(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンおよび／またはトリプトファンによって修飾された、ポリエチレンイミンおよびポリアリルアミンを含む群から選択された線状のポリアミンと、RNA干渉に活性のある二本鎖RNAまたはsiRNAとからなる、トランスフェクション剤として有用な組成物。
【請求項２】
前記ポリアミンの質量は４００Ｄａ超である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリアミンは、２〜２２０ＫＤａの質量を有するポリエチレンイミンおよび１０〜７０ＫＤａの質量を有するポリアリルアミンを含む群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
RNA干渉に活性のある二本鎖RNAまたはsiRNAは、通常のものであるかまたは修飾されており、該修飾基は、２’−フルオ、２’−メトキシ、ホスホロチオアート、ＬＮＡまたはモルホリノである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
siRNAは、１５〜３０ｍｅｒを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
チロシンおよび／またはトリプトファンによって修飾されたポリアミンと、RNA干渉に活性のある二本鎖RNAまたはsiRNAとを等張培地において含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
前記等張培地は、ＮａＣｌ、グルコースおよび緩衝液からなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
RNA干渉に活性のある二本鎖RNAまたはsiRNAの濃度は、ピコモルからマイクロモルまで変動する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
１種以上の添加剤を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記添加剤は、ＰＥＧ、ＰＶＡ、単糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質またはビタミン類である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
RNA干渉に活性のある前記二本鎖RNAまたはsiRNAは、プラスミドDNAにおいて発現される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物中のチロシンおよび／またはトリプトファンによって修飾された前記ポリアミンの窒素修飾の割合（百分率）は、０．０１〜１００％で変動する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１３】
前記線状のポリアミンは、チロシンおよび／またはトリプトファン残基により修飾され、ポリマー当たり２５〜３３％の窒素修飾を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
チロシンによって修飾された線状ポリエチレンイミンと、RNA干渉に活性のある二本鎖RNAまたはsiRNAとを含む組成物。
【請求項１５】
請求項１または１１に記載の組成物の使用を含む、RNA干渉に活性のある二本鎖RNAまたはsiRNAおよびプラスミドDNAをin vitroまたはex-vivo転移する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のチロシンおよび／またはトリプトファンによって修飾されたポリアミンを含む組成物を合成する方法であって、
ａ．  前記ポリアミンを、チロシンおよび／またはトリプトファンを含む群から選択される芳香族アミノ酸と結合させて、第１の反応混合物を形成する工程；
ｂ．  ジメトキシトリアジン−Ｎ−メチルモルホリウムを前記第１の反応混合物に加えて、第２の反応混合物を形成する工程；
ｃ．  前記第２の反応混合物を攪拌し、前記第２の反応混合物を蒸発させる工程；および
ｄ．  前記組成物を得る工程
を含む、方法。
【請求項１７】
ポリアミンの合成は、塩基性緩衝液、あるいは塩基存在下の水性培地または水／アルコール混合物中で行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物中のチロシンおよび／またはトリプトファンによるポリアミンの窒素修飾の割合（百分率）は、０．０１％から１００％までで変動する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養下の真核細胞へ、in vivoまたはex vivoで、細胞中で遺伝子サイレンシングを媒介する核酸、特に低分子干渉RNA（下記説明および特許請求の範囲においてsiRNAという）であって、RNA干渉（RNAi）および場合によってはプラスミドDNAを提供するものを、効果的な合成のポリマー媒介性に送達するめの手段、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉（RNAi）は、初期の遺伝子機能レベルであるmRNAにおける遺伝子サイレンシングのための技術である（非特許文献１）。この原理は短いRNA二本鎖（siRNA；small interfering RNA：低分子干渉RNA）がmRNAの単一の標的と極端に選択的に相互作用して、配列特異的mRNAの分解およびひいてはタンパク質産生の阻害をもたらすことにある。
【０００３】
RNAiは、siRNAの活性配列の予測可能な設計とmRNAのターゲッティングとに起因して非常に有効である。トランスフェクション試薬であるベクターによるトランスフェクションによってsiRNA二本鎖を導入し、細胞質に送達する場合、RNAiは細胞系（非特許文献２）および初代細胞（primary cell）などの種々の哺乳動物細胞において、外因性または内因性遺伝子を効率的にサイレンシングすることがわかっている。
【０００４】
RNAiは人間の治療にとって強力なツールであり、癌またはウイルス感染などの重篤な疾患のための新しい治療アプローチの開発に劇的に影響を及ぼすだろう。RNAiの非常に大きな可能性を引き出すために、疾患のある器官の細胞および組織への効果的な送達のために開発されるRNAiトランスフェクションベクターおよび戦略の創出が必要である。
【０００５】
RNAiの成功は、siRNA（設計および化学）および細胞送達系のためのベクター／担体の両者に左右される。アンチセンスまたはリボザイム技術と比較すると、標的mRNA（そうでない場合もある）の二次構造は、siRNAによるサイレンシングの強力な制限因子ではない。siRNAの多数の配列は、所与の標的mRNAに有効であり得る。siRNA二本鎖の安定性および細胞に送達されるsiRNAの量は、選ばれた配列による標的利用可能性よりむしろサイレンシングにとって最も大きい制限因子である。細胞内にsiRNAを導入するために２つのアプローチが提唱されている：合成siRNA二本鎖のトランスフェクションによる細胞の細胞質への送達および核への遺伝子導入によって予め導入されたプラスミド（またはDNAカセット）からの、in situで発現したsiRNAの送達。
【０００６】
哺乳動物細胞におけるRNAiは、si/shRNAまたはmicroRNA適合低分子ヘアピン型RNA（shRNAmir）を発現するsiRNAまたはDNAベクターのいずれかの効果的な細胞内送達に依存する（非特許文献３〜７）。哺乳動物細胞におけるshRNA（short hairpin RNA：低分子ヘアピン型RNA）またはsiRNAの発現は、Pol IIまたはPol III（Ｕ６またはＨ１）プロモータのいずれかからの転写により実現され得る。DNAベクターは、二本鎖低分子ヘアピン型RNA（shRNA）（後に細胞機構によってsiRNAに処理される）を発現するプラスミドおよびウイルスベクター系をベースとする。近年のshRNA系の開発によって、組織特異的で誘導性の遺伝子のノックダウンが可能になっている。RNA干渉用の活性RNAを発現するそういったDNAベクターの細胞内送達は、組換えウイルスまたは非ウイルス送達系を用いて実現され得る。
