(57)【要約】本発明はユニーク配列プローブ、ユニーク配列プローブを作成する方法、およびハイブリダイゼーションアッセイにユニーク配列プローブを使用する方法を提供する。
2008534011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユニーク配列プローブを調製する方法であって、
（ａ）核酸プローブ中に含まれるユニーク配列要素を同定する工程であって、核酸プローブは対象の核酸標的に選択的に結合する複数のユニーク配列要素と、複数の反復配列要素とを含むことと；
（ｂ）増幅されたユニーク配列要素を生成すべく、核酸プローブ中のユニーク配列要素を増幅する工程と、前記増幅する工程は、
（ｉ）核酸プローブへのプライマーセットのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸プローブを複数のユニーク配列要素に対するプライマーセットと接触させること、複数のプライマーセット中の各プライマーは５２℃と６５℃の間のアニール温度を有し、複数のプライマーセット中のすべてのプライマーのアニール温度は互いに３℃以内にあること、および
（ｉｉ）５１℃と６５℃の間の温度で核酸プローブへ複数のプライマーセットをアニーリングすることを含む条件下でポリメラーゼ連鎖反応によりプライマーセットにより特定されたユニーク配列要素を増幅すること、を含むことと；および
（ｃ）増幅されたユニーク配列要素をプールしてユニーク配列プローブを生成すること；
からなる方法。
【請求項２】
前記接触させることが、核酸プローブ中の少なくとも１０個のユニーク配列要素に対する少なくとも１０個のプライマーセットと、核酸プローブとを接触させることからなり、前記ユニーク配列要素を増幅することが、同少なくとも１０個のユニーク配列要素を増幅することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触させることが、核酸プローブ中の少なくとも５０個のユニーク配列要素に対する少なくとも５０個のプライマーセットと、核酸プローブとを接触させることからなり、前記ユニーク配列要素を増幅することが、同少なくとも５０個のユニーク配列要素を増幅することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ユニーク配列プローブを標識する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸プローブをプライマーセットと接触させることが、前記核酸プローブを各個別のプライマーセットと別々に接触させることからなり、前記増幅することが、個別のポリメラーゼ連鎖反応中で各ユニーク配列要素を増幅することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記個別のポリメラーゼ連鎖反応が同時に行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ユニーク配列プローブを固相支持体上に配置する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法により作成され、
（ａ）配列番号８９３−９８６から選択された少なくとも５０個の核酸；
（ｂ）配列番号９８７−１０８２から選択された少なくとも５０個の核酸；
（ｃ）配列番号１０８３−１１５４から選択された少なくとも５０個の核酸；
（ｄ）配列番号１１５５−１２４２から選択された少なくとも５０個の核酸；および
（ｅ）配列番号１２４３−１３３８から選択された少なくとも５０個の核酸；
から選択されたユニーク配列プローブ。
【請求項９】
（ａ）配列番号８９３−９８６から選択された少なくとも５０個の核酸；
（ｂ）配列番号９８７−１０８２から選択された少なくとも５０個の核酸；
（ｃ）配列番号１０８３−１１５４から選択された少なくとも５０個の核酸；
（ｄ）配列番号１１５５−１２４２から選択された少なくとも５０個の核酸；
および
（ｅ）配列番号１２４３−１３３８から選択された少なくとも５０個の核酸；
から選択されたユニーク配列プローブ。
【請求項１０】
（ａ）図３に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−９４から選択された少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
（ｂ）図４に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−９６から選択された少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
（ｃ）図５に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−７２から選択された少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
（ｄ）図６に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−８８から選択された少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドプライマーセット；および
（ｅ）図７に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−９６から選択された少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
から選択された単離ポリヌクレオチドプライマーセット。
【請求項１１】
（ａ）図３に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−９４から選択された少なくとも２５個の単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
（ｂ）図４に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−９６から選択された少なくとも２５個の単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
（ｃ）図５に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−７２から選択された少なくとも２５個の単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
（ｄ）図６に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−８８から選択された少なくとも２５個の単離ポリヌクレオチドプライマーセット；および
（ｅ）図７に列挙されたポリヌクレオチドプライマーセット１−９６から選択された少なくとも２５個の単離ポリヌクレオチドプライマーセット；
から選択された請求項１０に記載の単離ポリヌクレオチドプライマーセット。
【請求項１２】
請求項８に記載のユニーク配列プローブとハイブリダイゼーションアッセイにおける同ユニーク配列プローブの使用に関する説明書とを含むキット。
【請求項１３】
対象の核酸標的を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法によりユニーク配列プローブを生成する工程と；
（ｂ）核酸標的へのユニーク配列プローブのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、試験標本にユニーク配列プローブを接触させる工程と；
（ｃ）ユニーク配列プローブと核酸標的との間に形成され、標本中の核酸標的の測定基準を提供するハイブリダイゼーション複合体を検出する工程と； 
からなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は一般に、核酸、検出、ハイブリダイゼーション、診断および予後の分野に関する。
【０００２】
（相互参照）
本願は、２００５年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／６６６，０００号および２００５年４月２２日に出願された米国通常特許出願第１１／１１２，９２６号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
核酸検出は、核酸標的への核酸プローブの塩基対の結合を介したハイブリダイゼーションが通常関与する。そのような検出分析は、様々な基礎研究および臨床研究の分野や、診断および予後の用途において、広く利用されている。核酸検出はゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡ、染色体スプレッド、細胞および組織サンプル等の複合サンプル中の標的核酸を検出するために行なうことができる。同様に、対象の標的に対するプローブは、標的に特異的なユニーク配列要素と、標的に特異的でない１または複数の反復配列ＤＮＡ要素との両方を含むことが多い。反復配列が無効でない場合、プローブはサンプル中の反復部分を含む多くの核酸で反応し、標的核酸と特異的に反応しない。この問題は、ゲノム全体にわたって広く散らばった散在反復シーケンスについて特に顕著であるが、ＤＮＡ分子上でクラスターになったすなわち隣接した縦列反復（tandem repeat）にも存在する。
