(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコロニトリルをグリコール酸に変換するニトリラーゼ活性を有する酵素触媒の初期比活性の保持を改善するための方法であって、以下：
（ａ）発酵によってニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を生産する工程、ここで前記酵素触媒が、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、及び５７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；
（ｂ）該酵素触媒をグルタルアルデヒドで前処理する工程；
（ｃ）（ｂ）から酵素触媒を回収し、該酵素触媒をカラゲナンに固定化する工程；並びに
（ｄ）（ｃ）の得られたカラゲナン固定化酵素触媒をグルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンで架橋し、それによってグルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒を生産し、そしてここで該グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒が、同一反応条件下での非グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒と比較して、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する上での初期比活性の改善された保持を有する工程
を含む、方法。
【請求項２】
ｐＨが、グルタルアルデヒドでの前処理の間、５.０〜９.０に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）におけるグルタルアルデヒドでの前処理が、工程（ａ）によって生産された発酵ブロスにグルタルアルデヒドを約３ｇ／Ｌ（０.０２５ｇ  ＧＡ／ＯＤ550）〜約５
ｇ／Ｌ（０.０４２ｇ  ＧＡ／ＯＤ550）の範囲内の量で添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）におけるグルタルアルデヒドでの前処理が、工程（ａ）によって生産された発酵ブロスにグルタルアルデヒドを５０ｍｇ／Ｌ／ｈ〜５００ｍｇ／Ｌ／ｈの速度で添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法によって生産されたグルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒であって、少なくとも４連続バッチリサイクル反応後に、その初期比活性の少なくとも７０％を保持している、酵素触媒。
【請求項６】
グリコロニトリルをグリコール酸に変換するニトリラーゼ活性を有する固定化酵素触媒の初期比活性の保持を改善することを含む、グリコロニトリルをグリコール酸に加水分解するための改善された方法であって、以下：
（ａ）発酵によってニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を生産する工程、ここで前記酵素触媒が、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、及び５７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；
（ｂ）該酵素触媒をグルタルアルデヒドで前処理する工程；
（ｃ）（ｂ）から酵素触媒を回収し、該酵素触媒をカラゲナンに固定化する工程；
（ｄ）（ｃ）の得られたカラゲナン固定化酵素触媒をグルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンで架橋し、それによって架橋固定化酵素触媒を生産する工程；並びに
（ｅ）適した反応条件下で水溶液中のグリコロニトリルと（ｄ）の架橋固定化酵素触媒とを接触させ、それによってグリコール酸を生産する工程
を含む、方法。
【請求項７】
工程（ｅ）において生産されたグリコール酸を回収する工程（ｆ）をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
架橋固定化酵素触媒が、固定化酵素触媒１グラム乾燥細胞質量当たり少なくとも４０ｇのグリコール酸を生産後に、その初期比活性の少なくとも約７０％を保持し、そしてここで該方法が、グルタルアルデヒドで前処理されていないニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を含む架橋固定化酵素触媒でグリコール酸を生産する方法と比較して、グリコール酸生産について改善された生産性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前処理工程の後かつ回収工程の前に、重亜硫酸塩で未反応グルタルアルデヒドを不活性化する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前処理工程の後かつ回収工程の前に、重亜硫酸塩で未反応グルタルアルデヒドを不活性化する工程をさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸合成及び微生物学の分野に関係する。より詳しくは、本発明は、グリコロニトリルのグリコール酸への加水分解中の初期ニトリラーゼ活性の改善された保持を有する酵素触媒を調製するための方法であって、固定化及び架橋の前にグルタルアルデヒドで酵素触媒を前処理する工程を含む、上記方法を提供する。グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒は、非グルタルアルデヒド前処理の固定化・架橋酵素触媒と比較した場合、上述したように、改善された比活性を有し、それによってグリコロニトリルのグリコール酸への変換について、改善された全体的な触媒活性、触媒生産性及び容積生産性を有する。
【背景技術】
【０００２】
グリコール酸（ＨＯＣＨ2ＣＯＯＨ；ＣＡＳ登録番号は７９−１４−１である）は、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである。その特性のために、それは、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）の作製におけるモノマーとして、及びパーソナルケア製品における成分として、井戸修復、皮革産業、石油及びガス産業、洗濯及び繊維産業における使用を含む広範囲の消費者及び産業用途について理想的である。グリコール酸はまた、さまざまな産業（乳及び食品加工器具洗浄剤、家庭及び施設用洗浄剤、産業用洗浄剤［輸送器具、石造、プリント回路基板、ステンレス鋼ボイラー及び加工器具、冷却塔／熱交換器用］、及び金属加工［金属酸洗い、銅光沢、エッチング、電気メッキ、電気研磨用］における洗浄剤の主成分である。ポリグリコール酸が、食品及び炭酸飲料を包装するためのガスバリヤ材として有用である（即ち、高い酸素バリヤ特性を示す）ことも報告されている（特許文献１）。しかし、グリコール酸の伝統的な化学合成では、使用前に除去されなければならないかなりの量の不純物が製造される。グリコール酸を商業的に製造する新しい技術、特に高純度かつ低費用でグリコール酸を製造するものは、産業によって熱心に受入れられるであろう。
【０００３】
微生物酵素触媒は、ニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）を使用して、ニトリル（例えば、グリコロニトリル）を対応のカルボン酸（例えば、グリコール酸）へ直接加水分解し得、ここで、対応のアミドの中間体製造は存在せず（等式１）、又はニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）及びアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）酵素の組み合わせによって、ここで、ニトリルヒドラターゼ（ＮＨアーゼ）が最初にニトリルをアミドへ変換し、次いでアミドが続いてアミダーゼによって対応のカルボン酸へ変換される（等式２）：
【化１】
0005702604.tif 000002
【０００４】
触媒１ｇ乾燥細胞質量当たり１分当たり製造されるグリコール酸マイクロモルとして測定される酵素触媒比活性は、生体触媒リサイクルを伴う連続バッチ反応において１回使用した後、初期活性の３５％〜５０％減少することが実証された。これは、バッチ反応における酵素触媒の比活性、次に、全体的な酵素活性及び生産性の著しい低下を示す。グリコール酸の製造についての商業的に実行可能な酵素方法のために、酵素活性のこの低下が、扱われる必要がある。
【０００５】
酵素活性の低下の一局面は、グリコール酸製造のために酵素触媒とグリコロニトリルとを反応させる際に存在する不純物及び他の成分が原因であり得る。ホルムアルデヒド及びシアン化水素の水溶液を反応させることによってグリコロニトリルを合成する方法が、以前報告された（特許文献２、３及び４；等式３）。
【化２】
0005702604.tif 000003
【０００６】
しかし、これらの方法は、かなりの精製（例えば、蒸留精製）を必要とする水性グリコロニトリル反応生成物を典型的に生じさせ、何故ならば、反応の不純物及び／又は副生成物（過剰な反応性ホルムアルデヒドを含む）の多くは、触媒活性の抑制（即ち、減少した比活性）を含んで、グリコロニトリルのグリコール酸への酵素的変換を妨げ得るためである。特に、ホルムアルデヒドは、アルギニン、システイン、ヒスチジン及びリジン残基の側鎖並びにＮ末端アミノ酸残基由来のアミノ基と反応することによってタンパク質において望ましくない修飾を作り得ることが周知である（非特許文献１）。触媒活性の抑制は、触媒の全体的な生産性（即ち、触媒１グラム当たりの形成されるグリコール酸の総グラム）を減少させ、全体的な方法に著しいコストを付加し、このため、化学合成と比較した場合、酵素による製造が経済的に実行不可能となり得る。従って、触媒の活性を減少させる望ましくない不純物から酵素活性を保護するに役立ち得る反応条件が、必要とされる。
【０００７】
グリコロニトリル合成反応の前にホルムアルデヒドを熱処理へ供することによって高純度グリコロニトリルを製造する方法が、報告された（特許文献５及び６；等式３）。しかし、グリコロニトリルは、ホルムアルデヒド及びシアン化水素へ可逆的に解離し得る。従って、グリコロニトリルの解離によって生成されるホルムアルデヒド及びシアン化水素の両方の望ましくない効果からニトリラーゼ活性を保護する必要性が存在するままである。
【０００８】
特許文献７はまた、ニトリル化合物をα−ヒドロキシ酸へ変換する際の急速な酵素触媒不活性化に関する同様の困難を記載している。具体的には、特許文献７は、α−ヒドロキシニトリル化合物が、解離平衡に従って、対応のアルデヒドへ部分的に解離することを提供している。これらのアルデヒドは、タンパク質への結合によって短時間内に酵素を不活性化し、このため、α−ヒドロキシニトリルから高生産性と共に高濃度でα−ヒドロキシ酸又はα−ヒドロキシアミドを得ることが困難になることが報告された（第２欄、第１６〜２９行）。アルデヒドの蓄積による酵素不活性化を防止する解決法として、リン酸イオン又は次亜リン酸イオンが反応混合物に添加された。同様に、特許文献８は、アルデヒドを隔離し酵素不活性化を防止するために、亜硫酸イオン、二亜硫酸イオン、又は亜ジチオン酸イオンを使用することを記載しているが、生成され蓄積されるα−ヒドロキシ酸の濃度は、このような添加物を使用することによってさえ、大抵の商業目的について十分ではないと結論付けている。
【０００９】
さらに、特許文献９は、α−ヒドロキシ酸生成物の低い蓄積が、解離アルデヒド蓄積による短時間内の酵素不活性化に関係していることを教示している。これらの発明者は、酵素活性が、対応のアルデヒド又はケトン（非特許文献２）と共に水中でα−ヒドロキシニトリルの部分分離において生成されるシアン化水素（非特許文献３）の存在下で阻害されることを示している。これらの発明者は、その酵素活性が、反応混合物にシアン化物物質を添加することによって改善され得る微生物を使用することによってアルデヒド誘発酵素不活性化の課題を扱っている。シアン化物物質の添加は、アルデヒド及びシアン化水素へのα−ヒドロキシニトリルの解離を制限した。この作戦はシステムへ利益を提供する一方、それは、上述したように、グリコロニトリルはシアン化水素及びホルムアルデヒドへ可逆的に解離することが公知であり、両方とも酵素触媒活性に負に影響することが公知である点において、グリコロニトリルのグリコール酸への変換における酵素不活性化に関連する一局面を扱うのみである。
【００１０】
ホルムアルデヒドの存在下でグリコロニトリルをグリコール酸へ変換する際のニトリラーゼ活性を有する酵素触媒の比活性を保護するための別の方法が開発され（参照により本明細書に組み入れられる同時係属中の米国出願第ＸＸ／ＸＸＸＸＸＸ号（ＣＬ３５８４）を参照のこと）、ここで、触媒活性及び安定性の著しい改善が、反応混合物へアミン保護剤を添加することによって、又は、アミン保護剤、例えば、ＰＥＩ、ポリアリルアミン、ＰＶＯＨ／ポリビニルアミンなどから構成されているマトリクス中若しくは上にニトリラーゼ触媒を固定することによって、達成された。そのシステムにおいて、ホルムアルデヒドの存在下での触媒の比活性は改善され、しかし、触媒リサイクルを伴う連続バッチ反応における回収された触媒活性の比活性の低下に関連する問題は、全く、扱われていない。
【００１１】
特許文献１０は、グルタルアルデヒド感受性酵素（例えば、チオール酵素（例えば、ニトリラーゼ）及び酵素分子の活性部位中又は活性部位の非常に近くにＳＨ基を有する他のもの）が、グルタルアルデヒドなどのチオール反応性薬剤によって不活性化されることを開示している（第１欄、第４６〜４９行、及び第２欄、第５０〜５５行）。従って、グリコロニトリルのグリコール酸への加水分解の間、初期触媒活性の保持を改善するためにグルタルアルデヒドを使用することは、以前は、予測不可能であった。この予測不可能な利益が、本明細書において実証されている。
【００１２】
従って、グリコロニトリルのグリコール酸への加水分解の間、初期ニトリラーゼ活性の改善された保持を提供し、それによって、グリコロニトリルのグリコール酸への変換についての全体的な触媒活性、触媒生産性、及び容積生産性を改善する、方法についての必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ２００５／１０６００５  Ａ１
【特許文献２】ＵＳ２，１７５，８０５
【特許文献３】ＵＳ２，８９０，２３８
【特許文献４】ＵＳ５，１８７，３０１
【特許文献５】ＵＳ１１／３１４３８６５
【特許文献６】ＵＳ１１／３１４９０５
【特許文献７】ＵＳ５，５０８，１８１
【特許文献８】ＵＳ５，３２６，７０２
【特許文献９】ＵＳ６，０３７，１５５
【特許文献１０】ＵＳ４，２８８，５５２
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（８）：６２３５−６２４３（２００４）
