(57)【要約】  本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連疾患の処置用医薬の製造のための４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−ｆｍｓ関連疾患の処置用医薬の製造のための４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（化合物Ｉ）の使用。
【請求項２】
ｃ−ｆｍｓ関連疾患が絨毛血管癌腫、悪性組織球増殖症、胎児性癌腫、子宮内膜癌腫、脳の小グリア細胞腫瘍、サルコイドーシス、小グリア細胞関連通常型および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病または筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化合物Ｉがモノメタンスルホン酸塩形である請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩と請求項１または２に記載の使用のための指示書を一緒に含む商品パッケージ。
【請求項５】
動物に有効量の式Ｉの化合物を投与することを含む、絨毛血管癌腫、悪性組織球増殖症、胎児性癌腫、子宮内膜癌腫、脳の小グリア細胞腫瘍、サルコイドーシス、小グリア細胞関連通常型および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、または筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択されるｃ−ｆｍｓ関連疾患を有するまたは有する可能性のある温血動物、好ましくはヒト患者の処置法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連疾患の処置用医薬の製造のための４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最初に単核性食細胞系の増殖因子として記載されたマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１）は、免疫および炎症反応、骨代謝および妊娠にも関わる。Ｍ−ＣＳＦの生物活性はチロシンキナーゼ受容体ｃ−ｆｍｓにより介在される。Ｃ−ｆｍｓはリガンド誘導タンパク質チロシンキナーゼであり、そして受容体サブファミリーＩＩＩに属する。ｃ−ｆｍｓプロトオンコジーンは、マクロファージコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）に対する唯一の既知の受容体をコードする。それは、細胞外部分、すなわち５回の免疫グロブリン繰り返しを含むリガンド結合ドメインから、非触媒挿入配列に隣接している２個の部分からなる細胞内チロシンキナーゼドメイン、キナーゼ挿入部分を分離する１回膜貫通ドメインからなる。Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１／チロシンキナーゼ受容体ｃ−ｆｍｓ部分は単球およびマクロファージ分化、胚移植、胎盤発達、およびヒトの乳房の催乳性分化の不可欠な生理的機能を有する。ｃ−ｆｍｓプロトオンコジーンに対するヒトｍＲＮＡは、ENTREZ www.ncbi.nlm.nih.gov.でアクセス可能なＸ０３６６３であり、そしてCoussens L et al., Nature 1986, 320(6059) 277-280を参照のこと。
【０００３】
Ｍ−ＣＳＦおよびｃ−ｆｍｓのｍＲＮＡおよびタンパク質の異常な過剰発現は、上皮性起源の原発腫瘍で検出される。チロシンキナーゼ受容体ｃ−ｆｍｓの異常な高発現は、乳房、前立腺、卵巣および子宮内膜癌を含む、様々な悪性腫瘍の侵襲性の作用に関連している。
【０００４】
４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（以下化合物Ｉと記載する）は慢性骨髄性白血病（略称ＣＭＬ）および消化管間質腫瘍（略称ＧＩＳＴ）の処置において高い有効性を示すタンパク質キナーゼ阻害剤である。化合物ＩはＣＭＬ特異的チロシンキナーゼｂｃｒ−ａｂｌを標的とするだけでなく、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、幹細胞因子（ｃ−ｋｉｔ）、ｃ−ａｂｌおよびａｂｌ関連遺伝子（ＡＲＧ）の強力な阻害剤でもある。チロシンキナーゼ受容体ｃ−ｋｉｔおよびＰＤＧＦ−Ｒベータと対照的に、Ｍ−ＣＳＦ受容体、ｃ−ｆｍｓのリン酸化は、化合物Ｉに影響されないと報告されていた。化合物Ｉがｃ−ｆｍｓの阻害のために有用であるまたはｈｃ−ｆｍｓ関連疾患の処置用医薬の製造のために有用であるとして記載されたことはこれまでにない。
【発明の開示】
【０００５】
化合物Ｉは、下記式
【化１】
2008516898.tif 000002
