(57)【要約】  本発明は、幹細胞または幹細胞由来の細胞を凍結する方法であって、細胞懸濁液を提供する工程と、該細胞懸濁液に氷核形成を実施する工程と、該幹細胞の長期保存を可能にするのに十分に低い温度に該氷核形成細胞懸濁液の温度を下げることを含む方法を提供する。本方法は、ヒト胚性幹細胞の低温保存に使用されることが好ましい。
2008501320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞または幹細胞由来の細胞を凍結する方法であって、細胞懸濁液を提供する工程と、前記細胞懸濁液に氷核形成を実施する工程と、前記幹細胞の長期保存を可能にするのに十分に低い温度まで前記氷核形成細胞懸濁液の温度を下げる工程とを含む方法。
【請求項２】
前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
解凍したとき、前記細胞は、肝細胞、腎細胞、真皮細胞、心血管細胞、神経細胞、骨細胞、膵細胞および生殖細胞からなる群から選択される細胞型に分化することができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
解凍したとき、前記細胞は、腸管上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、心筋細胞様細胞、β様細胞、および毛嚢細胞からなる群から選択される細胞型に分化することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記氷核形成工程は、前記細胞懸濁液の温度を、前記低温活性化工程の終わりにおける温度から、約−１０〜約−１２℃の温度に下げることによって実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記温度は、約−１０．９℃である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記温度は、約−１５／分〜約−５５℃／分の速度で急速に下げられる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記温度は、約−３５／分〜約−３８℃／分の速度で下げられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記氷核形成工程は、前記細胞懸濁液の温度を、約−１１〜約−１３℃の温度に下げることを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞懸濁液の温度は、約−１２．１℃の温度に下げられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞懸濁液の温度は、約−５／分〜約−１５℃／分の速度で下げられる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞懸濁液は、約−９℃／分の速度で下げられる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記氷核形成工程の終わりにおける、前記細胞懸濁液の温度は、約−１２．１℃である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞懸濁液は、前記細胞における適切なシード又は適切な複数のシードの形成を可能にするため、氷核形成が実施される温度に一定期間維持される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記期間は約５分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞懸濁液は、前記氷核形成工程の前に低温活性化工程に付される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記低温活性化工程は、前記細胞懸濁液を、約−４〜約−１２℃の温度に冷却することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記低温活性化工程は、前記細胞懸濁液を約−８℃に冷却することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記低温活性化工程は、約−１℃／分の速度で前記細胞懸濁液を冷却することを含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞懸濁液は、前記低温活性化工程後および／または前記氷核形成工程前に、浸漬工程に付せられる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記浸漬工程は、前記細胞懸濁液を、前記低温活性化工程により達成された最終温度に約５〜約１０分間、維持することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記氷核形成工程後、前記細胞懸濁液の温度は、前記核形成点から凝固点に下げられる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記氷核形成工程後に脱水工程を含み、それによって前記細胞懸濁液の温度が約−３５〜約−３８℃の温度に下げられる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞懸濁液の温度は、約−０．８℃／分の速度で下げられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記氷核形成工程または脱水工程の後で、前記細胞懸濁液の温度は、約−１８０℃の温度に急速に下げられる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞懸濁液は、外因性の生物学的低温防護剤を含まない、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記外因性の生物学的低温防護剤は、血清である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞パラメーターは、解凍後、実質的に変化せず、前記細胞パラメーターは、生存能力および／または適切な刺激を受けて分化する能力を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
解凍したとき、前記細胞懸濁液中の前記細胞集団は、最高９０％の生存率を有する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
解凍したとき、前記細胞は、多分化能を保持しおよび／または未分化の表現型を保持する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
解凍したとき、前記細胞は、非胞性増殖を示す、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
解凍後前記細胞は、Ｏｃｔ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群より選択されるマーカーを保持する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
解凍したとき、前記細胞は、ごくわずかなマーカーＳＳＥＡ−１の保持を示す、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
解凍したとき、前記細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、内胚葉細胞、中胚葉細胞または外胚葉細胞に分化することができる、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも２ヶ月間、凍結保存された細胞が、多分化能を保持する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
解凍したとき、前記細胞は、正常な核型を示す、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
解凍したとき、前記細胞は、正常な増殖速度を示す、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項による方法で凍結された細胞。
【請求項４０】
解凍された細胞であって、請求項１〜３９のいずれか１項による方法で予め凍結されていた解凍細胞。
【請求項４１】
請求項４０に記載の解凍細胞に由来する細胞。
【請求項４２】
