(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体へのフィラデルフィア染色体陽性白血病の治療用薬剤の製造のための胎盤増殖因子の選択的阻害剤の使用であって、前記胎盤増殖因子の選択的阻害剤が、胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体またはその断片である使用。
【請求項２】
前記胎盤増殖因子の選択的阻害剤が、抗体１６Ｄ３である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
被験体へのフィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病の治療用薬剤の製造のための胎盤増殖因子の阻害剤の使用であって、前記胎盤増殖因子の選択的阻害剤が、胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体もしくはその断片、またはＶＥＧＦＲ１に特異的に結合する抗体もしくはその断片、または可溶性ＶＥＧＦＲ１である使用。
【請求項４】
前記胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体またはその断片が、抗体１６Ｄ３である請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記フィラデルフィア染色体陽性白血病が、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療され得ないフィラデルフィア染色体陽性白血病、および／またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独で治療され得ないフィラデルフィア染色体陽性白血病である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記フィラデルフィア染色体陽性白血病が、チロシンキナーゼ阻害剤であるＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療することができないフィラデルフィア染色体陽性白血病である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記フィラデルフィア染色体陽性白血病が、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ＡＴ９２８３、ＳＧＸ３９３、ＩＮＮｏ−４０６またはＭＫ０４５７で治療され得ないフィラデルフィア染色体陽性白血病である請求項６に記載の使用。
【請求項８】
被験体へのフィラデルフィア染色体陽性白血病の治療用薬剤の製造のための胎盤増殖因子の選択的阻害剤とＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤との組み合わせの使用であって、前記胎盤増殖因子の選択的阻害剤が、胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体またはその断片である使用。
【請求項９】
前記胎盤増殖因子の選択的阻害剤が、抗体１６Ｄ３である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
被験体へのフィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病の治療用薬剤の製造のための胎盤増殖因子の阻害剤とＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤との組み合わせの使用であって、前記胎盤増殖因子の阻害剤が、胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体もしくはその断片、またはＶＥＧＦＲ１に特異的に結合する抗体もしくはその断片、または可溶性ＶＥＧＦＲ１である使用。
【請求項１１】
前記胎盤増殖因子の阻害剤が、抗体１６Ｄ３である請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である請求項８〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ＡＴ９２８３、ＳＧＸ３９３、ＩＮＮｏ−４０６またはＭＫ０４５７である請求項８〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
胎盤増殖因子の選択的阻害剤を含有してなり、前記胎盤増殖因子の選択的阻害剤が、胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体またはその断片である、被験体へのフィラデルフィア染色体陽性白血病の治療用薬剤。
【請求項１５】
前記胎盤増殖因子の選択的阻害剤が、抗体１６Ｄ３である請求項１４に記載の治療用薬剤。
【請求項１６】
前記フィラデルフィア染色体陽性白血病が、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療され得ないフィラデルフィア染色体陽性白血病、および／またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独で治療され得ないフィラデルフィア染色体陽性白血病である請求項１４または１５に記載の治療用薬剤。
【請求項１７】
前記フィラデルフィア染色体陽性白血病が、チロシンキナーゼ阻害剤であるＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療することができないフィラデルフィア染色体陽性白血病である請求項１６に記載の治療用薬剤。
【請求項１８】
前記フィラデルフィア染色体陽性白血病が、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ＡＴ９２８３、ＳＧＸ３９３、ＩＮＮｏ−４０６またはＭＫ０４５７で治療することができないフィラデルフィア染色体陽性白血病である請求項１７に記載の治療用薬剤。
【請求項１９】
ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤をさらに含有してなる請求項１４〜１８のいずれかに記載の治療用薬剤。
【請求項２０】
前記ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である請求項１９に記載の治療用薬剤。
【請求項２１】
前記ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ニロチニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、ＡＴ９２８３、ＳＧＸ３９３、ＩＮＮｏ−４０６またはＭＫ０４５７である請求項１９または２０に記載の治療用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、癌、詳しくは、白血病の分野に関する。より詳しくは、フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）白血病の治療に関する。これは、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）の阻害によって達成される。したがって、ＰｌＧＦ阻害剤を用いる、具体的には抗ＰｌＧＦ抗体を用いるＰｈ＋白血病の治療方法が提供される。この方法で治療されることが予想される白血病の具体的な型は、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）、特に、イマチニブなどの従来のＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤が十分な治療効果をもたらすことができない患者における慢性骨髄性白血病である。
【背景技術】
【０００２】
フィラデルフィア染色体は、フィラデルフィア転座としても公知であり、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）と関連した特異的染色体異常である。これは、９番染色体と２２番染色体との間の相互転座の結果であり、特に、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）と命名される。この転座の存在は、ＣＭＬ患者の９５％がこの異常を有するので、ＣＭＬの高感度試験である。ＣＭＬ患者の残りの５％は、典型的に、Ｇバンド染色体調製物上で不可視の潜在性転座、または９番染色体および２２番染色体の長腕とともに別の単数の染色体もしくは複数の染色体を含むバリアント転座のいずれかを有する。しかしながら、成人急性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病（ＡＬＬ）症例の２５〜３０％（および小児ＡＬＬ症例の２〜１０％）にも見られるので、フィラデルフィア（Ｐｈ）染色体の存在だけでは、ＣＭＬを診断するのに十分特異的ではない。
【０００３】
それでもなお、これらの疾患は、明らかに異なる。急性リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病（ＡＬＬ）は、悪性で未熟な白血球が継続的に増殖し、骨髄中で過剰産生される、白血病の一形態である。ＡＬＬは、骨髄中の正常な細胞を締め出すことおよび他の器官に拡散（転移）ことによって、損傷および死亡を引き起こす。ＡＬＬは、小児期および青年期において最も一般的であり、４〜５歳に発生率のピークがあり、別のピークは老齢期にある。全体の治癒率は、小児で８５％であり、成人の約５０％は長期の無病生存期間を有する。「急性」は、循環リンパ球（「芽細胞」）の未分化で未熟な状態をいい、治療しないまま放置されれば数週間から数ヵ月中に致死し得る、疾患の急速な進行をいう。急性白血病の治療としては、化学療法、ステロイド剤、放射線療法、集中的な併用療法（骨髄移植または幹細胞移植を含む）、および増殖因子を挙げることができる。
【０００４】
もう一方の慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）（または骨髄球性（ｍｙｅｌｏｉｄ））白血病（ＣＭＬ）は、主に骨髄中の骨髄系細胞の無秩序な増殖の増加およびこれらの細胞の血液中の蓄積によって特徴付けられる、白血病の一形態であり、したがって、これは骨髄増殖性疾患である。ＣＭＬは、成熟した顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）の増殖ならびにそれらの前駆体が主な所見であるクローン性骨髄幹細胞障害である。現在、標的療法も利用可能であり、標準的な治療として用いられているが、歴史的には、これは化学療法、インターフェロンおよび骨髄移植で治療されている。
【０００５】
フィラデルフィア染色体中で観察される９番染色体および２２番染色体の一部の交換は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を生じさせる（メロ（Ｍｅｌｏ）、１９９６年））。すなわち、２２番染色体由来のＢＣＲ（「易切断領域」）遺伝子の一部（ｑ１１領域）が、９番染色体上のＡＢＬ遺伝子の一部（ｑ３４領域）と融合する。Ａｂｌは、同様のタンパク質を保有する白血病ウイルスの名前である「エーベルソン」を表す。２種類のＢＣＲ−ＡＢＬ転写産物（ｋＤａで表される見かけの分子量にちなんで名付けられたｐ１８５およびｐ２１０アイソフォームを産生する）が、ＢＣＲ領域の切断点によって産生される。融合「ＢＣＲ−ＡＢＬ」遺伝子は、得られた、より短い２２番染色体上に位置する。ＡＢＬは、チロシン残基にリン酸基を付加することができるドメイン（チロシンキナーゼ）を保持し、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子産物も、チロシンキナーゼである（フェイダール（Ｆａｄｅｒｌ）ら、１９９９年）。
【０００６】
融合ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質は、インターロイキン−３β共通受容体サブユニットと相互作用する。ＢＣＲ−ＡＢＬ転写産物は、継続的に活性があり、他の細胞メッセージングタンパク質による活性化を必要としない。そして、ＢＣＲ−ＡＢＬは、細胞周期を制御するタンパク質のカスケードを活性化し、細胞分裂を加速させる。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質は、ＤＮＡ修復を阻害してゲノム不安定性を引き起こし、細胞に、さらなる遺伝子異常をより発生しやすくし、慢性期から治療不能な急性転化へのＣＭＬの進行を強く促進する。ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質のチロシンキナーゼ作用は、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病の病態生理学的な原因であると考えられている。ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の活性を特異的に阻害する標的療法が開発されている。これらの最初のものは、イマニチブ（そのメシル酸塩として、グリベック（Ｇｌｉｖｅｃ）（登録商標）またはグリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標）の商品名で市販されている）であった。これらのチロシンキナーゼ阻害剤および他のチロシンキナーゼ阻害剤は、ＣＭＬにおいて完全寛解を引き起こすことができ、ＣＭＬにおけるＢＣＲ−ＡＢＬの最重要性が確認される（ヒールマン（Ｈｅｈｌｍａｎｎ）ら、２００７年）。フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）ＡＬＬをＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療した場合に、限られた成果も報告されている（ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）およびナオエ（Ｎａｏｅ）、２００６年；ピッカルガ（Ｐｉｃｃａｌｕｇａ）ら、２００６年）。
【０００７】
イマチニブおよび第２世代ＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤（例えば、ダサチニブ）の導入が、フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）白血病の患者の治療に革命をもたらしたにもかかわらず、治療に成功した患者においても白血病細胞が存続し、一部の患者は抵抗性を生じ、最終的には再発することは、公知の課題である（スウォード（Ｓｗｏｒｄｓ）ら、２００７年；ブチャート（Ｂｕｃｈｅｒｔ）、２００７年；リ（Ｌｉ）およびリ（Ｌｉ）、２００７年；クジャウスキー（Ｋｕｊａｗｓｋｉ）およびタルパッツ（Ｔａｌｐａｚ）、２００７年）。これらの欠点の理由は、完全には解決されていない。
【０００８】
したがって、フィラデルフィア染色体陽性白血病の患者、特に、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤での治療に応答しない患者を治療するためのさらなる選択肢を有することは、有利であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）白血病を治療するための新規の治療のアプローチを提供することは、本出願の目的である。具体的には、イマチニブのようなＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が療法として適合しない（または、もはや適合しない）患者に役立つアプローチを提供することができることも想定される。驚くべきことに、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）の阻害は、この因子が白血病細胞系中で発現されないにもかかわらず、白血病マウスの有意に長期の生存期間をもたらすことが見出された。さらに、この長期の生存期間は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤について見られるものに反して、ＢＣＲ−ＡＢＬ変異状態とは無関係である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、第１の側面によれば、フィラデルフィア染色体陽性白血病の治療のための胎盤増殖因子の阻害剤の使用が想定される。また、フィラデルフィア染色体陽性白血病の治療用薬剤の作製のための胎盤増殖因子の阻害剤の使用が想定される。
【００１１】
同様に、被験体にＰｌＧＦの阻害剤を投与することを含む、それを必要とする被験体におけるフィラデルフィア染色体陽性白血病の治療方法が提供される。もちろん、それによって、それを必要とする被験体において、症状を寛解させるか、または最終的にはＰｈ＋白血病を治療することが目標である。
【００１２】
具体的な実施形態によれば、本明細書中に記載されている使用および方法において提供される胎盤増殖因子の阻害剤は、胎盤増殖因子の選択的阻害剤である。具体的には、選択的阻害剤は、胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体またはその断片である。かかる抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であってもよい。具体的な実施形態によれば、胎盤増殖因子に特異的に結合する抗体またはその断片は、モノクローナル抗体である。さらなる具体的な実施形態によれば、これは、マウスモノクローナル抗体である。なおさらなる具体的な実施形態によれば、マウスモノクローナル抗体は、ヒト化されていてもよく、すなわち、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトのゲノムＤＮＡ配列あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから開始して、組み換えＤＮＡ技術によって作製されたヒト化バージョンのマウスモノクローナル抗体であってもよい。他の実施形態によれば、抗体またはその断片は、ヒト抗体（またはその断片）、具体的にはヒトモノクローナル抗体である。
【００１３】
具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦに特異的に結合する抗体の断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【００１４】
他の具体的な実施形態によれば、選択的阻害剤は、ＰｌＧＦに対するナノボディである。さらに他の具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、選択的阻害剤ではない。その具体的な例は、ＶＥＧＦＲ−１抗体またはその断片などの、ＶＥＧＦＲ−１阻害剤である。
【００１５】
フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）白血病の治療のために、ＰｌＧＦ阻害剤の方法および使用が提供される。具体的な実施形態によれば、フィラデルフィア染色体陽性白血病は、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）である。他の実施形態によれば、Ｐｈ＋白血病は、例えば、Ｂ−ＡＬＬ（Ｂ細胞が白血病細胞である）またはＴ−ＡＬＬ（白血病細胞がＴ細胞である）などの急性リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病（ＡＬＬ）である。
【００１６】
本明細書中に記載された方法および使用が、広範な適用性を有することが想定される。具体的には、ＰｌＧＦ阻害剤は、全てのフィラデルフィア染色体陽性白血病、具体的には、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療することができないものおよび／またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独で治療することができないものの治療のために（または治療の方法において）用いられ得ることも想定される。Ｐｈ＋白血病は、種々の理由により、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独で治療可能でないかもしれない。最も一般的な理由は、白血病は（少なくとも部分的には）治療に対して非感受性である（または少なくとも部分的に治療に対して抵抗性／非感受性を生じている）こと、またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤が（例えば、アレルギーまたは有害な副作用によって）患者によって許容され得ないことである。ＰｌＧＦ阻害は、Ｐｈ＋白血病の治療における一般的なアプローチを提供するが、これは特に、例えば、ＣＭＬに対する標準的な治療アプローチであるＢＣＲ−ＡＢＬ阻害によって所望の治療効果がもたらされない症例について、有益であり得る。このとき、ＰｌＧＦ阻害剤の使用は、代替的または付加的な手段を提供し得る。特定の実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤と組み合わせて用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、インビトロでの白血病細胞、造血細胞および一次骨髄間質細胞におけるＰｌＧＦ発現を示す。Ａ：種々の細胞系および単離された細胞によって分泌されたＰｌＧＦタンパク質の量（より詳しくは、実施例１を参照のこと）；Ｂ：マウスＢＭＤＳＣの造血画分（ＣＤ４５+）および非造血画分（ＣＤ４５-）によるＰｌＧＦ発現。＊はｐ＜０，００１を示す。ＢＭ：骨髄。
【図２】図２において、ＰｌＧＦおよび他の分子の発現がインビボで示される（詳細については、実施例２を参照のこと）。Ａ、Ｂ：マウスにおける白血病疾患進行の異なる時点での末梢血または骨髄中のＰｌＧＦタンパク質レベル；Ｃ、Ｄ：マウスにおける白血病疾患進行の異なる時点での末梢血または骨髄におけるＰｌＧＦ対ｓＶＥＧＦＲ−１タンパク質レベルの比；Ｅ：健常および白血病マウスにおける骨髄ＰｌＧＦ  ｍＲＮＡ発現、＊はｐ＜０．００２を示す；Ｆ：骨髄の亜集団におけるＰｌＧＦ発現の特徴づけ、＊はｐ＜０．０５を示す；Ｇ：健常および白血病マウスにおける骨髄ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現；Ｈ、Ｉ：末梢血または骨髄におけるＰｌＧＦタンパク質レベルは、末期罹患マウスにおける白血病負荷と相関がある。
【図３】図３は、ＰｌＧＦによる白血病細胞の増殖を示す（詳細については、実施例３を参照のこと）。Ａ、Ｂ：異なる白血病細胞系におけるＮｐｎ−１およびＮｐｎ−２の発現；Ｃ：異なる濃度のＰｌＧＦによるＢＶ−１７３細胞系における増殖の誘導；Ｄ：Ｋ５６２（左上のパネル）、ＢＶ−１７３（右上のパネル）、ＫＣＬ−２２（左下のパネル）およびＢａＦ３（右下のパネル）細胞系それぞれにおける５０ｎｇ／ｍｌ  ＰｌＧＦによる増殖の誘導；Ｅ：抗ＶＥＧＦＲ−１抗体によるＢＶ−１７３細胞系におけるＰｌＧＦ誘導性増殖の阻害；Ｆ：抗ＰｌＧＦ抗体によるＢＶ−１７３細胞系におけるＰｌＧＦ誘導性増殖の阻害。ＢＭ：骨髄；ＰｌＧＦ：胎盤増殖因子；αＶＥＧＦＲ−１：抗血管内皮増殖因子受容体−１抗体；αＰｌＧＦ：抗ＰｌＧＦ抗体。
