(57)【要約】  ＬＸＲとコアクチベーターとの結合活性を利用してＬＸＲリガンドが例えば、哺乳動物における血漿トリグリセリド濃度及び／又はＬＤＬコレステロール濃度の上昇に影響する作用を有するか否かを簡易に測定する方法、及び、ＬＸＲとコアクチベーターとの結合活性を利用して、例えば血漿トリグリセリド濃度及び／又はＬＤＬコレステロール濃度の上昇に影響する作用を有さないＬＸＲリガンドを同定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含むことからなる、哺乳動物におけるＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度に作用する治療又は予防剤を同定する方法：
（ｉ）ＬＸＲα及びＲＸＲαからなるヘテロダイマーを提供する；
（ｉｉ）被験物質をＬＸＲコアクチベーターの存在下で該ヘテロダイマーと接触する；
（ｉｉｉ）該ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量とコントロールでヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を比較する；
（ｖ）結合したコアクチベーターの量とコントロールにて結合したコアクチベーターの量との違いを、被験物質が哺乳動物において、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度を有意に増加させる活性を有することの指標として相関させる。
【請求項２】
その方法が哺乳動物におけるＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇を引き起こさない治療又は予防剤を同定するための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験物質がＬＸＲリガンドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療又は予防剤が、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、脂質関連疾患、免疫性サイトカイン介在性免疫疾患、自己免疫疾患、心循環疾患、脳循環疾患、腎臓疾患、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、腎炎及びアルツハイマー病から選択される疾患の治療用である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
コアクチベーターが、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
コアクチベーターが配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８、並びにそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＬＸＲαが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するヒト全長ＬＸＲαポリペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するそのポリペプチドのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＬＸＲαが、配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７からなるアミノ酸配列を有する全長ＬＸＲα、配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＲＸＲαが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するヒト全長ＲＸＲαポリペプチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＸＲαが、配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２からなるアミノ酸配列を有するヒト全長ＲＸＲα、配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量をＦＲＥＴアッセイを用いて測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＬＸＲα及び／又はＲＸＲαが、ＬＸＲα及び／又はＲＸＲα発現細胞を用いて提供されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＬＸＲα及び／又はＲＸＲαがＬＸＲα及び／又はＲＸＲαを外来タンパク質として発現する細胞を用いて提供されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＬＸＲα及び／又はＲＸＲαがＬＸＲα及び／又はＲＸＲαを内在性タンパク質として発現する細胞を用いて提供されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
以下の［Ａ］〜［Ｌ］から選択される一つ又は２つ以上を含む、請求項１乃至１４のいずれか一つの方法に使用されるキット；
［Ａ］ヒト全長ＬＸＲαポリペプチド、ヒト全長ＲＸＲαポリペプチド、並びに、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）からなる群から選択されるコアクチベーター；
ここで、ヒト全長ＬＸＲαポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するバリアントであり、ヒト全長ＲＸＲαポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するバリアントである。
［Ｂ］［Ａ］に記載のポリペプチドのリガンド結合部位及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；ここでヒト全長ＬＸＲαポリペプチドのリガンド結合部位は配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアントであり、そしてヒト全長ＲＸＲαポリペプチドのリガンド結合部位は配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するバリアントである；
［Ｃ］［Ｂ］に記載のリガンド結合部位を含む融合ポリペプチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｄ］［Ａ］から［Ｃ］のいずれか１つに記載のポリペプチド及び、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８に記載のアミノ酸配列及びそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
［Ｅ］［Ａ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｆ］［Ｂ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｇ］［Ｃ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｈ］［Ｅ］から［Ｇ］のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド及び、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８に記載のアミノ酸配列及びそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
［Ｉ］［Ｅ］から［Ｈ］のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｊ］発現ベクターである、［Ｉ］に記載の組換えベクター、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｋ］［Ｉ］又は［Ｊ］に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；  並びに
［Ｌ］哺乳動物細胞である、［Ｋ］に記載の宿主細胞、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ。
【請求項１６】
以下の工程を含む、哺乳動物の病気の状態を診断する方法
（ｉ）哺乳動物由来の、血液、血漿、肝臓、腸、脂肪、腎臓、副腎、筋肉又は造血系細胞等の生体試料を集める；
（ｉｉ）ＬＸＲコアクチベーターの存在下で、ＬＸＲα及びＲＸＲαからなるヘテロダイマー及び被験物質を生体試料と接触させる；
（ｉｉｉ）コントロールの試料で上記（ｉ）に記載の接触工程を繰り返す；
（ｉｖ）ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する；
（ｖ）哺乳動物から採取された生体試料中でヘテロダイマーに結合しているコアクチベーターの量とコントロールサンプル中でヘテロダイマーに結合しているコアクチベーターの量を比較する；及び
（ｖｉ）生体試料中のコアクチベーターの量がコントロール中でヘテロダイマーに結合しているコアクチベーターの量よりも多いときに、それが哺乳動物における、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリドレベルの増加の指標になるということに基づいて、その哺乳動物が病気の状態かどうかを決定する。
【請求項１７】
病気の状態が、（ａ）動脈硬化症、（ｂ）アテローム性動脈硬化症、（ｃ）高脂血症、（ｄ）脂質関連疾患、（ｅ）免疫性サイトカイン介在性免疫疾患、（ｆ）自己免疫疾患、（ｇ）心循環疾患、（ｈ）脳循環疾患、（ｉ）腎臓疾患、（ｊ）糖尿病、（ｋ）糖尿病合併症、（ｌ）肥満、（ｍ）腎炎、（ｎ）肝炎、（ｏ）腫瘍、（ｐ）アルツハイマー病及び、（ｑ）（ｃ）〜（ｏ）の１つ又はそれ以上によって引き起こされる動脈硬化症からなる群から選択されるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生体試料が血液試料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
コアクチベーターがＬＸＲコアクチベーターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コアクチベーターが、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）からなる群から選択されるものである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連技術の記載
血漿トリグリセリドおよびＬＤＬコレステロールは動脈硬化の危険因子であることが知られている。トリグリセリドやＬＤＬコレステロールの血中濃度が高くなっている高脂血症は血管内皮細胞障害作用を引き起こすのみならず、血管壁へのコレステロールの沈着を引き起こす疾患である。
