(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物生息微生物由来の紫外線吸収剤組成物であって、320-400nmの波長領域に紫外線吸収スペクトルの吸収ピークを有し、前記植物生息微生物はMethylobacterium属の細菌である、紫外線吸収剤組成物。
【請求項２】
紫外線吸収スペクトルの[340-380nmのピーク面積]/[320-400nmのピーク面積]の比が0.5以上である、請求項１記載の紫外線吸収剤組成物。
【請求項３】
溶媒極性パラメーターＥＴ値が45.0〜65.0の溶媒で植物生息微生物を抽出した植物生息微生物抽出物を含む、請求項１又は２記載の紫外線吸収剤組成物。
【請求項４】
溶媒がメタノールと水の混合物である、請求項３記載の紫外線吸収剤組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の紫外線吸収剤組成物を含む化粧品。
【請求項６】
320-400nmの波長領域に紫外線吸収スペクトルの吸収ピークを有する紫外線吸収成分を有する植物生息微生物を培養する工程、植物生息微生物の培養物を溶媒で抽出する工程、及び、溶媒から紫外線吸収成分を分離する工程を含み、前記植物生息微生物はMethylobacterium属の細菌である、前記紫外線吸収成分を含む紫外線吸収剤組成物の製造方法。
【請求項７】
溶媒極性パラメーターＥＴ値が45.0〜65.0の溶媒で植物生息微生物を抽出する、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
植物生息微生物から、50%メタノール溶液で抽出した場合に320-400nmの波長領域に紫外線吸収スペクトルの吸収ピークを有する紫外線吸収成分を有する微生物を選抜する工程、選抜された微生物を培養する工程、選抜された微生物の培養物を溶媒で抽出する工程、及び、溶媒から紫外線吸収成分を分離する工程を含む、前記紫外線吸収成分を含む紫外線吸収剤組成物の製造方法。
【請求項９】
植物生息微生物が、イネ、コムギ、オオムギ、トマト、イチゴ、ニラ、コマツナ、チンゲンサイ又はダイズに生息する微生物である、請求項７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農作物等の植物表面に生息する微生物に由来する紫外線吸収剤組成物及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線防止剤は、化粧品や日焼け止め製品、その他工業製品において、皮膚や製品を紫外線から守るために従来より様々な種類のものが使用されている。例えば化粧品や日焼け止め製品に使用される紫外線防止剤は、主にＵＶ−Ａ（320-400nmの長波長紫外線）とＵＶ−Ｂ（280-320nmの中波長紫外線）に様々な観点から対応するものであり、より具体的には、反射剤（酸化チタン、酸化亜鉛等）、吸収剤（オキシベンゾン、アボベンゾン等）、抗酸化剤（ビタミン、カロチノイド等）などが使用されている。
【０００３】
上記のうち、素材としてほぼ確立している反射剤、既に多様な種類のものが存在する抗酸化剤と比較して、紫外線吸収剤はまだ実用されている種類が少ない。また、化粧品原料等に用いられる既存の紫外線波長ＵＶ−Ａの吸収剤のオキシベンゾンやアボベンゾン等は化学合成品であるが、これらの物質は炎症や肌荒れの原因になる場合もあるため、皮膚に処理するという観点上、天然由来成分の物質に代替されることが市場で望まれている。また、ＵＶ−Ａが皮膚の光老化の主因であるとする認識が広まり、ＵＶ−Ａ対策に関する消費者の関心も高い。
【０００４】
天然由来の紫外線吸収物質として、海洋に生息する細菌やラン藻類の生産するマイコスポリン様化合物やサイトネミン等がこれまでに報告されている（特許文献１，２；非特許文献１、２、３、４）。しかしながら、地上の農作物体上に普遍的に生息する微生物に着眼して発見された例はなく、それらが含有する紫外線吸収成分については知られていない。また、既知の吸収剤は極性が低い性状を有するものが多く、加工特性の観点からも課題が存在した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６―１６０６６２
【特許文献２】特開２０００―１６９７６
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ボータニカマリーナ（Ｂｏｔ．Ｍａｒ．）１６，２３（１９７４）
【非特許文献２】マリンバイオロジー（Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ）１０８，１５７（１９９０）
【非特許文献３】ジャーナルオブプランクトンリサーチ（Ｊ. ＰｌａｎｋｔｏｎＲｅｓ.）１２，９０９（１９９０）
