(57)【要約】  ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）を測定して腎障害を診断する方法を提供する。
2008524610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの腎障害の可能性を診断、モニタリングまたは決定する方法であって、
腎障害と腎臓に影響を及ぼさない別の症状とを識別することを特徴とし、
ｉ）ヒトからの体液のサンプル中のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の濃度を決定し、
ｉｉ）該濃度をあらかじめ定められたカットオフ値、すなわち腎臓に影響を及ぼさない症状に関連するＮＧＡＬの低濃度を除外するように選択されたカットオフ値と比較し、該カットオフ値を超えた濃度が腎障害を示すとするステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
サンプルが尿サンプルであり、カットオフ値が２５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２５０ｎｇ／ｍＬと５２５ｎｇ／ｍＬの間の値である請求項１の方法。
【請求項３】
サンプルが血漿または血清サンプルであり、カットオフ値が２５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２５０ｎｇ／ｍＬと５２５ｎｇ／ｍＬの間の値である請求項１の方法。
【請求項４】
別の症状が炎症性障害であり、カットオフ値が炎症性障害に関連するＮＧＡＬの低濃度を除外するように選択されている請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
方法が腎障害と感染性障害とを更に識別し、カットオフ値が感染性障害に関連するＮＧＡＬの低濃度を除外するように選択されている請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
方法が腎障害と癌性の障害とを更に識別し、カットオフ値が癌性の障害に関連するＮＧＡＬの低濃度を除外するように選択されている請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
ステップｉ）およびｉｉ）を１回以上更に繰り返すステップを含む請求項１〜６のいずれかのモニタリング方法。
【請求項８】
２４時間以内、例えば１２時間以内、６時間以内、３時間以内に、ステップｉ）およびｉｉ）を更に繰り返すステップを含む請求項１〜７のいずれかのモニタリング方法。
【請求項９】
腎障害の治療が開始または完了した後、ステップｉ）およびｉｉ）を更に繰り返すステップを含む請求項１〜８のいずれかのモニタリング方法。
【請求項１０】
腎障害が虚血後の腎損傷である請求項１〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
腎障害が急性腎不全、急性腎尿細管壊死または急性尿細管間質性腎障害を引き起こしうる障害である、請求項１〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
腎障害が腎毒性剤で引き起こされる請求項１〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
該濃度を第二カットオフ値、すなわち透析よる患者の処置が要求されないような程度の腎障害に関連するＮＧＡＬの低濃度を除外するように選択された第二カットオフ値と更に比較するステップを含むことを特徴とし、
カットオフ値を超えた濃度が透析による処置が強く要求されているような重症な腎障害を示していることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
該第二カットオフ値が１０００ｎｇ／ｍＬと３０００ｎｇ／ｍＬの間、例えば、１２５０ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、１７５０ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２２５０ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、または２７５０ｎｇ／ｍＬである請求項１３の方法。
【請求項１５】
ＮＧＡＬがＮＧＡＬに特異的に結合する分子を用いて測定されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
体液が尿である請求項１〜１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
体液が血液、血漿または血清である請求項１〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
ヒトにおける腎障害の発症をモニタリングする方法であって、
ｉ）ヒトからの体液のサンプル中のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の濃度を決定し、
ｉｉ）所定の時間後同一のヒトから更に採取した体液のサンプルにおいてステップｉ）を繰り返し、および
ｉｉｉ）第二サンプル中のＮＧＡＬの有意に高い濃度が、腎障害が進行しているまたは腎障害が進行しようとしているヒトを示しているステップｉ）およびｉｉ）で得られた濃度と比較して、ヒトの腎障害が進行しているまたは腎障害が進行しようとしているかどうかを評価するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
有意に高い濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ以上、１５０ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、４００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上のＮＧＡＬ濃度における上昇である請求項１８の方法。