【０００４】
反復配列の非特異的ハイブリダイゼーションはいくつかの方法で無効にすることができる。反復配列を無効にする最も一般的な方法は、相補的断片を含む過剰の非標識反復配列を予め結合させることにより１または複数の反復配列をブロックすることであり、そのような相補的断片の例にはコンペティター核酸またはブロック核酸としてよく知られるＣＯＴ−１  ＤＮＡがある。その通常の使用状態では、プローブ中の反復配列は標的ハイブリダイゼーションの前に、コンペティター核酸中の非標識反復配列とアニールされる（このプロセスは通例により「プレアニーリング」と呼ばれる）。プレアニーリング工程の間、プローブの標識された反復配列と非標識のコンペティター核酸反復配列は、相補性を共有する全長にわたって速やかにハイブリダイゼーションする。一本鎖の核酸プローブだけが標的核酸とハイブリダイゼーションすることができるので、プローブ中の反復配列はもはや標的にハイブリダイゼーションすることができず、プローブのユニーク配列要素のみがハイブリダイゼーションに利用可能なものとして残る。この方法を商業的に使用するには、大量のコンペティター核酸の調製または市販元からの購入が必要であるが、これには法外な時間と費用がかかる。
【０００５】
核酸の反復配列要素を無効にするための他の方法には、ハイブリダイゼーションの前にプローブ自体の追加の操作工程を必要とするものが含まれる（Craig et al., Hum Genet 1997 Sep;100(3-4):472-6およびHozier et al., Cytogenet. Cell Genet 1998;83(l-2):60-3参照）が、これらの方法のプローブセットの商業的調製への利用可能性は限られてい
る。
【０００６】
反復性ＤＮＡを含むプローブからユニーク配列を生成するためにポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を使用する試みはいくらか成功しているが、これらの方法では、ゲル電気泳動でフランキング反復配列で一本鎖ＰＣＲ伸長産物を除去することにより、適切な大きさのＰＣＲ産物の精製が必要である（Rogan et al., Genome Research 11 : 1086-1094 (
2001)および米国６，８２８，０９７号）。その結果、方法は商業的規模での生産に適用
できないか、または例えば大きな染色体領域の標的核酸に対する多数のユニーク配列プローブの調製には適用できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、特にそのようなユニーク配列プローブの商業的生産で使用される、ユニーク配列プローブの調製方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はユニーク配列プローブおよびそれらの調製方法ならびに使用方法を提供する。１態様では、本発明は、ユニーク配列プローブを調製する方法であって、
（ａ）核酸プローブ中に含まれるユニーク配列要素を同定する工程であって、核酸プローブは対象の核酸標的に選択的に結合する複数のユニーク配列要素と、複数の反復配列要素とを含むことと；
（ｂ）増幅されたユニーク配列要素を生成すべく、核酸プローブ中のユニーク配列要素を増幅する工程と、前記増幅する工程は、
（ｉ）核酸プローブへのプライマーセットのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸プローブを複数のユニーク配列要素に対するプライマーセットと接触させること、複数のプライマーセット中の各プライマーは５２℃と６５℃の間のアニール温度を有し、複数のプライマーセット中のすべてのプライマーのアニール温度は互いに３℃以内にあること、および
（ｉｉ）５１℃と６５℃の間の温度で核酸プローブへ複数のプライマーセットをアニーリングすることを含む条件下でポリメラーゼ連鎖反応によりプライマーセットにより特定されたユニーク配列要素を増幅すること、を含むことと；および
（ｃ）増幅されたユニーク配列要素をプールしてユニーク配列プローブを生成すること；
からなる方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、本発明の方法により製造されたユニーク配列プローブ、そのようなユニーク配列プローブを生成するためのポリヌクレオチドプライマーセット、ならびにそのような構成物を含むキットを提供する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、対象の核酸標的を検出する方法であって、
（ａ）本発明の方法により対象の核酸標的に対するユニーク配列プローブを生成する工程と；
（ｂ）核酸標的へのユニーク配列プローブのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、試験標本にユニーク配列プローブを接触させる工程と；
（ｃ）ユニーク配列プローブと核酸標的との間に形成され、標本中の核酸標的の測定基準を提供するハイブリダイゼーション複合体を検出する工程と； 
からなる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
引用される全ての参照文献は、その全体が参照により本願に援用される。
本願においては、別途記載のない限り、使用される技法については、いくつかの著名な参照文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Techlogy (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, placeCitySan Diego, StateCA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and 
Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, placeCitySan Diego, StateCA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. placeCityNew York, StateNY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. EJ. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, NJ.), and the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX); Fish: A Practical Approach, Barbara G. Beatty, Sabine Mai, and Jeremy A. Squire, editors (Oxford University Press, 2002)などのいずれかに見出すことができる。
【００１２】
本発明はユニーク配列プローブおよびそれらの調製方法を提供する。これらのプローブおよび方法は、コンペティターＤＮＡや労力を要する増幅後精製の必要性を回避するため、ユニーク配列の商業的調製に特に有用であるが、同プローブおよび方法はユニーク配列プローブのいかなる調製のためも使用することができる。
【００１３】
第１態様では、本発明は、ユニーク配列プローブを調製する方法であって、
（ａ）核酸プローブ中に含まれるユニーク配列要素を同定する工程であって、核酸プローブは対象の核酸標的に選択的に結合する複数のユニーク配列要素と、複数の反復配列要素とを含むことと；
（ｂ）増幅されたユニーク配列要素を生成すべく、核酸プローブ中のユニーク配列要素を増幅する工程と、前記増幅する工程は、
（ｉ）核酸プローブへのプライマーセットのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸プローブを複数のユニーク配列要素に対するプライマーセットと接触させること、複数のプライマーセット中の各プライマーは５２℃と６５℃の間のアニール温度を有し、複数のプライマーセット中のすべてのプライマーのアニール温度は互いに３℃以内にあること、および
（ｉｉ）５１℃と６５℃の間の温度で核酸プローブへ複数のプライマーセットをアニーリングすることを含む条件下でポリメラーゼ連鎖反応によりプライマーセットにより特定されたユニーク配列要素を増幅すること、を含むことと；および
（ｃ）増幅されたユニーク配列要素をプールしてユニーク配列プローブを生成すること；
からなる方法を提供する。
【００１４】
