(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌におけるピラジナミド、リファンピシンおよび／またはニューロキノン感受性の検出用キットであって：
結核菌におけるピラジナミド、リファンピシンおよび／またはニューロキノン感受性を検出するための試験片；
発色用試薬；および
ｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子増幅用プライマー対；
を含み、
該試験片において、少なくとも２つのプローブが固定されており、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、結核菌のｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子のサイレント変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、そして該サイレント変異を有する塩基配列の領域において、該サイレント変異以外の塩基の配列が野生型であり、
該プローブのうちの他のプローブが、結核菌のｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、そして該他のプローブが、それぞれ該試験片の異なる位置に固定され、そして
該サイレント変異を有する塩基配列の領域が、該野生型塩基配列の任意の領域のうちの１つとほぼ同じ領域であり、
該サイレント変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドおよび該領域とほぼ同じ領域の野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、該試験片の同じ位置に固定され、
該位置は、野生型またはサイレント変異を有する結核菌の遺伝子をｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子増幅用プライマー対で増幅し、発色用試薬を用いて試験片で検出した場合は発色し、
サイレント変異を有する塩基配列の領域に結核菌のピラジナミド、リファンピシンおよび／またはニューロキノン感受性の変異を有する結核菌の遺伝子をｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子増幅用プライマー対で増幅し、発色用試薬を用いて試験片で検出した場合は発色しない、
キット。
【請求項２】
結核菌におけるピラジナミド、リファンピシンおよび／またはニューロキノン感受性の検出用キットであって：
結核菌におけるピラジナミド、リファンピシンおよび／またはニューロキノン感受性を検出するための試験片；
発色用試薬；および
ｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子増幅用プライマー対；
を含み、
該試験片において、少なくとも２つのプローブが固定されており、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、結核菌のｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子のサイレント変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、そして該サイレント変異を有する塩基配列の領域において、該サイレント変異以外の塩基の配列が野生型であり、
該プローブのうちの他のプローブが、結核菌のｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、そして該他のプローブが、それぞれ該試験片の異なる位置に固定され、そして
該サイレント変異を有する塩基配列の領域が、該野生型塩基配列の任意の領域のうちの１つとほぼ同じ領域であり、
該サイレント変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドおよび該領域とほぼ同じ領域の野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、該試験片の同じ位置に固定され、
該試験片に、該プライマー対によって増幅された野生型またはサイレント変異を有する結核菌の遺伝子あるいは該プライマー対によって増幅された該サイレント変異を有する塩基配列の領域に結核菌のピラジナミド、リファンピシンおよび／またはニューロキノン感受性の変異を有する結核菌の遺伝子のうち、該プライマー対によって増幅された野生型またはサイレント変異を有する結核菌の遺伝子のみが結合する、
キット。
【請求項３】
前記野生型塩基配列の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが複数あり、該オリゴヌクレオチドが、前記ｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子の塩基配列のそれぞれ異なる領域とハイブリダイズし、そして該異なる領域によって該ｐｎｃＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子および／またはｇｙｒＡ遺伝子のコード配列またはその相補配列のほぼ全体が網羅される、請求項１または２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本では年間数千人が、地球規模では年間数百万人が結核により死亡しているといわれている。結核の治療は、基本的には化学療法を中心とする内科的療法であり、内科的療法では治療の目的を達成することが不可能な場合に外科療法が考慮される。
【０００３】
内科的療法で使用される結核治療の薬剤としては、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、エタンブトール（ＥＢ）、ニューキノロン（ＮＱ）などの多くの種類の薬剤が知られている。しかし、薬剤を患者に投与した場合、突然変異によって、投与した薬剤に対する耐性を有する耐性菌が生じることが問題となっている。１９９６年より使用が開始されたピラジナミド（以下、「ＰＺＡ」ともいう）についても、その耐性菌の出現が危惧されている。
【０００４】
結核患者が保有する結核菌の薬剤耐性について情報を得るために、結核菌の薬剤感受性試験が行われている。薬剤感受性試験は、所定の薬剤を含有する薬剤感受性試験用培地における菌体の増殖の有無により、該所定の薬剤に対する耐性の有無を検査する方法が一般的に行われている。例えば、薬剤感受性試験用培地としては、バクテックMGITTM960（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）、結核感受性ＰＺＡ液体培地（極東製薬株式会社）などが挙げられる。しかし、結核菌は増殖が遅く、結核菌の増殖の有無を確かめて耐性の有無を判断するまでに数週間を要するという問題がある。
【０００５】
薬剤耐性菌は、特定遺伝子が変異することにより薬剤耐性を獲得することが報告されている。そのため、特定遺伝子の変異を検出することによる薬剤耐性菌の検出法が開発されている。例えば、結核治療用薬剤に感受性である野生型結核菌およびいずれかの薬剤に耐性を有する変異型結核菌における結核菌ゲノム上の結核治療用薬剤耐性関連遺伝子の塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを固定化した基板を含む結核菌診断キットが開示されている（特許文献１）。現在開発されているＤＮＡマイクロアレイキット「Oligo Array」（日清紡績株式会社）は、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＳＭ、カナマイシン（ＫＭ）、およびＥＢの５薬剤に対する耐性に関与する遺伝子変異を検出し得るキットである。
【０００６】
