(57)【要約】【課題】本発明は、インビトロで培養された細胞個体群における標的組織型に対する薬理学的効果の迅速な決定のための系を提供する。【解決手段】細胞は、スクリーニングされている作用物質により引き起こされる毒物学的又は代謝的変化を反映するプロモーター−レポーター構築物を含有する。プロモーターは、細胞の代謝状態に従って上方又は下方制御されることが知られている遺伝子から取られ、プロモーター活性をモニタリングするために、外部シグナルを提供するレポーター遺伝子に結合している。プロモーター−レポーター細胞は、ヒト胚幹細胞株の中にこれらの遺伝子改変を配置し、細胞を所望の任意の程度に増大し、次に細胞を所望の細胞型に分化することによって産生することができる。本開示は、本発明のプロモーター−レポーター細胞の幾つかの強力な特徴を説明し、当業者が本発明を医薬開発及び試験のために、又は移植片の生存度をモニタリングするために使用できる多様な方法を示す。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている細胞を含む、未分化ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の個体群又はそれらから分化した細胞の個体群。
【請求項２】
実質的に未分化ｈＥＳ細胞の個体群である、請求項１記載の細胞個体群。
【請求項３】
神経細胞、心筋細胞又は肝細胞の細胞系である、請求項１記載の細胞個体群。
【請求項４】
細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている細胞を含む、非癌由来ヒト肝細胞個体群。
【請求項５】
ｈＥＳ細胞の分化により得られる、請求項４記載の肝細胞個体群。
【請求項６】
前記プロモーターがアポトーシスに反応する、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項７】
前記プロモーターが、ＰＵＭＡ遺伝子のためのプロモーターである、請求項６記載の細胞個体群。
【請求項８】
前記プロモーターがＤＮＡ損傷に反応する、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項９】
前記プロモーターが、ｐ２１  ＯＲ  ｐ２１／ＷＡＦ１遺伝子のためのプロモーターである、請求項８記載の細胞個体群。
【請求項１０】
前記プロモーターが過形成に反応する、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項１１】
前記プロモーターが、Ｋｉ−６７遺伝子のためのプロモーターである、請求項１０記載の細胞個体群。
【請求項１２】
前記プロモーターが酸化ストレスに反応する、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項１３】
前記プロモーターが、ヘムオキシゲナーゼ１、スーパーオキシドジスムターゼ、γ−グルタミルシステイニルリガーゼ又はメタロチオニン遺伝子のためのプロモーターである、請求項１２記載の細胞個体群。
【請求項１４】
前記プロモーターが、細胞における代謝的又は毒物学的変化を反映する転写因子のためのプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項１５】
前記プロモーターが、ＰＸＲ、ＣＡＲ、アリール炭化水素レセプター（ＡｈＲ）又はＮｒｆ２遺伝子のためのプロモーターである、請求項１４記載の細胞個体群。
【請求項１６】
前記プロモーターが、アンドロゲン、エストロゲン又はｐＰＡＧ反応性遺伝子のためのプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項１７】
前記プロモーターが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のためのプロモーターである、請求項１６記載の細胞個体群。
【請求項１８】
前記プロモーターが、チトクロームＰ４５０酵素のためのプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項１９】
前記プロモーターが、ＣＹＰ３Ａ４又はＣＹＰ１Ａ１のためのプロモーターである、請求項１８記載の細胞個体群。
【請求項２０】
前記プロモーターが、薬剤トランスポーター遺伝子のためのプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項２１】
前記遺伝子がＭＤＲ１である、請求項２０記載の細胞個体群。
【請求項２２】
前記プロモーターが、心臓の収縮速度又はＱＴ間隔に影響を与える遺伝子のためのプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項２３】
前記プロモーターが、カルシウム流遺伝子のためのプロモーターである、請求項２２記載の細胞個体群。
【請求項２４】
前記レポーター遺伝子が、発現するときに蛍光又はリン光シグナルを生じるタンパク質をコードする、請求項１〜２３のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項２５】
前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質のアイソフォームである、請求項２４記載の細胞個体群。
【請求項２６】
前記プロモーター及び前記レポーター遺伝子の両方が、細胞個体群に対して異種である、請求項１〜２５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項２７】
異種レポーター遺伝子が、内在性プロモーターの制御下におかれる、請求項１〜２５のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項２８】
組織特異的な第２プロモーターが第２レポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている、請求項１〜２８のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項２９】
前記第２プロモーターが、アルブミン、α１−アンチトリプシン、α−フェトプロテイン、γ−グルタミルトランペプチダーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、カタラーゼ及びモノオキシゲナーゼから選択される肝細胞特異的マーカーのためのプロモーターである、請求項２８記載の細胞個体群。
【請求項３０】
内在性薬剤標的又は代謝酵素の変種をコードする遺伝子を発現するように遺伝子改変されている、請求項１〜２９のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項３１】
前記変種が、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ又はチオプリンメチルトランスフェラーゼの対立変種である、請求項３０記載の細胞個体群。
【請求項３２】
異なる細胞が、同じ薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種を発現するように遺伝子改変されている、請求項３０又は３１記載の細胞個体群。
【請求項３３】
薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種を有する細胞が、異なるレポーター遺伝子に連鎖するプロモーターも含有する、請求項３２記載の細胞個体群。
【請求項３４】
前記細胞の少なくとも２０％が、以下の肝細胞系の特徴：
・α1−アンチトリプシン（ＡＡＴ）の抗体検出可能発現：
・アルブミンの抗体検出可能発現；及び
・グルコース−６−ホスファターゼ活性の証拠
を有する、請求項１、３〜２１及び２３〜３３のいずれか１項記載の細胞個体群。
【請求項３５】
ｈＥＳ細胞株から請求項１及び３〜３４のいずれか１項記載の分化細胞個体群を産生する方法であって、
ａ）前記ｈＥＳ細胞株からの遺伝子改変細胞と、その結果の、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御する産生ｈＥＳ細胞；
ｂ）前記遺伝子改変ｈＥＳ細胞を繁殖させて、遺伝子改変ｈＥＳ細胞個体群を形成すること；次に、
ｃ）前記遺伝子改変ｈＥＳ細胞個体群を分化して、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御する遺伝子改変分化細胞の個体群にすること
を含む方法。
【請求項３６】
ｃ）が、前記ｈＥＳ細胞個体群を神経細胞、心筋細胞又は肝細胞の細胞系の個体群に分化することを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ｃ）が、内胚葉細胞の個体群を形成し、次に、更に、内胚葉細胞を肝細胞に分化することを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
より多くの前記プロモーター−レポーター細胞を産生するために、前記プロモーター−レポーター細胞個体群を誘導するのに使用される同じ株からの未分化ｈＥＳ細胞と合わせて、請求項１及び３〜３４のいずれか１項記載の分化細胞個体群を含む、プロモーター−レポーター細胞を産生又は維持する系又はキット。
【請求項３９】
薬剤を試験する方法であって、薬剤を請求項１〜３４のいずれか１項記載の細胞個体群と組み合わせること、及び前記細胞における前記レポーター遺伝子の発現がそれによって影響をうけるかを決定することを含む方法。
【請求項４０】
前記薬剤が、前記レポーター遺伝子の実質的な上方制御を引き起こさないので、更なる開発のために選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記薬剤が、別個のストレス誘発化合物又は培養条件の存在により引き起こされる細胞における前記レポーター遺伝子の発現を防止又は低下させるので、更なる開発のために選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
薬剤を試験する方法であって、前記薬剤を請求項２８又は請求項２９記載の細胞個体群と組み合わせること、及び前記第２レポーター遺伝子を発現する細胞において前記第１レポーター遺伝子の発現に変化があるかを決定することを含む方法。
【請求項４３】
薬剤を試験する方法であって、前記薬剤を薬剤標的又は薬剤代謝酵素のためにＲＮＡｉの存在下又は不在下で請求項１〜３４のいずれか１項記載の細胞個体群と組み合わせること、及び前記ＲＮＡｉを伴うか又は伴わない前記薬剤の存在下で前記レポーター遺伝子の発現に違いがあるかを決定することを含む方法。
【請求項４４】
請求項１〜３４のいずれか１項記載の細胞個体群を含む、請求項４０又は４１記載の方法による薬剤試験用の系又はキット。
【請求項４５】
細胞においてレポーター遺伝子の発現を変化させることが知られている化合物を更に含む、請求項４４記載の系又はキット。
【請求項４６】
同じゲノムを共有しているが、代謝又は毒物学的変化に反応する異なるプロモーターがそれぞれの細胞個体群においてレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている複数個の細胞個体群を含む、請求項４４又は請求項４５記載の系又はキット。
【請求項４７】
同じゲノムを共有しているが、異なる組織の細胞に分化している複数個の細胞個体群を含む、請求項４４〜４６記載の系又はキット。
【請求項４８】
同じゲノムを共有しているが、薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種を有する請求項１〜３０のいずれか１項に記載された複数個の細胞個体群を含む、薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種に対する薬剤の効果を決定するための系又はキット。
【請求項４９】
前記変種が、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ又はチオプリンメチルトランスフェラーゼの対立変種である、請求項４８記載の系又はキット。
【請求項５０】
請求項１〜３４のいずれか１項記載の細胞個体群と、薬剤標的又は代謝酵素をコードする遺伝子のためのＲＮＡｉとを含み、請求項４３記載の方法により薬剤標的を確認するための系又はキット。
【請求項５１】
請求項１〜３４のいずれか１項記載のプロモーター−レポーター構築物を有する細胞を含有する、移植のために調製され、被験体への移植後のモニタリングのために適合された単離組織。
【請求項５２】
前記プロモーター−レポーター細胞個体群における前記レポーター遺伝子が、分泌性レポーターをコードする、請求項５１記載の単離組織。
【請求項５３】
前記分泌性レポーターがヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）である、請求項５２記載の単離組織。
【請求項５４】
被験体への移植後に、請求項５１〜５３のいずれか１項記載のプロモーター−レポーター細胞個体群を含有する組織同種移植片を評価する方法であって、移植片における前記レポーター遺伝子の発現をモニタリングすることを含む方法。
【請求項５５】
本明細書に記載される、前記細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている細胞を含む、細胞個体群。
【請求項５６】
本明細書に記載される、プロモーター−レポーター細胞を使用する、薬剤試験又は標的確認の方法。
【請求項５７】
本明細書に記載される、プロモーター−レポーター細胞を含む、薬剤試験又は標的確認のための系又はキット。
【請求項５８】
本明細書に記載される、移植のために調製され、被験体への移植後のモニタリングのために適合された単離組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先の出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６９３，３１９号（案件番号１４０／００１ｘ）、２００５年６月２２日出願及び米国仮特許出願第６０／７１９，８４３号、２００５年９月２２日出願（案件番号１４０／００２ｘ）の優先権利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
