(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）再生可能資源であるフィードを備えるステップ、
（ｂ）フィードを水素存在下で触媒と接触させて、奇数鎖アルカンに対する偶数鎖アルカンの比率が少なくとも１０であり、Ｃn鎖長の直鎖アルカンを含む炭化水素生成物を生成させるステップ、および
（ｃ）Ｃn鎖長の直鎖アルカンの少なくとも一部をＣn鎖長の直鎖ジカルボン酸に発酵させるステップ、
を含み、
ここで、ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８であり、そして
ここで触媒が、酸化物、モリブデン、ニッケル、およびコバルトを含み、そして触媒が使用前にスルフィド化される、
Ｃn鎖長の直鎖ジカルボン酸を製造する方法。
【請求項２】
フィードを水素存在下、２５０℃〜４２５℃の温度および５００ｐｓｉｇ〜２５００ｐｓｉｇ（３４４７.３８ｋＰａ〜１７２３６.９ｋＰａ）の圧力で、触媒と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フィードが、
（ａ）植物および／または動物に由来して、１つまたはそれ以上の遊離脂肪酸および／または１つ以上のトリグリセリドを含む油であって、少なくとも５モル％のＣn鎖長の直鎖脂肪酸、および／またはＣn鎖長の直鎖脂肪酸から誘導される少なくとも５モル％のトリグリセリドを含む、上記油；
（ｂ）トリグリセリドから誘導される脂肪酸のアルキルエステルであって、少なくとも５モル％のＣn鎖長の直鎖脂肪酸エステルを含む、上記エステル；または
（ｃ）それらの混合物
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
フィードが、少なくとも５モル％のＣn鎖長の直鎖脂肪酸を含む油を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脂肪酸が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
フィードが、ココナッツ油、パーム核油、パーム油、ナタネ油、カノーラ油、ダイズ油、綿実油、またはこれらの組み合わせから選択される植物油を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
フィードが、家禽脂、黄色グリース、獣脂、またはこれらの組み合わせを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
フィードがトリグリセリドから誘導される脂肪酸エステルを含んでなり、エステルが少なくとも５モル％のＣn鎖長の直鎖脂肪酸エステルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ｎ＝１２、１４または１６である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃn鎖長の直鎖アルカンの少なくとも一部を炭化水素生成物から分離するステップと、残留炭化水素生成物の少なくとも一部を燃料として使用するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃn鎖長の直鎖アルカン、またはその一部を、形質転換カンジダ・マルトーサ株または形質転換ピチア・パストリス株を用いて発酵させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃn鎖長の直鎖ジカルボン酸を重合するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｎ＝１６または１８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
酸化物がアルミナである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下で、あらゆる目的のためにその内容全体を参照によって援用する、２００８年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／１２２，０７４号明細書の優先権を主張し、その利益を主張する。
【０００２】
本発明は、直鎖ジカルボン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カルボン酸、特に長鎖ジカルボン酸は、ポリマー、接着剤、香水、および抗生物質の生産に利用される商業的に重要な製品である。ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＯＨ（式中、ｍ＝７〜１６）の形態の脂肪族ジカルボン酸は、ナイロンまたはポリエステル製品中でポリマー中間体として、例えばコモノマーとして使用される。石油化学原料からの長鎖直鎖ジカルボン酸合成のための化学経路が利用できる一方で、合成は複雑であり、より短い鎖長のジカルボン酸を含有する混合物がもたらされる。その結果、ポリマー用途で必要な純度でジカルボン酸を得るためには、大規模な精製工程が必要である。ジカルボン酸の生産はまた、炭素源としてアルカンまたは脂肪酸を使用して、例えば酵母などの様々な微生物による発酵によっても起こり得る。アルカンまたは脂肪酸は、石油原料から入手し得る。
【０００４】
化石燃料の高コストおよび環境の足跡増大、そして限りある世界の石油埋蔵量は、再生可能な燃料源への関心の高まりを引き起こしている。再生可能資源としては、自動車で使用するためのトウモロコシおよび糖からのエタノール、そしてディーゼル燃料として使用するための植物油が挙げられる。ディーゼル燃料分野の研究は、バイオディーゼルおよびグリーンディーゼルの２つの主要分野を含む。
【０００５】
石油化学ベースのポリマーと同様のまたはより良い性能特性を有する再生可能なバイオポリマーに対する要求は、化石原料価格の上昇と相俟って、再生可能な原料から直鎖長鎖ジカルボン酸を製造する方法の開発を高度に望ましいものにする。さらに無駄を最小化して、再生可能原料の生産的利用を最大化する、直鎖長鎖ジカルボン酸を製造する経済的なバイオベースの方法が所望される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要約
本発明は、再生可能資源から直鎖ジカルボン酸を製造する方法に関する。脂肪酸または脂肪酸エステルの水素化処理によって得られるＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６またはＣ１８鎖長の直鎖炭化水素を、炭化水素として同一炭素鎖長の直鎖ジカルボン酸に発酵させる。残る炭化水素は、ディーゼル燃料として使用しても、またはディーゼル燃料の生産において使用してもよい。
【０００７】
本発明のいくつかの方法の特徴は、様々なこのような特徴を一緒に合わせた、１つ以上の特定の実施態様の文脈で本明細書に記載される。しかし本発明の範囲は、いかなる特定の実施態様内の特定の特徴のみの説明によって制限されず、本発明は以下もまた含む。（１）あらゆる記載される実施態様の全部の特徴よりも少ない下位組み合わせであって、下位組み合わせを形成するために除外された特徴の不在によって特徴付けられてもよい下位組み合わせ；（２）あらゆる記載される実施態様の組み合わせに個々に含まれる各特徴；および（３）２つ以上の記載される実施態様から選ばれた選択された特徴のみをグループ化することで形成される特徴のその他の組み合わせであって、任意に本明細書の他の部分に開示されるその他の特徴と一緒にされる、組み合わせ。本明細書の方法の特定の実施態様のいくつかは、次の通りである。本明細書の代案の一実施態様は再生可能資源からのＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６またはＣ１８鎖長の直鎖ジカルボン酸の製造に関する。再生可能資源である供給物を水素化処理反応条件下で触媒と接触させ、少なくとも５：１の偶数鎖炭化水素と奇数鎖炭化水素との比率を有し、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６またはＣ１８鎖長の直鎖炭化水素を含んでなる炭化水素製品を製造する。次に所望の二酸生成物の炭素鎖長を有する直鎖炭化水素を対応する炭素鎖長の直鎖ジカルボン酸に発酵させる。残留炭化水素生成物はディーゼル燃料として、または石油ディーゼルに混合するための添加剤として使用し得る。適切な供給物の例としては、脂肪酸、トリグリセリドから誘導される脂肪酸エステル、植物油、および動物油が挙げられるが、これに限定されるものではない。触媒は、酸化物と、モリブデンと、ニッケル、コバルト、およびそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の活性金属とを含んでなる。
【０００８】
本発明の代案の一実施態様では、
（ａ）再生可能資源である供給物を提供するステップと；
（ｂ）供給物を水素存在下で触媒と接触させて、少なくとも５：１の偶数鎖アルカンと奇数鎖アルカンとの比率を有してＣｎ鎖長の直鎖アルカンを含んでなる炭化水素生成物を製造するステップと；
（ｃ）Ｃｎ鎖長の直鎖アルカンの少なくとも一部をＣｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸に発酵させるステップ
を含む方法が提供され、式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８であり；触媒は酸化物と、モリブデンと、ニッケル、コバルト、およびそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の活性金属とを含んでなり；触媒はスルフィド化形態である。
【０００９】
本発明によって提供される方法の別の代案の実施態様では、供給物を水素存在下、約２５０℃〜約４２５℃の温度および約５００ｐｓｉｇ〜約２５００ｐｓｉｇ（３４５０ｋＰａ〜約１７，２５０ｋＰａ）の圧力で、触媒と接触させてもよい。
【００１０】
本発明によって提供される方法の別の代案の実施態様では、供給物は、
（ａ）植物および／または動物に由来して、１つ以上の遊離脂肪酸および／または１つ以上のトリグリセリドを含んでなる油であって、少なくとも約５モル％のＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸、および／またはＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸から誘導される少なくとも約５モル％のトリグリセリドを含んでなる油；
（ｂ）トリグリセリドから誘導される脂肪酸のアルキルエステルであって、少なくとも約５モル％のＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸エステルを含んでなるエステル；または
（ｃ）その混合物
である。
【００１１】
本発明によって提供される方法のさらなる代案の実施態様では、供給物は、少なくとも約５モル％のＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸を含んでなる油である。一実施態様では、脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施態様では、供給物は、ココナッツ油、パーム核油、パーム油、ナタネ油、カノーラ油、ダイズ油、綿実油、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される植物油である。別の実施態様では、供給物は、家禽脂、黄色油脂、獣脂、またはこれらの組み合わせを含んでなる。別の実施態様では、供給物は、トリグリセリドから誘導される脂肪酸のエステルであって、少なくとも約５モル％のＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸エステルを含んでなるエステルエステルである。別の実施態様では、エステルはメチルエステルである。方法の別の実施態様では、供給物はバイオディーゼルまたはグリーンディーゼルプロセスから得られる再生可能資源である。
【００１２】
本明細書で提供される方法のさらに別の代案の実施態様では、炭化水素生成物は、少なくとも１０：１の偶数鎖アルカンと奇数鎖アルカンとの比率を有する。別の実施態様では、ｎ＝１２、１４または１６である。別の実施態様では、温度は約２７５℃〜約４００℃である。別の実施態様では、温度は約３００℃〜約３７５℃である。別の実施態様では、圧力は約１０００ｐｓｉｇ〜約２０００ｐｓｉｇ（約７０００ｋＰａ〜約１３，９００ｋＰａ）である。別の実施態様では、触媒中の金属濃度は触媒総重量を基準にして０．１〜９０重量％である。別の実施態様では、触媒中の金属濃度は０．５〜６０重量％である。
【００１３】
さらに別の代案の実施態様では、本明細書で提供される方法は、Ｃｎ鎖長の直鎖アルカンの少なくとも一部を炭化水素生成物から分離して、残留炭化水素生成物の少なくとも一部を燃料として使用するステップもまた含む。別の実施態様ではｎ＝１０である。別の実施態様ではｎ＝１２である。別の実施態様ではｎ＝１４である。別の実施態様ではｎ＝１６である。別の実施態様ではｎ＝１８である。本明細書で提供される方法の別の代案の実施態様では、ＡＴＣＣ  ７４４３１と同定された形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＳＷ８１／８２株を発酵で使用する。別の実施態様では、ＡＴＣＣ  ７４４３０と同定された形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＳＷ８４／８７．２株を発酵で使用する。別の実施態様ではＡＴＣＣ  ７４４０９と同定された形質転換ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＷ６４／６５株を発酵で使用する。別の実施態様では、ｎ＝１２、１４または１６である。
【００１４】
本明細書で開示される本発明は、ジカルボン酸を調製する方法；ジカルボン酸をそれに転換し得る生成物を調製する方法；このような方法の使用；このような方法によって得られた生成物および得られ得る生成物を含む。
【００１５】
したがってさらに別の代案の実施態様では、本明細書で提供される方法はまた、本明細書で提供されるジカルボン酸からナイロンまたはポリエステルなどのポリマーを調製するための重合させるステップも含む。
【００１６】
本明細書では、直鎖の長鎖アルカンを有利にジカルボン酸に発酵させるためには、分枝アルカン異性体を除去する抽出分離法の使用に頼ることなく、高純度直鎖アルカンを製造することが望ましいことが分かった。
【００１７】
配列説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１８】
配列番号１は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ１−Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００１９】
配列番号２は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ２−Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２０】
配列番号３は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ３−Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２１】
配列番号４は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ４−Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２２】
配列番号５は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ５−Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２３】
配列番号６は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ６−Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２４】
配列番号７は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ７遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２５】
配列番号８は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ８遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２６】
配列番号９は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０還元酵素遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本明細書の対象の説明では、明細書中で様々に用いられる特定の用語法について以下の定義構造が提供される。
【００２８】
本明細書での用法では、「炭化水素」という用語は、炭素および水素原子だけからなる化合物を指す。
【００２９】
本明細書での用法では、「アルカン」という用語は、炭素および水素原子のみから構成されて、排他的に単結合のみを含有する化合物である飽和炭化水素を指す。
【００３０】
本明細書での用法では、「パラフィン」という用語は、直鎖（ノルマル）アルカンを指す。
【００３１】
本明細書での用法では、「炭化水素生成物」という用語は、供給物を水素存在下において、下述の反応条件下で触媒に接触させることで得られる生成物を指す。炭化水素生成物は、少なくとも５：１の偶数鎖アルカンと奇数鎖アルカンとの比率を有して、少なくとも１つのＣｎ鎖長の直鎖アルカン含んでなり、式中ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８である。
【００３２】
