(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が多発性筋炎または皮膚筋炎に特徴的な遺伝子発現パターンを示すかどうかを決定する方法であって、該方法は、
ａ）インターフェロンアルファ誘導タンパク質２７（ＩＦＩ２７）遺伝子、ならびに、インターフェロン誘発タンパク質４４様（ＩＦＩ４４Ｌ）；ラジカルＳ−アデノシルドメイン／ＣＩＧ５（ＲＳＡＤ２）；およびインターフェロン誘発タンパク質４４（ＩＦＩ４４）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子の発現について、該被験体から得た、末梢血単核細胞を含有する試験生物学的試料をアッセイする工程であって、該患者は、炎症性筋障害の少なくとも１つの臨床上の兆候または症状として筋脱力、筋委縮または筋炎症を示すヒトである、工程、
を含み、ここで、段落ａ）のアッセイにおいて決定された結果が、該ＩＦＩ２７および少なくとも１つのさらなる遺伝子がそれぞれ、１つまたは複数の対照試料よりも該試験試料において少なくとも１０倍高く発現されることを示す場合に、それは、該被験体が多発性筋炎または皮膚筋炎に特徴的な遺伝子発現プロファイルを有することを示す、方法。
【請求項２】
前記試験生物学的試料が血液、血漿または血清の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アッセイがマイクロアレイプレートを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＦＩ２７および前記さらなる遺伝子の少なくとも２個の発現が、１つまたは複数の前記対照試料と比較して前記試験試料において上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段落ａ）における前記遺伝子の全ての発現が、１つまたは複数の前記対照試料と比較して前記試験試料において上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記マイクロアレイプレートは、一連の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含み、
ａ）該オリゴヌクレオチドが、インターフェロンアルファ誘導タンパク質２７（ＩＦＩ２７）遺伝子配列と、ならびに、インターフェロン誘発タンパク質４４様（ＩＦＩ４４Ｌ）配列；ラジカルＳ−アデノシルドメイン／ＣＩＧ５（ＲＳＡＤ２）配列；インターフェロン誘発タンパク質４４（ＩＦＩ４４）配列からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成し、
ｂ）該遺伝子配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する該オリゴヌクレオチドが、その他の配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するいかなるオリゴヌクレオチドも含有しない該マイクロアレイプレート上の場所に固定化され、
ｃ）該マイクロアレイプレートが、合計で５００個以下の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む
方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、前記インターフェロンアルファ誘導タンパク質２７（ＩＦＩ２７）遺伝子配列、および少なくとも２個のさらなる遺伝子配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロプレートが段落ａ）の遺伝子の全てとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
合計で１００個以下の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロプレートが段落ａ）の遺伝子以外の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するあらゆる別々の固定化オリゴヌクレオチドも含まない、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００７年７月１２日に出願された、米国仮出願第６０／９２９，７７５号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、炎症性筋障害の診断および進行の評価に用いることができる組成物および方法の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
炎症性筋障害は、筋肉または付随する組織の炎症を伴い、脱力、筋萎縮症およびときには疼痛を主な特徴とする疾患群である。炎症性筋障害の３つの主要なサブタイプは、皮膚筋炎（ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭ）および封入体筋炎（ＩＢＭ）である。ＰＭおよびＤＭは、ＤＭが皮疹を伴うのに対し、ＰＭは伴わない以外は、臨床的に類似している。ＤＭは、内皮抗原の抗体攻撃により引き起こされる疾患として特徴付けられているが（非特許文献１）、よく特徴付けられた病原性の抗体または内皮抗原は同定されていない（非特許文献２）。
【０００４】
ＩＢＭは、しばしばＰＭとして誤って診断されるが、ＰＭまたはＤＭとは異なって、免疫抑制薬を用いる治療には典型的に応答しない。ＩＢＭの診断は、通常、封入体、すなわちアミロイドタンパク質を含有する空胞を有する筋細胞を明らかにする生検結果に基づく。ＩＢＭに対する効果的な治療は現在、存在しないが、プレドニゾンまたは静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の投与は、ときに患者に利益となり得る。
【０００５】
他の炎症性筋障害および正常な健常対照と比較した成体ＤＭにおける筋肉の遺伝子発現プロファイリングにより、インターフェロンα／β（ＩＦＮ−α／β）誘導遺伝子の上方制御が優位な遺伝子転写サインが明らかになっている（非特許文献３）。天然のＩＦＮα／β生成細胞である形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）は、ＤＭの筋肉内に存在する。インターフェロンα／β誘発タンパク質であるＭｘＡは、筋束周辺の筋繊維および毛細血管で発現される。これらの知見は、ＤＭにおける組織損傷は、自然免疫系の自己破壊的過剰活性化に由来することを示唆する（非特許文献３）。ＤＭ、ＰＭおよびＩＢＭにおける遺伝子発現パターンをさらに特徴付けることにより、炎症性筋障害を互いに、そして進行性の筋肉脱力を特徴とするその他の疾患と区別するためのよりよい方法を導くことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄａｌａｋａｓら、Ｌａｎｃｅｔ（２００３年）３６２巻（９３８８号）：９７１〜８２頁
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２００４年）１７巻（３号）：３５９〜６４頁
