(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物又はその塩。
【化１】
0005802518.tif 000009
【請求項２】
下記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法であって、
サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とする化合物の製造方法。
【化２】
0005802518.tif 000010
【請求項３】
サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５２のサッカロスリックス  エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）ＭＩ５５９−４６Ｆ５株である請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属する微生物であって、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有し、
前記微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５２のサッカロスリックス  エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）ＭＩ５５９−４６Ｆ５株であることを特徴とする微生物。
【化３】
0005802518.tif 000011
【請求項５】
下記構造式（Ａ）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかを含有することを特徴とする化合物含有組成物。
【化４】
0005802518.tif 000012
【請求項６】
請求項５に記載の化合物含有組成物を含有し、プロスタグランジン産生抑制作用を有することを特徴とするプロスタグランジン産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジン産生抑制作用を有する新規化合物及びその製造方法、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、前記新規化合物を含有する化合物含有組成物、並びに、前記化合物含有組成物を含有するプロスタグランジン産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ：ＰＧ）は、細胞膜から遊離したアラキドン酸の代謝物である生理活性物質であり、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２などが知られている。生体が、物理的刺激や炎症性刺激等の刺激を受けると生体内において前記プロスタグランジンが産生され、それぞれ特異的な受容体と結合し、生体内において種々の生理反応を引き起す。
【０００３】
前記生理反応としては、例えば、掻痒、発熱、血管透過性亢進、疼痛等の炎症反応、知覚神経の異常亢進、気管支平滑筋収縮、血小板凝集、腫瘍細胞増殖、骨吸収促進、神経細胞変性などが挙げられる。そのため、前記プロスタグランジンは、喘息、心臓血管疾患、早産、腎炎、アテローム硬化症、過活動膀胱、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、癌等の多くの疾患における症状発現あるいは病態形成において重要な役割を担っている。
したがって、前記プロスタグランジンの産生を抑制することにより、前記種々の疾患を予防又は治療できることが期待されている。
【０００４】
前記プロスタグランジンの産生を抑制する化合物については種々の提案がなされているが（例えば、特許文献１〜３参照）、これらのプロスタグランジン産生抑制作用は十分なものではなかった。
【０００５】
したがって、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有し、プロスタグランジンに起因する各種疾患の予防又は治療に用いることができ、安全性の高い新規化合物の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３２６８６４号公報
【特許文献２】特開２００９−１６７２１７号公報
【特許文献３】特開２００４−２６２８６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有し、プロスタグランジンに起因する各種疾患の予防又は治療に用いることができ、安全性の高い新規化合物及びその製造方法、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、前記新規化合物を含有する化合物含有組成物、並びに、前記化合物含有組成物を含有するプロスタグランジン産生抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、各地の土壌から微生物を分離し、それらが生産する代謝産物について研究を重ね、新たに分離したサッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属する微生物が、プロスタグランジン産生抑制作用を示す物質を培養液中に生産していることを見出した。その培養液から活性成分を分離精製し、その物理化学的性質を調べたところ、得られた活性成分は、いかなる既知物質とも相違する下記構造式（Ａ）表される化合物であり、かつプロスタグランジン産生抑制作用を有することを知見し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、
＜１＞  下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物又はその塩である。
【化１】
0005802518.tif 000002
＜２＞  下記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法であって、
サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から下記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
【化２】
0005802518.tif 000003
＜３＞  サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５２のサッカロスリックス  エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）ＭＩ５５９−４６Ｆ５株である前記＜２＞に記載の化合物の製造方法である。
