(57)【要約】本発明は、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減／緩和する方法を提供する。この方法は、典型的には、習慣性行動の１以上の構成要素を緩和するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストをそれを必要とする対象へ投与することを含む。また、本発明は、哺乳動物による、乱用薬物の慢性的消費、そのような消費の中止、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減するための組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
習慣性行動の１以上の構成要素を軽減するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａレセプターアゴニストを習慣性行動の１以上の構成要素を呈する哺乳動物に投与することを含み、ここに、該Ａ２Ａレセプターアンタゴニストはカフェインではないことを特徴とする、哺乳動物による、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関係する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減する、方法。
【請求項２】
該アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストが（−）−Ｒ，Ｓ）−メフロキン、３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン（ＤＭＰＸ）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−７−メチル−８−（ｍ−メトキシスチリル）−１−プロパルギルキサンチン（ＭＸ２）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−８−（３−メトキシスチリル）−７−メチル−１−プロパルギルキサンチンホスフェート二ナトリウム塩（ＭＳＸ−３）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ＳＣＨ５８２６１、ＫＷ−６００２、アミノフリルトリアゾロ−トリアジニルアミノエチルフェノール（ＺＭ２４１３８５）、および８−クロロスチリルカフェイン、ＫＦ１７８３７、ＶＲ２００６、イストラデフィリン、ＶＥＲ−１１１３５、ＶＥＲ６４０９、ＶＥＲ６４４０、ＶＥＲ６４８９、ＶＥＲ６６２３、ＶＥＲ６９４７、ＶＥＲ７１３０、ＶＥＲ７１４６、ＶＥＲ７４４８、ＶＥＲ７８３５、ＶＥＲ８１７７、ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、および５−アミノ−イミダゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジンよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンタゴニストがアデノシンＡ１Ａレセプターに実質的に拮抗しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記乱用物質がエタノール、オピエート、カンナビノイド、ニコチン、および刺激体よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記乱用物質がモルヒネ、ヘロイン、マリファナ、ハシーシ、コカイン、およびアンフェタミンよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記乱用物質がエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記習慣性行動の構成要素が前記乱用物質の慢性自己投与である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記習慣性行動の構成要素が前記乱用物質に対する欲望である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記習慣性行動の構成要素が前記乱用物質に対する欲望行動の復帰である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物が乱用物質の慢性的消費を行う動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が乱用物質の慢性的消費を終止した哺乳動物である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物が禁断症状の１以上の兆候を経験している哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がパーキンソン病に罹っていないヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンタゴニストが全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンタゴニストが経口投与、鼻投与、直腸投与、腹腔内注射、血管内注射、皮下注射、経皮投与、吸入投与、および筋肉内注射よりなる群から選択される経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンタゴニストが単位投与処方として処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンタゴニストが時間放出処方として処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、さらに、前記アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストと組み合わせてドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストが、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストよりも前に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストが、前記アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト後に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストが、前記アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストと同時に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストおよび前記ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストが単一化合物処方として処方される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストが、ブタクラモール、クロルプロマジン、ドムペリドン、フルフェナジン、ハロペニドール、ヘテロアリールピペリジン、メトクロプラミド、オランザピン、ペロスピロン塩酸塩水和物、フェノチアジン、ピモジド、ケチアピン、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、ジプラシドン、およびゾテピンよりなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト；およびドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストを含む、哺乳動物による、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減するための組成物。
【請求項２６】
前記ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストが、ブタクラモール、クロルプロマジン、ドムペリドン、フルフェナジン、ハロペニドール、ヘテロアリールピペリジン、メトクロプラミド、オランザピン、ペロスピロン塩酸塩水和物、フェノチアジン、ピモジド、ケチアピン、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、ジプラシドン、およびゾテピンよりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストが（−１）−Ｒ，Ｓ）−メフロキン、３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン（ＤＭＰＸ）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−７−メチル−８−（ｍ−メトキシスチリル）−１−プロパルギルキサンチン（ＭＸ２）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−８−（３−メトキシスチリル）−７−メチル−１−プロパルギルキサンチンホスフェート二ナトリウム塩（ＭＳＸ−３）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ＳＣＨ５８２６１、ＫＷ−６００２、アミノフリルトリアゾロ−トリアジニルアミノエチルフェノール（ＺＭ２４１３８５）、および８−クロロスチリルカフェイン、ＫＦ１７８３７、ＶＲ２００６、イストラデフィリン、ＶＥＲ−１１１３５、ＶＥＲ６４０９、ＶＥＲ６４４０、ＶＥＲ６４８９、ＶＥＲ６６２３、ＶＥＲ６９４７、ＶＥＲ７１３０、ＶＥＲ７１４６、ＶＥＲ７４４８、ＶＥＲ７８３５、ＶＥＲ８１７７、ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、および５−アミノ−イミダゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジンよりなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを含有する容器、ここに、該１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの少なくとも１つはカフェインではなく；および
哺乳動物における物質乱用の治療において該アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを用いることを教示する指示材料；
を含む、
哺乳動物による、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減するためのキット。
【請求項２９】
前記１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストが（−）−Ｒ，Ｓ）−メフロキン、３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン（ＤＭＰＸ）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−７−メチル−８−（ｍ−メトキシスチリル）−１−プロパルギルキサンチン（ＭＸ２）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−８−（３−メトキシスチリル）−７−メチル−１−プロパルギルキサンチンホスフェート二ナトリウム塩（ＭＳＸ−３）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ＳＣＨ５８２６１、ＫＷ−６００２、アミノフリルトリアゾロ−トリアジニルアミノエチルフェノール（ＺＭ２４１３８５）、および８−クロロスチリルカフェイン、ＫＦ１７８３７、ＶＲ２００６、イストラデフィリン、ＶＥＲ−１１１３５、ＶＥＲ６４０９、ＶＥＲ６４４０、ＶＥＲ６４８９、ＶＥＲ６６２３、ＶＥＲ６９４７、ＶＥＲ７１３０、ＶＥＲ７１４６、ＶＥＲ７４４８、ＶＥＲ７８３５、ＶＥＲ８１７７、ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、および５−アミノ−イミダゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジンよりなる群から選択されるアンタゴニストを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記アンタゴニストがアデノシンＡ１Ａレセプターに実質的に拮抗しない、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記乱用物質がエタノール、オピエート、カンナビノイド、ニコチン、および刺激体よりなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
前記乱用物質がモルヒネ、ヘロイン、マリファナ、ハシーシ、コカイン、およびアンフェタミンよりなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３３】
前記乱用物質がエタノールである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３４】
前記習慣性行動の構成要素が前記乱用物質の慢性的自己投与である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３５】
前記習慣性行動の構成要素が前記乱用物質に対する欲望である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３６】
前記習慣性行動の構成要素が前記乱用物質に対する欲求行動の復帰である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３７】
前記アンタゴニストが、経口投与、鼻投与、直腸投与、腹腔内注射、血管内注射、皮下注射、経皮投与、吸入投与、および筋肉内注射よりなる群から選択される経路による投与のために処方される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３８】
前記アンタゴニストが単位投与処方として処方される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３９】
前記アンタゴニストが時間放出処方として処方される、請求項２８に記載のキット。
【請求項４０】
１以上のテスト因子を提供し；次いで、アデノシンＡ２Ａレセプターの発現または活性を阻害する能力について前記テスト因子をスクリーニングすることを含み、ここに、アデノシンＡ２Ａレセプターの発現または活性の阻害が、前記１以上のテスト因子が乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害するための候補剤であることを示すことを特徴とする、乱用物質の慢性的消費に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害する因子をスクリーニングする方法。
【請求項４１】
前記スクリーニングが、Ａ２Ａレセプターに結合する能力について前記テスト因子をスクリーニングすることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４２】
前記スクリーニングが、さらに、前記乱用物質のオペラント自己投与を阻害する能力について前記テスト因子をスクリーニングすることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記スクリーニングが、さらに、前記乱用物質に対する欲求行動の復帰を阻害する能力について前記テスト因子をスクリーニングすることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記乱用物質がエタノール、オピエート、カンナビノイド、ニコチン、および刺激体よりなる群から選択される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記乱用物質がモルヒネ、ヘロイン、マリファナ、ハシーシ、コカイン、およびアンフェタミンよりなる群から選択される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
１以上の推定アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを提供し；次いで、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害する能力について前記テスト因子をスクリーニングすることを含む、乱用物質の慢性的消費に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害する因子についてスクリーニングする方法。
【請求項４７】
前記スクリーニングが、前記乱用物質のオペラント自己投与を阻害する能力について前記テスト因子をスクリーニングすることを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記スクリーニングは、さらに、前記乱用物質に対する欲求行動の復帰を阻害する能力について前記テスト因子をスクリーニングすることを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記乱用物質が刺激体、オピエート、カンナビノイド、ニコチン、およびエタノールよりなる群から選択される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記乱用物質がモルヒネ、ヘロイン、マリファナ、ハシーシ、コカインおよびアンフェタミンよりなる群から選択される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年６月１７日に出願されたＵＳＳＮ  ６０／５８１，１４３の利益および優先権を主張する。この出願は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府の支援した研究開発の下でなされる発明に対する権利に関する陳述）
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの助成金ＡＡ１００３０およびＡＡ１００３９によって一部支援されており、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通したエタノールおよび物質の乱用に対する医療研究のためにＣａｌｉｆｏｒｎｉａ州により提供される基金によって一部支援されており、そしてＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒｍｙ（ＤＡＭＤ  １７−０１−１−０８０３）からの助成金によって一部支援される。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、物質乱用の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストが、乱用物質の慢性的消費、または禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害することができるという発見に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