本明細書での用法では、「残留炭化水素生成物」という用語は、同一Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸に発酵させるのに純度が十分である所望のＣｎアルカンを分離した後に残留する、炭化水素生成物の集合的部分を指す。例えば蒸留によって所望のＣｎアルカンを炭化水素生成物から分離する場合、同一Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸に発酵させるのに純度が十分な所望のＣｎアルカンを含有しない蒸留留分および蒸留缶出液が、残留炭化水素生成物と称される。
【００３３】
本明細書での用法では、「直鎖ジカルボン酸」という用語は、ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＯＨの形態の枝なしジカルボン酸を指し、式中、ｍはメチレン単位数を示す。このような化合物はまた、ジカルボン酸とも称される。「Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸」
という用語は、末端カルボキシル基の炭素を含めてｎ個の総炭素数を有する枝なしジカルボン酸を指し、式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８である。
【００３４】
ｎの値（ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８）は、例えば脂肪酸、アルカン、またはジカルボン酸などのそれが言及する化学物質の炭素鎖長を示す。本明細書で開示されるＣｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸を製造する方法は、その他の鎖長を有するジカルボン酸を実質的に含まない高純度のジカルボン酸を提供する。供給物、およびそれからジカルボン酸が製造される炭化水素生成物は、２つ以上のＣｎ鎖長の脂肪酸またはアルカンを含有してもよく、開示される方法は、２つ以上のＣｎ鎖長のジカルボン酸を別々に提供し得ることが考察される。例えば供給物はＣ１２およびＣ１４脂肪酸を含んでなってもよく、水素化処理してＣ１２およびＣ１４アルカンを含んでなる炭化水素生成物にしてもよく、それを分離し、独立してＣ１２およびＣ１４ジカルボン酸に発酵させ得る。
【００３５】
本明細書での用法では、Ｃ１０ジカルボン酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸、式中、ｎ＝１０」という用語は、デカン二酸または１，８−オクタンジカルボン酸としてもまた知られているセバシン酸を指す。
【００３６】
本明細書での用法では、Ｃ１２ジカルボン酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸、式中、ｎ＝１２」という用語は、１，１０−デカンジカルボン酸としてもまた知られている１，１２−ドデカン二酸を指す。
【００３７】
本明細書での用法では、Ｃ１４ジカルボン酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸、式中、ｎ＝１４」という用語は、１，１２−ドデカンジカルボン酸としてもまた知られているテトラデカン二酸を指す。
【００３８】
本明細書での用法では、Ｃ１６ジカルボン酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸、式中、ｎ＝１６」という用語は、１，１４−テトラデカンジカルボン酸またはタプス酸としてもまた知られているヘキサデカン−１，１６−二酸を指す。
【００３９】
本明細書での用法では、Ｃ１８ジカルボン酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸、式中、ｎ＝１８」という用語は、１，１６−ヘキサデカンジカルボン酸としてもまた知られているオクタデカン−１，１８−二酸を指す。
【００４０】
本明細書での用法では、「脂肪酸」という用語は、枝なし脂肪族末端、または鎖があるモノカルボン酸を指す。「Ｃｎ鎖長の直鎖カルボン酸」という用語は、末端カルボキシル基の炭素を含めてｎ個の総炭素を有する枝なしカルボン酸を指す。脂肪酸はエステル化形態から誘導され、またはその形態で動物または植物性脂肪、油、またはワックスに含有される。天然の脂肪酸は、一般に４〜２８個の炭素原子の鎖長を有する。脂肪酸はトリグリセリド中で見られるように、その他の分子に結合し得る。
【００４１】
本明細書での用法では、「遊離脂肪酸」という用語は、その他の分子に結合していない脂肪酸を指す。遊離脂肪酸は、例えばトリグリセリドをその構成要素（脂肪酸およびグリセロール）に分解した際に得られる。
【００４２】
本明細書での用法では、Ｃ１０脂肪酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖脂肪酸、式中、ｎ＝１０」という用語は、カプリン酸としてもまた知られているデカン酸を指す。
【００４３】
本明細書での用法では、Ｃ１２脂肪酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖脂肪酸、式中、ｎ＝１２」という用語は、ラウリン酸としてもまた知られているドデカン酸を指す。
【００４４】
本明細書での用法では、Ｃ１４脂肪酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖脂肪酸、式中、ｎ＝１４」という用語は、ミリスチン酸としてもまた知られているテトラデカン酸を指す。
【００４５】
本明細書での用法では、Ｃ１６脂肪酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖脂肪酸、式中、ｎ＝１６」という用語は、パルミチン酸としてもまた知られているヘキサデカン酸を指す。
【００４６】
本明細書での用法では、Ｃ１８脂肪酸とも称される「Ｃｎ鎖長の直鎖脂肪酸、式中、ｎ＝１８」という用語は、ステアリン酸としてもまた知られているオクタデカン酸を指す。
【００４７】
本明細書での用法では、「トリグリセリド」という用語は、グリセロール分子と３つの脂肪酸のエステル化によって形成するグリセリドを指す。３つの脂肪酸は、全て異なり、全て同一であり、または２つのみが同一であり得る。トリグリセリドは植物油および獣脂の主成分である。
【００４８】
本明細書での用法では、「獣脂」という用語は獣脂を指し、羊脂、牛脂、および豚脂（ラード）を含む。
【００４９】
本明細書での用法では、「家禽脂」という用語は、家禽から得られる獣脂を指す。
【００５０】
本明細書での用法では、「黄色油脂」という用語は、例えばジャガイモ加工工場、スナック食品工場、およびファストフードレストランの業務用フライヤーから入手し得る廃植物油を指す。
【００５１】
本明細書での用法では、「グリーンディーゼル」という用語は、再生可能資源からのディーゼルを指す。グリーンディーゼルの入手は、水素化脱酸素（ＨＤＯ）を通じてトリグリセリド中の脂肪酸を直鎖アルカンに転換することを伴う。トリグリセリド主鎖は、プロパンに転換されて分離される。グリーンディーゼルは、エンジンの改造はほとんどまたは全く必要なく、単独燃料として、または石油原料からのディーゼル（石油ディーゼル）との混合物として使用し得て、目下粗製油を精製している製油所で加工し得る。現行のプロセスには、水素化脱酸素、水素異性化、および／または水素化分解をはじめとする多段階が関与して、石油ディーゼルに匹敵する特性を有するグリーンディーゼル燃料を得る。
【００５２】
本明細書での用法では、「ＡＴＣＣ」は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  Ｕ．Ｓ．Ａ．に所在するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙを指す。「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣに寄託された培養物の登録番号である。
【００５３】
ＡＴＣＣ番号７４４０９と同定されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＷ６４／６５は、メタノールの存在によって誘発されると、Ｃ６〜Ｃ２２アルカンを対応する一酸および二酸に転換する活性アルカンチトクロームＰ４５０を産生する能力を有するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株と特徴付けられた。
【００５４】
ＡＴＣＣ番号７４４３１と同定されたカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＳＷ８１／８２は、Ｃ６〜Ｃ２２アルカンまたはモノ脂肪酸上で成長しないが、グリセロールなどの適切な炭素およびエネルギー源の存在下で、Ｃ６〜Ｃ２２一酸またはアルカンから二酸を産生する能力を有するカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）と特徴付けられた。この株は中断されたＰＯＸ４遺伝子を含有し、その他の栄養要求性マーカーが除去されている。この株はβ−酸化が遮断されている。
【００５５】
ＡＴＣＣ番号７４４３０と同定されたカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＳＷ８４／８７．２は、Ｃ６〜Ｃ２２アルカンまたはモノ脂肪酸上で成長しないが、グリセロールなどの適切な炭素およびエネルギー源の存在下で、Ｃ６〜Ｃ２２一酸またはアルカンから二酸を産生する能力を有するカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）と特徴付けられた。さらにＳＷ８４／８７．２は、５ｇ／Ｌを超える濃度のグルコース存在下で、Ｃ６〜Ｃ２２アルカンまたは一酸を二酸に酸化する能力を有する。この株は改善されたアルカンヒドロキシル化活性を発現し、中断されたＰＯＸ４遺伝子を含有する。
【００５６】
本明細書での用法では、「還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド」はＮＡＤＨと略記する。
【００５７】
本明細書での用法では、「還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート」はＮＡＤＰＨと略記する。
【００５８】
本明細書での用法では、「カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７チトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子」はＡｌｋ１−Ａと略記する。
【００５９】
本明細書での用法では、「カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７チトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子」はＡｌｋ３−Ａと略記する。
【００６０】
本明細書での用法では、「カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨ還元酵素遺伝子」はＰ４５０還元酵素またはＣＰＲと略記する。
【００６１】
本明細書での用法では、「カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）アシルＣｏＡ遺伝子」はＰＯＸ４と略記する。
【００６２】
本明細書での用法では、「酵素オロチジン−５’−一リン酸脱炭酸酵素をコードするカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７  ＵＲＡ３遺伝子」は、ＵＲＡ３と略記する。
【００６３】
本明細書での用法では、「ホスホグリセロールキナーゼ」はＰＧＫと略記する。
【００６４】
本明細書での用法では、「アルコールオキシダーゼＩ」はＡＯＸ１と略記する。
【００６５】
本明細書での用法では、「ガスクロマトグラフィー」はＧＣと略記する。
【００６６】
本明細書での用法では、「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。
【００６７】
本明細書での用法では、「自己複製配列」はＡＲＳと略記する。
【００６８】
「遺伝的に改変された」という用語は、細胞外の何らかの手段によって生成されまたは誘導された核酸分子のあらゆるウィルス、細菌プラスミドまたはその他のベクターシステムへの挿入による、遺伝材料の新たな組み合わせの形成を指し、それによって、それらの宿主生物への組み込みが可能になり、その中でそれらが増殖し発現して宿主生物の表現型を変更する。
【００６９】
「形質転換」という用語は、その中で核酸断片が宿主生物のゲノムに転移されて、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、遺伝子操作を指す。転移核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「形質転換」生物または形質転換体と称される。
【００７０】
「核酸」という用語は、生きている細胞内で生じる高分子量の複合化合物を指し、その基本単位は、リン酸塩架橋によって共に連結されたヌクレオチドである。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の２つのタイプにさらに分割される。
【００７１】
「単離された核酸断片」は、任意に合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００７２】
「チトクロームＰ４５０」という用語は、多数の異なる生物学的ヒドロキシル化反応において活性であり、チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化系の１つの構成要素である、広く分布しているモノオキシゲナーゼを指す。
【００７３】
「チトクロームＰ４５０還元酵素」という用語は、多数の異なる生物学的ヒドロキシル化反応において活性であり、チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化系の１つの構成要素である広く分布している還元酵素を指す。
【００７４】
「遮断β−酸化経路」および「β−遮断」という用語は、野生型のβ−酸化経路中の第１の酵素であるアシル−ＣｏＡオキシダーゼを効果的に排除する遺伝子破壊を指す。
【００７５】
「レベル改変」は、生物中における、正常、野生型、または非形質転換生物とは異なる量または比率での遺伝子産物の生成を指す。さらに具体的には、生成は、正常、野生型、非形質転換生物と比較して「増進された」または「減少した」と表現されてもよい。
【００７６】
「増進された」という用語は、元の観察または機能との比較での改善または増大を指す。増進されたアルカンヒドロキシル化活性は、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび／またはチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨ還元酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの追加的コピー（野生型と比較して）と関連付けられている。
【００７７】
「カセット」および「遺伝子カセット」という用語は、意図的に生体外でユニークな構造に結合されまたは組み合わされたいくつかのヌクレオチド配列を指す。「発現カセット」は、具体的にはプロモーター断片、選択された遺伝子産物のためのＤＮＡ配列、および転写ターミネーターを含む。
【００７８】
「プラスミド」および「クローニングベクター」という用語は、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態であり、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を保有することが多い、染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直鎖または環状の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージ配列であってもよい。「自己複製配列」という用語は、酵母中でプラスミドの自律複製を可能にする能力がある染色体配列を指す。
【００７９】
「発現」という用語は、本発明の核酸断片から誘導される、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。「過剰発現」は、正常なまたは非形質転換生物中の生成レベルを超える、遺伝子導入生物中の遺伝子産物の生成を指す。「相互抑制」は、同一のまたは実質的に同様の外来性または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写物の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００８０】
「変異」という用語は、生物の遺伝的特徴の変化をもたらす、生物のＤＮＡ中の化学変化を指す。このような変化した特徴を示す株は、「変異体」と称される。
【００８１】
「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、一本鎖テンプレートオリゴヌクレオチドの領域と塩基対合する短いオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖ＤＮＡによる相補鎖合成を生じさせるＤＮＡポリメラーゼの出発点を形成するのに必要である。
【００８２】
「制限酵素」および「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ中の特定のヌクレオチド配列内の加水分解開裂を触媒する酵素を指す。
【００８３】
「直鎖炭化水素」という用語は、炭素主鎖中に０、１または２個の二重結合を含有する、炭素数Ｃ６〜Ｃ２２の脂肪族炭化水素、脂肪酸、および脂肪酸エステルを指す。さらに用語は、末端炭素の１つがフェニル基によって置換されている、上述の直鎖化合物のいずれかを含む。特定の好ましい炭化水素は、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカンまたはそれぞれのモノカルボン酸のいずれかである。好ましいのはＣ１２〜Ｃ１４アルカンである。ドデカンが特に好ましい。
【００８４】
