(57)【要約】  本発明は新規1,4-ベンゾチアゼピン中間体及び誘導体、これらの合成方法、並びにこれらのアッセイ方法を提供する。又、本発明はこれらの新規化合物を使用して対象におけるRyR2結合FKBP12.6のレベルの減少を制限もしくは防止し、対象における運動誘発性心臓突然死を予防し、また対象における心不全、心房細動、又は運動誘発性心臓不整脈を治療又は予防する方法を提供する。更に、本発明はRyR2及びFKBP12.6の結合を高める薬剤を同定する方法、及びこれらの方法により同定された薬剤を提供する。更に、本発明は心不全、心房細動、又は運動誘発性心臓不整脈を治療又は予防し、また運動誘発性心臓突然死を予防する際の使用のための薬剤を同定する方法を提供する。又、このような方法により同定された薬剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2008534497.tif 000078
（式中、Rはアリール、アルケニル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物。
【請求項２】
式：
【化２】
2008534497.tif 000079
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物。
【請求項３】
式：
【化３】
2008534497.tif 000080
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）
を有する化合物。
【請求項４】
式：
【化４】
2008534497.tif 000081
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつXはNH又はOである）
を有する化合物。
【請求項５】
S7、S-20、S-25、S-27、及びS36からなる群から選ばれた化合物。
【請求項６】
式：
【化５】
2008534497.tif 000082
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物の合成方法であって、
(a) 式：
【化６】
2008534497.tif 000083
を有する化合物を塩化スルホニル化合物及び塩基で処理して、式：
【化７】
2008534497.tif 000084
を有する化合物を生成する工程、
(b) 必要により、工程(a)で生成された化合物を一級又は二級アミンで処理して、式：
【化８】
2008534497.tif 000085
（式中、Ｒは先に定義されたとおりである）
の化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法。
【請求項７】
工程(a)における塩化スルホニル化合物がアルキルスルホニルクロリド及びアリールスルホニルクロリドからなる群から選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程(a)における塩基がEt3Nである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程(b)における一級又は二級アミンが4-ベンジルピペリジンである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
式：
【化９】
2008534497.tif 000086
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物を酸化剤で酸化して、式：
【化１０】
2008534497.tif 000087
（式中、Ｒは先に定義されたとおりであり、かつｍは１又は２である）
を有する化合物を生成する工程を更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
酸化剤が過酸化水素である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
式：
【化１１】
2008534497.tif 000088
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物の合成方法であって、
式：
【化１２】
2008534497.tif 000089
を有する化合物を、塩基の存在下で、塩化スルフリル及び一級又は二級アミンで処理して、式：
【化１３】
2008534497.tif 000090
（式中、Ｒは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法。
【請求項１３】
塩基がEt3Nである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
一級又は二級アミンが1-ピペロニルピペラジンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
式：
【化１４】
2008534497.tif 000091
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物を酸化して、式：
【化１５】
2008534497.tif 000092
（式中、Ｒは先に定義されたとおりであり、かつｍは１又は２である）
を有する化合物を生成する工程を更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
式：
【化１６】
2008534497.tif 000093
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）
を有する化合物の合成方法であって、
式：
【化１７】
2008534497.tif 000094
（式中、Ｒは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を酸化剤で処理して、式：
【化１８】
2008534497.tif 000095
（式中、Ｒ及びｍは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法。
【請求項１７】
酸化剤が過酸化水素である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
式：
【化１９】
2008534497.tif 000096
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつXはNH又はOである）
を有する化合物の合成方法であって、
式：
【化２０】
2008534497.tif 000097
を有する化合物を、塩基の存在下で、塩化カルボニル化合物、及び一級もしくは二級アミン又はアルコールで処理して、式：
【化２１】
2008534497.tif 000098
（式中、Ｒ及びＸは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法。
【請求項１９】
塩化カルボニル化合物がトリホスゲンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
塩基がEt3Nである、請求項１８記載の化合物。
【請求項２１】
一級又は二級アミンが4-ベンジルピペリジンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
式：
【化２２】
2008534497.tif 000099
（式中、R1はフェニル環の２位、３位、４位、又は５位の、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール、又はＨであり、R2はＨ、アルキル、又はアリールであり、かつR3はＨ、アルキル、又はアリールである）
を有する2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン化合物の合成方法であって、
(a) 式：
【化２３】
2008534497.tif 000100
（式中、R1は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を、任意の触媒の存在下で、還元剤で処理して、式：
【化２４】
2008534497.tif 000101
（式中、R1は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、
(b) 工程(a)で生成された化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、式：
【化２５】
2008534497.tif 000102
（式中、R1は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、
(c) 工程(b)で生成された化合物を活性剤及びクロロエチルアミンで処理して、式：
【化２６】
2008534497.tif 000103
（式中、R1、R2、及びR3は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、
(d) 工程(c)で生成された化合物を還元剤及び塩基で処理して式：
【化２７】
2008534497.tif 000104
（式中、R1、R2、及びR3は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、及び
(e) 工程(d)で生成された化合物を還元剤で処理して、式：
【化２８】
2008534497.tif 000105
（式中、R1、R2、及びR3は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本件特許出願は2005年3月23日付で出願された、米国分割特許出願（出願番号は未だ指定されていない）の利益を請求するものであり、該米国特許出願は2004年1月22日付で出願された、米国特許出願第10/763,498号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2003年10月7日付で出願された、米国特許出願第10/680,988号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2003年6月26日付で出願された、米国特許出願第10/608,723号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2002年11月5日付で出願された、米国特許出願第10/288,606号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2002年12月3日付で発行された米国特許第6,489,125B1である、2000年5月10日付で出願された、米国特許出願第09/568,474号の利益を請求している。これらの内容を、本発明の参考として、ここに組み入れる。
（政府の所有権に関する陳述）
本件発明はNIH承認番号PO1HL 67849-01の下で政府による支援を受けて行われたものであった。従って、米国政府は本件発明に或る種の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
治療法の進歩にも拘らず、鬱血性心不全は西欧諸国において依然として大きな死因となっている。米国に限っても、5,000,000名の人々が心不全に罹っており、また約50％という5-年死亡率により特徴付けられる(Levy等, 心不全に係る罹患率及び生存率の長期間の傾向(Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure), N. Engl. J. Med., 347:1397-402, 2002)。心不全の重要な特徴は、低い心筋の収縮性である(Gwathmey等, 末期段階の心不全に罹っている患者由来の、心筋層における、異常な細胞内カルシウム処理, Circ. Res., 61:70-76, 1987)。
健常な心筋、及び他の横紋筋においては、リアノジンレセプタ(RyRs)を含む、筋小胞体(SR)上のカルシウム-放出チャンネルが、活動電位と筋肉細胞の収縮とのカップリング(即ち、励起-収縮(EC)カップリング)を容易にする。収縮はカルシウム(Ca2+)がSRから周辺の細胞質に放出された際に開始される。心不全において、収縮異常は、一部には、心臓の活動電位(AP)が収縮を開始することを可能とする、シグナリングカスケードにおける変化によって生じる。特に、衰えた心臓においては、全細胞のCa2+過渡現象の振幅は減少し(Beuckelmann等, 末期の心不全に罹っている患者由来の単離された心室筋細胞における、細胞内カルシウム処理, Circ., 85:1046-55, 1992; Gomez等, 実験的な心肥大及び心不全における欠損性励起-収縮カップリング, Science, 276:800-06, 1997)、またその持続性が延長される(Beuckelmann等, 末期の心不全に罹っている患者由来の単離された心室筋細胞における、細胞内カルシウム処理, Circ., 85:1046-55, 1992)。
【０００３】
心不全の共通の特徴である心不整脈は、その疾患と関連する死亡の多くをもたらす。心房細動(AF)はヒトにおける最も普通の心不整脈であり、罹患率及び死亡率の主な原因を表している(Chugh等, 心房細動の疫学的及び自然の履歴：臨床的意味, J. Am. Coll. Cardiol., 37:371-78, 2001; Falk, R.H., 心房細動, N. Engl. J. Med., 344:1067-78, 2001)。AFの臨床的な重要性にも拘らず、この不整脈の基礎となる分子的なメカニズムが不十分に理解されており、治療選択肢が制限される。
心房無反応性の短縮を含む、構造的リモデリング及び電気的リモデリング、無反応性の速度-関連適合の喪失(Wijffels等, 心房細動が、心房細動を招く：慢性的に機器を取付けたヤギの覚醒における研究; Circulation, 92:1954-68, 1995; Morillo等, 慢性的急速心房ペーシング：持続性心房細動の新規モデルの、構造的、機能的及び電気生理学的諸特性; Circulation, 91:1588-95, 1995; Elvan等, ペーシング-誘発性心房細動は、イヌにおける洞結節機能を損傷する: 電気生理学的リモデリング; Circulation, 94:2954-60, 1996; Gaspo等, 慢性のイヌモデルにおける、頻拍-誘発性持続的心房細動を引起す機能的なメカニズム; Circulation, 96:4027-35, 1997)及び凹入小波の波長の短縮化が、持続的な頻拍症を伴うことが良く確認されている(Rensma等, 正常な覚醒したイヌにおける凹入心房性不整脈の励起波の長さ及び感受性; Circ. Res., 62:395-410, 1988)。このリモデリングはおそらく心房細動の発症、維持、及び進行において重要である。
【０００４】
従来の研究はカルシウム処理が心房細動の電気的リモデリングにおいて役割を果たし得ることを示唆している (Sun等, 持続的な心房頻拍によって引起される、心房収縮機能不全の細胞的メカニズム; Circulation, 98:719-27, 1998; Goette等, 心房細動における電気的リモデリング：タイムコース及びメカニズム; Circulation, 94:2968-74, 1996; Daoud等, ヒトにおける心房細動-誘発性電気的リモデリングに及ぼす、ベラパミル及びプロカインアミドの作用; Circulation, 96:1542-50, 1997; Yu等, ヒトにおける、心房凹入性期間の頻拍-誘発性変化：抗不整脈薬の速度依存性及び効果; Circulation, 97:2331-37, 1998; Leistad等, 短期間の心房細動後の心房性収縮機能不全は、ベラパミルによって軽減されるが、BAY K8644により高められる; Circulation, 93:1747-54, 1996; Tieleman等, ベラパミルは、心房の頻拍-誘発性電気的リモデリングを軽減する; Circulation, 95:1945-53, 1997)。しかしながら、心房細動中のRyR2の調節は従来報告されていなかった。
心臓疾患に罹っている全患者の約50％が、致死性の心不整脈により死亡している。幾つかの場合において、心臓における心室性不整脈は、急速に「心臓突然死」(SCD)と呼ばれる現象である、致死性のものとなり得る。致死性の心室性不整脈(及びSCD)は、また若者、又は構造的な心疾患に罹っていることが知られていない、その他は健康な個人においても起こり得る。事実、心室性不整脈は、その他は健康な個人における突然死の最も一般的な原因である。
【０００５】
カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)は、構造的に正常な心臓を持つ個体における遺伝性の疾患である。これは、ストレス-誘発性の心室頻拍症、即ちSCDを引き起こす可能性のある致死性の不整脈によって特徴付けられる。CPVTに罹っている対象において、肉体的な力の発揮及び/又はストレスが、検出可能な構造的心臓疾患の不在下において、SCDに導く、二方向性及び/又は多形型心室頻拍症を誘発する(Laitinen等, 家族性多形型心室頻拍症における、心臓リアノジンレセプタ(RyR2)遺伝子の変異体, Circulation, 103:485-90, 2001; Leenhardt等, 子供におけるカテコールアミン性多形型心室頻拍症：7-年間の追跡調査において21名, Circulation, 91:1512-19, 1995; Priori等, カテコールアミン性多形型心室頻拍症に罹患した患者の、臨床的及び分子的特徴付け, Circulation, 106:69-74, 2002; Priori等, 心臓リアノジンレセプタ遺伝子(hRyR2)の変異体が、カテコールアミン性多形型心室頻拍症の基となっている, Circulation, 103:196-200, 2001; Swan等, 染色体1q42-q43にマッピングされた不整脈性疾患が、構造的に正常な心臓における悪性の多形型心室頻拍症を引き起こす, J. Am. Coll. Cardiol., 34:2035-42, 1999)。
CPVTは、主として常染色体優性遺伝様式で遺伝する。CPVTに罹っている個体は、運動状態にある際に心室性不整脈を示すが、静止状態において不整脈を起こすことはない。結合研究及び直接的配列決定は、CPVTに罹っている個体の、染色体1q42-q43における、ヒトRyR2遺伝子中に変異体の存在を同定した(Laitinen等, 家族性多形型心室頻拍症における、心臓リアノジンレセプタ(RyR2)遺伝子の変異体, Circulation, 103:485-90, 2001; Priori等, 心臓リアノジンレセプタ遺伝子(hRyR2)の変異体が、カテコールアミン性多形型心室頻拍症の基となっている, Circulation, 103:196-200, 2001; Swan等, 染色体1q42-q43にマッピングされた不整脈性疾患が、構造的に正常な心臓における悪性の多形型心室頻拍症を引き起こす, J. Am. Coll. Cardiol., 34:2035-42, 1999)。
3つの型のリアノジンレセプタ：RyR1、RyR2、及びRyR3が存在し、これら全てが、Ca2+チャンネルと強い関連性を持つ。RyR1は、骨格筋中に見出され、またRyR2は、心臓に見出され、またRyR3は、脳内に位置している。タイプ2リアノジンレセプタ(RyR2)が、ECカップリング及び心臓の横紋筋における筋肉収縮にとって必要とされる、主なCa2+-放出チャンネルである。
【０００６】
