(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託された、単離されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３。
【請求項２】
請求項１に記載の株と、
受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託された、単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗと
を含む、組み合わせ。
【請求項３】
受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３として寄託された、単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６をさらに含む、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２、および、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３の少なくとも１つから選択された、単離株。
【請求項５】
キャリアをさらに含む、請求項４に記載の株。
【請求項６】
受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２、および、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３から選択される少なくとも１つの株の有効量を非ヒト動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項７】
前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３、および、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、および、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物はブタである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
１×１０８合計ｃｆｕ／ブタ／日から５×１０１０合計ｃｆｕ／ブタ／日の前記株または前記複数の株が前記ブタに投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記動物は雌ブタである、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記雌ブタは授乳中の雌ブタである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、および、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６であり、
前記雌ブタから生まれた子ブタにおける体重および１日平均増体量を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりも改善させる工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、および、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６であり、
前記雌ブタから生まれた同腹仔内の子ブタ体重の変動範囲の増加を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりもよく防ぐ工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３であり、
前記雌ブタから生まれた同腹仔内の子ブタ体重の変動範囲の増加を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりもよく防ぐ工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３であり、
前記雌ブタから生まれた同腹仔内の子ブタ体重の変動範囲を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりも減少させる工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物は生産の哺育フェーズにあるブタであり、前記株は、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２である、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記株によって前記動物の免疫系を調節する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
直接給餌微生物を調製する方法であって、前記方法は、
（ａ）液体栄養ブロス中で、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２として寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２、および、受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３から選択される少なくとも１つの株を生育させる工程と、
（ｂ）前記液体栄養ブロスから前記株を分離して前記直接給餌微生物を形成する工程と
を含む、方法。
【請求項２１】
前記株は、受入番号Ｂ−５０１０１として寄託されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法の１１９（ｅ）条のもと、２００９年１月１２日出願の米国仮特許出願第６１／１４３，９９０号の優先権を主張し、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
文献目録
本明細書において、括弧内に第１著者の姓および出版年によって示されている参考文献の完全な文献引用は、特許請求の範囲の直前にある文献目録セクションに見出すことができる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、農業に役立つ生物学的方法および製品に関する。より特定的だが排他的ではなく、本発明は乳酸菌、ブタなどの動物に乳酸菌を投与する方法、および乳酸菌を作る方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ブタ産業では、効率的かつ経済的なブタ生産のために、早期離乳の実施を実行してきた（Ｗｉｌｓｏｎ，１９９５）。離乳の結果として明らかなのは、雌ブタの乳から固形飼料への食餌の急激な変化、およびブタの社会的環境の変化である（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。第１週は飼料の摂取が減少し、それに関連してたとえば絨毛萎縮、より深い陰窩、および未熟な腸細胞による絨毛先端の浸潤など、動物の腸の解剖学および生理学的に有害な変化が起こる。絨毛萎縮とは、栄養素摂取のために利用可能な吸収面積が少なくなることを意味し、より深い陰窩は組織代謝回転が大きいことを表す（Ｃｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。過去の研究では、異なる離乳環境および定住胃腸ミクロフローラ集団の集団に応答して絨毛の高さ対陰窩の深さの比が変わることが報告されている（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。腸ミクロフローラの破壊はしばしば突然の離乳に伴っており、胃腸管の安定性に有害な影響を与え、この破壊が刺激となって飼料の摂取および胃の解剖学的形態が変化して、離乳後の期間に生育が悪くなったり健康が損なわれたりするおそれがある（Ｄｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。これらの条件が組み合わされると、子ブタの成長および健康に著しく有害な影響を与え、成熟した消化器系および効果的な免疫防御の発達に負の影響を与え、その後の生産サイクルにおけるブタの成長成績にも派生する。
【０００５】
近年のブタ生産では、これらの問題に対処するためにいくつかのアプローチが考案されているが、なおも管理および食餌の変化を含む早期離乳の効率および経済的利益を利用している。２１日齢未満の早期に離乳し、その後ブタを第２の分離した場所に移すことを、一般的に分離早期離乳（ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｗｅａｎｉｎｇ：ＳＥＷ）と呼ぶ。このアプローチはいくつかの病原体の発生率を低減し、よって免疫学的ストレスを低減し、成長の改善および飼料利用効率の上昇をもたらす（Ｆａｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。この戦略は病原体の数を減らすことに成功しているが、すべての病原体をなくすことはできていない。前提となっているのは、移行抗体の結果としてのブタの免疫がまだ高いうちにブタを雌ブタから引き離すということである。この母系由来の受動免疫は、常在病原体の垂直伝達を防ぐ。突然の離乳による胃腸の破損はＳＥＷによって除去されないが、ブタを早期に離乳させて農場の場所から分離した施設に入れるとき、その問題は罹患率および深刻度がかなり低くなるようにみえる。これは、ブタの生得的防御が損なわれるときである離乳の際にブタへの病原体の攻撃が少なくなるためと考えられる。
【０００６】
