(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の上面にハイドロゲル前駆体を含む溶液を注いで、前記基板の上面に設けられた穴部の中に前記溶液を充填する充填工程と、
前記基板の上方にある前記溶液に巨大ベシクルを添加し、前記巨大ベシクルを沈降させ、前記穴部の近傍で前記巨大ベシクルを展開し、前記穴部の開口を脂質二分子膜で覆う脂質二分子膜形成工程と、
前記穴部の外部のハイドロゲル前駆体を含む溶液を除去せずに、前記穴部の内外において、前記溶液中のハイドロゲル前駆体をゲル化させてハイドロゲルを形成するゲル化工程と、を有することを特徴とする脂質二分子膜基板の製造方法。
【請求項２】
前記脂質二分子膜を損なわないように前記穴部の外部のハイドロゲルを除去する工程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の脂質二分子膜基板の製造方法。
【請求項３】
前記穴部の開口に該開口を狭める方向に延びるオーバーハング部が設けられた基板を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の脂質二分子膜基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質二分子膜基板、脂質二分子膜基板の製造方法、及びハイドロゲル基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板に、タンパク質、核酸、糖鎖、脂質、細胞等を備えたバイオチップが、新薬探索（Drug Discovery）や創薬において盛んに利用されている。タンパク質の中でも、細胞膜においてレセプターやチャネルとして機能する膜タンパク質が、創薬標的として非常に注目されている。２０００年度の米国における医薬の売り上げトップ２０のうち、膜タンパク質（ＧＰＣＲ，イオンチャネルを含む）を標的とする医薬が約５０％を占めている（非特許文献１参照）。膜タンパク質の重要性は今後も益々高まると考えられ、種々の膜タンパク質の機能測定を行うことが可能な実験系やバイオチップの開発は非常に重要である。
【０００３】
細胞から膜タンパク質を取り出すことなく、生きた細胞を構成する細胞膜を試料として、そこに含まれる膜タンパク質の機能解析をする方法、例えばパッチクランプ法（非特許文献２参照）が従来知られている。しかしながら、試料とした細胞膜中には種々の膜タンパク質が含まれているため、得られるデータにはノイズが多く含まれるという問題があった。このため、特定の膜タンパク質を特定の濃度で含む試料を使用することが望ましい。
しかしながら、創薬標的となるような膜タンパク質は巨大で複雑な構造を有しており、細胞膜から精製されると変性し易いという技術的な困難さがある。このため、正常な機能を維持した状態で膜タンパク質をバイオチップ等のin vitro測定系に組み込むための技術開発が進められている。
【０００４】
この測定系の一例としては、脂質分子をｎ−デカンなどの有機溶媒に溶解し、水溶液中で該有機溶媒をプラスチック板等に設けられた小穴に塗りつけることにより黒膜を形成し、形成した黒膜に膜タンパク質を融合させた測定系を準備して、この測定系において、膜タンパク質の電解質溶液中におけるイオン透過性の変化を、電流の変化として計測する技術がある（例えば非特許文献３）。
しかしながら、上述の黒膜化法では下記のような問題がある。
１）脂質分子を溶解している有機溶媒は高沸点であるため、膜形成後も残留してしまう。
２）小穴に塗りつけた脂質溶液の自発的膜形成に頼るため、形成された膜は脂質二分子膜とその周囲を取り囲む環状バルク層との混合状態であり、小穴全面を均一な脂質二分子膜で覆うことが困難である。
３）測定のたびに小穴を手作業で作成する必要があるため、穴の径が不均一で、測定結果にばらつきが生じてしまう。
【０００５】
細胞膜は、全面が脂質二分子膜で形成されており、その中で膜タンパク質は機能している。残留有機溶媒や脂質二分子膜の不均一性は、膜タンパク質の機能・形態に影響を与える可能性がある。このため、膜タンパク質の機能を正確に測定するためには、より細胞膜を模倣した状態、つまり、全面が脂質二分子膜で覆われた系における測定が必要となる。また、測定毎の結果のばらつきを解消するためには、均一な穴径の小穴を複数作製することが望ましい。それによって、一度の測定で多点計測が可能になり、測定結果のばらつきを平均化することが可能になる。
【０００６】
そこで、本発明者らは、人工的に作製した穴部を有し、該穴部の開口部をオーバーハング形状とした基板の上部に、膜タンパク質を有した脂質二分子膜を展開させた基板によって、上記の問題点を改善する技術を提案している（例えば非特許文献４）。
この基板では、微小穴の開口部を覆う脂質二分子膜を形成するために、均一な脂質二分子膜から成る巨大ベシクルを用いているため、残留溶媒や膜の不均一性の問題が解決されている。また、基板上に複数の微小穴をアレイ化しているため、測定結果を平均化することが可能であり、迅速かつ高感度な測定が可能になる。このような、人工的に作製した微小穴を有し、精製した膜タンパク質を配置できる脂質二分子膜基板（膜タンパク質固定化基板）はin vivoに類似した条件下でのin vitro測定系を実現するものとして期待されている（例えば、特許文献１）。また、固体基板上に人工的に作製した穴部（微小穴）を有する構造は、膜タンパク質の機能を利用するバイオセンサへの応用も期待されている（例えば、非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２７５４８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Drews J. Science, 287: 1960-1964 (2000)
【非特許文献２】E. Neher and B. Sakaman, Nature 260, 799 (1976)
【非特許文献３】「新パッチクランプ実験技術法」岡田泰伸 編 (2001年，吉岡書店）
【非特許文献４】K. Sumitomo et al. Applied Physics Express Vol. 3, 107001 (2010)
