(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験調節分子−被験遺伝子エレメント対により提示される発現レベルをインビトロで評価する方法であって、
構成的エフェクター遺伝子エレメントとエフェクター調節型タンパク質のコード配列を含み、前記構成的エフェクター遺伝子エレメントが、前記エフェクター調節型タンパク質の発現を制御し、前記エフェクター調節型タンパク質が、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントに結合し、前記エフェクター調節型タンパク質の、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントに対する結合活性が、入力エフェクターによりモジュレートされる、エフェクター転写単位、
前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントと前記被験調節分子のコード配列を含み、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントが、前記被験調節分子の発現を制御する、被験調節分子転写単位であり、
前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントと入力レポータータンパク質のコード配列を含み、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントが、前記入力レポータータンパク質の発現を制御する、入力転写単位であって、
前記被験調節分子転写単位と前記入力転写単位が、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の同じ遺伝子分子エレメント上にあるか、または、前記被験調節分子転写単位と前記入力転写単位が、異なる個別のコピーからそれぞれ個別に発現する前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子分子エレメントのコピー上にあり、
前記被験調節分子に対して応答性の前記被験遺伝子エレメントと出力レポータータンパク質のコード配列を含み、前記被験調節分子に対して応答性の前記被験遺伝子エレメントが、前記出力レポータータンパク質の発現を制御する、出力転写単位、および
構成的遺伝子エレメントと構成的レポータータンパク質のコード配列を含み、前記構成的遺伝子エレメントが、前記構成的レポータータンパク質の発現を制御する、構成的レポータータンパク質転写単位を含む細胞集団を有する検体を用意すること、
前記細胞の検体を、前記入力エフェクターの量で、前記エフェクター転写単位、前記被験調節分子転写単位、前記入力レポータータンパク質転写単位、前記出力レポータータンパク質転写単位、および前記構成的レポータータンパク質転写単位の発現を可能とするのに十分な時間及び条件下においてインキュベートすること、
前記検体の個々の細胞内の前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質のレベルを測定すること、
前記細胞を、二次元的にビニングして、有限数のビニング細胞を提示し、各ビンについて、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルを計算すること、
前記被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる前記発現レベルを、入力レポータータンパク質および出力レポータータンパク質の前記レベルにより評価することを含む方法。
【請求項２】
前記被験調節分子が、転写活性または転写後活性を調節する、タンパク質または核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験調節分子が、タンパク質であり、前記被験調節分子転写単位内の前記被験調節分子の前記配列が、前記被験調節タンパク質のコード配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり、前記被験調節分子転写単位内の前記被験調節分子の前記配列が、前記ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記構成的エフェクター遺伝子エレメント、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメント、前記被験遺伝子エレメント、または前記構成的遺伝子エレメントが、ＤＮＡプロモーターまたは上流の活性化配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記構成的エフェクター遺伝子エレメント、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメント、前記被験遺伝子エレメント、および前記構成的遺伝子エレメントが、ＤＮＡプロモーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記被験遺伝子エレメントが、誘導的プロモーター、抑制性プロモーター、またはハイブリッドプロモーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記入力エフェクターが、物理的シグナルまたは低分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記出力レポーター転写単位が、複数の連結された転写単位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記構成的レポーター、前記入力レポータータンパク質、および前記出力レポータータンパク質が、ｍＫＡＴＥ、増強青色蛍光タンパク質２（ＥＢＦＰ２）、および増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質の前記レベルを測定することが、フローサイトメトリーによる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質の前記測定されたレベルに対してシグナル補正を実施して、シグナルの重複を低減し、入力レポータータンパク質の補正レベル、出力レポータータンパク質の補正レベル、および構成的レポータータンパク質の補正レベルを提示すること、または、
各ビン内の前記細胞について、出力レポータータンパク質の前記非補正もしくは補正レベル、および／または入力レポータータンパク質の前記非補正もしくは補正レベルを、構成的レポータータンパク質の前記ビン平均レベルにより標準化して、入力レポータータンパク質の標準化レベルおよび／または出力レポータータンパク質の標準化レベルを提示することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
色補正が、直線的または非直線的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
入力レポータータンパク質の前記非補正または補正レベル、出力レポータータンパク質の前記非補正または補正レベル、および構成的レポータータンパク質の前記非補正または補正レベルを、基準単位へと変換して、入力レポータータンパク質の非補正変換または補正変換レベル、出力レポータータンパク質の非補正変換または補正変換レベル、および構成的レポータータンパク質の非補正変換または補正変換レベルを提示することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記エフェクター転写単位、前記被験調節タンパク質転写単位、または前記入力転写単位が、さらなるタンパク質のコード配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記さらなるタンパク質が、さらなる調節タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる前記発現レベルを評価することが、入力レポータータンパク質の前記レベルを、前記入力エフェクターの量と対比した、入力エフェクターの伝達曲線を提示すること、および／または出力レポータータンパク質の前記レベルを、入力レポータータンパク質の前記レベルと対比した、調節分子の伝達曲線を提示することによりなされ、前記被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる前記発現レベルを評価することが、前記入力エフェクターの伝達曲線および／または前記調節分子の伝達曲線による、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記３つの蛍光タンパク質が同時に測定できる請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１２年１月４日に出願された、米国出願第１３／３４３，５０４号に対する優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景】
【０００２】
生細胞を定量的に理解するには、空間的および時間的に微細な解像度で、それらの構成要素であるタンパク質の活性を摂動させ、制御する方法が要望される。精密な摂動に対する応答を測定することにより、細胞内ネットワークについての予測モデルを調べ、反復的に改良することができる。
【０００３】
遺伝子回路は、摂動をデザインし、制御する方法を提供し、このことは細胞内ネットワークの予測モデルの開発に寄与する。電子回路に類似する機能をコードする遺伝子回路が構築され、多重回路を組み合わせることにより遺伝子プログラムが構築されている。遺伝子エレメントの活性の理解が、このような回路のデザインおよび開発に重要である。
【０００４】
ここでは、試験回路の発現レベル、特に、調節タンパク質−遺伝子エレメント対の発現レベルを決定する新たな方法が開示される。
【概要】
【０００５】
一態様では、被験調節分子−被験遺伝子エレメント対により提示される発現レベルを評価する方法が、
構成的エフェクター遺伝子エレメントとエフェクター調節型タンパク質のコード配列を含み、構成的エフェクター遺伝子エレメントが、エフェクター調節型タンパク質の発現を制御し、エフェクター調節型タンパク質が、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントに結合し、エフェクター調節型タンパク質の、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントに対する結合活性が、入力エフェクターによりモジュレートされる、エフェクター転写単位、
エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントと被験調節分子のコード配列を含み、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントが、被験調節分子の発現を制御する、被験調節分子転写単位であり、
エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントと入力レポータータンパク質のコード配列を含み、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントが、入力レポータータンパク質の発現を制御する、入力転写単位であって、
エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の同じ遺伝子エレメントから共発現するか、またはエフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントの個別のコピーから個別に発現する、被験調節分子転写単位と入力転写単位、
被験調節分子に対して応答性の被験遺伝子エレメントと出力レポータータンパク質のコード配列を含み、被験調節分子に対して応答性の被験遺伝子エレメントが、出力レポータータンパク質の発現を制御する、出力転写単位、および
構成的遺伝子エレメントと構成的レポータータンパク質のコード配列を含み、構成的遺伝子エレメントが、構成的レポータータンパク質の発現を制御する、構成的レポータータンパク質転写単位
を含む細胞集団を用意すること、
細胞を、複数の入力エフェクター量で、エフェクター転写単位、被験調節分子転写単位、入力レポータータンパク質転写単位、出力レポータータンパク質転写単位、および構成的レポータータンパク質転写単位の発現を可能とするのに十分な時間および条件下においてインキュベートすること、
細胞集団の個々の細胞内の入力レポータータンパク質、出力レポータータンパク質、および構成的レポータータンパク質のレベルを測定すること、
任意に、入力レポータータンパク質、出力レポータータンパク質、および構成的レポータータンパク質の測定されたレベルに対してシグナル補正を実施して、シグナルの重複を低減し、入力レポータータンパク質の補正レベル、出力レポータータンパク質の補正レベル、および構成的レポータータンパク質の補正レベルを提示すること、