【０００２】
ＡＴＰ結合輸送体Ａ１（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−Ａ１）（以下「ＡＢＣＡ１」）は、血管壁に沈着したコレステロールを除去する作用を持つことから、ＡＢＣＡ１の発現量を増加させれば動脈硬化症の進展を防止、あるいは改善することができると考えられている（Ｂｏｄｚｉｏｃｈ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２，  ３４７−３５１）。
【０００３】
核内受容体である、肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（以下「ＬＸＲ」とする。）はコレステロールや脂質代謝の調節遺伝子の転写を制御している。そして、ＬＸＲのアゴニストは、ＡＢＣＡ１の発現を増加させる作用を有することから、ＬＸＲのアゴニストは新規な抗動脈硬化症剤として期待されている。
【０００４】
ＬＸＲはＬＸＲαとＬＸＲβの２種類のアイソフォームからなることが知られている。ＬＸＲαは肝臓、腸、脂肪細胞、腎臓で高く発現し、副腎、筋肉、造血系の細胞でわずかに発現している。一方、ＬＸＲβは全ての組織と細胞で普遍的に発現している。
【０００５】
パン（ｐａｎ）−ＬＸＲアゴニストが野生型のマウス、ＬＸＲα欠損マウスあるいはＬＸＲβ欠損マウスに投与されたときに、パン−ＬＸＲアゴニストは野生型のマウスとＬＸＲα欠損マウスの血漿トリアシルグリセロール濃度の上昇を引き起こし、一方パン−ＬＸＲアゴニストは血漿トリグリセリドレベルに影響しなかった。これらの結果に基づいて、ＬＸＲβ選択的アゴニスト獲得のためのプロセスが開示された（ＵＳ２００３／００７３６１４Ａ１）。
【０００６】
核内受容体にリガンドが結合すると、核内受容体の三次元構造が変化し、そして、これらのコンフォメーションの変化は、核内受容体と転写共役因子、即ちコアクチベーターまたはコリプレッサータンパク質との結合によって引き起こされることが知られている。核内受容体に結合するコアクチベーターの種類は、細胞及び組織の種類によって異なる。また、核内受容体と結合するリガンドが異なれば、核内受容体の三次元構造の変化も異なり、その結果、核内受容体と結合するコアクチベーターの種類および数も異なる。
【０００７】
ＬＸＲについてもコアクチベーター又はコリプレッサー蛋白質として、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体ガンマ・コアクチベーター１，アルファ：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｇａｍｍａ，  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １，  ａｌｐｈａ：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００，５４１９−２４，２００３）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ２）（ＥＭＢＯ  Ｊ．，２３，２０８３−２０９１，２００４）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２：Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  ２）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２３，３５８３−３５９２，２００３），ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体コアクチベーター−１：Ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１）（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，２４，７０３−７０８，２００４），ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル・アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１：ｄｏｓａｇｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｘ  ｒｅｖｅｒｓａｌ，  ａｄｒｅｎａｌ  ｈｙｐｏｐｌａｓｉａ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ（ＡＨＣ）  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，  ｇｅｎｅ  １）（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１７，９９４−１００４，２００３），ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン：ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１４，９８６−９９８，２０００），ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０：ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２２０）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，１６２５−１６３３，２００５），ＰＥＲＣ  （ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター・１−ベータ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１  ｂｅｔａ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，１４５３７−１４５４６，２００６），ＡＣＴＲ（ステロイド受容体コアクチベーター−３：ｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−３）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，１４７８７−１４７９５，２００６）が知られているが、これらのコアクチベーターとＬＸＲ及びＬＸＲリガンドとの相互作用を考慮したＬＸＲリガンドの研究は行われていなかった。
【０００８】
発明の要旨
本発明の課題は哺乳動物において、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセライド濃度を増加させる作用を有さないＬＸＲリガンドを同定する方法を提供することにある。
【０００９】
さらに、本発明の他の課題は、ＬＸＲリガンドの血漿脂質に及ぼす影響を簡便に測定する方法を提供することにある。
【００１０】
さらに本発明の他の課題は、哺乳動物においてＬＤＬコレステロール濃度及び／又は血漿トリグリセリドを増加させる作用を有さないＬＸＲリガンドを同定するために用いることができるキットを提供することにある。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＬＸＲアゴニストの中には、低密度リポ蛋白質（以下「ＬＤＬ」）コレステロールの濃度を上昇させる作用を有するものがあることを見出し、さらに、ＬＸＲαと特定のコアクチベーターとの結合活性が低いＬＸＲリガンドは血漿トリグリセライド及び／又はＬＤＬコレステロール濃度の上昇作用が見られないか、又はわずかの上昇のみ見られることも見出した。
【００１２】
さらに本発明者らは、ＬＸＲとコアクチベーターとの結合活性を利用して、ＬＸＲリガンドが血漿トリグリセライド濃度及び／又はＬＤＬコレステロール濃度の上昇作用を有するか否かを簡便に測定する方法を見出した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、ＬＸＲとコアクチベーターとの結合活性を利用した、哺乳動物において血漿トリグリセライド濃度及び／又はＬＤＬコレステロール濃度の上昇作用のないＬＸＲリガンドを同定する方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明は、ＬＸＲリガンドが哺乳動物において、血漿トリグリセリド濃度及び／又はＬＤＬコレステロール濃度上昇作用を有するか否かを簡便に測定する方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は哺乳動物において血漿トリグリセリド濃度及び／又はＬＤＬコレステロール濃度の上昇作用を有さないＬＸＲリガンドの同定方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は哺乳動物において、ＬＤＬコレステロール濃度及び／又は血漿トリグリセリド濃度に有意な効果を引き起こさないＬＸＲリガンドを同定する方法に用いることができるキットを提供する。
【００１７】
これらの発明は以下の通りである：
１）下記の工程を含むことからなる、哺乳動物におけるＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度に作用する治療又は予防剤を同定する方法：
（ｉ）ＬＸＲα及びＲＸＲαからなるヘテロダイマーを提供する；
（ｉｉ）被験物質をＬＸＲコアクチベーターの存在下で該ヘテロダイマーと接触する；
（ｉｉｉ）該ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量とコントロールでヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を比較する；
（ｖ）結合したコアクチベーターの量とコントロールにて結合したコアクチベーターの量との違いを、被験物質が哺乳動物において、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度を有意に増加させる活性を有することの指標として相関させる、
２）その方法が哺乳動物におけるＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇を引き起こさない治療又は予防剤を同定するための方法である、１）に記載の方法、
３）被験物質がＬＸＲリガンドであることを特徴とする、１）に記載の方法、
４）治療又は予防剤が、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、脂質関連疾患、免疫性サイトカイン介在性免疫疾患、自己免疫疾患、心循環疾患、脳循環疾患、腎臓疾患、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、腎炎及びアルツハイマー病から選択される疾患の治療用である、１）に記載の方法、