【請求項２０】
ステップｉｉ）およびｉｉｉ）を１回以上更に繰り返すステップを含む請求項１８または１９の方法。
【請求項２１】
所定の時間が２４時間以内、例えば１８時間以内、１２時間以内、６時間以内、３時間以内である請求項１８〜２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
更に請求項１０〜１７のいずれかの特徴の１つまたはそれ以上を有する、請求項１８〜２１のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／６３７，５０３号（2004年12月20日出願）および米国仮出願第６０／７１９，３０７号（2005年9月21日出願）の通常の出願であり、そのまま本明細書に引用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、体液中のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の測定によって、ヒトの疾患を診断し、モニタリングする方法に関するもので、これらの異常な濃度は疾患または疾患群を示し、この例において低下した腎機能を生じる腎臓障害には、虚血性傷害（腎臓への害された血液供給による）または腎毒性剤への暴露または移植された腎臓の拒絶反応によって生じた障害が含まれる。本発明の方法は、虚血性傷害への腎臓の反応、すなわち、典型的には急性腎不全（ＡＲＦ）、急性腎尿細管壊死（ＡＴＮ）または急性尿細管間質性腎障害（ＡＴＩＮ）である臨床上または病理学上の結果の早期の検出に特に有用であり、治療上の測定への反応を含む腎障害の経過をモニタリングするのにも用いられうる。
【０００３】
（背景技術）
ＡＲＦ、ＡＴＮまたはＡＴＩＮをもたらす腎臓の虚血性傷害の検出は、従来臨床上の徴候、例えば乏尿および体液貯留に頼っており、血液および尿のおける化学試験結果、すなわち、低ナトリウム排泄、上昇した血中のクレアチニンおよび尿素のレベル、並びにもし測定されるなら低クレアチニンクリアランスを示す結果と組み合わせられて行われていた。これらの徴候は、確立された症状の存在を示している。腎臓の尿細管損傷の様々な尿のマーカーも分析されてきている。これらの中で、α１−ミクログロブリン、β２−ミクログロブリン（Penders and Delanghe JR, 2004）およびＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）（Kotanko et al., 2000）は、確立されたＡＴＮの場合に評価されるが、実験動物における虚血性または毒性の発作の４、５日後に現れうるのみである。腎臓傷害分子−１（ＫＩＭ−１）もまた、ＡＴＮの患者の尿中上昇するが、その時間経過は、おそらく早期であったが、ヒトの患者において確立されていない（Han et al., 2002）。システインリッチのタンパク質６１（ＣＹＲ６１）は、実験動物における虚血性傷害の６〜９時間後に尿中でピークとなる（Muramatsu et al., 2002）。しかしながら、ヒトにおけるレベルはなお不明である。研究されている他のマーカーには、クラスタリン（Aulitzky et al., 1992）およびリポカリン型プロスタグランジンＤシンターゼ（Ｌ−ＰＧＤＳ）（Tsuchida et al., 2004）が含まれるが、ＡＴＮの早期診断または予測のためのこれらの有用性はなお不明である。虚血剤または腎毒性剤に腎臓が曝された後の尿中のこれらのマーカー分子の出現が一般的にゆっくりとした時間経過になるために、これらのマーカーはこれらの発作から生じる早期のまたは切迫した腎障害を診断するのに一般的使用はしない。
【０００４】
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）はまた、好中球リポカリン（ＮＬ；ヒト好中球リポカリンの場合はＨＮＬ）、リポカリン２（ＬＣＮ２）、２５−ｋＤａα２−ミクログロブリン関連タンパク質（ラットにおいて）または２４Ｐ３（マウスにおいて）としても知られている。ラットにおいては、その遺伝子がｎｅｕ（ＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂＢ−２）癌遺伝子によって開始される哺乳動物の腫瘍に過剰発現されるので、それはｎｅｕ関連リポカリン（ＮＲＬ）として言及されている（Stoesz and Gould, 1995）。ＮＧＡＬは、多形核白血球の顆粒剤から最初に単離された２５−ｋＤａ糖タンパク質である（Triebel et al., 1992; Kjeldsen et al., 1993）。それにはジスルフィド架橋が含まれ、二量体の部分および三量体のより小さな部分を形成する。それは９２−ｋＤａヒト好中球ＩＶ型コラゲナーゼに関連し、また、見かけｋＤａ １１５の複合体を形成するモノマー（Monier et al., 2000; Yan et al., 2001）として、または見かけｋＤａ １２５の複合体を形成する二量体（Yan et al., 2001）として、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）またはゼラチナーゼＢと呼ばれる。これらの複合体は、様々な癌（例えば、前立腺、膀胱、腎臓および乳房の癌）を患った患者の尿中に確認されている。
【０００５】
ＮＧＡＬは、浸潤する微生物、特に化膿菌が好中球の脱顆粒および顆粒タンパク質の開口分泌の原因となる場合に、血液中に放出される好中球活性化のマーカーとして最初開示された。それにおいて、ヒトからの血漿または血清サンプルにおけるＮＧＡＬの上昇したレベルの測定は、炎症、特に細菌感染によって引き起こされる炎症を患った患者を表すと信じられている（Venge, 2000；米国特許第6,136,526号；ＰＣＴ出願 WO95/29404）。この点で、好中球からの特許請求された特定の誘導体とは反対に、ＮＧＡＬ（２４Ｐ３）はマウスにおけるタイプ１の急性期タンパク質として確認され、マウスにおいては急性期の反応中主に肝臓に発現が局在化した（Liu and Nilsen-Hamilton, 1995）。
