(57)【要約】本発明は、母液からＣＣＩ−７７９を回収する方法を提供する。この方法は、母液からＣＣＩ−７７９を回収する方法であって、（ａ）母液を濃縮する工程；（ｂ）母液の濃縮によって得られたＣＣＩ−７７９を、約５〜約５．５のｐＨを有するｐＨ調整緩衝液での処理に付す工程；（ｃ）混合物を溶媒抽出に付す工程；（ｄ）得られた有機相を乾燥し、濃縮する工程；および（ｅ）ＣＣＩ−７７９を再結晶する工程を含む。別の実施形態において、工程（ｅ）から得た母液を使用して、工程（ａ）から（ｄ）を繰り返す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
母液からＣＣＩ−７７９を回収する方法であって、
（ａ）母液を濃縮する工程；
（ｂ）母液の濃縮によって得られたＣＣＩ−７７９を、約５〜約５．５のｐＨを有するｐＨ調整緩衝液での処理に付す工程；
（ｃ）混合物を溶媒抽出に付す工程；
（ｄ）得られた有機相を乾燥し、濃縮する工程；および
（ｅ）ＣＣＩ−７７９を再結晶する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｅ）から得た母液を使用して、工程（ａ）から（ｄ）を繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
最終合計収率が９５％を超える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
最終合計収率が９８％を超える、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ調整緩衝液が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムまたは酢酸亜鉛を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｐＨ調整緩衝液が、酢酸ナトリウムを含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｐＨ調整緩衝液を、溶媒としてのアセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルまたは酢酸と共に使用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨ調整緩衝液を、溶媒としてのアセトンと共に使用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
エーテルを再結晶に使用する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、エーテルとヘキサンもしくはヘプタンとの混合物、またはｔ−ブチルメチルエーテルとヘキサンもしくはヘプタンとの混合物を、再結晶用の溶媒として使用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
溶媒がジエチルエーテルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｆ）ＣＣＩ−７７９を析出させる工程；および
（ｇ）ＣＣＩ−７７９を減圧乾燥させる工程
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生成されたＣＣＩ−７７９が、３０：１より大きいＢ：Ｃ異性体比を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
生成されたＣＣＩ−７７９が、４５：１より大きいＢ：Ｃ異性体比を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
酢酸エチルを、溶媒抽出用の溶媒として使用する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、母液からのＣＣＩ−７７９の回収に関する。
ＣＣＩ−７７９（３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル）はラパマイシンのエステルであり、これはインビトロおよびインビボモデルの両方において腫瘍成長に有意な阻害作用を示す。ＣＣＩ−７７９は、細胞質タンパク質ＦＫＢＰに結合して複合体を形成し、これは、酵素ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的；ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン関連タンパク質［ＦＲＡＰ］としても公知）を阻害する。ｍＴＯＲのキナーゼ活性の阻害は、サイトカイン刺激細胞増殖、細胞周期のＧ１期を調節するいくつかの主要タンパク質のｍＲＮＡの翻訳、およびＩＬ−２−誘発転写を含む種々のシグナル伝達経路を阻害して、Ｇ１からＳへの細胞周期の進行の阻害を生じる。ＣＣＩ−７７９は、中枢神経系癌、白血病、乳癌、前立腺癌、メラノーマ、グリオーマおよびグリオブラストーマの阻害を含む多くの適用において、有効であることが示されている。
【背景技術】
【０００２】
ＣＣＩ−７７９を含むラパマイシンのヒドロキシエステルの生成および使用は、米国特許第５，３６２，７１８号に開示されている。ＣＣＩ−７７９の位置選択的合成は、米国特許第６，２７７，９８３号に開示されている。しかし、得られるＣＣＩ−７７９の収率は７０〜８０％にすぎない。他の位置選択的合成が、米国特許出願公開第２００５−００３３０４６Ａ１号に開示されている。臨床用途に使用される結晶性生成物を得るために、ＣＣＩ−７７９の再結晶が必要である。
