(57)【要約】  本発明は、配列番号１に構造的に関係するアミノ酸配列を含むポリペプチド及びかかるポリペプチドの使用を特徴とする。配列番号１は完全長Ｓ．アウレウスポリペプチドの切断誘導体である。完全長ポリペプチドを本明細書では完全長ペニシリン結合タンパク質４（「ＰＢＰ４」）と称する。配列番号１のＨｉｓ標識誘導体は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫応答を生じることが判明した。
2008513010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド免疫原であり、前記ポリペプチドはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して防御免疫をもたらし、１個以上の追加のポリペプチド領域が存在する場合には、前記追加の領域は配列番号３のアミノ酸３９８−４３１を含むカルボキシ末端をもたらさない、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド免疫原。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸４−３８５から本質的になる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号１の、メチオニン−配列番号１の、アラニン−セリン−配列番号１の又はメチオニン−アラニン−セリン−配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列とおよびカルボキシ末端又はアミノ末端において前記アミノ酸配列に共有結合した１個以上の追加の領域又は部分とを含み、各領域又は部分は、以下の諸性質、すなわち、免疫応答を増強する性質、精製を容易にする性質又はポリペプチドの安定性を高める性質のうち少なくとも１つを有する領域又は部分から独立に選択される、免疫原。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫原の免疫学的有効量とおよび薬剤として許容される担体とを含む、患者において防御免疫応答を誘導することができる組成物。
【請求項７】
前記組成物がさらにアジュバントを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含む核酸。
【請求項９】
前記核酸が発現ベクターである、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含む組換え細胞。
【請求項１１】
（ａ）ポリペプチドが発現される条件下で請求項１０に記載の組換え細胞を増殖させる段階と、および
（ｂ）前記ポリペプチドを精製する段階と
を含む、防御免疫をもたらすＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫原の免疫学的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において防御免疫応答を誘導する方法。
【請求項１３】
前記患者がヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者がＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して予防的に処置を受ける、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法によって製造されるポリペプチドの免疫学的有効量を患者に投与する段階を含む、患者における防御免疫応答を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願を通して引用する参考文献が本発明の従来技術であるとは認められない。
【０００２】
スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は広範な疾患及び症状の原因となる病原体である。Ｓ．アウレウスに起因する疾患及び症状の例としては、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、せつ、よう、膿か疹、水ほう性膿か疹、蜂か織炎、ボトリオミセス症、毒素性ショック症候群、熱傷様皮膚症候群、中枢神経系感染症、感染性及び炎症性眼疾患、骨髄炎（ｏｓｔｅｏｍｙｌｅｔｉｔｉｓ）並びに関節及び骨の他の感染症、気道感染症などが挙げられる。（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ  （ｅｄｓ．），  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．  １９９７．）
【０００３】
Ｓ．アウレウス感染及びＳ．アウレウスの伝播を抑えるために、免疫学に基づく戦略を使用することができる。免疫学に基づく戦略としては、受動免疫、能動免疫などが挙げられる。受動免疫は、Ｓ．アウレウスを標的にした免疫グロブリンの移行を使用する。能動免疫は、Ｓ．アウレウスに対する免疫応答を誘導する。
【０００４】
Ｓ．アウレウスワクチン候補は、Ｓ．アウレウス多糖及びポリペプチドを標的にする。ターゲティングは、適切なＳ．アウレウス多糖又はポリペプチドをワクチン成分として使用して実施することができる。多糖ワクチン成分候補の例としては、Ｓ．アウレウス５型及び８型きょう膜多糖が挙げられる。（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６：４９１−４９６，  ２００２．）ワクチン成分候補として使用することができるポリペプチドの例としては、コラーゲン付着因子、フィブリノーゲン結合タンパク質及びクランピング因子が挙げられる。（Ｍａｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：４７−５４，  １９９４，  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１：２６４０−２６４９，  １９９８，  Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８４：  １５７２−１５８０，  ２００１．）
【０００５】
Ｓ．アウレウスポリペプチド配列に関する情報は、Ｓ．アウレウスゲノムの配列を決定することによって得られる。（Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１２２５−１２４０，  ２００１，  Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１８１９−１８２７，  ２０００、Ｋｕｎｓｃｈ他、１９９７年７月３０日に発行された欧州特許公報ＥＰ  ０  ７８６  ５１９号。）ゲノム配列決定から得られたポリペプチド配列を特徴づけようとしてバイオインフォマティクスがある程度使用された。（Ｋｕｎｓｃｈ他、１９９７年７月３０日に発行された欧州特許公報ＥＰ  ０  ７８６  ５１９号。）
