(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯ含む基質の微生物発酵の効率を高める方法であって、ＣＯの第一の部分が酸、アルコール、及びそれらの混合物からなる群から選択される１種以上の所望の産物として固定され、ＣＯの第二の部分がＣＯ２に変換されるように前記基質を微生物培養物に提供することを含み、ＣＯ２に変換されるＣＯの割合を定量して、１種以上の所望の産物の産生を促進するための基質供給速度を決定する、前記方法。
【請求項２】
前記基質供給速度を、
ｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が最適値または最適範囲未満であると定量される場合には増加させ、または
ｉｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が最適値または最適範囲を超えていると定量される場合には減少させ、または
ｉｉｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が実質的に最適値または最適範囲にあると定量される場合には維持する、
請求項１に記載される方法。
【請求項３】
前記基質供給速度はＣＯ２に変換されるＣＯの割合が実質的に最適値または最適範囲に維持されるように自動的に調節される、請求項２に記載される方法。
【請求項４】
ＣＯを含む前記基質が、５％容量未満のＨ２を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載される方法。
【請求項５】
前記アルコールがエタノールである請求項１〜４のいずれか１項に記載される方法。
【請求項６】
所定の操作パラメータに基づくＣＯを含む基質の微生物発酵による１種以上の酸および／またはアルコールの産生効率を高める方法であって、１種以上の産物として固定される、ＣＯにおける炭素の割合を定量し、定量結果により、
ｉ）所望の産物として固定される炭素の割合が増加するように１種以上の操作パラメータを調節すること、または
ｉｉ）所望の産物として固定される炭素の割合が実質的に一定に維持されるように前記操作パラメータを維持すること、
のいずれかを含み、
当該１種以上の産物として固定される炭素の割合は、ＣＯ２に変換されるＣＯの割合を定量して定める、前記方法。
【請求項７】
１種以上の前記操作パラメータは、前記発酵液のｐＨ、前記発酵液の酸化還元電位、前記発酵液のＣＯ濃度、基質供給速度、前記基質流の組成、前記基質流の圧力、発酵液の攪拌速度、産物の除去速度、前記発酵液の酸および／またはアルコール濃度、前記培養液中の１種以上の栄養素の種類、１種以上の栄養素の供給速度から選択される、請求項６に記載される方法。
【請求項８】
発酵が、クロストリジア（Clostridia）、ムーレラ、ピロコッカス（Pyrococcus）、ユウバクテリウム、デスルフォバクテリウム（Desulfobacterium）、カルボキシドサーマス、アセトゲニウム（Acetogenium）、アセトバクテリウム、アセトアナエロビウム（Acetoanaerobium）、ブチリバクテリウムおよびペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）からなる群から選択される微生物によって行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載される方法。
【請求項９】
前記クロストリジア微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナムである請求項８に記載される方法。
【請求項１０】
ＣＯを含む基質流の、１種以上の酸および／または１種以上のアルコールである産物への微生物発酵のためのシステムであって、微生物培養物を使用時に含有するバイオリアクタ、特定の産物として固定される、ＣＯにおける炭素の割合を、ＣＯ２に変換されるＣＯの割合を定量することによって定量するように構成された測定手段、および前記微生物培養物および／または基質流に対して１種以上の調節をするように構成された少なくとも１種の調節手段を含むシステム。
【請求項１１】
前記測定手段は、バイオリアクタから出る排出流の組成を定量するように構成された少なくとも１種の手段、またはバイオリアクタから出る排出流の組成およびバイオリアクタに入る基質流を定量するように構成された少なくとも１種の手段を含む、請求項１０に記載されるシステム。
【請求項１２】
前記調節手段は、前記測定手段が所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断した場合には、１種以上の調節を行うように構成される、請求項１０または１１に記載されるシステム。
【請求項１３】
前記調節手段は、前記発酵液のｐＨの変更；または前記発酵液の酸化還元電位の変更；または前記発酵液のＣＯ濃度の変更；または前記発酵液のＨ２濃度の変更；または前記基質流の組成の変更；または前記基質流の圧力の変更；または発酵液の攪拌速度；または産物の除去；または前記発酵液の酸および／もしくはアルコール濃度の変更；または前記培養液中の１種以上の栄養素の変更；または１種以上の栄養素の供給速度の変更による調節を行うように構成される、請求項１２に記載されるシステム。
【請求項１４】
前記システムは、所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断される場合には、前記微生物培養物および／または基質流に対して１種以上の調節を行うように、１種以上の調節手段を制御するように構成される処理手段を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載されるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にガス基質に関する微生物発酵による微生物成長および産物の産生の効率を高める方法に関する。より具体的には、本発明は一酸化炭素含有ガスの微生物発酵によりアルコール、特にエタノールを産生する方法に関する。具体的な態様では、本発明は微生物発酵の間にＣＯの産物への全体的な正味変換率を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノールは世界中で水素が豊富な液状交通燃料として主要なものに急速になりつつある。２００５年のエタノールの世界消費量は概算で１２２億ガロンであった。燃料エタノール産業の世界市場も、ヨーロッパ、日本、米国、およびいくつもの発展途上国での関心の高まりから、将来急速に成長し続けることが予想されている。
【０００３】
例えば米国では、ガソリンに１０％のエタノールを入れた混合物であるＥ１０を生産するのにエタノールが使用される。Ｅ１０混合物では、エタノール成分は酸素化剤として働き、燃焼効率を高め、大気汚染物質の産生を減らす。ブラジルでは、エタノールはガソリンに混入させる酸素化剤としてまたそれ自体純燃料として交通燃料需要の約３０％を充足する。またヨーロッパでは、温室効果ガス（ＧＨＧ）放出の重大性を中心とする環境への関心が刺激となって、欧州連合（ＥＵ）はエタノール由来のバイオマスのような持続可能な交通燃料消費についての強制的な目標を加盟国に課した。
【０００４】
燃料エタノールの大部分は、主要な炭素源として、サトウキビから抽出されるショ糖または穀類から抽出されるデンプンのような作物由来の炭水化物を使用する、伝統的な酵母に基づく発酵過程を経て生産される。しかしながら、これらの炭水化物供給原料の費用は人間の食物または動物の飼料としてのそれらの価格によって影響を受け、また、エタノール生産用のデンプンまたはショ糖産生作物の栽培は地理学上あらゆる場所で経済的に持続可能なわけではない。したがって、より低原価および／またはより豊富な炭素源を燃料エタノールに変換する技術開発に関心が持たれる。
【０００５】
ＣＯは石炭または石油および石油派生製品のような有機物の不完全燃焼における主要な、遊離した、エネルギーに富む副産物である。例えば、オーストラリアの鉄鋼産業は年間５００，０００トンを超えるＣＯを産生し大気中に放出すると報告されている。
【０００６】
主としてＣＯおよび／またはＣＯと水素（Ｈ２）からなるガスを種々の燃料および化学物質に変換するには触媒過程を使用することができる。微生物もこれらのガスを燃料および化学物質に変換するのに使用することができる。これらの生物学的過程は、一般に化学反応よりも遅いが、より高い選択性、より高い収率、より低いエネルギー費用、およびより大きな耐毒性など触媒過程より有利な点がいくつもある。
【０００７】
ＣＯを唯一の炭素源として成長する微生物の能力は１９０３年に最初に発見された。これは後に独立栄養成長のアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）生化学的経路（Woods-Ljungdahl経路および一酸化炭素脱水素酵素／アセチルＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）経路としても知られている）を使用する生物の特性であることが究明された。カルボキシド栄養性生物、光合成生物、メタン産生生物、および酢酸産生生物を含む多数の嫌気性生物は、ＣＯを種々の最終産物、すなわちＣＯ２、Ｈ２、メタン、ｎ−ブタノール、アセタート、およびエタノールに代謝することが示された。ＣＯを唯一の炭素源として使用しながら、すべてのそのような生物は少なくとも２種のこれらの最終産物を産生する。
【０００８】
例えばクロストリジウム属のような嫌気性細菌は、アセチルＣｏＡ生化学的経路を経てＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２からエタノールを産生することが示された。例えば、ガスからエタノールを産生する種々のクロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)株がＷＯ００／６８４０７、ＥＰ１１７３０９、米国特許第５，１７３，４２９号、第５，５９３，８８６号、および第６，３６８，８１９号、ＷＯ９８／００５５８、およびＷＯ０２／０８４３８に記載されている。細菌のクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)種もガスからエタノールを産生することが知られている(Abriniら、Archives of Microbiology 161,pp345-351(1994))。
【０００９】
しかしながら、ガスの発酵による微生物によるエタノール産生は、通常はアセタートおよび／または酢酸の同時産生を伴う。利用可能な炭素の一部はエタノールではなくアセタート／酢酸に変換されるので、そのような発酵過程を使用するエタノールの生産効率は望ましいものとはいえない。また、副産物であるアセタート／酢酸が何か他の目的に使用できない限り、廃棄物処理の問題をもたらす。アセタート／酢酸は微生物によってメタンに変換されるので、地球温暖化ガス放出に寄与する可能性がある。
【００１０】
一酸化炭素を唯一の炭素源およびエネルギー源として用いる微生物の能力に関して知られているいくつかの酵素はその活性に金属補因子を必要とすることが知られている。活性のための金属補因子を必要とする鍵酵素の例としては一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）およびアセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）が挙げられる。
【００１１】
ＷＯ２００７／１１７１５７、ＷＯ２００８／１１５０８０、ＷＯ２００９／０２２９２５、ＷＯ２００９／０５８０２８、ＷＯ２００９／０６４２００、ＷＯ２００９／０６４２０１、およびＷＯ２００９／１１３８７８は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれるが、一酸化炭素を含むガスの嫌気性発酵によりアルコール、特にエタノールを産生する過程を記載する。ＷＯ２００７／１１７１５７に記載される発酵過程の副産物として産生されるアセタートは水素ガスおよび二酸化炭素ガスに変換され、その一方または両方が嫌気性発酵過程で使用することができる。ＷＯ２００９／０２２９２５はＣＯを含む基質の発酵による酸およびアルコールのような産物への変換におけるｐＨおよびＯＲＰの効果を開示する。ＷＯ２００９／０５８０２８には産業排気ガスを使用してアルコールのような産物を発酵により産生することが開示されている。ＷＯ２００９／０６４２０１にはＣＯ担体および発酵におけるＣＯの使用について開示されている。ＷＯ２００９／１１３８７８にはＣＯを含む基質の発酵の間に１種以上の酸を１種以上のアルコールに変換することが開示されている。
【００１２】
ＣＯを含むガスによって成長することができる微生物は糖類によって成長する微生物に関する従来からの速度よりも遅く成長することが知られている。商業的観点からは、発酵過程において、採算の合うレベルの産物が合成されることを可能にする、十分に高い細胞密度まで微生物個体群が成長するのに必要な時間が、前記過程の収益性に影響する重要な操業費用である。培養物の成長速度および／または生産性を高める技術は、したがって、所望の細胞密度および／または所望の産物水準に到達するのに必要な時間を減じ全体の過程の商業的実行可能性を改善することができる。
【００１３】
ガス原料からアルコールを産生するための発酵過程では、微生物成長および／またはアルコール産生のための適切な条件確保が最適な微生物成長および／またはアルコール生産性を維持するのに重要である。例えば、発酵の初期操業の間、主要な目標は微生物の成長であってよい。しかしながら、所望の微生物密度に到達したら、主要な目標はアルコール産生量であってよい。変化が起きると、特に操作条件の変化に応じて、産物のプロファイルが発酵の進行とともにいかに変化するかを理解することでオペレータは生産性を最適化することができる。
【００１４】
