(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクアレン合成酵素遺伝子（ＥＲＧ９遺伝子）に変異を有するファルネソール生産性アルコール醸造用酵母（サッカロミセス・セレビシエ）を用いてファルネソールを生産させることを含むファルネソールの製造方法であって、
３４℃を超える温度条件で前記酵母を培養することを含み、
前記酵母が、erg9-2変異を有する酵母（サッカロミセス・セレビシエ）と、清酒酵母一倍体との戻し交雑により得られた、erg9-2変異を有するファルネソール生産性酵母（一倍体）、又は、この酵母と清酒酵母一倍体との戻し交雑株同士の交雑により得られた、erg9-2変異を有するファルネソール生産性酵母（二倍体）であり、
前記erg9-2変異が、ＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された、配列表の配列番号１で表される変異である、ファルネソール製造方法。
【請求項２】
前記培養温度が、４０℃以下である、請求項１に記載のファルネソール製造方法。
【請求項３】
製造されるファルネソールが、（トランス，トランス）型である、請求項１又は２に記載のファルネソール製造方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のファルネソール製造方法によりファルネソールを製造することを含む、ファルネソール含有飲食品の製造方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のファルネソール製造方法によりファルネソールを製造することを含む、ファルネソール含有化粧品の製造方法。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のファルネソール製造方法によりファルネソールを製造することを含む、ファルネソール含有医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファルネソールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファルネシル二リン酸が脱リン酸化されて生成するファルネソールは、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）の標的遺伝子の転写活性化に機能していることが報告されている（非特許文献１参照）。ファルネソールは、そのＰＰＡＲ活性化効果から、抗肥満や抗高脂血症などの効果が期待されている。
【０００３】
ファルネソールは、精油等の天然物から調製する方法、化学合成により合成する方法、組み換え酵母又は非組み換え酵母を使用して産生する方法などで製造される。
【０００４】
ファルネソールは、シス−トランス異性を示す二重結合を２つ有する。２つの二重結合が（Ｅ）型（トランス型）である（Ｅ，Ｅ）型ファルネソールは、生物の代謝経路で生合成される幾何異性体であり、工業的価値がある。しかし、化学合成法で合成されるファルネソールは、一般的に、（Ｅ）型（トランス型）と（Ｚ）型（シス型）とが混在する混合物であるため、（Ｅ，Ｅ）型ファルネソールを純粋な形で得るためには、カラムクロマトグラフィーや精密蒸留などの操作が必要となる。したがって、（Ｅ，Ｅ）型ファルネソールを大量に製造するには適さない。
【０００５】
ファルネソールを生産する酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変異菌株としては、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子（スクアレンシンセターゼ遺伝子）のerg9変異株が知られている（非特許文献２）。さらに、前記erg9変異株のエルゴステロール要求性を無くすことができるerg9-2変異が導入され、培養条件が簡易化された非組み換え酵母erg9-2変異株も知られている（特許文献１）。
【０００６】
一般に、アルコール醸造用酵母はエルゴステロール量が多く、エルゴステロール合成系が活発である。例えば、清酒酵母では、エルゴステロールの合成に関わる遺伝子群が実験室酵母等と比べて高発現していることが知られている（非特許文献３〜５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４２３６２６５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】N.Takahashi et al. (2002) Dual action of is oprenols from herbal medicines on both PPARγ and PPARα in 3T3-L1 adipocytes and HepG2 hepatocytes, FEBS Lett. 514:315-22.
