(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする組換え核酸を含む、組換えストレス耐性デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）細菌であって、該組換え核酸構築物が、細菌のゲノム中に組み込まれる、細菌。
【請求項２】
ＰＤＣ及びＡＤＨ核酸が、同じコンストラクト中のオペロン中に置かれる、請求項１記載の細菌。
【請求項３】
ＰＤＣ及びＡＤＨ核酸がジモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）からである、請求項１又は２記載の細菌。
【請求項４】
細菌が、不活性な乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を含む改変ゲノムを有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の細菌。
【請求項５】
ＬＤＨ遺伝子が、全て又は部分において、欠損され、機能的タンパク質をコードしない、請求項４記載の細菌。
【請求項６】
ＬＤＨ遺伝子が、細菌又はその祖先において、相同組換え、遺伝子置換、又は標的化された突然変異誘発により不活化されている、請求項４又は５記載の細菌。
【請求項７】
細菌のゲノムが、ＬＤＨ遺伝子の少なくとも５８９の連続ヌクレオチドを欠く、請求項１〜６のいずれか一項記載の細菌。
【請求項８】
デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、デイノコッカス・ゲオサーマリス（Ｄ．  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、デイノコッカス・ムライ（Ｄ．  Ｍｕｒｒａｙｉ）、デイノコッカス・セルロシリティカス（Ｄ．  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、又はデイノコッカス・デゼルティ（Ｄ．  ｄｅｓｅｒｔｉ）より選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の細菌。
【請求項９】
好熱性デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）細菌である、請求項１〜８のいずれか一項記載の細菌。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の細菌を適切な基質の存在において培養すること、及びエタノールを回収することを含む、エタノールを産生する方法。
【請求項１１】
培養を、４０℃又はそれ以上の温度で、酸性ｐＨ条件下で、及び／又はエタノールの存在において実施する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
エタノールを産生するための請求項１〜９のいずれか一項記載の細菌の使用。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の組換え細菌、又はその祖先を産生するための方法であって、以下：
−ストレス耐性デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）細菌を提供すること；
−選択された細菌中に、ＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする組換え核酸分子を導入すること；
−場合により、細菌をさらに処理して、ＬＤＨ遺伝子を不活化すること、及び、不活化されたＬＤＨ遺伝子を有する細菌を選択すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え細菌及び特にエタノールの産生のためのその使用に関する。本発明は、また、そのような細菌の産生のための方法、ならびにそのような産生のために適した核酸コンストラクトに関する。本発明は、具体的には、機能的ＬＤＨ遺伝子を欠く及び／又はＰＤＣもしくはＡＤＨをコードする組換え核酸を含む細菌に関する。本発明の細菌は、任意のストレス耐性細菌から、特に、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓの任意の株、好極限性細菌株（例えば、限定はされないが、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｄ．  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ、Ｄ．  Ｍｕｒｒａｙｉ、Ｄ．  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、又はＤ．  ｄｅｓｅｒｔｉなどを含む）から産生されうる。
【０００２】
序論
ストレスにより破壊された場合にそのゲノムをリアセンブルする能力を有する細菌が、文献中に報告されている（例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌など）。Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓは、１９５６年にAnderson及びその共同研究者により単離されたグラム陽性細菌である。この好極限性細菌生物は、ＵＶ及び電離放射線による又は架橋剤（マイトマイシンＣ）によるＤＮＡ損傷に対して耐性であり、乾燥に対して寛容性がある。
【０００３】
ＷＯ０１／０２３５２６は、放射線に対するＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓの異常な耐性を示し、バイオレメディエーションにおけるその操作及び使用をさらに提案する。特許出願ＷＯ２００９／０６３０７９は、本願の優先日に未公開であり、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌が溶媒に対して耐性であり、バイオマスを形質転換して、エタノールを生成しうることを示す。
【０００４】
他のストレス耐性細菌が、特許出願ＥＰ０９  ３０５０４１．７に開示されており、現在未公開である（ならびにその単離及び／又は選択のための方法、及び代謝物（例えば抗生物質など）を産生するその能力）。
【０００５】
遺伝的に変化されたグラム陽性株又はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が、ＷＯ９５／２７０６４及びＷＯ２００６／１３１７３４に言及されている。工業的な展望から、満足な代謝物産生は、これらの株について開示されていない。さらに、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、胞子を産生し、それは、工業的な使用にとって実質的な欠点である。
【０００６】
本発明は、本明細書で、ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌のゲノムを改変し、エタノールを産生するその能力を改善することができることを示す。より具体的には、本発明は、エタノールの産生におけるその性能を増加させるために、ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌内の代謝経路を改変することが可能であることを示す。
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、組換えストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関し、それにおいて、前記細菌は、不活性なＬ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を含む改変ゲノムを有する。
【０００８】
特定の実施態様において、ＬＤＨ遺伝子は、全て又は部分において、欠損され、機能的な乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードしない。
【０００９】
本発明の組換え細菌は、好ましくは、さらに、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする組換え核酸分子を含む。
【００１０】
この点において、本発明のさらなる目的は、組換えストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌であり、それにおいて、前記細菌は、組換え核酸、好ましくは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含むプラスミドを含む。
【００１１】
