用の試料とした。採取物の細胞溶解を、１ｍＬ試料体積の各振盪容器を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃で３０分間培養することにより行った。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇにて遠心分離の工程後、試料を−６５℃未満の温度にてＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析を実行するまで保存した。 
【００９６】
２Ｌバイオリアクター内の残留細胞を、新鮮な無血清培地で８．７×１０６総細胞／ｍＬの細胞濃度（８４％生存率）まで希釈した。バイオリアクターをＡｄ３５．ＴＢ−Ｓで７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、１０％ＣＯ２、ｐＨ７．３ｒｐｍおよびＤＯ４０％にて培養した。ＡＴＦシステムを、感染後１５時間、一つのバイオリアクター容積／日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後１，２，３および４日目、バイオリアクターを細胞数（Ｃａｓｙ細胞数）およびＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス産生測定のために試料抽出した。試料の調製を上記のように行った。ＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析を行うまで、試料を−６５℃未満にて保存した。バイオリアクターの感染後約１時間、少なくとも６０ｍＬの試料を２Ｌバイオリアクターから取り出し、２つの感染（２５０ｍＬ振盪容器における）を３０ｍＬ／振盪容器の容積にて開始した。感染後１から２日目、培地リフレッシュメントを行って潅流システムを再現した。この培地リフレッシュメントを５分間３００ｇにおける遠心分離工程により行い、細胞沈殿物を振盪容器あたり３０ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した。感染後３日目、振盪容器を採取し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣＥ分析用の試料とした。試料の調製を上記のように行った。ＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析を行うまで試料を−６５℃未満にて保存した。
【００９７】
結果を図２に示す。結果は、１．３×１０６生存細胞／ｍＬから３０×１０６生存細胞／ｍＬの間の感染が可能なことを示す。ｒＡｄ５との結果と対照的に、ｒＡｄ３５の総収率は、１０×１０６生存細胞／ｍＬ試料を超える感染での上昇する細胞密度とともに増大した。３０×１０６生存細胞／ｍＬにおいて、１．４×１０１２ＶＰ／ｍＬの体積収率を達成した。
【００９８】
これらの結果は、Ａｄ３５．ＴＢ−Ｓでの感染が高細胞密度、即ち１０×１０６生存細胞／ｍＬ以上において可能であることを明らかに示す。３０×１０６生存細胞／ｍＬにてでさえ、感染は高体積収率を与えた。 
【００９９】
減少が、１．３×１０６細胞／ｍＬにおいて１２０．０００ＶＰ／細胞から３０×１０６生存細胞／ｍＬにおいて４７．０００ＶＰ／細胞までの単位産生率で確認されたことを留意する。バイオリアクター内で感染した細胞懸濁液から開始した振盪容器は、８．０×１０１１ＶＰ／ｍＬの採取収率および９２．０００ＶＰ／細胞の単位産生率を示す。２Ｌバイオリアクターにおける結果は多少低いもので：採取収率が５×１０１１ＶＰ／ｍＬに達し、５７．０００ＶＰ／細胞の単位産生率である。
【０１００】
実施例４：  高い細胞密度における他のｒＡｄ３５ベクターでの感染の実現可能性。 
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃、１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。２Ｌバイオリアクターを１．５Ｌの体積および０．２から０．５×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度にて接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞をバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。ＡＴＦ潅流処理を５．１×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度にて開始した。７０時間後、細胞密度が２５×１０６総細胞／ｍＬまで達した。この時点で細胞の一部を採取した。細胞を５分間３００ｇにて遠心分離し、細胞沈殿物を以下の濃度まで新鮮な無血清培地に再懸濁した ：
１．３×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
１０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
２０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
３０×１０６生存細胞／ｍＬ、３０ｍＬ／振盪容器、２つの２５０ｍＬ振盪容器
【０１０１】
振盪容器をＡｄ５．ｅＧＦＰ（他のトランス遺伝子、即ちＧＦＰ遺伝子を含有するｒＡｄ５ベクター）で７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、１０％ＣＯ２および１００ｒｐｍにて培養した。感染後１から２日目、培地リフレッシュメントを１０，２０および３０×１０６生存細胞／ｍＬにて感染させた振盪容器に対して行った。この培地リフレッシュメントを５分間３００ｇにおける遠心分離の工程により行い、細胞沈殿物を振盪容器あたり３０ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した。感染後３日目、振盪容器を採取し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析用の試料とした。採取物の細胞溶解を、１ｍＬ試料体積の各振盪容器を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃で３０分間培養した。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇにて遠心分離した工程後、試料を−６５℃未満の温度にてＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析を実行するまで保存した。結果を図３に示す。結果は、高い細胞密度における感染が他のＡｄ３５ベクター（Ａｄ３５．ｅＧＦＰ）でも実現可能であることを示す。体積収率（図３）および単位産生率（データ図示せず）は、Ａｄ３５．ＴＢ−Ｓベクターと同じ範囲内である。