【０００７】
遺伝子送達技術に関して、強力なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは細胞内にsiRNA二本鎖を導入するのに有用である。培養哺乳動物細胞に関し、ウイルスベクターには核内にDNAを送達する導入効率および能力があるため、ウイルスベクターは送達されたプラスミドDNAから発現したsiRNAの細胞内プールの産生のための強力なツールであると考えられる。しかし、組換えウイルス送達系は、依然として、それらの免疫原性および臨床的症状における潜在的リスクに悩まされる。対照的に、合成系を核酸（プラスミドまたは合成siRNA）にトランスフェクトすることは、柔軟性を示し免疫原生のない万能な方法である。非ウイルスベクターを（化学的または酵素的に生じた）合成siRNA二本鎖体にトランスフェクトすることは、主に短い二本鎖RNAを細胞質に送達するのに最良の技術である。siRNA送達のために最も効率的な非ウイルスベクターは、元は遺伝子送達の分野に由来するか特異的RNAi適用のために新たに開発された、カチオン性脂質媒介トランスフクションをベースとしている。カチオン性脂質調合物は、核酸（プラスミド、オリゴヌクレオチド、siRNA二本鎖）を、正電荷粒子にコンパクトにし、この正電荷粒子は、細胞表面でアニオン性のプロテオグリカンと相互に作用し、かつ、エンドサイトーシスにより細胞に入ることができる。エンドサイトーシスの細胞内小胞（主にエンドソーム）に向けて輸送された後、カチオン性脂質には脂質交換／拡散によってこれら細胞内区画の膜を不安定にする性質があり、核酸の「脱複合体化（decomplexation）」および細胞質内への放出を可能にする（Xu and Szoka,1996）。また、プロトンスポンジ活性（proton sponge activity）と呼ばれる二次機構は、エンドソームの膨潤および破壊を誘導し、ひいては細胞質内の核酸を放出する一部の脂質に関与する可能性がある。RNAi機構が細胞質内で発生すると、カチオン性脂質の製剤をベースとするベクターは合成siRNA二本鎖を細胞内に送達するのに効率的な媒体となる。プラスミドからin situで発現したsiRNAに関して、エンドソーム区画を不安定にする、カチオン性脂質製剤またはカチオン性ポリマーをベースとする非ウイルスベクターが適している。
【０００８】
遺伝子（長い二本鎖DNA）を細胞に効率的にトランスフェクトするカチオン性ポリマーの能力とは対照的に、それらは、短い核酸の送達には効率的ではない。カチオン性ポリマーはカチオン性脂質をベースとする系よりも、siRNA送達に効率的ではないことがわかっている。カチオン性ポリマーは、約１００〜２００ｎＭの濃度のsiRNAによりin vitroのRNA干渉を媒介することができる。このような濃度でのRNA干渉の選択性のために、カチオン性ポリマーの使用が制限される。また、使用される多量のsiRNAは、細胞毒性効果を誘導する多量のポリマーと関連する。これまで、カチオン性ポリマー（例えば、分枝または線状（liner）のポリエチレンイミン、ポリ−ヒスチジルポリマー、キトサン、ポリ（アミノエステルグリコールウレタン）、アミノシクロデキストリン誘導体）がin vitroで用いられてきたが、カチオン性脂質に比して関連性のある効果はなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】フィレ・エイ（Fire, A）、エス・グ（S. Xu）、エム・ケイ・モントゴメリ（M. K. Montgomery）、エス・エイ・コスタス（S. A. Kostas）、エス・イー・ドライバ（S. E. Driver）およびシー・シー・メロ（CC. Mello）著、「ポテント・アンド・スペシフィック・ジェネティック・インターフェアランス・バイ・ダブル・スタンダードＲＮＡ・イン・カエノルハブディティス・エレガンス（Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans）」、ネイチャー（Nature）、１９９８年、第３１巻、ｐ．806-11.
【非特許文献２】エルバシア・エス（Elbashir, S）、エム・ジェイ・ハーボルス（M., J. Harborth）、ダブリュー・レンデッケル（W. Lendeckel）、エイ・ヤルシン（A. Yalcin）、ケイ・ウェバー（K.Weber）およびティー・ツシュル（T. Tuschl）著、「ドュプレクセス・オフ・２１−ヌクレオチド・ＲＮＡｓ・メディエイト・ＲＮＡインターフェアランス・イン・カルチャード・マンマリアン・セルズ（Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells）」、ネイチャー（Nature）、2001年、.第411巻、ｐ．494-8.
【非特許文献３】スイ・ジー（Sui, G.）、シー・スーホー（C. Soohoo）、ビー・アファーエル（B. Affar el）、エフ・ガイ（F. Gay）、ワイ・シ（Y. Shi）、ダブリュー・シー・フォレスター（W. C. Forrester）および,ワイ・シ（Y. Shi）著、「ア・ＤＮＡベクター−ベースドＲＮＡｉテクノロジー・ツー・サプレス・ジーン・エクスプレッション・イン・マンマリアン・セルズ（A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.）」、Proc Natl Acad Sci U S A、2002年.、第99巻、ｐ．5515-20
【非特許文献４】ユ・ジェイ・ワイ（Yu, J.Y.）、エス・エル・デルイター（S. L. DeRuiter）およびディー・エル・ターナー（D. L. Turner.）著、「ＲＮＡインターフェアランス・バイ・エクスプレッション・オフ・ショート−インターフェアリングＲＮＡｓアンド・ヘアピンＲＮＡｓ・イン・マンマリアン・セルズ（RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.）」、Proc Natl Acad Sci U S A.、2002年、.第99巻、ｐ．6047-52.
【非特許文献５】ミヤギシ・エム（Miyagishi, M.）およびケイ・タイラ（K. Taira）著、「Ｕ６プロモータ−ドライブン・ｓｉＲＮＡｓウィズ・フォー・ウリジン・３’オーバーハングス・イフィシエントリー・サプレス・ターゲッテッド・ジーン・エクスプレッション・イン・マンマリアン・セルズ（U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.）」、Nat Biotechnol 、. 2002.年、第20巻、ｐ．497-500.
【非特許文献６】シルバ・ジェイ・エム（Silva, J. M）、エム・ゼット・リ（M. Z. Li）、ケイ・チャン（K. Chang）、ダブリュー・ゲ（W. Ge）、エム・シー・ゴールディン（M. C. Golding）、アール・ジェイ・リッケルス（R.J. Rickles）、ディー・シオラス（D. Siolas）、ジー・フ（G. Hu）、ピー・ジェイ・パディッソン（P.J. Paddison）、エム・アール・シュラバッハ（M. R. Schlabach）、エヌ・シェス（N. Sheth）、ジェイ・ブラッドショー（J. Bradshaw）、ジェイ・バーチャード（J. Burchard）、エイ・クルカラニ（A. Kulkarni）、ジー・キャベット（G. Cavet）、アール・サチダナンダム（R. Sachidanandam）、ダブリュー・アール・マクコンビ（W. R. McCombie）、エム・エイ・クリアリ（M. A. Cleary）、エス・ジェイ・エレッジ（S.J. Elledge）およびジー・ジェイ・ハノン（G.J. Hannon）著、「セカンド−ジェネレーション・ｓｈＲＮＡライブラリーズ・カバリング・ザ・マウス・アンド・ヒューマン・ゲノムズ（Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes）、 Nat Genet、. 2005年、第37巻、ｐ．1281-8.
