(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Ｉを有するポリマー性反応剤。
【化４５】
0005766118.tif 000058
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含み；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが；ここで、Ｃαに隣接する前記炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく；そして、
ＮＲ５は、必要に応じてスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよい。］
【請求項２】
構造Ｉａを有する、請求項１に記載の反応剤。
【化４６】
0005766118.tif 000059
［式中、
Ｒ１、ＮＲ５、ＺおよびＰＯＬＹは、先に定義されたものであり，
前記置換基Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、および水溶性ポリマーから選択され、そして前記置換基ＲｂおよびＲｂ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択され、
それらの置換基の多くとも一つが水溶性ポリマーであり、それらの置換基のいずれか２個が、合体して脂肪族環を形成することが可能である。］
【請求項３】
Ｒ１が、Ｈまたはメチルである、請求項１に記載の反応剤。
【請求項４】
Ｒ１が、Ｈである、請求項３に記載の反応剤。
【請求項５】
前記置換基Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’が独立して水素およびアルキルから選択され、該置換基の該アルキルのいずれか２個が合体して、５員〜７員の脂肪族環を形成することが可能である、請求項２に記載の反応剤。
【請求項６】
前記置換基Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’の隣接炭素原子の上のアルキル置換基のいずれか２個が合体して、５員〜７員の脂肪族環を形成している、請求項５に記載の反応剤。
【請求項７】
Ｒ５が、低級アルキルであり、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含む、請求項２に記載の反応剤。
【請求項８】
Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれが水素であり、Ｒ５がメチルである、請求項７に記載の反応剤。
【請求項９】
Ｚが、アルキレン、エーテル、チオエーテル、アミド、二級アミノ基または三級アミノ基から選択される、請求項１に記載の反応剤。
【請求項１０】
Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれが水素であり、そしてＮＲ５がＺと合体してピペラジン環を形成し、それに対して、環の窒素原子を介してＰＯＬＹがリンクされている、請求項２に記載の反応剤。
【請求項１１】
構造ＩＩを有するポリマー性反応剤。
【化４７】
0005766118.tif 000060
［式中、
ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコールであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンルカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２およびさらなる水溶性ポリマーから選択されるが、
ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、またここで、−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−の中の２個の置換基Ｒ２またはＲ３が合体して環を形成することが可能であるが；
ただし、Ｃαに隣接する前記炭素の上のＲ２またはＲ３はいずれも、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基ではない。］
【請求項１２】
多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）および−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２から選択される、請求項１１に記載の反応剤。
【請求項１３】
ｍが、０〜６である、請求項１１に記載の反応剤。
【請求項１４】
１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、および−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２から選択され；前記基Ｒ２またはＲ３およびｍの値を選択して、Ｒ２またはＲ３の上の酸素原子または窒素原子がＣαから４−結合長さだけ離れるようにする、請求項１１に記載の反応剤。
【請求項１５】
１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、およびアルキレンカルボン酸から選択される、請求項１４に記載の反応剤。
【請求項１６】
Ｒ１が、Ｈまたはメチルである、請求項１４に記載の反応剤。
【請求項１７】
ＰＯＬＹが、ｍＰＥＧである、請求項１６に記載の反応剤。
【請求項１８】
Ｒ１がＨであり、ｍが３であり、そして−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−（ＣＨ２）３−および−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−から選択される、請求項１７に記載の反応剤。
【請求項１９】
−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−（ＣＨ２）３−である、請求項１８に記載の反応剤。
【請求項２０】
−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−である、請求項１８に記載の反応剤。
【請求項２１】
ｍが１であり、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、そしてＲ３がイミノアルキルである、請求項１７に記載の反応剤。
【請求項２２】
Ｒ３が、（４−イミダゾリル）メチルである、請求項２１に記載の反応剤。
【請求項２３】
−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−ＣＨ２−ＣＨＲｘ−Ｃ（ＮＨ２）Ｒｙ−であり、ＲｘとＲｙとが５員〜７員の環を形成し、それにＰＯＬＹがリンクされている、請求項１７に記載の反応剤。
【請求項２４】
構造ＩＩＩを有するポリマー性反応剤。
【化４８】
0005766118.tif 000061
［式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；そして
（ｉ）Ｒ７は、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１、であり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は、ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であるが；
ここでそれぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含む。］
【請求項２５】
Ｒ７が、ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、Ｒ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、および−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２から選択される、請求項２４に記載の反応剤。
【請求項２６】
それぞれのＲ１が独立して、Ｈまたはメチルである、請求項２４に記載の反応剤。
【請求項２７】
前記残基−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１の中のＲ１がＨであって、前記反応剤がα−ヒドロキシアルデヒドを含むようになっている、請求項２４に記載の反応剤。
【請求項２８】
Ｒ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−ＣＨ２ＮＨ２であるか、あるいはＲ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、請求項２７に記載の反応剤。
【請求項２９】
Ｒ７が、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、請求項２７に記載の反応剤。
【請求項３０】
水溶性ポリマーを、反応性アミン基を有する化合物Ｂ−ＮＨ２と抱合させる方法であって、前記方法が；
前記化合物Ｂ−ＮＨ２を、それぞれ水溶性ポリマーおよびα−ヒドロキシアルデヒドまたはα−ヒドロキシケトン末端基を含む水溶性ポリマー性反応剤と接触させる工程、
それにより、抱合体を形成させるが、その中では、前記水溶性ポリマーが、構造−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂを有する残基（Ｒ１はそれぞれ水素またはメチルであり、ＮＨ−Ｂは、アミン含有化合物の残基を表す）にリンクされている工程、
を含む、方法であって、ここで、該ポリマー性反応剤は、
構造Ｉ：
【化４５−２】
0005766118.tif 000062
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含み；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが；ここで、Ｃαに隣接する前記炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく；そして、
ＮＲ５は、必要に応じてスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよい。］
を有するか、または
構造ＩＩ：
【化４７−２】
0005766118.tif 000063
［式中、
ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコールであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２およびさらなる水溶性ポリマーから選択されるが、
ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、またここで、−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−の中の２個の置換基Ｒ２またはＲ３が合体して環を形成することが可能であるが；
ただし、Ｃαに隣接する前記炭素の上のＲ２またはＲ３はいずれも、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基ではない。］
を有するか、または
構造ＩＩＩ：
【化４８−２】
0005766118.tif 000064
［式中、  （ｉ）Ｒ７は、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１、であり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は、ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であるが；
ここでそれぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含み、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーである。］
を有する
方法。
【請求項３１】
前記ポリマー性反応剤が構造Ｉを有している、請求項３０に記載の方法。
【化４９】
0005766118.tif 000065
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含み；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが；ここで、Ｃαに隣接する炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく、そして、
ＮＲ５は、必要に応じてスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよい。］
【請求項３２】
ＰＯＬＹが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ４が、３炭素鎖である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマー性反応剤が構造ＩＩを有している、請求項３０に記載の方法。
【化５０】
0005766118.tif 000066
［式中、
ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコールであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２およびさらなる水溶性ポリマーから選択されるが、
ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、またここで、−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−の中の２個の置換基Ｒ２またはＲ３が合体して環を形成することが可能であるが、ただし、Ｃαに隣接する前記炭素の上のＲ２またはＲ３はいずれも、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基ではない。］
【請求項３５】
前記基Ｒ２またはＲ３およびｍの値が、Ｒ２またはＲ３の上の酸素原子または窒素原子が、Ｃαから４−結合長さだけ離れるように選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキルカルボキシル、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、および−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、および−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリマー性反応剤が構造ＩＩＩを有している、請求項３０に記載の方法。
【化５１】
0005766118.tif 000067
［式中、
（ｉ）Ｒ７は、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１、であり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であるが；
ここでそれぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含む；そして
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーである。］
【請求項３９】
Ｒ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、Ｒ１がＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−ＣＨ２ＮＨ２であるか、あるいは、Ｒ７が、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、それぞれのＲ１が独立してＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
構造ＩＶを有するポリマー性抱合体。
【化５２】
0005766118.tif 000068
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含み；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが；ここで、前記カルボニル炭素に隣接する前記炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく、そして、
ＮＲ５は、必要に応じてスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよく：そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。］
【請求項４１】
ＰＯＬＹがポリエチレングリコールであり、そしてＲ１がＨまたはメチルである、請求項４０に記載の抱合体。
【請求項４２】
Ｒ１がＨである、請求項４１に記載の抱合体。
【請求項４３】
Ｒ４が非置換である、請求項４１または４２に記載の抱合体。
【請求項４４】
Ｒ５が、低級アルキルであり、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含む、請求項４０に記載の抱合体。
【請求項４５】
Ｒ５がメチルである、請求項４４に記載の抱合体。
【請求項４６】
ＮＲ５がＺと合体してピペラジン環を形成し、環の窒素原子を介してそれにＰＯＬＹがリンクされている、請求項４０に記載の抱合体。
【請求項４７】
構造Ｖを有するポリマー性抱合体。
【化５３】
0005766118.tif 000069
［式中：
ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコールであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２およびさらには水溶性ポリマーから選択されるが、ここで、該カルボニル炭素に隣接する前記炭素の上のＲ２またはＲ３のいずれもが、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基でなく、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、そしてここで−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−の中の２個の置換基Ｒ２およびＲ３が合体して環を形成することも可能であり、そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。］
【請求項４８】
多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、および−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２から選択される、請求項４７に記載の抱合体。
【請求項４９】
ｍが、０〜６である、請求項４７に記載の抱合体。
【請求項５０】
Ｒ１がＨである、請求項４９に記載の抱合体。
【請求項５１】
１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、アルキレンカルボン酸、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏアルキル）、および−ＯＰ（Ｏ）（Ｏアルキル）２から選択され；前記基Ｒ２またはＲ３およびｍの値を選択して、Ｒ２またはＲ３の上の酸素原子または窒素原子がＣαから４−結合長さだけ離れるようにする、請求項４７に記載の抱合体。
【請求項５２】
１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボキシル、およびアルキレンカルボン酸から選択される、請求項５１に記載の抱合体。
【請求項５３】
構造ＶＩを有するポリマー性抱合体。
【化５４】
0005766118.tif 000070
［式中、
（ｉ）Ｒ７は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であり；
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表しており；
ここでそれぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、該低級アルキルは１〜６個の炭素原子を含む。］
【請求項５４】
それぞれのＲ１が独立して、Ｈまたはメチルである、請求項５３に記載の抱合体。
【請求項５５】
それぞれのＲ１が、Ｈである、請求項５４に記載の抱合体。
【請求項５６】
Ｒ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、Ｒ１がＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−ＣＨ２ＮＨ２であるか、あるいはＲ７が、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、それぞれのＲ１が独立してＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、請求項５３に記載の抱合体。
【請求項５７】
前記アミン含有生物学的活性化合物が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項４０、４７、および５３のいずれか一項に記載の抱合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に従い、米国仮特許出願第６１／０９６，１１２号明細書（出願日、２００８年９月１１日）に対する優先権の利益を主張するものである（該出願の開示のすべてを参照することにより、本明細書に取り入れたものとする）。
【背景技術】
【０００２】
近年になって、ヒト治療学は、伝統的な小分子医薬品を通り過ぎて、バイオ医薬品の領域にまで拡大されてきている。新規なタンパク質およびペプチドの発見によって、数多くのタンパク質およびポリペプチド系バイオ医薬品の開発が行われるようになってきた。残念ながら、タンパク質およびポリペプチドを治療薬として使用すると、循環半減期が短い、免疫原性がある、タンパク質分解酵素で分解される、溶解度が低いなど、それらを配合したり投与したりすることが極端に困難となるような性質を示すことが多い。バイオ医薬品の薬物動態学的または薬力学的性質を改良するための一つのアプローチ方法は、天然または合成のポリマーたとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に抱合させる方法である。ＰＥＧを治療用タンパク質に共有結合的に結合させることによって、（ｉ）タンパク質の抗原決定基をシールドして、それによりその細胞内皮クリアランスおよび免疫系による認識を抑制する、（ｉｉ）タンパク質分解酵素による分解を抑制する、および（ｉｉｉ）腎臓濾過率を抑制するなど、いくつかのメリットが得られる。
【０００３】
ペプチドのようなバイオ医薬品にカップリングさせるためのポリマー誘導体の開発、特にタンパク質の反応性アミノ基にカップリングさせるためのポリマー誘導体の開発のために、多大な努力がなされてきた。そのようなＰＥＧ誘導体の例としては、ＰＥＧジクロロトリアジン、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧスクシンイミジルカーボネート、ＰＥＧカルボニルイミダゾール、およびＰＥＧスクシンイミジルスクシネートなどが挙げられる。しかしながら、それらの反応剤は、カップリングを起こさせるのに必要な反応条件下では望ましくない副反応が起きる、選択性に欠ける、および／またはそのバイオ医薬品とＰＥＧとの間に生成するリンクが弱い（すなわち不安定である）などの欠点に悩まされる可能性がある。
【０００４】
アルデヒド末端のＰＥＧ、たとえばＰＥＧプロピオンアルデヒドおよびＰＥＧアセトアルデヒド（それぞれたとえば、特許文献１および特許文献２を参照されたい）では、それらが結合する化学反応における選択性の点ではメリットがある。しかしながら、ポリペプチドまた反応性アミン基を有する類似の分子と抱合させるためにポリマー性アルデヒドまたはケトンを使用すると、抱合の過程で形成されるイミンリンクを安定化させるために還元工程を含む必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，２５２，７１４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９９０，２３７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの態様において、本発明は、構造Ｉを有するポリマー性反応剤を提供する：
【０００７】
【化１】
0005766118.tif 000002
式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、好ましくはＨまたはメチルであり；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが、ここで、Ｃαに隣接する炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく；そして、
ＮＲ５は、任意のスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹ、好ましくはポリエチレングリコールにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよい。
【０００８】
一つの実施態様において、Ｒ１がＨであって、そのためにその反応剤がα−ヒドロキシアルデヒドを含んでいる。
【０００９】
さらなる実施態様においては、構造Ｉの中のＲ４が、非置換であるか、または低級アルキルを用いて置換されている。構造Ｉの中のＲ４が、３炭素鎖であるのが好ましいが、それは飽和であっても不飽和であってもよい。Ｒ４が飽和の３炭素鎖である反応剤が構造Ｉａを有していれば、より好ましい：
【００１０】
【化２】
0005766118.tif 000003
式中、Ｒ１、ＮＲ５、ＺおよびＰＯＬＹは先に定義されたものであり、置換基Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、および水溶性ポリマーから選択され、そして、置換基ＲｂおよびＲｂ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択されるが、ここでこれらの置換基の内の多くとも一つが水溶性ポリマーであり、そしてここで、これらの置換基の内のいずれか２個が合体して脂肪族環を形成することができる。
【００１１】
この構造の選択された実施態様においては、置換基Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’は独立して、水素およびアルキルから選択されるが、ここでそのようなアルキル置換基のいずれか２個、好ましくは隣接した炭素原子の上にあるものが合体して、５員〜７員の脂肪族環を形成することもできる。
【００１２】
一つの実施態様において、その基Ｒ５がメチルである。このタイプの反応剤としては、本明細書において（５）および（１０）と名付けられたもの（５−（ｍＰＥＧ−メチル−アミノ）−２−ヒドロキシペンタナール）が挙げられる。これらの例に挙げた反応剤においては、構造Ｉａの中のＲｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’はそれぞれ水素である。
【００１３】
スペーサー基Ｚが存在しているならば、それは、アルキレン、エーテル、チオエーテル、アミド、およびアミンから選択される結合からなっているのが好ましい。一つの実施態様において、ＮＲ５がＺと合体して環を形成し、それにＰＯＬＹがリンクされていて、たとえば、ピペラジン環に環の窒素原子を介してＰＯＬＹがリンクされている。このタイプの反応剤としては、本明細書において（１１）および（１２）と名付けられたもの（５−ｍＰＥＧ−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール）が挙げられる。これらの例に挙げた反応剤においては、構造Ｉａの中のＲｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’はそれぞれ水素である。
【００１４】
また別の態様において、本発明は、構造ＩＩを有するポリマー性反応剤を提供する：
【００１５】
【化３】
0005766118.tif 000004
式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマー、好ましくはポリエチレングリコールであり、それには、本明細書に記載のように、それを（ＣＲ２Ｒ３）ｍにリンクさせるリンカー残基を含んでいてもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキル、好ましくはＨまたはメチル、より好ましくはＨから選択され；
ｍは、０〜１２、好ましくは０〜６であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、アルキレン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、アルキルホスフェートおよびさらには水溶性ポリマーから選択されるが、ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、そしてここで（ＣＲ２Ｒ３）ｍの中の２個の置換基Ｒ２およびＲ３が合体して環を形成することも可能であるが；
ただし、Ｃαに隣接する炭素の上のＲ２またはＲ３はいずれも、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基ではない。
【００１６】
多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択されるのが好ましい。アミノアルキルおよびイミノアルキルとしては、（環状アミノ）アルキルまたは（環状イミノ）アルキルを挙げることができる；すなわち、環の中にアミン窒素が含まれているならば、それ自体が−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−鎖の一部を形成していてもよい。
【００１７】
さらに好ましい実施態様においては、１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから、そして好ましくはアミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、およびアルキルカルボン酸から選択され、そしてこの基（Ｒ２またはＲ３）およびｍの値を選択して、Ｒ２またはＲ３の上の酸素または窒素原子が、Ｃαから４−結合長さ（ｆｏｕｒ−ｂｏｎｄ  ｐａｔｈ）だけ離されているようにする。
【００１８】
一つの実施態様において、ＰＯＬＹがｍＰＥＧ−Ｏ−であり、ｍが３であり、そして−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−（ＣＨ２）３−および−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−から選択される。本明細書において４と名付けられた化合物（５−ｍＰＥＧ−２−ヒドロキシペンタナール）が、−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が−（ＣＨ２）３−であるそのような構造の一例である。
【００１９】
その中で−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−がＣαに結合された残基−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−を含んでいるような反応剤は、還元糖の３−デオキシ類似体、たとえば３−デオキシリボースに基づくものである。一つの例が、本明細書において１３と名付けられた化合物のｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）Ｈである。その他の可能な反応剤としては、たとえば、キシロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース、またはマンノースの３−デオキシ類似体から誘導されたものが挙げられる。５炭素糖たとえば、リボース、キシロース、およびアラビノースが好ましい。そのような反応剤は、元々の糖の対応する誘導体よりは有利であるが、その理由は、最終的に抱合された反応生成物の中に３−ヒドロキシル基が存在しないために、抱合された反応生成物が分解される機会が低下するからである。
【００２０】
また別な実施態様においては、ＰＯＬＹがｍＰＥＧ−Ｏ−であり、ｍが１であり、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、そしてＲ３がイミノアルキルである。本明細書において３と名付けられた化合物がそのような構造の一例であるが、ここでＲ３は（４−イミダゾリル）メチルである。
【００２１】
さらなる実施態様においては、構造ＩＩの中の−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が−ＣＨ２−ＣＨＲｘ−Ｃ（ＮＨ２）Ｒｙ−で定義されるが、ここでＲｘおよびＲｙは５員〜７員の脂肪族環を形成していて、それにＰＯＬＹがリンクされている。そのような反応剤としては次式に示すものが挙げられるが、ここでｎは０〜２である。
【００２２】
【化４】
0005766118.tif 000005
そのアミノ基が、メチルアミノまたはジメチルアミノで置換されていてもよい。上に示したものと類似しているが、ただし芳香族環を含んでいる反応剤も提供されるが、それについては後に説明する。
【００２３】
先に述べたように、リンカー残基を使用して、ポリマー成分ＰＯＬＹを構造ＩＩの反応剤の官能性の部分に結合させたり、あるいはポリマーセグメントを結合させて成分ＰＯＬＹにしたりしてもよい。リンカーが存在している場合には、その特性を以下に説明する。典型的には、リンカーとしては、アミド、エステル、ウレタン、またはウレアのような官能基が挙げられるが、場合によっては単一の官能基のいずれかの側に配置されたメチレンまたはその他のアルキレン基が含まれる。別な形として、リンカーをアルキレン鎖とすることも可能であり、場合によっては１個または複数の酸素または硫黄原子がふくまれてもよい（すなわち、エーテルまたはチオエーテル）。
【００２４】
関連する態様において、本発明は、構造ＩＩＩを有するポリマー性のα−ヒドロキシアルデヒドまたはケトン反応剤を提供する。
【００２５】
【化５】
0005766118.tif 000006
式中、
ＰＯＬＹは水溶性ポリマー、たとえばポリエチレングリコールであるが、それには、本明細書に記載したような、芳香族環にそれをリンクさせるリンカー残基が含まれていてもよく；そして
（ｉ）Ｒ７は、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるが、好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、および−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であるが；
ここで、それぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択されるが、好ましくは独立してＨおよびメチルから選択される。選択された実施態様においては、Ｃ（＝Ｏ）に結合されているＲ１がＨであって、それによりその反応剤にはα−ヒドロキシアルデヒドを含む。他の実施態様においては、それぞれのＲ１がＨである。
【００２６】
このタイプの反応剤の例としては、本明細書において６と名付けられた化合物（そこでは、Ｒ７が−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである）；７と名付けられた化合物（そこでは、Ｒ７が−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が−ＯＨである）；および８と名付けられた化合物（そこでは、Ｒ７が−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が−ＯＨである）が挙げられる。類似の反応剤としては、そのフェノール性ヒドロキシ基（ＯＨ）が、ＮＨ２またはＮ（ＣＨ３）２で置換されている（すなわち、Ｒ８が−ＮＨ２または−Ｎ（ＣＨ３）２である）ものが挙げられる。
【００２７】
また別な態様においては、本発明は、水溶性ポリマーを、反応性アミン基を有する化合物Ｂ−ＮＨ２と抱合させる方法を提供するが、その方法に含まれるのは；
化合物Ｂ−ＮＨ２を、それぞれ水溶性ポリマーおよびα−ヒドロキシアルデヒドまたはα−ヒドロキシケトン末端基を含むポリマー性反応剤と接触させ、
それにより、抱合体を形成させるが、その中では、水溶性ポリマーが、構造−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂを有する残基（Ｒ１はそれぞれ水素またはメチルであり、ＮＨ−Ｂが、アミン含有化合物の残基を表している）にリンクされている。そのような接触は、適切な水性溶媒または有機溶媒中、反応にとって必要な条件下で、必要であるならば触媒を加えて、実施される。
【００２８】
好ましい実施態様においては、そのポリマー性反応剤には、酸素および窒素から選択されるプロトン引抜き性原子を含むプロトン引抜き性官能基がさらに含まれ、プロトン引抜き性原子とα−ヒドロキシアルデヒドまたはα−ヒドロキシケトンのα−炭素との間に３−結合間隔または４−結合間隔、好ましくは４−結合間隔が存在するようにする。そのような反応剤は「自己触媒性（ｓｅｌｆ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ）」抱合反応をすることが可能であるが、これについては後に説明する。
