(57)【要約】本発明は、完全長ｒｐｏＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子断片の配列番号９および１１〜３２、ならびに前記ｒｐｏＢ遺伝子の高変異性断片の配列番号３３および３５〜５６および７７〜１００、ならびにｒｐｏＢ遺伝子のフレームを構成する高変異性の非コード配列の核酸断片である配列番号１２１〜１４４および１６５〜１８８、さらには、前記高変異性配列の断片に由来する種特異的な配列のオリゴヌクレオチドならびにアシネトバクター属細菌の様々な種の間のコンセンサスオリゴヌクレオチドである配列番号１〜８であって、次の２４の種：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｚｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｌｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｉｖｏｆｆｌｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒｎｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｎｉｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓのためのものに関する。本発明はさらに、アシネトバクター属細菌種の分子同定による検出方法における、前記オリゴヌクレオチド、前記遺伝子断片、または完全長ｒｐｏＢ遺伝子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシネトバクター属細菌の次の２３の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選択された細菌の、完全長ｒｐｏＢ遺伝子であって、前記遺伝子の配列は、それぞれ配列番号９および１１〜３２の配列、および少なくとも９８％の類似性を有する配列、およびそれらの相補的配列などの配列の中から選択された配列を含んでなることを特徴とする遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の前記２３の種の中から選択されたアシネトバクター属細菌の完全長ｒｐｏＢ遺伝子であって、前記遺伝子の配列は、配列番号９および１１〜３２の配列、逆配列および相補的配列、ならびに前記配列と少なくとも９８％の類似性を有する配列の中から選択された配列で構成されることを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
アシネトバクター属細菌の次の２３の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選択された細菌の、ｒｐｏＢ遺伝子断片であって、前記遺伝子断片の配列は、それぞれ配列番号３３および３５〜５６の配列、およびそれぞれ配列番号７７および７９〜１００の配列、および少なくとも９８％の類似度を有する配列、およびそれらの相補的配列などの配列の中から選択された配列を含んでなることを特徴とする遺伝子断片。
【請求項４】
アシネトバクター属細菌の次の２４の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選択された細菌の、ｒｐｏＢ遺伝子断片であって、前記遺伝子断片の配列は、それぞれ配列番号３３〜５６の配列、およびそれぞれ配列番号７７〜１００の配列、および少なくとも９８％の類似度を有する配列、およびそれらの相補的配列の中から選択された配列で構成されることを特徴とする遺伝子断片。
【請求項５】
アシネトバクター属細菌の次の２４の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃ
ｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選択された細菌の、ｒｐｏＢ遺伝子に隣接する非コード断片であって、前記断片の配列は、それぞれ配列番号１２１〜１４４の配列、およびそれぞれ配列番号１６５〜１８８の配列、および少なくとも９８％の類似性を有する配列、およびそれらの相補的配列などの配列の中から選択された配列を含んでなることを特徴とする断片。
【請求項６】
請求項５に記載のアシネトバクター属細菌のｒｐｏＢ遺伝子に隣接する非コード遺伝子断片であって、前記遺伝子断片の配列は、それぞれ配列番号１２１〜１４４の配列、およびそれぞれ配列番号１６５〜１８８の配列、および少なくとも９８％の類似性を有する配列、およびそれらの相補的配列の中から選択された配列で構成されることを特徴とする遺伝子断片。
【請求項７】
アシネトバクター属細菌の次の２４の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選択された細菌に特異的な配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの配列は、
−それぞれ配列番号３３〜５６、
−それぞれ配列番号７７〜１００、
−それぞれ配列番号１２１〜１４４、
−それぞれ配列番号１６５〜１８８、ならびに
−少なくとも９８％の類似性を有する配列およびこれらの相補的配列
の配列などから選択された配列のうちの１つに含まれる、好ましくは少なくとも１８個、さらに好ましくは１８〜３５個の連続したヌクレオチドパターンを有する配列を含んでなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の遺伝子断片または請求項７に記載のオリゴヌクレオチドの、種プライマーとしてのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用。
【請求項９】
アシネトバクター属細菌の次の２４の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選択された細菌の保存された配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドであって、以下の配列番号１〜８の配列、すなわち
―配列番号１：５’−ＴＡＹＣＧＹＡＡＡＧＡＹＴＴＧＡＡＡＧＡＡＧ−３’、
―配列番号２：５’−ＣＭＡＣＡＣＣＹＴＴＧＴＴＭＣＣＲＴＧＡ−３’、
―配列番号３：５’−ＧＴＧＡＴＡＡＲＡＴＧＧＣＢＧＧＴＣＧＴ−３’、
―配列番号４：５’−ＣＧＢＧＣＲＴＧＣＡＴＹＴＴＧＴＣＲＴ−３’、
―配列番号５：５’−ＧＡＡＧＡＲＣＴＴＡＡＧＡＭＤＡＡＲＣＴＴＧ−３’
―配列番号６：５’−ＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＧＧＴＡＴＡＴＧＡＧＴ−３’、
―配列番号７：５’−ＧＴＴＣＴＴＴＡＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡ−３’、
―配列番号８：５’−ＧＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＣＧＲＡＴ−３’
（上記配列において、
−ＤはＡ、ＧまたはＴを表し、
−ＹはＣまたはＴを表し、
−ＢはＣ、ＧまたはＴを表し、
−ＲはＡまたはＧを表し、
−ＭはＡまたはＣを表す）
およびその相補的配列などの配列から選択された配列のうちの１つに含まれる、少なくとも１２個、好ましくは１８個の連続したヌクレオチドパターンの配列を含んでなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド混合物であって、配列番号１〜５および８の配列のうちの１つに含まれる少なくとも連続して１２個、好ましくは少なくとも連続して１８個のヌクレオチドパターンを含む異なる配列の、例えば請求項９に記載のオリゴヌクレオチド、あるいは相補的配列のオリゴヌクレオチドの、等モル混合物を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項１１】
配列番号１の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の８種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項１２】
配列番号２の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の１６種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項１３】
配列番号３の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の６種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項１４】
配列番号４の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の２４種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項１５】
配列番号５の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の２４種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項１６】
請求項９に記載のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６の配列または相補的配列であるオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項９に記載のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの配列が、配列番号７の配列または相補的配列であるオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号８の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の２種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド混合物。
【請求項１９】
請求項９〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物の、前記アシネトバクター属のいずれかの種の細菌を分子同定により検出するための増幅用プライマーおよびシーケンス反応用プライマーのうち少なくともいずれか一方としての用途。
【請求項２０】
アシネトバクター属のいずれかの種の細菌を検出するための分子同定法であって、
請求項１もしくは２に記載の前記細菌の完全長ｒｐｏＢ遺伝子、または
請求項３〜６のいずれか１項に記載の遺伝子断片と、
請求項７、９、１６もしくは１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項１０〜１５もしくは１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド混合物と
のうち少なくともいずれか一方を使用することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、アシネトバクター属細菌の次の２４の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれた細菌の所与の種を特異的に検出することを狙いとし、
１−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含むかまたは含む可能性のあるサンプルを、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項３〜７に記載の遺伝子断片、好ましくは次の配列：
それぞれ配列番号３３〜５６、
それぞれ配列番号７７〜１００、
それぞれ配列番号１２１〜１４４、
それぞれ配列番号１６５〜１８８、および
少なくとも９８％の類似性を有する配列およびそれらの逆配列および相補的配列
の中から選ばれた配列のうち１つでそれぞれ構成された遺伝子断片、で構成された少なくとも１つの種プローブと接触させ、
２−  前記プローブとサンプルの核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されたか否かを決定し、ハイブリダイゼーション複合体が形成されていればアシネトバクター属の前記の種がサンプル中に存在することが決定される
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、
１−  請求項１０〜１５または１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド混合物を含んでなる増幅プライマーを、アシネトバクター属の少なくとも１つの細菌の核酸を含むかまたは含む可能性のあるサンプルと接触させ、該核酸の増幅を、
−５’プライマーとして、請求項１０、１１、１３、１５および１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物であって、配列番号１、３、５および７の配列のうち１つに含まれる配列を含んでなるか、好ましくは配列番号１、３、５および７の完全な配列または相補的配列で構成されるもの、ならびに、
−３’プライマーとして、請求項１０、１２、１４、１６および１８のいずれか１項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物であって、配列番号２、４、６および８のそれぞれの配列のうち１つに含まれる配列を含んでなるか、好ましくは配列番号２、４、６および８の完全長配列またはそれぞれの相補的配列で構成されるもの
