(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式１又は化学式２に示されるジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤。
【化１】
0005716140.tif 000023
化学式１
【化２】
0005716140.tif 000024
化学式２
【請求項２】
化学式３又は化学式４に示されるジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤。
【化３】
0005716140.tif 000025
化学式３
【化４】
0005716140.tif 000026
化学式４
【請求項３】
化学式５、化学式８又は化学式１０に示されるジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤。
【化５】
0005716140.tif 000027
化学式５
【化６】
0005716140.tif 000028
化学式８
【化７】
0005716140.tif 000029
化学式１０
【請求項４】
化学式１４、化学式１５又は化学式１６に示されるジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤。
【化８】
0005716140.tif 000030
化学式１４
【化９】
0005716140.tif 000031
化学式１５
【化１０】
0005716140.tif 000032
化学式１６
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オステオポンチン（OPN）産生亢進が原因として起こる疾患（例えば、癌の転移）を予防又は改善し得る、ジクチオピロン（Dictyopyrone）誘導体又はジヒドロジクチオピロン（Dihydrodictyopyrone）誘導体を有効成分とするOPN産生阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
OPNは、カルシウムの沈着した骨組織のマトリックスを構成する主要な非コラーゲン性タンパク質として同定された、分子量約41kDaの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質である。乳汁、尿、腎尿細管、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化T細胞、及び多くの腫瘍組織で広くその発現が認められている。OPNは、骨基質中で破骨細胞とハイドロキシアパタイトとをつなぐ架け橋として働くと考えられていたが（非特許文献１）、他にも細胞接着、細胞遊走、一酸化窒素産生の制御、腫瘍、又は免疫系への関与といった多彩な機能が報告されている。【０００３】
OPN発現は腫瘍の進行度と相関し、癌転移との関連性が示されている。肺癌、肝癌、乳癌又は前立線癌の患者の血漿からOPNが検出されており（非特許文献２）、正常部と比較して癌部のOPN mRNAが上昇していることが報告されており（非特許文献３）、グリオーマにおけるOPN発現も悪性度と相関する傾向があることが報告されている（非特許文献４）。OPN発現と腫瘍との相関は、動物モデルにおいても確かめられている（非特許文献５）。このようなOPNに関する最近の知見から、腫瘍細胞の転移及び浸潤を促進するOPNの産生を抑制することは、癌の転移を防ぐ抗癌剤の新しい標的の一つと考えられるようになった（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Miyauchi A，Alvarez J，Greenfield EM，Teti A，Grano M，Colucci S，Zambonin-Zallone A, Ross FP，Teitelbaum SL，Cheresh D，Hruska KA. (1991) Recognition of osteopontin and related peptides by an alpha v beta 3 integrin stimulates immediate cell signals in osteoclasts. J Biol Chem  266，20369-20374.
【非特許文献２】Senger DR, Perruzzi CA, Gracey CF, Papadopoulos A, Tenen DG. (1988)  Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation : close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation. Cancer Res 48, 5770 - 5774
【非特許文献３】Brown LF, PapadopoμLos-Seigiou A, Brygida B, Manseau EJ, Tognazzi K, Perruzzi CA, Dvorak HF, Senger DR. (1994) Osteopontin expression in human carcinoma. Am J Pathol. 145, 610 - 623
【非特許文献４】Saitoh Y, Kuratsu JI, Takeshima H, Yamamoto S, Ushio Y (1995) Expression of osteopontin in human glioma. Lab Invest 72, 55-63.
【非特許文献５】Suzuk M, Mose E, Galloy C ,and Tarin T (2007) Osteopontin Gene Expression Determines Spontaneous Metastatic Performance of Orthotopic Human Breast Cancer Xenografts. Am J Pathol 171, 682 - 692
【非特許文献６】Weber GF (2001) Review: The metastasis gene osteopontin : a candidate target for cancer therapy. Biochim Biophys Acta 1552, 61-85.
【非特許文献７】Kikuchi H, Sasaki K, Sekiya J, Maeda M, Amagai A, Kubohara Y and Oshima Y (2004) Dihydrodictyopyrone A and C: new members of dictyopyrone family isolated from Dictyostelium cellular slime molds Bioorg Med Chem 12, 3203-3214
【非特許文献８】Matsuura M, Suzuki T, Suzuki M, Tanaka R, Ito E and Saito T (2011) Statin-mediated reduction of osteopontin expression induces apoptosis and cell growth arrest in ovarian clear cell carcinoma. Oncol Rep 25, 41-47
【非特許文献９】Haruhisa Kikuchi, Koji Nakamura, Yuzuru Kubohara, Naomi Gokan, Kohei Hosaka, Yasuo Maedad and Yoshiteru Oshima, Tetrahedron Letters 48 (2007) 5905-5909.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、OPNの産生を抑制することにより、癌の転移を防ぐことができる可能性がある。OPN産生阻害作用を有する薬剤としては、PPAR-γ（Peroxysome Proliferator-Activated Receptor-γ）アゴニストであるインスリン抵抗性改善薬（トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン及び非ステロイド性抗炎症薬（例えば、インドメタシン又はイブプロフェン）及びHMG-CoA還元酵素阻害剤であるスタチン系高コレステロール血症治療薬（例えば、ロスバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン及びメバスタチン）が知られている。【０００６】
一方、細胞性粘菌は、広く土壌表層に分布している原生生物の1種であり、生活環の中に動物的と植物的、単細胞と多細胞といった大きく異なる性質を併せ持つとともに、細胞運動、細胞質分裂又は分化のような多細胞生物の発生系を構成する主要過程を含んでいる。天然化学において従来良く利用されている生物種とは大きく異なっているため、様々な新規化合物を産生していることが期待されている。【０００７】
本発明は、OPN産生亢進に起因する疾患（例えば、癌の転移）を予防し得る、OPN産生阻害剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、OPNの遺伝子発現を抑制する化合物を見出すため、OPNプロモーター制御下でレポーター遺伝子のルシフェラーゼを発現する細胞株を用い、D. discoideumのような細胞性粘菌の二次代謝産物を対象としてスクリーニングを行った。【０００９】
その結果、本発明者等は、ジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体の中にルシフェラーゼ発現を抑制する化合物を見出した。【００１０】
本発明者等はまた、このようなOPNプロモーター制御下におけるルシフェラーゼ活性を抑制する化合物は、ヒト小細胞肺癌由来細胞株A549又はヒト肝癌由来細胞株HepG2の産生するOPN量を低下させることも見出した。本発明者等はさらに、Wound-Healingアッセイによりジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体がOPNの生理的な機能である細胞の遊走能を抑制することと、マトリクスゲル浸潤アッセイによりジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体が細胞の転移及び浸潤能を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
具体的に、本発明は、ジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤に関する。【００１２】
ジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体の中には、ヒト白血病細胞由来K562細胞の増殖を抑制する活性を有している化合物が存在することは報告されているが（非特許文献７）、OPN産生阻害作用はこれまで報告されていない。【００１３】
