(57)【要約】  第一の態様において、本発明は代謝型グルタミン酸受容体をコードする誘導性発現ベクターを提供する。特に、グループＩ  ｍＧｌｕＲのメンバーを、特にヒトｍＧｌｕＲ１ａ（配列番号１）もしくはｍＧｌｕＲ５受容体（配列番号３）をコードするヌクレオチド配列を含んでなる例えば市販されているｐｃＤＮＡ４／ＴＯ哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のようなテトラサイクリン誘導性発現ベクター。より好ましい態様において、誘導性発現ベクターはテトラサイクリン誘導性発現プラスミドｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図４）およびｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図５）から選択される。第二の態様において、本発明は上記の誘導性発現ベクターのいずれかを含んでなる細胞系を提供する。特に、２００４年６月２４日にＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯクローンとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたテトラサイクリン誘導性発現プラスミドｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図４）およびｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図５）で安定にトランスフェクションされたＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞。第三の態様において、本発明は代謝型グルタミン酸受容体の活性を調節する能力を有する化合物を同定する方法を提供し、該方法は；試験する化合物と上記の細胞系を接触させる段階、および代謝型グルタミン酸受容体活性への該試験化合物の効果を決定する段階を含んでなる。代謝型グルタミン酸受容体活性への効果は、特に例えばｆｌｕｏ−３−ＡＭのような蛍光色素を用いて、細胞内カルシウムの変化を評価することにより典型的に決定される。代謝型グルタミン酸受容体と、特にグループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体と相互作用することができる化合物を同定する方法を提供することもまた本発明の目的であり、該方法は、適切な条件下で試験する化合物と本発明の細胞を接触させる段階および細胞への該試験化合物の結合を決定する段階を含んでなる。
2008503228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝型グルタミン酸受容体をコードするテトラサイクリン誘導性発現ベクター。
【請求項２】
該ベクターがグループＩ  ｍＧｌｕＲのメンバーをコードする請求項１に記載のテトラサイクリン誘導性発現ベクター。
【請求項３】
該ベクターがヒトｍＧｌｕＲ１ａ（配列番号：２）もしくはヒトｍＧｌｕＲ５（配列番号：４）をコードする請求項２に記載のテトラサイクリン誘導性発現ベクター。
【請求項４】
テトラサイクリン誘導性発現プラスミドｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図４）およびｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図５）から選択される請求項３に記載のテトラサイクリン誘導性発現ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のベクターを含んでなるＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞。
【請求項７】
ａ）ｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物の存在下および不在下で、請求項１〜４のいずれかに記載の誘導性発現ベクターを含んでなり且つｍＧｌｕＲ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞はｍＧｌｕＲ受容体を通常は発現しない）を試験化合物と接触させること、および
ｂ）対照としてｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物を用いてｍＧｌｕＲ受容体への試験化合物の結合を決定すること
を含んでなる、試験化合物がｍＧｌｕＲ受容体タンパク質に結合しそしてそれ故にｍＧｌｕＲ受容体の潜在的アゴニストもしくはアンタゴニストであるかどうかを同定する方法。
【請求項８】
ｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物を検出可能に標識し、そしてｍＧｌｕＲ受容体への試験化合物の結合を決定するために該標識を用いる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物が３Ｈ−グルタミン酸塩（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、３Ｈ−ＡＣＰＤおよび３Ｈ−キスカル酸塩（ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ）よりなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階ａ）の細胞を中程度ないし高誘導培養条件に維持する請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）ｍＧｌｕＲ受容体の活性化を可能にする条件下で請求項５もしくは６に記載の細胞を少なくとも１種の対照化合物と接触させること、
ｂ）ｍＧｌｕＲ受容体の活性化を可能にする条件下で段階ａ）の細胞を試験化合物と接触させること、および
ｃ）該試験化合物が対照化合物と比較してｍＧｌｕＲ受容体活性を調節するかどうかを決定すること
を含んでなる、ｍＧｌｕＲ受容体活性を調節する能力を有する化合物の同定方法。
【請求項１２】
対照化合物がグルタミン酸塩、ＡＣＰＤ、ＣＰＣＣＣＯＥｔ、ＡＩＤＡ、ＬＹ３４１４９５もしくはキスカル酸塩よりなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５もしくは６の細胞を非誘導もしくは低誘導培養条件に維持する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ｍＧｌｕＲ受容体活性を調節する試験化合物の能力をｃＡＭＰの変化、カルシウム濃度の変化およびイノシトールリン酸レベルの変化よりなる群から選択される機能的反応の１つもしくはそれ以上を用いて決定する請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞内カルシウム濃度の変化をｆｌｕｏ−３，ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｎ、ｆｕｒａ  ｒｅｄを包含するイオン感受性蛍光色素を用いて；特にｆｌｕｏ−３  ＡＭを用いて決定する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｍＧｌｕＲ受容体アゴニストがグルタミン酸塩、ＡＣＰＤもしくはキスカル酸塩よりなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ｉ）非誘導ないし低誘導培養条件で本発明の細胞を培養することを含んでなるｍＧｌｕＲの機能発現の方法、もしくは
ｉｉ）中程度ないし高誘導培養条件で本発明の細胞を培養することを含んでなるｍＧｌｕＲ結合アッセイ
における請求項５もしくは６に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グループＩ代謝型グルタミン酸受容体のモジュレーターである物質を同定する新規な方法を提供する。本発明の方法は、アッセイ条件によりグループＩ代謝型グルタミン酸受容体ｍＧｌｕ１もしくはｍＧｌｕ５の活性を調節する物質を同定するために機能アッセイにおいてまたは上記の受容体と相互作用する物質を同定するために結合アッセイにおいて用いることができる細胞系の開発を提供する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸塩（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）は、哺乳類の脳における主要な興奮性神経伝達物質である。グルタミン酸塩は、細胞表面受容体に結合しそしてそれによってそれらを活性化することにより中枢ニューロンへのその効果をもたらす。これらの受容体は、受容体タンパク質の構造的特徴、受容体が細胞にシグナルを伝達する手段、および薬理学的プロフィールに基づいて２つの主要クラス、イオンチャンネル型および代謝型グルタミン酸受容体に細分されている。
【０００３】
代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）は、グルタミン酸塩もしくはキスカル酸塩（ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ）および１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）を包含する他の強力なアゴニストの結合後に様々な細胞内二次メッセンジャー系を活性化することができるＧタンパク質共役受容体である（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００４】
ｉｎ  ｓｉｔｕでの異なる代謝型グルタミン酸受容体サブタイプの活性化は、以下の反応の１つもしくはそれ以上を引き起こす：ホスホリパーゼＣの活性化、ホスホイノシチド（ＰＩ）加水分解の増加、細胞内カルシウム放出、ホスホリパーゼＤの活性化、アデニリルシクラーゼの活性化もしくは抑制、環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）の形成の増加および減少、グアニリルシクラーゼの活性化、環状グアノシン１リン酸（ｃＧＭＰ）の形成の増加、ホスホリパーゼＡ２の活性化、アラキドン酸放出の増加、ならびに電位依存性およびリガンド依存性イオンチャンネルの活性の増加もしくは減少（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００５】
これまでに、８つの異なったｍＧｌｕＲサブタイプが分子クローニングによって単離され、そしてそれらが発見された順序に従ってｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８と命名されている（非特許文献５；非特許文献４；非特許文献６）。さらなる多様性は、ある種のｍＧｌｕＲサブタイプの選択的スプライシング形態の発現によって生じる（非特許文献７；非特許文献８）。ｍＧｌｕＲは全て、それらが大きいアミノ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、続いて３個の細胞内および３個の細胞外ループにより連結される７個の推定膜貫通へリックスを含んでなる７個の推定膜貫通ドメイン（７ＴＭＤ）、および可変長の細胞内カルボキシ末端ドメイン（細胞質尾部）（ＣＴ）を有する単一サブユニット膜タンパク質である点において構造的に類似する（概略図１ａを参照）。
【０００６】
８つのｍＧｌｕＲは、アミノ酸配列同一性、それらが利用する二次メッセンジャー系、および薬理学的特性に基づいて３群に細分されている（非特許文献５；非特許文献４；非特許文献６）。既定群内のｍＧｌｕＲ間のアミノ酸同一性は約７０％であるが、異なる群におけるｍＧｌｕＲ間では約４０％まで減少する。同じ群におけるｍＧｌｕＲでは、この関連性は、シグナル伝達機序および薬理学的特性における類似性とほぼ同等である。
【０００７】
グループＩ  ｍＧｌｕＲは、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ５およびそれらの選択的スプライシングバリアントを含んでなる。これらの受容体へのアゴニストの結合は、ホスホリパーゼＣの活性化およびその後の細胞内カルシウムの動員をもたらす。例えば、組み換えｍＧｌｕＲ１受容体を発現するゼノパス卵母細胞は、電気生理学的手段により間接的にこの効果を示すために利用されている（非特許文献９；非特許文献７）。同様の結果が、組み換えｍＧｌｕＲ５受容体を発現する卵母細胞で得られた（非特許文献１０；非特許文献８）。
【０００８】
グループＩ  ｍＧｌｕＲのアゴニスト効能プロフィールは、キスカル酸塩＞グルタミン酸塩＝イボテン酸塩＞（２Ｓ，１’Ｓ，２’Ｓ）−２カルボキシシクロプロピル）グリシン（Ｌ−ＣＣＧ−Ｉ）＞（１Ｓ，３Ｒ）−１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）である。