良質なタンパク源および離乳移行を容易にするための添加剤を利用した食餌配合物は、子ブタの健康を守るための付加的なアプローチである。最もよく用いられる選択肢のうちの２つは、噴霧乾燥された血漿タンパク質を含ませることおよび飼料内の抗生物質である。ブタの食餌に抗生物質を補給することの利益はよく実証されており、離乳したブタに抗生物質を加えることによって、それより後の成長段階のブタに比べて応答が最大限に改善される（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，２００１に概説される）。噴霧乾燥された動物血漿（ｓｐｒａｙ−ｄｒｉｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｐｌａｓｍａ：ＳＤＡＰ）が成績を増強する利益を有することは科学文献においても広く実証されており（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａに概説される）、ＳＤＡＰは離乳したブタの最初の食餌の成分として特に高く評価されている。ＳＤＡＰを一貫して加えることによって体重増加および飼料の摂取が改善され、特に離乳後１週間から２週間の期間における離乳後の下痢が減少する（Ｃｏｆｆｅｙ  ａｎｄ  Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，１９９５；ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１ａ；Ｂｉｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。科学文献において過去に報告された、提案される機構は以下を含む：食餌嗜好性の改善、栄養素の消化性の改善、有益な成長因子の存在、病原体結合／阻害糖タンパク質、毒素の中和、免疫グロブリンの存在、免疫調節、腸形態の改善、および腸微生物生態学の変化（Ｂｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，２００４；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｏｕｒｉｃｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｎｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｐｅｒｅｚ−Ｂｏｓｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｔｏｒｒａｌｌａｒｄｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ；ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）。
【０００７】
これらおよびその他の食餌性添加剤の効果は、管腔の栄養素および添加剤がブタに直接的な影響を与えるのではなく、外来栄養素の有効性に応答して微生物シフトを仲介することによって作用するという概念を支持する（Ｇａｓｋｉｎｓ，２００１）。このことから、直接給餌微生物（ｄｉｒｅｃｔ−ｆｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ：ＤＦＭ）添加剤を使用して、病原体侵入の道を開く胃腸生態系の破損を防ぐことによって離乳移行を助け、それによって若いブタの成長を促進し、健康を維持することに大きな関心が持たれている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養液の補給は、ブタを病原体の攻撃から保護することによって離乳したブタの成長成績を改善させることが報告されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋｙｒｉａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ａｄａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。一般的にブタに給餌されるＤＦＭ添加剤のほとんどはＢａｃｉｌｌｕｓに基づくものであり、乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の補給も若いブタに成績の利益を与える。乳酸桿菌の５株の組み合わせを補給された、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに攻撃されたブタは、攻撃された未補給のブタに比べて体重増加が改善し、症状の深刻度が低く、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの糞便脱落が少なかった（Ｃａｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。さらに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓを新生仔ブタに補給した結果、小腸における杯状細胞成熟がもたらされ、離乳後の体重増加が劇的に改善し、これはトール様受容体シグナリングを通じた腸の炎症シグナルの制御によるものと考えられる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，２００７）。家畜に給餌された抗生物質の成長促進レベルに関連する抗生物質抵抗、および伝染性海綿状脳炎（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）に関する近年の懸念を伴う血漿タンパク質などの動物副産物の使用の欠点によって、有益な細菌の補給によって同じ利益のいくつかを提供することが家畜産業において人気を得ている。
【０００８】
その有効性に対する科学的支持は不足しており、その作用モードの理解は限られているが、プロバイオティク製品の補給はヒトおよび農業分野の両方において一般的になってきている。歴史的に、プロバイオティクスは、ヨーグルトおよびチーズなどの発酵乳製品を大量に消費した個体が特に長命だったという概念から始まったものである（Ｔａｎｎｏｃｋ，２００４）。プロバイオティク生物の大部分は、増殖が容易で、食品発酵プロセスから容易に入手可能であるという理由で選択されており、それらの選択を導く科学的支持はほとんどない（Ｆｕｌｌｅｒ，１９９７）。したがって、家畜種のためのＤＦＭ製品に用いられる細菌は、家畜生産系に存在する攻撃に理想的に適した細菌生物を提供するように選択されていないことが多い。
【０００９】
必要なのは、ブタおよび他の動物において有用な細菌株である。細菌株を作製および使用する方法も必要とされている。加えて、これらの株を同定するためのＤＮＡ配列、およびそのＤＮＡ配列によって株を同定する方法も必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この開示の最後に示される請求項によって定義される本発明は、上述の問題の少なくともいくつかを解決することが意図されている。
【００１１】
ＤＮＡ配列が提供される。このＤＮＡ配列は乳酸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コード領域の部分を含み、その５’末端は５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’の配列を含み、その３’末端はＢｆａＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩのうちの１つに対する制限酵素認識部位を含む。制限酵素認識部位がＢｆａＩであるとき、このＤＮＡ配列の長さは約９９塩基対から約１０３塩基対、約２６８塩基対から約２７３塩基対、約２６０塩基対から約２６５塩基対、約２７９塩基対から約２８４塩基対、約２７８塩基対から約２８２塩基対、または約２７３塩基対から約２７７塩基対である。制限酵素認識部位がＨａｅＩＩＩであるとき、このＤＮＡ配列の長さは約３２９塩基対から約３３４塩基対、約３５２塩基対から約３５７塩基対、約２７７塩基対から約２８２塩基対、または約３３５塩基対から約３３９塩基対である。制限酵素認識部位がＭｓｐＩであるとき、このＤＮＡ配列の長さは約１８８塩基対から約１９２塩基対である。
【００１２】
直接給餌微生物として用いられ得る１つまたは複数の株を同定する方法も提供される。この方法においては、動物の胃腸管からの細菌からＤＮＡが単離される。ＤＮＡは増幅される。増幅されたＤＮＡはＴ−ＲＦＬＰによって分析されてＴＲＦデータを生成する。ＴＲＦデータは目的の特徴と相関される。その相関から目的の株が同定される。株中のＴＲＦの存在が確認される。
【００１３】
この方法によって同定される１つまたは複数の株が付加的に提供される。この１つまたは複数の株の有効量を動物に投与するための方法も提供される。
【００１４】
加えて、単離されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）が、単離されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）および単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）を含む組み合わせとともに提供される。
【００１５】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１）、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）の少なくとも１つから選択された単離株が付加的に提供される。上に挙げた株の１つのすべての判明している特徴（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を有する単離株も提供される。
【００１６】
付加的な方法が提供される。方法の１つにおいては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１）、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）から選択される少なくとも１つの株の有効量が動物に投与される。
【００１７】
別の方法は、直接給餌微生物を調製する方法である。この方法においては、液体栄養ブロス中で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１）、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）から選択される少なくとも１つの株が生育される。液体栄養ブロスから株を分離して直接給餌微生物を形成する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
