(57)【要約】  一般的に、本発明は、トリアジン３位に並びにベンゼン４位及び５位上に置換基があるラモトリジン類似体に関する。ラモトリジン類似体は、抗ラモトリジン抗体を調製するのに用いる免疫原性部分、又はラモトリジンの免疫診断アッセイに用いる抗原性部分を含んでもよい。また、ラモトリジン類似体は、免疫診断アッセイ中に、類似体の存在又は量を検出するトレーサー部分を含んでもよい。さらに、ラモトリジン類似体を免疫診断アッセイで用いて、抗ラモトリジン抗体との結合を、ラモトリジンと競合させることもできる。
2008518234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のラモトリジンの存在を検出する免疫診断系で用いる抗体組成物であって：
ラモトリジンに結合でき、ラモトリジン類似体に結合できる、少なくとも約１：５，０００の力価で存在する、少なくとも１の結合性ドメインを有する抗ラモトリジン抗体
を含む、前記抗体組成物。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体組成物。
【請求項３】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１記載の抗体組成物。
【請求項４】
ラモトリジンと比較した、ラモトリジン類似体に対する、抗体の親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つが、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）又は不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）免疫診断アッセイに用いるのに十分な、請求項１記載の抗体組成物。
【請求項５】
抗体及びラモトリジン類似体の間の相互作用が、ラモトリジンに対する抗体の親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つの少なくとも５０％である、請求項４記載の抗体組成物。
【請求項６】
抗体及びラモトリジン類似体の間の相互作用が、ラモトリジンに対する抗体の親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つの少なくとも７０％である、請求項４記載の抗体組成物。
【請求項７】
請求項４記載の抗体であって、前記抗体が、ラモトリジン類似体を含む免疫原性組成物により産生され、前記ラモトリジン類似体が、式１、式２、又は式３；
【化１】
2008518234.tif 000035
式中、Ｌは、ＮＨ、ＮＨＣＯ、Ｏ、ＳＯ２基、又は脂肪族基の少なくとも１つであり；
Ｗは、１〜１０の炭素及び／又はヘテロ鎖原子を有する、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖であり；
Ｘは、Ｗ及びＹ間の結合、１〜２の環を有する置換又は非置換の芳香族又は脂肪族基、あるいは１〜１０の炭素及び／又はヘテロ鎖原子を有する、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖の少なくとも１つであり；
Ｙは、脂肪族、アルコール、アミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、活性化エステル、脂肪族エステル、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオラクトン、ジアゾニウム、マレイミド、及び作用基とカップリングした、これらに由来するリンカーからなる群から選択され；そして
式１のＹ−Ｘ−Ｗ−Ｌは５−スクシニルアミノ部分ではない；
の１の化学構造を有する、前記抗体。
【請求項８】
少なくとも１：１００，０００の力価で存在する、請求項１記載の抗体。
【請求項９】
試料中のラモトリジンの存在を検出するための免疫診断系において用いる系であって：
ラモトリジン類似体；及び
ラモトリジンに結合できる部分及びラモトリジン類似体に結合できる部分を有し、少なくとも約１：５，０００の力価で存在する、少なくとも１の結合性ドメインを有する抗ラモトリジン抗体；
を含む、前記系。
【請求項１０】
請求項９記載の系であって、ラモトリジン類似体が、式１、式２、又は式３；
【化２】
2008518234.tif 000036
式中、Ｌは、ＮＨ、ＮＨＣＯ、Ｏ、ＳＯ２基、又は脂肪族基の少なくとも１つであり；
Ｗは、脂肪族基であり；
Ｘは、Ｗ及びＹ間の結合、芳香族基、又は脂肪族基の少なくとも１つであり；
Ｙは、脂肪族、アルコール、アミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、活性化エステル、脂肪族エステル、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオラクトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミド、及び作用基とカップリングした、これら由来するリンカーからなる群から選択され；そして
式１のＹ−Ｘ−Ｗ−Ｌは５−スクシニルアミノ部分ではない；
の１の化学構造を有する、前記系。
【請求項１１】
請求項１０記載の系であって、類似体が、以下の少なくとも１つ：
Ｌは、ＮＨ、ＮＨＣＯ、又はＯ基の少なくとも１つであり；
Ｗは、１〜１０の炭素及び／又はヘテロ鎖原子を有する、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖であり；
Ｘは、Ｗ及びＹ間の結合、１〜２の環を有する置換又は非置換の芳香族又は脂肪族基、あるいは１〜１０の炭素及び／又はヘテロ鎖原子を有する、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖の少なくとも１つであり；又は
作用基は、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、テイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素供与体断片、酵素受容体断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、リン光部分、抗ストークス（ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ）上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される；
により特徴付けられる、前記系。
【請求項１２】
抗体が、少なくとも１：１００，０００の力価で存在する、請求項９記載の系。
【請求項１３】
ラモトリジン類似体又は抗ラモトリジン抗体の一方が、粒子、磁気粒子、微粒子、微小球体、支持体、酵素供与体、又は酵素受容体の１つとカップリングしている、請求項９記載の系。
【請求項１４】
以下の少なくとも１つ：
ラモトリジンのストック組成物；
濃度勾配を形成する、異なる濃度でラモトリジンを含有する一連の組成物；
トレーサー共役体（conjugate）を有するラモトリジン類似体；
微粒子にカップリングしたラモトリジン類似体；
微粒子にカップリングした抗体；
酵素供与体を有するラモトリジン類似体、及び対応する酵素受容体；
酵素受容体を有するラモトリジン類似体、及び対応する酵素供与体；又は
ろ過又は沈降による分離に適した粒子上に装填された抗体；
をさらに含む、前記系。
【請求項１５】
以前ラモトリジンを投与された被験体から得た試料中のラモトリジンの存在を検出する免疫診断アッセイを行う方法であって：
少なくとも１：５，０００の力価の抗ラモトリジン抗体及びラモトリジン類似体を試料と合わせて第一の組成物を形成する工程、ここで、前記抗体はラモトリジン及びラモトリジン類似体に結合することができる；
試料由来のいかなる遊離（ｆｒｅｅ）ラモトリジン及びラモトリジン類似体をも、抗体との結合に競合できるようにする工程；そして
ラモトリジン類似体及び抗体間の結合を検出する工程；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法であって、ラモトリジン類似体が、式１、式２、又は式３；
【化３】
2008518234.tif 000037
式中、Ｌは、ＮＨ、ＮＨＣＯ、Ｏ、ＳＯ２基、又は脂肪族基の少なくとも１つであり；
Ｗは、脂肪族基であり；
Ｘは、Ｗ及びＹ間の結合、芳香族基、又は脂肪族基の少なくとも１つであり；
Ｙは、脂肪族、アルコール、アミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、活性化エステル、脂肪族エステル、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオラクトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミド、及び作用基とカップリングした、これらに由来するリンカーからなる群から選択され；そして
式１のＹ−Ｘ−Ｗ−Ｌは５−スクシニルアミノ部分ではない
の１の化学構造を有する、前記方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法であって、類似体が、以下の少なくとも１つ：
Ｌは、ＮＨ、ＮＨＣＯ、又はＯ基の少なくとも１つであり；
Ｗは、１〜１０の炭素及び／又はヘテロ鎖原子を有する、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖であり；
Ｘは、Ｗ及びＹ間の結合、１〜２の環を有する置換又は非置換の芳香族又は脂肪族基、あるいは１〜１０の炭素及び／又はヘテロ鎖原子を有する、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖の少なくとも１つであり；又は
作用基は、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、テイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素供与体断片、酵素受容体断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、リン光部分、抗ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される；
により特徴付けられる、前記方法。
【請求項１８】
抗体が、少なくとも１：１００，０００の力価で存在する、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５記載の方法であって、
蛍光部分を含むラモトリジン類似体を得る工程；
第一の偏光量を有する偏光で蛍光共役体を励起する工程；そして
第二の偏光量を有する蛍光共役体から放出される偏光を検出する工程；
をさらに含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法であって、
第一の偏光量と第二の偏光量を比較する工程；そして
試料中にラモトリジンが存在するか否か決定する工程、ここで第二の偏光量が、第一の偏光量と異なる場合に、試料中にラモトリジンが存在する指標となる；
をさらに含む、前記方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法であって、
既知量のラモトリジンと、ラモトリジン類似体及び抗体を合わせて、対照結合組成物を形成する工程；
第三の偏光量を有する対照結合組成物中の蛍光共役体から放出される偏光を検出する工程；
第三の偏光量と第二の偏光量を比較する工程；そして
試料中に存在するラモトリジン量を決定する工程：
をさらに含む、前記方法。
【請求項２２】
請求項１５記載の方法であって、
ラモトリジン類似体及び抗体を得る工程、ここでラモトリジン類似体及び抗体の一方は微粒子にカップリングしている；
第一の組成物に入射光線を照射する工程；そして
第一の組成物由来の透過光の第一の強度を検出する工程；
をさらに含む、前記方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法であって、
ラモトリジン類似体及び抗体は有するが遊離ラモトリジンは有しない、対照結合組成物由来の透過光の最低強度を同定する工程；
透過光の第一の強度と透過光の最低強度を比較する工程；そして
ラモトリジンが試料中に存在するか否かを決定する工程、ここで最低強度が第一の強度と異なる場合は、試料中にラモトリジンが存在する指標となる；
をさらに含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法であって、
既知量のラモトリジンと、ラモトリジン類似体及び抗体を合わせて、対照結合組成物を形成する工程；
対照結合組成物に入射光線を照射する工程； 
対照結合組成物由来の透過光の第二の強度を検出する工程；そして
試料中に存在するラモトリジン量を決定する工程、ここで第一の強度及び第二の強度の比較は、試料中に存在するラモトリジン量の指標となる；
をさらに含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項１５記載の方法であって、
酵素供与体を含むラモトリジン類似体を得る工程；
第一の組成物と酵素受容体を合わせる工程；
第一の組成物と基質を合わせる工程、ここで基質は、酵素供与体及び酵素受容体との相互作用により切断できる；そして
酵素活性を検出する工程；
をさらに含む、前記方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法であって、
既知量のラモトリジンと、ラモトリジン類似体及び抗体を合わせて、対照結合組成物を形成する工程；
酵素受容体と対照結合組成物を合わせる工程；
対照結合組成物と基質を合わせる工程、ここで基質は、酵素供与体及び酵素受容体との相互作用により切断できる； 
対照酵素活性を検出する工程；そして
試料中に存在するラモトリジン量を決定する工程、ここで酵素活性と対照酵素活性の比較は、試料中に存在するラモトリジン量の指標となる；
をさらに含む、前記方法。
【請求項２７】
請求項１５記載の方法であって、
トレーサー部分を含むラモトリジン類似体を得る工程；
競合的結合組成物から抗体を分離する工程；
抗体から未結合のラモトリジン類似体を分離する工程；そして
抗体と結合している類似体のトレーサー部分を検出する工程
をさらに含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法であって、
既知量のラモトリジンと、ラモトリジン類似体及び抗体を合わせて、対照結合組成物を形成る工程；
対照結合組成物から抗体を分離する工程；
競合的結合組成物から、抗体と結合しているトレーサー共役体の第一の量を検出する工程；
対照結合組成物から、抗体と結合しているトレーサー共役体の第二の量を検出する工程；そして
試料中に存在するラモトリジン量を決定する工程、ここでトレーサー共役体の第一の量とトレーサー共役体の第二の量との比較は、試料中に存在するラモトリジン量の指標となる；
をさらに含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［００１］本米国特許出願は、Anlong Ouyang博士らを発明者とする、２００４年１０月２５日に出願された、米国仮出願第６０／６２１，７６４号の「ラモトリジンの免疫アッセイ」；及び２００５年１０月２０日に出願された、米国一般特許出願で番号不明の「ラモトリジンの免疫アッセイ」に優先権を請求し、どちらの出願も本明細書に援用される。
【０００２】
［００２］本発明は、ラモトリジン免疫診断試薬及びプロトコルに関する。より詳細には、本発明は、ラモトリジン、ラモトリジン類似体、ラモトリジン類似体から調製される免疫原及び抗原、ラモトリジンに基づく免疫原から調製される抗体、並びにこれらを作製し、用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
［００３］ラモトリジンは、化学的には３，５−ジアミノ−６−（２，３−ジクロロフェニル）−１，２，４−トリアジンと表される、以下に示すフェニルトリアジン類の抗癲癇薬（「ＡＥＤ」）であり、そして現存するＡＥＤとは化学的に無関係である。ラモトリジンは、抗癲癇治療及び双極性疾患等の精神障害の治療に用いる、ＦＤＡで認可された薬剤、ＬＡＭＩＣＴＡＬ（登録商標）（Glaxo Wellcome）中の活性成分である。
【０００４】
【化１】
2008518234.tif 000003
【０００５】
［００４］癲癇は、反復発作に起因する脳機能障害である。ラモトリジンは、広い範囲で臨床的効能を有することが示され、Ｌｅｎｎｏｘ−Ｇａｓｔａｕｔ症候群に関連する、部分発作、原発性及び続発性全身発作、欠神発作、並びに転倒発作を治療及び／又は予防するのに有効である。
【０００６】
［００５］ＡＥＤ等の様々な薬剤は、異なる患者集団では、異なる薬物動態及び／又は薬力学的プロフィールを有する可能性があり、この結果、ＡＥＤの治療薬剤モニタリング（「ＴＤＭ」）が致命的に重要であることが周知である。ＴＤＭプログラムの目的の１つは、様々な時点での薬剤濃度を決定して投薬計画を管理及び／又は最適化して、患者の臨床的結果を最適化することである。したがって、ＴＤＭに基づき、単一の患者又は患者集団に対して、薬剤用量及び投薬計画を調節することができる。
【０００７】
［００６］いくつかのラモトリジンの特質により、ＴＤＭを用いる場合は、臨床的に患者の療法を個別化する必要があることが示唆される。患者の血清濃度に対する用量は、個体間変動が大きいことが示唆されており、最適血清濃度を達成するのに必要なラモトリジン投薬量の必要条件には、薬物動態学的変動が主な役割を果たす。
【０００８】
［００７］不応性癲癇患者におけるラモトリジンの最適血清濃度の適切な範囲は、１２〜５５μｍｏｌ／ｌであることが示唆されている。Morris RGら, Br J Clin Pharmacol;46:547-51(1998)を参照されたい。ラモトリジン濃度の中央値は、副作用が生じる患者では６２μｍｏｌ／ｌ（範囲、３１〜６０μｍｏｌ／ｌ）であったのに比較して、応答する患者（＞５０％発作減少）では３１μｍｏｌ／ｌ（範囲、８〜６０μｍｏｌ／ｌ）であった。そこで、現在、ラモトリジンについて１０〜６０μｍｏｌ／ｌ（２．５４〜１５．２４μｇ／ｍｌ）の標的範囲が示唆されている。したがって、有効ＴＤＭを用いて治療指数内の適切なラモトリジン濃度を獲得できる投薬措置を予測することができる。
【０００９】
［００８］ラモトリジンを分析するための多くの方法が報告されている。まず、その方法は、紫外線（「ＵＶ」）検出を伴うＨＰＬＣを含む。Fraserら, Ther Drug Monitoring, 17:174-178, 1995；Lensmeyerら, Ther Drug Monitoring, 19:292-300, 1997；Crociら Ther Drug Monitoring 23:665-668, 2001を参照されたい。さらに、血清中のラモトリジンの測定のため、競合的結合酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が報告されている。Sailstadら, Ther Drug Monitoring, 13:433-442, 1991を参照されたい。しかし、当該方法は、例えば、試料調製時間が長く、アッセイ時間が長く、コストが高く、そして多大な労働力を伴う方法であるため商業的使用には非実用的である。したがって、有効なＴＤＭのためには、ラモトリジン血漿レベルを測定するための単純でそして迅速な分析法が必要であり、免疫アッセイ技術は、本分析適用に非常に適する。
【００１０】
［００９］免疫アッセイ技術は、生物学的試料中の様々な薬剤を検出するために開発され、商業的分析適用に非常に適する。したがって、免疫アッセイを用いて患者の血中の薬剤及び／又は薬剤代謝産物の量を迅速に評価することもできる。免疫アッセイの例としては、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）微粒子免疫アッセイ（例えば免疫比濁法）又は定量的微小球体系（「ＱＭＳ（登録商標）」）、蛍光偏光免疫アッセイ（「ＦＰＩＡ」）、クローニング酵素供与体免疫アッセイ（「ＣＥＤＩＡ」）、化学発光微粒子免疫アッセイ（「ＣＭＩＡ」）等があげられるが、これらに限定されるわけではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
［０１０］したがって、患者の血液、血清、血漿、及び／又は他の生物学的液体又は試料中のラモトリジンを検出するために設定された免疫アッセイがあれば好適であろう。さらに、本免疫アッセイで用いるラモトリジン類似体、及び／又は抗ラモトリジン抗体を産生する際に用いるラモトリジン類似体に基づく免疫原があれば好適であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の簡単な概要
［０１１］一般的に、本発明は、ラモトリジン類似体、及びラモトリジンに関する免疫診断アッセイに関する。ラモトリジン類似体は、抗ラモトリジン抗体を調製するために使用できる免疫原性部分；ラモトリジンの免疫診断アッセイで使用できる抗原性部分；又は免疫診断アッセイで使用できるトレーサー部分等の作用基を含むことができる。さらに、ラモトリジン類似体を免疫診断アッセイに用いて、抗ラモトリジン抗体に関してラモトリジンと競合させてもよい。
【００１３】
［０１２］本発明の１の態様では、ラモトリジン類似体には、式１Ａ、式２Ａ、又は式３Ａの少なくとも１の化学構造が含むことができる。
【００１４】
【化２】
2008518234.tif 000004
【００１５】