エタノールおよび他の「習慣性物質」の乱用は、依然として、合衆国および世界を通じて主な公衆健康問題である。薬物依存性は逃れるのが極端に困難である。これは、依存性がエタノール、アンフェタミン、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、コカイン、ニコチン、オピオイド、およびフェンシクリジン等に基づくものか否かに関わらず当てはまる。従って、そのような中毒、および／またはそのような中毒に関連する１以上の行動的構成要素（例えば、欲求）を減少させ、または克服するための薬剤に対する要望が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Ａ２Ａレセプターアンタゴニストが、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害することができるという発見に関する。該方法は、典型的には、習慣性行動の該１以上の構成要素を緩和するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む。典型的には、Ａ２Ａレセプターアンタゴニストはキサンテイン（ｘａｎｔｈｅｉｎｅ）（例えば、カフェインまたはカフェイン誘導体）ではない。ある実施形態においては、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、Ａ２Ａレセプターを特異的に阻害し、他のアデノシンレセプター（例えば、Ａ１レセプター）に対して実質的に低下した効果を有する。
【０００６】
従って、１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物による乱用物質の慢性的消費、そのような慢性的消費の中止、および／またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減する方法を提供する。該方法は、典型的には、習慣性行動の１以上の構成要素を軽減するのに十分な量のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを、習慣性行動の１以上の構成要素を呈する哺乳動物に投与することを含む。ある実施形態において、Ａ２Ａレセプターアンタゴニストはカフェインではなく、および／またはカフェイン誘導体ではない。ある実施形態において、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、限定されるものではないが、（−）−Ｒ，Ｓ）−メフロキン、３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン（ＤＭＰＸ）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−７−メチル−８−（ｍ−メトキシスチリル）−１−プロパルギルキサンチン（ＭＸ２）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−８−（３−メトキシスチリル）−７−メチル−１−プロパルギルキサンチンホスフェート二ナトリウム塩（ＭＳＸ−３）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ＳＣＨ５８２６１、ＫＷ−６００２、アミノフリルトリアゾロ−トリアジニルアミノエチルフェノール（ＺＭ２４１３８５）、および８−クロロスチリルカフェイン、ＫＦ１７８３７，ＶＲ２００６、イストラデフィリン、ＶＥＲ−１１１３５、ＶＥＲ−６４０９、ＶＥＲ−６４４０、ＶＥＲ６４８９、ＶＥＲ６６２３、ＶＥＲ６９４７、ＶＥＲ７１３０、ＶＥＲ７１４６、ＶＥＲ７４４８、ＶＥＲ７８３５、ＶＥＲ８１７７、ピラゾロ［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、５−アミノ−イミダゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン等を含む。ある実施形態においては、アンタゴニストはアデノシンＡ１Ａレセプターに実質的に拮抗しない。種々の実施形態において、それはエタノール、オピエート、カンナビノイド、ニコチン、刺激体等であり得る。種々の実施形態において、乱用物質はモルフィン、ヘロイン、マリファナ、ハシーシ、コカイン、アンフェタミン等であり得る。ある実施形態において、乱用物質はエタノールである。種々の実施形態において、習慣性行動の構成要素は乱用物質の慢性的自己投与、および／または乱用物質に対する欲求、および／または乱用物質に対する欲求行動の復帰である。ある実施形態において、哺乳動物は、乱用物質の慢性的消費をおこなう哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物は乱用物質の慢性的消費を中止した哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物は禁断症状の１以上の徴候を経験している哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物はヒト、例えば、パーキンソン病に罹っていないヒトである。種々の実施形態において、アンタゴニストは（例えば、経口投与、鼻投与、直腸投与、腹腔内投与、血管内注射、皮下注射、経皮投与、吸入投与、筋肉内注射などの経路によって）全身投与される。典型的には、アンタゴニストは単位投与処方として、例えば、時間放出処方として処方される。ある実施形態において、該方法は、さらに、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストと組み合わせてドーパミンＤ２レセプターのアンタゴニストまたはアゴニストを投与することを含む。Ｄ２レセプターアンタゴニストまたはアゴニストはＡ２Ａレセプターアンタゴニストの前、間または後に投与することができる。適当なＤ２レセプターとしては、限定されるものではないが、ブタクラモール、クロルプロマジン、ドムペリドン、フルフェナジン、ハロペリドール、ヘテロアリールピペリジン、メトクロプラミド、オランザピン、ペロスピロン塩酸塩水和物、フェノチアジン、ピモジド、ケチアピン、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、ジプラシドン、ゾテピン等が挙げられる。
【０００７】
また、本発明は、哺乳動物による、乱用薬物の慢性的消費、そのような消費の中止、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減するための組成物を提供する。該組成物は、典型的には、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト；およびドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストを含む。適当なＡ２Ａレセプターアンタゴニストおよび／またはＤ２レセプターアンタゴニストとしては、限定されるものではないが前記したものが挙げられる。
【０００８】
また、哺乳動物による乱用物質の慢性的消費、そのような消費の中止、および／またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減するためのキットが提供される。該キットは、典型的には、１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを含有する容器、ここに、１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの少なくとも１つはカフェインおよび／またはカフェイン誘導体ではなく；および哺乳動物における物質乱用の治療において、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの使用を教示する指示材料を含む。適当なＡ２Ａレセプターアンタゴニストとしては、限定されるものではないが、前記したものが挙げられる。種々の実施形態において、アンタゴニストはアデノシンＡ１Ａレセプターに実質的に拮抗しない。種々の実施形態において、乱用物質としては、限定されるものではないが、エタノール、オピエート、カンナビノイド、ニコチン、刺激体、モルフィン、ヘロイン、マリファナ、ハシーシ、コカイン、アンフェタミン等が挙げられる。習慣性行動の種々の構成要素としては、限定されるものではないが、乱用物質の慢性的自己投与、乱用物質に対する欲求、乱用物質についての欲求行動の復帰等が挙げられる。ある実施形態において、アンタゴニストは経口投与、鼻投与、直腸投与、腹腔内注射、血管内注射、皮下注射、経皮投与、吸入投与、筋肉内注射等のような経路によって投与するために処方される。種々の実施形態において、アンタゴニストは単位投与処方として、例えば、時間放出処方として処方される。
【０００９】
また、乱用物質の慢性的消費に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害する薬剤についてスクリーニングする方法も提供される。該方法は、典型的には、１以上のテスト因子を供し；次いで、アデノシンＡ２Ａレセプター発現またはその活性を阻害する能力についてテスト因子をスクリーニングすることを含み、ここに、アデノシンＡ２Ａレセプターの発現または活性の阻害は、該１以上のテスト因子が、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害するための候補剤であることを示す。ある実施形態においては、該スクリーニングは、Ａ２Ａレセプターに結合する能力についてテスト因子をスクリーニングし、および所望により、さらに、乱用物質のオペラント自己投与を阻害する能力についてテスト因子をスクリーニングすることを含む。ある実施形態においては、該スクリーニングは、乱用物質についての欲求行動の復帰を阻害する能力についてテスト因子をさらにスクリーニングすることを含む。ある実施形態において、乱用物質はエタノール、オピエート、カンナビノイド、ニコチン、および刺激体よりなる群から選択される。ある実施形態において、乱用物質はモルフィン、ヘロイン、マリファナ、ハシーシ、コカイン、アンフェタミン等よりなる群から選択される。
【００１０】
また、本発明は、乱用物質の慢性的消費に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害する剤についてスクリーニングする方法を提供し、ここに、該方法は１以上の推定アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを供し；次いで、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害する能力についてテスト因子をスクリーニングすることを含む。ある実施形態において、該スクリーニングが乱用物質のオペラント自己投与を阻害する能力についてテスト因子をスクリーニングすることを含む。ある実施形態において、該スクリーニングは、乱用物質に対する欲求行動の復帰を阻害する能力についてテスト因子をさらにスクリーニングすることを含む。乱用物質は、限定されるものではないが、本明細書中に記載された乱用物質のいずれかを含むことができる。
【００１１】
ある例においては、本明細書中に記載した実施形態のいずれにおいても、Ａ２Ａレセプターアンタゴニストの代わりにアデノシンＡ２Ａレセプターアゴニストを利用することができると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（定義）
用語「物質乱用」とは、物質、一般的には、天然の化学物質の、一般的に該物質の意図した使用を考慮すると不適切であると考えられるような使用をいう。物質乱用は今日の世界では極端に広くひろまりつつある。事実、多くの人が、物質乱用の問題は蔓延している考えている。物質乱用がより広くひろまるようになるにつれ、そのような物質乱用のもたらす壊滅的な影響は社会のメンバーに対して益々明らかとなる。物質乱用のもたらす壊滅的な影響がかつてないほど認識されてきた結果、社会は、そのような物質乱用を妨げ、治療するための方法を求め始める。
【００１３】
用語「乱用物質」とは、典型的には、精神活性であって、耐性および／または中毒を誘導する物質をいう。乱用物質は、限定されるものではないが、刺激体（例えば、コカイン、アンフェタミン）、オピエート（例えば、モルフィン、ヘロイン）、カンナビノイド（例えば、マリファナ、ハシーシ）、ニコチン、アルコール、ドーパミンＤ２レセプターにおいてアゴニスト活性を媒介する物質等を含む。乱用物質は、限定されるものではないが、習慣性薬物を含む。習慣性過剰消費の場合には、食物、糖等は乱用物質と考えることができる。
【００１４】
「ドーパミンレセプターアンタゴニスト」とは、そのレセプターの同族リガンドに応答してドーパミンレセプターによって媒介される活性を低下させ、またはブロックする物質をいう。従って、例えば、ドーパミンレセプターアンタゴニストは、ドーパミンレセプターおよび関連経路によって媒介されるドーパミンの活性を低下させ、または無くするであろう。アンタゴニストの活性は、例えば、レセプターをブロックすることによって、またはレセプターの立体配置またはレセプターの活性を改変することによって、レセプターにおいて直接的であり得る。アンタゴニストの活性もまた、レセプター活性を媒介する代謝経路における他の地点（例えば、１以上の第二のメッセンジャー、キナーゼ等）におけるものであり得る。
【００１５】
「アデノシンＡ２ａレセプターアンタゴニスト」とは、そのレセプターの同族リガンドに応答してアデノシンＡ２ａレセプターによって媒介される活性を低下させ、またはブロックする物質をいう。アンタゴニストの活性は、例えば、レセプターをブロックすることによって、またはレセプターの立体配置またはレセプターの活性を改変することによって、レセプターにおいて直接的であり得る。アンタゴニストの活性は、レセプター活性を媒介する代謝経路における他の地点（例えば、１以上の第二のメッセンジャー、キナーゼ等）におけるものでもあり得る。
【００１６】
語句「と組み合わされて」は、アデノシンＡ２ＡレセプターアンタゴニストおよびドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストの使用を参照して用いる場合、Ａ２ＡアンタゴニストおよびＤ２アンタゴニストは、生物に対するそれらの生理学的活性において少なくともいくらかの順番に重複があるように投与されることを示している。従って、Ａ２ＡアンタゴニストおよびＤ２アンタゴニストは同時におよび／または順次に投与することができる。引き続いての投与においては、第二の投与される薬剤が投与されるか、あるいは生物において活性となっている場合に、第一の投与される薬剤が生物に対していくらか生理学的な改変を発揮している限り、第二の剤の投与前にいくらかの実質的な遅延（例えば、数分または数時間または数日さえ）さえあり得る。
【００１７】
語句「実質的にレセプターに拮抗しない」は、例えば、レセプター（例えば、アデノシンＡ１Ａレセプター）に対する剤のインパクトに言及して用いられる場合、該剤が、例えば、同族または他の「作動的」リガンドに応答して、５０％を超えて、レセプターの活性を低下させないことを示し、好ましくは、活性は２０％を超えて低下せず、より好ましくは活性は１０％を超えて低下せず、最も好ましくは活性は５％または１％を超えて低下しない。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アデノシンＡ２Ａレセプターのアンタゴニストが、物質に対する（例えば、乱用物質に対する）中毒に関連する行動の１以上の構成要素を阻害（低下またはブロック）できるという発見に関する。例えば、アデノシンＡ２Ａアンタゴニストの全身投与によるＡ２Ａレセプターの阻害が、乱用物質（例えば、エタノール）のオペラント自己投与をブロックするのは驚くべき発見であった。加えて、アデノシンが欲求行動（オペラント自己投与）の復帰を媒介し、およびこれは全身投与されるＡ２Ａアンタゴニストによってやはりブロックされることが示された。復帰は、アルコール、または乱用の他の物質に対する欲求または中毒のより直接的な尺度であると考えられる。加えて、ヘロインに対して中毒となったラットの脳中の側座核へ直接的に投与されたＡ２Ａアンタゴニストは、静脈への自己注射によるヘロイン自己投与の復帰を妨げることが示された。側座核は習慣的薬物に対する欲求を媒介すると推定される脳領域である。対照的にアデノシンＡ１レセプターアンタゴニストはこの意味においては効果的でないように見える。
【００１９】
従って、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）による、乱用物質の慢性的消費またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を軽減する方法を提供し、ここに、該方法は習慣性行動（例えば欲求、欲求行動、不安、慢性自己投与等）の１以上の構成要素を緩和するのに十分な量の１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む。典型的には、Ａ２Ａレセプターアンタゴニストはカフェインではなく、ある実施形態においては、Ａ２Ａレセプターアンタゴニストはキサンチン、または改変されたもしくは誘導体化されたキサンチンではない。
【００２０】
特定の理論に拘束されるつもりはないが、Ａ２Ａレセプターアンタゴニストは、広く種々の習慣性物質のいずれかに対する習慣性行動（中毒）の治療において効果的であり得ると考えられる。そのような物質としては、限定されるものではないが、刺激体（例えば、コカイン、アンフェタミン）、オピエート（例えば、モルヒネ、ヘロイン）、カンノビノイド（例えば、マリファナ、ハシーシ）、ニコチン、アルコール、ドーパミンＤ２レセプターにおいてアゴニスト活性を媒介する物質等が挙げられる。ある例において、食品および／または糖は（例えば、脅迫的食障害において）乱用物質とみなすことができる。
【００２１】
典型的には、１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを哺乳動物、より典型的にはヒトに投与して、例えば、乱用物質に対する中毒、またはそのような物質からの禁断症状に関連する１以上の行動を緩和する。より典型的には、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを投与して、自己投与および／または欲求行動を低下させ、ならびに／または欲求および／もしくは不安を低下させる。ある実施形態においては、対象は、パーキンソン症候群、または他の神経学的障害（習慣的行動に関連するもの以外のもの）について治療されていない対象であろう。
【００２２】
（Ｉ．アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト）
多数のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストが当業者に知られており、個々に、あるいは本明細書中に記載された方法と組み合わせて用いることができる。そのようなアンタゴニストとしては、限定されるものではないが、（−）−Ｒ，Ｓ）−メフロキン（Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ（商標）として市販されるラセミ混合物の活性なエナンチオマー）、３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン（ＤＭＰＸ）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−７−メチル−８−（ｍ−メトキシスチリル）−１−プロパルギルキサンチン（ＭＸ２）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−８−（３−メトキシスチリル）−７−メチル−１−プロパルギルキサンチンホスフェート二ナトリウム塩（ＭＳＸ−３、ＭＳＸ−２のホスフェートプロドラッグ）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ＳＣＨ５８２６１、ＫＷ−６００２、アミノフリルトリアゾロ−トリアジニルアミノエチルフェノール（ＺＭ  ２４１３８５）、および８−クロロスチリルカフェイン、ＫＦ１７８３７、ＶＲ２００６、イストラデフィリン、ＶＥＲ６４８９、ＶＥＲ６６２３、ＶＥＲ６９４７、ＶＥＲ７１３０、ＶＥＲ７１４６、ＶＥＲ７４４８、ＶＥＲ７８３５、ＶＥＲ８１７７、ＶＥＲ−１１１３５、ＶＥＲ−６４０９、ＶＥＲ６４４０、ＶＥＲ６４８９、ＶＥＲ６６２３、ＶＥＲ６９４７、ＶＥＲ７１３０、ＶＥＲ７１４６、ＶＥＲ７４４８、ＶＥＲ７８３５、ＶＥＲ８１７７のようなＶＥＲＮＡＬＩＳの薬物、ピラゾロ［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、および５−アミノ−イミダゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン等が挙げられる。これらのアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは例示的であることを意図し、限定的ではない。
