(57)【要約】  本発明は、標的核酸配列における核酸配列の変化の存在を決定する新規方法を提供する。当該方法は、プライマーの一方が、例えば蛍光標識で標識されているプライマー対で増幅された増幅産物の融解プロファイルの変化を決定すること、を含んで成る。当該方法は、プライマー上の前記標識と相互作用する標識、例えば、プローブとプライマーが近接している場合にシグナルがクエンチングされるように、プライマー上の蛍光標識をクエンチングするクエンチャー、で標識されているプローブ、を利用する。コントロールと比較した場合の増幅産物の融解プロファイルの変化は、多型部位の存在を反映する。
2008546388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型部位を検出する方法であって、
（ｉ）標的配列を増幅するプライマー対を含んで成る増幅反応において、少なくとも１つの多型部位を含んで成る標的核酸配列を増幅すること、ここで、前記プライマー対のプライマーの少なくとも一方は標識されている；
（ｉｉ）増幅産物と、前記プライマー対によって増幅される核酸標的配列と特異的にハイブリダイズする標識プローブとを含んで成る融解分析における増幅反応の融点を決定すること、ここで、前記プローブ上の標識は、標識プライマーと標識プローブとが近接している場合にシグナルのクエンチングが起こるように（ｉ）のプライマー上の標識と相互作用する；そして、
融解プロファイルの変化をコントロールの融解プロファイルと比較して検出し、それにより、多型部位の存在を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記標識プライマー上の標識が蛍光標識であり、そして前記プローブ上の標識が前記蛍光標識をクエンチングするクエンチャーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマー上の標識が当該プライマーの３’末端から５ヌクレオチド以内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、前記標的配列を増幅する工程の間に存在している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブ上の標識が、当該プローブの３’末端から５ヌクレオチド以内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが、標的核酸配列における多型の位置に修飾塩基を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾塩基がロック核酸ヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが、標的核酸配列内の多型の位置に隣接している位置に修飾塩基を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸内の少なくとも１つの多型部位が、前記プローブがハイブリダイズする配列内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸内の第二多型部位が、前記プローブがハイブリダイズする配列内にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記多型部位が、前記プローブがハイブリダイズする配列の中部３分の１以内に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが、約１０〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブが、前記プライマーよりも高いＴｍを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅が、１つの標識プライマーを有する第二プライマー対であって、当該標識が第一プライマー対のプライマー上の標識と異なる、第二プライマー対；及び標識を有する第二プローブであって、当該プローブ上の標識が前記第二プライマー対の標識プライマー上の標識と相互作用することで、当該第二プライマー対の標識プライマーと前記第二の標識プローブとが近接している場合に標識シグナルをクエンチングする、第二プローブ、を含んで成る多重増幅反応において実施され；且つ、
前記第二プローブについての融解プロファイルを決定すること、が更に含まれている、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマー対によって増幅された標的核酸に存在する第二多型部位を標的とするクエンチャーで標識された第二プローブを用いて、融解プロファイルの変化を検出すること、が更に含まれており、ここで、前記プライマー対の第一標識プライマー上の標識と異なる蛍光標識であって、前記第二プローブ上のクエンチャーでクエンチングされる蛍光標識で、前記プライマー対の第二プライマーが標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１つのプライマーセットによって増幅されるアンプリコン内に存在する少なくとも２つの多型部位を検出する方法であって：
（ｉ）フォワードプライマー上に一つの蛍光標識を、そしてリバースプライマー上に第二の蛍光標識を有するプライマー対を用いて標的核酸配列を増幅すること；
（ｉｉ）増幅産物；
前記多型部位のうちの一つに特異的にハイブリダイズする１つのプローブであって、フォワードプライマー上の標識が近接している場合に当該標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ；
第二多型部位と特異的にハイブリダイズする第二プローブであって、リバースプライマー上の第二標識が近接している場合に当該標識をクエンチングするクエンチャーで標識されており、且つ第一プローブと比較して反対の鎖とハイブリダイズするプローブ；
を含んで成る、融解分析における増幅反応の融点を決定すること；そして
融解プロファイルのうちの少なくとも１つの変化を、コントロールの融解プロファイルと比較して検出し、それにより、少なくとも１つの多型部位の存在を決定すること、
を含んで成る方法。
【請求項１７】
同一のクエンチャーが第一及び第二プローブ上で使用されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一プローブ上のクエンチャーが前記第二プローブ上のクエンチャーと異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二プローブの標的にされる配列が、前記第一プローブの標的にされる配列と重複する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
２つの多型部位が約１０ヌクレオチド以下離れている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
一方のプライマーが蛍光標識で標識されている、標的核酸配列を増幅するプライマー対；及び標的核酸配列とハイブリダイズするプローブであって、前記蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ、を含んで成る、増幅反応混合物。