【図４】図４において、インビトロでの白血病細胞とＢＭＤＳＣとの間のパラクリン相互作用による誘導（Ａ〜Ｄ）を、白血病細胞馴化培地（Ｅ）とともに示す。Ａ：ＢＤＭＳＣ、ＢＶ−１７３細胞系および共培養物（ＢＭＤＳＣ＋ＢＶ）におけるＰｌＧＦ発現；Ｂ：Ｓ１７細胞、ＢＶ−１７３細胞系および共培養におけるＰｌＧＦ発現；Ｃ：ＢＶ−１７３白血病細胞単独およびＢＭＤＳＣとの共培養物における増殖ならびに抗ＰｌＧＦ抗体による阻害；Ｄ：ＢＭＤＳＣ単独およびＢＶ−１７３白血病細胞との共培養中の増殖、ならびに抗ＰｌＧＦ抗体による阻害；Ｅ：白血病細胞（ＢＶ−１７３）馴化培地とのインキュベーションによるＳ１７細胞におけるＰｌＧＦアップレギュレーション。ＢＶ：ＢＶ−１７３細胞系；αＰｌＧＦ：抗ＰｌＧＦ抗体。
【図５】図５Ａ：白血病ＰｌＧＦ−／−およびＷＴマウスの生存率；Ｂ：クロスオーバー白血病マウスの生存率（詳細については、実施例５を参照のこと）；Ｃ：抗ＰｌＧＦ抗体または対照抗体のいずれかで処理された、リンパ性ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ＢａＦ３細胞によって誘導された白血病を有するマウスの生存率；Ｄ、Ｅ：初期（ｄ１５）および末期（ｄ２８）白血病でのＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞のＦＡＣＳ解析ならびに抗ＰｌＧＦ抗体による阻害の効果；Ｆ：対照および抗ＰｌＧＦ処理された末期白血病マウスの骨髄組織像；Ｇ：抗ＰｌＧＦ抗体または対照抗体のいずれかで処理されたイマチニブ感受性ＣＭＬのマウスモデルにおける生存率；Ｈ：抗ＰｌＧＦ抗体または対照抗体のいずれかで処理されたイマチニブ抵抗性ＣＭＬのマウスモデルにおける生存率。αＰｌＧＦ：抗ＰｌＧＦ抗体；ｄ：日；Ｔ３１５Ｉ：ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質のＴ３１５Ｉ変異。さらなる詳細については、実施例６を参照のこと。
【図６】図６は、抗ＰｌＧＦ処理の際の骨髄血管新生過多および線維症の阻害を示す（実施例７を参照のこと）。Ａ、Ｃ：モック移植された末期白血病のマウス、対照抗体処理された末期白血病マウスおよび抗ＰｌＧＦ処理された末期白血病マウスにおける骨髄血管密度（ＭＶＤ）；Ｂ、Ｄ：モック移植された末期白血病マウス、対照抗体処理された末期白血病マウスおよび抗ＰｌＧＦ処理された末期白血病マウスにおけるレティキュリン線維の長さおよび骨髄線維症。
【図７】図７において、ヒトＣＭＬにおけるＰｌＧＦ発現に関するデータ（Ａ〜Ｄ、実施例８）、ならびにマウス（Ｅ）およびヒト（Ｆ、実施例９）におけるＰｌＧＦ発現とイマチニブ処理とを関連付けるデータが示される。Ａ：異なる段階のＣＭＬ（健常対照群、慢性期および急性転化）における血漿ＰｌＧＦレベル、＊はｐ＜０．０００１を示す；Ｂ：ＣＭＬ患者における骨髄血漿ＰｌＧＦレベル；ヒトＣＭＬにおける、ＰｌＧＦレベルとＢＣＲ／ＡＢＬ転写産物数との間の相関；Ｄ：健常対照群、ＣＭＬ患者の白血病細胞および間質細胞における、ＰｌＧＦ発現のＱＲＴ−ＰＣＲ；Ｅ：非処理白血病マウスならびにイマチニブで処理された健常および白血病マウスの骨髄ＰｌＧＦレベル；Ｆ：健常ヒト被験体およびイマチニブ（ＩＭ）に対する異なる応答レベルを有する患者におけるＰｌＧＦレベル。詳細については、実施例９を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本発明は、具体的な実施形態に関して、特定の図面を参照して記載されるが、本発明はこれらに限定されることはなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲中のいかなる引用符号も、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。記載されている図面は、模式的であるだけであり、非限定的である。図面中、いくつかの構成要素のサイズは誇張されており、例示目的の尺度で描かれてない。本明細書および特許請求の範囲中で、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が用いられる場合、他の要素または工程を排除するものではない。単数の冠詞をいうときに不定冠詞または定冠詞、例えば、「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」が用いられる場合、これは、特に他に示されない限りは、複数のその名詞を含む。
【００１９】
さらに、明細書中および特許請求の範囲中の用語である第１、第２、第３などは、同様の要素の間を区別するために用いられ、必ずしも順次的または時系列順で記載するためではない。このようにして用いられる用語は、適当な状況下で互換性があり、本明細書中に記載される発明の実施形態は、本明細書中に記載または例示されている他の順序で実施可能であると理解されるべきである。
【００２０】
以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためのみに提供される。本明細書中で特に定義されない限りは、本明細書中で用いられる全ての用語は、本発明の当業者に対して有するのと同じ意味を有する。実行者は、当該技術の定義および用語について、具体的には、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラークローニング：ア・ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、プレインズビュー（Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８９年）；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、カレントプロトコール・イン・モレキュラーバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（追補４７）、ジョン・ウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９９年）を対象とする。本明細書中で提供される定義は、当業者によって理解されるよりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００２１】
本明細書中で用いられる「胎盤増殖因子」または「ＰｌＧＦ」は、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）サブファミリーのメンバー、具体的には、ヒトＰｌＧＦ（遺伝子ＩＤ５２２８；ＲｅｆＳｅｑ（ゲノムビルドとは無関係である）ＮＭ＿００２６３２．４（ｍＲＮＡ）およびＮＰ＿００２６２３．２（タンパク質））をいう。他に特定されない限りは、用語「ＰｌＧＦ」は、遺伝子、ならびにＰｌＧＦ  ＲＮＡ（最も具体的には、ＰｌＧＦ  ｍＲＮＡ）およびＰｌＧＦタンパク質などの、その産物をいってもよい。ＰｌＧＦの全てのアイソフォームが、ＰｌＧＦの定義に含まれるように意図される。
【００２２】
用語「フィラデルフィア染色体陽性」または「Ｐｈ＋」白血病は、本明細書中で用いられる場合、フィラデルフィア転座が存在すると確認されている疾患をいう。フィラデルフィア染色体は、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）転座（フィラデルフィア転座）の結果である。フィラデルフィア染色体転座の少なくとも２つの代替的形態が実証されているが、両方の代替的切断点は、９番染色体上に位置するＡＢＬ遺伝子のエクソンの共通サブセット（ＯＭＩＭ＊１８９９８０）への２２番染色体上のＢＣＲの異なるエクソンセット（ＯＭＩＭ＊１５１４１０）の連結を生じる。したがって、融合物は、ｐ２１０（ＢＣＲ−ＡＢＬ）およびｐ１８５（ＢＣＲ−ＡＢＬ）と称され、本明細書中でまとめて「ＢＣＲ−ＡＢＬ」と称される２つの代替的キメラ癌遺伝子産物が生じ得る（ＯＭＩＭ＊１５１４１０および＊１８９９８０に含まれる）。ＡＢＬチロシンキナーゼ活性の活性化は、キメラ癌遺伝子の発癌能に必要である。キメラＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子（およびその遺伝子産物）の存在は、Ｐｈ＋白血病の特質であるので、「Ｐｈ＋」も、融合遺伝子の存在を示すために、「ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性」または「ＢＣＲ−ＡＢＬ＋」白血病という場合もある。したがって、機能性ＢＣＲ−ＡＢＬキメラ遺伝子（すなわち、ＢＣＲ−ＡＢＬ＋）の生成をもたらす転座または変異も転座の機序にかかわらず、本明細書中で「Ｐｈ＋」として分類されることに留意されたい。これは、例えば、より複雑な転座の場合にあり得る。
【００２３】
本出願において用いられる「胎盤増殖因子の選択的阻害剤」は、他の分子の生理学的機能を妨げることなくＰｌＧＦの機能またはシグナル伝達経路を阻害する分子または化合物である。具体的には、選択的ＰｌＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦの機能を妨げない。したがって、非限定的な例として、ＰｌＧＦに特異的に向けられた化合物（例えば、抗ＰｌＧＦ抗体）は選択的阻害剤であるが、ＶＥＧＦも標的とする（ＶＥＧＦＲ−１ベースの化合物など）か、またはＶＥＧＦ／ＰｌＧＦ共有受容体を標的とする（例えば、ＶＥＧＦＲ１に対する抗体、またはｓＶＥＧＦＲ−１）化合物は、典型的には非選択的阻害剤である。
【００２４】
「慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病」、「慢性骨髄球性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病」または「ＣＭＬ」は、本明細書中で用いられる場合、骨髄性、赤血球系、巨核球性、Ｂリンパ系およびＴリンパ系の細胞を含むが骨髄線維芽細胞を含まない特定の細胞遺伝学的異常（フィラデルフィア染色体）を有する多能性幹細胞のクローン性骨髄増殖性障害をいう（ＯＭＩＭ＃６０８２３２；シルバー（Ｓｉｌｖｅｒ）、２００３年）。
【００２５】
「急性リンパ球性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病」、「急性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病」または「ＡＬＬ」は、本出願において用いられる場合、未熟な白血球細胞が継続的に増加し、骨髄中で過剰産生される、急性形態の白血球をいう。ＡＬＬの例示としては、Ｔ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬが挙げられる。また、ＡＬＬ症例の異種の群の具体的なサブセットは、フィラデルフィア染色体に陽性、すなわち、Ｐｈ＋またはＢＣＲ−ＡＢＬ＋である（レイディッヒ（Ｒａｄｉｃｈ）、２００１年；アルバラード（Ａｌｖａｒａｄｏ）ら、２００７年）。
【００２６】
本出願において用いられる「ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤」は、キメラＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子またはその遺伝子産物の発現または機能を阻害する分子または化合物である。注目すべきなのは、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤は、必ずしもＢＣＲ−ＡＢＬに特異的であることを要しない。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼのみではなくそれ以上のものを標的とするチロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤は、Ｐｈ＋白血病における標的療法として周知であり、非限定的であるが典型的な例示はイマチニブである。他の例示は、本出願に含まれる。
【００２７】
本出願において用いられる「治療する」は、Ｐｈ＋白血病と関連した１つ以上の臨床症状の有意な寛解を達成することを意味する。状況によって、有意な寛解は、定量的または定性的にスコアリングしてもよい。定性的基準は、例えば、患者の幸福であってもよい。定量的評価の場合、有意な寛解は、典型的には、ＰｌＧＦ阻害剤の投与の前の状況に対して、１０％より高いか、２０％より高いか、２５％より高いか、３０％より高いか、４０％より高いか、５０％より高いか、６０％より高いか、７０％より高いか、７５％より高いか、８０％より高いか、９０％より高いか、９５％より高いか、または１００％以上の改善である。もちろん、改善が減少（例えば、患者試料中に存在する悪性細胞の数）として表される場合、改善は、１００％を超えることはあり得ない。改善が評価される時間枠は、観察される基準のタイプに依存して、当業者によって決定され得る。
【００２８】
フィラデルフィア染色体陽性白血病の治療のための胎盤増殖因子の阻害剤の方法および使用を提供することは、本発明の重要な側面である。また、フィラデルフィア染色体陽性白血病の治療用薬剤の製造のための胎盤増殖因子の阻害剤の使用が教示される。
【００２９】
胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）の阻害剤は、具体的には、他の分子を妨げないようなＰｌＧＦの選択的阻害剤である。具体的には、選択的ＰｌＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦの機能を妨げるべきではない。具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦ阻害剤ではない。他の具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦＲ１阻害剤ではない。特定の実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦＲ１に基づいていない。
【００３０】
阻害剤は、ＰｌＧＦの活性を、その合成、翻訳、二量体化、受容体結合および／または受容体結合媒介性シグナル伝達を妨げることによって、中和し得る。ＰｌＧＦの活性を中和することは、ＰｌＧＦ活性を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはちょうど１００％抑制することと理解されるべきである。
【００３１】
ＰｌＧＦの阻害剤、具体的には選択的阻害剤は、当該分野で公知である。具体的な実施形態によれば、選択的阻害剤は、抗体である。用語「抗体」または「抗体（複数）」は、ＰｌＧＦもしくはその任意の機能性誘導体に特異的に向けられたものとして特徴付けられる抗体もしくはその任意の機能性誘導体またはその抗原結合性断片、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）もしくは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）型、またはそれに由来する任意の型の組み換え抗体に関する。ＰｌＧＦまたはその任意の機能性誘導体に対して作製された特異的ポリクローナル抗血清を含む本明細書中に記載された抗ＰｌＧＦ抗体は、他のタンパク質に対する交差反応性を有しない。具体的な実施形態によれば、抗ＰｌＧＦ抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、古典的な方法に従って、ＰｌＧＦまたはその任意の機能性誘導体に対して免疫化された動物、具体的には、マウスまたはラットの脾臓細胞と骨髄腫細胞系の細胞とから形成され、動物の免疫に最初に用いられたＰｌＧＦまたはその任意の機能性誘導体を認識するモノクローナル抗体を産生する能力によって選択される傾向がある、任意のハイブリドーマによって産生され得る。
【００３２】
具体的な実施形態によれば、ヒトＰｌＧＦに対するモノクローナル抗体の作製は、例えば、以下のように行なうことができる：ＰｌＧＦまたはその断片によってコードされるアミノ酸からなる組み換えヒトＰｌＧＦ融合タンパク質を、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に結合させ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現させ、固定化されたグルタチオン（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。また、組み換えヒトＰｌＧＦは、アール・アンド・ディー・システムズ・インコーポレーティッド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、６１４  マッキンリー・プレース・エヌ．イー．ミネアポリス（ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  Ｎ．Ｅ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ  ５５４１３、ＵＳＡ．（２６４−ＰＧ−０１０、２６４−ＰＧ−０１０／ＣＦ、２６４−ＰＧ−０５０または２６４−ＰＧ−０５０／ＣＦ）、リサーチ・ダイアグノスティック・インコーポレーティッド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ）、プレザンド・ヒル・ロード（Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｈｉｌｌ  Ｒｏａｄ）、フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）  ＮＪ  ０７８３６、ＵＳＡ（組み換えヒトＰｌＧＦ−１：カタログ番号ＲＤＩ−３００−０１５およびカタログ番号ＲＤＩ−３００−０１６ならびにヒトＰｌＧＦ−２：カタログ番号ＲＤＩ−３００−０１９）またはアレキシス・コーポレーション（ＡＬＥＸＩＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＣＨ−４４１５  ローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）、スイス（胎盤増殖因子−２（ヒト）（組み換え）カタログ番号ＲＬＴ−３００−０２０）から入手可能である。
【００３３】
組み換えヒトＰＬＧＦを、等量のアジュバントと混合し、次いで、得られた混合物を、Ｂａｌｂ／ｃ雄マウス（免疫の開始の際に８週齢）に、マウス１匹あたり１００μｇのＰｌＧＦの量に相当する量で皮下投与する（免疫刺激）。
【００３４】
約２１日後、上述したのと同様の様式の皮下投与によって、免疫を行なうことができる（追加免疫）。追加免疫の１９日または３０日後に、ヒトＰｌＧＦをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２５０μｇ／ｍｌの濃度を有するように希釈することによって得られた調製物２００μｌを、尾静脈を介して、マウスに投与することができる（最終免疫）。次いで、最終免疫から約３日後に、脾臓をマウスから切除し、それらを単細胞に分離するべきである。続いて、脾臓細胞を適切な培地、例えば、ＤＭＥＭ培地で洗浄する。一方、対数増殖期に適切なマウス骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）を採取し、適切な培地、例えば、ＤＭＥＭ培地で洗浄するべきである。脾臓細胞およびマウス骨髄腫細胞は、１０：１の細胞数の比でプラスチックチューブ中で十分に混合し、次いで５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ，例えば、ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のもの、平均分子量：４０００）を添加して、３７℃で７分間の細胞融合を行なわなければならない。上清溶液の（遠心分離による）除去の後、残渣をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンが添加された１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地）に添加する。約５×１０６個の細胞／ｍｌの脾臓細胞の濃度が得られるように、残渣を懸濁するべきである。次いで、この細胞懸濁液を、１つのウェルが約１００μｌの懸濁液を含むように、９６ウェルプラスチックプレートに分配して注ぎ、次いで、５％二酸化炭素中において、３７℃で培養することができる。ＨＡＴ培地は、例えば、２日目および５日目に５０μｌ／ウェルの量で、補充するべきである。その後、半分の体積の培地を、ハイブリドーマの増殖に従って、３日または４日ごとに交換することができる。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、スクリーニングされるべきである。これは、ＰｌＧＦが有する生理学的活性に対するモノクローナル抗体の阻害活性を指標として用いることによって行なわれるべきである。
【００３６】
次いで、ＰｌＧＦとの反応性を示すモノクローナル抗体を産生したハイブリドーマを、選択されたクローンから選択しなければならない。次いで、得られたハイブリドーマを、適切な培地、例えば、ＨＡＴ培地と同じであるがアミノプテリンを含まないＨＴ培地に移し、さらに培養しなければならない。クローニングは、適切なハイブリドーマが入手可能な限界希釈法に従って、２回行なうことができる。
【００３７】
次いで、モノクローナル抗体の生産および精製を、以下のように行なってもよい：２．６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（例えば、シグマ（Ｓｉｇｍａ）のプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）、０．５ｍｌ）を、Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（生後６〜８週齢）に腹腔内注射することができる。１０〜２０日後に、クローンの細胞（１×１０6〜１０7個の細胞）をＰＢＳ中に懸濁し、マウスに腹腔内接種することができる。７〜１０日後に、マウスを屠殺し、腹部手術に供し、そこから生成された腹水を採取することができる。腹水を遠心分離して、不溶物を除去することができ、上清を回収し、精製まで−２０℃で保存した。結果的に、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ抗体精製キット（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ローゼンダール（Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ）、オランダから入手可能）を用いることによって、上述の腹水上清からＩｇＧを精製することができる。すなわち、腹水（２ｍｌ）に、溶液Ａ（１．５Ｍグリシン、３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．９、８ｍｌ）を添加し、４５ｌｍの孔サイズを有するろ過のためのフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でろ過することができる。その後、得られたろ液を、溶液Ａで十分平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を充填したカラム（カラム体積：１ｍｌ）にアプライすることができ、カラムを、カラム体積の１０倍の量の溶液Ａで洗浄する。続いて、ＩｇＧ画分を、カラム体積の１０倍の量の溶液Ｂ（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８）で溶出させることができる。溶出したＩｇＧ画分をＰＢＳに対して透析することができる。モノクローナル抗体は、市販のサブクラス決定キット（商標：Ｍｏｎｏ  Ａｂ−ＩＤ  ＥＩＡキットＡ、Ｚｙｍｅｄ製）によって、前述のもので得られた精製抗体を用いることによって、それらのＩｇＧサブクラスに対して決定することができる。この方法は、ＥＬＩＳＡ法に基づく。
