(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）エンテロウイルス７１ＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし、ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなり、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなる試料中のエンテロウイルス７１ＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、
前記（６）の工程が、前記ＲＮＡ転写産物と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの存在下、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成し、蛍光特性の変化を測定する工程であり、
前記第一のプライマーが配列番号５および７に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが配列番号１０に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチドであり、
前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが配列番号２４および２５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ  Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１７および１９に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、かつ高感度にエンテロウイルス７１ＲＮＡを検出する方法、および該方法に用いるための検出試薬に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査の分野に有用である。
【背景技術】
【０００２】
エンテロウイルス７１はピコルナウイルス科、エンテロウイルス属に属するウイルスであり、約７５００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムに持つノンエンベロープウイルスである。エンテロウイルス属には、ポリオウイルス、コクサッキーＡ群ウイルス、コクサッキーＢ群ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルスなどが含まれており、１００程度の血清型を有することが明らかにされている。
【０００３】
エンテロウイルスは、急性灰白髄炎（ポリオ）、無菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ、手足口病、急性出血性結膜炎、急性脳炎など、ヒトに対して多様な病原性を示すことが知られている。
この中で、手足口病は、口腔および四肢末端に発疹ができることを特徴とした疾患であり、主に夏季に乳幼児を中心として流行する、きわめてありふれたエンテロウイルス感染症である。
【０００４】
手足口病の主要な原因ウイルスは、エンテロウイルス７１（以降、ＥＶ７１と表記する）およびコクサッキーＡ群ウイルス１６（以降、ＣＡ１６と表記する）であることが知られており、年により、規模や主要な原因ウイルスが異なることが知られている。
【０００５】
近年、東アジア地域における大規模な手足口病流行時に、ＥＶ７１感染が原因と考えられる、無菌性髄膜炎や急性脳炎患者が多発し、死亡例をともなう重症化事例も報告されている。また、日本でも、散発的ではあるものの、ＥＶ７１感染による重症例が認められている。これらのことから、ＥＶ７１感染による手足口病の流行時には、中枢神経合併症に対する警戒が必要であると考えられている。（非特許文献１および２）  しかしながら、臨床症状から、手足口病の原因ウイルスを特定することは不可能であるため、ＥＶ７１とＣＡ１６とを鑑別する検査方法の開発が強く望まれている。
【０００６】
エンテロウイルスの検出方法には、従来から用いられてきた方法として、培養細胞によるウイルス分離とそれに続く中和法、または蛍光抗体法による同定法が知られている。これらの方法では、エンテロウイルス感染が疑われる患者の検体を感受性培養細胞に接種し、１週間程度培養しウイルス分離を行ってから、抗血清を用いた中和法、または、蛍光抗体法などにより、ウイルスの同定を行う。これらの方法は、エンテロウイルス分離・同定の基本であり、適切な抗血清を使用すれば信頼性が高い方法であるといわれているが、ウイルス分離に１週間程度を要する、非常に時間のかかる方法である。
【０００７】
臨床現場における、手足口病の診断においては、原因ウイルスを迅速に鑑別し、患者の重症化のリスクを把握することが重要である。なぜならば、診断の結果、ＥＶ７１が検出された場合、症状の推移を注意深く観察し、または適切な医療上の処置を講ずることにより、重症化を回避、または、重症化したとしても、早期に回復することが期待できるからである。このように、長時間を要する検出法では、臨床現場における手足口病の原因ウイルスの鑑別による重症化リスクを判断する目的では、適用することが困難であるため、より迅速な検出方法の開発が強く望まれていた。
【０００８】
そこで、エンテロウイルスを迅速に検出する方法として、イムノクロマトグラフィーの適用が考えられる。イムノクロマトグラフィーは、非常に迅速な検査方法であることが知られており、インフルエンザウイルスや、アデノウイルス検査などに広く用いられている。
【０００９】
しかしながら、現在、手足口病の原因ウイルス検査を目的とした、実用的なイムノクロマトグラフィーは見当たらない。このことは、おそらく、イムノクロマトグラフィーの検出感度が、分離・同定法に比べて低いことや、検出に多量のウイルスを必要とすること、ＥＶ７１に良好な特異性を持ち、イムノクロマトグラフィーに適応しやすい抗体が得られていないことなどが原因と推定される。
【００１０】
一方、エンテロウイルスを迅速かつ高感度に測定する手段としてエンテロウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物を電気泳動で検出する方法や、増幅産物をシークエンスする方法、型特異的オリゴヌクレオチドプローブで検出する方法（特許文献１）などが挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲ法は、エンテロウイルスのＲＮＡを鋳型に逆転写（ＲＴ）反応を行い、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成し、該ＤＮＡ鎖を鋳型としてＰＣＲ反応を行なうことにより、高感度にエンテロウイルスを検出する方法である。該方法では、従来の分離・同定法と比較して、極めて迅速かつ高感度にエンテロウイルスを検出することが可能である。
【００１１】