【請求項２２】
標的配列を増幅するプライマー対であって、一方のプライマーが蛍光標識で標識され、そして他方のプライマーが未標識であるプライマー対；及び当該プライマー対によって増幅される標的核酸配列とハイブリダイズするプローブであって、前記蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ、を含んで成る、キット。
【請求項２３】
少なくとも第一及び第二の多型部位を含んで成る標的配列を増幅するプライマー対であって、一方のプライマーが第一蛍光標識で標識されており、そして他方のプライマーが第一のものと異なる第二蛍光標識で標識されているプライマー対；
当該プライマー対によって増幅される標的核酸配列の、第一多型部位を含んで成る亜配列とハイブリダイズする第一プローブであって、第一蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されている第一プローブ；及び
前記プライマー対によって増幅される標的核酸配列の亜配列であって、前記第二多型部位を含んで成る亜配列とハイブリダイズする第二プローブであって、第二蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されている第二プローブ、
を含んで成る、キット。
【請求項２４】
２つの標的配列を増幅する２つのプライマー対であって、第一標的配列を増幅する第一プライマー対の一方のプライマーが第一蛍光標識で標識されており、そして他方のプライマーが未標識であり；そして第二のプライマー対の一方のプライマーが第一標識と異なる第二蛍光標識で標識されている、プライマー対；並びに、前記第一標的配列に対する１つのプローブであって、前記第一蛍光標識が近接している場合に第一蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ；及び第二標的配列に対する第二プローブであって、第二蛍光標識が近接している場合に当該第二蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されている第二プローブ、を含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸配列における多型の新規検出方法に関する。多型の検出は、例えば患者の遺伝子型の決定に有用である。多型検出に常用されている融解曲線分析は、オリゴヌクレオチドがプローブによって標的とされる領域内のある位置で多型の標的核酸とハイブリダイズした場合に、蛍光の変化が生じるように構築される。例えば、そのような方法の１つは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用するデュアルフルオロフォアアプローチ、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ハイブリダイゼーションプローブを必要とし、これは、２つのオリゴヌクレオチドプローブがアンプリコンに対しアニーリングする（例えば、米国特許第６，１７４，６７０号；及び米国特許出願番号２００５００４２６１８号及びこれらで引用されている文献）。前記オリゴヌクレオチドはフルオロフォアで標識され、そして効率的なエネルギー移動に適合性がある距離で離されたフルオロフォアと、頭と尾の配向でハイブリダイズするよう設計される。ＦＲＥＴシグナルは、２つの特異的ハイブリダイゼーションイベントが生じた場合にのみ見られる。レポーター色素で内部標識されたプライマーが検出プローブの対応物として働く、この方法の変法も採用されている(von Ahsen, et al. Clin. Chem. 46:156-161, 2000)。この変法では、プライマーを標識している蛍光色素が、ポリメラーゼ伸長によって形成された鎖内に直接組み込まれる。前記プライマー上の色素の位置が重要であるのは、ＦＲＥＴが起こることができるように十分近接していなければならないためである。更に、当該プローブは、色素標識オリゴヌクレオチドの伸長によって生じる鎖とハイブリダイズしてＦＲＥＴシグナルを生成しなければならない。
【０００２】
本発明は、融解曲線を使用して多型を同定する新規方法を提供する。本発明は、クエンチング部分で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ及び増幅反応においてプライマーの１つとして働く蛍光標識プライマーを利用する。融解曲線分析は、標的核酸配列の変化を検出するために利用される。
【０００３】
本発明の簡単な説明
１つの観点において、本発明は、少なくとも１つの多型部位を検出する方法であって、（ｉ）標的配列を増幅するプライマー対を含んで成る増幅反応において、少なくとも１つの多型部位を含んで成る標的核酸配列を増幅すること、ここで、前記プライマー対のプライマーの一方は標識されている；（ｉｉ）増幅産物と、前記プライマー対によって増幅される核酸標的配列と特異的にハイブリダイズする標識プローブとを含んで成る融解分析における増幅反応の融点を決定すること、ここで、前記プローブ上の標識は、標識プライマーと標識プローブとが近接している場合にシグナルのクエンチングが起こるように（ｉ）のプライマー上の標識と相互作用する；そして、融解プロファイルの変化をコントロールの融解プロファイルと比較して検出し、それにより、多型部位の存在を検出すること、を含んで成る方法、を提供する。好ましい態様において、前記プライマー上の標識は蛍光標識であり、そして前記プローブは、当該蛍光標識をクエンチングするクエンチャーである。
【０００４】
態様によっては、前記標識は、前記プライマーの３’末端から５ヌクレオチド以内に位置する。
【０００５】
前記プローブは、標的核酸配列の増幅の間存在することができる。別の態様においては、前記プローブは、増幅反応の繰り返しのサイクルの後で且つ融解曲線分析の再アニーリング工程の前に添加される。
【０００６】
前記プローブ上の標識は、これがプライマー標識の機能している半径内にあればどこにでも位置付けることができる。態様によっては、前記プローブ上の標識は、前記プライマーの３’末端から５ヌクレオチド以内に位置する。
【０００７】
１つの態様において、前記プローブは、標的核酸配列において多型の位置に修飾塩基を含んで成る。当該修飾塩基は、例えば、ロック核酸ヌクレオチドであってもよい。別の態様において、前記プローブは、前記標的核酸配列において多型の位置に隣接した位置に修飾塩基を含んで成る。
【０００８】
態様によっては、前記多型部位は、前記プローブがハイブリダイズする配列の中部３分の１以内に存在する。他の態様において、前記多型部位は、前記プローブがハイブリダイズする配列に隣接している。
【０００９】
態様によっては、前記プローブはしばしば長さが約１０〜約５０ヌクレオチドである。典型的に、前記プローブは、前記プライマーよりも融解温度（Ｔｍ）が高い。
【００１０】