【０００６】
米国特許出願第２００４／０２１９６０３号は、腎臓の尿細管細胞傷害の早期開始を検出するための尿のバイオマーカーとして、ＮＧＡＬの使用を記載している。しかし、腎臓の尿細管細胞傷害が上昇したＮＧＡＬレベルの原因として全身性炎症または細菌感染と識別されるかどうか、あるいはどのように識別されるかは記載されていない。
【０００７】
（発明の概要）
驚くべきことに、今回、腎損傷のためのＮＧＡＬレベルが一般的に、腎機能に影響を与えない炎症、感染または癌の症状から生じたＮＧＡＬのレベルよりも高いことを見出した。このことは、腎障害を腎臓に影響を与えない他の障害と識別して、患者の腎障害を診断および／またはモニタリングする方法を確立させたことである。腎障害とは機能のあらゆる変化を意味しており、それには腎臓全体としての変化、またはそれを構成している１またはそれ以上の細胞構造の変化の構造的および構造を超えた相関関係が含まれており、通常の健康状態を維持する調整メカニズムを超えることである。かかる障害の非排他的な例には、急性腎尿細管壊死（ＡＴＮ）または急性尿細管間質性腎障害（ＡＴＩＮ）のような腎臓虚血に関連した症状が含まれ、また何らかの原因の急性腎不全（ＡＲＦ）または慢性腎不全（ＣＲＦ）、何らかの原因の急性および慢性糸球体腎炎、尿路閉塞による腎障害、高血圧症による腎障害、子癇前症または妊娠中毒症に関連する腎障害、移植された腎臓の拒絶反応または再発症、並びに腎臓の先天性および腫瘍性疾患も含まれる。
【０００８】
従って、本発明は、患者から得た体液（好ましくは尿）のサンプル中のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の量を測定することを特徴とする、ヒトにおける腎損傷の診断および／またはモニタリングの方法を提供する。ＮＧＡＬの上昇レベルは、必ずしも腎機能に影響を与えない他の障害（例えば、炎症または感染の症状または癌）から得られる特定化されたＮＧＡＬのより低い上昇レベルより高ければ、腎損傷を示すことになる。従って、第一の態様において、本発明は、ヒトの腎障害の可能性を診断、モニタリングまたは決定する方法であって、腎障害と腎臓に影響を及ぼさない別の症状とを識別することを特徴とし、
ｉ）ヒトからの体液のサンプル中のヒトＮＧＡＬの濃度を決定し、
ｉｉ）該濃度をあらかじめ定められたカットオフ値、すなわち腎臓に影響を及ぼさない症状に関連するＮＧＡＬの低濃度を除外するように選択されたカットオフ値と比較し、該カットオフ値を超えた濃度が腎障害を示すとするステップを含むことを特徴とする方法に関する。
【０００９】
更に１つの態様において、本発明は腎障害の異なる度合間の識別をする。従って、例えば１つの態様において、本発明の方法は該濃度を第二カットオフ値と比較する更なるステップを含み、ここで該第二カットオフ値は透析による治療が要求されないような軽い程度の腎障害に関連するより低い濃度のＮＧＡＬを除くように選択され、この中でカットオフ値を超えた濃度は、透析による治療が要求されるようなより重篤な障害を示す。
【００１０】
ＡＲＦ、ＡＴＮまたはＡＴＩＮとなりうる腎損傷の他のマーカー分子の分析は、型にはまった臨床的な使用に至っていない、その理由は、これらの他のマーカーは、腎障害の進行の過程で尿中に現れるのが遅すぎ、医師が腎障害の進行を知らせるのに有効でなく、あるいは予防的または治療的方法を誘導できないからである。この問題は、腎障害の進行を検出するためにヒトサンプル（例えば、尿）中のＮＧＡＬの分析を用いる本発明によって解決した。
【００１１】
動物試験により、これが発作の開始後２、３時間以内に尿中で上昇するレベルで尿中に現れる腎臓の発作の最も早いマーカーであることが示唆される。このように、本発明による尿中のＮＧＡＬの分析は、他の障害と識別しながらＡＲＦ、ＡＴＮまたはＡＴＩＮになりうる腎損傷を検出する方法を提供する。そして進行速度が許すなら、進行を戻すために適当な方法を開始する。
【００１２】
ＮＧＡＬのレベルは好ましくは、免疫化学の方法で決定される。かかる方法の例には、これらに限らないが、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、側方流動法（lateral flow method）、またはディップスティック（dipstick）が含まれる。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
我々は、ヒトの尿サンプル中のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）濃度が感染症または炎症の容態にだけ適度に影響を受けることを見出した。しかし、ＮＧＡＬレベルは虚血性傷害に属する腎障害において顕著に上昇し、ＮＧＡＬの上昇は特にＡＴＮにおいて高い。更に、ＮＧＡＬの血清または血漿レベルが感染症または炎症の容態を必ずしも反映せず、白血病において生じうるように、または白血病治療結果のように、血液好中球カウントが極端に低い場合でさえ上昇し得ることを我々はここで見出した。実際、ランダムに選択された重篤な患者からの血液および尿のスポットサンプルを分析する場合、ヒト血清または血漿中のＮＧＡＬ濃度と尿中のＮＧＡＬ濃度の間には密接した相関があるが、一方これらのレベルと、末梢血液中の好中球カウントまたはＣ反応性タンパク質、すなわち炎症マーカーとして一般的に用いられる急性期タンパク質の濃度との相関は非常に乏しい。従って、特定の理論に縛られることなく、虚血、および腎臓のＮＧＡＬ発現を刺激できる他の作用に応答して、ＮＧＡＬが腎臓で生成され、尿中にだけでなく血中にも大量に放出されるという仮説が立てられ得、従って、米国特許第6,136,526号に示されているように、血清または血漿中のＮＧＡＬ測定の、炎症または細菌感染のマーカーとしての使用を混乱させている。