ＣＯおよび任意成分のＨ２を、急速成長および／またはアルコール産生のような特定の要求についての最適濃度または最適範囲で含む基質を提供することもまた困難だがやりがいのあることである。例えば、過剰なＣＯは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２８５，４０２号に記載されるようにＣＯ阻止作用をもたらす可能性がある。さらに、過少なＣＯでは、微生物成長およびアルコール産生を含む代謝速度が落ちる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は上記の欠点を少なくともある程度克服するための過程を提供すること、または公衆に少なくとも有用な選択を与えることである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ＣＯを含む基質の微生物発酵による酸および／またはアルコールを含む産物を産生する方法に関し、少なくとも一部の微生物培養物は、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を微生物バイオマスに変換し；および／または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換し；および／または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換し；および／または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換する。
【００１７】
一態様では、前記微生物培養物は、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換し；かつ
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換する。
【００１８】
別の一態様では、前記微生物培養物は、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換し；かつ
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換し；かつ
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換する。
【００１９】
本発明の具体的態様では、前記基質はＣＯおよびＨ２を含む。しかしながら、本発明によれば、前記変換は全部の炭素を細胞物質および／または産物に固定するには不十分なＨ２で進行する。具体的態様では、Ｈ２の供給は２：１未満のＨ２：ＣＯが培養物により変換されるようになされ、例えば約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５、または約１：１０である。具体的態様では、Ｈ２は供給されない。
【００２０】
本発明の第一の側面では、ＣＯおよび任意成分のＨ２を含む基質の微生物発酵の効率を高める方法が提供され、その方法はＣＯの第一の部分が１種以上の酸および／または１種以上のアルコールを含む１種以上の所望の産物として固定され、ＣＯの第二の部分がＣＯ２に変換されるように前記基質を微生物培養物に提供することを含む。具体的態様では、ＣＯ２に変換されるＣＯの割合を定量して１種以上の所望の産物の産生のための基質供給速度を決定する。
【００２１】
具体的態様では、基質供給速度は、
ｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が最適値または最適範囲未満であると定量される場合には増加させ；または
ｉｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が最適値または最適範囲を超えていると定量される場合には減少させ；または
ｉｉｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が実質的に最適値または最適範囲にあると定量されると維持される。
【００２２】
具体的態様では、基質供給速度はＣＯ２に変換されるＣＯの割合が実質的に最適値または最適範囲に維持されるように自動的に調節される。
具体的態様では、前記最適な値または範囲は所望の発酵産物に基づき実験的に究明することができる。具体的態様では、アルコールが所望の産物である場合、前記基質は固定炭素の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％がアルコールとして固定されるように提供することができる。それに加えてまたはそれに代えて、アセタートが所望の産物である場合、前記基質は固定炭素の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％がアセタートとして固定されるように提供することができる。
【００２３】
具体的態様では、所望の産物として固定される炭素の割合は実質的に一定に維持することができる。具体的態様では、所望の産物として固定される炭素の割合が所定の範囲から外れる場合に、基質の供給は前記割合が所定の範囲に戻るように制御される。具体的態様では、前記所定の範囲は約±１％、または約±２％、または約±３％、または約±４％、または約±５％である。
【００２４】
具体的態様では、基質の供給は前記所定の範囲からの逸脱に応じて自動的に調節される。
本発明の第二の側面では、ＣＯおよび任意成分のＨ２を含む基質の微生物発酵による１種以上の酸および／またはアルコールの生産効率を高める方法が提供され、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；
から、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；
へ微生物培養物の少なくとも一部が遷移される。
【００２５】
本発明の具体的態様では、微生物培養物の少なくとも一部をその微生物培養物および／または前記基質流を調節して遷移することができる。特定の態様では、嫌気性発酵はバイオリアクタ内で実行され、前記微生物培養物は培養液を含む発酵液に少なくともある程度に懸濁される。具体的態様では、前記微生物培養物の少なくとも一部を前記発酵液および／または培養液を調節して遷移することができる。
【００２６】
特定の態様では、前記調節は、前記発酵液のｐＨの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のＣＯ濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液の攪拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および／またはアルコール濃度の変更、前記培養液中の１種以上の栄養素の変更、１種以上の栄養素の供給速度の変更のうち１種以上を含む。
【００２７】
本発明の具体的態様では、ＣＯを含む前記基質はまたＨ２を含む。ある態様では、前記調節は前記発酵液のＨ２濃度の変更および／または前記発酵液中のＣＯ：Ｈ２比の変更を含む。特定の態様では、ＣＯおよび任意成分のＨ２を含む前記基質はガス状である。ある態様では、前記調節には前記バイオリアクタ内のＣＯおよび／またはＨ２の分圧の変更を含む。
【００２８】
本発明の具体的態様では、前記方法は前記微生物培養物による正味の変換が定量できるように、ＣＯ２に酸化されたＣＯの割合を定量することを含む。具体的態様では、前記微生物発酵の全体的な正味の変換は、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換することである。
【００２９】
第三の側面では、所定の操作パラメータに基づくＣＯを含む基質の微生物発酵による１種以上の酸および／またはアルコールの産生効率を高める方法が提供され、前記方法は１種以上の産物に向けられる炭素の割合を定量し、定量結果により、
ｉ）所望の産物として固定される炭素の割合が増加するように１種以上の操作パラメータを調節すること；または
ｉｉ）所望の産物として固定される炭素の割合が実質的に一定に維持されるように操作パラメータを維持すること
のいずれかを含む。
【００３０】
特定の態様では、前記調節は下記の操作パラメータの１種以上を変更することを含む。すなわち、前記発酵液のｐＨの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のＣＯ濃度の変更、基質の供給速度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液の攪拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および／またはアルコール濃度の変更、前記培養液中の１種以上の栄養素の変更、１種以上の栄養素の供給速度の変更である。
【００３１】
本発明の具体的態様では、ＣＯを含む前記基質はＨ２をも含む。ある態様では、前記調節は前記発酵液のＨ２濃度の変更および／または前記発酵液中のＣＯ：Ｈ２比の変更を含んでよい。特定の態様では、ＣＯおよび任意成分のＨ２を含む前記基質はガス状である。ある態様では、前記調節には前記バイオリアクタ内のＣＯおよび／またはＨ２の分圧の変更を含む。
【００３２】
前記第一、第二、第三の側面の具体的態様では、効率を高める前記方法にはアルコール、特にエタノールのような産物が１種以上産生される速度を高めることを含む。
本発明の第四の側面では、ＣＯを含む基質の微生物発酵における全体的な正味の変換の定量方法が提供され、前記方法は微生物培養物によって特定の産物として固定される炭素の割合の定量を含む。
【００３３】
具体的態様では、特定の産物として固定される炭素の割合はＣＯ２へ酸化されるＣＯの割合を定量して定めることができる。
具体的態様では、前記微生物発酵における全体的な正味の変換は、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること、または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換することである。
【００３４】
具体的態様では、ＣＯ２に変換されたＣＯの割合は前記微生物培養物によって消費されたＣＯおよび任意成分のＨ２並びに微生物培養物によって産生されたＣＯ２を測定して決められる。
【００３５】
前記第一、第二、第三、または第四の側面の特定の態様では、バイオリアクタに出入りするＣＯ、Ｈ２、および／またはＣＯ２は実質的に連続的に、または調節がなされる前後のような不連続な時点で監視することができる。ある態様では、バイオリアクタに出入りするＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２の量はガスクロマトグラフィーを用いて定量することができる。具体的態様では、ガスクロマトグラフィーはＣＯ２に変換されたＣＯの割合を定量するのに使用される。一態様では、前記ガスクロマトグラフィーはマイクロＧＣを使用して実施される。
【００３６】
前記微生物培養物の一部は別の変換を伴う可能性が認められるが、全体の培養物による全体的な正味の変換を定量することはできる。本発明の具体的態様では、基質流が５％未満のＨ２、または４％未満のＨ２、または３％未満のＨ２、または２％未満のＨ２、または１％未満のＨ２を含むような態様で、実質的にＨ２が制限されている場合には、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が０．５であるとＣＯを含む基質の１種以上の酸および必要なら微生物細胞への正味の変換を示す。ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が０．６６７であるとＣＯを含む基質の１種以上のアルコールへの正味の変換を示す。ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が０．５〜０．６６７であるとＣＯを含む基質の１種以上の酸および１種以上のアルコール並びに必要なら微生物細胞への正味の変換を示す。ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が０．６６７を超えるとＣＯおよび１種以上の酸を含む基質の１種以上のアルコールへの正味の変換を示す。
【００３７】
上記の側面の種々の態様において、少なくとも一部の微生物培養物は１種以上のアルコールを１種以上の酸および一酸化炭素に変換するかもしれない。しかしながら、具体的な態様では、前記嫌気性発酵はＣＯを含む基質の産物への正味の全体的変換をもたらす。他の態様では、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が０．５未満の場合、前記正味の変換は１種以上のアルコールから１種以上の酸への変換であり、そしてＣＯ２および／またはＨ２Ｏの還元であり、望ましくない。
【００３８】
本発明の第五の側面では、ＣＯを含む基質流の１種以上の酸および／または１種以上のアルコールのような産物への前記微生物発酵のためのシステムが提供され、前記システムは微生物培養物を含有するバイオリアクタ、特定の産物として固定される炭素の割合を定量するように構成された測定手段、および前記微生物培養物および／または前記基質流に対して１種以上の調節をするように構成された少なくとも１種の調節手段を含む。
【００３９】
具体的態様では、前記測定手段はバイオリアクタから出る排出流の組成および必要ならバイオリアクタに入る基質流を定量するように構成された少なくとも１種の手段を含む。前記測定手段は所望の産物として固定される炭素の割合が定量できるように処理手段に必要に応じて連結されてよい。一態様では、前記測定手段はガスクロマトグラフである。
【００４０】
特定の態様では、前記調節手段は前記定量手段が所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断した場合には１種以上の調節を行うように構成される。具体的態様では前記調節は、前記発酵液のｐＨの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のＣＯ濃度の変更、前記発酵液のＨ２濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液の攪拌速度、産物の除去、前記発酵液の酸および／またはアルコール濃度の変更、前記培養液中の１種以上の栄養素の変更、１種以上の栄養素の供給速度の変更による調節を行うように構成される。
【００４１】
具体的な態様では、前記システムは所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断した場合には、前記微生物培養物および／または基質流に対して１種以上の調節を行うように１種以上の調節手段を制御するように構成される処理手段を含む。 他の態様では、前記システムはオペレータ向けの視覚的および／または聴覚的フィードバックを含んでよく、その結果前記オペレータは調節手段を手動で制御することができる。
【００４２】