RyR2チャンネルは、細胞内に多量のCa2+を放出するSRの特定の領域において、高密度のアレイとして詰込まれており、結果として筋肉の収縮を開始する(Marx等, 個々の骨格筋Ca2+-放出チャンネル(リアノジンレセプタ)間の共同的ゲーティング(開閉動作), Science, 281:818-21, 1998)。ECカップリング中には、APゼロ段階における心筋細胞膜の脱分極が、電位-開閉Ca2+チャンネルを活性化する。引続き、これらチャンネルを通過するCa2+の流入が、Ca2+-誘発性Ca2+放出として知られている過程において、RyR2を介するSRからのCa2+-放出を開始する(Fabiato, A., 心臓筋小胞体からの、カルシウム-誘発性カルシウム放出, Am. J. Physiol., 245:C1-C14, 1983; Nabauer等, カルシウム放出の調節は、心筋細胞においては、開閉電荷ではなく、カルシウム電流によって開閉される, Science, 244:800-03, 1989)。このRyR2-媒介、Ca2+-誘発性Ca2+放出は、次に心筋の収縮を司る収縮タンパク質を活性化する。
RyR2は、4つの12,000-ダルトンを持つFK506結合タンパク質(FKBP)、特にFKBP12.6(カルスタビン(calstabin))と結合している、4つの565,000-ダルトンを持つRyR2ポリペプチドを含むタンパク質複合体である。FKBPは、シス-トランスペプチジル-プロリルイソメラーゼであり、これらは幅広く発現されており、また様々な細胞機能を発揮する(Marks, A.R., イムノフィリンの細胞機能, Physiol. Rev., 76:631-49, 1996)。FKBP12タンパクは、密に結合しており、また骨格リアノジンレセプタ、RyR1の機能(Brillantes等, FK506-結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化, Cell, 77:513-23, 1994; Jayaraman等, カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)と関連するFK506-結合タンパク, J. Biol. Chem., 267:9474-77, 1992); 心臓リアノジンレセプタ、RyR2 (Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca(2+)-放出チャンネルに及ぼす、ラパマイシンの作用, Circ. Res., 78:990-97, 1996); タイプ1イノシトール1,4,5-トリスホスフェートレセプタ(IP3R1)として知られている、関連細胞内Ca2+-放出チャンネル(Cameron等, FKBP12は、ロイシン-プロリン(1400-1401)においてイノシトール1,4,5-トリスホスフェートレセプタを結合し、カルシニューリンをこのFK506-様のドメインに繋留する, J. Biol. Chem., 272:27582-88, 1997); 及びタイプIトランスフォーミング成長因子β(TGFβ)レセプタ(TβRI)(Chen等, FKBP12によるTGFβレセプタの阻害に関するメカニズム, EMBO J., 16:3866-76, 1997)等の機能を調節する。FKBP12.6は、RyR2チャンネルと結合(RyR2サブユニット当たり1分子)し、RyR2-チャンネル機能を安定化し(Brillantes等, FK506-結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化, Cell, 77:513-23, 1994)、また隣接RyR2-チャンネル間の共役的開閉(coupled gating)を容易にして(Marx等, 個々の骨格筋のCa2+-放出チャンネル(リアノジンレセプタ)間の共役的開閉, Science, 281:818-21, 1998)、それにより心臓サイクルの静止段階におけるチャンネルの異常(迷入的)な活性化を防止する。
【０００７】
プロテインキナーゼ(PKA)による、心臓のRyR2のホスホリル化は、「闘争又は逃避」応答の重要な部分であり、これは与えられたトリガーに対して放出されるCa2+の量を増すことにより、心臓のEC-カップリングゲインを高める(Marks, A.R., 心臓の細胞内カルシウム放出チャンネル：心不全における役割, Circ. Res., 87:8-11, 2000)。このシグナリング経路は、ストレスに応答する、交感神経系の活性化が、このストレス応答の代謝要求を満たすのに必要な高い心臓出力をもたらす、メカニズムを与える。カテコールアミンが結合する際に、β1-及びβ2-アドレナリンレセプタは、刺激性G-タンパク、Gαsを介してアデニリルシクラーゼを活性化する。アデニリルシクラーゼは、細胞内cAMPレベルを高め、これはcAMP-依存性のPKAを活性化する。RyR2のPKAホスホリル化は、チャンネル複合体からのカルスタビン2(FKBP12.6)の解離によって、チャンネルの開放確率を高める。これは、引続きCa2+-依存性活性化に対するRyR2の感受性を高める(Hain等, ホスホリル化は、心筋由来の筋小胞体のカルシウム放出チャンネルの機能を変調する；J. Biol. Chem., 270:2074-81, 1995; Valdivia等, 心臓リアノジンレセプタの迅速適合：Mg2+及びホスホリル化による調節, Science, 267:1997-2000, 1995; Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル由来のFKBP12.6(リアノジンレセプタ)を解離する：心臓機能の低下における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000)。
【０００８】
機能低下した心臓(例えば、心不全を患っている患者、及び心不全の動物モデルにおける心臓)は、慢性的なアドレナリン過剰刺激を含む不適応応答によって特徴付けられる(Bristow等, 機能低下したヒトの心臓における、低下したカテコールアミン感受性及びβ-アドレナリンレセプタ密度; N. Engl. J. Med., 307:205-11, 1982)。心不全におけるこの刺激の病原的重要性は、β-アドレナリン刺激及び左心室心筋壁ストレスを低下させ、かつ心室のリモデリングを強力に逆転させる治療上の戦略によって、支持されている(Barbone等, 重篤な心不全に罹っている患者における、左右心室応答対左心室アシストデバイスによる維持の比較：機械的な負荷のない基本的な逆転リモデリングの主な役割；Circulation, 104:670-75, 2001; Eichhorn & Bristow, 医学療法は、慢性的に機能低下した心臓の生物学的な特性を改善できる：心不全の治療における新世紀；Circulation, 94:2285-96, 1996)。心不全においては、慢性的β-アドレナリン刺激は、心臓におけるβ-アドレナリンレセプタの活性化と関連しており、活性化は、G-タンパクとのカップリングを通して、アデニリルシクラーゼを活性化し、結果的に細胞内cAMP濃度を高める。cAMPは、cAMP-依存性PKAを活性化し、後者は、RyR2の過度のホスホリル化を誘発することが示されていた。従って、慢性的な心不全は、慢性的な過アドレナリン状態にあり(Chidsey等, 鬱血性心不全に罹っている患者において使用するための、血漿ノルエピネフリン応答の増強；N. Engl. J. Med., 267:650, 1962)、この状態は、RyR2のPKA過剰ホスホリル化を含む幾つかの病理的結果をもたらす(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000)。
【０００９】
RyR2のPKA過剰ホスホリル化は、心不全における低下した収縮機能及び不整脈増強に寄与する因子として提案された(Marks等, 心不全の進行：プロテインキナーゼは、リアノジンレセプタの過剰ホスホリル化の寄与因子か？Circulation, 105:272-75, 2002; Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000)。この仮説と一致して、機能低下した心臓におけるRyR2のPKA過剰ホスホリル化は、動物モデル及び心臓の移植を受けた心不全患者両者において、インビボにて、明らかにされた(Antos等, プロテインキナーゼAの構成的(constitutive)活性化に起因する拡張型心筋症及び突然死; Circ. Res., 89:997-1004, 2001; Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000; Ono等, 心不全における異常なCa2+-放出の原因としての、リアノジンレセプタとFKBP12.6との変更された相互作用；Cardiovasc. Res., 48:323-31, 2000; Reiken等, β-アドレナリンレセプタ遮断剤は、心不全における、心臓のカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)構造及び機能を回復させる；Circulation, 104:2843-48, 2001; Semsarian等, L-型のカルシウムチャンネル阻害剤ジルチアゼムは、マウスモデルにおける心筋症を阻害する；J. Clin. Invest., 109:1013-20, 2002; Yano等, 心不全におけるリアノジンレセプタを介する、異常なCa2+の漏れの原因としての、FKBP12.6対リアノジンレセプタの化学量論的な変化；Circulation, 102:2131-36, 2000)。
機能低下した心臓において、PKAによるRyR2の過度のホスホリル化は、RyR2チャンネル由来の調節性FKBP12.6サブユニットの解離を誘発する(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000)。これは、RyR2チャンネルの生物物理学的な特性における、顕著な変化を引起す。このような変化は、Ca2+-依存性の活性化に対する高い感受性のために、増大された開放確率(Po) (Brillantes等, FK506-結合タンパクによる、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化； Cell, 77:513-23, 1994; Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca2+-放出チャンネルに及ぼす、ラパマイシンの作用, Circ. Res., 78:990-97, 1996); サブコンダクタンス状態をもたらす、チャンネルの脱安定化；及び不完全なEC-カップリング及び心臓の機能不全をもたらす、チャンネルの損傷を受けた共役ゲート開閉(Marx等, 個々の骨格筋のCa2+-放出チャンネル(リアノジンレセプタ)間の共役的開閉； Science, 281:818-21, 1998)によって証拠付けられる。従って、PKA-過ホスホリル化RyR2は、低レベルのCa2+-刺激に対して極めて敏感であり、またこれは、それ自身、過ホスホリル化チャンネルを介するSR Ca2+の漏洩として現れる。
【００１０】
心不全におけるストレスに対する不適応は、チャンネルの巨大分子複合体由来のFKBP12.6の枯渇をもたらす。これは、Ca2+-誘発性Ca2+放出に対するRyR2の感度の左方へのシフトに導き、結果として、チャンネルは、低〜中度の[Ca2+]においてより活性となる(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000; Yamamoto等, 頻脈-誘発性心不全における心臓の筋小胞体からの異常なCa2+放出; Cardiovasc. Res., 44:146-55, 1999; Yano等, 心不全におけるリアノジンレセプタを介する、異常なCa2+の漏れの原因としての、FKBP12.6対リアノジンレセプタの化学量論的な変化；Circulation, 102:2131-36, 2000)。ある期間に渡り、この増大したRyR2を介する「漏洩」は、SR Ca2+含有率の、低レベルへの再設定を結果し、これが更に、ECカップリングゲインを減じ、かつ障害を受けた収縮期の収縮能(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する：機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000)に寄与する。
特に「漏洩性の高い」RyR2チャンネルの亜集団が、心臓サイクルの静止段階、拡張期において、SR Ca2+を放出できる。これは、脱分極後に遅延(DAD)することが知られている心筋細胞膜の脱分極をもたらし、この脱分極が、致死性の心室性心不整脈を誘発することが知られている(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死と関連した、FKBP12.6欠乏及び不完全なカルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 113:829-40, 2003)。
構造的に正常な心臓において、同様な現象を検討することができる。詳しくは、運動及びストレスが、心臓内のβ-アドレナリンレセプタを活性化する、カテコールアミンの放出を誘発することが知られている。β-アドレナリンレセプタの活性化が、RyR2チャンネルの過ホスホリル化に導く。証拠は、またβ-アドレナリンレセプタの活性化に起因する、このRyR2の過ホスホリル化が、変異されたRyR2チャンネルを、心臓サイクルの弛緩段階において、より一層開放性のものとし、結果的に不整脈の発生頻度を高めることを示唆している。
【００１１】
心不整脈は構造的に正常な心臓におけるSR Ca2+の漏洩と関連していることが知られている。これらの場合において、心室性頻拍の誘導及び維持に関する最も一般的なメカニズムは、異常な自動能である。不整脈を開始することが知られている、異常な自動能の一形態は、SR Ca2+の異常な放出に関連し、これがDADsを開始する(Fozzard H.A., 後脱分極及び開始された活動, Basic Res. Cardiol., 87, 105-13, 1992; Wit & Rosen, 心不整脈の病理生理学的メカニズム, Am. Heart J., 106:798-811, 1983)。DADsは、心臓活動電位の再分極後に起こる、心筋細胞における異常な脱分極である。DADsをもたらす、異常なSR Ca2+の放出に係る分子的な基礎は、完全には解明されていない。しかし、DADsは、リアノジンによって遮断されることが知られており、これはRyR2が、この異常なCa2+の放出の病因において主要な役割を演じている可能性のあることの証拠を与える(Marban等,フェレットの心室性筋肉における不整脈的遅延及び初期後脱分極のメカニズム, J. Clin. Invest., 78:1185-92, 1986; Song & Belardinelli, ATPが、心筋細胞における後脱分極及び開始された活動の発生を促進する, Am. J. Physiol., 267:H2005-11, 1994)。
【００１２】
以上に鑑みて、RyR2-チャンネルにおける漏洩が、疾患のある心臓及び構造的に正常な心臓両者において、多くの病理的状態と関連していることが明らかである。従って、RyR2の漏洩を修復する方法は、何百万もの患者における心不全、並びに致死性心不整脈、及び細動を予防することを可能とする。
1,4-ベンゾチアゼピンの誘導体、JTV-519（4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン一塩酸塩(k201又はICP-カルスタン(Calstan) 100としても知られている)）は、カルシウムイオンチャンネルの新規な調節剤である。心筋細胞内のCa2+レベルの調節に加えて、JTV-519は、またモルモットの心室細胞におけるNa+流及び内向き整流K+流をも調節し、またモルモットの心房細胞における遅延-整流K+流を阻害する。これらの研究は、カテコールアミン-誘発心筋障害、心筋障害-誘発性筋原線維過収縮、及び虚血/再灌流障害に対して、JTV-519が、強力な心臓保護作用を持つことを示している。実験的な筋原線維過収縮モデルにおいて、JTV-519が、プロプラノロール、ベラパミル、及びジルチアゼムよりも、高い心臓保護作用を持つことが立証されている。実験的なデータは、またJTV-519が、動物モデルにおいて、細胞内Ca2+の過剰放出レベルを減じることにより、心室性虚血/再灌流を効果的に防止することを示唆した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明はRyR2が心房細動及び心室性不整脈（運動-誘発性心臓突然死(SCD)を生じる）を包含する、心不全及び心不整脈を治療し、また予防するためのターゲットであるという驚くべき発見に基いている。ここにおいて説明するように、本発明者等は7種の異なるCPVT変異を持つ突然変異RyR2チャンネルを作成し、それらの機能を研究した。7種全ての変異体は、運動中に刺激を受けた際に、漏洩性(カルシウムの漏洩)となるチャンネルをもたらすような、機能上の欠陥を有していた。本発明者等の研究は、まずSRカルシウムの漏洩が、DADを引起すメカニズムを同定することである。注目すべきことに、チャンネルを構成する変異CPVTチャンネルにおける欠陥が、終末期の心不全、即ち致死性の心不整脈の高い発症率によって特徴付けられる疾患、に罹っている患者の心臓における漏洩性のチャンネルであるように思われる。従って、本発明者等は、CPVTにおけるVTのメカニズムが、心不全におけるVTのメカニズムと同一であることを本明細書で実証する。
本発明者等はまた化合物の1,4-ベンゾチアゼピンファミリーの一員である、JTV-519(k201又はICP-カルスタン100)が、RyR2チャンネルにおける漏洩を修復することをここに開示する。本発明者等がここに示すように、JTV-519はFKBP12.6とPKA-ホスホリル化RyR2との結合性、及び変異体RyR2との結合性(変異体RyR2は、FKBP12.6と結合しない場合には、これに対して低いアフィニティーを持つか、あるいは結合しない)を高める。JTV-519のこの作用は致死性心不整脈(心臓死)を開始させ、かつ心不全における心房/心室細動及び心筋機能不全に寄与するRyR2の漏洩を修理する。
従って、一局面において、本発明は新規1,4-ベンゾチアゼピン中間体及び誘導体だけでなく、これらの合成方法、及びこれらのアッセイ方法を提供する。或る実施態様において、これらの新規1,4-ベンゾジアゼピン中間体及び誘導体として、下記のものが挙げられる。
【００１４】
【化１】
2008534497.tif 000002
【００１５】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
【００１６】
【化２】
2008534497.tif 000003
【００１７】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
【００１８】
【化３】
2008534497.tif 000004
【００１９】
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）
【００２０】
【化４】
2008534497.tif 000005
【００２１】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつXはNH又はOである）、及び
【００２２】
【化５】
2008534497.tif 000006
【００２３】
（式中、R1はフェニル環の２位、３位、４位、又は５位の、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール、又はＨであり、R2はＨ、アルキル、又はアリールであり、かつR3はＨ、アルキル、又はアリールである）
付加的な実施態様は下記の化合物を含んでもよい：S7、S-20、S-25、S-27、及びS36（図８に示される）。