細胞を、各入力エフェクター量で、構成的レポータータンパク質の非補正または補正レベルにより、複数のビンへと二次元的にビニングして、有限数のビニング細胞を提示し、各ビンについて、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルを計算すること、
任意に、各ビン内の細胞について、出力レポータータンパク質の非補正もしくは補正レベル、および／または入力レポータータンパク質の非補正もしくは補正レベルを、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルにより標準化して、入力レポータータンパク質の標準化レベルおよび／または出力レポータータンパク質の標準化レベルを提示すること、ならびに
被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる発現レベルを、入力レポータータンパク質および出力レポータータンパク質の非補正、補正、標準化、または非標準化レベルにより評価することを含む。
【０００６】
別の態様では、蛍光を同時に測定するための、３つの光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質対を選択する方法が、
ａ）複数の光バンドパスフィルターと複数の蛍光タンパク質を選択するステップ、
ｂ）複数の光バンドパスフィルターの各々により、複数の蛍光タンパク質の各々についての発光を測定し、発光を寒色〜暖色にスケーリングするステップであって、各光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せについて、寒色が低度の発光を表し、暖色が高度の発光を表すステップ、
ｃ）複数の蛍光タンパク質の各々について、複数の光バンドパスフィルターの各々によりスケーリングされた発光のための、二次元マトリックスを構築するステップ、
ｄ）第１の被験蛍光タンパク質を選択し、二次元マトリックス内の被験蛍光タンパク質に対して、可能な限りの暖色である一方、少なくとも第２および第３の被験蛍光タンパク質に対しては寒色である、第１の被験タンパク質のための第１の被験光バンドパスフィルターを同定して、第１の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、
ｅ）第２および第３の被験蛍光タンパク質について、ステップｄ）を繰り返して、第２および第３の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、ならびに
ｆ）３つの蛍光タンパク質を同時に測定するための、第１、第２、および第３の選択された光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せを選択するステップ
を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、先行技術によるＤＮＡ回路についての特徴付けプロセスであって、染色体への組込みを用いる特徴付けプロセス（ａ）、および本発明の開示による標準化法であって、第１のステップにおいて、データの迅速な収集を可能とする、多重回路のトランスフェクションを実施する標準化法を示す。
【図２】図２は、コピーカウントインジケーターを伴う回路の概略図を示す。
【図３】図３は、エフェクター転写単位を組み入れた回路の概略図を示す。
【図４】図４は、多重プラスミド型回路からのＴａｌ１抑制因子に由来する特徴付けデータを示す。先行技術による方法（ａ）の下では、測定される伝達曲線が、統計学的に有意な抑制を伴わずに、本質的に平坦であり、有意義なデータを回収することができない。ここで記載される、ビニングを用いる標準化された特徴付け（ｂ）によれば、個々の細胞挙動における、３〜５倍の偏差を伴う１００分の１の抑制が観察される。
【図５】図５は、例示的なマルチプレックス試験回路を示す。
【図６】図６は、図５の回路について、２次元ビニングによるビンカウントを示す。
【図７】図７は、入力レポータータンパク質の標準化レベルを低分子エフェクターの量と対比した、標準化低分子エフェクターの伝達曲線を示す。
【図８】図８は、出力レポータータンパク質の標準化レベルを、入力レポータータンパク質の補正レベルと対比した、標準化調節タンパク質の伝達曲線を示す。
【図９】図９は、例２のための試験回路を示す。
【図１０】図１０は、入力レポータータンパク質の標準化レベルを、低分子エフェクターの量と対比した、標準化低分子エフェクターの伝達曲線を示す。
【図１１】図１１は、出力レポータータンパク質の標準化レベルを、入力レポータータンパク質の補正レベルと対比した、標準化調節タンパク質の伝達曲線を示す。
【図１２】図１２は、ｍｉＲ２１低濃度回路であるｍｉＲＮＡ回路の態様を示す。
【図１３】図１３は、図１２のｍｉＲＮＡ回路についての伝達曲線を示す。
【図１４】図１４は、ｍｉＲ２１高濃度回路であるｍｉＲＮＡ回路の態様を示す。
【図１５】図１５は、図１４のｍｉＲＮＡ回路についての伝達曲線を示す。
【図１６】図１６は、二次元ヒートマップの例を示す。
【図１７】図１７は、１つのタンパク質の発光をゼロとし、残りの発光をスケーリングすることを示す。
【図１８】図１８は、１つのタンパク質の発光をゼロとし、残りの発光をスケーリングすることを示す。
【図１９】図１９は、「暖」色が、ゼロに設定された値より大きな値を意味することを示す。
【図２０】図２０は、寒色が、ゼロに設定された値より小さなシグナル値を意味することを示す。
【図２１】図２１は、固有の値を伴う色／フィルター対の選択を示す。
【図２２】図２２は、ＣｅｒｕｌｉａｎとＥＢＦＢを、ＡｍｅｒＣｙａｎ−Ａフィルターと共に、同時に用いるべきではないことを示す。
【図２３】図２３は、色／フィルターの組合せの最適化されたセットを示す。
【０００８】
当業者は、以下の詳細な説明、図面、および付属の特許請求の範囲から、上記で記載した特色と他の特色を、認識および理解するであろう。
【詳細な説明】
【０００９】
一側面において、ここでは、試験回路内のタンパク質発現を調節するＤＮＡ部分の発現レベルを評価する方法が提供される。特に、ここで開示される方法は、調節分子−遺伝子エレメント対により調節される出力タンパク質の発現を評価するのに有用である。ＤＮＡ部分の特徴付けは、合成生物学の根源的側面であり、その目標は、基準化部分を使用して、予測可能なデバイスデザインを提示できることである。しかし、個々の細胞内で関与する化学的特性について正確な測定値を得ることにはかなりの困難が存在している。加えて、ＤＮＡ部分を新規の回路デザインにおいて用いる場合、その挙動を予測することにも難題が存在する。ここで記載されるハイスループットの特徴付けに適する方法を使用することにより、既存の方法における場合より迅速、かつ、より正確にＤＮＡ部分の特徴付けを実施することができる。
【００１０】
ＤＮＡ部分を解析するためのハイスループットの方法を開発するときに克服すべき１つの難題は、研究されるＤＮＡ部分を含有するプラスミドのコピー数を制御できないことである。哺乳動物トランスフェクションでは、プラスミドの多重コピーを細胞に導入するが、これは、２〜３桁を超えて変化することが多い。したがって、細胞内のプラスミドのコピー数を制御するには著明な難題が存在する。図１ａにおいて示される通り、以前は、試験回路のコピー数を制御するために、試験回路を細胞の染色体に組み込んで、試験回路の１つまたは２つのコピーが、各細胞内で産生されることを確認した。入力／出力伝達曲線は、多くの細胞コロニーを、異なる条件下で、例えば、異なるレベルの誘導因子下で成長させ、次いで、レポーターレベル、例えば、蛍光を、単一の細胞内で測定することによれば、得ることができよう。この方法は、労力を要し、エラーを起こしやすい。図１ｂで示される通り、ここで記載される方法では、第１のステップにおいて、多重回路のトランスフェクションを実施しうることから、多様な条件下における、迅速なデータの収集が可能となる。次いで、第２のステップにおいて、有望な回路を組み込み、研究しうるが、初期スクリーニングを行えば、注意深い研究により、回路の改良に成功する機会がもたらされるであろう。ここで記載される方法の別の利点は、試験回路を、同じプラスミドに入れることもでき、研究に応じて個別のプラスミドに分けることもできることである。
【００１１】
細胞に導入するプラスミドの数を制御することはできないが、細胞内のプラスミドの数は、構成的遺伝子エレメント、例えば、図２の一態様で例示されるプロモーターであるＰｃｏｎｓｔの制御下にある構成的レポータータンパク質（ＣＲＰ）である、コピーカウントインジケーターを含有するように回路を修飾することにより測定することができる。レポータータンパク質は、例えば、蛍光タンパク質であり、蛍光は、ＦＡＣＳ解析を用いて測定することができる。図２では、Ｘが、被験遺伝子エレメントであるＰｘに結合する被験調節タンパク質であり、ここで、被験タンパク質であるＸの産生は、低分子エフェクターであるＰｓｍｉに対して応答性の遺伝子エレメントにより調節される。入力レポータータンパク質（ＩＲＰ）の産生はまた、Ｐｓｍｉによっても調節されるために、Ｘの濃度とＩＲＰの濃度が密接に関連する。出力レポータータンパク質（ＯＲＰ）の産生は、Ｘを被験遺伝子エレメントであるＰｘへと結合させることにより制御する。このように、系は、３つのレポーターである、入力レポータータンパク質、出力レポータータンパク質、および構成的レポータータンパク質を含有する。
【００１２】
ここで用いられる「レポーター」遺伝子またはタンパク質は、容易に検出可能で測定可能な任意の遺伝子またはタンパク質である。例示的なレポータータンパク質には、例えば、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質、免疫染色により検出しうるタンパク質、および放射性標識タンパク質が含まれる。
【００１３】
例示的な蛍光タンパク質には、例えば、増強青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質２（ＥＢＦＰ２）、ｍＫＡＴＥ、ｉＲＦＰ（赤外蛍光タンパク質）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、Ｋａｔｕｓｈｋａ、Ｄｓ−Ｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、ｍＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、およびＡＱ１４３が含まれる。
【００１４】
蛍光タンパク質は、例えば、ＦＡＣＳまたは蛍光顕微鏡法によりアッセイすることができる。
【００１５】
一態様では、構成的レポーターが、ｍＫＡＴＥであり、入力レポーターが、増強青色蛍光タンパク質２（ＥＢＦＰ２）であり、出力レポーターが、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）である。
【００１６】
他の例示的なレポータータンパク質には、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、検出可能なタンパク質タグ、例えば、ＦＬＡＧタグもしくはＨＩＳ×６タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、またはＨａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むポリペプチドが含まれる。
【００１７】
レポーター遺伝子発現は、例えば、発現したタンパク質を、異なる検出可能なプローブ（例えば、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、またはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ））で標識した抗体で検出することにより、免疫組織化学によりアッセイすることができる。一態様では、Ｘ−Ｇａｌ基質を用いて、ベータ−ガラクトシダーゼをアッセイする。
【００１８】
一態様では、被験レポータータンパク質と対照レポータータンパク質を、異なる放射性同位元素、例えば、32Ｐ、125Ｉ、または35Ｓで、例えば、細胞を同位元素の存在下で培養することにより標識することができる。対照および被験レポータータンパク質における、異なる同位元素の区別的な標識化は、例えば、質量分析によりアッセイすることができる。
【００１９】
一態様では、被験調節分子−被験遺伝子エレメント対により提示される発現レベルを評価する方法が、
構成的エフェクター遺伝子エレメントとエフェクター調節型タンパク質のコード配列を含み、構成的エフェクター遺伝子エレメントが、エフェクター調節型タンパク質の発現を制御し、エフェクター調節型タンパク質が、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントに結合し、エフェクター調節型タンパク質の、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントに対する結合活性が、入力エフェクターによりモジュレートされる、エフェクター転写単位、
エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントと被験調節分子の配列を含み、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントが、被験調節分子の発現を制御する、被験調節分子転写単位であり、
エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントと入力レポータータンパク質のコード配列を含み、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントが、入力レポータータンパク質の発現を制御する、入力転写単位であって、
エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の同じ遺伝子エレメントから共発現するか、またはエフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントの個別のコピーから個別に発現する、被験調節分子転写単位と入力転写単位、
被験調節分子に対して応答性の被験遺伝子エレメントと出力レポータータンパク質のコード配列を含み、被験調節分子に対して応答性の被験遺伝子エレメントが、出力レポータータンパク質の発現を制御する、出力転写単位、および
構成的遺伝子エレメントと構成的レポータータンパク質のコード配列を含み、構成的遺伝子エレメントが、構成的レポータータンパク質の発現を制御する、構成的レポータータンパク質転写単位、
を含む細胞集団を用意すること、
細胞を、複数の入力エフェクター量で、エフェクター転写単位、被験調節分子転写単位、入力レポータータンパク質転写単位、出力レポータータンパク質転写単位、および構成的レポータータンパク質転写単位の発現を可能とするのに十分な時間および条件下においてインキュベートすること、
細胞集団の個々の細胞内の入力レポータータンパク質、出力レポータータンパク質、および構成的レポータータンパク質のレベルを測定すること、
任意に、入力レポータータンパク質、出力レポータータンパク質、および構成的レポータータンパク質の測定されたレベルに対してシグナル補正を実施して、シグナルの重複を低減し、入力レポータータンパク質の補正レベル、出力レポータータンパク質の補正レベル、および構成的レポータータンパク質の補正レベルを提示すること、
細胞を、各入力エフェクター量で、構成的レポータータンパク質の非補正または補正レベルにより、複数のビンへと二次元的にビニングして、有限数のビニング細胞を提示し、各ビンについて、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルを計算すること、
任意に、各ビン内の細胞について、出力レポータータンパク質の非補正もしくは補正レベル、および／または入力レポータータンパク質の非補正もしくは補正レベルを、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルにより標準化して、入力レポータータンパク質の標準化レベルおよび／または出力レポータータンパク質の標準化レベルを提示すること、ならびに
被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる発現レベルを、入力レポータータンパク質および出力レポータータンパク質の非補正、補正、標準化、または非標準化レベルにより評価すること
を含む。
【００２０】
一態様では、被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる発現レベルを評価することが、入力レポータータンパク質の非標準化もしくは標準化レベルを、入力エフェクターの量と対比した、入力エフェクターの伝達曲線を提示すること、および／または出力レポータータンパク質の非標準化もしくは標準化レベルを、入力レポータータンパク質の非標準化もしくは標準化レベルと対比した、調節分子の伝達曲線を提示することによりなされ、被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる発現レベルを評価することが、入力エフェクターの伝達曲線および／または調節分子の伝達曲線による。
【００２１】
被験調節分子転写単位、入力転写単位、出力転写単位、および構成的転写単位の一態様を、図２に例示する。ここで記載される方法の利点は、全ての転写単位を、個別に、例えば、個別のプラスミド上に用意し、マルチプレックストランスフェクションの形でトランスフェクトしうることである。ここで記載されるビニングおよび標準化手順は、有用なデータの複合系からの抽出を可能とする。
【００２２】
エフェクター転写単位、被験調節分子転写単位、および／または入力転写単位は、さらなる調節タンパク質のコード配列、および／または他の被験タンパク質のコード配列をさらに含みうる。例えば、調節タンパク質は、共因子、例えば、それらの活性を緩和するエンハンサーに結合させることができる。共因子は、転写単位のうちの１つ以上においてコードされうる。
【００２３】
被験遺伝子エレメントのアッセイにおいて用いられる適切な細胞には、真核細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、哺乳動物、または他の多細胞生物に由来する有核細胞）および原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。例示的な哺乳動物細胞には、Ｈｅｋ２９３、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７、Ｂａｌｂ／ｃなどが含まれる。
【００２４】
転写単位を評価するのに適するプラスミドには、また、選択マーカーとも呼ばれる、選択遺伝子を組み入れることができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生剤または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか；（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか；または（ｃ）複合培地からは補給可能でない極めて重要な栄養物質、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のためのＤ−アラニンラセマーゼを供給するタンパク質をコードする。
【００２５】
任意に、哺乳動物細胞に適する選択マーカーは、被験および対照プロモーターを含む（１つ以上の）プラスミドを取り込むためのコンピテント細胞の同定を可能とする選択マーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ｎｅｏ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ｇｐｔ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）、またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）である。野生型のＤＨＦＲを使用する場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性欠損型ＣＨＯ細胞系である。酵母において用いるのに適する選択遺伝子は、酵母プラスミドであるＹＲｐ７内に存在するｔｒｐ１遺伝子である。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異体株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーをもたらす。
【００２６】
核酸を生細胞へと導入するのに、例えば、転写単位、または多重プラスミド／転写単位を含むプラスミドを細胞へと導入するのに、多様な技法が利用可能である。核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、哺乳動物細胞へと導入するのに適する技法には、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が含まれる。電気穿孔または塩化カルシウム法を含めた多様な公知の方法を用いて、核酸を原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉへと導入することができる。
【００２７】
一態様では、ウイルスを用いて、核酸を細胞へと送達する。
【００２８】
ここで用いられる、入力エフェクターとは、エフェクター調節型タンパク質の発現を制御するシグナルである。入力エフェクターの量、例えば、濃度は、エフェクター調節型タンパク質の発現を調節する。例示的なエフェクターには、物理的シグナル、例えば、光、および低分子が含まれる。
【００２９】
一態様では、入力エフェクターは、低分子エフェクターである。細胞を、複数濃度の低分子エフェクターと共に、エフェクター転写単位、被験調節タンパク質転写単位、入力レポータータンパク質転写単位、出力レポータータンパク質転写単位、および構成的レポータータンパク質転写単位の発現を可能とするのに十分な時間および条件下でインキュベートする。例示的な条件には、ここで例において記載される条件が含まれる。特定の態様では、低分子エフェクターの濃度が、２〜３桁を超えて変化することが多い。
【００３０】
図３は、エフェクター転写単位、被験調節タンパク質転写単位、入力レポータータンパク質転写単位、出力レポータータンパク質転写単位、および構成的レポーター転写単位の態様について例示し、低分子エフェクターによる被験調節タンパク質および入力レポーター転写単位の調節を示す。
【００３１】
別の態様では、Ｌｅｖｓｋａｙａら（Ｌｅｖｓｋａｙａ，Ａ．、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ａ．Ａ．、Ｔａｂｏｒ，Ｊ．Ｊ．、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｚ．Ｂ．、Ｌａｖｅｒｙ，Ｌ．Ａ．、Ｌｅｖｙ，Ｍ．、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．Ａ．、Ｓｃｏｕｒａｓ，Ａ．、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．、Ｍａｒｃｏｔｔｅ，Ｅ．Ｍ．、およびＶｏｉｇｔ，Ｃ．Ａ．「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  ｓｅｅ  ｌｉｇｈｔ」、Ｎａｔｕｒｅ、４３８：４４１〜４４２）により開発された光センサーおよびエフェクターとしての光を用いうるであろう。１つの実装では、ＭＩＴ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉに由来する部分であるＢＢａ＿Ｉ１５００８、ＢＢａ＿Ｉ１５００９、ＢＢａ＿Ｉ１５０１０を用いうるであろう。
【００３２】
エフェクター転写単位と構成的レポーター転写単位の両方についての例示的な構成的遺伝子エレメントには、ｐｈｅｆ１Ａプロモーター、ｐＣＡＧプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ１）プロモーター、またはＣＭＶプロモーターが含まれる。
【００３３】
エフェクター転写単位には、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントに結合するエフェクター調節型タンパク質のコード配列を組み入れる。例示的なエフェクター転写単位には、テトラサイクリン抗生剤、例えば、ドキシサイクリンにより調節されるテトラサイクリン誘導性または抑制性系が含まれる。ＴｅｔＯｆｆ系では、ｔｅｔオペレーターが、テトラサイクリントランス活性化因子（ｔＴＡ）タンパク質に結合し、これにより、隣接遺伝子を活性化させる。テトラサイクリン抗生剤への結合は、ｒＴＡがＤＮＡに結合することを阻止し、したがって、遺伝子の活性化をオフにする。ｔｅｔＯｎ系では、テトラサイクリン抗生剤が結合するときのみ、ｒｔＴＡタンパク質は、オペレーターに結合することが可能である。したがって、隣接遺伝子は、テトラサイクリン抗生剤の存在下だけで活性化する。当技術分野で公知の他のエフェクター転写単位には、ｌａｃオペレーター（ＬａｃＯ）、ＬｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ系プロモーター、もしくはＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）、もしくはＴ−ＲＥｘ（商標）系プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または同一もしくは実質的に類似の機構を伴うこれらの同等物に作動可能に連結されたプロモーターが含まれる。別の態様では、エフェクター転写単位に、ＲｈｅｏrｅｃｅｐｔｏｒとＲｈｅｏ活性化因子タンパク質がＲＳＬ１リガンドの存在により活性化する、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ系を組み入れる。ＲＳＬ１リガンドの存在下で、レセプターと活性化因子が安定的に二量体化し、応答エレメントに結合し、転写をオンにする。