本明細書に使用する場合、「核酸プローブ」（または「プローブ」）は、対象の標的に対する任意の核酸プローブであって、複数のユニーク配列要素および複数の反復配列要素をいずれも含む核酸プローブである。したがって、核酸プローブは、対象の標的核酸の少なくとも一部に対して相補的かつ特異的な「ユニークな（固有の）」ＤＮＡ配列と、標的核酸がその一部をなすゲノムに繰り返し現われる「反復する」ＤＮＡ配列との両方を含む。そのような核酸プローブは染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ（細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡライブラリ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡライブラリ、Ｐ１  ＤＮＡライブラリ、λクローンライブラリ、コスミドクローンライブラリ、フォスミドライブラリ、プラスミドＤＮＡライブラリ）、発現遺伝子のｃＤＮＡコピー、ｃＤＮＡまたは発現ライブラリから単離されたｃＤＮＡクローン、およびゲノムＤＮＡから直接調製されたポリメラーゼ連鎖反応産物のｃＤＮＡコピーを含む種々の出所に由来するが、それらに限定されるわけではない。核酸プローブの長さは発明にとって重要ではないが、少なくとも２キロベース（「ｋｂ」）長であることが好ましく、種々の好ましい実施形態では、核酸プローブは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００
、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００または５０００ｋｂ長である。
【００１５】
発明の方法を使用する前に、核酸プローブは好ましくは日本鎖である。核酸プローブは溶液中で遊離状態であってもよいし、またはプラスミド、ウイルスおよび細菌の人工染色体を初めとするある種のベクター内に含まれていてもよい。
【００１６】
本明細書に使用する場合、「対象の核酸標的」は、本発明の方法によりユニーク配列プローブを使用して検出できるいかなる核酸標的であってもよい。好ましい実施形態では、対象の核酸標的は単一コピー遺伝子（シングルコピージーン）であるか、またはイントロン等の遺伝子の非コードユニーク配列セグメントであるか、または遺伝子の非翻訳の３’または５’領域であるか、またはゲノム中のユニークな遺伝子間セグメントからなる。本明細書に使用する場合、「単一のコピー遺伝子」は、標的核酸が存在するゲノム中の他の遺伝子から標準ＤＮＡハイブリダイゼーション法（すなわち標準的なハイブリダイゼーションおよび線上条件下で所望の標的だけが検出できるようなハイブリダイゼーションおよび選択条件）を使用して同定することができるものである。対象の核酸標的はさらに遺伝子ファミリーのメンバーを含むことも可能であり、その場合、ファミリーの一部または全部のメンバーがユニークな存在として検出されるが元のプローブの反復要素のためにゲノムの無関係の領域とはクロスハイブリダイゼーションしないよう、ＵＳＰの少なくとも一部は遺伝子ファミリーの１または複数のメンバーとホモロジー領域を共有する。
【００１７】
本明細書に使用する場合、「ユニーク配列要素」は、反復配列要素を含んでいないが、反復配列要素によって核酸プローブ中につながれている核酸プローブの部分である。好ましい実施形態では、「ユニーク配列要素」は、標準ハイブリダイゼーション条件で、標的核酸がその一部をなすゲノム中の単一のコピー遺伝子または任意のユニーク配列領域と選択的にハイブリダイズするために使用することができる。
【００１８】
本明細書に使用する場合、「反復配列要素」は、標準ハイブリダイゼーション条件下で標的核酸がその一部をなすゲノム中の反復配列とハイブリダイズする核酸プローブの核酸配列部分であり、高度な反復配列、中程度の反復配列、縦列反復（サテライト、ミニサテライトおよびマイクロサテライトを含むがこれらに限定されない）、散在配列（ＡＬＵ、ＬＩＮＥＳおよびＳＩＮＥＳを含むがこれらに限定されない）、ならびにパリンドローム反復がそれに含まれる。そのような反復配列要素は、セントロメアおよびテロメアの近くや不均一染色領域（ＨＳＲＳ）内に位置するか、一本の染色体上に分配されるか、または標的核酸が由来するゲノム中の一部または全部の染色体の全体にわたって分配され得る。ハイブリダイゼーションプローブ中のそのような反復配列要素の存在により、もしプローブ全体が例えば細胞、組織切片、または染色体スプレッドのインサイチュハイブリダイゼーションアッセイに使用されれば、プローブは非特異性になる。
【００１９】
核酸プローブは複数のユニーク配列要素と複数の反復の要素を含み、これは反復配列要素により結合される少なくとも２つのユニーク配列要素を要するが、好ましい実施形態では、核酸プローブは、ほぼ等しい数の反復配列要素によって結合された少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のユニーク配列を含んでいる。
【００２０】
本明細書に使用する場合、用語「複数」は２またはそれ以上を意味する。
本明細書に使用する場合、「ユニーク配列要素を同定する」という語句は、核酸プローブ内の複数のユニーク配列要素の位置を決定することを意味する。これは所与の核酸プローブ中のユニーク配列要素のすべてが同定されることを要しない。例えば、対象の核酸プ
ローブが５０個のユニーク配列要素を含んでいる場合、「同定」は例えばユニーク配列要素のうちの１０個を同定することを含み得る。種々の好ましい実施形態では、同定は、核酸プローブ中のユニーク配列要素の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を同定することを含む。種々の他の好ましい実施形態では、同定は、核酸プローブ中の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のユニーク配列要素を同定することを含む。そのような同定が当該技術分野で周知のいかなる手段でも行えることが当業者には理解され、その手段としては、ＤＮＡ配列分析および既知の反復配列要素との比較、対象の核酸プローブに関するシーケンス情報を含む種々のデータベースに格納されたＤＮＡシーケンス情報の調査（例えば以下の実施例に論じる）、または他の計算方法によるものがある。そのような既知のシーケンスベースの技術は、ＰＣＲプライマーを設計する元になる配列を提供し、そのため好ましい。ユニーク配列要素を核酸プローブ中の反復配列要素の同定に基づいて推論により同定できることもまた理解される。そのような１つの例では、反復配列はプローブとのハイブリダイゼーションにより同定され、反復配列プローブとハイブリダイズしない要素はすべてユニーク配列と見なされる。この場合、ユニーク配列要素ＤＮＡの少なくとも一部分が、増幅用の適切なプライマーを決定するために好ましくは配列決定される。
【００２１】
本明細書に使用する場合、用語「複数のユニーク配列要素を増幅する」は、核酸プローブ中の、２以上の同定されたユニーク配列要素またはその一部の追加のコピーを生産することを意味し、この増幅は「増幅されたユニーク配列要素」を生成する。核酸プローブ中の同定されたユニーク配列要素を各々すべてを増幅する必要はないことが当業者には理解されよう。例えば、核酸プローブで５０個のユニーク配列要素が同定される場合、「増幅」は例えばそのユニーク配列要素のうち１０個を増幅することからなり得る。種々の好ましい実施形態では、増幅は、核酸プローブ中の同定されたユニーク配列要素の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を増幅することからなる。種々の他の好ましい実施形態では、増幅は、核酸プローブ中の同定されたユニーク配列要素のうちの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の１０００を増幅することからなる。所与の同定されたユニーク配列要素の全部を増幅する必要はないことが当業者にはさらに理解されるだろう。したがって、所与の同定されたユニーク配列要素の全部または一部が、ポリヌクレオチドプローブ設計の考慮（以下を参照）および当業者の技術常識内の他の実験的考慮に基づいて増幅され得る。
【００２２】
本明細書に使用する場合、「プライマーセット」は、核酸プローブ中の所与のユニーク配列要素に相補的で、所与のユニーク配列要素の一定領域を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）で使用することができる核酸ポリヌクレオチドプライマーのグループ（２以上のプライマー；好ましくは２つ）のことを指す。一般にこれは、一方は核酸プローブの一つの鎖の５’末端に相補的なポリヌクレオチドプライマー、他方は核酸プローブのもう一つ鎖の５’末端に相補的なポリヌクレオチドプライマーの、少なくとも２つのポリヌクレオチドプライマーを必要とする。標識効率（ＵＳＰを標識することが望ましい）およびＰＣＲに関する制限以外に、増幅されるユニーク配列要素のサイズに特にサイズの制約はない。したがって、好ましい実施形態では、増幅されるユニーク配列要素の長さは少なくとも２００のヌクレオチドであり、任意の所望のサイズ以下である。当業者には、必要なまたは所望のサイズの産物を達成するためにＰＣＲ条件を最適化する方法は理解される。