【非特許文献３】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２００５年）５７巻（５号）：６６４〜７８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、なかでも、ＩＦＩ２７、ＩＦＩ４４Ｌ、ＥＰＳＴＩ１、ＣＭＰＫ２／ＬＯＣ１２９６０７、ＩＦＩ４４、ＨＥＲＣ５、ＩＳＧ１５、ＭＸ１、ＳＡＭＤ９Ｌ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴ５、ＢＩＲＣ４ＢＰ、ＰＬＳＣＲ１、ＴＮＦＡＩＰ６、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＨＭＰ５、ＩＦＩＨ１、ＥＩＦ２ＡＫ２およびＧＢＰ１の遺伝子のそれぞれにより生成される血液ＲＮＡ転写産物の定量的測定に基づく。これらのいずれかの転写産物の高いレベルは、皮膚筋炎または多発性筋炎の診断のために高い正の予測価を有し、関連する炎症性筋障害である封入体筋炎（ＩＢＭ）の診断を除外する。これらの遺伝子のいずれかについての転写産物の高いレベルは、筋ジストロフィーまたは重症筋無力症のような他の筋肉状態ではみられず、これは診断上の区別のために重要であり得る。同定された遺伝子転写産物のうち、ＩＦＩ２７は、最も強い予測価および正確さを有する。この遺伝子は、ＤＭの筋肉において過活動であると以前に報告されている（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５７巻（５号）：６６４〜７８頁（２００５年））。３つの他の遺伝子（ＲＳＡＤ２、ＩＦＩ４４ＬおよびＥＰＳＴＩ１）も、単独遺伝子に基づく試験のための優れた選択肢である。
【０００８】
その第１の態様において、本発明は、被験体が多発性筋炎、皮膚筋炎または封入体筋炎に特徴的な遺伝子発現パターンを示すかどうかを、末梢血単核細胞またはあまり好ましくないが筋肉組織（例えば生検から）の試験生物学的試料を得て、この試料を以下の遺伝子（その生成産物に基づいて命名される）：インターフェロンアルファ誘導タンパク質２７；インターフェロン誘発タンパク質４４様；ラジカルＳ−アデノシルドメイン／ＣＩＧ５；インターフェロン誘発タンパク質４４；ＣＭＰＫ２（仮定上のタンパク質ＬＯＣ１２９６０７）；２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素１；上皮間質相互作用１；ＸＩＡＰ関連因子１；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド１，インターフェロン誘発テトラトリコペプチド２，インターフェロン誘発テトラトリコペプチド３，インターフェロン誘発テトラトリコペプチド５；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素様；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素３；リン脂質スクランブラーゼ１；ｈｅｃｔドメインおよびＲＬＤ５；インターフェロン誘導プロテインキナーゼＥＩＦ２ＡＫ２；ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー１０（ＴＮＦＳＦ１０）；グアニル酸結合タンパク質１；ＴＮＦ，アルファ誘発タンパク質６；不稔アルファモチーフドメイン９様；クロマチン修飾タンパク質５；ＩＳＧ１５ユビキチン様修飾因子；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素２；インターフェロン誘発ヘリカーゼＣドメイン１；ならびにミクソウイルス耐性１のうちの１つまたは複数の発現についてアッセイすることにより決定する方法を対象とする。遺伝子の名称、それぞれについての略称、ならびにＵｎｉＧｅｎｅおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける配列についてのアクセッション番号は、表４に示す。
【０００９】
本発明の目的のために、遺伝子の発現のレベルを決定するためのアッセイは、核酸（例えばｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を用いる）または遺伝子産物（例えばＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイを用いる）のいずれかに対するものであってよい。試験試料を用いて得られた結果を、当該技術において周知の基準を用いて選択された１つまたは複数の対照試料からの結果と比較する。対照試料は、例えば、炎症性筋障害もしくはその他の筋肉疾患を有さないことが分かっている個体に由来する血液、血清または血漿の試料であってよいか、あるいはそれらは全体として、そして必要に応じて被験体の年齢、性別などに関して試験試料と適合させた集団から採取してよい。対照からの結果と試験試料とからの結果を比較することにより、被験体が炎症性筋障害を有するかについてと、もし存在するならば、炎症性筋障害の特定のタイプについての結論を導き出すことができる。違いを示す遺伝子が多いほど、そして違いの大きさが大きいほど、被験体が疾患について陽性である危険性がより大きい。好ましくは、アッセイは、少なくとも３つの遺伝子、より好ましくは少なくとも５、１０または１５個の遺伝子に対して行われる。炎症性筋障害の患者においては通常、対照と比較して被験体に由来する試料中で少なくとも２倍の増大が観察されるはずであり、それよりも大きい増大（４、６、１０もしくは２０または５０倍）は、ＤＭまたはＰＭにさらに特徴付けられる。表２に列挙する最も好ましい遺伝子は、対照と比較して疾患を有する個体における発現レベルに最大の違いを示すものである。
【００１０】
上記の方法は、他の様式で用いてもよい。例えば、アッセイは、多発性筋炎、皮膚筋炎または封入体筋炎を有すると既に診断された患者に対して、疾患の進行または治療管理の効果を追跡する目的で行うことができる。さらに、上記の方法は、ＤＭ（発現レベルの増大が最も著しい）；ＰＭ（遺伝子発現レベルの増大がさらにより穏やか）およびＩＢＭ（遺伝子発現の上昇は依然としてあるが、ＤＭまたはＰＭのいずれかでみられる増大よりもずっと小さい程度である）を区別する補助として用いることができる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、上記で列挙した遺伝子の配列を認識する一連の別々の固定化されたオリゴヌクレオチドを有するマイクロアレイプレートまたはスライドを対象とする。用語「別々の」とは、オリゴヌクレオチドが異なる相補配列とハイブリッド形成することを可能にする異なる配列をオリゴヌクレオチドが有することを示す。この性質のプレートまたはスライドを製造するための多くの方法が当該技術において知られ、これらの方法のいずれも、本発明に適合可能である。プレートまたはスライドは、上記の遺伝子の少なくとも１つとストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する固定化オリゴヌクレオチドを含まなければならず、好ましくは、スライドは、異なる遺伝子と結合するいくつかの別々のオリゴヌクレオチドを含む。用語「ストリンジェントな条件」とは、固定化オリゴヌクレオチドの完全相補配列とのハイブリッド形成のみが実質的に生じることを許容する条件のことを示す。一般的に、これらのハイブリッド形成は、０．１〜０．５  ＮａＣｌを含有する略中性ｐＨの緩衝液中で、４５〜７０℃の温度にて行われる。低いストリンジェンシーの条件下でインキュベーションを行い、次いで高いストリンジェンシーの洗浄条件を用いて完全には一致しないハイブリッド形成した配列の解離を引き起こすことも可能である。マイクロアレイプレートまたはスライドに関連してこの型のインキュベーションを行うための手順は、当該技術において周知である。
【００１２】
特定の遺伝子とハイブリッド形成する固定化オリゴヌクレオチドのそれぞれの群は、マイクロアレイプレートまたはスライドの分かれた場所を占め、合計で５００個以下の別々のオリゴヌクレオチドが存在するべきである。好ましい実施形態において、異なる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する少なくとも１０個の別々のオリゴヌクレオチドが、プレート上に固定化され、１５または２０個のこのように固定化されたオリゴヌクレオチドが好ましい。経済的な理由から、存在する固定化配列の合計数は、５００個以下も好ましく、より好ましくは１００個以下、より好ましくは５０個以下である。
【００１３】