【０１０２】
実施例５：  高い細胞密度におけるｒＡｄ３５ベクターでの感染のさらなる実験。
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃、１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。２Ｌバイオリアクターを０．２５×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞を２Ｌバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。約３．７×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度を達成（接種後４日目）したとき、ＡＴＦシステムを開始した。６７時間後、４０．７×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度を達成した。この時点にて、細胞懸濁液の一部を採取し、残留細胞を新鮮な培地で２Ｌバイオリアクター内にて細胞密度１２．７×１０６総細胞／ｍＬ（８７％生存率、したがって１１×１０６生存細胞／ｍＬ）まで希釈した。その後、２ＬのバイオリアクターをＡｄ３５．ＴＢ−Ｓで７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、１０％ＣＯ２、ｐＨ７．３ｒｐｍおよびＤＯ４０％にて培養した。ＡＴＦシステムを、感染後１５時間、５つの容器容量／日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後１，２，３および４日目、２Ｌのバイオリアクターを細胞数およびＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、１ｍＬの試料を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃で３０分間培養した。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇにて遠心分離した工程後、試料を−６５℃未満の温度にてＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析をするまで保存した。結果を表１に示す。 
【０１０３】
【表１】
0005770633.tif 000002
【０１０４】
結果は、１０×１０６生存細胞／ｍＬを超える細胞密度における感染が潅流システムと連結したバイオリアクター内にて実行可能であり、バッチ処理と比較して体積収率を約７倍まで上昇させることが可能であることを示した。感染培養物の早期細胞損失が観測されなかったことから、ＡＴＦ処理が感染細胞を培養するための適切なシステムであることを示す。 
【０１０５】
ｒＡｄバッチ用のＦＤＡの必要条件は、ＶＰ／ＩＵ＜３０の比率である。ＱＰＡ（Ｑ−ＰＣＲに基づく効力試験；Wang et al, 2005）分析は、全ての試料が前記必要条件を満たすことを示した。対照的に、Ｙｕｋら（２００４）に開示された試料は、約１００のＶＰ／ＩＵ比率を有する（図２Ａ／２Ｂ）。物理的粒子に対する感染性粒子の比率は、アデノウイルスに対するパラメータに関するものであり、より低い比率がｒＡｄバッチに好適である。本例において調製したバッチは、約１５：１から１８：１の低い比率を一貫して有する。 
【０１０６】
約１．５×１０１９ＶＰの年間の需要のため、約１．５×１０１２ＶＰ／ｍＬの収率で約１００００Ｌを処理しなければならない。かかる体積を１０００Ｌ以下の施設にて処理することができ、従ってワクチン開発中の先行投資費用委託を減少する。
【０１０７】
実施例６：  高い細胞密度における減少した潅流割合でｒＡｄ３５ベクターでの感染のさらなる実験。
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃、１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。２Ｌバイオリアクターを０．５９×１０６生存細胞／ｍＬの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞を２Ｌバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。約２．９×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度を達成（接種後４日目）したとき、ＡＴＦシステムを開始した。潅流１１８時間後、２９×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度を達成した。この時点にて、細胞懸濁液の一部を採取し、残留細胞を新鮮な培地で２Ｌバイオリアクター内にて細胞密度１６．４×１０６総細胞／ｍＬ（８２％生存率、したがって１３．４×１０６生存細胞／ｍＬ）まで希釈した。その後、２ＬのバイオリアクターをＡｄ３５．ＴＢ−Ｓで７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、ｐＨ７．３ｒｐｍおよびＤＯ４０％にて培養した。ＡＴＦシステムを、感染後１５時間、２つの容器容量／日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後１，２および３日目、２Ｌのバイオリアクターを細胞数およびＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、１ｍＬの試料を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃にて３０分間培養した。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇにて遠心分離した工程後、試料を−６５℃未満の温度にてＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析をするまで保存した。結果を表２に示す。 
【０１０８】
結果は、１０×１０６生存細胞／ｍＬを超える細胞密度における感染が潅流システムと連結したバイオリアクター内にて実行可能であり、バッチ処理と比較して体積収率を約１０倍まで上昇させることが可能であることを示した（実施例２）。感染培養物の早期細胞損失が観測されず、ＡＴＦ処理が感染細胞を培養するための適切なシステムであることを示す。 
【０１０９】
【表２】
0005770633.tif 000003
【０１１０】