を有する４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドである。
【０００６】
４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドの製造は、ＥＰ−Ａ−０  ５６４  ４０９に記載されている。
【０００７】
化合物Ｉの薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸、例えば塩酸、硫酸またはリン酸、または適当な有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、脂肪族モノ−もしくはジ−カルボン酸、例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸もしくはシュウ酸、またはアミノ酸、例えばアルギニンもしくはリシン、芳香族カルボン酸、例えば安息香酸、２−フェノキシ−安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、芳香族−脂肪族カルボン酸、例えばマンデル酸もしくはケイ皮酸、ヘテロ芳香族カルボン酸、例えばニコチン酸もしくはイソニコチン酸、脂肪族スルホン酸、例えばメタン−、エタン−もしくは２−ヒドロキシエタン−スルホン酸、または芳香族スルホン酸、例えばベンゼン−、ｐ−トルエン−もしくはナフタレン−２−スルホン酸との薬学的に許容される酸付加塩である。
【０００８】
化合物Ｉのモノメタンスルホン酸付加塩（以下“塩Ｉ”と記載する）およびそれらの結晶形、例えばα結晶形およびβ結晶形は、例えば１９９９年１月２８日公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／０３８５４および欧州特許番号９９８  ４７３に記載されている。
【０００９】
すべてのＷＯ（番号）引用文献は、対応する引用文献のＰＣＴ特許出願のＷＩＰＯ公開を引用することを意味する。
【００１０】
今回驚くべきことに、化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉが、受容体サブファミリーＩＩＩに属し、そしてＭ−ＣＳＦ依存性細胞系の増殖に関連するチロシンキナーゼ受容体ｃ−ｆｍｓを阻害する能力があることを見いだした。
【００１１】
本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連疾患、例えばｃ−ｆｍｓ関連腫瘍性疾患およびｃ−ｆｍｓ関連非腫瘍性疾患の処置用医薬の製造のための化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉの使用に関する。
【００１２】
本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連癌、例えばｃ−ｆｍｓ関連卵巣癌、例えばｃ−ｆｍｓ関連卵巣漿液性癌腫またはｃ−ｆｍｓ関連進行上皮性卵巣癌腫の処置用医薬の製造のための化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉの使用に関する。
【００１３】
本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連乳癌の処置用医薬の製造のための化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉの使用に関する。
【００１４】
本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連骨代謝疾患の処置用医薬の製造のための化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉの使用に関する。
【００１５】
本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連転移、例えば骨へのｃ−ｆｍｓ関連転移、例えば乳癌のｃ−ｆｍｓ関連骨転移の予防および／または処置用医薬の製造のための化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉの使用に関する。
【００１６】
本発明は、ｃ−ｆｍｓ関連炎症性疾患、例えばｃ−ｆｍｓ関連リウマチ性関節炎の処置用医薬の製造のための化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉの使用に関する。
【００１７】
ｃ−ｆｍｓ関連疾患は、ｃ−ｆｍｓが関連する疾患、とりわけｃ−ｆｍｓタンパク質もしくはｍＲＮＡまたは両方がｃ−ｆｍｓ関連疾患を有さない患者と比較して過剰発現している疾患を意味する。本定義はまたｃ−ｆｍｓ受容体のリガンドレベルが過剰発現である場合、およびｃ−ｆｍｓ受容体が構造的に活性化されている場合を含む。
【００１８】