【非特許文献２】C.Chambon et al. (1990) Isolation and properties of yeast mutants affected in farnesyl diphosphate synthetase, Curr. Genet. 18, 41-46
【非特許文献３】下飯仁 (2001) 「清酒酵母は他の酵母とどこが違うか−ＤＮＡマイクロアレイによる解析−」、生物工学  第７９巻、第４４８頁
【非特許文献４】M.Shobayashi et al. (2005) Effects of Culture Conditions on Ergosterol Biosynthesis by Saccharomyces cerevisiae, Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(12), 2381-2388
【非特許文献５】F.Aguilera et al. (2006) Relationship between ethanol tolerance, H+-ATPase activity and the lipid composition of the plasma membrane in different wine yeast strains, Int. J. Food Microbiol. 110, 34-42
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
飲食品にも利用できるファルネソールを製造するには、酵母等を利用した生物産生であることが好ましいが、工業的製造の点からは、より効率的なファルネソールの製造方法が望まれている。本発明は、ファルネソールの生産量を向上できるファルネソールの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、スクアレン合成酵素遺伝子（ＥＲＧ９遺伝子）に変異を有するファルネソール生産性アルコール醸造用酵母を用いてファルネソールを生産させることを含むファルネソールの製造方法であって、３４℃を超える温度条件で培養することを含む、ファルネソール製造方法に関する。
【００１１】
本発明は、その他の態様として、本発明のファルネソール製造方法によりファルネソールを製造することを含む、ファルネソールを含有する飲食品、化粧品、及び／又は医薬品の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生産量が向上した効率的なファルネソールの製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、酵母株Ａ、Ｂ及びＣを３０℃、３４℃、３５℃、３７℃、３９℃、及び４０℃で培養したときの培養液の吸光度（ＯＤ６６０）の経時変化を示すグラフである。
【図２】図２は、酵母株Ａ、Ｂ及びＣを３０℃、３４℃、３５℃、３７℃、３９℃、及び４０℃で培養したときの培養液中のファルネソール濃度の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、酵母株Ａ、Ｂ及びＣを３０℃、３４℃、３５℃、３７℃、３９℃、及び４０℃で培養したときの培養液の中のファルネソール濃度の最大値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、スクアレン合成酵素遺伝子（ＥＲＧ９遺伝子）に変異がアルコール醸造用酵母に導入されることにより得られるファルネソール生産性酵母のファルネソール生産量が、３４℃を超える培養温度で著しく向上するという知見に基づく。これらの酵母は、３０℃を超える培養温度では生育が抑制される傾向があり、従来３０℃を超える温度でのファルネソール産生は行われていなかった。
【００１５】
すなわち、本発明は、一態様において、スクアレン合成酵素遺伝子（ＥＲＧ９遺伝子）に変異を有するファルネソール生産性アルコール醸造用酵母を用いてファルネソールを生産させることを含むファルネソールの製造方法であって、３４℃を超える温度条件で培養することを含むファルネソール製造方法（以下、「本発明のファルネソール製造方法」ともいう。）に関する。本発明のファルネソール製造方法によれば、培養液中に含まれるファルネソール濃度が増加して生産性が向上し、効率的なファルネソールの製造が可能となる。
【００１６】
本発明のファルネソール製造方法において、３４℃を超える温度条件下の培養でファルネソールの生産性が向上するメカニズムの詳細は明らかではないが、アルコール醸造用酵母における活発なエルゴステロール合成経路に起因すると考えられ、このような特性のアルコール醸造用酵母にＥＲＧ９遺伝子が導入されることで３４℃を超える温度条件下の培養でファルネソールの生産性が向上すると推定される。但し、本発明はこのメカニズムに限定されて解釈されなくてもよい。
【００１７】
［アルコール醸造用酵母］
本明細書において「アルコール醸造用酵母」とは、アルコール含有飲料の醸造用に用いられる酵母をいい、特に限定されないが、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母等を含み、一般にSaccharomyces属に属する酵母である。上述のとおり、一般に、アルコール醸造用酵母はエルゴステロール量が多く、エルゴステロール合成系が活発である。
【００１８】
［ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母］
本明細書において「ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母」とは、本発明のファルネソール製造方法において培養に供しファルネソールを生産させる酵母をいう。また、前記ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母は、アルコール醸造用酵母のスクアレン合成酵素遺伝子（ＥＲＧ９遺伝子）に変異が導入されることによりファルネソール生産性が付与された酵母をいう。
【００１９】