【００２３】
当業者に理解されるように、は核酸プローブ由来の複数の異なるユニーク配列要素を増
幅するために、複数のそのようなポリヌクレオチドプライマーセットが使用できる。異なるユニーク配列要素を増幅するために、それごとに各プライマーセットが使用されることが好ましいが、所与のユニーク配列要素の異なる複数の領域を増幅するために多数のプライマーセットを使用することもできることもできる。
【００２４】
複数のプライマーセット中の各ポリヌクレオチドプライマーは５２℃と６５℃の間、好ましくは５５℃と６３℃の間、より好ましくは５６℃と６１℃の間のアニール温度を有する。これらのいずれの実施形態でも、一つの核酸プローブに対する種々のプライマーセット中のポリヌクレオチドはすべて、互いに０、１、２または３℃以内のアニール温度を有する。
【００２５】
非制限的な例では、ＮＲ１Ｄ１  ＢＡＣプローブ（以下を参照）のＵＳＰを調製する際には、各プライマーのアニール温度は５７−５９℃の範囲であり、ＮＲ１Ｄ１  ＵＳＰプローブ調製のＰＣＲ中には５６℃のアニール温度が使用される。同様に、ＣＹＰ２４  ＢＡＣプローブのＵＳＰを調製する際には、各プライマーのアニール温度は５９−６１℃の範囲であり、ＣＹＰ２４  ＵＳＰプローブ調製のＰＣＲ中には５８℃のアニール温度が使用される。
【００２６】
当業者に理解されるように、ポリヌクレオチドプライマー配列は、実質的に自己相補的またはプライマー対の別のメンバーと相補的であってはならない。さらに、プライマーは、核酸プローブ内の内部部位（所望部位以外）と実質的に相補的であってはならない。プライマーは、その内部で、または核酸プローブもしくはそのプライマーセット中の別のポリヌクレオチドプライマーと、ヘアーピンループを形成してはならない。
【００２７】
多くのプライマー設計ソフトウェアがインターネットで容易に利用可能であり、自由にアクセスできる（例えばhttp://www.bioinformatics.vg）。１実施形態では、「ＦＡＳＴ
ＰＣＲ」ソフトウェア(http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-l_html/oligos.htm)を使用してプライマーを設計し、アニール温度を決定することができる。Ｆａｓｔ  ＰＣＲソフトウェアは、標準および長鎖ＰＣＲ、逆ＰＣＲならびにマルチプルＰＣＲを含む多くのＰＣＲ用途に適用可能である。プログラムがいくつかの配列（１，０００，０００個まで）を同時に分析するので、同じバッファおよび同じアニール温度での増幅の設計を含め、単一反応容器中の１よりも多い産物の増幅のためのプライマー設計がサポートされる。正確な最適アニール温度の予測を保証するために、プライマーはすべて、ｄＳ、ｄＨおよびｄＧ統合パラメータによる最も近い熱力学的理論を使用して融解温度について分析される。プライマー設計プログラムは、プライマー−二量体形成、自己相補、プライマーの溶融温度が低すぎること、内部安定プロフィールの誤り、プライミングの誤り、およびプライマー複製部位制御等の落とし穴(pitfall)を生じさせ得るプライマー配列を特異的
に同定し、除外する。プログラムはローカルアライメントによる人の個人データベースを提供するようにも設計され、他の公的に利用可能な生物情報科学ツールが含まれる。プライマー設計に他のそのようなプログラムが利用可能であることが当業者には理解されるだろう。
【００２８】
代わりに、本発明で使用されるポリヌクレオチドプライマーは、特定のソフトウェアを使用せずとも、関連するユニーク配列要素についての知識や本願で提供する教示に基づいて、当業者には設計することができる。
【００２９】
プライマーのアニール温度が５２℃と６５℃の間のアニール温度を有する限り、そして複数のプライマーセット中のプライマーがすべて互いに０、１、２または３℃以内のアニール温度を有する限り、ポリヌクレオチドプライマーの長さは変更可能である（以下の実施例に開示される）。これらの条件に使用すると、コンペティターＤＮＡや労力を要する
増幅後精製の必要性を回避するユニーク配列プローブが生成される。
【００３０】
合成ポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の種々の溶液または固相法により調製することができる。例えば、亜リン酸トリエステル−リン酸トリエステル、およびＨ−ホスフォン酸塩の化学反応によるポリヌクレオチドの固相合成のための手順の詳細な説明は広く利用可能である（例えば米国特許第６，６６４，０５７号およびそこに開示されている文献を参照）。ポリヌクレオチドを精製する方法には、従来のアクリルアミドゲル電気泳動およびPearson (1983) J. Chrom. 255:137-149に記載されているように陰イオン交換ＨＰＬＣが含まれる。合成ポリヌクレオチドの配列は標準のＤＮＡ塩基配列決定法を使用して確認することができ、多くの商用サイト（例えばアイオワ州Coralville市 のIntegrated DNA Techlogies社）より容易に入手できる。
【００３１】
本発明の各態様および各実施形態に関して本明細書に使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖のいずれか、好ましくは一本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを意味する。用語「ポリヌクレオチド」には、所望の目的に関して、参照ポリヌクレオチドと類似もしくは改善された結合特性を備えた、天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含む核酸が包含される。用語「ポリヌクレオチド」は、合成の骨格を備えた核酸類似構造も包含する。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格アナログには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート結合またはメチルホスホネート結合とホスホジエステル結合とが交互になっているもの（Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698）、ならびに米国特許第６，６６４，０５７号明細書で議論されているよう
なベンジルホスホネート結合が挙げられる。また、Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991)、Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume
600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992)、Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937、およびAntisense Research and Applications (1993, CRC Press) も参照され
たい。
【００３２】
好ましい実施形態では、各プライマーセットは、別のＰＣＲ反応で核酸プローブからその関連するユニーク配列要素を増幅するために使用される。ほとんどの好ましい実施形態では、核酸プローブする、各プライマー対がマルチウェルプレートの一つのウェルに予めアリコートされたマルチウェルの形式で増幅される。代わりに、多数のプライマーセットが各々のＰＣＲ反応において存在してもよい。例えば、所与のユニーク配列要素は、２つユニーク配列要素の異なる部分を増幅するために使用される１つよりも多いプライマーセット（例えば２つ以上のプライマーセット）を使用して増幅することができる。さらなる代替例では、２つ以上の異なるユニーク配列要素を増幅するために２つ以上のプライマーセットを使用することができる。これらの実施形態では、一つのＰＣＲ反応で、２から１０の間の異なるプライマーペアが、１または複数のユニーク配列要素を増幅するために使用されることが好ましく、より好ましくは２〜７個の異なるＰＣＲプライマー、さらに好ましくは２〜５個の異なるＰＣＲプライマー、もっと好ましくは２〜３個の異なるＰＣＲプライマーが使用される。
【００３３】
ＰＣＲ反応が、例えばＰＣＲでの使用に適合されたマイクロプレートで同時に行なわれることはさらに好ましい。当業者はそのような技術に精通しているだろう。そのようなプレートおよびＰＣＲ装置の製造業者の例には、Applied BioSystems社、 Perkin Elmer社
、 およびMJ Devices社が含まれる。
【００３４】
ユニーク配列要素の増幅を促進するＰＣＲ条件は、当該技術分野において標準的なものであるが、ただしその条件は複数のプライマーセットを核酸プローブに５１℃と６５℃の間の温度でアニールすることを含む。好ましい実施形態では、ＰＣＲ反応のアニーリング工程はプライマーセット中の最低のアニール温度でのポリヌクレオチドプライマーのアニール温度より約１℃低い温度で行われる。
【００３５】
