(57)【要約】  本発明の第１の態様は、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有している、デコリンの一部由来の５〜４０個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体を提供する。本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の２種以上のペプチド、または本発明の第１の態様の１種のペプチドおよびデコリン由来でない追加のペプチド配列を含む２５０個以下のアミノ酸残基からなるペプチド、あるいは２５０個以下のアミノ酸残基の前記ペプチドの変異体を提供する。本発明のペプチドは、例えば癌の治療などにおいて、有害な血管新生を阻害するために用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜４０個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体。
【請求項２】
ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜３０個のアミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。
【請求項３】
ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜２６個のアミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。
【請求項４】
デコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなる請求項３に記載のペプチド、またはかかるペプチドの変異体。
【請求項５】
アミノ酸配列ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２）；ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫ（配列番号４）；もしくはＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号５）；ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（配列番号６）を有する、請求項４に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。
【請求項６】
デコリンのＬＲＲ４由来の５〜２４個のアミノ酸からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。
【請求項７】
アミノ酸配列ＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮ（配列番号８）を有する、請求項６に記載のペプチド、またはその変異体。
【請求項８】
デコリンのＬＲＲ３由来の５〜２１個のアミノ酸からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド、またはその変異体。
【請求項９】
アミノ酸配列ＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭＰＫ（配列番号７）を有する、請求項８に記載のペプチド、またはその変異体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に定義した２種以上のペプチド、または請求項１〜９のいずれか一項に定義した１種のペプチドおよびデコリン由来でない追加のペプチド配列を含む、２５０個以下のアミノ酸残基からなるペプチド、あるいは２５０個以下のアミノ酸残基の前記ペプチドの変異体。
【請求項１１】
１００個以下のアミノ酸残基からなる請求項１０に記載のペプチド、またはその変異体。
【請求項１２】
変異体において、デコリン配列由来の１個または２個または３個または４個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドの変異体。
【請求項１３】
置換アミノ酸の１種または複数が非天然アミノ酸である、請求項１２に記載の変異体。
【請求項１４】
変異体が、ペプチド結合の代わりに１種または複数の非ペプチド結合を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドの変異体。
【請求項１５】
環状ペプチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載したペプチドまたはその変異体の製造方法であって、前記ペプチドまたは変異体を化学的に合成することを含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか一項に定義したペプチドの製造方法であって、請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７に記載の発現ベクターから、あるいは請求項１８に記載の宿主細胞中で前記ペプチドを発現することを含む方法。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体と、薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
薬剤として使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項２３】
患者の血管新生を阻害する方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、または請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターを投与することを含む方法。
【請求項２４】
患者が有害な血管新生がある疾患に罹患しているか、その疾患に罹患しやすい、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患しているか、または罹患しやすい患者を治療する方法であって、患者に、有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、または請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターを投与することを含む方法。
【請求項２６】
患者の有害な血管新生を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２７】
癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患しているか、または罹患しやすい患者を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、請求項１６に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７に記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化合物およびその使用に関し、特に、ペプチドおよびその変異体ならびに血管新生の阻害におけるその使用に関する。本ペプチドおよびその変異体は、癌の治療で用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（新しい血管の形成）は、癌、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、関節リウマチおよび乾癬をはじめとする、多くのヒト疾患に関与している。腫瘍増殖および転移はともに、腫瘍細胞から放出される様々な血管新生増殖因子により刺激される血管新生に依存している。従って、抗血管新生は、従来の癌治療に比べて優れたいくつかの利点（例えば、低毒性、癌が治療に対して耐性を有するようになる可能性の低減、広範囲の腫瘍が治療可能など）をもつ抗癌剤開発における有望な代替手法である。
【０００３】
デコリンは、スモールロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）プロテオグリカンファミリーに属するマトリックスプロテオグリカンである。これは、Ｃ末端に１０個のＬＲＲリピートを含んでいる。主として、これは線維芽細胞より分泌される。その正常な生理機能は、コラーゲン線維素生成を微調整することである。これは、他のマトリックス分子、例えばフィブロネクチン、トロンボスポンジン、コラーゲンおよび増殖因子ＴＧＦ−β、ＥＧＦ受容体、ならびにいくつかの金属イオンに関する数種類の結合ドメインを持っている。
【０００４】
デコリンはＩ型、ＩＩ型およびＩＶ型のコラーゲンに結合し、安定性の高い線維の形成を促進する。これが抗血管新生特性を有することは既に発見されている。これは、腫瘍細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害することによって腫瘍細胞介在性血管新生を抑制する（例えば、Ｓｃｈｏｎｈｅｒｒら、（１９９９）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７８、４４〜５５；Ｓｔａｎｄｅｒら、（１９９９）、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２９６、２２１〜２２７；Ｍｅｒｌｅら、（１９９９）、Ｊ  ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ  ７５、５３８〜５４６；Ｎｅｌｉｍａｒｋｋａら、（２００１）、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５８、３４５〜３５３；Ｄａｖｉｅｓら、（２００１）、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ  ６２、２６〜４２；および、Ｇｒａｎｔら、（２００２）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１、４７６５〜４７７７を参照されたい）。
【発明の開示】
【０００５】
国際公開第９０／００１９４号パンフレットには、デコリンが細胞増殖を抑制し得ることが報告されている。米国特許第５７０５６０９号はデコリンのＴＧＦβへの結合に関するものであり、デコリンのＴＧＦβへの結合を阻害するデコリンのＮ末端領域由来ペプチドが記載されている。さらにこの特許には、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とデコリンの一部との間の融合が記載されているが、そのいくつかは、デコリンのＴＧＦβへの結合を阻害する。米国特許第６２７７８１２  Ｂ１号は、創傷にデコリンを投与することによって瘢痕形成を予防または低減させることに関するものである。しかし、これらの刊行物はいずれも、デコリンの一部の使用により血管新生が阻害されることは記載しておらず、またそれらの刊行物はいずれも、デコリンの中央部分またはＣ末端部分由来の遊離ペプチドについては記載していない。
【０００６】
この明細書の既に刊行されている文献のすべてのリストまたは記述は、必ずしも、その文献が現況技術の一部であること、または通常の一般知識であるということを承認するものとして受け取られるべきものではない。
【０００７】
驚いたことに、本発明者らは、デコリンの中央部分の一部を含有している合成ペプチドが血管新生阻害剤として機能することを見出した。特に、完全な５番目のＬＲＲを表すペプチド（ＬＲＲ５；ペプチドｄＬＲＲ５、２６個のアミノ酸）は特有のロイシン構成を有し、デコリン中の他のすべてのＬＲＲと比較した場合、これは、余剰アミノ酸を含む長い配列を持ち、コラーゲンＩに結合するがＴＦＧ−βには結合しない（前記両分子は血管新生で役割を果たすことが知られている）能力を有する。また、ＬＲＲ３、ＬＲＲ４に基づくペプチド、およびＬＲＲ５の突然変異バージョン（ＬＲＲ５由来の短くしたペプチドを含む）について、これらの抗血管新生機能を評価した。本発明者らは、様々なインビトロでの血管新生アッセイを用いてデコリンペプチドの機能を分析した。これらのアッセイには、血管新生中に起こる主要事象に関連する、内皮細胞遊走アッセイ、マトリゲル管腔形成アッセイおよびアポトーシスアッセイが含まれる。
【０００８】
本発明の目的は、血管新生関連疾患の治療で使用するための抗血管新生ペプチドおよびその変異体を提供することである。現在、多数の抗血管新生タンパク質が臨床試験にある。薬剤としてタンパク質を使用する場合の主な欠点には、それらのバイオアベイラビリティーおよび生物学的安定性が低いこと、それらの大量生産が困難であること、宿主の免疫反応、ならびに患者に注射で投与する必要があることがある。これらの問題は、小型ペプチドおよび／またはペプチド模倣物を用いて回避することができる。また、ペプチドは水に溶解しやすく、細胞膜に浸透可能であって、治療用途の経口活性剤または鼻内噴霧型製剤へさらに開発される可能性がある。
【０００９】
これらのペプチドは、癌、関節リウマチ、乾癬、不妊、創傷治癒の遅延、潰瘍、黄斑変性、糖尿病性網膜症等をはじめとする、不均衡性血管新生と関係しているすべての疾患の薬剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第１の態様は、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有するデコリンの一部由来の５〜４０個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体を提供する。
【００１１】
図１８にヒトデコリンのアミノ酸配列を示すが、ヒトデコリン中の前記一部は、アミノ酸残基８２〜３１６に対応する。
【００１２】
また他の種のデコリンに由来する同等な一部も、本発明のペプチドおよびその変異体の設計および合成に用いることができる。ヒトデコリンのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＭ９８２６３であり、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔについてはＰ０７５８５である。
【００１３】
本ペプチドは、５〜３５残基、５〜３０残基、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９残基であってよい。１０〜３０残基のペプチドが好ましく、例えば、１２、１３、２１、２４および２６残基のペプチドである。
【００１４】
典型的には、本ペプチドは、ロイシンリッチリピートのＬＲＲ１、ＬＲＲ２、ＬＲＲ３、ＬＲＲ４、ＬＲＲ５、ＬＲＲ６、ＬＲＲ７、ＬＲＲ８、ＬＲＲ９またはＬＲＲ１０由来のアミノ酸配列を有している。図４にヒトデコリンのＬＲＲを示すが、特に、それぞれのアミノ酸残基は、順に以下の残基の位置を占めている：（１）８２〜１０５；（２）１０６〜１２９；（３）１３０〜１５０；（４）１５１〜１７４；（５）１７５〜２００；（６）２０１〜２２１；（７）２２２〜２４５；（８）２４６〜２６９；（９）２７０〜２９２；および（１０）２９３〜３１６。
【００１５】
特に、デコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチド、またはかかるペプチドの変異体が好ましい。好適なかかるペプチドとしては、ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２）；ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫ（配列番号４）；ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号５）；もしくはＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（配列番号６）またはより小型のその一部、あるいは前記ペプチドの変異体が挙げられる。好ましくは、本ペプチドがＬＲＲ５由来の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基を有しているか、またはかかるペプチドの変異体である。
【００１６】
また、デコリンのＬＲＲ４由来の５〜２４個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体も好ましい。かかるペプチドとしては、ＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮ（配列番号８）またはその一部あるいはその変異体が挙げられる。好ましくは、本ペプチドは、ＬＲＲ４由来の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３個のアミノ酸残基を有しているか、またはかかるペプチドの変異体である。
【００１７】
また、デコリンのＬＲＲ３由来の５〜２１個のアミノ酸からなるペプチド、またはその変異体も好ましい。かかるペプチドとしては、ＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭＰＫ（配列番号７）またはその一部、あるいはその変異体が挙げられる。好ましくは、本ペプチドは、ＬＲＲ３由来の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸残基を有しているか、またはかかるペプチドの変異体である。
【００１８】
また本発明は、上に定義した２種以上のペプチド、または上に定義した１種もしくは複数のペプチドとデコリンに由来しない追加のペプチド配列を含む２５０個以下のアミノ酸残基からなるペプチド、あるいは２５０個以下のアミノ酸残基の前記ペプチドの変異体を提供する。特に、追加のペプチド配列が細菌性マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の配列ではないのが好ましい。
【００１９】
上に定義した２種以上の同一ペプチドまたは異種ペプチドを結合させて、より大型のペプチド（ただし、前記ペプチドは２５０個のアミノ酸残基を超えず、好ましくは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０または５０個を超えない）を形成することができることは理解されよう。好ましくは、同一ペプチドを配列中で２回以上直列させる。好ましくは、本デコリンペプチド部分は、（本発明の第１の態様のペプチドが配列中に直列に存在する場合）１００個以下のアミノ酸残基を含み、好ましくは、本デコリンペプチドの一部は、８０または７０または６０または５０または４０または３０または２０または１０個のアミノ酸残基を含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態は、１〜２０個、好ましくは１から１０個のアミノ酸残基のリンカーによって直列に結合されている、配列中に２つのヒトＬＲＲ５ペプチドを含むペプチドである。
