(57)【要約】  本発明は、細胞の大部分が系統陰性であって、ＣＤ４４抗原とＣＤ１１ｂ抗原の両方を発現する、単離骨髄球様骨髄細胞集団を提供する。これらの細胞は、ほ乳動物、特に眼球変性疾患に罹患したほ乳動物の眼に投与すると、有益な血管栄養活性及び神経栄養活性を有する。骨髄球様骨髄細胞は、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）に対する抗体、ＣＤ１１ｂに対する抗体又は両方に対する抗体で骨髄細胞を処理することと、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４４及び／又はＣＤ１１ｂ発現細胞をポジティブ選択することによって、単離される。本発明の単離された骨髄球様骨髄細胞は、治療上有用であるタンパク質をコードする遺伝子を網膜に送達するために、この遺伝子を形質移入することができる。
2008537478.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の大多数が系統陰性であって、ＣＤ４４抗原とＣＤ１１ｂ抗原の両方を発現する、単離骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項２】
細胞集団が、ほ乳動物から骨髄を単離することと、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１１ｂ及びこれらの組合せからなる群から選択される抗体と免疫反応する細胞を骨髄からポジティブ選択することとを含む方法によって生産される、請求項１に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項３】
細胞がネズミ細胞である、請求項１に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項４】
細胞集団がＴＥＲ−１１９発現細胞を実質的に含まない、請求項３に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項５】
細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項６】
ほ乳動物から骨髄を単離することと、抗ＣＤ４４抗原、抗ＣＤ１１ｂ及びこれらの組合せからなる群から選択される抗体と免疫反応する細胞を骨髄からポジティブ選択することとを含む、請求項１に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団を調製する方法。
【請求項７】
眼球疾患に罹患したほ乳動物の眼に、請求項１に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団から得られた細胞の治療有効量を投与することを含み、該細胞の量が、細胞が投与される眼の網膜における血管の変性、ニューロンの変性又はその両方を遅延させるのに十分である、ほ乳動物における眼球変性疾患を改善する方法。
【請求項８】
細胞が、細胞が投与されるほ乳動物の自家細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ほ乳動物がヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が眼内注射によって投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
疾患が網膜変性疾患である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が虚血性網膜症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
疾患が血管からの出血（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
疾患が血管からの漏出（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋａｇｅ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
疾患が脈絡膜症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
疾患が加齢黄斑変性症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
疾患が糖尿病性網膜症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
疾患が推定眼ヒストプラスマ症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
ほ乳動物がほ乳動物新生仔である、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
疾患が未熟児網膜症である、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
疾患が鎌状赤血球貧血である、請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
疾患が網膜色素変性症である、請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が、ほ乳動物の眼に該細胞を投与する前に、治療上有用であるペプチドを作動可能にコードする遺伝子で形質移入される、請求項７に記載の方法。
【請求項２４】
治療上有用であるペプチドが抗血管新生ペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療上有用であるペプチドが神経栄養物質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
神経栄養物質が、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、毛様体神経栄養因子、網膜色素上皮由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子及び脳由来神経栄養因子からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞の大多数が系統陰性であり、ＣＤ４４抗原とＣＤ１１ｂ抗原の両方を発現し、前記細胞が治療上有用であるペプチドを作動可能にコードする遺伝子で形質移入された、単離され、形質移入された骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項２８】
治療上有用であるペプチドが抗血管新生ペプチドである、請求項２７に記載の単離され、形質移入された骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項２９】
治療上有用であるペプチドが神経栄養物質である、請求項２７に記載の単離され、形質移入された骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項３０】
神経栄養物質が、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、毛様体神経栄養因子、網膜色素上皮由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子及び脳由来神経栄養因子からなる群から選択される、請求項２９に記載の単離され、形質移入された骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項３１】
細胞がヒト細胞である、請求項２７に記載の単離され、形質移入された骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項３２】
集団中の細胞の少なくとも約７５パーセントがＣＤ４４を発現する、請求項１に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項３３】
集団中の細胞の少なくとも約９０パーセントがＣＤ４４を発現する、請求項１に記載の単離骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項３４】
Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅに対して特異的である抗体と複数の骨髄細胞を接触させることと、複数の骨髄細胞からのＴｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅ抗体と免疫反応する細胞を複数の骨髄細胞から除去することと、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅ発現細胞では欠落している骨髄球様骨髄細胞を回収することを含み、回収された細胞の大多数がＣＤ４４を発現する、ネガティブ細胞マーカー選択によって骨髄から骨髄球様骨髄細胞集団を単離する方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法によって調製された骨髄球様骨髄細胞集団。
【請求項３６】
集団中の９０パーセントを超える細胞がＣＤ４４を発現する、請求項３５に記載の骨髄球様骨髄細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された、ほ乳動物の骨髄細胞に関する。より詳細には、本発明は、骨髄細胞特性を有し、眼の硝子体内に注射したときに網膜血管構造中に取り込まれ得る、単離された骨髄細胞集団に関する。本発明は、単離骨髄細胞をほ乳動物の眼に投与することによって眼球変性疾患を治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、先進国における視力喪失の主要原因であり、異常な網膜血管新生の結果として起こる。網膜は、ニューロン、グリア及び血管の各要素の明確に画定された層からなるので、血管増殖又は浮腫に見られる障害などの比較的小さな障害が、視覚機能の重大な喪失につながる恐れがある。網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜変性は、細動脈狭窄、血管萎縮などの血管異常とも関連する。ヒトの大部分の遺伝性網膜変性は、かん体光受容器で特異的に発症するが、ヒトにおいて中枢の繊細な視力を担う網膜領域である斑の主細胞成分である網膜錐体も同時に失われる。錐体に特異的な生存因子は、最近報告され（Ｍｏｈａｎｄ−Ｓａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５：８３５７−８３６２）、網膜変性のマウスモデルにおいて錐体の生存を延長することができる。
【０００３】
遺伝性網膜変性は、３５００人に１人もの多数の個体が発症し、進行性夜盲症、視野喪失、視神経萎縮、細動脈の減弱、血管透過性の変化、及び完全な失明に進行することが多い中心視力喪失（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｖｉｓｉｏｎ）を特徴とする（Ｈｅｃｋｅｎｌｉｖｅｌｙ，  Ｊ．Ｒ．，  ｅｄｉｔｏｒ，  １９８８；  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．）。これらの疾患の分子遺伝解析によって、１１０個を超える種々の遺伝子の変異が特定されたが、これは、既知の患者の比較的少数の原因にしかなっていない（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０４−８０８；  Ｆａｒｒａｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２１：８５７−８６４．）。これらの変異の多くは、ロドプシン、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、ｒｄｓペリフェリン及びＲＰＥ６５を含めて、光伝達機構の酵素成分及び構造成分と関連がある。これらの知見にもかかわらず、これらの網膜変性疾患の進行を遅らせ、又は逆転させる有効な治療はまだない。遺伝子療法の最近の進歩によって、特定の変異を有する動物において光受容器又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）に野生型導入遺伝子を組み込むと、マウスにおけるｒｄｓ（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５：３０６−３１０）及びｒｄ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：７８１２−７８１６）表現型並びにイヌにおけるＲＰＥ６５表現型（Ａｃｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２８：９２−９５）が首尾良く逆転した。
【０００４】
長年、幹細胞集団は、正常な成体の循環系及び骨髄中に存在することが知られている。異なる幹細胞亜集団は、造血の系統陽性（Ｌｉｎ＋）又は系統陰性（Ｌｉｎ−）に沿って分化し得る。また、系統陰性造血幹細胞（ＨＳＣ）集団は、最近、血管をインビトロ及びインビボで形成することができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含むことが判明した（Ａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：９６４−７参照）。幹細胞は、出生後の正常な血管新生及び異常な血管新生に関与し（Ｌｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７，  １１９４−２０１；  Ｋａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９７：３４２２−７及びＫｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：４３０−６）、肝細胞（Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：１２２９−３４参照）、小こう細胞（Ｐｒｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：１３５６−６１参照）、心筋細胞（Ｏｒｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８：１０３４４−９参照）及び上皮（Ｌｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：１１９４−１２０１参照）を含めて、内皮細胞以外の多様な細胞に分化する。幹細胞は幾つかの血管新生実験モデルに使用されたが、新血管構造（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を標的にするＥＰＣの機序は不明であり、特定の血管構造に寄与する細胞の数を効果的に増加させる戦略は不明である。
【０００５】
骨髄由来の造血幹細胞は、現在、治療に一般に使用される唯一の幹細胞タイプである。骨髄ＨＳＣは、４０年以上も移植に使用されてきた。現在、精製幹細胞を収集する高度な方法が、白血病、リンパ腫及び遺伝性血液疾患の治療療法を開発するために検討されている。ヒトにおける幹細胞の臨床応用は、限られたヒト患者において、糖尿病及び進行腎癌の治療のために検討されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣＤ４４、ＣＤ１１ｂ又は両方の抗原を発現する細胞をほ乳動物の骨髄からポジティブ選択することによって生産される単離骨髄球様骨髄（ＭＬＢＭ）細胞集団を提供する。ＭＬＢＭ細胞は、ほ乳動物、特に眼球変性疾患に罹患したほ乳動物の眼に投与すると、有益な血管栄養（ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）活性及び神経栄養活性を示す。本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）に対する抗体、ＣＤ１１ｂに対する抗体又は両方の抗原に対する抗体で骨髄細胞を処理することと、抗体と免疫反応する細胞をポジティブ選択することと、場合によっては（例えば、フローサイトメトリー又は抗体被覆ビーズ若しくは抗体結合ビーズを用いて細胞を分離すること）によって、単離することができる。本発明のＭＬＢＭ細胞集団の細胞の大多数は、系統陰性であり、ＣＤ４４抗原とＣＤ１１ｂ抗原の両方を発現する。
【０００７】
本発明は、ほ乳動物における血管栄養性及び神経栄養性の網膜疾患を治療する方法も提供する。この方法は、ＭＬＢＭ細胞集団から単離した細胞をほ乳動物の患部の眼に、好ましくは眼内注射によって、投与することを含む。ＭＬＢＭ細胞集団は、治療するほ乳動物の自家細胞であることが好ましい（すなわち、ＭＬＢＭ細胞集団は、治療を受ける個々のほ乳動物の骨髄から単離される。）。本治療方法は、眼球疾患に罹患したほ乳動物の網膜における血管変性及び光受容器ニューロンの変性を改善する。ＭＬＢＭ細胞は、網膜中の血管及び神経の変性を遅延させるのに十分な量で投与される。有利には、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、網膜の血管構造と一体になり、内皮細胞に分化し、同時に、ニューロンネットワークと一体になり、網膜中の錐体細胞の変性を改善する。ほ乳動物の単離ＭＬＢＭ細胞集団は、眼の硝子体内に注射したときに、活性化された網膜星状細胞を選択的に標的にする細胞であって、眼の新血管構造及びニューロンネットワークと安定に一体化したままになる細胞を含む。ほ乳動物はヒトであることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
好ましい実施形態においては、単離骨髄球様骨髄細胞集団中の細胞の少なくとも約７５パーセント、より好ましくは少なくとも約９０パーセントは、ＣＤ４４を発現する。
【０００９】
好ましい一実施形態においては、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、治療上有用である遺伝子が形質移入されている。例えば、新血管構造を選択的に標的にし、細胞を用いた遺伝子療法の一形態によって既に形成された血管に影響を及ぼさずに新血管形成を阻害する、神経栄養物質又は抗血管新生物質を作動可能にコードするポリヌクレオチドを細胞に形質移入することができる。一実施形態においては、本発明の単離ＭＬＢＭ細胞集団は、血管新生阻害ペプチドをコードする遺伝子を含む。ＭＬＢＭ細胞集団由来の血管新生阻害細胞は、ＡＲＭＤ、ＤＲ、異常な血管構造と関連するある種の網膜変性などの疾患における異常な血管成長の調節に有用である。別の好ましい実施形態においては、本発明のＭＬＢＭ細胞集団由来の単離細胞は、神経栄養ペプチドをコードする遺伝子を含むように形質移入される。神経栄養性形質を移入したＭＬＢＭ細胞は、緑内障、網膜色素変性症などの網膜神経変性を含む眼球疾患において、ニューロンの救済を促進するのに有用である。
【００１０】
本発明の単離ＭＬＢＭ細胞集団による眼球治療の特別な利点は、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞で硝子体内の治療を受けた眼において認められる血管栄養性及び神経栄養性の救済効果である。本発明のＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞による治療を受けた眼は、網膜のニューロン及び光受容器、特に錐体が維持され、ある程度の視覚機能を維持することができる。
【００１１】
本発明は、ネガティブ細胞マーカー選択によって骨髄から骨髄球様骨髄細胞集団を単離する方法も提供する。この方法は、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅに対して特異的である抗体と複数の骨髄細胞を接触させること、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅ抗体と免疫反応する細胞を複数の骨髄細胞から除去すること、並びにＴｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅ発現細胞では欠落している骨髄球様骨髄細胞を回収することを含む。この方法を用いて、９０パーセントを超える細胞がＣＤ４４を発現する細胞集団を回収することができる。
【００１２】
本発明のＭＬＢＭ細胞集団及び方法によって治療される患部網膜は、活性化された星状細胞を含むことが好ましい。星状細胞は、神経こう症（神経膠症）が付随するときには眼の早期治療によって、又はレーザーを用いて活性化星状細胞の局所的増殖を刺激することによって、活性化することができる。
【００１３】
治療上の使用に加えて、本発明の単離骨髄球様骨髄細胞集団は、眼における血管発生の生理を検討する研究ツールとして、また、眼内の特定の場所（例えば、星状細胞）に特定の遺伝子を組み込む研究ツールとしても有用である。かかる使用は、遺伝子機能及び可能な治療機序を検討する貴重なツールとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
骨髄細胞は、ＣＤ４４抗原（すなわち、ヒアルロン酸受容体）及びＣＤ１１ｂ（インテグリンαＭ）を発現する細胞の亜集団を含む。ＣＤ４４及びＣＤ１１ｂ発現細胞が豊富な骨髄細胞の骨髄球様集団は、ＣＤ４４抗原に対する抗体（抗ＣＤ４４）及び／又はＣＤ１１ｂ抗原に対する抗体（抗ＣＤ１１ｂ）で骨髄細胞を処理し、次いで抗体と免疫反応する細胞を選択することによって、骨髄から単離することができる。次いで、当分野で周知の方法によって抗体を細胞から除去することができる。細胞は、例えば、フローサイトメトリーによって、ビーズに結合した抗体又はビーズに塗布された抗体を用い、続いてろ過することによって、又は当分野で周知の他の分離方法によって、選択することができる。選択した細胞の大多数は系統陰性であり、単離に用いた抗体の種類にかかわらず、ＣＤ４４抗原とＣＤ１１ｂ抗原の両方を発現する。
【００１５】
骨髄は幹細胞を含む。幹細胞は、典型的には、細胞表面の抗原分布によって同定される（詳細な考察については、参照により本明細書に援用する、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｏｌｉｃｙによって用意された報告書であるＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，  Ｊｕｎｅ  ２００１，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｅ：  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｋｅｒｓを参照されたい。）。骨髄から単離された系統陰性造血幹細胞の約７５％もＣＤ４４陽性である。好ましい実施形態においては、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞の大多数は、系統陰性造血幹細胞（すなわち、ＣＤ４４＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ）である。
【００１６】
本発明は、眼球疾患に罹患したほ乳動物の網膜における血管及びニューロンの変性を改善する方法を提供する。本発明の単離ＭＬＢＭ細胞集団は、ほ乳動物の網膜に、好ましくは硝子体内注射によって、投与される。細胞は、網膜中の血管及び／又はニューロンの変性を改善するのに十分な量で投与される。単離ＭＬＢＭ細胞集団は、治療を受けるほ乳動物の自家細胞であることが好ましい。ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの生理的に容認できる媒体中で投与することが好ましい。
【００１７】
好ましい方法は、治療を受けるほ乳動物の骨髄からＭＬＢＭ細胞集団を単離することと、次いで網膜の血管及び／又はニューロンの変性を改善するのに十分な数の細胞をほ乳動物に投与することを含む。ＭＬＢＭ細胞は、眼球変性疾患に罹患したほ乳動物から、好ましくは眼球疾患の早期において、又は眼球変性疾患に罹りやすいことが（すなわち、遺伝的素因によって）知られている健康なほ乳動物から、単離することができる。後者の場合、単離ＭＬＢＭ細胞集団を単離後保存することができ、次いで将来発症する眼球疾患の早期に予防的に注射することができる。患部網膜は、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞が標的にする活性化された星状細胞を含むことが好ましい。したがって、付随する神経こう症があるときには眼の早期治療は有益である。或いは、自家ＭＬＢＭ細胞集団を投与する前に、網膜をレーザーで処置して、網膜中の活性化星状細胞の局所的増殖を刺激することができる。
【００１８】