【非特許文献５】K. Sumitomo et al. NTT Technical Review Vol. 4, No.9 pp40-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
少量の膜タンパク質の機能を、感度良く、定量的に測定するためには、微小穴を安定に脂質二分子膜で覆う必要がある。しかし、測定中に、膜の張力、応力、穴内外の浸透圧、温度等が変化する場合に、脂質二分子膜が容易に穴の内部に落ち込んだり破れたりするという問題があった。
【００１０】
上記事情に鑑み、本発明は、脂質二分子膜の安定性が向上した脂質二分子膜基板、該脂質二分子膜基板の製造方法、及びその製造方法に用いられるハイドロゲル基板を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に関連する脂質二分子膜基板は、基板に穴部が設けられ、該穴部の開口が脂質二分子膜によって覆われている脂質二分子膜基板であって、前記穴部の中にハイドロゲルが充填されていることを特徴とする。
本発明に関連する脂質二分子膜基板によれば、穴部に充填されたハイドロゲルが脂質二分子膜を支持することにより、脂質二分子膜の安定性を向上させることができる。この結果、浸透圧変化や温度変化による影響を受け難くなる。また、当該基板を運搬する際の振動等の影響も受け難くなる。この結果、脂質二分子膜が穴部の中に落ち込んだり破れたりすることを防止できる。
【００１２】
本発明に関連する脂質二分子膜基板は、前記脂質二分子膜と前記ハイドロゲルとが、前記開口において接していることを特徴とする。
この構成によれば、開口における脂質二分子膜をより安定に維持することができる。さらに、脂質二分子膜を、細胞膜を構成する脂質二分子膜に近い状態（生理学的な状態）に近づけることができる。これは、ハイドロゲルの性状が細胞を構成する細胞質に近いためである。この結果、当該脂質二分子膜に配置した膜タンパク質の機能を生理学的な状態で解析することができる。
【００１３】
本発明に関連する脂質二分子膜基板は、前記穴部の開口に該開口を狭める方向に延びるオーバーハング部が設けられていることを特徴とする。
この構成によれば、開口における脂質二分子膜をより安定に維持することができる。さらに、当該基板の製造時において、開口を覆うように脂質二分子膜を配することがより容易となる。
【００１４】
本発明に関連する脂質二分子膜基板は、前記脂質二分子膜における前記開口を覆っている部分に、膜タンパク質が配置されていることを特徴とする。
この構成によれば、膜安定性が向上した脂質二分子膜において、当該膜タンパク質の機能を解析することができる。
【００１５】
本発明に関連する脂質二分子膜基板は、前記ハイドロゲルの内部に蛍光分子が含まれていることを特徴とする。
この構成によれば、脂質二分子膜でシールされた穴内部の状態を当該蛍光分子によって調べることができる。また、蛍光分子が穴外部へ流出することを抑制できる。
【００１６】
本発明の請求項１に記載の脂質二分子膜基板の製造方法は、基板の上面にハイドロゲル前駆体を含む溶液を注いで、前記基板の上面に設けられた穴部の中に前記溶液を充填する充填工程と、前記基板の上方にある前記溶液に巨大ベシクルを添加し、前記巨大ベシクルを沈降させ、前記穴部の近傍で前記巨大ベシクルを展開し、前記穴部の開口を脂質二分子膜で覆う脂質二分子膜形成工程と、前記穴部の外部のハイドロゲル前駆体を含む溶液を除去せずに、前記穴部の内外において、前記溶液中のハイドロゲル前駆体をゲル化させてハイドロゲルを形成するゲル化工程と、を有することを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の脂質二分子膜基板の製造方法は、請求項１において、前記脂質二分子膜を損なわないように前記穴部の外部のハイドロゲルを除去する工程をさらに有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の製造方法によれば、穴部の中に充填されたハイドロゲル前駆体を含む溶液と脂質二分子膜とを、当該穴部の開口において接触させた状態で配置することができる。この状態で当該溶液をゲル化させることによって、穴内部で形成されたハイドロゲルと脂質二分子膜とを、当該穴部の開口において接触させた状態で配置することができる。この接触状態であると、穴部の中のハイドロゲルが脂質二分子膜を充分に支持することができるので、当該脂質二分子膜の安定性がより一層向上した脂質二分子膜基板を製造することができる。また、当該脂質二分子膜を生理学的状態により近づけたものとすることができる。
【００１８】
本発明の請求項３に記載の脂質二分子膜基板の製造方法は、請求項１又は２において、前記穴部の開口に該開口を狭める方向に延びるオーバーハング部が設けられた基板を用いることを特徴とする。
この構成によれば、前記脂質二分子膜形成工程において、未だゲル化していない溶液が充填された穴部の開口を脂質二分子膜で覆う際に、当該脂質二分子膜が穴部の中に落ち込むことを抑制できる。この結果、脂質二分子膜基板を歩留まり良く製造することができる。
また、製造された脂質二分子膜基板において、当該脂質二分子膜の安定性をより向上させることができる。
【００１９】
本発明に関連するハイドロゲル基板は、前記脂質二分子膜基板を製造するためのハイドロゲル基板であって、基板に穴部が設けられ、該穴部の中にハイドロゲルが充填されていることを特徴とする。
本発明に関連する前記ハイドロゲル基板を用いることにより、前記脂質二分子膜基板を容易に得ることができる。当該ハイドロゲル基板の上面に脂質二分子膜を配置した際、当該脂質二分子膜が穴部の中に落ち込むことを防止できるからである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の脂質二分子膜基板によれば、穴部に充填されたハイドロゲルが脂質二分子膜を支持することにより、脂質二分子膜の安定性を向上させることができる。この結果、浸透圧変化や温度変化による影響を受け難くなる。また、脂質二分子膜が穴部の中に落ち込んだり破れたりすることを防止できる。さらに、膜安定性が向上した脂質二分子膜に、例えば膜タンパク質を配置することによって、該膜タンパク質の機能解析を行うことがより容易となり、信頼性の高いデータを得ることができる。また、当該脂質二分子膜の安定性が向上しているので、振動等の物理的な衝撃に対する耐性も向上している。この結果、当該基板の運搬をより容易に行うことができる。