＜４＞  サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、下記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
【化３】
0005802518.tif 000004
＜５＞  受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５２のサッカロスリックス  エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）ＭＩ５５９−４６Ｆ５株である前記＜４＞に記載の微生物である。
＜６＞  下記構造式（Ａ）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかを含有することを特徴とする化合物含有組成物である。
【化４】
0005802518.tif 000005
＜７＞  前記＜６＞に記載の化合物含有組成物を含有し、プロスタグランジン産生抑制作用を有することを特徴とするプロスタグランジン産生抑制剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有し、プロスタグランジンに起因する各種疾患の予防又は治療に用いることができ、安全性の高い新規化合物及びその製造方法、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、前記新規化合物を含有する化合物含有組成物、並びに、前記化合物含有組成物を含有するプロスタグランジン産生抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の化合物をＫＢｒ法で測定した赤外吸収スペクトルである。
【図２】図２は、本発明の化合物のメタノール溶液を測定した紫外吸収スペクトルである。
【図３】図３は、本発明の化合物の重ジメチルスルホキシド（重ＤＭＳＯ）溶液を測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】図４は、本発明の化合物の重ＤＭＳＯ溶液を測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルである。
【図５】図５は、本発明の化合物のプロスタグランジン産生抑制作用を示す図である。縦軸：ＰＧＥ２又は６−ケト−ＰＦＧ１αの産生率（％）、横軸：化合物濃度（ｎｇ／ｍＬ）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（新規化合物）
本発明の化合物は、下記構造式（Ａ）で表される化合物であり、本発明者らが分離した新規化合物である。
下記構造式（Ａ）で表される化合物は、下記に示す物理化学的性質及び構造上の特徴によって、既知の化合物と明確に区別される新規物質である。
【化５】
0005802518.tif 000006
【００１３】
＜物理化学的性質＞
前記構造式（Ａ）で表される化合物の物理化学的性質としては、次のとおりである。
（１）  外観は、赤紫色の粉状である。
（２）  分子式は、Ｃ２０Ｈ２４Ｎ２Ｏ９で表される。
（３）  高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ  ４５９．１３７１（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ  ４５９．１３７４（Ｃ２０Ｈ２４Ｎ２Ｏ９Ｎａとして）である。
（４）  比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−３５８°（ｃ  ０．００３６，  メタノール）である。
（５）  ＫＢｒ法で測定した赤外吸収スペクトルは、図１に示すとおりである。
（６）  メタノール溶液で測定した紫外吸収スペクトルは、図２に示すとおりである。
λｍａｘ  ｎｍ（ε）  ：２６３（９，９０９）、４７０（２，７３９）
（７）  プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重ＤＭＳＯ溶媒中で２５℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、図３に示すとおりである。
（８）  炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重ＤＭＳＯ中で２５℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、図４に示すとおりである。
【００１４】
化合物が、前記構造式（Ａ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析、前記赤外吸収スペクトル、前記紫外吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル等の分析を行うことにより確認することができる。
【００１５】
本発明の前記新規化合物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物の塩であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
【００１６】
前記構造式（Ａ）で表される化合物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の化合物の製造方法により得られることが好ましい。
【００１７】
＜用途＞
前記構造式（Ａ）で表される化合物は、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有し、安全性の高い化合物である。そのため、前記構造式（Ａ）で表される化合物は、例えば、後述する本発明の化合物含有組成物や、本発明のプロスタグランジン産生抑制剤等の有効成分として好適に利用可能である。
【００１８】
（化合物の製造方法）
本発明の化合物の製造方法は、前記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法であって、培養工程と、採取工程と、を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１９】
＜培養工程＞
前記培養工程は、サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する工程である。
【００２０】
前記微生物としては、サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