本発明の細菌が、ストレス耐性細菌の種々の種、例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ細菌、Ｔｒｕｅｐｅｒａ細菌、Ｐｏｒｐｈｙｒａｂａｃｔｅｒ細菌、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ細菌、又はＥｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌などから選択されうる。本発明の好ましい細菌は、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌、例えば、限定はされないが、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｄ．  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ、Ｄ  ｍｕｒｒａｙｉ、Ｄ．  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、又はＤ．  ｄｅｓｅｒｔｉ、好ましくは好熱性Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌である。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、バイオ燃料、特にエタノールを産生する方法にあり、上で定義する細菌を適切な基質の存在において培養すること、及びバイオ燃料を回収することを含む。
【００１３】
本発明は、また、エタノールを産生するための上で定義する細菌の使用に関する。
【００１４】
本発明は、また、組換えストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌（上で定義する）、又はその祖先を産生するための方法に関し、方法は以下：
−  （親）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌を提供すること；
−  細菌を処理して、ＬＤＨ遺伝子を不活化すること、及び
−  不活化ＬＤＨ遺伝子を有する細菌を選択すること
を含む。
【００１５】
本発明は、また、組換えストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌（上で定義する）、又はその祖先を産生するための方法に関し、方法は以下：
−  （親）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌を提供すること；
−  前記細菌中に、ＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする組換え核酸分子を導入すること、及び
−  前記核酸を発現する細菌を選択すること
を含む。
【００１６】
本発明は、また、プラスミドコンストラクトに関し、それにおいて、前記プラスミドがＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌中で複製し、ＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする核酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】部分的なＬＤＨ欠失のための組込みコンストラクトｐＤＲ−ＬＤＨｄｅｌの構築及び構造。相同領域及びクロラムフェニコールカセットを伴うインサートを合成し、ＬＩＴＭＵＳ２８ｉ中にクローン化する。ＣａｍＲ、クロラムフェニコール耐性；ＡｍｐＲ、アンピシリン耐性；ＧＤＲ＿ｔｅｒｍ８５、推定Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ転写ターミネーター；Ｐ  Ｄ．  ｒａｄ．、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ推定プロモーター；５’ＨＲ、５’相同領域；３’ＨＲ、３’相同領域；Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＯＲＩ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ複製起点。
【図２】５’（配列番号１）及び３’（配列番号２）相同領域の配列。
【図３】相同組換えによるＬ乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｏｃｕｓ  ＤＲ＿２３６４）Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ突然変異体の構築のプロセス。ＣａｍＲ、クロラムフェニコール耐性；ＡｍｐＲ、アンピシリン耐性；５’ＨＲ、５’相同領域；３’ＨＲ、３’相同領域；Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＯＲＩ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ複製起点。
【図４−１】ＺｍＰＤＣ（配列番号３）及びＺｍＡＤＨ  ＩＩ（配列番号４）遺伝子の核酸配列。
【図４−２】ＺｍＰＤＣ（配列番号３）及びＺｍＡＤＨ  ＩＩ（配列番号４）遺伝子の核酸配列。
【図５】プラスミドｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−ＡＤＨ（ａ）、ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−ＡＤＨｔａｇ（ｂ）、ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨ（ｃ）、及びｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−Ｐ−ＡＤＨｔａｇ（ｄ）の構築及び構造。ＲＢＳ  ｇｒｏＥＳＬオペロン、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ｇｒｏＥＳＬオペロンの上流に位置づけられるリボソーム結合部位領域（Meima et al, 2001）；ＡｍｐＲ、アンピシリン耐性；ＣａｍＲ、クロラムフェニコール耐性；Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＯＲＩ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ複製起点；ＰｔｕｆＡ、ｔｕｆＡ遺伝子の予測された翻訳開始コドンの上流に位置づけられる４３２ｂｐ；ＰｔｕｆＢ、ｔｕｆＢ遺伝子の予測された翻訳開始コドンの上流に位置づけられる２３４ｂｐ；ＺｍＰＤＣ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子；ＺｍＡＤＨ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ遺伝子；Ｔｅｒｍ８５、遺伝子座ＤＲ＿１１８４及びＤＲ＿１１８５の間に位置づけられる、推定転写ターミネーターを含む、遺伝子間配列；Ｔｅｒｍ１１６、転写ターミネーターＴｅｒｍ１１６（Lecointe et al, 2004）；Ｄ．  ｒａｄ．  ＯＲＩ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ複製起点；Ｐ  Ｄ．  ｒａｄ．、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓプロモーター。
【図６】ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨ（ａ）又はｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−Ｐ−ＡＤＨｔａｇ（ｂ）を用いて形質転換されたＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓについてのアルコールデヒドロゲナーゼ活性。
【図７】再操作された代謝経路。
【図８】ＰＤＣ＋ＡＤＨ＋ＬＤＨ−突然変異体の作製のためのＰＣＲ産物の三者間ライゲーション。ＣａｍＲ、クロラムフェニコール耐性；ＰｔｕｆＡ、ＴｕｆＡ遺伝子の予測された翻訳開始コドンの上流に位置づけられる４３２bp；ＰｔｕｆＢ、ＴｕｆＢ遺伝子の予測された翻訳開始コドンの上流に位置づけられる２３４bp；ＺｍＰＤＣ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子；ＺｍＡＤＨ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ遺伝子；Ｔｅｒｍ８５、遺伝子座ＤＲ＿１１８４及びＤＲ＿１１８５の間に位置づけられる、推定転写ターミネーターを含む、遺伝子間配列；Ｔｅｒｍ１１６、転写ターミネーターＴｅｒｍ１１６（Lecointe et al, 2004）；Ｐ  Ｄ．  ｒａｄ．、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ推定プロモーター；５’ＨＲ、５’相同領域；３’ＨＲ、３’相同領域。
【００１８】
表１：代謝分析のために使用される組換え体の名称。
【００１９】
