(57)【要約】【解決手段】本発明は、後の移植のためにドナー臓器から分離される膵島の生着性及び回復性を高める方法に関する。望ましい実施例において、膵島は、ドナー膵臓から分離され、糖尿病患者の肝臓に移植される。一種以上の乳化されたパーフルオロカーボン（ｅＰＦＣ）を、膵島単離及び移植の前にドナー膵臓に注入する。ｅＰＦＣは、膵島の酸素化を高め、それらが厳しい単離処置、例えばエドモントンプロトコールに耐えることができるように、生着性及び健康状態を高める。本発明は、ｅＰＦＣを使ってドナー臓器を保存するだけでなく、単離及び移植処置中にて損傷又は破壊されかねない膵島及びドナー臓器を救い出す。分離された膵島は、肝臓の門脈に注入されて、インスリンの生成と血糖値の調整を支援する。【選択図】図２
2008532547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島を単離する方法であって、
少なくとも一種の乳化されたパーフルオロカーボンをドナー臓器に導入し、
ドナー臓器から膵島を分離すること、
を含んでいる、膵島を単離する方法。
【請求項２】
ドナー細胞は、ヒトの膵臓を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一種の乳化されたパーフルオロカーボンは、パーフルオロデカリン及びパーフルオロオクチルブロミドを含む群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
乳化されたパーフルオロカーボンは、約４０〜９０重量パーセントのパーフルオロカーボンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
乳化されたパーフルオロカーボンは、複数のミセルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
各ミセルは、平均サイズが約２７５〜３１０ミクロンの範囲である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
各ミセルは、平均サイズが約２９０ミクロンである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
約２０〜１５０ミリメートルの乳化されたパーフルオロカーボンが、ドナー臓器に導入される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
乳化されたパーフルオロカーボンは、注入によってドナー臓器に導入される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
乳化されたパーフルオロカーボンは、注入によって膵臓に導入され、膵管に入る請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
膵島は、エドモントンプロトコールによってドナー臓器から分離される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＴＰレベルは、乳化されたパーフルオロカーボンの導入により増加する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＴＰレベルは、乳化されたパーフルオロカーボンの導入によってほぼ同じ状態である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
組織エネルギー変化は、乳化されたパーフルオロカーボンの導入により増加する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
組織エネルギー変化は、乳化されたパーフルオロカーボンの導入によってほぼ同じ状態である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
乳化されたパーフルオロカーボンは、使用に不適当であると考えられかねないドナー臓器を救い出す請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
膵島を移植する方法であって、
乳化されたパーフルオロカーボンをドナー臓器に導入し、
ドナー臓器から膵島を分離し、
分離された膵島を目的臓器に移植すること、
を含む、膵島を移植する方法。
【請求項１８】
