(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植または輸血に供されるドナー組織が、ヒトレシピエントにおいて、輸血関連急性肺障害(ＴＲＡＬＩ)または移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)を誘発するかどうかを判定する方法であって、
当該ヒトレシピエントが、ＨＮＡ-３ａ抗原またはＨＮＡ-３ｂ抗原を発現しており、
当該方法が、以下の工程：
ａ）移植または輸血に供される試料を、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはその抗原性断片、または、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはその抗原性断片と接触させて、当該試料に含まれるＨＮＡ-３特異的抗体を有する複合体を形成し、および
ｂ）当該複合体を検出する工程を含み、当該複合体の存在は、当該ドナー組織が、ＨＮＡ-３抗原を発現するヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすいことを示す、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
移植または輸血を受けるヒトレシピエントの移植または輸血組織の拒絶に対する感受性を判定する方法であって、
当該移植または輸血組織は、ＨＮＡ-３ａポリペプチドもしくはその抗原性断片、または、ＨＮＡ-３ｂポリペプチドもしくはその抗原性断片を含有しており、
当該方法が、以下の工程：
ａ）移植または輸血を受けるヒトレシピエントから得た生物学的試料を、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはその抗原性断片、または、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはその抗原性断片と接触させて、当該生物学的試料に含まれるＨＮＡ-３特異的抗体を有する複合体を形成し、および
ｂ）当該複合体を検出する工程を含み、当該複合体の存在が、当該ヒトレシピエントには、移植または輸血組織の拒絶に対する感受性が備わっていることを示す、ことを特徴とする方法。
【請求項３】
ｃ）前記試料を、Ｆｃ-γ受容体IIIｂポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料に含まれるＨＮＡ-１特異的抗体を有する複合体を形成させ、
ｄ）前記試料を、ＣＤ177ポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料に含まれるＨＮＡ-２特異的抗体を有する複合体を形成させ、
ｅ）前記試料を、ＣＤ11ｂポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料に含まれるＨＮＡ-４特異的抗体を有する複合体を形成させ、
ｆ）前記試料を、ＣＤ11ａポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料に含まれるＨＮＡ-５特異的抗体を有する複合体を形成させ、または
ｇ）前記試料をＨＬＡ抗原と接触させて、前記試料に含まれるＨＬＡ特異的抗体を有する複合体を形成させる工程の１つ以上の工程、および
ｈ）当該複合体を検出する工程をさらに含み、当該複合体の存在は、前記試料がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすい、ことを示す請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
移植または輸血に供されるドナー組織が、ヒトレシピエントにおいて、拒絶されやすいかどうかを判定する方法であって、
当該ヒトレシピエントが、ＨＮＡ-３ａ抗原またはＨＮＡ-３ｂ抗原を発現しており、
当該方法が、以下の工程：
ａ）移植または輸血に供される組織の試料から核酸を抽出し、
ｂ）当該核酸を、配列番号：３に記載の核酸配列の断片もしくは配列番号：４に記載の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させるか、あるいは、ＨＮＡ-３核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、当該核酸から配列番号：３に記載のＨＮＡ-３ａ核酸の断片もしくは配列番号：４に記載のＨＮＡ-３ｂ核酸の断片を増幅し、および
ｃ）当該試料に含まれるＨＮＡ-３ａ核酸の存在もしくはＨＮＡ-３ｂ核酸の存在を検出し、または、当該核酸と当該プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程を含み、当該核酸と当該プローブのハイブリダイゼーションが、当該試料におけるＨＮＡ-３ａ核酸またはＨＮＡ-３ｂ核酸の存在を示し、当該試料におけるＨＮＡ-３ａ核酸またはＨＮＡ-３ｂ核酸の存在は、ＨＮＡ-３ａ特異的抗体またはＨＮＡ-３ｂ特異的抗体を発現するヒトレシピエントにおいて当該試料が拒絶されやすいということを示す、ことを特徴とする方法。
【請求項５】
輸血関連急性肺障害(ＴＲＡＬＩ)または移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)の発症に対する移植または輸血を受けるヒトレシピエントの感受性を判定する方法であって、
移植または輸血に供される組織は、抗ＨＮＡ-３ａ特異的抗体または抗ＨＮＡ-３ｂ特異的抗体を含有しており、
当該方法が、以下の工程：
ａ）移植または輸血を受けるレシピエントから得た生物学的試料から核酸を抽出し、
ｂ）当該核酸を、配列番号：３に記載の核酸配列の断片もしくは配列番号：４に記載の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させるか、あるいは、ＨＮＡ-３核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、当該核酸から配列番号：３に記載のＨＮＡ-３ａ核酸の断片もしくは配列番号：４に記載のＨＮＡ-３ｂ核酸の断片を増幅し、および
ｃ）当該試料に含まれるＨＮＡ-３ａ核酸の存在もしくはＨＮＡ-３ｂ核酸の存在を検出し、または、当該核酸と当該プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程を含み、当該核酸と当該プローブとのハイブリダイゼーションが、当該試料におけるＨＮＡ-３核酸の存在を示し、および、当該試料におけるＨＮＡ-３ａ核酸またはＨＮＡ-３ｂ核酸の存在は、移植または輸血を受けるヒトレシピエントが、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤの発症に対する感受性を有していることを示す、ことを特徴とする方法。
【請求項６】
１）前記核酸と、配列番号：３に記載の断片または配列番号：４に記載の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとを接触させる場合、
ｄ）前記試料と、配列番号：５に記載の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとを接触させ、
ｅ）前記試料と、配列番号：７に記載の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとを接触させ、
ｆ）前記試料と、配列番号：９に記載の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとを接触させ、
ｇ）前記試料と、配列番号：11に記載の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとを接触させ、または
ｈ）前記試料と、ＨＬＡ抗原をコードするヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとを接触させる、工程の１つ以上の工程、および
ｉ）前記核酸と前記プローブとのハイブリダイズを検出する工程を含み、前記プローブのいずれかのハイブリダイゼーションは、前記試料におけるＨＮＡ-１、ＨＮＡ-２、ＨＮＡ-３ｂ、ＨＮＡ-４、ＨＮＡ-５またはＨＬＡ核酸のいずれかの存在を示し、そして、前記試料におけるＨＮＡ-１、ＨＮＡ-２、ＨＮＡ-３ｂ、ＨＮＡ-４、ＨＮＡ-５またはＨＬＡ核酸のいずれか１つの存在は、前記試料がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすいこと、または、前記試料がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすいことを示し、または、
２）配列番号：３に記載のＨＮＡ-３ａ核酸の断片もしくは配列番号：４に記載のＨＮＡ-３ｂ核酸の断片を増幅する場合、
ｄ）ＨＮＡ-１核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号：５に記載のＨＮＡ-１核酸の断片を増幅し、
ｅ）ＨＮＡ-２核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号：７に記載のＨＮＡ-２核酸の断片を増幅し、
ｆ）ＨＮＡ-４核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号：９に記載のＨＮＡ-４核酸の断片を増幅し、
ｇ）ＨＮＡ-５核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号：11に記載のＨＮＡ-５核酸の断片を増幅し、または
ｈ）ＨＬＡ核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＬＡ核酸の断片を増幅する、工程の１つ以上の工程、および
ｉ）前記試料に含まれるＨＮＡ-１、ＨＮＡ-２、ＨＮＡ-４、ＨＮＡ-５またはＨＬＡ核酸の前記断片を検出する工程を含み、前記試料におけるＨＮＡ-１、ＨＮＡ-２、ＨＮＡ-３ｂ、ＨＮＡ-４、ＨＮＡ-５またはＨＬＡ核酸のいずれか１つの存在は、前記試料がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすいこと、または、前記試料がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすいことを示す、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、膜、フィルター、ビーズ、および、チップからなる群から選択される支持体に固定される請求項４乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記組織試料または生物学的試料が、血液、血液誘導体、血漿、血清、細胞、および、組織からなる群から選択される請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはその抗原性断片、または、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはその抗原性断片、および
ｂ）Ｆｃ-γ受容体IIIｂポリペプチド(ＨＮＡ-１)、ＣＤ177ポリペプチド(ＨＮＡ-２)、ＣＤ11ｂポリペプチド(ＨＮＡ-４)、ＣＤ11ａポリペプチド(ＨＮＡ-５)、およびＨＬＡ抗原からなる群から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその抗原性断片、
を含む、ことを特徴とするキット。
【請求項１０】
ＨＮＡ-３ａ、ＨＮＡ-３ｂ、ＨＮＡ-１、ＨＮＡ-２、ＨＮＡ-４、ＨＮＡ-５、および、ＨＬＡからなる群から選択される抗原を含むペプチドと特異的に結合する１つもしくは複数の抗体をさらに含む請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ａ）配列番号：３に記載の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、または、配列番号：４に記載の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブであって、当該核酸の断片は、ＨＮＡ-３ａ特異的同種異系抗体またはＨＮＡ-３ｂ特異的同種異系抗体と特異的に結合するポリペプチドをコードするものであり、および
ｂ）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11、および、ＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片とハイブリダイズする１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプローブ、
を含む、ことを特徴とするキット。
【請求項１２】
ａ）配列番号：３に記載のＨＮＡ-３ａ核酸の断片、または、配列番号：４に記載のＨＮＡ-３ｂ核酸の断片を増幅するための１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、および
ｂ）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11、および、ＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片を増幅するための１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、
を含む、ことを特徴とするキット。
【請求項１３】
ＨＮＡ-３ａ特異的同種異系抗体またはＨＮＡ-３ｂ特異的同種異系抗体の同定のための単離したポリペプチドまたはその断片の使用であって、当該ポリペプチドが、
ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基１５４を含む、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の断片、
ｃ）配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、および、配列番号２６からなる群から選択され、かつ、ＨＮＡ-３ｂ特異的同種異系抗体と反応するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、および、配列番号：４２からなる群から選択され、かつ、ＨＮＡ-３ａ特異的同種異系抗体と反応するアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする当該単離したポリペプチドまたはその断片の使用。
【請求項１４】
ＨＮＡ-３ａ遺伝子型の確定のための、ＨＮＡ-３ａ特異的同種異系抗体と反応するタンパク質をコードする配列番号：３に記載のポリヌクレオチドまたはその断片の使用。
【請求項１５】
ＨＮＡ-３ｂ遺伝子型の確定のための単離したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片の使用であって、当該ポリペプチドが、
ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基１５４を含む、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の断片、
ｃ）配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、および、配列番号２６からなる群から選択され、かつ、ＨＮＡ-３ｂ特異的同種異系抗体と反応するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、および、配列番号：４２からなる群から選択され、かつ、ＨＮＡ-３ａ特異的同種異系抗体と反応するアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする当該単離したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片の使用。
【請求項１６】
ヒト被験者におけるＨＮＡ-３ｂ遺伝子型に関するスクリーニング方法であって、
ａ）生物学的試料から核酸を抽出し、および
ｂ）当該生物学的試料に含まれる配列番号：４に記載の核酸配列の断片を検出する工程を含み、当該断片は、配列番号：４に記載のコドン１５４を含み、当該配列番号：４に記載のコドン１５４の存在は、当該ヒト被験者が、ＨＮＡ-３ｂ遺伝子型を有することを示す、ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年９月４日に出願されたドイツ国出願第１０  ２００８  ０４５  ６９６．９号に対する優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、輸血関連急性肺障害症候群（ＴＲＡＬＩ）の発生に関連づけられたＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂのポリペプチド配列の同定に関する。本発明は、移植または輸血のために意図された生物学的組織の試料中のＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂ特異的抗体、ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂポリペプチド、ならびにＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂ核酸に関してスクリーニングするための方法およびキットを提供する。本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がＴＲＡＬＩを誘発するか否かを判定するための方法およびキットにも関する。本発明はさらに、ＴＲＡＬＩを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性を確定するための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト好中球特異的抗原（ＨＮＡ）に対する抗体は、臨床的合併症、例えば肺輸血反応を、そしてある場合には輸血関連急性肺障害（ＴＲＡＬＩ）を引き起こし（Ｐｏｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐ．  Ｄｉｓ．  １２８（１）：  １８５−９，  １９８３）、あるいは新生児同種異系免疫好中球減少症（ＮＡＩＮ）を引き起こす（Ｂｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．  Ｍｅｄ．  ２（２）：  １４３−９，  １９９２）ことが示された。したがって、ＨＮＡ特異的抗体の検出は、重要な臨床的用途を有する。
【０００４】
ＴＲＡＬＩは致命的な輸血合併症であり、米国における輸血関連死の最も高頻度の原因の１つである。ＴＲＡＬＩは、ＡＢＯ不適合保存血液の投与後の欧州における死亡の第二の最高頻度輸血関連原因である（Ｈｏｌｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｖ．  １８：  １８４−１８８，  ２００４）。輸血の合併症としてＴＲＡＬＩを発症する危険は、ＨＩＶまたはＣ型肝炎感染に罹患するより少なくとも２０００倍高い。
【０００５】
ＴＲＡＬＩは、心臓の機能不全または容積過負荷の指標を伴わない両側性肺浸潤（肺水腫）と関連した輸血後６時間以内の突然の急性息切れからなる臨床的実体、と定義される（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈａｅｍｏｖｉｇｉｌａｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＥＨＮ）．  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｅｖｅｎｔ．  ｗｗｗ．ｅｈｎ−ｏｒｇ．ｎｅｔ）。
【０００６】
ＴＲＡＬＩ症候群は、最初は、輸血と無関係な肺機能不全（ＡＬＩ）またはその最大の変種であるＡＲＤＳ（「後天性呼吸促迫症候群」）と同様であることが多いため、診断するのが難しい（Ｐｏｐｏｖｓｋｙ  ＆  Ｍｏｏｒｅ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２５：  ５７３−５７７，  １９８５）。ＴＲＡＬＩの症候としては、低酸素血症、頻拍、低血圧症、チアノーゼおよび発熱が挙げられる。その症候は他の原因、例えば体液過負荷に起因することが多いため、しばしば、ＴＲＡＬＩはクリニックにおいて認識されないかまたは誤診断される。ＴＲＡＬＩは、血液成分、例えば白血球、赤血球濃縮物、新鮮凍結血漿、血小板由来白血球、プール血小板、静脈内ガンマグロブリン、寒冷沈降物、幹細胞および顆粒球を含有する全血漿の輸血と関連付けられてきた。ＴＲＡＬＩは肺微小血管の損傷であり；したがって、治療は、呼吸補助および生理食塩水注入に集中する。
【０００７】
ＴＲＡＬＩは、ＨＮＡ、顆粒球−およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩに特異的な抗体と主に関連する免疫関連障害である。輸血レシピエントにおいてＴＲＡＬＩを誘発したことのある他の因子としては、生物学的に活性な脂質類およびＨＬＡクラスＩＩ抗体が挙げられる。ほとんどの場合、（ドナー血漿中の）ドナーの抗体は、保存血液とともに移入されて、次いで、レシピエントの白血球（顆粒球）と反応する。これらの抗体が顆粒球と結合すると、それらは活性化し、一部は凝集する。この顆粒球からの殺菌性集積物のその後の放出により、毛細血管内皮が損傷され、これが肺水腫を引き起こす。この免疫反応は、内皮を損傷する酸素ラジカルおよびプロテアーゼを放出するよう補体活性化顆粒球を誘導して、肺胞および間質中への富タンパク質液の溢出を生じさせる。さらに、保存血液内の抗体は、レシピエントの顆粒球と結合し、活性化させて、接着分子の発現（Ｕｃｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｖ．  ８：  ８４−９５，  １９９４）、肺の肺胞および血管内皮間の間質間隙への顆粒球の遊出、ならびにサイトカイン、プロテアーゼおよび酸素ラジカルの放出（Ｓｎｙｄｅｒ．，  Ｉｍｍｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２４：  ３３３−９，  １９９４）を生じさせる。これらの細胞性作用は、毛細血管壁に対する損傷と、その後の透過性亢進を引き起こす。肺水腫が発症し、罹患患者の１０％がこの合併症のために死亡する。
【０００８】
ＴＲＡＬＩでは、レシピエント抗体はドナーの顆粒球とめったに反応しない（Ｂｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈｅａｍａｔｏｌ．  ９３：  ７０７−７１３、１９９６）。しかしながら、輸血レシピエントにおける抗体により誘発されたＴＲＡＬＩの症例もあった。非常に稀な症例では、抗ＩｇＡ抗体もＴＲＡＬＩを誘発し得る（Ｓａｉｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  ２７：  ９６−１００，  １９９９）。
【０００９】
小児の顆粒球−またはＨＬＡ−抗原に対する抗体形成が妊娠中に起こり得るため、経産婦の献血は特有の危険を保有する。同様に、患者は、早期輸血により免疫感作され得る（Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ  ５０：  ９３０−９３２，  ２００１）。ＴＲＡＬＩを誘発するドナー血漿は、臨床的には検出され得ない。一般に産生される赤血球濃縮物は極わずかな血漿と少数の顆粒球のみを含有し、したがってＴＲＡＬＩは、新鮮な血漿および血小板濃縮物の投与後に最も起き易い。
【００１０】
