(57)【要約】  本発明は、トリプトファンの少なくとも１つの生体内分解産物の濃度を測定するステップを含み、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための方法に関する。さらに、本発明は、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための予測マーカーとしての前記値の使用と、前記値を検出するための手段を含むキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人から得られた全血、血清、血漿、尿、唾液、およびＣＳＦから成る群から選択された体液中のトリプトファンおよび／またはトリプトファンの少なくとも１つの生体内分解産物の濃度を測定するステップと、精神医学的状態を評価するステップとを含む、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための方法。
【請求項２】
トリプトファンの分解産物は、３−ヒドロキシキヌレニン、キノリン酸、メラトニン、セロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸、キヌレン酸、およびキヌレニンから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液中のキヌレン酸の濃度の値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより神経保護比を決定するステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
うつ病を伴うことのある精神医学的状態を有する個人は、約０から約１８までの体液中の神経保護比により特徴付けられる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記体液中のキヌレン酸の濃度の二乗値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより神経保護指数を決定するステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
うつ病を伴うことのある精神医学的状態を有する個人は、約０から約７００までの神経保護指数により特徴付けられる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記体液中の３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸の濃度の値で割ることにより比を決定するステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記体液中の３−ヒドロキシキヌレニンの濃度×１０００の値をトリプトファンの濃度の値で割ることにより比を決定するステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項９】
うつ病を伴うことのある精神医学的状態を有する個人は約２またはそれより大きな比により特徴付けられる請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
うつ病を伴うことのある精神医学的状態はアルツハイマー病（ＡＤ）である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
キヌレン酸の濃度と、神経保護比と、体液中の３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸またはトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比と、体液の神経保護指数とを含む群から選択された少なくとも２つの値を組み合わせるステップを含む、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための方法。
【請求項１２】
体液中のキヌレン酸の濃度の値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより決定された神経保護比の、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための予測マーカーとしての使用。
【請求項１３】
体液中のキヌレン酸の濃度の二乗値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより決定された神経保護指数の、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための予測マーカーとしての使用。
【請求項１４】
体液中の３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸またはトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比の、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための予測マーカーとしての使用。
【請求項１５】
キヌレン酸の濃度と、神経保護比と、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸またはトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比と、体液の神経保護指数とを含む群から選択された少なくとも２つの値の組み合わせの、うつ病を伴うことのある精神医学的状態の検出のための予測マーカーとしての使用。
【請求項１６】
請求項１から１１の何れか一項に記載の方法を行うための手段を含むキット。
【請求項１７】
体液中のキヌレン酸および／またはキヌレニンおよび／または３−ヒドロキシキヌレニンおよび／またはトリプトファンの濃度を検出するための手段を含む、精神医学的状態を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプトファンの少なくとも１つの生体内分解産物の濃度を測定するステップを含み、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための方法に関する。さらに、本発明は、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための予測マーカーとしての前記値の使用と、前記値を検出するための手段を含むキットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
うつ病は、欧州において女性で１４．１％、男性で８．６％、全体として１２．３％の発生率を有する主な精神障害である（Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＪＲ，Ｂｅｅｋｍａｎ  ＡＴ，Ｄｅｗｅｙ  ＭＥ，Ｈｏｏｉｊｅｒ  Ｃ，１９９９，Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ．Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｏｌｄｅｒ  ｐｅｏｐｌｅ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；１７４：３１２−３２１）。地域社会においてそして従業員の間で、診断されていないうつ病の症例がある。アメリカでは、２０人の従業員のうち１人がうつ病をいつ経験してもおかしくない。うつ病は、未治療のまま放置すると、結果として、生産性の低下および病気欠勤日の増加につながる。国立精神衛生協会によれば、アメリカの従業員たちは未処置のうつ病が原因で毎年およそ３００万日間欠勤していた。これは、糖尿病、高血圧、および関節炎のような他の身体的疾患の従業員を超えている（Ｂｕｒｎｓ  Ｈ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｐｒｉｌ，２００４）。
【０００３】