表２〜５：Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ組換え体：複合培地又は定義された培地中での代謝物産生。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、組換えストレス耐性細菌及びバイオ燃料又は他の代謝物を産生するためのその使用に関する。
【００２１】
本発明に関連して、用語「ストレス耐性細菌」は、より具体的には、ストレスにより破壊された場合、そのゲノムを完全に又は部分的にリアセンブルする能力を有する細菌を指定する。ストレスは、任意の細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、即ち、９０%又はそれ以上の細胞死をＥ．  ｃｏｌｉ細菌の培養中で起こすために十分である処理でありうる。さらにより好ましくは、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、少なくとも２対数だけ細菌力価をＥ．  ｃｏｌｉの培養中で低下させるために十分である処理である。そのような処理の例は、照射、好ましくは反復及び連続ＵＶ照射、及び／又は遺伝毒性薬剤の使用を含む。好ましいストレス処理は、０．５〜４００mJ/cm2の間、より好ましくは１〜２００mJ/cm2の間、典型的には１〜１００mJ/cm2の間のＵＶ処理であり、約５”〜５’の時間の期間にわたり適用される。好ましいＵＶ処理は、３０秒間にわたる４mJ/cm2であり、それは、１〜８時間、好ましくは３〜５時間、より好ましくは約４時間の間隔で反復してもよい。本発明の特定の細胞ストレス処理が、特許出願ＥＰ０９  ３０５０４１．７（未公開）に記載されており、それは、参照により本明細書において組み入れられる。
【００２２】
本発明の細胞ストレス耐性細菌は、より具体的には、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ細菌、Ｔｒｕｅｐｅｒａ細菌、Ｐｏｒｐｈｙｒａｂａｃｔｅｒ細菌、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ細菌又はＥｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌を含む。本発明の好ましい細菌は、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌、特に好極限性細菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌、より好ましくはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌（Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｄ．  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ、Ｄ．  Ｍｕｒｒａｙｉ、Ｄ．  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、又はＤ．  ｄｅｓｅｒｔｉより選択される）、好ましくは好熱性Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌である。
【００２３】
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、ストレスにより破壊された場合、そのゲノムを完全に又は部分的にリアセンブルする能力を有することが示されている。以前に言及したとおりに、これらの細菌、特にＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓは、バイオレメディエーションのために提案されてきた。バイオマスからバイオエネルギー産物を産生するＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓの能力が、ＷＯ２００９／０６３０７９に開示されており、本願の優先日に未公開である。本発明は、本明細書において、ストレス耐性細菌（例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌など）の性能を、組換え技術を使用して代謝経路を再操作することにより改善することができることを示す。特に、本発明は、再操作されたエタノール生合成経路を有する新規組換えストレス耐性細菌を提供する。
【００２４】
この点について、本発明者らは、ストレス耐性細菌株中に新規生合成経路を設計及び作製しており、それらは、ビルピン酸変換経路の再ルーティングに基づく。特に、本発明者らは、新規組換え株を設計しており、それにおいて、ピルビン酸が、エタノールを産生するための基質として効率的に使用される。この点について、本発明者らは、１つ又はいくつかの酵素（又は対応する遺伝子）を挿入しており、それらは、ピルビン酸のエタノールへの変換を起こす又は触媒する。本発明者らは、また、乳酸を産生するためにピルビン酸を使用する内因性経路を欠失させており、それにより、エタノール合成経路に関与するピルビン酸の量を増加させる。
【００２５】
本発明の目的は、このように、（組換え又は遺伝的に改変された）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関し、それにおいて、前記細菌は、ＰＤＣをコードする組換え核酸を含む。
【００２６】
用語「組換え細菌」は、異種（例、前記細菌中には天然で存在しない）核酸配列又は分子の欠失及び／又は挿入の結果として、改変ゲノムを含む細菌を指定する。「組換え核酸」は、従って、操作されており、それ自体が野生型細菌中で見出されない核酸を指定する。
【００２７】
本発明の別の目的は、（組換え又は遺伝的に改変された）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関し、それにおいて、前記細菌は、ＡＤＨをコードする組換え核酸を含む。
【００２８】
さらなる好ましい実施態様において、本発明は、（組換え又は遺伝的に改変された）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関し、それにおいて、前記細菌は、ＰＤＣ及びＡＤＨをコードする組換え核酸を含む。
【００２９】
本発明の別の目的は、（組換え又は遺伝的に改変された）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関し、それにおいて、前記細菌は、不活性な乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を含む改変ゲノムを有する。
【００３０】
本発明の最も好ましい目的は、（組換え又は遺伝的に改変された）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関し、それにおいて、前記細菌は、不活性な乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を含む改変ゲノムを有し、及び、さらに、それにおいて、前記細菌は、ＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする組換え核酸を含む。
【００３１】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ、ＥＣ  ：  ４．１．１．１）は、ピルビン酸のアセトアルデヒド及び二酸化炭素への一酸化脱カルボキシル化を触媒する。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ、ＥＣ  ：  １．１．１．１）は、アセトアルデヒドのエタノールへの変換を触媒する。
【００３２】
この代謝経路を作製又は改善するために、ＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする核酸分子をクローン化し、ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ株中に成功裏に導入している。用語「核酸」は、好ましくはＤＮＡを指定するが、組換え核酸はＲＮＡでありうる。状況に依存して、核酸分子は、二本又は一本鎖でありうる。
【００３３】
特に、機能的ＰＤＣをコードする核酸分子が調製されている。そのような核酸分子は、天然又は合成又は突然変異体ＰＤＣ遺伝子の配列の全て又は部分を含みうる（核酸分子が、ピルビン酸のアセトアルデヒド及び二酸化炭素への一酸化脱カルボキシル化を触媒するタンパク質をコードする限り）。
【００３４】