ｃ−ｆｍｓ関連腫瘍性疾患は、ｃ−ｆｍｓが関連する絨毛血管癌腫、肝細胞癌腫、乳癌、悪性組織球増殖症、急性骨髄性白血病、胎児性癌腫、膀胱癌腫、腎臓癌腫、前立腺癌腫、胃癌、子宮内膜癌腫、脳の小グリア細胞腫瘍、黒色腫および転移の疾患を意味する。
【００１９】
ｃ−ｆｍｓ関連非腫瘍性疾患は、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、小グリア細胞関連通常型および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症およびアテローム性動脈硬化症を意味する。
【００２０】
本発明の１つの態様は、絨毛血管癌腫、悪性組織球増殖症、胎児性癌腫、子宮内膜癌腫、脳の小グリア細胞腫瘍、サルコイドーシス、小グリア細胞関連通常型および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、または筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択されるｃ−ｆｍｓ関連疾患の処置用医薬の製造のための化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩、例えば塩Ｉの使用に関する。
【００２１】
本発明の１つの態様にしたがって、化合物Ｉまたは医薬的に許容されるその塩、例えば塩Ｉを患者に投与する。用量は投与する化合物Ｉの遊離塩基として示し、例えば１００ｍｇの用量は、１００ｍｇの化合物Ｉの遊離塩基に対応する１１９．５ｍｇの塩Ｉを投与することを示す。例えば、用量４００ｍｇの化合物Ｉは、４００ｍｇの化合物Ｉの遊離塩基に対応する４７８ｍｇの塩Ｉを投与することと理解されるべきである。
【００２２】
種、年齢、個々の状態、投与経路および問題の臨床像に依存して、有効量の化合物Ｉ、例えば、約１００−１０００ｍｇ、例えば２００から８００ｍｇ、例えば２００−６００ｍｇ、例えば４００ｍｇの１日用量の化合物Ｉを、約７０ｋｇ体重の温血動物に投与する。ｃ−ｆｍｓ介在またはｃ−ｆｍｓ関連疾患を有している成体患者に関して、１日２００−４００ｍｇの化合物Ｉの開始用量を推奨できる。１日４００ｍｇの化合物Ｉでの治療応答評価後、不十分な応答である患者に関して、用量増加を安全に考慮してでき、そして患者が処置から利益を得そして制限する毒性が存在しない限り患者を処置し得る。このような方法で、例えば、当業者は患者に投与すべき化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩の有効量を決定し得る。
【００２３】
本発明にしたがって、化合物Ｉメシラート（塩Ｉ）、例えばα結晶型、β結晶型、またはその混合物を、ｃ−ｆｍｓ関連疾患の処置を必要とする患者に投与する。
【実施例】
【００２４】
実施例１：化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩は臨床的に関連のある濃度でマクロファージコロニー刺激因子受容体ｃ−ｆｍｓのチロシンキナーゼ活性を阻害する
材料および方法
骨髄単核球（ＢＭＭＮＣ）の単離。正常骨髄（ＢＭ）をインフォームド・コンセント後に健康な被験者の後部腸骨の頂点から吸引する。低密度骨髄単核球をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、１．０７７ｇ／ｄＬ；Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）で３０分間４００ｇでの遠心分離により回収する。
ＣＤ３４＋細胞の単離。ＣＤ３４＋前駆細胞（＞９０％純粋）をＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ３４＋前駆細胞選択単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を製造業者の指示書にしたがって使用し、ＢＭＭＮＣから単離する。
【００２５】
造血コロニーアッセイ。ＢＭＭＮＣまたはＣＤ３４＋細胞をJohnson G.R. 1980. J Cell Physiol 103:371-383の改良法を使用し、半固体寒天中のコロニー形成についてアッセイする。簡潔に言うと、０．３３％の寒天（Ｂａｃｔｏ（登録商標）Ａｇａｒ、Ｄｉｆｃｏ）、２５％のＦＣＳ、および２ｍＭのＬ−グルタミンを補った１．０ｍＬのＩＭＤＭ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中５．０×１０４のＢＭＭＮＣまたは７．５×１０３のＣＤ３４＋細胞を、３５ｍｍ細胞培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）あたりにまく。コロニー増殖を４種の増殖因子（（４ＨＧＦ）ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５種の増殖因子（（５ＨＧＦ）ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）またはＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の添加により刺激する。