「アルカンヒドロキシル化活性」という用語は、チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化系を使用して、直鎖炭化水素の末端メチル基を酵素的にヒドロキシル化する、酵母などの生物の能力を指す。「チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化系」という用語は、少なくとも以下の３つの生物学的構成要素から構成されるヒドロキシル化系を指す。１）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、２）チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨ還元酵素、および３）還元ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰＨ）。
【００８５】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）および後続する制御配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質をコードする核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、自然界でそれ自身の制御配列と一緒に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界に一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよく、または制御配列およびコード配列は同一起源に由来するが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列していてもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中でその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、常態では宿主生物中に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を包含し得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００８６】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性、または随伴するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでもよい。
【００８７】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーター配列は、近位の要素およびより遠位の上流要素からなり、後者の要素はエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得要素であってもよく、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種要素であってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型内で、または異なる成長段階で、または異なる環境条件に応じて、遺伝子発現を誘導してもよい。ほとんどの場合に、ほとんどの成長条件下で遺伝子発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。植物細胞で有用な様々なタイプの新たなプロモーターが絶えず発見されており、多数の例がＯｋａｍｕｒｏおよびＧｏｌｄｂｅｒｇによる編纂物（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ  １５：１−８２（１９８９））にある。しかしほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されておらず、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有するかもしれない。
【００８８】
「作動可能に連結する」という用語は、１つの機能が他方の機能によって影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼす（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、それはコード配列と作動可能に連結する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結し得る。
【００８９】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理ポリペプチド、すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレ−またはプロペプチドがそれから除去されているものを指す。「前駆体タンパク質」とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物、すなわちプレ−およびプロペプチドがなおも存在しているものを指す。プレ−およびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよいがこれに限定されるものではない。
【００９０】
供給物
供給物は、再生可能資源であり、あらゆる植物または動物由来油、脂肪、遊離脂肪酸、アルキルエステル、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００９１】
再生可能資源は、植物および／または動物に由来する油であってもよく、１つ以上の遊離脂肪酸を含んでなり、油は例えば少なくとも約１０モル％、または少なくとも約１５モル％、または少なくとも約２０モル％、または少なくとも約２５モル％、または少なくとも約３０モル％、または少なくとも約３５モル％、または少なくとも約４０％などの少なくとも約５モル％のＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸を含んでなり、式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６、または１８である。供給物は、遊離脂肪酸混合物を含んでなってもよい。例えば供給物は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはこれらの組み合わせを含んでなってもよい。
【００９２】
再生可能資源は、植物および／または動物に由来する油であってもよく、１つ以上のトリグリセリドを含んでなり、油は例えば少なくとも約１０モル％、または少なくとも約１５モル％、または少なくとも約２０モル％、または少なくとも約２５モル％、または少なくとも約３０モル％、または少なくとも約３５モル％、または少なくとも約４０モル％などの少なくとも約５モル％のＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸から誘導されるトリグリセリドを含んでなり、式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６、または１８である。供給物は、トリグリセリド混合物を含んでなってもよい。これらのトリグリセリドは、マツ、ナタネ、カノーラ、ヒマワリ、ナンヨウアブラギリ、海岸アオイ、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される植物に由来してもよい。例えば遺伝子改変高ステアリン酸または高ラウリン酸カノーラ変種などの遺伝子改変植物種からの油もまた、使用してよい。
【００９３】
供給物は、ココナッツ油、パーム核油、パーム油、ダイズ油、綿実油、およびこれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される植物油であってもよい。供給物はまた、家禽脂、黄色油脂、獣脂、またはこれらの組み合わせを含んでなってもよい。供給物はまた、使用済み植物油または生物由来資源の熱分解からの油を含んでなってもよい。供給物はまた、藻類などの海洋生物に由来する油を含んでなってもよい。
【００９４】
再生可能資源はまた、トリグリセリドから誘導される脂肪酸のアルキルエステルであってもよく、エステルは、例えば少なくとも約１０モル％、または少なくとも約１５モル％、または少なくとも約２０モル％、または少なくとも約２５モル％、または少なくとも約３０モル％、または少なくとも約３５モル％、または少なくとも約４０％などの少なくとも約５モル％のＣｎ鎖長の直鎖脂肪酸エステルを含んでなり、式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６、または１８である。アルキル基は、例えばメチルなどのＣ１〜Ｃ１０アルキル基であってもよい。供給物は、エステル混合物を含んでなってもよい。
【００９５】
メタノールと、メチル酸ナトリウムなどの触媒を使用した、トリグリセリド中の脂肪酸のメチルエステルへのエステル交換は、一般にバイオディーゼルと称されるＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）を生じる。主に直鎖Ｃ１４〜Ｃ２２カルボン酸であるこれらのメチルエステルは燃料として使用し得て、または粗製油原料から精製されたディーゼルに混合し得る。
【００９６】
供給物はまた、例えばＣｎ鎖長の直鎖アルカンを含んでなる生成物またはプロセス流などのバイオディーゼルまたはグリーンディーゼルプロセスから得られる再生可能資源であってもよく、アルカンの鎖長は所望の直鎖ジカルボン酸の鎖長に一致する。一般にグリーンディーゼルと称される再生可能資源からのディーゼルには、水素化脱酸素（ＨＤＯ）を通じた、トリグリセリド中の脂肪酸の直鎖アルカンへの転換が伴う。トリグリセリド主鎖はプロパンに転換されて分離される。
【００９７】
それによって供給物が炭化水素生成物に転換される水素化処理工程は適応性があり、供給物の選択は、脂肪酸の鎖長が所望の直鎖ジカルボン酸の鎖長に一致するＣｎ脂肪酸の含量、ならびにその入手可能性および費用に基づいてもよい。供給物の選択はまた、水素化脱酸素工程から得られるその他の炭化水素、発酵せず所望の直鎖ジカルボン酸にならず、集合的に「残留炭化水素生成物」と称されるアルカンの価値または有用性に基づいてもよい。
【００９８】
残留炭化水素生成物は、例えばグリーンディーゼルとして、またはグリーンディーゼル製造工程の供給物として使用してもよい。残留炭化水素生成物はまた、（石油）ディーゼル燃料のための調合剤として使用してもよい。したがって供給物の選択はまた、残留炭化水素生成物のエネルギー価と組み合わさった、所望の直鎖ジカルボン酸生産の全体的経済性に基づいてもよい。その結果、場合によっては、約５モル％未満の所望の直鎖脂肪酸を含んでなる油、または約５モル％未満の直鎖脂肪酸から誘導されるトリグリセリドを含んでなる油を供給物として使用してもよい。同様に、場合によっては、約４０モル％を超える直鎖脂肪酸を含んでなる油、または直鎖脂肪酸から誘導される約４０モル％を超えるトリグリセリドを含んでなる油もまた、使用してもよい。供給物次第で、水素化処理工程で得られる炭化水素生成物は、例えばＣ８またはＣ２０アルカンなどのその他の鎖長の直鎖アルカンを含んでなってもよい。取り扱いの容易さのため、供給物は液体供給物として使用してもよい。
【００９９】
触媒
Ｄｅｌｍｏｎ，Ｂ．“Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｉｎ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｒｅｆｉｎｉｎｇ  １９８９”ｉｎ：Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｅｄｓ．Ｔｒｉｍｍ，Ｄ．Ｌ．，Ａｋａｓｈａｈ，Ｓ．，Ａｂｓｉ−Ｈａｌａｂｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｉｓｈａｒａ，Ａ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９０），ｐｐ１−３８は、クラッキングおよび水素化処理工程に依存する、粗製油の大部分の使用可能製品への転換を開示する。過去数十年間にわたって、水素化処理工程はより複雑になり多様化してきており、水素化精製（例えばイオウ、窒素、酸素、金属などの除去）、水素化転化（例えばジェット燃料または潤滑剤の生産）、および水素化分解（マイルドまたは高度水素化分解）のような工程が含まれる。具体的には、イオウ、窒素、酸素、および金属の除去は、それぞれ水素化脱硫、水素化脱窒素、水素化脱酸素、および水素化脱金属と称される。
【０１００】
石油原料と共に使用するための特定の水素化処理触媒は、典型的にアルミナ、シリカまたはシリカ−アルミナなどの単金属または混合金属酸化物上に担持される、ニッケル、コバルト、モリブデン、およびタングステンなどの１つ以上の卑金属を含んでなる。触媒は、Ｉ族金属（例えばリチウム、ナトリウム、およびカリウム）および／またはフッ素、ホウ素、およびリンによって促進され得る。触媒は、それを水素化処理反応に供する前に、同時の定位置還元およびスルフィド化によって活性化される。コバルト（Ｃｏ−Ｍｏ／Ａｌ２Ｏ３）またはニッケル（Ｎｉ−Ｍｏ／Ａｌ２Ｏ３）などのプロモーターと共にα−アルミナ上に担持されるモリブデンからなる触媒は、石油留分および残油の水素化処理で広く使用される。
【０１０１】
再生可能資源からのディーゼル生産で最も一般的に使用される触媒は、白金および／またはパラジウムなどの貴金属を含んでなる。Ｍｕｒｚｉｎらは、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４５（２００６）ｐｐ．５７０８−５７１５で、このような触媒作用で使用される多数の金属を開示する。白金およびパラジウムは、所望の生成物の最良の転換を与えた。ニッケル触媒は、供給材料のクラッキングからもたらされる部分の再結合のために、二量体などの望まれない重産物を生じた。
【０１０２】
本明細書の方法では、触媒は活性金属および酸化物を含んでなる。活性金属は、１つ以上の卑金属であってもよい。酸化物は単金属または混合金属酸化物を含んでなり、担体として使用される。活性金属は、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、または例えばニッケル−モリブデン（ＮｉＭｏ）、コバルト−モリブデン（ＣｏＭｏ）などのそれらの混合物であってもよい。好ましくは活性金属はＮｉである。金属は還元またはスルフィド化形態（例えばＮｉ９Ｓ８、Ｃｏ９Ｓ８、ＭｏＳ２）のどちらであってもよい。活性金属がニッケルである場合、担体としてのアルミナ存在下で還元させるのに、少なくとも４０重量％などのより高い量が必要かもしれない。
【０１０３】
還元ステップでは、触媒を好ましくは１００℃〜４００℃などの高温において水素で処理する。典型的に触媒温度は水素流中で増大されて、例えば約１３０℃の温度で開始され、２５０℃または３５０℃の温度に増大される。このような方法は当業者に知られている。触媒を還元するための特定の手順を下の実施例に提供する。
【０１０４】
調製した触媒を高温で、チオール、硫化物、二硫化物、Ｈ２Ｓ、またはそれらの組み合わせなどのイオウ含有化合物に接触させることで、触媒を硫化してもよい。触媒を使用する前、または水素化処理工程中に、チオール、硫化物、二硫化物、Ｈ２Ｓ、家禽脂、またはそれらの２つ以上の組み合わせなどの少量のイオウ含有化合物を供給物中に導入することで、それをスルフィド化してもよい。スルフィド化は反応条件および供給物組成次第で、触媒の長期活性に寄与するかもしれない。詳細なスルフィド化手順については、実施例で下述する。
【０１０５】
任意に、本発明によって提供される方法で、活性金属と共に金属プロモーターを使用してもよい。適切な金属プロモーターとしては、次が挙げられる。１）周期表ＩおよびＩＩ族からの元素；２）スズ、銅、金、銀、およびそれらの組み合わせ；および３）より少ない量の周期表のＶＩＩＩ族金属の組み合わせ。還元またはスルフィド化されているかどうかに拘わらず、活性金属は所望の生成物に基づいて選択される。
【０１０６】
酸化物は、活性金属のための担体として使用される、単金属または混合金属酸化物を含んでもよい。酸化物として使用されることが多い材料は、触媒単位重量当たり高濃度の活性部位を提供し得る、総表面積（外面および内面）の高い多孔性固体である。酸化物は活性金属の機能を増強する能力を有し、金属がより効率的に使用されることから担持型触媒が一般に好ましい。
【０１０７】
酸化物は、触媒の単位重量当たり高濃度の活性部位を提供し得る、高い総表面積（外面および内面）がある多孔性固体酸化物を含んでもよい。好ましくは酸化物は、好ましくは５０ｎｍ以下の比較的小さな直径の孔を有する。好ましい酸化物は、２０ｍ２／ｇを超える表面積を有し、より好ましくは酸化物は７５ｍ２／ｇを超える表面積を有し、さらにより好ましくは酸化物は少なくとも１００ｍ２／ｇの表面積を有する。一般に表面積は３００ｍ２／ｇ未満である。
【０１０８】
酸化物は、シリカ、アルミナ、チタニア、チタニア−アルミナ、チタニア−シリカ、酸化カルシウム、酸化バリウム、ジルコニア、酸化ランタン、酸化マグネシウム、ケイ藻土、シリカ−アルミナ、酸化亜鉛、およびそれらの組み合わせなどの酸化物をはじめとするが、これに限定されるものではない、高い表面積がある多孔性固体酸化物であってもよい。酸化物は好ましくはアルミナ、シリカ、チタニア、ジルコニア、ケイ藻土、シリカ−アルミナ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。より好ましくは酸化物は、アルミナ、シリカ、ケイ藻土、またはその組み合わせである。
【０１０９】
触媒は、活性炭、黒鉛、および原線維ナノチューブ炭素、ならびに炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムおよび硫酸バリウムなどの炭素をはじめとする、その他の材料をさらに含んでなってもよい。
【０１１０】
触媒は、当該技術分野で知られている様々な方法のいずれかを使用して調製してよい。好ましくは予形成（例えば既に焼成された）金属酸化物が使用される。例えば金属酸化物は、好ましくは活性金属を塗布する前に焼成される。活性金属を金属酸化物上に配置する方法は重要でない。いくつかの方法が当該技術分野で知られている。多数の適切な触媒が市販されている。