本発明の方法によっては、増幅反応において増幅される標的核酸配列は、複数の多型部位を含んで成る。従って、態様によっては、標的核酸内の第二の多型部位は、前記プローブがハイブリダイズする配列内に存在することもある。
【００１１】
本発明の特定の態様において、増幅は、一方が標識されたプライマーである第二プライマー対（ここで、前記標識は、第一プライマー対のプライマー上の標識と異なる）；及び第二多型部位に対する第二プローブ（ここで、当該第二プローブは、第二の対のうちの標識されたプライマー上の標識と相互作用するクエンチャーで標識されており、この第二の対のうちの標識されたプライマーと当該第二の標識プローブとが近接している場合に前記標識のシグナルをクエンチングする）を含んで成る多重反応において実施される。本方法は更に、第二アンプリコンの融解曲線プロファイルを決定することを含んで成り、ここで、当該第二アンプリコンの変化が検出されると第二多型部位の存在が示唆される。
【００１２】
本発明はまた、１つのプライマーセットによって増幅されるアンプリコン内に存在する少なくとも２つの多型部位を検出する方法を提供するものであり、当該方法は：（ｉ）標的核酸配列を、フォワードプライマー上に一つの蛍光標識を、そしてリバースプライマー上に第二の蛍光標識を有するプライマー対で増幅すること；（ｉｉ）増幅産物；
前記多型部位のうちの一つに特異的にハイブリダイズする１つのプローブであって、フォワードプライマー上の標識が近接している場合に当該標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ；
第二多型部位と特異的にハイブリダイズする第二プローブであって、リバースプライマー上の第二標識が近接している場合に当該標識をクエンチングするクエンチャーで標識されており、且つ第一プローブと比較して反対の鎖とハイブリダイズするプローブ；
を含んで成る、融解分析における増幅反応の融点を決定すること；
（ｉｉｉ）融解プロファイルのうちの少なくとも１つの変化を、コントロールの融解プロファイルと比較して検出し、それにより、少なくとも１つの多型部位の存在を決定すること、
を含んで成る。態様によっては、第一プローブ及び第二プローブ上のクエンチャーは同一である。他の態様において、前記クエンチャーは異なる。
【００１３】
第二プローブの標的にされる配列は、第一プローブの標的にされる配列と重複することもある。態様によっては、前記２つの多型部位は、約１０ヌクレオチド以下離れている。
【００１４】
別の観点において、本発明は、本発明は増幅反応混合物を提供する。１つの態様において、増幅反応混合物は、標的核酸配列を増幅するプライマー対であって、一方のプライマーが蛍光標識で標識され、そして他方のプライマーが未標識であるプライマー対；及び標的核酸配列とハイブリダイズするプローブであって、前記蛍光標識と近接している場合に当該蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ、を含んで成る。
【００１５】
別の態様において、前記増幅反応は：ｉ）少なくとも２つの多型部位を含んで成る標的核酸配列を増幅するプライマー対であって、一方のプライマーが第一蛍光標識で標識されており、そして反対のプライマーが第一のものと異なる第二蛍光標識で標識されているプライマー対；ｉｉ）第一蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブであって、第一多型部位を含む亜配列(subsequence)とハイブリダイズするプローブ；及びｉｉｉ）第二蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブであって、第二多型部位を含む亜配列とハイブリダイズするプローブ、を含んで成る。態様によっては、第一プローブ及び第二プローブ上のクエンチャーは同一である。
【００１６】
別の観点において、本発明はキットを提供する。１つの態様において、当該キットは、標的配列を増幅するプライマー対であって、一方のプライマーが蛍光標識で標識され、そして他方のプライマーが未標識であるプライマー対；及び当該プライマー対によって増幅される標的核酸配列とハイブリダイズするプローブであって、前記蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されるプローブ、を含んで成る。別の態様において、前記キットは：少なくとも第一及び第二の多型部位を含んで成る標的配列を増幅するプライマー対であって、一方のプライマーが第一蛍光標識で標識されており、そして他方のプライマーが第一のものと異なる第二蛍光標識で標識されているプライマー対；当該プライマー対によって増幅される標的核酸配列の、第一多型部位を含んで成る亜配列とハイブリダイズする第一プローブであって、第一蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ；及び前記プライマー対によって増幅される標的核酸配列の、第二多型部位を含んで成る亜配列とハイブリダイズする第二プローブであって、第二蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ、を含んで成る。別の態様において、本発明は、２つの標的配列を増幅する２つのプライマー対であって、第一標的配列を増幅する第一プライマー対の一方のプライマーが第一蛍光標識で標識されており、そして他方のプライマーが未標識であり；そして第二のプライマー対の一方のプライマーが第一標識と異なる第二蛍光標識で標識されている、プライマー対；並びに、前記第一標的配列に対する１つのプローブであって、前記第一蛍光標識が近接している場合に第一蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ；及び第二標的配列に対する第二プローブであって、第二蛍光標識が近接している場合に当該第二蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されている第二プローブ、を含んで成るキットを提供する。
【００１７】
本発明の詳細な説明
用語「増幅反応」は、核酸の標的配列のコピーを増大させるための任意のin vitroでの手段を指す。
【００１８】
「増幅」とは、前記反応の成分全てが無傷である場合に、ポリヌクレオチドの増幅を可能にするのに十分な条件の解決手段を提示する工程を指す。増幅反応の成分には、例えばプライマー、ポリヌクレオチドの鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド等が含まれる。用語「増幅」とは、典型的には、標的核酸の「指数関数的」増大を指す。しかしながら、「増幅」は、本明細書で使用する場合、核酸の選択標的配列の数の線形増大を指すこともある。
【００１９】
用語「増幅反応混合物」は、標的核酸を増幅するために使用される種々の試薬を含んで成る水溶液を指す。これらには、限定しないが、酵素、水性の緩衝液、塩、増幅プライマー、標的核酸、ヌクレオシド三リン酸、界面活性剤、分子スペーサー、修飾ヌクレオチド等の成分が含まれる。状況次第で、当該混合物は完全な又は不完全な増幅反応混合物のいずれかであってもよい。
