(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子の少なくとも２つの内在性アレルが、野生型ＩＮＤ遺伝子の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルであり、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、下記：
（ａ）配列番号２の位置１２４に相当する位置のバリンが、メチオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｂ）配列番号２の位置１４６に相当する位置のグリシンが、セリンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｃ）配列番号２の位置１５９に相当する位置のアラニンが、バリンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｄ）配列番号４の位置１４２に相当する位置のアルギニンが、システインに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号４の位置１３６に相当する位置のスレオニンが、メチオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、および
（ｆ）配列番号４の位置１３９に相当する位置のアラニンが、スレオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸
からなる群より選択されることを特徴とする、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物。
【請求項２】
前記野生型ＩＮＤ遺伝子が、
（ａ）配列番号１、配列番号３の４６位のヌクレオチドから６３３位のヌクレオチドまで、配列番号３、配列番号５または配列番号７との配列同一性が少なくとも９０％である核酸分子と、
（ｂ）配列番号２、配列番号４の１６位のアミノ酸から２１０位のアミノ酸までまたは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列をコードする核酸分子と、
ここで、前記野生型ＩＮＤ遺伝子は、野生型の機能的ＩＮＤタンパク質をコードする、
からなる群から選択される核酸分子を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、下記：
（ａ）位置３７０のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、
（ｂ）位置４３６のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、
（ｃ）位置４７６のｃが、ｔに置換されている配列番号１の核酸、
（ｄ）位置４２４のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、
（ｅ）位置４０７のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、および
（ｆ）位置４１５のｇが、ａに置換されている配列番号３の核酸
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
前記少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子のさらなる少なくとも１つの内在性アレルが、完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルであり、前記完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、塩基性ヘリックスループヘリックスドメインを欠く切断されたＩＮＤタンパク質の産生をもたらすか、またはコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の１０位のアルギニンが芳香族のヒスチジンに置換されているＩＮＤタンパク質の産生をもたらすか、またはＩＮＤタンパク質の産生をもたらさない突然変異を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物。
【請求項５】
前記完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、下記：
（ａ）位置３６４のｃが、ｔに置換されている配列番号１の核酸、
（ｂ）位置３０７および３８０のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、
（ｃ）位置１４８のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、および
（ｄ）位置４０３のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸
からなる群から選択される、請求項４に記載の植物。
【請求項６】
前記部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルにとってホモ接合である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物。
【請求項７】
莢が、１０〜８０秒の不規則衝撃加振試験における莢試料の半減期を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物。
【請求項８】
莢が、２０〜６０秒の不規則衝撃加振試験における莢試料の半減期を有する、請求項７に記載の植物。
【請求項９】
少なくとも１つのＩＮＤ遺伝子の内在性アレルが、野生型ＩＮＤ遺伝子の部分ノックアウト突然変異株アレルである、植物であって、
野生型ＩＮＤ遺伝子が、野生型の機能的ＩＮＤタンパク質をコードし、下記：
（ａ）配列番号１、配列番号３の４６位のヌクレオチドから６３３位のヌクレオチドまで、配列番号３、配列番号５または配列番号７との配列同一性が少なくとも９０％である核酸分子と、
（ｂ）配列番号２、配列番号４の１６位のアミノ酸から２１０位のアミノ酸までまたは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列をコードする核酸分子と、からなる群から選択される核酸分子を含み、
部分ノックアウト突然変異株アレルが、下記：
（ａ）配列番号２の位置１２４に相当する位置のバリンが、メチオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｂ）配列番号２の位置１４６に相当する位置のグリシンが、セリンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｃ）配列番号２の位置１５９に相当する位置のアラニンが、バリンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｄ）配列番号４の位置１４２に相当する位置のアルギニンが、システインに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号４の位置１３６に相当する位置のスレオニンが、メチオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、および
（ｆ）配列番号４の位置１３９に相当する位置のアラニンが、スレオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される、植物。
【請求項１０】
前記部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、下記：
（ａ）位置３７０のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、
（ｂ）位置４３６のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、
（ｃ）位置４７６のｃが、ｔに置換されている配列番号１の核酸、
（ｄ）位置４２４のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、
（ｅ）位置４０７のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、および
（ｆ）位置４１５のｇが、ａに置換されている配列番号３の核酸
からなる群から選択される、請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の植物から入手可能な種子莢。
【請求項１２】
野生型ＩＮＤ遺伝子が、野生型の機能的ＩＮＤタンパク質をコードし、下記：
（ａ）配列番号１、配列番号３の４６位のヌクレオチドから６３３位のヌクレオチドまで、配列番号３、配列番号５または配列番号７との配列同一性が少なくとも９０％である核酸分子と、
（ｂ）配列番号２、配列番号４の１６位のアミノ酸から２１０位のアミノ酸までまたは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列をコードする核酸分子と、からなる群から選択される核酸分子を含む、ＩＮＤ遺伝子の部分ノックアウト突然変異株アレルであって、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、下記：
（ａ）配列番号２の位置１２４に相当する位置のバリンが、メチオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｂ）配列番号２の位置１４６に相当する位置のグリシンが、セリンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｃ）配列番号２の位置１５９に相当する位置のアラニンが、バリンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｄ）配列番号４の位置１４２に相当する位置のアルギニンが、システインに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）配列番号４の位置１３６に相当する位置のスレオニンが、メチオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸、および
（ｆ）配列番号４の位置１３９に相当する位置のアラニンが、スレオニンに置換されているＩＮＤタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される核酸分子を含む、野生型ＩＮＤ遺伝子の部分ノックアウト突然変異株アレル。
【請求項１３】
下記：
（ａ）位置３７０のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、
（ｂ）位置４３６のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、
（ｃ）位置４７６のｃが、ｔに置換されている配列番号１の核酸、
（ｄ）位置４２４のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、
（ｅ）位置４０７のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、および
（ｆ）位置４１５のｇが、ａに置換されている配列番号３の核酸
からなる群から選択される、請求項１２に記載の部分ノックアウト突然変異株アレル。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の部分ノックアウト突然変異株アレルによってコードされる突然変異株ＩＮＤタンパク質。
【請求項１５】
請求項１２または１３に記載の少なくとも２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを１つの植物で組み合わせる方法であって、
（ａ）各々少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含む少なくとも２つの植物を同定するステップと、
（ｂ）前記少なくとも２つの植物を交雑させ、前記少なくとも１つの交雑種からＦ１ハイブリッド種子を採取するステップと、
（ｃ）任意に、少なくとも２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含むＦ１植物を同定するステップと、を含む、方法。
【請求項１６】
選択された前記突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断することで、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルにとってホモ接合またはヘテロ接合であるＦ１植物を同定するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを１つの植物から別の植物に移行するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含む第１の植物を同定するか、あるいは、請求項１５に従って少なくとも２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含む第１の植物を生成するステップと、
（ｂ）第１の植物を、前記少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含まない第２の植物と交雑させ、前記交雑種からＦ１種子を採取するステップと、
（ｃ）任意に、少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含むＦ１植物を同定するステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含むＦ１植物を、前記少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含まない第２の植物と、少なくとも１世代（ｘ）戻し交雑させ、前記交雑種からＢＣｘ種子を採取するステップと、
（ｅ）前記少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含む各世代のＢＣｘ植物で同定するステップと、を含む、方法。
【請求項１８】
部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断することで、前記部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルにとってホモ接合またはヘテロ接合であるＢＣｘ植物を同定するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１２または１３に記載の第１の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルをホモ接合状態で含む第１の植物と、請求項１２または１３に記載の第２の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルをホモ接合状態で含む第２の植物を、同定するステップと、
（ｂ）第１および第２の植物を交雑させ、交雑種からＦ１ハイブリッド種子を採取するステップと、を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のハイブリッドアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子または植物を生成するための方法。
【請求項２０】
第１および第２の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが同一である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の植物が第１の完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルをホモ接合状態でさらに含み、前記第２の植物が第２の完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルをホモ接合状態でさらに含み、前記完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、塩基性ヘリックスループヘリックスドメインを欠く切断されたＩＮＤタンパク質の産生をもたらすか、またはコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の１０位のアルギニンが芳香族のヒスチジンに置換されているＩＮＤタンパク質の産生をもたらすか、またはＩＮＤタンパク質の産生をもたらさない突然変異を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１および第２の完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが同一である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５７０で寄託され、位置３７０のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸を含む種子、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５７１で寄託され、位置４３６のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸を含む種子、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５７２で寄託され、位置４７６のｃが、ｔに置換されている配列番号１の核酸を含む種子、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５７５で寄託され、位置４２４のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸を含む種子、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５７３で寄託され、位置４０７のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸を含む種子、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５７４で寄託され、位置４１５のｇが、ａに置換されている配列番号３の核酸を含む種子、これらの誘導体からなる群から選択される部分ノックアウトｉｎｄアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の種子から得られる、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代。
【請求項２５】
請求項２３に記載の種子から生育させたアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の繁殖および／または育種によって得られる、位置３７０のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、位置４３６のｇが、ａに置換されている配列番号１の核酸、位置４７６のｃが、ｔに置換されている配列番号１の核酸、位置４２４のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、位置４０７のｃが、ｔに置換されている配列番号３の核酸、または位置４１５のｇが、ａに置換されている配列番号３の核酸を自らのゲノムに含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代。
【請求項２６】
１つの遺伝子座での少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子の２つの内在性アレルが、請求項１２または１３に記載の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルである、２つの遺伝子座に少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物。
【請求項２７】
前記２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルがホモ接合である、請求項２６に記載の植物。
【請求項２８】
突然変異株ＩＮＤアレルを含まない対応する植物によって産生される機能的ＩＮＤタンパク質の量と比較して少なくとも３０％減少した量の機能的ＩＮＤタンパク質を産生する、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の植物。
【請求項２９】
突然変異株ＩＮＤアレルを含まない対応する植物の種子収量に比して、植物の種子収量が高まる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の植物。
【請求項３０】
少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子の２つの突然変異ホモ接合ＩＮＤアレルを内在的に導入することを含む、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の収量を増すための方法。
【請求項３１】
請求項１〜１０または２６〜２９のいずれか一項に記載の植物の細胞、一部分、種子または後代。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は農業分野に関し、特に、分子生物学の技術を用いて、裂開種子植物、特にアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種を変化させるおよび／または当該裂開種子植物の育種を加速することに関する。特に、本発明は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物、特に種子生成用に生育されるアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物などの植物において脱粒を低減または脱粒を収穫後まで遅らせつつ、同時に莢の農学的に妥当な脱穀性を維持するための改善された方法および手段に関する。また、裂開種子植物の個体群における脱粒低減または脱粒遅延と関連した分子マーカーを同定する方法も得られる。さらに、収量、特に穀物および種子の収量を高めるための方法および手段も得られる。収量増加表現型が、種子脱粒低減表現型または種子脱粒遅延表現型と切り離されていてもよい。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の長角果または莢は、果実裂開と呼ばれるプロセスを介して種子を放出する。長角果は、縁辺と縁辺でつながった２枚の心皮からなる。縁辺間の縫線が隔膜と呼ばれる厚いリブを形成する。莢の成熟が近づくにつれて、２つの朔片が莢の決められた弱い線に沿って少しずつ隔膜から離れ、最終的には隔膜に結合した種子のシャッタリングが生じる。朔片が分離する厳密な位置を裂開ゾーンと定義する。
【０００３】
作物の収穫前または収穫時における成熟莢による種子の脱落（「種子脱粒」または「裂莢」とも呼ばれる）は、乾燥裂開果をつける作物に普遍的な現象である。未熟種子脱粒は種子の回収率を下げるが、これは搾油用アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にアブラナなど主に種子を取るために育てられている作物で問題となる。未熟な脱粒に関するもうひとつの問題として、翌穀物年度の自生成長の増加があげられる。アブラナでは、裂莢に伴う収量損失が平均２０％である（Ｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ  ４９：  ８２９〜８３８）が、天候状態次第では最大５０％に達することもある（ＭａｃＬｅｏｄ，  １９８１，  Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｏｉｌｓｅｅｄ  Ｒａｐｅ，  ｐｐ．  １０７〜１２０，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。
【０００４】
現在流通しているアブラナの変異体は、極めてシャッタリングしやすい。既存のセイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）育種プログラムにはシャッタリングに対する耐性についてのバリエーションはほとんどないが、セイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）の二倍体の親（キャベツ（Ｂ．  ｏｌｅｒａｃｅａ）およびカブ（Ｂ．  ｒａｐａ））ならびにアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の属に含まれる他のメンバ、特にカラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、アビシニアカラシ（Ｂ．  ｃａｒｉｎａｔａ）およびクロガラシ（Ｂ．  ｎｉｇｒａ）で、耐性系統が見つかっている。Ｋａｄｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６，  Ａｕｓｔ．  Ｊ．  Ｂｏｔａｎｙ  ３４  （５）：  ５９５〜６０１）は、長角朔片が隔膜に結合される領域に分離層がないことに関連したハクサイ（Ｂ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の特定の到達種におけるシャッタリングに対する耐性の高まりを報告している。Ｐｒａｋａｓｈ  ａｎｄ  Ｃｈｏｐｒａ  （１９８８，  Ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  １０１：  １６７〜１６８）は、非相同的な組換えによるカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）からのセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のシャッタリングに対する耐性の浸透性交雑について説明している。Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６，  Ｊ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  １８１：  １９５〜２０３）は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）の系統によってはセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）系統よりもシャッタリングの傾向が低減されることについて説明している。Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８  （Ｆｉｅｌｄｓ  Ｃｒｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８，  １５３〜１６５）は、合成セイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）から発育されたアブラナの系統間での耐裂莢性の遺伝的変異について説明し、莢を開くのに大きなエネルギが必要な系統では裂開ゾーンの脈管化も増し、裂開ゾーン内での細胞壁の崩壊が減るように見えたと結論付けている。さらに彼らは、莢のくちばしの長さと莢シャッタリングを引き起こすのに必要な力との間には有意な陰性相関があることも見出した。Ｃｈｉｌｄ  ａｎｄ  Ｈｕｔｔｌｙ  （１９９９，  Ｐｒｏｃ  １０ｔｈ  Ｉｎｔ．  Ｒａｐｅｓｅｅｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ）は、放射線誘発突然変異株セイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）およびその親品種であるＪｅｔ  Ｎｅｕｆの個体群での莢成熟のバリエーションについて説明しており、最も耐性のある野生型および突然変異株植物で裂開ゾーン全体にわたる細胞群の木化が多く認められ、突然変異株の裂開ゾーンの内縁の近くにある維管束の跡が、朔片を固定しておく助けになっていると説明されていた。Ｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔａｎｙ  ５４  （３８９）：  １９１９〜１９３０）はさらに、再合成したセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）系統の耐裂莢性の増大と莢の維管束構造の変化の関連性について説明している。しかしながら、従来の育種方法では、早期開花、成熟および黒脚病耐性などの他の望ましい特色に干渉せずにナタネ品種にシャッタリング耐性を導入することに成功していない（Ｐｒａｋａｓｈ  ａｎｄ  Ｃｈｏｐｒａ，  １９９０，  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：  １〜２）。
【０００５】
莢の裂開を促進または阻害するいくつかの遺伝子が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の突然変異解析で同定されている。ＳＨＡＴＴＥＲＰＲＯＯＦ１（ＳＨＰ１；初期にはＡＧＬ１と呼ばれた）とＳＨＡＴＴＥＲＰＲＯＯＦ２（ＳＨＰ２；初期にはＡＧＬ５と呼ばれた）の突然変異株の組み合わせで、非裂開長角果（すなわち、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の成熟時に閉じたままの長角果）が得られた（Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，  ７６６〜７７０）。同様に、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＩＮＤＥＨＩＳＣＥＮＴ遺伝子（ＩＮＤ１と呼ばれる）の突然変異株（Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｃｅｌｌ  １１６：  ８４３〜８５３；国際特許出願公開第ＷＯ０１／７９５１７号パンフレット）ならびにＡＬＣＡＴＲＡＺ（ＡＬＣと呼ばれる；Ｒａｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１，  １９１４〜１９２２）における突然変異株が莢の裂開に干渉し、耐裂莢性となった。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＳＨＰおよびＩＮＤのリプレッサーであるＦＲＵＩＴＦＵＬ（ＦＵＬ）の構成的発現でも、非裂開長角果が得られた（Ｆｅｒｒａｎｄｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８９，  ４３６〜４３８）。これらの転写因子は、朔片縁辺の独自性や裂莢を制御する非線形転写ネットワークを形成すると考えられている。Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，  Ｃｅｌｌ  １１６：  ８４３〜８５３）はさらに、ＩＮＤすなわち非定型塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）で朔片縁辺から分離層および木化層への分化を指令すると説明している。内果皮ｂ層（各朔片の単一の木化細胞層）に沿った分離層に近い木化細胞の層で、乾燥しつつある果実の中でばねのようなねじれが生じ、そのおかげで莢が開く。朔片内果皮ｂ層の木化には、朔片全体で発現されるＩＮＤ、ＳＨＰ、ＡＬＣおよびＦＵＬ、ＭＡＤＳ−ドメイン転写因子の活動が必要である（Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  上掲；  Ｍａｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ，  １９９５，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７，  １７６３〜１７７１）。ＦＵＬおよび隔膜ＬＥＳＳ（ＲＰＬ）すなわち隔膜で発現されるホメオドメイン転写因子（Ｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １３，  １６３０〜１６３５）は、朔片縁辺の同一性をもたらす遺伝子の境界を定めることが見出されている（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，  １５０９〜１５１７；Ｆｅｒｒａｎｄｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８９，  ４３６〜４３８；Ｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  上掲）。最後に、２つのＹＡＢＢＹファミリ転写因子であるＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＬＯＷＥＲ（ＦＩＬ）およびＹＡＢＢＹ３（ＹＡＢ３）（Ｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３，  １０７９〜１０８８；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，  ４１１７〜４１２８）およびＪＡＧＧＥＤ（ＪＡＧ）すなわちＣ２Ｈ２ジンクフィンガー転写因子（Ｄｉｎｎｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，  １１０１〜１１１０；Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，  １１１１〜１１２２）が、領域特異的にＦＵＬおよびＳＨＰの発現を促進することで、適切な朔片および朔片縁辺の発達に冗長的に寄与するとして同定された（Ｄｉｎｎｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２，  ４６８７−４６９６）。アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の莢におけるプログラムされた裂開ゾーンの破壊で莢の裂開時に何らかの役割を果たすエンドポリガラクツロナーゼなどの多数の加水分解性酵素の遺伝子も、同定されている（国際特許出願公開第ＷＯ９７／１３８６５号パンフレット；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ３１：５１７〜５２７などを参照のこと）。
【０００６】
Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４，  Ｃｅｌｌ  １１６：  ８４３〜８５３）は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤの５つの突然変異株アレルについて説明している。裂開ゾーンの木化細胞は、変異の重大性（重大なｉｎｄ突然変異株は野生型植物の朔片縁辺の内側部分に対応する領域に木化細胞を含まない）次第でこれらの突然変異株アレルを含む植物に存在しないか存在するかのいずれかであるが、どちらの場合も長角果は閉果である。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  Ｐｌａｎｔａ  ２２４，９７１〜９７９）は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤの６つの突然変異株アレルについて説明している。この突然変異株アレルを含む植物には、朔片縁辺と隔膜の結合部分に木化細胞が認められず、７層の細胞からなる領域に細胞が少ししかなく、野生型植物で一般に知られている裂開ゾーンおよび隔膜境界に含まれ、この層では細胞質分裂が不完全であるように見えた。
【０００７】
米国特許出願第２００５／０１２０４１７号明細書および同第２００７／０００６３３６号明細書には、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の２つのＩＮＤ１オルソログを同定および単離することについて記載されている。
【０００８】
国際特許出願公開第ＷＯ９９／００５０３号パンフレット、同第ＷＯ０１／７９５１７号パンフレット、同第ＷＯ０１５９１２２号パンフレットには、遺伝子サイレンシング技術（アンチセンスサプレッションまたはコサプレッションなど）ならびに突然変異誘発を用いて、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）  ＡＬＣ、ＩＮＤ、ＡＧＬ１およびＡＧＬ５遺伝子ならびにこれらのオルソログの発現を下方制御することについて記載されている。
【０００９】
Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２  （ＸＩＩＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｅｖｉｌｌａ，  Ｓｐａｉｎ  Ｊｕｎｅ  ２８−Ｊｕｌｙ  ２；  ２００２）には、アブラナのＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下におけるシロイヌナズナ（Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＦＵＬの発現によって、多数の耐裂莢性形質転換体が得られたことが報告されていた。このような裂莢耐性系統の莢には裂開ゾーンがなく、相当な圧力を印加することで朔片を無作為に破断させたときにだけ莢を開くことができた。
【００１０】
Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２  （ＸＩＩＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｅｖｉｌｌａ，  Ｓｐａｉｎ  Ｊｕｎｅ  ２８−Ｊｕｌｙ  ２；  ２００２）には、いわゆるｄｓＲＮＡサイレンシング技術を用いるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＩＮＤ遺伝子のサイレンシングによって、ほぼ完全な耐裂莢性が得られることも報告されていた。トランスジェニックシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）系統の９８パーセントで長角果が発育したが、これは朔片縫線に沿っては開かず、朔片に相当な圧力を印加することによってのみ開くことができた。