５）コアクチベーターが、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）からなる群からから選択される、１）に記載の方法、
６）コアクチベーターが配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８、並びにそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである、１）に記載の方法、
７）ＬＸＲαが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するヒト全長ＬＸＲαポリペプチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するそのポリペプチドのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、１）に記載の方法、
８）ＬＸＲαが、配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７からなるアミノ酸配列を有する全長ＬＸＲα、配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、１）に記載の方法、
９）ＲＸＲαが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するヒト全長ＲＸＲαポリペプチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、１）に記載の方法、
１０）ＲＸＲαが、配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２からなるアミノ酸配列を有するヒト全長ＲＸＲα、配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアント、又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質である、１）に記載の方法、
１１）ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量をＦＲＥＴアッセイを用いて測定する、１）に記載の方法、
１２）ＬＸＲα及び／又はＲＸＲαが、ＬＸＲα及び／又はＲＸＲα発現細胞を用いて提供されるものである、１）に記載の方法、
１３）ＬＸＲα及び／又はＲＸＲαがＬＸＲα及び／又はＲＸＲαを外来タンパク質として発現する細胞を用いて提供されるものである、１）に記載の方法、
１４）ＬＸＲα及び／又はＲＸＲαがＬＸＲα及び／又はＲＸＲαを内在性タンパク質として発現する細胞を用いて提供されるものである、１）に記載の方法、
１５）以下の［Ａ］〜［Ｌ］から選択される一つ又は２つ以上を含む、１）〜１４）のいずれか一つの方法に使用されるキット；
［Ａ］ヒト全長ＬＸＲαポリペプチド、ヒト全長ＲＸＲαポリペプチド、並びに、コアクチベーターが、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）からなる群から選択されるコアクチベーター；
ここで、ヒト全長ＬＸＲαポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するバリアントであり、ヒト全長ＲＸＲαポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するバリアントである。
［Ｂ］［Ａ］に記載のポリペプチドのリガンド結合部位及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；ここでヒト全長ＬＸＲαポリペプチドのリガンド結合部位は配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアントであり、そしてヒト全長ＲＸＲαポリペプチドのリガンド結合部位は配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するバリアントである；
［Ｃ］［Ｂ］に記載のリガンド結合部位を含む融合ポリペプチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｄ］［Ａ］から［Ｃ］のいずれか１つに記載のポリペプチド及び、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８に記載のアミノ酸配列及びそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
［Ｅ］［Ａ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｆ］［Ｂ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｇ］［Ｃ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｈ］［Ｅ］から［Ｇ］のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド及び、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８に記載のアミノ酸配列及びそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
［Ｉ］［Ｅ］から［Ｈ］のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｊ］発現ベクターである、［Ｉ］に記載の組換えベクター、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｋ］［Ｉ］又は［Ｊ］に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；  並びに
［Ｌ］哺乳動物細胞である、［Ｋ］に記載の宿主細胞、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ、
１６）以下の工程を含む、哺乳動物の病気の状態を診断する方法
（ｉ）哺乳動物由来の、血液、血漿、肝臓、腸、脂肪、腎臓、副腎、筋肉又は造血系細胞等の生体試料を集める；
（ｉｉ）ＬＸＲコアクチベーターの存在下で、ＬＸＲα及びＲＸＲαからなるヘテロダイマー及び被験物質を生体試料と接触させる；
（ｉｉｉ）コントロールの試料で上記（ｉ）に記載の接触工程を繰り返す；
（ｉｖ）ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する；
（ｖ）哺乳動物から採取された生体試料中でヘテロダイマーに結合しているコアクチベーターの量とコントロールサンプル中でヘテロダイマーに結合しているコアクチベーターの量を比較する；及び
（ｖｉ）生体試料中のコアクチベーターの量がコントロール中でヘテロダイマーに結合しているコアクチベーターの量よりも多いときに、それが哺乳動物における、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリドレベルの増加の指標になるということに基づいて、その哺乳動物が病気の状態かどうかを決定する、
１７）病気の状態が、（ａ）動脈硬化症、（ｂ）アテローム性動脈硬化症、（ｃ）高脂血症、（ｄ）脂質関連疾患、（ｅ）免疫性サイトカイン介在性免疫疾患、（ｆ）自己免疫疾患、（ｇ）心循環疾患、（ｈ）脳循環疾患、（ｉ）腎臓疾患、（ｊ）糖尿病、（ｋ）糖尿病合併症、（ｌ）肥満、（ｍ）腎炎、（ｎ）肝炎、（ｏ）腫瘍、（ｐ）アルツハイマー病及び、（ｑ）（ｃ）〜（ｏ）の１つ又はそれ以上によって引き起こされる動脈硬化症からなる群から選択されるものである、１６）に記載の方法、
１８）哺乳動物がヒトである、１７）に記載の方法、
１９）生体試料が血液試料である、１８）に記載の方法、
２０）コアクチベーターがＬＸＲコアクチベーターである、１９）に記載の方法、
２１）コアクチベーターが、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）からなる群から選択されるものである、２０）に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．用語の説明
本明細書中における、「血漿トリグリセリド濃度に影響する」とは、ＬＸＲリガンドを治療又は予防剤として用いて、哺乳動物においてＬＤＬコレステロール及び血漿トリグリセリド濃度を調節／監視することを意味し、その結果として、動脈硬化あるいは動脈硬化性疾患のような代謝性疾患の状態によって引き起こされるリスクを阻害、予防、改善、又は軽減することになる。
【００１９】
本明細書中において、「動脈硬化関連疾患」とは、その発症からの経過において動脈硬化を症状として呈する疾患、または、動脈硬化に起因する疾患を意味する。また、本明細書中において、動脈硬化関連疾患とは、動脈硬化状態の悪化を抑制するか、動脈硬化状態を改善するか、動脈硬化状態を完治させるか、あるいは動脈硬化状態の発現を予防するか、あるいは原因疾患を治療することにより、その症状の一部または全部が改善され得る疾患である。
【００２０】
動脈硬化関連疾患としては、動脈硬化（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、脂質関連疾患（ｌｉｐｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、免疫性サイトカイン介在性免疫疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、心循環疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び脳循環疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）を例示することができる。
【００２１】
高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、脂質関連疾患（ｌｉｐｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、免疫性サイトカイン介在性免疫疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、心循環疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、脳循環疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、腎臓疾患（ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、糖尿病合併症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、及び肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ）から選択される１つ又は２つ以上の疾患に起因する動脈硬化も、本発明の動脈硬化関連疾患に包含される。