ジクチオピロン誘導体としては、化学式１又は化学式２に示される化合物が好ましい。【００１４】
【化１】
0005716140.tif 000002
【００１５】
【化２】
0005716140.tif 000003
【００１６】
ジヒドロジクチオピロン誘導体としては、化学式３又は化学式４に示される化合物が好ましい。【００１７】
【化３】
0005716140.tif 000004
【００１８】
【化４】
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【発明の効果】
【００１９】
本発明のジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするOPN産生阻害剤は、インスリン抵抗性改善薬又はスタチン系高コレステロール血症治療薬とは異なる作用機序を有するOPN産生阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】化合物３（化学式３に示される化合物）添加によるA549細胞のOPN産生抑制効果を表すグラフを示す。
【図２】化合物３（化学式３に示される化合物）添加によるHepG2細胞のOPN産生抑制効果を表すグラフを示す。
【図３】化合物３（化学式３に示される化合物）添加によるA549細胞の創傷回復抑制効果を表すグラフを示す。
【図４】化合物３（化学式３に示される化合物）添加によるA549細胞のマトリクス浸潤抑制効果を表すグラフを示す。
【図５】SVS（シンバスタチン）によるOPN産生量抑制効果に対する、MVA（メバロン酸）添加による回復効果を表すグラフを示す。
【図６】化合物３によるOPN産生量抑制効果に対する、MVA添加による影響を表すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施形態について、適宜図面を参照しながら説明する。本発明は、以下の記載に限定されない。
【００２２】
＜Ａ：OPNプロモーター制御下におけるルシフェラーゼ発現阻害効果の確認方法＞
pGL-3ベクター basic （Promega）のマルチクローニング部位に、ヒトOPNプロモーター配列（−765から23）を組込んだレポーターベクターpOPN1-lucは、動物細胞にトランスフェクションするとルシフェラーゼを発現する。このpOPN1-lucを、ピューロマイシン耐性遺伝子（puromycin-N-acetyl-transferase gene）を発現するpPUR（Clontech）と共にヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549にトランスフェクションし、ピューロマイシン添加培地にて増殖可能である、ルシフェラーゼを発現する細胞を選択した。選択された細胞をA549/OPNluc細胞と名づけ、後述するOPNプロモーター制御下におけるルシフェラーゼ発現阻害効果の観察に使用した。
【００２３】
被験化合物をA549/OPNluc細胞の培養液中に添加し、細胞内のルシフェラーゼ発現量に対する影響を観察した。ここで、被験化合物が細胞毒性又は細胞増殖抑制効果を有している場合には、被験化合物の濃度に依存した生細胞数の減少により総ルシフェラーゼ発現量が低下し、被験化合物のOPNプロモーター制御下でのルシフェラーゼ発現阻害効果を正しく評価できないことが考えられる。このため、細胞増殖能力又は細胞生存能力を発色測定により定量する方法であるWSTアッセイをまず実施し、被験化合物の細胞増殖に対するIC50（50％細胞増殖阻害濃度）を求めた。その後、ルシフェラーゼ活性測定を実施し、被験化合物のOPNプロモーター制御下のルシフェラーゼ発現に対するEC50（50％ルシフェラーゼ発現抑制濃度）を求めた。
【００２４】
Ａ１）  WSTアッセイ
A549/OPNluc細胞を10％牛胎児血清（FCS）及び1％ペニシリン・ストレプトマイシン（P/S）を添加したDMEM培地に3×104 cells/mLとなるよう懸濁させ、これを96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注した。試験をトリプリケートで実施するので、対照群及び各濃度の被験化合物添加用として、それぞれ3ウェルずつ準備した。分注後、96ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。
【００２５】
被験化合物をジメチルスルホキシド（DMSO）によって50mmol/L溶液とし、−80℃に保存した。この被験化合物溶液を、DMSOによって2倍希釈系列として希釈し（通常は0.31mmol/L〜20mmol/Lの範囲）、2倍ずつ濃度の異なった被験化合物溶液をWSTアッセイのために準備した。
【００２６】
細胞懸濁液を入れた各ウェルに、DMSOのみ（対照）又は希釈した被験化合物（検体）の溶液を0.5μLずつ分注した（200倍希釈）。ボルテックスミキサーで混和した後、96ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で48±4時間培養した。その後、Premix WST-1 Reagent（タカラバイオ）を10μLずつ各ウェルに添加した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、96ウェルプレートを37℃, 5％CO2条件下でインキュベーションし、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad；Benchmark又はThermo Scientific；Varioskan Flash）を用いて60分後又は120分後の吸光値（450nm）を測定した。
【００２７】
対照のウェル及び各濃度の検体ウェルの吸光値をそれぞれエクセルファイルに入力し、対照の平均吸光値に対する、各濃度の検体ウェルの吸光値のパーセントを求めた。求めた値から最小二乗法による近似曲線式を求め、IC50を計算した。
【００２８】
Ａ２）  ルシフェラーゼアッセイ
細胞懸濁液を入れた各ウェルにDMSOのみ（対照）又は希釈した被験化合物（検体）の溶液を0.5μLずつ加えて200倍希釈し、ボルテックスミキサーで混和した後、炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で48±4時間培養する工程まで、上述したWSTアッセイと同じ操作を行った。
【００２９】
Luciferase Assay Systems（Promega：Cat# E1500）に含まれるLuciferase Assay Substrate（以下、LASと表記する）をLuciferase Assay Buffer（LAB）で溶解し、ルシフェラーゼ試薬を調製した。5×Cell Culture Lysis Reagent（以下、CCLRと表記する）を水で5倍希釈し、1×CCLRを調製した。
【００３０】
培養48±4時間後、各ウェルの培地を完全に取り除き、1×CCLRを50μLずつ分注した。室温で30分静置した後、各ウェル内の1×CCLRを測定用試料とした。化学発光測定用のチューブにルシフェラーゼ試薬を100μL入れ、これに測定用試料20μLを添加して混和し、Tuner Design Luminometer 20/20 （Promega）を用いて、化学発光（相対発光強度：RLU）を測定した。
【００３１】
対照のRLU及び各濃度の検体のRLUをそれぞれエクセルファイルに入力し、対照のRLUの平均値に対する各濃度の検体のRLUのパーセントを求め、その値から最小二乗法により近似曲線式を求め、EC50を計算した。
【００３２】
表１は、被験化合物である化学式１〜化学式１６に示されるジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体について、WSTアッセイ及びルシフェラーゼアッセイによって計算されたIC50及びEC50を示す。
【００３３】
【化５】
0005716140.tif 000006
【００３４】
【化６】
0005716140.tif 000007
【００３５】
【化７】
0005716140.tif 000008
【００３６】
【化８】
0005716140.tif 000009
【００３７】
【化９】
0005716140.tif 000010
【００３８】
【化１０】
0005716140.tif 000011
【００３９】
【化１１】
0005716140.tif 000012
【００４０】
【化１２】
0005716140.tif 000013
【００４１】
【化１３】
0005716140.tif 000014
【００４２】
【化１４】
0005716140.tif 000015
【００４３】
【化１５】
0005716140.tif 000016
【００４４】
【化１６】
0005716140.tif 000017
【００４５】
ここで、化学式１，２，５〜８に示される化合物は、非特許文献７に開示されている製造方法に従って製造した。化学式３，１２，１３，１５〜１６に示される化合物は、非特許文献９に開示されている製造方法に従って製造した。
【００４６】
［化学式４に示される化合物の製造方法］
非特許文献７の記載どおりに合成された5mgの (S)-3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6-dimethyl- 1H-pyridin-2-one を 1mL のメタノールに溶解させた。1mg のパラジウム炭素（Pd 5％）を添加し、水素雰囲気下、室温にて2時間攪拌した。反応液を濾過してパラジウム炭素を除去し、その濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル（4:1）で溶出させた画分より、化学式４に示される化合物を4mg得た。
【００４７】
得られた化合物は、EIMS（電子衝撃質量スペクトル）法による質量分析及びNMRによって解析された。EIMS及びNMRの結果は、以下に示されるとおりであった。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 5.76 (1H, br.s),  3.52-3.64 (1H, m), 3.05 (1H, d, J = 11.2 Hz), 2.81 (1H, dt, J = 17.8, 7.5 Hz), 2.52 (1H, dt, J = 17.8, 7.4 Hz), 2.28-2.41 (1H, m), 1.87 (1H, dt, J = 13.0, 2.3 Hz), 1.52-1.68 (3H, m), 1.23-1.36 (16H, s), 1.17 (3H, d, J = 6.4 Hz), 0.94 (3H, d, J= 6.5 Hz), 0.88 (3H, t, J = 6.4 Hz).
