(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のパッセンジャー遺伝子と、
哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する１種以上の因子と
をコードする核酸配列を含む遺伝子工学作製細菌であって、
前記１種以上のパッセンジャー遺伝子をコードする前記核酸配列が少なくとも１種の真核細胞プロモータに読み取り可能に連結されているとともに、哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記核酸配列が少なくとも１種の真核細胞プロモータに読み取り可能に連結されており、
前記１種以上のパッセンジャー遺伝子をコードする前記核酸配列が、真核細胞プロモータに読み取り可能に連結されており、哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記核酸配列が、真核細胞プロモータに読み取り可能に連結されていることを特徴とする遺伝子工学作製細菌。
【請求項２】
哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記核酸配列が、真核細胞プロモータに読み取り可能に連結されている請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項３】
哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記核酸配列が、原核細胞プロモータに読み取り可能に連結されている請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項４】
哺乳類Ｉ型タフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする核酸配列が、前記遺伝子工学作製細菌の染色体上に存在する請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項５】
ｉ）前記１種以上のパッセンジャー遺伝子をコードする核酸配列と、
ｉｉ）哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする核酸配列と
の一方または両方が、プラスミド上に存在する請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項６】
哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子がウイルス起源である請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項７】
前記１種以上のパッセンジャー遺伝子が結核抗原をコードする請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項８】
前記遺伝子工学作製細菌がシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌である請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項９】
前記遺伝子工学作製細菌がマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌である請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項１０】
前記１種以上のパッセンジャー遺伝子が非相同性トランスジーンである請求項１記載の遺伝子工学作製細菌。
【請求項１１】
宿主細胞または組織Ｉ型インタフェロン（ＩＦＮ）応答サプレッサー因子をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸配列と、
１種以上の宿主細胞または組織活性アミノ酸配列をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸と
により遺伝的に形質転換された細菌を含む組換え細菌ベクターであって、
前記１種以上の宿主細胞または組織活性アミノ酸配列をコードする１種以上の遺伝子工学作製核酸が、前記細菌が前記宿主細胞または組織に侵入すると過剰発現されることを特徴とする組換え細菌ベクター。
【請求項１２】
前記宿主細胞または組織Ｉ型ＩＦＮ応答サプレッサー因子が、ロタウイルスＮＳＰ１またはインフルエンザウイルスＮＳ１である請求項１１記載の組換え細菌ベクター。
【請求項１３】
前記１種以上の宿主細胞または組織活性アミノ酸配列が結核抗原およびマラリア抗原から選択される請求項１１記載の組換え細菌ベクター。
【請求項１４】
前記宿主細胞または組織活性アミノ酸配列が、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、エクトロメリアウイルス、肝炎ウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、パラミキソウイルス、ＨＰＶ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ，エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、ＥＥＥ，ＶＥＥ，西ナイルウイルス、ノーウォークウイルス、パルボウイルス、デングウイルス、および出血熱ウイルスの１種以上に由来する１種以上の免疫刺激アミノ酸配列を含む請求項１１記載の組換え細菌ベクター。
【請求項１５】
前記１種以上の宿主細胞または組織活性アミノ酸配列が、ホルモン、酵素、抗癌剤、およびアポトーシス因子から選択される請求項１１記載の組換え細菌ベクター。
【請求項１６】
前記宿主細胞または組織Ｉ型ＩＦＮ応答サプレッサー因子が、ロタウイルスＮＳＰ１、インフルエンザ−ウイルスＮＳ１、エクトロメリアウイルスＣ１２Ｒたんぱく質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ワクチニアウイルスνＩＦＮ−α／β  Ｒｃたんぱく質、アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質、パラミキソウイルスのＣたんぱく質およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインから構成される群から選択される請求項１１記載の組換え細菌ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的には、自然のＩ型インタフェロン応答を阻害することによって、真核細胞中における向上したトランスジーン発現を促進する細菌デリバリシステムに関する。本発明は、より詳しくいうと、真核細胞に対して、ｉ）トランスジーン類およびｉｉ）真核細胞Ｉ型インタフェロン応答サプレッサー類を運搬する組換え細菌デリバリシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
数種の病原性菌の生の弱毒化変異体が、粘膜経路により非相同性抗原運搬のための潜在的ワクチンベクターとして開発されている。このような生ベクターは経口で、経鼻でまたは吸入による単回投与で哺乳類細胞および組織に対する巨大分子の標的化デリバリにより、全身および粘膜免疫応答の両者を刺激するという利点を提供する。ワクチン抗原および／または治療分子をコードするプラスミドＤＮＡの細菌媒介運搬という大きな潜在力が、感染性疾患、腫瘍および遺伝的欠陥の実験的動物モデルにおいて、実証されている。
【０００３】
残念なことに、哺乳類における外来たんぱく質または阻害性ＲＮＡの発現のためのパッセンジャーＲＮＡ／ＤＮＡおよび他の分子の細菌ベクターによる放出の結果、Ｉ型インタフェロン（ＩＦＮ）応答が起こる。侵入する病原体のための宿主サーベイランスシステムの重要な成分は、細胞壁成分から核酸にわたるパターン化された微生物／ウイルスリガンド類を結合する病原体認識レセプター類（ＰＲＲ）の進化上保存されたファミリである。ＰＲＲシグナル伝達の結果、ニュークリアファクターＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂ）（ＮＦ−Ｂ）およびインタフェロン制御因子３（ＩＲＦ−３）のような転写因子の活性化が起こり、それらは、宿主防御の迅速活性化のための炎症性文脈を提供する。前記のＮＦ−Ｂ経路は、ＩＬ−１および腫瘍壊死因子−αのような前炎症性サイトカイン類の発現を制御し、一方、ＩＲＦ−３経路は、Ｉ型インタフェロン（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）の産生を導く。この最初に産生された“第一波”ＩＦＮは、関連因子ＩＲＦ−７の発現を惹起し、それは通常、極めて低濃度でほとんどの細胞中に存在している（非特許文献１）。ＩＲＦ−３はＩＲＦ−７と協働する可能性が非常に高く、数種のＩＦＮ−αサブタイプを”第二波”ＩＦＮｓとして合成開始する正のフィードバックループに関与している（非特許文献２および非特許文献３）。Ｉ型ＩＦＮｓは、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達によって数百種のＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧｓ）を活性化し（非特許文献４；非特許文献５）、それらのいくつかには、抗ウイルスたんぱく質をコードする。今日まで、３種のＩＦＮ刺激経路が完璧に樹立されている。これらには、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）（非特許文献６）、２’−５’オリゴアデニレートシンセターゼ（２’−５’ＯＡＳ）（非特許文献７）、およびＭＸたんぱく質（非特許文献８）が含まれる。このＩ型ＩＦＮ応答は、ＰＫＲおよび２’−５’ＯＡＳにより外来遺伝子または阻害性ＲＮＡｓの発現を限定する。活性化ＰＫＲは、真核細胞開始因子ｅＩＦ２のαサブユニットをリン酸化することによって翻訳を妨害する。一方、２−５Ａシンセターゼ類は、ｍＲＮＡおよびリボソームＲＮＡを消化する一重鎖特異的エンドリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅ  Ｌを活性化させる短い２’−５’ＯＡＳ関連オリゴアデニレート類を産生する。あるＲＮＡウイルスに感染した後の宿主生存におけるＭＸたんぱく質の重要性が、十分に実証されている（非特許文献９）が、作用の正確な様式は、未だ不明である。このＩ型ＩＦＮ応答は、従って、ＲＮＡ産生と安定性を低下させる機構によって外来核酸の発現を限定し、また、細菌ベクターによって運搬されたパッセンジャー核酸からのメッセージ翻訳を阻害する。
【０００４】
さまざまな細菌ベクターの成分は、宿主細胞でＩＦＮ応答を惹起する。この細菌自体は、トル様レセプター類を介してＩＦＮ応答を惹起できる。転写時においてパッセンジャー核酸により産生された二重鎖ＲＮＡはＩ型ＩＦＮｓを誘発させるばかりでなく、ＰＫＲおよび２’−５’ＯＡＳを直接的に活性化する。哺乳類細胞の細胞質に運搬されると、プラスミドＤＮＡは、しばしば、ｍＲＮＡとアニールしてｄｓＲＮＡを形成するアンチセンスＲＮＡを産生する陰性プロモータ類を含有する。細菌ベクターのこれらの成分全てが、従って、生体医療手段としての細菌ベクターの有効性を低下させる。
【０００５】
特許文献１は、アデノウイルスベクターのような組換えベクターに対する免疫応答を阻害する方法を記載している。しかし、この技術は、ベクターによりコードされた遺伝子の長期発現に対する液性応答（例  抗体）および前記ベクターの免疫系によるクリアランスを防止することに関しており、細菌ベクターまたはそのパッセンジャー核酸に対するＩ型ＩＦＮ応答の防止については記載していない。
【０００６】
【特許文献１】米国特許６，５２５，０２９（Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｒｅｒｓｅｎら、２月２５日、２００３年）
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｔｏ  Ｍら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３（４）５３９−５４８；２０００
【非特許文献２】Ｍａｒｉｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １７（２２）、６６６０−６６６９；１９９８
【非特許文献３】Ｓａｔｏ  Ｍら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４４１（１）１０６−１１０；１９９８
【非特許文献４】ｄｅ  Ｖｅｅｒら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  ６９（６）９１２−９２０、２００１
【非特許文献５】Ｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５（２６）１５６２３−１５６２８；１９９８
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（４５）６１１２−６１２０；１９９９
【非特許文献７】Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ．、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ  １４（３）１０１−１０４；１９９４
【非特許文献８】Ｈａｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｃｈｓ、Ｔｒａｆｆｉｃ  ３（１０）７１０−７１４；２００２
【非特許文献９】Ｈｅｆｔｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３（８）６９８４−６９９１；１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記先行技術は従って、これまで、宿主細胞のＩ型ＩＦＮ応答を消去させるかまたは減弱させる細菌ベクターを提供できなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、細菌発現ベクターによる侵入に対する応答で哺乳類宿主細胞によって通常開始されるＩ型ＩＦＮ応答の消去または減弱に成功した組換え細菌発現ベクターを提供する。前記組換え細菌発現ベクターは、宿主細胞中でＩ型ＩＦＮ応答を阻害するかまたは抑制する因子をコードすることによって、通常のＩＦＮ応答を回避する。このＩＦＮサプレッサーは、ｉ）たんぱく質として運搬するために細菌細胞中で、または、ｉｉ）前記細菌細胞によって運搬される塩基配列から真核細胞中で、発現する。ＩＦＮ応答の阻害は、細菌ベクターによって運搬されたパッセンジャー遺伝子のより確実な発現を可能とし、発現は、Ｉ型ＩＦＮ応答が抑制された真核細胞中でのみ増強される。例えば、本発明の組換え細菌発現ベクターが免疫応答を望む抗原をコードするパッセンジャー塩基配列を運搬する時、哺乳類細胞によるそれらの抗原の産生が、宿主ＩＦＮ系による妨害が少なくなるかまたは全く妨害されず（または、妨害程度が低下する）、抗原が発現され、前記抗原に対する所望の免疫応答が産生できる。これとは別に、前記パッセンジャー核酸配列が酵素、ホルモン類または治療または栄養性因子のような所望のたんぱく質産物のためである時、前記哺乳類細胞によるこれらのたんぱく質産物の産生は、宿主ＩＦＮ系による妨害が少ないかまたは全く妨害されない。
【００１０】
本発明の目的は、ｉ）１種以上のパッセンジャー遺伝子；およびｉｉ）哺乳類インタフェロン応答を阻害する１種以上の因子をコードする核酸配列、を含む遺伝子工学作製細菌を提供することである。前記１種以上のパッセンジャー遺伝子をコードする核酸配列は真核細胞プロモータに読み取り可能に連結され、哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する１種以上の因子をコードする核酸配列は、真核細胞プロモータまたは原核細胞プロモータに読み取り可能に連結されている。さらに別の態様では、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記発現可能な核酸配列は、前記遺伝子工学作製細菌の染色体上に存在する。さらなる態様では、ｉ）１種以上のパッセンジャー遺伝子をコードする真核細胞で発現可能である核酸配列；およびｉｉ）哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする核酸配列の一方または両方が、プラスミド上に存在する。さらに、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子細胞は、ウイルス起源であり得る。いくつかの態様において、前記１種以上のパッセンジャー遺伝子は、結核またはマラリア抗原をコードする。さらなる態様において、前記遺伝子工学作製細菌は、シゲラ菌であるかまたはマイコバクテリウムである。さらに、前記パッセンジャー遺伝子は、非相同性トランスジーンであることもできる。
【００１１】