【００２２】
２．ＬＸＲリガンド
本発明で用いることができるＬＸＲリガンドとしては、例えば以下の化合物を挙げることができるがＬＸＲリガンドであれば、これらに制限されない。
【００２３】
例えば、ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの発現亢進作用、コレステロールの排出量、コレステロール排出（ｅｆｆｌｕｘ）活性、共トランスフェクションアッセイ（Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＷＯ２００３／１０６４３５の試験例３）に記載の方法等によってＬＸＲリガンドとして同定される物質も本発明においてＬＸＲリガンドとして用いることができる。
【００２４】
ＬＸＲリガンドの例としては、国際公開パンフレットＷＯ２０００／０５４７５９号の５５頁に記載された化合物１２（Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−｛４−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］フェニル｝ベンゼンスルホンアミド、ＷＯ１９９７／０２８１３７号の第７０頁の実施例２０に記載の３−クロロ−４−（３−（２−プロピル−３−トリフルオロメチル−６−ベンズ−［４，５］−イソオキサゾールオキシ）プロピルチオ）フェニル酢酸、国際公開パンフレットＷＯ２００５／００５４１６号の４１頁に記載の１−（２−メトキシエチル）−４−［（４−メトキシフェニル）アミノ］−３−フェニル−５−チオキソ−１，５−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−オン、ＷＯ０３／０９０８６９号の３７頁に記載の２−メチル−Ｎ−｛５−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］−１，３−チアゾール−２イル｝プロパンアミド、ＷＯ０２／４６１８１号の２７頁に記載の１−［（６−フルオロ（２Ｈ，４Ｈ−ベンゾ［ｅ］１，３−ジオキシン−８−イル））メトキシ］−２−ニトロベンゼン、ＷＯ２００４／０７６４１８号の２０頁に記載の１−［１−（４−シクロヘキシルベンゾイル）−４−フェニルピペリジン−４−イル］エタノン、ＷＯ０２／２４６３２号の４６頁に記載の２−（３−｛３−［［２−クロロ−３−（トリフルオロメチル）ベンジル］（２，２−ジフェニルエチル）アミノ］プロポキシ｝−フェニル）酢酸、ＷＯ２００４／００９０９１号の５９頁に記載のメチル−４−アミノ−１−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−２−ピペリジン−１−イル−１Ｈ−イミダゾール−５−カルボン酸、ＷＯ０３／０４５３８２号の２４頁に記載の２，４−ジヒドロキシ−３−プロピル−１’，１’，１’−トリフルオロアセトフェノン、ＷＯ９７／２８１３７号の４２頁に記載の３−クロロ−４−（３−（３−エチル−７−プロピル−６−ベンズ−［４，５］−イソキサゾロキシ）プロピルチオ）フェニル酢酸、ＷＯ２００４／０２６８１６号に記載の３−［（｛２−［（２，２−ジメチルプロパノイル）チオ］メチル｝−Ｎ−（４−メトキシルベンジル）ベンズアミド、ＷＯ０３／０５９８７４号の２９頁に記載のＮ−（２−｛［６−クロロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル］メチル｝チオフェニル）−２−２−２−トリフルオロアセトアミド、ＷＯ２００４／０４３９３９号の４５頁に記載の２−（３−｛３−［（２−クロロ−３−（トリフルオロメチル）−ベンジル）−（２，２−ジフェニル）−アミノ］−プロポキシ｝フェニル）−１−モルフォリン−４−イル−エタノン  塩酸塩、ＷＯ０３／０８２８０２号の４３頁に記載の（Ｒ）−２−（３−｛３−［［クロロ−３−（トリフルオロメチル）ベンジル］（２，２−ジフェニルエチル）アミノ］−２−メチル−プロポキシ｝−フェニル）酢酸ヒドロキシクロリド塩、ＷＯ０３／０８２２０５号の５５頁に記載の２−（３−｛３−［［２−クロロ−３−（トリフルオロメチル）ベンジル］（２，２−ジフェニルエチル）アミノ］プロポキシ｝−フェニル）酢酸，Ｎ−オキシド、ＷＯ０３／０６３７９６号の３３頁に記載のＮ−���４−｛１−ヒドロキシ−１−［１−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−エチル｝−フェニル）−Ｎ−メチル−ベンゼンスルフォンアミド、ＷＯ０３／０６３５７６号の２９頁に記載のＮ−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−フェニルエチル）］−ベンゼンスルフォンアミド、ＷＯ０５／０５８８３４号の８６頁に記載の［４−（｛３−［３−ベンジル−８−（トリフルオロメチル）キノリン−４−イル］フェノキシ｝メチル）フェニル］酢酸及び、ＷＯ０６／０１７３８４号の２５１頁に記載の［４−（｛３−［２−メチル−７−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インダゾール−３−イル］フェノキシ｝メチル）フェニル］酢酸が含まれる。
【００２５】
ＬＸＲリガンドの例には、「リースント・パテンツ・オン・カルディオバスキュラー・ドラッグ・ディスカバリー、２００６年、１巻、２１−４６頁」に示されている構造（１）−（１６５）を持つ化合物も含む。
【００２６】
３．ＬＸＲα、ＬＸＲβ及びＲＸＲαの調製
ヒトＬＸＲα、ヒトＬＸＲβ及びヒトＲＸＲαはその全長タンパク質に限らず、リガンドの結合領域を含んでいる限りにおいて、その一部の配列からなる部分ペプチドでも良い。ヒト全長ＬＸＲαは配列番号２のアミノ酸配列又はリガンド結合能を有するそのバリアントのアミノ酸配列を有する。ヒト全長ＲＸＲαは配列番号４のアミノ酸配列又はリガンド結合能を有するそのバリアントのアミノ酸配列を有する。ヒト全長ＬＸＲβは配列番号６のアミノ酸配列又はリガンド結合能を有するそのバリアントのアミノ酸配列を有する。配列番号２、４又は６に対するポリペプチドのバリアントの相同性は好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。バリアントの相同性は好ましくはコンピューターソフトウエア、例えば相同性検索を行うためのアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴプログラムによって判定することができる。更に、それらのタンパク質としては、ヒト由来細胞から取得された天然由来タンパク質、及びＰＣＲ等の方法でクローニングされた遺伝子によってそれらのタンパク質を発現するように改変された組換え細胞由来のタンパク質でもよい。更に、これらのタンパク質は精製されたもの又は部分精製されただけのものでもよい。
【００２７】
また、ヒトＬＸＲα、ヒトＬＸＲβ及びヒトＲＸＲα並びにその部分ペプチドに他のアミノ酸配列を付加した融合タンパク質も、ヒトＬＸＲα、ヒトＬＸＲβ及びヒトＲＸＲα並びにその部分ペプチドに含まれる。融合タンパク質の例としてはヒスチジンタグ融合タンパク質、ＦＬＡＧ融合タンパク質、並びに、ＧＦＰ及び他の蛍光色素融合タンパク質等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２８】
ヒトＬＸＲα遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｕ２２６６２で登録されている（Ｐ．Ｊ．Ｗｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ９  （９），  １０３３−１０４５  （１９９５）参照）のヌクレオチド番号５９７から１３７９まで）。
【００２９】
ヒトＬＸＲβ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｕ０７１３２で登録されている（Ｊ．Ｗｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ９  （９），１０３３−１０４５（１９９５）参照）。
【００３０】
ヒトＲＸＲα遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｘ５２７７３で登録されている。
【００３１】
４．コアクチベーターの調製
ＬＸＲコアクチベーターの例としては、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）が含まれる。コアクチベーターとしては全長タンパク質に限定されず、ＬＸＸＬＬモチーフ（Ｌはロイシンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す。）を含む部分ペプチドも用いることができる。配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８及びＬＸＸＬモチーフを含むそのバリアントのアミノ酸配列を有するペプチド群から選択されるペプチドもコアクチベーターとして用いることができる。ポリペプチドのバリアントの、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８に対する相同性は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は１００％である。それらのタンパク質としては、ヒト由来細胞から取得された天然由来タンパク質、及びＰＣＲ等の方法でクローニングされた遺伝子によってそれらのタンパク質を発現するように改変された組換え細胞由来のタンパク質でもよい。更に、化学合成されたタンパク質も用いることができる。
【００３２】
ＰＧＣ−１αのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿０１３２６１で登録されている。ＴＩＦ−２のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿００６５４０で登録されている。ＡＳＣ−２のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＦ１７７３８８で登録されている。ＳＲＣ−１のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｕ９０６６１で登録されている。ＤＡＸ１のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＰ＿０００４６６で登録されている。ＰＮＲＣのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿００００４４で登録されている。ＴＲＡＰ２２０のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿００４７７４で登録されている。ＰＥＲＣのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿１３３２６３で登録されている。ＡＣＴＲのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＦ＿０１２１０８で登録されている。