ピラジナミド（ＰＺＡ）に対する耐性菌は、ピラジナミダーゼ（pyrazinamidase）をコードするｐｎｃＡ遺伝子の変異により耐性となることが報告されている（特許文献２、および非特許文献１〜５）。しかし、ＰＺＡ薬剤耐性に関連する遺伝子の変異はｐｎｃＡ遺伝子の全領域にわたって数多く存在することが知られており、またそのうちのいずれか１つの変異によりＰＺＡ耐性を獲得するといわれている。つまり、ＰＺＡ耐性菌を適切に検出するためには、いずれか１つの変異を漏らすことなく検出できなければならない。ＰＺＡ耐性に関連するｐｎｃＡ遺伝子変異には、さらに未知のものが存在する可能性があり、ＰＺＡ耐性菌検出のために早急にこれらの変異を突き止める必要がある。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ｐｎｃＡ遺伝子の全領域にわたって存在する変異を確実に検出するために、ｐｎｃＡ遺伝子の全領域を網羅可能な検出用プローブセットを開発した（特許文献３および４）。この検出用プローブセットは、各プローブが、野生型のｐｎｃＡ遺伝子とハイブリダイズ可能であるように設計されている。詳細には、この検出用プローブセットでは、ｐｎｃＡ遺伝子がプローブに結合すると発色するので、セット中の全てのプローブの発色は変異がないことを示し、したがってＰＺＡ感受性であると判定される。一方、ｐｎｃＡ遺伝子に変異がある場合は、ｐｎｃＡ遺伝子がその変異箇所に対応するプローブに結合しないため、発色しない。したがって、発色しないプローブがあれば、変異が存在すること、すなわち、ＰＺＡ耐性菌であることがわかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１０３９８１号公報
【特許文献２】特表２０００−５１２４９３号公報
【特許文献３】特開２００６−１８０７４６号公報
【特許文献４】特開２００６−１８０７５３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Korean Med Sci., 16巻, p.537-543 (2001)
【非特許文献２】Epidemiol. Infect., 128巻, p.337-342 (2002)
【非特許文献３】J. Clin. Microbiol., 40巻, 2号, p.501-507 (2002)
【非特許文献４】Microbiol. Drug, 3巻, 7号, p.223-228 (2001)
【非特許文献５】Scorpioら、Nat. Med., 2巻, 6号, p.662-667 (1996)
【非特許文献６】Siddiqiら、Antimicrob. Agents Chemother., 46巻, p.443-450 (2002)
【非特許文献７】Giannoniら、Antimicrob. Agents Chemother., 49巻, p.2928-2933 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
遺伝子変異には、塩基が置換しているが、コードするアミノ酸が変化しない、サイレント変異がある。また、塩基が置換し、コードするアミノ酸が変化しているが、薬剤感受性に影響を及ぼさない遺伝子多型（一塩基多型：ＳＮＰ）もある。例えば、プローブを用いる遺伝子の変異の検出において、タンパク質に影響を及ぼす（例えば、酵素活性を変化させる）変異とサイレント変異またはＳＮＰとが離れた位置に存在する場合には、タンパク質に影響を及ぼす変異のみを検出するようにプローブを設計し、サイレント変異またはＳＮＰについては考慮する必要がない。しかし、タンパク質に影響を及ぼす変異とサイレント変異またはＳＮＰとが非常に近い位置に存在する場合には、プローブによる検出範囲がこれらの変異またはＳＮＰの位置と重複し、それぞれの変異を確実に区別可能なプローブを設計することは困難である。そのため、タンパク質に影響を及ぼす変異の検出を目的としたプローブは、いずれか一方の変異またはＳＮＰが存在すれば検出される。このように、サイレント変異またはＳＮＰのみが存在する場合には、タンパク質に影響がないにもかかわらず、タンパク質に影響を及ぼす変異があるとの誤った検出結果を得るという問題がある。
【００１１】
本発明者らは、ｐｎｃＡ遺伝子においてもサイレント変異が存在し、このサイレント変異がＰＺＡ耐性に関連する変異の位置に非常に近い位置に存在することを見出した。さらに、ＲＥＰ感受性遺伝子であるＲＮＡポリメラーゼサブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子にもサイレント変異が存在し、ＲＥＰ耐性に関連する変異の位置に非常に近い位置に存在することが報告されている（非特許文献６）。また、ＮＱ感受性遺伝子であるＤＮＡジャイレースＡをコードするｇｙｒＡ遺伝子には、ＮＱ耐性に関連する変異の位置に非常に近い位置にＳＮＰが存在することが報告されている（非特許文献７）。このような薬剤感受性遺伝子において新たなサイレント変異またはＳＮＰが見出された場合に、薬剤耐性に関連する変異の位置に非常に近い位置に存在する可能性がある。そのため、例えば、上記のｐｎｃＡ遺伝子検出用プローブセットでは、サイレント変異のみを有しＰＺＡ感受性である結核菌を、ＰＺＡ耐性菌であると誤って判断し、その結果、このようなサイレント変異菌を保有する結核患者に対して、本来有効であるべきＰＺＡ投与による治療が施されないという問題を生じる。このように、薬剤感受性菌についての誤検出を防止するための手段が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、サイレント変異またはＳＮＰに対応するプローブと野生型に対応するプローブとの両方を用いることによって、薬剤感受性についてより確実に判定できることを見出した。
【００１３】
本発明は、結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片を提供し、
該試験片には、少なくとも２つのプローブが固定されており、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、結核菌の薬剤感受性遺伝子のサイレント変異または遺伝子多型を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、そして該サイレント変異を有する塩基配列の領域において、該サイレント変異以外の塩基の配列が野生型であり、
該プローブのうちの他のプローブが、結核菌の薬剤感受性遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、そして該他のプローブが、それぞれ該試験片の異なる位置に固定され、そして
該サイレント変異を有する塩基配列の領域が、該野生型塩基配列の任意の領域のうちの１つとほぼ同じ領域である。
【００１４】
好適な実施態様では、上記野生型塩基配列の任意の領域とハイブリダイズし得る複数のオリゴヌクレオチドは、上記薬剤感受性遺伝子の塩基配列のそれぞれ異なる領域とハイブリダイズし、そして該異なる領域によって該薬剤感受性遺伝子のコード配列またはその相補配列のほぼ全体が網羅される。
【００１５】
さらなる実施態様では、上記サイレント変異または遺伝子多型を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドおよび該領域とほぼ同じ領域の野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、上記試験片の同じ位置に固定される。
【００１６】
ある実施態様では、上記薬剤感受性遺伝子は、ピラジナミド感受性遺伝子、リファンピシン感受性遺伝子、またはニューキノロン感受性遺伝子である。
【００１７】
１つの実施態様では、上記ピラジナミド感受性遺伝子は、ｐｎｃＡ遺伝子である。
【００１８】
他の１つの実施態様では、上記リファンピシン感受性遺伝子は、ｒｐｏＢ遺伝子である。
【００１９】
さらに他の１つの実施態様では、上記ニューキノロン感受性遺伝子は、ｇｙｒＡ遺伝子である。
【００２０】
本発明はまた、上記いずれかの試験片を含む、結核菌における薬剤感受性の検出用キットを提供する。
【００２１】
１つの実施態様では、上記キットは、さらに、発色用試薬および薬剤感受性遺伝子増幅用プライマー対を含む。
【００２２】
本発明はさらに、結核菌における薬剤感受性を検出する方法を提供し、該方法は、
試料中の結核菌の薬剤感受性遺伝子を抽出する工程、