【特許文献１】米国特許第５，３６２，７１８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２７７，９８３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５−００３３０４６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
必要とされるのは、ＣＣＩ−７７９結晶化の副生成物として得られる母液から、付加的結晶性ＣＣＩ−７７９を回収する方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、母液からのＣＣＩ−７７９の回収法を提供する。該方法は、母液を濃縮し、濃縮ＣＣＩ−７７９を緩衝剤で処理し、有機相を乾燥し、濃縮し、好ましくはエーテルから、ＣＣＩ−７７９を再結晶することを含む。
【０００５】
他の実施形態において、付加的収量を得るために、該方法から得られた母液を、該方法に使用する。他の実施形態において、該方法を多数回繰り返す。
【０００６】
本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、母液からＣＣＩ−７７９を回収する新規方法を提供する。
【０００８】
ＣＣＩ−７７９（３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル）は、下記の反応式２に示す２つの異性体の形態で存在しうる。本発明によって母液から回収されたＣＣＩ−７７９は、約９５ｗｔ％のＣＣＩ−７７９異性体Ｂ、および約３ｗｔ％の異性体Ｃを一般に含有する。
【０００９】
本明細書において使用される「合計収量または合計総収量」は、従来法による初期再結晶を含む全ての再結晶工程から回収されたＣＣＩ−７７９、および本発明の方法によって母液から回収されたＣＣＩ−７７９の総量を意味する。
【００１０】
一実施形態において、ＣＣＩ−７７９は、米国特許第５，３６２，７１８号に開示のように調製される。他の実施形態において、ＣＣＩ−７７９は、米国特許出願公開第ＵＳ２００５−００３３０４６Ａ１号に開示のように調製される。
【００１１】
他の実施形態において、ＣＣＩ−７７９は、２，２，５−トリメチル［１．３−ジオキサン］−５−カルボン酸とのラパマイシン４２−エステルの酸加水分解から得られる。一実施形態において、硫酸を使用してこれを行い、次に、シリカゲルクロマトグラフィーに付す。酸加水分解は、米国特許第６，２７７，９８３号（Shawら）に開示されている。本明細書に示す反応式１は、加水分解工程の概略を示している。加水分解後に、従来法によって再結晶を行う。一実施形態において、エーテルを用いて再結晶を行う。一般に、再結晶から得られたＣＣＩ−７７９は、Ｂ：Ｃ異性体比約３０：１〜約３５：１、収率約７０％〜約８０％、または約７２％〜約７６％を有する。一実施形態において、再結晶から得られたＣＣＩ−７７９は、Ｂ：Ｃ異性体比約３２：１、収率約７４％を有する。
【化１】
2008531685.tif 000002
【００１２】
再結晶工程の副生成物は、付加的ＣＣＩ−７７９を含有する母液である。一般に、母液に存在するＣＣＩ−７７９の量は、再結晶後の生成物の２０％またはそれ以上である。一実施形態において、ＣＣＩ−７７９生成物の２５〜２６％が、母液に存在する。さらに、これらの母液中のＣＣＩ−７７９は、ＣＣＩ−７７９に一般に見られるより高い比率のＣＣＩ−７７９異性体Ｃを含有し、即ち、より低いＢ：Ｃ比を有する。一実施形態において、母液におけるＢ：Ｃ異性体比は、約１．５：１〜３：１、約１．５：１〜２．５：１、約２：１または約１．６：１である。
【００１３】
結晶性ＣＣＩ−７７９と対比して、母液におけるより高い比率の異性体Ｃの存在は、結晶化溶媒における異性体Ｃのより高い溶解性を示している。理論に縛られるものではないが、異性体Ｃは異性体Ｂより低い結晶性であり、それによって母液中の異性体Ｃの存在が増加すると考えられる。本出願人は、母液からの付加的収量を回収するために、ｐＨの調整によって、異性体比を増加しうることを見出した。本明細書における反応式２は、所望の異性体シフトを示している。
【化２】
2008531685.tif 000003
【００１４】
前記のようにＣＣＩ−７７９の結晶化から得られた母液を、先ず、減圧下に濃縮する。得られた泡状物を、緩衝系、即ち、ｐＨ調整緩衝剤（緩衝液）および溶媒と合わせる。一実施形態において、緩衝液のｐＨは約５〜６．５である。他の実施形態において、緩衝液のｐＨは約５〜５．５である。
【００１５】
一実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウムを含有する。他の実施形態において、緩衝液は、酢酸カリウムまたは酢酸亜鉛を含有する。さらに他の実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムおよび／または酢酸亜鉛の混合物を含有する。一実施形態において、溶媒は有機溶媒である。さらなる実施形態において、有機溶媒はアセトンである。さらに他の実施形態において、有機溶媒は、テトラヒドロフラン、アセトニトリルまたは酢酸である。他の実施形態において、溶媒は、溶媒の混合物、例えば、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルおよび対または酢酸の混合物である。一実施形態において、溶媒／緩衝液の容量比は、１．５〜１．１：１．０である。他の実施形態において、該容量比は１．１：１．０である。ｐＨを調整するために、他の緩衝系、緩衝液、溶媒および容量比が、本発明によって考えられ、かつ当業者に公知である。
【００１６】
母液からの残留泡状物および緩衝系（即ち、緩衝液および溶媒）の溶液を混合する。一実施形態において、溶液を窒素下に約２０〜２５℃の温度で２４時間混合する。他の実施形態において、溶液を４８時間混合物する。異性体Ｂ対異性体Ｃの比率を最大にするために、時間を調節しうる。他の実施形態において、例えばＨＰＬＣによって、混合の際に比率を監視する。