【非特許文献４】ジャーナルオブファイコロジー（Ｊ. Ｐｈｙｃｏｌ.）２７，３９５，（１９９１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決する新規の紫外線吸収剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、紫外線等の様々な環境ストレスに曝されている植物葉圏の微生物（植物生息微生物）から、紫外線、特にＵＶ−Ａの有効な吸収効果を有する紫外線吸収成分が得られることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、植物生息微生物由来の紫外線吸収剤組成物であって、320-400nmの波長領域に紫外線吸収スペクトルの吸収ピークを有する紫外線吸収剤組成物を提供する。
また、本発明は、上記紫外線吸収剤組成物を含む化粧品を提供する。
また、本発明は、320-400nmの波長領域に紫外線吸収スペクトルの吸収ピークを有する紫外線吸収成分を有する植物生息微生物を培養する工程、植物生息微生物の培養物を溶媒で抽出する工程、及び、溶媒から紫外線吸収成分を分離する工程を含む、前記紫外線吸収成分を含む紫外線吸収剤組成物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、天然成分由来の新規の紫外線吸収剤組成物を提供することができる。また、本発明の紫外線吸収剤組成物は極性が高い性状を有するため、加工特性の観点からも化粧品やインク等の工業製品に対する適用性における利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Methylobacterium sp. W-213株の抽出物のＵＶ吸収スペクトルを示す。
【図２】培地に培養したMethylobacterium sp. W-213株の写真を示す。
【図３】Methylobacterium sp. W-213株の菌体の懸濁液を示す。
【図４】Methylobacterium sp. W-213株の塩基性化合物成分溶液を示す。
【図５】Methylobacterium sp. W-213株の吸収成分のHPLCプロファイルを示す。
【図６】Methylobacterium sp. W-213株、W-182株およびBacillus sp. No.20株（対照）の菌体乾燥物の懸濁水の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図７】Methylobacterium sp. W-213株、市販日焼け止めクリームＡ、市販日焼け止めクリームＢのメタノール抽出物の紫外線吸収スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、植物生息微生物由来の紫外線吸収剤組成物であって、320-400nmの波長領域に紫外線吸収スペクトルの吸収ピークを有する紫外線吸収剤組成物を提供する。
本発明に使用される植物生息微生物は、所望の紫外線吸収能力を有し、また、所望の波長領域の紫外線の吸収を有するものを当業者が適宜選択することが可能である。例えば、植物から単離された一群の微生物について、それらの抽出物を作成し、ＵＶ吸収スペクトルを測定することによって、本発明に適した植物生息微生物をルーチン作業により選択することができる。
【００１３】
植物生息微生物の種類としては、上述の方法等によって選択されるものであれば特に限定されず、細菌、酵母、カビなどのいずれでもよいが、上記のうち細菌が好ましく、例えば、Rhizobiales（リゾビウム目）、さらにMethylobacteriaceae（メチロバクテリウム科）に属するものが好ましい。そのなかでも、Methylobacterium属の細菌は植物の葉などに多く生息することが知られるものであり、本発明の目的において特に好ましい。
また、本発明の植物生息微生物の単離源となる植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トマト、イチゴ、ニラ、コマツナ、チンゲンサイ、ダイズなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明の紫外線吸収剤組成物において、植物生息微生物を紫外線吸収剤組成物に使用する態様は当業者が適宜決定することが可能であり、その培養物をそのまま、又は菌体を乾燥して得られた乾燥物を紫外線吸収剤組成物に使用してもよい。あるいは、適宜培養した植物生息微生物を適切な溶媒で抽出した抽出物を紫外線吸収剤組成物に使用してもよい。好ましくは、培養した植物生息微生物を抽出した溶媒からイオン交換クロマトグラフィ等の手段によって紫外線吸収成分を分離し、紫外線吸収剤組成物に配合される。
培養の方法は特に限定されず、液体培養、固体培養のいずれでもよく、微生物の種類等に応じて適宜決定することができる。