を含んでなる酵素的重合反応により実施する工程と、
２−増幅産物が形成されたか否かを決定する工程であって、増幅産物が形成されたか否かによってサンプル中の前記細菌の有無が決定される工程と
からなる方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、アシネトバクター属細菌の次の２４の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれた細菌の所与の種を特異的に検出することを狙いとし、工程２において、前記所与の細菌種の有無は、次の工程：
ａ）前記プライマーで増幅された遺伝子断片のシーケンス反応を行う工程、および
ｂ）得られた前記増幅断片の配列を、前記細菌の遺伝子断片の配列と比較する工程であって、前記細菌の遺伝子断片の配列はそれぞれ：
−前記５’および３’プライマーが配列番号１および２の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合は、配列番号３３〜５６の配列、
−前記５’および３’プライマーが配列番号３および４の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合は、配列番号７７〜１００の配列、
−前記５’および３’プライマーが配列番号５および６の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合は、配列番号１２１〜１４４の配列、
−前記５’および３’プライマーが配列番号５および６の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合は、配列番号１６５〜１８８の配列
を含むことを特徴とする工程
を実施することによって決定される方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、アシネトバクター属細菌の次の２４の種、すなわちＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれた細菌の所与の種を特異的に検出することを狙いとし、工程２において、前記所与の細菌種の有無は、次の工程：
ａ）  前記細菌のうち少なくとも１つの増幅核酸を含むかまたは含む可能性のあるサンプルを、少なくとも１つの種プローブと接触させる工程であって、前記種プローブは、請求項３〜６のいずれか１項に記載のｒｐｏＢ遺伝子断片または請求項７に記載のオリゴヌクレオチド、好ましくは次の配列：
−前記５’および３’プライマーが配列番号１および２の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号３３〜５６の配列
−前記５’および３’プライマーが配列番号３および４の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号７７〜１００の配列
−前記５’および３’プライマーが配列番号５および６の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号１２１〜１４４の配列
−前記５’および３’プライマーが配列番号５および６の配列にそれぞれ含まれる配列
のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号１６５〜１８８の配列
から選ばれた配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片から構成されることを特徴とする工程、ならびに、
ｂ）  前記プローブとサンプルの増幅核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されたか否かを決定する工程であって、ハイブリダイゼーション複合体が形成されるかどうかによって、アシネトバクター属の前記の種がサンプル中に存在するか否かが決定されることを特徴とする工程
を実施することによって決定される方法。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、
１−  請求項１１および１２に記載のオリゴヌクレオチド混合物の中から選ばれた１対の５’および３’プライマーを用いて前記サンプルの核酸を増幅する第１の増幅工程であって、前記オリゴヌクレオチド混合物は配列番号１および配列番号２の配列にそれぞれ含まれる配列を含むか、好ましくは配列番号１および配列番号２の配列または相補的配列で構成されることを特徴とする工程と、
２−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む増幅産物が形成されたか否かを、ハイブリダイゼーションもしくは任意選択で配列決定によって決定する第１の決定工程であって、かつ工程１で得られたアンプリコンを配列番号３３〜５６の中からそれぞれ選ばれた配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片と比較する工程と
を実施し、
―上記工程２において、種Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉまたはＡ．ｊｕｎｉｉの存在が測定された場合は、下記の工程：
３ａ−  請求項１０または請求項１３および１４に記載のオリゴヌクレオチド混合物の中から選ばれた１対の５’および３’プライマーを用いた第２の増幅反応工程であって、前記オリゴヌクレオチド混合物は配列番号３および配列番号４の配列にそれぞれ含まれる配列を含むか、好ましくは配列番号３および４の配列または相補的配列で構成されることを特徴とする工程、および
４ａ−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む増幅産物が形成されたか否かを、ハイブリダイゼーションもしくは任意選択で配列決定によって決定する工程であって、かつ工程３ａで得られたアンプリコンを配列番号７７〜１００の中からそれぞれ選ばれた配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片と比較する工程
も実施し、
―最初の工程２において、種Ａ．ｂａｙｌｉｉまたは遺伝種１１の存在が測定された場合は、下記の工程：
３ｂ−  請求項１７および１８のいずれか１項に記載の前記オリゴヌクレオチドの混合物の中から選ばれた１対の５’および３’プライマーを用いた第２の増幅反応工程であって、前記オリゴヌクレオチド混合物は配列番号７および配列番号８の配列にそれぞれ含まれる配列を含むか、好ましくは配列番号７および８の配列または相補的配列で構成されることを特徴とする工程、および
４ｂ−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む増幅産物が形成されたか否かを、ハイブリダイゼーションもしくは任意選択で配列決定によって決定する工程であって、かつ工程３ｂで得られたアンプリコンを配列番号１６５〜１８８の中からそれぞれ選ばれた配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片と比較する工程
も実施することを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法において使用可能な分析用キットであって、請求項７、９、１６もしくは１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１０〜１５もしくは１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド混合物、または請求項３〜６のいずれか１項に記載の遺伝子断片のうちの少なくとも１つを含み、かつ好ましくは、適宜ハイブリダイゼーション反応もしくは増幅反応に、または配列決定に
使用することができる試薬を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析の分野に関する。より正確には、本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅および配列決定技術を使用するアシネトバクター属細菌の分子同定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アシネトバクター属の細菌は、好気的に増殖するグラム陰性の球桿菌の形態で見られる細菌である。現在、ほぼ６０種および２つの亜種が知られている。
これらの細菌は、唯一というわけではないが本質的に院内感染の原因である。該細菌の諸形態は、単なるコロニー形成から生命に危険のある感染、特に肺炎、泌尿器感染、菌血症および脳膜炎にまで及ぶ（ファンデセル（ｖａｎ  Ｄｅｓｓｅｌ）ら、２００４年）。該細菌の、病院外環境中での優れた生存能力およびほとんどの抗生物質に対する急速な抵抗性獲得能力は、特に集中治療室における院内感染の原因として該細菌が出現する主たる要因となっている（ベルゴグネ‐ベレツィン（Ｂｅｒｇｏｇｎｅ−Ｂｅｒｅｚｉｎ）およびタウナー（Ｔｏｗｎｅｒ）、１９９６年；タウナー（Ｔｏｗｎｅｒ）、１９９７年）。
【０００３】
ほとんどの種はヒトの感染症の原因であるが、一部の種は、環境中にのみ分離されている（ネメク（Ｎｅｍｅｃ）ら、２００１年、２００３年；カー（Ｃａｒｒ）ら、２００３年）。
【０００４】
アシネトバクター属には３２の種が提唱されているが（ファンデセル（ｖａｎ  Ｄｅｓｓｅｌ）ら、２００４年）、現在実施されている命名法により２４の「ゲノム種」（「遺伝種」あるいは「ｇ．ｓｐ．」と略称される）が認識されており、１７種だけが公認の名称を有している（ネメク（Ｎｅｍｅｃ）ら、２００３年；カー（Ｃａｒｒ）ら、２００３年）。不運にも、この属のメンバーの表現型は非常に広い種内差があり、したがって、表現型レベルで識別することができない。これらの病原体と関係する感染症数の増加は、これらの細菌の同定および体系的分類のための分析法に関する研究を促してきた。こうして、表現型の特徴および１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列決定に基づく同定法はＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションと比較して有効ではないことが示された。したがって、これらの細菌の迅速な同定法の探索は依然として問題になっている（ゲルナー‐シュミット（Ｇｅｒｎｅｒ−Ｓｍｉｄｔ）ら、１９９１年；イブラヒム（Ｉｂｒａｈｉｍ）ら、１９９７年；レイネイ（Ｒａｉｎｅｙ）ら、１９９４年）。特に、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列決定に基づいた分子技法では、とりわけこの属では該遺伝子の多型がないために、最も近縁の種を識別することができない。（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）およびヒラヤマ（Ｈａｒａｙａｍａ）、１９９８年；オクマン（Ｏｃｈｍａｎ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、１９８７年；シュタッケブラント（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ）およびゲーベル（Ｇｏｅｂｅｌ）、１９９４年）。さらに、このように多型がないために、種の識別が可能であることが望まれる場合には１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の完全長配列を決定する必要がある。このことは、約１６００塩基対の該遺伝子全体を配列決定することを必要とする。実務上の結論としては、評価可能な結果を得るためには、増幅反応に加えて最低６つのシーケンス反応に基づいて配列決定しなければならないということである。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（イブラヒム（Ｉｂｒａｈｉｍ）ら、１９９７年）の代わりとして、ｇｙｒＢ遺伝子（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）およびヒラヤマ（Ｈａｒａｙａｍａ）、１９９６年；ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、１９９９年）およびｒｅｃＡ遺伝子（クローツヴィク（Ｋｒａｗｃｚｙｋ）ら、２００２年）の比較を使用した系統発生学的な試みもなされている。不運にも、これらの遺伝子の配列は、最も新しい１０種につ
いては決定されていない（ネメク（Ｎｅｍｅｃ）ら、２００１年、２００３年；カー（Ｃａｒｒ）ら、２００３年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、アシネトバクター属の細菌種を同定するための分子同定ツールであって、細菌学実験室内で日常的に使用することが可能であり、特に、十分な遺伝子多型を使用するためわずか１回の増幅反応および２回のシーケンス反応による短い配列（５００塩基対未満）の測定により識別する、つまり、一組のプライマーセットを使用して増幅および配列決定可能である分子同定ツールがなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは本発明によって以下のことを発見し説明した。すなわち：
―ｒｐｏＢ遺伝子および該遺伝子に境界を接する非コード配列、すなわち
―ｒｐｌＬ遺伝子とｒｐｏＢ遺伝子の配列の間の５’側非コード配列（以降「ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサ」または「ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢ遺伝子間断片」とも呼ばれる）、および
