(57)【要約】  本発明ではヒトの自閉症感受性遺伝子の同定が開示されており、該遺伝子は医薬的に活性な薬剤のスクリーニングの他、自閉症および関連する障害の診断、予防、治療に有用となりうる。本発明ではより具体的には、１番染色体上のＭＡＲＫ１およびその特定の対立遺伝子が自閉症への感受性と関連しており、治療的診断の新しい標的を示していることが開示されている。本発明は、ＭＡＲＫ１遺伝子内の特定の突然変異および発現産物、そしてこれらの突然変異に基づいた診断ツールおよびキットと関連する。本発明は、アスペルガー症候群、広汎性発達障害、精神遅滞、心配、憂うつ、注意不足活動過多症障害、発語の遅れ、てんかん、代謝異常、免疫障害、双極性疾患および精神分裂症などの他の精神疾患および神経疾患の素因の診断、発見、予防および／または治療に使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の存在または素因を検出する方法であって、（ｉ）該被験者からの検体の提供、（ｉｉ）該検体のＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害からの防御を検出する方法であって、（ｉ）該被験者からの検体の提供、（ｉｉ）該検体のＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項３】
自閉症、または関連の障害の治療に対する被験者の反応を評価する方法であって、（ｉ）該被験者からの検体の提供、（ｉｉ）該検体のＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項４】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の治療に対する被験者の有害反応を評価する方法であって、（ｉ）該被験者からの検体の提供、（ｉｉ）該検体のＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項５】
被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の予防方法であって、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の素因の指標である被験者の検体のＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出すること、および自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害に対する予防的治療を施行することを含む方法。
【請求項６】
ＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在が、塩基配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、および／または選択的増幅によって検出される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
該変化が、自閉症と関連する１または複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
自閉症と関連する該ハプロタイプが、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択される複数のＳＮＰを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
自閉症と関連する該ＳＮＰがＳＮＰ１３である、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、試験化合物をＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその遺伝子ないしそれらの断片と接触させること、および該ＭＡＲＫ１ポリペプチド、またはその遺伝子ないしその断片と結合する該試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１１】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、ＭＡＲＫ１ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞と試験化合物とを接触させること、および該ＭＡＲＫ１ポリペプチドと結合するおよびＭＡＲＫ１ポリペプチド活性を調節する該試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１２】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、試験化合物とＭＡＲＫ１遺伝子とを接触させること、および該試験化合物が該ＭＡＲＫ１遺伝子の発現を調節する能力を決定することを含む方法。
【請求項１３】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、試験化合物と、ＭＡＲＫ１遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組み換え宿主細胞とを接触させること、および該レポーター遺伝子の発現を調節する（例えば、促進または減少させる）試験化合物を選択することを含む方法。
【請求項１４】
該ＭＡＲＫ１遺伝子またはそのポリペプチドまたはその断片が、変化または突然変異ＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチド、または変化または突然変異を含むそれらの断片である、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
該調節が活性化である、請求項１０〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
該調節が抑制である、請求項１０〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の治療または予防のための医薬組成物の製造における、ＭＡＲＫ１のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＭＡＲＫ１のアンチセンスまたはＲＮＡｉ、ＭＡＲＫ１ポリペプチドに特異的な抗体、もしくはその断片もしくはその派生物からなる群から選択される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、遺伝学および医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症は、社会的相互作用および言葉・非言語コミュニケーションにおける障害、限定的で、型にはまったパターンの興味および活動、そして３歳までの発育障害の存在を特徴とする、神経精神病学的な発育障害である（Ｂａｉｌｅｙ  ら，  １９９６）。彼の小児自閉症に関する先駆的な記述において、Ｋａｎｎｅｒ（１９４３年）は以下の症状を挙げた：言語障害、アイコンタクトの欠如、社会的相互作用の欠如、反復行動、日常的に融通が利かない。彼は、大半の症例において、子供の行動が幼児期から異常であったことを指摘した。これに基づき、彼は、生まれつきの、恐らくは遺伝性の異常の存在を示唆した。１年後、ドイツのＨａｎｓ  Ａｓｐｅｒｇｅｒは同様の患者について記載しており、この症状を「自閉的精神病質」と呼んだ。
【０００３】
自閉症については、これまで疾患を診断するための具体的、生物学的指標は知られていないため、行動基準を利用して定義されている。自閉症の臨床像については、重症度が変動し、教育、能力、気質などの多くの因子によって変わる。さらに、臨床像は個人の発育過程においても変わる。また、自閉症は、注意欠陥障害、運動失調、心配や憂うつなどの精神科的症状といった他の障害と関連付けられることが多い。自閉症が、てんかん性、代謝性、そして免疫性障害も含みうるとの証拠が存在する。該変動性に関する臨床的認識に沿って、全てのレベルの知能、言語能力および全ての重症度にある個人を含めた、一連の自閉症障害が存在するとの一般的な合意が現在存在する。
【０００４】
自閉症領域の一部であるが、特別なサブグループと見なされているのが、アスペルガー症候群（ＡＳ）である。ＡＳは、自閉症領域障害（ＡＳＤ）の特徴である、社会的相互作用の障害および限定された反復的行動、興味、活動の存在下で、臨床上の有意な言語発達の遅れの欠如によって自閉性障害とは区別される。
【０００５】
ＡＳＤは広汎性発達障害（ＰＰＤ）型である。ＰＰＤ，（ｎｏｔ  ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ（他に規定のない限り））（ＰＰＤ−ＮＯＳ）は、非定型自閉症を呈する、または２、３の重要な領域においてほぼ診断基準を満たすことによって、自閉症についての厳密な基準を満たさないが、自閉症に近い小児を分類するために使用される。
【０００６】
自閉症の診断を標準化するために、診断基準が世界保健機構（国際疾病分類第１０改訂（ＩＣＤ−１０），１９９２）およびアメリカ精神医学協会(Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（ＤＳＭ−ＩＶ），１９９４)によって定義された。自閉症診断インタビュー（ＡＤＩ）が開発された（Ｌｅ  Ｃｏｕｔｅｕｒ  ら，１９８９；  Ｌｏｒｄ  ら，１９９４）。ＡＤＩは、標準化され、厳しく検証され、そして広く一般に認識されているＡＳＤ診断のために利用可能な唯一の診断ツールである。ＡＤＩは、ＩＣＤ−１０改訂および自閉症の診断に関するＤＳＭ−ＩＶ基準に基づく、採点方式による親の半構造的面接である。ここでは、３つの主要分野（社会的相互作用の質、コミュニケーションおよび言語、限定的かつ反復的で型にはまった関心および行動）において、行動に焦点を合わせる。これらの基準を利用した場合、自閉症が稀な障害であるとはもはや見なされない。Ｋａｎｎｅｒの基準に基づいた１０，０００人毎に４−５症例という過去に報告された有病率（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ−Ｓｈｅｉｄｌｅｙ，２００１）と比較して、１０，０００人毎に１０−１２症例という高い有病率が最近の研究において報告された(Ｇｉｌｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｗｉｎｇ，１９９９)。自閉性障害の全領域の有病率に関する推定値は１．５〜２．５倍高い。女性と比較して、男性では４倍高い発生率の報告には矛盾がない。精神遅滞がＡＳＤ症例の２５〜４０％に存在する（Ｂａｉｒｄ  ら． ２０００； Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ａｎｄ  Ｆｏｍｂｏｎｎｅ，２００１）。脳が関与する別の病状が、母集団の約１０％で認められる（Ｇｉｌｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｃｏｌｅｍａｎ，２０００）。
【０００７】
自閉症の報告症例数の増加の根本にあるメカニズムは不明である。この差が、自閉症の有病率の増加、診断基準の段階的変化、病気発現のより大きな変動性の認識、あるいは障害に関する意識の高まりを反映しているのか否かについては大いに議論の余地がある。また、見掛け上の増加が主に環境因子に起因するという広範囲に及ぶ一般の認識がある（Ｎｅｌｓｏｎ，１９９１；Ｒｏｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｈｙｍａｎ，１９９８）。しかし、有病率の上昇の大部分が、これらの基準のより広範な適用と共に、診断基準の広幅化によって説明できる可能性は高いと思われる。
【０００８】
病気を改善させるための有効な処置が存在するが、利用可能な治療法はなく、処置の有益性は低くなる傾向がある。様々な行動・発育上の戦略を利用したいくつかのプログラムにおいて有望な結果が得られている。最も有望なものに、応用挙動解析（ＡＢＡ）に基づくプログラムがある。いくつかの薬物療法が、自閉症に関連する様々な症状を改善して、それによって教育的および行動的診断からの個人の受益能を高めると思われた。最も広範に研究されている薬剤はドーパミンアンタゴニストである。数例の研究によって、様々な選択的セロトニン再取り込み阻害薬の有用性が示唆されている。
【０００９】