本発明はさらに、細胞または組織中において１種以上の問題の遺伝子産物の産生を増大させる方法を提供する。前記方法は、前記細胞または組織に対して、ｉ）問題の１種以上の遺伝子産物およびｉｉ）哺乳類インタフェロン応答を阻害する１種以上の因子をコードする核酸配列を含む遺伝子工学作製細菌を投与することを含む。前記１種以上のパッセンジャー遺伝子をコードする核酸配列は、真核細胞プロモータに読み取り可能に連結され、哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する１種以上の因子をコードする前記核酸配列は、真核細胞プロモータまたは原核細胞プロモータに読み取り可能に連結されている。投与段階は、前記の遺伝子工学作製細菌が前記細胞または組織に侵入して、問題の１種以上の遺伝子産物および前記１種以上の因子を細胞内または組織内で産生できるようにする条件下で行われる。１態様において、前記発現可能な核酸配列の転写は、真核細胞プロモータによって制御される。別の態様において、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記発現可能な核酸配列の転写は、原核細胞プロモータによって制御される。さらに別の態様において、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記発現可能な核酸配列は、遺伝子工学作製細菌の染色体上に存在する。さらなる態様において、ｉ）前記１種以上の問題の遺伝子産物をコードする発現可能な核酸配列、およびｉｉ）哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする発現可能な核酸配列の一方または両方が、プラスミド上に存在する。さらに、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子は、ウイルス起源であることができる。いくつかの態様において、前記問題の１種以上の遺伝子産物は、結核抗原であることができる。さらなる態様において、前記遺伝子工学作製細菌は、シゲラ菌またはマイコバクテリウムである。
【００１２】
本発明はさらに、哺乳類中に問題の抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。前記方法は、前記哺乳類に対して問題の抗原をコードする核酸配列；および哺乳類インタフェロン応答を阻害する１種以上の因子をコードする核酸配列、を含む遺伝子工学作製細菌を投与する過程を含む。前記１種以上のパッセンジャー遺伝子をコードする核酸配列は、真核細胞プロモータに読み取り可能に連結されており、および哺乳類Ｉ型インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする核酸配列は、真核細胞プロモータまたは原核細胞プロモータに読み取り可能に連結されている。本発明の１態様において、問題の抗原は、マイコバクテリウム・チューバキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原である。いくつかの態様において、前記発現可能な核酸配列の転写は、真核細胞プロモータによって制御されている。他の態様において、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする前記発現可能な核酸配列の転写は、原核細胞プロモータによって制御されている。さらに他の態様において、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする発現可能な核酸配列は、前記遺伝子工学作製細菌の染色体上に存在する。いくつかの態様において、ｉ）問題の抗原をコードする発現可能な核酸配列およびｉｉ）哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子をコードする発現可能な核酸配列の一方または両方は、プラスミド上に存在する。さらなる態様において、哺乳類インタフェロン応答を阻害する前記１種以上の因子は、ウイルス起源であることができる。
【発明の効果】
【００１３】
結核ワクチン剤のワクチン性質を改善し、そのワクチン剤の製造を効率化する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の組換え細菌発現ベクターは、細菌侵入に対する応答において哺乳類宿主細胞によって通常開始されるＩ型インタフェロン応答を消去、減弱または抑制する因子をコードするように遺伝子工学で作製されている。これらの因子は、前記細菌ベクター細胞によって発現されることもあるし、真核宿主細胞によって翻訳される核酸中にコードさせることもできる。真核宿主細胞中におけるＩＦＮ応答の減弱または消去は、ベクターに導入された核酸から問題のたんぱく質およびペプチドを効率的に転写および翻訳させる。このようなベクターに入れた分子は、菌の繁殖および生存に必要なペプチドおよびたんぱく質、ならびに、菌内部に含まれる問題の“パッセンジャー”分子をコードすることもできる。問題のパッセンジャー核酸の例には、例えば、遺伝子工学で細菌がコードするようにさせた抗原を含むが、それらに限定されない。真核宿主細胞Ｉ型インタフェロン応答は減弱しているので、前記抗原は、持続的にかつ宿主細胞が前記抗原に対して免疫応答を開始させるだけ十分なレベルで発現される。本発明の細菌発現ベクターは、従って、ワクチン調製物における使用に理想的である。
【００１５】
本発明の細菌発現ベクターは、Ｉ型インタフェロン応答を消去、減弱、阻害または抑制する因子をコードするように遺伝子工学で作製されている。当業者は、ＩＦＮ応答の特異的メディエータを標的とする因子を多くのウイルスがコードすることを理解するであろう。これらの因子は、ＩＦＮ応答拮抗剤と称することもできる。最も特性解析のすすんだウイルス標的の中でも、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、ＲＮａｓｅ  Ｌ活性化（２’−５’）オリゴアデニレートシンセターゼおよびたんぱく質のインタフェロン制御因子（ＩＲＦ）ファミリがある。
【００１６】
免疫応答を“阻害する”または“抑制する”とは、真核細胞中で惹起された典型的または通常の免疫応答が、完全または部分的に阻害され、低下され、減弱され、妨害される等を意味している。このような阻害は、当業者に思い浮かぶだろう数種の方法のいずれによっても検出しかつ測定でき、それらは、前記免疫応答の指標であるかまたはそれに特徴的であるかまたはそれに関連している物質（例  ＩＦＮα、ＩＦＮβ等）の量、活性または属性の低下を検出することを含むが、それらに限定されない。阻害レベルは、一般的に、少なくとも約２５％、好適には約５０％、およびさらに好適には約６０、７０、８０、９０または１００％である。阻害レベルは、典型的には、本発明のベクター（１種以上のトランスジーンプラス１種以上の免疫系阻害剤をコードするベクター）を移入した宿主細胞中で産生される１種以上の物質の量を、対照細胞（前記１種以上のトランスジーンをコードするが免疫系阻害剤はコードしないベクターを移入された細胞）で産生された同一物質の量と比較し、その差を検出することで、通常、測定する。
【００１７】
同様に、トランスジーンの発現を“増大”または“増加”させるとは、一般的に、対照細胞に比較して、本発明のベクターを移入した宿主細胞中において発現（すなわち、転写ならびに翻訳）したトランスジーンの量の増大、増加等を意味する。このような増大は、例えば前記ベクターから産生されるトランスジーン産物の量、活性または属性の増大を検出すること；産生されるトランスジーン産物に関連する物質（例  ｍＲＮＡ、前記トランスジーン産物により産生される物質または効果、前記トランスジーン産物に対する抗体）の量、活性または属性の増大を検出すること等、当業者に思い浮かぶいくつかの方法のいずれによっても、測定できる。増大レベルは、一般的に、少なくとも約２５％、好適には約５０％、およびさらに好適には約６０、７０、８０、９０または１００％、またはそれをはるかに超えている。
【００１８】
本発明での使用に適した免疫応答阻害たんぱく質は、さまざまなウイルスによってコードされ、それらの例には、ロタウイルス非構造たんぱく質１（ＮＳＰ１）；インフルエンザ−Ａウイルス非構造たんぱく質１（ＮＳ１）；アデノウイルス関連ＲＮＡ  ＩおよびＩＩ（ＶＡ  ＩおよびＩＩ）；ワクチニアウイルスＥ３ＬまたはνＩＦＮ−α／βＲｃたんぱく質；Ｃ型肝炎ウイルス非構造たんぱく質５Ａ（ＮＳ５Ａ）またはＮＳ３／４Ａプロテアーゼ；シミアンウイルス−Ｖたんぱく質；センダイウイルスＣたんぱく質；エクトロメリアウイルスＣ１２Ｒたんぱく質；アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質、パラミキソウイルスのＣたんぱく質、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインが含まれるが、それらに限定されない。
【００１９】
ウイルス感染に対する宿主防御としてのＩＦＮ系の基本的重要性は、さらに、いくつかのウイルスがＩＦＮ誘発抗ウイルス応答に拮抗する遺伝子産物をコードするという知見によって例示される。ウイルスは、ＩＦＮ誘発可能たんぱく質の誘発および作用を妨害するために、数種の異なる戦略を用いる。ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスは両者ともに、ＩＦＮシグナル伝達経路の活性を不完全にするたんぱく質をコードする。複数の機構類が関与しているようである。これらの中には、模倣が含まれる。ＩＦＮシグナル伝達経路の細胞成分を模倣する産物をウイルスがコードする２−３の例がある。この分子的模倣が、ＩＦＮシグナル伝達過程に対する拮抗をもたらすことができる。例えば、ポックスウイルスは、可溶性ＩＦＮレセプターホモログ類をコードする（νＩＦＮ−Ｒｃ）。これらのνＩＦＮ−Ｒｃホモログ類は、ポックスウイルス感染細胞から分泌され、ＩＦＮを結合し、それによって、それらの天然レセプターを介してそれらが抗ウイルス応答を惹起するように作用するのを妨害する。νＩＦＮ−α／βＲｃたんぱく質は、ワクチニアウイルスおよび他のいくつかのオルソポックスウイルスにより分泌される。νＩＦＮ−α／βレセプターホモログ、ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）株中のＢ１８Ｒ遺伝子産物およびコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株中におけるＢ１９Ｒ産物は、数種の異なるＩＦＮ−αサブタイプならびにＩＦＮ−βを結合し、ＩＦＮ−α／βシグナル伝達活性を妨害する。ＩＦＮシグナル伝達に悪影響を及ぼす他の３種のＤＮＡウイルスは、アデノウイルス、パピローマウイルスおよびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）である。前記アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質は、ＩＳＧＦ−３活性化上流のあるところでＩＦＮ媒介シグナル伝達を妨害する。ＩＳＧＦ−３のＤＮＡ結合活性は、Ｅ１Ａにより阻害される。宿主細胞質で複製するパラミキソウイルスであるＳｅＶ（ＳｅＶ）のＣたんぱく質は、ＩＦＮ誘発可能細胞性遺伝子の転写活性化に干渉することにより、ＩＦＮ誘発抗ウイルス応答を回避させる。センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスの場合、前記Ｃたんぱく質は、少なくとも２種の方法でＩＦＮ作用に干渉する。Ｃたんぱく質はＳＴＡＴ−１の合成を防止し、それらはまた、ＳＴＡＴ−１ターンオ−バーの亢進を誘発する。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６オンコプロテインは選択的にＩＲＦ−３に結合するが、しかし、ＩＲＦ−２およびＩＲＦ−９を含む他の細胞性ＩＲＦ類には非常に弱くしか結合しない。Ｅ６がＩＲＦ−３に会合してトランス活性化を阻害しそれによってＩＦＮ応答を回避する機構を、ＨＰＶに付与する。アデノウイルスＥ１Ａたんぱく質はまた、ｐ３００を結合するＥ１Ａ能力に依存性の機構によってＩＲＦ−３媒介転写活性化を阻害する。ＨＨＶ−８はカポジ肉腫に関連するガンマヘルペスウイルスであり、ＩＦＮ−α／βにより誘発された転写活性化のリプレッサーとして機能するＩＲＦホモログ（νＩＲＦ）を合成する。ＨＨＶ−８にコードされたνＩＲＦたんぱく質はまた、ＩＲＦ−１媒介転写活性化を抑制する。２種の他のヘルペスウイルスである帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）もま��、ＩＦＮシグナル伝達経路の機能を破壊する。ＶＺＶは、ＳＴＡＴ−１およびＪＡＫ−２たんぱく質の発現を阻害するが、ＪＡＫ−１に対してはほとんど効果を有していない。異なる拮抗戦略がＣＭＶ感染細胞で起こり、ＭＨＣクラスＩＩ発現もまた、そこで阻害される。ＣＭＶ感染線維芽細胞中でたんぱく質分解が増大するためＪＡＫ−１レベルが特異的に低下する。Ｉ型ＩＦＮレセプター類からのＩＦＮレセプター媒介シグナル伝達に関与する遺伝子産物を、数種の非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスがコードする。例えば、シミアンウイルス５またはおたふくかぜウイルスによる感染は、ＳＴＡＴ−１のプロテオゾーム媒介分解増加につながり、一方、２型パラインフルエンザウイルスに感染した細胞中では、ＳＴＡＴ−２の分解が起こる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスであるエボラウイルスのＶＰ３５たんぱく質は、Ｉ型ＩＦＮ拮抗剤として作用するが、前記拮抗作用の詳細な生化学的機構は未だ明らかになっていない。ＶＰ３５は、ＩＦＮ−βプロモータのウイルス誘発およびＩＳＲＥ駆動遺伝子発現のｄｓＲＮＡ−およびウイルス媒介活性化を阻害する。３種の例示阻害剤（インフルエンザウイルスからのＮＳ１、ロタウイルスからのＮＳＰ１およびアデノウイルスからのＶＡＩ）をコードする核酸配列を、図９のＡ−Ｃに示した。
【００２０】
ＩＦＮ抑制因子はまた、他の非ウイルス起源からも得ることができ、例えば、宿主細胞からも得ることができ（例  サイトカインシグナル伝達サプレッサー（ＳＯＣＳ）、優性ＰＫＲネガティブおよび優性ＲＮａｓｅ  Ｌネガティブ）、本発明の実施において利用することができる。このＩＦＮ応答を抑制するかまたは減弱させかつウイルス発現ベクター中に遺伝子工学で作製できかつウイルス発現ベクターから発現に成功した核酸配列によりコードされるいかなる因子（例  インタフェロン刺激遺伝子に対するｓｉＲＮＡｓ）も、本発明の実施において使用できる。例には、上記に述べたようなもの、ならびにＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）；２，５’−オリゴアデニレートシンセターゼ（ＯＡＳ）；ＲＮａｓｅ  Ｌ；Ｍｘたんぱく質ＧＴＰａｓｅ類；ＩＦＮ誘発可能ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）；ＩＲＦ−５およびＩＲＦ−７のようなＩＦＮ制御因子；ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９のような（ＩＲＦ）ファミリの転写因子；ＩＲＡＫ１／４およびＴＲＡＦ６のような因子；ＲＬＲ、ＭｙＤ８８、ＴＡＫ１、ＴＯＬＬＩＰ、ＴＩＦＡ等のような、Ｉ型ＩＦＮ類の抗ウイルス作用に必須のさまざまなオートクリンＩＦＮ誘発エフェクターおよびモジュレータたんぱく質が含まれるが、それらに限定されない。
【００２１】
“細菌発現ベクター”とは、問題の核酸配列を含有しかつ運搬し、および／または発現するように遺伝子工学で作製された細菌細胞を意味する。このように利用できる菌の例には、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．），ヘモフィラス種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．），アエロモナス種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．），フランシセラ種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．），イエルシニア種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．），クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．），ボルデテラ種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．），レジオネラ種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．），コリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．），シトロバクター種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．），クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．），ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．），シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．），ヘリコバクター種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．），またはビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）を含むが、それらに限定されない。
【００２２】