上記のマイクロアレイプレートは、本明細書で議論される試料分析方法のいずれを行うためにも用いてよい。分析を行うある様式は、細胞を溶解し、次いで、遊離されるｍＲＮＡを、検出可能な標識、例えば色素もしくはその他のマーカーと結合しかつＰＣＲプライマー中に存在するヌクレオチドの存在下で増幅することを含むだろう。よって、マイクロアレイプレートまたはスライド上に固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に直ちに用いることができる標識ｃＤＮＡの集団が得られる。ｍＲＮＡの異なる２つの集団を、それぞれの集団について異なる色素の存在下でＰＣＲを行うことにより比較することも可能である。ハイブリッド形成が終了した後に、プレートは、自動化リーダーを用いて、元の溶解物中のハイブリッド形成した配列の量を反映する、それぞれの固定化配列に結合した標識の量を決定することにより分析される。この基本的な手順の多くの変形が当該技術において記載され、本発明に適合可能である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
被験体が多発性筋炎または皮膚筋炎に特徴的な遺伝子発現パターンを示すかどうかを決定する方法であって、該方法は、
ａ）該被験体から末梢血単核細胞を含有する試験生物学的試料を得る工程、
ｂ）インターフェロンアルファ誘導タンパク質２７；インターフェロン誘発タンパク質４４様；ラジカルＳ−アデノシルドメイン／ＣＩＧ５；インターフェロン誘発タンパク質４４；仮定上のタンパク質ＬＯＣ１２９６０７；２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素１；上皮間質相互作用１；ＸＩＡＰ関連因子１；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド５；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素様；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素３；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド１；リン脂質スクランブラーゼ１；ｈｅｃｔドメインおよびＲＬＤ５；インターフェロン誘導プロテインキナーゼ；ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー１０；グアニル酸結合タンパク質１；ＴＮＦ，アルファ誘発タンパク質６；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド３；不稔アルファモチーフドメイン９様；クロマチン修飾タンパク質５；ＩＳＧ１５ユビキチン様修飾因子；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素２；インターフェロン誘発ヘリカーゼＣドメイン１；およびミクソウイルス耐性１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現について該試料をアッセイする工程、
ｃ）段落ｂ）のアッセイにおいて決定された結果から、該遺伝子の１つまたは複数が１つまたは複数の対照試料よりも該試験試料において高く発現されることが示された場合に、該被験体が多発性筋炎または皮膚筋炎に特徴的な遺伝子発現プロファイルを有すると結論付ける工程
を含む、方法。
（項目２）
前記試験生物学的試料が血液、血漿または血清の試料である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記アッセイがマイクロアレイプレートを用いて行われる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記遺伝子の少なくとも５個の発現が、１つまたは複数の前記対照試料と比較して前記試験試料において上昇する、項目１に記載のアッセイ。
（項目５）
前記遺伝子の少なくとも１０個の発現が、１つまたは複数の前記対照試料と比較して前記試験試料において上昇する、項目１に記載のアッセイ。
（項目６）
前記遺伝子の少なくとも１５個の発現が、１つまたは複数の前記対照試料と比較して前記試験試料において上昇する、項目１に記載のアッセイ。
（項目７）
段落ｂ）における前記遺伝子の全ての発現が、１つまたは複数の前記対照試料と比較して前記試験試料において上昇する、項目１に記載のアッセイ。
（項目８）
多発性筋炎または皮膚筋炎の患者が、疾患の進行または疾患の寛解に特徴的な遺伝子発現パターンを有するかどうかを決定する方法であって、該方法は、
ａ）該患者から末梢血単核細胞を含有する試験生物学的試料を得る工程、
ｂ）インターフェロンアルファ誘導タンパク質２７；インターフェロン誘発タンパク質４４様；ラジカルＳ−アデノシルドメイン／ＣＩＧ５；インターフェロン誘発タンパク質４４；仮定上のタンパク質ＬＯＣ１２９６０７；２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素１；上皮間質相互作用１；ＸＩＡＰ関連因子１；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド５；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素様；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素３；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド１；リン脂質スクランブラーゼ１；ｈｅｃｔドメインおよびＲＬＤ５；インターフェロン誘導プロテインキナーゼ；ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー１０；グアニル酸結合タンパク質１；ＴＮＦ，アルファ誘発タンパク質６；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド３；不稔アルファモチーフドメイン９様；クロマチン修飾タンパク質５；ＩＳＧ１５ユビキチン様修飾因子；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素２；インターフェロン誘発ヘリカーゼＣドメイン１；およびミクソウイルス耐性１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現について該試料をアッセイする工程、
ｃ）段落ｂ）のアッセイにおいて決定された結果から、該遺伝子の１つまたは複数がより早い時期に同じ患者から得られた１つまたは複数の試料よりも該試験試料において高く発現されることが示された場合に、該被験体が疾患の進行に特徴的な遺伝子発現プロファイルを有すると結論付けるか、または
ｄ）段落ｂ）のアッセイにおいて決定された結果から、該遺伝子の１つまたは複数がより早い時期に同じ患者から得られた１つまたは複数の試料よりも該試験試料において低く発現されることが示された場合に、該被験体が疾患の寛解に特徴的な遺伝子発現プロファイルを有すると結論付ける工程
を含む、方法。
（項目９）
前記生物学的試料が血液、血漿または血清の試料である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記アッセイがマイクロアレイプレートを用いて行われる、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記疾患が進行していると結論付けるためには、前記遺伝子の少なくとも５個の発現が前記試験試料中で上昇しなければならず、該疾患が進行していると結論付けるためには、該遺伝子の少なくとも５個の発現が該試験試料中で減少しなければならない、項目８に記載のアッセイ。
（項目１２）
前記疾患が進行していると結論付けるためには、前記遺伝子の少なくとも１０個の発現が前記試験試料中で上昇しなければならず、該疾患が進行していると結論付けるためには、該遺伝子の少なくとも１０個の発現が該試験試料中で減少しなければならない、項目８に記載のアッセイ。
（項目１３）