【００１１】
アブラナの栽培では脱粒が重要な問題となるが、これは耐裂莢性系統を開発することで解決でき、究極的には、莢からの種子の分離が依然として求められる状態を実現することが重要である。通常の農業実務では、これはコンバインハーベスタによる莢の脱穀によって達成されている。コンバインハーベスタによる莢の脱穀は完全でなければならず、これによって放出される種子への損傷が最小限のものでなければならない。しかしながら、莢の強度が増すにつれて、その脱穀に必要なさらに激しい作用によって、種子に許容できないレベルの損傷が生じる。このため、耐裂莢性アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物の莢は、コンバインハーベスタで脱穀できないほど強いものであってはならない（Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｅｎｇｎｇ  Ｒｅｓ．  ８０，  ３４３〜３５０）。
【００１２】
国際特許出願公開第ＷＯ２００４／１１３５４２号パンフレットには、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物の莢の裂開ゾーンおよび朔片縁辺の発達に関与する遺伝子の適度なｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングによって、耐裂莢性が高まり脱粒性が低くなったトランスジェニック系統を単離できるが、その莢は限られた物理的な力が加わることで依然として裂開ゾーンに沿って開いてしまうことがある旨が記載されている。
【００１３】
国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）には、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含み、かつ３つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを自らのゲノムに含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物であって、当該植物の耐裂莢性が突然変異株ＩＮＤアレルを含まない植物の耐裂莢性に比して有意に高くなっているが、当該植物が好ましくは莢の農学的に妥当な脱穀性を維持する植物が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
異なる実施形態、実施例、特許請求の範囲にて以下に述べる本発明は、裂開種子植物の裂開特性を調節するためのさらに改善された方法および手段を提供するものである。特に、本発明は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物、特に種子生成用に生育されるアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物などの植物において脱粒を低減または脱粒を収穫後まで遅らせつつ、同時に莢の農学的に妥当な脱穀性を維持するためのさらに改善された方法および手段について説明するものである。特に、本出願は、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含み、２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを自らのゲノムに含むか、あるいは２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルおよび２つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物であって、当該植物の耐裂莢性が突然変異株ＩＮＤアレルを含まない植物の耐裂莢性に比して有意に高くなっているが、当該植物が好ましくは莢の農学的に妥当な脱穀性を維持する植物を開示するものである。また、収量、特に穀物および種子の収量を高めるための方法および手段も得られる。収量増加表現型が、種子脱粒低減表現型または種子脱粒遅延表現型表現型と切り離されていてもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、次のことを見出した。３つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを組み合わせるのではなく、２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを組み合わせる（２つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルの有無を問わない）ことで、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されたアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物に似た裂莢表現型を有するセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物すなわち、耐裂莢性の増大と莢の農学的に妥当な脱穀性との組み合わせを得ることも可能である。
【００１６】
よって、第１の態様では、本発明は、自らのゲノムに少なくとも２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含むことを特徴とする、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代を提供するものである。一実施形態では、ＩＮＤ遺伝子がＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子である。もうひとつの実施形態では、ＩＮＤ遺伝子が、配列番号１、配列番号３の４６位のヌクレオチドから６３３位のヌクレオチドまで、配列番号３、配列番号５または配列番号７に対する配列同一性が少なくとも９０％である核酸分子と、配列番号２、配列番号４の１６位のアミノ酸から２１位のアミノ酸までまたは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列をコードする核酸分子と、からなる群から選択される核酸分子を含む。別の実施形態では、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルがＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の突然変異株ＩＮＤアレルである。さらに別の実施形態では、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０６、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０９、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０８、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、植物が、自らのゲノムに少なくとも１つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルをさらに含む。さらに別の実施形態では、完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の突然変異株ＩＮＤアレルである。もうひとつの実施形態では、完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０１、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０５、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０１、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０３からなる群から選択される。さらにもうひとつの実施形態では、植物が、部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルにとってホモ接合である。さらにもうひとつの実施形態では、植物が、突然変異株ＩＮＤアレルを含まない対応する植物によって産生される機能的ＩＮＤタンパク質の量と比較して有意に低減された量の機能的ＩＮＤタンパク質を産生する。別の実施形態では、植物の脱粒が、突然変異株ＩＮＤアレルを含まない対応する植物の脱粒と比較して有意に低減または遅延される。なお一層別の実施形態では、植物が、莢の農学的に妥当な脱穀性を維持する。さらにもうひとつの実施形態では、植物が、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種、好ましくはセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、アビシニアカラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）またはキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来の植物である。さらにもうひとつの実施形態では、植物が、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）油糧種子種、好ましくはセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）またはカブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）由来の植物である。
【００１７】
もうひとつの態様では、本発明は、ＩＮＤ遺伝子が、配列番号１、配列番号３の４６位のヌクレオチドから６３３位のヌクレオチドまで、配列番号３、配列番号５または配列番号７との配列同一性が少なくとも９０％である核酸分子と、配列番号２、配列番号４の１６位のアミノ酸から２１位のアミノ酸までまたは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列をコードする核酸分子と、からなる群から選択される核酸分子を含む、自らのゲノムにＩＮＤ遺伝子の少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株アレルを含む植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代を提供するものである。一実施形態では、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０６、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０９、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０８、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９からなる群から選択される。もうひとつの実施形態では、突然変異株ＩＮＤアレルが、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種の植物由来である。さらにもうひとつの実施形態では、植物がアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種由来の植物である。
【００１８】
別の態様では、本発明の植物から入手可能な種子莢が得られる。
【００１９】
さらに別の態様では、ＩＮＤ遺伝子が、配列番号１、配列番号３の４６位のヌクレオチドから６３３位のヌクレオチドまで、配列番号３、配列番号５または配列番号７との配列同一性が少なくとも９０％である核酸分子と、配列番号２、配列番号４の１６位のアミノ酸から２１位のアミノ酸までまたは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列をコードする核酸分子と、からなる群から選択される核酸分子を含む、ＩＮＤ遺伝子の部分ノックアウト突然変異株アレルが得られる。一実施形態では、突然変異株アレルが、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０６、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０９、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０８、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９からなる群から選択される。もうひとつの実施形態では、突然変異株アレルが、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種の植物、好ましくはアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種またはアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）油糧種子種由来である。さらに別の態様では、本発明の突然変異株ＩＮＤアレルによってコードされる突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。
【００２０】
さらに別の態様では、生体試料に存在する核酸における突然変異株ＩＮＤ特異的領域の存在を判断することを含む、生体試料において本発明による突然変異株ＩＮＤアレルを同定するための方法が得られる。一実施形態では、この方法は、一組の少なくとも２つのプライマーを用いて生体試料でポリメラーゼ連鎖反応アッセイを実施することをさらに含み、前記組が、一組のプライマーであって、前記プライマーの一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方が突然変異株ＩＮＤアレルの３’フランキング領域を特異的に認識する、一組のプライマーと、一組のプライマーであって、前記プライマーの一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方が突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識する、一組のプライマーと、一組のプライマーであって、前記プライマーの一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方が突然変異株ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識する、一組のプライマーと、からなる群から選択される。もうひとつの実施形態では、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプライマーが、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらの相補体から選択される１７〜２００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるか、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプライマーが、突然変異株ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらの相補体から選択される１７〜２００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるか、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプライマーが、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列あるいはそれらの相補体から選択される１７〜２００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるものであり、前記１７〜２００の連続したヌクレオチドが、変異配列またはフランキング配列のいずれか一方だけから誘導されるものではない。さらに別の実施形態では、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプライマーが、その３’最末端に、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらの相補体から選択される少なくとも１７の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプライマーが、その３’最末端に、突然変異株ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらの相補体から選択される少なくとも１７の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプライマーが、その３’最末端に、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列あるいはそれらの相補体から選択される少なくとも１７の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、前記３’に位置する１７の連続したヌクレオチドが、変異配列またはフランキング配列のいずれか一方だけから誘導されるものではない。さらに別の実施形態では、この方法は、少なくとも１つの特異的プローブを含む一組の特異的プローブを用いて生体試料でハイブリダイゼーションアッセイを実施することをさらに含み、前記組が、一組の特異的プローブであって、前記プローブの一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他方が突然変異株ＩＮＤアレルの３’フランキング領域を特異的に認識する、一組の特異的プローブと、一組の特異的プローブであって、前記プローブの一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他方が突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識する、一組の特異的プローブと、一組の特異的プローブであって、前記プローブの一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識し、前記プローブの他方が突然変異株ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する、一組の特異的プローブと、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する特異的プローブと、からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらの相補体からそれぞれ選択される１３〜１０００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列あるいは、それとの配列同一性が少なくとも８０％である配列からなるか、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらの相補体から選択される１３〜１０００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列あるいは、それとの配列同一性が少なくとも８０％である配列からなるか、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列あるいはそれらの相補体からそれぞれ選択される１３〜１０００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるものであり、前記１３〜１０００の連続したヌクレオチドが、変異配列またはフランキング配列のいずれか一方、あるいはそれとの配列同一性が少なくとも８０％である配列だけから誘導されるものではない。特定の実施形態では、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１３の連続したヌクレオチドが、変異配列またはフランキング配列のいずれか一方だけから誘導されるものではない。もうひとつの特定の実施形態では、５’または３’フランキング領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９２９または９３１〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、前記変異領域が、配列番号５のヌクレオチド９３０またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９３０または９３０〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９９５または９９７〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、前記変異領域が、配列番号５のヌクレオチド９９６またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９９６または９９６〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜１０３５または１０３７〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、前記変異領域が、配列番号５のヌクレオチド１０３６またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜１０３６または１０３６〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９０２または９０４〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、前記変異領域が、配列番号７のヌクレオチド９０３またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９０３または９０３〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９１０または９１２〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、前記変異領域が、配列番号７のヌクレオチド９１１またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９１１または９１１〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９１９または９２１〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、前記変異領域が、配列番号７のヌクレオチド９２０またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９２０または９２０〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含む。さらにもうひとつの特定の実施形態では、一組のプローブが、配列番号１１の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号１２の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号１４の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号１５の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号１７の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号１８の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号２０の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号２１の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号２３の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号２４の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号２６の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号２７の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、からなる群から選択される。
【００２１】
さらに別の態様では、植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代において本発明による突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するための方法であって、前記植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代のゲノムＤＮＡにおける突然変異株および／または対応する野生型ＩＮＤ特異的領域の存在を判断することを含む、方法が得られる。一実施形態では、この方法は、一組の少なくとも２つまたは少なくとも３つのプライマーを用いて前記植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代のゲノムＤＮＡで、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを実施することを含む方法であって、前記プライマーの少なくとも２つが野生型ＩＮＤアレルを特異的に認識し、前記少なくとも２つのプライマーが、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域をそれぞれ特異的に認識する第１のプライマーと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域を特異的に認識する第２のプライマーと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプライマーと、野生型ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識する第２のプライマーと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプライマーと、野生型ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識する第２のプライマーと、からなる群から選択され、前記プライマーの少なくとも２つが、突然変異株ＩＮＤアレルを特異的に認識し、前記少なくとも２つのプライマーが、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプライマーと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域をそれぞれ特異的に認識する第２のプライマーと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプライマーと、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識する第３のプライマーと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプライマーと、突然変異株ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識する第３のプライマーと、からなる群から選択される。別の実施形態では、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプライマーが、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される１７〜２００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプライマーが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される１７〜２００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプライマーが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される１７〜２００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなり、前記１７〜２００の連続したヌクレオチドが、変異領域またはフランキング配列のいずれか一方だけから誘導されるものではない。さらに別の実施形態では、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプライマーが、その３’最末端に、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される１７の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプライマーが、その３’最末端に、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される１７の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプライマーが、その３’最末端に、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域にある配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される１７の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、前記３’に位置する１７の連続したヌクレオチドが、変異部位あるいは変異領域またはフランキング配列のいずれか一方だけから誘導されるものではない。さらに別の実施形態では、この方法は、一組の少なくとも２つの特異的プローブを用いて前記植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代のゲノムＤＮＡでハイブリダイゼーションアッセイを実施することをさらに含み、前記特異的プローブの少なくとも１つが野生型ＩＮＤアレルを特異的に認識し、前記少なくとも１つのプローブが、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプローブと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの３’および５’フランキング領域をそれぞれ特異的に認識する第２のプローブと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプローブと、野生型ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識する第２のプローブと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプローブと、野生型ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識する第２のプローブと、野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブと、からなる群から選択され、前記特異的プローブの少なくとも１つが、突然変異株ＩＮＤアレルを特異的に認識し、前記少なくとも１つのプローブが、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域をそれぞれ特異的に認識する第１のプローブと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域を特異的に認識する第２のプローブと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプローブと、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識する第３のプローブと、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプローブと、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第３のプローブと、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブと、からなる群から選択される。特定の実施形態では、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらそれぞれの相補体あるいは、それとの配列同一性が少なくとも８０％である配列から選択される１３〜１０００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異領域の配列それぞれ、あるいは、それとの配列同一性が少なくとも８０％である配列から選択される１３〜１０００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列それぞれ、あるいは、それとの配列同一性が少なくとも８０％である配列から選択される１３〜１０００の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなり、前記１３〜１０００の連続したヌクレオチドが、変異部位あるいは変異領域またはフランキング配列のいずれか一方だけから誘導されるものではない。もうひとつの特定の実施形態では、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらの相補体から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むか、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブが、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列あるいはそれらそれぞれの相補体から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１３の連続したヌクレオチドが、変異配列またはフランキング配列のいずれか一方だけから誘導されるものではない。別の特定の実施形態では、５’または３’フランキング領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９２９または９３１〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を有し、野生型ＩＮＤアレルの前記変異領域が配列番号５のヌクレオチド９３０またはその相補体のヌクレオチド配列を含み、突然変異株ＩＮＤアレルの前記変異領域が、配列ａまたはその相補体を有し、野生型ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９３０または９３０〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、突然変異株ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９２９にａが続くヌクレオチド配列またはａに配列番号５のヌクレオチド９３１〜１６２２が続くヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９９５または９９７〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、野生型ＩＮＤアレルの前記変異領域が、配列番号５のヌクレオチド９９６またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、突然変異株ＩＮＤアレルの前記変異領域が、配列ａまたはその相補体を有し、野生型ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９９６または９９６〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、突然変異株ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜９９５にａが続くヌクレオチド配列またはａに配列番号５のヌクレオチド９９７〜１６２２が続くヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜１０３５または１０３７〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、野生型ＩＮＤアレルの前記変異領域が配列番号５のヌクレオチド１０３６またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、突然変異株ＩＮＤアレルの前記変異領域が配列ｔまたはその相補体を有し、野生型ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜１０３６または１０３６〜１６２２あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、突然変異株ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号５のヌクレオチド１〜１０３５にｔが続くヌクレオチド配列またはｔに配列番号５のヌクレオチド１０３７〜１６２２が続くヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９０２または９０４〜１５９３あるいはそれら
それぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、野生型ＩＮＤアレルの前記変異領域が、配列番号７のヌクレオチド９０３またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、突然変異株ＩＮＤアレルの前記変異領域が、配列ｔまたはその相補体を有し、野生型ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９０３または９０３〜１５９３のヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含み、突然変異株ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９０２にｔが続くヌクレオチド配列またはｔに配列番号７のヌクレオチド９０４〜１５９３が続くヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９１０または９１２〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、野生型ＩＮＤアレルの前記変異領域が、配列番号７のヌクレオチド９１１またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、突然変異株ＩＮＤアレルの前記変異領域が、配列ａまたはその相補体を有し、野生型ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９１１または９１１〜１５９３のヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含み、突然変異株ＩＮＤアレルの前記連結領域が配列番号７のヌクレオチド１〜９１０にａが続くヌクレオチド配列またはａに配列番号７のヌクレオチド９１２〜１５９３が続くヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含むか、５’または３’フランキング領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９１９または９２１〜１５９３あるいはそれらそれぞれの相補体のヌクレオチド配列を含み、野生型ＩＮＤアレルの前記変異領域が配列番号７のヌクレオチド９２０またはその相補体のヌクレオチド配列を有し、突然変異株ＩＮＤアレルの前記変異領域が配列ｔまたはその相補体を有し、野生型ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９２０または９２０〜１５９３のヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含み、突然変異株ＩＮＤアレルの前記連結領域が、配列番号７のヌクレオチド１〜９１９にｔが続くヌクレオチド配列またはｔに配列番号７のヌクレオチド９２１〜１５９３が続くヌクレオチド配列あるいはそれらそれぞれの相補体を含む。特定の実施形態では、少なくとも３つの特異的プローブの前記組が、配列番号１１の配列を含む１つのプローブ、配列番号１２の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号１３の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号１４の配列を含む１つのプローブ、配列番号１５の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号１６の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号１７の配列を含む１つのプローブ、配列番号１８の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号１９の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号２０の配列を含む１つのプローブ、配列番号２１の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号２２の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号２３の配列を含む１つのプローブ、配列番号２４の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号２５の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、配列番号２６の配列を含む１つのプローブ、配列番号２７の配列を含む１つのプローブおよび／または配列番号２８の配列を含む１つのプローブを含む一組のプローブと、からなる群から選択される。
【００２２】
生体試料において本発明による突然変異株ＩＮＤアレルを同定するためのキットであって、上述したようなプライマーまたはプローブを含む植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代において本発明による突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するためのキットも得られ、さらに本発明による突然変異株ＩＮＤアレルを１つの植物で組み合わせるための方法、本発明による突然変異株ＩＮＤアレルを１つの植物から別の植物に移行させるための方法、本発明による植物または種子を生成（ハイブリダイズ）する方法も得られる。
【００２３】
本発明のもうひとつの実施形態では、本発明の突然変異株ＩＮＤアレルは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の収穫される種子または穀物の収量を高めるために用いられる。収量が増すのは、脱粒が低減または遅延した結果かもしれないが、種子の脱粒の低減または遅延とは独立している可能性もある。特に、これらの植物が、本明細書に記載したような２つの突然変異株ホモ接合ＩＮＤアレルを自らのゲノムに含むことを特徴とする、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物あるいは、その細胞、一部分、種子または後代が得られる。
【００２４】
一般的定義
「耐裂莢性を高める」および「脱粒の低減」とは、本明細書で使用する場合、果実が通常は同時期に成熟せず順次成熟するため、収穫前や収穫時にいくつかの莢が開いて種子を脱粒するアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の種子脱粒傾向を低下させること、および／または脱粒タイミングを特に収穫後まで遅延させることを示す。裂莢に対する耐性レベルは、「引張分離試験」で莢を破るのに必要な力（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ，  １９９７，  Ｊ  Ｍａｔ  Ｓｃｉ  ３２：  ５８９５〜５８９９；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｃｒｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８，  １５３−１６５）、「不規則衝撃加振試験」で２０秒間経過した後に無傷の莢の数（「ＩＰ２０」；  Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  上掲）、９．７秒間または１７秒間など経過した後に無傷の莢の数（Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｎｇ  ８１（２）：  １７９−１８４）、不規則衝撃加振試験での莢試料半減期（以下、「ＬＤ５０」とも呼ぶ）すなわち被験莢試料で５０％の莢を開かせるのに必要な処理時間、「シャッタリングの圃場スコア」（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  上掲）を判断することなどで測定可能であり、これらと陽性相関している。不規則衝撃加振試験（ＲＩＴ）および当該ＲＩＴで莢試料の半減期を規定するためのアルゴリズムについては、Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２  （上掲）、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８  （上掲）ならびに以下の実施例に記載されている。これらの刊行物を両方とも参照により本明細書に援用する。簡単に説明すると、無傷の成熟莢の試料を鋼球と一緒に閉じたドラムに入れ、ドラムを時間をのばしながら（１０秒間、２０秒間、４０秒間、８０秒間など）強く振盪攪拌する。それぞれの時間経過後、ドラムを開いて破れたり損傷を受けたりした莢を数える。線形×線形曲線を得られたすべてのデータにフィットさせ、試料内の莢の半分が破れるまでの時間（「莢試料半減期」または「ＬＤ５０」）を推定することで、各系統のシャッタリング耐性レベルの最も正確な推定値を計算する。しかしながら、莢は主に裂開ゾーンに沿って開くため、非裂開莢で生じるような単純に粉砕された状態になるわけではない点は重要である。
【００２５】
「農学的に妥当な耐裂莢性の増大」とは、本明細書で使用する場合、裂莢に伴う収量の損失が、圃場でその植物に通常観察されるよりも低い結果となる、圃場（収穫前）の植物での耐裂莢性の増大を示す。アブラナでは、圃場での裂莢に伴う収量の損失は、成長条件が良好な時期で平均約１１％、成長条件の悪い時期には平均で約２５％であると報告されている。Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２  （Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｎｇ  ８１（２）：  １７９〜１８４）に記載されているような不規則衝撃加振試験では、これらの種子損失レベルと、９．７秒間および１７秒間の処置した時点での種子損失レベルとの間には、それぞれ陽性相関が認められる。あるいは、植物での裂莢に対する耐性レベルが農学的に妥当か否かを判断するために、植物の莢試料半減期（「ＬＤ５０」、上記参照）を、アブラナであれば、現在市販されているすべてのアブラナ変種など、耐裂莢性が平均レベルであることがわかっている植物の莢試料半減期と比較することが可能である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「裂莢または脱粒」または「果実または莢の裂開」とは、種子が成熟した後に果実で生じるプロセスを示し、それによって朔片が中央の隔壁から離れて種子を蒔くことになる。破れる領域（すなわち「裂開ゾーン」）は朔片と隔膜（外側の隔壁）の間で果実の長さ全体におよぶ。成熟時、「裂開ゾーン」は本質的に朔片の木化細胞の領域と隔膜との間の非木化層の細胞である。裂開ゾーンでの細胞壁のゆるみと、長角果の乾燥しつつある細胞の機械的特性の差がゆえに生じる張力とがあいまって、シャッタリングが生じる。
【００２７】
アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の「果実」とは、本明細書で使用する場合、融合心皮からなる雌しべから発達するアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の器官を示し、受精時に成長して発達する種子の入った「（種子）莢」または「長角果」になる。アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の「（種子）莢」または「長角果」は、隔壁によって隔てられた２つの子房室を囲む果皮（心皮）からなる。「裂開ゾーン」は、隔壁に隣接した心皮縁辺で発達し、長角果の長さ全体におよぶ。裂開ゾーンの細胞は最終的に劣化しはじめ、それによって心皮壁または朔片と隔壁との密着が弱くなる。細胞の接着性が失われるのは裂開ゾーンの細胞にかぎられており、中ほどのラメラが破壊される（Ｍｅａｋｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９９０，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ  ４１，  ９９５〜１０１１）。
【００２８】
「裂開ゾーン」とは、本明細書で使用する場合、二朔片莢植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の両側にある縫線に含まれる単純な、柔組織細胞の層を示す。裂開ゾーンは、莢朔片の縁と、柄または小花柄への主な維管束を含む中央の隔膜との間にある。裂開ゾーンでの細胞の解離は莢の老化時に発生し、莢が完全に成熟するまでに終わる（Ｍｅａｋｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９９０，上掲）。その後、朔片を分離できるようになる。裂開ゾーンには莢壁から小花柄（柄）および隔膜まで走っている維管束の跡がある。朔片を分離させて種子を地面に落とせるように、裂莢のプロセスは外からの力によってデリケートな維管束の筋を破壊した後にしか起こらない。これは、収穫時にコンバインと接触するなどしてキャノピーが乱れたときに生じる。維管束組織には、厚くて木化した細胞が含まれており、これが誘導組織細胞に隣接して見られる細胞の厚角細胞群を形成する（Ｍｅａｋｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９９０，上掲）。これによって組織に捩り剛性が生まれ、おそらくは、破損に対するいくらかの耐性も生じる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「農学的に妥当な脱穀性」とは、コンバインハーベスタで用いられているような、種子への損傷は防ぎつつ莢を完全に開けるほどの物理的な力が加わると、莢が裂開ゾーンに沿って開いて種子が放出されてしまうことに対する莢、特にアブラナ莢の耐性を示す。不規則衝撃加振試験における莢試料の半減期（「ＬＤ５０」）とその脱穀性との間には陽性相関が認められた。農学的に妥当な脱穀性に対応するアブラナ莢試料の半減期は、実施例で説明するようにして実施したＲＩＴで判断した場合に８０秒を超えないようにする。市販のアブラナ変種での対照系統の一般的な試料半減期の値は約１０秒である。よって、農学的に妥当な脱穀性を持ち、耐裂莢性が有意に高められた系統は、ＲＩＴでの莢試料半減期が約１０〜約８０秒、約１０〜約７０秒、約１５〜約７０秒、約１０〜約６０秒、約１０〜約５０秒、約２０〜約６０秒、約２０〜約５０秒、約４０〜約６０秒、約５７秒となる。
【００３０】
「裂開種子植物」は、開いて中にある種子を放出できる果皮を持つ乾燥裂開果をつける植物を意味する。裂開果には通常、複数個の種子が入っており、マメ科植物、朔果、長角果などとして知られる果実を含む。
【００３１】
「作物植物」とは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、アビシニアカラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）（ｓｙｎ．タアサイ（Ｂ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））（ＡＡ、２ｎ＝２０）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ＣＣ、２ｎ＝１８）またはクロガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）（ＢＢ、２ｎ＝１６）などの作物として栽培される植物種を示す。この定義には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）などの雑草は含まない。
【００３２】
「核酸配列」（または核酸分子）という用語は、一本鎖または二本鎖形態のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、特に本発明によるタンパク質またはタンパク質断片をコードするＤＮＡを示す。「内在性核酸配列」とは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞の核ゲノム内に存在するＩＮＤ遺伝子の内在性アレルなど植物細胞内の核酸配列を示す。「単離された核酸配列」は、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え細菌または植物宿主細胞などの天然の環境にはない核酸配列を示すのに用いられる。
【００３３】
「遺伝子」という用語は、調節領域（プロモーターなど）と作動的に連結された細胞のＲＮＡ分子に（イントロン配列を含むｐｒｅ−ｍＲＮＡ（後でスプライスして成熟ｍＲＮＡにする）あるいは、イントロン配列なしで直接ｍＲＮＡに）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を意味する。遺伝子は、プロモーター、翻訳開始に関与する配列などを含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、転写終端部位などを含む３’非翻訳配列など、いくつかの作動的に結合された配列を含むものであってもよい。「内在性遺伝子」は、「外来遺伝子」、「導入遺伝子」または「キメラ遺伝子」と区別するために用いられ、特定の植物属、種または変種の植物由来の（変換でその植物に導入されていない（すなわち「導入遺伝子」されていない））が、通常はその属、種または変種の植物に存在するか、あるいは、通常はそれが存在する別の植物属、種または変種の植物から、通常の育種技術または超音波ハイブリダイゼーション、たとえばプロトプラスト融合などによってその植物に導入された遺伝子を示す。同様に、遺伝子の「内在性アレル」は、植物変換によっては植物または植物組織に導入されていないが、たとえば、植物の突然変異誘発および／または選択によって生成または植物の天然個体群をスクリーニングして得られる。
【００３４】
「遺伝子の発現」または「遺伝子発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに対して作動的に結合されたＤＮＡ領域を、ＲＮＡ分子に転写するプロセスを示す。次に、ＲＮＡスプライシングや翻訳開始およびアミノ酸鎖（タンパク質）への翻訳、翻訳停止コドンによる翻訳終端などで、ＲＮＡ分子が細胞内でさらに処理される（転写後プロセスによる）。「機能的に発現」という表現は、本明細書で使用する場合、機能的タンパク質を産生させることを示す；「機能的に発現させない」という表現は、機能性（生物活性）が有意に低減したかまったくないタンパク質を産生するか、タンパク質が産生されない（下記をさらに参照のこと）ことを示す。
【００３５】
「タンパク質」という用語は、特定の作用機構、サイズ、３次元構造または起源に言及することなく、アミノ酸の鎖からなる分子を示す。よって、ＩＮＤタンパク質の「断片」または「一部」も、「タンパク質」と呼ぶことができる。「単離されたタンパク質」とは、その天然の環境にはない、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え細菌または植物宿主細胞にあるタンパク質を示す意図で用いる。「アミノ酸」は、タンパク質および酵素の主要なビルディングブロックである。アミノ酸はトランスファーＲＮＡによって遺伝コードどおりにタンパク質に取り込まれるが、メッセンジャーＲＮＡはリボソームによってデコードされる。タンパク質の最終アセンブリの途中と終了後には、アミノ酸含有量がタンパク質または酵素の空間的および生化学的特性を示す。アミノ酸骨格がタンパク質の一次配列を決めるが、タンパク質の特性は側鎖の性質によって決まる。「類似のアミノ酸」とは、本明細書で使用する場合、類似のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸、すなわち、極性、非極性または実用上は中性の側鎖を有するアミノ酸を示す。「非類似のアミノ酸」とは、本明細書で使用する場合、たとえば、非極性側鎖を有するアミノ酸とは極性側鎖が似ていないアミノ酸など、異なるアミノ酸側鎖を有するアミノ酸を示す。極性側鎖は通常、細胞にみられる水性環境との間で相互作用できるタンパク質の表面に存在することが多い（「親水性」アミノ酸）。他方、「非極性」アミノ酸は、類似の非極性隣接物質と相互作用できるタンパク質内の中心付近にあることが多い（「疎水性」アミノ酸」）。極性側鎖を有するアミノ酸の例としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、システイン、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リシン、セリン、トレオニン（疎水性であるシステイン以外はいずれも親水性）があげられる。非極性側鎖を有するアミノ酸の例としては、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン（中性のグリシン以外はいずれも疎水性）があげられる。
【００３６】
「転写因子」という用語は、一緒に作用して標的遺伝子プロモーターからの転写開始速度を調節する少なくとも２つの離散的なドメインすなわち、ＤＮＡ結合ドメインと活性化または抑制ドメインとからなるタンパク質を示す意図で用いられる（Ｐｔａｓｈｎｅ，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  ６８３〜６８９）。「塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ドメイン転写因子」という表現は、ｂＨＬＨ  ＤＮＡ結合ドメイン（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０，  ７３５〜７４７；Ｔｏｌｅｄｏ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５，  １７４９〜１７７０）すなわち、異なる種由来の関連のタンパク質においてアミノ酸レベルで保存できる遺伝子発現の調節に重要であることが知られているドメイン（Ｑｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３，  ７９２〜８００）を含み、これとは別の転写因子を示す意図で用いられる。ｂＨＬＨドメインを含む転写調節因子は、塩基性領域の残基によってＤＮＡと結合するのに対し、ヘリックスループヘリックスドメインは二量体化を促進し、ファミリのメンバがヘテロ二量体またはホモ二量体を形成できるようにする（Ｍｕｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｅｌｌ  ５６，  ７７７〜７８３）。
【００３７】
「ＩＮＤ遺伝子」という用語は、本明細書では、種子の分散に必要な塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ドメイン転写因子である、ＩＮＤＥＨＩＳＣＥＮＴ（ＩＮＤ）タンパク質をコードする核酸配列を示す（Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｃｅｌｌ  １１６：  ８４３〜８５３）。
【００３８】
本明細書で使用する場合、単数または複数の「アレル」という用語は、特定の遺伝子座における１つ以上の別の形態の遺伝子のいずれかを意味する。生物体の二倍体（または複二倍体）細胞において、特定遺伝子のアレルは染色体上の特定の場所または遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）（複数形は遺伝子座（ｌｏｃｉ））に存在する。一対の相同的な染色体の各染色体に１つのアレルが存在する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「相同的な染色体」という用語は、同一の生物学的特徴についての情報を含み、同一の遺伝子座に同一の遺伝子を含むが、おそらくはこれらの遺伝子のアレルが異なる染色体を意味する。相同的な染色体は、減数分裂時に対合する染色体である。生物体のすべての生物学的特徴を表す「非相同的な染色体」は組を形成し、細胞内の組の数が倍数性と呼ばれる。二倍体の生物体は、２組の非相同的な染色体を持ち、各々の相同的な染色体が異なる親から継承される。複二倍体の種では、本質的に２組の二倍体ゲノムが存在し、２つのゲノムの染色体が「相同染色体」と呼ばれる（また、同様に、２つのゲノムの遺伝子座または遺伝子も相同遺伝子座または遺伝子と呼ばれる）。二倍体または複二倍体の植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なるアレルを含むことがある。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ヘテロ接合」という用語は、２つの異なるアレルが特定の遺伝子座にあるが、細胞における相同的な染色体の対応する対で個々に位置する遺伝子状態を意味する。逆に、本明細書で使用する場合、「ホモ接合」という用語は、２つの同じアレルが特定の遺伝子座にあるが、細胞における相同的な染色体の対応する対で個々に位置する遺伝子状態を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子座」という用語（複数形はｌｏｃｉ）は、たとえば遺伝子または遺伝子マーカーが見つかる染色体上の特定の場所または部位を意味する。たとえば、「ＩＮＤ−Ａ１遺伝子座」は、Ａゲノムの染色体上でＩＮＤ−Ａ１遺伝子（および２つのＩＮＤ−Ａ１アレル）を見つけられる位置を示し、「ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子座」はＣゲノムの染色体上でＩＮＤ−Ｃ１遺伝子（および２つのＩＮＤ−Ｃ１アレル）を見つけられる位置を示す。
【００４２】
本発明による単数または複数の「植物」について言及する場合は常に、特に明記しないかぎり、植物の一部（細胞、組織または器官、種子莢、種子、根や葉、花、花粉といった分離された部分など）、ハイブリッド種子（２つの近交親系統を交雑させて得られる）、ハイブリッド植物および植物の一部といった自家受粉または交雑によって得られた種子などの親が持っていた区別できる特徴（特に果実裂開特性）が残っている植物の後代、これらに由来するものなども本明細書に包含されることは理解できよう。
【００４３】
「分子アッセイ」（または試験）とは、本明細書では、一方または両方のＩＮＤ遺伝子座（ＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子座の一方または両方など）で１つ以上の特定のＩＮＤアレルの存在または非存在を（直接的にまたは関接的に）示すアッセイを示す。一実施形態では、これによって、個々の植物のいずれにおいても遺伝子座で特定の（野生型または突然変異株）ＩＮＤアレルがホモ接合であるかヘテロ接合であるかを判断できるようになる。
【００４４】
「野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」（「野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）」または「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」とも表記される）とは、本明細書で使用する場合、天然に最も一般的に生じる植物または遺伝子の典型的な形態を示す。「野生型植物」とは、天然の個体群において当該植物の最も一般的な表現型を有する植物を示す。「野生型アレル」とは、野生型の表現型を産生するのに必要な遺伝子のアレルを示す。反対に、「突然変異株植物」とは、天然の個体群においてこのような植物の希な表現型が異なる植物あるいは、突然変異誘発などによって人間が介入して創り出された植物を示し、「突然変異株アレル」は、突然変異株の表現型を生成するのに必要な遺伝子のアレルを示す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「野生型ＩＮＤ」という用語（野生型ＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１など）は、機能的ＩＮＤタンパク質（それぞれ機能的ＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１など）をコードする植物、特にアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物に見られる天然に発生するＩＮＤアレルを意味する。対照的に、「突然変異株ＩＮＤ」という用語（突然変異株ＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１など）は、本明細書で使用する場合、機能的ＩＮＤタンパク質をコードしないＩＮＤアレル、すなわち非機能的ＩＮＤタンパク質（非機能的ＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１、それぞれなど）（本明細書で使用する場合、対応する野生型の機能的ＩＮＤタンパク質と比較して生物活性がないか生物活性が有意に低減されたＩＮＤタンパク質である）をコードするか、ＩＮＤタンパク質をまったくコードしないＩＮＤアレルを示す。「完全ノックアウト」または「ヌル」突然変異株ＩＮＤアレルは、本明細書で使用する場合、突然変異株ＩＮＤアレルを示し、対応する野生型の機能的ＩＮＤタンパク質と比較して生物活性のないＩＮＤタンパク質をコードするか、タンパク質をまったくコードしない。このような「完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレル」は、たとえば、野生型ＩＮＤアレルであり、１つ以上のナンセンスまたはミスセンス変異などの１つ以上の変異を核酸配列に含む。特に、このような完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルは野生型ＩＮＤアレルであり、ＩＮＤタンパク質の生物活性が完全に除外されるか、あるいはそれによって変異が好ましくはＩＮＤタンパク質を生成しないように、活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または二量体化ドメインなどの少なくとも１つの機能ドメインを欠いているか、配列番号２の１２７位または配列番号４の１４０位のアルギニンあるいは配列番号２の１２２位または配列番号４の１３５位のグルタミンなどのＤＮＡ結合に不可欠なアミノ酸など、その機能にとって不可欠な少なくとも１つのアミノ酸を欠いているＩＮＤタンパク質の生成につながる変異を含むと好ましい。「部分ノックアウト」突然変異株ＩＮＤアレルは、本明細書で使用する場合、突然変異株ＩＮＤアレルを示し、対応する野生型の機能的ＩＮＤタンパク質と比較して生物活性が有意に低減されたＩＮＤタンパク質をコードする。このような「部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレル」は、たとえば、１つ以上のミスセンス変異などの１つ以上の変異を自らの核酸配列に含む野生型ＩＮＤアレルである。特に、このような部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルは、ＩＮＤタンパク質の生成につながると好ましい変異を含む野生型ＩＮＤアレルであり、生物活性が有意に低減されるが完全にはなくならないように少なくとも１つの保存されたおよび／または機能的なアミノ酸が別のアミノ酸で置換される。このような完全または部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルは、顕性不活性のＩＮＤタンパク質もコードする。これは、同一細胞内の他のＩＮＤタンパク質の生物活性に悪影響をおよぼし得る。このような顕性不活性のＩＮＤタンパク質は、野生型ＩＮＤタンパク質と同一の要素と相互作用できるが、その機能のいくつかの側面をブロックするＩＮＤタンパク質であってもよい。顕性不活性ＩＮＤタンパク質の例として、ＤＮＡ結合部位の細胞に存在する野生型および／または部分ノックアウトＩＮＤタンパク質と競合することで、自らの生物活性を低減あるいは排除するだけでなく細胞全体でのＩＮＤ活性も落とすような形で、活性化ドメインおよび／または二量体化ドメインあるいは、活性化および／または二量体化に不可欠な特定のアミノ酸残基を欠いているが、依然としてＤＮＡ結合ドメインを含むＩＮＤタンパク質があげられる。顕性不活性ＩＮＤタンパク質の他の例として、少なくとも１つの機能ドメインを欠いたタンパク質二量体を生成することで、自らの生物活性を低減あるいは排除するだけでなく細胞全体でのＩＮＤ活性も落とすような形で、活性化ドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインあるいは、活性化および／またはＤＮＡ結合に不可欠な特定のアミノ酸残基を欠いているが、依然として二量体化ドメインは含むＩＮＤタンパク質があげられる。ＩＮＤタンパク質コード核酸配列の突然変異株アレルを本明細書では「ｉｎｄ」と表記（それぞれｉｎｄ−ａ１またはｉｎｄ−ｃ１など）する。突然変異株アレルは、天然に見られる（人間が変異原を加えなくても自然発生的に生成される）突然変異株アレルである「天然の突然変異株」アレルであってもよいし、突然変異誘発などの人間の介入によって生成される「誘導された突然変異株」アレルであってもよい。
【００４６】
「有意に低減された量の機能的ＩＮＤタンパク質」（機能的ＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１タンパク質など）は、突然変異株ＩＮＤアレルを含む細胞によって産生される機能的ＩＮＤタンパク質の量が、突然変異株ＩＮＤアレルを含まない細胞によって生成される機能的ＩＮＤタンパク質の量と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％低減される（すなわち、細胞によって機能的ＩＮＤタンパク質が産生されない）ことを示す。この定義には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性を持たない「非機能的」ＩＮＤタンパク質（切断されたＩＮＤタンパク質など）の生成、機能的ＩＮＤタンパク質の絶対量の低減（ＩＮＤ遺伝子の変異がゆえに機能的ＩＮＤタンパク質が作られないなど）、機能的な野生型ＩＮＤタンパク質の活性と比較して、生物活性が有意に低減されたＩＮＤタンパク質の生成（下記にて例示するようにコードされたＩＮＤタンパク質の生物活性に不可欠な１つ以上のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されたＩＮＤタンパク質など）および／または他の機能的および／または部分的に機能的なＩＮＤタンパク質への顕性不活性ＩＮＤタンパク質の悪影響も包含する。
【００４７】
「突然変異株ＩＮＤタンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、突然変異株ＩＮＤ核酸配列（「ｉｎｄアレル」）によってコードされるＩＮＤタンパク質を示し、この変異の結果、非突然変異株の野生型ＩＮＤ配列（「ＩＮＤアレル」）でコードされるＩＮＤタンパク質の活性と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＮＤ活性が有意に低減されるおよび／または消失する。
【００４８】
「突然変異誘発」とは、本明細書で使用する場合、植物細胞（複数のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子または花粉といった他の部分など）に対して、化学物質（エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソウレア（ＥＮＵ）など）や電離線（中性子（高速中性子突然変異誘発など）、α線、γ線（Ｃｏｂａｌｔ  ６０源から供給されるものなど）、Ｘ線、ＵＶ線など）といった変異原因子あるいは、これらの２つ以上の組み合わせに接触させるなど細胞のＤＮＡに変異を誘発する技術をほどこすプロセスを示す。このため、１つ以上の植物組織をエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソウレアなどに接触させるなどの化学的な手段を用いることや、ｘ線などの物理的な手段を用いること、あるいはＣｏｂａｌｔ  ６０源から供給されるものなどのγ放射線によって、１つ以上のＩＮＤアレルの所望の突然変異誘発を達成できる。放射線によって創り出した変異は、転座または複雑な再配列など大きな欠失や他の肉眼的病変であることが多いが、化学的な変異原によって創り出した変異は点変異などの離散的な病変であることが多い。たとえば、塩基の不対合につながるＥＭＳアルキレートグアニン塩基：アルキル化グアニンはチミン塩基と対をなし、主にＧ／ＣからＡ／Ｔへの遷移を生じる。突然変異誘発後、周知の技術を用いてアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を処理済みの細胞から再生させる。たとえば、得られたアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子を従来の生育手順で植えた後、その植物に自家受粉種子を形成させる。あるいは、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８，  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ．  Ｄｅｐ．  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎ．  Ｂｕｌｌ．  ＯＡＣ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ０４８９．  Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｇｕｅｌｐｈ，  Ｇｕｅｌｐｈ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）に記載されているように、倍加半数体小植物を抽出し、ホモ接合植物をすみやかに形成してもよい。現世代または以後の世代でのこのような自家受粉の結果として形成された追加の種子を収穫し、突然変異株ＩＮＤアレルの存在をスクリーニングする。特定の突然変異株アレルのスクリーニングには、いくつかの技術が周知であり、たとえば、Ｄｅｌｅｔｅａｇｅｎｅ（商標）など、（Ｄｅｌｅｔｅ−ａ−ｇｅｎｅ；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２７：  ２３５〜２４２）では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いて、高速中性子突然変異誘発によって生成された欠失突然変異株をスクリーニングし、ＴＩＬＬＩＮＧ（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ；ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：４５５〜４５７）ではＥＭＳ誘発点変異を同定するといった具合である。特定の突然変異株ＩＮＤアレルの存在をスクリーニングする別の技術を、以下の実施例にあげておく。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「非天然型の」または「栽培した」という表現は、植物について用いる場合、人間が改変したゲノムを有する植物を意味する。たとえば、トランスジェニック植物は、転写するとＩＮＤ遺伝子などの内在性遺伝子の発現を低減できる生物学的に活性なＲＮＡ分子を生成する転写領域を含むキメラ遺伝子などの外来性の核酸分子を持ち、人間が遺伝的に改変した非天然型の植物である。また、変異原因子への曝露の結果として内在性ＩＮＤ遺伝子（調節要素またはコード配列など）の変異などの変異を内在性遺伝子に持つ植物も、非天然的な植物であるとみなされる。なぜなら、これも人間によって遺伝的に改変されているからである。さらに、該当する植物のカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）やカブ（ｒａｐａ）などの同一または別の種の植物とのマーカー利用育種および選択または浸透性交雑などの直接育種プロセスなどの結果として、該当する植物種で自然には生じない変異を内在性ＩＮＤ遺伝子などの内在性遺伝子に含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）などの特定の種の植物も、非天然型の植物であるとみなす。対照的に、自然発生または天然に生じる変異しか含まない植物、すなわち人間によって遺伝的に改変されていない植物は、本明細書で定義するような「非天然型の植物」ではないため、本発明には包含されない。非天然型の植物は一般に、天然に生じる植物と比較すると変化したヌクレオチド配列を有するが、非天然型の植物でもメチル化パターンを変えるなどの方法でヌクレオチド配列を変えることなく人間によって遺伝的に改変可能である旨は当業者であれば理解できよう。
