(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算する方法であって、
該方法が、
第１の複数の蛍光測定値を受け取るステップ（Ａ）であって、
前記第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnは、前記試料の第１のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である、
受け取るステップと、
前記第１のＰＣＲ増幅実験において前記標的核酸の前記初期量Ｎ0をコンピュータシステムにより計算する第１のモデルを計算するステップ（Ｂ）であって、
前記第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記第１のモデルが以下のＮnに対する式を有し、
【数１】
0005787517.tif 000040
式中、
（ｉ）前記Ｎnは、前記各蛍光測定値が測定された前記第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
（ｉｉ）前記Ｎnに対する前記式は、前記第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、前記第１のＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数である、
計算するステップと、
前記第１のモデルを用いて、前記第１のＰＣＲ増幅実験における前記標的核酸の初期量Ｎ0を計算するステップ（Ｃ）と、
前記第１のモデルによってコンピュータシステムにより計算される値Ｎnと前記第１の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、
それにより標的核酸の前記初期量Ｎ0を前記第１のモデルに対するＮ0の前記最小値として計算することによって前記第１のモデルを精密化するステップ（Ｄ）と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記計算ステップ（Ｃ）で計算された標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0を、ユーザ可読形式でユーザインターフェースデバイス、
モニタ、
コンピュータ可読ストレージ媒体、
コンピュータ可読メモリ、または
ローカルもしくは、
リモートコンピュータシステムに出力するか、
あるいは前記計算ステップ（Ｃ）で計算された標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0を表示するステップ（Ｅ）をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
ＫおよびＮ0の調節による前記第１のモデルの精密化は、Ｎ0およびＫに関する複数の残差Ｎn−ＦＳnの平方和を最小にするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１のＰＣＲ増幅実験が、直線期のサイクルと指数期のサイクルを含み、
前記第１の複数の蛍光測定値が、前記第１のＰＣＲ増幅実験の前記指数期のサイクルおよび前記第１のＰＣＲ増幅実験の前記直線期のサイクルからとられる蛍光測定値からなることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１の複数の蛍光測定値が、
前記第１のＰＣＲ増幅実験の複数の連続するサイクルからとられる蛍光測定値からなり、
前記第１のＰＣＲ増幅実験における前記複数の連続するサイクルの最初のサイクルはｎstartと表され、および前記第１のＰＣＲ増幅実験における前記複数の連続するサイクルの最後のサイクルはｎendと表される、ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記ｎstartが、
（ｉ）前記第１のＰＣＲ増幅実験におけるその後のすべてのサイクルの効率が一貫して減少し、及び、
（ｉｉ）前記第１のＰＣＲ増幅実験の前記サイクルｎstart＋１の効率が１．０５未満である前記第１のＰＣＲ増幅実験における前記ＰＣＲサイクルであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、
ｎendは、前記観察された蛍光シグナルの二次導関数（ｄ2ＦＳ／ｄｎ2）がゼロ未満となる前記第１のＰＣＲ増幅実験における第１のサイクルであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１のＰＣＲ増幅実験は、
直線期のサイクルを含み、
前記第１の複数の蛍光測定値が、前記第１のＰＣＲ増幅実験の測定可能な指数および直線期の７個から１２個までの点からなることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記受け取るステップ（Ａ）が、
複数の増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験に対する複数の蛍光測定値を受け取り、
前記第１のＰＣＲ増幅実験が前記複数のＰＣＲ増幅実験に含まれることを含み、
前記計算ステップ（Ｂ）が、
前記複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験に対する以下の式で示される複数のモデルのうちのあるモデルを計算し、
前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて、前記各モデルは、前記各モデルに対応する前記ＰＣＲ増幅実験における前記対応する蛍光測定値に対するＮnの式中、
（ｉ）前記各モデルにおけるそれぞれのＮnは、前記各蛍光測定値が測定された前記各モデルに対応する前記ＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の量であり、
（ｉｉ）前記各モデルにおけるＮnに対する式は、Ｎnに対する式に対応している前記対応するＰＣＲ増幅実験における前記対応する蛍光測定値の前記サイクルｎに関係なく、ＫXおよびＮ0のみで表され、
ＫXは前記対応するＰＣＲ増幅実験ｘのミカエリスーメンテン定数である式を含み、
（ｉｉｉ）それぞれのモデルはＮnに対する式
【数２】
0005787517.tif 000041
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記複数のモデルのうちの各モデルの精密化を、
前記各モデルによって計算される値Ｎnと前記各モデルに対応する前記ＰＣＲ増幅実験の前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまで前記各モデルにおけるＮnに対するそれぞれの式についてＫおよびＮ0を調節し、
それにより標的核酸の前記初期量Ｎ0を各モデルに対するＮ0の前記最小値として計算することによって行うステップ（Ｄ）をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、
前記複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、
前記試料の連続希釈を表し、
前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて、
前記ＰＣＲ増幅実験で使用される前記試料の相対濃度の関数として前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の前記初期量Ｎ0のｌｏｇ10（Ｎ0）をプロットするステップ（Ｄ）をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、
前記複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、前記試料の連続希釈を表し、
前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて、
前記ＰＣＲ増幅実験で使用される前記試料の相対濃度の関数として前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の前記初期量Ｎ0をプロットするステップ（Ｄ）をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、
前記複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、前記試料の連続希釈を表し、
前記試料の相対濃度の関数として前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された前記値Ｎ0を精密化し、
Ｎ0に対する単一の精密化された値が前記複数のモデルについて計算されるようにするステップ（Ｄ）をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記精密化ステップ（Ｄ）は、
前記複数のモデルのうちのそれぞれのモデルによって計算された前記値Ｎ0に関して複数のＡＲＥ値の平均ＡＲＥ（絶対相対誤差）を最小にする加重回帰を実行することを含み、
前記複数のＡＲＥ値におけるそれぞれの
【数３】
0005787517.tif 000042
値は、前記複数のモデルのうちの各モデルに対する値であり、
【数４】
0005787517.tif 000043
は前記各モデルに対応する前記ＰＣＲ増幅実験に使用される前記試料の実際の相対濃度であり、
【数５】
0005787517.tif 000044
は前記各モデルに対する前記計算された値Ｎ0によって決定される前記各モデルに対応する前記ＰＣＲ増幅実験に使用される前記試料の前記計算された相対濃度であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項９に記載の方法であって、
前記複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、
前記試料の連続希釈を表し、
前記連続希釈は、２点併行または３点併行で行われ、
異なるモデルは、それぞれの連続希釈のそれぞれの２点併行について、またはそれぞれの連続希釈のそれぞれの３点併行について計算されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、
前記受け取るステップ（Ａ）は、
前記試料を使用して第２のＰＣＲ増幅実験に対する複数の蛍光測定値を受け取ることを含み、
前記計算ステップ（Ｂ）は、
前記第２のＰＣＲ増幅実験に対する第２のモデルを計算することを含み、
前記第２の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記第２のモデルは、Ｎnに対する式を含み、
式中、
（ｉ）Ｎnは、前記各蛍光測定値が測定された前記第２のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の前記計算された量であり、
（ｉｉ）前記第２のモデルにおけるＮnに対する前記式は、サイクルｎに関係なく、Ｋ2およびＮ0のみで表され、
Ｋ2は、前記第２のＰＣＲ増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、
第２のモデルへの式Ｎnは
【数６】
0005787517.tif 000045
を含み、
前記第１のモデルによってコンピュータシステムにより計算されるＮ0に対応する前記試料、および前記第２のモデルによって計算されるＮ0に対応する前記試料をコンピュータシステムにより計算するステップ（Ｄ）と、
式
【数７】
0005787517.tif 000046
を計算するステップ（Ｅ）をさらに含み、
式中、
ＮAMは、前記第１のモデルによって計算される前記試料に対する前記計算されたＮ0であり、
ＮBMは、前記第２のモデルによって計算される前記試料に対する前記計算されたＮ0であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記第２のモデルは、前記第２のモデルによって計算された値Ｎnと、
前記第２の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫ2およびＮ0を調節することによって前記計算ステップ（Ｂ）の実行において精密化されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、
前記第１の増幅実験は、第１の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、
前記第２の増幅実験は、第２の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、
式中、
ＮAMは、前記試料中の前記第１の遺伝子の前記ｍＲＮＡの存在量の尺度であり、
ＮBMは、前記試料中の前記第２の遺伝子の前記ｍＲＮＡの存在量の尺度であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記第１の遺伝子は、表現型の特徴に関連する遺伝子であり、
前記第２の遺伝子は、表現型の特徴に関連しない遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法であって、前記表現型の特徴は、細胞型、細胞形態、病態、組織または器官内の異常な状態、異常な細胞型、または異常な細胞形態であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法であって、
前記表現型の特徴は、前記試料が採取された試験被検体が敗血症を起こす可能性のあることを示す指標であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、
前記試料中の標的核酸の前記初期量Ｎ0は、前記試料中の第１の遺伝子の前記ｍＲＮＡの濃度であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、
前記試料中の標的核酸の前記初期量Ｎ0は、前記試料中の第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の個数であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
試料が表現型の特徴を有するかどうかを判定する方法であって、
第１の複数のサイクルを含む第１のＰＣＲ増幅実験に対する第１のモデルを計算するステップ（Ａ）であって、
（ｉ）前記第１のＰＣＲ増幅実験は、第１の複数の蛍光測定値を含み、
（ｉｉ）前記第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの測定は、前記第１のＰＣＲ増幅実験の前記第１の複数のサイクルのうちの異なる１つのサイクルから行われ、
（ｉｉｉ）前記第１のＰＣＲ増幅実験は、前記試料中の第１の遺伝子のＰＣＲ増幅であり、
（ｉｖ）前記第１のモデルは、前記第１のＰＣＲ増幅実験におけるそれぞれのサイクルｎに対する以下の前記第１の遺伝子の量Ｎnの式を含み、
（ｖ）前記第１のモデルにおけるＮnに対する式は、前記式Ｎnによって表される前記サイクルｎに関係なく、Ｋ１およびＮAMのみで表され、および、
前記第１のモデルに対するＮnに対応する前記式は
式
【数８】
0005787517.tif 000047
を含み、
式中、
（ｖｉ）Ｋ１は、前記第１のＰＣＲ増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、
（ｖｉｉ）ＮAMは、前記試料の前記第１のＰＣＲ増幅実験の前の前記試料中の前記第１の遺伝子の量である、計算するステップと、
第２の複数のサイクルを含む第２のＰＣＲ増幅実験に対する第２のモデルを計算するステップ（Ｂ）であって、
（ｉ）前記第２のＰＣＲ増幅実験は、第２の複数の蛍光測定値を含み、
（ｉｉ）前記第２の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの測定は、前記第２のＰＣＲ増幅実験の前記第２の複数のサイクルのうちの異なる１つのサイクルから行われ、
（ｉｉｉ）前記第２のＰＣＲ増幅実験は、前記試料中の第２の遺伝子のＰＣＲ増幅であり、
（ｉｖ）前記第２のモデルは、前記第２のＰＣＲ増幅実験におけるそれぞれのサイクルｎに対する前記第２の遺伝子の量Ｎnの式を含み、
（ｖ）前記第２のモデルにおけるＮnに対する式は、前記式Ｎnによって表される前記
サイクルｎに関係なく、Ｋ２およびＮBMのみで表され、および、
前記第２のモデルに対するＮnに対応する前記式は
式
【数９】
0005787517.tif 000048
を含み、
式中、
（ｖｉ）Ｋ２は、前記第２のＰＣＲ増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、
（ｖｉｉ）ＮBMは、前記試料の前記第２のＰＣＲ増幅実験の前の前記試料中の前記第２の遺伝子の量である、計算するステップと、
ＮAMを計算させる前記第１のモデルおよび、ＮBMを計算させる前記第２のモデルを用いるステップ（Ｃ）と、
式
【数１０】
0005787517.tif 000049
をコンピュータシステムにより計算するステップ（Ｄ）と、および、
ρは閾値よりも上か下かをコンピュータシステムにより決定するステップ（Ｅ）であって、
ρについて計算された前記値は、前記試料が前記表現型の特徴を有するかどうかを示すことを決定するステップと、
を含み、
前記複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、前記試料の連続希釈を表し、前記方法がさらに、
前記計算するステップ（Ｃ）の前に前記試料の相対濃度の関数として前記複数の第１のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された前記値ＮAMを精密化すること、および、
前記計算するステップ（Ｃ）の前に前記試料の相対濃度の関数として前記複数の第２のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された前記値ＮBMを精密化することを含み、
前記ＮAMの精密化は、前記第１のモデルのそれぞれによって計算されたＮAMに関して複数のＡＲＥ値の平均ＡＲＥ（絶対相対誤差）を最小にする加重回帰を実行するステップを含み、
前記複数のＡＲＥ値におけるそれぞれの
【数１１】
0005787517.tif 000050
値は、前記複数の第１のモデルのうちの各第１のモデルに対する値であり、
【数１２】
0005787517.tif 000051
は前記各第１のモデルに対応する第１のＰＣＲ増幅実験で使用される前記試料の実際の相対濃度であり、
【数１３】
0005787517.tif 000052
は前記各第１のモデルに対する前記計算された値ＮAMによって決定される前記各第１のモデルに対応する前記第１のＰＣＲ増幅実験に使用される前記試料の前記計算された相対濃度であり、
ＮBMの精密化は、前記第２のモデルのそれぞれによって計算されたＮBMに関して複数のＡＲＥ値の平均ＡＲＥ（絶対相対誤差）を最小にする加重回帰を実行することを含み、
前記複数のＡＲＥ値におけるそれぞれの
【数１４】
0005787517.tif 000053
値は、前記複数の第２のモデルのうちの各第２のモデルに対する値であり、
【数１５】
0005787517.tif 000054