前記疾患が進行していると結論付けるためには、前記遺伝子の少なくとも１５個の発現が前記試験試料中で上昇しなければならず、該疾患が進行していると結論付けるためには、該遺伝子の少なくとも１５個の発現が該試験試料中で減少しなければならない、項目８に記載のアッセイ。
（項目１４）
前記疾患が進行していると結論付けるためには、段落ｂ）における前記遺伝子の全ての発現が前記試験試料中で上昇しなければならず、該疾患が進行していると結論付けるためには、段落ｂ）における該遺伝子の全ての発現が該試験試料中で減少しなければならない、項目８に記載のアッセイ。
（項目１５）
一連の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含むマイクロプレートであって、
ａ）該オリゴヌクレオチドの少なくとも５個が、インターフェロンアルファ誘導タンパク質２７；インターフェロン誘発タンパク質４４様；ラジカルＳ−アデノシルドメイン／ＣＩＧ５；インターフェロン誘発タンパク質４４；仮定上のタンパク質ＬＯＣ１２９６０７；２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素１；上皮間質相互作用１；ＸＩＡＰ関連因子１；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド５；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素様；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素３；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド１；リン脂質スクランブラーゼ１；ｈｅｃｔドメインおよびＲＬＤ５；インターフェロン誘導プロテインキナーゼ；ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー１０；グアニル酸結合タンパク質１；ＴＮＦ，アルファ誘発タンパク質６；インターフェロン誘発テトラトリコペプチド３；不稔アルファモチーフドメイン９様；クロマチン修飾タンパク質５；ＩＳＧ１５ユビキチン様修飾因子；２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素２；インターフェロン誘発ヘリカーゼＣドメイン１；およびミクソウイルス耐性１からなる群から選択される遺伝子配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成し、
ｂ）該遺伝子配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する該オリゴヌクレオチドが、その他の配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するいかなるオリゴヌクレオチドも含有しない該マイクロアレイプレート上の場所に固定化され、
ｃ）該マイクロアレイプレートが、合計で５００個以下の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む
マイクロアレイプレート。
（項目１６）
段落ｂ）の遺伝子から選択される遺伝子配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する少なくとも１０個の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む、項目１５に記載のマイクロアレイプレート。
（項目１７）
段落ｂ）の遺伝子から選択される遺伝子配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する少なくとも１５個の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む、項目１５に記載のマイクロアレイプレート。
（項目１８）
段落ｂ）の遺伝子の全てとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む、項目１５に記載のマイクロアレイプレート。
（項目１９）
合計で１００個以下の別々の固定化オリゴヌクレオチドを含む、項目１８に記載のマイクロアレイプレート。
（項目２０）
段落ｂ）の遺伝子以外の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するあらゆる別々の固定化オリゴヌクレオチドも含まない、項目１８に記載のマイクロアレイプレート。
（項目２１）
被験体の遺伝子発現プロファイルを決定する方法であって、
ａ）該被験体から末梢血単核細胞を含有する試験生物学的試料を得る工程、
ｂ）項目１５〜２０のいずれか１項のマイクロアレイプレートを用いて該試験生物学的試料中の遺伝子発現をアッセイする工程
を含む、方法。
（項目２２）
被験体における多発性筋炎または皮膚筋炎を診断する方法であって、
ａ）該被験体から血液または筋肉の試験生物学的試料を得る工程、
ｂ）該試験生物学的試料をアッセイして、ＩＦＩ４４Ｌ遺伝子および／またはＥＰＳＴＩ１の発現レベルを決定する工程、
ｃ）段落ｂ）で決定される遺伝子発現レベルが、１つまたは複数の対照生物学的試料中よりも高い場合に、該被験体が多発性筋炎または皮膚筋炎を有すると結論付ける工程
を含む、方法。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｉ．ハイブリッド形成に用いるための試料の調製
本明細書に記載される手順および当該技術において標準的な手順を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する試料を得て、溶解し、抽出して、ＲＮＡを得てよい。アッセイは、マイクロアレイプレート製造業者により記載され、全般的にＧｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５９巻（８号）：１１７０〜８２頁（２００２年）に以前に記載されたような標準的な手順を用いて行ってよい。あるいは、ｍＲＮＡは、生検の間に得られた筋肉細胞から得て、分析できる。
【００１５】
ＩＩ．マイクロアレイの材料およびアッセイ
多発性筋炎または皮膚筋炎の患者において変化したと本明細書において同定される全ての遺伝子は、実施例の部に記載されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプレート上に存在した。原則的に、同じプレートを、ＰＢＭＣまたは筋肉細胞からのｍＲＮＡの評価のために用いることができた。しかし、用いられるプレートは、数千の異なる遺伝子についての固定化オリゴヌクレオチドを含むので、この系は不便であり不必要に高価である。本明細書で議論される分析により適するプレートは、表２に列挙される遺伝子に焦点を当てることにより作製できる。よって、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプレートに似ているが、ほんの少数（例えば５〜５０または５〜１００個）の別々のハイブリッド形成部位を有するプレートを、同じアッセイ条件下で用いてよい。このことは分析を単純化し、結果の一貫性をよりよく確認するための重複を含めることを可能にする。
【００１６】