ＨＬＡ抗体のほかに、顆粒球上の３つの異なる抗原系に対する抗体が、ＴＲＡＬＩの誘発に関与すると思われる（Ｌｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  ９１：  １５２９−１５３２，  １９９９；Ｄａｖｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４３：  ６４１−６４５，  ２００３；Ｋｏｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  ＪＡＭＡ  ２８７：  １９６８−１９７１，  ２０００；Ｒｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（印刷中。オンラインでアクセス可能），  ２００８）。抗原系のうちの２つ（ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２）は、それらの構造および局在化に関して既知である。抗原ＨＮＡ−２は、教授であるＢｕｘ博士により特徴付けられ、特許として出願された（ＤＥ  １００  ２８  ７２５  Ａ１）。第三の抗原系であるＨＮＡ−３（相反抗原ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂからなる）は、特徴付けされていない。抗原ＨＮＡ−３ａは集団の約９５％に生じ（Ｄａｖｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４３：  ６４１−６４５，  ２００３）、ＴＲＡＬＩの重症経過に特に高頻度に関与する（Ｒｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（印刷中。オンラインでアクセス可能），  ２００８）。
【００１１】
輸血における副作用に関する英国通知および評価センターのＳＨＯＴ（Ｓｅｒｉｏｕｓ  Ｈａｚａｒｄｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ：輸血による重篤な副作用報告制度）による最新の報告によれば、ＴＲＡＬＩは、輸血による重篤な副作用の最もよくある原因である。当該報告は、１９９６年〜２００３年（ＳＨＯＴ）（付加的累積データ１９９６〜２００３。ｗｗｗ．ｓｈｏｔｕｋ．ｏｒｇ）の期間中、９％の死亡率を示している。２００１年以来、米国食品医薬品局は、同様に、輸血関連合併症の主因としてのＴＲＡＬＩを報告した（Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｖ．  １９：  ２−３１，  ２００５；Ｂｏｓｈｋｏｖ，  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ８３：  ２９９−３０３，  ２００２）。
【００１２】
一般に、ほとんどの血液および組織ドナーは、ＨＮＡ型で分類されていない。好中球免疫生物学の特殊性、ＨＮＡ分類血清の欠乏、ならびに新鮮好中球を試験する必要性は、ＨＮＡ適合血液成分の分類を拘束する。高いパーセンテージのＴＲＡＬＩ症例は、女性、特に経産婦により献血された血液により、ならびに新鮮凍結血漿の輸血から引き起こされる。ＴＲＡＬＩの発生率を低減するために提案される一般的解決法としては、ドナーとして経産婦（妊娠３回以上）を除外するためにドナーとしての全女性の除外、ならびに新鮮凍結血漿の輸血の低減が挙げられる。
【００１３】
一般に、顆粒球特異的抗体の検出は労力を要する；そして血液ドナーの血清中のＨＬＡ抗体の検出は十分でない。ＴＲＡＬＩの危険性の最も信頼できる判定は、一般に、ドナー血清と患者白血球との間の交差適合試験でなされる。この試験は、専門実験室で実行され得るだけであり（Ｖｏｓｓ，  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ  ５０：  ９３０−９３２，  ２００１）、これは、ドナースクリーニングに適していない。その他の戦略は、現在、より限定的なドナー管理に向けられている（Ｍａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ３４：  １３７−１４３，  ２００６）（上記）。これは、妊娠後の女性からの献血の除外が保存血液の量の深刻な低減をもたらすため、許容可能でない。
【００１４】
女性ドナーの除外は、カナダにおいて体系的に調査された。経産婦ドナーの除外により、全献血の１２％がカナダ血液サービスから失われる（Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｖ．  １９：  ２−３１，  ２００５）。いくつかの研究により、このような戦略の履行は、第三の潜在的女性ドナーを除外する（Ｄｅｎｓｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３９：  １０３−１０６，  １９９９）。代替的戦略は、顆粒球特異的抗体に関して全保存血液を試験することである。現在、これは技術的に実行可能でない。血液成分を処理するための他の戦略が提案されているが、しかしこれらの戦略は細菌汚染のような新規の危険をはらんでおり、そしてそれらの時間要件のため、計画された輸血にのみ適していて、緊急時の輸血には適していない（Ｍａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ３４：  １３７−１４３，  ２００６）。さらに、このような戦略がＴＲＡＬＩの発症を実際に低減し得るか否かに関する証拠が欠如している。
【００１５】
ヒト好中球抗原は、好中球特異的抗原またはＨＮＡとしても知られている。現在、以下の５つのＨＮＡ抗原系が存在する：ＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３、ＨＮＡ−４およびＨＮＡ−５。ＨＮＡ−１、２、４および５に関する対立遺伝子が同定され、対応する糖タンパク質が特徴付けられた；しかしながら、ＨＮＡ−３に関する対立遺伝子は、依然として不明である（Ｓｔｒｏｎｃｅｋ，  ＡＳＨＩ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  ２００４により再検討）。好中球上でのみ発現され、低親和性Ｆｃ−γ受容体ＩＩＩｂ上に位置する３つのＨＮＡ−１抗原（ＨＮＡ−１ａ、ＨＮＡ−１ｂおよびＨＮＡ−１ｃ）が存在する。ＨＮＡ−２系は、１つの十分に確立された抗原（ＨＮＡ−２ａ）を有する。ＨＮＡ−２は好中球および好中球前駆体上でのみ発現され、糖タンパク質ＣＤ１７７（ＮＢ１  ｇｐ）上に位置する。ＨＮＡ−４およびＨＮＡ−５は、β２インテグリン上に位置する。ＨＮＡ−４は、顆粒球、単球およびリンパ球上で発現される（Ｓｔｒｏｎｃｅｋ，  ＡＳＨＩ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  ２００４参照）。
【００１６】
ＨＮＡ−３系は、５ｂとしても知られている１つの既知の抗原ＨＮＡ−３ａを有する。ＨＮＡ−３は、好中球、リンパ球、血小板、内皮細胞、腎臓、脾臓および胎盤細胞上で発現され、そして７０〜９５ｋＤａの好中球糖タンパク質上に位置することが知られている（Ｓｔｒｏｎｃｅｋ，  ＡＳＨＩ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  ２００４参照）。ＨＮＡ−３ａに関する遺伝子はクローン化されておらず、糖タンパク質の性質および機能は、従来、不明であった。したがって、ＨＮＡ−３抗体の一般的検出は、凝集検査（Ｌａｌｅｚａｒｉ  ＆  Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５：  １３５−４２，  １９６５）またはＧＩＦＴ−ＦＣ検定（Ｄａｖｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４３（５）：  ６４１−５，  ２００３）のような非特異的検定にのみ基づいている。
【００１７】
５ｂとしても知られているＨＮＡ−３の推定対立遺伝子は、約０．８２の遺伝子頻度を有する（Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ９：  ４３１−４６，  １９６４）。それが、０．６６の遺伝子頻度を有することも報告された（Ｌａｌｅｚａｒｉ  ＆  Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５：  １３５−４２，  １９６５）。５ｂのタンパク質は７０〜９５ｋＤの分子量を有することが報告された（Ｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０（２）：  ２２２−７，  ２０００）が、未だに５ｂ遺伝子はクローン化されておらず、そのタンパク質の性質および機能は依然として不明である。
【００１８】
本発明が関心を有するのはＣＴＬ２であり、これは、１０個のらせん膜貫通ドメインを含む７０６アミノ酸膜貫通タンパク質（約８０．１５２ｋＤ）である。このタンパク質は、ＳＬＣ４４Ａ２、ＤＫＦＺｐ６６６Ａ０７１  ２、ＦＬＪ４４５８６  ２およびｐｐ１２９２としても知られており、内耳内のコリン輸送に関与することが知られており、そして内耳支持細胞上で発現される。ＣＴＬ２をコードする遺伝子は、染色体１９ｐ１３上に位置する。さらに、抗原である内耳支持細胞抗原（ＩＥＳＣＡ）は、自己免疫感音性聴力損失（ＡＩＳＮＨＬ）に関連する自己抗体と反応性があるＣＴＬ２タンパク質であることが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
現在、ＴＲＡＬＩを誘発するＨＮＡ抗体に関して移植片組織または輸血をスクリーニングし、分類する方法は、不適切で、問題がある。さらに、血液および組織を供与することからヒト集団の大部分を除外することは、極端な解決法である。したがって、ＨＮＡ抗原のスクリーニング方法の開発が強く必要とされている。
【００２０】
したがって、ＴＲＡＬＩに関与するヒト好中球抗原−３ａまたは−３ｂ（ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ）のタンパク質またはＤＮＡ配列を明らかにすることが、本発明の一目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、ＨＮＡ−３ａが配列番号１のアミノ酸配列内にあり、ＨＮＡ−３ｂが配列番号３ｂのアミノ酸配列内にあり、そしてこれらのアミノ酸配列はコリン輸送体様タンパク質２（ＣＴＬ２）のアミノ酸配列と高度に類似する、という発見に関する。
【００２２】
細胞外ループ上のコドン１５４内の単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）は、このＳＮＰがＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂ間で異なるので、極めて重要である（ＳＮＰ  ｒｓ２２８８９０４）。ＨＮＡ−３ａをコードするポリヌクレオチドは位置４６１に「Ｇ」（グアニン）を有し、結果として、ＨＮＡ−３ａアミノ酸配列の位置１５４の「Ｒ」（アルギニン、Ａｒｇ）をコードし、したがって、ＨＮＡ−３ａ対立遺伝子を表す。ＨＮＡ−３ｂをコードするポリヌクレオチドは位置４６１に「Ａ」（アデニン）を有し、結果として、そのアミノ酸配列の位置１５４の「Ｑ」（グルタミン、Ｇｌｎ）をコードし、したがって、ＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を表す。
【００２３】
ＨＮＡ−３遺伝子のコドン１５４内のＳＮＰの存在は、対立するＨＮＡ−３抗原に曝露された場合に、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂに対する同種異系抗体を生成し得る集団の一部を生じる。この差により、集団の一部は２つの抗ＨＮＡ−３特異的抗体のうちの１つを有することが可能になり、外来ＨＮＡ−３抗原を含有する血液または組織に曝露された場合、レシピエントにおいて輸血関連急性肺障害（ＴＲＡＬＩ）を誘発することになる。
【００２４】
本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ特異的抗体の検出方法であって、ａ）生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料を、配列番号１のＨＮＡ−３ａポリペプチドまたはその断片を発現するよう形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞と接触させて、試料中のＨＮＡ−３ａと複合体を形成させること、そしてｃ）前記生物学的試料がＨＮＡ−３ａ特異的抗体を含有する、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法を提供する。
【００２５】
前記方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性断片を用いて実行され得る。
【００２６】
本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ｂ特異的抗体の検出方法であって、ａ）生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料を、配列番号２のＨＮＡ−３ｂポリペプチドまたはその断片を発現するよう形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞と接触させて、試料中のＨＮＡ−３ｂと複合体を形成させること、そしてｃ）前記生物学的試料がＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を含有する、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法も提供する。
【００２７】
前記方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性断片を用いて実行され得る。
【００２８】
本発明は、細胞が異種ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ポリペプチドを発現するよう、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞または昆虫細胞のようなＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを内因的に発現しないものを含めた任意の細胞型を用いることを意図する。「異種」という用語は、異なる種または異なる細胞型に由来する細胞の構成要素、例えばＤＮＡまたはタンパク質を指す。
【００２９】
本発明は、低レベルのＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを発現する細胞を用いること、ならびに異種プロモーターまたはエンハンサーを挿入することにより内因性タンパク質の発現を増大すること、あるいはＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ遺伝子のコピー数を増大することも意図する。用いられ得る細胞の例としては、ＥＢ−３細胞およびＫ−５６２細胞が挙げられる。
【００３０】
本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ特異的抗体の検出方法であって、ａ）生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料を、配列番号１のＨＮＡ−３ａポリペプチドの抗原性断片を模倣するアプタマーと接触させて、前記試料中のＨＮＡ−３ａ特異的抗体と複合体を形成させること、そしてｃ）前記生物学的試料がＨＮＡ−３ａ特異的抗体を含有する、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法も提供する。これらの方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性断片を模倣するアプタマー用いて実行され得る。
【００３１】
本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ特異的抗体の検出方法であって、ａ）生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料を、配列番号２のＨＮＡ−３ｂポリペプチドの抗原性断片を模倣するアプタマーと接触させて、前記試料中のＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と複合体を形成させること、そしてｃ）前記生物学的試料がＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を含有する、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法も提供する。これらの方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性断片を模倣するアプタマー用いて実行され得る。
【００３２】
本発明は、ドナー組織が、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体の存在の結果として、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを発現するヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘発するか否かを判定するために、移植片または輸血のために意図されたドナー組織中のＨＮＡ−３ａおよび／またはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体に関してスクリーニングする方法を提供する。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発する（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ抗原を発現する）か否かを判定する方法であって、ａ）ヒト被験者に移植または輸血することを意図した組織の試料を獲得すること、ｂ）前記試料を、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、試料中のＨＮＡ−３ａ特異的抗体と複合体を形成させること、そしてｃ）前記ドナー組織がＨＮＡ−３ａ抗原を発現するヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすい、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるＨＮＡ−３ａアミノ酸配列（配列番号１）の抗原性断片を用いて実行され得る。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発する（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ抗原を発現する）か否かを判定する方法であって、ａ）ヒト被験者に移植または輸血することを意図した組織の試料を獲得すること、ｂ）前記試料を、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、試料中のＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と複合体を形成させること、そしてｃ）前記ドナー組織がＨＮＡ−３ｂ抗原を発現するヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすい、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出することを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるＨＮＡ−３ｂアミノ酸配列（配列番号２）の抗原性断片を用いて実行され得る。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発するか否かを判定する方法であって、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を検出するほかに、以下のステップ：すなわち、前記試料を、Ｆｃ−γ受容体ＩＩＩｂポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−１特異的抗体と複合体を形成させること；前記試料を、ＣＤ１７７ポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−２特異的抗体と複合体を形成させること；前記試料を、ＣＤ１１ｂポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−４特異的抗体と複合体を形成させること；前記試料を、ＣＤ１１ａポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−５特異的抗体と複合体を形成させること；前記試料をＨＬＡ抗原と接触させて、前記試料中のＨＬＡ特異的抗体と複合体を形成させること；そして前記試料がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすい、ということを前記複合体のいずれかの存在が示す前記複合体を検出することのうちの１つもしくは複数のステップをさらに包含する方法を提供する。
【００３６】
本発明は、ＨＮＡ−３ａおよび／またはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体に関して移植片または輸血のレシピエントをスクリーニングする方法も提供する。このスクリーニングは、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−抗原を含む場合には、移植または輸血組織はレシピエントが対応する抗原に対する抗体を含むと拒絶されやすいため、注目される。拒絶に際して、レシピエントの抗体は、当該組織に結合し、異物として標的にし、その免疫系によりその組織を破壊する
【００３７】
一実施形態では、本発明は、移植または輸血組織を拒絶することに対するヒト移植片または輸血のレシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−３ａポリペプチドまたはその抗原性断片を含有する）を判定する方法であって、ａ）移植または輸血前に、ヒトの移植片または輸血のレシピエントから生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料を、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ特異的抗体と複合体を形成させること、そしてｃ）前記ヒト移植片または輸血レシピエントが移植または輸血組織を拒絶することに対して感受性である、ということを前記生物学的試料中の複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるＨＮＡ−３ａアミノ酸配列（配列番号１）の抗原性断片を用いて実行され得る。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、移植または輸血組織を拒絶することに対するヒトの移植片または輸血のレシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−３ｂポリペプチドまたはその抗原性断片を含有する）を判定する方法であって、ａ）移植または輸血前に、ヒト移植片または輸血レシピエントから生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料を、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と複合体を形成させること、そしてｃ）前記ヒトの移植片または輸血のレシピエントが移植または輸血組織を拒絶することに対して感受性である、ということを前記生物学的試料中の複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるＨＮＡ−３ｂアミノ酸配列（配列番号２）の抗原性断片を用いて実行され得る。