前記微生物が前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有することは、例えば、該微生物の培養物、好ましくは培養上清中の成分の、プロスタグランジン産生抑制作用を測定する方法、各種分析法により前記構造式（Ａ）で表される化合物を検出する方法などが挙げられる。
【００２２】
前記プロスタグランジン産生抑制作用を測定する方法においては、前記微生物の培養物がプロスタグランジン産生抑制作用を有する場合、前記微生物は前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有すると判断することができる。
具体的には、ヒト等の培養細胞に前記培養物を添加し、該培養物中に産生されるプロスタグランジン（例えば、プロスタグランジンＥ２やプロスタグランジンＩ２の安定化代謝物である６−ケト−プロスタグランジンＦ１αなど）を検出し、前記プロスタグランジンの産生が抑制された微生物の培養物をプロスタグランジン産生抑制作用を有すると判断することができる。
【００２３】
前記微生物の具体例としては、本発明者らの分離したサッカロスリックス  エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）ＭＩ５５９−４６Ｆ５株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５２）などが挙げられる。また、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記サッカロスリックス  エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）ＭＩ５５９−４６Ｆ５株を含め、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産能を高めることも可能である。更に、遺伝子工学的手法による前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産も可能である。
【００２４】
前記培養は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する生産菌（以下、単に「化合物類生産菌」と称することがある）を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産に良好な温度で培養することによって行われる。
【００２５】
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができ、液体培地であってもよく、寒天培地であってもよい。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン、バクトソイトン等の炭水化物、脂肪などが使用できる。更に、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、前記化合物生産菌が利用し、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
【００２６】
前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産のための種母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、寒天培地上や斜面培地上で前記化合物生産菌を培養した生育物などを使用することができる。
【００２７】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件で培養することが好ましい。
前記培養の温度としては、前記化合物生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の蓄積に合わせて適宜選択することができる。
【００２８】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物から前記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する工程である。前記構造式（Ａ）で表される化合物は、上述した物理化学的性質を有するので、その性状に従って培養物から採取することができる。ここで、本発明において、採取とは、前記構造式（Ａ）で表される化合物を、前記培養物から分離及び／又は精製することを意味する。
【００２９】
前記培養物としては、前記培養工程で得られ、前記構造式（Ａ）で表される化合物を含むものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、菌体、培養上清、及びこれらの混合物などが挙げられる。これらの中でも、前記培養物としては、培養上清を用いることが、前記構造式（Ａ）で表される化合物を効率よく得ることができる点で好ましい。
なお、前記培養物として、前記菌体を用いる場合は、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記構造式（Ａ）で表される化合物を菌体から抽出し、これを分離及び／又は精製に供してもよい。
【００３０】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、溶媒抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、クロマトグラフィー法などが挙げられる。これらの方法を単独又は適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、前記構造式（Ａ）で表される化合物を分離及び／又は精製することができる。
【００３１】
前記溶媒抽出法に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸エチル、ｎ−ブタノールなどが挙げられる。
【００３２】
前記吸着剤としては、特に制限はなく、公知の吸着剤の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン系吸着樹脂などが挙げられる。
前記吸着剤の市販品の具体例としては、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）などが挙げられる。
【００３３】
前記クロマトグラフィー法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薄層クロマトグラフィー法、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）法などが挙げられる。
前記クロマトグラフィー法に用いる担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲル濾過、シリカゲル、アルミナ、活性炭などが挙げられる。