これらの方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要であり、このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、コンタミネーションの危険性を増加させることになる。特に、一般的なＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＴ工程とＰＣＲ工程、さらには増幅産物の検出・ウイルスの同定のための電気泳動、シークエンス解析、または、型特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法など、多段階の工程から成り立っている。また、それぞれの工程の間に、反応産物を移し替える操作が要求されたり、コンタミネーションの危険性が極めて高い操作である、増幅産物の電気泳動による検出操作や、シークエンス操作、ハイブリダイゼーション操作が必要である。さらに、前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程、さらには増幅産物の検出工程を合わせると通例４〜５時間以上の時間を要し、迅速であるとはいえず、また、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。
【００１２】
ＲＴ−ＰＣＲ法における、上記した課題の一部を解決した方法として、Ｔａｑｍａｎプローブなどのハイブリダイゼーションプローブを用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献３および４）があげられる。該方法は、ＰＣＲ工程と増幅産物の検出工程が同時であるため、増幅産物の電気泳動によるコンタミネーションリスクを回避し、かつ、検査時間の短縮を実現した優れた検出方法である。しかしながら、該方法でも一般的にはＲＴ工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要であり、操作の煩雑性とコンタミネーションの可能性を完全に克服した検査方法であるとはいえず、検査時間も、従来のＲＴ−ＰＣＲ法よりも短縮されているものの、ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例３時間以上の時間を要し、臨床現場で適用可能な迅速検査であるとは言えない。
また、ＰＣＲ工程は、原則的に熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなる急激な温度サイクルを必要とし、システム化を考える場合に簡素化および低コスト化のための大きな障壁となっている。
【００１３】
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、ＮＡＳＢＡ法（特許文献２および３）、ＴＭＡ法（特許文献４）およびＴＲＣ法（特許文献５および６、非特許文献７）などが報告されている。これらのＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【００１４】
前記ＲＮＡ増幅法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であるばかりでなく、結果として再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。また、結果が出るまでに通常、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ共に９０分以上必要であり、迅速な結果を得るには至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に変性のための加温（例えば、６５℃）が必要であり（特許文献３実施例１および特許文献４実施例１に記載）、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっていた。
【００１５】
一段階反応のＲＮＡ増幅法の一つであるＮＡＳＢＡ法に改良を加え、電気泳動による増幅産物の検出を不要とした、リアルタイム検出ＮＡＳＢＡ法によるエンテロウイルスの検出方法（非特許文献５および６）が報告されている。該方法によれば、ＲＴ−ＰＣＲのように、ＲＴ工程とＰＣＲ工程の二段階の工程が一段階の工程となり、操作の煩雑性の低下、およびコンタミネーションリスクの低減を実現した方法であるといえる。しかしながら、該方法をもってしても、エンテロウイルスの検出に数時間を要するため、依然として迅速性に課題があるとともに、ＥＶ７１を特異的に検出することが不可能であり、手足口病患者の重症化リスクを評価することはできない。
【００１６】
簡便に、一定温度・一段階でＲＮＡを増幅・測定する方法としてはＴＲＣ法（特許文献５〜７、非特許文献７）が挙げられる。当該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識され、標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって、蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、前記ＲＮＡ増幅法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、プライマーなどの結合領域を標的ＲＮＡの（二次構造を計算して推定した）高次構造フリー領域に設定することで、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を、同時にかつ迅速（３０分以内）・簡便に実施することが可能である（非特許文献５）。
【００１７】
このＲＮＡ増幅測定法は、前記ＲＮＡ検出法の中で、迅速性、簡便性、信頼性の点から、特に好適な方法といえる。ただし、該ＲＮＡ増幅測定法は、比較的低温度（３５〜６０℃）の一定温度で実施し、変性工程をまったく行わないため、標的ＲＮＡの高次構造の影響だけでなく、プライマーダイマー等の非特異的増幅の影響も受けやすいため、そのプライマーセットの設計には細心の配慮が必要で、汎用されているＰＣＲプライマー用の設計手法では不十分なことが明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開平８−１７３１９５号
【特許文献２】特許２６５０１５９号公報
【特許文献３】特許３１５２９２７号公報
【特許文献４】特許３２４１７１７号公報
【特許文献５】特開２０００−１４４００号
【特許文献６】特開２００１−３７５００号
【特許文献７】特開２００１−３５３０００号
【特許文献８】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献９】特開２００１−１３１４７号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】清水博之（２００５）、日本臨牀、Ｖｏｌ．６３、Ｓｕｐｐｌ．７、３８９−３９２
【非特許文献２】清水博之（２００７）、感染症、Ｖｏｌ．３７、Ｎｏ．４、１１７−１２４
【非特許文献３】Ｘｉａｏ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１５４，１２１−１２５．
【非特許文献４】Ｔａｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｄｉａｇ．Ｍｉｃｒｏ．ＡＮＤ  Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，６１，２９４−３０１．
【非特許文献５】Ｃａｐａｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｖｉｏｌ．，３２，２３６−２４０．