医薬の開発において満たされていない主要な要求は、薬剤化合物の代謝的及び毒物学的特性を決定するための信頼性のある入手可能で費用効果の高い予測的なモデルである。初代肝細胞のような現行のインビトロモデルは、一貫しない入手可能性及び著しく多様な表現型が難点である。インビボ動物モデルは、法外に高価であり、処理量が低く、多くの場合にヒトにとっては予測的ではない。
【０００３】
その結果、化合物の代謝的及び毒物学的特性は、多くの場合、前臨床開発の後期になるまで研究されず、製薬会社は、これらの最も重要な試験についての情報が不在のままで化合物の開発に膨大な資源を投資することを必要とされる。残念なことに、後期の前臨床動物試験で得られる結果は、多くの場合、初期ヒト試験において後に見られる問題を予測することに失敗し、第１相試験において志願者に対する高い失敗率及び高い危険性をもたらす。
【０００４】
ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞（米国特許第６，２００，８０６号）は、この要求に対処する特有の機会を提供する。未分化ｈＥＳＣは、培養において実質的に無限の解説能力を有する。最近の開発は、商業的な量での未分化細胞の経済的に実現可能な産生を可能にする。例えば、米国特許第６，８００，４８０号；ＷＯ０１／５１６１６；ＷＯ０３／０２０９２０；Rosier et al., Dev Dyn. 2004;229(2):259-74; Xu et al., Stem Cells 2005;23(3):315-23及びLi et al., "Expansion of human embryonic stem cells", Biotechnology and Bioengineering, Published Online: 21 Jun 2005を参照すること。
【０００５】
Geron社は、以前、ｈＥＳ細胞を、集団として特定の表現型の細胞に分化するようにし、再現可能な基準で高品質の細胞個体群を生成できることを示した。例えば、米国特許第６，４５８，５８９号及び同第６，５０６，５７４号；ＷＯ０１／８１５４９；Rambhatla et al., Cell Transplant. 2003;12(1):1-11;並びにＵＳ２００５／００３７４９３  Ａ１は、肝細胞の細胞系を生成する手順を記載している。ｈＥＳ細胞を使用して、薬剤スクリーニング産業にとって特に興味深い他の細胞型を生成することができる。
【０００６】
本開示は、ｈＥＳ細胞及びそれらの誘導体の特異的性質の幾つかを利用して、薬理学的及び毒物学的効果の迅速な読み取りをもたらす遺伝子修飾細胞を提供する。
【発明の開示】
【０００７】
本開示は、インビボにおける同じ組織型に対する効果をスクリーニングされている薬剤の存在のような培養環境における変化を報告する細胞を使用する、薬剤及び環境のスクリーニング及び分析のための新たな系を提供する。
【０００８】
本発明の一つの態様は、プロモーター−レポーター系を含有する未分化ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞、肝細胞様細胞又はｈＥＳ由来細胞産物である。細胞は、細胞における代謝的及び毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように遺伝子改変されている。適切な部類のプロモーター及びレポーター遺伝子は、それぞれの例と共に以下のセクションで提示されている。
【０００９】
例示的な分化細胞型は、神経細胞、心筋細胞又は肝細胞系を表し、そのような細胞の特徴的なマーカーを有する。ユーザーは、細胞個体群を全体として調べることによって、特定の細胞個体分がｈＥＳ由来であることを決定することができる。調製物における他の細胞型の特徴が、ｈＥＳ由来細胞を他の供給源から得られた細胞と区別することになる。本発明の分化細胞は、混合個体群内で特定の細胞型を同定するために第２プロモーター−レポーター系を含有することもできる。
【００１０】
本発明の別の態様は、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターがレポーター遺伝子の発現を制御するように未分化ｈＥＳ細胞を遺伝子改変することによって、プロモーター−レポーター系により分化細胞個体群を産生する方法である。次に細胞を、繁殖及び分化させて、ユーザーの目的の特定の細胞型にする。
【００１１】
本発明の別の態様は、薬剤を本発明のプロモーター−レポーター細胞個体群と合わせ、ユーザーが、レポーター遺伝子の発現に変化があるかを決定する、薬剤を試験する方法である。薬剤は、毒性若しくは望ましくない代謝効果を誘発しないため、望ましい代謝効果を誘発することを助けるため、又は別の化合物若しくは培養条件の望ましくない代謝効果に対して保護的であるために、更なる開発又は調査に適していると同定することができる。レポーター発現は、細胞個体群を全体として、又は組織特異的プロモーターの制御下で第２レポーター遺伝子によりマークされた特定の細胞において測定することができる。薬剤の代謝に関わっていると考えられる薬剤標的又は酵素は、ＲＮＡｉを使用して確認することができる。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明のプロモーター−レポーター細胞を、場合により、同じｈＥＳ細胞株由来であり、同じゲノムを共有している１つ以上の他の細胞個体群と組み合わせて含む、キット又は試薬の組み合わせである。マッチした細胞個体群は、異なるプロモーター−レポーター系、別の細胞型に分化した細胞、又は薬剤標的若しくは薬剤代謝系の対立変種を有する細胞を含有することができる。
【００１３】
本発明の別の態様は、移植片の生存をモニタリングする系である。単離組織は、組織中の少なくとも一部の細胞をプロモーター−レポーター構築物により遺伝子改変することによって、移植用に適合される。プロモーターは、酸化ストレス又はアポトーシスに反応することができ、これは、細胞生存度又は移植片拒絶を反映することができる。レポーターは、細胞から分泌され、可能であれば腎臓により排出されうる産物をコードし、移植片の状態を血液又は尿の中で追跡すること可能にする。
【００１４】
本発明のこれらの及び他の実施態様は、以下のセクションで記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、インビトロで培養された細胞個体群における標的組織型に対する薬理学的効果の迅速な決定のための系を提供する。細胞は、培地に存在する薬剤候補により引き起こされうるような細胞における毒物学的又は代謝的変化を反映する、プロモーター−レポーター構築物を含有する。プロモーターは、特定の毒物学的又は他の代謝的効果が細胞において生じるときに、上方制御されていることが知られている遺伝子から取られる。それは、プロモーター活性の指標としてモニタリングすることができる外部シグナルを提供するレポーター遺伝子の転写を制御する。この系は、細胞に対する潜在的な毒性及び他の代謝効果について、一団の試験作用物質の迅速なハイスループットスクリーニングを可能にする。
【００１６】
本発明の多くの態様は、ヒト胚幹細胞の特定の特性を利用する。とりわけ下記である：
・ｈＥＳ細胞は、同じゲノム及び再現可能な表現型を有する分化細胞の実質的に無制限の供給を提供することができ、一貫した産生及び再現可能なスクリーニングアッセイを可能にする。
【００１７】
・ｈＥＳ細胞を供給源として使用すると、プロモーター−レポーター系が、肝細胞のような、本来であれば限定された複製能力のために遺伝子修飾されにくい非癌由来細胞型の中に構築されることを可能にする。
【００１８】
・同じ細胞株に対して多重修飾を行う能力は、高度な二重標識系の開発を可能にし、それによって、多重代謝効果を、必要であれば混合個体群において細胞毎に同時に追跡することができる。
【００１９】
・ｈＥＳ細胞を異なる細胞系に向かわせる能力は、異なる組織に対する化合物の効果をインビトロで全て測定することができる、マッチした細胞個体群の開発を可能にする。
【００２０】
・ｈＥＳ細胞を使用して、ＣＹＰ２Ｄ６のような重要な薬剤代謝酵素の変種を除いて、遺伝子的に同一である異なる株を作り出すことができるか、又はユーザーが、変種依存的である薬剤の効果を決定することができるＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）のような薬剤標的を作り出すことができる。
【００２１】
上述の記載及びそれに続く実施例は、本発明のプロモーター−レポーター細胞の幾つかの強力な特徴を示し、読み手が、医薬開発及び試験に関する、並びにヒトの臨床治療における多様な目的のためにこれらをどのように使用できるかを説明する。
定義
プロトタイプ「霊長類多機能幹細胞」（ｐＰＳ細胞）は、受精後の任意の時点での前期胚子、胚又は胎児組織由来の多機能細胞であり、標準的な技術の許容される試験によって決定されるように、それぞれ３つの胚葉：内胚葉、中胚葉及び外胚葉を表す子孫を適切な条件下で産生することができる特徴、例えば、適切な宿主において奇形腫を形成する能力、又は培養中の３つの胚葉の全ての組織型を表すマーカーにより染色可能な細胞に分化する能力を有する。
【００２２】
プロトタイプ「ヒト胚幹細胞」（ｈＥＳ細胞）は、Thomsonらにより記載されている（Science 282:1145, 1998；米国特許第６，２００，８０６号）。用語の範囲は、胚盤胞の段階又は細胞が３つの胚葉に実質的に分化する前にヒト胚から誘導される多機能幹細胞を網羅する。特に明確に必要とされる以外、用語には、ｈＥＳ細胞の表現型の特性を有する初代組織及び樹立株、並びに３つの胚葉のそれぞれの子孫を産生する能力を依然として有するそのような株の子孫が含まれる。ｈＥＳ細胞及びそれらの誘導体の操作及び使用に対する本記載における参照は、特に禁止されない限り、他のｐＰＳ細胞に準用して適用可能であることが理解される。
【００２３】
ｐＰＳ及びｈＥＳ細胞培養は、個体群における幹細胞及びそれらの誘導体の相当な割合が、未分化細胞の形態学的特性を示し、３つの胚葉の全てに分化する能力を維持する場合に、「未分化」であると記載される。未分化細胞のコロニーは、多くの場合、分化している隣接細胞で囲まれている。それにもかかわらず、未分化コロニーは、未分化細胞が細胞個体群の相当な割合を構成するように、適切な条件下で培養又は継代される場合に持続する。「分化」細胞は、細胞が、典型的には形態学的変化を伴って、３つの胚葉の全てに分化する能力を失うような方法で培養又は維持されている。例示的な分化細胞は、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、島細胞及び造血細胞のような特定の組織型の特徴を有する。
【００２４】
「プロモーター」は、それが結合している遺伝子のコード領域の転写を開始することに関わるＤＮＡ配列である。これは、遺伝子の構成的発現を引き起こすことができるか、組織特異的な方法で上方制御されることができるか、又は代謝若しくは毒物効果に反応して上方制御されることができる。特定の特異性を有するプロモーターを使用する本発明の実施態様は、それが結合しているプロモーターの特異性を制御するエンハンサーのような、同じ特異性を有する他の転写制御エレメントの組み合わせに準じて同等である。
【００２５】
「レポーター遺伝子」は、細胞で発現すると、蛍光若しくはリン光シグナル、アッセイにおいて検出可能なタンパク質若しくは酵素活性、又は、特定の染料、抗体若しくはレクチンにより細胞上若しくは中で検出可能な抗原のような検出可能な標識を細胞に提示させる任意の核酸配列である。
【００２６】
遺伝子エレメントは、構造的な関係において、それらの予測される機能に従って操作することが可能である場合に、「機能的に結合」している。プロモーターは、プロモーターがコード領域の転写を駆動する場合に、コード領域に機能的に結合している。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターとコード領域の間に介在配列があってもよい。
【００２７】
細胞は、ポリヌクレオチドが任意の適切な人為的操作により細胞の中へ移動される場合、又は細胞がポリヌクレオチドを遺伝している原型的に改変された細胞の子孫である場合、「遺伝子改変」又は「形質移入」されたと言われる。遺伝子改変は、７世代目の細胞におけるポリヌクレオチドの鋳型の存在により検出可能である、細胞培養の少なくとも４継代を通して遺伝される場合、「安定」していると言われる。細胞ゲノムの改変（導入遺伝子の挿入又は内在遺伝子の不活性化）は、通常、安定している。遺伝子改変は、細胞の複製又は培養の延長により希薄化される場合、「一過性」であると言われる。これには、アデノウイルスベクター又はプラスミドによる一過性形質移入が含まれる。
【００２８】
「発現系」は、制御エレメントがコード領域の発現を駆動するように、コード領域に機能的に結合している制御エレメントである。
【００２９】
「プロモーター−レポーター構築物」は、細胞の内側又は外側の組み換えポリヌクレオチドであり、プロモーターがレポーター遺伝子に機能的に結合している。「プロモーターレポーター細胞」は、プロモーターレポーター構築物を含有するように（安定的に又は一過的に）遺伝子改変されている細胞であり、その中で、プロモーターを活性化する化合物が、細胞においてレポーター遺伝子の発現を引き起こす。
【００３０】
「細胞株」は、表現型が実質的に変化することなく少なくとも１０継代を通して培養中に繁殖することができる細胞の個体群である。個体群は、表現型的に同質であることができるか、又は個体群は、適度に異なる表現型の混合物であることができる。細胞株の特徴は、概して、１０継代後に実質的に未改変である個体群としての特徴である。
【００３１】
本発明の細胞株は、典型的には「非癌由来」である。これは、これらが癌細胞由来でないか又は腫瘍遺伝子により形質導入されていないこと、及び癌由来細胞の遺伝的及び表現型の特徴を欠いていることを意味する。