【００３４】
別の態様では、誘導性／抑制性系に、図９で例示されるＧａｌ４系が含まれる。
【００３５】
ここで用いられる被験調節分子は、被験遺伝子エレメントに結合し、転写または転写後レベルでタンパク質の発現を調節するタンパク質、核酸、またはこれらの組合せ（例えば、ＬａｃＩ＋ｍｉＲＦＦ４）である。一態様では、被験調節分子は、ＤＮＡ配列、例えば、プロモーターまたは上流の活性化配列へと結合することにより転写を調節する調節タンパク質である。例示的な被験調節タンパク質には、ＬａｃＩおよびＴａｌ１が含まれる。被験調節分子がタンパク質である場合、被験調節分子転写単位には、タンパク質のコード配列を組み入れる。
【００３６】
別の態様では、被験調節分子が、転写を転写後レベルで調節するＲＮＡ分子、例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子である。被験調節分子が核酸である場合、被験調節分子転写単位には、核酸の配列を組み入れる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、被験遺伝子エレメントであるメッセンジャーＲＮＡ上の相補的な配列に結合し、例えば、翻訳抑制、標的分解、または遺伝子サイレンシングを介して、転写後において翻訳を調節する、約２２ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡ分子である。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とは、標的ｍＲＮＡ内の相補的な配列と塩基対合し、ｍＲＮＡの切断を誘導し、これにより、翻訳を阻止する、短鎖干渉またはサイレンシングＲＮＡである。したがって、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの場合、被験遺伝子エレメントとは、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと相補的な配列である。
【００３７】
被験調節分子転写単位と入力転写単位は、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の同じ遺伝子エレメントから共発現するか、またはエフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントの個別のコピーから個別に発現する。すなわち、被験調節分子転写単位と入力転写単位は、同じプラスミド上の場合もあり、個別のプラスミド上の場合もある。バイシストロニックまたはマルチシストロニックの発現ベクターを用意するためには、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を用いることができる。しかし、ＩＲＥＳ前後の遺伝子間の発現レベルの差違が注意されている。代替法は、翻訳されると、Ｃ末端におけるグリシル−プロリル結合のスキッピングおよび２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドの間の切断をもたらす１８〜２２アミノ酸のペプチドである、自己切断型２Ａペプチドを用いることである。例示的な２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１）のＰ２Ａである。
【００３８】
特定の態様では、細胞が、入力および出力レポーターの、程度を変化させた制御／発現を可能とする、さらなる転写単位を含有する。
【００３９】
一態様では、出力転写単位が、複数の連結された転写単位を含む。複数の連結された転写単位内の各転写単位は、プロモーターと、被験調節分子−被験遺伝子エレメント対を、出力レポータータンパク質の産生と連関させる１つ以上の配列を含有する。すなわち、出力レポータータンパク質と被験遺伝子エレメントは、連結されている限りにおいて、同じ転写単位上に存在する必要がない。図１４は、連結された出力レポーター転写単位の例を示す。
【００４０】
転写単位の発現がなされたら、入力レポータータンパク質、出力レポータータンパク質、および構成的レポータータンパク質のレベルを測定する。好ましくは、測定を、技法、例えば、フローサイトメトリーを用いて単一の細胞レベルで行う。フローサイトメトリーでは、光のビーム、例えば、レーザー光を、測定される粒子、例えば、細胞を含有する、流体力学的に焦点化された液体の流れへと方向付ける。複数の検出器を用いて、粒子内のレポーターを、それらが通過するときに測定する。蛍光標識、化学発光標識、量子ドット、および同位元素標識は、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。
【００４１】
一態様では、レポーターが、蛍光レポーターである。この態様では、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取器）解析により測定を実施する。ＦＡＣＳとは、単一の細胞に由来するレポーターシグナルを測定しうるフローサイトメトリーの一種である。多重波長フィルターを用いることにより、同じ試料に由来する多重レポーターを測定することができる。
【００４２】
個々の細胞内の３つのレポータータンパク質のレベルを測定したら、入力レポータータンパク質、出力レポータータンパク質、および構成的レポータータンパク質の測定されたレベルに対して、シグナル補正を任意に実施して、シグナルの重複を低減し、入力レポータータンパク質の補正レベル、出力レポータータンパク質の補正レベル、および構成的レポータータンパク質の補正レベルを提示する。蛍光測定値の場合、色補正とは、検出されるフルオロフォア以外の１つのフルオロフォアに由来する蛍光スピルオーバーを、検出されるフルオロフォアから、通例はサブトラクションとして控除する方法である。蛍光補正は、蛍光スペクトルの重複を最小化し、各蛍光色素の真の発光を測定する。構成的入力および出力レポーターは、それらの発光スペクトルにおける重複が最小限となるように選択するが、典型的には、ある程度のスピルオーバーまたは重複が存在する。色補正は、多重レポーターが同時に測定される場合に、特に重要でありうる。色補正はまた、発現レベルに大きな差違が存在する場合にも、重要でありうる。例えば、発現レベルの差違が１００倍である場合には、１％のブリードオーバーも著明である。
【００４３】
色補正は、典型的には、構成的入力および出力レポーターの発光スペクトルを検討し、スペクトルの重複の量を決定することにより行う。補正は、百分率を各測定値から控除する直線的補正の場合もあり、非直線的補正、例えば、データの区分的直線近似を実施する場合もある。非直線的補正という用語は、１つは、一次チャネルであり、いま１つは、補正チャネルである、２つのＦＡＣＳレーザー／フィルターの組合せにより発色を測定する、区分的直線近似を包含する。蛍光タンパク質の十分な発現範囲を得るために、低分子誘導因子のような入力エフェクターを用いることが有用でありうる。データを、一次チャネル値についてのビンへと分割し、次いで、そのビン内の点の平均および標準偏差を、補正チャネルについて測定する。この情報は、非直線モデルを形成する。補正を実施するためには、測定値のセットを取り出し、重ね合わされて生の測定値のセットを提示する（例えば、収束までの反復により）一次チャネル発現値のセットについて解く。
【００４４】
色補正はまた、自己蛍光補正、すなわち、細胞自体の自己蛍光の補正も包含する。
【００４５】
入力レポーターおよび出力レポーターおよび構成的レポーターを含め、ここで記載される試験回路は、プラスミドコピーカウントについて補正することを可能とするが、細胞ごとのプラスミドコピーカウントの補正が提示しうる誘導レベルの推定は、不十分な場合がある。本出願の発明者らは、入力および出力レポーターの誘導レベルならびに構成的レポーターレベルで細胞をビニングすることにより、細胞を、入力および出力発現レベルが実質的に類似するコレクションへと群分けしうることを、予測外に見出した。したがって、これらの群の平均および分散内で作業し、再度標準化することにより、平均の構成的蛍光から、有意義なデータの抽出を可能とする特徴付け曲線がもたらされる。図４（ａ）は、細胞ごとに採取され、誘導因子レベルにより群分けされ、次いで、平均されたデータであって、統計学的に有意な抑制を示さないデータと、ここで記載される方法により標準化されたデータ（ｂ）であって、３〜５倍の標準偏差を伴う１００分の１の抑制を示すデータを示す。
【００４６】
したがって、方法は、各入力エフェクター量で、構成的レポータータンパク質の補正レベルにより、細胞を複数のビンへと、二次元的にビニングして、有限数のビニング細胞を提示し、各ビンについて、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルを計算することを包含する。ビンは、等間隔を置くことができるが、これは必要ではない。加えて、ここで用いられるビン平均という用語は、ビン内の全ての細胞にわたる平均、ビンの中央、またはビン内の単一の細胞のレベルを意味する。ビン内の細胞の平均、ビンの中央、およびビン内の単一の細胞は一般に、類似の結果をもたらすことが決定されている。例示的なビンの数には、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０のビンが含まれる。一態様では、ビンが比較的狭い、例えば、０．２５桁であるが、可変的なサイズにより、ビンカウントを最適化することが可能となりうる。誘導レベルおよび構成的蛍光レベルで細胞をビニングすることにより、細胞のビンまたはコレクションは、実質的に同じ入力および出力蛍光レベルを有することになろう。ビンを解析することにより、統計学的に有意な抑制または活性化レベルを解析しうる特徴付け曲線の作成が可能となる。
【００４７】
細胞をビニングしたら、入力および／または出力タンパク質レベルを、ビンについての構成的レポーターの平均レベルにより任意に標準化する。上記で説明した通り、ビンの平均とは、ビン内の全ての細胞にわたる平均、ビンの中央、またはビン内の単一の細胞のレベルである。したがって、方法は、各ビン内の細胞について、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルにより、出力レポータータンパク質の非補正もしくは補正レベル、および／または入力レポータータンパク質の非補正もしくは補正レベルを任意に標準化して、入力レポータータンパク質の標準化レベルおよび／または出力レポータータンパク質の標準化レベルを提示することを包含する。標準化により、系内の多重プラスミドコピーを説明することが可能となる。
【００４８】
任意の標準化の後、伝達曲線を作成する。一般に、伝達曲線は、系のシグナルの出力を、シグナルの入力と対比してプロットし、系の性能についてのグラフ表示をもたらす。したがって、方法は、入力レポータータンパク質の標準化レベルを、低分子エフェクターの量と対比した、入力エフェクターの伝達曲線を提示すること、および／または出力レポータータンパク質の標準化レベルを、入力レポータータンパク質の補正レベルと対比した、標準化調節タンパク質の伝達曲線を提示することをさらに含む。これらの伝達曲線により、被験調節分子−被験遺伝子エレメント対の発現レベル、すなわち、活性化または抑制の強度を、多様な入力レベルにおいて評価することが可能となる。
【００４９】
伝達曲線をプロットすることにより、データが視覚化されるために、データの品質を肉眼で評価することができる。プロットせずに用いうるデータは、多種多様なモデル化、シミュレーション、予測、およびデザインタスクへと適用することができる。このようなタスクの例には、一部のデザインされた目的で複合系を構築するための、自動推定遷移（変曲）点、適合可能な発現レベルを伴う遺伝子部分の選択；所望の系の実現の加速化のために、生物学的系の挙動と同等ののシミュレーションであるべき系の代替的な実現の選択；予測された通りに作動しない系のデバッギング；および生物学的現象、例えば、環境条件の変化に応答する代謝的負荷の研究が含まれる。
【００５０】