乳酸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コード領域の一部分を含むＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列の５’末端は５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’の配列を含み、前記ＤＮＡ配列の３’末端はＢｆａＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩのうちの１つに対する制限酵素認識部位を含み、
前記制限酵素認識部位がＢｆａＩであるとき、前記ＤＮＡ配列の長さは約９９塩基対から約１０３塩基対、約２６８塩基対から約２７３塩基対、約２６０塩基対から約２６５塩基対、約２７９塩基対から約２８４塩基対、約２７８塩基対から約２８２塩基対、または約２７３塩基対から約２７７塩基対であり、
前記制限酵素認識部位がＨａｅＩＩＩであるとき、前記ＤＮＡ配列の長さは約３２９塩基対から約３３４塩基対、約３５２塩基対から約３５７塩基対、約２７７塩基対から約２８２塩基対、または約３３５塩基対から約３３９塩基対であり、
前記制限酵素認識部位がＭｓｐＩであるとき、前記ＤＮＡ配列の長さは約１８８塩基対から約１９２塩基対である、ＤＮＡ配列。
（項目２）
直接給餌微生物として用いられ得る１つまたは複数の株を同定する方法であって、前記方法は、
動物の胃腸管からの細菌からＤＮＡを単離する工程と、
前記ＤＮＡを増幅する工程と、
前記増幅されたＤＮＡをＴ−ＲＦＬＰによって分析してＴＲＦデータを生成する工程と、
前記ＴＲＦデータを目的の特徴と相関させる工程と、
前記相関から目的の株を同定する工程と、
前記株中の前記ＴＲＦの存在を確認する工程と
を含む、方法。
（項目３）
項目２に記載の方法によって同定された株。
（項目４）
前記株は潜在的プロバイオティクである、項目３に記載の株。
（項目５）
前記株は潜在的病原体である、項目３に記載の株。
（項目６）
項目３に記載の少なくとも１つの株の有効量を動物に投与する工程を含む、方法。
（項目７）
単離されたＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）。
（項目８）
項目７に記載の株と、
単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）と
を含む、組み合わせ。
（項目９）
単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）をさらに含む、項目８に記載の組み合わせ。
（項目１０）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１）、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）の少なくとも１つから選択された、単離株。
（項目１１）
項目１０に記載の株の１つのすべての判明している特徴を有する、単離株。
（項目１２）
キャリアをさらに含む、項目１０に記載の株。
（項目１３）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１）、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）から選択される少なくとも１つの株の有効量を動物に投与する工程を含む、方法。
（項目１４）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記動物はブタである、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
約１×１０８合計ｃｆｕ／ブタ／日から約５×１０１０合計ｃｆｕ／ブタ／日の前記株または前記複数の株が前記ブタに投与される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記動物は雌ブタである、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記雌ブタは授乳中の雌ブタである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）であり、
前記雌ブタから生まれた（ｂｏｒｎｅ  ｔｏ）子ブタにおける体重および１日平均増体量を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりも改善させる工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）であり、
前記雌ブタから生まれた同腹仔内の子ブタ体重の変動の増加を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりもよく防ぐ工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）であり、
前記雌ブタから生まれた同腹仔内の子ブタ体重の変動の増加を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりもよく防ぐ工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）であり、
前記雌ブタから生まれた同腹仔内の子ブタ体重の変動を、前記株を投与されていない雌ブタから生まれた子ブタにおけるそれよりも減少させる工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記動物は生産の哺育フェーズにあるブタであり、前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１）である、項目１３に記載の方法。
（項目２６）
前記株によって前記動物の免疫系を調節する工程をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目２７）
直接給餌微生物を調製する方法であって、前記方法は、
（ａ）液体栄養ブロス中で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＰｌＢ  ｃ６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ｏ２４６ｅ  ３３ｗ（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１）、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１）から選択される少なくとも１つの株を生育させる工程と、
（ｂ）前記液体栄養ブロスから前記株を分離して前記直接給餌微生物を形成する工程と
を含む、方法。
（項目２８）
前記株はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３  Ｂ−５０１０１である、項目２７に記載の方法。
【００１８】
本発明の例示的な実施形態を添付の図面に示す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、屋外施設で産まれたブタと比べたときの、従来の屋内施設で産まれた子ブタの末梢血から単離された、離乳後のｄａｙ１、３、１０および２４（または２０、２２、２９および４３日齢）のリンパ球の濃度を示すグラフである（処置×Ｄａｙ相互作用、Ｐ＜０．０１；ａ、ｂ、各日のうちの異なる文字を伴う平均は異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図２】図２Ａは、ＲＡＰＤプライマー１および４フィンガープリントによって定められた９つの候補ＤＦＭ株の類似性を示すデンドログラムの半分である。制限エンドヌクレアーゼＢｆａＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩに対する９株のＴＲＦバンド形成パターンも示される。図２Ｂは、ＲＡＰＤプライマー１および４フィンガープリントによって定められた９つの候補ＤＦＭ株の類似性を示すデンドログラムの半分である。制限エンドヌクレアーゼＢｆａＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩに対する９株のＴＲＦバンド形成パターンも示される。
【図３】図３は、授乳期間の雌ブタに対するプロバイオティクの組み合わせの投与の結果もたらされる、同腹仔内の体重の初期および最終変動係数を示すグラフである（処置×時間相互作用、Ｐ＝０．０６；ＳＥ＝１．２２）。ＰＡ＝Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３；ＬＡ＝Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６；ＬＳ＝Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明に示されるかまたは図面に示される構成の詳細および構成要素の配置に限定されないことが理解されるべきである。本発明は他の実施形態も可能であるし、さまざまなやり方で実施または実行されてもよい。加えて、本明細書で用いられる表現および用語は説明の目的に対するものであって、限定するものとみなされるべきではないことが理解されるべきである。
【００２１】
本発明に従って、当該技術における従来の分子生物学および微生物学が利用されてもよい。こうした技術は文献において十分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．などを参照。
【００２２】
本明細書に記載されるのは、新規の乳酸菌株およびその組み合わせである。この株を、単独または組み合わせて、ブタなどの動物に投与できる。この株はブタに給餌されると多くの利益を提供する。この株を妊娠中の雌ブタまたは未経産雌ブタまたは授乳中の雌ブタに給餌すると、それらの子に利益がみられる。たとえば子ブタおよび成長／仕上げのブタなど、他の齢のブタに給餌されるときにも、この株は利益を提供する。
【００２３】
直接給餌微生物（ＤＦＭ）として使用可能な１つまたは複数の株を同定する方法も本明細書に記載される。この方法においては、動物の胃腸管からの細菌からＤＮＡが単離される。ＤＮＡは増幅される。増幅されたＤＮＡは末端制限断片長多型（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：Ｔ−ＲＦＬＰ）によって分析されて、末端制限断片（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＴＲＦ）データを生成する。ＴＲＦデータは目的の特徴に相関される。その相関から目的の株が同定される。株のＲＡＰＤ  ＰＣＲ分析またはあらゆるその他の好適な方法によって、株の数が減らされる。株中のＴＲＦの存在が確認される。