［０１３］さらに、式１Ａ、式２Ａ、及び／又は式３Ａの上記化学構造は共役化された様々な部分を含みうる骨格である。つまり、本骨格はさらに、以下のように定義することができる：（ａ）Ｌは、ＮＨ、ＮＨＣＯ、又はＯ基の１つであってもよく；（ｂ）Ｗは、１〜１０の炭素又はヘテロ鎖原子の、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖であってもよく；（ｃ）Ｘは、Ｗ及びＹ間の結合、１〜２の環を有する置換又は非置換の芳香族又は脂肪族基、及び／又は１〜１０の炭素又はヘテロ鎖原子を有する、飽和もしくは不飽和、置換もしくは非置換、又は直鎖もしくは分枝鎖の少なくとも１つであってもよく；（ｄ）Ｙは、脂肪族、アルコール、アミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、活性化エステル、脂肪族エステル、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、アルコール、チオラクトン、ジアゾニウム、及びマレイミド基からなる群から選択され；そして（ｅ）式１のＹ−Ｘ−Ｗ−Ｌ−は５−スクシニルアミノ部分ではない。さらに、Ｙは、作用基にカップリングしたリンカー基でもよい。
【００１６】
［０１４］１の態様では、ラモトリジンに関する免疫診断アッセイで用いるのに十分な力価の抗体を生成する免疫原を形成するため、式１Ａ、２Ａ、及び／又は３Ａに示す骨格いずれかのラモトリジン類似体を、適切な化学反応を介して免疫原性部分にカップリングして特定することもできる。また、ラモトリジン類似体が免疫原性部分にカップリングして免疫原を形成することもできるが、本免疫原は、抗原及びラモトリジンと相互作用し、ラモトリジン及び類似体に対する親和性、特異性、及び／又は結合活性が実質的に類似する抗体を生成し、競合的結合研究に用いることができる。さらに、ラモトリジン類似体は、トレーサー部分にカップリングすることができ、免疫診断アッセイで用いるのに十分な溶解度でありうる。また、本類似体は抗原部分にカップリングすることができ、免疫診断アッセイで用いるのに十分な溶解度でありうる。さらに、ラモトリジン類似体は、粒子又は微粒子上に安定して装填できる。さらに、ラモトリジン類似体は、酵素、酵素供与体、又は酵素受容体にカップリングすることができる。
【００１７】
［０１５］本発明の１の態様としては、試料中のラモトリジンの存在を検出する免疫診断系で用いる抗体組成物があげられる。抗体組成物には、少なくとも１の結合ドメインを有する抗ラモトリジン抗体であって、ラモトリジンに結合でき、ラモトリジン類似体に結合できる、前記抗体が含まれてもよい。また、抗体は、少なくとも約１：５，０００、より好ましくは少なくとも約１：１０，０００、さらにより好ましくは少なくとも約１：５０，０００、さらにより好ましくは少なくとも約１：１００，０００、そして最も好ましくは少なくとも約１：３００，０００の力価で存在してもよい。場合によっては、好ましくは、最低１：５，０００又は最高１：３００，０００の抗体力価を有しうる。
【００１８】
［０１６］さらに、抗体は、モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体である。抗体は、ラモトリジンに比較してラモトリジン類似体に対して、均一系又は不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）免疫診断アッセイに用いるのに十分な、親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つを有してもよい。そのようなものとして、抗体及びラモトリジン類似体間の相互作用は、ラモトリジンに対する抗体の親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つの少なくとも５０％であり、さらにより好ましくは、ラモトリジンに対する抗体の親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つの少なくとも７０％であり、最も好ましくは、ラモトリジンに対する抗体の親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つの少なくとも９０％でもよい。場合により、ラモトリジン類似体に対する抗体の親和性、特異性、又は結合活性の少なくとも１つは、ラモトリジンに対するものと実質的に同一である。
【００１９】
［０１７］１の態様では、本発明としては、試料中のラモトリジンの存在を検出するための免疫診断系で用いる系があげられる。当該系には、ラモトリジン類似体及び抗ラモトリジン抗体が含まれうる。１の側面において、ラモトリジン類似体には、飽和又は不飽和脂肪族、アルコール、アミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、活性化エステル、脂肪族エステル、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、アルコール、チオラクトン、ジアゾニウム基、及びマレイミド基からなる群から選択される、末端基にカップリングしたリンカー置換基が含まれる。本系では、リンカー置換基は、以下の少なくとも１つにより特徴付けられうる：（ａ）少なくとも５つの炭素又はヘテロ原子脂肪族鎖を有する５位置換基；（ｂ）少なくとも４つの炭素又はヘテロ原子脂肪族鎖を有する４位置換基；又は（ｃ）少なくとも４つの炭素又はヘテロ原子脂肪族鎖を有する３位置換基。さらに、ラモトリジン類似体又は抗ラモトリジン抗体の一方が、粒子、磁気粒子、微粒子、微小球体、支持体、酵素供与体、又は酵素受容体の１つとカップリングしてもよい。
【００２０】
［０１８］１の態様では、本系には、以下の少なくとも１つが含まれてもよい：（ａ）ラモトリジンのストック組成物；（ｂ）濃度勾配を形成する、異なる濃度のラモトリジンを含有する一連の組成物；（ｃ）トレーサー部分を有するラモトリジン類似体；（ｄ）微粒子にカップリングしたラモトリジン類似体；（ｅ）微粒子にカップリングした抗体；（ｆ）酵素供与体を有するラモトリジン類似体、及び対応する酵素受容体；（ｇ）酵素受容体を有するラモトリジン類似体、及び対応する酵素供与体；又は（ｈ）ろ過又は沈降による分離に適した粒子上に装填された抗体。
【００２１】
［０１９］本発明としては、試料中のラモトリジンの存在を検出するための免疫診断アッセイを行う方法もあげられる。本方法には、少なくとも１：５，０００の力価の抗ラモトリジン抗体及びラモトリジン類似体を、以前ラモトリジンを投与した被験体から得た試料と合わせて、第一の組成物を形成する工程が含まれてもよい。その後、試料由来のいかなる遊離（ｆｒｅｅ）ラモトリジン及びラモトリジン類似体も、抗体との結合に関して競合できるようにする。競合的結合後、ラモトリジン類似体及び抗体間の結合を検出する。
【００２２】
［０２０］１の態様では、免疫診断アッセイは、上記のように、蛍光部分を含むラモトリジン類似体を利用し、当該類似体と抗体及び試料を合わせる。第一の偏光量を有する偏光で蛍光部分を励起することもでき、第二の偏光量を有する蛍光部分から放出される偏光を検出する。場合により、第一の偏光量と第二の偏光量を比較して試料にラモトリジンが存在するか否かを決定するが、ここで第二の偏光量が第一の偏光量と異なる場合、試料中にラモトリジンが存在する指標とする。さらに、免疫診断アッセイには、既知量のラモトリジンと、ラモトリジン類似体及び抗体とを合わせて、対照結合組成物を形成することによる対照が含まれうる。第三の偏光量を有する対照結合組成物中で、蛍光共役体から放出される偏光を検出して第二の偏光量と比較する。その後、試料中に存在するラモトリジン量を決定する。
【００２３】
［０２１］１の態様では、免疫診断アッセイは、微粒子上に装填されたラモトリジン類似体又は抗体を用いる。類似体、抗体及び試料を合わせて第一の組成物とし、いかなる遊離ラモトリジンも、抗体との結合に関して類似体と競合する。その後、第一の組成物に入射光線を照射して第一の組成物由来の透過光の第一の強度を検出する。ラモトリジン類似体及び抗体を有するが遊離ラモトリジンを有しない、対照結合組成物由来の透過光の最低強度を同定して透過光の第一の強度と比較する。ラモトリジンが試料に存在するか否かを決定し、ここで最低強度が第一の強度と異なるならば、試料中にラモトリジンが存在する指標となる。さらに、免疫診断アッセイには、既知量のラモトリジンと、ラモトリジン類似体及び抗体を合わせて、対照結合組成物を形成することによる、対照が含まれていてもよい。その後、対照結合組成物に入射光線を照射して対照結合組成物由来の透過光の第二の強度を検出する。その後、試料中に存在するラモトリジン量を決定してもよく、第一の強度と第二の強度の比較は、試料中に存在するラモトリジン量の指標となる。
【００２４】
［０２２］１の態様では、免疫診断アッセイは、酵素供与体を有するラモトリジン類似体を用いる。類似体、抗体及び試料を合わせて第一の組成物とし、いかなる遊離ラモトリジンも抗体との結合に関して類似体と競合する。その後、第一の組成物と酵素受容体及び基質を合わせるが、基質は、酵素供与体と酵素受容体との相互作用により切断できる。その後酵素活性を検出する。さらに、免疫診断アッセイには、既知量のラモトリジンと、ラモトリジン類似体及び抗体を合わせて対照結合組成物を形成することによる、対照が含まれてもよく、その後、酵素受容体及び基質をこれと合わせる。試料中に存在するラモトリジン量の指標を提供する、酵素活性と対照酵素活性の比較により、試料中に存在するラモトリジン量を決定する。
【００２５】
［０２３］１の態様では、免疫診断アッセイは、トレーサー共役体を含むラモトリジン類似体を用いる。類似体、抗体及び試料を合わせて第一の組成物とし、いかなる遊離ラモトリジンも、抗体との結合に関して類似体と競合する。その後、第一の組成物から抗体を分離して未結合のラモトリジン類似体を抗体から分離する。その後、競合的結合組成物から、抗体と結合するトレーサー共役体を検出する。さらに、免疫診断アッセイには、既知量のラモトリジンとラモトリジン類似体及び抗体を合わせて、対照結合組成物を形成することによる、対照が含まれていてもよい。このように、試料中に存在するラモトリジン量の指標を提供できるため、第一の組成物中のトレーサー共役体量と対照結合組成物中のトレーサー共役体量を比較して試料中に存在するラモトリジン量を決定できる。
【００２６】
［０２４］本発明のこれら及び他の態様及び特徴は、以下の説明及び付随する請求項からより完全に明らかになるであろうし、又は以下に示す本発明の実施により確認できる。
［０２５］本発明の上記及び他の利点及び特徴をより明確にするため、添付の図面に例示する、本発明の特定の態様を参照して、本発明のより詳細な説明を提供する。本図面は本発明の典型的な態様のみを示すため、その範囲を限定すると見なしてはならないことは認識されよう。添付の図面を用いて、本発明をより具体的かつ詳細に記載し、説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
［０４６］一般的に、本発明は、ラモトリジン類似体及びラモトリジンの免疫診断アッセイに関する。ラモトリジン類似体は、抗ラモトリジン抗体を調製するために用いうる免疫原性部分、又はラモトリジンの免疫診断アッセイで用いうる抗原性部分若しくはトレーサー部分が含まれていてもよい。さらに、ラモトリジン類似体を免疫診断アッセイに用いて、抗ラモトリジン抗体に関してラモトリジンと競合させることもできる。このように、以下の専門用語は、本発明の態様を説明することを意味するが、限定することを意図したものではない。
【００２８】
［０４７］本明細書中、用語「ハプテン」は、部分的又は不完全な抗体を意味し、小分子又は薬剤でもよい。さらにハプテンは、タンパク質不含又はポリペプチド不含物質である低分子量分子でもよい。通常ハプテンは、単独で抗体形成を刺激できないが抗体と相互作用できる。そこで本発明のラモトリジン及びラモトリジン類似体はハプテンでもよい。
【００２９】
［０４８］本明細書中、用語「類似体」又は「誘導体」は、１以上の化学反応により、親化合物又は分子から作製される化学的化合物又は分子を意味する。そこで、類似体は、ラモトリジンの構造に類似であるか又はラモトリジン骨格に基づくが、特定の構成要素又は構造的性質はラモトリジンと異なる構造の化合物でもよく、代謝的に類似の作用又は反対の作用でありうる。本発明のラモトリジンの類似体又は誘導体を用いて類似体及びラモトリジンを共に認識する抗体との結合に関して競合させることもできる。また、類似体には、リンカー基を介したラモトリジンにカップリングした作用基が含まれうる。
【００３０】
［０４９］本明細書中、用語「免疫原」及び「免疫原性」は、生物中で免疫応答を産生又は生成できる物質を意味する。免疫原はまた抗原でもよい。通常、免疫原は、非常に分子量が高く（例えば１０，０００より大きい）、したがって、本発明の免疫原を形成するために、タンパク質、リポタンパク質、多糖、核酸及び特定のテイコ酸等の様々な巨大分子をハプテンにカップリングしてもよい。
【００３１】
［０５０］本明細書中、用語「免疫原性」は、分子が免疫応答を誘導する能力を意味し、これは、注入される分子の固有の化学構造及び宿主動物が化合物を認識できるか否かで決定する。抗原の構造中の僅かな変化により化合物の免疫原性が大きく改変することもあり、当該変化は、抗体、特に、極めて高く保存されている抗原に対する抗体を得る機会を高める一般的な手段として広く用いられてきた。例えば、これらの修飾技術は、免疫原の領域を改変して、Ｔ細胞結合により優れた部位を提供するか、又はＢ細胞結合のための新規のエピトープを暴露するかである。
【００３２】
［０５１］本明細書中、用語「担体」、「免疫原性部分」、又は「免疫原性担体」は、ハプテンにカップリングすることができる免疫原性物質、一般的にはタンパク質である作用基を意味する。ハプテンにカップリングした免疫原性部分は、免疫応答を誘導することができ、ハプテンと特異的に結合できる抗体の産生を誘発できる。免疫原性部分は、異質（foreign）と認識されて宿主から免疫学的応答を誘発する、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、複合多糖、粒子、核酸、ポリヌクレオチド等を含む作用基である。さらに、リンカーには、修飾又は非修飾のヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖及び他の炭水化物、例えばポリエチレングリコール等のポリエーテル、ポリアルコール、ポリプロピレン、プロピレングリコール、エチレン及びプロピレングリコールの混合物、ポリアルキルアミン、スペルミジン等のポリアミン、ポリ（アクリル酸エチル）等のポリエステル、ポリホスホジエステル、及びアルキレン含まれる。作用基及びそのリンカーの例としてはコレステロール−ＴＥＧ−ホスホロアミダイトがあり、ここでコレステロールは作用基であり、そしてテトラエチレングリコール及びホスフェートがリンカーとして機能する。
【００３３】
［０５２］一例として、作用基は免疫原性を刺激し、ハプテンに対する抗体形成を刺激するためにハプテンにカップリングさせることができる、免疫原性担体である。通常、免疫原性担体は、免疫原性が高くハプテンに対して免疫原性を供与できる、巨大分子である。例えば、異質のタンパク質は当該免疫学的応答を誘発できるため、タンパク質を免疫原性担体として用いうる。タンパク質担体は可溶性が高くてもよく、ハプテン分子との共役化を容易に促進できる官能基を含んでいてもよい。現在用いられている最も一般的な担体タンパク質のいくつかは、キーホールリンペット（keyhole limpet）・ヘモシアニン（ＫＬＨ；ＭＷ  ４５０，０００〜１３，０００，０００）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭＷ  ６７，０００）である。キーホールリンペット・ヘモシアニンは、海生キーホールリンペットの酸素運搬タンパク質であり、非常に巨大で、解離させてサブユニットにすると免疫原性が高まるが、これはおそらく他のエピトープ部位が免疫系に曝露されるためである。ＢＳＡは共役化に適した多くの官能基を含有する可溶性の高いタンパク質である。
【００３４】
［０５３］本明細書中、用語「抗体」は、体内の異質な分子の存在に応答して産生されるタンパク質を意味する。これらは、抗原及び免疫系の特異的な細胞又はタンパク質の両方に結合する能力で特徴付けできる。抗体は、５つのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤに分けられる、形質細胞により産生される免疫グロブリンである。
【００３５】
［０５４］本明細書中、用語「エピトープ」は、抗体と相互作用する抗原の領域を定義するよう意味する。したがって、抗原である分子又は他の物質としては、抗体活性がある少なくとも１のエピトープがあげられる。これにより、抗原が、同一抗体又は異なる抗体により認識される様々なエピトープがありうる。また、エピトープは任意の特定構造の固有の特性ではなく、抗体と相互作用する結合部位と定義できる。
【００３６】
［０５５］本明細書中、用語「親和性」は、エピトープ及び抗体間の結合強度の測定値を意味する。したがって、単一の抗体は、様々なエピトープに対する親和性が異なってもよい。これにより、単一の抗体は１のエピトープに強く結合し、他のエピトープにより弱く結合することが可能となる。つまり、抗体は、ラモトリジン等の薬剤に対して第一の親和性があり、ラモトリジン類似体に対して第二の親和性があってもよい。しかし、抗体は、ラモトリジン及びラモトリジン類似体の両方に対する親和性が実質的に同等又は類似であってもよく、これにより、類似体を用いてラモトリジンに対する抗体を生成して、競合的結合研究に用いることが可能となる。したがって、本発明のラモトリジン類似体を用いて、ラモトリジンに親和性がある抗体を生成することができる。
【００３７】
［０５６］本明細書中、用語「結合活性」は、抗体及び抗原の複合体の全体的な安定性の測定値を意味する。抗体−抗原相互作用の全体的な安定性は、以下の３つの主な要因に制御されうる：（ａ）エピトープに対する抗体固有の親和性；（ｂ）抗体及び抗原の価数；及び（ｃ）相互作用構成要素の幾何学的配置。つまり、上記パラメーター及び他のパラメーターを変化させて、抗体−抗原複合体の結合活性を調節することができる。
【００３８】
［０５７］本明細書中、用語「特異性」は、他の利用可能なエピトープと比較した、エピトープと抗体の優先的な結合を意味する。すなわち、抗体の特異性は、ラモトリジン代謝産物ではなく、ラモトリジン及び／又は類似体に優先的に結合できる。これを用いて、不都合な抗体−代謝産物結合が混入しないようにして、ラモトリジンの真の濃度を評価できるように、代謝産物よりもラモトリジンと優先的に結合する、抗ラモトリジン抗体を生成することができる。また、ラモトリジンとの結合に関する抗体の特異性を用いて、ラモトリジンの特異性が類似又は実質的に同一な類似体を調製することもできる。
【００３９】
［０５８］本明細書中、用語「ポリクローナル抗体」は、所定の抗原又はエピトープに対する特異性及び親和性の範囲が広い抗体の異種混合物を意味する。したがって、ポリクローナル抗体としては、各々他と区別でき、抗原と結合するか又は他の態様で相互作用する、複数の抗体があげられる。エピトープのある免疫原を動物内に注射して適切な時間の経過後、目的の抗体を含有する血液分画を収集して、場合により精製することにより、ポリクローナル抗体を含む、異なる抗体を産生するか又は生成することができる。抗体を産生する場合、ポリクローナル抗体の最終的な使用について、いくつかのパラメーターを考慮してもよい。これらのパラメーターとしては以下があげられる：（１）抗体の特異性（すなわち抗原を区別する能力）；（２）抗体の結合活性（すなわちエピトープに結合する強度）；及び（３）アッセイ系での抗体の最適な希釈を決定する、抗体力価。
【００４０】
［０５９］本明細書中、用語「モノクローナル抗体」は、正常な抗体産生細胞及び１の前駆細胞の培養物から単離された抗体を意味する。モノクローナル抗体の結合定数は、均一であってもよく、当該技術分野で周知である。
【００４１】
［０６０］本明細書中、「抗体力価」は、血清希釈の逆数を意味する。より好適に記載及び形式化するため、本態様で力価を記載する。１／５００００の力価は、抗原を１：５００００で希釈した場合に、抗体が、共に結合させた抗原のエピトープを有効に検出することを意味する。力価は、最大Ｏ．Ｄ．の約１０％である終点力価により計算される。
【００４２】
［０６１］本明細書中、用語「免疫アッセイ」又は「免疫診断」は、生物学的試料中の特定の抗原又は特定の抗体の少なくとも１つを同定及び／又は定量化するため、抗原及び抗体間の結合を利用する実験技術を意味する。現在、以下に記載するような３種の免疫アッセイがある：（１）抗体捕捉アッセイ；（２）抗原捕捉アッセイ；及び（３）２抗体サンドイッチアッセイ。さらに、新規免疫アッセイが開発され、本発明の類似体及び抗体を使用しうるであろうことが意図される。
【００４３】
［０６２］本明細書中、用語「競合的免疫アッセイ」は、既知量の同定可能な抗原が、抗体との結合に関して他の抗原と競合する、実験プロトコルを意味する。すなわち、既知の抗体と結合する既知の抗原を、その既知の抗体と結合する他の抗原を含有すると推測される試料と合わせる。これにより、該抗体上の結合部位で、既知の抗原及び他の抗原が共に競合することができる。例えば、抗ラモトリジン抗体と結合するラモトリジン類似体を、ラモトリジンを含有すると推測される試料と合わせることもでき、当該類似体及びラモトリジンが、抗ラモトリジン抗体との結合に関して競合する。その後、抗体との結合に関する競合を用いて、試料中にラモトリジンが存在するか否かを決定することもでき、試料中のラモトリジン量を定量化することもできる。
【００４４】
［０６３］本明細書中、用語「比濁検出」は、凝集粒子により散乱される光による、入射光線の透過における強度の減少又は吸光度の増加の測定値を意味する。透過光の強度の減少は、透過光のより高い出発バックグラウンド強度に対して測定される。通常、読取りは、光供給源と一列になった検出装置で行われ、粒子の凝集が光の透過を阻害する。したがって、ラモトリジン等の標的分析物の存在を評価するための手段として、凝集の阻害又は促進を用いうる。比濁アッセイは、様々な臨床分析装置に容易に適応できる。