【００２１】
本発明の脂質二分子膜基板の製造方法によれば、当該脂質二分子膜の安定性がより一層向上した脂質二分子膜基板を製造することができる。また、当該脂質二分子膜を生理学的状態により近づけたものとすることができる。
【００２２】
本発明のハイドロゲル基板を用いることにより、前記脂質二分子膜基板を容易に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明にかかる脂質二分子膜基板の第一実施形態の模式的な断面図である。
【図２】本発明にかかる脂質二分子膜基板の第二実施形態の模式的な断面図である。
【図３】本発明にかかる脂質二分子膜基板の第三実施形態の模式的な断面図である。
【図４】実施例１で作製した脂質二分子膜基板の上面の蛍光観察像である。
【図５】比較例１で作製した脂質二分子膜基板の、浸透圧変化に対する耐性を調べた結果である。
【図６】本発明にかかるハイドロゲル基板をAFMによって観察した結果である。
【図７】オーバーハング部が設けられた穴部の開口を上方から観察した電子顕微鏡像である。
【図８】（ａ）別のオーバーハング部が設けられた穴部の開口を上方から観察した電子顕微鏡写真であり；（ｂ）その断面の電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、好適な実施の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明するが、本発明はかかる実施形態に限定されない。
＜第一実施形態＞
図１に示すように、本発明の脂質二分子膜基板１（第一実施形態）は、基板１０に穴部２０が設けられ、該穴部の開口２１が脂質二分子膜３０によって覆われ、更に、穴部２０の中にハイドロゲル２２が充填されたものである。
【００２５】
本発明において、脂質二分子膜３０とハイドロゲル２２とは、開口２１において接触しても良いし、接触していなくても良い。
接触している場合は、脂質二分子膜３０を常に支持することができるので、膜安定性をより向上することができる。また、当該脂質二分子膜を生理的な状態に近づけることができる。
接触していない場合は、脂質二分子膜３０とハイドロゲルの上面との間に、適当な溶媒、例えば膜タンパク質３１の機能解析に適した緩衝液等の水溶液を配置することが好ましい。接触していない場合であっても、脂質二分子膜３０が穴部２０の中に落ち込んだ際に、脂質二分子膜３０が穴部２０の底へ達する前に、その落ち込みを途中で止めることができる。
本発明においては、より好ましい効果が奏される観点から、脂質二分子膜３０とハイドロゲル２２とは接触していることが好ましい。
【００２６】
なお、ハイドロゲル２２の上面は、開口２１において平坦であっても良いし、平坦ではなく、例えば上方へ膨らんでいても良い。表面張力等の影響でハイドロゲル２２の上面が膨らんだり凹んだりする場合もあるが、その程度が軽微であれば問題は無い。
【００２７】
本発明において、穴部２０の開口２１（開口部２１）の形状は特に制限されない。
開口２１を上面から見た場合の形状としては、例えば円形、楕円形、三角形、矩形、多角形等の形状とすることができる。また、開口２１を含む穴部２０の断面を見た場合の形状は、例えば、単純な凹状や、図１に示すようなオーバーハング形状（ひさし状）とすることができる。ここで、オーバーハング形状である開口部２１をオーバーハング部１１ａと呼ぶことにする。オーバーハング部１１ａは、穴部２０の開口２１において、該開口２１を狭める方向に延びるように設けられている。
【００２８】
本実施形態におけるオーバーハング部１１ａは、基板１０の上面１０ａに設けられた薄膜層１１が、穴部２０の開口２１を狭めるように、開口２１の四隅に張り出すことによって形成されている。この状態を電子顕微鏡で観察した写真を図７に示す。  
本実施形態においては、穴部２０の四隅（四つの角）にオーバーハング部１１ａが設けられているが、この形態に限らず、例えば、図８に示すように、開口２１の周囲全体から開口２１の中心に向けて円形に張り出したオーバーハング部１１ａとすることもできる。つまり、本発明において、基板１０の上方からオーバーハング部１１ａに囲まれた領域を見た場合の形状としては、例えば円形、楕円形、三角形、矩形、多角形等の形状とすることができる。
【００２９】
穴部２０の開口２１の直径又は開口２１を構成する多角形の一辺は、１００ｎｍ〜１０μｍとすることが好ましい。
上記範囲の下限値以上とすることにより、脂質二分子膜３０内に充分な量の膜タンパク質３１を配置することができる。上記範囲の上限値以下とすることにより、脂質二分子膜３０が穴部２０に落ち込むことを防いで安定に維持する力の一部として、開口２１が寄与することができる。
また、穴部２０の深さは、脂質二分子膜３０が底面に接触しない深さがあれば特に制限されず、開口部直径に応じて設計すればよい。該深さは、例えば０．１μｍ〜１０μｍとすることができる。
【００３０】
基板本体１０の材料は特に制限されず、例えば、シリコン、ガラス、プラスチックなどが挙げられる。また、基板本体１０の厚みや形状は用途に応じて適宜調整される。
基板本体１０に設けられた穴部２０の数は特に限定されず、例えば１〜１０，０００個とすることができる。
【００３１】
基板本体１０への穴部２０の形成方法は、例えば、フォトリソグラフィ法、電子ビームリソグラフィ法、ドライエッチング法等の微細加工技術を適用することができる。
【００３２】
脂質二分子膜３０の脂質分子の種類は、脂質二分子膜（脂質二重膜）を形成できるものであれば特に制限されず、例えばホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（PIP）、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルグリセロール（PG）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。これらの脂質は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００３３】
