(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロビアーゼ、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼ活性を示し、唯一の炭素源としてセルロース又はその誘導体の存在下に好気生活で培養したときエタノールを生産する、単離されたデイノコッカス（Deinococcus）細菌。
【請求項２】
好気生活で炭素源としてセルロースを利用して０．０４％よりも多いエタノールを生産することができる、請求項１記載の細菌。
【請求項３】
好熱性であって、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能である、請求項１又は２記載の細菌。
【請求項４】
グルコース、デンプンおよび／またはスクロースを炭素源として利用することができる、請求項１〜３のいずれか一項記載の細菌。
【請求項５】
４５℃以上の温度で成長する、請求項１〜４のいずれか一項記載の細菌。
【請求項６】
Ｄ．ジオサーマリス（D. geothermalis）及びＤ．マーレイ（D murrayi）の株より選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の細菌。
【請求項７】
２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５７の番号で寄託されたデイノコッカスＭ１３−１Ａ株。
【請求項８】
エタノールを生産する方法であって、適切な炭素源の存在下で請求項１〜７のいずれか一項記載の細菌またはその抽出物を培養すること、およびエタノールを収集することを含む方法。
【請求項９】
エタノールを生産するための、請求項１〜７のいずれか一項記載の細菌の使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項記載の細菌を含む培養装置または発酵槽。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細菌およびその使用に関する。さらに具体的には、本発明は、多様な培養条件で有機酸またはアルコールを生産するための有利な性質を有する、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌に関する。本発明は、また、該細菌を使用して特にバイオマスから有機酸またはアルコールを生産する方法に関する。
【０００２】
緒言
自己のゲノムがストレスによって破壊されたときにそれを再度組立てる能力を有する、Deinococcus細菌などの細菌が文献に報告されている。Deinococcusは、Andersonおよび共同研究者らによって１９５６年に単離されたグラム陽性細菌である。この好極限性生物は、ＵＶおよび電離放射線によるＤＮＡ損傷または架橋剤（マイトマイシンＣ）によるＤＮＡ損傷に耐性であって、乾燥に抵抗力がある。
【０００３】
国際公開公報第０１／０２３５２６号は、放射線に対するDeinococcusの珍しい耐性を示しており、さらにそれらの操作およびバイオレメディエーションにおける使用を提案している。現在未公開の特許出願PCT/EP2008/065613は、Deinococcus細菌が溶媒に耐性を有し、バイオマスを変換し、エタノールを生成できることを示している。
【０００４】
他のストレス耐性細菌、ならびにそれらを単離および／または選択するための方法、ならびにそれらが抗生物質などの代謝物を生産できることが、現在未公開の特許出願EP 09 305041.7に開示されている。
【０００５】
本発明は、有機酸またはアルコールを生産するための注目すべき性質を有する、新規なストレス耐性細菌の単離および特徴づけに起因する。さらに具体的には、本発明は、多様な炭素源を利用して工業的に高い関心が持たれる有機酸またはアルコールを生産することができる新規なストレス耐性細菌の単離を開示する。本発明は、本発明者らによって単離された、顕著に広いスペクトルの炭素源を利用することができ、かつ／または有機酸もしくはアルコール、特にエタノールを予想外に生成できる株を開示する。本発明は、特に有機酸またはアルコールを生産するためのそのような単離された細菌、およびその使用に関する。
【０００６】
発明の概要
本発明の第一の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好気生活において炭素源としてセルロースを利用して有機酸またはアルコールを生産することができる細菌に関する。好ましい態様では、その細菌は、好熱性（すなわち４５℃以上の温度で生存可能）であって、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能である。
【０００７】
本発明の別の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能であり、少なくとも２g/Lの乳酸を生産する細菌である。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能であり、少なくとも０．０５g/Lのコハク酸を生産する細菌にある。
【０００９】
本発明の別の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能であり、少なくとも０．２５g/Lの酢酸を生産する細菌である。