【００２９】
選択された実施態様においては、その方法に、本明細書に記載の構造Ｉ／Ｉａ、ＩＩ、またはＩＩＩのポリマー性反応剤が採用されている。
【００３０】
その方法のさらなる好ましい実施態様では一般的に、本明細書に記載の反応剤Ｉ／Ｉａ、ＩＩおよびＩＩＩの好ましい実施態様が採用される。そのアミン含有化合物は典型的には、生物学的活性化合物または生物学関連化合物たとえばポリペプチドまたはタンパク質である。
【００３１】
関連の態様においては、本発明は、そのような方法によって形成させることが可能な抱合体を提供する。たとえば、本発明は、構造ＩＶを有するポリマー性抱合体を提供する：
【００３２】
【化６】
0005766118.tif 000007
式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、好ましくはＨまたはメチルであり；
Ｒ４は、２炭素鎖または３炭素鎖であって、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよく、
ここで、そのカルボニル炭素に隣接した炭素は、ヒドロキシでは置換されておらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく；そして
ＮＲ５は、任意のスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹ、たとえばポリエチレングリコールにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよく；そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。
【００３３】
抱合体の選択された実施態様としては、本明細書に記載の反応剤Ｉ／Ｉａの選択された実施態様に対応するものが挙げられる。
【００３４】
本発明のさらなる抱合体としては構造Ｖのものが挙げられる：
【００３５】
【化７】
0005766118.tif 000008
式中：
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマー、たとえばＰＥＧであり、それには、本明細書に記載のように、それを（ＣＲ２Ｒ３）ｍにリンクさせるリンカー残基を含んでいてもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、アルキレン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、アルキルホスフェートおよびさらには水溶性ポリマーから選択されるが、ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、そしてここで（ＣＲ２Ｒ３）ｍの中の２個の置換基Ｒ２およびＲ３が合体して環、好ましくは脂肪族の環を形成することも可能であり；そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物、たとえばポリペプチドまたはタンパク質の残基を表す。
【００３６】
カルボニル炭素に隣接する炭素の上のＲ２またはＲ３のいずれもが、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基でないのが好ましい。
【００３７】
抱合体のさらに好ましい実施態様は、一般的には、本明細書に記載の反応剤ＩＩの好ましい実施態様に対応している。
【００３８】
本発明のさらなる抱合体としては構造ＶＩのものが挙げられる：
【００３９】
【化８】
0005766118.tif 000009
式中、
（ｉ）Ｒ７は、Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるが、好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、および−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であり；  
ＰＯＬＹは水溶性ポリマー、たとえばＰＥＧであるが、それには、本明細書に記載したような、芳香族環にそれをリンクさせるリンカー残基が含まれていてもよく；そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表しており；
ここで、それぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから、好ましくはＨおよびメチルから選択される。
【００４０】
その抱合体のさらに好ましい実施態様は一般的に、本明細書に記載の反応剤ＩＩＩの好ましい実施態様に対応するが、ここでその基Ｒ７およびＲ８はそれに従って定義されたものである。
【００４１】
構造ＩＶ、Ｖ、およびＶＩの抱合体においては、そのアミン含有化合物は典型的には、生物学的活性化合物または生物学関連化合物、たとえばポリペプチドまたはタンパク質である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
構造Ｉを有するポリマー性反応剤。
【化４５】
0005766118.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが；ここで、Ｃαに隣接する前記炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく；そして、
ＮＲ５は、任意のスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよい。］
（項目２）
構造Ｉａを有する、項目１に記載の反応剤。
【化４６】
0005766118.tif 000011
［式中、
Ｒ１、ＮＲ５、ＺおよびＰＯＬＹは、先に定義されたものであり，
前記置換基Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、および水溶性ポリマーから選択され、そして前記置換基ＲｂおよびＲｂ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択され、
それらの置換基の多くとも一つが水溶性ポリマーであり、それらの置換基のいずれか２個が、合体して脂肪族環を形成することが可能である。］
（項目３）
Ｒ１が、Ｈまたはメチルである、項目１に記載の反応剤。
（項目４）
Ｒ１が、Ｈである、項目３に記載の反応剤。
（項目５）
前記置換基Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’が独立して水素およびアルキルから選択され、そのようなアルキル置換基のいずれか２個が合体して、５員〜７員の脂肪族環を形成することが可能である、項目２に記載の反応剤。
（項目６）
隣接炭素原子の上の２個のそのようなアルキル置換基が合体して、５員〜７員の脂肪族環を形成している、項目５に記載の反応剤。
（項目７）
Ｒ５が、低級アルキルである、項目２に記載の反応剤。
（項目８）
Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれが水素であり、Ｒ５がメチルである、項目７に記載の反応剤。
（項目９）
Ｚが、アルキレン、エーテル、チオエーテル、アミド、およびアミンから選択される結合からなる、項目１に記載の反応剤。
（項目１０）
Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれが水素であり、そしてＮＲ５がＺと合体してピペラジン環を形成し、それに対して、環の窒素原子を介してＰＯＬＹがリンクされている、項目２に記載の反応剤。
（項目１１）
構造ＩＩを有するポリマー性反応剤。
【化４７】
0005766118.tif 000012
［式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、アルキレン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、アルキルホスフェート、およびさらなる水溶性ポリマーから選択されるが、
ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、またここで、−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−の中の２個の置換基Ｒ２またはＲ３が合体して環を形成することが可能であるが；
ただし、Ｃαに隣接する前記炭素の上のＲ２またはＲ３はいずれも、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基ではない。］
（項目１２）
多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択される、項目１１に記載の反応剤。
（項目１３）
ｍが、０〜６である、項目１１に記載の反応剤。
（項目１４）
ＰＯＬＹが、ポリエチレングリコールである、項目１１に記載の反応剤。
（項目１５）
１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択され；前記基Ｒ２またはＲ３およびｍの値を選択して、Ｒ２またはＲ３の上の酸素原子または窒素原子がＣαから４−結合長さだけ離れるようにする、項目１１に記載の反応剤。
（項目１６）
１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、およびアルキルカルボン酸から選択される、項目１５に記載の反応剤。
（項目１７）
Ｒ１が、Ｈまたはメチルである、項目１４に記載の反応剤。
（項目１８）
ＰＯＬＹが、ｍＰＥＧである、項目１７に記載の反応剤。
（項目１９）
Ｒ１がＨであり、ｍが３であり、そして−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−（ＣＨ２）３−および−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−から選択される、項目１８に記載の反応剤。
（項目２０）
−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−（ＣＨ２）３−である、項目１９に記載の反応剤。
（項目２１）
−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−である、項目２０に記載の反応剤。
（項目２２）
ｍが１であり、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、そしてＲ３がイミノアルキルである、項目１８に記載の反応剤。
（項目２３）
Ｒ３が、（４−イミダゾリル）メチルである、項目２２に記載の反応剤。
（項目２４）
−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が、−ＣＨ２−ＣＨＲｘ−Ｃ（ＮＨ２）Ｒｙ−であり、ＲｘとＲｙとが５員〜７員の環を形成し、それにＰＯＬＹがリンクされている、項目１８に記載の反応剤。
（項目２４）
構造ＩＩＩを有するポリマー性反応剤。
【化４８】
0005766118.tif 000013
［式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；そして
（ｉ）Ｒ７は、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１、であり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は、ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であるが；
ここでそれぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択される。］
（項目２５）
Ｒ７が、ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、Ｒ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、および−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２から選択される、項目２４に記載の反応剤。
（項目２６）
それぞれのＲ１が独立して、Ｈまたはメチルである、項目２４に記載の反応剤。
（項目２７）
前記残基−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１の中のＲ１がＨであって、前記反応剤がα−ヒドロキシアルデヒドを含むようになっている、項目２４に記載の反応剤。
（項目２８）
Ｒ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−ＣＨ２ＮＨ２である、項目２７に記載の反応剤。
（項目２９）
Ｒ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、項目２７に記載の反応剤。
（項目３０）
Ｒ７が、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、項目２７に記載の反応剤。
（項目３１）
水溶性ポリマーを、反応性アミン基を有する化合物Ｂ−ＮＨ２と抱合させる方法であって、前記方法が；
前記化合物Ｂ−ＮＨ２を、それぞれ水溶性ポリマーおよびα−ヒドロキシアルデヒドまたはα−ヒドロキシケトン末端基を含む水溶性ポリマー性反応剤と接触させる工程、
それにより、抱合体を形成させるが、その中では、前記水溶性ポリマーが、構造−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂを有する残基（Ｒ１はそれぞれ水素またはメチルであり、ＮＨ−Ｂは、アミン含有化合物の残基を表す）にリンクされている工程、
を含む、方法。
（項目３２）
前記ポリマー性反応剤が、酸素および窒素から選択されるプロトン引抜き性原子を含むプロトン引抜き性官能基をさらに含んでいて、前記プロトン引抜き性原子と前記α−ヒドロキシアルデヒドまたはα−ヒドロキシケトンのα−炭素との間に３−結合間隔または４−結合間隔が存在するようになっている、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記反応剤における前記間隔が、４−結合間隔である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ポリマー性反応剤が構造Ｉを有している、項目３１に記載の方法。
【化４９】
0005766118.tif 000014
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが；ここで、Ｃαに隣接する炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく、そして、
ＮＲ５は、任意のスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよい。］
（項目３５）
ＰＯＬＹが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
Ｒ４が、３炭素鎖である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ポリマー性反応剤が構造ＩＩを有している、項目３１に記載の方法。
【化５０】
0005766118.tif 000015
［式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、アルキレン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、アルキルホスフェート、およびさらなる水溶性ポリマーから選択されるが、
ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、またここで、−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−の中の２個の置換基Ｒ２またはＲ３が合体して環を形成することが可能である。］
（項目３８）
前記基Ｒ２またはＲ３およびｍの値が、Ｒ２またはＲ３の上の酸素原子または窒素原子が、Ｃαから４−結合長さだけ離れるように選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択される、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
ＰＯＬＹが、ポリエチレングリコールである、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択される、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記ポリマー性反応剤が構造ＩＩＩを有している、項目３１に記載の方法。
【化５１】
0005766118.tif 000016
［式中、
（ｉ）Ｒ７は、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１、であり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であるが；
ここでそれぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；そして
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーである。］
（項目４３）
Ｒ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、Ｒ１がＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−ＣＨ２ＮＨ２である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
Ｒ７が、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、それぞれのＲ１が独立してＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
構造ＩＶを有するポリマー性抱合体。
【化５２】
0005766118.tif 000017
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが；ここで、前記カルボニル炭素に隣接する前記炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく、そして、
ＮＲ５は、任意のスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよく：そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。］
（項目４６）
ＰＯＬＹがポリエチレングリコールであり、そしてＲ１がＨまたはメチルである、項目４５に記載の抱合体。
（項目４７）
Ｒ１がＨである、項目４６に記載の抱合体。
（項目４８）
Ｒ４が非置換である、項目４５に記載の抱合体。
（項目４９）
Ｒ５が、低級アルキルである、項目４５に記載の抱合体。
（項目５０）
Ｒ５がメチルである、項目４９に記載の抱合体。
（項目５１）
ＮＲ５がＺと合体してピペラジン環を形成し、環の窒素原子を介してそれにＰＯＬＹがリンクされている、項目４５に記載の抱合体。
（項目５２）
構造Ｖを有するポリマー性抱合体。
【化５３】
0005766118.tif 000018
［式中：
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、アルキレン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、アルキルホスフェートおよびさらには水溶性ポリマーから選択されるが、ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、そしてここで−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−の中の２個の置換基Ｒ２およびＲ３が合体して環を形成することも可能であり、そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。］
（項目５３）
前記カルボニル炭素に隣接する前記炭素の上のＲ２またはＲ３のいずれもが、ヒドロキシル基または１，２，３−トリヒドロキシプロピル基でない、項目５２に記載の抱合体。
（項目５４）
多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択される、項目５２に記載の抱合体。
（項目５５）
ｍが、０〜６である、項目５２に記載の抱合体。
（項目５６）
ＰＯＬＹが、ポリエチレングリコールである、項目５２に記載の抱合体。
（項目５７）
Ｒ１がＨである、項目５２に記載の抱合体。
（項目５８）
１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択され；前記基Ｒ２またはＲ３およびｍの値を選択して、Ｒ２またはＲ３の上の酸素原子または窒素原子がＣαから４−結合長さだけ離れるようにする、項目５２に記載の抱合体。
（項目５９）
１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、およびアルキルカルボン酸から選択される、項目５８に記載の抱合体。
（項目６０）
構造ＶＩを有するポリマー性抱合体。
【化５４】
0005766118.tif 000019
［式中、
（ｉ）Ｒ７は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であり；
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表しており；
ここでそれぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択される。］
（項目６１）
それぞれのＲ１が独立して、Ｈまたはメチルである、項目６０に記載の抱合体。
（項目６２）
それぞれのＲ１が、Ｈである、項目６０に記載の抱合体。
（項目６３）
Ｒ７が、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、Ｒ１がＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−ＣＨ２ＮＨ２である、項目６０に記載の抱合体。
（項目６４）
Ｒ７が、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１（ここで、それぞれのＲ１が独立してＨまたはメチルである）であり、そしてＲ８が、−ＯＨまたは−ＮＨ２である、項目６０に記載の抱合体。
（項目６５）
前記アミン含有生物学的活性化合物が、ポリペプチドまたはタンパク質である、項目４５、５２、および６０のいずれか一項に記載の抱合体。
【００４２】
本発明のこれらおよびその他の態様は、以下の説明および添付の図面を参照することにより、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】タンパク質、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を，ポリマー性反応剤のｍＰＥＧ１００００−ＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物４）およびｍＰＥＧ１００００−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（従来技術化合物）と、実施例６ａに記載したような各種の反応条件下で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン：１）ベンチマークラダー、２）リゾチーム（Ｌｙｚ）、３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ６．５、４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ７．５、５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ９．０、６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ７．５＋ＮａＣＮＢＨ３、７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２０ｋＤ）、ｐＨ７．５、８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２０ｋＤ）、ｐＨ７．５＋ＮａＣＮＢＨ３。
【図２】リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を、ポリマー性反応剤のｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−アセタール（本発明化合物４のアセタール）、ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物５、「自己触媒性」）およびそのアセタールと、実施例６ｂに記載したような各種の反応条件下で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン：１）ベンチマークラダー、２）リゾチーム（Ｌｙｚ）、３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ（４）アセタール、ｐＨ６．５、４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ（４）アセタール、ｐＨ９．０、５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ（５）アセタール、ｐＨ６．５、６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ（５）アセタール、ｐＨ９．０、７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）、ｐＨ６．５、８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）、ｐＨ９．０、９）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ（５）アセタール（精製、９５％品）、ｐＨ６．５、１０）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ（５）アセタール（精製、９５％品）、ｐＨ９．０。
【図３】タンパク質、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を，ポリマー性反応剤のｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物４）、ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物５、「自己触媒性」）およびそのアセタール、ならびにｍＰＥＧ１０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（従来技術化合物）と、実施例６ｃに記載したような各種の反応条件下で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン：１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ６．５、２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ７．５、３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）（精製、９５％品）、ｐＨ６．５、４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）（精製、９５％品）、ｐＨ７．５、５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ（５）アセタール（精製、９５％品）、ｐＨ７．５、６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ、ｐＨ７．５、７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ、ｐＨ６．５＋ＮａＣＮＢＨ３、８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ、ｐＨ７．５＋ＮａＣＮＢＨ３、９）リゾチーム、１０）ベンチマークラダー。
【図４】タンパク質、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を，ポリマー性反応剤のｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物１０、「自己触媒性」）およびｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物１１、「自己触媒性」）と、実施例１１に記載したような各種の反応条件下で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン：１）ベンチマークラダー、２）リゾチーム（Ｌｙｚ）、３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１１）、２５×、ｐＨ６．５、４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１１）、５０×、ｐＨ６．５、５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１１）、５０×、ｐＨ９．１、６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１１）、２５×、ｐＨ６．０、７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１１）、５０×、ｐＨ６．０、８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（１０）、２５×、ｐＨ６．５、９）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（１０）、５０×、ｐＨ６．５、１０）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（１０）、５０×、ｐＨ９．１。
【図５Ａ】５５ｋＤａのタンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）を、ポリマー性反応剤のｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物９）およびｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物１０、「自己触媒性」）と、実施例１２に記載したような各種の反応条件下で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。図５Ａ、バリウム／ヨウ素染色；図５Ｂ、クーマシー染色。レーン：１）ＭＷマーカー、２）１μｇのｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、３）３μｇの未変性５５ｋＤａタンパク質、４）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ６．５、５）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ７．５、６）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ９．０、７）１μｇのｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）、８）３μｇの未変性５５ｋＤａタンパク質、９）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ６．５、１０）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ７．５、１１）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ９．０、１２）ブランク。
【図５Ｂ】５５ｋＤａのタンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）を、ポリマー性反応剤のｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物９）およびｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（本発明化合物１０、「自己触媒性」）と、実施例１２に記載したような各種の反応条件下で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。図５Ａ、バリウム／ヨウ素染色；図５Ｂ、クーマシー染色。レーン：１）ＭＷマーカー、２）１μｇのｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、３）３μｇの未変性５５ｋＤａタンパク質、４）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ６．５、５）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ７．５、６）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ９．０、７）１μｇのｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）、８）３μｇの未変性５５ｋＤａタンパク質、９）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ６．５、１０）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ７．５、１１）ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＭＡＬＤ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ９．０、１２）ブランク。
【図６Ａ】リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を、表示されたポリマー性反応剤（５０×）と、実施例１２に記載されたようにして、０．２Ｍリン酸緩衝液中ｐＨ６．５および９．０で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。図６Ａ：室温で１日の反応；図６Ｂ、５℃で１日の反応。レーン：１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、ｐＨ６．５、２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、ｐＨ９．０、３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ（１０）、ｐＨ６．５、４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ（１０）、ｐＨ９．０、５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ６．５、６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ９．０、７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ、ｐＨ６．５、８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ＋ＮａＣＮＢＨ３、ｐＨ６．５、９）リゾチーム（Ｌｙｚ）、１０）ベンチマークラダー。
【図６Ｂ】リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を、表示されたポリマー性反応剤（５０×）と、実施例１２に記載されたようにして、０．２Ｍリン酸緩衝液中ｐＨ６．５および９．０で、抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。図６Ａ：室温で１日の反応；図６Ｂ、５℃で１日の反応。レーン：１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、ｐＨ６．５、２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、ｐＨ９．０、３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ（１０）、ｐＨ６．５、４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ（１０）、ｐＨ９．０、５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ６．５、６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ９．０、７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ、ｐＨ６．５、８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ＋ＮａＣＮＢＨ３、ｐＨ６．５、９）リゾチーム（Ｌｙｚ）、１０）ベンチマークラダー。