【非特許文献７】ブルメルカンプ・ティー・アール（Brummelkamp, T. R.）、アール・ベルナルド（R. Bernards）および, アール・アガニ（R. Agami）著、「ア・システム・フォー・ステーブル・エクスプレッション・オフ・ショート・インターフェアリングＲＮＡｓ・イン・マンマリアン・セルズ（A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells）」、Science、2002年. 第296巻、ｐ．550-3.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らの目的は、カチオン性ポリマー（この主要なクラスの非ウイルス送達ベクター）の、in vitro siRNAトランスフェクション能力を増大させることであった。カチオン性ポリマーは、静電的相互作用を介して、siRNAのリン酸塩とポリマーのアミノ基との間で相互作用することができる。しかし、siRNAの構造によれば、ポリマーは２回転しか含まないそういった小さなダブルヘリックス（鎖１本あたり約２０個のヌクレオチド）を凝縮することができない。siRNAとカチオン性ポリマーとの間で複合体形成さえも生じ、その結果siRNAがポリアミン骨格に沿って固着することになり、カチオン性ポリマーは協同的相互作用を失って、複合体形成された分子の粒子またはミクロ凝集体への凝縮が誘導される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ポリアミンおよび小さな二本鎖オリゴヌクレオチドによって担われる正電荷と負電荷との間の静電的相互作用に加えて、核酸塩基および水素結合形成相互作用による疎水性スタッキングは、ポリアミンとsiRNAとの間の相互作用を増大させるために本発明者らが提唱する方法である。総合すると、静電的および疎水性の相互作用並びに水素結合は、siRNAの安定した複合体形成および凝縮をもたらす十分なエネルギーを提供する。
【００１２】
芳香族アミノ酸（aromatic amino acid：ＡＡＡ）はタンパク質において疎水性の原因となり、疎水性相互作用を介してタンパク質−タンパク質間およびタンパク質−リガンド間の相互作用に関与する。ＡＡＡはまた、核酸塩基（グアニジン、アデノシン、チミンまたはシトシン）とスタッキングすることによって核酸と相互作用することもできる。
【００１３】
本発明は、芳香族アミノ酸で高度に修飾されたポリアミン骨格を含む新しい概念の疎水性ポリアミンに関する。このタイプのポリマーによって、静電相互作用、疎水性スタッキングおよび水素結合を介してsiRNAのような小さな核酸と相互作用する可能性が得られる。克服するためのエネルギー障壁として、化学的グラフトによってポリアミンにＡＡＡを付加することにより、最終的に凝縮をもたらす協同的相互作用を誘導するのに十分なエネルギーが提供され得ることになる。その結果、安定した粒子または凝集体の下での疎水性相互作用によって生成する複合体が安定する。
【００１４】
本発明は、カチオン性ポリマーのグループに属する新種の非ウイルス性トランスフェクション剤を記載するものであり、特に小サイズのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションに適合させられている。特に、小さなオリゴヌクレオチドの物理的性質が、本発明者らが疎水性およびカチオン性ポリマーをベースとする新種のトランスフェクション剤を設計するきっかけとなった。
【００１５】
本発明者らは、関心のあるオリゴヌクレオチドを疎水性およびカチオン性ポリマーと結合させることによってトランスフェクションの安定な複合体を形成する高効率のトランスフェクション剤が得られ得ることを見出した。
【００１６】
有利には、前記トランスフェクション剤はまた、RNA干渉を媒介する小型のRNAをin situでの発現を促進し得るプラスミドDNAをsiRNAに共トランスフェクトするのにも有用である。
【００１７】
また、本発明の目的は、siRNA用のトランスフェクション剤および場合によってはRNAiに活性のあるRNAを発現するDNAベクターとして有用な新規組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明はまた、細胞をin vitroでトランスフェクトする方法に関する。
【００１９】
トランスフェクション剤として有用な本発明の組成物は、芳香族アミノ酸によって修飾されたポリアミンと、小さな二本鎖または一本鎖RNAとを含む。
【００２０】
有利には、ポリアミンは、分枝または線状のポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、デンドリマー、ポリアミノエステル、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンまたはキトサンを含む。
【００２１】
ポリアミンは、より具体的には、線状ポリエチレンイミン（linear polyethylenimine：ＬＰＥＩ）、ポリアリルアミン（polyallylamine：ＰＡＡ）およびポリリジン（polylysine：ＰＬＬ）を含む群から選択される。
【００２２】
好ましくは、ポリアミンの分子量は４００Ｄａ超である。
【００２３】
有用なポリアミンは、２〜２２０ＫＤの線状ポリエチレンイミン、１０〜７０ＫＤのポリアリルアミンおよび１〜３００ＫＤのポリリジを含む群から選択される。
【００２４】
ポリアミンを修飾するのに用いられる芳香族アミノ酸は、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンまたはそれらの誘導体を含む群から選択される。
【００２５】
好ましくは、芳香族アミノ酸はトリプトファンおよび／またはチロシンである。
【００２６】
上記組成物において、RNAは通常のものであるか修飾されており、修飾基は例えば２’−フルオ、２’−メトキシ、ホスホロチオアート、ＬＮＡまたはモルホリノである。
【００２７】
上記RNAは、二本鎖または一本鎖アンチセンスsiRNAまたは一本鎖センス／アンチセンスsiRNAの混合物である。
【００２８】
有利には、siRNAは、１５〜３０ｍｅｒを有する。
【００２９】
好適な組成物は、等張培地（例えば、ＮａＣｌ、グルコース）、緩衝液中に、上記のような芳香族アミノ酸および二本鎖または一本鎖siRNAによって修飾されたポリアミンを含む。
【００３０】
siRNAの濃度はピコモルからマイクロモルまで変動し得る。
【００３１】
有利には、上記組成物は、１種以上の添加剤（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＡ、単糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ビタミン類）を含む。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、上記組成物は、RNAiに活性なRNAを発現するかまたは導入遺伝子をコードするプラスミドDNAを更に含む。
【００３３】
前記プラスミドは、特に、siRNA、shRNAまたはmino-RNA適合低分子ヘアピン型RNAを発現する。
【００３４】
前記siRNAはそれぞれ、分解に対し適切な基により安定化される群を含むことができ、該群は、デオキシヌクレオチドなどの修飾された類似体により置換されたプリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、および／または、糖−あるいは骨格修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチド類似体を含む群から選択される。オリゴヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、メチルホスホナート、モルホリノ・ホスホロジアミダート、ホスホロチオアート、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’アルキルヌクレオチド類似体を含有し得る（Verma and Eckstein， 1998）。
【００３５】
別の目的は、前記組成物の合成方法を提供することである。
【００３６】
上記組成物の芳香族アミノ酸によって修飾されたポリアミンを合成する方法は、ポリアミンの存在下でジメトキシトリアジン−Ｎ−メチルモルホリウム（Dimethoxytriazine-N-methylmorpholium：ＤＭＴＭＭ）によって活性化された芳香族アミノ酸のスーパーエステルの使用を含む。
【００３７】
有利には、ポリアミンの合成は、塩基性緩衝液（例えば、ホウ酸塩緩衝液、２００ｍＭ、ｐＨ＝７．５〜９）中で、あるいは塩基または水／アルコール混合物の存在下の水性培地中で行われる。