【００４５】
［０６４］本明細書中、用語「微粒子凝集アッセイ」は、標的分析物による微粒子の凝集を阻害する原理を用いる免疫アッセイを意味する。すなわち、標的分析物が存在すると凝集が減少する。例えば、標的薬剤の誘導体が微粒子表面に共有結合し、及び／又は増感粒子はモノクローナル抗体により凝集する。試料が遊離薬剤を含有する場合、凝集は薬剤濃度に比例して阻害され、吸光度と関連した薬剤濃度の古典的な阻害曲線が導かれる。
【００４６】
［０６５］本明細書中、用語「作用基」は、リンカー基を介してラモトリジンにカップリングした分子又は巨大分子を意味する。作用基としては、免疫原性部分、抗原部分、トレーサー部分等があげられる。さらに、本明細書記載の化学的骨格のＺ基が作用基である。つまり、作用基をＹリンカー基にカップリングさせ、類似体に他の機能を提供しうる。
【００４７】
［０６６］本明細書中、用語「活性エステル」又は「活性化エステル」は、例えばペプチド及びタンパク質等の化合物の遊離アミノ基と反応できるエステル基を意味する。活性エステルとしては、活性脱離基に連結されたカルボキシル基があげられる。しばしば、活性脱離基には、エステル酸素が含まれ、活性脱離基はエステル酸素を除去する。例えば活性エステルは、一級アミンによる置換に感受性であり、これにより、エステル酸素が除去され、アミド基が形成される。活性エステルを形成する活性脱離基の例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル等があげられる。よって、用語「ＮＨＳ」を用いる場合は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとして定義されることを意味する。
【００４８】
［０６７］本明細書中、用語「標識」、「検出剤分子」又は「トレーサー」は、検出可能シグナルを生じるか又は生じるように誘導できる、いかなる作用基をも意味する。標識をラモトリジン、ラモトリジン類似体、ハプテン、分析物、免疫原、抗体、又は受容体又は受容体に結合できる分子等の他の分子に共役化できる。トレーサーの例としては、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触媒、フルオロフォア、色素、化学発光剤、発光剤、増感剤、非磁気又は磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体等があげられるがこれらに限定されない。本明細書中、類似体は、当該技術分野で周知の方法で様々な標識にカップリングして、様々な免疫アッセイ系で有用な様々な試薬を提供することもできる。免疫アッセイの結果を検出するため、フルオロフォア、例えばフルオレセイン、放射標識、又は化学発光基等の検出剤分子を類似体にカップリングして、トレーサーを産生することができる。
【００４９】
［０６８］本明細書中、用語「連結基」又は「リンカー」は、例えばラモトリジン、ラモトリジン類似体、ハプテン、及び例えば免疫原性部分、担体、免疫原、標識、トレーサー等の作用基の、２以上の基礎構造（substructure）を連結する化学構造部分を意味する。連結基は、基礎構造間に伸長する、水素（又は他の一価の原子）以外の原子の少なくとも１の中断されていない鎖があってもよい。通常、連結基としては、置換されていても又は置換されていなくてもよい炭素原子又はヘテロ原子の鎖があげられる。連結基の原子及び連結基内の鎖の原子は、化学的結合で相互連結できる。例えば、リンカーは、直鎖又は分枝鎖、置換又は非置換、飽和又は不飽和鎖でもよく、鎖の原子としては、炭素及び／又はヘテロ原子があげられる。これには、鎖内又は鎖末端の１以上のヘテロ原子も含まれうる。さらに、連結基にはまた、鎖の一部として、又は鎖中の１の原子上の置換として、環状基及び／又は芳香族基もあげられる。連結されている基礎構造間の最短経路である鎖の主鎖の水素以外の原子の数を計測することにより、連結基又はリンカー中の原子の数を決定する。ハプテンをトレーサー、標識、担体、免疫原性部分等と共役化するため、連結基を用いて、利用できる部位をハプテン上に提供することができる。
【００５０】
［０６９］本明細書中、用語「ヘテロ原子」は、酸素、窒素、硫黄、リン等の炭素原子以外の原子を意味する。通常、連結基又は他の部分で用いられる、少なくとも２つの共有結合を形成できるように、ヘテロ原子は多価である。
【００５１】
［０７０］本明細書中、用語「生物学的試料」は、生命体から得られる固体又は液体試料を意味する。つまり、生物学的試料としては、ヒト及び他の動物等の、生物又は以前生存していたものに由来する、いかなる量の物質もあげられるが、これらに限定されない。本物質としては、血液、血清、血漿、尿、涙、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、内皮細胞、皮膚等があげられるが、これらに限定されない。
【００５２】
［０７１］本明細書中、用語「患者」は、ヒト及び他の動物被験体を意味する。より詳細には、患者は、ラモトリジン等の抗癲癇薬剤が必要なヒト又は他の動物被験体である。
［０７２］ラモトリジン類似体には、リンカー部分にカップリングしたラモトリジン分子が含まれてもよく、場合により作用基が含まれる。リンカー部分及び作用基は、ラモトリジンの物理化学的特性を修飾できる化学的化合物の範囲は広くてもよい。したがって、リンカー部分は、アルキル、脂肪族、直鎖脂肪族、分枝鎖脂肪族、置換脂肪族、環状脂肪族、複素環脂肪族、芳香族、複素環芳香族、多環芳香族等が含まれる。
【００５３】
［０７３］本明細書中、用語「脂肪族」は、直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和、及び／又は置換又は非置換であってもよく、主鎖中に２０以下の炭素又はヘテロ原子を有する、アルキル基等のヒドロカルビル部分を意味する。さらに、脂肪族には、主鎖中に１０以下の炭素又はヘテロ原子が含まれうる。脂肪族基は、直鎖、分枝鎖、環状及び／又は複素環である部分を含んでいてもよく、エーテル、ケトン、アルデヒド、カルボキシレート等の官能基を含有してもよい。典型的な脂肪族基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、より多数の炭素のアルキル基等、並びに２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル等の置換及び／又は非置換基が含まれるが、これらに限定されない。用語、脂肪族又はアルキルはまた、ビニル等のアルケニル基、アリル、アラルキル及びアルキニル基も含む。
【００５４】
［０７４］脂肪族基内の置換には、脂肪族部分で許容されうるいかなる原子又は基も含まれてよく、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエステル、アミン（一級、二級、又は三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、酸素等が含まれるが、これらに限定されない。脂肪族基としてはまた、例えば、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボニル基、カルボキシル基、ニトロ、ニトロソ又はニトリル基、イミダゾール等の複素環、ヒドラジノ又はヒドロキシルアミノ基、イソシアネート又はシアネート基、並びにスルホキシド、スルホン、スルフィド、及びジスルフィド等の硫黄含有基等の修飾も含んでよい。さらに、置換は、適切か又は可能な場合、単結合、二重結合、又は三重結合を介してもよい。
【００５５】
［０７５］さらに、脂肪族基はまた、例えば窒素、酸素、リン、又は硫黄等のヘテロ原子により炭素原子が置換されたヘテロ置換も含有しうる。つまり、置換脂肪族で構成されるリンカーは、炭素、窒素、酸素、硫黄、リン及び／又は同様のもので構成される主鎖を有しうる。複素環置換は、ヘテロ原子が１以上あるアルキル環をいう。複素環部分の例には、モルホリノ、イミダゾール、及びピロリジノが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
［０７６］本明細書中、用語「芳香族」は、電子が原子の円形又は環状配置周囲を自由に循環し、互いに交互に単結合及び二重結合する分子をいう。より適切には、これらの結合が単結合及び二重結合のハイブリッドであり、環中の各結合が他のすべてと同一であるとみなすこともできる。ラモトリジン類似体中に存在しうる芳香族化合物の例としては、ベンゼン、ベンジル、トルエン、キシレン等があげられる。芳香族化合物には、ピリジン、フラン、テトラヒドロフラン等のヘテロ芳香族となるようなヘテロ原子を含んでいてもよい。また、芳香族は、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、多環芳香族炭化水素、インドール、キノリン、イソキノリン等の多環芳香族でもよい。
【００５７】
［０７７］本明細書中、用語「アミン」は、１、２、又は３の水素原子を、例えばアルキル基等の他の基で置換して、アンモニアに直接又は間接的に由来しうる部分を意味する。一級アミンの一般構造はＲＮＨ２であり、そして二級アミンの一般構造はＲ２ＮＨである。用語、アミンには、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、多環アミン、アリール及びアルキルアミンで置換されたヘテロ原子、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、２，６−ジメチルピペリジン、ピペラジン、及びアルキル又はアリール二級アミンで置換されたヘテロ原子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
［０７８］本明細書中、用語「ポリ（アミノ酸）」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸から形成されるポリアミドである。ポリ（アミノ酸）は、一般的に、分子量約２００〜２，０００又は分子量の範囲が約２，０００を超えるか又は、分子量上限がなく、通常、分子量が１０，０００，０００未満であり、最高でも約６００，０００ダルトンであろう。通常、免疫原性担体又は酵素が関与するか否かに応じて範囲が異なるであろう。
【００５９】
［０７９］本明細書中、用語「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合により２以上のアミノ酸の連結により形成されるいかなる化合物をも意味し、通常、直鎖中の各アミノ酸残基のα−アミノ基（ＮＨ２末端を除く）が、次の残基のα−カルボキシル基に連結されているα−アミノ酸のポリマーである。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「ポリ（アミノ酸）」は、本明細書中、大きさの制限なくこの種の化合物を指すべく、同義的に用いられる。この種の最大のメンバーは、明確なポリペプチド配列があるタンパク質をいう。
【００６０】
［０８０］さらに、本発明を記載するために本明細書で用いる用語は、上記定義及び／又は当該技術分野で周知の定義を用いて解釈できる。つまり、上記命名法は、本発明を説明するよう意味し、そして限定することを意図したものではない。
【００６１】
Ｉ．ラモトリジン類似体
［０８１］１の態様では、本発明は、ラモトリジン類似体に基づくトレーサー、免疫原及び／又は類似体を調製するために用いられるラモトリジン類似体に関する。以下に示すように、ベンゼン環上の４原子及び５原子での４位又は５位置換等のベンゼン環の誘導体、並びに／あるいはトリアジン環上の３原子での３位置換等のトリアジン環の誘導体としてラモトリジン類似体を調製できる。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を調製する際に用いるラモトリジン類似体に基づく免疫原を産生するため、ラモトリジン類似体が免疫原性部分にカップリングしていてもよい。したがって、固有のラモトリジン免疫原を用いて生成される抗体は、ラモトリジン及び類似体と相互作用及び／又は結合しうる。抗体、免疫原、抗原及び類似体は、生物学的液体中のラモトリジン検出のための免疫アッセイを行うために調製するのに有用でありうる。
【００６２】
【化３】
2008518234.tif 000005
【００６３】
［０８２］１の態様では、本発明は、ベンゼン環上の５原子に５−置換があるラモトリジンの新規類似体を記載する。すなわち、類似体を形成するため、ベンゼン環は、連結部分及び／又は類似体部分に５原子で共役化しうる。類似体部分を、類似体を形成するため、ラモトリジン骨格とカップリングしている置換基と見なしてもよい。類似体部分は、以下により詳細に記載する、様々な化学物質でもよい。したがって、ラモトリジンの５−置換類似体には式１Ａ及び／又は式１Ｂの一般的な構造を有する：
【００６４】
【化４】
2008518234.tif 000006
【００６５】
［０８３］式１Ａ及び／又は式１Ｂに示すラモトリジン骨格は、広範囲にわたる化学物質で置換できる。しかし、５−置換スクシニルアミノには不都合な性質があることが見出されている。化学薬品７４Ｗ８６として知られる、ラモトリジンの５−スクシニルアミノ類似体（例えばスクシンアミド酸）は担体に直接カップリングできるが、該物質は極性が高く、多くの一般的な溶媒への溶解度が低い。さらに、in situで生成できる活性化エステル又は活性化種は非常に不安定である。７４Ｗ８６と担体タンパク質とのカップリングは全く十分ではなく、免疫アッセイで用いるのに十分な抗ラモトリジン抗体を産生せず、通常は力価が低い。したがって、類似体部分の以下の記載は５−スクシニルアミノ類似体を除くと解釈することもできる。しかし、本発明によればラモトリジン類似体を産生するために物理化学的特性が改善できるように、７４Ｗ８６をさらに修飾することができる。
【００６６】
［０８４］さらに、式１Ａ及び１Ｂに関して、Ｌ及びＷが共にラモトリジン骨格にカップリングしたアミド結合を形成する場合、Ｗ、Ｘ、及びＹが共にＨＯＯＣ（ＣＨ２）２Ｃ＝Ｏを形成できない。つまり、Ｌ−Ｗ−Ｘ−Ｙは５−スクシニルアミド基を形成しない。
【００６７】
［０８５］他の態様において、ラモトリジン骨格には、５−置換に類似の４−置換が含まれうる。したがって、ラモトリジンの４−置換類似体には、式２Ａ及び／又は式２Ｂの一般構造を有してもよい：
【００６８】
【化５】
2008518234.tif 000007
【００６９】
［０８６］式２Ａ及び２Ｂに関して、Ｚが存在せず、Ｌ及びＷが共にラモトリジン骨格にカップリングしたアミド結合を形成する場合、Ｗ、Ｘ、及びＹは共にＨＯＯＣ（ＣＨ２）２Ｃ＝Ｏを形成することができる。つまり、類似体部分は、４−スクシニルアミド置換体からなってもよい。
【００７０】
［０８７］他の態様において、ラモトリジン骨格はトリアジン環中の３−置換を含んでいてもよい。したがって、ラモトリジンの３−置換類似体は、式３Ａ及び／又は式３Ｂの一般構造を有してもよい：
【００７１】
【化６】
2008518234.tif 000008
【００７２】
［０８８］式３Ａ及び３Ｂに関して、Ｚが存在せず、Ｌ及びＷが共にラモトリジン骨格にカップリングしたアミド結合を形成する場合、Ｗ、Ｘ、及びＹは共にＨＯＯＣ（ＣＨ２）２Ｃ＝Ｏ形成することができる。つまり、類似体部分は、４−スクシニルアミド置換からなっていてもよい。
【００７３】
［０８９］式１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、及び３Ｂに示すラモトリジン骨格中のＬの化学物質の範囲は広くてもよい。したがって、Ｌ基は、ＮＨ（アミノ）、ＮＨＣＯ（アミド）、ＳＯ２、Ｏ基、及び脂肪族基から選択できる。つまり、Ｌ基を連結基として用いて、類似体部分及び／又は免疫原性部分をラモトリジン骨格に共役化することができる。
【００７４】
［０９０］さらに、Ｗ基は脂肪族基でもよく、１〜１０の炭素又はヘテロ原子を有する、飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び直鎖又は分枝鎖として例示できる。Ｘ基は、脂肪族、Ｗ及びＹ間の結合、１〜２の環を有する置換又は非置換の芳香族又は脂肪族基、並びに／あるいは炭素又はヘテロ鎖原子が１〜１０である、飽和もしくは不飽和、置換もしくは非置換、又は直鎖もしくは分枝鎖の少なくとも１つでもよい。脂肪族リンカー基上の置換の例としては、一級及び二級アミン、カルボニル基、ハロゲン等があげられる。
【００７５】
［０９１］Ｙ基は、末端基又はカップリング基でもよく、担体、標識、免疫原性部分等の作用基とリンカー基とのカップリングに用いることができる。また、Ｙ基は、Ｚ基へ連結基をカップリングするのに用いる反応基でもよい。つまり、Ｙは、脂肪族、アミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、活性化エステル、脂肪族エステル、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、アルコール、チオラクトン、ジアゾニウム、マレイミド基等の様々な基でありうる。また、Ｙは、Ｙ１−Ｚでもよく、Ｙ１は、Ｙ末端基に由来する連結基、又はＺ基にカップリングしているカップリング基でもよい。
【００７６】
［０９２］さらに、作用基Ｚは、存在しないくてもよく、又はリンカー部分にカップリングすることもできるいかなる部分でもよい。つまり、Ｌ−Ｗ−Ｘ−Ｙ基は、リンカー部分と見なすこともできるし、Ｚ基は作用基でもよい。つまり、リンカー部分は、ラモトリジン骨格及び作用基間のリンカー又は連結基として機能的に作用しうる。例えば、作用基は、担体、標識、トレーサー、タンパク質、酵素、蛍光化合物、リン光生成化合物、温度発色性（ｔｈｅｒｍｏｃｈｒｏｍｉｃ）化合物、光発色性化合物、抗ストークス（ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ）上方制御化合物、化学発光物質、電気化学仲介剤、粒子、レポーター基、酵素阻害剤、核酸、ポリペプチド等でもよい。
【００７７】
［０９３］例えば、Ｗ基は原子の鎖を１以上含んでもよく、存在する場合は少なくとも１の原子が炭素である。具体例として、Ｗは以下の：ＣＨ２；（ＣＨ２）２；（ＣＨ２）３；（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；ＣＨ２ＣＯ；（ＣＨ２）２ＣＯ；（ＣＨ２）３ＣＯ；（ＣＨ２）４ＣＯ；（ＣＨ２）５ＣＯ；（ＣＨ２）６ＣＯ；ＣＨ２ＣＯＯ；（ＣＨ２）２ＣＯＯ；（ＣＨ２）３ＣＯＯ；（ＣＨ２）４ＣＯＯ；（ＣＨ２）５ＣＯＯ；（ＣＨ２）６ＣＯＯ；ＣＯ；ＣＯＯ；ＣＯＣＨ２；ＣＯ（ＣＨ２）２；ＣＯ（ＣＨ２）３；ＣＯ（ＣＨ２）４；ＣＯ（ＣＨ２）５；ＣＯ（ＣＨ２）６；ＣＯＣＨ２ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）５ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯ；ＣＯＣＨ２ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）５ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２；ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３；ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯ；ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ；ＮＨＣＨ２；ＮＨ（ＣＨ２）２；ＮＨ（ＣＨ２）３；ＮＨ（ＣＨ２）４；ＮＨ（ＣＨ２）５；ＮＨ（ＣＨ２）６；ＮＨＣＨ２ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）６ＣＯ；ＮＨＣＨ２ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）６ＣＯＯ；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ；ＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯ；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ；又はＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ、その組み合わせ等のいずれの基でもよい。より好ましくはＷは、ＣＨ２、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、ＣＨ２ＣＯＯ、（ＣＨ２）２ＣＯ、（ＣＨ２）２ＣＯＯ、（ＣＨ２）３ＣＯ、（ＣＨ２）３ＣＯＯ、ＣＯ（ＣＨ２）６、ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯ、ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ、ＣＯ、ＣＯＯ  ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ、ＣＯ（ＣＨ２）２、ＣＯＣＨ２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２、その組み合わせ等からなる群から選択される。最も好ましくはＷは、ＣＯ（ＣＨ２）２、ＣＯＣＨ２、ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２及びＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２からなる群から選択される。１の態様ではＷは炭素及び／又はヘテロ鎖原子が５〜１０の脂肪族でもよい。
【００７８】