【００３８】
モノクローナル抗体の阻害活性は、ＶＥＧＦＲ１受容体へのｒＰｌＧＦの結合の完全な阻害を試験することができる。これは、例えば、ＰＢＳ中において、室温で一晩、１ｇ／ｍｌのｒｍＦｌｔ−１／Ｆｃキメラ１００μｌによって９６ウェルプレートがコーティングされる免疫機能性ＥＬＩＳＡで測定することができる。ＰＢＳ中１％ＢＳＡでの１時間のブロッキングの後、次いで、１０ｎｇ／ｍｌの組み換えｍＰｌＧＦ−２７０μｌとともに室温で２時間プレインキュベートされたハイブリドーマ培地７０μｌの混合物１００μｌを、プレートにアプライする。２０ｎｇ／ｍｌ〜１５６ｐｇ／ｍｌの範囲のｒｍＰｌＧＦ−２の標品が含まれ得る（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で希釈。ＢＳＡ−ＥＤＴＡ）。次いで、プレートを３７℃で１時間および室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、２００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗マウスＰｌＧＦ−２  １００μｌを室温で２時間アプライすることができる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、１００μｌのアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ｖｅｃｔａｓｔｏｒｉｎ  ＡＢＣキット）を室温で１時間アプライすることができる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、プレートをｏ−フェニレンジアミンを有するクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５．０  ９０μｌで３０分間展開して、４９０ｎｍで測定することができる。
【００３９】
ＰｌＧＦに結合することができる抑制抗体リガンドも本明細書中で提供される。より好ましくは、かかるリガンドは、ＰｌＧＦ上に位置する特異的なエピトープを認識することができるべきである。例えば、本発明は、動物における意図的な免疫によって生産されたモノクローナル抗体に由来する上述の型のリガンドに関する。また、本発明は、当該分野で周知の方法を用いて、パパインによる上記モノクローナル抗体のタンパク質分解性消化によって得ることができる抗原結合性Ｆａｂ断片またはかかる断片のホモログ誘導体を提供する。マウス抗ＰｌＧＦモノクローナル抗体の免疫原性を減少させるために、また、本発明は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体定常領域と選択的に組み合わせる単鎖可変ドメイン、いわゆるヒト化モノクローナル抗体としての、キメラ抗体の構築を含む。
【００４０】
動物において産生されるモノクローナル抗体は、例えば、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８６年）もしくはリーヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）（リーヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら、１９８８年）によって開示されているように、または他の方法でハイブリダイスして、非ヒトモノクローナル抗体由来の結合相補性決定領域（「ＣＤＲ」）をヒトフレームワーク領域、具体的には、ヒト遺伝子の定常Ｃ領域と結合させることによって、ヒト化してもよい。
【００４１】
これらの実施形態に係るモノクローナル抗体は、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトゲノムＤＮＡ配列あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから逸脱する組み換えＤＮＡ技術によって作製されたマウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンであってもよい。
【００４２】
あるいは、これらの実施形態に係るモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。かかるヒトモノクローナル抗体は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３６０５に記載されているように、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）再増殖によって、または米国特許第５，５４５，８０６号に記載されているように、ヒト抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物を用いることによって作製される。Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびｓｃＦｖ（「単鎖可変断片」）などのこれらのモノクローナル抗体に由来する断片もそれらが元の結合特性を保持している場合は、本明細書中に開示されているものの一部を形成する。かかる断片は、一般に、例えば、パパイン、ペプシン、または他のプロテアーゼによる抗体の酵素消化によって生じる。具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦの選択的阻害剤は、抗体の断片であり、この断片は、胎盤増殖因子に特異的に結合する。具体的な実施形態によれば、抗体断片はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【００４３】
特定の実施形態によれば、Ｆ（ａｂ’）２または一価Ｆａｂ断片の作製は、例えば、以下の通りである：Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するために、モノクローナル抗体を、０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に対して一晩透析することができる。次いで、抗体（２００部）を、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス（Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ）、ミザーリ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ））から入手可能なペプシン（１部）とともに３７℃で１時間のインキュベーションすることによって消化する。その結果、１０体積の抗体に１体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）を添加することによって消化が停止される。一価Ｆａｂ断片は、以下のように、パパイン消化によって作製することができる：１体積の１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を１０体積のモノクローナル抗体に添加し、次いで、１体積のパパイン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、モノクローナル抗体、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−システインＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および１５ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡという）を含む２５体積のリン酸緩衝液に添加する。３７℃で３時間のインキュベーションの後、新たに調製した終濃度３０ｍｍｏｌ／ｌのヨードアセトアミド溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加することによって消化を停止させ、混合物を室温で暗所で３０分間維持する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用い、混入しているインタクトなＩｇＧおよびＦｃ断片から、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片の両方を、さらに精製することができる。精製された断片は、最終的に、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳという）に対して透析することができる。断片の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定することができ、タンパク質濃度は、ビシンコニン酸Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））を用いて決定することができる。
【００４４】
（モノクローナル）抗体またはその断片を種々の使用のために改変してもよいことは、当業者に周知である。本発明に関する抗体は、酵素的、蛍光性たは放射性のタイプの適切な標識によって標識することができる。
【００４５】
抗ＰｌＧＦ抗体の例示は、当該分野で十分に実証されている。それらとしては、フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、２００７年）によって記載されたもの、またはマウスモノクローナル抗体Ｍａｂ−ＰＬ５Ｄ１１（ＷＯ０１／８５７９６；このモノクローナル抗体は、ウェーイーベー・ヴェサリウス・リサーチ・センター（ＶＩＢ  Ｖｅｓａｌｉｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ユーゼット・ガストゥイスベルク（ＵＺ  Ｇａｓｔｈｕｉｓｂｅｒｇ）、ヘレストラート（Ｈｅｒｅｓｔｒａａｔ）  ４９、Ｂ−３０００、リューヘン（Ｌｅｕｖｅｎ）において入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。１６Ｄ３抗体などの他の抗体が、例えば、ＥＰ１８６９０８５に記載されている。国際公開第２００４／００２５２４号も抗ＰｌＧＦ抗体の生じ方を記載している。欧州特許出願公開第１８６９０８５号公報および国際公開第２００４／００２５２４号は、ともに、参照によって本明細書中に援用される。さらに、抗ＰｌＧＦ抗体も、例えば、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー・インコーポレーティッド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）、アブカム（Ａｂｃａｍ）、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、シグマ−アルドリッヒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびさらに多くの企業から、市販されている。
【００４６】
また、上述の方法は他の抗体の生産、例えば、ＰｌＧＦの非選択的阻害剤である抗ＶＥＧＦＲ−１抗体の生産に適用されることが理解されるべきである。
【００４７】
ＰｌＧＦの他の阻害剤、ＰｌＧＦの具体的な選択的阻害剤としては、上述のような中和効果を有する、ペプチド、四量体ペプチド、タンパク質、有機分子またはその断片もしくは相同体が挙げられるが、これらに限定されない。この限定的なリスト中のさらなる阻害剤は、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子ならびにＰｌＧＦの翻訳を阻害するように機能するリボザイム、ペプチドアプタマー（例えば、ｓｉＲＮＡ（例えば、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー・インコーポレーティッド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ））、ヘアピンＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ（例えば、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー・インコーポレーティッド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ））、ナノボディならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。かかる（選択的ならびに非選択的）阻害剤の多くは、市販されている。可能な阻害剤のいくつかを、本明細書中でさらに説明する。
【００４８】
小分子、例えば、有機小分子および他の薬剤候補は、例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然物ライブラリーから入手することができる。上記の候補／試験分子についてスクリーニングするために、例えば、ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞系を用いてもよく、参照によって本明細書中に援用される国際公開第０１／８５７９６号に詳細に記載されているように、シグナル伝達をモニタリングする。
【００４９】
上記のモニタリングは、標準的な生化学的技術を用いて測定することができる。また、触媒活性の活性化もしくは抑制、他のタンパク質のリン酸化（例えば、受容体の細胞内ドメインのチロシンリン酸化）もしくは脱リン酸化、二次メッセンジャー生成の活性化もしくは調節、細胞イオンレベルの変化、シグナル分子の会合、解離もしくは転位、または特定の遺伝子の転写もしくは翻訳などの他の応答をモニタリングしてもよい。これらのアッセイは、スクリーニングの過程で、これらの目的のために開発された従来の技術を用いて行なってもよい。細胞受容体へのリガンドの結合の阻害は、シグナル伝達経路を介して、種々の細胞プロセスに影響を与え得る。ＶＥＧＦＲ−１／ＰｌＧＦシグナル経路の制御下の細胞プロセスとしては、未制御の細胞増殖、接触阻害の喪失、分化のブロッキングまたは細胞死などの異常または潜在的に有害なプロセスに加えて、通常の細胞機能、増殖、分化、細胞形態の維持および接着が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の技術による、記載された細胞プロセスのいずれかの定性的または定量的観察および測定を、スクリーニングの過程でシグナル伝達のスコアリングの手段として有利に用いてもよい。
【００５０】
小分子のスクリーニングの他の方法は、インシリコ設計によるものである。ヒト胎盤増殖因子の結晶構造は、入手可能であり（ＰＤＢコード：１ＦＺＶ）、そのため、これは、さらなる小分子アンタゴニスト選抜のためのプラットフォームとしても働き得る。阻害分子または一連の分子は、ＰｌＧＦの構造に基づいて設計することができ、その後上述のようなスクリーニングを用いてそれらを確認することができる。
【００５１】
固相支持体に付着したアミノ酸の全ての可能な組み合わせからなる本明細書中にさらに記載された四量体ペプチドライブラリーなどのランダムペプチドライブラリーは、所定の受容体のリガンド結合部位またはキナーゼドメインなどの受容体の他の機能ドメインに結合することができるペプチドを同定するために用いてもよい（ラム（Ｌａｍ）ら、１９９１年）。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、所定の受容体との相互作用を通じて受容体の生物学的活性を阻害するように作用する医薬品の発見において、治療上の価値を有し得る。ＰｌＧＦ（または場合によりＶＥＧＦＲ−１）に結合することができる分子の同定は、組み換えＰｌＧＦタンパク質（または可溶性ＶＥＧＦＲ−１タンパク質）でペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって達成し得る。例えば、ＶＥＧＦＲ−１のキナーゼおよび細胞外リガンド結合ドメインを別々に発現させて用いてペプチドライブラリーをスクリーニングしてもよい。可溶性ＶＥＧＦＲ−１分子を用いることに加えて、別の実施形態において、インタクトな細胞を用い、細胞表面受容体に結合するペプチドを検出することが可能である。この技術において用いられる細胞は、生きている細胞または固定細胞のいずれでもよい。細胞は、ランダムペプチドライブラリーとともにインキュベートされ、ライブラリー中のあるペプチドと結合し、標的細胞と関連する固相支持体／ペプチドとの間で「ロゼット」を形成する。その後、ロゼットを、分画遠心法によって単離するか、または手術用顕微鏡下で物理的に除去することができる。
【００５２】
特定の実施形態において、ＶＥＧＦ受容体のトランスドミナントネガティブ変異体形態（例えば、ＶＥＧＦ−Ｒ１のトランスドミナントネガティブ受容体）を用いてＰｌＧＦのシグナル伝達を阻害することができる。上記のＶＥＧＦ受容体のトランスドミナントネガティブ変異体形態の使用は、米国特許第５，８５１，９９９号に十分記載されている。さらに、胎盤可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いたＶＥＧＦ受容体Ｆｉｔ１のスプライスバリアントが、強力なＰｌＧＦアンタゴニストとして作用することが公知であり（ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）ら、１９９６年；シブヤ（Ｓｈｉｂｕｙａ）、２００１年）、可溶性ＶＥＧＦＲ１融合タンパク質（アイエロ（Ａｉｅｌｌｏ）ら、１９９５年）をインビボで用いて、ＰｌＧＦ活性を阻害することができる。しかしながら、それ自体ではうまくいくが、トランスドミナントネガティブ受容体の使用は、ＰｌＧＦのみの選択的阻害剤ではないという欠点を有し得る。したがって、特定の実施形態によれば、ＰｌＧＦの阻害剤は、トランスドミナントネガティブ受容体ではない。
【００５３】
ＲＮＡは、インビボでタンパク質機能を不活性化するためのその使用を考えると、有機小分子に対して明白な利点を有する。ＲＮＡコード配列をプロモーターに連結することができ、この人工遺伝子を細胞または生物に導入することができる。含まれる制御配列に依存して、これは、時間および／または組織特異的抑制遺伝子を構築する独特の方法を提供する。かかるＲＮＡ発現遺伝子は、通常、タンパク質コード遺伝子よりも小さく、遺伝子治療ベクターに容易に挿入することができる。外来性のタンパク質または変化したタンパク質とは異なり、ＲＮＡは、免疫応答を誘発する可能性が低い。アンチセンス分子およびリボザイムが、それらの合理的な薬剤設計および非常に強い特異性を見込んで、遺伝子機能を不活性化する「コードブロッカー」として開発されている（アルトマン（Ａｌｔｍａｎ）、１９９５年；マテウッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）、１９９６年）。機構的に、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）および生物工学的に作られたリボザイムはともに、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン塩基配列形成に基づいて標的ヌクレオチド配列とともに安定した二本鎖（またはＯＤＮのいくつかの場合においては三重鎖）を形成することによって、それらの作用の最初の段階で特異的結合を達成すると期待される。
【００５４】
ある実施形態において、ＰｌＧＦ阻害剤は、アプタマーであってもよい。アプタマーの構築および結合特性の決定の方法は、当該分野で周知である。例えば、かかる技術は、米国特許第５，５８２，９８１号、第５，５９５，８７７号および第５，６３７，４５９号に記載されており、それぞれ参照によって本明細書中に援用される。
【００５５】
アプタマーは、合成、組み換えおよび精製方法を含む任意の公知の方法によって作製してもよく、かつ単独でまたは同じ標的に特異的な他のリガンドと組み合わせて用いてもよい。一般に、特異的結合をもたらすためには、最低およそ３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチドが必要である。１０塩基よりも短い配列のアプタマーは、実現可能であり得るが、１０、２０、３０または４０ヌクレオチドのアプタマーが好ましいであろう。
【００５６】
アプタマーは、結合特異性を与える配列を含む必要があるが、フランキング領域で伸長されてもよく、他の方法で誘導体化されてもよい。具体的な実施形態において、アプタマーのＰｌＧＦ結合配列は、プライマー結合配列に隣接させて、ＰＣＲまたは他の増幅技術によるアプタマーの増幅を容易にしてもよい。さらなる実施形態において、フランキング配列は、ある部分を選択的に認識または結合して基質に対するアプタマーの固定化を促進する、特異的配列を含んでもよい。
【００５７】
アプタマーは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として、単離、配列決定および／または増幅もしくは合成されてもよい。あるいは、目的のアプタマーは、改変されたオリゴマーを含んでもよい。アプタマー中に元々存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホン酸基、リン酸基で置換するか、標準的な保護基によって保護するか、もしくは活性化して、他のヌクレオチドへのさらなる結合を作製するか、または固体支持体にコンジュゲートしてもよい。式中ＲがＨまたはアルキル（１〜２０Ｃ）でありＲ’がアルキル（１〜２０Ｃ）である、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＮＲ２によって置換されたＰ（Ｏ）Ｏなど、１つ以上のホスホジエステル結合を代替的結合基によって置換してもよい；また、この基は、ＯまたはＳを介して、隣接するヌクレオチドに付着していてもよい。オリゴマー中の全ての結合が同一である必要はない。
【００５８】
特異的結合配列を決定するための開始物質として用いられるアプタマーは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。具体的な実施形態において、当該配列は、一本鎖ＤＮＡであり、これはＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解を受けにくい。具体的な実施形態によれば、出発アプタマーは、約１０〜４００ヌクレオチド、特に、２０〜１００ヌクレオチドを一般に含むランダム化配列部分を含むであろう。ランダム化配列は、標的に結合することが分かっているアプタマーの増幅を可能にするプライマー配列に隣接されている。ランダム化領域の合成のために、ランダム化が所望される位置のヌクレオチドの混合物が、合成の際に添加され得る。
【００５９】
具体的な目的の標的に結合するアプタマーの作製およびスクリーニングのための方法は周知であり、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号および米国特許第５，２７０，１６３号であり、それぞれ参照によって援用される。当該技術は、一般に、候補アプタマーの混合物からの選択および結合の段階的相互作用、非結合アプタマーからの結合アプタマーの分離ならびに増幅を含む。最も高いアフィニティーのアプタマーに相当する少数の配列のみ（ことによると１分子のアプタマーのみ）が混合物中に存在するので、一般に、混合物中の有意な量のアプタマー（およそ５〜５０％）が分離の間に維持されるように、分配基準を設定することが望ましい。各サイクルは、標的への高いアフィニティーを有するアプタマーの濃縮をもたらす。３〜６回の選択および増幅サイクルの繰り返しを用いて、高いアフィニティーおよび特異性でＰｌＧＦなどの標的と結合するアプタマーを生成してもよい。