EIMS m/z (rel. int) 309 [M]+ (11), 294 (5), 182 (10), 169 (13), 127 (100), 112 (55).
【００４８】
［化合物９に示される化合物の製造方法］
297mgの suberic acid monomethyl ester を8mLの塩化メチレンに溶解させ、250mgのメルドラム酸、453mg1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、及び19mgの4-(ジメチルアミノ)ピリジンを加えて、室温にて４時間攪拌した。反応液に0.5M塩酸30mLを加え、30mLの酢酸エチルを用いて3回抽出した。抽出され酢酸エチル層を全て合わせて、60mLの水及び60mLの飽和食塩水によってそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。その残渣を5mLのトルエンに溶解させ、246mg の (2S,4S)-2,4-pentandiol を添加し、120℃で2時間攪拌した。室温に戻した後、反応液を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(3:1)で溶出させた画分より200mgの 1-(1S,3S)-3-hydroxy-1-methylbutyl 10-methyl 3-oxodecanedioate を得た。
【００４９】
196mgの 1-(1S,3S)-3-hydroxy-1-methylbutyl 10-methyl 3-oxodecanedioate を8mLの塩化メチレンに溶解させ、109mgの N-methylmorpholine N-oxide、311mgの粉末状のモレキュラーシーブス4A、及び11mgの tetrapropylammonium perruthenate を順次添加し、室温にて5時間攪拌した。反応液を濾過し、その濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(4:1)で溶出させた画分より133mgの 1-(S)-1-methyl-3-oxobutyl 10-methyl 3-oxodecanedioate を得た。
【００５０】
126mgの 1-(S)-1-methyl-3-oxobutyl 10-methyl 3-oxodecanedioate を2mLのエタノールに溶解させ、41mgのナトリウムエトキシドを添加し、室温にて10時間攪拌した。反応液を20mLの0.5M塩酸に注ぎ、20mLの酢酸エチルを用いて3回抽出した。抽出された酢酸エチル層を全て合わせて、40mLの水、及び40mLの飽和食塩水によってそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(4:1)で溶出させた画分より 88mgのmethyl (S)-8-(4,6-dimethyl-2-oxo-5,6-dihydro-2H-pyran-3-yl)-8-Oxooctanoate（化学式９に示される化合物）を得た。
【００５１】
得られた化合物は、EIMS（電子衝撃質量スペクトル）法による質量分析及びNMRによって解析された。EIMS及びNMRの結果は、以下に示されるとおりであった。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 4.50-4.60 (1H, m), 3.67 (3H, s), 2.74 (1H, dt, J = 17.3, 7.4 Hz), 2.73 (1H, dt, J = 17.3, 7.4 Hz), 2.45(1H, ddq, J = 17.9, 11.6, 0.9 Hz), 2.31 (1H, dd, J = 17.9, 3.8 Hz), 2.30 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.01 (3H, d, J = 0.9 Hz), 1.58-1.68 (4H, m), 1.44 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.30-1.38 (4H, m).
EIMS m/z (rel. int) 296 [M]+ (6), 281 (10), 265 (11), 246 (14), 181 (20), 168 (83), 153 (100), 109 (30).
【００５２】
［化合物１０に示される化合物の製造方法］
非特許文献７の記載どおりに合成された300mgの (S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione を6mLのメタノールに溶解させ、ヒドラジン一水和物1038mgを添加し、6時間加熱還流した。室温に戻した後、反応液に1M水酸化ナトリウム水溶液30mLを添加し、30mLの酢酸エチルによって3回抽出した。抽出された酢酸エチル層を全て合わせて、60mLの水、及び60mLの飽和食塩水でそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣を6mLのトルエンに溶解させ、565mgの 5-butanoyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione を添加し、15時間加熱還流した。室温に戻し、反応液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル（2:1）を用いて溶出させた画分より、140mgの (S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxohexanamide を得た。
【００５３】
115mgの (S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxohexanamide を80％酢酸水溶液4mLに溶解させ、室温にて7時間攪拌した。反応液を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル（2:1）を用いて溶出させた画分より、59mgの (S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxodecanamide を得た。
【００５４】
11mgの (S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxodecanamide を1mLのエタノールに溶解させ、5mgのナトリウムエトキシドを添加し、室温にて8時間攪拌した。反応液を10mLの0.5M塩酸に注ぎ、10mLの酢酸エチルによって3回抽出した。抽出された酢酸エチル層を全て合わせて、20mLの水、及び20mLの飽和食塩水によってそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル（2:1）で溶出させた画分より、4mgの (S)-3-butanoyl-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-1H-pyridin-2-one （化学式１０に示される化合物）を得た。
【００５５】
生成物は、EIMS（電子衝撃質量スペクトル）法による質量分析及びNMRによって解析された。EIMS及びNMRの結果は、以下に示されるとおりであった。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 5.45 (1H, br.s), 3.66-3.78 (1H, m), 2.71 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.31 (1H, dd, J= 17.6, 7.6 Hz), 2.23 (1H, dd, J = 17.6, 7.2 Hz), 1.93 (3H, s), 1.64 (2H, quint, J = 7.4 Hz), 1.24, (3H, d, J= 6.4 Hz), 0.94 (3H, t, J = 7.4 Hz).
EIMS m/z(rel. int) 195 [M]+ (19), 180 (100), 152 (54), 109 (22).