【図６Ｃ】リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を、表示されたポリマー性反応剤（５０×）と、実施例１４に記載されたようにして、ｐＨ７．５で抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン：１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、０．２ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ（１０）、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ（１０）、０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＡＬＤ（１２）、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＡＬＤ（１２）、０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ、＋ＮａＣＮＢＨ３、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、９）リゾチーム、１０）ベンチマークラダー。
【図７】リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を、ｍＰＥＧ−アルデヒド２０Ｋ反応剤（５０×）と、実施例１７の記載のようにして、ｐＨ６．５、７．５、および９．０で抱合反応させた反応混合物の電気泳動から得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン：０）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２（商標）；１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ６．５；２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ７．５；３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ９．０。
【図８】本発明の分岐状ＰＥＧ反応剤、５−ｒｕＰＥＧ２２０Ｋ−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール（すなわちｒｕＰＥＧ２２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ）の反応生成物（１４）を調製するための合成スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
Ｉ．定義
本発明の詳細な説明をする前に、本発明は特定のポリマー、合成法、活性薬剤などに限定されるものではなく、それなりに変化させてもよいということは理解されたい。
【００４５】
本明細書および特許請求項において使用する際に、単数の形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈から明確にそうではないと宣言されていない限りにおいては、複数の対象も含まれる。このことは、たとえば、「ポリマー（ａ  ｐｏｌｙｍｅｒ）」と参照したものには、単一のポリマーと同様に２種以上の同一または異なったポリマーが含まれ、「抱合体（ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」と参照したものには、単一の抱合体と同様に２種以上の同一または異なった抱合体が含まれ、「賦形剤（ａｎ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」と参照したものには、単一の賦形剤と同様に２種以上の同一または異なった賦形剤が含まれる。
【００４６】
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」および「場合によっては（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、その後に記載されている状況が起きても、起きなくてもよいということを意味していて、その結果、その記述には、その状況が起きる場合と、それが起きない場合との両方が含まれる。
【００４７】
本発明の明細書および特許請求項においては、以下の用語が、以下に記載の定義に従って使用されるであろう。
【００４８】
「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」および「ポリ（エチレングリコール）」という用語は、本明細書で使用するとき、すべての水溶性のポリ（エチレンオキシド）を包含していることを意味している。典型的には、本発明において使用されるＰＥＧには、次の構造「−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−」（ここで（ｍ）は２〜４０００）が含まれる。本明細書で使用するとき、ＰＥＧにはさらに、その末端の酸素が置換されているか否かに依存して、「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−」および「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−」が含まれる。ＰＥＧにさらにスペーサー残基（以下において、さらに詳しく説明する）が含まれている場合には、そのスペーサー残基を含む原子は、水溶性ポリマーセグメントに共有結合的に結合されている場合、酸素−酸素結合（すなわち、「−Ｏ−Ｏ−」またはペルオキシドリンク）の形成には関与しない。本明細書および特許請求項の全体を通して、「ＰＥＧ」という用語には、各種の末端基または「末端封止（ｅｎｄ  ｃａｐｐｉｎｇ）」基などを有する構造も含まれるということは、認識しておくべきである。「ＰＥＧ」という用語はさらに、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−のモノマー性サブユニットが大部分、すなわち５０％を超える量で含むポリマーを意味している。特有の形態に関しては、ＰＥＧは、広く各種の分子量、さらには構造または形状たとえば「分岐状」、「直鎖状」、「フォーク状」、「多官能」、「デンドリマー状」などをとることができるが、これについては以下においてさらに詳しく説明する。
【００４９】
「末端封止された（ｅｎｄ−ｃａｐｐｅｄまたはｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ｃａｐｐｅｄ）」という用語は、本明細書においては置き換え可能に使用され、末端封止残基を有するポリマーの末端または終点を指す。必須という訳ではないが、典型的には、その末端封止残基には、ヒドロキシまたはＣ１〜２０アルコキシ基が含まれる。従って、末端封止残基の例としては、アルコキシ（たとえば、メトキシ、エトキシおよびベンジルオキシ）、さらにはアリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどが挙げられる。その上に、前述のもののそれぞれの飽和、不飽和、置換、および非置換の形態も考えられる。さらに、末端封止基をシランとすることも可能である。末端封止基に検出可能なラベルを含ませることができれば、都合がよい。ポリマーが検出可能なラベルを含む末端封止基を有している場合には、ポリマーおよび／またはそのポリマーがカップリングされている対象となる残基（たとえば、活性薬剤）の量および位置を、適切な検出器を用いることによって求めることができる。そのようなラベルとしては、発蛍光剤、化学発光剤、酵素のラベリングに使用される残基、比色（たとえば、色素）、金属イオン、放射性残基などが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。適切な検出器としては、光度計、フィルム、分光計などが挙げられる。
【００５０】
ポリマーまたは水溶性ポリマーに関して「天然には起こりえない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、そのポリマーが全体として自然界には見いだせないということを表している。しかしながら、天然には起こりえないポリマーまたは水溶性ポリマーには、ポリマー構造全体としては自然界に見いだせないものの、自然界に存在する一つまたは複数のサブユニット、またはサブユニットの部分が含まれていてもよい。
【００５１】
「水溶性ポリマー」とは、室温で水の中に可溶性のすべてのポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、濾過をした後の同一の溶液を透過する光の、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を透過させるであろう。重量基準にすると、水溶性ポリマーは、好ましくは水中に少なくとも約３５％（重量基準）溶解、より好ましくは水中に少なくとも約５０％（重量基準）溶解、さらにより好ましくは水中に約７０％（重量基準）溶解、さらにより好ましくは水中に約８５％（重量基準）溶解するであろう。しかしながら、その水溶性ポリマーが、水中に約９５％（重量基準）溶解すればさらにより好ましく、その水溶性ポリマーが水の中に完全に溶解すれば最も好ましい。
【００５２】
本発明の水溶性ポリマーたとえばＰＥＧの文脈においては、「分子量」は、数平均分子量または重量平均分子量のいずれかで表すことができる。特に断らない限り、本明細書において分子量に言及する場合には、すべて重量平均分子量である。数平均および重量平均のいずれの分子量も、ゲル透過クロマトグラフィーまたはその他の液体クロマトグラフィー技法を使用して測定することができる。分子量を測定するためのその他の方法もまた使用することができるが、そのような方法としてはたとえば、数平均分子量を測定するための末端分析もしくは束一性測定（たとえば、凝固点降下、沸点上昇、または浸透圧）、または重量平均分子量を測定するための光散乱法、超遠心法もしくは粘度測定法が挙げられる。本発明のポリマーは、典型的には、多分散性であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、さらにさらにより好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散値性を有している。
【００５３】
使用されている「有機基（ｏｒｇａｎｉｃ  ｒａｄｉｃａｌ）」という用語には、たとえば、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、および置換されたアリールが含まれる。
【００５４】
「アルキル」という用語は、典型的には長さが約１〜２０原子の範囲の炭化水素鎖を指している。そのような炭化水素鎖は、必須という訳ではないが、好ましくは飽和であり、分岐状であっても直鎖状であってもよいが、典型的には直鎖状の鎖が好ましい。アルキル基の例としては、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、イソオクチル、デシル、３−エチル−３−ペンチル、２−メチル−１−ヘキシルなどが挙げられる。本明細書で使用するとき、「アルキル」には、３個以上の炭素原子が言及されたときには、シクロアルキル、および低級アルキルが含まれる。「アルキレン」という用語は、不飽和で二価の基（たとえば、−（ＣＨ２）ｎ−）を指している。
【００５５】
「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を含むアルキル基を指すが、それらは直鎖であっても分岐鎖であってもよく、例を挙げれば、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルなどである。本明細書において、基が「アルキル」と定義された場合には、一般的には低級アルキルが好ましい実施態様である。
【００５６】
「シクロアルキル」という用語は、飽和または不飽和の環状炭化水素鎖を指しているが、それには、好ましくは３〜約１２個、より好ましくは３〜約８個の炭素原子からできている橋かけ、縮合、またはスピロ環状化合物が含まれる。
【００５７】
「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−Ｒ基を指しているが、ここでＲはアルキまたは置換されたアルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アルキル（たとえば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ベンジル、ペルフルオロブチルなど）、好ましくはＣ１〜Ｃ７アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ７アルキルである。「アルコキシアルキル」という用語は、−Ｒ−Ｏ−Ｒ基を指しているが、ここでＲは先に定義されたものであり、好ましくは非置換のＣ１〜Ｃ７アルキルである。
【００５８】
「アミノアルキル」という用語は、−ＮＨＲまたは−ＮＲ２基を指しているが、ここでＲは先に定義されたアルキルであり、好ましくは非置換のＣ１〜Ｃ７アルキルであるが、その−ＮＲ２の中の２個のＲ基は、同一であっても異なっていてもよい。その２個のＲ基が、５員〜７員の環を形成していてもよい。
【００５９】
「イミノアルキル（エン）」という用語は、−Ｒ’−Ｎ＝Ｒ”基を指しているが、ここでＲ”はＣＨ２、ＣＨＲ、またはＣＲ２を表し、ここでそれぞれのＲは先に定義されたアルキルであり、そして−ＣＲ２の中の２個のＲ基は、同一であっても異なっていてもよい。Ｒ’は先に定義されたアルキル、すなわちｓｐ２混成軌道炭素、またはアルキレン、すなわち二重結合の一つのメンバーを形成するｓｐ２混成軌道炭素である。ＣＨＲまたはＣＲ２の中のＲがＲ’と合体して、５員〜７員の環を形成してもよい。本明細書で使用するとき、「アルケニル」という用語は、少なくとも１個の二重結合を含む長さが２〜１５原子の分岐状または非分岐状の炭化水素基、たとえばエテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニルなどを指している。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「アルキニル」という用語は、少なくとも１個の三重結合を含む長さが２〜１５原子の分岐状または非分岐状の炭化水素基、たとえばエチニル、ｎ−ブチニル、イソペンチニル、オクチニル、デシニルなどを指している。
【００６１】
「脂肪族」という用語は、炭素および水素を含み、芳香族ではない基を指している。本明細書で使用するとき、それは直鎖基、分岐基、または環状基を指すことができる。それは飽和基または不飽和基を指すことができるが、一般的には飽和基が好ましい。
「アリール」という用語は、それぞれ５個または６個のコア炭素原子を有する１個または複数の芳香族環を意味している。アリールには、多重のアリール環が含まれ、それらはナフチルにおけるように縮合されていてもよいし、あるいはビフェニルにおけるように、縮合されていなくてもよい。アリール環が、１個または複数の環状炭化水素、ヘテロアリール、またはヘテロサイクリック環と縮合されていても、縮合されていなくてもよい。本明細書で使用するとき、「アリール」にはヘテロアリールが含まれる。芳香族残基（たとえば、Ａｒ１、Ａｒ２など）は、アリールを含む構造を意味している。
【００６２】
「ヘテロアリール」は、１〜４個のヘテロ原子、好ましくはＮ、Ｏ、もしくはＳ、またはそれらの組合せを含むアリール基である。ヘテロアリール環もまた、１個または複数の環状炭化水素、ヘテロサイクリック、アリール、またはヘテロアリール環と縮合されていてもよい。
【００６３】
「ヘテロサイクル」または「ヘテロサイクリック」という用語は、不飽和または芳香族性の存在下または非存在下で、少なくとも１個の炭素以外の環原子を有する、５〜１２個の原子、好ましくは５〜７個の原子の１個または複数の環を意味している。好適なヘテロ原子としては、硫黄、酸素、および窒素が挙げられる。
【００６４】
「置換されたヘテロアリール」とは、置換基として１個または複数の非干渉性（ｎｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）基を有するヘテロアリールである。
【００６５】
「置換されたヘテロサイクル」とは、非干渉性置換基から形成される１個または複数の側鎖を有するヘテロサイクルである。
【００６６】
「非干渉性置換基」とは、一つの分子の中に存在しているときに、その分子の中に含まれる他の官能基と典型的には非反応性であるような基である。そのような基としては以下のようなものが挙げられる低級アルキル、低級アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、たとえば、シクロプロピル、シクロブチルなど；ハロ、たとえば、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード；シアノ；フェニル；置換フェニルなど。フェニル環の上での置換に関しては、それらの置換基は、各種配位（すなわち、オルト、メタ、またはパラ）のいずれであってもよい。好ましい非干渉性置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、シクロプロピル、フルオロ、クロロ、およびシアノが挙げられる。
【００６７】
たとえば「置換されたアルキル」といった場合の「置換された」という用語は、１個または複数の非干渉性置換基を用いて置換された残基（たとえば、アルキル基）を指しているが、そのような置換基としては以下のものが挙げられる（これらに限定される訳ではない）：Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、など；ハロ、たとえば、フルオロ、クロロ、ブロモ、および；シアノ；アルコキシ、低級（ｌｏｗｅｒ）フェニル（たとえば、０〜２置換されたフェニル）；置換されたフェニルなど。「置換されたアリール」とは、置換基として１個または複数の非干渉性基を有するアリールである。フェニル環の上での置換に関しては、それらの置換基は、各種配位（すなわち、オルト、メタ、またはパラ）のいずれであってもよい。
【００６８】
本明細書で使用するとき、「ハロ」という呼称（たとえば、フルオロ、クロロ、ヨード、ブロモなど）は一般的に、そのハロゲンが分子に結合されている場合に使用されるが、その一方で、「ｉｄｅ」という接尾語（たとえば、フルオリド（ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、クロリド（ｃｈｌｌｏｒｉｄｅ）、ヨーダイド（ｉｏｄｉｄｅ）、ブロミド（ｂｒｏｍｉｄｅ）など）は、そのハロゲンが、その独立したイオンの形態で存在している場合（たとえば、脱離基が分子から脱離した場合）に使用される。
【００６９】
「求電子基（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ）」という用語は、イオン性であってよく、求電子中心すなわち、電子を求めている中心を有しており、求核基と反応することが可能なイオンまたは原子または原子の集合体を指している。
【００７０】
「求核基（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）」という用語は、イオン性であってよく、求核中心すなわち、求電子中心を求めるか、または求電子基と共にある、イオンまたは原子または原子の集合体を指している。
【００７１】
本明細書に記載の塩基性または酸性の反応剤には、中性反応剤、電荷を有する反応剤、およびそれらに相当する塩の形態が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「イオン化可能な水素原子」（「Ｈα」）という用語は、塩基、多くの場合水酸化物またはアミン塩基の存在下で除去されることが可能な水素原子を意味している。典型的には、「イオン化可能な水素原子」（「Ｈα」）は、炭素原子に結合されている水素であるが、その炭素原子がさらに、何らかの方式で、そのイオン化可能な水素原子がプロトンとして失われたときに生成するカルボアニオンを安定化させる（または前記カルボアニオンに至る遷移状態にある）１個または複数の芳香族残基またはその他の１個または複数の基にさらに結合されている炭素原子にさらに結合されている。
【００７３】
本明細書で使用するとき、「カルボン酸」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ官能基を有する残基、さらにはカルボン酸の誘導体、たとえば保護されたカルボン酸も含めた誘導体である残基である。したがって、文脈から明確にそうではないと宣言されていない限りにおいては、「カルボン酸」という用語には、酸の形態だけではなく、対応するエステルおよび保護された形態も同様に含まれる。本明細書に記載のカルボン酸およびその他各種の官能基に好適な保護基に関しては、Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，『ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ』，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）を参照されたい。
【００７４】
「反応性」または「活性化」という用語は、特定の官能基に関連して使用された場合には、他の分子の上の求電子基または求核基と容易に反応する反応性官能基を指している。これは、反応させるために強い触媒や高度に非現実的反応条件を必要とするような基（すなわち、「非反応性」または「不活性」基）とは、対照的なものである。
【００７５】
「保護された」または「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ、またはｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）」という用語は、ある種の反応条件下において、分子の中の特定の化学反応性官能基の反応を防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）かまたは阻止する（ｂｌｏｃｋ）残基（すなわち、保護基）が存在していることを指している。保護基は、保護するべき化学反応性官能基のタイプ、さらには採用される反応条件、ならびに（あるとすれば）その分子内にさらなる反応性基または保護基の存在などに依存して、変化するであろう。当業者に公知の保護基は、先のＧｒｅｅｎｅらの文献に見出すことができる。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「官能基」またはそれと同義の各種用語は、それが保護された形態も包含されることを意味している。特に、カルボン酸、アルデヒド、またはヒドロキシル基のような特定の官能基を言及した場合には、それらの保護された形態も包含されている。
【００７７】
本発明のポリマーの文脈においては、「多官能」という用語は、その中に３個以上の官能基が含まれるポリマーを意味しているが、それらの官能基は同一であっても異なっていてもよい。本発明の多官能ポリマーは典型的には、約３〜１００個の官能基、もしくは３〜５０個の官能基、もしくは３〜２５個の官能基、もしくは３〜１５個の官能基、もしくは３〜１０個の官能基を含むか、またはそのポリマーの中に３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の官能基を含むであろう。「二官能」ポリマーとは、その中に２個の官能基を有するポリマーを意味しているが、それらの２個は同一であっても（すなわち、ホモ二官能）、異なっていても（すなわち、ヘテロ二官能）よい。
【００７８】
ポリマーの全体構造の形状に関連して「分岐状」という用語は、２本またはそれ以上のポリマーの「腕（ａｒｍ）」を有するポリマーを指している。分岐状のポリマーは、２本のポリマーの腕、３本のポリマーの腕、４本のポリマーの腕、６本のポリマーの腕、８本のポリマーの腕またはそれ以上を有していてよい。高度に分岐状であるポリマーの一つの特殊なタイプが、樹枝状ポリマー（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）またはデンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）であるが、このものは、本発明の目的においては、分岐状のポリマーの構造とは区別される構造を有しているものと考えられる。
【００７９】
「デンドリマー」または樹枝状ポリマーは、球状であって、単分散のサイズを有するポリマーであり、その中では、すべての結合が中心の焦点またはコアから、放射状に拡がっていて、規則的な分岐パターンと、それぞれが分岐点に寄与している繰り返し単位とを備えている。デンドリマーは、たとえばコアを包み込むようなある種の樹枝状状態の性質を示し、そのことが、それを他のポリマーとは異なったユニークなものとしている。
【００８０】
本明細書の記載の文脈においては、一つの構造または化学式が備えている変数の定義は、文脈から明確にそうではないと宣言されていない限りにおいては、また別な構造において繰り返されている同じ変数にも適用することができる。したがって、たとえばポリマーに関しての「ＰＯＬＹ」、「スペーサー残基」、「Ｒｅｌ」などの定義は、本明細書において提供される水溶性ポリマーの抱合体に対しても同様に適用することができる。
【００８１】
「スペーサー」または「スペーサー残基」（これは、「リンカー」または「リンカー残基」と呼ぶこともできる）という用語は、本明細書においては、場合によっては１個の残基を他の残基にリンクさせるため、たとえば水溶性ポリマーセグメントをポリマー性反応剤中の官能性残基にリンクさせるために、使用される１個の原子または複数の原子の集合体を指すのに使用されている。本発明のスペーサー残基は、加水分解安定性であるのが好ましいが、一つまたは複数の、生理活性的に加水分解可能であるか、または酵素的に分解可能なリンクを含んでいてもよい。スペーサー残基の例については、以下においてさらに詳しく述べる。
【００８２】
「生理活性的に開裂可能な」または「加水分解可能な」結合とは、生理活性的条件において水と反応する（すなわち、加水分解される）比較的弱い結合である。結合が水の中で加水分解される傾向は、二つの中心原子を繋いでいるリンクの一般的なタイプだけではなく、それらの中心原子に結合している置換基にも依存するであろう。適度に加水分解的に不安定、すなわち弱いリンクとしては、以下のようなものが挙げられる（これらに限定される訳ではない）：カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチド。
【００８３】
「分解可能なリンク」としては、生理活性的に開裂可能な結合、加水分解可能な結合、および酵素的に分解可能なリンクなどが挙げられるが、それらに限定される訳ではない。したがって、「分解可能なリンク」とは、生理活性的条件下において、いくつかのその他の機構（たとえば、酵素触媒的、酸触媒的、塩基触媒的など）によって、加水分解または開裂反応のいずれかを受けるリンクである。たとえば、「分解可能なリンク」としては、ドライビングフォースとして、プロトンの塩基引抜き反応（たとえば、イオン化可能な水素原子、Ｈα）を有する脱離反応を挙げることができる。
【００８４】
「酵素的に分解可能なリンク」とは、１種または複数の酵素によって分解されるリンクを意味している。
【００８５】
「加水分解的に安定な」リンクまたは結合とは、水中で実質的に安定である、すなわち、生理活性的条件においては、長期間にわたっても、それとわかるような加水分解を受けることがない、化学結合、典型的には共有結合を指している。加水分解的に安定なリンクの例としては以下のものが挙げられる（これらに限定される訳ではない）：（たとえば、脂肪族鎖中の）炭素−炭素結合、エーテル、アミド、ウレタン（カルバメート）など。一般的には、加水分解的に安定なリンクは、生理活性的条件下において、１日あたり約１〜２％未満の加水分解速度を示すものである。代表的な化学結合の加水分解速度は、最も標準的な化学の教科書に見出すことができる。いくつかのリンクでは、（たとえば）隣接および近隣の原子や周囲条件に依存して、加水分解的に安定にも、あるいは加水分解可能にもなりうるということは、指摘しておかなければならない。当業者ならば、あるリンクまたは結合が、ある状況下で加水分解的に安定であるか、または加水分解可能であるかを、たとえば、問題となっているリンク含有分子を問題となっている条件下に置き、加水分解の証拠（たとえば、単一の分子が開裂してできる二つの分子の存在および量を）を試験することによって決めることができる。あるリンクまたは結合が加水分解的に安定であるか、または加水分解可能であるかを求めるための、当業者に公知のその他の方法を使用することもできる。
【００８６】
本明細書で使用するとき、「薬剤放出速度」という用語は、その間にある系の中のポリマーと活性薬剤との抱合体の全量の半分が活性薬剤とポリマー性残基とに開裂する、（半減期で表される）速度を意味している。
【００８７】
「活性薬剤」、「生物学的活性薬剤」、および「薬理学的活性薬剤」という用語は、本明細書においては、相互に置き換え可能に使用され、そして、インビボまたはインビトロで実証することが可能な、なにがしかの薬理学的な（多くの場合有益な）効果を与える、各種の薬剤、薬物、化合物、組成物、または混合物を含むものと定義される。これには、食品、栄養補助食品、栄養剤、栄養薬剤（ｎｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌ）、薬物、タンパク質、ワクチン、抗体、ビタミン、およびその他有益な薬剤が含まれる。本明細書で使用するとき、これらの用語にはさらに、患者において局所的または全身的な効果をもたらす各種の生理活性的または薬理学的に有効な物質も含まれる。
【００８８】
「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明の組成物の中に加えることが可能であり、患者に顕著で有害な毒性学的影響を起こさせない賦形剤を指している。
【００８９】
「薬理学的有効量」、「生理活性的有効量」、および「治療有効量」という用語は、本明細書においては相互に置き換え可能に使用され、血流中または目標の組織中において、活性薬剤および／または抱合体の所望のレベルを与えるのに必要とされる、典型的には製剤の中に存在している、ポリマーと活性薬剤との抱合体の量を意味している。その正確な量は、たとえば、具体的な活性薬剤、製剤の成分および物理的特性、目的とする患者の母集団、患者の状況など数々の因子に依存するであろうし、本明細書において提供される情報および関連の文献において入手可能な情報に基づいて、当業者ならば容易に決めることができる。
【００９０】
「患者」という用語は、本明細書において提供される抱合体を投与することによって、予防または治療することが可能である状態を罹患しているか、またはその状態になりやすい生体を指しており、それにはヒトおよび動物の両方が含まれる。
【００９１】
ＩＩ．ポリマー性反応剤
Ａ．反応剤の構造的特徴
本発明のポリマー性反応剤は、一つの態様において、構造Ｉを有するα−ヒドロキシアルデヒドまたはケトンを含んでいる：
【００９２】
【化９】
0005766118.tif 000020
式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、好ましくはＨまたはメチルであり；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが、ここで、Ｃαに隣接する炭素はヒドロキシを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が合体して脂肪族または芳香族環を形成していてもよく；そして、
ＮＲ５は、任意のスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹ、好ましくはポリエチレングリコールにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよい。
【００９３】
一つの実施態様において、Ｒ１がＨであって、そのためにその反応剤がα−ヒドロキシアルデヒドを含んでいる。さらなる実施態様においては、Ｒ４が、非置換であるか、または低級アルキルを用いて置換されている。構造Ｉの中のＲ４が、３炭素鎖であるのが好ましいが、それは飽和であっても不飽和であってもよい。Ｒ４が飽和の３炭素鎖である反応剤が構造Ｉａを有していれば、より好ましい：
【００９４】
【化１０】
0005766118.tif 000021
式中、Ｒ１、ＮＲ５、ＺおよびＰＯＬＹは先に定義されたものであり、置換基Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、および水溶性ポリマーから選択され、そして、置換基ＲｂおよびＲｂ’のそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択されるが、ここでこれらの置換基の内の多くとも一つが水溶性ポリマーであり、そしてここで、これらの置換基の内のいずれか２個が合体して脂肪族環を形成することができる。
【００９５】
この構造の選択された実施態様においては、置換基Ｒｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’は独立して、水素およびアルキルから選択されるが、ここでそのようなアルキル置換基のいずれか２個、好ましくは隣接した炭素原子の上にあるものが合体して、５員〜７員の脂肪族環を形成することもできる。
【００９６】
一つの実施態様において、その基Ｒ５がメチルである。  このタイプの反応剤としては、本明細書において（５）および（１０）と名付けられたものが挙げられる（５−（ｍＰＥＧ−メチル−アミノ）−２−ヒドロキシペンタナール）（下に示す）。これらの例に挙げた反応剤においては、構造Ｉａの中のＲｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’はそれぞれ水素であり、Ｚは存在しない。
【００９７】
【化１１】
0005766118.tif 000022
スペーサー基Ｚが存在しているならば、それは、アルキレン、エーテル、チオエーテル、アミド、およびアミンから選択される結合からなっているのが好ましい。スペーサー基が存在している場合には、それは典型的には、約１５原子までの長さ、好ましくは８原子までの長さである。スペーサー基を有する一つの実施態様において、ＮＲ５がＺと合体して環を形成し、それにＰＯＬＹがリンクされていて、たとえば、ピペラジン環に環の窒素原子を介してＰＯＬＹがリンクされている。このタイプの反応剤としては、本明細書において（１１）および（１２）と名付けられたものが挙げられる（５−ｍＰＥＧ−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール）（下に示す）。これらの例に挙げた反応剤においては、構造Ｉａの中のＲｂ、Ｒｂ’、Ｒｃ、Ｒｃ’、Ｒｄ、およびＲｄ’はそれぞれ水素である。
【００９８】
【化１２】
0005766118.tif 000023
類似の反応剤としては、ＮＲ５がＺと合体することにより形成される環が異なったサイズである（たとえば、５員環または７員環）か、または異なった組成を有している（たとえば、窒素に加えて炭素と水素だけを含むか、または環の中に酸素のようなその他の原子を含む）のようなものが挙げられる。
【００９９】
また別な態様においては、本発明は、構造ＩＩを有するポリマー性α−ヒドロキシアルデヒドまたはケトン反応剤を提供する：
【０１００】
【化１３】
0005766118.tif 000024
式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマー、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、それには、本明細書に記載のように、それを（ＣＲ２Ｒ３）ｍにリンクさせるリンカー残基を含んでいてもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
ｍは、０〜１２、好ましくは０〜６；そして選択された実施態様においては３〜６であり；
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、アルキレン、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、アルキルホスフェート、およびさらなる水溶性ポリマーから選択されるが、
ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、またここで、（ＣＲ２Ｒ３）ｍの中の２個の置換基Ｒ２またはＲ３が合体して環を形成することもできる。
【０１０１】
好ましい実施態様においては、ポリマー性反応剤の中の多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３は、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択される。「アミノアルキル」および「イミノアルキル」としては、（環状アミノ）アルキルまたは（環状イミノ）アルキルを挙げることができる；すなわち、環の中にアミン窒素が含まれているならば、それ自体が−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−鎖の一部を形成していてもよい。
【０１０２】