【００２０】
この実施形態のペプチドは、本デコリンアミノ酸配列に基づいたペプチドまたは変異体の他に、配列がデコリンに基づいていない追加のアミノ酸残基を含んでいてもよいことは理解されよう。追加の配列は、他の公知のタンパク質配列、例えば、別の抗血管新生ペプチドまたは足場ペプチドまたは腫瘍血管に対する本ペプチドを標的とするペプチド（例えば、アミノ酸配列ＲＤＧを含有しているもの）に基づいていてもよく、自然界に存在しない配列に基づいていてもよい。追加のアミノ酸残基は、追加の配列がデコリンに基づくペプチドに隣接するように、デコリンに基づくペプチドのＮ末端であってもよく、デコリンに基づくペプチドのＣ末端であってもよく、またその両方であってもよい。典型的には、１〜１０個の追加のアミノ酸残基であるが、８０個もの残基であってもよい。典型的には、この実施形態では、本ペプチドのトータルサイズは、８０または７０または６０または５０または４０または３０または２０または１５個のアミノ酸残基を超えない。また、この実施形態のペプチドの変異体も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２１】
本発明のペプチドは、典型的には、また好ましくは、Ｌ−立体配置のアミノ酸を含むが、これは下記を参照されたい。本発明のペプチドまたはその変異体は、環化されていてもよく（すなわち、遊離のＮ末端またはＣ末端を持っていない）、直鎖または分枝鎖であってもよい。
【００２２】
本発明の上述のペプチドの変異体には、これらに限定されるものではないが、デコリン含有部分のデコリンアミノ酸配列の４０％以下（例えば３０％、２０％または１０％）が他のアミノ酸で置換されているものが含まれる。典型的には、デコリン配列由来の１または２または３または４または５または６または７個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている。別の天然アミノ酸で置換されていてもよく、非天然のアミノ酸で置換されていてもよい。典型的な置換には、Ｌ−アミノ酸を対応Ｄ−アミノ酸で置換、あるいは１個のアミノ酸を保存的アミノ酸（例えば、基Ａ、Ｖ；Ｆ、Ｙ、Ｗ；Ｔ、Ｓ；Ｉ、Ｌ、Ｖ；Ｄ、Ｅ；およびＱ、Ｎ、Ｈの範囲内のもの）で置換することが含まれるが、非保存的置換も考えられる。
【００２３】
またペプチドの変異体には、ペプチド結合の代わりに１種または複数の非ペプチド結合を含有しているものが含まれる。また変異体は、Ｎ末端またはＣ末端またはその両方が加水分解に対する耐性を付与するために遮断されているペプチドも含んでいる。同様に、アミノ酸残基の１種または複数の側鎖を修飾して、かかる耐性または他の望ましい特性を付与することもできる。ペプチドの安定性およびバイオアベイラビリティーを改善し、かつそれらを薬剤としてより有効にする方法は、当技術分野で周知である。特に、Ａｄｅｓｓｉ  ＆  Ｓｏｔｏ、（２００２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９、９６３〜９７８（これは参照によって本明細書に援用するものとする）を参照されたいが、この中に、かかる方法が詳細に記載されている。
【００２４】
ペプチドの変異体は、都合に応じて「修飾ペプチド」、「偽ペプチド」および「ペプチド模倣物」と呼称することができる数種類のクラスに分類される。
【００２５】
修飾ペプチドの例は、Ｎ末端および／またはＣ末端が、例えば、アミノアシル化またはカルボキシアミド化によって、あるいはＮ末端のピログルタミン酸基の結合によって修飾される場合である。他の修飾ペプチドは、ペプチドの環化（すなわち、−ＮＨ２と−ＣＯＯＨ末端を縮合してペプチド結合を形成させる場合）、アミド窒素アルキル化、Ｄ−アミノ酸置換および側鎖修飾である。
【００２６】
偽ペプチドとは、分子中のごく部分的なペプチドで起こる、ペプチド骨格に関係している一部の原子に改変または置換があるものである。これらには、アミド結合代用物（例えば、−ＣＯＮＨ−基の−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＳＯ−、−ＣＨＣＨ３Ｓ−による置換など）、ペプトイドおよびアザペプチドが含まれる。ペプトイドは、ペプチド構造中のＩ−炭素に結合している側鎖が、アミド窒素へ同じ位置で「切り替えられている」場合である。アザペプチドは、１種または複数のＩ−炭素原子が窒素原子で置換されている分子である。Ｉ−炭素が全部置換されている場合、その分子はアザチド（ａｚａｔｉｄｅ）と呼ばれる。
【００２７】
本発明のペプチドおよび変異体は、典型的には抗血管新生の活性を有しており、これはインビトロまたはインビボで評価することができる。好ましくは、ペプチドまたは変異体は、インビトロおよびインビボの両方で抗血管新生活性を有する。抗血管新生活性は、インビボで、新しい血管新生を異種移植片腫瘍モデルなどにおいて評価するモデル系を用いて評価することができる。また抗血管新生活性は、インビトロで、例えば、ＶＥＧＦ誘導性内皮細胞遊走アッセイ（以下の実施例で記載のＨＵＶＥＣアッセイなど）を用いて、評価することができる。典型的には、本発明のペプチドまたは変異体は、コラーゲン、ゼラチンまたはフィブロネクチンの任意の１種または複数に結合する可能性があり、これらの分子への結合を測定する試験は当技術分野で周知である。
【００２８】
ペプチドＭ−ｈｄＬＲＲ５（配列番号６；ＬＲＲ５Ｍともいう）は、管腔形成を阻害し得る。ペプチドＣ−ｈｄＬＲＲ５（配列番号５；ＬＲＲ５Ｃともいう）は、内皮細胞遊走を阻害し得る。これら両ペプチドは、血管新生阻害に有用であると考えられる。従って、本発明の好ましいペプチドは、これらのペプチド、これらのアミノ酸配列を含有している４０個以下のアミノ酸残基のペプチド、または前記ペプチドの変異体である。
【００２９】
従って、本発明のペプチドおよび変異体には、インビトロのアッセイで、例えば、実施例のＨＵＶＥＣ遊走アッセイで、ｄＬＲＲ５ペプチド（配列番号２）と同様の活性を実質的に有しているものが含まれることは理解されるであろう。好適には、本ペプチド模倣物は、上述の特定のペプチドのいずれか１種（特に、ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２））と実質的に同一の電荷分布および／または空間立体配置を有する部分を含む。
【００３０】
一部の変異体は、本ペプチドの非ペプチド模倣物であってもよく、上述の特定のペプチド（特に、ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２））のいずれか１種と同一の電荷分布および／または空間立体配置を有する分子が含まれる。
【００３１】
本発明のペプチドおよび変異体は、典型的には、分子量が約８００〜１００００であり、典型的には約２０００〜５０００である。
【００３２】
本発明の化合物がペプチドである場合、当技術分野で周知の方法を用いてそれを合成することができる。例えばペプチドは、Ｌｕら、（１９８１）、Ｊ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６、３４３３とその中の引用文献に記載されている、固相ペプチド合成のＦｍｏｃポリアミド法によって合成することができる。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基により得られる。この高度塩基易変性保護基の反復開裂は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いることにより行われる。側鎖の機能性は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、ならびに４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護することができる。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が側鎖のアミド機能性の保護に利用される。固相支持体は、３種類のモノマー、すなわち、ジメチルアクリルアミド（主鎖モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能基化剤）から構成されるポリジメチルアクリルアミドポリマーがベースとなっている。使用するペプチド−樹脂間の開裂可能な結合剤は、酸易変性の４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。アミノ酸誘導体はすべて、アスパラギンとグルタミンを除き、予成形したそれらの対称的な無水物誘導体として加え、アスパラギンとグルタミンは、逆Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール使用カップリング法を用いて加える。カップリング反応および脱保護反応はすべて、ニンヒドリン試験法、トリニトロベンゼンスルホン酸試験法またはイソスズ試験法を用いて観察する。合成完了後、ペプチドは、５０％捕捉剤混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸で処理することにより、側鎖保護基の除去と同時に樹脂支持体から開裂される。一般に用いられる捕捉剤は、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であるが、正確な選択は、合成するペプチドの構成アミノ酸によって決まる。トリフルオロ酢酸は真空蒸発により除去し、その後ジエチルエーテルで滴定することにより粗製ペプチドが得られる。存在するすべての捕捉剤は簡易抽出法によって除去されるが、この方法で、水相を凍結乾燥することにより捕捉剤を含まない粗製ペプチドが得られる。一般に、ペプチド合成用の試薬は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ（ノッティンガム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）ＮＧ７  ２ＱＪ、英国）から購入することができる。精製は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび（基本的には）逆相高速液体クロマトグラフィーなどの方法のいずれか１つの方法、またはそれらの組合せによって実施することができる。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を用いて、また��高速原子衝撃（ＦＡＢ）、エレクトロスプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分光分析により実施することができる。
【００３３】
従って、本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはその変異体を製造する方法であって、前記ペプチドまたは変異体を化学的に合成することを含む方法を提供する。
【００３４】
あるいは、本発明のペプチドが好適な大きさである場合、例えば、長さが約５０個の残基を超える場合には、組換えＤＮＡ技術によって本ペプチドを生成することが望まれ得る。従って、本発明のさらなる態様は、ペプチドの製造方法であって、前記方法が、下により詳細に記載している通り、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターから、あるいは宿主細胞中で、前記ペプチドを発現することを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明のペプチドは、好適なポリヌクレオチドによってコードされ得るが、これは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、米国）に記載されているような当技術分野で周知の方法によって取得または合成することができる。
【００３６】
次いで、ポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）は、好適な宿主中で発現され、本発明の化合物を含むペプチドが生成される。従って、本発明の化合物を構成するペプチドをコードしているＤＮＡは、本明細書に記載されている内容を考慮して適切に変更された公知の技術に従って用い、発現ベクターを構築することができる。次いで、これは、本発明のペプチドを発現し産生させるのに適した宿主細胞を形質転換するのに用いられる。
【００３７】
本発明の化合物を構成しているペプチドをコードするＤＮＡは、適切な宿主へ導入する際、各種の別のＤＮＡ配列に結合することができる。随伴するＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入方法、およびエピゾームの維持または組込みを所望するか否かによって決まる。一般に、発現のための適切な方向および正確なリーディングフレームで、ＤＮＡをプラスミドなどの発現ベクターに挿入する。必要に応じて、ＤＮＡは、所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳を制御する調節ヌクレオチド配列に結合させることができるが、かかる調節ヌクレオチド配列は一般に発現ベクターで入手できる。次いで、標準法によりベクターを宿主へ導入する。次いで、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞は、本明細書に記載の技術を考慮して当業者に周知の十分な時間と適切な条件下で培養し、ペプチドを発現させ、次いで、これを回収することができる。
【００３８】
多数の発現系が知られており、例えば、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【００３９】
また本発明は、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換した宿主細胞に関する。宿主細胞は原核生物であっても、真核生物であってもよい。細菌細胞は、原核生物の宿主細胞であるのが好ましく、典型的には、大腸菌の菌株であって、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）から入手可能な大腸菌ＤＨ５株、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）から入手可能な大腸菌株ＲＲｌ株（ＡＴＣＣ番号３１３４３）である。好ましい真核生物の宿主細胞としては、酵母細胞および哺乳動物細胞が挙げられ、好ましくは例えば、マウス、ラット、サルまたはヒトの線維芽細胞系由来の脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞としてはＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらは、一般に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、米国）から入手可能である。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ  １６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＣＲＬ  １６５０としてＡＴＣＣから入手可能なサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞が挙げられる。形質転換した宿主細胞それ自体の他に、本発明はさらに、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に同質である）培養物、またはモノクローナル培養物から誘導される培養物を意図する。
【００４０】
本発明のペプチドは、例えばヒトまたは動物の患者における血管新生を阻害するのに有用である。従って、本発明のさらなる態様は、薬剤として使用するための本発明のペプチドまたは変異体を提供する。また本発明は、本発明のペプチドまたは変異体と薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４１】
本組成物または製剤は、好適には単位剤形で提供することができ、それは薬学分野で周知の任意の方法により調製することができる。かかる方法は、有効成分（本発明のペプチドまたは変異体）を１種または複数の副成分が構成する担体と一緒に会合体へ取り入れるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体もしくは微粉固体担体またはその両方と一緒に会合体へ均一かつ密に取り入れることによって、その後必要に応じて、生成物を成形することによって調製する。
【００４２】
経口投与に好適な本発明による製剤は、不連続単位として、例えば、それぞれ所定量の有効成分を含有しているカプセル剤、カシェ剤または錠剤として；散剤または顆粒剤として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として；あるいは水中油滴型乳濁液または油中水滴型乳濁液として提供することができる。また、有効成分はボーラス剤、舐剤またはペースト剤として提供することもできる。
【００４３】
錠剤は、圧縮または成形によって、場合により１種または複数の副成分と一緒に製造することができる。圧縮錠剤は、例えば、粉剤または粒剤などの流動性形態の有効成分を、場合により結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムスターチグリコレート、架橋結合ポビドン、架橋結合カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性または分散剤と一緒に混合して、好適な機械で圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、好適な機械で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより製造することができる。錠剤は、場合により被覆されていてもよく、刻み目を入れられていてもよく、また、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために異なる割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、そこでの有効成分の徐放または制御放出が提供されるように製剤化することができる。