【００５６】
［化合物１１に示される化合物の製造方法］
非特許文献７の記載どおりに合成された300mgの (S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan- 2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione を6mLのメタノールに溶解させ、ヒドラジン一水和物1038mgを添加して、6時間加熱還流させた。室温に戻した後、反応液に1M水酸化ナトリウム水溶液30mLを添加し、30mLの酢酸エチルによって3回抽出した。抽出された酢酸エチル層を全て合わせて、60mLの水、及び60mLの飽和食塩水でそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣を6mLのトルエンに溶解させ、564mgの 2,2-dimethyl-5-octanoyl-1,3-dioxane-4,6-dione を添加して、15時間加熱還流させた。室温に戻した後、反応液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(2:1)で溶出させた画分より、51mgの (S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxodecanamide を得た。
【００５７】
47mgの (S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxodecanamide を80％酢酸水溶液3mLに溶解させ、室温にて7時間攪拌した。反応液を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(2:1)で溶出させた画分より、38mgの (S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxodecanamide を得た。
【００５８】
23mgの (S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxodecanamide を2mLの N,N-ジメチルホルムアミドに溶解させ、3mgの水素化ナトリウム（60％，鉱油中に分散）を添加し、室温にて10時間攪拌した。反応液を10mLの0.5M塩酸に注ぎ、10mLの酢酸エチルによって3回抽出した。抽出された酢酸エチル層を全て合わせて、20mLの水、及び20mLの飽和食塩水でそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(2:1)で溶出させた画分より、9mgの (S)-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-3-octanoyl-1H-pyridin-2-one（化学式１１に示される化合物）を得た。
【００５９】
生成物は、EIMS（電子衝撃質量スペクトル）法による質量分析及びNMRによって解析された。EIMS及びNMRの結果は、以下に示されるとおりであった。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 5.52 (1H, br.s), 3.65-3.78 (1H, m), 2.72 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.31 (1H, dd, J= 17.2, 5.6 Hz), 2.23 (1H, dd, J = 17.2, 7.2 Hz), 1.92 (3H, s), 1.60 (2H, quint, J = 7.6 Hz), 1.23-1.35 (8H, m), 1.24 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.87 (3H, t, J= 7.0 Hz).
EIMS m/z (rel. int) 251 [M]+ (33), 236 (57), 180 (100), 167 (69), 152 (76), 109 (23).
【００６０】
［化合物１４に示される化合物の製造方法］
非特許文献７の記載どおりに合成された10mgの3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6,6-trimethyl- 2H-pyran-2-one を1mLの酢酸エチルに溶解させ、1mgの20％水酸化パラジウム-炭素を添加し、水素雰囲気下、室温にて20時間攪拌した。反応液を濾過してパラジウム炭素を除去し、その濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(19:1)で溶出させた画分より、9mgの化学式１４に示される化合物を得た。
【００６１】
生成物は、EIMS（電子衝撃質量スペクトル）法による質量分析及びNMRによって解析された。EIMS及びNMRの結果は、以下に示されるとおりであった。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 3.13 (1H, d, J= 10.8 Hz), 2.87 (1H, dt, J = 14.8, 7.2 Hz), 2.59-2.67 (1H, m), 2.55 (1H, dt, J= 14.8, 6.8 Hz), 1.84 (1H, dd, J = 13.4, 4.0 Hz), 1.57-1.66 (2H, m), 1.51 (1H, t, J= 13.4 Hz), 1.43 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.25-1.31 (16H, m), 0.95 (3H, d, J = 6.4 Hz), 0.88 (3H, t, J = 6.6 Hz).
EIMS m/z (rel. int) 324 [M]+ (3), 309 (6), 84 (100).
【００６２】
【表１】
0005716140.tif 000018
【００６３】
化学式１，２及び８に示されるジクチオピロン誘導体と、化学式３，４，１５及び１６に示されるジヒドロジクチオピロン誘導体とは、EC50濃度がIC50濃度の1/2以下であった。特に、化学式１〜４に示される化合物（化合物１〜化合物４）は、EC50濃度が30μM未満であり、低濃度でOPNプロモーター制御下におけるルシフェラーゼ（OPN Luc）発現を50％抑制した。
【００６４】
＜Ｂ：ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549及びヒト肝癌由来細胞株HepG2のOPN産生に対する化合物３の抑制効果＞
上述したように、ジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体の中に、50％細胞増殖を抑制する濃度（IC50）の1/2以下の濃度で、OPNプロモーター制御下でのルシフェラーゼ発現を50％阻害する化合物が存在することが確認された。そこで、最もEC50濃度が低く、なおかつIC50濃度がEC50濃度の2倍以上を示した化学式３に示される化合物（化合物３）について、癌細胞由来細胞株から産生されるOPN量を実際に抑制できるか否かの確認試験を行った。
【００６５】
化合物３を、ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549、及びヒト肝癌由来細胞株HepG2の培養液に加え、2日間培養後の培養上清中のOPN量を、Human Osteopontin Immunoassay kit（R&D systems）を使用して測定し、化合物３無添加群（対照群）のOPN量と比較することにより、確認試験を行った。
【００６６】
化合物３は、細胞増殖抑制効果も有していることから、OPN産生量抑制効果を正しく評価するために、培養上清を除いてウェルに残った細胞に、ルシフェラーゼアッセイで使用した1×CCLR液を添加して細胞溶解液を調製し、その蛋白量をBCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific）を使用して測定した。化合物３の添加によるOPN産生量への影響は、蛋白1mg量当たりのOPN量で比較した。
【００６７】
Ｂ１）  試料調製方法