【００２３】
ある実施形態においては、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、アデノシンＡ１レセプターに対して実質的に低い効果を有するアンタゴニストである。ある実施形態において、このアンタゴニストが、アデノシンＡ１レセプターと比較して、Ａ２Ａレセプターに対して少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは少なくとも１０倍大きな阻害活性を示す。
【００２４】
（ＩＩ．ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストとの使用）
ある実施形態において、本発明では、１以上のドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストと組み合わせたアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの使用が考えられる。
【００２５】
ドーパミンレセプターアンタゴニストとしては、当業者によく知られており、限定されるものではないが、ブタクラモール、クロルプロマジン、ドムペリドン、フルフェナジン、ハロペリドール、ヘテロアリールピペリジン、メトクロプラミド、オランザピン、ペロスピロン塩酸塩水和物、フェノチアジン、ピモジド、ケチアピン、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、ジプラシドン、ゾテプリン等が挙げられる。
【００２６】
ある実施形態において、ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストおよびアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは単一の「化合物」処方として処方される。これは、多数の公知の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、Ａ２ＡレセプターアンタゴニストおよびＤ２レセプターアンタゴニストは単一の医薬上許容される賦形剤中で合わせることができる。もう一つのアプローチにおいて、Ａ２ＡレセプターアンタゴニストおよびＤ２レセプターアンタゴニストは、マイクロカプセル化され、次いで、合わせられるか、あるいは単一丸剤中に別々の薄層を形成する、などといった別々の賦形剤中に処方することができる。
【００２７】
ある実施形態において、ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストおよびアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは一緒に直接的に合わせるか、あるいは「連結体」または「リンカー」によって一緒に合わせて、単一の化合物を形成する。特定の理論に拘束されるつもりはないが、そのような合わせたアンタゴニストは改良された特異性／選択性を供すると考えられる。
【００２８】
分子を直接的に、またはリンカー／連結体を介して連結するための多数の化学が当業者によく知られている。Ｄ２レセプターアンタゴニストおよびＡ２Ａレセプターアンタゴニストを結合させて、二官能的アンタゴニストを形成するために使用される特別な化学は、所望の間隔を設けたアンタゴニスト、および「インターリガンド」（インター−アンタゴニスト）の化学的性質に依存する。種々のＤ２レセプターアンタゴニストおよび／またはＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、典型的には、リンカー上の、または他のアンタゴニスト上の適当な官能基との反応で利用できて、アンタゴニストを結合させ合う種々の官能基（例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）等）を含む。
【００２９】
別法として、アンタゴニストを誘導体化して、露出されるか、またはさらなる反応性官能基を結合させることができる。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能なもののような多数のリンカー分子のいずれかの結合を含むことができる。
【００３０】
本明細書中で用いるように、「リンカー」または「連結体」は２以上のリガンド（例えば、レセプターアンタゴニスト）を連結させて、二官能性アンタゴニストまたは多官能性アンタゴニストを形成するのに用いられる分子である。リンカーは、典型的には、該二官能性部位または多官能性部位を含むアンタゴニストの全てに対して共有結合を形成することができるように選択する。適当なリンカーは当業者によく知られており、これらとしては、限定されるものではないが、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、アミノ酸、核酸、デンドリマー、合成ポリマー、ペプチドリンカー、ペプチドおよび核酸アナログ、炭水化物、ポリエチレングリコール等が挙げられる。１以上のアンタゴニストがポリペプチドである場合、リンカーはそれらの側鎖を介して（例えば、システインに対するジスルフィド結合を介して）、あるいは末端アミノ酸のα炭素のアミノ基またはカルボキシル基を介して、構成アミノ酸に連結させることができる。
【００３１】
ある実施形態において、第一のＤ２レセプターアンタゴニスト上の基と反応性である一つの官能基、およびＡ２Ａレセプターアンタゴニスト上の官能基と反応性であるもう一つの基を有する二官能性リンカーを用いて、二官能性アンタゴニストを形成することができる。別法として、誘導体化は、遊離アルデヒド基を生成させるための、アンタゴニストの化学的処理、例えば、過ヨウ素酸塩での糖タンパク質、炭水化物、または核酸等の糖部位のグリコール切断を含むことができる。該遊離アルデヒド基をリンカー上の遊離アミンまたはヒドラジン基と反応させて、リンカーをアンタゴニストに結合させることができる（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号参照）。抗体または抗体断片のような、ポリペプチド上の遊離スルフヒドリル基の生成手法もまた知られている（米国特許４，６５９，８３９号参照）。
【００３２】
Ｄ２レセプターアンタゴニストおよびＡ２Ａレセプターアンタゴニストが共にペプチドである場合、二官能性アンタゴニストを化学的に合成することができるか、あるいは相互に対して直接に結合した、あるいはペプチドリンカーを介して結合した双方のアンタゴニストを含む融合タンパク質として組換えにより発現させることができる。
【００３３】
ある実施形態において、リシン、グルタミン酸、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのリンカーの異なる長さを用いて、アンタゴニストをカップリングさせる。ＰＥＧへの分子のコンジュゲーションの化学は当業者によく知られている（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ（２００１０  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２：４０５−４１７；ＺａｌｉｐｓｋｙおよびＭｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９７）Ｐｐ．３１８−３４１、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＸ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編），Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｄｅｌｇａｄｏら（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，９：２４９−３０４；Ｐｅｄｌｅｙら（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１２６−１１３−０；ＥｙｒｅおよびＦａｒｖｅｒ（１９９１）Ｐｐ．３７７−３９０：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｏｌｌｅｂら（編），Ａｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃ．，Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ；Ｌｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１０：９７３−９８１；Ｎｕｃｃｉら（１９９１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．，６：１３３−１５１；Ｆｒａｎｃｉｓら（１９９６）Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，３：３２１−３４０）。
【００３４】
ある実施形態においては、ドーパミンＤ２レセプターアンタゴニストおよびアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストのコンジュゲーションは、グルタルアルデヒド、ＥＤＣＩ、塩化テレフタロイル、臭化シアン等のような連結試薬の使用によって、または還元的アミノ化によって達成することができる。ある実施形態において、アンタゴニストはＷＯ−Ａ−９３１７７１３に開示されている種類のヒドロキシ酸リンカーを介して連結することができる。ある実施形態においては、ＰＥＧリンカーを利用することができる（種々のＰＥＧ連結薬物の調製については、例えば、Ｌｅｅら（１９９９）Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．，１：１７９−１８１参照。）
（ＩＩＩ．医薬処方物）
本明細書中で説明するように、乱用物質（例えば、エタノール、オピエート、バルビツレート等）の慢性的消費に関連する１以上の徴候は、単独で、あるいはある実施形態においては１以上のドーパミン（Ｄ１）レセプターアンタゴニストの投与と共に、１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの投与によって軽減することができる。同様に、乱用物質（例えば、エタノール）の慢性的消費からの禁断症状に関連する１以上の徴候は、単独で、ある実施形態においては、１以上のドーパミン（Ｄ２）レセプターアンタゴニストの投与と共に、１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストの投与によって軽減することができる。
【００３５】
アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストおよび／またはＡ２Ａレセプター／Ｄ２レセプターアンタゴニスト組み合わせは、限定されるものではないが、遊離酸の形態、塩の形態、水和物としての形態等を含めた多数の形態に処方することができる。全ての形態は本発明の範囲内のものである。塩基性酸を形成することができ、用いるのに単純により便宜な形態であり、現実には、塩形態の使用は、固有に、酸形態の使用に等しい。塩を調製するのに用いることができる塩基としては、好ましくは、遊離酸と組み合わせた場合に、医薬上許容される塩、すなわち、そのアニオンが医薬用量の塩において動物生物に対して非毒性である塩を生じ、従って、遊離酸に固有の有益な特性がカチオンに起因する副作用によって台無しにされないものが挙げられる。酸化合物の医薬上許容される塩が好ましいが、全ての塩は、たとえ特定の塩それ自体が、例えば、塩が精製および同定の目的だけのために形成される場合、あるいはそれを、イオン交換手法によって医薬上許容される塩を調製するにおいて中間体として用いる場合に、中間体生成物としてのみ望まれるのであっても、遊離酸形態の源として有用である。
【００３６】
そのような物質は種々の形態で哺乳動物宿主に投与することができ、すなわち、それらは、例えば、経口または非経口の選択された投与経路に応じて錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハードキャンディ、粉末、スプレー、エリキシル、シロップ、注射もしくは点眼溶液等の形態で種々の医薬上許容される不活性な担体と組み合わせることができる。この点に関しての非経口投与は以下の経路、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、滑膜内、（経皮、目、舌下およびバッカルを含めた）経上皮、（眼、皮膚、目、直腸、吸入およびエアロゾルを介する鼻吸入を含めた）局所、および直腸全身による投与を含む。経口投与が好ましい。
【００３７】
活性化合物（例えば、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト）は、例えば、不活性な希釈剤と共に、あるいは同化性食用担体と共に経口投与することができるか、あるいはそれらはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに包むことができるか、あるいはそれらは圧縮して錠剤とすることができるか、あるいはそれらは食事の食物と直接的に一体化することができる。経口治療投与では、活性化合物を賦形剤と一体化し、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハー等の形態で用いることができる。そのような組成物および製剤は、典型的には少なくとも０．１％の活性化合物を含有する。組成物および製剤のパーセンテージは、もちろん、変化させることができ、便宜には、ユニットの重量の約２〜約２５％の間とすることができる。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な用量が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物または製剤は、経口投与単位形態が約１ｍｇ〜１０００ｍｇの間の活性化合物を含有するように調整される。
【００３８】
ある実施形態において、錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等は以下の、すなわち、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシア、スクロース、トウモロコシ澱粉またはゼラチンのようなバインダー；リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウムおよび炭酸カルシウムのような賦形剤；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、タピオカ澱粉、ある種の複合シリカ、アルギン酸等のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウム、タルクおよびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、冬緑油またはチェリーフレーバーのようなフレーバー剤を含有することもできる。同様なタイプの固体組成物もまた、ソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても使用され、この意味で好ましい物質としてはラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。投与単位形態はカプセルである場合、それは、前記したタイプの物質に加えて、液体担体を含有することができる。種々の他の物質はコーティングとして存在させて、あるいはそうでなければ投与単位の物理的形態を改変するように存在させることができる。例えば、錠剤、丸剤、カプセルはシェラック、糖または双方で被覆することができる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、チェリーまたはオレンジフレーバーのようなフレーバー、乳化剤および／または沈殿防止剤、ならびに水、エタノール、ポリエチレングリコール、グリセリンおよびその種々の同様な組み合わせの希釈剤を含有することができる。もちろん、いずれの投与単位形態を調製するのに用いるいずれの物質も、使用される量において医薬上純粋かつ実質的に非毒性であるべきである。加えて、活性化合物を徐放性の製剤および処方に配合することができる。
【００３９】
活性化合物は非経口または腹腔内投与することもできる。非経口投与の目的では、ゴマ油または落花生油中の、または水性プロピレングリコール中の溶液ならびにこれまでに列挙した対応する水溶性のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の滅菌水性溶液を使用することができる。そのような水性溶液は、必要であれば適当に緩衝化すべきであり、液体希釈剤を、まず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張とすべきである。遊離塩基または医薬上許容される塩としての活性な化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物中で、および油中で分散液を調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を妨げるために保存剤を含有する。これらの特別な水性溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射目的に特に適している。この関連で、使用される滅菌水性媒体は、全て、当業者によく知られた標準技術によって容易に得ることができる。
【００４０】
注射使用に適した医薬形態としては、滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、該形態は望ましくは滅菌されており、容易なシリンジ性が存在する程度に流体である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であることが好ましく、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して維持されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、その適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めるのが好ましいであろう。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって実現することができる。
【００４１】