【０００６】
抗原候補をコードする遺伝子を特定するために、ディスプレイ技術を含む手法などの手法及び感染者の血清が一部使用された。（Ｆｏｓｔｅｒ他、２００１年１２月２７日に発行された国際公開第０１／９８４９９号、Ｍｅｉｎｋｅ他、２００２年８月１日に発行された国際公開第０２／０５９１４８号、Ｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９９：６５７３−６５７８，  ２００２．）
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、配列番号１に構造的に関係するアミノ酸配列を含むポリペプチド及びかかるポリペプチドの使用を特徴とする。配列番号１は完全長Ｓ．アウレウスポリペプチドの切断誘導体である。完全長ポリペプチドを本明細書では完全長ペニシリン結合タンパク質４（「ＰＢＰ４」）と称する。配列番号１のＨｉｓ標識誘導体は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫応答を生じることが判明した。
【０００８】
「防御」免疫又は免疫応答という表記は、Ｓ．アウレウス感染に対する検出可能な防御レベルを指す。この防御レベルは、本明細書に記載のモデルなどの動物モデルを用いて評価することができる。
【０００９】
従って、本発明の第１の態様は、配列番号３のアミノ酸３９８−４３１によって与えられるカルボキシ末端を含まない、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫を示す、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原である。配列番号３は、アミノ酸３９８−４３１がカルボキシ末端ドメインをもたらす完全長ＰＢＰ４ポリペプチドを与える。
【００１０】
「免疫原」という表記は、防御免疫をもたらす能力を示す。配列番号３のアミノ酸３９８−４３１によってもたらされるカルボキシ末端をポリペプチドが含まない、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むという表記は、配列番号１に関係する領域が存在し、追加のポリペプチド領域が存在し得ることを示す。追加のポリペプチド領域が存在する場合、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３９８−４３１によってもたらされるカルボキシルドメインを持たない。
【００１１】
基準配列に対する（同一割合（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）とも称される）同一性の割合（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、ポリペプチド配列を基準配列と整列させ、対応領域中の同一アミノ酸数を求めることによって決定される。この数値を基準配列（例えば、配列番号１）中のアミノ酸総数で除算し、次いで１００を掛け、最も近い整数に四捨五入する。
【００１２】
本発明の別の態様は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすアミノ酸配列とおよびカルボキシ末端又はアミノ末端においてポリペプチドに共有結合した１個以上の追加の領域又は部分とを含み、各領域又は部分は、以下の諸性質、すなわち、免疫応答を増強する性質、精製を容易にする性質又はポリペプチドの安定性を高める性質のうち少なくとも１つを有する領域又は部分から独立に選択される、免疫原を記述する。
【００１３】
「追加の領域又は部分」という表記は、ＰＢＰ４領域とは異なる領域又は部分を示す。例えば、追加の領域又は部分は、追加のポリペプチド領域又は非ポリペプチド領域とすることができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、患者においてＳ．アウレウスに対する防御免疫を誘導することができる組成物を記述する。この組成物は、薬剤として許容される担体と、Ｓ．アウレウスに対する防御免疫をもたらす免疫原の免疫学的有効量とを含む。
【００１５】
免疫学的有効量は、Ｓ．アウレウス感染に対して防御免疫をもたらすのに十分な量である。この量は、Ｓ．アウレウス感染の可能性又は重症度を有意に抑制するのに十分な量とすべきである。
【００１６】
本発明の別の態様は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む核酸を記述する。組換え遺伝子は、適切な転写及びプロセシングのための（翻訳要素及び翻訳後要素を含むことができる。）調節要素と一緒にポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。この組換え遺伝子は、宿主ゲノムとは無関係に存在することができ、又は宿主ゲノムの一部であることができる。
【００１７】
組換え核酸は、その配列及び／又は形態のために天然には存在しない核酸である。組換え核酸の例としては、精製核酸、天然に存在するのとは異なる核酸を与える結合された２個以上の核酸領域、及び本来は相互に関連する１個以上の核酸領域（例えば、上流又は下流領域）の欠如が挙げられる。
【００１８】
本発明の別の態様は組換え細胞を記述する。この細胞は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
【００１９】
本発明の別の態様は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドを製造する方法を記述する。この方法は、このポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え細胞を増殖させる段階と、このポリペプチドを精製する段階とを含む。
【００２０】
本発明の別の態様は、このポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え細胞を宿主中で増殖させる段階とこのポリペプチドを精製する段階とを含むプロセスによって製造された、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらすポリペプチドを記述する。様々な宿主細胞を使用することができる。
【００２１】
本発明の別の態様は、患者においてＳ．アウレウスに対する防御免疫応答を誘導する方法を記述する。この方法は、Ｓ．アウレウスに対して防御免疫をもたらす免疫原の免疫学的有効量を患者に投与する段階を含む。
【００２２】
特定の用語が相容れない場合を除き、「又は」という表記は一方又は両方の可能性を示す。「及び／又は」などの句は、一方又は両方の可能性を強調するのに使用することがある。