【００１４】
従って、本発明は、腎障害、特に腎臓の虚血剤または腎毒性剤による腎障害の診断用マーカーとして、体液（好ましくはいずれの好中球を除去したヒトの尿）のサンプルのＮＧＡＬの測定に関する。本発明において、腎障害を特異的に示すＮＧＡＬ濃度では、腎損傷を生じさせない感染症または炎症の容態または癌に起因しうるＮＧＡＬの低濃度を除外するには、設定されたカットオフ値を超えなければならない。
【００１５】
一つの態様における本発明の方法は、診断される個体からの尿サンプル、好ましくはいずれの好中球を除くために遠心分離した尿サンプル中のヒトＮＧＡＬ濃度を測定するステップ、および測定された濃度を、腎障害でなく見かけ上健康でありうるヒトにおいても、他の障害（例えば、炎症症状、細菌感染または癌）を有するヒトにおいても検出されるこれらの尿の濃度を超えるように決定して選択されたカットオフ値と比較するステップを含む。もし測定されたＮＧＡＬ濃度がカットオフレベルを超えるなら、このことはヒトが腎損傷を患っており、ＡＲＮ、ＡＴＮまたはＡＴＩＮに進行し得るか進行していることの指標である。
【００１６】
該カットオフレベルは、それ以下のレベルでは健常人でも、炎症、感染症もしくは癌の症状を患っている患者においても検出されうるので、許容できる程度の特異性を持って腎損傷の診断はできないレベルであり、好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬ以上のレベル、例えば、２５０ｎｇ／ｍＬと５２５ｎｇ／ｍＬの間の値で、例えば、２７５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４２５ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４７５ｎｇ／ｍＬ、または５００ｎｇ／ｍＬである。別の態様において、用いられるカットオフ値は１μｇ／ｍＬの値またはそれ以上の値である。好ましくは、尿のカットオフ値に対する陽性の予測値は、８０％以上、例えば８５％以上または９０％以上である。あるいはまた、尿のカットオフの陰性の予測値は、好ましくは８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、診断される個体からの血漿または血清サンプル中のヒトＮＧＡＬ濃度を測定するステップ、および測定された濃度を、腎障害でなく見かけ上健康でありうるヒトにおいても、他の障害（例えば、炎症症状、細菌感染または癌）を有するヒトにおいても検出されるこれらの血漿または血清濃度を超えるように決定して選択されたカットオフ値と比較するステップを含む。もし測定されたＮＧＡＬ濃度がカットオフレベルを超えるなら、このことはヒトが腎損傷を患っており、ＡＲＮ、ＡＴＮまたはＡＴＩＮに進行し得るか進行していることの指示である。
【００１８】
血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度に対するカットオフレベルは、尿でのレベルと類似し、好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬ以上のレベル、例えば３００ｎｇ／ｍＬまたはそれ以上の値、あるいは２５０ｎｇ／ｍＬと５２５ｎｇ／ｍＬの間の値、例えば、２７５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４２５ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４７５ｎｇ／ｍＬ、または５００ｎｇ／ｍＬである。好ましくは、血漿のカットオフ値に対する陽性の予測値は、８０％以上、例えば８５％以上または９０％以上である。あるいはまた、血漿のカットオフの陰性の予測値は、好ましくは８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上である。
【００１９】
本発明の更なる態様は、該方法がある種の透析が要求されるような重篤な腎臓の発作で、一般的に非常に高いＮＧＡＬの尿レベルを生じる発作を、ときどき透析が要求されうる程度だけのより重篤でない腎臓の発作で、一般的に尿ＮＧＡＬの低上昇を生じる発作を識別するのに用いられうることである。
【００２０】
このように、第二のより高いカットオフレベルは、それ以下のレベルではＮＧＡＬの尿レベルが透析の要求性を予測しないが、より低い程度の腎損傷を診断するレベルであり、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬと３０００ｎｇ／ｍＬの間、例えば、１２５０ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、１７５０ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２２５０ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、または２７５０ｎｇ／ｍＬのレベルである。好ましくは、より高いカットオフ値に対する陽性の予測値は、８０％以上、例えば８５％以上または９０％以上である。あるいはまた、より高いカットオフの陰性の予測値は、好ましくは７０％以上である。
【００２１】
本発明の更なる態様は、該方法が、それ自身がＮＧＡＬの体液レベルの上昇と関連しうるかしない別の疾患の観察下および／または治療下の患者において、腎臓障害の開始を検出するのに用いられることであり、ここで腎臓障害は可能な合併症である。この状況において、患者に潜んだ症状に関連する尿または血漿もしくは血清のＮＧＡＬ濃度は、毎日または短い間隔でモニタリングすることができ、腎臓障害の開始は、尿または血漿もしくは血清のＮＧＡＬ濃度の上昇が前記のレベルを超えることで示される。これらの状況の中で、腎臓障害の開始を示すＮＧＡＬ濃度の上昇の大きさは、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ以上、１５０ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、４００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上である。