まず、A549細胞又はHepG2細胞を、それぞれ10％FCS、1％P/Sを添加したDMEM培地に4×104 cells/mLとなるよう懸濁させ、24ウェルプレートの各ウェルに500μLずつ分注した。試験はトリプリケートで実施するので、対照及び各濃度の被験化合物添加群は、それぞれ3ウェルずつ準備した。24ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）内で24±4時間培養した。
【００６８】
被験化合物である化合物３は、DMSOを用いて50mmol/L溶液とし、−80℃に保存した。この化合物３溶液を、DMSOを用いて希釈し、3.75mmol/L, 7.5mmol/L及び15mmol/Lの濃度にそれぞれ調製した。A549細胞を培養している各ウェルには、化合物３の7.5mmol/L溶液又は15mmol/L溶液を2μLずつ添加した。対照ウェルには、DMSOのみ2μLずつ添加した。
【００６９】
HepG2細胞を培養している各ウェルには、化合物３の3.75mmol/L溶液又は7.5mmol/L溶液を2μLずつ添加した。対照ウェルには、DMSOのみ2μLずつ添加した。
【００７０】
24ウェルプレートを前後左右に揺すり、ウェル内の溶液を混和した後、炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で48±4時間培養した。その後、培養上清全量を1.5mLチューブに移し、細胞が残ったウェルには、D-PBS(-)を500μL添加した。
【００７１】
24ウェルプレートを軽く揺すってから、D-PBS(-)を除き、ルシフェラーゼアッセイで使用する5×CCLRを水で5倍希釈して調製した1×CCLRを、各ウェルに200μLずつ分注した。その後、24ウェルプレートをロッキングシェーカーに乗せ、15分間ロッキングした。
【００７２】
15分間ロッキングした後の24ウェルプレートの各ウェルから、細胞溶解液を1.5mLチューブに移し、細胞破壊片のような夾雑物を除くために微量高速冷却遠心機にて4℃、15,000rpmで1分間遠心した。得られた上清を蛋白量測定用試料とした。
【００７３】
一方、1.5mLチューブに移した培養上清を、細胞破壊片のような夾雑物を除くために、微量高速冷却遠心機によって4℃、15,000rpmで1分間遠心した。得られた上清をELISA用試料とした。
【００７４】
Ｂ２）  OPN蛋白量の測定
ELISA用試料を以下のように希釈した。
A549細胞（20倍希釈）：試料5μL＋培養培地95μL
HepG2細胞（80倍希釈）：試料2μL＋培養培地158μL
【００７５】
ELISAキットに含まれているOPN standardのバイアルに水1mLを加え、穏やかに混和し、室温に15分間静置して200ng/mL OPN Standardを調整した。そして、表２に示されるように、OPN standardをキットに含まれている希釈液RD5-24によって段階希釈した。
【００７６】
【表２】
0005716140.tif 000019
【００７７】
キットに含まれる必要数のOPN MicroplateとRD1-6を用意し、RD1-6を100μLずつウェルに分注した。希釈したOPN Standard（バイアルA〜H）及び試料を、RD1-6を添加したウェルにさらに50μLずつ添加した。その後、ウェル上部をシールでカバーし、室温で2時間静置した。この間に、キットに含まれているWash Buffer Concentrateを水で希釈し、Wash Bufferを調整した。
【００７８】
2時間静置後、各ウェル内の液を除去した。各ウェルにWash Bufferを250μL分注した後、Wash Bufferを除去し、ウェルを洗浄した。この洗浄操作を4回行った。
【００７９】
OPN conjugateを各ウェルに200μLずつ分注した。そして、ウェル上部をシールでカバーし、室温で2時間静置した。この間に、キットに含まれているColor Reagent AとColor Reagent Bを等量混和し、Substrate Solutionを調製した。
【００８０】
2時間静置後、各ウェル内の液を除去した。各ウェルにWash Bufferを250μL分注した後、Wash Bufferを除去し、ウェルを洗浄した。この洗浄操作を4回行った。
【００８１】
Substrate Solutionを各ウェルに200μLずつ分注し、遮光して室温で30分間静置した。その後、キットに含まれているStop Solutionを各ウェルに50μLずつ添加し、ウェルの液全体が青色から黄色になるまで、穏やかにボルテックスミキサーによって混和した。混和後、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad；Benchmark又はThermo Scientific；Varioskan Flash）を用いて、吸光値（450nm及び 570nm）を測定した。全ての測定データのOD 450nmからOD 570nmの値を減算し、以降の計算はこの値を用いた。
【００８２】
検量線サンプルの吸光値より、検量線を作成した。検量線の数式を用いて各サンプルの吸光値からOPN蛋白量を算出した。
【００８３】
Ｂ３）  細胞中の総蛋白量測定
蛋白量測定用試料10μLと水90μLを混和し、10倍希釈した。検量線サンプルを、表３に示されるように、BSA溶液を水で希釈して調製した。
【００８４】
【表３】
0005716140.tif 000020
【００８５】
蛋白測定用キットに含まれているBCA Reagent A とBCA Reagent B（50：1）を混和し、Working Reagentを調製した。96ウェルプレートに検量線サンプル（バイアルA〜F）及び10倍希釈した蛋白測定用試料をそれぞれ25μL分注した。試験はデュプリケートで実施するので、対照群及び各濃度の被験化合物添加群は、それぞれ2ウェルずつ準備した。
【００８６】
Working Reagentを各ウェルに200μLずつ添加し、ボルテックスミキサーで30秒間混和した。60℃で30分間加温した後、室温で15分間静置した。その後、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad；Benchmark又はThermo Scientific；Varioskan Flash）を用いて吸光値（550nm）を測定した。
【００８７】
検量線サンプルの吸光値より、検量線を作成し、検量線の数式より各ウェルの希釈した試料の総蛋白濃度を算出した。さらに、総タンパク濃度に希釈倍率（10倍）を乗算し、試料の総蛋白濃度を算出した。
【００８８】
（OPN（蛋白）量の表示）
OPN量（培養上清1mL当たりの量）は、ELISA測定用の試料の全量（0.5mL）当たりに換算された。この換算値を、OPN量を求めた試料と同じウェルの蛋白測定用試料全量（0.2mL）中の蛋白量で除し、OPN量を細胞総蛋白1mg当たりに換算した。この蛋白1mg当たりのOPN量で、化合物３投与の影響を検討した。
【００８９】
（統計処理）
OPN量の統計処理には、エクセル統計Statcel 3を用いた。エクセルファイル上にて、被験化合物である化合物３を添加された試料のOPN量を、対照のOPN量との比較でDunnett検定した。
【００９０】
図１は、化合物３添加によるA549細胞のOPN産生抑制効果を表すグラフを示す。化合物３は、濃度30μmol/Lの場合には５％未満の危険率、濃度60μmol/Lの場合には1％未満の危険率において、対照群（コントロール）と比較してA549細胞のOPN産生を有意に抑制することが確認された。
【００９１】
図２は、化合物３添加によるHepG2細胞のOPN産生抑制効果を表すグラフを示す。化合物３は、濃度15μmol/L及び濃度30μmol/Lの場合に、1％未満の危険率において、対照群と比較してHepG2細胞のOPN産生を有意に抑制することが確認された。特に、濃度30μmol/Lの場合には、対照群と比較してOPN産生量が半分以下に減少した。
【００９２】
図１及び図２より、化合物３は、ヒト小細胞肺癌由来細胞株A549及びヒト肝癌由来細胞株HepG2の産生するOPN量を有意に低下させることが確認された。
【００９３】
＜Ｃ：ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549の創傷治癒能に対する化合物３の抑制効果＞