本発明に関連して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより記載されるのと同じ手順およびハードウェアを用いることができるが、他の代替も利用可能である。多くの概説が、マイクロアレイの作製およびアッセイの実行のための方法を詳細に記載している（例えばＢｏｗｔｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．２１巻：２５〜３２頁（１９９９年）；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．Ｎｅｗｓ１巻：１１〜１３頁（１９９８年）；Ｒａｍｓａｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻：４０〜４４頁（１９９８年）を参照されたい）。さらに、マイクロアレイプレート、スライドおよび関連する装置の製造（米国特許第６，９０２，７０２号；米国特許第６，５９４，４３２号；米国特許第５，６２２，８２６号）、およびアッセイの実行（米国特許第６，９０２，９００号；米国特許第６，７５９，１９７号）についての技術を記載した特許が発行されている。プレートまたはスライドを作製するための２つの主な技術は、ポリリソグラフィ法（米国特許第５，４４５，９３４号；米国特許第５，７４４，３０５号を参照されたい）またはロボットスポッティング法（米国特許第５，８０７，５２２号）を含む。その他の手順は、インクジェットプリンティングまたはキャピラリースポッティングを含み得る（例えばＷＯ９８／２９７３６またはＷＯ００／０１８５９を参照されたい）。
【００１７】
マイクロアレイプレートまたはスライド用の基材は、プラスチック、白金のような金属およびガラスを含め、オリゴヌクレオチドに結合して固定化できる任意の材料が可能である。好ましい基材は、ポリリジンのようなオリゴヌクレオチドの結合を促進する材料で被覆されたガラスである（Ｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０巻：４６７〜４７０頁（１９９５年）を参照されたい）。オリゴヌクレオチドを共有結合させるための多くのスキームが記載され、本発明に関連して用いるために適する（例えば米国特許第６，５９４，４３２号を参照されたい）。固定化オリゴヌクレオチドは、最小で２０塩基長であるべきであり、ハイブリッド形成の標的である遺伝子のセグメントに完全に対応する配列を有するべきである。
【００１８】
ＩＩＩ．さらなる方法論に関するコメント
上記の方法を用いてＰＢＭＣおよび筋肉細胞内の遺伝子発現レベルを決定することができるが、この分析を行う任意のその他の手順も、本発明に関連して用いることができる。例えば、ＰＣＲ増幅を伴うかまたは伴わないＤＮＡブロッティング技術は、遺伝子のレベルを定量するために用いてよい。ウェスタンブロットまたはイムノアッセイを用いて、遺伝子産物を定量してよく、酵素ベースのアッセイを用いてよい場合もある。発現のレベルは、免疫蛍光技術またはプロモーターに基づくレポーターアッセイにより評価することもできる。手順に必須の要素は、定量をどのように行うかではなく、むしろ、調査される特定の遺伝子と、これらの遺伝子がＰＭ、ＤＭまたはＩＢＭの存在または状態に特徴的なレベルで発現されているかどうかを決定することである。
【００１９】
Ｖ．有用性に関するコメント
本明細書に記載されるアッセイは、ＰＢＭＣまたは筋肉細胞が、多発性筋炎、皮膚筋炎または封入体筋炎の存在または進行を示す遺伝子発現プロファイルを有するかどうかを評価するように設計されている。このことは、これらの疾患を研究する科学者、および診断を行うかまたは治療計画もしくは薬物が有益な効果を有するかどうかを決定しようとする臨床医にとって、明らかに大きな価値がある。
【実施例】
【００２０】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ全ゲノムマイクロアレイを用いて、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、重症筋無力症、筋ジストロフィーの５６名の被験体および健常な有志からの６５個の血液試料および１５個の筋肉試料中のおよそ３８，５００の遺伝子の発現を測定した。さらに、疾患の活動性が異なる様々な時期の同じ個体からの９対の血液試料を比較した。生命情報科学の技術を用いて、診断カテゴリーのうちで、そして疾患の活動性に関連して著しく異なる遺伝子発現を示す遺伝子を同定した。マイクロアレイデータは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて確認した。
【００２１】
活動性皮膚筋炎および多発性筋炎のほとんどの患者は、封入体筋炎の患者とは異なり、血液中で１型インターフェロンα／β誘導遺伝子が著しく高く上方制御されていることが見出された。さらに、これらの遺伝子の上方制御は、皮膚筋炎および多発性筋炎における疾患の活動性と相関し、疾患が治療により管理されているときは下方制御が生じる。
【００２２】
材料および方法
研究の対象
６５回のマイクロアレイ実験を、３６名が炎症性筋障害を有する（１２名がＤＭ、１１名がＰＭおよび１３名がＩＢＭ）合計で５６名の元々登録されていた被験体からの血液試料に対して行った。さらなる対照群のために、我々は、非炎症性自己免疫性筋障害である重症筋無力症の患者５名、遺伝子的に決定された筋障害の患者３名（２型筋緊張性ジストロフィー２名およびミトコンドリア筋症１名）、ならびに１２名の健常被験体有志について研究した。ＤＭの患者６名およびＰＭの患者２名は、一方は疾患が活動性のとき、他方は疾患が改善中の２回の異なる時点で行ったマイクロアレイ実験のための第２の血液試料を提供した。不応性ＤＭの１名の患者は、ともに疾患が活動性のときの異なる時点での２つの試料を提供した。全ての患者は、ＤＭまたはＰＭが確定的またはほぼ確定的（Ｈｏｏｇｅｎｄｉｊｋら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１４巻（５号）：３３７〜４５頁（２００４年））、およびＩＢＭが確定的またはほぼ確定的（Ｇｒｉｇｇｓら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３８巻（５号）：７０５〜１３頁（１９９５年））との調査基準を満たしていた。全身性エリテマトーデスの患者は除外した。ＤＭ（平均年齢４７歳）およびＰＭ（平均年齢５４歳）の患者の臨床的特徴を表１に概説する。ＤＭの２名およびＰＭの４名の６名の患者は、間質性肺疾患であった。これらのうち、ＤＭの２名およびＰＭの１名の患者は、抗ヒスチジルトランスファーＲＮＡ（抗Ｊｏ−１）抗体をさらに有した。５名の男性および７名の女性であるＩＢＭの患者は、平均年齢６９歳であり、免疫調節薬の投与を受けている者はいなかった。採用時に健常な有志は、過去６カ月間にいずれの重篤な病気もなく、過去６カ月間にいずれの新しい投薬も開始せず、過去２カ月間に重篤な風邪、流感またはその他の感染がなかった。有志は、５名の男性および７名の女性からなり、平均年齢４６歳（３０〜６２歳の範囲）であった。内部調査委員会が研究を承認した。書面のインフォームドコンセントを、全ての参加する患者および健常有志から得た。
【００２３】
疾患の活動性の評価
我々は、ＤＭおよびＰＭの患者を、活動性疾患の者（ＤＭＡ；ＰＭＡ）と改善中の疾患の者（ＤＭＩ；ＰＭＩ）とに分類した。以下の４つのうち３つを有する患者を、活動性と分類した：（１）症状の増加、（２）徒手筋試験における客観的脱力の増大、（３）高い血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベル、そしてもし１回を超える測定が可能であればそのレベルの増大、ならびに（４）治療している医師が患者の免疫治療を増大させる。筋炎における活動性疾患を定義するために、同様の特徴が以前に用いられた（Ｎａｇｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７４巻（３号）：２０７〜１０頁（２０００年））。ＤＭおよびＰＭの患者を、遺伝子発現データの分析の前に、先を見越して活動性または改善中に分類した。ＭＲＣ等級分けを用いる徒手筋試験を用いて強さを評価した。３０の異なる筋肉群についての複合スコアを算出し、最大スコアは１５０であった。我々は、国際筋炎評価・臨床研究グループ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｏｓｉｔｉｓ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｇｒｏｕｐ）により提案されるように、疾患活動性のさらなる指標として、筋炎治療意図活動性指数（Ｍｙｏｓｉｔｉｓ  Ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）（ＭＩＴＡＸ）を用いた（Ｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （Ｏｘｆｏｒｄ）４３巻（１号）：４９〜５４頁（２００４年））。ＭＩＴＡＸは、筋肉、皮膚粘膜、胃腸、呼吸器および筋骨格の系統をみる多系統の評価ツールである。疾患活動性のこの指標について、良好な評価者間信頼性が報告されている。対の試料を有する９名の患者において、活発と改善中との間に８．５のＭＩＴＡＸスコアの平均的な低減がみられた。活動性のスコアは１２〜１３の範囲であり、改善中のスコアは２〜６の範囲であった。