【０１１１】
活性金属および酸化物の相対比は決定的ではない一方、少なすぎる活性金属が存在すると、初期活性が所望されるよりも低くなり、触媒が最大活性に達するのに長い活性化期間を要するかもしれない点で重要である。活性金属の重量％が高いほど、反応はより早くなることが理解されるであろう。触媒中の活性金属の好ましい含量範囲は、総担持型触媒の約０．１重量％〜約９０重量％である。より好ましい活性金属含量範囲は、約０．２重量％〜約７５重量％である。さらに好ましい活性金属含量範囲は、約０．５重量％〜約６０重量％である。
【０１１２】
本発明の方法の水素化処理工程では、偶数鎖炭化水素と奇数鎖炭化水素のより高い比率を有する炭化水素が生成する。この工程では、活性金属は好ましくはニッケル、コバルト、およびモリブデンを含んでなる。この方法の触媒のニッケル含量は、一般に０．２重量％〜２０重量％、より好ましくは０．５重量％〜１５重量％である。
【０１１３】
水素化処理工程
水素化処理工程は、水素化脱酸素（ＨＤＯ）、水素異性化（ＨＩ）および／または水素化分解（ＨＣ）の３つの主反応を含んでなってもよいが、これに限定されるものではない。これらのステップ中に、所望の生成物を顕著に変化させることなく、副次反応も起こり得る。
【０１１４】
ＨＤＯ処理は、パラフィン（炭化水素）生成物を製造するためのトリグリセリドおよびその他の遊離脂肪酸中の脂肪酸からの酸素の除去である。ＨＤＯは、脱カルボニル化、脱カルボキシル化または水素化脱酸素またはその組み合わせのいずれかとして起こり得る。脱カルボキシル化は、二酸化炭素としての酸素除去工程を指し、パラフィン系炭化水素が生じる。脱カルボニル化は、一酸化炭素および水としての酸素除去工程を指し、不飽和炭化水素が直接生成され、または水素を添加することで飽和炭化水素が間接的に生成される。水素化脱酸素は、水素添加による水としての酸素除去工程を指す。脱カルボキシル化および脱カルボニル化では、得られるパラフィン系炭化水素は、対応するカルボン酸よりも１炭素単位分だけ短い。水素化脱酸素では、得られる炭化水素は対応するカルボン酸と同数の炭素を有する。
【０１１５】
有利には水素化処理工程は、目的に合わせて酸素除去経路を調節してもよい。水素を最小限に使用する工程では、脱カルボキシル化および直接脱カルボニル化経路を使用し得る。一酸化炭素および二酸化炭素の発生を最小限にする工程では、間接的脱カルボニル化または水素化脱酸素が好ましい経路である。炭素−炭素結合の切断を回避して、アルカン直鎖主鎖（そして究極的にジカルボン酸）中に、供給物中に含有される脂肪酸と同数の炭素原子を保つことが所望される場合、水素化脱酸素もまた好ましい経路である。
【０１１６】
鎖長は、どの特定の脱酸素化工程を使用するかを決める上で、重要な役割を果たすかもしれない。例えばＣ１１の製造が、主にＣＯおよび／またはＣＯ２として脂肪酸から酸素を除去する（水素消費削減）のに対し、Ｃ１２の製造は、主にＨ２Ｏの形態として酸素を除去する（温室効果ガス排出削減）。特定の用途に応じて、Ｃ１１またはＣ１２直鎖炭化水素が好まれるかもしれない。これらの経路は、本明細書に記載されるように、触媒のタイプおよび／または組成を変化させることで選択的に制御し得る。還元担持金属酸化物触媒は、偶数直鎖炭化水素と奇数直鎖炭化水素とのより低い比率が所望される場合に使用し得る一方、スルフィド化担持金属酸化物触媒は、偶数直鎖炭化水素と奇数直鎖炭化水素とのより高い比率が所望される場合に使用し得る。
【０１１７】
本明細書の方法で記載されるように、水素化処理は、供給物を開示される触媒組成物存在下、高温高圧で水素に接触させて、供給物を水素化脱酸素、水素化異性化、および／または水素化分解して、所望の燃料にするステップを含む。温度は２５０〜４２５℃、好ましくは２７５〜４００℃、最も好ましくは３００〜３７５℃の範囲である。圧力は、５００〜２５００ｐｓｉｇ（３，４５０〜１７，２５０ｋＰａ）、好ましくは１０００〜２０００ｐｓｉｇ（６，９００〜１３，９００ｋＰａ）の範囲である。
【０１１８】
水素化処理工程の別の実施態様では、（ａ）再生可能資源である供給物を提供するステップと；（ｂ）供給物を水素存在下、２５０〜４２５℃の温度および５００〜２５００ｐｓｉｇ（３，４５０〜１７，２５０ｋＰａ）の圧力で触媒に接触させるステップを含んでなる、再生可能資源を水素化脱酸素する工程が提供され、触媒は、モリブデンと、ニッケル、コバルト、またはそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の活性金属とを含んでなり、触媒は使用前にスルフィド化されて、少なくとも１：１、好ましくは少なくとも３：１、より好ましくは少なくとも５：１、最も好ましくは少なくとも１０：１の偶数鎖炭化水素と奇数鎖炭化水素との比率を有する、炭化水素生成物が生じる。好ましくは
触媒はニッケル、コバルト、およびモリブデンを含んでなる。
【０１１９】
意外にも、本方法の水素化処理工程におけるニッケル、コバルト、モリブデン、またはそれらの組み合わせなどの卑金属の使用からは、米国特許出願公開第２００６／０２０７１６６号明細書で開示されるようなより高価な貴金属触媒を使用して得られる収率に等しく、またはそれに優る水素化処理生成物の収率が得られる。
【０１２０】
本明細書の方法は、固定床反応器およびスラリー反応器をはじめとする、あらゆる適切なタイプの反応器内で実施してもよい。固定床反応器は、触媒からの反応物質および生成物の分離が容易である利点を有する。固定床反応器としては、押し出し流れ反応器および散水濾床反応器が挙げられる。固定床反応器は、断熱、多管、連続再循環充填床反応器タイプであり得る。スラリー反応器としては、バッチ、連続撹拌タンク反応器、および気泡塔反応器が挙げられる。スラリー反応器内では、濾過または遠心作用によって反応混合物から触媒を除去してもよい。好ましくは本発明の工程は連続プロセスであり、反応器は固定床または連続撹拌タンク反応器である。より好ましくは工程は連続プロセスであり、反応器は固定床反応器である。
【０１２１】
好ましくは工程は、固定床またはスラリー反応器内の連続プロセスであり、触媒は粒子形態、好ましくは成形粒子である。「成形粒子」とは、触媒が押し出し物の形態であることを意味する。押し出し物としては、シリンダー、ペレット、または球体が挙げられる。シリンダー型は、１つ以上の補強リブがある中空であってもよい。三葉、クローバー形、長方形および三角形の管、十字型、および「Ｃ」型触媒を使用し得る。
【０１２２】
好ましくは成形触媒粒子は、充填床反応器が使用される場合、直径が約０．０１〜約０．５インチ（約０．２５〜約１３ｍｍ）である。より好ましくは触媒粒子は、直径が約１／３２〜約１／４インチ（約０．７９〜約６．４ｍｍ）である。
【０１２３】
多様な適切な触媒濃度を使用してもよい。反応器あたりの触媒の量は、一般に反応器タイプに左右される。固定床反応器では反応器あたりの触媒容積が高いのに対し、スラリー反応器内では容積はより低い。典型的にスラリー反応器内では、触媒は反応器内容物の０．１〜約３０重量％を構成する。好ましくは触媒は、反応器内容物の１〜１５重量％である。
【０１２４】
固定床反応器では、重量空間時速は、典型的に０．０５〜１００ｈｒ−１、好ましくは０．１〜１０ｈｒ−１、より好ましくは１．０〜５．０ｈｒ−１の範囲内に入る。
【０１２５】
本明細書方法の水素化処理工程の一実施態様では、供給物を水素に接触させて液体供給物／水素混合物を形成してから、液体供給物／水素混合物を触媒に接触させる。任意に、触媒に接触させるのに先立って、実質的に全ての水素が溶液中にあるように、水素に対して比較的高い溶解性を有する溶剤または希釈剤を供給物および水素に添加して、液体供給物／溶剤または液体供給物／希釈剤混合物を形成し得る。次に液体供給物／溶剤または液体供給物／希釈剤混合物を水素に接触させて、液体供給物／溶剤／水素または液体供給物／希釈剤／水素混合物を形成する。次に水素を含有する混合物を触媒に接触させる。
【０１２６】
好ましい工程では、供給物と水素を反応させるために、液体供給物／溶剤／水素または液体供給物／希釈剤／水素混合物を押し出し流れ、管状またはその他の固定床反応器などの充填床反応器内で触媒に接触させる。充填床反応器は、上で論じたように、単一充填床であっても、または直列または並列またはその組み合わせの多床であってもよい。
【０１２７】
液体供給物／溶剤／水素または液体供給物／希釈剤／水素混合物は、実質的に水素ガスを含まない液体供給流であり得る。供給流は、液体供給物を水素および溶剤または希釈剤に接触させて、水素飽和液体供給物を生じさせることで生成し得る。代案としてはまたはこれに加えて、液体供給物を水素および溶剤または希釈剤に接触させた後に、例えば離脱工程で既知の気体／液体分離法によって、水素ガスを供給流から除去し得る。水素ガスを含まない液体供給流を生成する方法は知られており、米国特許第６，１２３，８３５号明細書、米国特許第６，４２８，６８６号明細書、米国特許第６，８８１，３２６号明細書、および米国特許第７，２９１，２５７号明細書で開示されている。
【０１２８】
溶剤／希釈剤に可溶性の水素の百分率は、液体供給物反応物質に可溶性の水素の百分率を超える。本実施態様では、好ましくは反応に要する水素は全て、固定床反応器上流の溶液中で利用できるようになり、したがって反応器内で水素ガスを循環させる必要がなくなる。
【０１２９】
液体供給物／溶剤／水素または液体供給物／希釈剤／水素混合物と触媒との反応は、高度に発熱性であり、その結果多大な熱が反応器内に生じる。反応器温度は、再循環流を使用することで制御してもよい。溶剤または希釈剤として使用するために、パラフィン（炭化水素）生成物（反応器溶出物）の一部を再循環流として反応器前部に戻して再循環させ、新鮮な供給物および水素と混合してもよい。
【０１３０】
工程は一連の２つ以上の直列反応器を使用する多段階工程であってもよく、各反応器の入口で新鮮な水素を添加してもよい。再循環流はいくらかの熱を吸収して、反応器全体の温度上昇を低下させる。反応器温度は、新鮮な供給物の温度と、再循環量を調節することで制御してもよい。さらに再循環流は反応済み構成要素を含んでなるので、再循環流はまた、不活性希釈剤の役割も果たす。
【０１３１】
添加される希釈剤のタイプおよび量、ならびに反応器条件は、反応に要する水素が実質的に全て溶液中で利用できるように設定し得る。溶剤または希釈剤は、好ましくは再循環流として使用される反応器溶出物の一部であるが、代案としては、軽質炭化水素、軽質留分、ナフサ、ディーゼルなどからなる群から選択され得る。例としては、プロパン、ブタン、および／またはペンタンが挙げられる。溶剤または希釈剤中の水素の百分率は供給物中の水素の百分率を超え、したがって本実施態様では、反応に要する水素は全て、固定床反応器上流の溶液中で利用できるようになり、溶出物または生成流と共溶出する水素ガスを再循環させる必要がなくなる。
【０１３２】
アルカンの分離
供給物を適切な反応条件下において水素存在下で触媒に接触させることによって得られる炭化水素生成物は、Ｃｎ鎖長の直鎖アルカンを含んでなり、式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８である。供給物次第で、炭化水素生成物は、例えばＣ８またはＣ２０アルカンなどのその他の炭素鎖長の直鎖アルカンを含んでなってもよい。
【０１３３】
Ｃ９〜Ｃ１７範囲の直鎖パラフィンが一般に精密蒸留によって単離され、分子ふるいを用いた選択的吸着による分枝鎖炭化水素および芳香族からの単離がそれに続く。これらの分子ふるいは、孔によって相互連結する一連の中心腔を有する合成ゼオライトである。孔は、より小さな直径の枝なしパラフィンのみを通過させるのに十分大きい、均一の直径を有する。イソパラフィン、シクロパラフィン、および芳香族などのより嵩高い構成要素は除外されて、分子ふるいによって内部吸着されない。直鎖パラフィンは後から脱離され、９７〜９９％アッセイの直鎖生成物が生成する。
【０１３４】
分子ふるいを使用した商業的単離工程としては、ＩｓｏＳｉｖ（登録商標）（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｘ（登録商標）（ＵＯＰ  ＬＬＣ）、およびＥｎｓｏｒｂ（登録商標）（Ｅｘｘｏｎ  Ｍｏｂｉｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。ｎ−パラフィン抽出単位の原料は、通常従来の技術によって脱硫化され、所望生成物の直鎖パラフィンの範囲（炭素数）を含むように分留される。抽出は、液相（Ｍｏｌｅｘ（登録商標））または気相（Ｅｎｓｏｒｂ（登録商標）、ＩｓｏＳｉｖ（登録商標））のどちらかの中で達成される。ｎ−パラフィンの脱離は、ヘプタン、オクタンまたはイソオクタンなどのより低い分子量のｎ−パラフィンによる置換（Ｍｏｌｅｘ（登録商標））によって、またはアンモニアなどの極性脱吸着材（Ｅｎｓｏｒｂ（登録商標）、ＩｓｏＳｉｖ（登録商標））によって達成してもよい。
【０１３５】
様々な抽出工程は、芳香族およびイオウなどの供給不純物に対する感度、または分子ふるい上の粘結速度が異なっているかもしれないが、比較できる製品を製造できると考えられる。９８％ｎ−パラフィンを含有する生成物は、広範囲（１５〜２５体積％）の直鎖Ｃ９〜Ｃ１７パラフィンを含有する灯油／軽油留分から製造されてもよい。収率は、供給物中のｎ−パラフィンのおよそ９８％の回収率に相当する。単離された直鎖パラフィンは一般に分留されて、特定の最終用途および消費者規格に必要とされる、特定のｎ−パラフィン混合物の精密分留分が生成する。しかし上の商業的方法は、高価で大規模な精製および分離工程、大量の分子ふるいまたはその他の分離媒体を必要とし、直鎖アルカンと分枝アルカンとの高い比率を含有する製品には、非常に効果がない。
【０１３６】
意外にも本明細書の工程では、高価な選択的吸着技術を使用する現行の商業的方法とは対照的に、直鎖および分枝異性体のアルカン混合物から、１回以上の蒸留による１つ以上の蒸留留分として、Ｃｎ鎖長の所望の直鎖アルカンを効果的に単離し得ることが観察された。任意にさらなる蒸留を実施して、所望の純度の所望の直鎖アルカンを得てもよい。
【０１３７】
蒸留は、１つ以上の蒸留塔を使用して連続様式で、または単一カラムを使用してバッチ様式で実施してもよい。多数の連続蒸留配置を使用してもよいが、望ましい配置は、第１の蒸留塔内の塔頂留出物中の低沸点不純物を除去し、リボイラーから生成物および高沸点物を収集するものである。次に生成物留分を第２の蒸留塔内の塔頂留出物から収集し、高沸点不純物をリボイラーからパージしてもよい。
【０１３８】
例えばランダム充填、構造化充填、またはトレイを使用する蒸留塔を分離のために使用してもよい。連続蒸留では、過剰なカラム高さなしで生成物収率を最大化するために、１〜１００の平衡棚段、または例えば５〜５０の平衡棚段、または例えば２０〜３０の平衡棚段を含有するカラムが望ましい。連続蒸留塔は、カラム長さに沿ったあらゆる位置で供給してもよいが、各カラムの中央近くの供給が好ましい。カラムへの気体または液体供給、および留出物または残留分としてのカラムからの気体または液体除去を使用してもよい。最小カラム直径を用いて純度および容量を最大化するために、連続蒸留のための所望の還流比は１〜５０、または例えば５〜３０、または例えば１０〜２０の範囲である。蒸留は陽圧下、大気圧下、または減圧下で実施してもよい。過剰なポット温度を防止するために、１０〜２５０ｍｍ  Ｈｇ（絶対的）の操作圧力が好ましく、２０〜１００ｍｍ  Ｈｇ（絶対的）が最も好ましい。リボイラーは、蒸気、電気、またはその他の適切な熱伝達媒体を用いて加熱してもよい。冷却管は、水、空気、または適切な熱伝達媒体を用いて冷却してもよい。
【０１３９】
低沸点不純物を除去する塔頂での初留液留分の収集を通じて生成物を精製するために、バッチ蒸留もまた使用してもよく、生成物としてのポット液の収集がそれに続く。任意に生成物留分を塔頂で取り出して、生成物を高沸点不純物から分離してもよい。バッチ蒸留では、１〜５０の平衡棚段、または例えば５〜３０の平衡棚段、または例えば１０〜２５の平衡棚段を有するカラムが望ましい。最小の機器寸法とバッチサイクル時間で、純度を最大化し収率損失を最小化するために、例えば２〜３０、または例えば１０〜２５などの０．２〜５０の還流比が望ましい。主要生成物分留の間に、より低い還流比を使用してサイクル時間を最小化してもよく、生成物分留の終わり近くにおける、高沸点不純物を分離するための還流比増大がそれに続く。バッチ蒸留で使用される操作圧力は、連続蒸留と同一である。
【０１４０】
同一Ｃｎ鎖長の直鎖ジカルボン酸への発酵に十分な純度の所望されるアルカンを含有しない蒸留留分および蒸留缶出液は、本明細書で「残留炭化水素生成物」と称される。残留炭化水素生成物の少なくとも一部は、そのエネルギー価のために、例えばグリーンディーゼルを製造する工程において、またはグリーンディーゼルとして、燃料として使用してもよい。このような方法で残留炭化水素生成物を使用することは、再生可能資源の廃棄を最小化し、直鎖ジカルボン酸を製造する工程の経済性を改善する。残留炭化水素生成物はまた、石油ベースのディーゼルに混合しても良い。
【０１４１】
残留炭化水素生成物から製造し得るグリーンディーゼルは、ディーゼルとして使用するため、または石油ディーゼルと混合するための所望の特性を有する。グリーンディーゼルは、単独で、またはライトサイクルオイル、オイルサンドまたは灯油などのセタン価のより低い生成物と混合して、燃料として使用してもよい。（ライトサイクルオイルはセタン価向上剤を使用しなければ、ディーゼル燃料として使用できない。）残留炭化水素生成物の水素異性化（ＨＩ）および水素化分解（ＨＣ）は、水素化処理生成物の寒冷特性を改善し得る。水素異性化では、直鎖炭化水素は分枝炭化水素に転換される。好ましくは異性化は、分枝炭化水素が、または直鎖および分枝炭化水素混合物が、石油ディーゼルの範囲で沸騰するように制御される。水素化分解は鎖長を低下させる。より短い炭化水素は、グリーンディーゼル中で、または石油ディーゼルへの添加剤として、融点がより低い構成要素を提供する。ＨＩおよびＨＣはどちらも曇り点および流動点を低下させることで、グリーンディーゼルの寒冷特性を実質的に改善する。
【０１４２】