【００２３】
「含む」などの非制限的用語の表記では、要素又は段階を追加することができる。「１個以上」などの句は、追加の要素又は段階の可能性を強調するのに、非制限的用語と一緒に、又は非制限的用語なしで使用することがある。
【００２４】
「ａ」又は「ａｎ」などの用語の表記は、特に明示しない限り１に限定されない。例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は「複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）」を排除しない。１個以上などの句は、複数の可能な存在を強調するのに使用する。
【００２５】
本発明の他の特徴及び利点は、様々な実施例を含めて本明細書のさらなる説明から明らかである。記載した実施例は、本発明の実施に有用である様々な成分及び方法を説明するものである。実施例は、請求する本発明を限定するものではない。当業者は、本開示に基づいて、本発明の実施に有用である他の成分及び方法を確認し、使用することができる。
【００２６】
配列番号１関連ポリペプチドが防御免疫をもたらす能力を、配列番号２を用いて下記実施例中で説明する。配列番号２は、アミノ末端メチオニン（ｍｅｔｈｉｎｏｎｉｎｅ）−アラニン−セリン付加体とカルボキシルＨｉｓ−Ｔａｇとを含む、配列番号１の誘導体である。アミノ末端付加体は、制限酵素切断部位を与えるコード配列への改変から得られた。Ｈｉｓ−Ｔａｇは、ポリペプチドの精製及び識別を容易にする。
【００２７】
配列番号１はＰＢＰ４の誘導体である。完全長ＰＢＰ４ポリペプチド配列は、配列番号３によって与えられる。配列番号１は、アミノ末端メチオニン及びアミノ酸３９８−４３１を欠く点で配列番号３とは異なる。アミノ酸３９８−４３１は、膜結合に関与する推定カルボキシル疎水性領域である。
【００２８】
配列番号１に構造的に関係するポリペプチドとしては、様々なＳ．アウレウス系統及び誘導体中に存在する、天然領域の対応領域を含むポリペプチドなどが挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列を図１中の太字の領域によって示す。図１は、配列番号２中に存在する、アミノ末端メチオニン（ｍｅｔｈｉｎｏｎｉｎｅ）−アラニン−セリン付加体及びカルボキシルＨｉｓ−Ｔａｇも示す。
【００２９】
ＰＢＰ４配列
ＰＢＰ４はペニシリン（ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ）結合タンパク質である。（Ｈｅｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３９：２４１５−２４２２，  １９９５；Ｄｏｍａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６７：１１１−１１３，  １９９５；Ｈｅｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４０：２１２１−２１２５，  １９９６；Ｈｅｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ２：１９３−１９９，  １９９６；Ｄｏｍａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７９：２６５１−２６５７，  １９９７．）
【００３０】
他の天然ＰＢＰ４配列は、公知ＰＢＰ４配列と比較して、高度の配列類似度又は隣接アミノ酸の依存に基づいて特定することができる。隣接アミノ酸は特徴的なタグとなる。異なる実施形態においては、天然ＰＢＰ４配列は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、好ましくはＳ．アウレウス中に存在する配列であり、配列番号１同様、少なくとも２０、少なくとも３０若しくは少なくとも５０個の隣接アミノ酸を有し、及び／又は配列番号１と少なくとも８５％の配列類似度若しくは同一性を有する。
【００３１】
配列類似度は、当分野で周知の様々なアルゴリズム及び技術によって求めることができる。一般に、配列類似度は、配列の一方におけるギャップ、付加及び置換を容認にする、最大のアミノ酸同一性が得られるように２個の配列を整列させる技術によって決定される。
【００３２】
配列類似度は、例えば（≪ｓｉｍ≫プログラム用に、Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  １２：３３７−３５７，  １９９１によって開発された）プログラムｌａｌｉｇｎを利用した局所的アラインメントツールを用いて決定することができる。オプション及び環境変数は、第１の残基ギャップに対する−ｆ  ＃  Ｐｅｎａｌｔｙ（デフォルトの−１４）、ギャップ中の各追加の残基に対する−ｇ  ＃  Ｐｅｎａｌｔｙ（デフォルトの−４）−ｓ  ｓｔｒ（ＳＭＡＴＲＩＸ）代替スコアリングマトリックスファイルのファイル名である。タンパク質配列の場合、ＰＡＭ２５０を配列アラインメントのデフォルト−ｗ  ＃（ＬＩＮＬＥＮ）出力印字幅（６０）で使用する。
【００３３】
配列番号１関連ポリペプチド
配列番号１「関連」ポリペプチドは、完全長ＰＢＰ４又はその断片に構造的に関係する領域を含む。配列番号１関連ポリペプチドは、天然ＰＢＰ４の対応領域と少なくとも約８５％の配列同一性を有するポリペプチドである。「ポリペプチド」という表記は、最小又は最大サイズ限界を与えない。
【００３４】
配列番号１と少なくとも８５％同一であるポリペプチドは、配列番号１からの最高約５６個のアミノ酸変化を含む。異なる実施形態においては、配列番号１関連ポリペプチドは、配列番号１と９０％、少なくとも９４％若しくは少なくとも９９％同一であり、配列番号１と０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個のアミノ酸変化だけ異なり、又はアミノ酸配列番号１から本質的になる。各アミノ酸変化は、独立に付加、欠失又は置換である。
【００３５】
示したアミノ酸から「本質的になる」という表記は、参照アミノ酸が存在し、追加のアミノ酸が存在してもよいことを示す。追加のアミノ酸は、カルボキシル又はアミノ末端位とすることができる。異なる実施形態においては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の追加のアミノ酸が存在する。さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号１、メチオニン−配列番号１、アラニン−セリン−配列番号１又はメチオニン−アラニン−セリン−配列番号１からなる。
【００３６】
配列番号１を変更して、Ｓ．アウレウスに対する防御免疫を誘導することができる誘導体を得ることができる。変更を実施して、例えば、Ｓ．アウレウスに対する防御免疫誘導能力を保持する誘導体を得ることができ、又は防御免疫をもたらすことに加えて、特定の目的を達成することができる領域も有する誘導体を得ることができる。