化合物Ｉ（０．３μＭから３０μＭ）、抗−ｃ−ｆｍｓ抗体（２−４Ａ５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）（１μｇ／ｍＬ）、または抗−ｃ−ｋｉｔ抗体（Ｓｉｇｍａ）（１μｇ／ｍＬ）をまた、コロニー培養に加える。培養は３７℃＋５％  ＣＯ２の加湿チャンバー内で２週間インキュベートし、その後培養物を３％のグルタルアルデヒド中で固定する。単球／マクロファージ、好中球および好酸球コロニーそれぞれを同定するために、固定された培養物を例えばLojda, Z. et a.l, 1979 .Enzyme histochemistry: a laboratory manual, Springer-Verlag, Berlinに記載のとおりに酢酸ナフトールエステラーゼおよびクロロ酢酸エステラーゼ（例えばKubota K. et al., 1980, Exp. Hematol. 8:339-44参照）で連続染色し、次いでルクソール・ファースト青色色素（ＢＤＨ）で染色する。コロニーを標準基準にしたがって採点する（＞５０細胞）。
【００２６】
Ｍ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ。単球は、例えばDewar A et al., 2003, Leukemia 17:1713-21において以前記載されたとおりに正常ドナーの軟膜から単離する。単球培養（１×１０５／ｍＬ）を血清枯渇培地（ＳＤＭ；２ｍＭのＬ−グルタミン、２００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、１０μｇ／ｍＬのインスリン（Ａｃｔｒａｐｉｄ（登録商標）、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、１０−４Ｍのβ−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍＬの低密度リポタンパク質（Ｓｉｇｍａ）を補ったＩＭＤＭ／１％のＢＳＡ）中の２４ウェルプレートで構築し、そして２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦで刺激する。上清を５日間２４時間間隔で回収し、そして製造業者の指示書にしたがってＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ開発システムを使用しＭ−ＣＳＦに関して分析する。
【００２７】
ＦＤＣ−Ｐ１細胞へのｃ−Ｆｍｓの形質導入。ＭＳＷ／ＩＲＥＳ／ＧＦＰ／ｃｆｍｓ（M. Roussel, St Jude Children's Research Hospitalにより恵与された）をトランスフェクトされた安定なＰｓｉ−２ウイルス産生細胞系をＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクションにより生産し、ＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分類し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞を回収する。この細胞を共培養によりＦＤＣ−Ｐ１細胞に感染するために使用し、そしてｃ−ｆｍｓタンパク質（ＦＤＣ−ｃｆｍｓ）を発現するＦＤＣ−Ｐ１細胞を１０％のＦＣＳ、２００ｍＭのＬ−グルタミンおよび６０ｎｇ／ｍＬのｒｈＭ−ＣＳＦを補ったＤＭＥＭ中で選択する。
増殖アッセイ。ＦＤＣ−ｃｆｍｓ細胞を１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に５．０×１０４／ｍＬで再懸濁し、そしてマウスのＩＬ−３（１：２０００）（Ｄｒ  Ｓ．  Ｒｅａｄ、ＩＭＶＳにより恵与された）またはｒｈＭ−ＣＳＦ（６０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で刺激する。トリプリケートで、化合物Ｉを０．５μＭ−５．０μＭ最終濃度まで加え、そして細胞を１２、２４および４８時間時点で回収する。細胞を既知の容量で固定し、そして既知の密度の固定された容量のＦｌｏｗ−ＣｈｅｃｋＴＭＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を加える。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ−ＭＣＳ分析フローサイトメーターで、ビーズ／細胞に対応するＦＳ  ｖ  ＳＳプロットのゲートに基づく分析を使用し測定する。
【００２８】