該抽出した薬剤感受性遺伝子を上記のいずれかの試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
該プローブに結合した薬剤感受性遺伝子を発色させる工程
を含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、新たにサイレント変異またはＳＮＰが見出された場合には、その変異に対応するプローブを設計し、野生型に対応するプローブとともに試験片に配置すればよい。本発明の結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片は、このようなプローブを有するので、この試験片を用いると、サイレント変異またはＳＮＰのみを有する薬剤感受性菌を薬剤耐性であると誤検出することなく、より確実に薬剤感受性を検出することができる。その結果、薬剤感受性結核菌を保有する結核患者に対して、適切な治療を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】結核菌のｐｎｃＡ遺伝子の塩基配列および設計したプローブの位置の関係を示す図である。
【図２】本発明の試験片（混合型試験片）および従来型試験片を用いた、野生型、Ｓ６５Ｓサイレント変異型、およびＰ６２Ｌ変異型の各結核菌のＰＺＡ感受性検出の結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明において、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の薬剤感受性遺伝子とは、結核治療用薬剤の作用に関連する遺伝子をいう。薬剤耐性菌では、この野生型の薬剤感受性遺伝子に変異が生じ、結核治療用薬剤の作用に対する薬剤耐性が獲得される。具体的には、変異を持つ薬剤感受性遺伝子から発現した酵素では、構成するアミノ酸配列において置換、挿入および／または欠落が生じているため、酵素活性の低下や薬剤結合部位の構造変化が生じ、結核治療用薬剤の効果が抑制される。
【００２６】
このような薬剤感受性遺伝子としては、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、エタンブトール（ＥＢ）、ニューキノロン（ＮＱ）、ピラジナミド（ＰＺＡ）などの作用に関連する遺伝子が挙げられる。具体的には、ｒｐｏＢ（ＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットをコードする）、ｋａｔＧ（カタラーゼペルオキシダーゼをコードする）、ｉｎｈＡ（エノイルＣｏＡレダクターゼをコードする）、ｇｙｒＡおよびｇｙｒＢ（ＤＮＡジャイレースＡおよびＢをコードする）、ｒｐｓＬ（リボソームタンパク質Ｓ１２をコードする）、ｒｒｓ（１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする）、ｐｎｃＡ（ピラジナミダーゼをコードする）などが挙げられる。
【００２７】
以下、具体的にｐｎｃＡ、ｒｐｏＢ、およびｇｙｒＡを例に挙げて、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
（ピラジナミダーゼをコードするｐｎｃＡ遺伝子）
結核菌のＰＺＡ耐性は、ピラジナミダーゼをコードするｐｎｃＡ遺伝子の変異により生じ得る。野生型の結核菌が保有するｐｎｃＡ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的な配列である。配列番号１に記載の塩基配列８１位〜８３位の塩基ＡＴＧはタンパク質合成の開始コドンに該当し、５５９位〜５６１位は終止コドンに該当する。すなわち、この８１〜５６１位はピラミナミダーゼのコード配列であり、ピラミナミダーゼのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示すとおりである。−８０位〜−１位の塩基は、タンパク質合成の上流部分に該当する。
【００２９】
（ｐｎｃＡ遺伝子の変異）
本発明におけるＰＺＡ耐性菌となり得るｐｎｃＡ遺伝子の変異の位置は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のコード配列中（１位から５６１位まで）に、さらには−２０位から５６１位までに存在し得るｐｎｃＡ遺伝子の変異が挙げられる。ＰＺＡ耐性を誘導するｐｎｃＡ遺伝子の変異は既知のものが多数存在しており、これらは、例えば、特許文献３および４ならびに非特許文献１〜５に開示されている。これらの変異のうち、いずれか１つの変異があれば、ＰＺＡ耐性結核菌となり得る。
【００３０】
ｐｎｃＡ遺伝子には、上記の変異以外に、サイレント変異も存在することを新たに見出した。サイレント変異とは、上記のように、野生型の塩基が変異（置換）されているが、コードするアミノ酸は変化しないため、酵素活性に影響を及ぼさない変異をいう。具体的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列の２７５位の塩基ＣからＴへの変異、ならびに２６０位の塩基ＣからＴへの変異が挙げられる（図１の白抜き矢印の位置）。これらのサイレント変異の位置は、いずれも上記のＰＺＡ耐性に関連する変異（図１の細い矢印および太い矢印の位置）に非常に近い位置に存在する。
【００３１】
上記のｐｎｃＡ遺伝子のサイレント変異は次のようにして見出された。まず、結核患者から喀痰を採取し、雑菌除去し、培養をする。雑菌除去法として、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）・水酸化ナトリウム法が挙げられる。具体的には、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ（４％ＮａＯＨ（ｍｌ）：２．９％クエン酸ナトリウム水溶液（ｍＬ）：ＮＡＬＣ（ｇ）＝１００：１００：１）の雑菌処理溶液を喀痰に２倍量加え、５〜２０秒間混和した。その後、時々混和しながら１５分間室温に放置し、さらにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ６．８）を加え混和した。遠心分離後、上清を捨て、沈渣をＰＢＳに懸濁させ、得られた結核菌をミドルブルック７Ｈ９液体培地（ベクトン・ディッキンソン社）の結核菌分離培地で培養し、分離された結核菌を最終濃度１００ｍｇ／ＬのＰＺＡを含むミドルブルック７Ｈ１２液体培地（ベクトン・ディッキンソン社）でＰＺＡ感受性試験を行った。具体的には、結核菌にＰＺＡを加えて数日間培養後、硫酸鉄アンモニウムを加えてピラジナミダーゼ活性の有無を測定した。以上のような検査から、ＰＺＡ感受性であると判別された結核菌からゲノムＤＮＡを、フェノール抽出法で抽出し、シークエンサーで塩基配列を解析した。
【００３２】
ｐｎｃＡ遺伝子上の上記変異を検出する方法としては、Nollauら, Clin. Chem., 43, 1114-1120 (1997)、「突然変異検出のための研究室プロトコル」（Landegren, U.ら, Oxford University Press (1996)）、および「ＰＣＲ」第２版（Newtonら, BIOS Scientific Publishers Limited (1997)）などに記載されている通常用いられる手段が適用できる。具体的には、例えば、ＰＣＲ断片シークエンシング法、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ法：Orita, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(8), 2766-2770 (1989)）、ヘテロ二本鎖変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法：Sheffield, V. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(1), 232-236 (1989)）、インベーダー法（Griffin, T. J.ら, Trend Biotech, 18, 77 (2000)）、ＳｎｉＰｅｒＴＭ法（Amersham pharmacia biotech）、タックマンＰＣＲ法（Livak, K. J., Genel. Anal., 14, 143 (1999)；Morris, T.