【００３７】
図２の配列比較を使用して、配列番号１の変更候補の設計を導くことができる。図２は、様々な天然配列、すなわち、配列番号３（ＣＯＬ，  ＳＡ０６９９；ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）、配列番号４（ＭＳＲＡ．ＳＡＲ０６５２，  Ｈｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １０１（２６）：９７８６−９７９１，  ２００４）、配列番号５（ＳＡＶ０６４２，  Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１２２５−１２４０，  ２００１）、配列番号６（ＭＷ２，  ＭＷ０６０４  Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：  １８１９−１８２７，  ２００２及びＭＳＳＡ，  ＳＡＳ６０８  Ｈｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １０１（２６）：９７８６−９７９１，  ２００４）、配列番号７（Ｕ２９４５４，  Ｄｏｍａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  １６７：  １１１−１１３  １９９５）及び配列番号８（Ｘ９１７８６，  Ｈｅｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４０：  ２１２１−２１２５，  １９９６）である。
【００３８】
また、変更は、他のＰＢＰ４配列を考慮し、アミノ酸の公知の諸性質を考慮して行うことができる。一般に、異なるアミノ酸を置換して活性を維持する際には、類似した諸性質を有するアミノ酸を交換することが好ましい。アミノ酸置換で考慮することができる要因としては、アミノ酸のサイズ、電荷、極性及び疎水性などが挙げられる。アミノ酸の諸性質に対する様々なアミノ酸Ｒ基の効果は当分野で周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  １９８７−２００２，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃを参照されたい。）。
【００３９】
アミノ酸を交換して活性を維持する際には、置換アミノ酸は、ほぼ同じ電荷及び／又はサイズ及び／又は極性及び／又は疎水性などの１つ以上の類似した性質を有するべきである。例えば、ロイシンをバリンで、リジンをアルギニンで、グルタミンをアスパラギンで置換することは、ポリペプチド機能を変化させない良好な候補である。
【００４０】
特定の目的を達成する変更としては、ポリペプチドの産生又は効力を高めるように設計された変更、コードされた核酸のクローニングなどが挙げられる。ポリペプチド産生は、組換え発現に適切な（例えば、メチオニンをコードする）開始コドンを使用することによって促進することができる。メチオニンは、後で細胞のプロセシング中に除去することができる。クローニングは、例えば、アミノ酸付加又は変化に付随し得る制限酵素切断部位を導入することによって促進することができる。
【００４１】
免疫応答を誘導するポリペプチドの効力は、エピトープを増強することによって高めることができる。エピトープの増強は、ＭＨＣ分子に対するペプチド親和性を改善するアンカー残基の変更を含む技術、Ｔ細胞受容体に対するペプチド−ＭＨＣ複合体の親和性を増大させる技術などの様々な技術を用いて実施することができる。（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １：２０９−２１９，  ２００１．）
【００４２】
好ましくは、ポリペプチドは精製ポリペプチドである。「精製ポリペプチド」は、ポリペプチドに天然に付随する１種類以上の他のポリペプチドを欠く環境中に存在し、及び／又は存在する総タンパク質量の少なくとも約１０％に相当する。異なる実施態様においては、精製ポリペプチドは、試料又は調製物中の総タンパク質量の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約９５％である。
【００４３】
一実施態様においては、ポリペプチドは「実質的に精製されている」。実質的に精製されたポリペプチドは、ポリペプチドに天然に付随する全て又は大部分のポリペプチドを欠く環境中に存在する。例えば、実質的に精製されたＳ．アウレウスポリペプチドは、全て又は大部分の他のＳ．アウレウスポリペプチドを欠く環境中に存在する。環境は、例えば、試料又は調製物とすることができる。
【００４４】
「精製された」又は「実質的に精製された」という表記は、ポリペプチドを精製する必要がない、例えば、精製されていない化学合成ポリペプチドを含むことができる。
【００４５】
ポリペプチドの安定性は、ポリペプチドカルボキシル又はアミノ末端を修飾することによって高めることができる。可能な修飾の例としては、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニルなどのアミノ末端保護基及びアミド、メチルアミド、エチルアミドなどのカルボキシ末端保護基が挙げられる。
【００４６】
本発明の一実施態様においては、ポリペプチド免疫原は、カルボキシ末端又はアミノ末端においてポリペプチドに共有結合した１個以上の追加の領域又は部分を含む免疫原の一部であり、各領域又は部分は、以下の諸性質、すなわち、免疫応答を増強する性質、精製を容易にする性質又はポリペプチドの安定性を高める性質のうち少なくとも１つを有する領域又は部分から独立に選択される。ポリペプチドの安定性は、例えば、アミノ又はカルボキシ末端上に存在し得るポリエチレングリコールなどの基を用いて高めることができる。
【００４７】
ポリペプチドの精製は、精製を容易にする基をカルボキシル又はアミノ末端に付加することによって向上させることができる。精製を容易にするのに使用することができる基の例としては、親和性タグを与えるポリペプチドが挙げられる。親和性タグの例としては、６−ヒスチジンタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオン及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。
【００４８】
ポリペプチドの免疫応答生成能力は、免疫応答を一般に高める基を用いて増強することができる。ポリペプチドに対する免疫応答を高めるためにポリペプチドに結合させることができる基の例としては、ＩＬ−２などのサイトカインが挙げられる。（Ｂｕｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３７：５４５−５５２．）。
