(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す遺伝子を含有する組換えベクターによりエシェリヒア・コリが形質転換されてなる形質転換体またはその調製物を、ｃｉｓ−アコニット酸を含有する液と接触させることにより、該液中にイタコン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするイタコン酸の製造方法。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
組換えベクターが、（ａ）または（ｂ）に示す遺伝子を発現ベクターｐＣｏ１ｄＩに挿入したものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形質転換体が、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４６）である請求項２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素（ＣＡＤ：cis-Aconitic  acid  decarboxylase）およびｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への脱炭酸反応を触媒するｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子に関する。また、該遺伝子を含有する組換えベクターおよび該ベクターにより形質転換された微生物に関する。さらに、該微生物もしくはその調製物を用いたイタコン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イタコン酸は、エチレン重合性不飽和二重結合やカルボキシル基を有するニ塩基酸化合物であり、これらの官能性を利用して、合成樹脂、接着剤、洗剤、ラテックス、塗料、印刷インキやアクリル繊維改質剤など広く化学工業用途の原料として使用されており、非常に有用な化合物である。
【０００３】
イタコン酸の製造は、従来より、グルコース、スクロース及びフラクトースのようなモノ−及びジ−サッカライド並びにデンプン等の炭水化物を原料として発酵法により実施されている。発酵生産に使用される微生物としては、アスペルギルス（Aspergillus）属微生物（特許文献１）やリゾプス（Rhizopus）属微生物（特許文献２）などのカビ類、そして、カンジダ（Candida）属微生物（特許文献３）などの酵母類が知られている。特許文献４には、イタコン酸生産菌であるアスペルギルス・テレウス（Aspergillus  terreus）の突然変異処理により高温耐性株を取得する技術が開示されている。
【０００４】
しかしながら、上記の各種特許文献においては、培養技術が開示されているのみで、イタコン酸生産菌体内で働くイタコン酸生成代謝経路に関しては全く言及されていない。
【０００５】
また、非特許文献１では、アスペルギルス・テレウス菌体内でのグルコースからイタコン酸生成に至る幾つかの可能性ある代謝経路の中でも、イタコン酸はＴＣＡ回路で生成されるｃｉｓ−アコニットがｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素（以下、ＣＡＤともいう）の作用によりイタコン酸が生成すると特定されているものの、ＣＡＤそのものに関しては、遺伝子工学的知見の提供は勿論のこと何ら解析は行われていない。
【０００６】
さらに、非特許文献２では、アスペルギルス・テレウス株よりＣＡＤを分離・精製し、ＣＡＤ溶液中でのｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への脱炭酸反応（セルフリー反応）に関するＣＡＤ触媒活性が調べられており、ＣＡＤの分離・精製技術やその触媒機能に関する知見が開示されているが、微生物菌体内で発現されているＣＡＤの遺伝子工学的知見は何ら提供されていない。
【０００７】
遺伝子情報に基づく遺伝子工学的手法により、ＣＡＤの高発現が可能になれば、イタコン酸の高効率な生産技術を提供することが可能となる。即ち、従来のイタコン酸生産菌に限定されない広範囲に亘る宿主の組換え技術により、ＣＡＤの高生産技術の獲得や宿主の適性に応じた多様な条件や方法によるイタコン酸生産技術の確立ができる。
【特許文献１】米国特許５，６７３，４８５号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０９５９６号公報
【特許文献３】特開昭５５−３４０１７号公報
【特許文献４】特開平６−３８７７４号公報
【非特許文献１】Ｐ．ＢＯＮＮＡＲＭＥ，他５名、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal  Of  Bacteriology)、６月号、１９９５年、ｐ．３５７３−３５７８
【非特許文献２】ＬＩＥＳ  ＤＷＩＡＲＴＩ，他４名、ジャーナル・オブ・バイオサイエンス アンドバイオエンジニアリング（Journal  of  Bioscience  and  Bioengineering）、９４巻、１号、２９−３３、２００２年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への脱炭酸反応を触媒するｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素（ＣＡＤ）およびそれをコードする遺伝子を提供する。また、本発明は、該遺伝子を含有する組換えベクターを提供する。さらに、該ベクターにより宿主が形質転換されてなる微生物（形質転換体）を提供する。さらに、該微生物またはその調製物を用いたイタコン酸の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への脱炭酸反応を触媒するｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を取得するために、例えば、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus  terreus）株が産生する全可溶性酵素蛋白よりＣＡＤ活性を有するものを選別し、そのアミノ酸配列より求めた遺伝子配列をクローニングし発現させた結果、目的とする遺伝子配列であることを見出し、この知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
［１］  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示す遺伝子：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、
［２］  以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質、