ＰＤＣは植物、菌類、及び酵母中に存在するが、しかし、細菌中では稀である。明かなＰＤＣは、完全に配列決定されたＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓゲノム中に見出されていない。ＰＤＣ遺伝子が、種々の株、例えばＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ中（Brau and Sahm, 1986 ; Conway et al, 1987a ; Neale et al, 1987）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ中（Ｇｅｎｂａｎｋ：  ＡＦ３６８４３５）（Chandra et al, 2001）、Ｓａｒｃｉｎａ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ：  ＡＦ３５４２９７）（Lowe and Zeikus, 1992）中、及びＺｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：  ＡＦ４７４１４５）（Raj et al, 2002）中などにおいて同定されている。
【００３５】
好ましい実施態様において、ＰＤＣ核酸は、細菌ＰＤＣ遺伝子の全て又は部分の配列を含む。特定の実施態様において、核酸は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓからのＰＤＣ遺伝子（ＺｍＰＤＣ、ＺＭＯ１３６０）の配列を含む。ＺｍＰＤＣ遺伝子配列は１７０７塩基対を含み、図４に示される。
【００３６】
さらに、ストレス耐性細菌（例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓなど）においてＡＤＨ活性を作製するために、機能的ＡＤＨをコードする核酸分子が調製されている。そのような分子は、天然又は合成又は突然変異体ＡＤＨ遺伝子の配列の全て又は部分を含みうる（核酸分子が、アセトアルデヒドのエタノールへの変換を触媒するタンパク質をコードする限り）。
【００３７】
ＡＤＨ遺伝子が、異なる生物（限定はされないが、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ（Ingram et al, 1987）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（Liu et al, 2007）、又はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ：  Ｚ２５５４４）（Talarico et al, 2005）を含む）からクローン化されている。推定ＡＤＨ遺伝子（ＤＲ＿２２７９）は、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓゲノム中でも見出されている。しかし、その発現は、単独で、エタノールの効率的な産生を可能にするとは思われない。
【００３８】
好ましい実施態様において、ＡＤＨ核酸は、細菌ＡＤＨ遺伝子の全て又は部分の配列を含む。特定の実施態様において、核酸は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓからのＡＤＨ遺伝子（ＺｍＡＤＨ、ＺＭＯ１５９６）の配列を含む。ＺｍＡＤＨ  ＩＩは１１５２塩基対を含み、その配列は図４に描写される。
【００３９】
これらの核酸は、さらに、調節配列又は領域、例えばプロモーター（例、ｔｕｆＢプロモーター）及びターミネーターなどを含みうる。プロモーターは、宿主に対して内因性（例、本発明の組換え核酸をＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ株においてクローン化するためのＤｅｉｎｏｃｃｏｃｕｓ遺伝子からのプロモーター）又は異種（例、異なる起源、例えば異なる細菌、ファージ、合成又はハイブリッドプロモーターなどから）でありうる。好ましいプロモーターは内因性である。この点について、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓプロモーターが試験され、遺伝子発現のために使用されてきた。そのようなプロモーターの例は、翻訳伸長因子Ｔｕ遺伝子ｔｕｆＡ（ＤＲ０３０９）及びｔｕｆＢ（ＤＲ２０５０）からのＰｔｕｆＡ及びＰｔｕｆＢ、ｐＩ３中に位置づけられる推定リゾルバーゼをコードするｒｅｓＵ遺伝子のプロモーター、及びｇｒｏＥＳＬオペロンのプロモーター領域ＰｇｒｏＥＳＬを含む（Lecointe et al, 2004; Meima et al, 2001）。
【００４０】
核酸は、別々の実体として（例、異なる核酸コンストラクト）、又は同じコンストラクト中で、異なるプロモーター領域下で又はオペロン中でクローン化されうる。
【００４１】
本願において提供される例は、新たなコンストラクトの作製を開示し、そこでは、ＺｍＰＤＣ遺伝子及びＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓからのアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ遺伝子（ＺｍＡＤＨ）が、同じコンストラクト中で、別々のプロモーター下で又はオペロン中のいずれかでクローン化された。これらのコンストラクトは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ株中に成功裏に導入され、それは、前記組換え株からのエタノール産生をもたらし、未改変（親）株は、テストされた条件下でエタノールを産生しなかった。
【００４２】
核酸は、細菌のゲノム中に挿入されうる、又は（自己）複製分子（例、プラスミド、エピソーム、人工染色体上など）として挿入されうる。
【００４３】
典型的な実施態様において、組換え核酸は、適したベクター（それはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ中で複製的でありうる）中にクローン化される。典型的なプラスミドは、クローン化されたインサートに加えて、選択遺伝子（例、抗生物質耐性、色素など）及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ中で効果的な又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓのゲノム中に組込み可能にする複製起点を含む。プラスミド（又は組換え核酸）は、さらに、調節配列（例えば、プロモーター、ターミネーター、及び／又はエンハンサーなど）を含みうる。
【００４４】
そのようなベクターの例は、ｐＭＤ６６、ｐＩ３、ｐＲＡＤ１、及びｐＵＥ３０を含む。ｐＭＤ６６は、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ及びＥ．  ｃｏｌｉ用の、ｐＩ３の１２kbフラグメントを含む大きなベクター（２７kb）である（Daly et al, 1994）。ｐＩ３は、Masters及びMinton(1992)により記載された。ｐＲＡＤ１は、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ−Ｅ．  ｃｏｌｉシャトルプラスミドであり、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ用の最小レプリコンを含む（Meima and Lidstrom, 2000）。ｐＵＥ３０は、Ｄ．  ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓの株に由来する内因性プラスミドであり、それは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓにおいて複製することができる（ＵＳ２００３／０１７５９７７を参照のこと）。
【００４５】
本発明の特定の目的は、プラスミドコンストラクトにあり、それにおいて、前記プラスミドは、ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌において複製し、ＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする核酸を含む。ＰＤＣ及びＡＤＨをコードする核酸は、オペロン中で又は同じプラスミド中もしくは異なるプラスミド中の異なる発現単位としてでありうる。本発明の好ましいプラスミドは、ＺｙｍｏｍｏｎａｓからのＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする。本発明のプラスミドの特定の例は、ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−ＡＤＨ、ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−ＡＤＨｔａｇ、ｐＩ３−Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨ、及びｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−Ｐ−ＡＤＨｔａｇである。
【００４６】