【００２２】
本発明の更なる態様は、該方法が、自然増でおよび治療上の方法に応答しての両方で、上昇したＮＧＡＬレベルを生じさせる腎障害の進行をモニタリングするのに用いられうる。これらの状況において、ＮＧＡＬレベルにおける変化は腎損傷または再生の状態を反映するが、但し、いずれかの同時発生する炎症、感染症または癌の症状は、モニタリング期間中比較的安定のままである。体液のサンプルをモニタリングするのに採取する間隔は短く、従って腎損傷を最も早く指示することが可能であり、治療方法の早期設定を可能とする。腎障害を検出するのに体液中のＮＧＡＬレベルをモニタリングすることは、２４時間以内の間隔で実施するのが好ましく、３時間以内の提案された期間に間隔を短縮すること、あるいは例えば、発作が起こったことが知られたなら（例えば外科手術中）、さらに短いのがより好ましい。
【００２３】
体液サンプル（例えば尿サンプル）中のヒトＮＧＡＬの測定は、満足な分析の特異性、感度および精度を提供するいずれの方法によって実施され得る。好ましい方法はヒトＮＧＡＬに特異的な１またはそれ以上の結合分子を用いた結合アッセイである。かかる結合分子には、これらに限らないが、ＮＧＡＬのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または他の方法で産生された特定のＮＧＡＬ結合分子が含まれる。
【００２４】
好ましい方法において、組換ヒトＮＧＡＬに対して生じたモノクローナル抗体が用いられる。一つの抗体はサンプル（例えば尿サンプル）からのＮＧＡＬを捕らえる固体の支持体に結合し、一方、他方の抗体は当業者に公知の多くの方法のいずれかで検出可能な染色複合体、ビオチンまたは酵素のようなラベル体に結合する。該固体支持体は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）用のポリスチレンまたはポリビニルクロリド表面、またはラテックス（ポリスチレン）粒子、または圧縮ポリエチレン粒子から構成されるフィルターフリット、または多孔性ニトロセルロースマトリックス、または実際に免疫化学分析に用いられるいずれかの適当な支持体であってもよい。
【００２５】
本発明に従ったヒトの尿サンプル中のＮＧＡＬの測定の好ましい方法は、ディップスティック、側方流動またはミニカラム試験が含まれ、それらは迅速な、患者の近くでのサンプルの分析(near-patient analysis)を可能にする。しかし、本開示を読んで当業者が理解されるように、ＮＧＡＬを測定する他の方法を用いることができる。
【００２６】
好ましい態様において、本発明の方法は、ヒトまたは動物の身体において行う外科、治療または診断用ステップを含まない。
【００２７】
以下の制限するものでない実施例を、本発明を更に詳しく説明するのに提供する。
【００２８】
（実施例）
実施例１：ＮＧＡＬディップスティック(Dipstick)試験
ポリスチレン表面からなるディップスティックの分析範囲は、ヒトＮＧＡＬに対する捕獲抗体でコーティングされる。遠心沈降し、希釈したサンプルのアリコートを、第一のチューブ中のＮＧＡＬに対する検出抗体で酵素標識された抗体の溶液に加え、その中にディップスティックを浸す。酵素標識された検出抗体のＮＧＡＬとの複合体はディップスティックに結合し、それは次いで水道水で洗浄され、第二のチューブの中の発光基質溶液に入れる。所定の時間内に基質溶液で発光した色は、肉眼で尿サンプル中のＮＧＡＬ濃度を指示する色強度のチャートと比較して読み取るか、例えばＮＧＡＬ濃度を直接指示するようにプログラムされているサンプル比色計で読み取られる。
【００２９】
実施例２：ＮＧＡＬ側方流動装置
多孔性ニトロセルロース小片からなる側方流動装置は、その遠位末端近くで、トランスバースバンド(transverse band)として作用するＮＧＡＬに対する捕獲抗体でコーティングされる。検出抗体が得られる種の抗体に対する更なる抗体のトランスバースバンドは捕獲抗体バンドに遠位に置かれ、小片機能のコントロールとして用いられる。該小片の近位末端には、標識されたポリスチレン粒子または染色複合体の粒子に吸着または結合したＮＧＡＬに対する検出抗体が含まれる。遠心沈降した尿サンプルのアリコートを該小片の近位末端に適用する場合、検出抗体に付いた標識された粒子は毛管引力によって該小片に沿って移動する。捕獲抗体のバンドに達する場合、ＮＧＡＬと結合したこれらの粒子だけが保持され、検出可能なバンドを生じる。検出抗体に対する抗体のコントロールバンドに達する粒子は、いずれかのＮＧＡＬが結合しているかどうかを検出できるバンドを生じる。標識したバンドの強度は着色した粒子の場合は肉眼で、標識使用の場合は適当な検出装置によって読み取ることができる。陽性の結果は両バンドにおける顕色または標識の増大によって示され、一方、陰性の結果はコントロールバンドだけの顕色または他の標識によって示される。コントロールバンドにおける顕色または他の標識のないことは不適当な小片機能を示している。試験の感度は、用いるサンプルの希釈によって制御することができ、所定のカットオフ値を超えたＮＧＡＬ濃度だけが陽性結果を生じるように調整される。試験の感度はまた、標識および非標識の粒子の混合物に検出抗体を結合させることによっても調整される。小片のバッチは、定量のまたは半定量の結果が該装置から読み取れるように、あらかじめ校正され、検出装置で読み取れるキャリブレーションコードを備えられうる。この側方流動技術の個々の態様の多くのバリエーションは、当業者に知られているように可能である。
【００３０】
実施例３：ＮＧＡＬミニカラム試験