双生児に関する研究３例が、自閉症の遺伝率を推定するために実施されている(Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｕｔｔｅｒ，１９７７；Ｂａｉｌｅｙ  ら，１９９５；  Ｓｔｅｆｆｅｎｂｕｒｇ  ら，１９８９)。地理的に定義された集団内に生活していた全ての双生児を探し出した。統合データにおいて、一卵性（ＭＺ）双生児３６人および二卵性（ＤＺ）双生児３０人が調査された。ＤＺ率０％と比較して、平均ＭＺ一致率は７０％である。ＭＺとＤＺとの一致率および約２〜４％と推定された兄弟での再発リスクから、遺伝率９０％以上が算出された（Ｊｏｒｄｅ  ら，１９９１  Ｓｚａｔｍａｒｉ  ら，１９９８）。自閉症ではない血縁者に関する研究によって、社交場での寡黙、コミュニケーションにおける困難、日常での嗜好、変化の困難を含めた、ＡＳＤのいくつかの特徴が、対照とする親よりも、自閉症の子供達の親においてより頻繁に見いだされることが明らかにされた（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｕｔｔｅｒ，１９７７）。発語開始の遅れおよび読みの困難も自閉症患者の家族においてより多く見られ、再発性の憂うつ、不安障害、血小板セロトニンの上昇、そして頭囲の増大も同様であった（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ−Ｓｈｅｉｄｌｅｙ，２００１）。
【００１０】
自閉症の発生率は罹患した個人との血縁度の低下に応じて有意に低下し、一遺伝子モデルによって大半の自閉症症例が説明される可能性は低いことを示している（Ｊｏｒｄｅ  ら，１９９０）。報告された分離比解析は、多遺伝子性遺伝様式と全く矛盾がなかった（Ｊｏｒｄｅ  ら，１９９１）。最も節約的な遺伝モデルは、数種の遺伝子が自閉症表現型を生じるために互いに相互作用するモデルである（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ−Ｓｈｅｉｄｌｅｙ，２００１）。
【００１１】
相当な状況証拠によって、自閉症における自己免疫の果たし得る役割が示されている。１例の研究では、対照の発端者と比較して、自閉症の発端者のいる家族においてより多くの自己免疫疾患を患う家族メンバーが認められた（Ｃｏｍｉ  ら，  １９９９）。２，３例の研究では、自閉症を患う一部の子供、または彼らの母親に存在する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子座のハプロタイプによって、彼らの自閉症の子供たちが自己免疫病にかかりやすくなると報告されている（Ｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｒｒｅｎ，１９９８）。２例の研究では、ミエリン塩基性タンパク質、神経フィラメントタンパク質、血管上皮などの特定の脳組織およびタンパク質に対する自己抗体が、対照と比較して、自閉症の子供たちにおいてより多く認められた（Ｓｉｎｇｈ  ら，１９９３；  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ら，１９９９； Ｗｅｉｚｍａｎ  ら，１９８２）。
【００１２】
自閉症の大半の症例について、ｏｌｉｇｏｇｅｎｉｃｉｔｙおよびエピスタシスという示されたメカニズムと矛盾はないが、少数については染色体異常および特定の病因を伴う障害と関連して認められた。Ｓｍａｌｌｅｙ（１９９７年）は、既知の遺伝性疾患または染色体異常を伴う５〜１４％を含めた、自閉症症例の約１５〜３７％が合併症を伴うと記述している。ほぼ全てのヒト染色体の関与する染色体異常が報告されている。これらには常染色体の異数性、性染色体異常、欠失、重複、転座、環状染色体、逆位、マーカー染色体が含まれる（Ｇｉｌｌｂｅｒｇ，１９９８）。１５番染色体上のプラダーウィリ／アンジェルマン症候群の領域の異常が最も多く見られる。自閉症とメンデル性疾患（Mendelian condition）または遺伝的症候群との関連には、未治療のフェニルケトン尿症、脆弱Ｘ症候群、結節性脳硬化症、神経線維腫症が含まれる。近年、Ｃａｒｎｅｙら（２００３）は、ＭＥＣＰ２遺伝子（メチルＣｐＧ−結合蛋白２）の突然変異が症例の８０％における原因となっている、レット症候群の症状を伴わない、自閉症を患う２人の女性におけるＭＥＣＰ２遺伝子の突然変異を同定した。
【００１３】
様々なグループが、自閉症またはＡＳＤのより広範な表現型に関するゲノムスキャンを実施している。このアプローチは、組織的でモデルを使用しないため、非常に有望と思われる。また、既に成功していることが示されている。このように比較的小さな試験群での解析によってでさえ、陽性の連鎖結果が得られている。より重要なことは、一部の知見が既に再現されていることである。最も一致した結果が染色体７ｑにおいて得られたが、染色体２ｑおよび１６ｐにもかなりの重複が認められる（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ−Ｓｈｅｉｄｌｅｙ，２００１）。染色体領域の特定における重要な進歩が、同じく１５番染色体およびＸ染色体上において成されている。ＮＬＧＮ（ニューロリジン）３およびＮＬＧＮ４をコード化する２つのＸ連鎖遺伝子における突然変異が、自閉症領域障害を患う兄弟において同定された（Ｊａｍａｉｎ  ら，２００３）。いくつかの証拠によって、ニューロリジンの突然変異が自閉性障害に関与しているという事実が裏付けられた。第一に、報告された突然変異は予測されたタンパク質の立体構造に重大な変化を生じる。第二に、ＮＬＧＮ４を含むＸｐ２２．３の欠失が数人の自閉症の小児において報告されている。第三に、ＮＬＧＮ４の突然変異が、１人の罹患者の母親においてデノボで現れた。
【００１４】
発明の概要
本発明では、治療効果のある薬剤のスクリーニングの他、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の診断、予防、治療のために利用可能なヒトの自閉症感受性遺伝子の同定について開示されている。
【００１５】
本発明では特に、治療効果のある薬剤のスクリーニングの他、自閉症および関連する障害の診断、予防、治療のために利用可能なヒトの自閉症感受性遺伝子の同定について開示されている。本発明は具体的には自閉症への感受性と関連しており、治療的介入のための新しいターゲットを示すＭＡＰ／微小細管親和性調節キナーゼ１（ＭＡＲＫ１）遺伝子の特定の対立遺伝子を開示している。本発明は、ＭＡＲＫ１遺伝子内の特定の突然変異および発現産物、そしてこれらの突然変異に基づいた診断ツールおよびキットと関連する。本発明は、アスペルガー症候群、広汎性発達障害、精神遅滞、心配、うつ病、注意不足活動過多症障害、発語の遅れ、てんかん、代謝異常、免疫障害、双極性疾患および精神分裂症などの他の精神疾患および神経疾患の素因の診断、発見、予防および／または治療に使用可能である。
【００１６】
本発明は、自閉症、自閉症領域障害（autism spectrum disorder）、または自閉症関連の障害（autism associated disorder）の素因の診断、防御、発見、予防および／または治療において使用可能であり、方法は、被験者の検体におけるＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチドにおける変化の存在、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の存在または素因の指標となる該変化の存在の検出を含む。該変化の存在は自閉症からの防御においても指標となりうる。
【００１７】
特に本発明の目的は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の存在または素因の検出方法にあり、該方法は、被験者の検体でのＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含み、該変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の存在または素因の指標となる。
【００１８】
特に本発明の別の目的は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害からの防御の検出方法にあり、該方法は、被験者の検体でのＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含み、該変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害からの防御の指標となる。
【００１９】
特に本発明の別の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の治療に対する被験者の反応の評価方法にあり、該方法は、被験者の検体でのＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含み、該変化の存在が該治療に対する特定の反応の指標となる。
【００２０】
特に本発明の別の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の治療に対する被験者の有害反応の評価方法にあり、該方法は、被験者の検体でのＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含み、該変化の存在が該治療に対する有害反応の指標となる。
【００２１】
本発明は、被験者の検体におけるＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の素因の指標となる該変化の存在の検出、および自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害に対する予防的治療の施行を含む、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の素因の予防方法とも関連する。
【００２２】
好ましい一実施態様では、該変化は、自閉症と関連する１つ以上のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。より好ましくは、該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択される複数のＳＮＰを含む、もしくは複数のＳＮＰを含む。さらに好ましくは、該ハプロタイプは、表４に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する該ＳＮＰはＳＮＰ１３でありうる。
【００２３】
好ましくは、ＭＡＲＫ１遺伝子座の変化は、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイ、対立遺伝子特異的増幅アッセイの実施によって判定される。
【００２４】
本発明の特定の態様は、ＭＡＲＫ１遺伝子を含むゲノム領域内の自閉症と関連する少なくとも１つのＳＮＰまたはハプロタイプを特異的に検出するように設計された、プライマー、プローブ、および／またはオリゴヌクレオチドを含む組成物、またはそれらの組み合わせにある。より好ましくは、自閉症と関連する該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択される複数のＳＮＰを含む、もしくは複数のＳＮＰを含む。さらに好ましくは、該ハプロタイプは、表４に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する該ＳＮＰはＳＮＰ１３でありうる。
【００２５】
本発明は、ＭＡＲＫ１の発現または活性の調節を介した、被験者における自閉症および／または関連する障害の治療法にもある。該治療には、例えば、ＭＡＲＫ１の発現または活性を調節する、ＭＡＲＫ１ポリペプチド、ＭＡＲＫ１  ＤＮＡ配列（ＭＡＲＫ１遺伝子座を標的とするアンチセンス配列およびＲＮＡｉを含む）、抗ＭＡＲＫ１抗体または薬剤が使用される。
【００２６】
本発明は、遺伝子治療、タンパク質の補給療法、またはＭＡＲＫ１タンパク質の模倣薬および／または阻害剤の投与による、発症前治療または併用療法を含めた、ＭＡＲＫ１遺伝子の有害対立遺伝子を有する個人の治療法とも関連している。
【００２７】
本発明の別の態様は、自閉症または関連する障害に関わるＭＡＲＫ１遺伝子の対立遺伝子、またはその遺伝子産物の調節または結合に基づく、自閉症または関連する障害の治療薬のスクリーニングにある。
【００２８】
本発明の別の態様には、ＭＡＲＫ１ポリペプチド断片に特異的な抗体および該抗体の派生物、該抗体を分泌するハイブリドーマ、これらの抗体を含む診断キットが含まれる。より好ましくは、該抗体は、ＭＡＲＫ１の活性を変える変化を含むＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片に特異的である。
【００２９】