【００６０】
具体的な実施形態によれば、アプタマーは、ＰＬＧＦ、または場合によりＶＥＧＦＲ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）もしくはＶＥＧＦＲ−１／ＰｌＧＦシグナル経路の他の非核酸物質と特異的に相互作用するＲＮＡアプタマーである。これらは、治療用薬剤として用いることができる。ＲＮＡアプタマーは、それらが直接タンパク質機能を破壊する能力のために用いられる。インビトロでのアプタマーの選択は、特定のタンパク質に対する高い特異性およびアフィニティーを有する非常に珍しいＲＮＡの迅速な単離を可能にする。例示的なＲＮＡアプタマーは、ゴールド（Ｇｏｌｄ）らに対する米国特許第５，２７０，１６３号、ならびにエリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）およびショスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）、１９９０年、ならびにタック（Ｔｕｅｒｋ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ）、１９９０年による論文に記載されている。標的が一次元格子であるアンチセンス化合物とは異なり、ＲＮＡアプタマーは、タンパク質の三次元表面に結合することができる。さらに、ＲＮＡアプタマーは、しばしば、タンパク質の異なる機能部位の間を細かく区別することができる（ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、１９９５年）。治療用薬剤として、アプタマーは、抗体および低分子量薬剤の複合的利点を有するだけでなく、ＲＮＡアプタマーのインビボ生成も遺伝的に制御することができる。高アフィニティーＲＮＡアプタマーの制御された発現によって、タンパク質の特定のドメインを迅速に不活性化する手段が提供され、それによって、それらの機能および作用の機序を評価する。
【００６１】
米国特許第５，８４０，８６７号におけるトール（Ｔｏｏｌｅ）らおよび米国特許第６，２０７，３８８号におけるグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）らは、アプタマーを生成するための方法および生体分子に結合するアプタマーを開示している。これらのアプタマーを用い、分離ツール、診断用または治療用として、生体分子の正常な生物学的機能を妨げることができる。トール（Ｔｏｏｌｅ）らによって記載されているアプタマーは、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
【００６２】
コース（Ｋｏｒｔｈ）ら（コース（Ｋｏｒｔｈ）ら、１９９７年）は、シリアンゴールデンハムスタープリオンタンパク質に対する一本鎖ＲＮＡアプタマーを適用し、当該アプタマーは、数百の異なるタンパク質の混合物内で、それらの特異的な標的を認識することができた。デービス（Ｄａｖｉｓ）（１９９４年）は、トロンビンの活性部位に結合してインビボで抗凝固効果を示す一本鎖ＤＮＡアプタマーを記載した。
【００６３】
ラジェンドラン（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ）、マンジュラ（Ｍａｎｊｕｌａ）ら（ＵＳ２００２０１２７５８１）は、ＤＮＡが特定の非対称のモル比のヌクレオチドのランダムなインサートを有するＤＮＡプールを合成する工程；ＤＮＡプールを増幅する工程；蛍光標識ヌクレオチドを用いて、増幅ＤＮＡからＲＮＡプールを転写する工程；蛍光標識ＲＮＡプールをアフィニティーカラムにアプライして蛍光標識ＲＮＡプールから高アフィニティー蛍光ＲＮＡ分子を除去する工程；高アフィニティー蛍光ＲＮＡ分子からｃＤＮＡプールを得る工程；蛍光ＲＮＡ分子に関する増幅および選択工程を繰り返して蛍光ＲＮＡ分子をクローニングし、シグナル伝達アプタマーを得る工程を含む、シグナル伝達アプタマーのインビトロ選択のための方法を提供している。ＤＮＡ分子を含むシグナル伝達アプタマーも選択される。
【００６４】
リガンドの結合の際のコンフォメーション変化をシグナル伝達アプタマーの蛍光強度の変化に変換するシグナル伝達アプタマーも本明細書中に提供される。
【００６５】
このように、アプタマーは、ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦＲ１などの非核酸物質と特異的に相互作用するように設計することができる。アプタマーは、ＰｌＧＦの高アフィニティー受容体として機能するか、またはＰｌＧＦ（または場合によりＶＥＧＦＲ１）と密接に相互作用し得る。ＰＬＧＦまたはＶＥＧＦＲ１の周囲の最初に構造不定な分子のフォールディングおよびＰＬＧＦまたはＶＥＧＦＲ１との水素結合ネットワークの形成によって、この中和結合が容易になる。
【００６６】
しかしながら、アプタマーも、触媒的であり得る。触媒的なアプタマーは、リボザイムに近いか、またはアプタザイムと考えられる。アプタマーは、同様に、反対方向の核酸配列中の塩基の間でのワトソン・クリック塩基対形成に基づいて単純にそれらを結合するよりもむしろ、核酸物質と特異的に相互作用するように設計することができる。
【００６７】
かかるアプタマーは、触媒的である場合、ほとんどアプタザイムと称され得る。かかる特異的作用は、治療目的のために追求され得る。
【００６８】
ＰｌＧＦに対して、５３％の配列相同性を有するタンパク質である血管内皮増殖因子の１６５アミノ酸形態（ＶＥＧＦ１６５）に対する２’−フルオロピリミジンＲＮＡベースのアプタマーの生成は、ラックマン（Ｒｕｃｋｍａｎ）ら、１９９８年およびブリドノウ（Ｂｒｉｄｏｎｎｅａｕ）ら、１９９９年に詳細に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセス（上述されているゴールド（Ｇｏｌｄ）らによる米国特許）を用いて、ヒトＶＥＧＦ１６５に対する２’−Ｆ−ピリミジンＲＮＡオリゴヌクレオチドリガンド（アプタマー）が単離された。また、これらのアプタマーは、ＶＥＧＦ１６５およびＰｌＧＦ１２３のヘテロ二量体に結合し、アイソフォームＰｌＧＦ１５２などのようなより大きいアイソフォームに結合する可能性もある。３つの異なる配列ファミリーに由来する代表的なアプタマーが切断されて、ＶＥＧＦへの高アフィニティー結合が可能な最小配列（２３〜２９ヌクレオチド）になり、置換が許容された全てのリボプリン位置での２’−ＯＨへの２’−Ｏ−メチルの置換によってさらに改変された。中和抗ＰｌＧＦアプタマーを製造するために、当業者により、このプロトコールが用いられ得る。また、ＶＥＧＦアプタマー（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）、ペガプタニブナトリウム）は、ヒトに投与される第１の治療用アプタマーであり、加齢性黄斑変性の患者のために現在市販されている。
【００６９】
ＶＥＧＦＲ−１  ｍＲＮＡまたはＰｌＧＦ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように機能するリボザイムなどの触媒的ＲＮＡ分子を含むオリゴリボヌクレオチド配列も本明細書中に記載されているような阻害剤の範囲内である。
【００７０】
多数のＲＮＡ分子は、触媒として活性があることが知られており、単に情報を核外に運び出す手段として働くのではない。
【００７１】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機序は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼ的切断を含む。自己切断または他のＲＮＡを切断するリボザイムの活性は、ＲＮＡの二次構造に依存すると理解されており、これは塩基配列、および金属配置を含むことなどの要因に依存し得る。リボザイムは、遺伝子発現を人工的に制御することにおいて高い有用性を有する。塩基配列および予測可能なワトソン・クリック塩基対形成に基づいて、核酸の非常に特異的な電荷パターン、それらの塩基およびバックボーンならびにＤＮＡが予測可能な二次構造を形成する能力を利用し得る。核酸の小さい寸法および柔軟性のある性質は、タンパク質などの他の物質における特徴を認識し、かつ特異的に結合することができる複合体の構築によく適合させる。バイオチップ上にマウントされた一本鎖核酸への結合に依存するＳＥＬＥＸを活用したスクリーニング（ゴールド（Ｇｏｌｄ）らに対する米国特許第５，５６７，５８８号）を通して、研究者らは、触媒的に活性が１００倍または１０００倍も高いリボザイムを発見した。フェルナンデズ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）ら（２００１年）は、リボザイム中の単一分子のコンフォメーション変化から収集されたデータを報告している。また、フェルナンデズ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）らは、かかる本質的に二本鎖の核酸構造は、期待されるであろう対結合による進行性の対ではなく、コンフォメーション中の「全か無か」の離散遷移を経ることを報告している。
【００７２】
切断部位で別々のＲＮＡ分子を切断する酵素活性を有する環状ＲＮＡおよびインビボで内在性リボザイム結合タンパク質を通してＲＮＡに安定性を与えることができるＲＮＡ分子が、ビーン（Ｂｅｅｎ）らの米国特許第５，７１２，１２８号およびシオウド（Ｓｉｏｕｄ）の米国特許第５，９８５，６２０号に記載されている。
【００７３】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特定のリボザイム切断部位は、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって、最初に同定される。一旦同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に相当する１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適当にし得る二次構造などの予測される構造的特性について評価し得る。また、候補標的の適合性は、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用い、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するそれらの接触性を試験することによって評価し得る。
【００７４】
阻害を提供する別の方法は、被験体、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトにおけるフィラデルフィア染色体陽性白血病の治療のためのＰｌＧＦ（または場合によりＶＥＧＦＲ−１）ＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子操作されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子の使用である。アンギオザイムなどの抗ＶＥＧＦＲ−１リボザイムが、リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーティッド（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）、ボルダー（Ｂｏｕｌｄｅｒ）、コロラド（Ｃｏｌｏｒａｄｏ）  ８０３０１、ＵＳＡによって、ＶＥＧＦＲ−１  ｍＲＮＡに対して開発されており、癌治療にすでに用いられている（ウェン（Ｗｅｎｇ）およびウスマン（Ｕｓｍａｎ）、２００１年；パブコ（Ｐａｖｃｏ）ら、２０００年）。いくつかある抗ＶＥＧＦＲ−１触媒ＲＮＡ分子の中でも、このアンギオザイムは、ＰｌＧＦ受容体活性の阻害のために用いることができ、これは主なＰｌＧＦ受容体であるＶＥＧＦＲ−１のｍＲＮＡを特異的に切断することによってＰｌＧＦ受容体機能をダウンレギュレーションする。抗ＶＥＧＦＲ−１リボザイムの臨床治験が、乳癌について現在進行中である。
【００７５】
本明細書中で想定される他の阻害剤は、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子ならびにＰｌＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ配列またはその受容体ＶＥＧＦＲ−１  ｍＲＮＡの一部に相同なｓｉＲＮＡコンストラクトを含むオリゴリボヌクレオチド配列である。ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、ファイヤ（Ｆｉｒｅ）および同僚らにより、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現をブロッキングすることができるという観察を述べるために最初に作り出された用語である（ファイヤ（Ｆｉｒｅ）ら、１９９８年）。ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的翻訳後サイレンシングを支配し、遺伝子機能を研究するための新たなツールを提供している。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ分解を含む。ＰｌＧＦは、目的の細胞に上記ＰｌＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部に相同なｓｉＲＮＡコンストラクトを導入することを含む目的の細胞におけるＰｌＧＦの発現の選択的翻訳後サイレンシング方法によってサイレンシングすることができる。本発明は、細胞におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ＰｌＧＦ発現および／または細胞におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ＶＥＧＦＲ−１発現を翻訳後遺伝子サイレンシングすることによって被験体におけるＰｈ＋白血病を治療する方法を提供する。これは、ヒト患者におけるインビボで、特に重要な方法である。同様に、ＰｌＧＦ  ＲＮＡｉの使用が、Ｐｈ＋白血病の治療のために想定される。
【００７６】
ＲＮＡｉを開始するために用いられるｄｓＲＮＡは、天然の供給源から単離してもよく、公知の手段によって生成、例えば、ＤＮＡから転写してもよい。例えば、プロモーター（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識される結合部位を含むＤＮＡの任意の二本鎖配列を意味する）へのＲＮＡポリメラーゼの結合は、転写の開始を可能にする。多くの公知のプロモーター配列、例えば、限定されないが、ファージＴ７、Ｔ３またはＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を用いて、ｄｓＲＮＡを生成することができる。しかしながら、これは、このように同定され、相当するＲＮＡポリメラーゼが入手可能な任意のプロモーター配列を使用できることが当業者に明らかであるので、限定を表すものではない。あるいは、ｄｓＲＮＡを形成するために用いられる二本鎖のＤＮＡは、同じ、またはそれぞれが少なくとも部分的に相補的な配列のＤＮＡ鎖とともに形成する２つの異なる二本鎖に属していてもよい。ｄｓＲＮＡがこのようにして生成される場合、転写されるＤＮＡ配列は、一方が鎖の一方の転写を制御し、他方が相補鎖を制御する２つのプロモーターに隣接されている。これらの２つのプロモーターは、同一であってもよく、異なっていてもよい。実際、米国特許第５，７９５，７１５号に従うと、プロモーター配列とともに各末端に提供されるＤＮＡ二本鎖は、定義された長さを有し、対になってｄｓＲＮＡを結合させることができるＲＮＡを、直接生成することができる。
【００７７】
ｄｓＲＮＡは、合成であれ天然由来であれ、種々の動物種、特に、霊長類の血清中に存在するヌクレアーゼによる迅速な分解の対象である。結果的に、ｄｓＲＮＡに関する手順は、一般に、初めから終わりまで、焼成ガラス製品を利用し、全ての緩衝液は、無菌性のために、例えば、ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）  ４５ミクロンフィルターを通して、ろ過される。エンドドキシン混入のいかなる可能性も最小限にするために、全ての溶液について、パイロジェンフリー再蒸留水を用いなければならない。
【００７８】
ｄｓＲＮＡ溶液の濃度は、そのＵＶスペクトルから決定してもよい。例えば、天然または合成ｄｓＲＮＡのモル濃度は、文献から入手可能な吸光係数または標準的な手順を用いて測定された吸光係数を用いて、２６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）から測定される：ＯＤ２６０の４４．７倍＝マイクログラムｄｓＲＮＡ／ｍｌ
【００７９】
適切な場合、操作の容易性のために、ｄｓＲＮＡ溶液を、パイロジェンフリー緩衝液で希釈することができる。場合により、得られたｄｓＲＮＡを支持体；またはアビジンでコートされた支持体に付着させることができるビオチンなどのリガンドに連結させてもよい。これによって、解析用ツールとして利用した場合、直接の定量化が可能になる。
【００８０】
具体的な実施形態によれば、本発明のｄｓＲＮＡ組成物は、被験体の治療のため、具体的には、ヒト患者の治療のための医薬組成物として作製される。より具体的には、当該医薬組成物を投与して、ヒト患者におけるフィラデルフィア染色体陽性白血病が治療される。他の実施形態において、当該組成物を用いて、標的遺伝子が欠損しているか、この場合発現が阻害されている、機能的「ノックアウト」モデル生物が作製される。ｄｓＲＮＡ医薬組成物は、上記患者に局所領域的に投与することができる。本発明のｄｓＲＮＡ医薬組成物は、好ましくは、化合物または混合物を、例えば、非経口的、静脈内、皮内、筋肉内または皮下、もしくは経皮的に投与可能にするのに適した薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む。有効成分は、任意の従来の薬学的に許容され得る担体または賦形剤とともに混合または配合されてもよい。
【００８１】
機能性の可能性の高いＶＥＧＦＲ１遺伝子のサイレンシングおよび９０％超のｍＲＮＡのノックダウンのための選択されたｓｉＲＮＡは、ダーマコン・インコーポレーティッド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．）、ラファイエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）、ＣＯ８００２６、ＵＳＡから入手可能である。ＳＭＡＲＴプーリング／ＳＭＡＲＴセレクションと称される、全て１つの標的遺伝子に対するいくつかの異なるｓｉＲＮＡ二本鎖の貯蔵は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子および／またはＰｌＧＦ遺伝子をサイレンシングするための効率的な技術として用いられる。ＰｌＧＦに対するｓｉＲＮＡも市販されている（例えば、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー・インコーポレーティッド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．））。
【００８２】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡに結合することおよびタンパク質翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンスＤＮＡに関して、翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチド、例えば、ＶＥＧＦＲ−１またはＰｌＧＦヌクレオチド配列の−１０〜＋１０領域が、具体的に想定される。例えば、ＶＥＧＦＲ２アンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクションによって獲得された、別のチロシンキナーゼ受容体であるＶＥＧＦＲ２受容体のダウンレギュレーションは、標準的なアンチセンス技術によって、すでに獲得されている（ベラード（Ｂｅｒａｒｄ）ら、１９９７年）。さらに、ＰｌＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ１に対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドが、インビボで、血管新生をブロックすることが実証されている（マーチャンド（Ｍａｒｃｈａｎｄ）ら、２００２年）。さらに、ＰｌＧＦタンパク質産生のアンチセンス阻害は、ヨネクラ（Ｙｏｎｅｋｕｒａ）ら（１９９９年）によってすでに実証されている。
【００８３】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子の両方ならびにリボザイムは、ＲＮＡ（またはＤＮＡ）分子を合成する当該分野で公知の任意の方法によって作製してもよい。これらのものとしては、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成などの当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術が挙げられる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成されてもよい。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む広範なベクターに組み込んでもよい。あるいは、用いられるプロモーターに依存して、構成的または誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡコンストラクトは、細胞系に安定して導入することができる。
【００８４】
また、特定の実施形態において、フィラデルフィア染色体陽性白血病の治療のための本発明の治療方法は、Ｐｈ＋白血病の治療のための当該分野で公知の任意の他の療法と組み合わせて使用できることは明らかである。具体的に想定される療法としては、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤、特に、ＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤、例えば、イマチニブなどが挙げられる。
【００８５】
本出願において用いられる用語「薬剤」は、上記のような疾患を治療するための、前記分子（阻害剤）および薬学的に許容され得る担体または賦形剤（両方の用語は、互換的に用いられ得る）を含む組成物に関する。当業者に公知の適切な担体または賦形剤は、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、ハンクス溶液、固定油、オレイン酸エチル、５％ブドウ糖を含む生理食塩水、等張性および化学安定性を高める物質、緩衝液ならびに保存剤である。他の適切な担体としては、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーなどの、組成物を施される個体に有害な抗体の産生をそれ自体では誘導しない任意の担体が挙げられる。「薬剤」は、当業者の知識の範囲内の任意の適切な方法によって投与してもよい。好ましい投与の経路は非経口的である。