使用した特定のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ株の例には、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．４３４３６、４３４３７、４３４３８）、カンピロバクター・ヒョインテスチナリス（Ｃ．ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３５２１７）、カンピロバクター・フィータス（Ｃ．ｆｅｔｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９４３８）カンピロバクター・フェカリス（Ｃ．ｆｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３７０９）、カンピロバクター・ドイレイ（Ｃ．ｄｏｙｌｅｉ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４９３４９）およびカンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．３３５５９、４３１３３）を含むが、それらに限定されない。
【００２３】
使用した特定のイエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＹｅｒｓｉｎｉａ株の例には、イエルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．９６１０）またはイエルシニア・ペスチス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９４２８）、イエルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）Ｙｅ０３−Ｒ２（ａｌ  Ｈｅｎｄｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０：８７０；１９９２）またはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ａｒｏＡ（Ｏ’Ｇａｏｒａら、Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，９：１０５；１９９０）を含む。
【００２４】
使用した特定のクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ株の例には、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．１３８８４）を含む。
【００２５】
使用した特定のボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ株の例には、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびボルデテラ・ブロンチセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９３９５）が含まれる。
【００２６】
使用した特定のナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＮｅｉｓｓｅｒｉａ株の例には、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３０７７）およびナイセリア・ゴノルホエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９４２４）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＭＳＩＩ  ａｒｏ変異体（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，１５：５１−６３；１９９３）が含まれる。
【００２７】
使用した特定のアエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＡｅｒｏｍｏｎａｓ株の例には、アエロモナス・サルミノシダ（Ａ．ｓａｌｍｉｎｏｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．３３６５８）、アエロモナス・シューベリ（Ａ．ｓｃｈｕｂｅｒｉｉ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４３７００）、アエロモナス・ヒドロフィア（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・ユークレノフィラ（Ａ．ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２３３０９）が含まれる。
【００２８】
使用した特定のフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ株の例には、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．１５４８２）が含まれる。
【００２９】
使用した特定のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の例には、コリネバクテリウム・シュードチューバキュローシス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９４１０）を含むが、それらに限定されない。
【００３０】
使用した特定のシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株の例には、シトロバクター・フロウンジ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．８０９０）を含む。
【００３１】
使用した特定のクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＣｈｌａｍｙｄｉａ株の例には、クラミジア・ニューモニアエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ１３１０）を含むが、それらに限定されない。
【００３２】
使用した特定のヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株の例には、ヘモフィラス・インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７１５１；１９９５）、ヘモフィラス・ソムナス（Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４３６２５）を含むが、それらに限定されない。
【００３３】
使用した特定のブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＢｒｕｃｅｌｌａ株の例には、ブルセラ・アボルツス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２３４４８）を含む。
【００３４】
使用した特定のレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株の例には、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３１５６）またはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｍｉｐ変異体（Ｏｔｔ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．，１４：１６１；１９９４）を含む。
【００３５】
使用した特定のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株の例には、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２３２６７）を含む。
【００３６】
使用した特定のヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ株の例には、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４３５０４）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４３７７２）を含む。
【００３７】
使用した特定のビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＶｉｂｒｉｏ株の例には、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４０３５）、ビブリオ・シンシナチエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３５９１２）、ビブリオ・コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＲＳＩ強毒性変異体（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０：１５１８−１５２３；１９９４）およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｃｔｘＡ、ａｃｅ、ｚｏｔ，ｃｅｐ変異体（Ｗａｌｄｏｒ  Ｊら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０：２７８−２８３；１９９４）を含む。
【００３８】
好適な実施の態様において、本発明においてベクター株を展開した細菌株には、担体としておよびワクチンベクターとしての両者として作用する能力を有するエンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のような菌が含まれ、エスシェリチア種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．），シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．），およびサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）を含むがそれらに限定されない。グラム陽性でかつ抗酸ベクター株も、同様に、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）またはマイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）から構築できる。
【００３９】
使用した特定のエスシェリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるエスシェリチア株の例には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＨＳ−４、４６０８−５８、１１８４−６８、５３６３８−Ｃ−１７，１３−８０および６−８１（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上；Ｇｒａｎｔら、同上；Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉら、Ａｎｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ）、１３２Ａ：３５１；１９８２を参照）、エンテロトキシン原性の大腸菌（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１２：６５６；１９７５参照）、腸管病原性の大腸菌（例えば、Ｄｏｎｎｅｎｂｕｒｇら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６９：８３１；１９９４を参照）、腸管侵入性大腸菌（例えば、Ｓｍａｌｌら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，５５：１６７４；１９８７を参照）、および腸管出血性大腸菌（例えば、ＭｃＫｅｅおよびＯ’Ｂｒｉｅｎ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３：２０７０；１９９５を参照）が含まれる。
【００４０】
使用した特定のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の例には、サルモネラ・チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７２５１参照）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３３１１を参照）、サルモネラ・ガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇａｌｉｎａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．９１８４）、サルモネラ・エンテリジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４９３１参照）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６９９４参照）、サルモネラ・チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ａｒｏＣ、ａｒｏＤ二重変異体（例えば、Ｈｏｎｅら、Ｖａｃｃ．，９：８１０−８１６；１９９１参照）、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｒｏＡ変異体（例えば、Ｍａｓｔｒｏｅｎｉら、Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３：４７７−４９１；１９９２参照）が含まれる。
【００４１】
使用した特定のシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＳｈｉｇｅｌｌａ株の例には、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２９９０３参照）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＣＶＤ１２０３（例えば、Ｎｏｒｉｅｇａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：５１６８；１９９４）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  １５Ｄ（例えば、Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９９；１９９５）、シゲラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２９９３０参照）、およびシゲラ・ジセテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３３１３参照）が含まれる。
【００４２】
使用した特定のマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるマイコバクテリウム株の例には、マイコバクテリウム・チューバキュローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＣＤＣ１５５１株（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．Ａｕｇ；１５２（２）：８０８；１９９５参照）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｂｅｉｊｉｎｇ株（Ｓｏｏｌｉｎｇｅｎら、１９９５）Ｈ３７Ｒｖ株（ＡＴＣＣ＃：２５６１８）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓパントテン酸栄養素要求株（Ｓａｍｂａｎｄａｍｕｒｔｈｙ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００２  ８（１０）：１１７１；２００２）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｒｐｏＶ変異体株（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２（１７）：８０３６；１９９５）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓロイシン栄養素要求株（Ｈｏｎｄａｌｕｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（５）：２８８８；２０００）、バシレ・カルメッテ−ゲリン（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））Ｄａｎｉｓｈ株（ＡＴＣＣ＃：３５７３３）、ＢＣＧ日本株（ＡＴＣＣ＃：３５７３７）、ＢＣＧ，シカゴ株（ＡＴＣＣ＃：２７２８９）、ＢＣＧコペンハーゲン株（ＡＴＣＣ＃：２７２９０）、ＢＣＧパスツール株（ＡＴＣＣ＃：３５７３４）、ＢＣＧグラクソ株（ＡＴＣＣ＃：３５７４１）、ＢＣＧ  Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ株（ＡＴＣＣ＃：３５７４５）、ＢＣＧモントリオール（ＡＴＣＣ＃：３５７４６）が含まれる。
【００４３】