【０００９】
キスカル酸塩は、グループＩＩおよびグループＩＩＩ  ｍＧｌｕＲと比較した場合に、グループＩ受容体に対して比較的選択的であるが、それはまたイオンチャンネル型ＡＭＰＡ受容体も強く活性化する（非特許文献４；非特許文献６）。
【００１０】
グループＩ  ｍＧｌｕＲの生理的役割を解明する試みにより、これらの受容体の活性化はニューロン興奮を引き起こすことが示唆される。様々な研究により、ＡＣＰＤは海馬、大脳皮質、小脳および視床ならびに他の脳領域におけるニューロンへの使用の際にシナプス後興奮をもたらすことができることが示されている。この興奮はシナプス後ｍＧｌｕＲの直接活性化に起因することが証拠により示されるが、増加した神経伝達物質放出をもたらすシナプス前ｍＧｌｕＲの活性化により媒介されることもまた示唆されている（非特許文献１１；非特許文献３；非特許文献４）。薬理学的実験により、グループＩ  ｍＧｌｕＲはこの興奮のメディエーターに関係するとみなされる。
【００１１】
ｍＧｌｕＲの生理的役割を調べる他の研究により、代謝型グルタミン酸受容体は哺乳類ＣＮＳにおける多数の正常プロセスに関与していることが示される。ｍＧｌｕＲの活性化は、海馬長期増強および小脳長期抑圧の誘導に必要とされることが示されている。非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５。侵害受容および無痛覚におけるｍＧｌｕＲ活性化の役割もまた、特にグループＩ  ｍＧｌｕＲについて示されている。侵害受容伝達におけるグループＩ  ｍＧｌｕＲの関与を示唆するかなりの証拠が蓄積されている。ファーマコフォア、受容体特異的抗体もしくはアンチセンスプローブを用いるグループＩ受容体拮抗作用は、神経障害性疼痛のモデルにおいて痛覚過敏および異痛を阻止し、ｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５アンタゴニストが新規の有効な慢性疼痛治療を提供し得ることを示唆する（非特許文献１６）。
【００１２】
さらに、ｍＧｌｕＲ活性化は、シナプス伝達、ニューロンの発達、アポトーシスニューロン死、シナプス可塑性、空間学習、嗅覚記憶、心臓活動の中枢制御、覚醒、運動制御、および前庭動眼反射の制御を包含する様々な他の正常プロセスにおいて調節的役割を果たすことが示唆されている。総説には、非特許文献５；非特許文献４；非特許文献６を参照。
【００１３】
代謝型グルタミン酸受容体はまた、ＣＮＳを冒す様々な病態生理学的プロセスおよび病状において役割を果たすことも示唆されている。これらには、脳卒中、頭部外傷、酸素欠乏障害および虚血性障害、低血糖症、癲癇、およびアルツハイマー病のような神経変性疾患が包含される。非特許文献２；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献４；非特許文献６。
【００１４】
これらの症状における病変の多くは、ＣＮＳニューロンの過剰なグルタミン酸塩誘発性興奮に起因すると考えられる。グループＩ  ｍＧｌｕＲはシナプス後機序および増大したシナプス前グルタミン酸塩放出によってグルタミン酸塩媒介ニューロン興奮を増加するように思われるので、それらの活性化はおそらく病変の一因となる。従って、グループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体の選択的アンタゴニストは、特に鎮痛剤（ａｎａｌｇｅｓｉａ）として、神経保護薬としてもしくは抗痙攣薬として、治療的に有益であり得る。
【００１５】
これまで、グループＩ  ｍＧｌｕＲに結合しそしてその機能を特異的に調節する治療薬の探索は、機能アッセイにおける再現可能なそして信頼性のあるアウトプットを提供するだけでなく結合アッセイにおいても展開することができるスクリーニングアッセイが利用できないことによって阻まれている。
【００１６】
特許文献１がヒト代謝型グルタミン酸受容体ｍＧｌｕＲ１、−２、−３およびｍＧｌｕＲ５をコードする核酸ならびにこれらの受容体に結合するかもしくはそれらを調節する化合物を同定する方法を提供すること、そして適切に機能するように思われる代謝型グルタミン酸受容体を発現する細胞系をいくつかの研究所が構築していることにもかかわらず（非特許文献１０；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２）。他の報告は、機能的ｍＧｌｕＲ発現細胞系の発現が予測可能でないことを記載している。例えば、Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（非特許文献１９）は、ｍＧｌｕＲ３およびｍＧｌｕＲ４の機能発現を示すことができず、そしてＣＨＯ細胞における天然のｍＧｌｕＲ１の発現を得ることの難しさを記載した。Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（非特許文献２９）もまた、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＧｌｕＲ１発現での困難を記載し、そしてこれらの困難のいくつかはこれらの受容体の脱感作特性に起因し得る可能性がある。アゴニスト刺激の際のこの迅速な脱感作はさらに、これらの受容体を発現する細胞系の生存能力に悪影響を及ぼす可能性があり、そしてスクリーニングのための天然のｍＧｌｕＲの使用を困難にする。Ｌａｃ抑制系を用いるＣＨＯ細胞におけるｍＧｌｕＲ１ａ受容体の誘導性発現は、これらの受容体の脱感作特性に関連する問題の多くを克服したが（非特許文献３３）、構成的発現ベクターで起こるよりも低いレベルの転写にまだ悩んでいる。受容体薬理学上の密度の重要性（非特許文献３４）およびｍＧｌｕＲの３群の薬理学的プロフィールの違いを考えると、しかしながら、天然の受容体タンパク質を用いて異なるｍＧｌｕＲの活性に特異的に影響を及ぼす分子を同定するためのスクリーニング方法を有することが望ましい。
【００１７】
当該技術分野における上記の問題を解決することが本発明の目的である。
【特許文献１】ＰＣＴ公開  ＷＯ９４／２９４４９明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｏｅｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１１：５０８，１９９０
【非特許文献２】Ｓｃｈｏｅｐｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：１３．１９９３
【非特許文献３】Ｓｃｈｏｅｐｐ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２４：４３９，１９９４
【非特許文献４】Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１，１９９５
【非特許文献５】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：１０３１，１９９４
【非特許文献６】Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１７，１９９５
【非特許文献７】Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８９：１０３３１，１９９２
【非特許文献８】Ｍｉｎａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  １９９：１１３６，１９９４
【非特許文献９】Ｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７６０，１９９１
【非特許文献１０】Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３３６１，１９９２
【非特許文献１１】Ｂａｓｋｙｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１５：９２，１９９２
【非特許文献１２】Ｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：３４７（１９９３）
【非特許文献１３】Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４０（１９９４）
【非特許文献１４】Ａｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７９：３６５（１９９４）
【非特許文献１５】Ａｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７９：３７７（１９９４
【非特許文献１６】Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉ  ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍＧｌｕ１  ａｎｄ  ｍＧｌｕ５  ｉｎ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ａ．Ｓ．Ｊ．  Ｌｅｓａｇｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（印刷中）
【非特許文献１７】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：１３５（１９９４）
【非特許文献１８】Ｈｏｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：３１（１９９４）
【非特許文献１９】Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１６９，１９９２
【非特許文献２０】Ａｒａｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｎｅｕｒｏｎ  ８：７５７，１９９２
【非特許文献２１】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：５９７，１９９２
【非特許文献２２】Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６１９：２２，１９９２
【非特許文献２３】Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２７：３６１，１９９２
【非特許文献２４】Ｏ’Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １１：４１，１９９３
【非特許文献２５】Ｎａｋｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１８６８，１９９３
【非特許文献２６】Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１３７２，１９９３
【非特許文献２７】Ｓａｕｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：３６７，１９９４
【非特許文献２８】Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２３１，１９９４
【非特許文献２９】Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，Ｉｎｔ．２４：５３３，１９９４
【非特許文献３０】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．２０：４６８，１９９４
【非特許文献３１】Ｆｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．２０：４６８，１９９４
【非特許文献３２】Ｆｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１４９，１９９４
【非特許文献３３】Ｍ．Ｓ．Ｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２００１，７７，１６６４−１６６７
【非特許文献３４】Ｈｅｒｍａｎｓ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９，１２６，８７３−８８２
【発明の開示】
【００１８】
［発明の要約］