【００２４】
末端制限断片（ＴＲＦｓ）：
本明細書に記載されるのは、目的の株を同定するために有用なＴＲＦである。それらのＴＲＦは、乳酸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コード領域の部分を含むＤＮＡ配列を含むがそれに限定されない。そのＤＮＡ配列の５’末端は５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’の配列を含み、３’末端はＢｆａＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩのうちの１つに対する制限酵素認識部位を含む。制限酵素認識部位がＢｆａＩであるとき、このＤＮＡ配列の長さは約９９塩基対から約１０３塩基対、約２６８塩基対から約２７３塩基対、約２６０塩基対から約２６５塩基対、約２７９塩基対から約２８４塩基対、約２７８塩基対から約２８２塩基対、または約２７３塩基対から約２７７塩基対である。制限酵素認識部位がＨａｅＩＩＩであるとき、このＤＮＡ配列の長さは約３２９塩基対から約３３４塩基対、約３５２塩基対から約３５７塩基対、約２７７塩基対から約２８２塩基対、または約３３５塩基対から約３３９塩基対である。制限酵素認識部位がＭｓｐＩであるとき、このＤＮＡ配列の長さは約１８８塩基対から約１９２塩基対である。
【００２５】
乳酸菌：
末端制限断片（ＴＲＦ）を用いて同定された乳酸菌の株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ｏ２４６ｅ  ４２、およびＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３も本明細書に記載される。これらの株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ），１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，６１６０４に以下のとおりに寄託された。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６は２００８年１月１８日に寄託されて受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０３を受け、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗは２００８年１月１８日に寄託されて受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０２を受け、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ｏ２４６ｅ  ４２は２００８年８月２９日に寄託されて受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１７１を受け、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３は２００８年１月１８日に寄託されて受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１０１を受けた。本明細書に記載されるＴＲＦによって同定された付加的な株も本発明の範囲内である。
【００２６】
乳酸菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  １Ｅ１を、上に挙げた株の１つまたは複数とともに用いてもよい。株１Ｅ−１（株１Ｅ１とも表記される）は、健康な離乳したブタの腸管から単離された。株１Ｅ−１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０の微生物コレクションから受入番号ＰＴＡ−６５０９の下で入手可能であり、これは２００５年１月１２日に寄託された。すべての寄託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの規定の下で行なわれた。
【００２７】
上に挙げた株の（下に提供される）判明している特徴をすべて有する株も、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００２８】
簡単には、以下のとおりにＴＲＦを用いて乳酸菌の株が同定され、そのさらなる詳細は下記の実施例セクションに示される。ブタを条件が異なる２つのグループに分けて、成績および免疫測定値、たとえば免疫細胞の特定の免疫部分母集団などの差を生じさせた。本明細書において用いられる「成績（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）」とは、以下のパラメータによって測定される動物の成長を示す：１日の平均体重増加、合計体重増加、飼料転換率、これは飼料：増体量および増体量：飼料の両方を含む、飼料効率、死亡率、および飼料摂取。本明細書において用いられる「成績の改善」とは、成績の定義の下で上に挙げられたパラメータの少なくとも１つにおける改善を意味する。
【００２９】
成績および免疫特徴に対する測定値を有するブタのグループからは、その胃腸管の乳酸菌からＴＲＦを同定した。これらのＴＲＦは、有益な測定値を有するブタのグループに存在し、有益な測定値を有さないブタのグループには存在しなかった。ＲＡＰＤ  ＰＣＲ分析を用いて、潜在的に有用な株の数を狭めた。狭めたグループの株にＴＲＦが存在することを確認した。それらのＴＲＦはより良好な測定値を有するブタのグループに見出されたため、それらの株は成績および／または免疫調節に正の影響を与えるはずだと発明者らは考えた。動物に給餌したときに、４株の乳酸菌が成績に正の影響を与えることが見出された。
【００３０】
株は単独または組み合わせて給餌されてもよい。例示的な実施形態の１つにおいては、株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３を組み合わせて、たとえば授乳中の雌ブタおよび／または子ブタなどの動物に投与する。別の例示的な実施形態においては、株Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗを組み合わせて投与する。別の例示的な実施形態においては、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３のみを、たとえば授乳中の雌ブタおよび／または子ブタなどの動物に投与する。
【００３１】
直接給餌微生物：
直接給餌微生物（ＤＦＭ）は、この開示においては「プロバイオティク」と相互交換可能に用いられ、これは上に挙げられる乳酸菌の１つまたは複数の株を含む。ＤＦＭに１つまたは複数のキャリアまたはその他の成分が加えられてもよい。ＤＦＭは、たとえばトップドレス（ｔｏｐ  ｄｒｅｓｓ）、液体水薬として用いられるかもしくはミルク代替品に加えられる水溶性濃縮物、ゼラチンカプセル、またはゲルなど、さまざまな物理的形状で提供されてもよい。トップドレス形状の実施形態の１つにおいては、凍結乾燥した乳酸菌発酵産物を、たとえば乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、石灰石（炭酸カルシウム）、米外皮、酵母培養物、乾燥デンプン、およびケイアルミン酸ナトリウムなどのキャリアに加える。液体水薬またはミルク代替品補給のための水溶性濃縮物の実施形態の１つにおいては、凍結乾燥した乳酸菌発酵産物を、たとえば乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、乾燥デンプン、ケイアルミン酸ナトリウムなどの水溶性キャリアに加え、液体を加えて水薬を形成するか、またはこの補給品をミルクもしくはミルク代替品に加える。ゼラチンカプセル形状の実施形態の１つにおいては、凍結乾燥した乳酸菌発酵産物を、たとえば乳清、マルトデキストリン、糖、石灰石（炭酸カルシウム）、米外皮、酵母培養物、乾燥デンプン、および／またはケイアルミン酸ナトリウムなどのキャリアに加える。実施形態の１つにおいては、乳酸菌およびキャリアを分解性のゼラチンカプセルに封入する。ゲル形状の実施形態の１つにおいては、凍結乾燥した乳酸発酵産物を、たとえば植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、および人工着色剤などのキャリアに加えてゲルを形成する。
【００３２】
乳酸菌を得るため、およびＤＦＭを形成するために、乳酸菌を適切なレベルまで発酵させてもよい。限定しない実施例において、そのレベルは約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌレベルから約１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌレベルの間である。これらの乳酸菌は、ｄｅ  Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）ブロス中で３７℃にて２４時間生育されてもよい。遠心分離によって細菌を収集してもよく、上清は除去される。
【００３３】
ペレット状の乳酸菌は、次いでブタなどの動物にＤＦＭとして給餌され得る。いくつかの実施形態において、ＤＦＭは雌ブタ、未経産雌ブタ、離乳前の子ブタ、離乳後の子ブタ、またはあらゆる年齢のブタに給餌される。乳酸菌は授乳期間に雌ブタに給餌されてもよいが、異なる期間および異なる時間に乳酸菌が給餌されてもよい。未経産雌ブタまたは雌ブタに給餌されるとき、その株は未経産雌ブタまたは雌ブタから生まれた（ｂｏｒｎｅ  ｔｏ）子ブタに伝達される。これは糞便−経口経路および／または他の経路を介して達成されると考えられる。実施形態の１つにおいて、ペレット状の乳酸菌は、動物への直接的給餌のために凍結乾燥される。少なくともいくつかの実施形態において、乳酸菌は動物の飼料に添加される。
【００３４】