ドナー細胞は、ヒトの膵臓を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的臓器は、糖尿病患者の肝臓を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも一種の乳化されたパーフルオロカーボンは、パーフルオロデカリン及びパーフルオロオクチルブロミドを含む群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
乳化されたパーフルオロカーボンは、約４０〜９０重量パーセントのパーフルオロカーボンを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
乳化されたパーフルオロカーボンは、複数のミセルを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
各ミセルは、平均サイズが約２７５〜３１０ミクロンの範囲である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
各ミセルは、平均サイズが約２９０ミクロンである請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
約２０〜１５０ミリメータの乳化されたパーフルオロカーボンが、ドナー臓器に導入される請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
乳化されたパーフルオロカーボンは、注入によってドナー臓器に導入される請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
乳化されたパーフルオロカーボンは、注入によって膵臓に導入され、膵管に入る請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
膵島は、エドモントンプロトコールによってドナー臓器から分離される請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＴＰレベルは、乳化されたパーフルオロカーボンの導入により増加する請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
ＡＴＰレベルは、乳化されたパーフルオロカーボンの導入によってほぼ同じ状態である請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
組織エネルギー変化は、乳化されたパーフルオロカーボンの導入により増加する請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
組織エネルギー変化は、乳化されたパーフルオロカーボンの導入によってほぼ同じ状態である請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
乳化されたパーフルオロカーボンは、使用に不適当であると考えられかねないドナー臓器を救い出す請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜発明の分野＞
本発明は、膵島を単離及び移植する方法に関するものであり、より具体的には、パーフルオロカーボン乳剤（ｅＰＦＣ）(perfluorocarbon emulsification)を用いて、膵島の生着率を高めることに関する。
【背景技術】
【０００２】
＜背景情報＞
膵島は、膵臓内でインスリンを生成する細胞を含む多細胞体である。平均的なヒトは、約１００万の膵島を有しており、それらは、膵臓内の細胞総数のおよそ３パーセントを占めている。膵臓は、ランゲルハンス島を有しており、これは、インスリンを生成するβ細胞を収容している。β細胞は、血液中の血糖値をモニターし、精細に測定された量のインスリンを放出し、血糖ピークを平衡させる。１型糖尿病及び２型糖尿病は、これらのβ細胞の９０パーセント以上が損傷を受けた場合に発症する。
【０００３】
「エドモントンプロトコール」は、健康な膵島を糖尿病患者に移植するものである。エドモントンプロトコールを用いた膵島移植は、[Shapiro, Ryan, and Lakey, Clinical Islet Transplantation - State of the Art, Transplantation Proceedings, 33, pp. 3502-3503 (2001); Ryan et al., Clinical Outcomes and Insulin Secretion After Islet Transplantation With the Edmonton Protocol, Diabetes, Vol. 50, April 2001, pp. 710-719; and Ryan et al., Continued Insulin Reserve Provides Long- Term Glycemic Control, Diabetes, Vol. 51, July 2002, pp. 2148-2157]に記載されている。