本発明は、ＭＡＲＫ１の活性を変える変化を含むＭＡＲＫ１遺伝子またはその断片にも関する。本発明は、ＭＡＲＫ１の活性を変える変化を含むＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片にも関する。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明では、ヒトの自閉症感受性遺伝子としてＭＡＲＫ１の同定を開示している。自閉症を患う１１４の家族からの様々な核酸検体が、特別なＧｅｎｏｍｅＨＩＰプロセスに提出された。このプロセスによって、自閉症の被験者において変化している、該集団における特定の同一家系（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ−ｂｙ−ｄｅｓｃｅｎｔ）内の断片が同定された。ＩＢＤ断片のスクリーニングによって、自閉症および関連する表現型に対する候補として、染色体１ｑ１４上のＭＡＰ／微小細管親和性調節キナーゼ１遺伝子（ＭＡＰＫ１）を同定した。この遺伝子は実際に重要な間隔内に存在しており、自閉症での遺伝子調節と一致した機能的表現型を発現する。ヒトの被験者における自閉症と相関があるとして、ＭＡＲＫ１遺伝子のＳＮＰも同定された。ＭＡＲＫ１遺伝子座に位置するＳＮＰ１３が自閉症と関連することが見出された。ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択される数種のＳＮＰを含む、表４に開示されるハプロタイプも自閉症と関連するものとして同定されている。
【００３１】
このように本発明は、治療効果のある薬剤のスクリーニングの他、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の、診断、予防、治療のためにＭＡＲＫ１遺伝子および対応する発現産物を使用することを提案している。
【００３２】
定義
自閉症および自閉症領域障害（ＡＳＤ）：自閉症は通常、アスペルガー症候群（ＡＳ）および他の広汎性発達障害（ＰＰＤ）を含む自閉症領域（ＡＳＤ）の一部と特徴付けられる。自閉症は、健康が損なわれうる程度にまで、３歳までの行動、興味、活動の様式が限定的、反復的で、型にはめられている、社会的相互作用およびコミュニケーションが損なわれた状態と解釈される。ＡＳは、自閉症領域障害（ＡＳＤ）の特徴である、社会的相互作用の障害および限定された反復的行動、興味、活動の存在下で、言語発達における臨床上の有意な遅れの欠如によって、自閉性障害から区別される。ＰＰＤ−ＮＯＳ（ＰＰＤ，“ｎｏｔ  ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ”（他に規定のない限り））は、非定型自閉症を呈する、または２、３の重要な領域においてほぼ診断基準を満たすことによって、自閉症についての厳密な基準を満たさないが、自閉症に近い子供たちを分類するために使用される。
【００３３】
自閉症関連の障害、疾患、病状として、具体的には代謝異常、免疫障害、てんかん、心配、憂うつ、精神分裂症、注意欠陥多動性障害、発語の遅れ、運動失調が挙げられる。
本発明は、様々な被験者、特に成人、子供、胎児を含めたヒトにおいて使用可能である。
【００３４】
本発明の文脈中で、ＭＡＲＫ１遺伝子座は、ＭＡＲＫ１コード配列、ＭＡＲＫ１非コード配列（例、イントロン）、転写、翻訳（例、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）、ＲＮＡおよび（または）タンパク質の安定性を制御するＭＡＲＫ１調節配列そしてＭＡＲＫ１  ＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ）およびＭＡＲＫ１ポリペプチド（例、タンパク質前駆体および成熟タンパク質）などの対応する発現産物を含めた、細胞または生物内の全てのＭＡＲＫ１配列または産物を示す。ＭＡＲＫ１遺伝子座は、ＭＡＲＫ１遺伝子内に位置するＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含むＭＡＲＫ１の周辺配列も含む。
【００３５】
本出願において使用されているとおり、「ＭＡＲＫ１遺伝子」という用語は、自閉症および自閉症関連の障害への感受性と関係する、ヒト染色体１ｑ４１上のＭＡＰ／微小細管親和性調節キナーゼ１遺伝子、そして対立遺伝子（例、生殖細胞系突然変異）を含めた、その変異体、類似体、断片を示す。ＭＡＲＫ１遺伝子の別名は、ＭＡＰ／微小細管親和性調節キナーゼ、ＭＡＲＫ、ＫＩＡＡ１４７７である。
【００３６】
「遺伝子」という用語は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成または半合成ＤＮＡ、対応する任意の形のＲＮＡを含めた、任意の種類のコード核酸を含むと解釈される。遺伝子という用語は特に、ＭＡＲＫ１をコードする組み換え型核酸、つまり人工的に作成された（例、配列の組み立て、切断、連結、増幅による）非天然核酸を含む。
【００３７】
通常、ＭＡＲＫ１遺伝子は二本鎖であるが、一本鎖などの他の形も検討できる。ＭＡＲＫ１遺伝子は、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または様々な天然材料からの増幅など、様々な材料から、周知の様々な技術によって得ることができる。組み換え核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素技術、これらの組み合わせを含めた、従来の方法によって比較可能である。適当なＭＡＲＫ１遺伝子配列は、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｆｏｒ  ＭＡＲＫ１（Ｈｓ．４９７８０６）およびＵｎｉｇｅｎｅ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿０１８６５０などのジーンバンクにおいて見出すことができる。ＭＡＲＫ１遺伝子の特定の実施例は配列番号：１を含む。
【００３８】
「ＭＡＲＫ１遺伝子」という用語は、配列番号：１もしくは先に同定された任意のコード配列の変異体、断片、類似体を含んでいる。該変異体には、例えば、個人間での対立遺伝子の変化に起因する天然の変異体（例、多型）、自閉症と関連する突然変異対立遺伝子、選択的スプライシング形態などが含まれる。変異体という用語には、別の材料または生物由来のＭＡＲＫ１遺伝子配列も含まれる。変異体は、好ましくは配列番号：１とかなりの相同性を有しており、つまり配列番号：１と少なくとも約６５％、通常は少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列の同一性を示す。ＭＡＲＫ１遺伝子の変異体および類似体は核酸配列も含んでおり、これはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で先に定義された配列（またはその相補的鎖）とハイブリダイズする。
【００３９】
通常のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、温度３０℃以上、好ましくは３５℃以上、より好ましくは４２℃以上、および／または塩分約５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩分および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の薬剤の濃度を変えることで当業者によって調節可能である。
【００４０】
ＭＡＲＫ１遺伝子断片は、先に開示された少なくとも約８個、好ましくは少なくとも約１５個、より好ましくは少なくとも約２０個、さらに好ましくは少なくとも約３０個の連続する核酸配列の任意の一部分を示す。断片には、ヌクレオチド８〜１００個、好ましくは１５〜１００個、より好ましくは２０〜１００個の全ての可能なヌクレオチド長を含む。
【００４１】
ＭＡＲＫ１ポリペプチドは、先に開示されたＭＡＲＫ１遺伝子によってコード化される任意のタンパク質またはポリペプチドを示す。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の伸長を構成する任意の分子を示している。この用語は、ペプチドおよびタンパク質のなどの様々な長さの分子を含む。ポリペプチドは、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応または結合などによって変性が可能であり、１つ以上の非天然型アミノ酸または合成アミノ酸を含みうる。ＭＡＲＫ１ポリペプチドの特定の実施例には、配列番号：２（ＮＰ＿０６１１２０）の全体または一部を含む。
【００４２】
「治療への反応」という用語は、治療化合物の代謝能力およびプロドラッグの活性薬剤への変換能を含めるが、これらに限定されない治療効果、そして個人における薬剤の薬物動態（吸収、分布、排出）および薬力学（受容体関連）を示す。
【００４３】
「治療に対する有害反応」という用語は、薬剤の主な薬理作用の延長に起因する治療の有害反応、または薬剤と固有の宿主因子との相互作用に起因する特有の有害反応を示す。「治療に対する副作用」として、皮膚、血液、肝臓への毒性などの有害反応、さらに胃腸での潰瘍形成、血小板機能の障害、腎臓傷害、全身性の蕁麻疹、気管支狭窄、低血圧、ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
診断
今回、本発明では、被験者におけるＭＡＲＫ１遺伝子座のモニタリングに基づく診断方法が提供されている。本発明の文脈中において、「診断」という用語は、成人、子供、胎児における、初期、発症前、後期を含めた様々な段階での、検出、モニタリング、投薬、比較などを含む。通常、診断には、予後、素因または発症リスクの評価、最適な治療を定義するための被験者の特性付け（薬理遺伝）などが含まれる。
【００４５】
本発明は、個人において、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を発症するリスクがあるのか、もしくはＭＡＲＫ１遺伝子座の突然変異または多型に起因する自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を患うか否かを判定するための診断方法を提供する。本発明は、個人が治療薬に対して前向きな反応を示す可能性があるのか否か、または個人が治療薬に対する有害反応を生じるリスクがあるのか否かを判定する方法を提供する。
【００４６】
本発明の特定の目的は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の存在または素因を検出する方法にあり、該方法は被験者の検体のＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含む。該変化の存在は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の存在または素因の指標である。場合により、該方法は被験者から検体を提供する前段階を含む。好ましくは、該検体中のＭＡＲＫ１遺伝子座内の変化の存在は、検体の遺伝子型決定によって検出される。
【００４７】
本発明の別の特定の目的は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害からの防御方法にあり、該方法は被験者の検体のＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含み、該変化の存在は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の存在または素因の指標である。
【００４８】
好ましい一実施態様では、該変化は、自閉症と関連する１つ以上のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。より好ましくは、自閉症と関連する該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択される複数のＳＮＰを含む、もしくは複数のＳＮＰからなる。さらに好ましくは、該ハプロタイプは、表４に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する該ＳＮＰはＳＮＰ１３である。
【００４９】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の治療に対する被験者の反応を評価する方法であり、該方法が（ｉ）被験者の検体の提供、（ｉｉ）該検体のＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含む。
【００５０】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の治療に対する被験者の反応を評価する方法にあり、該方法は被験者の検体のＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含む。該変化の存在は、該治療に対する特定の反応の指標である。好ましくは、該検体中のＭＡＲＫ１遺伝子座内の変化の存在は、検体の遺伝子型決定によって検出される。