【００８６】
非経口投与において、本発明の薬剤は、上記で定義された薬学的に許容され得る賦形剤に伴って、溶液、懸濁液または乳濁液などの単位投薬注射可能形態で製剤化される。しかしながら、投与量および投与の様式は個体に依存する。一般に、薬剤は、ＰｌＧＦ阻害剤（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、化合物または分子）が１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、最も具体的には０．１〜２ｍｇ／ｋｇの用量で施されるように投与される。好ましくは、これは、ボーラス投与として施される。また、持続注入を用いてもよく、浸透圧ミニポンプを介した持続皮下送達が挙げられる。そうだとしたら、薬剤は、５〜２０μｇ／ｋｇ／分、より具体的には７〜１５μｇ／ｋｇ／分の用量で注入してもよい。
【００８７】
本明細書中で用いられる用語「薬学的に許容され得る担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが挙げられる。医薬有効成分のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が本発明の組成物と不適合性である場合を除いて、治療製剤におけるその使用が期待される。補助的な有効成分も製剤処方中に組み込むことができる。
【００８８】
従来採用されており、有効成分に関して不活性な任意の投与の様式、ビヒクルまたは担体を、本発明の医薬組成物を作製または投与するために利用してもよいことは、当業者に理解されるであろう。かかる方法、ビヒクルおよび担体の実例は、例えば、レミングストンズ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第４版（１９７０年）に記載されているものであり、その開示は参照によって本明細書中に援用される。本発明の原理に触れた当業者は、適切で適当なビヒクル、賦形剤および担体を決定するのに、またはそれとともに有効成分を配合して本発明の医薬組成物を形成するのに、困難を経験しない。
【００８９】
本発明の医薬組成物中に含まれる有効成分の治療上有効量は、その都度、いくつかの要因、例えば、治療される患者のタイプ、大きさおよび状態、意図される投与の様式、意図される剤形を患者が取り込む能力などに依存する。一般に、有効成分の量は、各剤形に、約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、具体的には約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇを与えるように含まれる。本明細書中で用いられる「治療量」または治療上有効な量は、疾患の１つ以上の症状を寛解させる量である。かかる量は、典型的には、阻害剤および疾患の重症度に依存するが、場合により、日常の実験を通じて、当業者によって決定され得る。
【００９０】
治療のための投与の別の側面は、前記ＰｌＧＦ遺伝子のアンチセンス遺伝子もしくは機能部分またはＰｌＧＦ  ｍＲＮＡもしくはその機能部分に対するリボザイムを送達する遺伝子治療の使用である。遺伝子治療は、患者の細胞への治療用核酸の送達による治療を意味する。これは、レバー（Ｌｅｖｅｒ）およびグッドフェロー（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ）、１９９５年；Ｂｒ．Ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ．、５１、１〜２４２；クルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）ら、１９９５年；レッドリー（Ｌｅｄｌｅｙ）、１９９５年において広範に概説されている。遺伝子治療を達成するために、患者の細胞に遺伝子を送達する方法および任意の治療用遺伝子の有効な生産を確実にするさらなる方法がなければならない。
【００９１】
インビトロで、特にインビボでも、標的細胞における治療用遺伝子産物発現を達成するように意図された遺伝子治療プロトコールが、当該分野で広範に説明されている。これらのものとしては、プラスミドＤＮＡ（ネイキッドのものまたはリポソーム中のもの）の筋肉内注射、間質内注射、気道中の注入、内皮への適用、肝実質内、および静脈内または動脈内の投与（例えば、肝動脈内、肝静脈内）が挙げられるが、これらに限定されない。標的細胞に対するＤＮＡの有効性を高めるために、種々の装置が開発されている。単純なアプローチは、標的細胞を、ＤＮＡを含むカテーテルまたは埋め込み可能な器具と物理的に接触させることである。別のアプローチは、高圧下で標的組織中に直接液体のカラムを突出する針を用いないジェット注射装置を利用することである。また、これらの送達パラダイムは、ウイルスベクターを送達するために用いられ得る。標的遺伝子送達のための別のアプローチは、分子コンジュゲートの使用であり、これは、細胞への核酸の特異的標的化のために核酸またはＤＮＡ結合剤が付着したタンパク質または合成リガンドからなる（クリスティアーノ（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ）ら、１９９３年）。標的細胞は、典型的には、治療される必要のある症状に依存し、当業者によって選択され得る（例えば、白血病を治療するための骨髄細胞または間質細胞）。
【００９２】
遺伝子治療ベクターは、治療量のＰｌＧＦ阻害剤を発現するべきである。具体的な実施形態によれば、本出願において説明される遺伝子治療ベクターは、長期間にわたって、治療量の遺伝子産物の発現を支配する。実際、治療レベルが達成される限りは、新しい治療は必要ない。典型的には、治療用発現は、少なくとも２０日間、少なくとも５０日間、少なくとも１００日間、少なくとも２００日間、およびいくつかの場合においては３００日間以上続くことが想定される。コード配列によってコードされる遺伝子産物（例えば、ポリペプチド、ＲＮＡｉなど）の発現を、抗体ベースのアッセイ、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイによるなどの任意の当該分野において認識されている手段によって測定し、例えば、遺伝子産物の治療上の発現が達成されているかどうかを評価することができる。また、遺伝子産物の発現は、遺伝子産物の酵素的または生物学的活性を検出する生物検定において測定してもよい。
【００９３】
遺伝子治療ベクターは、エピソームベクター（すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれない）であってもよく、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。エピソームベクターの例示としては、（染色体外）プラスミド、および発現カセットのみで構成され、細菌性配列がない、いわゆるミニサークルが挙げられ、宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターの例示としては、ウイルスベクターが挙げられる。
【００９４】
代表的なプラスミドベクターとしては、ｐＵＣベクター、ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ｐＢＳ）およびｐＢＲ３２２またはそれらの細菌性配列のない誘導体（ミニサークル）が挙げられる。プラスミドベクターのいくつかは、トランスフェクト細胞中でのエピソームプラスミド持続性を高める要素を組み入れるように適応させ得る。かかる配列としては、転写単位に連結された足場／マトリックス付着領域モジュールに相当するＳ／ＭＡＲが挙げられる（ジェンケ（Ｊｅｎｋｅ）ら、２００４年；マンツィーニ（Ｍａｎｚｉｎｉ）ら、２００６年）。
【００９５】
代表的なウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスに由来するベクターが挙げられる。あるいは、遺伝子送達系を用いて、ナノ粒子またはビロソームなどのウイルス成分および非ウイルス成分を組み合わせることができる（ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）ら、２００３年）。
【００９６】
レトロウイルスおよびレンチウイルスは、感染後にそれらのゲノムを宿主細胞染色体に挿入する能力を有するＲＮＡウイルスである。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を欠くが、細胞に感染してそれらの遺伝子を標的細胞の染色体に挿入する能力は保持するレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが開発されている（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９９０年；ナルディニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）ら、１９９６年）。レンチウイルスベクターと古典的なモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベースのレトロウイルスベクターとの間の違いは、レンチウイルスベクターが分裂および非分裂細胞の両方を形質導入できるが、ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターは分裂細胞のみを形質導入できることである。
【００９７】
アデノウイルスベクターは、生きている対象に直接投与されるように設計される。レトロウイルスと異なり、アデノウイルスベクターゲノムのほとんどは、宿主細胞の染色体に組み込まれない。その代わり、アデノウイルスベクターを用いて細胞に導入された遺伝子は、長期間にわたって存続する染色体外要素（エピソーム）として核中に維持される。アデノウイルスベクターは、気道上皮細胞、間質細胞、肝細胞および種々の腫瘍などのインビボの多くの異なる組織中で分裂細胞および非分裂細胞を形質導入する（トラップネル（Ｔｒａｐｎｅｌｌ）、１９９３年）。
【００９８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、疾患を引き起こすことが知られており、その結果非常に温和な免疫応答しか引き起こさず、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染する小さいｓｓＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み入れることができる。これらの特性は、ＡＡＶを、遺伝子治療のためのウイルスベクターを作製するための非常に魅力的な候補とさせるが、ベクターのクローニング能力は比較的限られている。
【００９９】
別のウイルスベクターは、大きい二本鎖ＤＮＡウイルスであり、単純ヘルペスウイルスに由来する。別のｄｓＤＮＡウイルスである組み換え型のワクシニアウイルスは、大きいインサートを収容することができ、相同組み換えによって生じる。
【０１００】
本明細書中に挙げられた阻害剤は、フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋またはＢＣＲ−ＡＢＬ＋）白血病の治療のために用いてもよく、Ｐｈ＋（ＢＣＲ−ＡＢＬ＋）白血病の治療用薬剤の製造のために用いてもよい。Ｐｈ＋／ＢＣＲ−ＡＢＬ＋白血病の治療方法は、典型的には、治療を必要とする被験体、最も具体的にはヒト被験体へのかかるＰｌＧＦ阻害剤の投与を含む。Ｐｈ＋白血病の具体的なサブセットは、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）である。したがって、具体的な実施形態によれば、本出願において説明された使用および方法は、ＣＭＬの治療のためである。Ｐｈ＋白血病の別の重要なカテゴリーは、同様にフィラデルフィア染色体の存在によって特徴付けられる、急性リンパ球性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病（ＡＬＬ）である。このカテゴリーは、典型的には、Ｐｈ＋ＡＬＬ症例において多くの標準的な治療が失敗するように悪い予後を有する。具体的な実施形態によれば、フィラデルフィア染色体（またはＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質）が存在するもう一方の白血病も本明細書中に記載されている使用および方法に適するであろう。しかしながら、これらの症例は、ＣＭＬまたはＡＬＬよりも一般的でない。それでもなお、Ｐｈ＋ＡＭＬ（急性骨髄球性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病）のいくつかの症例が報告されており、かかるＰｈ＋白血病の症例も本出願において提供される使用および方法から恩恵を得ると想定される。
【０１０１】
白血病が深刻な疾患であり、しばしば患者にとって悪い予後を伴うことを知ることは、重要である。したがって、１つの治療のアプローチが失敗した場合に、他の治療戦略、または併用法を提供することができることは、重要である。治療の恩恵を、具体的には他の治療計画から恩恵を得られない患者にも提供することは、本出願の目的である。
【０１０２】
フィラデルフィア染色体陽性白血病、具体的にはＣＭＬの、標準的な治療は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤またはチロシンキナーゼ阻害剤の使用である。このタイプの薬剤の最もよく知られている例は、イマチニブであるが、ニロチニブ（ＡＭＮ１０７）、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、ＡＴ９２８３（アステックス・セラピューティクス（Ａｓｔｅｘ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））、ＳＧＸ３９３（イーライ・リリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ））、ＩＮＮｏ−４０６（イノバイブ・ファーマシューティカルズ（Ｉｎｎｏｖｉｖｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、ボスチニブ（ＳＫＩ６０６）、およびＭＫ０４５７（Ｍｅｒｃｋ）などの、いくつかの他の例が存在する。
【０１０３】
しかしながら、いくつかの報告によって、これらの薬剤に対する抵抗性が一般的な問題であることが示されている。実際、白血病細胞は、治療が成功した患者においても生き残っており、患者の一部は抵抗性を生じ、最終的には再発する（スワーズ（Ｓｗｏｒｄｓ）ら、２００７年；ブチャート（Ｂｕｃｈｅｒｔ）、２００７年；リ（Ｌｉ）およびリ（Ｌｉ）、２００７年；クジャウスキー（Ｋｕｊａｗｓｋｉ）およびタルパッツ（Ｔａｌｐａｚ）、２００７年）。具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療することができないＰｈ＋白血病、および／またはより具体的にはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独で治療することができない症例の治療のために用いられる。フィラデルフィア染色体陽性白血病は、種々の理由のため、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独）で治療することができないことがあり、その２つの最も一般的なものは、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対して悪性細胞が非感受性であることおよび医薬が患者によって許容されないことである。
【０１０４】
ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対する白血病細胞の非感受性は、いくつかの機序により（シャア（Ｓｈａｈ）およびソイヤーズ（Ｓａｗｙｅｒｓ）、２００３年）、発症から起こり得る（すなわち、最初の治療で非感受性）か、または（例えば、再発を示す患者において、または例えば、急性転化期のさらに進行した白血病の患者において）抵抗性を獲得し得る。
【０１０５】
また、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤は、患者において有害な副作用を引き起こすことが知られており、これは特定の患者にとって薬剤がもはや適さなくなることにつながり得る。患者におけるアレルギー反応も医薬に対する不耐性につながり得る。
【０１０６】
特定の実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤での治療に（少なくとも部分的に）抵抗性のあるＰｈ＋白血病の治療のために用いられる。ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対して（部分的に）抵抗性のある白血病は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対する応答が減弱した白血病細胞が存在する白血病として定義され得る。応答が減弱した細胞の量は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対する抵抗性の程度の指標である。典型的には、必ずしもそうではないが、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対する（部分的）抵抗性は、後天的な現象である。さらなる特定の実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、イマチニブ抵抗性Ｐｈ＋白血病の治療のために用いられる。かかる白血病の非限定的な例示としては、イマチニブ抵抗性Ｐｈ＋ＣＭＬ、イマチニブ抵抗性Ｐｈ＋ＡＬＬ、例えば、イマチニブ抵抗性Ｐｈ＋Ｔ−ＡＬＬ、イマチニブ抵抗性Ｐｈ＋Ｂ−ＡＬＬが挙げられる。
【０１０７】
もちろん、全ての奨励においてではないが、時々、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対する抵抗性、特に、マチニブに対する抵抗性は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子、特に、チロシンキナーゼドメインにおける変異と関連がある。Ｔ３１５Ｉ変異が、その最もよく知られている例である。他の例示としては、Ｅ２５５Ｋ、Ｅ２５５Ｖ、Ｙ２５３Ｈ、Ｈ３９６Ｐ、Ｆ３１７Ｌ、Ｍ３５１Ｔ、Ｇ２５０Ｅ、Ｆ３１１Ｌ、Ｍ２４４Ｖ、Ｆ３５９Ｖ、Ｌ３８７Ｍ、Ｈ３９６Ｒ、Ｑ２５２Ｈ、Ｙ２５３Ｆ、Ｑ２５２Ｒ、およびＥ３５５Ｇ変異が挙げられる（シャア（Ｓｈａｈ）およびソイヤーズ（Ｓａｗｙｅｒｓ）、２００３年）。コービン（Ｃｏｒｂｉｎ）らは、特に、Ｇ２５０Ｅ、Ｈ３９６Ｐ、Ｈ３９６Ｒ、Ｅ２５５ＶおよびＴ３１５Ｉがイマチニブに対する抵抗性を与えるように見えることを報告した（コービン（Ｃｏｒｂｉｎ）ら、２００３年）。具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子が少なくとも１つの変異を有するＰｈ＋白血病の治療のために用いられる。さらなる具体的な実施形態によれば、ＰｌＧＦ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤で治療することができないおよび／またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独で治療することができない、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子が少なくとも１つの変異を有するＰｈ＋白血病の治療のために用いられる。さらにさらなる具体的な実施形態によれば、Ｐｈ＋白血病は、イマチニブで治療することができないか、またはイマチニブ単独で治療することができない。さらにより特定の実施形態によれば、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子中の少なくとも１つの変異は、Ｔ３１５Ｉ、Ｅ２５５Ｋ、Ｅ２５５Ｖ、Ｙ２５３Ｈ、Ｈ３９６Ｐ、Ｆ３１７Ｌ、Ｍ３５１Ｔ、Ｇ２５０Ｅ、Ｆ３１１Ｌ、Ｍ２４４Ｖ、Ｆ３５９Ｖ、Ｌ３８７Ｍ、Ｈ３９６Ｒ、Ｑ２５２Ｈ、Ｙ２５３Ｆ、Ｑ２５２ＲおよびＥ３５５Ｇの変異からなる群から選択される。
【０１０８】
フィラデルフィア染色体陽性白血病の治療のための胎盤増殖因子の阻害剤の使用は、独立型の療法または治療の方法であってもよいことが想定される。しかしながら、具体的な実施形態によれば、Ｐｈ＋白血病の治療におけるＰｌＧＦ阻害剤の使用は、併用療法の一部として想定される。したがって、ＰｌＧＦ阻害は、放射線療法、化学療法、生物学的療法（例えば、インターフェロン治療）、幹細胞移植、骨髄移植、外科手術（例えば、脾臓除去）、またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害、Ｌｙｎ阻害、Ｈｓｐ９０阻害、Ｓｒｃ阻害などの標的療法などのＰｈ＋白血病を治療するために用いられる他の療法とともに用いられてもよい。もちろん、ＰｌＧＦ阻害は、これらの療法の２以上（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＬｙｎ阻害とともに）を組み合わせて用いてもよい。
【０１０９】
ＰｌＧＦ阻害は、他の療法と同時に、または他の療法の前もしくは後に行なってもよく、または、それらを、例えば、間欠的に変化させてもよい。当業者は、最適な治療計画に基づいて、場合により日常の実験の後に、決定することができる。
【０１１０】
具体的な実施形態、特定の構成ならびに材料および／または分子を、本発明による細胞および方法について本明細書中で説明してきたが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変化および改変がなされてもよいことが、理解されるべきである。以下の実施例は、具体的な実施形態をよりよく説明するために提供され、本出願を限定すると見なされるべきでない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１１】
材料および方法
動物
雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢）をジャンビエール（Ｊａｎｖｉｅｒ）から得た。飼育および全ての実験動物手順は、ケー．ユー．リューヘン（Ｋ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ）の動物の取り扱いと動物実験に関する企業内諮問委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１１２】
細胞および培養条件
ＫＣＬ−２２およびＣＲＬ−１９２９細胞を、ＡＴＣＣから得た。Ｂｖ−１７３、Ｋ５６２、ＢａＦ３、３２ＤおよびＮａｌｍ６細胞は、ジェイ・クールズ（Ｊ．Ｃｏｏｌｓ）（ヴェーイーベー、リューヘン（ＶＩＢ、Ｌｅｕｖｅｎ））の厚意により提供された。Ｂｖ−１７３細胞およびＫ５６２細胞を、２０％ＦＣＳ（ハイクローン・ラボラトリーズ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を含むＲＰＭＩ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））中で培養し；ＢａＦ３、３２ＤおよびＫＣＬ−２２細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中で培養し；Ｎａｌｍ６細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））中で培養し、ＣＲＬ−１９２９細胞を、２０％ＦＣＳと０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））とを含むＩＭＤＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））中で培養した。