肝臓に入ると、細胞は、血液供給を発達させ、インスリンの生成を始める。エドモントンプロトコールは、使用される方法によって、７〜１０のステップを含んでいる。最初のステップは、ドナー膵臓への特異的酵素（リベラーゼ）の送達が含まれ、それは、膵臓組織は消化(digests)されるが、膵島は消化されない。消化ステップの次に、膵島を膵臓内の他の細胞から分離するいくつかの連続的なステップがある。分離された膵島は、門脈として知られている肝臓の主血管に移植される。肝臓は、損傷を受けた場合、それ自体を再生でき、新たな血管を作って、組織をサポートする。それゆえに、膵島が肝臓に移植された場合、新規な血管が形成され、膵島をサポートすると考えられている。細胞が生成するインスリンは、これらの周囲血管を通じて血流中に吸収され、全身に広がって、血液中血糖値を制御する。
【０００４】
つまり、エドモントンプロトコールのステップは、膵島の生着率を犠牲にする厳しいプロセスを構築し、膵島は、脆弱な三次元構造を有しており、増殖及び生着率のために多量の酸素を必要としている。このプロセス中、膵島は、酸素送達の条件が最適でなければ損傷又は破壊され、所定のドナー膵臓から取り出される健康な膵島の収率に影響を及ぼす。さらに、膵島移植は、ドナー入手可能性によって厳しい制限を受け、一人の患者をインスリン非依存とするには、２つの膵臓が必要となることが多い。このため、膵島の損傷が緩和され、一人のドナーからの移植によってインスリン非依存を可能にする、単離及び移植の改善された方法が求められている。
【０００５】
一人のドナーからの移植の割合の改善について、膵臓保存の二層法（ＴＬＭ）を用いた報告がある。例として、[Salehi et al., Ameliorating ischemic injury during preservation and isolation of human islet cells using the two layer method with perfluorocarbon and University of Wisconsin solution, Transplantation 2005 (in press); Lakey et al., Human Pancreas Preservation Prior to Islet Isolation, Cell Preservation Technology, Vol. 1, No. 1, 2002, pp. 81-87; 及び、Tsujimura et al., Human Islet Transplantation From Pancreases with Prolonged Cold Ischema Using Additional Preservation by the Two-Layer (UW Solution/ Perfluorochemical) Cold-Storage Method, Transplantation, Vol. 74, No. 12, Dec. 27, 2002, pp. 1687-1691]を参照。ＴＬＭは、ウィスコンシン大学（ＵＷ）の溶液を、パーフルオロデカリンのようなパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）と共に用い、ヒトの膵臓を保存している。ＵＷは、長年に亘って臓器保存に用いられている。それには、ラクトビオン酸のような細胞非透過性剤が含まれており、これは、抗酸化剤として機能するグルタチオン及び、アデノシン・トリホスファターゼ合成のために重要なアデノシンと同様に、保冷中、細胞の膨張を防ぐ。ＰＦＣは、水とは混ざらないが、膵臓の保存に有用であるのは、ＰＦＣは、酸素貯蔵能力が高く、酸素結合定数が低いからであり、これにより、多量の酸素を貯蔵し、虚血臓器へ効果的に送達することができる。ＴＬＭ法によれば、臓器は、ＵＷとＰＦＣの入った容器に浸し、臓器は、２つの液体の界面に位置するように配置して保存される。
【発明の開示】
【０００６】
＜発明の要旨＞