【００４４】
局所経口投与に好適である製剤としては、風味付けした基剤（通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴム）中に有効成分を含むロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムなどの不活性基剤中に有効成分を含む錠剤；ならびに好適な液体担体中に有効成分を含む洗口剤が挙げられる。
【００４５】
非経口投与に好適である製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤に対象の服用者の血液との等張性を付える溶質を含有していてもよい、水溶性および非水溶性の殺菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および粘稠化剤を含んでいてもよい水溶性および非水溶性の殺菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位投与用量容器または多回投与用量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供することができ、使用直前に、殺菌液体担体（例えば、注射剤用の水）を添加することだけが必要であるフリーズドライされた（凍結乾燥された）状態で保管することができる。
【００４６】
即時調合注射液および懸濁液は、前述の種類の殺菌済み粉剤、粒剤および錠剤から調製することができる。
【００４７】
好ましい単位用量製剤は、日用量もしくは日用単位、日用副用量またはその適切な分割量の有効成分を含有しているものである。
【００４８】
上で詳しく説明した成分以外に、本発明の製剤は、当該製剤のタイプを考慮して、当技術分野で慣用の他の薬剤を含んでいてもよく、例えば、経口投与に好適なものは着香剤を含んでいてもよいことは理解すべきである。
【００４９】
本発明の化合物の一部は、塩の形態であることは理解されよう。
【００５０】
治療で好適に用いられ得る塩としては、例えば、適切な塩基から誘導される生理学的に許容される塩基塩が挙げられ、例としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウム塩およびＮＸ４＋（式中、ＸはＣ１〜４アルキルである）塩がある。生理学的に許容される酸性塩としては、塩酸塩、硫酸塩、メシル酸塩、ベシル酸塩、リン酸塩およびグルタミン酸塩などが挙げられる。
【００５１】
本発明による塩は、慣用の方法で、例えば、親化合物を適切な塩基と反応させて対応する塩基塩を形成させることによって、または親化合物を適切な酸と反応させて対応する酸性塩を形成させることによって調製することができる。
【００５２】
本発明の前述の化合物またはその製剤は、経口投与および非経口投与（例えば、皮下投与または筋肉内投与）をはじめとする、すべての慣用の方法によって投与することができる。この治療は、単回投与、またはある期間にわたる複数回投与から構成され得る。
【００５３】
本発明の化合物は単独で投与することができるが、１種または複数の許容される担体と一緒に医薬製剤として提供することが望ましい。１種または複数の担体は、本発明の化合物と適合し、その服用者にとって有害でないという点で許容可能でなければならない。典型的には、担体は、殺菌され、発熱性物質を含まない、水または生理食塩水である。
【００５４】
本ペプチドまたはその変異体が、口腔粘膜（頬粘膜、舌下粘膜または歯肉粘膜を含む）を介して送達される場合、あるいは液体の形態で（例えば、水溶液で）静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与により投与される場合が特に好ましい。
【００５５】
本発明のペプチドまたはその変異体の１回または複数回の用量は医師によって決定され得るが、それは治療する疾患に応じて変わり得る。典型的には、その用量は、疾病または疾患の症状を有効範囲まで改善するのに効果的である。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドもしくは変異体、または前記ペプチドをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターを投与することを含む、患者の血管新生を阻害する方法を提供する。典型的には、患者は、有害な血管新生がある疾患、または血管新生を阻害することが望ましい疾患に罹患しているか、これに罹患しやすい。
【００５７】
有害な血管新生は様々な疾病および病状に関係している。これらには、癌、特定の感染症、特定の自己免疫障害、血管奇形、ディジョージ症候群、ＨＨＴ、海綿状血管腫、アテローム性動脈硬化症、移植動脈症、肥満、乾癬、疣贅、アレルギー性皮膚炎、傷跡ケロイド、化膿性肉芽腫、水疱形成疾患、ＡＩＤＳ患者のカポジ肉腫、硝子体過形成遺残症、糖尿病性網膜症、末熟児網膜症、脈絡膜血管新生、原発性肺高血圧症、喘息、鼻茸、炎症性腸疾患および歯槽膿漏症、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、不正子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、関節炎、滑膜炎、骨髄炎および骨増殖体形成が挙げられる（例えば、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ、２００３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９、６５３〜６６０を参照されたい。なお、これは参照により本明細書に援用するものとする）。従って、本発明のさらなる態様は、これらの疾患または症状（特に、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬）のいずれかに罹患している患者または罹患しやすい患者を治療する方法であって、前記方法が、患者に、有効量の本発明のペプチドもしくは変異体またはそれをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターを投与することを含む、方法を含んでいる。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、患者の有害な血管新生を治療する薬剤の製造における本発明のペプチドもしくは変異体またはそれをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターの使用；ならびに、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患している患者または罹患しやすい患者を治療する薬剤の製造における本発明のペプチドもしくは変異体またはそれをコードしているポリヌクレオチドもしくは発現ベクターの使用を含んでいる。
【実施例】
【００５９】
ここでは、以下の実施例および図を参照して、より詳細に本発明を記載する。
【００６０】
デコリンは配列番号１であり；ＬＲＲ３は配列番号６であり；ＬＲＲ４は配列番号７であり；ＬＲＲ５は配列番号２であり；スクランブルＬＲＲ５は配列番号３である。
【００６１】
実施例１：ヒトデコリンコアタンパク質ロイシンリッチリピート５由来のペプチドは、複数の機序によって血管新生を強く阻害する
本実施例で用いられる略語は次の通りである：ＤＣＮ：デコリン；ＬＲＲ：ロイシンリッチリピート；ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子；ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子；ＴＧＦ：トランスフォーミング増殖因子；ＴＮＦ：腫瘍壊死因子；ＦＢＳ：ウシ胎児血清；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；ＧＡＧ：グリコサミノグリカン；ＰＧ：プロテオグリカン；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート；ＴＵＮＥＬ：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介性ｄＵＴＰニック末端標識；ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯血管内皮細胞；ＦＡＫ：局所接着キナーゼ；ＥＣ：内皮細胞、ＣＤ：円偏光二色性。
【００６２】
過度の血管新生は多くのヒトの疾患に関係しており、血管新生を阻害することは薬剤開発の重要な分野である。デコリンが、細胞外の可溶性因子として用いられた場合に血管新生阻害剤として機能し得るかどうかについて相反する報告があった。本研究で、本発明者らは、精製デコリンだけでなく、デコリンコアタンパク質の２６残基ロイシンリッチリピート５（ＬＲＲ５）が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導性血管新生および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）誘導性血管新生の両方を阻害することにより血管新生阻害剤として強く機能することを証明する。ペプチドＬＲＲ５は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の刺激による内皮細胞（ＥＣ）遊走、マトリゲル上の管腔形成、フィブロネクチンへの細胞接着、ならびにＥＣアポトーシスの誘導をはじめとする血管新生の複数の局面を、それらの増殖に有意な影響を及ぼすことなく、阻害した。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５の異なるサブ領域に由来するペプチドが血管新生の異なる局面を阻害し、中央領域（ＬＲＲ５Ｍ、１２残基）がＬＲＲ５よりも最高１０００倍まで内皮細胞管腔形成を阻害することを証明した。Ｃ末端領域（ＬＲＲ５Ｃ）はＶＥＧＦの刺激による内皮細胞遊走を強く阻害したが、Ｎ末端領域（ＬＲＲ５Ｎ）は、フィブロネクチンへの内皮細胞接着の阻害活性がＬＲＲ５と同程度である。ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｎはともにカスパーゼ依存的経路を介してＬＲＲ５と同様に用量依存的にＥＣアポトーシスを誘導したが、ＬＲＲ５Ｃはかかる機能を持っていない。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍによる管腔形成阻害は、それらがＶＥＧＦ誘導性局所接着キナーゼの活性化と局所接着およびＥＣでのアクチンストレスファイバーの構築を抑制する能力と連動しているが、マトリックスへの内皮細胞接着を阻害するそれらの能力とは連動していないことを証明した。円偏光二色性による研究では、ＬＲＲ５が溶液中で３１０ヘリックスとβ−シート構造の間の相互変換を受けること（これは、この抗血管新生活性に関する潜在的に重要な特性である）を明らかにした。従って、ペプチドＬＲＲ５およびその誘導体は、抗血管新生剤のさらなる開発において基本型として役立ち得る新規の血液新生阻害剤である。
【００６３】
タンパク質は、それらの機能性ドメインを介して他の分子と相互作用することによってそれらの機能を実行する。これらのドメインは、大きさ、組成および構造の点で多様である。近年、治療用途のためのタンパク質の開発に多大な努力が払われてきた。しかし、薬剤としてタンパク質を使用する場合、その低いバイオアベイラビリティー、抗原性、好ましくない薬物動態、およびバッチ間生産の生物活性における不均一により制限がある（１）。一方、小型ペプチドは、自動ペプチド合成機を用いる合成によって生産が容易であること、抗原性が低いこと、水への溶解性が高いこと、およびバイオアベイラビリティーが改善され経口送達に有効であることといった長所を有する（２）。かかるペプチドは、完全または部分的タンパク質機能モジュール、ならびに有望なタンパク質間相互作用部位を示し得る（３〜６）。
【００６４】
血管新生（現存の脈管構造からの新しい血管の形成）は、細胞外マトリックスの分解、内皮細胞増殖および遊走、毛細血管形成およびマトリックスリモデリングが関与する多重ステップ工程である（７、８）。増殖因子およびそれらの細胞表面受容体、細胞外マトリックス分子、インテグリン、マトリックスメタロプロテアーゼをはじめとする多くのタンパク質とその阻害剤は、この工程に関与している。エンドスタチンおよびアンギオスタチン（それぞれ、コラーゲンおよびプラスミノーゲンのフラグメントである）などの数種類の内因性タンパク質は、血管新生の強力な阻害剤である（９、１０）。過度の血管新生はヒトの多くの疾患に関与するので、血管新生阻害剤の開発は薬剤開発の重要な分野である。
【００６５】
小型デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＰＧ）であるデコリンは、細胞外マトリックスに遍在する成分であるが、そこでデコリンは、コラーゲン細線維と結合して優先的に見出される。その主要な機能は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦβ１）の貯蔵部として役立つだけでなく、コラーゲン線維素生成の制御、フィブロネクチンおよびトロンボスポンジンとの結合を介した組織完全性の維持が含まれる（１１〜１４）。デコリンは、フィブロネクチンにおける細胞接着と伸展を阻害する（１５）。さらにデコリンが腫瘍細胞中で過剰発現されるか、組換えタンパク質として提供された場合、様々な組織学的バックグラウンドを有する各種の腫瘍細胞の増殖を、主として表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼの持続的不活性化を介して阻害する（１６、１７）。デコリンの発現は、血管新生中に内皮細胞で誘導されるが、遊走および増殖が刺激される時には誘導されない。従って、デコリンは、血管新生の後期段階の期間に、分化内皮表現型を安定させる原線維性細胞周囲マトリックスの形成をサポートし得ると仮定された（１８）。しかし、血管新生阻害剤としてのデコリンの相反する報告があった。デコリンは、腫瘍細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害することにより、腫瘍血管新生を間接的に抑制することが報告された（１９）。レトロウイルスを形質導入することによる内皮細胞でのデコリンの高発現は、ＥＣ遊走を阻害した（１８）。さらに、ＥＣがデコリンをコートした表面で増殖した場合、精製デコリンは、内皮細胞遊走とコラーゲンＩ格子内の管腔形成を阻害した（２０）。一方、組換えデコリンは、マトリゲル上での内皮細胞管腔形成に対して効果がないこと（１９）、及び、アデノウイルス形質導入によるＥＡ．ｈｙ９２６  ＥＣでのデコリン発現が、ＥＣアポトーシスを阻害しながらコラーゲン格子内の管腔形成を促進したこと（２１）が報告されている。
【００６６】
構造上、デコリンは、スモールロイシンリッチリピートＰＧの増殖ファミリーに属している。デコリンは、１つのコンドロイチン硫酸塩またはデルマタン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合している３５９個のアミノ酸のコアタンパク質を含んでいる（１１）。この成熟タンパク質は種を超えて高度に保存されており、ジスルフィド結合した末端配列に隣接した１０個のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を保持している中央ドメインからなる。アミノ末端は、ＧＡＧに対する１つの付着部位を有しているが、中央ドメインは３つのＮ−結合可能なグリコシル化部位を有している。ＬＲＲはタンパク質間相互作用に関与し、ビグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）、フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）およびルミカン（ｌｕｍｉｃａｎ）などのＰＧをはじめとする多数のタンパク質中で発見されている（２２）。デコリンは、主としてコアタンパク質のＬＲＲ４およびＬＲＲ５を介してコラーゲンに結合する（２３）。さらに、ＴＧＦβに対する高親和性結合部位がＬＲＲ３とＬＲＲ５の間に位置する（２４）。デコリンのＴＧＦβへの結合は、ＴＧＦβがその受容体へ結合することを妨げ、ＴＧＦβ介在性細胞シグナル伝達を制御する（２５）。最近、生物学的活性デコリンは、溶液中でモノマーであり、従って、デコリンは、種々の様々な細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子および細胞表面受容体に対する１価のリガンドであるとの報告があった（２６）。しかし、デコリンの結晶構造分析により、それが大きな界面部を有する安定した二量体であることが示された（２７）。
【００６７】
血管新生におけるデコリンコアタンパク質とそのＬＲＲリピートの役割を特徴づけ、小型ペプチドの血管新生阻害剤を開発する試みの中で、本発明者らは、合成ペプチド手法を用いて、血管新生におけるデコリンコアタンパク質とＬＲＲ３、ＬＲＲ４およびＬＲＲ５の役割を分析した。この２６残基のＬＲＲ５ペプチドは、強力な血管新生阻害剤であることが確認され、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび血清誘導性血管新生を阻害した。ＬＲＲ５は、マトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成、ＥＣ遊走、ならびにフィブロネクチンへのＥＣ結合をはじめとする複数の機序により血管新生を阻害する。さらに、それはまた、カスパーゼ依存的経路によりＥＣアポトーシスを誘導した。機能的マッピングにより、血管新生の異なる局面を阻害したＬＲＲ５のサブ領域を同定した。重要なことに、中央の１２残基（ＬＲＲ５Ｍ）が、ＬＲＲ５に比べて最高１０００倍まで強くＥＣ管腔形成を特異的に阻害した。Ｃ末端の１３残基（ＬＲＲ５Ｃ）はＥＣ遊走を阻害する能力を維持したが、Ｎ末端の１３残基（ＬＲＲ５Ｎ）はフィブロネクチンへのＥＣ結合の阻害に非常に有効である。さらに、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５ＭはともにＥＣアポトーシスを誘導し、ＬＲＲ５ＭはＬＲＲ５と同様の効果があった。さらにメカニズム的研究を行ったところ、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５ＭのＥＣ管腔形成阻害能力は、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫ  Ｙ３９７のリン酸化と、その後のＥＣにおける局所接着およびアクチンストレスファイバーの構築とをＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍが阻害していることに連動していることが示唆された。