―ｒｐｏＣ遺伝子とｒｐｏＢ遺伝子の配列の間の３’側非コード配列（以降「ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ」または「ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣ遺伝子間断片」とも呼ばれる）が、
アシネトバクター属の各細菌種の検出および特異的同定を可能にする遺伝マーカーを形成する。該細菌種は具体的には次の２４種、すなわち：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓである。
【０００７】
遺伝種１〜１６（「ゲノム種」）は、ＧＥＮＢＡＮＫにおいて参照される菌株に対応し、該菌株の一部（番号３、６、９、１０、１３および１６）については名前がまだ与えられていない。
【０００８】
本発明者らは、２０の異なる種の間で高変異性領域をいくつか発見した。該領域は従って各細菌種に特異的であり、異なる種の間で保存された配列に隣接している。該領域は、前記保存された配列由来のプライマーを用いた増幅、および増幅された特定の配列のハイブリダイゼーションおよび／または配列決定によってアシネトバクター属細菌の様々な種の分子同定法を実現するために、使用することが可能である。
【０００９】
より具体的には、本発明は、上記のアシネトバクター属の各細菌種に特異的な核酸の配列であって、そのヌクレオチド配列が前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子由来である配列に関する。
【００１０】
ラスカノ（Ｌａｚｃａｎｏ）ら［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．（１９８８）  ２７：３６５−３７６］によれば、ＲＮＡポリメラーゼはその起原に従って２つのグループに分割される。１つはＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性のウィルスＲＮＡポリメラーゼであり、他方は真核生物もしくは原核生物（古細菌と真性細菌）起原のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。真性細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’と表わされる「コア酵素」、あるいはαββ’σと表わされる「ホロ酵素」と呼ばれる単純な保存された多量体構成を特徴とする［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ）、Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．  （１９７９）  １３：５９−９７］。多数の研究から、真性細菌のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットの、多量体酵素複合体内での機能的な役割が証明されている。他方、古細菌や真核生物のＲＮＡポリメラーゼはより複雑な構造を有し、サブユニットが約１０個や、３０個にすらなることがある［ペーレット（Ｐｕｅｈｌｅｔ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  （１９８９）  ８６：４５６９−４５７３］。
【００１１】
真性細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの異なるαββ’σサブユニットをそれぞれコード化する遺伝子、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣおよびｒｐｏＤ遺伝子は、リボソームサブユニットの構成タンパク質、またはゲノムの複製および修復に関与する酵素をコードする遺伝子からなる異なるグループに分類される［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）  １３：５９−９７］。一部の著者は、ｒｐｏＢ遺伝子とｒｐｏＣの配列を使用して進化系統樹を構築し［ローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（１９９２）  ２１：４０Ｓ］、生物界の異なる分岐および亜分岐の分類を可能としうることを示している。
【００１２】
本発明について詳細に述べる前に、説明および特許請求の範囲において使用される種々の用語を以下のように定義する。
「細菌から抽出された核酸」とは、核酸全体、またはゲノムＤＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写から得たＤＮＡのいずれかを意味する。
【００１３】
「ヌクレオチド断片」または「オリゴヌクレオチド」は、天然の（または修飾されていてもよい）核酸の情報配列を特徴とする鎖状のヌクレオチドパターンであって、所定の高ストリンジェント条件の下に、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド断片と、自然な核酸のようにハイブリダイズすることが可能なものを示す、２つの同意語である。上記鎖は、天然の核酸の構造とは異なる構造を有するヌクレオチドパターンを含んでいてもよい。ヌクレオチド断片（またはオリゴヌクレオチド）は、例えば最大１００のヌクレオチドパターンを含みうる。ヌクレオチド断片は一般に少なくとも１０、好ましくは１８〜３５のヌクレオチドパターンを含み、天然の核酸分子から得られてもよいし、遺伝子組換えまたは化学合成のうち少なくともいずれか一方によって得られてもよい。
【００１４】
−ヌクレオチドパターンはモノマーから得られ、該モノマーは、糖、リン酸基、ならびにアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の中から選ばれた窒素を含む塩基を構成要素とする天然の核酸ヌクレオチドであってもよいし、あるいはそうでなければ、モノマーは、前述の３つの構成要素のうち少なくとも１つが修飾されているヌクレオチドである。例えば、修飾は塩基に関するものでもよく、任意の塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、ＣもしくはＧとハイブリダイズ可能なイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジンなどの修飾塩基、またはハイブリダイゼーション可能なその他の任意の修飾塩基を用いてもよい。あるいは例えばポリアミドで少なくとも１つのデオキシリボースを置換するなどの糖修飾でもよく［ニールセン  ピーイー（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）  ２５４：１４９７−１５００］、あるいは、例えば、特にジホスフェート、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートの中から選択されたエステルで置換することによるリン酸基の修飾塩基でもよい。
【００１５】
「ハイブリダイゼーション」とは、適切な条件の下で、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチド断片が、安定な特異的水素結合の下で結合して二本鎖を形成することが可能なプロセスを意味する。ハイブリダイゼーション条件は、「ストリンジェンシー」す
なわち操作条件の厳密度によって決定される。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションを実施する際のストリンジェンシーが高いほど特異性が高くなる。ストリンジェンシーは、プローブ／標的二重鎖の塩基組成、および２つの核酸の間のミスマッチの程度と特に関係がある。ストリンジェンシーはまた、ハイブリダイゼーション反応のパラメータ、例えばハイブリダイゼーション溶液の中に存在するイオン種の濃度および種類、変性剤の種類および濃度、および／またはハイブリダイゼーション温度にも関係する場合がある。ハイブリダイゼーション反応が行なわれなければならない条件のストリンジェンシーは、使用されるプローブに特に依存する。これらのデータ項目はいずれも良く知られており、適切な条件は、各場合において日常的な実験で決定することが可能であろう。一般に、使用されるプローブの長さによって、ハイブリダイゼーション反応の温度は、およそ０．８〜１Ｍの濃度の生理食塩水中でおよそ２０〜６５℃、特に３５〜６５℃である。
【００１６】
「プローブ」は、所定の条件下で、核酸、本例においてはメッセンジャーＲＮＡ中または転写産物である前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸、と共にハイブリダイゼーション複合体を形成するハイブリダイゼーション特異性を備えたヌクレオチド断片である；プローブは分析目的（特に捕捉プローブまたは検出プローブ）で使用されてもよいし、あるいは治療目的に使用されてもよい。
【００１７】
プローブを、任意の適切な手段によって、例えば共有結合によって、吸着によって、または固体上で直接合成することによって、固体担体上に固定化しても、固定化可能としてもよい。担体の例にはマイクロタイタプレートおよびＤＮＡチップが含まれる、
「プローブ」は一般に、例えば放射性同位体、酵素、特に発色基質、蛍光基質、発光基質に作用しうる酵素（特にペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼ）の中から、あるいは色素性の化学化合物、発色性、蛍光性もしくは発光性の化学化合物、ヌクレオチド塩基のアナログの中から選択されたマーカー物質で標識される。この標識はＤＮＡと前記マーカーとの間で直接的であってもよいし、あるいは間接的、すなわち、ビオチンなどのリガンドまたはマーカーに結合可能なその他の分子を介してもよい。
【００１８】
「種プローブ」は、所定の属、この場合アシネトバクター属の細菌種を特異的に同定することを可能にするプローブである。
「属プローブ」は、あるハイブリダイゼーション条件の下に、細菌の属を、前記属の細菌の種とは関係なく、特異的に同定することを可能にするプローブである、
「プライマー」は、例えば１０〜１００のヌクレオチドパターンを含み、所定の条件下での酵素的増幅反応のためのハイブリダイゼーション特異性を有するプローブである、
「属プライマー」とは、あるハイブリダイゼーション条件および増幅条件の下で、ある１つの同じ属の任意の細菌を、種に関する区別なく特異的に増幅することを可能にする一組のプライマーを意味する（「属プライマー」は、本出願においては「コンセンサスプライマー」または「普遍的プライマー」とも呼ばれる）。
【００１９】
「増幅反応」とは、例えば、プライマーオリゴヌクレオチドによって開始されＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲのような増幅技術における、酵素による重合反応を意味する。
【００２０】
「シーケンス反応」とは、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて開始しジデオキシヌクレオチドを使用する不完全な重合プロセス（サンガー  エフ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ）、コールソン  エイアール（Ｃｏｕｌｓｏｎ  ＡＲ）、１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ９４：  ４４１）により、あるいは例えばＤＮＡチップに使用されるような固体担体上に固定した多数のプローブを用いた多重ハイブリダイゼーションにより、あるいは当業者に周知のその他の技法により、核酸断片または完全長遺伝子の配列の決定をもたらす反応を
意味する。
【００２１】
本発明者らは、アシネトバクター属の２４の種について、ｒｐｏＢ遺伝子の完全長配列、および該遺伝子をｒｐｌＬ遺伝子およびｒｐｏＣ遺伝子から隔てる境界の非コード配列（「ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサ」および「ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ」）を決定した。上記アシネトバクター属の２４の種は、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｎｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓである。
【００２２】
前記ｒｐｏＢの完全長配列およびアシネトバクター属細菌のすべての種におけるｒｐｏＢの隣接配列の決定を達成するために、本発明者らは（アシネトバクター属の細菌のｒｐｏＢ配列およびその周辺の非コード領域のみについての数多くの失敗に終わったテストの後で）、近縁でありＧＥＮＢＡＮＫから入手可能な細菌の対応する配列、すなわちアシネトバクター属細菌のＡＤＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００５９６６）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ  ００４５７８）およびシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）のＫＴ２４４０（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ  ００６３４７）の５１のプライマー（表２）を最初に決定することを強いられた。
【００２３】