前記細胞は、前駆細胞、肝細胞、腎細胞、真皮細胞、心血管細胞、神経細胞、骨細胞、膵細胞および生殖細胞からなる群より選択される、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
幹細胞移植を必要としている被検対象を治療する方法であって、有効量の請求項３９に記載の凍結細胞または請求項４０に記載の解凍細胞を、前記被検対象に投与することを含む方法。
【請求項４４】
幹細胞移植の必要性は、神経変性障害、心臓疾患または糖尿病に起因する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、器官または組織を成長させる方法であって、請求項３９に記載の凍結細胞または請求項４０に記載の解凍細胞を使用することを含む方法。
【請求項４６】
薬学的に許容し得る担体と組み合わせて、請求項３９に記載の凍結細胞または請求項４０に記載の解凍細胞を含む、医薬組成物。
【請求項４７】
幹細胞移植を必要とする病気の治療または予防の薬剤の調製における、請求項３９に記載の凍結細胞または請求項４０に記載の解凍細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、凍結により細胞を保存する方法に関する。より具体的には、本方法は、幹細胞の低温保存に有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景
動物細胞および組織の長期保存は、研究および生物医学分野に広く極めて重要である。細胞および組織の低温保存は、不変の細胞集団を提供するための細胞系の長期保存；および研究または医療目的のための細胞集団の保存に有用である。
【０００３】
動物細胞は、一度、液体窒素温度（−１９６℃）に達すると、永久に保存できると広く信じられている。しかし、凍結処理それ自体が、細胞に即時損傷および長期損傷を来たし、冷却中および解凍中に中間温度帯域（−１５℃〜−６０℃）を横切るとき、細胞に最大の損傷が生じることが十分に証明されている（Ｍａｚｕｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４７：Ｃ１２５−１４２，１９８４）。凍結処理中に細胞に生じる可能性がある、損傷を与える主な物理事象としては、脱水および細胞内氷晶形成などがある。凍結中に、溶質が固相から排斥され、溶液の未凍結部分の濃度が激変する。生体細胞は、脱水して細胞内溶液と細胞外溶液との新たな平衡状態に達することにより、この混乱状態に対処する。冷却速度が速いと、細胞外溶液における化学ポテンシャルが低下する速度は、水が細胞から外に抜け出せる速度よりはるかに速いため、平衡を維持することができない。この不均衡のため、最終的に、細胞にとって致命的な細胞内結氷が観察される結果となる（Ｔｏｎｅｒ，Ｊ．ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓ．，６７：１５８２−１５９３，１９９０）。冷却速度が遅いと、細胞は、長時間にわたって氷点下の温度で高い細胞外濃度に曝され、結果として細胞内高濃度を損なう可能性がある（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０：４１４−４４６，１９５３）。
【０００４】
当該技術分野では、細胞を低温保存する方法にガラス化処理を組み込む試みもあった。ガラス化の目的は、粘稠な溶液または高濃度の溶液を使用することにより、氷晶の形成を避けながら細胞懸濁液の温度を下げることである。この手法は、氷晶の形成を注意深く制御した条件で、もっと濃縮する標準的な凍結方法とは根本的に異なる。ガラス化を組み込む方法は、幾らか有望であったが、回収率が低いの可能性がある。さらに、該方法は、容易に自動化できず、したがって品質管理が困難な可能性がある。もう１つの問題は、ポリエチレングルコール等の化合物が、ガラス化溶液に必要なことである。ガラス化に関するさらなる問題は、使用される容器によって、凍結され得る材料の量が厳しく制限されることである。加えて、一般に使用される「オープンストロー（ｏｐｅｎ  ｓｔｒａｗｓ）」は、凍結材料の微生物交差汚染の可能性を回避することにほとんど効果がない。
【０００５】
ある特定の細胞型に関する低温保存の臨床応用および商用使用は、正常に機能する全ての生細胞のうち、かなりの数を再生できる能力により制限される。ある種の主要細胞型では、細胞生存能力のかなりの喪失が認められる。凍結解凍細胞外傷の例は、肝細胞（Ｂｏｒｅｌ−Ｒｉｎｋｅｓら，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１：２８１−２９２，１９９２）、ブタ角膜（Ｈａｇｅｎａｈ  ａｎｄ  Ｂｏｈｎｋｅ，３０：３９６−４０６，１９９３）、骨髄（Ｃｈａｒａｋら，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１１：１４７−１５４，１９９３）、ブタ大動脈弁（Ｆｅｎｇら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．，６：２５１−２５５，１９９２）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ；   HYPERLINK "http://www.wicell.org/forresearchers" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ、よくある質問と回答−ヒトＥＳ細胞を培養する：よくある質問と回答４および８（ＦＡＱ−Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ：ＦＡＱ  ４＆８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ，１６（１０）：２１８７−２１９４，２００１）の低温保存を経験していた。
【０００６】
臨床上許容し得るｈＥＳＣを産生するための調節要件は、独特の特徴および付随する課題を提示する。たとえば、ｈＥＳＣが日常的な治療用途で有用であるためには、１つのｈＥＳＣソースからマスター・セル・バンク（Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）で細胞を作成して保存することが必要であろう。コンプライアンスは、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ））の第一の使命である、臨床効果の最大化に向けた品質保証および安全性を確実にする。細胞に基づいた治療のための生存可能物質の製造および使用には、適正組織基準（Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＴＰ））および適正製造基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））に基づいた、既存または今後の規定を満たす適当な低温保存方法が不可欠であろう。したがって、有効成分を含み、感作試薬、たとえばある種の動物血清および選択されたタンパク質等が存在せず、外来因子による汚染を最小限に抑えるようにデザインされた条件で実施され、また大きい細胞バンクを作るためのハイスループット処理が容易にできる標準方法が、必要な前提条件である。
【０００７】
低温保存プロトコールは、動物細胞で向上した生存率を達成するために、一般的に凍結防御剤（「ＣＰＡ」）の使用を必要とする。凍結工程における細胞の生存率を高めるための可能性のある添加物として、様々な物質が使用または調査研究されてきた。使用された他の物質としては、糖類、ポリマー、アルコール類およびタンパク質などがある。ＣＰＡは、大雑把に、細胞膜を透過する物質および不透過性の物質という２つの異なるカテゴリーに分けることができる。ＣＰＡが存在するとき、１つの保護機構は、氷点下温度で、イオン性溶質の実濃度が減少することに起因する。この統合的な効果は、ＣＰＡの役割を果たす全ての物質に当てはまる（Ｆａｈｙ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３２：８３７−８５０，１９８０）。しかし、ＣＰＡの添加により、該溶液のイオン性が変化する。凍結溶液の導入により生じる、外部浸透圧の十分に大きい階段状変化に暴露されるとき、組織も無処置の器官も、細胞生存能力低下を示す可能性がある（Ｐｅｇｇ，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：４１１−４１９，１９７２）。加えて、ある種のＣＰＡに長期暴露することは、室温で低濃度であっても、損傷を招く可能性がある（Ｆａｈｙ，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，２７：２４７−２６８，１９９０）。