【００６８】
実験手順
試薬および抗体−  組換えヒトＶＥＧＦ１６５および組換えヒトデコリン（ｒｈＤＣＮ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ミネアポリス、米国）から購入した。塩基性ＦＧＦは、Ｐｒｏｍｅｇａ（マディション（Ｍａｄｄｉｓｉｏｎ）、米国）から入手した。ウシ関節軟骨由来の精製デコリン（ＤＣＮ）、ゼラチンおよびギムザ溶液は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）製であった。Ｆａｌｃｏｎ細胞培養インサート（８．０μｍ孔径）およびマトリゲルは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）製であった。ヒト血漿フィブロネクチンはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製であった。内皮培養培地ＣＳＣは、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア、米国）製であった。汎用カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、メルク（Ｍｅｒｃｋ）製であった。シグマのウシ関節ＤＣＮタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素結合アッセイを用い、Ｓｉｇｍａウシ血清アルブミンを基準として測定した。ＤＣＮ純度は、ｎａｔｉｖｅおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥの双方によってチェックしたところ、９５％以上純粋であることが示された。ＤＣＮおよびｒｈＤＣＮ中のエンドトキシンレベルは、シグマ製のＥＴ０２００キットを用いて測定した。
【００６９】
ペプチド合成−  ペプチドは、内部にＦＭＯＣ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学を採用しているＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成機を用いて固相法により合成するか、市販原料（ＳｙｎＰｅｐ、カリフォルニア、米国）から購入した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００７０】
細胞培養−  ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ヒト臍の緒から単離し、加湿した５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にてＣＳＣ完全培地中で培養した。実験に使用したすべての細胞は３〜６継代であった。
【００７１】
内皮細胞管腔形成アッセイ−  ２．５×１０４のＨＵＶＥＣをペプチド（１ｎＭ〜１００μＭ）の様々な濃度で３０分間プレインキュベートした後、９６ウェルプレート中の固化した増殖因子低減マトリゲルに播種した。４〜６時間３７℃で、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ含有培地または非含有培地中でインキュベーションした後、細胞を固定化し、光学顕微鏡法（×１００）により管腔形成を分析した。各ウェルで４ヶ所のランダムフィールドを選択し、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ  １．３２ソフトウェアを使用して管腔長の合計を計測した。
【００７２】
細胞遊走アッセイ−  遊走アッセイは、以前に記載されたファルコン細胞培養インサートに改変を加えたものを用いて行った（２８）。簡単に説明すると、ＨＵＶＥＣを一晩飢餓させ、トリプシン処理し、３×１０５細胞／ｍｌの最終濃度で懸濁した。ゼラチンコーティングした細胞培養インサート上に播種する前に、様々な濃度のペプチドを、２〜３×１０４細胞とともに３７℃で３０分間プレインキュベートした。ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を下方チャンバーに入れた。次いで、構築した細胞培養インサートチャンバーを３７℃で１０〜１２時間インキュベートした。遊走しない細胞を綿球で除去した後、培養インサートの下方表面上の遊走細胞を固定化し、０．４％ギムザで染色し、光学顕微鏡（×２００）下で写真撮影した。各インサート中で５ヶ所のランダムフィールドを選択し、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ  １．３２ソフトウェアを用いて細胞数を測定した。
【００７３】
増殖および細胞毒性の分析−  増殖と細胞毒性は、非放射性ＥＺ４Ｕ細胞増殖および細胞毒性アッセイキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、ウィーン、オーストリア）を用いて、メーカーの取扱説明書に従って測定した。この方法は、生細胞がほとんど色調のないテトラゾリウム塩を強い色調のホルマザン誘導体に還元し得るという事実に基づいていた。この還元方法では機能的なミトコンドリアが必要であるが、これは細胞死後、数分以内に不活性化される。典型的な９６ウェルプレートアッセイにおいて、本発明者らは約３０００ＨＵＶＥＣ／ウェルを用いて、４６０ｎｍのホルマザン吸光度をミトコンドリア活性として示した。細胞は、２％ＦＢＳを入れたＣＳＣ培地中、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦまたはｂＦＧＦを含有または非含有で、各種濃度（１ｎＭから１００Ｍ）のペプチドとともに４８時間インキュベートした。細胞毒性分析については、ＨＵＶＥＣをペプチドと６時間インキュベートし、一方、増殖の測定には、４８時間のペプチドインキュベーションを用いた。
【００７４】
細胞接着アッセイ−  ＨＵＶＥＣを異なるペプチドで２０分間事前処理した後、フィブロネクチンをコーティングした２４ウェルプレート上にプレーティングし、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、接着した細胞を固定し、ギムザで染色した。接着した細胞数をウェル当たり５つのランダムフィールドで定量した。アッセイは二重に行い、別の日に３回繰り返した。
【００７５】
アポトーシスアッセイ−  アポトーシスは、以前に記載されたクロマチン断片形成の形態学的検出により分析した（２９）。４ウェルのチャンバースライド中で６０〜７０％細胞密度に増殖させたＨＵＶＥＣをペプチドと共に、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在または不在下、０．５％ＦＢＳ中にて４８時間インキュベートした。細胞を固定化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８で染色し、蛍光顕微鏡（×６３０）下で観察した。あるいは、ＴＵＮＥＬ染色は、ＡｐｏＡｌｅｒｔ  ＤＮＡ断片形成アッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を用いて行った。アポトーシスは、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を用いて数量化した。簡単に説明すると、２０，０００ＨＵＶＥＣ／ウェルを、０．２％ゼラチンでコーティングした２４ウェルプレート上に２４時間播種した後、ペプチドで処理した。細胞を異なる濃度のペプチドと共に、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと一緒に、またはＶＥＧＦなしで２４時間処理し、その後、トリプシンを用いて回収した。ＤＮＡ断片形成は、メーカーの取扱説明書に従い、細胞質ゾルのオリゴヌクレオソーム結合ＤＮＡを数量化することにより測定した。プレートに被覆されている抗ヒトヒストン抗体と、検出用ペルオキシダーゼに結合されている第２の抗ＤＮＡ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下および不在下で、ペプチドで処理したＨＵＶＥＣの細胞画分（１３，０００×ｇ）を抗原源として用いた。アポトーシス誘導におけるペプチドの効果は、４０５ｎｍの吸光度値として示した。またこの実験は、１０μＭのベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）（汎用カスパーゼ阻害剤）の存在下で実施した。
【００７６】
固相結合アッセイ−  ９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩、１００μｇ／ｍｌのコラーゲンＩまたはフィブロネクチン溶液で被覆した。コントロールのウェルは、ＰＢＳに溶解した０．１％ＢＳＡでコーティングした。０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０ですすいだ後、ウェルを０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで２時間プレインキュベートし、その後、様々な濃度のＦＩＴＣ標識したペプチドで４時間室温にてインキュベートした。ウェルに結合した蛍光は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ二重走査分光蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ドイツ）を用いて測定した。飽和グラフは、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国）により、単一部位結合の非線形回帰分析を用いて取得した。分析はすべて三連で実施した。
【００７７】
ウェスタンブロットおよび免疫沈降−  飢餓ＨＵＶＥＣを別々に３０μＭの各種ペプチドで２時間処理した後、１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５に３０分間暴露した。これらの細胞を溶菌緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）中に溶解させた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を調整した後、各試料からのタンパク質１００ｇをウェスタンブロット解析に用いた。ブロットは、ウサギ抗ＦＡＫ第１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）と西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した第２抗体を用いて探索した。生成物は、高感度の化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）により可視化した。一方、同一試料からのタンパク質５００μｇをウサギ抗ＦＡＫ抗体で一晩４℃にて免疫沈降し、マウス抗リンＦＡＫ（Ｙ３９７）第１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国）を用いて探索した。
【００７８】
ＨＵＶＥＣにおける局所接着とアクチンストレスファイバーの分析−  細胞は、チャンバースライド上でほぼ集密するまで増殖させた。ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびペプチド（１００μＭ）をウェルへ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。細胞を固定化し、透過処理し、パキシリンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）で染色した。スライドは、共焦点顕微鏡（オリンパス  １×７０）下で観察した。アクチン細胞骨格の染色にはＴＲＩＴＣ結合ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を用い、核小体の対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８を用いた。
【００７９】
円偏光二色性スペクトル解析−  すべてのペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、１ｍＭ濃度で１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１ｍｍ路長石英セルを用いて室温にてＪＡＳＣＯ  Ｊ−８１０分光旋光計で記録した。スペクトルは５０ｎｍ／分の走査速度で１９０〜２６０ｎｍの間を記録し、３回の走査の平均を求めた。最終表示に対して基線を差し引いた。
【００８０】
結果
デコリンおよびＬＲＲ５の抗血管新生作用
血管新生の阻害におけるデコリンの役割に関して、可溶性因子として用いた場合に相反する報告があった。ＥＣ管腔形成におけるデコリンの役割を明らかにするために、本発明者らは、ウシ関節軟骨由来の精製デコリンおよび昆虫細胞で発現される組換えヒトデコリンについて、マトリゲル上でのＨＵＶＥＣ管腔形成アッセイを用いて試験した。両デコリンは、増殖因子低減マトリゲル上で、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦで刺激したＨＵＶＥＣの管腔形成を強く阻害すること、また組換えヒトデコリンよりも精製ウシ関節デコリンが強く阻害することを見出した（図１Ａおよび図１Ｂ）。両デコリン調製物は、ｂＦＧＦ誘導性管腔形成よりもＶＥＧＦ誘導性管腔形成を強く阻害した。従って、この明細書は、その後の研究において主にＶＥＧＦ誘導性血管新生に焦点を合わせている。エンドトキシン混入はデコリン調製物では確認されておらず（方法の節を参照されたい）、このことは、抗血管新生活性がデコリンの比活性であることを裏付けている（データは示さず）。
【００８１】
デコリンコアタンパク質中のＬＲＲドメインはデコリン機能において重要な役割を果たし、ＬＲＲ３〜５領域は、コラーゲンＩおよびＴＧＦβに結合する主要領域であることが明らかになっている（１４、２５）。本発明者らは、合成ペプチド手法を用いて、各ＬＲＲ３、ＬＲＲ４およびＬＲＲ５がＨＵＶＥＣ管腔形成を阻害し得るか否かについて試験を試みた。この試験で使用したすべてのペプチドを図２Ａに挙げる。ペプチドＬＲＲ５は、用量依存的にＥＣ管腔形成を効果的に阻害したが、１００μＭのＬＲＲ３およびＬＲＲ４は限界効果がわずかにあっただけであった（図２Ｂおよび図２Ｃ）。重要なことは、ＬＲＲ５アミノ酸配列がスクランブル化された場合（ＬＲＲ５Ｓ）、阻害作用が完全に失われたことである。表１から明らかなように、これらのペプチドは、１００μＭ以下で試験した場合にはＥＣに対して細胞傷害性ではない。従って、ＬＲＲ５は、配列依存的にマトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成を特異的に阻害し、血管新生阻害剤として機能する。血管新生は複数の工程を含んでいることから、本発明者らは、ＬＲＲペプチドについて、ＥＣ増殖と遊走を阻害するそれらの能力を試験した。図３から明らかなように、ペプチドＬＲＲ５は、推定ＥＤ５０が１００ｎＭ〜１μＭで、用量依存的および配列依存的にＶＥＧＦ刺激によるＥＣ遊走を強く阻害したが、ＬＲＲ５Ｓにはかかる活性はなかった。また精製ウシデコリンもｎＭ濃度でＥＣ遊走を強く阻害した（図３Ａ）。また、デコリンおよびＬＲＲ５はともにｂＦＧＦ誘導性ＥＣ遊走を阻害したが（図３Ｂ）、ＶＥＧＦ刺激の場合と比べるとそれほど効果はなかった。
【００８２】
一方、デコリンおよびＬＲＲ５はどちらも、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対して有意な阻害作用を有しておらず、ＬＲＲ５にのみ１００μＭで穏やかな阻害作用があった（図４Ａおよび図４Ｂ）。
【００８３】
内皮細胞におけるアポトーシスの誘導は、血管新生を阻害するために抗血管新生分子により利用される機序の１つである。ＬＲＲ５がＨＵＶＥＣのアポトーシスを誘導する能力を有しているか否かについて試験するため、ペプチド処理細胞において、クロマチン断片の形態学的検出、ＴＵＮＥＬ染色、ならびに断片化ＤＮＡの定量的ＥＬＩＳＡ測定によりアポトーシスを分析した。図５Ａから明らかなように、ＬＲＲ５は、濃度依存的にＨＵＶＥＣでのアポトーシスを特異的に誘導した。１００μＭで、断片化クロマチンを有する多数の細胞が認められた。またＴＵＮＥＬ染色では、形態学的観察が認められた（図５Ｂ）。ＤＮＡ断片化のＥＬＩＳＡ測定では、ＬＲＲ５が、１００μＭでＶＥＧＦの存在下または不在下におけるアポトーシスを強く誘導し、またこの阻害は、汎用カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋがそのアポトーシス誘導活性を効果的に防止したので、カスパーゼ依存性であることが示唆された（図５Ｃ）。１００ｎＭのデコリンは、ＥＣアポトーシスを誘導しなかった（図５Ｃ）。
【００８４】
要約すると、デコリンおよびそのコアタンパク質ＬＲＲ５ドメインは、有効な血管新生阻害剤である。ＬＲＲ５ペプチドは、ＥＣ管腔形成、走化性遊走、およびアポトーシス誘導の阻害をはじめとする複数の機序によって血管新生を阻害する。ＬＲＲ５の抗血管新生活性は、配列依存性であり、かつ用量依存性である。
【００８５】
ＬＲＲ５の異なる領域は各種抗血管新生機能を仲介する
この抗血管新生活性に関与しているＬＲＲ５内のサブ領域をマッピングし、より短鎖のペプチド血管新生阻害剤を取得するため、２６残基のＬＲＲ５を、さらにＬＲＲ５のＮ末端（ＬＲＲ５Ｎ、１３残基）部分、中央（ＬＲＲ５Ｍ、１２残基）部分およびＣ末端（ＬＲＲ５Ｃ、１３残基）部分を示す３種類のオーバーラップするペプチドに切り出した（図２Ａ）。興味深いことに、ＬＲＲ５Ｍペプチドが、マトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ管腔形成をＬＲＲ５ペプチド以上に非常に強く阻害した（図６Ａ）。ＬＲＲ５は、約１００ｎＭのＥＤ５０で用量依存的に管腔形成を阻害したが、ＬＲＲ５Ｍは、１０ｎＭ濃度で管腔形成を完全に阻害した。そのＥＤ５０は１００ｐＭであり、ＬＲＲ５と比べると、最高１０００倍の強い効力があると推定された（図６Ｂ）。一方、ペプチドのＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｃは、ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成を効果的に阻害することができない。またＬＲＲ５ペプチドは、不活性なＬＲＲ５Ｃを除き、用量依存的にｂＦＧＦ誘導性管腔形成も阻害した（図６Ｃ）。実験をＨＵＶＥＣの異なるバッチで繰り返した場合、一貫した結果が認められた（データは示さず）。