細胞溶解物。ＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓを３７℃で、化合物Ｉを添加したまたはしていない無血清培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１時間インキュベートする。飢餓後、細胞を化合物Ｉを添加したまたはしていないＤＭＥＭ中に１．５×１０７／ｍＬで再懸濁し、６０ｎｇ／ｍＬのｒｈＭ−ＣＳＦで３７℃で２分間刺激し、次いで０．５ＭのＮａＦ、０．１ＭのＮａＰＰｉ、０．５ＭのＮａＶＯ４、０．１ＭのＰＭＳＦ、および完全なプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補ったＴＳＥ（５０ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）中の１％のＮＰ４０に溶解する。
【００２９】
免疫沈降。ｃ−Ｆｍｓを２．５μｇ／ｍＬの抗−ｃ−ｆｍｓ抗体（２−４Ａ５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）およびタンパク質Ｇセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し、ＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ細胞抽出物から免疫沈降させる。免疫沈降は２時間４℃で行い、サンプルを十分に洗浄し、３０μＬの還元（抗−ホスホチロシンブロット）または非還元（抗−ｃ−ｆｍｓブロット）ローディングバッファーに再懸濁する。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し測定して等量のタンパク質をそれぞれのＩＰに使用する。
【００３０】
ウエスタンブロット分析。免疫沈降物を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に電気ブロットする。膜を抗−ホスホチロシン抗体（１／１０００  ＰＹ２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）および１／２０００  ４Ｇ１０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））の混合物）または抗−ｃ−ｆｍｓ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で探索する。アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇ抗体を使用し検出を行い、そしてＥＣＦ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し展開する。膜を４８８ｎｍ励起でＴｙｐｈｏｏｎ  ９４１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し撮像し、そしてＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用し定量を行う。
【００３１】
ｃ−Ｆｍｓ発現のフローサイトメトリー分析。ＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ細胞（５×１０５）を化合物Ｉの存在下無血清ＩＭＤＭ中で１時間培養し、次いで０．５μｇの抗−ｃ−ｆｍｓ抗体で標識する。結合した抗体をＲ−フィコエリトリン結合抗マウス抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で標識することにより検出し、そして細胞をＣｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ−ＭＣＳ分析フローサイトメーターを使用し分析する。
【００３２】
統計学的および薬物動態学的データ分析。データはＡＮＯＶＡを使用し分析し、そして確率値が＜０．０５であるとき統計学的に有意な差であると見なす。ＩＣ５０値の計算はヒル方程式、ｙ＝１００／（１＋１０（ｌｏｇＩＣ５０−ｘ）×ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））（式中、ｙは阻害レベルであり、ｘは対数薬物濃度である）を使用し行う。
【００３３】
結果
抗−ｃ−ＦｍｓがＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦで刺激される単球／マクロファージコロニーの増殖を阻害する。
化合物Ｉは正常ドナーから単離される単球／マクロファージ系の細胞増殖を刺激するＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦを抑制する、例えばDewar, A.L et al., 2003 Leukemia 17:1713-21参照。関連するクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔおよびＰＤＧＦＲと対照的に、ｃ−ｆｍｓのリン酸化は１０μＭまでの濃度の化合物Ｉには影響を受けないと報告されている、例えばBuchdunger, E. et al., 2000. J Pharmacol Exp Ther 295:139-145参照。