残留炭化水素生成物から製造し得るグリーンディーゼルは、密度に悪影響を及ぼすことなくセタン価を上昇させる。実質的に直鎖の生成物は、ディーゼルエンジンが効率的に駆動するパワーを保つのに要する高セタン価を有する。セタン価は、特定の水素化処理触媒および作業条件の選択によって制御してもよい。セタン価は５０〜１００、より好ましくは７０〜１００の範囲であることが所望される。一部の鎖の枝分れと、より小さな鎖へのクラッキングは曇り点温度を低下させ、それによって寒冷気候石油ディーゼルに混合した際、−４０℃に至る寒冷用途におけるその使用が可能になる。枝分れの度合いは用途の温度に左右され、水素化処理触媒の選択によって制御してもよい。この工程によって生成されるグリーンディーゼルはまた、今日のディーゼルエンジンに適した、所望の潤滑性（４００〜６５０μｍ）、粘度（４０℃で３〜５ｃＳｔ）、および密度（２５℃で７５０〜８００ｋｇ／ｍ３）も示す。
【０１４３】
「生物由来資源経済」の１つのパラダイムは、化学中間体または構成要素の生産を活用して、高価値／小容積製品と、高容積／低価値燃料との平衡を保つ新しい生物精製所を成功裏に創出することである。生物精製所は石油化学的に対する必要性をなくさないが、それらは２１世紀をますます持続可能な、国産の、環境に責任を持てる生物由来資源経済にする上で、重要な役割を演じる。所望の鎖長の直鎖アルカンＣｎ（式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８である）は、グリーンディーゼル工場で同時生産し得る。それは有利には、供給物のための再生可能資源を適切に選択することにより、期間生産で意図的に生産し得る。所望のアルカンは、水素化処理工程によって得られる炭化水素生成物から分離し得て、残留炭化水素生成物はグリーンディーゼルまたは石油ディーゼル燃料に戻して混合し得る。比較的小容積の直鎖アルカンが必要であれば、所望の直鎖アルカンはまた、有利には分留またはバッチ蒸留によってグリーンディーゼルから直接分離し得る。
【０１４４】
発酵
Ｃｎ鎖長の直鎖アルカンは別々に、所望のＣｎ鎖長（式中、ｎ＝１０、１２、１４、１６または１８である）の直鎖ジカルボン酸に発酵させてもよい。直鎖アルカンを直鎖ジカルボン酸に発酵する方法および微生物は知られており、例えば米国特許第５，２５４，４６６号明細書、米国特許第５，６２０，８７８号明細書、米国特許第５，６４８，２４７号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１８１４９１号明細書および米国特許出願公開第２００４／０１４６９９９号明細書（あらゆる目的のために本明細書の一部としてその各内容全体を参照によって援用する）、および欧州特許第１２７３６６３号明細書に記載される。発酵ブロスから直鎖ジカルボン酸を回収する方法もまた知られており、少なくとも上で引用した参考文献のいくつかと、また例えば国際公開第２０００／２０６２０号パンフレットおよび米国特許第６，２８８，２７５号明細書で開示される。
【０１４５】
米国特許出願公開第２００４／０１４６９９９号明細書は、遺伝子操作されたアルカンヒドロキシル化活性の改善によって特徴付けられる形質転換ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または遺伝子操作されたアルカンヒドロキシル化活性の改善によって特徴付けられる形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）と、ＣＨ３（ＣＨ２）ｘＣＨ３（式中、ｘ＝４〜２０である）の形態の少なくとも１つのＣ６〜Ｃ２２直鎖炭化水素とを好気性条件下で接触させることで、Ｃ６〜Ｃ２２モノ−およびジ−カルボン酸を生物生産する方法を開示する。参考文献はまた、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの外来遺伝子と、チトクロームＰ４５０還元酵素をコードする少なくとも１つの外来遺伝子とを含んでなる形質転換ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）も開示し、各遺伝子は、アルカンヒドロキシル化活性が改善されるように適切な制御要素と作動可能に連結する。チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５（配列番号１））、Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ５５８８１（配列番号２））、Ａｌｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１（配列番号３））、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６（配列番号４））、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７（配列番号５））、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８（配列番号６））、Ａｌｋ７（Ｄ１２７１９（配列番号７））およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９（配列番号８））、またはそれと実質的に同様の遺伝子からなる群から選択される。
【０１４６】
チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つの追加的コピーおよび／またはチトクロームＰ４５０還元酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの追加的コピーを含んでなる、形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）もまた開示され、遺伝子は適切な制御要素と作動可能に連結する。さらに参考文献は、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびターミネーターへの正確な融合によって、主要アルカンモノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ）、脂肪酸モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ）、およびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨ還元酵素の発現を調節解除するようにデザインされた、発現カセットの構築について記載する。
【０１４７】
米国特許出願公開第０４／１４６，９９９号明細書はまた、遺伝子操作された遮断β−酸化経路によって特徴付けられる形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）と、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎ＝４〜２０である）の形態の少なくとも１つのＣ６〜Ｃ２２直鎖炭化水素とを好気性条件下で接触させることで、Ｃ６〜Ｃ２２モノ−およびジ末端カルボキシレートを生物生産する方法、ならびに遺伝子操作された遮断β−酸化経路およびアルカンヒドロキシル化活性の改善によって特徴付けられる形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）と、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎ＝４〜２０である）の形態の少なくとも１つのＣ６〜Ｃ２２直鎖炭化水素とを好気性条件下で接触させることで、Ｃ６〜Ｃ２２モノ−およびジ末端カルボキシレートを生物生産する方法も開示する。チトクロームＰ４５０活性の改善および／または
β−酸化経路中の遺伝子破壊を有する遺伝子操作カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）株もまた、開示される。
【０１４８】
米国特許出願公開第０４／１４６，９９９号明細書は、新しいＤＮＡ断片をさらに開示する。これらの断片は、（ａ）カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）からの少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡと作動可能に連結する、第１のカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）プロモーター、および（ｂ）カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）からの少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡと作動可能に連結する第２のカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）プロモーターを含んでなる。第１のカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）プロモーターに結合する遺伝子は、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードし、第２のカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）プロモーターに結合する遺伝子は、チトクロームＰ４５０還元酵素をコードする。より好ましくは第１のカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）プロモーターはＰＧＫであり、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子はＡｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５（配列番号１））、Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ５５８８１（配列番号２））、Ａｌｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１（配列番号３））、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６（配列番号４））、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７（配列番号５））、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８（配列番号６））、Ａｌｋ７（Ｄ１２７１９（配列番号７））、およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９（配列番号８））である。
【０１４９】
（アルカンＰ４５０モノオキシゲナーゼ、脂肪酸モノオキシゲナーゼ、およびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨ還元酵素の組み合わさった同時発現を含む）チトクロームＰ４５０活性の改善および／またはβ−酸化経路中の遺伝子破壊を有する形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）株については、米国特許出願公開第０４／１４６，９９９号明細書に記載される。野生型株の成長およびアルカン利用率を基準にして、改善されたＰ４５０またはβ−遮断株のどちらかの容積生産性（ｇ生成物／Ｌ／時間）のさらなる改善が、経済的なバイオプロセスのために必要であろう。したがってこれらの２つの概念の組み合わせは、脂肪族基質からのモノ−およびジ末端カルボキシレートの生産のための優れた生体触媒を提供し、商業的に実現可能であるのに十分な量および変換効率で、所望のカルボキシレートを与える。
【０１５０】
１つの組み換え生物は、改善されたアルカンヒドロキシル化活性を発現する。アルカンヒドロキシル化活性は、末端メチル基のヒドロキシル化の役割を担う。改善されたヒドロキシル化活性は、別々にまたは様々な組み合わせで、改善されたアルカンモノオキシゲナーゼ、脂肪酸モノオキシゲナーゼまたはチトクロームＰ４５０還元酵素に起因してもよい。カルボン酸型へのさらなる酸化のためには、追加的な酵素段階が必要である。アルコールオキシダーゼ［Ｋｅｍｐｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８：３７０（１９８８）］およびアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される２つのさらなる酸化工程が、対応するカルボキシレートをもたらす。
【０１５１】
得られる脂肪酸および／またはジカルボン酸が成長および生物体量形成のための炭素源として分解されることから、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）では、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび／またはチトクロームＰ４５０還元酵素の少なくとも１つの追加的コピーの増幅が、機能性β−酸化経路の存在下でジカルボン酸の改善された生物生産をもたらすことは予期されない。
【０１５２】
別の組み換え生物は、β−酸化経路中に遺伝子破壊を有する。二倍体酵母カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）は、β−酸化経路を通じてその炭素およびエネルギーを引き出すことにより、唯一の炭素源としてのアルカン上で成長する。この経路は非常に効率的であるので、野生型株は常態では、アルカン上での成長中にω−酸化を通じてジカルボン酸を産生しない。ω−酸化経路への代謝流量を増大させ、それによってアルカンのモノ−およびジ末端カルボキシレートへの転換へのバイオプロセスの収率および選択性を増大させるために、β−酸化経路を遮断した。
【０１５３】
第３の組み換え生物は、アルカンヒドロキシル化活性の改善およびβ−酸化経路中の遺伝子破壊の双方を有する。改善されたヒドロキシル化活性は、別々にまたは様々な組み合わせで、改善されたアルカンモノオキシゲナーゼ、脂肪酸モノオキシゲナーゼまたはチトクロームＰ４５０還元酵素に起因してもよい。
【０１５４】
組み換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の構築
米国特許出願公開第０４／１４６，９９９号明細書は、異種性起源に由来する活性Ｐ４５０系の発現を達成するためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の遺伝子操作に関する。発現カセットは、Ａｌｋ１−Ａ遺伝子に（または代案としてはＡｌｋ３−ＡまたはＰ４５０還元酵素遺伝子に）融合した、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）の強力なメタノール誘導性プロモーターなどであるが、これに限定されるものではない、プロモーターを含むように構築され、転写ターミネーター（ＡＯＸ１からなどの）がそれに続く。発現カセットは、ＨＩＳ４；ＡＲＧ４；ＳＵＣ２；またはゼオシン抵抗性をコードするｓｈ  ｂｌｅ遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）などであるが、これに限定されるものではない、適切な形質転換マーカーを含有するベクターにサブクローンされる。確立された方法（米国特許第４，８５５，２３１号明細書）による、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の適切な株の逐次形質転換は、遺伝子発現カセットのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムへの組み込みをもたらす。発現カセットの複数コピーを含む形質転換体は、ＰＣＲおよびサザンブロット分析などであるが、これに限定されるものではない、多様な方法によって同定し得る。
【０１５５】
１または２個のプラスミド上に複数発現カセットをサブクローニングすることで、異種性起源に由来する活性Ｐ４５０系を発現させる、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の遺伝子操作もまた開示される。例えばＡｌｋ１−ＡおよびＡｌｋ３−Ａ遺伝子の発現カセットを１個のプラスミド上にサブクローニングしてもよく、Ｐ４５０還元酵素遺伝子の発現カセットを第２のプラスミド上にサブクローニングしてもよい。またはＡｌｋ１−ＡおよびＰ４５０還元酵素遺伝子の発現カセットを１個のプラスミド上にサブクローニングしてもよく、Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の発現カセットを第２のプラスミド上にサブクローニングしてもよい。またはＡｌｋ３−ＡおよびＰ４５０還元酵素遺伝子の発現カセットを１個のプラスミド上にサブクローニングしてもよく、Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の発現カセットを第２のプラスミド上にサブクローニングしてもよい。またはＡｌｋ１−ＡおよびＡｌｋ３−ＡおよびＰ４５０還元酵素遺伝子の発現カセットを１個のプラスミド上にサブクローニングしてもよい。次にプラスミドを使用して、適切なピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主を逐次または同時に形質転換する。発現カセットの複数コピーを含む形質転換体は、ＰＣＲおよびサザンブロット分析などであるが、これに限定されるものではない、多様な方法によって同定し得る。
【０１５６】
プラスミド組み込みについて上述したように、Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−Ａ、およびＰ４５０還元酵素遺伝子の発現カセットを個々にまたは複数コピーで複製型プラスミド上にサブクローニングすることを伴う、異種性起源に由来する活性Ｐ４５０系を発現させるためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の遺伝子操作もまた開示される。次に複製型プラスミドを使用して、適切なピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主を逐次または同時に形質転換する。発現カセットの複数コピーを含む形質転換体は、ＰＣＲおよびサザンブロット分析などであるが、これに限定されるものではない、多様な方法によって同定し得る。