又、対象におけるRyR2結合FKBP12.6のレベルの減少を制限もしくは防止する方法、対象における心不全、心房細動、もしくは運動誘発心不整脈を治療もしくは予防する方法、及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法における新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物の使用が提供される。
更なる局面において、本発明はRyR2及びFKBP12.6の結合を高める薬剤を同定する方法を提供するものであり、この方法は (a) RyR2の源を得、あるいはこれを生成する工程；(b) RyR2を、候補薬剤の存在下でFKBP12.6に暴露する工程；及び(c)薬剤がRyR2及びFKBP12.6の結合を高めるかどうかを測定する工程を含む。或る実施態様において、RyR2はホスホリル化されなくてもよく、PKA-ホスホリル化されてもよく、又はPKA-過剰ホスホリル化されてもよい。又、この方法によって同定された薬剤、及び対象におけるRyR2結合FKBP12.6のレベルの減少を制限もしくは防止する方法、対象における心不全、心房細動、もしくは運動誘発心不整脈を治療もしくは予防する方法、及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法におけるその薬剤の使用が提供される。
更に別の局面において、本発明はRyR2及びFKBP12.6の結合を高める薬剤を同定する方法を提供するものであり、この方法は (a)FKBP12.6の源を得、あるいはこれを生成する工程；(b)FKBP12.6を、候補薬剤の存在下でRyR2に暴露する工程；及び(c)薬剤がRyR2及びFKBP12.6の結合を高めるかどうかを測定する工程を含む。或る実施態様において、RyR2はホスホリル化されなくてもよく、PKA-ホスホリル化されてもよく、又はPKA-過剰ホスホリル化されてもよい。又、この方法によって同定された薬剤、及び対象におけるRyR2結合FKBP12.6のレベルの減少を制限もしくは防止する方法、対象における心不全、心房細動、もしくは運動誘発心不整脈を治療もしくは予防する方法、及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法におけるその薬剤の使用が提供される。
本発明の追加の局面は、以下の記載に照らして明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
上で論じた如く、カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)は、構造的に正常な心臓を持つ個体の遺伝性の疾患である。それは、ストレスにより誘発される心室頻拍、突然心臓死(SCD)を引起す可能性のある致死性の不整脈によって特徴付けられる。筋小胞体(SR)上に位置する、RyR2チャンネルにおける変異は、CPVTと結合している。CPVTにおける致死性の心不整脈の基礎となる分子的なメカニズムを決定するために、本発明者等は、CPVT-関連変異RyR2チャンネル(例えば、S2246L、R2474S、N4104K、R4497C)を研究した。
【００２５】
CPVTを持つ全ての個体が運動誘発心不整脈を有する。本発明者らは運動誘発不整脈及び突然死（CPVTを持つ患者における）がRyR2に関するFKBP12.6の低下されたアフィニティーから生じることを既に示していた。ここで、本発明者らは運動がアデノシン3',5'-一リン酸塩(cAMP)依存性プロテインキナーゼ(PKA)によるホスホリル化の結果としてRyR2を活性化することを実証した。基本的な条件下で、平坦な脂質二重層において、正常な機能を有する変異RyR2チャンネルは、PKAホスホリル化による活性化に対してより敏感であり、このことは、野生型のチャンネルと比較して、高い活性(開放確率)及び長い開放状態を示す。更に、PKA-ホスホリル化変異RyR2チャンネルは、そのチャンネルの生理的な阻害剤であるMg2+による阻害に対して抵抗性であり、またFKBP12.6(閉鎖状態にあるチャンネルを安定化する)に対する低い結合性を示した。これらの知見は、運動中に、RyR2チャンネルがPKA-ホスホリル化される場合、変異CPVTチャンネルが、心臓サイクル(拡張期)の弛緩段階においてより開放状態になり易く、そのためにSR Ca2+漏れにより誘発される、不整脈の発生し易さが高くなる。心不全は、世界的に第一の死因であり、RyR2における漏れの修復方法が、何百万もの患者における致死的な不整脈を防止することができる。
本発明者等は、ここにおいて更に、JTV-519、即ち1,4-ベンゾチアゼピン誘導体が、FKBP12.6遺伝子に対してヘテロ接合性の、マウスにおける致死性の心室性不整脈を防止することを実証した。JTV-519はPKA-ホスホリル化RyR2についてのFKBP12.6のアフィニティーを増大することにより、運動後に死亡したFKBP12.6+/-マウスから分離された、RyR2の開いた可能性を減少した。更に、JTV-519はFKBP12.6結合アフィニティーを増大することによりCPVT-関連変異体RyR2チャンネルのゲーティングを標準化した。これらのデータはJTV-519がFKBP12.6-RyR2結合アフィニティーを増大することにより致死性心室不整脈を予防し得ることを示す。
【００２６】
治療及び予防の新規モデル
上記の記載によれば、本発明は、対象の細胞内のRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を制限し又は防止する方法を提供する。ここで使用する「FKBP12.6」とは、「FKBP12.6タンパク」及び「FKBP12.6類似体」両者を含む。ここでは、特に示さない限り、「タンパク」とは、タンパク、タンパクドメイン、ポリペプチド、又はペプチド、及びこれらのあらゆるフラグメントを含むものとする。「FKBP12.6類似体」は、FKBP12.6の生物学的な活性を持つ、FKBP12.6タンパクの機能性の変異体であり、これは60%又はそれ以上の、FKBP12.6タンパクとの、アミノ酸配列相同性を持つものである。更に、ここで使用する用語「FKBP12.6の生物学的な活性」とは、ここに記載するアッセイ条件下で、未-ホスホリル化又は非-過ホスホリル化RyR2と、物理的に会合又はこれらと結合する(即ち、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を持つことが立証されているが、アフィニティーは、FKBP12.6のものとは異なっていても良い、タンパク又はペプチドの活性を意味する。
更に、ここで使用する「RyR2」とは、「RyR2タンパク」及び「RyR2類似体」両者を含む。「RyR2類似体」とは、RyR2の生物学的な活性を持つ、RyR2タンパクの機能性の変異体であって、これは60%又はそれ以上の、RyR2タンパクとの、アミノ酸配列相同性を持つものである。ここで使用する「RyR2類似体」とは、RyR2の骨格筋イソ型である、RyR1を包含する。本発明のRyR2は、ホスホリル化されていなくても、ホスホリル化されていても(例えば、PKAによって)、あるいは過ホスホリル化されていてもよい(例えば、PKAにより)。更に、ここで使用する用語「RyR2の生物学的な活性」とは、ここに記載するアッセイ条件下で、FKBP12.6と、物理的に会合又はこれと結合する(即ち、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を示すことが立証されているが、アフィニティーは、RyR2のものとは異なっていても良い、タンパク又はペプチドの活性を表す。
【００２７】
上記のように、心臓リアノジンレセプタである、RyR2は、4つの12,000ダルトンのFKBP12.6タンパクと結合状態にある、4つの565,000ダルトンを持つRyR2タンパクを含む、タンパク複合体である。FK506結合タンパク(FKBPs)は、広範に発現されている、また様々な細胞機能を果たす、シス-トランス型ペプチジル-プロリルイソメラーゼである。FKBP12.6タンパクは、RyR2としっかりと結合し、かつその機能を調節する。FKBP12.6は、RyR2チャンネルと、RyR2サブユニット当たり1分子宛結合して、RyR2-チャンネル機能を安定化し、しかも隣接するRyR2チャンネル間の共役的ゲート開閉を容易にし、結果として心臓サイクルの静止段階中の、チャンネルの異常な活性化を防止する。従って、ここで使用する用語「RyR2-結合FKBP12.6」とは、RyR2タンパクサブユニットと結合したFKBP12.6タンパクの分子、又はRyR2のテトラマーと結合状態にあるFKBP12.6のテトラマーを包含する。
本発明の方法によれば、対象の細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける「減少」とは、対象の細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける検出可能な減少、減衰、又は低下を意味する。この減少が、JTV-519(以下に記載するような)を投与することによって、何れにしろ、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルが、JTV-519の不在下において見られるレベルよりも高くなるように、停止され、妨害され、妨げられ、邪魔され、又は低下される場合に、このような減少は、対象の細胞内で制限され又は防止される。
【００２８】
対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルは、既知技術から容易に測定できるもの(例えば、免疫学的な技術、ハイブリッド化分析、免疫沈降、ウエスタン-ブロット分析、蛍光造影技術、及び/又は放射線技術等)を包含する標準的なアッセイ及び技術、並びにここに開示するあらゆるアッセイ及び検出技術によって検出できる。例えば、タンパクは、当分野において知られている標準的な方法を利用して、対象の細胞から単離及び精製することができる。ここで、標準的な方法とは、細胞からの抽出(例えば、タンパクを可溶化する洗浄剤を用いた抽出、この場合必要ならば、カラム上でのアフィニティー精製を伴う)、クロマトグラフィー(例えば、FTLC及びHPLC)、免疫沈降(抗体を使用)、及び沈殿法(例えば、イソプロパノール及びトリゾール(Trizol)等の試薬を使用)を含むが、これらに限定されない。タンパクの単離及び精製後には、電気泳動(例えば、SDS-ポリアクリルアミドゲル上)を行っても良い。対象におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルの減少、あるいはその制限又は防止は、JTV-519の投与 (例えば、以下に記載する方法による)に先立って検出された、RyR2-結合FKBP12.6の量と、JTV-519の投与後の、適当な時点において検出された量とを比較することによって、決定することができる。
本発明の方法において、対象の細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルの減少は、例えば、対象におけるFKBP12.6及びRyR2の解離を阻害し；対象の細胞におけるFKBP12.6とRyR2との間の結合性を高め；あるいは対象の細胞におけるRyR2-FKBP12.6複合体を安定化することにより、制限し又は防止することができる。ここで使用する用語「解離の阻害」とは、対象の細胞におけるRyR2分子からのFKBP12.6サブユニットの物理的な解離又は分離を遮断し、減少させ、阻害し、制限し又は防止すること、及び対象の細胞におけるFKBP12.6サブユニットからのRyR2分子の物理的な解離又は分離を遮断し、減少させ、阻害し、制限し又は防止することを含む。更に、ここで使用する用語「結合性を高める」とは、ホスホリル化されたRyR2の、対象の細胞内で、FKBP12.6と物理的に結合する(例えば、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を増強し、高め、又は改善すること、及びFKBP12.6の、対象の細胞内で、ホスホリル化されたRyR2と物理的に結合する(例えば、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を増強し、高め、又は改善することを含む。更に、本発明の方法では、対象の細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6のレベルの減少は、対象におけるホスホリル化されたRyR2のレベルを直接減じ、あるいは細胞におけるホスホリル化されたRyR2のレベルを間接的に減じる(例えば、該細胞内のホスホリル化されたRyR2の機能又はレベルを、調節又は変調する酵素(例えば、PKA)又は他の内在性分子で攻撃させる)ことにより、制限し又は防止することができる。好ましくは、細胞におけるホスホリル化されたRyR2のレベルは、本発明の方法において少なくとも10%減じられる。より好ましくは、ホスホリル化されたRyR2のレベルは、少なくとも20%低下される。
【００２９】
本発明の方法によれば、RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少が対象、特に対象の細胞において制限され、又は防止される。本発明の対象は、両生類、鳥類、魚類、哺乳類及び有袋類を包含するあらゆる動物であり得るが、好ましくは哺乳動物(例えば、ヒト、家畜動物、例えばネコ、イヌ、サル、マウス又はラット、あるいは商業動物、例えばウシ又はブタ)である。更に、本発明の対象は、運動誘発心不整脈の候補者である。運動誘発心不整脈は対象が肉体的運度を行なう間／後に発生する心臓状態 (例えば、心臓突然死をもたらすあらゆるものを含む、心室細動又は心室頻拍症)である。運動-誘発性心不整脈に関する「候補」は、肉体的な運動中/その後に、心不整脈を発症する危険性のあることが知られている、あるいは危険性があると思われる、あるいはその状態に罹っていると推定される対象である。運動-誘発性心不整脈に関する「候補」の例は、カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)に罹っていることが知られている動物/ヒト；CPVTに罹っているものと推定される動物/ヒト；及び肉体的な運動中/その後の、運動を始めようとしている、現在運動中の、又はまさに運動を完了したものの、心不整脈を発症する危険性のあることが知られている、あるいは危険性があると思われる、あるいはその状態に罹っていると推定される動物/ヒトを含むが、これらに制限されない。上で論じた如く、CPVTは、構造的に正常な心臓を持つ個体における遺伝的な障害である。それは、ストレス-誘発性心室頻拍症、即ち心臓突然死を引起す恐れのある、致死性の不整脈によって特徴付けられる。CPVTに罹っている対象において、肉体的な力の発揮及び/又はストレスが、検出し得る構造上の心臓疾患のない場合に、心臓突然死(SCD)に導く、二方向性の及び/又は多形性の心室頻拍症を誘発する。CPVTに罹っている個体は、運動した際に心室性不整脈を起こすが、静止中に不整脈を起こすことはない。
【００３０】
本発明の方法において、対象の細胞は、好ましくは横紋筋細胞である。横紋筋は、収縮性筋原線維の繰返し単位(サルコメア)が、細胞全体に、縞状に(in registry)配列され、光学顕微鏡のレベルで観測できる、横断又は斜走線を与える、筋肉である。横紋筋細胞の例は、随意(骨格)筋細胞及び心筋細胞を含むが、これらに制限されない。好ましい一実施態様では、本発明の方法において使用する細胞は、ヒトの心筋細胞である。ここで使用する用語「心筋細胞」とは、心筋線維、例えば心臓の心筋層に見られるものを包含する。心筋線維は、境界膜において端部同士が接合している、連続する心臓の筋肉細胞、又は心筋細胞の連鎖で構成される。これらの境界膜は、2種の細胞接合部、即ちこれらの横方向の部分に沿って伸びた、伸縮性デスモソーム、及びギャップ接合体を持ち、その最長のものは、それらの長手方向の部分に沿って配置されている。
【００３１】
本発明の方法では、対象にJTV-519を投与することにより、対象の細胞中の、RyR2-結合FKBP12.6レベルにおける減少を、制限し又は防止する。故に、又、対象の細胞とJTV-519との間の接触が可能となる。k201としても知られている、JTV-519(4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン一塩酸塩)は、1,4-ベンゾチアゼピンの誘導体であり、かつカルシウム-イオンチャンネルの調節剤である。心筋細胞におけるCa2+-レベルの調節に加えて、JTV-519は、モルモットの心室細胞内の、Na+流及び内側整流体K+流を変調し、またモルモットの心房細胞内の、遅延整流体K+流を阻害する。FK506及びラパマイシンは、運動誘発心不整脈の候補である対象の細胞におけるRyR2-FKBP12.6複合体を安定化する、他の化合物を設計するのに使用できる薬物である。FK506及びラパマイシン両者は、RyR2からFKBP12.6を解離する。これら薬物と構造的に関連性を持つが、逆の作用を持つ化合物を設計し及び/又はスクリーニングすることが可能である。
【００３２】
本発明の方法において、JTV-519は、これと医薬上許される担体とを含む、治療組成物として、対象に投与することができる。医薬上許される担体は、その組成物の他の成分と相溶性であり、かつそのレシピエントにとって有害でないという意味で、「許される」ものである必要がある。ここで使用する医薬上許される担体は、医薬処方物用の材料として使用される、様々な有機又は無機物質から選択され、これらは、鎮痛剤、バッファー、バインダ、崩壊剤、希釈剤、乳化剤、賦形剤、増量剤、滑剤(glidants)、可溶化剤、安定化剤、懸濁剤、張度調節剤、ビヒクル、及び粘度上昇剤として配合することができる。必要ならば、医薬添加剤、例えば酸化防止剤、芳香剤、着色剤、矯味剤、保存剤、及び甘味料を添加することもできる。医薬上許される担体の例は、特にカルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、グリセリン、アラビアガム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、粉末、塩水、アルギン酸ナトリウム、スクロース、デンプン、タルク、及び水を含む。
本発明の医薬処方物は、製薬の分野において周知の方法で製造することができる。例えば、JTV-519を、懸濁液又は溶液として、担体又は希釈剤と併合することができる。場合によっては、1又はそれ以上の副成分(例えば、バッファー、矯味剤、界面活性剤、等)を、添加することもできる。担体の選択は、投薬経路に依存するであろう。
【００３３】
JTV-519は、インビボにおいて、対象内のターゲット細胞(例えば、心筋細胞)を、JTV-519と接触させることにより、対象に投与することができる。JTV-519は、タンパク、核酸及びその他の薬物を導入し、また投与するのに利用されている、既知の技術を利用して、対象の細胞と接触させることができる。これらの細胞とJTV-519とを接触させる(即ち、後者で細胞を治療するための)方法の例は、吸収法、エレクトロポレーション、浸漬、注射、導入、リポソーム放出、トランスフェクション、輸液、ベクタ、及び他の薬物放出ビヒクル、及び方法を含むが、これらに制限されない。ターゲット細胞が、対象の特定の位置に局在している場合、注射又は幾つかの他の手段(例えば、血液又は他の体液への、JTV-519の導入)によって、該JTV-519を直接該細胞に導入することが望ましい場合がある。ターゲット細胞は、対象の心臓組織中に含まれていても良く、また既知技術から容易に決定できる、標準的な検出法によって、対象の心臓組織内で検出することも可能であり、検出法の例としては、免疫学的な技術(例えば、免疫組織化学的染色法)、蛍光造影技術、及び顕微鏡技術を含むが、これらに制限されない。