組換え核酸は、また、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌のゲノム中への組込みのために適した組込みカセット中にクローン化されうる。そのような組込みカセットは、典型的には、１つ又はいくつかの配列に連結された（又は隣接された）組換え核酸を含み、組込み、好ましくは部位特異的組込みを可能にする。そのような配列は、例えば、ゲノムの標的領域と相同である核酸配列でありうる（クロスオーバーを通じた組込みを可能にする）。この点について、本発明の特定の細菌は、そのゲノム中に、ＬＤＨをコードする内因性遺伝子の全て又は部分との置換で組み込まれたＰＤＨ及び／又はＡＤＨをコードする組換え核酸を含む。これに関連して、用語「ＬＤＨ遺伝子の部分」は、遺伝子の任意の部分を意味し、その欠失は、細胞において遺伝子の不活化を起こすために十分である。
【００４７】
種々の技術を使用して、組換え核酸分子を、ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ中に挿入することができる。特に、それらは、天然の形質転換（それは、さらに、塩化カルシウムの存在において増強することができる）又はエレクトロポレーションを通じて挿入されうる。
【００４８】
この点について、本発明は、また、組換えストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌（上で定義する）、又はその祖先を産生するための方法に関し、方法は以下：
−  （親）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌を提供すること；
−  前記細菌中に、ＰＤＣ及び／又はＡＤＨをコードする組換え核酸分子を導入すること、及び
−  前記核酸を発現する細菌を選択すること
を含む。
【００４９】
挿入された核酸を有する組換え体は、それ自体が公知である技術（例えば抗生物質耐性など）に従い選択されうる。
【００５０】
適切なＰＤＣ又はＡＤＨの発現を、定量的ＰＣＲを使用して検証してもよく、これらの酵素の産生を、ウエスタンブロットにより又は当技術分野においてそれ自体が公知である酵素アッセイにより検証してもよい。ＰＤＣ活性を、ＮＡＤ＋の低下を分析することにより測定することができ、ＡＤＨ活性を、ＮＡＤ＋の低下又はＮＡＤＨの酸化（これらの酵素の活性に起因する）を分析することにより測定することができる（Conway et al, 1987a and b）。
【００５１】
実験セクションに開示される通り、ＰＤＣ及びＡＤＨをコードする組換え核酸を含むＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌が産生されている。これらの細菌を培養することができ、生存可能であり、組換え核酸を安定的に含む。組換え体の安定性によって、好ましくは、９５%を上回る形質転換細菌が、依然として、２増殖サイクル後にベクターを含むようになる。結果は、ＰＤＣ及びＡＤＨゲノム挿入が、２増殖サイクル後でさえ安定であることを示す。これらの細菌は、エタノールを産生し、基質特異性、培養条件、及び代謝物産生に関して、多くの利点を組み合わせる。
【００５２】
さらに、エタノール産生をさらに改善するために、ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌（それにおいて、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が不活化されている）も産生されている。
【００５３】
ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子は、ピルビン酸の乳酸への変換に関与する。Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＬＤＨ遺伝子が、１９９６年に、Narumi及びWatanabeによりクローン化された。この酵素は四量体であり、その結晶構造が解析された（Coquelle et al, 2007）。
【００５４】
本発明者らは、本明細書で、前記酵素が不活性である新規細菌を作製している。特定の実施態様において、ＬＤＨ遺伝子は、全て又は部分において、欠損され、機能的タンパク質をコードしない。ＬＤＨ遺伝子は、前記細菌又はその祖先において、相同組換え、遺伝子置換、又は標的化された突然変異誘発、又は当技術分野においてそれ自体が公知である任意の他の技術により不活化されうる。
【００５５】
好ましい実施態様において、ＬＤＨ遺伝子は、前記遺伝子の少なくとも部分の欠失により不活化され、それは、異種核酸（例、選択マーカー）により置換されうる。
【００５６】
ＬＤＨ遺伝子は９１５塩基対を含む。それは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓのゲノム中の座標２３６２８９０と２３６３８０４の間に位置づけられる。前記遺伝子の配列は、例えば、ｇｅｎｅＳｅｑ１７９９７１２の下で利用可能である。好ましい実施態様において、本発明の細菌は、前記遺伝子の部分、好ましくはその少なくとも１００の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００、３００、４００、又は５００を欠く。実施例において、欠損したＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ株が産生されており、それは、ＬＤＨ遺伝子の５８９の連続ヌクレオチドを欠く。この株は、ＬＤＨ遺伝子の部分及び（場合により）ＬＤＨ遺伝子に隣接する領域の部分と相同である２つの領域により隣接されたマーカー遺伝子を含む特定のコンストラクトを使用した二重クロスオーバーにより調製されている（図３を参照のこと）。典型的な相同領域は、ハイブリダイゼーション及びクロスオーバーを可能にするだけ十分に長くなければならない（例、２００を上回るヌクレオチド、好ましくは３００を上回るヌクレオチド、典型的には３００〜７００の間）。そのようなコンストラクトは、本発明の特定の目的を表す（図１及び２を参照のこと）。
【００５７】
この点について、本発明は、また、組換えストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌（上で定義する）、又はその祖先を産生するための方法に関し、方法は以下：
−  （親）ストレス耐性細菌、特にＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細菌を提供すること；
−  細菌を処理して、ＬＤＨ遺伝子を不活化すること、及び
−  不活化されたＬＤＨ遺伝子を有する細菌を選択すること
を含む。
【００５８】
本発明の細菌は、任意の適した培養液及びデバイス中で培養及び／又は維持されうる。そのような培地の例は、複合グルコース培地又は定義された培地（実施例において開示される）、例えば、定義された培地ショ糖、定義された培地デンプンなどを含む。適した培地は、また、商業的に利用可能である。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、エタノール又は他の代謝物を産生するための上で定義する細菌の使用に関する。
【００６０】
本発明は、また、バイオ燃料、特にエタノールを産生する方法に関し、上で定義する細菌を適切な基質の存在において培養すること、及びバイオ燃料を回収することを含む。
【００６１】
基質は、任意の培養液又は種々の型のバイオマス又はそれに由来する産物でありうる。特に、バイオ燃料は、再生可能な資源、特に植物もしくは動物バイオマスから、又は自治体の及び工業的な廃棄物から産生されうる。
【００６２】
本発明の用語「バイオ燃料」は、「第一世代バイオ燃料」及び／又は「第二世代バイオ燃料」を含む。第一世代バイオ燃料は、植物性又は動物性有機物質、好ましくは糖、デンプン、植物油、又は動物性脂肪から得られる。第一世代バイオ燃料の産生のための主な供給源は、食用植物又はその部分である。第一世代バイオ燃料は、植物油、バイオディーゼル、バイオアルコール、バイオガス、合成ガス、及び固形バイオ燃料を含む。バイオアルコールは、エタノール、プロパノール、及びブタノールを含む。
【００６３】
第二世代バイオ燃料は、好ましくは、非食用植物又は植物の非食用部分から産生される。それらは、非食物作物、バイオマス廃棄物、小麦の茎、トウモロコシ、及び木を含む。
【００６４】
より好ましくは、本発明の方法は、エタノールの産生のために使用される。
【００６５】
本発明の方法は、変換のリアクター中で実施されうる。「リアクター」により、従来の発酵タンク又はバイオマス変換のための任意の装置もしくはシステム（特に、本発明を実施するために設計され、従って、特に、バイオリアクター、バイオフィルター、回転式の生物学的接触器、ならびに他の気相及び／又は液相バイオリアクターからなる）、特に、バイオマス又はバイオマス派生物の処理のために適応されたものを意味する。本発明に従って使用することができる装置は、連続的に又はバッチ積載において使用することができる。
【００６６】
リアクター中では、本発明の方法を実施するために、本発明の少なくとも１つの細菌、又はその細菌抽出物を使用し、前記リアクターを配置及び提供し、物理化学的条件を設定し、そこで維持されるようにし、前記細菌が、考察下にある適用のために操作的になり、場合により、細菌増殖が可能であり、好ましくは、そこで促進されるようになる。