【００２４】
ＰＢＭＣの回収、筋肉組織の回収およびＲＮＡ抽出
我々は、患者および有志からの血液１０ｍｌを、ＥＤＴＡ含有試験管（５７個の試料）、またはいくつかの場合においてＰＡＸ−Ｇｅｎｅ−ＲＮＡ試験管に直接（８個の試料）回収した。ＥＤＴＡ含有試験管について、遠心分離の後に、血漿（上層）を赤血球細胞から１ｍｍのところまで低く吸引し、５００μｌのバフィコートを、１．２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を予め充填した低温槽貯蔵試験管に、注意深く吸引して入れた。併せたバフィコートとＲＮＡｌａｔｅｒを−２０℃にて凍結した。ＲＮＡを「Ｒｉｂｏ  Ｐｕｒｅ」（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を用いてバフィコートおよびＰＡＸ−Ｇｅｎｅ  ＲＮＡ試験管から抽出した。ＲＮＡ濃度は、分光光度計を用いて測定し、ＲＮＡの質を、１μｇのＲＮＡを１％アガロースゲル上を移動させることにより評価した。７０〜１２０ｍｇの重量の筋肉生検試料のＲＮＡを、以前に記載されたようにして抽出した（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５９巻（８号）：１１７０〜８２頁（２００２年））。筋肉生検組織は、１５名の患者（５名のＤＭ、５名のＰＭおよび５名のＩＢＭ）から、活動性疾患のときに得て、これらの全ての患者は、活動性または改善中の時点で血液マイクロアレイ研究も受け、神経筋疾患を有さない５名の患者は診断生検を受けた。筋肉ＲＮＡ抽出は、ＲｉｂｏＰｕｒｅを用いて、ＰＢＭＣ  ＲＮＡ抽出と同様にして行った。１５の炎症性筋障害筋肉マイクロアレイ研究のうち、９つ（３名のＤＭ、２名のＰＭおよび４名のＩＢＭ）は、発表に用いたデータの一部分を用いて以前に行って、この研究において再分析し、６つはこれらの研究について特に新しく行った。
【００２５】
標的の調製、ハイブリッド形成およびシグナルの検出
マイクロアレイ研究を、以前に記載されたようにして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイを用いて筋肉について行った（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５９巻（８号）：１１７０〜８２頁（２００２年））。ＰＢＭＣ試料は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａプラス２．０マイクロアレイおよびＧｅｎｅＣｈｉｐオペレーティングシステム（ＧＣＯＳｖ１．３）バージョン１．３を用いて処理した。
【００２６】
データ処理
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３プラス２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐは、６３個の対照プローブセットを含む５４，６７５個のプローブセットを有する。プローブセットのアノテーションは、ＮｅｔＡｆｆｘ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、バージョン３／９／２００７から得た。発現レベルは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＧＣＲＭＡパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｏｌｄｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ１．６／ｐｏｐｕｌａｒ／ｇｃｒｍａ．ｈｔｍｌで利用可能）に備えられたＧＣ−Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＣＲＭＡ）を用いて算出した。このアルゴリズムは、実験における全てのアレイからのＧＣ含量に基づく偏りと光学的ノイズ挙動とを計上することにより、改善された発現測定を行う（Ｗｕら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１２巻（６号）：８８２〜９３頁（２００５年））。品質管理は、走査され再構築された画像を目視検査して、全体のアーチファクトを同定すること、および対照プローブセットを含む品質評価パラメータを注意深く評価することにより行った。全ての血液および筋肉のマイクロアレイデータは、この研究においてＧＣＲＭＡを用いて一緒に分析した。
【００２７】
データ分析および可視化
倍率変化の平均および９０％信頼区間（ＣＩ）を、対照群と比較してそれぞれの疾患群について算出し、それに加えてＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて２群の比較のｐ値も算出した（表２）。我々は、ｐ値＜０．０００１を必要とし、ＣＩの下限＞４．０として、著しく上方制御されている遺伝子を選択するために厳しい基準を用いた。遺伝子は、文献（１０−１２）および分子データベースの検索により、ＩＦＮ−α／β誘発と同定された。
【００２８】
群の倍率変化およびＣＩを、８個のＤＭＡ、１１個のＤＭＩ、７個のＰＭＡ、６個のＰＭＩ、１３個のＩＢＭ、５個のＭＧ、３個の遺伝的に決定された筋障害および１２個の健常血液検体を比較して算出した。さらに、対の試料の９名の患者（７名のＤＭ、２名のＰＭ）（１８個の試料）を、遺伝子サインにおける治療に関連する変化について対で分析した。血液および筋肉の発現データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットの識別に従ってマッピングされるＨＧ−Ｕ１３３ＡおよびＨＧ−Ｕ１３３Ａプラス２．０マイクロアレイチップの両方に共通する１３，３９８個の遺伝子について比較した。
【００２９】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
我々は、定量的リアルタイムＰＣＲを、Ｐｒｉｍｅｒソフトウェア（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて設計され、商業的に購入された（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）プライマーを用いて、１８個の試料（４個のＤＭＡ、５個のＤＭＩ、４個のＩＢＭおよび５個の健常有志）に対して、２つのＩＦＮ誘導遺伝子：ＩＦＩＴ１およびＭＸ１について行った。用いたプライマーは、次のとおりであった：ＭｘＡ：フォワード５’−ＣＧＧＣＴＡＡＣＧＧＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１）およびリバース５’−ＡＣＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＡＡ−３’（配列番号２）；ＩＦＩＴ１：フォワード５’−ＡＡＡＡＧＣＣＣＡＣ−ＡＴＴＴＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号３）、およびリバース５’−ＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡ−３’（配列番号４）。