［０９４］例えば、Ｘ基は、結合するか又は存在する場合、少なくとも１の原子が炭素であり、原子の鎖が０以上でもよい。つまり、ＸはＬとＹの共有結合でもよい。具体例として、Ｘは以下のいずれの群：ＣＨ２；（ＣＨ２）２；（ＣＨ２）３；（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；ＣＨ２ＣＯ；（ＣＨ２）２ＣＯ；（ＣＨ２）３ＣＯ；（ＣＨ２）４ＣＯ；（ＣＨ２）５ＣＯ；（ＣＨ２）６ＣＯ；ＣＨ２ＣＯＯ；（ＣＨ２）２ＣＯＯ；（ＣＨ２）３ＣＯＯ；（ＣＨ２）４ＣＯＯ；（ＣＨ２）５ＣＯＯ；（ＣＨ２）６ＣＯＯ；ＣＯ；ＣＯＯ；ＣＯＣＨ２；ＣＯ（ＣＨ２）２；ＣＯ（ＣＨ２）３；ＣＯ（ＣＨ２）４；ＣＯ（ＣＨ２）５；ＣＯ（ＣＨ２）６；ＣＯＣＨ２ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）５ＣＯ；ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯ；ＣＯＣＨ２ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）５ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２；ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２；Ｐｈ；ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ；ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３；ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯ；ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ；ＮＨＣＨ２；ＮＨ（ＣＨ２）２；ＮＨ（ＣＨ２）３；ＮＨ（ＣＨ２）４；ＮＨ（ＣＨ２）５；ＮＨ（ＣＨ２）６；ＮＨＣＨ２ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ２）６ＣＯ；ＮＨＣＨ２ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯＯ；ＮＨ（ＣＨ２）６ＣＯＯ；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ；ＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯ；ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ；又はＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ；その組み合わせ等でもよい。より好ましくは、Ｘは、ＣＨ２、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、ＣＨ２ＣＯＯ、（ＣＨ２）２ＣＯ、（ＣＨ２）２ＣＯＯ、（ＣＨ２）３ＣＯ、（ＣＨ２）３ＣＯＯ、ＣＯ（ＣＨ２）６、ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯ、ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ、ＣＯ、ＣＯＯ、Ｐｈ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ、その組み合わせ等からなる群から選択される。最も好ましくは、Ｘは、ＣＨ２、ＣＯＮＨＣＨ２Ｐｈ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２、Ｐｈ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６及びＮＨＣＯ（ＣＨ２）２からなる群から選択される。
【００７９】
［０９５］例えば、式１及び２の各々において、Ｙ基は末端基又は末端基由来のリンカーを含んでいてもよく、常に存在する。具体例として、Ｙは、以下の末端基又はそれに由来するリンカー基：ＣＯＯＨ（カルボン酸）；ＣＯＯ；ＣＯＯ−ＮＨＳ（ＮＨＳ活性エステル）；ＮＨＳ；ＣＯＯ−ｔｅｒｔブチル；ｔｅｒｔブチル（ｔ−ブチル）；ＯＨ；Ｏ−ＮＨＳ（ＮＨＳ活性エステルリンカー）；ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３；ＣＯＯＣＨ３；ＯＣＨ２ＣＨ３；ＯＣＨ３；ＮＨ；ＮＨ２；ＮＨＣＯ（アミド）；その組み合わせ等のいずれでもよい。より好ましくは、Ｙが末端基である場合、Ｙは、ＮＨＳ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−ＮＨＳ、ＣＯＯ−ｔｅｒｔブチル、ｔｅｒｔブチル、ＯＨ、Ｏ−ＮＨＳ、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＯＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ３、又はＮＨ２からなる群から選択される。一方、Ｙがリンカーである場合、Ｙは、Ｙ１−Ｚであり、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、又はＮＨの少なくとも１つからなる群から選択され、そしてＺは巨大分子である。
【００８０】
［０９６］したがって、共役体Ｚ又は巨大分子は、担体、トレーサー、又は標識、例えばタンパク質、酵素、蛍光化合物、化学発光物質、電気化学仲介剤、粒子、レポーター基、酵素阻害剤、及び／又は核酸でもよい。具体例として、Ｚは、以下の共役基：（ａ）ＢＳＡ；（ｂ）ＫＬＨ；（ｃ）蛍光トレーサー；及び（ｄ）これらと同等のいずれでもよい。
【００８１】
［０９７］１の態様では、ラモトリジン類似体は、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＯＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯＮＨＳ、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＮＨＳ、ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯＨ、
ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯＮＨＳ、ＮＨＣＯＰｈＣＯＯＨ、ＮＨＣＯＰｈＣＯＯＮＨＳ、
ＯＯＣＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＯＣＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＣＨ３、
ＯＯＣＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＮＨＳ、ＯＯＣＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ、
ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＮＨＳ等からなる群から選択されるＬ−Ｗ−Ｘ−Ｙを有してもよい。
【００８２】
［０９８］１の態様では、ラモトリジン類似体は、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ−ＢＳＡ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＢＳＡ、ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨＣＯＰｈＣＯＯ−ＢＳＡ、ＯＯＣＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＢＳＡ、
ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＢＳＡ等からなる群から選択されるＬ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚを有してもよい。
【００８３】
［０９９］１の態様では、式１Ａ、２Ａ、及び３Ａのラモトリジン類似体は治療剤として用いることができる。つまり、ラモトリジン同様、ラモトリジン類似体を抗癲癇薬剤として用いうことができる。しかし、ラモトリジン類似体を治療剤として用いる場合、Ｚは、好ましくは、免疫原を形成しないように存在しない。したがって、ヒトを含む動物の抗癲癇治療で、ラモトリジンの非免疫原性類似体を用いることができる。
【００８４】
ＩＩ．ラモトリジン免疫原
［０１００］ラモトリジン等の小分子の検出のために免疫アッセイを実行するのは、困難な場合もある。これは、当該小分子に抗原性がない場合があるためであり、そのため、ラモトリジンに対する抗体を生成することが困難になり、そして免疫原性がないラモトリジンでは特に問題があるためである。免疫原性を高めるため、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン等を含むが、これらに限定されない、より大きい抗原性化合物を薬剤にカップリングしてもよい。さらに、免疫アッセイで薬剤を検出する場合は、一般的に、抗体、ラモトリジン、又はラモトリジン類似体に共役化された検出可能標識を用いることが必要となる。
【００８５】
［０１０１］ラモトリジン類似体の１のリンカーを介して、ラモトリジンを抗原性担体タンパク質にカップリングして、免疫原を作製することもできる。つまり、ラモトリジンに基づく免疫原もまたラモトリジン類似体と見なされる。具体例として、ベンゼン環上の５−アミノ置換がタンパク質と連結することが示され、これは、本明細書に援用されるSailstadら, Ther Drug Monitoring 13:433-442(1991)に記載されている。しかし、Salistadらが報告した免疫原から生成される抗体は、いかなる免疫アッセイ、特に自動免疫アッセイにおいて、十分でなかった。免疫原性が弱いのは、力価が低く、感度が低く、ＢＳＡの免疫原性がＫＬＨと同程度ではなく、５位のリンカーが短いことが原因でありうる。
【００８６】
［０１０２］担体タンパク質にカップリングする効率を改善する試みとして、図１０に示すように、７４Ｗ８５をＮＨＳで修飾して、単離活性化エステル誘導体５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）（例えばＬがＮＨ；ＷがＣ＝Ｏ；ＸがＣＨ２ＣＨ２；ＹがＮＨＳ活性化エステルである）にした。５−ＮＨＳ活性エステル（５）は、タンパク質内のリジン又は他のアミンと直接反応するため、担体タンパク質と効率的にカップリングできる。当該カップリングの例は、図１３Ｅの免疫原５−ＫＬＨ−７４Ｗ８６（２０）に見られうる。しかし、（２０）のリンカーは、以下により詳細に記載する２つの免疫プログラムでは、抗体相互作用に用いうるエピトープを提供するには短すぎることが示された。
【００８７】
［０１０３］免疫プログラムが成功しないため、５位に共役化されるより長いリンカー、並びに４位及び３位に共役化される様々な長さのリンカーを含む、ラモトリジンに関する新規ハプテンを徹底的に調べた。ここで、図１３Ａ〜１３Ｄは、本発明により調製される免疫原を例示し、それは以下のとおりである：（ａ）３−ラモトリジン免疫原（１８）；（ｂ）５−長鎖リンカーラモトリジン免疫原（１６）；（ｃ）５−長鎖リンカーラモトリジン免疫原（１９）；及び（ｄ）４−ラモトリジン免疫原（１７）。具体的には、５−長鎖リンカーラモトリジン免疫原（１６）及び（１９）のリンカーは極めて長く、より利用可能なエピトープを提供する。つまり、ラモトリジン部分は、抗体相互作用に極めて利用しやすく、免疫原性が高い。
【００８８】
［０１０４］１の態様では、本発明は、上記ラモトリジン類似体骨格から調製される免疫原に関する。すなわち、式２Ｂ、３Ｂ、及び４Ｂの類似体には、上記リンカー部分が含まれてもよく、Ｚは免疫原性部分等の作用基でもよい。つまり、Ｚは、免疫学的応答を誘発でき、ラモトリジン類似体の少なくとも一部を標的とする抗体の産生を提供できる、いかなる免疫原性部分であってもよい。
【００８９】
［０１０５］免疫原性部分には、免疫原性担体として機能できる、様々なタンパク質又はポリペプチドが含まれうる。これらの種類のポリペプチドとしては、アルブミン、血清タンパク質、グロブリン、眼球レンズのタンパク質、リポタンパク質、及びその一部があげられる。具体例となるタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、キーホールリンペット・ヘモシアニン（「ＫＬＨ」）、卵オボアルブミン、ウシ・ガンマ−グロブリン（「ＢＧＧ」）等があげられる。あるいは、合成ポリペプチドを利用してもよい。さらに、免疫原性部分はまた、高分子量ポリマーである多糖でもよい。多糖の例は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアゴム等の炭水化物ゴム、寒天等である。また、免疫原性部分は、ＤＮＡ又はＲＮＡ等のポリヌクレオチドでもよい。ポリヌクレオチドは修飾されても又は修飾されなくてもよく、担体及び／又は免疫原性機能を提供する限り、いかなる数の核酸で構成されてもよい。多糖はまた、ポリペプチド残基、ポリヌクレオチド残基、及び／又は脂質残基を含有又はこれらに連結できる。さらに、免疫原性部分はまた、単独の、又は上記ポリペプチド又は多糖の１つへの共役体のポリヌクレオチドでもよい。
【００９０】
［０１０６］免疫原性部分又は担体はまた粒子又は微粒子でもよい。免疫原性粒子は、一般的に、少なくとも直径約０．０２ミクロン（μｍ）で、約１００μｍ以下であり、通常、直径約０．０５μｍ〜１０μｍである。粒子は、有機又は無機、膨潤性又は非膨潤性、及び／又は多孔又は無孔でもよい。場合により、免疫原性粒子は、水に近い密度、一般的に約０．５〜１．５ｇ／ｍｌであり、透明、部分的透明、又は不透明であってもよい物質で構成される。免疫原性粒子は、赤血球、白血球、リンパ球、連鎖球菌属（Streptococcus）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、大腸菌（E. coli）及びウイルス等を含むがこれらに限定されない、細胞及び微生物等の生物学的物質でもよい。粒子はまた、有機及び無機ポリマー、リポソーム、ラテックス、リン脂質小胞、リポソーム、陽イオン性リポソーム、陰イオン性リポソーム、リポタンパク質、リポポリマー等で構成されうる。
【００９１】
［０１０７］１の態様では、ラモトリジン類似体は、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ−ＫＬＨ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＫＬＨ、ＮＨＣＨ２ＰｈＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨＣＯＰｈＣＯＯ−ＫＬＨ、ＯＯＣＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＫＬＨ、
ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯ−ＫＬＨ等からなる群から選択される、Ｌ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚを有することができる。
【００９２】
［０１０８］したがって、本発明により調製された免疫原を用いて、ラモトリジン並びにラモトリジン類似体に対する親和性がある抗体を生成することができる。
【００９３】
ＩＩＩ．ラモトリジン及びラモトリジン類似体に対する抗体
［０１０９］１の態様では、本発明のラモトリジン類似体に基づく免疫原を、モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を産生するための方法の態様において用いることができる。つまり、ラモトリジンに基づく免疫原から、ラモトリジンと相互作用及び／又は結合する抗体を産生できる。これにより、本発明の類似体が、ラモトリジンの存在を同定するの免疫アッセイで用いるの抗体を調製する場合に有用となることができる。また、免疫原を用いて抗体を産生する方法が当該技術分野に周知である。これにより、ラモトリジンと相互作用及び／又は結合するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体をスクリーニングする場合に、本免疫原を用いることができる。
【００９４】
［０１１０］さらに、抗体を回収する周知の技術により、血清を獲得し、プロセシング及び／又は精製することができる。つまり、ラモトリジン及びラモトリジン類似体と相互作用及び／又は結合するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を得ることもできる。これにより、ラモトリジンを認識し、そして免疫診断アッセイに用いる抗体を調製する場合に、ラモトリジン免疫原を用いることができる。
【００９５】
［０１１１］図１は、抗ラモトリジン抗体を得る方法の１の態様１０を例示する流れ図であり、ラモトリジン類似体に基づく免疫原を得ることができる（ブロック１２）。その後、免疫原を免疫原性配合物と合わせてもよい（ブロック１４）。簡潔には、約０．５の免疫原組成物を約０．５ｍｌのフロイント完全アジュバントと混合する；が、他の量の免疫原及び／又はアジュバントを用いてもよい。その後、抗体を産生する被験体に免疫原性配合物を投与してもよく（ブロック１６）、被験体は、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、鳥類及び／又は他の動物でもよいが、好ましくは哺乳動物である。投与は、尾静脈注射、皮下注射、静脈内注射、又は他の周知の注射部位を介してよい。続いて、最初の投与を受けた動物に、免疫原性追加免疫を投与してもよく（ブロック１８）、追加免疫は、最初の配合物と実質的に同一成分を含んでもよく、所定の間隔で投与できる。例えば、最初の投与後、週１回、あるいは他のそれより長いか又は短い間隔で、その後追加免疫を行うことができる。少なくとも最初の投与後、そして場合によりその後の追加免疫後、動物により産生される抗ラモトリジン抗体を回収することができる（ブロック２０）。以前免疫原を投与された動物由来の血液、血清、血漿、又は他の生物学的試料を得て、抗体を回収できる。場合により、その後、当該技術分野に周知であるように、抗体含有組成物をプロセシングしてもよく（ブロック２２）、当該プロセシングには、抗体を、免疫診断アッセイを行うのに適した形式にする技術も含まれうる。あるいは、プロセシングには、周知の技術及び確立された技術による、ＥＬＩＳＡを用いた抗体のスクリーニングが含まれうる。つまり、プロセシングを用いて、ポリクローナル抗体を得ることができ（ブロック２４）、これによりポリクローナル抗体を精製することができる（ブロック２６）。あるいは、当該技術分野に周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を得ることもでき、これによりモノクローナル抗体を精製することもできる。
【００９６】
ＩＶ．免疫診断アッセイ
［０１１２］血液、血漿、血清、組織等の試料中のラモトリジンの存在を同定するため、モノクローナルか又はポリクローナルの抗ラモトリジン抗体を、免疫アッセイで用いることができる。これは、患者又は患者集団におけるラモトリジンの薬物動態学的及び／又は薬力学的パラメーターを同定又はアクセスするのに有益でありうる。したがって、ラモトリジンの存在を同定し、そして場合によりラモトリジン量を定量化するためのアッセイを構成できるように、免疫診断アッセイにおいて、他の抗体の代わりに、抗ラモトリジン抗体を用いてもよい。さらに、免疫診断アッセイは、本発明のラモトリジン類似体又は他のラモトリジン類似体を用いてもよい。
【００９７】
Ａ．ラモトリジンに関する蛍光偏光免疫アッセイ
［０１１３］蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）技術は、試料中の抗原／薬剤と既知の濃度の標識抗原／薬剤との競合的結合に基づく。ＦＰＩＡ技術は、本明細書に援用される米国特許第４，５９３，０８９号、第４，４９２，７６２号、第４，６６８，６４０号、及び第４，７５１，１９０号に記載がある。したがって、援用される参考文献に記載されるＦＰＩＡ試薬、系、及び装置を、抗ラモトリジン類似体抗体でもある抗ラモトリジン抗体とともに用いることができる。
【００９８】
［０１１４］ラモトリジンの存在を同定するため、及び試料中のラモトリジン量を定量化するアッセイで、ＦＰＩＡ技術を用いることができる。部分的に、溶液中の分子の回転特性により、偏光の程度が分子の大きさに正比例させることができるようになる。したがって、偏光は、分子の大きさが大きくなるにつれて高まる。すなわち、溶液中で迅速に回転する小さい蛍光標識又は他の発光標識ラモトリジン又はその類似体を、直線偏光を用いて励起すると、放出される光の偏光は有意に解消される。蛍光標識ラモトリジン又は類似体が、抗体と相互作用するか又は抗体に結合すると、回転が遅くなり、放出される光の偏光が高まる。これは、抗体が有意に測定できる程度に複合体を大きくするためである。また、試料中の非標識ラモトリジン量を増やすと、その結果、抗ラモトリジン抗体による蛍光標識ラモトリジン又は類似体の結合が低下して、試料から放出される光の偏光が低下する。既知の濃度のラモトリジンを用いて、較正の偏光値を測定することにより、偏光と試料中の非標識ラモトリジンの濃度との定量的関係を確立することができる。したがって、ＦＰＩＡを用いて、試料中のラモトリジンの存在及び濃度を同定することができる。
【００９９】
［０１１５］本発明の１の態様はＦＰＩＡアッセイ系である。ＦＰＩＡ系の構成要素の例としては、以下があげられる：ｉ）ラモトリジン及びラモトリジン類似体へ結合できるモノクローナル又はポリクローナルな抗ラモトリジン抗体；ｉｉ）ラモトリジンを含有すると推測される試料；及びｉｉｉ）フルオレセイン等の蛍光部分で標識されたラモトリジン類似体である。あるいは、試料を除いたキットとして系を提供することができる。さらに、系は、様々な緩衝剤組成物、ラモトリジン濃度勾配組成物又はラモトリジンのストック組成物等を含んでもよい。