OPNプロモーター制御下でのルシフェラーゼ発現を抑制する化合物３は、実際に蛋白としてのOPN産生を阻害することが、図１及び図２に示される実験結果から判明した。次の段階として、OPNが産生されたことにより細胞に生じる生理的な機能が、被験化合物である化合物３によって抑制されるか否かを確認した。確認方法の一つとして、細胞の創傷治癒試験（Wound-Healing assay）を行った。この試験は、細胞の遊走能を調べる方法として一般的に知られている方法である。単層培養した細胞をピペットの先などで部分的に細胞を剥がした際に、傷のまわりの細胞が移動（遊走）することで傷の部分を埋めていくが、培養液中に被験化合物を添加することより、この機能に影響を与えるかを観察した。
【００９４】
Ｃ１）  創傷治癒試験（Wound-Healing assay）方法
ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549を10％FCS、1％P/Sを添加したDMEM培地に3.5×105 cells/mLとなるよう懸濁させた。24ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を500μL（1.75×105cells）ずつ分注した。試験はトリプリケートで実施するので、対照及び各濃度の被験化合物添加用として、それぞれ3ウェルずつ準備した。分注後、24ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。
【００９５】
培養後、全てのウェルから培地を除去した。DMEMに0.1％牛血清アルブミン（BSA）及び1％P/Sを添加した培地（無血清培地）を全てのウェルに500μLずつ分注した。プレートを前後左右に揺すった後、もう一度、全ウェルから培地を除去した。培地除去後、無血清培地を全てのウェルに500μLずつ分注した。
【００９６】
被験化合物である化合物３は、DMSOで50mmol/L溶液とし、−80℃に保存した。この化合物３溶液をDMSOで希釈し、3.125mmol/L及び6.25mmol/Lの濃度にそれぞれ調製した。A549細胞を培養している各ウェルには、化合物３の3.125mmol/L,又は6.25mmol/Lの溶液を2μLずつ添加した。対照ウェルには、DMSOのみ2μLずつ添加した。
【００９７】
24ウェルプレートを前後左右に揺すり、ウェル内の溶液を混和した後、炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。
【００９８】
24ウェルプレート内の細胞を顕微鏡下で観察し、100％ confluentであることを確認した後、20μL用のマイクロピペットチップの先端で、プレート底面の細胞に、1ウェルにつき3箇所引っ掻き傷をつけた。顕微鏡として、CCDカメラシステムのRetiga-2000 Fast 1394 Color（QImaging）を取り付けた倒立型リサーチ顕微鏡IX71（オリンパス）を使用した。
【００９９】
顕微鏡で創傷部を観察し、創傷部が画像に収まるように調整して撮影した。倍率は40倍（接眼：×10、対物：×4）に設定した。撮影後、24ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で48±4時間培養した。
【０１００】
培養後、顕微鏡で創傷部を観察し、創傷部が画像に収まるように調整して撮影した。倍率は40倍（接眼：×10、対物：×4）に設定した。
【０１０１】
Image-Pro Plus 7.0J（MediaCybernetics社）を用いて、撮影した画像に基づいて、創傷部の面積を確認した。そして、
創傷回復率(％) ＝100 - [創傷２日後の創傷面積/創傷直後の創傷部面積]×100
という計算式に基づいて、創傷回復率(％)を計算した。対照群及び2種類の濃度の化合物３投与群それぞれの創傷回復率（％）の平均値を算出した。また、対照群の創傷回復率に対する化合物処理群の創傷回復率（％）も算出した。
【０１０２】
Ｃ２）  統計処理
創傷回復率の算出値の統計処理は、エクセル統計Statcel 3を用い、エクセルファイル上ですべての化合物３投与処理群の創傷回復率を、対照との比較でDunnett検定を行うことにより実施された。
【０１０３】
図３は、化合物３添加によるA549細胞の創傷回復抑制効果を表すグラフを示す。化合物３は、濃度12.5μmol/Lの場合には対照群との間で創傷回復率に違いが認められなかったが、濃度25μmol/Lの場合には、1％未満の危険率において、対照群の間で創傷回復率に有意差が認められた。すなわち、化合物３は、濃度25μmol/Lの場合に、A549細胞の創傷回復を有意に抑制することが確認された。
【０１０４】
＜Ｄ：ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549の転移浸潤能に対する化合物３の抑制効果＞
OPNが産生されたことにより細胞に生じる生理的な機能が、被験化合物によって抑制されるか否かを調べる2番目の試験として、マトリクス浸潤試験（Matrix-Invasion assay）を行った。この試験では、細胞外マトリクス成分であるコラーゲン又はラミニン（マトリゲル、BD Bioscience社）をコーティングした、φ8μmの細孔（ポア）を有する膜が底部に張ってあるカップ（インサート）と、そのインサートを挿入する24ウェルプレートを用意した。無血清培地に懸濁した細胞を内側のインサートに入れ、外側の24ウェルプレートの各ウェルに細胞の転移及び浸潤を誘引する物質（ここでは牛胎児血清）を加えた培地を注入し、インサートのマトリゲルをコーティングした膜を通過して外側のウェルに出てくる細胞数を観察した。
【０１０５】
マトリゲルは、細胞培養用の人工基底膜マトリックスであり、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫から抽出された可溶性基底膜調製品である。マトリゲルの主成分は、ラミニン、コラーゲンIV、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン/ニドジェンである。マトリゲルには、TGF-β、上皮細胞増殖因子、インシュリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びEHS腫瘍に自然に産生される他の増殖因子も含まれる。
【０１０６】
具体的には膜の外側に浸潤してきたA549細胞に蛍光色素を取り込ませた後、膜から剥がし、その蛍光強度を測定した。同時に、数が既知である検量線作成用の細胞にも蛍光色素を取り込ませ、その蛍光強度から検量線を作成した。そして、近似曲線式から細胞数が未知である被験サンプルの浸潤細胞数を求めた。
【０１０７】
癌細胞は、外側の培地に加えた牛胎児血清の刺激によりOPNを産生する。しかし、培養液にOPNが存在すると、細胞はMatrix Metalloproteinase（MMP）というコラーゲンを分解する酵素を産生してマトリゲルを溶解し、さらに遊走能が高まるので外側のウェルに移動してくる。OPNプロモーター制御下でのルシフェラーゼ発現を抑制するジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体の代表として、化合物３のA549細胞のマトリクス浸潤機能に対する抑制効果を観察した。
【０１０８】
Ｄ１）  マトリクス浸潤試験（Matrix-Invasion assay）方法
ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549を、10％FCS、1％P/Sを添加したDMEM培地に1.8×105 cells/mLとなるよう懸濁させた。その懸濁液を75cm2フラスコに10mL分注し、炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。同様に、検量線作成用にA549細胞の6×104cells/mLの懸濁液を調製し、その懸濁液を25cm2フラスコに5mL分注し、炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。この日を作業の0日目とした。
【０１０９】
［翌日：作業1日目］
細胞をシードした75cm2フラスコから培地を除去した。培地を除去したフラスコに0.1％BSA及び1％P/S添加DMEM培地（無血清培地）を10mL分注し、細胞表面に一様に培地が被るようにフラスコを前後左右に傾けた。その後、フラスコから培地を除去した。
【０１１０】