第一の態様において、本発明は代謝型グルタミン酸受容体をコードする誘導性発現ベクター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｅｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）を提供する。特に、所望の代謝型グルタミン酸受容体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる例えば市販されているｐｃＤＮＡ４／ＴＯ哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のようなテトラサイクリン誘導性発現ベクター。好ましい態様において、本発明の誘導性発現ベクターはグループＩ  ｍＧｌｕＲのメンバーを、特にヒトｍＧｌｕＲ１ａ（配列番号１）もしくはｍＧｌｕＲ５受容体（配列番号３）をコードする。より好ましい態様において、誘導性発現ベクターはテトラサイクリン誘導性発現プラスミドｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図４）およびｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図５）から選択される。
【００１９】
第二の態様において、本発明は上記の誘導性発現ベクターのいずれかを含んでなる細胞系を提供する。特に、それぞれ受託番号ＬＭＢＰ  ６１５６ＣＢで２００４年６月２４日にＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯクローンとしてそして受託番号ＬＭＢＰ  ６１５７ＣＢで２００４年６月２４日にＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯとしてＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）に寄託されたテトラサイクリン誘導性発現プラスミドｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図４）およびｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（図５）で安定にトランスフェクションされたＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞。
【００２０】
第三の態様において、本発明は代謝型グルタミン酸受容体の活性を調節する能力を有する化合物を同定する方法を提供し、該方法は；
−試験する化合物と上記の細胞系を接触させる段階、および
−代謝型グルタミン酸受容体活性への該試験化合物の効果を決定する段階
を含んでなる。代謝型グルタミン酸受容体活性への効果は、特に例えばｆｌｕｏ−３−ＡＭのような蛍光色素を用いて、細胞内カルシウムの変化を評価することにより典型的に決定される。
【００２１】
代謝型グルタミン酸受容体と、特にグループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体と相互作用することができる化合物を同定する方法を提供することもまた本発明の目的であり、該方法は、適切な条件下で試験する化合物と本発明の細胞を接触させる段階および細胞への該試験化合物の結合を決定する段階を含んでなる。
【００２２】
あるいはまた、上記の結合アッセイは、本発明の細胞の細胞抽出物上で、特にそれぞれ受託番号ＬＭＰＢ  ６１５６ＣＢおよびＬＭＢＰ  ６１５７ＣＢで２００４年６月２４日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯおよびＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯの細胞膜調製物上で行われる。
【００２３】
本発明のこのおよびさらなる態様は、以下にさらに詳細に説明される。
［詳細な記述］
本発明は、代謝型グルタミン酸受容体、そして特にグループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体のようなＧタンパク質共役受容体が、機能および結合アッセイの両方における組み換え受容体の使用に関して最適な発現レベルを有するという発見に基づく。本発明の薬理学的研究において、化合物ライブラリースクリーニングは機能スクリーニング（すなわち、受容体活性を調節する化合物の能力）ならびに結合実験（すなわち、受容体タンパク質と相互作用する化合物の能力）の両方を可能にするアッセイ成分を用いて典型的に行われる。これらのアッセイは、好ましくはヒト組み換え材料を用いて行われる。しかしながら、Ｇタンパク質共役受容体では、機能発現が原形質膜への組み込みを包含する正しい翻訳後プロセシングを必要とし、従って、高いタンパク質発現レベルが優れた機能発現を自動的にもたらさないという問題に直面している。以下の実施例において示されるように、例えばＨｅｒｍａｎｓ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０：１７７２−１７７５に記述されているような誘導性発現系の使用でさえ、優れた結合および機能スクリーニング特性を自動的にもたらさない。例えば、酪酸ナトリウムでの前処理により誘導性ベクター／構築物で典型的に認められる低レベル発現を扱う、Ｍ．Ｓ．Ｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７，１６６４−１６６７を参照。驚くべきことに、グループＩ  ｍＧｌｕＲの過剰発現は、細胞表面上の機能的受容体の量を減少することが本発明者等により見出された。発現のレベルの増加に伴って受容体は凝集体、すなわちダイマーもしくはマルチマー複合体を形成し、機能的細胞表面受容体の数を減少する可能性がある。このダイマー化の役割はまだ不明であるが、これらの複合体はクラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の大部分についてそして他のクラスからのＧＰＣＲについても同様に示されている。受容体発現レベルと機能的細胞表面受容体の量との間の逆相関は、より一般的であり得る。この洞察は、将来他のＧＰＣＲのアッセイ開発に役立つ可能性がある。以下の実験部分において示されるように、最良の結果は、グループＩ代謝型グルタミン酸受容体をコードするテトラサイクリン誘導性プラスミドで安定にトランスフェクションされたＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞を用いて得られた。
【００２４】
本発明を記述する目的のために：ヒトｍＧｌｕ１ａもしくはｍＧｌｕＲ１ａは、本明細書において用いる場合、Ｄｅｓｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：６４８において既知であるヒト代謝型グルタミン酸受容体サブユニット（そのアミノ酸配列（配列番号：２）は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３２５５で見出すことができる）ならびにその哺乳類相同分子種をさす。ｍＧｌｕＲ１ａはまた、上記のものからアミノ酸配列におけるわずかな変化を有する他のｍＧｌｕＲ受容体サブユニットもさし、ただし、これらの他のｍＧｌｕＲ受容体サブユニットは、上記のサブユニットと実質的に同じ生物学的活性を有する。ｍＧｌｕＲサブユニットは、それが配列番号：２に少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９５％同一である、より好ましくは少なくとも９７％同一である、そして最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する場合に実質的に同じ生物学的活性を有する。
【００２５】
ｍＧｌｕＲ５は、本明細書において用いる場合、Ｍｉｎａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：１１３６−１１４３においてＭＧＲ５として既知であるヒトｍＧｌｕＲ受容体サブユニット（そのアミノ酸配列（配列番号：４）は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４１５９４で見出すことができる）ならびにその哺乳類相同分子種をさす。ｍＧｌｕＲ５はまた、上記のものからアミノ酸配列におけるわずかな変化を有する他のｍＧｌｕＲ受容体サブユニットもさし、ただし、これらの他のｍＧｌｕＲ受容体サブユニットは、上記のサブユニットと実質的に同じ生物学的活性を有する。ｍＧｌｕＲサブユニットは、それが配列番号：４に少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９５％同一である、より好ましくは少なくとも９７％同一である、そして最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する場合に実質的に同じ生物学的活性を有する。
【００２６】
従って、代謝型グルタミン酸受容体をコードする、特にグループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体をコードする、より好ましくはｍＧｌｕｒ１ａもしくはｍＧｌｕｒ５をコードする誘導性発現ベクターを提供することは、本発明の目的である。「誘導性発現ベクター」は、「誘導性」発現要素の制御下での興味のあるポリペプチドをコードする遺伝子の異種発現のためのベクターをさす。発現要素は、適当なレベルでそして都合のよい時点で興味のあるタンパク質の発現のために与えられる要素である。例えば、プロモーター、オペレーターおよびリボソーム結合部位よりなる群から選択される、多種多様な既知の発現要素のいずれかを用いることができる。本発明の「誘導性」発現ベクターにおいて、該発現要素は調節可能、すなわち誘導性、すなわち、例えば、金属、温度、ホルモンなどのような外来因子を用いて随意に転写因子などをそれに結合させることができるプロモーターである。誘導性プロモーターの例には、例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢ、Ｐｚｔ−１、λＰＬなどが包含される。ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーターは、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いることにより誘導することができ；ｔｒｐ、ａｒａＢおよびＰｚｔ−１プロモーターは、それぞれ、３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、Ｌ−アラビノースおよびテトラサイクリンを用いることにより誘導することができ；そしてλＰＬプロモーターは、高温（４２℃）で誘導することができる。また使用可能であるのは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより特異的にそして強力に転写されるＴ７プロモーターである。本発明の好ましい態様において、誘導性発現要素はテトラサイクリン系に基づく。該系では、テトラサイクリンもしくは誘導体の存在下でｔｅｔオペレーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドからの発現を誘導することができるテトラサイクリンに制御されたトランスアクチベーターを作るためにエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｅｔリプレッサーを単純ヘルペスウイルスビリオンタンパク質１６酸性活性化ドメイン（ＶＰ１６）に融合させる。
【００２７】
「機能的ｍＧｌｕＲ受容体」は、細胞（ここで、該細胞はｍＧｌｕＲ受容体を通常は発現しない）におけるグループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体、好ましくはｍＧｌｕＲ１ａもしくはｍＧｌｕＲ５の発現により形成されるｍＧｌｕＲ受容体をさし、ここで、機能的ｍＧｌｕＲ受容体は、ｍＧｌｕＲ受容体アゴニストグルタミン酸塩にさらされる場合に少なくとも１つの機能的反応を媒介する。機能的反応の例は：ゼノパスメラニン細胞における色素凝集、ｃＡＭＰレベルの負の調節、内向き整流カリウムチャンネルへの共役、ニューロンにおける遅延抑制性シナプス後電位の媒介、細胞内カルシウム濃度の変化、イノシトールリン酸の増加、ＭＡＰキナーゼ活性化、細胞外ｐＨ酸性化、およびＧタンパク質共役受容体に特有な他の機能的反応である。当業者は、ｍＧｌｕＲ受容体のようなＧタンパク質共役受容体の機能的反応を測定する様々な方法に精通している（例えば、Ｌｅｒｎｅｒ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１４２−１４６［メラニン細胞における色素分布の変化］；Ｙｏｋｏｍｉｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：６２０−６２４［ｃＡＭＰもしくはカルシウム濃度の変化；走化性］；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：９７４−９７７［ゼノパス卵母細胞における膜電流の変化］；ＭｃＫｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１：４１５−４２３［エクオリンアッセイを用いて測定されるカルシウム濃度の変化］；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ＆  Ｓｉｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０［イノシトールリン酸レベルの変化］を参照）。既定の実験系について機能的反応を測定する適切な方法を選択することは当業者の能力の十分に範囲内である。