【００３３】
５．ＬＸＲリガンドによるＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリドレベルの上昇作用の判定方法
ＬＸＲリガンドが血漿中のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用を有するか否かは、当該ＬＸＲリガンドが、ＬＸＲαと、ＰＧＣ−１α、ＴＩＦ−２、ＡＳＣ−２、ＳＲＣ−１、ＤＡＸ１、ＰＮＲＣ、ＴＲＡＰ２２０、ＰＥＲＣ及びＡＣＴＲから選択される少なくともいずれか一つのコアクチベーターとの結合量を増大させるか否かによって判定することができる。さらに具体的には、本方法は具体的には以下の１）又は２）の工程を含む。
１）
ｉ）ＬＸＲαとＲＸＲαからなるヘテロダイマーを、ＬＸＲのコアクチベーターおよび被検物質と接触させる工程；
ｉｉ）ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する工程；及び、
ｉｉｉ）上記ｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量と、ヘテロダイマーを被検物質と接触させない場合に測定されたヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量とを比較する工程。
２）
ｉ）ＬＸＲαとＲＸＲαからなるヘテロダイマーを、ＬＸＲコアクチベーター及び被検物質と接触させる工程；
ｉｉ）ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量と、ヘテロダイマーを被検物質と接触させない場合に測定された、ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量とを比較する工程；及び、
ｉｖ）上記工程ｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量が、ヘテロダイマーを被検物質と接触させない場合に測定されたヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量と比較して増大している場合に、ＬＸＲリガンドが血漿中のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用を有すると判定する工程。
【００３４】
以下、各工程を説明する。
【００３５】
１）
工程１）−ｉ）：
ＬＸＲαとＲＸＲαからなるヘテロダイマーは、上記「３．ＬＸＲα、ＬＸＲβ及びＲＸＲαの調製」の項に記載した方法によってＬＸＲα及びＲＸＲαを混合することによって取得することができる。
【００３６】
また、ＬＸＲαとＲＸＲαとのヘテロダイマーは例えば、ヒトＬＸＲα（配列表の配列番号２）のリガンド結合領域（配列表の配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７）とＨｉｓタグとの融合タンパク質及び、ＲＸＲα（配列表の配列番号４）のリガンド結合領域（配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２）とＦＬＡＧとの融合タンパク質を共発現するベクターを作製し、該発現ベクターで形質転換された組換え体より発現蛋白質を精製することによって取得することができる。
【００３７】
さらに、比較実験のために用いるＬＸＲβ及びＲＸＲαからなるヘテロダイマーは例えば、ヒトＬＸＲβ（配列表の配列番号６）のリガンド結合領域（配列番号６のアミノ酸番号１５５〜４６１）とＨｉｓタグとの融合タンパク質及び、ＲＸＲα（配列表の配列番号４）のリガンド結合領域（配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２）とＦＬＡＧとの融合タンパク質を共発現するベクターを作製し、該発現ベクターで形質転換された組換え体より発現蛋白質を精製することによって取得することができる。
【００３８】
ＬＸＲコアクチベーターとしては、上記「４．コアクチベーターの調製」の項で説明したものを用いることができる。
【００３９】
被験物質としては、上記「２．ＬＸＲリガンド」の項に記載した物質を用いることができる。
【００４０】
さらに、反応液には、必要に応じて、ｐＨ調整のための緩衝液や、融合タンパク質検出用の抗体が添加され得る。
【００４１】
これらの材料はそれから、混合されて、例えば以下に示す反応に供される。
【００４２】
温度条件：０℃〜４０℃、好適には４℃
反応液のｐＨ：６〜９、好適には７．４
反応時間：１分〜４８時間、好適には１７時間
反応は、例えば、３８４穴アッセイプレートを用いて行うことができる。
【００４３】
工程１）−ｉｉ）：
ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する方法の例は以下に記載されている。
【００４４】
Ｎ末端がビオチン化されたコアクチベーターを用いてアッセイプレート内で反応を行った場合には、反応終了後のプレートに蛍光プレートリーダーで３３７ｎｍの励起光を与え、６６５ｎｍでの蛍光強度（Ａ）及び６２０ｎｍでの蛍光強度（Ｂ）を測定し、そして６６５ｎｍでの測定値を６２０ｎｍでの測定値で割り、その値を１０００倍した値（Ｃ）を求める。
Ｃ＝（Ａ／Ｂ）×１０００
Ａ：６６５ｎｍでの蛍光強度；  Ｂ：６２０ｎｍでの蛍光強度；  
工程１）−ｉｉｉ）：
上記Ｃの値を、被験物質を添加しないで同じ実験をしたときに得られた値（Ｃ’）で割り、そしてその値に１００をかけた値をコントロールに対する相対活性（Ｒ：％  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）とする。
計算式は以下のとおりである。
Ｃ’＝（Ａ’／Ｂ’）×１０００
Ｒ＝Ｃ／Ｃ’×１００
Ａ’：被験物質を添加しないで反応を行った場合の６６５ｎｍでの蛍光強度；  
Ｂ’：被験物質を添加しないで反応を行った場合の６２０ｎｍでの蛍光強度
相対活性（Ｒ）が高いほど、ＬＸＲリガンドを添加していないコントロールに比べて、コアクチベーターの結合量が多いことを意味する。
【００４５】
相対活性（Ｒ）が１００より大きい場合、ヘテロダイマーを被験物質と接触させたことによって、コアクチベーターの量が増加していると判断することができる。そして、相対活性の値が１００に近い被験物質ほどＬＤＬコレステロール濃度及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用が少ない物質と判定することができる。
【００４６】
被験物質の相対活性が、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用が調べられているＬＸＲリガンド（以下、「化合物Ｘ」とする。）について測定されている相対活性と比較して高い場合には、被験物質のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用は、化合物Ｘよりも強いと判定することができる。
【００４７】
被験物質の相対活性が、「化合物Ｘ」について測定されている相対活性と比較して、低い場合には、被験物質のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用は、化合物Ｘよりも弱いと判定することができる。
【００４８】
複数の被験物質について測定された相対活性を比較すれば、相対活性の低い被験物質ほど、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用が低いと判定することができる。
【００４９】
２）
工程２）−ｉ）、２）−ｉｉ）及び２）―ｉｉｉ）については上記１）−ｉ）、１）−ｉｉ）及び１）−ｉｉｉ）と同様である。
【００５０】
工程２）−ｉｖ）：
上記１）−ｉｉｉ）で説明したように、相対活性の値が１００に近い被験物質ほどＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用が少ない物質と判定することができる。逆に、相対活性の値が１００より大きい場合、被験物質はＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用を有すると判定することができる。
【００５１】
被験物質の相対活性が、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用が調べられているＬＸＲリガンド（以下、「化合物Ｘ」とする。）について求められている相対活性と比較して高い場合には、被験物質のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用は、化合物Ｘよりも強いと判定することができる。
【００５２】
被験物質の相対活性が化合物Ｘについて測定されている相対活性と比較して低い場合には、被験物質のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用は、化合物Ｘよりも弱いと判定することができる。
【００５３】
複数の被験物質について測定された相対活性を比較すれば、相対活性の低い被験物質ほど、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の上昇作用が低いと判定することができる。
【００５４】
さらに、上記１）及び２）において、一つのコアクチベーターについての相対活性に基づく他に、複数のコアクチベーターについての相対活性を総合的に判断して、被験物質の血漿中のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用を判定することができる。
【００５５】
６．ＬＤＬリガンドの中でコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度上昇作用が少ないか又は有さない物質の同定方法
以下の工程によって、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度上昇作用が少ないか又は有さないＬＸＲリガンドを取得することができる：
ｉ）ＬＸＲα及びＲＸＲαからなるヘテロダイマーを、ＬＸＲコアクチベーター及び被検物質と接触させる工程；
ｉｉ）ヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を測定する工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量と、ヘテロダイマーを被検物質と接触させない場合に測定されたヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量とを比較する工程；及び、