【００８６】
３種類の短鎖ペプチドについて、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害する能力を分析したところ、１３残基のＬＲＲ５ＣペプチドにＬＲＲ５と同じ効力があった（図７Ａ）。ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｃはともに、１００ｎＭ〜１μＭのＥＤ５０で、用量依存的にＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走を阻害した。ＬＲＲ５Ｎでいくつかの阻害が認められたが、その作用は用量依存的ではなく、一方、ＬＲＲ５Ｍは不活性である。これに対し、ｂＦＧＦ誘導性ＥＣ遊走の阻害において、ＬＲＲ５Ｃは効果を示さないが、ＬＲＲ５Ｍは高い濃度でわずかに穏やかな阻害作用がある（図７Ｂ）。
【００８７】
ＥＣ増殖に対してＬＲＲ５の阻害が小さいことと一貫して（図４Ａおよび４Ｂ）、ＶＥＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対しては、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｃが高濃度で穏やかに阻害するのみであり、ｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対しては、短鎖ペプチドはいずれも阻害しなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。
【００８８】
３種類の短鎖ペプチドについて、ＥＣアポトーシスを誘導する能力を試験したところ、ＬＲＲ５ＭにはＬＲＲ５と同じ活性があったが、ＬＲＲ５Ｎは活性が低かった（図５Ｂ；図９Ａおよび９Ｂ）。ＬＲＲ５と同じく、両者の短鎖ペプチドはカスパーゼ依存的にＥＣアポトーシスを誘導した。一方、ＬＲＲ５Ｃは、アポトーシス誘導機能を欠いている。
【００８９】
要約すると、上記の結果は、ＬＲＲ５の異なるサブ領域が血管新生の異なる局面を阻害することを示唆している。中央領域はＥＣ管腔形成を阻害するが、Ｃ末端領域はＶＥＧＦに関するＥＣ遊走を阻害することに関与している。Ｎ末端領域（ＬＲＲ５Ｎ）および中央領域（ＬＲＲ５Ｍ）は共に、カスパーゼ介在性アポトーシス経路によりＥＣアポトーシスを誘導することに関与する。
【００９０】
ＬＲＲ５は血管新生を阻害したが、マトリックスへのＥＣ接着の抑制によるものではない
デコリンは、フィブロネクチンおよびコラーゲンをはじめとする多数のＥＣＭタンパク質、ならびに、ＴＧＦβなどの増殖因子と結合することが知られている（１１〜１５）。ＬＲＲ５およびその短鎖ペプチドもまた、これらのタンパク質と結合するか否かについて試験するため、ゼラチン、コラーゲンＩ、フィブロネクチンをはじめとする様々なマトリックスタンパク質、増殖因子（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ）、フィブリノーゲンおよびＢＳＡをニトロセルロース膜上に固定化し、ＦＩＴＣ標識ペプチドで検索した。すべてのペプチドがマトリックスタンパク質のゼラチン、コラーゲンＩおよびフィブロネクチンには直接結合することができたが、試験した他のタンパク質には結合しなかった（データは示さず）。次いで、固相結合アッセイを用いて、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩへのそれらの結合親和力を測定した。ペプチドＬＲＲ５と３種類のすべての短鎖ペプチドは、フィブロネクチンよりもコラーゲンＩに対する結合親和力がわずかに高かったが、一般にこの結合親和力は非常に低く、そのＫｄはμＭまたは低ｍＭの範囲でさえある（表２）。
【００９１】
ＥＣＭへのＥＣ接着および付着は、血管新生の進行にとって重要である。遊走および管腔形成は双方とも接着によって開始されるが、本ペプチドが抗接着因子として役割を果たすならば、その後の細胞遊走と管腔形成は双方とも阻害することができるだろう。ＬＲＲ５およびその関連ペプチドはすべてフィブロネクチンおよびコラーゲンＩに結合するので、それらは、ＥＣＭへのＥＣ接着を抑制し、それにより血管新生を阻害することができるだろう。実際、細胞をペプチドと３０分間プレインキュベーションした後、フィブロネクチンをコーティングした９６ウェル上に播種したところ、接着した細胞の数は有意に減少した（図１０）。この有意な阻害は、精製デコリンのものと比較可能であった１０ｎＭの低濃度においても、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｎで認められた。一方、ペプチドＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃはこの機能にそれほど効果的ではなく、μＭの濃度でわずかに明白な阻害作用があった。同様に、これらのペプチドはコラーゲンＩへのＥＣ接着も用量依存的に阻害した（データは示さず）。これらの結果によれば、ＬＲＲ５Ｎは、フィブロネクチンへのＥＣ接着阻害においてＬＲＲ５と同程度に効果的であるが、ＬＲＲ５Ｎが管腔形成または遊走の阻害に効果的ではないので、ＬＲＲ５がＥＣ管腔形成および遊走を阻害する能力は、それがフィブロネクチンへのＥＣ接着を抑制することによるものではないことが明らかである。
【００９２】
ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、ＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫリン酸化、局所接着へのパキシリンの局在化、ならびにアクチンストレスファイバーの形成を阻害する
ＬＲＲ５ＭペプチドおよびＬＲＲ５Ｃペプチドの異なる機能を理解するため、ＦＡＫに関連するさらなるメカニズム試験を行った。ＦＡＫは、細胞外マトリックスに細胞を付着する、局所接着複合体の重要な成分であって、細胞遊走、付着、生存および細胞周期制御にとって不可欠である（３０）。これは非受容体型チロシンキナーゼであり、増殖因子及びインテグリンシグナルを統合し、細胞遊走を促進する。適切な細胞の遊走は、アクチンフィラメント動態と付着複合体リモデリングの双方に依存する。ＶＥＧＦ刺激によるＥＣ遊走の機序の１つは、ＦＡＫリン酸化を刺激することによるものであり、これはＦＡＫを活性化し、局所接着の構築と再配列を開始することが報告されている（３１）。次いで、活性化されたＦＡＫはパキシリンをはじめとする他の局所接着関連タンパク質をリン酸化及び活性化し、これは直ちに局所接着複合体へ補充される。これが終了した後、局所接着関連パキシリンと相互作用する新しいアクチン重合に伴って、アクチンストレスファイバーが蓄積される（３２）。次いで、ＦＡＫは脱リン酸化により不活性化され、細胞プロテアーゼによって切断され、局所接着ならびにアクチンフィラメントの解体が生じる。アポトーシス中、ＦＡＫはカスパーゼにより切断され、ＦＡＫ機能を阻害するＦＡＫのＣ末端断片であるＦＲＮＫが生じる（３３）。
【００９３】
図１１から明らかなように、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは共に、ＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫリン酸化を抑制した。ＬＲＲ５Ｍは、ＦＡＫリン酸化の阻害においてＬＲＲ５よりもより効果的であったが、これは、ＥＣ管腔形成とアポトーシス誘導の阻害においてそれがより強力な活性を有することと一致している。一方、ＥＣ遊走阻害に非常に効果的であるが、管腔形成とアポトーシス誘導の阻害に活性がないＬＲＲ５Ｃは、ＦＡＫリン酸化に対していかなる阻害作用も示さなかった。むしろ、このペプチドによりＦＡＫリン酸化が穏やかに刺激される。
【００９４】
また、局所接着の形成と再編成の指標である、ＶＥＧＦ誘導性パキシリンの局所接着への補充は、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの双方によって効果的に遮断された。図１２から明らかなように、多数のＶＥＧＦ誘導によるパッチ化パキシリン染色（矢印によって示した）が、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍで処理した場合にほぼ完全になくなり、その場合、ＬＲＲ５Ｍがより効果的であった。また、精製デコリンも１００ｎＭで局所接着形成を阻害した。ペプチドＬＲＲ５Ｎは局所接着の形成を多少低減したが、ＬＲＲ５ＣおよびＬＲＲ５Ｓは不活性であった（図１２）。
【００９５】
ＴＲＩＴＣ結合ファロイジンによるアクチンフィラメントの免疫蛍光染色によって明らかなように、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、一貫してＶＥＧＦ誘導性アクチンストレスファイバー形成を強く抑制した（図１３）。ＬＲＲ５Ｎはそれほど効果的ではなかったが、ＬＲＲ５Ｃはこの機能に関し本質的には効果がなかった。
【００９６】
上記３つの実験を互いに十分に相関させたところ、ペプチドＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍによるマトリゲル上のＥＣ管腔形成およびＥＣアポトーシス誘導の阻害が、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫリン酸化、局所接着へのパキシリン再配置、およびアクチンストレスファイバー形成を抑制するそれらの能力に連動していることが明らかであった。また、ＥＣ管腔形成およびＥＣアポトーシス誘導の阻害において効力の高いＬＲＲ５Ｍは、Ｙ３９７でのＦＡＫリン酸化の抑制においても効力が高い。
【００９７】
ＣＤスペクトル研究により、溶液中のＬＲＲ５に関する安定構造が明らかになった
ペプチド機能の構造的基盤を検討するため、ペプチドのＣＤ分析を行った。１ｍＭ濃度のペプチドＬＲＲ５のＣＤスペクトルは負の極大約２１２ｎｍと負のショルダー約２２２ｎｍを示したが、これは３１０ヘリックス構造の可能性を示唆している（図１４）。トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を５〜８０パーセントの各種比率のＴＦＥ／水で添加したところ、ＬＲＲ５のＣＤスペクトルではいかなる差異も現れず、ＬＲＲ５ペプチドが安定したヘリックス構造を持っていることが示唆された（３４）。さらに、２０８付近の弱い曲がりと、２１２および２２２ｎｍの２つの負の極小は、このペプチドがｐＨ７．０で３１０とβ−シート構造の相互変換を経ていることを示している可能性がある。同様の吸収パターンがペプチドＬＲＲ５Ｎで観察され、２０９〜２４０ｎｍの広範な負の極小範囲と２０９ｎｍの鋭いシャープな極小を持っており、このペプチドがヘリックスとβ−シート構造またはβ−ターン構造の相互変換を経ていることが推測される。しかし、ＴＦＥを添加すると、β−シートの除去により螺旋形形状が改善されるので、ＬＲＲ５Ｎの構造は不安定である（データは示さず）。スクランブル化ペプチドＬＲＲ５Ｓは、２１０ｎｍ付近に強い負の吸収と２２２〜２２５ｎｍ付近に弱い負の吸収を示したが、これは３１０ヘリックス構造を示唆している。ＬＲＲ５ＣおよびＬＲＲ５Ｍの両ＣＤスペクトルは、２０２〜２０５ｎｍで負の吸収を示したが、これはＩ型β−ターンを示唆している。
【００９８】
考察
デコリンが特定の状況下で抗血管新生活性を有することが報告されているが、本発明者らは、精製デコリンがマトリゲル上でのＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよび血清誘導性ＨＵＶＥＣ管腔形成を阻害し得ることを初めて本明細書で示した。精製ウシ関節デコリンは、昆虫細胞で発現される組換えヒトデコリンよりもＥＣ管腔形成を強く阻害した（図１）。さらに、コアタンパク質のＬＲＲ５ドメインを表すペプチド（２６残基）は、マトリゲル上のＥＣ管腔形成、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ刺激による遊走、フィブロネクチンへの接着、ならびにＥＣアポトーシスの誘導をはじめとする、血管新生の複数の局面を阻害することによって、有効な血管新生阻害剤として機能する。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５の異なるサブ領域が血管新生の異なる局面を阻害することを証明した。中央領域（ＬＲＲ５Ｍ）はＥＣ管腔形成を阻害することに関与する。Ｃ末端領域（ＬＲＲ５Ｃ）は、ＶＥＧＦが関与する走化性ＥＣ遊走を特異的に阻害するが、しかし、ｂＦＧＦ誘導性ＥＣ遊走には作用しなかった。Ｎ末端および中央領域はともに、ＥＣアポトーシスの誘導に関与する。一方、Ｎ末端領域（ＬＲＲ５Ｎ）は、フィブロネクチンへのＥＣ接着の阻害においてより効果がある。また本発明者らは、ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成を阻害するＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの能力が、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫ活性化、局所接着の構築ならびにアクチンストレスファイバー形成のそれらの抑制と連動しているが、マトリックスタンパク質へのＥＣ付着の抑制によるものではないことを明らかにした。表３にＬＲＲ５ペプチドの概要を示す。
【００９９】
ＶＥＧＦは、ＥＣ増殖、遊走、局所接着複合体形成および再編成、アクチン細胞骨格のストレスファイバーへのリモデリングならびに管腔形成、血管新生応答のすべての必要な成分を誘導する、最も重要な血管新生因子である。増殖を除き、ＬＲＲ５はＶＥＧＦ誘導性血管新生のすべての局面を阻害した。ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの強力な抗管腔形成活性と、ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫ活性化、局所接着へのパキシリンの補充およびアクチンストレスファイバー形成を阻害するそれらの能力との相関関係は、ＦＡＫシグナル伝達経路がマトリゲル上のＶＥＧＦ誘導性ＥＣ管腔形成に重要な役割を果たすことを強く示唆している。強力なＬＲＲ５Ｍの抗管腔形成活性は、その強力なＦＡＫ活性化阻害と相関していた。
【０１００】
またＦＡＫシグナル伝達経路もＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走に関与するが、ＥＣ遊走を阻害したＬＲＲ５ＣがＦＡＫ活性化を抑制しなかったので、ＬＲＲ５はＦＡＫ非依存性シグナル伝達経路によりＥＣ遊走を阻害した可能性が高いと考えられる。最近、インテグリンの細胞質ドメインと相互作用するシグナル伝達タンパク質であるインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）もまた、ＶＥＧＦにより誘導されるＨＵＶＥＣ血管形態形成に重要な役割を果たしており、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ走化性遊走がＩＬＫの阻害により抑制されることが報告されている（３５）。またＩＬＫも、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／Ｒａｃｌシグナル伝達を介してアクチンフィラメント再編成および細胞遊走および浸潤を仲介する（３６）。ＬＲＲ５Ｃもまた、ＩＬＫシグナル伝達経路の阻害によりＶＥＧＦ刺激によるＨＵＶＥＣ走化性遊走を阻害するか否かについては、今後の研究が待たれる。
【０１０１】
細胞遊走は、局所接着とアクチンフィラメントの両方の動的構築と分解に関与する。ＬＲＲ５ＣはＶＥＧＦ誘導性の局所接着構築およびアクチンストレスファイバー形成を阻害しなかったが、ＬＲＲ５Ｃが、それらの分解または動的変化を妨げるか否かについては今後さらに調査を行う必要がある。さらに、ＦＡＫリン酸化および脱リン酸化の動的サイクルは、局所接着の動的変化に不可欠なものである。ＬＲＲ５ＣはわずかにＦＡＫリン酸化を刺激したので、このペプチドがＦＡＫリン酸化／脱リン酸化の動的変化に影響を及ぼすのか否かについては、さらに検討する必要がある。
【０１０２】
細胞遊走は、マトリックス媒介性インテグリンクラスター形成およびＦＡＫ活性化を介してだけでなく、増殖因子／受容体が活性化した多数の細胞内シグナル伝達経路を介して誘発され得る。ＦＡＫ経路の他に、例えば、ＰＩ３キナーゼ活性化、ｐ３８−ＭＡＰＫ活性化、Ａｋｔ活性化、ＮＯ放出の誘導などの他の多数の経路もまたＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走と連動していた（３２）。ＬＲＲ５Ｃが、これらの経路の１つを阻害することにより、ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ遊走を阻害した可能性がある。
【０１０３】
ＥＣ管腔形成の媒介に関与しているシグナル伝達経路は完全には理解されていない。管腔形成には、細胞遊走の他に、細胞間接着、細胞マトリックス接着、細胞融合、アポトーシス、ならびにＥＣ分化をはじめとする多数の過程が必要であるので、ＦＡＫ活性化の阻害はこれらの１つまたは複数の過程に影響を及ぼし、それが管腔形成の阻害をもたらす可能性が高いと考えられる。我々のデータは、ＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫシグナル伝達経路の阻害が、ＬＲＲ５ペプチドおよびＬＲＲ５Ｍペプチドのマトリゲル上での管腔形成阻害能力と連動していることを明らかに示唆している。ペプチドＬＲＲ５ＣおよびＬＲＲ５Ｎは、（ＦＡＫ活性化、局所接着複合体へのパキシリン再配置ならびにアクチンストレスファイバー形成から明らかなように）ＶＥＧＦ誘導性ＦＡＫシグナル伝達経路を阻害することができないか、弱く阻害するが、管腔形成に効果的な阻害はなかった。
【０１０４】
