(57)【要約】  本発明は、蛋白質結合性基を含有しそしてＰＳＡによって切断され得るペプチド配列を含む、低分子量アントラサイクリンペプチド誘導体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのアントラサイクリン−ペプチド誘導体：
【化１】
2008531617.tif 000014
式中、
Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ３；
Ｒ２＝ＨまたはＯＨ；
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；
Ｐ１−Ｐ１０は、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるＰＳＡにより切断可能なペプチド配列であり；そして
ＰＭは、蛋白質結合性基である。
【請求項２】
前記アントラサイクリン成分が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、４’−エピルビシン、イダルビシン、またはカルビシン（carubicin）である、請求項１に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項３】
前記アントラサイクリン成分がドキソルビシンであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項４】
ＰＭが、必要に応じて置換され得る、マレインイミド基（maleinimide group）、２−ジチオピリジル基、ハロゲンアセトアミド基、ハロゲンアセテート基、ジスルフィド基、アクリル酸エステル基、モノアルキルマレイン酸エステル基（monoalkyl maleicacid ester group）、モノアルキルマレアミニックアシッドアミド基（monoalkyl maleaminic acid amide group）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、イソチオシアネート基、またはアジリジン基である、請求項１に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項５】
ＰＭが、必要に応じて置換され得る、マレインイミド基である、請求項２に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項６】
ｎ＜２およびｍ＝２〜５、ならびにｎ＝４およびｍ＝０であることを特徴とする、請求項１、４または５の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体
【請求項７】
ｎ＝４およびｍ＝０であることを特徴とする、前記請求項の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項８】
前記ペプチド配列（Ｐ１−Ｐ１０）におけるＰ１が、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓである、請求項１に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項９】
前記ペプチド配列におけるＰ１がＡｒｇである、請求項１または請求項７に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項１０】
前記ペプチド配列におけるＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６が、同一であるかまたは異なり、そしてＳｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＰｈｅを表す、前記請求項の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項１１】
前記ペプチド配列におけるＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６が、同一であるかまたは異なり、そしてＳｅｒまたはＴｙｒを表す、前記請求項の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項１２】
前記ペプチド配列Ｐ１−Ｐ１０が、６、７、または８個のアミノ酸を含むことを特徴とする、前記請求項の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項１３】
前記ペプチド配列が、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ、またはＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇであることを特徴とする、前記請求項の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項１４】
前記ペプチド配列がＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇであることを特徴とする、前記請求項の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体。
【請求項１５】
前記請求項の１項に記載のドキソルビシン−ペプチド誘導体の製造方法であって、ドキソルビシンと、一般式ＩＩのペプチド誘導体：
【化２】
2008531617.tif 000015
（式中、
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；
Ｐ１−Ｐ１０は、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるペプチド配列であり；そして
ＰＭは、蛋白質結合性基である）
とを、カルボン酸活性化試薬の存在下で反応させることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
ＰＭがマレインイミド基であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記請求項の１項に記載のドキソルビシン−ペプチド誘導体の製造方法であって、ドキソルビシンと、一般式ＩＩＩのペプチド：