【００３４】
正常ドナー由来骨髄単核球を使用して構築されるコロニー培養は、４ＨＧＦまたは５ＨＧＦで刺激し、そして化合物Ｉと組み合わせた抗−ｃ−ｋｉｔ抗体の効果を単球／マクロファージ増殖において試験する、下記表１Ａ参照。化合物Ｉの不存在下、４ＨＧＦで刺激された培養物への抗−ｃ−ｋｉｔの添加はコロニー数に影響しない。これらの試験で使用される抗−ｃ−ｋｉｔ（１μｇ／ｍＬ）の用量は、４ＨＧＦ＋ＳＣＦ（５ＨＧＦ）で刺激された培養物への抗−ｃ−ｋｉｔの添加が、４ＨＧＦのみで刺激された培養物と同等レベルまでコロニー増殖を減少させるため、ＳＣＦ受容体を完全に阻害するために十分であることが示される、下記表１Ａ参照。ＳＣＦおよび化合物Ｉ添加の不存在下、単球／マクロファージ増殖における抗−ｃ−ｋｉｔ抗体の影響の欠如は、自己分泌ＳＣＦ生産に続くｃ−ｋｉｔシグナル経路への標的化が、本阻害の説明とならないことを示す。下記の表において、略語“ＳＥＭ”は平均の標準偏差であり、“ｃｃ”は濃度である。
【００３５】
【表１】
2008516898.tif 000003
表１Ａ：化合物Ｉはｃ−ｆｍｓの阻害を介して単球／マクロファージコロニー形成を阻害する。正常ＢＭ由来ＭＮＣを４ＨＧＦ（ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、４ＨＧＦ＋抗−ｃ−ｋｉｔ抗体（＋ＫＩＴ）、５ＨＧＦ（ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ）、５ＨＧＦ＋抗−ｃ−ｋｉｔ抗体（＋ＫＩＴ）で刺激し、そして単球／マクロファージコロニー形成に対する影響を試験した。
【００３６】
コロニー増殖におけるｃ−ｆｍｓの役割を試験するために、Ｍ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦで刺激下に続き、抗−ｃ−ｆｍｓ抗体を培養に加える。Ｍ−ＣＳＦ刺激培養において、単球／マクロファージコロニーのみを観察し、それは１．０μＭの化合物Ｉの存在下８０％まで阻害される（下記の表１Ｂ参照）。
【００３７】
【表２】
2008516898.tif 000004
表１Ｂ：Ｍ−ＣＳＦで刺激されるＣＤ３４＋前駆細胞由来単球／マクロファージの増殖は、抗−ｃ−ｆｍｓ抗体の添加により阻害される。
抗−ｃ−ｆｍｓ抗体は単球／マクロファージコロニーを完全に阻害するために十分であり、増殖のＭ−ＣＳＦ依存を証明する、上記表１Ｂ参照。
【００３８】
ＧＭ−ＣＳＦ刺激培養への１．０μＭの化合物Ｉの添加は、単球／マクロファージコロニー増殖を約８０％減少させた。対照的に、好酸球増殖は１０．０μＭ以下の濃度での化合物Ｉによる影響がない、下記の表１Ｃ参照。
【００３９】
【表３】
2008516898.tif 000005
表１Ｃ：ＧＭ−ＣＳＦで刺激されるＣＤ３４＋前駆細胞由来単球／マクロファージの増殖。ＧＭ−ＣＳＦで刺激下で、化合物Ｉも抗−ｃ−ｆｍｓ抗体も好酸球コロニー増殖に影響しない。
【００４０】
ＧＭ−ＣＳＦ刺激培養への抗−ｃ−ｆｍｓ抗体の添加は、単球／マクロファージコロニー増殖を完全に停止するが、一方、好酸球増殖には影響なく、ＧＭ−ＣＳＦが直接的に好酸球増殖を刺激し、それが間接的に単球／マクロファージコロニー増殖を刺激していることを示す。
【００４１】
単球のＧＭ−ＣＳＦ刺激はＭ−ＣＳＦタンパク質分泌を誘導し、そしてＧＭ−ＣＳＦが間接的に抗−ｃ−ｆｍｓで阻害可能な単球／マクロファージコロニー増殖を刺激するため、ＧＭ−ＣＳＦが培養系においてＭ−ＣＳＦの自己分泌生産を誘導するかどうかを試験する。低レベル（２０ｐｇ／ｍＬ）のＭ−ＣＳＦを培養構築２４時間後に検出し（データは示していない）、このレベルは５日間にわたって約７０ｐｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦまで徐々に増加する。１．０μＭの化合物Ｉの添加は培養されている単球によるＭ−ＣＳＦ生産に作用しないが、５日目でＭ−ＣＳＦ生産の３０％増加が５．０μＭの化合物Ｉで見られる。生産されるＭ−ＣＳＦの最高レベルは７０ｐｇ／ｍＬになると概算され、これはこの試験において使用される添加したＭ−ＣＳＦの濃度より３００−５００倍低い。Ｍ−ＣＳＦの最適より低い濃度が単球の増殖および分化を誘導するために十分であり、ＧＭ−ＣＳＦのみでは単球／マクロファージ増殖の維持ができないが、しかし相乗的にＭ−ＣＳＦの作用を強化することができる。
【００４２】