乳酸菌は動物に給餌されると、その胃腸管内で樹立される。合計ＣＦＵが１つの生物に由来するか、生物の組み合わせに由来するかに関わらず、約１×１０８ＣＦＵ／動物／日から約５×１０１０ＣＦＵ／動物／日の乳酸菌が給餌されてもよい。例示的な実施形態においては、合計ＣＦＵが１つの生物に由来するか、生物の組み合わせに由来するかに関わらず、１×１０９合計ＣＦＵ／動物／日の乳酸菌が給餌される。実施形態の１つにおいては、等量の各株が用いられる。別の実施形態においては、不均等な量が用いられる。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、例示的な目的のためにのみ提供される。実施例は、現在説明される発明のより完全な理解を助けるためにのみ本明細書に含まれている。実施例は、いかなる態様でも本明細書に記載または請求される本発明の範囲を限定することはない。
【００３６】
（実施例１）
従来の離乳対分離早期離乳の成長成績モデル：
敷地外の分離早期離乳管理条件で飼育したブタと、雌親による出産および飼育が行なわれたのと同じ農場の場所で従来通りに飼育されたブタとの比較を用いて、成長成績における分離を与えるためのモデルを確立した。１１組の同腹仔からの８８匹の交雑した去勢ブタおよび未経産雌ブタを１９日齢で離乳させた。４４匹のブタの一方のグループを雌ブタの群から１２ｋｍ離れた分離哺育室に移し、残りのブタは離乳前の場所に位置する哺育施設に移した。各施設において、ブタを１６個の囲いの中に割当て、離乳後のｄａｙ１１、１８および２５に体重および飼料消失を測定して、１日平均増体量（ａｖｅｒａｇｅ  ｄａｉｌｙ  ｇａｉｎ：ＡＤＧ）、１日平均飼料摂取（ａｖｅｒａｇｅ  ｄａｉｌｙ  ｆｅｅｄ  ｉｎｔａｋｅ：ＡＤＦＩ）、および増体量：飼料を定めた。離乳後のｄａｙ１、３、１１および２５にサンプリングのために各施設から４匹のブタを選択して、細胞単離のために大静脈穿刺によって血液サンプルを得てから、ブタを人道的に安楽死させて、微生物分析および免疫細胞単離のための胃腸管組織を得た。下の表１は、従来通り飼育されたブタに比べて、分離早期離乳管理系で飼育されたブタに対して観察された１日平均増体量および１日平均飼料摂取応答が改善したこと（Ｐ＜０．１０）、ならびに研究の終わり（離乳後２５日）に分離早期離乳されたブタに対して観察されたブタ体重がより重かったこと（Ｐ＜０．０１）を示す。
【００３７】
【表１】
0005770640.tif 000002
（実施例２）
屋外対従来の飼育の成長成績モデル：
若いブタの成長成績のより強固な分離を提供するために第２のモデルを確立し、ここでブタは従来の閉じられた分娩施設で飼育されるか、または屋外管理系で出産された。この実験のために各施設で１４４匹のブタを識別した。従来通り飼育されたブタはインディアナ州に位置し、一方で屋外飼育されたブタはコロラド州に位置した。どちらの施設のブタも類似の遺伝的背景を有した（ＰＩＣ  Ｃ−２２×ＰＩＣ２８０）。６日齢および１４日齢ならびに離乳の２４時間前（１８日齢）の各時間間隔で、各施設すなわち屋外および屋内から６匹のブタをランダムに選択して屠殺し、離乳前の期間の胃腸微生物集団および免疫細胞発生を測定した。各施設からの１２６匹のブタを１９日齢で離乳させて、アーカンソー州に位置する敷地外哺育施設に移動させた。到着すると、各グループからのブタを同じ施設内の別々の部屋に入れて、２グループ間のミクロフローラへの露出を防ぐためにこれらのグループを分離し続けながら、離乳後の期間における成長成績をモニタした。フェーズ１（離乳後のｄａｙ０から１１）、フェーズ２（離乳後のｄａｙ１１から２５）、およびフェーズ３（離乳後のｄａｙ２５から３９）として定義される各食餌フェーズの終わりに、ブタの体重および飼料消失を定めた。離乳後のｄａｙ１、３、７、１０および２４にサンプリングのために各グループから６匹のブタを選択して、細胞単離のために大静脈穿刺によって血液サンプルを得てから、ブタを人道的に安楽死させて、微生物分析および免疫細胞単離のための胃腸管組織を得た。従来の雌ブタ施設で出産されたブタは、屋外施設で飼育されたブタに比べて、離乳時の初期体重が数値的に大きかった（５．１８対５．７４±０．２８；Ｐ＝０．１６）。しかしながら、予め屋外で飼育されたブタは、従来の閉じられた施設で出産されたブタよりも各フェーズの終わりにおける１日平均増体量、１日平均飼料摂取、および体重が大きかった（Ｐ＜０．０１）（下の表２を参照）。
【００３８】
【表２】
0005770640.tif 000003
（実施例３）
免疫測定およびフローサイトメトリ分析：
血液および胃腸サンプルから免疫細胞を単離し、実施例１および２の両方の成長成績モデルから以下を含む免疫測定値の組を得た：白血球百分率；末梢血単核球増殖およびサイトカイン増殖；胃腸の形態、杯状細胞計数、および空腸組織からの免疫組織化学；ならびに末梢血および空腸組織から単離した細胞に対するフローサイトメトリ分析。細胞単離法および実験手順は過去に科学文献に発表されている（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）。免疫組織化学およびフローサイトメトリ分析に対する免疫細胞サブセットを定めるために用いられた抗体パネルを下の表３に示す。
【００３９】
【表３】
0005770640.tif 000004
腸形態、杯状細胞分化、および胃腸免疫細胞集団によって定められた、従来通りのブタおよび分離早期離乳ブタの胃腸発達および健康の差は、過去に文献において報告されている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ）。従来通りの飼育と屋外飼育成長モデルとの比較において用いられた２つの離乳前管理系によっても免疫発達が変わった。具体的には、離乳後の期間に、従来の管理系および屋外管理系の間で末梢血中のリンパ球集団が異なっており、ここで予め屋外で飼育されたブタは、従来通り飼育されたブタに比べて離乳３日後の血中リンパ球の割合が低かった（Ｐ＜０．０５）が、離乳１０日後には割合が高くなった（Ｐ＜０．０５）（管理系×ｄａｙ相互作用、Ｐ＜０．０１；図１）。さらに、末梢血単核球のフローサイトメトリ分析から、授乳期間に従来の閉じられた施設で飼育されたブタは、離乳前（４０．９０対２６．９５±４．９９；Ｐ＜０．０５）および離乳後（３４．７８対１９．２６±４．５５；Ｐ＜０．０５）の期間に、活性化分子ＣＤ２５を発現する白血球の割合が高いことが明らかになった。これらのデータは、異なる飼育系によって、各系のブタが分離されるとき（離乳前）および２つのグループが類似の離乳後管理系に入れられるときの両方の期間における免疫発達がいかに変わるかを示している。胃腸の発達においても差が明らかであり、ここでは従来の閉じられた施設で飼育されたブタの方が、屋外飼育されたブタよりも離乳前の十二指腸内の絨毛の高さが大きく（Ｐ＜０．０１）、陰窩の深さが小さかった（Ｐ＜０．０５）が、離乳後は従来通り飼育されたブタよりも屋外飼育されたブタの方が十二指腸の絨毛の高さ、陰窩の深さ、および面積が大きかった（Ｐ＜０．０１）（下の表４を参照）。このことは、胃腸管の空腸内の免疫細胞発生の違いによってさらに証明される。この例は、離乳前にＣＤ２５活性化分子を発現する白血球の割合が高いこと（１２．４４対８．９９±１．２２；Ｐ＜０．０５）、離乳後２４日間に予め屋外で飼育したブタにおけるＣＤ８を発現するリンパ球の割合が高いこと（２５．０８対１６．４９±３．４９；Ｐ＜０．０５）、および免疫組織化学分析によって証明されたとおり、授乳期間にブタを従来の閉じられた系よりも屋外系で飼育したときの方が離乳前（３０．６対１８．４±４．４）および離乳後（２６．０対３５．１±３．７）期間において抗原提示分子の主要組織適合複合体ＩＩ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ＩＩ：ＭＨＣ−ＩＩ）を発現する白血球の割合が高いことを含む。
【００４０】
【表４】
0005770640.tif 000005
（実施例４）
胃腸細菌の単離および同定：
組織処理。細菌細胞単離のために、食道部、十二指腸、空腸および回腸を含む胃腸部分を回収した。２５ｍＬの滅菌洗浄緩衝液（０．３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および０．０５％システイン塩酸塩、ｐＨ７．０）で２回洗浄することによって、各腸部分から管腔材料を取除いた。滅菌鉗子で管部分を横方向に切断し、２５ｍＬの滅菌０．１％ペプトン希釈緩衝液によって、あらゆる残りの管腔材料を再び取除いた。腸部分を９９ｍＬの滅菌ペプトン希釈緩衝液とともに滅菌ｗｈｉｒｌ−ｐａｋバッグに入れ、ストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）中で３０秒間粉砕して、コロニー形成または粘液に結合している細菌を放出させた。粉砕後の溶液を、腸部分は除いて滅菌２５０ｍＬ遠心管に注ぎ入れた。この細菌細胞含有溶液に対して、１３，１７０×ｇにて１０分間の遠心分離を行なった。その後上清を捨てて、ペレットに１０ｍＬの滅菌ＭＲＳ＋１０％グリセロールブロスを加え、再懸濁してその後のＤＮＡ単離まで−２０℃で凍結した。
【００４１】
ＤＮＡ単離。ＤＮＡ単離の前に、凍結した離乳後の胃腸部分サンプル（Ｎ＝１２８）を氷上で融解した。溶液を３０秒間ボルテックスして不均一なサンプルを得、かつ凝集した細胞または凍結の際に小球材料に結合したおそれのある細胞をばらばらにした。次いで２ｍＬの混合細胞を滅菌１Ｍ  Ｗｈａｔｍａｎミルク濾紙で濾過することで、ＤＮＡ単離プロセスを妨げる小球材料を除去した。ＤＮＡ単離プロセスは以下のとおりに続けられた：０．５ｍＬの細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに加え、１５ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｔ５０Ｅ１０）溶液、ｐＨ７．５で洗浄した後、２，４８５×ｇにて１０分間遠心分離して、ＰＣＲを阻害する物質を除去した。この洗浄および遠心分離の工程を再び繰り返した。わずかに改変したＲｏｃｈｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の指示に従って、ペレット状の細胞を単離した。すべてのリン酸緩衝食塩水溶液をＴ５０Ｅ１０に置換え、推奨される５ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液をＴ５０Ｅ１０に溶解した１００ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液に置換えた。単離後、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＴＤ−３６０  Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてＤＮＡを定量化した。