【００３９】
さらなる実施形態では、本発明は、移植または輸血組織を拒絶することに対する感受性（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂポリペプチドまたはその抗原性断片を含有する）を判定する方法であって、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を検出することのほかに、以下のステップ：すなわち、前記生物学的試料を、Ｆｃ−γ受容体ＩＩＩｂポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記生物学的試料中のＨＮＡ−１特異的抗体と複合体を形成させること；前記生物学的試料を、ＣＤ１７７ポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記生物学的試料中のＨＮＡ−２特異的抗体と複合体を形成させること；前記生物学的試料を、ＣＤ１１ｂポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記生物学的試料中のＨＮＡ−４特異的抗体と複合体を形成させること；前記生物学的試料を、ＣＤ１１ａポリペプチドまたはその抗原性断片と接触させて、前記生物学的試料中のＨＮＡ−５特異的抗体と複合体を形成させること；前記生物学的試料をＨＬＡ抗原と接触させて、前記生物学的試料中のＨＬＡ特異的抗体と複合体を形成させること；そしてヒトの移植片または輸血のレシピエントが移植または輸血組織の拒絶に対して感受性である、ということを前記生物学的試料中の複合体のいずれかの存在が示す前記複合体を検出すること（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＨ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡのいずれかを含有する）、とのうちの１つもしくは複数をさらに包含する方法を提供する。
【００４０】
前記方法のいずれかは、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂエピトープを模倣し、したがってＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と結合するアプタマーを用いて実行され得る。
【００４１】
本発明は、ドナー組織中のＨＮＡ−３ａおよび／またはＨＮＡ−３ｂのスクリーニング方法を提供する。ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗原のスクリーニングは、移植片または輸血のレシピエントがＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗体を発現することが既知である場合、重要である。レシピエントの抗体は、ドナー組織内の細胞と結合して、移植または輸血された組織の拒絶の危険性を引き起こすかまたは増大し得る。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ特異的抗体を有する）か否かを判定する方法であって、ａ）ヒトレシピエントに移植または輸血することを意図した組織の試料を獲得すること；ｂ）前記試料を、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＮＡ−３ａポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体と接触させて、試料中のＨＮＡ−３ａと複合体を形成させること；そしてｃ）ＨＮＡ−３ａ特異的抗体を発現するヒトレシピエントにおいて前記ドナー組織が拒絶されやすい、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法を提供する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を有する）か否かを判定する方法であって、ａ）ヒトレシピエントにおいて移植片または輸血のために意図された組織の試料を獲得すること；ｂ）前記試料を、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＮＡ−３ｂポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体と接触させて、試料中のＨＮＡ−３ｂと複合体を形成させること；そしてｃ）ＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を発現するヒトレシピエントにおいて前記ドナー組織が拒絶されると思われる、ということを前記複合体の存在が示す前記複合体を検出すること、とを包含する方法を提供する。
【００４４】
さらなる実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発する（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ特異的抗体またはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を有する）か、否かを判定する方法であって、ＨＮＡ−３ａおよび／またはＨＮＡ−３ｂ抗原を検出することのほかに、以下のステップ：すなわち、前記試料を、ＨＮＡ−１と特異的に結合する抗体と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−１と複合体を形成させること；前記試料を、ＨＮＡ−２と特異的に結合する抗体と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−２と複合体を形成させること；前記試料を、ＨＮＡ−４と特異的に結合する抗体と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−４と複合体を形成させること；前記試料を、ＨＮＡ−５と特異的に結合する抗体と接触させて、前記試料中のＨＮＡ−５特異的抗体と複合体を形成させること；あるいは前記試料をＨＬＡ抗原と特異的に結合する抗体と接触させて、前記試料中のＨＬＡと複合体を形成させること；そして、前記試料がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすい、ということを前記複合体のいずれかの存在が示す前記複合体を検出することのうちの１つもしくは複数のステップをさらに包含する方法を提供する。
【００４５】
前記の方法のいずれかにおいて、これらの抗体は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識またはビオチン標識からなる群から選択される標識を含み得る。さらに、上記の方法のいずれかにおいて、抗原−抗体複合体は、二次抗体を用いて検出され得る。二次抗体は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識またはビオチン標識からなる群から選択される標識を含み得る。
【００４６】
本発明はさらに、移植片または輸血ドナーのＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を遺伝子型分類する方法を提供する。遺伝子型分類するという用語は、ヒト被験者の特定の対立遺伝子、例えばＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂの存在を検出することを指す。これらの方法は、意図された移植片または輸血レシピエントがＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗体を発現することが既知であり、したがって、輸血またはトランスフェクトされた組織中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗原の存在がそれぞれレシピエントにより拒絶されやすい場合、注目される。遺伝子型分類方法は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドプローブ、あるいはＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を含むヌクレオチド断片を増幅するためのＰＣＲを用い得るし、あるいはＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を検出するのに当該技術分野において標準であるシーケンシング法を用いる。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ特異的抗体を発現する）か否かを判定する方法であって、ａ）移植片または輸血のために意図された組織の試料を獲得すること、ｂ）前記試料から核酸を抽出すること、ｃ）前記核酸を、配列番号３の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること、そしてｄ）前記核酸との前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること（ここで、前記プローブのハイブリダイゼーションはＨＮＡ−３ａ核酸の存在を示し、前記試料中のＨＮＡ−３ａの存在は、ＨＮＡ−３ａ特異的抗体を発現するヒトレシピエントにおいて前記試料が拒絶されやすい、ということを示す）、とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて実行され得る。
【００４８】
本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を発現する）か否かを判定する方法であって、ａ）移植片または輸血のために意図された組織の試料を獲得すること、ｂ）前記試料から核酸を抽出すること、ｃ）前記核酸を、配列番号４の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること、そしてｄ）前記核酸との前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること（ここで、前記プローブのハイブリダイゼーションはＨＮＡ−３ｂ核酸の存在を示し、前記試料中のＨＮＡ−３ｂの存在は、ＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を発現するヒトレシピエントにおいて前記試料が拒絶されやすい、ということを示す）、とを包含する方法も提供する。これらの方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて実行され得る。
【００４９】
さらなる実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を発現する）か否かを判定する方法であって、ＨＮＡ−３ａ対立遺伝子またはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子の存在を検出することのほかに、以下のステップ：すなわち、前記試料を、配列番号５の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；前記試料を、配列番号７の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；前記試料を、配列番号９の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；前記試料を、配列番号１１の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；または前記試料を、ＨＬＡ抗原をコードするヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；そして、前記核酸との前記プローブのハイブリダイズを検出すること（ここで、前記プローブのいずれかのハイブリダイゼーションは、前記試料中のＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＨ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡ核酸のいずれかの存在を示し、そして前記試料中のＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＨ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡ核酸のいずれかの存在は、前記試料がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい、ということを示す）、とのうちの１つもしくは複数をさらに包含し得る方法を提供する。例えば、本発明は、ＨＮＡ−１の断片（配列番号５）が、配列番号５のヌクレオチド１４１、ヌクレオチド１４７、ヌクレオチド２２６、ヌクレオチド２２７、ヌクレオチド２７７またはヌクレオチド３４９の少なくとも１つを含む、ということを意図する。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ａ特異的抗体を含有する）を判定する方法であって、ａ）移植または輸血の前に、ヒト移植片または輸血レシピエントから生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料から核酸を抽出すること、ｃ）前記核酸を、配列番号１のヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること、そしてｄ）前記核酸との前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること（ここで、前記核酸との前記プローブのハイブリダイゼーションは前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ核酸の存在を示し、前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ａの存在は、ヒト輸血または移植片レシピエントがＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対して感受性である、ということを示す）、とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて実行され得る。
【００５１】
本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を含有する）を判定する方法であって、ａ）移植または輸血の前に、ヒト移植片または輸血レシピエントから生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料から核酸を抽出すること、ｃ）前記核酸を、配列番号２のヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること、そしてｄ）前記核酸との前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること（ここで、前記核酸との前記プローブのハイブリダイゼーションは前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ｂ核酸の存在を示し、前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ｂの存在は、ヒト輸血または移植片レシピエントがＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対して感受性である、ということを示す）、とを包含する方法も提供する。これらの方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて実行され得る。
【００５２】
本発明はさらに、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を含有する）を判定する方法であって、それぞれＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子の存在を検出することのほかに、以下のステップ：すなわち、前記試料を、配列番号５の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；前記試料を、配列番号７の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；前記試料を、配列番号９の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；前記試料を、配列番号１１の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；または前記試料を、ＨＬＡ抗原をコードするヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；そして前記核酸との前記プローブのハイブリダイズを検出すること（ここで、前記プローブのいずれかのハイブリダイゼーションは、前記試料中のＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＨ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡ核酸のいずれか１つの存在を示し、そして前記試料中のＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＨ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡ核酸のいずれか１つの存在は、前記試料がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすい、ということを示す）のうちの１つもしくは複数のステップをさらに包含する方法を提供する。例えば、本発明は、ＨＮＡ−１（配列番号５）の断片が、配列番号５のヌクレオチド１４１、ヌクレオチド１４７、ヌクレオチド２２６、ヌクレオチド２２７、ヌクレオチド２７７またはヌクレオチド３４９の少なくとも１つを含む、ということを意図する。
【００５３】
前記方法のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドプローブは、膜、フィルター、ビーズおよびチップからなる群から選択される支持体に貼り付けられ得る。さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブがアレイ状にある方法を提供する。本発明は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識またはビオチン標識からなる群から選択される標識を含むオリゴヌクレオチドプローブを包含する。
【００５４】
代替的には、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ特異的抗体を有する）か否かを判定する方法であって、ａ）前記組織から試料を獲得すること、ｂ）前記試料から核酸を抽出すること、ｃ）ＨＮＡ−３ａ核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記抽出核酸から配列番号３のＨＮＡ−３ａ核酸の断片を増幅すること、そしてｃ）前記試料中のＨＮＡ−３ａ核酸の断片を検出すること（ここで、前記試料中のＨＮＡ−３ａ核酸の存在は、ＨＮＡ−３ａ特異的抗体を有するヒトレシピエントにおいて前記試料が拒絶されやすい、ということを示す）,とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＨＮＡ−３ａ核酸の断片を増幅するプライマーを用いて実行され得る。
【００５５】
本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を有する）か否かを判定する方法であって、ａ）前記組織から試料を獲得すること、ｂ）前記試料から核酸を抽出すること、ｃ）ＨＮＡ−３ｂ核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記抽出核酸から配列番号４のＨＮＡ−３ｂ核酸の断片を増幅すること、そしてｄ）前記試料中のＨＮＡ−３ｂ核酸の断片を検出すること（ここで、前記試料中のＨＮＡ−３ｂ核酸の存在は、ＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を有するヒトレシピエントにおいて前記試料が拒絶されやすい、ということを示す）、とを包含する方法も提供する。これらの方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＨＮＡ−３ｂ核酸の断片を増幅する少なくとも１つのプライマーを用いて実行され得る。
【００５６】
本発明はさらに、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を有する）か否かを判定する方法であって、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を検出することのほかに、以下のステップ：すなわち、ＨＮＡ−１核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−１核酸の断片（配列番号５）を増幅すること；ＨＮＡ−２核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−２核酸の断片（配列番号７）を増幅すること；ＨＮＡ−４核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−４核酸（配列番号９）の断片を増幅すること；ＨＮＡ−５核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−５核酸の断片（配列番号１１）を増幅すること；またはＨＬＡ核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＬＡ核酸の断片を増幅すること；そして前記試料中の任意のＨＮＡまたはＨＬＡ核酸の断片を検出すること（ここで、前記試料中のＨＮＡまたはＨＬＡ核酸の存在は、前記試料がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい、ということを示す）のうちの１つもしくは複数のステップをさらに包含する方法を提供する。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−３ａ特異的抗体を含有する）を判定する方法であって、ａ）移植または輸血の前に、ヒトの移植片または輸血のレシピエントから生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料から核酸を抽出すること、ｃ）前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記抽出核酸からＨＮＡ−３ａ核酸の断片（配列番号３）を増幅すること、そしてｄ）前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ核酸の存在を検出すること（ここで、前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ａの存在は、ヒトの輸血または移植片のレシピエントがＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対して感受性である、ということを示す）、とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＨＮＡ−３ａ核酸配列の断片を増幅するプライマーを用いて実行され得る。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ｂ抗体を含有する）を判定する方法であって、ａ）移植または輸血の前に、ヒトの移植片または輸血のレシピエントから生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料から核酸を抽出すること、ｃ）ＨＮＡ−３ｂ核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記抽出核酸からＨＮＡ−３ｂ核酸の断片（配列番号４）を増幅すること、そしてｄ）前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ｂ核酸の存在を検出すること（ここで、前記生物学的試料中のＨＮＡ−３ｂの存在は、ヒト輸血または移植片レシピエントがＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対して感受性である、ということを示す）、とを包含する方法を提供する。これらの方法は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片を増幅するプライマーを用いて実行され得る。