ｉｖ）工程ｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量が、ヘテロダイマーを被検物質と接触させない場合に測定されたヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量と比較して増大していない場合に、ＬＸＲリガンドが血漿中のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用を有すると判定する工程。
【００５６】
上記「５．ＬＸＲリガンドによるＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリドレベルの上昇作用の判定方法」に記載した方法と同様の方法によって本工程を行うことができる。
【００５７】
「工程ｉｉ）で測定されたコアクチベーターの量が増大していない」とは、以下の少なくともいずれかを意味する。：ａ）相対活性が約１００であること、ｂ）相対活性が、血漿中のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度の増加作用が少ないか又はないことが実証されているＬＸＲリガンドについて求められた相対活性と同程度又は小さいこと。
【００５８】
本方法によって、ＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度上昇作用が少ないか又は有さないと同定された物質は下記の疾患（ａ）乃至（ｑ）より選択される１又は２以上の疾患の治療又は予防剤となり得る。
（ａ）動脈硬化（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）；  
（ｂ）アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）；
（ｃ）高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；
（ｄ）脂質関連疾患（ｌｉｐｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）；
（ｅ）免疫性サイトカイン介在性免疫疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）；
（ｆ）自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）；
（ｇ）心循環疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）；
（ｈ）脳循環疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）；
（ｉ）腎臓疾患（ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）；
（ｊ）糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）；
（ｋ）糖尿病合併症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；
（ｌ）肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ）；
（ｍ）腎炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）；
（ｎ）肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）；  
（ｏ）腫瘍（ｔｕｍｏｒ）；
（ｐ）アルツハイマー病；および
（ｑ）（ｃ）〜（ｏ）から選択される疾患の一つ又は二つ以上によって引き起こされる動脈硬化。
【００５９】
７．ＬＸＲリガンド同定用キット
以下のキットは、哺乳動物のＬＤＬコレステロール及び／又は血漿トリグリセリド濃度を上昇させないＬＸＲリガンドを同定するために用いることができ、本キットは下記［Ａ］〜［Ｌ］よりなる群から選択される１つ又は２つ以上を含むことからなる：
［Ａ］ヒト全長ＬＸＲαポリペプチド、ヒト全長ＲＸＲαポリペプチド、並びに、ＰＧＣ−１α（ホモ・サピエンス・ペルオキシソーム増殖性活性化受容体、ガンマ・コアクチベーター１，アルファ）、ＴＩＦ−２（ホモ・サピエンス核内受容体コアクチベーター２）、ＡＳＣ−２（活性化シグナル・コインテグレーター２）、ＳＲＣ−１（ヒト・ステロイド受容体・コアクチベーター−１）、ＤＡＸ１（用量感受性セックス・リバーサル，アドレナル・ハイパープラシア・コンジェニタル（ＡＨＣ）Ｘクロモゾーム必須領域，遺伝子１、ＰＮＲＣ（プロリン・リッチ核内受容体・コレギュラトリー・プロテイン）、ＴＲＡＰ２２０（チロイド・ホルモン受容体付随プロテイン２２０）、ＰＥＲＣ（ペルオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ・コアクチベーター−１・ベータ）及びＡＣＴＲ（ステロイ受容体コアクチベーター−３）からなる群から選択されるコアクチベーター、
ここで、ヒト全長ＬＸＲαポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有するそのバリアントであり、そしてヒト全長ＲＸＲαポリペプチドは配列番号４と少なくとも８０％の相同性を有する。
【００６０】
［Ｂ］［Ａ］に記載のポリペプチドのリガンド結合部位、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ、
ここでヒト全長ＬＸＲαポリペプチドのリガンド結合部位は、配列番号２の１６４番〜４４７番のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸番号１６４〜４４７と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、そしてヒト全長ＲＸＲαポリペプチドのリガンド結合部位は配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２と少なくとも８０％の相同性を有する；
［Ｃ］［Ｂ］に記載のリガンド結合部位を含有する融合ポリペプチド、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｄ］［Ａ］〜［Ｃ］のいずれかに記載のポリペプチド、並びに配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８及びそのバリアントからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
［Ｅ］［Ａ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｆ］［Ｂ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｇ］［Ｃ］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｈ］［Ｅ］〜［Ｇ］のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、及び配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及びそのバリアントからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
［Ｉ］［Ｅ］〜［Ｈ］のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｊ］発現ベクターである、［Ｉ］に記載の組換えベクター及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；
［Ｋ］［Ｉ］又は［Ｊ］に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞及び、［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ；及び
［Ｌ］哺乳動物細胞である、［Ｋ］に記載の宿主細胞、及び［Ａ］に記載のコアクチベーターのいずれか１つ。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を試験例及び実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００６２】
（試験例１）ＬＸＲリガンドのコレステロール放出活性の測定（コレステロール放出測定）
２種のＬＸＲリガンド（化合物Ａ（Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−｛４−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］フェニル｝ベンゼンスルホンアミド及び化合物Ｂ（３−クロロ−４−（３−（２−プロピル−３−トリフルオロメチル−６−ベンズ−［４，５］−イソオキサゾールオキシ）プロピルチオ）フェニル酢酸）のコレステロール放出活性は以下の方法により測定された。
【００６３】
３×１０５個のＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−２０２）を９６穴白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に撒き、次いで２００ｎＭ  ホルボール  １２−ミリスチン酸  １３−酢酸（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した。
【００６４】
次に０．２μＣｉ／ｍｌ  ４−１４Ｃ−コレステロール（パーキンエルマー）を含む培地（ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１％  ウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を各ウエルに１２５μｌずつ添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、４８時間培養した。
【００６５】
培養終了後、０．２％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むＰＢＳ  １００μｌを各ウエルに添加して細胞を洗浄した。次に、最終濃度１０μｇ／ｍｌのアポリポタンパクＡ１（以下「ＡｐｏＡ１」と呼ぶ。）（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０又はＡｐｏＡ１を含まないＲＰＭＩ  １６４０を１００μｌを各ウエルに添加した。次に化合物Ａ（Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−｛４−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］フェニル｝ベンゼンスルホンアミド又は化合物Ｂ（３−クロロ−４−（３−（２−プロピル−３−トリフルオロメチル−６−ベンズ−［４，５］−イソオキサゾールオキシ）プロピルチオ）フェニル酢酸）の最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ及び１μＭの各濃度になり、ＤＭＳＯの最終濃度が１％になるようにＤＭＳＯ溶液をウエルに添加し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した。