ＦＡＫシグナル伝達は、増殖因子とインテグリン媒介性細胞遊走に関与するだけでなく、細胞増殖、アポトーシスならびに細胞接着および伸展にも関与することは周知である（３７）。我々の結果は、ペプチドＬＲＲ５およびＬＲＲ５ＭによるＦＡＫ  Ｙ３９７のリン酸化の阻害が、カスパーゼ依存性経路を介して、管腔形成ならびにＥＣアポトーシス誘導をそれらが阻害する能力に連動していることを明らかに示唆している。マトリックスへの細胞付着および接着は、血管新生における重要な工程である。フィブロネクチンおよびＴＳＰ１基質上での細胞接着および伸展がデコリンにより阻害されることは周知である（１３、１５）。ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｎは、フィブロネクチンへのＨＵＶＥＣ接着を低濃度で効果的に妨げたが、マトリックスへのＥＣ接着阻害は、ＬＲＲ５がＥＣ管腔形成を阻害したことの重要な機序でないと考えられる。それは、ＬＲＲ５Ｍが、フィブロネクチンへのＨＵＶＥＣ接着の阻害にほとんど効果のない濃度で、ＥＣ管腔形成を強く阻害したからである（図６および図１０）。
【０１０５】
コラーゲンＩおよびフィブロネクチンへの本ペプチドの結合親和力は低く、低ｍＭ〜μＭの範囲である。ＦＩＴＣ標識ペプチドを用いたところ、本発明者らは、ＬＲＲ５およびその関連ペプチドは、細胞に入らないか、細胞表面には結合しないことを観察したが（データは示さず）、これは、ＬＲＲ５およびその関連ペプチドが細胞外マトリックス中で機能していると考えられることを示唆している。デコリンコアタンパク質のＬＲＲ３〜ＬＲＲ５領域は、血管新生に関与する増殖因子であるＴＧＦβに結合することが報告されているが、本研究で記載した結合条件で試験した場合には、ＬＲＲ５はこの増殖因子に結合しなかった（データは示さず）。恐らく、ＬＲＲ５の抗血管新生活性は、デコリンがＴＧＦβに結合する能力とは無関係であろう。
【０１０６】
ペプチド治療は、臨床用途にますます利用されてきている。ペプチドの利点は、そのサイズが小さいこと、合成が簡単であること、宿主系に毒性および免疫反応がないこと、化学的な修飾が可能であることである（２）。ＭＭＰ−２のＰｅｘドメイン、ＶＥＧＦＲ１のＩｇドメイン、ＴＳＰ１のＴＳＲドメインならびにエンドスタチンをはじめとする内因性タンパク質の様々なドメインから、いくつかの抗血管新生ペプチドが得られている（５、２８、３８、３９）。本研究は、ＬＲＲドメイン由来の抗血管新生ペプチドの初めての報告である。
【０１０７】
最近、抗血管新生ペプチドは、高頻度の疎水性残基を有し、逆平行β−シートとして折り重なる傾向があること報告されている（４０）。強力な血管新生阻害剤である３３アミノ酸Ａｎｇｉｎｅｘペプチドは、生理活性構造であるβ−シートを含有するよう設計されたものである（４１、４２）。ＣＤスペクトルによって示した通り、２６残基のＬＲＲ５ペプチドもまた、溶液中で安定した３１０ヘリックス構造を有するのに加えて、β−シートも有している（図１４）。この原稿の準備をしている間、デコリンの二量体タンパク質コアの結晶構造が報告されたが（２７）、これは、ウシデコリンのＬＲＲ  ＶＩ（本発明におけるヒトＬＲＲ５に等しい）が３１０ヘリックスとβ−シートを含んでいることを示しており、これは本発明者らのＣＤの結果と一致している。ＬＲＲ５は、外面に暴露している３１０ヘリックスと二量体界面部のβ−シートを有するバナナ形のデコリンモノマー分子の中心にある。デコリンコアタンパク質のすべてのＬＲＲの中で、ＬＲＲ５だけが３１０ヘリックス構造を持っている（２７）。さらに、多数の生理活性ペプチドにおいて、βターンの存在はその機能にとって重要である（４３）。また、本明細書に記載したすべてのペプチドもまた、それらの生物活性にとって重要であり得るβターン構造を持っている。
【０１０８】
要約すると、デコリンコアタンパク質のＬＲＲ５ドメインは、ＥＣ管腔形成、遊走、マトリックスへの接着ならびにＥＣアポトーシスの誘導を阻害することにより、強い抗血管新生作用を示す。さらに、ＬＲＲ５の異なるサブ領域は、血管新生の異なる局面に影響を及ぼす。すなわち、ＬＲＲ５Ｍは管腔形成を阻害し、ＬＲＲ５Ｃは遊走を阻害し、ＬＲＲ５ＮはマトリックスへのＥＣ接着の阻害に非常に効果がある。ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｍはともに、ＥＣアポトーシスの誘導に関与する。さらに本発明者らは、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍの抗管腔形成活性が、ＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫ  Ｙ３９７のリン酸化、ならびに局所接着およびアクチンストレスファイバー形成を抑制する能力と連動していることを明らかにした。ＬＲＲ５Ｍは、ＬＲＲ５およびその親分子デコリンに比べ、管腔形成の阻害においてはるかに強力である。
【０１０９】
【表１】
2008503205.tif 000002
【０１１０】
【表２】
2008503205.tif 000003
【０１１１】
【表３】
2008503205.tif 000004
【０１１２】
実施例１のための参考文献
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Ｉｎｖｅｓｔ．１００，１４９−１５７．
１７．Ｒｅｅｄ，Ｃ．Ｃ．，Ｇａｕｌｄｉｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，３６８８−３６９５
１８．Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｍ．Ｇ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｍａｓｏｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｗｉｇｈｔ，Ｔ．Ｎ．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１３９２４−１３９３２
１９．Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．，Ｙｅｎｉｓｅｙ，Ｃ．，Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｔｏｏｔｅｌｌ，Ｍ．，Ｓａｎｔｒａ，Ｍ．，Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，４７６５−４７７７
２０．Ｄａｖｉｅｓ，Ｃｄｅ  Ｌ．，Ｍｅｌｄｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｕｎｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｍｏｕｔａ−Ｃａｒｒｅｉｒａ，Ｃ．，Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｙ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｖａｓ．Ｒｅｓ．６２，２６−４２
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２２．Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｏｈｙａｎａｇｉ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｋｒｅｓｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３８，２１０−２２５
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２８．Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｓ．Ａ．，Ｋ．Ａｌｉｔａｌｏ，ａｎｄ  Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａ，Ｊ．（２００４）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
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Ｐ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１７２１−１１７２６
３０．Ｎｉｅｃｋｏ，Ｖ．Ｇ．，Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｄｕｎｔｙ，Ｊ．Ｍ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ．
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３１．Ａｂｅｄｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１５４４２−１５４５１
３２．Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｒｕｉｚ，Ｍ．，Ｆｕｌｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｏｗａ，Ｇ．，Ｌａｎｇｕｉｎｏ，Ｌ．Ｒ．，Ｆｕｊｉｏ，Ｙ．，Ｗａｌｓｈ，Ｋ．，Ｓｅｓｓａ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｃｉｒｃｕ．Ｒｅｓ．８６，８９２−８９６
３３．Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｆ．Ｇ．，Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．，Ｒｕｆｆｏｌｏ，Ｓ．Ｃ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｒｏｙ，Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，
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３４．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．，Ｙｕａｎ，Ｔ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｈ．Ｊ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１１，１９３１−１９３７
３５．Ｋａｎｅｋｏ，Ｙ．，Ｋｉｔａｚａｔｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｂａｓａｋｉ，Ｙ．（２００４）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１１７，４０７−４１５
３６．Ｑｉａｎ，Ｙ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．，Ｆｌｙｎｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｚ．，Ｑｉａｏ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｃ．，Ｄｅｄｈａｒ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，Ｂ−Ｈ．
（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｆｅｂ  ２１．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
３７．Ｓ．Ａｂｂｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．Ｇｕａｎ．（２００２）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１７：１１６３−１１７１
３８．Ｔａｎ，Ｄ．Ｃ．Ｗ．，Ｋｉｎｉ，Ｒ．Ｍ．，Ｊｏｉｓ，Ｓ．Ｄ．Ｓ．，Ｌｉｍ，Ｄ．Ｋ．Ｆ．，Ｘｉｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｇｅ，Ｒ．（２００１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９４，１５０−１５６
３９．Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｏｍｂａｒｄｏ，Ｍ．，Ｋｒｕｔｚｓｃｈ，Ｈ．Ｃ．，Ｌａｗｌｅｒ，Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｄ．（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１００，１４２３−１４３１
４０．Ｍａｙｏ，Ｋ．Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈａｆｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ，Ａ．Ｗ．（２００１）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ４，４５−５１
４１．Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ，Ａ．Ｗ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈａｆｔ，Ｄ．Ｗ，Ｂａｒｅｎｄｓｚ−Ｊａｎｓｏｎ，Ａ．Ｆ，Ｃｏｘ，Ａ，Ｓｔｒｕｉｊｋｅｒ  Ｂｏｕｄｉｅｒ，Ｈ．Ａ，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｈ．Ｆ，Ｍａｙｏ，Ｋ．Ｈ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５４，２３３−２４２
４２．Ｄｉｎｇｓ  ＲＰ，Ａｒｒｏｙｏ  ＭＭ，Ｌｏｃｋｗｏｏｄ  ＮＡ，ｖａｎ  Ｅｉｊｋ  ＬＩ，Ｈａｓｅｍａｎ  ＪＲ，Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ  ＡＷ，Ｍａｙｏ  ＫＨ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３７３：２８１−２８８
４３．Ｋｅｅ，Ｋ．Ｓ，ａｎｄ  Ｊｏｉｓ，Ｓ．Ｄ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．９，１２０９−１２２４
【０１１３】
実施例２：デコリンペプチドは血管新生を阻害する
ペプチド合成
本ペプチドはペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、型番４７３Ａ）を用いて合成し、次いで、０．１％のトリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて、ＨＰＬＣ  Ｃ１８逆相カラムにより精製した。
【０１１４】
１．ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（ｈｄＬＲＲ５）（２６−ｍｅｒ）（配列番号２）
２．ＴＡＬＱＬＫＳＩＧＫＭＭＳＧＩＧＶＮＰＩＦＧＥＥＮＱ（スクランブルｄｈＬＲＲ５）（２６−ｍｅｒ）（配列番号３）
３．ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫ（Ｎ−ｈｄＬＲＲ５）（１３−ｍｅｒ）（配列番号４）
４．ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（Ｃ−ｈｄＬＲＲ５）（１３−ｍｅｒ）（配列番号５）
５．ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（Ｍ−ｈｄＬＲＲ５）（１２−ｍｅｒ）（配列番号６）
６．ＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭＰＫ（ｈｄＬＲＲ３）（２３−ｍｅｒ）（配列番号７）
７．ＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮ（ｈｄＬＲＲ４）（２６−ｍｅｒ）（配列番号８）。
【０１１５】
血管新生アッセイ
ＨＵＶＥＣ遊走アッセイ
細胞遊走アッセイは、２４ウェルのフォーマット中で８Ｔｍ細胞培養インサート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いて実施した。ＨＵＶＥＣは、実験前に３〜５時間、２％血清を加えた培地中で予め飢餓させた。細胞培養インサートは、０．２％ゼラチンまたはフィブロネクチン（５０ｕｇ／ｍｌ）で両サイドをプレコーティングし、乾燥させた。次いで、飢餓させたＨＵＶＥＣを、種々のすべてのペプチドと個別に、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで３０分間インキュベートした。
【０１１６】
次いで、細胞（３．０×１０４細胞／インサート）を、２４ウェル培養プレート中の細胞培養インサートの上部表面上にプレーティングした。走化因子（ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ）含有培地を底部に十分に加え、細胞を６〜１４時間インキュベートした。インサートの上部表面の細胞を綿棒で優しく取り除いた。インサートの底部横の細胞を７０％エタノールで１０〜１５分間固定し、次いで、インサートを乾燥させた。顕微鏡下で分析するために、細胞を０．０４％のギムザ液で１０分間染色した。ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて遊走細胞をカウントした。
【０１１７】
マトリゲル管腔形成アッセイ
マトリゲル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製またはＢＤ製）を、９６ウェルプレートのウェル表面にプレコーティングした。ＨＵＶＥＣ（１．５〜２×１０４／ウェル、継代＜６）を回収し、１％ウシ胎児血清を含む培地（増殖因子を含まないＭ１９９培地またはＣＳＣ培地）に再懸濁した。次いで、細胞を、３０分間３７℃の細胞培養インキュベーターで種々のすべてのペプチドと様々な濃度で個別にインキュベートし、その後、９６ウェル上にプレーティングし、１２〜１６時間インキュベートした。管腔形成は、細胞プレーティング後７〜８時間から観察した。血管新生は、５ヶ所の任意の領域を取って測定し、ＮＩＨイメージャー（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅｒ）ソフトウェアを用いて管腔長および面積を測定した。