は前記各第２のモデルに対応する第２のＰＣＲ増幅実験で使用される前記試料の実際の相対濃度であり、
【数１６】
0005787517.tif 000055
は前記各第２のモデルに対する前記計算された値ＮAMによって決定される前記各第２のモデルに対応する前記第２のＰＣＲ増幅実験に使用される前記試料の前記計算された相対濃度であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、
前記ステップ（Ａ）は、複数の第１のモデルを計算し、
それぞれの第１のモデルは、前記試料の連続希釈からの前記第１の遺伝子のＰＣＲ増幅実験であり、
式中、
ＮAMは、前記第１のモデルのそれぞれから決定された前記値ＮAMの中心傾向の尺度としてみなされることをさらに含み、
前記ステップ（Ｂ）は、複数の第２のモデルを計算し、
それぞれの第２のモデルは、前記試料の連続希釈からの前記第２の遺伝子のＰＣＲ増幅実験であり、
式中、
ＮBMは、前記第２のモデルのそれぞれから決定された前記値ＮBMの中心傾向の尺度としてみなされることをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記試料の第１のアリコートは、ステップ（Ａ）の前記連続希釈で使用され、
前記試料の第２のアリコートは、ステップ（Ｂ）の前記連続希釈で使用されることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、
前記ステップ（Ａ）の前記連続希釈は、２点併行または３点併行で行われ、
異なる第１のモデルは、前記第１の遺伝子について、それぞれの希釈のそれぞれのＰＣＲ増幅実験についてコンピュータシステムにより計算され、
式中、
ＮAMは、前記第１のモデルのそれぞれから計算された前記値ＮAMの中心傾向の尺度としてみなされ、
前記ステップ（Ｂ）の前記連続希釈は、２点併行または３点併行で行われ、
異なる第１のモデルは、前記第２の遺伝子について、それぞれの希釈のそれぞれのＰＣＲ増幅実験についてコンピュータシステムにより計算され、
式中、
ＮBMは、前記第２のモデルのそれぞれから計算された前記値ＮBMの中心傾向の尺度としてみなされることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、
式中、
前記ＮAMは、前記試料中の前記第１の遺伝子の前記ｍＲＮＡの濃度であり、
前記ＮBMは、前記試料中の前記第２の遺伝子の前記ｍＲＮＡの濃度であることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、
式中、
前記ＮAMは、前記試料中の前記第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の個数であり、
前記ＮBMは、前記試料中の前記第２の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の個数であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２８に記載の方法であって、
前記第１の増幅実験は、第１の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、
前記第２の増幅実験は、第２の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、
式中、
ＮAMは、前記試料中の前記第１の遺伝子の前記ｍＲＮＡの存在量の尺度であり、
ＮBMは、前記試料中の前記第２の遺伝子の前記ｍＲＮＡの存在量の尺度であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２８に記載の方法であって、
前記第１の遺伝子は、表現型の特徴に関連する遺伝子であり、
前記第２の遺伝子は、表現型の特徴に関連しない遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、
ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、
ρが閾値より高い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、
ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持つとみなされることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法であって、
ρが閾値より低い場合、前記試料に関わった種の構成要素は、前記表現型の特徴を持たないとみなされることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３５に記載の方法であって、
前記表現型の特徴は、細胞型、細胞形態、病態、組織または器官内の異常な状態、異常な細胞型、または異常な細胞形態であることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項２８に記載の方法であって、
前記試料の前記第１のＰＣＲ増幅実験の前の前記試料中の前記第１の遺伝子の量は、前記試料中の前記第１の遺伝子の前記ｍＲＮＡの濃度であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項２８に記載の方法であって、
前記試料の前記第１のＰＣＲ増幅実験の前の前記試料中の前記第１の遺伝子の量は、前記試料中の前記第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の個数であることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項２８に記載の方法であって、
ρをユーザ可読形式でユーザインターフェースデバイス、
モニタ、
コンピュータ可読ストレージ媒体、
コンピュータ可読メモリ、または
ローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力すること、あるいは
ρを表示するステップ（Ｄ）をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）システムであって、
複数の蛍光測定値を生成し、前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnが試料のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である、ＰＣＲ解析モジュールと、
前記試料中の前記標的核酸の計算された初期量Ｎ0をもたらす前記ＰＣＲ増幅実験のモデルをコンピュータシステムにより計算することによって前記複数の蛍光測定値を処理するように適合されたインテリジェント型モジュールとを備え、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について前記インテリジェント型モデルが以下のＮnに対する式を含み、
式中、
（ｉ）Ｎnは、前記各蛍光測定値が測定された前記ＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
（ｉｉ）Ｎnに対する前記式は、前記ＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、
ＫはＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数である式を含み、
前記Ｎnに対する式が、
【数１７】
0005787517.tif 000056
を含み、
前記インテリジェント型モジュールは、
前記モデルによって計算される値Ｎnと、及び、
前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより前記試料中の前記標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0を決定するための命令とを含む、
ことを特徴とするＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）システム。
【請求項４５】
請求項４４に記載のＰＣＲシステムであって、
前記インテリジェント型モジュールは、
Ｎ0をユーザインターフェースデバイス、
モニタ、
コンピュータ可読ストレージ媒体、
コンピュータ可読メモリ、
またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、
あるいはＮ0を表示するための命令をさらに備えることを特徴とするＰＣＲシステム。
【請求項４６】
試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算するためのコンピュータシステムであって、
前記コンピュータシステムはプロセッサ、前記プロセッサに結合されたメモリおよび前記メモリ格納するモジュールを備え、
前記モジュールは、
第１の複数の蛍光測定値を受け取るための命令であって、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnが前記試料の第１のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である命令（Ａ）と、
前記試料中の前記標的核酸の計算された初期量Ｎ0をもたらす前記ＰＣＲ増幅実験のモデルを計算するための命令（Ｂ）とを含み、
前記第２の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記モデルは、以下のＮnに対する式を含み、
式中、
（ｉ）Ｎnは、前記各蛍光測定値が測定された前記ＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
（ｉｉ）Ｎnに対する前記式は、前記ＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、ＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数であって、
前記Ｎnに対する式が、
【数１８】
0005787517.tif 000057
を含む、
命令からなるモジュールを備え、
前記命令は前記モデルを計算するための命令であって、
前記命令は、
前記モデルによって計算される値Ｎnと前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより前記モデルに対するＮ0の前記最小値として標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0を計算することによって前記モデルを精密化するための命令であることを特徴とするコンピュータシステム。
【請求項４７】
請求項４６に記載のコンピュータシステムであって、
前記モジュールは、
前記計算（Ｂ）のための前記命令によって計算された標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、あるいは前記計算（Ｂ）のための前記命令によって計算された標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0を表示するための命令をさらに備えることを特徴とするコンピュータシステム。
【請求項４８】
試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算するためのコンピュータによって実行可能なコンピュータプログラムを格納する固定ストレージ内に埋め込まれたコンピュータ可読媒体であって、
前記コンピュータプログラムが、
複数の蛍光測定値を受け取るための命令（Ａ）であって、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnが前記試料のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である、命令と、
前記試料中の前記標的核酸の計算された初期量Ｎ0をもたらす前記ＰＣＲ増幅実験のモデルを計算するための命令（Ｂ）であって、
前記複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、前記モデルは、以下のＮnに対する式を含み、
【数１９】
0005787517.tif 000058
式中、
（ｉ）Ｎnは、前記各蛍光測定値が測定された前記ＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける前記標的核酸の前記計算された量であり、
（ｉｉ）Ｎnに対する前記式は、前記ＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、ＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数である命令と、を含み、
前記固定ストレージ内に埋め込まれたコンピュータ可読媒体であって、
計算するための前記命令は、
前記モデルによって計算される値Ｎnと、
前記複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、
それにより前記モデルに対するＮ0の前記最小値として標的核酸の前記初期量Ｎ0を計算することによって前記モデルを精密化することをさらに含むコンピュータプログラムを格納することを特徴とするコンピュータ可読媒体。
【請求項４９】
請求項４８に記載の固定ストレージ内に埋め込まれたコンピュータ可読媒体であって、
前記コンピュータプログラム製品は、
ユーザ可読形式で計算（Ｂ）のための前記命令によって計算された標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、
あるいは計算（Ｂ）のための前記命令で計算された標的核酸の前記計算された初期量Ｎ0を表示するための命令をさらに備えることを特徴とするコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ミカエリスーメンテン速度式によって律則される個別ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅曲線から試料中の標的核酸の初期量Ｎ0に関する定量的情報を抽出するためのシステムおよび方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、限定された核酸配列の酵素的合成または増幅を行うためのインビトロ方法である。この反応は、典型的には、ＤＮＡ分子の逆鎖にハイブリダイズし、増幅されるテンプレートまたは標的ＤＮＡ配列の両端に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。プライマーの伸長は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。テンプレート変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長を伴う反復する一連のサイクルの結果、特定ＤＮＡフラグメントの指数関数的累積が生じる。蛍光プローブまたはマーカーは、典型的には、リアルタイムＰＣＲ、または速度論的ＰＣＲで使用され、これにより、増幅プロセスの検出および定量化が容易になる。
【０００３】
図１を参照すると、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるサイクルのステップが説明されている。ＰＣＲサイクルには３つのステップがある。サイクルのステップ１で、温度は約９５度に上げられ、次いで、増幅されるべき標的ＤＮＡがその時点で変性して２つの鎖に分離する。サイクルのステップ２で、温度は約５０度に下げられ、その時点で、プライマーは一本鎖にアニーリングされる。これらのプライマーは、２本の変性ＤＮＡ鎖のそれぞれに特異的に結合する短いオリゴマーである。サイクルのステップ３で、温度は７２度に上げられ、ポリメラーゼ酵素が、分離された鎖を伸長させ、その結果、それぞれのサイクルの後に二本鎖ＤＮＡ毎に二本鎖ＤＮＡの２つのコピーが生成される。これらのステップは、標的核酸を増幅するために各サイクルにおいて繰り返される。例えば、ＰＣＲサイクルの前述のステップは、４０回又はそれ以上繰り返すことができる。
【０００４】
図２を参照すると、リアルタイムＰＣＲ中には、サイクリング中に蛍光シグナルが測定される。この蛍光シグナルは、生成された二本鎖ＤＮＡの個数の尺度となる。曲線２０２は、絶対目盛での各サイクル後の蛍光シグナルの測定結果であり、曲線２０４は、対数目盛での各サイクル後の蛍光シグナルの測定結果である。曲線２０２から、リアルタイムＰＣＲ中には３つの異なる期があることがわかる。第１の期は、指数期である。図２に例示されている特定の場合において、指数期は、おおよそ、サイクル１〜２６からなる。第２の期は、直線期である。直線期では、蛍光シグナルはＰＣＲサイクルの関数として直線的に増大し、次いで、シグナルは横ばい状態になり始める。図２に例示されている特定の場合において、直線期は、ＰＣＲサイクル２７〜３１からなる。蛍光シグナルが横ばい状態になり始めるサイクルは、定常期と称される。図２に例示されている特定の場合において、定常期は、ＰＣＲサイクル３２〜４０からなる。
【０００５】
指数期の一部は、蛍光シグナルが背景より小さいため見えない。これは、図２からわかり、蛍光シグナルはＰＣＲサイクル１から２０の背景ノイズより小さい。したがって、第１のＰＣＲサイクルでは、検出可能な蛍光シグナルが読み取られない。蛍光シグナルは、測定するのに十分に強くなるまで観察されない。図１に例示されている特定の場合において、蛍光シグナルは、２１番目のＰＣＲサイクルの後に測定するのに十分に強いものである。多くの場合、蛍光シグナルは、第１の複数のＰＣＲサイクルについては検出できないが、それは、典型的には、増幅されるオリジナルの標的二本鎖核酸の２０から１００コピー程度と少ないからである。したがって、蛍光シグナルの強度が反応混合物中にある二本鎖核酸のコピーの数に比例するため、リアルタイムＰＣＲの初期段階において測定すべきものは本質的に何もない。
【０００６】
１００％の効率を仮定すると、それぞれのＰＣＲサイクルにより、反応混合物中の二本鎖標的核酸の数は２倍になる。したがって、ＰＣＲの効率が１００％であると仮定すると、それぞれのサイクルにおけるテンプレート（二本鎖標的核酸）の総数は２倍になり、その結果、ｎサイクル後には、反応混合物中のテンプレート数Ｎnは、リアルタイムＰＣＲ増幅が開始する前の初期反応混合物中のテンプレートのコピーの数Ｎ0に２のｎ乗を掛けたものになる。すなわち、
【０００７】
【数１】
0005787517.tif 000002
【０００８】
効率が１００％以外の場合、ｎサイクル後の反応混合物中のテンプレート数Ｎnは、Ｅを効率として、式
【０００９】
【数２】
0005787517.tif 000003
【００１０】
で表される。実際には、リアルタイムＰＣＲの効率は１００％ではなく、したがって、Ｅは１未満の実数値である。式（２）の対数をとると、
Ｌｏｇ（Ｎn）＝Ｌｏｇ（Ｎ0）＋ｎＬｏｇ（１＋Ｅ）n    （３）
が得られ、
式中、ｎ番目のサイクルにおける反応混合物中のテンプレートのコピー数の対数であるＬｏｇ（Ｎn）は、テンプレートの数の初期値Ｎ0の対数と効率に１を足した値のｎ乗の対数のｎ倍との和である。図３を参照すると、Ｎnを式３の対数形式で表すことの利点は、閾値線Ｔを確定できるという点である。閾値線Ｔは、背景ノイズより高い値に設定される。閾値線Ｔの配置は、変えることができるが、背景ノイズより高い曲線の指数期内のいずれかに設定される。閾値線Ｔが配置された後の目的は、Ｔ以上の蛍光シグナルを得るために要求されるリアルタイムＰＣＲサイクルの数ＣTを正確に決定することである。式（３）からＣTは、