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、必要であれば前記にて列挙した種々の他の成分と共に適当な溶媒中に配合し、続いて濾過滅菌によって調製する。一般には、分散液は、基本的な分散媒体、および前記列記からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに滅菌した活性成分を配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは、その予め滅菌濾過した溶液から活性成分に加えいずれかのさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【００４２】
局所投与の目的では、そうでなければ前記した非経口溶液と同様な（通常は約０．１％〜５％濃度の）希薄な滅菌水溶液を、目への点眼投与に適した容器中で調製する。本発明の治療化合物は、単独で、あるいは医薬上許容される担体と組み合わせて、哺乳動物に投与することができる。前記したように、活性成分および担体の相対的割合は、化合物の溶解度および化学的性質、選択された投与の経路、および標準的な医薬プラクティスによって決定される。予防または治療に最も適するであろう本発明の治療剤の用量は、投与の形態、選択された特定の化合物、および治療中の特定の患者の生理学的特徴に伴って変化するであろう。一般に、小さな用量を最初に用い、もし必要であれば、状況下で最適な効果に到達するまで、少量ずつ増加させる。経口投与はより高い用量を必要とする。化合物は経口または非経口で投与されるか、あるいは点眼剤として局所投与される。用量は、出発点として動物実験から定型的には決定される用量を用い、当該分野で公知の方法を用いて医師が容易に決定することができる。
【００４３】
ある実施形態において、ドーパミンレセプターアンタゴニストおよび／またはドーパミンレセプターアンタゴニストは標準的な治療用量にて、より好ましくは標準以下の治療用量にて、なおより好ましくはほぼ閾値用量にて、最も好ましくは閾値下用量にいて投与され、ここに、閾値用量または閾値下用量は、単独で投与される各アンタゴニストについての閾値または閾値下用量である。ある特に好ましい実施形態においては、アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストは、１以上の有害な副作用を生じることが知られている用量よりも低い用量で投与される。
【００４４】
（ＩＶ．キット）
また、本発明では、本発明の方法の実施のためのキットが考えられる。そのようなキットは、典型的には、本明細書中に記載された１以上のアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストを含有する容器を含む。該キットは、典型的には、さらに、乱用物質の消費に関連した習慣性行動の１以上の構成要素を阻害するためのアンタゴニストの使用を教示する指示材料をさらに含む。該指示材料は、好ましい用量、投与の態様、コンターインディケーション（ｃｏｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）などを教示することができる。
【００４５】
指示材料は、典型的には、書かれたまたは印刷された材料を含むが、それらはそのようなものに限定されない。そのような指示を保管し、それらを最終ユーザーに連絡することができるいずれの媒体も本発明により考えられる。そのような媒体としては、限定されるものではないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられる。そのような媒体は、そのような指示材料を供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
【００４６】
（Ｖ．乱用物質に対する中毒、またはそれからの禁断症状の１以上の行動構成要素を軽減する剤についてのスクリーニングおよび／またはプレスクリーニング）
前記したように、１つの態様において、本発明は、アデノシンレセプターＡ２Ａアンタゴニストが、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害することができるという発見に関する。従って、推定アデノシンＡ２Ａレセプターインヒビターの同定により、乱用物質の慢性的消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素を阻害するための候補剤が事実上同定される。
【００４７】
ある実施形態において、スクリーニング方法は、Ａ２Ａレセプターの発現および／もしくは活性を阻害する能力、ならびに／または習慣性行動（例えば、自己投与、欲求、欲望など）の１以上の構成要素を阻害する能力についてテスト因子（例えば、推定アデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニスト）をスクリーニングすることを含む。
【００４８】
かくして、ある実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、哺乳動物テスト細胞をテスト因子と接触させ、次いで、アデノシンＡ２Ａレセプター、あるいはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分（例えば、β／γダイマー）の発現または活性を検出することを含むことができ、ここに、たとえば対照と比較したテスト細胞におけるＡ２Ａレセプターの発現または活性の差は、テスト因子が習慣性行動の１以上の構成要素を阻害するための候補であることを示す。
【００４９】
遺伝子の発現レベルは、遺伝子産物の転写（すなわち、ｍＲＮＡの転写）の変化によって、および／または遺伝子産物の翻訳（すなわち、タンパク質の翻訳）の変化によって、および／または翻訳後修飾（例えば、タンパク質折畳み、グリコシル化など）によって改変することができる。従って、本発明の好ましいアッセイは、転写されたｍＲＮＡ（あるいはＡ２ＡレセプターまたはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分をコードする核酸に由来する他の核酸）のレベル、翻訳されたタンパク質のレベル、翻訳されたタンパク質の活性などについてのアッセイを含む。そのようなアプローチの例は後に記載する。これらの例は説明的であり、限定的ではないことを意図する。
【００５０】
（Ａ）核酸ベースのアッセイ）
（１）標的分子）
Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の発現レベルの変化は、該Ａ２Ａレセプターまたは経路成分をコードするｍＲＮＡおよび／または該ｍＲＮＡに由来する核酸（例えば、逆転写されたｃＤＮＡなど）の変化を測定することによって検出することができる。発現レベルを測定するためには、そのような分析のための核酸試料を供するのが望ましい。好ましい実施形態において、核酸は生物学的試料において見出されるか、あるいはそれに由来する。本明細書中で用いるように、用語「生物学的試料」とは、生物から、あるいは生物または細胞培養物もしくは組織培養物の成分（例えば、細胞）から得られた試料を言う。
【００５１】
核酸（例えば、ｍＲＮＡに由来するｍＲＮＡ核酸）は、ある好ましい実施形態においては、当業者によく知られた多数の方法のいずれかに従って試料から単離される。ｍＲＮＡを単離する方法は、当業者によく知られている。例えば、核酸の単離および精製の方法は、Ｔｉｊｓｓｅｎ編（１９９３）Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第３章：Ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，パートＩ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ｔｉｊｓｓｅｎ編、によって詳細に記載されている。
【００５２】
好ましい実施形態において、「全」核酸は、例えば、酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出方法を用いて与えられた試料から単離され、ポリＡ＋ｍＲＮＡは、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーによって、あるいは（ｄＴ）ｎ磁性ビーズを用いることによって単離される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｇ；Ａ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）参照）。
【００５３】
多くの場合、発現レベルについてのアッセイに先立って核酸試料を増幅するのが望ましい。核酸を増幅する方法は当業者によく知られており、限定されるものではないが、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ，例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ参照）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７，およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３）、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲなど）を含む。
【００５４】
試料中のＡ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の転写レベル（および、それにより、発現レベル）を定量するのが望まれる特に好ましい実施形態において、核酸試料は、Ａ２ＡレセプターのｍＲＮＡ転写物濃度、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分のｍＲＮＡ転写物濃度、あるいはＡ２ＡレセプターのｍＲＮＡ転写物濃度、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分のｍＲＮＡ転写物に由来する核酸の濃度が、その遺伝子の転写レベル（および、これによる発現レベル）に比例するものである。同様に、ハイブリダイゼージョンシグナル強度がハイブリダイズした核酸の量に比例するのが好ましい。比例性は相対的に厳格である（例えば、転写速度における倍化の結果、試料核酸プールにおけるｍＲＮＡ転写体の倍化、およびハイブリダイゼーションシグナルの倍化がもたらされる）のが好ましいが、当業者であれば、この比例性はより緩慢であり得、非直線的であり得ることを認識するであろう。従って、例えば、標的ｍＲＮＡの濃度の５倍の差がハイブリダイゼーション強度の３〜６倍の差をもたらすアッセイは、ほとんどの目的で十分である。
【００５５】
より正確な定量が必要な場合、適当な対照を実行して、本明細書中に記載されているよう、試料調製およびハイブリダイゼーションに導入された改変について補正することができる。加えて、「標準」標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の系列希釈を用いて、当業者によく知られた方法に従って較正曲線を作成することができる。もちろん、転写体の存在または不存在、あるいは核酸濃度の大きな差の単純な検出が望まれる場合、技巧を凝らした対照または較正は必要とされない。
【００５６】
最も単純な実施形態において、Ａ２ＡレセプターまたはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分をコードする核酸を含む試料は、全ｍＲＮＡまたは全ｃＤＮＡを単離し、そうでなければ生物学的試料から、単離および／または誘導される。核酸は、前記にて示した当業者によく知られた多数の方法のいずれかに従って試料から単離することができる。
【００５７】
（２）ハイブリダイゼージョンベースのアッセイ）
Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分をコードする公知の核酸配列を用いて、これらの核酸の転写体の検出および／または定量は、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて日常的に達成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲参照）。例えば、逆転写されたｃＤＮＡの存在、不存在または量を評価する１つの方法としては「サザーンブロット」が挙げられる。サザーンブロットにおいては、典型的には断片化され、かつ電気泳動ゲルで分離されたＤＮＡ（例えば、逆転写されたＡ２ＡレセプターｍＲＮＡ）を、その核酸に対して特異的なプローブにハイブリダイズさせる。「テスト」プローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と、「対照」プローブ（例えば、「ハウスキーピング遺伝子」についてのプローブ）からのハイブリダイゼーションシグナルの強度との比較により、標的核酸の相対的発現レベルが見積もられる。
【００５８】
別法として、ｍＲＮＡをノーザンブロットにおいて直接的に定量することができる。簡単に述べれば、ｍＲＮＡを、例えば、酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出方法を用いて与えられた細胞試料を単離する。次いで、ｍＲＮＡを電気泳動に付して、ｍＲＮＡ種を分離し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロース膜に移す。サザーンブロットに関しては、標識されたプローブを用いて、標的ｍＲＮＡを同定し、および／または定量する。適当な対照（例えば、ハウスキーピング遺伝子に対するプローブ）は、相対的発現レベルを評価するための参照を提供する。
【００５９】
Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の発現レベルを測定するための代替手段はイン・サイチュハイブリダイゼーションである。イン・サイチュハイブリダイゼーションアッセイはよく知られている（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５２：６４９）。一般に、イン・サイチュハイブリダイゼーションは以下の主な工程、すなわち、（１）分析するべき組織または生物学的構造物の固定、（２）標的ＤＮＡの接近性を増加させ、および非特異的結合を低下させるための生物学的構造物のプレハイブリダイゼーション処理、（３）核酸の混合物の、生物学的構造または組織中の核酸へのハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸断片を除去するためのポスト−ハイブリダイゼーション洗浄、および（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出を含む。これらの工程の各々で用いる試薬、および使用条件は、特定の適用に応じて変化する。
【００６０】
いくつかの適用においては、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロックすることが必要である。従って、いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−１  ＤＮＡを用いて、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。
【００６１】
（３）増幅ベースのアッセイ）
もう１つの実施形態において、増幅ベースのアッセイを用いて、Ａ２ＡレセプターまたはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の（転写）レベルを測定することができる。そのような増幅ベースのアッセイにおいて、標的核酸配列（すなわち、Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分をコードする核酸）は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））において鋳型として作用する。定量的増幅において、増幅産物の量は元の試料中の鋳型（例えば、Ａ２ＡレセプターをコードするｍＲＮＡ）の量に比例するであろう。適当な（例えば、テスト因子に曝露されていない健康な組織または細胞）対照との比較は、転写体レベルの尺度を提供する。
【００６２】
「定量的」増幅の方法は当業者によく知られている。例えば、定量ＰＣＲは、同一プライマーを用いて既知量の対照配列を同時に増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するのに用いることができる内部標準を供する。定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に供される。１つのアプローチは、例えば、標的を増幅するのに用いられるのと同一のプライマーを用い、既知量の対照配列を同時に増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するのに用いることができる内部標準を供する。
【００６３】
１つの好ましい内部標準は合成ＡＷ１０６  ｃＲＮＡである。該ＡＷ１０６  ｃＲＮＡは、当業者に知られた標準的技術に従って試料から単離されたＲＮＡと合わせる。次いで、逆転写酵素を用いてＲＮＡを逆転写して、コピーＤＮＡを得る。次いで、標識されたプライマーを用い、（例えば、ＰＣＲによって）ｃＤＮＡ配列を増幅する。増幅産物を、典型的には、電気泳動によって分離し、（増幅された産物の量に比例する）標識された核酸の量を測定する。次いで、既知のＡＷ１０６  ＲＮＡ標準によって生じたシグナルとの比較によって、試料中のｍＲＮＡの量を計算する。定量的ＰＣＲについての詳細なプロトコルは、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．に供される。
【００６４】
（４）ハイブリダイゼーションフォーマットおよびハイブリダイゼーション条件の最適化）
（ａ）アレイベースのハイブリダイゼーションフォーマット）
１つの実施形態において、本発明の方法はアレイベースのハイブリダイゼーションフォーマットで利用することができる。アレイは、１以上の表面（例えば、固体、膜、またはゲル）に結合した複数の異なる「プローブ」核酸または「標的」核酸（または他の化合物）である。好ましい実施形態において、複数の核酸（または他の部位）を、単一の連続表面に、または相互に隣接した複数の表面に結合させる。
【００６５】
アレイフォーマットにおいて、非常に多数の異なるハイブリダイゼーション反応を実質的に「並行して」行うことができる。これは、単回の「実験」において、多数のハイブリダイゼーションの迅速な実質的に同時の評価を提供する。アレイベースのフォーマットでのハイブリダイゼーション反応を行う方法は当業者によく知られている（例えば、Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６０６−６１４；Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６８５；Ｃｈｅｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０；ＷＯ９６／１７９５８，Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：２０７−２１１参照）。
【００６６】
アレイ、特に核酸アレイは、当業者によく知られた広く種々の方法に従って製造することができる。例えば、単純な実施形態において、異なる核酸を（例えば、ピペットを用いて、手によって）固体支持体（例えば、ガラス表面、膜など）上の異なる位置にスポットすることによって、「低密度」アレイを簡単に製造することができる。
【００６７】