培地を除去したフラスコに無血清培地を10mL分注した。その後、炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。
【０１１１】
［作業2日目］
マトリゲル（10mg/mL：BD Biosciences）を氷上で融解させた。セルカルチャーインサート（24ウェル用, 8.0μmポア：BD Biosciences）及び無血清培地を氷冷しておいた。マトリゲルを氷冷した無血清培地で25倍希釈し、マトリゲル溶液を調製した。
【０１１２】
24ウェルプレートに必要数のセルカルチャーインサートをセットし、マトリゲル溶液を50μLずつセルカルチャーインサートに分注し、チップの先でメンブレン全体にマトリゲル溶液を行き渡らせた。その後、24ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）に1〜2時間入れた。
【０１１３】
前日に無血清培地に交換した75cm2フラスコの細胞の培養上清を除去した。 カルシウム・マグネシウム無添加リン酸緩衝生理食塩液（D-PBS（-））10mLを分注し、細胞表面に一様にD-PBS(-)が被るようにフラスコを前後左右に傾けた後、D-PBS（-）を除去した（この操作をD-PBS（-）による洗浄操作という）。その後、Cell Dissociation Solution（CDS／細胞剥離溶液：シグマ）を3〜5mLフラスコに分注した。CDSを分注したフラスコを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）に入れて、20分間程度加温（5分毎にロッキング）し、細胞をフラスコ底部より剥離させる作業を行った（この作業をCDSによる細胞剥離という）。
【０１１４】
300×gでの遠心分離の後、上清を除去し、5mLの無血清培地を用いて細胞を懸濁させた。懸濁液の一部（10μL）を分取し、0.4％トリパンブルー溶液を10μL添加して軽くピペッティングした後、Burker-Turk血球計算板を用いて細胞数を計数し、細胞濃度を求めた（この作業を細胞数カウントという）。
【０１１５】
無血清培地を用いて、2×105cells/mLの細胞濃度の懸濁液を8mL調製した。マトリゲル溶液によって表面をコートした後、炭酸ガス培養器で1〜2時間インキュベーションしたカルチャーインサートに、調製した細胞懸濁液を0.5mL（1×105cells）ずつ穏やかに分注した。試験は、トリプリケートで行った。
【０１１６】
15mLチューブに10％FCS、1％P/S添加を添加したDMEM培地を5mL分注した。このチューブに化合物３の50mmol/L DMSO溶液を2.5μL（最終濃度25μmol/L）又は5μL（最終濃度50μmol/L）を分注し、化合物３添加培地を調製した。転移及び浸潤の抑制効果を有するドキシサイクリン（DOXY；DMSOを用いて100mmol/Lに調製し、−30℃で保存しておいた）を陽性対照として用いた。DMEM の10％FBS、1％P/S添加培地の5mLにドキシサイクリン100mmol/Lを3.75μL(最終的に75μmol/L)添加して、陽性対照添加培地を調整した。10％FCS、1％P/Sを添加したDMEM培地の5mLにDMSOを5μL添加し、陰性対照添加培地を調製した。
【０１１７】
カルチャーインサートとプレートの隙間から、24ウェルプレートのウェルに化合物３添加培地、陽性対照添加培地又は陰性対照添加培地を0.75mLずつ分注した。その後、24ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で48±4時間培養した。
【０１１８】
［作業3日目］
25cm2フラスコで培養していたA549細胞の培地を除去し、無血清培地5mLに交換した。その後、25cm2フラスコを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。
【０１１９】
［作業4日目］
カルセインAM（50μg/バイアル：BD Biosciences）のバイアルを室温に戻し、DMSOを30μL添加して混和し、カルセインAM溶液を調製した。15mLチューブにCDSを5mL分注し、これにカルセインAM溶液を6μL添加して混和し、1×カルセインAM溶液（被験インサート用カルセインAM溶液）を調製した。一方、15mLチューブにCDSを1.5mL分注し、カルセインAM溶液を3.6μL添加して混和し、2×カルセインAM溶液（検量線用カルセインAM溶液）を調製した。
【０１２０】
Ｄ２）  検量線用細胞の準備
前日に培地交換した25cm2フラスコの細胞の培養上清を除去し、D-PBS（-）5mLを用いて、上述した洗浄操作を行った。さらに、CDS 3mLを用いて上述した細胞剥離を行った。その後、上述した細胞数カウントを行い、CDSを用いて5×105 cells/mLの細胞懸濁液を調製した。そして、表４に示されるように、細胞懸濁液をCDSを用いて希釈した。96ウェルブラックプレート（コーニング）の各ウェルに、バイアルA〜H内の細胞懸濁液を50μLずつ分注した。試験は、トリプリケートで行った。
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
Ｄ３）  カルセインAM染色
新しい24ウェルプレートの各ウェルにD-PBS（-）を0.75mLずつ分注した。各インサートをピンセットで持ち上げながらインサート内の培地をピペットによって除去し、D-PBS（-）0.75mLを分注したウェルに挿入した。各インサートにD-PBS（-）を0.5mL分注し、インサートをD-PBS（-）によって洗浄した。
【０１２３】
新しい24ウェルプレートを用意し、その各ウェルに1×カルセインAM溶液をそれぞれ0.35mL分注した。D-PBS（-）によって洗浄したインサートをピンセットで持ち上げながら、インサート内のD-PBS（-）を、ピペットを用いて除去し、1×カルセインAM溶液を分注したウェルに移した（被験インサートの細胞の蛍光染色）。インサートを移した24ウェルプレートを、炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で1時間インキュベーションした。30分おきにプレート側面を軽く叩いた。
【０１２４】
インキュベーションの間、細胞懸濁液を分注した96ウェルブラックプレートの各ウェルに、2×カルセインAM溶液を50μLずつ分注し、アルミホイルで包んでから室温に静置した（検量線用の細胞の染色）。
【０１２５】
Ｄ４）  蛍光測定
1時間のインキュベーションが終わった後、インサートの入った24ウェルプレートを、内部の液がこぼれないように注意しながら揺すって、液を混和した。その後、24ウェルプレートの各ウェルからピンセットを用いて各インサートを取り除いた。インサートを除いた各ウェルの液を、新しい96ウェルブラックプレートの各ウェルに100μLずつ3ウェルに移した（被験インサートの細胞用プレート）。
【０１２６】
マイクロプレートリーダー（Molecular Device；SpectraMax M5又はThermo Scientific； Varioskan Flash）を用いて、検量線用細胞及び被験インサートの細胞用、それぞれの96ウェルブラックプレートの各ウェルの蛍光を測定（excitation：485nm, emission：520nm）した。
【０１２７】
Ｄ５)  総浸潤細胞数の算出
検量線用細胞の蛍光強度（RLU）をエクセルに入力し、最小二乗法により近似曲線（検量線）の数式を求めた。検量線の数式を用いて、96ウェルプレートの1ウェルあたりの蛍光強度から浸潤細胞数を算出した。その浸潤細胞数に3.5を乗じ、24ウェルプレートの1ウェル当たりの総浸潤細胞数を算出し、さらにトリプリケートで行っているので3ウェルの総浸潤細胞数の平均値を算出した。
【０１２８】
Ｄ６）  統計処理
統計処理は、エクセル統計Statcel 3を用いて、エクセルファイル上で、陽性対照及び化合物３処理群の総浸潤細胞数を、陰性対照（Control）値との比較でDunnett検定を行うことにより実施された。
【０１２９】
図４は、化合物３添加によるA549細胞のマトリクス浸潤抑制効果を表すグラフを示す。陽性対照群（ドキシサイクリン投与群）の総浸潤細胞数は、対照群の1/3以下であった。一方、化合物３は、濃度25μmol/Lの場合には対照群よりも総浸潤細胞数が減少したが、有意差は認められなかった。しかし、化合物３は、濃度50μmol/Lの場合には、総浸潤細胞数が対照群の約半分となり、1％未満の危険率において、対照群との間で総浸潤細胞数に有意差が認められた。すなわち、化合物３は、濃度50μmol/Lの場合に、A549細胞のマトリクス浸潤を有意に抑制することが確認された。