一態様において、ここでは、方法、例えば、ここで記載される方法における使用のための３つのレポーター、例えば、３つの蛍光タンパク質を同定する方法が開示される。蛍光タンパク質は、例えば、スペクトルのある幅の域に対して応答し、ある幅の域にわたり発色する。これは、１つの蛍光タンパク質の測定レベルのうちの数パーセントが、別の蛍光タンパク質のレベルへと付加されることを意味する。先行技術による補正モデルは直線的であり、補正の精度についての推定はもたらさなかった。ここで提示される、ヒートマップによる色の選択は、経験的データに由来し、実際の干渉により良好に合致し、干渉が補正可能であるのかどうかを決定するのに用いうる分散の推定を可能とする、区分的非直線モデルをもたらす。
【００５１】
ヒートマップとは、二次元の表内の変数の値が、色として表される、データのグラフ表示である。データをヒートマップへと構築することを容易にする多くのソフトウェアパッケージが市販されている。
【００５２】
ＦＡＣＳ解析では、蛍光マーカー、例えば、個々の粒子、例えば、細胞内の蛍光タンパク質の発光を、異なる波長で測定する。特定の波長における蛍光発光は、光バンドパスフィルターを用いて測定する。光バンドパスフィルターとは、特定の範囲内の周波数がその中を通過することを可能とし、かつ、この範囲の外側の周波数は除去する（緩和する）光学的デバイスである。例えば、５２５ｎｍのバンドパスフィルターは、「緑色」光だけがその中を通過して検出器に至ることを可能とする。しかし、同じ実験において複数のフルオロフォアまたは蛍光タンパク質を測定することに関わる問題は、スペクトルの重複に起因して生じる、ブリードオーバー（また、ブリードスルーまたはクロストークとも呼ばれる）である。特定の蛍光マーカー−光バンドパスフィルターの組合せに対するミッドレンジのブリードオーバーは、測定器の飽和状態にも、複数の方途で決定されうる、測定器により測定される自己蛍光レベルにも近接しない範囲にわたる、ブリードの平均百分率と定義される。この場合の範囲は、１０3.8（約６３１０）〜１０4.5（約３１６２３）である。
【００５３】
蛍光を同時に測定するための、３つの光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質対を選択する方法は、
ａ）複数の光バンドパスフィルターと複数の蛍光タンパク質を選択するステップ、
ｂ）光バンドパスフィルターの各々により、複数の蛍光タンパク質の各々についての発光を測定し、発光を寒色〜暖色にスケーリングするステップであって、各光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せについて、寒色が低度の発光を表し、暖色が高度の発光を表すステップ、
ｃ）複数の蛍光タンパク質の各々について、光バンドパスフィルターの各々によりスケーリングされた発光のための、二次元マトリックスを構築するステップ、
ｄ）第１の被験蛍光タンパク質を選択し、二次元マトリックス内の被験蛍光タンパク質に対して、可能な限りの暖色である一方、少なくとも第２および第３の被験蛍光タンパク質に対しては寒色である、第１の被験タンパク質のための第１の被験光バンドパスフィルターを同定して、第１の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、
ｅ）第２および第３の被験蛍光タンパク質について、ステップｄ）を繰り返して、第２および第３の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、ならびに
ｆ）３つの蛍光タンパク質を同時に測定するための、第１、第２、および第３の選択された光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せを選択するステップ
を含む。
【００５４】
ここで記載される方法を用いて、スペクトルの重複を最小化し、これにより、より正確な測定を容易にするために、同時的な検出のための３つの蛍光タンパク質を選択することができる。また、各タンパク質について最良のバンドパスフィルターも選択される。一態様では、光バンドパスフィルターの各々により、複数の蛍光タンパク質の各々についての発光を、ミッドレンジ値、すなわち、測定された中央の蛍光として表す。
【００５５】
一態様では、６つのフィルター：１）Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ａ、２）ＡｍＣｙａｎ−Ａ、３）ＦＩＴＣ−Ａ、４）ＰＥ  ＹＧ−Ａ、５）ＰＥ−Ｃｙ−５．５  ＹＧ−Ａ、６）ＰＥ−ＴｘＲｅｄ  ＹＧ−Ａにより選択を実施する。
【００５６】
「ＤＮＡ部分」とは、特定の機能を伴うヌクレオチドの有限の配列、例えば、特異的タンパク質のコード配列（ＣＤＳ）、プロモーター（Ｐ）、遺伝子の発現を容易とする配列、例えば、誘導因子または抑制因子、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、またはターミネーターである。問題は、多くの部分が十分に特徴付けられていないことである。ＤＮＡ部分が、常にそれらの挙動を示すように調べられているとは限らず、そのように調べられている場合でもなお、それらの性能は、異なる細胞型により、または異なる実験室条件の下で変化しうる。
【００５７】
「回路」とは、ＤＮＡ部分のコレクション、例えば、１つ以上の転写単位であり、これはタンパク質またはタンパク質断片、例えば、特定の機能を有するレポータータンパク質および／またはタンパク質断片をコードする。回路のＤＮＡ部分は、相互作用して、各部分の発現を活性化または抑制する。回路を細胞へとトランスフェクトして、回路が発現すると、細胞は、特定の予測可能な形で応答するであろう。例えば、回路が発現すると、細胞は、特定の形状または構造を帯びる場合もあり、その環境に対して特定の形で応答する、例えば、光に向かって成長する場合もあり、光から遠ざかって成長する場合もある。
【００５８】
転写単位が、細胞内に含有され、細胞を、レポータータンパク質の発現に適する条件下でインキュベートする場合、「転写単位」とは、レポータータンパク質の発現を可能とする調節配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質のコード配列を組み入れたヌクレオチドの配列である。レポータータンパク質は、例えば、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、抑制性プロモーター、またはハイブリッドプロモーターの制御下にありうる。
【００５９】
「発現制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーエレメント、および所与の核酸配列の発現の調節に寄与する、他の核酸配列を指す。ここで用いられる「エンハンサーエレメント」という用語は、距離および配向に依存せず、相同ならびに異種プロモーターからの転写開始を制御するシス作用型核酸エレメントを指す。好ましくは、「エンハンサーエレメント」はまた、転写開始に対する組織および時間による指定も制御する。具体的な態様では、エンハンサーエレメントに、ＵＡＳ制御エレメントが含まれるがこれらに限定されない。
【００６０】
「ＤＮＡプロモーター」とは、遺伝子の転写を容易とするＤＮＡ配列である。プロモーターは、典型的には、プロモーターにより調節される遺伝子（または転写単位）の５’端に位置する。プロモーターは、ＤＮＡ配列と、ＲＮＡ転写機構（ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子を含めた）のための初期の結合部位をもたらす応答エレメントを含有する。転写因子は、特定のプロモーターに接合し、遺伝子発現を調節する、特異的活性化因子および抑制因子の配列に結合する。
【００６１】
プロモーターは、多様な長さでありうる。ここで用いられるプロモーターは、典型的には、５ヌクレオチド〜４０００ヌクレオチド以上の長さ、例えば、１０ヌクレオチド〜２０００ヌクレオチド以上の長さ、２０ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチド以上の長さ、３０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド以上の長さ、４０ヌクレオチド〜３００ヌクレオチド以上の長さ、例えば、５０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチド以上の長さ、６０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド以上の長さ、または７０ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド以上の長さである。一部の態様では、プロモーターが、５ヌクレオチド未満の長さである。一部の態様では、プロモーターが、５ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さ、１０ヌクレオチド〜６０ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さ、５０ヌクレオチド〜１５０ヌクレオチドの長さ、６０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドの長さ、または８０ヌクレオチド〜２５０ヌクレオチドの長さ、１００ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドの長さ、もしくは３００ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの長さでありうる。被験プロモーターは、典型的には、例えば、５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド以上の長さである。
【００６２】
プロモーターは、典型的には、問題の遺伝子とじかに隣接するので、プロモーター内の位置は、特定の遺伝子、例えば、レポータータンパク質をコードする遺伝子のための、ＲＮＡの転写が始まる転写開始部位に照らして指定される。したがって、遺伝子の上流の位置は、−１から逆に数えた負の数の位置であり、例えば、−１００は、その発現が調節される遺伝子の１００位上流で塩基対合する位置である。プロモーターは、典型的には、遺伝子、例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子の転写開始部位の少なくとも３５ヌクレオチド上流に位置する。被験プロモーターは、例えば、転写開始部位から−４０、−５０、−７０、−８０、または−１００ヌクレオチド以上の上流で始まりうる。
【００６３】
「構成的」プロモーターとは、大半の環境条件ならびに発生または細胞分化の状態の下で、発現を持続的に駆動するプロモーターである。対照プロモーターとして有用である例示的な構成的プロモーターは、Ｈｅｆ１ａプロモーターである。例えば、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓの参照番号ＢＢａ＿Ｋ５１１８０１として入手可能なＤＮＡ部分には、ｍＫＡＴＥ蛍光タンパク質遺伝子へと融合されたＨｅｆ１ａプロモーターが組み入れられている。
【００６４】
誘導的プロモーターとは、特定の化合物、すなわち、誘導因子の存在、または明確な外部条件、例えば、高温に応答して活性化するかまたは抑制されるプロモーターである。誘導的プロモーターは、低分子、例えば、抗生剤により、またはタンパク質生成物により、活性化させることもでき、抑制することもできる。例示的な誘導的プロモーターは、テトラサイクリン類似体の存在下で、ｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子バリアントにより活性化させることができ、ＬａｃＩ転写抑制因子のバリアント、例えば、ＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ−ＬａｃＯｉｄプロモーター（ＢｉｏＢｒｉｃｋｓの参照番号ＢＢＡ＿ｋ５１１００４）により、抑制することができる。
【００６５】
ここで用いられる「ハイブリッドプロモーター」は、多重エレメント、例えば、多重合成エレメント、または異なるプロモーター領域に由来するエレメントを含有しうる。ハイブリッドプロモーターは、１つ以上のエンハンサーエレメント、および１つ以上の活性化配列、および／または示差的に調節されるエレメントを含有しうる。
【００６６】
［実施例］
本発明は、以下の非限定的な例によりさらに説明される。
【００６７】
例１
Ｌａｃ−抑制因子−ＨＥＦ１ａ−ＬａｃＯ１Ｏｉｄ応答エレメント対の特徴付け
特徴付けられるマルチプレックス回路を、図５に示す。
【００６８】
構成的レポータータンパク質転写単位は、構成的遺伝子エレメント（ｐＨｅｆ１ａ）と、構成的レポータータンパク質のコード配列（ｍＫａｔｅ）を含む。ｍＫａｔｅ構成的レポーターは、赤色の蛍光発光を示す。
【００６９】