アシネトバクター属菌株ＡＤＰ１は、本発明以前には特徴解析が行われていなかったが、本特許出願に記述し以下に列挙する病原性菌株のうちのいずれとも一致しない菌株である。
【００２４】
したがって、本発明の主題は、次の２３の種の中から選択されたアシネトバクター属細菌の完全なｒｐｏＢ遺伝子である。前記２３の種とは、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓである。前記ｒｐｏＢ遺伝子の配列は、それぞれ配列番号９および１１〜３２に記載の配列、および少なくとも９８％の類似性を有する配列、およびそれらの相補的配列の中から選択された配列を含んでなり、より特定的には該配列で構成される。
【００２５】
本発明のさらなる主題は、次の２４の種の中から選択されたアシネトバクター属細菌のｒｐｏＢ遺伝子に隣接する非コード断片を含んでなり、より特定的には該断片で構成される核酸断片に関する。前記２４の種とは、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓである。前記核酸断片の配列は、それぞれ配
列番号１２１〜１４４として記載の配列、およびそれぞれ配列番号１６５〜１８８に記載の配列、および少なくとも９８％の類似性を有する配列、およびそれらの相補的配列の中から選択された配列を含んでなり、より特定的には該配列で構成される。
【００２６】
前述の配列番号９〜３２、１２１〜１４４および１６５〜１８８の配列と少なくとも９８％の類似度を有する前記配列は、亜種に相当すると考えられる１つの同じ種の異なる菌株の間に存在しうる変異に相当する。したがって配列番号１４５〜１６４および１８９〜２０８の配列は、配列番号１２２〜１６６の配列とそれぞれ少なくとも９８％の相同性を有するＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの様々な菌株に対応する。
【００２７】
「類似度」あるいは「相同性（％）」とは、配列同一性の割合（％）、すなわちその配列のヌクレオチドが、別の配列の同じ部位において同一である割合（％）を意味する。
配列番号１２１〜１４４の配列は、上述の２４種のアシネトバクター属細菌の各々の種に関する、ｒｐｌＬ遺伝子とｒｐｏＢ遺伝子との間のｒｐｏＢ遺伝子に接する長さ３０１〜３１０ｂｐの完全長ｒｐｏＢスペーサを表わす５’隣接配列に相当する。
【００２８】
配列番号１６５〜１８８の配列は、上述の２４種のアシネトバクター属細菌の各々の種に関する、ｒｐｏＢ遺伝子とｒｐｏＣ遺伝子との間のｒｐｏＢ遺伝子に接する長さ８６〜１７７ｂｐの完全長ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサを表わす３’隣接配列に相当する。
【００２９】
ｒｐｏＢ遺伝子に接するｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサおよびｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサ、ならびにｒｐｏＢ遺伝子の完全長配列を、単にプローブとして用い、かつ／または一次配列を調べることによるばかりでなく、完全長ＤＮＡ塩基配列の転写に由来するメッセンジャーＲＮＡの二次構造および三次構造を調べることによって細菌を同定することができる。
【００３０】
アシネトバクター属のこれらのｒｐｏＢ遺伝子および該遺伝子に接する非コード配列（ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサおよびｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ）において、本発明者らは配列番号１、２、３、４、５、６、７および８のコンセンサス配列（表３）を証明した。該配列はアシネトバクター属のすべての細菌の間で保存された配列であり、つまり、前記すべてのアシネトバクター属細菌のｒｐｏＢ遺伝子および該遺伝子に接する非コード領域（ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサおよびｒｐｏＢ−ｎｐｏＣスペーサ）の同じ部分を増幅するためのプライマーとして使用することができる：すなわち
―配列番号１および２はｒｐｏＢ遺伝子の第１領域用、
―配列番号３および４はｒｐｏＢ遺伝子の第２領域用、
―配列番号５および６はｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサ用、
―配列番号７および８はｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ用であり、
―配列番号１〜４および６〜７はｒｐｏＢ遺伝子の内部にあり、
―配列番号８および６はそれぞれｒｐｏＢ遺伝子およびｒｐｏＣ遺伝子の５’端に近接しており、
―配列番号７および５はそれぞれｒｐｌＬ遺伝子およびｒｐｏＢ遺伝子の３’端に近接している。
【００３１】
したがって、本発明は、前述の２４種の中から選択されたアシネトバクター属細菌の保存された配列を有するオリゴヌクレオチドであって、以下の配列番号１〜８の配列、およびその相補的配列などの配列から選択された配列のうちの１つに含まれる、少なくとも連続して１２個、好ましくは１８個のヌクレオチドパターンの配列を含んでなり、好ましくは該配列で構成されるオリゴヌクレオチドを提供する。上記配列番号１〜８の配列は、
―配列番号１：５’−ＴＡＹＣＧＹＡＡＡＧＡＹＴＴＧＡＡＡＧＡＡＧ−３’、
―配列番号２：５’−ＣＭＡＣＡＣＣＹＴＴＧＴＴＭＣＣＲＴＧＡ−３’、
―配列番号３：５’−ＧＴＧＡＴＡＡＲＡＴＧＧＣＢＧＧＴＣＧＴ−３’、
―配列番号４：５’−ＣＧＢＧＣＲＴＧＣＡＴＹＴＴＧＴＣＲＴ−３’、
―配列番号５：５’−ＧＡＡＧＡＲＣＴＴＡＡＧＡＭＤＡＡＲＣＴＴＧ−３’
―配列番号６：５’−ＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＧＧＴＡＴＡＴＧＡＧＴ−３’、
―配列番号７：５’−ＧＴＴＣＴＴＴＡＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡ−３’、
―配列番号８：５’−ＧＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＣＧＲＡＴ−３’であって、
該配列において：
−ＤはＡ、ＧまたはＴを表し、
−ＹはＣまたはＴを表し、
−ＢはＣ、ＧまたはＴを表し、
−ＲはＡまたはＧを表し、
−ＭはＡまたはＣを表す。
【００３２】
配列番号１、２、３、４、５および８の配列内のヌクレオチドＤ、Ｙ、Ｂ、ＭまたはＲに相当する位置では、問題の細菌種の相補的な標的配列にヌクレオチドの変異が見られるが、他のすべてのヌクレオチドはアシネトバクター属のすべての細菌種で保存されている。
【００３３】
配列番号１、３、５および７の配列を、直接鎖上のプライマーとして使用し、配列番号２、４、６および８の配列を、間接鎖上のプライマーとして使用する。したがって、配列番号２、４、６および８の配列は、直接鎖の配列に相補的な配列に相当する。
【００３４】
したがって、コンセンサスプライマーとして使用するためには、配列番号１、２、３、４、５および８の配列のこれらのオリゴヌクレオチドを、異なる配列のオリゴヌクレオチドの等モル混合物の形で使用する。配列番号１〜８の各配列についての前記異なる配列のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５および８の各配列について考えられる種々の定義に見合うものである。
【００３５】
オリゴヌクレオチドの等モル混合物は、オリゴヌクレオチド合成の際に、関係する異なるヌクレオチドの等モル混合物をそれぞれ使用することによって得られる。すなわち：
−ＤについてはＡ、Ｇ、およびＴ、
−ＹについてはＣおよびＴ、
−ＢについてはＣ、Ｇ、およびＴ、
−ＲについてはＡおよびＧ、
−ＭについてはＡおよびＣである。
【００３６】
配列番号１、２、３、４、５および８のヌクレオチド配列の定義に見合ったオリゴヌクレオチドの混合物は、したがって、アシネトバクター属のすべての細菌種およびより特定的には前述の２４種の、ｒｐｏＢ遺伝子、および該遺伝子に接する非コード領域（ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサおよびｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ）に隣接するｒｐｌＬ遺伝子とｒｐｏＣ遺伝子の末端に含まれる、種々の標的の相補的配列とハイブリダイズすることが可能である。
【００３７】
これらのプライマーが、アシネトバクター属のすべての種のｒｐｏＢ遺伝子断片および該遺伝子に接する非コード領域（ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサおよびｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ）を増幅することができることから、これらのプライマーは、今後報告されるかもしれないアシネトバクター属の新たな種を同定するのに有効であると考察することが可能である。
【００３８】
したがって、本発明のさらなる主題はオリゴヌクレオチドの混合物であり、該混合物は
、配列番号１〜５および８の配列のうちの１つに含まれる少なくとも連続して１２個、好ましくは少なくとも連続して１８個のヌクレオチドパターンを含む異なる配列のオリゴヌクレオチドあるいは相補的配列のオリゴヌクレオチドの等モル混合物を含むことを特徴とする。
【００３９】
より具体的には、本発明の主題は次のオリゴヌクレオチド混合物である。すなわち：
―配列番号１の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の８種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物；
―配列番号２の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の１６種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物；
―配列番号３の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の６種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物；
―配列番号４の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の２４種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物；
―配列番号５の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の２４種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物；
―配列番号６の配列または相補的配列で構成されるオリゴヌクレオチド配列；
―配列番号７の配列または相補的配列で構成されるオリゴヌクレオチド配列；
―配列番号８の配列または相補的配列のオリゴヌクレオチドで構成される、異なる配列の２種のオリゴヌクレオチドの等モル混合物
である。
【００４０】
本発明の配列番号１〜８の配列のうちの１つに含まれる配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物は、属プライマーとしてアシネトバクター属の細菌に使用することが可能である。
【００４１】
すでに述べたように、配列番号１、２、３、４、５および８をコンセンサス配列と定義したが、該配列は、アシネトバクター属の各細菌種に特異的な高変異性配列にも隣接している。
【００４２】
したがって、本発明者らは、上記の２４の細菌種各々のための種特異的な配列を証拠づけることができた。すなわち該配列は、
−配列番号１および２のコンセンサス配列に隣接した配列番号３３〜５６（以後「ｒｐｏＢの領域１」とする）；
−配列番号３および４のコンセンサス配列に隣接した配列番号７７〜１００（以後「ｒｐｏＢの領域２」とする）；
−配列番号５および６のコンセンサス配列に隣接した配列番号１２１〜１４４（以後「ｒｐｏ／Ｌ−ｒｐｏＢスペーサ」とする）；そして
−配列番号７および８のコンセンサス配列に隣接した配列番号１６５〜１８８（以後「ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ」とする）
に相当する。
【００４３】
したがって、配列番号１、２、３、４、５、６、７および８に隣接したオリゴヌクレオチド配列は、アシネトバクター属細菌の種プライマーとして使用することが可能である。
配列番号１および２の配列に隣接した配列番号３３〜５６の前記特異的高変異性配列は、Ａ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種１１、およびＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉの組み合わせは例外として、異なる種の間で類似度が９６％未満（表７）の長さ３５０ｂｐのｒｐｏＢ遺伝子断片に相当する。このことは、Ａ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種１１およびＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉの組み合わせは例外として、前記高変異性配列が、アシネトバクター属の各細菌種、より正確には上記の２４の種の特異的同定のための短い
特異的標的配列を形成することを意味している。
【００４４】