【００４２】
ＰＣＲ増幅およびＴ−ＲＦＬＰ分析。適切な量の増幅産物を提供し、かつＰＣＲの変動を減らすために、各腸部分サンプル（食道部を除く）からのＤＮＡ５０ｎｇを用いた増幅反応を３つ組で行なった。食道部の部分からのＤＮＡはこの範囲で検出できないことがしばしばあったため、２μＬの食道部ＤＮＡ単離サンプルをＰＣＲ反応に加えた。５’−テトラクロロフルオレセイン標識８Ｆドメインプライマー（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’）および１４０６Ｒユニバーサルプライマー（５’ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ３’）を用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コード領域（Ｂａｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）の大部分を増幅した。
【００４３】
１００μＬの反応混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液、２８０μＭの濃度の各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＮＴＰ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１２．５ｐＭの塩化テトラメチルアンモニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＴＭＡＣ）、７７ｐＭの各プライマーおよび１０ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含んだ。この高濃度のＴａｑは、微小量のＰＣＲ阻害物質の影響を克服するための手段として我々の研究室が定めたものである。市販のＴａｑ酵素に見出される混入ＤＮＡの影響をモニタするために、正および負の対照が含まれた。ＰＣＲ条件は、９５℃にて５分間、９４℃にて３０秒間の変性を３０サイクル、５７．５℃にて３０秒間のアニーリング、および７２℃にて１２０秒間の伸長であった。最後のサイクルは７２℃にて７分間の最終伸長を含んだ。１％アガロースゲル内を走行させて、臭化エチジウムにて染色し、ＵＶトランスイルミネータで可視化することによって、ＰＣＲ産物の純度を確認した。各サンプルから３つ組で行なわれた蛍光標識ＰＣＲ増幅産物をプールしてから、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてプライマーから精製し、８０μＬに濃縮した。その後、精製したサンプルを等体積に４つに分けた。アリコートのうちの３つは、別個に１０ＵのＢｆａＩ、ＨａｅＩＩＩまたはＭｓｐＩのいずれかによって３７℃にて４時間消化され、第４のアリコートは必要に応じて第４の制限酵素分析を行なうために２０℃にて保存された。ＢｆａＩを用いた消化からのＴＲＦは文字Ｂで示され、ＨａｅＩＩＩによるＴＲＦを示すために文字Ｈが用いられ、ＭｓｐＩに対してＭが用いられる。すべてのＴＲＦ呼称は断片のサイズも含んでおり、たとえばＢ１００．７９はＢｆａＩによって生じた１０１ｂｐＴＲＦである。３つの制限酵素を用いることによって、各ＴＲＦを最小数の菌種に分類学的に同定する可能性が改善された。消化されたＤＮＡを次いでＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製して、ＤＮＡシーケンサにおける分解能を改善した。２μＬのＴ−ＲＦＬＰ産物を３μＬのプレミックス添加緩衝液と混合し、このプレミックス添加緩衝液は２μＬのブルーデキストラン／ＥＤＴＡ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、０．５μＬのＧｅｎｅＳｃａｎ５００  ＴＡＭＡＲＡサイズ基準（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、０．５μＬのホルムアミドとを含んだ。Ｇｅｎｅｓｃａｎモード（Ｌａｒａｇｅｎ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）におけるモデルＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた電気泳動によってＴ−ＲＦを分析した。局所的サザン法を用いるＧｅｎｅＳｃａｎ３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて断片サイズを推定した。５０〜５００ｂｐの範囲外のサイズのＴ−ＲＦおよび５０相対蛍光単位未満のピーク高さのＴ−ＲＦは分析から除外した。
【００４４】
Ｔ−ＲＦマッチングによる細菌の同定。各サンプリング日からの各個別のブタ腸部分からのサンプルＴ−ＲＦＬＰデータを、特定化したＴ−ＲＦＬＰ伸長を用いてＢｉｏｎｕｍｅｒｉｃｓ  Ｇｅｌ  ＣｏｍｐａｒＩＩパッケージ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）にインポートした。Ｇｅｌ  ＣｏｍｐａｒＩＩプログラムを用いて０．５％の位置公差を用いて３つの制限酵素すべてに対する正確なバンドマッチングを容易にし、３つの制限酵素に由来するＴ−ＲＦによって操作的分類単位（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔｓ：ＯＴＵ）として同定された菌種を定めた。
【００４５】
（実施例５）
胃腸細菌の成長成績および免疫特徴に対する相関性：
実施例１および２の両方において同定された細菌集団を、各試験からの成長成績因子および免疫特徴測定値と別々に相関させた。両方の分析に対する方法を説明する：ＯＴＵをＥｘｃｅｌにエクスポートし、２進文字（０、１）として有／無に変換するか、または定量的な形のままでｌｏｇ１０変換して正規分布を提供した。実験単位として囲いを用いて、各ブタの成績データ（ＡＤＧ、ＡＤＦＩ、ブタ体重および飼料効率）に対して各データ組をプロットおよび回帰した。各個別のブタから取られた免疫データ結果をｌｏｇ１０変換して、各時点の各個別動物のＴ−ＲＦＬＰデータに対して回帰した。これらのデータは２つの基本的なやり方で分析された。第１に、Ｃａｎｏｃｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（ｖ４．５−Ｂｉｏｍｅｔｒｉｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、グラフィカルプロットを伴う分類法を適用することで、共同体または集団ＯＴＵ全体と研究パラメータ（腸部分、成績、免疫因子または管理実行）のそれとの関係を理解した。第２に、個別のＯＴＵを各個別の変数またはパラメータに対して回帰して、直接の単変量関係を定めた。制約付き順序法（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｏｒｄｉｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を適用して、支配変数の存在下でのＯＴＵ集団対変数の関係の決定を可能にした。
【００４６】
スケーリングは種間の相関に焦点を置き、種スコアを標準偏差で割った。サンプルおよび種データを集めたが、希少種を過度に重要視することを避けるために標準化は行なわなかった。免疫学的回帰のために、データ分析の前にすべての免疫因子データをｌｏｇ１０変換した。各環境変数との関係における種集団（全種またはＯＴＵ）データの統計的有意性は、４９９の非制限的置換を用いたＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓによって定められた。成績または免疫の結果に関係する各個別ＯＴＵの統計的有意性も、ＳＡＳ分析パッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）による一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌ：ＧＬＭ）−最小２乗方法論を行なって単変量の態様で定められ、ガウス分布による一般化線形モデルもＣａｎｏｃｏを用いて適用された。後者の方法は古典的なＧＬＭ法の延長である。次いで、正または負の成績関係を有するＯＴＵを、Ｉｄａｈｏ大学のＭｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭｉＣＡ）およびＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＰｒｏｊｅｃｔからのＴ−ＲＦＬＰ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＴＡＰ；Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）の両方を用いて、３つの制限酵素すべての結果と比較することによって推定的に同定した。３つの酵素を使用することによって、特定のＯＴＵ組を示し得る潜在的菌種の数を著しく減らし、潜在的偽−ＴＲＦの影響をふるい落とすことを助けた。集団クラスター回帰（ＲＤＡ）および個別ＯＴＵ回帰（ＧＬＭ）手順の両方を用いて、処置または日などの変数とは独立してＯＴＵを分析した。
【００４７】
（実施例６）
成長成績との相関に基づくプロバイオティク細菌の同定：
成績基準、特に１日平均増体量、ブタ体重、および１日平均飼料摂取に対するＴＲＦの有意な相関に基づいて、潜在的プロバイオティクスとしての細菌を選択した。実施例１に記載した従来離乳対分離早期離乳管理モデルにおいて、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関連するＴＲＦは、哺育の初期部分（フェーズ１）における１日平均増体量、哺育期間の３つのフェーズすべてにおけるブタ体重、ならびに初期および後期哺育期間における１日平均飼料摂取に対して最もよく正の相関を示した（Ｐ＜０．０５）（下の表５を参照）。