【００４９】
ポリペプチド製造
ポリペプチドは、化学合成を含む標準技術、及びポリペプチド産生細胞からの精製を含む標準技術を含めて、標準技術によって製造することができる。ポリペプチドの化学合成技術は当分野で周知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｄｅｃｋｅｒ，  １９９０を参照されたい。）。組換えポリペプチドの製造及び精製技術も当分野で周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  １９８７−２００２を参照されたい。）
【００５０】
細胞からポリペプチドを得ることは、ポリペプチドを製造する組換え核酸技術を用いて促進される。ポリペプチドを製造する組換え核酸技術は、ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を細胞中に導入して、又は細胞中で生成させて、ポリペプチドを発現させる必要がある。
【００５１】
組換え遺伝子は、ポリペプチドをコードする核酸をポリペプチド発現調節要素と一緒に含む。組換え遺伝子は細胞ゲノム中に存在することができ、又は発現ベクターの一部とすることができる。
【００５２】
組換え遺伝子の一部として存在し得る調節要素としては、ポリペプチドコード配列に天然に付随する調節要素、ポリペプチドコード配列に天然には付随しない外来性調節要素などが挙げられる。外来性プロモーターなどの外来性調節要素は、特定の宿主における組換え遺伝子発現に有用であり得、又は発現レベルを増加させるのに有用であり得る。一般に、組換え遺伝子中に存在する調節要素としては、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーターなどが挙げられ、場合によってはオペレーターも挙げられる。真核細胞におけるプロセシングに好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。
【００５３】
細胞中での組換え遺伝子発現は、発現ベクターを使用すると容易である。発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞中で自己複製するための複製開始点、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位及び高複製能力も含むことが好ましい。発現ベクターの例は、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド及びウイルスなどである。
【００５４】
遺伝コードの縮重のために、多種多様なコード核酸配列を使用して特定のポリペプチドをコードすることができる。遺伝コードの縮重は、ほぼ全てのアミノ酸が３個のヌクレオチド、すなわち「コドン」の異なる組み合わせによってコードされているために発生する。アミノ酸は、以下のコドンによってコードされる。
【００５５】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ
【００５６】
配列番号１関連ポリペプチドの組換え核酸発現に適切な細胞は原核生物及び真核生物である。原核細胞の例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウスなどのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の細胞、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）などのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細胞、Ｌ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）などのラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細胞及びＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細胞が挙げられる。真核細胞の例としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の細胞（例えば、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ハンゼヌラ（ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の細胞（例えば、Ｈ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞（例えば、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）又はＫ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ））、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞（例えば、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ））などの酵母細胞が挙げられる。
【００５７】
組換え遺伝子製造技術、細胞への導入及び組換え遺伝子発現は当分野で周知である。かかる技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  １９８７−２００２及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９などの参考文献にある。
【００５８】
特定の宿主における発現は、必要に応じて、コドンを最適化することによって促進することができる。コドンの最適化は、より好ましいコドンの使用を含む。様々な宿主におけるコドン最適化技術が当分野で周知である。
【００５９】
配列番号１関連ポリペプチドは翻訳後修飾、例えば、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化又はアセチル化を含むことができる。「ポリペプチド」又はポリペプチドの「アミノ酸」配列という表記は、哺乳動物、昆虫又は酵母の宿主細胞などの宿主細胞由来の、翻訳後修飾構造を有する１個以上のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
【００６０】
翻訳後修飾は、化学的に、又は適切な宿主を利用して、行うことができる。例えば、Ｓ．セレビシエにおいては、最後から２番目のアミノ酸の性質によってＮ末端メチオニンが除去されるかどうかが決まると考えられる。また、最後から２番目のアミノ酸の性質によって、Ｎ末端のアミノ酸がＮα−アセチル化されるかどうかも決まる（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：８２４２−８２４６，  １９８７）。別の例としては、分泌性リーダー（例えば、シグナルペプチド）が存在するために分泌の標的となる、Ｎ結合型又はＯ結合型グリコシル化によって修飾されたポリペプチドが挙げられる。（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５６：９１５−９４４，  １９８７．）