【０００８】
凍結中および解凍中の細胞損傷および細胞死を減少させるために凍結媒体に日常的に添加されるもう１つの媒体成分は、血清である。しかし、この添加物は、極めて複雑で、多数の因子（既知および未知）を加える可能性があり、これによって、細胞機能が妨害されたり変化したりする可能性がある。他の非透過性保護剤、たとえばエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（Ｋｌｅｂｅ  ａｎｄ  Ｍａｎｃｕｓｏ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，１９：１６７−１７０，１９８３）スクロース、および培地（Ｓｈｉｅｒ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３１：３３６−３３７，１９９５）は、細胞用凍結防御剤としての効果について研究されてきたが、結果は様々であった。
【０００９】
Ｌｉｏｎｅｔｔｉらに付与された米国特許第４，００４，９７５号は、ヒドロキシエチルデンプンおよびジメチルスルフォキシドの溶液中での、遠心分離血液からの白血球の低温保存について開示している。Ｂｒｏｃｋｂａｎｋに付与された米国特許第５，０７１，７４１号およびＣｒｙｏｌｉｆｅに付与された１９９２年５月２９日公開のＰＣＴ  ＷＯ  ９２／０８３４７号は、凍結防御用細胞媒体における、かび由来の多糖類、たとえばアガロースおよびアルギネートの使用について開示している。Ｔａｙｌｏｒに付与された米国特許第５，４０５，７４２号は、血液代替物として、また組織を保存するために、使用するためのデキストラン含有溶液について開示している。
【００１０】
ＰＣＴ  ＷＯ  ９５／０６０６８号は、造血機能を改善し、放射線防護剤の役割を果たすための、多糖類の使用について開示している。ヒツジ精液凍結媒体中におけるアラビアゴム、チェリー樹脂およびアンズ樹脂の使用については、Ｐｌａｔｏｖら（Ｏｖｔｓｅｖｏｄｓｔｖｏ，１０：３８−３９，１９８０，アブストラクト）に開示されている。Ｈｏｌｔｚら（Ｐｒｏｃ．ＦｏｕｒｔｈＩｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｐｒ．Ｐｈｙｓ．Ｆｉｓｈ，１９９１）は、マス精液の低温保存における、糖類、たとえばグルコースおよびスクロースの使用について開示している。Ｈｉｌｌら（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１１１：７３−８３，１９８８）は、遠心分離により洗浄ネズミ血小板を得るためのアラビノガラクタンの使用について開示している。Ｍａｉｓｓｅ（Ａｑｕａｔ．Ｌｉｖｉｎｇ  Ｒｅｓｏｕｒ．，７：２１７−２１９，１９９４）は、マス精子の低温保存に対する、炭水化物、たとえばグルコースおよびマルトースの作用の研究について開示している。動物細胞の低温保存用培地には、ウシ血清と組み合せた等張スクロースが使用されてきた（Ｓｈｉｅｒ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３１：３３６−３３７，１９９５）。
【００１１】
低温保存の分野における長年の調査を考慮しても、細胞を凍結するための代替方法および改良された方法ならびに組成物が、当該技術分野でやはり必要である。ｈＥＳＣに適する方法が特に必要である。ｈＥＳＣは、人体における２００を超える細胞型の全てまたはほぼ全てになる可能性を有する。ｈＥＳＣは、疾患を治療するためならびに損傷した組織および器官を再生するための治癒的価値を大いに有する。しかし、それらの臨床的可能性は、それらが容易にかつ確実に、継代され、凍結され、輸送され、保存され、また使用される能力によって左右される。
【００１２】
生物医学的研究で使用される多くの細胞と同様に、胚性幹細胞は現在、液体窒素浴中に低温保存された状態で保存され、輸送される。しかし、研究室で使用するために該細胞を研究者が解凍するとき、１％未満しか生き残らない。僅かな生存細胞を培養に入れ、新しいコロニーが、実験または治療に有用なほど十分に豊富になる前に、苦労して何週間も世話をしなければならない。生存率が低いため、幹細胞を扱う仕事は、時間および労働集約的になる。さらに、非常に僅かな細胞が、凍結を切り抜けて生きるため、自然選択により、未知の好ましくない方法で、細胞系が変化しているかもしれない。
【００１３】
加えて、ＧＴＰおよびＧＭＰに関する既存および今後の要件を満たし、かつ幹細胞の治癒的有用性に品質保証を提供するためには、有効成分を含み、感作試薬、たとえばある種の動物血清および選択されたタンパク質等が存在せず、外来因子による汚染を最小限に抑えるようにデザインされた条件で実施され、また細胞バンクを作成するためのハイスループット処理が容易にできる、低温保存方法が必要である。
【００１４】
したがって、適当な凍結後／解凍細胞生存能力および幹細胞の治癒的有用性に関する細胞品質を保証するために、幹細胞低温保存のための改良された方法を提供する先行技術の問題を克服することが、本発明の側面である。
【００１５】
資料の検討、法令、材料、装置、論文等々は、本発明の背景を提供するためだけに、この明細書に含まれている。こうした事柄のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成されたり、または本出願の優先日以前に、オーストラリアに存在していた本発明に関連する分野における共通の一般知識であったりしたことは、示唆されたり示されたりしはない。
【発明の開示】
【００１６】
幹細胞は、身体の成熟機能細胞に分化できる能力を有するとして、当該技術分野で周知の原始細胞である。したがって、これらの細胞は、被検対象自身の細胞が不足している、損傷しているまたは単に存在しない病気に罹っている人体の治療に用途があることが提示されている。したがって、置換細胞が必要とされる場合、必要とされる成熟細胞、組織または器官を生じさせるための出発点として幹細胞を使用することが可能である。この筋書きがクリニックで現実になるためには、幹細胞を低温保存する方法を提供することが必要である。
【００１７】
したがって、第１の態様では、本発明は、幹細胞または幹細胞由来の細胞を凍結する方法であって、細胞懸濁液を提供する工程と、細胞懸濁液に氷核形成を実施する工程と、該幹細胞の長期保存を可能にするのに十分に低い温度まで、氷核形成細胞懸濁液の温度を下げる工程とを含む方法を提供する。出願人は、細胞懸濁液の温度を上述の方法で下げることにより、解凍後、増強された生存能力を持つ細胞が提供されることを発見した。
【００１８】
本明細書に記載の低温保存方法は、特に、プログラム可能なフリーザーを使用して容易に実行できる。この自動化手法は一般的に、ＦＤＡ等の権威による登録に必要とされるような規制パッケージの要素である、適正製造基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）の規約遵守が認定される細胞の品質に関して、一貫した結果をもたらす。重要なことは、低温防護剤として外因性生体物質を使用せずに低温保存を実行できることを、本出願人が証明したことである。凍結細胞用液体媒体中に血清が含まれることが多いが、血清の規格化には特有の問題があるため、この生物学的製剤を含む治療薬の登録に際して、困難が生じる可能性がある。この方法は、胚性幹細胞および部分的に分化した胚性幹細胞由来の前駆細胞に特に有利である。より詳細には、本出願は、ヒトＥＳＣを長期間、凍結することができ、また解凍したとき、重要な特徴、たとえば生存能力および多分化能等を保持できることを実証するものである。
【００１９】
また、本発明の本方法で作られた凍結および解凍された細胞、ならびに該細胞を組み入れた医薬組成物、および該細胞を使用した治療方法も、本発明により提供される。
【００２０】
発明の詳細な説明
第１の態様で、本発明は、幹細胞または幹細胞由来の細胞を凍結する方法であって、細胞懸濁液を提供する工程と、細胞懸濁液に氷核形成を実施する工程と、該幹細胞の長期保存を可能にするのに十分に低い温度まで氷核形成細胞懸濁液の温度を下げる工程とを含む方法を提供する。
【００２１】
本出願人は、本方法が、幹細胞を長期間保存するのに驚くほど効果的であることを発見した。本方法は、手動で実施することが可能であるが、凍結プログラムを実行することができるフリーザーを使用して実施することが好ましい。
【００２２】