【００３２】
本開示で使用されるとき、用語「薬剤標的」は、目的の特定薬剤の薬理学的効果（例えば、意図される治療効果又は副作用）を仲介する、細胞又は組織における生物学的分子又は生化学的経路を意味する。医薬効果は、薬剤標的への薬剤の直接的な結合の結果生じることができるが、必ずしもその必要はない。
【００３３】
本開示で使用されるとき、用語「薬剤代謝酵素」は、薬剤又は薬剤の部類を化学的に改変するか又は隔離させる、細胞上の又は細胞に結合している任意のタンパク質又は核タンパク質を意味する。特に明確な指示のない限り、この用語には、化学的分解、接合、別の化合物への変換、又は別の細胞間若しくは細胞内空間への輸送が、このことが薬剤の排除又はその効果の実質的な変更をもたらす限り含まれる。
【００３４】
＜一般的な参考文献＞
細胞生物学、タンパク質化学及び抗体技術における一般的な方法は、Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J.S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) および Current protocols in Immunology (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons.)において見出すことができる。本開示において参照される試薬、クローニングベクター及び遺伝子操作用のキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen及びClonTechのような商業的供給者から入手可能である。
【００３５】
細胞の培養方法は、一般に、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (R.I. Freshney ed., Wiley & Sons); General Techniques of Cell Culture (M.A. Harrison & I. F. Rae, Cambridge Univ. Press)及びEmbryonic Stem Cells: Methods and Protocols (K. Turksen ed., Humana Press)の最新版において記載されている。組織培養供給物及び試薬は、Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.,及びICN Biomedicalsのような商業的供給者から入手可能である。
【００３６】
興味深い特別の参考図書には、The Hepatocyte Review, M.N. Berry & A.M. Edwards Eds., Kluwer Academic Publishers, 2000; Stem Cell and Liver Regeneration, Kiwamu Okita, Springer-Verlag 2004;及びThe Reporter's Handbook, S. Weinberg et al., St. Martin's Press 1995が挙げられる。薬剤スクリーニング及び評価についての参考文献には、 Handbook of Drug Screening, R. Seethala & P.B. Fernandes Eds., Marcel Dekker, 2001; Bioassay Techniques for Drug Development, Atta-Ur-Rahman et al., Taylor & Francis, 2001;及びCytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry, P.R. Ortiz de Montellano, Kluwer Academic/Plenum, 2005が挙げられる。
【００３７】
＜幹細胞の供給源＞
本発明は、多様な型の幹細胞を使用して実施することができる。本発明の多くの態様での使用に適切なものは、必要とされる定義を満たした、任意のヒト又は他の霊長類の組織由来の多機能幹細胞である。非限定例は、ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の初代培養又は樹立株である。
【００３８】
＜胚幹細胞＞
胚幹細胞は、霊長類種の胚盤胞から単離することができる（米国特許第５，８４３，７８０号; Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995）。ｈＥＳ細胞は、Thomsonら（米国特許第６，２００，８０６号； Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133, 1998）により、Reubinoffらによる、Nature Biotech. 18:399, 2000において、及び、Genbacevらによる、Fertil Steril. 2005;83(5): 1517-29において記載されている技術を使用してヒト胚盤胞から調製することができる。ｈＥＳ細胞と同等の細胞型には、ＷＯ０１／５１６１０（Bresagen）に概説されている、原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞のようなそれらの多機能誘導体が含まれる。また同等のものは、ｈＥＳ細胞との融合により多機能幹細胞に再プログラムされた細胞である。
【００３９】
繁殖を促進するが分化を抑制する培養条件を使用して、ｈＥＳ細胞を繁殖させることができる。伝統的には、ｈＥＳ細胞は、フィーダー細胞の層、典型的には胚又は胎児組織由来の線維芽細胞の層で培養される（Thomson et al., Science 282:1145, 1998）。
【００４０】
ｈＥＳ細胞を、特別に設計した培養環境においてフィーダー細胞なしに未分化状態に維持することもできる。フィーダーなしの培養は、多くの場合、Matrigel（登録商標）又はラミニンのような細胞外マトリックスを含む。培養は、未分化形態の細胞の繁殖を促進する因子を含有する栄養培地により支持されている（ＷＯ９９／２０７４１）。そのような因子は、培地を、照射済み初代マウス胚線維芽細胞、テロメア化マウス線維芽細胞又はｈＥＳ細胞由来の線維芽細胞様細胞のような、そのような因子を分泌する細胞を伴って培養することによって培地に導入することができる（米国特許第６，６４２，０４８号；米国特許第６，８００，４８０号；ＷＯ０１／５１６１６；Xu et al., Nat. Biotechnol. 19:971, 2001）。
【００４１】
あるいは、未分化形態の細胞の繁殖を促進する（線維芽細胞増殖因子又はフォルスコリンのような）因子を直接添加することにより補充される場合、新たな非調整培地を使用することができる。例は、４０〜８０ng/mLのｂＦＧＦで補充され、場合により幹細胞因子、Ｆｌｔ３リガンド、ＴＧＦβ１又はＴＧＦβ２を含有する、X-VIVO（商標）10（Biowhittaker）又はQBSF（商標）-60（Quality Biological Inc.）のような基本培地である。これらの培地配合物は、他の培養系よりも２〜３倍の速度で細胞増殖を支持するので有利である（ＷＯ０３／０２０９２０；Li et al., Biotechnol. Bioeng. 91:688, 2005）。
【００４２】
顕微鏡下では、ＥＳ細胞は、高い核／細胞質比、顕著な核小体、及び細胞間結合の識別があまりできない緻密なコロニー形成を有するように見える。霊長類のＥＳ細胞は、典型的には、時期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４を発現し、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１に設計された抗体を使用して検出可能なマーカーを発現する。未分化ｈＥＳ細胞は、典型的には、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、転写因子Ｏｃｔ−３／４、Ｃｒｉｐｔｏ及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）も発現する（ＵＳ２００３／０２２４４１１Ａ１）。
【００４３】
＜他の幹細胞＞
実施例セクションに提供されている説明は、ｈＥＳ細胞による処理に続く。しかし、それ以外に必要な場合を除いて、本発明は、ヒト、非ヒト霊長類及び他の非ヒト哺乳動物からの多機能幹細胞を含む、任意の脊椎動物種の多能性細胞を使用して実施することができる。
【００４４】
本発明の実施は、本発明の実施のためのｈＥＳ又は胚幹細胞を産生するために、ヒト胚盤胞を脱凝集させることを必要とはしない。ｈＥＳ細胞は、公共の供託所から入手可能な樹立株から得ることができる（例えば、the WiCeII Research Institute, Madison Wl U.S.A.又はthe American Type Culture Collection, Manassas VA, U.S.A.）。ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞は、Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:13726, 1998及び米国特許第６，０９０，６２２号に記載されているように、原始生殖細胞から調製することができる。米国特許公報第２００３／０１１３９１０Ａ１号は、胚又は胎児組織を使用することなく誘導された多機能幹細胞を報告する。多機能表現型を誘発する因子を使用して、他の前駆細胞をｈＥＳ細胞に再プログラムすることも可能である（Chambers et al., Cell 113:643, 2003; Mitsui et al., Cell 113:631, 2003）。適切な条件下で、適切な繁殖及び分化能力を有する任意の細胞を、本発明での使用のために分化組織の誘導に使用することができる。
【００４５】
＜プロモーター−レポーター系＞
本発明の細胞は、細胞における遺伝子発現のパターンに影響を与える薬剤又は培養環境の他の局面に反応にするプロモーター又は他の転写調節配列の制御下で１つ以上のレポーター遺伝子を発現させるように設計される。幾つかの場合において、細胞は、ユーザーが、混合細胞個体群の中の同定されるべき目的である１つの細胞を同定することを可能にする、第２（組織特異的）プロモーターを有するように操作される。
【００４６】
＜代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーター＞
培養条件の変化（特に試験薬剤の部類の存在）に反応して上方又は下方制御される遺伝子を制御する任意のプロモーター又は転写制御エレメントは、本発明の使用に適切でありうる。適切な特性を有するプロモーターの例は、以下である：
・アポトーシスに反応する遺伝子、例えばＰＵＭＡ遺伝子のためのプロモーター。アポトーシスの引き金を引く薬剤は、この範疇のプロモーターの引き金を引くことができる。他の候補は、Ｇａｄｄ３４、ＰＵＭＡ、ＧＡＨＳＰ４０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５、ｃ−ｆｏｓ、Ｇａｄｄ１５３、ＡＰＡＦ−１、Ｇａｄｄ４５、ＢＴＧ２／ＰＣ３、Ｐｅｇ３／Ｐｗｌ、Ｓｉａｈ１ａ、Ｓ２９リボソームタンパク質、ＦａｓＬ／ＣＤ９５Ｌ、組織トランスグルタミナーゼ、ＧＲＰ７８、Ｎｕｒ７７／ＮＧＦＩ−Ｂ、シクロフィリンＤ／ＣＹＰＤ及びＰ７３である。
【００４７】
・ＤＮＡ損傷に反応する遺伝子、例えばｐ２１、ｐ２１／ＷＡＦ又はＰｉｇ３遺伝子のためのプロモーター。突然変異原又は催奇形因子は、この範疇のプロモーターの引き金を引くことができる。
【００４８】
・過形成に反応する遺伝子、例えばＫｉ−６７又はＡｕｒｏｒａ  Ａ遺伝子のためのプロモーター。繁殖を刺激する薬剤は、この範疇のプロモーターの引き金を引くことができる。
【００４９】
・酸化ストレスに反応する遺伝子のためのプロモーター。ヘムオキシゲナーゼ１（Ｈｍｏｘ１）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）は、低酸化レベルで上方制御され、γ−グルタミルシステイニルリガーゼ（ＧＣＬ）及びメタロチオニンＩ及びＩＩは、グルタチオンの枯渇又は金属イオンの存在によりそれぞれ上方制御される。他の候補は、ＩｋＢ、ＡＴＦ４、キサンチンオキシダーゼ、ＣＯＸ２、ｉＮＯＳ、Ｅｔｓ−２、シクロフィリンＡ／ＣＹＰＡ、ＮＱＯ１及びｂＮＩＰ３である。
【００５０】
・これらの事象のいずれかの開始による遺伝子発現プロフィールにおける変化を反映する転写因子、例えばＰＸＲ、ＣＡＲ、アリール炭化水素レセプター（ＡｈＲ）又はＮｒｆ２遺伝子のためのプロモーター。
【００５１】
・肝臓毒性で上方制御される他の肝細胞マーカー、例えばＬｒｇ−２１、ＳＯＣＳ−２、ＳＯＣＳ−３、ＰＡＩ−Ｉ、ＧＢＰ２８／アディポネクチン、α１−酸糖タンパク質、ＡＴＦ３及びｌｇｆｂｐ−３のためのプロモーター。
【００５２】
・核の中で作用するレセプターに反応する遺伝子、例えばアンドロゲン、エストロゲン及びｐＰＡＧ反応性遺伝子のためのプロモーター。例は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。
【００５３】
・基質の存在でも上方制御される、薬剤代謝に関わる肝細胞酵素のためのプロモーター。例は、チトクロームＰ４５０遺伝子、例えばＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ１である。
【００５４】
・基質によっても上方制御される、薬剤トランスポーター遺伝子、例えばＭＤＲ１のためのプロモーター。
【００５５】
・心臓の収縮速度又はＱＴ間隔に影響を与える遺伝子、例えばカルシウム流遺伝子のためのプロモーター。
【００５６】
・特定の臨床条件下で不足する産物を制御する遺伝子であり、発現を調節できる薬剤をスクリーニングするのに有用でありうる遺伝子のためのプロモーター。例は、ホルモン発現（例えば、インスリン又はコルチゾール）を制御する遺伝子、及び神経伝達物質（例えば、セロトニントランスポーター及びチロシンヒドロキシラーゼ）の合成、放出、代謝又は再取り込みを制御する遺伝子である。