使用した特定のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株は、本発明にとって重大ではない。本発明に使用できるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の例には、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株１０４０３Ｓ（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７８：８２１０−８２１８；２００４）または（ｉ）ａｃｔＡ  ｐｌｃＢ二重変異体（Ｐｅｔｅｒｓら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：２４３−２５３；２００３）；（Ａｎｇｅｌａｋｏｐｏｕｌｏｕｓら、Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７０：３５９２−３６０１；２００２）；（ｉｉ）アラニンラセマーゼ遺伝子およびＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のためのｄａｌ  ｄａｔ二重変異体（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６：３５５２−３５６１；１９９８）のような変異Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株が含まれる。
【００４４】
本発明のいくつかの実施の態様において、前記菌は、特に、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種であり、特に、弱毒化侵入性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａである。これらの株、ＭＰＣ５１およびＮＣＤ１は、ａｓｄおよびｍｕｒＩ欠失変異を導入したＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株２４５７Ｔの誘導体である。このａｓｄ欠損は、発現ベクターコードａｓｄ対立遺伝子によって補完されており、ｍｕｒＩ変異の結果、前記株がＤ−グルタメートを合成できなくなる；従って、これらの株は、ジアミノピメリン酸およびＤ−グルタメート不在下で適切な細胞壁を合成できなくなり、そのことが、真核細胞の侵入後の細菌細胞の溶解を促進する。ゲンタミシン保護アッセイにより測定されるように、△ａｓｄ、△ｍｕｒＩ二重変異体ＭＰＣ５１のＨｅＬａ細胞侵入挙動は、親株およびＭＰＣ５１ｐＹＡ３３４２（ａｓｄをコードするプラスミド）のそれと類似していた。前記株はさらに、先に染色体ａｓｄ座に挿入したカナマイシン耐性遺伝子の除去により、さらに改変されている。生成した株Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１は、従って、抗生物質耐性マーカー類を含んでおらず、ａｓｄおよびｍｕｒＩ遺伝子の染色体欠損をまだ保持しており、現在の法的要件下でヒトにおける薬理用途のために許容できる。ＮＣＤ１はまた、親株と同様の様式でＨｅＬａおよびＣａｃｏ−２細胞に侵入性であることが明らかとなっている。
【００４５】
一般的に、本発明の細菌発現ベクターは、ＩＦＮ阻害因子および１種以上の問題の他の遺伝子すなわちパッセンジャー遺伝子の両方をコードし運搬するように遺伝子工学で作製されている。前記パッセンジャー遺伝子は、典型的には、別の菌または病原体のような別の生物由来の非相同性トランスジーンであり、いかなる生物由来であってもよい。しかし、前記“パッセンジャー遺伝子”はまた、細菌ベクターそれ自体に自然に出現する遺伝子である（すなわち、ベクターとして作用する菌に由来するかまたはそれから派生する）こともできるが、しかし、１個以上の付加的コピーが、例えば、細菌にとって典型的なレベルを上回るように転写レベルを増大させるプロモータまたは宿主細胞または組織（例  肺、リンパ節、樹状突起細胞等）の特定型に特異的なプロモータの制御下にある細菌ベクター中に、遺伝子工学で作製できる。さらに、“パッセンジャー遺伝子”は、全“遺伝子”を称するばかりでなく問題のペプチド、ポリペプチド、たんぱく質または核酸をコードするいかなる配列をも称することを意図しており、すなわち、全“遺伝子”それ自体が含まれなくてもよく、むしろ、例えば抗原性ペプチドのような問題のポリペプチドまたはペプチドをコードする遺伝子の部分が含まれる。さらに、例えば、キメラたんぱく質またはアミノ酸配列のさまざまな変異体（天然であるかまたは遺伝子工学で作製された）形態のようなさまざまな他の構築体も、パッセンジャー遺伝子によってコードされることができる。さらに、自然に出現しない完全に人工的なアミノ酸配列も同様に、コードすることができる。前記細菌発現ベクターは、１種以上のこのような“パッセンジャー遺伝子”を含むように遺伝子工学で作製でき、また、各パッセンジャー遺伝子の複数コピーをコードすることもできる。前記組換え細菌発現ベクターは、前記細菌の侵入を受けた宿主細胞中に前記パッセンジャー遺伝子（類）を保有するベクターとして作用し、その細菌中で前記遺伝子産物が発現され、すなわち、遺伝子配列が発現可能でかつ前記遺伝子産物の転写および／または翻訳が、前記細菌による侵入を受ける宿主細胞中で起こる。前記パッセンジャー遺伝子をコードする配列は、発現制御配列、特に細菌および／または真核宿主細胞内部で発現を可能とする発現制御配列に機能的に（読み取り可能に）連結している。“読み取り可能に連結する”とは、前記パッセンジャー遺伝子をコードする核酸配列が、細菌ベクターまたは哺乳類細胞のような適切な宿主細胞内部における有効な転写および翻訳を受けることを意味している。
【００４６】
特に、上記パッセンジャー遺伝子は、抗原でありかつそれに対する免疫応答を惹起するのが望ましい１種以上のペプチドまたはたんぱく質をコードできる。当業者は、広く多様なこのような抗原が、さまざまなウイルス、菌、真菌、さまざまな寄生体等の病原菌に関連するものを含めてただしそれに限定されずに、存在することを認識するであろう。前記ウイルス抗原が由来するウイルス病原体は、インフルエンザウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：５９７７１のようなオルソミキソウイルス；ＲＳＶ，ＨＴＬＶ−１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３９０１５）およびＨＴＬＶ−ＩＩ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１９０９）のようなレトロウイルス、ＨＰＶ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３３７０４３）のようなパピロ−マヴィリダエ、ＥＢＶ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２９５）のようなヘルペスウイルス；ＣＭＶ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０３５８）または単純ヘルペスウイルス（ＡＴＣＣ＃：ＶＲ−１４８７）；ＨＩＶ−１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２７２１）およびＨＩＶ−２  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１７０９）のようなレンチウイルス；狂犬病のようなラブドウイルス；ポリオウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２０８０）のようなピコルノウイルス；ワクチニア（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２４５）のようなポックスウイルス；ロタウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０９１２）；およびアデノ関連ウイルス１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：８５１０６）のようなパルボウイルスがあげられるが、それらに限定されない。
【００４７】
ウイルス抗原の例は、ヒト免疫不全ウイルス抗原Ｎｅｆ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．（国立アレルギー感染症ＨＩＶ保管カタログ番号）＃１８３；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃ＡＦ２３８２７８）、Ｇａｇ，Ｅｎｖ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２４３３；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃Ｕ３９３６２）、Ｔａｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ＃８２７；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃Ｍ１３１３７）、Ｔａｔ−３１−４５（Ａｇｗａｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１００３７；２００２）のようなＴａｔの変異誘導体、Ｒｅｖ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２０８８；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃Ｌ１４５７２）、およびＰｏｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２３８；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃ＡＪ２３７５６８）およびｇｐ１２０のＴおよびＢ細胞エピトープ（Ｈａｎｋｅ  ａｎｄ  ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，ＡＩＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．，６６：１７７；１９９９）；（Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：５８９；１９９９）；（Ｐａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２  ３６１９；１９８９）限定されるわけではないがｇｐ１２０とＣＤ４の融合体（Ｆｏｕｔｓら、Ｖｉｒｏｌ．２０００，７４：１１４２７−１１４３６；２０００）のようなＨＩＶ−１  Ｅｎｖとｇｐ１２０のキメラ誘導体；限定されるわけではないがｇｐ１４０（Ｓｔａｍａｔｏｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２：９６５６−９６６７；１９９８）またはＨＩＶ−１  Ｅｎｖの誘導体および／またはそのｇｐ１４０（Ｂｉｎｌｅｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７６：２６０６−２６１６；２００２）；（Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７４：５０９１−５１００（２０００））；（Ｂｉｎｌｅｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７４：６２７−６４３；２０００）のようなＨＩＶ−１  ｅｎｖの短く切断されたかまたは修飾された誘導体、Ｂ型肝炎抗原（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃ＡＦ０４３５７８）；（Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４７２６  ４７３０；１９８９）；ＶＰ４（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃ＡＪ２９３７２１）；（Ｍａｃｋｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７：５１８  ５２２；１９９０）およびＶＰ７（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号＃ＡＹ００３８７１）；（Ｇｒｅｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１８１９  １８２３；１９８８）のようなロタウイルス抗原、ヘマグルチニンまたは（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号＃ＡＪ４０４６２７）；（ＰｅｒｔｍｅｒおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５７：４０６；���９９９）；ヌクレオプロテイン（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号＃ＡＪ２８９８７２）；（Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ９７：９６５４−９６５８；２０００）のようなインフルエンザウイルス抗原、チミジンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号＃ＡＢ０４７３７８；（Ｗｈｉｔｌｅｙら、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、８２５−８５４ページ）のような単純ヘルペスウイルス抗原が含まれるが、それらに限定されない。
【００４８】
前記細菌抗原が由来する菌病原体には、マイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．），ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．），シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．），大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），リケッチア種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．），リステリア種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．），レジオネラ・ニューモニアエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．），ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．），バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００４９】
細菌病原体の防御性抗原の例には、ＣＦＡ／Ｉフィンブリエ抗原（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５０：９２５  ９２８；１９８５）および熱不安定性トキシンの無毒性Ｂサブユニット（ら、Ｉｎｆｅｃｔ．、Ｉｍｍｕｎ．，４０：８８８−８９３；１９８３）のようなエンテロトキシン原性大腸菌の体性抗原；ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のパータクチン（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｖａｃｃ．，１０：４３−４８；１９９２）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニレートシクラーゼヘモライシン（Ｇｕｉｓｏら、Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，１１：４２３−４３１；１９９１）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）の破傷風毒素のＣ断片（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：１３２３  １３２６；１９９０）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のＯｓｐＡ（Ｓｉｋａｎｄら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１０８：１２３−１２８；２００１）；（Ｗａｌｌｉｃｈら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，６９：２１３０−２１３６；２００１）、リケッチア・プロワゼキ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）およびリケッチア・チフィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）の防御性パラクリスタリン表面層たんぱく質（Ｃａｒｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８７：８２３７−８２４１；１９９０）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオライシン（“Ｌｌｏ”および“Ｈｌｙ”としても公知）および／またはスーパーオキシドジスムターゼ（“ＳＯＤ”および“ｐ６０”としても公知）（Ｈｅｓｓ、Ｊ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１２８６−９２；１９９７）；Ｈｅｓｓ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４５８−１４６３；１９９６）；（Ｂｏｕｗｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１４６７−７１；１９９２）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｏｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のウレアーゼ（Ｇｏｍｅｚ−Ｄｕａｒｔｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６、４６０−７１；１９９８）；（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６、５８１−６；１９９８）およびバシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御性抗原および致死的因子レセプター結合ドメイン（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９、４５０９−４５１５；２００１）が含まれる。