前記ゲル濾過クロマトグラフィー法に用いる担体の市販品の具体例としては、トヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社製）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ＧＥ社製）などが挙げられる。
【００３４】
前記吸着剤や前記クロマトグラフィーにおける担体から前記構造式（Ａ）で表される化合物を溶出させる方法としては、特に制限はなく、該吸着剤や該担体の種類や性質等に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いて溶出する方法などが挙げられる。
【００３５】
以上のようにして前記構造式（Ａ）で表される化合物を製造することができ、これにより、前記構造式（Ａ）で表される化合物を好適に得ることができる。
【００３６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養工程で得られた培養物又は前記採取工程で得られた前記構造式（Ａ）で表される化合物を洗浄する洗浄工程、前記採取工程で得られた前記構造式（Ａ）で表される化合物を更に精製する精製工程などが挙げられる。前記洗浄工程や前記精製工程は、公知の方法で適宜行われる。
【００３７】
（微生物）
本発明の微生物は、サッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属し、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する。前記微生物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有し、そのために、本発明の前記化合物の製造方法において、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
このような微生物の中でも、特に、ＭＩ５５９−４６Ｆ５株の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。なお、前記ＭＩ５５９−４６Ｆ５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に平成２３年９月２８日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５２として受託された。
【００３９】
なお、他の菌にも見られるように、前記ＭＩ５５９−４６Ｆ５株は、性状が変化し易いが、例えば、前記ＭＩ５５９−４６Ｆ５株に由来する突然変異株（例えば、紫外線、エックス線、放射線、薬品等の変異処理により取得できる人工変異株や、自然変異株）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。
【００４０】
（化合物含有組成物）
本発明の化合物含有組成物は、少なくとも前記構造式（Ａ）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４１】
＜構造式（Ａ）で表される化合物＞
前記化合物含有組成物中の前記構造式（Ａ）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記化合物含有組成物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物そのものであってもよい。
【００４２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
【００４３】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムなどのカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００４４】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００４５】
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００４６】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００４７】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００４８】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００４９】
前記ｐＨ調整剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５０】
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００５１】
前記化合物含有組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５２】
＜用途＞
前記化合物含有組成物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかを含むため、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有し、安全性の高いものであり、後述する本発明のプロスタグランジン産生抑制剤などに好適に利用可能である。
【００５３】
（プロスタグランジン産生抑制剤）
本発明のプロスタグランジン産生抑制剤は、本発明の前記化合物含有組成物を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。前記プロスタグランジン産生抑制剤は、プロスタグランジン産生抑制作用を有する。
【００５４】
＜化合物含有組成物＞
前記プロスタグランジン産生抑制剤中の前記化合物含有組成物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記プロスタグランジン産生抑制剤は、前記化合物含有組成物そのものであってもよい。
【００５５】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、前記化合物含有組成物中のその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記プロスタグランジン産生抑制剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
なお、前記プロスタグランジン産生抑制剤は、一種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記プロスタグランジン産生抑制剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００５７】