前記種々の側面の具体的態様では、前記基質は工業的過程の副産物として得られるガスを含む。特定の態様では、前記工業的過程は鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、バイオマスのガス化、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、およびコークス生産からなる群から選択される。具体的な態様では前記ガス基質は製鋼所から得られるガスを含む。
【００４３】
特定の態様では、前記基質は容量で２０％のＣＯから１００％のＣＯ、例えば容量で４０％から９５％のＣＯ、容量で６０％から９０％のＣＯ、または容量で７０％から９０％のＣＯを含む。具体的な態様では、前記基質は容量で２５％、または３０％、または３５％、または４０％、または４５％、または５０％のＣＯを含む。
【００４４】
前記基質は水素を含む必要はないが、水素の存在が本発明の方法に従えば産物の形成に弊害をもたらすことはない。具体的な態様では、水素の存在がアルコール産生の全体的効率を高める結果になる。前記ガス基質はまたある程度のＣＯ２例えば容量で約１％から約８０％のＣＯ２、または容量で１％から約３０％のＣＯ２を含有してもよい。
【００４５】
前記種々の側面の具体的な態様では、ＣＯを含む前記基質はガス状である。
具体的な態様では、前記発酵過程により産生されるアルコールはエタノールである。前記発酵反応はまたアセタートを産生してもよい。
【００４６】
具体的な態様では、前記発酵反応は多くのカルボキシド栄養性細菌の一種以上の株によってなされる。好ましくは、前記カルボキシド栄養性細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)、クロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム・ラグスダレイ(Clostridium ragsdalei)、クロストリジウム・カルボキシジボランス(Clostridium carboxydivorans)、およびムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)などのクロストリジウム、ムーレラ、およびカルボキシドサーマスから選択される。一態様では、前記カルボキシド栄養性細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【００４７】
本発明は上記に広く定義されるが、それに限定されることはなく、下記に提供する実施例の態様を含む。
本発明は以下の添付図面を参照して詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１はアルコールを含む産物を産生するためのＣＯを含む基質のバッチ発酵におけるアセタートとアルコールの産生量およびＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）の変化を示すグラフである。
【図２】図２はアルコールを含む産物を産生するためのＣＯを含む基質のバッチ発酵におけるアセタートとアルコールの産生量およびＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）の変化を示すグラフである。
【図３】図３は本発明の特定の態様に従って、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を定量するための手段を含むシステムの略図である。
【図４】図４は実施例３における微生物培養物によって消費されたＣＯおよびＨ２の量を示すグラフである。
【図５】図５は実施例３における微生物培養物の代謝産物産生量と成長を示すグラフである。
【図６】図６は実施例４におけるＣＯの量と微生物培養物によって消費された量を示すグラフである。
【図７】図７は実施例４における微生物培養物の代謝産物産生量と成長を示すグラフである。
【図８】図８は実施例５における連続発酵での代謝産物産生量を示すグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００４９】
クロストリジウム・オートエタノゲナムのようなカルボキシド栄養性細菌は、同時に進行する多くの異なる作用によって、ＣＯおよび任意成分のＨ２を含む基質の嫌気性発酵により１種以上の酸および１種以上のアルコール等の産物を予想外に産生する。カルボキシド栄養性微生物による１種以上の酸および１種以上のアルコールの産生が水の産生を付随しないで起きることが意外にも認められた。従前報告されたＣＯおよびＨ２を含む基質の発酵では、アルコールおよび／または酸のような産物は水と一緒に産生されると考えられる。しかしながら、細胞物質並びにアルコールおよび／または酸のような産物に完全な炭素固定をするのに使用可能なＨ２が不十分であると、前記発酵は水の産生を付随せずに進行することが意外にも認められた。具体的な態様では、微生物培養物によって２：１未満のＨ２：ＣＯ比、例えば約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５、または約１：１０、でＨ２およびＣＯが消費される場合には、完全な炭素固定をするのに使用可能なＨ２が不十分である。具体的な態様では、Ｈ２は前記微生物培養物には実質的に利用されない。
【００５０】
理論に制約されることは望まないが、アセタートおよびエタノールは下記の同時進行する作用の少なくとも一つ、または少なくとも二つ、または少なくとも三つ、またはすべてによって産生される。
【００５１】
１．一酸化炭素の酢酸への固定
２ＣＯ＋２Ｈ２→ＣＨ３ＣＯＯＨ
２．一酸化炭素のエタノールへの固定
３ＣＯ＋３Ｈ２→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋ＣＯ２
３．酢酸のエタノールへの還元
ＣＨ３ＣＯＯＨ＋Ｈ２→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋ＣＯ２
４．エタノールの酢酸への酸化
ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２
同化作用または微生物細胞の大量蓄積は通常は少なくとも作用１に付随して起きる。しかしながら、他の代謝産物に比較して少ない割合の炭素だけが同化作用に向けられると考えられる。
【００５２】
さらに、前記微生物は水性ガスシフト反応（ＣＯ＋Ｈ２Ｏ→ＣＯ２＋Ｈ２）を経てそれら自身のＨ２を産生する。したがって、アセタートおよびエタノールを含む代謝産物もまたＡ〜Ｃに従って産生される。
【００５３】
Ａ）４ＣＯ＋２Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２
Ｂ）６ＣＯ＋３Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋４ＣＯ２
Ｃ）ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ＋Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋２ＣＯ２
前記微生物培養物は動的であり、理論に制約されることは望まないが、前記微生物培養物はＣＯおよび任意成分のＨ２を含む基質の少なくとも一部を1〜3およびＡ〜Ｃの一つ以上にしたがって同時に産物に変換すると考えられる。したがって、動的微生物培養物では、いくつかの異なる作用がシステム内で進行して全部のＣＯのアルコールおよび／または酸への全体的な正味の変換がされる。ＣＯがいかに代謝されるかを定量するには、Ｈ２の影響と式１〜３の式Ａ〜Ｃに対する重みづけ決めなければならない。これが決まれば、式１〜３および式Ａ〜Ｃの相対的な個々の影響は、産生されたＣＯ２、並びに消費されたＨ２およびＣＯを定量して定められる。
【００５４】
本発明の一側面によれば、ＣＯを含む基質の微生物発酵による酸および／またはアルコールを含む産物を産生するための方法が提供され、微生物培養物の少なくとも一部は、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸および微生物細胞に変換し；および／または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換し；および／または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換し、および／または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換する。
【００５５】
ＣＯ２へ変換されるＣＯの割合を定量することで、ＣＯを代謝する細菌について、アルコールおよび／または酸のような産物の産生プロファイルを予見するモデルシステムが開発できることが意外にも見出された。産物中の酸化の程度は前記細菌が有機酸またはアルコールを合成しているかどうかにより異なるから、細菌が溶媒産生（アルコール産生など）に供している炭素の割合は基礎をなす化学過程の化学量論に基づいて予測できる。
【００５６】
システムの産物プロファイルがいかに変化するかを理解することで、アルコール産生量の増大のような望ましい成果を増長するためにすべきシステムの操作条件の調節または変更を可能にする。さらに、具体的な態様では、本発明はＣＯを含む基質の１種以上のアルコールおよび／または１種以上の酸を含む産物を産生するための発酵効率を上げる方法を提供し、前記方法は基質を最適な濃度または最適な範囲内で供給することを含む。
【００５７】
具体的な態様では、Ｈ２が存在しないか限定的な量のＨ２とともにＣＯが供給される場合、１〜３の前記影響はわずかである。限定的な量のＨ２が利用できる場合は基質流中のＨ２の割合が、例えば４％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満のように、５％未満である。そのような場合、式Ａ〜Ｃの相対的影響はＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比をｙ＝２／３ｘ＋０．５により計算して定めることができる。そのような態様では、式Ａは０．５の比を与え、式Ｂは０．６６７の比を与え、式Ｃは０．６６７よりも大きな値を与え、式４は０．５よりも小さな値を与える。この計算値から、各式の相対的影響が判断される。
【００５８】
本発明はまたＣＯを含む基質の微生物発酵による１種以上の酸および／またはアルコールを産生する効率を高める方法が提供され、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸および微生物細胞に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；
から、
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸および微生物細胞に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上の酸に変換すること；または
ＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；または
１種以上の酸、およびＣＯを含む基質の少なくとも一部を１種以上のアルコールに変換すること；
へ微生物培養物の少なくとも一部は遷移される。
定義
別に定義されない限り、明細書を通して使用される下記の用語は次のように定義される。
【００５９】
「効率を高める」、「高い効率」などの用語は発酵過程に関連して使用される場合、以下の１種以上を高めることを含むが、これらに限定はされない。すなわち、発酵に触媒作用を及ぼす微生物の成長速度、消費される基質（例えば一酸化炭素）の容積あたり産生される所望の産物（例えばアルコール）の容積、所望の産物の産生速度または産生濃度、および発酵の他の副産物と比較した産生した所望の産物の相対的割合である。
【００６０】
「一酸化炭素を含む基質」などの用語は、一酸化炭素が例えば成長および／または発酵のために細菌の１種以上の株に利用可能な任意の基質を含むと理解される。
「一酸化炭素を含むガス基質」は一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。そのガス基質は通常はかなりの割合のＣＯを含有し、好ましくは容積で少なくとも約５％から約１００％のＣＯを含有する。
【００６１】
発酵産物の文脈では、明細書中の「酸」という用語は、明細書に記載されるように発酵液中に存在する遊離酢酸およびアセタートの混合物のような、カルボン酸およびその関連カルボン酸陰イオンの両方を含む。発酵液中の分子状の酸のカルボキシラートに対する比はその系のｐＨに依存する。「アセタート」という用語は、例えば本明細書で記載されるように発酵液中に存在する酢酸塩と遊離酢酸の混合物のような、酢酸塩単体並びに分子状または遊離酢酸および酢酸塩の混合物の両方を含む。発酵液中の分子状の酢酸のアセタートに対する比はその系のｐＨに依存する。
【００６２】
「バイオリアクタ」という用語は一つ以上の容器および／または塔または配管からなる発酵装置を含み、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、中空繊維膜反応器（ＨＦＭＢＲ）のような膜反応器、静的ミキサー、または気液接触に適切な他の容器または装置を含む。
【００６３】
文脈が他を要求しない限り、「発酵する」、「発酵過程」、または「発酵反応」などの語句は、本明細書では過程中の成長段階と産物の生合成段階の両方を包含することを意図している。本明細書でさらに記載されるように、ある態様では、前記バイオリアクタは第一の成長反応器と第二の発酵反応器を含む。そのような場合に金属または組成物の発酵反応への添加はこれらの反応器の一方または両方への添加を含むと理解される。
【００６４】
「全体的な正味の変換」などの用語は、本明細書ではＣＯのような基質の特定の時点における微生物培養物による１種以上の酸および／または１種以上のアルコールを含む産物への変換を記載することを意図する。微生物培養物の一部は特定の時点において異なる作用に供され、多くの産物が産生されることが認められる。さらに、発酵液中に存在する１種以上の産物が他の産物に変換される。したがって全体的な正味の変換は任意の特定の時点における微生物培養物によって産生されるすべての産物を含む。
【００６５】