［３］  前記［１］に記載の遺伝子を含有する組換えベクター、
［４］  前記［３］に記載の組換えベクターにより宿主が形質転換されてなる微生物、
［５］  宿主が、大腸菌、コリネバクテリウム属菌及び酵母の内から選ばれることを特徴とする前記［４］記載の微生物、
［６］  微生物が、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４６）である前記［５］記載の微生物、
［７］  微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム  Ｒ／ｃａｄ００２株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４７）である前記［５］記載の微生物、および
［８］  前記［４］〜［７］のいずれかに記載の微生物またはその調製物を、ｃｉｓ−アコニット酸を含有する液と接触させることにより、該液中にイタコン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするイタコン酸の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素およびｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への脱炭酸反応を触媒するｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を提供することができる。また、該遺伝子を含有する組換えベクターは、本発明の形質転換された微生物の生産に利用することができる。さらに、本発明の微生物は、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素を産生することができ、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素の生産に利用でき、また、該ベクターにより形質転換された微生物またはその調製物を用いて、イタコン酸を高効率で製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素（ＣＡＤ）は、ｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への脱炭酸反応を触媒する蛋白酵素である。従って、このＣＡＤを微生物菌体内で著量蓄積できれば、ＣＡＤ産生微生物またはその調製物により、イタコン酸を高効率・高生産性で製造することができる。
本発明のＣＡＤとしては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質が好ましく挙げられる。また、本発明のＣＡＤには、前記配列番号２において１若しくは複数個（約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＣＡＤ活性を有する蛋白質なども含まれる。
【００１３】
本発明で用いられるＣＡＤをコードする遺伝子としては、アスペルギルス属、カンジダ属、リゾプス属、ウスティラゴ（Ustilago）属、シュードザイマ(Pseudozyma)属、ヘリコバシディウム（Helicobacidium）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属などの微生物由来の遺伝子、さらに好ましくは、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus  terreus）由来の遺伝子、とりわけ好ましくは、アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部の保存株）由来の遺伝子が挙げられる。
【００１４】
アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株由来のＣＡＤをコードするＤＮＡを含む遺伝子としては、例えば本発明で初めて特定された配列番号１で示される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
【００１５】
また、前記配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＡＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明に用いられる遺伝子である。また、本発明のＤＮＡは、化学合成によっても調製することもできる。加えて、これら本発明のＤＮＡから、ＣＡＤ活性を有する人工変異タンパク質をコードするＤＮＡも本発明は包含するものである。すなわち、対応する塩基配列やアミノ酸配列に関する本発明の人工変異ＤＮＡを得るには、公知の突然変異導入方法を用いればよく、例えば市販の突然変異誘発キットを用いて変異を容易に導入することができる。
【００１６】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、配列番号１に示す塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法などにより得られるＤＮＡを意味する。
なお、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも、配列番号１で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなるものをいう）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えば、ＥＭＢＯＳＳ(The  European  Molecular  Biology  Open  Software  Suite)などにより計算することができる。
ただし、本発明における遺伝子は、上記の遺伝子に限定されず、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＣＡＤをコードする全ての遺伝子を含む。
【００１７】
また、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」という用語はＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを含むものとする。従って、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１８】
本発明における微生物の「調製物」とは、形質転換体にｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素（ＣＡＤ）を生成蓄積し抽出された酵素、好ましくは精製されて樹脂担体等に固定化された固定化酵素を意味する。さらには、ＣＡＤをコードする遺伝子または該遺伝子を含むベクターにより形質転換された微生物菌体をアクリルアミドやカラギーナン等の担体上に固定化された固定化菌体も含まれる。