ＣT＝−Ｌｏｇ（Ｎ0）／Ｌｏｇ（１＋Ｅ）＋Ｌｏｇ（Ｔ）／Ｌｏｇ（１＋Ｅ）    （４）
となる。
【００１１】
図３から、蛍光シグナルの対数は、コピー数の初期値に対し負の値を持つことがわかる。閾値Ｔは変化しうるが、式４から、ＣTは−Ｌｏｇ（Ｎ0）に依存することがわかる。
【００１２】
図４を参照すると、定量ＰＣＲにおいて、いくつかの増幅曲線が計算されている。これは、均等目盛（４０２）または対数目盛（４０４）で行うことができる。図４では、増幅曲線は、標的核酸ＰＢＥＦ１に対するものである。これらの増幅曲線のそれぞれは、ＰＢＥＦ１の初期試料の連続希釈を表す。さらに、これらの連続希釈のそれぞれを３回(トリプリケート)実行することができる。言い換えると、初期試料は３つの試料に分けられ、標的核酸の数は試料のそれぞれにおいて同じである。これら３つの試料のそれぞれについてリアルタイムＰＣＲが実行される。次いで、これら３つの試料のそれぞれは連続希釈され、この連続希釈された試料に対しリアルタイムＰＣＲが実行される。この作業すべておよびすべての増幅曲線の計算の目的は、試料中に最初にあったテンプレート核酸のコピーの数（Ｎｏ）を割り出すことである。
【００１３】
連続希釈の背後にある前提条件は、Ｎ0がオリジナルの試料中の標的核酸の数であり、また試料が繰り返し２倍希釈されるときに、Ｎ0も同様に２倍の減少となるべきというものである。そこで、式（４）によれば、連続希釈のそれぞれについてＣTが計算されるときに、ＣTは、傾きを−１／Ｌｏｇ（１＋Ｅ）とするＬｏｇ（Ｎ0）の一次関数となるべきである。Ｌｏｇ（Ｎ0）の関数としてのＣTの計算は、標準曲線と称される。このような標準曲線は、図５のＰＢＥＦ１の増幅曲線について例示されている。値Ｌｏｇ（Ｎ0）は、例示されているｙ軸に取り、ＣTはｘ軸に取る。さらに、図５に例示されているように、標準曲線は直線である。
【００１４】
標準曲線は直線であるため、決定係数Ｒ2、または調整されたＲ2および効率Ｅを計算することが可能である。調整されたＲ2は、
【００１５】
【数３】
0005787517.tif 000004
【００１６】
として定義され、式中、ｐはモデル内のリグレッサーの総数であり、ｎは例数である。図５に標準曲線としてプロットされている、図４のデータについて、調整されたＲ2は０．９９９０１１である。そこで、図５は、Ｎ0が小さければ小さいほど、ＣTを達成するのに要するサイクル数が少なくなり、Ｎ0が対数的に増大すると、直線的にＣTは大きくなることを示している。したがって、標準曲線を使用すると、初期未希釈試料Ｎ0に対する値ＣTは、この傾きから計算されうる。式４から
ＣT＝−Ｌｏｇ（Ｎ0）／Ｌｏｇ（１＋Ｅ）＋Ｌｏｇ（Ｔ）／Ｌｏｇ（１＋Ｅ）    （６）
＝−３．４Ｌｏｇ（Ｎ0）＋２６．０８１    （７）
となる。
【００１７】
図５に標準曲線としてプロットされている、図４のデータについて、効率Ｅは９６．８％であり、これはほぼ完全な１００％である。
【００１８】
式４、ならびに式４の計算例である図６および７に示されている計算では、多数の基本的仮定を用いている。仮定の１つは、蛍光シグナルが背景より大きくなるすべてのサイクルについて、蛍光シグナルは標的核酸のコピー（およびその増幅コピー）の数に比例するということである。この仮定は、問題にならない。さらに、式４では、ＣTに至るサイクルのそれぞれが指数期にあると仮定している。Ｔを直線期または定常期で設定できないのは、式４の基礎となる仮定がこれらの期において働かないからである。ここでもまた、この仮定は問題にならないが、それというのも、Ｔは指数期で設定されうるからである。さらに、多くのＰＣＲ機の自動化ソフトウェアが自動的にＴに対する妥当な値を見つけることができるか、またはユーザが指数期のどこかでＴを設定できる。
【００１９】
式４の背後にある問題となる仮定の１つは、ＣＴに至るサイクルのそれぞれにおける効率Ｅは、蛍光シグナルが背景に比べてまだ小さいため単に測定可能でないサイクルを含めて、同じであると仮定していることである。しかし、第１の複数のＰＣＲサイクルから測定可能なシグナルが得られない場合に、この仮定を検証することは可能でない。さらに、他の問題となる仮定は、式４では、初期テンプレート濃度および個別反応条件と無関係に、すべての応答曲線（例えば、図４に例示されている応答曲線）について同じになると仮定していることである。したがって、式４では、応答曲線実験のセット全体について、Ｅは同じであると仮定している。与えられたＰＣＲ実験におけるＣTの前のそれぞれのサイクルについてＥが同じであり、連続希釈で行われたＰＣＲ実験のそれぞれについてＥが一定であるという仮定は、これらの仮定が実際に妥当であるという保証はないため大きな問題を引き起こす。例えば、それぞれ異なる標的核酸を使用する異なる試料が２つあり、目的が２つの試料中の標的核酸の初期濃度を定量的に比較することである場合を考えてみる。上記の分析結果から、２つの標的核酸の初期濃度の比較は、従来の技術を使用したのでは問題になる可能性があることがわかるが、それは、Ｅが２つの試料について増幅曲線を生成するために使用されるＰＣＲ実験において同じになるという保証がないからである。この点については、以下の説明とともに図７を参照するとわかるであろうが、ＩＦＮＡＲ１増幅曲線に対するＰＣＲ反応の効率が、図４のＰＢＥＦ１増幅曲線に対するＰＣＲ反応の効率より実質的に低いことが示されている（Ｅ＝８３．５％（ＩＦＮＡＲ１）とＥ＝９６．８％（ＰＢＥＦ１）との対比）。
【００２０】
図６を参照しつつ、与えられたＰＣＲ実験の効率をチェックすることができる。定義により、ＰＣＲ実験Ｅnにおける与えられたサイクルｎの効率（ＰＣＲ実験の複数のサイクル全体を通してＰＣＲ実験全体の効率が一定であると仮定しているのとは反対に、局所効率と称する）は、（ｉ）現在のサイクルにおける標的核酸のコピー数Ｎnを（ｉｉ）前の+サイクルにおける標的核酸のコピー数Ｎn-1で割った値マイナス１である、つまり
Ｅn＝Ｎn／Ｎn-1−１    （８）
となる。
【００２１】
ＰＢＥＦ１増幅曲線におけるリアルタイムＰＣＲ実験のサイクルのそれぞれに対する局所効率Ｅnをプロットした図６は、Ｅnが至る所で変化することを示す。式４に基づいて計算するためにＥnが１００パーセントに設定されるべきであるという要件はないが、そのような計算では、Ｅnが定数であると仮定している。図６からわかるように、測定可能な蛍光シグナルがないため、Ｅnの値は初期サイクルでは知られていない。また、測定可能な蛍光シグナルが見える指数期におけるこれらのサイクルについては、Ｅnは低下する。図６に示されているように、サイクル２０の近くで測定可能な蛍光シグナルが検出された場合、効率は１の周りのどこかにある。次いで、これは低下し、ゼロにまで下がる。さらに、２０未満のサイクルに対する効率は一定しているという保証もない。観察可能なものから見て、効率は一定ではない。
【００２２】
図６は、ＰＣＲ反応の効率が９７％付近のどこにもないことを例示している。しかし、図４および５に例示されているように、同じ試料に対する標準曲線は、ＰＣＲ反応の効率が実際には９７％であることを示す。したがって、図５の標準曲線によって計算された効率Ｅと図６で計算された局所効率との間に食い違いがある。
【００２３】
さらに、上で示されているように、図５に例示されている標準曲線には、異なる試薬または異なる反応条件が標準曲線に対するデータを生成するために使用されるさまざまなＰＣＲ反応で使用される場合に生じる効率の変動を補正するメカニズムがない。
【００２４】
図７を参照すると、標的核酸ＩＦＮＡＲ１に対する増幅曲線、さらにはそれらの増幅曲線からの標準曲線が例示されている。標準曲線から
ＣT＝−Ｌｏｇ（Ｎ0）／Ｌｏｇ（１＋Ｅ）＋Ｌｏｇ（Ｔ）／Ｌｏｇ（１＋Ｅ）    （９）
＝−３．７９５Ｌｏｇ（Ｎ0）＋３０．９５５    （１０）
となる。
【００２５】
さらに、ＩＦＮＡＲ１データに対するＥは、８３．５パーセントである。ＩＦＮＡＲ１増幅曲線におけるリアルタイムＰＣＲ実験のサイクルのそれぞれに対する局所効率Ｅnをプロットした図８を参照すると、これはＥnが至る所で変化することを示す。
【００２６】
図９を参照すると、調整されたＲ2および効率が閾値Ｔの配置の関数として上で説明されているＰＢＥＦ１およびＩＦＮＡＲ１データセットに対しどのように変化するかが決定されることがわかる。図８を参照すると、図９に対するデータは、例えば、閾値Ｔの直線８０２をある値に設定し、ＣTを計算し、Ｔをどこか別の所に移動し、ＣTを再計算し、というように行うことで計算されることがわかる。閾値Ｔ（線８０２）が高く移動しすぎた場合、データはもはや、特に対数目盛の場合に、完全には指数領域内に収まらない。対数目盛では、この指数期は直線的であるべきである。線８０２（Ｔ）が低下し始める位置より高い位置へ移動した場合、すでに式４の指数期には入っていない。したがって、閾値が十分に高く移動した場合、式４の基礎となる仮定はもはや有効でなく、効率は下がることが予期される。図９に例示されているように、設定される閾値Ｔが（蛍光シグナル強度に関して）高ければ高いほど、より効率が低下し始める。そのため、効率が出発試薬に依存するだけでなく（ＰＢＥＦ１対ＩＦＮＡＲ１）、Ｔの値に対する選択にも依存する。
【００２７】
理想的には、十分に低いＴがあるべきであり、これにより計算された効率は９８％または９８％に近い値になる。また、閾値が高くなった場合、効率は、効率が下がりつつあるＰＣＲ実験の領域が組み込まれているため下がるはずである（例えば、図６および８のＰＢＥＦ１およびＩＦＮＡＲ１について計算された局所効率を参照）。しかし、図９に例示されているように、これが常にそうであるとは限らない。図９に例示されているように、ＩＦＮＡＲ１は行うと考えられることを行う。効率は、０．８５程度で始まる。次いで、閾値Ｔでより高く設定され、効率は低下する。しかし、ＰＢＥＦ１の場合、効率は０．９８から始まり、Ｔが増大するとこれにより効率の低いサイクルが計算に含まれ、効率は低下しないが、図９に例示されているように、実際には増大する。
【００２８】
上記の分析結果は、効率の概念に問題があることを示している。そこで、一方の試料中の標的核酸の出発濃度と他方の試料中の標的核酸の出発濃度とを比較するために効率に依存する方法は、問題がある。
【００２９】
Ｎ0に対する出発値を計算し、予測するために標準曲線が使用されうる。これは、定量ＰＣＲの目的、つまり、標準曲線に基づく、ＣTからのＮ0の計算である。したがって、原理上、標準曲線が計算され、これにより、ＣTとＮ0との間の関係が与えられる。Ｎ0に対する特定の値を予測するためにさらなる実験においてこの関係が使用されうる。したがって、標準曲線を計算するために使用される同じデータから、Ｎ0に対する特定の値を予測して、同じデータセットに対しこの方法がどの程度働くかチェックすることを試みることができる。図１０を参照すると、試料の実際のＮ0が知られているときに、上記のように標準曲線を使用するＮ0の予測における絶対誤差ＡＥを計算できることがわかる。絶対誤差は、
【００３０】
【数４】
0005787517.tif 000005
【００３１】
として定義される。
【００３２】
言い換えると、ＡＥは、知られている初期Ｎ0と予測されたＮ0との差の絶対値である。ＡＥは、初期Ｎ0が増大すると感度が低下するので、絶対相対誤差は、絶対誤差を実際のＮ0で割ったものであり、Ｎ0の値の関数として著しく変化しない誤差値を与える。図１０から、ＰＢＥＦ１データについては、平均ＡＲＥ（すべての連続希釈にわたる）は３．９％であるが、ＩＦＮＡＲ１については、平均ＡＲＥ（すべての連続希釈にわたる）は６．５％である。これは、ＡＲＥが遺伝子毎に、Ｎ0の関数として変化するが、ＰＢＥＦ１およびＩＦＮＡＲ１について得られた値は、完全定量ＰＣＲに対しては典型的なものであることを示している。
【００３３】
遺伝子発現測定には、付加的ステップがあるが、それは、所望の量がｍＲＮＡ濃度であり、測定されたｃＤＮＡではないからである。したがって、付加的ステップでは、所望の量、初期ｍＲＮＡ濃度、測定された量、ｃＤＮＡから逆転写の効率を決定する。逆転写酵素反応は、ｍＲＮＡの量の測定に対する変動の大部分に関わっている。逆転写反応の効率、したがって所望の値、初期ｍＲＮＡ濃度を決定することが可能であるが、実際には、これは難しいプロセスである。そのため、逆転写酵素反応の効率を決定する必要性を回避するために、実際に行われるのは、注目する遺伝子の測定された存在量値と参照遺伝子の測定された存在量値とを比較することである。以下に示されるように、これにより、注目する遺伝子に対する逆転写酵素反応の効率を知る必要がなくなる。この方法では、同時に２つの異なる遺伝子が、すなわち注目する遺伝子と変化しないと仮定される遺伝子（例えば、研究下の生物学的状態によって調節されない）測定される。２つの遺伝子ＡおよびＢに対する相対発現は、
【００３４】
【数５】
0005787517.tif 000006
【００３５】
によって与えられ、
式中、
κRSは、遺伝子ＡおよびＢに対する検出化学の相対的感度であり、
ηAは、遺伝子Ａに対するｃＤＮＡ逆転写酵素収量であり、
ηBは、遺伝子Ｂに対するｃＤＮＡ逆転写酵素収量であり、
ＥAは、遺伝子Ａに対するＰＣＲ反応の効率であり、
ＥBは、遺伝子Ｂに対するＰＣＲ反応の効率であり、
ＮAは、遺伝子ＡのｍＲＮＡ存在量であり、
ＮBは、遺伝子ＢのｍＲＮＡ存在量であり、
ＣTBは、遺伝子Ａに対するＣTであり、
ＣTBは、遺伝子Ｂに対するＣTである。
【００３６】
値κRSは、多くの異なる反応条件に依存する。未知のパラメータκRS、ηA、およびηBを決定するという問題を回避するために、「比較定量」法（またはΔΔＣT法）が使用される。パラメータの値が試料毎に変化しないと仮定すると、パラメータκRS、ηA、およびηBは、異なる試料に対する比ＮA／ＮBの比が考察される場合に相殺される。
【００３７】
典型的には、この注目する遺伝子（遺伝子Ａ）が、注目する遺伝子である。例えば、遺伝子ＡのｍＲＮＡの存在量が研究されているが、それは、その遺伝子のｍＲＮＡの存在量が母集団の要素における研究対象の疾病の状態に応じて変化しうると考えられるからである。このような場合、遺伝子Ｂは、母集団の要素における研究対象の疾病の状態に応じて変化すると考えられない式１２による計算に対する参照遺伝子として選択され、さらに、その場合に、遺伝子Ｂに対するｍＲＮＡの発現レベルは母集団の要素において変化しないと考えられる。したがって、２つの定量ＰＣＲ反応は、同時に実行され、一方の反応は注目する遺伝子（例えば、遺伝子Ａ）に対するものであり、もう１つは参照遺伝子（例えば、遺伝子Ｂ）に対するものである。これらの実験から、ＮAおよびＮBが計算される。パラメータκRS、ηA、およびηBが変化しない場合、Ψ＝ηA／ηBκRSが一定であるとして、異なる試料について比
【００３８】
【数６】
0005787517.tif 000007
【００３９】
を単純に比較するだけで十分である。これは、ηA、ηB、およびκRSに対する値は、試料毎に変わることがなければ重要でないからである。そのため、目標が、疾病状態と健全状態とを比較することであれば、ηA、ηB、およびκRSが変化しない場合には量
【００４０】
【数７】
0005787517.tif 000008
【００４１】
と量
【００４２】
【数８】
0005787517.tif 000009
【００４３】
との比があれば十分である。それに加えて、遺伝子ＡとＢ（注目する遺伝子と参照遺伝子）の両方に対する効率が同じであり、効率はＥ（ＥA＝ＥB≡Ｅ）であるという仮定を置くと、式１３は式１４
【００４４】
【数９】
0005787517.tif 000010
【００４５】
に簡約される。
式１４では、異なる試料を定量的に比較するために、ΔＣT≡ＣTB−ＣTAを比較するだけでよい。効率ＥAおよびＥBが知られている場合、式１４からのρを計算できる。
【００４６】
従来の定量ＰＣＲでは、ΔＣTは、異なる試料同士を比較するために使用される計量である。しかし、上述のように、ΔＣＴについては、ＥAおよびＥBが同じであると仮定する。代表的なデータから、ＥAおよびＥBが同じであるという仮定は、研究されているさまざまな遺伝子について計算された効率はさまざまな範囲にわたるため問題になる。例えば、遺伝子ＰＢＥＦ１に対すＥは、Ｅ＝０．９６８４±０．００９４となり、遺伝子ＡＤＭに対するＥは、Ｅ＝０．９１４１±０．０１６４となり、ＩＬ１Ｒ２に対するＥは、Ｅ＝０．７７４４±０．０１５６となり、ＩＲＡＫ３に対するＥは、１．０１１８±０．０１３０であり、ＪＡＫ３に対するＥは、０．９７７７±０．０１０２である。なおいっそう問題になるのは、いくつかの遺伝子に対するＥが試験毎に異なることである。例えば、参照遺伝子（考察されている実施例における遺伝子１８Ｓ）に対するＥは、０．８８、０．９３、０．９７、および１．１とさまざまに計算される。
【００４７】
式１４においてそのような変動がないと仮定した場合ＥAおよびＥBにおける変動が与えられたとすると、注目するのは、異なる試料同士を比較するためにΔＣTが使用されたときにＥAおよびＥBの変動で比ＮA／ＮB内にどれだけの誤差が入り込むかである。標準誤差伝播の法則
ｚ＝ｆ（ｘ1，ｘ2，・・・，ｘn）      （１５）
【００４８】
【数１０】
0005787517.tif 000011
【００４９】
を適用し、したがって
【００５０】
【数１１】
0005787517.tif 000012
【００５１】
とし、パラメータ
ＥA≡ＥB≒９６％、
ＣＴA≒９．５、
ＣＴB≒２６、および
σ（ＣＴA）＝σ（ＣＴB）≒０．１２
を使用することで、
Ｌｏｇ10ρの変動係数、ＣＶ（Ｌｏｇ10ρ）を計算できる。Ｌｏｇ10ρは、遺伝子ＡおよびＢの比の尺度である。ＣＶ（ＥB）およびＣＶ（ＥA）の関数として、ＣＶ（Ｌｏｇ10ρ）≡σ（Ｌｏｇ10ρ）／Ｌｏｇ10ρである。図１１の上のグラフに例示されているように、ＣＶ（Ｌｏｇ10ρ）は、低いＣＴを有する遺伝子（ここでは遺伝子Ｂ）の変動係数の関数としてあまり大きく変化しない。典型的には、参照遺伝子は、低いＣＴを有する。そのため、参照遺伝子の効率の変動係数が例えば２％から８％に変わっても、ＣＶ（Ｌｏｇ10ρ）は、図１１の上側のグラフの平坦な曲線によって示されているように、それほど大きくは変化しない。他方で、図１１の下側のグラフを参照すると、高いＣＴを有する遺伝子（ここでは遺伝子Ｂ）の効率の変動係数は、Ｌｏｇ10ρの誤差に対し劇的な効果をもたらすことがわかる。図１１の下側のグラフに示されているように、遺伝子Ｂの変動係数とＬｏｇ10ρの誤差との間の関係は、直線関係を共有する。したがって、下側のグラフは、実際には変化しているのに効率が変化していないと仮定した場合に有意な誤差が生じることを示している。
【００５２】