【非特許文献２】Ｍｏｗｒｙ，  Ｄａｖｉｄ  Ｔ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．４２，ｐ１８９−２８３（１９４８）
【非特許文献３】Ａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４６，ｐ１１６５−１１７４（１９８２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、グリコロニトリルのグリコール酸への加水分解用初期触媒活性の改善された保持を伴うニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を調製する方法であって、固定化及び架橋の前に酵素触媒をグルタルアルデヒドで前処理する工程を含む方法を提供することによって、上述の必要性を解決する。グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒は、グルタルアルデヒド前処理無しで調製された固定化架橋酵素触媒と比較した場合、グリコロニトリルのグリコール酸への変換中、改善された比活性を有し、それによって、グリコロニトリルのグリコール酸への変換についての改善された全体的な触媒活性、触媒生産性、及び容積生産性を有する。
【００１６】
一局面において、本発明は、グリコロニトリルのグリコール酸への変換中、初期比活性の改善された保持を伴う、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を生産するための方法を提供し、該方法は、以下を含む：
（ａ）発酵によってニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を生産する工程；
（ｂ）該酵素触媒をグルタルアルデヒドで前処理する工程；
（ｃ）場合により、グルタルアルデヒド前処理後に、重亜硫酸塩で未反応グルタルアルデヒドを不活性化する工程；
（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）から酵素触媒を回収し、該酵素触媒をカラゲナンに固定化する工程；並びに
（ｅ）（ｄ）の得られたカラゲナン固定化酵素触媒をグルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンで架橋し、それによってグルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒を生産し、そしてここで該グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒が、同一反応条件下での非グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒と比較して、グリコロニトリルのグリコール酸への変換中の、初期比活性の改善された保持を有する工程。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、適した反応条件下で水溶液中のグリコロニトリル（glycolontrile）と上記（ｅ）のグルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒とを接触させ、それによってグリコール酸を生産する工程を含む。さらに、前記グリコール酸を回収する工程を含む。
【００１８】
本発明の別の局面は、前記工程ａ）〜ｅ）の方法によって生産されるグルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒に関する。さらに、ニトリラーゼ活性を有する前記グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒は、グルタルアルデヒド前処理無しの対応する酵素触媒と比較して、グリコロニトリルのグリコール酸（アンモニウム塩として）への変換用に使用される場合、有意により高いパーセンテージのその初期比活性（触媒１グラム当たり１分当たりの加水分解されるグリコロニトリルのμｍｏｌ）を保持する。
【００１９】
本発明の別の局面は、前記工程ａ）〜ｅ）の方法によって生産される、ニトリラーゼ活性を有するグルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒に関し、ここで該酵素触媒は、少なくとも４連続バッチリサイクル後に、その初期比活性の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％を保持している。
【００２０】
本発明の別の局面は、前記工程ａ）〜ｅ）の方法によって生産される、ニトリラーゼ活性を有するグルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒に関し、ここで該酵素触媒は、例えば連続撹拌タンクリアクター（ＣＳＴＲ）中、又は固定床栓流リアクター中、又は流動床若しくは半流動床リアクター中、反応を実行する場合の、グリコロニトリルからのグリコール酸の生産についての連続反応において、グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒１グラム乾燥細胞質量当たり少なくとも４０ｇのグリコール酸生産後に、その初期比活性の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％を保持している。
【００２１】
本発明のさらなる局面は、グリコロニトリルのグリコール酸への変換中の、ニトリラーゼ活性を有する固定化酵素触媒の初期比活性の保持を改善することを含む、グリコロニトリルをグリコール酸に加水分解するための改善された方法であって、該方法は、以下：
（ａ）発酵によってニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を生産する工程；
（ｂ）該酵素触媒をグルタルアルデヒドで前処理する工程；
（ｃ）場合により、グルタルアルデヒド前処理後に、重亜硫酸塩で未反応グルタルアルデヒドを不活性化する工程；
（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）から酵素触媒を回収し、該酵素触媒をカラゲナンに固定化する工程；
（ｅ）（ｄ）の得られたカラゲナン固定化酵素触媒をグルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンで架橋し、それによって架橋固定化酵素触媒を生産する工程；並びに
（ｆ）適した反応条件下で水溶液中のグリコロニトリル（glycolontrile）と（ｅ）の架橋固定化酵素触媒とを接触させ、それによってグリコール酸を生産する工程；
を含み、ここで、工程（ｆ）は、少なくとも２連続バッチリサイクルにおいて生じる。
【００２２】
さらに、本方法は、前記改善された方法によって生産されたグリコール酸を回収する工程を含み得る。
【００２３】
図面、配列表、及び生物寄託の簡単な説明
本発明は、本出願を一緒に形成する図面、配列表、生物寄託、及び詳細な説明から、より十分に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】パネルＡは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）を示す図である。触媒システイン残基を囲む保存された触媒シグネチャー配列が、灰色シェーディングで強調されている。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、及びＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づく番号付け）に下線が引かれている。
【図１Ｂ】パネルＢは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）を示す図である。触媒システイン残基を囲む保存された触媒シグネチャー配列が、灰色シェーディングで強調されている。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、及びＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づく番号付け）に下線が引かれている。
【図１Ｃ】パネルＣは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）を示す図である。触媒システイン残基を囲む保存された触媒シグネチャー配列が、灰色シェーディングで強調されている。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、及びＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づく番号付け）に下線が引かれている。
【図１Ｄ】パネルＤは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）を示す図である。触媒システイン残基を囲む保存された触媒シグネチャー配列が、灰色シェーディングで強調されている。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、及びＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づく番号付け）に下線が引かれている。
【図１Ｅ】パネルＥは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）を示す図である。触媒システイン残基を囲む保存された触媒シグネチャー配列が、灰色シェーディングで強調されている。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、及びＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づく番号付け）に下線が引かれている。
【図１Ｆ】パネルＦは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）を示す図である。触媒システイン残基を囲む保存された触媒シグネチャー配列が、灰色シェーディングで強調されている。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、及びＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づく番号付け）に下線が引かれている。
【図１Ｇ】パネルＧは、種々のニトリラーゼ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（デフォルトパラメータを使用するバージョン１．８３）を示す図である。触媒システイン残基を囲む保存された触媒シグネチャー配列が、灰色シェーディングで強調されている。触媒トライアドを表わすアミノ酸（Ｇｌｕ48、Ｌｙｓ130、及びＣｙｓ164；アミノ酸配列  配列番号４に基づく番号付け）に下線が引かれている。
【００２５】
配列表
本明細書に添付された以下の配列の説明及び配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５に記載された特許出願におけるヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列の開示を規定する規則に従うものである。配列の説明は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１−３０３０（１９８５）及びＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）に記載されたＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に従って定義される通りヌクレオチド配列文字についての１文字表記及びアミノ酸についての３文字表記を含む。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データについて使用される記号及び書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載された規則に従う。
【００２６】
配列番号１は、ニトリラーゼ酵素の必須システイン残基を包含する触媒シグネチャーモチーフのアミノ酸配列である（式１）。
【００２７】
配列番号２は、ニトリラーゼ酵素の必須システイン残基を包含する好ましい触媒シグネチャーモチーフのアミノ酸配列である（式２）。
【００２８】
配列番号３は、大腸菌中において組換え発現を促進するＴＴＧからＡＴＧへの開始コドンの変化を含むアシドボラクス・ファシリス（Acidovorax facilis）７２Ｗニトリラーゼコード配列のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号４は、アシドボラクス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼの推定アミノ酸配列である（ＡＴＣＣ５５７４６）。
【００３０】
配列番号５は、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＪＭ３ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＢＡＡ０２６８４．１）。
【００３１】
配列番号６は、ロドコッカス・ロドクロス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ｑ０３２１７）。
【００３２】
配列番号７は、ロドコッカス・ロドクロスＫ２２ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ｑ０２０６８）。
【００３３】
配列番号８は、ノカルジア（Nocardia）・エスピーＣ−１４−１ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＸ１８１８２．１）。
【００３４】
配列番号９は、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）ＲＢ５０ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿８８７６６２．１）。
【００３５】
配列番号１０は、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ６０２７５．１及びＡＡＡ１９６２７．１）。
【００３６】
配列番号１１は、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）ＰＣＣ７９４２ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿３９９８５７．１）。
【００３７】
配列番号１２は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ６３０１ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿１７１４１１．１）。
【００３８】