【００３０】
ＲＮＡ（１μｇ）を、ｃＤＮＡに、オリゴ（ｄＴ）２０および（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）からのＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ逆転写キットを用いて逆転写した。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩに基づくリアルタイムＰＣＲを、Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において、ｃＤＮＡ鋳型（ＲＴ反応の１／１００）を用い、２５ｍｌの最終容量の反応中でＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）ｔａｑポリメラーゼおよび緩衝液、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４００ｍＭデオキシ−ＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、０．５×ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ、０．８ｍＭの各ＰＣＲプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）を用いて行った。試料を、Ｌｏｗ  Ｐｒｏｆｉｌｅ９６ウェルマイクロプレートのウェルに装填した。９５℃にて５分間の最初の変性ステップの後に、サイクル条件は、４０サイクルの変性（９５℃にて３０秒）、アニーリング（３０秒）および伸長（７２℃にて１分）であった。蛍光シグナルを、各伸長ステップの後の７９℃で５秒間のインキュベーションの直後に測定して、プライマー二量体の検出の可能性を除去した。ＰＣＲサイクルの最後に、融解曲線を作成して、ＰＣＲ産物の特異性を確認した。各運転について、ヒトＧＡＰＤＨプラスミドの系列希釈を、増幅ｃＤＮＡの量の定量的測定についての標準として用いた。全てのＰＣＲ反応は、３重で行った。比較ＣＴ法を用いて、増幅転写産物を定量した。増幅転写産物の平均倍率比を、ＤＭＩ／ＤＭＡ、ＤＭＡ／正常、ＤＭＩ／正常およびＩＢＭ／正常の比較で算出した。
【００３１】
免疫組織化学
筋肉がマイクロアレイ研究に付された１５名の患者（ＤＭ、ＰＭおよびＩＢＭの５名ずつ）の凍結筋肉切片を、ミクソウイルス耐性Ａに対する抗体（抗ＭｘＡ抗体；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ＧｅｒｍａｎｙのＯｔｔｏ  Ｈａｌｌｅｒ博士の好意）を用いて、以前に記載されたようにして染色し（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５７巻（５号）：６６４〜７８頁（２００５年））、転写研究との相関関係について調べた。
【００３２】
結果
血液インターフェロンα／β誘導遺伝子転写産物は、活動性ＤＭの患者からのＰＢＭＣ中の全ての遺伝子のうちで最も上方制御され、活動性のＰＭの患者からのＰＢＭＣ中ではより低い程度で上方制御される
活動性のＤＭ（ＤＭＡ）およびＰＭ（ＰＭＡ）についての転写産物発現レベルを健常対照と比較すると、インターフェロンα／βにより誘導される遺伝子が、測定したおよそ３８，５００個の転写産物のうちで、最も大きい倍率変化および最も高い統計学的有意性を有していた（ｐ値＜０．０００１）（表２）。２５個の最も高く上方制御された遺伝子のうち、少なくとも２１個（８４％）は、インターフェロンα／β誘導性であることが知られている。これらの遺伝子のうち、ＩＢＭ、ＭＧまたは遺伝子的に決定された筋障害の患者において著しく上方制御されたものはなかった。上方制御の大きさは、全般的にＤＭにおいてＰＭにおけるよりも高かった。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、インターフェロン誘導遺伝子Ｍｘ１およびＩＦＩＴ１が、ＤＭＡ血液中で高く上方制御されたことを示し、このことは、マイクロアレイデータからの我々の知見を支持した（表３）。０．９９の３重の測定間の高い相関関係で、３重の試料の平均変動係数は０．１５であった。マイクロアレイデータとのＲＴ−ＰＣＲデータの相関関係は優れていた（Ｍｘ１：Ｒ２＝０．９８８９；ＩＦＩＴ１：Ｒ２＝０．９９７８）。全体として、８名のＤＭＡ患者のうちの８名および７名のＰＭＡ患者のうち５名が、研究した全てのその他の５０個の血液検体のものを超えるインターフェロンα／β誘導遺伝子の過剰発現のレベルを有した。
【００３３】
インターフェロンα／β誘導遺伝子は、ＤＭおよびＰＭにおける臨床的改善とともに下方制御される
我々は、８個のＤＭＡ試料の転写産物プロファイルを１１個のＤＭＩのものと、そして別個に、７個のＰＭＡ試料を６個のＰＭＩと比較した。疾患の改善とともに最も高く下方制御された遺伝子は、主にインターフェロンα／β誘導性である（表２、右の列）。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、同様に、ＤＭ患者における改善を確認した（表３）。２つの異なる時点にて活動性および改善中の疾患を有するＤＭ（Ｎ＝６）またはＰＭ（Ｎ＝２）の同じ患者からの対の試料において、１型インターフェロン誘導遺伝子は、再び、全ての遺伝子のうちで最も下方制御された。不応性ＤＭである１名の患者について、対の検体において、多くの１型インターフェロン誘導遺伝子について全体的な変化はほとんど観察されなかった。
【００３４】
インターフェロンα／β誘導遺伝子の上方制御は、ＤＭにおいて血液中よりも筋肉においてより大きいが、ＰＭまたはＩＢＭではそうではない
１５名の患者（ＤＭ、ＰＭおよびＩＢＭの５名ずつ）について、我々は、Ｕ１３３Ａ（筋肉プロファイリングのために用いられる）およびＵ１３３プラス２．０（血液プロファイリングのために用いられる）マイクロアレイの両方で共有される１３，３９８個の遺伝子を用いて、血液遺伝子発現プロファイルを筋肉遺伝子発現と比較した。ＤＭ筋肉において、血液中で高く上方制御されていることを我々が見出したのと同じインターフェロンα／β誘導遺伝子の発現が著しく上方制御される。これとは対照的に、ＰＭおよびＩＢＭの筋肉において、インターフェロンα／β誘導遺伝子転写は、穏やかに増加しただけであった。これは、それら自体がＭｘＡのようなインターフェロンα／β誘導遺伝子を発現する浸潤性免疫系細胞に起因するかもしれない。ＤＭにおいて特に興味深いことに、血液と比較して筋肉において特定のインターフェロン誘導遺伝子が著しく過剰発現する。例えば、ＩＳＧ１５のＤＭ筋肉発現は、正常の筋肉のおよそ５７０倍で、ＤＭ血液よりも約１００倍高い。
【００３５】
インターフェロンα／β誘導ＭｘＡタンパク質の上方制御は、組織病変と相関関係がある
以前に報告されたように、１つのインターフェロンα／β誘導遺伝子タンパク質ＭｘＡの過剰発現が、ＤＭの筋肉に存在する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５７巻（５号）：６６４〜７８頁（２００５年））。今回の研究において、ＭｘＡ転写産物レベルは、ＤＭＡ血液（６．２倍）およびＰＭＡ血液（６．０倍）において同様に上昇したが、ＰＭ筋肉（２．５倍）と比較してＤＭ筋肉（２８１倍）において、マイクロアレイ研究により、著しくより高かった。ＤＭ筋肉中のＭｘＡ転写産物の著しい富化は、ＤＭおよびＰＭからの筋肉切片の比較における免疫組織化学によるＭｘＡタンパク質の著しい富化を同様に伴う。５名のＤＭ患者のうち４名において、ＭｘＡ染色が、多くの筋繊維、特に筋束周辺の筋繊維に強く存在したが、ＰＭの５名全ての患者およびＩＢＭの５名において、ＭｘＡ染色は、浸潤性免疫系細胞に限定されていた。ＭｘＡ染色は、正常筋肉生検に存在しない。
【００３６】
考察