図１２を参照すると、それぞれ試料毎に３つの複製を用意した４つの異なる試料に対する参照遺伝子１８ＳのＣT値は、試料と試料との間でほんの少ししか変動を示さず、１８Ｓ遺伝子がそれらの試料を提供した被検体中に発現しないという仮定と一致することがわかる。図１３は、３つの複製に基づく１８Ｓの平均ＣT値およびその９５％信頼区間（ＣＩ）を示している。図１３に示されているように、１８ＳのＣTには試料毎にごくわずかの変動があり、試料を提供した被検体に１８Ｓが発現されていないという仮定と一致している。したがって、図１２および１３は、まとめて、それらの試料は完全に異なる患者からのものであるけれども、１８Ｓ  ｍＲＮＡの存在量が試料毎に変化しないことを示している。図１４では、それぞれの試料について３つの複製を持つ４つの異なる試料に対する発現される遺伝子ＰＢＥＦ１のＣT値が与えられている。図１５では、ＰＢＥＦ１に対する平均ＣT値は、異なる試料について十分に隔たっている。図１５では、示されている９５％信頼区間は、各試料について３つの複製に基づく。図１６では、ΔＣＴ≡ＣＴPBEF1−ＣＴ18Sの平均は、試料と試料との間できわめて十分に隔てられていることがわかる。しかし、上の背景技術の項で説明されているように、ΔＣＴは、異なる試料に対する比Ｎ18S／ＮPBEF1の潜在的な差を直接的には反映せず、これらの比（または少なくともρもしくはＬｏｇ10ρ）の変動性を考慮しなければならない。
【００５３】
図１７を参照すると、遺伝子効率ＥPBEF1およびＥ18Sが試料毎に変化せず、効率不確定性の唯一の源は、標準曲線の回帰に関係する場合、計算されたｌｏｇ10ρの平均は、それでも潜在的に十分に隔てられている。これは、標準定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析は、もしそのような差が存在すれば、試料を提供した被検体の比Ｎ18S／ＮPBEF1の差を検出することができることを示唆している。この実施例では、ＰＢＥＦ１と１８Ｓの両方について、Ｅ＝０．９６８４±０．００９４が仮定されている。１８Ｓのこの効率では、考察されている例示的遺伝子および試料について結果として得られる尺度ｌｏｇ10ρに対する変動値の典型的な係数は、約１．５％から３％までの範囲である。
【００５４】
しかし、図１８を参照すると、試料と試料との間のＥPBEF1およびＥ18Sの変動性が考慮される場合、比Ｎ18S／ＮPBEF1のｌｏｇ10ρの信頼区間が非常に大きく、試料分離が疑わしくなる。この実施例では、Ｅ18S＝０．９７±０．０９４（ＣＶ約１０％）およびＥPBEF1＝０．９７±０．０４７（ＣＶ約５％）が仮定されており、これは潜在的な最悪の場合のシナリオを表している。これらの結果は、効率変動を制御するために何らかの処置を講じることができない限り、ここに示されている標準ｑＰＣＲ解析によって、比Ｎ18S／ＮPBEF1の差の確実な検出に至ることはありえない。
【００５５】
図１７の条件が真であれば、９５％信頼区間は重なり合わないため、さまざまな被検体において比Ｎ18S／ＮPBEF1の差があるかどうかの判定を行うことができる。しかし、図１８の条件が真であれば、効率の仮定で誤りを犯した場合に、信頼区間は重なり合い始め、試料毎に比Ｎ18S／ＮPBEF1の変化を弁別する能力が失われる。
【００５６】
そのため、式の基礎となる仮定が実際には正しくない場合に上記の式の可能性の高い誤差発生源が与えられたとすると、必要なのは、個別ＰＣＲ増幅曲線から標的核酸の初期量に関する定量的情報を抽出するための新しい方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５７】
【非特許文献１】Duda et al., Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley & Sons, New York, 2001
【非特許文献２】Hastie et al., The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, 2001
【非特許文献３】American College of Chest Physicians Society of Critical Care Medicine, Chest, 1997, 101:1644-1655
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００５８】
本発明は、個別ＰＣＲ増幅曲線から核酸の初期標的濃度に関する定量的情報を抽出するためのシステムおよび方法を実現する。このアプローチは、部分的には、ＰＣＲ反応がミカエリスーメンテン式（ＭＭＫ）によって律則されるという事実に基づく。本発明では、ＰＣＲ増幅曲線は、ＭＭＫモデルにフィッティングされ、これにより、初期テンプレートＤＮＡ濃度の直接的推定およびＰＣＲ反応の実効ミカエリスーメンテン定数が得られる。上述の従来の方法とは異なり、本発明の方法は、ＰＣＲ増幅効率に関する情報も仮定も必要としない。有利なことに、従来の方法とは異なり、本発明のシステムおよび方法では、背景ノイズの上に利用可能な指数期点が十分にない場合に指数期と直線期の両方からの増幅曲線上の点を使用することができる。ＭＭＫモデルは、別の効率研究を実施しなくても初期テンプレートＤＮＡ濃度の直接的推定を行える。有利なことに、本発明のシステムおよび方法では、較正点は１つあればよいが、標準ｑＰＣＲアプローチでは、少なくとも２つの較正点を必要とする。上述の標準ｑＰＣＲアプローチとは対照的に、初期テンプレート濃度の均等目盛による標準曲線を作成し、二次項を含めるか、または加重回帰を使用して例えば平均絶対相対誤差（ＭＡＲＥ）を最小にすることによって精密化することが可能である。背景技術の項で説明されているように、標準ｑＰＣＲ定量方法を使用すると、ＰＣＲ効率変動により考察される遺伝子ＡおよびＢの初期数の比ＮA／ＮBの不確定性が非常に高くなる可能性がある。対照的に、本発明のシステムおよび方法では、ＰＣＲ効率に関係する不確定性が排除され、またＬｏｇ（ＮA／ＮB）の変動係数を標準ｑＰＣＲアプローチと比較して１０倍程度に低減できる。
【００５９】
本発明の一態様では、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算する方法を提供する。この方法では、第１の複数の蛍光測定値を受け取る。第１の複数の蛍光測定値のうちの蛍光測定値ＦＳnは、試料の第１のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとった蛍光測定値を含む。次いで、第１のＰＣＲ増幅実験について、第１のモデルを計算する。このモデルでは、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0の計算が行われる。第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、第１のモデルは、Ｎnに対する各式を含み、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式は、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、第１のＰＣＲ増幅実験の実効ミカエリスーメンテン定数である。第１のモデルの精密化を行うことができる。例えば、第１のモデルの精密化は、第１のモデルによって計算される値Ｎnと第１の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより標的核酸の初期量Ｎ0を第１のモデルに対するＮ0の最小値として計算することを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のモデルの精密化は、実行されず、むしろ、ＫおよびＮ0の値は、ＫおよびＮ0の可能なすべての値に対する完全検索によって識別される。このような完全検索では、完全検索から識別された値ＫおよびＮ0が、モデルで使用されるｎの値のそれぞれについて第１のモデルによって計算される値Ｎnに対する最良の一致をもたらすべきである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、計算ステップで計算された標的核酸の計算された初期量Ｎ0を例えばユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力すること、あるいは計算ステップで計算された標的核酸の計算された初期量Ｎ0を表示することを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、第１のモデルは、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクル１における標的核酸の計算された量である、Ｎ1に対する式、
【００６２】
【数１２】
0005787517.tif 000013
【００６３】
を含む。
いくつかの実施形態では、第１のモデルは、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクル２における標的核酸の計算された量である、Ｎ2に対する式、
【００６４】
【数１３】
0005787517.tif 000014
【００６５】
を含む。
いくつかの実施形態では、第１のモデルは、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクル３における標的核酸の計算された量である、Ｎ3に対する式、
【００６６】
【数１４】
0005787517.tif 000015
【００６７】
を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＫおよびＮ0の調節による第１のモデルの精密化は、Ｎ0およびＫに関する複数の残差Ｎn−ＦＳnの平方和を最小にすることを含む。いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲ増幅実験は、直線期のサイクルと指数期のサイクルを含み、第１の複数の蛍光測定値は、第１のＰＣＲ増幅実験の指数期のサイクルおよび第１のＰＣＲ増幅実験の直線期のサイクルからとられる蛍光測定値からなる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、第１の複数の蛍光測定値は、サイクルｎstartおよびサイクルｎendによって制約される第１のＰＣＲ増幅実験の複数の連続するサイクルからとられる蛍光測定値である。いくつかの実施形態では、ｎstartは、（ｉ）第１のＰＣＲ増幅実験におけるその後のすべてのサイクルの局所効率が一貫して減少し、（ｉｉ）第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎstart＋１の効率が１．０５未満である第１のＰＣＲ増幅実験におけるＰＣＲサイクルである。いくつかの実施形態では、ｎendは、観察された蛍光シグナルの二次導関数（ｄ2ＦＳ／ｄｎ2）がゼロ未満となる第１のＰＣＲ増幅実験における第１のサイクルである。いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲ増幅実験は、直線期のサイクルを含み、第１の複数の蛍光測定値は、典型的には、第１のＰＣＲ増幅実験の直線期の７個から１２個までの点からなる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、受け取るステップは、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験に対する複数の蛍光測定値を受け取ることを含む。このような実施形態では、計算するステップは、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験に対する複数のモデルのうちの１つのモデルを計算することを含み、それらの複数のモデルのうちの各モデルについて、各モデルは各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験における対応する蛍光測定値のＮnに対する各式を含む。各モデルにおけるそれぞれのＮnは、各蛍光測定値がとられた各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の量である。この実施形態では、各モデルにおけるＮnに対する各式は、Ｋを対応するＰＣＲ増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数として、Ｎnに対する各式に対応している対応するＰＣＲ増幅実験における対応する蛍光測定値のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表される。いくつかの実施形態では、複数のモデルが精密化される。例えば、複数のモデルのうちの各モデルの精密化は、各モデルによって計算される値Ｎnと各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまで各モデルにおけるＮnに対するそれぞれの式についてＫおよびＮ0を調節し、それにより標的核酸の初期量Ｎ0を各モデルに対するＮ0の最小値として計算することによって行うことができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表す。このような実施形態では、この方法は、複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについてＰＣＲ増幅実験で使用される試料の相対濃度の関数として複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の初期量Ｎ0のｌｏｇ10（Ｎ0）をプロットすることをさらに含む。試料の相対濃度は、それぞれの連続希釈で使用される希釈係数によって決定される。いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、この方法は、複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについてＰＣＲ増幅実験で使用される試料の相対濃度の関数として複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の初期量Ｎ0をプロットすることをさらに含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、この方法は、試料の相対濃度の関数として複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された値Ｎ0を精密化し、Ｎ0に対する単一の精密化された値がこれらの複数のモデルについて計算されるようにすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、精密化ステップは、複数のモデルのうちのそれぞれのモデルによって計算された値Ｎ0に関して複数のＡＲＥ値の平均ＡＲＥ（絶対相対誤差）を最小にする加重回帰を実行することを含み、複数のＡＲＥ値におけるそれぞれの
【００７３】
【数１５】
0005787517.tif 000016
【００７４】
値は、複数のモデルのうちの各モデルに対する値であり、
【００７５】
【数１６】
0005787517.tif 000017
【００７６】
は各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験に使用される試料の実際の相対濃度であり、
【００７７】
【数１７】
0005787517.tif 000018
【００７８】
は各モデルに対する計算された値Ｎ0によって決定される各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験に使用される試料の計算された相対濃度である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、連続希釈は、２点併行または３点併行で行われ（または複製数をさらに増やして）、異なるモデルは、それぞれの連続希釈のそれぞれの２点併行について、またはそれぞれの連続希釈のそれぞれの３点併行（または複製数をさらに増やして）について計算される。いくつかの実施形態では、受け取るステップは、試料を使用して第２のＰＣＲ増幅実験に対する複数の蛍光測定値を受け取ることを含む。さらに、計算するステップは、第２のＰＣＲ増幅実験に対する第２のモデルを計算することを含み、第２の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、第２のモデルは、Ｎnに対する各式を含み、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第２のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）第２のモデルにおけるＮnに対する各式は、サイクルｎに関係なく、Ｋ2およびＮ0のみで表され、Ｋ2は、第２のＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数であり、第２のモデルの精密化は、前記第２のモデルによって計算された値Ｎnと第２の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫ2およびＮ0を調節することを含む。この方法は、
【００８０】
【数１８】
0005787517.tif 000019
【００８１】
を計算することをさらに含み、式中、ＮAMは第１のモデルによって計算される試料に対する計算されたＮ0であり、ＮBMは第２のモデルによって計算された試料に対する計算されたＮ0である。いくつかの実施形態では、第１の増幅実験では、第１の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、第２の増幅実験では、第２の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、ＮAMは、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの存在量の尺度であり、ＮBMは、試料中の第２の遺伝子のｍＲＮＡの存在量の尺度である。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、表現型の特徴に関連する遺伝子であり、第２の遺伝子は、表現型の特徴に関連しない遺伝子である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ρは、閾値を超えており、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持つとみなされる。いくつかの実施形態では、ρは、閾値を超えており、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持たないとみなされる。いくつかの実施形態では、ρは、閾値未満であり、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持つとみなされる。いくつかの実施形態では、ρが閾値未満である場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持たないとみなされる。いくつかの実施形態では、表現型の特徴は、細胞型、細胞形態、病態（非存在、存在、段階）、組織または器官内の異常な状態、異常な細胞型、または異常な細胞形態である。いくつかの実施形態では、表現型の特徴は、試料が採取された試験被検体が敗血症を起こす可能性のあることを示す指標である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0は、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの濃度である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0は、試料中の第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の数である。