配列番号１３は、シネコシスティス（Synechocystis）・エスピーＰＣＣ６８０３ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿４４２６４６．１）。
【００３９】
配列番号１４は、シュードモナス・エントモフィラ（Pseudomonas entomophila）Ｌ４８ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿６０９０４８１．１）。
【００４０】
配列番号１５は、ザイモモナス・モブリス（Zymomonas moblis）ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿１６２９４２．１）。
【００４１】
配列番号１６は、バシラス（Bacillus）・エスピーＯｘＢ−１ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＢＡＡ９０４６０．１）。
【００４２】
配列番号１７は、コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＡ８２０８５．１）。
【００４３】
配列番号１８は、シネココッカス（Synechococcus)・エスピーＣＣ９６０５ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿３８１４２０．１）。
【００４４】
配列番号１９は、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆ−５ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿２６００１５．１）。
【００４５】
配列番号２０は、ノカルジア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿１１９４８０．１）。
【００４６】
配列番号２１は、アルカリゲネス・フェカリス１６５０ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＹ０６５０６．１）。
【００４７】
配列番号２２は、シュードモナス・シリンガェ・ピーブイ・シリンガェ（Pseudomonas syringae pv. syringae）Ｂ７２８ａニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＹ３５０８１．１）。
【００４８】
配列番号２３は、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）・エスピーＢＴＡｉｌニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＺＰ＿００８５９９４８．１）。
【００４９】
配列番号２４は、ロドコッカス・ロドクロスＮＣＩＭＢ１１２１６ニトリラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＡＣ８８２３７）。
【００５０】
配列番号２５は、ロドコッカス・ロドクロスＡＴＣＣ（商標）３９４８４のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２６は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｑ；Ｌｅｕ→Ｇｌｎ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号２７は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｇｌｎ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号２６）の推定アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２８は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ａ；Ｌｅｕ→Ａｌａ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号２９は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ａｌａ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号２８）の推定アミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号３０は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｃ；Ｌｅｕ→Ｃｙｓ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００５６】
配列番号３１は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｃｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３０）の推定アミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３２は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｔ；Ｌｅｕ→Ｔｈｒ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００５８】
配列番号３３は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｔｈｒ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３２）の推定アミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３４は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｇ；Ｌｅｕ→Ｇｌｙ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号３５は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｇｌｙ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３４）の推定アミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号３６は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｈ；Ｌｅｕ→Ｈｉｓ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号３７は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｈｉｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３６）の推定アミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号３８は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｋ；Ｌｅｕ→Ｌｙｓ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号３９は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｌｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号３８）の推定アミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号４０は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｎ；Ｌｅｕ→Ａｓｎ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００６６】
配列番号４１は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ａｓｎ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４０）の推定アミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号４２は、残基位置２０１で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｌ２０１Ｓ；Ｌｅｕ→Ｓｅｒ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００６８】
配列番号４３は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２０１で単一アミノ酸置換（Ｌｅｕ２０１→Ｓｅｒ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４２）の推定アミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号４４は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｆ１６８Ｋ；Ｐｈｅ→Ｌｙｓ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００７０】
配列番号４５は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｌｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４４）の推定アミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号４６は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｆ１６８Ｍ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００７２】
配列番号４７は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｍｅｔ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４６）の推定アミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号４８は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｆ１６８Ｔ；Ｐｈｅ→Ｔｈｒ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００７４】
配列番号４９は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｔｈｒ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号４８）の推定アミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号５０は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｆ１６８Ｖ；Ｐｈｅ→Ｖａｌ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００７６】
配列番号５１は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置１６８で単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｖａｌ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号５０）の推定アミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号５２は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｔ２１０Ａ；Ｔｈｒ→Ａｌａ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００７８】
配列番号５３は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２１０で単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ａｌａ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号５２）の推定アミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号５４は、残基位置１６８で単一アミノ酸置換を生じさせた（Ｔ２１０Ｃ；Ｔｈｒ→Ｃｙｓ）コドン変化を含むＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体のヌクレオチド配列である。
【００８０】
配列番号５５は、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの残基位置２１０での単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ｃｙｓ）を含む突然変異ニトリラーゼ（配列番号５４）の推定アミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号５６は、大腸菌株ＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）中において発現されたＡ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼのヌクレオチド配列である。
【００８２】
配列番号５７は、大腸菌ＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）中において発現された突然変異Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００８３】
生物寄託
以下の生物寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下に行われた：
【表１】
0005702604.tif 000004
【００８４】
本明細書において使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、ＡＴＣＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに所在のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙを指す。「国際寄託の名称」はＡＴＣＣに寄託されている培養物に対するアクセッション番号である。
【００８５】