地域社会における診断されていないまたは診断不十分なうつ病に関する課題を解決するために、訪問看護師たちにＰＲＩＭＥ−ＭＤ検査またはＰＤＩ−２９検査等の箇条書き形式を用いて問診を行うよう命じた。ＰＲＩＭＥ−ＭＤ検査およびＰＤＩ−２９検査のどちらも人の心理状態を評価するために作成されたものである。ＰＲＩＭＥ−ＭＤの感度が４１．７％、特異度が８３％であるのに対して、より優れた検査であると考えられているＰＤＩ−２９検査では感度が７３．６％に、特異度が５９％に達する（Ｐｒｅｖｉｌｌｅ  Ｍ，Ｃｏｔｅ  Ｇ，Ｂｏｙｅｒ  Ｒ，Ｈｅｂｅｒｔ  Ｒ（２００４）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｘｉｅｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｂｙ  ｈｏｍｅ  ｃａｒｅ  ｎｕｒｓｅｓ．Ａｇｉｎｇ  Ｍｅｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ；８（５）：４００−４０９）。
【０００４】
うつ病における神経化学物質の役割に関する説がある。うつ病の病態生理学において重要であると分かった神経化学物質のグループがモノアミンであり、１９６０年代以来提唱されていた（Ｃｏｐｐｅｎ  Ａ，１９６９，Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ；７２（２）：１７３−１８０）。さらに、トリプトファンがモノアミンオキシダーゼ阻害薬つまり抗うつ薬の効果を増加させることが分かった（Ｃｏｐｐｅｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｎｏｇｕｅｒａ  Ｒ，１９７０，Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ；１（７６５６）：１１１１）。数年後、セロトニン（５ＨＴ）の役割が情動障害における病因論で提唱された（Ｃｏｐｐｅｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｗｏｏｋ  Ｋ，１９８２，５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４：２４９−２５８）。
【０００５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は最もよくあるヒト脳の神経変性疾患である。特に、ＡＤの初期において、自覚的認知障害を伴ううつ病（いわゆるうつ病による仮性認知症または認知症症候群）とＡＤとを区別することが重要であるが困難とされる（Ｔｅｋｉｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｌ．（２００１）．Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｓｔ  ７，２５２−２５９）。ＡＤ患者においてうつ病の有病率が１５〜５０％であり（Ｒｏｖｎｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｂｒｏａｄｈｅａｄ，Ｊ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｍ．，Ｃａｒｓｏｎ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｆｏｌｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｆ．（１９８９）．Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １４６，３５０−３５３．；Ｍｉｇｌｉｏｒｅｌｌｉ，Ｒ．，Ｔｅｓｏｎ，Ａ．，Ｓａｂｅ，Ｌ．，Ｐｅｔｒａｃｃｈｉ，Ｍ．，Ｌｅｉｇｕａｒｄａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｔａｒｋｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｅ．（１９９５）．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｈｙｍｉａ  ａｎｄ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １５２，３７−４４）、数人の著者により、うつ症状がＡＤの症状発現前段階の一部であると提言された（Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｆｒａｔｉｇｌｉｏｎｉ，Ｌ．，Ｆｏｒｓｅｌｌ，Ｙ．，Ｗｉｎｂｌａｄ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｂａｃｋｍａｎ，Ｌ．（１９９９）．Ｔｈｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ＡＤ：ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５３，１９９８−２００２．；Ｖｉｓｓｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｖｅｒｈｅｙ，Ｆ．Ｒ．，Ｐｏｎｄｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｋｅｓｔｅｒ，Ａ．，ａｎｄ  Ｊｏｌｌｅｓ，Ｊ．（２０００）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．４８，４７９−４８４．）。
【０００６】
セロトニンは、気分を良好とするために脳に必要であり、脳のための増殖因子であり、トリプトファンから合成される神経化学物質である。トリプトファンは、食物からのそして体内のアミノ酸プールからのアミノ酸である。トリプトファンは、肺、白血球、胎盤、および脳中に存在している酵素であるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼにより部分的に分解され（Ｈｅｙｅｓ  ＭＰ，Ｓａｔｉｏ  Ｋ，Ｍａｒｋｅｙ  ＳＰ，１９９２，Ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｃｏｎｖｅｒｔ  Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．；２８３（３）：６３３−６３５；Ｍｅｌｌｏｒ  ＡＬ  ａｎｄ  Ｍｕｎｎ  ＤＨ，１９９９，Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ；２０（１０）：４６９−４７３）、また、トリプトファンは、トリプトファンジオキシゲナーゼにより肝臓で部分的に分解される。インドールアミン−２，３−ジゴキシゲナーゼを介したトリプトファン異化経路またはキヌレニン経路が血液中および脳中の両方に存在し、脳キヌレニンの６０％は末梢血から生じる（Ｇａｌ  ＥＭ，Ｓｈｅｒｍａｎ  ＡＤ，１９８０，Ｌ−Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ；５（３）：２２３−２３９）。
【０００７】