本発明は、後で移植するためにヒトのドナー臓器から分離される、膵島の生着率を向上する方法を提供する。望ましい実施例では、膵島は、ドナー膵臓から分離され、糖尿病患者の肝臓に移植される。本発明は、細胞単離及び移植の前に、一種以上の乳化されたパーフルオロカーボン（ｅＰＦＣ）をドナー膵臓に注入することを含んでいる。ｅＰＦＣは、膵島の酸素化を高め、健康状態及び生着率を高めることで、それらが厳しい単離処置に耐えることができるようにする。本発明は、ｅＰＦＣを用いてドナー臓器を保存するだけでなく、単離及び移植処置中に損傷又は破壊されかねない膵島を救うものである。分離された膵島は、肝臓の門脈に注入され、そこで、膵島は、血液を供給し、インスリンの生成と、血糖値の調整を支援する。
【０００７】
本発明の目的は、膵島を単離する方法を提供することであって、該方法には、少なくとも一種の乳化されたパーフルオロカーボンをドナー臓器に導入し、ドナー臓器から膵島を単離することを含んでいる。
本発明の他の目的は、膵島を移植する方法を提供することであって、該方法は、乳化されたパーフルオロカーボンをドナー臓器に導入し、ドナー臓器から膵島を分離し、分離された膵島を目的臓器に移植することを含んでいる。
本発明の別の目的は、膵島への酸素供給を増大することであって、それによって、これら細胞の健康状態及び生着率を高め、それらが単離及び移植処置に耐えることができるようにすることである。
【０００８】
本発明の他の目的は、単離及び移植プロセス中に損傷又は破壊される膵島の数を低減し、生着能力のある健康な移植細胞の収率を増大することである。
本発明の他の目的は、インスリン非依存性を達成するために、複数のドナー臓器が必要となることを軽減することである。
本発明の他の目的は、ドナー臓器を、より長い輸送時間に持ちこたえるようにすることである。
【０００９】
本発明の他の目的は、使用に不適当と考えられかねないドナー臓器を救い出すことである。
本発明の他の目的は、様々な品質のドナー臓器のために用いられる単離処置を標準化することである。
本発明のこれら及びその他の側面は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から、より容易に明らかになるであろう。
【００１０】
＜表＞
表１は、ラットの膵臓を対象に実施した実験に関する、膵島の一覧(enumeration)、サイズ及び生着率を表している。
表２は、ヒトのドナー膵臓を用いて行った実験に関する、経時的な組織ＡＴＰレベルを表している。
表３は、ヒトのドナー膵臓を用いて行った実験に関する、経時的な組織エネルギー変化を要約したものである。
【００１１】
＜詳細な説明＞
本発明は、後の移植のためにヒトのドナー臓器から分離される膵島の生着率と回復を向上する方法を提供するものである。望ましい実施例において、膵島は、ドナー膵臓から分離され、糖尿病患者の肝臓に移植される。本明細書に含まれる説明は、主として、肝臓への細胞移植を意味するが、本発明は、その他の目的、例えば精巣に使用されることもできると理解されるべきである。本明細書で用いられる場合、患者、ドナー及びドニーなる用語は、人間と動物界の構成員を意味する。
【００１２】
本発明は、細胞の単離及び移植の前に、一種以上の乳化されたパーフルオロカーボン（ｅＰＦＣ）をドナー膵臓に導入することを含んでいる。この導入は、ドナー膵臓への注入によって実現され、それは、ドナー膵臓へのｅＰＦＣの注入も含まれる。ｅＰＦＣは、膵島の酸素化を高め、それによって、それらがエドモントンプロトコールのような厳しい単離処置に耐えることができるように、健康状態及び生着率を高めることができる。本発明は、ｅＰＦＣを用いてドナー臓器を保存するだけでなく、単離及び移植処置によって損傷又は破壊されかねない膵島を救うものである。
【００１３】
ｅＰＦＣは、水と、パーフルオロデカリン又はパーフルオロオクチルブロミドのようなあらゆる適当なＰＦＣの注入可能な乳剤(emulsification)を含んでいる。ＰＨＥＲ−Ｏ２は、Sanguine Corporationによって製造された商業的に利用可能なｅＰＥＣの一例である。乳剤中のＰＦＣミセルは、特定サイズに限定されるものではなく、各ミセルの平均サイズ(例えば、幅)は、望ましくは、約２７５〜３１０ミクロンの範囲であり、最も望ましいミセルサイズは約２９０ミクロンである。乳剤は、混濁又は不透明に見える。乳剤中のＰＦＣの量を変える場合、約４０〜９０重量パーセントの範囲とすることが望ましい。一般的なドナー膵臓の場合、単離前の膵島の生着率を高めるために、２０〜１５０ミリメートルの乳剤を用いることができる。乳剤は、膵管の膨張又は破裂を避けるために、小さな部分にゆっくりと注入する。しかしながら、ＰＦＣの量及び乳剤の総量は、使用される注入法と同様に、ドナー臓器の品質、健康状態及びサイズと、ドナーから取り出された時間と、臓器を輸送する方法によって、上記の値とかなり異なる又は離れることもある。