【００８３】
本発明の他の態様は、試料が表現型の特徴を有するかどうかを判定する方法を提供する。この方法は、（Ａ）第１の複数のサイクルを含む第１のＰＣＲ増幅実験に対する第１のモデルを計算することを含み、第１のＰＣＲ増幅実験は、第１の複数の蛍光測定値を含む。第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの測定は、第１のＰＣＲ増幅実験の第１の複数のサイクルのうちの異なる１つのサイクルから行われた。第１のＰＣＲ増幅実験は、試料中の第１の遺伝子のＰＣＲ増幅である。第１のモデルは、第１のＰＣＲ増幅実験におけるそれぞれのサイクルｎに対する第１の遺伝子の量Ｎnの各式を含む。いくつかの実施形態では、第１のモデルにおけるＮnに対する各式は、各式Ｎnによって表されるサイクルｎに関係なく、Ｋ１およびＮAMのみで表され、Ｋ１は、第１のＰＣＲ増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、ＮAMは、試料の第１のＰＣＲ増幅実験の前の試料中の第１の遺伝子の量である。この方法は、（Ｂ）第２の複数のサイクルを含む第２のＰＣＲ増幅実験に対する第２のモデルを計算することをさらに含む。第２のＰＣＲ増幅実験は、第２の複数の蛍光測定値を含む。第２の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの測定は、第２のＰＣＲ増幅実験の第２の複数のサイクルのうちの異なる１つのサイクルから行われる。第２の増幅実験は、試料中の第２の遺伝子のＰＣＲ増幅である。第２のモデルは、第２のＰＣＲ増幅実験におけるそれぞれのサイクルｎに対する第２の遺伝子の量Ｎnの各式を含む。第２のモデルにおけるＮnに対する各式は、各式Ｎnによって表されるサイクルｎに関係なく、Ｋ２およびＮBMのみで表され、Ｋ２は、第２のＰＣＲ増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、ＮBMは、試料の第２のＰＣＲ増幅実験の前の試料中の第２の遺伝子の量である。この方法は、（Ｃ）第１のモデルを使用してＮAMに対する値を決定し、第２のモデルを使用してＮBMに対する値を決定することをさらに含む。この方法は、さらに、（Ｄ）計算
【００８４】
【数１９】
0005787517.tif 000020
【００８５】
を含み、ρについて計算された値は、試料が表現型の特徴を有するかどうかを示す。
【００８６】
いくつかの実施形態では、複数の第１のモデルが計算され、それぞれの第１のモデルは、試料の連続希釈からの第１の遺伝子のＰＣＲ増幅実験であり、ＮAMは、第１のモデルのそれぞれから決定された値ＮAMの中心傾向の尺度としてみなされる。さらに、複数の第２のモデルが計算され、それぞれの第２のモデルは、試料の連続希釈からの第２の遺伝子のＰＣＲ増幅実験であり、ＮBMは、第２のモデルのそれぞれから決定された値ＮBMの中心傾向の尺度としてみなされる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、試料の第１のアリコート（分割量）が、ステップ（Ａ）の連続希釈で使用され、試料の第２のアリコートが、ステップ（Ｂ）の連続希釈で使用される。いくつかの実施形態では、ステップ（Ａ）の連続希釈は、２点併行または３点併行で行われ（または複製数をさらに増やして）、異なる第１のモデルは、第１の遺伝子について、それぞれの希釈のそれぞれのＰＣＲ増幅実験について計算され、ＮAMは、第１のモデルのそれぞれから決定された値ＮAMの中心傾向の尺度としてみなされる。さらに、いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）の連続希釈は、２点併行または３点併行で行われ（または複製数をさらに増やして）、異なる第１のモデルは、第２の遺伝子について、それぞれの希釈のそれぞれのＰＣＲ増幅実験について計算され、ＮBMは、第２のモデルのそれぞれから計算された値ＮBMの中心傾向の尺度としてみなされる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、この方法は、さらに、計算するステップ（Ｃ）の前に試料の相対濃度の関数として複数の第１のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された値ＮAMを精密化すること、および、計算するステップ（Ｃ）の前に試料の相対濃度の関数として複数の第２のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された値ＮBMを精密化することを含む。いくつかの実施形態では、ＮAMの精密化は、第１のモデルのそれぞれによって計算されたＮAMに関して複数のＡＲＥ値の平均ＡＲＥ（絶対相対誤差）を最小にする加重回帰を実行することを含み、複数のＡＲＥ値におけるそれぞれの
【００８９】
【数２０】
0005787517.tif 000021
【００９０】
値は、複数の第１のモデルのうちの各第１のモデルに対する値であり、
【００９１】
【数２１】
0005787517.tif 000022
【００９２】
は各第１のモデルに対応する第１のＰＣＲ増幅実験で使用される試料の実際の相対濃度であり、
【００９３】
【数２２】
0005787517.tif 000023
【００９４】
は各第１のモデルに対する計算された値ＮAMによって決定される各第１のモデルに対応する第１のＰＣＲ増幅実験に使用される試料の計算された相対濃度である。さらに、ＮBMの精密化は、第２のモデルのそれぞれによって計算されたＮBMに関して複数のＡＲＥ値の平均ＡＲＥ（絶対相対誤差）を最小にする加重回帰を実行することを含み、複数のＡＲＥ値におけるそれぞれの
【００９５】
【数２３】
0005787517.tif 000024
【００９６】
値は、複数の第２のモデルのうちの各第２のモデルに対する値であり、
【００９７】
【数２４】
0005787517.tif 000025
【００９８】
は各第２のモデルに対応する第２のＰＣＲ増幅実験で使用される試料の実際の相対濃度であり、
【００９９】
【数２５】
0005787517.tif 000026
【０１００】
は各第２のモデルに対する計算された値ＮAMによって決定される各第２のモデルに対応する第２のＰＣＲ増幅実験に使用される試料の計算された相対濃度である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＮAMは、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの濃度であり、ＮBMは、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの濃度である。いくつかの実施形態では、ＮAMは、試料中の第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の個数であり、ＮBMは、試料中の第２の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の個数である。いくつかの実施形態では、第１の増幅実験では、第１の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、第２の増幅実験では、第２の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し、ＮAMは、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの存在量の尺度であるが、ＮBMは、試料中の第２の遺伝子のｍＲＮＡの存在量の尺度である。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、表現型の特徴に関連する遺伝子であり、第２の遺伝子は、表現型の特徴に関連しない遺伝子である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ρが閾値より高い場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持つとみなされる。いくつかの実施形態では、ρが閾値より高い場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持たないとみなされる。いくつかの実施形態では、ρが閾値未満である場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持つとみなされる。いくつかの実施形態では、ρが閾値未満である場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持たないとみなされる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、表現型の特徴は、細胞型、細胞形態、病態、組織または器官内の異常な状態、異常な細胞型、または異常な細胞形態である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0は、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの濃度である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0は、試料中の第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の数である。いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、（Ｄ）ρをユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力すること、あるいはρを表示することを含む。
【０１０４】
本発明の他の態様は、第１の複数の蛍光測定値を行うＰＣＲ解析モジュールを備えるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）システムを実現し、第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnは、試料の第１のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である。ＰＣＲシステムは、さらに、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0の推定値をもたらす第１のＰＣＲ増幅実験のモデルを計算することによって第１の複数の蛍光測定値を処理するように適合されているインテリジェント型モジュールを備える。第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、モデルは、Ｎnに対する各式を含み、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式は、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、第１のＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数であり、Ｎ0は、試料中の標的核酸の初期量である。いくつかの実施形態では、モデルが精密化される。例えば、モデルの精密化は、モデルによって計算される値Ｎnと第１の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を決定することによって行える。いくつかの実施形態では、このインテリジェント型モジュールは、さらに、Ｎ0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、あるいはＮ0を表示するための命令を備える。
【０１０５】
本発明の他の態様は、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算するためのコンピュータシステムを実現するものであり、このコンピュータシステムは、プロセッサおよびプロセッサに結合されたメモリを備え、メモリは第１の複数の蛍光測定値を受け取るための命令を備えるモジュールを格納し、第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnは、試料の第１のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である。メモリは、さらに、標的核酸の初期量Ｎ0の推定を与える第１のＰＣＲ増幅実験のモデルを計算するための命令を格納し、第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、モデルは、Ｎnに対する各式を含む。ここで、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式は、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、第１のＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数である。いくつかの実施形態では、モデルが精密化される。例えば、モデルの精密化は、モデルによって計算される値Ｎnと第１の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それによりモデルに対するＮ0の最小化された値として標的核酸の初期量Ｎ0を計算することによって行える。いくつかの実施形態では、モジュールは、さらに、標的核酸の計算された初期量Ｎ0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、あるいは標的核酸の計算された初期量Ｎ0を表示するための命令を備える。
【０１０６】
本発明の他の態様は、試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算するためのコンピュータによって実行可能なコンピュータプログラムを格納するコンピュータ可読媒体を備える。コンピュータプログラムは、（Ａ）第１の複数の蛍光測定値を受け取るための命令を含み、第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnは、試料の第１のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である。コンピュータプログラムは、さらに、（Ｂ）標的核酸の初期量Ｎ0の推定を与える第１のＰＣＲ増幅実験の第１のモデルを計算するための命令を備え、第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、第１のモデルは、Ｎnに対する各式を含み、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式は、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、第１のＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数である。いくつかの実施形態では、モデルが精密化される。例えば、モデルの精密化は、第１のモデルによって計算される値Ｎnと第１の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより第１のモデルに対するＮ0の最小化された値として標的核酸の初期量Ｎ0を計算することによって行える。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラム製品は、さらに、標的核酸の計算された初期量Ｎ0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、あるいは標的核酸の計算された初期量Ｎ0を表示するための命令を備える。
【０１０７】
本発明の他の態様は、第１の複数の蛍光測定値を受け取るための命令を実行するコンピュータを制御するプログラムを表すコンピュータデータ信号を含み、第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳnは、試料の第１のＰＣＲ増幅実験において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である。プログラムは、さらに、標的核酸の初期量Ｎ0の推定を与える第１のＰＣＲ増幅実験の第１のモデルを計算するための命令を備え、第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、第１のモデルは、Ｎnに対する各式を含む。ここで、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式は、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、第１のＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数である。いくつかの実施形態では、モデルが精密化される。例えば、モデルの精密化は、第１のモデルによって計算される値Ｎnと第１の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより第１のモデルに対するＮ0の最小化された値として標的核酸の初期量Ｎ0を計算することによって行える。いくつかの実施形態では、プログラムは、さらに、標的核酸の計算された初期量Ｎ0をユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力するための命令、あるいは標的核酸の計算された初期量Ｎ0を表示するための命令を実行するコンピュータを制御する。
【０１０８】
一般に、本発明のモデルはどれも、精密化することができる。いくつかの実施形態では、このようなモデルは精密化されず、むしろ、ＫおよびＮ0の値は、ＫおよびＮ0の可能なすべての値に対する完全検索によって識別される。このような完全検索では、完全検索から識別された値ＫおよびＮ0が、モデルで使用されるｎの値のそれぞれについて第１のモデルによって計算される値Ｎnに対する最良の一致をもたらすべきである。モデルを精密化するために精密化が使用される場合、限定はしないが、回帰、最小二乗、確率統計的手法（例えば、シミュレーテッドアニーリング；simulated annealing、遺伝的アルゴリズム；genetic algorithms）、または線形判別関数（linear discriminant functions）を含む、精密化技術が使用できる。（例えば、モデル精密化方法に関してそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている、非特許文献１および非特許文献２を参照。）
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】従来技術によるリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のステップを示す図である。
【図２】絶対目盛および対数目盛でリアルタイムＰＣＲ実験のそれぞれのサイクルの後に測定される蛍光シグナルを示す図である。