脂質二分子膜３０の形成方法としては、例えば、その直径が１０μm以上の巨大脂質ベシクルを基板上で展開する方法が挙げられる。
ベシクルを形成する代表的な手法としては、静置水和法やエレクトロスウェリング法（電解形成法）が例示できる。ベシクルの作製手法は特に限定されないが、巨大ベシクルを作製しやすく、反応時間や反応プロセスが簡易であるという観点から、電解形成法を採用することが好ましい。電解形成法は、酸化インジウムスズ（ITO）などの電極上に、リン脂質を薄膜化した後、交流電場をかけて水溶液中に巨大ベシクルを形成する手法である。サイズの揃ったベシクルを得るためには、ITO基板上に厚さ数十nm〜数μmの均一なリン脂質分子の膜を形成することが好ましく、また、交流電場は数百mV〜2V程度の印加条件が好ましい。
【００３４】
穴部２０に充填するハイドロゲル２２は、脂質二分子膜３０の形成に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えば、アガロースゲルやポリアミノ酸といった高分子の１種類または２種類以上との混合溶液から形成されるものが挙げられる。また、アクリルアミド、N,N’-ジメチルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、N-アクリロイルアミノエトキシエタノール、N-アクリロイルアミノプロパノール、N-メチロールアクリルアミド、N-ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルエキストリン等の単量体の１種類または２種類以上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体と、を共重合したものをハイドロゲル２２として用いることができる。また、前記単量体の誘導体を用いてハイドロゲル２２を構成してもよい。
【００３５】
前記単量体（モノマー）を重合させてハイドロゲル２２とするための重合反応としては、ラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合などが挙げられる。これらの重合方法は特に限定されないが、例えば重合開始剤の添加が挙げられる。重合開始剤とその重合方法としては、例えば、モノマー水溶液中での過硫酸アンモニウム（以下ＡＰＳ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（以下ＴＥＭＥＤ）との混合による方法、ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｒｏｎｉｔｒｉｌｅ（以下ＡＩＢＮ）などの熱分解による方法、イルガキュア等の光反応性重合開始剤への光照射による方法が挙げられる。また、アガロースゲルの場合は、加熱した溶液を穴部２０へ充填し、その後、当該溶液を冷却することによりゲル化させることができる。
【００３６】
穴部２０にハイドロゲル２２を充填する方法は特に限定されないが、例えば、穴部２０の内部にゲル化する前のハイドロゲル前駆体を含む溶液、例えば前記単量体を含む水溶液を充填し、必要に応じて重合開始剤を添加し、その直後に（ゲル化する前に）脂質二分子膜３０で該穴部２０の開口部２１をシールし、穴部２０の外部の余剰なハイドロゲル前駆体を含む溶液を、水もしくは電解質水溶液等と置換することにより、穴部２０の内部のみで選択的にハイドロゲル２２を形成する方法が挙げられる。また、他の方法として、穴部２０の外部の余剰なハイドロゲル前駆体を含む溶液を除去せずに、穴部２０の内外でハイドロゲル２２を形成した後、脂質二分子膜３０を損なわないように、穴部２０の外部のハイドロゲル２２のみを除去する方法も例示できる。
【００３７】
ハイドロゲル２２の硬度や含水量は、用途に応じて、例えば機能解析する膜タンパク質３１の種類に応じて、適宜調整される。ハイドロゲル２２を構成する前駆体の濃度や重合方法の種類を検討することによって、最適な硬度及び含水量のハイドロゲル２２とすることができる。例えば、アガロースゲルを充填する場合は、その濃度は０．０１wt%〜５．０wt%とすることができる。好適には０．０５wt%〜５wt%であり、より好適には０．５wt%〜３wt%である。また、例えば、ポリアクリルアミドゲルを充填する場合は、その濃度は１wt%〜３０wt%とすることができる。好適には３wt%〜２０wt%であり、より好適には５wt%〜１５wt%である。
【００３８】
ハイドロゲル２２に含まれる水には、脂質二分子膜３０が安定に維持される範囲であれば、ｐＨ緩衝剤、各種イオン、酸化防止剤、界面活性剤等が含まれていても良い。膜タンパク質３１の機能が最適に発揮されるために必要な成分を含有させることが好ましい。
【００３９】
本実施形態においては、穴部２０の開口２１を覆う脂質二分子膜３０に膜タンパク質３１が配置されて、脂質二分子膜基板１が膜タンパク質固定化基板１とされている。脂質二分子膜３０は外部溶液Lによって覆われている。例えば、外部溶液Lに医薬候補物質等を添加することにより、膜タンパク質３１の機能を解析することができる。
【００４０】
脂質二分子膜３０に、機能測定対象となる膜タンパク質３１を再構成する方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、ベシクルフュージョン法が挙げられる。具体的には、プロテオリポソームと呼ばれる膜タンパク質を含有するベシクルを、脂質二分子膜上に添加することにより、プロテオリポソームと脂質二分子膜が融合し、膜タンパク質が脂質二分子膜中に再構成される。
脂質二分子膜３０に融合する膜タンパク質３１は、脂質二分子膜３０に保持され、かつ、該脂質二分子膜３０を境界に孔の内部と外部のイオン濃度を変化させるものが好ましい。膜タンパク質３１としては、例えば、イオンチャネル型受容体が挙げられる。
【００４１】