【００５９】
さらなる実施形態では、本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織はＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を含有する）を判定する方法であって、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を検出することのほかに、以下のステップ：すなわち、ＨＮＡ−１核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−１核酸の断片（配列番号５）を増幅すること；ＨＮＡ−２核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−２核酸（配列番号７）の断片を増幅すること；ＨＮＡ−４核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−４核酸（配列番号９）の断片を増幅すること；ＨＮＡ−５核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＮＡ−５核酸（配列番号１１）の断片を増幅すること；またはＨＬＡ核酸に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＬＡ核酸の断片を増幅すること；そして前記試料中のＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡ核酸のいずれか１つの断片を検出すること（ここで、前記試料中のＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡ核酸のいずれか１つの存在は、前記試料がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発しやすい、ということを示す）のうちの１つもしくは複数のステップをさらに包含する方法を提供する。
【００６０】
本発明の前記方法のどの方法においても、前記組織試料または生物学的試料は、血液、血液誘導体、血漿、血清、細胞および組織からなる群から選択される。特に、前記組織試料または生物学的試料は、好中球であり得る。
【００６１】
本発明は、前記方法のどれでも実行するためのキットも提供する。特に、本発明は、ＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡのうちの１つもしくは複数に特異的な抗体を検出するとともに、ＨＮＡ−３ａおよび／またはＨＮＡ−３ｂ抗体を検出するためのキットを提供する。本発明は、ＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡを検出するとともに、ＨＮＡ−３ａおよび／またはＨＮＡ−３ｂ抗原を検出するためのキットも提供する。本発明はさらに、ＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡのうちの１つもしくは複数に関する対立遺伝子を検出するとともに、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を検出する方法を提供する。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発する（ここで、ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ抗原を発現する）か、否かを判定するためのキットであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片、ならびにＦｃ−γ受容体ＩＩＩｂポリペプチド、ＣＤ１７７ポリペプチド、ＣＤ１１ｂポリペプチド、ＣＤ１１ａポリペプチドおよびＨＬＡ抗原からなる群から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその抗原性断片を包含するキットを提供する。本キットは、ＨＮＡ−３ａ特異的抗体の検出とともに、ＨＮＡ３ｂ特異的抗体の検出のために、配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチドまたはその抗原性断片も包含し得る。
【００６３】
本キットは、任意に、ＨＮＡ−３ａに特異的な抗体、ならびにＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡからなる群から選択される抗原を含むペプチドと特異的に結合する１つもしくは複数の抗体も包含し得る。これらのキットのＨＮＡ−３ａポリペプチド断片は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００６４】
本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ特異的抗体を有する）か否かを判定するためのキットであって、ＨＮＡ−３ａに特異的な抗体、ならびにＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡからなる群から選択される抗原を含むペプチドと特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を包含するキットも提供する。
【００６５】
さらに、本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ａ抗体を含有する）を判定するためのキットであって、ＨＮＡ−３ａに特異的な抗体、ならびにＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡからなる群から選択される抗原を含むペプチドと特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を包含するキットを提供する。
【００６６】
前記キットのどのキットも、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片、および／またはＦｃ−γ受容体ＩＩＩｂポリペプチド、ＣＤ１７７ポリペプチド、ＣＤ１１ｂポリペプチド、ＣＤ１１ａポリペプチドおよびＨＬＡ抗原からなる群から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその抗原性断片をさらに包含し得る。本キットは、ＨＮＡ−３ａ抗原の検出とともに、ＨＮＡ−３ｂ抗原の検出のためのＨＮＡ−３ｂに特異的な抗体も包含する。
【００６７】
本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいてＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを誘発する（ここで、ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ抗原を発現する）か、否かを判定するためのキットであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片、ならびにＦｃ−γ受容体ＩＩＩｂポリペプチド、ＣＤ１７７ポリペプチド、ＣＤ１１ｂポリペプチド、ＣＤ１１ａポリペプチドおよびＨＬＡ抗原からなる群から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその抗原性断片を包含するキットを提供する。本キットは、ＨＮＡ−３ａに特異的な抗体、および／またはＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ｂ、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡからなる群から選択される抗原を含むペプチドと特異的に結合する１つもしくは複数の抗体も包含し得る。特に、本発明は、配列番号２のアミノ酸の抗原性断片が配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるキットを意図する。
【００６８】
本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を有する）か否かを判定するためのキットであって、ＨＮＡ−３ｂに特異的な抗体、ならびにＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡからなる群から選択される抗原を含むペプチドと特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を包含するキットも提供する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ｂ抗体を含有する）を判定するためのキットであって、ＨＮＡ−３ｂに特異的な抗体、ならびにＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５およびＨＬＡからなる群から選択される抗原を含むペプチドと特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を包含するキットを提供する。
【００７０】
これらのキットは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片、および／またはＦｃ−γ受容体ＩＩＩｂポリペプチド、ＣＤ１７７ポリペプチド、ＣＤ１１ｂポリペプチド、ＣＤ１１ａポリペプチドおよびＨＬＡ抗原からなる群から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその抗原性断片をさらに包含し得る。
【００７１】
さらに、前記キットは、ＨＮＡ−３ｂ特異的抗体の検出とともに、ＨＮＡ−３ａ特異的抗体の検出のために、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原性断片を包含する。
【００７２】
前記キットのどのキットも、二次抗体を包含し得る。一次または二次抗体は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識またはビオチン標識からなる群から選択される標識を含み得る。
【００７３】
さらなる実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ特異的抗体を有する）か否かを判定するためのキットであって、配列番号３の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片とハイブリダイズする１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプローブを包含するキットを提供する。
【００７４】
本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ａ抗体を含有する）を判定するためのキットであって、配列番号３の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片とハイブリダイズする１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプローブを包含するキットも提供する。これらのキットのオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片を包含し得る。
【００７５】
本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を発現する）か否かを判定するためのキットであって、配列番号４の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片とハイブリダイズする１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプローブを包含するキットも提供する。
【００７６】
本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ｂ抗体を含有する）を判定するためのキットであって、配列番号４の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片とハイブリダイズする１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプローブを包含するキットも提供する。これらのキットのオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片を含み得る。
【００７７】
前記キットのどのキットにおいても、オリゴヌクレオチドプローブは、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識およびビオチン標識からなる群から選択される標識を含み得る。さらに、これらのキットは、ゲルローディング用の緩衝液をさらに包含し得る。
【００７８】
別の実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ａ特異的抗体を発現する）か否かを判定するためのキットであって、配列番号３のＨＮＡ−３ａ核酸配列の断片を増幅するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片を増幅するための１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを包含するキットを提供する。
【００７９】
本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒトの移植片または輸血のレシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ａ抗体を含有する）を判定するためのキットであって、配列番号３のＨＮＡ−３ａ核酸配列の断片を増幅するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片を増幅するための１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを包含するキットも提供する。これらのプライマーは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＨＮＡ−３ａ核酸の断片を増幅し得る。
【００８０】
前記キットは、オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅されるＨＮＡ−３ａ核酸の断片、および/または、オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅される、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の１つもしくは複数の断片をさらに包含し得る。さらに、これらのキットは、ＨＮＡ−３ａの断片の増幅とともに、配列番号４のＨＮＡ−３ｂ核酸の断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーをさらに包含する。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、移植片または輸血のために意図されたドナー組織がヒトレシピエントにおいて拒絶されやすい（ここで、前記ヒトレシピエントはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を発現する）か否かを判定するためのキットであって、配列番号４のＨＮＡ−３ｂ核酸配列の断片を増幅するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列の断片を増幅するための１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを包含するキットを提供する。
【００８２】
本発明は、ＴＲＡＬＩまたはＧＶＨＤを発症することに対するヒト移植片または輸血レシピエントの感受性（ここで、前記ドナー組織は抗ＨＮＡ−３ｂ抗体を含有する）を判定するためのキットであって、配列番号４のＨＮＡ−３ｂ核酸配列の断片を増幅するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１およびＨＬＡヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列およびＨＬＡヌクレオチド配列の断片を増幅するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを包含するキットも提供する。これらのプライマーは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＨＮＡ−３ａ核酸の断片を増幅し得る。
【００８３】
前記キットのどのキットも、ＰＣＲ増幅のための緩衝液、ｄＮＴＰおよびゲルローディングのための緩衝液を包含し得る。
【００８４】
別の実施形態では、本発明は、単離ＨＮＡ−３ｂポリペプチド、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、配列番号２のポリペプチドの断片を含む単離ポリペプチドであって、前記断片が少なくとも７アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長または少なくとも５０アミノ酸長である単離ポリペプチドを提供する。ＨＮＡ−３ｂの断片としては、配列番号２のアミノ酸残基を含む断片（ここで、残基１５４はグルタミン（Ｇｌｎ）である）が挙げられる。ＨＮＡ−３ｂポリペプチドの断片は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＨＮＡ−３ｂ特異的同種異系抗体と反応するかまたは特異的に結合する。本発明は、ＨＮＡ−３ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
【００８５】
本発明は、配列番号１のＨＮＡ−３ａポリペプチドの断片、例えば、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供し、この単離ポリペプチドはＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体と反応するかまたは特異的に結合する。
【００８６】
別の実施形態では、本発明は、ＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体の同定のためのＨＮＡ−３ａポリペプチドまたはその断片の使用を提供する。ＨＮＡ−３ｂ特異的同種異系抗体の同定のためのＨＮＡ−３ｂポリペプチドまたはその断片の使用も提供される。
【００８７】
本発明はさらに、ＨＮＡ−３ａ遺伝子型の確定のための、ＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体と反応するか、特異的に結合するタンパク質をコードするＨＮＡ−３ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片の使用を提供する。さらに、本発明は、ＨＮＡ−３ａ遺伝子型の確定のための、ＨＮＡ−３ｂポリヌクレオチドまたはその断片の使用を提供する。例えば、本発明は、ＨＮＡ−３ｂ遺伝子型の確定のためのコドン１５４を含む配列番号４の断片の使用を提供する。
【００８８】
さらなる実施形態では、本発明は、ＨＮＡ−３ａ抗原に対する抗体の同定のために、血液試料または血漿の分析における、ＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体と反応する配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を含むタンパク質またはＨＮＡ−３ａタンパク質断片の使用を提供する。
【００８９】
本発明は、ＨＮＡ−３ｂ抗原に対する抗体の同定のために、血液試料または血漿の分析におけるＨＮＡ−３ｂポリペプチドの使用も提供する。
【００９０】
血液試料または血漿から抗体を分離するためにタンパク質またはタンパク質断片を用いるプロセスにおける、配列番号１のアミノ酸配列（ＨＮＡ−３ａ）またはその断片、あるいは配列番号２のアミノ酸（ＨＮＡ−３ｂ）またはその断片を含むポリペプチドの使用。
【００９１】
抗体、好ましくはモノクローナル抗体を産生するためにタンパク質またはタンパク質断片を用いるプロセスにおける、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＨＮＡ−３ａ）またはその断片、あるいは配列番号２のポリペプチド（ＨＮＡ−３ｂ）またはその断片の使用。さらなる実施形態では、本発明は、ヒト被験者におけるＨＮＡ−３ｂ遺伝子型のスクリーニング方法であって、ａ）前記ヒト被験者から生物学的試料を獲得すること、ｂ）前記生物学的試料から核酸を抽出すること、そしてｃ）前記生物学的試料中の配列番号４の核酸配列の断片を検出すること（ここで、前記断片は配列番号４のコドン１５４を含み、配列番号４のコドン１５４の検出は、前記ヒト被験者がＨＮＡ−３ｂ遺伝子型を有するということを示す）、とを包含する方法を提供する。本検出ステップは、前記核酸を、配列番号４の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させること、あるいは配列番号４の断片に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて前記抽出核酸から配列番号４の断片を増幅することを包含し得る。ＨＮＡ−３ｂ遺伝子型に関してスクリーニングする方法に関しては、用いられる生物学的試料は、血液、血液誘導体、血漿、血清、細胞および組織からなる群から選択され得る。
【００９２】
本発明の配列
配列番号１  −  ヒトＨＮＡ−３ａタンパク質
【００９３】
配列番号２  −  ヒトＨＮＡ−３ｂタンパク質
【００９４】
配列番号３  −ヒトＨＮＡ−３ａＤＮＡ
【００９５】
配列番号４  −ヒトＨＮＡ−３ｂＤＮＡ
【００９６】
配列番号５  −  ヒトＦＣγ受容体ＩＩＩｂＤＮＡ（ＨＮＡ−１）
【００９７】
配列番号６  −  ヒトＦＣγ受容体ＩＩＩｂタンパク質（ＨＮＡ−１）
【００９８】
配列番号７  −  ヒトＣＤ１７７ＤＮＡ（ＨＮＡ−２）
【００９９】
配列番号８  −  ヒトＣＤ１７７タンパク質（ＨＮＡ−２）
【０１００】
配列番号９  −  ヒトＣＤ１１ｂＤＮＡ（ＨＮＡ−４）
【０１０１】
配列番号１０  −  ヒトＣＤ１１ｂタンパク質（ＨＮＡ−４）
【０１０２】
配列番号１１  −  ヒトＣＤ１１ａＤＮＡ（ＨＮＡ−５）
【０１０３】
配列番号１２  −  ヒトＣＤ１１ａタンパク質（ＨＮＡ−５）
【０１０４】
配列番号１３  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸１〜２３１