【０１１３】
一次マウス骨髄由来間質細胞（ＢＭＤＳＣ）の単離
ＢＭＤＳＣの単離のために、大腿骨および脛骨由来の骨髄をフラッシングし、溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ（ＮＨ４Ｃｌ）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3（ＫＨＣＯ３）、ｐＨ７．４）で赤血球を除去し、続いて細胞を、１５％ＦＣＳが補われたＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間後に、非接着細胞画分を除去し、接着細胞をさらに培養し、３週間増殖させた。
【０１１４】
増殖アッセイおよび共培養
ＭＴＴアッセイを用いること、または血球計算器を用いた手作業での集計によって、白血病細胞およびＢＭＤＳＣの増殖を解析した。マウス組み換えＰｌＧＦおよび抗ＶＥＧＦＲ−１を、アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から得た。抗ＰｌＧＦおよび対照ＩｇＧは、トロンボジェニックス（Ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｓ）およびバイオインベント（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）によって製造され、説明されるように特徴付けられる（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、２００７年）。ＰｌＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用い、抗体は、他に示されない限りは、１００倍モル過剰で用いた。共培養実験のために、１０５個のＢＭＤＳＣを、４×１０５個の白血病細胞単独とともに、または血清不含培地中のそれぞれの抗体の存在下で、４８時間培養した。続いて、接着ＢＭＤＳＣおよび非接着白血病細胞の数を測定し、ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦタンパク質の解析のために上清を回収した。
【０１１５】
末梢血解析
後眼窩出血によるキャピラリーピペットで血液を採取し、白血球数（ＷＢＣ）を、自動細胞計数器を用いて測定した（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡ
「Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ」マウスＰｌＧＦおよびマウスＶＥＧＦイムノアッセイ（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））を用い、細胞培養上清、末梢血血漿および骨髄血漿において、ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦの濃度を定量した。濃度を、ｐｇ／ｍｌ／１０５個の細胞またはｐｇ／ｍｌとして表した。
【０１１７】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲは、本質的に、以前に記載されているようにプライマーおよびプローブを用いて行なった（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、２００７年）。
【０１１８】
ＢＣＲ−ＡＢＬ＋プレＢ細胞白血病の同系モデル
ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ＢａＦ３細胞を上述のように培養し、１×１０６個の細胞を、尾静脈を通して同系８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスに注射した。
【０１１９】
イマチニブ感受性およびイマチニブ抵抗性ＣＭＬの移植モデル
ＣＭＬの誘導のために、２００ｍｇ／ｋｇ  ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ；シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））での処理の４日後にＢａｌｂ／Ｃドナー（８週齢）から、大腿骨および脛骨をフラッシングすることによって骨髄細胞を回収し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦを含む培地中においてインビトロで予備刺激した。続いて、前記細胞を、レトロウイルスストックでの１回の共沈降に供した（レトロウイルスコンストラクト：ＭＣＳＶ−ＧＦＰ、ＭＳＣＶ−ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｐ２１０  ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、ＭＳＣＶ−ＢＣＲ−ＡＢＬ−Ｔ３１５Ｉ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ；ジャン・クールズ（Ｊａｎ  Ｃｏｏｌｓ）の厚意により提供された）。レシピエント雌マウスを致死線量照射により準備し、形質導入された骨髄を、動物１匹あたり０．５×１０6（０．５×１０６）個の細胞の静脈内注射により移植した。
【０１２０】
実施例１  インビトロでの白血病細胞および一次骨髄間質細胞におけるＰｌＧＦ発現の解析
インビトロでの、白血病細胞によるおよび白血病関連間質細胞の異型集団によるＰｌＧＦの発現プロファイルを決定するために、一組のＢＣＲ−ＡＢＬ＋骨髄系およびリンパ球細胞系（マウス：ＢａＦ３、３２Ｄ；ヒト：Ｋ５６２、Ｂｖ−１７３、ＫＣＬ−２２）においてＰｌＧＦ発現を解析した。また、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬ−リンパ球細胞系Ｎａｌｍ−６を調べた。さらに、骨髄間質細胞の異型集団において、ＰｌＧＦ発現を定量化した。ＥＬＩＳＡによって測定すると、調べられた全ての白血病細胞系においてＰｌＧＦタンパク質の発現は見出されず、マウス骨髄から単離された健常ＣＤ４５＋造血細胞において非常に少量（４１±２．３ｐｇ／ｍｌ）が見出された（図１Ａ）。対照的に、マウス一次骨髄由来間質細胞（ＢＭＤＳＣ）および間質細胞系（Ｓ１７、ＯＰ９）は、大量のＰｌＧＦタンパク質を発現した（図１Ａ）。
【０１２１】
骨髄由来間質細胞のＦＡＣＳ解析から、３週間の平均培養期間の後、マウスＢＭＤＳＣの４９．７％±２０％が造血系統であることが明らかになった（示さず）。マウスＢＭＤＳＣの造血画分（ＣＤ４５＋）または非造血画分（ＣＤ４５−）がＰｌＧＦを発現したかどうかを解明するために、我々は、免疫磁気アプローチによって両方の集団を分離させ（純度＞９３％、示さず）、続いて、ＣＤ４５＋およびＣＤ４５−ＢＭＤＳＣの上清中のＰｌＧＦを測定した。これらの実験によってＣＤ４５−ＢＭＤＳＣによるＰｌＧＦのほとんど独占的な発現が明らかにされた（図１Ｂ）（Ｎ＝３；ｐ＜０，００１）。さらに、我々は、ヒト（ＨＵＶＥＣ）およびマウス（ｆＥＮＤ５）内皮細胞におけるＰｌＧＦ発現を測定し、ＰｌＧＦタンパク質の大量発現を見出した（ＨＵＶＥＣ：２７９，７±２９，９ｐｇ／ｍｌ；ｆＥＮＤ５：１２５，７±１８，８ｐｇ／ｍｌ；Ｎ＝３）。要するに、これらの結果は、ＰｌＧＦが、インビトロで、白血病細胞によってではなく、骨髄間質細胞によって主に発現されるという傾向を示す。
【０１２２】
実施例２  ＰｌＧＦは、白血病間質によって発現され、インビボでの白血病進行のバイオマーカーになる。
白血病疾患進行に対するＰｌＧＦの潜在的影響を解明し、インビボでのαＰｌＧＦの治療可能性を解明するために、ＢＣＲ／ＡＢＬ−ＧＦＰ形質導入骨髄を同系の亜致死的に照射されたマウスに移植することにより、十分に説明されたＣＭＬ急性転化モデルを用いた。我々は、まず、対照マウスと比較して、異なる時点（ｄ１４、ｄ２１およびｄ２８）で罹患マウスの血漿中のＰｌＧＦタンパク質レベルを解析し、健常マウスまたはモック形質導入された骨髄を移植されたマウスの末梢血中の非常に少量のＰｌＧＦタンパク質、およびそれらの骨髄中の少量のＰｌＧＦタンパク質を検出した。対照的に、白血病マウスは、それらの循環において、末期に、固形腫瘍を有するマウスに匹敵するレベル（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、２００７年）に達する疾患進行の際のＰｌＧＦタンパク質の増加を示した（図２Ａ、Ｂ）。ＰｌＧＦ増加の同様の動態が、骨髄血漿中で観察された（図２Ｂ）。また、我々は、ＰｌＧＦの天然の阻害剤であるｓＶＥＧＦＲ−１を定量し、ｓＶＥＧＦＲ−１がＰｌＧＦと比較して過剰に存在するが、ＰｌＧＦ／ｓＶＥＧＦＲ−１比が疾患進行の際に血液中および骨髄中で増加し、ＰｌＧＦのアップレギュレーションが白血病の経過においてｓＶＥＧＦＲ−１よりも顕著であることが示されることが分かった（図２Ｃ、Ｄ）。
【０１２３】
インビボでのＰｌＧＦの源を解析するために、骨および骨髄のリアルタイムＰＣＲ解析を行ない、骨髄中のＰｌＧＦ  ｍＲＮＡの１２．６倍のアップレギュレーションを明らかにした（Ｎ＝８；Ｐ＜０．００２）（図２Ｅ）。骨中のＰｌＧＦ  ｍＲＮＡレベルは、罹患および健常マウスにおいて同様であり（データ示さず）、白血病マウスの骨髄血漿中で検出された、ＰｌＧＦの上昇の主な原因は、骨髄を示した。骨髄内のＰｌＧＦ産生細胞をさらに特定するために、我々は、白血病細胞（ＧＦＰ＋）、非白血病造血細胞（ＧＦＰ−ＣＤ４５＋）および非白血病非造血間質細胞（ＧＦＰ−ＣＤ４５−）をＦＡＣＳ選別し、続いて、これらの細画分におけるＲＴ−ＰＣＲによって、ＰｌＧＦ  ｍＲＮＡ発現を測定した。これらの実験は、上述のインビトロでの知見と同様に、ＰｌＧＦがＣＤ４５−間質細胞によって主に発現されており、インビボの白血病細胞マウスにおいて白血病細胞または造血細胞によってはほんのわずかしか発現されないことを明らかにした。実際、ＧＦＰ−ＣＤ４５−間質細胞は、白血病細胞より９５，６倍多くＰｌＧＦ  ｍＲＮＡを発現し、造血細胞より３２倍多くＰｌＧＦ  ｍＲＮＡを発現した（Ｎ＝４；Ｐ＜０，０５）；図２Ｆ）。白血病マウス由来のＣＤ４５−骨髄細胞におけるＰｌＧＦ  ｍＲＮＡレベルを健常マウスの骨髄由来のＣＤ４５−細胞における中のＰｌＧＦ  ｍＲＮＡレベルと比較した場合、我々は、白血病を有するマウスの非造血間質細胞区画内で、ＰｌＧＦ発現の強い（２５，４倍）アップレギュレーションを見出した（Ｎ＝４；Ｐ＜０，０５）（図２Ｆ）。興味深いことに、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、健常マウスと比較した場合、白血病を有するマウスの骨髄において、ほんのわずかしかアップレギュレーションされておらず（Ｎ＝８；Ｐ＝０．２３）（図２Ｇ）、ＰｌＧＦが、インビボでも、ＢＣＲ／ＡＢＬ＋白血病において特異的な間質由来病原因子になることを示した。この仮説は、末期罹患マウスの骨髄中のＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳ解析によって測定すると、白血病マウスの血漿または骨髄血漿中に存在するＰｌＧＦタンパク質の量が、骨髄に浸潤する白血病性芽球の数と相関するという観察によってさらに実証される（ｒ＝０．８１およびｒ＝０．８５；ｐ＜０．０５；図２Ｈ、Ｉ）。したがって、ＰｌＧＦは、マウスにおける急性転化ＣＭＬの疾患進行のバイオマーカーになる。
【０１２４】
実施例３  抗ＰｌＧＦは、白血病細胞のＰｌＧＦ誘導性増殖を阻害する。
白血病細胞に対するＰｌＧＦの潜在的な生物学的効果を測定するために、白血病細胞系における主なＰｌＧＦ受容体であるＶＥＧＦＲ−１およびその共受容体であるＮｐｎ１およびＮｐｎ２の発現を調べた。ＶＥＧＦＲ−１は、既刊文献（フラゴーゾ（Ｆｒａｇｏｓｏ）ら、２００６年）と一致して、最もよく研究された細胞系によって発現された（データ示さず）。Ｎｐｎ１およびＮｐｎ２は、Ｋ５６２、Ｎａｌｍ−６、ＢＶ−１７３およびＫＣＬ−２２細胞系において、異なるレベルではあるが発現されたが、３２Ｄ細胞においては発現されなかった（図３Ａ、Ｂ）。これらの知見に基づいて、我々は、白血病細胞をＰｌＧＦとともにインビトロでインキュベートし、既刊文献にしたがって、５つのＢＣＲ／ＡＢＬ＋細胞系のうち４つの増殖を用量依存的に誘導した（図３Ｃ、Ｄ）。その主な受容体であるＶＥＧＦＲ−１に加えて、ＰｌＧＦも、共受容体であるＮｐｎ−１およびＮｐｎ−２に結合する。白血病細胞のＰｌＧＦ誘導性増殖がＶＥＧＦＲ−１を必要とするかどうかを解明するために、細胞外ＶＥＧＦＲ−１遮断抗体（αＶＥＧＦＲ−１）の阻害効果を評価した。αＶＥＧＦＲ−１の存在下でのＰｌＧＦ媒介増殖の阻害が見出された（図３Ｅ）。対照的に、白血病細胞のＰｌＧＦ誘導性増殖は、Ｎｐｎ−１およびＮｐｎ−２に対する細胞外の機能遮断抗体の添加の際には阻害されず、ＰｌＧＦの増殖促進効果がＶＥＧＦＲ−１によって主に媒介されないことを示した（図１Ｇ）。次の工程において、抗ＰｌＧＦ（αＰｌＧＦ）が白血病細胞のＰｌＧＦ誘導性増殖を阻害し、αＰｌＧＦの添加の際のＰｌＧＦの増殖促進効果のほぼ完全な抑止が見られるかどうかを調べ、白血病における治療可能性を示した（図３Ｆ）。
【０１２５】
ＢＣＲ／ＡＢＬ＋白血病細胞のＡＢＬリン酸化の変化をＰｌＧＦが誘導するかどうかを明らかにするために、ＰｌＧＦ存在下および比存在下でインキュベートされたＢｖ−１７３およびＫＣＬ−２２細胞のウエスタンブロットを行なった。これらの実験は、ＰｌＧＦがＡＢＬのリン酸化を改変しなかったことを示した（データ示さず）。
【０１２６】
実施例４  白血病細胞とＢＭＤＳＣとの間のパラクリン相互作用は、ＢＭＤＳＣによるＰｌＧＦ分泌を誘導する。
共培養実験を行ない、ＢＭＤＳＣまたはＳ１７細胞のいずれかによるＰｌＧＦ分泌の増加をもたらすヒト白血病細胞とマウスＢＭＤＳＣまたはマウス骨髄間質細胞系（Ｓ１７）との間の潜在的な相互作用を調べ、共培養の際のマウスＰｌＧＦの有意なアップレギュレーションが見出された（図４Ａ、Ｂ）。この知見は、我々に共培養物の増殖を解析することを促し、白血病細胞およびＢＭＤＳＣの増殖の有意な誘導を明らかにした（図４Ｃ、Ｄ）。また、この増殖促進効果は、培養物へのαＰｌＧＦの添加の際にほとんど完全に抑制され、ＰｌＧＦがパラクリン様式で白血病細胞の増殖を誘導し得るが、同時にオートクリンループによって骨髄間質細胞の増殖を媒介し、したがって白血病性クローンおよびその支持的間質を同時に促進することが示された（図４Ｃ、Ｄ）。興味深いことに、この相互作用は、ＶＥＧＦが共培養の際にアップレギュレーションされないために、ＰｌＧＦのアップレギュレーションを特異的にもたらす（データ示さず）。インビボでのＢＣＲ−ＡＢＬ＋白血病におけるＰｌＧＦの潜在的な役割を試験するために、ＢＣＲ／ＡＢＬ＋骨髄球性（ｍｙｅｌｏｉｄ）およびリンパ性白血病の３つの異なるマウスモデルを樹立した。
【０１２７】
ＰｌＧＦのアップレギュレーションを誘導し得る分子シグナルを解明する目的で、我々は、まず、白血病細胞馴化培地（ＣＭ）とのインキュベーションが、白血病細胞との直接共培養と同様の間質細胞（Ｓ１７）におけるＰｌＧＦのアップレギュレーションを誘導するのに十分であるかどうかを解析し、実際に、ＣＭが、Ｓ１７によるＰｌＧＦ分泌の誘導に十分であることを見出した（Ｎ＝３；Ｐ＝０，００８；図４Ｅ）。
【０１２８】
実施例５  白血病細胞でなく宿主間質の遺伝的欠損は、白血病マウスの生存期間を延長させる。
インビボでのＢＣＲ／ＡＢＬ＋白血病におけるＰｌＧＦの役割を決定するために、我々は、ＰｌＧＦに遺伝的に欠損のあるマウス（ＰｌＧＦ−／−）およびｗｔマウス（ＷＴ）において、白血病を誘導し、両方の群の間で生存期間を比較した。我々は、ＰｌＧＦを欠損するマウスがＷＴマウスよりも有意に長く生存し、ＰｌＧＦがインビボで白血病の発症において重要な役割を果たすことを示唆することを見出した（Ｎ＝１４／１５；Ｐ＝０．００３；図５Ａ）。
【０１２９】
ＢＣＲ／ＡＢＬ＋白血病においてＰｌＧＦが間質由来因子になるという我々の仮説を証明するために、我々は、ＷＴマウスおよびＰｌＧＦ  ＫＯマウス由来の形質導入骨髄細胞をＷＴ宿主に移植することにより、クロスオーバー研究を行ない、異なる群の間で生存期間を比較した（ＷＴ→ＷＴ、ＫＯ→ＷＴおよびＷＴ→ＫＯ）。我々は、白血病細胞中にＰｌＧＦがないとマウスの生存期間を延長しないが、宿主間質のＰｌＧＦ欠損によって白血病マウスにおける有意な生存優位性を誘導し、完全なＰｌＧＦ欠損系における範囲に匹敵する範囲にあることを見出した（上記参照）。したがって、間質由来ＰｌＧＦは、インビボでＢＣＲ／ＡＢＬ＋白血病の進行を決定的に促進する（図５Ｂ）。
【０１３０】
実施例６  抗ＰｌＧＦでの白血病マウスの処理は、白血病マウスの生存期間を有意に延長する。
マウスＰｈ＋白血病におけるＰｌＧＦ阻害の治療可能性を調べるために、ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ＢａＦ３細胞の静脈内注射によって誘導された白血病を有するマウスをαＰｌＧＦで処理し、対照抗体と比較して１８日間という生存期間中央値の有意な延長を見出した（Ｎ＝９；Ｐ＝０．０１５）（図５Ｃ）。これらの結果は、我々に、白血球の増加を末梢血中で最初に検出することができた１週間後に罹患マウスの死をもたらす脾腫および骨髄球性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病細胞の過剰増殖によって特徴付けられる急性転化において、ヒト疾患状態を臨床的に模倣するＢＣＲ−ＡＢＬ形質導入ＢＭの移植によって誘導されたイマチニブ感受性およびイマチニブ抵抗性（Ｔ３１５Ｉ変異）ＣＭＬのマウスモデルを樹立することを促した。その後、白血病負荷、骨髄組織学およびマウスの生存期間に対するαＰｌＧＦの効果を調べた。減少した白血病負荷が観察され（データ示さず）、初期（ｄ１５）および末期（ｄ２８）白血病のＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳ解析は、ＢＭおよびＰＭにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞の特異的な減少を明らかにした（Ｎ＝７；Ｐ＜０，０５）（図５Ｄ、Ｅおよび示さず）。さらに、末期の骨髄組織像は、αＰｌＧＦでの処理によって誘導された疾患進行の実質的な阻害を示す（図５Ｆ）。その後、マウスの生存期間に対するαＰｌＧＦの効果を調べた。これらの実験は、イマチニブ感受性および抵抗性白血病を有するマウスの両方において、対照抗体と比較した場合、αＰｌＧＦでの処理の際の生存期間の有意な延長を示唆する（図５Ｇ、Ｈ）。したがって、αＰｌＧＦは、ＢＣＲ／ＡＢＬ変異状態と無関係に、マウス急性転化白血病の進行を阻害する。
【０１３１】
実施例７  抗ＰｌＧＦでの白血病マウスの処理は、骨髄血管新生過多および線維症を阻害する。
骨髄の血管新生は、白血病における重要な病原因子になる。ＰｌＧＦは、強力な血管新生促進サイトカインであり、腫瘍血管新生を促進することがすでに示された。したがって、末期白血病を有するモック移植された対照抗体処理マウスおよび末期白血病を有するαＰｌＧＦ処理マウスにおけるＣＤ３１染色の形態計測学的解析によって、骨髄血管新生に対するＰｌＧＦ阻害の効果を解析した。これらの実験は、モック移植された対照と比較して、白血病マウスにおける骨髄の深刻な血管新生過多を示唆した（図６Ａ、Ｃ）。この血管新生過多は、αＰｌＧＦでの処理の後に、有意に減少した（図６Ａ、Ｃ）。
【０１３２】
骨髄線維症は、ＣＭＬにおける周知の有害因子であり、イマチニブに対する抵抗性と関連する。ＰｌＧＦがＢＭＤＳＣの増殖を刺激するという本発明者らの観察に基づいて（上記参照）、我々は、αＰｌＧＦでの白血病マウスの処理が骨髄線維症を改変するかどうかを調べた。骨髄中のレティキュリン＋線維の平均長の形態計測学的解析に際して、我々は、ＰｌＧＦの阻害によって誘導された骨髄線維症の有意な減少が見られた（図６Ｂ、Ｄ）。したがって、αＰｌＧＦは、白血病マウスにおける骨髄の血管新生過多および線維症の両方を減少させる。
【０１３３】
興味深いことに、初期実験は、イマチニブおよび抗ＰｌＧＦが、インビボでＢＣＲ／ＡＢＬ＋白血病に対して付加的な阻害効果を有することを示している。
【０１３４】
実施例８  ＰｌＧＦは、ヒトＣＭＬにおいてアップレギュレーションされる。
ヒトＣＭＬにおける新規の標的分子としてのＰｌＧＦの関連性を調べるために、我々は、健常対照群（ｎ＝１０）、一次診断の際に慢性期（ＣＰ）にある非処理患者（ｎ＝３２）と、異なるチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）での処理下にある急性転化（ＢＣ、疾患の末期）の患者（ｎ＝９）とにおけるＰｌＧＦ血漿レベルを測定した。これらの解析は、健常対照群と比較して、ＣＰにある新たに診断された患者において２．１倍のＰｌＧＦのアップレギュレーション（ｐ＜０．０００１）およびＢＣの患者における３．７倍のＰｌＧＦレベルの増加（ｐ＜０．０００１）を明らかにした（図７Ａ）。続いて、新たに診断されたＣＭＬの患者（ｎ＝７）および骨髄の浸潤のないリンパ腫と診断された対照患者（ｎ＝５）の骨髄血漿（ＢＭＰ）におけるＰｌＧＦレベルを測定した（図７Ｂ）。これらの解析は、対照と比較して、ＣＭＬ患者のＢＭＰにおいてもＰｌＧＦのアップレギュレーションを明らかにした。
【０１３５】
次いで、単一の施設中でＱＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＰＢ  ＰｌＧＦタンパク質とＢＣＲ−ＡＢＬ１転写産物数との間の潜在的関係を調べた（ｎ＝４３  ＣＰ、ｎ＝２移行期；異なるＴＫＩでの処理、イマチニブ＋インターフェロン、またはホモハリングトニン）。我々は、ＰｌＧＦレベルとＢＣＲ−ＡＢＬ１転写産物数との間の有意な相関を見出し（ｒ＝０．４５；ｐ＝０．００１６）、ＰｌＧＦがヒトＣＭＬにおける疾患特異的標的になることを示した（図７Ｃ）。続いて、我々は、健常ドナーならびにＣＰおよびＢＣにあるＣＭＬドナーからＣＤ３４＋細胞を単離し、ＱＲＴ−ＰＣＲによってＰｌＧＦ発現を測定した。これらの解析は、ＰｌＧＦ発現が、白血病細胞において、健常ＣＤ３４＋細胞におけるのと等しく低いことを明らかにした（図７Ｄ）。したがって、上昇した循環ＰｌＧＦは、白血病細胞によって分泌されないが間質細胞によって分泌される可能性が最も高い。この仮説を調べるために、我々は、新たに診断されたＣＭＬの患者から接着ＢＭ間質細胞を単離し、ＰｌＧＦ発現レベルを、ＣＤ３４＋白血病細胞のものと比較した。我々は、間質細胞が、白血病細胞よりも７倍超多くＰｌＧＦを発現し（図７Ｄ；ｐ＝０．００３）、我々の前臨床データを実証し、ＰｌＧＦがＣＭＬ患者において間質細胞によって主に産生されるという概念を拡張した。
【０１３６】
実施例９  イマチニブ下のＣＭＬ患者において、ＰｌＧＦレベルは上昇したままである。