リストされた寄託物は、表示された国際寄託機関において少なくとも三十（３０）年間保管され、それを開示する特許の付与で公衆に利用可能とされる。寄託物の利用可能性には、政府の行為によって付与された特許権の特例（derogation）において主題発明を実施するための許諾が構成要素とされることはない。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
発明の詳細な説明
本発明は、グリコロニトリルのグリコール酸への変換中の初期酵素触媒活性の改善された保持を伴うグリコロニトリルのグリコール酸への加水分解のためのニトリラーゼ活性を有する固定化架橋酵素触媒を調製するための方法であって、固定化より前にグルタルアルデヒドで酵素触媒を前処理する工程を含む方法を提供する。グルタルアルデヒド前処理固定化酵素触媒は、グリコロニトリルのグリコール酸への変換中の非グルタルアルデヒド前処理の固定化・架橋酵素触媒の初期比活性の保持と比較した場合、上述したように、初期比活性の改善された保持を有し、そのために改善された全体的な触媒活性、触媒生産性及び容積的生産性を有する。
【００８７】
定義：
本開示において、多くの用語及び略語が使用される。以下の定義が、別段の規定がない限り適用される。
【００８８】
本明細書において使用される場合、用語「含む」は、請求の範囲において言及されるような記載の特徴、整数、工程、又は構成要素の存在を意味するが、それは、１つ又はそれ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素、又はそれらの群の存在又は付加を排除しない。
【００８９】
本明細書において使用される場合、使用される本発明の成分又は反応物の量を変える用語「約」は、例えば現実世界において濃縮物を作成するための又は溶液使用のために用いた典型的な測定及び液体取り扱い手順を通して；これらの手順におけるふとした誤りを通して；その組成物を作成するか、又はその方法を実行するために使用される成分の製造、供給源、又は純度の差；などを通して、生じ得る数量の変化を指す。用語「約」はまた、特定の初期混合から生じる組成についての異なる平衡条件に起因して異なる量を包含する。用語「約」によって変えられているかどうかに関係なく、特許請求の範囲は、量の同等物を含む。一実施形態において、用語「約」は、報告される数値の１０％以内、好ましくは、報告される数値の５％以内を意味する。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「グリコロニトリル」は、「ＧＬＮ」と略され、ヒドロキシアセトニトリル、２−ヒドロキシアセトニトリル、ヒドロキシメチルニトリル、及びＣＡＳ登録番号１０７−１６−４の全ての他の同義語と同義である。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「グリコール酸」は、「ＧＬＡ」と略され、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシエタン酸、及びＣＡＳ登録番号７９−１４−１の全ての他の同義語と同義である。本方法によって製造されるグリコール酸は、プロトン化したカルボン酸及び／又は対応のアンモニウム塩の形であり得る。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「グリコール酸アンモニウム」は、「ＮＨ4ＧＬＡ」と略される。
【００９３】
本明細書において使用される場合、用語「グリコールアミド」は、アンモニアとグリコール酸との反応から誘導されるアミドであり、ＣＡＳ登録番号５９８−４２−５を有する化合物の全ての他の同義語を指す。
【００９４】
本明細書において使用される場合、用語「グリコリド」は、ＣＡＳ登録番号５０２−９７−６の化合物を指す。
【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「ホルムアルデヒド」は、「ＦＡ」と略され、ギ酸アルデヒド、メチルアルデヒド、オキソメタン、及びＣＡＳ登録番号５０−００−０の全ての他の同義語と同義である。市販のホルムアルデヒドは、いくらかのメタノールを含む（典型的に約１ｗｔ％〜約１５ｗｔ％）、単量体ホルムアルデヒド（「遊離ホルムアルデヒド」）及びホルムアルデヒドの種々のオリゴマーの混合物から典型的に構成される。
【００９６】
本明細書において使用される場合、用語「シアン化水素」は、青酸、シアン化水素酸、及びＣＡＳ登録番号２００−８２１−６の全ての他の同義語と同義である。
【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「グルタルアルデヒド」は、「ＧＡ」と略され、ペンタンジアール、１，５−ペンタンジアール、１，５−ペンタンジオン、ジグルタリックアルデヒド、グルタラール、グルタルジアルデヒド、グルタル酸ジアルデヒド、グルタリックジアルデヒド、及びＣＡＳ登録番号１１１−３０−８の全ての他の同義語と同義である。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「重亜硫酸塩」又は「重亜硫酸ナトリウム」は、亜硫酸ナトリウム塩、亜硫酸一ナトリウム塩、亜硫酸水素ナトリウム（hydrogen sodium sulfite）、亜硫酸水素ナトリウム（hydrogen sulfite sodium）、亜硫酸一ナトリウム、酸性亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム（sodium hydrogen sulfite）、亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、及びＣＡＳ登録番号７６３１−９０−５の全ての他の同義語と同義である。
【００９９】
本明細書において使用される場合、用語「回収（すること）」は、本方法によって形成される生成物の単離、精製すること、又は移すことを意味する。反応混合物から生成物を単離し、精製する方法は、当技術分野においてよく知られており、選択的沈殿、結晶化、濾過、反応性溶媒抽出、イオン交換、電気透析、重合、蒸留、熱分解、アルコール分解、カラムクロマトグラフィー、及びそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されない。一実施態様において、用語「回収（すること）」はまた、生成混合物（典型的に酵素触媒の濾別後）を別の反応に移し、１つ又はそれ以上の追加の生成物を作出することを含み得る。好ましい実施態様において、イオン交換が、グリコール酸を回収するために使用される。
【０１００】
本明細書において使用される場合、用語「酵素触媒」、「ニトリラーゼ触媒」又は「微生物細胞触媒」は、グリコロニトリルをグリコール酸及びアンモニアに変換するためのニトリラーゼ活性を特徴とする（即ち、ニトリラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む）触媒を指す。ニトリラーゼ酵素は、中間体として対応のアミドを形成させることなく、ニトリル（好ましくは、脂肪族ニトリル）を対応のカルボン酸へ直接変換する（等式１を参照のこと）。ニトリラーゼは、「触媒シグネチャー配列」又は「シグネチャー配列」と本明細書において呼ばれるシグネチャードメインを含む、当技術分野において公知のいくつかの保存されたシグネチャードメインを共有する。この領域は、必須システイン残基（例えば、配列番号４のＣｙｓ164）を含む。従って、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、触媒ドメインシグネチャー配列（配列番号１）の存在によって同定され得る。好ましい実施態様において、シグネチャー配列は配列番号２である。酵素触媒は、全微生物細胞又は透過処理微生物細胞の形態であり得る。本明細書において使用される場合、「リサイクルされる酵素触媒」は、バッチ又は連続反応において酵素触媒として再使用される酵素触媒を指す。本明細書に記載される酵素触媒を製造又は使用する方法における工程に応じて、酵素触媒は、グルタルアルデヒド前処理、固定化、及び架橋され得る。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「アシドボラクス・ファシリス」及び「Ａ．ファシリス」は交換可能に使用され、アクセッション番号５５７４６（「ＡＴＣＣ５５７４６」）を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（国際寄託機関）に寄託されたアシドボラクス・ファシリス７２Ｗを指す。グリコロニトリルをグリコール酸へ変換する際の改善されたニトリラーゼ活性を特徴とするＡ．ファシリス７２Ｗ由来の突然変異ニトリラーゼが、これまで報告されている（共有の米国特許第７，１９８，９２７号を参照のこと）。これらのＡ．ファシリス７２Ｗ由来の突然変異ニトリラーゼの例は、配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、及び５５によって与えられている。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、用語「エシェリキア・コリ（Escherichia coli）」及び「大腸菌（E. coli）」は、交換可能に使用される。組換え発現に適した大腸菌のいくつかの株が本明細書に記載され、国際寄託番号ＡＴＣＣ４７０７６を有する大腸菌ＭＧ１６５５、国際寄託番号ＡＴＣＣ５３９１１を有する大腸菌ＦＭ５、国際寄託番号ＡＴＣＣ２７３２５を有する大腸菌Ｗ３１１０、国際寄託番号ＡＴＣＣ３５６９５を有する大腸菌ＭＣ４１００、及び国際寄託番号ＡＴＣＣ１２４３５を有する大腸菌Ｗ１４８５を含むが、これらに限定されない。一実施態様において、適したエシェリキア・コリ株は、大腸菌ＦＭ５（ＡＴＣＣ５３９１１）及び大腸菌ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）を含む。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、用語「大腸菌ＳＳ１００１」又は「ＳＳ１００１」は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１７７を有するアシドボラクス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼを発現する形質転換大腸菌株を指す（米国特許第６，８７０，０３８号；参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。組換え発現された大腸菌ＳＳ１００１ニトリラーゼ（配列番号５７）は、野生型７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号４）と比べて２つの小さな配列変化を含有する。開始コドンはＧＴＧからＡＴＧへ変化して組換え発現を促進し、アーチファクトがクローニング中に導入され、結果としてＣ末端近くに単一アミノ酸変化をもたらした（Ｐｒｏ３６７［ＣＣＡ］→Ｓｅｒ［ＴＣＡ］）。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、用語「適した水性グリコロニトリル反応混合物」及び「適した水性反応混合物」は、その中においてグリコロニトリル及び酵素触媒が接触する、水及び材料（少なくとも１つのアミン保護剤を含む）を指す。適した水性反応混合物の成分は本明細書において与えられ、当業者は、本方法に適した成分変動の範囲を正しく認識する。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、用語「グリコール酸アンモニウム水溶液」、「グリコール酸アンモニウムを含む水溶液」、及び「グリコール酸アンモニウムの水溶液」は、典型的な酵素反応条件（即ち、約６〜約８のｐＨ範囲）下でのグリコロニトリルの酵素加水分解によって生成されるグリコール酸アンモニウムを含む水溶液を記載するために使用される。グリコール酸アンモニウムの水溶液は、少なくとも約０．１質量パーセント（ｗｔ％）〜約９９ｗｔ％グリコール酸アンモニウムの濃度でグリコール酸アンモニウムを含む。別の実施態様において、グリコール酸アンモニウムの水溶液は、少なくとも約１０ｗｔ％〜約７５ｗｔ％グリコール酸アンモニウムから構成される。さらなる実施態様において、グリコール酸アンモニウムの水溶液は、少なくとも約２０ｗｔ％〜約５０ｗｔ％グリコール酸アンモニウムから構成される。グリコール酸アンモニウムの水溶液のｐＨは、約２〜約１２、好ましくは５〜約１０、より好ましくは６〜約８であり得る。ｐＨは、グリコール酸アンモニウム水溶液からグリコール酸（酸又は塩の形態）を回収することに関連するプロセス工程を開始する前に、必要に応じて調整され得る。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、用語「触媒生産性」及び「酵素触媒生産性」は、酵素触媒乾燥細胞質量の１グラム当たりの製造される生成物の総量を指す。本発明において、酵素触媒はニトリラーゼ酵素（ＥＣ３．５．５．７）を含み、形成される生成物はグリコール酸及び／又はグリコール酸アンモニウムである（反応のｐＨに依存）。一般的に、グリコール酸を製造することに従がう本方法は、本質的にｐＨ中性条件下で行われて生産されるグリコール酸が主にグリコール酸の対応する塩の形態（即ち、グリコール酸アンモニウム）となる。一般的に、触媒リサイクルを伴うバッチ反応において、触媒活性は各々のリサイクル反応と共に減少する（酵素不活化）。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、用語「容積生産性」は、単位時間当たり反応混合物の体積当たりの製造されるグリコール酸のグラムとして表現される、反応におけるグリコール酸の容積生産を指す。典型的に、容積生産性は、グリコール酸グラム／Ｌ／ｈとして表現される。
【０１０８】