【非特許文献６】Ｃｏｓｔａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６，８０−８３．
【非特許文献７】病原体検出情報、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．１（Ｎｏ．３４７）Ｊａｎｕａｒｙ  ２００９、９−１０
【非特許文献８】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６
【非特許文献９】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
冒頭で述べたとおり、ＥＶ７１やＣＡ１６が含まれるエンテロウイル属には、約１００程度と多様な血清型が存在することが知られており、エンテロウイルスは、ヒトに対して多様な疾患を引き起こし、また、疾患ごとに、主な原因ウイルスが異なることも知られている。エンテロウイルスが引き起こす疾患で、代表的なものの一つである手足口病は、５歳以下の小児および乳幼児を中心に夏期に流行する。手足口病は、一般に予後は良好であるものの、ＥＶ７１を原因とする場合、重症化するリスクが高いことが知られており、ＥＶ７１の迅速かつ高感度な検出方法の開発が望まれているのは、前述の通りである。
手足口病のおもな原因ウイルスは、ＥＶ７１とＣＡ１６であるため、リスク管理の目的として、これらの血清型を、特異性よく鑑別する必要がある。さらに、ＥＶ７１は、多様な遺伝子群（ジェノグループ）が存在することが知られており、現在、ジェノグループＡ、ジェノグループＢ１から４、ジェノグループＣ１から４の分類が提唱されている。（非特許文献１）。また、報告数に差は見られるものの、全てがヒトに対する病原性を有するため、これらの多様な遺伝子群を全て検出することが必要である。
【００２１】
このように、ＥＶ７１の多様な遺伝子群を、高感度、高特異的、かつ、簡便、迅速に測定することが可能な検出方法を提供することが、本発明が解決すべき課題である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、一度の測定でＥＶ７１の多様な遺伝子群／遺伝子型を高感度、高特異的、かつ、迅速に検出することが可能となった。
【００２３】
本発明中の第一の発明は、試料中のエンテロウイルス７１ＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、前記特定塩基配列の増幅が、配列番号１または６に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上の第一のプライマー、および、配列番号８に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上の第二のプライマーを用いてなされることを特徴とする、エンテロウイルス７１ＲＮＡの検出方法である。
【００２４】
第二の発明は、第一の発明における特定塩基配列の増幅において、第一のプライマーとして、配列番号５または７に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、および、第二のプライマーとして、配列番号１０に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、エンテロウイルス７１ＲＮＡの検出方法である。
【００２５】
第三の発明は、第一の発明あるいは第二の発明における特定塩基配列の増幅において、第一のプライマーとして、配列番号５または７に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチド、および、第二のプライマーとして、配列番号１０に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、エンテロウイルス７１ＲＮＡの検出方法である。
【００２６】
第四の発明は、第一の発明から第三の発明における第一のプライマーおよび第二のプライマーの少なくとも一方は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、転写調節部位、制限酵素部位、ステム・ループ構造などから選ばれた機能的配列が、その末端にさらに付加されてなることを特徴とする、エンテロウイルス７１ＲＮＡの検出方法である。
【００２７】
第五の発明は、試料中のエンテロウイルス７１ＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、
（１）エンテロウイルス７１ＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなることを特徴とする、第一の発明から第五の発明に記載のエンテロウイルス７１スＲＮＡの検出方法である。
【００２８】
第六の発明は、第五の発明におけるＲＮＡ転写産物量の測定が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする検出方法である。
【００２９】
第七の発明は、第六の発明における蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする検出方法である。
【００３０】
第八の発明は、第七の発明におけるインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２０に記載の塩基配列、あるいはその相補的配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする検出方法である。
【００３１】
第九の発明は、第八の発明におけるインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２４または配列番号２５に示された配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする検出方法である。
【００３２】
第十の発明は、第五の発明におけるエンテロウイルス７１ＲＮＡの検出方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ  Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、
【００３３】
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１３または１８記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする検出方法である。
【００３４】
第十一の発明は、第十の発明における切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１７または１９に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、エンテロウイルス７１ＲＮＡの検出方法である。
【００３５】