本開示で参照されているこれら及び他のプロモーターを、ＧｅｎＢａｎｋのような供給源からの配列データを使用して構築された所望の配列に特異的なプライマーを使用して、適切なゲノムライブラリーから増幅することによってクローニングすることができる。
＜組織特異的プロモーター＞
個体群において特定の表現型の細胞を同定するカウンターマーカーを提供するために、ユーザーは、試験化合物が培地に存在しているか否かにかかわらず、あるレベルで構造的に発現する第２プロモーターを選択することができる。
【００５７】
肝臓前駆細胞、肝細胞及び胆管上皮に特異的な細胞マーカーが、表１に示されている。
【００５８】
【表１】
2008546417.tif 000003
他の肝細胞マーカーは、ＨＮＦ−１及びトランスサイレチンである。
【００５９】
心筋細胞及びその前駆体に特異的な細胞マーカーには、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、Ｎｋｘ２．５、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ、特に心筋特異的なβ鎖）、タイチン（Titin）、トロポミオシン、α−サルコメアアクチニン(α-sarcomeric actinin）、デスミン（desmin）、ＧＡＴＡ−４、ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、Ｎ−カドヘリン、コネクシン４３、β１−アドレノセプター（β１−ＡＲ）、クレアチンキナーゼ  ＭＢ（ＣＫ−ＭＫ）、ミオグロビン、α−心筋アクチン、心房性ミオシン軽鎖、心室ミオシン軽鎖、ミオカルジン、ミオシン軽鎖２ｖ及び心房性ナトリウム利尿ペプチドが含まれる。
【００６０】
神経細胞系に特異的な細胞マーカーは、Ａ２Ｂ５（糖脂質）及びポリシアル酸神経細胞接着分子（略語ＮＣＡＭ）が含み、時々、肝臓又は筋肉細胞のような他の細胞型で示されうる。ニューロン細胞のマーカーには、神経前駆体及び他の細胞に特有の、β−チューブリンＩＩＩ、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）及びネスチン（Nestin）が含まれる。ＭＡＰ−２は、種々の型の完全に分化したニューロンのためのより厳密なマーカーである。ニューロン細胞のための他のマーカーには、ニューロフィラメント重鎖、ニューロフィラメント重鎖、ドーパミンレセプターｄ１、セロトニンレセプター２ａ、セロトニンレセプター５ａ及びドーパデカルボキシラーゼが含まれる。オリゴデンドロサイト細胞のマーカーは、細胞個体群の成熟度に応じて存在し、それらには、ＮＧ２、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦの膜レセプター、及びＴＲα１が含まれる。
【００６１】
他の細胞型のための構成的マーカーを、細胞の既知の表現型に基づいて文献から選択することができる。本発明で使用される組織特異的プロモーターを、マーカーがタンパク質である場合は、対応する遺伝子から、又はマーカーが炭水化物である場合は、マーカーの合成を触媒する酵素から直接クローンすることができる。
＜レポーター遺伝子＞
培養環境における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーターによる潜在的な上方又は下方制御を検出するために、検出可能なシグナルを生成するレポーター遺伝子に機能的に結合する。
【００６２】
レポーター遺伝子は、肝細胞で発現するときに蛍光又はリン光シグナルを生じるタンパク質をコードすることができる。このような方法では、プロモーター配列の挙動をその場で測定することができる。自己蛍光タンパク質を、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ若しくはＤｓＲｅｄ）から選択することができる。生物発光タンパク質には、ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼが含まれる。化学発光基質を変換するのに使用できる酵素には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。
【００６３】
また（例えば、自動化系での使用のために）考慮されるものは、他の方法で検出可能なシグナルを生成するレポーターである。例は、発現すると、培地への生体分子の放出を引き起こすか、又は培地中で基質の触媒を検出可能な産物にする遺伝子である。次に、プロモーターの調節は、例えばイムノアッセイにより、培養上澄み中の生体分子又は触媒産物のアッセイにより追跡できる。
【００６４】
＜遺伝子改変細胞の産生＞
プロモーター−レポーター系が選択されると、細胞は、標準的な組み換え技術により遺伝子改変されて、レポーター遺伝子をプロモーターの制御下におく。このことは、両方とも細胞に対して異種であるプロモーター及びレポーターを含むベクターを用いた細胞の形質移入によって実施され、前記プロモーター及びレポーターは、既に発現カセットとして結合している。次にカセットを、無作為様式でゲノムの中に配置することができる。あるいは、ユーザーは、異種レポーターを、相同組み換えにより内在性レポーターの制御下におくこともできる。このことは、適切な環境下で転写を許容することが知られているゲノムの位置にプロモーターを配置するという利点を有する。
【００６５】
原則的に、遺伝子改変は、形質移入された個体群に形質移入細胞の選択を可能にするほど十分な複製能力がある限り、ｈＥＳ細胞の分化の前又は後で実施することができる。ｈＥＳ細胞を用いる処理の利点の一つは、分化の前に望ましい任意の程度で個体群を増大する能力である。そのために、読み手は、ｈＥＳ細胞が依然として未分化の状態のままで遺伝子改変を行うことを好む可能性がある。このような方法において、更なる使用のために未分化及び分化細胞の継続的な供給を続いて生成することができる。しかし、形質移入及び選択は、細胞の早期分化を避けるように選択された条件下で実施されなければならない。
【００６６】
未分化ｈＥＳ細胞を遺伝子改変する方法は、ＵＳ２００２／０１６８７６６Ａ１において包括的に記載されている。 Lipofectamine 2000（商標）（Gibco Life Technologies）又はFuGENE（商標）（Roche Diagnostic Corporation）のようなプラスミドベクター系、及びレトロウイルス又はレンチウイルスに基づくウイルスベクター系が、全て適している。形質移入ｈＥＳ細胞の選択は、抗生物質耐性フィーダー細胞により又はフィーダー無含有培養環境において実施することができる（ＵＳ２００２／０１６８７６６Ａ１）。
【００６７】
既に示されているように、同じ細胞株において多重プロモーター−レポーター系が存在することができ、例えば、第１レポーターに結合し、培養環境における代謝的又は毒物学的変化に反応する第１プロモーターと、第２レポーターに結合し、組織特異的な第２プロモーターである。あるいは又は追加的に、代謝的又は毒物学的変化に対して別の潜在的な反応を表す、異なる様式で培養環境に反応する１つ以上の追加的なプロモーターが存在することができる。この場合でも、追加的なプロモーターは、それぞれ、他のレポーターと区別されるレポーターに結合している。例えば、蛍光アッセイにおける使用では、それぞれのレポーターの転写は、異なる波長の蛍光を発射する遺伝子又は酵素産物を生成する。この戦略を使用すると、細胞個体群は、異なる潜在的な代謝攻撃を同時に報告することができる。
【００６８】
＜対立変種＞
ｈＥＳ細胞を使用する別の利益は、特定の目的薬剤代謝酵素又は薬剤標的をコードする遺伝子の特定の変種を有することを除いて、全ての局面において同一である細胞を作る能力である。このことは、薬剤スクリーニングの状況において関連性があり、それは、特定の部類の薬剤に反応する又はそれを代謝する個別の能力に影響を与える天然に生じる対立変種が幾つか存在するからである。そうでなければ細胞は同じであるので、ユーザーは、スクリーニングされる化合物の効果をアロタイプ特異的な方法で決定することができる。公開された米国特許出願第２００３／０００３５７３  Ａ１号、段落［０１２８］〜［０１３４］（Geron Corp.）を参照すること。
【００６９】
結果として既知の対立変種を有する薬剤代謝酵素の例は、Wolf et al., Br. Med. J. 320:987, 2000; Wolf et al., Br. Med. Bull. 55:366, 1999; and W. Webber, Pharmacogenetics. Oxford Univ. Press, 1997に記載されている。
【００７０】
【表２】
2008546417.tif 000004
既知の変種を有する別の酵素は、ＣＹＰ３Ａ４であり、テストステロンの不活性化において役割を果たし、前立腺癌に対する感受性に関与している（Paris et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 8:901, 1999）。
【００７１】
本発明のこの実施態様を実施するために、ｈＥＳ細胞を２つ以上の別個の細胞個体群に分ける。１つ以上の細胞個体群を遺伝子改変して、薬剤代謝酵素又は薬剤標的のための遺伝子の変種を（プロモーター−レポーター構築物の指示の前又は後で）導入する。遺伝子をランダム形質導入により導入することができるが、より典型的には、変種を、相同組み換えにより未変性遺伝子と置換する。この両方とも内在性遺伝子を静め、変種を内在性転写制御エレメントの制御下におく。あるいは、天然に生じる変種が点変異により通常の遺伝子と異なることが知られている場合、内在性遺伝子を、同じ表現型が付与されるように変異することができる。ユーザーは、対向する対立遺伝子を、例えば相同組み換えにより同じ変種を発現するように改変するか又は不活性化する選択肢を有する。
【００７２】
次に細胞は、以下のセクションで記載されているように、分化され、薬剤スクリーニングに使用される。
＜所望の組織型への細胞の分化＞
いったん、ｈＥＳ細胞が、試験細胞個体群における発現のために設計されたプロモーター−レポーター系により遺伝子改変されると、個体群を、必要な任意の程度に増大することができ、次に、随意に所望の細胞型に分化することができる。
【００７３】
＜肝臓細胞＞
肝細胞は、米国特許第６，４５８，５８９号及びＰＣＴ公報ＷＯ０１／８１５４９（Geron Corporation）に記載されているように、ヒストンデアセチラーゼのインヒビターを使用して、ｈＥＳ細胞から分化することができる。未分化ｈＥＳ細胞を、ヒストンデアセチラーゼのインヒビターの存在下で培養する。例示的な方法において、分化は、１％ＤＭＳＯ、次に２．５mMのヒストンデアセチラーゼインヒビターｎ−ブチレートにより開始される。得られた細胞は、ｎ−ブチレート、ＤＭＳＯ、ＥＧＦ、肝細胞増殖因子及びＴＧＦ−αのような増殖因子を含有する肝細胞培養培地中で４日間培養することによって、成熟させることができる。
【００７４】
ｈＥＳ細胞を肝細胞へ分化する段階プロトコールは、ＵＳ２００５／００３７４９３Ａ１（Geron Corp.）に記載されている。細胞は、幾つかの分化剤及び成熟剤の組み合わせにより順に培養され、ｈＥＳ細胞を最初に初期内胚葉又は肝細胞前駆体に分化し、次に成熟肝細胞様細胞に分化する。
【００７５】
内胚葉様細胞への分化は、場合により線維芽細胞増殖因子と組み合わせて、ブチレート、ＤＭＳＯ又はウシ胎児血清を使用して開始することができる。次に分化を、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及び／又は骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２、４又は７）のような因子を多様な組み合わせで含む、市販の肝細胞培地を使用して続けることができる。最終成熟を、デキサメタゾン又はオンコスタチンＭのような作用物質の存在により増強することができる。本発明のレポーター肝細胞に適用される、ＵＳ２００５／００３７４９３Ａ１の「ＤＭＳＯプロトコール」の説明は、下記の実施例３に提供されている。精製された肝細胞分化プロトコールにおいて、分化は、典型的にはブチレート及び／又はＤＭＳＯのような他の因子の存在下で又はそれらにより順次、アクチビン活性を有するタンパク質を使用して開始される（実施例６）。次に細胞を、ＨＧＦ、ＥＧＦ及び／又はＢＭＰを使用し、段階的に成熟させることができ、デキサメタゾン、続いてオンコスタチンＭのような作用物質の存在により増強させることができる。
【００７６】
本開示で使用されるとき、用語「肝細胞」又は「肝細胞の細胞系」は、少なくとも３つ、好ましくは５〜７つの次の特性：α1−アンチトリプシン；アシアロ糖タンパク質、グリコーゲン蓄積、チトクロームＰ４５０酵素発現；グルコース−６−ホスファターゼ活性、低いかごくわずかのα−フェトプロテイン及び肝細胞の形態学的特徴（立体細胞、場合によってはその間に細管状空間を有する立体細胞）を有する細胞を意味する。ヒト肝臓から単離された成熟肝細胞の他の特徴は、この定義内で肝細胞として細胞を認めるために存在することができるが、必ずしも必要ではない。細胞マーカーを同定するアッセイの方法は、米国特許第６，４５８，５８９号に詳述されている。本発明の「肝細胞」は、必要であると明示されない限り、ヒト胚幹細胞を分化することによって得ることができるが、必ずしもそうである必要はない。
【００７７】
薬剤スクリーニングの状況において、ユーザーは、チトクロームＰ４５０酵素のような特定の薬剤代謝酵素の活性を試験することも望む場合もある。チトクロームＰ４５０の活性を調査する都合の良い方法は、細胞を基質の「カセット」と、例えば、ミダゾラム（ＣＹＰ３Ａ４で代謝されている）、トルブタミド（ＣＹＰ２Ｃ９で代謝されている）、フェナセチン（ＣＹＰ１Ａ２）及びブブラロール（ＣＹＰ２Ｄ６）と組み合わせることである。活性は、ＨｅｐＧ２細胞のような基準細胞株の約０．１、１又は１０倍として定量化することができる。カセットにおいて全ての薬剤の代謝産物を同時にモニタリングする都合の良い方法は、ＧＣＭＳによるものである。必要に応じて、細胞を、細胞中のチトクロームＰ４５０の発現又は活性を増加するように、薬剤スクリーニングでの使用の前又はその間に、デキサメタゾン又はリファンピシンのような化合物で処理することができる。