【００３８】
前記組成物中の芳香族アミノ酸によるポリアミンの修飾の割合（百分率）は、更に具体的には、０．０１〜１００％、特には１５〜５０％である。
【００３９】
本発明はまた、siRNAまたはsiRNAおよびプラスミドDNAのin vitro、ex vivoおよびin vivoの転移（transfer）方法であって、上記のような組成物を用いる工程を包含する、方法に関する。
【００４０】
siRNAのin vitro転移は有利には、懸濁液中に接着細胞または浮遊細胞を含む培地で実行される。
【００４１】
培地は、正常培地または合成培地である。
本発明また、遺伝子による遺伝病（genetic herediary disease）または複雑な遺伝子疾患の原因となるか、またはそれに関与する１種以上の標的タンパク質の発現に対し調節作用を誘導する医薬組成物として使用される組成物を提供する。
【００４２】
本発明の目的は、RNA干渉を媒介する小さなRNAのin situ発現を促進し得る、DNAベクタートランスフェクション剤として有用な新規組成物を提供することにある。
【００４３】
本発明の他の特徴および利点は図１〜８を参照しながら以下の実施例に与えられることになる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】D2O中のL-PEI-Tyr接合体の1H-NMR分析。
【図２】図２Ａおよび２Ｂ：A549細胞におけるsiRNA送達。
【図３】種々の程度のチロシン残基で修飾されたL-PEI10KをトランスフェクトされたGL3Luc siRNAによるA549-GL3Luc細胞によって安定して発現されたルシフェラーゼ遺伝子（pGL3）のRNA干渉効率。
【図４】L-PEI10KまたはL-PEI10KTyr33%接合体をトランスフェクトされたGL3Luc siRNAによるA549-GL3Luc細胞によって安定して発現されたルシフェラーゼ遺伝子（pGL3）の比較サイレンシング効率。
【図５】L-PEI10K-Tyr33%をトランスフェクトされたGL3Luc siRNAによるA549-GL3Luc細胞によって安定して発現されたルシフェラーゼ遺伝子（pGL3）の選択的RNA干渉。
【図６】L-PEI10K-Tyr33%と複合体形成されたsiRNAのトランスフェクション後のヒーラ細胞系における効率的且つ選択的なＧＡＰＤＨ遺伝子サイレンシング。
【図７】PAA17K-Tyr40%をトランスフェクトされたGL3Luc siRNAによるA549-GL3Luc細胞によって安定して発現されたルシフェラーゼ遺伝子（pGL3）の選択的RNA干渉。
【図８】図８Ａおよび８Ｂ：GL2Luc siRNAおよびpCMVLucプラスミド（pGL2Luc）にPEI10K-Tyr19%を共トランスフェクトされた後にヒーラ細胞によって発現されたルシフェラーゼ遺伝子（GL2Luc）の選択的RNA干渉。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（材料と方法）
（化学薬品およびオリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、Eurogentec（ベルギー）によってPAGE精製した。オリゴヌクレオチドは、１ｘアニーリング緩衝液（５０ｍＭの酢酸カリウム、５０ｍＭの酢酸マグネシウム）（Eurogentec）中、２分間にわたり９５℃でアニーリングされ、次いで、室温で２〜４時間インキュベートされた。GAPDH SMARTプール（登録商標）試薬はDharmaconから入手した。
【００４６】
使用されたsiRNA二本鎖体は、配列（配列番号１および配列番号２；配列番号３および配列番号４；配列番号５および配列番号６；配列番号７および配列番号８）に相当する。
【００４７】
【表１Ａ】
0005802389.tif 000002
【００４８】
化学用試薬および出発原料はすべてSigma-Aldrich（フランス）から購入され、事前に精製することなく使用された。溶媒はSDS-Carlo Erba（フランス）から取り寄せられた。ジエチルエーテルは乾燥させられて、ナトリウムベンゾフェノンから蒸留された。
【００４９】
1H NMRスペクトルは、CDCl3、D2OまたはCD3OD中２５℃でBrukerのAF-400スペクトロメーターで記録され、プロトンの化学シフトをTMSから低磁場で記録した。ＮＭＲ多重度は、ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｂｒ＝ブロード、ｍ＝マルチプレット、ｔ＝トリプレットと略している。
【００５０】
（線状ポリエチレンイミン（L-PEI）の合成）
LPEIは２−エチル−２−オキサゾリンモノマーのリビングカチオン開環重合後に生成させられた中間体ポリ−２−エチル−２−オキサゾリンから得られる。
【００５１】
ポリ−２−エチル−２−オキサゾリンの合成：０．４molの２−エチル−２−オキサゾリンモノマーをアセトニトリル４０ｍｌに溶解させ、次いで、０．４／Xmolのｐ−トルエンスルホン酸メチルをアルゴン雰囲気下に添加した。反応物を８０℃で２４〜４８時間にわたって加熱した。反応物をＮａ２ＣＯ３飽和水溶液でクエンチし、２４時間にわたって加熱した。室温で緩やかに冷却した後、沈殿が生じるまで１０ｍｌのメタノールおよびエーテルを添加した。沈殿物をろ過し、エーテルで洗浄した。ポリ−２−エチル−２−オキサゾリンを８０〜９０％の収率で得た。
【００５２】
1H-NMR分析(400MHz, CDCl3): 1-1.06ppm (s, 3H, CH3CH2CONCH2CH2); 2.2-2.3ppm (m, 2H, CH3CH2CONCH2CH2); 3-3.4ppm (s, 4H, CH3CH2CONCH2CH2).
L-PEIの合成：０．３５molのポリ−２−エチル−２−オキサゾリンを水１００ｍＬに溶解させ、次いで、２００ｍＬの３７％塩酸を添加し、混合物を１２０℃に加熱した。２４時間後、反応混合物を蒸発させ、次いで、水を添加した後に凍結乾燥させた。収率は９０％であった。
【００５３】
1H-NMR(400MHz, D2O)による分析：３．４ｐｐｍにシングルピーク
【００５４】
【表１Ｂ】
0005802389.tif 000003
【００５５】
（ポリエチレンイミン−芳香族α−アミノ酸接合体の合成）
（Ｎ，Ｏ−Ｂｏｃ−チロシンの合成）
Ｌ−チロシン（Sigma）５ｇをＮａ２ＣＯ３（０．１ｍｇ／ｍＬ）１２５ｍＬおよびＴＨＦ５０ｍＬに溶解させた。次いで、ＴＨＦ７５ｍＬに溶解したＢｏＣ２Ｏ１７．２ｇをチロシン溶液に添加し、その混合物を室温で３日間にわたり攪拌した。水（４０ｍｌ）を加え、Ｎ，Ｏ−Ｂｏｃ−チロシンをエーテルで抽出した。水相をＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで新たに２回抽出した。蒸発させた後、この粗製産物をシリカゲルクロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２中）によって精製する。５．２ｇのＮ，Ｏ−ＢＯＣ−チロシンを得た。
【００５６】
1H-NMR(400MHz, CDCl3)による分析:7.2ppm (d, 2H, 芳香族H), 7.1ppm (d, 2H, 芳香族H), 4ppm (m, 1H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 3-2.99ppm (dd, 1H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 2.84-2.78ppm (dd, 1H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 1.48ppm (s, 9H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC), 1.32ppm (s, 9H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH)。
（Ｎ−Ｂｏｃ−トリプトファンの合成）
Ｎ−Ｂｏｃ−トリプトファンの合成は、Ｎ，Ｏ−Ｂｏｃ−チロシンの合成のために用いられたのと同一の手順により実現されたが、トリプトファン２ｇおよびＢｏｃ２Ｏ６．５ｇにより出発し、白色固体２．７９ｇを得た。
【００５７】