【００２０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、標的二本鎖ＤＮＡの特定のセグメント又は亜配列が等比級数的に増幅されるような方法を指す。ＰＣＲは当業者に周知である；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号；並びにPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. , eds, 1990; Sambrook and Russell, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (3rd ed. 2001); 及びCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al, eds., John Wiley & Sons, Inc. 1994-1997, 2001 version)を参照のこと。
【００２１】
「プライマー」は、標的核酸の鋳型上の配列とハイブリダイズし、且つ核酸合成の開始点としての役割を果たすポリヌクレオチドを指す。本発明の文脈においては、プライマーは、標的核酸の増幅におけるプライマー対のメンバーとして参加する増幅反応の一成分である。プライマーは種々の長さのものであってもよく、しばしば５０ヌクレオチド未満の長さ、例えば１２〜２５ヌクレオチドの長さである。ＰＣＲにおいて使用するためのプライマーの長さ及び配列は、当業者にとって既知の原理に基づいて設計することができる。例えば、Innis et al.（上掲）を参照のこと。
【００２２】
「プローブ」とは、注目の標的ポリヌクレオチド配列に対しハイブリダイゼーション可能であり、且つ選択したポリヌクレオチド配列の特異的な検出を可能とするポリヌクレオチド配列を指す。本発明との関連での「プローブ」とは、クエンチング試薬に連結したポリヌクレオチド配列を含んで成ることで、これらの試薬の検出を可能にするものである。従って、「プローブ」とは、本明細書では「ｑ−プローブ」とも称する。「プローブ」はまた、他の成分、例えばペプチド（ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見られるようなもの）、修飾塩基、又はプローブ配列の配向を保存するスペーサー、を含むことがある。
【００２３】
「近接」は、フルオロフォア／クエンチャーの対の位置に関して本発明との関連で使用する場合、特定のフルオロフォア及びクエンチャーによって変化する。「近接」とは、フルオロフォアとクエンチャーとの間の距離であって、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光強度を低下させる距離を指す。フルオロフォアとクエンチャーは、フルオロフォアで標識されているハイブリダイズしたプライマーの存在下、特異的なプローブが標的核酸と結合することで蛍光強度の低下が見られる場合、「近接」と見なされる。蛍光強度の低下に達しているのは、典型的には、計算上の出発点（すなわち、融解曲線の起源又は最低温度）での相対的蛍光強度が少なくとも１０％、好ましくは５０％、参照の増幅されていない曲線と比較して、増幅産物由来のピーク強度と比較して低下している場合である。
【００２４】
「クエンチャー」は、本明細書で使用する場合、クエンチャーが発光せずに標識の放出物を吸収するように当該標識、例えばフルオロフォアと相互作用することである。
【００２５】
「ミスマッチのヌクレオチド」又は「ミスマッチ」とは、その位置で標的核酸に対してワトソン−クリック対合した場合に相補的でないヌクレオチドを指す。
【００２６】
「コントロール融解プロファイル」とは、本明細書で使用する場合、既知の配列によって生じた参照融解曲線を指す。当該配列は、「野生型」配列であってもよいが、野生型配列に限定されない。当該参照は、当該参照と他の配列変化又は変更との間で融解プロファイルの違いを示す人工物であってもよい。
【００２７】
用語「亜配列」とは、より長い配列の中で連続しているヌクレオチド配列を指すが、当該より長い配列のヌクレオチド全てを含むものではない。
【００２８】
「標的」又は「標的核酸配列」とは、増幅反応において増幅されることが求められている一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド配列を指す。２つの標的配列は、それらが同一でないポリヌクレオチド配列を含んで成る場合、そして／あるいは一方が他方と比べて修飾された塩基を含む場合、異なる。標的核酸配列は、典型的に、プライマーセットによって増幅反応において増幅される。
【００２９】
「温度プロファイル」とは、ＰＣＲ反応の変性、アニーリング及び／又は伸長の温度及び時間の長さ、を指す。ＰＣＲ反応の温度プロファイルは、典型的に、類似又は同一のより短い温度プロファイルを１０〜６０回反復したものから成る；これらのより短いプロファイルのそれぞれが、典型的に、２段階又は３段階のＰＣＲ反応を規定する。「温度プロファイル」の選択は、当業者にとって既知の種々の検討事項に基づく。例えば、Innis et al.（上掲）を参照のこと。
【００３０】
「融解プロファイル」とは、融解曲線分析の間の二本鎖核酸対一本鎖核酸の量の変化を指す。当該融解プロファイルは、標的核酸に存在する配列を反映している。
【００３１】
「鋳型」とは、増幅され、プライマーハイブリダイゼーション部位に隣接し、標的ポリヌクレオチドを含んで成る二本鎖ポリヌクレオチド配列を指す。従って、「標的鋳型」は、標的ポリヌクレオチド配列及び５’プライマーと３’プライマーのための隣接ハイブリダイゼーション部位を含んで成る。
【００３２】
アンプリコンとは、増幅反応の間プライマー対によって増幅される核酸配列を指す。
【００３３】
「多重増幅(multiplex amplification)」とは、同一反応中での多数のポリヌクレオチドフラグメントの増幅を指す（例えば、PCR PRIMER, A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach, ed. 1995) Cold Spring Harbor Press, pages 157-171を参照のこと）。
【００３４】
「多型」とは、本願の文脈において、対立遺伝子変異体である。多型は、単純配列長多型だけでなく、一塩基多型を含むことがある。多型は、別の対立遺伝子変異体と比較してある対立遺伝子における１又は複数のヌクレオチド置換に起因することがあり、あるいは挿入又は欠失に起因することもある。「多型」は、本明細書で使用する場合、任意の配列の変化を指し、その結果、表現効果を有するもの、例えば突然変異だけでなくサイレント多型を含む。従って、「多型」とは、それらがプローブ標的領域内で生じる限り、一塩基の変化、突然変異、配列挿入／欠失／逆位を含んでもよい。
【００３５】
序文