更に、本発明のJTV-519は、経口投与、腸管外投与、及び経皮投与を含むが、これらに制限されない、既知の手順でヒト又は動物の対象に投与できる。好ましくは、JTV-519は、筋膜上、被膜内、頭蓋内、皮内、鞘内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、血管内、静脈内、実質、皮下、又は舌下注射、又はカテーテルにより腸管外投与される。
一実施態様によれば、薬剤は、対象の心臓に挿入されたカテーテルを介する、心臓筋肉にターゲット的放出により、対象に投与される。
経口投与のためには、JTV-519処方物は、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤として、又は懸濁剤として提供することができる。処方物は、通常の添加剤、例えばラクトース、マニトール、コーンスターチ、又はポテトスターチを含むことができる。処方物は、またバインダ、例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンと共に処方することもできる。更に、処方物は、コーンスターチ、ポテトスターチ、又はナトリウムカルボキシメチルセルロース等の崩壊剤と共に処方することもできる。同様に、処方物は、二塩基性無水燐酸カルシウム又はナトリウムデンプングリコレートと共に、処方することもできる。最後に、処方物は、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤と共に処方することもできる。
【００３４】
腸管外投与(即ち、消化管以外の経路を介する注射による投与)のためには、JTV-519は、好ましくは対象の血液に対して等張性である無菌水性溶液と組み合わせることができる。このような処方物は、固形活性成分を、生理的に許容される物質、例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み、また生理的条件と一致する緩衝されたpHを有する水に溶解して、水性溶液を製造し、次いで前記溶液を滅菌することにより製造できる。この処方物は、単位用量又は多数の用量を含む容器、例えば封止したアンプル又はバイアルビン中に処方できる。この処方物は、筋膜上、被膜内、頭蓋内、皮内、鞘内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、血管内、静脈内、実質、皮下、又は舌下を含むが、これらに制限されない注射により、又はカテーテルにより、対象の心臓内に放出することができる。
経皮投与のためには、JTV-519は、皮膚浸透性増強剤、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、N-メチルピロリドン等と組合わせることができ、これらは皮膚のJTV-519に対する浸透性を増し、かつJTV-519が、皮膚を透過して、血流内に浸入することを可能とする。このJTV-519/増強剤組成物は、更にポリマー物質、例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン/ビニルアセテート、ポリビニルピロリドン等と組合わせて、塩化メチレン等の溶媒に溶解でき、所望の粘度にまで蒸発させ、次いで支持体材料に適用し、貼付剤を製造することもできる。
【００３５】
本発明の方法によれば、対象、特に対象の細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量で、JTV-519を対象に投与する(及びJTV-519を対象の細胞と接触させる)ことができる。この量は、既知の手順に従って、当業者が容易に決定でき、既知の手順は、インビボで確立された滴定曲線の解析、及びここに記載する方法並びにアッセイを含む。対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な、JTV-519の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にあり、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。好ましくは、JTV-519の量は、約10mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある。
本発明の一実施態様において、対象は、未だ運動-誘発性心不整脈を発症していない。この場合、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な、JTV-519の量は、対象内の、運動-誘発性心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の量であり得る。心不整脈は心拍数又は心臓リズムの異常として発現する心臓の電気的活動の乱れである。ここに使用される“運動誘発心不整脈を予防するのに有効な”JTV-519の量は運動誘発心不整脈の臨床的障害又は症候（例えば、動悸、失神、心室細動、心室頻拍、及び心臓突然死）の発生を予防するのに有効なJTV-519の量を含む。対象における運動誘発心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の量は、運動誘発心不整脈の型、対象の体重、対象の症状の重度、及びJTV-519の投与の様式を含む、夫々の症例の特別な因子に応じて変化するであろう。この量は、既知の手順に基いて、当業者が容易に決定でき、その既知の手順は、臨床的な試み、及びここに記載する方法を含む。好ましい実施態様において、運動-誘発性心不整脈を防止するのに有効なJTV-519の量は、対象における、運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有効なJTV-519の量である。別の好ましい実施態様では、JTV-519)は、対象における、運動-誘発性心不整脈及び運動-誘発性心臓突然死を予防する。
【００３６】
JTV-519が、RyR2-結合FKBP12.6を安定化し、かつ動的なRyR2のPKA-ホスホリル化と脱ホスホリル化との関連におけるバランスを維持し、かつ回復する能力を持つことから、JTV-519は、また運動誘発心不整脈の臨床的な症状を示し始めている対象を、治療する上で有益である。不整脈の症候が、対象において十分に早期に観測されている場合には、JTV-519は、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの更なる減少を、制限又は防止する上で有効であり得る。
従って、本発明の他の実施態様では、対象は、かつて運動しており、あるいは現在運動しており、また運動-誘発性心不整脈を発症していた。この場合、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効なJTV-519の量は、対象における、運動-誘発性心不整脈を治療するのに有効な、JTV-519の量であり得る。ここで使用する用語、「運動-誘発性心不整脈を治療するのに有効な」JTV-519の量とは、運動-誘発性心不整脈の臨床的な機能障害又はその症候（例えば、動悸、失神、心室細動、心室頻拍症、及び心臓突然死）を軽減し又は改善するのに有効なJTV-519の量を包含する。対象における、運動-誘発性心不整脈を治療するのに有効なJTV-519の量は、運動-誘発性心不整脈の種類、対象の体重、対象の症状の重篤度、及びJTV-519の投与モードを含む、各場合における特定の因子に依存して変動するであろう。この量は、既知の手順に基いて、当業者が容易に決定することができ、既知の手順とは、臨床的な試み、及びここに開示する方法を含む。好ましい実施態様において、JTV-519は、対象における、運動-誘発性心不整脈を治療する。
【００３７】
本発明は、更に対象における、運動-誘発性心不整脈を治療する方法をも提供する。その方法は、対象における、運動-誘発性心不整脈を治療するのに有効な量で、対象にJTV-519を投与することを含む。対象における、運動-誘発性心不整脈を治療するのに有効なJTV-519の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にあり、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。本発明は、また対象における、運動-誘発性心不整脈を予防する方法をも提供する。その方法は、対象における運動-誘発性心不整脈を予防するのに有効な量で、対象にJTV-519を投与することを含む。対象における、運動-誘発性心不整脈を予防するのに有効なJTV-519の好適な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にあり、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。更に、本発明は対象における運動誘発心臓突然死を予防する方法を提供する。その方法は対象における運動誘発心臓突然死を予防するのに有効な量のJTV-519を対象に投与することを含む。対象における運動誘発心臓突然死を予防するのに有効なJTV-519の好適な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にあり、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。
【００３８】
上記方法の様々な態様において、対象における運動-誘発性心不整脈は、VTと関連している。好ましい実施態様において、VTは、CPVTである。これら方法の別の実施態様では、対象は、運動-誘発性心臓突然死に関する候補を包含する、運動-誘発性心不整脈に関する候補である。
上記方法に鑑みて、本発明は、また運動-誘発性心不整脈の候補である対象内での、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法における、JTV-519の使用をも提供する。本発明は、また対象内での、運動-誘発性心不整脈を治療し又は予防する方法における、JTV-519の使用をも提供する。更に、本発明は対象における運動誘発心臓突然死を予防する方法におけるJTV-519の使用を提供する。
【００３９】
上で議論し、またここに提示した如く、本発明者等のデータは、セリン2809上の、心臓リアノジンレセプタ、RyR2の、タンパクキナーゼA(PKA)によるホスホリル化が、FK506結合タンパク、FKBP12.6を放出することによって、チャンネルを活性化することを示している。機能低下した心臓(心不全のヒトの心臓及びその動物モデルを含む)においては、RyR2が、PKA-過ホスホリル化されており、結果として低下したFKBP12.6の結合量を持つ、不完全なチャンネルをもたらし、またカルシウム-誘発性活性化に対して高い感受性を持つ。これら変化の正味の結果は、RyR2チャンネルが、「漏洩性」となることである。これらチャンネルの漏れは、もはや十分なカルシウムが、筋小胞体(SR)中には存在せず、結果的に筋肉収縮の強烈な刺激を与えるような程度までカルシウムの細胞内貯蔵量の枯渇をもたらす可能性がある。このことは、心筋の弱い収縮をもたらす。このチャンネル漏洩の第二の結果として、RyR2チャンネルは、「拡張期」として知られる、心臓サイクルの静止段階中に、カルシウムを放出する。この拡張期中のカルシウムの放出は、心臓突然死(SCD)を引起す、該心臓の致死的な不整脈(例えば、心室頻拍症及び心室細動)を誘発し得る。
本発明者等は、また心臓を静止状態に置き、かつ正常化された機能を回復させる、左心室アシストデバイス(LVAD)と呼ばれる、機械的なポンプ輸送デバイスによる、心不全の治療が、RyR2のPKA-過ホスホリル化、及びチャンネルの正常化された機能の低下と関連していることをも示した。更に、本発明者等は、イヌ(ペーシング-誘発性心不全を持つ)の、β-アドレナリン遮断剤(β-遮断剤)による治療が、RyR2のPKA-過ホスホリル化を反転させることを示した。β-遮断剤は、PKAを活性化する経路を阻害する。本発明者等の研究結果から誘導できる結論は、以下のようなものである：RyR2のPKA-ホスホリル化は、チャンネルの活性を高め、結果的に、チャンネルの所定のトリガー(活性化剤)に対して、該細胞により多くのカルシウムを放出する。
【００４０】
ここで更に開示するように、本発明者等は、運動-誘発性心臓突然死が、RyR2タンパク(特に、CPVT-関連RyR2変異タンパク)のホスホリル化における増加、及びRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少と関連していることを立証した。このメカニズムを、このような運動-誘発性心臓突然死の予防にとって効果的な薬物の設計に利用できる。RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限し、あるいは防止する能力を有する候補薬物は、この活性の制限又は阻害の結果として、RyR2-関連生物学的事象に及ぼす作用を持つことができ、結果として運動-誘発性心臓突然死を予防する。
従って、本発明は、更に運動-誘発性心臓突然死を予防するのに使用するための薬剤を、同定する方法をも提供する。この方法は、(a) RyR2を含む細胞の培養物を得、あるいはこれを生成する工程；(b)細胞と、候補薬剤とを接触させる工程；(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、細胞を暴露する工程；及び(d)薬剤が、細胞内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。ここで使用する用語「薬剤」とは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸(DNA又はRNAを含む)、抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、分子、化合物、抗生物質、薬物、及びこれらのあらゆる組合せを含むものとする。RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する薬剤は、天然又は合成薬剤であり得、またRyR2及び/又はFKBP12.6と反応性の(即ち、これらに対してアフィニティーを持ち、あるいは結合し、もしくはこれらを指向する)薬剤であり得る。更にここで使用する如く、「RyR2-含有」細胞は、RyR2又はその誘導体又は類似体が、天然に発現し、又は天然に発生する、細胞(好ましくは、心筋細胞)である。細胞内で、RyR2のホスホリル化を高めることが知られている状態は、PKAを含むが、これに限定されない。
【００４１】
本発明の方法においては、細胞を、ここに記載した、あらゆる導入並びに投与モードを包含する、薬物/薬剤と細胞との間の接触を行う、標準的な方法の何れかによって、接触させることができる。細胞内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルは、当業者には公知の、又はここに記載した、任意の方法、分子的な手続き、及びアッセイを含む、既知の手順によって、測定又は検出することができる。本発明の一実施態様によれば、薬剤が、細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限し又は阻害する。
ここで論じるように、RyR2は、横紋筋細胞内で、多くの生物学的な事象に関係している。例えば、RyR2チャンネルは、心筋細胞における、ECカップリング及び収縮能において重要な役割を演じていることが明らかにされている。従って、細胞内のRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限し、又は防止するように設計された、予防薬物が、ECカップリング及び収縮能を包含する、多数のRyR2-関連生物学的事象の調節において有用であり得ることは、明白である。このように、本発明の候補薬剤が、一旦スクリーニングされ、かつRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少に対して、適当な制限又は防止作用を持つことが決定されれば、細胞、特に心筋細胞における、ECカップリング及び収縮能に及ぼすその作用について評価することができる。本発明の予防剤が、運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有用であろうことが予想される。
【００４２】
従って、本発明の方法は、更に(e)候補薬剤とRyR2を含有する細胞の培養物とを接触させる工程；及び(f)薬剤が、細胞内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含むことができる。ここで使用する「RyR2-関連生物学的事象」とは、RyR2のレベル又は活性が関連している生化学的又は生理学的な過程を含む。ここに開示したように、RyR2-関連生物学的事象の例は、心筋細胞におけるECカップリング及び収縮能を含むが、これらに制限されない。本発明のこの方法によれば、候補薬剤は、インビトロでの、1又はそれ以上の細胞(好ましくは、心筋細胞)とを接触させることができる。例えば、細胞の培養物は、候補薬剤を含む製剤と共にインキュベートすることができる。従って、RyR2-関連生物学的事象に及ぼす候補薬剤の効果は、あらゆる生物学的アッセイ、又は免疫ブロット法、単チャンネル記録(single-channel recordings)、及びここに開示するあらゆる他の方法を含む、当分野において既知の方法により、評価することができる。
本発明は、更に上記の同定法により同定された薬剤、並びに薬剤及び医薬上許される担体を含む医薬組成物に関する。薬剤は、対象における運動-誘発性心臓突然死を防止するのに、また他のRyR2-関連状態を治療並びに予防するために有益であり得る。ここで使用する、「RyR2-関連状態」とは、RyR2のレベル又は活性が関連している状態、疾患、又は障害であり、またRyR2-関連生物学的事象を包含する。RyR2-関連状態は、対象に、そこにおけるRyR2-関連状態を治療し又は予防するのに有効な量の薬剤を投与することによって、対象内で、治療し又は予防することができる。当業者は、この量を容易に決定することができる。一実施態様において、本発明は、ある対象における、運動-誘発性心臓突然死を、対象における運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有効な量で、対象に薬剤を投与することによって、予防するための方法を提供する。
【００４３】
本発明は、また運動-誘発性心臓突然死を予防するために使用する、薬剤を同定するためのインビボ方法をも提供する。この方法は、以下の諸工程：(a) RyR2を含む動物を得、あるいはこれを発生させる工程；(b)動物に、候補薬剤を投与する工程；(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、動物を暴露する工程；及び(d)薬剤が、動物内で、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。この方法は、更に、(e)薬剤を、RyR2を含有する動物に投与する工程；及び(f)薬剤が、動物内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含むことができる。本発明は、またこの方法により同定された薬剤；薬剤を含む医薬組成物；及び対象における、運動-誘発性心臓突然死を、対象内の運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有効な量で、対象にこの薬剤を投与することによって、予防するための方法をも提供するものである。