ミニカラムは、体液および細胞の通過が可能な圧縮されたポリエチレン粒子から作られたフリットを含む。該フリットはヒトＮＧＡＬに対する捕獲抗体でコーティングされる。該ミニカラムは装置に組み込まれ、 自動液体ハンドリングによって、希釈されたサンプルを固定された流速および量で適用させ、続いて色素を複合化した検出抗体を適用させる。洗浄溶液を通した後、フリットの着色強度は、光散乱測光法(light diffusion photometry)で読み取る。定量結果がスタンダードを用いたあらかじめのキャリブレーションが必要でない器具によって示すことができるように、フリットのバッチはあらかじめ校正され、ミニカラムは装置で読み取れるキャリブレーションコードを備えている。
【００３１】
実施例４：ＮＧＡＬサンドウィッチＥＬＩＳＡ
スタンダードとしておよびキャリブレーター物質として使用するための精組換ヒトＮＧＡＬは、Kjeldsen et al. (1996)によって記載のように製造した。ＮＧＡＬに対する抗体は、Kjeldsen et al. (1993; 1996)によって記載された抗体であった。ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートは、０.０５Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９.４）中２μｇ／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェルで適用し、４℃で、終夜抗体２１１−１で覆った。ウェルを空にし、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ ７.４）の洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロッティングした。希釈緩衝液（０.１ｍｇ／ｍＬでウシアルブミンを含む洗浄緩衝液）中のキャリブレーターおよびサンプルの希釈液は、１００μＬの容量でウェルに適用させ、振とう台上で１時間室温でインキュベートした。ウェルを次いで前のように空にし、洗浄し、ブロッティングした。希釈緩衝液中の０.２５μｇ／ｍＬのビオチン化抗体２１１−２を、１００μＬ／ウェルで各ウェルに加え、振とう台上で１時間室温でインキュベートした。ウェルを次いで前のように空にし、洗浄し、ブロッティングした。希釈緩衝液中１／２０００の希釈での西洋わさびペルオキシダーゼおよびストレプトアビジン（Zymed， CA）の複合体を、１００μＬ／ウェルで各ウェルに加え、振とう台上で１時間室温でインキュベートした。ウェルを次いで前のように空にし、洗浄し、ブロッティングした。テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を含む基質溶液（ＴＭＢ−ＯＮＥ， Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃｈ，デンマーク）を次いで、１００μＬ／ウェルで各ウェルに適用し、正確に８分間暗所で室温でインキュベートし、その後各ウェルに１Ｍ硫酸５０μＬを加えて、呈色反応を終了した。ウェルの４５０ｎｍの波長での吸光度は次いでＥＬＩＳＡプレートリーダー中読み取り、６５０ｎｍでの吸光度を差し引いた。サンプル中のＮＧＡＬの濃度を次いで、公知の濃度のキャリブレーターの吸光度の読み取りから作成した標準曲線から計算した。
【００３２】
アッセイは、２.４ｐｇ／ｍＬの検出限界（０からの偏差の９５％信頼限界）で、０.０２ｎｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬの範囲を有し、精製したキャリブレーターおよびサンプルの希釈液の間に類似性が見られた。ＮＧＡＬの濃度は、通常のヒト血清プール中９０ｎｇ／ｍＬであり、通常のヒト尿プール中５.４ｎｇ／ｍＬであった。
【００３３】
更に実施例は、腎障害に関する診断的価値の評価、病院の集中治療室に入っている成人の患者の任意からの血清または血漿および尿中におけるＮＧＡＬ測定の評価と共に、臨床的および準臨床的関係を示す。ＮＧＡＬは、すべての本質的な詳細において、上記実施例４に記載された方法に類似するサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定した。
【００３４】
実施例５：初期の臨床的および準臨床的関係
病院の集中治療室に収容されている成人の患者の任意１１人からの尿および血清の単回のスポットサンプル中のＮＧＡＬ濃度を表１に示し、臨床および準臨床データと比較する。
【表１】
2008524610.tif 000003
スペアーマン(Spearman)の順位相関係数
ｕ−ＮＧＡＬ／s−ＮＧＡＬ： r ０.９４５ P <<０.００１
ｕ−ＮＧＡＬ／p−クレアチニン：r ０.４１８ P ０.１
ｓ−ＮＧＡＬ／好中球カウント：r ０.２７３，有意差なし
ｓ−ＮＧＡＬ／ｓ−ＣＲＰ：r ０.０６４，有意差なし
【００３５】
すべての患者で尿のＮＧＡＬ濃度が上昇した。血清と尿中ＮＧＡＬレベルの間には非常に密接な関係があったが、尿中ＮＧＡＬと血漿クレアチニンの間には中程度の関係のみであった。ＡＴＮとして臨床的に診断される場合は、血漿クレアチニン中に有意な上昇がない時に、極端に高い尿中ＮＧＡＬを特徴とした。血清ＮＧＡＬと好中球カウントの間の乏しい関係は、血清ＮＧＡＬが好中球を反映していないことを示す。特に、尿および血清ＮＧＡＬの両方が患者番号３においては上昇したが、急性リンパ性白血病のため好中球カウントはわずか２.０×１０９／ｍＬであり、患者番号６においては急性骨髄性白血病のため数えられないほどの低い数の好中球であった。更に、ＣＲＰとの相関の欠如はｓ−ＮＧＡＬが単に急性期タンパク質でないことを示す。保存サンプルの繰り返し分析は、ＮＧＡＬが、血清サンプル中ではより安定ではあるが、尿サンプル中では安定性が制限されうることを示した。該結果は器官の損傷、特にこれに限らないが腎臓の損傷によってＮＧＡＬが産生されることを示唆する。それは血液にあふれ、尿中に排泄される。しかし、ＡＴＮにおける腎臓のＮＧＡＬも尿に直接通過して、ＮＧＡＬの非常に高い尿濃度を生じる。
【００３６】