この単純なスポッティングアプローチは、高密度のスポットされたアレイを製造するために自動化されている（例えば、米国特許第５，８０７，５２２号参照）。この特許は、表面に対して毛管をタップすること、小さな容量の生物学的試料を沈積させる自動システムの使用を記載する。このプロセスを繰り返すことにより、高密度アレイを生成する。
【００６８】
または、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、アレイを製造することもできる。従って、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９０／１５０７０および９２／１００９２は、高密度オリゴヌクレオチドアレイの光指向性コンビナトーリアル合成の使用を教示する。高密度アレイの合成は米国特許第５，７４４，３０５号、第５，８００，９９２号および第５，４４５，９３４号にも記載されている。
【００６９】
（ｂ）他のハイブリダイゼーションフォーマット）
前記したように、種々の核酸ハイブリダイゼーションフォーマットが当業者に知られている。例えば、通常のフォーマットとしては、サンドイッチアッセイおよび競合もしくは置換アッセイが挙げられる。そのようなアッセイフォーマットは、一般的には、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３：３７８−３８３およびＪｏｈｎら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３：５８２−５８７に記載されている。
【００７０】
サンドイッチアッセイは、核酸配列を検出し、または単離するための市販の有用なハイブリダイゼーションアッセイである。そのようなアッセイは、固体支持体に共有結合により固定化された「捕獲」核酸、および溶液中の標識された「シグナル」核酸を利用する。試料は標的核酸を提供する。「捕獲」核酸および「シグナル」核酸プローブは標的核酸とハイブリダイズして、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。最も効果的であるためには、シグナル核酸は捕獲核酸とハイブリダイズすべきでない。
【００７１】
典型的には、標識されたシグナル核酸を用いてハイブリダイゼーションを検出する。相補的核酸またはシグナル核酸は、典型的には、本明細書中に記載されたように、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在を検出するのに用いられるいくつかの方法のうちのいずれか１つによって標識することができる。
【００７２】
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出すべき標的核酸を増加させる核酸増幅システムの使用を介して増強することができる。そのようなシステムの例としては、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）システム、およびリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）システムが挙げられる。当該分野で最近記載された他の方法は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡＯ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱβレプリカーゼシステムである。
【００７３】
（ｃ）ハイブリダイゼーション条件の最適化）
核酸ハイブリダイゼーションは、単に、変性したプローブおよび標的核酸を、該プローブおよびその相補的標的が相補的塩基対合を介して安定なハイブリッド二重鎖を形成できる条件下に供することを含む。次いで、ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸を洗浄して除去し、残ったハイブリダイズした核酸を、典型的には、結合した検出可能な標識の検出を介して検出する。一般的には、温度を上昇させるか、あるいは核酸を含有する緩衝液の塩濃度を減少させ、あるいは、化学剤の添加に加えて、ｐＨを上昇させることによって核酸を変性させることが認められている。低ストリンジェンシー条件（例えば、低温および／または高塩および／または高標的濃度）下では、アニールされた配列が完全には相補的でない場合でさえ、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。従って、ハイブリダイゼーションの特異性はより低いストリンジェンシーにおいては低下する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度、またはより低い塩）においては、首尾よいハイブリダイゼーションはより少ないミスマッチを必要とする。
【００７４】
当業者であれば、ハイブリダイゼーション条件は、いずれの程度のストリンジェンシーも供するように選択できるのを認識するであろう。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシーで行って、ハイブリダイゼーションを確実にし、次いで、引き続いての洗浄をより高いストリンジェンシーで行って、ミスマッチしたハイブリダッド二重鎖を排除する。順次の洗浄は、所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性が得られるまで、徐々に高くするストリンジェンシー（例えば、３７℃〜７０℃における０．２５×ＳＳＰＥと低くなるまで）において行うことができる。ストリンジェンシーはホルムアミドのような薬剤の添加によって増加させることもできる。ハイブリダイゼーション特異性は、テストプローブに対するハイブリダイゼーションを、存在できる種々の対照に対するハイブリダイゼーションと比較することによって評価することができる。
【００７５】
一般に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）およびシグナルの強度の間には兼ね合いがある。従って、好ましい実施形態においては、洗浄は最高のストリンジェンシーで行い、これは、一貫性のある結果を生じ、バックグラウンド強度のほぼ１０％よりも大きなシグナル強度を供する。従って、好ましい実施形態において、ハイブリダイズしたアレイを順次により高いストリンジェンシーの溶液において洗浄し、各洗浄の間に読み取ることができる。これによって生じたデータセットの分析は、それを超えては、ハイブリダイゼーションパターンが認識可能に変化せず、かつ注目する特定のプローブについての適切なシグナルを供する、洗浄ストリンジェンシーを明らかとするであろう。
【００７６】
好ましい実施形態においては、バックグラウンドシグナルは、ハイブリダイゼーションの間にブロッキング試薬（例えば、ｔＲＮＡ、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１  ＤＮＡなど）を用いることによって低下させて非特異的結合を低下させる。ハイブリダイゼーションにおけるブロッキング剤の使用は当業者によく知られている（例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ中の第８章（前掲）を参照）。
【００７７】
ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は当業者によく知られている（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）  Ｌａｂｏｌａｒｏｔｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４巻：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００７８】
また、最適条件は、基質タイプ、フルオロクローム、励起および発光バンドの異なる組み合わせについての標識（例えば、蛍光）検出の感度、スポットサイズなどの関数でもある。低い蛍光バックグラウンド表面を用いることができる（例えば、Ｃｈｕ（１９９２）  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｔ  １３：１０５−１１４参照）。候補表面での種々の直径でのスポット（「標的エレメント」）の検出についての感度は、例えば、蛍光により末端が標識されたＤＮＡ断片の系列希釈をスポットすることによって容易に測定することができる。次いで、これらのスポットを、慣用的な蛍光顕微鏡を用いてイメージする。従って、フルオロクロームおよび固体表面（例えば、ガラス、溶融シリカなど）など種々の組み合わせから達成することができる感度、直線性および動的範囲を決定することができる。公知の相対的割合のフルオロクロームの対の系列希釈も分析することができる。これは、蛍光比率測定が、ディテクターによって許容される動的範囲にわたる現実のフルオロクローム比率、およびプローブが固定された基材の蛍光を反映する精度を決定する。
【００７９】
（ｄ）核酸の標識および検出）
Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の発現レベルの検出のために本明細書中に用いられるプローブは、全長、全長未満とすることができる。より短いプローブは経験的に特異性についてテストされる。好ましいプローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズするように十分に長い。好ましいサイズ範囲は約２０塩基から標的ｍＲＮＡの長さ、より好ましくは約３０塩基から標的ｍＲＮＡの長さ、最も好ましくは約４０塩基から標的ｍＲＮＡの長さである。
【００８０】
プローブは、典型的には、検出可能な標識で標識される。本発明で用いるのに適した検出可能な標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出できるいずれの組成物も含む。本発明における有用な標識としては、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートでの染色のためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｂｓ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡを参照）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで通常用いる他のもの）、およびコロイド状金（例えば、４０ｎｍ〜８０ｎｍ直径サイズ範囲において緑色光を高い効率で散乱する金粒子）のような比色標識、または着色したガラスビーズまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許としては米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【００８１】
蛍光標識は低いバックグラウンドにて非常に強いシグナルを生じるので好ましい。それはまた、迅速なスキャニング手法を介して、高い分解能および感度で光学的に検出可能である。核酸試料は、全て、単一の標識、例えば、単一の蛍光標識で標識することができる。別法として、もう１つの実施形態において、異なる核酸試料を同時にハイブリダイズさせることができ、そこでは、各核酸試料は異なる標識を有する。例えば、１つの標的は緑色蛍光標識を有することができ、第二の標的は赤色蛍光標識を有することができる。スキャニング工程は緑色蛍光標識への結合から、赤色標識の結合の部位を識別するであろう。各核酸試料（標的核酸）は相互に独立して分析することができる。
【００８２】
使用することができる適当なクロモゲンとしては、色が観察できるように区別される範囲の波長の光を吸収するか、あるいは、別法として、特定の波長または波長範囲の放射線で照射した場合に、光を発する分子および化合物（例えば、蛍光剤）が挙げられる。
【００８３】
検出可能なシグナルは、ケミルミネセント源およびバイオルミネセント源によって生じさせることもできる。ケミルミネセント源は、化学反応によって電子的に励起されたようになり、次いで、光を発することができる化合物を含み、これは、検出可能なシグナルとして供されるか、あるいはエネルギーを蛍光アクセプターに与える。別法として、ルシフェラーゼまたはルシゲニンと組みあわせてルシフェリンを用いて、生物発光を提供することができる。
【００８４】
スピン標識は、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法によって検出することができ、不対電子スピンを持つレポーター分子によって供される。例示的なスピン標識としては、有機フリーラジカル、遷移金属錯体、特にバナジウム、銅、鉄およびマンガン等が挙げられる。例示的なスピン標識としては、窒素酸化物フリーラジカルが挙げられる。
【００８５】
標識は、ハイブリダイゼーションに先立って、またはその後に標的（試料）核酸に付加することができる。いわゆる「直接的標識」は、ハイブリダイゼーションに先立って標的（試料）核酸に直接的に結合させるか、あるいは一体化される検出可能な標識である。対照的に、いわゆる「間接的標識」はハイブリダイゼーションの後にハイブリッド二重鎖に連結される。しばしば、間接的標識はハイブリダイゼーションに先立って、標的核酸に結合されている結合部分に結合される。従って、例えば、標的核酸はハイブリダイゼーション前にビオチニル化することができる。ハイブリダイゼーション後に、アビジン−コンジュゲーテッドフルオロフォアはビオチン担持ハイブリッド二重鎖に結合し、容易に検出される標識を供する。核酸を標識し、標識されたハイブリダイズ核酸を検出する方法の詳細なレビューについてはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４巻：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９９３）を参照されたし）。
【００８６】
蛍光標識は、イン・ビトロ転写反応の間に容易に付加される。従って、例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよびＣＴＰをイン・ビトロ転写で生じたＲＮＡに取り込むことができる。
【００８７】
標識は直接的にまたはリンカー部位を介して結合させることができる。一般に、標識の部位またはリンカー標識結合はいずれかの特定の位置に制限されない。例えば、標識を、望まれる検出またはハイブリダイゼーションに干渉しないいずれかの位置のヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそのアナログに結合させることができる。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのある種のＬａｂｅｌ−ＯＮ試薬は、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格を通じて分布した標識、ならびに３’末端および５’末端における末端標識を供する。本明細書中の実施例で示すように、標識はリボース環上の位置に結合させることができるか、リボースを改変し、望まれればなくすることさえできる。有用な標識試薬の塩基部位は、天然に生じるか、あるいはそれが置かれる目的に干渉しない様式で改変されたものを含むことができる。改変された塩基としては、限定されるものではないが、７−デアザＡおよび７−デアザＧ、７−デアザ−８−アザＡおよび７−デアザ−８−アザＧ、および他の複素環部位が挙げられる。
【００８８】
蛍光標識としては、単一の種有機分子に制限されず、無機分子、有機および／または無機分子の複数分子混合物、結晶、ヘテロポリマーなどが挙げられることが理解されるであろう。従って、例えば、シリカシェルに包まれたＣｄＳｅ−ＣｄＳコア−シェルナノ結晶は生物学的分子にカップリングさせるために容易に誘導体化することができる（Ｂｒｕｃｈｅｚら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１３−２０１６）。同様に、高蛍光量子ドット（硫化亜鉛キャップ化セレン化カドミウム）は、超感受性生物学的検出で用いるための生体分子に共有結合によりカップリングされてきた（ＷａｒｒｅｎおよびＮｉｅ（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１６−２０１８）。
【００８９】
（Ｂ）ポリペプチドベースのアッセイ）
（１）アッセイフォーマット）
核酸発現レベルの検出に加えて、またはその代替法において、Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の発現または活性の改変は、翻訳されたＡ２Ａレセプタータンパク質またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の量および／または活性を検出、および／または定量することによって検出し、および／または定量することができる。
【００９０】
（２）発現されたタンパク質の検出）
Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分は、当業者によく知られた多数の方法のいずれかによって検出し、定量することができる。これらとしては、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィーなどのような分析生化学的方法、あるいは流体またはゲル沈殿反応、免疫拡散（単一または二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなどのような種々の免疫学的方法が挙げられる。
【００９１】
１つの好ましい実施形態において、Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分は、電気泳動タンパク質分離（例えば、一次元、または二次元電気泳動）において検出し／定量する。電気泳動技術を用いてタンパク質を検出する手段は当業者によく知られている（一般には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｒ，（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００９２】
もう１つの好ましい実施形態において、ウェスタンブロット（イムノブロット）分析を用いて、Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分の存在を検出し、それを定量する。この技術は、一般には、分子量に基づくゲル電気泳動によって試料タンパク質を分離し、分離されたタンパク質を（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルターのような）適当な固体支持体に移し、次いで、標的ポリペプチドに特異的に結合する抗体と共に試料をインキュベートすることを含む。
【００９３】
標的ポリペプチドに特異的に結合する抗体は直接的に標識することができるか、あるいは、別法として、抗体のドメインに特異的に結合する標識された抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続いて検出することができる。
【００９４】
好ましい実施形態において、Ａ２Ａレセプター、またはＡ２Ａレセプターシグナル伝達経路の他の成分は、イムノアッセイを用いて検出される。本明細書中で用いるように、イムノアッセイは、分析物（例えば、標的ポリペプチド）に特異的に結合する抗体を利用するアッセイである。従って、イムノアッセイは、分析物を単離し、標的化し、および定量するための他の物理的または化学的特性の使用とは反対に、本発明のポリペプチドの抗体への特異的結合の検出によって特徴付けられる。
【００９５】