造血幹細胞は、種々の血球タイプ、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、血小板及び赤血球に成長し得る幹細胞である。系統表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ：ＣＤ１８）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ネズミＬｙ−６Ｇ、ネズミＴＥＲ−１１９、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）を含めて、成熟血液細胞系列のマーカーである細胞表面タンパク質の一群である。これらの抗原をさほど発現しない造血幹細胞を一般に系統陰性（Ｌｉｎ−）と称する。ヒト造血幹細胞は、一般に、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）及び／又はＣＤ１３３などの他の表面抗原を発現する。ネズミ造血幹細胞は、一般に、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、Ｔｈｙ−１及び／又はＳｃａ−１などの他の表面抗原を発現する。
【００１９】
細胞表面で「系統表面抗原」（Ｌｉｎ）をさほど発現しない単離造血幹細胞を本明細書では「系統陰性」又は「Ｌｉｎ−」造血幹細胞、すなわち、Ｌｉｎ−ＨＳＣと称する。本発明のＭＬＢＭ細胞集団の細胞の大多数はＬｉｎ−であり、比較的多量のＣＤ４４抗原（ＣＤ４４ｈｉ）とＣＤ１１ｂ抗原を発現する。これらのＣＤ４４＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣは、発達中の血管構造に取り込まれ、次いで分化して、血管内皮細胞になり得る。
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、骨髄及び骨髄細胞に関連した「成体」という句は、胎仔に相対して、出生後に、すなわち、若年及び成体の個体から単離した骨髄を含む。したがって、「成体ほ乳動物」という用語は、胎仔又は出生前の個体に対して、若年（出生後）及び完全に成長したほ乳動物を指す。
【００２１】
本発明の単離ＭＬＢＭ細胞集団は、星状細胞を選択的に標的にし、マウス、ヒトなどのほ乳動物種の、細胞を単離した眼の硝子体内に注射したときに網膜の新血管構造に組み込まれる。
【００２２】
本発明の単離ＭＬＢＭ細胞集団は、内皮細胞に分化して網膜内で血管構造を形成する細胞を含む。特に、本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、網膜の新生血管及び血管の変性疾患の治療並びに網膜血管の外傷の修復に有用である。本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、網膜中のニューロンの救済も促進し、抗アポトーシス遺伝子の上方制御も促進する。さらに、本発明のＭＬＢＭ細胞集団を利用して、酸素誘発性網膜症又は未熟児網膜症に罹患したほ乳動物などのほ乳動物新生仔の眼における網膜の欠陥を治療することができる。
【００２３】
ＣＤ４４を発現しない骨髄細胞（ＣＤ４４ＬＯ細胞）は、一般に、以下の細胞マーカー、すなわち、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅの１種類以上を発現することが判明した。このことを利用して、本発明のＣＤ４４ＨＩＭＬＢＭ細胞を、ネガティブ細胞マーカー選択を含む方法によって単離することができる。この方法は、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅに対して特異的である抗体と複数の骨髄細胞を接触させること、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅ抗体と免疫反応する細胞を複数の骨髄細胞から除去すること、並びにＴｅｒ１１９、ＣＤ４５ＲＢ２２０及びＣＤ３ｅ発現細胞では欠落している骨髄球様骨髄細胞を回収することを含む。この方法を用いて、９０パーセントを超える細胞がＣＤ４４を発現する細胞集団を回収することができる。
【００２４】
本発明は、ほ乳動物の骨髄からＭＬＢＭ細胞集団を単離すること、及び疾患を阻止するのに十分な数のＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞をほ乳動物の眼の硝子体内に注射することを含む、ほ乳動物における眼球疾患を治療する方法も提供する。本方法を利用して、新生仔、若年又は完全に成長したほ乳動物における、網膜変性疾患、網膜血管変性疾患、虚血性網膜症、血管からの出血、血管からの漏出、脈絡膜症などの眼球疾患を治療することができる。かかる疾患の例としては、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、推定眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、鎌状赤血球貧血及び網膜色素変性症並びに網膜の傷害が挙げられる。
【００２５】
眼に注射したＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞の数は、眼の病態を阻止するのに十分である。例えば、注射した細胞の量は、眼の網膜損傷の修復、網膜の新血管構造の安定化、網膜の新血管構造の成熟化、並びに血管からの漏出及び出血の防止又は修復に有効であり得る。
【００２６】
本発明のＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、細胞を用いた眼球の遺伝子療法に使用する抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子、ニューロンの救済効果を高める神経栄養物質をコードする遺伝子などの治療上有用である遺伝子を形質移入することができる。
【００２７】
形質移入した細胞は、網膜の障害の治療に有用である遺伝子を含み得る。好ましい一実施形態においては、本発明のＭＬＢＭ細胞集団由来の形質移入細胞は、タンパク質、ＴｒｐＲＳなどのタンパク質断片又はその抗血管新生（すなわち、血管新生抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ））断片、例えば、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ（図３４の配列番号３）、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ−ＧＤ（図３４の配列番号４）（どちらも好ましい血管新生抑制ペプチドである）並びにｍｉｎｉ−ＴｒｐＲＳ（図３５の配列番号５）及びＴ１−ＴｒｐＲＳ（図３６の配列番号６）と命名されたＴｒｐＲＳ断片を含めて、抗血管新生ペプチドを作動可能にコードする遺伝子を含む。本発明の抗血管新生ペプチドをコードする、ＭＬＢＭ細胞集団由来の形質移入細胞は、糖尿病性網膜症、同様の疾患などの異常な血管の発生を含む網膜疾患の治療に有用である。ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞はヒト細胞であることが好ましい。
【００２８】
別の好ましい実施形態においては、本発明のＭＬＢＭ細胞集団由来の形質移入細胞は、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、毛様体神経栄養因子、網膜色素上皮由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子などの神経栄養物質を作動可能にコードする遺伝子を含む。ＭＬＢＭ細胞集団由来のかかる神経栄養性細胞は、網膜神経などに対する傷害の治療において、緑内障、網膜色素変性症などの網膜ニューロン変性疾患におけるニューロンの救済を促進するのに有用である。毛様体神経栄養因子の移植は、網膜色素変性症の治療に有用であると報告されている（Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，  ３（２）：２４１−８；  Ｆａｒｒａｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００２，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１：８５７−８６４参照）。脳由来神経栄養因子は、傷害を受けた網膜神経節において、成長に関連する遺伝子を調節すると報告されている（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ４７：５６１−５７２参照）。グリア細胞系由来の神経栄養因子は、網膜色素変性症において、光受容器の変性を遅延させると報告されている（ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ４（６）：６２２−９参照）。
【００２９】
本発明は、本発明のＭＬＢＭ細胞集団由来の形質移入細胞を眼の硝子体内に注射投与することによって、眼球の血管由来の疾患を治療する方法も提供する。ＭＬＢＭ細胞集団由来のかかる形質移入細胞は、抗血管新生遺伝子産物又は神経栄養性遺伝子産物をコードする遺伝子など、治療上有用である遺伝子を形質移入した、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞を含む。ＭＬＢＭ細胞集団由来の形質移入細胞はヒト細胞であることが好ましい。
【００３０】
ＭＬＢＭ細胞集団由来の少なくとも約１×１０５個の細胞又は形質移入細胞を、網膜変性疾患に罹患したほ乳動物の眼の硝子体内に注射することによって投与することが好ましい。注射すべき細胞数は、網膜変性の重症度、ほ乳動物の年齢、及び網膜疾患を治療する当業者には容易に理解される他の因子に応じて決まり得る。ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、治療を担当する臨床家によって決定されるように、単回投与することができ、又はある期間にわたって複数回投与することができる。
【００３１】
本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、網膜血管構造の中断若しくは分解又は網膜ニューロン変性を含む、網膜の傷害及び欠陥の治療に有用である。ヒトＭＬＢＭ細胞集団を使用して、網膜血管構造の再生又は修復治療における使用のための、また、網膜ニューロン変性の治療又は改善のための、一連の遺伝的に同一な細胞、すなわち、クローンを生成することもできる。また、本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、網膜血管の発達を研究する研究ツールとして、また、星状細胞などの選択された細胞標的に遺伝子を送達する研究ツールとして、有用である。
【００３２】
ネズミ網膜血管の発達。
【００３３】
眼球血管新生モデル。マウスの眼は、ヒトの網膜血管の発達など、ほ乳動物の網膜血管の発達を研究するために一般に認められたモデルである。ネズミの網膜血管構造の発達中に、虚血によって誘導される網膜血管は、星状細胞と密接に関連して発達する。このこう細胞要素は、視神経乳頭から神経節細胞層に沿って、３番目の三半期のヒト胎児又はげっ歯類新生仔の網膜に移動し、放射状に広がる。ネズミの網膜血管構造が発達するにつれ、内皮細胞は、この既に形成された星状細胞のテンプレートを利用して、網膜血管パターンを決定する（図１（ａ及びｂ）参照）。図１（ａ及びｂ）は、発達中のマウス網膜の略図である。パネル（ａ）は星状細胞テンプレート（明るい線）上に重なった一次叢（図左上の暗線）であり、（ｂ）は網膜血管形成の第二相である。図１において、ＧＣＬは神経節細胞層を表し、ＩＰＬは内叢状（ｐｌｅｘｕｓ）層を表し、ＩＮＬは内顆粒層を表し、ＯＰＬは外叢状層を表し、ＯＮＬは外顆粒層を表し、ＲＰＥは網膜色素上皮を表し、ＯＮは視神経を表し、Ｐは末梢を表す。
【００３４】
出生時、網膜血管構造は実質的に存在しない。生後１４日（Ｐ１４）までに、網膜は、視覚の発生と同時に、網膜血管の複雑な一次（表面）層及び二次（深部）層を発達させる。最初に、既存の星状細胞ネットワーク上をスポーク状の乳頭周囲血管が末梢に向かって放射状に成長し、毛管網の形成によって次第に相互接続される。これらの血管は、神経線維内で単層としてＰ１０まで成長する（図１（ａ））。Ｐ７−Ｐ８で、側副枝がこの一次叢から伸び、網膜から外網状層に貫入し、そこで二次又は深部網膜叢を形成する。Ｐ２１までに、ネットワーク全体が大規模な再構築を行い、三次又は中間部叢が内顆粒層の内面に形成される（図１（ｂ））。
【００３５】
新生仔マウスの網膜血管新生モデルは、幾つかの理由によって、眼球血管新生中のＨＳＣの役割を研究するのに有用である。この生理的に関連したモデルにおいては、大きい星状細胞テンプレートが、内因性血管が出現する前に存在し、新生血管プロセス中の細胞−細胞ターゲティングの役割を評価することが可能である。また、この一貫して再現性のある新生仔の網膜血管プロセスは、低酸素誘導性であることが知られており、この点で、虚血がある役割を果たすことが知られている多数の網膜疾患と類似している。
【００３６】
骨髄からの内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の濃縮
細胞表面マーカーの発現は、ＨＳＣ調製物中に存在するＥＰＣ集団について広範に評価されたが、ＥＰＣを一義的に特定するマーカーはまだ十分に明らかにされていない。ＥＰＣを濃縮するために、造血性系統マーカー陽性細胞（Ｌｉｎ＋）、すなわち、Ｂリンパ球（ＣＤ４５）、Ｔリンパ球（ＣＤ３）、顆粒球（Ｌｙ−６Ｇ）、単球（ＣＤ１１）及び赤血球（ＴＥＲ−１１９）をマウスの骨髄単核球から枯渇させた。Ｓｃａ−１抗原を用いてＥＰＣをさらに濃縮した。同一数のＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋細胞又はＬｉｎ−細胞の硝子体内注射後に得られた結果を比較すると、２つのグループ間で違いは認められなかった。実際、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−細胞のみを注射したときには、発達中の血管へのはるかに多量の取り込みが観察された。
【００３７】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団は、機能アッセイに基づいて、ＥＰＣと一緒に濃縮される。また、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ集団は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団とは機能的に全く異なった挙動を示した。（既報のインビトロでのキャラクタリゼーション試験に基づいて）各画分のＥＰＣを特定するのに一般に使用されるエピトープも評価した。これらのマーカーのいずれもＬｉｎ−画分と独占的に関連してはいないが、いずれのマーカーもＬｉｎ−ＨＳＣがＬｉｎ＋ＨＳＣ画分よりも約７０から約１８００％増加した（図１（ｃ））。図１、パネル（ｃ）は、骨髄由来のＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリー分析結果である。パネル（ｃ）の上列は、非抗体標識細胞の造血幹細胞ドットプロット分布である。Ｒ１は、陽性ＰＥ染色の定量可能なゲート領域であり、Ｒ２はＧＦＰ陽性である。Ｌｉｎ−ＨＳＣのドットプロットを中間列に示す。Ｌｉｎ＋ＨＳＣのドットプロットを下列に示す。Ｃ５７Ｂ／６細胞を、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ複合抗体で標識した。Ｔｉｅ−２データをＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。ドットプロットの各コーナーの割合は、全Ｌｉｎ−又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団に対する陽性標識細胞のパーセントである。興味深いことに、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２及びＳｃａ−１のような一般に容認されたＥＰＣマーカーは発現が不十分であり、したがって、さらなる分画には使用しなかった。
【００３８】
Ｌｉｎ−ＨＳＣは、（ａ）成体ほ乳動物から骨髄を抽出し、（ｂ）骨髄から複数の単球を分離し、（ｃ）１種類以上の系統表面抗原、好ましくはＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ（ネズミ）、ＴＥＲ−１１９（ネズミ）、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）からなる群から選択される系統表面抗原に対するビオチン複合系統パネル抗体で単球を標識し、（ｄ）１個以上の前記系統表面抗原に対して陽性である単球を複数の単球から除去し、（ｅ）系統陰性造血幹細胞集団をそこから回収することによって単離することができる。
【００３９】
Ｌｉｎ−ＨＳＣを成体ヒト骨髄から単離するときには、系統表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）及びＣＤ２３５ａに対するビオチン複合系統パネル抗体で単球を標識することが好ましい。Ｌｉｎ−ＨＳＣを成体ネズミ骨髄から単離するときには、系統表面抗原ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン複合系統パネル抗体で単球を標識することが好ましい。
【００４０】
硝子体内注射したＨＳＣ  Ｌｉｎ−細胞は、星状細胞を標的にするＥＰＣを含み、発達中の網膜血管構造に組み込まれる。
【００４１】
硝子体内注射したＬｉｎ−ＨＳＣが、特定の網膜細胞タイプを標的にし、星状細胞のテンプレートを利用し、網膜血管新生に関与することができるかどうかを判定するために、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の約１０５個の細胞又は成体（ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニック）マウスの骨髄から単離されたＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（対照、約１０５個の細胞）を生後２日（Ｐ２）のマウスの眼に注射した。注射後４日（Ｐ６）で、ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニックマウスから得られた本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の多数の細胞は、網膜に付着し、内皮細胞の特徴的な細長い外観を呈した（図２（ａ））。図２は、発達中のマウス網膜中へのＬｉｎ−細胞の移植を示す。図２、パネル（ａ）に示すように、注射後４日（Ｐ６）で、硝子体内注射したｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣは付着し、網膜上で分化する。
【００４２】
網膜の多数の領域において、ＧＦＰ発現細胞は、下にある星状細胞と一致したパターンで整列し、血管に似ている。これらの蛍光性細胞は、発達中の内因性血管網の前方に観察される（図２（ｂ））。逆に、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（図２（ｃ））又は成体マウス腸間膜内皮細胞（図２（ｄ））は網膜表面にわずかしか付着しなかった。注射したＬｉｎ−ＨＳＣ集団由来の細胞が、既に形成された血管を有する網膜にも付着することができるかどうかを判定するために、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を成体の眼に注射した。興味深いことに、網膜に付着する細胞も、形成された正常な網膜血管に取り込まれる細胞もなかった（図２（ｅ））。これは、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物が、正常に発達した血管構造を乱さず、正常に発達した網膜において異常な血管新生を惹起しないことを示している。
【００４３】
注射した本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物と網膜の星状細胞との関係を明らかにするために、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状細胞のマーカー）及びプロモーター誘導性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスから得られたＬｉｎ−ＨＳＣを注射したこれらのＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの網膜を検査すると、注射したｅＧＦＰ  ＥＰＣと既存の星状細胞が共存した（図２（ｆ−ｈ）、矢印）。ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣのプロセスは、下にある星状細胞のネットワークに従うことが認められた（矢印、図２（ｇ））。これらの眼を検査すると、注射した標識細胞のみが星状細胞に付着し、網膜の末梢がまだ内因性血管を持たないＰ６のマウス網膜においては、注射した細胞が、これらのまだ血管新生されていない領域において星状細胞に付着して観察された。驚くべきことに、注射した標識細胞は、網膜のより深い層の、正常な網膜血管が続いて発生する正確な場所において観察された（図２（ｉ）、矢印）。
【００４４】
注射したＬｉｎ−ＨＳＣが、発達中の網膜血管構造に安定に組み込まれるかどうかを明らかにするために、その後の幾つかの時点において網膜血管を調べた。早くもＰ９（注射後７日）でＬｉｎ−ＨＳＣはＣＤ３１＋構造に組み込まれた（図２（ｊ））。Ｐ１６（注射後１４日）までに、細胞は網膜血管様構造に広範に組み込まれた（図２（ｋ））。動物を屠殺する前に（機能的な網膜血管を特定するために）ローダミン−デキストランを血管内に注射すると、Ｌｉｎ−ＨＳＣの大多数が開存血管（ｐａｔｅｎｔ  ｖｅｓｓｅｌ）と整列していた（図２（ｌ））。２つの標識細胞分布パターンが観察された：（１）一方のパターンにおいては、細胞が非標識内皮細胞間の血管に沿って散在し、（２）他方のパターンでは、血管は専ら標識細胞からなった。注射した細胞は、深部血管叢（ｄｅｅｐ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｌｅｘｕｓ）の血管にも組み込まれた（図２（ｍ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣ由来のＥＰＣが新血管構造に散発的に取り込まれることは以前に報告されているが、本発明は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ由来のＥＰＣで専ら構成される血管網の第１報である。これは、硝子体内注射した骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団由来の細胞が、網膜血管叢を形成する任意の層に効率的に組み込まれ得ることを示している。
【００４５】
非網膜組織（例えば、脳、肝臓、心臓、肺、骨髄）の組織検査は、硝子体内注射後５又は１０日まで調べても、ＧＦＰ陽性細胞の存在を示さなかった。これは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ画分内の細胞亜集団が、網膜星状細胞を選択的に標的にし、発達中の網膜血管構造中に安定に組み込まれることを示している。Ｌｉｎ−ＨＳＣ画分内の細胞は、内皮細胞の多数の特性（網膜星状細胞との会合、細長い形態、開存血管への安定な組み込み、及び血管外の場所に存在しないこと）を有するので、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団中に存在するＥＰＣである。標的星状細胞は、低酸素性網膜症の多くで観察されるのと同じタイプである。グリア細胞が、ＤＲ及び他の網膜傷害形態で観察される血管叢の新生血管の葉状態（ｆｒｏｎｄ）の顕著な成分であることはよく知られている。反応性神経こう症及び虚血誘導性新血管新生の条件下で、活性化星状細胞は、ヒトを含めた多数のほ乳動物種において新生仔の網膜血管テンプレート形成中に観察されるのと同様に、増殖し、サイトカインを産生し、ＧＦＡＰを上方制御する。
【００４６】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団は、新生仔の眼の場合と同様に、成体マウスの眼の活性化星状細胞を標的にする。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を、光凝固（図３（ａ））又は針の先端部（図３（ｂ））によって傷つけた網膜を有する成体の眼に注射した。両方のモデルにおいて、顕著にＧＦＡＰ染色される細胞集団が、傷害部位の周囲にのみ観察された（図３（ａ及びｂ））。注射したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞は、傷害部位に局在し、ＧＦＡＰ陽性星状細胞と特異的に会合したままであった（図３（ａ及びｂ））。これらの部位において、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は、新生仔の深部網膜血管構造の形成中に観察されるのと類似したレベルで、網膜のより深い層に移動することも観察された。網膜の傷ついていない部分はＬｉｎ−ＨＳＣ細胞を含まず、傷ついていない正常成体網膜にＬｉｎ−ＨＳＣを注射したときに観察されたのと同じであった（図２（ｅ））。これらのデータによれば、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物は、傷害を受けた神経こう症の成体網膜、及び血管新生が進む新生仔の網膜において、活性化グリア細胞を選択的に標的にすることができる。