【００５０】
寄生体抗原が由来する寄生体病原体には、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：３０１４５）のようなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種；トリパノゾーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｃｒｕｚｉ）（ＡＴＣＣ＃：５０７９７）のようなＴｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ種；ジアルジア・インテスチナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ＃：３０８８８Ｄ）のようなＧｉａｒｄｉａ種；ブーフィラス（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）種、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）（ＡＴＣＣ＃：３０２２１）のようなＢａｂｅｓｉａ種；エンタメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃：３００１５）のようなＥｎｔａｍｏｅｂａ種；エイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）（ＡＴＣＣ＃：４０３５７）のようなＥｉｍｅｒｉａ種；リューシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３８５６８）；シストゾーム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）種、ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）種、ファスシダ（Ｆａｓｃｉｄａ）種、ジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）種、ウチェレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）種、およびオンチョセレア（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｅａ）種を含むがそれらに限定されない。
【００５１】
寄生体病原体の防御性抗原の例には、プラスモジウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）のサーカムスポロゾイテ抗原またはプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポロゾイテ抗原のようなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のサーカムスポロゾイテ抗原（Ｓａｄｏｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：３３６  ３３７；１９８８）；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のメロゾイテ表面抗原（Ｓｐｅｔｚｌｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４３：３５１−３５８；１９９４）；エンタメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）のガラクトース特異的レクチン（Ｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ，８８：３２４８−３２５２；１９９１）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種のｇｐ６３（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：１２７４  １２７８；１９８８）；（ＸｕおよびＬｉｅｗ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：１７３−１７６；１９９５）、リューシュマニア・メージャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）のｇｐ４６（Ｈａｎｄｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：３０１１−３０１７；２０００）ブルギア・マライ（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）のパラミオシン（Ｌｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，４９：３１５−３２３；１９９１）、シストソマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）のトリオースーホスフェートイソメラーゼ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１８４２  １８４６；１９９２）；トリチョストロンギラス・コルブリホルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）の分泌グロビン様たんぱく質（Ｆｒｅｎｋｅｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，５０：２７−３６；１９９２）、フランシオラ・ヘパチカ（Ｆｒａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）（Ｈｉｌｌｙｅｒら、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，７５：１７６−１８６；１９９２）、シストゾーマ・ボビス（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｂｏｖｉｓ）およびシストゾーマ・ジャポニクム（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）（Ｂａｓｈｉｒら、Ｔｒｏｐ．Ｇｅｏｒ．Ｍｅｄ．，４６：２５５−２５８；１９９４）のグルタチオン―Ｓ―トランスフェラーゼ類；およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｂｏｖｉｓおよびＳ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍのＫＬＨ（Ｂａｓｈｉｒら、同上、１９９４）が含まれる。
【００５２】
これとは別に、例えば、癌細胞、アルツハイマー病、１型糖尿病、心疾患、クローン病、多発性硬化症等関連抗原のような感染性物質関連でない抗原に対する免疫応答を惹起するのが望ましい。
【００５３】
さらに、前記細菌によって保有されるパッセンジャー遺伝子は、抗原をコードする必要はないが、問題のいかなるペプチドまたはたんぱく質もコードすることができる。例えば、本発明の方法は、先天性障害の矯正のためのパッセンジャー分子の運搬のために用いることができる。このような遺伝子には、例えば、嚢胞性線維症のための嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンスレギュレータ（ＣＦＴＲ）遺伝子のような欠損遺伝子の配置；またはＨＩＶ治療のためのインテグラーゼアンチセンス遺伝子のような新規遺伝子の導入；またはインタロイキン−２７（ＩＬ−２７）のようなＩ型Ｔ細胞応答を増強するための遺伝子；またはコレステロールとコレステロールレセプターまたはインシュリンとインシュリンレセプターのようなあるレセプター、代謝物またはホルモンの発現を修飾する遺伝子；または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）のような癌細胞を死滅させることができる産物をコードする遺伝子；または骨吸収を阻害する天然のたんぱく質オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）；または完全長ヒト化抗体類を効率的に発現させるための例えば癌細胞上のＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）レセプターに作用するヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００５４】
さらに、前記パッセンジャー遺伝子は、“小型阻害性”ｓｉＲＮＡｓのような阻害性ＲＮＡｓをコードすることもできる。当該技術で公知のように、このようなＲＮＡｓは、問題のｍＲＮＡに対して相補性であり、例えば、遺伝子産物発現を防止する手段としてｍＲＮＡに結合してその翻訳を防止する。
【００５５】
同様の方法をパッセンジャー分子の運搬のために用いて、自己免疫疾患または他の免疫系疾患を予防しまたは制御するために、免疫系を下方制御できる。例には、糖尿病、多発性硬化症、紅班性狼そうおよびクローン病、さらに炎症性関節皮膚疾患の予防または治療が挙げられる。他の例には、癌および他の疾患に対する治療的免疫応答をそらす免疫応答類の下方制御のような特定の免疫応答を妨害する免疫応答の微細調整が含まれる。Ｔｈ１応答が、癌、リューシュマニア症、結核、およびＨＩＶの予防および治療に適している時、例えば、Ｔｈ２応答の下方制御である。このことは、適切な免疫応答の刺激と不適切な免疫応答の阻害のための適切なサイトカイン環境を発現させる能力と組み合わせた免疫系の免疫抑制性の性質を操作することにより、現技術によって達成できる。
【００５６】
好適な実施の態様において、本発明は、宿主細胞中にＩＦＮ耐性遺伝子を導入する方法に関する。このような方法は、問題の遺伝子すなわち核酸配列をコードする配列とともに細菌ベースデリバリシステムに所望のＩＦＮ耐性遺伝子を導入することを含み、ＩＦＮ耐性たんぱく質および問題の核酸配列が、前記菌を宿主に投与する時発現するようにする。前記ＩＦＮ阻害剤は、前記菌（例  シゲラ）によってまたは宿主細胞によって産生されることができる。すなわち、ＩＦＮ耐性遺伝子は、原核細胞プロモータからまたは真核細胞プロモータから発現させることができる。問題の前記遺伝子または核酸配列（パッセンジャー遺伝子）は、宿主細胞中で発現される。さらに、遺伝子配列は全て、連続的にまたは一時的に発現させるかまたは誘発させることもできる。
【００５７】
さらに別の好適な実施の態様において、本発明は、１種以上の問題の遺伝子とともにインビトロで細胞中にＩ型ＩＦＮ耐性遺伝子を導入する方法を提供する。このような方法は、例えば、弱毒化または減弱／不活性化シゲラ類中に１種以上のＩＦＮ耐性遺伝子とともに問題の１種以上のたんぱく質をコードする遺伝子の導入を含み、前記所望のたんぱく質／ペプチドは、前記シゲラを細胞に投与すると産生される。シゲラは、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト頚部エピセロイドカルシノーマ）、ＣａＣｏ−２（ヒト結腸アデノカルシノーマ）のような数種の異なる細胞型に感染し、従って、細胞中に所望のパッセンジャー分子を運搬可能である。シゲラ感染細胞中における遺伝子発現は、Ｉ型ＩＦＮ応答の阻害剤によって増強される。核酸運搬後、細胞を治療目的のため、遺伝子療法のため移植でき、または、診断アッセイの試薬として使用する。
【００５８】
いくつかの場合、前記菌は、細胞に対して、所望の物質をコードする核酸配列を運搬し、細胞中でその産生を媒介することによって、”遺伝子療法”物質として作用する。例えば、シゲラベクターを用いて腸内にＣＸＣＲ４／またはＣＣＲ５結合ケモカインコード遺伝子を運搬することは、ＨＩＶ−Ｉ感染治療のためとみなすことができる。遺伝子工学作製菌のための操作は当業者に周知であり、このような操作を行う指針も、周知である。Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ，およびＬｉｓｔｅｒｉａを弱毒化させる方法も、当業者に周知である（Ｅｖａｎｓら、Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏ．，Ｖｏｌ．１２０，１９７８，ｐ．１４２３）；（Ｎｏｒｉｅｇａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２（１１）：５１６８−５１７２  １９９４）；（Ｈｏｎｅら、Ｖａｃｃ．，９：８１０−８１６；１９９１）。
【００５９】
例えば、細胞中に所望の遺伝子または遺伝子を運搬するための方法には、菌株中に問題の遺伝子を導入することを含め得る。本発明によれば、抗ＩＦＮ応答遺伝子または遺伝子は、菌染色体または強毒性プラスミド中に、当業者に周知の方法によって導入でき、またはこれとは別に、複製性または非複製性のプラスミド中に保有させることができる。問題のベクターは、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、移入、結合等により、細菌中に導入できる。前記株および細菌ベクター構築に用いた組換えＤＮＡ操作には、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）、制限エンドヌクレアーゼ（本文で“ＲＥ”と称する）消化、ＤＮＡ連結、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ精製、およびジデオキシヌクレオチド配列決定を含むが、それらに限定されず、それらは、他所に記載されており（Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（細菌遺伝学の短期コース），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；１９９２）；（Ｂｏｔｈｗｅｌｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ（真核細胞遺伝子のクローニングと分析のための方法），Ｅｄｓ．，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍａｓｓ．１９９０）；および（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学のカレントプロトコール），ｖｏｌ．２：１０．８．１−１０．８．１３，１９９２），バクテリオファージ媒介形質導入（ｄｅＢｏｅｒら、Ｃｅｌｌ，５６：６４１−６４９；１９８９）；（Ｍｉｌｌｅｒ，同上、１９９２）および（Ａｕｓｕｂｅｌら、同上）、または化学的（Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、同上）；（Ａｕｓｕｂｅｌら、同上）；（Ｆｅｌｇｎｅｒら、同上）；および（Ｆａｒｈｏｏｄ，同上）、エレクトロポレーション（Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、同上）；（Ａｕｓｕｂｅｌら、同上）；（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（モレキュラークローニング：ラボラトリマニュアル）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；１９９２）および物理的形質転換技術（Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、同上）を含むが、それらに限定されない。前記遺伝子は、ファージ類（ｄｅＢｏｅｒら、同上）、プラスミドベクター（Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（新世代ワクチン類）：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（分子的アプローチ），Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、１６１−１８８ページおよび２６９−２８８ページ、１９８９）中に取り込ませることができるし、または、標的株の染色体中にスプライシングする（Ｈｏｎｅら、同上）こともできる。