本発明は、標的核酸配列における核酸配列の変化の存在を決定する新規方法を提供する。当該方法は、標識プライマー、未標識の反対のプライマー、すなわち、標的核酸配列を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマー対における第二プライマー、及びクエンチング分子で標識されているプローブ、を利用する。前記標的核酸は、前記プライマー対を用いた増幅反応において増幅される。当該標的核酸は、続いて、クエンチングプローブの存在下融解曲線分析にかけられる。融解曲線分析において、蛍光がモニタリングされ、そして増幅産物が徐々に加熱される。蛍光の増大は、プローブが標的核酸配列から解離する(melt off)場合に達成される。オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸配列のヌクレオチドの変化の存在は、当該ヌクレオチドの変化を匿わない配列と比較して、融解曲線プロファイルを変化させ、その結果、注目の核酸の標的領域の配列の変化の存在が決定される。
【００３６】
オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー
本発明の方法で使用するためのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、任意の適当な方法、例えば当業者にとって周知のホスホトリエステル及びホスホジエステルを用いる方法を用いて調製することができる。態様によっては、１又は複数のホスホロチオエート結合がプローブに含まれていてもよい。当該オリゴヌクレオチドはまた、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において、副溝結合剤、挿入剤等を用いて修飾されることがある。
【００３７】
増幅反応のためのプライマーは、既知のアルゴリズムに従い設計される。当該プライマーは、標的核酸に隣接する配列、すなわち１又は複数の配列の変化の存在について分析される配列を含む核酸の領域、とハイブリダイズするよう設計される。しばしば、市販されているか特注のソフトウェアは、アニーリング温度が融解温度に近くなるようにプライマーを設計するアルゴリズムを使用する。増幅プライマーは、通常少なくとも１２塩基であり、より頻繁には約１５、１８、又は２０塩基の長さである。プライマーは、典型的には、特定の反応に参加する全てのプライマーが互いに５℃以内、最も好ましくは２℃以内の融解温度を有するように設計される。プライマーは更に、それ自身又は互いにプライミングするのを回避するべく設計される。プライマー濃度は、増幅配列の量の正確な評価を提供するように増幅される標的配列の量と結合するのに十分なものであるべきである。当業者は、プライマーの濃度の程度がプライマーの結合親和性並びに結合されるべき配列の量に従い変化することを認識するであろう。典型的なプライマー濃度は、０．０１μＭ〜１．０μＭであろう。プライマー濃度はまた、プローブ濃度に関して検討される。典型的に、プローブ濃度は両プライマーのものより過剰である。
【００３８】
増幅反応は、プライマーが標的配列の鋳型とハイブリダイズし、そしてポリメラーゼによって伸長される条件下でインキュベートされる。当業者が理解しているとおり、かかる反応条件は、注目の標的核酸及びプライマーの組成によって変化しうる。増幅反応サイクル条件は、プライマーが標的鋳型配列と特異的にハイブリダイズし、且つ伸長されるように選択される。標的鋳型と特異的にハイブリダイズするプライマーは、分析される試料中に存在しうる他の核酸と比較して優先的に標的配列を増幅させる。増幅サイクルの温度プロファイルは、経験的に決定することができる。
【００３９】
注目の核酸領域を増幅するプライマー対におけるプライマーの一方は、発光することなくクエンチャーがフルオロフォアの放出物を吸収するよう、クエンチャーと相互作用するフルオロフォアで標識される。フルオロフォアは、プライマー上で、合成しやすいように、例えばプライマーの３’末端から３〜６塩基内側に位置している。態様によっては、フルオロフォアは、それがプローブ上のクエンチャーによってクエンチングするために有効な範囲内である限り、プライマーの５’末端にあってもよい。
【００４０】
ハイブリダイゼーションプローブ
本発明に使用するためのプローブオリゴヌクレオチドは、任意の適当なサイズであってもよく、そしてしばしば約６〜約１００ヌクレオチド、より頻繁には約６〜約８０ヌクレオチド、そしてしばしば約１０〜約４０ヌクレオチドである。正確な配列及びオリゴヌクレオチドの長さは、これと結合する標的ポリヌクレオチドの性質に一部よる。かかる結合部位及び長さは、特定の態様にとって適切なアニーリング及び融解特性を達成するために変更してもよい。例えば、当該長さは、必要な分解能、プローブにとって所望の融解温度、及びプローブ内に取り込まれる修飾塩基又は置換塩基の数、によるであろう。典型的な融解曲線は、ミスマッチの場合、完全なマッチよりも低い融解温度を示す。かかる設計の選択のためのガイダンスは、多数の当業界で公知の刊行物で見られる。前記プローブは、標識されたプライマーの伸長産物と相補的である。
【００４１】
本発明において使用するためのプライマー及びプローブのセットを選択する際には多くのことが考慮される。例えば、典型的なプローブは、標識されたプライマーよりも高いＴｍを有する。これは、標識プライマーが伸長産物の一部であり、そして解離しない。従って、プローブは、少なくとも若干高いＴｍを持つことで、それが融解曲線分析のために実施される再アニーリング工程の間、新たに出現した鎖のハイブリダイゼーションを凌駕する("out-compete")。プライマー及びプローブのパラメーターを最適化する際に他に考慮することとして、増幅アッセイで使用されるポリメラーゼがある。例えば、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いた場合、プローブの幾つかは消化される；従って、プローブは、分析に影響を及ぼさないよう十分過剰量で存在している。置換ポリメラーゼを用いた場合、当該プローブは、しばしばそれほど過剰量である必要はない。
【００４２】
配列変異体の検出
本発明の方法は、典型的に、注目の核酸配列における配列多型、例えば一塩基置換、を検出するために使用される。評価される試料の核酸はＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。核酸試料がＲＮＡである場合、逆転写工程が通常用いられる。
【００４３】
ハイブリダイゼーションプローブによって標的にされる核酸配列は、配列変異を含むことが疑われる注目の領域である。配列変異は、ヌクレオチド置換、欠失又は付加を含むことがある。プローブ及び標的配列に特徴的な融解プロファイルにより、生じる種々の多型が区別される。本発明の方法は、プローブによって覆われた領域内の複数の多型の同定をもたらす。例えば、ＳＮＰによっては、極めて近くに、例えば互いに１０塩基以内に発生する。
【００４４】
従って、前記反応に使用するためのプローブは、注目の核酸の多型領域を標的とする。好ましい態様において、前記プローブは、多型領域を含むよう設計され、すなわち、当該プローブは多型部位を含んで成る。例えば、あるプローブは、特定の部位で多型である対立遺伝子を検出するよう設計されうる。当該プローブは、典型的には、多型である位置を含んで成るように、すなわち、多型部位で標的核酸配列とハイブリダイズするように設計される。当該プローブは、標的核酸と正確にマッチングしてもよく、あるいはミスマッチを有していてもよい。塩基ミスマッチが存在する場合、融点は、プローブが多型部位で標的ヌクレオチドとミスマッチする場合と比較してより低い。多型部位は、前記プローブの何れの位置にあってもよい。態様によっては、多型部位が中部３分の１以内に存在するように標的結合部位を選択して、全体的な安定性を増大させるのが望ましいこともある。