【００１０】
本発明の最も好ましい細菌は、少なくとも０．００４％、最も好ましくは少なくとも０．０４％のエタノールを生産する。
【００１１】
本発明は、また、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、炭素源の存在下で、さらに好ましくは炭素源としてセルロースの存在下で好気生活において培養したときに０．０４％よりも多いエタノールを生産する細菌に関する。
【００１２】
さらなる局面では、本発明は、上記と同義の単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、炭素源として追加的な基質、特にグルコース、デンプンおよびスクロースをさらに利用することができる細菌に関する。
【００１３】
本発明の好ましい細菌は、また、炭素源としてカルボキシメチルセルロース、セロビオース、ヘミセルロースおよびキシロースも利用することができる。
【００１４】
本発明は、実際に、炭素源として非常に大きなスペクトルの基質を利用する顕著な能力を有するストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌の単離を開示する。本発明の特定の細菌は、例えばD. radiodurans、D. geothermalis、D murrayi、D. cellulosilyticusまたはD. desertiより選択されうるDeinococcus細菌である。そのような細菌の具体例には、２００９年５月７日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes - Institut Pasteur - Paris）にＣＮＣＭ  Ｉ−４１５５の番号で寄託されたDeinococcus Ｍ１１−９Ｄ株、２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５６の番号で寄託されたDeinococcus strain ＭＣ２−２Ａ株、および２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５７の番号で寄託されたDeinococcus Ｍ１３−１Ａ株、または該細菌の派生株、突然変異体、トランスフォーマントもしくは子孫が挙げられる。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、有機酸またはアルコール、特にエタノールを生産する方法であって、適切な炭素源の存在下で上記開示の細菌を培養すること、およびその有機酸またはアルコールを収集することを含む方法である。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、バイオアルコール、好ましくはエタノールを生産するための、上記と同義の細菌の使用にある。
【００１７】
本発明は、また、上記開示の細菌を含む培養装置または発酵槽に関する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、有機酸またはアルコールを生産するためのストレス耐性細菌およびその使用に関する。
【００１９】
本発明の文脈内で「ストレス耐性細菌」という用語は、具体的には自己のゲノムがストレスによって破壊されたときにそれを全体または部分的に再度組立てる能力を有する細菌を意味する。そのストレスは、任意の細胞破壊性ＤＮＡ損傷処理、すなわちE. coli細菌培養物に９０％以上の細胞死を引き起こすために十分な処理でありうる。なおいっそう好ましくは、細胞破壊性ＤＮＡ損傷処理は、E. coli培養物中の細菌力価を少なくとも２ｌｏｇだけ減少させるために十分な処理である。そのような処理の例には、照射、好ましくは反復および連続ＵＶ照射、ならびに／または遺伝毒性剤の使用が挙げられる。好ましいストレス処理は、０．５〜４００mJ/cm2の間、さらに好ましくは１〜２００mJ/cm2の間、典型的には１〜１００mJ/cm2の間で約５秒〜５分間適用されたＵＶ処理である。好ましいＵＶ処理は、４mJ/cm2を３０秒間であるが、それを１〜８時間、好ましくは３〜５時間、より好ましくは約４時間の間隔で繰り返してもよい。本発明による特定の細胞ストレス処理は、未公開の特許出願EP09 305041.7に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２０】
本発明による細胞ストレス耐性細菌には、より具体的にはDeinococcus細菌、Tepidimonas細菌、Truepera細菌、Porphyrobacter細菌、Novosphingobium細菌またはExiguobacteria細菌が挙げられる。本発明の好ましい細菌は、Deinococcus細菌、特に好極限性Deinococcus細菌、より好ましくはD. radiodurans、D. geothermalis、D. murrayi、D. cellulosilyticusまたはD. desertiより選択されるDeinococcus細菌である。
【００２１】