【００６０】
例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩＴＭ３９００ハイスループット（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）ＤＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ９４４０４  Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いかつ製造業者が示した操作を用いて、遺伝子配列を合成により作製できる。約２００ｂｐを超える大きな配列を合成するため、完全長配列の１連のセグメント類をＰＣＲにより作製し、それらを結合し、当該技術で周知の操作を用いて、完全長配列を形成させる。しかし、約２００ｂｐより小さい小型配列も、一回で合成できる。
【００６１】
組換えプラスミド類を、例えば、バイオラッドジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ）を用いてエレクトロポレーションにより菌株中に導入することもできる。ヌクレオチド配列決定によるｃＤＮＡ配列の確認は、標準的自動化配列決定技術を用いて（例  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動シークエンサー、モデル３７３Ａを用いて）達成できる。ＤＮＡ配列決定およびポリメラーゼチェーン反応（本文で“ＰＣＲ”と称する）のためのＤＮＡプライマー類は、合成で調製できる。
【００６２】
本発明のいくつかの実施の態様において、遺伝子工学作製菌は、弱毒化侵入性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉであり、前記菌中に導入する遺伝子は、アデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ロタウイルスのＮＳＰ１および／またはインフルエンザウイルスのＮＳ１であり、それらは、真核細胞プロモータ制御下にクローニングされ、エレクトポレーションによって前記細菌中に導入される。
【００６３】
本発明はまた、本発明の組換え細菌発現ベクターを投与するための調製物を提供する。例えば、免疫応答惹起において使用するためのワクチン調製物を提供する。前記調製物には、本文に記載のような少なくとも１種の遺伝子工学作製菌株、および薬理学的に適切な担体を含む。このような組成物（例  ワクチンとしての用途用）の調製は、当業者に周知である。典型的には、このような組成物は液体溶液または懸濁物のいずれかとして調製されるが、錠剤、丸剤、粉剤等のような固体形状も同様に考えられる。固体形状または投与前溶液または懸濁液との混合に適した濃縮形状も同様に調製することができる。前記調製物も乳化できる。前記活性成分は、薬学的に許容でき前記の活性成分と相溶性の賦形剤と混合することもできる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等またはそれらの組み合わせである。さらに、前記組成物は、湿潤剤または懸濁化剤、ｐＨ緩衝剤等のような少量の助剤を含むことができる。本発明のワクチン調製物はさらに、アジュバントを含むことができ、その例には、セピック（Ｓｅｐｐｉｃ），クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）、アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）等が含まれるが、それらに限定されない。
【００６４】
もし前記組成物の経口形態を投与することを望むならば、さまざまな粘稠剤、着香料、希釈剤、懸濁化剤、分散剤または結合剤等を添加することができる。本発明の組成物は、投与に適した形状で前記組成物を提供するため、いかなる上記のような追加成分をも含むこともできる。前記製剤中の組換え菌の最終的量は変化してもよい。しかし、一般的に前記製剤中の前記量は、約１−９９％であろう。さらに、本発明の調製物は、単一タイプの組換え菌または１種を超える組換え菌を含むことができる。最初、前記細菌ベクター株を約１０２−１０９ｃｆｕの用量で投与し、適切な経路で投与する。投与回数は、それぞれのベクター株の強度、および問題のコードされた組換え産物の価数、特定用途等に応じて変化させることができる。
【００６５】
ワクチン調製物の場合、本発明は、前記細菌によってコードされた抗原に対する免疫応答を惹起する方法および前記抗原関連疾患または状態に対して哺乳類にワクチン接種する方法を提供する。免疫応答を惹起するとは、本発明のワクチン調製物投与が特異的抗体の合成（約１乃至１×１０６の範囲、好適には１×１０３、さらに好適には約１×１０３乃至約１×１０６の範囲、最も好適には１×１０６を超える力価）および／または例えば、３Ｈチミジンキナーゼによって測定するような細胞性増殖を引き起こすことを意味している。本方法は、本発明の菌株を薬理学的に許容できる担体中に含む組成物を、哺乳類に投与することを含む。本発明のワクチン調製物は、当業者に周知の多くの適切な手段のいずれによって投与でき、それらは、注射によって、経口的に、経鼻的に、吸入によって、組換え菌を含む食品を摂取することによって等を含むがそれらに限定されない。好適な態様において、投与様式は、経口、皮下、皮膚内または筋肉内である。
【００６６】
本発明をさらに、下記の非限定的実施例によって例示する。
【実施例１】
【００６７】
組換えシゲラベクターによる宿主細胞中におけるＩ型ＩＦＮ応答の誘発
Ｉ型インタフェロン応答を哺乳類細胞中で誘発する菌の能力を試験し、前記応答の性質を分析した。実験条件は、下記のようであった：セミコンフルエンスのＨｅＬａ細胞単層を、ＲＮＡパッセンジャー分子を有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉに１時間、感染多重度（ＭＯＩ）１００で３７℃の６ウェルプレート中で暴露させた。細胞を、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２回洗浄した。１５０μｇ／ｍｌゲンタミシンを含有する培地を１時間、前記細胞に添加し、細胞外菌を死滅させた。その後、細胞を２回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭを添加し、感染細胞を２０時間、インキュベーションした。細胞を次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。ヒトインタフェロンおよびレセプター類ＲＴ２ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ  ＰＣＲアレイ（Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用し、８４種のインタフェロン関連遺伝子の発現の上方制御または下方制御を明らかにした。
【００６８】
結果を、表１に示した。この表からわかるとおり、シゲラベクターのヒト細胞への侵入は、Ｉ型ＩＦＮｓおよび２’−５’オリゴアデニレートシンセターゼ（２’−５’ＯＡＳ）のようなＩＦＮ刺激遺伝子の転写誘発につながった。調べた８９種の遺伝子中、７４種が、転写において２倍を超える増大を示した。
【００６９】
さらに、実験を行い、シゲラにより運搬されたプラスミドＤＮＡパッセンジャー分子由来のレポーター遺伝子のＩＦＮ−α／β欠失細胞中における発現が、自然のＩＦＮ系を有する細胞に比較して増強している（図１）ことを示した。
【００７０】
これらの結果は、ＩＦＮ刺激遺伝子が細菌ベクターにより哺乳類細胞に運搬されたパッセンジャー分子からの遺伝子発現を抑制することを示している。
【００７１】
【表１】
0005665541.tif 000002
0005665541.tif 000003
0005665541.tif 000004
【実施例２】
【００７２】
Ｉ型ＩＦＮ応答抑制細菌デリバリシステムの構築および細菌ベクターにより運搬されたパッセンジャー核酸の発現に及ぼす効果
この実施例は、Ｉ型ＩＦＮ応答を抑制する２種の細菌デリバリシステムの構築とその利用、ならびに、パッセンジャー核酸発現に及ぼすその効果を記載している。両者の場合において、核酸は、エレクトポレーションによって弱毒化、侵入性Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ中に遺伝子工学で作製した。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉは多くの組織培養細胞株中および動物モデル中で自然に侵入性であるので、それを選択した。このシゲラ株は導入された染色体変異を有しており、真核細胞侵入後それを溶解させ、エンドサイトーシス性小胞から逃れさせ、パッセンジャー分子の真核細胞の細胞質への放出を可能とする。
【００７３】
実験第１セットにおいて、電気的に受容能力があるＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ株ＮＣＤ１を調製し、市販のＥ．ｃｏｌｉベータ−ガラクトシダーゼ発現レポーターベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりエレクトロポレーションした。レポーターベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺは、哺乳類細胞中でヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ制御下に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベータ−ガラクトシダーゼを発現させ、前記ベクターの運搬後、哺乳類媒介遺伝子発現の簡易分析を可能とする。この実験に用いた前記インタフェロン耐性遺伝子は、アデノウイルス関連Ｉ（ＶＡＩ）ＲＮＡ遺伝子であった。このアデノウイルスＲＮＡ遺伝子は、アデノウイルス感染後大量のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写されることが公知となっている（Ｒｅｉｃｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７，４２８，１９９６；Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９，６２，１９７２；Ｗｅｉｎｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７１，３４２６；Ｓｏｌｄｅｒｌｕｎｄら、Ｃｅｌｌ  ７，５８５，１９７６）。アデノウイルスは、インタフェロン誘発二重鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼＰＫＲの活性化をブロックすることによって細胞性抗ウイルス性応答に対する防御として、ウイルスコードウイルス関連ＲＮＡを用いる（Ｇａｌａｂｒｕ  Ｊ、Ｋａｔｚｅ  ＭＧ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｎ，Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ  ＡＧ．Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９  Ｊａｎ２；１７８（３）：５８１−９）。アデノウイルスウイルス関連Ｉ（ＶＡＩ）ＲＮＡ遺伝子を１７２４ｂｐ挿入体上に有するｐＡｄＶＡｎｔａｇｅベクターを同様に、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１株中にエレクトポレーションによって入れた。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ株によるエレクトロポレーションによって、実施例１に記載のようにしてＨｅＬａ細胞に侵入させた。簡単に述べると、ＶＡＩ遺伝子の抗インタフェロン効果を試験するため、ＨｅＬａ細胞に、１）ベータ−ガラクトシダーゼレポーターベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ）を含むＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１およびｐＡｄＶＡｎｔａｇｅベクターを含むＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１；または２）ベータ−ガラクトシダーゼレポーターベクターのみを含むＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１株のいずれかを感染させた。２４時間後、ベータ−ガラクトシダーゼアッセイ試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、細胞溶解のためおよび細胞抽出物中におけるベータ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイするための両者のため、用いた。結果を、図２に示した。この図からわかるとおり、ベータ−ガラクトシダーゼ活性の大幅な増加が、ベータ−ガラクトシダーゼレポーターベクターおよびＶＡＩ抗インタフェロンベクターの両者を含むシゲラが侵入したＨｅＬａ細胞中で観察された。
【００７４】
同様に、第二セットの実験で、レポーター遺伝子グリーンフルオレセントプロテイン（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）含有組換え二重鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｒｄｓＲＮ）を保有するシゲラベクターを、真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングしたインフルエンザ−Ａ  ＮＳ１またはロタウイルスＮＳＰ１のいずれかをコードする配列によってエレクトロポレーションした。生成したシゲラ株は、従って、ＲＮＡヌクレオカプシド（ｒｄｓＲＮ）中にＧＦＰ遺伝子およびｐｃＤＮＡ中にＮＳＰ１またはＮＳ１のいずれかの両者を含んでいた。ＢＨＫ−２１およびＨｅＬａ細胞は、ＧＦＰおよびＮＳＰ１またはＮＳ１発現プラスミド保有シゲラ株に感染させ、または、ＧＦＰ発現プラスミドのみを保有するシゲラ株に感染させた。１６時間後、侵入を受けたＨｅＬａ細胞を緑色蛍光について試験し、ＨｅＬａ細胞溶解物をイムノブロッティングによってＧＦＰたんぱく質について分析した。蛍光結果は、ＧＦＰ遺伝子のみを有するＳｈｉｇｅｌｌａ株による侵入を受けた細胞に比較して、ＧＦＰたんぱく質の発現がＮＳ１またはＮＳＰ１発現プラスミド保有Ｓｈｉｇｅｌｌａ株の侵入を受けた細胞中で増強していることを示していた（データを示さず）。真核細胞により産生された総たんぱく質のイムノブロッティングは、ＮＳ１またはＮＳＰ１発現プラスミド保有Ｓｈｉｇｅｌｌａ株の侵入を受けた細胞中でＧＦＰ発現が高いことを確認した（図３）。
【００７５】
これらの知見は、哺乳類細胞内部における細菌ベクターによるＩ型インタフェロン応答阻害剤をコードする遺伝子（例  ＶＡＩ、ＮＳ１またはＮＳＰ１）の発現が、問題のたんぱく質（例  ベータ−ガラクトシダーゼまたはＧＦＰ）をコードするトランスジーンの共発現を増強することを示している。この実施例に述べた結果は、問題のたんぱく質の発現増強が、細菌ベースのデリバリシステムを用いてＩＦＮ応答を減弱させることによって得ることができることを示す最初のエビデンスである。
【実施例３】
【００７６】
組換えＳｈｉｇｅｌｌａベクターによるＩ型インタフェロン応答の哺乳類宿主細胞における誘発が、インタフェロンアンタゴニスト類によって抑制される
この実施例では、哺乳類細胞中で菌によって誘発されたインタフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧｓ）の発現を抑制するインタフェロンアンタゴニスト類の能力を述べている。これらの実験で用いたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ株は、真核細胞に侵入した後にそれを溶解させる染色体変異を有している。このシゲラは、宿主細胞中で十分に長く生存し、エンドサイトーシス小胞を逃れ、インタフェロンアンタゴニスト類を含むプラスミド分子の、哺乳類細胞の細胞質への放出を可能とする。前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ株は、レポーター遺伝子緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）をコードする組換えヌクレオカプシドを含みかつ発現させる。このＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株は、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）およびｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にそれぞれクローニングされたインフルエンザ−Ａ  ＮＳ１遺伝子またはアデノウイルスＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子によりエレクトロポレーションした。これらのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株は、ＮＳ１遺伝子またはＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子のいずれかを保有し、これらを用いて、哺乳類細胞中における遺伝子発現を調べた。