下記の記載は本発明の具体的な態様、すなわち主要な基質としてＣＯを用いたエタノールおよび／またはアセタートの産生に焦点を合わせるが、本発明は別のアルコールおよび／または酸の産生に応用できることは当然であり、別の基質を使用することも本発明に関連する当業者によって知られている。例えば、二酸化炭素および水素を含有するガス基質を使用できる。さらに、本発明は酪酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、エタノール、プロパノール、およびブタノールを産生する発酵に応用できる。前記方法はまた水素の産生に使用してもよい。一例として、これらの産物はムーレラ、クロストリジア（Clostridia）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、ユウバクテリウム（Eubacterium）、ブチリバクテリウム（Butyribacterium）、オキシオバクター（Oxobacter）、メタノサルシナ（Methanosarcina）、およびデスルフォトマクルム（Desulfotomaculum）属からの微生物を使用した発酵により産生することができる。
【００６６】
本発明の特定の態様では、１種以上の工業的過程により産生されるガス流を使用するように構成される。そのような過程は製鋼工程、特に高いＣＯ含量、すなわち所定の濃度（すなわち５％）を超えるＣＯ含量を有するガス流を産生する過程を含む。そのような態様では、酢酸産生菌が酸および／またはアルコール、特にエタノールまたはブタノール、を一つ以上のバイオリアクタ内で産生するのに好ましく使用される。当業者は本開示を検討して本発明は種々の産業または排ガス流(内燃機関を有する車両の排ガス流を含む）に応用できると気付くであろう。また、当業者は本開示を検討して本発明は同じまたは異なる微生物を用いた場合を含む他の発酵反応に応用できることに気付くであろう。したがって、本発明の範囲は前記の具体的な態様および／または応用に限定されず、広義に解釈され、例えば前記ガス流源は少なくともその一成分が発酵反応に供することに使用できる限り、限定されない。本発明は自動車排ガスおよび高容量ＣＯ含有の産業排煙ガスのようなガス基質からの全体的な炭素捕捉を改善し、並びに／またはエタノールおよび他のアルコールの産生への適用性が特に高い。
【００６７】
発酵
ガス基質からエタノールおよび他のアルコールを産生する過程は知られている。典型的な過程は例えばＷＯ２００７／１１７１５７、ＷＯ２００８／１１５０８０、米国特許第６，３４０，５８１号、米国特許第６，１３６，５７７号、米国特許第５，５９３，８８６号、米国特許第５，８０７，７２２号、米国特許第５，８２１，１１１号に記載され、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
多くの嫌気性細菌がｎ−ブタノールおよびエタノールを含むアルコール並びに酢酸へのＣＯの発酵を行うことができることが知られ、本発明の過程に使用に適する。本発明の使用に適するそのような細菌としては、ＷＯ００／６８４０７、ＥＰ１１７３０９、米国特許第５，１７３，４２９号、第５，５９３，８８６号、および第６，３６８，８１９号、ＷＯ９８／００５５８およびＷＯ０２／０８４３８に記載されるものを含むクロストリジウム・リュングダリイ株のようなクロストリジウム属、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Liou et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091）、クロストリジウム・ラグスダレイ（ＷＯ／２００８／０２８０５５）およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Abrini et al, Archives of Microbiology 161: pp 345-351）が挙げられる。その他の適合する細菌にはムーレラ種ＨＵＣ２２−１（Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612）を含むムーレラ属のもの、およびカルボキシドサーマス種（Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260）のものが挙げられる。さらには、ムーレラ・サーモアセチカ、ムーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermoautotrophica）、ルミノコッカス・プロダクタス（Ruminococcus productus）、アセトバクテリウム・ウッディー（Acetobacterium woodii）、ユウバクテリウム・リモーサム（Eubacterium limosum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィクム（Butyribacterium methylotrophicum）、オキシオバクター・フェニギー（Oxobacter pfennigii）、メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）、メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）、およびDesulfotomaculum kuznetsovii (Simpa et. al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. pp41-65) が挙げられる。なお、その他の酢酸を産生する嫌気性細菌も本発明に適用されてもよいことは当業者により理解される。また本発明は２種以上の細菌の混合培養物に当然に適用される。
【００６９】
本発明の使用に適する典型的な微生物の１種はクロストリジウム・オートエタノゲナムである。一態様では、前記クロストリジウム・オートエタノゲナムはドイツ生物材料資源センター（ＤＳＭＺ）において寄託第１９６３０号として同定される寄託株の同定特性を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。別の一態様では、前記クロストリジウム・オートエタノゲナムはＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭＺ１００６１号として同定される特性を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【００７０】
本発明の方法に使用される細菌の培養は当業者に知られている多くの培養過程と嫌気性細菌を用いた発酵基質を用いて行われる。典型的な手法は下記の「実施例」の項に提供される。さらなる例としては発酵のためのガス基質を使用する下記の論文に一般的に記載されている過程が利用できる。(i) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources（合成ガス発酵源のためのバイオリアクタ）. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations（合成ガス発酵のためのバイオリアクタ設計）. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels（合成ガスの液体または気体燃料への生物変換）. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation（ガス基質発酵の研究）: Carbon Monoxide Conversion to Acetate（一酸化炭素のアセタートへの変換）. 2. Continuous Culture（連続培養）. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations（ガス基質発酵の研究）: Carbon monoxide conversion to acetate（一酸化炭素のアセタートへの変換）. 1. Batch culture（バッチ培養）. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations（石炭合成ガス発酵のためのバイオリアクタ設計）. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160。これらのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
前記発酵は連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器、ガスリフト発酵槽、気泡塔反応器（ＢＣＲ）、中空繊維膜反応器（ＨＦＭＢＲ）のような膜反応器、またはトリクルベッド反応器（ＴＢＲ）のような適切なバイオリアクタ内で行われる。また、本発明のある態様では、前記バイオリアクタには微生物が培養される第一の成長反応器と成長反応器から発酵液が供給されほとんどの発酵産物（例えばエタノールおよびアセタート）が産生される第二の発酵反応器を含むことができる。
【００７２】
本発明の種々の態様では、発酵反応のための炭素源はＣＯを含むガス基質である。前記基質は、工業過程の副産物として得られる、または自動車排ガスのようなその他の源から得られるＣＯ含有排ガスであってよい。特定の態様では、前記工業的過程は製鋼所のような鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、およびコークス生産からなる群から選択される。これらの態様では、前記ＣＯ含有基質は任意の使いやすい方法を用いて、大気へ放出される前に工業的過程から捕捉される。ＣＯ含有基質の組成により、基質を発酵に導入する前に処理して塵埃粒子のような望ましくない不純物を除去することも望ましい。例えば、前記ガス基質は既知の方法を用いてろ過または洗浄される。
【００７３】
あるいは、前記ＣＯ含有基質はバイオマスのガス化により調達されてもよい。前記ガス化過程は空気または酸素の供給を制限したバイオマスの部分燃焼を伴う。得られたガスは通常は主にＣＯおよびＨ２を含み、わずかにＣＯ２、メタン、エチレンおよびエタンを含む。例えば、サトウキビから砂糖のような食材を抽出または加工する間に得られるバイオマス副産物、またはトウモロコシもしくは穀物からのデンプン、または林業で発生する非食物バイオマス廃棄物をガス化して本発明の使用に適するＣＯ含有ガスを産生することができる。
【００７４】
前記ＣＯ含有基質は通常は主要な割合のＣＯを含み、例えば少なくとも容量で約２０％から約１００％のＣＯ、容量で４０％から９５％のＣＯ、容量で６０％から９０％のＣＯ、および容量で７０％から９０％のＣＯを含む。具体的な態様では、前記基質は容量で２５％、または３０％、または３５％、または４０％、または４５％、または５０％のＣＯを含む。例えば６％のようなより低い濃度のＣＯを有する基質も、特にＨ２およびＣＯ２の共存下では適切である。
【００７５】
前記基質は水素を含む必要はないが、本発明の方法に従えばＨ２の存在が産物の形成に弊害をもたらすことはない。具体的な態様では、水素の存在がアルコール産生の全体的効率を高める結果になる。例えば、具体的な態様では、前記基質はＨ２：ＣＯ比として２：１、または１：１、または１：２まで含むことができる。他の態様では、前記基質流は例えば５％未満、または４％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満、のような低濃度のＨ２を含むか、または実質的に水素を含まない。前記基質はまたある程度のＣＯ２例えば容量で約１％から約８０％のＣＯ２、または容量で１％から約３０％のＣＯ２を含有してもよい。
【００７６】
通常は、前記一酸化炭素は気体状態で発酵反応に添加される。しかしながら、本発明の方法はこの状態での基質の添加に限定されない。例えば、前記一酸化炭素は液状で供給することができる。例えば、液体が一酸化炭素含有ガスで飽和され、その液体がバイオリアクタに添加されてもよい。これは標準的なやり方を用いて達成される。一例としては、微小気泡分散発生機（Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation（好気性発酵のための微小気泡分散発生機のスケールアップ）; Applied  Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002）はこの目的のために使用できる。
【００７７】
細菌の成長とＣＯのアルコールへの発酵が起きるためには、ＣＯ含有の基質ガスに加えて、適切な培養液がバイオリアクタに供給される必要がある。栄養媒体は使用される微生物が成長できるに十分なビタミンとミネラルを含む。ＣＯを単独の炭素源として用いるエタノールの発酵に適した嫌気性媒体は当業者に知られている。例えば、適合する媒体は上記に参照した米国特許第５，１７３，４２９号および第５，５９３，８８６号、並びにＷＯ０２／０８４３８、ＷＯ２００７／１１５１５７、およびＷＯ２００８／１１５０８０に記載されている。本発明は微生物の成長、および／または発酵過程におけるアルコール産生を支える効能が高い新規の媒体を提供する。この媒体については以下により詳しく記載される。
【００７８】
前記発酵は所望の発酵が生じる（例えばＣＯからエタノールへ）ように適切な条件下で望ましく行われなければならない。考慮すべき反応条件は、圧力、温度、ガス流速、液体流速、媒体ｐＨ、媒体酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型反応器を使用の場合）、接種材料濃度、液相中のＣＯが限定されないための最大ガス基質濃度、産物阻害を避けるための最大産物濃度が挙げられる。適合条件はＷＯ０２／０８４３８、ＷＯ０７／１１７１５７およびＷＯ０８／１１５０８０に記載されている。
【００７９】
最適反応条件は部分的には具体的な使用微生物に依存する。しかしながら、一般に、前記発酵は環境圧力よりも高い圧力で行われることが好ましい。高い圧力での操作はＣＯがガス相からエタノール産生のための炭素源として微生物によって吸収されて液相へ移動する速度を顕著に高める。これは換言すると、バイオリアクタを環境圧力よりも高圧に維持すると保持時間（バイオリアクタ中の液体容量を投入ガス流速で割ったものと定義される）を減らすことができることを意味する。
【００８０】