【００１９】
本発明のＣＡＤをコードする遺伝子または該遺伝子を含むベクターにより形質転換された微生物は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異導入方法により変異しうるが、このようにして得られる変異株であっても、本発明の目的であるｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への脱炭酸反応を触媒する蛋白酵素を産生する能力を有するかぎり、本発明の形質転換された微生物である。
【００２０】
アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株からＣＡＤの単離およびそのアミノ酸配列を決定する。別菌株ではあるが、全ゲノムドラフトシーケンスが完了しているアスペルギルス・テレウス  ＮＩＨ２６２４株が持つ約１万個の遺伝子群より本発明の目的とする遺伝子と相同性の高い配列を選定する（推定遺伝子）。次にこれら推定遺伝子のうち、イタコン酸を生産しているアスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株のなかで発現している遺伝子を探索する。最終的に選定された推定遺伝子配列は、その遺伝子機能を有するクローニングベクターを例えば大腸菌などに導入して、組換えタンパク質を発現させる。さらに、こうして発現誘導される酵素タンパク質がＣＡＤ活性を有することを確認することにより、上記のごとく選定された推定遺伝子が、本発明のＣＡＤをコードする遺伝子であると決定することができる。これら一連の実施態様を詳細に以下に記載する。
【００２１】
ｉ）アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株の培養とＣＡＤの単離
アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株を、例えば、表１に示す固体培地を用いて約３０℃で好気的に培養後、例えば、表２に示す液体培地に植菌し、約１週間程度の培養を行い、菌体を回収する。
【００２２】
【表１】
0005702902.tif 000002
【００２３】
【表２】
0005702902.tif 000003
【００２４】
なお、上記培地組成は、上記の他、アスペルギルス・テレウスにイタコン酸を生産させることができる培地組成であれば、何れも好ましく用いることができる。
菌体をろ過や遠心分離などで回収後、凍結乾燥する。この乾燥菌体を例えば、乳鉢等で磨砕後、ｐＨが５〜７、好ましくは約６．５の緩衝液に分散させ、遠心分離などにより不溶性物質を除くことで粗酵素液を得ることができる。
粗酵素液からＣＡＤタンパク質を精製する方法は、非特許文献２に示されるような一般的なタンパク質精製に用いられる公知の技術、沈殿分画、イオン交換、疎水相互作用などのカラムクロマトグラフィー法を組み合わせることにより行うことができる。ＣＡＤタンパク質の同定は、精製酵素によるｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸への変換反応で検定を行うことにより確定できる。
【００２５】
ii）単離されたＣＡＤのアミノ酸配列分析
精製されたＣＡＤの内部アミノ酸配列分析は、適当なタンパク質分解酵素、例えばリシルエンドペプチダーゼやトリプシンなどを用いて精製ＣＡＤタンパク質を分解し、生じたペプチド断片を高速液体クロマトグラフィーや電気泳動などにより分離回収し、そのアミノ酸末端をアミノ酸配列分析装置、例えばＰｒｏｃｉｓｅ  ４９４ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムス社製）などにより決定することで行うことができる。
【００２６】
iii）アミノ酸配列分析に基づくＣＡＤをコードする推定遺伝子のクローニング
決定されたアミノ酸配列に対し、ブラスト（ＢＬＡＳＴ：Basic  Local  Alignment  Search  Tool)などのプログラムを用いて相同性検索を実施する。そのような解析結果を通して、高い相同性を示す遺伝子が存在すれば、そのＤＮＡ配列をＰＣＲ(Polymerase  chain  reaction)法により増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを作製する。このようなプライマーとしては、例えば配列番号６、７の塩基配列で示されるものなどが挙げられる。ＰＣＲ法は、公知のＰＣＲ装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用することができる。ＰＣＲのサイクルは、公知の技術にしたがって行われてよく、例えば、変性、アニーリング、伸張を１サイクルとし、通常約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクルである。ＰＣＲ反応の鋳型としては、イタコン酸を産生しているアスペルギルス・テレウスより単離したＲＮＡもしくはＲＮＡから逆転写反応により合成した一本鎖ｃＤＮＡ（first  strand  cDNA）を用いて、ＲＴ(reverse  transcription)−ＰＣＲもしくはＰＣＲ法によりＣＡＤのｃＤＮＡを合成することができる。ＰＣＲ法により得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターへ導入することができる。クローニング法としては、pGEM-T  easy  vector  system（Ｐｒｏｍｅｇａ社製)、TOPO  TA-cloning  system(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)、Mighty  Cloning  Kit（Ｔａｋａｒａ社製）などの商業的に入手可能なＰＣＲクローニングシステムなどを好ましく挙げることができる。
【００２７】
次いでＰＣＲで得られた遺伝子を含むクローニングベクターを、微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia  coli）  ＪＭ１０９菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例えばアンピシリン、クロラムフェニコールなど）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の技術によって行うことができ、また市販のプラスミドＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に抽出することもできる。市販のプラスミド抽出キットとしては、キアクイック  プラスミド精製キット（商品名：Qiaquick  plasmid  purification  kit、キアゲン社製)などが挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のＣＡＤをコードする遺伝子配列を決定することができる。