【００５１】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の治療に対する被験者の有害反応を評価する方法にあり、該方法は被験者の検体のＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出を含む。該変化の存在は、該治療に対する有害反応の指標である。好ましくは、該検体中のＭＡＲＫ１遺伝子座内における変化の存在は、検体の遺伝子型決定によって検出される。
【００５２】
好ましい一実施態様では、該変化は、自閉症と関連する１つ以上のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。より好ましくは、自閉症と関連する該ハプロタイプは、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択される複数のＳＮＰを含む、もしくは複数のＳＮＰからなる。さらに好ましくは、該ハプロタイプは、表４に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する該ＳＮＰはＳＮＰ１３である。
【００５３】
別の一実施態様では、本発明は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の予防方法に関するものであり、被験者の検体のＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在の検出、ここで該変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害の素因の指標となり、および自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連の障害に対する予防的治療の施行を含む。該予防的治療は、薬物投与でありうる。
【００５４】
治療または薬剤に対する反応、もしくは治療または薬剤に対する副作用を解析・予測する診断法を利用して、個人を特定の治療薬で治療すべきか否かを判断できる。例えば、仮に診断において個人が特定の薬物治療に対して前向きな反応を示す可能性が示される場合、その個人に薬剤を投与できる。反対に、仮に診断において個人が特定の薬物治療に対して否定的な反応を示す可能性が示される場合、代わりの治療コース（course）を処方できる。否定的な反応を示すとは、有効な反応の欠如または有毒な副作用の存在のいずれかとして定義できる。
【００５５】
臨床試験ではＭＡＲＫ１  ＳＮＰの別の用途が示される。上記の方法を利用して、薬剤への反応または薬剤への副作用の指標となる１つ以上のＭＡＲＫ１  ＳＮＰを同定可能である。その後、該薬剤の臨床試験における潜在的な参加者をスクリーニングして、該薬剤に良好な反応を示す可能性の最も高い個人を特定して、副作用を経験する可能性の高い個人を除外できる。このようにして、試験において前向きな反応を示す可能性の低い個人を含めた結果、測定値を低下させることなく、また好ましくない安全性の問題という危険を冒すことなく、薬剤に前向きな反応を示す個人において薬物療法の有効性を判定可能である。
【００５６】
変化は、ＭＡＲＫ１  ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドのレベルで判定可能である。場合により、ＭＡＲＫ１遺伝子の全体または一部分の塩基配列決定、またはＭＡＲＫ１遺伝子の全体または一部分の選択的ハイブリダイゼーションまたは選択的増幅によって検出される。より好ましくは、変化の同定段階より前に、ＭＡＲＫ１遺伝子を特異的に増幅させる。
【００５７】
ＭＡＲＫ１遺伝子座の変化は、単独または様々な組み合わせで、遺伝子座のコード領域および／または非コード領域内の突然変異、欠失、再配列および／または挿入の任意の形でありうる。突然変異はより具体的には点突然変異を含む。欠失は、残基２個から遺伝子または遺伝子座全体までの、遺伝子座のコード部分または非コード部分内の２つ以上の残基の任意の領域を含みうる。典型的な欠失は、約５０個未満の連続する塩基対のドメイン（イントロン）または反復配列または断片などの、小さな領域に影響を及ぼすが、より大きな欠失も生じうる。挿入は、遺伝子座のコード部位または非コード部位内の１個または数個の残基の付加を含みうる。挿入は通常、遺伝子座内の１〜５０個の塩基対の付加を含みうる。再配列には配列の逆位が含まれる。ＭＡＲＫ１遺伝子座の変化は、停止コドンの形成、フレームシフト変化、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングまたはプロセシング、産物の不安定化、切断ポリペプチドの産生などをもたらしうる。該変化は、機能、安定性、標的化、構造の変化したＭＡＲＫ１ポリペプチドの産生をもたらしうる。該変化は、タンパク質発現の減少、あるいは該生産量の増加の原因にもなりうる。
【００５８】
本発明に従った方法での特定の一実施態様では、ＭＡＲＫ１遺伝子座における変化は、ＭＡＲＫ１遺伝子または対応する発現産物における点突然変異、欠失、挿入、より好ましくは点突然変異、欠失から選択される。該変化は、ＭＡＲＫ１  ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドのレベルで判定されうる。
【００５９】
この点において、今回、本発明ではＭＡＲＫ１遺伝子内のＳＮＰおよび特定のハプロタイプを開示しており、これらには自閉症と関連するＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択されるＳＮＰが含まれる。ＳＮＰは以下の表１において報告されている。
【００６０】
【表１】
2008532494.tif 000002
【００６１】
本発明に従った任意の方法では、ＭＡＲＫ１遺伝子内の１つまたは数個のＳＮＰおよびＭＡＲＫ１遺伝子内のＳＮＰを含む特定のハプロタイプ、より好ましくはＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０を、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害と関連している、また他の遺伝子内に存在する、別のＳＮＰまたはハプロタイプと併用可能である。
【００６２】
別の変異体では、方法には、ＭＡＲＫ１ＲＮＡ発現の変化の存在の検出が含まれる。ＲＮＡ発現の変化には、ＲＮＡ配列の変化の存在、ＲＮＡスプライシングまたはプロセシングの変化の存在、ＲＮＡ量の変化の存在などが含まれる。これらは周知の様々な技術、例えば、ＭＡＲＫ１  ＲＮＡの全体または一部分の塩基配列決定、または該ＲＮＡの全体または一部分の選択的ハイブリダイゼーションまたは選択的増幅によって検出可能である。
【００６３】
別の変異体では、方法には、ＭＡＲＫ１ポリペプチド発現の変化の存在の検出が含まれる。ＭＡＲＫ１ポリペプチド発現の変化には、ポリペプチド配列の変化の存在、ＭＡＲＫ１ポリペプチド量の変化の存在、組織分布における変化の存在などが含まれる。これらは周知の様々な技術、例えば、配列決定および／または特定リガンド（抗体など）への結合によって検出可能である。
【００６４】
上記のとおり、配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特定リガンド（抗体）への結合など、周知の様々な技術を利用して、ＭＡＲＫ１遺伝子／ＲＮＡ発現または配列の変化を検出または定量可能である。他の適当な方法には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロッティング（ＤＮＡに対して）、ノーザンブロッティング（ＲＮＡに対して）、一本鎖高次構造解析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリデーション法（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプ変性ゲル電気泳動法、ヘテロ二本鎖解析、ＲＮａｓｅプロテクション法、化学的ミスマッチ切断、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。
【００６５】
これらの方法の一部（例、ＳＳＣＡおよびＣＧＧＥ）は、配列の変化の存在に起因する、核酸の電気泳動移動度の変化に基づいている。これらの技術に従って、配列の変化をゲル上での移動度の変化によって可視化させる。次に、断片の配列を決定して、変化を確認する。
【００６６】
他の一部は、被験者の核酸と野生型または変化したＭＡＲＫ１遺伝子／ＲＮＡに特異的なプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。プローブは、浮遊状態にする（suspension）か、もしくは基質に固定できる。プローブは通常、標識して、ハイブリッドの検出を容易にする。
【００６７】
これらの方法の一部（ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなど）は、ポリペプチド配列または発現レベルの評価に特に適している、これらの後者では、ポリペプチドに特異的なリガンド、より好ましくは特異的抗体の使用が必要となる。
【００６８】
特に、好ましい一実施態様では、方法には、被験者の検体におけるＭＡＲＫ１遺伝子発現プロファイルの変化の存在の検出が含まれる。上記のとおり、これは、より好ましくは、該検体に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅によって達成可能である。
【００６９】
配列決定
自動シークエンサーを用いて、周知の技術を利用して配列決定を実施可能である。完全なＭＡＲＫ１遺伝子、より好ましくは、通常、有害な突然変異又は他の変化を有することが判明している、もしくは有することが疑われるＭＡＲＫ１遺伝子の特異的領域について配列決定を実施可能である。
【００７０】
増幅
増幅は、核酸複製の開始に役立つ相補的な核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づいている。
【００７１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）などの周知の様々な技術に従って増幅を実施する。これらの技術は、市販の試薬およびプロトコルを利用して実施可能である。好ましい技術では、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰが利用される。通常、増幅において、反応を開始させるために特異的な核酸プライマーの使用が必要である。
【００７２】
ＭＡＲＫ１遺伝子または遺伝子座からの配列の増幅に有用な核酸プライマーは、該遺伝子座の標的領域に隣接するＭＡＲＫ１遺伝子座の一部に特異的にハイブリダイズ可能であり、該標的領域は、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を患う特定の個人において変化している。該標的領域の例を表１に示している。
【００７３】
表１において特定されているＳＮＰを含むＭＡＲＫ１標的領域を増幅させるために使用可能なプライマーは、配列番号：１の配列またはＭＡＲＫ１のゲノム配列に基づいて設計されうる。特定の一実施態様では、プライマーは配列番号：３−１１の配列に基づいて設計されうる。
【００７４】
本発明の別の特定の目的は、周辺領域を含めたＭＡＲＫ１遺伝子または遺伝子座からの配列の増幅に有用な核酸プライマーにある。該プライマーは、好ましくはＭＡＲＫ１遺伝子座内の核酸配列と相補的であり、特異的にハイブリダイズする。特定のプライマーは、該遺伝子座の標的領域に隣接するＭＡＲＫ１遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイズ可能であり、該標的領域は、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を患う特定の個人において変化している。
【００７５】
本発明は核酸プライマーとも関連しており、該プライマーは自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を患う特定の被験者において変化しているＭＡＲＫ１コード配列（例、遺伝子またはＲＮＡ）の一部と相補的であり、特異的にハイブリダイズする。この点について、本発明の特定のプライマーはＭＡＲＫ１遺伝子／ＲＮＡの変化した配列に特異的である。該プライマーを使用した増幅産物の検出は、ＭＡＲＫ１遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の非存在は、検体中に特定の変化が存在しないことを示す。
【００７６】