【００４７】
硝子体内注射したＬｉｎ−ＨＳＣは、変性血管構造を救済し、安定化することができる。
【００４８】
硝子体内注射したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物は、星状細胞を標的にし、正常な網膜血管構造に組み込まれるので、Ｌｉｎ−ＨＳＣは、神経こう症及び血管変性に関連する虚血性又は変性網膜疾患における変性血管構造も安定化する。ｒｄ／ｒｄマウスは、生後１ヵ月までに光受容器及び網膜血管層の深刻な変性を示す網膜変性モデルである。これらのマウスにおける網膜血管構造は、Ｐ１６まで正常に発達し、Ｐ１６でより深部の血管叢が退行する。大部分のマウスでは、深部及び中間部の叢がＰ３０までにほぼ完全に変性した。
【００４９】
ＨＳＣが、退行する血管を救済することができるかどうかを明らかにするために、（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の）Ｌｉｎ＋又はＬｉｎ−ＨＳＣをＰ６にｒｄ／ｒｄマウスの硝子体内に注射した。Ｌｉｎ＋細胞注射後、Ｐ３３までに、最深部の網膜層の血管はほぼ完全に消失した（図４（ａ及びｂ））。これに対し、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した大部分の網膜は、Ｐ３３まで、３層の平行で形のよい血管層を含むほぼ正常な網膜血管構造を有した（図４（ａ及びｄ））。この効果を定量化すると、Ｌｉｎ−を注射したｒｄ／ｒｄ眼の深部血管叢中の血管の平均長さは、無処置の眼又はＬｉｎ＋細胞で処置した眼のほぼ３倍であった（図４（ｅ））。驚くべきことに、ｒｄ／ｒｄ成体マウス（ＦＶＢ／Ｎ）骨髄由来のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物の注射によっても、ｒｄ／ｒｄ新生仔マウスの変性網膜血管構造が救済された（図４（ｆ））。ｒｄ／ｒｄマウスの眼における血管構造の変性は、早くも生後２−３週で観察された。Ｐ１５もの遅いＬｉｎ−ＨＳＣの注射も、ｒｄ／ｒｄマウスにおける変性血管構造を少なくとも１ヵ月間ある程度安定化した（図４（ｇ及びｈ））。
【００５０】
より若年の（例えば、Ｐ２）ｒｄ／ｒｄマウスに注射したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物も、発達中の表面血管構造に組み込まれた。Ｐ１１までに、Ｌｉｎ−ＨＳＣは、深部血管叢のレベルに移動し、野生型外網膜血管層において認められたのと同一のパターンを形成することが観察された（図５（ａ））。注射したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞が、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて、変性網膜血管構造に組み込まれ、それを安定化した様式をより明確にするために、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物をＴｉｅ−２−ＧＦＰ  ＦＶＢマウスの眼に注射した。ＦＶＢマウスは、ｒｄ／ｒｄ遺伝子型を有する。ＦＶＢマウスは、融合タンパク質Ｔｉｅ−２−ＧＦＰを発現するので、すべての内因性血管は蛍光性である。
【００５１】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の非標識細胞を新生仔のＴｉｅ−２−ＧＦＰ  ＦＶＢ眼に注射し、続いて発達中の血管構造に組み込むと、注射し、組み込まれた非標識Ｌｉｎ−ＨＳＣに対応する非標識の空白が内因性Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ標識血管中に存在するはずである。続いて別の血管マーカー（例えば、ＣＤ−３１）で染色すると血管全体が描出され、非内因性内皮細胞が血管構造の一部であるかどうかを決定することができる。注射後２ヵ月で、ＣＤ３１−陽性Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ陰性血管が、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を注射した眼の網膜中に観察された（図５（ｂ））。興味深いことに、救済された血管の大多数がＴｉｅ−２−ＧＦＰ陽性細胞を含んだ（図５（ｃ））。平滑筋アクチンの染色によって求めた周細胞分布は、血管の救済の有無にかかわらず、Ｌｉｎ−ＨＳＣ注射によって変化しなかった（図５（ｄ））。これらのデータは、遺伝的に欠陥のあるマウスにおいて、硝子体内注射したＬｉｎ−ＨＳＣ細胞が網膜に移動し、正常な網膜血管の形成に関与し、内因性変性血管構造を安定化することを明確に示している。
【００５２】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ由来の形質移入細胞による網膜血管新生の阻害。
【００５３】
網膜血管疾患の大多数は、変性ではなく、異常な血管増殖を含む。星状細胞を標的にするトランスジェニック細胞を使用して、抗血管新生タンパク質を送達し、血管新生を阻害することができる。Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞にＴ２−トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）を形質移入した。Ｔ２−ＴｒｐＲＳは、網膜血管新生を強力に阻害するＴｒｐＲＳの４３ｋＤ断片である（図６（ａ））。プラスミドによって形質移入された対照Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ遺伝子なし）をＰ２に注射した眼の網膜は、Ｐ１２において、正常な一次（図６（ｃ））及び二次（図６（ｄ））網膜血管叢を有した。Ｔ２−ＴｒｐＲＳを形質移入した本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物をＰ２の眼に注射し、１０日後に評価すると、一次ネットワークがかなり異常であり（図６（ｅ））、深部網膜血管構造の形成がほぼ完全に阻害された（図６（ｆ））。これらの眼において観察された数本の血管は、著しく減衰して、各血管の間に大きい隙間が存在した。Ｔ２−ＴｒｐＲＳを分泌するＬｉｎ−ＨＳＣによる阻害の程度を表１に詳細に示す。
【００５４】
Ｔ２−ＴｒｐＲＳは、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物中の細胞によってインビトロで産生され、分泌される。この形質移入細胞を硝子体に注射すると、網膜中にＴ２−ＴｒｐＲＳの３０ｋＤ断片（図６（ｂ））が観察された。この３０ｋＤ断片は、形質移入Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜においてのみ特異的に観察された。組み換えタンパク質又はインビトロで合成したタンパク質と比較した見掛け分子量のこの減少は、Ｔ２−ＴｒｐＲＳのインビボでのプロセシング又は分解によるものであり得る。これらのデータによれば、Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を使用して、活性化星状細胞を標的にすることによって、血管新生抑制分子を発現する遺伝子などの機能的に活性な遺伝子を網膜血管構造に送達することができる。観察された血管新生抑制効果は、細胞媒介性活性によるものであり得るが、同一の、但しＴ２を形質移入していないＬｉｎ−ＨＳＣ組成物で処置した眼は、正常な網膜血管構造を持たないので、この可能性は極めて低い。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
硝子体内注射したＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、網膜星状細胞に局在し、血管に組み込まれ、多数の網膜疾患の治療に有用であり得る。注射したＨＳＣ組成物由来の大部分の細胞は、星状細胞のテンプレートに付着するが、少数は深部の網膜に移動し、深部血管網が続いて発生する領域に向かう。ＧＦＡＰ陽性星状細胞は、生後４２日前にはこの領域に観察されないが、これは、ＧＦＡＰ陰性グリア細胞が既に存在して、Ｌｉｎ−ＨＳＣ局在化の信号を送っている可能性を排除するものではない。以前の研究によれば、多数の疾患が反応性神経こう症と関連している。ＤＲにおいては、特に、グリア細胞及びその細胞外基質が病的血管新生と関連している。
【００５７】
注射したＬｉｎ−ＨＳＣ組成物由来の細胞は、傷害のタイプにかかわらず、ＧＦＡＰを発現するグリア細胞に特異的に付着するので、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣ組成物を使用して、網膜中の血管形成前の病変部を標的にすることができる。例えば、糖尿病などの虚血性網膜症においては、新血管新生は、低酸素に対する応答である。Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物を病的新血管新生部位に向けることによって、発達中の新血管構造を安定化して、出血、浮腫などの新血管構造の異常（ＤＲに付随する失明の原因）を防止することができ、新血管新生を最初に刺激する低酸素を場合によっては軽減することができる。異常な血管を正常な状態に回復させることができる。また、Ｔ２−ＴｒｐＲＳなどの血管新生抑制タンパク質は、形質移入Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物及びレーザーによる星状細胞の活性化によって、病的血管新生部位に送達することができる。レーザー光凝固は、臨床の眼科において一般に使用されているので、この手法は多数の網膜疾患に適用される。細胞を用いたかかる手法は癌治療において探究されてきたが、それを眼疾患に使用することは、眼内注射によって、多数の細胞を患部に直接送達することができるので、さらに有利である。
【００５８】
Ｌｉｎ−ＨＳＣによる神経栄養性及び血管栄養性救済。
【００５９】
ＭＡＣＳを使用して、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、Ｃ３Ｈ（ｒｄ／ｒｄ）、ＦＶＢ（ｒｄ／ｒｄ）マウスの骨髄から、上述したように、Ｌｉｎ−ＨＳＣを分離した。これらのマウスから得たＥＰＣを含むＬｉｎ−ＨＳＣをＰ６のＣ３Ｈ又はＦＶＢマウスの眼の硝子体内に注射した。注射後種々の時点（１ヵ月、２ヵ月及び６ヵ月）で網膜を収集した。ＣＤ３１に対する抗体で染色した後の走査レーザー共焦点顕微鏡によって、また、ＤＡＰＩで核染色した後の網膜組織像によって、血管構造を分析した。異なる時点において網膜から得たｍＲＮＡのマイクロアレイ遺伝子発現解析によって、上記効果に潜在的に関与する遺伝子を特定した。
【００６０】
ｒｄ／ｒｄマウスの眼は、神経感覚網膜と網膜血管構造の両方の深刻な変性をＰ２１までに起こした。Ｐ６にＬｉｎ−ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウスの眼は、正常な網膜血管構造を６ヵ月間も維持した。深部と中間部の両方の層は、すべての時点（１Ｍ、２Ｍ及び６Ｍ）において対照よりもかなり改善された（図１２参照）。また、本発明者らは、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した網膜が、対照としてのＬｉｎ＋ＨＳＣで処置した眼よりも厚く（１Ｍ；１．２倍、２Ｍ；１．３倍、６Ｍ；１．４倍）、外顆粒層においてより多くの細胞を有する（１Ｍ；２．２倍、２Ｍ；３．７倍、６Ｍ；５．７倍）ことを認めた。対照（無処置又は非Ｌｉｎ−処置）のｒｄ／ｒｄ網膜と比較して「救済された網膜」（例えば、Ｌｉｎ−ＨＳＣ）の大規模ゲノム解析によれば、図２０、パネルＡ及びＢに記載のタンパク質をコードする遺伝子を含めて、血管及び神経の救済と相関があるｓＨＳＰ（小さい熱ショックタンパク質）及び特定の成長因子をコードする遺伝子がかなり上方制御された。
【００６１】
骨髄由来のＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて、正常な血管構造を有意に再現性よく維持し、光受容器及び他の神経細胞層を劇的に増加させた。この神経栄養性救済効果は、小さい熱ショックタンパク質及び成長因子のかなりの上方制御と相関があり、現在治療不能な網膜変性疾患に対する治療手法についての洞察を与えるものである。
【００６２】
Ｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜は、深刻な血管及びニューロンの変性を示す。
【００６３】
マウスにおける出生後の網膜血管及びニューロンの正常な発達は、詳細に記述されており、３番目の三半期のヒト胎児において認められる変化と類似している（Ｄｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ４３：３５００−３５１０）。ｒｄ１遺伝子に対して同型接合であるマウスは、ヒト網膜変性の多数の特性を共有し（Ｆｒａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５：１１８３−１１８７）、ＰＲ  ｃＧＭＰホスホジエステラーゼをコードする遺伝子の変異の結果として、重度の血管萎縮症を伴う光受容器（ＰＲ）の急速な損失を示す（Ｂｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：６７７−６８０）。網膜の発達とそれに続くその変性中の血管構造を調べるために、コラーゲンＩＶ（ＣＩＶ）、成熟血管構造の細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、及び内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）に対する抗体を使用した（図１５）。ｒｄ１／ｒｄ１（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）の網膜は、生後（Ｐ）約８日まで正常に発達したが、その後、光受容器を含む外顆粒層（ＯＮＬ）の変性が始まった。ＯＮＬは急速に変性し、細胞はアポトーシスによって死滅し、核の単一層のみがＰ２０まで残った。ＣＩＶとＣＤ３１の両方に対する抗体で全載網膜を二重染色すると、他（Ｂｌａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５４：５４３−５５３）によって記述された詳細と類似した、ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける血管変性の詳細が明らかになった。一次及び深部網膜血管層は、Ｐ１２まで正常に発達したと考えられたが、その後、ＣＤ３１染色の欠如によって示されるように、内皮細胞が急速に消失する。ＣＤ３１陽性内皮細胞は、Ｐ１２まで正常な分布で存在したが、その後急速に消失した。興味深いことに、ＣＩＶ陽性染色は検査時点を通して存在したままであり、血管及び付随するＥＣＭが正常に形成されたことを示唆したが、ＣＤ３１陽性細胞がもはや観察されないＰ１３後には、マトリックスのみが残存した。（図１５、中間のパネル）。中間部血管叢もＰ２１後に変性するが、その進行は、深部叢の場合よりも遅い（図１５、上のパネル）。正常なマウスの網膜血管及び神経細胞層を、ｒｄ１／ｒｄ１マウスとの比較のために示す（右パネル、図１５）。
【００６４】
ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣの神経保護作用。
【００６５】
硝子体内注射したＬｉｎ−ＨＳＣは、全３つの血管叢中の内因性網膜血管構造に組み込まれ、血管の変性を防止する。興味深いことに、注射した細胞は、外顆粒層では実質的に観察されない。これらの細胞は、形成中の網膜血管に組み込まれるか、又はこれらの血管の近傍で観察される。（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ由来の）ネズミＬｉｎ−ＨＳＣを、変性が始まる直前のＰ６にＣ３Ｈ／ＨｅＪ（ｒｄ１／ｒｄ１）マウスの眼の硝子体内に注射した。対照細胞（ＣＤ３１−）を注射した眼は、Ｐ３０までに、典型的なｒｄ１／ｒｄ１表現型を示し、すなわち、深部血管叢がほぼ完全に変性した。ＯＮＬは、検査した全網膜で観察された。Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した眼は、正常な外観の中間部及び深部血管叢を維持した。驚くべきことに、対照細胞を注射した眼よりもかなり多くの細胞が、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した眼の内顆粒層（ＩＮＬ）及びＯＮＬで観察された（図１６（Ａ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣのこの救済効果は、注射後２ヵ月（図１６（Ｂ））で観察することができ、６ヵ月間も観察することができた（図１６（Ｃ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した眼の中間部叢と深部叢の血管構造の違い、並びに神経細胞を含むＩＮＬとＯＮＬの血管構造の違いは、救済された眼と救済されなかった眼を比較すると全測定時点において大きかった（図１６（Ｂ及びＣ））。この効果を、血管構造の全長を測定することによって（図１６（Ｄ））、また、ＯＮＬ中で観察されるＤＡＰＩ陽性細胞核の数を数えることによって（図１６（Ｅ））、数量化した。単純線形回帰分析を全時点におけるデータに適用した。
【００６６】
Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した眼において、血管の救済とニューロン（例えば、ＯＮＬ厚さ）の救済との統計的に有意な相関がＰ３０（ｐ＜０．０２４）及びＰ６０（ｐ＜０．０３４）において認められた（図１６（Ｆ））。Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜を対照細胞を注射した網膜と比較すると、相関は、統計的に有意ではないが（ｐ＜０．１４）、Ｐ１８０においても高いままであった（図１６（Ｆ））。これに対し、対照細胞を注射した網膜は、血管構造とＯＮＬの保存の有意な相関をどの時点においても示さなかった（図１６（Ｆ））。これらのデータによれば、Ｌｉｎ−ＨＳＣの硝子体内注射は、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜において網膜血管とニューロンを同時に救済する。注射した細胞は、ＯＮＬでは観測されず、網膜血管内以外、網膜血管近傍以外のどの場所でも観測されなかった。
【００６７】
Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射したｒｄ／ｒｄ網膜の機能の救済。
【００６８】
網膜電図（ＥＲＧ）を、対照細胞又はネズミＬｉｎ−ＨＳＣの注射後２ヵ月のマウスで実施した（図１７）。血管及びニューロンが救済されたことを確認するために、ＥＲＧ記録後に各眼の免疫組織化学分析及び顕微鏡分析を実施した。処置され、救済された眼及び対照の救済されなかった眼の代表的なＥＲＧ記録によれば、救済された眼において、減算した信号（処置の眼−無処置の眼）から８−１０マイクロボルトの振幅を有する明確に検出可能な信号が生成した（図１７）。両方の眼からの信号が極度に異常であることは明らかである。しかし、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した眼からは、一貫して検出可能なＥＲＧを記録することができた。いずれの場合においても、対照の眼からのＥＲＧは検出不能であった。救済された眼における信号の振幅は通常よりもかなり小さかったが、信号は、組織が救済されるときはいつでも一貫して観測され、他の遺伝子に基づく救済試験によって報告された信号の桁であった。全体的に、これらの結果は、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した眼におけるある程度の機能救済を実証している。
【００６９】
救済されたｒｄ／ｒｄ網膜細胞タイプは、主に錐体である。
【００７０】
救済された網膜及び救済されなかった網膜を、かん体又は錐体のオプシンに特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に分析した。図１７に示すＥＲＧ記録に用いたのと同じ眼をかん体又は錐体のオプシンについて分析した。野生型マウス網膜においては、存在する光受容器の約５％未満が錐体である（Ｓｏｕｃｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：  ４８１−４９３）。図２５（Ａ）に示す錐体の赤／緑オプシン、又は図２５（Ｂ）に示すかん体ロドプシンを用いて観察された免疫組織化学的染色パターンは、錐体細胞のこの割合と一致した。野生型網膜を免疫前ＩｇＧで染色すると、染色は、血管の自己蛍光を除いて、神経感覚網膜中のどこにも観察されなかった（図２５（Ｃ））。生後２ヵ月、注射しなかったｒｄ／ｒｄマウスの網膜は、赤緑錐体のオプシン（図２５（Ｄ））又はロドプシン（図２５（Ｇ））に対する抗体で染色されない、本質的に萎縮性の外顆粒層を有した。対照のＣＤ３１−ＨＳＣを注射した眼も、錐体（図２５（Ｅ）））又はかん体（図２５（Ｈ））のオプシンの存在に対して陽性染色されなかった。これに対し、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した反対側の眼は、維持された外顆粒層中の約３から約８列の核を有し、Ｌｉｎ−ＨＳＣの大部分は、錐体のオプシンに対して陽性であり（図２５（Ｆ））、かん体のオプシンに対して約１−３％陽性であった（図２５（Ｉ））。意外なことに、これは、かん体が支配的である正常なマウス網膜において通常観察されるものとほぼ逆である。これらのデータによれば、Ｌｉｎ−ＨＳＣの注射によって、通常であれば錐体が変性する長期間、錐体が維持される。
【００７１】
ヒト骨髄（ｈＢＭ）由来のＬｉｎ−ＨＳＣは変性網膜も救済する。
【００７２】
ヒト骨髄から単離されたＬｉｎ−ＨＳＣは、ネズミＬｉｎ−ＨＳＣと同様に挙動する。骨髄をヒトドナーから収集した。Ｌｉｎ＋ＨＳＣを枯渇させると、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ（ｈＬｉｎ−ＨＳＣ）集団が生成した。これらの細胞を生体外で蛍光色素で標識し、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウスの眼に注射した。注射したｈＬｉｎ−ＨＳＣは、ネズミＬｉｎ−ＨＳＣを注射したときに観察されるのと同様にして、網膜血管新生部位に移動し、それを標的にした（図１８（Ａ））。血管ターゲティングに加えて、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣは、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの血管層及び神経細胞層に対する堅牢な救済効果ももたらす（図１８（Ｂ及びＣ））。この観察は、網膜血管構造を標的にし、網膜変性を防止することができる、ヒト骨髄中の細胞の存在を立証するものである。
【００７３】
Ｌｉｎ−ＨＳＣは、ｒｄ１０／ｒｄ１０マウスにおいて血管栄養性効果及び神経栄養性効果を有する。
【００７４】
ｒｄ１／ｒｄ１マウスは、網膜変性に対して最も広く用いられており、最も特徴づけられたモデルであるが（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．  ４２：５１７−５２５）、変性が極めて速く、この点で、ヒト疾患において観察される通常の遅い進行とは異なる。この系統においては、光受容器細胞の変性は、網膜血管構造がまだ急速に拡大しつつあるＰ８頃に始まる（図１５）。中間部叢がまだ形成中ではあるが、深部網膜血管構造の変性がそれに続いて起こる。したがって、この疾患を有する大部分のヒトにおいて観察されるのとは異なり、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜は完全には発達しない。変性の進行が遅く、ヒト網膜の変性条件により近似したｒｄ１０マウスモデルを用いて、Ｌｉｎ−ＨＳＣによって媒介される血管の救済を検討した。ｒｄ１０マウスにおいては、光受容器細胞の変性はＰ２１頃に始まり、その後間もなく血管の変性が始まる。
【００７５】