【０１０５】
配列番号１４  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸５５〜１８３
【０１０６】
配列番号１５  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸５５〜１６４
【０１０７】
配列番号１６  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸１１４〜１６４
【０１０８】
配列番号１７  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸５５〜７０６
【０１０９】
配列番号１８  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸１１４〜７０６
【０１１０】
配列番号１９  −  ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）のアミノ酸１〜２３１
【０１１１】
配列番号２０  −  ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）のアミノ酸５５〜１８３
【０１１２】
配列番号２１  −  ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）のアミノ酸５５〜１６４
【０１１３】
配列番号２２  −  ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）のアミノ酸１１４〜１６４
【０１１４】
配列番号２３  −  ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）のアミノ酸５５〜７０６
【０１１５】
配列番号２４  −  ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）のアミノ酸１１４〜７０６
【０１１６】
配列番号２５  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸１５４〜１６４
【０１１７】
配列番号２６  −  ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）のアミノ酸１５４〜１６４
【０１１８】
配列番号２７〜４７  −  表１のＨＮＡ−３ａの断片
【０１１９】
配列番号４８  −  ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）のアミノ酸１４５〜１６７
【０１２０】
配列番号４９〜５５  −  プライマー配列。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
本発明は、ＨＮＡ−３がＣＴＬ２膜貫通タンパク質上に位置するという発見に基づいている。輸血レシピエントにおいてＴＲＡＬＩを誘発することが既知であったが、ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２抗体に関して陰性であった血清試料を用いて、ＨＮＡ−３ａ抗原の供給源を同定した。ＨＮＡ−３ａ血清により免疫沈降されたＨＮＡ−３ａ陽性および陰性細胞表面タンパク質を先ず比較することにより、ＨＮＡ−３ａを同定した。フローサイトメトリーにより、ＨＮＡ−３ａ陽性および陰性血清で細胞を特徴付けした。次いで、ＨＮＡ陽性および陰性顆粒球を、ＨＮＡ−３ａ陽性血清とともにインキュベートし、当該血清と反応する細胞表面タンパク質を、実施例６に詳述されるようなプロテインＧ被覆磁気ビーズを用いて免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質プロフィールを先ず分析したが、約８０〜１００ｋＤの分子量を有する２つの同定されたタンパク質は、陽性細胞中にのみ存在し、陰性細胞中には存在しなかった。それらのタンパク質をＳＤＳゲルから切り出して、質量分光分析法（ＭＳ）によりさらに分析して、アミノ酸配列をシーケンシングすることにより確認した。
【０１２２】
本発明は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗原に特異的な抗体を検出するための生物学的試料のスクリーニング方法を提供する。生物学的試料としては、全血、血液誘導体、赤血球濃縮物、血漿、血清、新鮮凍結血漿、全血由来血小板濃縮物、アフェレーシス血小板、プール血小板、静脈内ガンマグロブリン、寒冷沈降物、脳脊髄液、組織および細胞、例えば幹細胞、好中球および顆粒球が挙げられる。生物学的試料は、移植のために意図された組織または細胞のヒトドナー、あるいは輸血のために意図された血液または血液誘導体のヒトドナーから獲得され得る。生物学的試料は、ヒトレシピエントに移植するために意図した組織または細胞から獲得され得る。さらに、生物学的試料は、ヒトレシピエントに輸血するために意図した血液または血液誘導体から獲得され得る。生物学的試料は、移植片または輸血の意図されたレシピエントであるヒト被験者からも獲得され得る。
【０１２３】
本発明は、レシピエントが移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症する場合の感受性に関してスクリーニングすること、あるいは発症するか否かを判定することにも関する。ＧＶＨＤは、レシピエントを攻撃する免疫学的コンピテント細胞または抗体を組織が含む場合である。ＧＶＨＤの主因は、同種異系間（２つの個体間）および自己由来（同一個体から）の両方の造血細胞移植である。固形器官移植片、輸血および母親−胎児輸血もＧＶＨＤを引き起こすと報告されている。ＧＶＤＨの急性症候としては、腹部の疼痛または障害、下痢、発熱、黄疸、皮膚発疹、嘔吐および体重損失が挙げられる。ＧＶＨＤの慢性症候としては、ドライアイ、口渇、肝炎、肺および消化管障害ならびに皮膚発疹が挙げられる。
【０１２４】
本発明は、移植または輸血組織がレシピエントにより拒絶されやすいか否かを判定することに関連した方法および生成物にも関する。拒絶の症候としては、移植器官が適正に機能しないという適応症、全身性不快、困惑または気分の悪さ、疼痛あるいは器官の位置での腫脹および発熱が挙げられる。
ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂの同定
【０１２５】
したがって、ＴＲＡＬＩに関与するヒト好中球抗原−３ａまたは−３ｂ（ＨＮＡ−３ａ、ＨＮＡ−３ｂ）ノタンパク質およびＤＮＡ配列を同定し、提供することが、本発明の一目的である。
【０１２６】
言い換えれば、ＨＮＡ−３ａに特異的である同種異系抗体と反応するアミノ酸配列（配列番号１）からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）の提供により、ならびにＨＮＡ−３ｂに特異的である同種異系抗体と反応するアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ｂ抗原）の提供により、問題を解決した。
【０１２７】
ＨＮＡ−３ａ陽性および陰性被験者の細胞がさらなる研究のために用いられ得るＨＮＡ−３ａ陽性および陰性被験者の同定のために、問題となっている被験者を検査した。ドナーの血液製剤がＴＲＡＬＩを誘発しているドナーからの抗体、ならびに対応する抗原が白血球の表面上に発現される白血球を用いた。ＨＮＡ−３ａ抗体とともに抗原が沈降され得る高力価ＨＮＡ−３ａ抗体を有する被験者の同定後、抗原−抗体反応のために十分な材料を得るために、ドナーを血漿分離交換に付した。これらの抗体によりこれらの抗原を沈降させ、ＨＮＡ−３ａの依然として未知のタンパク質／遺伝子構造を特徴付けした。
【０１２８】
詳述すると、先ず、顆粒球の調製の最適化を開発した。次いで、スクリーニング計画により、その細胞がさらなる研究に用いられ得るＨＮＡ−３ａ陽性および陰性被験者を確定した。次に、ＨＮＡ−３ａ抗体とともに抗原が沈降され得る高力価ＨＮＡ−３ａ抗体を有する被験者を選択した。抗原−抗体反応に十分な材料を得るために、選択した被験者の血漿分離交換を実行した。血小板が核を有さず、したがって調製が簡単であるため、血小板を用いて、定量的ゲル電気泳動のための顆粒球膜タンパク質の調製のための方法を先ず開発した。次いで、当該方法を、核を含有する白血球／顆粒球に移し、適合させた。これにより、顆粒球膜タンパク質の調製の最適化が可能になった。分析法により、対応するタンパク質を分析した。免疫沈降により調製膜タンパク質からのＨＮＡ−３ａの濃縮／単離を実行し、ウエスタンブロットにより確認した。質量分光分析法により、ＨＮＡ−３ａを保有するタンパク質を同定し、その後、配列分析によりＨＮＡ−３ａの一次配列を同定した（配列番号１）。
【０１２９】
したがって本発明は、ＨＮＡ−３ａ特異的である同種異系抗体と反応するアミノ酸配列（配列番号１）からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）に関する。さらに、１つもしくは複数のアミノ酸が除去されたか、付加されたかまたは置換された、そしてＨＮＡ−３ａ特異的である同種異系抗体と反応する、アミノ酸配列（配列番号１）からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）も包含される。同定されたＨＮＡ−３ａ抗原は、膜貫通受容体ＣＴＬ２の変異体であることを証明した。これは、８０〜１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、脱グリコシル化は、ウエスタンブロットにおいてバンドを６４ｋＤａにシフトした。
【０１３０】
ＨＮＡ−３抗原は、顆粒球およびリンパ球上のＣＴＬ２上で発現される。細胞外ループ上の単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）は、このＳＮＰがＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂ間の違いであるので、極めて重要である（ＳＮＰ  ｒｓ２２８８９０４）。このＳＮＰは、それらのＨＮＡ−３ａ／ＨＮＡ−３ｂ状態に関連して、血液ドナーの遺伝子型分類を可能にする。ＨＮＡ−３ａをコードするポリヌクレオチドは位置４６１に「Ｇ」（グアニン）を有し、結果として、ＨＮＡ−３ａアミノ酸配列の位置１５４の「Ｒ」（アルギニン、Ａｒｇ）をコードし、したがって、ＨＮＡ−３ａ対立遺伝子を表す。ＨＮＡ−３ｂをコードするポリヌクレオチドは位置４６１に「Ａ」（アデニン）を有し、結果として、そのアミノ酸配列の位置１５４の「Ｑ」（グルタミン、Ｇｌｎ）をコードし、したがって、ＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子を表す。
【０１３１】
位置１５４アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）のグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）へのアミノ酸交換により、ＨＮＡ−３ｂ抗原の一次配列を確定した（配列番号２参照）。したがって、本発明は、ＨＮＡ−３ｂ特異的同種異系抗体と反応する配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ｂ）に関する。同様に、本発明は、１つもしくは複数のアミノ酸が除去されたか、付加されたかまたは置換された、そしてＨＮＡ−３ｂ特異的同種異系抗体と反応する、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨＮＡ−３ｂタンパク質を包含する。
【０１３２】
同様に、本発明は、少なくとも７、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸または少なくとも５０アミノ酸の鎖長を有するタンパク質断片である、ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂの両方に関する、タンパク質を提供する。
【０１３３】
その後、ＨＮＡ−３ａ遺伝子を単離し、異種発現させた。対応するＨＮＡ−３ａのＤＮＡ配列は、ヌクレオチド配列（配列番号３）（上記ＨＮＡ−３ａ抗原をコードし、ＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体と反応するかまたはそれと結合する）として示される配列、ならびにそれとハイブリダイズする全ての配列に対応する。本発明は、配列番号３（上記ＨＮＡ−３ａ抗原をコードし、ＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体と反応するかまたはそれと結合する）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％のヌクレオチドレベルでの同一性を有するヌクレオチド配列、ならびにそれとハイブリダイズする全ての配列も包含する。
【０１３４】
さらに、本発明は、ヌクレオチド配列（配列番号３）と少なくとも７０％同一である配列番号３のヌクレオチド配列のスプライス変異体を提供する。好ましくは配列番号３との配列同一性は、少なくとも８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である。
【０１３５】
本発明はさらに、ヌクレオチド配列（配列番号４）（上記ＨＮＡ−３ｂ抗原をコードし、ＨＮＡ−３ｂ特異的同種異系抗体と反応する）ならびにそれとハイブリダイズする全ての配列を提供する。これは、配列番号４（上記ＨＮＡ−３ｂ抗原をコードし、ＨＮＡ−３ｂ特異的である同種異系抗体と反応する）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％のヌクレオチドレベルでの同一性を有するヌクレオチド配列、ならびにそれとハイブリダイズする全ての配列も包含する。例示的な緊縮ハイブリダイゼーション条件は、６５℃でハイブリダイズさせること、６５℃の０．２５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間、３回洗浄することを包含する。付加的例示的な緊縮ハイブリダイゼーション条件は、約５０℃〜７０℃の温度の０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌまたは６５℃の０．５×ＳＳＣ、０．２５％ＳＤＳ中で、１５分間ハイブリダイズさせること、その後、６５℃で３０分間洗浄すること、あるいは６５℃で１４時間ハイブリダイズさせ、その後、６５℃の０．５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで３回洗浄することを包含する。
【０１３６】
さらに、本発明は、ヌクレオチド配列（配列番号４）と少なくとも７０％同一である配列番号４のヌクレオチド配列のスプライス変異体を提供する。好ましくは配列同一性は、少なくとも８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である。
【０１３７】
配列同一性またはヌクレオチドレベルでの同一性は、一般に、１００％同一性を意味する。
【０１３８】
確定された一次構造に基づいて、抗原の組換え産生のための方法を、既知のタンパク質／抗原ＨＮＡ−１ａ、−１ｂ、−１ｃ、−２ａを基礎にして最適化した。ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２抗原に関して得られた結果をＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂに移したが、その結果、適切な発現系で、例えば大腸菌中で、真核生物細胞中で、昆虫細胞中でこれらの抗原を産生し得る。
【０１３９】
本発明は、したがって、ＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体の同定のために、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）の使用を含む。同様に、ＨＮＡ−３ｂ特異的同種異系抗体の同定のために、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ｂ抗原）の使用が本発明に包含される。
【０１４０】
さらに、本発明は、ＨＮＡ−３ａ遺伝子型を判定するために配列番号３のヌクレオチド配列の使用、ならびにＨＮＡ−３ｂ遺伝子型を判定するために配列番号４のヌクレオチド配列の使用を包含する。
【０１４１】
本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ検定、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、エレクトロチップ検定、ＰＣＲおよび凝集検査を用いて実行され得る。
【０１４２】
同様に、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）と結合するＨＮＡ−３ａ特異的同種異系抗体を確定するための試験系を提供する。本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ｂ抗原）と結合するＨＮＡ−３ｂ特異的同種異系抗体を確定するための試験系を提供する。
【０１４３】
本発明は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＨＮＡ−３ａ遺伝子型を確定するための試験系、ならびに配列番号４のヌクレオチド配列を含むＨＮＡ−３ｂ遺伝子型を確定するための試験系も提供する。
【０１４４】
本発明によれば、配列番号１のアミノ酸からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）は、ＨＮＡ−３ａ抗原と特異的に結合する抗体の同定のために血液試料または血漿の分析に用いられ得る。同様に、配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ｂ抗原）は、ＨＮＡ−３ｂ抗原に対する抗体の同定のために血液試料または血漿の分析に用いられ得る。
【０１４５】
本発明はさらに、血液試料または血漿から抗体を分離するための、抗原を用いる方法における配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）の使用を包含する。本発明は、同様に、血液試料または血漿から抗体を分離するための、抗原を用いる方法における上記と同様の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ｂ抗原）の使用を包含する。特に好ましいのは、血漿分離交換法のような吸着方法における当該タンパク質の使用である。
【０１４６】
本発明はさらに、抗体、好ましくはモノクローナル抗体を産生するための、抗原を用いる方法における配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ａ抗原）の使用を提供する。同様に、本発明は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体を産生するための、抗原を用いる方法における配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＮＡ−３ｂ抗原）の使用を提供する。
【０１４７】
ＨＮＡ−３ａの抗原性断片
ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を生じるＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂの抗原性断片のエピトープマッピングは、当該技術分野で標準な方法、例えば部位特異的突然変異誘発、遺伝子工学処理、ＣＴＬ２ペプチドライブラリーの解析、予測アルゴリズム、機能的分析、例えばＥＬＩＳｐｏｔまたは細胞内サイトカイン染色、および細胞結合検定を用いて同定され得る。ペプチドライブラリーの解析のための高処理量系、例えばＲＥＶＥＡＬ＆ＰｒｏＶＥ（商標）系（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ．  ＶＡ）が、市販されている。
【０１４８】
ＨＮＡ−３ａ（配列番号１）の好ましいタンパク質断片としては、同種異系抗体のようなＨＮＡ−３ａ特異的抗体と反応するか結合する、少なくとも配列番号１３のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸１〜２３１）、少なくとも配列番号１４のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸５５〜１８３）、少なくとも配列番号１５のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸５５〜１６４）、少なくとも配列番号１６のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸１１４〜１６４）、少なくとも配列番号２５のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸１５４〜１６４）、少なくとも配列番号１７のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸５５〜７０６）、および少なくとも配列番号１８のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸１１４〜７０６）が挙げられる。
【０１４９】
さらに、本発明は、１つもしくは複数のアミノ酸が除去され、付加されまたは置換されており、ＨＮＡ−３ａ特異的抗体または同種異系抗体と反応するかまたは結合する、本明細書中に記載されるような配列番号１のアミノ酸配列からなる任意のタンパク質断片に関する。
【０１５０】
本発明は、配列番号２のアミノ酸のタンパク質断片に関する。ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）の好ましいタンパク質断片としては、同種異系抗体のようなＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と反応するか結合する、少なくとも配列番号１９のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜２３１）、少なくとも配列番号２０のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸５５〜１８３）、少なくとも配列番号２１のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸５５〜１６４）、少なくとも配列番号２２のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１１４〜１６４）、少なくとも配列番号２６のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１５４〜１６４）、少なくとも配列番号２３のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸５５〜７０６）、および少なくとも配列番号２４のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１１４〜７０６）が挙げられる。
【０１５１】
同様に、本発明は、１つもしくは複数のアミノ酸が除去され、付加されまたは置換されており、ＨＮＡ−３ｂ特異的抗体または同種異系抗体と反応するかまたは結合する、上記のような配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質断片に関する。
【０１５２】
ＨＮＡ−３特異的抗体の検出方法