本発明の通常のプライマーは、約５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは約８〜２５ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。配列は、ＭＡＲＫ１遺伝子座の配列に直接由来できる。高い特異性を保証するには、完全な相補性が好ましい。しかし、一定のミスマッチは許容できる。
【００７７】
本発明は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の存在または素因の検出方法、または自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の治療に対する被験者の反応の評価方法における上記の核酸プライマーまたは核酸プライマー対の使用とも関連している。
【００７８】
選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションの検出方法は、核酸配列の変化の検出に役立つ相補的な核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づいている。
【００７９】
特定の検出方法には、野生型または変異ＭＡＲＫ１遺伝子もしくはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、そしてその後のハイブリッドの存在の検出が含まれる。プローブは、浮遊状態にするか、もしくは基材または担体上に固定できる（核酸アレイまたはチップ技術など）。プローブは通常、標識付きで、ハイブリッドの検出を容易にする。
【００８０】
この点について、本発明の特定の一実施態様は、被験者の検体を変化したＭＡＲＫ１遺伝子座に対して特異的な核酸プローブと接触させること、およびハイブリッド形成を評価することを含む。特に、好ましい一実施態様では、該方法は、検体を野生型ＭＡＲＫ１遺伝子座および野生型ＭＡＲＫ１遺伝子座の様々な変化型に対して特異的な一連のプローブと同時に接触させることを含む。この実施態様では、検体中のＭＡＲＫ１遺伝子座における様々な変化の存在を直接検出できる。また、様々な被験者の様々な検体を同時に処理できる。
【００８１】
本発明の文脈中では、プローブは、ＭＡＲＫ１遺伝子もしくはＲＮＡ（の標的部位）と相補的かつ特異的なハイブリダイゼーションが可能であり、また自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害に罹りやすくする、または関連するＭＡＲＫ１対立遺伝子と関連するポリヌクレオチド多型の検出に適したポリヌクレオチド配列を示す。プローブは好ましくはＭＡＲＫ１遺伝子、ＲＮＡ、またはその標的部位と完全に相補的である。通常、プローブは、８〜１，０００ヌクレオチド長、例えば１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、通常は２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含んでいる。より長いプローブも使用可能であることを理解する必要がある。本発明の好ましいプローブは、８〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子であり、これは変化を有するＭＡＲＫ１遺伝子あるいはＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイズできる。
【００８２】
本発明の具体的な一実施態様は、変化した（例、突然変異を起こした）ＭＡＲＫ１遺伝子あるいはＲＮＡに特異的な核酸プローブ、つまり該変化したＭＡＲＫ１遺伝子あるいはＲＮＡに特異的に結合するが、該変化を欠くＭＡＲＫ１遺伝子あるいはＲＮＡには基本的にハイブリダイズしない核酸プローブである。特異性とは、標的配列へのハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションによって生じるシグナルとは区別可能な特異的シグナルを生じることを示している。本発明に従ったプローブを設計するためには、完全に相補的な配列が好ましい。一方で、特異的シグナルが非特異的シグナルと区別可能である限り、ある程度のミスマッチは許容可能であることを理解する必要がある。
【００８３】
該プローブの特定例は、上記の表１に記載されている点突然変異を有するＭＡＲＫ１遺伝子あるいはＲＮＡを含むゲノム領域の標的部位と相補的な核酸配列である。より特にプローブは、配列番号：３〜１１、またはＳＮＰまたはＳＮＰの相補的配列を含むその断片からなる群から選択される配列を含みうる。
【００８４】
該プローブの配列は、本出願において示されるＭＡＲＫ１遺伝子およびＲＮＡの配列由来とすることができる。プローブの化学的変化の他、ヌクレオチドの置換も可能である。該化学的変化は、ハイブリッドの安定性の向上（例、挿入基）またはプローブの標識化のために実施できる。標識の典型例として放射能、蛍光、発光、酵素標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の存在または素因の検出方法、または自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の治療に対する被験者の反応の評価方法における上記の核酸プローブの使用にも関する。
【００８６】
特異的なリガンド結合
上記のとおり、ＭＡＲＫ１遺伝子座の変化は、ＭＡＲＫ１ポリペプチド配列または発現レベルにおける変化を検査することによっても検出可能である。この点において、本発明の具体的な一実施態様には、検体とＭＡＲＫ１ポリペプチド特異的なリガンドとの接触および複合体の形成の決定が含まれる。
【００８７】
特異的抗体などの異なる種類のリガンドを使用可能である。具体的な一実施態様では、検体をＭＡＲＫ１ポリペプチド特異的抗体と接触させて、免疫複合体の形成を判定する。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）などの免疫複合体を検出するための様々な方法を使用可能である。
【００８８】
本発明の文脈中では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そして実質的に同じ抗原特異性を有するこれらの断片または派生物を示す。断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域などが含まれる。派生物には、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体などが含まれる。
【００８９】
ＭＡＲＫ１ポリペプチドに特異的な抗体は、ＭＡＲＫ１ポリペプチドに選択的に結合する抗体、つまりＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはそのエピトープを含む断片に対して作成された抗体を示す。他の抗原に対して非特異的な結合も生じるが、標的であるＭＡＲＫ１ポリペプチドに高い親和性で結合し、非特異的な結合とは確実に識別可能である。
【００９０】
具体的な一実施態様では、該方法は、被験者からの検体を変異型ＭＡＲＫ１ポリペプチドに対して特異的な抗体（でコーティングされた担体）と接触させること、および免疫複合体の存在を測定することからなる。特定の一実施態様では、野生型およびその様々な変化型のようなＭＡＲＫ１ポリペプチドの様々な形態に対して特異的な様々な抗体（でコーティングされた担体）と検体とを同時または並行して、または連続的に接触させることができる。
【００９１】
本発明は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の存在または素因の検出方法、または自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の治療に対する被験者の反応の評価方法における上記のリガンド、好ましくは抗体、断片またはその派生物の使用にも関する。
【００９２】
本発明は、被験者の検体におけるＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチド、ＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチドの発現、および／またはＭＡＲＫ１活性における変化の存在を検出するための産物および試薬を含む診断キットにも関する。本発明に従った該診断キットは、本発明に記載のプライマー、プライマー対、核酸プローブおよび／またはリガンドを含む。本発明に従った該診断キットはさらにハイブリダイゼーション、増幅、抗原‐抗体免疫反応を実施するための試薬および／またはプロトコルをさらに含むことができる。
【００９３】
診断方法は、インビトロ、エクスビボ、インビボ、好ましくはインビトロまたはエクスビボで実施可能である。これらにおいては、被験者の検体を用いて、ＭＡＲＫ１遺伝子座の状態を評価する。検体は、核酸またはポリペプチドを含む、被験者由来の任意の生物検体が可能である。該検体の例として、体液、組織、細胞検体、器官、生検などが挙げられる。最も好ましい検体は、血液、血漿、唾液、尿、精液などである。例えば胎児細胞や胎盤細胞の検査によって出生前診断を実施することも可能である。従来の方法に従って検体を採取して、診断に直接使用するか、保存することが可能である。検査において核酸またはポリペプチドの利用性を与える、もしくは向上させるために、該方法の実施前に検体を処理可能である。処理としては、例えば溶解（例、機械的、物理的、化学的など）、遠心分離などが挙げられる。また、核酸および／またはポリペプチドを従来の方法で前精製または濃縮する、および／または複雑性を低減させることができる。核酸およびポリペプチドに酵素処理、もしくは他の化学的処理または物理的処理を施して、その断片を作成することもできる。請求の範囲に記載されている方法の高い感度を考慮すると、アッセイの実施にはごく微量の検体で十分である。
【００９４】
示されたように、変化したＭＡＲＫ１遺伝子座の存在を評価するために、好ましくはプローブ、プライマー、リガンドなどの試薬を検体と接触させる。プレート、チューブ、ウェル、ガラスなどの適当なデバイス内で接触させることができる。具体的な実施態様では、核酸アレイまたは特異的リガンドアレイなど、試薬でコーティングされた基材上で接触させることができる。該基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の担体といった固形または半固形基材でありうる。基材は、スライド、メンブレン、ビーズ、カラム、ゲルなどの様々な形状および大きさでありうる。薬剤と検体の核酸またはポリペプチド間で複合体を形成するのに適した条件下で接触させることができる。
【００９５】
検体中の変化したＭＡＲＫ１ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡに関する知見は、被験者における変化したＭＡＲＫ１遺伝子座の存在の指標であり、これは自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の存在、素因、または進行の段階と相関する可能性がある。例えば、生殖細胞系にＭＡＲＫ１突然変異を有する個人では、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を発症するリスクが増大している。被験者における変化したＭＡＲＫ１遺伝子座の存在の判定によって、より効果的で特別あつらえの、適切な治療的介入の計画が可能となる。また、発症前の段階でのこの判定によって、予防計画の適用が可能となる。
【００９６】
連鎖不平衡
第一のＳＮＰが目的のゲノム領域内、より具体的にはＭＡＲＫ１遺伝子座内で同定されれば、通常の技量を有する専門家であれば、最初のＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰを容易に同定可能である。実際に、自閉症または関連する障害と関連する第一のＳＮＰと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰは、この特性と関連しうる。したがって、ひとたび任意のＳＮＰと自閉症または関連する障害との関連が実証されれば、この特定領域内においてＳＮＰ密度を増すために、この特性と関連する追加のＳＮＰを発見することが重要となる。
【００９７】
所定のＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰの同定には、（ａ）複数の個人由来の第一のＳＮＰを含む、もしくは第一のＳＮＰの周辺のゲノム領域からの断片の増幅、（ｂ）第一の該ＳＮＰを含む、もしくは第一のＳＮＰの周辺のゲノム領域内の第二のＳＮＰの同定、（ｃ）第一のＳＮＰと第二のＳＮＰ間での連鎖不平衡解析の実施、（ｄ）第一の該マーカーと連鎖不平衡にあるものとしての第二の該ＳＮＰの選択が含まれる。（ｂ）および（ｃ）の段階を含むサブコンビネーションも検討される。
【００９８】