【００４５】
他の態様において、プローブは、検出される配列変異を含むアンプリコンの亜配列とハイブリダイズしなくてもよいが、配列変異の存在により、融解プロファイルの変化を尚も検出することができる。例えば、プローブは、配列変異の存在が当該プローブのＴｍを変化させるように変異部位に隣接している位置とハイブリダイズすることもある。プローブは、標識されたプライマーの位置に十分近い部位にハイブリダイズして、プライマーをクエンチングする。融解曲線分析の間、配列変異の存在は、当該配列変異から生じるプローブのＴｍの変化に起因する、融解曲線の変化を検出することで検出される。
【００４６】
しばしば、プローブはプライマーと比較して過剰に存在する。しかしながら、当業者が認識しているように、プローブとプライマーの量は、試験的な融解曲線分析を実施して、変異型対立遺伝子間の区別を最大限にすることで経験的に決定することができる。
【００４７】
プローブは、修飾塩基、例えばロック核酸(locked nucleic acid)（ＬＮＡ）、ペプチド−核酸、又は他の塩基置換を含んで成ることもある。典型的に、そのような置換塩基は、マッチ配列とミスマッチ配列とのＴｍの差異の区別を向上させるために利用される。
【００４８】
態様によっては、ロック核酸の修飾が利用される。ＬＮＡとは、二環及び三環のヌクレオシド及びヌクレオチドのアナログ、並びにそのようなアナログを含むオリゴヌクレオチドを指す。ＬＮＡ及び関連アナログの基本的な構造及び機能特性は、種々の刊行物及び特許、例えばＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ９８／３９３５２、米国特許第６，０４３，０６０号、及び米国特許第６，２６８，４９０号において開示されている。ロック核酸がクエンチャープローブにおいて使用される場合、クエンチャープローブは、アニーリング温度を増大させるために短くすることもできる。ＬＮＡはまた、ミスマッチを最大化して、それにより融解温度を増大させてマッチとミスマッチとを区別するように、多型部位の反対側に置くこともできる。
【００４９】
プローブが増幅反応の間に存在する場合、当該プローブに含まれる修飾塩基は、しばしば、それらが増幅の間プライマー伸長を停止させないように配置される。修飾塩基が伸長を停止させるのに応用される場合、修飾塩基は、しばしばプローブの３’末端方向に配置される。
【００５０】
標識
ハイブリダイゼーションプローブは、典型的に、本明細書に記載のクエンチング分子によってクエンチングすることができる蛍光分子で標識される。蛍光標識は当業界で周知である。蛍光標識の例には、限定しないが、Alexa Fluor色素(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660及びAlexa Fluor 680)、AMCA、AMCA- S、BODIPY色素 (BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODEPY 650/665)、カルボキシローダミン 6G、カルボキシ-X-ローダミン (ROX)、カスケードブルー、カスケードイエロー、シアニン色素(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、ダンシル、ダポキシル、ジアルキルアミノクーマリン、4', 5'-ジクロロ-2 ',7'-ジメトキシ-フルオレセイン、DM-NERF、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクーマリン、IRDyes (IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、リサミンローダミンＢ、マリーナブルー、メトキシクーマリン、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、PyMPO、ピレン、ローダミン 6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、 Rhodol Green、2 ', 4 ', 5 ', 7'-テトラ-ブロモスルホン-フルオレセイン、テトラメチル-ローダミン (TMR)、カルボキシテトラメチルローダミン (TAMRA)、テキサスレッド、及びテキサスレッド-Xが含まれる。
【００５１】
本発明のアッセイは、蛍光部分と協同してクエンチャーを利用するものである。クエンチャーには、蛍光標識に近接した位置にある場合に励起蛍光のエネルギーを吸収することができ、且つ可視光を発光することなくそのエネルギーを消散させることのできる任意の部分が含まれる。クエンチャーの例には、限定しないが、ＤＡＢＣＹＬ（4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシニミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシニミジルエステル（ＱＳＹ−７）、及び4 ',5'- ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシニミジルエステル（ＱＳＹ−３３）（全てMolecular Probes社から入手可能。一部は現在Invitrogen社の製品)、クエンチャール(quencherl) (Ql; Epoch社から入手可能)又はIowa Black（登録商標）クエンチャー(Integrated DNA Technologies)及び「ブラックホールクエンチャー」BHQ-1、BHQ-2及びBHQ-3 （BioSearch, Inc.から入手可能)が含まれる。
【００５２】
プローブ内に存在するクエンチャー標識は末端に存在してもよいが、必ずしもではない。例えば、クエンチャー部分は、プローブ（及びプライマー）が標的核酸にハイブリダイズする場合に、プライマー上の蛍光標識とクエンチャーが相互作用する限り、プローブの末端から少なくとも１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０、又はそれ以上のヌクレオチド離れていてもよい。典型的には、クエンチャーは、プライマーから３０ヌクレオチド以内にあるが、この距離は必須ではない。最大距離は、クエンチング作用の半径に依存して変化する。フルオロフォアとクエンチャーは、特定のプローブが、フルオロフォアで標識されたハイブリダイズ済みのプライマーの存在下標的核酸配列と結合する際蛍光強度が低下する場合に、相互作用したとみなされる。蛍光強度の低下は、典型的に、融解曲線におけるもとの温度又は最低温度と、参照未増幅曲線と比較した場合の増幅産物についてのピーク強度との間の少なくとも１０％の相対蛍光強度である。例えば、ピークの相対蛍光強度（ＲＦＩ）が５７℃で９８０ユニットである場合、曲線の開始についてのベースラインは典型的に８８２ＲＦＩ以内である。