【０１１８】
ＴＵＮＥＬアポトーシスアッセイは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のＡｐｏＡｌｅｒｔキットを用いて行った。簡単に説明すると、ＨＵＶＥＣを４ウェルのチャンバースライドに本ペプチドと一緒に播種し、２４時間本ペプチドで処理した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、細胞をＦＩＴＣ標識ＵＴＰおよびＴｄＴを含有するヌクレオチド混合物とともにインキュベートした。細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で対比染色した。
【０１１９】
あるいは、アポトーシスは、様々な濃度で本ペプチドとともにインキュベートし、アセトン：メタノール（１：１）で細胞を１０分間固定した後、ＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８（５００ｎｇ／ｍｌ）で直接染色することにより分析した。アポトーシスを起こした細胞は、顕微鏡下、任意の領域でカウントした（倍率６３０×、１試料当たり５領域）。
【０１２０】
結果
図１５〜１７にそれらの結果を示す。図１５は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２）がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害することを示す。図１６は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２）がマトリゲルで管腔形成を阻害することを示す。図１７は、ＴＵＮＥＬ標識により測定した場合、デコリンペプチドｈｄＬＲＲ５が、ＥＣアポトーシスを誘導することを示す。
【０１２１】
ヒトデコリンのＬＲＲ５に対応する２６アミノ酸のペプチド（すなわちｈｄＬＲＲ５；配列番号２）は、インビトロでのマトリゲル血管新生アッセイにおいて管腔形成を阻害し、ＶＥＧＦによる内皮細胞遊走（ＨＵＶＥＣ）を阻害し得る。ＬＲＲ５は、余剰アミノ酸を含む長鎖配列のデコリン中の他のすべてのＬＲＲに比べた場合のその特有のＬ（ロイシン）構成、コラーゲンおよびＴＧＦβに結合する高い能力により選別される。
【０１２２】
試験したデコリンペプチドは、内皮細胞にとって細胞傷害性ではない。内皮細胞の代謝状態に対するその効果について、１０ｐＭ〜１ｍＭの間の濃度範囲で試験した。１ｍＭの濃度であっても、培養した内皮細胞に細胞毒性は認められなかった。その細胞毒性レベルは、アンギオスタチンおよびエンドスタチンなどの他の周知の血管新生阻害剤と同水準である。
【０１２３】
また本発明者らは、ｈｄＬＲＲ５（配列番号２）がニトロセルロース結合コラーゲンに結合することも明らかにした（データは示さず）。
【０１２４】
実施例３：追加のペプチド
追加のＬＲＲ５の修飾バージョン：
ＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号９）
ＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１０）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１１）
ＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１２）
ＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１３）
ＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１４）
ＧＩＥＮＴＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１５）
ＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号１６）
【０１２５】
追加のペプチドのアラニンスキャン突然変異：
Ｍ−ＬＲＲ５をベースとしたもの：
ＡＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号１７）
ＬＡＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号１８）
ＬＧＡＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号１９）
ＬＧＴＡＰＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２０）
ＬＧＴＮＡＬＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２１）
ＬＧＴＮＰＡＫＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２２）
ＬＧＴＮＰＬＡＳＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２３）
ＬＧＴＮＰＬＫＡＳＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２４）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＡＧＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２５）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＡＩＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２６）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＡＥ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２７）
ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＡ（１２−ｍｅｒ）（配列番号２８）
【０１２６】
Ｃ−ＬＲＲＳをベースとしたもの：
ＡＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（１３−ｍｅｒ）（配列番号２９）
ＳＡＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３０）
ＳＳＡＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３１）
ＳＳＧＡＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３２）
ＳＳＧＩＡＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３３）
ＳＳＧＩＥＡＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号３４）
ＳＳＧＩＥＮＡＡＦＱＧＭＫ（配列番号３５）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＡＱＧＭＫ（配列番号３６）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＡＧＭＫ（配列番号３７）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＡＭＫ（配列番号３８）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＡＫ（配列番号３９）
ＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＡ（配列番号４０）
【０１２７】
他の脊椎動物種の類似配列：
ＱＭＩＶＶＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌＬＲＲ５）（配列番号４１）
ＮＶＬＶＩＥＬＧＧＮＰＬＫＮＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＬＫ（マウスＬＲＲ５）（配列番号４２）
ＲＭＩＶＩＥＬＧＧＮＰＬＫＮＳＧＩＥＮＧＡＬＱＧＭＫ（ラットＬＲＲＳ）（配列番号４３）
ＱＶＩＶＬＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（ニワトリＬＲＲＳ）（配列番号４４）
ＮＶＩＶＭＥＬＧＳＮＰＬＳＳＳＧＶＤＮＧＡＦＡＤＬＫ（ゼブラフィッシュＬＲＲ５）（配列番号４５）
【０１２８】
実施例４：癌の治療
癌に罹患している患者に、ペプチドＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２）を静脈内投与する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２；ＬＲＲ５ともいう）がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害することを示す図である。１．増殖因子なし  コントロール；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；３〜８：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ＋１００μＭ、１０μＭ；１μＭ；１００ｎＭ；１０ｎＭ；１ｎＭの濃度のデコリンｈｄＬＲＲ５ペプチド。
【図１Ａ】図１Ａは、デコリンはマトリゲル上のＥＣ管腔形成を阻害することを示す図である。２種類のデコリンの阻害作用を示す代表的な写真である。１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦまたは１０％ＦＢＳ存在下のＥＣ管腔形成アッセイにおけるウシ軟骨（ＤＣＮ）由来の天然プロテオグリカンと組換えヒトデコリン（ｒｈＤＣＮ）。このアッセイは、増殖因子を減らしたマトリゲルを用いて行った。
【図１Ｂ】図１Ｂは、デコリンはマトリゲル上のＥＣ管腔形成を阻害することを示す図である。阻害作用の数量化を示す棒グラフの図面である。
【図２】図２は、デコリンコアタンパク質中のＬＲＲ５ドメインが、マトリゲル上のＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、図２Ｂの試験で用いたペプチドのリストである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、デコリンコアタンパク質中のＬＲＲ５ドメインが、マトリゲル上のＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。増殖因子を経らしたマトリゲルを用いた管腔形成アッセイの代表的な写真である。各試料は、１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下、０．５％ＦＢＳと１００μＭのペプチドを含有している培地中でインキュベートした。
【図２Ｃ】図２Ｃは、デコリンコアタンパク質中のＬＲＲ５ドメインが、マトリゲル上のＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。ＬＲＲペプチドによる管腔形成阻害の定量を示すグラフである。ＬＲＲ５は、ＶＥＧＦ誘導性管腔形成を用量依存的に阻害した。
【図３】図３は、デコリンペプチドｈｄＬＲＲ５は、ＴＵＮＥＬ標識により測定した場合、ＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。緑色蛍光（これは白黒写真では見ることができない）はアポトーシスを起こした細胞を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＬＲＲ５が、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害したことを示す図である。ＬＲＲ５は投与依存的にＥＣ遊走を阻害する。ＶＥＧＦ１６５（１０ｎｇ／ｍｌ）を走化剤として用いた。Ｙ軸の遊走（％）は、３組の実験から得た平均値である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＬＲＲ５が、ｂＦＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害したことを示す図である。ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を化学遊走物質として用いた。Ｙ軸の遊走（％）は、３組の実験から得た平均値である。
【図４】図４は、ヒトデコリンタンパク質の配列（配列番号１）および注解を示す図である。シグナルペプチド（残基１〜１６）にはアンダーラインを引いている。プロペプチド（残基１７〜３０）はイタリック体で示す。成熟デコリンは残基３１〜３５９である。ＬＲＲは、位置８２で始まる交互の大文字および小文字で示している。ＬＲＲ５は、太字でアンダーラインを引いている（残基１７５〜２００）。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位は、太字でアンダーラインを引いて示したＳ３４にある。残基Ｎ２１１、Ｎ２６２およびＮ３０３は、少糖類炭水化物に結合するための（Ｎ結合グリコシル化）３つの部位であり、アンダーラインを引いている。非依存性Ｎ末端コラーゲンＩ結合ドメインは、残基４８〜７２にある。ＬＲＲ６はＥＧＦＲを結合する。ＬＲＲ３はフィブロネクチンおよびトロンボスポンジンを結合する。またＣ末端ドメイン（残基３０９〜３５９）もフィブロネクチンを結合する。またＮ末端ドメインは、Ｚｎ＋＋の存在下でフィブリノーゲンを結合する。
【図４Ａ】図４Ａは、ＬＲＲ５がＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。ＥＣ増殖が１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦによって誘導された。ＬＲＲ５は１０μＭ濃度以下では増殖を阻害しないが、１００μＭでは穏やかに阻害した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＬＲＲ５がＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。ＥＣ増殖が１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦによって誘導された。ＬＲＲ５は、ｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖にいかなる作用も持たなかった。
【図５】図５は、ｈｄＬＲＲ５（配列番号２）が高濃度（１００μＭ）で内皮細胞アポトーシスを誘導することを示す図である。矢印はアポトーシスを起こした細胞を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＬＲＲ５がＨＵＶＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８でＤＮＡを染色することによる顕微鏡下の断片化染色体の観察結果を示す。白色の矢印は、断片化染色体を有するアポトーシス細胞を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＬＲＲ５がカスパーゼ依存的経路を介してＨＵＶＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。細胞死ＥＬＩＳＡアッセイを用いたアポトーシスの定量結果を示す。実験は、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび／または１０μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（汎用カスパーゼ阻害剤）の存在または不在下で行う。ＬＲＲ５は、ＶＥＧＦの存在下であってもアポトーシスを誘導したが、この作用はｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによってほぼ完全に阻害される。
【図６】図６は、管腔形成アッセイの結果を示す図である。デコリンペプチドは、マトリゲルでの管腔形成を阻害した。ｄＬＲＲ５は配列番号２であり；ｓｄＬＲＲ５は配列番号３であり；ｄＬＲＲ５Ｍは配列番号６であり；ｄＬＲＲ５Ｎは配列番号４であり；ｄＬＲＲ５Ｃは配列番号５であり；デコリンは配列番号２である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＬＲＲ５の中央領域が、ＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。ＬＲＲ５Ｎ、ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃの抗管腔形成活性の代表的な写真である。ペプチドＬＲＲ５Ｍは、増殖因子を減らしたマトリゲル上のＶＥＧＦ刺激によるＥＣ管腔形成を投与依存的に強く阻害する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＬＲＲ５の中央領域が、ＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下で形成された管腔の定量結果を示す。これらの値は、２回の繰り返し実験から得られた管腔の平均の長さである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＬＲＲ５の中央領域が、ＥＣ管腔形成を強く阻害することを示す図である。１５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下で形成された管腔の定量結果を示す。これらの値は、２回の繰り返し実験から得られた管腔の平均の長さである。
【図７】図７は、ＨＵＶＥＣ遊走に対するデコリンペプチドの効果の結果を示す図である。１．増殖因子なし（−）；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（＋）；３．３Ｔｇ／ｍｌのデコリン（＋）；４．１ＴＭのＬＲＲ３（＋）；５．１ＴＭのＬＲＲ４（＋）；６．１ＴＭのＬＲＲ５（＋）；７．１ＴＭのスクランブルＬＲＲ５（＋）。