【図３】閾値線Ｔの確定およびＴ以上の蛍光シグナルを得るために要求されるリアルタイムＰＣＲサイクルの数（ＣT）の決定を示す図である。
【図４】ＰＢＥＦ１の初期試料の連続希釈を表す均等目盛と対数目盛の両方における定量ＰＣＲ増幅曲線を示す図である。
【図５】図４の増幅曲線からのＰＢＥＦ１に対する標準曲線の計算を示し、標準曲線はＮ0を初期テンプレート核酸の濃度としてＬｏｇ（Ｎ0）の関数としてＴより大きい蛍光シグナルを得るために必要なサイクル数であるＣTをプロットした曲線である、図である。
【図６】遺伝子ＰＢＥＦ１に対するＰＣＲ実験におけるそれぞれのサイクルの局所効率Ｅnを示す図である。
【図７】ＩＦＮＡＲ１の初期試料の連続希釈を表す均等目盛と対数目盛の両方における定量ＰＣＲ増幅曲線、およびＩＦＮＡＲ１増幅曲線からのＩＦＮＡＲ１に対する標準曲線を示す図である。
【図８】遺伝子ＩＦＮＡＲ１に対するＰＣＲ実験におけるそれぞれのサイクルの局所効率Ｅnを示す図である。
【図９】ＰＢＥＦ１およびＩＦＮＡＲ１データに対する閾値Ｔの配置の関数としてＰＣＲ反応の推定効率の変動を示す図である。
【図１０】定量ＰＣＲ試料中の標的核酸の実際の初期量が知られている場合の定量ＰＣＲ試料中の標的核酸の初期量の予測における絶対誤差ＡＥおよび絶対相対誤差ＡＲＥを定義する図である。
【図１１】ＣTに対する異なる値を持つ遺伝子のＰＣＲ効率の誤差の変動がＬｏｇ10ρの誤差の大きさにどのような影響を及ぼすかを示す図である。
【図１２】それぞれの試料について３つの複製を持つ４つの異なる試料に対する参照遺伝子１８ＳのＣT値を示す図である。
【図１３】３つの複製に基づく参照遺伝子１８Ｓの平均ＣＴおよびその９５％信頼区間（ＣＩ）を示す図である。
【図１４】それぞれの試料について３つの複製を持つ４つの異なる試料に対する発現される遺伝子ＰＢＥＦ１のＣT値を示す図である。
【図１５】３つの複製に基づく遺伝子ＰＢＥＦ１の平均ＣＴ値およびその９５％信頼区間を示す図である。
【図１６】ΔＣＴ≡ＣＴPBEF1−ＣＴ18Sの平均を示す図である。
【図１７】ＥPBEF1およびＥ18Sが変化しないと仮定した場合の比Ｎ18S／ＮPBEF1に対するＬｏｇ10ρを示す図である。
【図１８】ＥPBEF1およびＥ18Sの典型的な変動を試料毎に考慮したときの比Ｎ18S／ＮPBEF1に対するＬｏｇ10ρの信頼区間を示す図である。
【図１９】ミカエリスーメンテン式に基づくモデルを使用してＰＣＲサイクル数の関数として局所効率を示す図である。
【図２０】ミカエリスーメンテン式に基づくモデルを使用してＰＣＲサイクル数の関数として試料中の標的核酸の量を示す図である。
【図２１】ミカエリスーメンテン式に基づくモデルを使用してＰＣＲサイクル数ｎの関数としてのＮnの計算を示す図である。
【図２２】ミカエリスーメンテン式に基づくモデルを使用してＰＣＲサイクル数ｎの関数としてのＬｏｇ（Ｎn）の計算を示す図である。
【図２３】本発明の一実施形態によりパラメータＮ0およびＫのフィッティングを行うために選択された第１のＰＣＲサイクルｎstartがどのように選択されるかを示す図である。
【図２４】本発明の一実施形態によりパラメータＮ0およびＫのフィッティングを行うために選択された最後のＰＣＲサイクルｎendがどのように選択されるかを示す図である。
【図２５】ミカエリスーメンテン式に基づくモデルを使用して解析されたＰＣＲ増幅曲線を示す図である。
【図２６】ミカエリスーメンテン式に基づくモデルを使用して解析された２つの異なる遺伝子の連続希釈された試料のＰＣＲ増幅によって生成された均等目盛上の標準曲線を示す図である。
【図２７】ミカエリスーメンテン式に基づくモデルを使用して解析された２つの異なる遺伝子の連続希釈された試料のＰＣＲ増幅によって生成された後対数目盛上の標準曲線を示す図である。
【図２８】絶対誤差と絶対相対誤差の両方の誤差を、従来の定量ＰＣＲアプローチとＰＢＥＦ１の試料を３点併行で連続希釈する場合のミカエリスーメンテン式に基づくモデル（ＭＭＫアプローチ）について比較した図である。
【図２９】絶対誤差と絶対相対誤差の両方の誤差を、従来の定量ＰＣＲアプローチとＩＦＮＡＲ１の試料を３点併行で連続希釈する場合のＭＭＫアプローチについて比較した図である。
【図３０】ＭＭＫアプローチをどのように使用して均等目盛上に標準曲線を構成できるか、次いで二次項を含めることでどのように精密化できるかを示す図である。
【図３１】二次項を組み込んだＭＭＫ均等目盛モデルの平均ＡＲＥがどのようにＰＢＥＦ１データセットについて標準ｑＰＣＲによって生成された平均ＡＲＥ（３．９％）より小さい（２．４％）かを示す図である。
【図３２】加重二次項を組み込んだＭＭＫ均等目盛モデルの平均ＡＲＥがどのようにＩＦＮＡＲ１データセットについて標準ｑＰＣＲによって生成された平均ＡＲＥ（６．５％）より小さい（５％）かを示す図である。
【図３３】試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶを計算するとＰＢＥＦ１データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと比べて変動係数が大きいｌｏｇ10ρがどのように生成されるかを示す図である。
【図３４】試料毎に効率が変動しないと仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶを計算するとＰＢＥＦ１データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと比べて変動係数が大きいｌｏｇ10ρがどのように生成されるかを示す図である。
【図３５】ＭＭＫモデルを使用して計算された、各試料について３つの複製を有する４つの異なる試料に対する参照遺伝子１８ＳのＮ0値（上側グラフ）および３つの複製に基づくその９５％信頼区間（下側グラフ）を示す図である。
【図３６】図３５の１８Ｓデータセットで実行された４つの異なる試料のそれぞれの３つの複製のそれぞれに対するミカエリスーメンテン定数Ｋ値（上側グラフ）および１８Ｓデータセット内の４つの試料のそれぞれについて計算された値Ｎ0における信頼区間（下側グラフ）を示す図である。
【図３７】ＭＭＫモデルを使用して計算された、各試料について３つの複製を有する４つの異なる試料に対する遺伝子ＰＢＥＦ１のＮ0値（上側グラフ）および３つの複製に基づくその９５％信頼区間（下側グラフ）を示す図である。
【図３８】図３７のＰＢＥＦ１データセットで実行された４つの異なる試料のそれぞれの３つの複製のそれぞれに対するミカエリスーメンテン定数Ｋ値（上側グラフ）およびこのＰＢＥＦ１データセット内の４つの試料のそれぞれについて計算された値Ｎ0における信頼区間（下側グラフ）を示す図である。
【図３９】試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算と、ＡＤＭデータセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチとの対比を示す図である（それぞれの試料が３つの複製を含む４つの異なる試料を含む）。
【図４０】試料毎に効率が変動しないと仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算を、図３９のＡＤＭデータセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと対比して示す図である。
【図４１】試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算を、ＩＬ１Ｒ２データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと対比して示す図である（それぞれの試料が３つの複製を含む４つの異なる試料を含む）。
【図４２】試料毎に効率が変動しないと仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算を、図４１のＩＬ１Ｒ２データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと対比して示す図である。
【図４３】試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算を、ＩＲＡＫ３データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと対比して示す図である（それぞれの試料が３つの複製を含む４つの異なる試料を含む）。
【図４４】試料毎に効率が変動しないと仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算を、図４３のＩＲＡＫ３データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと対比して示す図である。
【図４５】試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算を、ＪＡＫ３データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと対比して示す図である（それぞれの試料が３つの複製を含む４つの異なる試料を含む）。
【図４６】試料毎に効率が変動しないと仮定して標準ｑＰＣＲを使用してｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算を、図４５のＪＡＫ３データセットを使用するＭＭＫｑＰＣＲアプローチと対比して示す図である。
【図４７】本発明の一実施形態により試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算するためのコンピュータシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
図面のいくつかの図全体を通して類似の参照番号は、対応する部分を指す。
発明の詳細な説明
本発明は、試料から取った個別ＰＣＲ増幅曲線から試料中の核酸の初期量に関する定量的情報を抽出するためのシステムおよび方法を実現する。このアプローチは、ＰＣＲ反応がミカエリスーメンテン式（ＭＭＫ）によって律則されるという事実に基づく。
定義
本明細書で使用されている「受け取る（受信する）」および「受け取っている（受信している）」という用語は、それぞれ「入手する」または「入手しようとしている」を意味する。これは、例えば、ローカルまたはリモートコンピュータシステム、ネットワーク、またはインターネットからデータを取り出すことによって行うことができる。これは、例えば、直接測定によって行うこともできる。
【０１１１】
本明細書で使用されている「試料」という用語は、器官、組織、または生体液からの任意の生体試料などを指し、例えば、任意の被検体から得られる肝組織試料、膵臓組織試料、軟組織、筋肉組織、骨組織、膀胱組織、肺組織、上皮組織、内皮組織、血液試料、尿、粘膜スワブは、生物検体として役立つことができる。典型的には、生体試料は、少なくとも第１の遺伝子のｍＲＮＡを含み、試料中のｍＲＮＡに関する定量的情報が望ましい。遺伝子の定量的情報は、例えば、試料中の遺伝子に対するｍＲＮＡの濃度、試料中の他の遺伝子のｍＲＮＡの存在量に関する試料中の遺伝子のｍＲＮＡの存在量、および／または試料中の遺伝子に対するｍＲＮＡの分子の数とすることができる。
【０１１２】
本明細書で使用されている「敗血症」という用語は、ＳＩＲＳの感染に加えて文書に記載されている感染に対する全身性宿主反応を指す（例えば、微生物に対する陽性培養などの臨床的に有意な感染の研究室におけるその後の確認）。したがって、敗血症は、文書に記載されている感染への全身性炎症反応を指す（例えば、参照により本明細書に組み込まれている非特許文献３を参照）。本明細書で使用されているように、「敗血症」は、限定はしないが、敗血症、重篤の敗血症、敗血症性ショック、および敗血症の末期に伴って生じる多臓器機能不全（「ＭＯＤ」）の発症を含む、敗血症のすべての段階を含む。
【０１１３】
本明細書で使用されているように、「被検体」は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト以外の霊長類、および最も好ましくはヒトである。「被検体」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
ＭＭＫモデル
本発明では、試験試料中の標的核酸の濃度および／または存在量に関する定量的情報をもたらすためのアプローチは、本明細書ではＭＭＫモデルと称するモデルを使用して構成される。ＭＭＫモデルは、ＰＣＲ反応が酵素反応であり、したがってミカエリスーメンテン式によって律則されるという事実に基づく。ＰＣＲ反応は、典型的な酵素反応を律則する同じミカエリスーメンテン式に基づくので、ＰＣＲ反応のそれぞれのステップは式
【０１１４】
【数２６】
0005787517.tif 000027
【０１１５】
によって律則され、
式中、Ｚは酵素であり、Ｓは基質である。そこで、Ｚ・Ｓに対し擬似定常状態を仮定して、Ｚ・Ｓの濃度は、
［ＺＳ］＝［Ｚ］［Ｓ］／ＫM    （１９）
のようにミカエリスーメンテン式によって決定され、
式中、ＫM＝（ｋcat＋ｋ-1）／ｋ1は、ミカエリスーメンテン定数である。したがって、生成物生成速度は
【０１１６】
【数２７】
0005787517.tif 000028
【０１１７】
によって与えられ、
式中、［Ｚt］は全酵素濃度である。式２０は、ミカエリスーメンテン式によって律則される反応に対する生成物生成速度を与える。ＰＣＲにおける実際の伸長プロセスは、複雑な多段階酵素反応であるけれども、それぞれのＰＣＲサイクルをミカエリスーメンテン式によって律則される有効な酵素反応として記述するのが妥当である。そこで、ＰＣＲサイクルｎにおける生成物（ＤＮＡ）生成速度ｖnは、
【０１１８】
【数２８】
0005787517.tif 000029
【０１１９】
としてモデル化される。
前の（ｎ−１）サイクル［Ｄn-1］〜Ｎn-1からの標的ＤＮＡの濃度は、サイクルｎにおける基質濃度の役割を果たす。ＫMは、ＰＣＲプロセスの実効ミカエリスーメンテン定数であり、プロセス全体を通して一定であると仮定される（つまり、ＫM（ｎ）＝ＫM＝一定）。式２１では、前のサイクルからのＤＮＡの濃度は、次のサイクルに対する基質と考えられる。
【０１２０】
サイクルｎにおける局所ＰＣＲ効率Ｅｎは、遊離濃度対全酵素濃度の比によって決定され、生成物生成速度ｖnに関して
【０１２１】
【数２９】
0005787517.tif 000030
【０１２２】
のように表すことができる。
式２１を使用した場合、ｎ番目のサイクルの効率は、前のサイクル［Ｄn-1］においてＤＮＡのコピーがいくつあったかに依存する。
【０１２３】
試料中の標的核酸のコピー数であるＮ0から始めて、それぞれのサイクルにおけるテンプレート分子の数を計算することができる。そこで、第１のサイクルの後の試料中の標的核酸の個数（Ｎ1）および第２のサイクルの後の試料中の標的核酸の個数（Ｎ2）は、
【０１２４】
【数３０】
0005787517.tif 000031
【０１２５】
で与えられる。
そこで、標的核酸のコピーの出発数であるＮ0から始めて、ＰＣＲプロセス全体を続けることができる。第１のサイクルにおける標的核酸のコピーの数Ｎ1は、１＋第１のサイクルにおける効率Ｅ1をＮ0に掛けた値である。しかし、次に、第１のサイクルにおける効率が式２２からわかる。これは、ＫをＫ＋Ｎ0で割った値であり、Ｋはミカエリスーメンテン定数である。第２のサイクルにおける標的核酸のコピーの数Ｎ2は、１＋第２のサイクルにおける効率Ｅ2をＮ1に掛けた値である。しかし、第２のサイクルにおける効率が式２２からわかる。これは、ＫをＫ＋Ｎ1で割った値である。さらに、Ｎ1がわかり、Ｎ0で表すことができる。このようにして、与えられたステップに対するＮnを、式２３によって例示されている再帰的方法で計算することができる。
【０１２６】
式（２３）について与えられる形式の式が、ＭＭＫモデルの基礎をなす。ＭＭＫモデルの特徴は、ＭＭＫモデルが、ＰＣＲ増幅実験の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、Ｎnに対する各式を含み、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられたＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式は、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、ＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数であることである。後述のように、ＭＭＫモデルは、有利には、ＭＭＫによって計算される値ＮnとＰＣＲ増幅実験における対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより第１のモデルに対するＮ0の最小化された値として標的核酸の初期量Ｎ0を計算するために使用されうる。いくつかの実施形態では、このようにして計算した標的核酸の初期量Ｎ0は、ユーザインターフェースデバイス、モニタ、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ可読メモリ、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力される。いくつかの実施形態では、このようにして計算された標的核酸の計算された初期量Ｎ0が表示される。
【０１２７】
図１９を参照すると、そこにはＰＣＲサイクル数の関数としての局所効率がＭＭＫモデルを使用してプロットされており、局所効率は、
【０１２８】
【数３１】
0005787517.tif 000032
【０１２９】
として定義され、Ｋに対する特定の値が仮定されている。図１９では、線１９０２は、ＭＭＫモデルによって予測される値を示しているが、データ点は測定された値である。図１９からわかるように、サイクル数が少なく、Ｎ0が小さい場合には、Ｎn-1はＫに比べてかなり小さい。したがって、式２４から、効率は１００パーセントに近づくことがわかる。図１９では、サイクル２０より下のサイクルに対する測定可能なデータはなく、したがってこれらのサイクルの計算された効率は考えられないことに留意されたい。Ｎが増大するにつれ、図１９からわかるように効率は徐々に減少する。その一方で、図２０に示されているように、大きなｎについては、関係式
【０１３０】
【数３２】
0005787517.tif 000033
【０１３１】
が成り立つ。
【０１３２】
図２０では、線２００２は、ＭＭＫモデルによって予測される値を示しているが、データ点は測定された値である。
【０１３３】
図２１および２２を参照すると、そこではＮnはＰＣＲサイクル数ｎの関数として計算され（図２１）、ｌｏｇ（Ｎｎ）はＰＣＲサイクル数の関数として計算され（図２２）、その際にＭＭＫモデルが使用され、ＭＭＫモデルはＰＣＲの指数期と直線期の両方を記述することがわかる。図２１では、線２１０２は、ＭＭＫモデルによって予測される値を示しているが、データ点は測定された値である。図２２では、線２２０２は、ＭＭＫモデルによって予測される値を示しているが、データ点は測定された値である。
【０１３４】