トリプトファンがキヌレニン経路を介して分解されるとき、次の産物となるのは、トリプトファンの最初の代謝産物であるキヌレニンである（Ｂｅｎｄｅｒ  ＤＡ，１９８９，Ｔｈｅ  ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｉｎ  ＴＷ  Ｓｔｏｎｅ（ｅｄ）．Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅｓ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：３−３８）。このキヌレニンはさらに２つの経路：（１）神経を保護するキヌレン酸および（２）神経を変性させる３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、ヒドロキシアントラニル酸、およびキノリン酸に分解される（Ｃｈｉａｒｕｇｉ  Ａ，Ｃａｌｖａｎｉ  Ｍ，Ｍｅｌｉ  Ｅ，Ｔｒａｇｇｉａｉ  Ｅ，Ｍｏｒｏｎｉ  Ｆ，２００１，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ；１２０（１−２）：１９０−１９８）。通常は、キノリン酸の形成の方が速く、キヌレン酸はキノリン酸に対して反作用的な保護的な役割を有する（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＭＮ  ａｎｄ  Ｓｔｏｎｅ  ＴＷ，１９８２，Ａｎ  ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ  ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｃｉｔａｎｔ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．；２４７（１）：１８４−１８７）。上記の証拠に基づき、神経変性経路、神経保護経路の不均衡により人が慢性的にうつ状態になるという仮説が提唱された（Ｍｙｉｎｔ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ＹＫ，２００３，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＩＤＯ：ａ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ；６１（５−６）：５１９−５２５）。
【０００８】
神経科学の分野の科学者たちが大うつ病の病因論的要因を見つけ出そうとしたが、単一の要因は見つからず、うつ病は、遺伝的または先天的要因と精神的ストレスおよび癌等のある種の慢性疾患等の環境要因との両方により引き起こされる疾患と考えられている。さらに、生化学的診断マーカーについて調査されたが、効率的なバイオマーカーは見つからなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の基礎となる課題は、低分子量の生化学的マーカーを使用して精神医学的状態を検出する新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記技術的課題の解決は請求項に特徴付けられた実施形態により達成される。
【００１１】
特に、本発明は、検査されている個人から得られた血漿試料中の、トリプトファンの少なくとも１つの生体内分解産物、好ましくは、３−ヒドロキシキヌレニン、キノリン酸、メラトニン、セロトニン、５−ヒドロキシインドール酢酸、キヌレン酸、および／またはキヌレニンの濃度を測定するステップと、精神医学的状態を評価するステップとを含む、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための方法に関する。
【００１２】
本明細書で用いられる用語「トリプトファンの分解産物」にはトリプトファンもまた含まれる。この血漿試料は、当技術分野において知られる任意の方法により得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、終夜絶食した患者の早朝の血液試料をヘパリン処理済チューブ中に採取する。血漿は、前記ヘパリン処理済チューブを遠心分離し、上清となる血漿画分を分離することにより得られる。さらに好ましい実施形態において、トリプトファンの少なくとも１つの生体内分解産物の濃度を測定する前に、血漿は、最も好ましくは−７０℃で凍結される。血漿の代わりに、全血、血清、尿、唾液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）等の任意の他の体液源を本発明に用いることができる。これらの体液は、当技術分野において知られる方法により得ることができる。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、上記方法は、血漿試料中のキヌレニン濃度を測定するステップをさらに含む。
【００１４】
本発明の他の好ましい実施形態において、上記方法は、血漿試料中の３−ヒドロキシキヌレニン濃度を測定するステップをさらに含む。
【００１５】
血漿試料等の体液中のトリプトファンならびに／または３−ヒドロキシキヌレニンおよび／もしくはキヌレン酸および／もしくはキヌレニン等の分解産物の濃度の測定は当技術分野において知られる任意の方法により実施することができる。本発明の好ましい実施形態において、分析物、特にトリプトファンの分解産物の濃度の測定は高速液体クロマトグラフィーを用いて、さらに好ましい実施形態においてはＵＶ検出器および／または蛍光検出器および／または免疫アッセイおよび／またはリガンド結合アッセイを用いて実施する。本発明の好ましい実施形態において、分析物は、リガンド結合アッセイ、たとえば抗体に基づく免疫アッセイまたは受容体結合アッセイまたは酵素結合アッセイまたはそれらのアッセイの１つまたは複数の拮抗的なタイプのものにより決定する。
【００１６】
本発明の他の実施形態において、トリプトファンの少なくとも１つの生体内分解産物、好ましくは３−ヒドロキシキヌレニン、キヌレン酸、および／またはキヌレニンの濃度を測定する前に、試料からたとえば実質的にタンパク質を除去する（すべてのタンパク質を除去する）。
【００１７】
血液試料中のキヌレン酸およびキヌレニンの濃度を測定した後、前記血漿試料中のキヌレン酸の濃度の値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより神経保護比を決定してもよい（キヌレン酸値／キヌレニン値）。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を有する個人は、約０から約１８まで、より好ましくは約３から約１７まで、最も好ましくは約６から約１６．３までの血漿中の神経保護比により特徴付けられる。
【００１９】
さらに、血液試料中のキヌレン酸およびキヌレニンの濃度を測定した後、前記血漿試料中のキヌレン酸の濃度の二乗値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより神経保護指数を決定してもよい（キヌレン酸値２／キヌレニン値）。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を有する個人は、約０から約７００まで、より好ましくは約１００から約６００まで、最も好ましくは約２００から約４７３までの血漿中の神経保護指数により特徴付けられる。
【００２１】
本発明の他の実施形態において、血液試料中のキヌレン酸および３−ヒドロキシキヌレニンの濃度を測定した後、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸またはトリプトファンの濃度の値で割ることにより比（「神経変性比」）を決定してもよい（３−ヒドロキシキヌレニン値／キヌレン酸値または３−ヒドロキシキヌレニン値／トリプトファン値）。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸の濃度の値で割ることにより決定された比は健康な個人と比較すると著しく増加し、うつ病を伴うことのある精神医学的状態は好ましくはアルツハイマー病（ＡＤ）である。
【００２３】
本発明の他の好ましい実施形態において、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を有する個人は、血漿中の３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸またはトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比により特徴付けられる。たとえばこの比が約２またはそれより大きい場合、分析物が同一ユニットにおいて提供されたものであれば、これはアルツハイマー病の徴候と考えられる。分析物が同一ユニットにおいて提供されたものであれば、血漿中の係数１０００を掛けた３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値、すなわち、３−ＨＫに１０００を掛ける、をトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比にも同じことが当てはまる（３−ＨＫ×１０００／ＴＲＰ）。