【００６６】
培養終了後のプレートを１，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。遠心上清である培地７５μｌを９６穴Ｌｕｍａ  ｐｌａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ）に移し、乾燥させた。一方、細胞が沈殿しているプレートの各ウエルにＰＢＳ  １００μｌを添加して細胞を洗浄した。
【００６７】
上清を乾燥させたプレート及び細胞を洗浄したプレートの各ウエルにｍｉｃｒｏ  ｓｃｉｎｔｉ  ２０（Ｐａｃｋａｒｄ）を２５０μｌずつ添加し一晩放置し、シンチレーションカウンター（トップカウント、Ｐａｃｋａｒｄ）で培地及び細胞の放射活性を測定した。測定値より放出割合（％）を以下の計算式にしたがって算出した。
放出割合（％）＝（培地の比放射活性（ＣＰＭ）／７５×１００）／（培地の比放射活性（ＣＰＭ）＋細胞の比放射活性（ＣＰＭ））×１００
１μＭの濃度の化合物Ａによる放出割合（％）の値を１００として、この値を基準として他の結果を換算し、相対活性とした（表１）。化合物Ａ及びＢは最終濃度が０．０１μＭで約５０％のコレステロール放出活性を示し、１μＭ約１００％の放出活性を示し、ＬＸＲリガンドである化合物Ａおよび化合物Ｂは同等のコレステロールの放出活性を有することが明らかになった。
【００６８】
【表１】
2008546423.tif 000002
（実施例１）．ヒスチジンタグ融合蛋白質の取得
（１）ヒスチジンタグ融合ヒトＬＸＲαタンパク質の発現プラスミドの構築
下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
ｇｃｃａｔａｔｇｃｇｇｇａｇｇａｇｔｇｔｇｔｃｃｔｇｔｃ（ＬＸＲα−Ｆ：配列表の配列番号７）、
ｃｔｇｇａｔｃｃｔｔｃｇｔｇｃａｃａｔｃｃｃａｇａｔｃｔ（ＬＸＲα−Ｒ：配列表の配列番号８）
をＤＮＡ合成機で合成し、ＰＣＲプライマーとしてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｐ．  Ｊ．  Ｗｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ９（９），ｐ．１０３３−１０４５（１９９５）参照）を鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＬＸＲα（配列表の配列番号２）のリガンド結合領域（以下、「ＬＢＤ」という。）（配列番号２のアミノ酸番号１６４乃至４４７）に制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトを導入したＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したＨｉｓタグ融合タンパク質発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。得られたヒスチジンタグ融合ヒトＬＸＲαタンパク質発現プラスミドをｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲαとした。
【００６９】
（２）ヒスチジンタグ融合ヒトＬＸＲβタンパク質の発現プラスミドの構築
下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
ｇｃｃａｔａｔｇａｇｇｇａｇｃａｇｔｇｃｇｔｃｃｔｔｔｃ（ＬＸＲβ―Ｆ：配列表の配列番号９）
ｃｔｇｇａｔｃｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｇｔｃｃｃａｇａｔｃｔ（ＬＸＲβ−Ｒ：配列表の配列番号１０）
をＰＣＲプライマーとしてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＬＸＲβ（配列表の配列番号６）のリガンド結合領域（配列番号６のアミノ酸番号１５５乃至４６１）に制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトを導入したＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したＨｉｓタグ融合タンパク質発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。得られたヒスチジンタグ融合ヒトＬＸＲβタンパク質発現プラスミドをｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲβとした。
【００７０】
（３）Ｈｉｓ−ＬＸＲα、ＦＬＡＧ−ＲＸＲα共発現プラスミド及びＨｉｓ−ＬＸＲβ、ＦＬＡＧ−ＲＸＲα共発現プラスミドの構築
下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
ｃｃａｇａｔｃｔａａｇｃｇｇｇａａｇｃｃｇｔｇｃａｇｇａ（ＲＸＲα−Ｆ：配列表の配列番号１１）
ｃｃａｇａｔｃｔａｇｔｃａｔｔｔｇｇｔｇｃｇｇｃｇｃｃｔ（ＲＸＲ−Ｒ：配列表の配列番号１２）
をＰＣＲプライマーとしてヒト肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＲＸＲα（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｘ５２７７３；配列表の配列番号４）のリガンド結合領域（配列番号４のアミノ酸番号２０１〜４６２）にＢｇｌＩＩサイトを導入したＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩにより消化し、このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲαとライゲーションし、Ｈｉｓ−ＬＸＲα（配列表の配列番号１３）とＦＬＡＧ−ＲＸＲα（配列表の配列番号１４）を共発現するプラスミド、ｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲα／ＦＬＡＧ−ＲＸＲαを構築した。
【００７１】
次に、上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩで消化し、ＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲβのＢａｍＨＩサイトに組み込み、Ｈｉｓ−ＬＸＲβ（配列表の配列番号１５）とＦＬＡＧ−ＲＸＲαを共発現するプラスミド、ｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲβ／ＦＬＡＧ−ＲＸＲαを構築した。
【００７２】
（４）Ｈｉｓ−ＬＸＲα／ＦＬＡＧ−ＲＸＲα及びＨｉｓ−ＬＸＲβ／ＦＬＡＧ−ＲＸＲαの取得
ｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲα／ＦＬＡＧ−ＲＸＲα又はｐＥＴ１５ｂ−ＬＸＲβ／ＦＬＡＧ−ＲＸＲαを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体のそれぞれをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（１０ｇ  トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ  イーストエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ  塩化ナトリウムをそれぞれ１Ｌの水溶液に含む。）２０ｍｌにて、３７℃で４時間振とう培養を行なった。次に、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地４００ｍｌにその形質転換体を５．０％（ｖ／ｖ）植菌し、３７℃にて４時間振とう培養を行なった。次に、タンパク質の発現誘導のため、０．１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」とする。）を添加し、２５℃で１７時間振とう培養を行なった。
【００７３】
培養終了後の菌体を８，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により集め、４０ｍｌのリシスバッファー（表２）に懸濁した。その後、超音波処理にて菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００×ｇ、２０分）により不溶性画分を除去した後、その上清にＮｉ２＋レジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  「Ｐｒｏｂｏｎｄ  Ｒｅｓｉｎ」）を２ｍｌ添加し、１．５時間氷上で静かに振とうした。ゲルをウォッシュバッファー（表３）２０ｍｌで７回洗浄した後、バッチ法により、溶出バッファー（表４）１ｍｌを用いて４回溶出し、Ｈｉｓ−ＬＸＲα／ＦＬＡＧ−ＲＸＲα及びＨｉｓ−ＬＸＲβ／ＦＬＡＧ−ＲＸＲαをそれぞれ４ｍｌ得た。１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という。）を行ない、精製されたタンパク質が、予想される融合タンパク質の分子量Ｈｉｓ−ＬＸＲα  ３５，５００、Ｈｉｓ−ＬＸＲβ  ３７，２００、ＦＬＡＧ−ＲＸＲα  ３０，９００に相当する位置に存在することを確認し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により、タンパク濃度を求めた。得られたタンパク質溶液に保存液（表５）４ｍｌを加え、−２０℃で保存した。
【００７４】
【表２】
2008546423.tif 000003
@0002
【００７５】
【表３】
2008546423.tif 000004
【００７６】
【表４】
2008546423.tif 000005
【００７７】
【表５】
2008546423.tif 000006
（実施例２）．蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ（以下、「ＦＲＥＴ」という。）によるＬＸＲαへの結合能を指標としたＬＸＲリガンドの選択
実施例１で調製されたＨｉｓ−ＬＸＲα及びＦＬＡＧ−ＲＸＲαを含む、８μｌのＬＸＲα反応液（０．０５μｌの４μＭ  Ｈｉｓ−ＬＸＲα及びＦＬＡＧ−ＲＸＲαの混合溶液、１．００μｌの１０×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２．５０μｌの２Ｍ  ＫＦ（和光純薬）、０．１０μｌの１０％  ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）、０．１５μｌの抗Ｈｉｓタグ抗体（ＣＩＳ  ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｓｉｏｎａｌ）及び４．２０μｌのＨ２Ｏ）を３８４穴アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に入れた。