第十三の発明は、試料中のエンテロウイルス７１ＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出するための試薬であって、少なくとも、前記第一のプライマーが配列番号１または６に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、および前記第二のプライマーが配列番号８に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とするエンテロウイルス７１ＲＮＡの検出試薬である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明は、
（１）ＥＶ７１  ＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、第一のプライマー及び第二のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸重合酵素を用いて、前記特定塩基配列を含む核酸を増幅する工程、
（２）該核酸増幅産物を測定する工程、
からなるＥＶ７１  ＲＮＡの検出方法において、前記第一のプライマー配列番号１および６に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも１種類以上のオリゴヌクレトチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号８に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも１種類以上のオリゴヌクレトチドからなることを特徴としている。
【００３７】
本発明により、試料中に含まれる微量なＥＶ７１  ＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に増幅、検出することが可能となった。
【００３８】
さらに、プロモーター配列を有する第一のプライマー、または第二のプライマーを用いて得られるＲＮＡ転写産物量を測定する工程において、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブを共存させ、増幅されたＥＶ７１ＲＮＡの特定核酸に由来する蛍光強度の増加を経時的に測定することにより、ＥＶ７１ＲＮＡの検出を簡便、迅速、かつ高感度に行なうことが可能となった。
【００３９】
本発明の検出方法を用いたＥＶ７１  ＲＮＡの検出試薬は、一度の測定でＥＶ７１  ＲＮＡの多くの遺伝子群／遺伝子型を迅速、かつ高感度に検出することができる。特に、従来技術と比較すると圧倒的に迅速である、という特徴を有しているため、臨床現場において、糞便やぬぐい液といった臨床検体中にＥＶ７１が存在するかを迅速、かつ簡便に判定することが可能となった。
【００４０】
そのため、手足口病患者の重症化リスクを臨床現場で評価できるようになり、重症化の兆候が見られた際などに、迅速な医療行為を行うことができるようになった。また、手足口病蔓延の防止、およびＥＶ７１感染経路の調査研究などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献９）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明中の試料とは、食品、飲料水、環境水、糞便および嘔吐物、鼻腔および咽頭等のぬぐい液、血液、その他の分泌液、体液、組織洗浄液などである。
【００４３】
本発明中の特定塩基配列とは、ＥＶ７１ゲノムＲＮＡ上で、第一のプライマーと相同領域の５’末端から第二のプライマーと相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、本発明では前記特定塩基配列あるいはその相補配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。該ＲＮＡ転写産物を転写するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖に特定塩基配列を有する。
【００４４】
本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、該部位は後述する切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。
【００４５】
本発明中のＥＶ７１ＲＮＡを増幅し検出する工程における、ＲＮＡ増幅法としては、ＴＲＣ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＬＡＭＰなどが使用可能であり、特に限定されないが、混入するＤＮＡの影響を受けず、一定温度で実施可能なＲＮＡ増幅法であるＴＲＣ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなどが好ましい。
【００４６】
検出方法としては既知の核酸検出方法が使用可能であるが、ハイブリダイズすることによって蛍光特性が変化するように設計された蛍光物質標識プローブを使用することが好ましい。該蛍光物質標識プローブとしては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブやインターカレーター標識プローブなどが挙げられる。前記ＥＶ７１ＲＮＡを増幅し検出する工程における最も好適な方法は、他法に比して顕著に迅速で、一定温度・一段階でＲＮＡを増幅し、同時に増幅産物をモニタリングする特許文献５に記載の方法であるが、本願以前にＥＶ７１を迅速に検出する方法は提示されていなかった。
【００４７】
本発明中のストリンジェントな条件とは特に限定されるものではないが、例えば、４２℃における５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、や本明細書の実施例に記載のＲＮＡ増幅条件など、あるいはこれらの適宜改変された条件が挙げられる。本明細書中で単にハイブリダイズすると記載された場合、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることを指す。また、該条件におけるハイブリダイゼーションの十分な特異性や効率が得られる範囲内で、塩基の置換、欠失、付加、修飾等が可能であり、長さも任意に設定できる。
【００４８】
本発明の好適な態様では、配列番号１または６で示された塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にハイブリダイズ可能な配列、配列番号８に示された塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にハイブリダイズ可能な配列を選定することができる。
【００４９】
本発明中の、少なくとも連続する１５塩基とは、機能的なプライマーとして常識の範囲内で設定可能であることを示すものであり、通例は連続する１５塩基以上５０塩基未満を指す。
【００５０】
本発明中のＲＮＡポリメラーゼあるいはＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は特定のプロモーター配列が既知のものなら特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用されるバクテリアファージ由来の、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどを使用することができる。
【００５１】
本発明中のプロモーター配列としては、前記ＲＮＡポリメラーゼに対応するプロモーター配列を使用する。また前記プロモーター配列には、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域が付加されていても良い。