また、所定のＣＯからアルコールへの転換速度は部分的に基質保持時間の関数であり、換言すると所望の保持時間を達成することは必要とされるバイオリアクタの容積を決定するから、加圧システムの使用は必要とされるバイオリアクタの容量、その結果として発酵装置の投資コストを大幅に減らすことができる。米国特許第５，５９３，８８６号に記載の実施例によれば、反応器の容量は反応器の操作圧力の増加に線形に比例して小さくすることができ、具体的には１０気圧の操作圧力のバイオリアクタは１気圧の操作圧力のバイオリアクタの容量の１／１０を必要とするだけである。
【００８１】
ガスからエタノールへの発酵を高圧で行うことの利点は他にも記載されている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８は３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの圧力で行うガスからエタノールへの発酵が、それぞれエタノールの生産性として１５０ｇ／ｌ／日および３６９ｇ／ｌ／日を得たことを記載している。しかしながら、同様の媒体と投入ガス組成を用いて大気圧で行う発酵実施例では１日あたり１リットルあたりのエタノールは１０倍から２０倍少ない生産量であることが分かった。
【００８２】
ＣＯを含むガス基質の導入速度は液相中のＣＯ濃度が制限されないようなものであることも望ましい。これはＣＯが制限された条件の結果としてエタノール産物が培養物によって消費されるからである。
【００８３】
産物の回収
発酵反応の産物は既知の方法を用いて回収することができる。典型的な方法としてはＷＯ０７／１１７１５７、ＷＯ０８／１１５０８０、米国特許第６，３４０，５８１号、  米国特許第６，１３６，５７７号、米国特許第５，５９３，８８６号、米国特許第５，８０７，７２２号、および米国特許第５，８２１，１１１号に記載のものが挙げられる。しかしながら、簡単にいうと一例では分留または蒸発、および抽出発酵のような方法により発酵液からエタノールだけが回収される。
【００８４】
発酵液からのエタノールの蒸留でエタノールと水の共沸性混合物（すなわち９５％エタノールと５％水）が得られる。無水エタノールはその後に、これも当業者に知られている分子篩エタノール脱水技術を用いて得られる。
【００８５】
抽出発酵処理は発酵微生物に対する毒性リスクが低い水混和性溶媒の使用を伴い、低濃度の発酵液からエタノールを回収する。例えばオレイルアルコールはこのタイプの抽出過程に使用できる溶媒の１種である。オレイルアルコールは発酵槽に連続的に導入され、すぐにこの溶媒は上昇して連続的に抽出され遠心分離機に供給される層を発酵槽の上端に形成する。水と細胞はその後にオレイルアルコールから容易に分離され発酵槽へ戻される一方、前記エタノールを含む溶媒はフラッシュ蒸発装置へ供給される。前記エタノールのほとんどは蒸発、凝縮されるが、オレイルアルコールは不揮発性で発酵に再使用のため回収される。
【００８６】
アセタートは前記発酵反応の副産物として産生され、やはり当業者に知られている方法を使用して発酵液から回収することができる。
例えば、活性炭フィルタを伴う吸着システムを使用することができる。この場合には、微生物細胞は適切な分離装置を用いて発酵液から最初に除去されることが好ましい。産物回収のために細胞が存在しない発酵液を作り出すための、ろ過に基づく多数の方法が当業者に知られている。前記の細胞を含まないエタノール（およびアセタート）含有透過物はその後アセタートを吸着するための活性炭を含むカラムを通過させられる。酸の形態のアセタート（酢酸）は塩の形態（酢酸塩）よりも容易に活性炭に吸着する。したがって、発酵液のｐＨは活性炭カラムを通過する前に約３未満に減じて、大部分のアセタートを酢酸の形態に変換することが好ましい。
【００８７】
活性炭に吸着した酢酸は当業者に知られている方法を用いて溶離により回収することができる。例えば、エタノールは前記固定したアセタートを溶離するのに使用することができる。特定の態様では、発酵過程それ自体で産生されるエタノールを、アセタートを溶離するのに使用することができる。エタノールの沸点は７８．８°Ｃで酢酸は１０７°Ｃであるから、蒸留のような揮発度に基づく方法を用いてエタノールとアセタートは容易に相互に分離させることができる。
【００８８】
発酵液からアセタートを回収するためのその他の方法も当業者に知られていて、本発明の過程に使用することができる。例えば米国特許第６，３６８，８１９号および第６，７５３，１７０号は発酵液からの酢酸の抽出に使用することができる溶媒および共溶媒システムを記載している。エタノールの抽出発酵について記載したオレイルアルコールに基づくシステムの例と同様に、米国特許第６，３６８，８１９号および第６，７５３，１７０号に記載のシステムは酢酸産物を抽出するために発酵生物が存在してもしなくても発酵液に混ぜることができる水不混和溶媒／共溶媒を記載している。前記酢酸産物を含む溶媒／共溶媒はその後蒸留によって発酵液から分離される。第二の蒸留段階は溶媒／共溶媒からの酢酸を精製するのにその後使用することができる。
【００８９】
発酵反応の産物（例えばエタノールおよびアセタート）は、発酵バイオリアクタからの発酵液の一部を連続的に除去し、発酵液からの微生物細胞を分離し（簡便にはろ過により）、かつ発酵液から１種以上の産物を同時にまたは逐次に回収することにより、発酵液から回収することができる。エタノールの場合には蒸留により簡便に回収することができ、アセタートは上記の方法を用いて活性炭に吸着して回収することができる。前記分離した微生物細胞は好ましくは発酵バイオリアクタに戻される。エタノールとアセタートが除去された後に残る細胞を含まない透過物もまた好ましくは発酵バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢなど）は細胞を含まない透過物がバイオリアクタに戻される前に添加して栄養媒体へ補給してもよい。また、前記発酵液のｐＨが上記のように調節されて活性炭への酢酸の吸着を促進させる場合には、前記ｐＨはバイオリアクタに戻す前に発酵バイオリアクタ中の発酵液と同様なｐＨに再調節されなければならない。
【００９０】
発酵における炭素固定の定量
ＣＯ２へ変換されるＣＯの割合を定量することで、ＣＯを代謝する細菌について、産物の産生プロファイルを予見するモデルシステムが開発された。前記産物中の酸化の程度は前記細菌が有機酸またはアルコールを合成しているかどうかにより異なるから、細菌が溶媒産生に供している炭素の割合は基礎をなす化学過程の化学量論に基づいて予測することができる。酸化された副産物（ＣＯ２）の程度の分析および／または定量化は微生物培養物による全体の産物変換のリアルタイムの指標を効果的に提供する。
【００９１】
本システムは前記反応器の状態を、基礎をなす化学量論から計算した一つ以上の「理想状態」の合成としてモデル化する。前記モデルシステムは具体的なガス標本を、二つの第一の状態と、利用できる水素に依存して二つの第二の混成反応を作り出す修正条件との間の「最適」折衷、および二つの第三の状態に割り当てる。
【００９２】
前記第一の状態は下記である。
一酸化炭素の酢酸への固定
２ＣＯ＋２Ｈ２→ＣＨ３ＣＯＯＨ（ＣＯ２／ＣＯ比は０）
一酸化炭素のエタノールへの固定
３ＣＯ＋３Ｈ２→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋ＣＯ２（ＣＯ２／ＣＯ比は０．３３３３）
遊離の水素ガスが存在しないと、これらの第一の反応の両方とも水性ガスシフト反応によって補完される。
【００９３】
ＣＯ＋Ｈ２Ｏ→Ｈ２＋ＣＯ２
この水性ガスシフトは遊離水素が存在しないで炭素固定が行われる場合には、炭素固定と同時に起きると想定することができる。
【００９４】
前記水性ガスシフトを前記二つの第一の反応と合わせると遊離水素ガスが存在しないで起きる一対の第二の混成反応を与える。
遊離水素が存在しない場合の一酸化炭素の酢酸への固定
４ＣＯ＋２Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２（ＣＯ２／ＣＯ比は０．５）
遊離水素が存在しない場合の一酸化炭素のエタノールへの固定
６ＣＯ＋３Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋４ＣＯ２（ＣＯ２／ＣＯ比は０．６６６７）
さらに二つの潜在的な第三の状態がある。
酢酸のエタノールへの還元
ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ＋Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋２ＣＯ２（ＣＯ２／ＣＯ比は１）
エタノールの酢酸への酸化
ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２（ＣＯ２／ＣＯ比は０）
ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を観察することにより、培養物の状態を推測することができ、その産物産生量を計算することができる。１００％水素消費の特性を有する培養物では、前記比は０と１／３の間で変化する。これは方程式ｙ＝ｌ／３ｘによる線形関数としてグラフに表すことができる。１００％水性ガスシフトの特性を有する培養物では、前記比は１／２と２／３の間で変化し、これは同様に方程式ｙ＝２／３ｘ＋０．５による線形関数としてグラフに表すことができる。
【００９５】
水素消費が無視できる場合、モデル化の目的では第一の線形関数は事実上無視することができ、観察したＣＯ２／ＣＯ値を用いて第二の方程式だけを解くことにより、計算されたｘの値はエタノール産生に向けられた炭素の割合になる。全部の炭素摂取量から遊離した全ＣＯ２量を差し引くと固定化に利用できる炭素が得られ、これに前記のあらかじめ計算した比を乗じるとエタノールとして固定される予測炭素量が得られる。二つの炭素原子が一つのエタノール分子に固定されるから、投入炭素モルを産生エタノールモルに変換するにはこの値を半分にしなければならない。
【００９６】
水素消費が。無視できないが産物および／または細胞物質として完全に炭素固定されるには不十分である場合には、培養物の状態を直接的に推測するにはＣＯ２／ＣＯ比も水素の量も使用することができない。水素からのエタノールの産生は下記の二つの間の範囲にある。
【００９７】
３ＣＯ＋３Ｈ２→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋ＣＯ２（ＣＯ２／ＣＯ比は０．３３３３）および
２ＣＯ＋２Ｈ２→ＣＨ３ＣＯＯＨ（ＣＯ２／ＣＯ比は０）
両方ともＣＯとＨ２を１：１の比で利用する。微生物培養物の水素消費部分によって占められるこの範囲の状況を知らなければ、水素を消費する微生物によるＣＯ２の相対的産生量は分からない。正確な全体的なＣＯ２／ＣＯ比は基礎をなす水性ガスシフトを利用する個体群によって産生されたＣＯ２を知らなければ計算できず、その数量は水素を消費するもののＣＯ２／ＣＯ比とそれらが産生するＣＯ２の相対的量を第一に正確に知ることなしには計算できない。
【００９８】
しかしながら、これは水素消費状態ではＨ２消費はＣＯ消費に等しく、前記第二の状態方程式もまたＣＯ２／Ｈ２比が、ｘ値よりもｚ値として表されることを考慮することにより回避することができ、
ｙ＝２／３ｘ＋０．５
および
ｙ＝  ｌ／３ｚ
である。
【００９９】
しかしながら、ｘとｚを関連づける第三の方程式がなければ、連立方程式を解くことはできない。培養物の状態は変化するから、この第三の方程式、ｙ＝ａｘ＋ｂｚは、実際は変数であり、発酵が進行する間培養物がアセタートまたはエタノールを産生する程度は当然に条件により変わる。
【０１００】
培養物が水素を全部消費する環境では、ＣＯ消費は水素消費と１：１であるから、ＣＯ２／ＣＯ比とＣＯ２／Ｈ２比の両方が等しくなる。このことから、ＣＯ２／ＣＯ比から計算される点とＣＯ２／Ｈ２比から計算される点の間に引かれる直線は、微生物個体群の水素消費特性が増大すると水平に近づき、ｚ軸切片は、前記直線が完全に水平な場合は水素を食べる状態においてＣＯ２はエタノールと１：１基準で産生されるから、エタノールへ固定される炭素の割合に直接的に比例することが推測される。
【０１０１】
この情報から、一つの概算を付加することができ、前記第三の「混成」方程式を計算することができる。
ＣＯ２／ＣＯとＣＯ２／Ｈ２比の間の直線の勾配がこの混成直線のｚ切片の重みづけを割り当てるのに使用される。この直線が水平な場合には前記勾配（［ＣＯ２／ＣＯ］／［ＣＯ２／Ｈ２］）は１であり、純粋な水素消費培養物を示し、すべてのエタノール産物は水素を消費するものに由来し、考慮すべき唯一の方程式は前記水素方程式である。
【０１０２】
この直線が水平から離れるにつれて、その勾配（［ＣＯ２／ＣＯ］／［ＣＯ２／Ｈ２］）はゼロに近づく。これをｚ切片を掛け合わせる乗法の重み値として使用すると、水素を消費するものによって産生されるＣＯ２（およびエタノール）の推測量は、ＣＯ２／ＣＯとＣＯ２／Ｈ２比の間の前記直線が水平からさらに一層離れるにつれてゼロに近づく。
【０１０３】
前記ｚ切片に前記勾配から導いた重みづけ係数を乗じて、水素を消費する微生物による全体的な産生されたＣＯ２の概算が得られ、前記水素を消費するものによって消費されたＣＯは水素消費と１：１であり、この値はその後代入され、方程式ｙ＝ｌ／３ｘを解く。水素を消費する微生物による前記ＣＯ消費とＣＯ２産生は全体の消費と産生から差し引かれ、前記水性ガスシフト個体群が関与する残余のＣＯとＣＯ２が得られ、この残余物の比を代入して方程式ｙ＝２／３ｘ＋０．５を解くことができる。こうして、１種以上の酸および／または１種以上のアルコールのような具体的な産物に固定される炭素の割合が定量される。
【０１０４】
当業者は消費されるＣＯと任意成分のＨ２の量および産生されるＣＯ２の量を所望により連続的にまたは不連続な時点で監視することができる。当業者に知られている方法を用いてＣＯ２、ＣＯ、およびＨ２を定量することができるが、本発明の一態様では、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いてバイオリアクタから出る排出流中に存在するＣＯ２、ＣＯ、およびＨ２の量の測定をする。アルコールおよび／または酸として固定される炭素の割合は、バイオリアクタに入る基質流の組成が分かれば計算することができる。基質流の組成が不明な場合にはさらなるガスクロマトグラフを用いて組成の定量を行うことができる。産生されたＣＯ２と消費された基質を定量するための他の方法には質量分析（ＭＳ）、ＧＣＭＳ、およびインラインセンサーが挙げられる。
【０１０５】