【００２８】
ＤＮＡの塩基配列の決定は、公知の方法、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用いて、検出には多蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシークエンサー、例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムス社製）などを使用して決定することもできる。
【００２９】
上記のようにして、ＣＡＤをコードする遺伝子配列を決定し、例えば配列番号１に示す塩基配列を決定しうる。次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、配列番号２に示すＣＡＤの全アミノ酸配列を決定することができる。
【００３０】
iv）宿主によるＣＡＤ遺伝子の発現
次に、組換えＣＡＤ発現ベクターの作製は、全アミノ酸配列が決定された該酵素をコードする遺伝子を、適当な発現ベクターに挿入することにより行うことができる。発現ベクターとしては、例えばｐＥＴ、ｐＭａｌ、ｐＣｏｌｄ、ｐＧＥＸ、ｐＣＲＢ１とその誘導体や、一般的な細菌用プラスミド、ｐＵＣ１８，１９、ｐＢＲ３２２などが挙げられ、更には酵母プラスミド（ＹＥｐ型、ＹＣｐ型など）、ファージＤＮＡ、哺乳類細胞用のベクターとしてバキュウロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどのウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体などが挙げられ、宿主において複製可能である限りほかのいかなるベクターも用いることができる。
【００３１】
ベクターは例えば複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、Ｈｉｓ−ｔａｇまたはＧＳＴ−ｔａｇのような精製・検出用タグ配列、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいてもよい。ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいる、または単一の制限酵素部位を含んでいることが望ましい。制限酵素部位としては、例えばＰｓｔＩサイト、ＮｄｅＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＥｃｏＲＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩサイトなどが挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＰｓｔＩ、ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなどで切断され得る。
【００３２】
ベクターヘの遺伝子導入は、公知の手段で行なうことができる。具体的には、ベクター中の特定の制限酵素部位を特定の制限酵素によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。このようにして、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを調製できる。
【００３３】
例えば、配列番号１に示した酵素遺伝子の５’末端配列の上流に、例えば制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を追加したプライマーと、３’末端配列の下流に例えば制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を追加したプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲ法によりＣＡＤをコードするＤＮＡを増幅する。この増幅した断片を制限酵素ＮｄｅＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、同じく両制限酵素で処理した発現用ベクター、例えばｐＣｏｌｄＩ（Ｔａｋａｒａ社製）と連結させることにより本発明の遺伝子を含む組換えベクター、すなわちＣＡＤ発現ベクターを得ることができる。
【００３４】
次いで、この発現ベクターを、宿主に挿入し、宿主（菌株）を形質転換する。本発明において形質転換の対象となる宿主は、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換され、結果としてｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限されない。当業者であれば、適切な宿主とベクターの組み合わせを選択することができる。宿主としては、例えば細菌、例えば大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９菌株等）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属菌、バチルス(Bacillus)属（例えば、枯草菌等）、ストレプトミセス（Streptomyces）など；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌など；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母など；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila  Schneider-2）、スポドプテラＳｆ９（Spodoptera  Sf9）など；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７など；あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられ、好ましくは大腸菌のコンピテントセルである。
【００３５】
形質転換は、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。具体的には、例えば本発明の遺伝子を含む組換えベクターとエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（以下、大腸菌ＪＭ１０９ともいう）のコンピテントセルを接触させることにより、形質転換された微生物を得ることができる。
【００３６】