該細胞の解凍に際して、生存能力および適切な刺激を受けて分化する能力等の多くの細胞パラメーターは、実質的に変わらないことが分かった。このことは、悪影響を及ぼす先行技術に記載の方法（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ，１６（１０）：２１８７−２１９４，２００１；Ｒｉｃｈａｒｄｓら，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．２００４；２２（５）：７７９−８９）と大いに異なる。
【００２３】
低温保存用の出発材料は一般に、研究室のインキュベーターから採取した幹細胞培養である。凍結の準備に関して、酵素的方法または機械的方法のいずれかによって、該細胞を脱凝集させて懸濁液を作ることが可能である（図４参照）。同様に、凍結後継代を機械的に実施することができる（図５参照）。
【００２４】
該細胞を凍結するためまたはさらに継代するために、細胞懸濁液を調製するための標準方法は多数あることを、当業者は理解するであろう。しかし、本方法の好ましい様式では、該細胞は、細胞凝集塊を産生するのに十分な時間、かなりの量のコラゲナーゼに細胞培養または細胞集合体を暴露する工程と、該細胞凝集塊を過剰量のｈＥＳＣ媒体に暴露する工程と、該細胞凝集塊を機械的に破壊して均一な大きさの細胞凝集塊を作成する工程と、該細胞集合体をペレット化する工程と、該細胞を低温防護剤含有溶液中に再懸濁する工程とを含む方法によって準備される。本方法の好ましい様式では、該溶液は、外来の生体物質たとえば血清等が実質的にない。事実、細胞を首尾よく低温保存できることは、本発明の利点である。生物学的製剤が、不明確な物質、たとえば動物血清等を含むかまたはそれと接触していた場合、該生物学的製剤を臨床使用のために登録することは非常に困難である。血清等の物質はまた、細菌およびウイルス等の病原体も含む可能性がある。本方法の好ましい様式では、該溶液は、ＣｒｙｏＳｔｏｒTM  ＣＳ５またはＣｒｙｏＳｔｏｒTM  ＣＳ１０溶液と同じであるか、または類似している。ＣｒｙｏＳｔｏｒTM  ＣＳ５溶液は、最終濃度５％のＤＭＳＯを低温防護剤として含有し、１０％の最終濃度を実現するために、ＤＭＳＯをさらに加えることによってそれ以上に増加することができる。あるいは、最終濃度１０％のＤＭＳＯを既に含有するＣｒｙｏＳｔｏｒTM  ＣＳ１０を使用してもよい。今述べた好ましい凍結溶液は、細胞療法および組織工学の場での使用に関してＦＤＡに認可されている。
【００２５】
氷核形成の先行工程として、該細胞懸濁液を「低温活性化工程」に付してもよい。この工程は一般的に、該懸濁液を、約−４〜約−１２℃の温度に冷却することを含む。好ましくは、低温活性化工程では、該懸濁液を、約−１℃／分の速度で、約−８℃に冷却する。次いで「浸漬」工程が続き、該細胞懸濁液は、低温活性化に使用した温度（一般的に−８℃）に、約５〜約１０分間、維持される。
【００２６】
熱平衡を達成するための「低温活性化工程」に続いて、氷核形成を開始する。氷核形成は、細胞サンプルの温度を核形成点まで下げることによって起こる。該細胞サンプル氷核形成後、温度を核形成点から凝固点に下げる。
【００２７】
プログラム可能なフリーザーを使用して本方法を実行する場合、該氷核形成工程は、該フリーザーに適切な指示を与えることによって実施される。好ましくは、該氷核形成工程は、該細胞懸濁液の温度を、低温活性化工程の終わりの温度から、約−１０〜約−１２℃の温度に下げることによって実施される。より好ましくは、該温度は、約−１０．９℃に下げられる。該温度は一般的に約−１５℃／分〜約−５５℃／分の速度で急速に下げられる。より好ましくは、該速度は約−３５℃／分〜約−３８℃／分である。
【００２８】
本発明の一様式では、該氷核形成工程は、該細胞懸濁液の温度を、約−１１〜約−１３℃の温度に下げることを含む。該温度は、約−１２．１℃の温度に下げることが好ましい。一般的に、温度を下げる速度は、約−５℃／分〜約−１５℃／分である。好ましくは、該速度は−９℃／分である。氷核形成工程の終わりに、該細胞懸濁液の温度は、一般的に約−１２．１℃である。
【００２９】
本方法の別の実施形態において、該氷核形成工程は手動で実施される。プログラム可能なフリーザーを使用する場合、該手動の氷核形成工程は、該フリーザーのプログラムされたシーケンスを適切な時点で停止し、該細胞懸濁液が入っているストローを取り外し、該ストローを液体窒素冷却鉗子と接触させ、該ストローを該フリーザーに戻し、該凍結プログラムを再開するように該フリーザーに指示することにより実施することが可能である。当業者は、氷核形成を手動で実行するための他の方法および装置を確認することができ、その全ては本出願の範囲に含まれる。
【００３０】
手動の氷核形成を調整するための１つの可能なフリーザープログラムを、実施例２に示す。あるいは、氷核形成を、フリーザープログラムにより自動的に実施してもよい。これは、実施例３に記載のプログラムの工程４〜８に記載されているような、フリーザープログラムに、さらなる工程をプログラミングすることによって行うことが可能である。
【００３１】
本方法は、所与のプロセスを少なくとも部分的に完結させることができるように、該細胞懸濁液をしばらくインキュベートさせておく期間を含んでもよいことが理解されるであろう。たとえば、該細胞における適切な単一又は複数のシードの形成を可能にするため、該氷核形成工程に続いて、該細胞懸濁液を氷核形成が実施される温度に維持してもよい。本方法の好ましい様式では、さらに冷却が進められる前に適切なシードが形成できるように、約５分間のゆとりが見込まれている。
【００３２】
該氷核形成工程後に、本方法は、該細胞懸濁液の温度が、約−３５〜約−３８℃の温度に下げられる脱水工程を含んでもよい。この温度低下は、多くの場合、比較的緩徐に実行され、一般的に約−０．８℃／分で実施される。
【００３３】
該氷核形成工程または脱水工程の後、液体窒素で長期分離および保存するために、一般的に、該懸濁液を急速に約−１８０℃の温度までさらに下げる。
【００３４】
理論に制限されることを望まないが、冷却速度が低すぎるとき、高張条件への長期暴露により細胞死が起こることが明示されている。したがって、冷却速度を高めることにより、高張条件への暴露時間は、細胞損傷の付随的な減少とともに減少する。該冷却速度が速すぎる場合、細胞内結氷により細胞死が起こる。したがって、好ましい冷却速度は、細胞内結氷しない最も速い冷却速度と考えられる。
【００３５】
当業者は、本方法が、さらなる温度操作または試薬の添加を含む他の工程を含んでもよいことを理解するであろう。
【００３６】
本発明は、哺乳動物幹細胞の低温保存に特に適用することができる。幹細胞は、他のタイプの細胞と区別される２つの重要な特徴を有する。第１に、幹細胞は、細胞分裂を介して長期にわたって再生する未分化の細胞である。第２は、ある特定の生理的条件または実験条件で、幹細胞を、特別な機能を備えた細胞たとえば心筋細胞または膵臓のインスリン産生細胞になるように誘導できることである。
【００３７】
本発明のより好ましい様式において、該幹細胞は胚性幹細胞であり、これは、胚の内細胞塊から得られる細胞から培養される。胚性幹細胞は多能性であり、体内のほぼ全ての組織になれる潜在能力を有する。このクラスの細胞には、ｉｎ  ｖｉｖｏで等価の細胞型はないようであり、組織培養人工産物であると提唱されている（Ｚｗａｋａ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎによるレビュー、２００５，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１３２（２），２２７−２３３）。胚性幹細胞は、無処置の胚では絶対に見られない多数の特性を示すことが判明している。たとえば、胚性幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで初期胚細胞の特性を保持するが、ｉｎ  ｖｉｖｏで長期自己複製を示す多能性細胞はない。胚細胞は、組織培養するとすぐに、ｉｎ  ｖｉｖｏでは曝されたことがないような多数の外的シグナルに暴露される。ＥＳ細胞は、組織培養条件に順応し、未分化状態で無限に増殖することを可能にする新しい機能を獲得することを示した研究者もいる（Ｂｕｅｈｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，２００３，Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  ＢｉｏｌＳｃｉ  ３５８，１３９７−１４０２；Ｒｏｓｓａｎｔ，２００１，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １９，４７７−４８２；Ｓｍｉｔｈ，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ１７，４３６−４６２）。その上さらに好ましくは、該幹細胞はｈＥＳＣである。本明細書の他所で検討される通り、胚性幹細胞がヒトの疾患を治療するために治療的使用される可能性は大いにある。