調節タンパク質転写単位と入力レポータータンパク質転写単位のいずれも、低分子エフェクターであるドキシサイクリン（ｄｏｘ）の制御下にある。この例では、低分子エフェクター（ｄｏｘ）の活性が、エフェクター転写単位を通して媒介される。エフェクター転写単位は、構成的エフェクター遺伝子エレメント（ｐＨｅｆ１  ａ）と、エフェクター調節型タンパク質（ｒｔＴＡ）のコード配列を含み、ここで、構成的エフェクター遺伝子エレメント（ｐＨｅｆ１  ａ）は、エフェクター制御型タンパク質（ｒｔＴＡ）の発現を制御する。
【００７０】
調節タンパク質転写単位は、低分子エフェクターに対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）と、調節タンパク質（ＬａｃＩ）のコード配列を含み、ここで、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）は、調節タンパク質（ＬａｃＩ）の発現を制御する。本発明の場合、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）は、エフェクター制御型タンパク質（ｒｔＴＡ）に対して応答性である。
【００７１】
入力転写単位は、低分子エフェクターに対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）と、入力レポータータンパク質のコード配列（ＥＢＦＰ２）を含み、ここで、エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）は、入力レポータータンパク質の発現（ＥＢＰＦ２）を制御する。エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）は、エフェクター制御型タンパク質（ｒｔＴＡ）に対して応答性である。入力レポータータンパク質であるＥＢＦＰ２は、青色の蛍光発光を示す。
【００７２】
調節タンパク質と入力レポータータンパク質のいずれの発現も、低分子エフェクターに対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）により制御されるため、調節タンパク質と、入力レポータータンパク質のモル量は、ほぼ同じであると考えられる。
【００７３】
出力転写単位は、調節タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメント（Ｈｅｆ１ａ−ＬａｃＯ１Ｏｉｄ）と、出力レポータータンパク質のコード配列（ＥＹＦＰ）を含み、ここで、調節タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメント（Ｈｅｆ１ａ−ＬａｃＯ１Ｏｉｄ）は、出力レポータータンパク質（ＥＹＦＰ）の発現を制御する。出力レポータータンパク質であるＥＹＦＰは、黄色の蛍光発光を示す。
【００７４】
この例では、構成的転写単位、入力転写単位、出力転写単位、調節転写単位、およびエフェクター転写単位が全て、個別のプラスミド上にあり、細胞へと同時にトランスフェクトされる。プラスミドは、細菌の成長および選択機構を含有する。構成的転写単位は、構成的プロモーター（すなわち、ヒト伸長因子１アルファ（Ｈｅｆ１ａ）、ＣＡＧ（ＣＭＶバリアント）、ＣＭＶ、ＵＢＣ・・・）を含有する。入力転写単位は、誘導性活性化プロモーター（すなわち、Ｔｅｔ応答性エレメント（ＴＲＥ）、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ系・・・）からなる。調節単位は、活性化可能と抑制性の両方である「ハイブリッドプロモーター」（すなわち、Ｇａｌ４ＶＰ１６により活性化し、ＴＡＬ１により抑制される）、または抑制因子が結合し、抑制を引き起こすためのＤＮＡ結合部位を付加した構成的プロモーター（すなわち、Ｈｅｆ１ａ−ＬａｃＯ１Ｏｉｄ）を含む。
【００７５】
細胞は、転写単位の転写／翻訳を可能とする適切な条件下で成長させる。加えて、異なる細胞集団を、異なる濃度の低分子エフェクターであるドキシサイクリンへと曝露する。標準的な細胞培養慣行を用いた。ＨＥＫ  ２９３  ＦＴ細胞系と派生細胞系を、１０％のＦＢＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＣｅｌｌＧｒｏ）、１００倍濃度のストレプトマイシン／ペニシリン（ＣｅｌｌＧｒｏ）、１００倍濃度の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）、および１０，０００倍濃度のＦｕｎｇｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地（ＣｅｌｌＧｒｏ）中で培養した。選択は、２ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）により、２〜４日間にわたり、またはピューロマイシン耐性を含有しない対照細胞が死滅するまで行った。０．０５％のトリプシンを用いて、細胞を継代培養した。
【００７６】
次いで、細胞を、ＦＡＣＳ解析にかけ、入力、出力、および構成的タンパク質の蛍光量を、各細胞について測定する。ＦＡＣＳ解析のために細胞を調製するときは、培地を吸引して取り除き、適量のトリプシンを、細胞へと添加し、次いで、最長５分間にわたりインキュベートする。次いで、トリプシンを不活化するために、血清を補充した培地を用いて、細胞を再懸濁させる。次いで、細胞を、１００×ｇの速度で、１０分間にわたりスピンダウンし、上清を除去し、細胞を、適切な容量中、１倍濃度のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液）中に再懸濁させる。次いで、これらの細胞を、測定のために、フローサイトメーターにかける。
【００７７】
入力、出力、および構成的タンパク質の蛍光の色は、可能な限り重複が小さくなるように選択するが、異なる色の間には、固有の重複がある程度存在する。色補正とは、検出されるフルオロフォア以外の１つのフルオロフォアに由来する蛍光スピルオーバーを、通例はサブトラクションとして、検出されるフルオロフォアから控除するプロセスである。シグナルの重複を低減するために、入力レポータータンパク質（ＥＢＰＦ２）、出力レポータータンパク質（ＥＹＦＰ）、および構成的レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）の測定されたレベルに対して色補正を使用して、シグナルの重複を低減し、入力レポータータンパク質（ＥＢＰＦ２）の補正レベル、出力レポータータンパク質（ＥＹＦＰ）の補正レベル、および構成的レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）の補正レベルを提示する。
【００７８】
色補正は、一定の百分率のシグナルを控除する直線的色補正の場合もあり、非直線的補正の場合もある。非直線的補正という用語は、１つは、一次チャネルであり、いま１つは、補正チャネルである、２つのＦＡＣＳレーザー／フィルターの組合せにより発色を測定する、区分的直線近似を包含する。非直線的補正は、蛍光タンパク質の十分な発現範囲を得るために、入力エフェクター、例えば、低分子誘導因子を用いるのに有用でありうる。データを、一次チャネル値についてのビンへと分割し、次いで、そのビン内の点の平均および標準偏差を、補正チャネルについて測定する。この情報は、非直線モデルを形成する。補正を実施するためには、測定値のセットを取り出し、（例えば、収束までの反復により）重ね合わせて生の測定値のセットを提示する一次チャネル発現値のセットについて解く。
【００７９】
色補正はまた、自己蛍光補正、すなわち、細胞自体の自己蛍光の補正も包含する。
【００８０】
３つのシグナルに対する色補正が完了したら、二次元分割、すなわち、ビニングを実施する。使用される各濃度の低分子エフェクター（ｄｏｘ）について、細胞を、それらの構成的レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）の補正レベルに従い、等しく間隔を置くビンへとビニングして、複数の等しく間隔を置くビンを生成させる。細胞のビニングにより、個々の細胞内のレベルを測定することに関連するノイズが低減される。各ビンについて、構成的レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）のビン平均レベルを計算するか、またはビン中央値を用いて、ビンを表しうるであろう。この例では、ビンの中央を、ビンを表すものとして用いた。図６は、この例のための２次元ビニングの結果を示す。
【００８１】
入力レポータータンパク質（ＥＢＰＦ２）の補正レベル、出力レポータータンパク質（ＥＹＦＰ）の補正レベル、および構成的レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）の平均レベルに対して、蛍光の色変換を任意に実施する。入力、出力、および構成的レポーターは、色が異なるため、同じ「単位」を有さない。したがって、色変換により、３つの異なる色を、同じ単位へと変換することが可能となるために、３つの色についての測定値を直接比較することができる。色変換を実施するために、３つの構成的に生成する色により実験を行った。これらの色は、色の間の直線的マッピング、例えば、何単位のＥＢＦＰ２／Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ａが、１単位のｍＫａｔｅ／ＰＥ−ＴｘＲｅｄ  ＹＧ−Ａと釣り合うかのマッピングを可能とする同じプロモーターで誘導した。
【００８２】
ビニングおよび任意の蛍光色変換の後、各ビン内の細胞について標準化を実施する。出力レポータータンパク質（ＥＹＦＰ）の補正レベルおよび／または入力レポータータンパク質（ＥＢＰＦ２）の補正レベルを、構成的レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）の平均レベルにより標準化して、入力レポータータンパク質（ＥＢＰＦ２）の標準化レベルおよび／または出力レポータータンパク質（ＥＹＦＰ）の標準化レベルを提示する。
【００８３】
入力および出力蛍光を標準化したら、低分子エフェクター（ｄｏｘ）または調節タンパク質（ＬａｃＩ）について伝達曲線を作成する。
【００８４】
入力レポータータンパク質の標準化レベルを、低分子エフェクターの量と対比した、標準化低分子エフェクターの伝達曲線を、図７に示す。各点は、個別の細胞ビンを表す。
【００８５】
この伝達曲線は、３ｎＭ以下のｄｏｘレベルでは、ＩＦＰレベルが、プラスミドカウントに関わらず、低レベルにとどまり、２００ｎＭを超えるｄｏｘレベルでは、ＩＦＰレベルが、高値で飽和することを示す。ＩＦＰレベルと産生されるＬａｃＩの量は、正に相関することに注意されたい。この伝達曲線により、ｒｔＴＡと高レベルのＤｏｘの存在下におけるＴｒｅの活性化が検証される。
【００８６】
出力レポータータンパク質の標準化レベルを、入力レポータータンパク質の補正レベルと対比した、標準化調節タンパク質の伝達曲線を、図８に示す。各直線は、異なる量の低分子エフェクター（ｄｏｘ）を表す。
【００８７】
この伝達曲線は、Ｈｅｆ１ａ−Ｌａｃｏ１Ｏｉｄの出力を、ＬａｃＩにより１００分の１に抑制しうることを示す。
【００８８】
例２
Ｔａｌ１−抑制因子−ＵＡＳ−Ｔ１応答エレメント対の特徴付け
特徴付けられるマルチプレックス回路を、図９に示す。
【００８９】
構成的レポータータンパク質転写単位は、構成的遺伝子エレメント（ｐＨｅｆ１ａ）と、構成的レポータータンパク質（ＥＢＦＰ２）のコード配列を含む。構成的レポーターであるＥＢＦＰ２は、青色の蛍光発光を示す。
【００９０】
この例では共発現する、調節タンパク質転写単位と入力レポータータンパク質転写単位は、構成的に発現したタンパク質であるｒｔＴＡに結合して、Ｔｒｅ遺伝子エレメントからの転写を調節する低分子エフェクターである、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の制御下にある。
【００９１】
この例では、エフェクター転写単位が、構成的エフェクター遺伝子エレメント（ＣＡＧ）と、エフェクター調節型タンパク質（ｒｔＴＡ）のコード配列を含み、ここで、構成的エフェクター遺伝子エレメント（ＣＡＧ）は、エフェクター制御型タンパク質（ｒｔＴＡ）の発現を制御する。この例では、エフェクター転写単位が、出力転写単位内のＵＡＳ−Ｔ１に結合する、ＶＰ１６−ＧＡＬ４活性化因子のコード配列をさらに含む。ｄｏｘの非存在下では、Ｔａｌ１が発現せず、構成的に発現したＶＰ１６−ＧＡＬ４活性化因子がＵＡＳ−Ｔ１に結合することから、ｍＫａｔｅ出力レポーターの発現がもたらされる。エフェクター転写単位は、同じ構築物からのｒｔＴＡとＶＰ１６−ＧＡＬ４の発現を可能とする２Ａ自己切断型ペプチドのコード配列を含有する。
【００９２】
被験調節タンパク質転写単位と入力転写単位は、低分子エフェクターに対して応答性の遺伝子エレメント（Ｔｒｅ）から共発現する。ｄｏｘを系へと添加すると、ｄｏｘは、ｒｔＴＡに結合し、活性化したｒｔＴＡは、Ｔｒｅエレメントに結合し、これにより、被験調節タンパク質（Ｔａｌ１）と、入力レポータータンパク質（ＥＹＦＰ）の転写が活性化される。被験調節タンパク質転写単位と入力転写単位の組合せは、同じ構築物からのＴａｌ１とＥＹＦＰの発現を可能とする２Ａ自己切断型ペプチドのコード配列を含有する。入力レポータータンパク質であるＥＹＦＰは、黄色の蛍光発光を示す。