正常な神経感覚網膜の発達はＰ２１までにほぼ完了するので、変性は、網膜が分化し終えた後に開始することが観測され、したがってｒｄ１／ｒｄ１マウスモデルよりもヒト網膜変性に類似している。ｒｄ１０マウス由来のＬｉｎ−ＨＳＣ又は対照細胞をＰ６の眼に注射した。網膜を異なる時点で評価した。Ｐ２１において、Ｌｉｎ−ＨＳＣ及び対照細胞を注射した眼の網膜は、全血管層が完全に発達し、ＩＮＬ及びＯＮＬが正常に発達して、正常と考えられた（図１８（Ｄ及びＨ））。約Ｐ２１において、網膜変性が始まり、加齢とともに進行した。対照細胞を注射した網膜は、Ｐ３０までに、重度の血管及びニューロンの変性を示した（図１８（Ｉ））。一方、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜は、ほぼ正常な血管層及び光受容器細胞を維持した（図１８（Ｅ））。救済された眼と救済されなかった眼の差は、時間が遅いほどより明白になった（図１８（Ｆ及びＧ）と１８（Ｊ及びＫ）を比較されたい。）。対照で処理した眼においては、血管の変性の進行は、ＣＤ３１及びコラーゲンＩＶに対する免疫組織化学的染色によって極めて明確に観察された（図１８（Ｉ−Ｋ））。対照で処置した眼は、ＣＤ３１に対してほぼ完全に陰性であるのに対して、コラーゲンＩＶ陽性血管「跡（ｔｒａｃｋ）」は明白なままであり、不完全な血管形成ではなく、血管の退行が起こったことを示している。これに対し、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した眼は、正常な野生型の眼に極めて類似しているようにみえるＣＤ３１及びコラーゲンＩＶ陽性血管を有した（図１８（Ｆ及びＩ）を比較されたい。）。
【００７６】
Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置後のｒｄ／ｒｄマウス網膜の遺伝子発現解析。
【００７７】
大規模ゲノム科学（マイクロアレイ分析）を用いて、救済された網膜及び救済されなかった網膜を分析して、神経栄養性救済の推定媒介物質を特定した。Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置したｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜における遺伝子発現を、注射しなかった網膜及び対照細胞（ＣＤ３１−）を注射した網膜と比較した。これらの比較を各々３つ組で実施した。存在するとみなすには、遺伝子は、全３つの３つ組においてバックグラウンドレベルの少なくとも２倍の発現レベルを有する必要があった。Ｌｉｎ−ＨＳＣで保護された網膜において、対照細胞を注射したｒｄ／ｒｄマウス網膜及び注射しなかったｒｄ／ｒｄマウス網膜の３倍上方制御された遺伝子を図２０、パネルＡ及びＢに示す。発現した遺伝子について、標準偏差を各ｃＲＮＡ複製の平均発現レベルで除算して、変動係数（ＣＯＶ）レベルを計算した。また、発現レベルと雑音分散の相関を、平均と標準偏差（ＳＤ）の相関を取ることによって計算した。各遺伝子に対する遺伝子発現レベルと標準偏差の相関を得た。これによって、バックグラウンドレベル及び信頼できる発現レベルしきい値を決定することができた。全体として、データは十分許容限度内であった（Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：１４０３１−１４０３６）。以下で個々に考察する遺伝子は、これらの臨界発現レベルを超える発現レベルを示した。考察した遺伝子に対する対応のある「ｔ検定」値も求めた。各場合において、ｐ値は妥当であり（約０．０５以下）、複製間に類似性があること、及び異なる試験群間に考えられる有意差があることが実証された。ＭＡＤ及びＹｉｎｇ  Ｙａｎｇ−１（ＹＹ−１）（Ａｕｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２４：１２３−１３０．）を含めて、かなり上方制御された遺伝子の多くは、アポトーシスからの細胞の保護を含む機能を有するタンパク質をコードする。配列相同性を有し、ストレスからの細胞の保護を含む、公知の熱ショックタンパク質と類似の機能を有する、幾つかのクリスタリン遺伝子も、Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置によって上方制御された。α−クリスタリンの発現は、免疫組織化学分析によればＯＮＬに局在した（図１９）。図１９によれば、クリスタリンαＡは、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した後に、救済された外顆粒層細胞において上方制御されるが、対照細胞で処置した反対側の眼では上方制御されない。左パネルは、救済された網膜におけるＩｇＧ染色（対照）を示す。中間のパネルは、救済された網膜におけるクリスタリンαＡを表す。右パネルは、救済されなかった網膜におけるクリスタリンαＡを表す。
【００７８】
ヒトＬｉｎ−ＨＳＣを用いて救済されたｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜から得られたメッセンジャーＲＮＡを、ヒト特異的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイチップとハイブリッド形成させた。厳密な分析の後、そのｍＲＮＡ発現が、ヒト特異的であり、バックグラウンド以上であり、ネズミＬｉｎ−ＨＳＣによって救済された網膜及びヒト対照細胞を注射して救済されなかった網膜よりもヒトＬｉｎ−ＨＳＣによって救済された網膜においてかなり高い、幾つかの遺伝子を見出した（図２０、パネルＣ）。初期の新たに分化したＣＤ３４＋造血幹細胞の表面で発現される細胞接着分子であるＣＤ６と、造血幹細胞によって発現される別の遺伝子であるインターフェロンアルファ１３は、どちらもマイクロアレイバイオインフォマティクス技術によって見出され、評価プロトコルの正しいことが証明された。また、幾つかの成長因子及び神経栄養因子は、ヒトＬｉｎ−ＨＳＣによって救済されたマウス網膜試料によって、バックグラウンド以上に発現された（図２０、パネルＤ）。
【００７９】
系統が決定されている（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）造血細胞のマーカーを用いて、ＥＰＣを含む骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団をネガティブ選択した。ＥＰＣとして役立ち得る骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣの亜集団は、一般に使用される細胞表面マーカーによって特徴づけられないが、発達中の又は傷害を受けた網膜血管構造における骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣの挙動は、Ｌｉｎ＋又は成体内皮細胞集団の場合に観察される挙動とは全く異なる。骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣは、網膜の血管新生部位を選択的に標的にし、開存血管の形成に関与する。
【００８０】
遺伝性網膜変性疾患は、網膜血管構造の損失を伴うことが多い。かかる疾患の有効な治療には、機能を回復し、複雑な組織構造を維持する必要がある。幾つかの最近の研究は、細胞を用いた栄養性因子の送達の使用、又は幹細胞自体の使用を探究しているが、両方の組合せが必要な場合もある。例えば、網膜変性疾患を治療する成長因子療法を使用すると、血管が無秩序に過形成し、正常な網膜組織構造が極度に破壊される。網膜変性疾患の治療に神経又は網膜の幹細胞を使用すると、ニューロンの機能が復元し得るが、網膜機能の完全性を維持するには機能的血管構造も必要である。Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団由来の細胞をｒｄ／ｒｄマウスの網膜血管に組み込むと、網膜構造を乱すことなく変性血管構造を安定化した。この救済効果は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団由来の細胞をＰ１５のｒｄ／ｒｄマウスに注射したときにも認められた。血管変性はｒｄ／ｒｄマウスにおいてＰ１６に始まるので、この知見は、有効なＬｉｎ−ＨＳＣ処置の治療窓を拡大するものである。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を注射した眼においては、網膜のニューロン及び光受容器が保存され、視覚機能が維持される。
【００８１】
成体骨髄由来Ｌｉｎ−ＨＳＣは、網膜変性疾患を有するマウスの硝子体内に注射すると、大きな血管及び神経栄養性効果を発揮する。この救済効果は、治療後最高６ヵ月持続し、網膜変性を完了する前（生後３０日までに完全な網膜変性を通常示すマウスにおいて生後１６日まで）にＬｉｎ−ＨＳＣを注射したときに最も効果的である。この救済は、網膜変性の２つのマウスモデルにおいて観察され、レシピエントが網膜変性を有する免疫不全のげっ歯類（例えば、ＳＣＩＤマウス）であるときに、又はドナーが網膜変性を有するマウスであるときに、意外なことに、成体ヒト骨髄由来のＨＳＣを用いて実施することができる。幾つかの最近の報告は、野生型遺伝子を用いた、ウイルスによる遺伝子救済後の、網膜変性を有するマウス又はイヌにおける部分表現型の（ｐａｒｔｉａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）救済を記述しているが（Ａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：３０６−３１０；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：７８１２−７８１６；  Ａｃｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２８：９２−９５．）、本発明は、血管の救済によって達成された、最初の一般的な細胞療法効果である。したがって、既知の関連する１００を超える変異を含む疾患（例えば、網膜色素変性症）群を治療する際のかかる手法の潜在的有用性は、既知の各変異を処置する個々の遺伝子療法を作成することよりも実際的である。
【００８２】
神経栄養性救済効果の正確な分子基盤は、未知のままであるが、血管の安定化と救済が同時であるときにのみ認められる。注射した幹細胞の存在それ自体では、神経栄養性救済を生じるのに十分ではない。外顆粒層中に幹細胞由来のニューロンが明らかに欠如している場合には、注射した細胞が光受容器に形質転換される可能性がなくなる。マイクロアレイ遺伝子発現解析によって得られたデータによれば、抗アポトーシス効果を有することが知られている遺伝子がかなり上方制御された。網膜変性において認められる大部分のニューロン死はアポトーシスによるものなので、かかる保護作用は、これらの疾患において光受容器及び視覚機能に重要な他のニューロンの寿命を延長するのに治療上極めて有益となり得る。ｃ−ｍｙｃは、下流の種々のアポトーシス誘発因子の上方制御によって、アポトーシスに関与する転写因子である。ｃ−ｍｙｃの発現は、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて野生型の４．５倍であり、ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおいて観察される光受容器の変性に関与し得ることを示している。Ｌｉｎ−ＨＳＣで保護された網膜において劇的に上方制御される２つの遺伝子Ｍａｄ１及びＹＹ−１は（図２０、パネルＡ）、ｃ−ｍｙｃの活性を抑制し、したがってｃ−ｍｙｃによって誘発されるアポトーシスを阻害することが知られている。Ｍａｄ１の過剰発現は、Ｆａｓによって誘導されるカスパーゼ−８の活性化を抑制することも示された。カスパーゼ−８は、アポトーシス経路の別の重要な成分である。これら２つの分子の上方制御は、ｒｄ／ｒｄマウスにおける変性を一般にもたらすアポトーシスの開始を防止することによって、血管及び神経の変性から網膜を保護するのにある役割を果たし得る。
【００８３】
Ｌｉｎ−ＨＳＣで保護された網膜において大きく上方制御される別の遺伝子セットとしては、クリスタリンファミリーのメンバーが挙げられる（図２０、パネルＢ）。熱ショック及び他のストレス誘発性タンパク質と同様に、クリスタリンは、網膜のストレスによって活性化され、アポトーシスに対して保護作用を及ぼし得る。クリスタリンαＡの異常に低い発現は、網膜ジストロフィーのラットモデルにおける光受容器の損失と相関がある。ｒｄ／ｒｄマウスにおける網膜の最近のプロテオミクス分析によって、網膜変性に応じてクリスタリンが上方制御されることが証明された。ＥＰＣによって救済されたｒｄ／ｒｄマウス網膜の本発明者らのマイクロアレイデータに基づいて、クリスタリンの上方制御は、ＥＰＣによって媒介される網膜神経保護において鍵となる役割を果たすと考えられる。
【００８４】
ｃ−ｍｙｃ、Ｍａｄ１、Ｙｘ−１、クリスタリンなどの遺伝子は、ニューロン救済の下流媒介物質である可能性がある。神経栄養物質は、抗アポトーシス遺伝子の発現を調節し得るが、マウス幹細胞を用いて救済された網膜の本発明者らのマイクロアレイ分析によれば、公知の神経栄養因子のレベルは増加しなかった。一方、ヒト特異的チップを用いた、ヒト骨髄由来の幹細胞によって媒介される救済の分析によれば、複数の成長因子遺伝子の発現は低いが、かなり増加する。
【００８５】
上方制御された遺伝子としては、線維芽細胞成長因子ファミリーの幾つかのメンバー、オトフェリンなどが挙げられる。オトフェリン遺伝子の変異は、聴神経障害による難聴をもたらす遺伝性疾患と関連がある。注射したＬｉｎ−ＨＳＣによるオトフェリン産生は、網膜神経障害の予防にも寄与し得る。歴史的に、網膜変性の患者及び動物において観察される血管の変化は、光受容器が消滅したときの代謝要求の減少に続発すると長い間考えられてきた。本データによれば、少なくとも遺伝性網膜変性のマウスでは、正常な血管構造を維持することは、外顆粒層の成分の維持に役立ち得る。最近の文献報告は、組織特異的血管構造が、単なる血管「栄養」の供給から予想される以上の栄養効果を有するという概念を支持している。例えば、肝臓内皮細胞は、肝傷害に直面して、ＶＥＧＦＲ１活性化後に、肝細胞の再生及び維持に重要な成長因子の産生を誘導し得る（ＬｅＣｏｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：８９０−８９３）。
【００８６】
血管内皮細胞と隣接する肝実質細胞との類似の暗示的な相互作用は、機能的血管が形成されるかなり前に、肝臓の器官形成に関与するとされている。網膜変性を有する個体における内因性網膜血管構造は、救済を劇的に促進するわけではないかもしれないが、この血管構造が骨髄造血幹細胞集団に由来する内皮前駆体で強化される場合には、内皮前駆体は、変性に対して血管構造をより抵抗性にし、同時に網膜のニューロン及び血管の生存を容易にし得る。網膜変性を有するヒトにおいては、完全な網膜変性の発症を遅延させることによって、視力を数年間延長することができる。Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した動物は、視力を維持するには十分であり得る、かなりのＥＲＧが保存される。
【００８７】
臨床的に、視力機能を依然として維持しながら、光受容器及び他のニューロンが実質的に失われ得ることは広く認識されている。ある時点において、臨界のしきい値を超え、視力が失われる。ヒト遺伝性網膜変性のほぼ全部が早期ではあるが、緩慢に発症するので、網膜変性を有する個体を確認することができ、本発明の自家骨髄幹細胞の移植片で硝子体内処置して、網膜変性及び同時に起こる視力喪失を遅延させることができる。本発明の幹細胞のターゲティング及び取り込みを促進するためには、活性化星状細胞が存在することが望ましい（Ｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：１００４−１０１０）。これは、神経こう症が付随するときには早期治療によって、又はレーザーを用いて活性化星状細胞の局所的増殖を刺激することによって、実施することができる。眼内注射前に、幹細胞に１種類以上の神経栄養物質を生体外で形質移入して、救済効果を場合によっては強化してもよい。この手法は、網膜神経節細胞変性が存在する、緑内障など他の視覚ニューロンの変性障害の治療に適用することができる。
【００８８】
成体骨髄由来のＬｉｎ−ＨＳＣ集団は、反応性星状細胞を標的にすることによって血管新生を促進することができるＥＰＣ集団を含み、形成されたテンプレートに、網膜構造を乱さずに組み込まれる。Ｌｉｎ−ＨＳＣは、網膜変性に罹患した眼において、長期の神経栄養性救済効果ももたらす。また、遺伝子改変された、ＥＰＣを含む自家Ｌｉｎ−ＨＳＣ組成物は、虚血性の眼又は異常に血管新生した眼に移植することができ、新しい血管及びニューロン層に安定に組み込むことができ、治療分子を局所的に長期間連続送達することができる。生理的に意味のある用量の薬物を発現する遺伝子のかかる局所送達は、現在治療不能な眼球疾患を治療する新しいパラダイムである。
【００８９】
例えば、正常なマウス網膜中の光受容器は主にかん体であるが、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣによる救済後に観察される外顆粒層は主に錐体を含んだ。大部分の遺伝性ヒト網膜変性は、初期のかん体特異的欠陥の結果として起こり、錐体の損失は、かん体によって発現されるある種の栄養性因子の損失に関係している可能性があるかん体の機能不全に続発すると考えられる。
実施例
【実施例１】
【００９０】
細胞の単離及び濃縮；ネズミＬｉｎ−ＨＳＣ集団Ａ及びＢの調製。
【００９１】
一般的手順。インビボでの全評価をＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って実施した。全評価手順は、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＴＳＲＩ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。骨髄細胞をＢ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６、Ｔｉｅ−２ＧＦＰ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ、ＦＶＢ／ＮＪ（ｒｄ／ｒｄマウス）又はＢａｌｂ／ｃＢＹＪ成体マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＥ）から抽出した。
【００９２】
次いで、単球を、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いた密度勾配分離によって分離し、マウスにおいてＬｉｎ−選択用のビオチン複合系統パネル抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１、ＴＥＲ−１１９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識した。系統陽性（Ｌｉｎ＋）細胞を、Ｌｉｎ−ＨＳＣから磁気分離装置（ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）選別機、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて分離し、除去した。内皮前駆細胞を含む生成Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団を、ＦＡＣＳ（商標）Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）によって、以下の抗体、すなわち、ＰＥ複合Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＫＤＲ及びＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、さらに分析した。Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ骨髄細胞をＴｉｅ−２のキャラクタリゼーションに使用した。
【００９３】
成体マウス内皮細胞を収集するために、腸間膜組織をＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから外科的に取り出し、コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）中に置いて組織を消化し、続いて４５μｍフィルターによってろ過した。ろ液（Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集し、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と一緒にインキュベートした。形態的に玉石状の外観を観察し、ＣＤ３１  ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）マトリックス（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中の管状構造の形成について培養物を検査することによって、内皮の特性を確認した。
【００９４】
ネズミＬｉｎ−ＨＳＣ集団Ａ。骨髄細胞を上記一般的手順によってＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから抽出した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞をＦＡＣＳフローサイトメトリーによってＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｆｌｋ−１及びＴｉｅ−２細胞表面抗原マーカーについて分析した。結果を図１（ｃ）に示す。Ｌｉｎ−ＨＳＣの約８１％がＣＤ３１マーカーを提示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約７０．５％がｃ−ｋｉｔマーカーを提示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約４％がＳｃａ−１マーカーを提示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣの約２．２％がＦｌｋ−１マーカーを提示し、Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞の約０．９１％がＴｉｅ−２マーカーを提示した。これに対し、これらの骨髄細胞から単離したＬｉｎ＋ＨＳＣは、かなり異なる細胞マーカープロファイルを示した（すなわち、ＣＤ３１：３７．４％；ｃ−ｋｉｔ：２０％；Ｓｃａ−１：２．８％；Ｆｌｋ−：０．０５％）。
【００９５】
ネズミＬｉｎ−ＨＳＣ集団Ｂ。骨髄細胞を上記一般的手順によってＢａｌｂ／Ｃ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ及びＣ３Ｈマウスから抽出した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を細胞表面マーカー（Ｓｃａ−１、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＤ３４、ＣＤ３１及び種々のインテグリン：α１、α２、α３、α４、α５、α６、αＬ、αＭ  αＶ、αＸ、α１１ｂ、β１、β２、β３、β４、β５及びβ７）の有無について分析した。結果を表２に示す。
【００９６】
【表２】
2008537478.tif 000004
【実施例２】
【００９７】
ネズミモデルにおける細胞の硝子体内投与。
【００９８】
マウスの眼けんに細いブレードで亀裂を入れて、Ｐ２からＰ６の眼球を露出させた。次いで、本発明の系統陰性ＨＳＣ集団Ａ（細胞培地約０．５μｌから約１μｌ中約１０５細胞）を、３３番ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）ニードルシリンジを用いて硝子体内注射した。
【実施例３】
【００９９】
ＥＰＣ形質移入。
【０１００】
ネズミＬｉｎ−ＨＳＣ（集団Ａ）に、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて製造者の手順に従って、Ｈｉｓ６タグも含む、ＴｒｐＲＳのＴ２断片をコードするＤＮＡ（配列番号１、図７）を形質移入した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞（約１０６細胞／ｍｌ）を、幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に懸濁させた。次いで、ＤＮＡ（約１μｇ）とＦｕＧＥＮＥ試薬（約３μｌ）の混合物を添加し、混合物を約３７℃で約１８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、収集した。この系の形質移入率は、ＦＡＣＳ分析によって確認して約１７％であった。Ｔ２−ＴｒｐＲＳの産生をウエスタンブロット法によって確認した。Ｈｉｓ６タグ付きＴ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列を配列番号２、図８に示す。
