(57)【要約】  本発明は、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療及び予防における、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤、例えば、ビタミンＥ、補酵素Ｑ10の誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質の使用に関する。本発明はまた、このような使用が意図される酸化防止剤を含む薬剤組成物に関する。更に本発明は、このような予防及び治療に有用な酸化防止剤を含む医薬の製造法に関する。
2008506667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝疾患及び上皮性癌の治療又は予防用の医薬の製造における、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含むことを特徴とする、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用。
【請求項２】
親油性カチオンが、トリフェニルホスホニウムカチオンである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
化合物が、下記式：
【化１】
2008506667.tif 000012
［式中、Ｘは、結合基であり、Ｚ-は、アニオンであり、そしてＲは、酸化防止剤残基である］で示される、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
酸化防止剤残基Ｒが、キノン又はキノールである、請求項３記載の使用。
【請求項５】
化合物が、下記式：
【化２】
2008506667.tif 000013
で示される、請求項４記載の使用。
【請求項６】
酸化防止剤残基Ｒが、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質である、請求項３記載の使用。
【請求項７】
グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質残基が、下記式：
【化３】
2008506667.tif 000014
で示される、請求項６記載のミトコンドリアを標的とした化合物の使用。
【請求項８】
酸化防止剤残基Ｒが、ビタミンＥ及びビタミンＥ誘導体、連鎖破壊型酸化防止剤（ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンを含む）、一般的ラジカルスカベンジャー（誘導体化フラーレンを含む）、スピントラップ剤（５，５−ジメチルピロリンＮ−オキシド、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン、及びα−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンの誘導体を含む）よりなる群から選択される、請求項３記載の使用。
【請求項９】
酸化防止剤残基Ｒが、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体である、請求項３記載の使用。
【請求項１０】
化合物が、下記式：
【化４】
2008506667.tif 000015
で示される、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
酸化防止剤残基Ｒが、ブチル化ヒドロキシアニソール又はブチル化ヒドロキシトルエンである、請求項３記載の使用。
【請求項１２】
酸化防止剤残基Ｒが、誘導体化フラーレンである、請求項３記載の使用。
【請求項１３】
酸化防止剤残基Ｒが、５，５−ジメチルピロリンＮ−オキシド、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン、α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン及びこれらの誘導体である、請求項３記載の使用。
【請求項１４】
化合物が、下記式：
【化５】
2008506667.tif 000016
で示される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
結合基Ｘが、Ｃ1〜Ｃ30炭素鎖（場合により１個以上の二重又は三重結合を含み、そして場合により１個以上の非置換又は置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル側鎖を含む）である、請求項３記載の使用。
【請求項１６】
結合基Ｘが、（ＣＨ2）n（ここで、ｎは、１〜２０の整数である）である、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
結合基Ｘが、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン又はデシレン基である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
アニオンＺ-が、薬剤学的に許容しうるアニオンである、請求項３〜１７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
Ｚ-が、ハロゲン化物である、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
Ｚ-が、臭化物である、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
Ｚ-が、アルカン−又はアリールスルホン酸のアニオンである、請求項１８記載の使用。
【請求項２２】
Ｚ-が、メタンスルホナートである、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
化合物が、下記式：
【化６】
2008506667.tif 000017
で示される、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
肝疾患が、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症、放射性肝傷害、肝癌、良性肝腫瘍及び限局性結節性過形成よりなる群から選択される疾患である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２５】
肝疾患が、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症及び放射性肝傷害よりなる群から選択される疾患である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２６】
肝疾患が、アルコール性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝疾患である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２７】
肝疾患が、アルコール性脂肪性肝炎又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２８】
肝疾患が、アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１〜２３のいずれか１項記載のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用。
【請求項２９】
肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項記載の肝疾患及び上皮性癌の治療又は予防のための、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含むことを特徴とする、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用。
【請求項３１】