【００９３】
出力転写単位は、調節タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメント（ＵＡＳ−Ｔ１）と、出力レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）のコード配列を含み、ここで、調節タンパク質（Ｔａｌ１）に対して応答性の遺伝子エレメントは、出力レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ）の発現を制御する。ｄｏｘの非存在下では、ＶＰ１６−Ｇａｌ４が、ＵＡＳ−Ｔ１に結合し、ｍＫＡＴＥの産生を活性化させる。しかし、ｄｏｘの存在下では、Ｔａｌ１が産生され、これにより、ＵＡＳ−Ｔ１が抑制され、これにより、出力レポーターであるｍＫａｔｅの産生が抑制される。出力レポータータンパク質であるｍＫａｔｅは、赤色の蛍光発光を示す。低分子エフェクター（ｄｏｘ）の存在下では、活性化因子タンパク質であるＶＰ１６−Ｇａｌ４が発現し、これにより、上流の活性化配列ＵＡＳ−Ｔ１が活性化する。被験調節タンパク質であるＴａｌ１の存在下では、出力レポータータンパク質の産生が抑制される。
【００９４】
データ解析は、実質的に例１における通りに実施した。
【００９５】
入力レポータータンパク質の標準化レベルを低分子エフェクターの量と対比した、標準化低分子エフェクターの伝達曲線を、図１０に示す。各直線は、個別の細胞ビンを表す。
【００９６】
この伝達曲線は、３ｎＭ以下のｄｏｘレベルでは、ＩＦＰレベルが、プラスミドカウントに関わらず、低レベルにとどまり、２００ｎＭを超えるｄｏｘレベルでは、ＩＦＰレベルが、高値で飽和することを示す。ＩＦＰレベルと産生されるＴａｌ１の量は、正に相関することに注意されたい。この伝達曲線により、ｒｔＴＡと高レベルのＤｏｘの存在下におけるＴｒｅの活性化が検証され、図７における曲線と符合する。
【００９７】
出力レポータータンパク質の標準化レベルを入力レポータータンパク質の補正レベルと対比した、標準化調節タンパク質の伝達曲線を、図１１に示す。各直線は、異なる量の低分子エフェクター（ｄｏｘ）を表す。
【００９８】
この伝達曲線は、ＵＡＳ−Ｔ１の出力を、Ｔａｌ１により１００分の１に抑制しうることを示す。
【００９９】
例３
ｍｉＲＮＡ調節分子の特徴付け
図１２は、ｍｉＲ２１低濃度センサーであるｍｉＲＮＡ回路の態様を示す。
【０１００】
エフェクター転写単位には、ＲｈｅｏｒｅｃｅｐｔｏｒとＲｈｅｏ活性化因子タンパク質を、ＲＳＬ１リガンドの存在により活性化させる、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ系を組み入れる。ＲＳＬ１リガンドの存在下で、レポーターと活性化因子が安定的に二量体化し、応答エレメントに結合し、転写をオンにする。エフェクター転写単位は、ｐｈＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＲｈｅｏＡｃｔとＲｈｅｏＲｅｃ遺伝子を含有する。２Ａ自己切断型配列は、同じ構築物内で、両方のタンパク質を産生することを可能とする。ＲＳＬエフェクターの存在下では、ＲｈｅｏＡｃｔ−ＲｈｅｏＲｅｃ複合体が、入力転写単位内のｐＵＡＳプロモーターに結合して、転写を活性化させる。
【０１０１】
被験調節分子転写単位と入力転写単位は、単一のｐＵＡＳから共発現する。入力レポータータンパク質は、ＥＹＦＰである。被験調節分子は、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ２１である。
【０１０２】
出力レポーター転写単位は、ｐＣＡＧＯＰプロモーターの制御下にあるｍＫａｔｅを含む。ＬａｃＩ制御型プロモーターであるＣＡＧｏｐは、ＬａｃＩ抑制型プロモーター（２つのＬａｃＯ部位を伴うイントロンが後に続くＣＡＧプロモーター）である。したがって、ＬａｃＩの非存在下では、このプロモーターが活性化する。
【０１０３】
出力レポーター転写単位は、被験調節分子であるｍｉＲ２１による、ｍＫａｔｅの産生の転写後調節のために、Ｔ２１配列を含有する。
【０１０４】
構成的転写単位は、構成的レポーターの青色蛍光タンパク質であるＴａｇＢＦＰの発現を制御する構成的プロモーターである、ｐＣＡＧを含有する。
【０１０５】
図１３は、図１２のｍｉＲ２１低濃度センサーについての伝達曲線を示す。（ａ）が、１２分の１の抑制を描示する集団動態を示すのに対し、（ｂ）では、ここで記載される方法により、少なくとも５０分の１の抑制が明示される。
【０１０６】
図１４は、ｍｉＲ２１高濃度ｍｉＲＮＡ回路を示す。
【０１０７】
構成的転写単位、エフェクター転写単位、および被験調節分子転写単位／入力転写単位は、ｍｉＲＮＡ低濃度センサーの場合と同じである。出力レポーター転写単位は異なる。ｍｉＲ２１−Ｔ２１間相互作用により直接調節される代わりに、出力レポーター転写単位は、２つの連結回路を介して間接的に調節される。この場合、連結回路とは、被験調節分子−被験遺伝子エレメント対の効果を、出力レポーター転写単位へと連関させる第２入力エフェクターにより任意に調節される回路と定義される。連結回路が、被験遺伝子エレメントを含有するのに対し、出力レポーター転写単位は、連結回路からの連結出力に対して応答性のシグナルを含有する。連結回路はまた、被験調節分子からのシグナルの増幅も可能とする。
【０１０８】
ｍｉＲ２１高濃度センサーでは、出力転写単位に、ｐＣＡＧＯＰプロモーターの制御下にあり、転写後においてｍｉＲＦＦ４−ＦＦ４対により調節される、ｍＫａｔｅ出力レポーターを組み入れる。ｐＣＡＧＯＰプロモーターを調節するためのＬａｃＩタンパク質と、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲＦＦ４のいずれも、ｒｔＴＡの存在下で活性化する、ｐＴＲＥプロモーターの制御下の第１の連結回路にある。第１の連結回路はまた、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ２１の存在に対して応答性のＴ２１配列も含有する。第１の連結回路におけるｐＴＲＥプロモーターの活性化は、構成的に発現したｒｔＴＡ遺伝子とＴ２１配列を含有する第２の連結回路により制御される。ｄｏｘの存在下では、構成的に発現したｒｔＴＡタンパク質が活性化して、第２の連結回路内のｐＴＲＥに結合することから、ＬａｃＩとｍｉＲＦＦ４の両方の転写が活性化される。ＬａｃＩとｍｉＲＦＦ４のいずれも、出力回路におけるｍＫａｔｅの産生を抑制する。
【０１０９】
図１５は、図１４のｍｉＲ２１高濃度センサーについての伝達曲線を示す。図は、プラスミドの数と強く相関する活性化関係を示す。ｍＫａｔｅの産生を抑制するのに十分なＬａｃＩが蓄積される前のｍＫａｔｅ発現に起因しうる第１のデータ点を除き、ＥＹＦＰ（およびｍｉＲ２１）が多く存在するほど、より多くのｍＫａｔｅが産生される。
【０１１０】
例４
同時的解析のための３つの蛍光タンパク質の選択
３つの蛍光タンパク質の間のスペクトルの重複を最小化するために、新規のヒートマップ選択プロセスを開発した。ここで記載される実験に用いられる、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩとＢＤ  ＬＳＲ  ＦｏｒｔｅｓｓａのＦＡＣＳ機は、６つのフィルター：１）Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ａ、２）ＡｍＣｙａｎ−Ａ、３）ＦＩＴＣ−Ａ、４）ＰＥ  ＹＧ−Ａ、５）ＰＥ−Ｃｙ−５．５  ＹＧ−Ａ、６）ＰＥ−ＴｘＲｅｄ  ＹＧ−Ａを有する。発光は、６つの異なる蛍光タンパク質：Ｃｅｒｕｌｅａｎ（ｃｅｒ）、ＥＢＦＰ（増強青色蛍光タンパク質）、ＡｍＣｙａｎ１、ＥＹＦＰ（増強黄色蛍光タンパク質）、ＥＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）、およびｍＫＡＴＥで６つのフィルターの各々について測定された。ｃｅｒの発光は、１）Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ａ、または２）ＡｍＣｙａｎ−Ａフィルターにより測定することができる。ＥＢＦＰの発光もまた、１）Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ａ、または２）ＡｍＣｙａｎ−Ａフィルターにより測定することができる。ＡｍＣｙａｎ１の発光は、１）Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ａ、または２）ＡｍＣｙａｎ−Ａフィルターにより測定することができる。ＥＹＦＰの発光は、３）ＦＩＴＣ−Ａフィルターにより測定することができる。ＥＧＦＰの発光は、３）ＦＩＴＣ−Ａフィルターにより測定することができる。ｍＫＡＴＥの発光は、４）ＰＥ  ＹＧ−Ａ、５）ＰＥ−Ｃｙ−５．５  ＹＧ−Ａ、または６）ＰＥ−ＴｘＲｅｄＹＧ−Ａフィルターにより測定することができる。
【０１１１】
ミッドレンジのブリードオーバー発光を、蛍光タンパク質／光バンドパスフィルターの組合せの各々について測定し、暖色性／寒色性の指標として表す。次いで、値の二次元ヒートマップマトリックスを提示する（図１６）。
【０１１２】
一例では、ＥＢＦＰタンパク質を伴うＡｍｅｒＣｙａｎ−Ａフィルターにより測定された「熱」をゼロとし、これにより、残りのスケーリングされた発光を調整する（図１７および１８）。「暖」色が、ゼロに設定された値より大きなシグナルを示す（図１９）のに対し、「寒」色は、ゼロに設定された値より小さなシグナルを示す（図２０）。この方法を、異なる光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せを伴って実施することにより、３つの蛍光色／光バンドパスフィルター対を選択することができる（図２１）。
【０１１３】
具体例では、ＣｅｒｕｌｉａｎとＥＢＦＢのいずれもが、ＡｍｅｒＣｙａｎ−Ａフィルターにより暖色のシグナルを提示するため、これらの２つの色素を、ＡｍｅｒＣｙａｎ−Ａフィルターと共に、同時に用いるべきではない（図２２）。
【０１１４】
重複を最小限とする３つの蛍光タンパク質／光バンドパスフィルターの組合せは、ＥＢＦＰ／Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−Ａ、ＥＹＦＰ／ＦＩＴＣ−Ａ、およびｍＫＡＴＥ／ＰＥ−ＴｘＲｅｄ  ＹＧ−Ａである（図２３）。
【０１１５】
「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」および「その」という用語ならびに類似の指示対象の使用（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈における）は、ここで別段に指示されるか、または文脈により明確にそうでないことが示されない限り、単数と複数の両方を対象とするとみなされるものとする。ここで用いられる、第１、第２などの用語は、任意の特定の序列を指し示すことを意味するものではなく、複数の、例えば、層を指し示す便宜のためだけのものである。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段に言及されない限り、オープンエンドの（すなわち、「〜が含まれるがこれらに限定されない」を意味する）用語とみなされるものとする。値の範囲の列挙は、ここで別段に示されない限り、その範囲内に収まる各個別の値に個々に言及する簡便な方法として用いられることだけを意図するものであり、各個別の値は、それがここで個々に列挙されたと仮定した場合と同様に、明細書へと組み込まれる。全ての範囲の端点は、その範囲内に包含され、独立に組合せ可能である。ここで記載される全ての方法は、ここで別段に指示されるか、または文脈により明確にそうでないことが示されない限り、適切な順序で実施することができる。任意および全ての例または例示的な表現の使用（例えば（ｅ．ｇ．）、「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は、本発明についてよりよく例示することだけを意図するものであり、別段に主張されない限り、本発明の範囲に限定を付与するものではない。明細書内のいかなる表現も、任意の特許請求されない要素を、ここで用いられる本発明の実施に不可欠なものとして指示するとはみなされないものとする。
【０１１６】