【０１５７】
Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−ＡおよびＰ４５０還元酵素遺伝子の発現カセットの複数コピーを含有する改変されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞は、炭素源としてグリセロール（またはグルコース）を含有する最少培地中で飽和するまで成長させ、メタノールによるＡＯＸ１プロモーターの誘導がそれに続く。これは、Ｐ４５０系構成要素の高レベルの生産と、高ヒドロキシル化活性をもたらす。脂肪族基質は、誘導前、誘導開始時、または誘導のあらゆる時点で添加してもよく、適切な時間経過後に、カルボキシレートについて上述のように培地を分析する。
【０１５８】
カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）からのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅
登録番号がそれぞれＤ１２４７５（配列番号１）、Ｘ５５８８１（配列番号３）、およびＤ２５３２７（配列番号９）である、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７チトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−ＡおよびＡｌｋ３−Ａ、およびチトクロームＰ４５０還元酵素遺伝子について、ＧｅｎＢａｎｋ（国立バイオテクノロジー情報センター，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手できる配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマーを調製する。適切なユニークな制限部位をプライマー中にデザインして、クローニングベクターへの都合よいライゲーション、ならびに遺伝子発現カセットの構築を可能にする[例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）を参照されたい]。同じような方法で、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７  ＵＲＡ３遺伝子のために、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインする。米国特許第４，６８３，２０２号明細書および／または米国特許第４，６８３，１９５号明細書に記載されるようにして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、ＡＴＣＣ  ９０６７７に相当するカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７から得られるゲノムＤＮＡから、適切なＤＮＡ配列を増幅する。同様のプロトコルと適切なプライマーもまた、チトクロームＰ４５０  Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ５５８８１（配列番号２））、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６（配列番号４））、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７（配列番号５））、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８（配列番号６））、Ａｌｋ７（Ｄ１２７１９（配列番号７））およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９（配列番号８））をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＧｅｎＢａｎｋから入手できるその他のカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７配列のＰＣＲ増幅を可能にするであろう。
【０１５９】
組み換えカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）の構築−染色体組み込み：
続く説明は、関心のある遺伝子の形質転換宿主への組込み転移を使用する。
【０１６０】
ＰＣＲによって合成されるＤＮＡ断片をｐＵＣ１８またはｌａｍｂｄａ  Ｚａｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの都合よいクローニングベクターに逐次挿入して、Ａｌｋ１−Ａ／Ａｌｋ３−Ａ／Ｐ４５０還元酵素／ＵＲＡ３／Ａｌｋ１−Ａの形態の遺伝子カセットを含むベクターを作成する。遺伝子カセットを含有するベクターの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へのクローニング後、適切な制限酵素で切断してカセット断片を直線化する。当該技術分野で知られている技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、前出）を使用してカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＩＡＭ１２２４７（ＡＴＣＣ  ２８１４０に相当する）を形質転換し、ヒスチジンおよび硫酸アデニンを添加した最少培地上での成長によって、ＵＲＡ３遺伝子の機能性コピーを獲得した形質転換体を選択する。当該技術分野で知られている技術を使用して、形質転換株からゲノムＤＮＡを単離する。適切な制限酵素を使用してゲノムＤＮＡを切断し、サザンブロット法を使用した調査がそれに続く。このようにして、最大数の遺伝子コピーが染色体に挿入されたクローンを判定する。より多数の遺伝子コピー数は、一般により高レベルの酵素活性をもたらす。
【０１６１】
カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）染色体へのＰ４５０系遺伝子の逐次の付加についても記載される。Ｘ／ＵＲＡ３／Ｘ（式中、Ｘ＝Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−Ａ、Ｐ４５０還元酵素遺伝子または上述のその他のＰ４５０系遺伝子である）形態のあらゆるカセットの宿主ゲノムへの挿入は、ＰＣＲ増幅、クローニング、直線化、形質転換、最少培地選択、およびサザンブロット法スクリーニングの同様のプロトコルに従って達成され、染色体中の各オリジナルコピー毎に、遺伝子Ｘの少なくとも１つの追加的コピーを含有するクローンが生じる。異なるチトクロームＰ４５０酵素は異なる基質特異性を有してもよいので、遺伝子Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−Ａ、およびＰ４５０還元酵素のあらゆる組み合わせでの挿入、または代案の１つ以上の遺伝子の挿入は、炭素数９〜１８のあらゆる適切な基質からのモノ−またはジ末端カルボキシレートの生成に有用なひとそろいの生体触媒をもたらす。
【０１６２】
同義遺伝子のコピー数は、各形質転換中に、関心のある遺伝子と共に回収可能マーカー遺伝子を挿入することで、逐次組み込み形質転換を通じて増大される。ＵＲＡ３遺伝子を繰り返し使用してもよい。ｕｒａ３−遺伝子型は、各形質転換後に、５−フルオロオロト酸上での選択的成長によって再生し、同一マーカー遺伝子が次の形質転換で使用できるようになる。この過程が各追加的形質転換で繰り返される。代案としては、ｈｉｓ５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１７３１０）またはａｄｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ００８５５）マーカー遺伝子をマーカー遺伝子として使用する。カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＡＴＣＣ  ９０６７７株は、３つの異なるマーカー遺伝子（ＵＲＡ３、ＨＩＳ５、およびＡＤＥ１）について栄養要求性であるので、栄養要求突然変異を再生することが必要になる前に、３つまでの関心のある遺伝子を挿入し得る。
【０１６３】
組み換えカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）の構築−自律複製：
チトクロームＰ４５０系をコードする遺伝子を有するカセットを含有するベクターに、自己複製配列（ＡＲＳ）を添加してもよい。このコンストラクトを用いて、宿主カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）を形質転換する。ＡＲＳ、そしてウラシルを欠く培地上での淘汰圧の結果として、ベクターは宿主中で安定して維持される。ベクターが運ぶ関心のある遺伝子の余剰コピーの結果として活性Ｐ４５０系の発現は増大し、より多量のカルボキシレート生産がもたらされる。本技術は、本実施例の遺伝子Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−Ａ、Ｐ４５０還元酵素、およびＵＲＡ３の使用によって制限されるものではない。このカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）株中で同定されるＰ４５０系遺伝子のいずれかを複製的プラスミドコンストラクトに単独でまたは組み合わせて含め、有用な生体触媒の作成のためにカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）に形質転換し得る。本発明で特に有用なのは、遺伝子Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−ＡおよびＰ４５０還元酵素である。適切なＰ４５０系遺伝子の発現レベル増大の結果として、より高レベルのカルボキシレートが生じる。
【０１６４】
カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）の反応条件：
任意に有効量の脂肪族基質を含有する適切な培地上で、最高レベルのチトクロームＰ４５０ヒドロキシル化活性を含有するクローンを２〜３日間成長させる。この期間の終わりに追加的基質を添加して、細胞を１〜２日間さらにインキュベートする。細胞を除去して上清を酸性化し、モノ末端およびジ末端カルボキシレートの沈殿をもたらす。沈殿物およびあらゆる溶解カルボキシレートを上清からメチル三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中に抽出し、ＭＴＢＥ溶剤の蒸発後に実質的に純粋形態で回収する。
【０１６５】
反応基質：
カルボキシレート製造のための適切な基質としては、単独、または組み合わせ中の炭素数Ｃ６〜Ｃ２２の直鎖炭化水素が挙げられる。炭素数Ｃ６〜Ｃ２２の脂肪酸もまた、ジ末端カルボキシレート製造のための基質の役割を果たす。さらに炭素主鎖中に１つまたは２つの二重結合を含有する脂肪族炭化水素または脂肪酸が、カルボキシレート製造の基質の役割を果たし得て、１つまたは２つの追加的末端カルボキシレート基が生成物中に現れる。末端炭素の１つがフェニル基によって置換されている上述の直鎖化合物のいずれかもまた、カルボキシレート製造のために有用である。
【０１６６】
細胞株および成長条件：
形質転換およびアルカンヒドロキシル化活性発現のために、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＡＴＣＣ  ９０６２５株およびＡＴＣＣ  ９０６７７株（ＡＴＣＣ酵母カタログを参照されたい）を使用する。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＴＳ１１５株はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得られる。これらの株は、ＹＥＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース）中で２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で慣例的に成長させる。ヒスチジンおよび硫化アデニンを添加した最少培地上の成長によって、追加的なＵＲＡ３遺伝子の機能性コピーがあるカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＡＴＣＣ  ９０６７７の形質転換体を選択する。最少培地は、アミノ酸＋５０ｍｇ／Ｌヒスチジンおよび２０ｍｇ／Ｌ硫化アデノシン＋１０ｇ／Ｌグルコースを添加したＹＮＢ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡのＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。
【０１６７】
米国特許出願公開第０４／１４６，９９９号明細書の実施例１〜１１、およびそれらに関わる一般方法（段落[０１４７]、[０１５０]、[０１５１]、[０１５２]、および[０１５３]）は、あらゆる目的のために本明細書の一部としてその各内容全体を参照によって援用する。
【実施例】
【０１６８】
本明細書の発明の特定の実施態様の操作および効果は、下述する一連の実施例からより完全に理解されるであろう。これらの実施例が基づく実施態様は単なる典型例であり、本発明を例証するためのこれらの実施態様の選択は、実施例に記載されない材料、反応物質、条件、操作法および／または技術が本明細書での使用に適さないことを示唆せず、または実施例に記載されない題材が添付の特許請求の範囲およびその同等物から除外されることを示唆しない。
【０１６９】
実施例１〜１１は、Ｃｎ鎖長の直鎖アルカンを含んでなる炭化水素生成物を製造するための、異なる供給物の水素化処理を例証する。実施例９〜１１は、精製されたＣｎ鎖長の直鎖アルカンの少なくとも１つの留分を得るための炭化水素生成物の蒸留を含む。実施例１２では、ＡＴＣＣ  ７４４３１と同定された形質転換カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＳＷ８１／８２株によって実施例９で得られた精製ドデカンを発酵して、ドデカン二酸にする。実施例１３は、市販のドデカン、および実施例９または１０からのドデカンの発酵を実証する。
【０１７０】
使用材料は、実施例で示すようにして得られた。市販の試薬は全て、受け入れたままの状態で使用した。以下の略語を使用する。「Ｃ」はセルシウス度または摂氏；「％」は百分率；「ｗ／ｗ」は重量あたり重量；「ｍＬ」はミリリットル；「ｈ」は時間；「ｒｐｍ」は毎分回転数；「ＥｔＯＨ」はエタノール；「ｍｇ／ｇ」はグラムあたりミリグラム数；「ｇ／１００ｍＬ」は１００ミリリットルあたりグラム数；「ｇ」はグラム；「ＮａＯＨ」は水酸化ナトリウム；「ｗ／ｖ」は重量あたり容積；「ｖ／ｖ」は容積あたり容積；「ｗ／ｗ」は重量あたり重量；「ｍｍ」はミリメートル；「ｍＬ／ｍｉｎ」は毎分ミリリットル；「ｍｉｎ」は分；「ｍＭ」はミリモル濃度；「Ｎ」は直鎖；「μＬ」はマイクロリットル；「ｃｃ」は立方センチメートル；「ｓｃｃｍ」は標準立方センチメートル毎分；および「ＯＤ」は外径である。
【０１７１】
実施例中の供給物および生成物の組成は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）およびＤＢ−１カラム（３０ｍ×０．３２０ｍｍ内径×０．２５ｕｍフィルム厚；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡのＪ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ａｎ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ製造）を装着したＡｇｉｌｅｎｔモデル７８９０ガスクロマトグラフ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。ヘリウムキャリアガス（超高純度９９．９９％；Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＰＡのＧＴＳ  Ｉｎｃ．から入手できる）の流速は、１０ｍＬ／分で一定に保った。方法では、初期オーブン温度７５℃、および３００℃への温度勾配７．５℃／分を用いた。温度をさらに５分間３００℃に保った（総実行時間３５分間）。注入サンプルは、塩化メチレン（試薬等級９９．９％；Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＧｅｒｍａｎｙのＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡの系列企業ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．による製造）中で１００：１の容積希釈に調製した。注入量は１μＬであった。Ｃ１０〜Ｃ１８の純粋直鎖アルカンを使用して、いくつかの標準サンプルを調製した。重量％は±５％の誤差でＧＣ面積％によって表し得ると判定された。したがって本明細書に記載する方法を使用してＧＣから得られるＧＣ面積％は、全ての実施例で重量％として報告する。
【０１７２】
ＧＣ結果は、アルカンを略記法で示して提示する。例えば「Ｃ１２」は、１２個の炭素原子を含有する直鎖アルカンを意味する。「Ｃ１２異性体」は、１２個の炭素原子を含有する分枝アルカンを意味する。Ｃ１８＋は、全アルカンが１８個を超える炭素を含有することを意味する。Ｃ８−は、全アルカンが３〜７個の炭素を含有することを意味する。
【０１７３】
触媒スルフィド化手順
例えばイオウ化合物が供給物中に存在しない操作後に水素化処理触媒の再生が必要であれば、以下の触媒スルフィド化手順を使用し得る。非スルフィド化水素化処理触媒もまた、この手順を使用してスルフィド化してもよい。
【０１７４】