本発明者等の研究は、PKAの活性化を妨害する化合物が、RyR2チャンネルの活性化を減じ、結果的に細胞へのカルシウムの放出量を低下するものと予想されることを明らかにした。FKBP12.6結合サイトにおいてRyR2チャンネルと結合するが、チャンネルがPKAによりホスホリル化される場合に、チャンネルを離れることのない化合物は、またPKAの活性化、又はRyR2チャンネルを活性化する他のトリガーに応答して、チャンネルの活性化を減じるものと予想される。このような化合物は、また細胞へのカルシウムの放出量を低下するであろう。これらの知見に鑑みて、本発明は、更に運動-誘発性心臓突然死を予防するに際して、それらがRyR2の活性化を妨害し又は阻害する点で、有益であり得る薬剤を同定するための、付随的なアッセイをも提供する。
【００４４】
例として、本発明の診断アッセイは、カルシウム-感受性の蛍光染料(例えば、フルオ-3(Fluo-3)、フラ-2(Fura-2)等)を使用して、RyR2チャンネルを介する、細胞へのカルシウムの放出についてスクリーニングすることができる。細胞に選択された蛍光染料を添加し、次いでRyR2活性化剤で刺激して、細胞に添加した化合物が、カルシウム-依存性の蛍光シグナルを減じるか否かを決定することができる(Brillants等, FK506-結合タンパク質による、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 77:513-23, 1994; Gillo等, ネズミの赤白血病細胞における、誘導分化の際のカルシウムの流入; Blood, 81:783-92, 1993; Jayaraman等, チロシンのホスホリル化による、イノシトール1,4,5-トリ燐酸レセプタの調節; Science, 272:1492-94, 1996)。カルシウム-依存性の蛍光シグナルは、光電子増倍管で追跡し、また前に記載されたような適当なソフトウエアを用いて解析できる(Brillants等, FK506-結合タンパク質による、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 77:513-23, 1994; Gillo等, ネズミの赤白血病細胞における、誘導分化の際のカルシウムの流入; Blood, 81:783-92, 1993; Jayaraman等, チロシンのホスホリル化による、イノシトール1,4,5-トリ燐酸レセプタの調節; Science, 272:1492-94, 1996)。このアッセイは、マルチウエルディッシュを用いて、多数の化合物をスクリーニングするために、容易に自動化することができる。
【００４５】
RyR2-媒介細胞内カルシウム放出のPKA-依存性活性化を阻害する化合物を同定するために、アッセイは、異種発現系、例えばSf9、HEK293、又はCHO細胞内での、組換えRyR2チャンネルの発現を含むことができる(Brillants等, FK506-結合タンパク質による、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)機能の安定化; Cell, 77:513-23, 1994)。RyR2は、β-アドレナリンレセプタによる、同時発現も可能であった。このことは、β-アドレナリンレセプタアゴニストの添加に応答する、RyR2の活性化に及ぼす、化合物の効果を評価することを可能とする。
心不全の程度と関連する、RyR2のPKA-ホスホリル化のレベルをもアッセイし、次いでRyR2チャンネルのPKA-ホスホリル化を阻害するように設計された、化合物の有効性を決定するのに使用できる。このようなアッセイは、RyR2タンパクに特異的な抗体の使用に基くものであり得る。例えば、RyR2チャンネルタンパクは、免疫沈降させ、次いでPKA及び[γ-32P]-ATPにより、逆-ホスホリル化することができる。次いで、RyR2タンパクに移行する、放射性[32P]標識の量を、リン光造影装置(phosphoimager)を用いて、測定することができる(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)からFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000)。
本発明の別のアッセイは、Ser 2809上でPKA-ホスホリル化される、RyR2を検出する、ホスホエピトープ(phosphoepitope)-特異的抗体の使用を含む。このような抗体を用いた免疫ブロット法は、心不全及び心不整脈に関する療法の効力を評価するのに使用できる。
更に、RyR2 S2809A及びRyR2 S2809Dノック-インマウスを使用して、心不全及び心不整脈に関する療法の効力を評価することができる。このようなマウスは、更に、RyR2 S2809A変異が、心不全及び不整脈を阻害し、かつRyR2 S2809D変異が、心不全及び不整脈を悪化させることを示すことによって、RyR2のPKA-過ホスホリル化が、心不全及び心不整脈における寄与因子であることの、証拠を与える。
【００４６】
新規化合物、これらの合成方法、及びこれらの使用
1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、特に2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、JTV-519を含む生物学的に活性な分子の製造における、重要な結合遮断物質である。本発明者等は、1,4-ベンゾチアゼピン中間体化合物、例えば7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造するための新規な方法を開発した。この本発明者等の方法は、容易に入手でき、かつ高価でない出発物質を利用し、また高収率で主要な1,4-ベンゾチアゼピン中間体を与える。
1990年代初期において、Kaneko等(米国特許第5,416,066号; WO 92/12148; JP4,230,681)は、JTV-519が、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1,4-ベンゾチアゼピン中間体)と、アクリロイルクロリドとを反応させ、次いで得られた生成物と4-ベンジルピペリジンとを反応させることによって、製造できることを開示している。
7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び同様な化合物を製造するための2つの方法が、以前に文献において報告されている。その第一の方法は、Kaneko等(米国特許第5,416,066号)に開示されており、これは2,5-ジヒドロキシ安息香酸から出発する、6段階の合成経路を含んでいた。この方法において、2,5-ジヒドロキシ安息香酸は、ジメチル硫酸によって選択的にメチル化された。次いで、得られる化合物を、20時間に渡り、ジメチルチオカルバモイルクロリドと反応させ、更に9時間に渡り高温(270℃)条件に暴露した。この段階の生成物を、メタノール中で20時間に渡り、ナトリウムメトキシドと共に還流した。次いで、この還流段階の生成物を、塩基性条件下で、かつ高温で、2-クロロエチルアミンと反応させて環化されたアミドを生成した。この環化されたアミドを、LiAlH4で還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1,4-ベンゾチアゼピン中間体)を製造した。
【００４７】
7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造するための第二の方法は、Hitoshiにより、日本国特許(JP 10,045,706)に開示されている。この方法は、2-ブロモ-5-メトキシベンズアルデヒドを出発物質としていた。この臭化物は、NaSMeで置換し、次いで得られた生成物を、塩素で酸化し、次いで水中で還流して、ジスルフィドジアルデヒドを生成した。このジアルデヒドを2-クロロエチルアミンで処理し、得られた生成物を、還元剤、例えばNaBH4で還元した。生成する化合物を、環化して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを得た。
始めに、本発明者等は、上記の方法を用いて、1,4-ベンゾチアゼピン中間体、即ち7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンの製造を試みた。しかし、本発明者等は、Kaneko等(米国特許第5,416,066号)に記載された第一の方法が、高温及び長い反応時間を必要とする合成段階を含むことを見出した。更に、本発明者等は、第三のチオール化中間体のチオ基が、空気によって容易に酸化されて、ジスルフィド化合物となり、後の環化生成物の合成を不可能にすることを発見した。本発明者等は、またHitoshi(JP 10,045,706)により記載された方法が、Cl2の使用を含み、またNaSMeによる臭化物の置換とは別に、第一の中間体の製造方法に関する、特許されたもう一つの方法を、使用する必要があることを確認した。
上記問題点を克服するために、本発明者等は、容易に入手でき、かつ高価でない出発物質から、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造する新規な方法を開発した。本発明者等の方法は、単離並びに精製段階を単純化し、しかも7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び以下の式で示される一般的な構造を持つ他の化合物を含む、様々な1,4-ベンゾチアゼピン中間体を製造するのに利用できる：
【００４８】
【化６】
2008534497.tif 000007
【００４９】
この方法は、またJTV-519の製造にも使用できる。
従って、上記の観点から、本発明は以下の式を有する化合物の合成方法を提供する：
【００５０】
【化７】
2008534497.tif 000008
【００５１】
（式中、RはOR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール、又はHであり、かつRが2位、3位、4位、又は5位にあり得る）前記方法は以下の工程を含む：
(a) 以下の式で表される化合物：
【００５２】
【化８】
2008534497.tif 000009
【００５３】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)を、任意の触媒の存在下で、還元剤で処理して、以下の式を有する化合物を生成する工程：
【００５４】
【化９】
2008534497.tif 000010
【００５５】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)；
(b) 工程(a)において生成した化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、以下の式を有する化合物を生成する工程：
【００５６】
【化１０】
2008534497.tif 000011
【００５７】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)；
(c) 工程(b)において製造した化合物を活性剤及びクロロエチルアミンで処理して、以下の式を有する化合物を生成する工程：
【００５８】
【化１１】
2008534497.tif 000012
【００５９】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)；
(d) 工程(c)において生成した化合物を還元剤と塩基とで処理して、以下の式を有する化合物を生成する工程：
【００６０】
【化１２】
2008534497.tif 000013
【００６１】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)；及び
(e) 工程(d)において生成した化合物を還元剤で処理して、以下の式を有する化合物を生成する工程：
【００６２】
【化１３】
2008534497.tif 000014
【００６３】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)。
本発明の方法によれば、工程(a)における還元剤はH2であり得る。更に、工程(b)におけるジアゾ化剤は、NaNO2であり得、また工程(b)におけるジスルフィドはNa2S2であり得る。更に、工程(c)におけるクロリドはSOCl2であり得る。工程(d)における還元剤はトリメチルホスフィン(PMe3)であり得、一方工程(d)における塩基はトリエチルアミンである。別の実施態様において、工程(e)における還元剤はLiAlH4である。
本発明は、更に、以下の式を有する化合物の合成法を提供する：
【００６４】
【化１４】
2008534497.tif 000015
【００６５】
（式中、RはOR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール又はHであり、またRが2位、3位、4位、又は5位にあり得る）前記方法は、以下に挙げる工程を含む：
(a) 以下の式を有する化合物：
【００６６】
【化１５】
2008534497.tif 000016
【００６７】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)を3-ブロモプロピオン酸クロリド及び以下の式を有する化合物と反応させ：
【００６８】
【化１６】
2008534497.tif 000017
【００６９】
以下の式を有する化合物を生成する工程：
【００７０】
【化１７】
2008534497.tif 000018
【００７１】
(式中、Rは先に定義されたとおりである)。
一例として、以下の式を有する化合物：
【００７２】
【化１８】
2008534497.tif 000019
【００７３】
(式中、RはOR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール又はHであり、またRが2位、3位、4位、又は5位にあり得る)は、以下のようにして合成することができる：
【００７４】
【化１９】
2008534497.tif 000020
【００７５】
一例として、また実施例７及び以下のスキーム1に示すように、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンは、2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸から、以下のようにして製造できる。2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸のニトロ基を、触媒としてPd/Cを使用して、H2により還元して、2-アミノ-5-メトキシ安息香酸を得る。2-アミノ-5-メトキシ安息香酸は、NaNO2でジアゾ化することができ、また次にNa2S2で処理して、安定なジスルフィド化合物を製造することができる。更に精製することなしに、安定なジスルフィド化合物をSOCl2で処理し、次いでEt3Nの存在下で、2-クロロエチルアミンと反応させて、アミドを製造する。次いで、このアミド化合物を、以下のように1-ポット(one-pot)法に従って、環化化合物に転化することができる。還元剤(例えば、トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィン)及び塩基(例えば、トリエチルアミン)を、アミド化合物のTHF(テトラヒドロフラン)溶液に添加することができる。次いで、生成した反応混合物を、3時間に渡り還流することができる。還元剤(例えば、トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィン)は、ジスルフィド(S-S)をそのモノスルフィドに開裂し、引続きクロリドと分子内環化を行って、環化されたアミドを生成する。次に、この環化されたアミドを、LiAlH4で還元して、1,4-ベンゾチアゼピン中間体、即ち7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造することができる。次いで、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンから、これと3-ブロモプロピオン酸クロリドとを反応させ、次いで得られる化合物と、4-ベンジルピペリジンとを反応させることにより、JTV-519を製造することができる。
本発明は、更に組成物を提供し、この組成物は、放射性標識したJTV-519を含む。JTV-519の標識は、当分野において既知の様々な異なる放射性標識の一種を用いて、行うことができる。本発明の放射性標識は、例えば放射性同位元素であり得る。放射性同位元素は、例えば検出可能な放射能を発するあらゆる同位体であり得、同位体は、例えば35S、125I、3H又は14Cを含むが、これらに限定されない。放射性同位元素によって放出される放射能は、当分野において公知の技術によって検出することができる。例えば、放射性同位元素からのγ-輻射線は、ガンマ線造影技術、特にシンチグラフィー造影法を用いて検出できる。
一例として、また実施例８及び以下のスキーム2に示すように、放射性標識したJTV-519は、以下のようにして製造できる。JTV-519は、BBr3を用いて、フェニル環において、脱メチル化することができる。次いで、得られるフェノール化合物を、塩基(例えば、NaH)の存在下において、放射性標識したメチル化剤(例えば、3H-ジメチル硫酸)で、再度メチル化して、3H-標識JTV-519を得ることができる。
本発明は、更にJTV-519に類似する、2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼペンを包含する、新規な1,4-ベンゾチアゼピン中間体及び誘導体を提供する。例として、本発明は、以下の式を有する化合物を提供する：
【００７６】
【化２０】
2008534497.tif 000021
【００７７】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）；
【００７８】
【化２１】
2008534497.tif 000022
【００７９】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）；
【００８０】
【化２２】
2008534497.tif 000023
【００８１】
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）；及び
【００８２】
【化２３】
2008534497.tif 000024
【００８３】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつXはNH又はOである）。又、更に以下の式を有する2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン化合物が提供される：
【００８４】
【化２４】
2008534497.tif 000025
【００８５】
（式中、R1はフェニル環上の2位、3位、4位、又は5位にある、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、かつR3はH、アルキル、又はアリールである）
本発明者等の新規な1,4-ベンゾチアゼピン化合物の例は、S7、S-20、S-25、S-27及びS36を含むが、これらに制限されない。化合物はS36であることが好ましい。S7、S-20、S-25、S-27及びS36に関する構造は図８に見られる。本発明のこれら及びその他の新規化合物は医薬組成物を生成するように、上記した如き医薬上許される担体と混在されてもよい。
【００８６】
本発明者等の新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物は、JTV-519と、機能特性を共有している。例えば、JTV-519(mwt=423)と同様に、化合物S36(mwt=267)は、カルシウムチャンネルを調節する。事実、S36(カルボン酸)は、カルシウムチャンネルの調節において、JTV-519よりも約10倍も強力である(データは示さない)。しかし、JTV-519とは違って、本発明者等の新規な化合物は、hERGsの活性に対して弱い遮断性を示す。