化合物ＩはＭ−ＣＳＦ依存性細胞系の増殖を阻害する。化合物Ｉは、その阻害作用をｃ−ｆｍｓを通して単球／マクロファージ発達に介在するように見えるため、マウスＩＬ−３またはヒトＭ−ＣＳＦのいずれかに依存している細胞系における化合物Ｉの影響を調べる。マウスＩＬ−３で刺激された対照培養が、試験した化合物Ｉ投与量の範囲にわたって１２または２４時間の細胞増殖における化合物Ｉ特異的作用を示さなかった、例えば表２Ａ参照。４８時間で、ＩＬ−３の存在下、ＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ増殖は２．５μＭの化合物Ｉで１５％および５．０μＭの化合物Ｉで４０％減少し、化合物Ｉがこれらの細胞に対して弱い毒性作用を有することを示す。
【表４】
2008516898.tif 000006
表２Ａ
【表５】
2008516898.tif 000007
表２Ｂ
表２Ａおよび２Ｂ：化合物Ｉは、治療濃度でｃ−ｆｍｓ発現細胞系のＭ−ＣＳＦ刺激増殖を阻害するが、ＩＬ−３刺激増殖を阻害しない。細胞数（細胞／ｍＬ）を１２、２４および４８時間時点で数える。マウスＩＬ−３で刺激された対照培養は４８時間で２．５μＭまたはそれ以上の化合物Ｉの濃度でわずかな増殖阻害を示した（２Ａ）。１２および２４時間時点では作用は見られない。５．９μＭのＩＣ５０値がシグモイドモデルを使用して予測され、化合物Ｉのより高い濃度でのわずかな薬剤毒性を示す（データは示していない）。Ｍ−ＣＳＦでの細胞の刺激は、１２時間で５．０μＭの化合物Ｉならびに２４および４８時間で２．５μＭの化合物Ｉにおいて増殖阻害を証明し、化合物ＩのＩＣ５０値は１．１μＭである（２Ｂ）。
【００４３】
Ｍ−ＣＳＦが唯一の刺激源であるとき、細胞増殖の５０％阻害は培養開始１２時間後に５．０μＭの化合物Ｉで見られる。２４時間で、細胞数は化合物Ｉで刺激されていない培養よりも２．５μＭの化合物Ｉで４５％まで低く、そして５．０μＭの化合物Ｉで、細胞数はまいた値よりも低い。Ｍ−ＣＳＦ刺激ＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ培養における化合物Ｉの作用は４８時間で最も大きく、その時２．５μＭの化合物Ｉは細胞数を対照に対して８０％減少させ、そして５．０μＭの化合物Ｉで、細胞濃度はまいたレベルよりも低い。
【００４４】
化合物Ｉはｃ−Ｆｍｓのリン酸化を阻害する。化合物Ｉが直接的にＭ−ＣＳＦ受容体における阻害作用を介在するかどうかを測定するために、ｃ−ｆｍｓのリン酸化における化合物Ｉの作用をＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ細胞系で試験する。Ｍ−ＣＳＦで刺激されていない飢餓ＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ細胞は非ｃ−ｆｍｓリン酸化を示さない。Ｍ−ＣＳＦで刺激された飢餓ＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ細胞は受容体リン酸化を示し、そして１．０μＭの化合物Ｉはこのリン酸化を約３０％減少させる。２．５μＭの化合物Ｉで、ｃ−ｆｍｓリン酸化は７５％まで減少し、そして５．０μＭの化合物Ｉで、顕著なリン酸化は見られない。データ分析で、増殖実験において得られる値と同等である１．４２μＭのｃ−ｆｍｓリン酸化の化合物Ｉ阻害に対するＩＣ５０値を得た。
【００４５】
化合物Ｉはｃ−Ｆｍｓタンパク質発現に影響しない。ｃ−Ｆｍｓは単球において低レベルで発現し、そしてその発現はマクロファージへの分化中顕著に増加する。Ｍ−ＣＳＦの不存在下、ｃ−ｆｍｓの成熟細胞表面形は比較的安定であるが、しかしリガンド結合がリソソーム内で内在化および分解により受容体発現を下方制御する。Ｍ−ＣＳＦ受容体のリン酸化は化合物Ｉでの処理により阻害されるため、ウエスタンブロットはｃ−ｆｍｓ発現を減少によるものでないことを確認するためにｃ−ｆｍｓタンパク質に対して探索する。これらのブロット分析において、２つのｃ−ｆｍｓバンドが検出され、完全なグリコシル化ｃ−ｆｍｓタンパク質を示す１７０ｋＤａバンド、および非グリコシル化形である未成熟を示す１３０ｋＤａバンドである。１７０ｋＤａおよび１３０ｋＤａバンド両方の強度を定量し、１７０ｋＤａのタンパク質がより高いレベルで常に検出されるが、ｃ−ｆｍｓの両形態の発現は化合物Ｉ処理により影響をうけない、下記表４Ａ参照。ｃ−ｆｍｓ発現における化合物Ｉの作用の欠如はフローサイトメトリーを使用して確認され、０．５μＭ−２．５μＭの化合物Ｉで培養されたＦＤＣ−ｃ−ｆｍｓ細胞におけるｃ−ｆｍｓの表面発現の差異がなく、そして５．０μＭの化合物Ｉでわずかに低い発現である、表４Ｂ参照。
【表６】
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表４Ａ：ｃ−ｆｍｓ種のウエスタンブロット定量。ＩＣ＝イソタイプ対照。
【表７】
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表４Ｂ：表面ｃ−ｆｍｓをフローサイトメトリーにより検出した。