【００７８】
＜神経細胞＞
神経細胞を、米国特許第６，８３３，２６９号；Carpenter et al., Exp Neurol. 2001 ;172(2):383-97;及びＷＯ０３／０００８６８（Geron Corporation）に記載されている方法に従ってｈＥＳ細胞から生成することができる。未分化ｈＥＳ細胞又は胚様体細胞を、１つ以上のニューロトロフィン及び１つ以上のマイトジェンを含有する培地で培養し、少なくとも約６０％の細胞がＡ２Ｂ５、ポリシアル酸ＮＣＡＭ又はネスチンを発現し、かつ培養において少なくとも２０倍加の能力がある細胞個体群を生成する。例示的なマイトジェンは、ＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＩＧＦ−１である。例示的なニューロトロフィンは、ＮＴ−３及びＢＤＮＦである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーアンタゴニストの使用、又はｃＡＭＰとアスコルビン酸の組み合わせの使用を、ドーパミン作動性ニューロンの特徴である、チロシンヒドロキシラーゼに陽性のニューロン細胞の割合を増加するために使用することができる。次に細胞の繁殖は、マイトジェンの不在下でニューロトロフィンにより培養することによって、最終分化を引き起こすことができる。
【００７９】
オリゴデンドロサイトは、ＦＧＦのようなマイトジェンと、トリヨードチロニン、セレン及びレチノイン酸のようなオリゴデンドロサイト分化因子とを含有する培地に懸濁して、細胞凝集体として培養することによってｈＥＳ細胞から生成することができる。次に細胞を固体表面で平板培養し、レチノイン酸を中止し、個体群を拡大させる。最終分化は、ポリ−Ｌ−リジンで平板培養し、全ての増殖因子を除去することによって実施することができる。細胞の８０％以上が、オリゴデンドロサイトマーカーのＮＧ２プロテオグリカン、Ａ２Ｂ５及びＰＤＧＦＲαに陽性であり、ニューロンマーカーのＮｅｕＮに陰性である個体群を得ることができる。ＰＣＴ公報ＷＯ０４／００７６９６及びKeirstead et al., J Neurosci. 2005;25(19):4694-705を参照すること。網膜色素上皮細胞の誘導も報告されている（Klimanskaya et al., Cloning Stem Cells 6:217, 2004）。
【００８０】
＜心臓細胞＞
心筋細胞又は心筋細胞前駆体を、ＷＯ０３／００６９５０に提供されている方法に従ってｈＥＳ細胞から生成することができる。細胞は、ウシ胎児血清又は血清代替物及び場合により５−アザシチジンのようなＤＮＡメチル化に影響を与える心臓代謝因子を有する懸濁液で培養される。あるいは、心筋細胞クラスターは、アクチビンＡを有する固体基質で培養し、続いてＢＭＰ４のような骨形成タンパク質と共に培養し、場合によりＩＧＦ−１のようなインスリン様増殖因子と共に更に培養することによって生成することができる。必要に応じて、次に自発的に収縮する細胞を、密度遠心分離により、個体群中の他の細胞から分離することができる。
【００８１】
更なるプロセスの工程は、cardiac bodies（商標）として知られているクラスターを形成するように細胞を培養すること、単一の細胞を除去すること、次にcardiac bodies（商標）の分散及び再形成を連続的に繰り返すことを含むことができる。ｃＴｎｌ、ｃＴｎＴ、心筋特異的ミオシン重鎖（ＭＨＣ）及び転写因子Ｎｋｘ２．５に染色陽性である細胞の割合が高い個体群が得られる。ＷＯ０３／００６９５０、Xu et al., Circ Res. 2002;91(6):501-8；及びＵＳ２００５／０２１４９３９Ａ１（Geron Corporation）を参照すること。
【００８２】
＜他の細胞型＞
島細胞は、アクチビンＡ、ヒストンデアセチラーゼインヒビター（例えば、ブチレート）、マイトジェン（例えば、ｂＦＧＦ）及びＴＧＦ−βスーパーファミリーアンタゴニスト（例えば、ノギン）から選択される幾つかの因子の組み合わせを含有する培地中の培養でｈＥＳ細胞の分化を開始することによって、ｈＥＳ細胞から分化することができる（ＷＯ０３／０５０２４９、Geron Corp.）。次に細胞をニコチンアミドと共に培養して成熟させることができ、少なくとも細胞の５％がＰｄｘ１、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵ポリペプチドを発現する細胞個体群を生じる。細胞クラスターは、インスリン産生細胞が豊富な芽を形成することができ、濾過より回収することができる。ＷＯ０３／０５０２４９（Geron Corp.）を参照すること。
【００８３】
造血細胞は、ｈＥＳ細胞とネズミ骨髄細胞と共に同時培養することにより作製することができるか、又は卵黄嚢内皮細胞を使用して、造血マーカーを有する細胞を生成した（米国特許第６，２８０，７１８号）。造血細胞は、ＵＳ２００３／０１５３０８２Ａ１及びＷＯ０３／０５０２５１（Robarts Institute）に記載されているように、ｈＥＳ細胞を造血サイトカイン及び骨形成タンパク質と共に培養することによって作製することもできる。
【００８４】
間葉系前駆細胞及び線維芽細胞を、ＷＯ０３／００４６０５に記載されている方法に従ってｈＥＳ細胞から生成することができる。次にｈＥＳ由来間葉細胞を、造骨性因子、例えば骨形成タンパク質（特に、ＢＭＰ−４）、ヒトＴＧＦ−βレセプターのリガンド又はヒトビタミンＤレセプターのリガンドを含有する培地中で骨芽細胞の細胞系に更に分化することができる（ＷＯ０３／００４６０５；Sotile et al., Cloning Stem Cells 2003;5(2): 149-55）。ＵＳ２００４／０００９５８９Ａ１（Iskovitz-Elder et al.）及びＵＳ２００３／０１６６２７３Ａ１（Kaufman et al., Wisconsin）は、ヒト胚幹細胞由来の内皮細胞を報告している。軟骨細胞又はそれらの前駆細胞は、ｈＥＳ細胞を、ＷＯ０３／０５０２５０（Geron Corp.）に提示されている分化因子の有効な組み合わせと共に微小凝集塊中で培養することによって生成することができる。
【００８５】
当該技術で既知であるか又は後で開発された他の分化方法を本発明と一緒に使用して、他の組織を表すプロモーター−レポーター細胞を作り出すことができる。
薬剤スクリーニングのためのレポーター細胞の使用
プロモーター−レポーター系を含有する本発明の細胞は、代謝特性又は遺伝子発現プロフィールに影響を与える因子（例えば、溶媒、小分子薬剤、ペプチド及びポリヌクレオチド）又は環境条件（例えば、培養条件若しくは操作）をスクリーニングするために使用することができる。このことは、薬剤の代謝及び薬剤の安全性を研究すること、薬剤代謝の調節に影響を与える因子を同定すること、又は薬理学的効果を評価及び確認することによって行うことができる。特に興味深いものは、医薬開発の一部として、小分子薬剤及び細胞に進入することができる他の作用物質をスクリーニングすること、並びに／又はインビボで細胞代謝を改変することにおけるこれらの細胞の使用である。
【００８６】
＜毒性試験＞
毒性試験における本発明のプロモーター−レポーター細胞の使用は、細胞個体群を、（典型的には培地に添加することによって）スクリーニングされる作用物質と組み合わせることを含む。プロモーター−レポーター系に対する作用物質の効果は、典型的には、選択されたレポーターに適切な検出系を使用して、作用物質の存在下及び不在下でのレポーター遺伝子からのシグナルを比較することによって追跡される。
【００８７】
例示として、ｈＥＳ細胞を、遺伝子修飾及び分化して、緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子に結合しているヘムオキシゲナーゼ１のプロモーターを含有する肝細胞の個体群を作り出す。細胞を同じ培地中で試験作用物質と組み合わせ、蛍光を、試験作用物質の不在下での蛍光と比較して測定する。蛍光レベルの増加は、ヘムオキシゲナーゼ１遺伝子が、試験作用物質により誘発された酸化ストレスに明らかに反応して上方制御されたことを示す。異なる作用物質及び作用物質の組み合わせを、例えば、マイクロタイタープレートのウエルで細胞を樹立することによって、急速スループットプロセスでスクリーニングすることができる。この系で試験した作用物質を、これらがレポーター発現のレベルを大幅に増加又は改変しないという理由で（これは、試験作用物質の存在に寄与する任意の効果が存在する場合は、ユーザーが許容できると考える閾値を下回ることを意味する）、更なる開発、試験又は使用のために同定及び選択することができる。
【００８８】
分化プロトコールに応じて、目的の細胞型に少なくとも５０％、８０％又は９０％の同質性がある細胞個体群を使用することができる。細胞個体群が比較的純粋である場合、又は選択されたプロモーターが目的の細胞型でのみ活性であるとき（例えば、肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４プロモーター）、標的細胞に対する試験作用物質の効果は、単に細胞個体群全体におけるレポーター遺伝子からのシグナルを追跡することによって測定することができる。
【００８９】
しかし、細胞個体群がより異質であり、プロモーターが、存在する２つ以上の細胞型を誘発する場合、細胞毎に効果を追跡することが好ましい場合もある。代謝反応性プロモーター−レポーター系と組織特異的プロモーター−レポーター系の両方を含有する細胞は、これを特に良好に実施する体勢が整っている。概して、試験作用物質は細胞個体群全体と組み合わされるが、アッセイの結果は、組織特異的レポーターで標識された細胞に存在するときの代謝反応性レポーターの変化として測定される。この手法の利益は、標的細胞型が試薬細胞個体群において優勢である必要がないことである。両方のレポーターが発現する検出可能な細胞が存在する場合に薬剤誘発効果が実証されるので、２０％、１０％又は５％未満の標的細胞を含む個体群を使用することができる。このことは、本発明の薬剤スクリーニング技術を、比較的希な細胞型又は亜型、例えば、インスリン産生膵島細胞又は特定の神経伝達物質を利用する神経細胞を用いて使用することを可能にする。
【００９０】
複数の代謝的又は毒物学的反応性プロモーター−レポーター系を備えた細胞個体群は（単一の細胞株中の異なるプロモーター−レポーター構築物として、又は異なるプロモーター−レポーター構築物を含有する混合細胞の個体群において）、レポーター遺伝子の産物が識別可能である限り、多重攻撃経路を同時にモニタリングするために使用することができる。
【００９１】
＜陽性薬理学的効果についてのスクリーニング＞
毒物学、薬剤代謝及び素因について試験化合物をスクリーニングする他に、本発明の細胞を使用して陽性薬理学的効果についてスクリーニングすることもできる。例えば、インスリンプロモーターにより駆動されるレポーター系を含有する膵臓細胞を使用して、インスリン分泌を誘発できる薬剤をスクリーニングすることができる。神経伝達物質の合成、放出又は取り込みにおける遺伝子のためにプロモーターにより駆動されるレポーター系を含有するニューロン細胞を使用して、潜在的に有益な神経効果を有する薬剤をスクリーニングすることができる。陽性スクリーニングのための本発明の細胞、キット及び方法論の使用は、毒性試験、適切なプロモーター構築物の選択及び必要に応じたアッセイの適合の使用と並行する。
【００９２】
別の例では、化合物を、別の薬剤又は培養条件に対する細胞保護作用について試験することができる。例えば、（ＰＵＭＡ又はヘムオキシゲナーゼ１のような）アポトーシス又はストレスにおいて上方制御される遺伝子のためのプロモーター−レポーターを含有する細胞を、メナジオン、第三級ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ヒドロペルオキシダーゼ、キノン又は異常酸素レベルのようなストレッサーの存在下で培養して、レポーターシグナルを作動させる。いったん樹立されると、そのようなストレッサーにより培養された細胞は、レポーターシグナリングを抑制、低下又は逆転し、それによって、遺伝子発現のレベルの低下を示し、したがって、保護効果のある薬剤をスクリーニングするために使用することができる。このことを、ｈＥＳ由来心筋細胞を用いて、例えば、心虚血の治療における適性について薬剤を試験するために使用することができる。陽性効果のための薬剤をスクリーニングすることと並行して、肝細胞のレポーター細胞のマッチした個体群を使用して、同じ化合物の毒物学的効果についてスクリーニングすることができる。
【００９３】
＜薬剤標的及び薬剤代謝酵素の確認＞
毒物学的又は薬学的効果をスクリーニングする過程において、ユーザーは、特定の薬剤の予測される標的又はその代謝に関わると考えられる酵素を確認することを望む場合がある。このことは、薬剤とプロモーター−レポーター細胞とを、薬剤標的又は代謝酵素の転写又は翻訳を活性化又は阻害する基質の存在下又は不在下で組み合わせることによって行うことができる。プロモーター−レポーター構築物は、活性が試験されているよりも下流の遺伝子活性を反映するように選択される。次にユーザーは、薬剤が当該の薬剤標的又は酵素に影響を与えるかの指標として、ＲＮＡｉを有するか又は有さない薬剤の存在下でレポーター遺伝子の発現に差があるかを決定する。
【００９４】