【０１００】
［０１１６］図２は、ＦＰＩＡアッセイを行う方法の１の態様１１０を例示する流れ図である。つまり、発光標識ラモトリジン又は類似体共役体を得ることができ（ブロック１１２）、抗ラモトリジン抗体を得ることもできる（ブロック１１４）。さらに、ラモトリジンを投与された患者由来の、ラモトリジンを含有すると推測される生物学的試料等の試料を得ることもできる（ブロック１１６）。競合的結合アッセイに用いるため、既知量又は濃度の発光標識ラモトリジン共役体及び抗ラモトリジン抗体を得て、そして標準的緩衝剤系中等で、別の組成物中に配合することもできる（ブロック１１８）。その後、反応溶液中で、抗ラモトリジン抗体及び発光標識ラモトリジン共役体を生物学的試料と合わせる（ブロック１２０）。発光標識ラモトリジン共役体と生物学的試料中の未知の量のラモトリジンとの間で、反応溶液中の抗ラモトリジン抗体との競合反応が生じる（ブロック１２２）。適切な期間及び／又は競合後、発光共役体に照射するが（ブロック１２４）、これは光照射、化学薬品照射、温度照射等によってもよい。その後、照射により放出される光の偏光を測定し（ブロック１２６）、そして既知量のラモトリジン及び／又は発光共役体の偏光値と比較し（ブロック１２８）、これを用いて、試料中にラモトリジンが存在するか否かを決定することができる（ブロック１３０）。さらに、既知の濃度の標準から得た標準化測定値と生物学的試料から得た測定値の比較を用いて、試料中のラモトリジン量を定量化することができ（ブロック１３２）、それにより、患者におけるラモトリジン量を同定することができる（ブロック１３４）。
【０１０１】
Ｂ．ラモトリジンに関する均一系微粒子免疫アッセイ
［０１１７］免疫比濁アッセイという、均一系微粒子免疫アッセイ（「ＨＭＩ」）技術は、溶液中の粒子及び化合物の凝集に基づく。粒子及び／又は化学的化合物が凝集すると、粒子の大きさが増して溶液の濁度が高まる。したがって、試料中のラモトリジンの存在、及び場合により量を評価するため、微粒子及びラモトリジン類似体と共に抗ラモトリジン抗体を用いることができる。免疫アッセイは血液、溶血溶液、血清、血漿、組織、及び／又は他の試料で行うことができるため、ＨＭＩ技術は好適でありうる。微粒子上に装填されたラモトリジン及び／又は類似体を用いるか、あるいは微粒子上に装填された抗ラモトリジン抗体を用いて行うように、ＨＭＩアッセイを設定することもできる。微粒子に効率的に装填できるため、微粒子上に装填された類似体を用いることが特に好適でありうる。いずれにしても、ＨＭＩ又は免疫比濁アッセイは試料中の物質の凝集を測定するものとして、当該技術分野に周知である。
【０１０２】
［０１１８］免疫比濁アッセイ技術は、参照により本明細書に含まれる、米国特許第５，５７１，７２８号、第４，８４７，２０９号、第６，５１４，７７０号、第６，２４８，５９７号に記載される。簡潔には、均一系アッセイ法では、主に光減衰、ネフェロメトリー法、又は比濁法を用いる。試料内に導かれた入射光線の分散又は吸収で生じる変化により、ラモトリジン（Ａ）及び抗ラモトリジン抗体微粒子結合パートナー（Ｂ）からの凝集化合物ＡＢの形成を測定することができる。あるいは、抗ラモトリジン抗体（Ａ）を、微粒子に装填されたラモトリジン又は類似体と結合させることもできる。結合パートナーが固定された懸濁可能な粒子を用いると、効果が増進され、これによりかなり低濃度でもラモトリジン濃度を測定することができる。これらの均一系法は、迅速かつ簡易に実行でき、そして特に、以下により詳細に記載するような試料分析自動化が可能になる。
【０１０３】
［０１１９］例えば、大量スクリーニング用途では、分析法は完全に自動化されていることが望ましい。つまり、分析物との特異的反応の結果、増感されたラテックス粒子等の粒子による光散乱の変化を検出する装置を設計することができる。当該装置を利用するアッセイは、ラテックス粒子懸濁物の表面積が広く及び光散乱の物理的原理のため、高感度になりうる。検出の主な原理としては、２以上の粒子が凝集中に緊密に接触するようになる際の光散乱変化があげられる。光線が非凝集粒子を含有する反応セルを通過する際、粒子による屈折、反射、吸収、及び回折のため、ある程度の光散乱がありうる。したがって、この原理は、ラモトリジン等の標的分析物の粒子凝集の阻害能を測定するために有益でありうる。抗体／抗原結合の初期段階中、複合体が形成され始める際に、これらの複合体は、より大きい粒子のように作用するため、散乱光強度の角度分布を実質的に改変することができる。以下により詳細に記載するような比濁検出及び他の方法により、凝集により、より大きい粒子が生成した結果の光散乱変化を測定することができる。SeradynのラモトリジンＱＭＳ（登録商標）試薬は、完全な自動化を可能にし、多くの臨床的化学反応分析装置に適用できる。
【０１０４】
［０１２０］図３は、ラモトリジン等の遊離薬剤を有する生物学的試料、及びラモトリジン類似体でもよいハプテンをコーティングした粒子試薬と、抗体緩衝液を合わせる競合アッセイの図解である。生物学的試料がほとんど又は全くラモトリジンを含有しない場合、凝集は阻害されない。試料中のラモトリジン量が増加しても、部分的な凝集しかおこらず、部分的にしか阻害されない。さらに、試料中に多量のラモトリジンがあれば、凝集の完全阻害が起こりうる。したがって、凝集の分析を用いて、ラモトリジンの存在を同定することができる。また、図４に示すようなラモトリジン濃度の標準化曲線を用いて、凝集からの吸光度変化に基づき、試料中のラモトリジン量を同定することができる。
【０１０５】
ｉ．ラモトリジンが装填された微粒子
［０１２１］図５は、ＨＭＩアッセイを行う方法の１の態様２１０を例示する流れ図である。これによれば、ラモトリジン類似体を得て（ブロック２１２）、微粒子上に装填してもよく（ブロック２１４）、微粒子は例えば、Seradyn, Inc.（インディアナ州インディアナポリス）により製造及び／又は販売されるもので、ポリスチレン、カルボキシレートで修飾されたポリスチレン、ストレプトアビジンをコーティングした磁気粒子等が含まれてもよい。ラモトリジンを投与された患者由来で、ラモトリジンを含有すると推測される生物学的試料等の試料を得ることもできる（ブロック２１６）。本発明により、ラモトリジン及びラモトリジン類似体に特異的に結合できるモノクローナル又はポリクローナル等の抗ラモトリジン抗体を得た（ブロック２１８）後、場合により、標準的緩衝剤系に配合する（ブロック２２０）。その後、抗体組成物をラモトリジン微粒子及び生物学的試料と合わせ（ブロック２２２）るが、抗体及び微粒子に結合したラモトリジン類似体の量は既知である。微粒子上に固定されたラモトリジン類似体と生物学的試料中のラモトリジンとの間で、反応溶液中の限定量の抗ラモトリジン抗体への結合に関して、競合反応が起こる（ブロック２２４）。ラモトリジンが装填された微粒子の抗体での凝集は、生物学的試料中のラモトリジンの存在により阻害されるが、凝集阻害は生物学的試料中のラモトリジン濃度に正比例する。これにより、周知の比濁アッセイで、試料中のラモトリジンの存在を測定できるようになる（ブロック２２６）。さらに、既知の濃度の標準から得た標準化測定値と生物学的試料から得た測定値との比較を用いて、試料中のラモトリジン量を定量化して（ブロック２２８）、患者のラモトリジン量を同定することもできる（ブロック２３０）。
【０１０６】
［０１２２］本発明の１の態様はラモトリジンが装填された微粒子のＨＭＩアッセイ系である。ＨＭＩ系の構成要素の例としては以下があげられる：ｉ）ラモトリジン及びラモトリジン類似体に結合できるモノクローナル又はポリクローナル抗ラモトリジン抗体；ｉｉ）ラモトリジンを含有すると推測される試料；及びｉｉｉ）ポリスチレン微粒子等の微粒子にカップリングしたラモトリジン類似体。あるいは、試料を含まないキットとして系を提供することもできる。さらに、系には、様々な緩衝剤組成物、ラモトリジン濃度勾配組成物又はラモトリジンのストック組成物等を含んでもよい。
【０１０７】
ｉｉ．抗ラモトリジン装填微粒子
［０１２３］ラモトリジンが装填された微粒子に関して、上記と類似の他の態様では、ラモトリジン及びラモトリジン類似体に結合できる抗ラモトリジン抗体を微粒子上に装填する。ラモトリジン類似体には、選択した作用基、例えばウシ血清アルブミン、オボアルブミン、デキストラン等を含んでもよい。ラモトリジン類似体と患者試料中のラモトリジンとの間で、微粒子上に固定された抗ラモトリジン抗体への結合に関して競合反応が起こる。ここでも、患者試料中に薬剤があると粒子の凝集は阻害される。
【０１０８】
［０１２４］図６は、ＨＭＩアッセイを行う方法の他の態様３１０を例示する流れ図である。これにより、ラモトリジン及びラモトリジン類似体に特異的に結合できる抗ラモトリジン抗体を得て（ブロック３１２）、微粒子上に装填することができる（ブロック３１４）。ラモトリジンを投与された患者由来で、ラモトリジンを含有すると推測される生物学的試料等の試料を得ることもできる（ブロック３１６）。適切な作用基を含むラモトリジン類似体を得ることができる（ブロック３１８）。競合的結合アッセイで用いるために、既知量又は濃度のラモトリジン類似体及び抗ラモトリジン抗体が装填された微粒子を標準的緩衝剤系等の他の組成物中に配合する（ブロック３２０）。その後、抗体−微粒子組成物を、ラモトリジン類似体組成物及び生物学的試料と合わせる（ブロック３２２）。反応溶液中、ラモトリジン類似体と生物学的試料中のラモトリジンとの間で、微粒子上に固定された抗ラモトリジン抗体との競合反応が起こる（ブロック３２４）。生物学的試料中のラモトリジンが存在すると、抗ラモトリジン抗体が装填された微粒子のラモトリジン類似体の凝集は阻害され、この凝集阻害は、生物学的試料中のラモトリジン濃度に正比例する。これにより、周知の比濁アッセイで試料中のラモトリジンの存在を測定できるようになる（ブロック３２６）。さらに、既知の濃度の標準から得た標準化測定値と生物学的試料から得た測定値との比較を用いて、試料中のラモトリジン量を定量化することにより（ブロック３２８）、患者のラモトリジン量を同定することもできる（ブロック３３０）。
【０１０９】
［０１２５］本発明の１の態様は、抗ラモトリジン抗体が装填された微粒子のＨＭＩアッセイ系である。ＨＭＩ系の構成要素の例としては、以下があげられる：ｉ）ラモトリジン及びラモトリジン類似体に結合できるモノクローナル又はポリクローナル抗ラモトリジン抗体が装填された微粒子；ｉｉ）ラモトリジンを含有すると推測される試料；及びｉｉｉ）場合により巨大分子又は他の担体を含みうるラモトリジン類似体。あるいは、試料を除いたアッセイ系を提供することもでき、試料を後で、又は他の供給源から提供することもできる。さらに、アッセイ系には、様々な緩衝剤組成物、ラモトリジン濃度勾配組成物、あるいはラモトリジン又は類似体のストック組成物等が含まれてもよい。
【０１１０】
Ｃ．ラモトリジンのクローニング酵素供与体免疫アッセイ
［０１２６］クローニング酵素供与体免疫アッセイ（「ＣＥＤＩＡ（登録商標）」、Roche Diagnosticsの商標）は、治療薬の存在を同定し、定量的測定を行うための非常に正確でそして有効な方法であることが立証されている。ＣＥＤＩＡ（登録商標）技術は、以下の特許に詳細に記載されている：（ａ）競合的均一系アッセイ法を開示する米国特許第４，７０８，９２９号；（ｂ）酵素供与体断片をコードする組換えＤＮＡ配列及び当該ベクターの宿主を開示する米国特許第５，１２０，６５３号；（ｃ）酵素供与体断片のアミノ酸配列を開示する米国特許第５，６０４，０９１号；及び（ｄ）ＣＥＤＩＡアッセイ用のキットを解説する米国特許第５，６４３，７３４号、ここで上記特許はすべて本明細書に援用される。簡潔には、ＣＥＤＩＡ（登録商標）技術は、ラモトリジンに特異的に結合できる抗体への結合に関する、大腸菌由来のβ−Ｄ−ガラクトシド・ガラクトヒドロラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ（「βｇａｌ」）由来等の、遺伝子操作された不活性酵素−供与体（「ＥＤ」）断片に共役化された類似体と、生物学的試料中のラモトリジンの競合に基づく。ラモトリジンが試料中に存在する場合、ラモトリジンが抗体に結合して、ＥＤ−類似体共役体のＥＤ部分が自由になり、酵素受容体（「ＥＡ」）断片と会合できるようになるため、反応混合物中でβ−Ｄ−ガラクトシド・ガラクトヒドロラーゼ又はβｇａｌの酵素活性が回復する。その後、適当な基質に曝露されると、活性酵素を定量化できる反応産物を生じることができるようになる。好ましい基質はクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（「ＣＰＲＧ」）であり、ＥＤ及びＥＡ断片を有する活性酵素に切断されて、ガラクトース及びＣＰＲになることができ、約５７０ｎｍの波長の吸光度でＣＰＲを測定する。ラモトリジンが試料中に存在しない場合、抗体は、ＥＤ−類似体共役体に結合して、ＥＤ断片とＥＡ断片の会合を阻害して酵素活性の回復を阻害する。反応産物の量及び生じる吸光度変化は試料中のラモトリジン量に比例する。
【０１１１】
［０１２７］図７は、ＣＥＤＩＡ（登録商標）アッセイを行う方法の１の態様４１０を例示する流れ図である。これにより、ラモトリジン−ＥＤ共役体を得ることができるが（ブロック４１２）、ラモトリジン類似体とＥＤを共役化しても得ることができる。また、ＥＤと対応するＥＡを得ることができる（ブロック４１４）。さらに、ラモトリジンを投与した患者由来の、ラモトリジンを含有すると推測される生物学的試料等の試料を得ることもできる（ブロック４１６）。本明発明記載の方法により、ラモトリジン−ＥＤ共役体とも相互作用できる抗ラモトリジン抗体を得ることができる（ブロック４１８）。競合的結合アッセイで用いるため、既知量又は濃度のラモトリジン−ＥＤ共役体、ＥＡ及び抗ラモトリジン抗体を得て、標準的緩衝剤系等の他の組成物中に配合する（ブロック４２０）。その後、反応溶液中で、ラモトリジン−ＥＤ共役体及び抗体を生物学的試料と合わせる（ブロック４２２）。場合により、この時点又は抗体との競合的相互作用が起きるのに十分な時間の経過後、反応溶液中でＥＡもまた合わせる。ラモトリジン−ＥＤ共役体と生物学的試料中のラモトリジンとの間で、反応溶液中の抗ラモトリジン抗体との競合反応が起こる（ブロック４２４）。競合反応後にＥＡを反応溶液中に導入した後、ＥＤ−ＥＡ酵素を切断することのできる基質を反応溶液中に導入する（ブロック４２６）。ＥＤ−ＥＡ酵素と酵素を切断することのできる基質との間の酵素活性を測定するが（ブロック４２８）、切断産物の吸光度を測定するか又は他の周知の測定技術で測定することもできる。酵素活性の測定を用いて、試料中にラモトリジンが存在するか否かを決定することもできる（ブロック４３０）。さらに、既知の濃度の標準から得た標準化測定値と生物学的試料から得た測定値の比較を用いて、試料中のラモトリジン量を定量化することもでき（ブロック４３２）、それにより、患者のラモトリジン量を同定することもできる（ブロック４３４）。
【０１１２】
［０１２８］本発明の１の態様はＣＥＤＩＡ（登録商標）アッセイ系である。ＣＥＤＩＡ（登録商標）系の構成要素の例としては以下があげられる：ｉ）ラモトリジン、ラモトリジン類似体及び／又はラモトリジン−ＥＤ又はラモトリジン−ＥＡに結合できるモノクローナル又はポリクローナル抗ラモトリジン抗体；ｉｉ）ラモトリジンを含有すると推測される試料；ｉｉｉ）ＥＤ又はＥＡにカップリングしたラモトリジン類似体；並びにｉｖ）ＥＤ及びＥＡが系に存在するように、酵素活性を回復するためにラモトリジン−ＥＤ又はラモトリジン−ＥＡと会合するような、ＥＤ又はＥＡの一方。また、試料を除いてキットとしてアッセイ系を提供することもできる。さらに、アッセイ系は、様々な緩衝剤組成物、ラモトリジン濃度勾配組成物又はラモトリジンのストック組成物等を含んでもよい。
【０１１３】
Ｄ．ラモトリジンの化学発光不均一系免疫アッセイ
［０１２９］また、化学発光微粒子免疫アッセイ（「ＣＭＩＡ」）技術を用いた競合的アッセイを用いて試料中にラモトリジンが存在するか否かを評価することもできる。不均一系免疫アッセイの技術分野で、試料中の化学物質の存在及び／又は量を決定するための様々な種類のＣＭＩＡ技術が周知であり、ＣＭＩＡ技術のいくつかは、本明細書に援用される、米国特許第６，４４８，０９１号、第５，７９８，０８３号、及び第５，８３４，２０６号に例示される。当該ＣＭＩＡアッセイには、特定の磁気粒子、又はろ過、沈降、及び／又は他の手段による分離に適した粒子等の粒子にカップリングした、ラモトリジン及びその類似体に特異的に結合できる抗ラモトリジン抗体を用いることを含む。さらに、適当な化学発光部分、例えばアクリジニウムエステルに連結されたラモトリジン類似体を含んでもよいトレーサーを用いて、粒子上の限定される量の抗ラモトリジン抗体に関して、患者試料中の遊離ラモトリジンと競合させることもできる。試料、トレーサー、及び抗体粒子が相互作用し、ルーチンの洗浄工程により未結合トレーサーを除去した後、抗体粒子に結合したトレーサーの量を、相対光単位（ＲＵＬＥ）で表される化学発光で測定することもできる。化学発光の量は、患者試料中の遊離薬剤の量に反比例し、既知の値の薬剤を用いた標準曲線を構築して、濃度を決定する。
【０１１４】
［０１３０］図８は、ＣＭＩＡアッセイを行う方法の１の態様５１０を例示する流れ図である。これによれば、抗ラモトリジン抗体−粒子共役体を得ることができ（ブロック５１２）、これは、磁気粒子等の粒子と抗体をカップリングすることにより実行される。また、化学発光部分を有するラモトリジン類似体を含むトレーサー化合物を得ることができる（ブロック５１４）。さらに、ラモトリジンを投与された患者由来で、ラモトリジンを含有すると推測される生物学的試料等の試料を得ることもできる（ブロック５１６）。競合的結合アッセイで用いるために、既知量又は濃度のトレーサー及び抗ラモトリジン抗体−粒子共役体を、標準的緩衝剤系等の他の組成物中に配合することもできる（ブロック５１８）。その後、反応溶液中で抗ラモトリジン抗体−粒子共役体及びトレーサーを生物学的試料と合わせる（ブロック５２０）。反応溶液中、トレーサーと生物学的試料中のラモトリジンとの間で、抗ラモトリジン抗体−粒子共役体との競合反応が起こる（ブロック５２２）。十分な期間及び／又は結合競合の後、抗体−粒子共役体を反応溶液から分離する（ブロック５２４）。場合により、洗浄又は他の分離技術により、抗体−粒子共役体から未結合ラモトリジン及び／又はトレーサーを除去することができる（ブロック５２６）。化学発光部分が、リン光、蛍光、又は測定できる他の発光による光を放出するようにトレーサーを励起して化学発光量を決定することができる（ブロック５２８）。しばしば、化学発光は、ＲＬＵで測定される蛍光である。化学発光の測定を用いて、ラモトリジンが試料中に存在するか否かを決定することもできる（ブロック５３０）。さらに、既知の濃度の標準から得た標準化測定値と生物学的試料から得た測定値との比較を用いて、試料中のラモトリジン量を定量化し（ブロック５３２）、それから患者のラモトリジン量を同定することもできる（ブロック５３４）。
【０１１５】
［０１３１］本発明の１の態様はＣＭＩＡアッセイ系である。ＣＭＩＡ系の構成要素の例としては以下があげられる：ｉ）ラモトリジン及びラモトリジン類似体に結合できるモノクローナル又はポリクローナル抗ラモトリジン抗体が装填された粒子又は微粒子；ｉｉ）ラモトリジンを含有すると推測される試料；及びｉｉｉ）類似体トレーサー。または、試料を除いてキットとしてアッセイ系を提供することもできる。さらに、系には、様々な緩衝剤組成物、ラモトリジン濃度勾配組成物、あるいはラモトリジン又は類似体のストック組成物等が含まれてもよい。
【０１１６】
Ｅ．ラモトリジンの他の免疫アッセイ
［０１３２］本明細書記載のラモトリジン類似体、共役体、抗体、免疫原及び／又は他の共役体はまた、酵素又は蛍光を含むがこれらに限定されないある範囲の検出系を用いた、いくつかの他の不均一系免疫アッセイ、及び／又は迅速側方流動アッセイを含むがこれらに限定されない均一系免疫アッセイ、及び抗体アレイ、並びに未だに開発されていない形式のいずれにも適している。
【０１１７】
［０１３３］ラモトリジン類似体、共役体、抗体、免疫原及び／又はトレーサーを利用する、様々な免疫診断アッセイを本明細書に記載しているが、当該技術分野で周知のように、当該アッセイを修飾することもできる。つまり、本発明の範囲内で当該免疫アッセイを行うための工程又は行為に様々な修飾を施すこともできる。
【０１１８】
実施例
［０１３４］以下の実施例は、予防の態様を例示するために提供され、限定することを意図するものではない。したがって、ある例は実験を介して行われ、そしてあるものは当該技術分野に周知の技術、標準、及び結果に基づく予測である。また、本発明には、実施例に例示されない他の態様が含まれることが明らかであるべきである。さらに、本発明により調製されるラモトリジン類似体、抗原、免疫原、及び抗ラモトリジン抗体を用いて、当該技術分野で周知の実験プロトコルを用いて多くの例が実行されている。したがって、こうした例は、すべて本明細書に援用される、以下の参考文献により補完される：（ａ）Caryl Griffinら, Microparticle Reagent Optimization: A Laboratory Reference Manual from the Authority on Microparticles, Seradyn(1994)；及び（ｂ）Boehringer Mannheim Corporation Technical Publications Department, Hitachi Operation Manual: Version B, Boehringer Mannheim Corporation Laboratory Diagnostic Division(1992)；及び（ｃ）ＮＣＣＬＳ認可指針、２００４年８月。
【実施例１】
【０１１９】