【００７７】
実験条件は、下記のようであった：セミコンフルエンスのＨｅＬａ細胞単層を、ＩＦＮサプレッサー遺伝子を有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉに１時間、感染多重度（ＭＯＩ）１００で３７℃の６ウェルプレート中で暴露させた。細胞を、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で２回洗浄し、１５０μｇ／ｍｌゲンタミシン含有ＥＭＥＭを細胞に対して１時間、添加し、細胞外菌を死滅させた。その後、細胞を２回洗浄し、新鮮ＥＭＥＭを添加し、侵入細胞を２０時間、インキュベーションした。細胞を次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。ヒトインタフェロンおよびレセプターＲＴ２ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ  ＰＣＲアレイ（Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用し、８４種のインタフェロン関連遺伝子の発現の上方制御または下方制御を明らかにした。
【００７８】
結果を、表２に示した。この表からわかるとおり、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのヒト細胞への侵入は、Ｉ型ＩＦＮｓおよび２’−５’オリゴアデニレートシンセターゼ（２’−５’ＯＡＳ）のようなＩＦＮ刺激遺伝子の転写誘発につながった。誘発された遺伝子は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉによりベクターとしたパッセンジャー核酸の転写と翻訳の阻害に関与している。しかし、図４に示したように、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのみの侵入を受けた細胞に比較して、インタフェロンアンタゴニストＮＳ１遺伝子を保有するＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの侵入を受けたＨｅＬａ細胞は、ＩＳＧｓ発現レベルが低いことを示した。これらの結果は、ＮＳ１が哺乳類細胞における細菌誘発ＩＳＧｓ発現を抑制することを明確にしている。
【実施例４】
【００７９】
インタフェロンアンタゴニストによるインタフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧｓ）発現の抑制
この実施例は、哺乳類細胞中で菌によって誘発されたインタフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧｓ）の発現を抑制するインタフェロンアンタゴニスト類の能力を述べている。これらの実験で用いたＳｈｉｇｅｌｌａ株は、真核細胞に侵入した後にそれを溶解させエンドサイトーシス小胞を逃れる染色体変異を有し、インタフェロンアンタゴニスト類を含むパッセンジャープラスミド分子の、哺乳類細胞の細胞質への放出を可能とする。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ株ＮＣＤは、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）およびｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にそれぞれクローニングしたインフルエンザ−Ａ  ＮＳ１遺伝子またはアデノウイルスＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子によりエレクトロポレーションした。ＮＳ１遺伝子またはＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子を保有するＳｈｉｇｅｌｌａ株を用いて、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘発と抑制を調べた。
【００８０】
実験条件は、下記のようであった：セミコンフルエンスのＨｅＬａ細胞単層を、ＩＦＮサプレッサー遺伝子（ＮＳ１またはＶＡＩ）を有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉに１時間、感染多重度（ＭＯＩ）１００で３７℃の６ウェルプレート中で暴露させた。細胞をイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で２回洗浄し、１５０μｇ／ｍｌゲンタミシン含有新鮮ＥＭＥＭを細胞に対して１時間、添加し、細胞外菌を死滅させた。その後、ＨｅＬａ細胞をＥＭＥＭで２回洗浄し、新鮮ＥＭＥＭを添加し、侵入後前記細胞を２０時間、インキュベーションした。ＨｅＬａ細胞を次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。ヒトインタフェロンおよびレセプターＲＴ２ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ  ＰＣＲアレイ（Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用し、８４種のインタフェロン関連遺伝子の発現の上方制御または下方制御を明らかにした。表２に示したように、Ｓｈｉｇｅｌｌａのヒト細胞への侵入は、非侵入細胞に比較して、Ｉ型ＩＦＮｓおよび２’−５’オリゴアデニレートシンセターゼ（２’−５’ＯＡＳ）のようなＩＦＮ刺激遺伝子の転写誘発につながった。しかし、図４に示したように、Ｉ型インタフェロンアンタゴニストＮＳ１遺伝子を保有するＳｈｉｇｅｌｌａ株の侵入を受けたＨｅＬａ細胞は、Ｓｈｉｇｅｌｌａのみに比較して、細菌誘発ＩＳＧｓ発現レベルが低いことを示した。これらの結果は、実際、ＮＳ１がＩＳＧｓの細菌誘発発現を抑制することを明確にしている。同様に、アデノウイルスＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子発現Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染ＨｅＬａ細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ発現研究は、ＣＸＣＬ１０およびＭＸ２のようなＩＳＧｓの発現もまた、インタフェロンアンタゴニスト類によって抑制されることを示唆している（図５）。上記結果は、ＩＦＮ応答阻害の原因となる分子機構を例示しており、それは、細菌ベクターによってコードされた非相同性パッセンジャー遺伝子のより強い発現を可能とする。
【００８１】
これらの結果は、細菌ベクターからのＩ型ＩＦＮ応答のウイルスサプレッサー類の発現が、感染細胞のＩＦＮ応答を阻害することを示している。
【００８２】
【表２】
0005665541.tif 000005
【実施例５】
【００８３】
ＩＦＮアンタゴニストの共発現による改良された細菌ベースのトランスジーン発現デリバリシステムの構築
プラスミドベクターを、レポーター遺伝子緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）を発現するように構築した。このＧＦＰ遺伝子は、アクプライム（Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）ならびにＨｐａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅させた。増幅された配列の大きさは、アガロースゲル電気泳動によって確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用い製造業者の指示に従って（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）精製した。このＧＦＰ遺伝子を、哺乳類発現プラスミドｐＳｈｏｏｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＨｉｎｃＩＩおよびＮｏｔＩ部位（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）にクローニングした。ｐＳｈｏｏｔｅｒベクター中における発現は、強くて構成的なヒトＥＦ−１αプロモータによって駆動される。この実験で用いたインタフェロン耐性遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータによって駆動されるアデノウイルス関連Ｉ（ＶＡＩ）ＲＮＡ遺伝子であった。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ下流のＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子をコードする遺伝子を、ＰＣＲで増幅し、ＧＦＰ  ｐＳｈｏｏｔｅｒベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。生成した構築体のマップを、図６に示した。
【００８４】
適切な挿入物を保有する組換えプラスミドを同定し、新規プラスミドをｐＡｄｇｆｐと命名した。ｐＡｄｇｆｐベクターを、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１株中にエレクトロポレーションした。ＨｅＬａ細胞の侵入は、実施例３に記載のように実行した。簡単に述べると、ＶＡＩ遺伝子の発現増強効果を試験するため、ＨｅＬａ細胞に、ｐＡｄｇｆｐプラスミド（ＧＦＰおよびＶＡＩをコードする）を有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１株、またはＧＦＰのみをコードするｐＳｈｏｏｔｅｒプラスミド（ｐＧＦＰ）を有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１株を侵入させた。２４時間後各ウェルの細胞を溶解させ、ＧＦＰ特異的抗血清によるイムノブロッティングにより分析した。結果を図７に示した。この図からわかるとおり、ＧＦＰ発現の増加が、ＧＦＰと抗インタフェロンＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の両者を含むＳｈｉｇｅｌｌａが侵入したＨｅＬａ細胞中で観察された。
【実施例６】
【００８５】
真核細胞に運搬された時のプラスミドコードベータ−ガラクトシダーゼの、インフルエンザインタフェロン阻害剤ＮＳ１発現弱毒化Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉによる発現増強
ＣＭＶプロモータの翻訳制御下においてベータ−ガラクトシダーゼコードプラスミド（ｐｃＤＮＡ−ｌａｃＺ）を、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤにエレクトロポレーションした。インフルエンザＡ  ＮＳ１遺伝子をコードする第二のプラスミド（ｐＥＦ  ＮＳ１）も同様に、別のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ株にエレクトロポレーションした。ｐＥＦ  ＮＳ１ベクター中で、ＮＳ１遺伝子発現は、強い構成的ヒトＥＦ−１αプロモータによって駆動される。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ株によるＨｅＬａ細胞の侵入は、実施例１に記載のように行った。簡単に述べると、ＮＳ１遺伝子の抗インタフェロン効果を試験するため、ＨｅＬａ細胞に、ベータ−ガラクトシダーゼレポーターベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ）を含むＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤおよびｐＥＦ  ＮＳ１ベクターを含むＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤによるか、または、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ株単独（ベクターなし）で共侵入させた。１８時間後、ＨｅＬａ細胞溶解のためおよび細胞抽出物中のベータ−ガラクトシダーゼ活性アッセイのための両者のために、ベータ−ガラクトシダーゼアッセイ試薬類（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。結果を、表３に示した。わかるように、ベータ−ガラクトシダーゼ活性の大幅な増加が、ベータ−ガラクトシダーゼレポーターベクターとＮＳＩ遺伝子の両者を含むＳｈｉｇｅｌｌａによる共侵入を受けたＨｅＬａ細胞で観察された。
【００８６】
【表３】
0005665541.tif 000006
【実施例７】
【００８７】
インフルエンザインタフェロン阻害剤ＮＳ１発現弱毒化Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉにより運搬された時のカプシドでコードされたＭＴＢ抗原８５Ａの発現
ＳおよびＭ  ＲＮＡセグメントの両者上でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原８５Ａを発現する組換えヌクレオカプシドを構築した（５１  ＭＳ８５Ａ）。侵入アッセイは、ＣＭＶプロモータの制御下に哺乳類プラスミド上これらのカプシド類±インフルエンザＮＳ１遺伝子を発現するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉおよび抗原８５Ａを発現するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ株（ｐｃＤＮＡ−８５Ａ）を用いて実施した。菌は、２８℃または３７℃において初期対数相になるまで増殖させ、３７℃で１時間、振とうせずにインキュベーションし、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ強毒性遺伝子の発現を誘発させた。前記菌は、イーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）中に再懸濁させ、３７℃＋５％ＣＯ２中ＭＯＩ  １００で、１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに接種しておいたＢＨＫ２１細胞と１時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＥＭＥＭ＋ゲンタミシン（１５０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベーションし、細胞外菌を全て死滅させた。細胞を次にＰＢＳで３回洗浄し、ＥＭＥＭ培地中で２０時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２５０μｌのＭＰＥＲマンマリアンプロテインエクストラクションリージェント（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ）により溶解させた。各細胞抽出物３０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、ニトロセルロース膜に移し、抗原８５Ａに対する抗血清によりイムノブロットした（図８）。抗原８５Ａの発現は、２８℃で増殖させたＮＳ１遺伝子発現プラスミド（ＭＳ８５Ａ  ｐＮＳ１）含有８５Ａカプシド株ＭＳ８５Ａ中でのみＢＨＫ−２１細胞中に見られた（レーン３）。ｐＮＳ１なしで２８℃または３７℃で増殖させたＭＳ８５Ａまたは３７℃で増殖させたＭＳ８５Ａ  ｐＮＳ１からは、発現が見られなかった（レーン１，２＆４）。このことは、ＮＳ１たんぱく質の発現が、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株によって運搬された組換えヌクレオカプシドによりコードされた抗原の発現に必要であることを示している。
【実施例８】
【００８８】
菌および哺乳類細胞の両者中でインタフェロン耐性遺伝子を発現しかつ哺乳類細胞でのみ問題のたんぱく質を発現させる発現ベクターの構築
ＨＩＶ−１のイムノドミナントＧａｇペプチドを発現するプラスミドベクターを構築する。６００ｂｐの断片を、合成ｇａｇ遺伝子からＰＣＲ増幅する。配列は、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＨｐａＩおよびＮｏｔＩ  ＲＥ部位を含むプライマー類を用いて増幅する。増幅させた配列の大きさは、アガロースゲル電気泳動によって確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用い製造業者の指示に従って（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２８１０６、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）精製した。この６００ｂｐのｇａｇ遺伝子を、発現ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ部位（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）にクローニングした。適切な挿入物を有する組換えプラスミド類を同定し、新規プラスミドをｐＧＡＧ４Ｘと命名する。