【化３】
2008531617.tif 000016
（式中、
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；
Ｐ３−Ｐ１０は、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるペプチド配列であり；そして
ＰＭは、蛋白質結合性基である）
とを、カルボン酸活性化試薬の存在下で反応させることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
ＰＭがマレインイミド基であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記カルボン酸活性化試薬が、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジノ−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、または（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、好ましくはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドから選択されることを特徴とする、請求項１４〜１７の１項に記載の方法。
【請求項２０】
有効成分としての請求項１〜１４の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体、ならびに必要に応じて従来の薬学的補助剤および／または溶媒を含むことを特徴とする、薬物。
【請求項２１】
癌疾患の治療のための、請求項１〜１４の１項に記載のアントラサイクリン−ペプチド誘導体の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１４の１項に記載の化合物を、治療的に適合性である溶液に変換することを特徴とする、癌疾患の治療のための薬物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって切断され得る低分子アントラサイクリンペプチド誘導体、それらの製造、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アントラサイクリンは、種々の癌疾患を治療するために使用される、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびエピルビシン等の、広く使用されている抗新生物性活性薬剤のグループである。しかし、アントラサイクリンでの悪性疾患の化学療法的治療は、これらの有効成分の限定された治療範囲の結果として、副作用を伴う（Dorr R. T., Von Hoff D. D.: “Cancer Chemotherapy Handbook”, 2ndedition, Appleton and Lange, Norwalk, 1994; Myers C.E., Chabner, B. A.: Anthracyclines. In: “Cancer Chemotherapy - Principles and Practice”, Lippincott, Philadelphia; Chabner, B. A., Collins, J. M. eds., 1990, pp. 356-381）。特定のプロドラッグを使用して、罹患組織への結合化有効成分の有効な輸送を達成し、そしてまた、悪性組織の特定の生化学的および生理学的特徴の結果としての標的位置での該有効成分の有効かつ非常に特異的な放出を達成することが可能であることは、公知である。アントラサイクリンまたはアントラサイクリン誘導体の副作用プロフィールおよび効力を改善するために、蛋白質結合性製剤が開発され、これは、インビボで内因性血清蛋白質（特に、アルブミン）へ結合し、そして従って有効成分の巨大分子輸送形態を提供する（Kratz et al., J. Med. Chem., 2002, 45, 5523; Mansour et al., Cancer Res. 2003, 63, 4062）。
【０００３】
さらに、ＰＳＡは、悪性腫瘍中のプロテアーゼとして同定された（Levesque, M., Yu, H., D’Costa, M., & Diamandis, E., . J. Clin. Lab. Anal., 1995, 9, 123-128）。高濃度のＰＳＡが、特に乳房組織および前立腺組織において検出され得る。
【０００４】
ＰＳＡ（分子量約３３ｋＤａ）はカリクレインの蛋白質ファミリーに属し、セリンプロテアーゼとしてキモトリプシンのそれに類似する基質特異性を示す。精液のゲル形成蛋白質セメノゲリン（semenogelin）ＩおよびＩＩは、ＰＳＡについての主要な基質である。ＰＳＡは、プロ酵素として前立腺細胞によって合成され分泌される。身体の他の細胞は、非常に少量しかＰＳＡを分泌しない（Yousef, G. M., Diamandis, E. P.: Endocr. Rev., 2001, 22, 184-204）。
【０００５】
大量のＰＳＡが、転移性前立腺癌の症例において発現され、その結果、局所濃度はｍｇ／ｍＬ範囲の高値を有する。ＰＳＡは細胞外空間で活性化され、そこで酵素効果を発する。しかし、血漿中では、ＰＳＡは、α１−抗キモトリプシンおよびα２−マクログロブリンに強く結合し、そしてその結果、酵素活性を有さない。これらの理由のため、ＰＳＡは、腫瘍関連プロテアーゼとして、ＰＳＡ陽性前立腺腫瘍の有効な治療へのプロドラッグ・アプローチについての非常に好適な候補である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明の基礎をなす目的は、静脈内投与後に、循環アルブミンへ共有結合し、そして腫瘍組織においてＰＳＡにより切断されて有効成分を放出する、アントラサイクリンの誘導体を作製することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、以下の一般式の低分子アントラサイクリン−ペプチド誘導体によって、本発明に従って達成される：
【０００８】
【化１】
2008531617.tif 000002
式中、
Ｒ１＝Ｈ、ＯＣＨ３、またはＯＨ；
Ｒ２＝ＨまたはＯＨ；