【００５０】
遺伝子またはタンパク質の「オルソログ」という用語は、本明細書では、遺伝子またはタンパク質と同一の機能を持つが、（通常は）その遺伝子を持っている種が分化した（すなわち、種分化によって共通の祖先から遺伝子が進化した）時点では配列の異なる、別の種に見られる相同遺伝子またはタンパク質を示す。このため、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ遺伝子のオルソログは、他の植物種（カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）など）で、両方の配列の比較（配列全体または特定のドメインでの配列同一性のパーセンテージに基づくなど）および／または機能的解析によって、同定できる。
【００５１】
「変種」とは、本明細書では、ＵＰＯＶ条約に準拠して使用し、わかっている範囲で最低ランクの単一の植物分類に区分される植物を示す。この区分は、特定の遺伝子型または遺伝子型を組み合わせることで生じる特徴の表現によって定義可能であり、前記特徴のうちの少なくとも１つを表すことで他の植物分類と区別でき、変更なく（安定して）伝えるための適合性に関する単位としてみなされる。
【００５２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、表記の物品、ステップまたは構成要素の存在を指定するものとして解釈されるが、１つ以上の別の物品、ステップまたは構成要素の存在を除外するものではない。よって、特定の特色を含む植物が別の特色を含むこともあり得る。
【００５３】
ある単語を単数形で用いる（植物または根など）場合、本明細書には複数形も含まれる（複数の植物、複数の根など）旨は理解できよう。よって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」を用いる要素に対する言及は、文脈から明らかに１つであることが求められ、１つの要素だけがある場合を除いて、２つ以上の要素が存在する可能性を除外するものではない。よって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は通常、「少なくとも１つの」を意味する。
【００５４】
本発明の目的で、パーセンテージで表される、２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」は、同じ残基（×１００）を有する最適にアライメントされた２つの配列における位置の数を、比較した位置の数で割ったものである。ギャップすなわち、残基が一方の配列に存在するが他方には存在しないアライメントの位置を、非同一残基の位置とみなす。２つの配列の「最適なアライメント」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムをデフォルトの設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチドの場合）／１０（タンパク質の場合）とギャップ伸張ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドの場合）／０．５（タンパク質の場合））で使用して、２つの配列を長さ方向全体でアライメントさせることで見出される（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８（３）：４４３〜５３）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ，    Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６（６）：  ２７６２７７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌなどを参照のこと）。ヌクレオチドの場合、使用するデフォルトのスコアリングマトリクスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質の場合はＥＢＬＯＳＵＭ６２がデフォルトのスコアリングマトリクスである。
【００５５】
「実質的に同一」または「本質的に類似の」とは、本明細書で使用する場合、上記にて定義したように最適な状態でアライメントした場合に、（下記にてさらに定義するような）少なくとも特定の最小パーセンテージの配列同一性を持つ配列を示す。
【００５６】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、特定のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するのに使用可能である。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、状況が変われば条件も異なる。通常、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に同系のプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。一般に、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７で塩濃度が約０．０２モル、温度が少なくとも６０℃で選択される。塩濃度を下げるおよび／または温度を上げるとストリンジェンシーが高くなる。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件（１００ｎｔなどのプローブを用いるノーザンブロット）は、たとえば、０．２×ＳＳＣで６３℃、２０分間の洗浄を少なくとも１回含むものなどあるいは、これと等価の条件である。
【００５７】
「高ストリンジェンシー条件」は、たとえば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣで、３．０ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸Ｎａを含有し、ｐＨ７．０）、５×デンハート（１００×デンハートで、２％Ｆｉｃｏｌｌ、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非特異的競合体として２０μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ（一本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長１２０〜３０００ヌクレオチド）を含有する水溶液中、６５℃でのハイブリダイゼーションで実施可能である。ハイブリダイゼーション後、いくつかのステップにわけて最終洗浄（約３０分）をハイブリダイゼーション温度にて０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとすることで、高ストリンジェンシーでの洗浄を実施できる。
【００５８】
「中程度のストリンジェンシー条件」とは、上述した溶液中であるが約６０〜６２℃でのハイブリダイゼーションに相当する条件を示す。ハイブリダイゼーション温度にて１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、中程度のストリンジェンシーでの洗浄を実施できる。
【００５９】
「低ストリンジェンシー」とは、上述した溶液にて約５０〜５２℃でのハイブリダイゼーションに相当する条件を示す。ハイブリダイゼーション温度にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、低ストリンジェンシーでの洗浄を実施できる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （２００１）も参照のこと。
【００６０】
「収穫収量増大」または「種子または穀物収量増大」という表現は、突然変異株ＩＮＤアレルを含まない同等数の同質遺伝子植物の種子または穀物の量と比較したときに、各々が本発明による突然変異株ＩＮＤアレルを含む複数の植物から収穫される種子または穀物の量が増えていることを示す。収量は一般に、ブッシェル／エーカーまたはｋｇ／ｈａなど、表面単位あたりの収穫された種子の量の単位で表される。収量の増加は一般にパーセンテージで表される。その場合は基準植物または対照植物の収量を１００％として、本発明による植物の収量を対照植物の収量に対する％で示す。本発明によるアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物で観察される収量の増加は、少なくとも１０１％から少なくとも１２４％の範囲であり、さらに高い収量の増加が実現可能であると思われる。収量の増加は、１０４％から１０８％または１０５％から１１０％の範囲にもなり得る。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されているように、それまでは、２つのＩＮＤ遺伝子のうちの一方だけすなわちＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１で完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合であるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物では、突然変異株ＩＮＤアレルを含まないセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物と比較して耐裂莢性の有意な増大が認められず、両方のＩＮＤ遺伝子で完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合であるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物であれば、耐裂莢性が有意に増大するが、農学的に妥当な脱穀性を維持するには耐裂莢性のレベルが高すぎることが見出された。対照的に、２つのセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ遺伝子の３つの完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物では、植物が莢の農学的に妥当な脱穀性を維持するレベルまで耐裂莢性が有意に増大した。
【００６２】
本発明者らは、驚くべきことに、２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを２つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルと組み合わせれば、３つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを組み合わせなくても、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物すなわち、耐裂莢性の高さと莢の農学的に妥当な脱穀性とを兼ね備える植物と類似の裂莢表現型を持つセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物を得られることを見出した。また、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の変異がＩＮＤ−Ａ１遺伝子の変異よりも一層大幅に耐裂莢性を増大させることも見出した。セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物の耐裂莢性が一層大幅に増大することは、２つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルがＩＮＤ−Ａ１遺伝子由来で、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルがＩＮＤ−Ｃ１遺伝子由来である場合よりも、たとえば、２つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルがＩＮＤ−Ｃ１遺伝子由来の完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルであり、２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルがＩＮＤ−Ａ１遺伝子由来の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルであるときに観察された。驚くべきことに、特にＩＮＤ−Ｃ１遺伝子のものだけの２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを導入することで、耐裂莢性の高さと莢の農学的に妥当な脱穀性とを兼ね備えたセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物を得ることができた。
【００６３】
よって、本発明の一実施形態では、特にＩＮＤ−Ａ１および／またはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子、好ましくはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の２つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを自らのゲノムに含むことを特徴とする、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１遺伝子を含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物が本明細書で得られ、ｉｎｄアレルがゆえに、これらの突然変異株アレルと同等の野生型によってコードされるタイプの機能的ＩＮＤタンパク質の量が有意に低減され、植物細胞、具体的には発達している種子莢でｉｎ  ｖｉｖｏにて生成される機能的ＩＮＤタンパク質の量が全体的に有意に低減される。
【００６４】
もうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ｅｍｓ０１、ｉｎｄ−ａ１−ｅｍｓ０５、ｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０１またはｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０３など、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されているものなどのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物が、特にＩＮＤ−Ｃ１および／またはＩＮＤ−Ａ１遺伝子、好ましくはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の２つの完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを自らのゲノムにさらに含む。
【００６５】
１つの植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物で特定の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルの十分なコピーを特定の完全ノックアウト突然変異株および／または野生型ＩＮＤアレルの十分なコピーと組み合わせることで、生成する機能的ＩＮＤタンパク質の量および／またはタイプを微調整することが可能であり、これによって植物の果実裂開特性に影響を与えられると考えられる。このように、収穫前または収穫時の脱粒を低減しつつ、種子莢の農学的に妥当な脱穀性を可能にできるだけの十分なＩＮＤタンパク質を産生する植物が得られるように、ＩＮＤタンパク質の絶対量と相対量を調整することが可能である。
【００６６】
よって、本発明のもうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ｅｍｓ０６、ｉｎｄ−ａ１−ｅｍｓ０９、ｉｎｄ−ａ１−ｅｍｓ１３、ｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０４、ｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０８またはｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０９など、後述するものなどの部分的に機能的なＩＮＤタンパク質をコードする少なくとも１つの部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを含む植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物が得られる一方で、残りのアレルは部分ノックアウトであってもよいし、完全ノックアウトおよび／または野生型ＩＮＤアレルであってもよい。
【００６７】
本発明の一態様では、少なくとも１つのアレルが少なくとも部分的に機能的なＩＮＤタンパク質を生成するように、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にそのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の２つのＩＮＤ遺伝子、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ−Ａ１および／またはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子、好ましくはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の２つの部分ノックアウトｉｎｄアレルおよびｎ組の完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物が得られ、ｎ≦２（ｎ＝０、１または２など）である。
【００６８】
本発明の別の態様では、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のホモ接合ＩＮＤ単一突然変異株（ｎ＝２、すなわち、１つのＩＮＤ遺伝子の部分ノックアウト突然変異株アレルにとってホモ接合）および／またはホモ接合ＩＮＤ二重突然変異株（ｎ＝４、すなわち、２つのＩＮＤ遺伝子の完全および／または部分ノックアウト突然変異株アレルにとってホモ接合）植物が得られ、それによって突然変異株アレルがそのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の２つのＩＮＤ遺伝子、特にＩＮＤ−Ａ１および／またはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子を含む突然変異株アレルである。このような突然変異株植物は、本発明によれば、育種目的で使用できるものである。
【００６９】
よって、本発明の一実施形態では、ホモ接合ＩＮＤ単一部分ノックアウト突然変異株セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物が本明細書で得られ、ここで、その植物の遺伝子型をｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１またはＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐと表現することが可能である。本発明のもうひとつの実施形態では、ホモ接合ＩＮＤ二重部分突然変異株セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物が本明細書で得られ、ここで、その植物の遺伝子型をｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐと表現することが可能である。本発明のさらに他の実施形態では、ホモ接合ＩＮＤ二重部分および完全突然変異セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物が本明細書で得られ、ここで、その植物の遺伝子型をｉｎｄ−ａ１Ｆ／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐまたはｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆと表現することが可能である。
【００７０】
本明細書でさらに得られるのは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種由来の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子／アレルの新規な核酸配列ならびに、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質である。また、特定の組み合わせで完全および部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを自らのゲノムに含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、ならびにアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物および植物の一部で、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを生成して組み合わせる方法も得られ、それによってこれらの植物の脱粒が低減される。これらの植物を用いて部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを他の植物に移行させることや、ここに記載の植物の植物産物も、本発明の実施形態である。また、ＩＮＤ遺伝子および／またはアレルを組み合わせまたは検出するためのマーカー利用選抜（ＭＡＳ）用のキットおよび方法も得られる。本発明の各実施形態については、以下において詳細に説明する。
【００７１】
脱粒が低減または遅延された本明細書で説明するアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物では、収穫される種子の収量が増す。しかしながら、突然変異株ＩＮＤアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物には観察可能な種子脱粒表現型の低減または遅延がないにもかかわらず、突然変異株ＩＮＤアレルを含まない同質遺伝子アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物と比較した場合に、ｉｎｄ−ｃ１−０９アレルだけをホモ接合状態で含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物から収穫される種子の収量（観察可能な種子脱粒表現型の低減または遅延を示す）だけでなく、２つの突然変異株ＩＮＤアレルだけをホモ接合状態で含むすなわち、植物の遺伝子型をｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１またはＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐと表現可能な他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物から収穫される種子の収量も有意に増加することが観察された。また、本発明は、少なくとも２つのアレルが機能的ＩＮＤタンパク質を生成し、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物も提供するものであり、この植物のほうが種子収量が大きい。ＩＮＤ−Ａ遺伝子座またはＩＮＤ−Ｃ遺伝子座の２つの突然変異株アレルは、同一の突然変異株アレルであっても異なる突然変異株アレルであってもよいことは明らかであろう。
【００７２】
本発明による核酸配列
得られるのは、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来であるが、他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種由来であってもよいＩＮＤ遺伝子の部分的に機能的なＩＮＤタンパク質、すなわち生物活性が有意に低減されたＩＮＤタンパク質（すなわち、コードされたＩＮＤタンパク質の生物活性が有意に低減される１つ以上の変異を含むＩＮＤ核酸配列）をコードする部分ノックアウト突然変異株ｉｎｄ核酸配列である。たとえば、Ａおよび／またはＣゲノムを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種は、ＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１遺伝子のアレルを含むものであってもよく、これは本発明の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルと本質的に類似しており、同定して本発明による単一の植物で組み合わせることが可能である。また、突然変異誘発方法を利用して、野生型ＩＮＤアレルに変異を生成し、これによって本発明で使用する、本発明の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルと本質的に類似の突然変異株ｉｎｄアレルを生成することが可能である。特異的ＩＮＤアレルは、好ましくは交雑および選択によって植物で組み合わせられるが、一実施形態では、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）と交雑可能あるいは、「合成」セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物の生成に利用可能ななアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、好ましくはアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物など、植物内で（すなわち内在的に）ｉｎｄ核酸配列を得る。異なるアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種間のハイブリダイゼーションについては、Ｓｎｏｗｄｏｎ  （２００７，  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：  ８５〜９５）などにおいて従来技術で説明されている。種間ハイブリダイゼーションを使用すれば、たとえば遺伝子をセイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）のＣゲノム（ＡＡＣＣ）などからアビシニアカラシ（Ｂ．  ｃａｒｉｎａｔａ）のＣゲノム（ＢＢＣＣ）に、あるいはセイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）のＣゲノム（ＡＡＣＣ）などからカラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）のＢゲノム（ＡＡＢＢ）（ＣとＢのゲノムの非正統的組換えの散発事象による）にすら移行可能である。「再合成」または「合成」セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）系統は、元の祖先であるブラッシカ・オレラセア（Ｂ．  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ＣＣ）とカブ（Ｂ．  ｒａｐａ）（ＡＡ）を交雑させることで生成可能である。アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種とその近縁種との交雑では、胚救出技術またはプロトプラスト融合（上記のＳｎｏｗｄｏｎなどを参照）によって、種間および属間の不適合性バリアをうまくかわすことが可能である。
【００７３】
しかしながら、単離されたｉｎｄ核酸配列（クローニングによって植物から単離またはＤＮＡ合成によって合成的に生成するなど）ならびにその変異体およびこれらのいずれかの断片も本明細書で提供され、これらを用いて、所望の組み合わせの部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルを有する植物を生成するために、特異的アレルの選択と１つの植物からもうひとつの植物への移行について、どの配列が植物または植物の一部に内在的に存在するか、配列が機能的、部分的に機能的、非機能的またはタンパク質なし（後述するような組換え宿主細胞での発現など）をコードするか否かを判断することができる。
【００７４】
野生型ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１の新規な部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤ核酸配列がセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）から単離されている。国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されているような野生型ＩＮＤ配列を配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示し、一方これらの配列ならびにこれらと本質的に類似した配列の新規な部分ノックアウト突然変異株ｉｎｄ配列については、野生型ＩＮＤ配列を参照して本明細書の後段ならびに実施例で説明する。セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のゲノムＩＮＤタンパク質コードＤＮＡはイントロンを含まない。
【００７５】
本発明による「ＩＮＤ−Ａ１核酸配列」または「ＩＮＤ−Ａ１変異体核酸配列」は、配列番号２との配列同一性が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列をコードする核酸配列あるいは、配列番号１または配列番号５との配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列である。これらの核酸酸配列を、配列表に示すＩＮＤ配列と「本質的に類似している」または「本質的に同一である」と呼ぶこともある。
【００７６】
本発明による「ＩＮＤ−Ｃ１核酸配列」または「ＩＮＤ−Ｃ１突然変異株核酸配列」は、配列番号４（ＩＮＤ−Ｃ１−ｌｏｎｇ）または配列番号４の１６位のアミノ酸から２１０位のアミノ酸まで（ＩＮＤ−Ｃ１−ｓｈｏｒｔ）との配列同一性が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列をコードする核酸配列あるいは、配列番号３（ＩＮＤ−Ｃ１−ｌｏｎｇ）、配列番号３の４６位のヌクレオチドから６３３位のヌクレオチドまで（ＩＮＤ−Ｃ１−ｓｈｏｒｔ）または配列番号７との配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列である。これらの核酸配列を配列表に示すＩＮＤ配列と「本質的に類似している」または「本質的に同一である」と呼ぶこともある。
【００７７】
よって、本発明は、野生型、機能的ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１タンパク質をコードする核酸配列の新規な部分ノックアウト変異核酸配列（（下記にてさらに定義するような）その変異体および断片を含む）を提供するものであり、それによって核酸配列の変異が、野生型ＩＮＤタンパク質に比して好ましくは１つ以上のアミノ酸が挿入、欠失または置換されることにつながり、特に１つ以上のアミノ酸が置換され、それによってＩＮＤタンパク質の生物活性が有意に低減される。ＩＮＤタンパク質の生物活性の有意な低減を本明細書では、対応する野生型ＩＮＤタンパク質を発現している植物と比較して突然変異株ＩＮＤタンパク質を発現している植物の耐裂莢性が高まるように、ＩＮＤタンパク質のＤＮＡ結合活性、二量体化能および／または転写調節活性が低減されると表現する。
【００７８】
植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物における特定のＩＮＤアレル／タンパク質の機能性を判断するには、特定のＩＮＤアレル／タンパク質を含む植物ならびに、Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４，  上掲）に記載されているように、あるいは以下の実施例で説明するように、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の果実および花で実施するアッセイに似た、対応する野生型植物の果実および花について、巨視的、顕微鏡的、組織学的アッセイを実施して、植物の裂莢に対する耐性レベルを判断することが可能である。簡単に説明すると、裸眼で種子莢を検査して、朔片縁辺の存在または非存在あるいは莢のくちばしの長さを評価するといった巨視的試験など；莢を軽くねじったときに莢の開きやすさを評価することで、異なる突然変異株ＩＮＤ系統および対応する野生型系統間の耐裂莢性のレベルを比較する手動衝撃加振試験（ＭＩＴ）；これらの系統の莢試料の半減期を測定することで、異なる突然変異株ＩＮＤ系統および対応する野生型系統由来の植物からの種子莢の脱穀性を比較する不規則衝撃加振試験（ＲＩＴ）；および／または種子莢の朔片縁辺および裂開ゾーンの細胞がＩＮＤの変異に影響されるか否か、影響される場合はどのように影響されるのかなどを調べる顕微鏡試験などによって、耐裂莢性の変化を評価および／または測定することができる。ＩＮＤタンパク質の二量体化パートナー（その機能がホモ二量体の形成に左右される場合はＩＮＤタンパク質自体、その機能がヘテロ二量体の形成に左右されるのであれば別のタンパク質など）および／または転写がＩＮＤタンパク質によって制御される遺伝子を同定してキャラクタライズし、特定のＩＮＤアレル／タンパク質の機能性を、二量体が形成可能である場合、二量体が制御された遺伝子のｂＨＬＨ結合部位に結合可能である場合および／またはこれらの遺伝子の転写がこの結合によって制御されている場合に、宿主細胞（大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの細菌など）で二量体の両方のパートナーを同時発現させて評価するなどの従来技術において周知の組換えＤＮＡ技術で評価することも可能である。
【００７９】
内在性の核酸配列と単離した核酸配列の両方が、本明細書にて得られる。また、本発明のもうひとつの態様（詳細については下記参照）によるプライマーまたはプローブならびにキットの構成要素として用いられる先に定義した突然変異株ＩＮＤ配列および突然変異株ＩＮＤ変異体核酸配列の断片も得られる。ｉｎｄ核酸配列またはその変異体の「断片」（定義したとおり）は、ＩＮＤまたはｉｎｄ配列（または変異体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、５００、６００の連続したヌクレオチドなど、さまざまな長さであってもよい。
【００８０】
機能的ＩＮＤタンパク質をコードする核酸配列