【００６７】
プロセスを、好気生活、嫌気生活下で又は微好気生活下で行ってもよい（基質及び細菌に依存する）。本発明の利点は、ストレス条件（培養液中でのエタノールの存在を含む）に抵抗する本発明の細菌の能力に関連する。本発明のプロセスは、このように、好ましくは、約４０℃又はそれ以上の温度で、特に４０〜７０℃の間を含む温度で；酸性ｐＨ条件下で、及び／又はエタノールの存在において実施してもよい。
【００６８】
本発明のさらなる局面及び利点を、以下の実施例において開示し、それらは、例示的であると考えるべきであり、本願の範囲を限定しない。
【００６９】
実施例
材料及び方法
細菌株及び増殖条件：
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株ＳＣＳ１１０、ＪＭ１０９、又はＤＨ５αを使用して、プラスミドを増殖させた。それらを、３７℃及び２００ＲＰＭで、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（１リットル当たり：トリプトン１０g、酵母抽出物５g、塩化ナトリウム１０g）中で培養した。固形培地を、寒天１．５%の添加により調製した。
【００７０】
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１（Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）を、３０℃及び２００ＲＰＭで、ＴＧＹ又はＰＧＹ中で培養した。ＴＧＹ培地の組成は、以下である（１リットル当たり）：トリプトン（５g）、酵母抽出物（１．５g）、及びグルコース（１g）。固形培地の組成（１リットル当たり）：トリプトン（５g）、酵母抽出物（２．５g）、グルコース（１g）、及び寒天（１５g）。ＰＧＹ培地の組成は、以下である（１リットル当たり）：ペプトン（１０g）、酵母抽出物（５g）、及びグルコース（１g）。固形培地の組成（１リットル当たり）：ペプトン（１０g）、酵母抽出物（５g）、グルコース（１g）、及び寒天（１５g）。
【００７１】
ＬＢ又はＴＧＹ培地に、必要な場合、適切な抗生物質を添加する（Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ形質転換体について最終濃度３μg/mlのクロラムフェニコール及びＥ．  ｃｏｌｉ形質転換体についてアンピシリン１００μg/ml）。
【００７２】
形質転換：
Ｅ．  ｃｏｌｉ形質転換を、市販のコンピテント細胞ＳＣＳ１１０（Stratageneから）又はＪＭ１０９（Promegaから）を使用して行った。
【００７３】
Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓコンピテント細胞の調製のために、静止期中の新鮮培養物を５０mlのＴＧＹ中で１００倍希釈した。細胞を、初期対数増殖期まで増殖させた（ＯＤ６００nm  ＝  ０．３）；ペレットを、適切な容積の氷冷２×ＴＧＹ／１０%ｖ／ｖグリセロール／３０mM  ＣａＣｌ２中に再懸濁させた。形質転換のために、所望の量のプラスミドＤＮＡを、１００μlの細胞に加えた。混合物を、チューブを３０℃に移す前に、氷上で３０分間インキュベーションした。３０℃で９０分間のインキュベーション後、９００μlの事前に温めた２×ＴＧＹを細胞に加えた。形質転換体を、２００ＲＰＭ及び３０℃で、２０時間の間振盪した。それらを連続希釈し、適切な非選択又は選択ＴＧＹプレート上に広げた。
【００７４】
ＤＮＡ操作：
ＬＩＴＭＵＳ２８ｉは、New England Biolabsからである。
【００７５】
Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞からのプラスミドミニ調製を、キットWizard（登録商標）Plus SVミニプレップＤＮＡ精製システム（Promegaから）を使用して行い、ミディ調製を、プラスミドＤＮＡ精製NucleoBond（登録商標）Xtra Midi Plus EFキット（Macherey-Nagelから）を使用して行った。これらの調製を、静止期中の３〜１００mlのＥ．  ｃｏｌｉ培養から行った。
【００７６】
Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓからのプラスミド調製のために、静止期中の５０mlの細胞を、０．５M  ＥＤＴＡ及び０．５M  ＥＤＴＡ飽和ブタノール中に再懸濁させた。室温で１５分間のインキュベーション後、ペレットを０．５M  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、細胞を７０℃で３０分間の間置いた。ペレットを、５mg/mlのリゾチーム（リゾチーム緩衝液中）の添加前に、リゾチーム緩衝液（１０mM  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、０．５M  ＮａＣｌ）中で２回洗浄した。サンプルを、ＲＮＡｓｅ及びプロテイナーゼＫの添加前に、３７℃で３０分間にわたりインキュベーションした。混合物を、５６℃で、１時間の間インキュベーションした。２００mM  ＮａＯＨを、次に、サンプルに加えて、それを数回転倒させて混合した；３M酢酸カリウムをサンプルに加えて、それを転倒させて混合した；混合物を、エタノールを上清に加える前に、氷上で１０分間にわたりインキュベーションした；この混合物を１０分間にわたり氷上でインキュベーションし、ペレットを、エタノール（７０%）を用いて洗浄した。乾燥させたＤＮＡペレットを水中に再懸濁させた。
【００７７】
Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓからのゲノムＤＮＡ抽出を、DNeasy（登録商標）Blood and Tissue市販キット（Qiagenから）を使用して行った。これらの調製を、５mlの静止期培養物から行った。
【００７８】
オリゴヌクレオチドをEurogentecにより合成した。ＰＣＲ増幅のために使用されるポリメラーゼは、DyNAzyme EXT DNAポリメラーゼ（Finnzymesから）又はExtensor Hi-Fidelity PCR Enzyme（Thermo Scientificから）であった。ＰＣＲフラグメントを、Wizard SV Gel及びPCR Clean-Up Systemキット（Promegaから）を使用して精製した。
【００７９】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）をＤＮＡライゲーションのために使用した。
【００８０】
プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物を、制限酵素（New England Biolabsから）を用いて消化した。
【００８１】
遺伝物質（ＰＣＲ又は消化産物）をアガロースゲル電気泳動により分離した。ＤＮＡを、Biophotometer（Eppendorfから）を用いて定量化した。
【００８２】
ＤＮＡインサートをGenecust Europeにより合成し、適切なベクター中にクローン化した。
【００８３】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性テスト：
４mlのパラローザニリン（Sigma）（無水エタノール中２．５mg/ml）を、５０mgの亜硫酸水素ナトリウムを含む２００mlのＬＢ寒天に加えた（Conway et al, 1987b）。ＴＧＹ寒天プレート（必要な場合、適切な抗生物質を添加）上で増殖させた２日齢のＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ細胞を、指標プレート上に蒔き、３７℃で２〜３時間にわたりインキュベーションした。
【００８４】
代謝物産生：
この方法によって、バイオマス又はバイオマスの派生物から目的の代謝物を産生する遺伝子改変微生物の能力の評価が可能になる。
【００８５】
テストは、３０℃で行う。
【００８６】
複合培地グルコース中で調製された前培養物（静止期中）から、６mlの濃縮培地を播種する（１%  ｖ／ｖで播種）。
【００８７】
テストされた濃縮培養液は、複合培地グルコース、定義された培地ショ糖、定義された培地デンプンである。
【００８８】
複合培地グルコースは以下を含む：ペプトン２g/L、酵母抽出物５g/L、及びグルコース１０g/L（浸透水中）：溶液をオートクレーブ（１２０℃で１５分間）により滅菌する。この溶液に、以下の溶液を加える：ＭＯＰＳ緩衝溶液（１０×）ｐＨ７［酸性ＭＯＰＳ  ４００mM、ＮＨ４Ｃｌ  ２００mM、ＮａＯＨ  １００mM、ＫＯＨ  １００mM、ＣａＣｌ２  ５μM、Ｎａ２ＳＯ４  ２．７６mM、ＭｇＣｌ２  ５．２８mM］；微量栄養素（１００００×）［（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）２４  ３００mM、Ｈ３ＢＯ３  ４mM、ＣｏＣｌ２  ０．３mM、ＣｕＳＯ４  ０．１mM、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＺｎＳＯ４  ０．１mM］；ＦｅＣｌ３（１００×）２mM（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７  ２０mM中）；Ｋ２ＨＰＯ４  １g/L：溶液をろ過（０．２μm）により滅菌する。