上記方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（例えば、Sambrook、J.、Russel、D.W.、Molecular Cloning  A  Laboratory  Manual、3rd  Edition、CSHL  Press、2001；HopwoodにD.A.、Bibb、M.J.、Chater、K.F.、Bruton、C.J.、Kieser、H.M.、Lydiate、D.J.、Smith、C.P.、Ward、J.M.、Schrempf、 H．Genetic  manipulation  of  Streptomyces：A  laboratory  manual、The  John  lnnes  institute、Norwich、UK、1985等)、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００３７】
上記ＣＡＤをコードする遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換された微生物（以下、単に形質転換された微生物または形質転換微生物という）は下記する微生物培養培地等で、培養温度約１５〜３７℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
また、形質転換された微生物は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異導入方法により変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の目的とするＣＡＤ生産能を有するかぎり、本発明の形質転換された微生物として使用することができる。
【００３８】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等が用いられる。
【００３９】
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸、エタノールまたはプロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００４０】
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機もしくは有機アンモニヴム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００４１】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
【００４２】
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Luria−Bertani）培地、ＮＺＹＭ培地、ＴＢ（Terrific  Broth）培地、ＳＯＢ培地、２×ＹＴ培地、ＡＨＣ培地、χ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地またはＳｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ培地等が挙げられる。
【００４３】
ｖ）発現ＣＡＤによるイタコン酸生成反応
本発明のイタコン酸合成反応は、本発明の形質転換微生物の調製物である分離・精製したＣＡＤとｃｉｓ−アコニット酸との接触、または、本発明の形質転換微生物細胞内における代謝産物としてのｃｉｓ−アコニット酸と発現ＣＡＤとの接触によって一段階合成反応として実施することができる。
形質転換微生物からＣＡＤを含む酵素液を調製するには、集めた形質転換微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズ、市販の大腸菌溶解液等で破砕した後のＣＡＤを含む遠心分離上清を回収すればよい。また、該上清から公知の技術によりＣＡＤを精製することもできる。
【００４４】
ＣＡＤによりｃｉｓ−アコニット酸からイタコン酸を生成させる反応は、ｐＨ約５〜７において、温度４〜５０℃、特に約１０〜４０℃で反応させるのが好ましい。反応時間は、通常１〜４８時間が好ましい。
【実施例】
【００４５】
以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１］
アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株よりｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素（ＣＡＤ）の単離
アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株を表１に示す固体培地により３０℃で培養した。これを表２に示す液体培地に植菌し、３０℃で７日間静置培養した。培養菌体は、濾布（商品名：ミラクロス、カルビオケム社製）を用いて培養液から分離し、純水により入念に洗浄した。こうして得た菌体は、十分に水分を切り、−８０℃で凍結後、凍結乾燥した。この乾燥菌体約２ｇに石英砂約２ｇを加え、乳鉢により粉砕した。これに２５ｍｌの緩衝液（０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μＭ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）を加えホモジナイズし、遠心分離（５０００ｇ，３０分）することで全可溶性酵素液を得た。この酵素液から３０〜６０％硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。得られた沈殿は、５ｍｌの緩衝液１（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５、以下、緩衝液１という）に懸濁し、これをあらかじめ緩衝液１により平衡化してあった脱塩カラム（商品名：１０ＤＧカラム、バイオラッド社製）により脱塩した。これを緩衝液１により平衡化してあった陰イオン交換カラム（商品名：ＤＥＡＥ−ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０カラム、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加した。その後、２０ｍｌの緩衝液１で洗浄し、塩化ナトリウム濃度０から０．５Ｍのグラジエント溶出（２００ｍｌ）を行い、ＣＡＤ活性を含む塩化ナトリウム濃度０．１８〜０．３５Ｍの画分を回収した。なお、ＣＡＤ活性の測定は、ｃｉｓ−アコニット酸を基質とし、生成したイタコン酸をＨａｒｔｆｏｒｄの方法（Analytical  chemistry、426-428、34巻、1962年）を用い定量することにより行った。この画分に硫酸アンモニウムを終濃度２Ｍとなるように添加し、あらかじめ緩衝液２（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５、２Ｍ硫酸アンモニウム、以下、緩衝液２という）により平衡化した疎水性相互作用カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＩＳＯカラム、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加した。