本発明について、例示的な態様を参照しながら記載してきたが、当業者は、本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、多様な変化を施してもよく、同等物でその要素を代替してもよいことを理解するであろう。加えて、その不可欠の範囲から逸脱しない限りにおいて、多くの改変を施して、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させてもよい。したがって、本発明は、本発明を実施するために想定される最良の様態として開示される特定の態様に限定されるものではなく、本発明は、付属の特許請求の範囲内に収まる全ての態様を包含することが意図される。ここで別段に指示されるか、または文脈により明確にそうでないことが示されない限り、本発明には、その全ての可能な変化形における、上記で記載した要素の任意の組合せが包摂される。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  被験調節分子−被験遺伝子エレメント対により提示される発現レベルを評価する方法であって、
構成的エフェクター遺伝子エレメントとエフェクター調節型タンパク質のコード配列を含み、前記構成的エフェクター遺伝子エレメントが、前記エフェクター調節型タンパク質の発現を制御し、前記エフェクター調節型タンパク質が、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の遺伝子エレメントに結合し、前記エフェクター調節型タンパク質の、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントに対する結合活性が、入力エフェクターによりモジュレートされる、エフェクター転写単位、
前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントと前記被験調節分子のコード配列を含み、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントが、前記被験調節分子の発現を制御する、被験調節分子転写単位であり、
前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントと入力レポータータンパク質のコード配列を含み、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントが、前記入力レポータータンパク質の発現を制御する、入力転写単位であって、
前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の同じ遺伝子エレメントから共発現するか、または前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメントの個別のコピーから個別に発現する、前記被験調節分子転写単位と前記入力転写単位、
前記被験調節分子に対して応答性の前記被験遺伝子エレメントと出力レポータータンパク質のコード配列を含み、前記被験調節分子に対して応答性の前記被験遺伝子エレメントが、前記出力レポータータンパク質の発現を制御する、出力転写単位、および
構成的遺伝子エレメントと構成的レポータータンパク質のコード配列を含み、前記構成的遺伝子エレメントが、前記構成的レポータータンパク質の発現を制御する、構成的レポータータンパク質転写単位
を含む細胞集団を用意すること、
前記細胞を、複数の前記入力エフェクター量で、前記エフェクター転写単位、前記被験調節分子転写単位、前記入力レポータータンパク質転写単位、前記出力レポータータンパク質転写単位、および前記構成的レポータータンパク質転写単位の発現を可能とするのに十分な時間及び条件下においてインキュベートすること、
前記細胞集団の個々の細胞内の前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質のレベルを測定すること、
任意に、前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質の前記測定されたレベルに対してシグナル補正を実施して、シグナルの重複を低減し、入力レポータータンパク質の補正レベル、出力レポータータンパク質の補正レベル、および構成的レポータータンパク質の補正レベルを提示すること、
前記細胞を、各前記入力エフェクター量で、構成的レポータータンパク質の前記非補正または補正レベルにより、複数のビンへと二次元的にビニングして、有限数のビニング細胞を提示し、各ビンについて、構成的レポータータンパク質のビン平均レベルを計算すること、
任意に、各ビン内の前記細胞について、出力レポータータンパク質の前記非補正もしくは補正レベル、および／または入力レポータータンパク質の前記非補正もしくは補正レベルを、構成的レポータータンパク質の前記ビン平均レベルにより標準化して、入力レポータータンパク質の標準化レベルおよび／または出力レポータータンパク質の標準化レベルを提示すること、ならびに
前記被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる前記発現レベルを、入力レポータータンパク質および出力レポータータンパク質の前記非補正、補正、標準化、または非標準化レベルにより評価すること
を含む方法。
［２］  前記被験調節分子が、調節タンパク質または調節核酸であり、調節が、転写調節または転写後調節である、［１］に記載の方法。
［３］  前記被験調節分子が、調節タンパク質であり、前記被験調節分子転写単位内の前記被験調節分子の前記配列が、前記被験調節タンパク質のコード配列である、［２］に記載の方法。
［４］  前記被験調節核酸が、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり、前記被験調節分子転写単位内の前記被験調節分子の前記配列が、前記ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である、［２］に記載の方法。
［５］  前記構成的エフェクター遺伝子エレメント、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメント、前記被験遺伝子エレメント、または前記構成的遺伝子エレメントが、ＤＮＡプロモーターまたは上流の活性化配列である、［１］に記載の方法。
［６］  前記構成的エフェクター遺伝子エレメント、前記エフェクター調節型タンパク質に対して応答性の前記遺伝子エレメント、前記被験遺伝子エレメント、および前記構成的遺伝子エレメントが、ＤＮＡプロモーターである、［３］に記載の方法。
［７］  前記被験遺伝子エレメントが、誘導的プロモーター、抑制性プロモーター、またはハイブリッドプロモーターである、［３］に記載の方法。
［８］  前記細胞が、哺乳動物細胞である、［１］に記載の方法。
［９］  前記入力エフェクターが、物理的シグナルまたは低分子である、［１］に記載の方法。
［１０］  前記出力レポーター転写単位が、複数の連結された転写単位を含む、［１］に記載の方法。
［１１］  前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、［１］に記載の方法。
［１２］  前記構成的レポーター、前記入力レポータータンパク質、および前記出力レポータータンパク質が、ｍＫＡＴＥ、増強青色蛍光タンパク質２（ＥＢＦＰ２）、および増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）から選択される、［１］に記載の方法。
［１３］  前記入力レポータータンパク質、前記出力レポータータンパク質、および前記構成的レポータータンパク質の前記レベルを測定することが、フローサイトメトリーによる、［１］に記載の方法。
［１４］  色補正が、直線的または非直線的である、［１］に記載の方法。
［１５］  入力レポータータンパク質の前記非補正または補正レベル、出力レポータータンパク質の前記非補正または補正レベル、および構成的レポータータンパク質の前記非補正または補正レベルを、基準単位へと変換して、入力レポータータンパク質の非補正または補正／変換レベル、出力レポータータンパク質の非補正または補正／変換レベル、および構成的レポータータンパク質の非補正または補正／変換レベルを提示することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［１６］  前記エフェクター転写単位、前記被験調節タンパク質転写単位、または前記入力転写単位が、さらなるタンパク質のコード配列を含む、［１］に記載の方法。
［１７］  前記さらなるタンパク質が、さらなる調節タンパク質である、［１６］に記載の方法。
［１８］  前記被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる前記発現レベルを評価することが、入力レポータータンパク質の前記非標準化もしくは標準化レベルを、前記入力エフェクターの量と対比した、入力エフェクターの伝達曲線を提示すること、および／または出力レポータータンパク質の前記非標準化もしくは標準化レベルを、入力レポータータンパク質の前記非標準化もしくは標準化レベルと対比した、調節分子の伝達曲線を提示することによりなされ、前記被験調節分子−被験遺伝子エレメント対によりもたらされる前記発現レベルを評価することが、前記入力エフェクターの伝達曲線および／または前記調節分子の伝達曲線による、［１］に記載の方法。
［１９］  前記構成的レポータータンパク質、前記入力レポータータンパク質、および前記出力レポータータンパク質は、蛍光タンパク質であり、かつ各タンパク質に対する光バンドパスフィルターと共に、
ａ）複数の光バンドパスフィルターと複数の蛍光タンパク質を選択するステップ、
ｂ）前記光バンドパスフィルターの各々により、前記複数の蛍光タンパク質の各々についての発光を測定し、前記発光を寒色〜暖色にスケーリングするステップであって、各光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せについて、寒色が低度の発光を表し、暖色が高度の発光を表すステップ、
ｃ）前記複数の蛍光タンパク質の各々について、前記光バンドパスフィルターの各々により前記スケーリングされた発光のための、二次元マトリックスを構築するステップ、
ｄ）第１の被験蛍光タンパク質を選択し、前記二次元マトリックス内の前記被験蛍光タンパク質に対して、可能な限りの暖色である一方、少なくとも第２および第３の被験蛍光タンパク質に対しては寒色である、前記第１の被験タンパク質のための第１の被験光バンドパスフィルターを同定して、第１の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、
ｅ）前記第２および前記第３の被験蛍光タンパク質について、ステップｄ）を繰り返して、第２および第３の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、ならびに
ｆ）３つの蛍光タンパク質を同時に測定するための、前記第１、第２、および第３の選択された光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せを選択するステップ
を含む方法により選択される、［１］に記載の方法。
［２０］  蛍光を同時に測定するための、３つの光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質対を選択する方法であって、
ａ）複数の光バンドパスフィルターと複数の蛍光タンパク質を選択するステップ、
ｂ）前記複数の光バンドパスフィルターの各々により、前記複数の蛍光タンパク質の各々についての発光を測定し、前記発光を寒色〜暖色にスケーリングするステップであって、各光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せについて、寒色が低度の発光を表し、暖色が高度の発光を表すステップ、
ｃ）前記複数の蛍光タンパク質の各々について、前記複数の光バンドパスフィルターの各々により前記スケーリングされた発光のための、二次元マトリックスを構築するステップ、
ｄ）第１の被験蛍光タンパク質を選択し、前記二次元マトリックス内の前記被験蛍光タンパク質に対して、可能な限りの暖色である一方、少なくとも第２および第３の被験蛍光タンパク質に対しては寒色である、前記第１の被験タンパク質のための第１の被験光バンドパスフィルターを同定して、第１の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、
ｅ）前記第２および前記第３の被験蛍光タンパク質について、ステップｄ）を繰り返して、第２および第３の蛍光タンパク質−光バンドパスフィルターの組合せを提示するステップ、ならびに
ｆ）３つの蛍光タンパク質を同時に測定するための、前記第１、第２、および第３の選択された光バンドパスフィルター−蛍光タンパク質の組合せを選択するステップ
を含む方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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