このように、本発明によれば、アセタートおよび／またはエタノールのような具体的な産物として固定される炭素の割合は産生されたＣＯ２、消費されたＣＯ、および消費された任意成分のＨ２を測定して定量することができる。基質（例えばＣＯおよび任意成分のＨ２）が微生物培養物に利用される速度はそれらが産生される速度と同じように産物の相対比に影響することが認められる。例えば、アセタートを産生する培養物への基質供給速度を増すとアルコール産生に向けられる炭素の割合を増すことができる。
【０１０６】
ＣＯと任意成分のＨ２を含む基質は通常は気体状態で提供され、微生物培養物に対するＣＯとＨ２の利用性は発酵システムの物質移動に依存することになる。例えば発酵液中に懸濁する微生物培養物に対するＣＯおよび／またはＨ２の利用性は温度、培養液組成、ガス供給速度、ガス組成、ＣＯ蒸気圧、Ｈ２蒸気圧、混合を含む当業者に知られている因子に依存する。したがって、微生物発酵に対するＣＯおよび／またはＨ２の利用性を増大させるには前記システムの物質移動特性を改善することが必要で、例えば基質の供給速度を高め、および／または機械的に撹拌されるバイオリアクタの撹拌を強めることである。
【０１０７】
本発明の方法によれば、発酵効率はＣＯと任意成分のＨ２を含む基質を最適濃度または範囲で、または最適濃度または範囲に向けて提供することにより改善することができる。最適濃度は前記発酵の所望の産物に基づき解明することができる。例えば、アルコールと微生物成長が望まれる場合は、ＣＯと任意成分のＨ２を含む基質は炭素が主にアルコールとして固定されるが、一部は微生物成長に利用されるように供給することができる。例えば、ＣＯを含む基質は微生物成長とアルコール産生が起きるように微生物に供給することができる。
【０１０８】
前記条件、特に前記基質供給速度および／またはＣＯおよびＨ２の相対濃度は微生物成長とアルコール産物が最適化されオペレータが満足するまで変化させることができる。炭素を産物に固定する各経路の影響は定量化することができるから、前記基質の供給を調節して発酵の間所望の条件に到達および／または維持することができる。例えば、基質流は変動するＣＯおよび／またはＨ２成分を含むことがあることが認められる。しかしながら、本発明の方法を用いれば、産物の正味の産生は基質の供給を調節することにより実質的に一定の比に維持することができる。
【０１０９】
これに加えてあるいはこれに代えて、微生物培養物が成長するかその微生物密度が変動するにつれて、前記基質の供給は産生されたＣＯ２並びに消費されたＣＯおよびＨ２の定量に基づき前記微生物培養物の要件に従って変化させることができる。
【０１１０】
その際、具体的な産物に向けられる炭素の割合は基質の供給および／または微生物密度についての変化に関わらず実質的に一定に維持することができる。本発明の具体的な態様では、前記具体的な産物に向けられる炭素の割合はオペレータが選択して前記条件を実質的に一定に維持するため調節することができる。例えば、オペレータが固定化炭素の９０％をエタノールへの産生に向ける必要がある場合、基質を前記割合が所定の範囲である±１％、または±２％、または±３％、または±４％、または±５％から外れないように供給することができる。具体的な態様では、前記基質の供給は具体的な産物に向けられる炭素の割合の定量に応じて制御することができる。具体的な態様では、前記基質の供給は具体的産物に向けられた炭素の割合の変化に応じて自動的に調節される。
【０１１１】
具体的な態様では、相当量のＨ２が存在しないでＣＯが供給される場合には、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を定量することができる。本発明の具体的な態様では、微生物成長とアルコール産生はアセタートが同時に産生される場合に最適化することができる。そのような場合は、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が０．６６７未満、例えば約０．６６、または約０．６５、または約０．６４、または約０．６３、または約０．６２、または約０．６１、または約０．６０、またはさらに小さいような場合が想定される。あるいは、アセタートが消費される場合に微生物成長とアルコール産生を最適化することができる。そのような場合はＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が０．６６７より大きい、例えば約０．６７、または約０．６８、または約０．６９、または約０．７０、またはさらに大きいような場合が想定される。
【０１１２】
最適濃度または最適範囲が定量されると、前記発酵または今後の発酵は同じような条件で操作することができ、実験的に定量された固定化炭素および／またはＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を実質的に維持するように、前記基質が供給される。ＣＯおよびＨ２を含む基質の発酵の最適比は同様に定量され適用される。
【０１１３】
追加のまたは別の一態様では、前記方法は微生物培養物がいつおよび／またはどのように一つの正味の全体的変換から別の変換へ遷移させられることができるか、またはすべきかを示すのに用いられる。例えば、前述したように、成長が第一の目的の場合には前記微生物培養物は好ましくは大部分の炭素がアセタートの産生に向けられるように維持することができる。例えば、ＣＯを含みＨ２はごく僅かしか含まないか全く含まない基質流では、前記ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は約０．５に維持される。前記ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が所定の範囲または閾値、例えば約０．４５〜０．５５、または約０．４８〜０．５２、を超えて外れた場合には、前記培養物および／または前記基質流を調節して、全体の培養物による全体の正味の変換が所望のものであるように、微生物培養物の少なくとも一部を遷移させる。例えば前記ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が約０．５であるように前記培養物を遷移させる。Ｈ２が存在する場合、炭素固定が実質的に一定に留まるよう、同等な調節を同様に行うことができる。
【０１１４】
本発明の具体的な態様では、前記微生物培養物の少なくとも一部は微生物培養物および／または前記基質流を調節して遷移させることができる。特定の態様では、バイオリアクタ中で嫌気性発酵が実施され、前記微生物培養物は少なくとも一部が培養液を含む発酵液中に懸濁する。具体的な態様では、前記微生物培養物の少なくとも一部は前記発酵液および／または培養液を調節することで遷移させることができる。
【０１１５】
特定の態様では、前記調節としては、前記発酵液のｐＨの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のＣＯ濃度の変更、前記発酵液のＨ２濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液撹拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および／またはアルコール濃度の変更、培養液中の１種以上の栄養素の変更、１種以上の栄養素の供給速度の変更の１種以上を含む。
【０１１６】
これに加えてあるいはこれに代えて、アルコール産生が第一の目的であるならば、基質は実質的にすべての炭素がエタノールとして固定されるように提供することができる。具体的な態様では、Ｈ２が利用できない場合には前記ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は好ましくは約０．６６７に維持することができる。前記ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が所定の範囲または閾値、例えば０．５８〜０．７３または０．６３〜０．７、を超えて外れた場合には、前記培養物および／または前記基質流を調節して微生物培養物の少なくとも一部を遷移させ、全体の培養物による全体の正味の変換が所望のものであるように、例えばＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比が約０．６６７に戻るようにする。
【０１１７】
追加のまたは別の態様では、約０．６６７のＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比に維持されたアルコールを産生する培養物は大量の不要なアセタート、例えば初期の成長段階からの残留アセタートを有するかもしれない。アセタートのアルコールへの還元（方程式３）の少なくとも一部を遷移させることにより、このアセタートはアルコールに変換することができる。そのような場合、前記培養物を調節して所望の変換が達成されるまで、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を０．６６７よりも大きくすることができる。
【０１１８】
ＣＯ２に酸化されたＣＯの割合を用いて微生物培養物の全体的な正味の変換を定量することができる。前記培養物によって消費されたＣＯの量はまた培養物の生存能力（特異的取り込み：ＣＯ摂取速度／細胞密度）の指標を提供する。したがって、本発明の方法は特異的取り込みの監視と組み合わせて用いることができる。例えば、具体的な産物として固定される炭素の割合および／または特異的取り込みが所定の閾値または範囲から外れる場合には、培養物に対して１種以上の調節をして生存能力および所望の変換を維持することができる。具体的な態様では、Ｈ２が制限され、または実質的に利用できない場合には、ＣＯの特異的取り込みは少なくとも０．５ｍｍｏｌ／グラム乾燥重量微生物細胞／分（ｍｍｏｌ／ｇ／分）であると推定され、例えば約０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分、例えば約０．７ｍｍｏｌ／ｇ／分、例えば約０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分、例えば約０．９ｍｍｏｌ／ｇ／分、例えば約１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分である。
【０１１９】
その際、具体的な産物として固定される炭素の割合はＣＯの特異的取り込みと組み合わせて使用して具体的な所望の代謝産物、例えば酸および／またはアルコールが産生される速度の定量をすることができる。具体的な態様では、前記方法を使用して１種以上の産物（アルコールなど）が産生される速度を最適化（すなわち改善）することにより微生物発酵の効率を改善することができる。例えば、エタノール産生は約０．６６７のＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を維持しながら、ＣＯの特異的取り込みを高める微生物培養物に対して１種以上の調節をすることにより高めることができる。これに加えてあるいはこれに代えて、１種以上の調節をして、ＣＯの摂取とＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を（例えば）０．５から（例えば）０．６６７に高めてアルコール産生の速度を改善することができる。
【０１２０】
本発明の具体的な態様では、ＣＯと任意成分のＨ２を含む基質の連続的発酵は少なくとも２日間、例えば少なくとも３日間、または例えば少なくとも５日間、または例えば少なくとも１週間、または例えば少なくとも１カ月間の長期間にわたり達成することができる。連続的発酵は新鮮な媒体を発酵液に供することと産物と微生物細胞を含む発酵液を除去して実質的に一定容量の発酵液を維持することを含む。具体的態様では、産物の濃度は１種以上のアルコール並びに１種以上の任意成分の酸および微生物細胞を含んで、連続的過程において実質的に一定に維持される。本発明の具体的な態様では、長期間連続的発酵を維持するには、前記微生物培養物は炭素の少なくとも一部をアセタートのような酸として固定する。前記アセタートは５ｇ／Ｌ未満の濃度で産生することができる。ただし、本発明の方法によれば、固定化炭素の大部分はエタノールのようなアルコールとして１０ｇ／Ｌ、または１５ｇ／Ｌより多く固定される。したがって、連続操業を維持するためには、前記基質は炭素がアセタート、エタノール、およびバイオマスとして固定されるように提供される必要がある。
【０１２１】
具体的な態様では、エタノールと少量のアセタートを長期間にわたり連続的に産生する発酵はＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を約０．６１〜０．６５の範囲内、例えば０．６２〜０．６４の間、に維持する。そのようなＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比により、大部分の固定化炭素がアルコール産生に向けられ、少量がアセタートと微生物成長を維持するための細胞物質に向けられ、その結果連続的培養物を維持する。具体的な態様では、前記基質はＣＯの特異的取り込みが少なくとも０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分、例えば１．０ｍｍｏｌ／グラム乾燥細胞質量／分、に維持されるように提供される。
【０１２２】
別の一態様によれば、非連続（バッチ）発酵は酸の産生を付随しないでアルコールが産生するように実施することができる。そのような態様では、アルコールおよび任意成分の細胞物質（バイオマス）が産生するように基質を提供する。本発明によれば、約０．６６７のＣＯ２／ＣＯ比が維持されるように基質を提供する。微生物培養物が成長すると、必要なＣＯ（および任意成分のＨ２）の量が高まることが認められる。しかしながら、本発明によれば、ＣＯの最適量は、基質供給速度が高まるときにＣＯ２／ＣＯ比を維持することによりもたらされる。
【０１２３】
図１は本発明の一態様によるシステム１００の概略図である。基質流１は適切な導管３を経てバイオリアクタ２に入る。基質流１はＣＯおよび任意成分のＣＯ２および／またはＨ２を含み、特定の態様では、前記基質は鋼の脱炭のような工業過程からの廃ガス流である。基質流１は絶えず供給されるという意味では一定流であるが、その流れの内容物は時間とともに変動してもよい。前記基質流の組成、特にＣＯおよびＣＯ２の濃度は既知であるか、またはその代わりに任意の定量手段（図示せず）により定量することができる。
【０１２４】