【００１４】
ｅＰＦＣは、調製及び瓶詰めされた後、無菌酸素を使用し、一定期間、酸素化される。次に、乳剤は、細い針、カニューレ、プラスチックチューブ又は同様なデバイスを用いて、ドナー膵臓の膵管に注入される。膵島単離処置の第１ステップ（酵素消化）の前に、乳剤は、約４時間そのまま放置し、十分に酸素化させる。注入は、ミセル状態において、ＰＦＣが、より大きい表面積となり、より多数の膵島と接触するから、膵臓を溶液に浸すことよりも望ましい。その一方で、ＰＦＣとＵＷのＴＬＭ溶液は、臓器に注入することはできない。一旦注入が行なわれると、ｅＰＦＣは、膵臓内に含まれている膵島に酸素を放出する。ＰＦＣからの酸素放出は、ＰＦＣを人工血液として使用する多くの試行により十分に立証されている。
【００１５】
ｅＰＦＣ注入後、エドモントンプロトコール又は別の適した処置を施して、ドナー膵臓中で他の細胞から膵島を分離する。エドモントンプロトコールは、複数のステップを含む。例として、管還流(ductal perfusion)を通じた膵臓の膨張と、それに続く酵素及び機械的消化と、密度勾配遠心分離法を用いた膵島の精製が挙げられる。酵素消化ステップは、一般的に多くの膵島を損傷や破壊を伴う厳しいプロセスであって、生着可能で移植可能な単離後の細胞の収率低下をもたらす。しかしながら、ｅＰＦＣを注入することで、膵島を成長させるためにより多くの酸素を利用することができ、これにより、これら細胞の多数は、酵素破壊と、プロセスのその他の機械的ステップの中で生き延びることができる。
【００１６】
細胞小器官のような膵島は、特殊な形状及び機能を有しており、膵島ユニット内に１タイプ以上の細胞（例えば、β細胞）を含んでいる。特異的細胞の優秀性(goodness)（すなわち、健康状態及び生着率）を決定するために多くのパラメータが用いられる。生着率は、１）ＡＴＰレベルの決定と、２）組織エネルギー変化(Tissue Energy Change)の測定を指標とすることができる。
【００１７】
エドモントンプロトコールを用いた一般的な単離処置中、ＡＴＰレベルは減少する。しかしながら、ｅＰＦＣがドナー膵臓に注入される場合、ＡＴＰレベルは、実際に同じ状態のまま又は、続く単離処置にて増加する。ｅＰＦＣ注入の後、ＡＴＰレベルは、ｅＰＦＣが注入されていない臓器と比べて、何倍にも増加した。ＡＴＰの上昇は、ｅＰＦＣが、膵臓細胞の優秀性を向上又は救い出し、それらが厳しい単離処置に耐えることができるようにすることを示唆している。ＡＴＰの上昇は、さらに、ｅＰＦＣが、膵臓から単離される、生着力のある健康な移植細胞の収率を増大させることを示唆している。特定の死因により、膵臓内の細胞の優秀性に悪影響が及び、その結果として、特定のドナー臓器が、使用に不適当と考えられることがある。しかしながら、ＡＴＰの上昇は、ｅＰＦＣが、死因によって拒絶されかねないドナー臓器を救い出すために使用できることを示唆している。ＡＴＰの上昇は、さらに、ｅＰＦＣによって、ドナー臓器を、内部に含まれる細胞の生着率を殆ど犠牲にすることなく、長時間の輸送を許容できることを示唆している。ＡＴＰのように、組織エネルギー変化は、ｅＰＦＣが無い場合に減少し、ｅＰＦＣを加えた場合に同じ状態のまま又は増大する傾向がある。ラットの膵臓と、ヒトのドナー臓器を対象に実施された実験の詳細を以下に示している。
【実施例】
【００１８】
＜実施例１＞
ＵＷ、ＴＬＭ及びｅＰＦＣの有効性を比較するために、後の単離にラット膵臓が維持する能力の実験を行った。６つのラット膵臓を、３つのグループとした。グループ１は、ＵＷの溶液に浸し、グループ２は、ＵＷとＰＦＣの界面にＴＬＭを使用して浸し、グループ３は、ｅＰＦＣを注入した。ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を膵臓の膨張に使用したのは、ｅＰＦＣでは適切な膨張には至らないからである。
【００１９】
２つの膵臓を、５００ｍＬのポリプロピレン製の長手広口瓶の入れられた３つの異なった溶液のうちの１つに移した。グループ１は、６０ｍＬのＵＷ溶液であり、グループ２は、６０ｍＬのＵＷ溶液（「Viaspan」）と６０ｍＬのＰＦＣ（３０分間１００％酸素で予め酸素化されている）からなる２層溶液であり、グループ３は、６０ｍＬのｅＰＦＣ（３０分間１００％酸素で予め酸素化されている）であった。使用した非混和性ＰＦＣ及びｅＰＦＣは、ＰＦＣの一種であるパーフルオロデカリンを含有していた。３つのグループすべてにおいて、金属製グリルを膵臓の上に用いた。特に、グループ２では、膵臓がＵＷとＰＦＣの界面に位置するように配置して、浮動を防止した。３つのすべての容器は、直ちに氷の上に置き、１８時間冷蔵保存（〜４℃）した。