ｒＡｄバッチ用のＦＤＡ必要条件は、ＶＰ／ＩＵ＜３０の比率である。ＱＰＡ（Ｑ−ＰＣＲに基づく効力検定；Wang et al, 2005）分析は、全ての試料が前記必要条件を満たすことを示す。対照的に、Ｙｕｋら（２００４）に開示された試料は、約１００のＶＰ／ＩＵ比率を有する（図２Ａ／２Ｂ）。物理的粒子に対する感染性粒子の比率は、アデノウイルスに対するパラメータのものであり、より低い比率がｒＡｄバッチに好適である。本例にて調製したバッチは、１０：１未満の低い比率を一貫して有する。 
【０１１１】
約１．５×１０１９ＶＰの年間の需要のために、約２×１０１２ＶＰ／ｍＬの収率で約７５００Ｌ未満の採取物を処理しなければならない。かかる体積を１０００Ｌ以下の施設にて処理することができ、したがってワクチン開発中先行投資費用委託を減少する。
【０１１２】
実施例７：  高細胞密度における減少した潅流割合でｒＡｄ３５ベクターでの感染のさらなる実験
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃、１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。２Ｌバイオリアクターを０．４４×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞を２Ｌバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。ＡＴＦシステムを接種後４日目に約２．７２×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度にて開始した。潅流１４４時間後、３０．５×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度を達成した。この時点にて、細胞懸濁液の一部を採取し、残留細胞を新鮮な培地で２Ｌバイオリアクター内にて細胞密度１６．２×１０６総細胞／ｍＬ（８１％生存率、したがって１３．１×１０６生存細胞／ｍＬ）まで希釈した。その後、２ＬのバイオリアクターをＡｄ３５．ＴＢ−Ｓで７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、ｐＨ７．３およびＤＯ４０％にて培養した。ＡＴＦシステムを、感染後５時間、２つの容器容量／日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後２，３および４日目、２Ｌのバイオリアクターを細胞数およびＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、１ｍＬの試料を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃にて３０分間培養した。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇにて遠心分離した工程後、試料を−６５℃未満の温度にてＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析をするまで保存した。結果を表３に示す。 
【０１１３】
【表３】
0005770633.tif 000004
【０１１４】
結果は、１０×１０６生存細胞／ｍＬを超える細胞密度における感染が潅流システムと連結したバイオリアクター内にて実行可能であり、バッチ処理と比較して体積収率を約１０倍まで上昇させることが可能であることを再度示す（実施例２）。さらに、実施例６および７では、感染後の潅流率をウイルス産生を損なうことなく２容器容量／日に制限することが可能であることを示す。 
【０１１５】
約１．５×１０１９ＶＰの年間の需要のため、約２×１０１２ＶＰ／ｍＬの収率で約７５００Ｌ未満の採取物を処理しなければならない。かかる体積を１０００Ｌ以下の施設にて処理することができ、したがってワクチン開発中先行投資費用委託を減少する。
【０１１６】
実施例８：  高い細胞密度における５０Ｌ規模でｒＡｄ３５ベクターでの感染のさらなる実験。
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）作業細胞貯蔵庫からの細胞を、加湿したインキュベーター内の無血清培養培地にて３７℃、１０％ＣＯ２で解凍し、増殖した。２Ｌバイオリアクターを０．５２×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度において接種するに十分な細胞密度を達成するまで、二次培養を３から４日間ごとに行った。細胞を１０Ｌのバイオリアクター内で３７℃、ＤＯ４０％およびｐＨ７．３にて増殖した。約５．３×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度を達成（接種後４日目）したとき、ＡＴＦシステムを開始した。潅流１６９時間後、７７×１０６総細胞／ｍＬの細胞密度を達成した。この時点において、１０Ｌの細胞懸濁液を新鮮な培地で５０Ｌバイオリアクター内にて１５．５×１０６総細胞／ｍＬ（８１％生存率、それゆえ１２．６×１０６生存細胞／ｍＬ）の細胞密度まで希釈した。その後、５０ＬのバイオリアクターをＡｄ３５．ＴＢ−Ｓで７０ＶＰ／細胞のＭＯＩにて感染させ、３６℃、ｐＨ７．３および４０％ＤＯにて培養した。ＡＴＦシステムを、感染後５時間、２つの容器容量／日の培地リフレッシュメント割合で開始した。感染後２から３日目、５０Ｌのバイオリアクターを細胞数およびＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス産生測定のために試料採取した。ウイルスを放出するため、１ｍＬの試料を１００μＬの１０％トリトンＸ−１００と混合し、３７℃にて３０分間培養した。培養後、試料を２．４２μＬのベンゾナーゼ／ＭｇＣｌ２と混合し、その後培養を３０分間３７℃で行った。最後に、１００μＬの５０％サッカロースを試料へ添加した。５分間２５００ｇにて遠心分離した工程後、試料を−６５℃未満の温度にてＡＥＸ−ＨＰＬＣによる分析をするまで保存した。結果を表４に示した。 
【０１１７】
【表４】
0005770633.tif 000005
【０１１８】
結果は、１０×１０６生存細胞／ｍＬを超える細胞密度における感染が潅流システムと連結した５０Ｌのバイオリアクター内にて実行可能であり、バッチ処理と比較して体積収率を約１０倍まで上昇させることが可能であることを示す（実施例２）。本明細書にて、開発された方法を拡大することができることを示した。年間のウイルス需要を満たすため年間処理されるべき採取体積を、本発明の方法で産生することができる。約１．５×１０１９ＶＰの年間の需要のため、約２×１０１２ＶＰ／ｍＬの収率で約７５００Ｌ未満の採取物を処理しなければならない。かかる体積を１０００Ｌ以下の施設にて処理することができ、従ってワクチン開発中先行投資費用委託を減少する。
【０１１９】
参考文献