そのため、図２１および２２は、ＭＭＫモデルがＰＣＲ反応の指数部分と直線期の両方を記述することをまとめて示している。さらに、図２１および２２からわかるように、ＭＭＫモデルと定常期（図２１におけるＰＣＲサイクル３５のあたり）までの測定データとの間の適合が優れており、そこでは、いくつかの試薬が消耗し始め、またＰＣＲ反応の速度が低下し始めるが、それは、プライマーが不十分であるか、酵素が不十分であるか、または酵素の効率が落ち始めたせいである。ＰＣＲ反応の定常期は、Ｎ0の値に関する情報的な値をもたらさない。
【０１３５】
図２１および２２は、ＰＣＲプロセスの直線期が、基礎となる酵素反応のミカエリスーメンテン式の結果であり、一般に考えられているように、ＰＣＲ試薬が切れてしまった結果ではないことをまとめて示している。ミカエリスーメンテン式は、ＰＣＲ増幅の直線的部分に関わっている。試薬は、ＰＣＲ増幅反応の定常期でのみ使い尽くされつつある。さらに、上述のように、定常期には、標的核酸の初期量（Ｎ0）に関する有用な情報はないが、それは、出発試薬の量、それらがＰＣＲサイクルの早い段階でまたは後になって使い果たしてしまうかどうか、およびＮ0に固有でない他の因子に依存するからである。
【０１３６】
ＰＣＲ反応の第３のサイクルに取り出される、ＭＭＫモデルは、
【０１３７】
【数３３】
0005787517.tif 000034
【０１３８】
で与えられる。
【０１３９】
式（２６）から、モデル全体では２つのパラメータＮ0およびＫに対して適合（フィッティング）のみすればよいことがわかる。都合のよいことに、値Ｎ0およびＫがそれぞれのＰＣＲ増幅曲線に個別にフィッティングされるため、それぞれの試料および試料のそれぞれの連続希釈に対する効率は同じであるという仮定がない。この方法では、残差Ｎn−ＦＳnの平方和（式中、Ｎnは再帰的モデルからの値であり、ＦＳnはＰＣＲサイクルｎで測定された蛍光シグナルである）は、Ｎ0およびＫに関して最小にされ、これにより、増幅軌跡のＮ0およびＫの直接推定が得られる。例えば、ＰＣＲ増幅のサイクル２０を考えてみる。ＫとＮ0だけに関してＮ20を表す再帰的な式を、式２６と同じ形式で書くことができる。次いで、この式と測定されたシグナルとの差が、２つのパラメータＮ0およびＫに関して最小にされる。
【０１４０】
ミカエリスーメンテン式に基づくモデルの場合、１つ問題になるのは、値Ｎ0およびＫを導き出すためにＰＣＲ反応のどのサイクルをフィッティングすべきかという点である。明らかに、蛍光シグナルが背景ノイズより高くないサイクルは、フィッティングに適しない。図２３を参照すると、一実施形態において、フィッティングのため選択された与えられたＰＣＲ増幅実験における第１のＰＣＲサイクルｎstartは、（ｉ）その後のすべてのサイクルの局所効率が一貫して減少し、（ｉｉ）サイクルｎstart＋１の効率が１．０５未満であるという基準に適合するＰＣＲサイクルである。図２３を参照すると、図２３に示されているデータに対するこの一組の基準に適合するサイクルは、ＰＣＲ増幅実験サイクル数１９である。
【０１４１】
図２４を参照すると、一実施形態において、フィッティングに選択された与えられたＰＣＲ増幅実験の最後のＰＣＲサイクルｎendは、ｎstart以上のそれぞれのサイクルに対する観察されたシグナルの二次導関数（ｄ2ＦＳ／ｄｎ2）をとり、二次導関数がゼロより小さい（ｄ2ＦＳ／ｄｎ2＜０）場合の第１のサイクルとなるようにｎendを選択することによって決定される。これは、尺度シグナルが一次従属性から逸脱し始めるサイクルに対応する。図２４の上側のプロットは、サイクル数ｎの関数として測定された蛍光シグナル（ＦＳ）を示している。図２４の下側のプロットは、サイクル数ｎに関して測定された蛍光シグナル（ＦＳ）の二次導関数を示している。ＰＣＲサイクル数２６では、図２４に示されているデータに関して、ｄ2ＦＳ／ｄｎ2＜０であり、したがってｎendはＰＣＲサイクル数２６となるように選択される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ｎstartおよびｎendは、図２３および２４に関して上で説明されている基準によって選択される。次いで、ミカエリスーメンテン式に基づくモデルにおけるパラメータＮ0およびＫは、集合｛ｎstart，．．．，ｎend｝に含まれるＰＣＲサイクルに対する残差Ｎn−ＦＳnの平方和が最小になるように調節され、これによりＮ0およびＫを得る。いくつかの実施形態では、ミカエリスーメンテン式に基づくモデルにおけるパラメータＮ0およびＫは、隣接する部分集合｛ｎstart，．．．，ｎend｝に含まれるＰＣＲサイクルに対する残差Ｎn−ＦＳnの平方和が最小になるように調節され、これによりＮ0およびＫを得る。いくつかの実施形態では、ミカエリスーメンテン式に基づくモデルにおけるパラメータＮ0およびＫは、集合｛ｎstart，．．．，ｎend｝に含まれるＰＣＲサイクルに対する残差Ｎn−ＦＳnの平方和が最小になるように調節され、これによりＮ0およびＫを得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ミカエリスーメンテン式に基づくモデルにおけるパラメータＮ0およびＫは、ＰＣＲ増幅の測定可能な指数期および直線期から５から２０のＰＣＲサイクルの集合に含まれるＰＣＲサイクルに対する残差Ｎn−ＦＳnの平方和が最小になるように調節され、これによりＮ0およびＫを得る。いくつかの実施形態では、ミカエリスーメンテン式に基づくモデルにおけるパラメータＮ0およびＫは、ＰＣＲ増幅の測定可能な指数期および直線期から約７から１２のＰＣＲサイクルの集合に含まれるＰＣＲサイクルに対する残差Ｎn−ＦＳnの平方和が最小になるように調節され、これによりＮ0およびＫを得る。いくつかの実施形態では、ミカエリスーメンテン式に基づくモデルに対し回帰が求められるＰＣＲサイクルの集合は、連続的でない（例えば、ｎstartとｎendの間の増幅系列内の１つまたは複数のサイクルが存在しない）。
【０１４４】
そのため、上記の本発明の方法により、残差Ｎn−ＦＳnの平方和の数値的最小化により、ＰＣＲ増幅実験のＮ0およびＫの直接推定が行われる。そこで、ｎstartおよびｎendが図２３および２４でそれぞれ使用されている方法を使用して識別されるこれらの方法を図２５に示されているＰＣＲ増幅実験に適用すると、Ｎ0＝１．５７×１０-7およびＫ＝０．８５８となる。
【０１４５】
ミカエリスーメンテン式に基づくモデルの精度を検査するために、初期核酸テンプレート既知濃度の連続希釈［Ｃ0＝８０，４０，２０，．．．１．２５ｎｇ／μＬ］を３点併行で実行し、これにＰＣＲ増幅を行った。このような希釈は、２点併行で、またはそれよりも多くの複製を使用して行われている可能性があることも理解され、本発明のＭＭＫモデルに任意の数の複製からのデータを含めることは、本発明の範囲内にある。その結果得られるＰＣＲ増幅反応のフィッティングを、ミカエリスーメンテン式に基づくモデルで行った。これらの実験の結果は、表２６に示されている。図２６は、均等目盛でのＰＢＥＦ１データとＩＦＮＡＲ１データの両方に対する初期試料の連続希釈［Ｃ0］とＮ0との間に予期された直線関係があることを示している。さらに、Ｋの値は、ＰＢＥＦ１については約０．８から０．９３、ＩＦＮＡＲ１については０．７０から０．８５の範囲に制限される。
【０１４６】
図２７を参照すると、本発明では、ミカエリスーメンテン式に基づく本発明のモデルを使用することで、標準曲線を、従来のｑＰＣＲ解析と同様に、後対数目盛で作成することができる。図２７に示されているように、調節されたＲ2はＰＢＥＦ１については０．９９９３であり、ＩＦＮＡＲ１については０．９９７１である。このデータは、ミカエリスーメンテン式に基づく本発明のモデルの妥当性を証明している。
【０１４７】
図２８は、誤差、つまり絶対誤差と絶対相対誤差を、背景技術の項で与えられている標準の定量ＰＣＲアプローチとＰＢＥＦ１の試料を３点併行で連続希釈する場合に上に提示されているミカエリスーメンテン式に基づく本発明のモデル（ＭＭＫアプローチ）について比較している。図２８に示されているように、ＰＢＥＦ１については、標準定量ＰＣＲアプローチにおけるすべての連続希釈にわたる平均（ＡＲＥ）は３．９パーセントである。対照的に、ＭＭＫアプローチにおけるすべての連続希釈にわたる平均（ＡＲＥ）は３．２パーセントである。そのため、ＭＭＫアプローチで生じる誤差は小さい。
【０１４８】
図２９は、誤差、つまり絶対誤差と絶対相対誤差を、背景技術の項で与えられている標準の定量ＰＣＲアプローチとＩＦＮＡＲ１の試料を３点併行で連続希釈する場合に上に提示されているミカエリスーメンテン式に基づく本発明のモデル（ＭＭＫアプローチ）について比較している。図２９に示されているように、ＩＦＮＡＲ１については、標準定量ＰＣＲアプローチにおけるすべての連続希釈にわたる平均（ＡＲＥ）は６．５パーセントである。さらに、ＭＭＫアプローチでは、同じ６．５パーセントという値が得られる。
【０１４９】
従来の定量ＰＣＲでは、標準曲線は対数目盛でしか作成できない。しかし、図３０を参照すると、ＭＭＫモデルは、初期テンプレートＤＮＡ濃度の直接推定を行うので、ＭＭＫアプローチの範囲内で、均等目盛で標準曲線を作成し、二次項を含めるか、または加重回帰を実行して例えば平均ＡＲＥを最小にすることによって精密化することが可能である。均等目盛は、Ｎ0がゼロに近づく場合を取り扱えるため有利である。対照的に、実際のＮ0がゼロに近づくと、計算されたＮ0は対数目盛上では無限大に近づく。
【０１５０】
そのため、図２６から２９は、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験について複数の蛍光測定値が得られる（受け取る、測定する）本発明の一態様を示している。次いで、複数のＭＭＫモデルのうちのそれぞれのＭＭＫモデルを精密化する。複数のＭＭＫモデルのうちのそれぞれのＭＭＫモデルは、複数のＰＣＲ増幅実験のうちの１つのＰＣＲ増幅実験に対するモデルである。複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて、各モデルは各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験における対応する蛍光測定値に対するＮnの各式を含み、（ｉ）各モデルにおけるそれぞれのＮnは、各蛍光測定値がとられた各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける標的核酸の量であり、（ｉｉ）各モデルにおけるＮnに対する各式は、Ｎnに対する各式に対応している対応するＰＣＲ増幅実験における対応する蛍光測定値のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表される。ここで、Ｋは、対応するＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数である。複数のモデルのうちの各モデルの精密化は、各モデルによって計算される値Ｎnと各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまで各モデルにおけるＮnに対するそれぞれの式についてＫおよびＮ0を調節し、それにより標的核酸の初期量Ｎ0を各モデルに対するＮ0の最小値として計算することを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、この方法は、複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについてＰＣＲ増幅実験で使用される試料の相対濃度の関数として複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の初期量Ｎ0のｌｏｇ10（Ｎ0）をプロットすることをさらに含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、この方法は、複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについてＰＣＲ増幅実験で使用される試料の相対濃度の関数として複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された標的核酸の初期量Ｎ0をプロットすることをさらに含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、この方法は、試料の相対濃度の関数として複数のモデルのうちのそれぞれのモデルについて計算された値Ｎ0を精密化し、Ｎ0に対する単一の精密化された値がこれらの複数のモデルについて計算されるようにすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この精密化ステップは、複数のモデルのうちのそれぞれのモデルによって計算された値Ｎ0に関して複数のＡＲＥ値の平均ＡＲＥ（絶対相対誤差）を最小にする加重回帰を実行することを含み、複数のＡＲＥ値におけるそれぞれの
【０１５４】
【数３４】
0005787517.tif 000035
【０１５５】
値は、複数のモデルのうちの各モデルに対する値であり、
【０１５６】
【数３５】
0005787517.tif 000036
【０１５７】
は各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験に使用される試料の実際の相対濃度であり、
【０１５８】
【数３６】
0005787517.tif 000037
【０１５９】
は各モデルに対する計算された値Ｎ0によって決定される各モデルに対応するＰＣＲ増幅実験に使用される試料の計算された相対濃度である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、複数のＰＣＲ増幅実験のうちのそれぞれのＰＣＲ増幅実験は、試料の連続希釈を表し、連続希釈は、２点併行または３点併行で行われ（または複製数をさらに増やして）、異なるモデルは、それぞれの連続希釈のそれぞれの２点併行について、またはそれぞれの連続希釈のそれぞれの３点併行（または複製数をさらに増やして）について計算される。
【０１６１】
そこで、本発明は、対数目盛または均等目盛のいずれかで実行されうるＭＭＫモデルを実現する。図２８および２９と併せて上で示されているように、従来の対数に基づく定量ＰＣＲに対するＭＭＫモデルの性能が比較可能である。しかし、有利には、本発明では、ＭＭＫモデルは、均等目盛で実行することができ、次いで、例えば加重回帰を使用してより適切なモデルを構成するように精密化できる。図３１は、二次項を組み込んだＭＭＫ均等目盛モデルの平均ＡＲＥが如何にＰＢＥＦ１データセットについて標準ｑＰＣＲによって生成された平均ＡＲＥ（３．９％）よりかなり小さい（２．４％）かを示す。図３２は、加重二次項を組み込んだＭＭＫ均等目盛モデルの平均ＡＲＥが如何にＩＦＮＡＲ１データセットについて標準ｑＰＣＲによって生成された平均ＡＲＥ（６．５％）よりかなり小さい（５．０％）かを示す。
【０１６２】
式２７を参照すると、相対検出感度および逆転写酵素関連パラメータが知られていないので、試料中の実際のｍＲＮＡレベルを決定するために、まだ計量ρ
【０１６３】
【数３７】
0005787517.tif 000038
【０１６４】
が必要であり、式中、ＮAMおよびＮBMは、遺伝子ＡおよびＢの分子の初期数についてＭＭＫモデルによって計算された値である。有利には、ρは、パラメータが追加されてもそれらのパラメータに依存しない。例えば、効率、あるいはミカエリスーメンテン定数Ｋすら知る必要がないか、またはその変動を考慮する必要がない。初期濃度ＮAMおよびＮBMは、個別のＰＣＲ増幅実験について別々に計算され、個別の反応速度に依存せず、さらに効率を調べる必要はない。
【０１６５】
式２７および本明細書で開示されている本発明のＭＭＫモデルが与えられたとすると、本発明の他の態様は、第１のＰＣＲ増幅実験に対する第１の複数の蛍光測定値および第２のＰＣＲ増幅実験に対する第２の複数の蛍光測定値を受け取る（測定する、取得する）ことを含み、第１および第２のＰＣＲ増幅実験では、第１の遺伝子に対するｍＲＮＡおよび第２の遺伝子に対するｍＲＮＡを含む与えられた試料を使用する。
【０１６６】
第１の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、第１のモデルは、Ｎnに対する各式を含み、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける第１の遺伝子に対するｍＲＮＡの計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式は、第１のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮAMのみで表され、Ｋは、第１のＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数であり、ＮAMは、第１のＰＣＲ増幅実験の前の試料中の第１の遺伝子の量である。
【０１６７】
第２の複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値について、第２のモデルは、Ｎnに対する各式を含み、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値がとられた第２のＰＣＲ増幅実験のサイクルｎにおける第２の遺伝子に対するｍＲＮＡの計算された量であり、（ｉｉ）第２のモデルにおけるＮnに対する各式は、サイクルｎに関係なく、Ｋ2およびＮBMのみで表され、Ｋ２は、第２のＰＣＲ増幅実験に対するミカエリスーメンテン定数であり、ＮBMは、第２のＰＣＲ増幅実験の前の試料中の第２の遺伝子の量である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲ増幅実験は、試料の第１のアリコートを使用して実行され、第２のＰＣＲ増幅実験は、試料の第２のアリコートを使用して実行される。
【０１６９】
第１のモデルの精密化は、第１のモデルによって計算される値Ｎnと第１の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮAMを調節し、それにより第１のＰＣＲ増幅実験における増幅前の試料中の第１の遺伝子に対するｍＲＮＡの初期量（ＮAM）を第１のモデルに対するＮAMの最小値として計算することを含む。第２のモデルの精密化は、前記第２のモデルによって計算された値Ｎnと第２の複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫ2およびＮBMを調節することを含む。この方法は、
【０１７０】
【数３８】
0005787517.tif 000039
【０１７１】