用語「ニトリラーゼ活性」又は「比活性」は、グリコロニトリルをグリコール酸（又は対応のグリコール酸アンモニウム）へ変換する場合のタンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞質量、又はビーズ質量（固定化触媒）当りの酵素活性を指す。ニトリラーゼ活性の比較は、乾燥細胞質量又はビーズ質量に比例して測定された。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、用語「酵素活性の１単位」又は「ニトリラーゼ活性の１単位」又は「Ｕ」は、規定温度（例えば、２５℃）で１分当たりグリコール酸生成物１μｍｏｌの製造に必要とされる酵素活性の量（ＧＬＡ  Ｕ／ｇ乾燥細胞質量又はビーズ質量）と定義される。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、用語「相対的ニトリラーゼ活性」、「改善されたニトリラーゼ活性」、及び「ニトリラーゼ活性の相対的改善」は、基準（対照）ニトリラーゼ活性の倍数（又は分数）として表現されるニトリラーゼ活性を指す。本明細書に記載されるニトリラーゼは、天然アシドボラクス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼで観察されるニトリラーゼ活性に比べてニトリラーゼ活性の有意な改善を示す。相対的ニトリラーゼ活性の「有意な改善」は、同一の反応条件下での対照のニトリラーゼ活性と比べて少なくとも１．５倍高いニトリラーゼ活性の改善である。別の実施形態において、改善は、同一の反応条件下での対照のニトリラーゼ活性と比べ少なくとも２倍高いニトリラーゼ活性である。さらなる実施形態において、改善は、同一の反応条件下での対照のニトリラーゼ活性と比べ少なくとも４倍高いニトリラーゼ活性である。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、用語「初期反応速度」は、指定反応条件下でのグリコロニトリルのグリコール酸への変換の速度の測定であり、ここで反応速度の測定は反応混合物へのグリコロニトリルの初期添加のときに開始し、ここで反応速度はある期間にわたって測定され、ここでグリコロニトリルの濃度は反応の経過の間、約５０ミリモル（ｍＭ）を上回ったままである。反応速度は単位時間当りに生産されるグリコール酸の濃度の変化として測定される（例えば、モルグリコール酸／Ｌ／分、又はｍＭグルコール酸／時）。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、用語「初期比活性の改善された保持」は、酵素触媒の１ｇ乾燥細胞質量当たり１分当たりの生産されるグリコール酸のマイクロモルとして、又は固定化架橋酵素触媒１ｇ当たり１分当たりの生産されるグリコール酸のマイクロモルとして測定される、記載の反応条件下でのグリコロニトリルのグリコール酸への変換中の、両方ともニトリラーゼ活性を有する、グルタルアルデヒド前処理・固定化・架橋酵素触媒と非グルタルアルデヒド前処理の固定化・架橋酵素触媒との比較を指し、ここで、第１又は「初期」反応において測定される比活性が、１又はそれ以上の続いての反応について、非グルタルアルデヒド前処理の固定化・架橋酵素触媒についてよりもグルタルアルデヒド前処理の固定化・架橋酵素触媒についてより高い程度で保持されている。最も注目に値する改善は、本明細書において記載されるように、触媒リサイクルを伴う１又はそれ以上の続いてのバッチ反応において測定される、初期バッチ反応直後の反応について保持される活性の量についてである。第２の注目に値する改善は、本明細書において記載されるように、連続撹拌タンクリアクター（ＣＳＴＲ）中、固定床栓流リアクター中、又は流動床若しくは半流動床中で、反応を実行する過程の間に保持される活性の量についてである。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、用語「組換え生物」、「形質転換宿主細胞」、「形質転換体」、「トランスジェニック生物」、及び「形質転換微生物宿主」は、異種又は外来ＤＮＡで形質転換されている宿主生物を指す。本発明の組換え生物は、活性ニトリラーゼ酵素をコードする外来コード配列又は遺伝子を発現する。「形質転換」は、宿主生物へのＤＮＡ断片の導入を指す。導入されたＤＮＡ断片は、宿主生物中の染色体に又は染色体外に（即ち、ベクターによって）組込まれ得る。本明細書で使用される場合、用語「形質転換カセット」は、通常はプラスミドの一部として、宿主細胞中に挿入するために便利に配置された一連の遺伝要素を含有するＤＮＡの特異的断片を指す。本明細書で使用される場合、用語「発現カセット」は、宿主における遺伝子発現の増強も可能にする、通常はプラスミドの一部として、宿主細胞中に挿入するために便利に配置された一連の遺伝要素を含有するＤＮＡの特異的断片を指す。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、用語「核酸断片」及び「核酸分子」語は、全遺伝子、コード配列、及び／又はコード配列に先行する（５’、上流）若しくはこれに続く（３’、下流）調節配列をコードし得る、ＤＮＡ分子を指す。一局面において、本核酸分子は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸分子を指す。本明細書において使用される場合、それは、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）及びこれに続く調節配列（３’非コード配列）を含む場合及び含まない場合がある。「キメラ遺伝子」は、天然において一緒には見られない調節及びコード配列を含む天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源由来である調節配列及びコード配列、又は同一の起源由来であるが、天然において見られるものと異なる様式で配置された調節配列及びコード配列を含み得る。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中におけるその天然の位置における天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入によって宿主生物中へ導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム中へ導入されている遺伝子である。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、用語「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書において使用される場合、「適した調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内、又は下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセッシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、及びステムループ構造を含み得る。
【０１１７】
「プロモーター」は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般的に、コード配列はプロモーター配列の３’に位置している。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子から誘導され得、又は、天然において見られる種々のプロモーター由来の種々の要素から構成され得、又は、合成ＤＮＡセグメントを含みさえし得る。大抵の細胞型において大抵の時間に又は大抵の環境条件下で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の化合物又は環境条件の存在下でのみ遺伝子に現させるプロモーターは、一般的に、「誘導性プロモーター」と呼ばれる。大抵の場合、調節配列の厳密な境界は完全に規定されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得る。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、用語「操作機能に連結した」は、一方の配列の機能が他方によって影響されるような、単一核酸分子における核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響を与えることが可能である（即ち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列と機能可能に連結されている。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に機能可能に連結され得る。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、用語「３’非コード配列」は、コード配列の下流に配置されたＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列（通常、真核生物に限定される）、及びｍＲＮＡプロセッシング又は遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナル（通常、真核生物に限定される）は、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことによって特徴付けられる。
【０１２０】
当業者は、所定のアミノ酸を特定するためにヌクレオチドコドンを使用することにおいて特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」を十分に知っている。従って、宿主細胞における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用が宿主細胞の好ましいコドンバイアスを反映するように遺伝子を設計することが望ましい。配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査によって、そのコドンバイアスが決定され得る。コドン最適化は当技術分野においてよく知られており、酵母（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，２４（１）：１８−２４（２００２））及び大腸菌（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（５０）：１５３９９−１５４０９（２０００））を含むがこれらに限定されない種々の系について記載されている。
【０１２１】
ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒
全てのニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）は、保存された触媒トライアド（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、及びＣｙｓ）を共有する（Ｃｈａｕｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１：１１８−１２２（２００３）；Ｐａｃｅ，Ｈ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｃ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．［ｏｎｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｆｉｌｅ］２（１）：ｒｅｖｉｅｗｓ０００１．１−０００１．９（２００１））。全ての公知のニトリラーゼは、酵素活性部位に求核性システインを有し（Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２：２０７−２１６（１９９８）；Ｐａｃｅ，Ｈ．及びＢｒｅｎｎｅｒ，Ｃ．，上記；並びにＣｈａｕｈａｎら，上記）、全てがチオール試薬による不活化に敏感である（１．０ｍＭ濃度の塩化銅、硝酸銀、酢酸水銀、又は塩化第二鉄は各々、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ酵素活性を大幅に減少させた）。システイン残基はまた、スルフィン酸へ不可逆的に酸化され得、酵素活性の低下が生じる。種々の不活化機構へのニトリラーゼ酵素の感受性にもかかわらず、固定化されたＡ．ファシリス７２Ｗ細胞は、多数のリサイクル反応後、それらのニトリラーゼ活性の多くを保持することができ、頑健である（ＵＳ６，８７０，０３８；ＵＳ７，１４８，０５１；ＵＳ７，１９８，９２７；及びＣｈａｕｈａｎら，上記）。Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ由来のニトリラーゼ触媒もまた、α−ヒドロキシニトリル（即ち、グリコロニトリル）のα−ヒドロキシカルボン酸（即ち、グリコール酸）への変換を触媒することが示された（ＵＳ６，３８３，７８６；ＵＳ６，４１６，９８０；及びＵＳ７，１９８，９２７を参照のこと）。
【０１２２】
Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼと他の細菌ニトリラーゼとの配列比較が報告された（ＵＳ６，８７０，０３８；Ｃｈａｕｈａｎら，上記）。７２Ｗニトリラーゼは、アミノ末端付近に１６アミノ酸領域（配列番号４のアミノ酸残基４０〜５５）と必須システイン残基を含有する１２アミノ酸触媒領域（配列番号４のアミノ酸残基１６０〜１７１）とを含むいくつかの保存的シグネチャードメインを有する。この必須システイン残基（配列番号４のＣｙｓ164）が、保存されたグルタミン酸（配列番号４のＧｌｕ48）及びリジン残基（配列番号４のＬｙｓ130）と共に、全てのニトリラーゼ中に見られる触媒トライアドモチーフを形成する（Ｐａｃｅ，Ｈ．及びＢｒｅｎｎｅｒ，Ｃ．，上記）。
【０１２３】
触媒トライアド残基の各々を囲む領域、特に、触媒システイン残基を囲む領域は、高度に保存されている。必須触媒システイン残基は、「触媒シグネチャーモチーフ」又は「シグネチャーモチーフ」と呼ばれる高度に保存された領域に位置する。従って、本方法は、式１によって定義される触媒シグネチャーモチーフを含む任意のニトリラーゼの酵素活性を保護するために有用である（太字は、厳密に保存されたアミノ酸残基を示し、イタリック体の残基は、最小の変動性［即ち、３又はそれ以下のアミノ酸残基の最小の変動］を示すものであり、触媒システイン残基には下線が引かれている）：
【０１２４】
式１（配列番号１）
【化３】
0005702604.tif 000005
式中、
Ｘａａ1＝Ａｌａ又はＧｌｙ；
Ｘａａ2＝Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａ；
Ｘａａ3＝Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、又はＧｌｎ；
Ｘａａ4＝Ｈｉｓ又はＡｓｎ；
Ｘａａ5＝Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、又はＡｒｇ；
Ｘａａ6＝Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＳｅｒ；
Ｘａａ7＝Ｐｒｏ又はＴｈｒ；及び
Ｘａａ8＝Ｌｅｕ又はＶａｌ。
【０１２５】
好ましい実施態様において、式１のニトリラーゼシグネチャーモチーフは、Ｘａａ1＝Ａｌａ又はＧｌｙ；Ｘａａ2＝Ｌｅｕ；Ｘａａ3＝Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、又はＧｌｎ；Ｘａａ4＝Ｈｉｓ；Ｘａａ5＝Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ又はＡｒｇ；Ｘａａ6＝Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、又はＭｅｔ；Ｘａａ7＝Ｐｒｏ；及びＸａａ8＝Ｌｅｕであり；以下によって示される触媒シグネチャーモチーフが生じる：
【化４】
0005702604.tif 000006
【０１２６】
対応の触媒シグネチャーモチーフ配列の配列及び位置を含む、ニトリラーゼの例を、表１に提供する。
【０１２７】
【表２】
0005702604.tif 000007
【０１２８】