【００５３】
塩基に連結している蛍光色素(fluor)とクエンチャーは当業界で容易に入手できる。それらは、例えば、Life Technologies (Gaithersburg, MD)、Sigma-Genosys (The Woodlands, TX)、Genset Corp. (La Jolla, CA)、Synthetic Genetics (San Diego, CA)、又はBiosearch Technologies (Novato, CA)から入手することができる。場合によって、塩基と連結している蛍光色素とクエンチャーは、塩基と連結した反応基を用いて合成されたオリゴヌクレオチドの翻訳後修飾によってオリゴヌクレオチド内に取り込まれる。蛍光色素又はクエンチャーは、糖又は塩基の３’ＯＨに結合することができる。
【００５４】
実務上の指針は、以下の刊行物：Pesce et al, Eds., Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et ah, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970)に例示されているとおり、特定のプライマー又はプローブにとって適切な蛍光色素又はクエンチャーを選択するための文献において入手可能なものである。前記刊行物はまた、蛍光及び発色分子並びにレポーター−クエンチャーの完全なリストを提供するものである（例えば、Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, Ed., Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992) Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949)を参照のこと）。更に、当該刊行物は、オリゴヌクレオチドに付加することができる一般的一般的な反応性基を介した共有結合のためのレポーター及びクエンチャー分子の誘導体化のための十分な指針を提供する（例えば、Haugland （上掲）；米国特許第3,996,345号; 及び米国特許第4,351,760号を参照のこと）。
【００５５】
プライマーの標識は、次の２つの条件を満たす限り、プライマー配列内の任意の位置であってよい：プライマー伸長が起こりうること、そして蛍光がクエンチングプローブのう有効なクエンチング範囲内であること。
【００５６】
融解曲線分析は、標準的な技術を用いて実施される。この方法において、クエンチャーで標識されたプローブが対立遺伝子とハイブリダイズする場合に、当該クエンチャーは、プライマー由来のシグナルをクエンチングする。蛍光は、増幅反応産物の温度が徐々に増大する間にモニタリングされる。プローブは、融解分析のための加熱の間に解離するので、クエンチャーはもはやプライマー上の標識をクエンチングせず、そして蛍光シグナルが生成する。融解曲線の中間点が決定されると、相当の温度がＴｍとして測定される。プローブがミスマッチの対立遺伝子とハイブリダイズする場合、プローブは、より低い温度で解離し、それにより融解曲線に変化が生じる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応の間に既に存在していてもよければ、後で加えられてもよい。典型的に、融解曲線分析において、標識済みのプライマーを含んで成る反応混合物中で生成する増幅産物は、１又は複数の所望の増幅サイクルに従い加熱され、冷却、例えば４０℃に冷却され、そしてゆっくり加熱され、典型的には約９５℃の温度に加熱される。クエンチャーを含んで成るオリゴヌクレオチドは、便宜的には増幅工程の開始時に添加されるが、融解分析が実施される前に、例えば増幅後の加熱段階に、添加してもよい。上述のとおり、プローブは、典型的にはプライマー配列よりも高いＴｍを有するように設計される。フォワードプライマーが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用する反応液中での増幅反応の間に伸長されると、当該５’−３’エキソヌクレアーゼ活性はプローブを消化し、そして当該プローブは標的ＤＮＡ鎖から放出されるであろう。この環境においては、フォワードプライマーに対してプローブが過剰に存在するはずである。過剰の量は、通常経験的に決定されるが、例えばリバース（蛍光標識）プライマーの濃度の二倍であってもよい。フォワードプライマーが標識されると、プローブは伸長産物に対しハイブリダイズし、そして単にプライマーよりもはっきりと過剰に存在する必要がある。当業者であれば理解するように、プローブとプライマーの量は反応を最適化するように経験的に決定することができる。
【００５８】
融解曲線の形状と位置は、ＧＣ／ＡＴ比、長さ、及び配列の関数であり、そして融解温度の僅かな増加によって分離される増幅産物を識別するために使用することができる。試験反応から得られる融解プロファイルは、典型的に、コントロールの融解プロファイルと比較される。コントロールの融解プロファイルは、既知の配列によって生成した参照融解曲線である。この配列は、例えば、野生型配列であってもよいが、別の既知の配列、例えば参照配列と他の配列との変化の間の融解プロファイルの差異を最大限にする人工コンストラクトであってもよい。
【００５９】
多重多型部位の検出
融解曲線の分析を使用することで、増幅反応、例えば多重増幅反応中で複数の標的核酸配列の存在を識別することができる。
【００６０】
本発明のｑ−プローブ反応は、多重分析、例えば、一反応容器中の多重変異体配列部位の評価、において容易に使用することができる。例えば、注目の標的核酸配列内の１つのＳＮＰは、１つの蛍光に相当することがあり（すなわち、ＳＮＰ部位を含む標的核酸は、プライマーの一方が特定の蛍光で標識されているプライマー対で増幅されている）、そして第二のＳＮＰは、第二の蛍光に相当し得る（すなわち、第二のＳＮＰを有する標的核酸は、プライマーの一方が第二の蛍光で標識されているプライマー対で増幅されている）。２つのＳＮＰ部位を検出するプローブは、クエンチャーで標識される。多数のＳＮＰは、２つの標識プライマーに相当する蛍光をモニタリングすることで検出される。
【００６１】
多重反応を利用することで、非重複標的領域で生じる注目の多重多型部位を評価することができる。他の態様では、同一のプライマー対によって増幅される領域において生じる多重多型部位を評価することができる。例えば、２つの標的領域を、非重複標的領域を増幅する２つのプライマーセットでアッセイすることができる。各プライマー対は、標識済みのプライマーと未標識のプライマーとを含んでもよい。各プライマーセットの標識プライマー上の標識は、適切なクエンチャーとマッチする。２つの異なる蛍光が使用され、そして１つの領域を問い合わせる各蛍光でモニタリングされる。
【００６２】