を計算することをさらに含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、表現型の特徴に関連する遺伝子であり、第２の遺伝子は、表現型の特徴に関連しない遺伝子である。例えば、いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、特定の表現型の特徴を有する被検体においてアップレギュレーション（発現増加制御）されるものとして知られている。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、特定の表現型の特徴を有する被検体においてダウンレギュレーション（発現減少制御）されるものとして知られている。対照的に、第２の遺伝子は、表現型の特徴を有しない被検体と比べて特定の表現型の特徴を有する被検体においてアップレギュレーションもダウンレギュレーションもされない。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ρが閾値より高い場合、試料に関わった種（例えば、ヒト、雌牛、イヌ、ヒツジ、任意の哺乳類、任意の植物など）の構成要素は、表現型の特徴を持つとみなされる。閾値は、適用事例に特有であるが、従来の技術を使用して過度の実験を行うことなく導くことができる。いくつかの実施形態では、ρが閾値より高い場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持たないとみなされる。いくつかの実施形態では、ρが閾値未満である場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持つとみなされる。いくつかの実施形態では、ρが閾値未満である場合、試料に関わった種の構成要素は、表現型の特徴を持たないとみなされる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、表現型の特徴は、細胞型、細胞形態、病態、組織または器官内の異常な状態、異常な細胞型、または異常な細胞形態である。いくつかの実施形態では、表現型の特徴は、試料が採取された試験被検体が敗血症を起こす可能性のあることを示す指標である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量ＮAMは、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの濃度である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量ＮAMは、試料中の第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の数である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量ＮBMは、試料中の第１の遺伝子のｍＲＮＡの濃度である。いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸の初期量ＮBMは、試料中の第１の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の数である。
【０１７５】
図３３を参照し、試料毎に５〜１０％程度の効率の変動があると仮定する従来の定量ＰＣＲを使用するｌｏｇ10ρに対する変動係数（ＣＶ）の計算とＰＢＥＦ１データセットを使用する革新的なＭＭＫｑＰＣＲアプローチとを比べると、標準ｑＰＣＲアプローチのｌｏｇ10ρの変動係数は、６．９０％から７．６３％までの範囲であるが、ＭＭＫｑＰＣＲアプローチの変動係数は、０．９９％から１．２８％の範囲であることがわかる。本発明のＭＭＫアプローチでは、変動係数の値が改善される（小さくなる）理由の１つは、ＭＭＫアプローチでは、Ｎ0が曲線毎に計算されるためＰＣＲ増幅実験のそれぞれにおいて一定であると仮定する必要がないことである。しかし、図３４を参照すると、効率Ｅに変動がないと仮定しても、標準ｑＰＣＲアプローチは、ｌｏｇ10ρに対して大きな変動係数値を有する。
【０１７６】
キット
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で説明されている方法のどれかを実行するためのキットを備えることもできる。限定しない一実施例において、プライマー、逆転写用の酵素、増幅用の酵素、および追加作用物質、ならびに本明細書で開示されている方法の任意の組合せを実行するためのソフトウェアをキットに入れることができる。したがって、これらのキットは、好適な容器手段内にこれらの試薬の１つまたは複数を収容する。キットは、ＲＮＡ単離、増幅生成物の精製、標識などのための薬剤も入れることができる。
【０１７７】
ソフトウェア以外の、キットの構成要素は、水媒体または凍結乾燥形態でパッケージすることができる。キットの好適な容器手段は、一般的に、少なくとも１つのバイアル瓶、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または他の容器手段を備え、これらの中に構成要素を入れ、適宜一定分量に分けて入れることができる。キット内に複数の構成要素がある場合、キットは、さらに、一般的に、追加の構成要素を別々に入れることができる第２、第３、または他の追加の容器を含む。しかし、構成要素のさまざまな組合せをバイアル瓶に入れてもよい。本発明のキットは、委託販売のため厳重に密封した試薬容器を収納する手段も備える。このような容器は、所望のバイアル瓶が中に入れられて保持される射出もしくはブロー成形プラスチック容器を備えることができる。
【０１７８】
コンピュータシステム
図４７は、本発明の方法により試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を計算する際に使用するための例示的なシステム１１の詳細を示している。このシステムは、好ましくは、以下のコンポーネントを有するコンピュータシステム１０を含む。
・  中央演算処理装置２２。
・  ストレージコントローラ１２によって制御される、ソフトウェアおよびデータを格納するための主不揮発性ストレージユニット１４、例えば、ハードディスクドライブ。
・  不揮発性ストレージユニット１４からロードされたプログラムおよびデータを含む、システム制御プログラム、データ、およびアプリケーションプログラムを格納するための、システムメモリ３６、好ましくは高速ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）。システムメモリ３６は、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）も含むことができる。
・  １つまたは複数の入力デバイス（例えば、キーボード２８、マウス）およびディスプレイ２６または他の出力デバイスを含む、ユーザインターフェース３２。
・  有線または無線通信ネットワーク３４（例えば、インターネットなどのワイドエリアネットワーク）に接続するためのネットワークインターフェースカード２０（通信回路）。
・  前述の要素に給電するための電源２４。
・  システムの前述の要素を相互接続するための内部バス３０。
【０１７９】
コンピュータ１０の動作は、中央演算処理装置２２によって実行される、オペレーティングシステム４０によってもっぱら制御される。オペレーティングシステム４０は、システムメモリ３６内に格納できる。典型的な実装では、システムメモリ３６は以下の要素も含む。
・  本発明によって使用されるさまざまなファイルおよびデータ構造体へのアクセスを制御するためのファイルシステム４２。
・  ＰＣＲ増幅実験４６における複数の蛍光測定値４８を生成し、複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値ＦＳn  ４８は試料のＰＣＲ増幅実験４６において異なるサイクルｎでとられる蛍光測定値である、ＰＣＲ解析モジュール４４。
・  ＰＣＲ増幅実験５２のモデルを精密化することによって複数の蛍光測定値４８を処理するように適合され、複数の蛍光測定値のうちのそれぞれの蛍光測定値４８についてモデル５２はＮnに対する各式５４を含む、インテリジェント型モジュール５０。
【０１８０】
ここで、（ｉ）Ｎnは、各蛍光測定値４８がとられたＰＣＲ増幅実験４６のサイクルｎにおける標的核酸の計算された量であり、（ｉｉ）Ｎnに対する各式５４は、ＰＣＲ増幅実験４６のサイクルｎに関係なく、ＫおよびＮ0のみで表され、Ｋは、ＰＣＲ増幅実験のミカエリスーメンテン定数であり、Ｎ0は、試料中の標的核酸の初期量である。インテリジェント型モジュール５０によるモデルの精密化は、モデルによって計算される値Ｎnと複数の蛍光測定値のうちの対応する蛍光測定値との間の差が最小になるまでＫおよびＮ0を調節し、それにより試料中の標的核酸の初期量Ｎ0を決定することを含む。
【０１８１】
図４７に示されているように、コンピュータ１０は、ＰＣＲ増幅実験４６を含む。ＰＣＲ増幅実験４６は、限定はしないが、フラットファイル、リレーショナルデータベース（ＳＱＬ）、またはオンライン分析処理（ＯＬＡＰ）データベース（ＭＤＸおよび／またはそれらの変種）を含む任意のデータストレージとすることができる。いくつかの実施形態では、図４７に示されているソフトウェア、モジュール、およびデータ（例えば、モジュール４４および５０）は、単一コンピュータ（例えば、コンピュータ１０）上にあり、他の実施形態では、これらはいくつものコンピュータ（図に示されていない）によってホストされる（格納される）。実際には、１つまたは複数のコンピュータ上の図４７に示されているモジュールの配列構成は、それらの１つまたは複数のコンピュータがネットワーク３４上で、または他の電子的手段によって互いに関してアドレッシング可能（アドレス可能）である限り、本発明の範囲内にある。したがって、本発明は、広範なコンピュータシステムのアレイを完全に包含する。
【０１８２】
本発明は、コンピュータ可読ストレージ媒体に埋め込まれたコンピュータプログラムメカニズムを備えるコンピュータプログラム製品として実施されうる。さらに、本発明の方法はどれも、１つまたは複数のコンピュータで実施されうる。さらに、本発明の方法はどれも、１つまたは複数のコンピュータプログラム製品で実施されうる。本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で開示されている方法のどれか、またはすべてを符号化するコンピュータプログラム製品を実現する。このような方法は、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスクストレージ製品、または他のコンピュータ可読データもしくはプログラムストレージ製品上に格納されうる。このような方法は、ＲＯＭ、１つまたは複数のプログラム可能チップ、あるいは１つまたは複数の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの固定ストレージ内に埋め込むこともできる。このような固定ストレージは、サーバ、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１無線ブリッジ／無線局、リピータ、ルータ、携帯電話、または他の電子デバイス内にローカル配置することができる。コンピュータプログラム製品内に符号化されるこのような方法は、デジタル方式または搬送波でのコンピュータデータ信号（ソフトウェアモジュールが埋め込まれている）の伝送によって、インターネットまたは他の手段を介して、電子的に配送することもできる。
【０１８３】
本発明のいくつかの実施形態は、図４７に示されているプログラムモジュールのどれか、またはすべてを含むコンピュータプログラム製品を実現する。これらのプログラムをモジュールは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスクストレージ製品、または他のコンピュータ可読データもしくはプログラムストレージ製品上に格納されうる。プログラムモジュールは、ＲＯＭ、１つまたは複数のプログラム可能チップ、あるいは１つまたは複数の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの固定ストレージ内に埋め込むこともできる。このような固定ストレージは、サーバ、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１無線ブリッジ／無線局、リピータ、ルータ、携帯電話、または他の電子デバイス内にローカル配置することができる。コンピュータプログラム製品内のソフトウェアモジュールは、デジタル方式または搬送波でのコンピュータデータ信号（ソフトウェアモジュールが埋め込まれている）の伝送によって、インターネットまたは他の手段を介して、電子的に配送することもできる。
【実施例】
【０１８４】
［実施例１］
図３５を参照すると、上側のグラフに示されているのは、革新的なＭＭＫモデルを使用して計算されたそれぞれの試料に対し３つの複製を用意した４つの異なる試料の参照遺伝子１８ＳのＮ0値である。下側のグラフに示されているのは、３つの複製に基づく１８Ｓの平均Ｎ0値およびその９５％信頼区間である。図３５は、革新的ＭＭＫモデルを使用して計算したときにどのように１８ＳのＮ0が試料毎にあまり変化しないかを示している。さらに、Ｎ0の変動係数は、７．５％〜９．５％である（Ｎ0の均等目盛に注意）。図３６を参照すると、上側グラフには、図３５に示されている１８Ｓデータセットに対するミカエリスーメンテン定数Ｋ値が、４つの測定される異なる試料のそれぞれの３つの複製のそれぞれについて与えられている。図３６の下側のグラフには、４つの試料のそれぞれに対する信頼区間が与えられている。データは、Ｋの平均がそれぞれの試料についてほとんど同じであることを示している。しかし、Ｋは、複製毎に著しく異なり、（Ｋ）の変動係数は８％〜１３．５％程度である。反応がそれぞれのウェル内で同じ速度で進むと予期する理由はないが、１８Ｓに対する平均Ｋは、４つの試料のそれぞれについてほぼ同じであるべきである。図３６の下側のグラフからわかるように、試料の平均Ｋの変動は非常に小さい。
【０１８５】
［実施例２］
図３７を参照すると、上側のグラフに示されているのは、革新的なＭＭＫモデルを使用して計算されたそれぞれの試料に対し３つの複製を用意した４つの異なる試料の発現遺伝子ＰＢＥＦ１のＮ0値である。下側のグラフに示されているのは、３つの複製に基づくＰＢＥＦ１の平均Ｎ0値およびその９５％信頼区間である。図３７は、ＰＢＥＦ１のＮ0の大きさは１８Ｓの場合に比べて４〜５桁小さいことを示している。さらに、ＰＢＥＦ１（および典型的には他の発現遺伝子も）の平均Ｎ0値は、異なる試料に対し十分に隔たっており、これは、ＭＭＫモデルが、異なる試料に対するＮ0の値の差を認識できることを意味している。図３７の下側のグラフでは、信頼区間は、３つの複製に基づいており、Ｎ0の変動係数（ＣＶ（Ｎ0））は均等目盛で４％〜９％程度である。図３８を参照すると、上側グラフには、図３７に示されているＰＢＥＦ１データセットに対するミカエリスーメンテン定数Ｋ値が、４つの測定される異なる試料のそれぞれの３つの複製のそれぞれについて与えられている。図３８の下側のグラフには、４つの試料のそれぞれにおけるＫの平均およびその信頼区間が与えられている。データは、Ｋの平均がそれぞれの試料についてほとんど同じであることを示している。しかし、Ｋは、複製毎に著しく異なり、（Ｋ）の変動係数は１％〜６％程度である。反応がそれぞれのウェル内で同じ速度で進むと予期する理由はないが、それぞれの試料に対する平均Ｋは、ほぼ同じであるべきである。図３８の下側のグラフからわかるように、試料の平均Ｋの変動は非常に小さい。
【０１８６】
［実施例３］
図３９を参照し、試料毎に５〜１０％程度の効率の変動があると仮定する標準ｑＰＣＲを使用するｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算と遺伝子に対するデータセットを使用する革新的なＭＭＫｑＰＣＲアプローチ（それぞれの試料が３つの複製を含む、４つの異なる試料を含む）とを比べると、標準ｑＰＣＲアプローチのｌｏｇ10ρの変動係数は、１０．１４％から１０．５８％までの範囲であるが、ＭＭＫｑＰＣＲアプローチの変動係数は、０．７％から０．９％の範囲であることがわかる。図４０を参照すると、効率Ｅに変動がないと仮定しても、標準ｑＰＣＲアプローチは、ｌｏｇ10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
【０１８７】
［実施例４］
図４１を参照すると、試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用するｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算が、遺伝子ＩＬ１Ｒ２に対するデータセットを使用する革新的なＭＭＫｑＰＣＲアプローチに基づく同じ値の計算と比較されている（それぞれの試料が３つの複製を含む４つの異なる試料を含む）。標準ｑＰＣＲアプローチに対するｌｏｇ10ρの変動係数は、１２．８７％から１３．８７％までの範囲であるが、ＭＭＫｑＰＣＲアプローチに対する変動係数は、０．７７％から０．８４％までの範囲であることがわかる。図４２を参照すると、効率Ｅに変動がないと仮定しても、標準ｑＰＣＲアプローチは、ｌｏｇ10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
【０１８８】
［実施例５］
図４３を参照すると、試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用するｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算が、遺伝子ＩＲＡＫ３に対するデータセットを使用する革新的なＭＭＫｑＰＣＲアプローチに基づく同じ値の計算と比較されている（それぞれの試料が３つの複製を含む４つの異なる試料を含む）。標準ｑＰＣＲアプローチに対するｌｏｇ10ρの変動係数は、７．３２％から７．７３％までの範囲であるが、ＭＭＫｑＰＣＲアプローチに対する変動係数は、０．７２％から１．２３％までの範囲であることがわかる。図４２を参照すると、効率Ｅに変動がないと仮定しても、標準ｑＰＣＲアプローチは、ｌｏｇ10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
【０１８９】
［実施例６］
図４５を参照すると、試料毎に効率が５〜１０％程度変動すると仮定して標準ｑＰＣＲを使用するｌｏｇ10ρに対する変動係数ＣＶの計算が、遺伝子ＪＡＫ３に対するデータセットを使用する革新的なＭＭＫｑＰＣＲアプローチに基づく同じ値の計算と比較されている（それぞれの試料が３つの複製を含む４つの異なる試料を含む）。標準ｑＰＣＲアプローチに対するｌｏｇ10ρの変動係数は、６．５７％から７．０５％までの範囲であるが、ＭＭＫｑＰＣＲアプローチに対する変動係数は、０．９６％から１．５％までの範囲であることがわかる。図４６を参照すると、効率Ｅに変動がないと仮定しても、標準ｑＰＣＲアプローチは、ｌｏｇ10ρに対して大きな変動係数値を有することがわかる。
【０１９０】
引用文献
本明細書で引用されているすべての参考文献は、そっくりそのまま参照により、またそれぞれの個別の刊行物または特許もしくは特許出願が、すべての目的に関して参照によりそっくりそのまま組み込まれることを特に、また個別に指示されていた場合と同じ程度にすべての目的に関して、本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
修正
本発明の多くの修正ならびに変更は、当業者には明らかなように、本明細書の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書で説明されている特定の実施形態は、例としてのみ示されており、本発明は、付属の請求項の表現によってのみ、そのような請求項が関係する均等物の全範囲ともに、制限されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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