【００４８】
【表５】
0005770640.tif 000006
Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、およびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｄｋｉｉに関連する他のＴＲＦも、改善された増体量、体重および飼料摂取に正の相関を示した（Ｐ＜０．１０）。屋外の牧場分娩施設に比べて、従来の閉じられた分娩施設で飼育されたブタに基づくモデルでは、再びＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関連するいくつかのＴＲＦが、１日平均増体量、ブタ体重、および１日平均飼料摂取に対して正の相関を示した（Ｐ＜０．１０）（下の表６を参照）。
【００４９】
【表６】
0005770640.tif 000007
実施例１と同様に、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓおよびＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉに関連する他のＴＲＦも、成長成績に正の相関を示した（Ｐ＜０．１０）。加えて、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｄｋｉｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓに関連するいくつかのＴＲＦが、屋内対屋外モデルにおける成長成績因子に断続的に正の相関を示した。離乳前の成績に関連するデータは、従来の離乳対分離早期離乳管理モデルにおいては集められなかった。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、およびＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓに関連するＴＲＦは、屋内対屋外飼育モデルにおける特に６、１３および１８日齢で、離乳前期間の子ブタの体重に正の相関を示した（Ｐ＜０．１０）（下の表７を参照）。
【００５０】
【表７】
0005770640.tif 000008
ＴＲＦおよびｄａｙに対する相関関係を用いて、特定のＴＲＦに関連する細菌がいつブタの胃腸管に存在するはずかを定めることができ、プロバイオティク株の投与のタイミングに対処するための戦略の開発を可能にできる。従来の離乳対分離早期離乳管理モデルにおいて、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関連するＴＲＦは、離乳の直前（１８日齢）には存在に正の相関を示し（Ｐ＜０．０７）、生命の初期（７日齢）および離乳後には存在に負の相関を示した（Ｐ＜０．０５）（下の表８を参照）。
【００５１】
【表８】
0005770640.tif 000009
これとは対照的に、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｄｋｉｉに関連するＴＲＦは、生命の初期（７および１４日齢）には存在に正の相関を示した（Ｐ＜０．１０）が、１８日齢およびそれより後には存在に負の相関を示した（Ｐ＜０．１０）。Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓおよびＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉに関連するいくつかのＴＲＦは、離乳前および離乳後の期間のさまざまな日において、存在に正および負の相関を示した（Ｐ＜０．１０）。屋内対屋外飼育モデルにおいて、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関連するＴＲＦは、離乳前および初期離乳移行（２０日齢）の際には存在と明らかな負の相関を示し、２２日齢の後には存在と正の相関を示した（下の表９を参照）。離乳前および離乳後期間の間で明確に分かれていないが、一般的にＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｄｋｉｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓに関連するＴＲＦは２２日齢およびその後に存在に正の相関を示し（Ｐ＜０．０５）、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉは離乳前および離乳移行において存在に正の相関を示した（Ｐ＜０．０５）。
【００５２】
【表９】
0005770640.tif 000010
（実施例７）
免疫特徴との相関に基づくプロバイオティク細菌の同定：
ブタの体循環（末梢血）および胃腸管内の免疫集団に特定のＴＲＦを関連付けて相関関係を作り、プロバイオティク細菌の投与が若いブタにおけるこれらの組織の免疫特徴にどのように影響するかを予測できるようにしてもよい。両方の成長モデルからの、特定のＴＲＦに対する正および負の関連を有する免疫集団を下の表１０および表１１に列挙している。一般的に、潜在的プロバイオティク細菌に関連するＴＲＦは、末梢血および胃腸管における活性化、記憶およびガンマデルタＴ細胞サブセットに対して正の相関を示した（Ｐ≦０．０５）。
【００５３】
【表１０】
0005770640.tif 000011
【００５４】
【表１１−１】
0005770640.tif 000012
【００５５】
【表１１−２】
0005770640.tif 000013
（実施例８）
ＲＡＰＤ  ＰＣＲ分析によるプロバイオティク細菌の株同定：
目的のＴＲＦに対する高いピーク高さをもたらした腸サンプルを、乳酸生成細菌に対して選択的にプレーティングした。コロニーを拾ってブロスに入れ、２４時間生育させた時点で、細胞培養液からＤＮＡを単離した。５’−テトラクロロフルオレセイン標識８Ｆドメインプライマー（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’）および１４０６Ｒユニバーサルプライマー（５’ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ３’）のＲＡＰＤ  ＰＣＲフィンガープリントを比較することによって、単離体の類似性を評価した。単離体に対して、ＢｆａＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＭｓｐＩを用いたＴＲＦＬＰも行なうことによって、それらの単離体が目的のＴＲＦを有することを確認した。目的のＴＲＦは、成績の増加に関連した表５、６、７、および８中のＴＲＦすべてであった。敷地内／敷地外試験および屋内／屋外試験からの、表５および表６におけるＴＲＦのサイズがわずかに異なるのは、Ｂｉｏｎｕｍｅｒｉｃｓソフトウェアにおいて用いた位置許容度および最適化の設定のためであるが、株選択プロセスにおいてはこれらを同じとみなした。表１２は、上記のわずかな差を説明するために、ＴＲＦの長さおよびＴＲＦの長さプラスマイナス２塩基対によって目的のＴＲＦを示している。１つの乳酸菌株からのＴＲＦ配列を別の乳酸菌株からのＴＲＦ配列と比べるとき、もしそれらの株が同じＴＲＦを有していれば約９０％の配列同一性があるものと発明者らは考えている。
【００５６】
上に示すとおりの１つまたは複数の目的のＴＲＦを含んだＲＡＰＤの９個のクラスターに関連するＲＡＰＤ  ＰＣＲフィンガープリント、ＴＲＦＬＰプロファイル、およびその結果もたらされるデンドログラムを図２に示す。４つのクラスターがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関連するＴＲＦを含み、３つがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに関連するＴＲＦを含み、２つがＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉに関連するＴＲＦを含んでいた。各クラスターから代表的な株を選択した：Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ｏ２４６ｉＬ７ｆｖ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢｃ８、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰＬＧｆｌ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ８、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＰＬ２ｉ４、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ｏ２４６ｅ  ４２、およびＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３。
【００５７】
【表１２】
0005770640.tif 000014
すべての乳酸菌単離体からのＲＡＰＤプロファイルを包含するデンドログラム内のこれら９個の候補株の同定から、これら９個の候補ＤＦＭ株は、同種の株の間でも互いに異なるＲＡＰＤプロファイルを有することが明らかである。たとえば、ＲＡＰＤプロファイルによると、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ｏ２４６ｅ  ４２は、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ株ＰｌＪ  ｅ３と約１０％しか類似しておらず、異なる種の多くの菌株は、これらの菌株が互いに有する類似性よりも高い類似性を同種の株に対して有する。
【００５８】
（実施例９）
離乳前および離乳後の期間における補給の利益を定めるための、プロバイオティク株の動物テスト：