この文脈における使用に適切なインヒビターは、遺伝子特異的な方法で翻訳を不活性することができる配列を有する、一本又は二本鎖変種のＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）である。この文脈における使用に適切なＲＮＡｉ分子及び他のインヒビターの合成及び使用は、当該技術において十分に記載されている。例えば、Huan et al., Cancer Res. 64:4294, 2004; Chan et al., Drug Discov. Today 10:587, 2005; M. Manoharan, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:570, 2004；ＷＯ０４／０９４５９５；ＷＯ０５／０１４７８２を参照すること。他の適切なアクチベーター又はインヒビターには、転写レベルで遺伝子を上方制御又は下方制御することが知られている小分子薬剤が含まれる（Campbell et al., J. Cell Sci. 109:2619, 1996）。
【００９５】
既知の薬剤標的には、ＴＮＦのようなリガンドにより活性化される、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）；マルグリタザール（muraglitazar）及び他の化合物に結合する、ペルオキシソーム増殖因子活性レセプター（ＰＰＡＲ）；デキサメタゾン、リファンピシン又はプレグネナロン１６α−カルボニトリルにより活性化される、ＰＸＲのようなチトクロームＰ４５０レギュレーター；フェノバルビタール及び他のバルビツール酸塩により活性化される、核内レセプターＣＡＲ；ポリ塩化ビフェニル化合物を処理する、グリコシルトランスフェラーゼのような第ＩＩ相酵素；ベンゾ〔ａ〕ピレン及びβ−ナフトフラボンに結合する、アリール炭化水素（Ａｈ）レセプター；並びにタモキシフェンのようなエストロゲン類似体に結合するエストロゲンレセプターが含まれる。
【００９６】
既知の薬剤代謝酵素には、チトクロームＰ４５０系（Ortiz de Montellano et al., supra）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、並びに胆汁酸と他の化合物との結合に関わる酵素が含まれる。
【００９７】
本発明のこの態様を例示するために、肝臓における薬剤代謝を、酸化ストレスに対応するプロモーター−レポーター系を有する肝細胞を使用して研究することができる。チトクロームＰ４５０系（例えば、フェノバルビタール）を介して代謝される薬剤は、ＣＹＰ３Ａ４のような特定のＰ４５０酵素に特異的なＲＮＡｉの存在下及び不在下で細胞と組み合わせることができる。ＲＮＡｉの存在下で薬剤により誘発される高いレポーター活性が存在する場合、ＲＮＡｉにより引き起こされるＣＹＰ３Ａ４活性の低減は、薬剤の代謝経路におけるＣＹＰ３Ａ４に関与する、ストレス増加をもたらす。
【００９８】
同様に、薬剤の医薬活性におけるエストロゲンレセプターの役割は、エストロゲンにより上方制御される遺伝子の転写を反映するプロモーターレポーター系を有する細胞を使用して評価することができる。エストロゲンレセプターに特異的なＲＮＡｉの存在下で薬剤により誘発される低いレポーター活性が存在する場合、エストロゲンレセプターは、試験される薬剤のための標的として確認される。
【００９９】
＜対立変種に対する効果＞
同じｈＥＳ細胞株から作製されるが、薬剤代謝酵素の異なる変種を含有するように操作されているプロモーター−レポーター細胞を使用して、酵素により代謝されると考えられる薬剤のプロセッシング又は効果を比較することができる。例えば、通常形態のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を有する同じｈＥＳ細胞由来の肝細胞を、デキストロメトルファンのような薬剤の効果について、個体群の６％に存在する変種（表２）を有する肝細胞と比較することができる。変異に起因する薬剤代謝の差は、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応するプロモーター−レポーターを介して生成されるシグナルに影響を与えるか、又は薬剤の代謝に関連する遺伝子産物の発現を反映する。
【０１００】
同様に、薬剤標的の異なる変種を含有するように操作されているプロモーター−レポーター細胞を使用して、標的変種に対する薬剤の効果を比較することができる。例えば、神経伝達物質の取り込みに関わる酵素の変異を有するニューロン細胞を、取り込みに影響を与えることが知られている薬剤（例えば、ブプロピオン）の効果について比較することができる。変異に起因する薬剤の医薬効果の差は、神経伝達物質の存在に反応するプロモーター−レポーターを介して生成されるシグナルに影響を与える。
【０１０１】
薬剤標的又は薬剤代謝酵素の異なる変種を有する別個の細胞個体群を、薬剤により並行して試験することができる。場合により、それぞれの変種を、異なるレポーター遺伝子を有する細胞個体群の中に配置することができる。このことは、ユーザーが、２つの細胞個体群を組み合わせ、一緒に両方の変種に対する薬剤の効果を測定することを可能にする。
移植組織をモニタリングするためのレポーター細胞の使用
本発明のプロモーター−レポーター細胞の別の使用は、ヒト被験体に移植された組織移植片（例えば、同種移植片）の運命をモニタリングすることである。レポーターの発現を、不適切な移植による、又は後の急性又は慢性免疫拒絶反応による、ストレス、アポトーシス又は移植組織の生存度の指標として使用することができる。
【０１０２】
例としては、この文脈において選択されるプロモーターは、細胞における代謝的又は毒物学的変化に反応することができるものであり、例えば、酸化ストレス又はアポトーシスに反応する遺伝子である。細胞により分泌されるタンパク質をコードするか、又は細胞から別のタンパク質の分泌を引き起こすレポーターが選択され、血液採取によりその効果をモニタリングすることができる。好ましくは、レポーターは、ヒトタンパク質又はその変種を、免疫反応を最小限にするようにコードする。理想的には、レポーター遺伝子産物は、また、プロモーターの活性が尿を介してモニタリングできるように、腎臓を介して排出できる（ＷＯ２００４／０９０５３２、CXR et al.）。適切な候補は、排出を促進し、腎臓損傷を最小限にする、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、主要な尿タンパク質、エンドスタチン、β−ラクトグロブリン、及び比較的小型の他のホルモン、タンパク質又はペプチド（＜２０，０００、＜１０，０００又は＜５，０００kDa）である。場合により、レポーター産物は、正常な生物学的活性を欠いている天然ポリペプチドの変種又はフラグメントであることができる。プロモーター−レポーター系を、一過性遺伝子改変として細胞個体群に（例えば、プラスミド又はアデノウイルスベクターを使用して）形質導入することができ、それによって、組織は、移植後のしばらくの間に最終的に遺伝子改変細胞がなくなる。
【０１０３】
本発明のこの態様を診療所で使用するために、プロモーター−レポーター細胞は、移植された組織と組み合わされる。移植片が主にｈＥＳ由来細胞（例えば、肝細胞、心筋細胞又は神経細胞）から構成される場合、プロモーター−レポーター細胞を、移植前の任意の時点で個体群と混合することができる。移植片がヒトドナーのような他の供給源由来の組織から主に構成される場合、細胞を、同じようにして一緒に混合することができるか、又は（固形組織移植片では）プロモーター−レポーター細胞を移植片の多重部位に移植することができる。移植片の運命を、適切であれば、移植後の多様な間隔で血液又は尿を評価することによって、その場でモニタリングすることができる。
【０１０４】
＜商業用の実施態様＞
営利事業として、ユーザーは、本発明のスクリーニング方法を、化合物又は作用物質の効果を試験することを望んでいる他の事業体にサービスとして提供することができる。あるいは、ユーザーは、本発明の細胞、組み合わせ及び試薬を、薬理学的スクリーニングにおける内部使用のために他の事業体に提供することができる。
【０１０５】
本発明の細胞を、輸送又は保存を促進するために場合により凍結している、等張賦形剤又は培地中の細胞培養又は懸濁液の形態で供給することができる。
【０１０６】
本発明には、プロモーター−レポーター系を有する肝細胞の誘導、産生又は製造に有用な系及びキットも含まれる。用語「系」は、互いに一緒に使用される、互いに隣接して保存若しくは使用される、又は単一の統一体、若しくは、提携の制御下にあるように設計されている複数の成分を意味する。本発明の系は、明確に必要とされるエレメントのみを最小限に含み、細胞産生又は薬剤スクリーニングのために設計された大規模な構造物又は方法で存在又は操作することができる。用語「キット」は、本発明に従って一緒に使用されるために、別の事業体に配布又は販売されている複数の成分を意味する。場合により、本発明の系又はキットは、標識（例えば、レクチン、抗体若しくは酵素基質）を検出するのに有用な１つ以上の試薬、プロモーター活性を誘発又は阻害（及び、その結果のレポーターの発現）をすることが知られている１つ以上の制御化合物、そうでなければそれらに影響を与える１つ以上のＲＮＡｉ分子若しくは他の化合物、並びに／又は薬剤のスクリーニング若しくは確認用のキットの細胞及び他の成分の使用についての書面情報を含むことができる。
【０１０７】
＜多数の細胞個体群を含む製品＞
本発明の一部の系又はキットは、維持されている２つ以上の異なる細胞個体群を単独で含む。細胞個体群は、同じゲノムを有するものとして参照することができる。これは、標準技術により測定される遺伝子多型（ＲＦＬＰ又はＳＮＰ）が、同じ細胞株由来のものと一致する（典型的には９５％を越える同一性である）ことを意味する。
【０１０８】
一つのそのような実施態様は、必要であればより多くの分化細胞を作製するために、遺伝子修飾分化細胞と、同じゲノム（及び可能であれば同じプロモーター−レポーター構築物）を有するｈＥＳ細胞株とを含む、本発明の分化プロモーター−レポーター細胞を産生する系又はキットである。
【０１０９】
別のそのような実施態様は、同じゲノム及び同じプロモーター−レポーター系を共有するが、異なる細胞系（例えば、肝細胞及び心筋細胞か又は神経細胞）に分化している複数の異なる細胞を有する、薬剤スクリーニングのための系又はキットである。この配置は、標的組織（例えば、心臓又は中枢神経系）に対する薬理学的効果と肝臓又は他の細胞型に対する毒性効果の両方について、薬剤の効果を試験するのに特に有用である。
【０１１０】
別のそのような実施態様は、同じゲノムを共有するが、異なるプロモーター−レポーター系を有する同じ分化細胞型の複数の細胞を有し、それによって、試験化合物の異なる代謝的又は毒物学的事象を順次スクリーニングすることができる、薬剤スクリーニングのためのキット又は系である。あるいは又は追加的に、キット中の異なる細胞個体群は、目的の細胞タンパク質へ導入された変種、例えば、チトクロームＰ４５０酵素の対立変種を除いて、遺伝子的に同一であることができる。ストレス又は毒性を反映するプロモーターは、スクリーニングされる化合物の効果を研究するために、それぞれの変種における同一又は異なるレポーター遺伝子と結合しており、酵素変種と関連する。
【０１１１】
他の商業的用途は、当業者が容易に思いつき、請求される発明の範囲内で実施することができる。
【０１１２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施態様の更なる非限定的例示として提供された。
【実施例】
【０１１３】
＜実施例１：ｈＥＳ細胞を分化するためのＤＭＳＯプロトコール＞
ｈＥＳ細胞を、図１で示されているスキームに従って肝細胞に分化することができる。
【０１１４】
一つの例示的な実験において、ヒトＥＳ細胞を、１０cmウエルあたり１×１０6個の細胞で平板培養し、添加された８ng/mLのｂＦＧＦを含有するｍＥＦ調整培地中で、培地を毎日換えながら、５日間増殖させた。段階ＩＩ／ＩＩＩは、２０％血清代替物（Serum Replacement）（Gibco # 10828-028）、２mMのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、０．１mMのβ−メルカプトエタノール、更に、１％ＤＭＳＯを含有するＫＯ−ＤＭＥＭを加えた中で細胞を培養することによって実施した。培地を７日間毎日換えた。
【０１１５】
次に段階ＩＶは、２．５ng/mLのＨＧＦを添加した１０ng/mLのＥＧＦを含有するＨＣＭに培地を換えることによって開始した。培地を４日間毎日換えた。
【０１１６】
次に細胞を、掻き取ることなく、トリプシン又はコラゲナーゼを使用して再び平板培養した。コラゲナーゼ継代（Collagenase passaging）を、上澄みを除去し、ウエル１mLあたり１mg/mLのコラゲナーゼＩＶを、予め３７℃に温めたＫＯ−ＤＭＥＭに添加することによって実施した。５分間インキュベートした後、コラゲナーゼを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に１mLの培地をウエルに添加し、次に細胞を、Ｐ１０００ピペットを使用して勢いよく２０〜３０回ピペッティングした。培養条件下で細胞が容易に剥離しなかったので、コラゲナーゼの代わりにトリプシン／ＥＤＴＡを使用した。洗浄した細胞を、１ウエルあたり０．５〜１mL（Gibco # 25300-054、０．０５％トリプシン、０．５３mMのＥＤＴＡ）で層にし、３７℃で５分間インキュベートした。次にこれらを繰り返しピペッティングすることで分散させ、酵素反応を、等量の１０％ＦＢＳ又はダイズトリプシンインヒビターで急停止させた。大型の凝集塊が後に残り、細胞を洗浄し、１２００rpmで１０分間ペレット化した。次に細胞を新たな培地に懸濁し、６ウエルプレートに平板培養した。
【０１１７】
次に細胞を、１ウエルあたり約０．２〜１×１０6個の細胞を再び平板培養し、培地を２〜３日毎に換えながら、１５日間又はウエルがコンフルエントに見えるまで増殖させた。これらを、１０ng/mLのＨＧＦ又は１０ng/mLのＥＧＦを添加した１μMのデキサメタゾンを含有する同じ培地で、培地を２〜３日毎に換えながら、培養することよって成熟させた。図１の中央パネルは約１５日後の細胞を示し、肝細胞の形態学的特徴を示している。
【０１１８】