【００７８】
次に、３８４穴アッセイプレートの各ウエルにジメチルスルホキシド（以下「ＤＭＳＯ」とする。）に１０μＭの濃度で溶解した化合物Ａ（Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−｛４−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］フェニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＷＯ２０００／０５４７５９号の５５頁に記載された化合物１２）又は化合物Ｂ（３−クロロ−４−（３−（２−プロピル−３−トリフルオロメチル−６−ベンズ−［４，５］−イソオキサゾールオキシ）プロピルチオ）フェニル酢酸（国際公開ＷＯ１９９７／０２８１３７号の第７０頁の実施例２０に記載された化合物）溶液２μｌを加えて、室温で１時間インキュベートした。
【００７９】
次に３８４穴アッセイプレートの各ウエル（ｗｅｌｌ）に１０μｌのペプチド反応液（１．００μｌの５μＭ  ペプチド、１．００μｌの１０×ＰＢＳ、２．５０μｌの２Ｍ  ＫＦ、０．１０μｌの１０％  ＮＰ４０、０．２０μｌのストレプトアビジン（ＣＩＳ  ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｓｉｏｎａｌ）、５．２０μｌのＨ２Ｏ）を加え、４℃で１７時間インキュベートした。ここで添加したペプチドは以下の（ａ）乃至（ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、Ｎ末端のアミノ酸がビオチン化されている。
（ａ）ＰＧＣ−１α：  ＤＧＴＰＰＰＱＥＡＥＥＰＳＬＬＫＫＬＬＬＡＰＡＮＴ（アミノ酸番号  １３０−１５４）（ＮＭ＿０１３２６１）（配列表の配列番号１６）
（ｂ）ＴＩＦ２：  ＨＧＴＳＬＫＥＫＨＫＩＬＨＲＬＬＱＤＳＳＳＰＶＤＬ（アミノ酸番号  ６７９−７０３）（ＮＭ＿００６５４０）（配列表の配列番号１７）
（ｃ）ＡＳＣ−２  ＮＲ−１：  ＮＫＤＶＴＬＩＳＰＬＬＶＮＬＬＱＳＤＩＳＡＧＨＦＧＶＮＮＫＱ（ＡＳＣ−２のＮ端側のＬＸＸＬＬモチーフ）（アミノ酸番号  ８８７−９０６）（ＡＦ１７７３８８）（配列表の配列番号１８）
（ｄ）ＡＳＣ−２  ＮＲ−２：  ＳＰＡＭＲＥＡＰＴＳＬＳＱＬＬＤＮＳＧＡＰＮＶＴＩＫＰＰＧＬ（ＡＳＣ−２のＣ端側のＬＸＸＬＬモチーフ）（アミノ酸番号  １４８１−１５１０）（配列表の配列番号１９）
（ｅ）ＳＲＣ−１−２：  ＣＰＳＳＨＳＳＬＴＥＲＨＫＩＬＨＲＬＬＱＥＧＳＰＳ（ＳＲＣ−１のＮ端側から２番目のＬＸＸＬＬモチーフ）（アミノ酸番号  ６７６−７００）（Ｕ９０６６１）（配列表の配列番号２０）
（ｆ）ＳＲＣ−１−３：  ＫＥＳＫＤＨＱＬＬＲＹＬＬＤＫＤＥＫＤＬ  （ＳＲＣ−１のＮ端側から３番目のＬＸＸＬＬモチーフ）（アミノ酸番号  ７４１−７６０）（配列表の配列番号２１）
（ｇ）ＳＲＣ−１−４：  ＱＫＰＴＳＧＰＱＴＰＱＡＱＱＫＳＬＬＱＱＬＬＴＥ（ＳＲＣ−１のＮ端側から４番目のＬＸＸＬＬモチーフ）（アミノ酸番号  １４１８−１４４１）（配列表の配列番号２２）
インキュベート終了後のアッセイプレートに蛍光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）で３３７ｎｍの励起光を与え、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍの蛍光強度を測定し、タンパク質とペプチドの結合能を測定した。
【００８０】
３３７ｎｍの励起光を与えた時の６６５ｎｍの測定値を６２０ｎｍの測定値で割った値を１０００倍した値を求めた。この値をＬＸＲリガンド（化合物Ａ又は化合物Ｂ）を添加せずＤＭＳＯのみを添加したときに同様の方法で求めた値で割り、１００をかけた数値を「コントロール％」（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として（表６）に示した。
【００８１】
ここで求められたコントロール％はＬＸＲリガンドを添加することによるコアクチベーターのＬＸＲαに対する結合量の増加の割合を示す値を％で示した値であり、この値が大きいほど、ＬＸＲαに対するコアクチベーターの結合量が多いことを示す。
【００８２】
本実施例により、ＬＸＲαに対するコアクチベーターの結合量を有意に増大する化合物として化合物Ａが、有意に増大させない化合物として化合物Ｂが同定された。
【００８３】
化合物Ａ及び化合物Ｂは参考例１の結果では同等のコレステロール放出活性を示したが、ＬＸＲαに対するコアクチベーターの結合量は化合物Ａの方が化合物Ｂに比して有意に多かった。
【００８４】
（実施例３）．蛍光共鳴エネルギー転移（以下「ＦＲＥＴ」）アッセイによるＬＸＲβへの結合能を指標としたＬＸＲリガンドの選択（１）
実施例１で調製されたＨｉｓ−ＬＸＲβ及びＦＬＡＧ−ＲＸＲαを含む、ＬＸＲβ反応液８μｌ（０．０２５μｌ  ８μＭ  Ｈｉｓ−ＬＸＲβ及びＦＬＡＧ−ＲＸＲα混合溶液、１．００μｌ  １０×ＰＢＳ、２．５０μｌ  ２Ｍ  ＫＦ、０．１０μｌ  １０％  ＮＰ４０、０．１５μｌ抗Ｈｉｓタグ抗体、４．２３μｌ  Ｈ２Ｏ）を３８４穴アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に入れ、実施例２と同様の方法によって測定を行い、コントロールに対する％（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を求めた（表６）。得られた値には化合物Ａと化合物Ｂとの間で有意な差は認められなかった。
【００８５】
【表６】
2008546423.tif 000007
（実施例４）．蛍光共鳴エネルギー転移（以下「ＦＲＥＴ」とする。）アッセイによるＬＸＲα及びＬＸＲβへの結合能を指標としたＬＸＲリガンドの選択
（１）実施例２と同じ方法（以下のペプチド（ｈ）〜（ｍ）を、実施例２のペプチド（ａ）〜（ｇ）の代わりに使用した。）で、ＬＸＲα及びＲＸＲαのヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量を決定した。
【００８６】
ＬＸＲα及びＲＸＲαからなるヘテロダイマーに結合したコアクチベーターの量は化合物Ｂよりも化合物Ａの方が多かった（表７）。
【００８７】
（ｈ）ＤＡＸ１：  ＣＣＦＣＧＥＤＨＰＲＱＧＳＩＬＹＳＬＬＴＳＳＫＱＴ（アミノ酸番号１３２−１５６）（ＮＰ＿０００４６６）（配列表の配列番号：２３）
（ｉ）ＰＮＲＣ：  ＫＮＰＴＳＣＳＲＲＦＹＱＬＴＫＬＬＤＳＶＱＰＩＡＲ（アミノ酸番号８４８−８７２）（ＮＭ＿００００４４）（配列表の配列番号：２４）
（ｊ）ＴＩＦ２  ＮＲＢ２：  ＫＱＥＰＶＳＰＫＫＫＥＮＡＬＬＲＹＬＬＤＫＤＤＴＫ  （アミノ酸番号  ７３１−７５５）（ＮＭ＿００６５４０）（配列表の配列番号２５）
（ｋ）ＴＲＡＰ２２Ｏ：  ＧＨＧＥＤＦＳＫＶＳＱＮＰＩＬＴＳＬＬＱＩＴＧＮＧ  （アミノ酸番号  ５９０−６１４）（ＮＭ＿００４７７４）（配列表の配列番号２６）
（１）ＰＥＲＣ  ＮＲＢ２：  ＨＳＫＡＳＷＡＥＦＳＩＬＲＥＬＬＡＱＤＶＬＣＤ  （アミノ酸番号  ３３２−３５４）（ＮＭ＿１３３２６３）（配列表の配列番２７）
（ｍ）ＡＣＴＲ  ＮＲＢ３：  ＳＰＫＫＸＥＮＮＡＬＬＲＹＬＬＤＲＤＤＰＳＤＡＬＳＫ  （アミノ酸番号  ７２８−７５３）（ＡＦＯ１２１０８）（配列表の配列番号２８）
（２）ＬＸＲβ：実施例３と同じ方法（実施例３のペプチド（ａ）〜（ｇ）の代わりに上記のペプチド（ｈ）〜（ｍ）を使用した。）で、ＬＸＲβ及びＲＸＲαからなるヘテロダイマーに結合するコアクチベーターの量を決定した。得られた値には化合物Ａと化合物Ｂとの間で有意な差は認められなかった（表７）。
【００８８】
【表７】
2008546423.tif 000008
（試験例２）カニクイサル薬物連投試験
５〜７才の雄性カニクイサル各群５匹に、投与基剤［プロピレングリコール（和光純薬）／Ｔｗｅｅｎ  ８０（花王）（容量比：４／１、以下、「ＰＧ／Ｔｗｅｅｎ」という。）のみ（以下、「対照群」という。）又はＰＧ／Ｔｗｅｅｎに溶解した化合物Ａ又は化合物Ｂを３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの量で１日１回、午前８時〜午前１０時の間に７日間強制経口投与した。投与７日目の午後５時より１６時間絶食後、ヘパリン処理注射器で橈側皮静脈より、１ｍＬ採血し、４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、血漿を得た。
【００８９】
血漿中のＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの量をオートアナライザー（日立：型番７１７０）により測定し、コントロール群に対する％を算出した（表８、表９）。
【００９０】
実施例２によりＬＸＲαに結合するコアクチベーターの量を有意に増大する化合物として同定された化合物Ａが、ＬＸＲαに結合するコアクチベーターの量を有意に増大しない化合物として同定された化合物に比べて、有意に、血漿中のＬＤＬコレステロール濃度及びトリグリセリドの濃度を増加させることが明らかになった。
【００９１】
すなわち、ＬＸＲリガンドが血漿中のＬＤＬコレステロール濃度及びトリグリセリド濃度の増加作用を有するか否かは動物実験をすることなく、単にＬＸＲリガンドを添加した際のＬＸＲα及びＲＸＲαからなるヘテロ蛋白質に対するコアクチベーターの結合量を測定することで判定できることが明らかになった。
【００９２】
血漿中のＬＤＬコレステロールの相対値
【００９３】
【表８】
2008546423.tif 000009
血漿中のＴＧの相対値
【００９４】
【表９】
2008546423.tif 000010
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号７：ＬＸＲαリガンド結合領域用のＰＣＲフォワードプライマー
配列番号８：ＬＸＲαリガンド結合領域用ＰＣＲリバースプライマー
配列番号９：ＬＸＲβリガンド結合領域用ＰＣＲフォワードプライマー
配列番号１０：ＬＸＲβリガンド結合領域用ＰＣＲリバースプライマー
配列番号１１：ＲＸＲαリガンド結合領域用ＰＣＲフォワードプライマー
配列番号１２：ＲＸＲαリガンド結合領域用ＰＣＲリバースプライマー
配列番号１３：ＬＸＲαリガンド結合領域とＨｉｓ−Ｔａｇとの融合タンパク質
配列番号１４：ＲＸＲαリガンド結合領域とＦＬＡＧとの融合タンパク質
配列番号１５：ＬＸＲβリガンド結合領域とＨｉｓ−Ｔａｇとの融合タンパク質
【配列表】
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【国際調査報告】
2008546423.tif 000011
2008546423.tif 000012