【００２４】
本発明によれば、たとえばトリプトファン、３−ヒドロキシキヌレニン、キヌレニン、およびキヌレン酸を入力値として使用し、解釈上同様の結果をもたらす当技術分野で知られている任意の数式を使用してもよい。
【００２５】
本発明は、さらに、前記精神医学的状態を検出する特異度および／または感度を改善するために、キヌレン酸の濃度と、神経保護比と、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸の濃度の値で割ることにより決定された比と、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比と、血漿試料の神経保護指数とから成る群から選択された少なくとも２つの値を組み合わせるステップを含む、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出する方法に関する。
【００２６】
トリプトファンの少なくとも１つの生体内分解産物の濃度の測定と組み合わせて、少なくとも他の１つの神経変性、神経保護、または神経栄養性マーカー（複数可）の測定を含む、うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための方法もまた本発明の一部である。
【００２７】
さらに、本発明は、（ｉ）うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するために予測マーカーとしてキヌレン酸を使用することならびに／または（ｉｉ）血漿試料中のキヌレン酸の濃度の値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより決定された神経保護比をうつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するために予測マーカーとして使用することならびに／または（ｉｉｉ）うつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するために３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸の濃度の値で割ることにより決定された比および／もしくは（ｉｖ）３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比を使用することならびに／または（ｖ）血漿試料中のキヌレン酸の濃度の二乗値をキヌレニンの濃度の値で割ることにより決定された神経保護指数をうつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するために予測マーカーとして使用することに関する。
【００２８】
本発明はまた、キヌレン酸の濃度と、神経保護比と、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸の濃度の値で割ることにより決定された比と、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比と、血漿の神経保護指数とから成る群から選択された少なくとも２つの値をうつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための予測マーカーとして組み合わせて使用することに関する。
【００２９】
本発明はまた、キヌレン酸の濃度、神経保護比、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸の濃度の値で割ることにより決定された比、血漿の神経保護指数、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比、および／または少なくとも他の１つの神経保護、神経変性、もしくは神経栄養性マーカー（複数可）を組み合わせてうつ病を伴うことのある精神医学的状態を検出するための予測マーカーとして使用することにも関する。
【００３０】
生物学的マーカーまたは予測マーカーとして用いられる因子、好ましくは血漿中のキヌレン酸の濃度、神経保護比、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をキヌレン酸の濃度の値で割ることにより決定された比、神経保護指数、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度の値をトリプトファンの濃度の値で割ることにより決定された比、またはこれらの組合せがうつ病を伴うことのある精神医学的状態を個人が有するかどうかという問題に関する指標であるということをここに用いられる用語「予測マーカー」または「生物学的マーカー」は意味する。
【００３１】
本発明はまた、全血、血清、血漿、尿、唾液等の体液中のトリプトファン変性産物の濃度を検出するための手段を含む、精神医学的状態を検出するためのキットに関し、ＣＳＦもまた本発明で用いることができる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、前記血漿試料中のキヌレン酸および／またはキヌレニンおよび／または３−ヒドロキシキヌレニンおよび／またはトリプトファンの濃度を検出するための手段をキットは含む。
【００３３】
本発明はまた、前記バイオマーカーのうち任意のものを変更する治療的介入に関する。
【００３４】
表１は、実施例１の結果を示す。（性別；Ｍ＝男性、Ｆ＝女性；年齢（歳）；ＴＹＲ（チロシン、マイクロモル／リットル）；ＶＡＬ（バリン、マイクロモル／リットル）；ＴＲＰ（トリプトファン、マイクロモル／リットル）；ＰＨＥ（フェニルアラニン、マイクロモル／リットル）；ＩＬＥ（イソロイシン、マイクロモル／リットル）；ＬＥＵ（ロイシン、マイクロモル／リットル）；Ｋｙｎ（キヌレニン、マイクロモル／リットル）；ＫＡ（キヌレン酸、ナノモル／リットル）；ＴＲＰｉ；（トリプトファン指数＝１００×トリプトファン／｛ＴＹＲ＋ＶＡＬ＋ＰＨＥ＋ＩＬＥ＋ＬＥＵ｝）；ＫＹＮ／ＴＲＰ（トリプトファン分解指数＝キヌレニン値／トリプトファン値）；ＫＡＫＹＮ（神経保護比＝１０００×キヌレン酸値（マイクロモル／リットル）／キヌレニン値（マイクロモル／リットル））；ＰＲＯｉ（神経保護指数＝１，０００，０００キヌレン酸値（マイクロモル／リットル）×キヌレン酸値（マイクロモル／リットル）／キヌレニン値（マイクロモル／リットル）））
表２は、患者と対照被験者の群特性を示す。ＡＤ＝アルツハイマー病を有する患者；ＭＤ＝大うつ病を有する患者；ＳＣＩ：自覚的認知障害を有する健康な人；ＭＭＳＥ＝ミニメンタルステート検査。
【００３５】
表３は移動相およびグラジエント条件を示す。溶媒Ａ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８；溶媒Ｂ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５６；溶媒Ｃ：１００％のアセトニトリル；溶媒Ｄ：１００％のメタノール。
【００３６】
表４は、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者、大うつ病（ＭＤ）を有する患者、および自覚的認知障害（ＳＣＩ）を有する健康な人におけるトリプトファン（ＴＲＰ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、および３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）の血清レベルを示す。調査した３つの群間の差異を試験するためにノンパラメトリッククラスカルウォリスの検定を用いた。３−ＨＫレベルおよび３−ＨＫ／ＴＲＰ比に関する有意差についてマンホイットニーの検定により確認した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下の実施例により、実施例に限定されることなく本発明をさらに説明することとする。