［０１３５］図９は、ラモトリジン（１）を５−中間体及び５−スクシニルアミノラモトリジン誘導体（「７４Ｗ８６」）（４）に変換する化学反応の模式図で、さらに本発明の様々なラモトリジン類似体に合成することができる。これによれば、ラモトリジン（１）を硝酸及び硫酸の混合物で処理し、５−ニトロラモトリジン類似体（２）を形成する。その後、５−ニトロラモトリジン類似体（２）を単離し、水素及びＰｄ触媒で還元し、生じる５−アミノラモトリジン類似体（３）を形成し、これを無水コハク酸でアシル化して、ラモトリジンの５−スクシニルアミノ誘導体（「７４Ｗ８６」）（４）を形成する。その後、ラモトリジンの５−スクシニルアミノ誘導体（「７４Ｗ８６」）（４）を精製する。
【実施例２】
【０１２０】
［０１３６］図１０は、担体タンパク質等にカップリングする効率を改善するため、７４Ｗ８６（４）をＮＨＳ−活性エステル型に変換する化学反応の模式図である。これによれば、実施例１記載の化学反応を介して得た７４Ｗ８６（４）をＮＨＳで修飾して、５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）であるラモトリジンの活性化エステル誘導体を得る。活性エステル５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）は、タンパク質内のリジンのアミン、及び他のアミン基と直接反応するため、担体タンパク質又は他の部分に効率的にカップリングできる。また、５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）を、担体タンパク質に既に共役化されている連結基にカップリングしてもよく、リンカーには、アミド連結基を形成するアミン基が含まれる。
【０１２１】
［０１３７］具体的には、２５ｍｌの無水ＤＭＦ中の７４５ｍｇの７４Ｗ８６（４）の溶液を０℃に冷却し、０．７ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加して反応混合物を形成する。７８５ｍｇのＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートを添加して反応混合物を反応させる。反応混合物を室温まで加温して一晩攪拌する。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶出剤として酢酸エチル／メタノールを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製して、およそ５００ｍｇの活性エステル誘導体５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）を得る。
【実施例３】
【０１２２】
［０１３８］続いて図１０を参照して、実施例２の化学反応を介して得られる５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）ラモトリジン類似体を連結基と共役化する。より具体的には、５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）類似体をエチレンジアミン等のアルキルジアミンと反応させて、ラモトリジン類似体５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）を産生させる。３ｍｌの無水ＤＭＦ中の３００ｍｇの５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）の溶液に、０．５ｍｌのエチレンジアミンを添加して反応混合物を形成して反応を行う。反応混合物を室温で一晩攪拌して減圧下で乾燥するまで濃縮する。溶出剤としてメタノール／水酸化アンモニウムを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで乾燥残渣を精製して、およそ２００ｍｇのラモトリジン類似体５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）を得る。他の連結基との共役化のため、５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）を活性化するか、又は他の分子上のカルボキシル基と直接反応させることもできる。
【実施例４】
【０１２３】
［０１３９］続いて図１０を参照して、実施例３の化学反応を介して得られる５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）ラモトリジン類似体を連結基とさらに共役化する。より具体的には、無水コハク酸と反応させて、５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）をアシル化し、５−ラモトリジン類似体（７）を形成する。５ｍｌの無水ＤＭＦ中の７５ｍｇのラモトリジン誘導体（６）の懸濁物に、約０．２ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加して反応混合物を形成して、反応を行う。反応混合物を５分間攪拌した後、８３ｍｇの無水コハク酸を添加する。反応混合物を２時間攪拌して減圧下で乾燥するまで濃縮する。溶出剤としてメタノール／酢酸エチルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで乾燥残渣を精製して、およそ２００ｍｇの５−ラモトリジン類似体（７）を得る。
【実施例５】
【０１２４】
［０１４０］続いて図１０を参照して、実施例３の化学反応を介して得られる５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）ラモトリジン類似体を連結基とさらに共役化する。より具体的には、スベリン酸ジスクシンイミジル（「ＤＳＳ」）と反応させて５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）をアシル化し、５−ラモトリジン類似体（８）を形成する。６ｍｌのＤＭＦ中の２ｇのＤＳＳの溶液に、約０．２ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加して、氷槽中で冷却した後、１５ｍｌの無水ＤＭＦ中の３２７ｍｇの５−エチレンジアミン７４Ｗ８６（６）の懸濁物を添加して反応混合物を形成して反応を行う。反応混合物を４時間攪拌して減圧下で乾燥するまで濃縮する。溶出剤としてメタノール／酢酸エチルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製して、およそ３５０ｍｇの５−ラモトリジン類似体（８）を得る。
【実施例６】
【０１２５】
［０１４１］続いて図１０を参照して、５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）ラモトリジン類似体を連結基とさらに共役化する。これによれば、磁気スターラーを含む丸底フラスコ中で、約５９ｍｇの５−ＮＨＳ−７４Ｗ８６（５）及び４０ｍｇのメチル４−アミノメチルベンゾエート塩酸を合わせる。約２ｍｌの無水ＤＭＦ及び０．１ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンをフラスコに添加して６０℃の油槽中、Ａｒ下で攪拌する。２４時間後反応を停止する。減圧下で揮発物を蒸発させて溶出剤として酢酸エチル／メタノールを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製して、２０ｍｇのラモトリジン類似体（９）を得る。
【実施例７】
【０１２６】
［０１４２］（実施例７）
［０１４３］図１１は、ラモトリジンを４−中間体及び４−スクシニルアミノラモトリジンに変換するための化学反応の模式図である。これによれば、ラモトリジンを硝酸及び硫酸の混合物で処理して４−ニトロラモトリジン（１０）を形成する。４−ニトロラモトリジン（１０）中間体を単離してＰｄ触媒を介して水素で還元し、４−アミノラモトリジン（１１）中間体を形成した後無水コハク酸でアシル化し、４−スクシニルアミノラモトリジン（１２）類似体を形成する。４−スクシニルアミノラモトリジン（１２）類似体を精製後、本発明の類似体及び共役体を形成するため、リンカー基又は担体部分とさらに反応させてもよい。
【実施例８】
【０１２７】
［０１４４］続いて図１１を参照して、４−スクシニルアミノラモトリジン（１２）類似体をＮＨＳと反応させて４−ＮＨＳ−スクシニルアミノラモトリジン（１３）類似体等の活性化エステルを形成する。これによれば、４−スクシニルアミノラモトリジン（１２）類似体を、実施例２と実質的に類似の反応条件下でＮＨＳと反応させる。その後、４−ＮＨＳ−スクシニルアミノラモトリジン（１３）類似体を精製する。
【実施例９】
【０１２８】
［０１４５］図１２は、ラモトリジンを３−中間体及び３−スクシニルラモトリジン（１４）に変換する化学反応の模式図である。これによれば、約１．０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、３０ｍｌの無水ＤＭＦ中の２ｇのラモトリジンの溶液に添加する。混合物を５分間攪拌した後、６００ｍｇの無水コハク酸を添加して反応混合物を形成する。反応混合物を一晩攪拌して減圧下で乾燥するまで濃縮する。溶出剤としてメタノール／水酸化アンモニウムを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで乾燥残渣を精製して、以下ＬがＮＨである式４Ａで特定される、およそ１ｇの３−スクシニルラモトリジン（１４）を得る。
【実施例１０】
【０１２９】
［０１４６］続いて図１２を参照して、３−スクシニルラモトリジン（１４）を活性エステルに修飾する。これによれば、２０ｍｌの無水ＤＭＦ中の４００ｍｇの３−スクシニルラモトリジン（１４）の溶液を０℃に冷却して、０．３ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加して反応混合物を形成する。その後、約４５０ｍｇのＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートを反応混合物に添加する。反応混合物を室温に加温して４時間攪拌する。その後、反応混合物を濃縮し、減圧下で乾燥残渣を得て、溶出剤として酢酸エチル／メタノールを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで乾燥残渣を精製し、およそ２３５ｍｇの３−ＮＨＳ−スクシニルラモトリジン（１４）を得る。
【実施例１１】
【０１３０】
［０１４７］図１３Ａ〜１３Ｄは、ラモトリジン類似体をラモトリジン類似体共役体に変換する化学反応の模式図であり、本ラモトリジン類似体共役体を免疫原として用いて、本明細書に記載の様々な免疫診断アッセイで用いる抗ラモトリジン抗体や共役体を産生することができる。より詳細には、ラモトリジン類似体（７）、（１３）、（１５）及び（８）の活性エステルを、キーホールリンペット・ヘモシアニン（「ＫＬＨ」）等の免疫原性担体タンパク質にカップリングすることができる。図１３Ａは、長いリンカーを有する５−ＫＬＨ−ラモトリジン類似体共役体である免疫原（１６）を形成するのに用いた典型的な合成法を例示する概略図である。氷槽中で、８ｍｌのＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．２）中の８０ｍｇのＫＬＨの溶液を冷却して反応を行う。次に、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．２中の１８ｍｇの５−ラモトリジン類似体（７）の溶液を、タンパク質溶液に滴下し、反応混合物を形成する。反応混合物を室温で１０分間攪拌した後、０．５ｍｌのＤＩ水中の６０ｍｇのＥＤＡＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸］を添加して３０分間攪拌する。生じた共役体を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、４℃で透析後、ｐＨ７．２のＰＢＳと５回交換する（各１リットル、少なくとも各々６時間）。ＢＣＡアッセイを用いて生じた免疫原（１６）のタンパク質濃度を決定する。
【実施例１２】
【０１３１】
［０１４８］図１３Ｂは、他の免疫原（１７）を提供する他の化学反応を例示する概略図である。６ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の６０ｍｇのＫＬＨの溶液を氷槽中で冷却後、３．８ｍｌのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に滴下して室温以下に維持する。１ｍｌのＤＭＳＯ中の１７．４ｍｇのラモトリジン類似体（１３）の溶液をタンパク質溶液に滴下して反応混合物を形成する。反応混合物を室温で４０時間攪拌する。生じた共役体、４−ＫＬＨ免疫原（１７）を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、１ｌのｐＨ７．２  ＰＢＳ中の３５％ＤＭＳＯ、１ｌのｐＨ７．２  ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、及び１ｌのＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯの連続透析槽中で室温で透析後、４℃でＰＢＳと４回交換する（各１リットル、少なくとも各々６時間）。本明細書に記載し、当該技術分野に周知である方法で、ラモトリジン及びラモトリジン類似体と相互作用して結合できるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を調製する際に免疫原（１７）を用いる。
【実施例１３】
【０１３２】
［０１４９］図１３Ｃは、他の免疫原（１８）を提供する他の化学反応を例示する概略図である。つまり、６ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の６０ｍｇのＫＬＨの溶液を氷槽中で冷却後、３．８ｍｌのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に滴下して室温以下に維持する。１ｍｌのＤＭＳＯ中の１２．７ｍｇのラモトリジン類似体（１５）の溶液をタンパク質溶液に滴下し、反応混合物を形成する。反応混合物を室温で４０時間攪拌する。生じた共役体を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の３５％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ中、室温で連続透析後、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７．２と４回交換する（各１リットル、少なくとも各々６時間）。ＢＣＡアッセイを用いて、免疫原（１８）のタンパク質濃度を、およそ２．１７ｍｇ／ｍｌと決定する。生じた免疫原（１８）、及び類似の化学反応を用いて調製される他の免疫原を用いて、本明細書に記載し、当該技術分野に周知である方法でモノクローナル及び／又はポリクローナル抗体を産生することができる。
【実施例１４】
【０１３３】
［０１５０］図１３Ｄは、他の免疫原（１９）を提供する他の化学反応を例示する概略図である。これによれば、出発材料であるラモトリジン類似体（８）と共に、実施例１１〜１３に記載する反応と実質的に類似の反応スキームを用いることもできる。簡潔には、６ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の６０ｍｇのＫＬＨの溶液を氷槽中で冷却して３．８ｍｌのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に滴下し、室温以下に維持する。１ｍｌのＤＭＳＯ中の１７．４ｍｇのラモトリジン誘導体（８）の溶液をタンパク質溶液に滴下し、反応混合物を形成する。反応混合物を室温で４０時間攪拌する。生じた共役体、５−ＫＬＨ類似体（１９）を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の３５％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ中、室温で透析後、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７．２と４回交換する（各１リットル、少なくとも各々６時間）。生じた５−免疫原（１９）、及び類似の化学反応を用いて調製される他の免疫原を用いて、本明細書に記載し、当該技術分野に周知である方法でモノクローナル及び／又はポリクローナル抗体を産生することができる。
【実施例１５】
【０１３４】
［０１５１］さらに、図１３Ｅは、実施例１０〜１３と類似の反応スキームを例示する概略図で、ラモトリジン類似体（５）を用いて対応する免疫原（２０）を作製することができる。しかし、免疫原（１９）の５位のリンカーが短いことが測定されており、７４Ｗ８６−免疫原の性質が極性であるため、劣ることを示すデータしか得られなかった。
【実施例１６】
【０１３５】
［０１５２］図１４Ａは、ラモトリジン類似体をラモトリジン類似体共役体に変換する化学反応の模式図であり、抗原、競合剤、及び本明細書に記載の様々な免疫診断アッセイで抗ラモトリジン抗体を産生するための免疫原として用いることができる。これによれば、出発材料であるラモトリジン類似体（８）を用いて、実施例１１〜１４の反応と実質的に類似の反応スキームを用いることができる。簡潔には、６ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の６０ｍｇのＢＳＡの溶液を氷槽中で冷却して３．８ｍｌのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に滴下し、室温以下に維持する。１ｍｌのＤＭＳＯ中の１８．２ｍｇのラモトリジン誘導体（８）の溶液をタンパク質溶液に滴下し、反応混合物を形成する。反応混合物を室温で４０時間攪拌する。生じた共役体、５−ＢＳＡ類似体（１９）を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の３５％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ中、室温で連続透析後、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７．２と４回交換する（各１リットル、少なくとも各々６時間）。生じた５−ＢＳＡ共役体（２１）を、本明細書に記載する不均一系及び均一系免疫診断アッセイ、並びにＥＬＩＳＡスクリーニング及び他の免疫アッセイで「競合剤」として用いることもできる。また、本発明の抗ラモトリジン抗体を調製するため、特に、ＢＳＡ部分がＫＬＨ部分で置換された免疫原（２１）を用いることもできる。
【実施例１７】
【０１３６】
［０１５３］図１４Ｂは、４−ＮＨＳ−スクシニルアミノラモトリジン類似体（１３）を、抗ラモトリジン抗体と相互作用できる抗原に変換する化学反応の模式図である。これによれば、示すように、４−ＢＳＡ共役体又は抗原（２２）を形成するため、４−ラモトリジン類似体（１３）を、ＢＳＡ又はＨＳＡ等の担体タンパク質と反応させることができる。合成プロトコルは、実施例１６に記載する反応と実質的に類似するものでもよい。
【実施例１８】
【０１３７】
［０１５４］図１４Ｃは、示すように、３−ＮＨＳ−スクシニルラモトリジン類似体（５）を３−ＢＳＡ共役体又は抗原（２３）に変換する化学反応の模式図である。合成プロトコルは、実施例１６に記載する反応と実質的に類似するものでもよい。
【実施例１９】
【０１３８】
［０１５５］図１４Ｄは、示すように、５−ＮＨＳ−スクシニルラモトリジン類似体（１４）を５−ＢＳＡ共役体又は抗原（２４）に変換する化学反応の模式図である。合成プロトコルは、実施例１６、１７、及び１８に記載する反応と実質的に類似でもよい。しかし、抗原（２４）の５位のリンカーが短いことが測定されており、７４Ｗ８６抗原の性質は極性であるため、結果は劣ることを示すデータしか得られなかった。
【実施例２０】
【０１３９】
［０１５６］図１５Ａは、ラモトリジン類似体をラモトリジン類似体抗原（２５）に変換する化学反応の模式図である。アミド結合形成剤を用いて、又は反応性カルボニル中間体を通じて、タンパク質中のカルボキシレート基（アスパラギン酸、グルタミン酸）を誘導体とすることができる。したがって、以下により詳細に記載するように、活性化ＢＳＡ又はＨＳＡの活性中間体を形成するため、ＢＳＡ又はＨＳＡ等の担体タンパク質を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（「ＥＤＡＣ」）で活性化することができる。その後、５−ＢＳＡ共役体又は抗原（２５）を形成するため、活性中間体をラモトリジン類似体（６）にカップリングすることができる。４ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の５１ｍｇのＢＳＡの溶液を氷槽中で冷却して反応を行い、溶液を氷槽中で３０分間攪拌させる。続いて、１ｍｌのＤＭＳＯ及び０．４ｍｌのＤＭＳＯ中の１０ｍｇのラモトリジン類似体（６）をＢＳＡ溶液中に滴下する。該溶液を攪拌しながら室温まで温める。０．４ｍｌのＤＩ水中の２５ｍｇのＥＤＡＣの溶液を上記ＢＳＡタンパク質溶液に添加する。該溶液を４時間攪拌する。生じた共役体を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の３０％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ、１ｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１０％ＤＭＳＯ中、室温で連続透析後、４℃でＰＢＳ、ｐＨ７．２と４回交換する（各１リットル、少なくとも各々６時間）。ＢＣＡアッセイを用いて、生じた免疫原（２５）のタンパク質濃度はおよそ６．４ｍｇ／ｍｌと決定する。