多数のよく認められている免疫学的結合アッセイ（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号参照）のいずれかは、ここで同定されたポリペプチドの検出または定量によく適合される。一般的イムノアッセイのレビューについては、Ａｓａｉ（１９９３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｒｒ（１９９１）  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７版を参照のこと。
【００９６】
免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、典型的には、分析物（Ａ２Ａレセプタータンパク質）に特異的に結合し、しばしばそれを固定化するために「捕獲剤」を利用する。好ましい実施形態において、捕獲剤は抗体である。
【００９７】
イムノアッセイは、しばしば、捕獲剤および分析物によって形成された結合複合体に特異的に結合し、それを標識するために標識剤を利用する。標識剤はそれ自体、抗体／分析物複合体を含む部位の１つであり得る。従って、標識剤は、既に結合した標的ポリペプチドを特異的に認識する標識されたポリペプチドであるか、あるいは標識抗体であり得る。別法として、標識剤は、捕獲剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する、もう１つの抗体のような第三の部位であり得る。
【００９８】
プロテインＡまたはプロテインＧのような免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができる他のタンパク質を標識剤として用いることもできる。これらのタンパク質はｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ細菌の細胞壁の通常の構成要素である。それらは、種々の種からの免疫グロブリン定常領域との強い非免疫原性反応性を呈する（一般に、Ｋｒｏｎｖａｌら（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１４０１−１４０６、およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２参照）。
【００９９】
標的ポリペプチドを検出するための好ましいイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれかである。非競合的イムノアッセイは、捕獲された分析物の量を直接的に分析するアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいては、例えば、捕獲剤（抗体）を、固体基材に直接的に結合させることができ、それら捕獲剤（抗体）はそこに固定化される。次いで、これらの固定化抗体はテスト試料に存在する標的ポリペプチドを捕獲する。次いで、かく固定化された標的ポリペプチドは、標識を有する第二の抗体のような標識剤によって結合される。
【０１００】
競合アッセイにおいては、試料に存在する分析物（例えば、Ａ２Ａレセプタータンパク質）の量は、試料に存在する分析物による捕獲剤（抗体）から置き換えられた（または競合により離れた）、添加（外因性）分析物の量を測定することによって間接的に測定される。１つの競合アッセイにおいて、この場合には、標識されたポリペプチドの既知量を試料に加え、次いで、試料を捕獲剤と接触させる。抗体に結合した標識ポリペプチドの量は、試料に存在する標的ポリペプチドの濃度に逆比例する。
【０１０１】
１つの特に好ましい実施形態において、抗体は固体基材に固定化される。抗体に結合した標的ポリペプチドの量は、ポリペプチド／抗体複合体に存在する標的ポリペプチドの量を測定することによって、あるいは別法として、残りの複合体化していないポリペプチドの量を測定することによって決定することができる。
【０１０２】
本発明のイムノアッセイとしては、使用する特定のプロトコルに応じて、単独で、または組み合わせて、ベータ／ガンマダイマーポリペプチドに結合する、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または抗体断片、または単一鎖抗体の標識されていないまたは標識された（例えば、酵素標識）誘導体を利用する酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）が挙げられる。標的ポリペプチドに結合する抗体が標識されない場合、異なる検出可能なマーカー、例えば、標的ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体に結合することができる酵素標識抗体を使用することができる。ＥＩＡの公知の改変のいずれか、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイを使用することもできる。前記したように、本発明ではまた、酵素検出システムを使用するウェスタンブロッティングのようなイムノブロッティングイムノアッセイ技術が考えられる。
【０１０３】
本発明のイムノアッセイ方法は、他の公知のイムノアッセイ方法、例えば、抗体コンジュゲート、またはフルオレセインまたはローダミンのような蛍光物質の抗原コンジュゲートを用いる蛍光イムノアッセイ、抗体被覆ラテックス粒子、または抗原被覆ラテックス粒子でのラテックス凝集、抗体被覆赤血球または抗原被覆赤血球での血球凝集反応、ならびにアビジン−ビオチン検出システム、またはストレプトアビジン−ビオチン検出システムである。
【０１０４】
本発明のイムノアッセイで使用される特定のパラメーターは、試料中の抗原の濃度、試料の性質、使用されるイムノアッセイのタイプなどのような種々の要因に応じて広く変化させることができる。最適条件は、当業者が容易に確立することができる。ある実施形態において、典型的には試料の不在下における検出可能マーカーの５０％結合を与えるように、標的ポリペプチドに結合する抗体の量を選択する。もし精製された抗体を抗体源として用いる場合、アッセイ当たりに使用される抗体の量は、一般には、約１ｎｇ〜約１００ｎｇの範囲である。典型的なアッセイ条件としては、約４℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃、最も好ましくは約２５℃の温度範囲、約５〜９、好ましくは約７のｐＨ値範囲、および蒸留水のそれから、約０．２Ｍ塩化ナトリウムのそれ、好ましくは０．１５Ｍ塩化ナトリウムのほぼそれまで変化するイオン強度が挙げられる。時間は、アッセイの性質に依存して広く変化し、一般には、約０．１分〜約２４時間の範囲である。広く種々の緩衝液、例えば、ＰＢＳを使用することができ、およびイオン強度を増強させるための塩、血清アルブミンのようなタンパク質、安定化剤、殺生物剤および非イオン性界面活性剤のような他の試薬を含めることもできる。
【０１０５】
本発明のアッセイは、当業者に良く知られた標準的方法に従い（標的ポリペプチドの陽性もしくは陽性量、または陰性もしくは陰性量として）スコア化する。スコア化の特定の方法はアッセイフォーマットおよび標識の選択に依存するであろう。例えば、ウェスタンブロットアッセイは、酵素標識によって生じた着色生成物を可視化することによってスコア化することができる。正しい分子量における明瞭に目に見える着色したバンドまたはスポットは陽性の結果としてスコア化され、他方、明瞭に目に見えるスポットまたはバンドの不存在は陰性としてスコア化される。バンドまたはスポットの強度は、標的ポリペプチドの濃度の定量的尺度を供することができる。
【０１０６】
本明細書中に記載された種々のイムノアッセイで用いる抗体は商業的に入手可能であるか、あるいは当業者に知られた標準的方法を用いて製造することができる。
【０１０７】
（Ｃ）行動アッセイ）
種々の実施形態において、行動アッセイを、アデノシンＡ２Ａレセプターの発現または活性を改変する因子についてのアッセイの代わりに、またはそれの補充として用いることができる。従って、例えば、化合物がアデノシンＡ２Ａレセプターアンタゴニストであることが既に知られている場合、行動アッセイを用いて、中毒に関連する行動の１以上の構成要素を阻害するにおける効力について化合物を評価することができる。
【０１０８】
そのような行動アッセイは当業者に良く知られている。これらとしては、限定されるものではないが、（例えば、エタノールまたは他の物質の）オペラント自己投与、アデノシンに媒介された欲望行動の復帰の阻害等が挙げられる。いくつかのそのようなアッセイは実施例およびそこに引用された文献において、本明細書中に説明されている。
【０１０９】
（Ｄ）アデノシンＡ２Ａレセプターに結合するテスト因子についてのプレスクリーニング）
ある実施形態において、アデノシンＡ２Ａレセプターをコードする核酸、および／またはアデノシンＡ２Ａレセプターと相互作用する（例えば、それらに特異的に結合する）能力についてテスト因子をプレスクリーニングするのが望まれる。具体的には、結合性テスト因子は、Ａ２Ａレセプターの発現および／または活性と相互作用し、それにより、それを阻害するようである。従って、いくつかの好ましい実施形態において、テスト因子を、前記したより複雑なアッセイを行うに先立って、Ａ２Ａレセプター核酸への、またはＡ２ＡレセプターもしくはＡ２Ａレセプタータンパク質への結合についてプレスクリーニングする。
【０１１０】
１つの実施形態において、そのようなプレスクリーニングは単純な結合アッセイで達成される。核酸またはタンパク質に対する特定のリガンドの特異的結合または結合親和性をアッセイする手段は、当業者に良く知られている。好ましい結合アッセイにおいて、標的（例えば、Ａ２Ａレセプタータンパク質または核酸）を固定化し、（標識することができる）テスト因子に暴露し、あるいは別法として、テスト因子を固定化し、標識することができるＡ２Ａレセプターに暴露する。次いで、固定化された部位を洗浄して、未結合物質をいずれも除去し、結合したテスト因子または結合したレセプタータンパク質を（例えば、結合した分子に結合した標識の検出によって）検出する。固定化された標識の量は、標的およびテスト因子の間の結合の程度に比例する。
【０１１１】
（Ｅ）アッセイのスコア化）
本発明のアッセイは、当業者に良く知られた標準的方法に従ってスコア化される。本発明のアッセイは典型的には、存在するテスト因子で観察される活性、および（通常は陰性の）対照の間に差がある場合、またはテスト因子が既に適用されている場合には、陽性としてスコア化される。ある好ましい実施形態において、変化／差は、例えば、供されるデータセットに適したいずれかの統計学的テスト（例えば、ｔ−検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、半パラメーター技術、非パラメーター技術（例えば、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｔｅｓｔ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｓｉｇｎｅｄ  Ｒａｎｋｓ  Ｔｅｓｔ、Ｓｉｇｎ  Ｔｅｓｔ、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｔｅｓｔ等））を用いて決定されるように、統計学的に有意な変化／差である。好ましくは、この差／変化は、８０％よりも大きな信頼レベル、好ましくは約９０％よりも大きな信頼レベル、より好ましくは約９８％よりも大きな信頼レベル、最も好ましくは約９９％よりも大きな信頼レベルにおいて統計学的に有意である。最も好ましい「陽性」アッセイは、陰性対照から少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、もっとも好ましくは少なくとも４倍、またはさらに１０倍の差を示す。
【０１１２】
（Ｆ）スクリーニング：コンビナトーリアルライブラリーのための因子（例えば、小さな有機分子））
実質的にいずれの因子も、本発明の方法に従ってスクリーニングすることができる。そのような因子としては、限定されるものではないが、核酸、タンパク質、糖、多糖、糖タンパク質、脂質、および有機低分子が挙げられる。用語、有機低分子とは、典型的には、医薬で通常用いられる有機分子と匹敵するサイズの分子をいう。該用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸等）を除外する。好ましい小さな有機分子は、サイズが、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａの範囲までである。
【０１１３】
便宜には、有用な特性を持つ（新しい化学実体は、いくらかの所望の特性または活性を持つ化学化合物（「リード化合物」といわれる）を同定し、このリード化合物の改変体を創製し、次いで、それらの変種化合物の特性および活性を評価することによって創製される。しかしながら、現在の傾向は、薬物発見の全ての態様について時間スケールを短縮することにある。大きな数を迅速かつ効果的にテストする能力のため、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法は、慣用的なリード化合物同定方法を置き換えつつある。
【０１１４】
１つの好ましい実施形態において、高スループットスクリーニング方法は非常に多数の潜在的治療化合物（候補化合物）を含有するライブラリーを提供することを含む。次いで、そのような「コンビナトーリアル化学ライブラリー」を本明細書中に記載した１以上のアッセイでスクリーニングして、所望の特徴的な活性を呈するライブラリーメンバー（特に、化学的種またはサブクラス）を同定する。これにより同定された化合物は慣用的な「リード化合物」として役立ち得るか、あるいはそれ自体が、潜在的または実際の治療剤として用いることができる。
【０１１５】
コンビナトーリアル化学ライブラリーは、多数の化学的「形成ブロック」を合わせることによって化学的合成または生物学的合成いずれかによって生じた多様な化学化合物のコレクション（例えば、試薬）ある。例えば、ポリペプチド（例えば、ムテイン）ライブラリーのような直線状コンビナトーリアル化学ライブラリーは、与えられた化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について可能な方法毎に、アミノ酸と呼ばれる化学形成ブロックのセットを合わせることによって形成される。化学形成ブロックのそのようなコンビナトーリアル混合を介して、数百万の化学化合物を合成することができる。例えば、一人のコメンテーターは、１００の相互交換可能な化学結合ブロックの系統的コンビナトーリアル混合の結果、１億のテトラマー化合物または１００億のペンタマー化合物の理論的合成がもたらされることを観察している（Ｇａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７（９）：１２３３−１２５０）。
【０１１６】
コンビナトーリアル化学ライブラリーの調製は当業者に良く知られている。そのようなコンビナトーリアル化学ライブラリーとしては、限定されるものではないが、ペプチドライブラリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，０１０，１７７号、Ｆｕｒｋａ（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−４９３，Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８参照）。ペプチド合成は、本発明で用いることが考えられ、それが意図される唯一のアプローチでは断じてない。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学も用いることができる。そのような化学としては、限定されるものではないが、ペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５，１９９１年１２月２６日）、コードされたペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２，１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオ−オリゴマー（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０００９１，１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソーマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３）、ビニル様ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８）、β−Ｄ−グルコースの基本骨格を持つ非ぺプド性のペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８）、小化合物ライブラリーの同様な有機合成（Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１．１３０３）、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８）が挙げられる。一般には、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５、核酸ライブラリー（例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｃｏｒｐ．）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許５，５３９，０８３号参照）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２、および米国特許第５，５９３，８５３号参照）、および有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ（１９９３）  Ｃ＆ＥＮ，Ｊａｎ１８、３３頁，イソプレノイド  米国特許第５，５６９，５８８号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン  米国特許第５，５４９，９７４号、ピロリジン  米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号、モルホリノ化合物  米国特許第５，５０６，３３７号、ベンゾジアゼピン  米国特許第５，２８８，５１４号参照、など）を参照されたし。
【０１１７】
コンビナトーリアルライブラリーの調製のためのデバイスは商業的に入手可能である（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ参照）。
【０１１８】
多数のよく知られたロボットシステムもまた液相化学のために開発されている。これらのシステムとしては、限定されるものではないが、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｓｕｓｔｒｉｒｅｓ，ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によって開発された自動合成装置のような自動化ワークステーション、および化学者によって行われる手動合成操作を模倣するロボットアーム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ，Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＶｅｎｔｕｒｅ（商標）プラットフォーム、出発から終了まで５７６〜９，６００の間の同時反応を行うことができる超高スループットシンセイサイザー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ参照）を利用する多くのロボットシステムが挙げられる。前記デバイスのいずれも、本発明で用いるのに適当である。本明細書中で議論するように操作できるようなこれらのデバイス（もしあれば）に対する変更の性質および実行は当業者に明白であろう。加えて、多数のコンビナトーリアルライブラリーはそれ自体が商業的に入手可能である（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ，３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等参照）。