Ｒ１がＨおよび低級アルキルから選択されるのが好ましく、選択された実施態様においては、Ｒ１がＨまたはメチルである。
【０１０３】
構造ＩＩのポリマー性反応剤は、それらの開環した形態ではα−ヒドロキシアルデヒドまたはケトンである、還元糖たとえば、リボース、キシロース、アラビノース、リキソース、マンノース、またはフルクトースのポリマー性誘導体であってよい。還元糖の３−デオキシ類似体、たとえば３−デオキシリボースをベースとする反応剤が好ましい。そのような反応剤の一つが、本明細書において１３と名付けられた化合物である（リボースの立体配置も合わせて次に示す）。
【０１０４】
【化１４】
0005766118.tif 000025
選択された実施態様においては、反応剤ＩＩには、３−デオキシ類似体ではない還元糖のポリマー性誘導体を含まない。すなわち、好ましい実施態様においては、Ｃαに隣接する炭素の上の置換基Ｒ２およびＲ３には、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基を含まないでけではなく、−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−には、Ｃαに隣接した骨格の１，２，３−トリヒドロキシプロピル残基も含まない。より具体的には、その反応剤には、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトースのポリマー性誘導体、特に、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトースのＰＥＧとの３−もしくは６−エーテルを含まない。そのような反応剤は、３−デオキシ類似体によって得られるものよりも安定性の低い抱合体を作る傾向があるが、その理由は、抱合体の中にカルボニル基に隣接している３−ヒドロキシル基が存在しているからである。
【０１０５】
さらなる実施態様においては、構造ＩＩの中の−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−が−ＣＨ２−ＣＨＲｘ−Ｃ（ＮＨ２）Ｒｙ−で定義されるが、ここでＲｘおよびＲｙは５員〜７員の脂肪族環を形成していて、それにＰＯＬＹがリンクされている。そのような反応剤としては次式に示すものが挙げられるが、ここでｎは０〜２である。
【０１０６】
【化１５】
0005766118.tif 000026
さらに、構造ＩＩＩを有するポリマー性反応剤も提供される：
【０１０７】
【化１６】
0005766118.tif 000027
式中、
ＰＯＬＹは水溶性ポリマー、たとえばポリエチレングリコールであるが、それには、本明細書に記載したような、芳香族環にそれをリンクさせるリンカー残基が含まれていてもよく；そして
（ｉ）Ｒ７は、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるが、好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、および−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１であり、そしてＲ８は−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であるが；
ここで、それぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択されるが、好ましくは独立してＨおよびメチルから選択される。選択された実施態様においては、Ｃ（＝Ｏ）に結合されているＲ１がＨであって、それによりその反応剤にはα−ヒドロキシアルデヒドを含む。他の実施態様においては、それぞれのＲ１がＨである。
【０１０８】
このタイプの反応剤の例としては、本明細書において６と名付けられた化合物（そこでは、Ｒ７が−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである）；７と名付けられた化合物（そこでは、Ｒ７が−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が−ＯＨである）；および８と名付けられた化合物（そこでは、Ｒ７が−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈであり、そしてＲ８が−ＯＨである）が挙げられる（ｍＰＥＧポリマーが結合されて保護された形態で次に示す）。類似の反応剤としては、そのフェノール性ヒドロキシ基（ＯＨ）が、ＮＨ２またはＮ（ＣＨ３）２で置換されている（すなわち、Ｒ８が−ＮＨ２または−Ｎ（ＣＨ３）２である）ものが挙げられる。
【０１０９】
【化１７】
0005766118.tif 000028
先に示したように、ここで開示されたすべての反応剤のＰＯＬＹ成分は、水溶性ポリマー、好ましくはポリ（エチレングリコール）である。反応剤のＰＯＬＹ成分、および得られた抱合体のＰＯＬＹ成分については、後にさらに詳しく説明する。反応剤は、１分子あたり、典型的には２〜３個の、より典型的には１個または２個の結合ポリマーを有している。一つの実施態様において、反応剤が１分子あたり１個の結合ポリマーを有している。
【０１１０】
本発明では、本明細書において表される構造の中にアルデヒドおよびケトンの保護された形態（典型的には、アセタールおよびケタール）を包含していることに注目すべきであって、たとえば、Ｃ＝Ｏは、Ｃ（ＯＲ）２によって置換することができるが、ここでＲはアルキルであり、その２個のＲ基は、２個の一価のアルキル基、または１個の二価のアルキル基（すなわち、環状保護基）を構成している。
【０１１１】
Ｂ．反応性および自己触媒作用
本明細書に記載のポリマー性α−ヒドロキシアルデヒドまたはα−ヒドロキシケトン反応剤は、反応性アミン基を含む化合物と抱合して、安定な抱合体を形成することができる。その反応は、単一の工程で実施される、すなわち、広く採用されているアルデヒドおよびケトンの還元性アミノ化の場合のような、最初の反応生成物を安定な誘導体に転換させるための還元工程をまったく必要としない。
【０１１２】
本発明の反応剤とアミン含有化合物との反応においては、最初の抱合反応生成物が、下記の第二工程に見られるように、酸触媒性または塩基触媒性転位反応を起こして、アミノケトンとなる。この転位反応は、アルドースのＮ−グリコシドを対応するケトースのＮ−グリコシドに転換させる形で、Ａｍａｄｏｒｉによって最初に報告された。
【０１１３】
【化１８】
0005766118.tif 000029
本発明の反応剤を使用した抱合に直ちに続くこの転位工程は、先に示したように、酸触媒性または塩基触媒性である。したがって、その反応は、アニオン性緩衝塩、たとえば炭酸塩およびリン酸塩の存在下に実施するのが好ましい。
【０１１４】
一つの実施態様において、そのポリマー性反応剤そのものに内部プロトン引抜き性（塩基性）官能基を組み込まれていて、イミン中間体のより効果的な転位を促進する。この官能基を与える置換基としては、カルボン酸塩（たとえば、アスパラギン酸誘導体）、リン酸塩、ヒドロキシル基、ならびに環式さらには非環式のアミンまたはイミンを挙げることができる。置換基は、必要であればリンカーを介して、プロトン引抜き反応のための基に対して適切な位置に、好ましくはその引抜き性原子とα−炭素の上の水素原子との間に４−または５−結合間隔（すなわち、引抜き性原子とα−炭素そのものとの間には３−または４−結合間隔）が得られるように位置させる。
【０１１５】
以下において自己触媒作用について説明するが、好ましい５−結合間隔に関して示して、遷移状態は６員環で表す。この構造においては、プロトン引抜き性原子はＸで表されている。
【０１１６】
【化１９】
0005766118.tif 000030
好適な自己触媒性反応剤としては、前述の構造Ｉ／ＩａおよびＩＩＩの反応剤、ならびに、１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択され、かつ基Ｒ２またはＲ３およびｍの値が、Ｒ２またはＲ３の上の酸素または窒素原子がＣαから４結合長さ（または、少し好ましくないが、３結合長さ）分だけ離れるようになっている、上述の構造ＩＩの反応剤が挙げられる。そのような反応剤においては、１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノ、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、およびアルキルカルボン酸から選択されるのが好ましい。
【０１１７】
自己触媒性反応剤は、下記の構造ＶＩＩによって表すこともできる：
【０１１８】
【化２０】
0005766118.tif 000031
式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、炭素原子であって、そのそれぞれが、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、本明細書において定義されたような非干渉性置換基（たとえば、ハロ、シアノ、アリールまたは置換されたアリール）、および水溶性ポリマーから選択される二つの基を用いて置換されており；Ｙは炭素であり、Ｘは窒素または酸素であり、そしてＲ６は、電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、および水溶性ポリマーから選択されていて；（ａ）Ｙ−Ｘ−Ｒ６が、カルボキシル、アルコキシルアルキル、アミノアルキル、またはイミノアルキル（エン）残基を表して、ここでＹ−Ｘがアミノアルキルまたはイミノアルキル（エン）の場合の環状構造の一部であってもよいか、または（ｂ）Ｘ−Ｒ６が単独でアミノまたはヒドロキシルを表しており；
ここで、Ｒ４とＲ５とが合体するか、またはＲ５とＹとが合体するか、またはＲ５が存在しないときにはＲ４とＹとが合体して、水溶性ポリマーを用いて置換されていてもよい５員環または６員環の一つの側環（ｓｉｄｅ）を形成してもよく；
そしてここで、その反応剤が少なくとも一つの水溶性ポリマーを含み、典型的に多くとも一つまたは二つの水溶性ポリマーを含む。
【０１１９】
Ｒ５が存在している（添字＝１）好ましい構造は、上図に見られるように、転位の場合に６員の遷移状態を与える。その中にＲ５が存在しない（添字＝０）構造では、転位の場合に５員の遷移状態を与えるが、これもまた有用となりうる。
【０１２０】
Ｒ１がＨおよび低級アルキルから選択されるのが好ましく、選択された実施態様においては、Ｒ１がＨまたはメチルである。Ｒ４とＲ５、またはＲ５とＹが、５員環または６員環の一つの側環を形成する場合には、そのような環は、１個または複数の先に定義された非干渉性置換基でさらに置換されていてもよい。
【０１２１】
一つの実施態様において、構造ＶＩＩの中のＹ−Ｘが、アミノアルキルを表し、構造−ＣＨ２−ＮＲ−（ここでＲは低級アルキルである）を有している。Ｒ６がＰＥＧであり、Ｒがメチルであり、そしてＲ４およびＲ５のそれぞれが−ＣＨ２−である、このタイプの反応剤は、本明細書においては、ＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（式５または式１０）と名付けられ（ここで、ＭＡＨＰはメチルアミノ２−ヒドロキシペンタナールを示している）、後述の実施例において使用される。この反応剤は、先に挙げた構造Ｉ／Ｉａの一つの実施態様でもある。
【０１２２】
【化２１】
0005766118.tif 000032
また別な実施態様においては、構造ＶＩＩの中のＹ−Ｘが、カルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）を表し、Ｒ６が水素で、カルボン酸（ＣＯＯＨ）置換された反応剤が与えられる。Ｒ１が水素であり、Ｒ４とＲ５とでｍＰＥＧを用いて置換されたベンゼン環の一つの側環を形成しているこのタイプの反応剤を（アルデヒドが保護された形態で）次に示す：
【０１２３】
【化２２】
0005766118.tif 000033
この反応剤は、先に挙げた構造ＩＩＩの一つの実施態様でもある。
【０１２４】
Ｙ−Ｘ−Ｒ６がイミノアルキル（エン）残基を表している、さらなる実施態様においては、構造ＶＩＩの中のＹ−Ｘが、４−イミダゾイル基を表している（環状イミノ基の一つの実施態様）。Ｒ４が水素およびＺ−ＰＥＧ（ここで、Ｚは、アミドリンカーである）を用いて置換され、そしてＲ５が−ＣＨ２−である、このタイプの反応剤を、次に示す。（その調製法は、実施例３に記載する。）この反応剤は、Ｒ２またはＲ３が（環状イミノ）アルキルである、上述の構造ＩＩの一つの実施態様でもある。
【０１２５】
【化２３】
0005766118.tif 000034
さらなる実施態様においては、Ｘ−Ｒ６が単独でヒドロキシル基を表し、Ｒ５とＹとが合体して一つの６員環たとえばベンゼンの側環を形成し、それが水溶性ポリマーを用いて置換されている。Ｒ４が−ＣＨ２−であるこのタイプの反応剤を、（保護された形で）下の右側（構造８）に示す。
【０１２６】
【化２４】
0005766118.tif 000035
先に説明したように、Ｒ５が存在している（添字＝１）構造ＶＩＩの反応剤は、転位の際に好ましい６員の遷移状態をとるように設計されている。５員の遷移状態をとるように設計された構造もまた有用であるが、それらは本質的に、Ｒ５が省略された（添字＝０）構造ＶＩＩを有していて、以下に示す（構造ＶＩＩ’）ように、Ｒ４がＹに直接結合されている。上述のような、このケースにおいては、Ｒ４とＹとが合体して、５員環または６員環の一つの側環を形成してもよいが、それは水溶性ポリマーを用いて置換されていてもよい。このタイプの反応剤の一例を、（保護された形態で）上の左側の構造（構造７）に示す。
【０１２７】
【化２５】
0005766118.tif 000036
反応剤の７および８は、先に示したような構造ＩＩＩの実施態様でもある。
【０１２８】
それらのポリマー性反応剤は、当業者が利用可能な標準的な合成方法に従って調製される。たとえば、一端に保護されたアルデヒドまたはケトンを、他端に反応性基を有する前駆体化合物を、相補的反応性基を有するポリマーと反応させる。別な方法として、適切な前駆体分子にポリマーを結合させた後にアルデヒドまたはケトンを生成させてもよい。たとえば、以下の実施例１〜５、７〜１０、および１８〜１９に記載されているスキームを参照されたい（これらは、本発明を限定するものと受け取ってはならない）。
【０１２９】
Ｃ．水溶性ポリマー
本明細書に記載されたポリマー性反応剤中において表される水溶性ポリマーに関しては、それぞれの水溶性ポリマー（たとえば、ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２など）は、そのポリマーが水溶性である限りにおいては、いかなるポリマーで構成されていてもよい。さらに、本明細書で使用するとき、水溶性ポリマーは典型的には、非ペプチドである。
【０１３０】
好ましくはポリ（エチレングリコール）ではあるが、本明細書において使用するための水溶性ポリマーとしては、たとえば、その他の水溶性ポリマーたとえば他のポリ（アルキレングリコール）たとえば、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど、ポリ（オレフィン系アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載されているような、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）などを挙げることができる。水溶性ポリマーは、上述の各種のもののホモポリマー、コポリマー、ターポリマー、非ランダムブロックポリマー、およびランダムブロックポリマーとすることができる。
【０１３１】
したがって、その水溶性ポリマーには、好ましくは、次のものから成る群から選択される最高３種までの異なったモノマーを含む：アルキレングリコールたとえば、エチレングリコールまたはプロピレングリコール；オレフィン系アルコールたとえば、ビニルアルコール、１−プロペノールまたは２−プロペノール；ビニルピロリドン；ヒドロキシアルキルメタクリルアミドまたはヒドロキシアルキルメタクリレート（ここで、アルキルは好ましくはメチルである）；サッカライド；α−ヒドロキシ酸たとえば、乳酸またはグリコール酸；ホスファゼン、オキサゾリン、およびＮ−アクリロイルモルホリン。好適なモノマーのタイプとしては、アルキレングリコール、オレフィン系アルコール、ヒドロキシアルキルメタクリルアミドまたはメタクリレート、Ｎ−アクリロイルモルホリン、およびα−ヒドロキシ酸が挙げられる。
【０１３２】
そのポリマーが、この群から選択される２種のモノマーのコポリマーであれば好ましく、この群から選択される１種のモノマーのホモポリマーであれば、より好ましい。したがって、代表的なＰＯＬＹとしては、以下のものが挙げられる：ポリ（アルキレングリコール）たとえばポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリ（オレフィン系アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）。ＰＯＬＹは、各種上述のものの、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、またはブロックトリポリマーとすることができる。コポリマーの中の２種のモノマーが、同一のタイプのモノマー、たとえば２種のアルキレングリコール、たとえばエチレングリコールとプロピレングリコールとであってもよい。
【０１３３】
そのポリマー性反応剤が２種以上の水溶性ポリマーを含んでいるような場合には、全体構造の中のそれぞれの水溶性ポリマーは、同一であっても、あるいは異なっていてもよい。しかしながら、全体構造の中の水溶性ポリマーがすべて、同一のタイプのものであるのが、好ましい。たとえば、ある構造の内部の水溶性ポリマーがすべて、それぞれポリ（エチレングリコール）であるのが好ましい。
【０１３４】
少なくとも１個の反応性末端を有する水溶性ポリマーであれば何であっても、本発明によるポリマー性反応剤を調製するために使用することができる。ただ１個だけの反応性末端を担持している水溶性ポリマーを使用することもできるが、本明細書に記載の転換をさせるために適切な、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれ以上の反応性末端を担持しているポリマーを使用することも可能である。全体構造の中に存在しているという文脈においては、水溶性ポリマーは、１個〜約３００個の末端を有している。
【０１３５】
そのポリマー成分は、各種各様の形状をとることが可能であり、たとえば、ＰＯＬＹは直鎖状、分岐状、またはフォーク状とすることができるが、これについては後にさらに詳しく説明するであろう。最も典型的には、ＰＯＬＹが直鎖状であるか、または分岐状で、たとえば２本のポリマーの腕を有している。
【０１３６】
各種個別の水溶性ポリマーの重量平均分子量は変化させることが可能ではあるが、いずれの水溶性ポリマーの重量平均分子量も典型的には、次の範囲に入るであろう：１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトン。しかしながら、範囲の例としては、以下の範囲の重量平均分子量が挙げられる：約８８０ダルトン〜約５，０００ダルトンの範囲、５，０００ダルトン超〜約１００，０００ダルトンの範囲、約６，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、１０，０００ダルトン超〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約５３，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約２９，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約３５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約８８０ダルトン〜約６０，０００ダルトンの範囲、約４４０ダルトン〜約４０，０００ダルトンの範囲、約４４０ダルトン〜約３０，０００ダルトンの範囲、および約４０，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲。いかなる水溶性ポリマーであっても、これらの範囲の一つまたは複数の分子量を有するＰＥＧが好ましい。
【０１３７】
水溶性ポリマーの重量平均分子量の例としては以下のものが挙げられる：約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約４４０ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約１６，０００ダルトン、約１７，０００ダルトン、約１８，０００ダルトン、約１９，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、および約７５，０００ダルトン。前述のいずれかの全重量平均分子量を有する、水溶性ポリマーの内の分岐状のもの（たとえば、二つの２０，０００ダルトンのポリマーからなる分岐状で４０，０００ダルトンの水溶性ポリマー）もまた、使用することができる。
【０１３８】
ポリマー性反応剤の中の水溶性ポリマーとしてＰＥＧを使用する場合には、そのＰＥＧには典型的には、数多くの（ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマー（またはＰＥＧの定義の仕方によるが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）モノマー）が含まれている。本明細書の記述を通して、繰り返し単位の数は、「（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」の中の添字「ｎ」によって同定される。したがって、（ｎ）の値は典型的には、以下の範囲の一つまたは複数の中に入る：２〜約３４００、約１００〜約２３００、約１００〜約２２７０、約１３６〜約２０５０、約２２５〜約１９３０、約４５０〜約１９３０、約１２００〜約１９３０、約５６８〜約２７２７、約６６０〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約９０９〜約２７３０、および約１，２００〜約１，９００。その分子量が公知のいかなるポリマーの場合であって、繰り返し単位の数（すなわち「ｎ」）は、そのポリマーの全重量平均分子量を、その繰り返しモノマーの分子量で割り算することによって求めることができる。
【０１３９】
それぞれの水溶性ポリマーは典型的には、生体適合性があり、非免疫原性である。生体適合性に関しては、ある物質が生体適合性があると考えられるのは、臨床医、たとえば医師による評価で、その物質を単独または他の物質（たとえば、活性薬剤）と組み合わせて、生体組織に関連して使用したこと（たとえば、患者への投与）に伴う有益な効果が、いかなる有害作用よりも上回るような場合である。非免疫原性に関しては、ある物質が非免疫原性であると考えられるのは、臨床医の評価で、その物質を単独または他の物質と組み合わせて生体組織に関連して使用したときに、免疫応答（たとえば、抗体の発生）を引き起こさないか、または免疫応答が起きたとしても、そのような応答が臨床的に顕著であるとか重要であるとはみなされないような場合である。本明細書に記載のポリマーおよび水溶性ポリマーセグメント、さらには活性薬剤とそのポリマーとの抱合体が、生体適合性があり、非免疫原性であるのが特に好ましい。
【０１４０】
好ましい実施態様においては、ＰＯＬＹがポリ（エチレングリコール）である。ＰＥＧポリマーは典型的には、透明で、無色で、無臭で、水溶性で、熱に対して安定で、多くの化学物質に対して不活性で、非毒性であり、加水分解または劣化を受けない（具体的にはそうなるように設計しない限りにおいて）。ポリ（エチレングリコール）は高度に生体適合性があり、実質的に非免疫原性である。薬理学的活性薬剤と抱合させた場合、ＰＥＧ分子は、その薬剤をマスクする傾向があり、その薬剤に対する免疫応答を抑制または排除することができる。ＰＥＧ抱合体は傾向として、実質的な免疫応答を起こしたり、あるいは凝血その他望ましくない効果の原因となったりはしない。
【０１４１】
ＰＥＧ成分の分子量は、先にも述べたように、変化させてもよいが、好適なポリマーには、約３〜約４，０００、または約３〜約３，０００、より好ましくは約２０〜約１，０００のモノマー単位を含んでいる。
【０１４２】
一つの形態においては、遊離または非結合のＰＥＧが、それぞれの末端がヒドロキシル基で終わっている直鎖状のポリマーであり：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ここで、（ｍ’）は典型的には、０〜約４，０００、好ましくは約２０〜約１，０００の範囲である。
【０１４３】
上述のポリマーである、アルファ−，オメガ−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、簡潔な形ではＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表すことができるが、ここでその−ＰＥＧ−の符号は、次式の構造単位を表すことができると理解されたい：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−
ここで、（ｍ’）は先に定義されたものである。
【０１４４】
ＰＥＧの末端が不活性な末端封止基を用いて封止されている、末端封止されたＰＥＧが、本発明の反応剤を調製するには好ましい。好適な末端封止残基としては、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アルケニルオキシ、置換されたアルケニルオキシ、アルキニルオキシ、置換されたアルキニルオキシ、アリールオキシ、および置換されたアリールオキシが挙げられる。最も好ましい末端封止基は、メトキシ、エトキシ、およびベンジルオキシである。ｍＰＥＧ（メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ）の構造を次式に挙げる：
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ここで、（ｍ’）は先に説明したものである。
【０１４５】
封止基は、リン脂質であってもよい。好ましいリン脂質は、ジアルキルホスファチジルエタノールアミン、たとえばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ；後述の構造参照）。その他の好適なリン脂質としては、たとえば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルコリンなどが挙げられるが、それらはすべて、当業者には公知であり、市販されている。ホスフェートのヘッド基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）の上の反応性基を使用して、その脂質をＰＥＧ鎖にリンクさせることができる；たとえば、ＤＳＰＥ中の末端アミンを、カルバメートリンクを介してＰＥＧにリンクさせることができる。  
【０１４６】
たとえば米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されているような、腕が複数または分岐状のＰＥＧ分子もまた、ＰＥＧポリマーとして使用することが可能である。たとえば、ＰＥＧは以下の構造をとることができる：
【０１４７】
【化２６】
0005766118.tif 000037
式中：
ｐｏｌｙａおよびｐｏｌｙｂは、（同一であっても、異なっていてもよい）ＰＥＧ骨格、たとえばメトキシポリ（エチレングリコール）であり；
Ｒ”は非反応性残基、たとえばＨ、メチル、またはＰＥＧ骨格であり；そして
ＰおよびＱは、非反応性リンクである。
【０１４８】
好ましい実施態様においては、その分岐状のＰＥＧポリマーが、メトキシポリ（エチレングリコール）で二置換されたリシンである。本発明化合物１４は、分岐状のＰＥＧを使用した反応剤のまた別な例である。
【０１４９】
さらに、ＰＥＧにはフォーク状ＰＥＧも含まれることができる。遊離または非結合のフォーク状ＰＥＧの一例を、以下の構造で表す：
【０１５０】
【化２７】
0005766118.tif 000038
ここで、Ｘは、スペーサー残基であり、それぞれのＺは、規定の長さの原子の鎖でＣＨにリンクされた活性化された末端基である。国際公開第９９／４５９６４号パンフレットには、本発明において使用可能な各種のフォーク状ＰＥＧ構造が開示されている。Ｚ官能基を分岐炭素原子にリンクしている原子の鎖は、繋ぎ基（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）として働いていて、たとえば、アルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖、およびそれらの組合せなどからなっていてよい。
【０１５１】
そのＰＥＧポリマーには、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧの長さ方向に共有結合的に結合された、反応性基たとえばカルボキシルを有するペンダントＰＥＧ分子が含まれていてもよい。そのペンダント反応性基は、ＰＥＧの直接結合させることも、あるいはアルキレン基のようなスペーサー残基を介して結合させることも可能である。
【０１５２】
上述のＰＥＧの形態に加えて、ポリマー性反応剤の中のそれぞれの水溶性ポリマーは、上述の各種ポリマーなども含めて、ポリマーの中の１種または複数の弱いかまたは分解可能なリンクを用いて調製することもできる。たとえば、ポリマーの中にエステルリンクを有するＰＥＧを調製して、後ほどそれを加水分解させることもできる。次式に見られるように、この加水分解の結果ポリマーの開裂が起きて、より低分子量の断片となる：
【０１５３】
【化２８】
0005766118.tif 000039
ポリマー骨格の内部で分解可能なリンクとして有用な、その他の加水分解的に分解可能なリンクとしては、以下のものが挙げられる：カーボネートリンク；たとえばアミンとアルデヒドとを反応させることにより得られるイミンリンク（たとえば、Ｏｕｃｈｉ  ｅｔａｌ．，（１９９７）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，３８（１）：５８２〜３、参照）；たとえばアルコールをホスフェート基と反応させることにより形成されるリン酸エステルリンク；典型的には、ヒドラジドとアルデヒドとを反応させることにより形成されるヒドラゾンリンク；典型的にはアルデヒドとアルコールとの間の反応により形成されるアセタールリンク；たとえばギ酸塩とアルコールとの間の反応により形成されるオルトエステルリンク；たとえば、ポリマーたとえばＰＥＧの末端にあるアミン基と別のＰＥＧ鎖のカルボキシル基とから形成されるアミドリンク；たとえば、末端イソシアネート基を有するＰＥＧとＰＥＧアルコールとを反応させて形成されるウレタンリンク；たとえば、ポリマーたとえばＰＥＧの末端にあるアミン基と、ペプチドのカルボキシル基とから形成されるペプチドリンク；および、たとえば、ポリマーの末端にあるホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とから形成されるオリゴヌクレオチドリンク。
【０１５４】
当業者には理解されることであるが、ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧという用語は、上述の形態のＰＥＧのすべてを表したり、含んでいたりする。
【０１５５】
実質的に水溶性のポリマーに関する上述の議論が、すべてを網羅しているということでは決して無く、単に説明のためのものであり、また上述の品質を有するすべてのポリマー物質が考慮の対象であるということは、当業者ならば認識するであろう。本明細書で使用するとき、「水溶性ポリマー」という用語は、一つの分子のみならず、さらには他の残基に結合している水溶性ポリマーの残基をも指している。
【０１５６】
Ｄ．リンカー残基
「リンカー残基」、または簡単には「リンカー」は、成分ＰＯＬＹを構成するポリマーセグメントを相互に接続するか、またはポリマー成分ＰＯＬＹを反応剤の官能基の部分に接続するために使用することができる。本明細書で使用するとき、「ＰＯＬＹ」という用語には、場合によっては、そのようなリンカーも含まれるということは理解されたい。リンカーは、単一の原子たとえば酸素もしくは硫黄であっても、二つの原子であっても、または多数の原子であってもよい。リンカーは典型的には、その性質が直鎖であるが、それが必須という訳ではない。リンカーの全体の長さは、典型的には１〜約４０原子の範囲となるであろうが、この場合の長さは、単一の鎖の中の原子の数を意味しているが、置換基は計算に入れない。たとえば、全体のリンカーの長さに関しては−ＣＨ２−は１原子として計算するが、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−は長さが３原子として計算する。リンカーは、好ましくは約１〜約２０原子、より好ましくは約２〜約１５原子の長さを有するであろう。
【０１５７】
リンカーが、たとえばアミド、エステル、ウレタン（カルバメート）、またはウレアのような単一の官能基であることが可能であり、あるいは、それが単一の官能基の両側に位置するメチレンまたはその他のアルキレン基であってもよい。別な方法として、リンカーが、同一であっても異なっていてもよいが、複数の官能基を組み合わせたものであってもよい。リンカーをアルキレン鎖とすることも可能であり、場合によっては１個または複数の酸素または硫黄原子がふくまれてもよい（すなわち、エーテルまたはチオエーテルリンク）。窒素原子を含むアルキレン鎖（すなわち、アミンリンク）もまた含まれる。好ましいリンカーは、加水分解的に安定なものである。
【０１５８】
リンカーを例示すれば、次の構造のいずれかに相当するものである：
−（ＣＨ２）ｃ−Ｄｅ−（ＣＨ２）ｆ−  または  −（ＣＨ２）ｐ−Ｍｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｋｓ−（ＣＨ２）ｑ−。
これらの構造に関連して言えば、変数「ｃ」は０〜８の範囲であり；「Ｄ」はＯ、ＮＨまたはＳであり：変数［ｅ］は０または１であり；変数「ｆ」は０〜８の範囲であり；変数「ｐ」は０〜８の範囲であり；「Ｍ」は−ＮＨまたはＯであり；「Ｋ」はＮＨまたはＯであり；変数「ｑ」は０〜８の範囲であり、そして変数「ｒ」および「ｓ」はそれぞれ独立して０または１である。
【０１５９】
リンカー残基の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定される訳ではない：−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ２）−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、二価のシクロアルキル、およびアミノ酸。
【０１６０】
さらに含まれるものとしては−Ｎ（Ｒ６）−があるが、ここでＲ６はＨまたは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリールおよび置換されたアリールからなる群より選択される有機基；ならびに−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−もしくは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−（ここで、（ｈ）は０〜６、（ｊ）は０〜２０である）である。その他の特異的なスペーサー残基は以下の構造を有している：−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ここで、それぞれのメチレンの後の添字の値は、その構造に含まれているメチレンの数を示していて、たとえば（ＣＨ２）１〜６は、その構造が、１、２、３、４、５または６個のメチレンを含むことが可能であることを意味している。
【０１６１】
リンカーには、上述の各種のものを二つ以上組み合わせたものも含まれていてよい。
【０１６２】
さらに、上述のスペーサー残基のいずれもが、１〜２０個のエチレンオキシドモノマー単位（すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０）を含む、エチレンオキシドオリゴマー鎖をさらに含んでいてもよい。すなわち、そのエチレンオキシドオリゴマー鎖は、スペーサー残基の前または後に存在することもできるし、また場合によっては、２個以上の原子からなるスペーサー残基のいずれか二つの原子の間に存在することもできる。しかしながら、そのオリゴマーがポリマーセグメントに隣接していて、ポリマーセグメントの伸長を単に表しているような場合には、そのオリゴマー鎖がスペーサー残基の一部であると考えてはならない。たとえば、ＰＯＬＹがＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−と定義されている場合には、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−は、リンカー残基とはならないであろうが、その理由は、そのような定義は、ポリマーの伸長を単に表しているだけであるからでる。しかしながら、リンカーには、先に記載した例示的リンカーの一つまたは組合せによって、側面に配置された一つまたは複数の−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−サブユニットを含むことはできるであろう。
【０１６３】
リンカーが加水分解的に安定であるのが好ましく、以下の官能基の一つまたは複数を含んでいてもよい：アミド、ウレタン、エーテル、チオエーテル、またはウレア。しかしながら、加水分解的に分解可能なリンク、たとえばカルボン酸エステル、リン酸エステル、オルトエステル、無水物、イミン、アセタール、ケタール、オリゴヌクレオチド、またはペプチドが存在していてもよい。