Deinococcus細菌は、自己のゲノムがストレスによって破壊されたときにそれを全体または部分的に再度組立てる能力を有することが示された。上記のように、これらの細菌、特にD. radioduransが、バイオレメディエーションのために提案されている。Deinococcus細菌がバイオマスからバイオエネルギー産物を生産できることは、現在未公開のPCT/EP2008/065613に開示されている。本発明は、今回、高性能ストレス耐性細菌の同定および特徴づけに起因する。さらに具体的には、本発明は、本発明者らによって環境試料から単離された、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、有機酸またはアルコールを生産するための改善された性能を、特に炭素源の利用および／または生産レベルに関して有する細菌を提供する。
【００２２】
本発明の文脈内で、有機酸という用語は、さらに好ましくは、ギ酸、酢酸、乳酸、酪酸、グルコン酸、クエン酸、コハク酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸、ピルビン酸、イタコン酸およびコウジ酸より選択される有機酸を意味する。より好ましくは、本発明の単離された細菌は、少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種の上記有機酸を生産する。本発明の最も好ましい細菌は、ピルビン酸、乳酸、コハク酸、酢酸、ギ酸および／またはリンゴ酸を生産する。
【００２３】
この点で、本発明の好ましい細菌は、少なくとも０．１g/Lの乳酸、より好ましくは少なくとも０．５g/L、なおいっそう好ましくは少なくとも０．８g/L、もっとも好ましくは少なくとも２g/Lの乳酸を生産するストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌である。
【００２４】
本発明の別の好ましい細菌は、少なくとも０．０５g/Lのコハク酸を生産するストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌である。
【００２５】
本発明の別の好ましい細菌は、少なくとも０．２５g/Lの酢酸を生産するストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌である。
【００２６】
本発明の別の好ましい細菌は、ギ酸またはリンゴ酸を生産するストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌である。
【００２７】
本発明の文脈内で、アルコールという用語は、より好ましくはエタノール、ブタノール、プロパノール、メタノール、イソプロパノール、プロパンジオール、グリセロール、または２，３−ブタンジオール、好ましくはエタノールを意味する。
【００２８】
この点で、本発明の好ましい細菌は、少なくとも０．００４％、より好ましくは少なくとも０．０１５％、最も好ましくは少なくとも０．０４％のエタノールを生産するストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌である。％のエタノールは、培地１ｇあたりのエタノールのｇ数を意味する（すなわち、典型的には１％のエタノール＝１ｇエタノール／１００ｇ培地＝１０ｇエタノール/L）。
【００２９】
実験の部に開示するように、多様な工業分野において特に有用な、その種の性質を有するストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌が今回単離された。なおいっそう興味深いことに、その細菌は、上記生産能力に加えて、以下：
−  好極限性である、
−  ４〜９の間に含まれるｐＨで生存可能である、
−  ２％のエタノールの存在下で生存可能である、
−  好気生活もしくは嫌気生活で成長することができる、および／または
−  炭素源としてセルロースもしくはその誘導体を利用することができる
の性質の一つまたは複数を示す。
【００３０】
この最後の性質は、特に有利で予想外である。実際に、唯一の炭素源としてのセルロース（またはその誘導体）の使用は、少なくとも１種のセロビアーゼおよび１種のグルカナーゼを含む効率的な酵素系を必要とし、本発明の細菌が多様な工業条件下で成長できることを例示している。
【００３１】
セルロース誘導体の例には、例えば、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルメチルセルロース、粉末セルロースおよびセルロースワッディングが挙げられる。そのようなセルロースまたは誘導体の市販の入手源には、例えばWhatman紙、Avicelle（微結晶セルロース）またはSolka Floc(粉末セルロース)が挙げられる。
【００３２】
この細菌がセルロースを利用できることは、例えばその細菌がWhatman紙の上で成長する予想外の能力によって例示される。この紙は、セルロースまたはその誘導体を含み、炭素源としてのその使用および完全な分解は、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼおよびセロビアーゼを含む効率的な酵素複合体を必要とする。
【００３３】
結果として、炭素源としてセルロースまたはWhatman紙を利用できる本発明の細菌は、バイオマスを含めた多種多様な基質で非常に効率的に成長し、かつ／または形質転換することができると予想される。この点で、注目すべきは、２００株の被験Deinococcus新規単離株のうち、５株がWhatman紙を完全に分解する能力を示したことに留意する。
【００３４】