【００３８】
本明細書に記載の低温保存方法を実行することにより、先行技術の方法と比較するとき、凍結用および解凍後に、改良された品質の細胞が提供されることを出願人は発見した。本方法の別の様式では、その時まだ生きている細胞数を、４℃の温度に暴露した後の時間の関数としてモニターすることにより、凍結用に準備された細胞の生存能力を測定することが可能である。この測定によって、凍結前に凍結用に準備した直後に生きていた細胞の約９０％より多くが、４℃で１時間後に依然として生きていた（図１２参照）。本方法のもう１つの好ましい様式では、解凍直後に生きていた細胞の約７５％が、４℃で３時間後に依然として生きていた（図１２参照）。
【００３９】
本発明のもう１つの利点は、解凍したとき、細胞が多分化能を保持し、未分化の表現型を保持していることである。図１に示す通り、ｈＥＳＣの解凍後、該細胞は、未分化細胞の特徴を保持していた。該細胞は、非胞性増殖を示し、またＯｃｔ−４、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１を発現した。図６は、この結果をフローサイトメトリーで確認するものであり、多分化能の他のマーカーたとえばＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の保持が証明され、分化マーカーＳＳＥＡ−１の保持はごくわずかであった。
【００４０】
さらに重要なことは、適切な条件で継代したとき、解凍細胞が多分化能を保持できることを出願人が示したことであった。図２は、５代継代後、該細胞がマーカーＯｃｔ−４、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１を保持していたことを示す。図７は、該細胞が、Ｏｃｔ−４、ＴＲＡ１−８１、ＴＲＡ１−６０、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４等のマーカー（これらのマーカーは、細胞の多分化能を示す）を保持していたが、ＳＳＥＡ−１（分化のマーカー）をごくわずか発現することを示す、ｈＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す図である。
【００４１】
本明細書に記載の方法に従って準備し、低温保存した細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、内胚葉細胞、中胚葉細胞または外胚葉細胞に分化できる能力を有する。本発明のより好ましい様式では、該細胞は、肝細胞、腎細胞、真皮細胞、心血管細胞、神経細胞、骨細胞、膵細胞および生殖細胞からなる群より選択される細胞型に分化することができる。最も好ましくは、該細胞は、腸管上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞および毛嚢細胞からなる群より選択される細胞型に分化することができる（図９参照）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化できる能力も、図１０に示されており、ｈＥＳ−３細胞がβ様細胞に分化した。当業者は、細胞を１つまたは複数の培養条件または作因に暴露することにより、幹細胞を要望通りのある特定の系に導く十分な知識を有するであろう。
【００４２】
本発明のさらなる利点は、保存の長さに準じて細胞が感知し得るほど悪化しないことである。図３は、１日間または６日間保存した細胞が、解凍後、同品質であることを示す。加えて、図７は、２ヶ月間保存した細胞が、高品質および多能性のままであることを示す。
【００４３】
細胞型ｈＥＳ−２、ｈＥＳ−３およびｈＥＳ−４の低温保存は、本明細書で実証してきたが、本方法は、胚性幹細胞、より詳細にはヒト胚性幹細胞を含むが、それらに限定されず、より広いクラスの幹細胞に適用できることが提唱される。図６は、ｈＥＳ−２細胞、ｈＥＳ−３細胞およびｈＥＳ−４細胞では、凍結後および解凍後の細胞品質が等価であることを示す。３つの細胞型の細胞遺伝学分析は、正常な核型を示した。下表は、凍結／解凍後ｈＥＳＣの細胞遺伝学分析−凍結／解凍後ｈＥＳ−２、ｈＥＳ−３およびｈＥＳ−４の正常な核型に関するデータを示す表であり、凍結、解凍および再培養後の細胞再生を示す。
【００４４】
【表１】
2008501320.tif 000003
【００４５】
該細胞はまた、図８により裏付けられる通り、低温保存および解凍後に正常な増殖速度も示す。該細胞は、解凍細胞で正常な倍加速度を示す、
【００４６】
本発明の方法はまた、ＥＳ細胞由来の細胞、たとえば前駆細胞、肝細胞、腎細胞、真皮細胞、心血管細胞、神経細胞、骨細胞、膵細胞および生殖細胞などに適用することもできる。幹細胞から低温保存用のより分化した細胞を産生することは、当業者の能力および知識の範囲内である。図１１は、ｈＥＳＣ由来の前駆細胞を低温保存し、解凍し、次いで心筋細胞様細胞に分化させることができることを示す図である。幹細胞を被検対象から回収し、該細胞を低温保存し、細胞品質の実質的な損失なしに、その被検対象または別の被検対象で使用するためにその後いつか該細胞を解凍することが初めて可能になるため、このことは当該技術に大いに貢献する。本件の出願する前は、当技術は、細胞のかなりの損失につながる細胞生存能力の重大な損失を招く結果となった方法に依存していた。少数の細胞は先行技術の低温保存方法を切り抜けて生き残るが、治療に有用な多数の細胞を生じさせるためには、生き残った細胞を複数回の継代を行うことが必要であった。当業者は熟知している通り、細胞ゲノムに突然変異を導入する機会が増加することを考えると、複数回の継代は望ましくない。さらに、生物学的製剤由来の材料を低温防護剤として含むことにより、外来の病原体に暴露する危険が必然的に増加する。
【００４７】
当業者が熟知している通り、幹細胞をより効果的に低温保存できることは、疾患の治療における治療法として、幹細胞をさらに開発する際のカギである。日常的な医療行為における治療法として幹細胞を適切に利用するためには、大きな幹細胞バンクであって、該バンク内の該細胞は、単一細胞集団に由来する、バンクを準備することが必要であろう。医師が、治療で使用するあらゆる幹細胞の起源、安全性および効果を保証されるのは、この手法に限られる。
【００４８】
本方法は、必要とされる温度および冷却速度を実現することができる任意の装置で実行することが可能である。一般的に言えば、専用のプログラム可能な生物学的速度のフリーザーが最適な装置である。代表的なフリーザーは、ＭＣ−０１２  Ｐｌａｎｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｒｅｅｚｅｒ（カタログ番号  Ｋｒｙｏ１０−１６またはＫｒｙｏ  ３６０−１．７）である。コンピューター制御式装置の使用は、高度の再現性を、したがって最小限のバッチ・バッチ変動をもたらす。
【００４９】
本発明の目的上、該細胞懸濁液は、任意の適当な容器内で提供することが可能である。該容器の大きさは、中に入っているサンプルの、本発明の方法を使用した急速凍結が容易になるようなものであってもよい。さらに、該容器は、該容器の外面から、該容器内に入っているサンプルに、冷たさまたは熱さを急速に伝導することが可能な材料で作られている可能性が高い。特に、本発明の実施形態では、該材料はまた、ほぼ−１９０〜−２００℃程度の温度を含むが、これらに限定されず、−１３０℃未満の温度で、凍結サンプルを保存することを可能にする。こうした条件で使用することが可能な代表的な材料は、ポリプロピレンである。ポリプロピレンは、既知の低温保存容器、たとえばクリオチューブ等で使用されてきた。本発明のさらなる実施形態において、該容器の壁の厚さは、本発明の方法を使用して、中に入っているサンプルを急速凍結できるほど十分に薄いであろう。本発明の特定の実施形態で使用することが可能な容器としては、細胞凍結または胚凍結で使用されるストロー等のストローなどが挙げられるが、これらに限定されない。該容器はまた、その両端のヒートシールを含むが、それに限定されず、任意の方法で閉鎖できる。凍結中に、該細胞懸濁液の生物物理学的パラメーターをモニターする必要がないため、容器を閉じて、または閉じないで、凍結処理を実行できることは、本発明の利点である。細胞懸濁液の無菌性を維持するために、該容器を閉じて本方法を実行することが一般に好ましい。
【００５０】