【００５２】
本発明中の、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用可能である。
【００５３】
前述したように、ＥＶ７１にはジェノグループＡ、Ｂ、Ｃが存在し、ジェノグループＢ、Ｃには、それぞれ、Ｂ１から４（５）、Ｃ１から４（５）と多様な遺伝子群、遺伝子型が存在していることが知られている（非特許文献１および８）。
【００５４】
非特許文献１において系統樹解析されているＥＶ７１株の塩基配列情報を入手し、遺伝子群間の塩基配列のホモロジーを確認した結果、塩基配列が高度に保存されている領域は比較的限定的であることが分かった。さらに、ジェノグループＡは、他のジェノグループＢ、Ｃに対して、塩基配列のホモロジーが低いことが分かった。
【００５５】
そのため、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ一種類ずつ用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、ＥＶ７１ＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することは困難であると予想された。
【００５６】
そこで発明者らは、多様な遺伝子群／遺伝子型を測定するために、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ一種類以上用いたオリゴヌクレオチドの最適な組み合わせについて鋭意研究を重ねた結果、一度の測定でＥＶ７１の多様な遺伝子群／遺伝子型を迅速、かつ高感度に検出する方法を見出した。
【００５７】
本発明において第一のプライマーはＥＶ７１  Ｂ３  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、ＥＶ７１  Ａ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号６に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列の中から選ばれる一種類以上のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーはＥＶ７１  Ｂ３  ＲＮＡの一部に相同な配列番号８に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列の中から選ばれる一種類以上のオリゴヌクレオチドからなる。
【００５８】
本発明の一態様は、第一のプライマーが配列番号５および７に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号１０に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなる。
【００５９】
本発明のより好ましい一態様は、第一のプライマーが配列番号５および７に記載の配列に相補的なオリゴヌクレオチドの混合物からなり、かつ第二のプライマーが配列番号１０に記載の配列に相補的なオリゴヌクレオチドの混合物からなる。
【００６０】
さらに、本発明の別の一態様としては、ＥＶ７１  ゲノムＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなるＥＶ７１ＲＮＡの検出方法である。
【００６１】
前記した態様において、第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合は、ＥＶ７１  ＲＮＡがｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定塩基配列の前記５’末端部位で切断されることが好ましい。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。
【００６２】
このような切断方法として、ＥＶ７１  ＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化などされているものを使用するのが好ましい。
【００６３】
本発明の好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドとして、ＥＶ７１  Ｂ３  ＲＮＡの一部に相同な配列番号１３に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、ＥＶ７１  Ａ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１８に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、の中から選ばれる一種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００６４】
本発明のより好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７または１９に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００６５】
なお、本発明中の配列番号１、８、１３、２０はＳＫ−ＥＶ００６（ＥＶ７１Ｂ３）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０５９８１９）の部分配列の相同鎖もしく相補鎖であり、配列番号６、１８はＢｒＣｒ（ＥＶ７１  Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２２５２１）の部分配列の相同鎖もしく相補鎖である。
【００６６】
本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。
【００６７】
本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが、ＥＶ７１  Ｂ３  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号２０に記載の塩基配列、あるいはその相補的配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００６８】
本発明の好ましい一態様では、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが、ＥＶ７１  Ｂ３  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号２４に記載の塩基配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、およびＥＶ７１  Ｃ５  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号２５に記載の塩基配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、の中から選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００６９】