迅速遅延整流(I(Kr))チャンネル、即ちカリウムチャンネルは、心臓活動電位の再分極にとって重要である。hERGは、I(Kr)チャンネルの孔-形成サブユニットである。I(Kr)機能の抑制は、有害薬物作用及び/又はhERGにおける遺伝的な欠陥の結果として、生命を脅かす不整脈の高い危険性をもたらす、長期-QT(LQT)症候群に導く恐れがある。従って、hERGsは、遮断された場合に、心不整脈及び心臓突然死を引起す可能性のある、カリウム-チャンネルサブユニットである。
本発明者等の化合物は、JTV-519と比較した場合に、hERG(I(Kr))チャンネルの有意に低い遮断性を有する。例えば、図4-7に示したように、本発明者等の化合物の一つであるS36は、JTV-519のhERG遮断活性よりも、約5-倍〜10-倍低い、hERG遮断活性を持つ。本発明者等の化合物は、弱いhERG遮断活性を持つので、それらは、JTV-519よりも毒性が低いものと予想される。
上記記載に基いて、本発明者等の新規化合物は、JTV-519よりも一層強力であり、また低い毒性を持つ。従って、本発明者等の新規な化合物は、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するための、上記方法の何れかにおいて特に有益であると思われる。ここで、対象とは、心不全、心房細動、又は運動-誘発性心不整脈の候補である対象を含む。また、本発明者等の新規化合物は、対象における心不全、心房細動、及び運動-誘発性心不整脈を治療又は予防する方法、及び対象における運動誘発心臓突然死を予防する方法において、特に有益であろうと思われる。
従って、本発明は、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量の薬剤を対象に投与することを含む、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するための方法をも提供する。薬剤は以下に列挙するものからなる群から選ばれる：
【００８７】
【化２５】
2008534497.tif 000026
【００８８】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）；
【００８９】
【化２６】
2008534497.tif 000027
【００９０】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）；
【００９１】
【化２７】
2008534497.tif 000028
【００９２】
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）；
【００９３】
【化２８】
2008534497.tif 000029
【００９４】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、XはNH又はOである）；及び
【００９５】
【化２９】
2008534497.tif 000030
【００９６】
（式中、R1はフェニル環上の2位、3位、4位、又は5位にある、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、かつR3はH、アルキル、又はアリールである）
上記のように、対象はあらゆる動物であり得るが、好ましくはヒトである。一実施態様において、対象はカテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)に罹っている。別の実施態様では、対象は心不全、心房細動、又は運動-誘発性心不整脈の候補者である。更に別の実施態様において、薬剤はS4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27、及びS36からなる群から選ばれる。これらの薬剤に関する構造が図８に見られる。
本発明の方法によれば、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少は、対象におけるホスホリル化されたRyR2のレベルを減じることにより、対象において制限又は防止することができる。一実施態様において、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な薬剤の量は、対象における心不全、心房細動、及び／又は運動-誘発性心不整脈を治療又は予防するのに有効な量である。別の実施態様において、対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な薬剤の量は対象における運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有効な薬剤の量である。
以上に鑑みて、本発明は更に対象における運動-誘発性心不整脈を治療又は予防するのに有効な量の、本明細書に開示された、新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物を対象に投与することを含む、対象における運動-誘発性心不整脈の治療又は予防方法を提供する。同様に、本発明は運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有効な量の、本明細書に開示された、新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物を対象に投与することを含む、対象における運動-誘発性心臓突然死の予防方法を提供する。更に、本発明は対象における心房細動又は心不全を治療又は予防するのに有効な量の、本明細書に開示された、新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物を対象に投与することを含む、対象における心房細動又は心不全の治療又は予防方法を提供する。これらの方法の夫々において、新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物は下記の化合物からなる群から選ばれてもよい：
【００９７】
【化３０】
2008534497.tif 000031
【００９８】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）；
【００９９】
【化３１】
2008534497.tif 000032
【０１００】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）；
【０１０１】
【化３２】
2008534497.tif 000033
【０１０２】
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）；
【０１０３】
【化３３】
2008534497.tif 000034
【０１０４】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつXはNH又はOである）；及び
【０１０５】
【化３４】
2008534497.tif 000035
【０１０６】
（式中、R1はフェニル環上の2位、3位、4位、又は5位にある、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール又はHであり、R2はH、アルキル、又はアリールであり、かつR3はH、アルキル、又はアリールである）
更に、本発明は本明細書に開示された新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物の合成方法を提供する。例えば、本発明は式：
【０１０７】
【化３５】
2008534497.tif 000036
【０１０８】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物の合成方法であって、
(a) 式：
【０１０９】
【化３６】
2008534497.tif 000037
【０１１０】
を有する化合物を塩化スルホニル化合物（あらゆる塩化スルホニル誘導体を含む）及び塩基で処理して、式：
【０１１１】
【化３７】
2008534497.tif 000038
【０１１２】
を有する化合物を生成する工程、
(b) 必要により、工程(a)で生成された化合物を一級又は二級アミンで処理して、式：
【０１１３】
【化３８】
2008534497.tif 000039
【０１１４】
（式中、Ｒは先に定義されたとおりである）
の化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法を提供する。一実施態様において、工程(a)における塩化スルホニル化合物はアルキルスルホニルクロリド及びアルキルスルホニルクロリドからなる群から選ばれる。別の実施態様において、工程(a)における塩基はEt3Nである。更に別の実施態様において、工程(b)における一級又は二級アミンは4-ベンジルピペリジンである。
本発明のその方法は更に式：
【０１１５】
【化３９】
2008534497.tif 000040
【０１１６】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物を酸化剤で酸化して、式：
【０１１７】
【化４０】
2008534497.tif 000041
【０１１８】
（式中、Ｒは先に定義されたとおりであり、かつｍは１又は２である）
を有する化合物を生成する工程を含んでもよい。本発明の一実施態様において、酸化剤は過酸化水素である。
例として、また実施例９及びスキーム３に示されるように、本発明者らは一般構造：
【０１１９】
【化４１】
2008534497.tif 000042
【０１２０】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物の合成方法を開発した。この一般構造の新規化合物は7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンをEt3Nの如き塩基の存在下で、アルキルスルホニルクロリド又はアリールスルホニルクロリドと反応させることにより調製し得る。付加的な反応（例えば、4-ベンジルピペリジンの付加）が所望により側鎖を延長するために、続いてもよい。スキーム３が示すように、2-クロロエタンスルホニルクロリド（例えば、180mg；1.1mM）及びEt3N（例えば、140mg；1.1mM）が０℃で、CH2Cl2（例えば、20ml）中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)（例えば、194mg；1mM）に添加し得る。次いでその混合物が撹拌され（例えば、０℃で２時間）、洗浄されてもよい（例えば、H2O及び飽和NaHCO3溶液で）。溶媒の除去が粗生成物（これはシリカゲルによるクロマトグラフィーにより精製されてもよい）を生じるであろう。その構造はNMRにより確認し得る。更に、スキーム３は得られる化合物の側鎖がその化合物（例えば、28mg；0.1mM）をCH2Cl2中で4-ベンジルピペリジン（例えば、21mg；0.13mM）と反応させることにより延長し得ることを示す。反応が完結した後、過剰のアミンが塩基脱除剤（例えば、3-(2-無水コハク酸)プロピル官能化シリカゲル、0.5g）により除去し得る。
又、本発明は式：
【０１２１】
【化４２】
2008534497.tif 000043
【０１２２】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物の合成方法であって、
式：
【０１２３】
【化４３】
2008534497.tif 000044
【０１２４】
を有する化合物を、塩基の存在下で、塩化スルフリル及び一級又は二級アミンで処理して、式：
【０１２５】
【化４４】
2008534497.tif 000045
【０１２６】
（式中、Ｒは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法を提供する。本発明の一実施態様において、塩基がEt3Nである。別の実施態様において、一級又は二級アミンが1-ピペロニルピペラジンである。
本発明の方法は更に式：
【０１２７】
【化４５】
2008534497.tif 000046
【０１２８】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）
を有する化合物を酸化して、式：
【０１２９】
【化４６】
2008534497.tif 000047
【０１３０】
（式中、Ｒは先に定義されたとおりであり、かつｍは１又は２である）
を有する化合物を生成する工程を含んでもよい。一実施態様において、酸化剤が過酸化水素である。
例として、また実施例９及びスキーム４に示されるように、本発明者らは一般構造：
【０１３１】
【化４７】
2008534497.tif 000048
【０１３２】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）を有する化合物の合成方法を開発した。この一般構造の新規化合物は塩基（例えば、Et3N）の存在下の、塩化スルフリル、続いて一級又は二級アミンによる7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンのワンポット反応により調製し得る。スキーム４が示すように、塩化スルフリル（例えば、15.0mg；0.111mM）及びEt3N（例えば、28.0mg；0.22mM）が０℃で、CH2Cl2（例えば、20ml）中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン（例えば、19.4mg；0.1mM）に添加し得る。その混合物を撹拌した後（例えば、０℃で２時間）、1-ピペロニルピペラジン（例えば、27mg；0.12mM）が添加されてもよい。その混合物が更に２時間撹拌され、次いで洗浄されてもよい（例えば、H2O及び飽和NaHCO3溶液で）。過剰のアミンが塩基脱除剤（例えば、3-(2-無水コハク酸)プロピル官能化シリカゲル、0.2 g）の添加により除去し得る。
更に、本発明は式：
【０１３３】
【化４８】
2008534497.tif 000049
【０１３４】
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）
を有する化合物の合成方法であって、
式：
【０１３５】
【化４９】
2008534497.tif 000050
【０１３６】
（式中、Ｒは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を酸化剤で処理して、式：
【０１３７】
【化５０】
2008534497.tif 000051
【０１３８】
（式中、Ｒ及びｍは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法を提供する。一実施態様において、酸化剤が過酸化水素である。又、この方法はJTV-519を酸化するのに使用し得る。
更に、本発明は式：
【０１３９】
【化５１】
2008534497.tif 000052
【０１４０】
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）
を有する化合物の合成方法であって、
式：
【０１４１】
【化５２】
2008534497.tif 000053
【０１４２】
を有する化合物を酸化剤で処理して、式：
【０１４３】
【化５３】
2008534497.tif 000054
【０１４４】
（式中、Ｒ及びｍは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法を提供する。一実施態様において、酸化剤が過酸化水素である。又、この方法はjtv-519を酸化するのに使用し得る。
例として、また実施例９及びスキーム５に示されるように、本発明者らは一般構造：
【０１４５】
【化５４】
2008534497.tif 000055
【０１４６】
（式中、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である）
を有する化合物の合成方法を開発した。この一般構造の新規化合物は過酸化水素によるJTV、又は本明細書に開示された新規1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の一種の酸化により調製し得る。スキーム５が示すように、MeOH（例えば、5ml）中の関係する1,4-ベンゾチアゼピン化合物（例えば、21mg；0.05mM）がH2O2（例えば、0.1ml、過剰）に添加されてもよい。その混合物が撹拌されてもよく（例えば、２時間）、得られる生成物がシリカゲルによるクロマトグラフィー（例えば、CH2Cl2:MeOH=10:1）により精製されてもよい。
更に、本発明は式：
【０１４７】
【化５５】
2008534497.tif 000056
【０１４８】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつXはNH又はＯである）
を有する化合物の合成方法であって、
式：
【０１４９】
【化５６】
2008534497.tif 000057
【０１５０】
を有する化合物を、塩基の存在下で、塩化カルボニル化合物、及び一級もしくは二級アミン又はアルコールで処理して、式：
【０１５１】
【化５７】
2008534497.tif 000058
【０１５２】
（式中、Ｒ及びＸは先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法を提供する。一実施態様において、塩化カルボニル化合物がトリホスゲンである。別の実施態様において、塩基がEt3Nである。更に別の実施態様において、一級又は二級アミンが4-ベンジルピペリジンである。
例として、また実施例９及びスキーム６に示されるように、本発明者らは一般構造：
【０１５３】
【化５８】
2008534497.tif 000059
【０１５４】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、-(CH2)nSR'2であり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつＸはNH又はＯである）
を有する化合物の合成方法を開発した。この一般構造の新規化合物は7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを塩基（例えば、Et3N）の存在下でトリホスゲンと反応させ、続いて二級もしくは三級アミン又はアルコールの添加により調製し得る。
更に、本発明は式：
【０１５５】
【化５９】
2008534497.tif 000060
【０１５６】
（式中、R1はフェニル環の２位、３位、４位、又は５位の、OR'、SR'、NR'、アルキル、又はハライドであり、かつR'はアルキル、アリール、又はＨであり、R2はＨ、アルキル、又はアリールであり、かつR3はＨ、アルキル、又はアリールである）
を有する2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン化合物の合成方法であって、
(a) 式：
【０１５７】
【化６０】
2008534497.tif 000061
【０１５８】
（式中、R1は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を、任意の触媒の存在下で、還元剤で処理して、式：
【０１５９】
【化６１】
2008534497.tif 000062
【０１６０】
（式中、R1は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、
(b) 工程(a)で生成された化合物をジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、式：
【０１６１】
【化６２】