配列表に示される核酸配列は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の野生型の機能的ＩＮＤタンパク質をコードする。よって、これらの配列は、その単離元となったセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物にとって内在性である。他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種、変種、育種系統または野生の到達種を、同一のＩＮＤタンパク質またはその変異体をコードする他のＩＮＤアレルについてスクリーニングしてもよい。たとえば、核酸ハイブリダイゼーション技術（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件などを用いるサザンブロット解析など）またはＰＣＲベースの技術を使用して、さまざまなセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）変種、系統または到達種などの他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物に内在性のＩＮＤアレルを同定してもよいが、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）（特にＡ−ゲノムのＩＮＤアレル）、アビシニアカラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）（特にＣ−ゲノムのＩＮＤアレル）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）（Ａ−ゲノム）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（Ｃ−ゲノム）植物、器官および組織を、他の野生型ＩＮＤアレルについてスクリーニングすることが可能である。このような植物、植物の器官または組織でＩＮＤアレルの存在をスクリーニングするには、配列表に示すＩＮＤ核酸配列あるいは、そのいずれかの変異体または断片を用いてもよい。たとえば全配列または断片をプローブまたはプライマーとして用いてもよい。たとえば特異的または変性プライマーを用いて、ＩＮＤタンパク質をコードする核酸配列を、植物、植物器官または組織のゲノムＤＮＡから増幅してもよい。これらのＩＮＤ核酸配列については、標準的な分子生物学技術によって単離および配列決定できる。その後、たとえばどのＩＮＤアレルに配列が対応し、どのＩＮＤタンパク質またはタンパク質変異体が配列によってコードされるのかを判断するために、バイオインフォマティクス解析を利用して、アレルをキャラクタライズすればよい。
【００８１】
核酸配列が機能的ＩＮＤタンパク質をコードするか否かは、完全ノックアウトｉｎｄ突然変異株アレルにとってホモ接合であるシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物あるいは、ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の両方の完全ノックアウトｉｎｄ突然変異株アレルにとってホモ接合であるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物などを用いる遺伝的相補性試験などの従来技術において周知のような組換えＤＮＡ技術によって分析可能である。
【００８２】
また、本質的に類似の配列について核酸データベースをスクリーニングすることで、ＩＮＤ核酸配列およびその変異体（またはこれらのいずれかの断片）をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定してもよいことは、理解できよう。同様に、核酸配列を化学的に合成してもよい。下記にてさらに説明する本発明による核酸分子の断片も得られる。断片は、ｂＨＬＨドメインだけをコードする核酸配列あるいは、塩基性ドメインまたはＨＬＨドメインなどのｂＨＬＨドメインの一部を含むさらに小さな断片を含む。
【００８３】
突然変異株ＩＮＤタンパク質をコードする核酸配列
本発明は、配列表の配列番号１、３、５および７で示す野生型ＩＮＤ核酸配列に対して１つ以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含む核酸配列を提供するものであり、核酸配列の当該変異によって、野生型ＩＮＤタンパク質に比してコードされたＩＮＤタンパク質の生物活性が有意に低減すなわち生物活性が部分ノックアウトされ、当該変異核酸分子の断片も提供するものである。このような変異核酸配列（ｉｎｄＰ配列と呼ぶ）は、以下においてさらに説明するような周知のさまざまな方法を用いて生成および／または同定可能である。繰り返すが、このような核酸分子は、内在性の形態と単離された形態の両方で得られる。
【００８４】
基本的に、野生型ＩＮＤタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を含むＩＮＤタンパク質を生じる野生型ＩＮＤ核酸配列の変異はどのようなものであっても、生物活性を有意に低減または生物活性をなくすことができるものである。しかしながら、ＤＮＡ結合ドメイン（「ｂ」）、二量体化ドメイン（「ＨＬＨ」）および／または転写調節ドメインなどの機能ドメインの有意な部分が欠けているか、５位、９位、１３位のＧｌｎ（Ｑ）、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）アミノ酸またはＨｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０，  ７３５〜７４７によって定義されたコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の１０位および１２位の塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇ（Ｒ）残基）；それぞれ配列番号１０の１２３位、１２７位および１３１位、１２８位および１３０位に対応、表１参照）などのこれらのドメイン内の特定の不可欠なアミノ酸残基が欠けているか、あるいは好ましくは非類似または非保存アミノ酸で置換された変異など、ＩＮＤタンパク質の特定の変異のほうがＩＮＤタンパク質の生物活性を完全に排除しやすいが、表１に示す保存されたアミノ酸など特定のアミノ酸の置換につながる変異など、ＩＮＤタンパク質の他の変異のほうがＩＮＤタンパク質の生物活性の有意な低減につながりやすく、コードされたＩＮＤタンパク質の生物活性を完全に排除することなくＤＮＡ結合の効率が低く、二量体化の効率が低くおよび／または転写調節の効率が低いことは理解できよう。国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）には、たとえば、ｂＨＬＨドメインのない切断されたＩＮＤタンパク質が生成されるナンセンス変異を含む完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレル、特にｉｎｄ−ａ１−ｅｍｓ０１、ｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０１およびｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０３ならびに、コンセンサスｂＨＬＨドメインの１０位で保存されたＡｒｇが芳香族Ｈｉｓで置換された、突然変異株ＩＮＤタンパク質をコードする完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレル、特にｉｎｄ−ａ１−ｅｍｓ０５について記載されているのに対し、本発明は部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレル、特に、コンセンサスｂＨＬＨドメインの９位で保存されたＡｌａがＴｈｒで置換された、突然変異株ＩＮＤタンパク質をコードするｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０９ならびに、コンセンサスｂＨＬＨドメインの１２位で保存されたＡｒｇがＣｙｓで置換された、突然変異株ＩＮＤタンパク質をコードするｉｎｄ−ｃ１−ｅｍｓ０４などについて説明するものである。
【００８５】
核酸分子は、以下にあげたものなどの１つ以上の変異を含むものであってもよい。
−  アミノ酸と別のアミノ酸との置換につながる核酸配列の変化である「ミスセンス変異」；
−  未熟ＳＴＯＰコドンの導入と、よって翻訳の終端につながる核酸配列の変化である「ナンセンス変異」または「ＳＴＯＰコドン変異」（切断されたタンパク質につながる）；植物遺伝子は、翻訳停止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡではＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡではＵＡＡ）、「ＴＡＧ」（ＲＮＡではＵＡＧ）を含有する；よって（読み枠での）翻訳対象の成熟ｍＲＮＡに含まれることになるこれらのコドンのうちの１つにつながるヌクレオチド置換、挿入、欠失であればどのようなものでも翻訳を終端させることになる；
−  １つ以上のコドンが核酸のコード配列に付加されたことによる１つ以上のアミノ酸の「挿入変異」；
−  １つ以上のコドンが核酸のコード配列で欠失したことによる１つ以上のアミノ酸の「欠失変異」；
−  変異下流の異なるフレームでの核酸配列の翻訳につながる「フレームシフト変異」。フレームシフト変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または複製などのさまざまな原因を持ち得る。
【００８６】
表１は、配列番号１０のシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤタンパク質の長さ、配列番号９のシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤコーディングＤＮＡの長さ、配列番号２と６ならびに配列番号４と８のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１タンパク質の長さ；Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＴＡＩＲ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／；遺伝子座Ａｔ４ｇ００１２０．１、参照により本明細書に援用；配列番号１０）によるシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤタンパク質におけるｐｆａｍドメインＰＦ０００１０、ｓｍａｒｔドメインＳＭ００３５３、ｐｒｏｓｉｔｅドメインＰＳ５０８８８、ｓｕｐｅｒｆａｍドメインＧ３Ｄ．４．１０．２８０．１０またはＳＳＦ４７４５９の表記の位置に基づくセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１タンパク質におけるｂＨＬＨドメインの位置；参照により本明細書に援用する、Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０，  ７３５〜７４７）、Ｔｏｌｅｄｏ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：  １７４９〜１７７０）、Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４，  Ｃｅｌｌ，  １１６，  ８４３〜８５３）に説明され、参照により本明細書に援用する国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）にもさらに記載された、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤタンパク質におけるｂＨＬＨドメインおよび保存されたアミノ酸の表記の位置に基づくセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１タンパク質におけるｂＨＬＨドメインおよび保存されたアミノ酸の位置；シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤタンパク質におけるｂＨＬＨドメインおよび保存されたアミノ酸の表記の位置に基づくセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１タンパク質におけるｂＨＬＨドメインおよび保存されたアミノ酸の位置を示す。
【００８７】
【表１】
0005770086.tif 000002
【００８８】
【表２】
0005770086.tif 000003
【００８９】
【表３】
0005770086.tif 000004
【００９０】
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤ核酸（配列番号９）およびアミノ酸（配列番号１０）配列とＩＮＤ核酸配列、特に本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＩＮＤ核酸（配列番号１および３）およびアミノ酸（配列番号２および４）配列との最適なアライメントによって、これらのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）配列で対応する保存されたドメインおよびアミノ酸の位置を判断することができる（配列番号１〜４のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＩＮＤ配列についての表１参照）。
【００９１】
よって、一実施形態では、上述した変異タイプの１つ以上を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤ核酸配列が得られる。もうひとつの実施形態では、１つ以上の停止コドン（ナンセンス）変異、１つ以上のミスセンス変異および／または１つ以上のフレームシフト変異を含む部分ノックアウトｉｎｄ配列が得られる。上記の変異核酸配列のいずれも、当該配列を内在的に有する植物および植物の一部での場合と同様に、それ自体で（単離された形態で）得られる。以下に示す表では、最も好ましいｉｎｄアレルを取り上げ、１つ以上のｉｎｄアレルを含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）種子の種子デポジットを図示のように寄託した。
【００９２】
ＩＮＤアレルのナンセンス変異とは、本明細書で使用する場合、ＩＮＤアレルの変異であり、それによって１つ以上の翻訳停止コドンが対応する野生型ＩＮＤアレルのコーディングＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡ配列に導入される。翻訳停止コドンは、ＴＧＡ（ｍＲＮＡではＵＧＡ）、ＴＡＡ（ＵＡＡ）、ＴＡＧ（ＵＡＧ）である。よって、コード配列におけるインフレームでの停止コドンの生成につながる変異（欠失、挿入または置換）は、アミノ酸鎖の翻訳と切断を終端させることになる。一実施形態では、ＣＡＧからＴＡＧ、ＴＧＧからＴＡＧ、ＴＧＧからＴＧＡまたはＣＡＡからＴＡＡへの変異などの単一のヌクレオチド置換によってインフレームでの停止コドンがＩＮＤコドン配列に導入されるナンセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。もうひとつの実施形態では、ＣＡＧからＴＡＡ、ＴＧＧからＴＡＡまたはＣＧＧからＴＡＧまたはＴＧＡへの変異などの二重ヌクレオチド置換によってインフレームでの停止コドンがＩＮＤコドン配列に導入されるナンセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。さらにもうひとつの実施形態では、ＣＧＧからＴＡＡへの変異などの三重ヌクレオチド置換によってインフレームでの停止コドンがＩＮＤコドン配列に導入されるナンセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。切断されたタンパク質には、変異下流（すなわちＩＮＤタンパク質のＣ末端部分）のコーディングＤＮＡによってコードされるアミノ酸が欠けており、変異上流（すなわちＩＮＤタンパク質のＮ末端部分）のコーディングＤＮＡによってコードされるアミノ酸が維持される。一実施形態では、Ｈ２ドメインの保存されたＬｅｕ残基前の存在するナンセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３によって説明されているようにコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の５６位、表１参照）ため、少なくとも保存されたＬｅｕ残基は欠けている。野生型ＩＮＤタンパク質に比して突然変異株ＩＮＤタンパク質の切断が進むにつれて、より多くの切断がＩＮＤタンパク質の活性を有意に低下させることになり得る。突然変異株ＩＮＤタンパク質が生物活性をいくらか保持するには、少なくともＤＮＡ結合（ｂ）ドメインを含んでいる必要があると考えられる。よって、もうひとつの実施形態では、約１７０アミノ酸未満（保存されたＬｅｕを欠いている）、約１５０アミノ酸未満（Ｈ２ドメインを欠いている）、約１４５アミノ酸未満（ＬおよびＨ２ドメインを欠いている）または約１３０アミノ酸未満（ＨＬＨドメインを欠いている）の切断されたタンパク質につながるナンセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる（表１参照）。
【００９３】
以下の表は、本明細書に記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＩＮＤ配列における広範囲にわたる可能なナンセンス変異について説明するものである。
【００９４】
【表４】
0005770086.tif 000005
【００９５】
【表５】
0005770086.tif 000006
【００９６】
明らかに、変異は上記の表に示した１つに限定されるものではなく、配列表に示して上記の表にあげたｉｎｄアレルに類似のＳＴＯＰ変異が存在してもよい旨は理解できよう。
【００９７】
ＩＮＤアレルのミスセンス変異は、本明細書で使用する場合、ＩＮＤアレルの変異（欠失、挿入または置換）であり、それによって１つ以上のコドンがコーディングＤＮＡおよび対応する野生型ＩＮＤアレルの対応するｍＲＮＡ配列に変化し、野生型ＩＮＤタンパク質での１つ以上のアミノ酸が突然変異株ＩＮＤタンパク質の１つ以上の他のアミノ酸で置換される結果につながる。一実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０６アレル（表３ａ）など、特にメチオニン（Ｍｅｔ）残基による、配列番号２におけるＩＮＤタンパク質の１２４位のバリン（Ｖａｌ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながるミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。もうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０９アレル（表３ａ）など、特にセリン（Ｓｅｒ）残基による、配列番号２におけるＩＮＤタンパク質の１４６位のグリシン（Ｇｌｙ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながるミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。さらにもうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３アレル（表３ａ）など、特にバリン（Ｖａｌ）残基による、配列番号２におけるＩＮＤタンパク質の１５９位のアラニン（Ａｌａ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながるミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。さらにもうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０８アレル（表３ｂ）など、特にメチオニン（Ｍｅｔ）残基による、配列番号４におけるＩＮＤタンパク質の１３６位のトレオニン（Ｔｈｒ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながるミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。別の実施形態では、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９アレル（表３ｂ）など、特にトレオニン（Ｔｈｒ）残基による、配列番号４におけるＩＮＤタンパク質の１３９位のアラニン（Ａｌａ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながるミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。さらに別の実施形態では、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４アレル（表３ｂ）など、特にシステイン（Ｃｙｓ）残基による、配列番号４におけるＩＮＤタンパク質の１４２位のアルギニン（Ａｒｇ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながるミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０６、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０９、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０８、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４アレルをホモ接合状態で含む基準種子については、ＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，  Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，  Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  ＡＢ２１  ９ＹＡ，  ＵＫ）にて、２００８年７月７日にそれぞれ受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１５７０、ＮＣＩＭＢ  ４１５７１、ＮＣＩＭＢ  ４１５７２、ＮＣＩＭＢ  ４１５７３、ＮＣＩＭＢ  ４１５７４，およびＮＣＩＭＢ  ４１５７５として寄託してある。
【００９８】
【表６】
0005770086.tif 000007
【００９９】
【表７】
0005770086.tif 000008
【０１００】
もうひとつの実施形態では、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９など、上述または表１に示す保存されたアミノ酸の１つ以上が置換され（表３では＊で示す）、ＩＮＤタンパク質をコードするミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルが得られる。Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０，  ７３５〜７４７）、Ｔｏｌｅｄｏ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：  １７４９〜１７７０）、Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４，  Ｃｅｌｌ，  １１６，  ８４３〜８５３）ならびに国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されているように、保存されたアミノ酸のいくつかはＩＮＤタンパク質の生物活性が他のものよりも不可欠である。よって、たとえば、Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）によって定義されたコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の５位、９位（ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９など）、１３位または１０位（ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０５など）ならびに１２位（ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４など）でのアミノ酸などの置換につながるミスセンス変異は、ＩＮＤタンパク質の標的ＤＮＡとの結合能が低下したため、活性の有意な低減につながりやすい。同様に、Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）によって定義されたコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の螺旋１の１６位、２０位、２３位、２７位または３６位、３９位、４３位、４９位（ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３など）、螺旋２の５３位および５６位でのアミノ酸の置換などにつながるミスセンス変異も、ＩＮＤタンパク質の二量体化能が低下することから、活性の有意な低減につながりやすい。
【０１０１】
さらにもうひとつの実施形態では、本発明によって使用可能なミスセンス変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルは、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）部分ノックアウトｉｎｄ−１（Ｌｉｌｊｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，上掲）アレルのミスセンス変異に対応するミスセンス変異を含むＩＮＤアレルである（表１参照）。
【０１０２】
ＩＮＤアレルのフレームシフト変異は、本明細書で使用する場合、変異下流の異なるフレームでの核酸配列の翻訳につながるＩＮＤアレルの変異（欠失、挿入、複製など）である。
【０１０３】
本発明によるアミノ酸配列
得られるのは、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来であるが、他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物の種に由来するものでもある、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアミノ酸配列（すなわち、ＩＮＤタンパク質の生物活性が有意に低減される１つ以上の変異を含むＩＮＤアミノ酸配列）である。たとえば、Ａおよび／またはＣゲノムを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種が、異なるＩＮＤ−Ａ１またはＩＮＤ−Ｃ１アミノ酸をコードすることがあり、これらのアミノ酸は本発明の新規な部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質と本質的に類似している。また、突然変異誘発方法を使用して、野生型ＩＮＤアレルに変異を生成することで、本発明の部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質と本質的に類似している別の突然変異株ＩＮＤタンパク質をコード可能な突然変異株アレルを生成することが可能である。一実施形態では、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物内に突然変異株ＩＮＤアミノ酸配列が得られる（すなわち内在性である）。しかしながら、本明細書では、単離状態のＩＮＤアミノ酸配列（植物から単離されるか、合成的に作られるなど）ならびにその変異体およびこれらのいずれかの断片も得られる。
【０１０４】
本発明の新規な部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質と本質的に類似しているアミノ酸配列は、本発明の部分ノックアウトＩＮＤアミノ酸配列のアミノ酸を、類似の特性（類似の疎水性、親水性、抗原性、α螺旋構造またはβシート構造を形成または破壊する傾向など）を有する他の他のアミノ酸で置換することによって得られる。保存された置換表は従来技術において周知である（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８４）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙおよび本特許出願の表４）。
【０１０５】
【表８】
0005770086.tif 000009
【０１０６】
野生型ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１タンパク質の新規な部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアミノ酸配列がセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）から単離されている。国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されているような野生型ＩＮＤ配列を配列番号２および配列番号４に示し、一方これらの配列ならびにこれらと本質的に類似した配列の新規な部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤ配列については、野生型ＩＮＤ配列を参照して本明細書の後段ならびに実施例で説明する。上述したように、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の野生型ＩＮＤタンパク質は、約１８５〜２１０アミノ酸長であり、多数の構造的および機能的ドメインを含む。
【０１０７】
本発明による「ＩＮＤ−Ａ１アミノ酸配列」または「ＩＮＤ−Ａ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号２との配列同一性が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を、配列表に示すＩＮＤ配列と「本質的に類似している」または「本質的に同一である」と呼ぶこともある。
【０１０８】
本発明による「ＩＮＤ−Ｃ１アミノ酸配列」または「ＩＮＤ−Ｃ１変異体アミノ酸配列」は、配列番号４（ＩＮＤ−Ｃ１−ｌｏｎｇ）または配列番号４の１６位のアミノ酸から２１０位のアミノ酸まで（ＩＮＤ−Ｃ１−ｓｈｏｒｔ）との配列同一性が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を配列表に示すＩＮＤ配列と「本質的に類似している」または「本質的に同一である」と呼ぶこともある。
【０１０９】
よって、本発明は、アミノ酸配列の変異によって好ましくは対応する野生型ＩＮＤタンパク質の生物活性と比してＩＮＤタンパク質の生物活性を有意に低減する、野生型のアミノ酸配列の新規な部分ノックアウト突然変異株配列、機能的ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１タンパク質（その変異体および断片（以下にてさらに定義）を含む）を提供するものである。ＩＮＤタンパク質の生物活性の有意な低減とは、本明細書では、対応する野生型植物の耐裂莢性と比較して対応する野生型ＩＮＤタンパク質を発現している植物に比して、突然変異株ＩＮＤタンパク質を発現している植物の耐裂莢性が高まるように、ＤＮＡ結合活性、二量体化能および／またはＩＮＤタンパク質の転写調節活性が低減されることを示す。
【０１１０】
内在性のアミノ酸配列と単離されたアミノ酸配列の両方が本明細書にて提供される。また、先に定義したＩＮＤ変異体アミノ酸配列およびＩＮＤアミノ酸配列の断片も得られる。ＩＮＤアミノ酸配列またはその変異体（先に定義したとおり）の「断片」は、ＩＮＤ配列（または変異体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、１５０、１７５、１８０の連続したアミノ酸など、さまざまな長さであってもよい。
【０１１１】
機能的ＩＮＤタンパク質のアミノ酸配列
配列表に示すアミノ酸配列は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の野生型の機能的ＩＮＤタンパク質である。よって、これらの配列は、単離元となったセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物にとっては内在性である。他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物の種、変種、育種系統または野生到達種を、上述したようにアミノ酸配列が同一の他の機能的ＩＮＤタンパク質またはその変異体についてスクリーニングしてもよい。
【０１１２】
また、本質的に類似の配列についてアミノ酸データベースをスクリーニングすることで、ＩＮＤアミノ酸配列およびその変異体（またはこれらのいずれかの断片）をコンピュータで同定できる旨も理解されている。また、本発明によるアミノ酸分子の断片も得られる。断片としては、ｂＨＬＨドメインのアミノ酸配列あるいは、ｂＨＬＨドメインの一部を含むそれよりも小さな断片（基本ドメインまたはＨＬＨドメインなど）があげられる。
【０１１３】
変異株ＩＮＤタンパク質のアミノ酸配列
本発明は、配列表の配列番号２および４に示す野生型ＩＮＤアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換を含むアミノ酸配列を提供するものであり、こうしたアミノ酸配列の変異によって、野生型タンパク質に対してコードされたＩＮＤタンパク質ならびに当該変異アミノ酸分子の断片の生物活性が有意に低減すなわち、生物活性が部分ノックアウトされる。このような変異アミノ酸配列は、上述したように周知のさまざまな方法を用いて生成および／または同定可能である。繰り返すが、このようなアミノ酸分子は内在性の形態と単離された形態の両方で得られる。
【０１１４】
上述したように、基本的には、野生型ＩＮＤタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を含むＩＮＤタンパク質につながる野生型ＩＮＤアミノ酸配列の変異によって、生物活性が有意に低減された状態または全くない状態につながることがある。しかしながら、以下のことは理解できよう。タンパク質につながる変異など、ＩＮＤタンパク質の特定の変異が他の変異よりもＩＮＤタンパク質の生物活性の完全排除につながりやすいため、ＤＮＡ結合ドメイン（「ｂ」）、二量体化ドメイン（「ＨＬＨ」）および／または転写の調節に重要なアミノ酸（表１参照）などの機能ドメインの有意な部分が欠如するか変異することで、５位、９位、１３位のＧｌｎ（Ｑ）、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）アミノ酸またはＨｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（上掲；それぞれ配列番号１０の１２３位、１２７位、１３１位および１２８位および１３０位に対応、表１参照）によって定義されたコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の１０位および１２位の塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇ（Ｒ）残基）など、これらのドメイン内にある特定の不可欠なアミノ酸残基が、好ましくは非類似または非保存アミノ酸によって欠如するか置換される一方で、表１に示す保存されたアミノ酸といった特定のアミノ酸の置換に至る変異など、タンパク質の他の変異は、ＩＮＤタンパク質の生物活性の有意な低減につながりやすく、コードされたＩＮＤタンパク質の生物活性を完全に排除せずにあまり効率のよくないＤＮＡ結合、効率のよくない二量体化および／またはあまり効率のよくない転写調節を生じる。
【０１１５】
よって、一実施形態では、１つ以上の欠失または挿入変異を含むことで、欠失または挿入によってｉｎ  ｖｉｖｏでの活性が有意に低減された突然変異株タンパク質が生じる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。当該突然変異株ＩＮＤタンパク質は、野生型ＩＮＤタンパク質と比べて少なくとも１、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、１００、１５０、１７５、１８０またはそれより多くのアミノ酸が欠失または挿入されることで、欠失または挿入が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性が有意に低減された突然変異株タンパク質につながるＩＮＤタンパク質である。
【０１１６】
もうひとつの実施形態では、切断されることで、この切断がｉｎ  ｖｉｖｏでの活性が有意に低減された突然変異株タンパク質につながる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。このような切断されたＩＮＤタンパク質は、対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＣ末端部分に機能的ドメインを欠いており、対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＮ末端部分が維持されたＩＮＤタンパク質である。よって、一実施形態では、Ｈ２ドメインの保存されたＬｅｕ残基（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３によって説明されているように、コンセンサスｂＨＬＨドメイン配列の５６位；上記参照）までの対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＮ末端部分を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。野生型タンパク質との比較で突然変異株タンパク質が切断されればされるほど、一層多くの切断がＩＮＤタンパク質の有意に低減された活性につながることがある。突然変異株ＩＮＤタンパク質が生物活性をいくらか維持するためには、少なくともＤＮＡ結合（ｂ）ドメインを含む必要があると考えられている。よって、もうひとつの実施形態では、第２のＨドメインの一部または全部を欠いたおよび／またはＬドメインの一部または全部を欠いたおよび／または第１のＨドメインの一部または全部を欠いた（表１参照）対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＮ末端部分を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。