単一のプライマーセットによるＰＣＲ反応に使用される適切な量の核酸プローブの決定は、当業者のレベルの範囲内にある。例えば、約１５０−２００ｋｂのＢＡＣクローンは好ましくは約０．０１〜１０．０ｎｇ／μｌの間、より好ましくは約０．０５〜約５ｎｇ／μｌの間、さらにより好ましくは約０．１〜１．０ｎｇ／μｌの間、最も好ましくは約０．３〜約０．５  ｎｇ／μｌの間で使用される。
【００３６】
ＰＣＲ反応に使用される適切な量の所与のポリヌクレオチドプライマーの決定は、当業者のレベルの範囲内にある。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドプライマー濃度は約０．１μＭ〜約２０μＭの範囲、より好ましくは約０．５μＭと１０μＭの間、最も好ましくは約１μＭと２．０μＭの間である。
【００３７】
ＰＣＲ反応混合物はさらに、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、例えば５−０ユニット／ｍｌで存在）陽イオン（例えばＭｇＣｌ2、０．５〜５
ｍＭの間で存在）源を含む水溶性バッファ溶媒、ヌクレオチド（例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、各々約１００μＭ〜約５００μＭの間で存在）および緩衝剤（例えばＴｒｉｓ）を含むが、これらに限定されない標準要素を含む。反応混合物のｐＨは好ましくは６．５〜９．０の間、より好ましくは７．０〜８．５の間にある。融点低下剤（例えばホルムアミド）を含むがこれに限定されない他の要素がＰＣＲ混合物中にさらに存在し得ることが当業者に理解されるだろう。
【００３８】
その後、生じたＰＣＲ反応混合物は、複数サイクルの変性、アニーリングおよび重合を受ける。変性工程、重合工程、および使用する反応サイクル数の決定は、当該技術分野の任意の技術を使用して行なうことができる。発明の方法に関して使用されるサーマルサイクラーの例は、米国特許第５，６１２，４７３号および第５，６０２，７５６号に記載されている。
【００３９】
例証的実施形態では、最初の変性工程は、約９０℃と約１００℃の間で、より好ましくは約９２℃と約９８℃の間で、より好ましくは約９４℃と約９６℃の間で任意選択で行われる。この最初の任意選択の工程は、約１−１０分の間、より好ましくは約２−８分の間、最も好ましくは約４−６分の間に行なわれる。
【００４０】
この任意選択の最初の変性工程の後、例証的な非制限的な反応サイクル（２０−４０サイクル、好ましくは２５−３５サイクル、より好ましくは２８−３２のサイクル）は以下の通りであり、反応は以下に指定した温度で５−１２０秒間、より好ましくは１０−９０秒間、より好ましくは１５−６０秒間、より好ましくは１５−３０秒間保持される。
【００４１】
１−変性：温度は約９０℃と約９８℃の間、より好ましくは約９２℃と９８℃の間、より好ましくは約９４℃と約９６℃の間に保持される。
２−アニーリング：温度は約５１℃と約６５℃の間、より好ましくは約５３℃と約６３℃の間、より好ましくは約５４℃と約６１℃の間、より好ましくは約５５℃と約５９℃の間に保持される。
【００４２】
３−伸長工程：温度は約６６℃と約７８℃の間、より好ましくは約６８℃と約７６℃の間、より好ましくは約７Ｏ℃と約７４℃の間、より好ましくは約７２℃に保持される。  
当業者に理解されるように、各工程の時間は、ＰＣＲチューブおよび器具自体の壁の厚さに一部依存して決まる。
【００４３】
増幅後に、増幅されたユニーク配列要素はユニーク配列プローブを生成するためにプールされる。増幅されたユニーク配列要素のすべてが増幅工程後に必ずプールされるとは限らないことが当業者に理解されるだろう。非制限的な例において、各プライマーセットのＰＣＲ反応が別々に行なわれる実施形態では、期待されたユニーク配列要素が増幅されたかどうか断定するために、例えばゲル電気泳動によりＰＣＲ反応からのアリコートを分析することができる。所望のユニーク配列要素が増幅しなかった反応は、増幅されたユニーク配列要素のプールに使用されない。しかしながら、本発明の方法を使用して、反復配列要素の汚染のないユニーク配列要素の成功した増幅は、９８％を越える時間で見出され、そのようなゲル分析の必要をなくした。しかしながら、そのような方法は、確認のために、また、増幅されたユニーク配列要素の量の評価を提供するために、依然として使用されてもよい。
【００４４】
さらに好ましいが任意選択の実施形態では、所望のユニーク配列要素の増幅が得られたＰＣＲ反応は、対象のユニーク配列要素を大量に生産するために、同じプライマーセットおよびＰＣＲ条件を使用して、第２のＰＣＲラウンドにかけることができる。その後、産物はプールされる。当業者は知っているだろう、そのようなさらなる増幅を２回以上実行することができ、かつ／またはプールする前に関連のユニーク配列要素をより大量に生産するためにスケールアップすることができることは、当業者に認識される。そのようなさらなるＰＣＲ反応は、上述したようにゲル電気泳動により任意選択で評価することができる。
【００４５】
ほぼ等モル量の各二次ＰＣＲ産物（例えばエチジウムブロマイド染色アガロースゲル中のＰＣＲ産物の強度によりまたは適切な分光光度分析により判断）は、その後プールされる。ＰＣＲ産物のプールは、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットまたはＭｉｎＥＬｕｔｅ  ９６  ＵＦ  ＰＣＲ精製キット（Qiagen社、カリフォルニア州Valencia））もしくはＹＭ−３０マイクロコンカラム（Millipore社）等の浄化カラムを使用すること
、任意選択で残りの非伸長プライマーから取り除くことができる。このプロセスは要求されないが、ＰＣＲ産物のより正確な定量化を与え得る。
【００４６】
その後、生じるユニーク配列プローブ（「ＵＳＰ」）の濃度および純度が、例えば２６０および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を分光測光法で測定し、２６０／２８０比を計算することにより評価することができる。
【００４７】
その後、ＵＳＰは検出可能な標識で標識することが可能である。有用な検出可能な標識には、32Ｐ、3Ｈおよび14Ｃ等の放射活性標識；イソチオシアン酸フルオレセイン（FITC
）、ローダミン、ランタニド燐光体、Texas red、およびALEXIS（商標）（Abbott Labs）、ＣＹ（商標）染料（Amersham社）等の蛍光染料、金等の高電子密度試薬）；セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ等の酵素；金コロイド等の比色定量標識；DYNABEADS（商標）で販売されている磁
気標識；ビオチン；ジオキシゲニン；または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質が利用される。ほとんどの好ましい実施形態では、ＵＳＰは、BioPrime Labelling Kit（Invitrogen社）等の任意の数の共通の標識技術を使用して、直接標識を付ける反応で、ｄＵＴＰ等の蛍光性ヌクレオシドアナログで標識される。さらなる実施形態では、ＵＳＰは、ビオチン等の非蛍光性部分で標識し、アビジン等の蛍光サンドイッチ技術を使用した後、蛍光抗アビジン抗体を使用して、ハイブリダイゼーション後のアッセイで検出することができる。
【００４８】
標識は、直接ポリヌクレオチドに組み込んでもよいし、またはポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合する分子に取り付けてもよい。標識は、当該技術分野で周知の二にの手段により、単離ポリヌクレオチドにつながれ得る。種々の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、ニックトランスレーション、ＰＣＲまたは任意のプライマー伸長（例えばSambrookらの前掲参照）を使用して標識される。標識を検出する方法には、分光分析法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的法、物理学的方法、または化学的法が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００４９】
ＵＳＰは、凍結乾燥された形式でもよいし、１つ以上の緩衝液、ハイブリダイゼーション溶液および組成物を貯蔵するための溶液を含む溶液の形式であってもよい。そのような溶液はそのようなものとして製造されるか、組成物の使用時に調製され得る。代わりに、ＵＳＰはマイクロアレイ、ビーズ、ナイロンメンブレン、スライドまたはマイクロプレートの形式等の固相支持体に配置されてもよい。
【００５０】