当業者は、細胞の低温保存に必要とされる非常に低い温度に耐えることができるこのような容器を熟知しており、その１例は、ＭＣ−００９  ＣＢＳハイ・セキュリティ・ストロー・ステリル（Ｈｉｇｈ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｓｔｒａｗ  Ｓｔｅｒｉｌｅ）（クリオ・バイオ・システム（Ｃｒｙｏ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）カタログ番号０１４６５１）である。該ストローは、ＣＢＳストロー用手動式シーリング・ユニットＭＣ−０１０  ＳＹＭＳ（Ｃｒｙｏ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号００７２１３）で閉じることが可能である。今述べた代表的なストローは、細胞療法および組織工学の場での使用に関してＦＤＡ認可済みである。
【００５１】
別の態様で、本発明は、本明細書に記載の方法に従って凍結されている細胞である、凍結細胞を提供する。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の方法に従って前もって凍結されていたことを特徴とする、解凍細胞を提供する。該細胞の解凍は、当業者に周知の任意の適当な方法によって遂行することができる。好ましい実施形態では、該細胞懸濁液が入っている該容器を水浴中に沈めることにより、該細胞を急速に３７℃にする。該懸濁液が解凍されたらすぐに、該細胞をペレット化して、任意の適当な媒体で洗浄することが可能である。多くの場合、該細胞をさらに培養するために必要な媒体中に該細胞を再懸濁することは有利であろう。
【００５３】
別の態様において、本発明は、幹細胞移植を必要としている被検対象を治療する方法であって、本明細書に記載の凍結または解凍した細胞の有効量を該被検対象に投与することを含む方法を提供する。幹細胞の投与により治療することが可能な疾患は多数あり、神経変性障害、心臓疾患および糖尿病を含む領域で有望である。
【００５４】
別の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで器官または組織を発達させる方法であって、本明細書に記載の凍結または解凍した幹細胞の使用を含む方法を提供する。幹細胞を使用して、完全な器官、器官の一部、または被検対象にその後移植するための組織を製造することが可能である。たとえば幹細胞を使用して、火傷被害者に使用するための皮膚移植片を作り出すことが可能である。幹細胞はまた、膵臓等の器官全体を作り出すために使用することも可能である。これは、インスリン依存性糖尿病の治療に使用されるであろう。
【００５５】
ＥＳ細胞の治癒的有用性を考えると、本発明の細胞は、医薬組成物の形態で使用されるであろうことは明白であろう。したがって、本発明は、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて、本明細書に記載の凍結細胞または解凍細胞を含む、医薬組成物を提供する。当業者は、該組成物中における該細胞の安定性および生存能力を高めるために、本発明の細胞と組み合わせることが可能な多くの物質を熟知しているであろう。一例として、全体として該組成物のｐＨおよび張性を調節するために、緩衝剤および塩類等の物質を添加してもよい。
【００５６】
別の態様で、本発明は、幹細胞移植を必要とする病気を治療または予防するための薬剤の調製における、本明細書に記載の凍結細胞または解凍細胞の使用を提供する。
【００５７】
次に、本発明で使用される方法の例を、さらに十分に説明する。しかし、当然のことながら、以下の説明は説明するために過ぎず、決して、上述の本発明の一般性に対する限定として受け止めてはならない。
【実施例１】
【００５８】
ｈＥＳＣの準備および低温保存。
本方法は、標準細胞生物学設備（バイオセーフティ・フード、ピペット類、吸引ポンプ、３７℃の５％  ＣＯ2インキュベーター、７０％エタノールスプレー、遠心分離機、試験管、ウォームステージ付き解剖顕微鏡、液体窒素貯蔵容器等々）を有する研究室で実施される。本方法を開始する前に、下記の試薬を準備した：生きているｈＥＳＣコロニー、ｈＥＳＣ培地（ｈＥＳＣ媒体）、リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１４０４０−１３３）、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）ＩＶ（社内で調製した２０ｍｇ／ｍｌストック；セルバ（Ｓｅｒｖａ）カタログ番号１７４５８．０３）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ；シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製品番号Ｄ１４３５／Ｄ２６５０）、およびクリオスターＣＳ５TM低温保存液（ＣＲＹＯＳＴＯＲ  ＣＳ５TM  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（バイオライフ・ソリューソンズ（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）カタログ番号９９−６１０−ＤＶ）。該ｈＥＳＣ媒体は、ウシ血清アルブミン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号０４−００９５）またはヒト血清アルブミン、７８％ノックアウト（ＫｎｏｃｋＯｕｔ）ＤＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号１０８２９−０１８）、１％Ｌ−グルタミン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号２５０３０−０８１）、１％ＮＥＡＡ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号１１１４０−０５０）、および５０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ（シュトラットマン・バイオテック（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）ＡＧ、カタログ番号９５１１０６０）を含む、２０％ノックアウト血清代用液（ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｖｅｍｅｎｔ）から成っていた。
【００５９】
下記の専用ハードウェアは、研究室に備えられていた：ＣＢＳハイ・セキュリティ・ストロー・ステリル（ＣＢＳ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｓｔｒａｗ  Ｓｔｅｒｉｌｅ）（クリオ・バイオ・システム（Ｃｒｙｏ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）カタログ番号０１４６５１）、ＣＢＳストロー用ＳＹＭＳ手動式ユニット（クリオ・バイオ・システム（Ｃｒｙｏ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）カタログ番号００７２１３）、プレナー・バイオロジカル・フリーザー（Ｐｌａｎｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｒｅｅｚｅｒ）（カタログ番号Ｋｒｙｏ  １０−１６またはＫｒｙｏ  ３６０−１．７）。
【００６０】
細胞は、コラゲナーゼＩＶを使用して回収した。簡単に記載すると、ｈＥＳＣが入っている細胞培養容器から培地を吸引し、ＰＢＳ＋ですすいだ。コラゲナーゼＩＶ作用液を細胞培養容器に加え、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１０分間、インキュベートした。培養表面からｈＥＳＣを優しく擦り取り、ｈＥＳＣ媒体を加え該細胞懸濁液を静かに撹拌した。
【００６１】
消化した細胞凝集塊（様々な大きさ）を、ｈＥＳＣ媒体が入っている試験管に移し、さらに脱凝集させて、より一様な細胞凝集塊を作った。次いで遠心分離により、細胞をペレット化させた。
【００６２】
培地を吸引し、各細胞ペレットを凍結溶液中に再懸濁した。凍結溶液中の細胞を、氷上で１０分間維持した。
【００６３】
Ｐ２００を使用して、凍結溶液中の細胞をＣＢＳTMハイ・セキュリティ・ストロー（ＣＢＳTM  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｓｔｒａｗ）に移した。安全栓が、充填手順を通して無菌性が保たれていることを保証する最上部に、各ストローを維持した。ストローの開放端は、あらゆる汚染から保護されていた。負荷したストローの両末端は、該シーリング・ユニットを使用して注意深くシールした。ストローにラベルを貼り、全ての「負荷」ストローがシールされるまで、氷上に維持した。
【００６４】