＜プロスタグランジン産生抑制活性＞
前記プロスタグランジン産生抑制活性を調べる方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例に記載の方法などが挙げられる。
【００５８】
＜剤型＞
前記プロスタグランジン産生抑制剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。
【００５９】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内容剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００６０】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００６１】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００６２】
＜投与＞
前記プロスタグランジン産生抑制剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、径腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００６３】
＜用途＞
前記プロスタグランジン産生抑制剤は、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有し、安全性が高いため、プロスタグランジンに起因する掻痒、発熱、血管透過性亢進、疼痛等の炎症反応、知覚神経の異常亢進、気管支平滑筋収縮、血小板凝集、腫瘍細胞増殖、骨吸収促進、神経細胞変性等の生理活性を抑制することができ、喘息、心臓血管疾患、早産、腎炎、アテローム硬化症、過活動膀胱、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、癌等の種々の疾患の予防薬又は治療薬として好適に利用可能である。
【実施例】
【００６４】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、特に明記しない限り「％」は「質量％」を表す。
【００６５】
（製造例１）
＜培養工程＞
ガラクトース２％、デキストリン２％、グリセリン１％、バクトソイトン（ディフコ社製）１％、コーン・スティープ・リカー０．５％、硫酸アンモニウム０．２％、及び炭酸カルシウム０．２％を水に懸濁し、種母培養液用液体培地（ｐＨ７．０に調整）を調製した。この種母培養液用液体培地を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注し、常法により１２０℃で２０分滅菌した。
前記滅菌した種母培養液用液体培地に、寒天斜面培地で前培養したサッカロスリックス  エスピー（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）ＭＩ５５９−４６Ｆ５株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５２として寄託）を接種し、３０℃で２日間回、回転速度１８０ｒｐｍで振とう培養することで、種母培養液を得た。
【００６６】
次に、グリセリン２．０％、デキストリン２．０％、酵母エキス（和光純薬工業株式会社製）０．３％、バクトソイトン（ディフコ社製）１．０％、硫酸アンモニウム０．２％、及び炭酸カルシウム０．２％を水に懸濁し、生産培地用液体培地（ｐＨ７．０に調整）を調製した。この生産培地用液体培地を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注し、常法により１２０℃で２０分滅菌した。この生産培地用液体培地に、前記調製した種母培養液の２体積％量を接種し、２７℃、５日間、回転速度１８０ｒｐｍで振とう培養した。
【００６７】
＜採取工程＞
前記培養工程で得られた培養液１５Ｌを、回転数８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、培養ろ液と菌体とに分離した。次いで、水で平衡化した１．５Ｌの吸着樹脂（ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径８０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）、に、得られた前記培養ろ液を通過させた後、該吸着樹脂を水３Ｌで洗浄し、続いて５０体積％メタノール水溶液４．５Ｌで洗浄した。洗浄後の吸着樹脂にメタノール３Ｌを供し溶出させ、この溶出液からメタノールをエバポレーターで留去し、得られた残渣を水１．５Ｌに溶解した。ここに酢酸エチル１．５Ｌを添加して攪拌し、これを静置して二相に分離させ、酢酸エチル層を回収することにより洗浄を行った。この洗浄の操作を更に続けて２回行った後、酢酸エチルをエバポレーターで留去し、赤色油状物質１．１３ｇを得た。
【００６８】
得られた赤色油状物質を少量のメタノールで溶解してセライトにまぶし、クロロホルムで充填した１４０ｍＬ容のシリカゲルカラムに供した。クロロホルム０．８Ｌで洗浄し、次に、クロロホルム−メタノール混合液（１００：１（体積比））０．８Ｌで洗浄し、更にクロロホルム−メタノール混合液（１００：２（体積比））１．２Ｌで洗浄した後、クロロホルム−メタノール混合液（１０：１（体積比））１．２Ｌで溶出した。この溶出液を減圧濃縮して、赤色油状物質１２７．６ｍｇを得た。
【００６９】
前記赤色油状物質をメタノールで溶解し、カラム（トヨパールＨＷ−４０Ｆ、内径３７ｍｍ×長さ６７０ｍｍ、東ソー株式会社製）に供し、メタノールで溶出した。溶出液を集めて減圧濃縮し、赤紫油状物質を得た。前記赤紫油状物質を少量のメタノールに溶解し、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ  ｐａｋ  ＵＧ１２０、内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂株式会社製）を用い、展開溶媒としてのアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸＝２０：８０：０．０００１（体積比）で、流速８ｍＬ／分間の条件にてクロマトグラフィーを行い、減圧濃縮した。これにより、目的物質３１．８ｍｇを得た。
【００７０】
（試験例１：化合物の同定）
製造例１で得られた目的物質の物理化学的性質を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、前記目的物質が、下記構造式（Ａ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１）  外観は、赤紫色の粉状であった。