【００８９】
定義された培地は以下を含む：炭素源１０g/L（浸透水中）：溶液をオートクレーブ（１２０℃で１５分間）により滅菌する。この溶液に、以下の溶液を加える：ＭＯＰＳ緩衝溶液（１０×）ｐＨ７［酸性ＭＯＰＳ  ４００mM、ＮＨ４Ｃｌ  ２００mM、ＮａＯＨ  １００mM、ＫＯＨ  １００mM、ＣａＣｌ２  ５μM、Ｎａ２ＳＯ４  ２．７６mM、ＭｇＣｌ２  ５．２８mM］；微量栄養素（１００００×）［（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）２４  ３００mM、Ｈ３ＢＯ３  ４mM、ＣｏＣｌ２  ０．３mM、ＣｕＳＯ４  ０．１mM、ＭｎＣｌ２  ２．５  mM、ＺｎＳＯ４  ０．１mM］；ＦｅＣｌ３（１００×）２mM（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７  ２０mM中）；Ｋ２ＨＰＯ４  １g/L：溶液をろ過（０．２μm）により滅菌する。
【００９０】
これらの培養液に、（野生型株を除く）、クロラムフェニコールを播種前に加える：３μg/mL、培養液。
【００９１】
培養を、好気生活及び嫌気生活の両方において実施する（Biomerieux, Genbag）。
【００９２】
好気生活条件中の培養物を、インキュベーター中で、３０℃で、撹拌下で、７日間にわたり放置する。培養物を、次に、１０分間にわたり、４０００rpmで遠心する。上清をろ過し（０．２μm）、他のチューブ中に注ぎ、−８０℃に置く。
【００９３】
嫌気生活条件中の培養物を、インキュベーター中で、３０℃で、４週間にわたり放置する。培養物を、次に、１０分間にわたり、４０００rpmで遠心する。上清をろ過し（０．２μm）、他のチューブ中に注ぎ、−８０℃に置く。
【００９４】
ガスクロマトグラフィＦＩＤ分析（Varian CP-WAX 57 CB 25m＊０．３２mmカラム）を使用して、アルコールを定量化した。有機酸をキャピラリー電気泳動により定量化した（５mM  ２，６ピリジンジカルボン酸  ０．５MＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム；５．６  ｐＨ調整済み緩衝液／６１cm長、５０μm直径キャピラリーAgilent）。残留グルコースを、屈折率測定と連動したＨＰＬＣにより定量化した（Phenomenex LUNA  ３μm  ＮＨ２  １００Ａ  １５０＊４．６mmカラム、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ  ８５：１５移動相）。
【００９５】
実施例１．Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１  Ｌ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）欠損
野生型Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ    ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１（Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）のＬＤＨ突然変異体を、以下の通りに産生した。
【００９６】
ａ．ＬＤＨ欠失のためのコンストラクト（ｐＤＲ−ＬＤＨｄｅｌ）
本発明者らは、野生型Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓにおけるＬＤＨ遺伝子の部分欠失（ＤＲ＿２３６４）のための新たなコンストラクト（ｐＤＲ−ＬＤＨｄｅｌと名付けた）を作製した（図１を参照のこと）。このために、本発明者らは、Ｅ．  ｃｏｌｉ中で複製可能であるが、しかし、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ中では複製可能ではないＬＩＴＭＵＳ２８ｉ骨格を使用した。合成されたＤＮＡインサートをＬＩＴＭＵＳ２８ｉ中にクローン化した；このインサートは、クロラムフェニコール耐性（ＣａｍＲ）カセット（１３４４ヌクレオチド）ならびにこのカセットのそれぞれ上流及び下流に置かれた５’及び３’隣接相同領域（５３７ヌクレオチド及び６１５ヌクレオチド）から作製される（図２）。ｐＤＲ−ＬＤＨｄｅｌコンストラクトを構築し、ＬＤＨ遺伝子の５８９ヌクレオチド（触媒作用に関与する残基をコードする５８９ヌクレオチドの一部）をＣａｍＲカセットにより置換した。
【００９７】
ｂ．ＬＤＨ欠損突然変異体の作製
ノックアウト突然変異体を作製するために、材料及び方法に記載される手順に従い、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ野生型を、ｐＤＲ−ＬＤＨｄｅｌを用いて形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール添加ＴＧＹ培地上で選択した。ＬＤＨ遺伝子の一部のクロラムフェニコール耐性カセットによる置換（図３）は、クロラムフェニコールカセットにアニーリングする適切なプライマーを使用したＰＣＲにより制御した。２つの二重クロスオーバー組込みクローン（０３−０４／８−１及び０３−０４／１１−２と名付けた）を、代謝産物分析のために選択した（表１）。
【００９８】
相同組換え時に、結果として得られる細菌は、５８９ヌクレオチドの欠失を含み、それは、ＣａｍＲカセットにより置換される。０３−０４／８−１及び０３−０４／１１−２のゲノム領域（そこでは、ＬＤＨ遺伝子の一部がＣａｍＲカセットにより置換された）を部分的に配列決定した。
【００９９】
実施例２．Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓにおけるピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼの産生
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓからのピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＺｍＰＤＣ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＺｍＡＤＨ）を産生するＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ株を以下の通りに作製した。
【０１００】
ａ．エタノール産生のための遺伝子を保有するコンストラクトの作製
４つのコンストラクトを、エタノールをＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ細胞中で産生するために作製した（図２を参照のこと）。
【０１０１】
第１のコンストラクト（ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−ＡＤＨと名付けた）について、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ亜種Ｍｏｂｉｌｉｓ  ＺＭ４からのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＺｍＰＤＣ、ＺＭＯ１３６０）及びアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ遺伝子（ＺｍＡＤＨ、ＺＭＯ１５９６）（図４）をオペロン中に置き、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ複製ｐＩ３プラスミドのＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ中にクローン化した（Masters and Minton, 1992）（図５を参照のこと）。ｐＩ３ベクターは、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓにおいてクロラムフェニコール耐性を与える。伸長因子ＴＵ  ｔｕｆＡ（ＤＲ＿０３０９）の翻訳開始コドンの上流に位置づけられ、プロモーター活性を含む４３２塩基対の領域（Lecointe et al, 2004）を、ＺｍＰＤＣ−ＡＤＨオペロンの前に置いた。スペーサーが、ＺｍＰＤＣ遺伝子とＺｍＡＤＨＺｍＡＤＨ遺伝子の間に存在し、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓオペロンｇｒｏＥＳＬ（Meima et al, 2001）からのリボソーム結合配列（ＲＢＳ）がＺｍＡＤＨの翻訳開始コドンの前に置かれた。Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ転写ターミネーターＴｅｒｍ１１６（Lecointe et al, 2004）が、ＺｍＡＤＨ遺伝子の下流に置かれた。ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−ＡＤＨに由来する第２のコンストラクトが作製された（ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−ＡＤＨｔａｇと名付けられている）。このコンストラクトにおいて、ｈｉｓタグ（６つのヒスチジン）がＺｍＰＤＣのＣ末端中に置かれ、ｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）がＺｍＡＤＨのＣ末端中に置かれた（図５）。