したがって、本発明の株は、代謝物の生産のための顕著な性質を示すばかりでなく、炭素源として特定の基質で成長し、それを利用することもできるが、このことは、その株を工業的使用に特に有利にする。
【００３５】
本発明の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好気生活で炭素源としてセルロースを利用して有機酸またはアルコールを生産することのできる細菌に関する。本発明の好ましい細菌は、少なくとも１種のセロビアーゼおよびグルカナーゼを含む効率的な酵素系を含有し、セルロース（例えばWhatman紙）を好ましくは完全に分解することができる。
【００３６】
そのうえ、本発明の好ましい細菌は、炭素源として追加的な基質、特にグルコース、デンプンおよびスクロースをさらに利用することができる。本発明の好ましい細菌は、また、炭素源としてカルボキシメチルセルロース、セロビオース、ヘミセルロースおよびキシロースを利用することができる。
【００３７】
本発明の別の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能で、少なくとも２g/Lの乳酸を生産する細菌である。
【００３８】
本発明の別の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能で、少なくとも０．０５g/Lのコハク酸を生産する細菌である。
【００３９】
本発明の別の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能で、少なくとも０．２５g/Lの酢酸を生産する細菌である。
【００４０】
本発明の別の目的は、単離されたストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌であって、好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで生存可能で、少なくとも０．００４％のエタノール、好ましくは少なくとも０．０４％のエタノールを生産する細菌である。
【００４１】
上述のように、本発明の好ましい細菌は、有利には炭素源としてセルロースを利用する。加えてそれらは、グルコース、デンプンおよびスクロース、カルボキシメチルセルロース、セロビオース、ヘミセルロースおよびキシロースなどの他の基質を利用する。
【００４２】
その細菌は、任意の適切な培地および装置中で培養および／または維持することができる。そのような培地の例には、実施例に開示されたような複合グルコース培地または限定培地が挙げられる。適切な培地は、市販もされている。
【００４３】
本発明の細菌の具体例は、２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５５の番号で寄託されたDeinococcus Ｍ１１−９Ｄ株、２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５６の番号で寄託されたDeinococcus ＭＣ２−２Ａ株、および２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５７の番号で寄託されたDeinococcus Ｍ１３−１Ａ株、または該細菌の派生株、突然変異体、トランスフォーマントもしくは子孫である。
【００４４】
実施例に開示されたようなこれらの寄託株は、全て好熱性で、５〜９の間に含まれるｐＨで成長することができ、かつ／または炭素源としてセルロース（Whatman紙で例示される）を利用することができる。
【００４５】
ＭＣ２−２Ａは、ＣＭＣ、セロビオース、キシランまたはキシロースなどの広スペクトルの基質を利用して有益な有機酸を生産する顕著な能力を有する。
【００４６】
Ｍ１３−１Ａは、唯一の炭素源としてWhatman紙の存在下で培養した場合に、実質的なレベルのエタノールを生産する予想外の能力を有する。
【００４７】
Ｍ１１９−Ｄは、Deinococcus細菌として前例のない、２．５g/Lよりも多い乳酸を生産する顕著な能力を有する。
【００４８】
したがって、本発明のこれらの細菌は、基質利用および／または代謝物生産に関して、特に工業目的に有用な、顕著な性質の組み合わせを示す。
【００４９】
本発明の教示を用いて、そして例えば実験の部に記載されたような実験手順に従って、本発明による性質を有するDeinococcus細菌などのさらなるストレス耐性細菌を選択または単離してもよいことを了解すべきである。特に本発明者らは、ある種のストレス耐性細菌がWhatman紙上で成長できることを実証したので、技術者は、実験の部に提供されたプロトコールに従ってそのような性質を有する他の株を単離することができる。
【００５０】
この点で、本発明のさらなる目的は、ストレス耐性細菌、特にDeinococcus細菌を単離する方法であって、以下：
−  潜在的に細菌を含有する試料を提供すること、
−  該試料をＤＮＡ切断処理に供すること、
−  該試料をセルロースまたはその誘導体（例えばwhatman紙）の存在下で培養すること、および
−  該培養物から成長または生存中の細菌を単離すること
を含む方法である。
【００５１】
この方法に従って、本発明者らは、上記の優れた特徴を併せ持つ追加的な株を単離した。特に、５〜９の間に含まれるｐＨで成長して０．３g/Lよりも多い乳酸を生産することができる好熱性Deinoccocus株が単離されたが、これは、上記方法の有用性を示している。
【００５２】