サンプリングの期間、腎障害の臨床的な診断がなかった患者番号３および４は、患者のｐ−クレアチニンがその時間で通常範囲内にあり、大動脈瘤破裂後無尿のために血液透析を受けている患者番号２よりも高い尿中ＮＧＡＬレベルを有した。２人の患者（番号３および４）は、重症感染のため腎臓の虚血性傷害が進行したかも知れず、ＡＴＮを有すると臨床的に診断された患者番号５においても観察されたように、いずれかのｐ−クレアチニン上昇に先んじて起こる尿中ＮＧＡＬが上昇した。
【００３７】
実施例６：集中治療室に収容された任意の成人患者における尿および血漿ＮＧＡＬ測定の腎障害に関する診断力
病院の集中治療室に収容された１０９人の連続する患者から各朝集められた尿および血漿サンプルで、ＮＧＡＬを測定した。退院時要約および決まりきった血液検査の結果に基づき、これらの患者の６０人を入院の間腎障害があったものおよびなかったものに（盲目的にＮＧＡＬデータに関して）分類することは可能であった。残りの４９人の患者を十分な確実性を持って分類することは不完全なデータのためできず、これらの患者は分析から除外した。６０人の臨床的に分類できる患者からの尿および血漿におけるＮＧＡＬ濃度の最大値は表２に示す。次いで、各分類された患者からの尿および血漿中で達したＮＧＡＬの最大濃度の腎障害に関する診断力は、尿および血漿値について受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットして決定した。毎日の尿および血漿ＮＧＡＬ値の経時変化も、各患者についてプロットされ、血漿クレアチニン値のような準臨床データと比較された。
【００３８】
【表２−１】
2008524610.tif 000004
【表２−２】
2008524610.tif 000005
【００３９】
図１は、腎障害の診断に関する尿ＮＧＡＬの最大値でのＲＯＣ曲線を示す。曲線下の面積は０.９３０であり、尿ＮＧＡＬの濃度が腎障害と診断されない下のカットオフ値は、３７０ｎｇ／ｍＬと３２９ｎｇ／ｍＬの間であると決定された。この範囲におけるカットオフで、診断の感度は９６.９％、診断の特異性は８９.３％、陽性適中率は９１.２％、および陰性適中率は９６.２％であった。
【００４０】
図２は、腎障害の診断に関する血漿ＮＧＡＬの最大値でのＲＯＣ曲線を示す。曲線下の面積は０.９１４であり、血漿ＮＧＡＬの濃度が腎障害と診断されない下のカットオフ値は、４３６ｎｇ／ｍＬと３５５ｎｇ／ｍＬの間であると決定された。この範囲におけるカットオフで、診断の感度は８４.８％、診断の特異性は９６.３％、陽性適中率は９３.１％、および陰性適中率は８３.９％であった。
【００４１】
透析要求の診断
腎障害の患者は、観察された尿中ＮＧＡＬの最大値に関して２つのグループに分類された。第一のグループ（１１人の患者）は、１３３７ｎｇ／ｍＬ以下の尿中ＮＧＡＬ値で特徴付けられ、他の臨床および準臨床データによって判断されるような腎障害のより軽い程度の患者が含まれた。このグループのうち、３人の患者は血液透析の何らかの形体を受けていた。第二のグループ（２１人の患者）は、２６７２ｎｇ／ｍＬ以上の尿中ＮＧＡＬ値で特徴付けられ、ＡＴＮまたはＡＴＩＮを有するとして臨床的に診断された１７人の患者が含まれた。このグループのうち、２０人の患者は血液透析の何らかの形体を要求されていた。尿中ＮＧＡＬ濃度が透析の必要性を予期しないが、腎障害のより軽い程度の診断がされ得る値の下であるカットオフ値は、したがって１３３８と２６７２ｎｇ／ｍＬの間である。
【００４２】
図３は、透析が要求される腎障害の診断に関する尿中ＮＧＡＬの最大値でのＲＯＣ曲線を示す。曲線下の面積は０.８０７であり、尿ＮＧＡＬの濃度が透析要求と診断されない下のカットオフ値は、１３３８ｎｇ／ｍＬと２６７２ｎｇ／ｍＬの間であることが確認された。この範囲におけるカットオフで、診断の感度は８７.０％、診断の特異性は８８.９％、陽性適中率は９５.２％、および陰性適中率は７２.７％であった。
【００４３】
ＮＧＡＬ値の経時変化
毎日の尿および血漿ＮＧＡＬ値の経時変化をプロットし、個々の分類された患者における臨床および準臨床データと比較した場合、先述のレベルを超える尿中ＮＧＡＬにおける８６ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬおよび２００ｎｇ／ｍＬの上昇が、退院時要約に記録されたようにまたは上昇した血漿クレアチニンレベルによって示されたように、腎機能の悪化に関連したことが観察された。先述のレベルを２００ｎｇ／ｍＬ以上超える尿中ＮＧＡＬにおける上昇は、該上昇が３２９ｎｇ／ｍＬのカットオフレベルを超える尿中ＮＧＡＬレベルをもたらす場合、腎機能の低下にも関連していた。尿ＮＧＡＬにおいてこのタイプの介入性の上昇を明らかに示す患者の数は、その上昇の大きさに関して急性腎不全についての診断値の意味ある分析を可能にするほど十分な大きさではなかった。
【００４４】
いくつかのケースで、尿ＮＧＡＬにおける上昇と低下する腎機能のための血漿クレアチニンの上昇との間に平行関係があった。図４では、腹部大動脈瘤破裂の急性に手術した老人男性患者における尿中ＮＧＡＬおよび血漿クレアチニンのかかる平行した上昇を示す。ここで、出血および大動脈狭窄のための腎臓への虚血性発作は、最初の血漿および尿サンプルの前日に起こったので、尿中ＮＧＡＬおよび血漿クレアチニンの初期のレベルはどちらも腎不全の程度を示した。
【００４５】
先述の値を超える２００ｎｇ／ｍＬ以上で、３２９ｎｇ／ｍＬのカットオフレベル以下のままである値までの尿ＮＧＡＬにおける上昇は、腎臓に必ずしも影響を与えない別の症状、例えば、敗血症のためであり得るので、急性腎不全の診断用ではない。血漿クレアチニンレベルが集中治療室での臨床過程の間ずっと通常の範囲でよく残ったという事実によって支持されるように、図５は腎機能に影響を及ぼさない敗血症の進行に関連する尿中ＮＧＡＬにおけるかかる上昇を示す。