【０１６４】
ＩＩＩ．抱合方法
本発明においては、水溶性ポリマーとアミン含有生物学的活性分子との安定な抱合体を形成するための方法が提供される。上述のように、その反応は、単一の工程で実施される、すなわち、広く採用されているアルデヒドおよびケトンの還元性アミノ化の場合のような、最初の反応生成物を安定な誘導体に転換させるための還元工程をまったく必要としない。
【０１６５】
したがって、本発明は、水溶性ポリマーを反応性アミン基を有する化合物と抱合させる方法を提供するが、その方法には、以下の工程が含まれる：その化合物を、水溶性ポリマーにリンクされたα−ヒドロキシアルデヒドまたは末端α−ヒドロキシケトンをそれぞれ含むポリマー性反応剤と反応させる工程、それによって、その水溶性ポリマーが、構造−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂ（式中、Ｒ１はそれぞれ水素またはメチルであり、ＮＨ−Ｂは、そのアミン含有化合物の残基を表す）を有する残基にリンクされた抱合体を形成する工程。
【０１６６】
好ましい実施態様においては、そのポリマー性反応剤には、酸素および窒素から選択されるプロトン引抜き性原子を含むプロトン引抜き性官能基がさらに含まれ、プロトン引抜き性原子とα−ヒドロキシアルデヒドまたはα−ヒドロキシケトンのα−炭素との間に３−結合間隔または４−結合間隔、好ましくは４−結合間隔が存在するようにする。そのような反応剤は、先に説明したように「自己触媒性（ｓｅｌｆ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ）」抱合反応をすることが可能である。
【０１６７】
より詳しくは、本発明は、水溶性ポリマーを、反応性アミン基を有する化合物と抱合させる方法を提供するが、それにはそのアミン含有化合物を本明細書に示したような構造Ｉ／Ｉａ、ＩＩまたはＩＩＩを有するポリマー性反応剤と反応させる方法によるが、ここでその反応剤には、少なくとも１種の水溶性ポリマーを含み、それによって、本明細書に記載されているような構造ＩＶ、ＶまたはＶＩそれぞれを有する抱合体を形成させるが、ここで、構造ＩＶ、ＶまたはＶＩの中の−ＮＨ−Ｂはアミン含有化合物の残基を表している。
【０１６８】
その抱合方法では、還元糖、たとえばリボース、キシロース、アラビノース、リキソース、ガラクトース、グルコース、マンノース、およびフルクトース（これらのものは、それらが開環した形ではα−ヒドロキシアルデヒドまたはケトンである）のポリマー性誘導体を採用してもよい。還元糖の３−デオキシ類似体、たとえば３−デオキシリボースをベースとする反応剤が好ましい。そのような反応剤は、元々の糖の対応する誘導体よりは有利であるが、その理由は、最終的に抱合された反応生成物の中に３−ヒドロキシル基が存在しないために、抱合された反応生成物が分解される機会が低下するからである。
【０１６９】
一般的には、その方法の好ましい実施態様では、本明細書に記載の反応剤の好ましい実施態様が採用される。そのアミン含有化合物は典型的には、生物学的活性化合物または生物学関連化合物であるが、これについては後にさらに詳しく説明する。
【０１７０】
Ａ．反応条件
抱合反応を実施するのに適した溶媒としては、たとえばリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、ホウ酸ナトリウム、およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）の水溶液のような緩衝液が挙げられる。タンパク質を抱合させるためには、典型的には、そのポリマー性反応剤をタンパク質含有溶液に、目標のタンパク質に対して等モル量または過剰モル量で添加する。目標のタンパク質に対するＰＥＧ−反応剤の過剰モルは、典型的には約２〜５の範囲である。抱合反応は典型的には、ほぼ１〜２４時間かけて、ほぼ室温（２５℃）またはそれ以下で実施するが、その温度範囲が、約−１５℃〜約１００℃、より好ましくは約４℃〜３７℃であってもよい。抱合反応条件の例は、以下の実施例６および１１〜１３に記載されている。
【０１７１】
小分子、たとえばアンホテリシンＢまたはその他のアミン含有分子（以下において説明する）に対しての抱合条件は、その修飾される小分子に応じて変化するであろう。しかしながら、典型的には、その抱合は、小分子に対してポリマー性反応剤をやや過剰モル、たとえば、約１．２〜１．５から約５〜１０倍までの過剰モルで使用して実施する。場合によっては、その分子に依存して、実際にはその小分子の薬物を過剰に使用してもよいが、それは、そのＰＥＧ−小分子抱合体が反応溶媒たとえばエーテルの中で沈殿し、それに対して未反応の薬物が溶液の中に残るような場合である。
【０１７２】
正確な反応時間は、時間による反応の進行をモニターして決める。反応の進行は、典型的には、各種のタイムポイントで反応混合物から一定分量をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析法またはその他適切な分析試験法によってその反応混合物を分析することによってモニターする。
【０１７３】
Ｂ．ＰＥＧマー（ＰＥＧ−ｍｅｒ）のキャラクタリゼーションおよび任意の分離法
場合によっては、その抱合される分子（たとえば、タンパク質）と反応条件から、複数のＰＥＧ化化学種が予想されるような場合には、本発明のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）反応剤を生物学的活性薬剤と反応させることによって生成する抱合体を精製して、各種のＰＥＧ化化学種を取得／単離する。タンパク質を、低分子量、たとえば約２０キロダルトン未満の分子量を有するＰＥＧと反応させた場合には、その反応生成物を精製して、タンパク質１分子あたりに付着しているＰＥＧの数の分布を得ることができる。たとえば、その反応生成物の混合物を精製して、タンパク質１分子あたりおおよそ平均１〜５個のＰＥＧ、典型的にはタンパク質１分子あたり平均約３個のＰＥＧを得ることができる。最終的な抱合体の反応混合物を精製するための戦略は、多くの因子、たとえば採用したポリマーの分子量、具体的なタンパク質、ならびに個々の抱合体化学種の残存活性およびインビボでの性質に依存するであろう。
【０１７４】
異なった分子量を有するＰＥＧ抱合体は、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して単離することができる。たとえば、約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ反応剤を、１００ｋＤａのタンパク質とランダムに抱合させるような反応を例に挙げれば、そうして得られた反応混合物にはおそらく、未変性タンパク質（ＭＷ：１００ｋＤａ）、モノ−ＰＥＧ化タンパク質（ＭＷ：１２０ｋＤａ）、ジ−ＰＥＧ化タンパク質（ＭＷ：１４０ｋＤａ）、などが含まれているであろう。このタイプの分離を実施するのに適したゲル濾過カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）およびＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、所望の分画範囲に依存するであろう。溶出は一般的には、非アミン系緩衝液、たとえばリン酸塩、酢酸塩などを使用して実施される。捕集した画分を、数種の各種の方法によって分析すればよいが、そのような方法としてはたとえば，（ｉ）タンパク質含量についてはＯＤ（２８０ｎｍ）、（ｉｉ）ＢＳＡタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量にはヨウ素試験法、または（ｉｖ）ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル法を実施した後で、ヨウ化バリウムを用いて染色、などが挙げられる。
【０１７５】
位置異性体（すなわち、タンパク質の異なった位置に結合したＰＥＧを有する複数の抱合体）の分離は、一般的には、分子量ベースの方法では達成できないが、たとえばＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＶｙｄａｃ）を使用した逆相クロマトグラフィーで実施することができる。
【０１７６】
Ｃ．タンパク質への抱合：ランダムおよびＮ末端選択的
一般的には、本発明のポリマー性反応剤は、Ｎ末端アミノ酸におけるα−アミンの反応性が区別される条件下において、タンパク質のＮ−末端の修飾を選択的に目標とするために使用することができる。Ｎ末端が修飾されたタンパク質またはペプチドを調製するための反応条件には、以下の工程が含まれる：（ｉ）アミン非含有緩衝液（たとえば、ｐＨ範囲約４〜約６．５、好ましくは約５〜６．５、最も好ましくはｐＨ約５〜５．５）の中に、修飾されるタンパク質またはペプチドを溶解させる工程，（ｉｉ）そのタンパク質またはペプチド溶液に、本発明のポリマー性反応剤（α−ヒドロキシアルデヒドまたはケトン）を添加する工程、ならびに（ｉｉｉ）そのタンパク質またはペプチドとポリマー性反応剤とを反応させて、抱合体を形成させる工程。
【０１７７】
ポリマー性反応剤（α−ヒドロキシアルデヒドまたはケトン）をランダムに結合させるためには、より高いｐＨの条件下の反応を使用することができる。さらに詳しくは、ポリマー性反応剤を表面に接近しうるいくつかの数のリシン残基に共有結合的に結合させるためには、タンパク質またはペプチド（たとえば、以下において出てくる生体分子例のようなもの）を、典型的には、一般的には約５〜８、より好ましくは約６．５〜８の範囲の穏やかなｐＨのアミン非含有緩衝液の中で、本発明のポリマー性反応剤と反応させる。アミン非含有緩衝液が好ましいが、その理由は、ポリマー性反応剤とのカップリングで、緩衝液の中のアミノ基が、タンパク質のアミノ基と競合する可能性があるからである。好適なアミン非含有緩衝液は、抱合化学反応を実施するのに望ましいｐＨ範囲にするような適切なｐＫを有するものから選択される。そのカップリング反応は一般的には、おおよそ数分間〜数時間（たとえば、５分間〜２４時間またはそれ以上）で進行するが、平均すると、約０．２〜４時間の間にカップリングが達成される。
【０１７８】
修飾の程度、すなわち、目標の分子の活性なサイトに共有結合的に結合されるＰＥＧの数は、ポリマー性反応剤対タンパク質またはペプチドのモル比率、温度、反応時間、およびｐＨのいずれか一つまたは複数を、単独かまたは同時に上げることによって、増やすことができる。
【０１７９】
ＩＶ．ポリマー性抱合体
先に説明したように、本発明は、ポリマーとその他の残基の間に分解可能なリンクを有する抱合体を得るのに有用な、ポリマー性反応剤を提供する。理論に束縛されることなく言えば、それらの抱合体は、その抱合体を形成させるのに使用されたポリマー性反応剤の残基または「タグ」を最小限にするか、または完全に消滅させるように、分解すると考えられる。その結果として、本明細書に記載のポリマー性反応剤をアミン含有活性薬剤と反応させることによって形成された抱合体を加水分解させたときに、活性薬剤の元の抱合されていない、未修飾の形態を再生または回復させることが可能となる。
【０１８０】
本発明においては、生物学的活性分子に対してα−アミノケトンリンクを介して共有結合的にリンクされた水溶性ポリマーを含むポリマー性抱合体が提供される。その抱合体は、本明細書における構造Ｉ／Ｉａ、ＩＩまたはＩＩＩの反応剤をアミン含有化合物と反応させることによって、調製される。
【０１８１】
上述の構造Ｉ／Ｉａを有する反応剤の場合には、そのような抱合体は、構造ＩＶを有することになろう：
【０１８２】
【化２９】
0005766118.tif 000040
式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され、好ましくはＨまたはメチルであり；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、ハロ、シアノ、および水溶性ポリマーから選択される１個または複数の基を用いて置換されていてもよい、２炭素鎖または３炭素鎖であるが、ここで、カルボニル炭素に隣接する炭素はヒドロキシルを用いて置換されてはおらず、そしてここで、Ｒ４の上の２個の置換基が脂肪族または芳香族環を形成していてもよく；
ＮＲ５は、任意のスペーサー基Ｚを介して水溶性ポリマーのＰＯＬＹ、たとえばポリエチレングリコールにリンクされている二級または三級アミノ基であるが、ここで、Ｒ５は水素またはアルキル基であるが、それがスペーサー基Ｚと共に環を形成していてもよく；そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。
【０１８３】
上述の構造ＩＩを有する反応剤の場合には、そのような抱合体はまた、構造Ｖを有することになろう：
【０１８４】
【化３０】
0005766118.tif 000041
式中：
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマー、好ましくはＰＥＧであり、それには、本明細書に記載のように、それを（ＣＲ２Ｒ３）ｍにリンクさせるリンカー残基を含んでいてもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびアルコキシアルキルから、好ましくはＨおよびメチルから選択され；
ｍは、０〜１２、好ましくは０〜６；そして選択された実施態様においては３〜６であり；そして
それぞれのＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、アルキル、アルキレン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、アルキルホスフェートおよびさらには水溶性ポリマーから選択されるが、ここで、多くとも１個のＲ２またはＲ３基が水溶性ポリマーであり、そしてここで（ＣＲ２Ｒ３）ｍの上の２個の置換基Ｒ２またはＲ３が環、好ましくは脂肪族の環を形成することも可能であり；そして
−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。
【０１８５】
好ましい実施態様においては、多くとも１個の基Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択される。先に説明したように、アミノアルキルおよびイミノアルキルとしては、（環状アミノ）アルキルまたは（環状イミノ）アルキルを挙げることができる；すなわち、環の中にアミン窒素が含まれているならば、それ自体が−（ＣＲ２Ｒ３）ｍ−鎖の一部を形成していてもよい。
【０１８６】
本発明のさらなる抱合体としては構造ＶＩのものが挙げられる：
【０１８７】
【化３１】
0005766118.tif 000042
式中、
（ｉ）Ｒ７は、Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＨ、および−Ｎ（Ｒ１）２から選択されるが、好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、および−ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）２から選択されるか；または  
（ｉｉ）Ｒ７は、−ＣＨＲ１−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ１−ＮＨ−Ｂであり、そしてＲ８は、−ＯＨまたは−Ｎ（Ｒ１）２であり；
ＰＯＬＹは水溶性ポリマー、たとえばＰＥＧであるが、それには、本明細書に記載したような、芳香族環にそれをリンクさせるリンカー残基が含まれていてもよく；そして−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表しており；ここで、それぞれのＲ１は独立して、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから、好ましくはＨおよびメチルから選択される。
【０１８８】
一般的には、抱合体ＩＶ、ＶおよびＶＩの好ましい実施態様は、本明細書に記載の対応する反応剤Ｉ／Ｉａ、ＩＩおよびＩＩＩの好ましい実施態様から誘導される。
【０１８９】
特に好ましい実施態様においては、その抱合体が、自己触媒性反応剤から誘導される。そのようなものしては、上述の構造ＩＶおよびＶＩの抱合体が挙げられるが、さらには上述の構造Ｖの抱合体も挙げられるが、それにおいては、１個の基Ｒ２またはＲ３が、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルキレン、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、アルキルカルボン酸、ホスフェート、およびアルキルホスフェートから選択され、そしてこの基Ｒ２またはＲ３およびｍの値が、Ｒ２またはＲ３の上の酸素または窒素原子がＣαから４結合長さだけ離れているように選択される。Ｒ２またはＲ３が、アミノアルキル、イミノアルキル、カルボン酸、およびアルキルカルボン酸から選択されるのが好ましい。
【０１９０】
自己触媒性反応剤から誘導されるある種の抱合体は、構造ＶＩＩＩ（上述の反応剤構造ＶＩＩから誘導されたもの）によって表すこともできる：
【０１９１】
【化３２】
0005766118.tif 000043
式中、
Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、およびアルコキシアルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、炭素原子であって、そのそれぞれが、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、非干渉性置換基（たとえば、ハロ、シアノ、アリールまたは置換されたアリール）、および水溶性ポリマーから選択される二つの基を用いて置換されており；Ｙは炭素であり、Ｘは窒素または酸素であり、そしてＲ６は、電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、および水溶性ポリマーから選択されていて；（ａ）Ｙ−Ｘ−Ｒ６が、カルボキシル、アルコキシルアルキル、アミノアルキル、またはイミノアルキル（エン）残基を表して、ここでＹ−Ｘがアミノアルキルまたはイミノアルキル（エン）の場合の環状構造の一部であってもよいか、または（ｂ）Ｘ−Ｒ６が単独でアミノまたはヒドロキシルを表しており；
ここで、Ｒ４とＲ５とが合体するか、またはＲ５とＹとが合体するか、またはＲ５が存在しないときにはＲ４とＹとが合体して、水溶性ポリマーを用いて置換されていてもよい５員環または６員環の一つの側環（ｓｉｄｅ）を形成してもよく；
そしてここで、その反応剤には、少なくとも１個の水溶性ポリマーが含まれ；
そして−ＮＨ−Ｂは、アミン含有生物学的活性化合物の残基を表している。
【０１９２】
そのような抱合体の好ましい実施態様としては、先の反応剤構造ＶＩＩについて記載した実施態様に相当するものが挙げられる。
【０１９３】
Ｖ．抱合されたアミン含有薬剤
本発明のポリマー性反応剤に抱合された生物学的活性薬剤は、たとえば次のいくつかの構造分類（これらに限定される訳ではない）の一つに該当するであろう：小分子（難溶性小分子も含む）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、ステロイド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪、電解質など。その分子は本来的なアミノ基を有しているか、または修飾されて、本発明のポリマー性反応剤とカップリングさせるのに適した少なくとも１個の反応性アミノ基を含んでいる。
【０１９４】
その薬剤は、たとえば以下のものから選択される治療用物質であってよい：催眠薬および鎮静薬、精神興奮薬、トランキライザー、呼吸用薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬（ドーパミンアンタゴニスト）、鎮痛薬、抗炎症薬、抗不安薬剤（抗不安薬）、食欲減退剤、抗偏頭痛薬、筋収縮薬、抗感染症薬（抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、ワクチン）、抗関節炎薬、抗マラリア薬、制吐薬、抗てんかん薬（ａｎｅｐｉｌｅｔｐｉｃｓ）、気管支拡張薬、サイトカイン、増殖因子、抗癌薬、抗血栓薬、抗高血圧症薬、心血管薬、抗不整脈薬、抗毒薬（ａｎｔｉｏｘｉｃａｎｔ）、抗喘息薬、避妊薬も含めたホルモン剤、交感神経興奮薬、利尿薬、脂質調節薬、抗アンドロゲン薬、駆虫薬、抗凝血薬、腫瘍薬、抗悪性腫瘍薬、低血糖症薬、栄養剤およびサプリメント、成長促進サプリメント、抗腸炎薬、ワクチン、抗体、診断薬、および造影剤。
【０１９５】
本発明のポリマーに共有結合的に結合させるのに適した活性薬剤の具体例としては以下のものが挙げられる：アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒｉｇｉｎａｓｅ）、アムドキソビル（ＤＡＰＤ）、アンタイド、ベカプレルミン、カルシトニン、シアノビリン、デニロイキン・ディフティトックス、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯアゴニスト（たとえば、国際公開第９６／４０７４９号パンフレットに記載されているような、長さが約１０〜４０アミノ酸で、特定のコアシーケンスを含むペプチド）、ドルナーゼα、赤血球生成促進タンパク質（ＮＥＳＰ）、凝固因子たとえば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ウィルブランド因子；セレダーゼ、セレザイム、α−グルコシダーゼ、コラーゲン、シクロスポリン、アルファ−デフェンシン、ベータ−デフェンシン、エキセディン−４、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、α−１プロティナーゼインヒビター、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、フィブリノーゲン、フィルグラスチム、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ベータ抗体、骨形態発生タンパク質たとえば骨形態発生タンパク質−２、骨形態発生タンパク質−６、ＯＰ−１；酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロンたとえば、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンオメガ、インターフェロンタウ、コンセンサスインターフェロン；インターロイキンおよびインターロイキン受容体、たとえば、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２、インターロイキン−２融合タンパク質、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３受容体、インターロイキン−１７受容体；ラクトフェリンおよびラクトフェリンフラグメント、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インスリン、プロインスリン、インスリン類似体（たとえば、米国特許第５，９２２，６７５号明細書に記載されているモノアシル化インスリン）、アミリン、Ｃペプチド、ソマトスタチン、ソマトスタチン類似体（オクトレオチドも含む）、バソプレシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インフルエンザワクチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、プラスミノーゲン活性化因子たとえばアルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、およびテネテプラーゼ；神経成長因子（ＮＧＦ）、オステオプロテジェリン、血小板由来増殖因子、組織増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−１、血管内皮増殖因子、白血病抑制因子、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦ）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ分子／抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、単球走化性タンパク質−１、内皮増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド、ソマトロピン、チモシンアルファ１、チモシンアルファ１ＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビター、チモシンベータ１０、チモシンベータ９、チモシンベータ４、アルファ−１アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物類、ＶＬＡ−４（最晩期抗原−４）、ＶＬＡ−４インヒビター、ビスホスホネート、呼吸器合胞体ウイルス抗体、嚢胞性線維症膜透過制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌性／膜透過性向上タンパク質（ＢＰＩ）、および抗ＣＭＶ抗体。モノクローナル抗体の例としては次のものが挙げられる：エタネルセプト（ＩｇＧ１のＦｃ位に結合されたヒト７５ｋＤＴＮＦ受容体の細胞外リガンド−結合部分からなる二量体融合タンパク質）、アブシキマブ、アフェリオモマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、インフリキシマブ、イブリツモバブチウキセタン、ミツモバブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ヨウ素１３１トシツモマブ抱合体、オリズマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブ（ハーセプチン）。
【０１９６】
本発明のポリマーに共有結合的に結合させるのに好適なさらなる薬剤としては以下のものが挙げられるが、これらに限定される訳ではない：アミホスチン、アミオダロン、アミノカプロン酸、アミノ馬尿酸ナトリウム、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、アントラサイクリン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシン、シラスタチンナトリウム、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、カンプトテシン、１３−ｃｉｓレチノイン酸、全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸；ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デフェロキサミン、デキサメタゾン、ジクロフェナク、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フェキソフェナジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、エピネフリン、Ｌドパ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イトラコナゾール、ゴセレリン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、リシノプリル、ロボチロキシンナトリウム、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、重酒石酸メタラミノール、メトレキセート、メトクロプラミド、メキシレチン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ナロキソン、ニコチン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、ピルカマイシン、ポリフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロクロルペラジン、オンダンセトロン、ラルチトレキセド、シロリムス、ストレプトゾシン、タクロリムス、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、テトラヒドロカンナビノール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ドラセトロン、グラニセトロン；フォルモテロール、フルチカゾン、リュープロリド、ミダゾラム、アルプラゾラム、アンホテリシンＢ、ポドフィロトキシン類、ヌクレオシド抗ウイルス薬、アロイルヒドラゾン、スマトリプタン；マクロライド類たとえば、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベルシン、アジスロマイシン、フルリトロマイシン、ジリトロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、アンダジスロマイシン、およびスウィノリドＡ；フルオロキノロン類たとえば、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イルロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシン、およびシタフロキサシン；アミノグリコシド類たとえば、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ラムポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメサート；ポリミキシン類たとえば、ポリミキシンＢ、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム類；ペニシリン類たとえば、ペニシリナーゼ感受性薬剤たとえば、ペニシリンＧおよびペニシリンＶ；ペニシリナーゼ抵抗性薬剤たとえば、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、およびナフシリン；グラム陰性微生物活性薬剤たとえば、アンピシリン、アモキシリン、およびヘタシリン、シリン、およびガランピシリン；抗シュードモナス性ペニシリン類たとえば、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、およびピペラシリン；セファロスポリン類たとえば、セフポドキシム、セフプロジル、セフトブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラドリン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロル、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラミド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフィネタゾール、セフタジジム、ロラカルベフ、およびモキサラクタム；モノバクタム類たとえば、アズトレオナム；ならびにカルバペネムたとえば、イミペネム、メロペネム、ペンタミジンイセチオネート、アルブテロール硫酸塩、リドカイン、メタプロテレノール硫酸塩、ベクロメタゾンジプロピオネート、トリアムシノロンアセトアミド、ブデソニドアセトニド、フルチカゾン、臭化イプラトロピウム、フルニソリド、クロモリンナトリウム、および酒石酸エルゴタミン；タキサン類たとえば、パクリテキセル；ＳＮ−３８、ならびにチルホスチン類。
【０１９７】
本発明のポリマー性反応剤にカップリングさせるための好ましい小分子は、少なくとも１個のアミノ基を有しているものである。好適な分子としては、次のものが挙げられる：アミノ馬尿酸ナトリウム、アンホテリシンＢ、ドキソルビシン、アミノカプロン酸、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、重酒石酸メタラミノール、パミドロネート二ナトリウム、ダウノルビシン、レボチロキシンナトリウム、リシノプリル、シラスタチンナトリウム、メキシレチン、セファレキシン、デフェロキサミン、およびアミホスチン。
【０１９８】
本発明のポリマー性反応剤にカップリングさせるための好適なペプチドまたはタンパク質として、以下のものが挙げられる：ＥＰＯ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、コンセンサスＩＦＮ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＩＬ−２、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｅｎｂｒｅｌ（エタネルセプト）、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（アブシキマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、ｔＰＡ、Ｃｅｒｉｚｙｍｅ（イミグルセラーゼ）、ヘパチツス−Ｂワクチン、ｒＤＮＡｓｅ、アルファ−１プロティナーゼインヒビター、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ｈＧＨ、インスリン、ＦＳＨ、およびＰＴＨ。
【０１９９】
上に例として挙げた生物学的活性薬剤には、適用可能であれば、類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター、異性体、およびそれらの薬学的に許容される塩の形態が包含されているものとする。ペプチドおよびタンパク質に関連しては、本発明には、合成品、組換え体、天然物、グリコシル化物、および非グリコシル化物の形態、さらにはそれらの生物学的活性フラグメントを包含するものとする。上述の生物学的活性タンパク質にはさらに、置換されたり、欠落したりした１種または複数のアミノ酸を有する変性物も、そうして得られた変性タンパク質が、親の（天然の）タンパク質の活性を少なくともある程度有している限りにおいては、包含されているものとする。
【０２００】
本発明の反応性ポリマー性反応剤は、各種の固体のエンティティに共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合されていてよいが、そのようなエンティティとしては以下のようなものが挙げられる：フィルム、化学的な分離および精製表面、固体の支持体、金属／金属酸化物表面たとえば、金、チタン、タンタル、ニオブ、アルミニウム、鋼、およびそれらの酸化物、および酸化ケイ素。さらに、本発明のポリマーはさらに、生化学的センサー、生物電子工学的スイッチ、およびゲートに使用してもよい。本発明のポリマー性反応剤はさらに、ペプチド合成のため、ポリマーコーティングした表面およびポリマーグラフト物を調製するため、アフィニティ分割のためのポリマー−リガンド抱合体を調製するため、架橋または非架橋ヒドロゲルを調製するため、およびバイオリアクターのため、ポリマー−補因子アダクトを調製するための、担体として採用してもよい。
【０２０１】
ＶＩ．医薬品組成物および投与方法
本発明にはさらに、本明細書において提供される抱合体を医薬用賦形剤と組み合わせて含む医薬製剤も含まれる。一般的に言って、その抱合体そのものは、固形の形態（たとえば、沈殿物）となるであろうが、固体の形態、液体の形態いずれでも使用することが可能な適切な医薬用賦形剤と組み合わせることができる。医薬製剤には、あらゆるタイプの製剤、特に注射に適したもの、たとえば、懸濁液および溶液に再構成することが可能な粉末も包含される。
【０２０２】
賦形剤の例としては、次のものから成る群から選択されものが挙げられるが、これらに限定される訳ではない：炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝液、酸、塩基、およびそれらの組合せ。
【０２０３】
炭水化物たとえば、糖、変性糖たとえばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマーが、賦形剤として存在していてもよい。具体的な炭水化物賦形剤としては、たとえば以下のものが挙げられる：単糖類たとえば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；二糖類たとえば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖類たとえば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；ならびに、アルジトールたとえば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなど。
【０２０４】
賦形剤にはさらに、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの組合せのような無機塩または緩衝剤を含むことができる。
【０２０５】
その製剤には、微生物の生育を防止または阻止するための抗菌剤も含まれていてよい。本発明に適した抗菌剤の例としては、以下のものが挙げられが、これらに限定される訳ではない：塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、およびそれらの組合せ。
【０２０６】
同様にして、その製剤の中に抗酸化剤を存在させることもできる。抗酸化剤は、酸化を防止し、それによってその製剤の抱合体またはその他の成分の劣化を防止するために使用される。本発明において使用するのに好適な抗酸化剤としては、たとえば以下のものが挙げられる：パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組合せ。