【０１０２】
コンストラクトｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨについて、推定転写ターミネーター（Ｔｅｒｍ８５と名付けた）を含む領域が、ＺｍＰＤＣ遺伝子の下流に置かれ、伸長因子ＴＵ  ｔｕｆＢ（ＤＲ＿２０５０）の翻訳開始コドンの上流に位置づけられる２３４ヌクレオチド（それはｔｕｆＢプロモーター領域に対応する、Lecointe et al, 2004）が、Ｔｅｒｍ８５とＺｍＡＤＨ遺伝子の間に置かれた（図５）。最後のコンストラクトは、ｐＩ３−Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨに由来し、ｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−Ｐ−ＡＤＨｔａｇと名付けられている；このベクターにおいて、ｈｉｓタグ（６つのヒスチジン）がＺｍＰＤＣ遺伝子のＣ末端中に置かれ、ｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）がＺｍＡＤＨ遺伝子のＣ末端中に置かれた（図５）。
【０１０３】
ｂ．ＺｍＰＤＣ及びＺｍＡＤＨを産生するＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ株の作製
Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓコンピテント細胞を、ＺｍＰＤＣ遺伝子及びＺｍＡＤＨ遺伝子を保有する異なるコンストラクトを用いて形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール耐性について選択した。プラスミドの存在は、特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅又はＤ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓクローンから抽出されたコンストラクトの酵素消化により制御された。４つのコンストラクトの各々について、２つのクローンを代謝試験のために使用した（表１）。
【０１０４】
実施例３．ＺｍＰＤＣ及びＺｍＡＤＨを産生する組込みＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＬＤＨ−突然変異体の作製
ＬＤＨ遺伝子の５８９ヌクレオチド（ＤＲ＿２３６４）を、野生型Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓにおいて、クロラムフェニコール耐性カセット（ＰｔｕｆＡプロモーター及びＰｔｕｆＢプロモーターの制御下にそれぞれＺｍＰＤＣ遺伝子及びＺｍＡＤＨ遺伝子が続く）により置換した。
【０１０５】
このＰＤＣ＋ＡＤＨ＋ＬＤＨ−突然変異体を作製するために、３つの以下のヌクレオチド配列：
−  ５’隣接相同領域（クロラムフェニコール耐性カセットが続く）を、プライマーＥＧ３１Ｆ及びＥＧ３２Ｒ（以下のリストを参照のこと）を用いて、ｐＤＲ−ＬＤＨｄｅｌを鋳型として使用して増幅させた
−  Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨ配列を、プライマーＥＧ３３Ｆ及びＥＧ３４Ｒ（以下のリストを参照のこと）を用いて、ｐＩ３−Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨを鋳型として使用して増幅させた
−  ３’隣接相同領域を、プライマーＥＧ３５Ｆ及びＥＧ３６Ｒ（以下のリストを参照のこと）を用いて、ｐＤＲ−ＬＤＨｄｅｌを鋳型として使用して増幅させた
をＰＣＲにより増幅した。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
これら３つのアンプリコンのライゲーション産物を使用して、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓを形質転換し、突然変異体ＰＤＣ＋ＡＤＨ＋ＬＤＨ−を得た（図８）。形質転換体を、クロラムフェニコール耐性について選択した。ＬＤＨ遺伝子の部分欠失、クロラムフェニコール耐性遺伝子ならびにＺｍＰＤＣ遺伝子及びＺｍＡＤＨ遺伝子のゲノム挿入を、適切なプライマーを使用したＰＣＲにより制御した。２つの二重クロスオーバー組込みクローン（１８−０６／１−１及び１８−０６／１−３と名付けた）を、代謝物分析のために選択した（表１及び４）。
【０１０８】
実施例４．Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１組換え体：アルコールデヒドロゲナーゼ活性
本発明者らは、アルデヒド産生及びＡＤＨ活性を、Ｃｏｎｗａｙ及び共同研究者（１９８７ｂ）の比色テストを用いて、ＺｍＰＤＣ遺伝子及びＺｍＡＤＨ遺伝子を有するプラスミドを用いて形質転換された異なる組換え体中で決定した。このテストは、エタノールからのＡＤＨにより産生されるアセトアルデヒドとロイコ色素との相互作用後に形成されるバイオレットシッフ塩基の形成に基づく。図６に示す通り、本発明の組換え体を、３７℃で、エタノール、パラローザニリン、及び亜硫酸水素ナトリウムを添加したＬＢ寒天プレート上で２〜３時間のインキュベーション後に、バイオレット中で着色する。この着色は、プラスミドｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣ−Ｐ−ＡＤＨ又はｐＩ３−ＤＲ−Ｐ−ＰＤＣｔａｇ−Ｐ−ＡＤＨｔａｇを用いて形質転換された組換え体の各クローンにおけるＡＤＨ活性を示す。これらの組換え体において、ＺｍＡＤＨ遺伝子転写を、ｔｕｆＢプロモーターにより制御した。
【０１０９】
実施例５．Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１組換え体：代謝物の産生
本発明の組換え体により産生された代謝物を分析した。
【０１１０】
本発明者らは、本発明の組換え体（例、クローン２４−０３／４−２、０３−０４／４−１、０３−０４／４−２）により産生される代謝物における変化を、野生型又は偽ベクター骨格ｐＩ３を用いて形質転換されたコントロール組換え体と比較して検出することができた（表２〜５を参照のこと）。特に、エタノールの産生が、異なる培養条件下で検出されたが、親株はエタノールを産生しない。
【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
【表３】
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各クローンについて、培養を３通りに実施する。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
各クローンについて、培養を３通りに実施する。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
各クローンについて、培養を３通りに実施する。
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
これらの結果は、このように、エタノール産生を、ストレス耐性細菌において、新たな代謝経路を操作することにより誘導又は増加することができることを実証する。結果は、さらに、ＬＤＨ欠損株が生存可能であること、及び、この遺伝子の不活化が本発明の細菌におけるエタノール産生をさらに増加させることを示す。また、結果は、株が、異なる型の基質を使用し、異なる型の培養液の下で増殖し、エタノールを産生しうることを示す。
【０１１９】
本発明の組換え株は、このように、ストレス耐性、培養条件、基質受け入れ、及び代謝物の産生という利点を組み合わせる。
【０１２０】
【表７】
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【図１】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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