イオンチャネル型受容体としては、例えば、細胞間情報伝達や温度の感受、炎症や痛みに関与するTRP（transient receptor potential）チャネル、細胞間情報伝達や痛みに関与するATP受容体、細胞間情報伝達や情動に関与するセロトニン受容体、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するNMDA受容体、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するAMPA受容体、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するカイニン酸受容体、細胞間情報伝達や抑制性神経伝達に関与するGABA受容体等が挙げられる。
【００４２】
穴内部および外部に電解質溶液を配置する場合、その電解質溶液は、膜タンパク質３１を埋め込んだ脂質二分子膜３０が安定に保持されるものが好ましく、例えば、100mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 10mM Tris-HCl (pH7.4)などが挙げられる。穴内部と外部の電解質溶液の組成は、同じ組成であってもよく、異なる組成であってもよい。
【００４３】
ところで、細胞を構成する細胞膜で覆われた細胞質には、細胞の形態を維持するためにアクチンフィラメント、中間径フィラメント、微小管といった細胞骨格分子によって繊維網状構造が形成されている。このため、分子クラウディングと呼ばれる溶媒中の分子の性質が変化するという効果が見られる。この効果によって（細胞骨格分子やその他の細胞内高分子が細胞内に高密度にあることによって）、細胞質内の分子の活量が増大するため、タンパク質の拡散や活性がin vitro中（単なる水溶液中）とは異なることが知られている。そのため、in vivoでのタンパク質の機能をより正確に測定するためには、細胞膜だけでなく細胞質内の環境も模倣された測定系が必要となる。しかし、細胞質内の骨格構造を模倣した状態での、タンパク質の機能測定の例は、従来、ほとんど報告されていない。
本発明が極めて有用である理由の一つは、in vivoに近い状態で膜タンパク質の機能を解析できることである。本発明の脂質二分子膜基板（膜タンパク質固定化基板）において、細胞膜に相当する脂質二分子膜３０が、細胞質に相当するハイドロゲル２２と接触した前述の構成とすることによって、当該脂質二分子膜３０に配置された膜タンパク質３１の機能を、in vivoに近い状態で測定することができる。
【００４４】
＜第二実施形態＞
図２に示すように、本発明の脂質二分子膜基板２（第二実施形態）は、第一実施形態の構成に加えて、ハイドロゲル２２の内部に蛍光分子２３（蛍光物質）が含まれている。
この特徴部以外は、前述した第一実施形態の脂質二分子膜基板１（膜タンパク質固定化基板１）と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
以下に、第二実施形態の脂質二分子膜２が、第一実施形態の脂質二分子膜基板１と相違する点を説明する。
【００４５】
蛍光分子２３は、穴部２０の内部の状態変化が起こった場合に蛍光を発する水溶性のものが好ましく、穴部２０の内部のイオン濃度の変化に伴い蛍光強度が変化するものがより好ましい。具体的には、例えば、カルシウムイオン濃度変化を検出可能なFluo4、Fura-2、Fluo-3を例示できる。
好適な蛍光分子を用いることによって、例えば脂質二分子膜３０にイオン透過性の膜タンパク質３１を配置して、その膜タンパク質を介して穴部２０の内外へイオンが流入又は流出した際、ハイドロゲル２２内の蛍光分子２３の蛍光強度が変化したことを蛍光顕微鏡等によって検出することができる。このような検出系は、膜タンパク質３１の機能解析において有用である。
【００４６】
＜第三実施形態＞
図３に示すように、本発明の脂質二分子膜基板３（第三実施形態）は、第一実施形態の構成に加えて、穴部２０の中に電極４０を備え、穴部２０の外部溶液L中に対向電極４１を備えている。
この特徴部以外は、前述した第一実施形態の脂質二分子膜基板１（膜タンパク質固定化基板１）と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
以下に、第三実施形態の脂質二分子膜３が、第一実施形態の脂質二分子膜基板１と相違する点を説明する。
【００４７】
第三実施形態の脂質二分子膜基板３は、電気生理的手法を用いて膜タンパク質３１の機能測定を行うのに好適な膜タンパク質固定化基板３としての態様である。
膜タンパク質３１の機能測定に際しては、穴部２０の外部溶液Lに対向電極４１を配置することが好ましい。電極４０および対向電極４１は、パッチクランプ測定装置に接続して使用することが好ましい。
例えば、膜タンパク質３１としてイオンチャンネル型タンパク質を配置した場合には、イオンチャンネル型タンパク質を透過したイオン電流を電気計測計で計測することにより、膜タンパク質３１の機能測定を行うことができる。
【００４８】
電極４０の配置方法としては、例えば、脂質二分子膜基板３の製造時に、スパッタリング等の成膜法によって金属層を形成し、エッチング等により該金属層を適宜パターニングして、形成した電極を絶縁層で被覆することによって、穴部２０に埋め込んで配置することができる。ここで、電極４０を基板本体１０に埋め込んだ構成とする場合、基板本体１０は絶縁性であることが必要である。この場合、基板本体１０の材料としては、シリコン酸化物やシリコン窒化物、アルミナ、酸化タンタル、レジスト膜等を用いることができる。
電極４０の材料としては、銀／塩化銀や、金、白金などが例示できる。
【００４９】
＜脂質二分子膜基板の製造方法＞
本発明の脂質二分子膜基板を製造する好適な方法を図１を参照して説明する。
その製造方法としては、充填工程、脂質二分子膜形成工程、及びゲル化工程をこの順で行う方法が好ましい。なお、本発明の趣旨を逸脱しない限り、ここで挙げた３つの工程以外の、他の工程を追加しても良い。
【００５０】
［充填工程］
充填工程は、基板１０の上面１０ａにハイドロゲル２２の前駆体を含む溶液を注いで、基板の上面１０ａに設けられた穴部２０の中に前記溶液を充填する工程である。