【００２８】
「化合物」、「試験化合物」、「薬剤」もしくは「候補薬剤」という用語は、本明細書において用いる場合、ｍＧｌｕｒ受容体活性を調節するそれらの能力について調べたいと思う例えばペプチド、ポリヌクレオチドもしくは小分子を包含する任意のタイプの分子であることができ、そしてここで、該薬剤は、それを受け取る被験体に治療的利点を提供することができる。候補薬剤は、例えば、経口的もしくは非経口的、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、直腸内、槽内またはそれぞれ例えば皮膚パッチもしくは経皮イオン導入を用いる皮膚を通した受動的もしくは促進吸収によるを包含する様々な経路により個体に投与することができる。さらに、化合物は注入、挿管によりもしくは局所的に投与することができ、これらのうち後者は、例えば軟膏の直接使用により受動的あるか、または例えば鼻腔用スプレーもしくは吸入剤を用いて能動的（この場合、組成物の１つの成分は適切な推進剤である）であることができる。化合物の投与の経路は、一つには化合物の化学構造により決まる。例えば、ペプチドおよびポリヌクレオチドは消化管において分解され得るので、経口的に投与する場合にそれらは特に有用ではない。しかしながら、ペプチドを化学的に修飾する、例えば、それらを分解されにくくする方法は周知であり、そして例えばＤ−アミノ酸の使用、ペプチド模倣物に基づくドメインの使用、もしくはビニル性ペプトイドのようなペプトイドの使用が包含される。
【００２９】
スクリーニング方法において使用する薬剤は、製薬学的に許容しうる担体において用いることができる。例えば、典型的な担体および薬剤の配合物の製造と関連して用いることができる製薬学的組成物を製造する常法を開示し、そして本明細書に引用することにより組み込まれる、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，最新版を参照。
【００３０】
細胞
上記にすでに概説したように、本発明はｍＧｌｕＲ、特に上記に定義するようなグループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体ｍＧｌｕＲ１ａおよびｍＧｌｕＲ５の発現を導く誘導性発現ベクターで安定にトランスフェクションされた細胞系を提供する。細胞は該ベクターと適合するように選択され、そして例えば細菌、酵母、昆虫もしくは哺乳類のものであることができる。宿主細胞は、コードされるポリペプチドが生産されるように、遺伝子の発現のための条件下で培養することができる。適当な宿主細胞には、細菌、哺乳類および酵母のような真核細胞、ならびにバキュロウイルス系が包含される。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野において利用可能な哺乳類細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞およびその他多数が包含される。
【００３１】
使用する培養条件により、細胞は結合アッセイにおいてもしくは機能スクリーニングアッセイにおいて用いることができる。ｍＧｌｕＲの機能発現のためには、細胞は非誘導ないし低誘導培養条件で維持される。「非誘導」培養条件は、本明細書において用いる場合、培養培地における、誘導性ベクター中の発現要素を調節する外来因子の不在をさす。本発明の目的において、非誘導培養条件は、例えばインターフェロン系、Ｇａｌ４−エストロゲン受容体系、突然変異体プロゲステロン系、突然変異体エストロゲン系およびテトラサイクリン系（ＵＳ特許出願ＵＳ  ２００３／０１９９０２２の表２に記述される）のような低い漏れを有する誘導性発現系で用いられる。「低誘導」培養条件は、発現されるｍＧｌｕＲの機能性に影響を与えない濃度での培養培地における上記の外来因子の存在をさす。ｍＧｌｕＲ過剰発現のレベルを減少することは、機能的反応を有意に増加するという本発明者等による発見に基づき、これらの低い誘導レベルは、受容体結合を示さずそしてアゴニスト処理への強い機能的反応を示す細胞をもたらすはずである。ｍＧｌｕＲの結合および活性を決定する実際の方法は、当業者に既知であり（以下参照）、従って、発現されるｍＧｌｕＲの活性に影響を与えない、培養培地における外来因子の濃度を決定するために用いられる。例えば、以下の実験部分において記述されるようなｍＧｌｕ１ａ発現および機能的反応へのテトラサイクリン誘導の効果（図３）を参照。この実施例において、受容体結合は放射性リガンド結合アッセイを用いて、すなわち、放射性リガンドとして［３Ｈ］Ｒ２１４１２７を用いて（Ｌａｖｒｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、そして活性／機能的反応は蛍光指示色素を用いて、特にｆｌｕｏ−３ＡＭを用いて細胞内カルシウムの変化を測定することにより評価される。結合アッセイでは、誘導性細胞は中程度〜高誘導培養条件下で維持される。「中程度ないし高」培養条件は、本明細書において用いる場合、ｍＧｌｕＲの機能発現をもたらさないｍＧｌｕＲ受容体のウェスタンブロットで検出可能な発現をもたらす濃度での培養培地における外来因子の存在をさす。
【００３２】
従って、
ｉ）非誘導ないし低誘導培養条件で本発明の細胞を培養することを含んでなるｍＧｌｕＲの機能発現の方法、もしくは
ｉｉ）中程度ないし高培養条件で本発明の細胞を培養することを含んでなるｍＧｌｕＲ結合アッセイ
における上記の細胞の使用を提供することが本発明の目的である。
【００３３】
特に、該発現ベクターでトランスフェクションされたＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞。そのような発現ベクターは、分子生物学の当該技術分野において日常的に構築され、そしてタンパク質発現を可能にするために、必要である可能性がありそして正しい方向性で位置付けられる、プラスミドＤＮＡならびに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素の使用を伴うことができる。一般に、ポリヌクレオチドを維持するか、増やすかもしくは発現させて宿主においてポリペプチドを生産するために適当な任意の系もしくはベクターを用いることができる。適切なヌクレオチド配列、すなわち、上記に定義されるようなヒトｍＧｌｕＲ１ａもしくはｍＧｌｕＲ５サブユニットのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９７に記載されるもののような様々な周知のそして日常的な技術のいずれかにより発現系に挿入することができる。
【００３４】
特定の態様において、本発明のＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞は、それぞれヒトｍＧｌｕＲ１ａ（配列番号：１）およびヒトｍＧｌｕＲ５（配列番号：３）をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる市販されているテトラサイクリン誘導性発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯでトランスフェクションされる。より好ましくは、本発明は、それぞれ受託番号ＬＭＰＢ  ６１５６ＣＢおよびＬＭＢＰ  ６１５７ＣＢで２００４年６月２４日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍに寄託された安定にトランスフェクションされた細胞系Ｔ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯおよびＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯを提供する。本発明の細胞系を用いることは、機能スクリーニングアッセイだけでなく、同じ細胞系から逸脱して（ｄｅｐａｒｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ）、化合物結合アッセイを行うことも可能にする。
【００３５】
核酸構築物の製造、突然変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析に関連するさらなる詳細は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【００３６】
アッセイ
本発明はまた、グループＩ  ｍＧｌｕＲ受容体と相互作用することができる化合物についてのアッセイも提供し、このアッセイは：本発明の細胞系を用いて、該受容体を推定の結合化合物と接触させること；および該化合物が該受容体と相互作用することができるかどうかを決定することを含んでなる。
【００３７】
アッセイの１つの態様において、受容体もしくは受容体のサブユニットを結合アッセイにおいて用いることができる。結合アッセイは、競合的もしくは非競合的であることができる。そのようなアッセイは、もしあれば、どの化合物がポリペプチドに結合することができるかを決定するための多数の化合物の迅速なスクリーニングに対応することができる。
【００３８】
この関連内で、本発明は、試験化合物が本発明の単離されたｍＧｌｕＲ受容体タンパク質に結合し、従って、ｍＧｌｕＲ受容体の潜在的アゴニストもしくはアンタゴニストであるかどうかを同定する方法を提供し、該方法は：
ａ）ｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物の存在下および不在下で、本発明の誘導性発現ベクターを含んでなりそしてｍＧｌｕＲ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は該ｍＧｌｕＲ受容体を通常は発現しない）を試験化合物と接触させること、および
ｂ）対照としてｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物を用いてｍＧｌｕＲ受容体への試験化合物の結合を決定すること
を含んでなる。試験化合物のもしくはｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物（以下で対照化合物とも呼ばれる）の結合は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のための当該技術分野で既知の方法を用いて評価される。例えば、そのような結合は、標識された物質もしくは対照化合物を用いることにより測定することができる。試験化合物もしくは対照化合物は、当該技術分野において既知である任意の都合のよい方法で、例えば、放射性、蛍光的もしくは酵素的に標識することができる。上記の方法の特定の態様において、対照化合物としても既知である、ｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物は検出可能に標識され、そして該標識はｍＧｌｕＲ受容体への試験化合物の結合を決定するために用いられる。該対照化合物は放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識、より好ましくは放射性標識を用いて標識される。さらに特定の態様において、本発明は、試験化合物が単離されたｍＧｌｕＲ受容体タンパク質に結合するかどうかを同定する方法を提供し、該方法は、ｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である化合物の使用を含んでなり、ここで、該対照化合物はグルタミン酸塩、ＡＣＰＤ、ＣＰＣＣＯＥｔ、ＡＩＤＡ、ＬＹ３４１４９５もしくはキスカル酸塩から選択され、好ましくは例えば３Ｈ−グルタミン酸塩、３Ｈ−ＣＰＣＣＯＥｔ、３Ｈ−ＡＩＤＡもしくは３Ｈ−キスカル酸塩のようなｍＧｌｕＲ受容体に結合することが既知である放射性標識化合物から選択される。
【００３９】
続いて、そのような化合物が本発明のポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するかどうかをさらに決定するために、結合することが見出されたこれらの化合物でさらに詳細なアッセイを実施することができる。グルタミン酸受容体アッセイの例は当該技術分野において周知であり、例えば、Ａｒａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ８：７５７（１９９２）；Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１６９（１９９２）を参照。これらの公開に記述される方法論は、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４０】