【００２０】
１８時間の冷蔵保存後、膵臓を冷蔵保存から取り出し、膵島を、標準的な技法を用いて単離した。取り出した膵島を、およそ２５ｍｌのＨＢＳＳ＋を含むチューブに入れ、２分間５００ｘｇで遠心分離器で分離し、次に、ＨＢＳＳ＋を用いて洗浄し、１時間３７℃のＭ１９９溶液に入れた。
【００２１】
ランダムに選んだサンプルを取り出し（１００μｌ又は１：５０）、染色用の７滴ジチゾンに留置した。５〜１０分後、サンプルを、ペトリ皿に塗りつけ、２つのブラインド式エニュメレータ(blinded enumerators)で、 顕微鏡検査下でグリッドシステムを使用してカウントした。このグリッドシステムは、増倍率を用い、直径１５０μｍの膵島を１膵島当量（ＩＥ）としてカウントとした。
【００２２】
膵島の生着率は、膜完全性分別染色(membrane integrity differential staining)を通じて定量化した。サンプルを取り出し、ジメチルスルホキシド中、５ｍＭのＹＳＴＯ  Ｇｒｅｅｎ １３、１０μｌと混合した。２分後、エチジウムブロマイドが２５.４ｍＭのダルベッコのリン酸平衡塩類（ＤＰＢＳ）溶液５μｌを添加した。スライドは層状(steaked)にし、生着率は、蛍光顕微鏡下で、生着力のある膵島と生着不能な膵島をカウントすることによって決定した。各グループの写真を撮った。
【００２３】
各グループからの３つの１：５０サンプル（１グループ当たり２つの膵臓）を、３７℃の９５％ＣＯ2で２時間、低血糖（２.８ｍＭ）溶液に留置し、その後、上清を除去し、それを後の試験のために冷凍した。膵島サンプルを、３７℃の９５％ＣＯ2で２時間、高血糖（２０ｍＭ）溶液に留置した。この場合も先と同様に、上清を除去し、冷凍した。サンプルは、ＥＬＩＳＡを用いてインスリン含有量を分析した。なお、この処置は、重要な成果を生み出さなかったので、特にサンプル試験のコストを考慮に入れ、中止した。
【００２４】
膵島の数、平均サイズ及び生着率は、ＳＰＳＳ１１.５ソフトウェアでＡＮＯＶＡ試験を使用し、グループ間で比較した。ＡＮＯＶＡがｐ＝０.０５で有意を示す場合には、ボンフェローニの事後解析により、有意に異なったグループを見つけた。表１は、その結果を要約しており、平均±ＳＥＭとして表している。これら結果は、グループ３の膵島サイズ及び生着率が、グループ１及び２と比較して増大していることを示している。しかしながら、ラット膵臓のサイズが小さく、これらの微小臓器の小さな管にｅＰＦＣを注入する困難であるため、ヒトの膵臓を用いたさらなる実験が必要であると判断した。
【００２５】
図１は、各グループに関する訂正されていない膵島エニュメレーション（islet enumeration：ＩＥ）のボックスプロットである。すべてのグループ、特にグループ３は、負側にスキュー(skewed)している。少数の主な異常値は、ＩＥカウントに最初に存在した。低い異常値をグループ２から取り除き、２つをグループ３から取り除いたのは、カウントが、問題のあると思われる染色が原因によるものと考えられ、カウントが極めて低かった（次の最低値より３倍低かった）からである。さらに、グループ２及び３からのカウントを取り除いたのは、それらが極めて高かったためであって、カウントを歪めるような極めて大きな膵島が少数存在したことが原因である（それぞれは、訂正された平均値から約３以上の標準偏差であった）。
【００２６】
図２は、訂正された膵島エニュメレーションのボックスプロットを表しており、異常値の除去した後のより正規な分布を示している。訂正されたデータセットのＡＮＯＶＡ分析は、有意差（ｐ＝０.０４１）を示した。ボンフェローニの事後解析は、グループ２（１４９１±２８０ＩＥ）とグループ１（６６７±１１８ＩＥ）の間の有意差（ｐ＝０.０４８）を示した。（注記：グループ２に関して、エニュメレーションは、２つのラット膵臓毎、すなわち、トライアル毎に２つの膵臓を表している。）グループ２及び３（１３２８±３０１ＩＥ）は、互いによく似ていたが（ｐ＝１.００）、グループ３とグループ１の間に有意差は無かった。幾つかのサンプルには、顕微鏡検査下で長糸状組織損傷があり、それは、恐らく過剰なコラゲナーゼ消化から、組織凝集を引き起こしたものと考えられる。しかしながら、何れのグループも、そのような損傷を表す高い傾向を示さなかった。