ＳＮＰを同定して、連鎖不平衡解析を実施するための方法は、過度の実験もなく、周知の方法によって当業者によって実施可能である。
【００９９】
連鎖不平衡にあるこれらのＳＮＰは、本発明に従った方法、特に本発明に従った診断方法においても使用可能である。
【０１００】
クローン病の連鎖遺伝子座は、染色体５ｑ３１上の１８ｃＭに及ぶ広範な領域にマッピングされている（Ｒｉｏｕｘら，  ２０００  ａｎｄ  ２００１）。領域全体に及ぶマイクロサテライトマーカーおよびＳＮＰの高密度マップを利用して、連鎖不平衡（ＬＤ）の有力な証拠が見出された。ＬＤの証拠を発見したため、著者らは、超高密度ＳＮＰマップを作成して、このマップから選択されたマーカーのより高密度な一群について研究した。多遺伝子座解析によって、ＴＤＴを利用してそれぞれ個別に関連付けられた複数のＳＮＰを特徴とする単一の共通したリスクハプロタイプを明確にした。これらのＳＮＰはリスクハプロタイプに固有であり、互いにほぼ完全なＬＤにあるために、本質的に情報の内容は同一である。これらのＳＮＰの同等の特性によって、遺伝的証拠のみに基づいてこの領域内の原因となる突然変異の同定が可能となる。
【０１０１】
原因となる突然変異
自閉症または関連する障害に関与するＭＡＲＫ１遺伝子の突然変異は、自閉症または関連する障害を呈する患者と対照の個人由来のＭＡＲＫ１遺伝子の配列を比較することで同定できる。ＭＡＲＫ１のＳＮＰと自閉症または関連する障害との同定された関連に基づいて、同定された遺伝子座の突然変異をスキャンできる。好ましい一実施態様では、ＭＡＲＫ１遺伝子のエクソンおよびスプライシング部位、プロモーターなどの調節領域などの機能的領域の突然変異がスキャンされる。好ましくは、自閉症または関連する障害を呈する患者が、自閉症または関連する障害と関連することが示されている突然変異を有しており、対照の個人は自閉症または関連する障害と関連する突然変異または対立遺伝子を有していない。自閉症または関連する障害を呈する患者が、対照である個人よりも高い頻度で、自閉症または関連する障害と関連することが示される突然変異を有することもありうる。
【０１０２】
該突然変異を検出するために使用される方法は、通常、以下の段階からなる：自閉症または関連する障害を呈する患者および対照である個人由来のＭＡＲＫ１遺伝子のＤＮＡ検体から、自閉症または関連する障害と関連するＳＮＰまたはＳＮＰ群を含むＭＡＲＫ１遺伝子領域の増幅；増幅された領域の配列決定；自閉症または関連する障害を呈する患者および対照である個人由来のＭＡＲＫ１遺伝子のＤＮＡ配列の比較；自閉症または関連する障害を呈する患者に対して特異的な突然変異の決定。
【０１０３】
したがって、ＭＡＲＫ１遺伝子の原因となる突然変異の同定は、過度の実験もなく、周知の方法によって当業者によって実施可能である。
【０１０４】
例えば、原因となる突然変異は、以下の実施例において通常の方法を利用して同定されている。
【０１０５】
Ｈｕｇｏｔら（２００１）は、ポジショナルクローニング戦略を適用して、過去にクローン病に対する感受性と関連していることが見出されている１６番染色体の領域内においてクローン病への感受性の強い遺伝子変異体を同定した。潜在的な感受性の遺伝子座の位置を狭めるために、２６種のマイクロサテライトマーカーについて遺伝子型を特定して、伝達不平衡試験（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｅｓｔ）を利用してクローン病との関連を調べた。マクロサテライトマーカーＤ１６Ｓ１３６の１つの対立遺伝子間においてボーダーライン上の有意な関連性（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が発見された。周辺領域から１１種の追加のＳＮＰを選択して、数種のＳＮＰが有意な関連性を示した。
【０１０６】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の単一のエクソン内にこの領域由来のＳＮＰ５−８が存在することが発見されており、非同義変異であることが示されている。これによって、著者らによる５０ＣＤ患者におけるこの遺伝子の完全コード配列の配列決定が促された。さらに２つの非同義変異（ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１３）が見出された。家系伝達不平衡試験（ｐｅｄｉｇｒｅｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｅｓｔ）を利用して、ＳＮＰ１３が最も有意に関連していた（ｐ＝６ｘ１０−６）。別の独立した研究では、４人の対照と比較して、１２人の罹患者由来のこの遺伝子のコード領域の配列決定によっても同じ変異が発見された（Ｏｇｕｒａ  ら，  ２００１）。ＳＮＰ１３の稀な対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質を断片にすることが予測される１ｂｐの挿入と一致した。この対立遺伝子は、対照と比較して頻度はかなり低いものの、健常な個人にも存在していた。
【０１０７】
同様に、Ｌｅｓａｇｅら（２００２）は、散発性症例１６６例および家族性症例２８７例を含むＣＤ患者４５３例、潰瘍性大腸炎（ＣＤ）患者１５９例、健常な対照患者１０３例において、コード領域の系統的配列決定によってＣＡＲＤ１５の突然変異解析を実施した。同定された６７の配列変異の内、ＣＤ患者における対立遺伝子頻度は＞５％であった。これらの内６例は多型と考えられ、３つ（ＳＮＰ１２−Ｒ７０２Ｗ、ＳＮＰ８−Ｇ９０８Ｒ、ＳＮＰ１３−１００７ｆｓ）はＣＤの感受性と独立して関連していることが確認された。２７の稀な突然変異も潜在的な疾患の原因となる突然変異（ＤＣＭ：ｄｉｓｅａｓｅ−ｃａｕｓｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）と見なされた。３つの主な変異（Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒ、１００７ｆｓ）は、全てのＣＤ突然変異のそれぞれ３２％、１８％、３１％を示していたが、合計２７の稀な突然変異はＤＣＭの１９％を示していた。全体で、突然変異の９３％は、遺伝子の３番目の末端に位置していた。ＵＣと関連する突然変異は発見されなかった。対照的に、二重突然変異を有する１７％を含め、ＣＤ患者の５０％は少なくとも１つのＤＣＭを有していた。
【０１０８】
薬剤スクリーニング
本発明は、新しい標的および薬剤候補又はリード（lead）のスクリーニング方法も提供する。方法には、結合解析および／または機能解析が含まれ、インビトロ、細胞系、動物などにおいて実施できる。
【０１０９】
本発明の特定の目的は、生物活性化合物の選択方法にあり、該方法は、試験化合物を本発明のＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチドとインビトロで接触させること、および該試験化合物と該ＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチドとの結合能を測定することからなる。該遺伝子またはポリペプチドとの結合は、化合物が該標的の活性を調節して、ひいては被験者における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を招く経路に影響を及ぼす能力に関する指標となる。好ましい一実施態様では、方法は、試験化合物を本発明に従ったＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片とインビトロで接触させること、および該試験化合物が該ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたは断片と結合する能力を測定することからなる。該断片は好ましくは、該ＭＡＲＫ１ポリペプチドの結合部位を含む。好ましくは、該ＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチドまたはその断片は、変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチドまたはその断片である。
【０１１０】
本発明の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害に対して活性を有する化合物の選択方法にあり、該方法は、試験化合物を本発明のＭＡＲＫ１ポリペプチドまたは結合部位を含むその断片とインビトロで接触させること、および該試験化合物が該ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片と結合する能力を測定することからなる。好ましくは、該ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片は、変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片である。
【０１１１】
別の特定の一実施態様では、方法は、本発明に従ったＭＡＲＫ１ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞を試験化合物と接触させること、および該試験化合物が該ＭＡＲＫ１に結合してＭＡＲＫ１ポリペプチドの活性を調節する能力を測定することからなる。好ましくは、該ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片は、変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片である。
【０１１２】
試験化合物の標識化、標識済み対照リガンドとの競合など、様々な方法を利用して結合を測定可能である。
【０１１３】
本発明の別の目的は、生物活性化合物の選択方法にあり、該方法は、試験化合物を本発明のＭＡＲＫ１ポリペプチドとインビトロで接触させること、および該試験化合物が該ＭＡＲＫ１ポリペプチドの活性を調節する能力を測定することからなる。好ましくは、該ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片は、変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片である。
【０１１４】
本発明の別の目的は、生物活性化合物の選択方法にあり、該方法は、試験化合物を本発明のＭＡＲＫ１遺伝子とインビトロで接触させること、および該試験化合物が該ＭＡＲＫ１ポリペプチドの発現を調節する能力を測定することからなる。好ましくは、該ＭＡＲＫ１遺伝子またはその断片は、変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１遺伝子またはその断片である。
【０１１５】
別の一実施態様では、本発明は、活性のある化合物、特に自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害に対して活性を有する化合物のスクリーニング、選択、同定の方法と関連しており、該方法は、試験化合物をレポーター構築物を含む組み換え宿主細胞と接触させること、ここで該レポーター構築物はＭＡＲＫ１遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む、およびレポーター遺伝子の発現を調節する（例えば、促進または減少させる）試験化合物を選択することからなる。好ましくは、該ＭＡＲＫ１遺伝子プロモーターまたはその断片は、変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１遺伝子またはその断片である。
【０１１６】
スクリーニング方法の特定の一実施態様では、調節は抑制である。スクリーニング方法の別の特定の一実施態様では、調節は活性化である。
【０１１７】
上記のスクリーニングアッセイは、プレート、チューブ、ディッシュ、フラスコなどの適当な機器内において実施可能である。通常、アッセイはマルチウェルプレート内で実施する。数種の試験化合物を同時にアッセイ可能である。さらに、試験化合物の由来、性質、組成は多様でありうる。分離された、もしくは他の物質との混合での、脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などの有機物質または無機物質でありうる。化合物は、例えば産物の組み合わせライブラリーの全体または一部でありうる。
【０１１８】
薬学的組成物、治療
本発明の別の目的は、（ｉ）ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片、ＭＡＲＫ１ペプチドまたはその断片をコードする核酸、上記のベクターまたは組み換え宿主細胞、および（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬的組成物である。
【０１１９】