上記方法に従って、本発明者らは、また、５〜９の間に含まれるｐＨで成長し、セルロースを用いた培養でエタノールを生産することのできる、追加的な好熱性Deinoccocus株を単離することができた。その種の細菌の例には：
−  炭素源としてのセルロースの存在下で０．０４１％のエタノールを生産するDeinoccocus Ｍ１１  １２Ｂ；
−  炭素源としてのセルロースの存在下で０．０２１％のエタノールを生産するDeinoccocus Ｍ１４  ６Ｃ；および
−  炭素源としてのセルロースの存在下で０．０１６％のエタノールを生産するDeinoccocus Ｍ１３  ８Ｄ
が挙げられる。
【００５３】
したがって本発明は、炭素源としてセルロースを使用する能力を有するいくつかのDeinococcus細菌を開示する。本発明は、その種の細菌がストレスの多い培養条件下でセルロースを使用してエタノールを生産することができることを開示する。
【００５４】
本発明のさらなる目的は、上記と同義の細菌の抽出物である。「細菌の抽出物」は、細胞上清、細胞破片、細胞壁、ＤＮＡ抽出物、酵素もしくは酵素調製物などの、細菌から入手される任意の画分、または化学、物理および／もしくは酵素処理により細菌から得られる、本質的に生きた細菌を有さない任意の調製物を意味する。
【００５５】
本発明は、また、上記細菌の派生株、トランスフォーマント、突然変異体または子孫に関する。トランスフォーマントという用語は、リコンビナント核酸(すなわち該細菌に自然には存在しない核酸または変更もしくは複製された核酸)を含有する株を意味する。突然変異体という用語は、突然変異誘発処理に起因する株を意味する。派生株は、本発明の株から例えばセレクションによって得られた任意の株であって、列挙された炭素源を利用して有機酸またはアルコールを生産する能力を保持する株を意味する。
【００５６】
本発明のさらなる目的は、有機酸またはアルコールを生産するための、上記と同義の細菌の使用に関する。
【００５７】
本発明のさらなる目的は、バイオアルコール、好ましくはエタノールを生産するための、上記と同義の細菌の使用に関する。
【００５８】
本発明は、また、アルコール、好ましくはエタノールを生産する方法であって、適切な基質の存在下で上記と同義の細菌を培養すること、およびそのアルコールを収集することを含む方法に関する。
【００５９】
基質は、任意の培地または様々な種類のバイオマスまたはそれ由来の産物でありうる。特に、該酸およびアルコールは、再生可能な資源、特に植物性もしくは動物性バイオマスから、または都市ゴミおよび産業廃棄物から生産することができる。本発明の文脈内で「バイオマス」という用語は、工業生産のために使用することのできる、生存した生物学的材料および死滅した生物学的材料を表す。最も一般的には、バイオマスは、例えば植物性材料、動物性材料、生分解性廃棄物を表す。バイオマスは、ススキ、スイッチグラス、アサ、サトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、ポプラ、ヤナギ、モロコシ、サトウキビを含めた多種類の植物、およびユーカリノキからアブラヤシに及ぶ多種の樹木から得ることができる。本発明によるバイオマスは、原料バイオマスおよび／または二次バイオマスを含む可能性がある。原料バイオマスは、生物学的材料からの未処理の材料である。例には、材木または紙生産に適さない成熟樹木などの林業産物、草、作物および厩肥などの農業産物、ならびに藻類および海草などの水性産物が挙げられる。二次バイオマスは、最初は原料バイオマスから得られた、顕著な化学的変化および物理的変化を受けた任意の材料である。例には、紙製品、皮革製品、綿製品、麻製品、天然ゴム製品、食品加工副産物、および使用済み植物油が挙げられる。
【００６０】
本発明の特定の目的は、バイオアルコールを生産するための方法であって、本発明の細菌またはその抽出物にバイオマスを曝露することおよび場合によりそのバイオアルコールを収集することを含む方法に関する。
【００６１】
バイオアルコールは、好ましくはエタノールである。
【００６２】
本発明の方法は、変換リアクター中で行うことができる。「リアクター」によって、従来の発酵タンク、または本発明を実施するために特別に設計され、したがって特にバイオリアクター、バイオフィルター、回転式生物学的コンタクター、ならびに他の気相および／もしくは液相バイオリアクターにある、バイオマス変換のための任意の装置もしくはシステム、特にバイオマスもしくはバイオマス誘導体の処理に適したものが意味される。本発明により使用することのできる装置は、連続的にまたはバッチ式ロードにより使用することができる。
【００６３】
本発明の方法を実施するために、リアクター中に本発明の少なくとも一つの細菌、またはその細菌抽出物が使用されるが、該リアクターは、該細菌が検討中のアプリケーションで動作可能なように、そして場合により細菌の成長が可能であり、好ましくはその中で促進されるように、その中で物理化学的条件が設定および維持されるようにアレンジおよび供給される。
【００６４】
基質および細菌に応じて、工程は、好気生活、嫌気生活または微好気生活下で行うことができる。
【００６５】
本発明のさらなる局面および利点を、以下の実施例に開示するが、それらの実施例は、例示として見なすべきであり、本出願の範囲を限定するものではない。
【００６６】
実施例