前記ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母は、特に限定されないが、例えば、「ＥＲＧ９遺伝子変異が導入されることによりファルネソール生産性が付与された酵母」と「アルコール醸造用酵母」との交雑により作製することができる。交雑の回数は特に制限されず、１、２、３、４、５、１０回などが挙げられる。前記「ＥＲＧ９遺伝子変異が導入されることによりファルネソール生産性が付与された酵母」は、公知の酵母を利用してもよく、新たに作製したものを使用してもよい。また、本明細書において「交雑」は、戻し交雑を含む。
【００２０】
或いは、前記ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母は、特に限定されないが、例えば、変異を起こさせたアルコール醸造用酵母をスクリーニングして（ＥＲＧ９遺伝子）に変異が導入されたものを選択することで作製してもよい。
【００２１】
これらのファルネソール生産性アルコール醸造用酵母の作製は、従来公知の方法を用いて行うことができる。
【００２２】
前記ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母は、非組み換え体及び組み換え体のいずれでもよいが、製造されたファルネソールの飲食品等への添加のし易さから、非組み換え酵母であることがより好ましい。本明細書において、組み換え体とは、遺伝子組み換え技術により製造された酵母をいう。また、本明細書において、非組み換え体の酵母とは、天然の酵母、飲食物の製造に使用されている酵母、これらの酵母の変異処理により得られた酵母、及び又は、これらの酵母の交雑により得られた酵母をいう。
【００２３】
前記ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母は、一倍体であっても、二倍体であってもよい。前記二倍体はアルコール醸造用酵母との交雑により得られたものでもよいが、ファルネソールの生産性向上の観点から、前記ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母間の交雑により得られるものであることが好ましい。
【００２４】
［ＥＲＧ９遺伝子の変異］
前記ファルネソール生産性アルコール醸造用酵母が有するＥＲＧ９遺伝子の変異は、培養条件の簡易化、すなわち、エルゴステロールの添加が不要となる点、及び、ファルネソールの生産性向上の観点から、erg9-2変異であることが好ましい。本明細書において「erg9-2変異」とは、ファルネソール生産性を付与し、かつ、エルゴステロール要求性を示さない変異をいう。また、本明細書において「erg9-2変異」とは、特開２００６−５５０５２号公報に開示された変異であって、ＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のｇ（グアニン）がａ（アデニン）に置換された、配列表の配列番号１で表わされる塩基配列を有する変異であることが好ましい。
【００２５】
［培養温度］
本発明のファルネソール製造方法における、前記ファルネソール生産性酵母の培養温度は、ファルネソールの生産性向上の観点から、３４℃を超え、３５℃以上が好ましい。また、ファルネソールの生産性向上の観点、及び、ファルネソール生産性酵母の増殖維持の観点から、前記ファルネソール生産性酵母の培養温度は、４０℃以下が好ましく、より好ましくは４０℃未満、さらに好ましくは３９℃以下、さらにより好ましくは３９℃未満、さらにより好ましくは３８℃以下、さらにより好ましくは３８℃未満、さらにより好ましくは３７℃以下である。なお、培養温度の上限は、菌体の増殖が著しく抑制されない温度が好ましく、例えば、培養液の最大吸光度（ＯＤ６６０）が３を超える温度であることが好ましい。
【００２６】
したがって、本発明のファルネソール製造方法における、前記ファルネソール生産性酵母の培養温度として、ファルネソールの生産性向上の観点から、以下の範囲を適宜選択することができる；３４℃を超え４０℃以下、３４℃を超え４０℃未満、３４℃を超え３９℃以下、３４℃を超え３９℃未満、３４℃を超え３８℃以下、３４℃を超え３８℃未満、３４℃を超え３７℃以下、３５℃以上４０℃以下、３５℃以上４０℃未満、３５℃以上３９℃以下、３５℃以上３９℃未満、３５℃以上３８℃以下、３５℃以上３８℃未満、３５℃以上３７℃以下。
【００２７】
［培地］
本発明のファルネソール製造方法における、前記ファルネソール生産性酵母を培養する培地は、酵母が資化することができる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、培養、ファルネソール生産を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクラロース、ラフィノース、デンプン等の炭化水素、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられ、その他ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等が挙げられる。無機物としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００２８】
［培養方法］
培養方法は、前記培地を使用し、前記温度で行うこと以外は、従来と同様に行うことができ、例えば、振とう培養、通気攪拌培養、静置培養等で行うことができる。ファルネソールの生産性向上の観点から、振とう培養や通気攪拌培養など好気的条件下が好ましい。
【００２９】
培養時間としては、培地中及び酵母菌体内のファルネソール含有量が最も高くなる時間まで培養することが好ましい。なお、培養液及び酵母菌体内のファルネソールはガスクロマトグラフや液体クロマトグラフなどを用いて測定できる。具体的には、実施例に記載した方法で測定できる。
【００３０】
本発明のファルネソール製造方法によれば、（Ｅ，Ｅ）型、すなわち、（トランス，トランス）型のファルネソールを製造することができる。
【００３１】