本発明は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を治療または予防する方法とも関連しており、該方法は機能的（例、野生型）ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはこれをコード化する核酸の該被験者への投与を含む。
【０１２０】
本発明の別の一実施態様は、被験者における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害を治療または予防する方法にあり、該方法は、本発明に従ったＭＡＲＫ１遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する、好ましくは活性化または模倣する化合物の該被験者への投与を含む。該化合物は、ＭＡＲＫ１のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＭＡＲＫ１のアンチセンスまたはＲＮＡｉ、本発明に従ったＭＡＲＫ１ポリペプチドに対して特異的な抗体または断片またはその派生物が可能である。該方法の特定の一実施態様では、調節は抑制である。該方法の別の特定の一実施態様では、調節は活性化である。
【０１２１】
本発明は概して、被験者における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の治療または予防のための医薬的組成物の製造における、機能的なＭＡＲＫ１ポリペプチド、これをコード化する核酸、本発明に従ったＭＡＲＫ１遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する化合物の使用とも関連している。該化合物は、ＭＡＲＫ１のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＭＡＲＫ１のアンチセンスまたはＲＮＡｉ、本発明に従ったＭＡＲＫ１ポリペプチドに対して特異的な抗体または断片またはその派生物が可能である。該方法の特定の一実施態様では、調節は抑制である。該方法の別の特定の一実施態様では、調節は活性化である。
【０１２２】
本発明によって、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害とＭＡＲＫ１遺伝子座との相関が実証される。このように、本発明によって治療的診断の新しい標的を提供される。被験者、特に変化したＭＡＲＫ１遺伝子座を有する被験者におけるＭＡＲＫ１の活性または機能を回復または調節するための様々なアプローチを検討可能である。野生型の機能を該被験者に与えることで、病的な細胞または生物における自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の表現型の発現が抑制されることが期待される。該機能の供給は、遺伝子またはタンパク質治療、またはＭＡＲＫ１ポリペプチドの活性を調節または模倣する化合物（例、上記のスクリーニングアッセイにおいて同定されたアゴニスト）の投与によって達成可能である。
【０１２３】
上記のベクターを利用して、野生型ＭＡＲＫ１遺伝子またはその機能的部分を、これらを必要としている被験者の細胞内に導入可能である。ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドでありうる。該遺伝子を裸のＤＮＡとしても導入可能である。受容者の宿主細胞のゲノム内に取り込ませる、もしくは染色体外に残存させるように、該遺伝子を供給可能である。組み込みは、相同組み換えなどによって、ランダムに、または正確に定められた部位で生じうる。特に、相同組み換えによる細胞内の変化したバージョンとの置換で機能的ＭＡＲＫ１遺伝子のコピーを挿入可能である。別の方法として、遺伝子銃、リポソーム媒介のトランスフェクション、陽イオン性脂質媒介のトランスフェクションなどが挙げられる。遺伝子治療は、直接の遺伝子注入、または機能的なＭＡＲＫ１ポリペプチドを発現するエクスビボで改変された遺伝子組み換え細胞の投与によって達成可能である。
【０１２４】
ＭＡＲＫ１活性を伴う他の分子（例、ペプチド、薬剤、ＭＡＲＫ１アゴニスト、有機化合物）を使用して、被験者における機能的なＭＡＲＫ１活性を回復させる、もしくは細胞内の有害な表現型を抑制させることが可能である。
【０１２５】
細胞内での機能的なＭＡＲＫ１遺伝子の機能の回復を利用して、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連の障害の発症を予防する、もしくは該疾患の進行を低下させることが可能である。該治療は、細胞、特に有害対立遺伝子を有する細胞の自閉症と関連する表現型を抑制可能である。
【０１２６】
本発明の別の態様および利点は、以下の実験の項で開示されており、これらは実例として見なすべきであり、本出願の範囲を限定しない。
【０１２７】
遺伝子、ベクター、組み換え細胞、ポリペプチド
本発明の別の態様は、診断、治療、スクリーニングに使用される新しい産物にある。これらの産物には、ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片をコード化する核酸分子、これらを含むベクター、組み換え宿主細胞、発現ポリペプチドを含む。
【０１２８】
より特に、本発明は、該変化または突然変異を含む、変化または突然変異ＭＡＲＫ１遺伝子またはその断片と関連する。本発明は、該変化または突然変異を含む、変化または突然変異ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片をコード化する核酸分子とも関連する。該変化または突然変異によってＭＡＲＫ１の活性が修飾される。修飾された活性は増加又は減少してもよい。本発明はさらに、該変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１遺伝子またはその断片、もしくは該変化または突然変異を含む変化または突然変異ＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその断片をコード化する核酸分子を含むベクター、組み換え宿主細胞、発現ポリペプチドに関連している。
【０１２９】
本発明の別の目的は、本発明に従ったＭＡＲＫ１ポリペプチドをコード化する核酸を含むベクターである。該ベクターとして、クローニングベクター、より好ましくは発現ベクター、つまりコンピテント宿主細胞内の該ベクターからＭＡＲＫ１ポリペプチドを発現させる調節配列を含むベクターが可能である。
【０１３０】
これらのベクターを使用して、インビトロ、エクスビボ、インビボでのＭＡＲＫ１ポリペプチドの発現、トランスジェニックまたは「ノックアウト」動物の作成、核酸の増幅、アンチセンスＲＮＡの発現などが可能となる。
【０１３１】
本発明のベクターは通常、調節配列（例、プロモーター、ポリＡなど）と作動的に連結された、本発明に従ったＭＡＲＫ１コード配列を含む。「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、コード配列および調節配列が機能的に関連しており、該調節配列がコード配列の発現（例、転写）を起こすことを示す。ベクターはさらに１個または数個の複製起点および／または選択マーカーを含みうる。プロモーター領域は、コード配列に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であり、インビボでの使用を含め、適当な任意の宿主細胞内において普遍的かつ構成的な、調節された、および／または組織特異的発現をもたらしうる。プロモーターの例として、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳動物遺伝子のプロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）などが挙げられる。
【０１３２】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどが可能である。プラスミドベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ、ｐＢＲなどの市販のベクターから調製可能である。ウイルスベクターは、周知の組み換えＤＮＡ技術に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから作成可能である。
【０１３３】
この点について、本発明の特別な目的は、先に定義されているＭＡＲＫ１ポリペプチドをコードする組み換えウイルスにある。組み換えウイルスは、好ましくは複製能を欠いており、さらに好ましくは、Ｅ１および／またはＥ４欠損アデノウイルス、Ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ欠損レトロウイルス、Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ欠損ＡＡＶから選択される。該組み換えウイルスは、パッケージング細胞へのトランスフェクション、またはヘルパープラスミドまたはウイルスの一過性トランスフェクションなどの周知の技術によって作成可能である。ウイルスのパッケージング細胞の典型例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。複製能を欠損した該組み換えウイルスの作成のための詳細なプロトコールは、例えば国際公開広報第９５／１４７８５号、国際公開広報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、国際公開広報第９４／１９４７８号において見ることができる。
【０１３４】
本発明の別の目的は、先の定義されている組み換えＭＡＲＫ１遺伝子またはベクターを含む組み換え宿主細胞にある。適当な宿主細胞として、原核生物細胞（細菌など）および真核生物細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられるが、これらに限定されない。具体例として、哺乳動物の初代培養細胞または確立された培養細胞（例、繊維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから作成）の他、大腸菌、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞株（例、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）が挙げられる。
【０１３５】
本発明は、本発明に従ったＭＡＲＫ１ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞の作成方法とも関連しており、該方法には、（ｉ）コンピテント細胞への上記の核酸またはベクターのインビトロまたはエクスビボでの導入、（ｉｉ）得られた組み換え宿主細胞の培養、（ｉｉｉ）場合により、ＭＡＲＫ１プロペプチドを発現する細胞の選択を含む。
【０１３６】
該組み換え宿主細胞は、下記のとおり、活性分子のスクリーニングの他、ＭＡＲＫ１ポリペプチドの生産に使用可能である。該細胞は、自閉症を研究するためのモデル系としても使用可能である。これらの細胞は、適当な培養器（プレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、ポーチなど）内で、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＨＡＭなどの適当な培地で維持可能である。
【０１３７】
実施例
１．１番染色体の感受性遺伝子を同定するためのＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォーム
自閉症の感受性遺伝子を迅速に同定を可能とするために、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォームを適用した。
【０１３８】
簡単に説明すると、該技術は、関係する個人でのＤＮＡの対形成を含む。各ＤＮＡを特異的標識で印を付けて、同定可能にする。次に、２つのＤＮＡ間でハイブリッドを形成させる。次に、特定のプロセス（国際公開広報００／５３８０２）を適用して、複数段階の手順で２つのＤＮＡから同祖的（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ−ｂｙ−ｄｅｓｃｅｎｔ（ＩＢＤ））な全ての断片を選択する。次に、ＩＢＤフラクションの染色体上のポジショニングを可能にするＢＡＣクローン由来のＤＮＡマイクロアレイに対して、残りのＩＢＤ濃縮ＤＮＡをスコアリングする。
【０１３９】
多くの異なる家族にこのプロセスを適用することで、各家族由来の各対についてＩＢＤフラクションのマトリクスがもたらされる。次に、統計解析によって、被験家族間で共有される最小ＩＢＤ領域が計算される。有意な結果（ｐ値）は、目的の特性（自閉症）を伴う陽性領域での連鎖の証拠である。有意なｐ値を示す最も遠い２つのクローンによって連鎖間隔の範囲を定めることが可能である。