【００３８】
実施例
実施例１：ヒト血漿中の神経保護指数、神経保護比、および血漿キヌレニン濃度の測定
被験者
一般病院の精神科への入院時において薬剤の投薬を受けたことがない合計４８人のうつ病患者（年齢４４．２７７±１１．４２歳）を採用した。同期間に定期検査のために同じ一般病院に来院した合計９５人の正常な健康な人（年齢３１．６３±８．５歳）を対照として採用した。インフォームドコンセントをすべての被験者から得た。
【００３９】
すべての患者が有資格精神科医による問診を受け、ＤＳＭ−ＩＶ基準に従い大うつ病と診断された（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９４，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＤＳＭ  ＩＶ）．Ａｍ．Ｐｓｙ．Ａｓｓｏ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）。アルコール中毒と他の急性疾患または慢性疾患とを含む他の精神障害の併存疾患を有するすべての患者を除外した。他の疾患の存在について臨床的および生化学的に確認した。
【００４０】
すべての対照について、患者と同じ方法で慢性疾患および急性疾患がないことを確認した。精神障害および関連障害がないかどうかについて確認するために有資格精神科医が問診を行った。
試料収集
終夜絶食した早朝の血液試料をヘパリン処理済チューブに合計１０ｍｌ採取し、血漿試料を収集し、後日の分析のために−７０℃で保存した。患者については、退院時に再度採取を行った。
試料とデータ分析
ＵＶ検出器および蛍光検出器を用いた高速液体クロマトグラフィーを用い、（１）トリプトファン（μｍｏｌ／ｌ）、（２）競合アミノ酸：チロシン、バリン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、タウリン、ａ−アミノ−ｎ−酪酸、およびメチオニン（μｍｏｌ／ｌ）、（３）キヌレニン（μｍｏｌ／ｌ）、ヒドロキシ−アントラニル酸（ｎｍｏｌ／ｌ）、ならびに（４）キレン（ｋｙｒｅｎｉｃ）酸（ｎｍｏｌ／ｌ）について試料を分析した（Ｈｅｒｖｅ  Ｃ，Ｂｅｙｎｅ  Ｐ，Ｊａｍａｕｌｔ  Ｈ，Ｄｅｌａｃｏｕｘ  Ｅ，１９９６，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（６７５）：１５７−１６１．）。
【００４１】
血液中のトリプトファンのアベイラビリティを表わすトリプトファン指数（ＴＲＰｉ）（１００×トリプトファン値／競合アミノ酸値の和）、トリプトファン分解を表わすトリプトファン分解指数（ＫＹＮ／ＴＲＰ）（キヌレニン値／トリプトファン値）、神経保護比（ＫＡＫＹＮ）（キヌレン酸値／キヌレニン値）、およびキノリン酸の興奮毒性作用に対する神経保護の強度を表わす神経保護指数（ＰＲＯｉ）（キヌレン酸値２／キヌレニン値）について算出した（表１）。
【００４２】
ＳＰＳＳ第１１．０版を用いて統計分析を行った。
結果
（１）入院時、患者のトリプトファン指数は、正常対照より有意に低かったが、著しく低くはなかった（９．９９±０．２６対１０．８８±０．１４）（ｐ＜０．０５）。
（２）入院時、患者のトリプトファン分解指数は、正常対照より有意に低かったが、著しく低くはなかった（０．０３±０．００２対０．０５±０．０２）（ｐ＜０．０４）。
（３）入院時、ニューロンに対する毒作用を示すヒドロキシアントラニル酸（異化におけるキノリン酸形成前のステップ）は、患者（２５．２６５±２．４３７）および正常対照（２５．１８２＋０．７６８）間において差異（ｐ＝０．１）がなかった。
（４）入院時、患者の血漿キヌレン酸濃度は、正常対照より有意にかつ著しく低かった（ｐ＜０．０００１）（２４．２９±１．１８対３５．９６±１．３７）（図１）。
（５）ＲＯＣ曲線分析により、キヌレン酸値２９．３ｎｍｏｌ／ｌがうつ病と正常との間のカットオフポイントであり、感度が８０．９％、特異度が７５％であることが示された（図４）。
（６）入院時、患者の神経保護比は、正常対照より有意にかつ著しく低かった（ｐ＜０．０００１）（１４．０８±０．６４対１９．３６±０．６１）（図２）。
（７）ＲＯＣ曲線分析により、神経保護指数１６．３がうつ病と正常との間のカットオフポイントであり、感度が７５．５％、特異度が６５％であることが示された（図５）。
（８）入院時、患者の神経保護指数は正常対照より有意に低かった（ｐ＜０．０４）（３５８．７７±５２．９３対７５７．７±８６．２２）（図３）。
（９）ＲＯＣ曲線分析により、神経保護指数４７３がうつ病と正常との間のカットオフポイントであり、感度が７８．７％、特異度が７７．６％であることが示された（図６）。
（１０）単変量解析により、上記の３つのマーカーは年齢または性別による影響を受けないことが示された。
結論
神経保護指数、神経保護比、および血漿キヌレン酸濃度は、正常な人とうつ病の人とを区別するために用いられる生物学的マーカーである。
実施例２：高速液体クロマトグラフィーを用いたキヌレニンおよびキヌレン酸の決定
１．概要：
外部標準化を用いるＨＰＬＣによるキヌレニンおよびキヌレン酸の結合測定。キヌレニンはＵＶで検出し、キヌレン酸はＺｎ含有溶離溶媒中での高い蛍光により検出する。
２．試料調製：
試料（血清、全血、血漿）はタンパク質除去の必要がある。
【００４３】
１８０μｌの試料に２０μｌの過塩素酸を加える。
【００４４】
１０分間そのままにしておき、次いで、１４０００ｇで５分間遠心分離する。１００μｌの上清をギルソン注入バイアルに移し、キャップし、６０００ｇで５分間、遠心分離する。
３．計測装置：構成システム２
３．１  ギルソン３０５ＨＰＬＣポンプ
３．２  ギルソン２３１オートインジェクター：
ダイリュータリザーバを確認する：２０％ＡＣＮ／ＡＤ
プログラムファイル１
分析時間＝４分間
試料数＝注入数
注入体積＝４０μｌ
３．３  蛍光検出器  島津社製１０Ａ（ｘｌ）：
励起：３３４ｎｍ
発光：３８８ｎｍ
ＳＥＮＳ：１
ＧＡＩＮ：３
３．４  ギルソン１１７検知器
波長：３６５ｎｍ
感度１：０．０１
感度２：０．１
最小ピーク幅：８秒
３．５  ギルソンユニポイントソフトウェア：
メソッドファイル：ＫＹＮＳ２．ＧＣＴ
ストップファイル：ＳＴＯＰＫＡ２．ＧＣＴ
分析ファイル：ＫＡＳ２．ＧＡＮおよびＫＹＮＳ２．Ｇ
４．クロマトグラフィー：
カラム：クロモリスガードカートリッジを有するクロモリスパフォーマンス４．６×１００ｍｍ。緩衝液：ＡＤ中２５０ｍＭのＺｎアセテート（５００ｍｌ中２７．４ｇ）。ｐＨを酢酸で５．８にし、メスシリンダー中、水で４５５ｍｌの容量にする。これに４５ｍｌのＡＣＮ（グラジエントクロマトグラフィー用）を加える。
【００４５】
溶媒を２０分間超音波により脱気する。
５．標準物質の調製：
５．１  キヌレニンストック標準物質は、２０ｍｇのキヌレニン（ＭＷ２０８．２）を量り取り、１００ｍｌのメスフラスコ中で水に溶解させることにより調製する。標準物質をエッペンドルフカップ中１ｍｌのアリコートとして−２０℃で保存する。
５．２  キヌレン酸ストック標準物質は、２０ｍｇのキヌレン酸（ＭＷ１８９．２）を量り取り、１００ｍｌのメスフラスコ中で１ｍｌの１２Ｎ  ＨＣｌとともにＥｔＯＨに溶解させることにより調製する。標準物質を−２０℃で保存する。
５．３  使用標準物質：
キヌレニン（５００μｌ）は５μＭの濃度まで、キヌレン酸（１０．０μｌ）は１００ｎＭの濃度まで、ＡＤ（１００ｍｌまで）中でストック標準物質を希釈する。室温で１日間安定である。
６．試薬：
過塩素酸（２．４Ｍ）：７ｍｌの過塩素酸＋１３ｍｌのＡＤ
７．品質の調整：
薬剤を含まない市販の血漿（ＴＲＰ、ＫＹＮ、ＫＡ）
８．手順：
−溶媒、試薬を調製し、使用標準物質溶液および対照血漿を解凍する。
−カラムを安定化させる。
−配管の確認をする。
−蛍光検出器。
−試料調製
−標準物質の注入数、試料数、および対照数にオペレーションファイルを適合させる。
−オートインジェクターをプログラムし、−スタートを実施する。
−システムをシャットダウンする。
９．正常値：
９．１  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４４：４，８５８−６２（１９９２）：