ハイドロゲル２２の前駆体は前述の重合前のモノマー等である。その前駆体を溶解又は分散させる溶媒は特に制限されず、水系溶媒が好ましい。前駆体の濃度は、ハイドロゲル２２の硬度及び含水量に応じて適宜調整される。
基板１０の上面１０ａに注ぐ前記溶液の量は、穴部２０を充填できる量であれば特に制限されないが、上面１０ａの上方にも溢れさせることができる量、すなわち上面１０ａの上方に当該溶液が溜まる状態にしうる量を注ぐことが好ましい。
基板１０の上面１０ａに前記溶液を注ぐ方法は特に制限されず、ピペット等で上面１０ａに前記溶液を滴下した後、必要に応じて当該基板および溶液を超音波処理又は真空処理等することによって、穴部２０から気泡を排出させて、穴部２０に当該溶液を充填することが可能である。
【００５１】
［脂質二分子膜形成工程］
脂質二分子膜工程は、基板１０の上方にある前記溶液に巨大ベシクルを添加し、前記巨大ベシクルを基板１０の上面１０ａ又は薄膜層１１の上面に沈降させ、穴部２０の近傍で前記巨大ベシクルを展開し、穴部２０の開口２１を脂質二分子膜３０で覆う工程である。
巨大ベシクルは、前述のとおり公知の方法で調製したものを使用できる。巨大ベシクルの大きさ（直径）は、開口２１よりも充分に大きいものであることが好ましく、例えば１０μｍ以上とすることができる。例えば、１０μｍ〜１００μｍの大きさの巨大ベシクルを使用することができるが、この大きさの範囲に限定されず、他の大きさのものを使用しても構わない。
巨大ベシクルを基板１０の上面の上方にある前記溶液に添加する方法は特に制限されず、例えば、巨大ベシクルを含むベシクル分散液を調製して、これを添加する方法が挙げられる。
ベシクル分散液における巨大ベシクルの濃度の目安としては、添加した巨大ベシクルが、基板１０の上面１０ａの広い領域、例えば上面１０ａの８０％以上の領域、を占有して拡がる程度の濃度であることが好ましい。例えば、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で使用することができるが、この濃度範囲に限定されず、他の濃度のものを使用しても構わない。
【００５２】
脂質二分子膜３０を歩留まり良く形成する観点から、本発明の製造方法において、穴部２０の開口２１に該開口を狭める方向に延びるオーバーハング部１１ａが設けられた基板１０を用いることが好ましい。
オーバーハング部１１ａがあると、未だゲル化していない溶液が充填された穴部２０の開口２１を脂質二分子膜３０で覆う際に、当該脂質二分子膜３０が穴部２０の中に落ち込むことを抑制できる。
【００５３】
［ゲル化工程］
ゲル化工程は、前記溶液中のハイドロゲル前駆体をゲル化させてハイドロゲルを形成する工程である。
前駆体を重合させる方法は、前述のとおりである。充填工程の後、ハイドロゲル前駆体を含む溶液が穴部２０の外部にある場合、これを除去して、穴部２０の内部のみでハイドロゲル前駆体をゲル化させても良いし、または、穴部２０の外部にあるハイドロゲル前駆体を含む溶液を除去せずに、穴部２０の内外でハイドロゲル前駆体をゲル化させても良い。前者の場合、穴部２０の外部溶液を例えば生理的塩類溶液等で置換してからゲル化する方法が挙げられる。後者の場合、穴部２０の上方でゲル化したハイドロゲルを、適当な手段例えば脂質二分子膜を損なわないようにゆっくりと剥がす等の方法により除去することができる。脂質二分子膜３０が空気中に曝された状態になると、脂質二分子膜３０の構造や機能が損なわれることがあるので、ハイドロゲルの除去は生理的塩類溶液等の適当な外部溶液Lに覆われた状態で行うのが好ましい。
【００５４】
＜ハイドロゲル基板＞
本発明にかかるハイドロゲル基板は、前述の本発明にかかる脂質二分子膜基板を製造するために用いられるものであり、基板１０に穴部２０が設けられ、該穴部２０の中にハイドロゲル２２が充填されているものである。
ハイドロゲル基板を製造する方法は、前述の脂質二分子膜基板を製造する方法における充填工程と同様に行う方法が例示できる。
穴部２０が設けられた基板１０を準備して、その上面１０ａにハイドロゲル前駆体を含む溶液を注ぎ、穴部２０内に当該溶液を充填し、その後ゲル化させれば良い。穴部２０の
外部でゲル化したハイドロゲルは、ヘラで擦り落とすか、単に剥がす方法で除去できる。この際、穴部２０の中のハイドロゲルは、穴部２０によって保持されているので、除去せずに残すことができる。
また、ハイドロゲル基板を製造する他の方法として、前述の脂質二分子膜基板を作製した後、基板上の脂質二分子膜を界面活性剤等を用いて除去することにより製造する方法も例示できる。
いずれの方法で製造したハイドロゲル基板であっても、ユーザーが使用時に脂質二分子膜で穴部の開口を覆う処理を行うことによって、脂質二分子膜基板（膜タンパク質固定化基板）を作製することができる。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
図２で模式的に表された第二実施形態の脂質二分子膜基板２（膜タンパク質固定化基板２）の作製例を具体的に説明する。
＜穴部の形成＞
基板本体１０には、シリコン基板を用いた。基板本体１０の上面１０ａに、１２０ｎｍの厚さのシリコン酸化膜層（薄膜層）１１を、熱酸化法により形成した。さらに、フォトリソグラフィ法とドライエッチング法を用いて、円形状の開口部２１（４μｍ×４μｍ）を持つ穴部２０を形成した。深さは、１μｍとした。さらに、水酸化カリウム溶液（１０重量％）により、シリコン酸化膜層１１の下の基板本体１０を、選択的にエッチングすることにより、穴部２０の開口部２１の四隅にオーバーハング部１１ａを形成した。
【００５６】
＜巨大ベシクルの準備＞