第２の態様では、本発明は本発明の方法によって作られた、本願に開示されたものを含むがこれらに限定されないユニーク配列プローブを提供する。そのようなユニーク配列プローブは、インサイチュハイブリダイゼーション、蛍光性インサイチュハイブリダイゼーション、化学物質誘発性インサイチュハイブリダイゼーション、および関連技術を含むがそれらに限定されない対象の核酸標的に対する任意のタイプのハイブリダイゼーションアッセイに使用することができる。ＵＳＰは、凍結乾燥された形式もよいし、１つ以上の緩衝液、ハイブリダイゼーション溶液および組成物を貯蔵するための溶液を含む溶液の形式であってもよい。そのような溶液はそういうものとして製造されるか、組成物の使用時に調製され得る。代わりに、ＵＳＰはマイクロアレイ、ビーズ、ナイロンメンブレン、スライドまたはマイクロプレートの形式等の固相支持体に配置されてもよい。この代替形式では、当業者は、ユニーク配列プローブが支持体に取り付けられ、反復配列を含む第２の検出プローブとハイブリダイズする時に、固相支持体に取り付けられたユニーク配列プローブには相補的な反復配列がないため、コンペティターＤＮＡがハイブリダイゼーションにおいて要求されないことが認識されるだろう。
【００５１】
本発明のこの第２態様の好ましい実施形態では、ユニーク配列プローブは、配列番号８９３−９８６（ＳＭＡＲＣＥ１  ＵＳＰ）から選択された複数の核酸を含むか、またはそれのみからなる。
【００５２】
本発明のこの第２態様のさらに好ましい実施形態では、ユニーク配列プローブは、配列番号９８７−１０８２（ＰＤＣＤ６ＩＰ  ＵＳＰ）から選択された複数の核酸に含むか、またはそれのみからなる。
【００５３】
本発明のこの第２態様のさらに好ましい実施形態では、ユニーク配列プローブは、配列番号１０８３−１１５４（ＣＹＰ２４  ＵＳＰ）から選択された複数の核酸に含むか、またはそれのみからなる。
【００５４】
本発明のこの第２態様のさらに好ましい実施形態では、ユニーク配列プローブは、配列番号１１５５−１２４２（ＮＲ１Ｄ１  ＵＳＰ）から選択された複数の核酸に含むか、またはそれのみからなる。
【００５５】
本発明のこの第２態様のさらに好ましい実施形態では、ユニーク配列プローブは、配列番号１２４３−１３３８（ＢＩＲＣ５  ＵＳＰ）から選択された複数の核酸に含むか、またはそれのみからなる。
【００５６】
第２態様で使用される場合、複数は２つ以上の記載された核酸を必要とする。本発明の
第２態様のこれらの好ましい実施形態の各々では、ユニーク配列プローブが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６個の記載された核酸を含むか、またはそれのみからなることが好ましい。
【００５７】
第３態様では、本発明はポリヌクレオチドプライマーセットを提供する。「ポリヌクレオチドプライマーセット」は、核酸プローブ中の所与のユニーク配列要素に相補的な順方向プライマーと逆方向プライマー（「プライマー対）を含むかまたはそれのみからなり、核酸プローブ中の所与のユニーク配列要素の一定領域を増幅するためにＰＣＲで使用できる。プライマーセット中の各ポリヌクレオチドプライマーは５２℃と６５℃の間、好ましくは５５℃と６３℃の間、より好ましくは５６℃と６１℃の間のアニール温度を有し、ポリヌクレオチドプライマーセット中のポリヌクレオチドプライマーは互いに３°、２°、１°または０℃以内のアニール温度を有する。
【００５８】
図３−７は特定の核酸プローブに対する多くのそのようなプライマー対を提供する。これらの図では、所与のポリヌクレオチドプライマーセットに対する順方向および逆方向ポリヌクレオチドプライマーが表中の同じ列に列挙されて、番号が付けられている。例えば図３の配列番号１および配列番号２は、例えば、ＳＭＡＲＣＥ１の一定領域を増幅するために使用することができるプライマー対番号１を構成する。当業者には多くのそのようなプライマー対が図３−７に提供されることが理解されるだろう。
【００５９】
この第３態様では、ポリヌクレオチドプライマーセットは、図３−７に提供されたプライマー対から選択された所与の核酸プローブ（ＳＭＡＲＣＥ１、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＣＹＰ２４、ＮＲ１Ｄ１およびＢＩＲＣ５）に対する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９６個のプライマー対を含むかまたはそれのみからなる。
【００６０】
第４の態様では、本発明は、本発明の方法によるユニーク配列プローブと、対象の核酸標的に対するハイブリダイゼーションアッセイにおける同プローブの使用に関する説明書とを含むキットを提供する。ハイブリダイゼーションアッセイには、インサイチュハイブリダイゼーション、蛍光性インサイチュハイブリダイゼーション、化学物質誘発性インサイチュハイブリダイゼーション、および関連技術を含むがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、キット中のＵＳＰは上述したように標識される。キットはさらに、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液、および制御スライドを含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーションアッセイで使用される要素をさらに含むことができる、さらに好ましい実施形態では、キットは、例えば本発明の方法によってＵＳＰを生成する際に使用可能な、本明細書に開示したポリヌクレオチドプライマーセットを含む。
【００６１】
第５の態様では、本発明は、対象の核酸標的を検出する方法であって、
（ａ）対象の核酸標的用の発明の方法によりユニーク配列プローブを生成する工程と；
（ｂ）核酸標的へのユニーク配列プローブのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、試験標本にユニーク配列プローブを接触させる工程と；
（ｃ）およびユニーク配列プローブと核酸標的との間で形成され、標本中の核酸標的の測定基準を提供するハイブリダイゼーション複合体を検出する工程と；
からなる方法を提供する。
【００６２】
この第５の態様では、ユニーク配列プローブの生成は本発明の第１態様で上述した通りである。核酸標的も先に定義した通りである。
本明細書に使用する場合、「接触する」は、標本中の標的核酸とＵＳＰを変性させ、それらをハイブリダイゼーションを促進するように接触させることからなる。そのような接触のためには当該技術分野で周知のいかなる技術を使用してもよい。例えば、接触はハイブリダイゼーション溶液の添加前に（例えば別の変性溶液中で）起こり得るが、標的核酸ならびにプローブの変性とハイブリダイゼーションとが同じ溶液中で起こることが好ましい。ハイブリダイゼーション溶液との標本の接触は標識ＵＳＰとの標本の接触と同時かまたはその前に起こり得るが、標識プローブがハイブリダイゼーション溶液に加えられ、標的核酸ならびにプローブの変性がハイブリダイゼーション溶液中で同時に起こることが好ましい。
【００６３】
好ましい実施形態では、方法は、米国特許第５，７５０，３４０号および第６，０２２，６８９号に開示されたハイブリダイゼーション緩衝液を利用する。
本明細書に使用する場合、「標本」は、ゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、細胞ならびに組織サンプル、外科標本、血液サンプル、骨髄サンプル、脳脊髄液、および中期染色体スプレッドを含むがこれらに限定されないＵＳＰへのハイブリダイゼーションによる核酸標的の検出が有用なすべての標本のことを指す。好ましい実施形態では、標本は細胞サンプル、組織サンプルまたは中期染色体スプレッドである。そのような細胞、組織および染色体スプレッドのサンプルの調製方法は当該技術分野で周知である。好ましい実施形態では、標本は、ガラスまたはプラスチック製のスライドおよびマルチウェル組織培養プレートを含むがこれらに限定されないＩＳＨを行なうことができるすべての基材等の、プラットフォームに固定される。ＵＳＰは標識され、標本に対するプローブとして使用される。
【００６４】
代わりに、ＵＳＰを固相支持体上に配列させ、標本由来の核酸を標識し、配列されたＵＳＰの検出のために使用してもよい。この実施形態ではＵＳＰは標識されない。この実施形態では、さらに、固相支持対に取り付けられたユニーク配列プローブには相補的な反復配列がないため、プローブ中に見出される反復配列を無効にするためのコンペティターＤＮＡが必要とされない。
【００６５】
ハイブリダイゼーションを促進する条件は当該技術分野で周知のいかなるものでもよい。ＵＳＰが他の配列には最小限にしかまたは全く結合せず核酸標的に選択的に結合してハイブリダイゼーション複合体を形成する、すべての条件を本発明の方法に使用することができる。使用される正確な条件は、ＵＳＰ中のユニーク配列要素の長さ、それらのＧＣ含量、ならび当業者に周知の種々の他の要因によって決まる。（例えば、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chapt 2, "Overview of principles of hybridization and
the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, N.Y. ("Tijssen")およびFish: A Practical Approach, Barbara G. Beatty, Sabine Mai, and Jeremy A. Squire, editors. Oxford University Press, 2002.参照）。