ら, J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Griffin, T. J.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96(11), 6301-6 (1999)）、制限酵素長多型解析法（ＲＦＬＰ：Murray, J. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80(19), 5951-5955 (1983)）、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法（Kokoris, K.ら, J. Med. Genet., 36, 730 (1999)）、ＭａｓｓｃｏｄｅＴＭ法（Qiagen Genomics）などに例示される公知の方法から選択され得るが、これらに限定されるものではない。遺伝子変異を検出する方法であれば、あらゆる手段を適用することができる。例えば、ＰＣＲ−配列特異的オリゴプローブ（ＳＳＯＰ：sequence-specific oligonucleotide probes）法を用いることもできる。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法とは、変異部位を含む約１０〜約３０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、変異部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法によりで増幅した後、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。
【００３３】
（ＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子）
結核菌のＲＥＰ耐性は、ＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子の変異により生じ得る。野生型の結核菌が保有するｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号５７に記載の塩基配列またはその相補的な配列である。配列番号５７に記載の塩基配列１位〜３位の塩基ＧＴＧはタンパク質合成の開始コドンに該当し、３５３２位〜３５３４位は終止コドンに該当する。すなわち、この１〜３５３４位はＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットのコード配列であり、ＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットのアミノ酸配列は、配列表の配列番号５８に示すとおりである。
【００３４】
（ｒｐｏＢ遺伝子の変異）
本発明におけるＲＥＰ耐性菌となり得るｒｐｏＢ遺伝子の変異の位置は、配列表の配列番号５７に記載の塩基配列のコード配列中（１位から３５３４位まで）に存在し得るｒｐｏＢ遺伝子の変異が挙げられる。ＲＥＰ耐性を誘導するｒｐｏＢ遺伝子の変異は既知のものが多数存在しており、これらは、例えば、非特許文献６に開示されている。これらの変異のうち、いずれか１つの変異があれば、ＲＥＰ耐性結核菌となり得る。
【００３５】
ｒｐｏＢ遺伝子には、上記のようにサイレント変異も存在する。具体的には、配列表の配列番号５７に記載の塩基配列またはその相補配列の１３０６位の塩基ＣからＴへの変異、ならびに１３３８位の塩基ＧからＡへの変異が挙げられる。これらのサイレント変異の位置は、いずれも上記のＲＥＰ耐性に関連する変異、具体的には、配列表の配列番号５７に記載の塩基配列またはその相補配列の１３０２位のＣからＡへの変異、１３０５位のＧからＴへの変異、１３２８位のＡからＣへの変異、ならびに１３３９〜１３４０位のＴＣからＣＡへの変異に非常に近い位置に存在する。
【００３６】
（ＤＮＡジャイレースをコードするｇｙｒＡ遺伝子）
結核菌のＮＱ耐性は、ＤＮＡジャイレースをコードするｇｙｒＡ遺伝子の変異により生じ得る。野生型の結核菌が保有するｇｙｒＡ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号６３に記載の塩基配列またはその相補的な配列である。配列番号６３に記載の塩基配列１位〜２５１７位の塩基ＡＴＧはタンパク質合成の開始コドンに該当し、２５１５位〜２５１７位は終止コドンに該当する。すなわち、この１〜２５１７位はＤＮＡジャイレースのコード配列であり、ＤＮＡジャイレースのアミノ酸配列は、配列表の配列番号６４に示すとおりである。
【００３７】
（ｇｙｒＡ遺伝子の変異）
本発明におけるＮＱ耐性菌となり得るｇｙｒＡ遺伝子の変異の位置は、配列表の配列番号６３に記載の塩基配列のコード配列中（１位から２５１７位まで）に存在し得るｇｙｒＡ遺伝子の変異が挙げられる。ＮＱ耐性を誘導するｇｙｒＡ遺伝子の変異は既知のものが多数存在しており、これらは、例えば、非特許文献７に開示されている。これらの変異のうち、いずれか１つの変異があれば、ＮＱ耐性結核菌となり得る。
【００３８】
ｇｙｒＡ遺伝子には、ＳＮＰが存在する。具体的には、配列表の配列番号６３に記載の塩基配列またはその相補配列の２８４位の塩基ＧからＣへの変異であり、コードするアミノ酸はセリンからトレオニンに変異している。このＳＮＰの位置は、上記のＮＱ耐性に関連する変異、具体的には、配列表の配列番号６３に記載の塩基配列またはその相補配列の２８０位のＧからＡへの変異、ならびに２８１位のＡからＣまたはＧへの変異に非常に近い位置に存在する。
【００３９】
（プローブ）
本発明の結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片に用いられるプローブとしては、薬剤感受性遺伝子のサイレント変異またはＳＮＰを有する領域に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「サイレント変異プローブ」または「ＳＮＰプローブ」という場合がある）、ならびに野生型の薬剤感受性遺伝子の任意の領域と結合し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「野生型プローブ」という場合がある）が挙げられる。各プローブの長さは、結合（ハイブリダイズ）させる時の温度にもよるが、一般的には１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２６ヌクレオチド長である。
【００４０】
本発明において、サイレント変異プローブまたはＳＮＰプローブは、サイレント変異またはＳＮＰのみを有する領域に結合（ハイブリダイズ）可能であり、このようなサイレント変異またはＳＮＰのみを有する領域は、サイレント変異またはＳＮＰ以外の塩基の配列が野生型である。この領域が野生型である場合ならびに他の変異を含む場合には、サイレント変異プローブまたはＳＮＰプローブはこの領域に結合できない。例えば、ｐｎｃＡ遺伝子の場合、サイレント変異としては、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列の２７５位の塩基ＣからＴへの変異；および配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列の２６０位の塩基ＣからＴへの変異が挙げられる。また、確実にサイレント変異を認識するために、サイレント変異プローブを構成するオリゴヌクレオチドの中程にサイレント変異の位置が存在するように設計することが好ましい。
【００４１】
本発明において、野生型プローブは、野生型の薬剤感受性遺伝子の任意の領域と結合し得る。薬剤感受性を検出するためには、少なくとも薬剤耐性菌に関連する上記の変異をもれなく検出することが重要である。そこで、本発明において、好適には、野生型プローブは、薬剤感受性遺伝子のほぼ全体を網羅するように設計される。例えば、ｐｎｃＡ遺伝子については、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはこれに相補的な塩基配列のコード配列のほぼ全体を網羅するように、例えば、−２０位から５６０位までの塩基、つまり合計５８０塩基に結合（ハイブリダイズ）可能なように設計される。