【０１３０】
＜Ｅ．OPN産生阻害作用に対するメバロン酸の影響＞
スタチン系高コレステロール血症治療薬（具体例は、ロスバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン又はメバスタチン）はHMG-CoA阻害剤であり、この酵素の阻害によりメバロン酸の低下を導き、それにともなうメバロン酸由来のイソプレノイド量の低下に起因するRasのようなG蛋白に影響をもたらし、OPN産生抑制効果を示すと考えられている（非特許文献８）。
【０１３１】
本発明のOPN産生阻害剤が有効成分とするジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体が示すOPN産生阻害効果が、公知であるスタチン系高コレステロール血症治療薬と同じ作用機作であるのかを確認するため、シンバスタチン又は化合物３をA549/OPNluc細胞の培養液に添加し、OPNプロモーター制御下の遺伝子発現に対する効果を調べ、メバロン酸の共存下でもその効果を維持するか否かを観察した。
【０１３２】
Ｅ１）  WSTアッセイ
A549/OPNluc細胞を10％FCS及び1％P/Sを添加したDMEM培地に3×104 cells/mLとなるよう懸濁させた。この懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注し、96ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で24±4時間培養した。
【０１３３】
−80℃で保存していた化合物３の50mmol/L DMSO溶液を室温に静置して融解させた後、DMSOを用いて希釈し、5.0mmol/Lの溶液を調製した。一方、DMSOを用いてシンバスタチン（SVS：シグマ）の50mmol/L溶液を調製し、−80℃で保存した。この溶液を用時室温に静置して融解させ、DMSOを用いてさらに希釈し、1mmol/LのSVS溶液を調製した。
【０１３４】
エタノールを用いてメバロン酸（MVA：シグマ）の0.5mol/L溶液を調製し、−80℃で保存した。この溶液を用時室温に静置して融解させた後、37℃で30分静置し、その後D-PBS(-)を用いて希釈し、20mmol/L及び200mmol/Lの溶液を調製した。調製した溶液を炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）内に20分間静置した（その間、時々混和した）。
【０１３５】
細胞懸濁液を分注したウェルに、2種類の濃度（20mmol/L及び200mmol/L）のMVA溶液を、それぞれ0.5μLずつ添加した（MVA 100μmol/L：4ウェル、MVA 1mmol/L：4ウェル）。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、96ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で4時間培養した。
【０１３６】
あらかじめMVAを100μmol/L又は1mmol/Lとなるように添加した4ウェルに、化合物３の5.0mmol/L溶液をそれぞれ0.5μLずつ添加した。 同様に、MVAを添加していなかった2ウェルにも、化合物３の5.0mmol/L溶液をそれぞれ0.5μLずつ添加した。さらにMVAを100μmol/L又は1mmol/Lとなるように添加した4ウェルに、1mmol/LのSVS溶液をそれぞれ0.5μLずつ添加した。同様に、MVAを添加していなかった2ウェルに、1mmol/LのSVS溶液をそれぞれ0.5μLずつ添加した。対照薬物であるMVA、化合物３及びSVSのいずれも添加しない2ウェルには、DMSOをそれぞれ0.5μL添加した（Control）。表５は、各試験群における添加薬物及び添加量を示す。
【０１３７】
【表５】
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【０１３８】
ボルテックスミキサーで混和した後、96ウェルプレートを炭酸ガス培養器（37℃, 5％CO2条件下）で48±4時間培養した。その後、Premix WST-1 Reagent（タカラバイオ）を10μLずつ各ウェルに添加した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、37℃, 5％CO2条件下でインキュベーションし、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad；Benchmark又はThermo Scientific；Varioskan Flash）を用いて、30分、90分及び120分後の吸光値（450nm）を測定した。
【０１３９】
吸光値は、エクセルファイルに入力し、各試験群の全てのサンプルの吸光値を、Controlの吸光値の平均値で除し、それぞれの吸光値のControlの吸光値に対する比（Ratio to Control）を求めた。
各サンプルの吸光値 ÷ Controlの吸光値 = Ratio to Control
【０１４０】
Ｅ２）  ルシフェラーゼアッセイ
WST アッセイの終わった各ウェルの上清を除き、D-PBS(-)を100μLずつそれぞれのウェルに分注した。Luciferase Assay Systems（Promega）に含まれるLuciferase Assay Substrate（LAS）を、Luciferase Assay Buffer（LAB）を用いて溶解し、ルシフェラーゼ試薬を調製した。さらに、5×CCLRを、水を用いて5倍希釈し、1×CCLRを調製した。
【０１４１】
各ウェルのD-PBS(-)を完全に取り除き、1×CCLRを50μLずつ分注した。その後、室温で96ウェルプレートを30分静置した。静置後の各ウェル内の1×CCLRを、測定用試料とした。化学発光測定用のチューブにルシフェラーゼ試薬を100μL分注し、このチューブに測定用試料を20μL添加して混和し、GloMax 20/20 Luminometer （Promega）を用いて、化学発光（相対発光強度：RLU）を測定した。
【０１４２】
ControlのRLU及び各測定用試料のRLUを、それぞれエクセルファイルに入力した。各群のRLUをWSTアッセイで求めたRatio to Control値で除し、化合物３又はSVS添加によって影響を受けた細胞増殖速度の差によって、生じたRLUの差を補正した。
【０１４３】
図５は、SVSによるルシフェラーゼ活性抑制効果に対する、MVA添加による回復効果を表すグラフを示す。SVSを添加することにより、OPNプロモーターを制御されたA549細胞のルシフェラーゼ活性は低下した。しかし、MVAを100μmol/L又は1mmol/Lの濃度で添加することにより、SVSのルシフェラーゼ活性抑制効果は消失し、A549細胞のルシフェラーゼ活性は、対照群と同程度にまで回復することが確認された。
【０１４４】
図６は、化合物３によるルシフェラーゼ活性抑制効果に対する、MVA添加による影響を表すグラフを示す。化合物３添加によるルシフェラーゼ活性抑制は、MVA添加によっては回復しなかった。
【０１４５】
図５及び図６より、SVSのルシフェラーゼ活性抑制と、化合物３のルシフェラーゼ活性抑制とは、作用機序が異なっていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明のジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするOPN産生阻害剤は、癌の転移のようなOPN産生亢進に起因する疾患を予防することが期待される。本発明のジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするOPN産生阻害剤は、従来のOPN産生阻害剤とは異なる作用機序を有するOPN産生阻害剤として、医薬品、生化学又はバイオテクノロジー分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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