本発明の一態様として、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１３および１８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。また、第一のプライマーは、その５’末端にプロモーター配列を有しており、配列番号１および６に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。そして、第二のプライマーは配列番号８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。さらに、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、配列番号２０に記載の塩基配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００７０】
より好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７および１９に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。また、第一のプライマーは、配列番号５および７に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。そして、第二のプライマーは配列番号１０に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００７１】
さらに、好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７および１９に記載の配列の相補鎖であるオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第一のプライマーは、配列番号５および７に記載の配列の相補鎖であるオリゴヌクレオチドの混合物からなり、さらに、第二のプライマーは配列番号１０に記載の配列の相補鎖であるオリゴヌクレオチドの混合物からなる。
【００７２】
また、ＥＶ７１  Ａは、エンテロウイルスの中ではいち早く分離・同定され、ＥＶ７１の標準株と位置付けられているものの、近年は、手足口病の原因ウイルスとして検出されることはほとんどない。
【００７３】
そこで、ジェノグループＡの検出感度が低下しても差し支えないと考えられる場合、上記した本発明の各種態様から、配列番号１８および１９記載の配列に相補的な切断用オリゴヌクレオチドや、配列番号６および７記載の配列に相補的な第一のプライマーなどを除いても構わない。
【００７４】
本発明のＥＶ７１ＲＮＡの検出方法において、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素））が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素をさらに添加して補足することなども可能である。
【００７５】
前記逆転写酵素は、分子生物学的実験で汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体が好ましく、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体が使用可能である。
【００７６】
本発明の一態様では、試料中のＥＶ７１ＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一のプライマーおよび第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがＥＶ７１ＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００７７】
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。
【００７８】
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から５０℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
【００７９】
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などが利用できる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好ましい方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献５および非特許文献８）。
【００８０】
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニンおよびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献８および非特許文献９）。
【００８１】
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献９および非特許文献９）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）などを用いることも可能である。
【００８２】
本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１または６に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号２６）を付加した配列）、第二のプライマー（配列番号８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号２０に示す配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列）、切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１３また１８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から５０℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
【００８３】
前記態様において、最も好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７および１９に記載の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第一のプライマーは、配列番号５および７に記載の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドの混合物からなり、さらに、第二のプライマーは配列番号１０に記載の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなる。
【００８４】
前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
【００８５】
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一の容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＥＶ７１ＲＮＡを増幅し検出することができる。
【００８６】