バイオリアクタ２は所望の発酵反応が産物を産生するように構成される。特定の態様によれば、バイオリアクタ２はＣＯを１種以上の酸および／またはアルコールを含む産物に変換するように構成される。バイオリアクタ２は一つ以上の槽を含むことができ、各槽は同じ反応および／または一つの具体的な発酵過程における異なる段階、および／または１種以上の共通段階を含んでもよい異なる発酵のための異なる反応を含む異なる反応を実施するように構成される。
【０１２５】
バイオリアクタ２内で産生された酸および／またはアルコールのような産物は当業者に知られている回収過程により回収することができる。
前記発酵反応で消費されない基質流の成分およびＣＯ２のような発酵反応の副産物は排出口４を経てバイオリアクタ２を出る。本発明の具体的な態様では、測定手段５は排出口４を経てバイオリアクタ２を出る排出流中のＣＯ、ＣＯ２、および任意成分のＨ２濃度を定量するように構成される。具体的な態様では、１種以上の酸および／または１種以上のアルコールに向けられる炭素の割合はバイオリアクタ２に供給されるＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２の量および出る量から定量することができる。したがって、オペレータは調節手段６を用いてバイオリアクタ２および／または前記培養物の基質流１中の微生物培養物を任意に調節して微生物培養物を所望の産生状態に維持し、またはその培養物をその状態に遷移させることができる。前記培養物を維持または遷移させる調節としては、前記発酵液のｐＨの変更、前記発酵液の酸化還元電位の変更、前記発酵液のＣＯ濃度の変更、前記発酵液のＨ２濃度の変更、前記基質流の組成の変更、前記基質流の圧力の変更、発酵液撹拌速度の変更、産物の除去、前記発酵液の酸および／またはアルコール濃度の変更、培養液の１種以上の栄養素の変更、１種以上の栄養素の供給速度の変更の１種以上を含む。
【０１２６】
これに加えてあるいはこれに代えて、システム１００は具体的な産物に向けられる炭素の割合を定量し調節手段６を制御するように構成された任意の処理手段７を含み、その結果前記培養物を所望の状態に維持し、または遷移することができる。
【０１２７】
具体的な態様では、バイオリアクタ２に出入りする前記ＣＯ２、Ｈ２およびＣＯは連続的にまたは不連続な時点で監視することができ、前記炭素固定を定量することができる。さらに、調節手段６は必要ならば連続的な調節または不連続な時点での調節がされるように構成することができる。
【０１２８】
ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を定量するための手段は任意だが、具体的な態様では、バイオリアクタ２から出る流れおよび任意の基質流１のＣＯ２およびＣＯの濃度を定量するのに一つ以上のガスクロマトグラフが使用される。一態様では、バイオリアクタ２から出る流れのＣＯ２およびＣＯの濃度を定量するための手段はバリアンＣＰ−４９００マイクロＧＣである。
【実施例】
【０１２９】
材料と方法（実施例１および２）
【０１３０】
【表１】
0005726760.tif 000002
【０１３１】
媒体の調製（実施例１および２）
媒体は次のように調製した。８５％Ｈ３ＰＯ４（２０ｍｍｏｌ）を１Ｌの溶液Ａに加えた。媒体のｐＨはＮａＯＨの５Ｍ溶液を添加して５．３に調節した。金属塩をその後１種以上の溶液Ｂに従い任意に加えた。媒体溶液は３０分間１２１°Ｃの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加え、１０ｍｌのビタミンＢ溶液（溶液Ｃ）を加えた。
【０１３２】
Ｎａ２Ｓｘの調製
５００ｍｌのフラスコにＮａ２Ｓ（９３．７ｇ、０．３９モル）および２００ｍｌのＨ２Ｏを入れた。溶液を撹拌して塩を溶解した後、硫黄（２５ｇ、０．１モル）を一定Ｎ２流の下で加えた。室温で２時間撹拌した後、その「Ｎａ２Ｓｘ」溶液（［Ｎａ］については約４Ｍ、［Ｓ］については約５Ｍ）は透明なえび茶色の液体となり、これをＮ２パージした血清瓶へ移しアルミ箔で包んだ。
【０１３３】
材料と方法（実施例３、４、および５）
【０１３４】
【表２】
0005726760.tif 000003
【０１３５】
Ｃｒ（ＩＩ）溶液の調製
１Ｌの三口フラスコに気密性の注入口と排出口を取り付けて不活性ガスの下での作業ができるようにし、その後前記の所望の産物を適切な貯蔵フラスコに移した。このフラスコにＣｒＣｌ３・６Ｈ２０（４０ｇ、０．１５モル）、亜鉛顆粒［２０メッシュ］  （１８．３ｇ、０．２８モル）、水銀（１３．５５ｇ、１ｍＬ、０．０６７６モル）、および５００ｍＬの蒸留水を入れた。Ｎ２を１時間流した後、前記混合物を約８０°Ｃに温めて反応を開始させた。一定のＮ２流の下で２時間の撹拌の後、前記混合物を室温に冷却し、さらに４８時間連続撹拌すると、反応混合物は藍色の溶液に変わった。その溶液をＮ２でパージした血清瓶に移し、後に使用するために冷蔵庫で保管した。
【０１３６】
細菌：使用したクロストリジウム・オートエタノゲナムはドイツ生物材料資源センター（ＤＳＭＺ）に寄託され、受入番号ＤＳＭＺ１９６３０号を割り当てられたものである。
標本採取と分析手順
媒体標本はＣＳＴＲ反応器から２０日間までの期間にわたり、周期的に採取された。媒体を標本採取する各時点で、反応器にガスが出入りしないように注意した。
【０１３７】
ＨＰＬＣ：
ＨＰＬＣシステムはアジレント１１００シリーズ。移動相：０．００２５Ｎ硫酸。流量および圧力：０．８００ｍＬ／分。カラム：オルテックＩＯＡ、カタログ番号９６４８、１５０´６．５ｍｍ、粒径５μｍ。カラム温度：６０°Ｃ。検出器：屈折率計。検出器温度：４５°Ｃ。
【０１３８】
標本調製の方法
４００μＬの標本と、５０μＬの０．１５Ｍ ＺｎＳＯ４と、５０μＬの０．１５Ｍ Ｂａ（ＯＨ）２と、をエッペンドルフ管に入れた。前記管を１０分間、１２，０００ｒｐｍ、４°Ｃで遠心分離機にかけた。２００μＬの上清をＨＰＬＣの小瓶に移し、５μＬをＨＰＬＣ機器に注入した。
【０１３９】
ヘッドスペース分析
測定はバリアンＣＰ−４９００マイクロＧＣに２つのチャンネルを取り付けて実施した。チャンネル１には１０ｍの分子篩カラムで７０°Ｃ、２００ｋＰａのアルゴンを４．２秒の逆流時間で流したのに対し、チャンンネル２には１０ｍのＰＰＱカラムで９０°Ｃ、１５０ｋＰａのヘリウムを逆流させずに流した。注入器温度は両方のチャンネルともに７０°Ｃであった。測定時間は１２０秒に設定されたが、関心のあるピークはすべて１００秒前に常に溶離した。
【０１４０】
実施例１：ＣＳＴＲ中のバッチ発酵
１種以上の溶液Ｂを含む１．５リットルの媒体溶液を無菌状態で嫌気的に２ＬのＣＳＴＲ容器に移し、Ｎ２を連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびｐＨは探針により直接測定することができた。前記媒体を３７°Ｃに加熱し３００ｒｐｍで撹拌した。前記媒体をその後０．３Ｍ Ｃｒ（ＩＩ）塩化物溶液を加えて−１３０ｍＶまでさらに還元した。
【０１４１】
多硫化物溶液（０．１％ｖ／ｖ、１．５ｍＬ）を前記溶液に加えた結果、黒色の沈殿物が媒体中に観察された。電位もまた初期に−３００ｍＶまでの低下が観察されたが、数時間後には−１５０ｍＶまでに安定化した。多硫化物溶液の添加後は前記溶液にＮ２を連続散布した。
【０１４２】
植菌に先立ち、ガスをあらかじめ混合した７０％ＣＯ、１％Ｈ２、１５％ＣＯ２、および１４％Ｎ２の混合物に切り替え、これを実験の間発酵液に連続散布した。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記ＣＳＴＲに約７．５％（ｖ／ｖ）の濃度で植菌した。この実験の間、ｐＨは約５．５に維持した。
【０１４３】
結果
図１に代謝体産生とＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比の比較を示す。前記培養物が顕著な量のガスを消費しない遅延期の後、ガスの消費と代謝体の産生が約５日後に始まった。
【０１４４】
最初の３日間はＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は０．５５と０．６２の間に留まり、この値は前記モデルがエタノールはアセタートとともに産生することを示し、エタノールとアセタートの両方の増加がＨＰＬＣによる分析で同時に観察される。
【０１４５】
９日目に、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は０．６６に急上昇し、この値はほとんどすべての摂取炭素がアセタートをほとんどあるいは全く産生することなくエタノールの産生に向けられていることを示すことが前記モデルにより推測される。同日のＨＰＬＣ分析は培養物による継続的エタノールの産生を示すが、アセタート濃度は横ばいである。比がわずかだがより高くなるときはアセタート消費を示すことになり、この事象はガスヘッドスペース分析を行わなかった１１日目と１２日目の間の夜に生じたことがＨＰＬＣ分析からわかる。
【０１４６】
１２日目と１３日目に、前記比は０．６に近づき、幾分かのアセタート産生を伴う継続的エタノールの産生を示し、これもＨＰＬＣ測定と一致する見解になる。１４日目から１６日目には、前記比は０．６６７より高くなり、エタノールの産生がアセタートの消費から生じていることを示す。これらの日のＨＰＬＣデータは継続的エタノールの蓄積を示すが、アセタート濃度は少量の増加と減少を伴って変動する。１９日目には前記比は急激に０．５未満に下がり、エタノールの消費を示唆し、その期間のＨＰＬＣ分析はエタノール濃度の低下を示す。１９日目の後は反応器によるガスの消費はゼロに近く、前記培養物は不活性であると推測された。
【０１４７】
実施例２：ＣＳＴＲ中のバッチ発酵
１種以上の溶液Ｂを含まないで１．５リットルの媒体溶液を無菌状態で嫌気的に２ＬのＣＳＴＲ容器に移し、Ｎ２を連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびｐＨは探針により直接測定することができた。前記媒体を３７°Ｃに加熱し３００ｒｐｍで撹拌した。前記媒体はその後０．３Ｍ Ｃｒ（ＩＩ）塩化物溶液を加えて−１３０ｍＶまでさらに還元した。
【０１４８】
多硫化物溶液（３Ｍ溶液、１．０ｍＬ）を前記溶液に加えた。初期に−２２０ｍＶまでの電位低下もまた観察されたが、数時間後には−１００ｍＶまでに安定化した。Ｎ２を１２時間連続散布した後、前記溶液に１種以上の溶液Ｄを加え、Ｃｒ（ＩＩ）を加えて前記ＯＲＰを約−２００ｍＶに調節した。
【０１４９】
植菌に先立ち、前記ガスをあらかじめ混合した７０％ＣＯ、１％Ｈ２、１５％ＣＯ２、および１４％Ｎ２の混合物に切り替え、これを実験の間は発酵液に連続散布した。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記ＣＳＴＲに約７．５％（ｖ／ｖ）の濃度で植菌した。この実験の間、ｐＨは外部からは制御しなかった。
【０１５０】
結果：
図２に代謝体産生とＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比の比較を示す。前記培養物が顕著な量のガスを消費しない遅延期の後、ガスの消費と代謝体の産生が約３日目に始まった。最初はＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は非常に高いことが観察され、実際に１：１を超える。１：１を超える計算値は前記モデルでは１：１に等しいとして処理される。この高い比からアセタートの消費とエタノールの産生が示唆される。この期間のＨＰＬＣ分析は対応するアセタートの減少とエタノールの増加を示した。５日目と９日目の間は、前記比は０．６と０．５の間に下がり、エタノールの産生は同時にアセタートの産生を伴うことを示し、ＨＰＬＣ分析と一致する。８日目と１１日目の間は、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は０．５未満に下がり、エタノールの消費を示す。９日目と１０日目には、ＨＰＬＣ分析はエタノール濃度が下がることを示す。１１日目の後は、前記比は０．６６７より高くなり、エタノールの産生がアセタートの消費から生じていることを示し、ＨＰＬＣ分析において観察されたアセタートの減少と一致する。この消費は１３日目と１４日目にはより顕著になり、前記比は対応して１：１を超えて急上昇する。
【０１５１】
１５日目から１８日目の期間は、ガスヘッドスペース分析は行わなかったが、ＨＰＬＣ分析ではエタノール濃度が徐々に減少しアセタート濃度がわずかに増加した。
１９日目には、ヘッドスペース分析を再開し、前記比は０．６６７より高く、エタノールの産生とアセタートの消費を示すものであった。ＨＰＬＣ分析で、標本採取を行わなかった期間にエタノール濃度は顕著に上昇したがアセタート濃度はほぼ変わらなかった。２０日目後は培養物についてさらなるデータ収集は行わなかった。
【０１５２】
実施例３：ＣＳＴＲ中のバッチ発酵
媒体を次のように調製した。８５％ Ｈ３ＰＯ４（４５ｍｍｏｌ）を１．５Ｌの溶液Ａの溶液に加えた。媒体のｐＨはＮａＯＨの５Ｍ溶液を加えて５．３に調節した。媒体溶液を３０分間１２１°Ｃの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加えた。前記媒体溶液を無菌状態で嫌気的に１．５ＬのＣＳＴＲ容器に移し、Ｎ２を連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびｐＨは探針により直接測定することができた。前記媒体を３７°Ｃに加熱し３００ｒｐｍで撹拌した。
【０１５３】
硫化ナトリウム溶液（３．７５ｍＬの０．２Ｍ溶液）を加えた後、ニトリロ酢酸（１．５ｍＬの０．１Ｍ溶液）、微量金属溶液Ｂ（１．５ｍＬ）Ｎａ２ＷＯ４（１．５ｍＬの０．０１Ｍ溶液）、およびビタミンＢ溶液Ｃ（１５ｍＬ）を加えた。前記溶液のＯＲＰはＣｒ（ＩＩ）溶液を用いて約−２００ｍＶに調節した。
【０１５４】
植菌に先立ち、前記ガスを３３％Ｈ２、２３％Ｎ２、３１％ＣＯ、１３％ＣＯ２の混合物に切り替えた。
活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記ＣＳＴＲに約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で植菌した。この実験の間ｐＨを約５．３に維持し、Ｎａ２Ｓ溶液を約０．１６ｍＭｏｌ／日の速度で加えた。
【０１５５】