触媒をスルフィド化するために、１４インチ（３６ｃｍ）長さの３／４インチ（１９ｍｍ）ＯＤ  ３１６Ｌステンレス鋼管から構成される反応器を使用する。触媒（１０〜３０ｇ）が充填される中央を除いて、反応器の両端に１ｍｍガラスビーズとＰＹＲＥＸウールの交互の層を充填した。反応器は、ガス注入口、ガス出口、および触媒床の温度を測定する３個の熱電対を有する。反応器を垂直管状炉に入れ、ガス注入口とガス出口の接続を確立する。２００ｓｃｃｍの窒素流を用いて、触媒を１３０℃で一晩乾燥させる。触媒の乾燥後、オーブン温度を０．５〜１．０℃／分の速度で上昇させて、２００ｓｃｃｍのＮ２流に２０ｓｃｃｍの硫化水素（水素中５％混合物）を添加する。温度が１９０℃に達したら、窒素流を１００ｓｃｃｍに低下させ、硫化水素流を３０ｓｃｃｍに増大させる。温度を２４０℃に保つ。２時間後、温度を緩慢に低下させる。温度が１２５℃未満になったら硫化水素流を停止するが、窒素流は反応器が室温（約２５℃）に達するまで１００ｓｃｃｍに保つ。反応器を炉から取り出して、窒素パージボックス内で中身を出す。
【０１７５】
触媒還元手順
スルフィド化触媒で使用したのと同様の装置および構成を触媒の還元に使用する。２００ｓｃｃｍの窒素流下において触媒を１３０℃で一晩乾燥させる。反応器は、ガス注入口、ガス出口、および触媒床の温度を測定する３個の熱電対を有する。反応器を垂直管状炉に入れ、ガス注入口とガス出口の接続を確立する。２００ｓｃｃｍの窒素流を用いて、触媒を１３０℃で一晩乾燥させる。触媒の乾燥後、オーブン温度を０．５〜１．０℃／分の速度で上昇させて、２００ｓｃｃｍのＮ２流に２０ｓｃｃｍ水素ガス（純度９９．０％）を添加する。温度が１９０℃に達したら、窒素流を１００ｓｃｃｍに低下させ、水素流を３０ｓｃｃｍに増大させる。特に断りのない限り、温度を２４０℃に保つ。２時間後、温度を緩慢に低下させる。温度が１２５℃未満になったら水素流を停止するが、窒素流は反応器が室温（約２５℃）に達するまで１００ｓｃｃｍに保つ。反応器を炉から取り出して、窒素パージボックス内で中身を出す。
【０１７６】
表１は、実施例のほとんどで使用される供給物のためのトリグリセリドの脂肪酸鎖長、および脂肪酸原料（重量％）を示す。ダイズ油とニワトリ脂肪を同重量で混合して、２つの構成物の５０／５０混合物を調製した。表１の脂肪酸鎖長はＣ：Ｄ形式の脂質命名法を使用して示し、式中、Ｃは脂肪酸中の炭素原子の数であり、Ｄは脂肪酸中の二重結合の数である。例えばＣ１８：１は１つの不飽和結合がある１８個の炭素鎖を指し、Ｃ１８：２は２つの不飽和結合がある１８個の炭素鎖を指し、およびＣ１８：３は３つの不飽和結合がある１８個の炭素鎖を指す。表１では、Ｃ１８＋は、１８を超える炭素を含有する脂肪酸を指す。表１の値はサンプル毎に変動し得る、表示油のトリグリセリド含量の代表値である。実施例１１で使用されたラウリン酸（ドデカン酸）は、約９８．９重量％のＣ１２アルカンおよび約１．１重量％のＣ１４アルカンを含有した。
【０１７７】
【表１】
0005726088.tif 000002
【０１７８】
実施例１−精製ココナッツ油の水素化処理
精製ココナッツ油（５０ｇ、Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡのＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得られる）、およびアルミナ担持前スルフィド化コバルト／ニッケル／モリブデン三元金属水素化処理触媒（５ｇ、ＣＲＩ  ＤＣ２３１８、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸのＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される）を２１０ｃｃの撹拌圧力反応器に入れた。容器を漏洩について窒素で検査した。９０ｐｓｉｇ（７２２ｋＰａ）に加圧し０ｐｓｉｇ（１０１ｋＰａ）に圧抜きすることで、反応器のヘッドスペースを窒素で１０回パージした。次に反応器を高純度水素（最小限の９９．９％；Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡのＡｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販される）で５回パージし、水素で１０００ｐｓｉｇ（７０００ｋＰａ）に加圧した。反応器とその内容物を撹拌し、３２５℃（６１７°Ｆ）に加熱した。水素圧を２０００ｐｓｉｇ（１３，９００ｋＰａ）に増大させ、そのまま５時間保った。圧力が１０００ｐｓｉｇ（７０００ｋＰａ）未満に低下した場合は、ヘッドスペースに新鮮な水素を１５００〜１７００ｐｓｉｇ（１１，８００ｋＰａ）に充填した。
【０１７９】
次に反応器内容物を５０℃（１２２°Ｆ）未満に冷却し、ヘッドスペースを排気して内容物をガラス瓶内に取り出した。内容物を秤量した。ＩＲおよび１Ｈ  ＮＭＲ分析は、モノ−、ジ−、およびトリグリセリドの痕跡を示さなかった。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＝８％、Ｃ１７＝１％、Ｃ１６＝８％、Ｃ１５＝１％、Ｃ１４＝１５％、Ｃ１３＝２％、Ｃ１２＝４０％、Ｃ１１＝４％、Ｃ１０＝６％、Ｃ９＝１％、Ｃ８＝１０％、Ｃ８〜＝１％。反応生成物はまた、主にＣ８〜Ｃ１８アルカンの分枝異性体である、約３％のその他の化合物も含有した。
【０１８０】
実施例２−パーム油の水素化処理
パーム油（５０ｇ、Ａｃｃｒａ，ＧｈａｎａのＴ．Ｉ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｈａｎａ  Ｌｔｄ．による製造）を使用したこと以外は、同一の装置、圧力、温度、および触媒（５ｇ）を使用して、実施例１の工程を繰り返した。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝０．５％、Ｃ１８＝４６．５％、Ｃ１７＝５％、Ｃ１６＝４３％、Ｃ１５＝４％、Ｃ１４＝１％。
【０１８１】
実施例３−ニワトリ脂肪の水素化処理
ニワトリ脂肪（５０ｇ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＭＤのＰｅｒｄｕｅ  Ｆａｒｍｓから得た）を使用したこと以外は、同一の装置、圧力、温度、および触媒（５ｇ）を使用して、実施例１の工程を繰り返した。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝１％、Ｃ１８＝６０％、Ｃ１７＝７％、Ｃ１６＝２８％、Ｃ１５＝３％、Ｃ１４＝１％。
【０１８２】
実施例４−５０／５０ニワトリ脂肪／ダイズ油の水素化処理
５０：５０のニワトリ脂肪とダイズ油の混合物（５０ｇ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＭＤのＰｅｒｄｕｅ  Ｆａｒｍｓから得たニワトリ脂肪およびダイズ油を社内で混合した）を使用したこと以外は、同一の装置、圧力、温度、および触媒（５ｇ）を使用して、実施例１の工程を繰り返した。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝２．１％、Ｃ１８＝６９．６％、Ｃ１７＝７．２％、Ｃ１６＝１８．５％、Ｃ１５＝１．９％、Ｃ１４＝０．５％、Ｃ１３＝０．１％、Ｃ１２＝０．１％。
【０１８３】
実施例５−パーム核油の水素化処理
１０ｇの同一ＣＲＩ  ＤＣ−２３１８触媒とパーム核油（１００ｇ、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｓ，ＩＬのＣｏｌｕｍｂｕｓ  Ｆｏｏｄｓ  Ｃｏｍｐａｎｙからウェブベース部門ｓｏａｐｅｒｓｃｈｏｉｃｅ．ｃｏｍを通じて得た）をより大きな（４００ｃｃ）撹拌圧力反応器内で使用したこと以外は、同一の圧力および温度を使用して実施例１の工程を繰り返した。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝０．４％、Ｃ１８＝１９．３％、Ｃ１７＝２．５％、Ｃ１６＝７．９％、Ｃ１５＝１．１％、Ｃ１４＝１５．０％、Ｃ１３＝２．０％、Ｃ１２＝４０．２％、Ｃ１１＝４．６％、Ｃ１０＝３％、Ｃ９＝０．４％、Ｃ８＝３．２％、Ｃ８−＝０．４％。
【０１８４】
実施例６−ダイズ油の水素化処理
ダイズ油（５０ｇ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た）を使用したこと以外は、同一の装置、圧力、温度、および触媒（５ｇ）を使用して、実施例１の工程を繰り返した。取り出した反応器内容物（５１ｇ）のＩＲおよび１Ｈ  ＮＭＲ分析は、モノ−、ジ−、およびトリグリセリドの痕跡を示さなかった。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝１％、Ｃ１８＝８１％、Ｃ１７＝６％、Ｃ１６＝１１．５％、Ｃ１５＝０．５％。Ｃ１８：Ｃ１７比は１３：１を超え、Ｃ１６：Ｃ１５比は２０：１を超える。
【０１８５】
実施例７−精製ダイズ油の水素化処理
精製脱色脱臭ダイズ油サンプル（５０ｇ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＭＤのＰｅｒｄｕｅ  Ｆａｒｍｓから得た）を使用したこと以外は、同一の装置、圧力、温度、および触媒（５ｇ）を使用して、実施例１の工程を繰り返した。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝０．５％、Ｃ１８＝７９％、Ｃ１７＝８％、Ｃ１６＝１１．３％、Ｃ１５＝１．２％。Ｃ１８：Ｃ１７比はほぼ１０であり、Ｃ１６：Ｃ１５比は９を超える。
【０１８６】
実施例８−ステアリン酸の水素化処理
ステアリン酸（５０ｇ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡのＶＷＲから入手）を使用したこと以外は、同一の装置、圧力、温度、および触媒（５ｇ）を使用して、実施例１の工程を繰り返した。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝０．７％、Ｃ１８＝９０．４％、Ｃ１７＝８．４％、Ｃ１６＝０．５％。Ｃ１８：Ｃ１７比はおよそ１０．８である。
【０１８７】
実施例９−粗製ココナッツ油の水素化処理および炭化水素生成物の蒸留
より大きな（４００ｃｃ）撹拌圧力反応器を使用してレシピを倍増させたこと以外は、同一の圧力、温度、触媒および粗製ココナッツ油（１００ｇ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手）を使用して、実施例１の工程を繰り返した。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝０．５％、Ｃ１８＝８．９％、Ｃ１７＝１．５％、Ｃ１６＝８．７％、Ｃ１５＝１．０％、Ｃ１４＝１６．９％、Ｃ１３＝２．３％、Ｃ１２＝４２．２％、Ｃ１１＝４．９％、Ｃ１０＝５．３％、Ｃ９＝０．５％、Ｃ８＝６．７％、Ｃ８−＝０．６％。
【０１８８】
実施例９をさらに３回繰り返し、サンプルを処理して湿潤触媒と水層を分離し、３６０ｇの合わせた炭化水素サンプルを得て、それをＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝０．６％、Ｃ１８＝８．９％、Ｃ１７＝１．８％、Ｃ１６＝８．６％、Ｃ１５＝１．５％、Ｃ１４＝１６．７、Ｃ１３＝２．５、Ｃ１２＝４２．４％、Ｃ１１＝４．６、Ｃ１０＝５．１、Ｃ９＝０．６、Ｃ８＝６．２％、Ｃ８−＝０．５％。
【０１８９】
リボイラーとして１Ｌ丸底フラスコを使用して、１０段１インチ内径（Ｉ．Ｄ．）実験室Ｏｌｄｅｒｓｈａｗカラム内で、合わせた炭化水素サンプルの内２９０ｇを５０トール（絶対的）の圧力で真空蒸留し、５１ｇの初留液（Ｃ１２＝８．７％、Ｃ１１＝２２．３％、Ｃ１０＝２８．０％、Ｃ９＝３．２％、Ｃ８＝３５．０％、Ｃ８−＝２．８％の直鎖炭化水素の重量配分を有する）、８９ｇの中間留分（Ｃ１４＝０．１％、Ｃ１３＝０．２％、Ｃ１２＝９７．６％、Ｃ１１＝２．１％の直鎖炭化水素の重量配分を有する）、およびリボイラー内に残留する１４１ｇの缶出液留分（Ｃ１８＋＝１．３％、Ｃ１８＝１９．６％、Ｃ１７＝３．０％、Ｃ１６＝１７．６％、Ｃ１５＝３．４％、Ｃ１４＝３５．０％、Ｃ１３＝４．０％、およびＣ１２＝１６．１％の直鎖炭化水素の重量配分を有する）を得た。蒸留中、還流比は４：１に保った。初留液収集中に、リボイラー温度は１３３℃〜１４８℃の間で変動し、ヘッド温度は５０℃〜１２７℃の間で変動した。中間留分収集中に、リボイラー温度は１４８℃〜１６６℃の間で変動し、ヘッド温度は１２７℃〜１２８℃の間で変動した。この中間留分の一部は、実施例１２で直鎖Ｃ１２ジカルボン酸への発酵のために使用した。
【０１９０】
所望ならば適切な蒸留条件を使用して缶出液留分を蒸留し、対応するジカルボン酸に発酵させるのに十分な純度の例えばＣ１４、Ｃ１６、またはＣ１８留分などの別のアルカン留分を得ることもできる。同様に適切な蒸留条件を使用して初留液を蒸留し、対応するジカルボン酸に発酵させるのに十分な純度のＣ１０アルカン留分を得ることもできる。
【０１９１】
９７．６％直鎖Ｃ１２アルカンを含有する中間留分の実験室での追加的蒸留を実施して、蒸留を通じたサンプルのさらなる精製を実証した。上の３２００ｇの中間留分サンプルの一部（２４００ｇ）を５段トレイＯｌｄｅｒｓｈａｗカラムおよび還流スプリッターのついた５Ｌフラスコに装入した。４００ｇの初留液が収集されるまで、２０：１の還流比および５０ｍｍ  Ｈｇ（絶対的）の上部圧力で、留出物を塔頂で収集した。最終リボイラー温度は１２９．７℃であり、最終塔頂温度は１１７．７℃であった。蒸留の終わりに５Ｌフラスコは１９７５ｇの無色液体を含有し、それをＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：直鎖Ｃ１２＝９９．０％、分枝Ｃ１２異性体１．０％。
【０１９２】
実施例１０−精製ココナッツ油の水素化処理および炭化水素生成物の蒸留
固形精製ココナッツ油（１０００ｇ、Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡのＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得られた）およびアルミナ担持前スルフィド化コバルト／ニッケル／モリブデン三元金属水素化処理触媒（７５ｇ、ＣＲＩ  ＤＣ２３１８、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸのＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される）を１ガロン撹拌圧力反応器に入れた。タービン型インペラーによる１，０００ｒｐｍでの撹拌は、撹拌機のブレードにおける吸引力を生みだし、それによって撹拌機のシャフトを通じたヘッドスペースからの水素循環が可能になり、撹拌される液体反応混合物中に気泡が生じる。反応器を最初に５０℃に加熱して、１００ｒｐｍで緩慢に撹拌しながらココナッツ油を溶解させた。容器を漏洩について窒素で検査した。９０ｐｓｉｇ（７２２ｋＰａ）に加圧し２ｐｓｉｇ（１１５ｋＰａ）に圧抜きすることで、反応器のヘッドスペースを窒素で１０回パージした。次に反応器を高純度水素（最小限９９．９％、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡのＡｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販される）で５回パージして、水素で７５０ｐｓｉｇ（７０００ｋＰａ）に加圧した。反応器とその内容物を撹拌しながら２，０００ｐｓｉｇ（１３，９００ｋＰａ）に緩慢に加圧して、３２５℃（６１７°Ｆ）に次第に加熱した。反応器内容物を３２５℃（６１７°Ｆ）および２０００ｐｓｉｇ（１３，９００ｋＰａ）に合計５時間保った。この間、圧力が２，０００ｐｓｉｇ未満に低下した場合は、ヘッドスペースに追加的な水素を充填した。
【０１９３】
次に反応器内容物を５０℃（１２２°Ｆ）未満に冷却し、ヘッドスペースを排気して、内容物をガラスジャー内に取り出した。内容物を秤量したところ、触媒および生成した水を含めて１０２７ｇであった。反応生成物をＧＣ−ＦＩＤによって分析して、以下の直鎖炭化水素の重量配分を得た：Ｃ１８＋＝０．３％、Ｃ１８＝８．８％、Ｃ１７＝１．６％、Ｃ１６＝７．７％、Ｃ１５＝１．４％、Ｃ１４＝１６．３％、Ｃ１３＝２．６％、Ｃ１２＝３９．５％、Ｃ１２異性体＝１．５％、Ｃ１１＝６．１％、Ｃ１０＝５．４％、Ｃ９＝０．８％、Ｃ８＝６．５％、およびＣ８−＝１．５％。
【０１９４】
実験をさらに１１回繰り返し、（各操作について水層と湿潤触媒を分離した後に）全ての操作からの生成物を合わせて、９２７７ｇの合わせた炭化水素サンプルを得た。合わせた炭化水素サンプルのＧＣ−ＦＩＤ分析は、以下の直鎖炭化水素の重量配分を与えた：Ｃ１８＋＝０．４％、Ｃ１８＝１０．０％、Ｃ１７＝１．６％、Ｃ１６＝８．１％、Ｃ１５＝１．４％、Ｃ１４＝１６．３％、Ｃ１３＝２．６％、Ｃ１２＝３９．０％、Ｃ１２異性体＝１．５％、Ｃ１１＝６．０％、Ｃ１０＝５．０％、Ｃ９＝０．７％、Ｃ８＝５．９％、およびＣ８−＝１．５％。
【０１９５】
リボイラーとして２２Ｌ丸底フラスコを使用して、２５段２インチ内径の銀被覆真空ジャケットガラス実験室Ｏｌｄｅｒｓｈａｗカラム内で、上の合わせた炭化水素生成物の一部（９１５０ｇ）を５０トール（絶対的）の圧力で真空蒸留して初留液を得た（Ｃ１２＝１７．２％、Ｃ１２異性体＝３．４％、Ｃ１１＝２４．３％、Ｃ１０＝２１．０％、Ｃ９＝３．１％、Ｃ８＝２４．８％、Ｃ８−＝６．２％の直鎖炭化水素の重量配分を有する２１８０ｇ）、中間留分（Ｃ１２＝９７．４％、Ｃ１２異性体＝２．０％、Ｃ１１＝０．６％の直鎖炭化水素の重量配分を有する３２００ｇ）、およびリボイラー内に残留する缶出液留分（Ｃ１８＋＝１．０％、Ｃ１８＝２５．１％、Ｃ１７＝３．９％、Ｃ１６＝２０．２％、Ｃ１５＝３．４％、Ｃ１４＝４２．２％、Ｃ１３＝４．１％、およびＣ１２＝０．１％の直鎖炭化水素の重量配分を有する３７５０ｇ）。蒸留中、還流比は１０：１に保った。初留液収集中に、リボイラー温度は１３５℃〜１５０℃の間で変動し、ヘッド温度は５０℃〜１２４℃の間で変動した。中間留分収集中、リボイラー温度は１５０℃〜１７７℃の間で変動し、ヘッド温度は１２４℃〜１２４．５℃の間で変動した。蒸留からの初留液、中間留分、および缶出液留分を合わせた重量は９１３０ｇであった。中間留分は直鎖Ｃ１２ジカルボン酸への発酵に適する十分な純度であった。
【０１９６】
【表２】
0005726088.tif 000003
【０１９７】