この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【００８７】
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりＥＶ７１ＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず高特異的、高感度、迅速、簡便、一定温度、かつ一段階の同時測定が可能となった。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００８９】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したＥＶ７１  ＲＮＡおよびＣＡ１６  ＲＮＡ（以降、ともに標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
【００９０】
（１）表１に示したエンテロウイルス分離株９株のＲＮＡ抽出物を用い、表１に記載した塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを、定法に従い、ｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（３）（２）の形質転換大腸菌の培養物からプラスミドを抽出し、挿入ＤＮＡの３’末端側を制限酵素で消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（４）（３）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製し、標準ＲＮＡを調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００９１】
【表１】
0005754100.tif 000002
なお、標準ＲＮＡは、ＥＶ７１およびＣＡ１６の構造遺伝子であるＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３，ＶＰ１を含み、全長は約３０００塩基（該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）と、ＥＶ７１  ＲＮＡやＣＡ１６  ＲＮＡの全長（約７５００塩基）の一部ではあるが、本発明の測定対象であるＥＶ７１  ＲＮＡやＣＡ１６  ＲＮＡの測定には十分適用可能である。
【００９２】
また、今回標準ＲＮＡを調製した中には、ＥＶ７１  Ｂ２およびＥＶ７１  Ｃ３が含まれていないが、ＧｅｎＢａｎｋよりそれぞれの塩基配列情報を確認した結果、（Ａ）ＥＶ７１  Ｂ１とＥＶ７１  Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２２５２２）との間（Ｂ）ＥＶ７１  Ｃ２とＥＶ７１  Ｃ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＹ１２５９６８）との間はそれぞれ相同性が比較的高いことが分かったため、今回調製した遺伝子型の標準ＲＮＡを全て検出できれば、全てのＥＶ７１  ＲＮＡを検出可能であることが予想される。
【００９３】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを調製した。非特許文献９に記載の方法で、
配列番号２１に記載の配列の５’末端から１１番目のＡと１２番目のＡの間、
配列番号２２に記載の配列の５’末端から９番目のＧと１０番目のＣの間、
配列番号２３に記載の配列の５’末端から８番目のＧと９番目のＣの間、
配列番号２４に記載の配列の５’末端から７番目のＧと８番目のＡの間、
配列番号２５に記載の配列の５’末端側から１１番目のＧと１２番目のＣとの間、
のリン酸ジエステル部分に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
【００９４】
実施例３  ＥＶ７１ＲＮＡ検出用プライマーセットの検討
表２に示した組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以降、ＩＮＡＦプローブと表記）、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行い、検出性能、特異性等について評価を行った。
【表２】
0005754100.tif 000003
【００９５】
（１）前記標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて、ＥＶ７１標準ＲＮＡは１０3コピー／５μＬ、ＣＡ１６標準ＲＮＡは１０10コピー／５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００９６】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１１０ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．８ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各０．５μＭ  第一のプライマー：該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモータ配列（配列番号２６）が付加されている
０．５μＭ  第二のプライマー
各１０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ：該プローブは実施例２で調製したもの
各０．０８μＭ  切断用オリゴヌクレオチド：該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１０．４％  ＤＭＳＯ
【００９７】
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素  （ライフサイエンス製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （インビトロジェン製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
【００９８】
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００９９】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表２から４に示した。
【０１００】
表２のＡからＡＦまでの組合せは、表１に示したＥＶ７１  Ｂ３およびＣＡ１６のＶＰ４−ＶＰ１領域に対応する塩基配列を持つ標準ＲＮＡを、表３および表４は、表１に記載の全９株のＶＰ４−ＶＰ１領域の塩基配列を持つ標準ＲＮＡをそれぞれ使用した。また、８株のＥＶ７１の標準ＲＮＡは１０3コピー／５μＬのものを使用し、ＣＡ１６の標準ＲＮＡは１０10コピー／５μＬのものを使用した。
【０１０１】
表３は、表２の組合せの中で、検出時間が早く、特異性も高い、良好な性能であると判断したＡＤに示すオリゴヌクレオチドの組合せを基本とし、さらに良好な性能を実現するため、配列番号２２、２３、２４、２５に記載のＩＮＡＦプローブを用いて、１０3コピー／５μＬのＥＶ７１標準ＲＮＡ、および１０10コピー／５μＬのＣＡ１６標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
【０１０２】