（２）  分子式は、Ｃ２０Ｈ２４Ｎ２Ｏ９で表される。
（３）  高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ  ４５９．１３７１（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ  ４５９．１３７４（Ｃ２０Ｈ２４Ｎ２Ｏ９Ｎａとして）であった。
（４）  比旋光度は、［α］Ｄ２３＝−３５８°（ｃ  ０．００３６，  メタノール）である。
（５）  赤外吸収スペクトルは、図１に示すとおりであった。
（６）  紫外吸収スペクトルは、図２に示すとおりであった。
λｍａｘ  ｎｍ（ε）  ：２６３（９，９０９）、４７０（２，７３９）
（７）  プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶媒中で２５℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、図３に示すとおりであった。
（８）  炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重ＤＭＳＯ中で２５℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、図４に示すとおりであった。
【化６】
0005802518.tif 000007
以下の試験例２〜４において、前記構造式（Ａ）で表される化合物を被験物質として用い、各試験を行った。
【００７１】
（試験例２：ＰＧＥ２産生抑制作用）
前記構造式（Ａ）で表される化合物のＰＧＥ２産生抑制作用について以下の方法で検討を行った。
【００７２】
−ＳＷ９８２細胞の培養−
ヒト骨肉腫細胞株であるＳＷ９８２細胞（米国の株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）より購入）を１０％牛胎児血清（ニチレイ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２、インビトロジェン社製）に懸濁した後、９６ウェル培養プレートに１×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、一晩培養した。
【００７３】
−被験物質添加系におけるＰＧＥ２濃度の測定−
前記一晩培養後のＳＷ９８２細胞における９６ウェル培養プレート中の培地をＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫＳバッファー（日水製薬株式会社製）に置き換え、前記製造例１で製造した被験物質（前記構造式（Ａ）で表される化合物）を１０，０００ｎｇ／ｍＬ、３，３３３ｎｇ／ｍＬ、１，１１１ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、１２３ｎｇ／ｍＬ、４１ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、又は２ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、更に炎症性の刺激剤としてブラジキニン（株式会社ペプチド研究所製）を１ｎＭになるように添加した。３０分間培養後、培養上清を回収し、該培養上清中のＰＧＥ２濃度Ａを、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）法ベースのキット（６２Ｐ２ＡＰＥＢ、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いて測定した。
【００７４】
−陰性対照におけるＰＧＥ２濃度の測定−
陰性対照としては、前記被験物質添加系におけるＰＧＥ２濃度の測定において、被験物質及びブラジキニン（刺激剤）を添加しなかったこと以外は、前記被験物質添加系におけるＰＧＥ２濃度の測定と同様の操作を行い、ＰＧＥ２濃度Ｂの測定を行った。
【００７５】
−陽性対照におけるＰＧＥ２濃度の測定−
陽性対照としては、前記被験物質添加系におけるＰＧＥ２濃度の測定において、被験物質を添加しなかったこと以外は、前記被験物質添加系におけるＰＧＥ２濃度の測定と同様の操作を行い、ＰＧＥ２濃度Ｃの測定を行った。
【００７６】
−ＰＧＥ２産生率の算出−
各ウェルのＰＧＥ２濃度の測定結果より、下記式（１）に基づきＰＧＥ２産生率を算出した。
ＰＧＥ２産生率（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００  ・・・式（１）
前記式（１）において、「Ａ」は、被験物質添加系におけるＰＧＥ２濃度を表し、「Ｂ」は、陰性対照におけるＰＧＥ２濃度を表し、「Ｃ」は、陽性対照におけるＰＧＥ２濃度を表す。
【００７７】
結果を図５に示す。試験例２において、被験物質中にプロスタグランジン産生抑制に有効な物質が含まれる場合は、細胞培養液中から検出されるＰＧＥ２が低下する。即ち、ＰＧＥ２産生率が低下する。
前記構造式（Ａ）で表される化合物を被験物質として添加した結果、図５に示すとおり、ＰＧＥ２産生率が低下した。
したがって、前記構造式（Ａ）で表される化合物が、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有することが認められた。
【００７８】
（試験例３：ＰＧＩ２産生抑制作用）
前記構造式（Ａ）で表される化合物のＰＧＩ２産生抑制作用について、以下の方法で検討を行った。ＰＧＩ２は、代謝されて安定代謝物である６−ケト−ＰＧＦ１α（６−ケト−プロスタグランジンＦ１α）となる。したがって、６−ケト−ＰＧＦ１α濃度を測定することで、産生されたＰＧＩ２濃度を測定することができる。
【００７９】
−ＳＷ９８２細胞の培養−
ヒト骨肉腫細胞株であるＳＷ９８２細胞（ＡＴＣＣより購入）を１０％牛胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）に懸濁した後、９６ウェル培養プレートに１×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、一晩培養した。
【００８０】
−被験物質添加系における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定−