従って、さらなる態様において、本発明はｍＧｌｕＲ受容体アゴニストを同定する方法を提供し、該方法は、
ａ）ｍＧｌｕＲ受容体アゴニストの存在下および不在下で、本発明の誘導性発現ベクターを含んでなり且つｍＧｌｕＲ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は該ｍＧｌｕＲ受容体を通常は発現しない）を試験化合物と接触させること、および
ｂ）該細胞への標識されたアゴニストの結合を決定すること
を含んでなり、ここで、標識されたアゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で低下する場合、該化合物はｍＧｌｕＲ受容体の潜在的アゴニストである。上記の一般的な結合アッセイについてすでに特定したように、ｍＧｌｕＲ受容体アゴニストの結合は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のための当該技術分野で既知である方法を用いて評価される。標識は一般に放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識、特に放射性標識から選択され、ここで、アゴニストは３Ｈ−グルタミン酸塩、３Ｈ−ＡＣＰＤもしくは３Ｈ−キスカル酸塩から選択される。
【００４１】
同様に、本発明はｍＧｌｕＲ受容体アンタゴニストを同定する方法を提供し、該方法は、
ａ）ｍＧｌｕＲ受容体アンタゴニストの存在下もしくは不在下で、本発明の誘導性発現ベクターを含んでなり且つｍＧｌｕＲ受容体を発現する細胞（ここで、そのような細胞は該ｍＧｌｕＲ受容体を通常は発現しない）を試験化合物と接触させること、および
ｂ）該細胞への標識されたアンタゴニストの結合を決定すること
を含んでなり、ここで、標識されたアンタゴニストの結合の量が試験化合物の存在下で低下する場合、該化合物はｍＧｌｕＲ受容体の潜在的アンタゴニストである。上記の一般的な結合アッセイについてすでに特定したように、ｍＧｌｕＲ受容体アンタゴニストの結合は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のための当該技術分野で既知である方法を用いて評価される。標識は一般に放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識、特に放射性標識から選択され、ここで、アンタゴニストは７−（ヒドロキシイミノ）シクロプロパ［ｂ］クロメン−１ａ−カルボン酸エチルエステル（ＣＰＣＣＯＥｔ）（Ｃａｓａｂｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｈｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、ＬＹ３４１１４９５、Ｂａｙ  ３６７６２０（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５９：９６５−９７３）、ＮＰＳ  ２３９０（Ｖａｎ  Ｗａｇｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｃｒｉｎｅ  ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ６１８．３）、ＭＰＥＰ（Ｓｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １２７：１０９７−１０９９）、Ｒ２１４１２７（Ｌａｖｒｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：１０８２−１０９３）および（ＲＳ）−１−アミノインダン−１，５−ジカルボン酸（ＡＩＤＡ）（Ｍｏｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）よりなる群から選択される。
【００４２】
本発明の代わりの態様において、上記の結合アッセイは、上記に定義されるようなｍＧｌｕＲ受容体を含んでなる細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官上で行われる。さらに特に、上記の結合アッセイは、上記に定義されるようなｍＧｌｕＲ受容体を含んでなる細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官上で行われ、ここで、該細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官は、本発明の誘導性発現ベクターを含んでなる細胞から得られる。より好ましくは、細胞組成物、すなわち、細胞抽出物、細胞画分もしくは細胞小器官は、それぞれ受託番号ＬＭＰＢ  ６１５６ＣＢおよびＬＭＢＰ  ６１５７ＣＢで２００４年６月２４日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された安定にトランスフェクションされた細胞系Ｔ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯおよびＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯから得られる。
【００４３】
さらなる態様において、本発現は本発明の細胞におけるｍＧｌｕＲ受容体活性を調節する化合物を同定するための機能アッセイを提供する。そのようなアッセイは本発明の、すなわち、それぞれｈｍＧｌｕＲ１ａもしくはｈｍＧｌｕＲ５をコードする誘導性発現ベクターでトランスフェクションされた細胞を用いて行われる。該細胞を少なくとも１つの対照化合物と接触させ、ここで、ｍＧｌｕＲ受容体活性を調節する該化合物の能力は既知である。その後に、細胞を試験化合物と接触させ、そして該試験化合物が対照化合物と比較してｍＧｌｕＲ受容体の活性を調節するかどうかを決定する。「対照化合物」は、本明細書において用いる場合、ｍＧｌｕＲ受容体に結合することおよび／もしくはその活性を調節することが既知である化合物をさす。
【００４４】
本発明のポリペプチドの「活性を調節する」化合物もしくはシグナルは、それが化合物もしくはシグナルの存在下で化合物もしくはシグナルの不在下と異なって機能するようにポリペプチドの活性を改変する化合物もしくはシグナルをさす。調節に影響を及ぼす化合物には、アゴニストおよびアンタゴニストが包含される。ｍＧｌｕＲ受容体のアゴニストには、ｍＧｌｕＲ受容体機能を活性化するグルタミン酸塩もしくはキスカル酸塩のような化合物が包含される。あるいはまた、アンタゴニストには、ｍＧｌｕＲ受容体機能を妨げる化合物が包含される。典型的に、アンタゴニストの効果は、アゴニストにより誘導される受容体活性化の阻止として認められる。アンタゴニストには、競合的ならびに非競合的アンタゴニストが包含される。競合的アンタゴニスト（もしくは競合的遮断薬）は、アゴニスト結合に特異的な部位ともしくはその近くで相互作用する。非競合的アンタゴニストもしくは遮断薬は、アゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用することにより受容体の機能を不活性化する。
【００４５】
１つの態様において、本発明はｍＧｌｕＲ受容体活性を調節する能力を有する化合物を同定する方法を提供し、該方法は：
ａ）ｍＧｌｕＲ受容体の活性化を可能にする条件下で本発明の細胞を少なくとも１つの対照化合物と接触させること；
ｂ）ｍＧｌｕＲ受容体の活性化を可能にする条件下で、段階ａ）の細胞を試験化合物と接触させること、および
ｃ）該試験化合物が対照化合物と比較してｍＧｌｕＲ受容体活性を調節するかどうかを決定すること
を含んでなる。
【００４６】
ｍＧｌｕＲ受容体活性を調節する化合物の能力を決定する方法は、Ｇタンパク質共役受容体の機能的反応を決定するために利用可能な様々なアッセイ（上記参照）に、そして特にカルシウム濃度の変化、ｃＡＭＰ形成の変化およびイノシトールリン酸形成の変化を決定するためのアッセイに基づく。ｍＧｌｕＲ受容体の活性化を可能にする条件は、当該技術分野において一般に既知であり、例えば、本発明の細胞は、Ｆｌｕｏ−３のようなカルシウム感受性蛍光色素を用いて細胞内カルシウム動員を測定するアッセイにおいて、もしくは以前に記述されているような（Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）３Ｈ−イノシトールリン酸（３Ｈ−ＩｎｓＰ）の変化を決定するアッセイにおいて用いることができる。
【００４７】
上記のアッセイにおいて、試験化合物の存在下での細胞内カルシウム動員の増加は、該化合物がｍＧｌｕＲ受容体活性を活性化すること、従って、該試験化合物がｍＧｌｕＲ受容体タンパク質の潜在的アゴニストであることの指標である。試験化合物の存在下での細胞内カルシウム動員の減少は、該化合物がｍＧｌｕＲ受容体タンパク質を不活性化すること、従って、該試験化合物がｍＧｌｕＲ受容体タンパク質の潜在的アンタゴニストであることの指標である。
【００４８】
アッセイの特に好ましいタイプには、結合アッセイおよび機能アッセイが包含され、これらは以下のように行うことができる：
受容体発現レベルと機能的細胞表面受容体の量との間に逆相関があるという本発明者等による発見と一緒に、本発明の誘導性発現ベクターを使用して、用いる誘導レベルにより結合もしくは機能アッセイのいずれかにおいて本発明の誘導性発現ベクターで安定にトランスフェクションされた細胞系を使用することができる。以下の実験部分において概説されるように、誘導なしにもしくは低誘導のみで、細胞はウェスタンブロット上で検出できないｍＧｌｕＲ受容体の機能発現を与える。中程度〜高誘導で、細胞は結合アッセイにおいて用いることができるがｍＧｌｕＲ受容体の機能発現をもたらさないｍＧｌｕＲ受容体のウェスタンブロットで検出可能な発現を与える。
【００４９】
結合アッセイ
本発明の細胞系の誘導によるｍＧｌｕＲ受容体の過剰発現は、リガンド結合研究用の該受容体を保有する膜調製物を製造するために用いることができる。これらの膜調製物は、放射性標識したｍＧｌｕＲリガンド（３Ｈ−グルタミン酸塩、３Ｈ−ＣＰＣＣＯＥｔ、３Ｈ−ＡＩＤＡ、３Ｈ−Ｒ２１４１２７もしくは３Ｈ−キスカル酸塩を包含する）の結合および結合部位に関する競合相手によるそのような放射性リガンドの置換を検出するために通常のフィルター結合アッセイ（例えば、Ｂｒａｎｄｅｌフィルターアッセイ装置を用いる）においてもしくはハイスループットシンチレーション近接タイプ結合アッセイ（ＳＰＡおよびＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔフラッシュプレート技術；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）において用いることができる。放射活性は、９６、３８４、１５３６マイクロタイターウェル形態から迅速な測定を行うことができる、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔもしくは同様の器具で測定することができる。ＳＰＡ／Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ技術はハイスループットスクリーニングに特に適しており、そしてそれ故にこの技術は、基準リガンドを置換することができる化合物のスクリーニングとして使用するのに適している。
【００５０】
天然の状態に近い環境においてｍＧｌｕＲタンパク質へのリガンドの結合を研究する別の方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）により利用される表面プラズモン共鳴効果を使用する。膜調製物もしくは全細胞におけるｍＧｌｕＲ結合受容体をＢｉａｃｏｒｅのバイオセンサーチップに付け、そしてリガンドの結合を化合物の存在下および不在下で調べて結合部位の競合相手を同定することができる。
【００５１】
機能アッセイ
ｍＧｌｕＲ受容体は、これらの受容体の活性化の際に細胞内Ｃａ２＋の放出をもたらす、ＩＰ３シグナル伝達経路に共役しているＧタンパク質共役受容体ファミリーに属する。細胞内カルシウムのこの変化は、特定の化合物のアゴニストもしくはアンタゴニスト効果を決定するために様々な技術を用いてリアルタイムで測定することができる。細胞内カルシウムの変化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓを包含する供給業者からのｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｎ、ｆｕｒａ  ｒｅｄおよび他の同様のプローブを包含する、いくつかのイオン感受性蛍光色素を用いて測定可能である。従って、ｍＧｌｕＲ受容体活性化の結果としてのカルシウム放出の抑制は、画像解析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点法とともにもしくはそれなしに蛍光顕微鏡検査を包含する、蛍光分析および蛍光イメージング技術を用いてリアルタイムで特性化することができる。