上に挙げた各種からの１つの株を選択して、これら特定の細菌の存在と若いブタにおける成長成績の改善との関連を検証するための最初の動物テストに供した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３を含む３つのプロバイオティク株を選択して、選択されたプロバイオティク株が離乳前および離乳後の生産期間における若いブタの成長成績を改善することの有効性を定めるためのテストに供した。３つの潜在的プロバイオティク株であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３を、雌ブタの食餌に組み合わせて含ませ、離乳後の子ブタの食餌に個別に含ませた。雌ブタを、処置当り４匹の雌ブタの８つの処置グループに分けて、同腹仔を８つの処置のうちの１つにランダムに割当てて、離乳前および離乳後にプロバイオティク生物を投与する影響、ならびに哺育期間に組み合わせまたは個別で投与する影響を定めた（下の表１３を参照）。雌ブタ（離乳前）にはトップドレスした（ｔｏｐｄｒｅｓｓｅｄ）；子ブタ（離乳後）に対しては、完全な食料の部分として食餌にＤＦＭを混合した。８つのプロバイオティク処置を処方して、合計ｃｆｕが１つの生物に由来するものか３つの選択生物の組み合わせに由来するものかにかかわらず、雌ブタまたはブタに１×１０９合計ｃｆｕ／ブタ／日を送達し、複数の生物を用いるときは各生物が（ＣＦＵに基づいて）等量含まれるようにした。
【００５９】
【表１３】
0005770640.tif 000015
３株の組み合わせによる３つの処置を比較した対比記載は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、およびＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３の組み合わせが雌ブタに投与されたときに、授乳期間の第３週における子ブタの体重および１日平均増体量を改善する（Ｐ＝０．０３）ことを示す（下の表１４を参照）。哺育期間における反復が限られていたため（４反復／処置）、プロバイオティク処置の結果によるものと考えられる子ブタの成績の何らかの差は検出できなかった（データは示さず）。
【００６０】
【表１４】
0005770640.tif 000016
（実施例１０）
授乳の際に雌ブタに３つのプロバイオティク株の組み合わせを補給することによる有益な応答を確認しさらに定めるための動物テスト：
授乳期間に雌ブタにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３の３株のプロバイオティクの組み合わせを給餌することによる有益な応答を、処置当り２０個の囲いによる以下の処置配置において、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３およびＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗの組み合わせならびにＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３単独をもテストすることによってこれらの株をさらに評価する第２の研究において確認した：（１）対照食餌、（２）Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６の各々を３．３４×１０８ｃｆｕ／ブタ／日ずつ含む、合計計数１×１０９合計ｃｆｕ／ブタ／日の３種すべての直接給餌微生物株を補給した対照食餌、（３）Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗの各々を５．０×１０８ずつ含む、合計計数１×１０９の２種の直接給餌微生物株を補給した対照食餌、ならびに（４）１×１０９のＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３のみを補給した対照食餌。すべての処置を雌ブタに対してトップドレスした。
【００６１】
３株の組み合わせによる補給は、ここでも非補給雌ブタからのブタに比べて授乳の第３週の子ブタの１日平均増体量を改善した（Ｐ＜０．０５）（下の表１５を参照）。対照と有意に異なったわけではないが、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３のみを補給された子ブタ哺育雌ブタの１日平均増体量は数値的に大きく、３株の組み合わせを補給された子ブタ哺育雌ブタに近かった。３株の組み合わせまたはＰ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３のみのいずれを雌ブタに補給しても、同腹仔内の子ブタ体重の変動の増加を防ぎ、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  ＰｌＪ  ｅ３のみの補給は授乳期間を通じて同腹仔内の子ブタ体重の変動を減少させた（処置×時間相互作用、Ｐ＝０．０６；図３を参照）。
【００６２】
【表１５】
0005770640.tif 000017
（実施例１１）
生産の哺育フェーズにおける補給の利益を定めるための、プロバイオティク株の動物テスト：
合計４８０匹のブタを離乳させ、初期体重に基づいてブロックし、合計１２０個の囲いに４匹のブタ／囲いで収容した。哺育期間の最初の２週間の間、子ブタに６つの食餌処置を投与した（２０の囲い／処置）。食餌処置は以下のとおりであった。１）哺育フェーズの最初の２週間、離乳したブタに対照食餌を投与；２）対照食餌に、直接給餌微生物候補生物であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，ＰｌＢ  ｃ６を１×１０９ｃｆｕ／ブタ／日にて補い、哺育食餌中に２週間投与；３）対照食餌に、直接給餌微生物候補生物であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，ｏ２４６ｅ  ８を１×１０９ｃｆｕ／ブタ／日にて補い、哺育食餌中に２週間投与；４）対照食餌に、直接給餌微生物候補生物であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｐｌ２  ｉ４を１×１０９ｃｆｕ／ブタ／日にて補い、哺育食餌中に２週間投与；５）対照食餌に、直接給餌微生物候補生物であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，ｏ２４６ｅ  ３３ｗを１×１０９ｃｆｕ／ブタ／日にて補い、哺育食餌中に２週間投与；６）対照食餌に、直接給餌微生物候補生物であるＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ，ｏ２４６ｅ  ４２を１×１０９ｃｆｕ／ブタ／日にて補い、哺育食餌中に２週間投与。
【００６３】
試験の最後の４週間は、すべてのブタに共通の哺育食餌を給餌した。毎週ブタの体重および飼料消失を定めて、６週間の試験の間、各囲いに対するＡＤＧ、ＡＤＦＩおよび飼料効率を算出した。
【００６４】
Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｏ２４６ｅ  ３３ｗの補給は、非補給ブタおよびＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ｐｌ２  ｉ４を給餌されたブタに比べて、離乳の第２週の飼料効率を改善した（ｐ＜０．０５）（表１５）。対照処置に比べて統計学的に有意ではないが（ｐ＞０．０５）、Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ  Ｏ２４６ｅ  ４２を給餌されたブタは、試験の第６週に最低のＦＥを有した。これと同じ株およびＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ｏ２４６ｅ  ８は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｌＢ  ｃ６およびＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ｐｌ２  ｉ４を給餌されたブタに比べて改善された（ｐ＜０．０５）飼料効率をもたらした（表１６）。
【００６５】
【表１６】
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（実施例１２）
潜在的病原性細菌に対する負の相関に基づくプロバイオティク細菌の同定：
選択されたプロバイオティク株を表す胃腸管内の特定のＴＲＦの存在を、病原体を定めるＴＲＦの存在と関連付けて相関関係を作り、プロバイオティク細菌の投与が若いブタにおけるこれらの組織における病原性生物の存在にどのように影響するかを予測できるようにしてもよい。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（表１７）およびＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（表１８）として定められたＴＲＦの存在は、クロストリジウム、マイコバクテリウムおよびパスツレラ菌種として定められたいくつかの病原体を定めるＴＲＦの存在に対して負の相関を示し（Ｐ＜０．０５）、これらのプロバイオティク細菌が胃腸管に存在するときにはこれらの病原体が存在する可能性が低いことを示した。
【００６６】
【表１７】
0005770640.tif 000019
【００６７】
【表１８】
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本発明の異なる可能な特徴およびさまざまなやり方を例示するために上記にさまざまな実施形態を示して説明しており、これらの特徴は組み合わされてもよいことが理解される。上記の実施形態の異なる特徴をさまざまなやり方で組み合わせることとは別に、他の修正も本発明の範囲内にあるとみなされる。本発明が上述の実施形態に限定されることは意図されておらず、以下に示される請求項によってのみ制限されることが意図されている。よって本発明は、文字通りまたは同等のものとしてこれらの請求項の範囲内に入るすべての代替的実施形態を包含する。
【００６８】
【数１】
0005770640.tif 000021
【００６９】
【数２】
0005770640.tif 000022
【００７０】
【数３】
0005770640.tif 000023
【００７１】
【数４】
0005770640.tif 000024
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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