【実施例４】
【０１０１】
免疫組織化学及び共焦点分析。
【０１０２】
マウス網膜を種々の時点において収集し、全載又は凍結切片用に調製した。全載の場合、網膜を４％パラホルムアルデヒドで固定し、５０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２０％正常ヤギ血清中で室温で１時間ブロックした。網膜を一次抗体に対して加工し、二次抗体を用いて検出した。使用した一次抗体は、抗コラーゲンＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、抗β−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、抗α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）であった。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ  ４８８又は５９４蛍光マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）との複合型であった。画像をＭＲＣ  １０２４共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって撮影した。全載網膜（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ  ｒｅｔｉｎａ）中の３つの異なる血管層の発生を調べるために、３次元画像をＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて作成した。共焦点顕微鏡法によって識別される、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マウスとＧＦＡＰ／ｗｔＧＦＰマウスのＧＦＰ画素強度の差を利用して、３次元画像を作成した。
【実施例５】
【０１０３】
マウスにおけるインビボでの網膜血管新生定量アッセイ。
【０１０４】
Ｔ２−ＴｒｐＲＳ分析のために、一次及び深部叢をマウス網膜の３次元画像から再構築した。一次叢を２つのカテゴリー、すなわち、正常発達又は血管進行停止に分類した。深部血管発達阻害のカテゴリーを、以下の判定基準を含めた血管阻害割合に基づいて解釈した。すなわち、深部叢形成の完全阻害を「完全」、（２５％未満の阻害を含めて）正常な血管発達を「正常」、残りを「部分」と表示した。ｒｄ／ｒｄマウス救済データの場合、各全載網膜（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔｅｄ  ｒｅｔｉｎａ）中のより深部の叢の４つの別々の領域を１０×レンズによって記録した。血管構造の全長を各画像について計算し、まとめ、グループ間で比較した。正確な情報を得るために、Ｌｉｎ−ＨＳＣを一方の眼に注射し、Ｌｉｎ＋ＨＳＣを同じマウスの別の眼に注射した。注射しなかった対照網膜を同腹仔から採取した。
【実施例６】
【０１０５】
成体網膜傷害ネズミモデル。
【０１０６】
レーザー及びはん痕モデルを、ダイオードレーザー（１５０ｍＷ、１秒、５０ｍｍ）を用いて、又はマウス網膜を２７番ゲージニードルで穿刺することによって機械的に、作製した。傷害後５日、細胞を硝子体内方法によって注射した。その５日後に眼をマウスから採取した。
【実施例７】
【０１０７】
網膜再生の神経栄養性救済。
【０１０８】
成体ネズミ骨髄由来の系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ−ＨＳＣ）は、網膜変性のマウスモデルにおいて血管栄養性及び神経栄養性の救済効果を有する。１０日齢のマウスの右眼の硝子体内に約１０５個の本発明のＬｉｎ−ＨＳＣを含む約０．５マイクロリットルを注射し、網膜血管構造の有無及びニューロンの層の核数について２ヵ月後に評価した。同じマウスの左眼にほぼ同数のＬｉｎ＋ＨＳＣを対照として注射し、同様に評価した。図９に示すように、Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した眼では、網膜血管構造はほぼ正常と考えられ、内顆粒層はほぼ正常であり、外顆粒層（ＯＮＬ）は約３から約４層の核を有した。これに対し、Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処理した反対側の眼は、中間の網膜血管層が著しく萎縮し、外網膜血管層が完全に萎縮し、内顆粒層が著しく萎縮し、外顆粒層が完全に消失した。これは、マウス３及びマウス５で劇的である。マウス１では救済効果はなく、これは、注射したマウスの約１５％に当てはまる。
【０１０９】
視覚機能を網膜電図（ＥＲＧ）によって評価すると、血管とニューロンの両方の救済が観察されたときに陽性ＥＲＧの修復が認められた（マウス３及び５）。陽性ＥＲＧは、血管又はニューロンの救済がないときには認められなかった（マウス１）。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣによるｒｄ／ｒｄマウスの眼の血管栄養性救済と神経栄養性救済のこの相関を、図１０に示す回帰分析プロットによって示す。ニューロン（ｙ軸）と血管（ｘ軸）の回復の相関が、中間部血管構造タイプ（ｒ＝０．４５）及び深部血管構造（ｒ＝０．６７）について認められた。
【０１１０】
図１１は、Ｌｉｎ＋ＨＳＣによる血管の救済とニューロンの救済の間に統計的に有意な相関がないことを示している。血管の救済を定量し、そのデータを図１２に示した。図１２に示す注射後１ヵ月（１Ｍ）、２ヵ月（２Ｍ）及び６ヵ月（６Ｍ）におけるマウスのデータによれば、血管長は、特に注射後１ヵ月及び２ヵ月において、同じマウスの無処置の眼における血管長（白棒）よりも、本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置した眼においてかなり増加した（黒棒）。神経栄養性救済効果を、Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣの注射後約２ヵ月、内及び外顆粒層中の核を数えることによって定量した。結果を図１３及び１４に示す。
【実施例８】
【０１１１】
ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団。
【０１１２】
骨髄細胞を上記一般的手順によって健康な成体ヒトボランティアから抽出した。次いで、単球を、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いた密度勾配分離によって分離した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団をヒト骨髄単核球から単離するために、以下のビオチン複合系統パネル抗体を磁気分離システム（ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）選別機、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ２３５ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と併用した。
【０１１３】
ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団をＣＤ１３３発現に基づいてさらに２つの亜集団に分けた。細胞をビオチン複合ＣＤ１３３抗体で標識し、ＣＤ１３３陽性亜集団とＣＤ１３３陰性亜集団に分けた。
【実施例９】
【０１１４】
網膜変性のネズミモデルにおけるヒト及びネズミ細胞の硝子体内投与。
【０１１５】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤ及びｒｄ１０マウス系統を網膜変性モデルとして使用した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ及びＣ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍａｉｎｅ）は、重度の早発性網膜変性を起こす変異である網膜変性１（ｒｄ１）変異に対して同型接合である。変異は、かん体光受容器ｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットをコードするＰｄｅ６ｂ遺伝子のエキソン７に位置する。この遺伝子の変異は、常染色体劣性網膜色素変性症（ＲＰ）のヒト患者において見出された。Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウスは、重症複合免疫不全自然変異（Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤ）に対しても同型接合であり、ヒト細胞移入実験に使用された。ｒｄ１０マウスにおける網膜変性は、Ｐｄｅ６ｂ遺伝子のエキソン１３の変異によって引き起こされる。これは、ｒｄ１／ｒｄ１よりも発症が遅く、網膜変性がより軽度の臨床的に関連するＲＰモデルでもある。全評価をＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って実施した。全手順は、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
【０１１６】
マウスの眼けんに細いブレードで亀裂を入れて、Ｐ２からＰ６の眼球を露出させた。次いで、ネズミ集団Ａ又はヒト集団Ｃの系統陰性ＨＳＣ細胞（細胞培地約０．５μｌから約１μｌ中約１０５細胞）を、３３番ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）ニードルシリンジを用いてマウスの眼の硝子体内に注射した。注射するヒト細胞を可視化するために、注射前に細胞を色素（Ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。
【０１１７】
網膜を種々の時点で収集し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及びメタノールで固定し、続いて５０％ＦＢＳ／２０％ＮＧＳ中で室温で１時間ブロックした。網膜血管構造を染色するために、網膜を抗ＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗コラーゲンＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体、続いてＡｌｅｘａ  ４８８又は５９４複合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）と一緒にインキュベートした。網膜に４本の放射状の減張切開（ｒｅｌａｘｉｎｇ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を施して平面状にして、全載標本を得た。中間部又は深部網膜血管叢の血管構造の画像（Ｄｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ４３：３５００−３５１０）をＲａｄｉａｎｃｅ  ＭＰ２１００共焦点顕微鏡及びＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて得た。血管構造を定量するために、４つの独立した視野（９００μｍ×９００μｍ）を中間部又は深部血管層の中間部分から無作為に選択し、血管構造の全長をＬＡＳＥＲＰＩＸ（登録商標）解析ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて測定した。同じ叢中のこれら４つの視野の全長をさらなる分析に使用した。
【０１１８】
平面状に装着した網膜をクリオスタット切片用に再包埋した。網膜を４％ＰＦＡ中に終夜放置し、続いて２０％スクロースと一緒にインキュベートした。網膜を最適切断温度の化合物（ＯＣＴ：Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；  Ｓａｋｕｒａ  ＦｉｎｅＴｅｃｈ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋した。クリオスタット切片（１０μｍ）を、核色素ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含むＰＢＳ中で再水和させた。視神経乳頭及び周辺部網膜全体を含む単一切片中の３つの異なる領域（幅２８０μｍ、偏りのない試料採取）のＤＡＰＩ標識核の画像を共焦点顕微鏡で撮影した。１つの切片中の３つの独立した視野のＯＮＬ中にある核の数を数え、分析のために合計した。単純線形回帰分析を実施して、深部叢中の血管構造の長さとＯＮＬ中の細胞核の数との関係を調べた。
【０１１９】
終夜暗順応させた後、マウスにケタミン１５μｇ／ｇｍ及びキシラジン７μｇ／ｇｍを腹腔内注射して麻酔した。瞳孔散大（１％硫酸アトロピン）後の各眼の角膜表面の網膜電図（ＥＲＧ）を、口の参照電極及び尾部の接地電極と一緒に角膜の環状金電極を用いて記録した。高反射性Ｇａｎｚｆｅｌｄドームの外側に貼ったＧｒａｓｓ  Ｐｈｏｔｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＰＳ３３  Ｐｌｕｓ、Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｑｕｉｎｃｙ、ＭＡ）を用いて刺激した。かん体の応答を、光刺激装置によって許容される最大値（０．６６８ｃｄ−ｓ／ｍ２）までの強度範囲にわたる短波長（Ｗｒａｔｔｅｎ  ４７Ａ：λｍａｘ＝４７０ｎｍ）フラッシュに対して記録した。応答信号を増幅し（ＣＰ５１１  ＡＣ増幅器、Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、デジタル化し（ＰＣＩ−１２００、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、コンピュータ−解析した。各マウスは、それ自身の内部標準として役立ち、処置した眼と無処置の眼の両方のＥＲＧを記録した。最も弱い信号に対する最高１００回の掃引を平均した。無処置の眼の平均応答を、処置した眼の応答から減算し、この信号差を用いて機能救済の指標とした。
【０１２０】
マイクロアレイ分析を用いて、Ｌｉｎ−ＨＳＣを標的にした網膜遺伝子発現を評価した。Ｐ６のｒｄ／ｒｄマウスにＬｉｎ−又はＣＤ３１−ＨＳＣを注射した。これらのマウスの網膜を、注射後４０日にＲＮａｓｅを含まない培地中で解剖した（網膜血管構造及び光受容器層の救済は、注射後のこの時点で明らかである。）。各網膜の４分の１をホールマウント（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）で分析して、正常なＨＳＣ標的並びに血管構造及び神経保護が得られたことを確認した。首尾良く注射された網膜から得られたＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、フェノール／クロロホルムＲＮＡ単離プロトコルによって精製した。ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｕ７４Ａｖ２チップとハイブリッド形成させ、遺伝子発現をＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウェア（ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて分析した。精製ヒト又はマウスＨＳＣをＰ６のマウスの硝子体内に注射した。Ｐ４５において、網膜を解剖し、ＲＮＡの精製及びヒト特異的Ｕ１３３Ａ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップとのハイブリダイゼーション用に、１）ヒトＨＳＣを注射して、救済されたマウス網膜、２）ヒトＨＳＣを注射して、救済されなかったマウス網膜、及び３）マウスＨＳＣを注射して、救済されたマウス網膜の各画分をプールした。ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウェアを使用して、バックグラウンドよりも発現され、ヒトＨＳＣによって救済された網膜においてより高度に発現される遺伝子を特定した。次いで、これらの遺伝子の各々のプローブペア発現プロファイルを個々に分析し、ｄＣｈｉｐを用いて正常ヒトＵ１３３Ａマイクロアレイ実験のモデルと比較して、ヒト種特異的ハイブリダイゼーションを求め、異種間ハイブリダイゼーションによる偽陽性を排除した。
【０１２１】
図２１は、本発明のＣＤ１３３陽性（ＤＣ１３３＋）及びＣＤ１３３陰性（ＣＤ１３３−）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団についてのＣＤ３１及びインテグリンアルファ６表面抗原の発現を比較したフローサイトメトリーデータである。左パネルは、フローサイトメトリー散布図である。中央及び右パネルは、細胞集団上の特異抗体発現レベルを示すヒストグラムである。Ｙ軸は現象数であり、Ｘ軸はシグナル強度である。白抜きのヒストグラムは、非特異的バックグラウンド染色レベルを示すアイソタイプＩｇＧ対照抗体である。塗り潰したヒストグラムは、細胞集団上の特異抗体発現レベルである。白抜きの（対照）ヒストグラムの右側に移動した、塗り潰したヒストグラムは、抗体の蛍光シグナル及び発現がバックグラウンドレベルよりも増加したことを表す。２つの細胞集団間の塗り潰したヒストグラムのピーク位置を比較すると、細胞上のタンパク質発現の差がわかる。例えば、ＣＤ３１は、本発明のＣＤ１３３＋とＣＤ１３３−の両方の細胞上でバックグラウンドよりも発現されるが、低レベルのＣＤ３１を発現する細胞は、ＣＤ１３３−細胞集団よりもＣＤ１３３＋細胞集団においてより多い。このデータから、ＣＤ３１発現は２つの集団間で異なり、アルファ６インテグリン発現は、主としてＬｉｎ−集団中の細胞に限られ、したがって血管及び神経栄養性救済機能を有する細胞のマーカーとして役立ち得ることが明らかである。
【０１２２】
ＣＤ１３３陽性及びＣＤ１３３陰性Ｌｉｎ−ＨＳＣ亜集団を新生仔ＳＣＩＤマウスの眼の硝子体内に注射すると、発達中の血管構造への最大の取り込みは、ＣＤ３１とインテグリンα６の両方の表面抗原を発現するＣＤ１３３陰性亜集団で観察された（図２１、下参照）。ＣＤ３１もインテグリンα６も発現しないＣＤ１３３陽性亜集団は（図２１、上）、虚血によって誘導される末梢の新血管新生部位を標的にすると考えられるが、血管新生を起こしている眼に注射したときには標的にしないと考えられる。
【０１２３】
救済された網膜及び救済されなかった網膜を、かん体又は錐体のオプシンに特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に分析した。図１７に示すＥＲＧ記録に用いたのと同じ眼をかん体又は錐体オプシンについて分析した。野生型マウス網膜においては、存在する光受容器の５％未満が錐体である（Ｓｏｕｃｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：４８１−４９３）。図２５（ａ）に示す赤／緑錐体オプシン、又は図２５（ｂ）に示すかん体ロドプシンを用いて観察された免疫組織化学的染色パターンは、錐体細胞のこの割合と一致した。かん体ロドプシンに特異的な抗体（ｒｈｏ４Ｄ２）を、ブリティッシュコロンビア大学のＤｒ．  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍｏｌｄａｙから入手し、既報のように使用した（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ４２：５５−７１）。錐体の赤／緑オプシンに特異的なウサギ抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ（ＡＢ５４０５）から購入し、製造者の指示に従って使用した。
【実施例１０】
【０１２４】
酸素誘発性網膜変性のネズミモデルにおけるネズミ細胞の硝子体内投与。
【０１２５】
新生野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスを、酸素誘発性網膜変性（ＯＩＲ）モデルにおいて、生後Ｐ７からＰ１２まで酸素過剰（７５％酸素）に曝露した。図２２は、Ｃ５７Ｂ１６マウスにおけるＰ０からＰ３０までの出生後の正常な血管発達である。Ｐ０においては、発達し始めた表面血管のみが視神経乳頭付近に観察される。それに続く数日間、初期の表面ネットワークが末梢に向かって拡大し、Ｐ１０までに遠位の末梢に達する。Ｐ７からＰ１２までに二次（深部）叢が発達する。Ｐ１７までに、広範な表面及び深部の血管ネットワークが出現する（図２２、挿入図）。その後数日間、成体構造がおよそＰ２１に生成するまで、再構築が血管の三次（中間）層の発達と一緒に起こる。
【０１２６】
これに対し、本明細書に記載のＯＩＲモデルにおいては、Ｐ７−Ｐ１２における７５％酸素曝露後に、正常な一連の現象が極度に乱れる（図２３）。本発明の成体ネズミＬｉｎ−ＨＳＣ集団を、その後ＯＩＲに供されるマウスの片眼の硝子体内にＰ３で注射した。他方の眼にＰＢＳ又はＣＤ３１陰性細胞を対照として注射した。図２４は、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団が、発達中のマウス網膜において、高酸素レベルの変性効果を逆転させることができることを示している。処置した眼においては、完全に発達した表面及び深部の網膜血管構造がＰ１７において観察されたのに対して、対照の眼は、実質的に深部血管のない大きな無血管領域を示した（図２４）。ＯＩＲモデルのマウスの約１００個の眼を観察した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団で処置した眼の５８％において正常な血管新生が観察された。これに対し、ＣＤ３１−細胞で処置した対照の眼では１２％、ＰＢＳで処置した対照の眼では３％であった。
【実施例１１】
【０１２７】
ＣＤ４４選択によるネズミ骨髄からの骨髄球様骨髄細胞の単離。
【０１２８】
骨髄細胞を成体マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＥ）から抽出した。骨髄全体をネズミＣＤ４４抗体で処置し、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４４発現細胞を骨髄から単離した。細胞を抗体から分離し、将来の使用に備えて緩衝液中に保存した。ＣＤ４４をさほど発現しない細胞集団も単離した（ＣＤ４４ｌｏＢＭ）。
【実施例１２】
【０１２９】
ＣＤ４４選択によるネズミ骨髄からの骨髄球様骨髄細胞の単離。
【０１３０】
骨髄細胞を、ＣＤ４４の代わりにＣＤ１１ｂに対する抗体を用いて、実施例１１に記載のように、ポジティブ選択した。ＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ１１ｂ＋である骨髄球様骨髄細胞集団を単離した。この集団は、実施例１１においてＣＤ４４を用いて単離したＣＤ４４ｈｉ集団と類似の活性特性を有した。ＣＤ４４ｌｏＣＤ１１ｂ−集団も単離した。この集団は不活性であることが判明した。
【実施例１３】
【０１３１】
ＭＬＢＭ細胞集団のキャラクタリゼーション。
【０１３２】
本発明におけるＣＤ４４の役割は不明であるが、この受容体は、細胞を眼に注射した後に、ヒアルロン酸が豊富な硝子体中で細胞の生存、細胞の遊走及び／又は細胞の分化を媒介する可能性がある。ＣＤ４４ｈｉ（すなわち、ＭＬＢＭ）及びＣＤ４４ｌｏ細胞の別個の集団が、分画されていないマウス骨髄中に存在した。ＭＬＢＭ細胞集団は、上記実施例に使用したＬｉｎ−集団の７６％であるのに対して、骨髄由来のＬｉｎ＋及びＣＤ３１−／ＣＤ３４−／ＣＤ１１ｂ−細胞集団のそれぞれわずか約３７％及び４％しかＣＤ４４を発現しなかった（図２６）。したがって、ＣＤ４４発現とこれら３つの集団において観察される血管栄養性及び神経栄養性活性との間には高い相関がある。すなわち、Ｌｉｎ−細胞は最も有効であったのに対して、ＣＤ３１−／ＣＤ３４−／ＣＤ１１ｂ−細胞は一貫して有効性が最も低かった。系統特異抗体のパネルを用いて、ＣＤ４４ｈｉ細胞の大多数は、骨髄球性特性を強く有すると判定された（図２７）。同様に、ＣＤ４４ｈｉ骨髄細胞のほぼ全部がＣＤ１１ｂ＋でもある（図２７）。
【０１３３】
実施例１２においてＣＤ１１ｂ抗体を用いてポジティブ選択されたＭＬＢＭ（ＣＤ４４ｈｉＣＤ１１ｂ＋）は、血管ターゲティング実験においてＣＤ４４抗体選択によって単離されたＭＬＢＭで得られた結果と類似した活性結果を示した。
【０１３４】
実施例１２のＭＬＢＭ細胞集団及び実施例１２において単離されたＣＤ４４ｌｏＣＤ１１ｂ＋細胞の各細胞表面抗原特性を下記表３に示す。表３において、プラス記号（＋）の数が多いほど、抗原の発現は比較的高い。マイナス記号（−）は、発現が検出されなかったことを示す。