上述の同一の２インチ内径２５段ガラスＯｌｄｅｒｓｈａｗカラム内での引き続く（２回目の）蒸留では、残留缶出液留分（３７５０ｇ）を２０トール（絶対的）圧力でさらに蒸留して、初留液（Ｃ１４＝５７．５％、Ｃ１４異性体＝１０．８％、Ｃ１３＝３１．１％、およびＣ１２＝０．６％の直鎖炭化水素の重量配分を有する４２６ｇ）、中間留分（Ｃ１５＝０．２％、Ｃ１４＝９８．６％、Ｃ１４異性体＝１．１％、およびＣ１３＝０．１％の直鎖パラフィンの重量配分を有する１０６６ｇ）、および缶出液留分（Ｃ１８＋＝２．０％、Ｃ１８＝４６．３％、Ｃ１７＝７．３％、Ｃ１６＝３７．０％、Ｃ１５＝６．１％、およびＣ１４＝１．３％の直鎖炭化水素の重量配分を有する２２２８ｇ）を得た。蒸留中、還流比は１０：１に保った。初留液収集中に、リボイラー温度は１６０℃〜１７１℃の間で変動し、ヘッド温度は１０５℃〜１３６℃の間で変動した。中間留分収集中、リボイラー温度は１７１℃〜１９２℃の間で変動し、ヘッド温度は１３６℃〜１３７℃の間で変動した。蒸留からの初留液、中間留分、および缶出液留分を合わせた重量は３７２０ｇであった。中間留分は直鎖Ｃ１４ジカルボン酸への発酵に適する十分な純度であると思われる。
【０１９８】
【表３】
0005726088.tif 000004
【０１９９】
実施例１１−ドデカン酸の水素化処理および炭化水素生成物の蒸留
ドデカン酸、（１０００ｇ、９８％純粋、固形、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得られた）およびアルミナ担持前スルフィド化コバルト／ニッケル／モリブデン三元金属水素化処理触媒（７５ｇ、ＣＲＩ  ＤＣ２３１８、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸのＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される）を１ガロン撹拌圧力反応器に入れた。タービン型インペラーによる１，０００ｒｐｍでの撹拌は、撹拌機のブレードにおける吸引力を生みだし、それによって撹拌機のシャフトを通じたヘッドスペースからの水素循環が可能になり、撹拌される液体反応混合物中に気泡が生じる。反応器を最初に５０℃に加熱して、１００ｒｐｍで緩慢に撹拌しながらドデカン酸を溶解させた。容器を漏洩について窒素で検査した。９０ｐｓｉｇ（７２２ｋＰａ）に加圧し２ｐｓｉｇ（１１５ｋＰａ）に圧抜きすることで、反応器のヘッドスペースを窒素で１０回パージした。次に反応器を高純度水素（最小限９９．９％、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡのＡｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販される）で５回パージして、水素で７５０ｐｓｉｇ（７０００ｋＰａ）に加圧した。反応器とその内容物を撹拌しながら２，０００ｐｓｉｇ（１３，９００ｋＰａ）に緩慢に加圧して、３２５℃（６１７°Ｆ）に次第に加熱した。反応器内容物を３２５℃（６１７°Ｆ）および２０００ｐｓｉｇ（１３，９００ｋＰａ）に合計５時間保った。
【０２００】
上の実験を２回繰り返し、操作からの生成物を合わせて２１３０ｇの総反応混合物を得た。水層と湿潤触媒を分離した後に（いくらかの炭化水素損失を伴う）、１６０２ｇの合わせた炭化水素サンプルを得た。合わせた炭化水素サンプルのＧＣ−ＦＩＤ分析は、以下の直鎖炭化水素の重量配分を与えた：Ｃ１４＝０．５％、Ｃ１３＝０．６％、Ｃ１２＝８５．１％、Ｃ１２異性体＝３．０％、Ｃ１１＝１０．４％、Ｃ１１−＝０．４％。
【０２０１】
上の合わせた反応生成物を真空蒸留した。反応生成物（１５９０ｇ）を５段トレイＯｌｄｅｒｓｈａｗカラムおよび還流スプリッターのついた５Ｌフラスコに装入した。出発原料は色が黄色であった。２７４．５ｇの初留液が収集されるまで、２０：１の還流比および５０ｍｍ  Ｈｇの絶対的上部圧力で、留出物を塔頂で収集した。初留液のＧＣ−ＦＩＤ分析は、以下の直鎖炭化水素の重量配分を与えた：Ｃ１０＝０．９％、Ｃ１１異性体＝２．０％、Ｃ１１＝４２．４％、Ｃ１２異性体＝４．８％、およびＣ１２＝４９．９％。最終ポット温度は１２８．６℃であり、最終ヘッド温度は１２１．６℃であった。
【０２０２】
初留液溜めを取り替えて蒸留を継続した。２．５：１の還流比および５０ｍｍ  Ｈｇの絶対的上部圧力で、無色の生成物留分を塔頂で収集した。最終ヘッド温度は１２６．３℃であった。ポットは７９．６ｇの金色の液体を含有した（ＧＣ−ＦＩＤ分析はＣ１２＝４６．７％、Ｃ１２＋＝５３．３％の直鎖炭化水素の重量配分を与えた）。ポットを空にした後、生成物留分をポットに再装入して、２０：１還流比および５０ｍｍ  Ｈｇの絶対圧で、１８３．７ｇの追加的な初留液（ＧＣ−ＦＩＤ分析はＣ１１＝１３．１％、Ｃ１２異性体＝５．５％、Ｃ１２＝８１．４％の直鎖炭化水素の重量配分を与えた）を塔頂で収集した。最終ヘッド温度は１２３．５℃であった。最終生成物をポットから収集した（ＧＣ−ＦＩＤ分析は１０２８．３ｇ、Ｃ１１＝０．６％、Ｃ１２異性体＝１．７％、およびＣ１２＝９７．７％の直鎖炭化水素の重量配分を与えた）。
【０２０３】
実施例１２−実施例９で得られたドデカンのドデカン二酸への発酵
ＳＷ  ８１／８２株、ＡＴＣＣ  ７４４３１は遺伝子改変カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）酵母である。この種は天然でＣ１２〜Ｃ１６アルカン酸化ができる。典型的にアルカンは、対応するアルコールおよびアルデヒドを通じて酸化される。対応する酸に達したら、β酸化を通じて酸を中央代謝に供給する。この遺伝子改変株ではβ酸化が遮断されており、対応する二酸の蓄積がもたらされる。この発酵実施例で使用されるＳＷ  ８１／８２は、米国特許出願公開第０４／１４６，９９９号明細書で開示されるようにして生成される。
【０２０４】
ＳＷ  ８１／８２株を使用して、ドデカン二酸を二段階発酵で製造した。細胞生成段階である第１段階では、酵母細胞がグルコース上で成長して生物体量が蓄積される。二酸製造段階である第２段階では、酵母細胞をグリセロール添加で維持し、グルコースは不在であった。この段階でドデカンを添加し、酵母をドデカン二酸に転換した。酸素供給は双方の段階において重要であり、培養液は連続的に激しく撹拌した。培養液ｐＨもまた重要であり中性範囲に保った。ｐＨ調節を助けるために、比色分析ｐＨ指示薬であるブロモチモールブルー／クレゾールレッドの組み合わせを使用して、約ｐＨ７．６のグリーンから空色の転移点に保った
【０２０５】
第１段階培養液のために、１リットルにつき以下の組成物を使用した。２０ｍＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡのＶＷＲから入手できる）、２４ｇのグルコース（ＶＷＲから入手できる）、０．４ｇのペプトン（ＶＷＲから入手できる）、２４ｇのＨＥＰＥＳ（ＶＷＲから入手できる）、および０．４ｇの酵母抽出物（ＶＷＲから入手できる）。培養液ｐＨをおよそ６．５に調節して、濾過滅菌した。第２段階培養液のために、１リットルにつき以下の組成物を使用した。２ｇのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ、８ｍＬのグリセロール（ＶＷＲから入手できる）、２ｇのペプトン、２４ｇのＨＥＰＥＳ、０．４ｇの酵母抽出物、２ｍＬのクレゾールレッド（ＶＷＲから入手できる）指示薬溶液、および２ｍＬのブロモチモールブルー（ＶＷＲから入手できる）指示薬溶液。培養液をおよそｐＨ７．８に調節して濾過滅菌した。Ｕｒｉｓｃａｎグルコースストリップ（Ｓｅｏｕｌ，ＫｏｒｅａのＹＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、発酵中のグルコース濃度を測定した。
【０２０６】
１００ｍＬの第１段階培養液を含有する２本の５００ｍＬフラスコを磁気撹拌機にのせて、撹拌速度をおよそ１２００ｒｐｍに設定した。フラスコにＳＷ  ８１／８２の凍結保存株を６００ｎｍでおよそ０．１２の初期光学濃度に接種した。室温で２４時間の成長後、培養物は複製フラスコ１および２で、それぞれ１０．４および６．６の光学濃度に達した。２９時間の成長後、培養液のｐＨはおよそ４に低下した。２９時間目には、２０ｇ／Ｌを超えるグルコースが培養液中に残留した。さらに４８時間後、グルコース濃度は１ｇ／Ｌ未満に低下した。この時点で細胞をドデカン二酸生産段階である２段階目の発酵のために調製した。酵母細胞を遠心分離によって収集し、第１段階培養液から取り出して第２段階培養液に懸濁した。第２段階のフラスコはどちらも酵母細胞に加えて、１００ｍＬの第２段階培養液、および２ｍＬのドデカン（実施例９の中間留分から得られる）を含有した。撹拌される第２段階フラスコをおよそ２４℃の室温でインキュベートした。１ＮのＮａＯＨを手動で添加したｐＨを周期的におよそｐＨ７．８に再調節した。第２段階培養のおよそ４８時間後、発酵を停止させた。
【０２０７】
水酸化ナトリウムをフラスコ１および２に添加して、ｐＨをおよそ８．４に上昇させた。細胞を遠心分離によってアルカリ性上清から分離した。１組のサンプルを液体クロマトグラフィー分析のために処理した。別の組を粗製酸不溶性物質（大部分はドデカン二酸）の単離のために処理した。粗製単離物の複製サンプルは、最初に１ＮのＨＣｌを添加して無細胞上清の複製５ｍＬサンプルのｐＨをおよそｐＨ３に低下させることにより得た。沈殿をおよそ１０分間にわたり形成させた。遠心分離によって酸性化上清から沈殿を分離し、０．０１ＮのＨＣｌで２回洗浄した。洗浄した固形物を３０℃で４８時間乾燥した。乾燥固形物を１００％エタノールに溶解し、遠心分離によってあらゆる不溶性物質をエタノール溶液から分離した。エタノール溶液を３０℃で４８時間乾燥させて、ドデカン二酸に特徴的な白色結晶性エタノール可溶性固体を得た。２本の複製フラスコから、それぞれおよそ２６７ｍｇ／Ｌの酸不溶性物質が生成した。
【０２０８】
ドデカン二酸を検出する液体クロマトグラフィーの分析のために、サンプルを処理した。３０％ＮａＯＨで発酵サンプルをｐＨ１２に調節し、ヘキサンで抽出してドデカンを除去した。２５０×４．６ｍｍのＺｏｒｂａｘ  Ｃ１８（３ミクロンパッキング）カラムを使用した液体クロマトグラフに水層を注入した。１％ＴＦＡ添加アセトニトリル／水を移動相として使用した。移動相勾配は、１０分間で５％アセトニトリルから１００％アセトニトリルへ、そして１００％アセトニトリルでさらに５分間の保持であった。移動相流速は１ｍｌ／分であった。カラム温度は４０℃であった。単点標準を較正のために使用した。同定は標準に比べた滞留時間で行った。液体クロマトグラフィーの分析は、各複製発酵フラスコからそれぞれ３０７ｍｇ／Ｌおよび３５４ｍｇ／Ｌのドデカン二酸の推定値を与えた。
【０２０９】
実施例１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃ−市販ドデカン（実施例１３Ａ）および実験的に得られたドデカン（実施例１３Ｂおよび１３Ｃ）のドデカン二酸への発酵
本明細書の方法によって得られたドデカンを用いて実施した実施例１３Ｂおよび１３Ｃとは異なり、実施例１３Ａは購入したドデカンを用いて実施した。実施例１３Ａ〜１３Ｃでは実施例１２とは異なる発酵プロトコルを使用したが、第１および第２段階の培養液は実施例１２と同一であった。
【０２１０】
２０ｇ／Ｌのグルコース、４．８ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、２０ｇ／Ｌのペプトン、および１０ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有する４０ｍＬの無菌寒天層を９本の無菌の５００ｍＬボトルの底に作成した。３０℃で一晩の培養によって、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）ＳＷ  ８１／８２株の菌叢が寒天表面に確立した。第１のドデカン二酸（ＤＤＤＡ）製造サイクルの始めに、三連の酵母菌叢を含有するボトルに、５ｍＬの無菌０．０１Ｍ  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２）＋０．５ｍＬの市販ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。さらに三連の酵母菌叢含有ボトルの第２の組に、５ｍＬの無菌０．０１Ｍ  ＰＢＳ＋０．５ｍＬのドデカン（実施例９または１０から得られる）を添加した。また三連の酵母菌叢含有ボトルの第３の組に、５ｍＬの無菌０．０１Ｍ  ＰＢＳ＋０．５ｍＬのドデカン（実施例９または１０から得られる）を添加した。第１の製造サイクルのために、ボトルを室温において２００ｒｐｍで振盪した。４日後に細胞および液相を収集して、４℃で冷蔵した。次に第２の製造サイクルを開始した。
【０２１１】
第２のＤＤＤＡ製造サイクルでは、三連の酵母菌叢含有ボトルに、５ｍＬの無菌０．０１Ｍ  ＰＢＳ＋０．５ｍＬの市販ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。さらに三連の酵母菌叢含有ボトルの第２の組に、５ｍＬの無菌０．０１Ｍ  ＰＢＳ＋０．５ｍＬのドデカン（実施例９または１０から得られる）を添加した。また三連の酵母菌叢含有ボトルの第３の組に、５ｍＬの無菌０．０１Ｍ  ＰＢＳ＋０．５ｍＬのドデカン（実施例９または１０から得られる）を添加した。ボトルを室温において２００ｒｐｍで振盪した。２日後に細胞および液相を収集した。
【０２１２】
双方の製造サイクルからの液体および細胞相をデカンで抽出して、あらゆる残留ドデカンを回収した。ボトル内に残留する寒天もまたデカンで抽出して、あらゆる残留ドデカンを回収した。双方のサイクルからの液体および細胞相のｐＨをｐＨ９〜９．５に上昇させて、ドデカン二酸を溶解した。アルカリ性細胞懸濁液を遠心分離して、細胞を除去した。ボトルの底に残留する寒天にもまたアルカリ洗浄を施して、ドデカン二酸を溶解した。次にアルカリ性液相をｐＨおよそ２に調節して、固形物を４℃で一晩沈殿させた。
【０２１３】
沈殿固形物および収集された細胞を６０℃で一晩乾燥させた。全ての乾燥固形物を酸性化（ＨＣｌ）イソプロパノールで抽出し、エキスドデカン二酸を抽出した。抽出物を窒素流下、室温で乾燥させた。ガスクロマトグラフィー−質量分析法による分析のために、サンプル留分を調製した。
【０２１４】
ＢＳＴＦＡ＋１％ＴＭＳによる誘導体化と、それに続くＤＢ５  ３０ｍ×０．２５ｍｍ内径、０．２５  フィルムカラムを用いたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０ガスクロマトグラフへの注入によって、サンプル中のドデカン二酸を分析した。クロマトグラフィーの実施においては、４０℃で１分間、７℃／分での３００℃への勾配と、５分間の最終保持の温度プログラムを使用した。化合物は、ＨＰ５９７１質量分光計上で検出した。１８〜５００質量単位の分子量をスキャンした。市販ドデカン二酸を用いて作成した標準を使用して、ドデカン二酸滞留時間を確認した。質量分光計フラグメンテーションパターンは、モニターされたサンプルピーク中の材料がドデカン二酸であったことを裏付けた。内部基準であるエチレングリコールジエチルエーテルの相対応答因子較正を使用して、サンプル中に存在するドデカン二酸量を推定した。
【０２１５】
転換されたドデカンの３つのサンプルについて、発酵容器内で生成した平均ドデカン二酸（ＤＤＤＡ）濃度は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈドデカン（実施例１３Ａ）および実施例９または１０から得られたドデカンサンプル（実施例１３Ｂおよび１３Ｃ）では、それぞれ３０．７ｍｇ／Ｌ、３０．０ｍｇ／Ｌ、および２５．６ｍｇ／Ｌであった。ドデカンの原料は、ドデカン二酸のモル濃度収率にはいかなる顕著な影響も及ぼさないようであった。平均値は両側ｔ検定において、ｐ＝０．０５のレベルで有意に異ならなかった。最善ではない工程管理によって手動の実験室規模条件下で得られた収率は、自動工程制御を使用して大規模な発酵で得られるものとは異なるかもしれない。
【０２１６】
本明細書で一連の数値が記述または確立される場合、範囲は、その終点、および範囲内の全ての個々の整数および部分を含み、より狭い各範囲があたかも明示的に記述されているかのように、記述範囲内の値のより大きな群の下位集団を形成する、これらの終点と内在する整数および部分の全ての様々な可能な組み合わせによって形成されるその中のより狭い各範囲もまた含む。本明細書で記述値を超えるとして一連の数値が記述される場合、範囲はそれでもなお有限であり、ここで述べられる本発明の文脈で作動可能な値によってその上限に拘束される。本明細書で記述値未満であるとして一連の数値が記述される場合、範囲はそれでもなおゼロでない値によってその下端に拘束される。
【０２１７】
本明細書では、特に断りのない限りまたは用法の文脈によって逆であるとされない限り、主題の実施態様が、特定の特徴または要素を含んでなる、含む、含有する、有する、それから構成される、またはそれによって構成されると記述されまたは記載される場合、明示的に記述または記載されるものに加えて、１つ以上の特徴または要素が実施態様中に存在してもよい。しかし本明細書の主題の代案の実施態様は、特定の特徴または要素から本質的になると記述または記載されてもよく、その実施態様では、実施態様の操作原理または際だった特徴を著しく変更する特徴または要素はその中に存在しない。本明細書の主題のさらなる代案の実施態様は、特定の特徴または要素からなると記述または記載されてもよく、その実施態様またはその想像上のバリエーションでは、具体的に記述または記載された特徴または要素のみが存在する。
【０２１８】
本明細書では、特に断りのない限りまたは用法の文脈によって逆であるとされない限り、（ａ）量、寸法、範囲、配合、パラメーター、および本明細書に記載されるその他の数量および特徴は、特に「約」という用語によって修飾される場合、厳密に正確なものとみなしてもよいが、必ずしも厳密に正確なものと解釈する必要はなく、それらの値の記述値は、許容範囲、変換係数、四捨五入、測定誤差を反映して、本発明の文脈の中で記述値と同等な機能および／または作用を持つ範囲を示す、むしろ概略値であり、および／または記載された値より（希望に応じて）大きかったり小さかったりしてもよいものと解釈されるべきであり、（ｂ）本発明の要素または特徴の存在の記述または説明に関する不定冠詞「ａ」または「ａｎ」の使用は、要素または特徴の存在数を１つに限定しない。
【配列表】
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