配列番号３および４の配列に隣接した配列番号７７〜１００の前記特異的高変異性配列は、Ａ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種１１およびＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉの組合せは例外として、異なる種の間で類似度が９６％未満（表８）の長さ４５０ｂｐのｒｐｏＢ遺伝子の断片に相当する。このことは、Ａ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種１１およびＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉの組み合わせは例外として、前記高変異性配列が、アシネトバクター属の各細菌種、より正確には上記の２４の種の特異的同定のための第２の短い特異的標的配列を形成することを意味している。
【００４５】
配列番号５および６の配列に隣接した配列番号１２１〜１６４の前記特異的高変異性配列は、Ａ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種１１、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉおよびＡ．ｌｗｏｆｆｉ／遺伝種９の組み合わせは例外として、異なる種の間で類似度が９７％未満（下記の表５を参照）の長さ３０１〜３１０ｂｐのｒｐｏＢ遺伝子に接するｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサに相当する。このことは、Ａ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種１１、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉおよびＡ．ｌｗｏｆｆｉ／遺伝種９の組み合わせは例外として、前記高変異性配列が、アシネトバクター属の各細菌種、より正確には上記の２４の種の特異的同定のための第３の短い特異的標的配列を形成することを意味している。
【００４６】
最後に、配列番号７および８の配列に隣接した配列番号１６５〜１８８の前記特異的高変異性配列は、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉおよびＡｃｂグループの種（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓおよび遺伝種３）の組合せは例外として、異なる種の間で類似度が９７％未満（下記の表６を参照）の長さ８６〜１７７ｂｐのｒｐｏＢ遺伝子に接するｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサに相当する。従って前記高変異性配列は、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉおよびＡｃｂグループの種（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓおよび遺伝種３）の組合せを例外として、アシネトバクター属の各細菌種、より正確には上記の２４の種の特異的同定のための第４の短い特異的標的配列を形成する。
【００４７】
したがって、本発明のさらなる主題は、２４の種、すなわち：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｂｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ、ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれたアシネトバクター属の細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片である。該断片の配列は、それぞれ配列番号３３〜５６の配列、およびそれぞれ配列番号７７〜１００の配列、および少なくとも９８％の類似度を有する配列、およびそれらの相補的配列などの配列から選択された配列から構成されることを特徴とする。
【００４８】
本発明のさらなる主題は、２３の種、すなわち：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｎｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれたアシネトバクター属の細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片である。
該断片の配列は、それぞれ配列番号３３および３５〜５６の配列、およびそれぞれ配列番号７７および７９〜１００の配列、および少なくとも９８％の類似度を有する配列、およびそれらの相補的配列などの配列から選択された配列から構成されることを特徴とする。
【００４９】
前記配列番号３３〜５６および７７〜１００の配列と少なくとも９８％の類似度を有する前記配列は、１つの同じ種の異なる菌株間に存在する可能性のある変異に相当しうるものであり、より具体的には亜種に相当する。したがって、配列番号５７〜７６および１０１〜１２０の配列は、それぞれ配列番号３４および７８と少なくとも９８％の相同性を有するＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの様々な菌株に相当する。
【００５０】
したがって、本発明の主題はまた、本発明のｒｐｏＢ、ｒｐｌＬまたはｒｐｏＣの遺伝子断片、あるいは本発明の前記アシネトバクター属細菌種に特異的な配列のオリゴヌクレオチドを種プローブとして使用することでもある。
【００５１】
より正確には、本発明は、分子同定によってアシネトバクター属の種のうちの１つの細菌種を同定するための検出方法を提供し、以下を使用することを特徴とする。すなわち、
−本発明による前記細菌の完全長ｒｐｏＢ遺伝子であって、前記配列番号９〜３２の配列を含むか、または好ましくは前記配列番号９〜３２、または相補的配列、または少なくとも９８％の類似性を有する配列で構成されるもの；
−本発明による前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片であって、前記配列番号３３〜５６または７７〜１００の配列を含むか、あるいは前記配列番号３３〜５６または７７〜１００、あるいは相補的配列、あるいは少なくとも９８％の類似性を有する配列で構成されるもの；
−本発明による前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片であって、前記配列番号７７〜１００を含むか、あるいは好ましくは前記配列番号７７〜１００、あるいは相補的配列、あるいは少なくとも９８％の類似性を有する配列で構成されるもの；
−本発明による前記細菌の完全長のｒｐｌＬ−ｒｐｏＢまたはｒｐｏＢ−ｒｐｏＣ遺伝子間断片からなる遺伝子断片であって、前記配列番号１２１〜１４４または１６５〜１８８を含むか、あるいは好ましくは前記配列番号１２１〜１４４または１６５〜１８８、相補的配列または少なくとも９８％の類似性を有する配列で構成されるもの；
−上述の２４の種から選ばれたアシネトバクター属細菌に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、以下の配列、すなわち
−それぞれ配列番号３３〜５６、
−それぞれ配列番号７７〜１００、
−それぞれ配列番号１２１〜１４４、
−それぞれ配列番号１６５〜１８８、ならびに
−少なくとも９８％の類似性を有する配列およびこれらの相補的配列
などに記載の配列から選択された配列のうちの１つに含まれる好ましくは少なくとも１８個、さらに好ましくは１８〜３５個の連続したヌクレオチドパターンを備えたもの；あるいは
−本発明によるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの等モル混合物であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７および８の配列またはそれらの相補的配列のうちの１つに含まれる少なくとも１２個、好ましくは１８個の連続したヌクレオチドを含むか、あるいは好ましくは前記配列番号１、２、３、４、５、６、７および８の配列のうちの１つで構成されるものである。
【００５２】
本発明の細菌検出方法の第１の実施形態では、次の２４の種、すなわち：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｌｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝
種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれたアシネトバクター属細菌の所与の種を特異的に検出することを狙いとしている。該方法においては、
１−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含むかまたは含む可能性のあるサンプルを、本発明のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子断片、好ましくは次の配列：
それぞれ配列番号３３〜５６、
それぞれ配列番号７７〜１００、
それぞれ配列番号１２１〜１４４、
それぞれ配列番号１６５〜１８８、ならびに
少なくとも９８％の類似性を有する配列およびそれらの相補的配列
の中から選ばれた配列のうち１つでそれぞれ構成された遺伝子断片で構成された少なくとも１つの種プローブと接触させる。
【００５３】
２−  前記プローブとサンプルの核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されたか否かを決定する。ハイブリダイゼーション複合体が形成されていればアシネトバクター属の前記の種がサンプル中に存在することが決定される。
【００５４】
アシネトバクター属細菌の特定の種を検出する方法の第２の実施形態では、次の工程が行なわれる：
１−  本発明のオリゴヌクレオチドの前記混合物を含んでなる増幅プライマーを、アシネトバクター属の少なくとも１つの前記細菌の核酸を含むかまたは含む可能性のあるサンプルと接触させ、核酸増幅を、以下のものからなる酵素的重合反応により実施する。前記以下のものとは、
−５’プライマーとして、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物であって、配列番号１、３、５および７の配列のうち１つに含まれる配列を含んでなるか、好ましくは配列番号１、３、５および７の完全な配列または相補的配列で構成されるもの、ならびに、
−３’プライマーとして、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物であって、配列番号２、４、６および８のそれぞれの配列のうち１つに含まれる配列を含んでなるか、好ましくは配列番号２、４、６および８の完全な配列またはそれぞれの相補的配列で構成されるもの、である。
【００５５】
２−増幅産物が形成されたか否かを決定する。増幅産物が形成されたか否かによってサンプル中の前記細菌の有無がそれぞれ決定される。
より具体的には、次の２４の種、すなわち：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれたアシネトバクター属細菌の所与の種を決定することを狙いとしている。そして、上記工程２では、前記所与の細菌種の有無は、次の工程を行なうことにより決定される。
【００５６】
該工程は、
ａ）前記プライマーで増幅された遺伝子断片のシーケンス反応を行う、そして
ｂ）得られた前記増幅断片の配列を、細菌の遺伝子断片の配列と比較する。前記細菌の遺伝子断片の配列はそれぞれ：
−前記５’および３’プライマーが配列番号１および２の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号３３〜５６の配列を含み、
−前記５’および３’プライマーが配列番号３および４の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号７７〜１００の配列を含み、
−前記５’および３’プライマーが配列番号５および６の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号１２１〜１４４の配列を含み、
−前記５’および３’プライマーが配列番号５および６の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号１６５〜１８８の配列を含む。
【００５７】
アシネトバクター属細菌の特定の種を検出する方法の前記第２の実施形態の別の変形形態では、次の２４の種、すなわち：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（遺伝種１）、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（遺伝種２）、遺伝種３、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（遺伝種４）、Ａ．ｊｕｎｉｉ（遺伝種５）、遺伝種６、Ａ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（遺伝種７）、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ（遺伝種８）、遺伝種９、遺伝種１０、遺伝種１１、Ａ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（遺伝種１２）、遺伝種１３、遺伝種１６、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｂａｙｌｙｉ、Ａ．ｂｏｕｖｅｔｉｉ、Ａ．ｇｅｒｎｅｒｉ、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ、Ａ．ｔａｎｄｏｉｉ、Ａ．ｔｊｅｒｎｂｅｒｇｉａｅ、Ａ．ｔｏｗｎｅｒｉ、Ａ．ｐａｒｖｕｓの中から選ばれたアシネトバクター属細菌の特定の種を検出することを狙いとしている。そして、上記工程２では、前記所与の細菌種の有無は、次の工程を行なうことにより決定される。