脂質二分子膜３０は以下のようにして形成した。ジフィタニルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）（８０モル％）とコレステロール（２０モル％）の混合クロロホルム溶液（濃度２．５ｍＭ）を調製した。続いて、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）基板（ＳｉＯ２上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｍｍ、５０〜１００Ω／ｃｍ）上に、前記クロロホルム溶液２００μＬを均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム溶媒を完全に除去することで、均一なリン脂質薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。その上に、窓部を有するシリコーンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に２００ｍＭのスクロース水溶液を４００μＬ滴下した。さらに、その上部にＩＴＯ基板を配置し、シリコーンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んで密閉した。続いて、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、６０℃のホットプレート上で、交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電界形成法により巨大ベシクルを作製した。
【００５７】
＜ハイドロゲルの形成＞
ハイドロゲル２２を構成する未重合のモノマーとして７％アクリルアミドと、アクリルアミドに対して１／１９重量％のビスアクリルアミドとを含むモノマー水溶液と、蛍光分子２３（１００μMカルセイン）と、塩化ナトリウムを含む水溶液との混合水溶液に、APSとTEMEDを添加した充填用の水溶液を準備した。この充填用水溶液を基板１０の上面１０ａに滴下し、穴内部に充填すると共に、上面１０ａの上方にも充分に溢れさせた。このモノマー充填の直後に、基板本体１０の上面１０ａに溢れさせた充填用水溶液中に巨大ベシクルを添加し、巨大ベシクルを沈降させて、上面１０ａのシリコン酸化膜層１１上に巨大ベシクルを展開することにより脂質二分子膜３０を形成した。その後、更に１５分以上静置し、モノマーがゲル化したハイドロゲル２２が形成された後、塩化ナトリウムを含む２００ｍＭグルコース溶液を十分な量加え、脂質二分子膜３０上の余剰なハイドロゲルを取り除いた。
上記方法により、図２に示す穴部２０を有する、脂質二分子膜基板を作製した。なお、脂質二分子膜３０に膜タンパク質３１を配置することによって、本発明にかかる脂質二分子膜を膜タンパク質固定化基板とすることができる。膜タンパク質３１を脂質二分子膜３０へ配置する方法は、公知の方法を適用できる。
【００５８】
図４に，穴部２０の内部に蛍光分子２３としてカルセインを、ハイドロゲル２２としてアクリルアミドを充填し、赤色の蛍光を示すローダミンを含む脂質二分子膜３０を穴開口部に展開した場合の蛍光観察結果を示す。穴部２０にハイドロゲル２２が充填されている穴部２０ａからは、カルセイン由来の緑色蛍光が観察されることから、ハイドロゲル内では蛍光分子２３が穴内部から外部溶液に拡散せずに、安定に閉じ込められていることが分かる。また、穴部２０bでは、緑色と赤色の蛍光が重なって、黄色の蛍光が観察されることから、穴内部にハイドロゲル２２が充填され、その開口部は脂質二分子膜３０が覆っていることが分かる。
上記の方法で作製した基板に、膜タンパク質を配置することで、膜タンパク質固定化基板１を作製することができる。
【００５９】
［実施例２］
次に、別の第二実施形態の脂質二分子膜基板２（膜タンパク質固定化基板２）の作製例を具体的に説明する。
実施例２において、膜タンパク質３１であるα−ヘモリシンを脂質二分子膜に配した膜タンパク質固定化基板２を用いる。この基板２は穴内部にイオンの流入により蛍光強度が変化する蛍光分子２３を保持している。これらの特徴部以外は、前述した実施例１と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
以下に、実施例２で用いる膜タンパク質固定化基板２が実施例１の膜タンパク質固定化基板２と相違する点を説明する。
穴部２０の内部には、カルシウムイオンの濃度によって蛍光強度が変化する蛍光色素Fluo4を最終濃度で１０μMとなるように含む、アクリルアミドからなるハイドロゲル２２を充填し、脂質二分子膜３０を穴開口部２１に展開し、脂質二分子膜基板２を得た。
得られた脂質二分子膜基板２を用いて、脂質二分子膜３０にα−ヘモリシンを配することによって、カルシウムイオンが透過する膜貫通チャネル（膜タンパク質３１）を形成させた膜タンパク質固定化基板２が得られる。これを用いて、穴部２０の外部水溶液を１ｍＭ塩化カルシウム水溶液に置換したときのFluo4の蛍光強度変化を測定することにより、α−ヘモリシンを介したカルシウムイオンの膜透過を定量的に検出することができる。
【００６０】
［実施例３］
次に、図３で模式的に表された第三実施形態の脂質二分子膜基板３（膜タンパク質固定化基板３）の作製例を具体的に説明する。
実施例３において、イオンの流入を電気生理的手法によって検出するために、穴部２０の内部および外部に電極４０，４１を有する膜タンパク質固定化基板３を用いる。この特徴部以外は、前述した実施例１及び実施例２と同様であるので、同一部分に同一符号を付して説明を省略する。
【００６１】
以下に、実施例３で用いる膜タンパク質固定化基板３が実施例１及び実施例２の膜タンパク質固定化基板と相違する点を説明する。
まず、厚さ２００ｎｍの熱酸化膜からなる絶縁層で被覆されたＳｉウエハーの上に、チタン、金、白金の順に金属層を堆積してフォトリソグラフィ法によりパターニングすることにより、厚さ約６０ｎｍの電極層４０（電極４０）を形成した。この電極層４０は、十分に大きなパッド部（３００ｎｍ四方）に接続され、電気生理測定装置へ接続することが可能となっている。
つぎに、電極層４０を形成したＳｉウエハーの上に、絶縁層としてシリコン窒化膜をプラズマＣＶＤ法により１μｍ堆積した。この絶縁層の上に、オーバーハング部が形成される薄膜層１１（オーバーハング形状形成層１１）として、シリコン酸化膜をスパッタ法を用いて、２００ｎｍ堆積した。
このように形成した基板本体１０に、フォトリソグラフィ法とドライエッチング法により穴部２０および開口部２１を形成した。この穴部形成のエッチングは、電極層４０に届くまで行った。
このドライエッチングの過程で、シリコン酸化膜（オーバーハング形状形成層１１）とシリコン窒化膜（基板本体１０）の間の選択性を利用することで、オーバーハング部１１ａを形成した。