【０１１７】
さらにもうひとつの実施形態では、１つ以上の置換変異を含むことで、置換によってｉｎ  ｖｉｖｏでの活性が有意に低減された突然変異株タンパク質が得られる、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。一実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０６アレル（表３ａ）によってコードされる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質など、特にメチオニン（Ｍｅｔ）残基による、配列番号２におけるＩＮＤタンパク質の１２４位のバリン（Ｖａｌ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながる置換変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。もうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０９アレル（表３ａ）によってコードされる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質など、特にセリン（Ｓｅｒ）残基による、配列番号２におけるＩＮＤタンパク質の１４６位のグリシン（Ｇｌｙ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながる置換変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。さらにもうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３アレル（表３ａ）によってコードされる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質など、特にバリン（Ｖａｌ）残基による、配列番号２におけるＩＮＤタンパク質の１５９位のアラニン（Ａｌａ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながる置換変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。さらにもうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０８アレル（表３ｂ）によってコードされる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質など、特にメチオニン（Ｍｅｔ）残基による、配列番号４におけるＩＮＤタンパク質の１３６位のトレオニン（Ｔｈｒ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながる置換変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。別の実施形態では、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９アレル（表３ｂ）によってコードされる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質など、特にトレオニン（Ｔｈｒ）残基による、配列番号４におけるＩＮＤタンパク質の１３９位のアラニン（Ａｌａ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながる置換変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。さらに別の実施形態では、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４アレル（表３ｂ）によってコードされる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質など、特にシステイン（Ｃｙｓ）残基による、配列番号４におけるＩＮＤタンパク質の１４２位のアルギニン（Ａｒｇ）残基あるいは本質的にこれと類似の配列の置換につながる置換変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。
【０１１８】
もうひとつの実施形態では、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ１３、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４またはｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９（表３において＊で示す）によってコードされる部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質など、上述したような、あるいは表１に示す、保存されたアミノ酸残基の置換につながる置換変異を含む部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤタンパク質が得られる。
【０１１９】
本発明による方法
本発明のもうひとつの態様では、少なくとも１つの部分および／または少なくとも１つの完全ノックアウトｉｎｄアレルを含有する裂開種子植物ならびにその細胞、一部分、種子および後代を生成および選択するための方法が得られる。特に、たとえばアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の２つの異なる遺伝子座の少なくとも１つなど、ゲノムの少なくとも２つの異なるＩＮＤ遺伝子座の少なくとも１つに少なくとも１つの部分および／または少なくとも１つの完全ノックアウトｉｎｄアレルを含有する、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物ならびにその細胞、一部分、種子および後代を生成および選択するための方法ならびに、裂開種子植物または植物の一部において完全ノックアウトｉｎｄアレル、部分ノックアウトｉｎｄアレルの存在と野生型ＩＮＤアレルの存在とを区別する方法が得られる。よって、このようなｉｎｄアレルを含む部分ノックアウトｉｎｄアレルおよび／または完全ノックアウトｉｎｄアレルまたは裂開種子植物または植物の一部を生成および／または同定するための（突然変異誘発および／またはマーカーによる選択など）方法ならびに、好適な数の部分ノックアウトｉｎｄアレルおよび／または完全ノックアウトｉｎｄアレルおよび／または異なるタイプの部分ノックアウトｉｎｄアレルおよび／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを単一の裂開種子植物で組み合わせ、植物の果実裂開特性を変化させる、特に脱粒を低減または脱粒を収穫後まで遅延させると同時に、莢の農学的に妥当な脱穀性を維持するための方法が得られる。
【０１２０】
本発明による部分および完全ノックアウト突然変異株ｉｎｄアレルは、たとえば、ｉｎｄゲノムまたはｃＤＮＡの一部または全部を増幅するためのＰＣＲベースの方法を用いるなど、従来技術において周知の広範にわたる方法を用いて生成（たとえば突然変異誘発によって誘導）および／または同定できるものである。
【０１２１】
突然変異誘発後、周知の技術を用いて、処理した種子から植物を生育させるか、処理した細胞から再生させる。たとえば、従来の生育手順で変異原化種子を蒔くと、以後はその植物に自家受粉種子を形成できる。あるいは、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８，  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ．  Ｄｅｐ．  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎ．  Ｂｕｌｌ．  ＯＡＣ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ０４８９．  Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｇｕｅｌｐｈ，  Ｇｕｅｌｐｈ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）などによって説明されているように、処理した小胞子または花粉細胞から倍加半数体小植物を抽出し、ホモ接合植物をすみやかに形成してもよい。現段階または以後の生成においてこのような自家受粉の結果として形成される別の種子を収穫し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術（ｉｎｄアレルの増幅）またはハイブリダイゼーションベースの技術（サザンブロット解析など）、ＢＡＣライブラリスクリーニングなどおよび／またはｉｎｄアレルの直接配列決定などの従来技術において周知の技術を用いて突然変異株ＩＮＤアレルの存在をスクリーニングしてもよい。突然変異株ＩＮＤアレルで点変異（いわゆる単一ヌクレオチド多型すなわちＳＮＰ）の存在をスクリーニングするには、たとえばオリゴライゲーションベースの技術、一塩基伸長ベースの技術あるいは、ＴＩＬＬＩＮＧなど制限部位における差異に基づく技術といった従来技術において周知のＳＮＰ検出方法を用いることが可能である。
【０１２２】
上述したように、特定の野生型ＩＮＤアレルの変異原化（自然ならびに誘導）によって、得られる突然変異株ＩＮＤアレルに１つ以上の欠失、挿入または置換ヌクレオチド（以下、「変異領域」と呼ぶ）が生じる。よって、突然変異株ＩＮＤアレルは、野生型ＩＮＤアレルの１つ以上の欠失、挿入または置換ヌクレオチドの場所とコンフィギュレーションによってキャラクタライズ可能である。野生型ＩＮＤアレルにおける１つ以上のヌクレオチドが挿入、欠失または置換された部位をそれぞれ、本明細書では「変異領域または配列」とも呼ぶ。「５’または３’フランキング領域または配列」とは、本明細書で使用する場合、１つ以上の欠失、挿入または置換ヌクレオチドを含有するＤＮＡとは異なる、少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、最大５０００ｂｐのＤＮＡの突然変異株（または対応する野生型）ＩＮＤアレルにおけるＤＮＡ領域または配列、好ましくは、突然変異株ＩＮＤアレル（または対応する野生型ＩＮＤアレル）の変異領域のすぐ上流に位置してこれと連続している（５’フランキング領域または配列」）か、すぐ下流に位置してこれと連続している（３’フランキング領域または配列」）突然変異株（または対応する野生型）ＩＮＤアレル由来のＤＮＡを示す。「連結領域」とは、本明細書で使用する場合、突然変異株（または対応する野生型）ＩＮＤアレルの変異領域と５’または３’フランキング領域とが互いに結合されたＤＮＡ領域を示す。よって、「変異領域と５’または３’フランキング領域との間にまたがる連結領域の配列は、変異配列だけでなくこれと連続したフランキング配列も含む。
【０１２３】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルあるいは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルを含む植物または植物材料、あるいは特定の突然変異株ＩＮＤアレルを含む植物材料を含む生成物を同定するために開発された道具では、変異領域、分子マーカーまたはフランキングおよび／または変異領域の配列を含むゲノム領域の特定の制限地図など、対応する野生型ＩＮＤアレルの特徴であるゲノムではなく、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの特徴である特定のゲノムを利用している。
【０１２４】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルの配列を決定したら、分子生物学的な技術によって、試料の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）において突然変異株ＩＮＤアレルの５’フランキング、３’フランキングおよび／または変異領域内の配列を特異的に認識するプライマーおよびプローブを開発することができる。たとえば、ＰＣＲ法を開発し、生体試料（植物の試料、植物材料または植物材料を含む生成物など）における突然変異株ＩＮＤアレルを同定することが可能である。このようなＰＣＲでは、少なくとも２つの特異的「プライマー」すなわち、一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域内の配列を認識し、他方が突然変異株ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域内の配列を認識する；または一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域内の配列を認識し、他方が突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域内の配列を認識する；または一方が突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域内の配列を認識し、他方が（以下においてさらに説明するような）特定の突然変異株ＩＮＤアレルの３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列を認識するものを利用している。
【０１２５】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルを含む核酸試料から特定の断片（「突然変異株ＩＮＤ特異的断片」または識別用の単位複製配列）が増幅されるように、プライマーは、最適化したＰＣＲ条件下で、５’または３’フランキング領域内の配列、変異領域内の配列あるいは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの３’または５’フランキングと変異領域との間の連結領域の配列を「特異的に認識する」１５〜３５ヌクレオチドの配列を有するものであると好ましい。これは、最適化したＰＣＲ条件下では標的となる突然変異株ＩＮＤアレルだけが増幅され、植物ゲノムの他の配列は増幅されないことを意味する。
【０１２６】
本発明に適したＰＣＲプライマーは以下のものであり得る。
−  長さが１７ｎｔ〜約２００ｎｔの範囲で、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらの相補体（すなわち、上述したナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を５’または３’フランキングする配列あるいは、上記の表に示すＳＴＯＰコドン変異を５’または３’フランキングする配列あるいは、上記にて示す置換変異またはそれらの相補体など、本発明の突然変異株ＩＮＤアレルで欠失、挿入または置換された１つ以上のヌクレオチドを５’または３’フランキングする配列など）から選択される少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド（５’フランキング配列を認識するプライマー）；または
−  長さが１７ｎｔ〜約２００ｎｔの範囲で、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域の配列あるいはそれらの相補体（すなわち、本発明のＩＮＤ遺伝子において挿入または置換されたヌクレオチドの配列あるいはそれらの相補体など）（変異配列を認識するプライマー）から選択される少なくとも１７の連続したヌクレオチド、好ましくは２０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列。
【０１２７】
もちろん、プライマーは、上述した１７の連続したヌクレオチドより長くてもよく、長さ１８、１９、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔまたはそれよりも長くてもよい。プライマーは、全体がフランキング配列および変異配列の上述したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなるものであってもよい。しかしながら、５’末端におけるプライマーのヌクレオチド配列（すなわち３’側にある１７の連続したヌクレオチドの外）は、それほど不可欠ではない。よって、プライマーの５’配列は、適宜フランキング配列または変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなるものであってもよいが、いくつかの（１、２、５、１０など）ミスマッチを含むものであってもよい。プライマーの５’配列は、全体が制限酵素認識部位を表すヌクレオチド配列などのフランキング配列または変異配列とは無関係のヌクレオチド配列からなるものであってもよい。このような無関係の配列またはミスマッチを含むフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは１００ヌクレオチドを超えないものとし、一層好ましくは５０ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチドすら超えないものとする。
【０１２８】
さらに、好適なプライマーは、ヌクレオチド配列が変異領域またはフランキング領域のいずれかだけに由来するものではないという条件で、フランキング配列と変異配列との間にある連結領域（すなわち、本発明の突然変異株ＩＮＤアレルにおいて欠失、挿入または置換された１つ以上のヌクレオチドを５’または３’フランキングする配列と、挿入または置換された１つ以上のヌクレオチドの配列との間の連結領域あるいは、上述した本発明のＩＮＤ遺伝子におけるナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を５’または３’フランキングする配列と、ナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異の配列との間の連結領域など、欠失された１つ以上のヌクレオチドをそれぞれ３’または５’フランキングする配列あるいは、上記の表に示すような潜在的なＳＴＯＰコドン変異または上記にて示した置換変異を５’または３’フランキングする配列と潜在的なＳＴＯＰコドン変異または置換変異の配列との間の連結領域など）のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなるものであってもよい。
【０１２９】
また、適切に選択したＰＣＲプライマー対が互いに相補の配列を含まないものとすべき旨も、当業者であればすぐにわかるであろう。
【０１３０】
本発明の目的で、「配列番号Ｘで表されるヌクレオチド配列の相補体」は、シャルガフ則（Ａ←→Ｔ；Ｇ←→Ｃ）に基づいてヌクレオチドを自らの相補的ヌクレオチドで置換し、５’から３’方向すなわち表記のヌクレオチド配列とは逆方向に配列を読み取るすることで、表記のヌクレオチド配列由来となり得るヌクレオチド配列である。
【０１３１】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するのに適したプライマーの例については実施例で説明する。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「位置Ｘから位置Ｙの配列番号Ｚのヌクレオチド配列」とは、両方のヌクレオチド端点を含むヌクレオチド配列を示す。
【０１３３】
好ましくは、増幅された断片は、５０〜５００ヌクレオチド長または１００〜３５０ヌクレオチド長など、長さが５０〜１０００ヌクレオチドである。最適化したＰＣＲ条件下で、ミスマッチによってこれらのプライマーを用いる特定の突然変異株ＩＮＤアレルの特異的同定が可能であるかぎり、特異的プライマーは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域内の配列、変異領域内の配列または３’または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列と８０〜１００％同一の配列を有するものであってもよい。しかしながら、許容可能なミスマッチの範囲は、実験によって容易に求められ、当業者間で周知である。
【０１３４】
「突然変異株ＩＮＤ特異的断片」の検出および／または同定は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動後のサイズ推定または蛍光ベースの検出方法によるなど、さまざまな方法で起こり得る。また、突然変異株ＩＮＤ特異的断片を直接的に配列決定してもよい。増幅されたＤＮＡ断片を検出するための他の配列特異的方法も従来技術において周知である。
【０１３５】
標準ＰＣＲプロトコールについては、‘ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９９）および他の参考文献など、従来技術において説明されている。特異的プライマーの配列をはじめとするＰＣＲに最適な条件は、特定の突然変異株ＩＮＤアレルそれぞれについての「ＰＣＲ同定プロトコール」に指定されている。しかしながら、ＰＣＲ同定プロトコールの多数のパラメータが、特定の実験室条件に合わせて調整を必要とする場合があり、類似の結果を得るのにわずかに修飾してもよいことは理解できよう。たとえば、ＤＮＡの調製に異なる方法を使用するには、使用するプライマーの量、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２濃度またはアニーリング条件などの調整が必要な場合がある。同様に、他のプライマーを選択することで、ＰＣＲ同定プロトコールに合った他の最適な条件を指示する場合もある。しかしながら、これらの調整は当業者間で周知であり、さらに、先に引用したものなどの現行のＰＣＲアプリケーションマニュアルに一層詳細に説明されている。
【０１３６】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するためのＰＣＲ同定プロトコールの例については実施例で説明する。
【０１３７】
あるいは、特異的プライマーを用いて、生体試料における特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するための「特異的プローブ」として使用可能な突然変異株ＩＮＤ特異的断片を増幅することも可能である。プローブと核酸のその対応する断片とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で生体試料の核酸をプローブと接触させると、核酸／プローブハイブリッドが形成される。このハイブリッドの形成は、（核酸またはプローブの標識など）検出可能であり、このハイブリッドが形成されると特定の突然変異株ＩＮＤアレルが存在していることがわかる。このような特異的プローブとのハイブリダイゼーションを利用した同定方法（固相キャリア上または溶液中のいずれか）については、従来技術において説明されている。特異的プローブは、好ましくは、最適化された条件下で、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域内および／または変異領域内の領域（以下、「突然変異株ＩＮＤ特異的領域」と呼ぶ）に対して特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは、特定の領域のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％、一層好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは９５％〜１００％同一（または相補的）である、１０〜１０００ｂｐ、５０〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、１５０〜３５０ｂｐの配列を含む。好ましくは、特異的プローブが、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの特定の領域に対して同一（または相補的）である約１３〜約１００の連続したヌクレオチドからなる配列を含む。
【０１３８】
本発明に適した特異的プローブは以下のものであり得る。
−  長さが１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの範囲で、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列あるいはそれらの相補体（すなわち、上述したナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を５’または３’フランキングする配列あるいは、上記の表に示す潜在的なＳＴＯＰコドン変異を５’または３’フランキングする配列あるいは、上記にて示す置換変異など、本発明の突然変異株ＩＮＤアレルで欠失、挿入または置換された１つ以上のヌクレオチドを５’または３’フランキングする配列など）あるいはそれに対して少なくとも８０％配列同一性の配列（５’フランキング配列を認識するプローブ）から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド；または
−  長さが１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの範囲で、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの変異配列あるいはそれらの相補体（すなわち、本発明のＩＮＤ遺伝子において挿入または置換されたヌクレオチドの配列あるいはそれらの相補体など）あるいはそれに対して少なくとも８０％配列同一性の配列（変異配列を認識するプローブ）から選択される少なくとも１３の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【０１３９】
プローブは、全体がフランキング配列および変異配列の上述したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなるものであってもよい。しかしながら、その５’または３’末端におけるプローブのヌクレオチド配列は、それほど不可欠ではない。よって、プローブの５’または３’配列は、適宜フランキング配列または変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなるものであってもよいが、フランキング配列または変異配列とは無関係のヌクレオチド配列からなるものであってもよい。このような無関係の配列は、好ましくは５０ヌクレオチドより長くないものとし、一層好ましくは２５ヌクレオチドより長くない、あるいは２０または１５ヌクレオチドより長くないものとする。
【０１４０】
さらに、好適なプローブは、上述したヌクレオチド配列が変異領域またはフランキング領域のいずれかだけに由来するものではないという条件で、フランキング配列と変異配列との間にある連結領域（すなわち、本発明の突然変異株ＩＮＤアレルにおいて欠失、挿入または置換された１つ以上のヌクレオチドを５’または３’フランキングする配列と、挿入または置換された１つ以上のヌクレオチドの配列との間の連結領域あるいは、上述した本発明のＩＮＤ遺伝子におけるナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を５’または３’フランキングする配列と、ナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異の配列との間の連結領域など、欠失された１つ以上のヌクレオチドをそれぞれ３’または５’フランキングする配列あるいは、上記の表に示すような潜在的なＳＴＯＰコドン変異または上記にて示した置換変異を５’または３’フランキングする配列と潜在的なＳＴＯＰコドンまたは置換変異の配列との間の連結領域など）のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなるものであってもよい。
【０１４１】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するのに適した特異的プローブについては実施例で説明する。
【０１４２】
特異的プローブとハイブリダイズされる「突然変異株ＩＮＤ特異的領域」の検出および／または同定は、ゲル電気泳動後のサイズ推定または蛍光ベースの検出方法によるなど、さまざまな方法で起こり得る。特異的プローブとハイブリダイズされる「突然変異株ＩＮＤ特異的領域」を検出するための他の配列特異的方法も従来技術において周知である。
【０１４３】
あるいは、高速中性子突然変異誘発によって生成される欠失突然変異株のスクリーニングにＰＣＲを用いる「Ｄｅｌｅｔｅ−ａ−ｇｅｎｅ（商標）」方法（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  ２００２，  Ｆｕｎｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２：２５４〜２５８によって概説）、ヘテロ二本鎖解析で塩基対の変化を検出する変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）を用いてＥＭＳ誘導点変異を同定するＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）方法（ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：４５５およびＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２３，  ４３９〜４４２）によるなどの他の方法を用いて、１つ以上の突然変異株ｉｎｄアレルを含む植物または植物の一部を生成および同定することが可能である。上述したように、ＴＩＬＬＩＮＧでは変異の高スループットスクリーニングを使用する（突然変異株−野生型ＤＮＡヘテロ二本鎖のＣｅｌ  １切断とシークエンシングゲルシステムでの検出を用いるなど）。よって、ＴＩＬＬＩＮＧを用いて１つ以上の突然変異株ｉｎｄアレルを含む植物または植物の一部を同定することならびに、当該植物、植物器官、組織および種子を生成および同定するための方法も本明細書に包含される。よって、一実施形態では、本発明による方法は、植物の種子を変異原化（ＥＭＳ突然変異誘発など）し、植物個体またはＤＮＡをプールし、対象となる領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成および高スループット検出、突然変異株植物の同定、突然変異株ＰＣＲ産物を配列決定するステップを含む。このような突然変異株植物の生成に他の突然変異誘発および選択方法も等しく使用できることは理解できよう。
【０１４４】
ＩＮＤアレルに変異を誘導する代わりに、従来技術において周知の方法で天然の（自然な）突然変異株アレルを同定してもよい。たとえば、ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧを用いて（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３５（２）：６３０〜６）複数の植物または植物の一部で天然の突然変異株ｉｎｄアレルの存在をスクリーニングしてもよい。上記の突然変異誘発技術については、同定されるｉｎｄアレルをあとで交雑（種間または種内交雑）と選択によってセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）などの他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種に導入できるように、Ａおよび／またはＣゲノムを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種をスクリーニングすると好ましい。ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧでは、育種系統または関連の種における天然の多型を上述したＴＩＬＬＩＮＧ方法でスクリーニングするが、この場合は個々の植物または植物のプールを、ｉｎｄ標的のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成および高スループット解析に使用する。続いて、あとから所望の突然変異株アレルを取り込むための育種プログラムで使用可能な所望の変異を有する個々の植物を選択することができる。
【０１４５】
次に、同定された突然変異株アレルを配列決定することができ、その配列を野生型アレルと比較して変異を同定することができる。任意に、先に示したような官能性を試験しても構わない。この手法を使用して、複数の突然変異株ｉｎｄアレル（と、これらを１つ以上含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）を同定することが可能である。その後、以下においてさらに説明するような交雑および選択方法によって、所望の突然変異株アレルを所望の野生型アレルと組み合わせることができる。最後に、所望数の突然変異株ｉｎｄと所望数の野生型ＩＮＤアレルとを含む単一の植物を生成する。
【０１４６】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルを検出するためのＰＣＲプライマーまたは特異的プローブとして適したオリゴヌクレオチドを使用して、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断する方法を開発することも可能である。
【０１４７】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するには、ＰＣＲベースのアッセイを開発して、突然変異株および／または対応する野生型ＩＮＤ特異的アレルの存在を判断することが可能である。
【０１４８】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに、野生型ＩＮＤアレルを特異的に認識する２つのプライマーが互いに指向して両プライマー間に存在する変異領域を有するように、これらのプライマーを設計してもよい。これらのプライマーは、それぞれ５’および３’フランキング配列を特異的に認識するプライマーであってもよい。この一組のプライマーによって、突然変異株ならびに対応する野生型ＩＮＤアレルの同時診断ＰＣＲ増幅が可能になる。
【０１４９】
あるいは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに、野生型ＩＮＤアレルを特異的に認識する２つのプライマーが互いに指向し、そのうち一方が変異領域を特異的に認識するように、これらのプライマーを設計してもよい。これらのプライマーは、野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域および変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーである。この一組のプライマーは、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域の配列を特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、突然変異株ＩＮＤ遺伝子ならびに野生型ＩＮＤ遺伝子の同時診断ＰＣＲ増幅を可能にするものである。
【０１５０】
あるいは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに、野生型ＩＮＤアレルを特異的に認識する２つのプライマーが互いに指向し、そのうち一方が５’または３’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するように、これらのプライマーを設計してもよい。これらのプライマーは、野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング配列ならびに、変異領域と３’または５’フランキング領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーであってもよい。この一組のプライマーは、突然変異株ＩＮＤアレルの変異領域と３’または５’フランキング領域との間の連結領域をそれぞれ特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、突然変異株ＩＮＤ遺伝子ならびに野生型ＩＮＤ遺伝子の同時診断ＰＣＲ増幅を可能にするものである。
【０１５１】
あるいは、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルを特異的に認識する別のプライマーセットを用いて特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断することも可能である。
【０１５２】
植物が突然変異株ＩＮＤ遺伝子または対応する野生型ＩＮＤ遺伝子にとってホモ接合である場合、上述した診断ＰＣＲアッセイでは突然変異株または野生型ＩＮＤアレルのいずれかに典型的、好ましくは長さの点で典型的な単一のＰＣＲ産物を生じることになる。植物が突然変異株ＩＮＤアレルにとってヘテロ接合である場合、突然変異株と野生型ＩＮＤアレルの増幅の両方を反映して２つの特異的ＰＣＲ産物が現れる。
【０１５３】
野生型および突然変異株ＩＮＤ特異的ＰＣＲ産物の同定は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動後のサイズ推定（野生型と突然変異株ＩＮＤアレルから増幅された断片をゲル上で可視的に分離できるよう前記断片間のサイズ差につながる多数の挿入または欠失されたヌクレオチドを含む突然変異株ＩＮＤアレルなど）；ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動後に２つの異なる断片の存在または不在を評価する（それによって突然変異株ＩＮＤアレルの診断ＰＣＲ増幅を、任意に、野生型ＩＮＤアレルの診断ＰＣＲ増幅とは別に実施可能になる）；増幅された断片の直接配列決定；または蛍光ベースの検出方法によって起こり得る。
【０１５４】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに適したプライマーの例については実施例で説明する。
【０１５５】