本発明のファルネソール製造方法は、培地中及び酵母菌体内のファルネソールを分離及び／又は回収する工程を含んでもよい。培地中及び酵母菌体内のファルネソールを分離・回収する方法としては、例えば、ホモジナイザー処理などを施して菌体を破砕することによりファルネソールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、培養液をそのまま使用してもよく、遠心分離等により、菌体を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により、前記培養物中からファルネソールを採取し、必要に応じて各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
【００３２】
ファルネソールは、ＰＰＡＲ活性化効果を有し、肥満、高脂血症、がんに対する抑制効果があるという報告もあり、また、芳香もある。したがって、本発明のファルネソール製造方法で製造したファルネソールは、飲食品、化粧品、医薬品に添加したり、栄養補助剤としたりすることもできる。したがって、本発明は、その他の態様において、前記ファルネソール製造方法によりファルネソールを製造することを含む、ファルネソールを含有する飲食品、化粧品、医薬品、飲食品添加物、及び／又は、栄養補助剤の製造方法に関する。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【００３４】
［ファルネソールの産生］
下記ファルネソール生産性酵母株Ａ、Ｂ及びＣを下記の培養条件で培養し、ファルネソールを産生させた（実施例１〜８、比較例１〜１０）。
【００３５】
〔使用した酵母株〕
株Ａ：erg9-2変異を有する酵母（下記株Ｃ）と清酒酵母一倍体との戻し交雑により得られた、erg9-2変異を有するファルネソール生産性酵母（一倍体）。特開２００６−５５０５２に開示されるＨＬ２９６株［ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１３２菌株］と同株。
株Ｂ：株Ａと清酒酵母一倍体との戻し交雑株同士の交雑により得られた、erg9-2変異を有するファルネソール生産性酵母（二倍体）。
株Ｃ：erg9-2変異を有する酵母（MATa erg9-2）。清酒酵母一倍体との交雑はしていない。野生型実験室酵母Ｘ２１８０−１Ａ株（ATCC 204504, MATa）を紫外線照射して変異を誘導した後に、ファルネソール生産性を指標にして選抜して得られた。シーケンスによってerg9-2変異を確認した。特開２００６−５５０５２に開示されるＨＬ２８５株と同株。
【００３６】
〔培養条件〕
１．前培養
ファルネソール生産性酵母株Ａ、Ｂ及びＣを、ＹＰ２Ｄ培地（１wt％  Bacto（商標）Yeast Extract、２wt％  Bacto（商標）Peptone、２wt％ D(+)-グルコース）を用い、３０℃で前培養した。
２．植菌
前培養後の培養液２ｍＬをＹＰ１０Ｄ培地（１wt％  Bacto（商標）Yeast Extract、２wt％  Bacto（商標）Peptone、１０wt％ D(+)-グルコース）２００ｍＬ（三角フラスコ）に植菌した。
３．培養及びファルネソール産生
酵母株Ａ、Ｂ及びＣのそれぞれにつき、培養温度を３０℃、３４℃、３５℃、３７℃、３９℃、及び４０℃で培養した（実施例１〜８、比較例１〜１０、下記表１〜３参照）。前記培養は、毎分１２０回の振とう培養を行った。培養は、６２時間行った。経時的にサンプリングし、培養液のＯＤ６６０、及び、ファルネソール濃度を測定した。
【００３７】
〔培養液のＯＤ６６０〕
培養液の吸光度（ＯＤ６６０）の測定は、分光光度計により測定した。経時的測定結果を図１に示す。
【００３８】
〔培養液のファルネソール濃度〕
培養液のファルネソール濃度は、酵母菌体が含まれる培養液のヘキサン抽出物を、ガスクロマトグラフを用いて分析した。具体的には、酵母菌体の含まれる培養液３ｍＬに２５００ｐｐｍ  １−ドデカノール  ４０μＬを添加した。ｎ−ヘキサン  ３ｍＬを添加し、ボルテックスした後、抽出溶媒層を分析に用いた。分析装置にはＨＰ６８９０（ＧＣ／ＦＩＤ）を用いた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｊ＆Ｗ  ＧＣカラム  ＤＢ−５（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を使用し、オーブンを４０℃で１．５分保持した後、２０℃／分で１５０℃まで昇温し、さらに４℃／分で２５０℃まで昇温した後、２５０℃で３分保持した。注入口は２２０℃、検出温度は２５０℃で行い、試料１μＬをスプリットレスにて自動的に導入した。
【００３９】
経時的測定結果を図２に示し、各温度におけるファルネソール濃度の最大値を、３０℃の値を１００として相対値として表したグラフを図３に示す。また、株Ａ、Ｂ及びＣの菌体あたりのファルネソール（ＦＯＨ）最大生産濃度を、３０℃の値を１００とした相対値で示した結果を表１〜３に示す。なお、菌体あたりのＦＯＨ最大生産濃度は、「ＦＯＨ最大生産濃度」を各菌株がＦＯＨ最大生産濃度を示した時の「ＯＤ６６０」の値で割ることで算出した。表１〜３は、それぞれ、株Ａ、株Ｂ、及び株Ｃの結果を示す。さらに、各株のファルネソール最大生産濃度を、株Ｃの値を１００とした相対値で示した結果を表４に示す。
【００４０】
【表１】
0005766597.tif 000002
【００４１】
【表２】
0005766597.tif 000003
【００４２】
【表３】
0005766597.tif 000004
【００４３】
【表４】
0005766597.tif 000005
【００４４】
表１〜４及び図３に示すとおり、株Ａ及びＢでは、培養温度が３５℃以上で急激にファルネソールの生産量が向上することが示されたが、株Ｃではそのような変化は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、ファルネソールの製造、並びに、ファルネソールを含む飲食品、化粧品、医薬品の分野等で有用である。
【図１】
0005766597.tif 000006
【図２】
0005766597.tif 000007
【図３】
0005766597.tif 000008
【配列表】
0005766597000001.app