【００５２】
Ｋ＋およびＣａ２＋チャンネルへのｍＧｌｕＲ受容体活性化の効果を考えると（Ｋａｍｍｅｒｍｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ  １９９９  Ｎｅｕｒｏｎ  ２２：８１９−８２９；Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９７  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：４４７−４９０）、代わりの機能スクリーニングにおいて化合物の調節効果はカルシウムおよびカリウムフラックスの変化によって評価される。従って、本発明の細胞系において機能的に発現される組み換えｍＧｌｕＲ受容体タンパク質は、興味のある化合物の作用機序を決定するために全細胞および単一チャンネル電気生理学を用いて特性化することができる。ｍＧｌｕＲ受容体タンパク質で活性の化合物について、電気生理学的スクリーニングは、通常の電気生理学的技術および利用可能になる場合には現在開発中の新規なハイスループット方法を用いて行うことができる。
【００５３】
別の方法は、カルシウムトランジエント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）に影響を与えるアゴニストもしくはモジュレーターのいずれかとして活性の化合物のハイスループットスクリーニングアッセイである。このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー（（ＦＬＩＰＲＲ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる装置に基づく。その最も一般的な形態において、それはフルオレセインに基づく色素を励起し、そしてそれにより出される蛍光を測定する。それはフルオロフォアの４８８ｎｍでの高出力励起をもたらすためのアルゴンイオンレーザー、９６／３８４ウェルプレートの底上を迅速に走査するための光学系および出された蛍光を捕獲するための高感度の冷却ＣＣＤカメラを使用する。それはまた、装置が９６／３８４ウェルプレートのウェルに試験薬剤の溶液を送達することを可能にする９６／３８４ウェルピペッティングヘッドも含有する。ＦＬＩＰＲアッセイは、同時に全ての９６／３８４ウェルからリアルタイムで化合物の添加の前、間そして後に細胞の集団から蛍光シグナルを測定するように設計される。ＦＬＩＰＲアッセイは、本発明の細胞系で機能的に活性の化合物をスクリーニングしそして特性化するために用いることができる。
【００５４】
ｍＧｌｕＲアゴニスト／アンタゴニストを同定するために特に有用なハイスループットスクリーニングアッセイは、それぞれ受託番号ＬＭＰＢ  ６１５６ＣＢおよびＬＭＢＰ  ６１５７ＣＢで２００４年６月２４日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍに寄託された安定にトランスフェクションされた細胞系Ｔ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯおよびＴ−Ｒｅｘ−２９３−ｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯを誘導なしにもしくは低誘導レベル下で維持し、そして適切な蛍光色素を負荷し、試験化合物とインキュベーションし、そして相互作用を可能にするために十分な時間（８〜２４時間、典型的に１２〜２４時間、特に２４時間）の後に相対蛍光単位の変化をＦＬＩＰＲもしくはＡｓｃｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている）のような自動蛍光プレートリーダーを用いて測定する配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）からなる。
【００５５】
このおよび他の機能スクリーニングアッセイは、以下の実施例において提供される。
【００５６】
処置の方法
本発明の方法を用いて同定される化合物の好ましい用途は、神経学的疾患および障害の処置においてである。神経学的疾患もしくは障害を患っている患者は、標準的な臨床方法論により診断することができる。神経学的疾患もしくは障害には、神経細胞変性疾患、グルタミン酸興奮毒性、広範囲のおよび局所的な虚血性および出血性脳卒中、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘導神経細胞損傷および癲癇が包含される。これらの異なる疾患もしくは障害は、さらに医学的に特性化することができる。例えば、神経細胞変性疾患には、アルツハイマー病およびパーキンソン病が包含される。
【００５７】
本発明の方法を用いて同定される化合物の別の好ましい用途は、鎮痛効果、認知増進効果もしくは筋弛緩効果のような他の治療効果の生成においてである。本発明の方法を用いて同定される化合物は、好ましくは、そのような処置を必要とする患者においてこれらの効果の１つもしくはそれ以上をもたらすために用いられる。
【００５８】
そのような処置を必要とする患者は、標準的な医学的技術により同定することができる。例えば、鎮痛活性の生成は、以下のもの：先制術前鎮痛；糖尿病および多発性硬化症で起こるような末梢神経障害；幻肢痛；灼熱痛；帯状疱疹で起こるような神経痛；脊髄損傷で見られるもののような中心性疼痛；痛覚過敏；癌性疼痛ならびに異痛を包含する急性および慢性疼痛の臨床症状を患っている患者を処置するために用いることができる。
【００５９】
患者を処置する方法において、代謝型グルタミン酸受容体の少なくとも細胞外ドメインを有するキメラ受容体の活性をインビトロで調節する化合物の治療的に有効な量を患者に投与する。特に、ヒトを包含する温血動物への本発明の化合物の有効量の全身もしくは局所投与。典型的に、化合物はアロステリックモジュレーターとしてまたはグルタミン酸塩結合部位活性化のアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することにより代謝型グルタミン酸受容体活性を調節する。好ましくは、患者は神経学的疾患もしくは障害を患い、好ましくは、化合物は生理学的活性への効果を有する。そのような生理学的活性は、痙攣、神経保護、ニューロン死、ニューロンの発達、心臓活動の中枢制御、覚醒、運動の制御および前庭動眼反射の制御であることができる。
【００６０】
代謝型グルタミン酸受容体活性を調節することにより処置することができる疾患もしくは障害には、以下のタイプの１つもしくはそれ以上が包含される：（１）異常なグルタミン酸ホメオスタシスを特徴とするもの；（２）代謝型グルタミン酸受容体活性によりその生成が影響を受けることができる細胞外もしくは細胞内メッセンジャーの異常な量を特徴とするもの；（３）代謝型グルタミン酸受容体活性によりそれ自体が改善されることができる細胞内もしくは細胞外メッセンジャーの異常な効果（例えば、種類もしくは大きさの異なる効果）を特徴とするもの；（４）グルタミン酸ニューロン活性の異常なレベル；（５）ｍＧｌｕＲ活性媒介メッセンジャーへの異常なニューロン反応および（６）代謝型グルタミン酸受容体活性の調節が有益な効果を及ぼす他の疾患もしくは障害、例えば、受容体活性により刺激される細胞内もしくは細胞外メッセンジャーの生成が異なるメッセンジャーの異常な量を補う疾患もしくは障害において。
【００６１】
これらの化合物および方法はまた、鎮痛効果、認知増進効果および筋弛緩効果のような他の効果をもたらすために用いることもできる。
【００６２】
「患者」は、代謝型グルタミン酸受容体の調節が有益な効果を有する哺乳類をさす。代謝型グルタミン酸受容体の調節を伴う処置を必要とする患者は、医療従事者に既知である標準的な技術を用いて同定することができる。好ましくは、患者は以下のもの：（１）異常なグルタミン酸受容体活性；（２）代謝型グルタミン酸受容体活性によりその生成もしくは分泌が影響を受けるメッセンジャーの異常なレベル；および（３）代謝型グルタミン酸受容体活性によりその機能が影響を受けるメッセンジャーの異常なレベルもしくは活性の１つもしくはそれ以上を特徴とする疾患もしくは障害を患っているヒトである。
【００６３】
「治療的に有効な量」は、患者における疾患もしくは障害の１つもしくはそれ以上の症状をある程度軽減するか；または疾患と関連するかもしくはその原因となる１つもしくはそれ以上の生理学的もしくは生化学的パラメーターを部分的にもしくは完全に正常に戻す薬剤の量を意味する。
【００６４】
より一般的に、本発明は、代謝型グルタミン酸受容体を有する細胞に代謝型グルタミン酸受容体でグルタミン酸塩の１つもしくはそれ以上の効果を模倣するかもしくは代謝型グルタミン酸受容体でグルタミン酸塩の１つもしくはそれ以上の効果を阻止するために十分な代謝型グルタミン酸受容体調節分子の量を与えることにより代謝型グルタミン酸受容体活性を調節する方法を提供する。該方法は、インビトロもしくはインビボで実施することができる。
【００６５】
そのような薬剤は、製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤と一緒に薬剤を含んでなる組成物に調合することができる。薬剤はエステルまたは塩、例えば酸付加塩もしくは塩基性金属塩、またはＮもしくはＳオキシドのような生理学的に機能的な誘導体の形態であることができる。組成物は、任意の適当な投与経路および手段用に調合することができる。製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤には、経口、直腸、鼻腔内、吸入可能、局所（口腔および舌下を包含する）、膣内もしくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を包含する）投与に適当な製剤において用いられるものが包含される。担体もしくは希釈剤の選択は、もちろん、薬剤およびその治療目的により決まることができる提示される投与経路により決まる。製剤は、単位投与形態物において都合よく与えることができ、そして薬学の当該技術分野において周知である方法のいずれかにより製造することができる。そのような方法は、１つもしくはそれ以上の副成分を成す担体と有効成分を会合させる段階を含む。一般に、製剤は、液状担体もしくは細かく分割された固形担体もしくは両方と有効成分を均一にそして密接に会合させ、そして次に必要に応じて生成物を成形することにより製造される。
【００６６】
固形組成物では、通常の無毒の固形担体には、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが包含され、用いることができる。上記に定義されるような活性化合物は、担体として例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを用いて座薬として調合することができる。液状の製薬学的に投与可能な組成物は、例えば、上記に定義するような活性化合物および任意の製薬学的添加剤を例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどのような担体に溶解、分散などしてそれにより溶液もしくは懸濁液を生成せしめることにより製造することができる。所望に応じて、投与する製薬学的組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどのような微量の無毒の補助剤を含有することもできる。そのような投与形態物を製造する実際の方法は既知であるか、もしくは当業者に明らかである；例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０を参照。
【００６７】
投与する組成物もしくは製剤は、いずれにしても、処置する被験体の症状を軽減するために有効な量の活性化合物（１つもしくは複数）の量を含有する。
【００６８】
０．２５〜９５％の範囲の有効成分を含有し、残りは無毒の担体からなる投与形態物もしくは組成物を製造することができる。
【００６９】
経口投与には、製薬学的に許容しうる無毒の組成物は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤のいずれかの導入により形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとる。そのような組成物は１％〜９５％、より好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％の有効成分を含有することができる。