我々の発見は、ＩＢＭの患者ではそうではないが、ＤＭおよびＰＭの患者のほとんどにおいて、インターフェロンα／β誘導遺伝子の著しい過剰発現を特徴とする独特の血液遺伝子発現プロファイルがあることを示唆する。免疫抑制治療の間の臨床的な改善は、一般的に、これらの遺伝子の過剰発現の正常レベルに向けての低減を伴う。筋肉における遺伝子発現に関連するこれらの発見は、病原の仮説および診断用の使用の可能性がある血液バイオマーカーのための意味を有する。
【００３７】
皮膚筋炎について、血液中のインターフェロンα／β遺伝子サインは、筋肉でのマイクロアレイ研究での発見と高く相関関係があり、この疾患がインターフェロンα／βの全身および筋肉内での過剰産生により駆動され得るとの仮説を支持する。同様の血液遺伝子転写サインが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）で報告されている（Ｂａｅｃｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００巻（５号）：２６１０〜５頁（２００３年）；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７巻（６号）：７１１〜２３頁（２００３年）；Ｈａｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．４巻（３号）：１７７〜８６頁（２００３年））。これらの遺伝子の少なくとも１つ（ＭｘＡ）についてのタンパク質レベルでの過剰発現が、ＤＭの筋肉毛細血管および筋束周辺の筋繊維ならびにＤＭの皮膚に存在する（Ｗｅｎｚｅｌら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５３巻（２号）：４６２〜３頁および４６３〜４頁（２００５年）；Ｗｅｎｚｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３１巻（４号）：５７６〜８２頁（２００６年））。さらに、天然のＩＦＮ−α生成細胞である形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、ＤＭの筋肉（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５７巻（５号）：６６４〜７８頁（２００５年））および皮膚（Ｗｅｎｚｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３１巻（４号）：５７６〜８２頁（２００６年））において豊富である。血液中のＭｘＡ転写産物レベルの上方制御は、若年性ＤＭにおいて観察され、疾患活動性と関連しているかもしれない（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０巻（３号）：３１９〜２５頁（２００６年））。
【００３８】
血液プロファイルは、ＤＭおよびＰＭの両方においてインターフェロンα／β誘導遺伝子の同様の過剰発現レベルを示したが、筋肉では、これらの遺伝子のいくつかは、ＤＭにおいてのみより高いオーダーで発現される。このことの１つの説明は、自然免疫系の全身での活性化が両方の疾患において存在するが、ＤＭ筋肉はＰＭ筋肉よりも１型インターフェロンにより大量に曝露されているということであり得る。この仮説は、ＩＢＭおよびＰＭでみられるよりも（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ３５巻（１号）：１７〜２３頁（２００７年））ずっと多数の、ＤＭ筋肉に浸潤するインターフェロンα／β分泌形質細胞様樹状細胞の以前の発見により支持される（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５７巻（５号）：６６４〜７８頁（２００５年））。さらに、ＰＭではインターフェロンα／β誘導タンパク質ＭｘＡの発現は、浸潤する炎症性細胞に限定されるが、ＤＭではＭｘＡタンパク質は筋繊維内に存在する。
【００３９】
このように特定のインターフェロンα／β誘導遺伝子の筋肉における富化は、ＤＭにおける組織損傷の性質に対する重要な手がかりであるようである。よって、ＤＭ筋肉におけるＩＳＧ１５転写産物の著しい富化は、ＤＭ血液および筋肉において上方制御される種々のインターフェロンα／β誘導タンパク質のうち、ユビキチン様修飾因子であるこの特定の分子が、ＤＭにおける組織損傷の直接的な機構に大きく関連するかもしれないことを示唆する。
【００４０】
ＰＭ血液と比較してＩＢＭ血液では高く上方制御されたインターフェロンα／β遺伝子が明らかに欠如していることは、これらの２つの疾患において筋肉で以前に観察された免疫異常の他の点では同様の性質と対照的である。これらの発見は、ＰＭにおけるＩＢＭとは異なる自然免疫系の活性化の大きさを示唆する。この仮説のさらなる研究は、多数の患者で取り組むのが最もよいであろう。さらに、多くの患者について、ＩＢＭの診断は遅れ、グルココルチコイド耐性ＰＭの先の診断の後にのみ認識される（Ａｍａｔｏら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４０巻（４号）：５８１〜６頁（１９９６年））。ＩＢＭおよびＰＭにおけるインターフェロンα／β誘導遺伝子血液バイオマーカーのさらなる特徴付けは、ＩＢＭの将来の早期診断およびこのような患者へのグルココルチコイド治療の回避の可能性を示唆する。
【００４１】
我々の発見は、ＤＭおよびＰＭの患者の補足的な管理に対する疾患活動性の血液バイオマーカーの有用性も示唆する。この研究において、我々は、活動性の治療応答性筋炎の複数の血液バイオマーカーを同定した。現在のところ、ＤＭまたはＰＭにおける疾患活動性を評価するためのより特異的な試験が必要とされている。血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）のレベルは、ＰＭにおける疾患活動性を一般的に反映するが、活動性ＤＭの患者においては正常であるかもしれない。ＭＩＴＡＸが、疾患の活動性の臨床的指標として提案されている。我々は、我々のＤＭ患者についてＭＩＴＡＸスコアを算出し、これは疾患活動性の我々独自の評価とよく相関した。しかし、ＭＩＴＡＸは疾患活動性評価についての良好なツールであることが示されているが、筋肉の関与についての評価者間のクラス内の相関関係が低く、より客観的な指標が必要とされることが強調された（Ｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （Ｏｘｆｏｒｄ）４３巻（１号）：４９〜５４頁（２００４年））。特定のインターフェロンα／β誘導遺伝子の発現を疾患活動性と関連付ける、客観的で安価なＰＣＲに基づく血液試験は、ＤＭおよびＰＭの臨床的な管理を補足できるだろう。結局、このような試験は、臨床試験における治療応答性についての代用マーカーを提供できるかもしれない。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
【表２−１】
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【００４４】
【表２−２】
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【００４５】
【表３】
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【００４６】
【表４】
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本明細書で引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。本発明をここで完全に記載したが、本発明は、本発明またはその任意の実施形態の意図および範囲に影響することなく、条件、パラメータなどの広く均等な範囲内で実行され得ることが当業者に理解されるであろう。
【配列表】
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