【００６１】
アジュバント
アジュバントは、免疫原の免疫応答生成を助けることができる物質である。アジュバントは、抗原の生物学的又は免疫学的半減期の増加、抗原提示細胞への抗原送達の向上、抗原提示細胞による抗原プロセシング及び提示の向上、並びに免疫調節性サイトカインの産生誘導の１つ以上などの異なる機序によって機能することができる。（Ｖｏｇｅｌ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０（ｓｕｐｐｌ．  ３）：Ｓ２６６−２７０，  ２０００．）
【００６２】
多種多様なアジュバントを使用して免疫応答の生成を助けることができる。特定のアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は他のアルミニウム塩、リン酸カルシウム、ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ、モノホスホリル脂質Ａ、コレラ毒素、Ｅ．コリ熱不安定性毒素、百日咳毒素、ムラミルジペプチド、フロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫賦活性複合体、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニン、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチドアナログ、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＳＣＯＭＳが挙げられる。（Ｖｏｇｅｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０（ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ２６６−２７０，  ２０００，  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９：３１１−３２１，  ２０００，  Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１１８０−１１８７，  ２００１，  Ｋｅｒｓｔｅｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：９１５−９２０，  ２００３，  Ｏ’Ηａｇｅｎ  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｏｒｄ．，  １：２７３−２８６，  ２００１．）
【００６３】
防御免疫を誘導するための患者
「患者」とは、Ｓ．アウレウスに感染し得る哺乳動物を指す。患者は、予防又は治療上の処置を受けることができる。予防処置は、Ｓ．アウレウス感染の可能性又は重症度を抑制するのに十分な防御免疫をもたらす。治療処置は、Ｓ．アウレウス感染の重症度を軽減するために実施することができる。
【００６４】
予防処置は、本明細書に記載の免疫原を含むワクチンを用いて実施することができる。かかる治療は好ましくはヒトに対して実施される。ワクチンは一般人又はＳ．アウレウス感染リスクの高い人に投与することができる。
【００６５】
Ｓ．アウレウス感染リスクの高い人としては、医療従事者、病院患者、免疫系の低下した患者、手術中の患者、外来移植片、かかるカテーテル又は血管装置を受けた患者、免疫低下をもたらす治療を受けている患者、火傷又は創傷のリスクが高い職業の人などが挙げられる。（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ  （ｅｄ．），  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．  １９９７．）
【００６６】
Ｓ．アウレウスに感染し得る非ヒト患者としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、マウスなどが挙げられる。非ヒト患者の治療はペット及び家畜の保護並びに特定の治療の効力の評価に有用である。
【００６７】
混合ワクチン
配列番号１関連ポリペプチドは、単体で使用して、又は他の免疫原と併用して、免疫応答を誘導することができる。添加可能な追加の免疫原としては、上記発明の背景に記載の免疫原などの１種類以上の追加のＳ．アウレウス免疫原、Ｓ．エピデルミディス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．ヘモリティカス（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ワーネリ（ｗａｒｎｅｒｉ）、Ｓ．ルグネンシス（ｌｕｇｕｎｅｎｓｉｓ）などの１種類以上の他のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）生物を標的とする１種類以上の免疫原、他の感染生物を標的とする１種類以上の免疫原などが挙げられる。
【００６８】
動物モデル系
動物モデル系を用いて、免疫原がＳ．アウレウスに対して防御免疫応答を生じる効力を評価した。動物モデルは、定常期の細胞から調製し、適切に滴定し、静脈内投与したＳ．アウレウスを含む低速の致死モデルであった。死亡速度が遅いと、細菌感染を撃退する特異的免疫防御に要する時間は十分である（例えば、２４時間ではなく１０日間）。
【００６９】
定常期のＳ．アウレウス細胞は、固体培地上で増殖した細胞から得ることができる。定常期のＳ．アウレウス細胞は、液体からも得ることができるが、固体培地上で増殖した細胞の結果はより再現性があった。細胞は、好都合には、固体培地上で終夜増殖させることができる。例えば、Ｓ．アウレウスは、倍加時間が約２０分から３０分という条件下で約１８から約２４時間増殖させることができる。
【００７０】
Ｓ．アウレウスは、固体又は液体培地から標準技術によって単離して、効力を維持することができる。単離したＳ．アウレウスは、例えば、グリセリンを含むリン酸緩衝食塩水中の洗浄された高密度懸濁液（＞１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ）として−７０℃で保存することができる。
【００７１】
Ｓ．アウレウス投与は、動物モデルにおいて第１日又は第２日から始まり約７日から１０日の期間にわたって約８０％から９０％の死亡をもたらす効力を有するべきである。保存Ｓ．アウレウス接種材料の効力をモニターするために、動物モデルを用いて力価測定実験を実施することができる。滴定実験は、接種実験の約１から２週間前に実施することができる。