一実施態様において、ニトリラーゼ触媒は、アシドボラクス、ロドコッカス、ノカルジア、バチルス、及びアルカリゲネスからなる群より選択される属より単離された、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む。一実施態様において、ニトリラーゼ触媒は、アシドボラクス及びロドコッカスからなる群より選択される属より単離された、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む。
【０１２９】
別の実施態様において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、アシドボラクス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）に由来するか、又は、アシドボラクス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼ（配列番号４）若しくは配列番号５１によって示されるＡ．ファシリス７２Ｗ由来酵素に実質的に類似しているポリペプチド（ニトリラーゼ活性を有する）である。
【０１３０】
一実施態様において、ニトリラーゼ触媒は、ニトリラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを発現するように形質転換された微生物宿主細胞である。一実施態様において、形質転換宿主細胞は、コマモナス・エスピー、コリネバクテリウム（Corynebacterium）・エスピー、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）・エスピー、ロドコッカス・エスピー、アゾトバクター（Azotobacter）・エスピー、シトロバクター（Citrobacter）・エスピー、エンテロバクター（Enterobacter）・エスピー、クロストリジウム（Clostridium）・エスピー、クレブシエラ（Klebsiella）・エスピー、サルモネラ（Salmonella）・エスピー、ラクトバチルス（Lactobacillus）・エスピー、アスペルギルス（Aspergillus）・エスピー、サッカロミセス（Saccharomyces）・エスピー、ヤロウイア（Yarrowia）・エスピー、ザイゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）・エスピー、ピキア（Pichia）・エスピー、クリベロミセス（Kluyveromyces）・エスピー、カンジダ（Candida）・エスピー、ハンゼヌラ（Hansenula）・エスピー、デュナリエラ（Dunaliella）・エスピー、デバリオミセス（Debaryomyces）・エスピー、ムコール（Mucor）・エスピー、トルロプシス（Torulopsis）・エスピー、メチロバクテリア（Methylobacteria）・エスピー、バシラス・エスピー、エシェリキア・エスピー、シュードモナス・エスピー、リゾビウム（Rhizobium）・エスピー、及びストレプトミセス（Streptomyces）・エスピーからなる群より選択される。好ましい実施態様において、微生物宿主細胞は、バシラス・エスピー、シュードモナス・エスピー、及びエシェリキア・エスピーからなる群より選択される。好ましい実施態様において、触媒は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドの１つ又はそれ以上を組換え発現するエシェリキア・コリ宿主細胞である。
【０１３１】
別の実施態様において、ニトリラーゼ触媒は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含み、ここで、ニトリラーゼ活性を有する該ポリペプチドは、配列番号５１に対して少なくとも６０％同一性、好ましくは配列番号５１に対して少なくとも７０％同一性、なおより好ましくは配列番号５１に対して少なくとも８０％同一性、なおより好ましくは配列番号５１に対して少なくとも９０％同一性、最も好ましくは配列番号５１に対して少なくとも９５％同一性を有する。
【０１３２】
Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ由来の触媒を含む、種々の供給源由来のニトリラーゼ活性を有するいくつかの触媒の裏付けのある実施例が、本明細書で開示される。アシドボラクス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼ酵素由来の種々の突然変異体が、当技術分野において報告された（ＵＳ特許７，１４８，０５１及びＵＳ７，１９８，９２７）。
【０１３３】
一実施態様において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、及び５７からなる群より選択される。別の実施態様において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、４、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、及び５７からなる群より選択される。別の実施態様において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、４、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、及び５７からなる群より選択される。別の実施態様において、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドは、４、２４、２５、及び５１からなる群より選択される。別の実施態様において、ニトリラーゼ触媒は、配列番号５１のポリペプチドを含む。
【０１３４】
アシドボラクス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ニトリラーゼ
Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．１）は、脂肪族又は芳香族ニトリルからカルボン酸を生産するための頑健な触媒である（ＷＯ０１／７５０７７；ＵＳ６，８７０，０３８；及びＣｈａｕｈａｎら，上記）。それはまた、α−ヒドロキシニトリル（即ち、グリコロニトリル）のα−ヒドロキシカルボン酸（即ち、グリコール酸）への変換を触媒することも示された（ＵＳ６，３８３，７８６及びＵＳ６，４１６，９８０を参照のこと）。しかし、グリコロニトリルをグリコール酸へ変換する際に改善されたニトリラーゼ活性及び／又は安定性を有するニトリラーゼ触媒は（Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼと比較して）、グリコール酸を生産するコストを削減する。従って、改善されたニトリラーゼ触媒を使用してグリコール酸を生産する方法は、グリコール酸を生産するコストを削減するために有用であり、しかし、Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼは、上記に詳述された前記改善されたニトリラーゼと同様に、本明細書における方法の目的のための酵素触媒である。
【０１３５】
酵素触媒の産業的生産
本明細書に記載される酵素触媒の商業的生産が望まれる場合、種々の培養方法が使用され得る。発酵操作は、当技術分野においてよく知られた方法である、バッチ、フェドバッチ、又は連続様式で行われ得る（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，（１９８９）；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（３）：２２７−２３４（１９９２））。
【０１３６】
古典的なバッチ培養方法は閉鎖システムであり、ここで、培地の組成物は、培養の開始時にセットされ、培養プロセスの間、人為的な変更へ供されない。従って、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物が接種され、増殖及び代謝活性が、システムに何も添加することなく生じることが許される。しかし、一般的に、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してバッチであり、しばしばｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御する試みが行われる。バッチシステムにおいて、システムの代謝産物及びバイオマス組成物は培養が終了するまで一定に変化する。バッチ培養内で、細胞は、静止遅滞期から高増殖対数期へ、最終的に静止期へ和らぎ、ここで、増殖速度は減少又は停止する。未処置の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。対数期における細胞は、最終生成物又はあるシステムにおいては中間体の製造の大半を担う。静止期又は対数期後製造は、他のシステムで得ることができる。
【０１３７】
標準バッチシステムの変形物は、フェドバッチシステムである。フェドバッチ培養方法もまた、本発明において好適であり、培養が進行すると共に基質が除々に添加されることを除き、典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、及び培地において限られた量の基質を有することが望ましい場合に、有用である。フェドバッチシステムにおける実際の基質濃度の測定は困難であり、従って、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ2など排ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ及びフェドバッチ培養方法は、一般的であり、当技術分野においてよく知られており、例は、Ｂｒｏｃｋ（上記）及びＤｅｓｈｐａｎｄｅ（上記）において確認され得る。
【０１３８】
ニトリラーゼ活性を有する本酵素触媒の商業的製造はまた、連続培養によっても達成され得る。連続的培養は開放システムであり、ここで、規定の培養培地が連続的にバイオリアクターに供給され、等量の馴化培地がプロセッシングのために同時に除去される。連続培養は、一般的に、一定の高液相密度で細胞を維持し、ここで、細胞は主に対数期増殖にある。又は、連続培養は、固定化細胞で実施され得、ここで、炭素及び栄養が連続的に添加され、有益な生成物、副産物、又は廃棄物が連続的に細胞塊から除去される。細胞固定化は、天然及び／又は合成材料から構成される広範囲の固体支持体を使用して行われ得る。
【０１３９】
連続又は半連続培養は、細胞増殖又は最終細胞濃度に影響を及ぼす１つの因子又は任意の数の因子の調節を可能にする。例えば、１つの方法は、炭素源また窒素レベルなどの制限栄養を固定速度で維持し、全ての他のパラメータを加減することを可能にする。他のシステムにおいて、培地濁度によって測定される細胞濃度が一定に保持されながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子が連続的に変更され得る。連続的システムは、定常増殖条件を維持しようとし、従って培地が除去されることによる細胞消失は、培養における細胞増殖速度に対してバランス化されなければならない。連続的培養方法のために栄養及び増殖因子を調節する方法、及び細胞形成の速度を最大限にするための技術は、工業微生物学の当技術分野においてよく知られており、さまざまな方法がＢｒｏｃｋ（上記）によって詳述されている。
【０１４０】
本発明における発酵培地は、適した炭素基質を含有しなければならない。適した基質は、グルコース及びフルクトースなどの単糖類、ラクトース又はスクロースなどの二糖類、デンプン又はセルロースなどの多糖類、又はそれらの混合物、並びにチーズホエーパーミエート、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、及び大麦モルトなどの再生可能原料からの非精製混合物を含み得るが、これらに限定されない。従って、本発明において使用される炭素源は、多種多様の炭素含有基質を包含し得、微生物の選択によってのみ限定されることが意図される。
【０１４１】
固定化前の酵素触媒のグルタルアルデヒド前処理
グルタルアルデヒドでの酵素触媒発酵培養物の処理は、培養物中の微生物を死滅させる便利な方法であり得、従って生きた組換え培養物に関連する取り扱い、貯蔵及び輸送についての封じ込め及び安全性問題を回避する。グルタルアルデヒドでの前処理、又は重亜硫酸塩処理が続くグルタルアルデヒド前処理が、懸濁液及び固定化形態の細胞中におけるニトリラーゼ活性を保存し得ることが、今回、発見された。
【０１４２】
酵素触媒のグルタルアルデヒド前処理でのニトリラーゼ活性の保存は、時間、温度、グルタルアルデヒド濃度、ｐＨ、並びに、グルタルアルデヒドと相互作用する培地中のアンモニア及び他のアミン（例えば、アミノ酸及びペプチド）等の阻害生産物の濃度によって影響される。好ましいグルタルアルデヒド前処理方法は、高密度発酵（１００〜１５０  ＯＤ550）由来の細胞を水中５〜１０ｗｔ％グルタルアルデヒドで処理し、これは好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇグルタルアルデヒド／Ｌ−ｍｉｎでの適切な混合と共に送達され、より好ましくは５０ｍｇ〜２００ｍｇグルタルアルデヒド／Ｌ−ｍｉｎでの適切な混合と共に送達され、最も好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇグルタルアルデヒド／Ｌ−ｍｉｎでの適切な混合と共に送達され、結果として約３ｇ〜約５ｇグルタルアルデヒド／Ｌ（約０．０２５ｇ〜約０．０４２ｇグルタルアルデヒド／ＯＤ550）、より好ましくは約３．６ｇ〜約５ｇグルタルアルデヒド／Ｌ（約０．０３０ｇ〜約０．０４２ｇグルタルアルデヒド／ＯＤ550）の最終濃度をもたらす。グルタルアルデヒド前処理培養物は、約１〜５時間、発酵槽中に保持され得る。次いで、重亜硫酸ナトリウムの１０ｗｔ％水溶液が、残存するグルタルアルデヒドを不活性化するために、１ｇ／Ｌで、場合により添加される。
【０１４３】
発酵ブロス又は細胞懸濁液中の酵素触媒のグルタルアルデヒド前処理について好ましいｐＨは、ｐＨ５．０〜９．０、より好ましくはｐＨ５．０〜８．０、さらにより好ましくはｐＨ５．０〜７．０、なおより好ましくはｐＨ５．０〜６．０、最も好ましくはｐＨ５．０〜５．５である。グルタルアルデヒド前処理後の残存するグルタルアルデヒド濃度は、典型的に低く、１０〜２００ｐｐｍの範囲内であり、約１ｇ／Ｌの最終濃度への重亜硫酸ナトリウムの添加によって、上述のように不活性化され得る。グルタルアルデヒド及び重亜硫酸塩前処理は、ニトリラーゼ活性に対して有意な有害効果を有さないことがわかった。グルタルアルデヒド又はグルタルアルデヒド／重亜硫酸塩前処理細胞懸濁液は、場合により５〜１０℃に冷却され、水又は適した保存緩衝液によって場合により洗浄され（細胞懸濁液又は発酵ブロスの濃縮及び再希釈による）、残存する重亜硫酸塩及び未反応のグルタルアルデヒドが除去される。
【０１４４】
グルタルアルデヒド前処理酵素触媒の固定化及び化学的架橋
酵素触媒の固定化のための方法は、広く報告されており、当業者によく知られている（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ；１９９７）。Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ触媒の固定化も、これまで報告された（ＵＳ６，８７０，０３８）。