薬剤の中止後にほとんどの患者において急速な再発を引き起こす、イマチニブで処理された患者において白血病細胞がなぜ存続するのかは、未だ不明である。ＢＣＲ／ＡＢＬ＋白血病細胞とは無関係に、宿主間質が、潜在的に重要な役割を果たす。イマチニブがＢＭＤＳＣによってＰｌＧＦ分泌を誘導し得るかどうかを明らかにするために、我々は、間質細胞を、イマチニブの濃度を増加させつつインキュベートした。これらの実験は、マウスＢＭＤＳＣにおけるＰｌＧＦの用量依存的誘導を明らかにし、イマチニブに対する抵抗性を媒介することにおける間質由来ＰｌＧＦの潜在的な役割を示唆した。ＢＭＤＳＣにおけるＰｌＧＦのこの誘導がインビボでも起こるのかどうかを明らかにするために、我々は、ＢＣＲ／ＡＢＬ形質導入骨髄の移植によって誘導されたＣＭＬを有するマウスをイマチニブで処理し、それらの骨髄中のＰｌＧＦレベルを非処理白血病マウスおよび健常マウスと比較した。これらの実験は、白血病を有するイマチニブ処理マウスの骨髄浸潤が有意に低かったものの、非処理マウスと比較して、イマチニブ処理した白血病マウスの骨髄におけるＰｌＧＦのアップレギュレーションを明らかにした（図７Ｅ）。これらの結果は、骨髄におけるイマチニブによる白血病誘導性ＰｌＧＦ発現の促進を示し、これはイマチニブ存在下での白血病細胞性生存および増殖を促進し得ることを示す。
【０１３７】
これらの発見は、我々に、異なる応答レベル（完全分子寛解ＣＭＲ；ＢＣＲ／ＡＢＬ／ＡＢＬ比＜１；ＢＣＲ／ＡＢＬ／ＡＢＬ比＜１０）に達するイマチニブで処理された患者のＰＢにおけるＰｌＧＦレベルを測定し、それらを健常個体群および一次診断された非処理ＣＭＬ患者と比較することを促した。興味深いことに、ＰｌＧＦレベルは、健常被験体および低いＢＣＲ／ＡＢＬ／ＡＢＬ比＜１を有する患者よりも、ＣＭＬの患者において有意に高く、非処理の新たに診断されたＣＭＬ患者において、ＰｌＧＦは同様のレベルまで上昇した（図７Ｆ）。これらのデータは、数桁の白血病負荷の減少にもかかわらず、ＰｌＧＦが上昇したままであり、イマチニブでの治療下での疾患の持続性に寄与し得ることを示す。
【０１３８】
結論として、我々のデータは、ＰｌＧＦが、ＢＣＲ／ＡＢＬ変異状態とは無関係に、Ｐｈ＋白血病の進行を促進する間質由来要素になり、ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ阻害剤の有用な補助であるか、またはＴＫＩ難治性白血病において有用な、白血病間質によって産生される新規の標的になることが示される。
【０１３９】
考察
イマチニブおよび第２世代ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤の導入によって、フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）白血病の患者の治療に革命がもたらされたが、治療が成功した患者においても白血病細胞が存続し、一部の患者は抵抗性を生じ、最終的には再発する。これらの欠点の理由は完全には解決されていないが、ＢＣＲ−ＡＢＬとは無関係に、宿主細胞が潜在的に重要な役割を果たすことが、我々によって推論された。胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）は、ＶＥＧＦのホモログであり、固形腫瘍中の間質細胞によって大量に分泌されることがすでに証明された。したがって、Ｐｈ＋リンパ性および骨髄球性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病におけるＰｌＧＦの役割を調べ、我々が固形腫瘍の様々な前臨床モデルにおいて広範な抗腫瘍能力を有すると最近報告した、ＰｌＧＦに対するモノクローナル抗体であるαＰｌＧＦの治療可能性に取り組む価値があると決定した（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、２００７年）。
【０１４０】
第１に、５つの異なるヒトおよびマウスＰｈ＋白血病細胞系（Ｂｖ−１７３、ＢａＦ３、３２Ｄ、Ｋ５６２、ＫＣＬ２２）によるＰｌＧＦの発現をインビトロで調べ、これらの細胞系の何れも、ＰｌＧＦタンパク質を分泌することが見出されれないが、それらはその標的受容体であるＶＥＧＦＲ−１を発現した。対照的に、一次マウス接着骨髄間質細胞（ＢＭＤＳＣ）は大量のＰｌＧＦタンパク質を発現し（１０５ｐｇ／ｍｌ／１０５個の細胞まで）、ＰｌＧＦの潜在的な間質関連機能を示唆した。
【０１４１】
第２に、ＰｌＧＦが増殖を誘導し得るかどうかが解析され、それによって、組み換えＰｌＧＦによる増殖の用量依存的誘導が、全ての解析された白血病細胞系において明らかとされた。ＰｌＧＦのこの効果は、αＰｌＧＦおよび細胞外抗ＶＥＧＦＲ−１抗体の両方によってほぼ完全に抑止され、したがって、ＰｌＧＦの増殖促進効果がＶＥＧＦＲ−１によって主に媒介されることが示された。
【０１４２】
第３に、共培養実験を行なうことによって、ＢＭＤＳＣと白血病細胞との間の潜在的なパラクリン相互作用を調べた。注目すべきことに、白血病細胞とのＢＭＤＳＣの共培養は、白血病細胞の増殖を有意に誘導した。この増殖の誘導がＰｌＧＦによって媒介され得るという仮説を立て、実際に、共培養へのαＰｌＧＦの添加の際のこの増殖促進効果のほぼ完全な抑止が見出された。さらに、ＢＤＭＳＣは、白血病細胞の存在下で培養された場合に、ＰｌＧＦ分泌を有意にアップレギュレーションし（２．１倍；Ｎ＝３；Ｐ＝０．００５）、両方の細胞型の間の実質的なパラクリン相互作用を示した。これらの結果は、我々に、間質由来ＰｌＧＦがＰｈ＋白血病における新規の標的になり得ると結論付けさせた。
【０１４３】
この仮説をインビボで試験するために、Ｐｈ＋骨髄球性（ｍｙｅｌｏｉｄ）およびリンパ性白血病の３つの異なるマウスモデルを樹立した。続いて、健常マウスと比較して、罹患マウスの血液中および骨髄中に存在するＰｌＧＦタンパク質を解析した。健常マウスの末梢血中にＰｌＧＦタンパク質は見出されず、それらの骨髄中に少量のＰｌＧＦタンパク質が見出された。対照的に、白血病マウスは、それらの循環中に、固形腫瘍を有するマウスに匹敵するレベルでＰｌＧＦタンパク質を示し（７６．５±１８．４ｐｇ／ｍｌ血漿；Ｎ＝７）、興味深いことに、それらの骨髄中に、健常マウスと比較して８．９倍超（Ｎ＝７；Ｐ＜０．０００１）上昇したＰｌＧＦレベルを示し、ＰｌＧＦがＰｈ＋白血病において間質由来の新規の病原因子になることを再度示した。
【０１４４】
マウスＰｈ＋白血病におけるαＰｌＧＦの治療可能性を調べるために、続いて、ＢＣＲ／ＡＢＬ＋ＢａＦ３細胞の注射によって誘導された白血病を有するマウスをαＰｌＧＦで処理し、対照抗体と比較し、αＰｌＧＦによって誘導された１８日間の平均生存期間の有意な延長を見出した（Ｎ＝９；Ｐ＝０．０１５）。これらの肯定的な結果に促され、一次骨髄細胞を形質導入し、続いて、致死線量照射されたレシピエントマウスに移植することによってイマチニブ感受性およびイマチニブ抵抗性（Ｔ３１５Ｉ変異）ＣＭＬのモデルを樹立し、これをαＰｌＧＦおよび対照抗体で処理した。興味深いことに、これらの積極的モデルにおいても、我々は、ＰｌＧＦの遮断によって誘導された罹患マウスの生存期間の有意な延長を見出した（ｗｔ  ＢＣＲ−ＡＢＬ誘導性白血病における生存期間中央値延長５日間；Ｎ＝１１；Ｐ＝０．００２；Ｔ３１５Ｉ変異体において４日間；Ｎ＝１２；Ｐ＝０．０３９）。骨髄組織像およびＦＡＣＳによる表現型解析は、白血病細胞を有する脾臓および骨髄の浸潤の減少を明らかにした（骨髄における３８％の減少および脾臓における２４％の減少）。
【０１４５】
我々は、本明細書中で、白血病細胞が非造血系骨髄由来間質細胞（ＢＭＤＳＣ）に胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）をアップレギュレーションするように指示し、前臨床マウスモデルにおいてＢＣＲ−ＡＢＬ＋白血病の進行が決定的に支配されることを解明する。重要なことには、これらの知見は、ＰｌＧＦがＣＭＬ患者の血液中および骨髄中でもアップレギュレーションされるので、ＣＭＬのヒト試料において確認された。ＰｌＧＦに対するモノクローナル抗体であるαＰｌＧＦによるこの新規の標的分子の阻害は、イマチニブ感受性および抵抗性（Ｔ３１５Ｉ変異）白血病を有するマウスの生存を促進する。抗ＰｌＧＦは、白血病細胞の増殖をブロックすること、ならびに血管新生過多および線維症を減少させることによって異常な白血病性骨髄微小環境を正常化することによって治療効果を示す。興味深いことに、イマチニブは、ＢＭＤＳＣにおいてＰｌＧＦをアップレギュレーションすることができ、イマチニブで治療されたＣＭＬ患者においてＰｌＧＦレベルは高いままであり、ＰｌＧＦが白血病細胞の存続に寄与し得ることを示す。これはさらに、ＰｌＧＦ阻害が、さらなる恩恵を与える療法と組み合わせて用いられ得ることを支持する。要約すると、ＰｌＧＦの阻害は、併用療法またはＴＫＩ難治性ＣＭＬにおいて標的とされる新しい候補として働き得る。
【０１４６】
結論として、これらのデータは、ＰｌＧＦがＢＣＲ−ＡＢＬ変異状態とは無関係にＰｈ＋白血病の進行を促進する間質由来因子になり、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ阻害剤への潜在的に有用な補助である白血病間質によって産生される新規の標的になり得る。
【０１４７】
参考文献
アイエロ  エルピー（Ａｉｅｌｌｏ  ＬＰ）、ピアース  イーエー（Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＡ）、フォリー  イーディー（Ｆｏｌｅｙ  ＥＤ）、タカギ  エイチ（Ｔａｋａｇｉ  Ｈ）、チェン  エイチ（Ｃｈｅｎ  Ｈ）、リドル  エル（Ｒｉｄｄｌｅ  Ｌ）、フェララ  エヌ（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ）、キング  ジーエル（Ｋｉｎｇ  ＧＬ）、スミス  エルイー（Ｓｍｉｔｈ  ＬＥ）。可溶性ＶＥＧＦ受容体キメラタンパク質を用いた血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害によるインビボの網膜血管新生の抑制（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｕｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＶＥＧＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９５年；９２（２３）：１０４５７−６１．
オルトマン  エス（Ａｌｔｍａｎ  Ｓ）。研究および治療におけるリボヌクレアーゼＰ（ＲＮａｓｅ  Ｐ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）。  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１９９５年；１３（４）：３２７−９．
アルバラド  ワイ（Ａｌｖａｒａｄｏ  Ｙ）、アポストリドウ  イー（Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｏｕ  Ｅ）、スウォーズ  アール（Ｓｗｏｒｄｓ  Ｒ）、ギルズ  エフジェイ（Ｇｉｌｅｓ  ＦＪ）．フィラデルフィア陽性急性リンパ球性白血病の新たな治療選択肢（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）。Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００７年；１２(１）：１６５−７９．
ベラード  エム（Ｂｅｒａｒｄ  Ｍ）、ソルデロ  エス（Ｓｏｒｄｅｌｌｏ  Ｓ）、オルテガ  エヌ（Ｏｒｔｅｇａ  Ｎ）、キャリヤー  ジェイエル(Ｃａｒｒｉｅｒ  ＪＬ)、ペイリ  エヌ（Ｐｅｙｒｉ  Ｎ）、ワゼフ  エム（Ｗａｓｓｅｆ  Ｍ）、バートランド  エヌ（Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｎ）、エンジョラス  オー（Ｅｎｊｏｌｒａｓ  Ｏ）、ドロウエト  エル（Ｄｒｏｕｅｔ  Ｌ）、プロイエト  ジェイ（Ｐｌｏｕｅｔ  Ｊ）。血管内皮増殖因子は、インビトロおよびインビボで、新生児血管腫から培養された間質細胞に増殖優位性を与える（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｏ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｈｅｍａｎｇｉｏｍａｓ）。Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９７年；１５０(４)：１３１５−２６．
ブリドノウ  ピー（Ｂｒｉｄｏｎｎｅａｕ  Ｐ）、バンチ  エス（Ｂｕｎｃｈ  Ｓ）、テングラー  アーアル（Ｔｅｎｇｌｅｒ  Ｒ）、ヒル  ケイ（Ｈｉｌｌ  Ｋ）、カーター  ジェイ（Ｃａｒｔｅｒ  Ｊ）、ピーケン・Ｗ（Ｐｉｅｋｅｎ  Ｗ）、ティナーマイヤー・ディー（Ｔｉｎｎｅｒｍｅｉｅｒ  Ｄ）、レーマンアール（Ｌｅｈｒｍａｎ  Ｒ）、ドロレット  ディーダブルユウ  ディーダブリューＤＷ（Ｄｒｏｌｅｔ．Ｄ．Ｗ．）。高度に改変されたＲＮＡアプタマーの構築。産物回収および特異的活性におけるクロマトグラフィーの際の完全な変性の影響（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ−ａｐｔａｍｅｒ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）。Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．１９９９年４月１６日；７２６(１−２)：２３７−４７．
バーチャート  エー（Ｂｕｒｃｈｅｒｔ  Ａ）。イマチニブ抵抗性のルーツ：自己再生の疑問？（Ｒｏｏｔｓ  ｏｆ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ａ  ｑｕｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ？）。Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｕｐｄａｔ．２００７年；１０(４−５)：１５２−６１．
コービン  エーエス（Ｃｏｒｂｉｎ  ＡＳ）、ラ  ロジー  ピー（Ｌａ  Ｒｏｓｅｅ  Ｐ）、ストッフレゲン  イーピー（Ｓｔｏｆｆｒｅｇｅｎ  ＥＰ）、ドルカー  ビージェイ（Ｄｒｕｋｅｒ  ＢＪ）、デイニンジャー  エムダブリュー（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＭＷ）。イマチニブメシル酸塩抵抗性と関連するいくつかのＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼドメイン変異体は、イマチニブに対する感受性が残る（Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｍｅｓｙｌａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｍａｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  ｉｍａｔｉｎｉｂ）。Ｂｌｏｏｄ。２００３年；１０１(１１)：４６１１−４。
クリスティアーノ  アールジェイ（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ＲＪ）、スミス  エルシー（Ｓｍｉｔｈ  ＬＣ）、ケイ  エムエー（Ｋａｙ  ＭＡ）、ブリンクリー  ビーアール（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ  ＢＲ）、ウー  エスエル（Ｗｏｏ  ＳＬ）。肝臓遺伝子治療：結合型アデノウイルス・ＤＮＡ複合体を利用した初代肝細胞における効率的な遺伝子送達および発現（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ．）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３年；９０(２４)：１１５４８−５２．
カルバー  ケーダブリュー（Ｃｕｌｖｅｒ  ＫＷ）、ビッカーズ  ティーエム（Ｖｉｃｋｅｒｓ  ＴＭ）、ラムサム  ジェーエル（Ｌａｍｓａｍ  ＪＬ）、ウォリング  エイチダブリュー（Ｗａｌｌｉｎｇ  ＨＷ）、セレギナ  ティー（Ｓｅｒｅｇｉｎａ  Ｔ）。固形腫瘍の遺伝子治療（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．）、Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ．１９９５年；５１(１）：１９２−２０４．
デービス（Ｄａｖｉｓ）。トロンビン・アプタマー相互作用の動力学的特徴づけ（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ａｐｔａｍｅｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  １９９４年；３０５．
エリントン  エーディー（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＡＤ）、ゾスタック  ジェイダブリュ（Ｓｚｏｓｔａｋ  ＪＷ）。特異的リガンドに結合するＲＮＡ分子のインビトロ選択（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ．）。Ｎａｔｕｒｅ．１９９０年；３４６(６２８７)：８１８−２２．
フェダール  エス（Ｆａｄｅｒｌ  Ｓ）、タルパッツ  エム（Ｔａｌｐａｚ  Ｍ）、エストロフ  ズィー（Ｅｓｔｒｏｖ  Ｚ）、カンタージャン  エイチエム（Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ  ＨＭ）。慢性骨髄性白血病：生物学および療法（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．）。Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１９９９年；１３１(３)：２０７−１９．
フェルナンデズ  ジェイエム（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＭ）、チュ  エス（Ｃｈｕ  Ｓ）、オーバーハウザー  エーエフ（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ＡＦ）。ＲＮＡ構造。ヘア（ピン）を引くこと（ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｐｕｌｌｉｎｇ  ｏｎ  ｈａｉｒ(ｐｉｎｓ)）。Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１年；２９２(５５１７)：６５３−４．
ファイヤ  エー（Ｆｉｒｅ  Ａ）、スー  エス（Ｘｕ  Ｓ）、モンゴメリー  エムケー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＭＫ）、コスタス  エスエー（Ｋｏｓｔａｓ  ＳＡ）、ドライバー  エスイー（Ｄｒｉｖｅｒ  ＳＥ）、メロ  シーシー（Ｍｅｌｌｏ  ＣＣ）。線虫における二本鎖ＲＮＡによる強力かつ特異的遺伝子干渉（Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．）。Ｎａｔｕｒｅ．１９９８年；３９１(６６６９)：８０６−１１．
フィッシャー  シー（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃ）、ジョンククス  ビー（Ｊｏｎｃｋｘ  Ｂ）、マッゾーネ  エム（Ｍａｚｚｏｎｅ  Ｍ）、ザッチーニャ  エス（Ｚａｃｃｈｉｇｎａ  Ｓ）、ロゲス  エス（Ｌｏｇｅｓ  Ｓ）、パッタリーニ  エル（Ｐａｔｔａｒｉｎｉ  Ｌ）、コリアノポロス  イー（Ｃｈｏｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｅ）、リーゼンボーグス  エル（Ｌｉｅｓｅｎｂｏｒｇｈｓ  Ｌ）、コッホ  エム（Ｋｏｃｈ  Ｍ）、デ  モル  エム（Ｄｅ  Ｍｏｌ  Ｍ）、アンティエロ  エム（Ａｕｔｉｅｒｏ  Ｍ）、ワインズ  エス（Ｗｙｎｓ  Ｓ）、プレイサンス  エス（Ｐｌａｉｓａｎｃｅ  Ｓ）、ムーンズ  エル（Ｍｏｏｎｓ  Ｌ）、ファン  ルーイエン  エヌ（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ  Ｎ）、ジアッカ  エム（Ｇｉａｃｃａ  Ｍ）、スタッセン  ジェイエム（Ｓｔａｓｓｅｎ  ＪＭ）、デュワーチン  エム（Ｄｅｗｅｒｃｈｉｎ  Ｍ）、コーレン  ディー（Ｃｏｌｌｅｎ  Ｄ）、カーメリエット  ピー（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ）。抗ＰｌＧＦは、健常な血管に影響を及ぼすことなくＶＥＧＦ（Ｒ）阻害剤抵抗性腫瘍の増殖を阻害する（Ａｎｔｉ−ＰｌＧＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ＶＥＧＦ(Ｒ）−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｅｓｓｅｌｓ．）Ｃｅｌｌ．２００７年；１３１(３)：４６３−７５．
フラゴッソ  アール（Ｆｒａｇｏｓｏ  Ｒ）、ペレイラ  ティー（Ｐｅｒｅｉｒａ  Ｔ）、ウー  ワイ（Ｗｕ  Ｙ）、チュウ  ゼット（Ｚｈｕ  Ｚ）、キャベキャダス  ジェイ（Ｃａｂｅｃａｄａｓ  Ｊ）、ディアス  エス（Ｄｉａｓ  Ｓ）。ＶＥＧＦＲ−１（ＦＬＴ−Ｉ）活性化は骨髄内で急性リンパ芽球性白血病局在化および生存期間を調節し、髄外疾患の発症を決定する（ＶＥＧＦＲ−Ｉ(ＦＬＴ−Ｉ）ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ、ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）。Ｂｌｏｏｄ。２００６年；１０７(４)：１６０８−１６。
ゴールド  エル（Ｇｏｌｄ  Ｌ）、ポリスキー  ビー（Ｐｏｌｉｓｋｙ  Ｂ）、アーレンベック  オー（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ  Ｏ）、ヤールス  エム（Ｙａｒｕｓ  Ｍ）。オリゴヌクレオチド機能の多様性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）。Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ。１９９５年；６４：７６３−９７。
ヘールマン  アール（Ｈｅｈｌｍａｎｎ  Ｒ）、ホーホハウス  エー（Ｈｏｃｈｈａｕｓ  Ａ）、バッカラーニ  エム（Ｂａｃｃａｒａｎｉ  Ｍ）；ヨーロピアン・リューケミアネット（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔ）。慢性骨髄球性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ）。Ｌａｎｃｅｔ。２００７年；３７０(９５８４)：３４２−５０。