【００４２】
例えば、ｐｎｃＡ遺伝子の上流側または下流側から順にプローブを設計し、隣接するプローブと約４〜７塩基重なるように配置すれば、その配置する領域の境界位置に変異が存在したとしても、どちらかのプローブが結合することができるので、好ましい。したがって、例えば、−２０位から５６０位までの合計５８０塩基を検出するための全プローブ数は、全てのプローブの長さを３０に統一し、各プローブが隣接するプローブと４塩基ずつ重なると想定すれば、少なくとも２２個以上であり、好ましくは３０個以上、より好ましくは３５個以上、さらに好ましくは４０個以上である。
【００４３】
本発明においては、野生型プローブとして、上記の各サイレント変異プローブまたはＳＮＰプローブの結合可能領域とほぼ同じ領域に結合し得るように設計された野生型プローブ（以下、「サイレント対応野生型プローブ」または「ＳＮＰ対応野生型プローブ」という場合がある）が必要である。ｐｎｃＡ遺伝子を例に挙げると、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列の２７５位または２６０位の変異を含む領域に結合可能なサイレント変異プローブに対して、ほぼ同じ領域に結合可能な野生型プローブが設計される。ほぼ同じ領域とは、全く同じ領域であっても、１〜２塩基長い／短い範囲の領域であってもよい。そのため、これらの領域においては、サイレント変異が存在する場合ならびに野生型の（変異がない）場合のいずれにおいても、少なくとも一方のプローブが結合し得、そしてサイレント変異以外の変異が存在する場合には両プローブとも結合しない。
【００４４】
上記の各プローブは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。
【００４５】
さらに、各プローブは、以下で詳述するように、試験片に固定するために５’または３’末端のいずれか一方が修飾されていてもよい。
【００４６】
（試験片）
本発明の、結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片は、少なくとも２つのプローブが固定されている。固定されているプローブのうちの少なくとも１つのプローブは、上記サイレント変異プローブまたはＳＮＰプローブであり、そして他のプローブは、試験片のそれぞれ異なる位置に固定された野生型プローブであり、サイレント対応野生型プローブまたはＳＮＰ対応野生型プローブを含む。
【００４７】
上記のように、好適には、試験片に固定された野生型プローブは、薬剤感受性遺伝子のコード配列またはその相補配列のほぼ全体を網羅するように設計されており、より好適には、プローブは、結合する塩基配列の順に上流側または下流側から一定の間隔で配置されている。さらに、発色を確認するためのコントロールまたはマーカーが固定されていてもよい。
【００４８】
さらに好適には、サイレント変異プローブとサイレント対応野生型プローブとは、あるいはＳＮＰプローブとＳＮＰ対応野生型プローブとは、試験片の同じ位置に固定される。サイレント変異プローブとサイレント対応野生型プローブとは、あるいはＳＮＰプローブとＳＮＰ対応野生型プローブとは、それぞれを別々に同じ位置に重ねて固定してもよく（順序は問わない）、あるいはこれらのプローブを混合して固定してもよい。この位置では、これらのプローブが結合する領域に、サイレント変異またはＳＮＰ以外の変異が存在する場合には薬剤感受性遺伝子が結合せず、変異がないまたはサイレント変異またはＳＮＰのみが存在する場合には薬剤感受性遺伝子が結合する。したがって、薬剤耐性の場合は結合せず、薬剤感受性の場合は結合する。
【００４９】
本発明の試験片は、上記プローブを担体表面上に物理的または化学的に固定して作成することができる。担体としては、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されない。成形加工性が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。これらの担体は、発色法での検知において、その発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。
【００５０】
上記プローブは、種類ごとに一定間隔で上記担体に配置される。これらの担体表面にプローブを物理的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法があり、この方法によれば、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる。プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定化の効率を上げる方法もある。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液をディスペンサからニトロセルロース膜上に吐出して、紫外線を照射することによって、比較的容易に種々のプローブを固定化することができる。具体的には、各プローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５〜１．０μＬ／分の量を吐出させながら２．５〜８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが、一定の間隔で並んだ約１〜２ｍｍの幅のストライプとして塗布される。このプローブのストライプが塗布された担体に紫外線を照射することによって、プローブが担体上に固定される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に配置された多数の試験片を一挙に得ることができる。
【００５１】
担体表面が金などの金属材料である場合には、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理することにより、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を介して固定化の効率がよくなることも知られている。
【００５２】
プローブに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、プローブの末端をトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾する方法があり、修飾プローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより試験片が得られる。あるいは、ガラス、シリコンなどの無機材料担体をアミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、担体の表面をアミノ化し、次いで、末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させることにより、プローブを固定化する方法もある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、この修飾プローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより固定化することができる。
【００５３】
また、合成されたプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、所望の配列を有するプローブを担体表面上で直接合成する方法も知られている。
【００５４】
（試験片を用いた薬剤感受性検出方法）
１．検体
本発明において、「検体」は、通常、結核菌検査に必要な検体であればよい。例えば、喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物および／または組織生検物などの体液、ならびにこれらから培養して得られた結核菌自体が挙げられる。
【００５５】
２．検体の前処理（ＤＮＡの抽出）
上記検体からのＤＮＡの抽出は、公知の方法で行うことができる。例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。検体を前処理したものを本明細書において「試料」という。