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；
Ｐ１−Ｐ１０は、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるペプチド配列であり；そして
ＰＭは、蛋白質結合性基である。
【０００９】
本発明の化合物は、アントラサイクリン有効成分、ペプチドスペーサー、およびヘテロ二官能性架橋剤から構成される。この構造体を、以下にさらに詳細に説明する。
【００１０】
発明の詳細な説明
抗腫瘍性効果を有するアントラサイクリン成分は、以下の一般式で表される有効成分である：
【００１１】
【化２】
2008531617.tif 000003
式中、
Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ３；そして
Ｒ２＝ＨまたはＯＨ。
【００１２】
好ましい有効成分は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、４’−エピルビシン、イダルビシン、またはカルビシン（carubicin）である。
【００１３】
特に好ましい有効成分は、ドキソルビシンである。
【００１４】
ヘテロ二官能性架橋剤は、以下の一般式で表される、蛋白質結合性基を有するカルボン酸誘導体である：
【００１５】
【化３】
2008531617.tif 000004
式中、
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；そして
ＰＭ＝蛋白質結合性基。
【００１６】
ｎ＜２およびｍ＝２〜５ならびにｎ＝４およびｍ＝０を有するヘテロ二官能性架橋剤を使用することが好ましい。オキシエチレン単位は、特にｍについてより大きな値で、水中における高い溶解性を保証する。
【００１７】
ｎ＝４およびｍ＝０の値が、特に好ましい。
【００１８】
蛋白質結合性基（ＰＭ）は、２−ジチオピリジル基、ハロゲンアセトアミド基、ハロゲンアセテート基、ジスルフィド基、アクリル酸エステル基、モノアルキルマレイン酸エステル基（monoalkyl maleicacid ester group）、モノアルキルマレアミニックアシッドアミド基（monoalkyl maleaminic acid amide group）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、イソチオシアネート基、アジリジン基、またはマレインイミド基（maleinimide group）から好ましくは選択される。マレインイミド基は、特に好ましい蛋白質結合性基である。
【００１９】
ペプチドスペーサーは、ＰＳＡによって切断される、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるペプチド配列Ｐ１−Ｐ１０であり、式中、Ｐ１は、アミノ酸Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓであり得る。Ｐ１について好ましいアミノ酸は、Ａｒｇである。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６についての好ましいアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＰｈｅ、最も好ましくはＳｅｒおよびＴｙｒである。
【００２０】
好ましいペプチドスペーサーは、６、７、または８個のアミノ酸からなる。
【００２１】
好ましい配列は、以下である：
【００２２】
【表１】
2008531617.tif 000005
特に好ましい配列は、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇである。
【００２３】
本発明のアントラサイクリンペプチド誘導体は、アントラサイクリン有効成分（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、カルビシン、またはイダルビシン）と、以下の一般式によって表されるペプチド誘導体：
【００２４】
【化４】
2008531617.tif 000006
（式中、
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；
Ｐ１−Ｐ１０は、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるペプチド配列であり；そして
ＰＭは、蛋白質結合性基である）
とを、該ペプチド誘導体のＰ１の活性化カルボキシル基と該有効成分のアミノ基との縮合により、反応させることによって、有効に作製される。
【００２５】
本発明のアントラサイクリンペプチド誘導体はまた、以下の一般式で表されるアントラサイクリンジペプチド：
【００２６】
【化５】
2008531617.tif 000007
と、以下の一般式で表されるペプチド誘導体：
【００２７】
【化６】
2008531617.tif 000008
（式中、
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；
Ｐ３−Ｐ１０は、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるペプチド配列であり；そして
ＰＭは、蛋白質結合性基である）
とを、該ペプチド誘導体のＰ３の活性化カルボキシル基と該アントラサイクリンジペプチドのアミノ基との縮合により、反応させることによって、有効に作製され得る。
【００２８】
本発明のアントラサイクリンペプチド誘導体はまた、以下の一般式で表されるアントラサイクリン−アミノ酸誘導体：
【００２９】
【化７】
2008531617.tif 000009
と、以下の一般式で表されるペプチド誘導体：
【００３０】
【化８】
2008531617.tif 000010
（式中、
ｍ＝０〜５；
ｎ＝０〜６；
Ｐ２−Ｐ１０は、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸からなるペプチド配列であり；そして
ＰＭは、蛋白質結合性基である）
とを、該ペプチド誘導体のＰ２の活性化カルボキシル基と該アントラサイクリン−アミノ酸誘導体のアミノ基との縮合により、反応させることによって、有効に作製され得る。