2008534497.tif 000063
【０１６２】
（式中、R1は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、
(c) 工程(b)で生成された化合物を活性剤及びクロロエチルアミンで処理して、式：
【０１６３】
【化６３】
2008534497.tif 000064
【０１６４】
（式中、R1、R2、及びR3は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、
(d) 工程(c)で生成された化合物を還元剤及び塩基で処理して式：
【０１６５】
【化６４】
2008534497.tif 000065
【０１６６】
（式中、R1、R2、及びR3は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程、及び
(e) 工程(d)で生成された化合物を還元剤で処理して、式：
【０１６７】
【化６５】
2008534497.tif 000066
【０１６８】
（式中、R1、R2、及びR3は先に定義されたとおりである）
を有する化合物を生成する工程
を含むことを特徴とする、前記化合物の合成方法を提供する。
本発明は、またRyR2とFKBP12.6との再結合に基づいて、正規に又はハイスループットスクリーニングするための、新規なアッセイをも提供する。特に、本発明は、RyR2とFKBP12.6との結合を増強する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、(a) RyR2の源を得、あるいはこれを生成する工程；(b) 候補薬剤の存在下で、RyR2をFKBP12.6に暴露する工程；及び(c)薬剤が、RyR2とFKBP12.6との結合を増強するか否かを決定する工程を含む。一実施態様において、RyR2は、PKA-ホスホリル化されている。他の実施態様では、RyR2は、PKA-過ホスホリル化されている。更に別の実施態様では、RyR2は、ホスホリル化されていない。
本発明の方法において、RyR2は、固相、例えばプレート又はビーズ等の固相に固定化される。RyR2-FKBP12.6結合の検出を容易にするために、FKBP12.6を放射線標識(例えば、32Sを用いて)することができる。更に、増強されたRyR2とFKBP12.6との結合は、FKBP12.6-結合剤を用いて検出することができる。一実施態様において、FKBP12.6-結合剤は、抗-FKBP12.6抗体である。本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、並びに対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法；対象における心不全、心房細動又は運動-誘発性心不整脈を治療又は予防する方法；及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法における、この薬剤の使用法をも提供する。
【０１６９】
更に、本発明は、RyR2とFKBP12.6との結合を増強する薬剤を同定する方法をも提供し、この方法は、(a) FKBP12.6の源を得、あるいはこれを生成する工程；(b) 候補薬剤の存在下で、FKBP12.6をRyR2に暴露する工程；及び(c)薬剤が、RyR2とFKBP12.6との結合を増強するか否かを決定する工程を含む。一実施態様において、RyR2は、PKA-ホスホリル化されている。他の実施態様では、RyR2は、PKA-過ホスホリル化されている。更に別の実施態様では、RyR2は、ホスホリル化されていない。
本発明の方法において、FKBP12.6は、固相、例えばプレート又はビーズ等の固相に固定化される。RyR2-FKBP12.6結合の検出を容易にするために、RyR2を放射線標識(例えば、32Pを用いて)することができる。更に、増強されたRyR2とFKBP12.6との結合は、RyR2-結合剤を用いて検出することができる。一実施態様において、RyR2-結合剤は、抗-RyR2抗体である。本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、並びに対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法；対象における心不全、心房細動又は運動-誘発性心不整脈を治療又は予防する方法；及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法における、この薬剤の使用法をも提供する。
【０１７０】
例として、また以下の実施例10に示すように、小分子をハイスループットスクリーニングするための、高効率のアッセイを、標準的な手順を用いて、グルタチオンで被覆した96-ウエルプレート上に、FKBP12.6(例えば、野生型のFKBP12.6又は融合タンパク質、例えばGST-FKBP12.6)を固定化することによって、開発することができる。PKA-ホスホリル化リアノジンレセプタタイプ2(RyR2)を、FKBP12.6-被覆プレート上に載せ、かつ様々な濃度(10〜100nM)にて、JTV-519類似体及び他の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体と共に30分間インキュベートすることができる。その後、プレートを洗浄して、未結合のRyR2を除去し、次に抗-RyR2抗体と共にインキュベートする(例えば、30分間)。プレートを、再度洗浄して、未結合の抗-RyR2抗体を除去し、次に蛍光標識した第二の抗体で処理することができる。プレートを、結合活性について、自動蛍光プレートリーダによって、読み取ることができる。
あるいはまた、RyR2は、32P-ATPの存在下において、PKA-ホスホリル化することができる。放射性PKA-ホスホリル化RyR2を、様々な濃度(10〜100nM)にて、JTV-519類似体及び他の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の存在下で、FKBP12.6-被覆96-ウエルプレート上に、30分間適用することができる。プレートを洗浄して、未結合の放射性RyR2を除去し、次いで自動プレートリーダによって、読み取ることができる。PKA-ホスホリル化RyR2は、またプレートに塗布し、かつ類似体及び誘導体の存在下で、32S-標識FKBP12.6と共にインキュベートすることができる。
本発明を、以下の実施例において説明する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために提示されたものであり、上記の特許請求の範囲に規定された如き、本発明の範囲を何ら限定するためのものであると見なされるべきではない。
【実施例】
【０１７１】
実施例1：FKBP12.6-枯渇マウス
FKBP12.6-枯渇マウスを、以前に記載されたように(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 113:829-40, 2003)して、発生させた。簡単に説明すれば、ヒトFK506結合タンパク12.6(FKBP12.6)の、ネズミオーソロガス遺伝子に関するマウスゲノムλ-ファージクローンを、完全な長さのネズミcDNAプローブを用いて、DBA/1lacJライブラリーから単離した。3.5kbのネズミゲノムDNAと、PGK-ネオ選択性マーカーで置換することにより、ターゲットベクタを、ネズミFKBP12.6に関する全コード配列を含む、エキソン3及び4を欠失するように設計した(Bennett等, ネズミFK506結合タンパク(FKBP) 12.6遺伝子の同定及び特徴付け; Mamm. Genome, 9:1069-71, 1998)。5.0-kbの5'フラグメント及び1.9-kbの3'フラグメントを、PGK-ネオ及びPGK-TKカセットを持つ骨格ベクタ、pJNS2にクローニングした。DBA/lacJ胚性幹(ES)細胞を、確立されたプロトコールを使用して、成長させ、かつトランスフェクションした。ターゲットES細胞を、まずサザン分析によりスクリーニングし、5つの正のES細胞系を、PCRにより解析して、相同的組換えを確認した。雄性キメラを、雌性DBA/1lacJと交配させ、生殖系列の子孫を、褐色コートカラーによって同定した。生殖系列の子孫を、5'サザン分析を使用して、遺伝子型決定(genotyped)を行った。正のFKBP12.6+/-の雄及び雌を、異種交配させたところ、子孫は、約25％の頻度にて、FKBP12.6-/-マウスを生成した。FKBP12.6-/-マウスは、繁殖力を持つものであった。
全ての研究は、年齢-及び性別-の一致するFKBP12.6+/+マウスをコントロールとして使用し、FKBP12.6-/-マウスについて行った。以下の素性：DBA/C57BL6交配種、純粋なDBA及び純粋なC57BL6から生育させた、FKBP12.6-/-マウス間には、何ら差が観測されなかった。
【０１７２】
実施例2：マウスにおけるテレメトリーによる記録及び運動テスト
FKBP12.6+/+マウス及びFKBP12.6-/-マウスを、インスティチューショナルアニマルケア＆ユースコミッティーオブコロンビアユニバーシティー(Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University)によって承認されたプロトコールに従って飼育し、かつ研究した。マウスを、2.5％イソフルラン吸入麻酔法を使用して麻酔した。歩行可能動物のECGラジオテレメトリーによる記録は、腹腔内移植後、>7日で得られた(Data Sciences International, MN、セントポール)(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 113:829-40, 2003)。ストレステストのために、マウスを、疲労するまで、傾斜のある足踏み車上を運動させ、次いでエピネフリン(0.5〜2.0mg/kg)を腹腔内注射した(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 113:829-40, 2003)。歩行可能動物の静止期心拍数を、4時間に渡り追跡して平均値を得た。
【０１７３】
実施例3：野生型及びRyR2-S2809D変異体の発現
RyR2(RyR2-S2809D)上のPKAターゲットサイトの突然変異誘発は、以前に記載されたように(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 113:829-40, 2003)行った。HEK293細胞を、20μgのRyR2野生型(WT)又は変異型cDNA及び5μgのFKBP12.6 cDNAにより、Ca2+-燐酸沈殿法を用いて、同時トランスフェクションした。RyR2チャンネルを含む小胞を、以前に記載された(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 113:829-40, 2003)ようにして調製した。
【０１７４】
実施例4：RyR2のPKA-ホスホリル化及びFKBP12.6の結合
心臓SR膜を、以前に記載(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000; Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca(2+)-放出チャンネルに及ぼす、ラパマイシンの作用, Circ. Res., 78:990-97, 1996)されたようにして製造した。35S-標識したFKBP12.6を、プロメガ(Promega)社(WI、マディソン)から入手した、TNTTMクイックカップルド転写/翻訳装置を用いて発生させた。[3H]リアノジン結合を使用して、RyR2レベルを定量した。100μgのミクロソームを、100μlの10-mMイミダゾールバッファー（pH6.8）で希釈し、250-nM(最終濃度)の[35S]-FKBP12.6と共に37℃にて60分間インキュベートし、次いで500μlの氷冷したイミダゾールバッファーで急冷した。サンプルを、100,000gにて10分間遠心分離処理し、イミダゾールバッファーで3回洗浄した。結合した[35S]-FKBP12.6の量を、ペレットの液体シンチレーションカウンタで測定した。
【０１７５】
実施例5：免疫ブロット
ミクロソーム(50μg)の免疫ブロット分析を、抗-FKBP12/12.6(1:1,000)、抗-RyR5029(1:3,000)(Jayaraman等, カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)と関連した、FK506結合タンパク質; J. Boil. Chem., 267:9474-77, 1992)又は抗-ホスホRyR2-P2809(1:5,000)を用いて、室温にて1時間行った(Reiken等, β-遮断剤は、ヒト心不全症における、カルシウム放出チャンネル機能を回復させ、かつ心筋の性能を改善する; Circulation, 107:2459-66, 2003)。このP2809-ホスホエピトープ-特異的抗-RyR2抗体は、アフィニティー-精製されたポリクローナルウサギ抗体である。これは、Ser2809において、PKA-ホスホリル化されたRyR2に相当する、ペプチドCRTRRI-(pS)-QTSQを用いて、ジムドラボラトリーズ(Zymed Laboratories)(CA、サンフランシスコ)により、オーダーメイドされたものであった。HRP-標識した抗-ウサギIgG(1:5,000希釈；トランスダクションラボラトリーズ(Transduction Laboratories, KY、レキシントン)と共にインキュベートした後、ブロットを、ECL(アマーシャムファルマーシア(Amersham Pharmacia, NJ、ピスカタウエイ)を用いて発現させた。
【０１７６】
実施例6：単一チャンネル記録
マウスの心臓由来の本来のRyR2、及び組換えRyR2の単一チャンネル記録は、以前に記載された(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節；Cell, 101:365-76, 2000)ようにして、0mVにて、電位-固定条件下で得た。チャンネル記録に使用した対称溶液(symmetric solutions)は、以下の通りであった：トランス区画：HEPES, 250ミリモル/L; Ba(OH)2, 53ミリモル/L(幾つかの実験では、Ba(OH)2をCa(OH)2で置換えた)；pH 7.35；及びシス区画：HEPES, 250ミリモル/L; Tris-塩基、125ミリモル/L; EGTA, 1.0ミリモル/L；及びCaCl2, 0.5ミリモル/L; pH 7.35。特に示さない限り、単一チャンネル記録は、シス区画において、150-nMの[Ca2+]及び1.0mMの[Mg2+]の存在下で行った。リアノジン(5mM)を、このシス区画に適用して、全チャンネルの同一性を確認した。データは、フェッチャン(Fetchan)ソフトウエア(アキソンインスツルメンツ(Axon Instruments), CA、ユニオンシティー)を用いて、デジタル化した電流の読みから解析した。全てのデータは、平均±SEとして表示する。アンペアードスチューデントt-テストを、実験同士の平均値の統計的な比較のために使用した。p<0.05なる値を、統計的に有意なものと考えた。
RyR2チャンネルに及ぼすJTV-519の効果は、図1-3及び(以下の)表1に示す。図3において示されるように、単一チャンネル研究は、特異的なPKA阻害剤、PKI5-24(C)の存在下における、PKA-ホスホリル化と比較して、PKA-ホスホリル化(D)に伴って、RyR2の高い開放確率を示した。単一チャンネル機能は、JTV-519の存在下で、FKBP12.6と共にインキュベートした、PKA-ホスホリル化RyR2においては、正常化された(E)。最大反応ヒストグラム(右)は、PKA-ホスホリル化RyR2における高い活性と準導電性の開放を示したが、JTV-519及びFKBP12.6で処理した後には、これらを示すことはなかった。図3Fは、PKA-ホスホリル化RyR2と、JTV-519の存在下における、PKA-ホスホリル化RyR2とFKBP12.6とのインキュベションは、RyR2活性化のCa2+-依存性を、右方向にずらすが、これにより、ホスホリル化されていないチャンネルのCa2+-依存性と同様になる。
【０１７７】
【表１】
2008534497.tif 000067
【０１７８】
JTV-519で処理したFKBP12.6+/-マウス(n=8)又はコントロール(n=6)、及びJTV-519で処理したFKBP12.6-/-マウス(n=5)における歩行性ECGデータのまとめ。SCL=洞サイクル長(sinus cycle length); HR=心拍数 ms=ミリ秒; bpm=拍動/分; FKBP12.6-/-= FKBP12.6異種接合マウス; FKBP12.6-/-= FKBP12.6枯渇マウス。
実施例７：1,4-ベンゾチアゼピン中間体及びJTV-519の合成
インビボ実験のために、本発明者等は、1g量のJTV-519を必要とした。しかし、報告された1,4-ベンゾチアゼピン中間体、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(以下のスキーム1における化合物6)を介して、この化合物を製造しようとした最初の試みは、成功しなかった。この中間体のチオ基は、空気で容易に酸化されて、ジスルフィド化合物となり、これは環化生成物(5)の合成を不可能にする。この問題を克服するために、本発明者等は、容易に入手でき、かつ高価でない2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸(1)から出発する新規な方法を開発した。この方法を、以下のスキーム1に示す。
H2を用い、また触媒としてPd/Cを使用した、この化合物(1)のニトロ基の還元は、2-アミノ-5-メトキシ安息香酸(2)を、定量的な収率で与えた。この化合物(2)を、NaNO2でジアゾ化し、次いでNa2S2で処理して、80％の収率で、安定なジスルフィド化合物(3)を生成した。更に精製することなしに、安定なジスルフィド(3)を、SOCl2で処理し、次いでEt3Nの存在下で、2-クロロエチルアミンと反応させ、90％の収率でアミド(4)を得た。この化合物(4)を、THF中で、トリメチルホスフィン及びEt3Nと共に還流することにより、1-ポット法によって、環化された化合物(5)に転化した。この環化されたアミド(5)を、次にLiAlH4で還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(6)を生成した。
化合物(6)と3-ブロモプロピオン酸クロリドとを反応させ、次いで得られた生成物を4-ベンジルピペリジンと反応させることにより、JTV-519を製造した。JTV-519の構造は、1H NMRにより確認した。
【０１７９】
【化６６】
2008534497.tif 000068
【０１８０】
実施例８：放射性-標識したJTV-519の合成
本発明者等の放射性-標識したJTV-519の新規な合成法を、以下のスキーム2に示す。放射性-標識したJTV-519を合成するために、JTV-519を、BBr3を用いて、そのフェニル環において脱メチル化して、フェノール化合物(21)を得た。このフェノール化合物(21)を、塩基(NaH)の存在下で、放射性標識したメチル化剤(3H-ジメチル硫酸)により、再度メチル化して、3H-標識したJTV-519を製造した(スキーム2)。
【０１８１】
【化６７】
2008534497.tif 000069
【０１８２】
実施例９：新規1,4-ベンゾチアゼピン誘導体及びそれらの合成方法
本発明者等は、また心不整脈を治療し及び予防するのに使用する、新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体をも開発した。特に、本発明者等は、以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した：