1H-NMR(400MHz, CDCl3)による分析: 8.1ppm (s, 1H, -COOH), 7.6ppm (d, H,芳香族H), 7.38ppm (d, 1H, 芳香族H), 7.2ppm (m, 1H, 芳香族H), 7.16 (m, 1H, 芳香族H), 7.01ppm (m, 1H, 芳香族H), 5.09ppm (d, 1H, NHBOC), 4.68ppm (br, 1H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 3.35ppm (m br, 2H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 1.45ppm (s, 9H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)
（ポリエチレンイミン−チロシン接合体（L-PEI-Tyr）の合成）
（L-PEI10KD-Tyr33%の合成）
手順１：１００ｍｇのL-PEI10K・ＨＣｌ（１．２６ｍｍｏｌ）を５ｍＬの２００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ＝８．２）に溶解させた。次いで、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて８に調節した。ＴＨＦ１５ｍＬに溶解したＮ，Ｏ−Ｂｏｃ−チロシン（０．６３２ｍｍｏｌ）２４０ｍｇを添加し、混合物を１０分間にわたり攪拌した。ＤＭＴＭＭ（５００ｍｇ）を混合物に添加し、４８時間にわたって攪拌した。蒸発させた後、固体を水で洗浄した。乾燥後、２３９ｍｇの黄色固体を得た（L-PEI10K-TyrBoc2）。１８５ｍｇのLPEI-TyrBoc2をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍＬに溶解させた。３時間後、反応混合物を蒸発させ、水中で透析した。凍結乾燥後、１１１ｍｇの白色固体（L-PEI10K-Tyr）を得た。
【００５８】
手順２：水４ｍＬ中のL-PEI10K.HCl  ２００ｍｇ（２．５３ｍｍｏｌ）に、Ｎ−メチルモルホリン０．５６ｍＬとメタノール１２ｍＬ中のＮ，Ｏ−Ｂｏｃ−チロシン４８３ｍｇ（０．５当量、１．２６ｍｍｏｌ）とを添加した。反応混合物を３０分間にわたり攪拌し、ＤＭＴＭＭ７００ｍｇを添加した。４８時間後、反応混合物を蒸発させ、固体をＴＦＡ８ｍＬに溶解させた。３時間後、反応混合物を蒸発させ、次いで、水中で１日、２Ｎ  ＨＣｌ中で２日透析した。凍結乾燥後、２６０ｍｇの白色固体を得た。
【００５９】
1H-NMR(400MHz, CDCl3)(図1): 6.9ppm (s br, 2H, 芳香族H), 6.7ppm (s br, 2H, 芳香族H), 3.8ppm (s, 4H, TyrCONCH2CH2), 3.68ppm (br, 1H, ArCH2CH(NH2)COPEI), 3.1ppm (br, 2H, ArCH2CH(NH2)COPEI), 2.74ppm (s br, 4H, NHCH2CH2)
（ポリエチレンイミン−トリプトファン接合体（L-PEI-Trp）の合成）
（L-PEI10KD-Trp33%の合成）
L-PEI-Trpの合成は、L-PEI-Tyrの合成のために用いられたのと同じ手順により実現されたが、０．１ｇのLPEIおよび０．１９３ｇのＮ−Ｂｏｃ−トリプトファンにより出発した。
【００６０】
1H-NMR(400MHz, D2O): 7.4-7.1ppm (m br, 5H, 芳香族H), 3.91ppm (m br, 3H, ArCH2CH(NH2)COPEI), 3.47ppm (s br, 4H, ArCONCH2CH2およびHNCH2CH2)
（細胞培養）
ヒーラ（ヒト子宮頚部上皮腺癌、CCl-2）細胞の成育がMEM（Eurobio）中においてなされ、このＭＥＭには、２ｍＭのグルタマックス（Eurobio）、Earle’s BSS（Eurobio）、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（Eurobio）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Eurobio）、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Eurobio）、１００単位／ｍｌのペニシリン（Eurobio）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Eurobio）および１０％のFBS（Perbio）が補充されていた。
【００６１】
GL3ルシフェラーゼ（SV40要素制御下のホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ）を安定的に発現するA549（ヒト肺癌、ATCC No.CCL-185）細胞は、pGL3Lucプラスミド（Clontech）の安定なトランスフェクションの後に得られた。A549-GL3Luc細胞をRPMI-1640中で成育させ、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタマックス、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．８μｇ／ｍｌのG418（Promega）を補充した。細胞はすべて５％ＣＯ２湿潤雰囲気中３７℃に維持された。
【００６２】
（トランスフェクション実験）
トランスフェクションの１日前、２．５×１０４個の細胞を、２４ウェル組織培養プレートにおいて１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの新鮮な完全培地中に播いた。トランスフェクションの前に、siRNA／ポリマーの複合体を調製した。所望量のsiRNAを５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６または８）に希釈した。次いで、所望量のポリマー溶液（７．５ｍＭ窒素）をsiRNA溶液に添加した。得られた溶液を１０秒間にわたりボルテックスにより混合し、室温にて１０〜１５分間にわたり放置した。トランスフェクション溶液を細胞に加える前に、完全培地を除去し、１０％のＦＢＳを含む新鮮な完全培地０．５５ｍｌと置き換えた。次いで、複合体溶液５０μｌをウェル毎に加え、プレートを３７℃でインキュベートした。
【００６３】
（共トランスフェクション実験）
トランスフェクションの１日前、５×１０４個の細胞を、２４ウェル組織培養プレートにおいて１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの新鮮な完全培地中に播いた。トランスフェクションの前に、ポリマー、プラスミドおよびsiRNAとの複合体を調製した。１００ｎｇのpCMVLuc（GL2Luc二本鎖配列）および所望量のsiRNAを５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に希釈した。次いで、２μｌのL-PEI10K-Tyr19%溶液（７．５ｍＭ窒素）をプラスミドおよびsiRNA溶液に添加した。得られた溶液を１０秒間にわたりボルテックスにより混合し、室温にて１０〜１５分間にわたり放置した。細胞にトランスフェクション溶液を加える前に、完全培地を除去し、１０％ＦＢＳを含んだ新鮮な完全培地０．５５ｍｌと置き換えた。次いで、複合体溶液５０μｌをウェル毎に添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。ルシフェラーゼ遺伝子発現を２４時間のインキュベート期間後に測定した。実験は三重測定で行い、ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液中のタンパク質含量（タンパク質重量（ｍｇ））によって規格化された相対光単位（Relative Light Unit：ＲＬＵ）として表された。次いで、サイレンシング効率をGL2Luc siRNAトランスフェクト細胞およびGL3Luc siRNAトランスフェクト細胞からのルシフェラーゼ活性の比からから算出した。
【００６４】
（DNAベクターをベースとするRNAi技術によるトランスフェクション手順）
トランスフェクションの１日前、５×１０４個の細胞を、２４ウェル組織培養プレートにおいて１０％のＦＢＳを含む１ｍｌの新鮮な完全培地中に播種した。トランスフェクションの前に、ポリマーと、RNAi（siRNA、shRNA、microRNA適合低分子ヘアピン型RNA）を媒介する短鎖RNAを発現するDNAベクターとの複合体を調製した。プラスミドRNAiベクター（１μｇ）を５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に希釈した。次いで、２〜４μｌのL-PEI10K-Tyr19%溶液（７．５ｍＭ窒素）をプラスミドRNAiベクター溶液に添加した。得られた溶液を１０秒間にわたりボルテックスで混合し、室温にて１０〜１５分間にわたり放置した。細胞にトランスフェクション溶液を加える前に、完全培地を除去し、１０％ＦＢＳを含んだ新鮮な完全培地０．５５ｍｌと置き換えた。次いで、１〜５０μｌの複合体溶液をウェル毎に添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。インキュベーション１日後、新鮮な完全培地０．４ｍｌを加えた。標的遺伝子の発現のレベル（mRNAレベル)またはタンパク質産生阻害のレベル（タンパク質レベル）を２４日以上後に決定した。コントロールとして、標的遺伝子発現に対する（ミスマッチ配列を含む）非特異的活性ＲＮＡを発現するプラスミドRNAiベクターを用いた。