【０１３５】
【表３】
2008537478.tif 000005
【実施例１４】
【０１３６】
ＭＬＢＭ細胞集団の血管栄養性及び神経栄養性効果。
【０１３７】
実施例１１のＭＬＢＭ細胞集団は血管ターゲティング並びに血管及び神経栄養性効果の点でＬｉｎ−細胞の諸性質を保持したが、ＣＤ４４ｌｏＢＭ細胞はほとんど又は全く活性を示さなかった。血管ターゲティング活性は、ＧＦＰ＋ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞を生後７日（Ｐ７）のマウスの硝子体内に注射し、網膜をＰ１４において分析することによって、実証された。血管をＧＳイソレクチンで標識した後、ＧＦＰ＋細胞は、網膜血管構造を標的にし、血管の周囲に局在化することが認められたが、取り込みの証拠はなかった。これらの現象は、ＭＬＢＭを用いたときには一般的であるが、ＣＤ４４ｌｏＢＭで処置した眼においては稀であり、又は存在しなかった（図２８）。
【０１３８】
実施例１１のＭＬＢＭ細胞集団の血管及び神経栄養性活性を、上述したように網膜変性マウスモデルを用いて、Ｌｉｎ−ＨＳＣについて評価した。ｒｄ１／ｒｄ１マウスは、光受容器の消滅及び深部網膜血管構造の萎縮を含めて、網膜変性疾患の特徴を示す。上述したように、Ｌｉｎ−ＨＳＣ骨髄細胞は、深部網膜血管構造及び部分的に救済された光受容器を維持する。本発明のＭＬＢＭ細胞集団は同じ機能を果たす（図２９）。
【０１３９】
酸素誘発性網膜症モデルは、未熟児網膜症と特徴を共有する。このモデルに付随する病状は、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞で眼を処置するとかなり軽減する。このモデルにおけるＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞の効果は、上記Ｌｉｎ−ＨＳＣを用いて認められる効果に類似していた。ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞で処置した眼は、このモデルにおいて病状の程度を数量化するのに使用される２つのパラメータ、すなわち、血管閉塞面積と新生血管叢面積がかなり減少した。これに対し、ＣＤ４４ｌｏＢＭ細胞で処置した眼は、ビヒクル対照で処置した眼よりも改善されなかった（図３０）。
【０１４０】
ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、網膜血管構造を標的にすることに加えて、マクロファージ様（Ｆ４／８０＋）細胞に分化し、網膜に侵入し、網膜色素上皮（ＲＰＥ）にほぼ対向する位置を占める。この局在化によって、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞の血管及び光受容器の救済効果が促進される。また、ＲＰＥ近くの位置を占めると、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、ＶＥＧＦ−ＧＦＰマウスから得られたＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞の注射によって実証されるように、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生する。ＶＥＧＦ−ＧＦＰマウスにおいては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がＶＥＧＦ遺伝子の活性化によって発現される（図３１）。したがって、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞は、ＶＥＧＦ「活性化」状態にあると考えられる。ＭＬＢＭ細胞集団から導入された細胞は、同じタイプの内因性細胞を補充すると考えられる。というのは、（導入された）ＧＦＰ＋と（内因性）ＧＦＰ−の両方の細胞がＲＰＥ領域に観察されるからである。この局在化は、正常な網膜血管発達中の野生型マウスにおいて、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの救済された網膜において、また、酸素誘発性網膜症モデルにおいて、認められた。
【０１４１】
類似の血管ターゲティング結果は、実施例１２のＭＬＢＭ細胞集団でも得られた。図３２は、実施例１２のＣＤ４４ｈｉＣＤ１１ｂ＋細胞（緑）が、実施例１１のＣＤ４４−ｈｉｇｈ集団と同様に、Ｐ２において注射したときに、Ｐ２０までに血管構造（赤）を特異的に標的にしたことを示している。図３３は、実施例１２のＣＤ４４ｌｏＣＤ１１ｂ−が血管構造を特異的に標的にしなかったことを示している。
【０１４２】
本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、眼球疾患に対して有効で万能な治療を提供する。これらの細胞は、自家骨髄から容易に単離され、したがって細胞療法においてしばしば見られる潜在的免疫原性が最小限に抑えられる。また、本発明のＭＬＢＭ細胞集団は、機能遺伝子を網膜に送達するために有用な遺伝子を形質移入することができる。
【実施例１５】
【０１４３】
骨髄細胞亜集団のさらなるキャラクタリゼーション。
【０１４４】
上記実施例に記載のように、全実験をＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って実施し、全実験手順は、ＴＳＲＩ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。ＯＩＲをＣ５７Ｂ１６マウスにおいて上記プロトコルに従って誘起した。生後７日の仔及びその母親を室内気から７５％酸素の環境に５日間移し、その後室内気に戻した。酸素レベルをＦＤＡ認定の酸素分析計（ＡＸ−３００、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてモニターした。これらの条件下で、大きな血管過少域が酸素過剰中に中心網膜に形成される。酸素正常状態に戻した後、網膜前方の異常な新血管新生が起こり、およそＰ１７にピークに達し、最終的に消散する（図３７、パネルｇ−ｉ；図２、パネルａ、ｃ）。
【０１４５】
細胞調製物：マウス骨髄細胞抽出を実質的に以下の通り実施した。すなわち、骨髄細胞をａｃｔＧＦＰマウスの大腿骨及びけい骨から収集し、２つの異なる方法によって加工した。第１の方法では、単核球を、ＦＩＣＯ／ＬＩＴＥ  ＬＭ（登録商標）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ）を用いて密度勾配によって分離し、ビオチン複合系統抗体（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ３ｅ、Ｌｙ−６Ｇ／Ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＴＥＲ１１９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識した。続いて、単核球を、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）又は抗ビオチン磁気ビーズと一緒にインキュベートし、ＭＡＣＳ細胞選別システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて選別して、Ｌｉｎ−ＨＳＣ集団を得た。第２の方法では、蛍光性標識と複合化されたＣＤ４４に対する抗体と一緒に骨髄全体をインキュベートした。次いで、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、ＣＤ４４ＨＩ細胞（すなわち、細胞の大多数がＣＤ４４を発現するＭＬＢＭ細胞集団）及びＣＤ４４ＬＯ細胞（すなわち、細胞の少数がＣＤ４４を発現する細胞集団）を単離した。
【０１４６】
骨髄細胞キャラクタリゼーション：上記方法によって得られた細胞亜集団のさらなる分析を２つの手順、すなわち、（１）ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ／Ｃ、ＣＤ４３、Ｆ４／８０、ＣＤ１４、ｃＫｉｔ、ＣＤ３４、α６インテグリン及びＣＤ１１５（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含めて、種々の系統及び前駆細胞表面マーカーに対する抗体と組み合わせた２カラーフローサイトメトリー並びに（２）ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）Ｍｕ４３０  Ｃｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いた当分野で公知の標準方法による遺伝子発現解析によって実施した。遺伝子発現をＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって解析した。
【０１４７】
硝子体内注射：Ｐ２−Ｐ７（酸素過剰前）のマウスの眼けんを軽く切開して亀裂を入れて、眼球を露出させた。各動物の一方の眼に、ビヒクル（０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）０．５μｌ中の約１５０，０００から２５０，０００個の骨髄由来細胞を、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ及び３３番ゲージニードル（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、Ｎｅｖａｄａ）を用いて、硝子体に注射した。反対側の対照の眼にほぼ同数の対照細胞又はビヒクルのみを注射した。注射をせずに、疾患の自然経過を観察する場合もあった。実験の一部では、細胞移植をＰ９からＰ１２までのより遅い日齢で実施した。
【０１４８】
網膜血管構造の染色：網膜をＰ１７で収集し、血管構造を画像化し、注射した細胞の場所を突き止め、特徴づけた。網膜を切開する前に、動物に麻酔をし、心臓内フルオレセイン（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）標識高分子量デキストラン（ＦＩＴＣ  Ｄｅｘｔｒａｎ、Ｓｉｇｍａ）を注射して、開存血管を可視化する場合もあった。或いは、血管及びＧＦＰ発現細胞を染色する免疫組織学的技術を用いた場合もあった。網膜を４％パーフルオロ酢酸（ＰＦＡ）及びメタノールで固定し、続いて２０％ＦＢＳ／２０％ＮＧＳで室温で１時間ブロックした。続いて、ＡＬＥＸＡ（登録商標）５９４と複合化されたイソレクチンＧＳ−ＩＢ４と一緒に終夜インキュベートして、血管を特定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）。網膜に放射状の減張切開を施して平面状にして、全載標本を得た。或いは、網膜をＯＣＴに包埋し、凍結切断して、網膜の断面を得、装着前にＤＡＰＩで対比染色した。
【０１４９】
移植細胞を特徴づけるために、免疫組織学的技術を用いて、眼のサブセット中の以下の細胞マーカー、すなわち、Ｆ４／８０（Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、ＣＤ４４、ＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＮＧ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を特定した。全網膜をレクチン、抗ＧＦＰ及び上記マーカーの１種類で三重染色した。
【０１５０】
画像化及び画像解析：網膜血管構造の画像を、ＲＡＤＩＡＮＣＥ（登録商標）２１００ＭＰレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて得た。血管閉塞及び新血管新生を以下の通り定量化した。すなわち、ＧＳレクチン染色網膜の中心網膜において無血管帯域の輪郭を慎重に描き、総面積をＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（登録商標）（Ａｄｏｂｅ）又はＶＯＬＯＣＩＴＹ（登録商標）ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ）を用いて計算することによって、血管閉塞面積を測定した。同様に、網膜前方の平面に焦点を合わせた共焦点画像を用い、画素強度に基づいて血管叢を選択することによって（血管叢は、正常な血管構造よりも明るく標識される。）、網膜前方の新血管新生（「血管叢」）の面積を計算した。次いで、選択領域を合計して、新血管新生の総面積を求めた。Ｔ検定によって異なる実験群を統計的に比較した。
【０１５１】
網膜血管構造及び血管周囲骨髄細胞の３次元画像を、共焦点画像のｚシリーズを収集し、それらをＶＯＬＯＣＩＴＹ（登録商標）ソフトウェアを用いて立体（ｖｏｌｕｍｅ）にレンダリングすることによって、作製した。したがって、網膜血管の断面を見ることができ、血管管腔に対する移植骨髄細胞の位置を決定することができた。
【０１５２】
網膜血管の発達、及び酸素誘発性網膜症のマウスモデル。正常酸素圧状態下で成長した出生後のマウスにおける正常な網膜血管の発達を図３７、パネルａ−ｆに示す。生後２日（Ｐ２）において、発達し始めた表面血管のみが視神経乳頭周囲の単一面を占めているのが観察される（図３７、パネルａ、ｂ）。次の週の間、初期の表面ネットワークが末梢に向かって拡大し、およそＰ１２に遠位の末梢に達する（図３７、パネルｃ）。Ｐ７からＰ１２まで、二次（深部）叢が発達する（図３７、パネルｄ）。１ヵ月の終わりまでに、三次（中間部）血管層の発達とともに、完全に血管が新生した網膜中で再構築が起こり（図３７、パネルｅ）、成体構造が形成される（図３７、パネルｆ）。
【０１５３】
これに対し、ＯＩＲモデルにおいては、Ｐ７からＰ１２まで７５％酸素に暴露すると、現象の正常な配列が極度に乱れ、中心網膜中に既に形成された血管の表面ネットワークが、特に動脈に沿って、著しく退行し（図３７、パネルｇ（Ｐ１０）及びパネルｈ、ｉ（Ｐ１７））、深部叢の発達が極度に遅れる（図３７、パネルｋ、ｍ、Ｐ１７における網膜断面）。Ｐ１２において正常酸素圧状態に戻した後にのみ、異常な血管成長が再開する。要するに、正常酸素圧状態は、極度の血管過少網膜にとって今では比較的低酸素状態になる。Ｐ１７において、一部の深部血管を末梢において特定することができるが、血管内色素の漏洩に伴う、網膜前方の異常な新生血管叢を、末梢中央部の、血管過少中心網膜とより多くの血管が新生した末梢との境界に見ることができる（図３７、パネルｈ）。その後数日間にわたって、表面及び深部の血管が無血管領域中で徐々に発達するが、網膜の内境界膜（ＩＬＭ）上で硝子体中に突出した新生血管叢がＰ２１まで、さらにはその後も持続する事が多い。Ｐ２５−Ｐ３０までに、網膜血管構造が再構築され、この時点で正常な血管構造に類似する。
【０１５４】
酸素過剰前に造血性前駆細胞を注射すると、酸素誘発性血管閉塞後の網膜における血管修復が促進される。本発明のＬｉｎ−ＨＳＣをＰ２−Ｐ７に注射すると、酸素過剰暴露後の網膜血管構造の回復能力が劇的に変化した（図３７、パネルｊ、ｌ、ｎ及び図３８、パネルｂ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）。ビヒクルのみの注射では、かかる変化を誘発しなかった。５０％を超える症例において、完全に発達した表面及び深部の網膜血管構造が、Ｐ１７のＬｉｎ−ＨＳＣを注射した眼において見られたが、反対側のビヒクルを注射した眼は、大きい無血管領域を示し、実際に深部血管を示さなかった（図３７、パネルｈ、ｉ、ｋ及びｍと比較したパネルｌ、ｎ）。特に、反対側の対照の眼が極めて重傷であるときには、Ｌｉｎ−細胞を注射した眼がＰ１７までに回復しない場合もあったが、大多数の症例においてはかなり改善した。同じ動物における他眼のこの比較は、大部分の他の遺伝及び環境要因を効果的に均等化して、Ｌｉｎ−ＨＳＣの効力をさらに裏付けるものである。
【０１５５】
血管閉塞は、このモデルにおいて正当に評価されていない特徴である。というのは、大部分の研究は、連続的な網膜切片における網膜前方の新生血管叢形成を分析するだけにすぎないからである。同じ網膜における血管閉塞及び血管叢形成を共焦点顕微鏡法及びデジタル画像解析によって評価することができる（例えば、図３８、パネルａ−ｄ参照）。Ｐ１７を、主要な分析時点として選択した。というのは、かなりの血管閉塞が対照の眼においては依然として存在するものの、血管叢形成がこの時点で最大であることが多いからである。新規複合分析方法を用いて、処置した眼と対照の眼との実質的な差を確認した。Ｐ１７において測定された血管閉塞は、ビヒクルのみを注射した眼、又は注射しなかった眼と比較して、Ｌｉｎ−で処置した網膜においてかなり減少した（閉塞面積における７５％を超える減少）（図３８、パネルｅ）。この点でビヒクル注射と注射なしでは有意差は認められなかった。同様に、Ｌｉｎ−細胞で処置した眼は、ビヒクルを注射した眼よりも新生血管叢面積が約７０％減少し、注射しなかった対照に対しては８０％を超える減少であった（図３８、パネルｆ）。したがって、Ｌｉｎ−ＨＳＣによる眼の処置は、マウスＯＩＲモデルの２つの主要な血管外傷及び修復パラメータ、すなわち、網膜内部の「生理的」血管再生を加速すると同時に新生血管叢の形成を減少させることに対して劇的な効果を有した。
【０１５６】
修復の加速は、処置を酸素過剰中及び酸素正常状態に戻した後に実施したときにも認められたが、効果は低下した。これまでに述べた実験では、酸素過剰に暴露する前のＰ２−Ｐ７で注射を行った。サイクルの酸素過剰時期中、酸素正常状態に戻した後など、後で注射した場合にＬｉｎ−細胞が血管修復に影響を及ぼし得るかどうかを判定するために、注射をＰ９、Ｐ１１又はＰ１２で実施し、網膜を種々の遅い時点で評価した。結果を図３８、パネルｇに示す。この結果によれば、Ｌｉｎ−ＨＳＣの注射は、酸素過剰中及びＰ１２で投与したときでも、血管修復を加速し、閉塞面積を減少させるのに有効であった。しかし、効果は幾らか低下したと考えられ、高濃度酸素暴露前に処置したときに最大の効力が得られることが示唆された。
【０１５７】
Ｌｉｎ−造血性前駆細胞で治療後、長期の網膜構造及び機能は十分に維持された。Ｌｉｎ−ＨＳＣ処置による長期効果及び起こり得る副作用も試験した。このために、確立されたモデルに従って、Ｌｉｎ−細胞注射を行い、酸素過剰に暴露した３−６ヵ月齢のマウスから１２個の網膜を採取した（図３９）。腫ようは認められず、神経網膜は、いずれの場合においても組織学的に維持されたと考えられた。唯一の注目すべき異常は、対照の眼においても見られる、網膜内の散在的な「ロゼット」の形成であった（図３９、パネルｇ、ｈ）。Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した眼の網膜血管構造は、正常な外観を有し、注射しなかった対照の網膜と明らかな差は見出されなかった（図３９、パネルａ−ｆ）。
【０１５８】
移植細胞の長期持続性についても試験した。ＧＦＰ＋細胞は、ほんの少数の眼（１０％）でしか認められず、注射した細胞の大多数が数ヵ月以上生存しないことを示している。存在するときには、残存細胞は、網膜血管構造の近傍に位置することが多かった。移植後１７日から６ヵ月まで実施した網膜電図記録によって測定して、網膜機能は、Ｌｉｎ−ＨＳＣを移植した眼と正常な非ＯＩＲ同齢対照とでは差がなかった。移植細胞が眼から退出し、全身に広がる可能性を検討するために、１５匹のマウスから得たひ臓及び／又は肝臓を、注射後約７から１０日にＧＦＰ＋細胞の有無について分析した。眼球外細胞は観察されなかった。
【０１５９】
活性細胞タイプの検証：Ｌｉｎ−集団をＣＤ４４ＨＩ細胞について濃縮した。これらのプロセス中に活性であり得る機序をより良く理解し、細胞選択手順を単純化する試みとして、活性ＨＳＣを骨髄から単離するのに使用することができる単一マーカーの特定を試みた。細胞遊走及び分化への関与などの諸特性に基づいて、骨髄前駆体マーカー候補の大きいパネルを組み立てた。フローサイトメトリーを用いて、これらのマーカーをスクリーニングし、活性なＬｉｎ−細胞における発現と、幾つかの実験系において不活性であることが以前に示された対照ＢＭ細胞における発現とを比較した。ＣＤ４４は、これら２つの集団において異なって発現されることが判明した。すなわち、ＣＤ４４ＨＩ細胞は、対照ＢＭ細胞集団中（４％）よりもＬｉｎ−細胞集団中においてかなり高い割合（７６％）で存在した（図４０、パネルａ）。上述したように、ＣＤ４４は、ヒアルロン酸の細胞表面受容体であり、生存、遊走及び分化を含めて、救済効果を媒介するのに重要であると考えられる幾つかの細胞機能の調節に関与することが判明した。活性細胞集団中に多く、活性の低い対照細胞中に極めて稀であるＣＤ４４ＨＩ細胞の分布は、ＣＤ４４が、実際に、活性の有効な指標であることを示している。
【０１６０】
例えば、ＣＤ４４ＨＩ細胞は、ＯＩＲモデルにおける血管修復を促進するが、ＣＤ４４ＬＯ細胞は促進しない。ＣＤ４４ＨＩ細胞の効力は、ＯＩＲモデルにおいて血管修復を促進する能力について検証された。Ｌｉｎ−細胞注射の場合と同じ実験計画を用いて、ＣＤ４４ＨＩ細胞が、このモデルにおいて、Ｌｉｎ−細胞の場合と類似した効力で、網膜血管修復を促進することが実証された（図４０、パネルｂ、ｃ）。これに対し、ＣＤ４４ｌｏ細胞は、修復に対して正の効果を示さなかった。ＣＤ４４ＬＯで処置した動物の網膜内で、注射した細胞はほとんど又は全く観察されないことが多いことは指摘する価値がある。これは、これらの細胞が硝子体中で生存する能力が乏しく、及び／又は網膜に移動することを示唆している。ＣＤ４４ＨＩ細胞が、唯一の活性骨髄亜集団であるか、又はこの活性を有する他の亜集団の１つであるかどうかは不明である。
【０１６１】
ＣＤ４４ＨＩ細胞は、骨髄起源であることを示唆する遺伝子及びマーカーを発現する。ＣＤ４４ＨＩ集団のさらなるキャラクタリゼーションを、大規模発現解析によって、また、Ｌｉｎ−及び前駆体特異的マーカーの抗体標識とそれに続くフローサイトメトリーによって、実施した（図４１及び図４４）。どちらの方法でも、ＣＤ４４ＨＩ細胞が、骨髄起源であることを示唆する発現プロファイルを有することが明らかになった。ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及びＬｙ６Ｇ／Ｃの強い発現がこれらの細胞上でタンパク質レベルで観察された。一方、強度の小さい陽性標識がフローサイトメトリーによってＦ４／８０、ＣＤ１４、ｃＫｉｔ及びＣＤ１１５に対して検出された。ＣＤ２０４、ＣＤ１１４、ＣＤ３３及びＣＤ１１５を含めた幾つかの骨髄球特異的遺伝子が、発現解析上でＣＤ４４ｌｏ細胞よりも高度に発現された（図４４）。これに対し、タンパク質レベルでは、ＣＤ４４ＬＯ集団は、それぞれ赤芽球／赤血球及びＢ細胞のマーカーであるＴｅｒ１１９及びＣＤ４５Ｒ  Ｂ２２０がかなり発現した。発現アレイ上では、リンパ球に関連する幾つかの遺伝子は、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ及びＣＤ２２を含めて、ＣＤ４４ＨＩ細胞よりもＣＤ４４ＬＯにおいて高度に発現された（図４４）。したがって、転写レベル及びタンパク質レベルでの解析によって、活性ＣＤ４４ＨＩ集団が主に骨髄起源であり、一方、不活性ＣＤ４４ＬＯ細胞が主としてリンパ起源であることが確認された。
【０１６２】
移植細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ分析  −  分化の証拠：骨髄由来の活性な細胞の集団をより明確に定義したので、眼に導入した後のこれらの細胞の運命を調べた。このため、ＣＤ４４ＨＩを注射した、ＯＩＲモデルの網膜を、種々のマーカーを用いた免疫組織化学によって分析した。導入した細胞の大多数は、網膜血管構造を選択的に標的にし、血管周囲に局在化し、宿主の血管と堅固に結合した細長い構造をしばしば形成した（図４２、パネルａ）。ＣＤ３１及びＮＧ２に対する抗体を用いて、ＧＦＰを発現する血管周囲骨髄細胞上でこれらのマーカーが検出されず、骨髄細胞がそれぞれ内皮細胞又は周細胞に分化しないことが示唆された。また、移植細胞は血管管腔の部分を形成しないと考えられ（図４２、パネルｂ）、移植細胞が内皮細胞に分化する可能性がないことが示された。これに対し、マクロファージ／小こう細胞マーカーＦ４／８０は、ＣＤ４４ＨＩで処置した眼においてすべてではないが多数の血管周囲ＧＦＰ＋細胞を標識した（図４３、パネルｄ−ｉ）。導入されたこれらのＦ４／８０＋細胞は、Ｆ４／８０でやはり標識された内因性血管周囲細胞と極めて類似した外観を有し（図４３、パネルａ−ｃ）、移植細胞がＯＩＲモデルにおいて未変性細胞と類似したアイデンティティを有することが示唆された。
【０１６３】
特に従来の薬物治療と比較して、細胞治療の考えられる利点の１つは、細胞が局所的合図に応答し、変わりつつある環境において改変し得る能力である。網膜血管構造を標的にし、血管周囲の位置を占めるＰ１７（注射後１０日）の移植細胞は、ＣＤ４４を検出不可能なレベルに下方制御することが認められた（図４３、パネルｊ−ｏ）。しかし、血管構造と関連しない細胞は、ＣＤ４４の発現を維持した。すなわち、ＦＡＣＳによって高度のＣＤ４４発現に基づいて最初に選択された移植細胞の亜集団は、この受容体をインビボで下方制御した。これは、網膜中の細胞の場所と相関があった。これは、導入された細胞が、実際に、眼の環境内で選択的に変化（分化）することを示唆している。