穴部２０および開口部２１を形成した後に、レジスト膜を洗浄・除去することで、電極４０を穴部２０に備えた基板を得た。
【００６２】
この実施形態において、穴部２０と電極４０の個数比は、１：１とすることが望ましい。１つの電極４０に対して複数の穴部２０を設けてもよいが、この構成の場合、当該１つの電極４０で測定する際に、全ての穴部２０を脂質二分子膜３０で覆う必要があるため、測定準備や測定条件が煩雑となる。よって、一つの電極４０には、一つの穴部２０を形成することが望ましい。
【００６３】
このようにして形成した、電極４０を穴部２０に備えた基板の上に、前述した実施例１の場合と同様に、ハイドロゲル２２を充填し、巨大脂質膜ベシクルを展開することにより、穴部２０の開口部２１を脂質二分子膜３０で覆う。さらに実施例２と同様に、脂質二分子膜３０に膜タンパク質３１としてα−ヘモリシンを配置し、電極４０と対向電極４１の間に電圧を印加した時にその間に流れる電流を計測することで，α−ヘモリシンを介したイオンの膜透過を定量的に検出することができる．
【００６４】
［比較例１］
ハイドロゲル２２を穴内２０の内部に備えていないこと以外は、実施例１と同じである脂質二分子膜基板を作製した。図５において、この基板の上面の蛍光像（ａ）と、基板断面の模式図（ｃ）を示す。
なお、実施例１の作製法と異なる主な点は、モノマーを含まず、蛍光分子を含む水溶液Qを基板の上面に滴下して、穴部２０に充填した点である。巨大ベシクルを用いて開口部２１を脂質二分子膜３０で覆った後、穴外部の蛍光分子を含む水溶液Qを適当な水溶液で置換して、穴外部の蛍光分子を除く点は、実施例１と同様である。
【００６５】
＜浸透圧変化による膜強度の評価＞
比較例１の脂質二分子膜基板を用いて、浸透圧変化を起こした場合の膜の状態を調べることにより、膜強度を評価した。この結果を図５を参照して説明する。
図５(a)は穴内外の浸透圧が同じである場合の、基板上面の蛍光像である。図５(b)は穴内部のイオン濃度が２００mＭであり、穴外部のイオン濃度が６００mＭである場合の、基板上面の蛍光像である。図５(c)は図５(a)の基板断面の模式図であり、図５(d)は図５(b)の基板断面の模式図である。
【００６６】
穴外部が穴内部に比較して浸透圧が高くなった場合、水は穴内部から外部に向かって流出するため、脂質二分子膜を穴内部に引き込む力が生じる。
図５は、この結果を表したものである。当初、複数の穴部を脂質二分子膜がシールしていたので、封入された蛍光分子からの発光が見られていた（図５(a)）。しかし、浸透圧を変化させた後では、多くの蛍光強度が観測されなくなった。浸透圧変化に伴う力により、脂質二分子膜が穴の内部に落ち込んだり、破れたりしたためである。部分的に穴の内部に落ち込むことにより、部分的に蛍光強度が変化している（図bに破線で囲んだ穴）ものも見られた。図(d)の模式図に示すように、脂質二分子膜が穴内部に落ち込んでいることを示すものである。
【００６７】
上記のように比較例１の脂質二分子膜基板は、浸透圧変化によって、当該脂質二分子膜が破損することがあった。
一方、実施例１の脂質二分子膜基板２について、同様の浸透圧変化を加えたところ、殆ど全ての穴部において、蛍光分子からの発光が変わらずに観察された。つまり、浸透圧変化の前後において、開口部２１を覆う脂質二分子膜３０が安定に維持された。
これらの結果から、本発明にかかる脂質二分子膜基板は、浸透圧変化の影響を受け難く、従来よりも膜の安定性（膜強度）が向上していることが明らかである。
【００６８】
＜ＡＦＭによる穴内部のゲルの観察＞
脂質二分子膜３０を形成しない以外は、実施例１と同様に行い、ハイドロゲル２２を穴部２０の中に充填した基板（ハイドロゲル基板）を準備した。この際、穴部２０の外部に形成されたハイドロゲルを剥がして除去した。
このハイドロゲル基板の上面の蛍光像を図６(a)に示す。ハイドロゲル２２に含まれるカルセインからの発光が３つの穴部から観測された。ハイドロゲル基板の上面の同じ領域をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察した結果を図６(b)(c)に示す。これらの結果から、発光がみられた３つの穴部に、ゲルが埋まっていることが確認された。
【００６９】
＜ＡＦＭによる膜強度の評価＞
実施例１の脂質二分子膜基板２における脂質二分子膜３０をＡＦＭで観察したところ、脂質二分子膜３０が開口部２１に張られていることを確認できた。これは、脂質二分子膜３０がハイドロゲル２２に支持されているため、ＡＦＭのプローブが脂質二分子膜を探知できる程度に膜強度が向上していることを示していると考えられる。
一方、図５(c)に示す比較例１の脂質二分子膜基板における脂質二分子膜をＡＦＭで観察することを試みたが、開口部における脂質二分子膜について、安定した信頼性の高い像を得ることができなかった。これは、当該脂質二分子膜の膜強度が、実施例１と比べて弱いことを示していると考えられる。
【００７０】
以上の結果から、本発明にかかる脂質二分子膜基板は、浸透圧変化や温度変化等の影響を受け難く、従来よりも膜の安定性（膜強度）が向上していることが明らかである。
【符号の説明】
【００７１】
１〜４…脂質二分子膜基板（膜タンパク質固定化基板）、
１０…基板（基板本体）、１０ａ…基板の上面、１１…薄膜層（シリコン酸化膜、オーバーハング形状形成層）、１１ａ…オーバーハング部、２０…穴部、２０ａ…脂質二分子膜で覆われていない穴部、２０ｂ…脂質二分子膜で覆われている穴部、２１…開口（開口部）、２２…ハイドロゲル、２３…蛍光分子（蛍光物質）、３０…脂質二分子膜（脂質二重膜）、３１…膜タンパク質、４０…電極、４１…対向電極、Ｌ…外部溶液、Q…蛍光分子を含む水溶液。
【図１】
0005770615.tif 000002
【図２】
0005770615.tif 000003
【図３】
0005770615.tif 000004
【図４】
0005770615.tif 000005
【図５】
0005770615.tif 000006
【図６】
0005770615.tif 000007
【図７】
0005770615.tif 000008
【図８】
0005770615.tif 000009