【００５６】
３．核酸の増幅
ＰＣＲ法で核酸を増幅する場合、例えば、以下の工程で行われる：（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程；（２）該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程；（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程；ならびに（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返す工程。例えば、ｐｎｃＡ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマー対として、全ての変異部位を含むｐｎｃＡ遺伝子を増幅し得るように、全ての変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流の配列と同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいプライマー対の例としては、配列表の配列番号５３および５４のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５７】
また、測定の感度を向上させるために、例えば、検体から直接ＤＮＡを増幅させる場合、上記ＰＣＲ反応の前にさらにNestedＰＣＲ法（特公平６−８１６００号公報）などで核酸を増幅してもよい。NestedＰＣＲ法におけるプライマーは、上記ＰＣＲ反応において用いたプライマーよりも外側の配列を選択することができる。例えば、ｐｎｃＡ遺伝子の増幅の場合には、配列表の配列番号５５および５６のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５８】
上記のプローブおよびプライマーの配列は、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社製）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。
【００５９】
４．結核菌の薬剤感受性検出方法
本発明において、結核菌の薬剤感受性は、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法によって検出することができる。より簡便には、固定されたプローブの数と、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットの数を比較することにより検出することもできる。例えば、上記のプローブが固定された試験片を使用する場合、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法におけるハイブリダイズは、非特異吸着反応が起きにくい点で、約６０〜６５℃の温度で行うことが好ましい。検出されたスポットの数が、固定されたプローブの数と同数であれば、結核菌は変異を有さない、すなわち薬剤感受性であり、検出スポット数が固定プローブ数より少なければ結核菌は薬剤耐性であると判断することができる。
【００６０】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットの数を容易にカウントするためには、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質を修飾したプライマー対を用いて遺伝子を増幅することが好ましい。上記標識物質を用いた検出方法のうち、比較的安価で容易に実施できる点で、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法が好ましい。具体的には、以下のとおりに行われる。まず、上記プライマーの３’または５’末端にビオチンを修飾したプライマー対を用いて、末端にビオチンを有する遺伝子を増幅する。次いで、増幅した遺伝子と試験片に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションによってプローブに結合させ、さらにアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンに接触させて、プローブと結合している遺伝子の末端に存在するビオチンに結合させる。さらに、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えてアルカリホスファターゼと反応させることにより、プローブに結合しているアルカリホスファターゼが存在する位置で発色させる。この発色は視認可能である。
【００６１】
（試験片を含む検出用キット）
本発明の検出用キットは、上記の試験片を含む。好適には、結核菌の薬剤感受性を検出するために適切な任意の試薬類を含み得る。例えば、上記のＤＮＡの抽出のための試薬、遺伝子増幅用試薬、プローブへの遺伝子の結合を検出するための試薬などが挙げられる。具体的なキットとして、上記のＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を実施するためのキットを例示する。
【００６２】
本発明のキットに含まれ得るＤＮＡの抽出のための試薬は、上記の任意の手法で用いられる試薬である。
【００６３】
薬剤感受性遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマー対も、本発明のキットに含まれ得る。プライマー対は、全ての変異部位を含む薬剤感受性遺伝子を増幅し得るように、全ての変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流の配列と同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。例えば、ＰＺＡ感受性の検出には、好ましいプライマー対の例としては、配列表の配列番号５３および５４のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。測定の感度を向上させるためのNestedＰＣＲ法におけるプライマー対はとしては、例えば、上記の配列表の配列番号５５および５６のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６４】
さらに、上記プライマー対は、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出を容易にするために、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などで修飾されていることが好ましい。
【００６５】
また、遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法以外にも、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの公知の技術が挙げられる。本発明においては、これらのいずれかの手法を用いてもよく、本発明にはこれらの手法で用いられる任意の試薬を含むキットも含まれる。
【００６６】
さらに、本発明のキットは、検出のための試薬類を含み得る。例えば、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法を採用する場合は、ストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼ、ＮＢＴ、およびＢＣＩＰが挙げられる。
【実施例】
【００６７】
（実施例１：ピラジナミド感受性試験）
１．試験用溶液の調製
ミドルブック液体培地（ベクトン・ディッキンソン社）に、最終濃度１００ｍｇ／Ｌのピラジナミドおよび蛍光発色基質であるトリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン塩化ルテニウム五水和物を溶解して試験用培地を調製した。
【００６８】
２．ピラジナミド感受性試験