ＫＹＮ：１．９８（中央値）範囲１．８６〜２．１０μＭ  ｎ＝７２
９．２  Ｊ  Ｃｈｒｏｍ  Ｂ，６７５（１９９６），１５７−６１：
ＫＹＮ：１．３５  ０．７−３．０μＭ  ｎ＝３５
ＫＡ：２３        ６−５４ｎＭ
９．３  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈ  １７２，５１８−２５（１９８８）：
ＫＹＮ：２．２１  １．３０−３．３２μＭ  ｎ＝２０Ｍ＋２０Ｆ
９．４  Ｒｏｓｅｎｅｃｋ  ｓｔｕｄｉｅ（ｐｒｏｊｅｃｔ  １１／０１）
ＫＹＮ：１．６６  １．０４−２．２８μＭ  ｎ＝３６
実施例３：高速液体クロマトグラフィーを用いたトリプトファンおよび競合アミノ酸の決定
１．概要：
チロシン（ＴＹＲ）、バリン（ＶＡＬ）、トリプトファン（ＴＲＹ）、フェニルアラニン（ＰＨＥ）、イソロイシン（ＩＬＥ）、ロイシン（ＬＥＵ）の同時測定
溶離させる他のアミノ酸：タウリン（ＴＡＵ）、ａ−アミノ−ｎ−酪酸（ＡＢＡ）、エタノールアミン、メチオニン（ＭＥＴ）
２．試料調製：
ギルソン試料バイアル中で２５μｌの試料を２５μｌの内部標準物質溶液（ＩＳ）で希釈する。
３．計測装置：
３．１  ギルソンシステム１
３．２  ＡＳＴＥＤ：
２０μｌ注入ループおよびダイアライザブロックを取り付ける。ダイリュータ０にプライム（Ｐｒｉｍｅ）溶液を、ダイリュータ１にダイアライザ溶液を使用する。ラック５０のバイアル位置ＡおよびＢにホウ酸緩衝液を置く。位置ＣにＯＰＡ誘導化試薬を置く。
３．３  島津ＲＦ−Ａ蛍光検出器：
励起：３３０
発光：４５０
ＳＥＮＳ：１
ＧＡＩＮ：２
３．４  ギルソンユニポイントソフトウェア：
コントロールメソッド：ＡＺＰ
分析メソッド：ＡＺＰ
４．クロマトグラフィー：
カラム：Ｅｃｏｎｏｓｐｈｅｒ  Ｃ１８、３μｍ、４．７×５０ｍｍ
溶媒Ａ：５７．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏまたは２２．６  ９  Ｎａ２ＨＰＯ４．ａｎｈを４００ｍｌの水中で撹拌し、徐々に加熱することにより溶解させる。ｐＨをリン酸で６．５にし、メスシリンダー中に水で１８４０ｍｌの容量にする。これに、クロマトグラフィー用の１６０ｍｌのアセトニトリルを加える。
溶媒Ｂ：４２０  水／２８０  ＡＣＮ／３２０  ＭｅＯＨ（すべてＳｐｅｃｔｒｏｇｒａｄｅ）。
【００４６】
両溶媒を２０分間超音波により脱気する。
５．標準物質の調製：
−各化合物を１００ｍｇ量り取り、１００ｍｌのメスフラスコ中で水に溶解させることにより個々のアミノ酸標準物質を調製する。
−使用標準物質溶液：以下の個々の５ｍｌのアミノ酸標準物質をメスフラスコ中で２５０ｍｌの水に溶解させる：ＴＹＲ、ＶＡＬ、ＴＲＹ、ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＬＥＵ。
−標準物質溶液の確認：使用標準物質溶液と同様であるが、以下の化合物を追加する：ＴＡＵ、ＡＢＡ、ＭＥＴ。この溶液は標準化ではなくクロマトグラムを確認するのに使用する。
−両標準物質をエッペンドルフカップ中に１ｍｌのアリコートとして−２０℃で保存する。
−実用溶液の実際の濃度（マイクロＭ）：ピーク表を参照。
６．試薬：
６．１  プライム溶媒（１週間）：８．６ｇのＮａＣｌを水１ｌ中に溶解させる。５００μｌのトリトンＸ１００を加える。十分に混合し、１０分間超音波にかける。
６．２  透析液（１週間）：ＮａＮ３と０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４（さじの先端）
６．３  内部標準物質ストック溶液：１００ｍｇのノルバリンを１００ｍｌの水中に溶解させる。１．５ｍｌのアリコートをエッペンドルフカップ中で−２０℃で保存する（２年間）。
６．４  内部標準物質（ＩＳ）：１ｍｌの内部標準物質ストック溶液を、シンチレーションバイアル中で２ｇ／ｌのＮａ２−ＥＤＴＡ（Ｋｅｓｔｒａｎａｌ  ２Ｓ）２０ｍｌで希釈する（１ヶ月間）。
６．５  ホウ酸緩衝液：３．１ｇのホウ酸を４００ｍｌの水中で溶解させ、ＮａＯＨ  ｃｏｎｃ．でｐＨ  ９．５にし、５００ｍｌまで希釈する（１ヶ月間）。
６．６  ＯＰＡ：５００ｍｇのオルトフタルジアルデヒド（ＯＰＡ）を１００ｍｌの三角フラスコ中で１０ｍｌのメタノールのスペクトルグレード（ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｄｅ）に超音波を短時間かけて溶解させる。９０ｍｌのホウ酸緩衝液および５００μｌのメルカプトエタノールを加える。この試薬は１か月間安定しているが、５０μｌのメルカプトエタノールを２日おきに加える。
７．品質管理：
ＥＤＴＡ血漿プールをエッペンドルフ社製チューブに−２０℃で保存する。
８．システムのシャットダウン：
−溶媒Ｂでカラムをすすぐ
−ＡＳＴＥＤに水をつぐ
９．手順：
−溶媒、試薬、ＩＳを調製し、使用標準物質溶液および対照血漿を解凍させる。
−グラジエントを３回実施することによりカラムを安定化させる：最初にポンプ１、ポンプ２（最終的に、カラムを外した状態でポンプを準備する）、Ｑａｔａ  Ｍａｓｔｅｒ、ダイリュータ、ＡＳＴＥＤ、プリンタ、コンピュータ画面、およびコンピュータの電源を入れる。メソッドＡＺＰ２を選択し、３回実施する（「継続」をクリックする）。試料調製ありおよび試料調製なしでグラジエントを少なくとも１回確認する。
−透析するためにＡＳＴＥＤを準備する（構成を変更する場合、最初にファイル１８１を実施する）：試薬および溶媒を置き、プライム（ｐｒｉｍｅ）する。ファイル１５０を実施（溶離時間＝５０）
−蛍光検出器
−カラムの安定化を開始
−配管を確認
−確認試料（使用標準物質）のためにＡＳＴＥＤを設定
−確認試料がＯＫでない場合は、改善し、再度開始する。
【００４７】
不確かな場合には調整用標準物質および／または品質調整用血漿をかける。
−試料調製
−標準物質注入数、試料数、および対照数に従いギルソンプログラムを適合させる。
−ＡＳＴＥＤを設定する。
−実施を開始する。
−システムをシャットダウンする。
実施例４：高速液体クロマトグラフィーを使用したヒドロキシアントラニル酸の決定
１．概要：
ＫＹＮをＵＶおよびＨＡＡの蛍光発光により検出してもよい。
２．試料調製：
試料（血清、ＥＤＴＡ全血、ＥＤＴＡ血漿、ヘパリン処理血漿、またはクエン酸血漿）を最初に４０００ｇで遠心分離し微粒子を除去する。この試料からタンパク質を除去する必要がある。
【００４８】
１８０μｌの試料に２０μｌの過塩素酸（６．３）を加える。
【００４９】
５分間そのままにし、次いで５分間１４０００ｇで遠心分離する。次いで、１００μｌの上清をギルソン注入バイアルに移し、キャップし、６０００ｇで５分間遠心分離する。
３．計測装置：
構成システム２
３．１  ギルソン３０５ＨＰＬＣポンプ
３．２  ギルソン２３４オートインジェクター：
ダイリュータリザーバを確認：２０％ＡＣＮ／ＡＤ
プログラムファイル３
分析時間＝１２分間
試料数＝注入数
注入体積＝４５μｌ
３．３  蛍光検出器  島津１０Ａ（ｘｌ）：
励起：３１６ｎｍ
発光：４２０ｎｍ
ＳＥＮＳ：１
ＧＡＩＮ：３
３．５  ギルソンユニポイントソフトウェア：
メソッドファイル：ＨＡＡＳ２．ＧＣＴ
ストップファイル：ＳＴＯＰＳＹＳ２．ＧＣＴ
分析ファイル：ＨＡＡＳ２．ＧＡＮおよびＨＡＡＳ２．ＧＡＮ
４．クロマトグラフィー：
カラム：Ｐｒｅｖａｉｌ  ｓｅｌｅｃｔ  Ｃ１８  ３μ  ４．６×１００ｍｍ（オルテック社９９３０２）
緩衝液：２０ｍＭの酢酸（９００ｍｌ中１．２ｍｌ）をＫＯＨでｐＨ  ５．８にし、メスシリンダー中に水で１０００ｍｌの容量にする。これに２０ｍｌのＭｅＯＨ（グラジエントクロマトグラフィー用）を加える。溶媒を１０分間超音波により脱気する。
５．標準物質の調製：
５．２  ２０ｍｇのアントラニル酸（ＭＷ）を量り取り、１００ｍｌのメスフラスコ中で４０ｍＭ、ｐＨ４．５のアセテートシトレートで溶解させることによりヒドロキシアントラニル酸ストック標準物質を調製する。標準物質を−８０で保存する。
５．３  使用標準物質：ＡＤ（１００ｍｌまで）中でヒドロキシアントラニル酸（１０．０μｌ）の濃度が１００ｎＭになるまでストック標準物質を希釈する。