【００６６】
任意の所望のハイブリダイゼーション処理後の工程を実行してもよい。プラットフォー
ム上の標本が検出前に空気乾燥等により乾燥されることが好ましい。任意選択で、生体試料が、核を染色する４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液による対比染色のように、細胞構造を検出するために対比染色されてもよい。
【００６７】
ハイブリダイゼーション複合体を検出するいかなる方法を使用してもよく、それには例えばサザンブロット法ならびにノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、比較ゲノムハイブリダイゼーションまたはアレイベースの方法がある。好ましい実施形態では、検出はインサイチュハイブリダイゼーションにより行なわれる（「ＩＳＨ」）。インサイチュハイブリダイゼーション測定法は当業者に周知である。例えば米国特許第５，７５０，３４０号および第６，０２２，６８９号を参照されたい。
【００６８】
上述したように、標識ＵＳＰには検出可能な部分（検出部分）が取り付けられている。検出部分は、例えば蛍光でタグ標識したヌクレオチド類似体がプローブに共有結合で取り付けられる場合のように、直接検出することができる。代わりに、取付部分は、取付部分に特異的な蛍光でタグ標識された抗体がハイブリダイゼーションおよび洗浄手順の後に加えられる場合のように、二次的な検出手順で検出することもできる。ハイブリダイゼーション複合体中に存在する標識を検出する方法には、分光分析法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的法、物理学的方法、または化学的法が含まれるが、これらに制限されるわけではない。例えば、例えば、有用な標識には、32Ｐ、3Ｈおよび14Ｃ等の放射活性標
識；イソチオシアン酸フルオレセイン（FITC）、ローダミン、ランタニド燐光体、Tex as
red（商標）、ALEXIS（商標）（Abbott Labs社）、ＣＹ（商標）色素（Amersham社）等
の蛍光色素；金等の高電子密度試薬；セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ等の酵素；金コロイド等の比色定量標識；DYNABEADS（商標）として販売されているような磁気標識；ビオチン；ジゴキシ
ゲニン；または抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。標識は、ポリヌクレオチドに直接組み入れられてもよいし、または、ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合するプローブもしくは抗体に結合させてもよい。標識は、当業者に周知の任意の手段によってプローブに連結されうる。種々の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ニックトランスレーション法、ＰＣＲ、TAQMAN（商標）またはランダムプライマー伸長法（例えば、前掲のサムブルック（Sambrook）らの文献を参照）を使用して標識される。
【００６９】
標識プローブからのシグナルは、使用される特定の標識に対して当該技術分野で周知のいかなる手段で検出してもよい。例えば、検出可能な標識が蛍光標識である場合、蛍光顕微鏡で視覚化することにより蛍光シグナルを検出することができる。
【００７０】
実施例：
対象のゲノム領域を含む完全ＤＮＡ配列を得る。対象の配列を含むクローンにはｃＤＮＡクローン、λ、コスミドもしくはクローン、またはＹＡＣ、ＢＡＣまたはＰ１等の大きな挿入クローンを含むがそれらに限定されるわけではない。クローンの完全ＤＮＡ配列は種々の手動または自動のＤＮＡ塩基配列決定プロトコルを使用して得ることができる。以下は、例えばＢＡＣクローンのユニーク配列を得るための手順について説明する。ＢＡＣクローンの配列の一般的な情報源はＵＣＳＣゲノム生物情報科学データベース（http://geme.ucsc.edu/index.html?org=Human）で得ることができる。公的データベースも任意の
対象ゲノム領域のＤＮＡ配列情報源として使用することができる。ＢＡＣの反復要素は、ＵＣＳＣゲノム生物情報科学データベースの「Mask Repeat」機能を用いて同定すること
ができ、次にＢＡＣの反復しない配列は「Get DNA」機能を使いて得られる。その後、各
ユニーク配列要素に隣接するＰＣＲプライマーを手動アプローチまたはコンピュータによ
るアプローチのいずれかを使用して設計する。プライマー設計には、「FAST PCR」（http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-l_html/oligos.htm）を含めて、商業用およびウェブ形式のもので、いくつかのソフトウェアが利用可能である。これらのプログラムは融解温度を計算し、自己アニールするヘアーピンループ構造およびプライマー二量化等の潜在的な問題を決定する。通常のＢＡＣの場合、クローンのユニーク配列要素全体を増幅するのに必要な増幅用のプライマー対の数は５０から１００以上までの範囲にある。
【００７１】
本発明を実証するために、５個のＢＡＣ  ＤＮＡが選択された。そのようなＢＡＣは、ＮＲ１Ｄ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＢＩＲＣ５、ＣＹＰ２４ＡおよびＰＤＣＤ６ＩＰに対する遺伝子を含んでいる。ＢＡＣはＣＨＯＲＩ（http://bacpac.chori.org/）に保管されている「３２Ｋ  ヒトゲノムＢＡＣ  再配列（Rearray）」から選択された。この実施例にお
けるＢＡＣＳのサイズは１５４−１７８ｋｂの範囲である。個々のＢＡＣの名前、サイズおよび染色体位置は表１に要約する。
【００７２】
【表１】
2008534011.tif 000003
【００７３】
ＢＡＣの反復の要素はＵＣＳＣゲノム生物情報科学データベースの「Mask Repeat」機
能を用いて同定し、次にＢＡＣの反復しない配列は「Get DNA」機能を使いて得た（http://geme.ucsc.edu/index.html?org=Human）。
【００７４】
各マーカーに対する関連ＢＡＣクローンの配列は反復配列でマークしてHuman UCSCゲノムブラウザからダウンロードした。３００ｂｐ以上の長さのユニーク配列領域の両端からプライマーを選択した。プライマーは「FAST PCR」プログラムを使用して、各ＢＡＣに対して設計した。
【００７５】
選択されたプライマーは以下の通りである（図３−７に記されているようにプライマー対で使用した）：
ａ）ＳＭＡＲＣＥ１プライマー：配列番号１−１８８；
ｂ）ＰＤＣＤ６ＩＰプライマー：配列番号１８９−３８０；
ｃ）ＣＹＰ２４プライマー：配列番号３８１−５２４；
ｄ）ＮＲ１Ｄ１プライマー：配列番号５２５−７００；および
ｅ）ＢＩＲＣ５プライマー：配列番号７０１−８９２。
【００７６】
ＰＣＲは以下のように実行した：
−Promega社（カタログ番号Ｍ７５０５）のPCR Master MixをＰＣＲに使用した。反応
緩衝液：２５ユニット／ｍｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、製造業者の独自仕様の反応緩衝液中−（ｐＨ８．５）、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ
ｄＣＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ（１．５のｍＭ  ＭｇＣｌ2）。−サイクル条件：
１．９５℃  ５分；
２．９５℃  １５秒；
３．５６℃  ３０秒；（この温度はプライマーのアニール温度に依存して変化する）
４．７２℃  ２分；
５．３０回  工程２に行く；
６．７２℃  ３分；
−プライマー濃度は１μＭとした。
【００７７】
−鋳型濃度：
−１回目実行のＰＣＲのＢＡＣクローン濃度は０．３〜０．５ｎｇ／μｌであった。
２回目実行のＰＣＲ（以下の「２回目実行のＰＣＲ」を参照）では、１回目実行のＰＣＲ反応混合物の１／１００量を鋳型として使用し、濃度は決定しなかった。
−５０μｌの１回目実行のＰＣＲ反応については、以下を混合する：
０．３μｌ  ＢＡＣ鋳型（５６ｎｇ／μｌ）；
５μｌ  順方向プライマー（１０μＭ）；
５μｌ  逆方向プライマー（１０μＭ）；
２５μｌ  ２ＸＰＣＲマスター混合物；
１４．７μｌ  滅菌ｄＨ2Ｏ。
【００７８】
−上記サイクルを実行し、−２０℃で保存。
−５０μｌの２回目実行のＰＣＲ反応については、以下を混合する：
０．５μｌ  １回目実行のＰＣＲ産物；
５μｌ  順方向プライマー（１０μＭ）；
５μｌ  逆方向プライマー（１０μＭ）；
２５μｌ  ２ＸＰＣＲマスター混合物；
１４．５μｌ  滅菌ｄＨ2Ｏ。
【００７９】