図１の下側パネルは、リアルタイムＰＣＲにより検出され、ヒト成人肝臓の試料により発現されたレベルに正規化されている、肝細胞の細胞系マーカーの発現の分析を示す。細胞が成熟過程を経ると、チトクロームＰ４５０酵素、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７及びＰ４５０レギュレーターＰＸＲのための培養中のｍＲＮＡのレベルは、無処置の肝臓に近いレベルに達する。酵素アッセイで測定されたＣＹＰ３Ａ４の活性は、リファンピシンにより活性化され、ケトコノゾールにより阻害され、このことは、肝臓組織から単離された肝細胞に存在するＣＹＰ３Ａ４活性では典型的である。
【０１１９】
＜実施例２：ｈＥＳＣレポーター株の生成＞
この実施例及び実施例３、４及び６の実験室作業は、Dept. of Gene Function & Development, Roslin Institute, Midlothian ScotlandのWei Cui、Debiao Zhao、David Hay及びArlene Rossにより実施され、請求される発明の所有者は、謝意を表明する。
【０１２０】
本発明のレポーター肝細胞のモデルとして、ヒトα−フェトプロテイン及びアルブミンプロモーターを、表２に提示した特定のプライマーによりヒトゲノムＤＮＡ（Promega G3041）から増幅した。
【０１２１】
【表３】
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ｈＥＳＣの形質移入に使用されるレンチウイルスベクターは、pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）ベクター（Invitrogen）の修飾型であった。ＣＭＶプロモーターフラグメントを除去し、多重クローニング部位を含むリンカー配列を挿入した。レポータープラスミドカセットを、修飾レンチウイルスベクターにクローンし、レンチウイルスを、Invitrogenにより提供されたプロトコールに従ってパッケージングし、ＨＴ１０８０細胞を使用して滴定した。
【０１２２】
全てのＤＮＡ配列の忠実性は、配列決定及び制限酵素消化により確認された。次に正確なプロモーターフラグメントを、ｅＧＦＰの上流にあるベクターｐｅＧＦＰ１（Invitrogen）にクローンした。ＡＦＰプロモーターは、エンハンサードメインＥA及びＥBと、近位及び遠位の両方のサイレンサーとを含む、５．４kbのサイズである（図２Ａ）。
【０１２３】
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）株Ｈ１を、マウス胚線維芽細胞調整培地（ｍＥＦ−ＣＭ）を使用して、Matrigel（登録商標）被覆プレートで培養した〔Gerrard et al., infra〕。コンフルエントなＨ１細胞を、０．５mMのＥＤＴＡでの２４時間処理し、１：３に分け、形質移入／形質導入を行なった。上述したように、細胞は、lipofectamine（商標）又はFugene6（商標）を使用し、線状プラスミドを用いて形質移入される、又は、ｂＦＧＦ（８ng/mL）及びポリブレン（６μg/mL）を含有するＣＭ中で１０2-3TU/mLのレンチウイルスと共に一晩インキュベートされる。選択は、形質移入／形質導入の４８時間後に、Ｇ４１８又はブラスチシジンを２〜３週間使用して適用した。生存コロニーを取り出し、拡大した。
【０１２４】
ｐｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ及びｐｈＡＬＢ−ｅＧＦＰを、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ）、並びに未分化ｈＥＳＣに一過的に形質移入した。ＧＦＰ発現は、形質移入されたＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ細胞において肉眼で見ることができたが、ｈＥＳＣでは見ることができず、両方のプロモーターが肝細胞様細胞に特異的であったことを示した。
【０１２５】
ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ又はｈＡＬＢ−ｅＧＦＰのいずれかのカセットを持つレンチウイルスベクターを、Ｈ１  ｈＥＳＣの形質導入に使用した。ブラスチシジンにより選択した後、９個及び１４個のクローンが、それぞれｐＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ及びｐＬＺ−ｈＡＬＢ−ｅＧＦＰで確立された。導入遺伝子の組み込みが、プロモーターとｅＧＦＰの結合領域に交差するフラグメントのＰＣＲ増幅により確認された。確立された導入遺伝子細胞株を、それぞれＨ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ及びＨ１−ＬＺ−ｈＡＬＢ−ｅＧＦＰと呼ぶ。
【０１２６】
参考文献：
1. Watanabe K, Saito A, Tamaoki T., (1987) Cell-specific enhancer activity in a far upstream region of the human alpha-fetoprotein gene. J Biol Chem. 1987 262:4812-8.
2. Hayashi Y, Chan J, Nakabayashi H, Hashimoto T, Tamaoki T., (1992) Identification and characterization of two enhancers of the human albumin gene. J Biol Chem. 267:14580-5.
3. Xu C, lnokuma M.S., Denham J., Golds K., Kundu P., Gold J. D., Carpenter M.K. (2001) Feeder- free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 19:971-4.
4. Gerrard L, Zhao DB, Clark AJ, and Cui W (2005) Stably transfected human embryonic stem cell clones express OCT4-specific green fluorescent protein and maintain self-renewal and pluripotency. Stem Cells 23: 124-33.
【０１２７】
＜実施例３：肝細胞への分化及びレポーター遺伝子の発現＞
レポーター構築物を含有する未分化ｈＥＳＣを、８ng/mLのｂＦＧＦを含有するｍＥＦ−ＣＭで、およそ７０％のコンフルエンスになるまで培養した。次に上述したＣＭをＳＲ／ＤＭＳＯ培地（２０％血清代替物、２mMのｌ−グルタミン、１×非必須アミノ酸、０．１mMのβ−メルカプトメエノール及び１％ＤＭＳＯを含有するノックアウトＤＭＥＭ）に代えて、７日間毎日換えた。次に細胞を、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）２．５ng/mL及びＥＧＦ  １０ng/mLを補充した肝細胞培地（CambrexからのＨＣＭ）を使用して更に２週間成熟させた。ＨＣＭを最初の４日間は毎日、後半の１０日間は２日毎に換えた。細胞を、１００％メタノールで固定した後に免疫染色した。
【０１２８】
図３は結果を示す。ＤＭＳＯ処置の後、細胞は、内胚葉様形態を示し、ＨＣＭ（ＨＧＦ及びＥＧＦで補充）での更なる培養の後、肝細胞の細胞系（ＨＬＣ）が、多角形の形状である巣として形成された（図３Ａ）。この形態は、初代ヒト肝細胞と類似していた。ＨＬＣは、顕著な核小体を有する僅かに大きい核を含有し、毛細胆管と似ている構造で囲まれていた。これらは、ＨＮＦ４、アルブミン及びＨｅｐＰａｒ１のような肝細胞マーカーを発現した（図３Ｂ）。
【０１２９】
毒素に対するＨＬＣの反応を試験するために、これらを、抗生物質リファンピシン（４０μM）及びデキサメタゾン（１μM）を含有するＨＣＭで６日間増殖させた。肝細胞機能を、１mg/mLのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）中で４５分間インキュベート、及び、ＨＧＦ及びＥＧＦで補充したＨＣＭでの培養によって評価し、その間、ＩＣＧのクリアランスを１時間毎にモニタリングした。細胞はＩＣＧを取り込み、清澄した（それは肝細胞の特徴である）（図３Ｃ）。ＨＬＣは、総細胞個体群の１％〜３０％（平均約１０％）に含まれる。ＨＬＣ巣内に、ＡＦＰ免疫染色で決定されたように、個々のＨＬＣは異なる段階の成熟度で存在した。巣特異的ＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲ研究は、細胞が一連の肝細胞マーカーを発現したことを示した（図３Ｄ）。
【０１３０】
８個のＨ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰクローン株は、肝細胞分化の後期段階でｅＧＦＰの発現を示した（図４Ａ）。ＧＦＰ発現は、ＨＬＣ巣に独占的に表れ、ＨＬＣの少なくとも５〜１５％が、ＧＦＰを発現しているそれぞれの病巣内にあった。検出されたＧＦＰが内在性ＡＦＰ発現と関連することを確認するために、細胞を、ＡＦＰとＧＦＰ抗体の両方で共染色し、ＡＦＰ染色とＧＦＰ染色の共局在化を示した（図４Ｂ）。
【０１３１】
ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰも、原始内胚葉を表すｈＥＳＣ由来細胞で発現するかを決定するために、Ｈ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ細胞を、懸濁液中で分化させて胚様体（ＥＢ）を形成し、次にそれを培養中で平板培養した。抗ＧＦＰ及び抗ＡＦＰによる二重染色は、内在性ＡＦＰ発現のみが原始内胚葉で検出され、ＧＰＦ発現は検出されなかったことを示した（図４Ｃ）。これらの結果は、クローンした５．４kBaseのｈＡＦＰ上流調節領域が、肝細胞の細胞系に関連している細胞に特異的であることを示す。
【０１３２】
Ｈ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ由来ＨＬＣを、抗ＧＦＰ及び抗アルブミン抗体で染色し、ＧＦＰ及びアルブミンでは異種の染色パターンを示した（図５、Ａ列）。一部の細胞（可能であれば肝細胞の初期段階）において、ｈＡＦＰ−ＧＦＰのみが発現しているが、他の細胞（可能であれば肝細胞の後期段階）では、ｈＡＦＰ−ＧＦＰとアルブミンが共局在化しているか、又はアルブミンのみが検出された。二重染色は、ｈＡＦＰ−ＧＦＰが、肝芽細胞のマーカーであるＨｅｐＰａｒ１と共局在化しているが（列Ｂ）、ｈＡＦＰ−ＧＦＰが、成熟肝細胞のマーカーであるＰＸＲと又はαＡＴとの共局在化を示さなかった（列Ｃ及びＤ）ことを示した。
【０１３３】
＜実施例４：ＣＹＰ３Ａ４プロモーターにより駆動されるレポーター肝細胞＞
この実施例は、チトクロームＰ４５０からのヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のプロモーターエレメントにより駆動されるＧＦＰレポーターを有する肝細胞を例示する。調節配列は２つのエレメント：０．８kBaseの生体異物反応性エンハンサーモジュール（ＸＲＥＭ）及び０．４kBaseの小型近位プロモーターを含有する。
【０１３４】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターを、表３に示されているプライマーを使用してＰＣＲによりヒトゲノムＤＮＡからクローンし、配列決定により確認し、次に一緒に結合した（図２Ｂ）。
【０１３５】
【表４】
2008546417.tif 000006
ＣＹＰ３Ａ４−ｅＧＦＰ構築物を、Lipofectamine（商標）を使用してｈＥＳ細胞のＨ１細胞株に形質移入し、４個のクローンが、導入遺伝子の正確な組み込みを有することを、サザンブロット分析により同定した。陽性対照として、ＣＹＰ３Ａ４−ｅＧＦＰを、ヒト肝細胞癌株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）にも形質移入した。ＣＹＰ３Ａ４インデューサーに対する細胞の反応性を試験するために、細胞を、ヒトプレグナンｘレセプター発現ベクターにより（Fugene 6（商標）又はEffectene（商標）を使用して）一過的に形質移入し、次に、デキサメタゾン又はリファンピシンの存在下で培養した。
【０１３６】
図６（Ａ）は、０．５μMのデキサメタゾン及び５μMのリファンピシンの不在下及び存在下で７２時間培養した後の、細胞の位相差（上段列）及びｅＧＦＰ蛍光（下段列）を示す。未分化ｈＥＳ細胞においてｅＧＦＰ発現は見られなかった。このことは、ＣＹＰ３Ａ４−ｅＧＦＰ構築物を確認し、これが、特に、活性なチトクロームＰ４５０系を有する肝細胞においてＣＹＰ３Ａ４インデューサーと正確に反応することを示す。
【０１３７】
次にＣＹＰ３Ａ４−ＧＦＰ  ｈＥＳ細胞を、実施例３と同様に肝細胞の細胞系に分化し、細胞がいったん適切な表現型を有したときのレポーター系の誘導能について再試験した。
【０１３８】
図６（Ｂ）は、低レベルのＧＦＰ発現が、リファンピシン及びデキサメタゾンで６日間培養した後、初期継代ＣＹＰ３Ａ４−ｅＧＦＰ肝細胞の細胞系で検出された、実験の結果を表す。後期継代細胞は、同じように反応しなかった。初期継代の結果は、適切な状況下では、ｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４−ｅＧＦＰレポーター系が、ＣＹＰ３Ａ４発現を誘発することが知られている化合物に反応することができることを示す。
参考文献：
1. Goodwin B, Hodgson E, and Liddle C, (1999) The Orphan human pregnane x receptor mediates the transcriptional activation of CYP3A4 by Rifampicin through a distal enhancer module. MoI Pharmacol. 56(6):1329-39.