あるいは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに、ハイブリダイゼーション−ベースのアッセイを開発し、突然変異株および／または対応する野生型ＩＮＤ特異的アレルの存在を判断してもよい。
【０１５６】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに、各プローブがＩＮＤ野生型アレル内の特異的に認識し、プローブによって認識された配列間に変異領域が存在するような形で、野生型ＩＮＤアレルを認識する２つの特異的プローブを設計してもよい。これらのプローブは、５’および３’フランキング配列をそれぞれ特異的に認識するプローブであってもよい。これらのプローブのうちの一方または好ましくは両方を用いると、突然変異株ならびに対応する野生型ＩＮＤアレルの同時診断ハイブリダイゼーションが可能になる。
【０１５７】
あるいは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに、２つの特異的プローブのうちの一方が変異領域の上流または下流、好ましくは変異領域の上流のＩＮＤ野生型アレル内の配列を特異的に認識し、一方が変異領域を特異的に認識するように、野生型ＩＮＤアレルを認識する２つの特異的プローブを設計してもよい。これらのプローブは、野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域の配列、好ましくは５’フランキング領域の配列と、変異領域とをそれぞれ特異的に認識するプローブであってもよい。これらのプローブのうちの一方または好ましくは両方を、任意に、突然変異株ＩＮＤアレルにおける変異領域の配列を特異的に認識する第３のプローブと一緒に用いると、突然変異株および野生型ＩＮＤ遺伝子の診断ハイブリダイゼーションが可能になる。
【０１５８】
あるいは、特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに、野生型ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブで、野生型ＩＮＤアレルを認識する特異的プローブを設計してもよい。このプローブは、任意に、突然変異株ＩＮＤアレルの５’または３’フランキング領域、好ましくは５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第２のプローブと一緒に、突然変異株および野生型ＩＮＤ遺伝子の診断ハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１５９】
あるいは、突然変異株および野生型ＩＮＤアレルを特異的に認識する別のプローブの組を用いて特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断することも可能である。
【０１６０】
植物が突然変異株ＩＮＤ遺伝子または対応する野生型ＩＮＤ遺伝子にとってホモ接合である場合、上述した診断ハイブリダイゼーションアッセイでは、突然変異株または野生型ＩＮＤアレルのいずれかに典型的、好ましくは長さの点で典型的な、１つ以上のハイブリダイズ用ＤＮＡ（制限）断片などの単一の特異的ハイブリダイゼーション産物を生じることになる。植物が突然変異株ＩＮＤアレルにとってヘテロ接合である場合、突然変異株と野生型ＩＮＤアレルのハイブリダイゼーションの両方を反映して２つの特異的ハイブリダイゼーション産物が現れる。
【０１６１】
野生型および突然変異株ＩＮＤ特異的ハイブリダイゼーション産物の同定は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動後のサイズ推定（野生型と突然変異株ＩＮＤアレル由来のハイブリダイズ用ＤＮＡ（制限）断片をゲル上で可視的に分離できるよう前記断片間のサイズ差につながる多数の挿入または欠失されたヌクレオチドを含む突然変異株ＩＮＤアレルなど）；ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動後に２つの異なる特異的ハイブリダイゼーション産物の存在または不在を評価する（それによって突然変異株ＩＮＤアレルの診断ハイブリダイゼーションを、任意に、野生型ＩＮＤアレルの診断ハイブリダイゼーションとは別に実施可能になる）；ハイブリダイズ用ＤＮＡ（制限）断片の直接配列決定；または蛍光ベースの検出方法によって起こり得る。
【０１６２】
特定の突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断するのに適したプローブの例については実施例で説明する。
【０１６３】
さらに、本明細書に記載の特定の突然変異株ＩＮＤアレル特異的配列情報を用いて、ＰＣＲ−またはハイブリダイゼーションベースの増幅方法とは異なる特定の突然変異株ＩＮＤアレルに特異的な検出方法を開発することも可能である。このような別の検出方法としては、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）技術（参照により本明細書に援用する米国特許第５，９８５，５５７号明細書「Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、同第６，００１，５６７号明細書「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅなどに記載）としても知られる特定の核酸構造の侵入切断を利用した線形シグナル増幅検出方法、ＴａｑｍａｎなどのＲＴ−ＰＣＲベースの検出方法、あるいはＳＮＰｌｅｘ、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｓｅ伸長（ＳＢＥ）といった他の検出方法などがあげられる。簡単に説明すると、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）技術では、標的変異配列を、たとえば変異配列または５’フランキング領域と変異領域との間の連結領域の配列のヌクレオチド配列を含む標識した第１の核酸オリゴヌクレオチドならびに、変異配列のすぐ下流で変異配列と隣接した３’フランキング配列を含む第２の核酸オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすればよく、この場合、第１のおよび第２のオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのヌクレオチド分だけオーバーラップする。このハイブリダイゼーションによって生成される二重鎖構造または三重鎖構造は、酵素（Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標））での選択的プローブ切断で標的配列を無傷のまま残すことを可能にする。その後、シグナルをさらに増幅させる中間ステップによって、切断された標識プローブを潜在的に検出する。
【０１６４】
「キット」とは、本明細書で使用する場合、本発明の方法、特に、生体試料における特定の突然変異株ＩＮＤアレルの同定または特定の突然変異株ＩＮＤアレルを含む植物材料の接合状態の判断を実施するための一組の試薬を示す。特に、本発明のキットの好ましい実施形態は、特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するための上述したような少なくとも２つの特異的プライマーあるいは、接合状態を判断するための少なくとも２つまたは３つの特異的プライマーを含む。任意に、キットは、ＰＣＲ同定プロトコールにて本明細書に記載の他の試薬をさらに含むものであってもよい。あるいは、本発明のもうひとつの実施形態によれば、キットは、生体試料の核酸と特異的にハイブリダイズして、そこにある特定の突然変異株ＩＮＤアレルの存在を同定する、特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するための上述したような少なくとも１つの特異的プローブを含あるいは、接合状態を判断するための少なくとも２つまたは３つの特異的プローブを含むものであってもよい。任意に、キットは、特異的プローブを用いて生体試料における特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するための他の試薬（ハイブリダイズ用緩衝液、標識などであるが、これに限定されるものではない）をさらに含むものであってもよい。
【０１６５】
品質制御（種子ロットの純度など）、植物材料あるいは、食品または飼料などであるが、これに限定されるものではない植物材料を含むまたは植物材料に由来する材料における特定の突然変異株ＩＮＤアレルの存在または非存在の検出の目的で、本発明のキットを使用可能であり、その構成要素を具体的に調整可能である。
【０１６６】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、ＰＣＲなどのテンプレート依存性プロセスでの新生核酸の合成を予備刺激できる核酸を包含する。一般に、プライマーは、１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、これよりも長い配列を用いることも可能である。プライマーは二本鎖の形態でも提供できるが、一本鎖の形態が好ましい。プローブをプライマーとして使用することも可能であるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと結合するように設計され、増幅プロセスで使用する必要はない。
【０１６７】
「認識する」という表現は、特異的プライマーに言及して本明細書で使用する場合、特異的プライマーが、当該方法に記載の条件（ＰＣＲ同定プロトコールの条件など）下で特定の突然変異株ＩＮＤアレルにおける核酸配列と特異的にハイブリダイズされることで、陽性対照および陰性対照の存在によって特異性が判断される事実を示す。
【０１６８】
「ハイブリダイズする」という表現は、特異的プローブに言及して本明細書で使用する場合、プローブが、標準的なストリンジェンシー条件下で特定の突然変異株ＩＮＤアレルの核酸配列の特定の領域に結合するという事実を示す。標準的なストリンジェンシー条件とは、本明細書で使用する場合、本明細書に記載のハイブリダイゼーションの条件あるいは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）に記載されているような従来のハイブリダイズ条件を示す。後者は、たとえば、以下のステップを含み得る。１）植物ゲノムＤＮＡ断片またはＢＡＣライブラリＤＮＡをフィルターに固定化し、２）フィルターを、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡにて６５℃で１〜２時間プレハイブリダイズし、３）標識済みのハイブリダイゼーションプローブを加え、４）１６〜２４時間インキュベートし、５）フィルターを６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて６８℃で３０分間洗浄し、６）フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて６８℃で３回（３０ｍｌ中３０分間を２回、５００ｍｌ中１０分間を１回）洗浄し、７）フィルターを−７０℃でＸ線フィルムに４〜４８時間曝露する。
【０１６９】
本明細書で使用する場合、「生体試料」は、植物、植物材料または植物材料を含む生成物の試料である。「植物」という用語には、成熟のあらゆる段階の植物組織ならびに、当該植物から採取または当該植物由来の細胞、組織または器官（限定することなく、種子、葉、茎、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物またはプロプラストを含む）を包含することを意図している。「植物材料」は、本明細書で使用する場合、植物から得られるまたは植物由来の材料を示す。植物材料を含む生成物は、植物材料を用いて生成されたまたは植物材料を混入させることが可能な食品、飼料または他の生成物に関する。本発明の文脈では、試料中での核酸の存在を暗示する特定の突然変異株ＩＮＤアレルに特異的な核酸の存在について当該生体試料を試験する旨は理解できよう。よって、生体試料の特定の突然変異株ＩＮＤアレルを同定するための本明細書にて示す方法は、特定の突然変異株ＩＮＤアレルを含む核酸の生体試料での同定に関する。
【０１７０】
また、本発明は、１つの植物における特定のＩＮＤアレルの組み合わせ、１つ以上の特定の突然変異株ＩＮＤアレルを１つの植物から別の植物に移行させること、１つ以上の特定の突然変異株ＩＮＤアレルを含む植物、これらの植物から得られる後代ならびに、これらの植物から得られる植物細胞、植物の一部および植物種子にも関する。
【０１７１】
一実施形態では、好適な数の部分ノックアウトｉｎｄアレルおよび／または完全ノックアウトｉｎｄアレルおよび／または異なるタイプの部分ノックアウトｉｎｄアレルおよび／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを単一の裂開種子植物で組み合わせ、植物の果実裂開特性を変化させる、特に脱粒を低減または脱粒を収穫後まで遅延させると同時に、莢の農学的に妥当な脱穀性を維持するための方法が得られる。
【０１７２】
一態様では、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の果実裂開特性を変化させる、特に脱粒を低減または脱粒を収穫後まで遅延させると同時に、莢の農学的に妥当な脱穀性を維持するための方法であって、
−  少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を生成および／または選択するステップであって、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子の少なくとも２つのアレルが、上述したような部分ノックアウトｉｎｄアレルであるステップと、
−  果実裂開特性が変化した植物、特に脱粒が低減または収穫後まで遅延されると同時に、莢が農学的に妥当な脱穀性を維持する植物を選択するステップと、を含む、方法が得られる。
【０１７３】
この態様の一実施形態では、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物が、ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１遺伝子を含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物である。この実施形態の特定の態様では、少なくとも２つの部分ノックアウトｉｎｄアレルが、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の部分ノックアウトｉｎｄアレルである。
【０１７４】
もうひとつの態様では、この方法は、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を生成および／または選択するステップをさらに含み、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子の少なくとも２つの別のアレルが、上述したような完全ノックアウトｉｎｄアレルである。一実施形態では、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物が、ＩＮＤ−Ａ１およびＩＮＤ−Ｃ１遺伝子を含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物である。この実施形態の特定の態様では、少なくとも２つの部分ノックアウトｉｎｄアレルがＩＮＤ−Ａ１遺伝子の部分ノックアウトｉｎｄアレルであり、少なくとも２つの完全ノックアウトｉｎｄアレルがＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の完全ノックアウトｉｎｄアレルである。
【０１７５】
本発明のもうひとつの実施形態では、植物または種子から生育された植物の果実裂開特性が変更され、特に脱粒が低減または収穫後まで遅延されると同時に、莢が農学的に妥当な脱穀性を維持する、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むハイブリッドアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物植物または種子、特にハイブリッドセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物または種子を生成するための方法であって、
−  上述したように、第１の部分ノックアウトｉｎｄアレルをホモ接合状態で含む第１の植物と、第２の部分ノックアウトｉｎｄアレルをホモ接合状態で含む第２の植物とを生成および／または同定するステップと、
−  第１および第２の植物を交雑させ、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子の２つの部分ノックアウトｉｎｄアレルを含む交雑種からＦ１ハイブリッド種子を採取するステップと、を含む方法。
【０１７６】
本発明の別の実施形態では、上述したように、第１の植物が第１の完全ノックアウトｉｎｄアレルをホモ接合状態でさらに含み、第２の植物が第２の完全ノックアウトｉｎｄアレルをホモ接合状態でさらに含み、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子の２つの部分ノックアウトｉｎｄアレルおよび２つの完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＦ１ハイブリッド種子が採取される。
【０１７７】
部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルをホモ接合状態で含む親植物を用いて、脱粒が低減または遅延されると同時に莢の農学的に妥当な脱穀性が維持される植物を生育可能なハイブリッド種子を生成する可能性によって、２つの完全ノックアウトｉｎｄアレルをホモ接合状態で含む１種類の親植物と、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されたような１つの完全ノックアウトｉｎｄアレル状態を含む１種類の親植物を使うよりも利点が得られる。これは、両方の親植物が農学的に妥当な脱穀性を示す莢を生成するのに対し、ホモ接合状態の２つの完全ノックアウトｉｎｄアレルを含む親植物の莢では、種子を収穫しにくい筒状の莢が形成されるためである。
【０１７８】
本発明の一態様では、Ｆ１ハイブリッド種子が部分ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合となるように、第１と第２の部分ノックアウトｉｎｄアレルが同一である。本発明のもうひとつの態様では、Ｆ１ハイブリッド種子が完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合となるように、第１と第２の完全ノックアウトｉｎｄアレルが同一である。
【０１７９】
国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されているものなどの完全ノックアウトｉｎｄアレル（すなわち、機能的発現が完全に消失されたＩＮＤアレル）および／または本発明による部分ノックアウトｉｎｄアレル（すなわち、機能的発現が部分的に消失されたＩＮＤアレル）を、標準的な育種技術で組み合わせることが可能である。
【０１８０】
部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルは、たとえば、
（ａ）部分ノックアウトｉｎｄアレルは上述したように、および完全ノックアウトｉｎｄアレルについては国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）において記述されるように、各々１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含む２つ以上の植物を生成および／または同定し、
（ｂ）１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含む第１の植物を、１つ以上の他の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含む第２の植物と交雑させ、交雑種からＦ１種子を採取し、任意に、上述したような第１の植物由来の１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを、第２の植物由来の１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルとともに含むＦ１植物を同定し、
（ｃ）任意に、選択されたすべての部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＦ１植物が得られるまでステップ（ｂ）を繰り返し、
（ｄ）任意に、
−  上述したように、部分および国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）において、完全ノックアウトｉｎｄアレルについて、あるいは突然変異株ＩＮＤアレルの接合状態を判断することで、選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合またはヘテロ接合であるＦ１植物を同定するか、あるいは、
−  以下のステップのうちの１つを実施することで、選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルのうちの１つ以上にとってホモ接合である植物を生成し、
−  上述したような１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＦ１植物の処理済みの小胞子または花粉細胞から倍加半数体植物を抽出し、
−  １つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＦ１植物を１以上の世代（ｙ）で自家受粉し、自家受粉種からＦ１  Ｓｙ種子を採取し、上述したように１つ以上の部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合であるＦ１  Ｓｙ植物を同定することによって、単一の裂開種子植物で組み合わせることが可能である。
【０１８１】
部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルは、たとえば、
（ａ）上述したような１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含む第１の植物を生成および／または同定するか、あるいは、上述したように１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを１つの植物で組み合わせることで第１の植物を生成し（この場合、第１の植物は１つ以上の部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合またはヘテロ接合である）、
（ｂ）１つ以上の部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含む第１の植物を、１つ以上の部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含まない第２の植物と交雑させ、Ｆ１種子を交雑種から採取し（この場合、第１の植物がその部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合であれば、種子は部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってヘテロ接合であり、第１の植物がその部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってヘテロ接合であれば、種子の半分がヘテロ接合で種子の半分が不対である、すなわち、部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含まない）、任意に、上述したような１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＦ１植物を同定し、
（ｃ）上述したような１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＦ１植物を、１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含まない第２の植物と１以上の世代（ｘ）で戻し交雑させ、交雑種からＢＣｘ種子を採取し、１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＢＣｘ植物を各世代で同定し、
（ｄ）任意に、以下のステップのうちの１つを実施することで、１つ以上の選択された部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合であるＢＣｘ植物を生成し、
−  上述したような１つ以上の所望の部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＢＣｘ植物の処理済みの小胞子または花粉細胞から倍加半数体植物を抽出し、
−  １つ以上の所望の部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むＢＣｘ植物を１以上の世代（ｙ）で自家受粉し、自家受粉種からＢＣｘ  Ｓｙ種子を採取し、上述したように１つ以上の所望の部分および／または完全ノックアウトｉｎｄアレルにとってホモ接合であるＢＣｘ  Ｓｙ植物を同定することによって、単一の裂開種子植物で組み合わせることが可能である。
【０１８２】
第１および第２の裂開種子植物は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物または別のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種由来の植物であってもよい。あるいは、第１の植物が、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物または別のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種由来の植物であってもよく、第２の植物が、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）育種系統、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）育種系統、特にセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）育種系統あるいは、別のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種由来の育種系統由来の植物であってもよい。「育種系統」とは、本明細書で使用する場合、好ましくは、ハイブリッド子孫の生成に用いられる好ましい遺伝子型および／または表現型によって他の植物系統とは区別可能であるホモ接合植物系統である。
【０１８３】
配列
配列番号１：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ａ１遺伝子のコーディングＤＮＡ。
配列番号２：配列番号１によってコードされる野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質。
配列番号３：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ｃ１遺伝子のコーディングＤＮＡ。
配列番号４：配列番号３によってコードされる野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質。
配列番号５：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ａ１遺伝子のゲノムＤＮＡ。
配列番号６：配列番号５によってコードされる野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質。
配列番号７：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ｃ１遺伝子のゲノムＤＮＡ。
配列番号８：配列番号７によってコードされる野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質。
配列番号９：シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤ１遺伝子のコーディングＤＮＡ
配列番号１０：配列番号９によってコードされるシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＩＮＤ１タンパク質。
配列番号１１：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０６および−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１２：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０６検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１３：ＩＮＤ−Ａ１−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１４：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０９および−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１５：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０９検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１６：ＩＮＤ−Ａ１−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１７：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ１３および−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１８：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ１３検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号１９：ＩＮＤ−Ａ１−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２０：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０４および−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２１：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０４検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２２：ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２３：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０８および−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２４：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０８検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２５：ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２６：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０９および−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２７：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０９検出用のオリゴヌクレオチド
配列番号２８：ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴ検出用のオリゴヌクレオチド
【０１８４】
実施例で特に明記しないかぎり、組換えＤＮＡ技術はすべて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ＵＳＡの第１巻および第２巻、Ｂｒｏｗｎ  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （ＵＫ）の第Ｉ巻および第ＩＩ巻に記載されているような標準的な分子生物学的技術に基づいて実施している。植物分子ワークの標準的な材料および方法については、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ  （ＵＫ）およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＵＫの共同出版である、Ｒ．Ｄ．Ｄ．  Ｃｒｏｙ著、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ  （１９９３）に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応の標準的な材料および方法は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ  （１９９５）  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓおよびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｔ  ａｌ．  （２０００）  ＰＣＲ  −  Ｂａｓｉｃｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ，  Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙに記載されている。ＡＦＬＰ解析の標準的な手順は、Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５，  ＮＡＲ  ２３：４４０７〜４４１４）ならびに欧州特許出願公開第ＥＰ  ５３４８５８号明細書に記載されている。
【実施例】
【０１８５】
実施例１−部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレル（ｉｎｄ）の生成と単離
配列表の配列番号１または３および５または７に示すＩＮＤ遺伝子の変異を以下のようにして生成および同定した。
−  エリート春アブラナ育種系統から得た３０，０００個の種子（Ｍ０種子）を脱イオン水または蒸留水中で湿った濾紙の上で２時間かけて予備吸水させた。種子の半分を０．８％ＥＭＳに曝露し、半分を１％ＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ：Ｍ０８８０）に曝露して、４時間インキュベートした。
−  変異原化種子（Ｍ１種子）を３回すすぎ、ドラフトで一晩乾燥させた。３０，０００のＭ１植物を土壌で生育させ、自家受粉させてＭ２種子を生成した。個々のＭ１植物について各々Ｍ２種子を収穫した。
−  異なるＭ１植物由来の２×４８００のＭ２植物を生育させ、ＣＴＡＢ法（Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ，  １９８７，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １９：１１〜１５）で個々のＭ２植物それぞれの葉試料からＤＮＡ試料を調製した。
−  標準的な配列決定技術（Ａｇｏｗａ）による直接配列決定と、ＮｏｖｏＳＮＰソフトウェア（ＶＩＢ  Ａｎｔｗｅｒｐ）を用いる点変異の存在についての配列の分析によって、ＩＮＤタンパク質、特にＩＮＤタンパク質のｂＨＬＨドメインでアミノ酸の置換を引き起こすＩＮＤ遺伝子における点変異の存在についてＤＮＡ試料をスクリーニングした。
−こうして、上記の表３ａおよび表３ｂに示す部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレル（ｉｎｄ）を同定した。
【０１８６】
結論として、上記の例は部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤアレルをどのようにして生成および単離可能であるかを示している。また、以下の実施例で説明するように、このような突然変異株アレルを含む植物材料を使用して、選択した突然変異株ＩＮＤアレルを植物で組み合わせることが可能である。
【０１８７】
実施例２−部分ノックアウト突然変異アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＩＮＤアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の同定
実施例１で同定したＩＮＤ遺伝子に変異を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を以下のようにして同定した。
−  Ｍ２植物のＤＮＡ試料で同定した各突然変異株ＩＮＤ遺伝子について、ＩＮＤ変異を含むＭ２植物と同一のＭ１植物に由来する少なくとも５０のＭ２植物を生育させ、個々のＭ２植物それぞれの葉試料からＤＮＡ試料を調製した。
−  実施例１で説明したようにして、同定された点ＩＮＤ変異の存在についてＤＮＡ試料をスクリーニングした。
−  同一の変異を含むヘテロ接合およびホモ接合（電気泳動図に基づいて判断）Ｍ２植物を自家受粉させ、Ｍ３種子を収穫した。
【０１８８】
実施例３−部分および／または完全ノックアウト突然変異アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＩＮＤ遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の果実裂開特性の分析
アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物における部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の存在とアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の果実裂開特性との相関を判断するために、部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子だけをホモ接合状態で含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物と、部分および完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の両方をホモ接合状態で含むものの果実裂開特性を温室および圃場で分析し、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載されているような２〜４の完全ノックアウトｉｎｄアレルを含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物の果実裂開特性と、以下のようにして比較した。
−  果実朔片縁辺と種子莢の裂開特性が部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の存在に影響されるか否か、影響される場合はどのようにして影響されるのかについて調べるために、以下の肉眼試験を用いてｉｎｄ果実を野生型果実と比較した。
（ａ）異なる部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の存在によって生じる莢および植物の表現型の差を判断するための裸眼での種子莢および植物の検査一般。莢の表現型の判断：莢が完全に成長して満ちていて、黄変直前の状態にある場合、５つの無作為に選んだ莢（１系統あたり複数の植物が手に入る場合は異なる植物由来）で両方の朔片がもう触れていない（莢の遠位端）ゾーンで朔片とくちばしの輪郭をなすゾーンの鋭さの度合いを評価し、０〜１０または１〜５のスコアを付けた。０または１はそれぞれ、はっきりとしたくぼみと、朔片とくちばしとを分ける鋭利なゾーンがある場合である。１〜３または２はそれぞれ、くぼみがいくらかあり、朔片をくちばしから隔てる明確ではあるが若干曖昧なゾーンがある場合である。４〜６または３はそれぞれ、朔片とくちばしが２つの異なる組織として観察可能ではあるが、両者の切り替えがきわめて滑らかな場合である。７〜９または４はそれぞれ、朔片とくちばしが辛うじて異なる組織として観察できる場合である。１０または５はそれぞれ、朔片とくちばしとの切り替えが完全になめらかで両方の組織型の間に明確な差がない、すなわち、莢の遠位端で朔片とくちばしの間にくぼみが少ないほどスコアが高くなる。０または１のスコアはそれぞれ（朔片とくちばしの間にはっきりとしたくぼみ）、野生型の莢の表現型に対応し、特に裂莢が起こりやすい莢の表現型に対応している；スコア１〜９または２〜４はそれぞれ（朔片とくちばしとの間が徐々に切り替わっている）、耐裂莢性の莢の表現型に対応し、限られた物理的な力を加えることで裂開ゾーンに沿って莢を開くことができるように、脱粒が有意に低減または遅延されると同時に、莢の農学的に妥当な脱穀性が維持される。スコア１０または５はそれぞれ（朔片とくちばしの間にくぼみがない）、耐裂莢性の莢の表現型に対応し、限られた物理的な力を加えるだけでは裂開ゾーンに沿って莢を開くことができないように、莢の農学的に妥当な脱穀性が生じない程度まで脱粒が低減または遅延される。
【０１８９】
（ｂ）異なる部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の存在によって生じる耐裂莢性の増大を判断するための手動衝撃加振試験（ＭＩＴ）：部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子だけをホモ接合状態で含むか、部分および完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の両方をホモ接合状態で含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）系統と、対応する野生型ＩＮＤアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）系統の耐裂莢性のレベルを、莢を手でねじって閉じた成熟莢を開くのに必要な物理的な力を判断することで、半定量的な方法で比較した。この物理的な力に基づいて、莢の耐裂莢性に１〜５のスコアを付けた。１は最も小さなねじれで裂開ゾーンに沿って完全に開く莢、２〜４は裂開ゾーンの基部だけが開き、完全に開くにはさらに強いねじれが必要な莢、５は破砕できるだけで、裂開ゾーンに沿っては開かない莢である。
【０１９０】
（ｃ）異なる部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の存在によって引き起こされる耐裂莢性の増加を判断するための不規則衝撃加振試験（ＲＩＴ）：部分ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子だけをホモ接合状態で含むか、部分および完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の両方をホモ接合状態で含むセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）系統と、対応する野生型ＩＮＤアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）系統の耐裂莢性のレベルを、Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２，上掲）に従って両系統由来の莢試料の半減期を判断することで、定量的に比較した。特に、各系統由来の２０個の無傷の成熟莢の複製試料２つでＲＩＴを実施した。２０個の莢を直径１２．５ｍｍの６個の鋼球と一緒に直径２０ｃｍの円筒形の容器に軸を垂直にして入れた。次に、この容器を、振動数４．９８Ｈｚ、ストローク５１ｍｍで水平面にて単純に調和運動させた。試験前に健全性を確認しておいた莢を、１０秒、２０秒、４０秒、さらには仮に５０％を超える莢が無傷であれば８０秒間の累積時間で振盪した。それぞれの時間経過後にドラムを開き、閉じた莢を数えた。莢を調べ、両方の朔片の裂開ゾーンが依然として閉じたままであれば「閉じた」に分類した。よって、１つまたは両方の朔片が離れたため種子が放出されてしまっていたら、莢を「開いた」に分類した。裂開ゾーンが開くことなく大多数の莢が破れたり損傷を受けたりした場合は、試料を「計数不能」とした（表５ｂでは＊で表示）。各点の重み付けを均等にするために、１を加えてｌｏｇ１０を取ることで、独立した変数である時刻でデータの間隔を等しくした。開いた莢のパーセンテージｐをロジット変換すなわちｌｏｇｉｔ  ｐ＝ｌｏｇｅ（ｐ／１００−ｐ）で変換した。次に、変換後の時刻とパーセンテージデータに線形モデルをフィットさせ、半減期の推測に用いた。
【０１９１】
（ｄ）耐裂莢性、脱穀性および収量ならびに、植物における特定の突然変異株ＩＮＤアレルの存在の関係を判断するための圃場試験：突然変異株ＩＮＤアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）系統と、対応する野生型ＩＮＤアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）系統の耐裂莢性、脱穀性および収量のレベルを、脱粒（ＳＨＡＴ）、コンバイナー収穫性（ＣＨＡ１）および脱穀性（ＣＨＡ２）のレベルを判断して比較することで半定量的に比較し、また、ｉｎｄ植物でのプロットと野生型植物でのプロットとの間で、圃場にて刈り取り後のプロットごとの種子収量（ＹＬＤＰ）および藁脱穀後の種子収量（ＹＬＤＳ）を判断して比較することで定量的に比較した。プロットにある実用上すべての植物が収穫前にシャッタリングしたことを示すスコア１から、プロットにある実用上すべての植物が収穫前にシャッタリングしなかったことを示すスコア９まで、プロットにスコア１〜９を付けて収穫前プロットの脱粒レベルを示した。プロットにスコア１〜５を付け、コンバイナーでのプロットの収穫性レベルを示した。スコア１〜３または５はそれぞれ、コンバイナーでのプロットの収穫が困難、実行可能または容易であったことを示す。プロットにスコア１〜５を付け、プロットの脱穀性レベルを示した。スコア１〜３または５はそれぞれ、コンバイナー収穫後に藁に残っている種子を手作業で収穫することが困難、実行可能または容易であったことを示す。プロットごとに種子をコンバインハーベスタで収穫し、種子を秤量することで、刈り取り後のプロットごとの種子収量（ＹＬＤＰ；プロットごとのグラム単位で表示）を判断し、また、コンバインハーベスタでの種子収穫後に藁に残っている種子を手作業で収穫して藁脱穀後の種子収量（ＹＬＤＳ；藁の重量％で表示）を判断した。
【０１９２】
−  種子藁の朔片縁辺の細胞が部分および／または完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ遺伝子の存在によって影響されるか否か、影響される場合はどのようにして影響されるのかを一層綿密に調べるために、種子莢の顕微鏡評価によってｉｎｄ果実の切片を野生型果実の切片と比較した。
−  外植体：似たような発達段階（開花後（ＤＡＡ）約３５日目、目に見える果皮黄変が開始される時期と密接に対応する発達段階）にある莢の中心と遠位端から採取した約３ｍｍの外植体とサイズを、温室で生育させた植物から収穫した（遺伝子型ごとに莢３つ）。１つの裂開ゾーンを莢から切り取った。
【０１９３】
−  固定：１０％ホルマリンおよび０．２５％グルタルアルデヒドを含む１００ｍＭのＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７）中で、合計４時間固定した。１時間後と２時間後に１５分間の減圧浸潤を実施した。各減圧浸潤後に固定液を交換した。
【０１９４】
−  脱水：標本を１００ｍＭのＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７）で３０分間、２回すすいだ。室温にて５０％エタノールで６０分間（’）、７０％エタノールで９０’、８０％エタノールで９０’、９０％エタノールで９０’、９５％エタノールで９０’、１００％エタノールで９０’、０．８５％ＮａＣｌの水溶液で希釈した工業用エタノールで脱水した。
【０１９５】
−  包埋：３成分樹脂（塩基性樹脂、活性化剤、硬化剤）キットである、Ｌｅｉｃａ  ７０２２−３１７３１  ＨｉｓｔｏｒｅｓｉｎまたはＫｕｌｚｅｒ  Ｈｉｓｔｏ−Ｔｅｃｈｎｉｋ  ７１００（Ｈｅｒａｅｕｓ）包埋キットで包埋した。３種類の成分を製造業者の指示どおりの割合で以下のように用いた。標本を５０％エタノール／５０％塩基性樹脂にて４時間、３０％エタノール／７０％塩基性樹脂（任意に４℃で）にて一晩、１００％塩基性樹脂で２〜４時間、塩基性樹脂と減圧浸潤を２０’（任意に４℃で）交換後に１００％塩基性樹脂で１日、この媒質で２０分間減圧浸潤後に塩基性樹脂＋活性化剤（１％）（「浸潤剤」）で１日インキュベートした。標本を塩基性樹脂＋活性化剤（１％）＋硬化剤（１５ｍｌ中１ｍｌ）（「包埋剤」）で洗浄した。フラット包埋型（ＡＧＡＲフラット包埋型Ｇ３５３１ｌ、キャビティ約３００μｌ：長さ１４ｍｍ×幅６ｍｍ×深さ４ｍｍ）に包埋した：包埋剤１００〜１２５μｌ／キャビティを加え、包埋剤を５５℃で約１時間重合し、組織を重合後の包埋剤（外植体１つ／キャビティ）に乗せ、キャビティを包埋剤で包み、包埋剤を５５℃で３〜５時間重合し、型を冷却し、プラスチックブロックを型から取り除き、密閉容器（エッペンドルフチューブなど）に入れて室温で保管した。
【０１９６】
−  切片化：プラスチックブロックの平らな側を１ｃｍ３のｐｅｒｐｅｘブロックに糊付けし、標本の周りを四角にトリミングした。４μｍの切片（遺伝子型１つあたり外植体３〜４つ、外植体１つあたり切片約２５個）をミクロトームにてラルフガラスナイフで切り出した（切断角約６°で厚さ６ｍｍのガラス棒を用いてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇのｈｉｓｔｏｋｎｉｆｅｍａｋｅｒの−１位置で作成）。Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理したスライドガラスに切片を貼り付けた。
【０１９７】
−  リグニンのデモンストレーション：蛍光用の装備を設けた顕微鏡（Ｚｅｉｓｓフィルターセット０２付き）を用いて、Ｅｕｋｉｔｔにのせた未染色切片を調べた。リグニンは明るい青みがかった蛍光を発する。
【０１９８】
−  組織像の評価：ＤＩＣ−Ｎｏｒｍａｓｋｉまたは自己蛍光（Ｚｅｉｓｓフィルターセット１８付き−−励起ＢＰ３９０−４２０；放出ＬＰ４５０）を用いて未染色切片を可視化した。
【０１９９】
植物材料：
ＩＮＤ−Ａ１遺伝子に完全ノックアウト変異を含む植物系統の後代（ｉｎｄ−ａ１Ｆとして示す）、特に国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載のｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０１アレル（表５にｉｎｄ−ａ１−０１として示す）ならびに、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子における部分ノックアウト変異（ｉｎｄ−ｃ１Ｐとして示す）、特に表３ｂに示すｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０４、−ＥＭＳ０８および−ＥＭＳ０９アレル（表５にｉｎｄ−ｃ１−０４、−０８、−０９として示す）で、遺伝子型ｉｎｄ−ａ１Ｆ／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐ（すなわち、ホモ接合二重突然変異株植物）、ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐ（すなわち、ホモ接合一重突然変異株植物）、ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１（すなわち、野生型植物）。
【０２００】
ＩＮＤ−Ａ１遺伝子に部分ノックアウト変異を含む植物系統の後代（ｉｎｄ−ａ１Ｐとして示す）、特に表３ａに示すｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０６、−ＥＭＳ０９および−ＥＭＳ１３アレル（表５にｉｎｄ−ａ１−０６、−０９、−１３として示す）ならびに、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子における完全ノックアウト変異（ｉｎｄ−ｃ１Ｆとして示す）、特に国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載のｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０１アレルおよびｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０３アレル（表５にｉｎｄ−ｃ１−０１および−０３として示す）で、遺伝子型ｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆ（すなわち、ホモ接合二重突然変異株植物）、ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆ（すなわち、ホモ接合一重突然変異株植物）、ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１（すなわち、野生型植物）。
【０２０１】
巨視的評価：
ａ）種子莢および植物の裸眼での検査
−  遺伝子型ｉｎｄ−ａ１Ｆ／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐまたはｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆのホモ接合二重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢は、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載の１つの完全ノックアウトｉｎｄアレルをホモ接合状態で含み、１つの完全ノックアウトｉｎｄアレルをヘテロ接合状態で含む植物（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１Ｆ／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１ＦまたはＩＮＤ−Ａ１／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆであり、ｉｎｄ−ａ１Ｆは完全ノックアウトｉｎｄ−ａ１アレル、特に、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載のｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０１またはｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０５アレルであり、ｉｎｄ−ｃ１Ｆは完全ノックアウトｉｎｄ−ｃ１アレル、特に、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載のｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０１またはｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０３アレル）由来の莢と類似の表現型を示す。特に、これらの突然変異株ＩＮＤ同胞植物の莢の朔片縁辺は通常、国際特許出願公開第ＷＯ０９／０６８３１３号パンフレット（欧州特許出願第ＥＰ  ０７０２３０５２号の優先権を主張）に記載のホモ接合二重完全ノックアウト突然変異株ＩＮＤ同胞植物（野生型ＩＮＤ同胞植物由来の莢に比して、適切な朔片縁辺画定の欠如を示し、特に果実の近位端と遠位端の両方で顕著である）よりも明確に画定されているが、野生型同胞植物の莢の遠位端における朔片とくちばしの間のはっきりとしたくぼみは、これらの突然変異株植物ではホモ接合二重完全ノックアウトｉｎｄ同胞植物同様にかなり欠如しており、朔片とくちばし組織との間の切り替えもゆるやかであった（温室育成植物についての表５ａならびに圃場育成植物についての表５ｂに示す可視スコアも参照のこと）。
【０２０２】
−  ホモ接合一重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢（遺伝子型：ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐまたはｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１）は、遺伝子型ｉｎｄ−ａ１Ｆ／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐまたはｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆのホモ接合二重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢と類似の莢の形態が変化した遺伝子型ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１／ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９／ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９のホモ接合一重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢以外、莢の形態が野生型ＩＮＤ同胞植物由来の莢と類似していた（温室育成植物についての表５ａならびに圃場育成植物についての表５ｂに示す可視スコアも参照のこと）。植物におけるヘテロ接合状態でのｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９アレルの存在（遺伝子型：ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９）は、遺伝子型ｉｎｄ−ａ１Ｆ／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐまたはｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆのホモ接合二重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢と類似の形態が変化した莢を生じるのに十分であったこともさらに観察された。塩基性ＤＮＡ結合ドメインの保存されたアミノ酸に置換変異を含むｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９アレルは、まだ二量体を形成できるが、調節された遺伝子のｂＨＬＨ結合部位との結合はできない顕性不活性ＩＮＤタンパク質を産生できると考えられた。
【０２０３】
ｂ）不規則衝撃加振試験：
−  表５は、完全ノックアウトｉｎｄ−ｃ１アレルをホモ接合状態で、部分ノックアウトｉｎｄ−ａ１アレルをホモ接合状態で含む植物由来の莢のほうが、完全ノックアウトｉｎｄ−ａ１アレルをホモ接合状態で、部分ノックアウトｉｎｄ−ｃ１アレルをホモ接合状態で含む植物由来の莢よりも通常はＬＤ５０値が高めであることから、ＩＮＤ−Ｃ１アレルの変異のほうがＩＮＤ−Ａ１アレルの変異よりも耐裂莢性に対する作用が強い可能性があることを示している。
【０２０４】
【表９】
0005770086.tif 000010
【０２０５】
【表１０】
0005770086.tif 000011
【０２０６】
ｃ）圃場試験
表５ｃは、表記のｉｎｄ植物および野生型植物を用いて圃場プロットについて上述したようにして判断した脱粒（ＳＨＡＴ）、コンバイナー収穫性（ＣＨＡ１）、脱穀性（ＣＨＡ２）、刈り取り後のプロットあたりの種子収量（ＹＬＤＰ）、藁脱穀後の種子収量（ＹＬＤＳ）のレベルを示す。収量ＷＴＳｅｇ％値は、ＹＬＤＰを１つの分離個体群内の野生型分離個体のパーセンテージで表したものである。
【０２０７】
【表１１】
0005770086.tif 000012
【０２０８】
顕微鏡評価：
−  遺伝子型ｉｎｄ−ａ１Ｆ／ｉｎｄ−ａ１Ｆ、ｉｎｄ−ｃ１Ｐ／ｉｎｄ−ｃ１Ｐまたはｉｎｄ−ａ１Ｐ／ｉｎｄ−ａ１Ｐ、ｉｎｄ−ｃ１Ｆ／ｉｎｄ−ｃ１Ｆのホモ接合二重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢と、遺伝子型ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１／ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９／ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９のホモ接合一重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢を、温室条件下で生育させたところ、裂開ゾーン全体にわたって遠位端が木化し、維管束組織細胞などの隣接する細胞型からの裂開ゾーンの細胞の分化があまり起こらず、細胞の木化層は主に内側の莢壁（すなわち、ｅｎｂ細胞）に見られた。莢の中心では、裂開ゾーン全体にわたって木化は発生しなかったが、莢には内側の莢壁が隔壁に結合する代わりに木化細胞の余分な層がわずかにあったことが示された。
【０２０９】
−  遺伝子型ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０１／ｉｎｄ−ａＡ１−ＥＭＳ０１、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９／ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０９のホモ接合二重突然変異株ＩＮＤ同胞植物由来の莢では、莢の遠位端および中心の両方で、裂開ゾーン全体にわたって木化が認められ、維管束組織細胞などの隣接する細胞型からの裂開ゾーンの細胞の分化があまり起こらず、細胞の木化層は主に内側の莢壁（すなわちｅｎｂ細胞）に見られた。
【０２１０】
実施例４−突然変異株ＩＮＤ遺伝子の検出および／または（エリート）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）系統への移行
突然変異株ＩＮＤ遺伝子を以下の方法で（エリート）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）育種系統に移行した：突然変異株ＩＮＤ遺伝子（ドナー植物）を含む植物を、（エリート）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）系統（エリート親／反復親）または突然変異株ＩＮＤ遺伝子を欠いた変種と交雑させた。以下の浸透性交雑スキームを使用する（突然変異株ＩＮＤ遺伝子をｉｎｄと略し、野生型をＩＮＤで示す）。
初期交雑：ｉｎｄ／ｉｎｄ（ドナー植物）×ＩＮＤ／ＩＮＤ（エリート親）
Ｆ１植物：ＩＮＤ／ｉｎｄ
ＢＣ１交雑：ＩＮＤ／ｉｎｄ×ＩＮＤ／ＩＮＤ（反復親）
ＢＣ１植物：５０％ＩＮＤ／ｉｎｄおよび５０％ＩＮＤ／ＩＮＤ
突然変異株ＩＮＤアレル（ｉｎｄ）用の分子マーカー（ＡＦＬＰ、ＰＣＲ、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）など；下記も参照のこと）を用いて５０％ＩＮＤ／ｉｎｄを選択する
【０２１１】
ＢＣ２交雑：ＩＮＤ／ｉｎｄ（ＢＣ１植物）×ＩＮＤ／ＩＮＤ（反復親）
ＢＣ２植物：５０％ＩＮＤ／ｉｎｄおよび５０％ＩＮＤ／ＩＮＤ
突然変異株ＩＮＤアレル（ｉｎｄ）用の分子マーカーを用いて５０％ＩＮＤ／ｉｎｄを選択する。
【０２１２】
ＢＣ３からＢＣ６まで戻し交雑を繰り返す
ＢＣ３〜６植物：５０％ＩＮＤ／ｉｎｄおよび５０％ＩＮＤ／ＩＮＤ
突然変異株ＩＮＤアレル（ｉｎｄ）用の分子マーカーを用いて５０％ＩＮＤ／ｉｎｄを選択する。戻し交雑回数を減らすために（ＢＣ６ではなくＢＣ３までなど）、エリート親の遺伝子バックグラウンドに特異的な分子マーカーを用いることが可能である。
【０２１３】
ＢＣ３〜６  Ｓ１交雑：ＩＮＤ／ｉｎｄ×ＩＮＤ／ｉｎｄ
ＢＣ３〜６  Ｓ１植物：  ２５％ＩＮＤ／ＩＮＤおよび５０％ＩＮＤ／ｉｎｄおよび２５％ｉｎｄ／ｉｎｄ
突然変異株ＩＮＤアレル（ｉｎｄ）用の分子マーカーを用いて、ｉｎｄを含有する植物を選択する。突然変異株および野生型ＩＮＤアレル用の分子マーカーを用いて、突然変異株ＩＮＤアレル（ｉｎｄ／ｉｎｄ）にとってホモ接合である個々のＢＣ３〜６  Ｓ１植物を選択する。その後、これらの植物を種子の生成に利用する。
【０２１４】
ＩＮＤアレルに点変異を含む植物を選定するために、実施例１で説明したものなどの従来技術において周知の標準的な配列決定技術による直接配列決定を用いることが可能である。
【０２１５】
あるいは、ＩＮＤアレルに特定の点変異を含む植物を、その特定の点変異を含まない植物と区別するためのＰＣＲアッセイを開発することも可能である。よって、以下の区別用ＰＣＲアッセイを開発し、実施例１で同定した突然変異株アレル（表３ａおよび３ｂ参照）の存在または非存在ならびに接合状態を検出することが可能である。
−  テンプレートＤＮＡ：
−  ホモ接合またはヘテロ接合突然変異株アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ（以下「ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ」と呼ぶ突然変異株ＩＮＤアレルを含む）。
−  野生型ＤＮＡ対照：野生型アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ（以下「ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ」と呼ぶ突然変異株ＩＮＤアレルの野生型等価物を含む）。
−  陽性ＤＮＡ対照：ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸを含むことが知られているホモ接合突然変異株アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ。
【０２１６】
−  通常、各プライマーセットは、突然変異株と野生型標的遺伝子の両方に特異的な１つのプライマー（ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０６およびＩＮＤ−Ａ１−ＷＴアレルの両方に特異的なプライマーなど）と、ヌクレオチド差に特異的な１つのプライマー（ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０６アレルまたはＩＮＤ−Ａ１−ＷＴアレルのいずれかに特異的なプライマーなど）からなる。一般に、後者のプライマーの最後のヌクレオチドがヌクレオチド差とマッチするが、１つ（またはそれより多く）の別の標的特異的ヌクレオチドを加えて、プライマーとその標的配列とのアニーリングを改善してもよい。
【０２１７】
−  ＰＣＲミックス：２．５μｌ  １０×ＰＣＲ緩衝液（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．２５μｌ  ｄＮＴＰ（２０ｍＭ）、１μｌフォワードプライマー（１０μＭ）、１μｌリバースプライマー（１０μＭ）、０．２５μｌ  Ｔａｑ−ポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、１９．５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ、０．５μｌ  ＤＮＡ（２０〜５０ｎｇ／μｌ）＝合計容量２５μｌ；
−サーモサイクルプロファイル：９５℃で４分間；３０×５℃で１分間（変性）、アニーリング温度で１分間、７２℃で２分間（伸び率）；７２℃で５分間；４℃まで冷却。最適なアニーリング温度については、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００（Ｂｉｏｚｙｍ）でアニーリング温度を５７℃〜７０℃などに変更できる温度勾配ＰＣＲによって判断することが可能である。野生型ＩＮＤ特異的プライマーに最適なアニーリング温度は、野生型アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来のＤＮＡ試料について（後述するような）想定サイズの明確なＰＣＲ断片を検出可能であるが、突然変異株アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来のＤＮＡ試料では検出できない温度である。突然変異株ＩＮＤ特異的プライマーに最適なアニーリング温度は、突然変異株アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来のＤＮＡ試料について（後述するような）想定サイズの明確なＰＣＲ断片を検出可能であるが、野生型アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来のＤＮＡ試料では検出できない温度である。
【０２１８】
−  増幅後、５μｌのローディング染料（オレンジ染料）を１５μｌのＰＣＲ試料に加え、試料を１．５％アガロースゲルにロードする。
【０２１９】
−  突然変異株アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物のゲノムＤＮＡの増幅後に得られる縞模様を以下のように評価する。
−  単一のＰＣＲランと単一のＰＣＲミックス内で突然変異株アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の葉材料から単離したＤＮＡ試料から得られたデータは、以下の条件が満たされるまで受け入れないものとする。
−  野生型ＤＮＡ対照がＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイで想定サイズのＰＣＲ断片を示し、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイでは想定サイズのＰＣＲ断片がない
−  陽性ＤＮＡ対照がＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイで想定サイズのＰＣＲ断片を示し、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイでは想定サイズのＰＣＲ断片がない
【０２２０】
−  ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイで想定サイズのＰＣＲ産物を示さず、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイで想定サイズのＰＣＲ断片を示すレーンは、ゲノムテンプレートＤＮＡの調製元となった対応する植物がＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸにとってホモ接合突然変異株であることを示している。
【０２２１】
−  ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイおよびＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイで想定サイズのＰＣＲ断片を示すレーンは、ゲノムテンプレートＤＮＡの調製元となった対応する植物が、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸにとってヘテロ接合突然変異株であることを示している。
【０２２２】
−  ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイで想定サイズのＰＣＲ断片を示し、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイで想定サイズのＰＣＲ産物を示さないレーンは、ゲノムテンプレートＤＮＡの調製元となった対応する植物が野生型植物であることを示している。
【０２２３】
あるいは、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）技術（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ａｇｂｉｏ）を用いて、ＩＮＤアレルに特定の点変異を含む植物を、その特定の点変異を含まない植物と区別することも可能である。よって、以下の区別用Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）プローブを開発し、実施例４で同定した突然変異株アレルの存在または非存在ならびに、接合状態を検出した（表６参照：
−  突然変異株または対応する野生型標的ＩＮＤ遺伝子に特異的なプローブ（それぞれ「５’フラップ１−ｘ」および「５’フラップ２−ｘ」として示す）ならびに、これらと併用可能な「侵入用」プローブを、表６に示す。通常、各プローブセットは、５’フラップ配列後の第１のヌクレオチドがヌクレオチド差とマッチする（表６の下線付きヌクレオチド）突然変異株または野生型標的遺伝子に特異的な１つのプローブ（いわゆる「一次プローブ」；配列番号１２のプローブはＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０６に特異的であり、配列番号１３のプローブはＩＮＤ−Ａ１−ＷＴに特異的であるなど）と、ヌクレオチド差の上流にあるヌクレオチドに特異的な１つのプローブ（いわゆる「ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）  ｏｌｉｇｏ」；配列番号１１のプローブはＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０６とＩＮＤ−Ａ１−ＷＴとの間のヌクレオチド差の上流にあるヌクレオチドに特異的であるなど）。後者のプライマーの最後のヌクレオチドは、突然変異株のヌクレオチド差とマッチすることがある（表６では太字ヌクレオチドで示す）が、一次プローブとｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）  ｏｌｉｇｏが標的ＤＮＡへのハイブリダイズ時に単一塩基オーバーラップを形成して、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ａｇｂｉｏ）によって認識される特定の侵入構造を生成できれば、この最後のヌクレオチドには他のヌクレオチドも使用できる。
【０２２４】
−  製造業者（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ａｇｂｉｏ）の指示どおりにＩｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ手順とデータの解釈を実施する。簡単に説明すると、表６で「フラップ１」および「フラップ２」として示すヌクレオチド配列は、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイの第一相で一次プローブから切断され、ＦＲＥＴ（商標）カセット１および２の配列とそれぞれ相補的であるが標的突然変異株または野生型配列とは相補的ではない５’「フラップ」の配列を表している。第一相で一次プローブを切断し、フラップ１−プローブおよび／またはフラップ２−プローブが第二相でＦＲＥＴ（商標）カセット１および２とそれぞれハイブリダイズされると、それぞれ突然変異株または対応する野生型標的ＩＮＤ遺伝子の試料における存在を示すシグナルが生成される。
【０２２５】
【表１２】
0005770086.tif 000013
【配列表】
0005770086000001.app