【００６５】
（ルシフェラーゼおよびタンパク質アッセイ）
ルシフェラーゼ遺伝子発現は、市販のキット（Promega、フランス）を用いて測定された。完全培地を除去した後、１ｍｌのＰＢＳ溶液で３回洗浄した。次いで、１×溶解バッファー１００μｌをウェル毎に加え、プレートを室温で３０分間にわたりインキュベートした。溶解液を集め、１４，０００ｇで５分間にわたり遠心分離した。ルシフェリン溶液１００μｌ注入後、ルシフェラーゼアッセイ法により溶解液２．５μｌを評価した。発光（ＲＬＵ）をルミノメーター（LB960、Berthold、フランス）により５秒間積算してモニタリングした。結果はＢＣＡアッセイ法（Pierce、フランス）を用いて、細胞タンパク質の重量（ｍｇ）当たりの１０秒間にわたり積算された光単位（ＲＬＵ）として表される。
【００６６】
（mRNAレベルの測定）
メッセンジャーRNAレベルは、QuantiGene（登録商標）BRANCHED ＤＮＡアッセイ（GenoSpectra）（全細胞溶解液を用い、標的増幅なしに実施される）により決定された。
【００６７】
４８時間のトランスフェクションの後、ヒーラ細胞を１ｍＬのＰＢＳ（Cambrex）で１回洗い、１×Genospectraの溶解バッファー０．６ｍＬ中に５０℃で３０分間にわたり溶解させた。次いで、プレートを−８０℃で少なくとも３０分間にわたり保存した。溶解液を融解し、２〜２０μｌの溶解液を捕捉プレートに加えた。溶解作用試薬１０μｌ（４８反応のため。溶解作用試薬は２５μｌのＣＥ（capture extender：捕捉増量剤）、２５μｌのＬＥ（label extender：標識増量剤）および２５μｌのＢＬ（遮断プローブ）と４２５μｌの３ｘ溶解混合物を加えることにより調製される。すべての化合物はGenospectraから入手）をプレートに加え、その容積を１ｘ溶解混合物により１００μｌとした。プレートに蓋をし、５０℃で１６時間にわたりインキュベートした。プレートを、１×洗浄バッファー（Genospectra）３００μｌで３回洗浄し、増幅作用溶液（０．１１６μｌの増幅剤を増幅剤希釈剤１１６μｌに希釈。すべてGenospectraから）１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを５０℃で１時間にわたりインキュベートした。１×洗浄バッファーで３回洗浄した後、１００μｌの標識プローブ作用試薬（標識プローブ０．１１６μｌを増幅剤希釈剤１１６μｌ中に希釈；すべてGenospectraから）を各ウェルに加え、５０℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを１ｘ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌの基質作用試薬（１１６μｌの基質中、１０％ラウリル硫酸リチウム０．３４８μｌ、すべてGenospectraから）を各ウエルに加えた。３０分のインキュベーションの後、各ウエルにおける発光を分光光度計（Berthold）により測定した。
【００６８】
（蛍光顕微鏡法）
トランスフェクションの１日前、２．５×１０４個のA549細胞を、２４ウェル組織培養プレートにおいて１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの新鮮な完全培地中に播種した。トランスフェクションの前に、siRNA／ポリマーの複合体を調製した。所望量のsiRNA−ローダミン（Rho）を５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６または８）に希釈した。次いで、所望容積のL-PEI10K-Tyr33%溶液（７．５ｍＭ窒素）をsiRNA溶液に添加した。得られた溶液を１０秒間にわたりボルテックスで混合し、室温にて１０〜１５分間にわたり放置した。細胞にトランスフェクション溶液を加える前に、完全培地を除去し、１０％ＦＢＳを含んだ新鮮な完全培地０．５５ｍｌと置き換えた。次いで、複合体溶液５０μｌをウェル毎に加え、プレートを３７℃で２４または４８時間にわたりインキュベートした。
【００６９】
観察前に、細胞を１ｍｌのPBS-BSA  １％で洗浄し、次いで、蛍光顕微鏡（ECLIPSE TE2000-S、Nikon）によって観察した。
【００７０】
（結果）
２−エチル−２−オキサゾリンモノマーのカチオン開環重合を用いて、平均分子量が１０ｋＤａである線状ポリエチレンイミン（linear polyethylenimine：L-PEI）を生じさせた。次いで、「材料と方法」に記載の手順１または２に従って、L-PEI10Kを種々の程度でチロシン残基により修飾した。L-PEI-Tyr誘導体はすべて、図１に例示されるように1H-NMRによって特徴付けられる。
【００７１】
（L-PEI-Tyr誘導体による培養細胞へのsiRNA送達）
線状ポリエチレンイミンおよびチロシン修飾線状ポリエチレンイミン（L-PEI10KTyr33%）による培養細胞への比較siRNA送達能力を蛍光siRNA（ローダミン標識siRNA、siRNA-FluoR）を用いて試験した。少量のsiRNA-FluoR（最終濃度２５および５０ｎＭ）を、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２μｌのL-PEI10KまたはL-PEI10KTyr33%（両者とも７．５ｍＭ窒素の保存溶液）と複合体形成させた。得られたトランスフェクション物を、１０％ＦＢＳを含む完全培地で培養されたA549細胞に加えた。細胞を２４ウェル組織培養プレートフォーマットで２４時間にわたりインキュベートした後に、蛍光顕微鏡によって観察した。結果を図２に示す（１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの完全細胞培養培地でインキュベートし、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２５ｎＭ（Ａ）または５０ｎＭ（Ｂ）のsiRNA−ローダミン（Rho）を２μｌのL-PEI10KまたはL-PEI10KTyr33%（７．５ｍＭ窒素）と複合体形成させた）。観察前、細胞を１ｍｌのPBS-BSA  １％で洗浄し、次いで、蛍光顕微鏡法（ECLIPSE TE2000-S、Nikon）（倍率２００）によって観察した。
【００７２】
試験された両siRNA濃度のL-PEI10K媒介の送達に関して、細胞の細胞質内には点状の蛍光は殆ど観察されなかった。L-PEI10KTyr33%によるsiRNA送達の後に、強力で点状の蛍光が細胞質のあらゆる領域で観察された。これらの結果から、未修飾のポリアミンに比してL-PEI10KTyr33%を用いると、siRNAの細胞取り込みは非常に有効であることがわかる。
【００７３】
内因性レポーター遺伝子のサイレンシングを媒介する本発明のポリマーの効率を試験するためのターゲットモデルとして、本発明者らは、GL3ルシフェラーゼ（SV40要素の制御下のホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ）を安定して発現するA549細胞を用いた。細胞は、１０％ＦＢＳを含む完全培地０．５５ｍｌ中（２４ウェルの組織培養プレートフォーマットにおける）で、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）中で２μｌのL-PEI10KTyrX%（７．５ｍＭ窒素）と複合体形成したGL3Luc siRNA（２０ｎＭ）をトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ遺伝子発現を４８時間のインキュベート期間後に測定した。実験は三重測定で行い、ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中のタンパク質含量（タンパク質の重量（ｍｇ））によって規格化された相対光単位（Relative Light Unit：ＲＬＵ）として表された。次いで、サイレンシング効率を非トランスフェクト細胞から算出した。
【００７４】