前記ガスの供給と撹拌はバイオリアクタを出るガス流中の変化に応じて発酵の経時変化とともに増加させた。本発明の方法によれば、アルコールに向けられる炭素の割合は７０％より大きいが１００％未満の区切り点を維持することにより高い水準に維持される。図４にＣＯ、Ｈ２の摂取および区切り点を示し、図５に微生物成長と代謝体産生を示す。基質供給を一定濃度に維持してアルコール産生を促進することにより、アセタートを産生せず、エタノールとバイオマスが急速に蓄積する。
【０１５６】
実施例４：ＣＳＴＲ中のバッチ発酵
媒体を次のように調製した。８５％ Ｈ３ＰＯ４（４５ｍｍｏｌ）を溶液Ａの１．５Ｌの溶液に加えた。媒体にＮａＯＨの５Ｍ溶液を加えてｐＨを５．３に調節した。媒体溶液は３０分間１２１°Ｃの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加えた。前記媒体溶液を無菌状態で嫌気的に１．５ＬのＣＳＴＲ容器に移し、Ｎ２を連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびｐＨは探針により直接測定することができた。前記媒体を３７°Ｃに加熱し３００ｒｐｍで撹拌した。
【０１５７】
硫化ナトリウム溶液（３．７５ｍＬの０．２Ｍ溶液）を加えた後、ニトリロ酢酸（１．５ｍＬの０．１Ｍ溶液）、微量金属溶液Ｂ（１．５ｍＬ）Ｎａ２ＷＯ４（１．５ｍＬの０．０１Ｍ溶液）、およびビタミンＢ溶液Ｃ（１５ｍＬ）を加えた。前記溶液のＯＲＰはＣｒ（ＩＩ）溶液を用いて約−２００ｍＶに調節した。
【０１５８】
植菌に先立ち、前記ガスを５０％ＣＯおよび５０％Ｎ２の混合物に切り替え、これを実験の間発酵液に連続散布した。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記ＣＳＴＲに約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で植菌した。前記発酵の間、ｐＨは約５．３に維持し、Ｎａ２Ｓ溶液を約０．１６ｍＭｏｌ／日の速度で加えた。
【０１５９】
前記ガスの供給と撹拌はバイオリアクタを出るガス流中の変化に応じて発酵の経時変化とともに増加させた。本発明の方法によれば、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は実質的にすべての炭素がアルコール産生に向けられるように約０．６６７に維持される。図６にＣＯの摂取とＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比を示し、図７に微生物成長と代謝体産生を示す。基質供給を一定水準に維持してアルコール産生を促進することにより、アセタートを産生せず、エタノールとバイオマスが急速に蓄積される。
【０１６０】
実施例５：ＣＳＴＲ中の連続発酵
２ＬのＣＳＴＲを次の条件下で用意した。媒体は次のように調製した。８５％ Ｈ３ＰＯ４（３０ｍＭ）を１．５Ｌの溶液Ａに加えた。媒体にＮＨ４ＯＨを加えてｐＨを５．３に調節した。媒体溶液を３０分間１２１°Ｃの高圧蒸気殺菌法または使用前ろ過殺菌により滅菌した。レザズリンを酸化還元指標として加えた。前記媒体溶液を無菌状態で嫌気的に１．５ＬのＣＳＴＲ容器に移し、Ｎ２を連続散布した。前記発酵容器に移した後、移された媒体の還元状態およびｐＨは探針により直接測定することができた。前記媒体を３７°Ｃに加熱し３００ｒｐｍで撹拌した後、０．３モル／Ｌのニトリロ酢酸（１．５ｍＬ）を含む微量金属溶液Ｂ（１．５ｍＬ）、Ｎａ２ＷＯ４（１．５ｍＬの０．０１Ｍ溶液）、および溶液Ｃ（１５ｍＬ）を加えた。植菌に先立ち、前記ガスを２％Ｈ２、２８％Ｎ２、４８％ＣＯおよび２２％ＣＯ２に切り替えた。活発に成長するクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を前記ＣＳＴＲに約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で植菌した。この実験の間、Ｎａ２Ｓ溶液（０．２Ｍ）を約０．３ｍｌ／時の速度で加えた。
【０１６１】
前記微生物培養物を約１日中バッチ形態で成長させた。１日目に前記発酵を連続操作に切り替え、新鮮な媒体を提供して約１から１．８の希釈割合を実現した。基質供給は前記微生物培養物の要求に応じて増加させた。
【０１６２】
図８に前記発酵の結果を示す。前記基質供給速度と撹拌速度はＣＯ２に変換されるＣＯの割合の変化に応じて発酵の経時変化とともに増減させた。本発明によれば、持続可能な連続操業は約０．６２〜０．６４のＣＯ２／ＣＯ比を維持して達成された。持続可能な連続操業は約３ｇ／Ｌの安定したバイオマス、約５ｇ／Ｌの実質的に安定したアセタート濃度、および少なくとも１０ｇ／Ｌの実質的に安定したエタノール濃度が得られた。微生物培養物によるＣＯの特異的取り込みは約１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分に維持された。
【０１６３】
実施例６：予測
培養液中のカルボキシド栄養性微生物培養物によるＣＯを含む基質の発酵であって、前記条件（当業者に知られているものなど）がアセタートの同時産生を伴って培養物の急成長を促進する発酵。そのような条件下では、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は好ましくは約０．５に維持されることになる。しかしながら、オペレータが培養物をアセタート産生からアルコール産生へ切り替えたい段階では、１種以上の調節を行うことができる。具体的な態様では、前記培養液のｐＨは前記微生物培養物の少なくとも一部をアルコールが産生する状態に遷移するように低減させることができる。所望の遷移がなされたら、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は約０．６６７に向けて増加することになる。別の一態様では、前記ｐＨを手動で変更するのではなく、前記微生物培養物がｐＨを自主調整できるようにｐＨの制御を止めて調節を実現させることができる。
【０１６４】
実施例７：予測
培養液中のカルボキシド栄養性微生物培養物によるＣＯを含む基質の発酵であって、前記条件（当業者に知られているものなど）がアルコールの産生を促進する発酵。そのような条件下では、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比は好ましくは約０．６６７に維持されることになる。しかしながら、ＣＯ２（産生）／ＣＯ（消費）比がこの値から外れる場合、例えば約０．５に下がれば、１種以上の調節をして前記比を前記最適値に戻すように高めることができる。例えば、前記ガス流の水素成分をアルコールの産生が促進するように増加させることができる。
【０１６５】
本明細書では読者が不適切な実験をすることなく本発明を実施することができるように特定の好ましい態様を参照して本発明を記載した。本発明が具体的に記載されていない変動や修正を許容することは当業者には当然である。本発明はすべてのそのような変動や修正を含むと理解される。さらに題名、見出しなどは本文書が読者に理解が高まるよう提供されていて、本発明の範囲を限定するように読み取るべきではない。上述およびもしあるとすれば下記の、すべての引用出願、特許および刊行物の開示の全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０１６６】
本明細書における先行技術の参照は先行技術が世界のどこかの国において開発分野の共通一般常識の部分を形成することを承認したり示したりするものではなく、そのように解釈されるべきではない。
【０１６７】
本明細書および下記のいずれかの請求項を通じて、文脈が他を要求しない限り、「含む
」の語は排他的意味に対立した包含的な意味で解釈され、すなわち「限定的ではなく包含
する」の意味である。
以下に、出願時の請求項を記載する。
［請求項１］
ＣＯおよび任意成分のＨ２を含む基質の微生物発酵の効率を高める方法であって、ＣＯの第一の部分が１種以上の酸および／または１種以上のアルコールを含む１種以上の所望の産物として固定され、ＣＯの第二の部分がＣＯ２に変換されるように前記基質を微生物培養物に提供することを含み、ＣＯ２に変換されるＣＯの割合を定量して１種以上の所望の産物の産生のための基質供給速度を決定する、前記方法。
［請求項２］
前記基質供給速度を、
ｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が最適値または最適範囲未満であると定量される場合には増加させ、または
ｉｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が最適値または最適範囲を超えていると定量される場合には減少させ、または
ｉｉｉ）ＣＯ２に変換されるＣＯの割合が実質的に最適値または最適範囲にあると定量される場合には維持する、
請求項１に記載される方法。
［請求項３］
前記基質供給速度はＣＯ２に変換されるＣＯの割合が実質的に最適値または最適範囲に維持されるように自動的に調節される、請求項２に記載される方法。
［請求項４］
Ｈ２が実質的に制限（５％未満）される、請求項１〜３のいずれか１項に記載される方法。
［請求項５］
所望の産物がエタノールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載される方法。
［請求項６］
所定の操作パラメータに基づくＣＯを含む基質の微生物発酵による１種以上の酸および／またはアルコールの産生効率を高める方法であって、１種以上の産物に向けられる炭素の割合を定量し、定量結果により、
ｉ）所望の産物として固定される炭素の割合が増加するように１種以上の操作パラメータを調節すること、または
ｉｉ）所望の産物として固定される炭素の割合が実質的に一定に維持されるように前記操作パラメータを維持すること、
のいずれかを含む、前記方法。
［請求項７］
１種以上の前記操作パラメータは、前記発酵液のｐＨ、前記発酵液の酸化還元電位、前記発酵液のＣＯ濃度、基質供給速度、前記基質流の組成、前記基質流の圧力、発酵液の攪拌速度、産物の除去速度、前記発酵液の酸および／またはアルコール濃度、前記培養液中の１種以上の栄養素、１種以上の栄養素の供給速度から選択される、請求項６に記載される方法。
［請求項８］
前記操作パラメータは基質供給の速度である、請求項６または７に記載される方法。
［請求項９］
１種以上の産物として固定される炭素の割合はＣＯ２へ酸化されるＣＯの割合を定量して定める、請求項６〜８のいずれか１項に記載される方法。
［請求項１０］
エタノールとして固定される前記炭素の割合が最適化される、請求項６〜９に記載される方法。
［請求項１１］
エタノールが連続産生される、請求項１０に記載される方法。
［請求項１２］
アセタートの同時産生を伴わないでエタノールが産生される、請求項１０または１１に記載される方法。
［請求項１３］
ＣＯを含む前記基質はガス状である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載される方法。
［請求項１４］
前記基質は鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製過程、バイオマスのガス化、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、およびコークス生産からなる群から選択される工業的過程の副産物として得られるガスを含む、請求項１３に記載される方法。
［請求項１５］
ＣＯを含む前記基質は容量で少なくとも約１５％から約１００％のＣＯを含む、請求項１３または１４に記載される方法。
［請求項１６］
ＣＯを含む前記基質は容量で少なくとも約４０％から約７０％のＣＯを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載される方法。
［請求項１７］
前記微生物はクロストリジウム、ムーレラ、ピロコッカス（Pyrococcus）、ユウバクテリウム、デスルフォバクテリウム（Desulfobacterium）、カルボキシドサーマス、アセトゲニウム（Acetogenium）、アセトバクテリウム、アセトアナエロビウム（Acetoanaerobium）、ブチリバクテリウムおよびペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載される方法。
［請求項１８］
前記微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナムである、請求項１７に記載される方法。
［請求項１９］
ＣＯを含む基質流の１種以上の酸および／または１種以上のアルコールのような産物への微生物発酵のためのシステムであって、微生物培養物を使用時に含有するバイオリアクタ、特定の産物として固定される炭素の割合を定量するように構成された測定手段、および前記微生物培養物および／または基質流に対して１種以上の調節をするように構成された少なくとも１種の調節手段を含む、前記システム。
［請求項２０］
前記測定手段はバイオリアクタから出る排出流の組成および任意にバイオリアクタに入る基質流を定量するように構成された少なくとも１種の手段を含む、請求項１９に記載されるシステム。
［請求項２１］
前記調節手段は、前記定量手段が所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断した場合には、１種以上の調節を行うように構成される、請求項１９または２０に記載されるシステム。
［請求項２２］
前記調節手段は、前記発酵液のｐＨの変更；または前記発酵液の酸化還元電位の変更；または前記発酵液のＣＯ濃度の変更；または前記発酵液のＨ２濃度の変更；または前記基質流の組成の変更；または前記基質流の圧力の変更；または発酵液の攪拌速度；または産物の除去；または前記発酵液の酸および／もしくはアルコール濃度の変更；または前記培養液中の１種以上の栄養素の変更；または１種以上の栄養素の供給速度の変更による調節を行うように構成される、請求項２１に記載されるシステム。
［請求項２３］
前記システムは、所望の産物として固定される炭素の割合が所定の値または範囲から外れていると判断される場合には、前記微生物培養物および／または基質流に対して１種以上の調節を行うように、１種以上の調節手段を制御するように構成される処理手段を含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載されるシステム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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