【００２７】
ＩＥシステムでは、膵島サイズを推定するためにグリッドを使用し、その後、トライアル毎に各グループの平均サイズを決定するために使用される。グループ１（１２０±６.５μｍ）と、グループ２（１２０±５μｍ）と、グループ３（１３３±１２μｍ）の間で、平均膵島直径に有意差（ｐ＝０.４３）は無かったが、グループ３は、その他の２つより僅かに大きかった。
【００２８】
ＳＹＴＯ／ＥＢ膜完全性染色は、膵島の生着率の定量的及び定性的評価をもたらした。図３は、グループ１、２及び３の微分蛍光染色の写真を示している。グループ１（５２±９％）と、グループ２（６１±９％）と、グループ３（６５±１２％）の間で、生着率に有意差（ｐ＝０.５８）は無かった。すべてのグループにおいて、幾つかの膵島の境界線に沿って断片化(fragmentation)があり、これにより、それらの品質が生着不能と認定されることがある。また、すべてのグループにおいて、幾つかの組織凝集があった。グループ１は、中央膵島死であることが特徴である。グループ２は、無傷の境界線を有する生着力のある膵島を含み、死因は、概して、膵島境界線周囲の断片化が原因であった。グループ３の生着力のある組織は、特に球状(spheroidal)であり、グループ３の生着不能な膵島は、概ね断片化によって、稀に中央死(central death)であることが特徴である。
【００２９】
上述の如く、静的培養は、この実験で中止した。静的培養（ＳＩ）は、高グルコース溶液におけるインスリン生成と、低グルコース溶液におけるインスリン生成の比である。グルコースに反応するインスリン刺激指数は、１より大きいと予想されたが、すべての場合において、１未満であった。例えば、３回目のトライアルでは、平均ＳＩが、グループ１については０.５９、グループ２については０.６２、グループ３については０.３９であった。
【００３０】
この実験は、表１に示すように、ＵＷに二層法を使用して１８時間保存した後、膵島収率において著しい改善を呈した。保存後ＩＥは、ｅＰＦＣと二層法の間でよく似ており（ボンフェローニの事後解析から（ｐ＝１.００））、その二層法は、若干高い平均値を生じた（１４９１ＩＥ対１３２８ＩＥ）。しかしながら、僅かな有意異常値を、データセットから取り除く必要があった。膵島単離は、その結果(例えば、コラゲナーゼ活性、ドナー、機械的消化及び膵島精製)に影響を及ぼす無数の変数に左右される。さらに、膵島の染色に関する問題は、カウントの異常値の一因になった。ジチゾンは、エニュメレーションのために使用される染色液であり、亜鉛をキレートし、後に通常インスリンとともに六量体を形成する。したがって、（静的培養検定法に見られるような、）保存された膵島のインスリン生成で観察された欠陥は、問題のある染色に起因したものと思われる。
【００３１】
静的培養により、高血糖条件に曝された場合における、保存されたすべての膵島のインスリン生成能力の欠陥が明らかとなった。これには幾つかの説明を行なうことができる。第１に、β細胞は、冷蔵保存によって、インスリン含有量が減少していたと考えられる。恐らく、低温での保存が、通常の細胞代謝プロセスを阻害し、それゆえに、インスリン生成酵素の発現と同様に、保存用インスリンの生成が阻止されたものと考えられる。３７℃未満での膵島の培養は、脱顆粒に関与しており、膵島β細胞のインスリン反応の障害となる。これは、膵臓の冷蔵保存についても同様であると考えられる。第２に、単離手法は、膵島（消化及び密度勾配遠心分離法）に対して過酷であり、脱顆粒及び／又は障害のあるインスリンの生成を引き起こす可能性がある。第３の可能性は、殆どの膵島が生着不能であったことである。しかしながら、膵島が殆ど生着不能だったという見解は、他の膜完全性染色の結果と一致しない。すべてのケースにおいて、この染色手法に由来する生着率は、低温虚血時間の長さ（１８時間）を考えると、適度に高かった（すべての手段は５０％以上であった）。それゆえに、低温保存と、膵島単離に関連する摂動(perturbations)を組み合わせた効果により、静的培養アッセイは、低ＳＩ値を示す可能性が高い。
【００３２】
一般的に、膵島は、低酸素状態にて中心性壊死(centrally necrotic)になる。大きい膵島が大きい程、膵島の表面積対直径の比が減少するので、中央組織への酸素化拡散が減少し、虚血状態において中心性壊死になり易いと推測することは、理にかなっている。膵島のサイズは、グループ間で著しい違いはなかったが、ｅＰＦＣグループは、他のグループと比べて僅かに高かった。これは、ｅＰＦＣグループにおける酸素化が、より優れていることを示唆している。