６．試薬：
６．３  過塩素酸（２．４Ｍ）：７ｍｌの過塩素酸＋１３ｍｌのＡＤ
６．４  内部標準物質実用溶液：６．３中６．４の５倍希釈液
７．手順：
−溶媒、試薬を調製、使用標準物質溶液および対照血漿を解凍
−カラムを安定化
−配管を確認
−蛍光検出器
−試料調製
−標準物質注入数、試料数、および対照数にオペレーションファイルを適合させ、
−オートインジェクターを設定−実施を開始
−システムをシャットダウン
８．正常値：
８．１  Ｊ  Ｃｈｒｏｍ  Ｂ，６７５（１９９６），１５７−６１：血清
ＫＹＮ：１．３５  ０．７−３．０μＭ  ｎ＝３５
ＨＡＡ：７９      １５−２０９ｎＭ
実施例５：アルツハイマー病での上昇した３−ヒドロキシキヌレニン血清レベルの測定
方法
患者および対照被験者
臨床的にアルツハイマー病（ＡＤ）である可能性が高いと診断された２０人の患者、遅発性大うつ病（ＭＤ）の２０人の患者、および健康診断および神経心理学的検査により神経変性疾患が除外された記憶愁訴（ＳＣＩ）を有する２０人の健康な高齢の被験者におけるＴＲＰ、ＫＹＮ、ＫＹＮＡ、ならびに３−ＨＫの血清レベルについて調査した。
【００５０】
被験者の特徴については、表２を参照されたい。国立神経疾患伝達障害研究所および脳卒中／アルツハイマー疾患関連疾病協会の基準に従い、ＡＤの可能性についての臨床診断がなされる（ＭｃＫｈａｎｎ，Ｇ．，Ｄｒａｃｈｍａｎ，Ｄ．，Ｆｏｌｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｋａｔｚｍａｎ，Ｒ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｔａｄｌａｎ，Ｅ．Ｍ．（１９８４）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ  Ｗｏｒｋ  Ｇｒｏｕｐ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ａｕｓｐｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４，９３９−９４４．）。ＩＣＤ−１０およびＤＳＭ−ＩＶの基準に従い、大うつ病の診断がなされる（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９４）．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｔｅｘｔ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ））。ＡＤ群の疾患の平均期間は２．２０年間（０〜５年間）である。すべてのＡＤ患者は抗認知症の治療を受けておらず、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）を用いた治療を実際に受けていない。ＡＤ患者のうちの１人が緩解再発性の大うつ病の既往歴を有したが、いかなるうつ症状もない状態で病院に入院し、抗うつの薬物治療を受けていない。入院時、ＭＤ患者のうちの３人は選択的セロトニン再取り込み阻害薬で治療しており、血液試料採取時、１人は三環系抗うつ薬で、１人は抗うつ薬の併用で治療しており、残りのＭＤ患者は抗うつ薬による薬物治療を受けていない。１人のＳＣＩ被験者は軽度のうつ病エピソードを患い、レボキセチンで治療しており、もう一人のＳＣＩ被験者が強直性脊椎炎のために単発的にＮＳＡＩＤを服用している。
【００５１】
年齢（クラスカルウォリスの検定Ｘ２＝１８．２２３、ｐ＜０．００１）、性別（Ｘ２＝６．６６７、ｐ＝０．０３６）、およびミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）のスコア（Ｘ２＝３１．９４４、ｐ＜０．００１、表２参照）において群間に有意差がある。ＡＤ患者は、ＭＤ患者（マンホイットニーの検定Ｚ＝−２．６５４、ｐ＝０，００８）およびＳＣＩ被験者（Ｚ＝−３．９９８、ｐ＜０．００１）より高齢であり、ＭＤ患者はＳＣＩ被験者（Ｚ＝−２．０７２、ｐ＝０．０３８）より高齢である。
【００５２】
他に添加剤を加えずに、血清試料を真空容器中に採取する。０．５時間凝固させた後、試料を遠心分離し、上清をエッペンドルフカップ（エッペンドルフ社、ハンブルグ、ドイツ）に等分し、直ちに−８０℃で凍結させる。
実験室での分析
紫外線（ＵＶ）および蛍光検出を用いたグラジエント高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を我々は確立した。
化学物質
固相抽出およびクロマトグラフィーのための試薬について、純度がグラジエントグレードで液体クロマトグラフィー用のものをメルク社（ダルムシュタット、ドイツ）から購入する。ミリポア社Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社、ミルフォード、ＭＳ）により超純水を作成する。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）カプセル（シグマ社、セントルイス、ＭＯ）を０．０５ＭのＰＢＳを生成するために用いる。トリプトファン、キヌレニン、キヌレン酸、および３−ヒドロキシキヌレニンについて、シグマ社製（セントルイス、ＭＯ）の高純度のものを購入する。
【００５３】
０．０５ＭのＰＢＳ溶液に濃度が確定した分析物を加えることによりキャリブレータおよび対照を作る。以下の濃度を５ポイントキャリブレーションに用いる：ＴＲＰ：０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０、２０．０μｇ／ｍｌ；ＫＹＮ：１２．５、２５．０、５０．０、１００、２００、４００、８００ｎｇ／ｍｌ；ＫＹＮＡ：４．６８８、９．３７５、１８．７５、３７．５、７５．０、１５０、３００ｎｇ／ｍｌ；３−ＨＫ：１．５６３、３．１２５、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０、１００ｎｇ／ｍｌ。
試料抽出
ウォーターズ社製オアシスＭＣＸ１ｃｃ（３０ｍｇ）抽出カートリッジ（ウォーターズ社、ミルフォード、ＭＳ）を用い、試料およびキャリブレータ／対照から分析物を以下のとおり抽出する（抽出はすべて手動式真空マニフォールドシステムにより行う）。（１）カートリッジを１ｍｌのメタノールで、次に１ｍｌの水ですすぐことにより前処理する。（２）１ｍｌの試料および１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４をカートリッジにかけ、軽度の真空下で引いて通過させる（２分間）。（３）カートリッジを１ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで、次に１ｍｌの１００％メタノールで洗浄する。最後に、（４）６％のＮａＯＨを含む１．５ｍｌのアセトニトリルでカートリッジをすすぐことにより分析物を溶離させる。次いで、溶離液を窒素下で蒸発させて乾燥させ、１５０μｌの０．１Ｍ  ＰＢＳで再構成する。次いで、再構成した試料／キャリブレータ／対照を微量注入バイアル（ウォーターズ社）に移す。
ＨＰＬＣ装置およびクロマトグラフィー条件
ウォーターズモデル２４８７デュアルλ  ＵＶ検出器および２４７５型蛍光検出器に接続されたウォーターズ２６９５クロマトグラフで分析を実施する。
【００５４】
ＫＹＮ、ＫＹＮＡ、および３−ＨＫを決定するために、１００μｌの試料を２５０ｍｍ×４ｍｍ  Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒｅ６０ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔＢ，Ｃ８カラムに装填する（メルク社、ダルムシュタット、ドイツ）。比較的、濃度が高いため、１０μｌの容量で２番目に注入を行いＴＲＰを測定する。クロマトグラムにおいて最適なピーク分解能を確実にし、その結果、適度に短時間（３０分間）で効率的に分析物を分離するために、異なる割合の０．０５０Ｍの酢酸ナトリウム（溶媒Ａ：ｐＨ４．８０；溶媒Ｂ：ｐＨ３．６５）と、アセトニトリル（溶媒Ｃ）と、メタノール（溶媒Ｄ）との混合物から成る移動相を用い、グラジエントモードで溶離を実施する（表３参照）。