ストレス耐性細菌は、環境試料から単離された。特定の炭素源を利用し、関心が持たれる代謝物を生産する予想外の能力を有する細菌が同定され、特徴づけられた。その種の株の例がＣＮＣＭに寄託されている。これらの細菌の選択プロトコールおよび主特性は、この実験の部に開示されている。
【００６７】
実施例１．成長のためのｐＨ範囲
材料および方法
本方法は、微生物がある範囲のｐＨで成長できることを評価することを可能にする。
【００６８】
試験は、４５℃で行うものとする（好熱株）。
【００６９】
複合培地グルコースに入れて調製した前培養物（定常期）を遠心分離し、次に滅菌した浸透水（osmosed water）で３回洗浄する。
【００７０】
洗浄した培養物を用いて、２００μLのＰＧＹ培地に植菌する（５％の接種）。９６ウェルマイクロプレート中で試験を行う。
【００７１】
ＰＧＹは、１０g/Lペプトン、５g/L酵母エキス、１g/Lグルコースを含有する。
【００７２】
ｐＨは、ｐＨメーターを使用してＨＣｌ  １ＭまたはＮａＯＨ  １Ｍで調整（master）する。
【００７３】
ｐＨ調整した培地を濾過する（０．２μm）。
【００７４】
好気生活において培養を行う。
【００７５】
マイクロプレートを撹拌しながらインキュベーター中に４５℃で放置する。
【００７６】
効果的な成長の結果は、７および１４日目の読み取り後に決定する。読み取りは、裸眼で陽性対照および陰性対照と比較しながら行う。
【００７７】
結果：
単離されたDeinococcus株は、ｐＨが５〜９の間の培地中で成長することができる。
【００７８】
【表１】
0005766182.tif 000002
【００７９】
実施例２  −  炭素源の利用性
材料および方法
この方法は、微生物が、関心が持たれる炭素源（グルコース、スクロース、デンプン、Whatman紙、ＣＭＣ、セロビオース、ヘミセルロース、キシロース）を利用できることの評価および成長のためのｐＨ範囲を試験することを可能にする。
【００８０】
試験は、４５℃（好熱株）で行うものとする。
【００８１】
複合培地グルコースに入れて調製した前培養物（定常期）を遠心分離し、次に滅菌した浸透水で３回洗浄する。
【００８２】
洗浄した培養物を用いて、２００μＬの限定培地に接種する（接種量５％）。９６ウェルマイクロプレートで試験を行う。
【００８３】
限定培地は、オートクレーブ（１２０℃で１５分間）した浸透水で調製する。オートクレーブした浸透水に以下の溶液を添加する：ＭＯＰＳ緩衝溶液（１０×）ｐＨ７［酸ＭＯＰＳ  ４００mM、ＮＨ４Ｃｌ  ２００ｍＭ、ＮａＯＨ  １００mM 、ＫＯＨ  １００mM 、ＣａＣｌ２  ５μM、Ｎａ２ＳＯ４  ２．７６mM、ＭｇＣｌ２  ５．２８mM］；微量栄養素（１００００×）［（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）２４  ３００mM、Ｈ３ＢＯ３  ４mM、ＣｏＣｌ２  ０．３mM、ＣｕＳＯ４  ０．１mM、ＭｎＣｌ２  ２．５mM、ＺｎＳＯ４  ０．１mM］；ＦｅＣｌ３（１００×）  ２mM（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７  ２０mMに溶かしたもの）；Ｋ２ＨＰＯ４  １g/L。溶液を濾過滅菌する（０．２μm）。
−  炭素源：１０g/L（デンプン５g/Lおよびヘミセルロース５g/L以外）
−  培養は好気生活において行う。
−  マイクロプレートを撹拌しながらインキュベーター中に４５℃で放置する。
−  ７および１４日目の読み取り後に有効な成長の結果を決定する。読み取りは、裸眼で陽性対照および陰性対照と比較しながら行う。
【００８４】
結果
結果は、株が唯一の炭素源としてグルコース、スクロース、デンプン、Whatman紙、ＣＭＣ、セロビオース、ヘミセルロースを使用できることを示している。これらの株は、特に第二世代のエタノール生産に有用である。特に表２に示される結果は、ＭＣ２−２Ａ株が炭素源としてグルコース、スクロース、デンプン、Whatman紙、ＣＭＣ、セロビオース、およびヘミセルロースを利用できることを示している。
【００８５】
【表２】
0005766182.tif 000003
【００８６】
本発明者らによって単離された、５から９の間に含まれるｐＨで成長してセルロースを分解することができる好熱性Deinoccocus株のさらなる例には、Deinoccocus Ｍ１１  １２Ｂ、Deinoccocus Ｍ１４  ６Ｃ；およびDeinoccocus Ｍ１３  ８Ｄが挙げられる。
【００８７】
実施例３．  代謝物の生産  −  複合培地グルコース
材料および方法
この方法は、微生物が、複合培地グルコースから関心が持たれる代謝物を生産できることを評価できるようにする。
【００８８】
試験は、４５℃（好熱株）で実施する。
【００８９】
複合培地グルコースに入れて調製した前培養物（定常期）から６mlの強化培地に接種する（接種量１％v/v）。
【００９０】
被験強化培地は、複合培地グルコース、限定培地Whatman紙である。
【００９１】