Altaras NE, Aunins JG, Evans RK, Kamen A, Konz JO, Wolf JJ. Production and formulation of adenovirus vectors. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. Vol. 99, 2005
Cortin V, Thibault J, Jacob D, Garnier A. High-Titer adenovirus vector production in 293S Cell Perfusion culture. Biotechnol. Prog. Vol. 20, 2004
Estape D, Wilde F. Comparison of campaign vs concurrent large-scale cell culture facilities. Pharmaceutical Engineering. Vol. 26, No. 5, September/October 2006.
Furey J. Scale-up of a cell culture perfusion process - A low-shear filtration system that inhibits filter-membrane fouling. Genetic Engineering News. Vol. 22, No. 7, April 2002.
Henry O, Dormond E, Perrier M, Kamen A. Insights into adenoviral vector production kinetics in acoustic filter-based perfusion cultures. Biotechnology and bioengineering, Vol. 86, No. 7, June 2004. 
Hodge G. Disposable bioprocessing: State of the Industry, Economics and a novel manufacturing platform case study (Presentation). NC Bio. Ctr. BPD Conference, 18 November 2004.
Kamen A, Henry O. Development and optimization of an adenovirus production process. The journal of gene medicin Vol. 6, 2004
Maranga L, Aunins JG, Zhou W. Characterization of changes in PER.C6 cellular metabolism during growth and propagation of a replication-deficient adenovirus vector. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 90, No. 5, June 2005.
Radosevic K, Wieland CW, Rodriguez A, Weverling GJ, et al. Protective immune responses to a recombinant adenovirus type 35 tuberculosis vaccine in two mouse strains: CD4 and CD8 T-cell epitope mapping and role of gamma interferon. Infect. Immun. 75: 4105-4115 (2007).
Shott JP, McGrath SM, Pau MG, Custers JH, et al. Adenovirus 5 and 35 vectors expressing Plasmodium falciparum circumsporozoite surface protein elicit potent antigen-specific cellular IFN-gamma and antibody responses in mice. Vaccine 26: 2818-2823 (2008).
United Nation web site: http://esa.un.org/unpp/index.asp?panel=2 (March 2008)
Wang F, Puddy AC, Mathis BC, Montalvo AG, et al. Using QPCR to assign infectious potencies to adenovirus based vaccines and vectors for gene therapy: toward a universal method for the facile quantitation of virus and vector potency. Vaccine 23: 4500-4508 (2005).
Xie L, Metallo C, Warren J, Pilbrough W, Peltier J, Zhong T, Pikus L, Yancy A, Leung J, Aunins JG, Zhou W. Large-Scale propagation of a replication-defective adeno vector in stirred-tank bioreactor PER.C6 cell culture under sparging conditions. Biotechnology and bioengineering, Vol. 83, No. 1, July 5, 2003
Yallop C, Crowley J, Cote J, Hegmans-Brouwer K, Lagerwerf F, Gagne R, Martin JC, Oosterhuis N, Opstelten DJ, Bout A. Per.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins. Modern Biopharmaceuticals - Design, Development and Optimization. Vol. 3, 2005
Yuk IHY, Olsen MM, Geyer S, Forestell SP. Perfusion Cultures of Human Tumor Cells: A Scalable Production Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors. Biotechnol. Bioengin. 86: 637-641 (2004).
【図１】
0005770633.tif 000006
【図２】
0005770633.tif 000007
【図３】
0005770633.tif 000008