その後、５ｍｌの緩衝液２で洗浄後、硫酸アンモニウム濃度２〜０Ｍのグラジエント溶出（４５ｍｌ）を行い、ＣＡＤ活性を含む画分を回収した。回収画分を上に示した手法により脱塩後、あらかじめ緩衝液１により平衡化してあったクロマトグラフィーカラム（商品名：Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ２−Ｉ  カラム、バイオラッド社製）に添加した。その後、５ｍｌの緩衝液３（５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５、以下、緩衝液３という）で洗浄後、リン酸濃度０〜２５０ｍＭのグラジエント溶出（５０ｍｌ）を行い、ＣＡＤ活性を含む５１〜５３．５ｍＭの画分を回収した。こうして得た酵素溶液を、ドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析したところ、分子量約５０ｋＤａに唯一のバンドを示した。精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に転写し、アミノ酸配列分析に供した。
【００４７】
アミノ酸配列分析は、タンパク質分解酵素（リジルエンドペプチダーゼ）により分解し、それにより得られたペプチド断片についてアミノ末端配列決定を、プロテインシーケンサ（商品名：Procise  494HT  Protein  Sequencing  System、アプライドバイオシステムス社製）を用いて行った。その結果、配列番号３〜５のアミノ酸配列が決定された。
【００４８】
［実施例２］
ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素遺伝子の単離
同定したアミノ酸配列を用いて、前記のアスペルギルス・テレウス  ＮＩＨ２６２４株のゲノム配列に対し相同性検索を行った。その結果、アスペルギルス・テレウス  ＮＩＨ２６２４株のロバスタチン生合成遺伝子の１つであるｌｏｖＦの近傍に存在する機能未知な推定遺伝子に対し、実施例１で同定した３つのアミノ酸断片（配列番号３〜５）すべてにおいて相同性が非常に高いことを見出した。そこでこの推定遺伝子の塩基配列を元にプライマー１，２（配列番号６、７）を作製し、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素遺伝子ｃＤＮＡをＰＣＲ(polymerase  chain  reaction)により増幅を試みた。はじめに、前述のようにアスペルギルス・テレウスを液体培地で培養し、６日後に菌体を回収した。全ＲＮＡの単離は、ＡＧＰＣ（acid  guanidinium  phenol-chloroform）法（Chonczynski  P．，Sacchi  N．，Analytical  Biochemistry，１６２，１５６−１５９，１９８７）により、菌体約０．１ｇ（湿潤重量）を用いて行った。単離した全ＲＮＡは、ＲＮＡ精製キット（商品名：oligotex-dT30  <Super>  mRNA  Purification  Kit、Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡを分別することにより回収した。６０ｎｇのＰｏｌｙＡ  ＲＮＡは、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により、プライマー３（配列番号８）を用いて取扱説明書に従い逆転写し、一本鎖ｃＤＮＡ（first  strand  cDNA）を得た。合成した１μlの一本鎖ｃＤＮＡ溶液に、０．２μＭのプライマー１および２（配列番号６、７）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（deoxyribonucleoside  triphosphate）、２ＵのＰＣＲ用酵素（Ｅｘ−Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ社製）、３μｌのバッファ（１０×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｋａｒａ社製）を加え、最終液量を３０μｌとした。ＰＣＲは、サーマルサイクラー（商品名：GeneAmp  PCR  System  9700、アプライドバイオシステムス社製）を用いて、反応１（９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１．５分、を３０サイクル；反応液、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、Ｅｘ−Ｔａｑ  ２Ｕ、１０×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ３μｌ、プライマー各０．２μＭ、最終液量３０μｌ、以下、反応１という）の条件で行った。この結果得られた反応液を、アガロース電気泳動にかけた後、ＤＮＡのゲル抽出キット（商品名：Minelute  Gel  Extraction  Kit、キアゲン社製）を用い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。該ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製)に取扱説明書に従い連結し、このベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、目的のＤＮＡ断片を含むコロニーを、シークエンスすることでＤＮＡ配列を決定した。なお、ＤＮＡシークエンサーはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００（アプライドバイオシステムス社製）、シークエンス反応はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムス社製)を用いた。