【００３１】
前記ペプチド誘導体のＣ末端を活性化するために、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジノ−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、または２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージドを、標準的な触媒または補助塩基（例えば、トリアルキルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、もしくはヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））の添加を伴って、使用することが好ましい。反応は、極性非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＡ、またはＤＭＳＯ）中、−２０℃〜４０℃の温度で、好ましくは０〜５℃で、有効に行われ、ここで、反応時間は、通常、１〜１２０時間、好ましくは２４〜９６時間である。生成物は、結晶化、シリカゲルにおけるクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、単離され得る。
【００３２】
本発明の蛋白質結合性アントラサイクリン−ペプチド誘導体は、非経口的に、好ましくは静脈内に投与される。この目的のために、本発明のアントラサイクリン−ペプチド誘導体は、必要に応じて従来の補助材料を使用して、溶液、固体、または凍結乾燥物として利用可能にされる。このような補助材料としては、例えば、ポリソルベート、グルコース、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストラン、クエン酸、トロメタモール、トリエタノールアミン、アミノ酢酸、および／または合成ポリマーが挙げられる。本発明のアントラサイクリン−ペプチド誘導体は、好ましくは、２．０〜８．０、好ましくはｐＨ５．０〜７．０のｐＨ範囲の等張緩衝液中に溶解されそして投与される。結果として、本発明のアントラサイクリン−ペプチド誘導体は、前記架橋剤中のオキシエチレン単位のためおよび／または前記ペプチド配列への極性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、またはＬｙｓ）の組み込みのために、水中における十分な溶解性を有する。アントラサイクリン−ペプチド誘導体の溶解性は、薬学的溶媒、例えば、１，２−プロパンジオール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、および／または２００〜６００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリエチレングリコール、好ましくは６００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリエチレングリコール、ならびに／あるいは可溶化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ、またはポリビニルピロリドンを添加することによって、必要に応じて改善され得る。
【００３３】
本発明のアントラサイクリン−ペプチド誘導体の必須の特徴は、蛋白質結合性基を介しての血清蛋白質へのそれらの迅速な共有結合化であり、この結果として、該有効成分の巨大分子輸送形態が形成される。腫瘍組織は、増加した量の血清蛋白質（例えば、トランスフェリンおよびアルブミン）を取り込む（takes up）ことが知られており（Kratz F., Beyer U: Drug Delivery, 1998, 5, 281-299）、このことは、それらが、細胞増殖抑制剤についてのいわゆる「内因性担体」として、本発明の範囲内において使用され得ることを意味する。特に好ましい血清蛋白質は、循環ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり、これは、３０〜５０ｇ／Ｌの平均濃度を有し、そして従って、ヒト血液の主要な蛋白質成分である（Peters T, Advantage. Protein Chem., 1985, 37, 161-245）。チオール結合性基（例えば、マレインイミドおよびジスルフィド）の結合のための結合部位として好適である（ＷＯ  ００／７６５５１）、遊離のシステイン基（システイン−３４基）が、この蛋白質の表面上に存在する。アントラサイクリン−ペプチド誘導体と血清蛋白質との反応はまた、例えば、注射に意図されるある量のアルブミン、血液、または血清を用いて、体外で行われ得る。
【００３４】
蛋白質結合されたアントラサイクリン−ペプチド誘導体の生体内分布は、遊離の有効成分のそれとは異なる。それらの巨大分子特徴の結果として、それは腫瘍組織中に蓄積し、そしてそれが腫瘍組織中においてＰＳＡによって切断されると、低分子アントラサイクリン−ペプチドが放出され、次いで、これは抗腫瘍効果を発することができる（図１、３、４、および５を参照のこと）。アントラサイクリン−ペプチドはまた、腫瘍組織中において元のアントラサイクリンへと切断されて戻され得る（図２を参照のこと）。動物実験研究において、蛋白質結合性ドキソルビシンペプチド誘導体は、非常に良好な抗腫瘍効果を示した（実施例１を参照のこと）。
【００３５】
以下の実施例は、図面と共に、さらに詳細に本発明を説明する。
【実施例】
【００３６】
実施例１
Ｄｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒを有するＥＭＣ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｄｏｘｏ（化合物１を参照のこと）の合成
【００３７】
【化９】
2008531617.tif 000011
１．ドキソルビシン−Ａｒｇの合成