【図７Ａ】図７Ａは、ＨＵＶＥＣ遊走に対するＬＲＲ５短鎖ペプチドの効果を示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで刺激した場合のＬＲＲ５Ｎ、ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃペプチドの抗遊走効果を示す。ＬＲＲ５Ｃは、用量依存的にＶＥＧＦ刺激によるＥＣ遊走を阻害する。これらの結果は、３つの異なる実験から得た平均値である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＨＵＶＥＣ遊走に対するＬＲＲ５短鎖ペプチドの効果を示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦで刺激した場合のＬＲＲ５Ｎ、ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃペプチドの抗遊走効果を示す。ＬＲＲ５ＣはｂＦＧＦ刺激によるＥＣ遊走を阻害しないが、ペプチドＬＲＲ５Ｍは効果がある。これらの結果は、３つの異なる実験から得た平均値である。
【図８Ａ】図８Ａは、ＬＲＲ５短鎖ペプチドがＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦにより刺激したＥＣ増殖。濃度が１０Ｍ以上のペプチドＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｃは、ＶＥＧＦ刺激によるＥＣ増殖を穏やかに阻害する。これらの結果は、３回の実験から得た平均値である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＬＲＲ５短鎖ペプチドがＥＣ増殖を阻害しないことを示す図である。１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦにより刺激したＥＣ増殖。いずれのペプチドも、ｂＦＧＦ刺激によるＥＣ増殖に対して有意な効果はなかった。これらの結果は、３回の実験から得た平均値である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＥＣアポトーシスの誘導におけるＬＲＲ５サブ領域の異なる活性を示す図である。ＴＵＮＥＬ染色後のアポトーシス細胞の代表的な写真。ここで示した写真は、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下におけるペプチドの効果である。ＬＲＲ５、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５Ｍは効果があるが、ＬＲＲ５Ｃにはあまり効果はない。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＥＣアポトーシスの誘導におけるＬＲＲ５サブ領域の異なる活性を示す図である。断片化ＤＮＡを測定する細胞死ＥＬＩＳＡアッセイを用いたアポトーシスの定量。実験は、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび／または１０μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（汎用カスパーゼ阻害剤）の存在下または不在下で行う。ＬＲＲ５、ＬＲＲ５ＮおよびＬＲＲ５ＭはＶＥＧＦの存在下であってもアポトーシスを誘導するが、この作用は、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによりほぼ完全に阻害される。
【図１０】図１０は、フィブロネクチンへのＥＣ結合の阻害におけるＬＲＲ５およびその関連ペプチドの効果を示す図である。フィブロネクチンへのＥＣ結合は、ＤＣＮ、ＬＲＲ５および３種類の短鎖ペプチド全部によって阻害される。ＬＲＲ５ＭおよびＬＲＲ５Ｃと比較した場合、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｎは高い効果を示す。ここで示した値は、３回の繰り返し実験の平均値である。
【図１１】図１１は、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、ＨＵＶＥＣ内のＶＥＧＦ刺激によるＦＡＫ  Ｙ３９７リン酸化を効果的に阻害したことを示す図である。ＩＰ：免疫沈降；Ｗｂ：ウェスタンブロット。
【図１２】図１２は、ペプチドＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、局所接着へのＶＥＧＦ誘導によるパキシリン再配置を効果的に阻害したことを示す図である。ＨＵＶＥＣを固定し、透過処理し、パキシリンに対し染色した。ペプチドの濃度は１００μＭであり、組換えＤＣＮは１００ｎＭであった。ペプチド処理した試料は、すべて１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下にあった。実験は３回繰り返した。代表的な写真を示す。白色の矢印は局所接着を示す。画像は、オリンパス１×７０共焦点顕微鏡を用いて得た。
【図１３】図１３は、ＬＲＲ５およびＬＲＲ５Ｍは、ＶＥＧＦ誘導性アクチンストレスファイバー形成を効果的に阻害したことを示す図である。ＨＵＶＥＣ細胞を固定し、線状アクチンをファロイジンＴＲＩＴＣコンジュゲートで染色した。ペプチド処理試料は、すべて１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下であった。実験は３回繰り返した。写真は、各試料の異なる２０ヶ所の顕微鏡検査位置の代表的写真である。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８による青色カウンター染色である。白色の矢印はアクチンストレスファイバーを示す。画像は、倍率６３０×のＺｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を用いて得た。
【図１４】図１４は、ＬＲＲ５、そのスクランブル誘導体および３種類の短鎖誘導体のＣＤスペクトルを示す図である。ペプチドの濃度は１ｍＭであった。
【図１５】図１５は、ペプチドｈｄＬＲＲ５（配列番号２；ＬＲＲ５ともいう）がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ遊走を阻害することを示す図である。１．増殖因子なし  コントロール；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；３〜８：１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ＋１００μＭ、１０μＭ；１μＭ；１００ｎＭ；１０ｎＭ；１ｎＭの濃度のデコリンｈｄＬＲＲ５ペプチド。
【図１６】図１６は、ペプチドｈｄＬＲＲ５がマトリゲルでの管腔形成を阻害することを示す図である。
【図１７】図１７は、デコリンペプチドｄＬＲＲ５が、ＴＵＮＥＬ標識で測定した場合にＥＣアポトーシスを誘導することを示す図である。緑色蛍光（これは白黒写真では見ることができない）は、アポトーシスを起こした細胞を示す。
【図１８】図１８は、ヒトデコリンタンパク質の配列（配列番号１）および注解を示す図である。シグナルペプチド（残基１〜１６）にはアンダーラインを引いている。プロペプチド（残基１７〜３０）はイタリック体で示す。成熟デコリンは残基３１〜３５９である。ＬＲＲは、位置８２で始まる交互の大文字および小文字で示している。ＬＲＲ５は、太字でアンダーラインを引いている（残基１７５〜２００）。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位は、太字でアンダーラインを引いて示したＳ３４にある。残基Ｎ２１１、Ｎ２６２およびＮ３０３は、少糖類炭水化物に結合するための（Ｎ結合グリコシル化）３つの部位であり、アンダーラインを引いている。非依存性Ｎ末端コラーゲンＩ結合ドメインは、残基４８〜７２にある。ＬＲＲ６はＥＧＦＲを結合する。ＬＲＲ３はフィブロネクチンおよびトロンボスポンジンを結合する。またＣ末端ドメイン（残基３０９〜３５９）もフィブロネクチンを結合する。またＮ末端ドメインは、Ｚｎ＋＋の存在下でフィブリノーゲンを結合する。
【図１９】図１９は、ｈｄＬＲＲ５（配列番号２）が高濃度（１００μＭ）で内皮細胞アポトーシスを誘導することを示す図である。矢印はアポトーシスを起こした細胞を示す。
【図２０】図２０は、管腔形成アッセイの結果を示す図である。デコリンペプチドは、マトリゲルでの管腔形成を阻害した。ｄＬＲＲ５は配列番号２であり；ｓｄＬＲＲ５は配列番号３であり；ｄＬＲＲ５Ｍは配列番号６であり；ｄＬＲＲ５Ｎは配列番号４であり；ｄＬＲＲ５Ｃは配列番号５であり；デコリンは配列番号２である。
【図２１】図２１は、ＨＵＶＥＣ遊走に対するデコリンペプチドの効果の結果を示す図である。１．増殖因子なし（−）；２．１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（＋）；３．３Ｔｇ／ｍｌのデコリン（＋）；４．１ＴＭのＬＲＲ３（＋）；５．１ＴＭのＬＲＲ４（＋）；６．１ＴＭのＬＲＲ５（＋）；７．１ＴＭのスクランブルＬＲＲ５（＋）。
【図１】
2008503205.tif 000005
【図１Ａ】
2008503205.tif 000006
【図１Ｂ】
2008503205.tif 000007
【図２】
2008503205.tif 000008
【図２Ａ】
2008503205.tif 000009
【図２Ｂ】
2008503205.tif 000010
【図２Ｃ】
2008503205.tif 000011
【図３】
2008503205.tif 000012
【図３Ａ】
2008503205.tif 000013
【図３Ｂ】
2008503205.tif 000014
【図４】
2008503205.tif 000015
【図４Ａ】
2008503205.tif 000016
【図４Ｂ】
2008503205.tif 000017
【図５】
2008503205.tif 000018
【図５Ａ】
2008503205.tif 000019
【図５Ｂ】
2008503205.tif 000020
【図６】
2008503205.tif 000021
【図６Ａ】
2008503205.tif 000022
【図６Ｂ】
2008503205.tif 000023
【図６Ｃ】
2008503205.tif 000024
【図７】
2008503205.tif 000025
【図７Ａ】
2008503205.tif 000026
【図７Ｂ】
2008503205.tif 000027
【図８Ａ】
2008503205.tif 000028
【図８Ｂ】
2008503205.tif 000029
【図９Ａ】
2008503205.tif 000030
【図９Ｂ】
2008503205.tif 000031
【図１０】
2008503205.tif 000032
【図１１】
2008503205.tif 000033
【図１２】
2008503205.tif 000034
【図１３】
2008503205.tif 000035
【図１４】
2008503205.tif 000036
【図１５】
2008503205.tif 000037
【図１６】
2008503205.tif 000038
【図１７】
2008503205.tif 000039
【図１８】
2008503205.tif 000040
【図１９】
2008503205.tif 000041
【図２０】
2008503205.tif 000042
【図２１】
2008503205.tif 000043
【配列表】
2008503205000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月28日(2006.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチド、またはかかるペプチドの変異体（ただし、ペプチドはＧＴＷＰＬＫＳＳＧＩＥＮではない）。
【請求項２】
アミノ酸配列ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号２）；ＱＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫ（配列番号４）；もしくはＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫ（配列番号５）；ＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥ（配列番号６）を有する、請求項１に記載のペプチド、または前記ペプチドの変異体。
【請求項３】
デコリンのＬＲＲ４由来の５〜２４個のアミノ酸からなるペプチド、または前記ペプチドの変異体。
【請求項４】
アミノ酸配列ＴＬＱＥＬＲＡＨＥＮＥＩＴＫＶＲＫＶＴＦＮＧＬＮ（配列番号８）を有する、請求項３に記載のペプチド、またはその変異体。
【請求項５】
デコリンのＬＲＲ３由来の５〜２１個のアミノ酸からなるペプチド、またはその変異体。
【請求項６】
アミノ酸配列ＫＬＥＲＬＹＬＳＫＮＱＬＫＥＬＰＥＫＭＰＫ（配列番号７）を有する、請求項５に記載のペプチド、またはその変異体。
【請求項７】
（１）請求項２〜６のいずれか一項に定義した２種以上のペプチド、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなる２種以上のペプチド、またはかかるペプチドの変異体、あるいは
（２）請求項２〜６のいずれか一項に定義した１種のペプチド、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなる１種のペプチド、またはかかるペプチドの変異体、およびデコリン由来ではない追加のペプチド配列
を含む２５０個以下のアミノ酸残基からなるペプチド、あるいは２５０個以下のアミノ酸残基の前記ペプチドの変異体。
【請求項８】
１００個以下のアミノ酸残基からなる請求項７に記載のペプチド、またはその変異体。
【請求項９】
変異体において、デコリン配列由来の１個または２個または３個または４個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、請求項１〜８のいずれか一項に定義したペプチドの変異体。
【請求項１０】
置換アミノ酸の１種または複数が非天然アミノ酸である、請求項９に記載の変異体。
【請求項１１】
変異体が、ペプチド結合の代わりに１種または複数の非ペプチド結合を含有する、請求項１〜８のいずれか一項に定義したペプチドの変異体。
【請求項１２】
環状ペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に定義したペプチド。
【請求項１３】
請求項２〜８のいずれか一項に定義したペプチド、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチド、またはかかるペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載の発現ベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載したペプチドまたはその変異体の製造方法であって、前記ペプチドまたは変異体を化学的に合成することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に定義したペプチドの製造方法であって、請求項１３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１４に記載の発現ベクターから、あるいは請求項１５に記載の宿主細胞中で前記ペプチドを発現することを含む方法。
【請求項１８】
請求項２〜１２のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチドもしくはかかるペプチドの変異体と、薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
薬剤として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項２０】
請求項２〜１２のいずれか一項に記載のペプチドもしくは変異体、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチドもしくはかかるペプチドの変異体、または請求項１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載の発現ベクターを投与することを含む、患者の血管新生を阻害する方法。
【請求項２１】
患者が有害な血管新生がある疾患に罹患しているか、その疾患に罹患しやすい、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患している患者またはそれらに罹患しやすい患者を治療する方法であって、有効量の請求項２〜１２のいずれか一項に記載のペプチドもしくは変異体、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチドもしくはかかるペプチドの変異体、または請求項１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載の発現ベクターを患者に投与することを含む方法。
【請求項２３】
患者の有害な血管新生を治療するための薬剤の製造における、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のペプチドもしくは変異体、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチドもしくはかかるペプチドの変異体、または請求項１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２４】
癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、潰瘍、子宮内膜症および乾癬のいずれかに罹患している患者または罹患しやすい患者を治療するための薬剤の製造における、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のペプチドもしくは変異体、またはデコリンのＬＲＲ５由来の５〜２６個のアミノ酸からなるペプチドもしくはかかるペプチドの変異体、または請求項１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載の発現ベクターの使用。
【国際調査報告】
2008503205.tif 000044
2008503205.tif 000045
2008503205.tif 000046
2008503205.tif 000047