【００８９】
インタフェロン耐性遺伝子（例  ＮＳ１またはＮＳＰ１）をこのｐＧＡＧ４Ｘベクター中に適切な真核細胞プロモータ（例  ＳＶ４０プロモータ）または原核細胞プロモータ（例  ａｒｇ１のハウスキーピングプロモータ）または両者の制御下にクローニングし、二重発現ベクターを作製する。（本文に記載の特定の真核細胞および原核細胞プロモータ配列は、前記ベクターの構築に重大ではなく、当業者は、他の適切なプロモータを思い浮かぶであろう。）従って、この発現ベクターは、細菌および哺乳類細胞の両者でインタフェロン耐性遺伝子を発現する；しかし、問題のたんぱく質（例  ＨＩＶ−１のＧａｇ）は、哺乳類細胞中でのみ発現する。この手法は、転写安定性とその後のパッセンジャーＲＮＡ／ＤＮＡおよび問題の外来たんぱく質の発現のための他の分子または哺乳類細胞における阻害性ＲＮＡｓの翻訳を向上させる。
【実施例９】
【００９０】
ＩＦＮ応答を抑制するために遺伝子工学で作製された組換え細菌発現ベクターのワクチンとしての使用
いかなる細菌性の生ベクターワクチンであってもその有効性は、ヒト免疫系に対して十分な外来性抗原を提示し、所望の防御性免疫応答を開始させるその能力にある。しかし、パッセンジャーＤＮＡ／ＲＮＡ分子は、宿主防御系すなわちＩＦＮ応答により、インビボで不安定になり、その結果、外来性遺伝子の損失と目的とした免疫応答の低下が起こる。この発明は、ＩＦＮ防御系を減弱させることによって宿主細胞内部で高レベルの抗原を合成するための解決策を提供する。
【００９１】
ＩＦＮ耐性および問題の抗原をコードする遺伝子の運搬と発現は、標的細胞（組織、生体等）に、問題のトランスジーンおよびＩ型ＩＦＮ応答のサプレッサーをコードする核酸を保有する非病原性のすなわち弱毒化細菌ワクチンベクターを接種することによって、達成できる。問題の生体応答は、防御性または調節性の免疫応答類；治療応答類；および宿主たんぱく質遺伝子発現（例  ｓｉＲＮＡ）の下方制御および遺伝子発現（例  サイトカイン発現）の上方制御を含むが、それらに限定されない。
【００９２】
いったん非病原性のすなわち弱毒化細菌ワクチンベクター株を選択すると、その株を修飾し、インタフェロン応答抑制株として機能させる。このことは、前記株中に１種以上のＩＦＮ耐性遺伝子を導入することを含む上記に述べた戦略類を用いて達成される。
【００９３】
Ｉ型インタフェロン耐性遺伝子と問題の抗原を含む株を作製するため、インビトロで合成した遺伝子（類）をエレクトロポレーションによって前記株中に導入し、形質転換体を、組換えプラスミド中に正の選択対立遺伝子（例  抗生物質耐性または栄養素要求性の補完）を保有しかつ発現させる株の増殖のみを可能とする条件下において固体培地上で単離する。生ベクターによる発現プラスミドの遺伝形質の増強方法は、細菌染色体中における導入変異を補完するように設計されたパッセンジャー核酸の構築を含む。プラスミドベースの補完システムにおいて、細菌の細胞質で複製するプラスミドは、前記細菌が増殖し複製するために必要な重要たんぱく質を発現させる；このようなプラスミドが損失すると、前記細菌が前記重要たんぱく質を発現する能力を取り去り、細胞死が結果として起こる。（細菌複製中におけるプラスミド損失という現象はまた“隔離後死滅”とも称され、その結果、プラスミドを有していない全ての細菌の死が起こる。）このようなシステムは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ中で使用に成功し、アスパルテートβ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）をコードする遺伝子ａｓｄの発現に基づいている（Ｇａｌｅｎら、Ｇｅｎｅ，１９９０；４９：２９−３５）。Ａｓｄは、グラム陰性菌中細胞壁の形成に必須の構造成分の合成に関与する重要酵素である。従って、このような重要酵素をコードするプラスミド類がないことは、染色体からＡｓｄを合成できないいかなる細菌にとっても致命的であろう。
【００９４】
投与するこの組換え菌の量は、対象種、ならびに治療しようとしている疾患または状態に応じて、変化する。一般的に、使用した投与量は、生菌体約１０３から１０１１、好適には生菌体約１０３から１０９である。前記ＤＮＡ／ＲＮＡパッセンジャー分子を保有する細菌ベクターは、一般的に、薬学的に許容できる担体または希釈剤とともに投与される。使用した特定の薬学的に許容できる担体または希釈剤は、本発明にとって重要ではない。希釈剤の例には、リン酸緩衝生理食塩水、ショ糖含有クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸緩衝液（ｐＨ１０）単独（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７９：８８８−９０２；１９８７）；（Ｂｌａｃｋら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：１２６０−１２６５；１９８７）；またはアスコルビン酸、ラクトースおよび任意のアスパルテート含有重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）のような胃中の胃液に対する緩衝作用のための緩衝液（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ，ＩＩ：４６７  ４７０；１９８８）が含まれる。担体の例には、スキムミルク中に見られるもののようなたんぱく質、ショ糖のような糖類またはポリビニルピロリドンが含まれる。典型的には、これらの担体類は、約０．１−９０（ｗ／ｖ）％の濃度で使用されるであろうが、好適には１−１０（ｗ／ｖ）％の範囲である。
【００９５】
ベクター株の生物活性は、適切な動物モデル（例  マウス、ウサギ、モルモット、またはアカゲザル）で評価する。当初、前記細菌ベクター株を用量１０２−１０９ｃｆｕで投与し、適切な経路（例  Ｅ．ｃｏｌｉ，ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｈｉｇｅｌｌａは、胃中または鼻腔中に投与できる）により投与する。投与回数は、それぞれのベクター株の能力、および問題のコードされた組換え産物の価数に応じて、変化するであろう。
【００９６】
動物モデル中でコードされた産物に対する免疫および他の生物応答を測定する方法は、当業者に周知である。抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ応答を測定するため、血清を、ワクチン接種前および接種後１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０および８０日後に採取する。血液約４００−５００μｌを各試験管に採取し、氷上で４時間インキュベーションし血餅とする。５分間ミクロ遠心管中で遠心した後、血清を新しい試験管に移し、−８０℃で保存する。問題の遺伝子により発現した抗原に対する粘膜ＩｇＧおよびＩｇＡ応答を、ワクチン接種前および接種後定期的に採取する糞便ペレットおよび膣洗浄物を用いて、決定する（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：４６２；１９９５）；（Ｓｔａａｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４６２；１９９６）。標準的ＥＬＩＳＡを用いて、前記血清および粘膜サンプル中問題の抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ応答を定量する（Ａｂａｃｉｏｇｌｕら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１０；３７１；１９９４）；（Ｐｉｎｃｕｓら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１２：１０４１；１９９６）。マイナス対照抗原として各ＥＬＩＳＡで卵アルブミンを含めることができる。さらに、各ＥＬＩＳＡは、プラス対照血清、糞便ペレットまたは膣洗浄サンプルを適切なものとして含むことができる。記載されているように（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５２６７；１９９７）、コレラトキシン１０μｇと混合した問題の遺伝子により発現した抗原１０μｇを経鼻的にワクチン接種した動物から、前記プラス対照サンプルを採取する。終点での力価は、４９０ｎｍにおける吸光度がマイナス対照列の平均プラス３標準誤差値を超える増加を示す最終血清希釈の逆数を得ることで、計算する。
【００９７】
細胞免疫は、細胞内サイトカイン染色（細胞内サイトカインサイトメトリとも称される）によってまたはＥＬＩＳＰＯＴ（Ｌｅｔｓｃｈ  Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１：１４３−４９；２００３）によって測定することができる。両者の方法とも抗原特異的免疫応答の定量を可能とするが、ただし、ＩＣＳは、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を特性解析する同時能力を付加する。このようなアッセイは、ＩＬ−２、ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−（Ｗｕら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１３：１１８７；１９９７）を分泌する抗原特異的Ｔ細胞の数を評価する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、市販の捕捉および検出ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、記載されたように（Ｗｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：４９３３；１９９５）および先に使用されているように（Ｘｕ−Ａｍａｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１３０９；１９９３）；（Ｏｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：１５１６；１９９６）、行う。各アッセイは、マイトジェン（ＣｏｎＡ）および卵アルブミン対照を含む。本文に記載の抗ＩＦＮ細菌ベースデリバリシステムは、ＩＦＮ耐性遺伝子を有していないデリバリシステムよりもいくつか利点を有している。前記抗原遺伝子は、より高いレベルでかつより長い時間発現され、従って、より活発な免疫応答を誘発する。動物モデル中で有効性を示し無毒性である細菌ベクターを、さらに臨床治験で評価する。
【実施例１０】
【００９８】
結核ワクチンの開発
ＢＣＧバクテリアを本文に記載のとおり遺伝子工学で作製し、１）パッセンジャー遺伝子としての１種以上の結核抗原、および２）哺乳類宿主細胞Ｉ型インタフェロン応答を阻害するかまたはそれに干渉する１種以上の因子、をコードする核酸を含ませる。哺乳類宿主（例  ヒト）に投与すると、前記の遺伝子工学作製ＢＣＧは、宿主細胞に侵入し、エンドソームを逃れ、溶解し、パッセンジャー遺伝子を放出し、前記１種以上の結核抗原を産生する。さらに、前記ＢＣＧはまた、宿主細胞ＩＦＮ応答を阻害する前記１種以上の因子を産生する。前記因子は宿主細胞ＩＦＮ応答を減弱させるが、それは、そうでない場合にはＴＢ抗原の産生を低下させるであろう。結果として、十分なＴＢ抗原が産生され、その結果、ＴＢ抗原に対する明確な免疫応答がおこる。
【００９９】
本発明を好適な態様の観点から説明してきたが、当業者は、本発明が付属の請求の範囲の真意と範囲内で修飾して実行できることを認識するであろう。従って、本発明は、上記に記載のような態様に限定されるべきではなく、本文の明細書の真意と範囲の中でその修飾物ならびにその均等物全てを含むことになる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
性質を改善した結核ワクチン剤の製造、およびその製造の効率化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】β−ガラクトシダーゼの真核細胞発現をコードするプラスミドを有するシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＮＣＤ１によるＨｅＬａまたはＢＨＫ−２１細胞（ＩＦＮ欠失）の侵入後における細胞溶解物のベータ−ガラクトシダーゼ活性。黒棒は、ｌａｃＺ遺伝子をコードするプラスミドを有する菌株による侵入後の細胞由来β−ガラクトシダーゼ活性を示し；白棒は、菌株マイナスｌａｃＺプラスミドの侵入後における細胞由来のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
【図２】β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドを有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１による侵入後およびＰＫＲのアデノウイルス由来阻害剤（アデノウイルス関連Ｉ、ＶＡＩ）をコードするＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ１との共侵入後におけるＨｅＬａ細胞溶解物のβ−ガラクトシダーゼ活性。
【図３】真核細胞ＧＦＰレポーター遺伝子のみ（レーン４）またはＧＦＰプラスＮＳ１（レーン５）またはＮＳＰ１（レーン２）を有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ株ＭＰＣ５１による侵入後ＨｅＬａ細胞中緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）のトランスジーン発現を示すイムノブロット。レーン１：正の対照；レーン３：非侵入ＨｅＬａ細胞。
【図４】ＨｅＬａ細胞中ＩＦＮ−α／β経路に及ぼすＮＳ１たんぱく質の効果。ＮＳ１（黒棒）は、シゲラ誘発ＩＦＮ関連遺伝子の発現（灰色棒）を抑制する。
【図５】ＨｅＬａ細胞中ＩＦＮ−α／β経路に及ぼすＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の効果。ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子（黒棒）は、シゲラ誘発ＩＦＮ関連遺伝子の発現（白棒）を抑制する。
【図６】レポーターベクターをコードするＩＦＮ拮抗剤の概略図。ＩＦＮ拮抗剤遺伝子を、ＧＦＰレポーターベクターの骨格にクローニングする。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ制御下におけるＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の転写のためならびにプロモータＰｅｆ−ａによる宿主細胞によるＧＦＰ遺伝子の発現のための単一プラスミド系。
【図７】ＧＦＰコードプラスミド（ｐＧＦＰ）またはＧＦＰおよびＶＡＩ  ＩＦＮサプレッサーをコードするプラスミド（ｐＡｄｇｆｐ）を有するＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉによるＨｅＬａ細胞侵入。ＧＦＰ発現は、ウサギ抗ＧＦＰ抗血清を用いるイムノブロット分析により決定した。ＧＦＰたんぱく質発現増強が、ＧＦＰおよびＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子の両者を含むシゲラ（ｐＡｄｇｆｐ）による侵入を受けたＨｅＬａ細胞中で観察された。２種の独立した実験の結果を示す。
【図８】ＩＦＮサプレッサーＮＳ１をコードするプラスミドを有するか有していないＭｔｂ抗原８５ＡをコードするＲＮＡを有するシゲラによる侵入を受けたＢＨＫ２１細胞の溶解物のウェスタンブロット。レーン１、５１  ＭＳ８５Ａ  ２８；レーン２、５１  ＭＳ８５Ａ  ３７；レーン３、５１  ＭＳ８５Ａ  ｐＮＳ１  ２８；レーン４、５１  ＭＳ８５Ａ  ｐＮＳＩ  ３７；レーン５、５１  ＭＳ８５Ａ  ｐＮＳＩ  ３７；レーン６、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＮＣＤ  ｐｃＤＮＡ−８５Ａ；レーン７、ＭＰＣ５１  ｐＬＭ２６５３；レーン８、ＢＨＫ２１細胞；レーン９、ｐｃＤＮＡ−８５Ａ移入ＢＨＫ２１細胞。
【図９】Ａ乃至Ｃは抗ウイルス免疫応答阻害剤の配列。Ａ，インフルエンザウイルス由来のＮＳ１のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；Ｂ，ロタウイルス由来のＮＳＰ１のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；Ｃ，アデノウイルス由来ＶＡＩのＲＮＡ遺伝子配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。
【図１】
0005665541.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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