−上記サイクルを実行し、−２０℃で保存。
使用されたすべてのプライマーの融解温度は５７℃から６０℃の範囲であった。増幅されたＰＣＲ産物を確認するアガロースゲル分析は、反応の９８−９９％が成功したことを示した。
【００８０】
各ＢＡＣに対するプライマー対の数、ＰＣＲ産物の平均長、およびユニーク配列プローブに含まれるオリジナルＢＡＣのカバー範囲合計を表２に要約する。
【００８１】
【表２】
2008534011.tif 000004
【００８２】
得られたＰＣＲ産物の配列を以下のように提供する：
（ａ）ＳＭＡＲＣＥ１  ＵＳＰ：配列番号８９３−９８６、
（ｂ）ＰＤＣＤ６ＩＰ  ＵＳＰ：配列番号９８７−１０８２、
（ｃ）ＣＹＰ２４  ＵＳＰ：配列番号１０８３−１１５４、
（ｄ）ＮＲ１Ｄ１  ＵＳＰ：配列番号１１５５−１２４２、
（ｅ）ＢＩＲＣ５  ＵＳＰ：配列番号１２４３−１３３８。
【００８３】
ＰＣＲ産物を伸長しなかったプライマーから精製し、プールした。次に、各プールのアリコート（当量分配物）を、Invitrogen社のBioPrime DNA Labeling Kitを用いて製造業
者の説明書に従ってSpectrum Orange、Spectrum Green、Spectrum Red（Vysis社）、またはDEAC（ジエチルアミノクマリン−５−ｄＵＴＰ、PerkinElmer）の４つの蛍光色素のう
ちの少なくとも１つで標識した。組み込まれなかった蛍光色素をＹＭ−３０マイクロコンカラム（Millipore社）を使用して精製した。
【００８４】
プローブを、単独で、対で、または三重で（すなわち１、２または３つの核酸標的に対し、従って１、２または３つの異なるＵＳＰに対し）中期染色体または乳癌薄切片に対し、またはパラフィンブロックから切除された組織培養細胞系の切片に対しハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション緩衝液は２０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、０．９％ＮａＣｌ  とした。Spectrum Orange、Texas Red、またはDEAC Aquaで標識され
る場合、プローブ濃度は４０ｎｇ／μｌとし、Spectrum Greenで標識される場合、６０ｎｇ／μｌとした。標本は３８℃で１４−２０時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後に、スライドを０．１５％ＮａＣｌで６０℃、１０分間洗浄した。
【００８５】
各実施例に関し、オリジナルＢＡＣおよびその派生物ＵＳＰを、中期染色体に同時ハイブリダイズさせた４つの蛍光色素のうちの１つで標識した。２つの標識プローブの各ペアで。親ＢＡＣに含まれていた反復配列を抑制するために、コンペティターＤＮＡがそれらの同時ハイブリダイゼーション溶液に含まれた。各対で、プローブは、予期された染色体領域と等しい強度で同時ハイブリダイズし、他の染色体領域とハイブリダイズすることはなく、または他の染色体領域との非特異的バックグラウンドやアーチファクトのハイブリダイゼーションもなかった。これらの２重ハイブリダイゼーションは、標識された親ＢＡＣとその派生物のＵＳＰとの間に特異性やシグナルの質に損失がないことを示している。
【００８６】
中期染色体では、すべてのプローブに対するシグナル強度は、蛍光色素にかかわらず、５つすべてのプローブで等しかった。すべての場合で、明るく強いシグナルがはっきりと見え、他の染色体ではアーチファクトシグナルは観察されなかった。ゲノム全体にわたってランダムに背景ハイブリダイゼーションが分配されることはなく、非特異的ハイブリダイゼーションが拡散する領域もなかった。
【００８７】
三重プローブのマルチプルハイブリダイゼーションを、５μＭホルマリンで固定したパラフィン埋込の間期乳腺癌細胞系薄切片についても試験した。これらのハイブリダイゼーションでは、使用した蛍光色素について期待された３つの固有の色で明らかな別個のハイブリダイゼーションシグナルが見られ、アーチファクトシグナルまたは干渉性の背景はなかった。したがって、プローブが単独でハイブリダイズされても三重でハイブリダイズされても、シグナルの質や強度に損失はない。
【００８８】
プローブの質およびシグナルの強度は特定のプローブおよび蛍光色素のペアによって決定されるわけではなかった。試験された蛍光色素およびプローブの対の組み合わせを表３に要約する。
【００８９】
【表３】
2008534011.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ａ）転写配列、ｂ）反復配列およびｃ）ユニーク配列の間の関係を示すゲノム領域の略図。様々な長さで反復配列がランダムに散在しており、反復配列は一つの遺伝子の転写セグメントの間かつ転写配列の中（両方向矢印によって示される）で生じることに留意する。
【図２】本発明によるユニーク配列プローブの生産方法の典型例の略図。ａ）ゲノム領域の各ユニーク配列セグメントがユニークなプライマー対により増幅される。（ｂ）ＰＣＲ産物はプールされ、ｃ）蛍光色素で標識され、およびｄ）中期染色体スプレッド、間期細胞またはＤＮＡマイクロアレイ染色体を初めとする複合標的とハイブリダイズされる。
【図３Ａ】ＳＭＡＲＣＥ１  ＵＳＰを作成するために使用されるプライマーを列挙した表。
【図３Ｂ】図３Ａに続く図。
【図３Ｃ】図３Ｂに続く図。
【図３Ｄ】図３Ｃに続く図。
【図３Ｅ】図３Ｄに続く図。
【図３Ｆ】図３Ｅに続く図。
【図３Ｇ】図３Ｆに続く図。
【図４Ａ】ＰＤＣＤ６ＩＰ  ＵＳＰを作成するために使用されるプライマーを列挙した表。
【図４Ｂ】図４Ａに続く図。
【図４Ｃ】図４Ｂに続く図。
【図４Ｄ】図４Ｃに続く図。
【図４Ｅ】図４Ｄに続く図。
【図４Ｆ】図４Ｅに続く図。
【図４Ｇ】図４Ｆに続く図。
【図５Ａ】ＣＹＰ２４  ＵＳＰを作成するために使用されるプライマーを列挙した表。
【図５Ｂ】図５Ａに続く図。
【図５Ｃ】図５Ｂに続く図。
【図５Ｄ】図５Ｃに続く図。
【図５Ｅ】図５Ｄに続く図。
【図６Ａ】ＮＲ１Ｄ１  ＵＳＰを作成するために使用されるプライマーを列挙した表。
【図６Ｂ】図６Ａに続く図。
【図６Ｃ】図６Ｂに続く図。
【図６Ｄ】図６Ｃに続く図。
【図６Ｅ】図６Ｄに続く図。
【図６Ｆ】図６Ｅに続く図。
【図７Ａ】ＢＩＲＣ５  ＵＳＰを作成するために使用されるプライマーを列挙した表。
【図７Ｂ】図７Ａに続く図。
【図７Ｃ】図７Ｂに続く図。
【図７Ｄ】図７Ｃに続く図。
【図７Ｅ】図７Ｄに続く図。
【図７Ｆ】図７Ｅに続く図。
【図７Ｇ】図７Ｆに続く図。
【図１】
2008534011.tif 000006
【図２】
2008534011.tif 000007
【図３Ａ】
2008534011.tif 000008
【図３Ｂ】
2008534011.tif 000009
【図３Ｃ】
2008534011.tif 000010
【図３Ｄ】
2008534011.tif 000011
【図３Ｅ】
2008534011.tif 000012
【図３Ｆ】
2008534011.tif 000013
【図３Ｇ】
2008534011.tif 000014
【図４Ａ】
2008534011.tif 000015
【図４Ｂ】
2008534011.tif 000016
【図４Ｃ】
2008534011.tif 000017
【図４Ｄ】
2008534011.tif 000018
【図４Ｅ】
2008534011.tif 000019
【図４Ｆ】
2008534011.tif 000020
【図４Ｇ】
2008534011.tif 000021
【図５Ａ】
2008534011.tif 000022
【図５Ｂ】
2008534011.tif 000023
【図５Ｃ】
2008534011.tif 000024
【図５Ｄ】
2008534011.tif 000025
【図５Ｅ】
2008534011.tif 000026
【図６Ａ】
2008534011.tif 000027
【図６Ｂ】
2008534011.tif 000028
【図６Ｃ】
2008534011.tif 000029
【図６Ｄ】
2008534011.tif 000030
【図６Ｅ】
2008534011.tif 000031
【図６Ｆ】
2008534011.tif 000032
【図７Ａ】
2008534011.tif 000033
【図７Ｂ】
2008534011.tif 000034
【図７Ｃ】
2008534011.tif 000035
【図７Ｄ】
2008534011.tif 000036
【図７Ｅ】
2008534011.tif 000037
【図７Ｆ】
2008534011.tif 000038
【図７Ｇ】
2008534011.tif 000039
【配列表】
2008534011000001.app
【国際調査報告】
2008534011.tif 000040
2008534011.tif 000041
2008534011.tif 000042
2008534011.tif 000043
2008534011.tif 000044
2008534011.tif 000045