【００４６】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、病院の集中治療室に収容された６０人の成人患者における腎障害の診断に関する尿ＮＧＡＬの最大値の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。腎障害を有するか有しないかのような他のデータから分類されうる患者だけが含まれた。
【図２】図２は、図１と同じ患者における腎障害の診断に関する血漿ＮＧＡＬの最大値の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図３】図３は、病院の集中治療室に収容され、腎障害を有すると臨床的に診断された３２人の成人患者における透析が要求される診断に関する尿中ＮＧＡＬの最大値での受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図４】図４は、腹部大動脈瘤破裂の急性に手術した老人男性患者における尿ＮＧＡＬおよび血漿クレアチニン値の経時変化を示す。
【図５】図５は、腎機能に影響を及ぼさない敗血症が進行した女性患者における尿ＮＧＡＬおよび血漿クレアチニン値の経時変化を示す。腎障害の診断の尿ＮＧＡＬカットオフレベル（３２９ｎｇ／ｍＬ）および女性の血漿クレアチニンの通常の上限（０.０８８ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【図１】
2008524610.tif 000006
【図２】
2008524610.tif 000007
【図３】
2008524610.tif 000008
【図４】
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【図５】
2008524610.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月21日(2007.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト体液サンプル中のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の濃度判定方法であって、
ｉ）ヒトからの体液サンプル中のＮＧＡＬの濃度を測定し、
ｉｉ）該濃度をあらかじめ定められたカットオフ値、すなわち腎臓に影響を及ぼさない症状に関連するＮＧＡＬの濃度より低濃度を除外するように選択された２５０ｎｇ／ｍＬ以上のカットオフ値と比較することを特徴とする方法。
【請求項２】
サンプルが尿サンプルである請求項１の方法。
【請求項３】
サンプルが血漿または血清サンプルである請求項１の方法。
【請求項４】
カットオフ値が炎症性障害に関連するＮＧＡＬの濃度より低濃度を除外するように選択されている請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
カットオフ値が感染性障害に関連するＮＧＡＬの濃度より低濃度を除外するように選択されている請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
カットオフ値が癌性の障害に関連するＮＧＡＬの濃度より低濃度を除外するように選択されている請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
ステップｉ）およびｉｉ）を１回以上更に繰り返すステップを含む請求項１〜６のいずれかの方法。
【請求項８】
２４時間以内に、ステップｉ）およびｉｉ）を更に繰り返すステップを含む請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
腎障害の治療が開始または完了した後、ステップｉ）およびｉｉ）を更に繰り返すステップを含む請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１０】
腎障害が虚血後の腎損傷である請求項９のいずれかの方法。
【請求項１１】
腎障害が急性腎不全、急性腎尿細管壊死または急性尿細管間質性腎障害を引き起こしうる障害である、請求項９〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
腎障害が腎毒性剤で引き起こされる請求項９〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
該濃度を第二カットオフ値、すなわち透析よる患者の処置が要求されないような程度の腎障害に関連するＮＧＡＬの濃度より低濃度を除外するように選択された第二カットオフ値と更に比較するステップを含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
該第二カットオフ値が１０００ｎｇ／ｍＬと３０００ｎｇ／ｍＬの間である請求項１３の方法。
【請求項１５】
ＮＧＡＬがＮＧＡＬに特異的に結合する分子を用いて測定されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
腎障害の発症モニタリング用のヒト体液サンプル中のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の濃度判定方法であって、
ｉ）ヒトからの体液サンプル中のＮＧＡＬの濃度を測定し、
ｉｉ）所定の時間後同一のヒトから更に採取した体液のサンプルにおいてステップｉ）を繰り返し、
ｉｉｉ）ステップｉ）およびｉｉ）で得られた濃度と比較して、第二サンプル中の濃度の上昇が５０ｎｇ／ｍＬ以上であるか否か判定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
ＮＧＡＬ濃度の上昇の判定値が１００ｎｇ／ｍＬ以上である請求項１６の方法。
【請求項１８】
ステップｉｉ）およびｉｉｉ）を１回以上更に繰り返すステップを含む請求項１６の方法。
【請求項１９】
所定の時間が２４時間以内である請求項１６〜１７のいずれかの方法。
【国際調査報告】
2008524610.tif 000011
2008524610.tif 000012
2008524610.tif 000013