【００１５】
また、抽出物を使用する場合、溶媒は、微生物の種類や、吸収剤が使用される最終製品の種類等に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、一般的な溶媒極性の指標として用いられている溶媒極性パラメーターＥＴ値（参考文献：Marcus, Y. 1998. The Property of Solvents, Wiley, ISBN: 978-0-471-98369-9）が45.0〜65.0(kcal/mol, 25℃)の溶媒を使用することが可能であり、より好ましくはＥＴ値46.0〜64.0、さらに好ましくは、ＥＴ値48.0〜63.5の溶媒を使用することができる。
より具体的な溶媒としては、水（ＥＴ値63.1）、メタノール（同55.5）、n-ブタノール（同49.7）、2-プロパノール（同48.6）、エタノール（同51.9）が挙げられ、これらを単独又は混合して使用してもよい。例えば、メタノールと水を混合し、５０〜８０％のメタノールとして使用することができる。
【００１６】
本発明の紫外線吸収剤組成物は、化粧品等に適宜配合することができる。化粧品の種類は特に限定されず、日焼け止めクリーム、化粧用下地、固形又は液体ファンデーション、ＵＶ防止用スプレー、乳液、整髪剤、口紅などが挙げられる。
【００１７】
本発明の紫外線吸収剤組成物はＵＶ−Ａ吸収活性を有し、その吸収スペクトルを分光光度計で測定した場合、320-400nmの波長領域に吸収ピークを有する。本発明の紫外線吸収剤組成物は、好ましくは、紫外線の波長領域における最大吸収ピークを320-400nm、より好ましくは340-380nm、さらに好ましくは355-365nmの波長範囲内に有する。
【００１８】
さらに、本発明の紫外線吸収剤組成物は、紫外線吸収スペクトル[340-380nmのピーク面積]/[320-400nmのピーク面積]の比が、0.5以上、好ましくは0.55以上、より好ましくは0.60以上である。上記の吸収スペクトル面積は、紫外線吸収ピークを半値幅法やSWIFT II-METHOD等の各種スペクトル解析ソフトの積分プログラム等により面積値に換算することにより求めることができる。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
（１）植物生息微生物の選抜
イネ葉鞘、各種植物の花弁、コムギ穂、イチゴ葉、チンゲンサイ葉から分離された細菌計239菌株を供試し、ジャガイモ・ペプトン・グルコース（PPG: ジャガイモ、200g; ペプトン、5g；グルコース、5g；リン酸二ナトリウム、3g；リン酸一カリウム、0.5g；塩化ナトリウム、3g；蒸留水、1000ml）の寒天平板培地上に塗抹後、25℃で5日間培養した。培養後、平板上の菌体を掻き取り、凍結乾燥等により、約10〜45mgの各菌株の菌体乾燥物を得た。菌体乾燥物に50%メタノール液を4ml入れ、5分間の超音波処理後20分間振とう（160rpm）抽出した。振とう後、遠心分離（10000rpm、10分）により抽出液を回収し、さらにこの抽出工程を２回繰り返して、最終的に約12mlの抽出液を得た。得られた抽出液の100ulを96穴のマイクロプレートに入れ、マルチスペクトロフォトメーター（Viento、大日本製薬株式会社製）および解析ソフトKcJunior（大日本製薬株式会社製）を用いて、抽出液の紫外線吸光スペクトルを測定した。測定は、200〜500nmの波長域を10nmの間隔で連続的に測定するスペクトルスキャン法で行った。その結果、W-213株を含む17菌株の抽出液で、いずれも360nm付近に最大吸収ピークをもつ特徴的スペクトルを示すことを見いだした（図１はW213株のスペクトルを示す）。なお、これは既存の化学合成した吸収剤であるアボベンゾンと同等のスペクトルであった。
【００２０】
これらの１７菌株をrRNA遺伝子の塩基配列に基づき同定した結果、いずれもMethylobacterium属細菌と同定した。特徴的なUV吸収スペクトルを示したMethylobacterium sp. W-213株の写真を図２に示す。
【００２１】
（２）抽出溶媒
上述（１）と同じ方法で得たMethylobacterium  sp.W-213株の乾燥菌体を出発材料とし、（１）と同様の手順で各種抽出溶媒による抽出を行い、最終的に菌体乾燥重量1mgあたり1mlの量になるように抽出液の濃度を調整した。濃度調整した各溶媒抽出液100μlについて、波長360nmにおける吸光度を分光光度計（Ultrospec 2000、ファルマシア製）および解析ソフトSWIFT II-METHOD（ファルマシア製；Wavescanプログラム、1.0nmステップ、スキャンスピードは6200nm/min）により測定した。各抽出溶媒で得られた抽出液の吸光度（360nm）及び溶媒のＥＴ値(kcal/mol, 25℃)を以下に示す。