【０１４５】
さらに、カラゲナン中における固定化及び固定化酵素触媒の引き続いてのグルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋のための方法が続き（ＵＳ６，８７０，０３８に開示される通りに、及びＵＳ６，５５１，８０４Ｂに詳細に記載される通りに；これらは、参照により本明細書に組み入れられる）、しかし、当業者は、固定化及び架橋を達成するためのバリエーションを認識し容易に適用する。前記バリエーションは本明細書において考えられており、本方法の範囲内にある。さらに、固定化及び化学的架橋のために使用される成分の量又は濃度は、酵素触媒の量及びタイプ並びに酵素触媒の発酵製造に応じて変化する。当業者は、これらの因子を認識し、固定化及び化学的架橋手順を適宜調節する。グルタルアルデヒド及びポリエチレンイミンでの架橋に関して、ＵＳ６，５５１，８０４（上記）は、アルギネート固定化細胞を化学的に架橋するための方法及び手順を記載している。前記説明は、カラゲナン固定化細胞についても同様に本明細書において適用される。
【０１４６】
ニトリラーゼ触媒を使用してのグリコロニトリルのグリコール酸への加水分解
グリコロニトリルのグリコール酸（酸及び／又は対応のアンモニウム塩の形態）への酵素的変換は、以下に記載される適した反応条件下で（即ち、あるｐＨ範囲、温度、濃度などで、水性反応混合物中において）、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒、固定化酵素触媒、又は架橋固定化酵素触媒を接触させることによって行われ得る。一実施態様において、組換え微生物細胞全体が、カラゲナン中に固定化され、架橋され、得られた酵素触媒は、グリコロニトリルのグリコール酸への変換について直接使用され、又は、固定化されていない細胞は、中空繊維膜カートリッジ若しくは限外濾過膜を使用してバルク反応混合物とは別に維持され得る。第２の実施態様において、組換え微生物細胞全体は、ポリアクリルアミドゲル中に固定化され、得られた酵素触媒は、グリコロニトリルのグリコール酸への変換について直接使用される。
【０１４７】
水性反応混合物中の酵素触媒の濃度は、酵素触媒の比活性に依存し、所望の反応速度を得るために選択される。加水分解反応において触媒として使用される微生物細胞の湿細胞質量は、典型的に、総反応体積１ｍＬ当り湿細胞０．００１グラム〜０．２５０グラム、好ましくは、１ｍＬ当り湿細胞０．００２グラム〜０．０５０グラムの範囲である。総反応体積の体積当たり記載のｗｔ％の湿細胞が、以前に記載された（上記）ように作製された固定化酵素触媒の形態で反応混合物中に存在し得、ここで、固定化酵素触媒の総質量のパーセンテージとしての湿細胞の質量は、固定化酵素触媒の作製方法から分かる。
【０１４８】
グリコロニトリル加水分解反応の温度は、反応速度及び酵素触媒活性の安定性の両方を制御するために選択される。反応の温度は、反応混合物の凝固点よりわずかに上（およそ０℃）〜約６５℃の範囲であり得、好ましい反応温度の範囲は約５℃〜約３５℃である。酵素触媒懸濁液は、蒸留水中に、又は約５．０〜約１０．０、好ましくは約５．５〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．７、最も好ましくは約６．０〜約７．７の反応の初期ｐＨを維持する緩衝水溶液中に固定化細胞を懸濁することによって、調製され得る。反応の進行とともに、反応混合物のｐＨは、対応のニトリル官能性からのカルボン酸のアンモニウム塩の形成に起因して変化し得る。反応は、ｐＨ制御なしにグリコロニトリルの変換を完了するように実行され得、又は、適した酸又は塩基が、ｐＨを維持するために反応の経過にわたって添加され得る。
【０１４９】
グリコロニトリルは、２５℃で、全ての部分において水と完全に混和性であることがわかった。基質（即ち、α−ヒドロキシニトリル）の可溶性がまた水相における溶液の温度及び／又は塩濃度（緩衝液又はグリコール酸アンモニウムとしても公知の生成物グリコール酸アンモニウム塩）に依存するような反応条件が選ばれる場合、反応混合物は、最初は２相から構成され得る：酵素触媒及び溶解α−ヒドロキシニトリルを含有する水相、及び有機相（非溶解α−ヒドロキシニトリル）。反応が進行するとともに、α−ヒドロキシニトリルは水相に溶解し、最終的に単一相の生成物混合物が得られる。反応はまた、酵素加水分解反応速度とほぼ等しい速度で反応混合物へα−ヒドロキシニトリルを添加することによって実行され得、それによって単一相の水性反応混合物を維持し、高い出発材料濃度で酵素の基質阻害という潜在的な問題を回避する。
【０１５０】
グリコール酸は、プロトン化したカルボン酸及び／又はその対応のアンモニウム塩の混合物として、生成物混合物中に存在し得（生成物混合物のｐＨに依存；グリコール酸のｐＫａは約３．８３である）、生成物混合物中に追加として存在し得る緩衝液と共にカルボン酸の塩としてさらに存在し得る。典型的に、生成されるグリコール酸は、主に、アンモニウム塩の形態である（グリコロニトリル加水分解反応のｐＨは、典型的に、約５．５〜約７．７である）。グリコール酸生成物は、プロトン化したカルボン酸として、又は、必要に応じて、カルボン酸の塩として、反応混合物から単離され得る。
【０１５１】
グリコロニトリルの完全変換時の生成物混合物中におけるグリコール酸の最終濃度は、０．００１Ｍからグリコール酸生成物の溶解度限度までの範囲であり得る。一実施態様において、グリコール酸の濃度は、約０．１０Ｍ〜約５．０Ｍの範囲である。別の実施態様において、グリコール酸の濃度は、約０．２Ｍ〜約３．０Ｍの範囲である。
【０１５２】
グリコール酸は、イオン交換、電気透析、反応性溶媒抽出、重合、熱分解、アルコール分解、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない、種々の技術を使用して、酸又は対応の塩の形態で回収され得る。
【０１５３】
さらに、量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値及び好ましい下限値のリストとして与えられる場合、これは、範囲が個別に開示されているかどうかに関係なく、任意の範囲上限又は好ましい値と任意の範囲下限又は好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示していると理解されるべきである。数値の範囲が本明細書に記載されている場合、別段の記述がない限り、範囲は、その終点、並びに範囲内の全ての整数及び分数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を定義する際に挙げられた特定の値に限定されることを意図するものではない。
【０１５４】
一般的な方法
本発明の好ましい実施態様を示すために、以下の実施例を提供する。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を示し、従ってその実施についての好ましいモードを構成すると考えられ得ることが、当業者によって正しく認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更が、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、開示される特定の実施態様において為され、同様又は類似の結果を依然として得ることができることを正しく認識すべきである。
【０１５５】
細菌培養物の維持及び増殖に適した材料及び方法は、当技術分野においてよく知られている。以下の実施例における使用に適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、又はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）に示されているように見い出し得る。酵素触媒を固定化する方法は、Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｇ．Ｆ．（上記）に見い出し得る。
【０１５６】
ゲノムＤＮＡ調製、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡのクローニング用の所望の末端を生成させるためのエンド及びエキソヌクレアーゼによるＤＮＡ修飾、ライゲーション、並びに細菌形質転換のために必要とされる手順は、当技術分野においてよく知られている。本明細書において使用される標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、Ｍａｎｉａｔｉｓ，上記；及びＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，（１９８４）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９４−１９９８）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋによって説明されている。
【０１５７】
全ての試薬及び材料は、別段特定されていない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、又はＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【０１５８】
明細書における略語は、以下の通り、測定の単位、技術、性質、又は化合物に対応する：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」又は「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」はｇ／ｍＬでの密度を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｗｔ」は質量を意味し、「ｗｔ％」は質量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「Ｏ．Ｄ．」は指定波長での光学密度を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞質量を意味し、「Ｕ」はニトリラーゼ活性の単位を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを意味する。ニトリラーゼ活性の１Ｕは、グリコロニトリル１μｍｏｌ／ｍｉｎの加水分解に相当する。
【０１５９】
分析方法
ＨＰＬＣ分析
別段の詳記がない限り、以下のＨＰＬＣ方法を使用した。反応生成混合物を以下のＨＰＬＣ方法によって分析した。反応混合物のアリコート（０．０１ｍＬ）を水１．５０ｍＬに添加し、ＨＰＬＣ（ＨＰＸ８７Ｈカラム、３０ｃｍ×７．８ｍｍ；０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4移動相；５０℃で１．０ｍＬ／分流れ；注入体積１０μＬ；ＲＩ検出器、分析時間２０分）によって分析した。Ａｌｄｒｉｃｈから購入した市販のグリコロニトリルを使用して一連の濃度でのグリコロニトリルで前記方法を較正した。
【０１６０】
定量的13Ｃ  ＮＭＲ分析
定量的13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚで操作するＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  Ｉｎｏｖａ分光計（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して得た。１０ｍｍ  ＮＭＲチューブ中に反応生成物３．０ｍＬ及びＤ2Ｏ  ０．５ｍＬを入れることによって、サンプルを調製した。13Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、典型的には、１００ｐｐｍ、１２８Ｋポイント、及び９０度パルス（５６ｄｂのトランスミッタ出力でｐｗ９０＝１０．７マイクロ秒）に配置されたトランスミッタを用いて２６ＫＨｚのスペクトル幅を使用して取得した。最も長い１３Ｃ  Ｔ１（２３秒）は、ＧＬＮニトリル炭素に関連し、総リサイクル時間を、この値の１０倍よりも大きく設定した（リサイクル遅延ｄ１＝２４０秒、取得時間ａｔ＝２．５２秒）。３６０スキャンのシグナル平均化は、２６．３時間の総実験時間を与えた。核オーバーハウザー増強（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）（ＮＯＥ）を、取得時間（ａｔ）の間にのみＷａｌｔｚ調節１Ｈデカップリングをゲートオンすることによって抑制した。
【０１６１】
実施例１
大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖの発酵
大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖの種培養物を、発酵槽の接種の前に、振盪（３００ｒｐｍ）しながら３０℃で６〜１０時間（ＯＤ550＝１〜２）、１ｍＬ当たりアンピシリン０．１ｍｇが補われたＬＢ培地５００ｍＬ中において増殖させた。大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖニトリラーゼ株の増殖は、グルコース、アンモニア、及び塩を含むミネラル培地を使用する１４−Ｌ  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｍｂｈ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）においてであり、誘導についてはラクトースを使用した。プレ滅菌発酵槽培地（７．５Ｌ）を表２に記載する。ポスト滅菌添加物は、濾過滅菌微量元素（表３）、アンピシリン０．１ｍｇ／ｍＬ、カザミノ酸２ｇ（Ｄｉｆｃｏ）／Ｌ、グルコース４ｇ／Ｌ、及び５００ｍＬ種培養物を含む。
【０１６２】
発酵セットポイントを表４に記載する。ＮＨ4ＯＨ（４０％ｗ／ｖ）及びＨ3ＰＯ4（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ制御のために使用した。酸素要求の増加に伴って最初は上昇するように設定された撹拌で、続いての通気で、溶存酸素濃度を空気飽和の２５％に制御した。ラクトース誘導を用いて使用した発酵供給プロトコルを表５に与える。グルコースが５ｇ／Ｌを超えて蓄積した場合、グルコース供給速度を減少させた。４０〜５６時間後、発酵ブロスを５〜１０℃に冷却し、細胞を遠心分離によって採取した。細胞ペーストを凍結し、−７０℃で保存した。細胞ペーストをＮＩＴ６０（１９１０  ＧＬＮ  Ｕ／ｇ  ｄｃｗ）と命名した。
【０１６３】
【表３】
0005702604.tif 000008
【０１６４】
【表４】
0005702604.tif 000009
【０１６５】
【表５】
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【０１６６】
【表６】
0005702604.tif 000011
【０１６７】
実施例２