【００７２】
投与
免疫原は、当分野で周知の技術と一緒に本明細書の指針によって、処方し、患者に投与することができる。薬剤投与指針は、一般に、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｅｄｓ．  Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２０００及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｓ．  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  １９９０に記載されており、これらの各々を参照により本明細書に組み入れる。
【００７３】
薬剤として許容される担体は、保存及び患者への免疫原投与を容易にする。薬剤として許容される担体は、緩衝剤、注射用滅菌水、等張食塩水又はリン酸緩衝食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩、ポリソルベートなどの様々な成分を含むことができる。
【００７４】
免疫原は皮下、筋肉内、粘膜などの様々な経路によって投与することができる。皮下及び筋肉内投与は、例えば、針又は噴射式注射器を用いて実施することができる。
【００７５】
適切な投薬計画は、患者の年齢、体重、性別及び健康状態、投与経路、所望の効果並びに使用される特定の化合物を含めて当分野で周知の要因を考慮して決定することが好ましい。免疫原は、複数回投与ワクチン形式で使用することができる。１回分は全ポリペプチド１．０μｇから１．０ｍｇの範囲からなると予想される。本発明の異なる実施態様においては、この範囲は０．０１ｍｇから１．０ｍｇ及び０．１ｍｇから１．０ｍｇである。
【００７６】
投与のタイミングは当分野で周知の要因によって決まる。最初の投与後、１回以上の追加量を続けて投与して抗体価を維持又は増大させることができる。投薬計画の例は、１日目の投薬、１ヶ月目の投薬、４、６又は１２ヶ月目の第３の投薬、及び必要に応じ離れた時間でのさらなる追加投薬である。
【００７７】
抗体の産生
配列番号１関連ポリペプチドを使用して、ポリペプチド又はＳ．アウレウスに結合する抗体及び抗体断片を産生することができる。かかる抗体及び抗体断片は、ポリペプチド精製、Ｓ．アウレウスの識別、又はＳ．アウレウス感染に対する治療処置若しくは予防処置における使用を含めて様々な用途を有する。
【００７８】
抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。抗体の産生及び使用の技術は当分野で周知である。かかる技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  １９８７−２００２，  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８及びＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，  １９７５に記載されている。
実施例
以下の実施例によって本発明の様々な特徴をさらに説明する。実施例によって、本発明の実施に有用な方法も説明する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７９】
防御免疫
本実施例によって、動物モデルにおいて防御免疫をもたらす配列番号１関連ポリペプチドの能力を説明する。配列番号１の誘導体である配列番号２を使用して防御免疫を得た。
【００８０】
配列番号２のクローニング及び発現
このタンパク質を、ベクターによってコードされたＨｉｓタグ残基を有するｐＥＴ２４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）から発現するように設計した。このベクターは、Ｎ末端の開始Ｍｅｔコドンとそれに続くＡｌａ及びＳｅｒコドンをもたらし、Ｃ末端（配列番号２のアミノ酸３７８−３８５）にＬｅｕ、Ｇｌｕ、（Ｈｉｓ）６及び終止コドンを付加する。設計したＤＮＡ配列は、成熟ｐｂｐ４（ＣＯＬ−ＳＡ０６９９）の３８５個のアミノ酸改変形態をコードする。
【００８１】
ｐｂｐ４  ＤＮＡ配列をＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウエアによって翻訳し、得られたアミノ酸配列（配列番号１）を分析した。シグナル配列を除去するために２５番目の残基（Ｔｈｒ）から始まる遺伝子を増幅し、Ｃ末端膜結合部位を除去するために３９８番目のコドン（Ｇｌｕ）で終了するようにＰＣＲプライマーを設計した。順方向ＰＣＲプライマーは、発現ベクターへのクローニングを容易にするＮｈｅＩ制限酵素切断部位を含んだ。逆方向ＰＣＲプライマーは、発現ベクターへのクローニングを容易にするＸｈｏＩ制限酵素切断部位を含んだ。
【００８２】
ＰＣＲ増幅配列を、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、次いで同じ２種類の酵素で消化したｐＥＴ２４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結した。連結反応物（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）をＥ．コリ系統ＮｏｖａＢｌｕｅに転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ中で増殖させることによってコロニーを選択した。ＤＮＡミニプレップを作製し（Ｑｉａｇｅｎ）、制限酵素による切断及び配列確認によって挿入の完全性を求めた。所望の配列からのＤＮＡ変化を含まないクローンを選択した。
【００８３】
Ｅ．コリＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上で増殖させた。液体ＬＢ（カナマイシン）培養物を、ＬＢ（カナマイシン）プレートから単一コロニーを接種することによって用意し、３７℃、２５０ｒｐｍで終夜インキュベートした。終夜培養物を新しいＬＢ（カナマイシン）に戻して希釈し、Ａ６００が０．６から１．０になるまで増殖させ、未誘導細胞ペレットを収集し、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加することによって培養物の残りの部分を誘導し、３時間発現させた。５０００ｘｇで室温で３分間遠心分離することによって、細胞ペレットを培養物１ｍｌから収集した。細胞ペレットを溶解緩衝剤（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ、プロテアーゼ阻害剤含有、Ｎｏｖａｇｅｎ）２００μｌに再懸濁させ、次いで誘導試料の可溶画分と不溶画分を得た。（β−メルカプトエタノールを最終体積５％まで補充した）等体積のローディングバッファーを試料に添加し、９０℃で３分間加熱した。抽出物をＮｏｖｅｘ  ４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上に流し、（クーマシーブルー染色）タンパク質を分析し、ニトロセルロース上にブロットし、抗ＨＩＳ６抗体（Ｚｙｍｅｄ）で精査した。