化学的に製造された明確（Elbashirらによって検証済み、２００１年）且つ従来のsiRNA（siRNAGL3Luc）と、GL3Luc mRNAと一致し、２−デオキシリボヌクレオチド（dT）の３’−オーバーハングを含む、１９個のヌクレオチドの短鎖dsRNAからなる配列特異的GL3Luc siRNAとをトランスフェクション実験に用いた。SiRNAを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、未修飾のL-PEI10Kまたは種々の程度（ポリマー１つあたり３、８、２５または３３％の窒素修飾）でチロシン残基により修飾したL-PEI10Kと複合体形成させた。得られたトランスフェクション複合体溶液を、血清を含んだ培地で成育中の細胞に加え、最終的に細胞を、２０ｎＭの濃度のsiRNAに曝露した。結果を図３に示す。トランスフェクション４８時間後、細胞溶解物のタンパク質含量によって規格化された標準的な発光アッセイによりルシフェラーゼ活性を測定することによってサイレンシング効率を決定した。未修飾のポリアミンによりトランスフェクションを行った場合、ルシフェラーゼ活性（タンパク質のＲＬＵ／ｍｇとして表される）は有意には阻害されなかった（＜２％）。ポリアミン−チロシン接合体を用いた場合、サイレンシング効率はチロシンがポリアミンにグラフトする程度に応じて増大し、２５〜３３％の修飾で平坦域に達し、ルシフェラーゼ活性は９０〜９５％阻害された。
【００７５】
（L-PEI10KまたはL-PEI10KTyr33%接合体をトランスフェクトされたGL3Luc siRNAによってA549 GL3Luc細胞により安定的に発現されたルシフェラーゼ遺伝子（pGL3）の比較サイレンシング効率）
GL3ルシフェラーゼ（SV40要素の制御下のホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ）を安定して発現するA549細胞を用いて、ポリマー媒介性siRNA送達後の選択的サイレンシングを評価した。１０％ＦＢＳを含む０．５５ｍｌの完全培地において（２４ウェル組織培養プレートフォーマット中）、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２μｌのL-PEI10KまたはL-PEI10KTyr33%（７．５ｍＭ窒素）と複合体形成したGL3Luc siRNA（１〜１００ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現を４８時間のインキュベート期間後に測定した。実験は三重測定で行い、ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中のタンパク質含量（タンパク質の重量（ｍｇ））によって規格化された相対光単位（Relative Light Unit:ＲＬＵ）として表された。次いで、サイレンシング効率を非トランスフェクト細胞から算出した。
【００７６】
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で特異的siRNA GL3LucをL-PEI10KTyr33%と複合体形成させた。細胞に５〜１００ｎＭのsiRNAをトランスフェクトした。５〜１００ｎＭのsiRNAによりトランスフェクションを行った場合、トランスフェクション４８時間後に決定されたルシフェラーゼ活性は９８％まで阻害された。結果を図４に示す。コントロールポリマーとして、未修飾のL-PEI10Kは同じ条件でルシフェラーゼ活性を１００ｎｍで１０％阻害することがわかった。しかし、このL-PEI10k濃度によりトランスフェクションを行った場合、５〜５０ｎＭのより低いsiRNA濃度を用いたところルシフェラーゼ活性は阻害されなかった。
【００７７】
（siRNA／L-PEI10KTyr複合体を用いた特異的遺伝子サイレンシング）
L-PEI10KTyr33%による同じトランスフェクション条件において、GL2Luc遺伝子（Elbashirら（２００１）によって検証済みのsiRNA）を標的にする非特異的siRNAを用いてルシフェラーゼサイレンシングの選択性を試験した。１０％ＦＢＳを含む０．５５ｍｌの完全培地（２４ウェル組織培養プレートフォーマット中）において、ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するA549-GL3Luc細胞に、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で２μｌのL-PEI10K-Tyr33%（７．５ｍＭ窒素）と複合体形成したGL3Luc siRNA（１〜２０ｎＭ）をトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現を４８時間のインキュベート期間後に測定した。実験は三重測定で行い、ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中のタンパク質含量（タンパク質重量（ｍｇ））によって規格化された相対光単位（ＲＬＵ）として表された。次いで、サイレンシング効率を非トランスフェクト細胞から算出した。結果を図５に示す。
【００７８】
この関連しない配列GL2Luc siRNAを同じ条件で細胞にトランスフェクトした場合にルシフェラーゼ活性への作用がないことにより、配列特異的なRNA干渉が裏付けられた。
【００７９】
（L-PEI10KTyr33%と複合体形成されたsiRNAの効果的な内在性遺伝子サイレンシングのトランスフェクション）
５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、２μｌのL-PEI10K-Tyr33%（７．５ｍＭ窒素）と複合体形成したGAPDH siRNA（１〜２５ｎＭ）をヒーラ細胞にトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション期間後に分枝DNAアッセイによりGAPDH mRNAレベルが測定され、１〜２５ｎＭのsiRNA濃度を用いたところ、GAPDH mRNAレベルは９０％超阻害された。結果を図６に示す。非特異的コントロールとして、無関係の配列（ラミンＡ／Ｃ）と一致するsiRNAを同じ条件でトランスフェクトした。非特異的コントロールはGAPDH mRNAレベルへの阻害作用を示さなかった。
【００８０】
（疎水性αアミノ酸または誘導体によって修飾されたカチオン性ポリマーは効果的な遺伝子サイレンシングを媒介する）
チロシン残基により修飾されたポリマーによる培養細胞へのsiRNA送達後の遺伝子サイレンシングの改善について、分子量１７ｋＤａを有するポリアリルアミン（polyallylamine：ＰＡＡ）を用いて例証する。ＰＡＡに４０％の窒素修飾程度でチロシン残基をグラフトした。５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、siRNAGL3Lucおよび１μｌのPAA17K-Tyr40%でトランスフェクション複合体を調製した。１０％ＦＢＳを含む０．５５ｍｌの完全培地において、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で２μｌのL-PEI10KTyr33%（７．５ｍＭ窒素）と複合体形成したGAPDH siRNA（１〜２５ｎＭ）をA549-GL3Luc細胞にトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション期間後に分枝DNAアッセイによりGAPDH mRNAレベルを測定した。非特異的コントロールとして、無関係の配列（ラミンＡ／Ｃ）と一致するsiRNAを同じ条件でトランスフェクトした。実験は三重測定で行い、GAPDHサイレンシング効率は非トランスフェクト細胞の内在性GAPDHレベルから算出された。結果を図７に示す。PAA17K-Tyr40%により９０％のサイレンシングが得られたが、未修飾のPAAはサイレンシングが低く、サイレンシングは約１０％と有意ではなかった。また、siRNAGL2Lucは全体的にルシフェラーゼ遺伝子をサイレンシングすることができなかったことから、PAA17K-Tyr40%により得られたサイレンシングは選択的であることが裏付けられた。
【００８１】
線状または分枝のポリエチレンイミン、ポリアリルアミンまたポリ−Ｌ−リジンなどの多数のポリマーは、種々の疎水性αアミノ酸または誘導体（例えば、チロシン、トリプトファン、またはフェニルアラニン誘導体である３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（dihydroxy-L-phenylalanine：ＤＯＰＡ））で化学的に修飾された。GL3ルシフェラーゼを安定して発現するA549細胞のトランスフェクション後に、５または２０ｎＭのsiRNAを用いて、これらのポリマー接合体のサイレンシング効率を試験した。結果を以下の表１に示す。