完全長ｃＤＮＡ配列の決定は、５’−および３’−ＲＡＣＥ(rapid  amplification  of  cDNA  ends)−ＰＣＲ法により決定した。なお、５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲには、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ(Ｔａｋａｒａ社製)を用い、取扱説明書にしたがって行った。まず、先に決定した部分ＣＡＤ  ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、プライマー４（配列番号９）を作製し、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。こうして得た一本鎖ｃＤＮＡをコンカテマー化後、これを１００倍希釈したもの１μｌを鋳型とし、プライマー５、６（配列番号１０、１１）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒、を３０サイクルとした。１００倍に希釈した該反応液１μｌを鋳型とし、プライマー７，８（配列番号１２、１３）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒、を２２サイクルとした。３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲには、５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの際に使用した一本鎖ｃＤＮＡ１μｌを鋳型とし、プライマー１、９（配列番号６、１４）を用い、反応１の条件で行った。上に示したＰＣＲの結果得られた該反応液を、アガロース電気泳動にかけた後、ＤＮＡのゲル抽出キット（商品名：Minelute  Gel  Extraction  Kit、キアゲン社製）を用いて、約０．６ｋｂｐ（５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）および１．５ｋｂｐ（３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）のＤＮＡ断片をゲルから回収した。該ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製)に取扱説明書に従い連結し、このベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、目的のＤＮＡ断片を含むコロニーを、シークエンスすることでＤＮＡ配列を決定した。こうして得た配列は、上記得られたＣＡＤ遺伝子断片の塩基配列と約３００ｂｐ以上にわたり同一の配列をもち、これらの配列を連結することにより完全長ＣＡＤ遺伝子ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を決定することができた。また、連結後の配列から推定されるＣＡＤアミノ酸配列（配列番号２）には、精製酵素より決定されたＮ末端アミノ酸配列が存在していた（配列番号３〜５、配列番号２中のアミノ酸６１〜６８、２１８〜２２９、３９２〜３９９）。
【００４９】
［実施例３］
ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素遺伝子の大腸菌による発現
ＣＡＤ  ｃＤＮＡの５’−および３’−末端にそれぞれＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加させたＤＮＡ断片を、プライマー１０、１１（配列番号１５、１６）を用い、反応１の条件で増幅した。増幅産物は、上述の方法によりｐＧＥＭ−Ｔベクターへ連結した。このように作製されたプラスミドからＮｄｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出したＣＡＤ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製し、これを発現ベクターｐＣｏｌｄＩ（Ｔａｋａｒａ社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐＣＡＤを作製した。作製したプラスミドを図１に示す。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ導入し、形質転換株エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株を得た。エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００６年１２月２７日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４６）。形質転換株エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株は、１００ｍｌのＬＢ液体培地で濁度０．５になるまで３７℃で増殖させた後、培養温度を１５℃とし、１時間後、ＩＰＴＧ(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を０．１ｍＭとなるように添加することでＣＡＤタンパク質の発現を誘導した。２４時間後菌体を回収した（乾燥菌体重量：３９ｍｇ）。この菌体を１．８ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に懸濁させ、２００μｌの菌体溶解バッファ（商品名：FastBreak  Cell  Lysis  Reagent、Ｐｒｏｍｅｇａ社製)を添加し、転倒混和した。１５分後、遠心分離（１０，０００ｇ，５分）により不溶性物質を分離し、細胞抽出液を得た。こうして調製した細胞抽出液は、３５７００ｕｎｉｔのＣＡＤを含んでいた（１Ｕｎｉｔは、１分間に１μｍｏｌのアコニット酸をイタコン酸へ変換する酵素量）。組換えＣＡＤ酵素の分離精製は、組換えタンパク質精製キット（商品名：Ni-NTA  Fast  Start  Kit、キアゲン社製)を用いて行った。調製した細胞抽出液に終濃度０．３Ｍ塩化ナトリウム、および５ｍＭイミダゾールを添加した。この溶液をＮｉ−ＮＴＡカラムに添加し、８ｍｌの洗浄液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７、０．３Ｍ塩化ナトリウム、６０ｍＭイミダゾール）により洗浄し、その後、２ｍｌの溶離液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２００ｍＭイミダゾール）により組換えＣＡＤを溶出した。精製ＣＡＤのドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を、図２に示した。エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株により発現させたＣＡＤは、アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株からＣＡＤを分離精製した（実施例１）場合より、はるかに容易な方法で同程度の純度のＣＡＤを得られることがわかった。なお、図２において、実施例３で分離精製されたＣＡＤ（レーン３）はＨｉｓ−ｔａｇ配列などの付加によりアスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株から分離精製したＣＡＤ（レーン２）よりも、分子量が約１．３ｋＤａ大きくなっている。