【０１３９】
＜実施例５：ｈＥＳＣ由来レポーター肝細胞におけるチトクロームＰ４５０酵素活性＞
この実施例の実験室作業は、CXR BiosciencesのCliff Elcombeと彼のチームにより実施され、請求される発明の所有者は、謝意を表明する。
【０１４０】
実施例３に記載されているように操作されたレポーター肝細胞の酵素活性を試験するために、細胞を、Ｐ４５０基質の組み合わせと接触させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより薬剤代謝についてモニタリングした。
【０１４１】
ＣＹＰ３Ａ４プロモーターＧＦＰレポーター構築物を含有する、ｈＥＳＣ由来肝細胞を、Matrigel（登録商標）に平板培養したＨｅｐＧ２細胞株（ヒト肝細胞癌細胞；ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５０１１４３０）と比較した。ｈＥＳ由来細胞を、ＨＣＭ  SingleQuots（商標）補充（Clonetics CC-4182）を添加し、ＥＧＦ及びゲンタマイシンを省いた肝細胞基本培地（Clonetics CC- 3199）で維持した。ペニシリン及びストレプトマイシンを加えて、最終濃度をそれぞれ１００U/mL及び１００μg/mLにした。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎児血清、２mMのＬ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１００U/mLのペニシリン及び１００μg/mLのストレプトマイシンを有するダルベッコー最小必須培地で維持した。
【０１４２】
細胞を、４０μMのリファンピシンと、伴う又は伴わない１μMのデキサメタゾンにより、又は溶媒対照（ＤＭＳＯ）により６日間活性化した。次にこれらを以下の基質と組み合わせた。
【０１４３】
ＣＹＰ３Ａ４（及び可能であればＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｄ６）を誘発するために、細胞を、４０μMのリファンピシンと、伴う又は伴わない１μMのデキサメタゾンにより、又は溶媒対照（ＤＭＳＯ）により６日間活性化するか、或いは未処置のまま放置した。次に細胞を、ＤＭＳＯと、リファンピシン又はデキサメタゾンの不在下で、以下の基質と共に２４時間インキュベートした。
【０１４４】
【表５】
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ＨｅｐＧ２対照細胞株による及びプロモーター−レポーターＨＬＣによるミダゾラム及びトルブタミドの代謝が、図７に示されている。データは、肝細胞の形態学的特性を有する細胞の割合によって調整されている。
【０１４５】
これらの結果は、ｈＥＳＣ由来細胞が、薬理学的に活性な肝細胞の特徴である、誘導性チトクロームＰ４５０活性を有することを実証している。
＜実施例６：アクチビンを使用して生成された肝細胞の細胞系においてシグナル伝達するレポーター＞
ｈＥＳ細胞のＨ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ株（実施例２）を、Matrigel（商標）被覆プレートにおいて、８ng/mLのｂＦＧＦを補充したｍＥＦ調整培地中で増大した。いったん９０〜９５％のコンフルエンスに達すると、細胞を投入し、ビタミンＡなしのＢ２７補充（GibcoBRL/lnvitrogen # 12587-010）、１mMの酪酸ナトリウム（Sigma Cat. no. B5887）及び１００ng/mLのアクチビンＡ（R&D Systems # 338-AC-025）を含有するＰＲＭＩ  １６４０により１日（１日目と呼ぶ）培養し、次に、０．５mMの酪酸ナトリウムを有する以外は同じ培地で２日間培養した（段階Ｉ）。かなりの細胞死があり、ここで残りの細胞は、間葉細胞形態を有し、一部はロゼットを形成した。
【０１４６】
４日目より、細胞に、２０％ノックアウト血清代替物（GibcoBRL/lnvitrogen # 10828-028）、２mMのＬ−グルタミン、１×非必須アミノ酸、０．１mMのβ−メルカプトエタノール及び１％ＤＭＳＯを含有するノックアウトＤＭＥＭ（GibcoBRL/lnvitrogen # 10829-018）を毎日与えた（段階ＩＩ）。１１日目より、細胞に、１０ng/mLのヒトＨＧＦ、１０ng/mLのヒトＥＧＦ及び１μMのデキサメタゾンを補充したＨＣＭブレットキット（Bullet Kit）（Cambrex/Clonetics/Biowhittaker # CC-3198）を毎日与えた（段階ＩＩＩ）。２０日目より、細胞に、１０ng/mLのヒトＨＧＦ、１０ng/mLのヒトＥＧＦ及び２５ng/mLのヒトオンコスタチンＭを補充したＨＣＭブレットキットを隔日で与えた（段階ＩＶ）。
【０１４７】
肝細胞マーカーの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによりそれぞれの段階においてｍＲＮＡのレベルで測定した。段階Ｉの終了時までに、分化ｈＥＳ細胞は、α−アンチトリプシン及びＣＹＰ３Ａ４の弱い発現を示した。段階ＩＩの終了時までに、α−アンチトリプシン及びＰ−４５０アイソエンザイムＣＹＰ３Ａ４の発現が増加し、ＡＦＰ及びＰＸＲが発現し、ＣＹＰ３Ａ７の弱い発現があった。段階ＩＩＩの終了時までに、アルブミンとＣＹＰ３Ａ７の両方の発現が増加した。段階ＩＶの終了時までに、ＣＹＰ２Ｃ９が弱く発現し、ＰＸＲの発現が減少した。
【０１４８】
図８（Ａ）は、１８日目の細胞におけるＡＦＰ−ｅＧＦＰ構築物からのＨ＆Ｅ染色（左側パネル）及び蛍光（右側パネル）を示す。図８（Ｂ）は、培養の過程において観察されたｅＧＦＰ蛍光の動態を示す。１１日目に導入された培地成分に反応して、細胞の約６０〜７０％がｅＧＦＰを発現し始め、１９又は２０日目にピークに達した。２１日目の培地交換の後、ｅＧＦＰ発現は徐々に消滅した。
【０１４９】
このことは、代謝変化を誘発する化合物に反応する系としてのｅＧＦＰレポーターを駆動するＡＦＰプロモーターの効果を確認する。ＡＦＰは、原始肝細胞の細胞系のためのマーカーであるが、成熟細胞のマーカーではない。適切であれば、レポーターは、初期発現因子デキサメタゾンの存在下で発現し、後期分化因子オンコスタチンＭの存在下で減少した。
【０１５０】
＜他の特許開示＞
本開示に提示されている教科書及び他の参考文献の他に、当業者は、以下の特許開示を参考にすることを望むであろう：
・ｈＥＳ細胞培養：米国特許第６，８００，４８０号；ＷＯ０１／５１６１６；ＷＯ０３／０２０９２０
・肝細胞：米国特許第６，４５８，５８９号；ＷＯ０１／８１５４９；ＵＳ２００３／０００３５７３Ａ１；ＵＳ２００５／００３７４９３Ａ１
・神経細胞：米国特許第６，８３３，２６９号；ＷＯ０３／０００８６８；ＷＯ０４／００７６９６
・心筋細胞：ＷＯ０３／００６９５０；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９０８１
・島細胞：ＷＯ０３／０５０２４９
・他の分化細胞；ＷＯ０３／００４６０５；ＷＯ０３／０５０２５０；ＷＯ０３／０５０２５１；ＵＳ２００４／０００９５８９Ａ１；及びＵＳ２００３／０１６６２７３Ａｌ
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】本開示の実施例１で例示されている、ｈＥＳ細胞からの肝細胞の細胞系を作製するプロトコールを示す。分化は、ＤＭＳＯを使用して開始され（上段パネル）、増殖因子（上皮増殖因子、ＥＧＦ；肝細胞増殖因子、ＨＧＦ）、グルココルチコイド（デキサメタゾン、Ｄｅｘ）及びオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）の組み合わせを使用して進行する。培養はＨＧＦと培養することによって更に成熟され、肝細胞の形態学的特徴を有する細胞を産生する（中段パネル）。下段パネルは、分化プロトコールの種々の段階を通してＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅）により検出された種々の細胞マーカーの発現を示す。
【図２】本発明のモデルプロモーター−レポーター構築物に使用されるヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＣＹＰ３Ａ４プロモーターを位置づける。パネルＡ：ＡＦＰ転写調節領域（５．４kb）は、ＥA：エンハンサードメインＡ；ＥB：エンハンサードメインＢ；Ｓｄ：遠位サイレンサー；Ｓｐ：近位サイレンサー；ｐＡＦＰ：ＡＦＰプロモーターを含有する。パネルＢ：ＣＹＰ３Ａ４調節領域は、０．８kBaseの生体異物反応性エンハンサーモジュール（ＸＲＥＭ）及び０．４kBaseの小型近位プロモーター（ｐ３Ａ４）を含有する。合計のサイズは約１．２kbである。
【図３】ｈＥＳ細胞が肝細胞の細胞系に分化する際の染色パターンを示す。上側パネルでは、ｈＥＳＣを、最初に調整培地で培養し（左側）、次にＤＭＳＯ培地で７日間培養して、内胚葉様形態にし（中央）、最後に肝細胞分化培地で約２週間培養して、肝細胞の細胞系の巣を形成する（ＨＬＣ、右側）。Ａ列は、位相差画像であり、Ｂ列は、肝細胞マーカー（アルブミン、ＨｅｐＰａｒ１及びＨＮＦ４）の免疫染色を示し、Ｃ列は、０〜４時間でのインドシアニングリーンの取り込み及びクリアランスを示す。下側パネルは、ＲＴ−ＰＣＲによる肝細胞マーカーの発現を示す。ＥＳ：ｈＥＳ細胞；ＨＬＣ：ｈＥＳ由来肝細胞の細胞系の単離巣；Ｆ：胎児肝細胞；Ａ：成人肝細胞。
【図４】分化後のＨ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰクローン細胞株におけるレポーターＧＦＰの発現を示す。Ａ列：ＨＬＣにおけるＡＦＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の発現。Ｂ列：ＨＬＣにおけるＡＦＰ−ＧＦＰ（左側）と内在性ＡＦＰタンパク質（中央）の共局在化。Ｃ列：ＡＦＰ−ＧＦＰは、胚様体の原始内胚葉において発現しないが（左側）、内在性ＡＦＰは陽性である（中央）。
【図５】Ｈ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰクローン細胞系におけるＨＬＣの免疫染色を示す。Ｈ１−ＬＺ−ｈＡＦＰ−ｅＧＦＰ  ｈＥＳＣを分化してＨＬＣとし、ＧＦＰに対する抗体で染色して（左側縦列）、ＡＦＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の発現、並びに肝細胞マーカー（中央縦列）、アルブミン（Ａ列）、ＨｅｐＰａｒ１（Ｂ列）、ＰＸＲ（Ｃ列）及びα1−アンチトリプシン（Ｄ列）の発現を表した。画像は、右側縦列では重ねられている。
【図６】チトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ３Ａ４−ＧＦＰのプロモーターで制御されているＧＦＰレポーターの発現を示す。図６（Ａ）は、デキサメタゾン及び抗生物質リファンピシンの不在下及び存在下で培養した後の、ＣＹＰ３Ａ４−ＧＦＰ構築物を含むＨｅｐＧ２細胞の位相差（上段列）及びｅＧＦＰ蛍光（下段列）を示す。図６（Ｂ）は、ｈＥＳ細胞から分化した初期継代肝細胞の細胞系における位相差及びｅＧＦＰ発現を示す。これらの結果は、適切な状況下では、ＣＹＰ３Ａ４−ｅＧＦＰレポーター系が、ＣＹＰ３Ａ４発現を誘発することが知られている化合物に反応することができることを示す。
【図７】ｈＥＳ細胞由来プロモーター−レポーター肝細胞による化合物ミダゾラム（上段パネル）及びトルブタミド（下段パネル）の代謝を示し、それぞれ、チトクロームＰ４５０のＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｃ９アイソザイムによりプロセスされている。これらの結果は、ｈＥＳＣ由来細胞が、薬理学的に活性な肝細胞の、誘導性チトクロームＰ４５０活性の特徴を有し、そのため、薬剤スクリーニングアッセイでの使用に適切な活性を有することを実証している。
【図８】細胞成熟に影響を与える因子を含有する培地で肝細胞の細胞系を培養することによりもたらされる、ＡＦＰプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰレポーターの発現を示す。図８（Ａ）、左側パネル：Ｈ＆Ｅ染色；右側パネル：ｅＧＦＰ蛍光。図８（Ｂ）は、１１日目の新たな培地成分の導入後に、細胞の約６０〜７０％がｅＧＦＰを発現し、２１日目の培地成分の交換後に徐々に消滅した、ｅＧＦＰ蛍光の動態を示す。
【図１】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008546417.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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