２００ｍｇ（０．３４４８ｍｍｏｌ）の塩酸ドキソルビシ、３０５ｍｇ（０．７７ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、および０．０００３１ｍｇ、２００μＬ（３１．５ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを、２５ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。溶液を２５℃（ＲＴ）で５分間撹拌し、次いで、１５７．３ｍｇ（０．４１３８ｍｍｏｌ、１．２当量）のＨＡＴＵをカップリング試薬として添加した。次いで、混合物を２５℃（ＲＴ）で２時間撹拌した。生成物を１，０００ｍＬのジエチルエーテルで沈殿させ、沈殿物をジエチルエーテルで３回洗浄し、そして真空下で乾燥した。該サンプルをＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液５ｍＬで処理することによって、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。５分の反応時間後、生成物を、２５０ｍＬのジエチルエーテルで沈殿させ、そして２０ｍＬのエーテルで３回洗浄した。次いで、クロロホルム／メタノール  ３：１  ＋０．１％ＴＦＡ、クロロホルム／メタノール  ２：１  ＋０．１％ＴＦＡ、そしてメタノール＋０．１％ＴＦＡを移動相としてその順序で使用して、前記生成物を、ジオールカラム、即ち、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＤＩＯＬ（４０−６３μｍ）において精製した。（前記サンプルは、移動相中で可溶となるように、最初に０．５％のＴＦＡと混合されなければならない。）生成物を含有するフラクションを回収し、ジエチルエーテルで沈殿させ、そして高真空下で乾燥させ、この結果として、３２２．５ｍｇの目標化合物が、赤色粉末として得られた。質量（ＥＳＩ：２．５ｋＶ，Ｍｒ  ６９９．７）：ｍ／ｚ  ７００．２［Ｍ＋Ｈ］＋，７２２．２［Ｍ＋ＮＡ］＋，ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：＞９８％。
【００３８】
２．ドキソルビシン−Ａｒｇ−Ｓｅｒの合成：
３９０ｍｇ（０．５５８ｍｍｏｌ）のＤｏｘｏ−Ａｒｇ−ＯＨ、３９０．５２ｍｇ（１．１９３ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、および４９．９７ｍｇ、４２６μＬ（２．５１２ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを、２２ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、そして２５℃（ＲＴ）で５分間撹拌した。３１８．２４ｍｇ（０．８３７ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵをカップリング試薬として添加し、次いで溶液を２５℃で２時間撹拌した。次いで、生成物を１，０００ｍＬのジエチルエーテルで沈殿させ、そしてこのようにして得られた沈殿物を２０ｍＬのジエチルエーテルで３回洗浄し、そして真空下で乾燥させた。生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール  ５：１  ＋０．１％トリフルオロ酢酸）により精製した後、該サンプルをＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液で処理することによって、前記保護基を除去した。５分の反応時間後、生成物を５０倍量のジエチルエーテルで沈殿させ、そしてエーテルで３回洗浄した。次いで、沈殿物を高真空下で乾燥し、この結果、１８６．３ｍｇのＤｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒが得られた。質量（ＥＳＩ：３ｋＶ，Ｍｒ  ７８７．２）：ｍ／ｚ  ７８８．２［Ｍ＋Ｈ］＋，ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：＞９５％。
【００３９】
３．ＥＭＣ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｄｏｘｏ（化合物１を参照のこと）の合成
１０ｍＬの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、１２８ｍｇ（０．１６３ｍｍｏｌ）のドキソルビシン−Ａｒｇ−Ｓｅｒ、１５９．３３ｍｇ（０．１８４ｍｍｏｌ）のＥＭＣ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＯＨ（ＥＭＣ＝マレインイミドカプロン酸（maleinimidocaproicacid））、６５．８７ｍｇ（０．４８７ｍｍｏｌ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、および７０．８６μＬ（６５．２１ｍｇ、０．６４３ｍｍｏｌ）の４−メチルモルホリンを、＋５℃で１５分間撹拌した。１５０．６８μＬ（１２３．０７ｍｇ、０．９７５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、該混合物を＋５℃で７２時間撹拌した。次いで、生成物を５０倍量のジエチルエーテル（５００ｍＬ）で沈殿させ、そして上澄みジエチルエーテルをデカントした。沈殿物を３×２０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄し、そして真空下で乾燥させた。生成物を、ＭｅＯＨ／水  ３：１に溶解し、そしてメタノールを用いてＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  ＬＨ−２０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）においてサイズ排除クロマトグラフィーを２回実行することによって精製した。得られたフラクションから溶媒を真空下で除去し、この後、高真空下でアセトニトリル／水  ５０：５０を用いて凍結乾燥を行った。結果として、１５２ｍｇの化合物１が赤色粉末として得られた。質量（ＬＣ−ＭＳ−ｐｏｓ．ＥＳＩ．１．５ｋＶ，Ｍｒ  １６３６．５）：ｍ／ｚ  １６３７．５［Ｍ＋Ｈ］＋，１７４９．７［Ｍ＋＋ＣＦ３ＣＯＯ−］，１７５０．７［Ｍ＋＋ＣＦ３ＣＯＯ−Ｈ＋］，ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：＞９５％。
【００４０】