イカイ  ティー（Ｉｋａｉ  Ｔ）、ミワ  エイチ（Ｍｉｗａ  Ｈ）、シカミ  エム（Ｓｈｉｋａｍｉ  Ｍ）、ヒラマツ  エー（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  Ａ）、タジマ  イー（Ｔａｊｉｍａ  Ｅ）、ヤマモト  エイチ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ）、イマイ  エヌ（Ｉｍａｉ  Ｎ）、ハットリ  エー（Ｈａｔｔｏｒｉ  Ａ）、ニシイ  ケー（Ｎｉｓｈｉｉ  Ｋ）、ミウラ  ケー（Ｍｉｕｒａ  Ｋ）、サトウ  エー（Ｓａｔｏｈ  Ａ）、イトウ  エム（Ｉｔｏｈ  Ｍ）、イマムラ  エー（Ｉｍａｍｕｒａ  Ａ）、ミハラ  エイチ（Ｍｉｈａｒａ  Ｈ）、カトウ  ワイ（Ｋａｔｏｈ  Ｙ）、ニッタ  エム（Ｎｉｔｔａ  Ｍ）。胎盤増殖因子は、オートクリンおよびパラクリン経路の両方によってフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病を刺激する（Ｐｌａｃｅｎｔａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｂｏｔｈ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ）。Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ。２００５年；７５(４)：２７３−９。
ジェンケ  エーシ（Ｊｅｎｋｅ  ＡＣ）、ステール  アイエム（Ｓｔｅｈｌｅ  ＩＭ）、ハーマン  エフ（Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｆ）、アイゼンバーガー  ティー（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｔ）、ベイカー  エー（Ｂａｉｋｅｒ  Ａ）、ボード  ジェイ（Ｂｏｄｅ  Ｊ）、ファッケルマイヤー  エフオー（Ｆａｃｋｅｌｍａｙｅｒ  ＦＯ）、リップス  エイチジェイ（Ｌｉｐｐｓ  ＨＪ）。転写単位に連結した核の足場／マトリックス付着領域モジュールは、哺乳動物エピソームの複製および維持に十分である（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｐｉｓｏｍｅ）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ。２００４年；１０１(３１)：１１３２２−７。
ジョーンズ  ピーティー（Ｊｏｎｅｓ  ＰＴ）、ディア  ピーエイチ（Ｄｅａｒ  ＰＨ）、フーテ  ジェイ（Ｆｏｏｔｅ  Ｊ）、ノイベルガー  エムエス（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ）、ウインター  ジー（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ）。ヒト抗体における相補性決定領域をマウス由来のもので置換する（Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｏｕｓｅ）。Ｎａｔｕｒｅ。１９８６年；３２１(６０６９)：５２２−５。
ケンダル  アールエル（Ｋｅｎｄａｌｌ  ＲＬ）、ワン  ジー（Ｗａｎｇ  Ｇ）、トーマス  ケーエー（Ｔｈｏｍａｓ  ＫＡ）。血管内皮増殖因子受容体である天然の可溶型のＦＬＴ−１およびＫＤＲとのそのヘテロ二量体化の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＬＴ−１，ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＫＤＲ）。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ。１９９６年；２２６(２)：３２４−８。
コース  シー（Ｋｏｒｔｈ  Ｃ）、スティーリ  ビー（Ｓｔｉｅｒｌｉ  Ｂ）、ストレイト  ピー（Ｓｔｒｅｉｔ  Ｐ）、モーゼル  エム（Ｍｏｓｅｒ  Ｍ）、シュアラー  オー（Ｓｃｈａｌｌｅｒ  Ｏ）、フィッシャー  アール（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｒ）、シュルツ−シャッファー  ダブリュー（Ｓｃｈｕｌｚ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  Ｗ）、クレッチュマー  エイチ（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｈ）、レーバー  エー（Ｒａｅｂｅｒ  Ａ）、ブラウン  ユー（Ｂｒａｕｎ  Ｕ）、アーレンスパーガー  エフ（Ｅｈｒｅｎｓｐｅｒｇｅｒ  Ｆ）、ホーンマン  エス（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎ  Ｓ）、グロックシュバー  アール（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ  Ｒ）、リエケ  アール（Ｒｉｅｋ  Ｒ）、ビレター  エム（Ｂｉｌｌｅｔｅｒ  Ｍ）、ヴュートリッヒ  ケー（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ  Ｋ）、オエシュ  ビー（Ｏｅｓｃｈ  Ｂ）。モノクローナル抗体によって特徴付けられたプリオン（ＰｒＰＳｃ）特異的エピトープ（Ｐｒｉｏｎ(ＰｒＰＳｃ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）。Ｎａｔｕｒｅ。１９９７年；３９０(６６５５)：７４−７。
クジャウスキー  エル（Ｋｕｊａｗｓｋｉ  Ｌ）、タルパッツ  エム（Ｔａｌｐａｚ  Ｍ）。慢性骨髄球性白血病におけるイマチニブ抵抗性を克服するための戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）。Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ。２００７年；４８(１２)：２３１０−２２。
ラム  ケーエス（Ｌａｍ  ＫＳ）、ソルモン  エスイー（Ｓａｌｍｏｎ  ＳＥ）、ハーシュ  イーエム（Ｈｅｒｓｈ  ＥＭ）、フルビー  ブイジェイ（Ｈｒｕｂｙ  ＶＪ）、カツミアスキー  ダブリューエム（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ  ＷＭ）、ナップ  アールジェイ（Ｋｎａｐｐ  ＲＪ）。リガンド結合活性を同定するための新しいタイプの合成ペプチドライブラリー（Ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）。Ｎａｔｕｒｅ。１９９１年；３５４(６３４８)：８２−４。
レドリー  エフディー（Ｌｅｄｌｅｙ  ＦＤ）。非ウイルス性遺伝子治療：薬品としての遺伝子の見込み（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ａｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ。１９９５年；６(９)：１１２９−４４。
リ  エス（Ｌｉ  Ｓ）、リ  ディー（Ｌｉ  Ｄ）。ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ阻害剤に対する白血病の抵抗性における幹細胞およびキナーゼ活性依存的経路（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｔｏ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ。２００７年；１１(６)：１２５１−６２。
マンチーニ  エス（Ｍａｎｚｉｎｉ  Ｓ）、バルギオル  エー（Ｖａｒｇｉｏｌｕ  Ａ）、ステール  アイエム（Ｓｔｅｈｌｅ  ＩＭ）、バッチ  エムエル（Ｂａｃｃｉ  ＭＬ）、セリート  エムジー（Ｃｅｒｒｉｔｏ  ＭＧ）、ジョバンニ  アール（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ  Ｒ）、ザノーニ  エー（Ｚａｎｎｏｎｉ  Ａ）、ビアンコ  エムアール（Ｂｉａｎｃｏ  ＭＲ）、フォーニ  エム（Ｆｏｒｎｉ  Ｍ）、ドニーニ  ピー（Ｄｏｎｉｎｉ  Ｐ）、パパ  エム（Ｐａｐａ  Ｍ）、リップス  エイチジェイ（Ｌｉｐｐｓ  ＨＪ）、ラビトラーノ  エム（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  Ｍ）。非ウイルス性エピソームベクターで作製された遺伝子組み換えブタ（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｉｇｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ。２００６年；１０３(４７)：１７６７２−７。
マーチャンド  ジーエス（Ｍａｒｃｈａｎｄ  ＧＳ）、ノワジュー  エヌ（Ｎｏｉｓｅｕｘ  Ｎ）、タンゲイ  ジェイエフ（Ｔａｎｇｕａｙ  ＪＦ）、シロイス  エムジー（Ｓｉｒｏｉｓ  ＭＧ）。アンチセンス遺伝子治療によるインビボのＶＥＧＦ媒介性血管新生の遮断：Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ−１受容体の役割（Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＶＥＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆｌｋ−１  ａｎｄ  Ｆｌｔ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ。２００２年；２８２(１）：Ｈ１９４−２０４。
マチュッシ  エムディー（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＭＤ）、ワンガー  アールダブリュ（Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷ）。アンチセンスを追求して（Ｉｎ  ｐｕｒｓｕｉｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）。Ｎａｔｕｒｅ。１９９６年；３８４(６６０４追補)：２０−２。
メロ  ジェイブイ（Ｍｅｌｏ  ＪＶ）。慢性骨髄球性白血病の分子生物学（Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ）。Ｌｅｕｋｅｍｉａ。１９９６年；１０(５)：７５１−６。
ミラー  エーディー（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ）。レトロウイルスパッケージング細胞（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）。Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ。１９９０年；１(１)：５−１４。
ナルディーニ  エル（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ）、ブルマー  ユー（Ｂｌｏｍｅｒ  Ｕ）、ギャレイ  ピー（Ｇａｌｌａｙ  Ｐ）、オリ  ディー（Ｏｒｙ  Ｄ）、ムリガン  アール（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｒ）、ゲージ  エフエイチ（Ｇａｇｅ  ＦＨ）、ヴェルマ  アイエム（Ｖｅｒｍａ  ＩＭ）、トロノ  ディー（Ｔｒｏｎｏ  Ｄ）。レンチウイルスベクターによる非分裂細胞のインビボ遺伝子送達および安定した形質導入（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）。Ｓｃｉｅｎｃｅ。１９９６年；２７２(５２５９)：２６３−７。
パブコ  ピーエー（Ｐａｖｃｏ  ＰＡ）、ボウハナ  ケーエス（Ｂｏｕｈａｎａ  ＫＳ）、ギャレゴス  エーエム（Ｇａｌｌｅｇｏｓ  ＡＭ）、アグラウォル  エー（Ａｇｒａｗａｌ  Ａ）、ブランカード  ケーエス（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ＫＳ）、グリム  エスエル（Ｇｒｉｍｍ  ＳＬ）、ヤンセン  ケーエル（Ｊｅｎｓｅｎ  ＫＬ）、アンドリューズ  エルイー（Ａｎｄｒｅｗｓ  ＬＥ）、ウィンコット  エフイー（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ＦＥ）、パイトット  ピーエー（Ｐｉｔｏｔ  ＰＡ）、トレスラー  アールジェイ（Ｔｒｅｓｓｌｅｒ  ＲＪ）、カッシュマン  シー（Ｃｕｓｈｍａｎ  Ｃ）、レイノルズ  エムエー（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＭＡ）、パリー  ティージェイ（Ｐａｒｒｙ  ＴＪ）。血管内皮増殖因子受容体のメッセンジャーＲＮＡを標的とするリボザイムの抗腫瘍および抗転移活性（Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ。２０００年；６(５)：２０９４−１０３。
ピッカルガ  ピーピー（Ｐｉｃｃａｌｕｇａ  ＰＰ）、マルチネッリ  ジー（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  Ｇ）、ロンドーニ  エム（Ｒｏｎｄｏｎｉ  Ｍ）、ヴィサーニ  ジー（Ｖｉｓａｎｉ  Ｇ）、バッカラーニ  エム（Ｂａｃｃａｒａｎｉ  Ｍ）。フィラデルフィア染色体陽性成人急性リンパ性白血病の進行および潜在的治療（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｄｕｌｔ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ）。Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ。２００６年；６(１０)：１０１１−２２。
ラディッヒ  ジェイピー（Ｒａｄｉｃｈ  ＪＰ）。フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ球性白血病（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）。Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ。２００１年；１５(１）：２１−３６。
リッヒマン  エル（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ）、クラーク（Ｃｌａｒｋ  Ｍ）、ウォルドマン  エイチ（Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｈ）、ウインター  ジー（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ）。治療のためのヒト抗体の再形成（Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）。Ｎａｔｕｒｅ。１９８８年；３３２(６１６２)：３２３−７。
ラックマン  ジェイ（Ｒｕｃｋｍａｎ  Ｊ）、グリーン  エルエス（Ｇｒｅｅｎ  ＬＳ）、ベッソン  ジェイ（Ｂｅｅｓｏｎ  Ｊ）、ワフ  エス（Ｗａｕｇｈ  Ｓ）、ジレット  ダブリューエル（Ｇｉｌｌｅｔｔｅ  ＷＬ）、ヘニンジャー  ディーディー（Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ  ＤＤ）、クレソン−ウェルシュ  エル（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ  Ｌ）、ジャンジック  エヌ（Ｊａｎｊｉｃ  Ｎ）。血管内皮増殖因子の１６５アミノ酸形態（ＶＥＧＦ１６５）に対する２’−フルオロピリミジンＲＮＡベースのアプタマー。エクソン７コードドメインを必要とする相互作用を介した受容体結合およびＶＥＧＦ誘導性血管透過性の阻害（２'−Ｆｌｕｏｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  １６５−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ(ＶＥＧＦ１６５），Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎ  ７−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ。１９９８年；２７３(３２)：２０５５６−６７。
シャア  エヌピー（Ｓｈａｈ  ＮＰ）、ソイヤーズ  シーエル（Ｓａｗｙｅｒｓ  ＣＬ）。フィラデルフィア染色体関連白血病におけるＳＴＩ５７１に対する抵抗性の機序（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＳＴＩ５７１  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ。２００３年；２２(４７)：７３８９−９５。
シブヤ  エム（Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ）。血管新生に関与するＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体系の構造および機能（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）。Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ。２００１年；２６(１）：２５−３５。
シルバー  アールティー（Ｓｉｌｖｅｒ  ＲＴ）。慢性骨髄球性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）。Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ。２００３年；１７：１１５９−１１７３。
スワーズ  アール（Ｓｗｏｒｄｓ  Ｒ）、アルバラド  ワイ（Ａｌｖａｒａｄｏ  Ｙ）、ギルス  エフ（Ｇｉｌｅｓ  Ｆ）。芽球期の慢性骨髄球性白血病およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病における新規のＡｂｌキナーゼ阻害剤（Ｎｏｖｅｌ  Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｂｌａｓｔｉｃ  ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）。Ｃｌｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｍｙｅｌｏｍａ。２００７年；７  追補３：Ｓ１１３−９。
トラップネル  ビーシー（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ＢＣ）。遺伝子導入用アデノウイルスベクター（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）。Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ。１９９３年；１２：１８５−１９９。
トゥエーク  シー（Ｔｕｅｒｋ  Ｃ）、ゴールド  エル（Ｇｏｌｄ  Ｌ）。指数関数的濃縮による、リガンドの系統的進化：バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡリガンド（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）。Ｓｃｉｅｎｃｅ。１９９０年；２４９(４９６８)：５０５−１０。
ウェン  ディーイー（Ｗｅｎｇ  ＤＥ）、ウスマン  エヌ（Ｕｓｍａｎ  Ｎ）。アンギオザイム：新規の血管新生阻害剤（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ。２００１年；３(２)：１４１−６。
ヤマダ  ティー（Ｙａｍａｄａ  Ｔ）、イワサキ  ワイ（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｙ）、タダ  エイチ（Ｔａｄａ  Ｈ）、イワブキ  エイチ（Ｉｗａｂｕｋｉ  Ｈ）、チュア  エムケイ（Ｃｈｕａｈ  ＭＫ）、ファンデンドリス  ティー（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  Ｔ）、フクダ（Ｆｕｋｕｄａ  Ｈ）、コンドー  エー（Ｋｏｎｄｏ  Ａ）、ウエダ  エム（Ｕｅｄａ  Ｍ）、セノ  エム（Ｓｅｎｏ  Ｍ）、タニザワ  ケイ（Ｔａｎｉｚａｗａ  Ｋ）、クロダ  エス（Ｋｕｒｏｄａ  Ｓ）。ヒト肝細胞への遺伝子および薬剤の送達のためのナノ粒子（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）。Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。２００３年；２１(８)：８８５−９０。
ヤナダ  エム（Ｙａｎａｄａ  Ｍ）、ナオエ  ティー（Ｎａｏｅ  Ｔ）。フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病のイマチニブ併用化学療法：現在の治療における大きな課題（Ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｍａｊｏｒ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）。Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ。２００６年９月；４７(９)：１７４７−５３。
ヨネクラ  エイチ（Ｙｏｎｅｋｕｒａ  Ｈ）、サクライ  エス（Ｓａｋｕｒａｉ  Ｓ）、リュウ  エックス（Ｌｉｕ  Ｘ）、ミギタ  エイチ（Ｍｉｇｉｔａ  Ｈ）、ワン  エイチ（Ｗａｎｇ  Ｈ）、ヤマギシ  エス（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｓ）、ノムラ  エム（Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ）、アベジン  エムジェイ（Ａｂｅｄｉｎ  ＭＪ）、ウノキ  エイチ（Ｕｎｏｋｉ  Ｈ）、ヤマモト  ワイ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ）、ヤマモト  エイチ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ）。毛細血管内皮細胞および周皮細胞における胎盤増殖因子ならびに血管内皮増殖因子ＢおよびＣ発現。血管新生のオートクリンおよびパラクリン制御における影響（Ｐｌａｃｅｎｔａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂ  ａｎｄ  Ｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．）。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ。１９９９年；２７４(４９)：３５１７２−８。
【図１】
0005766608.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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