【００５８】
該工程では、
ａ  −前記細菌のうち少なくとも１つの増幅核酸を含むかまたは含む可能性のあるサンプルを、本発明のｒｐｏＢ遺伝子断片または特定のオリゴヌクレオチド、好ましくは次の配列から選ばれた配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片から構成される、少なくとも１つの種プローブと接触させる。上記次の配列とは、
−前記５’および３’プライマーが配列番号１および２の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号３３〜５６の配列であり、
−前記５’および３’プライマーが配列番号３および４の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号７７〜１００の配列であり、
−前記５’および３’プライマーが配列番号５および６の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号１２１〜１４４の配列であり、
−前記５’および３’プライマーが配列番号７および８の配列にそれぞれ含まれる配列のオリゴヌクレオチドである場合、配列番号１６５〜１８８の配列である。
【００５９】
ｂ  −前記プローブとサンプルの増幅核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されたか否かを決定する。ハイブリダイゼーション複合体が形成されるかどうかによって、アシネトバクター属の前記の種がサンプル中に存在するか否かが決定される。
【００６０】
本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、以下の工程が行なわれる：
１−  本発明の前記オリゴヌクレオチド混合物の中から選ばれた１対の５’および３’プライマーを用いて前記サンプルの核酸を増幅する第１の増幅工程であって、前記オリゴヌクレオチド混合物は配列番号１および配列番号２の配列にそれぞれ含まれる配列を含むか、好ましくは配列番号１および配列番号２の配列または相補的配列で構成される。
【００６１】
２−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む増幅産物の有無を、ハイブリダイゼーションもしくは任意選択で配列決定によって決定する第１の決定工程であって、かつ工程１で得られたアンプリコンを配列番号３３〜５６および３４〜７６の中からそれぞれ選ばれ
た配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片と比較する。
【００６２】
―上記工程２において、種Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉまたはＡ．ｊｕｎｉｉの存在が測定された場合は、下記の工程も行なわれる。
３ａ−  本発明の前記オリゴヌクレオチド混合物の中から選ばれた１対の５’および３’プライマーを用いた第２の増幅反応工程であって、前記オリゴヌクレオチド混合物は配列番号３および配列番号４の配列にそれぞれ含まれる配列を含むか、好ましくは配列番号３および４の配列または相補的配列で構成される。
【００６３】
４ａ−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む増幅産物が形成されたか否かを、ハイブリダイゼーションもしくは任意選択で配列決定によって決定する工程であって、かつ工程３ａで得られたアンプリコンを配列番号７７〜１００の中からそれぞれ選ばれた配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片と比較する。
【００６４】
―最初の工程２において、種Ａ．ｂａｙｌｉｉまたは遺伝種１１の存在が測定された場合は、下記工程も行なわれる：
３ｂ−  本発明の前記オリゴヌクレオチド混合物の中から選ばれた１対の５’および３’プライマーを用いた第２の増幅反応工程であって、前記オリゴヌクレオチド混合物は配列番号７および配列番号８の配列にそれぞれ含まれる配列を含むか、好ましくは配列番号７および８の配列または相補的配列で構成される。
【００６５】
４ｂ−  少なくとも１つの前記細菌の核酸を含む増幅産物が形成されたか否かを、ハイブリダイゼーションもしくは任意選択で配列決定によって決定する工程であって、かつ工程３ｂで得られたアンプリコンを配列番号１６５〜１８８の中からそれぞれ選ばれた配列のうちの１つからそれぞれ構成される断片と比較する。
【００６６】
配列番号１〜２０８の配列は、遺伝子工学により、かつ／または当業者に周知の技術を使用する自動合成もしくは化学合成により調製することが可能である。
本発明のプローブは、任意の既知のハイブリダイゼーション技術を使用して該プローブとサンプル中の標的核酸との間のハイブリダイゼーション複合体が形成されるか否かを決定することにより、上述のように分析目的に使用することが可能である。前記ハイブリダイゼーション技術は特に、いわゆる「ドットブロット」技術［マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）］、「サザンブロット」と呼ばれるＤＮＡトランスファー技術［サザン  イー．エム．（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｅ．Ｍ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）  ９８：５０３］、「ノーザンブロット」と呼ばれるＲＮＡトランスファー技術、あるいはいわゆる「サンドイッチ」技術であって特に捕捉プローブおよび／または検出プローブを用い、これらのプローブが標的核酸の２つの異なる領域とハイブリダイズすることが可能で、かつ前記プローブのうち少なくとも一方（一般に検出プローブ）が、種に特異的な標的領域とハイブリダイズ可能であり、捕捉プローブおよび検出プローブは少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列をしていなければならないことを条件とする技術である。
【００６７】
検出される（標的）核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい（ＰＣＲ増幅の後に最初に得られたもの）。二本鎖の核酸標的を検出する場合、検出法を開始する前に該核酸を変性させなければならない。標的核酸は、既知の方法を使用して試験するサンプルの核酸を抽出することによって得てもよい。二本鎖の核酸の変性は、既知の化学的、物理的または酵素的変性方法を使用して、特に８０℃を越える適温に加熱することによって実施することができる。
【００６８】
上述のハイブリダイゼーション技術、特に「サンドイッチ」技術を実施するために、捕捉プローブと呼ばれる本発明のプローブを固体担体上に固定化し、検出プローブと呼ばれる本発明の別のプローブをマーカー物質によって標識する。担体およびマーカー物質の例は先に定義したとおりである。
【００６９】
有利には、１つの種プローブを固体担体上に固定化し、別の種プローブをマーカー物質によって標識する。
本発明のオリゴヌクレオチドの前記混合物の別の適用は、ヌクレオチドプライマーとしてのその使用である。該ヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜８の配列のうち１つに含まれる少なくとも１２個のヌクレオチドパターンの配列を有するモノカテナリーのオリゴヌクレオチドを含み、ポリメラーゼ存在下での周知の方法において、例えば特にポリメラーゼ存在下での増幅方法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において核酸の合成に使用することが可能である。特に、本発明のプライマーを、アシネトバクター属の細菌種のメッセンジャーＲＮＡ配列の特異的な逆転写に使用して、対応する相補的ＤＮＡ配列を得ることが可能である。逆転写によりＲＴ−ＰＣＲ技術の第１工程が成されたら、次の工程は得られた相補的ＤＮＡのＰＣＲ増幅である。
【００７０】
特定の１例では、本発明のオリゴヌクレオチドを含むプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータ（プロモータＴ７、Ｔ３、ＳＦ６（例えばスタディエル
エフダブリュ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ＦＷ）、ビーエイ  モファット（ＢＡ  Ｍｏｆｆａｔｔ）、１９８６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １８９：１１３）のセンス配列またはアンチセンス配列をも含む。前記プライマーは、転写工程、例えばＮＡＳＢＡ技術あるいは３ＳＲ技術［ファンゲーメン  ビー（Ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎ  Ｂ．）ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＭＡ  １０９１、第７回国際エイズ会議（１９９１）イタリア国フローレンス］などを要する核酸増幅方法に使用することが可能である。
【００７１】
本発明のさらなる主題はヌクレオチドプライマーであり、該ヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜８の配列のうち１つを含む、または好ましくは配列番号１〜８の配列のうち１つで構成されるオリゴヌクレオチドの中から選ばれた、モノカテナリーのオリゴヌクレオチドの混合物からなり、アシネトバクター属の任意の種のｒｐｏＢ遺伝子またはｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサもしくはｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサの全体または一部の配列を決定するために使用することが可能である。
【００７２】
アシネトバクター属の任意の細菌のｒｐｏＢ遺伝子またはｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサまたはｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサの全体または一部の配列を決定することにより、この配列のバイオコンピュータ分析によって任意のアシネトバクター属細菌の同定が可能となり、また未知のアシネトバクター属細菌の新種を認識することも可能となる。
【００７３】
好ましくは、ｒｐｏＢ遺伝子またはｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサまたはｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサの配列を決定するためのプライマーとして使用するために、配列番号１および２の配列のオリゴヌクレオチドの混合物が使用される。
【００７４】
本発明のさらなる主題は、本発明の方法において使用可能な分析キットである。該キットは、配列番号９〜１８８の配列のうちの１つを含むかまたは該配列で構成される本発明の前記ｒｐｏＢ遺伝子断片またはｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサ断片またはｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ断片を少なくとも１つ含み、または配列番号１〜８の配列に含まれる配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドの等モル混合物を含み、また上記に定義されるような相補的配列のｒｐｏＢ遺伝子断片またはｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサ断片またはｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサ断片のオリゴヌクレオチドを含み、かつ好ましくは、適宜ハイブリダイゼーション反応もしくは増幅反応に、または配列決定に使
用することができる試薬を含む。
【００７５】
定義の項目で述べたように、本発明のオリゴヌクレオチドまたは核酸断片は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の形態でも、ＴがＵに置き換わっているリボ核酸（ＲＮＡ）の形態でもよい。
【００７６】
最後に、本発明の最後の主題は、アシネトバクター属の１つの種に属する菌株によって引き起こされた感染症を治療するための遺伝子治療用プローブであり、該プローブは、先に定義したようなオリゴヌクレオチドを含んでなる。この遺伝子治療用プローブは、前記細菌のメッセンジャーＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズ可能であり、翻訳および／または転写および／または複製の現象を阻害することが可能である。
【００７７】