ＧＡ／ＰＥＩ架橋カラゲナンビーズの大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＮＭ１８−１６８Ｖの固定化
迅速に撹拌しながら、カラゲナン１２ｇ（ＦＭＣ  ＧＰ９１１）を、５０℃で脱イオン化蒸留水２２８ｇへ徐々に添加し、得られた混合物を、カラゲナンが完全に溶解するまで８０℃へ加熱し、得られた溶液を撹拌しながら５２℃に冷却した。撹拌子を備えた別のビーカー中、凍結大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＮＭ１８−１６８Ｖ細胞８３．２ｇ（２５．２％  ｄｃｗ）を、約２５℃で０．３５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4  ８４．８ｇ（ｐＨ７．３）に添加し、細胞が懸濁化されるまで混合し、次いでデオキシリボヌクレアーゼＩ溶液（１２，５００Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）  １０μＬ／細胞懸濁液１００ｍＬ）を添加した。細胞懸濁液を、連続的に２３０ミクロン及び１４０ミクロンＮｕｐｒｏ  ＴＦストレーナーエレメントフィルターを通して濾過し、撹拌しながら５０℃に加熱した。撹拌しながら、５０℃の大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＮＭ１８−１６８Ｖ細胞懸濁液１６０．０ｇを、５２℃の前記カラゲナン溶液に添加し、得られた細胞／カラゲナン懸濁液を、４７℃で、電気的に加熱された２０ゲージ針を通してポンピングし、約３７〜３８℃で撹拌しながら０．２５Ｍ  ＫＨＣＯ3（ｐＨ＝７．３）中にドリップし；針を通しての流速を５〜８ｍＬ／分に設定した。得られたビーズを、撹拌しながら室温で１時間この同一の緩衝液中で硬化させ、０．２５Ｍ炭酸水素カリウム（ｐＨ７．３）中に保存した。
【０１６８】
固定化細胞／カラゲナンビーズの化学的架橋を、水中２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｍ  ７５２−０７）０．５ｇを０．２５Ｍ炭酸水素カリウム４８ｍＬ（ｐＨ７．３）中に懸濁されたビーズ２０ｇへ添加し、室温で１時間撹拌することによって行った。次いで、ビーズの懸濁液に、水中１２．５ｗｔ％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＢＡＳＦ  ＬＵＰＡＳＯＬ  ＰＳ）２．０ｇを添加し、ビーズ懸濁液をさらに１８時間室温で撹拌した。ＧＡ／ＰＥＩ架橋ビーズを、懸濁液から回収し、０．２５Ｍ炭酸水素カリウム４８ｍＬ（ｐＨ７．３）中１５分間２回撹拌し、次いで５℃で１．０Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．３）中に保存した。グリコロニトリルのグリコール酸（アンモニウム塩として）への変換用の触媒として使用する前に、ビーズを室温で０．１Ｍグリコール酸アンモニウム１８０ｍＬ（ｐＨ７．３）で１５分間２回洗浄し、１．０Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．３）保存緩衝液を除去した。得られた固定化細胞触媒をＮＩＴ６０と同定した。
【０１６９】
実施例３：
固定化前のグルタルアルデヒドでの大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖの前処理
２００Ｌ発酵を行い、大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ細胞を含有するブロスを生産し、細胞を、続いて、固定化前にインサイチュでグルタルアルデヒドで前処理した。酵母抽出物（Ａｍｂｒｅｘ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｋ2ＨＰＯ4（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4七水和物（１．０ｇ／Ｌ）及びクエン酸第二鉄アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含有する種培地０．５Ｌを２Ｌ振盪フラスコに仕込むことによって、プレ種培養物を先ず調製した。培地のｐＨを６．８へ調整し、培地をフラスコ中滅菌した。ポスト滅菌添加物は、グルコース（１０ｍＬ、５０ｗｔ％）及びアンピシリン１ｍＬ（２５ｍｇ／ｍＬ）を含んだ。プレ種培地に、２０％グリセリン中の大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖの凍結ストック培養物１ｍＬを接種し、３５℃及び３００ｒｐｍで培養した。種培養物を、ＫＨ2ＰＯ4（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（Ａｍｂｒｅｘ６９５，５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2二水和物（１０ｇ／Ｌ）、及びＮＩＴ微量元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有する培地８Ｌを含む１４Ｌ種発酵槽（Ｂｒａｕｎ）に、約２  ＯＤ550で移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ4水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ4七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ4七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ4五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）及びＮａＭｏＯ4二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有した。ポスト滅菌添加物は、グルコース溶液１２０ｇ（５０％ｗ／ｗ）及びアンピシリン１６ｍＬストック溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）を含んだ。
【０１７０】
溶存酸素（ｄＯ）濃度を、空気飽和の２５％に制御した。ｄＯを、先ずインペラー撹拌速度（４００〜１４００ｒｐｍ）によって、後で通気速度（２〜１０ｓｌｐｍ）によって制御した。ｐＨは６．８に制御した。ＮＨ4ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）及びＨ2ＳＯ4（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ制御のために使用した。温度を３５℃で制御し、上部圧力は０．５ｂａｒであった。培養物を２００Ｌ  Ｂｉｏｓｔａｔ−Ｄ  Ｂｒａｕｎ発酵槽に約６  ＯＤ550で移した。使用した培地は種発酵槽と同一であり、初期ワーキング体積は１４０Ｌであり、５０％ｗ／ｗグルコースを８ｇ／Ｌで仕込んだ。発酵をバッチ運転として始め、グルコースが消耗されると（＜０．５ｇ／Ｌ）、５０％ｗ／ｗグルコースでのフェドバッチ運転を、所定の速度（表６）で開始し、約２５  ＯＤ550で、供給を、所定の速度（表７）で２５％Ｄ−ラクトース溶液に切り替えた。
【０１７１】
温度を３５．０℃、上部圧力を０．５ｂａｒ、ｐＨを第１段階（グルコース期）で６．８及び第２段階（ラクトース期）で７．２に制御し、ＮＨ4ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）及びＨ2ＳＯ4（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ制御のために使用し、ｄＯを第１段階で空気飽和の２５％及び第２段階で１０％に制御し、ｄＯを先ず撹拌（２５０〜４５０ｒｐｍ）によって後で通気（２５〜３５ｓｌｐｍ）によって制御した。グルコース及びラクトースレベルを、供給操作の間、モニタリングし、グルコースのレベルが０．１ｇ／Ｌを超えるか又はラクトースが１ｇ／Ｌを超える場合、供給プログラムを一時的に停止したか又は減らした。実行をラクトース供給の開始の４０時間後に終わらせ、細胞を、遠心分離若しくは精密濾過によって採取したか、又はグルタルアルデヒドでの処理のために容器中に維持した。発酵によって、２８１９  ＢＺＮ  Ｕ／ｇ  ｄｃｗ（１７８８  ＧＬＮ  Ｕ／ｇ  ｄｃｗ）のニトリラーゼ比活性を有する乾燥細胞質量約８ｋｇが生産された。
【０１７２】
【表７】
0005702604.tif 000012
【０１７３】
発酵の終わりに、撹拌を１５０ｒｐｍに減速し、通気を停止し、温度を３５℃で維持した。発酵ブロスの一部を取り出し、約１８０ｋｇを発酵槽中に残した。この残りのブロスはｐＨ５．２に滴定して、２０％Ｈ2ＳＯ4（２０％ｗ／ｗ）及びＮａＯＨ（５０％ｗ／ｗ）を用いてこのｐＨで維持し、一方水性グルタルアルデヒド９．０Ｌ（ＧＡ、１０％ｗ／ｗ）を、撹拌しながら、約９０ｍＬ／分の速度で添加し；この添加速度は、５０ｍｇグルタルアルデヒド／Ｌ発酵ブロス／分と等価であり、グルタルアルデヒドの最終濃度は、約５ｇグルタルアルデヒド／Ｌ（０．０３５ｇグルタルアルデヒド／ＯＤ550）であった。ブロスへのグルタルアルデヒド添加の開始から５時間後に、ｐＨを７．０に調整し、水性重亜硫酸ナトリウム１．８Ｌ（１０％ｗ／ｗ，ｐＨ７）を撹拌しながら添加し（約１ｇ重亜硫酸ナトリウム／Ｌ  最終濃度）、ブロスをさらに１５分間撹拌した。次いで、ブロスの温度を１０℃に低下させ、撹拌を１００ｒｐｍへ低下させた。Ｄｉｓｋｓｔａｃｋ遠心分離機（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ）を使用して、ブロスを細胞懸濁液４０ｋｇに濃縮し、次いで、５０ｋｇ  ＤＩ水（２０℃）を懸濁液に添加し、混合物を遠心分離によって濃縮し、洗浄細胞懸濁液４０ｋｇを生産した。懸濁液（ＮＩＴ１８８Ａ−Ｃ２と同定）を５℃で保存し、細胞懸濁液の一部を、固定化細胞触媒の調製（実施例６）のために直接使用した。各プロセス工程中のニトリラーゼ比活性を表８に要約する。
【０１７４】
【表８】
0005702604.tif 000013
【０１７５】
実施例４
ＧＡ／ＰＥＩ架橋カラゲナンビーズ中のグルタルアルデヒド前処理大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＮＭ１８−１６８Ｖの固定化
実施例５のグルタルアルデヒド及び重亜硫酸ナトリウム処理発酵ブロスから回収された最終細胞懸濁液濃縮物を、５℃で遠心分離した。得られた細胞ペレットを、質量で５倍の量の０．３５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁し、得られた細胞懸濁液の５℃での遠心分離によって、湿った細胞ペーストが生産され、これを、実施例２に記載したように、固定化し、ＧＡ及びＰＥＩで化学的に架橋した。得られた固定化細胞触媒を、固定化ＮＩＴ１８８Ａ−Ｃ２と同定した。
【０１７６】
実施例５
グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋カラゲナン固定化大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｖ形質転換体を使用しての触媒リサイクルを伴う連続バッチ反応における生体触媒比活性の改善
典型的な手順において、グリコロニトリルのグリコール酸への変換についてのバッチ反応の二連（duplicate）のセットを、オーバーヘッド撹拌及び温度コントロールを備えた５０ｍＬジャケット付き反応容器中で実行した。Ａ．ファシリス７２Ｗニトリラーゼ突然変異体Ｆ１６８Ｖ（配列番号５１）を発現する形質転換体を５％（ｄｃｗ）含有する、ＧＡ／ＰＥＩ架橋大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−１６８Ｖ／カラゲナンビーズ８ｇ（実施例１（固定化の前にＧＡ前処理無し）又は実施例４（固定化の前にＧＡ前処理）に記載された方法を使用して調製）を、各リアクターに入れた。次いで、容器に蒸留水１４．７８ｍＬ及び水性グリコール酸アンモニウム６．０ｍＬ（４．０Ｍ、ｐＨ７．０）を添加し、反応容器を窒素でフラッシュした。混合物を２５℃で撹拌し、一方、プログラム可能なシリンジポンプを使用して、水中６０ｗｔ％グリコロニトリル１．０７ｍＬ（ＧＬＮ）（１２．０ｍｍｏｌ  ＧＬＮ、０．０８４ｍｍｏｌホルムアルデヒド；Ｆｌｕｋａ（再蒸留、０．５ｗｔ％グリコール酸で安定化））及び水酸化アンモニウム水溶液０．１５０ｍＬ（１．８７５ｗｔ％）を同時に添加し；１等価体積のＧＬＮ及び水酸化アンモニウム溶液を２時間毎に同時に添加し（ＧＬＮ溶液及び水酸化アンモニウム水溶液の各々の全８等価添加につき）、ＧＬＮの濃度を≦４００ｍＭに、ｐＨを６．５〜７．５の範囲内に維持した。４つの０．０５０ｍＬ反応サンプルを第１ＧＬＮ添加後の所定の時点で取り出し、ＨＰＬＣによって分析し、初期反応速度及び触媒比活性（μｍｏｌグリコール酸／分／ｇ  ｄｃｗ生体触媒）を測定した。反応の完了時に、ＧＬＮの１００％変換があり、＞９９％収率でグリコール酸（アンモニウム塩として）が生産された。
【０１７７】
第１反応の終わりに、水性生成混合物を触媒からデカンテーションし（窒素下で）、固定化細胞触媒（８．０ｇ）及び残りの生成混合物（約２．３ｇ）の混合物約１０．３ｇを残した。次いで、反応容器に、蒸留した脱イオン水２０．７８ｍＬを添加し、直ぐ上で記載したように水性ＧＬＮ及び水酸化アンモニウムのアリコートを添加することによって、第２反応を２５℃で行った。触媒リサイクルを伴う連続バッチ反応で回収された生体触媒の比活性を、表７に列挙する。
【０１７８】
【表９】
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【０１７９】
実施例６
グルタルアルデヒド前処理細胞を使用して調製されたグルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋カラゲナン固定化大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｖの貯蔵安定性
グルタルアルデヒド前処理細胞を使用して調製された、新たに調製のグルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋カラゲナン固定化大腸菌ＭＧ１６５５／ｐＳＷ１３８−Ｆ１６８Ｖ（実施例４に記載の通り）を、５℃で、１．０Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．３）中、３２日間保管した。使用前に、ビーズを、室温で０．１Ｍグリコール酸アンモニウム１８０ｍＬ（ｐＨ７．０）で、１５分間、２回洗浄した。５℃で４日又は３２日間保管された生体触媒を各々、実施例５に記載した手順を使用して、生体触媒リサイクルを伴う連続バッチ反応の二連のセットにおいて評価した（表８）。
【０１８０】
【表１０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【配列表】
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