複合培地グルコースは、浸透水に溶かしたペプトン２g/L、酵母エキス５g/Lおよびグルコース１０g/Lを含有する。溶液をオートクレーブ（１５分間、１２０℃）により滅菌する。この溶液に以下の溶液を添加する：ＭＯＰＳ緩衝液（１０×）ｐＨ７［酸ＭＯＰＳ  ４００mM 、ＮＨ４Ｃｌ  ２００mM 、ＮａＯＨ  １００mM 、ＫＯＨ  １００mM 、ＣａＣｌ２  ５μM、Ｎａ２ＳＯ４  ２．７６mM、ＭｇＣｌ２  ５．２８mM］；微量栄養素（１００００×）［（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）２４  ３００mM、Ｈ３ＢＯ３  ４mM、ＣｏＣｌ２  ０．３mM、ＣｕＳＯ４  ０．１mM、ＭｎＣｌ２  ２．５mM、ＺｎＳＯ４  ０．１mM］；ＦｅＣｌ３（１００×）２mM（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７  ２０mMに溶かす）；Ｋ２ＨＰＯ４  １g/L。溶液を濾過滅菌する（０．２μm）。
【００９２】
培養を好気生活および嫌気生活（Biomerieux、Genbag）の両方において行う。
【００９３】
好気生活条件での培養物を撹拌しながらインキュベーター中に４５℃で７日間放置する。次に、培養物を４０００rpmで１０分間遠心分離する。上清を濾過（０．２μm）し、他のチューブに注ぎ、−８０℃で保存する。
【００９４】
嫌気生活条件での培養物をインキュベーター中に４５℃で４週間放置する。次に、培養物を４０００rpmで１０分間遠心分離する。上清を濾過（０．２μm）し、他のチューブに注ぎ、−８０℃で保存する。
【００９５】
ガスクロマトグラフィーＦＩＤ分析（Varian CP-WAX 57 CB ２５ｍ×０．３２mmカラム）を用いてアルコールを定量した。有機酸は、キャピラリー電気泳動（５mM  ２，６−ピリジンジカルボン酸、０．５mMセチルトリメチルアンモニウムブロミド；ｐＨ５．６に調整した緩衝液／長さ６１cm、直径５０μmのキャピラリー、Agilent）によって定量した。残留グルコースは、屈折計と連結されたＨＰＬＣ（Phenomenex LUNA 3u NH2 100A １５０×４．６mmカラム、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（８５：１５）移動相）によって定量した。
【００９６】
結果
好気生活および嫌気生活において複合培地グルコースを利用できる株を同定した。これは、関心のエタノールおよび酸の生産へと導く。
【００９７】
【表３】
0005766182.tif 000004
【００９８】
実施例４  −  代謝物の生産  −  限定培地Whatman紙
この方法は、微生物が、Whatman紙の利用から関心が持たれる代謝物を生産できることを評価できるようにする。
【００９９】
試験は、４５℃（好熱株）で実施する。
【０１００】
複合培地グルコースに入れて調製した前培養物（定常期）を遠心分離し、次に滅菌した浸透水で３回洗浄する。
【０１０１】
洗浄された培養物を用いて２０mLの限定培地Whatman紙に接種する。
【０１０２】
限定培地Whatman紙：
−  限定培地は、オートクレーブ（１２０℃で１５分間）した浸透水で調製する。オートクレーブした浸透水に以下の溶液を添加する：ＭＯＰＳ緩衝液（１０×）ｐＨ７［酸ＭＯＰＳ  ４００mM 、ＮＨ４Ｃｌ  ２００mM 、ＮａＯＨ  １００mM 、ＫＯＨ  １００mM、ＣａＣｌ２  ５μM、Ｎａ２ＳＯ４  ２．７６mM、ＭｇＣｌ２  ５．２８mM］；微量栄養素（１００００×）［（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）２４  ３００mM、Ｈ３ＢＯ３ ４mM、ＣｏＣｌ２  ０．３mM、ＣｕＳＯ４  ０．１mM、ＭｎＣｌ２  ２．５mM、ＺｎＳＯ４  ０．１mM］；ＦｅＣｌ３（１００×）２mM（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７  ２０mMに溶かす）；Ｋ２ＨＰＯ４  １g/L。溶液を濾過滅菌する（０．２μm）。
−  炭素源：Whatman濾紙No.1、９０mmディスク１枚をオートクレーブ（１２０℃で１５分間）し、限定培地に添加。
−  培養は好気生活で行う。
−  好気生活条件での培養物を撹拌しながらインキュベーター中に４５℃で６週間放置する。次に、培養物を４０００rpmで１０分間遠心分離する。上清を濾過し（０．２μm）、他のチューブに注ぎ、−８０℃で保存する。ガスクロマトグラフィーＦＩＤ分析（Varian CP-WAX 57 CB ２５ｍ×０．３２mmカラム）を用いてアルコールを定量した。有機酸は、キャピラリー電気泳動（５mM  ２，６−ピリジンジカルボン酸、０．５mMセチルトリメチルアンモニウムブロミド；ｐＨ５．６に調整した緩衝液／長さ６１cm、直径５０μmのキャピラリー、Agilent）によって定量した。残留グルコースは、屈折計と連結されたＨＰＬＣ（Phenomenex LUNA 3u NH2 100A １５０×４．６mmカラム、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（８５：１５）移動相）によって定量した。
【０１０３】
結果
好極限性条件下で唯一の炭素源としてWhatman紙を利用できる株を同定した。この分解は、関心の代謝物生産へと導く。
【０１０４】
【表４】
0005766182.tif 000005
【０１０５】
実施例５  −  溶媒の殺菌性
本発明の細菌の溶媒曝露への耐性を試験した。この方法は、エタノールに対する微生物の感受性を評価できるようにする。この試験は、４５℃で実施する（好熱性株）。エタノールの殺菌性は：
−  Ｔ０、
−  対数増殖期、
−  定常期
にエタノールを添加して決定する。