遺伝子治療の原理は周知であり、特に、アンチセンス鎖に相当するプローブの使用に基づいている。該プローブとセンス鎖との間のハイブリッド形成により、遺伝情報を解読するステップのうち少なくとも１つを妨害することが可能である。したがって、遺伝子治療用プローブは、アシネトバクター属の細菌によって引き起こされた感染症を治療するための抗菌性医薬品として使用することが可能である。
【００７８】
本発明を実行するために行なわれた実験ならびにその結果に関する以下の記載を助けとすれば、本発明のその他の特性および利点が明らかとなり、また本発明が一層よく理解されるであろう。これらの実験および結果は単なる例示として示されるものである。
【００７９】
以下の表１は、ｒｐｏＢおよびｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサおよびｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサの配列を決定したアシネトバクター属の種のリストを再掲するものである。記載された菌株は、パストゥール研究所コレクション（ＣＩＰ）から入手したものであり、配列番号１〜２０８の配列は配列表として追記されている。
【００８０】
表２は、ｒｐｏＢ遺伝子の増幅および配列決定に使用された種々のプライマーを列挙するものである。
表２にヌクレオチドＷ、Ｈ、Ｙ、Ｖ、Ｒ、Ｂ、Ｍ、Ｋ、ＳまたはＤを含む配列が示されている場合、これらのヌクレオチドは当業者に周知の意味を有し、同様に従来の方法で、これらのプライマーは、上記に説明したように前記ヌクレオチドの代わりに異なる配列のオリゴヌクレオチドの等モル混合物の形で使用される。
【００８１】
表３は、Ｃ．ａｆｆｅｒｎｉｅｎｔａｎｓの２つの亜種の間、ならびに１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列間の類似度が９８．５％以上であって近縁と思われる１１対の種の間の、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子およびｒｐｏＢ遺伝子の配列の類似度を比較し、得られた平均類似度の統計学的比較により示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
１−材料および方法。
１．１  菌株
使用した菌株は、表１に列挙されている。菌株はすべて、コロンビア寒天（５％ヒツジ血液）上で培養し、好気条件下で３７℃にて４８時間インキュベートした。
【００８３】
１．２  ｒｐｏＢ遺伝子ならびにｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサおよびｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサの増幅と配列決定
最も近縁の種におけるｒｐｏＢ遺伝子および該遺伝子に接する遺伝子間スペーサを、コンセンサス配列を得るためにアラインした。選ばれた配列は、アシネトバクター属細菌のＡＤＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００５９６６）、Ｐｓｅｕｄｏｎｉｏｎａｓ  
ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏのＤＣ３０００菌株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ  ００４５７８）およびＰ．ｐｕｔｉｄａのＫＴ２４４０（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ  ００６３４７）であった。該コンセンサス配列により、その後ＰＣＲ技術、「ゲノムウォーキング」および配列決定に使用されるプライマー決定が可能となった。一部のプライマーは結果の分析の後に決定された。プライマーを以下の表２に示す。
【００８４】
細菌ＤＮＡは、菌株の懸濁物から、ＱＩＡａｍｐ血液キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ連邦共和国ヒルデン所在）を製造業者メーカーの推奨に従って使用して抽出した。ＰＣＲ反応混合物はいずれも、１μｌあたり２．５×１０−２ＵのＴａｑポリメラーゼ、１×Ｔａｑバッファー、１．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ、フランス国セルジーポントアーズ所在）、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）有限会社、ドイツ連邦共和国ヒルデン所在）、および０．２μＭの各プライマー（ユーロゲンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ベルギー国スラン所在）を含むものとした。該ＰＣＲ反応混合物について、９４℃で３０秒間の変性、３０秒間のプライマーハイブリダイゼーション、および７２℃で２分間の伸長のサイクルを３５回実施した。増幅プログラムはそれぞれ９５℃で２分間の変性ステップで始め、７２℃１０分間の伸長ステップで終えた。遺伝子の末端配列の決定は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）キット（クロンテックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州パロアルト所在）を使用して実施した。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩおよびＳｃａＩによって消化した。ＤＮＡ断片を、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒアダプタに結合させ、製造業者によって提供された「アダプタ・プライマー」および特異的プライマーを加えることによりＰＣＲを実施した。増幅については、１．５ＵのＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（ベーリンガーマンハイム）を、１０ｐｍｏｌの各プライマー、２０ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５μｌの消化済みＤＮＡと共に最終容量５０μｌとして使用した。アンプリコンは「ＱｌＡｑｕｉｃｋスピンＰＣＲ精製キット」（キアゲン）で精製した。シーケンス反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３１００
ＤＮＡシークエンサの試薬（ｄＲｈｏｄ．Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＲＲミックス（パーキン・エルマー・アプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して実施した。
【００８５】
ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅および配列決定の条件はカミス（Ｋｈａｍｉｓ）ら、２００３に記載されたものである。
１．３  ｒｐｏＢ遺伝子中の識別可能な部分配列の決定
保存された領域に隣接した高変異性の配列部分を検出するために、本発明者らはＳＶＡＲＡＰプログラム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＶＡＲｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（URL: http://ifr48.free.fr/recherche/jeu cadre/jeu rickettsie.html ）のハイパーテキスト・リンク「Ｔｅｌｅｃｈａｒｇｅｍｅｎｔ」））を使用した。この分析がなされたら、ｒｐｏＢ遺伝子の最も多型に富む領域が決定され、周辺の保存された領域内で選ばれた普遍的プライマーが、種々の不成功な試みの末に選定された。普遍的プライマーを用いるＰＣＲ条件は以前に述べたものと同じであった。これらのプライマーを、テストしたすべての菌株の４つの高変異性領域の増幅および配列決定に使用した。
【００８６】
これらのプライマーを下記の表３および図１に示す。
１．４  ｒｐｏＢおよびｒｐｏＢに接する遺伝子間スペーサの配列分析
本研究で得られたｒｐｏＢ遺伝子配列の断片および境界を接する遺伝子間スペーサ断片を、「配列分析ソフトウェア」（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して分析した。また、「シーケンス・アセンブラー・ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）」（アプライド・
バイオシステムズ）を使用して部分配列を組み合わせて単一のコンセンサス配列とした。菌株のパストゥール研究所（「ＣＩＰ」）（フランス（パリ））への寄託参照番号はすべて表１に列挙されている。異なる種の遺伝子間の多重アラインメントおよび類似度（％）は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩサーバー（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、１９９４）上でＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用して実施した。配列から、「近隣結合（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ）」法（フェルセンシュタイン（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ）ら、１９８９）を使用して進化系統樹を作成した。ＰＨＹＬＩＰソフトウェアの中のＳＥＱＢＯＯＴを使用して「ブートストラップ」値を算出し、ノードの信頼性を評価した。
【００８７】
２−  結果
ａ．種々のアシネトバクター属細菌種のｒｐｏＢ遺伝子の完全長配列
選定されたプライマーにより、使用したすべての菌株の被検領域の増幅が可能であった。
完全長の遺伝子のサイズはすべての種について４０８９ｂｐである。菌株間の類似度（％）は、２組の種を例外として８３〜９４％である（表４）。Ａ．ｊｕｎｉｉ／Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉとＡ．ｂａｙｌｙｉ／遺伝種１１の２組の種間では類似度は９９％である。その他の種では互いに類似度は９５％未満である。
【００８８】
ｂ．ｒｐｏＢ遺伝子の部分配列に基づいたアシネトバクター属の様々な種の同定
ＳＶＡＲＡＰプログラムにより、保存された領域によって境界された２つの変異性領域の同定が可能であり、普遍的プライマーの作成が可能となった：
領域１：部位２９００〜３２５０、ならびに
領域２：部位３２５０〜３７００  ｂｐ（図１）。
【００８９】
これらの領域は、アシネトバクター属のすべての種およびＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉのすべての菌株からプライマーを使用して増幅された。領域１のサイズは３５０ｂｐであり、領域２は４５０ｂｐである。異なる種の間の領域１の類似度（％）は、２組を除くすべての種について７８．６〜９５．４％である。完全長配列に関しては、Ａ．ｂａｙｌｙｉ／遺伝種１１およびＡ．ｊｕｎｉｉ／Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉが最も高い類似度を有し、それぞれ９８％および９９．１％であるのに対し、その他の種では９６％未満である。領域２の類似度（％）は、すべての種について７５．８〜９５．３％であるが、この場合もＡ．ｊｕｎｉｉ／Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉおよびＡ．ｂａｙｌｙｉ／遺伝種１１は例外であり、最も高い類似度すなわちそれぞれ９８．８％および９９．６％を有し、その他の種では互いに類似度は９６％未満である。
【００９０】
領域１についてのＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの異なる菌株の種内類似度は、菌株ＣＩＰ１０３６５５を例外として９８．３〜１００％である。この菌株ＣＩＰ１０３６５５だけは他の菌株との類似度が９４．９〜９５．７％である。同様に、領域２では菌株ＣＩＰ１０３６５５を例外としたＡ．Ｂａｕｍａｎｉｉのすべての菌株について９８．７〜１００％である。菌株ＣＩＰ１０３６５５は、この菌種の他の菌株との類似度が９３．６〜９４．４％である。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに最も近縁の種は、領域１については遺伝種３、領域２についてはＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓであり、それぞれ類似度は９５．１％および９３．６％である。これらの値は、菌株ＣＩＰ１０３６５５を例外とした種内の変異性よりもはるかに低い値である。菌株ＣＩＰ１０３６５５については、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉのうち最も遠い菌株が領域１および２においてそれぞれ９４．９％および９３．６％の類似度を有している。
【００９１】
全体として、配列変異性は、完全長ｒｐｏＢ配列について０．８〜１６．９％であるのに比べ、部分配列については０．４〜２４．２％の範囲である。したがって、２つの部分
配列により、２４の種の明確な同定が可能となる。
【００９２】
ｃ．ｒｐｏＢ遺伝子に隣接する領域（遺伝子間スペーサｒｐｌＬ−ｒｐｏＢおよび遺伝子間スペーサｒｐｏＢ−ｒｐｏＣ）の分析