【００８２】
【表１Ｃ】
0005802389.tif 000004
【００８３】
各接合体の分子量は、ポリアミンの平均分子量および芳香族α−アミノ酸残基による修飾の割合（百分率）から算出された。ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するA549-GL3Luc細胞を用いて、サイレンシング効率を決定した。１０％ＦＢＳを含む０．５５ｍｌの完全培地（２４ウェル組織培養プレートフォーマット中）において、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２μｌの接合体と複合体形成したGL3Luc siRNA（５〜２０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現を４８時間のインキュベーションの期間後に測定した。実験は三重測定で行い、ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中のタンパク質含量（タンパク質重量（ｍｇ））によって規格化された相対光単位（ＲＬＵ）として表された。次いで、サイレンシング効率を非トランスフェクト細胞から算出した。
【００８４】
試験されたポリマー接合体はいずれも、低濃度のsiRNAを用いたところ、ルシフェラーゼ遺伝子の高いサイレンシング（８０％以上）を示した。
【００８５】
高い遺伝子サイレンシング効率を得るためには、修飾程度を大きくすることが必要である。この要件は、同じポリマーの骨格を用いるが分子量が異なる場合にも確認された。結果を以下の表２に示す。
【００８６】
【表２】
0005802389.tif 000005
【００８７】
各接合体の分子量は、ポリアミンの平均分子量およびチロシン残基による修飾の割合（百分率）から算出される。ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するA549-GL3Luc細胞を用いてサイレンシング効率を決定した。１０％ＦＢＳを含む０．５５ｍｌの完全培地（２４ウェル組織培養プレートフォーマット中）において、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２μｌの接合体と複合体形成したGL3Luc siRNA（５ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現を４８時間のインキュベーションの期間後に測定した。実験は三重測定で行い、ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中のタンパク質含量（タンパク質重量（ｍｇ））によって規格化された相対光単位（ＲＬＵ）として表された。次いで、サイレンシング効率を非トランスフェクト細胞から算出した。
【００８８】
前記結果によって示されるように、２、１０または２２ｋＤａの線状ポリエチレンイミンは、チロシン残基により同じ程度（２５％）修飾された。全てのこれらのポリマー接合体は、低濃度のsiRNA（５ｎＭ）をA549-GL3Luc細胞にトランスフェクトした後にルシフェラーゼ遺伝子をサイレンシングすることができた。
【００８９】
更に詳細に解析すると、ポリアミンにグラフトされた高含量の疎水性αアミノ酸はポリマー接合体の質量（分子量）を大幅に増大させる（表１および２）。特に、疎水性αアミノ酸または誘導体が結合した後でポリアミンの最初の質量が２〜３倍増大すると、修飾されたポリマーはRNA干渉に有効であることが明らかとなった。これらの修飾されたポリマーは、カチオン性というよりはむしろ疎水性である。この分析によって、疎水性相互作用はsiRNA存在下でポリアミンの挙動全体を支配し、高い遺伝子サイレンシング効率を促進することが裏付けられる。
【００９０】
（プラスミドと、L-PEI10K-Tyrと複合体形成したsiRNAとの共トランスフェクション後の効果的な遺伝子サイレンシング）
ヒーラ細胞（５００００細胞／ウェル）に、１０％ＦＢＳを含んだ０．５５ｍｌの完全培地（２４ウェル組織培養プレートフォーマット中）において、pCMVLucプラスミド（１００ｎｇ、GL2Luc配列）と、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で２μｌのPEI10K-Tyr19%と複合体形成した、特異的GL2Luc siRNAまたはミスマッチGL3Luc siRNA（０〜５０ｎＭ）のいずれかとを共トランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現を２４時間のインキュベーションの期間後に測定した。結果を図８に示す。実験は三重測定で行い、ルシフェラーゼ活性（Ａ）は細胞溶解液中のタンパク質含量（タンパク質重量（ｍｇ））によって規格化された相対光単位（ＲＬＵ）として表された。次いで、サイレンシング効率（Ｂ）はGL2Luc siRNAトランスフェクト細胞およびGL3Luc siRNAトランスフェクト細胞からのルシフェラーゼ活性の割合から算出された。
【００９１】
１０〜５０ｎＭのsiRNA濃度を用いたところ、特異的GL2Luc siRNAはＧＬ２ルシフェラーゼ発現を９０％以上阻害した（図８）。非特異的コントロールとして、無関係の配列（GL3Luc配列）に一致するsiRNAに同じ条件で共トランスフェクトした。非特異的コントロールはルシフェラーゼ活性への阻害作用を示さなかった。この実験から、L-PEI10K-Tyr接合体は導入遺伝子をコードするプラスミドと特異的且つ活性siRNAとを同時に共送達することが可能であることが裏付けられる。
【００９２】
（参照）
Brummelkamp, T. R., R. Bernards, and R. Agami . 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296:550-3.
Elbashir, S. M., J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, and T. Tuschl. 2001. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411:494-8. 
Fire, A., S. Xu, M. K. Montgomery, S. A. Kostas, S. E. Driver, and CC. Mello. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391:806-11.
Miyagishi, M., and K. Taira. 2002. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotechnol . 20:497-500.
Silva, J. M., M. Z. Li, K. Chang, W. Ge, M. C. Golding, R.J. Rickles, D. Siolas, G. Hu, P.J. Paddison, M. R. Schlabach, N. Sheth, J. Bradshaw, J. Burchard, A. Kulkarni, G. Cavet, R. Sachidanandam, W. R. McCombie, M. A. Cleary, S.J. Elledge, and G.J. Hannon. 2005. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nat Genet. 37:1281-8.
Sui, G., C. Soohoo, B. Affar el, F. Gay, Y. Shi, W. C. Forrester, and Y. Shi. 2002. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:5515-20.
Verma, S., and F. Eckstein. 1998. Modified oligonucleotides: synthesis and strategy for users. Annu Rev Biochem. 67:99-134. 
Yu, J. Y., S. L. DeRuiter, and D. L. Turner. 2002. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:6047-52. 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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