【０１４０】
今回の研究では、厳密な自閉症（ＡＤＩ−Ｒにより定義）と一致する米国の１１４の家族（独立した１１４の血縁者組）が、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプロセスを受けた。次に、結果として得られたＩＢＤ濃縮ＤＮＡフラクションをＣｙ５蛍光色素で標識して、平均間隔１．２Ｍｂｐのヒトゲノム全体をカバーする２，２６３個のＢＡＣクローンからなるＤＮＡアレイに対してハイブリダイズさせた。Ｃｙ３標識された非選択ＤＮＡを使用して、各クローンのシグナル値を標準化し、比率を計算した。次に、比率結果のクラスタリングを実施して、各クローンおよび対になったクローンのＩＢＤ状態を判定した。
【０１４１】
この手順を適用することで、自閉症との連鎖に関する有意な証拠（ｐ＝１．２ｅ−０５）を示したＢＡＣクローン（ＢＡＣＡ２６ＺＧ１１）を同定した。連鎖の有意な証拠を示すＢＡＣクローンの近位および遠位のクローンによって特徴づけられる連鎖領域は１番染色体上の約５．８５メガ塩基に及んでいた（塩基２１７１７６５３９〜２２３０２９７６５）。
【０１４２】
表２：ＭＡＲＫ１遺伝子座内の１番染色体に関する連鎖結果：連鎖の証拠を示すＢＡＣクローンと一致する領域が示されている。クローンの開始及び停止位置は、染色体の開始位置（ｐ−ｔｅｒ）に関するＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３４に基づくゲノム位置と一致する。
【０１４３】
【表２】
2008532494.tif 000003
【０１４４】
２．  １番染色体上の自閉症感受性遺伝子の同定
連鎖している染色体領域内の上記の５．８５メガ塩基をスクリーニングすることで、自閉症および関連する表現型の候補として、ＭＡＰ／微小細管親和性調節キナーゼ１遺伝子を同定した。この遺伝子は実際に重要な間隔内に存在しており、上にまとめられたクローンによって範囲を定められた連鎖が証拠である。
【０１４５】
ＭＡＲＫ１遺伝子は、ＮＰ＿０６１１２０（ｍＲＮＡ  ＮＭ＿０１８６５０，４６３８ｂｐ）の推定７５８アミノ酸のポリペプチドをコード化しており、ゲノム配列の１３５．７ｋｂにわたって広がっている。この遺伝子によってコード化されるタンパク質は、微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）をリン酸化して、微小管の破壊を引き起こすタンパク質キナーゼ群の一員である。
【０１４６】
ＭＡＲＫは、微小管結合ドメインにおいて微小管関連タンパク質ｔａｕ、ＭＡＰ２、ＭＡＰ４をリン酸化して、それらの微小管からの解離および微小管ダイナミクスの増大を起こす（Ｄｒｅｗｅｓ  ら，１９９７）。細胞内でのＭＡＲＫ過剰発現はＫＸＧＳモチーフ上のＭＡＰの過剰リン酸化および微小管配列の破壊につながり、形態変化および細胞死を引き起こす。
【０１４７】
脳内で発現している大型タンパク質をコード化する配列を探索することで、Ｎａｇａｓｅら（２０００）はＭＡＲＫ１をコード化する部分的ｃＤＮＡを同定して、ＫＩＡＡ１４７７と名付けた。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、睾丸と脳に偏在する最高レベルの発現を検出した。脳内では、海馬で最高レベルを検出した。
【０１４８】
Ｍａｎｄｅｌｋｏｗら（２００４）は、細胞極性をもたらすこと、およびアルツハイマー病神経変性中のｔａｕタンパク質をリン酸化することへの関与が知られているキナーゼの一群であるＭＡＲＫ／ＰＡＲ１キナーゼが、微小管依存性の軸索輸送の調節因子であることを報告した。
【０１４９】
興味深いことに、フィンランドの集団における統合失調症に関する連鎖解析によって、同定された自閉症感受性遺伝子座のすぐ近傍の遺伝子座との連鎖の証拠が得られており、同じ遺伝子が２つの疾患に関与する可能性を示している。この研究では、遺伝子型決定の結果を、フィンランドの隔離された内陸部出身の家族と、フィンランドの他の残りの地域出身の家族について別々に、および全家族を一緒にして解析している（Ｅｋｅｌｕｎｄ  ら，２００１）。総合した検体（Ｚ（ｍａｘ）２．７１）および隔離された内陸部外出身の核家族（Ｚ（ｍａｘ）３．２１）においてＤ１Ｓ２７０９（位置：２２９０６５３５５−２２９０６５６４５）について連鎖の証拠が得られた。
【０１５０】
まとめると、本出願において提供された、軸索内輸送に関与する、１番染色体上の自閉症と関連する遺伝子変化の重要な間隔でヒトのＭＡＲＫ１遺伝子を同定している連鎖結果から、ＭＡＲＫ１遺伝子変化またはその調節配列の変化（例、突然変異および／または多型）がヒトでの自閉症発症の一因となっており、診断または治療的診断の新しい標的が示されると結論付けた。
【０１５１】
３．関連研究
連鎖研究において使用された同じ家族を、問題になっている特定の表現型（本明細書の自閉症）と伝達不平衡試験（ＴＤＴ：Ｔｒａｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｔｅｓｔ）を利用する特定マーカーの対立遺伝子を含む遺伝子マーカー対立遺伝子またはハプロタイプとの間の関連研究にも使用した。ＴＤＴは被験体における集団階層化が問題とならないため、強力な関連研究である。簡単に説明すると、ヘテロ接合性の両親から罹患した子供への対立遺伝子の分離について試験した。伝達されない対立遺伝子と比べた、罹患した子供へ伝達された対立遺伝子の一部を、ランダム分布下において予測される比率と比較した。予測値を超える有意に過剰の対立遺伝子の伝達は、各対立遺伝子またはハプロタイプと試験した自閉症の表現型とが関連する証拠である。
【０１５２】
この解析での結果によって、ＭＡＲＫ１遺伝子の特定の対立遺伝子が自閉症と正に関連しており、ひいては疾患に対する感受性を高めることが示されている。被験集団において、ＳＮＰ１３の対立遺伝子Ｇは、ＴＤＴによって判定された自閉症と相関している（ｐ値０．０１１）。対照的に、ＳＮＰ１３の対立遺伝子Ａの自閉症患者への伝達は有意に低く、この対立遺伝子が該疾患から守る手助けとなることを示している。
【０１５３】
対立遺伝子の自閉症患者への伝達の例を表３に示している。
【０１５４】
【表３】
2008532494.tif 000004
【０１５５】
また、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ５０、ＳＮＰ９０のハプロタイプを構築して、全てのＳＮＰの段階を同定した。
【０１５６】
被験集団におけるこの解析での結果によって、ＳＮＰ１２の対立遺伝子２（Ｔ）の存在を特徴とする全ての特定ハプロタイプが自閉症と有意に関連しており、対立遺伝子１（Ａ）を欠く特定ハプロタイプが選択的に自閉症患者に伝達されないことが示された。一例は、ＳＮＰ１２−ＳＮＰ９０におけるハプロタイプ２−２（Ｔ−Ｔ）である（ｐ０．００３４８４）。ＳＮＰ１２において対立遺伝子Ｇの代わりに対立遺伝子Ａを有するハプロタイプは、自閉症患者において低く示されるという有意な証拠を示している。一例は、ＳＮＰ１０−ＳＮＰ１１−ＳＮＰ１２におけるハプロタイプ２−２−１（Ｇ−Ｇ−Ａ）である（ｐ０．００１６５）。
【０１５７】
自閉症患者に選択的に伝達されるハプロタイプおよび伝達されないハプロタイプの例を表４に示している。
【０１５８】
【表４】
2008532494.tif 000005
【０１５９】
【表５】
2008532494.tif 000006
2008532494.tif 000007
2008532494.tif 000008
2008532494.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＧｅｎｏｍｅＨＩＰ）を利用した高密度マッピング。
【図１】
2008532494.tif 000010
【配列表】
2008532494000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月18日(2007.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における自閉症または自閉症領域障害の存在または素因を検出するインビトロでの方法であって、該被験者からの検体においてＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
被験者における自閉症または自閉症領域障害からの防御を検出するインビトロでの方法であって、該被験者からの検体においてＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項３】
自閉症または領域障害の治療に対する被験者の反応を評価するインビトロでの方法であって、該被験者からの検体においてＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項４】
自閉症または自閉症領域障害の治療に対する被験者の有害反応を評価するインビトロでの方法であって、該被験者からの検体においてＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項５】
ＭＡＲＫ１遺伝子座の変化の存在が、塩基配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、および／または選択的増幅によって検出される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
該変化が自閉症と関連する１または複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
自閉症と関連する該ハプロタイプが、ＳＮＰ９、ＳＮＰ１０、ＳＮＰ１１、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３１、ＳＮＰ９０からなる群から選択される複数のＳＮＰを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
自閉症と関連する該ＳＮＰがＳＮＰ１３である、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物学的活性化合物の選択方法であって、試験化合物をＭＡＲＫ１ポリペプチドまたはその遺伝子ないしそれらの断片と接触させること、およびＭＡＲＫ１ポリペプチドまたは遺伝子ないしそれらの断片と結合する該試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１０】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物学的活性化合物の選択方法であって、ＭＡＲＫ１ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞を試験化合物と接触させること、および該ＭＡＲＫ１ポリペプチドと結合するおよびＭＡＲＫ１ポリペプチド活性を調節する該試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１１】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物学的活性化合物の選択方法であって、試験化合物をＭＡＲＫ１遺伝子と接触させること、および該ＭＡＲＫ１遺伝子の発現を調節する該試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１２】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物学的活性化合物の選択方法であって、試験化合物を、ＭＡＲＫ１遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組み換え宿主細胞と接触させること、および該レポーター遺伝子の発現を調節する（例えば、促進または減少させる）試験化合物を選択することを含む方法。
【請求項１３】
該ＭＡＲＫ１遺伝子またはそのポリペプチドまたはそれらの断片が、変化または突然変異ＭＡＲＫ１遺伝子またはポリペプチド、または変化または突然変異を含むそれらの断片である、請求項９〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
該調節が活性化である、請求項９〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
該調節が抑制である、請求項９〜１３のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
2008532494.tif 000011
2008532494.tif 000012
2008532494.tif 000013