【０１０６】
Ｔ０でのエタノール殺菌性について、０〜１０％の間のパーセンテージのエタノールを試験する。
【０１０７】
被験エタノール含量毎に、強化培地中の定常期の前培養物から２００μｌの複合培地グルコースに１％v/vで接種する。
【０１０８】
複合培地グルコースは、浸透水に溶かしたペプトン２g/L、酵母エキス５g/Lおよびグルコース１０g/Lを含有する。溶液はオートクレーブ（１２０℃、１５分間）によって滅菌する。この溶液に以下の溶液を添加する：ＭＯＰＳ緩衝液（１０×）ｐＨ７［酸ＭＯＰＳ  ４００mM、ＮＨ４Ｃｌ  ２００mM、ＮａＯＨ  １００mM、ＫＯＨ  １００mM、ＣａＣｌ２  ５μM、Ｎａ２ＳＯ４  ２．７６mM、ＭｇＣｌ２  ５．２８mM］；微量栄養素（１００００×）［（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）２４  ３００mM、Ｈ３ＢＯ３  ４mM、ＣｏＣｌ２  ０．３mM、ＣｕＳＯ４  ０．１mM、ＭｎＣｌ２  ２．５mM、ＺｎＳＯ４  ０．１mM］；ＦｅＣｌ３（１００×）２mM（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７  ２０mMに溶かす）；Ｋ２ＨＰＯ４  １g/L。溶液を濾過滅菌する（０．２μm）。
【０１０９】
試験は、９６ウェルマイクロプレートに入れて好気生活において行う。滅菌不透過性フィルムを使用してエタノールの蒸発を避ける。
【０１１０】
結果の読み取りは、肉眼で行う。
【０１１１】
結果：
本発明者らが細菌生存率の減少があると見なす溶媒濃度は、本発明者らが完全成長阻害を観察するときの最低溶媒濃度に対応する。
【０１１２】
被験株は、工業的応用の観点から発酵槽中で溶媒に十分な耐性を示す（表５参照）。
【０１１３】
対数増殖期および定常期の試験でのエタノールの殺菌性：
被験エタノール含量毎に、強化培地中の定常期の前培養物から５mLの複合培地グルコースに１％v/vで接種する。
【０１１４】
複合培地グルコースは、浸透水に溶かしたペプトン２g/L、酵母エキス５g/Lおよびグルコース１０g/Lを含有する。溶液をオートクレーブ（１２０℃、１５分間）によって滅菌する。この溶液に以下の溶液を添加する：ＭＯＰＳ緩衝液（１０×）ｐＨ７［酸ＭＯＰＳ  ４００mM、ＮＨ４Ｃｌ  ２００mM、ＮａＯＨ  １００mM、ＫＯＨ  １００mM、ＣａＣｌ２  ５μM、Ｎａ２ＳＯ４  ２．７６mM、ＭｇＣｌ２  ５．２８mM］；微量栄養素（１００００×）［（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）２４  ３００mM、Ｈ３ＢＯ３  ４mM、ＣｏＣｌ２  ０．３mM、ＣｕＳＯ４  ０．１mM、ＭｎＣｌ２  ２．５mM、ＺｎＳＯ４  ０．１mM］；ＦｅＣｌ３（１００×）２mM（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７  ２０mMに溶かす）；Ｋ２ＨＰＯ４  １g/L。溶液は濾過滅菌する（０．２μm）。
【０１１５】
成長の経過観察は、対照培養物（対数増殖期にも定常期にもエタノールを添加しない）を用いて実施する。ＯＤは、分光光度計（UV Light XS5、SECOMAM）を用いて６００nmで読み取る。
【０１１６】
対数増殖期（６００nmでの吸光度０．５）または定常期（プラトー）に達したら、溶媒を添加する。被験含量は０〜２０％である。次に、培養物を２時間インキュベーションする。
【０１１７】
インキュベーション時間の終わりに、被験エタノール含量毎に株に及ぼすエタノールの影響を評定するために計数する。
【０１１８】
計数：インキュベーションの終わりに、溶媒中の濃度毎に２０μLの培養液を別のマイクロプレートに移し、段階的に希釈する（９個のウェルにわたり１／１０希釈）。希釈用の培地は強化培地である。各希釈液の５μLをＰＧＹ寒天培地に三つ組で接種する。ペプトン５g/L、酵母エキス２．５g/L、グルコース０．５g/L、寒天１４g/L：１２０℃で２０分間オートクレーブすることにより培地を滅菌する。成長が許せば、被験溶媒のパーセンテージ毎に計数を実施し、有機溶媒が株に及ぼす影響を評価する。
【０１１９】
結果：
本発明者らが細菌生存率の減少があると見なす溶媒濃度は、本発明者らが対照に比べて１ｌｏｇの減少を観察するときの最少溶媒濃度に対応する。
【０１２０】
被験株は、工業的応用の観点から発酵槽中で溶媒に優れた耐性を示す（表５参照）。
【０１２１】
【表５】
0005766182.tif 000006
【０１２２】
ＣＮＣＭへの寄託
Deinococcus細菌ＭＣ２−２Ａ、Ｍ１３  １ＡおよびＭ１１  ９Ｄは、ブダペスト条約に基づきＣＮＣＭに寄託された。
【０１２３】
Ｍ１１−９Ｄは、２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５５の番号で、Deinococcus ＭＣ２−２Ａ株は、２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５６の番号で、Deinococcus Ｍ１３−１Ａ株は、２００９年５月７日にＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−４１５７の番号で寄託された。専門家の解決（expert solution）が要求された。