【０２０７】
界面活性剤が賦形剤として存在していてもよい。界面活性剤の例としては、以下のものが挙げられる：ポリソルベートたとえば、「Ｔｗｅｅｎ２０」および「Ｔｗｅｅｎ８０」、ならびにＰｌｕｒｏｎｉｃｓのたとえばＦ６８およびＦ８８（いずれも、ＢＡＳＦ、Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎ．Ｊ．から入手可能）；ソルビタンエステル；脂質たとえば、リン脂質たとえばレシチンおよびその他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（しかしながら、リポソームの形態でないのが好ましい）、脂肪酸および脂肪酸エステル；ステロイドたとえばコレステロール；ならびにキレート化剤たとえば、ＥＤＴＡ、亜鉛およびその他のそのような適切なカチオン類。
【０２０８】
その製剤の中に酸または塩基が賦形剤として存在していてもよい。使用可能な酸の例としては、次のものから成る群から選択される酸が挙げられるが、これらに限定される訳ではない：塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組合せ。塩基の例としては、次のものから成る群から選択される塩基が挙げられるが、これらに限定される訳ではない：水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびそれらの組合せ。
【０２０９】
組成物中の、抱合体（すなわち、活性薬剤と本明細書に記載のポリマーとの間で形成された抱合体）の量は、いくつもの因子に依存して変化するであろうが、その組成物を単位投与量容器（たとえば、バイアル）の中に貯蔵したときに、治療有効量となるようにするのが最適であろう。さらに、その医薬製剤は、注射筒の中に保存することもできる。治療有効量は、抱合体の量を増加させながら繰り返して実験的に投与して、いかなる量にすれば臨床的に所望のエンドポイントが得られるかを求めることによって、決めることができる。
【０２１０】
組成物中の各種個々の賦形剤の量は、賦形剤の効力およびその組成物が特に必要とされている量に応じて変化するであろう。典型的には、各種個々の賦形剤の量は、ルーチン的な実験法、すなわち、その賦形剤を（低から高までの範囲で）各種の量で含む組成物を調製し、安定性およびその他のパラメーターについての試験を行い、次いで、顕著な有害効果なしで最適な成績が得られる範囲を求めることによって、決められる。しかしながら一般的には、組成物の中に、賦形剤が約１％〜約９９重量％、好ましくは約５％〜９８重量％、より好ましくは約１５〜９５重量％の量で存在するようにするが、濃度が３０重量％とするのが最も好ましい。
【０２１１】
これら上述の医薬用賦形剤およびその他の賦形剤については、以下の文献に記載がある：『Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ』、１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、『ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ』，５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）、および『Ｋｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ』，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００。
【０２１２】
本発明の医薬製剤は典型的には（必須という訳ではない）、注射によって投与されるので、一般的には、投与の直前には液状の溶液または懸濁液の状態である。抱合体は、非経口的に静脈内注射によって注入投与することが可能であるが、少し好ましくないが、筋肉内または皮下注射でも投与できる。非経口の投与に好適な製剤のタイプとしては、予め注射器に充填された（ｒｅａｄｙ−ｆｏｒ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）溶液、使用直前に溶媒と組み合わせるための乾燥粉剤、注入可能とした懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わせるための乾燥不溶性組成物、およびとりわけ、投与前に希釈するための乳剤および液状濃縮物などが挙げられる。
【０２１３】
その医薬製剤は、シロップ剤、クリーム剤、軟膏剤、錠剤、散剤など、その他の形態をとることも可能である。その他の投与様式としては、たとえば肺内（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）、経直腸、経皮、経粘膜、経口、クモ膜下腔内、皮下、動脈内なども挙げられる。
【０２１４】
本発明はさらに、本明細書において提供される抱合体を、その抱合体製剤を用いた治療に反応する病状を罹患している患者に投与するための方法も提供する。その方法には、一般的には注射によって、（好ましくは医薬製剤の一部として提供される）その抱合体の治療有効量を投与することが含まれる。投与するべき実際の用量は、対象者の年齢、体重、および一般的な病状、さらには治療される病状の重篤度、医療専門家の判断、ならびに投与される抱合体に応じて変化するであろう。治療有効量は、当業者には公知であるか、および／または関連する参照資料および文献に記載されている。一般的には、治療有効量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲、好ましくは０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日の投与量、より好ましくは０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の投与量となるであろう。
【０２１５】
最適には、体内からのクリアランスを容易にするために望ましい水溶性ポリマー部分の開裂は、先に説明したように、生理活性的に開裂可能かおよび／または酵素的に分解可能なリンク、たとえばウレタン、アミド、カーボネートまたはエステル含有リンクの一つまたは複数を、ポリマー成分の中に組み入れることによって、容易とすることができる。この方法においては、（個々の水溶性ポリマー部分の開裂を介しての）抱合体のクリアランスは、所望のクリアランス性を与えるポリマーの分子サイズとリンクのタイプを選択することによって、調節することができる。当業者であれば、ポリマーの適切な分子サイズ、さらには開裂可能な官能基を決めることが可能である。クリアランス性能は、ポリマー分子量および開裂可能な官能基が異なる一連のポリマー誘導体を調製し、次いで、そのポリマー誘導体を患者に投与し、一定時間毎に血液および／または尿をサンプリングすることによって、クリアランスプロファイル（たとえば、一定時間毎の血液または尿のサンプリングによって）を得て、それにより評価することができる。
【実施例】
【０２１６】
実験例
実施例１：ｍＰＥＧ５０００−６−Ｏ−Ｄ−ガラクトピラノース（１）の調製法
【０２１７】
【化３３】
0005766118.tif 000044
５０ｍＬの脱水トルエン中のメトキシ−ポリエチレングリコール（ＭＷ：５，０００ダルトン）（Ｍ−ＰＥＧ−ＯＨ、５ｋＤ、８ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下６０℃で、共沸蒸留した。５０ｍＬの脱水トルエンを用いて共沸蒸留を繰り返して、ほぼ２５ｍＬになるまで蒸発させた。その溶液に、１０ｍＬの脱水塩化メチレンおよび脱水トリエチルアミン（０．３９ｍＬ、２．８ｍｍｏｌ）を添加した。その溶液を、室温アルゴン下で５分間撹拌し、０．１７９ｍＬの乾燥塩化メタンスルホニル（２．３ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。その溶液を、室温アルゴン下で一夜撹拌した。その混合物を真空下で蒸発させて塩化メチレンを除去し、Ｃｅｌｉｔｅのベッドの上で濾過して塩を除去した。追加のトルエンを用いてそのＣｅｌｉｔｅを洗浄し、濾液を合わせて、真空下で蒸発させた。固形分をほぼ１５ｍＬの塩化メチレンの中に溶解させ、氷の上でイソプロパノールを添加することによって沈殿させた。沈殿した反応生成物を濾過し、ジエチルエーテルを用いて洗浄し、減圧下に乾燥させた。
収量：７．７ｇ。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．１８（ｓ，３Ｈ，−ＳＯ２−ＣＨ３）；３．２４（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．５１（ｓ，ＰＥＧ骨格）；４．３１（−ＣＨ２−ＯＭｓ）。
【０２１８】
２０ｍＬの脱水トルエン中の、先に説明したようにして調製したＭ−ＰＥＧ−ＯＭｓ（５ｋＤ、３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下６０℃で、共沸蒸留した。３０ｍＬの脱水トルエンを用いて共沸蒸留を繰り返して、ほぼ１０ｍＬになるまで蒸発させた。その溶液に、０．４７ｍＬの１，２：３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−ガラクトピラノース（２．０ｍｍｏｌ）および０．７７ｇの水素化ナトリウム（鉱油中、６０％分散体、１９．３ｍｍｏｌ）を添加した。その反応液を、アルゴン雰囲気下、７５℃で一夜撹拌しながら加熱した。その反応混合物を冷却して室温とし、塩化メチレンを用いて希釈し、Ｃｅｌｉｔｅのベッドの上で濾過した。追加の塩化メチレンを用いてそのＣｅｌｉｔｅを洗浄し、濾液を合わせて、真空下で蒸発させた。その固形分を１８ｍＬの１：１塩化メチレン／トルエンの中に溶解させ、０℃で１００ｍＬのイソプロパノールおよび４０ｍＬのジエチルエーテルを添加して沈殿させた。沈殿した反応生成物を濾過し、ジエチルエーテルを用いて洗浄し、減圧下に乾燥させた。
収量：３．１５ｇ。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１．２１（ｄ，６Ｈ，（Ｏ）２Ｃ（ＣＨ３）２）；１．４４（ｓ，３Ｈ）、１．５３（ｓ，３Ｈ）（（Ｏ）２Ｃ（ＣＨ３）２）；３．３８（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．６４（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．８１（ｔ，１Ｈ）；４．２６（ｍ，１Ｈ）；４．３０（ｍ，１Ｈ）；４．５８（ｍ，１Ｈ）；５．５３（ｄ，１Ｈ）。
【０２１９】
脱保護：上述の反応生成物（２ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を０℃で、１０ｍＬの８：２トリフルオロ酢酸／水の中に溶解させ、アルゴン雰囲気下で１時間撹拌した。１０ｍＬのリン酸塩緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ９．１）を添加してその反応を停止させ、次いで３．０Ｍ水酸化ナトリウムを用いて中和してｐＨ６．８とした。等量の半飽和濃度の塩化ナトリウムを用いてその溶液を希釈し、塩化メチレン（２００ｍＬ）を用いて２回抽出した。その有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム／無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。その固形分を５ｍＬの塩化メチレンの中に溶解させ、０℃で６５ｍＬのイソプロパノールおよび２０ｍＬのジエチルエーテルを用いて沈殿させた。沈殿した反応生成物を濾過で分離し、０．３％の２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチル−フェノールを含むジエチルエーテルを用いて洗浄し、真空下で乾燥させた。
収量：１．８５ｇ。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ＋Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．２４（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．５１（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．９４（ｔ）；４．２３（ｄ）；４．９２（ｄ）。
【０２２０】
実施例２：ｍＰＥＧ５０００−３−Ｏ−Ｄ−グルコース（２）の調製法
【０２２１】
【化３４】
0005766118.tif 000045
５０ｍＬの脱水トルエン中の、実施例１の記載に従って調製したｍＰＥＧ−ＯＭｓ（５ｋＤ、７．７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下６０℃で、共沸蒸留した。６０ｍＬの脱水トルエンを用いて共沸蒸留を繰り返して、ほぼ５０ｍＬになるまで蒸発させた。その溶液に、１．３５ｇのジアセトン−Ｄ−グルコース（５．２ｍｍｏｌ）および０．２ｇの水素化ナトリウム（鉱油中、６０％分散体、５．０ｍｍｏｌ）を添加した。その反応液を、アルゴン雰囲気下、７５℃で一夜撹拌しながら加熱した。その反応混合物を冷却して室温とし、塩化メチレンを用いて希釈し、Ｃｅｌｉｔｅのベッドの上で濾過した。追加の塩化メチレンを用いてそのＣｅｌｉｔｅを洗浄し、濾液を合わせて、真空下で蒸発させた。その固形分を１５ｍＬの塩化メチレンの中に溶解させ、０℃で９５ｍＬのイソプロパノールおよび９５ｍＬのジエチルエーテルを添加することによって沈殿させた。沈殿した反応生成物を濾過し、ジエチルエーテルを用いて洗浄し、減圧下に乾燥させた。
収量：７．３ｇ。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）１．３１（ｓ，３Ｈ）、１．３５（ｓ，３Ｈ）、１．４２（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｓ，３Ｈ）（（Ｏ）２Ｃ（ＣＨ３）２）；３．３８（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．６４（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．９２（ｄ，１Ｈ）；３．９８（ｍ，１Ｈ）；４．０７（ｍ，１Ｈ）；４．１１（ｍ，１Ｈ）；４．３０（ｍ，１Ｈ）；４．５７（ｄ，１Ｈ）；５．８７（ｄ，１Ｈ）。
【０２２２】
脱保護：上述の反応生成物（２．５ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を０℃で、１０ｍＬの８：２トリフルオロ酢酸／水の中に溶解させ、アルゴン雰囲気下で１時間撹拌した。１０ｍＬのリン酸塩緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ９．１）を添加してその反応を停止させ、次いで３．０Ｍ水酸化ナトリウムを用いて中和してｐＨ６．８とした。等量の半飽和濃度の塩化ナトリウムを用いてその溶液を希釈し、塩化メチレン（２００ｍＬ）を用いて２回抽出した。その有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム／無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。その固形分を５ｍＬの塩化メチレンの中に溶解させ、０℃で６５ｍＬのイソプロパノールおよび２０ｍＬのジエチルエーテルを用いて沈殿させた。沈殿した反応生成物を濾過で分離し、０．３％の２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチル−フェノールを含むジエチルエーテルを用いて洗浄し、真空下で乾燥させた。
収量：１．８５ｇ。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ＋Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）２．９〜３．２（ｍ）；３．２４（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．５１（ｓ，ＰＥＧ骨格）；４．２９（ｄ）；４．８９（ｄ）。
【０２２３】
実施例３．「自己触媒性」反応剤（３）の調製法および抱合
Ａ．２−ヒドロキシ−３−アミノ−４−（２−イミダゾイル）−ブタナールの調製法
次の合成スキームを採用して表題の化合物を調製する（保護された形で示す）：
【０２２４】
【化３５】
0005766118.tif 000046
この化合物を、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（メトキシポリ（エチレングリコール）プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）と反応させて、アミドリンクされたＰＥＧ化反応剤３（次のスキーム中の第二番目の化合物）を得る。
【０２２５】
この反応剤は、先に記載した手順に従って、タンパク質と反応させると、図示された安定なケト−アミン抱合体が得られる。
【０２２６】
【化３６】
0005766118.tif 000047
実施例４：５−ｍＰＥＧ１００００−２−ヒドロキシペンタナール（ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ、１０ｋＤ）（４）の調製法
この反応剤は、次式のスキームに従って調製した。
【０２２７】
【化３７】
0005766118.tif 000048
ａ）臭化アリル、Ｉｎ（粉末）、エタノ−ル、４０℃；ｂ）臭化ベンジル、ＮａＨ、ＤＭＦ；ｃ）９−ＢＢＮ、ＤＣＭ、Ｈ２Ｏ２／ＮａＯＨ；ｄ）ｍＰＥＧ−ＯＭｓ、１０Ｋ、ＮａＨ、トルエン、５０℃；ｅ）リン酸ナトリウム、Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２；ｆ）１０％リン酸
（ａ）２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシペント−４−エンの調製法（Ｄ．Ｃｒｅｓｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  １２：８６９〜８７６、２００１  参照）
インジウム粉末（０．１７ｍｏｌ、０．７５当量、２０ｇ、１００メッシュ）を、２，２−ジメトキシアセトアルデヒド（０．２３ｍｏｌ、１．０当量、３５ｍＬ、水中６０重量％溶液）および臭化アリル（０．２８ｍｏｌ、１．２当量、２４ｍＬ）を含む、エタノール（２００ｍＬ）溶液に添加した。その懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。次いでそのスラリーを遠心分離にかけ、その上澄みをデカントした。残っているペレットを、エタノールの中に懸濁させ、３回洗浄した（３×１５０ｍＬ）。上澄みを合わせて、濾過し、減圧下で蒸発させると、粘稠な油状物が得られた（４５℃、透明黄色油状物、５６ｇ）。そうして得られた粗生成物（２５ｇ）を、塩水および酢酸エチル（２×）を用いて抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。収量：１１ｇ（８９％）（半精製油状物）。その反応生成物を、Ｂｉｏｓｔａｇｅ  ＳＰ−４（ＦＬＡＳＨ  ４０＋Ｍ）精製システムの上で、ヘキサン／酢酸エチルグラジエントを用いたシリカクロマトグラフィーにより精製した。
精製収量：５．２ｇ（４２％）、透明で無色の油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）５．９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；５．２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．７（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−）；３．４（ｄｓ，６Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．３（ｄｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）。
【０２２８】
（ｂ）２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタン−５−オールの調製法
乾燥させたフラスコの中で、２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシペント−４−エン（２．９２ｇ、２０ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（４０ｍＬ）の中に溶解させた。不活性窒素雰囲気下で、水素化ナトリウム（１．０ｇ、２５ｍｍｏｌ、１．２５当量、鉱油中、６０％分散体）および臭化ベンジル（２．７３ｍＬ、２３ｍｍｏｌ、１．１５当量）を撹拌しながら添加した。２．５時間後に、水を徐々に添加することによって、その反応を用心深く停止させた。塩水および酢酸エチル（２×）を用いて、その反応生成物を抽出した。有機層を合わせ、塩水（３×）を用いて洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。
粗製物収量：４．８ｇ（１００％）、透明油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．３（ｂｍ，５Ｈ，Ａｒ）；５．９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；５．１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；４．６（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ａｒ）；４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．５（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＢｚ）−）；３．４（ｄｓ，６Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．３（ｄｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）。
【０２２９】
（ｃ）
不活性窒素雰囲気下で、その粗製の２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペント−４−エン（４．２ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１．０当量）を、９−ＢＢＮ（ＴＨＦ中０．５Ｍ、８２ｍＬ、４１ｍｍｏｌ、２．３当量）を含むジクロロメタン（４０ｍＬ）の中に溶解させた。２時間後に、３０％過酸化水素溶液（２５ｍＬ）と１５％水酸化ナトリウム（２５ｍＬ）との混合物を、滴下により徐々に添加した。（注意：ガスおよび熱が発生するので、反応剤混合物は注意深く、徐々に添加すること。）その反応液をさらに３時間撹拌してから、塩水および酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を合わせ、塩水（３×）を用いて洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗製物収量は、７．０ｇ（１５５％）で、透明な油状物であった。その粗生成物を、メタノール（７０ｍＬ）／水（３．５ｍＬ）の中に溶解させ、ヘキサン（３×７０ｍＬ）を用いて抽出した。ヘキサン層を合わせて、メタノール（２０ｍＬ）／水（１ｍＬ）を用いて逆抽出をした。メタノール層を合わせ、塩水および酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を合わせ、塩水（２×）を用いて洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。収量：４．６ｇ（１００％）、透明な半精製油状物。その半精製反応生成物を、Ｂｉｏｓｔａｇｅ  ＳＰ−４（ＦＬＡＳＨ  ４０＋Ｍ）精製システムの上で、ヘキサン／酢酸エチルグラジエントを用いたシリカクロマトグラフィーにより精製した。
精製収量：２．５ｇ（５５％）、透明で無色の油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．３（ｂｍ，５Ｈ，Ａｒ）；４．６（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ａｒ）；４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．６（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＯＨ）；３．４（ｄｓ，６Ｈ，−ＯＣＨ３；ｍ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＢｚ）−）；１．７（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）；１．６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）。
【０２３０】
（ｄ）
ｍＰＥＧ１００００−ＯＭｓ（１０ｇ、１ｍｍｏｌ）と２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタン−５−オール（０．５１ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）との混合物を３０ｍＬの脱水トルエン中で調製し、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下５０℃で、共沸蒸留した。その混合物を蒸発乾固させ、次いで不活性窒素雰囲気下で脱水トルエン（３０ｍＬ）の中に懸濁させた。水素化ナトリウム（０．１１ｇ、２．８ｍｍｏｌ、２．８当量、鉱油中、６０％分散体）を添加し、その反応液を加熱して７５℃とした。その反応液を７５℃で２４時間撹拌してから、減圧下で蒸発させた。その粘稠な油状物をジクロロメタン（５ｍＬ）の中に溶解させ、イソプロパノール（３００ｍＬ）を添加して沈殿させた。沈殿した反応生成物を濾過し、イソプロパノール（７５ｍＬ）を用いて洗浄、ジエチルエーテル（７５ｍＬ）を用いて洗浄し、減圧下で乾燥させた。
収量は、９．８ｇで、オフホワイト色の粉末が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．３（ｂｍ，５Ｈ，Ａｒ）；４．６（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ａｒ）；４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；１．６（ｂｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２３１】
（ｅ）
Ｐａｒｒ水素化ボトルの中で、５−ｍＰＥＧ１００００−２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタン（２．５ｇ）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、５０ｍＬ）の中に溶解させた。窒素を用いてその溶液をスパージしてから、２０％Ｐｄ／Ｃペースト（５０．３８％水、Ｐｅａｒｌｍａｎタイプ、０．５ｇ）をそのボトルに添加した。Ｐａｒｒ試験装置の上で撹拌しながら、その反応混合物を水素化させた（水素ガス圧、２０ｐｓｉ）。３時間後に、その反応系から真空により水素を除去し、窒素フラッシュ下でボトルを外した。その懸濁液を濾過し、水ですすぎ、塩水およびジクロロメタン（２×）を用いて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させると、粘稠な油状物が得られた。ジエチルエーテルを徐々に添加することによって、反応生成物を沈殿させた。
収量：２．０ｇ、オフホワイト色の粉末。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．１（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；１．７、１．４、１．２、０．８（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２３２】
（ｆ）
５−ｍＰＥＧ１０，０００−２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシペンタン（１．６ｇ）を１０％リン酸（２５ｍＬ）の中に溶解させ、窒素を用いてその溶液をスパージした。その加水分解反応液を７時間撹拌してから、水酸化ナトリウム（１Ｍ）を用いてｐＨ６．９に調節した。その反応生成物を、塩水およびジクロロメタン（３×７５ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させると、粘稠な油状物が得られた。そのＰＥＧ物質を、ジクロロメタン／イソプロパノール（１ｍＬ：１２ｍＬ；ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）含有、２４ｍｇ）の中に溶解させ、ジエチルエーテル（７０ｍＬ）を添加することによって沈殿させた。フィルターケーキを、ジエチルエーテル（２０ｍＬ；ＢＨＴ含有、６ｍｇ）を用いて洗浄し、減圧下に蒸発乾固させた。
収量：１．４３ｇ、オフホワイト色の粉末。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；１．７、１．４、１．２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２３３】
実施例５：５−（ｍＰＥＧ１０Ｋ−メチル−アミノ）−２−ヒドロキシペンタナール（ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ、１０ｋＤ）（５）の調製法
この「自己触媒性」反応剤は、次式のスキームに従って調製した。
【０２３４】
【化３８】
0005766118.tif 000049
ａ）ＴＥＡ、ＭｓＣｌ、トルエン；ｂ）エタノ−ル、メチルアミン、水中４０％；ｃ）ｍＰＥＧ−ＯＭｓ  １０Ｋ、ＮａＯＨ、水、ＴＨＦ、５０℃；ｄ）リン酸ナトリウム、Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２；ｅ）１０％リン酸
（ａ）５−（メチルアミノ）−２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタンの調製法
乾燥させたフラスコの中で、２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタン−５−オール（０．６２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を、脱水トルエン（２５ｍＬ）の中に溶解させた。トリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）および塩化メタンスルホニル（０．２ｍＬ、２．５５ｍｍｏｌ）を、その反応液に室温で添加した。不活性雰囲気下でその反応液を２．５時間撹拌した。そのスラリーを濾過し（０．４５ミクロンのシリンジフィルター；トルエンですすぎ）、溶媒を減圧下で蒸発させた。
収量：０．８９ｇ、粗製油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．３（ｂｍ，５Ｈ，Ａｒ）；４．６（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ａｒ）；４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；４．２（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＯＭｓ）；３．４（ｄｓ，６Ｈ，−ＯＣＨ３；ｍ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＢｚ）−）；３．０（ｓ，３Ｈ，−ＯＭｓ）；１．９〜１．６（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２３５】
（ｂ）
その粗製油状物の５−［メタンスルホニルオキシ−エステル］−２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタン（０．８９ｇ）を、脱水エタノール（４ｍＬ）の中に溶解させた。メチルアミン（４０％水溶液、２５ｍＬ）を添加し、その反応混合物を２０時間撹拌した。塩水およびジクロロメタン（２×）を用いてその反応液を抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。
収量：０．６５ｇ、油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．３（ｂｍ，５Ｈ，Ａｒ）；４．６（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ａｒ）；４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．４（ｄｓ，６Ｈ，−ＯＣＨ３；ｍ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＢｚ）−）；２．６（ｔ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）；２．４（ｓ，３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）−）；１．７〜１．５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。  
【０２３６】
（ｃ）
リフラックスコンデンサーを備えたフラスコの中で、５−［メチル−アミノ］−２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタン（０．６５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７ｍＬ）および脱イオン水（５ｍＬ）の中に溶解させた。Ｍ−ＰＥＧ−ＯＭｓ（１０ｋＤ、３．５ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウムを撹拌しながら添加した。その温度を５０℃で１６時間保持してから、追加のテトラヒドロフラン（７ｍＬ）および脱イオン水（３．５ｍＬ）を添加した。その反応を５０℃で２４時間続けてから、８５℃のバスの中で４時間還流させた。その反応生成物を、塩水およびジクロロメタン（３×）を用いて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下に蒸発させると粘稠な油状物が得られた。ジエチルエーテルを徐々に添加することによって、反応生成物を沈殿させた。
収量：２．９４ｇ、オフホワイト色の粉末。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．３（ｂｍ，５Ｈ，Ａｒ）；４．６（ｄｄ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ａｒ）；４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．６（ｂｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−）；２．３（ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）；２．１（ｓ，３Ｈ，−ＮＨ（ＣＨ３）−）；１．５〜１．３（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２３７】
（ｄ）
Ｐａｒｒ水素化ボトルの中で、５−［ｍＰＥＧ１００００−メチル−アミノ］−２−ヒドロキシベンジルエステル−１，１−ジメトキシペンタン（２．９ｇ）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０、７４ｍＬ）の中に溶解させた。窒素を用いてその溶液をスパージし、２０％Ｐｄ／Ｃペースト（５０．４％水、Ｐｅａｒｌｍａｎタイプ、０．５９ｇ）をそのボトルに添加した。Ｐａｒｒ試験装置の上で撹拌しながら、その反応混合物を水素化させた（水素ガス圧、２０ｐｓｉ）。３０時間後に、その反応系から真空により水素を除去し、窒素フラッシュ下でボトルを外した。その懸濁液を濾過し、水ですすぎ、塩水およびジクロロメタン（３×）を用いて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下に蒸発させると粘稠な油状物が得られた。ジエチルエーテルを徐々に添加することによって、反応生成物を沈殿させた。
収量：２．３ｇ、オフホワイト色の粉末。
【０２３８】
その粗製のＰＥＧ反応生成物（１．４ｇ）を、ＰＯＲＯＳ媒体（０．２Ｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。アミンＰＥＧ反応生成物がカラムに捕捉されたので、次いで塩化ナトリウム（５％溶液）を用いて溶出させた。リン酸、塩水およびジクロロメタン（３×）を用いて、所望の反応生成物画分を抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下に蒸発させると粘稠な油状物が得られた。ジエチルエーテルを徐々に添加することによって、反応生成物を沈殿させた。