本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体の検出方法を提供する。本発明は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を検出することとともに、ＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２またはＨＬＡに特異的な抗体のような他の抗体を検出することも意図する。抗体の検出方法としては、非特異的および特異的検定、例えば顆粒球免疫蛍光試験、顆粒球免疫蛍光フローサイトメトリー検定（ＧＩＦＴ−ＦＣ）、顆粒球抗原のモノクローナル抗体固定化（ＭＡＩＧＡ）検定、一元放射免疫拡散検定（ＳＲＩＤ）、酵素免疫検定および赤血球凝集抑制検定（ＨＡＩ）が挙げられる。
【０１５３】
例示的な非特異的検定は、標的として無傷顆粒球を用い、例えば、ＧＩＦＴ−ＦＣは、異なるＨＮＡを有する好中球のパネルを用いる（Ｄａｖｏｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４３（５）：  ６４１−５，  ２００３；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｅｄ．  Ｒｅｓ．  ２６：  ２４６−２４９）。この好中球を、先ず、試験血清とともにインキュベートし、その後、蛍光標識二次抗体、例えば抗ヒト多価免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡとともにインキュベートする。洗浄後、細胞懸濁液と結合している抗体を、フローサイトメトリーにより検査する。
【０１５４】
例示的な特異的検定、例えばＭＡＩＧＡ検定は、標的として固定化ＨＮＡ糖タンパク質を用いる。ＭＡＩＧＡは、試験血清内の好中球抗原を捕捉するためにＨＮＡ−３特異的モノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡベースの試験である。その後、細胞混合物を酵素標識二次抗体、例えば抗マウスＩｇＧとともにインキュベートし、そして比色検定で結合を検出する（Ｂｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄ．  ３（２）：  １５７−６２，  １９９３；Ｍｅｔｃａｌｆｅ  ＆  Ｗａｔｅｒｓ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄ．  ２：  ２８３−２８７，１９９２）。
【０１５５】
ＥＬＩＳＡ検定を用いて、試料中の総抗体を確定する。免疫原、例えば配列番号１のＨＮＡ−３ａポリペプチド、配列番号２のＨＮＡ−３ｂポリペプチドまたはその抗原性断片を、微量滴定プレートの表面に吸着させる。試験血清を当該プレートに曝露し、その後、酵素結合性免疫グロブリン、例えばＩｇＧに曝露する。プレートに吸着している酵素活性は分光光度計のような任意の便利な手段により定量され、試験試料中に存在する免疫原に対する抗体の濃度に比例する。さらに、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂポリペプチドまたはその抗原性断片は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂに特異的な抗体の検出のための膜、ビーズ、フィルター、ガラス、ケイ素、金属、金属合金、ａｎｏｐｏｒｅ、重合体、ナイロンまたはプラスチックのような固体支持体に結合させることができる。
【０１５６】
ＳＲＩＤ検定は、試験されている抗原を含有するアガロースのようなゲルの層を利用する。このゲル中で切断されたウェルに、試験血清を入れる。ゲル中への抗体の拡散は、沈降輪の面積が試験されている血清中の抗体の濃度に比例する沈降輪を形成する。
【０１５７】
ＨＡＩは、ニワトリ赤血球（等）を凝集する免疫原の能力を利用する。この検定は、中和抗体、すなわち、赤血球凝集を抑制し得る抗体を検出する。試験血清の希釈液を標準濃度の免疫原とともにインキュベートし、その後、赤血球を付加する。中和抗体の存在は、免疫原による赤血球の凝集を抑制する。
【０１５８】
移植片または輸血患者の血清中の循環抗ＨＮＡ−３ａまたは抗ＨＮＡ−３ｂ抗体を検出するために、付加的な検定が用いられ得る。このような検定では、補体媒介性溶解活性の検出により、抗ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗体の存在に関して、血清をスクリーニングする。最も高頻度に見られるＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗原を有する個体のパネルから、ＴおよびＢリンパ球に対する補体媒介性溶解活性に関して血清をスクリーニングする。ジチオエリトリトールの存在下または非存在下で、本検定を実施する。
【０１５９】
本発明のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗体の検出方法は、好中球、あるいはＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを発現するよう形質転換されたかまたはトランスフェクトされた任意の細胞型を用いて実行され得る。当該方法は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３を内因的に発現しない細胞、例えばＢ細胞、ＣＨＯ細胞または昆虫細胞を用いて実行され得る。本発明は、低レベルのＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを発現する細胞を用いること、ならびに異種プロモーターまたはエンハンサーを挿入することにより内因性ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂタンパク質の発現を増大すること、あるいはＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ遺伝子のコピー数を増大することも意図する。
【０１６０】
本発明の方法に用いられ得る例示的なＢ細胞としては、ＥＢ−３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８５）、Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）、ＲＡＪＩ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、Ｊｉｙｏｙｅ細胞（ＣＣＬ８７）、ＩＭ−９（ＡＴＣＣ１５９）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２１３）、ＮＣ−３７細胞（ＡＴＣＣ  ２１４）、Ｍｏ−Ｂ細胞（ＡＴＣＣ  ２４５）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４６）、Ｈ２１２６細胞（ＡＴＣＣ  ２５６）、ＢＬ２１２６細胞（ＡＴＣＣ  ２５６）およびＭＣＬ−５細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０５７５）が挙げられる。本発明の方法に用いられ得るその他の例示的な細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７：  ４２１６−４２２０  （１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ９２）、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１６５０）およびＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１６５１）ならびにＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ７０）が挙げられる。さらに、昆虫細胞、例えばＳＦ−９およびＨＩ５細胞が、本発明の方法に用いられ得る。
【０１６１】
さらに、低または中等度レベルでＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを内因的に発現する細胞は、内因性ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを増強するかまたは過剰発現するよう修飾され得る。例えば、プロモーター、エンハンサー素子または内因性転写調節素子が、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすのに十分な近接性および配向で意図された細胞のゲノム中に挿入される。制御素子は、宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。したがって、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂポリペプチドの発現は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ遺伝子それ自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによるのでなく、むしろ、転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントに連結されたターゲッティングＤＮＡ（当該内因性遺伝子と相同の領域を含有する）の使用により、達成され得る。
【０１６２】
本発明は、生物学的試料を、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗原性断片またはエピトープを模倣するアプタマーと接触させることにより、生物学的試料内のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を検出する方法も提供する。アプタマーは、高親和性および特異性を有する標的タンパク質を結合する配列依存性三次元形状を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む高分子である。本発明は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂエピトープを模倣し、したがってＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と結合する配列を有するアプタマーを開発し、使用することを意図する。これらのアプタマーは、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体の存在を検出するために本発明の方法のどの方法にも用いられ得る。
【０１６３】
本発明のアプタマーは、チオレドキシンのような足場に融合される１５〜５０塩基の範囲のサイズの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。これらのアプタマーは、本発明のＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂペプチドの物理的または構造的特質を模倣する。これらのアプタマーは、一般に、指数関数的濃縮によるリガンドの統計的進化（ＳＥＬＥＸ）として既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択プロセスにより組合せライブラリーから得られる。ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗体に対するアプタマーを同定し、合成するための例示的な方法は、Ｌｏ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｖｏｌ  ２４８  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００４；Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，  Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ，  ２００６；およびＪａｙａｓｅｎａ  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４５：  １６８−１６５０，  １９９９に示されている。本明細書中に記載される検定のいずれかを用いて、意図されたアプタマーがＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と結合することを確認し得る。
【０１６４】
さらに、本発明は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂの抗原性断片の二次または三次構造を模倣するが、一方、一次アミノ酸構造が異なるペプチドを用いてＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を検出する方法を提供する。これらのペプチドの構造的特質は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗体をこれらのペプチドと交差反応させる。これらのペプチドは、当該技術分野における標準方法、例えばファージ表示ペプチドライブラリーおよび組合せライブラリーを用いて同定され得る。
【０１６５】
ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体の識別方法
生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を検出するための本明細書中に記載される技法のどの技法を用いても、特定の抗体がＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂと特異的に結合するか否かを識別し得る。これらの検定は、全長ポリペプチド、またはアミノ酸１５４を含むペプチドを用いて実行される。特に、これらの検定に用いられるペプチドは、ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂエピトープを識別する任意の二次または三次構造を保有し得る。
【０１６６】
さらに、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを発現することが知られている細胞または組織を用いる検定は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を同定し、識別するために用いられ得る。これらの検定は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを発現するようトランスフェクトされた、または形質転換された細胞を包含する。
【０１６７】
これらのＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体の単離は、本発明の方法を実行するために有用である。さらに、本発明のキットは、単離ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を含み得る。
【０１６８】
ＨＮＡ−３タンパク質の検出方法
本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂの検出方法を提供する。「ＨＮＡ−３ａ」という用語は、配列番号１の全長配列または配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一断片を指す。「ＨＮＡ−３ｂ」という用語は、配列番号２の全長アミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも一断片を指す。特異的抗体を生成する特定のエピトープを含むＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂの抗原性断片が注目される。例えば、細胞表面に曝露される配列番号１または２のアミノ酸配列の領域は、エピトープを含む可能性がより高い。
【０１６９】
ＨＮＡ−３ａ特異的抗体を生成するために用いられ得る例示的な抗原性断片としては、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２のアミノ酸配列が挙げられる。ＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を生成するために用いられ得る例示的な抗原性断片としては、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６のアミノ酸配列が挙げられる。
【０１７０】
ＣＴＬ２の一次構造は、ＣＴＬ２遺伝子のコード領域とプロモーター領域の両方に多数の多形領域の存在を示す。ＣＴＬ２遺伝子における多形性は、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂに関する多形情報を提供し得る。プロモーター領域内の違いは、異なる転写効率を生じ、したがってＣＴＬ２ポリペプチドの発現に影響を及ぼし得る。コード領域における多形性は、ＣＴＬ２タンパク質立体配座を変更し、したがって、異なる多形ＣＴＬ２タンパク質は互いに対して免疫原性になる。例えば、ＨＮＡ−３ａ／ＨＮＡ−３ｂのヌクレオチド４６１は多形性であり、この場合、ＨＮＡ−３ａ対立遺伝子が位置１５４のアルギニンをコードする「Ｇ」であり、ＨＮＡ−３ｂ対立遺伝子が「Ａ」であり、グルタミンをコードする。
【０１７１】
ヒト好中球抗原ＨＮＡ−１は、多形性エピトープを有する。ＨＮＡ−１は、ＦｃγＲＩＩＩｂ遺伝子内の多形性の結果である３つの対立遺伝子ＨＮＡ−１ａ、ＨＮＡ−１ｂおよびＨＮＡ−１ｃを有する。ＨＮＡ−１ａおよびＨＮＡ−１ｂは、４つのアミノ酸が異なる。ＨＮＡ−１ｃは、ＨＮＡ−１ｂとはヌクレオチド２６６での単一ヌクレオチド置換（ＣからＡへの置換）で異なり、これは、アミノ酸７８でのアラニンからアスパラギン酸への変化を生じる。上記のように、ＣＴＬ２遺伝子における多形性は、ＨＮＡ−１に関して観察されたものと同様のＨＮＡ−３多形性エピトープを生じ得る。
【０１７２】
しかしながら、ヒト好中球抗原ＨＮＡ−２は、集団の一部がＨＮＡ−２を発現しない単形性エピトープを有する。ＨＮＡ−２は１つの十分に説明された対立遺伝子ＨＮＡ−２ａのみを有する。ＨＮＡ−２ａ欠損は、５〜１０％の個体に存在する転写欠陥により引き起こされる。それらの個体は、ＨＮＡ−２ａ抗原に曝露されると、ＨＮＡ−２ａ抗体を生成し得る。したがって、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂは、ＨＮＡ−２と同様に単形性エピトープを有し得る、と意図される。
【０１７３】
本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを検出することとともに、付加的抗原、例えばＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５および／またはＨＬＡを検出することも意図する。
【０１７４】
ヒトＣＴＬ２と結合する市販の抗体が、本発明の方法に用いられ得る。市販抗体の例としては、ヒトモノクローナル抗ＳＬＣ４４Ａ２抗体（クローン３Ｄ１１）およびヒト抗ＳＬＣ４４Ａ２ポリクローナル抗体（ともに、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から入手可能）が挙げられる。付加的抗体の例としては、ＳＬＣ４４Ａ２抗体（ａｂ５７５７０）（Ａｂｃａｍ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）から入手可能）、ＣＴＬ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン３Ｄ１１（Ａｂｎｏｖａ  （Ｗａｌｎｕｔ，  ＣＡ）から入手可能）、マウスポリクローナル抗ＳＬＣ４４Ａ２−溶質キャリアファミリー４４、メンバー２、ＭａｘＰａｂ抗体およびマウスポリクローナル抗ＣＴＬ２（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  （Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，  ＣＯ）から入手可能）が挙げられる。
【０１７５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの独特のエピトープを結合するそれらの能力を保持する抗体断片（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２断片）、一本鎖抗体およびヒトまたはヒト化抗体であり得る。抗体は、ＣＴＬ２上のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂエピトープ、または配列番号１または配列番号２の抗原性断片を用いて、当該技術分野で標準である技法により生成され得る。本発明の抗体分子としては、ＩｇＧ（ならびにサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのクラスが挙げられる。
【０１７６】
本発明の抗体は、生物学的試料内の結合の検出のために標識され得る。これらの抗体は、放射性標識、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉを含み得る。さらに、これらの標識は、蛍光または化学発光化合物、例えばフルオレセインイソシアネート、フィコエリトリン、ローダミンまたはルシフェリンであり得る。これらの標識は、酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチンおよびアビジンまたはホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  １８４：  １３８−１６３  （１９９０））。
【０１７７】
ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂ特異的抗体は、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂの検出のために、固体支持体、例えば膜、ビーズ、フィルター、ガラス、ケイ素、金属、金属合金、ａｎｏｐｏｒｅ、重合体、ナイロンまたはプラスチックに結合され得る。
【０１７８】
本発明の抗原は、全タンパク質、切頭化タンパク質、タンパク質の断片またはペプチドであり得る。抗原は、自然に存在するし、タンパク質の遺伝子工学処理変異体であり得るし、あるいは、特定の哺乳類被験体または宿主中での発現のためにコドン最適化され得る。一般的に、Ｂ細胞のエピトープは少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３〜４個のアミノ酸という少ない場合もあり得る。
【０１７９】
普通は、エピトープは約７〜１５個のアミノ酸、例えば９、１０、１２または１５個のアミノ酸を含む。「抗原」という用語は、両方のサブユニット抗原（すなわち、抗原が自然に関連する全生物体とは別個のまたは異なる抗原）を意味する。抗体、例えば抗イディオタイプ抗体またはその断片、ならびに抗原または抗原決定基を模倣し得る合成ペプチドである合成ペプチドミモトープも、本明細書中で用いられるような抗原の定義下に取り込まれる。
【０１８０】
さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、本明細書中で定義されるように、免疫学的応答を発揮する能力をタンパク質が保持する限り、天然配列に対する（一般的に事実上保存的である）修飾、例えば欠失、付加および置換を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発による場合、意図的であり得るし、あるいは抗原を産生する宿主の突然変異による場合のように、偶発的であり得る。本発明の抗原はさらにまた、当該技術分野で既知の方法によりコドン最適化されて、宿主におけるそれらの発現または免疫原性を改善し得る。
【０１８１】