【００３３】
３つのグループ間で、（膜完全性データから算出される）生着率に有意差は無かったが、平均生着率は、グループ３（６５％）が、グループ２（６１％）又はグループ１（５２％）より若干高かった。ＵＶグループの膵島は、おそらく酸素抑制による中心性壊死の損傷が、その他の２つのグループより大きくなっているように思われる。ＴＬＭは、膵島を中央死から最も良く保存することを示したが、平均生着率は、ｅＰＦＣグループより若干低かった。このグループ及びｅＰＦＣグループにおいて、生着不能の膵島の殆んどは、断片化のためであると考えられ、単離処置によって、冷蔵保存により既に脆弱となっていた膵島の境界が分離されたためであると考えられる。
【００３４】
エニュメレーションデータから、ＴＬＭは、膵臓全体の保存する際に膵島を保存するのに、最も有効であったと思われる。しかしながら、ｅＰＦＣグループの膵島の平均数は、ＴＬＭグループと同等であり（ｐ＝１.００）、生着率及び膵島サイズは若干高かったが、何れのケースにも統計的な有意性は無かった。ｅＰＦＣに対するＴＬＭの利点のいくつかは、何れもＵＷにある細胞非透過性剤、グルタチオン及びアデノシンが欠如していたことによるものと思われる。
【００３５】
この実験は、前述のとおり、二層法が、膵島単離のために膵臓を保存する際に、ＵＷより効果的であることを確認するためのものである。さらに、新規ｅＰＦＣが、移植のために通常の膵島生理機能を保持するのに有効であることを立証するものである。乳化されたＰＦＣは、非混和性ＰＦＣを越える利点を有する可能性がある。例えば、ドナーから膵臓を回収する際、乳化物を膵臓に浸み込ませることができ、これにより、臓器内の細胞の直接的な酸素化を許容し、酸素送達の有効表面積が増大される。ｅＰＦＣ溶液をラット膵臓に浸み込ませる試行では、十分に膨張しなかったため達成には至らなかった。これは、溶液の粘度が高いこと、ラット膵臓の管系のサイズが小さいことによると考えられる。より大きいヒトの膵臓では浸み込みについての問題はない。さらに、ｅＰＦＣを希釈することで、この溶液を用いた膵臓膨張に対する今後の試行成果を高めることができる。
【００３６】
＜実施例２＞
細胞の生着性に関するｅＰＦＣの効果を試験するためにヒトのドナー膵臓を得た。２つのドナー膵臓(ドナー１及びドナー２と称する)を、対照として使用し、これらにはｅＰＦＣ注入を行わなかった。２つの実験用ドナー膵臓(ドナー３及びドナー４と称する)には、ｅＰＦＣ注入を行なった。膵島は、標準的なエドモントンプロトコールを用いて単離した。
【００３７】
表２は、ドナー１〜４に関する精製前及び精製後の組織ＡＴＰレベルを示している。表３は、ドナー１〜４に関する精製前及び精製後の組織エネルギー変化を示している。「精製(purification)」は、エドモントンプロトコールの一部として行なわれる膵島の精製を意味している。ドナー３及びドナー４に関する実験データは、ドナー１及びドナー２に関する対照データに比べて、ＡＴＰレベル及び組織エネルギー変化が顕著に増加していることを示している。実際に、対照は、これらのエネルギーレベルが殆んどが減少している。ＡＴＰレベル及び組織エネルギー変化の増加は、ｅＰＦＣで処理された膵島の生着性及び健康状態が高められたこと、及び、これらの膵島が回復又は救い出されたことを明確に証明している。
【００３８】
本発明の特定の実施例を例示目的で上述したが、当該分野の専門家であれば、本発明の詳細に関する様々な変更は、添付の請求項に規定される発明から逸脱することなく、行われることが明らかであろう。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
【表２】
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【００４１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ラット膵臓を対象に実施した実験に関する、訂正されていない膵島エニュメレーションのボックスプロットである。
【図２】ラット膵臓を対象に実施した実験に関する、訂正された膵島エニュメレーションのボックスプロットである。
【図３】ラット膵臓を対象に実施した実験からの微分蛍光染色を示す写真を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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