【０１１９】
（Ｇ）高スループットスクリーニング）
本明細書中に記載された代謝産物の蓄積または分解を変調する化合物についてのアッセイのいずれも高スループットスクリーニングに使用することができる。好ましいアッセイは、テスト化合物の存在に応答して、アデノシンＡ２Ａレセプターの発現または活性を検出する。
【０１２０】
本発明の方法で利用される細胞は、一度に単一のテスト因子と接触させる必要はない。対照的に、高スループットスクリーニングを容易とするためには、単一細胞を少なくとも２だけ、好ましくは少なくとも５だけ、より好ましくは少なくとも１０だけ、最も好ましくは少なくとも２０のテスト化合物に接触させることができる。もし細胞のスコアが陽性であれば、活性を有する因子が同定されるまで、それを引き続いてテスト因子のサブセットを用いてテストすることができる。
【０１２１】
種々のレポーター遺伝子産物についての高スループットアッセイは当業者によく知られている。例えば、マルチウェルフルオリメーターは（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから）商業的に入手可能である。
【０１２２】
加えて、高スループットスクリーニングシステムは商業的に入手可能である（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ等参照）。これらのシステムは、典型的には、全ての試料および試薬のピペッティング、液体分注、適時のインキュベーション、およびアッセイに適した検出器でのマイクロプレートの最終的な読み取りに挙げられる、全手法を自動化する。これらの配置可能なシステムは高スループットおよび迅速な開始、ならびに高度な柔軟性およびカスタマイズ性を提供する。そのようなシステムの製造業者は、種々の高スループットの詳細なプログラムを提供する。従って、例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合等の変調を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術公開を提供する。
【０１２３】
（Ｈ）モジュレーターデータベース）
ある実施形態においては、本明細書中に記載したアッセイにおいて陽性のスコアである（例えば、Ａ２Ａレセプターの発現または活性を阻害する能力を示す）因子は、乱用物質の消費、またはそれからの禁断症状に関連する習慣性行動の１以上の構成要素の推定および／または現実のインヒビターのデータベースに入力することができる。用語「データベース」とは、情報を記録し検索するための手段をいう。好ましい実施形態において、データベースとしては、記憶された情報を分類しおよび／またはサーチするための手段も提供する。データベースは、限定されるものではないが、ペーパーシステム、カードシステム、機械的システム、電子的システム、光学的システム、磁気システムまたはその組み合わせを含めたいずれかの便宜な媒体が挙げられ得る。好ましいデータベースとしては、電子的（例えば、コンピューターベースの）データベースが挙げられる。データベースの記憶および操作で用いるためのコンピューターシステムは当業者に良く知られており、限定されるものではないが「パーソナルコンピューターシステム」、メインフレームシステム、インターネットまたはイントラネットでの分散されたノード、特殊化されたハードウェアに（例えば、マイクロチップに）記憶されたデータまたはデータベース等が挙げられる。
【実施例】
【０１２４】
以下の実施例は説明のために供するものであって、特許請求される発明を限定するものではない。
【０１２５】
（実施例１）
ラットにおけるエタノールオペラント自己投与はアデノシンＡ２Ａレセプターによって調節される。
【０１２６】
側座核（ＮＡｃ）におけるドーパミン（ＤＡ）放出は、エタノール（ＥｔＯＨ）の神経および行動効果に関与する。最近の進歩は、アデノシンがＥｔＯＨに対するＣＮＳ応答の調節においても重要な役割を演じていることを示唆する。神経細胞培養における研究は、ＥｔＯＨが、アデノシンＡ２レセプター（Ａ２）の活性化を介して、ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達およびＣＲＥ媒介遺伝子発現をトリガーすることを示す。最も重要なことには、Ａ２を通じて作用するＥｔＯＨの閾値下の濃度、およびＤＡ  Ｄ２レセプター（Ｄ２）アゴニストが相乗作用をして、この経路を活性化する。相乗作用はＧｉ／ｏ  βγダイマーによって媒介される（Ｙａｏら、２００２）。最近、本発明者らは、ＮＡｃにおけるβγインヒビターの発現がラットにおけるＥｔＯＡ飲用を低下させることを報告した（Ｙａｏら、２００２）。もしＥｔＯＡの実りある効果がこの経路を通じて媒介されるならば、Ａ２またはＤ２の遮断はＥｔＯＨ消費を弱めるはずである。
【０１２７】
方法：雄Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットを作動非作動レバーで毎日３０分の期間で１０％ＥｔＯＨを自己投与するように訓練した。ラットの別の群には、全身注射によって、Ｄ２アンタゴニストエチクロピリド（０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ）、Ａ２ＡアンタゴニストＤＭＰＸ（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）およびＡ１アンタゴニストＤＰＣＰＸ（０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
【０１２８】
結果：エチクロプリドはＥｔＯＨ飲用を用量依存的に低下させた。ＤＭＰＸは双峰的効果を示した：１０および２０ｍｇ／ｋｇはＥｔＯＨ消費を減少させたが、１ｍｇ／ｋｇは増加させた。ＤＰＣＰＸは効果がなかった。
結論：本発明者らの仮説を裏付けて、Ｄ２アンタゴニストおよびＡ２Ａアンタゴニストは共にＥｔＯＨ自己投与を弱める。低用量のＡ２ＡアンタゴニストはＥｔＯＨの飲用を増大させ、これは、ラットがＥｔＯＨ自己投与を増加させて、部分的なＡ２Ａ遮断を克服するという可能性と合致する。これらのデータは、アデノシンＡ２Ａレセプターの薬理学的変調がラットにおいてＥｔＯＨ消費を調節することができるという最初の証拠を提供する。
【０１２９】
（導入）
側座核（ＮＡｃ）および背側線条体はＣＮＳにおいて最高濃度のアデノシンＡ２Ａレセプターを発現する（ＪａｒｖｉｓおよびＷｉｌｌｉａｍｓ，１９８９；Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎら、１９９７ａ）。神経細胞培養系における実験は、エタノール（ＥｔＯＨ）がＡ２のシグナル伝達を活性化することを示した（ＧｏｒｄｏｎおよびＤｉａｍｏｎｄ，１９８６）。これが起こるのは、ＥｔＯＨが平衡ヌクレオシドトランスポーターであるＥＮＴ１を介してアデノシンの摂取をブロックし、細胞外アデノシン濃度の増加を引き起こすからである（Ｎａｇｙら、１９９０；Ｋｒａｕｓｓら、１９９３）。増大した細胞外アデノシンはＡ２レセプターを活性化し、その結果、増大したｃＡＭＰレベルをもたらす。ｃＡＭＰにおけるエタノール誘導増加は、ＰＡＫの活性化、およびＰＫＡの触媒サブユニット（ＰＫＡ  Ｃα）の核へのトランスローケーションに導く（Ｄｏｈｒｍａｎら、２００２）。これに続いて、ｃＡＭＰ依存性ＣＲＥ媒介遺伝子転写の増加が起こる（Ｙａｏら、２００２）。
【０１３０】
ＥｔＯＨがアデノシン摂取を阻害することによって細胞外アデノシンを増加させる可能性に加えて、肝臓におけるＥｔＯＨ代謝は組織および器官におけるアデノシンの増加に導くこともできる（Ｃａｒｍｅｃｈａｅｌら，１９８７，１９８８，１９９１；Ｏｒｒｅｇｏら，１９８８ａ）。肝臓のアルコールアセトアルデヒド活性はＥｔＯＨからアセテートを作り出す（Ｏｒｒｅｇｏら，１９８８ｂ）。アセテートはさらに代謝されてアセチルＣｏＡとなり、該プロセスにおいてＡＴＰを消費し、これはアデノシンを作り出す（Ｉｓｒａｅｌら、１９９４）。循環系に放出されたアデノシンは血液−脳関門を横切る（ＣｏｒｎｆｏｒｄおよびＯｌｄｅｎｄｏｒｆ，１９７５）。加えて、肝臓におけるアルコール代謝によって生じたアセテートは循環系に放出され、そこで、やはり血液−脳関門を横切る。脳に入るアセテートは容易にアセチルＣｏＡに変換される（ＢｅｒｌおよびＦｒｉｇｙｅｓｉ，１９６９）。これはイン・サイチュにおいてアデノシンを生じるであろう。アセテートは、アデノシンのようにＣＮＳ抑制剤である。脳におけるアセテートの効果は、アデノシンによって媒介されるように見える。なぜならば、それはアデノシンレセプターアンタゴニストによってブロックされるからである（Ｉｓｒａｅｌら、１９９４；Ｃａｍｐｉｓｉら、１９９７）。一緒に考え合わすと、これらの発見は、イン・ビボにおけるＥｔＯＨの行動効果のいくつかが、アデノシンレセプターの引き続いての活性化を伴い、脳中の細胞外アデノシンの直接的および間接的ＥｔＯＨ誘導増加の双方によって媒介されるであろうことを示唆する。
【０１３１】
ＮＡｃおよび背側線条体のユニークな特徴の１つは、同一ＧＡＢＡ作動性媒体棘状ニューロン上のアデノシンＡ２Ａレセプターおよびドーパミン（ＤＡ）Ｄ２レセプターの共発現である（Ｆｉｎｋら、１９９２）。本発明者らは、細胞培養系におけるＥｔＯＨに対するニューロン応答の媒介における、Ａ２およびＤ２レセプターの相互作用を調べた。本発明者らは、Ｄ２誘導活性化とＥｔＯＨ／Ａ２誘導活性化との間の相乗作用を発見した。単独では効果を有しない閾値下濃度のＤ２アゴニストまたはＥｔＯＨは、一緒に加えると、ＰＫＡシグナル伝達の最大活性化を誘導した。さらに、本発明者らは、Ｇｉ／ｏ  βγダイマーの放出が、Ｄ２アゴニストおよびＥｔＯＨによって誘導される相乗作用に必要であることを見出した。本発明者らのモデルを裏付けて、本発明者らは、ＮＡｃのシェル領域におけるβγダイマー作用の阻害が、ＥｔＯＨ自己投与を減少させることを見出した（Ｙａｏら、２００２）。Ａ２Ａレセプターは機能的にＮＡｃの同じ線条体ＧＡＢＡ作動性媒体の棘状ニューロン内のＤ２レセプターと相互作用するので（Ｆｉｎｋら、１９９２；Ｆｅｒｒｅ，１９９７；Ｆｅｒｒｅら、１９９７；Ｆｕｘｅら、１９９８；Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎら、１９９９）、本発明者らは、Ａ２ＡレセプターおよびＤ２レセプターの間の相乗作用がこの脳領域に対して選択的ＥｔＯＨ過敏性を付与するという仮説を立てる。具体的には、本発明者らは、イン・ビボにおいて、ＥｔＯＨそれ自体が、ＶＴＡ  ＤＡニューロンの発信（ファイヤリング）を増加させ（Ａｐｐｅｌら、２００３）、これによって、ＮＡｃにおけるＤＡレベルを増強すること（ＩｍｐｅｒａｔｏおよびＤｉ  Ｃｈｉａｒａ，１９８６；Ｗｅｉｓｓら、１９９３）、および前記したメカニズムを介して細胞外アデノシンを増加させることの双方により、この相乗的相互作用に寄与すると提唱する。ＥｔＯＨの補強効果は、各々、Ｄ２レセプターおよびＡ２Ａレセプターに作用するＤＡおよびアデノシン双方のこれらのＥｔＯＨ誘導増加によって媒介され得る。
【０１３２】
この明細書中の研究は、Ｄ２またはＡ２Ａレセプターの遮断がＥｔＯＨの補強効果を低下させるか否かを調べる。本発明者らは、Ａ２ＡアンタゴニストＤＭＰＸを用いて、アデノシンＡ２Ａの遮断がラットにおいてＥｔＯＨ自己投与を低下させるか否かを判断した。ＥｔＯＨ消費の間におけるアデノシンＡ１レセプターの関与可能性を排除するために、Ａ１選択的アンタゴニストＤＰＣＰＸもテストした。Ｄ２レセプターはＥｔＯＨ自己投与を調節することが既に示されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９７；Ｃｏｈｅｎら、１９９８；Ｃｚａｃｈｏｗｓｋｉら、２００１）。本発明者らの実験条件下でＤ２レセプターの参画をさらに特徴付けるために、本発明者らは、本発明者らの知識の限りでは、ラットにおいてＥｔＯＨオペラント自己投与の実験でテストされたことがないＤ２アンタゴニストエチクロプリドの効果をテストした。
【０１３３】
（方法）
（動物および収容）
実験の開始時にほぼ体重が２５０ｇである雄Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、特記する場合を除いて食物および水を自由に手に入れることができるように個々に収容した。それらを午前７：００に明かりをつける１２時間の明／暗サイクルで維持した。オペラントの訓練は午前８：３０および午後２：００の間で行った。実験手法は、予め、本発明者らの動物管理使用委員会によって認可された。
【０１３４】
（薬物）
自己投与についてのＥｔＯＨ希釈物（１０％ｖ／ｖ）は、９５％エチルアルコールおよび水道水を用いて作製した。スクロース（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）溶液（１０％ｗ／ｖ）は水道水で作製した。テストした全ての化合物はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ａ２ＡアンタゴニストＤＭＰＸ（３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン）を温かい生理食塩水に溶解した。Ａ１アンタゴニストＤＰＣＰＸ（８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン）はＡｌｋａｍｕｌｓ  ＥＬ−６２０（Ｒｈｏｄｉａ  Ｉｎｃ．，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）およびリン酸緩衝化生理食塩水の２０：８０ｖ／ｖ混合物に溶解させた。Ｄ２アンタゴニストのエチクロプリドは生理食塩水に溶解させた。薬物は、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＤＭＰＸでテストした群を除いて１ｍｌ／ｋｇ容量にて投与し、ここに、注射容量は、達成された最高ＤＭＰＸ可溶性濃度が１０ｍｇ／ｍｌであったので２ｍｌ／ｋｇであった。薬物は各処理日に新たに調製した。
【０１３５】
（オペラント自己投与装置）
ＥｔＯＨオペラント自己投与は、音を減弱した小室に収容した標準オペラントチャンバー（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＶＴ）で行った。各チャンバー（３３×３０．５×３３ｃｍ）は右壁に対して２つの格納式レバーを、各々、フロアから７ｃｍ、および右壁の右または左エッジから１ｃｍの所に備えた。フロアレベル上方２．５ｃｍ、およびチャンバーの中心に向けてレバーから６ｃｍに位置した１つの凹んだ皿は補強体レセプタクルであった。流体（０．１ｍｌ）を２つの格納式応答レバーのうちの１つの作動に際してシリンジポンプから送り出した。３秒のトーンをレバー押し下げに対して作動した。非作動レバーを押し下げる結果、スクロースの一晩の期間の間を除いて、目に見える／聞こえる合図も、補強送達も生じなかった（後記参照）。訓練期間の最初は、フロア上方２７．２ｃｍの、レバーに面する壁の中央に位置したハウス光の開始によって合図した。コンピューターは刺激および流体送付を制御し、オペラント応答を記録した。
【０１３６】
（ＥｔＯＨ自己投与手法）
ＥｔＯＨオペラント自己投与の開始前に、ラットを、そのホームケージ中の唯一の液体源としての１０％ＥｔＯＨ（１０Ｅ）溶液に４日間暴露した。次の１４日間、動物に、規格ガラスチューブからの水道水中の１０Ｅまたは水道水の間で自由に選択させた。この１４日間の最後に、些細な変更を施したスクロース減少技術（Ｓａｍｓｏｎ，１９８６）に従ってオペラント自己投与を開始した。ラットを、１日当たり３０分の水に２日間連続して制限した。水制限の２日目の夜に、ラットを、強化因子としての１０％スクロース（１０Ｓ）かつ双方のレバーを作動性にしたＦＲ１スケジュール（レバー押し下げ当たり０．１ｍｌの１補強）にて、、１２〜１５時間の一晩のセッションの間オペラントチャンバーに入れた。翌日、ラットはオペラント自己投与訓練を開始した。動物を次の４〜５日間水制限に維持し、その間に、動物は強化因子としての１０Ｓおよび１つの作動性レバーでのＦＲ１スケジュールにて、１日当たり１回の４５分セッションを受けた。次いで、実験の残りの間、動物にそのホームケージ中の水を自由に与え、前記セッションのさらに２〜３回の間訓練した。翌日、セッションを３０分に短縮し、応答の比率をＦＲ３まで増加させた。ＥｔＯＨを甘い溶液（１０Ｓ１０Ｅ）に加え、ラットはこの溶液の３〜４セッションを受け、続いて、１０Ｅのみでの少なくとも２０のセッションを受けた。いずれの薬物処理の開始に先立っての８セッションにおける０．３ｇ／ｋｇＥｔＯＨ消費の最小平均を必要とした。最後の８セッションにおいてこの平均量のＥｔＯＨを消費しなかった動物は実験に含めなかった。
【０１３７】
（実験の設計）
一旦ラットがＥｔＯＨに対する安定な応答を達成すると、ラットを、一週間当たり１のセッションの間のビヒクルの皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）の注射に２週間連続で慣らした。次に、対象内ラテン方格法を用いて薬物をテストし、それにより、各動物に化合物のうちの１つの各用量および適当なビヒクルを受けた。ラットは月曜日〜金曜日に毎日訓練したが、テストセッションは各週の水曜日または木曜日に行った。この実験で用いた３つの薬物は動物の４つの別々の群でテストした。ＤＭＰＸ（０、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）またビヒクルを各セッション２０分前に腹腔内投与した。１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量のＤＭＰＸを、動物の１つの群でテストし、他方、残りのＤＭＰＸ用量（０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）は異なる群で実験して、重要な１０ｍｇ／ｋｇ用量の周りのＤＭＰＸ濃度をよりよく調べた。ＤＰＣＰＸ（０ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルは各セッション１５分前に腹腔内注射した。エチクロプリド（０ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇまたは０．０１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルは各セッションに２５分先立って皮下投与した。
【０１３８】
（統計学）
レバー押し下げ回数、ＥｔＯＨ補強の回数、ＥｔＯＨ消費のｇ／ｋｇならびにセッション当たりの非作動性レバー押し下げ回数は、一方向ＡＮＯＶＡによって分析し、対象内での因子はＤＭＰＸ、ＤＰＣＰＸまたはエチクロプリド用量であった。ＤＭＰＸ効果については、１、３および１０ｍｇ／ｋｇでテストした動物の群は、５、７および２０ｍｇ／ｋｇのＤＭＰＸを受ける動物とは別々に分析した。ポスト−ｈｏｃＬＳＤテストは適切な場合に行った。
【０１３９】
（結果）
（ＥｔＯＸ自己投与に対するＤＭＰＸの効果）