【００２２】
0005751517.tif 000002
以上より、溶媒極性パラメーターＥＴ値が48.6〜63.1である溶媒で植物生息微生物を抽出した場合に、360nmにおける吸収が確認されることが分かる。
【００２３】
（３）植物生息微生物からの、紫外線吸収成分の抽出
Methylobacterium sp. W-213株を用い、PPG液体培地での振とう培養およびPPG寒天平板上での塗抹培養により菌体を得た（図３）。菌体を乾燥して得られた乾燥物8.169 gを約3リットルの80%メタノールで抽出して活性のある抽出産物（1.13g）を得た。その抽出産物を固相カートリッジカラム（PoraPak, Waters製）を用い、カラムに添付された用法に従いメタノール、次いで濃アンモニア：メタノール＝5:95液でステップワイズ溶出し、濃アンモニア：メタノール＝5:95液画分である81.4mgの黄褐色の塩基性の吸収成分を活性画分として得た（図４）。
【００２４】
（４）抽出成分のHPLC解析
吸収成分を分離するため、HPLC（Waters製、600 Controller、2414 Detecter）による解析を行った。カラムはAtlantis T3（3μm、 4.6×150mm、 Waters製）を用い、溶出条件は、0→8分まではH2Oを流量0.5ml/分→0.7ml/分のリニアグラジエントで溶出、8→12分までは0.7ml/分の流量でH2O→100%メタノールのリニアグラジエントで溶出、12→30分までは0.7ml/分の流量で100%メタノールによる溶出とした。その結果、大きく５本のピークが検出され、いずれのピークも吸光度360nmの波長に対し最大吸収ピークを示したことから、本吸収成分は少なくとも５種類の吸収物質で構成されることが判明した（図５）。
【００２５】
（５）植物生息微生物の培養物を用いた紫外線吸収剤組成物
コムギの穂から分離したコムギの穂およびイチゴの葉からそれぞれ分離したMethylobacterium sp. W-213株、W-182株、および対照としてトマト葉から分離したBacillus sp. No.20株を用い、ポテト・ペプトン・グルコース（PPG）寒天平板上での塗抹培養により、それぞれの菌体を得た。菌体を乾燥して得られた乾燥物を滅菌水で0.1mg/ml濃度に懸濁し、懸濁液（100ul）の紫外線吸光スペクトルおよび320-400nmの波長域におけるピーク面積を分光光度計（Ultrospec 2000、ファルマシア製）および解析ソフトSWIFT II-METHOD（ファルマシア製；Wavescanプログラム、1.0nmステップ、スキャンスピードは6200nm/min）により測定した。その結果、Bacillus sp. No.20株の菌体懸濁液では320-400nmの波長域での吸収ピークは確認されなかったのに対し、Methylobacterium sp. W-213株、W-182株では確認され、そのピーク面積はそれぞれ、205.9および204.4であった（図６）。
【００２６】
（６）市販の化粧品と本発明の紫外線吸収剤組成物の吸収スペクトルの相違
上述（１）と同じ方法で得たMethylobacterium  sp.W-213株の乾燥菌体および市販の日焼け止めクリームＡ及びＢの乾燥物を出発材料とし、（１）と同様の手順でメタノールによる抽出を行い、最終的に菌体またはクリームの乾燥重量1mgあたり1mlの量になるようにそれぞれの抽出液の濃度を調整した。濃度調整した各抽出液100μlを供試し、それらの紫外線吸収スペクトルおよび320-400nmおよび340-380nmの波長域のピーク面積を（５）と同じ分光光度計及び解析ソフトで測定・比較した（図７）。
ここで、各サンプルについて、320-400nmのピーク面積、340-380nmのピーク面積、及び、[340-380nmのピーク面積]/[320-400nmのピーク面積]の比を以下に示す。
【００２７】
0005751517.tif 000003
【００２８】
上記の通り、本発明成分はＵＶ−Ａの領域に特異的吸収能を持つため、例えば、ＵＶ−Ａの領域に吸収能を持たない廉価品の市販日焼け止め製品に添加すること等により、天然由来成分として優れた効果を発揮することができる。
【図１】
0005751517.tif 000004
【図５】
0005751517.tif 000005
【図６】
0005751517.tif 000006
【図７】
0005751517.tif 000007
【図２】
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【図３】
0005751517.tif 000009
【図４】
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