収量：０．８１ｇ、オフホワイト色の粉末。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．６（ｂｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．２（ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）；２．９（ｓ，３Ｈ，−ＮＨ（ＣＨ３）−）；１．９〜１．５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２３９】
（ｅ）
５−［ｍＰＥＧ１００００−メチル−アミノ］−２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシペンタン（０．７ｇ）を、１０％リン酸（１５ｍＬ）の中に溶解させ、窒素を用いてその溶液をスパージした。その加水分解反応液を２８時間撹拌してから、水酸化ナトリウム（１Ｍ）を用いてｐＨ４．５に調節した。その反応生成物を、塩水およびジクロロメタン（３×７５ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下に蒸発させると粘稠な油状物が得られた。撹拌しながらジエチルエーテル（５０ｍＬ）を徐々に添加すると、その油状物から非晶質の固形物が得られた。この懸濁液を、減圧下に蒸発乾固させた。
収量：０．５４ｇ、オフホワイト色の粉末。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．６（ｂｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．２（ｂｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）；２．９（ｓ，３Ｈ，−ＮＨ（ＣＨ３）−）；１．９〜１．５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２４０】
実施例６リゾチームのｍＰＥＧ反応剤との抱合
（ａ）ｍＰＥＧ反応剤を用いた、脂肪族アルデヒド（ブチルアルデヒド）およびα−ヒドロキシアルデヒド（ＨＰ−ＡＬＤ反応剤４）の抱合
ｐＨ６．５、ｐＨ７．５およびｐＨ９．０のリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ）を調製した。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ−６８７６、ＥＣ３．２．１．１７）標準溶液（１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム）もまた、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）の中で調製した。図１の中の反応は、リン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、０．９ｍＬ）を使用することによる指示されたｐＨで、リゾチーム標準溶液（０．１ｍＬ）の混合物中に、指示されたＰＥＧ反応生成物（３６ｍｇ）を溶解させることによって実施した。ＮａＣＮＢＨ３を含むとラベルされている反応液には、フレッシュに調製したシアノホウ水素化ナトリウム標準溶液（２５μＬ；１ｍＬのリン酸ナトリウム（０．２Ｍ、ｐＨ７．５）中、９ｍｇＮａＣＮＢＨ３）がさらに含まれていた。それらの反応液を混合して、室温で１８時間培養させた。アリコート（３μＬ）を採取して、水およびサンプル緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ４×緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６μＬ）を用いて希釈した。
【０２４１】
それらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリス、泳動緩衝液ＭＥＳ１×）の上に担持させ、２００Ｖで４５分間泳動させた。ゲルを取り出し、すすぎ、１時間かけてＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、次いで２時間以上かけて脱染した。結果を図１に示すが、レーンは下記の通りである：
１）ベンチマークラダー、
２）リゾチーム（Ｌｙｚ）、
３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ６．５、
４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ７．５、
５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ９．０、
６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＨＰ−ＡＬＤ（４）、ｐＨ７．５＋ＮａＣＮＢＨ３、
７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２００００−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２０ｋＤ）、ｐＨ７．５、
８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２００００−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２０ｋＤ）、ｐＨ７．５＋ＮａＣＮＢＨ３。
【０２４２】
ゲル（図１）に見られるように、α−ヒドロキシアルデヒド（ＨＰ−ＡＬＤ）反応剤との反応においては、タンパク質（低泳動バンド）から抱合体（ゲルの中央あたりのバンド）への転換は、反応のｐＨが高くなるほど（レーン３〜５）、高くなる。
【０２４３】
タンパク質とＰＥＧブチルアルデヒド単独での反応（レーン７）では抱合反応生成物が検出されなかったが、その理由は、予期されたイミン反応生成物が、加水分解を極めて受けやすいからである。検出可能な反応生成物の、還元されたアミンが、還元剤（ＮａＣＮＢＨ３）の存在下（レーン８）では生成していた。
【０２４４】
（ｂ）ｍＰＥＧ反応剤を使用した、α−ヒドロキシアセタール（ＨＰ−ＡＬＤ４アセタール）および「自己触媒性」（ＭＡＨＰ）反応剤（５）との抱合
図２における反応は、リゾチーム標準溶液（０．０３ｍＬ）とリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、０．２７ｍＬ）との混合物中で、指示されたｍＰＥＧ反応剤（１０ｍｇ）を用いて、同様の方式で実施した。それらの反応液を混合して、室温で２４時間培養させた。アリコート（３．５μＬ）を採取して、水およびサンプル緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ４×緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６μＬ）を用いて希釈した。
【０２４５】
それらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリス、泳動緩衝液ＭＥＳ１×）の上に担持させ、２００Ｖで４２分間泳動させた。ゲルを取り出し、すすぎ、１時間かけてＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、次いで２時間以上かけて脱染した。結果を図２に示すが、レーンは下記の通りである：
１）ベンチマークラダー、
２）リゾチーム（Ｌｙｚ）、
３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＨＰ（４）アセタール、ｐＨ６．５、
４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＨＰ（４）アセタール、ｐＨ９．０、
５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＭＡＨＰ（５）アセタール、ｐＨ６．５、
６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＭＡＨＰ（５）アセタール、ｐＨ９．０、
７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）、ｐＨ６．５、
８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）、ｐＨ９．０、
９）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＭＡＨＰ（５）アセタール（精製、９５％品）、ｐＨ６．５、
１０）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１００００−ＭＡＨＰ（５）アセタール（精製、９５％品）、ｐＨ９．０。
【０２４６】
見ればわかるように、ｍＰＥＧ１００００−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ反応剤（５）（レーン７〜８）は、これまで試験したすべての反応剤の内で、最大量の抱合を示し、ｐＨが高い方が、反応が進んだ。（そのアセタールは、ｐＨが高くなると非反応性になると予想されていたが、より低いｐＨでは、反応性アルデヒドへの脱保護が起きる可能性が高かった。レーン９に示した精製生成手順でも、アルデヒドへのいくぶんかの脱保護が起きた可能性がある。）
（ｃ）ｍＰＥＧ反応剤を使用した、脂肪族アルデヒド（ブチルアルデヒド）、α−ヒドロキシアルデヒド（ＨＰ−ＡＬＤ、４）および「自己触媒性」（ＭＡＨＰ）反応剤（５）とのさらなる抱合反応
図３の中の反応は、リゾチーム標準溶液（０．０３ｍＬ）の混合物および指示されたｐＨのリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、０．９ｍＬ）の中で、指示されたＰＥＧ反応生成物（１０〜２０ｍｇ）を溶解させることによって実施した。ＮａＣＮＢＨ３を含むとラベルされている反応液には、フレッシュに調製したシアノホウ水素化ナトリウム標準溶液（７．５μＬ；１ｍＬのリン酸ナトリウム（０．２Ｍ、必要に応じてｐＨ６．５またはｐＨ７．５）中、９ｍｇのＮａＣＮＢＨ３）がさらに含まれていた。それらの反応液を混合して、室温で１８時間培養させた。アリコート（３．５μＬ）を採取して、水およびサンプル緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ４×緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６μＬ）を用いて希釈した。それらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリス、泳動緩衝液ＭＥＳ１×）の上に担持させ、２００Ｖで４５分間泳動させた。ゲルを取り出し、すすぎ、１時間かけてＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、次いで２時間以上かけて脱染した。結果を図３に示すが、レーンは下記の通りである：
１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）（１０ｋＤ）、ｐＨ６．５、
２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）（１０ｋＤ）、ｐＨ７．５、
３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）（精製、９５％品）、ｐＨ６．５、
４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）（精製、９５％品）、ｐＨ７．５、
５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＭＡＨＰ（５）アセタール（精製、９５％品）、ｐＨ７．５、
６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２０ｋＤ）、ｐＨ７．５、
７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２０ｋＤ）、ｐＨ６．５＋ＮａＣＮＢＨ３、
８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２０ｋＤ）、ｐＨ７．５＋ＮａＣＮＢＨ３、
９）リゾチーム、
１０）ベンチマークラダー。
【０２４７】
この場合もまた、「自己触媒性」反応剤、ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（５）との高いｐＨでの反応（レーン４）は、最大量の抱合を与えた。ＮａＣＮＢＨ３が存在しないと、ブチルアルデヒド反応剤との反応はまったく認められなかった（レーン６〜８）。単独のα−ヒドロキシアルデヒド反応剤、ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ（４）は、中程度の量の抱合を与えた（レーン１〜２）。
【０２４８】
実施例７：５−ｍＰＥＧ２０Ｋ−２−ヒドロキシ−ペンタナール（またはｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ）（９）の調製法
この反応剤（反応剤４の高分子量版）は、下記のスキームに従って調製した。
【０２４９】
【化３９】
0005766118.tif 000050
ａ）臭化アリル、Ｉｎ（粉末）、エタノ−ル、４０℃；ｂ）３，４−ジヒドロ−２ｈ−ピラン、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム、ＤＣＭ；９−ＢＢＮ、ＤＣＭ、Ｈ２Ｏ２／ＮａＯＨ；ｃ）塩化メタンスルホニル、ＴＥＡ、トルエン；ｄ）ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０Ｋ、ＮａＨ、トルエン、４５℃；ｅ）２０％リン酸
（ａ）２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシ−ペント−４−エンの調製法（Ｃｒｅｓｔｉａ  ｅｔ．ａｌ．，２００１）
インジウム粉末（０．５２ｍｏｌ、１当量、６０ｇ、１００メッシュ）を、２，２−ジメトキシアセトアルデヒド（０．５２ｍｏｌ、１．０当量、９０．６２ｇ、６０重量％水溶液）および臭化アリル（０．７９ｍｏｌ、１．５当量、６６．５ｍＬ）を含むエタノール（２５０ｍＬ）溶液に添加した。その懸濁液を４０℃で３時間撹拌した。次いでそのスラリーを遠心分離にかけ、その上澄みをデカントした。ペレットを懸濁させて、エタノールを用いて３回（３５０、３５０、および４５０ｍＬ）洗浄した。上澄みを合わせ、１５００ｍＬの脱イオン水および１５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムと混合した。クロロホルム（１５００、３００ｍＬ）を用いて、粗生成物を抽出した。有機層を合わせ、１５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムを用いて洗浄した。クロロホルム抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。
収量：４０．４ｇ（収率５３％）の反応生成物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）５．９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；５．２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．７（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−）；３．４（ｄ，６Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．３（ｄｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）。
【０２５０】
（ｂ）
（ｃ）２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−オールの調製法
乾燥させたフラスコの中で、２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシ−ペント−４−エン（３８．８４ｇ、０．２６６ｍｏｌ）を、トルエンの中に溶解させ、蒸留溶媒によって（４０℃で）共沸蒸留的に乾燥させると、油状物が残った。その物質を、脱水ジクロロメタン（７８０ｍＬ）の中に溶解させた。３，４−ジヒドロ−２ｈ−ピラン（４８．２ｍＬ、０．５３２ｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（３．３４ｇ、０．０１３ｍｏｌ）を添加した。薄層クロマトグラフィー（移動相：６０／４０酢酸エチル−ヘキサン、バニリン染色）を用いて、その反応のモニターを行った。２０時間後に、３，４−ジヒドロ−２ｈ−ピラン（５．０ｍＬ、０．０６ｍｏｌ）を添加した。最後の３，４−ジヒドロ−２ｈ−ピランの添加後３時間でその反応は完了した。飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×２００ｍＬ）を用いて、その反応溶液を洗浄した。そのジクロロメタン抽出物を、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。
粗製物収量：６１．６７ｇ（１００％）、透明な油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）５．９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；５．１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−）；４．７、４．９（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．２、４．４（ｄｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．０（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．８、３．５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２（ＴＨＰから））；３．４（ｄ，６Ｈ，（ＯＣＨ３）２）；２．４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）；１．５〜１．８（ｍ，６Ｈ，ＴＨＰ残基）。
【０２５１】
粗製の２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−オール（５８．７６ｇ、０．２５５ｍｏｌ）をトルエン（６００ｍＬ）の中に溶解させ、蒸留すると、油状物が残った。その油状物を、ジクロロメタン（５００ｍＬ）の中に溶解させた。不活性窒素雰囲気下で、９−ＢＢＮ（ＴＨＦ中０．５Ｍ、８１６ｍＬ、０．４０８ｍｏｌ）を添加した。２時間後に、３０％過酸化水素溶液（５００ｍＬ）と１５％水酸化ナトリウム（５００ｍＬ）との混合物を、滴下により徐々に添加した。（注意：ガスおよび熱が発生するので、反応剤混合物は注意深く、徐々に添加すること。）その反応液をさらに４時間撹拌し、飽和塩化ナトリウム（１０００ｍＬ、４００ｍＬ）を用いて反応混合物を洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。その粗生成物を、メタノール（１７００ｍＬ）と水（８３ｍＬ）の中に溶解させ、ヘキサン（３×７５０ｍＬ）を用いて抽出した。そのメタノール／水層（下層）を、飽和塩化ナトリウム／脱イオン水／１Ｍ水酸化ナトリウム（１８００ｍＬ）と混合し、ジクロロメタン（１７００ｍＬ、１０００ｍＬ）を用いて、反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを用いてその有機抽出物を乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。収量：８０．１４ｇ（１００％）、透明な半精製油状物。その半精製反応生成物の試料（５ｇ）を、Ｂｉｏｓｔａｇｅ  ＳＰ−４（ＦＬＡＳＨ  ４０＋Ｍ）精製システム上、メタノール／ジクロロメタングラジエントを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製した。
精製収量：３．４ｇ（７０％）、無色透明の油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．６〜４．７（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．３、３．３（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２）；４．２、４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．８（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．５、３．４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２）；３．３（ｓｓ，６Ｈ，−Ｏ（ＣＨ３）２）；１．８〜１．３（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２およびＴＨＰ残基）。
【０２５２】
（ｄ）２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネートの調製法
乾燥させたフラスコの中で、２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−オール（４ｇ、０．０１６ｍｏｌ）を、トルエンの中に溶解させ、蒸留溶媒によって（４０℃で）共沸蒸留的に乾燥させると、油状物が残った。その物質を、脱水トルエン（１５２ｍＬ）の中に溶解させた。トリエチルアミン（２．６５ｍＬ、０．０１９ｍｏｌ）および塩化メタンスルホニル（１．３３ｍＬ、０．０１７ｍｏｌ）を添加した。２０時間後に、その溶液を濾過し、１：１脱イオン水／飽和重炭酸ナトリウム（２×４００ｍＬ）を用いて洗浄した。硫酸ナトリウムを用いてそのトルエン抽出物を乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。
粗製物収量：５．２１ｇ（９６％）、透明な油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．６〜４．７（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２）；４．２、４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．８（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．６、３．５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２）；３．３（ｓ，６Ｈ，−（ＯＣＨ３）２）；３．１（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ３）；１．８〜１．３（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２およびＴＨＰ残基）。
【０２５３】
（ｅ）５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシペンタンの調製法
ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０Ｋ（３６．１５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）と２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネート（３．０ｇ、９．１ｍｍｏｌ）との混合物を３６０ｍＬの脱水トルエンの中に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下４５℃で、共沸蒸留した。その混合物を蒸発乾固させてから、不活性窒素雰囲気下で脱水トルエン（１００ｍＬ、１００ｍｇＢＨＴ存在）の中に懸濁させた。水素化ナトリウム（０．３６０ｇ、９ｍｍｏｌ、鉱油中、６０％分散体）を添加し、その反応液を加熱して４５℃とした。その反応液を、４５℃で６７時間撹拌した。追加の水素化ナトリウム（０．２ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を添加し、その反応液を４５℃でさらに４８時間撹拌し、次いで減圧下で蒸発させた。イソプロパノール（２０００ｍＬ）を添加することによって、粘稠な油状物が沈殿した。沈殿した反応生成物を濾過し、イソプロパノール（７５０ｍＬ）を用いて洗浄、ジエチルエーテル（１０００ｍＬ）を用いて洗浄し、減圧下で乾燥させた。
収量：２３．１ｇ、オフホワイト色の粉末（回収率６４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．８、４．７（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．４、４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．０（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；１．８〜１．４（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２、ＴＨＰ残基）。
【０２５４】
（ｆ）５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−２−ヒドロキシ−ペンタナールの調製法
５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシペンタン（２３．１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、５００ｍＬの２０％リン酸水溶液の中に溶解させた。２０時間後に、５０％水酸化ナトリウム／水を用いて混合物のｐＨを６．８０に調節した。（飽和ホスフェート塩による）塩を濾過し、ジクロロメタンを用いて反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを用いてそのジクロロメタン抽出物を乾燥させ、濾過し、蒸発させると粘稠な油状物が得られた。その油状物にイソプロパノール／ＢＨＴ溶液を添加した。沈殿した物質を濾過し、イソプロパノール／ＢＨＴ溶液を用いて洗浄した。ジエチルエーテル／ＢＨＴを用いてその反応生成物を洗浄し、減圧下で乾燥させた。
収量：１８．０ｇ、オフホワイト色の粉末。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）９．７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ＝Ｏ）；４．２（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；１．７〜１．８（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２５５】
実施例８：５−ｍＰＥＧ２０，０００−メチルアミノ−２−ヒドロキシ−ペンタナール（またはｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ）（１０）の調製法  
この反応剤（反応剤５の高分子量版）は、下記のスキームに従って調製した。
【０２５６】
【化４０】
0005766118.tif 000051
ａ）メチルアミン溶液；ｂ）ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０Ｋ、ＮａＯＨ、トルエン、７５℃；ｃ）１Ｍ硫酸
（ａ）２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メチルアミンの調製法
乾燥させたフラスコの中で、２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネート（８．５ｇ、０．０１６ｍｏｌ）をエタノール（４０ｍＬ）の中に溶解させた。メチルアミン（水中４０％、２５５ｍＬ）を添加した。室温で１７時間後に、飽和塩化ナトリウム溶液（３００ｍＬ）を添加した。ジクロロメタン（３００ｍＬ）を用いて、その反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを用いてそのジクロロメタン抽出物を乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。
収量：７．０３ｇ（１００％）、透明な油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．６、４．７（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．３、４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．８（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．５、３．４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２）；３．４（ｄ，６Ｈ，（ＯＣＨ３）２）、２．４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２）、１．８〜１．３（ｍ，１０Ｈ，ＴＨＰ残基およびＣＨ２ＣＨ２）。
【０２５７】
（ｂ）５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メチルアミンの調製法
乾燥させたフラスコの中で、ｍＰＥＧ−メシレート２０Ｋ（２５．０ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）をトルエン（１００ｍＬ）の中に溶解させた。水酸化ナトリウム（０．５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）および２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メチルアミン（３．３ｇ、１２．６３ｍｍｏｌｅ）を添加した。反応温度は７５℃であった。４９時間後に、ジエチルエーテル（１０００ｍＬ）を添加した。その反応生成物を濾過し、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を用いて洗浄した。硫酸ナトリウムを用いてその抽出物を乾燥させた。その反応生成物を濾過し、減圧下で乾燥させた。
収量：２３ｇ（９２％）、透明な油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．６、４．７（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．３、４．２（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．８（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ−骨格）；３．２（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）、２．２（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ３）、１．８〜１．３（ｍ，１０Ｈ，ＴＨＰ残基およびＣＨ２ＣＨ２）
粗製の５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メチルアミン（２２．５ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を脱イオン水（１５００ｍＬ）の中に溶解させた。その溶液を、脱塩媒体（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標））の中に通した。導電率は８．７１μＳ／ｃｍ、ｐＨは８．０９であった。その溶液を、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０（カチオン交換樹脂、１３００ｍＬ）の上に担持させた。脱イオン水（ほぼ１カラム容積）を用いて、そのカラムを洗浄した。塩化ナトリウム溶液（５％）を使用して、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０媒体から反応生成物を溶出させた。希水酸化ナトリウム溶液を用いてその溶液のｐＨを２．７０に調節した。ジクロロメタンを用いてその反応生成物を抽出し、そのジクロロメタン抽出物を、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、濾過し、減圧下で一夜濃縮した。
収量：１４ｇ（回収率６２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ（ＯＣＨ３）２）；３．６（ｂｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．２（ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）；２．９（ｓ，３Ｈ，−ＮＨ（ＣＨ３）−）；１．９〜１．５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２５８】
（ｃ）５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−メチルアミノ−２−ヒドロキシ−ペンタナールの調製法
乾燥させたフラスコの中で、５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−２−ヒドロキシ−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メチルアミン（１２．６３ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を１Ｍ硫酸（５１ｍＬ）の中に溶解させた。２０時間後に、脱イオン水（４４０ｍＬ）および１０％リン酸（１２６ｍＬ）を添加した。塩化ナトリウム（６１ｇ）を添加し、１Ｍ水酸化ナトリウムを使用してその溶液のｐＨを２．８に調節した。ジクロロメタン（３００、１００ｍＬ）を用いて、その反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを使用してその有機抽出物を乾燥させ、濾過した。濾液を蒸留すると粘稠な油状物が得られてので、次いでその反応生成物を、イソプロパノール／ＢＨＴ溶液を用いて沈殿させた。イソプロパノール／ＢＨＴ溶液を用いて、そのウェットケーキを洗浄した。ジエチルエーテル／ＢＨＴ溶液を用いてそのケーキを洗浄し、濾過し、減圧下で乾燥させた。
収量：１１．７ｇ（９３％）、透明な油状物。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ（トリフルオロ酢酸スパイク使用）、３００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．６（ｂｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；３．２（ｂｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）；２．９（ｓ，３Ｈ，−ＮＨ（ＣＨ３）−）；１．９〜１．５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）。
【０２５９】
実施例９：５−ｍＰＥＧ１０，０００−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール（またはｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ（１１）の調製法
この反応剤は、次式のスキームに従って調製した。
【０２６０】
【化４１】
0005766118.tif 000052
ａ）ピペラジン、水；ｂ）２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネ−ト、ジオキサン、１Ｍ水酸化ナトリウム；ｃ）１Ｍ硫酸
（ａ）ｍＰＥＧ−ピペラジン１０Ｋの調製法
丸底フラスコの中で、ｍＰＥＧ−メシレート１０Ｋ（３１．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を、９５ｍＬ脱イオン水中のピペラジン（１８．６５ｇ、２１６．５ｍｍｏｌ）の溶液の中に溶解させた。４８時間後に、飽和塩化ナトリウム（１００ｍＬ）および脱イオン水（１００ｍＬ）を添加した。ジクロロメタン（６０、６０、３０ｍＬ）を用いて、その反応生成物を抽出した。その有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、その溶液を濾過し、蒸留すると粘稠な油状物が得られた。ＢＨＴを含む１：１イソプロパノール／ジエチルエーテルを用いてその反応生成物を沈殿させ、イソプロパノール／ジエチルエーテル／ＢＨＴ溶液を用いて洗浄し、真空下で乾燥させた。
収量：２９．６ｇ（回収率９５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．６（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２）；２．４（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２）；２．３（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２）。