制御フリーザーの冷凍室が開始温度（＋４℃）に達するとすぐに、ストローをユニットに取り付けた。メインメニューから「実行（Ｒｕｎ）」を選択した。
【００６５】
−８℃での手動式氷核形成の場合、該細胞を−８℃で５分間浸漬した後、液体窒素で冷却した鉗子を該ストローの外側に当てることによって該細胞を氷核形成させた。制御フリーザー・コントロールパネル上の「エンター（Ｅｎｔｅｒ）」を押してプロファイルを開始した。該細胞の「自動」氷核形成を実行する場合、急速冷却傾斜プログラムを使用した（事例プログラムについては、実施例３の表を参照されたい）。
【００６６】
次いで、該ストローを制御フリーザーから取り出し、液体窒素に沈ませ、液体窒素容器キャニスター内に保存した。
【実施例２】
【００６７】
手動式氷核形成を組み入れたフリーザープログラム。
下記のプログラムを、プレーナー・バイオロジカル・レート・フリーザー（Ｐｌａｎｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒ）および含まれる手動式氷核形成工程とともに使用した。
【００６８】
【表２】
2008501320.tif 000004
【実施例３】
【００６９】
自動氷核形成を組み入れたフリーザープログラム。
下記の凍結プログラムを、プレーナー・バイオロジカル・レート・フリーザー（Ｐｌａｎｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒ）、および含まれる自動氷核形成工程とともに使用した。
【００７０】
【表３】
2008501320.tif 000005
【実施例４】
【００７１】
ｈＥＳＣの解凍。
ｈＥＳＣ負荷ストローを、液体窒素から、液体窒素が入っている携帯用容器に移動させた。該ストローを、小さい氷粒しか残っていなくなるまで（１０〜２０秒）３７℃の水浴中で穏やかに回旋させることによって、直ちに解凍した。
【００７２】
該ストローを７０％エタノール中に完全に沈めた。いったん乾燥させ、滅菌の外科用メスまたはハサミを使用して、該ストローの端を、疎水性プラグから約０．５ｃｍ切り取った。該ストローの他端を、シールより上で切り取った。
【００７３】
該ストローの内容物を、３７℃のｈＥＳＣ媒体が入っている円錐形の遠沈管に注入した。次いで、該ストローを追加のｈＥＳＣ媒体ですすいだ。該細胞を１０００ｒｐｍで３分間、遠心分離し、上澄を吸引し、該細胞ペレットを３７℃のｈＥＳＣ媒体中に再懸濁した。その後の培養のための３７℃のｈＥＳＣ媒体が入っている、準備が整った細胞培養容器に、該細胞懸濁液を移した。
【実施例５】
【００７４】
細胞のパラメーターに対する低温保存の作用
凍結および解凍した細胞の一般的品質を示すために、ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、コラゲナーゼＩＶで酵素的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で貯蔵した後、細胞サンプルを解凍して８日間、再培養した。図１は、再生したｈＥＳＣが健康で、頑強かつ未分化（非胞性および免疫陽性）の細胞増殖であったことを示し、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられる。
【００７５】
研究室およびクリニックで有用なためには、該低温保存方法が、複数回の継代を通じて維持されるべき細胞の能力に影響を及ぼさなかったことを示すことが必要であった。簡単に記載すると、ｈＥＳＣコロニーを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト・フィーダーで培養し、コラゲナーゼＩＶで酵素的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で６日間、貯蔵した後、細胞サンプルを解凍して、５代継代が終わるまで再培養した。図２の顕微鏡写真から、ｈＥＳＣコロニーは、健康で、頑強および未分化の（非胞性および免疫陽性）細胞増殖を含んでいたことが分かり、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられる。
【００７６】
該低温保存方法を使用して凍結したとき、低温保存の期間は、細胞に悪影響を及ぼさなかったことを証明するために、ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、密閉されているストローに入っている、コラゲナーゼＩＶで酵素的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れ、凍結させて、短期間（１日）および長期間（６日）保存した。液体窒素中で１日間または６日間、保存した後、細胞サンプルを解凍して１１日間、再培養した。図３は、再生したｈＥＳＣは健康で、頑強かつ未分化／非胞性の細胞増殖を含むことを示し、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられた。図７は、２ヶ月以上保存した細胞が、高品質で多能性のままであったことを示し、本低温保存方法を使用した長期保存の効果が確認される。
【００７７】
本発明の方法と組み合わせた機械的細胞継代の効果もまた、評価した。ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、機械的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で保存した後、細胞サンプルを解凍し、１５日間、再培養した。図４は、再生したｈＥＳＣが、健康で、頑強かつ未分化／非胞性であったことを示し、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられる。
【００７８】
図５は、機械的継代の有用性をさらに裏付ける図である。ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、コラゲナーゼＩＶで酵素的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で保存した後、細胞サンプルを解凍し、機械的トランスファーを使用して、１代継代が終わるまで再培養した。明らかに、再生したｈＥＳＣは健康で、頑強かつ未分化の（免疫陽性）増殖を示し、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられる。
【００７９】
機械的脱凝集と組み合わせた複数回の継代の影響を評価した。ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、機械的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で保存した後、細胞サンプルを解凍し、機械的トランスファーを再度使用して５代継代が終わるまで再培養した。５代継代後培養第７日に、免疫組織化学試験を実施した。明らかに、再生したｈＥＳＣは健康で、頑強かつ未分化（免疫陽性）の細胞増殖を示し、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられる（図６参照）。
【００８０】
図７は、該低温保存方法が、分化関連細胞のマーカーの発現に影響を及ぼさないことをさらに示す図である。ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、機械的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で保存した後、細胞サンプルを解凍し、再培養した。ネガティブコントロール（すなわちアイソタイプ抗体標識；左側緑色、アウトライン型プロット）と比べて、ほとんどの細胞は、高水準のＯｃｔ−４発現（〜９０％；ピンク色、塗りつぶし）、ＴＲＡ１−６０発現（〜９０％；ピンク色、塗りつぶし）、ＴＲＡ１−８１発現（〜９０；青色、アウトライン型）、ＳＳＥＡ−３発現（６０％；ピンク色、塗りつぶし）、ＳＳＥＡ−４発現（〜７０％；ピンク色、塗りつぶし）、およびごくわずかなＳＳＥＡ−１発現（〜５％；ピンク色塗りつぶし）を持続し、未分化のｈＥＳＣ増殖を示した。明らかに、データは、未分化（免疫陽性）の細胞増殖を含むｈＥＳＣ再生を支持し、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられる。
【００８１】