【００１７】
混合後、生成物を従来手段によって分離する。一実施形態において、混合物を酢酸エチルで希釈し、ブライン溶液で洗浄する。次に、有機相（または合わせた有機相）を水およびブラインで洗浄する。次に、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、泡状物を得る。生成物を分離する他の方法は、当業者に公知であり、本発明に使用しうる。生成物の分離方法は、有機相を形成するために有機媒体の添加を含む。分離後、泡状物を、従来法、例えば析出によって、再結晶する。一実施形態において、泡状物をエーテルから再結晶する。他の実施形態において、エーテルは、ジエチルエーテルまたはｔ−ブチルメチルエーテルである。再結晶用の溶媒として、アセトニトリル、エーテルとヘキサンまたはヘプタンとの混合物、ｔ−ブチルメチルエーテルとヘキサンまたはヘプタンとの混合物も使用しうる。さらに他の実施形態において、エーテルはジエチルエーテルである。一実施形態において、析出ＣＣＩ−７７９を、例えば真空下に従来法によって、乾燥しうる。
【００１８】
一実施形態において、再結晶ＣＣＩ−７７９は、約３０：１より大きいＢ：Ｃ異性体比を有する。他の実施形態において、再結晶ＣＣＩ−７７９は、約４５：１、または約４９：１、またはそれ以上の、Ｂ：Ｃ異性体比を有する。さらに他の実施形態において、再結晶ＣＣＩ−７７９は、約５５：１、または約５７：１、またはそれ以上の、Ｂ：Ｃ異性体比を有する。
【００１９】
他の実施形態において、ＣＣＩ−７７９の所望の総収量を得るために、該方法から得た母液を使用して該方法を繰り返す。一実施形態において、本発明の方法によって得られる合計総収量は、約９０％、または約９５％、またはそれ以上である。他の実施形態において、合計総収量は、約９８％またはそれ以上である。下記の反応式３は該方法を示している。
【化３】
2008531685.tif 000004
【００２０】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
母液からのＣＣＩ−７７９の回収
適切な容器に、４００ｍｌの水、次に、５．５ｇの酢酸ナトリウムを添加することにより酢酸緩衝液（ｐＨ５〜５．５）を調製し、撹拌して、溶液を形成した。この溶液に、０．０５Ｍ 酢酸（３００ｍｌ）を添加し、撹拌して、酢酸緩衝液（ｐＨ５〜５．５）を形成した。２Ｌのフラスコに、６００ｍｌのアセトン、次に、５４５ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５〜５．５）を装填した。混合物を撹拌して、均質溶液を、１．１：１のアセトン−酢酸緩衝液（ｐＨ５〜５．５）として形成する。
【００２２】
５００ｇのＣＣＩ−７７９母液（ジエチルエーテル溶媒）（分析物は、異性体比Ｂ：Ｃ＝１．６：１を有する７．９％のＣＣＩ−７７９を含有していた）を、１Ｌのフラスコに装填した。母液を減圧濃縮して、４９．８５ｇの生成物を泡状物として得た。泡状物を７５０ｍｌの１．１：１のアセトン−酢酸緩衝液に溶解させ、窒素下に２０〜２５℃で少なくとも２４時間混合し、その間、反応の進行をＨＰＬＣで監視した。１日後、ワークアップ試料のＢ：Ｃの比率は８．１：１であり、４８時間後に９：１であった。２つの異性体の比率は４８時間後に同じに維持された。
【００２３】
反応混合物を、１２００ｍｌの酢酸エチルで希釈し、３００ｍｌのブラインで洗浄した。水性相を分離し、３００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、水（３００ｍｌ）およびブライン（３００ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次に、減圧濃縮して、４５．４５ｇの生成物を淡黄色泡状物として得た。泡状物をエーテル（１８０ｍｌ）から再結晶した。生成物を真空炉において５０〜５５℃で一定量まで乾燥して、２２．５ｇの生成物を白色結晶性固形物として得、それは純度９３．２％（異性体Ｂ＋Ｃ）および異性体比Ｂ：Ｃ＝５７：１を有していた。回収率は５７％であった。
【００２４】
母液を減圧濃縮して、１９．５ｇの生成物を淡黄色泡状物として得、それはＢ：Ｃ異性体比〜約３．３：１を有していた。泡状物を３００ｍｌのアセトン−酢酸緩衝液で２０〜２５℃で４８時間処理した。反応混合物を４５０ｍｌの酢酸エチルで希釈し、１５０ｍｌのブラインで洗浄した。水性相を分離し、１５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、水（２００ｍｌ）、ブライン（２００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧濃縮した後、１７．２４ｇの生成物を淡黄色泡状物として得、それはＢ：Ｃ異性体比９：１を有していた。工程サイクルに記載のように、この物質をエーテルから再結晶して、さらに結晶性ＣＣＩ−７７９を得ることができる。
【００２５】
本明細書で特定された全ての特許、刊行物および他の文献は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、本発明から逸脱せずに、本明細書に開示した特定実施形態に記載されている条件および方法に軽微な変更を加えうることを認識する。そのような軽微な変更および変形は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内である。
【国際調査報告】
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