【００７０】
非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内もしくは静脈内のいずれかの注入を特徴とする。注入物質は、液状溶液もしくは懸濁液、注入の前の液における溶解もしくは懸濁に適当な固形形態として、またはエマルジョンとして、通常の形態で製造することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに、所望に応じて、投与する製薬学的組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウムなどのような微量の無毒の補助剤を含有することもできる。
【００７１】
そのような非経口組成物に含有される活性化合物のパーセンテージは、その特定の性質、ならびに化合物の活性および被験体の必要性に非常に依存する。しかしながら、溶液中０．１％〜１０％の有効成分のパーセンテージを用いることができ、そして組成物が上記のパーセンテージに後で希釈される固体である場合にはより高い。好ましくは、組成物は溶液中０．２〜２％の有効成分を含んでなる。
【００７２】
本記述の全体にわたって、「標準的な方法」、「標準的なプロトコル」および「標準的な方法」という用語は、分子生物学技術との関連で用いられる場合、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，編集者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４、もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９のような通常の実験室マニュアルに見出されるプロトコルおよび方法と理解される。
【００７３】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することでよりよく理解されるが、当業者は、これらがその後に続く請求項においてさらに十分に記述されるような本発明を例証するだけであることを容易に理解する。さらに、本願の全体にわたって、様々な公開が引用される。これらの公開の開示は、本発明が関係する最先端技術をさらに十分に記述するために本願に引用することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７４】
実験
材料および方法
材料
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。プラスミド調製キットおよびＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ増幅キットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ４／ＴＯ、ならびにＴ−ＲＥｘ−２９３細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。ｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、ウシ胎仔血清および透析ウシ胎仔血清を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬は、Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、そしてｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００はＧｉｂｏ−ＢＲＬ（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ラットｍＧｌｕ１ａおよびラットＧｌｕ５ａ受容体を安定に発現するＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞は、Ｓ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ（Ｔｏｋｙｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）からの親切な贈り物である。
【００７５】
ｐｃＤＮＡ４／ＴＯにおけるｈｍＧｌｕ１ａおよびｈｍＧｌｕ５ａのクローニング
ヒトｍＧｌｕ１ａおよびｍＧｌｕ５ａの両方をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローン化した。このベクターにおいて、受容体発現はＣＭＶプロモーターおよび２個のテトラサイクリンオペレーターの制御下にあり、それはインサートにテトラサイクリン誘導性発現を与える。ｈｍＧｌｕ１ａからの全長リーディングフレームをＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＩを用いて以前に記述されている（Ｌａｖｒｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐＭｘクローンから切断し、そしてＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで開いたｐｃＤＮＡ４／ＴＯに挿入した。ｈｍＧｌｕ５ａからの全長リーディングフレームをＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩを用いてｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ３クローンから切断し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩＩで開いたｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクターに挿入した。
【００７６】
細胞トランスフェクションおよび培養
一時的トランスフェクション実験には、供給業者の推奨に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｇｉｂｏ−ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて異なる細胞において異なる発現プラスミドをトランスフェクションした。永続的トランスフェクションには、供給業者の推奨に従ってＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴｅｔリプレッサーを安定に発現するＴ−ＲＥｘ−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にテトラサイクリン誘導性ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯおよびｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ発現プラスミドをトランスフェクションした。モノクローナル細胞系を１０％の熱不活性化透析ウシ胎仔血清および抗生物質を補足したＧｌｕｔａＭａｘ  Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）においてゼオシン（２００μｇ／ｍｌ）およびブラスチシジン（５μｇ／ｍｌ）下で単離した。同じ培地を細胞培養に使用した。ゼオシンおよびブラスチシジンは、任意のアッセイの前に少なくとも１日放置した。ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯもしくはｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ構築物でトランスフェクションされた細胞における受容体発現は、他に示されない限り１０００ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンで２４ｈの細胞の処置により誘導した。ｈｍＧｌｕＲ１ａ−ｐＭｘ構築物でトランスフェクションされた細胞系は、以前に記述されているように（Ｌａｖｒｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）アッセイの前に２４ｈインターフェロン−βで誘導した。
【００７７】
ｈｍＧｌｕ１ａおよびｈｍＧｌｕ５ａ受容体発現細胞における細胞内カルシウム反応
細胞内カルシウムイオンレベル（［Ｃａ２＋］）は、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて経口指示色素ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）で測定した。ｈｍＧｌｕ１ａもしくはｈｍＧｌｕ５ａ受容体を一時的にもしくは永続的に発現する細胞を実験の２４ｈ前にＢｉｏｃｏａｔポリ−Ｄ−リシン９６ウェルブラック−クリアーボトムプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＫ）において３０，０００細胞／ウェルで接種した。実験の日に、９５％の空気および５％のＣＯ２において３７℃で培養培地中２μＭのｆｌｕｏ−３−ＡＭを細胞に１ｈ負荷した。Ｆｌｕｏ−３−ＡＭは、細胞への色素の負荷を促進するために１０％のプルロニック酸／ＤＭＳＯに溶解した。負荷時間の間、細胞からの色素のＰ４５０糖タンパク質媒介輸送を抑制する５ｍＭのプロベネシドが存在し、そして培地のｐＨを１ＭのＨＥＰＥＳで７．４に調整した。細胞を１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのプロベネシド、ｐＨ７．４で２回洗浄し、そして測定の前にバッファーと室温で２０分間プレインキュベーションした。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を時間の関数として各ウェルについて記録した。グルタミン酸塩の添加の際に得られる蛍光ピークをシグナルと考えた。各実験において、濃度反応曲線を三重反復で行った。
【００７８】
膜調製
膜を全微粒子画分として調製した。細胞を１４５ｍｍペトリ皿上で９０％の飽和密度まで培養し、そして１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで２４ｈ誘導し、そして５ｍＭの酪酸ナトリウムで処理し、２４時間後に収集した。細胞をよく冷えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ  ｗ／ｏ  Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）で２回洗浄し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４においてプレートから剥がし、そして遠心分離（４℃で２３，５００ｇで１０分）により集めた。細胞ペレットを低張５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４において均質化した。ホモジネートを４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心分離した。最終ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４において均質化し、そして−７０℃で等分して保存した。タンパク質測定は、基準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【００７９】
放射性リガンド結合
ｍＧｌｕ１受容体結合．  一時的におよび永続的にｈｍＧｌｕ１ａを発現する細胞を特定化するために、以前に記述されている（Ｌａｖｒｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）［３Ｈ］Ｒ２１４１２７を用いる受容体結合アッセイを行った。簡潔に言えば、膜を氷上で融解し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するよく冷えた結合バッファーにおいて再均質化した。リガンド結合実験は、２０μｇの膜タンパク質および１０ｎＭの放射性リガンドで見かけの（ａｐｐａｒｅｎｔ）結合平衡（３０分のインキュベーション）で行った。非特異的結合は、１μＭのＲ１９３８４５の存在下で概算した。手動４０ウェル濾過マニホールドを用いてＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上で吸引下での急速濾過によりインキュベーションを止めた。次に、フィルターをシンチレーションバイアルに移し、そしてＵｌｔｉｍａ−Ｇｏｌｄ  ＭＶの添加後に、フィルター上に集められた放射活性をＰａｃｋａｒｄシンチレーションカウンターにおいて計数した。
【００８０】