【００５５】
流量を０．８０ｍｌ／分に設定し、カラム温度を３５．０℃に設定し、一方、試料を４．０℃に冷却する。ＴＲＰを蛍光検出により測定し（λｅｘ：３００ｎｍ；λｅｍ：３５０ｎｍ）、ＫＹＮ（３６５ｎｍ）、ＫＹＮＡ（３３０ｎｍ）、および３−ＨＫ（３６５ｎｍ）をＵＶ検出により測定する。注入後、化合物検出までのおよその実施時間はＴＲＰで約２０．４分間、ＫＹＮで１３．４分間、ＫＹＮＡで２２．５分間、３−ＨＫで７．０分間である。
【００５６】
ウインドウズ２０００ソフトウェア向けのＥＭＰＯＷＥＲ（ウォーターズ社）を用いデータを処理する。それぞれのキャリブレーションカーブのピーク高さと単一の分析物のピーク高さを比較することにより濃度を確定する。
統計
ＳＰＳＳ（第１２．０．１版；ＳＰＳＳ、シカゴ、イリノイ州）を用いノンパラメトリック法で統計分析を行う（クラスカルウォリスの検定、マンホイットニーの検定、スピアマンの順位相関）。有意水準をｐ＜０．０５０に設定する。年齢の差異により群間において有意な結果となることを調整するために、診断を独立因子とし年齢を共変量として線形モデルを用いる。回帰残差およびコルモゴロフスミルノフの検定（ｐ＜０．０５）を視覚的に判断しても結果変数が正規分布しないので、分布非依存の有意性検定のために診断および年齢を独立予測変数とした重回帰モデルに適用されたブートストラップ法を用いる。特に、９９９個の試料に基づく診断の各ペアに対する重回帰モデルについて繰り返し算出する。ＡＤ群および対照群間で有意差を示すマーカーが潜在的な診断検査として有用でありうるかどうかを評価するために、特異度＞８０％のときのマーカーの感度および感度＞８０％のときの特異度についてＲＯＣ分析を用いて決定する。合意基準に基づきＡＤにおける臨床的に有用なバイオマーカーとして８０％のレベルが選ばれる（Ｔｈｅ  Ｒｏｎａｌｄ  ａｎｄ  Ｎａｎｃｙ  Ｒｅａｇａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（１９９８）．Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｔｈｅ  Ｒｏｎａｌｄ  ａｎｄ  Ｎａｎｃｙ  Ｒｅａｇａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｎｅｕｒｏｂｌｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １９，１０９−１１６．）。
結果
アルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者、大うつ病（ＭＤ）を有する患者、および自覚的認知障害（ＳＣＩ）を有する健康な人におけるトリプトファン（ＴＲＰ）、キヌレニン（ＫＹＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、ならびに３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）の平均血清レベルを表４に示す。３群間でＴＲＰレベルに有意な差異はなく（クラスカルウォリス：Ｘ２＝５．５０７；ｐ＝０．０６４）、ＡＤ患者は対照の健康な人よりＴＲＰレベルが低い（マンホイットニーＺ＝−２．２８８；ｐ＝０．０２２）。この群間で、ＫＹＮ（Ｘ２＝１．５３６；ｐ＝０．４６４）およびＫＹＮＡ（Ｘ２＝０．０３３；ｐ＝０．９８４）の血清レベルに差異がない。対照的に、３−ＨＫレベルにおいて、３群間で有意差があり（Ｘ２＝２０．２８１；ｐ＜．０００１）、大うつ病の患者（Ｚ＝−３．５７１；ｐ＜０．００１）およびＳＣＩ対照（Ｚ＝−４．１３９；ｐ＜０．０００１）と比較してＡＤ患者における血清３−ＨＫレベルが高い。対照的に、血清３−ＨＫレベルは、ＭＤ患者とＳＣＩ対照（Ｚ＝−．５４１；ｐ＝０．６０２）間に差異がなかった。必須アミノ酸ＴＲＰのアベイラビリティは、代謝物を生産するための限定要因となるので、３−ＨＫレベルとＴＲＰレベルとの比も算出する。さらに、この群間で極めて有意な差があり（Ｘ２＝２１．９１１；ｐ＜０．０００１）、ＭＤ患者（Ｚ＝−３．５１７；ｐ＜０．００１）および健全な対照（Ｚ＝−４．４３６；ｐ＜０．０００１）においてよりもＡＤ患者における平均値比（３−ＨＫ／ＴＲＰ）が極めて高く、しかし、２つの対照群間に差異はない（Ｚ＝−０．７５７；ｐ＝０．４４９）。したがって、神経毒性の３−ＨＫと神経を保護するＫＹＮＡとの比がＡＤ患者において有意に増加していることになる（Ｘ２＝１８．０１６，ｐ＝０．０００１；ＡＤ対ＭＤ：Ｚ＝−３．２１９，ｐ＝０．００１；ＡＤ対ＳＣＩ：Ｚ＝−４．００３，ｐ＝０．００００２；ＭＤ対ＳＣＩ：Ｚ＝−０．６４９，ｐ＝０．５２９）。
【００５７】
標本分布を決定するためにブートストラップ法を用い、群間の３−ＨＫおよび３−ＨＫ／ＴＲＰにおける有意差について年齢を調整すると、３−ＨＫレベルは、ＡＤ患者およびＳＣＩ対照（偏相関係数−０．４２，ｐ＜０．０５）間ならびにＡＤ患者およびＭＤ患者間（偏相関係数−０．３５，ｐ＜０．０５）で有意差がある。３−ＨＫ対ＴＲＰの比は、ＡＤ患者およびＳＣＩ対照間で有意差がある（偏相関係数−０．４７，ｐ＜０．０５）が、ＡＤ患者およびＭＤ患者間で有意差がない（偏相関係数−０．２）。
【００５８】
ＭＤ群およびＳＣＩ群を組み合わせたものと比較してＡＤ群のＲＯＣ分析を行うと、特異度が８５％であるとき、３−ＨＫ感度が７５％であるのに対して、感度が９０％であるとき、特異度が７０％である。特異度が８２．５％であるとき３−ＨＫ対ＴＲＰの比の感度が８０％であるのに対して、感度が８５％であるとき、特異度が７７．５％である。
【００５９】
【表１−１】
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【００６０】
【表１−２】
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【００６１】
【表１−３】
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【００６２】
【表１−４】
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【００６３】
【表１−５】
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【００６４】
【表２】
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【００６５】
【表３】
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【００６６】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例１で得られたキヌレン酸濃度の度数をナノモル／リットルで示す。
【図２】実施例１で得られた神経保護比（ＫＡＫＹＮ）の度数を示す。
【図３】実施例１で得られた神経保護指数（ＰＲＯｉ）の度数を示す。
【図４】実施例１で得られたキヌレン酸（ＫＡ）の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図５】実施例１で得られた神経保護比（ＫＡＫＹＮ）のＲＯＣ曲線を示す。
【図６】実施例１で得られた神経保護指数（ＰＲＯｉ）のＲＯＣ曲線を示す。
【図７】アルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者、大うつ病（ＭＤ）を有する患者、および自覚的認知障害（ＳＣＩ）を有する健康な人における３−ＨＫおよびＴＲＰの血清レベルの比を示す。クラスカルウォリスの検定により調査した３群間の有意差が明らかになり、マンホイットニーの検定により、ＡＤ患者および２つの対照群の間の有意差が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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