【０１６４】
上で詳述した結果によれば、細胞療法によってＲＯＰ及び他の虚血性網膜症を治療することができる。マウスモデルにおいて観察された結果によれば、この手法は、高濃度酸素暴露に付随する血管の病状の緩和に効果的であり、ほとんど又は全く毒性を示さない。細胞治療を用いる利点は、単一因子療法（ｓｉｎｇｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）に対して、変わりつつある環境に順応し、応答する細胞の能力に存し得る。単一因子療法から、薬物と介入の組合せ、宿主組織と相互作用しながら、複雑な応答シークエンスを組織化し、実行することができる、精巧で順応性のある細胞の選択及び送達までの進化は、刺激的な新しい概念である。この点で、本発明は、虚血性網膜症／血管症に対する手法の「パラダイムシフト」を提供し、すなわち、阻害及び閉塞の代わりに治癒及び安定化を強調する。
【０１６５】
本発明の単離ＭＬＢＭ細胞集団は、網膜変性モデルにおいて、網膜血管構造を標的にし、血管新生抑制剤の送達に使用することができ、血管及び神経栄養性効果を有する。本研究においては、Ｌｉｎ−単離ＭＬＢＭ細胞集団の特定の亜集団は、ＯＩＲの修復を加速するのに極めて有効である。興味深いことに、活性な細胞は、骨髄起源であることを示唆するマーカーを発現し、移植後に恐らく分化及び改変する。
【０１６６】
血管新生を促進する細胞治療の使用は、梗塞性動脈の側枝を形成する目的で、心臓病学分野が先頭に立っている。かなりの量の証拠によって、ある種の骨髄細胞が灌流及び心機能の改善に有効であることが示されている。しかし、どの細胞タイプが、観察された効果の原因であるかはまだ不明である。骨髄由来内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の潜在的役割を検討する多数の研究は、骨髄由来内皮前駆細胞が新しい血管又は側枝血管中に存在すると結論したが、これらの研究の一部において報告された、少数の取り込まれた細胞がその重要性に関して疑問を投じている。さらに、極めて少数の幹細胞及び／又はＥＰＣを含む、単核球、分画されていない細胞などの不均一な骨髄集団も、側枝の発達をかなり促進することができ、血管への直接取り込み以外の他の機序が作用していることを示唆している。理論に拘泥するつもりはないが、これらの細胞が支持的なパラクリンの役割を果たし、それによって、これらの細胞から分泌された因子が、宿主血管構造に対する条件を最適化するように作用している可能性がある。多数の骨髄亜集団は、血管形成因子源であることが示されたが、単球細胞は、種々のかかる因子を分泌することが知られている。したがって、骨髄細胞がパラクリン様式で働き、側枝血管形成においてＥＰＣの役割を補完し、宿主免疫系と相互作用する可能性がある。
【０１６７】
この系において作用する正確な機序はまだ不明であるが、機能的な骨髄細胞の本質を理解する上で重要な進展がなされた。骨髄内の活性な骨髄系集団を特定することによって、本発明の細胞によって提供されるように、機序に関する幾つかの示唆がなされ得る。骨髄細胞、特に単球及びマクロファージは、血管新生増殖因子の分泌によって血管成長に影響を及ぼす、確立された能力を有する。また、マクロファージは、他の細胞タイプよりも低酸素に耐性があり、血管形成因子を分泌することによって低酸素状態に応答することが示されている。したがって、骨髄系前駆体を虚血性網膜に導入することによって、低酸素状態に耐えることができ、パラクリン方式で血管修復を促進することができる細胞を提供することができるかも知れない。ＯＩＲ網膜における宿主由来のＦ４／８０＋血管周囲細胞の存在は、このタイプの細胞がこの過程においてある役割を果たし、多量の類似の細胞（又はその前駆体）を眼に直接移植して送達することによって恐らくこの効果が増強されることを示唆している。このシナリオは、本研究において観察されるように、本発明の細胞集団の注射によって、網膜の血管再生が促進される一方で、網膜前方の新血管新生が抑制される奇異な観察結果を際立たせるものである。その根拠はまだ十分にわかっていないが、加速された「生理的」血管再生によって、網膜が受ける低酸素が緩和され、虚血によって刺激される新生血管叢が同じ程度に形成されない可能性がある。
【０１６８】
血管成長の骨髄球様細胞支援の考えは、網膜変性のｒｄ１及びｒｄ１０マウスモデルに関する初期の一部の研究と関連し得る。注射した骨髄系前駆体は、分泌された因子を介して深部網膜血管構造を維持し、これらのモデルにおいて認められる血管変性を防止するように作用することができるかも知れない。ｂＦＧＦなどマクロファージによって分泌された血管形成因子は、神経栄養性活性も同様に実証している。したがって、ｒｄマウスにおいて本発明の細胞集団を注射した後で観察される、光受容器の消滅の減少は、神経栄養因子が移植骨髄由来骨髄細胞によって産生される、パラクリン機序によって媒介され得る。この機構を支持して、本研究によれば、本発明の単離ＭＬＢＭ細胞集団は、ｒｄモデルにおいて、単離ＭＬＢＭ細胞の注射後に認められた効力と類似した効力で、血管及びニューロンを救済することができる。
【０１６９】
ＲＯＰの臨床治療においては、胎児さい帯血球をハイリスクな早産児の誕生中に収集し、次いで、細胞を選別して、救済効果を媒介する特定の亜集団を豊富にし、次いで、これらの自家前駆細胞を乳児の眼に注射することができる。
【０１７０】
細胞治療の使用に対する現時点での主要な制約の１つは、多くの場合において正確な分子作用機序がまだ不明であり、実際にはこれらの機序が各モデル間で異なり得ることである。しかし、これは、実際には、細胞療法の最大の利点、すなわち、変わりつつある条件及び合図に対して異なる方法で、かつ、広範に応答する能力になり得る。これは、異なる実験系と課題の間だけでなく、一つの系内で時間的に異なる場合にも当てはまる。換言すれば、かかる細胞は、ある種の因子をある時点で分泌し、異なる因子を別の時点で分泌し、最終的に、これらの因子の必要性が薄らいだ場合に、一斉に作用しなくなり得る。これは、現在の化学薬物療法で行うことのできないものであり、細胞がフィードバックを基本的に利用し、それに応答することに基づく。本研究で認められる、移植細胞におけるインビボでの細胞マーカーの改変は、この概念を支持するものである。
【実施例１６】
【０１７１】
ＭＬＢＭ細胞は、小こう細胞（小膠細胞）特性を有する細胞に分化する。
【０１７２】
ＣＤ４４ＨＩ細胞注射後の網膜の分析によって、眼に注射した後に、骨髄細胞のＣＤ４４ＨＩ集団が小こう細胞に分化することが示された。小こう細胞は、網膜中の常在性骨髄系集団であり、ＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０を含めて、特徴的なマーカーを発現する。これらの細胞は、その分岐（分枝）した形態によっても識別され、血管周囲に局在する。眼への注射後の種々のポイントにおけるＣＤ４４ｈｉ細胞の局在化、形態及び表面マーカー発現を解析した。注射したＣＤ４４ＨＩＧＦＰ＋細胞は、内因性網膜小こう細胞の上記特性のすべてを示すことが認められた（図４５）。図４５のパネルＡ及びＢによれば、注射したＣＤ４４ＨＩ細胞はＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０を発現し、内因性小こう細胞と類似した形態及び血管周囲局在化を示す。パネルＣは、３Ｄ画像解析であり、注射したＣＤ４４ＨＩ細胞が血管周囲領域に局在することを示している。パネルＤは、注射したＣＤ４４ＨＩ細胞の形態の高倍率画像である。
【実施例１７】
【０１７３】
ネガティブ選択によるＭＬＢＭ細胞の単離。
【０１７４】
抗体及び／又は磁気ビーズなど、表面に結合した選択剤を含まない細胞を注射することが、実験及び臨床応用の目的上望ましい。この目標を達成する一方法は、ネガティブ選択戦略を利用してＣＤ４４ＨＩ細胞を単離することである。本明細書に記載のＣＤ４４ＨＩ及びＣＤ４４ＬＯ細胞集団の表面マーカー発現プロファイルのキャラクタリゼーションによって、ＣＤ４４ＬＯ細胞がそれぞれ赤血球系細胞及びＢ細胞のマーカーであるＴｅｒ１１９及びＣＤ４５ＲＢ２２０を高度に発現することを発見した。Ｔ細胞マーカーＣＤ３ｅの添加に加えて、Ｔｅｒ１１９及びＣＤ４５ＲＢ２２０に対する抗体でＣＤ４４ＬＯ集団を効率的に標識し、磁気又はＦＡＣＳ分離によって除去して、「手つかずの（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ）」ＣＤ４４ＨＩ細胞を生成物として残すことができる。この戦略を用いてＦＡＣＳによって分離された細胞は、本発明のＭＬＢＭ細胞集団の典型的な機能的特性を示す（図４６）。
【０１７５】
図４６、パネルＡによれば、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９及びＣＤ３ｅに対して選択的な抗体を用いたＭＡＣＳによってマウス骨髄を枯渇させると、９０パーセントを超えるＣＤ４４ＨＩ細胞である細胞集団が生成する。パネルＢによれば、ネガティブ画分（ＣＤ４４ＨＩ集団）は、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９及びＣＤ３ｅ細胞を本質的に含まない。パネルＣによれば、ネガティブ選択されたＣＤ４４ＨＩ細胞は、網膜のターゲティング及び分化能力を保持する。
【０１７６】
本発明の精神及び新規特徴の範囲から逸脱することなく、上記実施形態の多数の変更及び改変を実施することができる。本明細書に記載する具体的実施形態は限定的なものではなく、限定的なものと考えるべきでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１Ａ】発達中のマウス網膜の略図である。（ａ）一次叢の発生、（ｂ）網膜血管形成の第二相。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内叢状層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＰＬ、外叢状層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、末梢。パネル（ｃ）は、骨髄由来のＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリー分析結果である。上列：非抗体標識細胞のドットプロット分布（Ｒ１は、陽性ＰＥ染色の定量可能なゲート領域であり、Ｒ２はＧＦＰ陽性である。）；中間列：Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下列：Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞。各細胞系は、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ複合抗体で標識されている。Ｔｉｅ−２データをＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。割合は、全Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団に対する陽性標識細胞のパーセントである。
【図１Ｂ】発達中のマウス網膜の略図である。（ａ）一次叢の発生、（ｂ）網膜血管形成の第二相。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内叢状層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＰＬ、外叢状層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、末梢。パネル（ｃ）は、骨髄由来のＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリー分析結果である。上列：非抗体標識細胞のドットプロット分布（Ｒ１は、陽性ＰＥ染色の定量可能なゲート領域であり、Ｒ２はＧＦＰ陽性である。）；中間列：Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下列：Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞。各細胞系は、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ複合抗体で標識されている。Ｔｉｅ−２データをＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。割合は、全Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団に対する陽性標識細胞のパーセントである。
【図１Ｃ】発達中のマウス網膜の略図である。（ａ）一次叢の発生、（ｂ）網膜血管形成の第二相。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内叢状層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＰＬ、外叢状層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、末梢。パネル（ｃ）は、骨髄由来のＬｉｎ＋ＨＳＣ及びＬｉｎ−ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリー分析結果である。上列：非抗体標識細胞のドットプロット分布（Ｒ１は、陽性ＰＥ染色の定量可能なゲート領域であり、Ｒ２はＧＦＰ陽性である。）；中間列：Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下列：Ｌｉｎ＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞。各細胞系は、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥ複合抗体で標識されている。Ｔｉｅ−２データをＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。割合は、全Ｌｉｎ−ＨＳＣ又はＬｉｎ＋ＨＳＣ集団に対する陽性標識細胞のパーセントである。
【図２Ａ】発達中のマウス網膜中へのＬｉｎ−ＨＳＣの移植を示す写真である。（ａ）注射後４日目（Ｐ６）に硝子体内注射したｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は、網膜に付着し、分化する。（ｂ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ（β−ｇａｌ抗体で染色されたＢ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６マウス）は、コラーゲンＩＶ抗体で染色された血管構造の前方に定着する（アステリスクは血管構造の先端を示す。）。（ｃ）注射後４日目（Ｐ６）においてＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ＋）の大部分は、分化することができなかった。（ｄ）腸間膜ｅＧＦＰ＋ネズミＥＣ  注射後４日（Ｐ６）。（ｅ）成体マウスの眼に注射したＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいて既存の星状細胞のテンプレートに向かい、それに沿って分化するｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ（矢印）の低倍率。（ｇ）Ｌｉｎ−細胞（ｅＧＦＰ）と下にある星状細胞（矢印）との会合の高倍率。（ｈ）注射しなかったＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック対照。（ｉ）注射後４日（Ｐ６）、ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣは、将来の深部叢の領域に移動し、分化する。左図は全載網膜中のＬｉｎ−ＨＳＣ活性を表現したものであり、右図は網膜中のＬｉｎ−細胞の位置である（矢印）（上が硝子体側であり、下が強膜側である。）。（ｊ）α−ＣＤ３１−ＰＥ抗体とα−ＧＦＰ−ａｌｅｘａ  ４８８抗体による二重標識。注射後７日、注射したＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ、赤）は血管構造（ＣＤ３１）に取り込まれた。矢じりは、取り込まれた領域を示す。（ｋ）ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は、注射後１４日（Ｐ１７）に血管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心臓内注射によれば、血管は無傷であり、一次叢（ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｌｅｘｕｓ）（ｌ）と深部叢（ｍ）の両方において機能する。
【図２Ｂ】発達中のマウス網膜中へのＬｉｎ−ＨＳＣの移植を示す写真である。（ａ）注射後４日目（Ｐ６）に硝子体内注射したｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は、網膜に付着し、分化する。（ｂ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ（β−ｇａｌ抗体で染色されたＢ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６マウス）は、コラーゲンＩＶ抗体で染色された血管構造の前方に定着する（アステリスクは血管構造の先端を示す。）。（ｃ）注射後４日目（Ｐ６）においてＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ＋）の大部分は、分化することができなかった。（ｄ）腸間膜ｅＧＦＰ＋ネズミＥＣ  注射後４日（Ｐ６）。（ｅ）成体マウスの眼に注射したＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいて既存の星状細胞のテンプレートに向かい、それに沿って分化するｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ（矢印）の低倍率。（ｇ）Ｌｉｎ−細胞（ｅＧＦＰ）と下にある星状細胞（矢印）との会合の高倍率。（ｈ）注射しなかったＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック対照。（ｉ）注射後４日（Ｐ６）、ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣは、将来の深部叢の領域に移動し、分化する。左図は全載網膜中のＬｉｎ−ＨＳＣ活性を表現したものであり、右図は網膜中のＬｉｎ−細胞の位置である（矢印）（上が硝子体側であり、下が強膜側である。）。（ｊ）α−ＣＤ３１−ＰＥ抗体とα−ＧＦＰ−ａｌｅｘａ  ４８８抗体による二重標識。注射後７日、注射したＬｉｎ−ＨＳＣ（ｅＧＦＰ、赤）は血管構造（ＣＤ３１）に取り込まれた。矢じりは、取り込まれた領域を示す。（ｋ）ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は、注射後１４日（Ｐ１７）に血管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心臓内注射によれば、血管は無傷であり、一次叢（ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｌｅｘｕｓ）（ｌ）と深部叢（ｍ）の両方において機能する。
【図３】ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞は、成体網膜において、レーザー（ａ）によって誘発された神経こう症（ＧＦＡＰ発現星状細胞、左端の画像によって示される。）と機械的（ｂ）に誘発された傷害（アステリスクは傷害部位を示す。）の両方に向かうことを示す写真である。右端の画像は、高倍率であり、Ｌｉｎ−ＨＳＣと星状細胞の密接な会合を示している。較正バー＝２０μＭ。
【図４】Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞が網膜変性マウスの血管構造を救済することを示した図である。（ａ−ｄ）注射後２７日目（Ｐ３３）のコラーゲンＩＶ染色した網膜。（ａ）及び（ｂ）、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ細胞を注射した網膜（Ｂａｌｂ／ｃ）は、血管構造が正常ＦＶＢマウスと同じであった。（ｃ）及び（ｄ）  Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜（Ｂａｌｂ／ｃ）は、野生型マウスと類似した豊富な血管網を示した。（ａ）及び（ｃ）、ＤＡＰＩ染色した網膜全体の凍結切片（上は硝子体側であり、下は強膜側である。）。（ｂ）及び（ｄ）、全載網膜（ｒｅｔｉｎａｌ  ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）の深部叢。（ｅ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞を注射した網膜中で形成された深部血管叢の血管分布の増加を示す棒グラフ（ｎ＝６）。深部網膜血管新生（ｄｅｅｐ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の程度は、各画像内の血管の全長を計算することによって定量した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｌｉｎ＋ＨＳＣ又は対照網膜の血管の平均全長／強拡大視野（単位ミクロン）を比較した。（ｆ）ｒｄ／ｒｄマウス由来のＬｉｎ−ＨＳＣ（Ｒ、右眼）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ（Ｌ、左眼）細胞を注射した後の深部血管叢の長さの比較。６匹の別個のマウスの結果を示す（各色は別々のマウスを表す。）。（ｇ）及び（ｈ）  Ｌｉｎ−ＨＳＣ細胞（Ｂａｌｂ／ｃ）もＰ１５の眼に注射するとｒｄ／ｒｄ血管構造を救済した。Ｌｉｎ−ＨＳＣ（Ｇ）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ（Ｈ）細胞を注射した網膜の中間部及び深部血管叢（注射後１ヵ月）を示す。
【図５】マウス網膜組織の顕微鏡写真である。（ａ）ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ−ＨＳＣを可視化した（灰色）、注射後５日（Ｐ１１）の全載網膜（ｒｅｔｉｎａｌ  ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）の深層（ｒｄ／ｒｄマウス）。（ｂ）及び（ｃ）  Ｂａｌｂ／ｃ  Ｌｉｎ−細胞（ｂ）又はＬｉｎ＋ＨＳＣ細胞（ｃ）をＰ６で注射したＴｉｅ−２−ＧＦＰ（ｒｄ／ｒｄ）マウスのＰ６０網膜血管構造。内因性内皮細胞（ＧＦＰ染色）のみが（ｂ）及び（ｃ）の左パネルでは見える。（ｂ）及び（ｃ）の中間のパネルは、ＣＤ３１抗体で染色された。矢印は、ＣＤ３１で染色されたが、ＧＦＰでは染色されない血管を示している。（ｂ）及び（ｃ）の右パネルは、ＧＦＰとＣＤ３１の両方で染色された。（ｄ）Ｌｉｎ−ＨＳＣ注射網膜（左パネル）及び対照網膜（右パネル）のα−ＳＭＡ染色。
【図６】Ｔ２−ＴｒｐＲＳを形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣがマウス網膜血管構造の発生を阻害することを示す図である。（ａ）ヒトＴｒｐＲＳ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ及びアミノ末端にＩｇｋシグナル配列を有するＴ２−ＴｒｐＲＳの略図。（ｂ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳを形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜は、Ｔ２−ＴｒｐＲＳタンパク質をインビボで発現する。（１）Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）中で産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ、（２）Ｅ．コリ中で産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ、（３）Ｅ．コリ中で産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ、（４）対照網膜、（５）Ｌｉｎ−ＨＳＣ＋ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（ベクターのみ）を注射した網膜、（６）Ｌｉｎ−ＨＳＣ＋ｐＫＬｅ１３５（ｐＳｅｃＴａｇ中のＩｇｋ−Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）を注射した網膜。（ａ）内因性ＴｒｐＲＳ。（ｂ）組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ）Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜のＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ−ｆ）  注射した網膜の代表的な一次（表面）及び二次（深部）叢、注射後７日。（ｃ）及び（ｄ）  空のプラスミドを形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣを注射した眼は正常に発達した。（ｅ）及び（ｆ）  Ｔ２−ＴｒｐＲＳを形質移入したＬｉｎ−ＨＳＣを注射した眼の大多数は、深部叢が阻害された。（ｃ）及び（ｅ）  一次（表面）叢。（ｄ）及び（ｆ）  二次（深部）叢）。（ｆ）において観察される血管のかすかな輪郭は、（ｅ）で見られる一次ネットワーク血管の「にじみ（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」画像である。