実施例２
ＰＳＡによる化合物１のアルブミン結合化形態の酵素切断
化合物１のアルブミン結合体の作製
１．８ｍｇの化合物１を、１ｍＬの市販のヒト血清アルブミンと共に、３７℃で１時間時間インキュベートした。得られたアルブミン結合体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）ＨＲ１００；緩衝液  ０．００４Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム；ｐＨ６．５）。
【００４１】
化合物１のアルブミン結合化形態［２００μＭ］をヒト前立腺特異的抗原（５０μｇ／ｍＬ）と共に３７℃でインキュベートし、そして４９５ｎｍで、図１に示される時間で、勾配溶離（流量：１．２〜１．８ｍＬ／分；  溶離剤Ａ：２２％アセトニトリル、７８％４ｍｍｏｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）；  溶離剤Ｂ：３０％４ｍｍｏｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、７０％アセトニトリル；  勾配：０〜２５分、１００％移動相Ａ；２５〜４０分、７０％アセトニトリル、３０％４ｍＭ酢酸ナトリウムへ；４０〜５０分、７０％ＣＨ３ＣＮ、３０％４ｍＭ酢酸ナトリウム；５０〜６０分、１００％移動相Ａ）によって、Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）３００−５  ４．６×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ製）におけるクロマトグラフィーによって検出した。注入量：５０μＬ。
【００４２】
化合物１のアルブミン結合体およびヒトＰＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＦＲＧ）で行った、インキュベーション研究により、ドキソルビシン−ジペプチドＤｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒが放出されたことが確認された（図１）。
【００４３】
これは、腫瘍組織（ＣＷＲ２２組織ホモジネート）中において、ドキソルビシンへ切断される（図２を参照のこと）。
【００４４】
実施例３
ＰＳＡ陽性前立腺癌ＣＷＲ２２でのドキソルビシン−ジペプチドＤｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒの切断研究
ｐＨ７．４でのＣＷＲ２２組織ホモジネートと共の３７℃でのインキュベーション研究を、実施例２に記載されるように、得られたドキソルビシンジペプチド（Ｄｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）を用いて行った。アントラサイクリンの濃度は、１００μＭであった。ＨＰＬＣクロマトグラフィーを、５分、６時間、および２０時間後に、実施例２の条件下で行った。得られた結果を図２に示す。切断研究によって、ＰＳＡで切断されたドキソルビシンジペプチド（Ｄｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）は、腫瘍組織（ＣＲＷ２２）中においてドキソルビシンへ切断されるという、興味深い事実が確認された。
【００４５】
実施例４
Ｍａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｄｏｘｏ（ＰＳＡ３）（化合物２を参照のこと）の合成：
【００４６】
【化１０】
2008531617.tif 000012
５８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）の塩酸ドキソルビシン、１０２．８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＭａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−ＯＨ（Ｍａｌ＝マレインイミドトリエチレングリコール酸（maleinimidotriethylenglycolic acid））、１３．５ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、および３３μＬ（３０．３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の４−メチルモルホリンを、２０ｍＬの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中において、＋５℃で１５分間撹拌した。４６．５μＬ（３７．９ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、そして該混合物を＋５℃で９６時間撹拌した。次いで、ＤＭＦを高真空下で除去した。残渣をクロロホルム／メタノール  ３／１に溶解し、そしてクロロホルム／メタノール  ３／１を用いてシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）においてカラムクロマトグラフィーを２回実行することによって精製した。５０ｍｇの化合物２が赤色粉末として得られた。質量（ＥＳＩ−ＭＳ，Ｍｒ  １５５３．５）：ｍ／ｚ  １５７６［Ｍ＋Ｎａ］＋，ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：＞９８％。
【００４７】
実施例５
ＰＳＡによる化合物２のアルブミン結合化形態の酵素切断
化合物２のアルブミン結合体の作製
１２．１ｍｇの化合物２を、１０ｍＬの市販のヒト血清アルブミンと共に、３７℃で１時間インキュベートした。得られたアルブミン結合体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）ＨＲ１００；緩衝液、０．００４Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム  ｐＨ６．５）。
【００４８】