【０１８３】
【化６８】
2008534497.tif 000070
【０１８４】
（式中、Rはアリール、アルケニル、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）この一般的な構造を持つ新規化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンとアルキルスルホニルクロリド又はアリールスルホニルクロリドとを、Et3N等の塩基の存在下で、反応させることにより製造した。追加の反応(例えば、4-ベンジルピペラジンの付加)を行って、所望通りに側鎖を伸張することができる。この一般的な方法の代表的な合成を、以下のスキーム3に示す。
スキーム3が示すように、2-クロロエタンスルホニルクロリド(180mg; 1.1mM)及びEt3N(140mg; 1.1mM)を、0℃にて、CH2Cl2(20ml)中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)(194mg; 1mM)に添加した。この混合物を0℃にて2時間攪拌し、H2O及び飽和NaHCO3溶液で洗浄した。溶媒を除去して、粗生成物(Ia)を得、これをシリカゲル上でのクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル=3:1)により精製した。この合成の収量は280mg、又は95％であった。その構造をNMRにより確認した。
スキーム3は、更に化合物(Ia)の側鎖が、この化合物(Ia)(28mg; 0.1mM)とCH2Cl2中の4-ベンジルピペリジン(21mg; 0.13mM)と反応させることにより、伸張されることを示した。反応が完了した(TLCにより確認)後、過剰量のアミンを塩基脱除剤(3-(2-無水コハク酸)プロピル官能化したシリカゲル、0.5g)で除去した。1H NMR及びHPLCは、生成物(Ib)の純度が、>98％であることを示した。
【０１８５】
【化６９】
2008534497.tif 000071
【０１８６】
スキーム3
更に、本発明者等は、以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した：
【０１８７】
【化７０】
2008534497.tif 000072
【０１８８】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、又は-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルである）この一般的な構造を持つ化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)とスルフリルクロリドとを、塩基(Et3N)の存在下で反応させ、次いで一級又は二級アミンと反応させることにより、製造した。この一般的な方法の代表的な合成例を、以下のスキーム4に示す。
スキーム4が示すように、スルフリルクロリド(15.0mg; 0.111mM)及びEt3N(28.0mg; 0.22mM)を、CH2Cl2(20ml)中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1) (19.4mg; 0.1mM)に、0℃にて添加した。この混合物を0℃にて2時間攪拌した後、1-ピペロニルピペラジン(27mg; 0.12mM)を、添加した。この混合物を、更に2時間攪拌し、次いでH2O及び飽和NaHCO3溶液で洗浄した。過剰量のアミンを、塩基脱除剤(3-(2-無水コハク酸)プロピル官能化したシリカゲル、0.2g)の添加により除去した。この合成の収量は36mg、又は77％であった。
【０１８９】
【化７１】
2008534497.tif 000073
【０１９０】
本発明者等は、また以下の一般的な構造を持つ化合物をも製造した：
【０１９１】
【化７２】
2008534497.tif 000074
【０１９２】
（式中、ＲはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、かつXはN又はSであり、かつnは1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつｍは１又は２である）この一般的な構造を持つ化合物は、JTV-519あるいは上記の新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の一つを、過酸化水素で酸化することにより製造した。この一般的な方法の代表的な合成例を、以下のスキーム5に示す。
スキーム5が示すように、MeOH(5ml)中の化合物(Ib)(21mg; 0.05mM)を、H2O2(0.1ml、過剰量)に添加した。この混合物を2日間攪拌し、生成物IIIを、シリカゲル上でのクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=10:1)によって精製した。この合成の収量は19mg、又は91％であった。
【０１９３】
【化７３】
2008534497.tif 000075
【０１９４】
スキーム5
最後に、本発明者等は、また以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した：
【０１９５】
【化７４】
2008534497.tif 000076
【０１９６】
（式中、Rはアリール、アルキル、-(CH2)nNR'2、-(CH2)nSR'であり、かつnは0、1、2、又は3であり、かつR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつXはNH又はOである）
この一般的な構造の新規化合物は、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)とトリホスゲンとを、塩基(Et3N)の存在下で反応させ、次いで一級もしくは二級アミン又はアルコールを添加することにより、製造した。この一般的な方法の代表的な合成例を、以下のスキーム6に示す。
【０１９７】
【化７５】
2008534497.tif 000077
【０１９８】
実施例10：ハイスループットスクリーニングするためのアッセイ
本発明者等は、生物学的に活性な小分子をスクリーニングするためのアッセイを開発した。これらアッセイは、RyRへのFKBP12.6タンパクの再結合に基いている。
小分子を、ハイスループットスクリーニングするための、高効率のアッセイは、グルタチオンで被覆した96-ウエルプレートに、FKBP12.6(GST-融合タンパク)を固定化することにより開発することができる。PKA-ホスホリル化リアノジンレセプタタイプ2(RyR2)を、FKBP12.6-被覆プレート上に装入し、様々な濃度(10-100nM)にて、JTV-519類似体と共に、30分間インキュベートする。その後、プレートを洗浄して、未結合のRyR2を除去し、次に抗-RyR2抗体と共に30分間インキュベートする。プレートを再度洗浄して、未結合の抗-RyR2抗体を除去し、次に蛍光-標識した第二の抗体で処理する。このプレートを、結合活性に関する、自動的蛍光プレートリーダーにより読取る。
別のアッセイにおいて、RyR2は、32P-ATPの存在下で、PKA-ホスホリル化する。
放射性PKA-ホスホリル化RyR2を、様々な濃度(10-100nM)にて、JTV-519類似体の存在下で、30分間、FKBP12.6-被覆96-ウエルプレート上に投入する。プレートを洗浄して、未結合の放射性標識したRyR2を除去し、次いで自動プレートリーダーにより読取る。
以上、本発明を、その明確化及び理解の目的のために、幾分詳細に説明してきたが、当業者は、その開示から、形態及び細部における様々な変更が、添付した特許請求の範囲における本発明の真の範囲を逸脱することなしに、なし得ることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図1は、JTV-519が、FKBP12.6+/-マウスにおける運動-誘発性心室不整脈を予防することを立証している。(A) 未処置のFKBP12.6+/-マウス、JTV-519で処置したFKBP12.6+/-マウス、及びJTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウスの代表的な歩行心電図。心拍数、又は測定されたECGパラメータには有意な差は存在しなかった。(B) 上部の記録：運動テストに掛けられ、かつ1.0mg/kgのエピネフリンが注射された、未処置のFKBP12.6+/-マウスについて記録された持続型多形型心室頻拍症の例。中間部の記録：同一のプロトコールに従って、JTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウスの心電図；不整脈は観測されなかった。下部の記録：JTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウスにおける、運動-誘発性心室頻拍症(VT)。点線は、図には示されていない16.31秒間のVTを表す。「P」はP-波を示し、これは心室頻拍に伴う洞調律の徴候である。(C) 夫々JTV-519で処置した、又は処置されていない、FKBP12.6+/-及びFKBP12.6-/-マウスにおける心臓突然死(左)、持続性心室頻拍(>10拍動、中央部)、及び非-持続性心室頻拍(3-10回の異常な拍動、右)の定量結果を示す棒グラフである。JTV-519による処置は、未処置のFKBP12.6+/-マウス(n=10)又はJTV-519で処置したFKBP12.6-/-マウス(n=5)と比較して、JTV-519で処置したFKBP12.6+/-マウス(n=9)における運動-及びエピネフリン-誘発性不整脈を完全に防止した点に注目すべきである。このことは、JTV-519が、FKBP12.6のRyR2への再結合によって、FKBP12.6+/-マウスにおける不整脈及び突然死を防止することを示唆している。
【０２００】
【図２】図2は、FKBP12.6+/-マウスにおいて、JTV-519が、RyR2に対するFKBP12.6のアフィニティーを高めることによって、運動-誘発性心臓突然死を防止することを示す。(A-B) 心臓リアノジンレセプタ(RyR2)は、RyR2-5029抗体を用いて免疫沈降させた。図示されているのは、夫々静止状態、及び運動後の、JTV-519の存在下又は不在下の、野生型(FKBP12.6+/+)マウス、FKBP12.6+/-マウス、及びFKBP12.6-/-マウスにおける、定量化した量のRyR2、PKA-ホスホリル化RyR2(RyR2-pSer2809抗体)、及びFKBP12.6を表す免疫ブロット分析(A)及び棒グラフ(B)である。静止条件下では、約70％のFKBP12.6が、FKBP12.6+/-マウスにおけるRyR2と結合している。運動テスト後、RyR2複合体と結合しているFKBP12.6の量は、FKBP12.6+/-マウスでは大幅に減少するが、これはJTV-519で処置することにより救出できた。(C) RyR2単一チャンネルを、運動テスト後及びエピネフリン注射後に得た心臓から単離した。JTV-519で予備処理した、又はしてないFKBP12.6+/-マウス由来のチャンネル、及びJTV-519で予備処理した後のFKBP12.6-/-マウス由来のチャンネルが示されている。RyR2-チャンネル機能は、運動させ、JTV-519で処置したFKBP12.6+/-マウスにおいては正常化されたことに注目すべきである。JTV-519で処置した後の、運動させたFKBP12.6-/-マウス由来の代表的な単一チャンネルは、心臓において、JTV-519の作用のために、FKBP12.6が必要であることを示している。点線は、不完全なチャンネルの開放、又は「準導電性の」開放を表し、FKBP12.6-枯渇RyR2チャンネルの指標である。左側の記録は、5.0秒のデータを示し、一方右側のものは500ミリ秒のデータを表す。図において、Poは、開放確率を；Toは平均開放時間を；Tcは平均閉鎖時間を；及びcはチャンネルの閉鎖状態を表す。(D) 単一RyR2チャンネル(上記参照)の平均開放確率を示す概略的な棒グラフである。JTV-519は、拡張期のカルシウム濃度(150nM)において、運動テスト後のFKBP12.6+/-マウス由来のRyR2の開放確率を大幅に減じる。
【０２０１】
【図３】図3は、JTV-519が、PKA-ホスホリル化RyR2チャンネルに対するFKBP12.6の結合アフィニティーを高めることにより、RyR2-チャンネルゲートの開閉を正常化することを示している。(A,B) イヌ心臓SR膜(A)及び組換えにより発現させたRyR2チャンネル(B)は、以前に記載された(Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca2+-放出チャンネルに及ぼすラパマイシンの効果; Circ. Res., 78:990-97, 1996)ようにして調製した。(A) リアノジンレセプタ(RyR2)は、PKA阻害剤、PKI5-24の存在下又は不在下で、ホスホリル化バッファー(8mMのMgCl2、10mMのEGTA及び50mMのTris/PIPES；pH 6.8)中で、PKA触媒性サブユニット(40U; シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)、MO、セントルイス)でホスホリル化された。サンプルを100,000xgにて10分間遠心分離処理し、イミダゾールバッファー(10mMのイミダゾール；pH 7)で3回洗浄した。組換えにより発現させたFKBP12.6(最終濃度=250nM)を、様々な濃度のJTV-519の存在下又は不在下で、これらサンプルに添加した。60分間のインキュベートの後、サンプルを100,000xgにて10分間遠心分離処理し、イミダゾールバッファーで２回洗浄した。サンプルを95℃に加熱し、SDS-PAGEを用いてサイズ-分画した。SRミクロソームの免疫ブロットを、以前に記載されたように(Jayaraman等, FK506結合タンパクは、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)と結合した; J. Biol. Chem., 267:9474-77, 1992)、抗-FKBP12.6抗体(1:1,000)及び抗-RyR2-5029抗体(1:3,000)を用いて行った。本図は、JTV-519が、FKBP12.6を、(A) PKA-ホスホリル化RyR2(100nMにおいて部分的に結合；1000nMにおいて完全に結合)又は(B) 本質的にPKA-ホスホリル化RyR2チャンネルである、RyR2-S2809D変異チャンネルと結合させる。(C-E) 単一チャンネルの研究は、特異的なPKA阻害剤、PKI5-24の存在下でのPKA-ホスホリル化(C)と比較して、PKA-ホスホリル化後のRyR2の高い開放確率(D)を示している。単一チャンネル機能は、JTV-519の存在下で、FKBP12.6と共にインキュベートしたPKA-ホスホリル化RyR2において正常化された(E)。チャンネル開放は上部であり、ダッシュは完全開放(4pA)のレベルを示し、また「c」は閉じた状態を示す。チャンネルは、圧縮した(5秒、上方の記録)及び拡大した(500ミリ秒、下方の記録)時間尺度で示されており、また記録は0mVにおけるものである。振幅ヒストグラム(右)は、PKA-ホスホリル化RyR2の高い活性及び準導電性開放を明らかにするが、JTV-519及びFKBP12.6で処理した後には、見られなかった。(F) 細胞質[Ca2+]の関数としての、開放確率の正常化されたプロット。JTV-519の存在下で、PKA-ホスホリル化RyR2をFKBP12.6と共にインキュベートすると、Ca2+-依存性のRyR2の活性化を右側にシフトし、ホスホリル化されていないチャンネルのCa2+-依存性と同様になった。
【０２０２】
【図４】hERG-チャンネル電流に関する本発明者らの新規JTV-519関連化合物（本明細書に開示された）の効果を試験するのに使用した実験プロトコルを示す。全細胞パッチ-クランプ実験をhERGチャンネルでトランスフェクトされたCHO細胞中で、室温で生物学的溶液で行なった。電圧-クランププロトコルを下のパネルに示す。ビヒクル中で、外部溶液中の0.1％のDMSOを上のパネルに示されたものと同じ時間-プロトコルで適用した。
【図５】80-mV脱分極により誘発されたhERG-チャンネル電流に関する、JTV-519及び本発明者らの新規JTV-519-関連化合物、S36（本明細書に開示された）の効果を示す。代表的なhERG-チャンネル電流（I(Kr)）を１μMのJTV-519（左のパネル）又は１μＭのJTV-S36（右のパネル）の適用の前（○）及び後（●）にCHO細胞から記録した。電圧-クランププロトコルを電流トレースの下に示す。電流を-90mVの保持電位からの、+80mVへの400ミリ秒の脱分極中に誘発した。400ミリ秒の脱分極（これはヒト活動電位期間(APD)を模擬する）後に、hERGチャンネルは非常にわずかな外向きの電流を通すことが注目されるべきである。何とならば、それらが迅速に不活化するからである。電流トレース中に丸によりマークされたテール電流を開放状態により不活化からの回復中に、-40mVへの膜電位の戻りにより誘発した。テール電流はAPDの制御に重要な寄与因子であるので、薬剤の効果を-40mVにおけるテール電流により評価した：JTV-519=83％の遮断；JTV-S36=39％の遮断。
【０２０３】
【図６】hERG-チャンネル電流（トレース）の活性化に関する、JTV-519、E4031、及び本発明者らの新規JTV-519関連化合物、S36（本明細書に開示された）の効果を示す。代表的なhERG-チャンネルI-V関係を0.1％のDMSO（ビヒクル；上の中央のパネル）、１μＭのJTV-519（中間の中央のパネル）、及び１μＭのJTV-S36（下の中央のパネル）の適用の前（対照、左のパネル）及び後（中央のパネル）に示す。右のパネルは５μＭのE4031（hERGチャンネルを遮断することが知られているクラスIII抗不整脈薬）がhERG-チャンネル電流を完全に遮断したことを示す（-40mVにおけるテール電流を注目のこと）。電圧-クランププロトコルをI-V関係として、図４に示す。
【図７】hERG-チャンネル電流の活性化に関する、JTV-519及び本発明者らの新規JTV-519関連化合物、S36（本明細書に開示された）の効果を示す。hERG-チャンネルI-V関係を0.1％のDMSO（ビヒクル；上のパネル、１μＭ）、１μＭのJTV-519（下の左のパネル）、及び１μＭのJTV-S36（下の右のパネル）の適用の前（□）及び後（■）にピークテール電流（活性化）について示す。薬剤のウォッシュアウトを△で示す。電圧-クランププロトコルをI-V関係として、図４に示す。JTV-S36は負の電位（０mV；20mV脱分極）でhERG電流を遮断せず、I(Kr)の電圧依存性遮断を示すことが注目されるべきである。
【図８】誘導体の構造を示す。
【図１】
2008534497.tif 000106
【図２】
2008534497.tif 000107
【図３】
2008534497.tif 000108
【図４】
2008534497.tif 000109
【図５】
2008534497.tif 000110
【図６】
2008534497.tif 000111
【図７】
2008534497.tif 000112
【図８】
2008534497.tif 000113
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月24日(2008.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｓ３６）で示される化合物。
2008534497.tif 000114
Ｓ３６
【国際調査報告】
2008534497.tif 000115