２つの別々の用量−効果関数を、ラットの２つの別々の群においてＤＭＰＸについて測定したが、テストしたＤＭＰＸの全ての用量の効果についての結果をより明瞭な比較のために１つの図面中で示す（図１）。生理食塩水処理に続いての平均応答は異ならなかった：群１：８９．２０±１５．２６（０．３９±０．０６ｇ／ｋｇ）、および群２：９９．４４＋１２．０２（０．４６＋０．０５ｇ／ｋｇ）。１、３および１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＰＸでテストした群において、レバー押し下げ回数［Ｆ（３，２７）＝９．６８，ｐ＜０．０００３］、ＥｔＯＸ強化の数［Ｆ（３，２７）＝８．６９，ｐ＜０．０００３］およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費［Ｆ（３，２７）＝８．６２，ｐ＜０．０００４］の有意な効果が観察された。非作動性レバーの押し下げはこれらの用量のいずれによっても影響されなかった［Ｆ（３，２７）＝０．８７，ＮＳ］（表１）。５、７および２０ｍｇ／ｋｇのＤＭＰＸでテストした群は、レバー押し下げ回数［Ｆ（３，２１）＝４．３７，ｐ＜０．０２］、ＥｔＯＸ強化の数［Ｆ（３，２１）＝４．７６，ｐ＜０．０２］およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費［Ｆ（３，２１）＝４．９６，ｐ＜０．０１］の有意な効果を示したが、非作動性レバー押し下げ回数の有意な効果は観察されなかった［Ｆ（３，２１）＝０．１５，ＮＳ］（表１）。Ａ２Ａアンタゴニストの用量効果機能は、ポスト−ｈｏｃテストによって明らかにされたように双峰的であった。テストした最低用量（１ｍｇ／ｋｇ）は、レバー押し下げ回数（ｐ＜０．０２）、ＥｔＯＨ強化の数（ｐ＜０．０３）並びにｇ／ｋｇのＥｔＯＨ摂取（ｐ＜０．０３）を有意に増加させた。中程度の用量である３、５およびｍｇ／ｋｇは測定のいずれにも有意に影響しなかった。１０ｍｇ／ｋｇの用量は分析した全ての測定、すなわち、レバー押し下げ回数（ｐ＜０．０２）、ＥｔＯＨ強化の数（ｐ＜０．０３）ならびにｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（ｐ＜０．０２）を有意に減少させた。最高の用量（２０ｍｇ／ｋｇ）は、ＥｒＯＨ強化の数（ｐ＜０．０５）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ摂取（ｐ＜０．０５）に対する有意な効果を示した。
【０１４０】
【表１−１】
2008503464.tif 000002
【０１４１】
【表１−２】
2008503464.tif 000003
（ＥｔＯＨ自己投与に対するＤＰＣＰＸの効果）
本実験の結果は図２および表１に示す。測定されたパラメーター、すなわち、レバー押し下げ回数［Ｆ（３，１８）＝０．８４，ＮＳ］、ＥｔＯＨ強化の数［Ｆ（３，１８）＝０．７４，ＮＳ］、ｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費［Ｆ（３，１８）＝０．８４，ＮＳ］または非作動性レバー押し下げ［Ｆ（３，１８）＝０．５２，ＮＳ］のいずれに対しても、選択的Ａ１アンタゴニストであるＤＰＣＰＸ（０．１２５、０．２５または０．５ｍｇ／ｋｇ）の効果はなかった。
【０１４２】
（ＥｔＯＨ自己投与に対するエチクロプリドの効果）
本実験の結果は図３に示す。レバー押し下げ回数［Ｆ（３，１３）＝１１．１３，ｐ＜０．０００４］、ＥｔＯＨ強化の数［Ｆ（３，１５）＝８．９６，ｐ＜０．００１］ならびにｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費［Ｆ（３，１５）＝１０．１４，ｐ＜０．０００７］の有意な減少が観察された。ポスト−ｈｏｃ分析により、分析した全ての測定、すなわち、レバー押し下げ回数（各々、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．０００１）、補強の数（各々、ｐ＜０．０２およびｐ＜０．００７）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（各々、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００４）に対する０．００７ｍｇ／ｋｇおよび０．０１ｍｇ／ｋｇエチクロプリドの有意な効果が明らかとなった。０．００５ｍｇ／ｋｇの用量は分析した測定のいずれにも有意には影響しなかった。非作動性なレバー押し下げは、いずれの用量によっても影響されなかった［Ｆ（３，１５）＝０．３９，ＮＳ］（表１）。
【０１４３】
（考察）
本実験における主な発見は、アデノシンＡ２ＡレセプターがＥｔＯＨの強化特性を調節するということである。Ａ２ＡアンタゴニストであるＤＭＰＸは、レバー押し下げ回数、補強の数、およびオペラント自己投与の間に消費されたｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨに双峰的に影響した。対照的に、アデノシンＡ１アンタゴニストの効果はなかった。予測されたように、ＤＡ  Ｄ２アンタゴニストであるエチクロプリドは、他のＤ２アンタゴニストで報告されているように（Ｈｏｄｇｅら、１９９７；Ｃｏｈｅｎら、１９９８；Ｃｚａｃｈｏｗｓｋｉら、２００１）、全ての測定されたパラメーターを減少させた。
【０１４４】
ＥｔＯＨはＥｔＯＨ感受性平衡ヌクレオシドトランスポーターであるＥＮＴ−１（Ｎａｇｙら、１９９０；Ｈａｎｄａら、２００１）を介するアデノシン再摂取を阻害し、細胞外アデノシンを増加に導く。アデノシンはＡ２レセプターを活性化し、細胞培養においてｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達を増加させる（Ｇｏｒｄｏｎら、１９８６）。最近、本発明者らは、ＰＫＡ活性化についてＮＰＡ、Ｄ２アゴニストおよびＥｔＯＨ／Ａ２の間の相乗作用を報告した。相乗作用はＧｉ／ｏから放出されたβγダイマーによって媒介される（Ｙａｏら、２００２）。本発明者らは、イン・ビボにおけるＥｔＯＨの行動効果におけるこの経路の役割についての支持を提供した：セットＮＡＣニューロンにおけるβγダイマーはＥｔＯＨ自己投与を減少させる（Ｙａｏら、２００２）。現在の研究は、Ａ２ＡまたはＤ２レセプター遮断がイン・ビボにてＥｔＯＨ自己投与を減少させることを示すことによって、このプロセスにおけるＡ２ＡおよびＤ２の重要性に対してさらなる支持を提供する。
【０１４５】
本発明者らは、ＤＭＰＸ（１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の全身投与がＥｔＯＨ自己投与を減少させたことを見出した。しかしながら、最低用量のＤＭＰＸは、パラドックス的に、レバー押し下げ回数を増加させ、その結果、ＥｔＯＨ消費を増加させる。ＤＭＰＸの二相効果についていくつかの可能な説明がある。第一に、低および高用量のＤＭＰＸは区別されるレセプター集団において作用に関係し得る。例えば、低用量において、ＤＭＰＸは高親和性Ａ２レセプターを阻害できるに過ぎず、より高い用量においては、ＤＭＰＸは高および低双方の親和性レセプターを阻害することができる。（ＳｅｂａｓｔｉａｏおよびＲｉｂｅｒｏ，１９９２；Ｃｕｎｈａら、１９９９；Ｅｌ  Ｙａｃｏｕｂｉら、２０００）。ＤＭＰＸもまた、選択性は低いものの、Ａ１レセプターに結合することができると考えられる（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、１９９３）。従って、より高い用量におけるＤＭＰＸの効果はやはりＡ１レセプターに関連し得るであろう。この可能性のため、本発明者らは、オペラントＥｔＯＨ自己投与に対する選択的Ａ１アンタゴニストの効果をテストした。Ａ１アンタゴニストであるＤＰＣＰＸの用量のいずれも、測定したパラメーターのいずれにも影響せず、従って、本発明者らはこの説明がありそうにないと考える。最後の可能性は、低用量のＡ２ＡアンタゴニストはＡ２Ａレセプターを部分的にブロックするに過ぎず、これらの条件下でＥｔＯＨの減少した有効性を補償するためのＥｔＯＨ消費の増加に導くことである。この現象は、より低い用量のオピエートアンタゴニストの存在下で動物自己投与モルヒネで観察されている（Ｋｏｏｂら、１９８６）。対象は自己投与に直接的に関与するレセプターの部分的遮断を克服しようと努力するが、同一レセプターがより高い用量において完全にブロックされた場合、対象は次いで自己投与を低下させるように見える。この現象は、Ａ２ＡレセプターがＥｔＯＨ自己投与の直接的かつ重要なメディエーターであるように見えるというさらなる行動の薬理学的証拠を提供する。
【０１４６】
アデノシンレセプターはげっ歯類において運動活性にも影響するので（Ｓｅａｌｅら、１９８８；Ｎｉｋｏｄｉｊｅｖｉｃら、１９９１；Ｂａｒｒａｃｏら、１９９３；Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎら、１９９７ｂ；ＧｒｅｅｎおよびＳｃｈｅｎｋ，２００２）、現在の研究におけるＤＭＰＸの効果は運動活性に対するその効果、およびＥｔＯＨの強化特性に対する効果による可能性がある。これは、もっともらしい説明には見えない。なぜならば、他のＡ２Ａアデノシンアンタゴニストのように、ＤＭＰＸが運動活性を増加させるからである。本発明者らは、運動活性の間接的な尺度である、非作動性レバー応答の数に対するＤＭＰＸの効果を見出さなかった。
【０１４７】
ＥｔＯＨ禁断症状症候群およびＥｔＯＨ誘導運動共調不能は、部分的には、Ａ１レセプターを主として介して媒介されるアデノシン系に関係するように見える（Ｍａｌｅｃら、１９９６；ＪａｒｖｉｓおよびＢｅｃｋｅｒ，１９９８；ＢａｒｖｉｃｋおよびＤａｒ，１９９８；Ｇａｔｃｈら、１９９９；Ｋａｐｌａｎら、１９９９；Ｄａｒ，２００１）。本発明者らは、Ａ１がＥｔＯＨ自己投与を変調しないことを見出した。２つの最近の報告は、ＥｔＯＨに対するＣＮＳ応答におけるアデノシンＡ２Ａレセプターを示している。Ｅｌ  Ｙａｃｏｕｂｉら（２００１）は、Ａ２Ａの不存在または慢性的遮断が、ＥｔＯＨ禁断症状の間の取扱誘導痙攣を低下させることを示した。Ｎａａｓｓｉｌａら（２００２）は、Ａ２Ａノックアウト雄マウスが多量の６％ＥｔＯＨおよび２０％ＥｔＯＨを消費したが、１０％ＥｔＯＨを消費せず、他方、雌は、野生型動物と比較して、２ボトル選択実験において、多量の６％ＥｔＯＨおよび１０％ＥｔＯＨを消費したが、２０％ＥｔＯＨを消費しなかったと報告した。対照的に、本発明者らは、アデノシンＡ２Ａレポーター遮断がＥｔＯＨ消費を減少することを見出した。この矛盾に対する理由はまだ分かっていないが、不安の発生（Ｌｅｄｅｎｔら、１９９７）およびＤ２とＡ２レセプターとの密接な物理的会合（Ｆｒａｎｃｏら、２０００）によるＤ２機能の可能な変化を含めた、Ａ２ノックアウトマウスにおける適合および補償によるものであろう。
【０１４８】
優れたＤ２アンタゴニストであるエチクロプリドは、ＥｔＯＨに対するレバー押し下げ回数ならびに消費されたｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨを用量依存的に減少させた。非作動性のレバー押し下げ回数に対する効果はなかった。これらの結果は、他のＤ２アンタゴニストがＥｔＯＨ消費を減少させたといういくつかの報告に合致する（Ｃｏｈｅｎら、１９９８；Ｃｚａｃｈｏｗｓｋｉら、２００１；Ｇｅｏｒｇｅら、１９９５；Ｈｏｄｇｅら、１９９７；Ｓａｍｓｏｎら、１９９３；Ｗｅｉｓｓら、１９９０）。しかしながら、本発明者らの知識では、これはＥｔＯＨオペラント自己投与におけるエチクプリドの最初の研究である。一緒にすると、これらの知見は、ＥｔＯＨの報償特性におけるＤ２の重要性を確認する。また、本発明者らの知見は、ＥｔＯＨ自己投与がＮＡｃにおける細胞外ＤＡを上昇させるという報告とも合致する（Ｄｏｙｏｎら、２００３；ＷｅｉｓｓおよびＰｏｒｒｉｎｏ，２００２；Ｗｅｉｓｓら、１９９３，１９９６）。また、ラットは、ＥｔＯＨをＶＴＡに直接的に自己投与し（Ｇａｔｔｏら、１９９４）、ＤＡ神経伝達の薬理学的操作はＥｔＯＨ強化オペラント行動およびＥｔＯＨ優先性を修飾する（Ｗｅｉｓｓら、１９９０；Ｓａｍｓｏｎら、１９９３；Ｇｅｏｒｇｅら、１９９５；Ｈｏｄｇｅら、１９９７；Ｃｏｈｅｎら、１９９８；Ｃｚａｃｈｏｗｓｋｉら、２００１）。
【０１４９】
要約すると、本発明者らは、Ａ２ＡまたはＤ２レセプターいずれかの遮断がＥｔＯＨ自己投与を減少させることを見出した。これらの知見は、ＥｔＯＨの強化効果における内因性アデノシンおよびＤＡの役割を支持するが、現在の研究におけるＥｔＯＨの自己投与量がアデノシンまたはＤＡの細胞外レベルの増加を引き起こすのに十分であったか否かは不明である。この制限にも拘わらず、本発明者らの結果は、自己投与ＥｔＯＨが、肝臓でのＥｔＯＨ代謝を介する細胞外アデノシンの増加を増強するアデノシントランスポーターをブロックする作業モデルを支持する。このアデノシンは、Ａ２Ａレセプターを介して、ＮＡｃにおけるｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達を活性化するように作用する。同様に、ＥｔＯＨ刺激ＤＡ放出もまたＤ２レセプターを介するこのＰＫＡシグナル伝達カスケードを活性化することができるようである。本発明者らは、Ａ２およびＤ２レセプター遮断が、これらのＥｔＯＨ誘導効果を妨げることによって、ＥｔＯＨの強化効果を低下させることを提案する。Ａ２ＡおよびＤ２レセプターの間の相乗作用がイン・ビボにてＥｔＯＨ自己投与に対して寄与するか否かを決定するための研究が進行中である。本発明者らの知識では、これらのデータは、イン・ビボでのアデノシンＡ２Ａレセプターの薬理学的操作がラットにおいてＥｔＯＨ消費を調節できるという最初の証拠を提供する。Ａ２Ａレセプター機能をブロックする薬物は、アルコール依存症における過剰飲用の治療および予防において有用である可能性がある。
【０１５０】
【表２−１】
2008503464.tif 000004
【０１５１】
【表２−２】
2008503464.tif 000005
【０１５２】
【表２−３】
2008503464.tif 000006
【０１５３】
【表２−４】
2008503464.tif 000007
【０１５４】
【表２−５】
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【０１５５】
【表２−６】
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【０１５６】
【表３−１】
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【０１５７】
【表３−２】
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本明細書中に記載された実施例および実施形態は説明のための目的のものであり、それに照らした種々の改変または変化は当業者に提案されるものであり、本出願の精神および目的、および添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的で、ここに引用してその全体を援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ＥｔＯＨ自己投与に対するＡ２ＡアンタゴニストＤＭＰＸの双峰的効果を示す。結果は、テストした異なるＤＭＰＸ用量下で応答するオペラントの３０分のＦＲ３期間の間におけるレバー押し下げ回数（図１Ａ）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（図１Ｂ）の平均±ＳＥＭを表す。Ａ２Ａアンタゴニストは該期間に２０分先立って腹腔内投与された。＊生理食塩水処理と比較して有意に異なる（ＬＳＤポスト−ＨＯＣ比較でのＡＮＯＶＡｐ＜０．０５、生理食塩水群についてはｎ＝１８、１、３および１０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝１０、５、７および２０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝８）。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ＥｔＯＨ自己投与に対するＡ２ＡアンタゴニストＤＭＰＸの双峰的効果を示す。結果は、テストした異なるＤＭＰＸ用量下で応答するオペラントの３０分のＦＲ３期間の間におけるレバー押し下げ回数（図１Ａ）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（図１Ｂ）の平均±ＳＥＭを表す。Ａ２Ａアンタゴニストは該期間に２０分先立って腹腔内投与された。＊生理食塩水処理と比較して有意に異なる（ＬＳＤポスト−ＨＯＣ比較でのＡＮＯＶＡｐ＜０．０５、生理食塩水群についてはｎ＝１８、１、３および１０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝１０、５、７および２０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝８）。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、Ａ１アンタゴニストＤＰＣＰＸがＥｔＯＨ自己投与に影響しなかったことを示す。結果は、テストした異なるＤＰＣＰＸ用量下で応答するオペラントの３０分のＦＲ３期間の間におけるレバー押し下げの数（Ａ）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（Ｂ）の平均±ＳＥＭを表す。Ａ１アンタゴニストは該期間に１５分先立って腹腔内投与された（ｎ＝７／群）。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、Ａ１アンタゴニストＤＰＣＰＸがＥｔＯＨ自己投与に影響しなかったことを示す。結果は、テストした異なるＤＰＣＰＸ用量下で応答するオペラントの３０分のＦＲ３期間の間におけるレバー押し下げの数（Ａ）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（Ｂ）の平均±ＳＥＭを表す。Ａ１アンタゴニストは該期間に１５分先立って腹腔内投与された（ｎ＝７／群）。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、Ｄ２アンタゴニストエチクロプリドが用量依存的にＥｔＯＨ自己投与を低下させたことを示す。結果は、テストした異なるエチクロプリド用量下で応答するオペラントの３０分のＦＲ３期間の間におけるレバー押し下げ回数（図３Ａ）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（図３Ｂ）の平均±ＳＥＭを表す。Ｄ２アンタゴニストは該期間に２５分先立って皮下投与された。＊、＊＊生理食塩水処理と比較して有意に異なる（ＬＳＤポスト−ＨＯＣ比較でのＡＮＯＶＡ、各々、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１；ｎ＝５／群）。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、Ｄ２アンタゴニストエチクロプリドが用量依存的にＥｔＯＨ自己投与を低下させたことを示す。結果は、テストした異なるエチクロプリド用量下で応答するオペラントの３０分のＦＲ３期間の間におけるレバー押し下げ回数（図３Ａ）およびｇ／ｋｇ  ＥｔＯＨ消費（図３Ｂ）の平均±ＳＥＭを表す。Ｄ２アンタゴニストは該期間に２５分先立って皮下投与された。＊、＊＊生理食塩水処理と比較して有意に異なる（ＬＳＤポスト−ＨＯＣ比較でのＡＮＯＶＡ、各々、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１；ｎ＝５／群）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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