化合物２のアルブミン結合化形態［２００μＭ］を、３７℃でヒト前立腺特異抗原（２０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、そして４９５ｎｍで、図５に記載の時間で、勾配溶離（流量：１．２ｍＬ／分、  移動相Ａ：２７．５％ＣＨ３ＣＮ、７２．５％２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）；  移動相Ｂ：ＣＨ３ＣＮ；  勾配：０〜２５分、１００％移動相Ａ；２５〜４０分、７０％ＣＨ３ＣＮ、３０％２０ｍＭリン酸カリウムへ；４０〜５０分、７０％ＣＨ３ＣＮ、３０％２０ｍＭリン酸カリウム；５０〜６０分、１００％移動相Ａ）によって、Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）３００−５  ４．６×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ製）におけるクロマトグラフィーによって検出した。注入量：５０μＬ。
【００４９】
化合物２のアルブミン結合体およびヒトＰＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＦＲＧ）で行ったインキュベーション研究により、ドキソルビシン−ジペプチドＧｌｎ−Ｐｈｅ−Ｄｏｘｏが放出されたことが確認された（図３）。
【００５０】
実施例６
ＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘｏ（化合物３を参照のこと）の合成
【００５１】
【化１１】
2008531617.tif 000013
２０ｍＬの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、５０ｍｇ（０．０８６ｍｍｏｌ）の塩酸ドキソルビシン、１００．７ｍｇ（０．０８６ｍｍｏｌ）のＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＥＭＣ＝マレインイミドカプロン酸）、１１．６ｍｇ（０．０８６ｍｍｏｌ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、および３７．８μＬ（３７．８ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の４−メチルモルホリンを、＋５℃で１５分間撹拌した。３９．８μＬ（３２．５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを添加し、そして該混合物を＋５℃で９６時間撹拌した。次いで、該生成物を、ジエチルエーテルで沈殿させ、そして２０ｍＬのジエチルエーテルで３回洗浄した。１３０ｍｇの化合物３が、赤色粉末として得られた。質量（ＥＳＩ−ＭＳ，Ｍｒ  １６９３．７）：ｍ／ｚ  １８０７．６［Ｍ＋Ｎａ］＋，ＨＰＬＣ（４９５ｎｍ）：＞９７％。
【００５２】
化合物３は、血漿中の内因性アルブミンのシステイン−３４位へ数分内に選択的に結合する（図４を参照のこと）。
【００５３】
実施例７
ＰＳＡによる化合物３のアルブミン結合化形態の酵素切断
化合物３のアルブミン結合化形態［２００μＭ］を、３７℃でヒト前立腺特異抗原（２０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、そして４９５ｎｍで、図５に記載の時間で、実施例３の条件下でＨＰＬＣクロマトグラフィーによって検出した。注入量：５０μＬ。
【００５４】
化合物３のアルブミン結合体およびヒトＰＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＦＲＧ）で行ったインキュベーション研究により、ドキソルビシン−ジペプチドＤｏｘｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが放出されたことが確認された（図５）。
【００５５】
実施例８
ＰＳＡ陽性異種移植片モデル（ＣＷＲ２２）における化合物３のインビボ活性
構造体３で処理した［用量（ｉ．ｖ．）：第１３日および第２０日に２×１３．３μｍｏｌ／ｋｇ（＝２×８ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量）；第１３日、第２０日および第２７日に３×３９．９μｍｏｌ／ｋｇ（＝３×２４ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量）；ならびに第１３日、第２０日および第２７日に３×５９．９μｍｏｌ／ｋｇ（＝３×３６ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量）］、皮下的に増殖するＰＳＡ陽性異種移植片モデルＣＷＲ２２の腫瘍増殖の過程を図６に示す。
【００５６】
該図は、記載されている時間での相対的腫瘍体積を示す。
【００５７】
動物：無毛マウス。化合物３のストック溶液：６．０ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％Ｄ−グルコース（ｐＨ６．４）中）；  コントロール（緩衝液）：グルコース−ホスフェート緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％Ｄ−グルコース  −  ｐＨ６．４）；第１３日および第２０日。
【００５８】
図６における曲線により、化合物３は十分な抗腫瘍効果を有することが確認される。
【００５９】
実施例９
ＰＳＡ陽性異種移植片モデル（ＣＷＲ２２）における化合物１のインビボ活性
構造体１で処理した［用量（ｉ．ｖ．）：第１３日および第２０日に２×１３．３μｍｏｌ／ｋｇ（＝２×８ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量）；第１３日および第２０日に３×２６．３μｍｏｌ／ｋｇ（＝３×１６ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量）または緩衝液（コントロール）］、皮下的に増殖するＰＳＡ陽性異種移植片モデルＣＷＲ２２の腫瘍増殖の過程を図７に示す。
【００６０】
該図は、記載されている時間での相対的腫瘍体積を示す。
【００６１】