ｈＥＳＣの増殖速度に及ぼす凍結および解凍の影響を調べた。ｈＥＳ−２細胞を、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、コラゲナーゼＩＶで酵素的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で保存した後、細胞サンプルを解凍し、９代を超える継代が終わるまで再培養した。培養の最後の週の対数増殖期の間ずっと生細胞数を確認した。コラゲナーゼＩＶを使用して細胞を毎日回収し、倍加時間の算出および細胞数と時間のグラフとしてのプロッティングのために、トリパンブルー色素排除法で生細胞数を決定した。全ての試験で、培養は高い細胞生存能力を含み、試験期間内に集密に達した。図８に示したデータから、正常な増殖を含むｈＥＳＣ再生が確認され、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられる。
【００８２】
細胞核型に及ぼす凍結および解凍の影響を調べた。簡単に記載すると、ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、機械的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で保存した後、細胞サンプルを解凍し、最小限５代の継代が終わるまで再培養して回収した。正常な細胞核型を、ギムザ染色された分裂中期スプレッドを評価することよって測定し、使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられた。反復試験は、並行して実施した別個の細胞培養を示す。
【００８３】
図９は、本方法で保存されたｈＥＳＣは、多分化能を維持しているため、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化し、したがって有用クリニックで有用であろうというさらなる証拠を提示する図である。ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ媒体中のヒト線維芽細胞フィーダー細胞で培養し、機械的に脱凝集させ、密閉されているストローに入れて凍結させた。液体窒素中で保存した後、細胞サンプルを解凍し、再培養し、回収して、奇形腫を生じさせるために重症複合型免疫不全症マウスの精巣に移植した。組織学的分析は、腫瘍が、腸管上皮（内胚葉）、軟骨および骨（中胚葉）、および毛嚢（外胚葉）等の、３胚葉の全ての分化した組織を含むことを示し；ｈＥＳＣ多分化能および使用した低温保存プロトコールの効果が裏付けられた。
【００８４】
解凍したｈＥＳＣのＩｎ  ｖｉｔｒｏ分化を試験した。ｈＥＳ−３細胞を解凍し、４代継代が終わるまで増殖させた。次いで、該細胞を、３６日最適化β−細胞分化プロトコールに委ね、第２０日に中間マーカー遺伝子ｐｄｘ−１について（左パネル）、また第３６日に培地中へのＣ−ペプチド放出について（右パネル）、スクリーニングした。総合すると、図１０に示したデータは、解凍後にβ様細胞等の分化した細胞型に転換され得る、ｈＥＳＣの保存のために使用した低温保存プロトコールの効果を裏づけるものである。
【００８５】
本方法をｈＥＳＣ由来の細胞に利用できることを示すために、ｈＥＳ−３由来の胚葉体を酵素で消化し、脱凝集させる前駆細胞を、２つのサンプル群に分け、密閉されているストロー内の別バッチの凍結媒体に入れて凍結させた。液体窒素中で８日間、保存した後、細胞サンプルを解凍し、計数し、プレーティングして方向付け分化により活動性の心筋細胞へと培養する。重要なことは、凍結／解凍後に、細胞の大半が付着し、５日間の培養後、拍動している心筋細胞がはっきり見えたことである。総合すると、図１１に示したデータは、心筋細胞様細胞等の分化した細胞に転換され得る、ｈＥＳＣ由来の前駆細胞の保存のために使用した低温保存プロトコールの効果を裏付けるものである。
【００８６】
凍結用に細胞を準備する効果は、明らかに本方法の重要な特徴である。この効果を、ｈＥＳＣ媒体中のマウス線維芽細胞フィーダー細胞でｈＥＳ−２細胞を培養し、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）ＩＶで酵素的に脱凝集させ、３時間にわたって４℃の低温保存媒体中に懸濁させることによって評価した。サンプルを、２０分毎にストックから採取し、トリプシン処理し、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）色素排除方法を使用して計数した。図１２に示すデータは、測定した時間の経過とともに、徐々にではあるが許容し得る、生細胞の緩徐な減少、および対応する生存できない細胞増加を示す。
【００８７】
本明細書に記載の様々な方法および組成物に、多くの日常的な変化を加えてもよいことは当業者には明白であろう。こうした変化は、本出願の範囲内に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】培養の第８日における凍結／解凍後ｈＥＳＣ再生を示す図である。凍結／解凍後ｈＥＳ−２細胞の明視野画像ならびにＯｃｔ−４、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１標識の代表的な顕微鏡写真は、凍結、解凍および再培養後の再生を示す。左右のパネルは、反復培養を表す。
【図２】複数回の継代が終わるまで維持した凍結／解凍後ｈＥＳＣ培養を示す図である。凍結／解凍後ｈＥＳ−２細胞の明視野画像（左右のパネルは、反復培養を表す。）ならびにＯｃｔ−４、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１標識の代表的な顕微鏡写真は、凍結、解凍および再培養後の再生を示す。
【図３】短期またはより長期の低温保存後の、凍結／解凍後ｈＥＳＣ再生を示す図である。凍結／解凍前後のｈＥＳ−２細胞の代表的な顕微鏡写真は、細胞凍結、解凍および再培養後の再生を示す。左右のパネルは、反復培養を表す。
【図４】機械的細胞継代を伴う凍結／解凍後ｈＥＳＣ再生を示す図である。凍結／解凍前後のｈＥＳ−２細胞の代表的な顕微鏡写真は、細胞凍結、解凍および再培養後の再生を示す。パネルは、反復培養を表す。
【図５】機械的細胞継代を伴う凍結／解凍後ｈＥＳＣ再生を示す図である。凍結／解凍後ｈＥＳ−２細胞の代表的な顕微鏡写真は、凍結、解凍および再培養後のＧＣＴＭ−２、Ｏｃｔ−４およびＴＲＡ１−８１標識を表す。
【図６】複数回の継代が終わるまで維持した多数のｈＥＳＣ系の、凍結／解凍後再生を示す図である。凍結／解凍後ｈＥＳ−２、ｈＥＳ−３、およびｈＥＳ−４細胞のＧＣＴＭ−２、Ｏｃｔ−４およびＴＲＡ１−８１標識の代表的な顕微鏡写真は、細胞凍結、解凍および再培養後の再生を表す。
【図７】液体窒素中で２ヶ月保存した後の、凍結／解凍後ｈＥＳＣ再生のフローサイトメトリー分析を示す図である。フローサイトメトリーのゲート事象から導かれた代表的なヒストグラム・プロットは、凍結、解凍および再培養後のｈＥＳ−２細胞の、細胞数（Ｙ−軸）ならびにＯｃｔ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＳＳＥＡ−１標識（Ｘ−軸）を示す。
【図８】凍結／解凍後ｈＥＳＣの増殖速度の測定を示す図である。凍結／解凍後ｈＥＳＣの代表的な増殖プロフィールは、凍結、解凍および再培養後、倍加速度が正常な再生を示す（試験１：黒四角／□、ｔｄ＝３５時間；試験２：黒三角／Δ、ｔｄ＝３１時間）。生細胞数は、塗りつぶした符号で表し、また全細胞の％生存率は、アウトライン型の符号により計算される。各点は、３つの測定値の平均値(標準誤差（ＳＥＭ）を表す。各プロフィールは、反復試験を表す。
【図９】凍結／解凍後ｈＥＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ分化を表す図である。代表的な顕微鏡写真は、凍結、解凍および再培養後のｈＥＳ−２細胞群の異種移植から得られた、奇形腫切片を表す。
【図１０】凍結／解凍後ｈＥＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化を示す図である。代表的なデータは、ｈＥＳＣの凍結／解凍後分化を表す。
【図１１】分化したｈＥＳＣ凍結／解凍後再生を示す図である。凍結／解凍後の代表的なデータは、心筋細胞分化プロトコールによるｈＥＳＣからの胚葉体（ＥＢ）の形成によって導かれた、分化した細胞の生存率を表す。
【図１２】凍結前ｈＥＳＣ生存能力を維持するための、低温保存媒体の効果を示す図である。ｈＥＳＣの代表的なプロファイリングは、低温保存媒体中、４℃で保存中の、経時的な（０〜３時間）生存能力を表す。データは、生細胞数および生存できない細胞数として示してあり、別々の３つの試験から得たものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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