【００８４】
配列番号２の精製
凍結組換えＥ．コリ細胞ペースト（３９．７グラム）を解凍し、溶解緩衝剤１００ｍｌ（プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８７３５８０、１錠／１０グラム細胞ペースト）、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭイミダゾール、０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．０２％アジ化ナトリウムに再懸濁させた。
【００８５】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０単位／マイクロリットル、ＥＭ  ＃１．１０６９７．０００２）を細胞懸濁液に１マイクロリットル／グラム細胞ペーストで添加した。溶解物をマイクロフルイダイザーで調製した。溶解物を４℃で２．５時間撹拌した。１０，０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離することによって溶解物を浄化した。５ミクロンガラス繊維フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＡＰ２５０４７００）で上清をろ過した。ＮａＣｌを５Ｍ原液から最終濃度０．５Ｍまでろ液に添加した。ろ液をＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ  ＃３０２５０）と混合し、４℃で終夜撹拌した。
【００８６】
クロマトグラフィー樹脂のスラリーをクロマトグラフィーカラムに注ぎ、非結合画分をカラム出口から重力によって収集した。カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭイミダゾール及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０で洗浄し、カラムを溶出緩衝剤（０．３Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出させた。タンパク質産物を含む画分をニトロセルロース膜上でＰｏｎｃｅａｕ−Ｓ染色を用いたドットブロッティングによって確認した。タンパク質含有画分をプールして、Ｎｉ−ＩＭＡＣ生成物を調製した。Ｎｉ−ＩＭＡＣ生成物をＳＥＣによって分画し、生成物含有画分をクーマシー染色を用いたＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確認した。最高の純度及び濃度のＳＥＣ画分をプールして、ＳＥＣ生成物を調製した。ＳＥＣ生成物を無菌ろ過し、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌで吸着させた。
【００８７】
Ｓ．アウレウス抗原の調製
Ｓ．アウレウスをＴＳＡプレート上で３７℃で終夜増殖させた。ＰＢＳ  ５ｍｌをプレートに添加することによってＴＳＡプレートから細菌を洗い流し、無菌延展機を用いて細菌を静かに再懸濁させた。細菌懸濁液をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心分離機（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを１６％グリセリンに再懸濁し、一定分量を−７０℃で凍結保存した。
【００８８】
使用前に、接種材料を解凍し、適切に希釈し、感染に使用した。各貯蔵物を少なくとも３回滴定して、未処置マウスにおいて遅い死亡速度をもたらす適切な用量を決定した。細菌接種材料の効力（８０から９０％の致死率）を絶えずモニターしてモデルの再現性を確保した。各投与実験の１０日前に、１０匹の（アジュバントのみで免疫された）対照動物群に投与し、モニターした。
【００８９】
配列番号２ポリペプチドの防御試験
２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（４５０μｇ／回）上の配列番号２のポリペプチド（２０μｇ／回）を３回投与して免疫した。ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）は、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９，  ３１１−３２１，  ２０００に記載されている。２０マイクログラムを含む１００マイクロリットルの筋肉内注射（１本の脚につき５０マイクロリットル）の用量を０、７及び２１日目に投与した。２８日目にマウスから採血し、配列番号２に対する抗体血清応答をＥＬＩＳＡによって定量した。
【００９０】
実験３５日目にマウスにＳ．アウレウス（５−９×１０８ＣＦＵ／マウス）を投与し、ＡＨＰで単に免疫されただけの２０匹のマウス対象群と比較評価した。マウスの生存を１０日間モニターした。実験の最後には、配列番号２免疫群では５匹のマウスが生存したのに対して、ＡＨＰ対照群で生存したのは１匹であった。結果を図４に示す。
【００９１】
他の実施形態も以下の特許請求の範囲内である。幾つかの実施形態を説明したが、様々な改変形態を本発明の精神及び範囲から逸脱することなく実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】配列番号２のアミノ酸配列である。太字で示した部分は配列番号１である。下線を引いた領域を配列番号１に付け加えると配列番号２になる。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列比較である。配列間のアミノ酸の違いを太字で示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の配列比較である。配列間のアミノ酸の違いを太字で示す。
【図３】配列番号２をコードする核酸配列（配列番号９）である。配列番号１をコードする領域を太字で示す。追加の配列をコードする領域には下線を引いてある。
【図４】ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）中の配列番号２のポリペプチドを用いた生存データである。
【図１】
2008513010.tif 000003
【図２Ａ】
2008513010.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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