【００５０】
［実施例４］
組換えＣＡＤの活性に及ぼすｐＨの影響
組換えＣＡＤ酵素は、実施例３と同様にして、細胞抽出液を調製し、精製した。組換えＣＡＤの活性に与えるｐＨの影響は、ｐＨ５〜６の酢酸種緩衝液、およびｐＨ６〜８のリン酸緩衝液を用いて検討した。反応液の組成は、１３０μｌの０．２Ｍ酢酸またはリン酸緩衝液、５０μｌ（６μｇ）の精製ＣＡＤ、２０μｌの１０ｍＭのｃｉｓ−アコニット酸であった。反応条件は、３０℃、１時間反応させた。反応液を前述のＨａｒｔｆｏｒｄの方法により分析し、イタコン酸を定量した。その結果を図３に示す。この結果から、ｐＨ６．０付近が、最も高いＣＡＤ活性を呈する反応条件であることが明らかとなった。
【００５１】
［実施例５］
ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素遺伝子のコリネバクテリウム属菌による発現
工業的に広く利用されているグラム陽性細菌コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium  glutamicum）を宿主とする組換えＣＡＤの発現システムを作製した。ＣＡＤ  ｃＤＮＡの５’−および３’−末端にそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ認識配列を付加させたＤＮＡ断片を、プライマー１２、１３（配列番号１７、１８）を用いて、反応１の条件で増幅した。増幅産物は、上述の方法によりｐＧＥＭ−Ｔベクターへ連結し、ＤＮＡ配列を確認した。このように作製されたプラスミドからＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩにより切り出したＣＡＤ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製し、これをコリネバクテリウム発現ベクターｐＣＲＢ１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入したプラスミドｐＣＡＤ２を作製した（図４）。このプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム  Ｒ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７６）へ導入し、形質転換株コリネバクテリウム・グルタミカム  Ｒ／ｃａｄ００２を得た。コリネバクテリウム・グルタミカム  Ｒ／ｃａｄ００２株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００６年１２月２７日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１４７）。形質転換株は、１００ｍｌの表３に示すＡ液体培地で３３℃、好気的に培養した。約２４時間後、菌体を遠心分離（５０００ｇ，５分）により回収した（乾燥菌体重量：８０ｍｇ）。回収した菌体を５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に懸濁させ、約０．５ｇのグラスビーズを加えた後、超音波破砕機（商品名：Ｂｉｏｒｕｐｔｅｒ、コスモバイオ社製）により１５分間破砕した。遠心分離（１０，０００ｇ，５分）により不溶性物質を分離し、細胞抽出液を得た。このようにして得た細胞抽出液は、１９３００ｕｎｉｔのＣＡＤを含んでいた。
【００５２】
【表３】
0005702902.tif 000004
【００５３】
［比較例］
実施例３および５で得られたエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株、およびコリネバクテリウム・グルタミカム  Ｒ／ｃａｄ００２株を宿主とする組換えＣＡＤの生産速度と、アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株による生産速度を比較した。アスペルギルス・テレウスは、実施例１に示した条件に従い培養した。すなわち、７０ｍｌのイタコン酸生産培地（前記表２記載）を含む５００ｍｌのフラスコ３本にアスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株を植菌し、３０℃で６日間培養した。濾布（商品名：ミラクロス）を用いて、菌体を洗浄・回収後、凍結乾燥した（乾燥菌体重量：７３３ｍｇ）。この菌体から実施例１に示した方法により粗酵素液（１０ｍｌ）から６６２００ｕｎｉｔのＣＡＤを得た。エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株およびコリネバクテリウム・グルタミカム  Ｒ／ｃａｄ００２株による組換えＣＡＤ生産速度は、実施例３および５に示した結果より算出した。その結果、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株での生産性は、約６１倍程度、コリネバクテリウム・グルタミカム  Ｒ／ｃａｄ００２株では、約１６倍程度、アスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株の場合よりも顕著に向上していることが明らかとなった。イタコン酸の生産速度の比較結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
0005702902.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素（ＣＡＤ）をコードする遺伝子を導入・高発現した組換え微生物またはその調製物を用いて、イタコン酸を高効率に製造し、合成樹脂、接着剤、洗剤、ラテックス、塗料、印刷インキやアクリル繊維改質剤など広く化学工業用途の原料として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、実施例３において作製したベクターｐＣＡＤを示す。
【図２】図２は、実施例１記載のアスペルギルス・テレウス  ＮＢＲＣ６１２３株（レーン２）および実施例３記載のエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｃａｄ００１株（レーン３）より精製したＣＡＤのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す（レーン１は分子量マーカーを示す)。
【図３】図３は、ＣＡＤ活性の至適ｐＨを示す。
【図４】図４は、実施例５において作製したベクターｐＣＡＤ２を示す。
【図１】
0005702902.tif 000006
【図３】
0005702902.tif 000007
【図４】
0005702902.tif 000008
【図２】
0005702902.tif 000009
【配列表】
0005702902000001.app