別の態様において、１つのプライマー対によって増幅される標的核酸アンプリコン内の２つの異なる領域がアッセイされる。例えば、２つのＳＮＰが、あるプローブにとって離れすぎているために両ＳＮＰを問い合わせることができない場合、あるいは、各ＳＮＰを別々に分析することが望ましい場合、一方はあるＳＮＰを標的とし、他方は第二ＳＮＰを標的としている２つのプローブは、共通のプライマーセットと一緒に使用することができる。２つのｑ−プローブは、反対の鎖とハイブリダイズする。２つのプローブ上に存在するクエンチャーは、適切な蛍光との適合性に依存して、異ならなくても異なっていてもよい。
【００６３】
キット
別の観点において、本発明はまた、１又は複数の多型の存在について標的核酸の分析を実施するためのキットも提供する。かかるキットは、注目の核酸配列を増幅するプライマー対であって、当該プライマーの一方が蛍光で標識されており、他方のプライマーが標識されていないもの；及びプライマー上の蛍光をクエンチングするクエンチャーで標識されているｑ−プローブ、を典型的に含んで成る。当該キットはまた、典型的には、前記プライマー／プローブを使用する際の説明書を含む。他の成分、例えばＰＣＲ試薬も任意に当該キットに含めることができる。
【００６４】
別の態様において、例えば、１つのアンプリコン内の２つの多型部位の存在を検出するために、キットは、プライマーがそれぞれ異なる蛍光で標識されている注目の領域を増幅するためのプライマー対と、各ｑ−プローブが前記の１つのアンプリコン内に存在する多型部位のうちの１つを検出するｑ−プローブとを含んで成ることもある。
【００６５】
従って、本発明はまた、標的配列を増幅させるプライマー対であって、一方のプライマーが蛍光標識で標識されており、且つ他方のプライマーが未標識であるもの；及び標的核酸配列とハイブリダイズするプローブであって、近接している場合にプライマー上の蛍光標識をクエンチングするクエンチャーで標識されているプローブ、を含んで成る反応混合物を含んで成る。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は二本鎖ＤＮＡについて提供するものである。しかしながら、ＲＮＡ核酸試料も同一の方法で評価することができる。
【００６７】
実施例１．１つの変異体部位の検出
典型的なＱ−融解(Q-melt)分析を以下実施する。図１は当該分析のためのプライマーとプローブの配置を示す。プライマー１（フルオロフォアで標識済み）が増幅反応の間伸長するにつれ、プライマー１はＳＮＰ部位を覆う。Ｑプローブは、蛍光(fluor)をクエンチングするクエンチャーを含む。当該Ｑプローブは、ＳＮＰ部位を含む亜配列を標的とし、すなわち、当該亜配列とハイブリダイズするよう設計されている。ＰＣＲの間、Ｑプローブは、未標識プライマーであるプライマー２を伸長するＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって開裂する。従って、この例においては、過剰のＱプローブが反応混合物に含まれている。Ｑプローブを開裂しないであろう置換ポリメラーゼ酵素も使用されうる。
【００６８】
増幅サイクルの後、増幅されたＤＮＡ、プライマー、及びプローブを含む反応混合物を温度勾配にかける。低温、例えば５０℃から出発すると、標識されたプライマーの全て又はほとんどが、増幅ＤＮＡ中に取り込まれ、その結果、ハイブリダイズしたＱプローブ付近に、すなわちクエンチングする距離で存在する。そのため、全体的にわずかな蛍光が見られる。温度が増大するにつれ、Ｑプローブは、伸長した標的のＤＮＡ鎖から解離し、そして蛍光が増大する。融解温度は、塩基のマッチ又はミスマッチの特性を示す。標的とされた多型部位での標的核酸内のミスマッチしたヌクレオチドの存在は、ミスマッチした配列がより低いＴｍを有するように融解曲線をシフトさせる。ミスマッチから生じるシフトを示す融解曲線の概略図を図２に示す。
【００６９】
態様によっては、Ｑプローブは、複数の多型部位に広がっている。従って、特徴的な融解プロファイルは、多型部位のいずれか又はその両方について得ることができる。
【００７０】
実施例２．多重部位の分析
血色素症に関与するＨＦＥ遺伝子は、注目すべき３つのＳＮＰ部位：Ｃ２８２Ｙ、Ｈ６３Ｄ、及びＳ６５Ｃを有する。実施例１で述べたとおり、近接している当該部位（Ｈ６３Ｄ及びＳ６５Ｃ）は、１つのプローブを用いて評価することができる。しかしながら、多くの場合において、Ｓ６５ＣにあるＳＮＰを、すぐ近くのＨ６３Ｄと切り離して試験するのが望ましい。図３のスキームは、１つのＱプローブを用いた、２つの隣接したＳＮＰ部位の分析のためのプローブとプライマーの配置を示す。図４で図解されたスキームは、ＳＮＰ検出のための、独立したＱ−融解プローブ分析を示す。
【００７１】
別個のＱ−プローブを利用することで、同一のプライマーセットによって増幅される２つのＳＮＰ部位が検出される分析において、各ＳＮＰプローブにつき１つのフルオロフォアが用いられる。融解曲線を使用することで、種々の多型（ｗｔ又は突然変異体）の存在が決定される。図４は、かかる分析のためのアレンジメントを表す。Ｑ−プローブは、反対の鎖とハイブリダイズするよう設計される。当該プローブは互いに重複してもよく、それにより、例えば必要に応じて安定性が増大され、又は必要な融解曲線の解像度が提供される。この配置はしばしば、ＳＮＰ部位が互いに近い場合に、例えば、約１０塩基未満離れている場合に利用される。遺伝性ヘモクロマトーシス遺伝子のＨ６３Ｄ及びＳ６５Ｃ部位を評価する例において、ＳＮＰは５塩基離れており、そして反対の鎖に対するプローブが使用される。
【００７２】
同一のプライマーセットによって増幅される領域内で２つのＱ−プローブを用いるＳＮＰ分析は、ＳＮＰ標的領域に対するプローブの効率的なハイブリダイゼーションを必要とする。修飾塩基を使用することもでき、例えばそれにより融解温度をアッセイの機能的範囲内に調節することができる。この例においては、両プローブは典型的にプライマーよりも高いＴｍを有しており、そして互いに数℃、例えば５℃以内のＴｍを有している。
【００７３】
本願明細書で引用されている全ての刊行物、特許、アクセッション番号、及び特許出願は、個々の刊行物が引用により援用されることを具体的且つ個別に示されている場合のように、本明細書で援用される。
【００７４】
前述した発明は、実例として、理解を明確にするための例として多少詳細に説明してあるが、当業者にとっては、本発明の教示に照らし、本発明の精神又は範囲を逸脱することなくある程度の変更及び修正が本発明になされ得ることは容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、１つのＳＮＰ部位の分析のためのプライマーとプローブの配置の概略図を提供する。
【図２】図２は、参照標的とマッチした配列及びミスマッチした配列の蛍光プロファイルの図を提供する。
【図３】図３は、１つのプローブで２つのＳＮＰ部位を分析するためのプローブとプライマーの配置を表している。
【図４】図４は、同一アンプリコン内の２つのＳＮＰ部位の独立した融解曲線分析のプローブとプライマーの配置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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