【実施例２１】
【０１４０】
［０１５７］図１５Ｂは、ラモトリジン類似体（７）をラモトリジン類似体抗原（２６）に変換する化学反応の模式図である。これによれば、ＥＤＡＣ活性化を介して、ラモトリジン類似体（７）をｉｎ  ｓｉｔｕで担体タンパク質にカップリングすることができる。生じた免疫原又は共役体（２６）を、本明細書に記載する不均一系及び均一系免疫診断アッセイ、並びにＥＬＩＳＡスクリーニング及び他の免疫アッセイで、競合剤として用いることができる。また、本発明の抗ラモトリジン抗体を調製するため、特に、ＢＳＡ部分がＫＬＨ部分で置換された免疫原（２６）を用いてもよい。したがって、５−ラモトリジン類似体（７）の活性中間体を形成するため、以下に詳細に記載するように、５−ラモトリジン類似体（７）をＥＤＡＣと反応させてもよい。その後、示すように、５−ＢＳＡ共役体又は抗原（２６）を形成するため、活性中間体をＢＳＡ又はＨＳＡ等の担体タンパク質とカップリングさせることができる。５ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の５１ｍｇのＢＳＡの溶液を氷槽中で冷却して反応を行い、溶液を室温に維持する。続いて、１ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２緩衝液中の１２ｍｇの５−ラモトリジン類似体（７）の溶液をタンパク質溶液中に滴下する。該溶液を１０分間攪拌後、０．５ｍｌのＤＩ水中の４０ｍｇのＥＤＡＣを添加する。反応混合物を室温で３０分間攪拌させる。生じた共役体を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、１ｌｘ７の１００％ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で、４℃で室温で透析後、ＰＢＳ、ｐＨ７．２と５回交換する（各１リットル、少なくとも各々６時間）。ＢＣＡアッセイを用いて、生じた共役体（２６）のタンパク質濃度を、約６．９ｍｇ／ｍｌと決定する。
【実施例２２】
【０１４１】
［０１５８］図１６Ａは、ＦＩＴＣ等の蛍光標識とラモトリジン類似体（２）をカップリングする化学反応を例示する概略図である。アルミニウムホイルを巻いた丸底フラスコ中、１０ｍｇのＦＩＴＣ（フルオレセイン−５−イソチオシアネート）、０．１ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び８ｍｇのラモトリジン類似体（２）の反応溶液を形成する。反応溶液を１８時間攪拌して揮発物を減圧下で蒸発させる。残渣をメタノールに再溶解して溶媒、酢酸エチル／メタノールを用いて分離用ＴＬＣプレートから精製する。トレーサー（２７）をメタノールに溶解してフリーザーに保存する。
【実施例２３】
【０１４２】
［０１５９］図１６Ｂは、ＦＡＭ等の蛍光標識とラモトリジン類似体（６）をカップリングする化学反応を例示する概略図である。アルミニウムホイルを巻いた丸底フラスコ中、１０ｍｇのＦＡＭ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）、０．１ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び１２ｍｇのラモトリジン類似体（６）の反応溶液を調製する。反応溶液を１８時間攪拌して揮発物を減圧下で蒸発させる。残渣をメタノールに再溶解して溶媒、酢酸エチル／メタノールを用いて分離用ＴＬＣプレートから精製する。トレーサー（２８）をメタノールに溶解してフリーザーに保存する。
【実施例２４】
【０１４３】
［０１６０］ポリクローナル抗血清を得て、ラモトリジン及びラモトリジン代謝産物とポリクローナル抗体の交差反応の量を決定するため、アッセイを行う。既知量のラモトリジンを用いて、本発明により調製した抗ラモトリジン抗体と反応させる。既知の濃度のラモトリジンを用いて、抗体調製物及び以下の代謝産物間の交差反応の量を計算する：Ｎ−メチル（２９）；Ｎ−オキシド（３０）；及びＮ−２グルクロニド（ｇｌｕｒｏｎｉｄｅ）（３１）。交差反応性比率は、μｇ／ｍｌのラモトリジンの観察される濃度を１００倍した後、μｇ／ｍｌの添加した代謝産物の濃度で割ったものに等しい。当該代謝産物を含有する標本では交差反応性は見られない。高濃度の当該化合物をヒト血清にスパイクして試料として試験する。代謝産物をアッセイして対照血清（ラモトリジンなし）と比較する。以下の等式を用いて交差反応性を計算する：
［０１６１］  交差反応性％＝    回収濃度    ｘ１００％
交差反応物濃度
［０１６２］結果から、５００μｇ／ｍｌの濃度では、Ｎ−２メチル及びＮ−２グルクロニドは、交差反応性がないことが示される。また、５００μｇ／ｍｌでのＮ−２オキシドの交差反応性は３％未満である。
【実施例２５】
【０１４４】
［０１６３］免疫原性共役体を有するラモトリジン類似体を用いてラモトリジンに結合するポリクローナル抗体を調製する。より詳細には、ＫＬＨ免疫原性部分を有するラモトリジン免疫原（２０）を用いて、当該技術分野で周知の抗ラモトリジンポリクローナル抗体を生成した。約０．５ｍｌの免疫原（２０）含有組成物と約０．５ｍｌのフロイントアジュバントを混合して免疫原性組成物を調製する。その後、生じた１ｍｌの免疫原性カクテルを各ウサギに注射する。続いて、ウサギに抗ラモトリジンポリクローナル抗体を産生させるため、４週毎にウサギに同一カクテルを有する免疫原性注射を施す。以下に記載するように、抗原を用いたＥＬＩＳＡを介して番号１３０９及び１３１０の２頭のウサギ由来の血清をスクリーニングする。
【実施例２６】
【０１４５】
［０１６４］実施例２５に記載するように調製したポリクローナル抗体を調べるため、ＥＬＩＳＡアッセイで用いるＥＬＩＳＡプレートを調製した。つまり、様々なラモトリジン抗原（２１）、（２３）及び（２４）を、異なるＥＬＩＳＡプレート上にコーティング後、抗ラモトリジンポリクローナル抗体に供して遊離ラモトリジンと競合させた。より詳細には、コーティング緩衝液中でラモトリジン抗原を希釈後、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で６０分間インキュベート後、コーティング緩衝液中の溶媒をデカントしてブロッキング緩衝液をプレートに添加した。プレートを再び、３７℃で６０分間インキュベートしてブロッキング緩衝液中の溶媒をプレートからデカントした。その後、ウェル中にブロッキング剤を含むＥＬＩＳＡプレートを２〜８℃で最長１週間保存した。
【実施例２７】
【０１４６】
［０１６５］実施例２６で調製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、実施例２３により調製したポリクローナル抗体の抗体力価を決定した。つまり、連続希釈で各ウェルを同様に１００μｌの体積とした。ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、１：１０〜１：２０００で抗体を希釈して調製した。試料を１０倍希釈して希釈を１：１００からプレートに１０倍で連続希釈した。続いて、１００μｌの抗体試料をＥＬＩＳＡプレート上の各ウェルに添加した。その後、プレートを３７℃で６０分間インキュベートして２５０μｌの０．０５％ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄した。次に、プレート上で以前コーティングした抗原とは異なる、１２５μｌの希釈した二次抗体共役体（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中）を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で６０分間インキュベート後、２５０μｌの０．０５％ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄して力価を実験的に決定した。洗浄後、約１２５μｌの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（「ＡＢＴＳ」）基質をプレート中の各ウェルに添加してプレートを再び２０分間インキュベートした。プレートを４０５ｎｍで読み取り、結果の力価を表１に提供する。
【０１４７】
表１
【０１４８】
【表１】
2008518234.tif 000009
【０１４９】
［０１６６］これらの結果は、力価が、微粒子凝集免疫アッセイには十分でなかったことを示す。これは、微粒子凝集免疫アッセイを、少なくとも１：１００，０００の力価で行わなければならないためである。つまり、免疫原（２０）は、商業的免疫診断アッセイプロトコルで用いるのに十分な抗体を生じなかった。
【実施例２８】
【０１５０】
［０１６７］免疫原（２０）を用いて調製した抗ラモトリジン抗体のラモトリジン類似体に対する結合活性を結合阻害研究で決定した。つまり、１ｍｌの０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で試料を調製した。３０％Ｂｍａｘ力価又は５０％Ｂｍａｘ力価の組成物を用いて得た力価値をおよそ半分の力価値に割った。したがって、これは、抗ラモトリジン抗体を阻害性タンパク質と混合する場合に起こる１：１希釈に適応できる。３０％Ｂｍａｘを用いて試料調製段階中に１：１２０００の抗体力価を１：６０００に希釈する。その後、異なる濃度又は標準物質値（０、２．５、５、１０、２０、４０μｇ／ｍｌ）の約５０μｌのラモトリジンを実施例２５により調製したプレートに適用した。約５０μｌの希釈抗体をプレート内に分配してプレート中の組成物を水平プレート振盪装置上で１分間混合した。プレートはラモトリジンも抗ラモトリジン抗体も含有しない第１列により特定されて第１列を陰性対照として用いた。ラモトリジンを含有しない第２列を陽性対照として用いた。プレートを６０分間インキュベートして２５０μｌの０．０５％ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の、免疫原１５とは異なる、抗原（２１）、（２３）、又は（２４）等の、約１２５μｌの希釈二次抗体共役体をプレートの各ウェルに添加した。３７℃で６０分間インキュベートして２５０μｌの０．０５％ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄して力価を実験的に決定した。続いて、約１２５μｌのＡＢＴＳ基質をプレートの各ウェルに添加してプレートを２０分間インキュベートした。プレートを４０５ｎｍで読み取り、結果を表２及び３に提供する。
【０１５１】
表２
【０１５２】
【表２】
2008518234.tif 000010
【０１５３】
表３
【０１５４】
【表３】
2008518234.tif 000011
【０１５５】
［０１６８］Ｂは試験試料に関する４０５ｎｍでの吸光度値であり、Ｂｏは競合分析物が存在しない場合の４０５ｎｍの吸光度値（Ａ４０５＠ゼロ標準物質）であり、ここでＢｏはゼロ標準物質又は分析物がない場合のＢである。Ｂ／Ｂｏは、競合する分析物を添加した際の阻害を示す（例えばＥＬＩＳＡ形式）。吸光度（Ｂ）は、免疫反応及び反応条件（緩衝剤、反応時間、パラメーター等）に依存する。吸光度は、より多くの試薬を添加するか、アッセイパラメーターの変化か、又は反応時間の変化か、又は反応温度の変化により、抗原が抗体に強く結合する際の強い免疫反応に起因して高まる可能性もある。
【０１５６】
［０１６９］０〜４０μｇ／ｍｌの既知の濃度の標準物質である、既知量の分析物は、抗ラモトリジン抗体に関して、ＥＬＩＳＡプレート上でラモトリジン類似体と競合する。所定の分析物濃度での吸光度（Ｂ）は、Ｂ／Ｂｏが１以下である場合、分析物を含まない場合の吸光度より低い場合がある。遊離薬剤又は分析物が抗体と強く結合する場合、利用できる抗体に関して抗原と自由に競合しうる。その後、吸光度Ｂは、利用できる抗体が遊離薬剤とのみ結合すると、迅速に低下する場合もあり、これにより、Ｂ／Ｂｏが迅速に減少する。遊離薬剤と抗体の結合が弱い場合、遊離薬剤は抗体から抗原を置換せず、吸光度Ｂはわずかに低下しうる。Ｂ／Ｂｏは、標準物質範囲の間に１．００から減少し、標準物質範囲の間のＢ／Ｂｏの変化は、抗原、遊離薬剤、及び抗体間の免疫反応に依存する。様々な濃度での免疫反応の相違（例えば競合又はＢ／Ｂｏ）は、競合的免疫アッセイでは必須である。各標準物質濃度でのアッセイ範囲の間のＢ／Ｂｏの相違が大きい場合、測定はより正確になる。アッセイ較正範囲の間でＢ／Ｂｏは、抗原及び抗体の相互作用に依存する。吸光度が高く（例えば０．５〜１．５の間のＯＤ）、各レベルの既知の分析物濃度（標準物質）でＢ／Ｂｏが大きく相違することが、信頼性があり、再現性あり免疫アッセイに重要である。アッセイ範囲でのＢ／Ｂｏの大きな動的範囲（例えば分析物濃度の増分変化でのＢ／Ｂｏの大きな相違）及び強い吸光度（Ｂ）が、商業的免疫アッセイの精密度及び精度を得るために必要である。
【０１５７】
［０１７０］表２及び３（例えばウサギ１３０９）で、抗原（２４）の吸光度（Ｂ又はＢｏ）は最高であり、Ｂ／Ｂｏは標準物質範囲の間で減少する。抗原（２４）の構造は免疫原（２０）と類似し、担体タンパク質のみが異なる。構造が類似するため、抗原上のエピトープは抗体応答を刺激したエピトープと同一であり、抗体はリンカー並びに薬剤も認識できる。したがって、抗原と、抗体に関して競合するため、遊離薬剤が多量に必要となるため、最高の吸光度が予測され、アッセイ範囲の間のＢ／Ｂｏの減少が小さくなる。
【０１５８】
［０１７１］抗原（２３）の構造は、免疫原と異なるため（例えば異なるリンカー、異なる誘導体化部位、及び異なる担体タンパク質）、吸光度（Ｂ）は最低となる。抗原（２１）の構造は免疫原と異なる（例えば異なるリンカー、同一誘導体化部位、及び異なる担体タンパク質）。吸光度（Ｂ）は中程度で、免疫原の吸光度とは異なり、アッセイ範囲の間でのＢ／Ｂｏの相違は最大となる。しかし、抗原（２４）、（２３）、（２１）は、力価が低く、Ｂ／Ｂｏプロフィールが劣るため、抗体に対して最適とはいえない。
【実施例２９】
【０１５９】
［０１７２］実施例２５に記載するものと類似のプロトコルを用いて、ラモトリジンと結合するポリクローナル抗体を調製した。より詳細には、ＫＬＨ免疫原性部分を有するラモトリジン免疫原（１８）を用いて、抗ラモトリジンポリクローナル抗体を生成した。
【実施例３０】
【０１６０】
［０１７３］実施例２７で調製したポリクローナル抗体を調べるため、実質的に実施例２６によりＥＬＩＳＡアッセイで用いるＥＬＩＳＡプレートを調製した。より詳細には、抗原（２４）、（２３）、（２１）、（２５）、及び（２６）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。
【実施例３１】
【０１６１】
［０１７４］実施例３０で調製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、実施例２９で調製したポリクローナル抗体に関する抗体力価を決定した。実施例２７に記載の抗体力価を決定するプロトコルにしたがった。したがって、プレートを４０５ｎｍで読み取り、力価の結果を表４に提供する。
【０１６２】
表４
【０１６３】
【表４】
2008518234.tif 000012
【０１６４】
微粒子凝集免疫アッセイは、少なくとも１：１００，０００の力価で行わなければならないため、上記結果は、微粒子凝集免疫アッセイには力価が十分でなかったことを示す。しかし、抗原（２３）の力価は、免疫原（２０）で生成した抗体に比較して、有意に高かった。部分的に、抗原（２３）の力価が高いのは、ＫＬＨ共役体がＢＳＡで置換されることのみ異なる免疫原（１８）と比較して、抗原（２３）の化学構造が類似であることに起因しうる。つまり、免疫原（１８）で生成した抗ラモトリジン抗体は、競合剤として抗原（２３）を用いた商業的免疫診断アッセイプロトコルで用いるのに適する可能性もある。
【実施例３２】
【０１６５】
［０１７５］実施例２８と実質的に類似のプロトコルを用いて行う結合阻害研究で免疫原（１８）で調製した抗ラモトリジン抗体の、ラモトリジン類似体に対する結合活性を決定した。より詳細には、抗原（２３）及び（２１）を用いた。プレートを４０５ｎｍで読み取り、そして結果を表５及び６に提供する。
【０１６６】
表５
【０１６７】
【表５】
2008518234.tif 000013
【０１６８】
表６
【０１６９】
【表６】
2008518234.tif 000014
【０１７０】
［０１７６］免疫原（２０）のリンカーは短く、免疫原（１９）ほど免疫原性でない。免疫原（２０）から生じる抗体の力価は、最低１：２１０及び最高１：１１０００であり、高すぎるか低すぎるアッセイ範囲の間でＢ／Ｂｏが変化する。免疫原（１８）のリンカーは短く、免疫原（１９）ほど免疫原性ではない。免疫原（１８）から生じる抗体の抗原（２３）に対する力価は優れる（例えばウサギ２６９０の力価、１：４５，０００；ウサギ２６８９の力価、１：１６０，０００）が、他のすべての抗原に対する力価は低い。
【０１７１】
［０１７７］抗原（２３）の構造は免疫原（１８）と類似である（例えば担体タンパク質のみが異なる）。構造が類似するため、抗原上のエピトープは、抗体応答を刺激したエピトープと実質的に同一である。つまり、抗体は、リンカー及び薬剤を認識でき、最高の吸光度が観察される。各々、最高１：１６０，０００及び１：４５，０００である、抗体による抗原の認識が高まり、ウサギ２６８９及び２６９０由来の抗体の力価が改善される。
【０１７２】
［０１７８］アッセイ範囲の間でのＢ／Ｂｏの漸進的変化は、有望なＢ／Ｂｏプロフィールを示す。Ｂ／Ｂｏのみを考慮すると、抗原（２１）は、抗体に関して、ラモトリジンに対する優れた競合剤である。この抗体は抗原（２１）に対する力価は低く（認識が劣る）、これは、この抗原の構造が免疫原（１８）と異なる（例えば異なるリンカー、同一誘導体化部位、及び異なる担体タンパク質）ためである可能性もある。
【実施例３３】
【０１７３】
［０１７９］実施例２５と類似のプロトコルを用いて、ラモトリジンに結合するポリクローナル抗体を調製した。より詳細には、ＫＬＨ免疫原性部分を有するラモトリジン免疫原（１９）を用いて、抗ラモトリジンポリクローナル抗体を生成した。
【実施例３４】
【０１７４】
［０１８０］実施例３３に記載した調製したポリクローナル抗体を調べるため、実質的に実施例２６により、ＥＬＩＳＡアッセイで用いるＥＬＩＳＡプレートを調製した。より詳細には、抗原（２４）、（２３）、（２１）、（２５）、及び（２６）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。
【実施例３５】
【０１７５】
［０１８１］実施例３４で調製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、実施例３３で調製したポリクローナル抗体に関する抗体力価を決定した。実施例２７に記載の抗体力価を決定するためのプロトコルにしたがった。したがって、プレートを４０５ｎｍで読み取り、力価結果を表７に提供する。
【０１７６】
表７
【０１７７】
【表７】
2008518234.tif 000015
【０１７８】
［０１８２］ラモトリジン骨格及び免疫原性部分の間に長いリンカーを含む、免疫原１９で調製した抗ラモトリジンポリクローナル抗体は、微粒子凝集免疫アッセイに適した高力価を示す。つまり、長いリンカーは、ラモトリジン薬剤に基づく免疫原に有効な免疫原性を与えるのに有益でありうる。つまり、免疫原１９のリンカー、あるいは類似の長さ又は他の特性があるものを、ラモトリジン類似体の４位及び３位に共役化してもよい。
【実施例３６】
【０１７９】
［０１８３］実施例２６と実質的に類似のプロトコルを用いて行った結合阻害研究により、免疫原（１９）で調製した抗ラモトリジン抗体の、ラモトリジン類似体に対する結合活性を決定した。より詳細には、抗原（２４）、（２３）、（２１）、（２５）、及び（２６）を用いた。プレートを４０５ｎｍで読み取り、そして結果を表８及び９に提供する。
【０１８０】
表８
【０１８１】
【表８】
2008518234.tif 000016
【０１８２】
表９
【０１８３】
【表９】
2008518234.tif 000017
【０１８４】
［０１８４］免疫原（１９）のリンカーは長く、エピトープは抗体相互作用のため、よりアクセスしやすく、最も免疫原性であり、抗体の力価は、最大１：４，４００，０００と最高であった。すべての抗原（例えば２１、２３、２４、２５、２６）は、免疫原（１９）から産生されるポリクローナル抗体に関して、ラモトリジン遊離薬剤と、中程度から優れた程度の競合を示す。
【０１８５】
［０１８５］抗原（２４）のリンカーは短く、誘導体化部位は、免疫原（１９）と同一である。抗原（２４）による抗体の認識がより弱いため、力価が最大１：３００，０００と比較的低い。抗原（２４）及び抗体の結合は、抗体相互作用に利用できる表面積が狭いため、比較的弱い。Ｂ／Ｂｏは、極めて低濃度のラモトリジンでも急激に減少するが、ラモトリジン濃度が高ければＢ／Ｂｏの斬新的変化は抗原（２４）の実現可能性を示す。
【０１８６】
［０１８６］抗原（２３）のリンカーは短く、誘導体化部位は免疫原（１９）と異なる。抗原（２３）による抗体の認識が比較的弱いため、力価が最大１：７００，０００と比較的低い。抗原（２３）及び抗体の結合は、抗体相互作用に利用できる表面積が狭く、認識がより低いため、非常により弱い。Ｂ／Ｂｏは、極めて低濃度のラモトリジンでも急激に減少するが、これは、ラモトリジン類似体でなくラモトリジンに対する優先性を示す。
【０１８７】
［０１８７］抗原（２１）は担体タンパク質が異なることを除いて、免疫原（１９）と構造が類似である。この抗体の力価は抗原（２１）に対して中程度である。
［０１８８］抗原（２５）のリンカーは免疫原（１９）より短いが類似する。実際、抗原（２５）の調製に用いる類似体（６）は、免疫原（１９）の調製に用いる類似体（８）の前駆体である。構造が類似することに起因する認識の強さは、力価が最大１：４，４００，０００と非常に高い。抗原（２５）は構造が異なるため、抗体に関し、遊離薬剤に対して自由に競合し、Ｂ／Ｂｏが漸進的変化を示す。抗原（２５）及び該ポリクローナル抗体は力価が高く、Ｂ／Ｂｏプロフィールが優れるため、商業的免疫アッセイに用いることができる。