生物学的試料内のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗原との抗体の特異的結合は、イムノブロッティング、免疫細胞化学、免疫組織化学、ドットブロット分析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ検定またはＲＩＡ検定とともにウエスタンブロットを用いて実行され得る。これらの技法およびその他のアプローチは、当該技術分野で慣用的である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）参照）。
【０１８２】
さらに、微量細胞傷害検定を用いて、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを検出し得る。微量細胞傷害検定は、レシピエントまたはドナー由来の純好中球を、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ免疫反応性である十分に特徴付けられた型別抗体と混合することを包含する。この混合物は、抗体を好中球表面ＨＮＡ抗原と結合させるのに十分な時間、インキュベートされる。この後、例えばウサギ血清から得られる補体が付加される。補体の付加は補体固定を生じ、細胞表面に結合された抗体を有する任意の細胞が補体固定反応のために溶解する。溶解細胞の量は、種々の異なる方法を用いて測定され得る。例えば、生細胞から排除されるがしかし死細胞を染色する生体染料、例えばトリパンブルーが試料に付加され得るし、死細胞対生細胞の数が確定され得る。
【０１８３】
ＨＮＡ−３核酸の検出方法
本発明は、配列番号３の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて生物学的試料中のＨＮＡ−３ａ核酸を検出する方法を提供する。本発明は、配列番号４の核酸配列の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて生物学的試料中のＨＮＡ−３ｂ核酸を検出する方法を提供する。ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、スロット−ブロット分析またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、あるいは当該技術分野で慣例的な任意の他の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）に記載された技法を用いて検出され得る。
【０１８４】
好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、ＨＮＡ−３ａエピトープをコードするＨＮＡ−３ａ遺伝子内の配列とハイブリダイズするものである。例えば、好ましいプローブは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドとハイブリダイズし得る。さらに、本発明のプローブとしては、ＨＮＡ−３ａをコードする遺伝子のイントロンまたは５’および３’非転写領域とハイブリダイズするものが挙げられる。
【０１８５】
好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、ＨＮＡ−３ｂエピトープをコードするＨＮＡ−３ｂ遺伝子内の配列とハイブリダイズするものである。例えば、好ましいプローブは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドとハイブリダイズし得る。さらに、本発明のプローブとしては、ＨＮＡ−３ｂをコードする遺伝子のイントロンまたは５’および３’非転写領域とハイブリダイズするものが挙げられる。
【０１８６】
オリゴヌクレオチドプローブは、生物学的試料から抽出されたＤＮＡとのハイブリダイゼーションの検出のために標識され得る。これらのプローブは、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉのような放射性標識を含み得る。さらに、これらの標識は、蛍光または化学発光化合物、例えばフルオレセインイソシアネート、フィコエリトリン、ローダミンまたはルシフェリンであり得る。これらの標識は、酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチンおよびアビジンまたはホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  １８４：  １３８−１６３  （１９９０））。
【０１８７】
アレイまたはマイクロアレイは、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップのような固体表面に結合した、発現プロファイリングまたは多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングする目的のためにアレイを形成するＤＮＡプローブまたはＤＮＡ断片のコレクションを指す。オリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂＤＮＡを検出し得る。好ましいアレイとしては、ＨＮＡ−１および／またはＨＮＡ−２とハイブリダイズするプローブが挙げられる。さらに、ＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２およびＨＬＡとハイブリダイズするプローブを含むアレイが好まれる。市販のアレイを用いて、アレイ番号Ｕ９５−ＣおよびＵ９５−Ｂ上のＳＬＣ４４Ａ２を検出するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ組番号５８８００、４８７９８および５６３４０；アレイ番号Ｕ１３３−Ｂ上のＳＬＣ４４Ａ２を検出するプローブ組番号２２５１７５および２２４６０９；ならびにアレイ番号Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２上のＳＬＣ４４Ａ２を検出するプローブ組番号２２５１７５および２２４６０９のようなＣＴＬ２とハイブリダイズするプローブを包含するＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを検出し得る。本発明のアレイとしては、マイクロアレイ、ＤＮＡチップ、ビーズアレイ、遺伝子チップおよびバイオチップが挙げられる。
【０１８８】
オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体、例えば膜、ビーズ、フィルター、ガラス、ケイ素、金属、金属合金、ａｎｏｐｏｒｅ、重合体、ナイロンまたはプラスチックに結合され得る。これらの支持体は、使用中に結合を増強するかまたは非特異的結合を抑制するためにプローブを結合する前に、化学物質で化学的に処理され得る。例示的な処理としては、アミノアルキルシランまたは高分子材料、例えばアクリルアミドまたはタンパク質のコーティングを伴うガラススライドのコーティングが挙げられる。プローブは、共有的または非共有的に支持体に結合され得る。
【０１８９】
本発明は、増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、ならびにＨＮＡ−３ａ（配列番号１）またはＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）をコードする核酸配列の断片に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを検出する方法も提供する。
【０１９０】
本明細書中で用いる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、少なくとも２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡのセグメントの増幅のための、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されたようなプロセスを意味する。その他の核酸増幅方法としては、鎖置換検定３（ＳＤＡ）、ＢＤ  ＰｒｏｂｅＴｅｃ（ＴＭ）、等温増幅法、例えばヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）および等温逆転写−好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（ＲＴ−ｔＨＤＡ）、回転円増幅（ＲＣＡ）ならびにループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）が挙げられる。これらの方法は、当該技術分野で標準である技法を用いて実行され得る。本発明は、ＰＣＲを用いて増幅されたＤＮＡ断片の同一性を確認するためにシーケンシング分析を用いることも意図する。
【０１９１】
本発明の方法では、ＰＣＲは、ＰＣＲを実行するのに安定な混合物である「ＰＣＲ反応混合物」を用いて実行され得る。ＰＣＲ反応混合物は、適量の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、増幅されるべき線状または環状鋳型ＤＮＡ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーの一方は鋳型の一鎖とのアニーリングのために設計され、他方のプライマーは鋳型の他方のまたは相補的鎖とのアニーリングのために設計される）、ＡＴＰ、適量の４つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の各々、ならびに緩衝液、ＭｇＣｌ２のような塩、保存剤、還元剤、および水（必要な場合）を含有する。
【０１９２】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＨＮＡ−３ａエピトープまたはＨＮＡ−３ｂエピトープをコードする核酸を特異的に増幅するよう設計される。オリゴヌクレオチドプライマーを設計する場合、プライマーの長さは、その（Ａ＋Ｔ）含量ならびにその相手のＴｍに依存する。さらに、プライマーは、プライマーが選択された標的以外の配列とアニーリングする可能性を低減するのに十分に複雑であるべきである。本発明の方法は、１０〜３０ヌクレオチドの長さの範囲のプライマーを利用し得るし、好ましくは、プライマーは、１７ヌクレオチド長である。一般的に、４０％〜６０％のＧ＋Ｃ含量がプライマーのために推奨されて、内部二次構造ならびに任意の一塩基の長いストレッチを回避する。さらに、プライマーは、プライマーより高い融点を有する（標的内の）二次構造の領域とアニーリングすべきでない。
【０１９３】
ＨＮＡ−３ａ表現型を遺伝子型分類するための本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを増幅するプライマーが挙げられる。さらに、本発明のプライマーとしては、ＨＮＡ−３ａをコードする遺伝子のイントロンまたは５’および３’非転写領域内にある配列番号３の断片を増幅するものが挙げられる。プライマーの例としては、センスプライマー５’ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ３’（配列番号４８）およびアンチセンスプライマー５’ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ３’（配列番号５０）が挙げられる。
【０１９４】
ＨＮＡ−３ｂ表現型を遺伝子型分類するための本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを増幅するプライマーが挙げられる。本発明は、配列番号４のコドン１５４を含む配列番号４の断片を増幅するプライマーも意図する。さらに、本発明のプライマーとしては、ＨＮＡ−３ｂをコードする遺伝子のイントロンまたは５’および３’非転写領域内にある配列番号４の断片を増幅するものが挙げられる。プライマーの例としては、センスプライマー５’ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  Ａ３’（配列番号４９）およびアンチセンスプライマー５’ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ３’（配列番号５０）が挙げられる。
【０１９５】
本発明は、ＨＮＡ−３核酸を検出するほかに、生物学的試料中のＨＮＡ−１核酸を検出する方法も意図する。ＨＮＡ−１核酸は、ヌクレオチド１４１、ヌクレオチド１４７、ヌクレオチド２２７、ヌクレオチド２７７またはヌクレオチド３４９（ＨＮＡ−１ａ対ＨＮＡ−１ｂ）およびヌクレオチド２６６（ＨＮＡ−１ｃ対ＨＮＡ−１ｂ）での独特のＨＮＡ−１エピトープ（多形性）を検出するオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いて検出され得る。本発明はさらに、ＨＮＡ−３核酸を検出することのほかに、生物学的試料中のＨＮＡ−２核酸を検出する方法を意図する。ＨＮＡ−２は１つの対立遺伝子を有するだけであるため、ＨＮＡ−２の発現は、任意のコード領域と相同であるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて検出され得る。
【０１９６】
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）としては、２’−でオキシグアノシン５’−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）および２’−でオキシチミジン５’−トリホスフェート（ｄＴＴＰ）が挙げられる。一般的には、ＰＣＲ反応におけるｄＮＴＰの濃度は約２００μＭである。各ｄＮＴＰの概算Ｋｍ（１０μＭ〜１５μＭ）を上回り、最良の塩基組み入れのために均衡の取れた４つのｄＮＴＰの濃度を保持することが重要である。等モル濃度でｄＮＴＰおよびマグネシウムイオンの濃度を下げると、忠実度(fidelity)が改善される。修飾されたｄＮＴＰ（ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ、５−ブロモ−ｄＵＴＰ、イノシン、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６−ｄＵＴＰおよび７−デアザｄＧＴＰ）および２’−でオキシウリジン５’−トリホスフェート（ｄＵＴＰ）も用いられ得る。
【０１９７】
キット
本発明は、本発明の方法のいずれかを実行するためのキットを提供する。本発明によるキットは、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を検出するための構成成分を含む。本キットは、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体ならびに陽性対照に関する既知のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ特異的抗体と複合体を形成する、単離または組換えＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂポリペプチドあるいはその抗原性断片を含み得る。本発明はさらに、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂに特異的な抗体のほかに、ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２に特異的な抗体を検出するためのキットであって、ＨＮＡ−１検出のためのＦｃ−γ受容体ＩＩＩｂまたはその抗原性断片、およびＨＮＡ−２の検出のためのＣＤ１７７またはその抗原性断片、ならびにＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２に特異的である既知の抗体を含有するキットを提供する。本発明はさらに、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂに特異的な抗体のほかに、ＨＮＡ−４および／またはＨＮＡ−５に特異的な抗体を検出するためのキットであって、ＨＮＡ−４検出のためのＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）またはその抗原性断片、およびＨＮＡ−５の検出のためのＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）またはその抗原性断片、ならびにＨＮＡ−４およびＨＮＡ−５に特異的である既知の抗体を含有するキットを提供する。さらに、本発明は、ＨＮＡに特異的な抗体のほかに、生物学的試料中のＨＬＡに特異的な抗体を検出するためのキットであって、ＨＬＡ抗原を含有するポリペプチドおよびＨＬＡに特異的である既知の抗体を含有するキットを提供する。
【０１９８】
ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂに特異的な抗体、ならびに任意に他のＨＮＡおよび／またはＨＬＡ抗原に特異的な抗体を検出するために有用なキットはさらに、当該技術分野で慣用的である検出検定を実行するために必要な任意の構成成分を含み得る。例えば、これらのキットは、ＳＲＩＤ、ＥＬＩＳＡ、ＨＡＩ、ＭＡＩＧＡ検定、ＧＩＩＦＴ、ＭＬＡＴおよびＧＡＴを実行するために必要な構成成分を含み得る。
【０１９９】
本発明によるキットは、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂを検出するための構成成分を含む。これらのキットは、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂと特異的に結合する抗体、ならびに陽性対照として用いるための抗体に関するＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂエピトープを含む単離または組換えタンパク質あるいはペプチドを含み得る。本発明はさらに、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂのほかに、ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２を検出するためのキットであって、ＨＮＡ−１および／またはＨＮＡ−２に特異的な抗体、ならびにＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２エピトープに対応する組換えタンパク質またはペプチドを含有するキットを提供する。さらに、本発明は、ＨＮＡのほかに生物学的試料中のＨＬＡを検出するためのキットであって、ＨＬＡに特異的な抗体、ならびにＨＬＡエピトープに対応する組換えタンパク質またはペプチドを含有するキットを提供する。
【０２００】
ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂおよび任意に他のＨＮＡおよび／またはＨＬＡ抗原を検出するために有用なキットは、当該技術分野で慣用的である検出検定を実行するために必要な任意の構成成分をさらに含み得る。例えば、これらのキットは、ウエスタンブロットを実行するのに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製する緩衝液、ローディング用染料、ポリアクリルアミドゲル等のゲル、ならびに分子量マーカーを含み得る。これらのキットは、標識化二次抗体のようなイムノブロッティングまたはドットブロッティング分析を実行するためのフィルター、膜遮断緩衝液、対照緩衝液、アイソタイプ対照抗体、洗浄緩衝液または検出用の緩衝液および試薬も含み得る。本キットは、例えば免疫細胞化学法または免疫組織化学法を実行するための固定試薬、遮断緩衝液、対照緩衝液、洗浄緩衝液、染色用染料および抗イディオタイプ抗体を含む検出試薬も含む。さらに、これらのキットは、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ検定、ＲＩＡ検定または微量毒性検定を実行するために必要な試薬およびツールを含み得る。
【０２０１】
本発明によるキットは、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ核酸を検出するための構成成分を含む。本キットは、配列番号３のＨＮＡ−３ａ核酸の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに陽性対照として用いるためのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする配列番号３の核酸の断片を含む。代替的には、本キットは、配列番号４のＨＮＡ−３ｂ核酸の断片とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに陽性対照として用いるためのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする配列番号４の核酸の断片を含む。本発明はさらに、生物学的試料中のＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂのほかに、ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２核酸を検出するためのキットであって、ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブならびに陽性対照としてのＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２核酸の対応する断片を含有するキットを提供する。さらに、本発明は、生物学的試料中のＨＮＡ核酸のほかにＨＬＡ核酸を検出するためのキットであって、ＨＬＡ核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブならびに陽性対照としてのＨＬＡ核酸の対応する断片を含有するキットを提供する。
【０２０２】
代替的には、ＨＮＡ−３ａ核酸を検出するためのキットは、配列番号３のＨＮＡ−３ａ核酸の断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに陽性対照として役立つ、オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅されることが知られているＨＮＡ−３ａ核酸の断片を含む。ＨＮＡ−３ｂ核酸を検出するためのキットは、配列番号４のＨＮＡ−３ｂ核酸の断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに陽性対照として役立つ、オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅されることが知られているＨＮＡ−３ｂ核酸の断片を含む。本発明はさらに、ＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅されることが知られているＨＮＡ−１およびＨＮＡ−２の核酸の断片を含むキットを提供する。さらに、本発明は、ＨＮＡ核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのほかにＨＬＡ核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅されるＨＬＡ核酸の断片を含有するキットを提供する。
【０２０３】
本発明のキットは、ＰＣＲまたは他の増幅方法を実行するために必要な構成成分も含み得る。例えば、本キットは、以下のうちの１つもしくは複数を含有し得る：Ｔａｑポリメラーゼまたは別の熱安定性ポリメラーゼ、ＡＴＰ、適量の４つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の各々、ならびに緩衝液、ＭｇＣｌ２のような塩、、保存剤、還元剤または水。
【０２０４】
ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ核酸および任意にその他のＨＮＡおよび／またはＨＬＡ核酸を検出するために有用なキットは、当該技術分野で慣用的である検出検定を実行するために必要な任意の構成成分をさらに含み得る。例えば、これらのキットは、生物学的試料から核酸を抽出するために必要な試薬を含み得る。これらのキットは、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、スロット−ブロット分析またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、ならびにそれらの技法のような当該技術分野で慣用的な任意の他の方法のための、緩衝液、ローディング用染料、ゲル、分子量マーカー、膜、フィルター、遮断緩衝液および検出試薬を含み得る。
【実施例】
【０２０５】
以下の実施例により本発明を例証するが、本発明はそれらに限定されるものではない。実施例１は、ドナー血からの顆粒球の単離を記載する。実施例２は、ＨＮＡ−３ａ陽性および陰性血漿を獲得するために用いられる方法を記載する。実施例３は、顆粒球表面タンパク質のビオチニル化を記載する。実施例４は、顆粒球を血漿とともにインキュベートする方法を記載する。実施例５は、フローサイトメトリーを用いた蛍光活性化細胞選別法を記載する。実施例６は、磁気ビーズを用いて免疫沈降を実行する方法を記載する。実施例７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを実行する方法を記載する。実施例８は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）を用いる方法を記載する。実施例１〜８に記載される実験を用いてＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂのアミノ酸配列を同定した。これらの方法は、本発明の方法を実行するために用いられ得る。実施例９は、ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂの異種発現を記載する。これらのポリペプチドは、本発明の方法に用いられ得る。実施例１０は、ＨＮＡ−３ａペプチド断片の異種発現を記載する。これらのペプチド断片を用いてＨＮＡ−３ａのエピトープをマッピングしたが、これらのペプチドは本発明の方法に用いられ得る。実施例１１は、ヒト血漿からのＨＮＡ−３ａ抗体のアフィニティー精製を記載する。実施例１２は、ＨＮＡ−３ａの抗原性断片の同定を記載し、これらの断片は本発明の方法を実行するために用いられ得る。実施例１３は、ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂに関して遺伝子型分類する方法を記載する。これらを用いて、本発明の方法を実行し得る。最後に、実施例１４は、抗ＨＮＡ−３抗体の製造方法を記載する。これらの抗体は、本発明の方法を実行するために用いられ得る。
【０２０６】
実施例１
顆粒球単離
選択されたドナー血を、１．２５％ＥＤＴＡおよび０．５％デキストランと混合した。沈澱後、上清をフィコール密度遠心分離のためにさらに用いた。得られたペレットを洗浄後、赤血球を溶血させた。残存する顆粒球を洗浄し、出発物質として種々の細胞濃度で用いた。
【０２０７】
実施例２
ＨＮＡ−３ａ陽性および陰性血漿の獲得
選択ドナー血を、１．２５％ＥＤＴＡと混合し、次いで、細胞を遠心分離により分離した。上清を対応する血漿として用いた。
【０２０８】
実施例３
顆粒球表面タンパク質のビオチニル化
ウエスタンブロットによる分析のために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を用いて精製顆粒球をビオチニル化した。
【０２０９】
実施例４
血漿との顆粒球のインキュベーション
（ビオチニル化または非ビオチニル化された）顆粒球を、３７℃で少なくとも３０分間、ＨＮＡ−３ａ陽性または陰性血漿とともにインキュベートした。バッチを洗浄後、全細胞のＦＡＣＳ分析が行なわれるか、トリトン−Ｘ１００を含有する緩衝液による細胞溶解を実行した。細胞破片を遠心分離後、タンパク質を含有する上清を分析した。
【０２１０】
実施例５
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ分析）フローサイトメトリー
ＨＮＡ−３ａ陽性および陰性ドナーの単離顆粒球を、（抗ＨＮＡ−３ａ抗体を有するおよび有しない）血漿とともにインキュベートし、洗浄した。その後、細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ウサギＦ（ａｂ’）２−抗ヒトＩｇＧとともにインキュベートした。洗浄後、細胞懸濁液をＦＡＣＳで検査して、顆粒球の蛍光強度を確定した。高強度は、ＨＮＡ−３ａ陽性結果を示した。
【０２１１】
実施例６
磁気ビーズによる免疫沈降
プロテインＧ被覆磁気ビーズを、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）と結合させた。洗浄後、これらのビーズを、実施例４に記載したように、タンパク質を含有する上清とともにインキュベートした。ビーズを新たに洗浄し、消磁した後、タンパク質を、ＳＤＳを含有する試料緩衝液を用いて溶離する（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる分析のため）か、あるいはトリプシンを含有する緩衝液中で直接消化した（フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）による分析のため）。
【０２１２】
実施例７
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット
免疫沈降の溶出液（ビオチニル化バッチ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％分離ゲル）により分離し、ニトロセルロース膜上にブロットした。ビオチニル化タンパク質と結合するために、膜を、遮断および洗浄ステップ後、ストレプトアビジンに結合されたアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）とともにインキュベートした。１〜１５分間、ＮＢＴ（塩化ニトロブルーテトラゾリウム）／ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩）を付加することにより、検出を実行した。
【０２１３】
実施例８
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）
Ｃ１８物質（ＺｉｐＴｉｐ）を用いて、免疫沈降タンパク質（ビオチニル化バッチでない）のトリプシン消化を予備清浄化し、ＭＳにより分析した。ＳＥＱＵＥＳＴ  ＳｏｒｃｅｒｅｒおよびＳｃａｆｆｏｌｄ２ソフトウェア（データバンク：ｕｎｉｐｒｏｔ−ｓｐｒｏｔ−ｈｕｍａｎ＿ｒｅ１５４）を用いたデータバンク比較により、ペプチドスペクトルの評価を実行した。
【０２１４】
実施例９
ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂの異種発現
ＨＮＡ−３ａタンパク質（配列番号１）をコードするＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡクローンを、大腸菌およびＣＨＯ細胞中で発現させた。この合成したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分離して（実施例７に記載）、ウエスタンブロットにおけるヒト抗ＨＮＡ−３ａ抗体の結合により特異性を示した。タンパク質ＨＮＡ−３ｂ（配列番号２）の発現のためのＤＮＡ配列を用いてｃＤＮＡクローンに関して、類似の手順を実行した。
【０２１５】
精製のためにＨｉｓタグを用いて、ＨＮＡ−３ａタンパク質を発現させた。さらに、固相ＥＬＩＳＡを用いて、組換えヒト抗ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂタンパク質とそのそれぞれの抗体との結合を実証した。
【０２１６】
実施例１０
ペプチド断片の異種発現
ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ，  ＵＫ）および制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＨＮＡ−３ａＤＮＡ断片をクローン化した。ｃＤＮＡクローンＮＭ＿０２０４２８．２（ＯｒｉＧｅｎｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を鋳型ＤＮＡとして用いて、グルタチオンＳ−Ｔトランスフェラーゼ遺伝子領域（ＧＳＴ）融合物を生成した。配列番号１のアミノ酸２２〜２３１（「ＨＮＡ−３ａ（２２〜２３１）」と表示される）および配列番号１のアミノ酸１４５〜１６７（「ＨＮＡ−３ａ（１４５〜１６７）と表示される」）をコードするＤＮＡ断片をベクターＪＨＣ２７中に挿入して、ＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ融合ペプチドをコードした。配列番号１のアミノ酸１１４〜１６４（「ＨＮＡ−３ａ（１１４〜１６４）」と表示される）をコードするＤＮＡ断片をｐＴＢ２５ベクター中に挿入して、ＧＳＴ融合ペプチドＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ（１１４〜１６４）をコードした。
【０２１７】
大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を、上記のベクターで形質転換して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する３７℃のＹＴＧ培地中で、ＯＤ６００＝０．７に増殖させた。その後、これらの細胞をイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ；１時間）とともにインキュベートし、その後、遠心分離（７，０００ｇ；１０分）し、氷冷ＰＢＳ中で洗浄した。次に、これらの細胞を変性緩衝液（８Ｍ尿素）中で音波処理し、遠心分離（１２，０００ｇ）して、上清を変性緩衝液（トリス−グリセリン）に対して透析した。融合タンパク質の上清をグルタチオンセファロースカラム上に載せて、ＰＢＳで洗浄した。１０ｍＭ還元型グルタチオンを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）の溶液を、ＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ融合ペプチドの溶出のために用いた。
【０２１８】
実施例１１
ヒト血漿からのＨＮＡ−３ａ抗体のアフィニティー精製
ヒト血漿からのＨＮＡ−３ａ抗体のアフィニティー精製のために、ＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ（１１４〜１６４）を実施例１０に記載したように産生し、濃縮し、カップリング緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に対して透析した。ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を、６ｍｌの氷冷１ｍＭ  ＨＣｌで平衡させて；その後、１ｍｌの濃縮ＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ（１１４〜１６４）ペプチドをカラム上に注入した（３ｍｇ／ｍｌ）。２５℃で３０分間インキュベーション後、メーカーの使用説明書に従ってカラムを洗浄した。
【０２１９】
ＨＮＡ−３ａに関して陽性であることが知られているヒト血漿を、洗浄緩衝液（１：２５）（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に希釈し、５０ｍｌを、０．８ｍｌ／分の流量でカラム上に載せた。洗浄緩衝液で洗浄後、１０ｍｌの０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）を用いて抗体をカラムから溶出した。収集分画のアリコート（７５０μｌ）を、２５０μｌ中和緩衝液（１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９）と混合した。５０μｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を含有する分画をプールし、洗浄緩衝液に対して透析した。
【０２２０】
顆粒球活性化検定を用いて、ＨＮＡ−３ａが顆粒球凝集を誘発するか否かを試験した。ＨＮＡ−３ａ陽性ドナーから単離された顆粒球（実施例１に記載されたように）を、抗ＨＮＡ−３ａ抗体を含有することが既知であるヒト血漿とともにインキュベートし（３０分、３７℃）、その後、洗浄した（１４０ｇ、５分）。メーカーの使用説明書に従って酸溶出のための系を用いて（ＢＡＧ，  Ｌｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、結合抗体を得た。
【０２２１】
顆粒球活性化検定においてＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ（１１４〜１６４）ペプチドと組合せて、アフィニティー精製により、溶出抗体のうちのＨＮＡ−３ａ特異的抗体を得た。この検定のための陰性対照は、ＧＳＴ融合タンパク質単独、ＨＮＡ−３ｂ抗体を有する対照血清、ならびに陰性対照抗体（ＨＮＡ−３抗体なし）であった。ＨＮＡ−３ａ抗体はその未変性形態でのみ顆粒球を活性化して集合物とし、変性形態ではほとんど作用を有さなかった。固定顆粒球凝集物は陽性でなかった。
【０２２２】
実施例１２
ＨＮＡ−３ａの抗原性断片の同定
ＨＮＡ−３ａアミノ酸配列（配列番号１）のエピトープをマッピングするために、ＨＮＡ−３ａアミノ酸配列の細胞外断片を含む組換えペプチドを、実施例１０に記載したようにＧＳＴ融合ペプチドとして生成した。ウエスタンブロットにより確定した場合のこれらのペプチドとＨＮＡ−３ａ血清との反応性を、以下の表１に示す。
【表１】
0005766606.tif 000002
【０２２３】
代表的ＨＮＡ−３ａ陽性（ＨＮＡ−３ａ＋）ドナーおよび代表的ＨＮＡ−３ａ陰性ドナー（ＨＮＡ−３ａ−）からの単離顆粒球を、ＨＮＡ−３ａ抗体を含有することが既知である血漿（＋）とともに、ならびにＨＮＡ−３ａ抗体を有さないことが既知である血漿（−）とともにインキュベートした。次に、ＨＮＡ−３ａタンパク質を、プロテインＧ結合磁気ビーズと結合された抗ヒトＩｇＧを用いて免疫沈降させた。各ドナー／血漿組合せに関して、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）で試料を脱グリコシル化した。
【０２２４】
免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、当該技術分野で周知の手法を用いてニトロセルロースに移して、ＨＮＡ−３ａ＋およびＨＮＡ−３ａ−血漿で免疫ブロッティングすることにより分析した。タンパク質を、先ず、ストレプトアビジン（ａ）または抗ヒトＩｇＧ（ｂ）と結合されたアルカリ性ホスファターゼを用いて可視化して、次に、検出のためにＮＢＴ／ＢＣＩＰとともにインキュベートした。
【０２２５】
配列番号１のアミノ酸１４５〜１６７（ＨＮＡ−３ａ（１４５〜１６７）；配列番号４８）および配列番号１のアミノ酸５５〜２３１（ＨＮＡ−３ａ（５５〜２３１）；配列番号２７）を含むＧＳＴ融合ペプチドを、免疫ブロットを用いて分析した。５０ｋＤａ帯域は、ＨＮＡ−３ａ陽性血清中に存在する抗体と結合されたＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ（５５〜２３１）ペプチドを表す。３６ｋＤａというより小さな帯域は、ＨＮＡ−３ａ陽性血清中に存在する抗体と結合しているＧＳＴ−ＨＮＡ−３ａ（１４５〜１６７）ペプチドを表す。ＨＮＡ−３＋血漿からの抗体のみが、ＨＮＡ−３ａ融合ペプチドと反応した。ＨＮＡ−３ａ−血清からの抗体は、ＨＮＡ−３ａ融合タンパク質と反応しなかった。より長いＨＮＡ−３ａアミノ酸５５〜２３１ペプチドとの結合は２つのＨＮＡ−３ａ陽性血漿に関して示され、より小さい断片ＨＮＡ−３ａアミノ酸１４５〜１６７に対する結合はＨＮＡ−３ａ陽性血漿に関して表示される。
【０２２６】
ＧＳＴ融合ペプチドＨＮＡ−３ａアミノ酸１４５〜１６７も、ＨＮＡ−３ａ陽性顆粒球における凝集を誘発する。
【０２２７】
この分析は、ＨＮＡ−３ａポリペプチド配列の重大な最小抗原性断片が配列番号１のアミノ酸１５４〜１６４である（配列番号２５）、ということを実証した。
【０２２８】
この方法を用いて、ＨＮＡ−３ａ、あるいは任意の他の抗原、例えばＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−５またはＨＬＡの抗原性断片を同定し得る。
【０２２９】
実施例１３
ＨＮＡ−３ａおよびＨＮＡ−３ｂに関する遺伝子型分類
ＨＮＡ−３多形に関するＰＣＲを、以下のように実行した。０．５ｐｍｏｌ対立遺伝子特異的センスプライマー（５’−ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ３’；配列番号４９；ＨＮＡ−３ａ）または（５’−ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  Ａ−３’；配列番号５０；ＨＮＡ−３ｂ）、ならびに部分的イントロンアンチセンスプライマー（５’ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＧ−３’；配列番号５１）を用いて、５０〜１００ｎｇＤＮＡのアリコートを増幅した。２０μＬの総容積中で、０．２ｍｍｏｌのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートおよび２．０単位のＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎｅＣｒａｆｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ    ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２７００，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。９５℃で１０分間加熱後、以下の条件下で、２段階ＰＣＲを実施した：変性（３０秒、９５℃）、アニーリング（４０秒、６４℃）、伸長（３０秒、７２℃）を２０サイクル、ならびに最終伸長（５分、７２℃）。内部陽性対照として、ｈＧＨ遺伝子の４３９ｂｐ断片を増幅する０．０６２５ｐｍｏｌのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）プライマーを用いた（５’−ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  Ａ−３’（配列番号５２）、５’−ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＴＴ  Ｃ−３’（配列番号５３））。トリスホウ酸塩ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ−緩衝液；５  Ｐｒｉｍｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１．５％アガロースゲルで、ＰＣＲ産物（２９１ｂｐ）を分析した。
【０２３０】
この方法を用いて、任意の抗原対立遺伝子、例えばＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡに関して遺伝子型分類し得る。
【０２３１】
実施例１４
抗ＨＮＡ−３抗体の製造方法
特定のＨＮＡ−３エピトープを含むペプチドで免疫感作することにより、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂタンパク質に特異的な抗体を獲得し得る。抗体を生成するための適切な手法としては、Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｙ，  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （１９８０）に記載された手法が挙げられる。ＨＮＡ−３ａ特異的抗体を生成するために用いられ得る抗原性断片の例としては、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２が挙げられる。ＨＮＡ−３ｂ特異的抗体を生成するために用いられ得る抗原性断片の例としては、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２６が挙げられる。
【０２３２】
抗体の産生のための一手法では、動物（典型的にはマウスまたはラビット）に、ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂエピトープ含有ペプチドを注射し、その結果生じたポリクローナル抗体（血清中）を単離する。さらに、ＥＬＩＳＡにより確定した場合に十分な血清力価レベルを有する動物を、ハイブリドーマ産生のために選択する。免疫化動物の脾臓を収集し、脾細胞が回収される単一細胞懸濁液として調製する。これらの脾細胞をマウス骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８１）と融合し、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、２００ｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩および４ｍＭグルタミンを有するＤＭＥＭ中でインキュベートさせた後、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン；アミノプテリン；チミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清をハイブリドーマを含有する各ウェルから取り、ＥＬＩＳＡにより抗ＨＮＡ−３ａまたはＨＮＡ−３ｂ抗体産生に関して試験する。
【０２３３】
抗ＨＮＡ−３ａまたは抗ＨＮＡ−３ｂ抗体を獲得するための代替的手法、例えば人抗体の産生のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫感作、ならびに抗体可変ドメインの突然変異誘発により生成されるもののような合成抗体ライブラリーのスクリーニングも用いられ得る。
【０２３４】
さらに、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリーから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：  ３８１  （１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：  ５８１  （１９９１））。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの表示による免疫選択と、その後の選り抜きの抗原とのそれらの結合によるファージの選択を模倣する。このような技法の１つは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４（このようなアプローチを用いたＭＰＬ−およびｍｓｋ受容体に関する高親和性および機能的アゴニスト抗体の単離を記載）に記載されている。
【０２３５】
これらの方法を用いて、ＨＮＡ−１、ＨＮＡ−２、ＨＮＡ−４、ＨＮＡ−５またはＨＬＡのような任意の抗原性タンパク質に特異的な抗体を生成する。
【０２３６】
本発明の好ましい実施形態を考えると、本発明の実行に際して多数の修正および変更がなされると、当業者は予測する。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されたものによってのみ限定されるべきである。
【配列表】
0005766606000001.app