表４は、表３の組み合わせの中で、検出スペクトルが最も広く、良好な性能であると判断した配列番号２４、２５に記載のＩＮＡＦプローブの混合系をおいて、ＥＶ７１  Ａの高感度検出を実現するため、配列番号１９に記載の配列に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、配列番号７に記載の配列に相補的な第一のプライマーを添加したものであり、１０3コピー／５μＬのＥＶ７１標準ＲＮＡ、および１０10コピー／５μＬのＣＡ１６標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
【０１０３】
表５は、表２から４までの検討で選抜された、最も性能の良いオリゴヌクレオチドの組み合わせを示したものである。
【０１０４】
表６は、表５に示したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、８株のＥＶ７１および１株のＣＡ１６のＲＮＡ抽出物を測定したときの結果を示した。
【０１０５】
なお、全ての表において、Ｎ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。また、Ｎｅｇａとは、滅菌済み蒸留水をサンプルとして測定したものである。また、特異性における＋の数は、ＣＡ１６  ＲＮＡに対する交差反応性の程度を示したものであり、＋の数が多いほど、交差反応性が強いことを表している。
【０１０６】
表２における「判定」とは、ＥＶ７１の検出時間、Ｎｅｇａの測定結果、ＣＡ１６  ＲＮＡに対する交差反応性の結果を踏まえた、オリゴヌクレオチドの組み合わせの判断結果であり、良好でないものは×、良好なものを○、特に良好なものを◎と記載した。
【表３】
0005754100.tif 000004
【表４】
0005754100.tif 000005
【表５】
0005754100.tif 000006
【０１０７】
表２から表４に示した検討結果より、ＥＶ７１  ＲＮＡを検出するのに好適なオリゴヌクレオチド配列が明らかになったとともに、迅速かつ高感度、高特異的に検出することが可能なオリゴヌクレオチドの組合せを見出した。
【０１０８】
表２に示した、ＡからＡＦのオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合の、ＥＶ７１  Ｂ３標準ＲＮＡの検出時間、およびＮｅｇａ、ＣＡ１６標準ＲＮＡの測定結果より、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡＤが最良の組み合わせと判断された。すなわち、第一のプライマーは配列番号５に記載の塩基配列の相補鎖、第二のプライマーは配列番号１０に記載の塩基配列の相補鎖を用いれば、ＥＶ７１標準ＲＮＡを特異性良く、迅速に増幅し検出することが可能であることが分かった。
【０１０９】
一方、他の組み合わせの測定結果より、配列番号２１のＩＮＡＦプローブや、配列番号１４に相補的な切断用オリゴヌクレオチド、配列番号２に相補的な第一のプライマーは、ＣＡ１６標準ＲＮＡを強く検出することから、ＥＶ７１に対する特異性が低いことが分かった。同様の理由から、配列番号１２に相補的な第二のプライマーも、良好な性能を有してないことが分かった。
【０１１０】
切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１５、１６、１７のそれぞれに相補的な配列が使用できることから、それらに対応した配列を含む、配列番号１３および１８にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列が使用できることが分かった。
【０１１１】
第一のプライマーは、配列番号３、４、５のそれぞれに相補的な配列が使用できることから、それらに対応した配列を含む、配列番号１および６にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列が使用できることが分かった。
【０１１２】
第二のプライマーは、配列番号９、１０、１１のそれぞれに相補的な配列が使用できることから、それらに対応した配列を含む、配列番号８にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列が使用できることが分かった。
【０１１３】
表３および表４より、それぞれのＩＮＡＦプローブの検出スペクトルが明らかとなり、配列番号２４および２５に記載のＩＮＡＦプローブを混合したものが、最善の性能を有することが明らかとなった。
【０１１４】
また、表１では、配列番号２１に記載のＩＮＡＦプローブは、良好な性能を示さなかったものの、配列番号２２から２５までに示したＩＮＡＦプローブは、いずれも、ＥＶ７１を特異的に検出することが可能であることが分かったため、インターカレーター性蛍光色素標識プローブは、配列番号２０に記載の配列またはその相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である、少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドから選ぶことが可能であることが分かった。
【０１１５】
表４より、ＥＶ７１  Ａ  ＲＮＡに相同的な塩基配列を有する第一のプライマー、相補的な塩基配列を有する第二のプライマー、相補的な塩基配列を有する切断用オリゴヌクレオチドを、表２までの検討結果で選ばれたオリゴヌクレオチドプライマーを含む系に添加することにより、ＥＶ７１  Ａ  ＲＮＡを迅速かつ高感度に検出することが可能であった。
【０１１６】
表５に、最終的に選抜されたオリゴヌクレオチドの組み合わせを記載した。記載の組み合わせのオリゴヌクレオチドを含む検出試薬を使用することで、ＥＶ７１の多くのジェノグループを迅速に検出することが可能であり、さらに、非常に高濃度のＣＡ１６  ＲＮＡを検出しないことから、特異性も良好であることが分かった。
【０１１７】
実施例３  ＥＶ７１ＲＮＡの検出試薬
【表６】
0005754100.tif 000007
【０１１８】
表５に示したＥＶ７１を検出するのに好適なオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、多くの遺伝子群のＥＶ７１  ＲＮＡを一度に測定可能な検出試薬の作製を試みた。
【０１１９】
表５に記載のオリゴヌクレオチドを混合し、実施例２に記載の試薬組成を調製し、ＥＶ７１ＲＮＡ検出試薬を作製した。
表１に記載の８株のＥＶ７１（８種類の遺伝子群）、および１株のＣＡ１６をエンテロウイルス感受性培養細胞に感染させ、十分にウイルスが増殖したものから抽出したＲＮＡを、上記のＥＶ７１  ＲＮＡ検出試薬で測定を実施した。
上記試薬の測定結果は、表６に示した通りであり、ＥＶ７１は，測定した全てのウイルス株が８分以内に検出された。一方、ＣＡ１６は検出されなかった。
【０１２０】
本実施例に示した方法は、ＥＶ７１ＲＮＡを高感度、高特異的、かつ、非常に迅速に測定することが可能であることが分かった。本実施例に示した方法が、本発明における最も好ましい系であるといえる。
【図１】
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【配列表】
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