結核患者２５５名の喀痰から精製培養した結核菌を上記試験用溶液に添加し、３７℃で４日間から２１日間培養した。ＰＺＡが添加されていないチューブで発育が観察され、ＰＺＡが添加されたチューブで発育が認められない場合を感受性とした。発育の確認は発育とともに増加する蛍光発色の有無により行った。その結果、２２７検体がＰＺＡに感受性を有することが明らかとなった。
【００６９】
（実施例２：ピラジナミド感受性結核菌の遺伝子解析）
１．ｐｎｃＡ遺伝子の抽出
実施例１でピラジナミド感受性結核菌と判定された２２７検体からフェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。
【００７０】
２．ｐｎｃＡ遺伝子の増幅
次に、以下に示すプライマーを用いてｐｎｃＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルにより、増幅を行った。
【００７１】
プライマー１ ggcagtttgc ctaccgacgc （配列番号５３）
プライマー２ ccaacagttc atcccggttc g （配列番号５４）
【００７２】
３．ピラジナミド感受性結核菌の遺伝子解析
増幅された２２７例のｐｎｃＡ遺伝子の塩基配列をシークエンサーで調べた。その結果、新たな変異：Ｓｅｒ６５Ｓｅｒ［ｔｃＣ→ｔｃＴ］（図１のプローブ１７上の白抜き矢印）が２２７例中６例において発見された。この変異は、塩基が置換されているにもかかわらずコードされるアミノ酸が変化しないサイレント変異であった。
【００７３】
（実施例３：試験片の作製）
１．野生型プローブの設計
特許文献３および４に記載の塩基の変異（図１の細い矢印の位置）ならびに新たに見出された変異Ｐｒｏ６２Ｌｅｕ［ｃＣｇ→ｃＴｇ］（図１の太い矢印の位置）のいずれかを検出し得るプローブとして、以下に示すプローブ１〜４７（それぞれ、配列番号３〜１８、２１、および２３〜５２に対応）を構築した。図１に、これらのプローブの位置関係を示す。
【００７４】
プローブ１  cgcatacgtc caccatacgt tcgg（配列番号３）
プローブ２  atgatcaacg cccgcatac（配列番号４）
プローブ３  cacgtcgacg atgatcaacg（配列番号５）
プローブ４  gtcgttctgc acgtcgac（配列番号６）
プローブ５  ccaccctcgc agaagtcgtt（配列番号７）
プローブ６  cgagccaccc tcgcagaag（配列番号８）
プローブ７  gttaccgcca gcgagccacc（配列番号９）
プローブ８  agcgcggcgc caccggttac cg（配列番号１０）
プローブ９  gtagtcgctg atggcgcggg ccagcgcg（配列番号１１）
プローブ１０  gccaggtagt cgctgatggc gc（配列番号１２）
プローブ１１  tggtagtccg ccgcttcggc caggta（配列番号１３）
プローブ１２  ggttgccacg acgtgatggt ag（配列番号１４）
プローブ１３  gatgtggaag tccttggttg c（配列番号１５）
プローブ１４  cgggtcgatg tggaagtc（配列番号１６）
プローブ１５  tggtcacccg ggtcgatgt（配列番号１７）
プローブ１６  cggtgtgccg gagaagtggt ca（配列番号１８）
プローブ１７  cgacgaggaa tagtccggtg t（配列番号２１）
プローブ１８  tgcggtggcc acgacga（配列番号２３）
プローブ１９  cgctgacgca atgcggtg（配列番号２４）
プローブ２０  cgccgggagt accgctg（配列番号２５）
プローブ２１  aagtccgcgc cgggagta（配列番号２６）
プローブ２２  gtccagactg ggatggaagt cc（配列番号２７）
プローブ２３  cctcgattgc cgacgtgtcc ag（配列番号２８）
プローブ２４  ccttgtagaa caccgcctcg a（配列番号２９）
プローブ２５  tccggtgtag gcacccttgt ag（配列番号３０）
プローブ２６  aagccgctgt acgctccggt（配列番号３１）
プローブ２７  ctcgtcgact ccttcgaagc cg（配列番号３２）
プローブ２８  tggcgtgccg ttctcgtcga（配列番号３３）
プローブ２９  gcagccaatt cagcagtggc gt（配列番号３４）
プローブ３０  cgccgcgttg ccgcagccaa（配列番号３５）
プローブ３１  atcgacctca tcgacgccgc（配列番号３６）
プローブ３２  tggcaatacc gaccacatcg ac（配列番号３７）
プローブ３３  cacacaatga tcggtggcaa ta（配列番号３８）
プローブ３４  ggccgtctgg cgcacacaat（配列番号３９）
プローブ３５  cgtaccgcgt cctcggccgt（配列番号４０）
プローブ３６  aagccattgc gtaccgcgtc（配列番号４１）
プローブ３７  ccagcaccct ggtggccaag ccat（配列番号４２）
プローブ３８  gtcaggtcca ccagcaccct gg（配列番号４３）
プローブ３９  cacccgctgt caggtccacc ag（配列番号４４）
プローブ４０  tcggccgaca cacccgct（配列番号４５）
プローブ４１  ggtggtatcg gccgacac（配列番号４６）
プローブ４２  cggcgacggt ggtatcgg（配列番号４７）
プローブ４３  ccagcgcggc gacggt（配列番号４８）
プローブ４４  cgcatctcct ccagcgcggc（配列番号４９）
プローブ４５  cggtgcgcat ctcctccag（配列番号５０）
プローブ４６  actcgacgct ggcggtgc（配列番号５１）
プローブ４７  gagctgcaaa ccaactcgac（配列番号５２）
【００７５】
２．サイレント変異プローブの設計
上記実施例２の解析により見出されたサイレント変異は、上記プローブ１７が結合し得る領域に存在する。したがって、以下のサイレント変異プローブ（プローブ１７Ｓ：配列番号２２）を構築した（図１を参照のこと）。
【００７６】
プローブ１７Ｓ  acgacgaaga atagtccggt gt（配列番号２２）
【００７７】
３．プローブの固定化
上記プローブ１〜４７（配列番号３〜１８、２１、および２３〜５２に記載の塩基配列）ならびにプローブ１７Ｓ（配列番号２２に記載の塩基配列）のそれぞれの５’末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ）を０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬ、オリゴヌクレオチドプローブ（５０ｍＭ）を２μＬ、製品添付の反応緩衝液を２μＬ、および精製水３．６μＬを混合して反応溶液を調製し、３７℃で４時間反応させた後、１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを加えることにより、ポリチミン付加されたオリゴヌクレオチドプローブ１ｐｍｏｌ／μＬを得た。
【００７８】
次いで、ポリチミン付加された野生型プローブ（プローブ１〜４７）をそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．７μＬ／分の量を吐出させながら２．５ｍｍ／秒の塗布速度で、２ｍｍの幅のストライプになるようにニトロセルロース膜（縦７５ｍｍ×横１５０ｍｍ：Whatman社）上に２ｍｍ間隔で縦方向に塗布した。さらに、サイレント変異プローブ（プローブ１７Ｓ）もディスペンサに入れ、プローブ１７の塗布位置に重ねて同様に塗布した。その後、これらのニトロセルロース膜に３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して、プローブを固定化した。次いで、ニトロセルロース膜を、全てのストライプを含むように切断して、５ｍｍ×１５０ｍｍの試験片（混合型試験片という）を作成した。
【００７９】
（比較例１：従来型試験片の作製）