前記一晩培養後のＳＷ９８２細胞における９６ウェル培養プレート中の培地をＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫＳバッファー（日水製薬株式会社製）に置き換え、前記製造例１で製造した被験物質（前記構造式（Ａ）で表される化合物）を１０，０００ｎｇ／ｍＬ、３，３３３ｎｇ／ｍＬ、１，１１１ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、１２３ｎｇ／ｍＬ、４１ｎｇ／ｍＬ、又は１４ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、更に炎症性の刺激剤としてブラジキニン（株式会社ペプチド研究所製）を１ｎＭになるように添加した。３０分間培養後、培養上清を回収し、該培養上清中の６−ケト−ＰＧＦ１α濃度Ｄを、６−ｋｅｔｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ１  α  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（＃５１５２１１、ＣＡＹＭＡＮ社製）を用いて測定した。
【００８１】
−陰性対照における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定−
陰性対照としては、前記被験物質添加系における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定において、被験物質及びブラジキニン（刺激剤）を添加しなかったこと以外は、前記被験物質添加系における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定と同様の操作を行い、６−ケト−ＰＧＦ１α濃度Ｅの測定を行った。
【００８２】
−陽性対照における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定−
陽性対照としては、前記被験物質添加系における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定において、被験物質を添加しなかったこと以外は、前記被験物質添加系における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定と同様の操作を行い、６−ケト−ＰＧＦ１α濃度Ｆの測定を行った。
【００８３】
−６−ケト−ＰＧＦ１α産生率の算出−
各ウェルの６−ケト−ＰＧＦ１α濃度の測定結果より、下記式（２）に基づき６−ケト−ＰＧＦ１α産生率を算出した。
６−ケト−ＰＧＦ１α産生率（％）＝（Ｄ−Ｅ）／（Ｆ−Ｅ）×１００  ・・・式（２）
前記式（２）において、「Ｄ」は、被験物質添加系における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度を表し、「Ｅ」は、陰性対照における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度を表し、「Ｆ」は、陽性対照における６−ケト−ＰＧＦ１α濃度を表す。
【００８４】
結果を図５に示す。試験例３において、被験物質中にプロスタグランジン産生抑制に有効な物質が含まれる場合は、細胞培養液中のＰＧＩ２の産生が抑制され、したがって該培養液中から検出されるＰＧＩ２の安定代謝物６−ケト−ＰＧＦ１αが低下する。即ち、６−ケト−ＰＧＦ１α産生率が低下する。
前記構造式（Ａ）で表される化合物を被験物質として添加した結果、図５に示すとおり、６−ケト−ＰＧＦ１α産生率が低下した。
したがって、前記構造式（Ａ）で表される化合物が、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有することが認められた。
【００８５】
（試験例４：細胞毒性試験）
前記構造式（Ａ）で表される化合物の細胞毒性について、以下の方法で検討を行った。
【００８６】
−被験物質添加系における細胞数の測定−
ＳＷ９８２細胞（ＡＴＣＣより購入）を、１０％胎仔牛血清（株式会社ニチレイ製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン社製）を用いて２×１０３個／ウェルとなるように調製し、９６ウェル培養プレートに０．１ｍＬずつ接種した。これと同時に、前記製造例１で製造した被験物質（前記構造式（Ａ）で表される化合物）を下記表１に示す濃度となるように各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。４８時間培養後、各ウェルに細胞数測定キット（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、同仁化学株式会社製）１０μＬを添加し、更に２時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度Ｇを測定した。
【００８７】
−細胞増殖率の算出−
前記細胞数測定キットは、生存細胞が発色する。したがって、４５０ｎｍの吸光度が高いほど、生存細胞が多いこと、即ち細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す。これより、各ウェルの吸光度の測定結果から、下記式（３）に基づき細胞増殖率を算出し、これにより細胞増殖に及ぼす影響を評価した。
細胞増殖率（％）＝Ｇ／Ｈ×１００  ・・・式（３）
前記式（３）において、「Ｇ」は、被験物質添加系における４５０ｎｍの吸光度を表し、「Ｈ」は、被験物質非添加系（下記表１の濃度０ｎＭ）における４５０ｎｍの吸光度を表す。
【００８８】
【表１】
0005802518.tif 000008
【００８９】
前記構造式（Ａ）で表される化合物を被験物質として添加した結果、表１に示すとおり、前記構造式（Ａ）で表される化合物は、ＳＷ９８２細胞に対して細胞増殖に影響を示さず、安全性が高いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の化合物は、優れたプロスタグランジン産生抑制作用を有し、安全性の高い化合物であるため、プロスタグランジンに起因する掻痒、発熱、血管透過性亢進、疼痛等の炎症反応、知覚神経の異常亢進、気管支平滑筋収縮、血小板凝集、腫瘍細胞増殖、骨吸収促進、神経細胞変性等の生理活性を抑制することができ、喘息、心臓血管疾患、早産、腎炎、アテローム硬化症、過活動膀胱、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、癌等の種々の疾患の予防薬又は治療薬の有効成分として好適に利用可能である。
【図１】
0005802518.tif 000013
【図２】
0005802518.tif 000014
【図３】
0005802518.tif 000015
【図４】
0005802518.tif 000016
【図５】
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