【００４６】
タンパク質−チロシンキナーゼ阻害剤化合物Ｉのインビトロ特性はｃ−ｆｍｓを含むまで拡大できることを証明する。阻害の効力はＡｂｌ（ＩＣ５０＝０．０２５μＭ）、ｃ−ｋｉｔ（ＩＣ５０＝０．１μＭ）またはＰＤＧＦ（ＩＣ５０＝０．２５μＭ）受容体チロシンキナーゼに対して観察されたものより低い。ウエスタンブロット分析はｃ−ｆｍｓチロシンリン酸化の５０％の阻害をするために１．４μＭ濃度の化合物Ｉが必要であることを示す。この本試験において、ｃ−ｆｍｓのリン酸化における化合物Ｉの作用は、Ｍ−ＣＳＦの飽和量でのｃ−ｆｍｓ免疫沈降物、次いで特異的受容体刺激を試験する。
【００４７】
化合物Ｉは、一般的な癌、例えば乳癌および上皮性卵巣癌、ならびに炎症性状態、例えばリウマチ性関節炎を含む異常ｃ−ｆｍｓ活性化関連疾患の処置において使用され得る。ｃ−ｆｍｓの異常発現は乳房および卵巣癌腫を含むヒトの癌の範囲で示され、そしてｃ−ｆｍｓの活性化はウロキナーゼ依存性メカニズムにより腫瘍浸潤を刺激することを示している、Kacinski B.M. 1997, Mol Reprod Dev 46:71-4, Sapi EおよびB.M. Kacinski, 1999, Proc Soc Exp Biol Med 220:1-8参照。乳房腫瘍および進行性上皮性卵巣癌腫におけるｃ−ｆｍｓの異常発現は、腫瘍細胞侵襲性および不利な臨床予後と相関があり、そして乳房腫瘍により生産されるＭ−ＣＳＦは乳癌の骨転移の促進に関与している、Toy E.P. et al., 2001, Gynecol. Oncol. 80:194-200, Sapi E. 2004 Exp Biol Med 229:1-11参照。ｃ−ｆｍｓリン酸化における化合物Ｉの強力な阻害作用はまた、潜在的薬剤毒性に関して重要な関係を有する。造血系以外で、ｃ−ｆｍｓシグナリングは着床前胚発達および乳腺発達に影響し、妊娠に重要な役割を果たす、Pollard J.W. 1997, Mol Reprod Dev 46:54-60参照。Ｍ−ＣＳＦ刺激を介して、ｃ−ｆｍｓはまた骨代謝および炎症進行において重要な役割を果たす、Fixe P. and V. Praloran, 1998, Cytokine 10: 32-37。今日までの証拠が、化合物Ｉが患者に耐容性であることを示したが、これらの過程における化合物Ｉの可能性のある作用は、長期間の化合物Ｉ処置の結果と考えなければならない。
【００４８】
実施例２：４−［（４−メチル−１−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］ベンズアミドモノメタンスルホン酸塩、β結晶形のカプセル
活性成分として１００ｍｇの化合物Ｉ（遊離塩基）に対応する１１９．５ｍｇの表題の化合物（＝塩Ｉ）を含むカプセルを下記の組成物で生成する：
【表８】
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カプセルは組成物を混合し、硬ゼラチンカプセル（サイズ１）に混合物を充填することにより生成する。
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月18日(2006.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絨毛血管癌腫、悪性組織球増殖症、胎児性癌腫、子宮内膜癌腫、脳の小グリア細胞腫瘍、サルコイドーシス、小グリア細胞関連通常型および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、または筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択されるｃ−ｆｍｓ関連疾患の処置用医薬の製造のための４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（化合物Ｉ）の使用。
【請求項２】
化合物Ｉがモノメタンスルホン酸塩形である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化合物Ｉまたは薬学的に許容されるその塩と請求項１または２に記載の使用のための指示書を一緒に含む商品パッケージ。
【請求項４】
動物に有効量の化合物Ｉを投与することを含む、絨毛血管癌腫、悪性組織球増殖症、胎児性癌腫、子宮内膜癌腫、脳の小グリア細胞腫瘍、サルコイドーシス、小グリア細胞関連通常型および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、または筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択されるｃ−ｆｍｓ関連疾患を有するまたは有する可能性のある温血動物、好ましくはヒト患者の処置法。
【国際調査報告】
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