サイレント変異プローブ（プローブ１７Ｓ）を塗布しなかったこと以外は、上記実施例３の３．と同様に操作して、野生型プローブ（プローブ１〜４７）のみを固定した試験片（従来型試験片という）を作成した。
【００８０】
（実施例４：試験片を用いたｐｎｃＡ遺伝子のＰＺＡ感受性の検出）
１．ｐｎｃＡ遺伝子の増幅
本実施例では、結核菌自体を検体とし、ｐｎｃＡ遺伝子のＰＺＡ感受性の検出を行った。用いた検体の結核菌は、野生型、Ｓ６５Ｓサイレント変異型、およびＰ６２Ｌ変異型であった。ＰＺＡ耐性菌を検出するために、検体中に存在し得るＰＺａｓｅ関連遺伝子であるｐｎｃＡ遺伝子を増幅する必要がある。そこで、まず、NestedＰＣＲ法によって、検体からｐｎｃＡ遺伝子を増幅した。Nestedプライマーとして、以下のものを使用した（図１を参照のこと）。
【００８１】
Nestedプライマー１  cagatatagg gccatgacgc c（配列番号５５）
Nestedプライマー２  cttgcggcga gcgctc（配列番号５６）
【００８２】
NestedＰＣＲの反応条件は、変性工程を９０℃、６０秒、アニール工程を５５℃、６０秒、鎖伸長工程を２７℃、６０秒とし、これらの工程を３０サイクル行って、ｐｎｃＡ遺伝子のより上流部分からより下流部分までのやや広い範囲の遺伝子を増幅した。
【００８３】
次いで、上記NestedＰＣＲ法で増幅した遺伝子をテンプレートとして、以下のプライマーを用いて（図１を参照のこと）、ＰＣＲ法でさらにｐｎｃＡ遺伝子を増幅し、ＤＮＡ溶液を得た。配列表の配列番号５３に記載の塩基配列からなるプライマー１、配列番号５４に記載の塩基配列からなりかつ５’末端にビオチンを結合させたプライマー２、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いたＰＣＲ法により、ｐｎｃＡ遺伝子の増幅を行った。各プライマーの塩基配列は以下に示すとおりである。
【００８４】
プライマー１  ggcagtttgc ctaccgacgc（配列番号５３）
プライマー２  ccaacagttc atcccggttc g（配列番号５４）
【００８５】
ＰＣＲの反応条件は、変性工程を９４℃、３０秒、アニール工程を５５℃、２０秒、鎖伸長工程を７２℃、２０秒とし、これらの工程を３０サイクル行って、ｐｎｃＡ遺伝子を増幅した。これにより増幅されたＤＮＡには、末端にビオチンが結合している。
【００８６】
２．プローブを用いた検出
増幅したＤＮＡ溶液１０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（１０μＬ）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを１本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液（１ｍＬ）、および上記実施例３で作成した混合型試験片を加え、反応温度６２℃の下で３０分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、試験片上の各プローブと結合している遺伝子の末端に存在するビオチンに結合させた。さらに、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、試験片上の各プローブに結合したアルカリホスファターゼが存在する位置で発色させた。結果を図２に示す。
【００８７】
混合型試験片においては、野生型結核菌およびＳ６５Ｓサイレント変異型結核菌の両方とも、全てのプローブ位置で発色が確認され、ＰＺＡ感受性であると判定され、そしてＰ６２Ｌ変異型結核菌は、プローブ１７の位置（図２において黒矢尻で示す位置）での発色が見られず、ＰＺＡ耐性と判定された。このように、混合型試験片を用いることにより、Ｓ６５Ｓサイレント変異型結核菌について、ＰＺＡ感受性であるという正しい判定を行うことができた。
【００８８】
（比較例２：従来型試験片を用いたｐｎｃＡ遺伝子のＰＺＡ感受性の検出）
混合型試験片の代わりに上記比較例１で作成した従来型試験片を用いたこと以外は、上記実施例４と同様に操作して、各結核菌についてのＰＺＡ感受性の検出を行った。結果を図２にまとめて示す。
【００８９】
従来型試験片においては、野生型結核菌のみが全てのプローブ位置で発色が確認され、ＰＺＡ感受性であると判定された。Ｓ６５Ｓサイレント変異型結核菌およびＰ６２Ｌ変異型結核菌はともに、プローブ１７の位置（図２において黒矢尻で示す位置）での発色が見られず、ＰＺＡ耐性との判定となった。このように、従来型試験片によれば、ＰＺＡ感受性であるＳ６５Ｓサイレント変異型結核菌について、誤った判定となった。
【００９０】
（実施例５：ピラジナミド感受性結核菌の遺伝子解析およびプローブの設計）
上記実施例２と同様に、増幅された２２７例のｐｎｃＡ遺伝子の塩基配列をシークエンサーでさらに調べた。その結果、さらに新たな変異：Ｇｌｙ６０Ｇｌｙ［ｇｇＣ→ｇｇＴ］（図１のプローブ１６上の白抜き矢印の位置）が２２７例中２例において発見された。この変異も、サイレント変異であった。
【００９１】
上記の解析により見出された新たなサイレント変異は、上記プローブ１６が結合し得る領域に存在する。したがって、以下のサイレント変異プローブ（プローブ１６Ｓ：配列番号２０）を構築した（図１を参照のこと）。さらに、プローブ１７Ｓと併用することを考慮して、これらの領域における検出をより確実にする目的で、野生型プローブ１６よりも２塩基短い野生型プローブ１６’（配列番号１９）を新たに設計した（図１を参照のこと）。
【００９２】
プローブ１６Ｓ  ggtgtaccgg agaagtggtc a（配列番号２０）
プローブ１６’  gtgtgccgga gaagtggtca（配列番号１９）
【００９３】
（実施例１６：リファンピシン感受性結核菌用のプローブの設計）
ｒｐｏＢで見出されているサイレント変異は、Ｌｙｓ４３６Ｌｙｓ［Ｃｔｇ→Ｔｔｇ  １３０６］およびＬｙｓ４４６Ｌｙｓ［ｃｔＧ→ｃｔＡ  １３３８］である（非特許文献６）。そこで、それぞれのサイレント変異に対して、以下の野生型プローブＲ１とサイレント変異プローブＲ１Ｓ、ならびに野生型プローブＲ２とサイレント変異プローブＲ２Ｓを設計した。
Ｌｙｓ４３６Ｌｙｓ［Ｃｔｇ→Ｔｔｇ  １３０６］用：
プローブＲ１    cagccagCtg agccaattca tg（配列番号５９）
プローブＲ１Ｓ  cagccagTtg agccaattca tg（配列番号６０）
Ｌｙｓ４４６Ｌｙｓ［ｃｔＧ→ｃｔＡ  １３３８］用：
プローブＲ２    aacccgctGt cggggttgac c（配列番号６１）
プローブＲ２Ｓ  aacccgctAt cggggttgac c（配列番号６２）
【００９４】
（実施例１７：ニューキノロン感受性結核菌用のプローブの設計）
ｇｙｒＡで見出されているＳＮＰは、Ｓｅｒ９５Ｔｈｒ［ａＧｃ→ａＣｃ  ２８４］である（非特許文献７）。そこで、このＳＮＰに対して、以下の野生型プローブＮ１とＳＮＰプローブＮ１Ｓを設計した。
【００９５】
プローブＮ１    cgatctacga caGcctggtg c（配列番号６５）
プローブＮ１Ｓ  cgatctacga caCcctggtg c（配列番号６６）
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片を用いると、サイレント変異またはＳＮＰのみを有する薬剤感受性菌を薬剤耐性であると誤検出することなく、より確実に薬剤感受性を検出することができる。特に、サイレント変異またはＳＮＰのみを有する薬剤感受性結核菌を保有する患者は、従来は薬剤耐性であると誤診されていたため、直ちに対象薬剤での治療が選択されなかったが、このような患者に対しても、対象薬剤で治療可能であることが容易に診断され得る。その結果、このような患者に、適切な治療を提供することができる。したがって、不要な薬剤投与や検査を防ぐことができ、患者の負担が軽減化され、さらに無駄な医療費を削減することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【配列表】
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