【０２６１】
（ｂ）５−ｍＰＥＧ（１０，０００）−ピペラジン−２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシペンタンの調製法
丸底フラスコの中で、ｍＰＥＧ−ピペラジン１０Ｋ（１．０９ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネート（０．１９２ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（１．３ｍＬ）および１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（１．３ｍＬ）の中に溶解させた。５０℃で２２時間経過後に、脱イオン水（１０ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム溶液（２５ｍＬ）を添加した。ジクロロメタン（２×２０ｍＬ）を用いてその反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを用いてそのジクロロメタン抽出物を乾燥させ、濾過した。その濾液を蒸留すると粘稠な油状物が得られ、イソプロパノールを用いて沈殿させた。濾過を助けるために、ジエチルエーテルおよびメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加した。その反応生成物を真空下において乾燥させた。
収量：０．６ｇ（回収率６１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．６、４．７（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．２、４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．８（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）、３．２（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．４２（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２）；１．８〜１．３（ｍ，１０Ｈ，ＴＨＰ残基および−ＣＨ２−ＣＨ２）。
【０２６２】
（ｃ）５−ｍＰＥＧ（１０，０００）−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール（またはｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ）の調製法
丸底フラスコの中で、５−ｍＰＥＧ（１０，０００）−ピペラジン−２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシペンタン（０．５２８ｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を１Ｍ硫酸（２．１ｍＬ）の中に溶解させた。室温（ほぼ２１℃）で１９時間経過後に、脱イオン水（２０ｍＬ）および１０％リン酸（５ｍＬ）を添加した。塩化ナトリウム（２．５ｇ）を添加し、１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを２．５に調節した。ジクロロメタンを用いてその反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを用いてそのジクロロメタン抽出物を乾燥させ、濾過した。その濾液を蒸留すると粘稠な油状物が得られたので、イソプロパノールとジエチルエーテルの１：１混合物を用いて沈殿させた。イソプロパノールとジエチルエーテルとの１：１混合物を用いてそのケーキを洗浄し、真空下において乾燥させた。
収量：０．３５ｇ（回収率６６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）９．８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ＝Ｏ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）。
【０２６３】
実施例１０：５−ｍＰＥＧ２０，０００−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール（またはｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１２）の調製法
この反応剤（反応剤１１の高分子量版）は、下記のスキームに従って調製した。
【０２６４】
【化４２】
0005766118.tif 000053
ａ）ピペラジン、水；ｂ）２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネ−ト、ジオキサン、１Ｍ水酸化ナトリウム；ｃ）１Ｍ硫酸
（ａ）ｍＰＥＧ−ピペラジン２０Ｋの調製法
丸底フラスコの中で、ｍＰＥＧ−メシレート２０Ｋ（４０．５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、１５０ｍＬ脱イオン水中のピペラジン（２５．２ｇ、２９３ｍｍｏｌ）の溶液の中に溶解させた。１９時間後に、飽和塩化ナトリウム（１２５ｍＬ）および脱イオン水（１２５ｍＬ）を添加した。ジクロロメタン（６０、６０、３０ｍＬ）を用いてその反応生成物を抽出し、その有機抽出物を合わせ、希水酸化ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウム（１：１、４００ｍＬ）を用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。その溶液を濾過し、蒸留して乾固させた。その反応生成物をジクロロメタン（８０ｍＬ）の中に溶解させ、ＢＨＴを含むイソプロパノール（１４００ｍＬ、４００ｍｇＢＨＴ）を用いて沈殿させた。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４００ｍＬ）を添加して濾過を助けた。イソプロパノール／ＢＨＴ溶液を用いてその反応生成物を洗浄し、真空下において乾燥させた。
収量：３７．３ｇ（回収率９５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．６（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２）；２．４（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２）；２．３（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２）。
【０２６５】
（ｂ）５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−ピペラジン−２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシペンタンの調製法
丸底フラスコの中で、ｍＰＥＧ−ピペラジン２０Ｋ（１２．０ｇ、０．６ｍｍｏｌ）および２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネート（１．０６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（１４．３ｍＬ）および１Ｍ水酸化ナトリウム（１４．３ｍＬ）の中に溶解させた。５０℃で２４時間経過した後、２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネート（０．５２１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加え、反応を５０℃でさらに２３時間続けた。脱イオン水（１００ｍＬ）およびａ飽和塩化ナトリウム溶液（１００ｍＬ）を添加した。ジクロロメタン（２００、１００ｍＬ）を用いて、その反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを用いてそのジクロロメタン抽出物を乾燥させ、濾過した。その濾液を蒸留すると粘稠な油状物が得られたので、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ＢＨＴを用いて沈殿させた。メチル−ｔｅｒｔ−ブチル−エーテル／ＢＨＴを用いてその反応生成物を洗浄し、真空下において乾燥させた。
収量：１１ｇ（回収率９２％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）４．６、４．７（ｔ，１Ｈ，−ＣＨ）；４．２、４．３（ｄ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．８（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）、３．２（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ３）；２．４２（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２）；１．８〜１．３（ｍ，１０Ｈ，ＴＨＰ残基および−ＣＨ２−ＣＨ２）。
【０２６６】
（ｃ）５−ｍＰＥＧ２０Ｋ−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール（またはｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ）の調製法
丸底フラスコの中で、５−ｍＰＥＧ（１０，０００）−ピペラジン−２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシペンタン（８．０ｇ、０．４ｃｍｍｏｌ）を１Ｍ硫酸（３５ｍＬ）の中に溶解させた。室温（ほぼ２１℃）で１８時間経過後に、脱イオン水（２５０ｍＬ）および１０％リン酸（５０ｍＬ）を添加した。塩化ナトリウム（４０ｇ）を添加し、１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを２．５に調節した。ジクロロメタン（２００、１００、１００ｍＬ）を用いて、その反応生成物を抽出した。硫酸ナトリウムを用いてそのジクロロメタン抽出物を乾燥させ、濾過した。その濾液を蒸留すると粘稠な油状物が得られたので、ＢＨＴを含むイソプロパノールとメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルの１：１混合物を用いて沈殿させた。ＢＨＴを含むイソプロパノールとメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルの１：１混合物を用いてそのケーキを洗浄し、真空下において乾燥させた。
収量：７．４ｇ（回収率９３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）９．７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ＝Ｏ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ骨格）；３．３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）。
実施例１１：リゾチームと、ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（１０）およびｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１１）との抱合
ｐＨ：６．０、６．５、および９．１のリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ）を調製した。１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ：７．０、１０ｍｇ／ｍＬ緩衝液）を使用して、別途にリゾチーム（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ−６７８６、ＥＣ３．２．１．１７）溶液を調製した。リゾチーム溶液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ：６．０、６．５、および９．１）の中にスパイクさせて、ＰＥＧと反応させるための所定の濃度を得た。
【０２６７】
２ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液の中での指示されたＰＥＧ反応生成物（１０ｍｇ、１５ｍｇ）を溶解させることによって、抱合反応を行わせた。その反応液を、室温で２４時間培養した。アリコートを採取し、４×ＬＤＳ緩衝液および脱イオン水を用いて希釈して、０．７５ｍｇリゾチーム／ｍＬ−溶液の溶液を得た。その試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）、４〜１２％ビス−トリス、泳動緩衝液：ＭＥＳ  ＳＤＳ１×）の上に担持させた。その試料を、２００Ｖで４５分間泳動させた。ゲルを取り出し、すすぎ、１時間かけてＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、２時間以上かけて脱染した。結果を図４に示すが、レーンは下記の通りである：
１）ベンチマークラダー、
２）リゾチーム（Ｌｙｚ）、
３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ（１１）、２５×、ｐＨ：６．５、
４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ（１１）、５０×、ｐＨ：６．５、
５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ（１１）、５０×、ｐＨ：９．１、
６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ（１１）、２５×、ｐＨ：６．０、
７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ（１１）、５０×、ｐＨ：６．０、
８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１０）、２５×、ｐＨ：６．５、
９）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１０）、５０×、ｐＨ：６．５、
１０）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１０）、５０×、ｐＨ：９．１。
【０２６８】
図４の結果には、両方の反応剤を使用するとタンパク質のモノＰＥＧ化およびジＰＥＧ化抱合体が得られたという証拠が示されている（反応剤１０では、予想された通りに、より高い分子量の抱合体が得られた）。より高いｐＨではより大量の抱合体が得られたが、このことは、これらの反応剤が、塩基で促進される自己触媒性を有しているという特徴と矛盾しない。
【０２６９】
実施例１２：タンパク質（５５ｋＤａ）の、ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）およびｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１０）との抱合
５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−２−ヒドロキシ−ペンタナール（ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ、９）および「自己触媒性」反応剤の５−ｍＰＥＧ（２０，０００）−メチルアミノ−２−ヒドロキシ−ペンタナール（ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＭＡＬＤ２０Ｋ、１０）に対する抱合を、５５ｋＤａの分子量を有するタンパク質を使用してさらに検討した。それぞれのＰＥＧ反応剤と、モル過剰を約２０として混合することによって、抱合反応を設定した。抱合反応は、スクロースを含む０．２Ｍリン酸塩緩衝液を使用して６．５〜９．０のｐＨ範囲で実施し、２５℃で最高１６時間反応させておいた。
【０２７０】
そうして得られた抱合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。簡単に説明すれば、それぞれのサンプル抱合体の４５μＬを、４×ＬＤＳ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）サンプル緩衝液１５μＬと混合し、４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上で、ＭＥＳ緩衝液系を使用して分離させたが、それぞれのレーンは下記の通りである：
１）ＭＷマーカー、
２）１μｇのｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）、
３）３μｇの未変性５５ｋＤａタンパク質、
４）ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ６．５、
５）ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ７．５、
６）ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ９．０、
７）１μｇのｍＰＥＧ−ＨＰ−ＭＡＬＤ２０Ｋ（１０）、
８）３μｇの未変性５５ｋＤａタンパク質、
９）ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＭＡＬＤ２０Ｋ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ６．５、
１０）ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＭＡＬＤ２０Ｋ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ７．５、
１１）ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＭＡＬＤ２０Ｋ（１０）／５５ｋＤａタンパク質；ｐＨ９．０、
１２）ブランク。
【０２７１】
データを図５Ａ〜Ｂに示す（５Ａ：バリウム／ヨウ素染色；５Ｂ：クーマシー染色）。（両方のパネルにおいて）タンパク質抱合体は、図の右側の矢印で示してある。
【０２７２】
実施例１３：インスリンの、ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１０）との抱合
インスリンを使用して、５−ｍＰＥＧ２０，０００−メチルアミノ−２−ヒドロキシ−ペンタナール（ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＭＡＬＤ  ２０Ｋ）の抱合を検討した。ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（２５ｍｇ）を、０．５ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬのインスリン溶液（５０％エタノール／水、ｐＨ９．７）の中に添加することにより、抱合反応を行わせた。反応混合物は、６００ｒｐｍで撹拌しながら、室温で培養した。１８時間後に、アリコートを採取し、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ水／アセトニトリルグラジエント、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ１８、ＵＶ：２７６ｎｍ）によって分析した。ＨＰＬＣの結果から、モノ−およびジ−ＰＥＧ化インスリン抱合体が、それぞれ２０％および２７％形成されていることがわかった。
【０２７３】
実施例１４：リゾチームの、ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）、ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１０）、ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ１０Ｋ（１１）、およびｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド２０Ｋとの抱合（ｐＨおよび温度を変化）
抱合反応は、指示されたｍＰＥＧ反応剤（２１ｍｇ、５０当量）をリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、０．２７ｍＬ）の中に溶解させ、次いでリゾチーム標準溶液（０．０３ｍＬ、０．２Ｍリン酸塩緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬ）を添加することによって実施した。その反応液を混合し、二つに分けて、室温（約２１℃）または５℃のいずれかで、２４時間または４８時間培養した。分析するまでの間、試料は冷凍しておいた（−２０℃）。アリコート（４μＬ）を採取して、水およびサンプル緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ４×緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６μＬ）を用いて希釈した。それらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリス、泳動緩衝液ＭＥＳ１×）の上に担持させ、２００Ｖで４２分間泳動させた。ゲルを取り出し、すすぎ、少なくとも１時間かけてＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、次いで２時間以上かけて脱染した。得られた結果を図６Ａ〜Ｂ（６Ａ：室温、１日の反応；６Ｂ；５℃、１日の反応）に示すが、それぞれのレーンは下記の通りである：
１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）、ｐＨ６．５、
２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）、ｐＨ９．０、
３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ２０Ｋ（１０）、ｐＨ６．５、
４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ２０Ｋ（１０）、ｐＨ９．０、
５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１２）、ｐＨ６．５、
６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１２）、ｐＨ９．０、
７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ２０Ｋ、ｐＨ６．５、
８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ２０Ｋ＋ＮａＣＮＢＨ３、ｐＨ６．５、
９）リゾチーム（Ｌｙｚ）、
１０）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（商標）ラダー。
【０２７４】
それらの反応を、ｐＨ７．５（０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液または０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液）で、室温で１日、繰り返した。それらの試料を、先に説明したようにして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を図６Ｃに示すが、レーンは下記の通りである：
１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、
２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（９）、０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、
３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ２０Ｋ（１０）、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、
４）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ２０Ｋ（１０）、０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、
５）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＡＬＤ２０Ｋ（１２）、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、
６）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＡＬＤ２０Ｋ（１２）、０．２ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、
７）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ２０Ｋ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、
８）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ−ｂｕｔｒｙＡＬＤ２０Ｋ、＋ＮａＣＮＢＨ３、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、
９）リゾチーム、
１０）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（商標）ラダー。
【０２７５】
図６Ａ〜Ｃからわかるように、ｍＰＥＧ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１０）およびｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１２）反応剤（自己触媒性）は、これまで試験したα−ヒドロキシアルデヒドの内では最大量の抱合を示し、ｐＨが高い方が、反応が進んだ。ゲルでは、過剰のｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ反応剤（１２）とモノ−ＰＥＧ−リゾチームの抱合体の共溶出を示しているが（レーン５〜６）、これは、モノ−ＰＥＧ反応生成物についての予想された移行を乱している。（下記の図７；実施例１７の精製した反応混合物のゲルと比較されたい。）ｍＰＥＧ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ２０Ｋ（１２）とのジ−ＰＥＧおよびトリ−ＰＥＧリゾチーム抱合体（レーン５〜６の、より高い移行バンド）は、その他の抱合体の場合に観察されたのにより似た移行を示していた。
【０２７６】
５℃で培養した反応液（図６Ｂ）は、室温で培養したもの（図６Ａ）に比較して、定性的には、抱合反応生成物が少ないが、ｐＨ９．０におけるｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（１０）（レーン４）ならびにｐＨ６．５およびｐＨ９．０におけるｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＡＬＤ（１２）（レーン５および６）では、リゾチーム抱合体が観察された。先の実験においても観察されたように、ブチルアルデヒド反応剤は、還元剤が存在しないとほとんど、またはまったく抱合を示さなかった（レーン７）。
【０２７７】
実施例１６：ｐＨ６．５、７．５または９．０においての、リゾチームの、ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＨＰ−ＡＬＤ（９）、ｍＰＥＧ２０Ｋ−ＭＡＨＰ−ＡＬＤ（１０）、ｍＰＥＧ１０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１１）およびｍＰＥＧ２０Ｋ−ブチルアルデヒドとの抱合
それらの反応を表１にまとめたが、それらは、指示されたｍＰＥＧ  ２０Ｋ反応剤（４２ｍｇ、２０当量）をリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、１．３５ｍＬ、所定のｐＨ）の中に溶解させ、次いで、リゾチーム標準溶液（０．１５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、指示された緩衝液中）を添加することによって実施した。それらの反応液を混合し、２５℃で２０〜２４時間培養した。アリコートを採取し、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ  水／アセトニトリルグラジエント、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ  Ｃ３、ＵＶ：２８０ｎｍ）によって分析した。ＨＰＬＣの結果は、下記の抱合体収量（ＵＶ２８０に基づく相対面積パーセント）の結果を与えた。
【０２７８】
先にも観察されたように、本明細書において開示されたα−ヒドロキシ反応剤との抱合収量は、ｐＨと共に増大するが、これは「自己触媒性」反応剤の場合には特にあてはまる。還元剤が不在の場合には、ブチルアルデヒド反応剤では、抱合がまったく観察されなかった。
【０２７９】
【表１】
0005766118.tif 000054
実施例１７：ｐＨ６．５、７．５または９．０においての、リゾチームの、ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）との抱合（過剰のＰＥＧ反応剤を除去した場合）
それらの反応を表２にまとめたが、それらは、指示されたｍＰＥＧ  ２０Ｋ反応剤（１０４ｍｇ、５０当量）をリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、１．３５ｍＬ、所定のｐＨ）の中に溶解させ、次いで、リゾチーム標準溶液（０．１５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、指示された緩衝液中）を添加することによって実施した。これらの反応は、表１の７〜９行にまとめたものと類似しているが、ＰＥＧ反応剤を大過剰に使用している（５０×対２０×）。それらの反応成分を混合し、２５℃で２０〜２４時間培養した。
【０２８０】
その反応混合物を精製して、過剰のＰＥＧ反応剤を除去し、それらの抱合体（未反応のタンパク質を含む）を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ  水／アセトニトリルグラジエント、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ  Ｃ３、ＵＶ：２８０ｎｍ）によって分析した。ＨＰＬＣの結果は、下記の抱合体収量（ＵＶ２８０に基づく相対面積パーセント）の結果を与えた。
【０２８１】
【表２】
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その精製した反応混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても分析した。そのために、それらの抱合体のプールをサンプル緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ４×緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０μＬ）と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリス、泳動緩衝液ＭＥＳ１×）の上に担持させ、２００Ｖで３５分間泳動させた。類似の量の抱合体プールをそれぞれのレーンに担持させた。ゲルを取り出し、すすぎ、少なくとも１時間かけてＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、次いで２時間以上かけて脱染した。結果を図８に示すが、レーンは下記の通りである：
レーン：
０）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２（商標）；
１）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ６．５；
２）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ７．５；
３）Ｌｙｚ＋ｍＰＥＧ２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ（１２）、ｐＨ９．０。
【０２８２】
図７の結果からもわかるように、反応液のｐＨが高くなるにつれて、モノ−抱合体のレベルが高くなるのは明らかであった。
【０２８３】
実施例１８：ｍＰＥＧ−５−Ｏ−３−デオキシリボース反応剤（５−ｍＰＥＧ２０Ｋ−２，４−ヒドロキシ−ペンタナールまたはｍＰＥＧ２０Ｋ−３ｄ−ＨＰ−ＡＬＤ）（１３）の調製法
次の合成スキームを採用して表題化合物を調製する：
【０２８４】
【化４３】
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ａ）ＯｓＯ４／ポリマ−、アセトン／Ｈ２Ｏ、３０％Ｈ２Ｏ２；ｂ）ＰｈＣＨＢｒ２、ピリジン；ｃ）ｍＰＥＧ−ＯＭｓ  ２０Ｋ、トルエン、ＮａＨ；ｄ）Ｐｄ／Ｃ、ＨＯＡｃ、Ｈ２；ｅ）２０％リン酸
代替えのルートを以下に示す。出発物質のメチル３−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシドは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６４，８６（１４），２９５２の記載に従って調製する。
【０２８５】
【化４４】
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ａ）アセトン、ｐ−トルエンスルホン酸；ｂ）ｍＰＥＧ−ＯＭｓ  ２０Ｋ、トルエン、ＮａＨ；ｃ）ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（８：１）
この反応剤を、先に記載した手順に従ってタンパク質またはその他のアミン含有化合物と反応させると、安定なケト−アミン抱合体を得ることができる。
【０２８６】
実施例１９：５−ｒｕＰＥＧ２２０Ｋ−ピペラジン−２−ヒドロキシ−ペンタナール（またはｒｕＰＥＧ２２０Ｋ−Ｐｉｐ−ＨＰ−ＡＬＤ）（１４）の調製法
図８に示した合成スキームを採用して、表題の化合物を調製する。簡潔に記せば、分岐状のＰＥＧ反応剤であるｒｕＰＥＧ２２０Ｋ−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  ＡＬ）から市販）を、アセトニトリルの中でピペラジンと反応させて、ピペラジンアミドを得る（工程ａ）。次いで、環の遊離の窒素を、ジオキサン／１Ｍ水酸化ナトリウムの中で、２−ヒドロキシテトラヒドロピラニル−１，１−ジメトキシ−ペンタン−５−メタンスルホネートと反応させて、表題化合物への保護された前駆体を得る（工程ｂ）。１Ｍ硫酸を用いた脱保護（工程ｃ）によって、表題の反応剤（１４）が得られる。この反応剤を、先に記載した手順に従ってタンパク質またはその他のアミン含有化合物と反応させると、安定なケト−アミン抱合体を得ることができる。
【０２８７】
参照文献
Ｃｒｅｓｔｉａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１２：８６９〜８７６（２００１）
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６，ｐｐ．３７〜３８
Ｈｏｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，Ａｄｖａｎ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．，１０：１６９（１９５５）
Ｉｓｂｅｌｌ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２３：１３０９（１９５８）
Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｒ．Ｕ．，ｉｎ  Ｐ．ｄｅ  Ｍａｙｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ，Ｐｔ．２，ｐ．７５３（１９６４）
Ｍｉｃｈｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．，６５８：１２０（１９６２）
Ｗｒｏｄｎｉｇｇ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ  Ｅｄｅｒ，Ｂ．，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１５：１１５〜１５２（２００１）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図８】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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