ｍＧｌｕ５受容体結合．  ｈｍＧｌｕ５ａ受容体結合アッセイには、［３Ｈ］ＭＰＥＰ（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｅｓｓｅｘ  ＵＫ）を用いた。膜を氷上で融解し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するよく冷えた結合バッファーにおいて再均質化した。リガンド結合実験は、４０μｇの膜タンパク質および４ｎＭの放射性リガンドで見かけの結合平衡（６０分のインキュベーション）で行った。非特異的結合は、１０μＭのＭＰＥＰの存在下で概算した。手動４０ウェル濾過マニホールドを用いてＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上で吸引下での急速濾過によりインキュベーションを止めた。次に、フィルターをシンチレーションバイアルに移し、そしてＵｌｔｉｍａ−Ｇｏｌｄ  ＭＶの添加後に、フィルター上に集められた放射活性をＰａｃｋａｒｄシンチレーションカウンターにおいて計数した。
【００８１】
免疫ブロッティング
免疫ブロッティングのために、２０μｇの膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３〜８％のＴｒｉｓ−酢酸塩ゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）に供し、そして１０％のメタノールを補足したＮｕＰａｇｅトランスファーバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）においてセミドライブロッティング（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によりＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に移した。等量のタンパク質が各レーンに負荷されたことおよびトランスファーが同等であることを保証するために、免疫ブロッティングの前に膜をクーマシー染色液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色した。ブロットをＰＢＳ中５％の脱脂粉乳／０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０で１時間ブロッキングし、そして２．５％の脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中の一次抗体（ｍＧｌｕ１ａには：１：２００希釈したＡＢ１５５１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ；ｈｍＧｌｕ５ａには：１：２００希釈したＡＢ５２３２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））と一晩インキュベーションした。続いて、かなり洗浄した後に、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０において１：５０００希釈した二次抗体（ロバからのペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ）とブロットをインキュベーションした。検出は、ケミルミネッセンスプラス（ＥＣＬ＋）ウェスタンブロッティング解析システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いることにより行った。
【００８２】
結果
ヒトｍＧｌｕ１ａおよびｍＧｌｕ５ａ受容体のインビトロ試験を開発するために、様々な細胞をｈｍＧｌｕ１ａ受容体の発現構築物で最初に一時的にトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で細胞膜を調製し、そして材料および方法の節に記述されるように免疫ブロットによりそして受容体結合によりｈｍＧｌｕ１ａ受容体の発現を分析した。同時に細胞のアリコートをＭＷ９６ウェルプレートにおいて接種し、そして機能的ＦＬＩＰＲアッセイにおいてグルタミン酸塩での刺激の際のカルシウムトランジエントについて試験した。このデータの要約を表Ｉに示す。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
ここで、ウェスタンブロット上のシグナルと受容体結合との間で強い相関が認められたが、機能的ＦＬＩＰＲ反応との相関は認められなかった。最も特筆すべきは、一時的にトランスフェクションされたＨＥＫ細胞は、ウェスタンブロットに基づく最も強い受容体発現を示し、そして最も強い結合を示したが、これらの細胞は、グルタミン酸塩への非常に弱いカルシウム反応のみを有した。対照的に、インターフェロン誘導性構築物ｈｍＧｌｕＲ１ａ−ｐＭｘで一時的にトランスフェクションされたＬ９２９細胞は結合を示さず、そしてウェスタンブロット上で非常に弱いシグナルを示したが、グルタミン酸塩刺激の際に強いカルシウム反応を有した。ラットｍＧｌｕ１を安定に発現するＣＨＯ細胞系は、中程度の受容体発現および受容体結合を示したが、同様にグルタミン酸塩刺激の際に強いカルシウム反応を有した。総合すると、これらのデータは、一時的にトランスフェクションされたＨＥＫ細胞におけるようなｈｍＧｌｕ１ａ受容体過剰発現が受容体シグナル伝達を妨げることを我々に示唆した。
【００８５】
この仮説をさらに探求するために、両方の受容体のテトラサイクリン誘導性発現を与えるｐｃＤＮＡ４／ＴＯにおいてｈｍＧｌｕ１ａおよびｈｍＧｌｕ５ａをクローン化した。Ｔｅｔリプレッサーを安定に発現するＴ−ＲＥｘ−２９３細胞を様々な量のｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ構築物で一時的にトランスフェクションした。細胞を異なる濃度のテトラサイクリンで２４ｈ誘導した。続いて、細胞をグルタミン酸塩で刺激し、そして放出されるカルシウムをＦＬＩＰＲにおいてアッセイした（図１）。
【００８６】
１５もしくは３μｇのｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ  ＤＮＡで一時的にトランスフェクションされたＴ−ＲＥｘ−２９３細胞は、受容体発現がテトラサイクリンで誘導されない場合にグルタミン酸塩に反応して最も強いＣａ＋＋フラックスを示した。明らかに、プロモーターの漏れからの少量の受容体発現は、最高数の機能的受容体をもたらした。テトラサイクリンで受容体発現を増加することは、機能的受容体反応を減少した。０．６μｇのｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ  ＤＮＡで一時的にトランスフェクションされたＴ−ＲＥｘ−２９３細胞では、最も強い機能的受容体反応は少量のテトラサイクリンでの誘導後に得られ、それはこの場合もやはりテトラサイクリンのレベルを増加するとともに減少した。これは、適度な（ｍｏｄｅｒａｔｅ）受容体発現レベルのみが最大の機能的反応を与えることを示唆する。
【００８７】
次に、ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯもしくはｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ構築物を安定に発現するＴ−ＲＥｘ−２９３細胞のモノクローナル細胞系を作製した。テトラサイクリン処理なしにこれらの細胞を様々な濃度のグルタミン酸塩で刺激し、そして放出されるカルシウムをＦＬＩＰＲにおいてアッセイした（図２）。
【００８８】
さらに、ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯを安定に発現するＴ−ＲＥｘ−２９３細胞を異なる濃度のテトラサイクリンで２４ｈ誘導した。細胞膜を調製し、そしてｈｍＧｌｕ１ａ受容体の発現を免疫ブロットにより分析した（図３ａ）。３ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンで２４ｈの誘導後にのみかすかなシグナルを検出することができた。このシグナルは、１００ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンでの最大レベルまでテトラサイクリンの量を増加するとともに増加した。
【００８９】
同時に細胞のアリコートをＭＷ９６ウェルプレートにおいて接種し、そして機能的ＦＬＩＰＲアッセイにおいて１ｍＭのグルタミン酸塩での刺激の際のカルシウムトランジエントについて試験した。最大ＦＬＩＰＲシグナルをテトラサイクリン濃度に対してプロットした（図３ｂ）。最大ＦＬＩＰＲ反応は、テトラサイクリン誘導がない場合に得られ、そして３ｎｇ／ｍｌより多いテトラサイクリンでの誘導後に減少し、そして１００ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリン誘導後にゼロまでほとんど減少した。要するに、ｍＧｌｕ１ａ発現レベルは、機能的受容体反応と非常に強い逆相関を示した。
【００９０】
説明
以前に、受容体発現はウェスタンブロット分析により示されるように非常に低いがｍＧｌｕ１ａアゴニストに反応して強いカルシウムフラックスを示す、Ｌ９２９細胞における誘導性の安定なヒトｍＧｌｕ１ａクローンが我々の研究所において開発された。さらに、利用可能な放射性リガンドのいずれでも有意な受容体結合を立証することができなかった。ＨＥＫ２９３細胞における一時的トランスフェクションを用いて、ウェスタンブロット分析および受容体結合研究に基づく強いｍＧｌｕ１ａ受容体発現が得られた。しかしながら、これらの細胞は、ＦＬＩＰＲアッセイにおいて測定される非常に弱い機能的受容体反応のみを示した。グループＩ  ｍＧｌｕ受容体の過剰発現は、受容体シグナル伝達を妨げると仮説を立てた。ここで、我々は、ＨＥＫ２９３細胞における受容体過剰発現のレベルを下げることにより機能的反応が有意に増加されることを示す。これらの結果は、グループＩ  ｍＧｌｕ受容体の過剰発現が細胞表面上の機能的受容体の量を減らすことを示す。同様の結果が、ｍＧｌｕ５ａについて認められた。発現のレベルを増加するとともに受容体は凝集体、すなわちダイマーもしくはマルチマー複合体を形成し、機能的細胞表面受容体の数を減少する可能性がある。このダイマー化の役割はまだ不明であるが、これらの複合体はクラスＣ  ＧＰＣＲの大部分についてそして他のクラスからのＧＰＣＲについても同様に示されている。受容体発現レベルと機能的細胞表面受容体の量との間の逆相関は、より一般的であり得る。この洞察は、将来他のＧＰＣＲのアッセイ開発に役立つ可能性がある。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
【表３】
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【００９３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】グルタミン酸塩によるｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯの活性化。ＨＥＫ細胞を様々な量のｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ構築物で一時的にトランスフェクションし、そして異なる濃度のテトラサイクリンで２４ｈ誘導した。ＦＬＩＰＲ反応は、１に設定したベースラインに対する誘導倍数として表した。
【図２】ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯもしくはｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯを安定に発現する非誘導Ｔ−ＲＥｘ−２９３細胞でのグルタミン酸塩の用量反応曲線。
【図３】ｍＧｌｕ１ａ発現および機能的反応のテトラサイクリン誘導の効果。ａ：Ｔ−ＲＥｘ−２９３細胞（最初のレーン）または異なる濃度のテトラサイクリンで２４ｈ誘導されるか（中央のレーン）もしくは全く誘導されない（最後のレーン）Ｔ−ＲＥｘ−２９３  ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯクローン７細胞のウェスタンブロット。ｂ：Ｔ−ＲＥｘ−２９３  ｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ細胞でのＦＬＩＰＲアッセイにおけるテトラサイクリンに誘導される最大グルタミン酸塩反応の用量反応。ＦＬＩＰＲ反応は、１に設定したベースラインに対する誘導倍数として表した。
【図４】テトラサイクリン誘導性発現プラスミドｈｍＧｌｕ１ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ。
【図５】テトラサイクリン誘導性発現プラスミドｈｍＧｌｕ５ａ−ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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