【０１８８】
［０１８９］抗原（２６）のリンカーは非常に長く、抗原（２１）の次に長い。抗原（２５）と抗体との間の免疫反応が高まると、力価が最大１，９００，０００に高まる。抗原（２６）の構造が異なるため、抗体に関し、遊離薬剤に対して自由に競合し、Ｂ／Ｂｏに漸進的変化を示す。抗原（２６）及び該ポリクローナル抗体は、力価が高く、Ｂ／Ｂｏプロフィールが優れるため、現在、商業的免疫アッセイに用いられている。したがって、免疫原１９で調製した抗ラモトリジンポリクローナル抗体の結合活性は好ましいことが示され、免疫診断アッセイに適した競合的結合プロフィールを示した。
【実施例３７】
【０１８９】
［０１９０］実施例３４と同様に調製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、実施例３３により調製したポリクローナル抗体に関する抗体力価を決定したが、抗ウサギＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＭをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。抗原２１を用いたことを除き、実施例２７の抗体力価を決定するプロトコルにしたがった。したがって、プレートを４０５ｎｍで読み取り、そして力価結果を表１０に提供する。
【０１９０】
表１０
【０１９１】
【表１０】
2008518234.tif 000018
【０１９２】
［０１９１］力価は、抗ウサギＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＭ共に抗原に対して活性化されたことを示す。抗体が、抗ウサギＩｇＧに対して著しく高い力価を示すため、ポリクローナル抗血清は、大部分ＩｇＧ抗体である。
【実施例３８】
【０１９３】
［０１９２］免疫診断アッセイで用いるため、ラモトリジン及び類似体と結合する抗ラモトリジン抗体を調製した。免疫原（１９）を複数回注射して免疫した、１６週齢以上の９匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスでモノクローナル抗体を調製した。各マウスに対する免疫原性注射溶液は、２５０μｌのフロイント完全アジュバントと混合した、免疫原（１９）を含む２５０μｌの免疫原性溶液を含有した。免疫原性注射溶液を、３７ゲージの皮下注射針を付けた適当な大きさのシリンジに装填して各マウスに注射した。１４日後、フロイント不完全アジュバントを用いて追加免疫注射を反復した。第６０日及び第８０日に、追加免疫注射を再び反復した。さらに、第４５日、尾の出血で血液を得て、抗ラモトリジン抗体に関してマウスを試験し、ＥＬＩＳＡで抗体を試験して力価及び結合活性を決定した。
【実施例３９】
【０１９４】
［０１９３］実施例３８で調製した抗体を調べるため、実質的に実施例２６により、ＥＬＩＳＡアッセイで用いるＥＬＩＳＡプレートを調製した。より詳細には、抗原（２１）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。簡潔には、抗原（２１）をコーティング緩衝液中に希釈してＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。３７℃６０分間インキュベート後、緩衝液溶媒をデカントしてプレートにブロッキング緩衝液を添加した。プレートを再び３７℃６０分間インキュベートしてブロッキング溶媒をプレートからデカントした。その後、ウェル中のブロッキング剤と共に最長１週間、２〜８℃でプレートを保存した。
【実施例４０】
【０１９５】
［０１９４］実施例３６の尾の出血で得た血液を用いて抗ラモトリジン抗体力価を決定した。１０倍希釈を用いて、出血した血液を１：１００〜１：１０，０００，０００に連続希釈して力価決定プロトコルを開始した。ｐＨ７．４のＰＢＳを含む微量遠心管で希釈を調製する。血液から得た試料約１００μｌを、ＥＬＩＳＡプレート上の各ウェルに添加した。その後、プレートを３７℃で６０分間インキュベートして２５０μｌの０．０５％ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄した。約１２５μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４中の希釈二次抗体共役体をプレートの各ウェルに添加した。約１２５μｌのＡＢＴＳ基質をプレートの各ウェルに添加して２０分間インキュベート後、４０５ｎｍで読み取り、この結果を表１１に示す。
【０１９６】
表１１
【０１９７】
【表１１】
2008518234.tif 000019
【０１９８】
［０１９５］最大ＯＤの約１０％を有する終点力価により、力価を計算する。表１１で、平均最大ＯＤは３．５であり、抗体力価は、最大Ｏ．Ｄ．の１０％の０．３５である。マウス３は、１：１，０００，０００希釈及び１：１０００００００希釈で吸光度が最高となる（ＯＤ）ため、最高の力価である。
【実施例４１】
【０１９９】
［０１９６］実施例２８と実質的に類似のプロトコルを用いて行った結合阻害研究により、モノクローナル抗体を生成する実施例３８のプロトコルにより、免疫原（１９）を用いて調製した抗ラモトリジン抗体の結合活性を決定した。より詳細には、抗原（２１）を用いた。プレートを４０５ｎｍで読み取り、そして結果を表１２及び１３に提供する。
【０２００】
表１２
【０２０１】
【表１２】
2008518234.tif 000020
【０２０２】
表１３
【０２０３】
【表１３】
2008518234.tif 000021
【０２０４】
［０１９７］ポリクローナル抗血清の力価（例えば血中の抗体量）及び結合活性（例えばラモトリジンに対する特異性）に基づき、融合候補を選択した。Ｂ／Ｂｏは、競合する分析物の添加に際して阻害を示すが、Ｂ／Ｂｏ＝１００−阻害％である。表１３は、１番、２番、３番、４番、及び１０番のマウス由来のポリクローナル抗体がラモトリジン類似体に対して優先性を示すことを示す（ＥＬＩＳＡ）。８番及び９番のマウス由来のポリクローナル抗体は、アッセイ間で（０〜２００μｇ／ｍｌ）、Ｂ／Ｂｏ（又は阻害％）の相違が大きかった。
【実施例４２】
【０２０５】
（実施例４０）
［０１９８］ラモトリジン及び類似体と結合できるモノクローナル抗体を生成するため、融合候補を調製した。血液中の抗体の結合活性及び／又は力価又は量に基づき融合候補を選択した。感度（例えば低濃度の分析物を検出する）又は特異性（例えば分析物及び交差反応物質間を区別する）がモノクローナル抗体の望ましい品質である場合、９番のマウス及び８番のマウスが第一の候補である。力価値が最高とは、血中の抗体量が最高であることを示し、脾臓中の抗体濃度が最高の場合、成功率は最高である。したがって、１番のマウスが、融合に成功する可能性がある候補である。
【０２０６】
［０１９９］融合の３〜５日前に、免疫したマウスに、最後の追加免疫注射を行い、融合候補を産生する方法を行った。以前の注射の４週間後に追加免疫注射を行うが、この間隔で、マウスによる血流からの循環抗体の大部分が一掃される。以下の２つの目的のため、最終追加免疫注射を行う：（１）優れた強い応答を誘導するため；及び（２）応答の成熟を同調させるため。これにより、適切なＢリンパ球融合パートナーの相対濃度が高まりうる。脾臓が、リンパ球単離の最適な選択肢であるため、最終追加免疫は、脾臓を標的とした。無菌技術でマウスの脾臓を除去して滅菌ペトリ皿中の１０ｍｌの完全培地に入れた後、すりガラスの滅菌顕微鏡スライド２枚の間ですりつぶした。生じた単細胞懸濁物を除去して血球計算板を用いて計数した。１：５の割合で、骨髄腫細胞を脾臓細胞内に混合して約８００ｘＧで１５分間遠心分離した。上清液を除去して廃棄し、１５ｍｌの血清を含まないＩＭＤＭ培地を添加した。細胞を再懸濁して再び遠心分離した。ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いて、生じた細胞ペレットを融合させた。
【０２０７】
［０２００］融合後、１０％ウシ胎児血清（Hyclone Labs）、１０％  condimed  ＨＩ、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２０ｍＭエタノールアミン、ヒポキサンチン−メトトレキセート−チミジン、４ｍＭグルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を添加したイスコーブのダルベッコの培地中に細胞を希釈した。この融合細胞混合物を、滅菌９６ウェル微量培養プレートに２００μｌ／ウェルで蒔いた。カバーをしたプレートを、５％ＣＯ２中、３７℃で６日間、インキュベーターに入れた。
【実施例４３】
【０２０８】
［０２０１］実施例２６と実質的に類似のプロトコルを用いて行った結合阻害研究でモノクローナル抗体を生成する実施例４２のプロトコルにしたがって、免疫原（１９）を用いて調製した抗ラモトリジン抗体の結合活性を決定した。より詳細には、抗原（２１）を用いた。プレートを４０５ｎｍで読み取り、結果を表１４及び１５に提供する。
【０２０９】
表１４
【０２１０】
【表１４】
2008518234.tif 000022
【０２１１】
表１５
【０２１２】
【表１５】
2008518234.tif 000023
【０２１３】
［０２０２］表１５の阻害プロフィールは、融合クローン４Ｇ６が遊離薬剤を優先し（例えば高い阻害％又は最小のＢ／Ｂｏ）、融合クローン３Ｅ８がラモトリジン類似体（２１）を優先することを示す。
【実施例４４】
【０２１４】
［０２０３］融合後、実施例４３で１ｘクローンを調製した。これによれば、陽性組織培養上清を同定した後の工程は、抗体産生細胞をクローニングである。元来の陽性ウェルは、しばしば、ハイブリドーマ細胞の１より多いクローンを含有し、多くの融合細胞は染色体の組合せが不安定である。単細胞クローニングは、目的の抗体を産生する細胞が、真にモノクローナルであり、確実に安定である。限界希釈によりハイブリドーマ細胞をクローニングした。融合細胞を含有するウェルに増殖培地を添加した。クローンは迅速に増殖し、２週間後、１ｘクローンをスクリーニング（ＥＬＩＳＡ及びＱＭＳ）する準備が整った。実施例２８と実質的に類似のプロトコルを用いて行った結合阻害研究で抗ラモトリジン抗体の結合活性を決定した。より詳細には、抗原（２１）を用いた。プレートを４０５ｎｍで読み取り、結果を表１６〜２１に提供する。
【０２１５】
表１６
【０２１６】
【表１６】
2008518234.tif 000024
【０２１７】
表１７
【０２１８】
【表１７】
2008518234.tif 000025
【０２１９】
表１８
【０２２０】
【表１８】
2008518234.tif 000026
【０２２１】
表１９
【０２２２】
【表１９】
2008518234.tif 000027
【０２２３】
表２０
【０２２４】
【表２０】
2008518234.tif 000028
【０２２５】
表２１
【０２２６】
【表２１】
2008518234.tif 000029
【０２２７】
［０２０４］阻害パーセントが高いのは、クローンがラモトリジン類似体（２１）より遊離ラモトリジンを優先することを示す。
［０２０５］ＱＭＳ（登録商標）アッセイを行い、実施例４４で調製した１ｘクローンを試験した。ＱＭＳ（登録商標）上のスクリーニングは最適化されない（アッセイパラメーター及び１ｘクローンの力価）。データを表２２に示す。
【０２２８】
表２２
【０２２９】
【表２２】
2008518234.tif 000030
【０２３０】
［０２０６］表２２から、１ｘクローンがラモトリジン類似体（２１）を認識してラモトリジン遊離薬剤が免疫反応を阻害する能力により、結合が、タンパク質担体の非特異的結合とは対照的に、ラモトリジンに特異的であることが示される。したがって、該クローンを免疫アッセイに用いることができる。
【実施例４５】
【０２３１】
［０２０７］ＱＭＳ（登録商標）ラモトリジンアッセイは、血清又は血漿中のラモトリジン分析に用いる自動化均一系粒子増進比濁免疫アッセイである。ＱＭＳ（登録商標）アッセイを行い、実施例３４で調製したポリクローナル抗体を試験した。約０．０５％アジ化ナトリウム含有ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液中、＜１％未満で、免疫原（１９）から調製したラモトリジンと結合するヒツジ・ポリクローナル抗体で構成されるＲ１；及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含み、抗原（２６）を含むラモトリジンをコーティングした０．５％未満の微粒子で構成されるＲ２を含有する、使用準備済みの液体２試薬キットを用いてラモトリジンに関するＱＭＳアッセイを行った。完全較正（６点）法を用いて、ＱＭＳラモトリジンアッセイを較正し、図４に類似の較正曲線を作成することもできるが、ここでSeradyn ＱＭＳラモトリジン標準物質（０．０、２．５、５、１０、２０、４０μｇ／ｍｌ）を用いる。結果を表２３に提供する。
【０２３２】
表２３
【０２３３】
【表２３】
2008518234.tif 000031
【０２３４】
［０２０８］ラモトリジンを含有する試料を添加すると、凝集反応が部分的に阻害されるが、これは、吸光度変化速度が遅延することで観察される。つまり、濃度依存性の古典的凝集阻害曲線を得ることもでき、最低ラモトリジン濃度（例えばゼロμｇ／ｍｌ）の場合は凝集速度が最大であり、最高ラモトリジン濃度（例えば４０μｇ／ｍｌ）の場合は凝集速度が最低である。表２３に示すアッセイ範囲の間の速度の漸進的変化により、抗体、抗原（競合剤）、及び遊離薬剤（ラモトリジン）相互作用が、自動化系で用いる商業的免疫アッセイに適していることが示される。
【実施例４６】
【０２３５】
［０２０９］ラモトリジンを検出するＨＰＬＣ法と、自動化均一系粒子増進比濁免疫アッセイを比較する実験を行った。方法比較アッセイは、同一分析物を測定する２つの方法のバイアスを評価するよう設計された実験である。実施例４５のＱＭＳ（登録商標）アッセイを行い、実施例３４で調製したポリクローナル抗体を試験した。つまり、ラモトリジン患者試料をアッセイして参照法であるＨＰＬＣと比較した。評価の目的は、２つの方法が、実験の統計的検出力内で同等の結果を生じるかを決定することである。血清又はナトリウム・ヘパリン処理血漿からなる２５の患者試料を用いて比較実験を行った。比濁免疫アッセイの濃度は１．５９〜３５μｇ／ｍｌの範囲であり、ＨＰＬＣでの濃度は１．３〜３２．９μｇ／ｍｌの範囲であった。自動化ＱＭＳ（登録商標）ラモトリジンアッセイの結果をＨＰＬＣの結果と比較して表２３及び２４に示す。
【０２３６】
表２３
【０２３７】
【表２３−１】
2008518234.tif 000032
【０２３８】
【表２３−２】
2008518234.tif 000033
【０２３９】
表２４
【０２４０】
【表２４】
2008518234.tif 000034
【０２４１】
［０２１０］図１９に示すように、自動化均一系粒子増進比濁免疫アッセイ及びＨＰＬＣ法の相違は約１０％未満であると決定された。図２０のように、比濁免疫アッセイでの濃度は１．５９〜３５μｇ／ｍｌの範囲であり、ＨＰＬＣでの濃度は１．３〜３２．９μｇ／ｍｌの範囲であった。比濁免疫アッセイ上のＱＭＳ（登録商標）ラモトリジンアッセイの傾斜は１．０７、切片は０．０１５１であり、これは、ＡＲＵＰ（ユタ州ソルトレークシティー）ＨＰＬＣ／ＵＶで準備したＨＰＬＣ法に匹敵した。相関係数（Ｒ）は０．９９４であった。バイアスプロットにより、ＨＰＬＣとＱＭＳ（登録商標）値との間の１０％のバイアスが示される。したがって、データは、ＱＭＳ（登録商標）アッセイが、ＨＰＬＣ参照法に対する適切な代替法であることを示す。
【０２４２】
［０２１１］本発明の精神又は本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形式で、本発明を具現しうる。記載する態様は、すべての観点で、単に例示的であり、そして限定的ではないと見なされる。したがって、本発明の範囲は、上記説明によるのではなく、添付の請求項に示される。請求項の意味及び等価の範囲内に属するすべての変化が、その範囲内に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】［０２６］図１は、抗ラモトリジン抗体を調製する方法の態様を例示する流れ図である。
【図２】［０２７］図２は、ラモトリジンの免疫診断アッセイを行う方法の態様を例示する流れ図である。
【図３】［０２８］図３は、蛍光偏光に基づく競合的結合研究の態様を例示する概略図である。
【図４】［０２９］図４は、ラモトリジンの較正曲線の態様を例示するグラフである。
【図５】［０３０］図５は、凝集に基づく競合的結合研究の態様を例示する流れ図である。
【図６】［０３１］図６は、凝集に基づく競合的結合研究の態様を例示する流れ図である。
【図７】［０３２］図７は、酵素活性に基づく競合的結合研究の態様を例示する流れ図である。
【図８】［０３３］図８は、化学発光に基づく競合的結合研究の態様を例示する流れ図である。
【図９】［０３４］図９は、ラモトリジン類似体を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１０】［０３５］図１０は、ラモトリジン類似体を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１１】［０３６］図１１は、ラモトリジン類似体を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１２】［０３７］図１２は、ラモトリジン類似体を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１３Ａ】［０３８］図１３Ａは、ラモトリジンに基づく免疫原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１３Ｂ】［０３８］図１３Ｂは、ラモトリジンに基づく免疫原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１３Ｃ】［０３８］図１３Ｃは、ラモトリジンに基づく免疫原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１３Ｄ】［０３８］図１３Ｄは、ラモトリジンに基づく免疫原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１３Ｅ】［０３８］図１３Ｅは、ラモトリジンに基づく免疫原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１４Ａ】［０３９］図１４Ａは、ラモトリジンに基づく抗原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１４Ｂ】［０３９］図１４Ｂは、ラモトリジンに基づく抗原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１４Ｃ】［０３９］図１４Ｃは、ラモトリジンに基づく抗原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１４Ｄ】［０３９］図１４Ｄは、ラモトリジンに基づく抗原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１５】［０４０］図１５Ａ〜１５Ｂは、ラモトリジンに基づく抗原を合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１６】［０４１］図１６Ａ〜１６Ｅは、ラモトリジンに基づく蛍光トレーサーを合成するための合成プロトコルの態様を例示する概略図である。
【図１７】［０４２］図１７は、ラモトリジン及びラモトリジン代謝産物の態様の概略図である。
【図１８】［０４３］図１８は、回復アッセイの態様のグラフである。
【図１９】［０４４］図１９は、自動免疫アッセイとＨＰＬＣ法の比較研究の態様のグラフである。
【図２０】［０４５］図２０は、自動免疫アッセイとＨＰＬＣ法の比較研究の態様のグラフである。
【図１】
2008518234.tif 000038
【図２】
2008518234.tif 000039
【図３】
2008518234.tif 000040
【図４】
2008518234.tif 000041
【図５】
2008518234.tif 000042
【図６】
2008518234.tif 000043
【図７】
2008518234.tif 000044
【図８】
2008518234.tif 000045
【図９】
2008518234.tif 000046
【図１０】
2008518234.tif 000047
【図１１】
2008518234.tif 000048
【図１２】
2008518234.tif 000049
【図１３Ａ】
2008518234.tif 000050
【図１３Ｂ】
2008518234.tif 000051
【図１３Ｃ】
2008518234.tif 000052
【図１３Ｄ】
2008518234.tif 000053
【図１３Ｅ】
2008518234.tif 000054
【図１４Ａ】
2008518234.tif 000055
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
2008518234.tif 000060
【図１６Ｂ】
2008518234.tif 000061
【図１８】
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【図１９】
2008518234.tif 000063
【図２０】
2008518234.tif 000064
【国際調査報告】
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