【図７Ａ】Ｈｉｓ６タグ付きＴ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す図である。
【図７Ｂ】Ｈｉｓ６タグ付きＴ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す図である。
【図８】Ｈｉｓ６タグ付きＴ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列、配列番号２を示す図である。
【図９】眼にＬｉｎ−ＨＳＣ及びＬｉｎ＋ＨＳＣ（対照）を注射したマウスから得られた網膜の顕微鏡写真及び網膜電図（ＥＲＧ）である。
【図１０】Ｌｉｎ−ＨＳＣで処理したｒｄ／ｒｄマウスの眼の中間部（Ｉｎｔ．）と深部の両方の血管層についての、ニューロンの救済（ｙ軸）と血管の救済（ｘ軸）との相関を示す統計プロットである。
【図１１】Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処理したｒｄ／ｒｄマウスの眼について、ニューロンの救済（ｙ軸）と血管の救済（ｘ軸）との相関がないことを示す統計プロットである。
【図１２】Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置したｒｄ／ｒｄマウスの眼（黒棒）及び無処置の（白棒）ｒｄ／ｒｄマウスの眼についての、注射後１ヵ月（１Ｍ）、２ヵ月（２Ｍ）及び６ヵ月（６Ｍ）の時点における、任意の相対単位の血管長さ（ｙ軸）の棒グラフである。
【図１３】注射後１ヵ月（１Ｍ）、２ヵ月（２Ｍ）及び６ヵ月（６Ｍ）における、ｒｄ／ｒｄマウスの外部神経層（ＯＮＲ）中の核数の３つの棒グラフである。Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処置した対照の眼（白棒）よりもＬｉｎ−ＨＳＣ（黒棒）で処置した眼の核数がかなり増加している。
【図１４】（注射後）１ヵ月（１Ｍ）、２ヵ月（２Ｍ）及び６ヵ月（６Ｍ）の時点において、（Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した）右眼（Ｒ）と左眼（Ｌ、Ｌｉｎ＋ＨＳＣで処置した対照の眼）とを比較した、個々のｒｄ／ｒｄマウスについての外部神経層中の核数のプロットである。プロット中の各線は、個々のマウスの眼を比較したものである。
【図１５】ｒｄ１／ｒｄ１（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、左パネル）又は野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、右パネル）における網膜血管構造及び神経細胞の変化を示す写真である。全載網膜中の中間部（上のパネル）又は深部（中間のパネル）の血管叢（赤：コラーゲンＩＶ、緑：ＣＤ３１）及び同じ網膜の切断面（赤：ＤＡＰＩ、緑：ＣＤ３１、下のパネル）の網膜血管構造を示す（Ｐ：出生後日数）。（ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：核間（ｉｎｔｅｒ  ｎｕｃｌｅａｒ）層、ＯＮＬ：外顆粒層）。
【図１６】Ｌｉｎ−ＨＳＣ注射がｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける神経細胞の変性を救済することを示す図である。（Ａ、Ｂ及びＣ）、Ｐ３０（Ａ）、Ｐ６０（Ｂ）及びＰ１８０（Ｃ）において、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した眼（右パネル）及び対照細胞（ＣＤ３１−）を注射した反対側の眼（左パネル）の中間部（Ｉｎｔ．）又は深部の叢及び切断面の網膜血管構造。（Ｄ）、Ｐ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中間、ｎ＝１０）及びＰ１８０（右、ｎ＝６）における、Ｌｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜又は対照細胞（ＣＤ３１−）を注射した網膜中の血管構造の平均全長（平均値の＋又は−標準誤差）。中間部（Ｉｎｔ．）と深部の血管叢のデータを別々に示す（Ｙ軸：血管構造の相対長さ）。（Ｅ）、対照細胞（ＣＤ３１−）又はＬｉｎ−ＨＳＣを注射した網膜のＰ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中間、ｎ＝１０）又はＰ１８０（右、ｎ＝６）におけるＯＮＬ中の細胞核の平均数（Ｙ軸：ＯＮＬ中の細胞核の相対数）。（Ｆ）、Ｌｉｎ−ＨＳＣ又は対照細胞を注射した網膜のＰ３０（左）、Ｐ６０（中間）及びＰ１８０（右）における血管構造の長さ（Ｘ軸）とＯＮＬ中の細胞核数（Ｙ軸）との線形相関。
【図１７】網膜機能がＬｉｎ−ＨＳＣ注射によって救済されることを示す図である。網膜電図検査（ＥＲＧ）記録を使用して、Ｌｉｎ−ＨＳＣ又は対照細胞（ＣＤ３１−）を注射した網膜の機能を測定する。（Ａ及びＢ）、救済された網膜及び救済されなかった網膜の注射後２ヵ月の代表例。同じ動物のＬｉｎ−ＨＳＣを注射した右眼（Ａ）及びＣＤ３１−対照細胞を注射した左眼（Ｂ）の網膜切片を示す（緑：ＣＤ３１で染色した血管構造、赤：ＤＡＰＩで染色した核）。（Ｃ）、（Ａ）及び（Ｂ）に示した同じ動物から得られたＥＲＧ結果。
【図１８】ヒト骨髄細胞集団がｒｄ１マウスにおける変性網膜を救済できることを示す写真である（Ａ−Ｃ）。救済は、網膜変性の別のモデルｒｄ１０（Ｄ−Ｋ）においても認められる。Ａ、緑色色素で標識したヒトＬｉｎ−ＨＳＣ（ｈＬｉｎ−ＨＳＣ）は、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ＳＣＩＤマウスの硝子体内に注射した後に網膜血管細胞に分化する。（Ｂ及びＣ）、ｈＬｉｎ−ＨＳＣを注射した眼（Ｂ）又は反対側の対照の眼（Ｃ）における注射後１．５ヵ月の網膜血管構造（左パネル；上：中間部叢、下：深部叢）及び神経細胞（右パネル）。（Ｄ−Ｋ）、（Ｐ６に注射した）Ｌｉｎ−ＨＳＣによるｒｄ１０マウスの救済。Ｐ２１（Ｄ：Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｈ：対照細胞）、Ｐ３０（Ｅ：Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｉ：対照細胞）、Ｐ６０（Ｆ：Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｊ：対照細胞）及びＰ１０５（Ｇ：Ｌｉｎ−ＨＳＣ、Ｋ：対照細胞）における代表的な網膜を示す（処置した眼及び対照の眼は、各時点において同じ動物から得た。）。網膜血管構造（各パネルの上の画像は中間部叢であり、各パネルの中間の画像は深部叢である。）をＣＤ３１（緑）及びコラーゲンＩＶ（赤）で染色した。各パネルの下の画像は、同じ網膜でできた断面を示す（赤：ＤＡＰＩ、緑：ＣＤ３１）。
【図１９】クリスタリンαＡが、救済された外顆粒層細胞ではＬｉｎ−ＨＳＣ処置後に上方制御されるが、対照細胞で処置した反対側の眼では上方制御されないことを示す写真である。左パネル；救済された網膜におけるＩｇＧ対照、中間のパネル；救済された網膜におけるクリスタリンαＡ、右パネル；救済されなかった網膜におけるクリスタリンαＡ。
【図２０Ａ】本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置したネズミ網膜中で上方制御される遺伝子の表である。（Ａ）ネズミＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が３倍になる遺伝子。（Ｂ）ネズミＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方制御されるクリスタリン遺伝子。（Ｃ）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が２倍になる遺伝子。（Ｄ）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が上方制御される神経栄養因子又は成長因子の遺伝子。
【図２０Ｂ】本発明のＬｉｎ−ＨＳＣで処置したネズミ網膜中で上方制御される遺伝子の表である。（Ａ）ネズミＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が３倍になる遺伝子。（Ｂ）ネズミＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方制御されるクリスタリン遺伝子。（Ｃ）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が２倍になる遺伝子。（Ｄ）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が上方制御される神経栄養因子又は成長因子の遺伝子。
【図２１】ＣＤ１３３陽性（ＤＣ１３３＋）及びＣＤ１３３陰性（ＣＤ１３３−）ヒトＬｉｎ−ＨＳＣ集団のＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の分布を示すグラフである。左パネルはフローサイトメトリー散布図を示す。中央及び右パネルは、細胞集団の特異抗体発現レベルを示すヒストグラムである。Ｙ軸は現象数であり、Ｘ軸はシグナル強度である。白抜きの（対照）ヒストグラムの右側に移動した、塗り潰したヒストグラムは、バックグラウンドレベルよりも抗体の蛍光シグナル及び発現が増加したことを表す。
【図２２】出生後日数Ｐ０からＰ３０における、正常な酸素レベル（酸素正常状態）で飼育した野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスの出生後の網膜の発達を示す写真である。
【図２３】Ｐ７からＰ１２において高酸素レベル（酸素過剰；酸素７５％）で飼育し、続いてＰ１２からＰ１７において酸素正常状態で飼育したＣ５７／Ｂ１６マウスの酸素誘発性網膜症モデルを示す写真である。
【図２４】酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）モデルにおいてＬｉｎ−ＨＳＣ集団を用いた処置による血管の救済を示す写真である。
【図２５】Ｌｉｎ−ＨＳＣの硝子体内注射後のｒｄ１マウスの外顆粒層（ＯＮＬ）において救済される光受容器が、主に錐体であることを示す写真である。野生型マウス網膜（上のパネル）中の光受容器の少数は、錐体の赤／緑オプシンの発現によって明らかなように錐体であった（Ａ）。一方、ＯＮＬの大部分の細胞は、かん体に特異的なロドプシンについて陽性であった（Ｂ）。網膜血管構造は、免疫前血清（Ｃ）によって自己蛍光する（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅ）が、顆粒層は、かん体又は錐体に特異的なオプシンによる染色に対して完全に陰性である。Ｒｄ／ｒｄマウス網膜（下のパネル）は、縮小した内顆粒層及びほぼ完全に萎縮したＯＮＬを有し、そのどちらも錐体（Ｄ）又はかん体（パネルＧ）のオプシンについて陰性である。対照のＣＤ３１−ＨＳＣで処置した眼は、注射しなかったｒｄ／ｒｄ網膜と同じであり、錐体（Ｅ）又はかん体（Ｈ）のオプシンに対して染色されない。Ｌｉｎ−ＨＳＣで処置した反対側の眼は、錐体の赤／緑オプシンに対する陽性の免疫反応性によって明らかなように、著しく減少したが、明らかに存在する、主に錐体からなるＯＮＬを示した（Ｆ）。少数のかん体も観察された（Ｉ）。
【図２６】ＣＤ４４抗原を発現する細胞（赤いデータポイント）の割合を示す、系統陰性及び系統陽性の幹細胞集団（それぞれ、左上及び左下のプロット）、並びにＣＤ４４抗原を発現する細胞（赤いデータポイント）の割合を示す、ＣＤ３１陰性及びＣＤ３１陽性細胞集団（それぞれ、右上及び右下のプロット）のフローサイトメトリー分析から得られた散布図である。
【図２７】かなりのレベルのＣＤ４４抗原を発現する系統陰性細胞集団（左側のプロットセット）及びＣＤ４４抗原をさほど発現しない骨髄細胞の亜集団（右側のプロットセット）のフローサイトメトリー分析から得られた散布図である。種々の他の細胞表面抗原を発現する細胞の相対割合を示す。
【図２８】ＣＤ４４ｌｏ細胞を硝子体内注射したマウスから得られた網膜と比較した、本発明のＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞を硝子体内注射したマウスから得られた網膜の顕微鏡写真画像（左パネル）である。
【図２９】ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞（ＣＤ４４ｈｉ）及びＣＤ４４ｌｏ細胞を注射した眼から得られた網膜の顕微鏡写真画像である。
【図３０】未熟児網膜症の酸素誘発性網膜症モデルにおいて、マウス網膜の病原性血管新生を改善し、有益な生理的血管再生を促進する、ＭＬＢＭ細胞集団の有益な効果を示す棒グラフである。上のグラフは、対照網膜（第１の棒）、ＣＤ４４ｌｏ細胞で処置した網膜（中間の棒）及びＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞で処置した網膜（右の棒）について網膜前方の新生血管叢面積を比較した。下のグラフは、対照網膜（第１の棒）、ＣＤ４４ｌｏ細胞で処置した網膜（中間の棒）及びＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞で処置した網膜（右の棒）について血管閉塞面積を比較した。
【図３１】画像の下の部分における細胞の緑色染色によって示されるように、ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞が網膜の血管構造に取り込まれた後、細胞が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現することを示す顕微鏡写真画像である。
【図３２】本発明のＣＤ１１ｂ＋ＭＬＢＭ細胞集団由来の細胞が、網膜の血管構造を選択的に標的にすることを示す顕微鏡写真画像である。
【図３３】ＣＤ４４−ＣＤ１１ｂ−骨髄細胞が網膜の血管構造を選択的に標的にしないことを示す顕微鏡写真画像である。
【図３４】ＴｒｐＲＳのＴ２断片（配列番号３）及びそのＴ２−ＴｒｐＲＳ−ＧＤ変異体（配列番号４）のアミノ酸残基配列である。
【図３５】ｍｉｎｉ−ＴｒｐＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号５）である。
【図３６】Ｔ１−ＴｒｐＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号６）である。
【図３７】マウスの酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）モデルにおける正常な網膜血管の発達及びＬｉｎ−骨髄由来細胞の硝子体内移植後の救済効果を示す写真である。マウスは、出生後２日（Ｐ２）において示されるように（パネルａ、網膜全組織標本）、主として無血管の網膜を有する。血管は、ｂに示す単一面を占める網膜表面に存在する。パネルｂ、ｄ及びｆは、９０度回転した正面共焦点ｚシリーズデータセットの３Ｄレンダリングから得られた画像である。生後第１週中に、網膜表面の血管構造は、視神経乳頭から放射状に成長し、Ｐ１０までに末梢にほぼ到達する（ｃ）。次いで、深部網膜血管構造が、第２週中に表面層の分枝から形成される（ｄ）。最後に、第３の血管叢が最初の２つの血管叢の間に形成され、ほぼＰ３０で成熟網膜血管構造が形成される（ｅ、ｆ）。パネルｇによれば、ＯＩＲモデルにおいて過剰の酸素に暴露すると、ここに示すようにＰ１０において中央の血管が閉塞する。パネルｈによれば、Ｐ１２において酸素正常状態に移行後、中心網膜が血管を再生し始め、網膜前方の特徴的な新生血管叢が、血管が新生した網膜（末梢）と無血管網膜（中央）の界面に形成される。これらの血管叢はイソレクチンで強く染色される。パネルｉ−ｎによれば、Ｌｉｎ−造血性前駆細胞は、ＯＩＲモデルにおいて血管修復を促進する。高濃度酸素暴露前に硝子体内注射したＬｉｎ−細胞は、Ｐ１７において、ビヒクルで処置した他眼よりも中心網膜の血管再生を劇的に加速する。ビヒクルで処置した網膜は、表面の血管構造が一部欠如し（ｉ）、深部網膜血管構造が完全に欠如しているが（ｋ、ｍ）、Ｌｉｎ−細胞で処置した他眼は、全３個の叢が存在し（ｋ、ｍ）、比較的正常な網膜血管構造（ｊ）を示す。パネルｏによれば、Ｐ１７において、Ｌｉｎ−細胞で処置したＯＩＲの眼は、注射しなかった眼又はビヒクルを注射した眼よりもかなりの頻度で血管が完全に再生する。血管を、パネルａ−ｆ、ｉ、ｊに示すようにフルオレセイン−デキストランの心臓灌流によって、また、パネルｇ、ｈ、ｋ−ｎにおけるＧＳレクチンによって、可視化した。パネルｋ−ｎの核は、ＤＡＰＩで標識した。
【図３８】Ｌｉｎ−細胞が、ＯＩＲにおいて、網膜血管再生を加速し、網膜前方の新生血管叢形成を減少させることを示す図である。パネルａ−ｄは、コンピュータ画像解析方法によって、生後１７日において、ＯＩＲの眼から得られた網膜全組織標本中の網膜血管閉塞、及び網膜前方の新生血管叢形成（赤）の面積が計算されたことを示す。パネルｅによれば、酸素過剰前にＬｉｎ−細胞で処置した網膜は、閉塞面積が、注射しなかった対照のほぼ１／６、ビヒクルのみで処置した眼の約１／５になった。パネルｆによれば、Ｌｉｎ−細胞による処置によって、注射しなかった眼及びビヒクルで処置した眼よりも、新生血管叢の二次元面積がかなり減少した。パネルｇによれば、Ｌｉｎ−細胞移植は、酸素過剰前に投与したときだけでなく、酸素過剰中のＰ９−Ｐ１２でも、また、酸素正常状態に戻した直後でも、閉塞面積の減少に有効である。（グラフは平均±ＳＥＭを示す。＊  ｐ＜０．００１）。
【図３９】骨髄細胞による処置がほとんど又は全く長期毒性作用を持たないことを示す写真である。Ｌｉｎ−細胞処置後５又は６ヵ月において評価した網膜は、正常な外見の網膜血管構造を有し、神経網膜は、断面上で組織学的に保存されていると考えられる（ａ−ｆ、注射しなかった網膜とＬｉｎ−細胞を注射した、移植後６ヵ月の網膜）。腫ようは認められず、唯一の異常は、対照の注射しなかった眼においても見られ得る、神経網膜中の散在的な「ロゼット」であった（ｇ、ｈ）。
【図４０】ＣＤ４４ＨＩ細胞がＬｉｎ−集団中で優勢であり、ＯＩＲモデルにおいて血管修復を効果的に促進することを示す図である。パネルａによれば、骨髄はＣＤ４４ＨＩ及びＣＤ４４ＬＯ画分を含み、Ｌｉｎ−集団は対照ＣＤ細胞よりもＣＤ４４ＨＩ細胞が豊富である。挿入図は、単球及び顆粒球に特有のものである、ＣＤ４４ＨＩ細胞の光散乱特性を示しており、一方、ＣＤ４４ＬＯ細胞の光散乱特性はリンパ球に特有のものである。パネルｂは、酸素暴露前にＣＤ４４ＬＯ及びＣＤ４４ＨＩ骨髄細胞で処置した眼から得られた代表的なＰ１７網膜を示す。下のパネルは、パネルｃに示すデータを作成するために使用した、Ｐ１７における閉塞及び新血管新生の数量化された面積を例示している。パネルｃによれば、血管閉塞及び網膜前方の新血管新生は、ＣＤ４４ＨＩ細胞で処置した眼において、Ｌｉｎ−細胞で処置した眼と類似した効率で減少する。血管閉塞（＊）及び網膜前方の新血管新生（＊＊）の面積は、ＣＤ４４ＨＩ及びＬｉｎ−眼において、ビヒクル注射又は注射なしと比較してかなり小さい（いずれの場合においてもｐ＜１０−５）。また、Ｌｉｎ−細胞で処置した眼における閉塞面積は、ＣＤ４４ＨＩよりも減少したが（ｐ＝０．０３）、その程度ははるかに小さかった。網膜前方の新血管新生の面積は、Ｌｉｎ−で処置した眼とＣＤ４４ＨＩで処置した眼とでは大差なかった（ｐ＝０．２５）。
【図４１】ＣＤ４４ＨＩ亜集団が骨髄球性マーカーを発現することを示すグラフである。パネルａにおいては、２カラーフローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４４集団の特性をさらに明らかにした。全細胞をＣＤ４４に対する抗体で標識し、示した種々の抗体で共標識（ｃｏ−ｌａｂｅｌ）した。ＣＤ４４ＨＩ集団は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及びＬｙ６ＧＣで強く標識された。ＣＤ４４ｈｉ細胞画分は、ＣＤ１４、Ｆ４／８０、ｃＫｉｔ及びＣＤ１１５に対して陽性であった。これらの抗原の大部分は、ミエロイド系列細胞上に存在する。ＣＤ４４ｌｏ細胞は、それぞれ赤芽球及びＢ細胞のマーカーであるＴｅｒ１１９及びＣＤ４５Ｒ  Ｂ２２０で強く標識された。
【図４２】ＣＤ４４ＨＩ細胞が網膜中の血管周囲に局在化することを示す写真である。共焦点画像解析を用いてｚ次元の一連の画像を作成し、次いでこれを３Ｄに描画した。パネルａにおいては、これの投写像が示され、ＣＤ３１−標識血管内皮及び導入した骨髄細胞からのＧＦＰ発現が見られる。骨髄細胞は、血管周囲の位置を取ると考えられる。３Ｄデータは、血管の管腔及びＧＦＰ＋骨髄細胞の相対位置が可視化されることを示している。（ｂ）に示す番号は、（ａ）に示した断面位置に対応する。ＧＦＰシグナルは、シグナルのにじみ（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）が明らかである強い蛍光を有する細胞体の断面であるパネルｂ、Ｎｏ．３を除いて、いずれの場合においても管腔の外側で検出された。
【図４３】ＯＩＲモデルにおいて注射したＣＤ４４ＨＩ骨髄細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ分析結果を示す写真である。細胞処置を受けていない対照網膜の標識は、内因性Ｆ４／８０＋血管周囲細胞の存在を示している（ａ−ｃ）。注射したＣＤ４４ＨＩ細胞は、網膜血管構造を標的にし、内因性細胞に類似した局在化、形態及びＦ４／８０発現パターンを有する（ｄ−ｉ）。血管周囲の移植した骨髄細胞はＣＤ４４を発現せず、一方、網膜血管構造と関連しない細胞はＣＤ４４発現を保持する（ｊ−ｏ）。
【図４４】発現アレイ分析結果を示す表である。それによれば、ＣＤ４４ＨＩ集団では骨髄関連遺伝子が高度に発現したのに対して、ＣＤ４４ＬＯ細胞はリンパ球関連遺伝子を発現した。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）アレイを用いて、これら２つの骨髄細胞集団の遺伝子発現プロファイルを比較した。示した遺伝子は、発現が５倍以上違った。ＣＤ４４ＨＩ集団では、ＣＤ４４ＬＯ細胞よりもかなり高レベルのＣＤ４４発現が観測された。
【図４５】ＣＤ４４ＨＩ細胞が小こう細胞の諸特性を有する細胞に分化し得ることを示す写真である。パネルＡ及びＢによれば、注射したＣＤ４４ＨＩ細胞はＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０を発現し、内因性小こう細胞と類似した形態及び血管周囲局在化を示す。パネルＣは、注射したＣＤ４４ＨＩ細胞の血管周囲局在化の３ｄ画像である。パネルＤは、注射したＣＤ４４ＨＩ細胞の形態の高倍率画像である。
【図４６】ＣＤ４４ＨＩ細胞がネガティブ選択によって単離され得ることを示す図である。パネルＡによれば、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９及びＣＤ３ｅに対して選択的な抗体を用いたＭＡＣＳによってマウス骨髄を枯渇させると、９０パーセントを超えるＣＤ４４ＨＩ細胞である細胞集団が生成する。パネルＢによれば、ネガティブ画分（ＣＤ４４ＨＩ集団）は、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９及びＣＤ３ｅ細胞を本質的に含まない。パネルＣによれば、ネガティブ選択されたＣＤ４４ＨＩ細胞は、網膜のターゲティング及び分化能力を保持する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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