動物：無毛マウス。化合物１のストック溶液：７．４ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％Ｄ−グルコース（ｐＨ６．４）中）；  コントロール（緩衝液）：グルコース−ホスフェート緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％Ｄ−グルコース  −  ｐＨ６．４）；第１３日および第２０日。
【００６２】
図７における曲線により、化合物３は十分な抗腫瘍効果を有することが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１：ＰＳＡによる化合物１のアルブミン結合化形態の酵素切断のクロマトグラム。３７℃でのヒトＰＳＡ（５０μｇ／ｍＬ）と共のインキュベーション後の、化合物１のアルブミン結合化形態の切断研究。アントラサイクリンの濃度は、２００μＭであった。ＨＰＬＣ：ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｄｕｏ−Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ製；Ｌａｍｂｄａ  １０００  Ｍｏｎｉｔｏｒ、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ製（λ＝４９５ｎｍ）；２５４ｎｍでＵＶ検出；  カラム：Ｗａｔｅｒｓ，３００Å，Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８［４．６×２５０ｍｍ］（入口カラム（inlet column）を備える）；  流量：１．２ｍＬ／分；  移動相Ａ：２２％ＣＨ３ＣＮ、７８％４ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；  移動相Ｂ：ＣＨ３ＣＮ；  勾配：０〜２５分、１００％移動相Ａ；２５〜４５分、７０％ＣＨ３ＣＮ、３０％４ｍＭ酢酸ナトリウムへ；４０〜５０分、７０％ＣＨ３ＣＮ、３０％４ｍＭ酢酸ナトリウム；および５０〜６０分、１００％移動相Ａ。注入量：５０μＬ。
【図２】図２：ＰＳＡ陽性前立腺癌ＣＷＲ２２でのドキソルビシン−ジペプチドＤｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒの切断研究のクロマトグラム。０時間、６時間、および２０時間後の、３７℃で記録された、ＣＷＲ２２ホモジネートと共の、切断化ドキソルビシン−ジペプチド［Ｄｏｘｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ］のインキュベーション研究のクロマトグラム。アントラサイクリンの濃度は、１２５μＭであった。ＨＰＬＣ条件：図１を参照のこと。ＣＷＲ２２ホモジネート（２５０ｍｇ／１ｍＬ）は、１ｍＭモノチオグリセロールを含有する５０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＣＷＲ２２異種移植片腫瘍の均質化によって、作製された。
【図３】図３：ＰＳＡによる化合物２のアルブミン結合化形態の酵素切断のクロマトグラム。３７℃（ｐＨ７．４）で、３０分、３時間、９時間および２４時間後の、前立腺特異的抗原（２０μｇ／ｍＬ）での化合物１のアルブミン結合体の酵素切断のクロマトグラム。アントラサイクリンの濃度は、５０μＭであった。ＨＰＬＣ：ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｄｕｏ−Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ製；Ｌａｍｂｄａ  １０００  Ｍｏｎｉｔｏｒ、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ製（λ＝４９５ｎｍ）；２５４ｎｍでＵＶ検出。カラム：Ｗａｔｅｒｓ，３００Å，Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８［４．６×２５０ｍｍ］（入口カラムを備える）；  流量：１．２ｍＬ／分；  移動相Ａ：２７．５％ＣＨ３ＣＮ、７２．５％２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）；  移動相Ｂ：ＣＨ３ＣＮ；  勾配：０〜２５分、１００％移動相Ａ；２５〜４０分、７０％ＣＨ３ＣＮ、３０％２０ｍＭリン酸カリウムへ；４０〜５０分、７０％ＣＨ３ＣＮ、３０％２０ｍＭリン酸カリウム；および５０〜６０分、１００％移動相Ａ。注入量：５０μＬ。
【図４】図４：５分および９０分後の、３７℃での、ヒト血漿と共の化合物３のインキュベーション研究のクロマトグラム。５分および９０分後の、３７℃での、ヒト血漿と共の化合物３のインキュベーション研究のクロマトグラム。アントラサイクリンの濃度は、１００μＭであった。ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件：図３を参照のこと。
【図５】図５：ＰＳＡによる化合物３のアルブミン結合化形態の酵素切断のクロマトグラム。３７℃（ｐＨ７．４）での、５分、３時間、および７時間後の、前立腺特異的抗原（２０μｇ／ｍＬ）での化合物３のアルブミン結合体の酵素切断のクロマトグラム。アントラサイクリンの濃度は、１００μＭであった。ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件：図３を参照のこと。
【図６】化合物３で処理したＣＷＲ２２異種移植片モデルの腫瘍増殖のグラフ。
【図７】化合物１で処理したＣＷＲ２２異種移植片モデルの腫瘍増殖のグラフ。
【図１】
2008531617.tif 000017
【図２】
2008531617.tif 000018
【図３】
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【図４】
2008531617.tif 000020
【図５】
2008531617.tif 000021
【図６】
2008531617.tif 000022
【図７】
2008531617.tif 000023
【国際調査報告】
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2008531617.tif 000025
2008531617.tif 000026
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