２つの遺伝子間スペーサのサイズは種によって変わる。ｒｐｌＬとｒｐｏＢとの間のスペーサのサイズは３０１〜３１０ｂｐである（表１）。種の間において、このｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサの類似度は８０．８〜９６．９％である。ただし例外として、Ａ．ｊｕｎｎｉｉおよびＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉの間では遺伝子間スペーサが同一であり、またＡ．ｂａｙｌｙｉと遺伝種１１およびＡ．ｌｗｏｆｆｉｉと遺伝種９などの種の組合せでは９８．４〜９９．７％の類似度を有する。
【００９３】
ｒｐｏＢとｒｐｏＣとの間の遺伝子間スペーサのサイズは８６〜１７７ｂｐであり（表１）、種の間の類似度は７０．２〜９６．５％である。ただし例外として、Ａ．ｊｕｎｎｉｉ／Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉでは９９．５％の高い類似度を有し、またＡｃｂ複合群（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉおよび遺伝種３）内では遺伝子間スペーサｒｐｏＢ−ｒｐｏＣの類似度は９８．５〜９９．０％である。一方、スペーサｒｐｌＬ−ｒｐｏＢと比較すると、Ａ．ｂａｙｌｙｉと遺伝種１１、およびＡ．ｌｗｏｆｆｉｉと遺伝種９は、ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣ遺伝子間スペーサについてそれぞれわずか８３．８および８７．９％の類似度を有するにすぎない。
【００９４】
Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの種内では、ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢ遺伝子間スペーサのサイズはすべての菌株について３０５ｂｐであり、ただし例外として菌株ＣＩＰ１０３６５５については３０４ｂｐである。ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣ遺伝子間スペーサのサイズは、すべての菌株について８６ｂｐである。この種においても同様に、ｒｐｏｌＬ−ｒｐｏＢスペーサの類似度は菌株ＣＩＰ１０３６５５を除くすべての菌株について９９〜１００％である。菌株ＣＩＰ１０３６５５は、他の菌株との類似度が９６．１〜９６．４％である。別の遺伝子間スペーサｒｐｏＢ−ｒｐｏＣはすべての菌株について１００％の類似度を有し、ただし例外として菌株ＣＩＰ１０３６５５は他の菌株との類似度が９７．７〜９８．８％である。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに最も近縁の種は、ｒｐｌＬ−ｒｐｏＢスペーサについては遺伝種３、ｒｐｏＢ−ｒｐｏＣスペーサについてはＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓであり、類似度はそれぞれ９５．９％および９８．５％である。これらは種内の類似性よりはるかに高い値であり、ただし例外として菌株ＣＩＰ１０３６５５については、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ種は、遺伝子間スペーサｒｐｌＬ−ｒｐｏＢおよびｒｐｏＢ−ｒｐｏＣについてそれぞれ９６．１％および９７．７％の類似度を有する。
【００９５】
配列番号５、６、７および８の配列のプライマーの位置から生じるので、これらのプライマーを使用して得られたアンプリコンに対応する断片は、実際の遺伝子間スペーサの配列と５’および３’端で重複する配列を有する。しかし本願に添付の配列表に示した配列番号１２１〜１４４および１６５〜１８８の配列は完全長の遺伝子間スペーサに相当し、ｒｐｌＬ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子およびｒｐｏＣ遺伝子とそれぞれ重複していない。
【００９６】
ｄ．アシネトバクター属細菌種の系統発生解析
ｒｐｏＢ遺伝子の完全長配列を用いて、近隣結合法で構築された進化系統樹は、非常に高いブートストラップ値で支持されている（図２）。ブートストラップ値は、完全長のｒｐｏＢ遺伝子を使用する場合７５％以上（１７／２２）であり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用する場合はわずかに７／２２である（ｐ＜０．０１）。すべての種がよく分離されて異なるグループになる。部分的なｒｐｏＢ遺伝子（領域１および領域２を連結したもの）に基づいた系統樹は、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの菌株群の均質性を示している。菌株ＣＩＰ１０３６５５は同じ群内のようであるが、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの他の単離株とは明白に分離されている。このグループ分けはブートストラップ値８５％に支持されている
。
【００９７】
２．４  議論
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を例外として、現在のところアシネトバクター属のすべての種についてのハウスキーピング遺伝子の配列決定は存在しない。遺伝子ｇｙｒＢおよびｒｅｃＡの配列は、ごく最近報告された１０の種については入手できない。ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９９６，  １９９９）ならびにクローツヴィク（Ｋｒａｗｃｚｙｋ）ら（２００２）は、１４の種のｇｙｒＢ遺伝子およびｒｅｃＡ遺伝子の配列を決定しており、この技法をＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（ブーベ（Ｂｏｕｖｅｔ）およびジンジン（Ｊｅａｎｊｅａｎ）、１９８９；ブーベ（Ｂｏｕｖｅｔ）およびグリモント（Ｇｒｉｍｏｎｔ）、１９８６；テルンバーグ（Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇ）およびウルシング（Ｕｒｓｉｎｇ）、１９８９）と比較した。１４の種を組み込んだｒｐｏＢ遺伝子に基づく系統樹の構築によって、異なる種の間で一致は観察されていない。しかしながら、ｒｐｏＢ遺伝子に基づく系統樹は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（４／１２）、ｇｙｒＢ（５／１２）およびｒｅｃＡ（６／１２）（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＝０．０１およびｐ＝０．０２）に基づく系統樹よりもはるかに高い７５％以上（１１／１２）のブートストラップ値を有している（図４）。このことは、ｒｐｏＢ遺伝子に基づいた系統樹の強健さを実証するものである。Ａ．ｌｗｏｆｆｉとアシネトバクター属の遺伝種９はｇｙｒＢ遺伝子上では１００％同一であるが、ｇｙｒＤおよびｒｅｃＡの配列上では分離される（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、１９９９；クローツヴィク（Ｋｒａｗｃｚｙｋ）ら、２００２）。ｒｐｏＢ遺伝子によって適切な境界を定められない種は、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉとＡ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種９の組合せである。不運にも、ｇｙｒＢおよびｒｅｃＡについてはＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉおよびＡ．ｂａｙｌｉｉの配列が利用できず、上記組合せを比較することはできない。
【００９８】
アシネトバクター属細菌の日常的な分子同定については、ｒｐｏＢ遺伝子および該遺伝子に接する２つの遺伝子間スペーサの部分配列の各々を、その識別力および長さを考慮して使用することが可能である。これらの配列のうちの１つだけを使用する場合の欠点は、Ａ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉおよびＡ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種９の組合せが良好に識別されないことである（表４〜１１）。しかしながらこの欠点は、これらの高変異性配列のうち少なくとも２つの配列を組み合わせることにより低減することが可能である。本発明者らは、そのサイズから領域１の配列で始めることが望ましいと考える。というのは、領域１の配列を使用して２４の種のうちの２０種を完全に同定することができるからである。得られた配列がＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ／Ａ．ｊｕｎｉｉのものである場合は、続いてこれら２つの種をよりよく区別する領域２の配列を実行するのがよい。得られた配列がＡ．ｂａｙｌｉｉ／遺伝種９に近縁である場合、これらの２つの種をよりよく区別するｒｐｏＢ―ｒｐｏＣスペーサの配列を決定することが望ましい。
【００９９】
Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ種の中で観察された短い断片の種内変異性は、菌株ＣＩＰ１０３６５５を例外として、すべての単離菌株がＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉとそれに最も近い種との間で観察される類似度よりも明らかに低い類似度を有することを示すものである。しかしながら、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ菌株ＣＩＰ１０３６５５と同種のその他の単離菌株との間に観察された低い類似度は、この種の一部の単離菌株の同定については曖昧なままである可能性を示している。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ種は最もヒトに影響を与えることの多い種である。上記の結果は、ＣＩＰ１０３６５５菌株が２４に分類された種とは異なり、恐らくＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ種の菌株ではないことを示している。
【０１００】
結論として、ｒｐｏＢ遺伝子ならびに遺伝子間スペーサｒｐｌＬ−ｒｐｏＢおよびｒｐｏＢ−ｒｐｏＣの部分配列の使用を通じて得られた結果は、これらのツールがアシネトバクター属菌株の日常的な分子同定に有効であることを示している。しかしながら、一部の
種の間の類似度が高いので、いくつかの種における種内類似度を検討するためのさらなる検討が必要であろう。さらに、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ菌株ＣＩＰ１０３６５５のような一部の菌株ならびにＡ．ｇｒｉｍｏｎｔｉｉおよびＡ．ｂａｙｌｉｉのような一部の種の状態について、他のハウスキーピング遺伝子（ｒｅｃＡおよびｇｙｒＢ）のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび配列によって調査しなければならない。
【０１０１】
【表１】
2008532537.tif 000002
2008532537.tif 000003
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
【表１０】
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【０１１１】
【表１１】
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【０１１２】
【表１２】
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【０１１３】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】アシネトバクター属の様々な種のｒｐｏＢ遺伝子配列および隣接配列の変異性の度合い（範囲部位変異性（range site variability）：ＲＳＶ（Ｙ軸））を５０ヌクレオチド枠（Ｘ軸）ごとに調べて示した図。保存された領域と境界を接し、コンセンサスプライマーを使用した種の同定に使用される高変異性領域をボックスで示す。
【図２】「近隣結合」法を使用してアシネトバクター属の様々な種の系統発生の関係を示す系統図。この系統樹はｒｐｏＢ遺伝子の配列アラインメントにより構築された。１０００個の系統樹サンプルに基づいて計算された「ブートストラップ」サンプリング値（ノード精度の確率（％））が、７５％以上の値についてのみ各ノードに示されている。
【図３】「近隣結合」法を使用してアシネトバクター属の様々な種の系統発生の関係を示す系統図。この系統樹はｒｐｏＢ遺伝子の高変異性配列（領域１および領域２）のアラインメントにより構築された。１０００個の系統樹サンプルに基づいて計算された「ブートストラップ」値（ノード精度の確率（％））が各ノードに示されている。
【図４】「近隣結合」法を使用してアシネトバクター属の様々な種の系統発生の関係を示す系統図。この４つの系統樹は、ｒｐｏＢ遺伝子、１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子の配列アラインメントにより構築された。１０００個の系統樹サンプルに基づいて計算された「ブートストラップ」サンプリング値（ノード精度の確率（％））が、７５％以上の値についてのみ各ノードに示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008532537.tif 000024