肝疾患又は上皮性癌の患者を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の請求項１〜２９のいずれか１項記載の化合物を投与することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療及び予防における、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤、例えば、ビタミンＥ、補酵素Ｑ10の誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質の使用に関する。
【０００２】
背景技術
肝疾患の範囲は、軽度で可逆性の脂肪肝から、肝硬変、肝不全及び肝癌という生死にかかわる症状の発生に至る、進行性の慢性肝疾患まで様々ある。
【０００３】
慢性肝疾患の主な原因は、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルスの感染、アルコールの過剰摂取及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、世界的な公衆衛生の問題である。これは、世界中で肝硬変及び肝細胞癌（ＨＣＣ）の主要な原因である（Conjeevaram H.S.ら, 2003, Journal of Hepatology, 38: 90-103）。世界中で肝臓関連の罹患及び死亡の主な原因である、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、主要な公衆衛生問題の１つである（Alberti, A.とBenvegnu L., Journal of Hepatology 2003, 38: 104-118）。ＨＣＶ感染は、しばしば慢性肝炎を引き起こすが、これは、肝硬変及びＨＣＣの発症につながる（Cyong J.C.ら, 2002, Am J Chin Med, 28: 351-360）。
【０００５】
アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）は、西洋では肝硬変の最大の原因であり、 現在のところ、十大死因の中の１つである。米国では、ＡＬＤに少なくとも２百万人、即ち人口の約１％が罹患している。多くの患者が無症候性であり、そして診察を受けないのかもしれないため、ＡＬＤの真の発生率は、特にその軽度のものは、実質的にはもっと大きいであろう。ＡＬＤの範囲は、大酒飲みの全てではないが多くに存在する脂肪肝（脂肪症）から、脂肪性肝炎、胆汁うっ滞（肝臓からの胆汁排出の阻止を特徴とする）、線維症及び最終的には肝硬変（Stewart S.F.及びDay C.P., 2003, Journal of Hepatology, 38: 2-13）までに及ぶ。脂肪肝は、禁酒により改善可能ではあるが、飲酒を続ける患者では（特に脂肪性肝炎が存在するとき）線維症及び肝硬変への進行のリスク因子である。
【０００６】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは、単純な脂肪症から、脂肪性肝炎、胆汁うっ滞、進行性線維症及び肝硬変までの、広い範囲の肝損傷を意味する。脂肪性肝炎（非アルコール性脂肪性肝炎）は、ＮＡＦＬＤの範囲内の病期のみを表す（Anguilo P., 2002, N Engl. J. Med., 346: 1221-1231）。病理像は、アルコール誘導肝傷害のものに似ているが、アルコールを濫用していない患者に発生する。ＮＡＦＬＤは、これらの症状が明確に異なる病因と転帰を持つため、副因から生じる肝炎を伴うか又は伴わない脂肪症とは区別すべきである。脂肪肝疾患（脂肪症）のこれらの副因は、栄養（例えば、タンパク質・カロリー欠乏、飢餓、完全非経口栄養、急激な体重減少、肥満症の消化管手術）、薬物（例えば、グルココルチコイド、合成エストロゲン、アスピリン、カルシウムチャネル遮断薬、テトラサイクリン、バルプロ酸、コカイン、抗ウイルス剤、フィアルリジン（fialuridine）、インターフェロンα、メトトレキサート、ジドブジン）、代謝又は遺伝（例えば、リポジストロフィ、異常βリポタンパク血症、ウェーバー・クリスチャン（Weber-Christian）病、ガラクトース血症、糖原病、妊娠の急性脂肪肝）、並びに糖尿病、肥満症又は高脂質血症のようなその他のものである（Anguilo P., 2002, N Engl. J. Med., 346: 1221-1231；MacSween R.N.M.ら, 2002, Pathology of the Liver. 第４版 チャーチル・リビングストーン（Churchill Livingstone）, エルゼビア・サイエンス（Elsevier Science））。
【０００７】
慢性肝障害の患者数にもかかわらず、このカテゴリーの多くの障害に対する有効な治療法は存在しない。
【０００８】
種々の遺伝性及び後天性肝疾患は、肝細胞の中間径フィラメント（ＩＦ）細胞骨格の変質を伴う。最も発生頻度の高いＩＦ関連の変質の１つは、マロリー小体（ＭＢ）であり、これは、アルコール性脂肪性肝炎及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ及びＮＡＳＨ）、慢性胆汁うっ滞、銅中毒及び他の代謝性肝疾患並びにある種の肝細胞癌（ＨＣＣ）の肝細胞中で形成される。ＭＢは、主要な成分として凝集した異常折り畳みケラチン（aggregated misfolded keratin）と、更には折り畳まれていないタンパク質の応答（unfolded protein response）に関与する幾つかのタンパク質（ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、ｐ６２及びユビキチン）からなる。タンパク質の異常折り畳みは、典型的には細胞ストレス、特に酸化ストレスの状況でのタンパク質改変の結果として起こる。ＭＢの化学組成は、ケラチンが、ストレス状況における異常折り畳みの好ましい標的であること、及びＭＢが、異常折り畳みケラチンへの細胞防御応答の結果と考えられることを示す（Denkら, 2000, J. Hepatol., 32: 689-702）。
【０００９】
最も重篤な非ウイルス性慢性肝疾患である、アルコール性脂肪性肝炎及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ及びＮＡＳＨ）は、高頻度で肝硬変、肝不全及び肝癌（例えば、ＨＣＣ）に至る。ＡＳＨ及びＮＡＳＨは、診断の病理検査室では形態学的評価によって識別することができない。しかし線維症、炎症及び肝臓細胞（肝細胞）形態の変質を伴う脂肪沈着の増加は、これらのより深刻な症状を示す。ＡＳＨ及びＮＡＳＨにおける細胞変化は、サイズの増大（膨張）及び細胞内凝集体（例えば、ＭＢ）の存在を含み、そしてこの範囲の肝臓細胞病理は、これらの症状についての徴候と考えられる。
【００１０】
全体的に見て、ＡＳＨ及びＮＡＳＨには、患者での疾患の管理にあまり影響しそうもない生検による確定診断法はあるが、証明された特異的な治療法は存在しない。
【００１１】
肝癌は、工業化された西洋世界では比較的まれであるが、全世界の癌の主要な原因に入る。他の多くの型の癌とは対照的に、肝癌が進行して死に至る人の数は増加している。
【００１２】
世界的規模では、ＨＣＣのような原発性肝癌は、約百万人死亡／年を占める、最もありふれた悪性腫瘍に属する（Bruix, J.ら, 2004, Cancer Cell (5): 215-219）。
【００１３】
肝癌の主要なリスク因子は、ウイルス、アルコール摂取、アフラトキシンかびによる食品汚染及び代謝障害である。アルコール依存症と慢性Ｂ型及びＣ型肝炎の比率は上昇し続けている。したがって肝癌比率の着実な上昇の見通しは、この領域における新しい治療法に対するニーズを際立たせている。
【００１４】
原発性肝癌は、治療が難しい。癌の外科的除去及び肝臓移植は、小さい癌に限定されており、そして診断時には癌がしばしば進行期に入っているため、多くの患者には実行可能な選択肢ではない。化学療法は、手術に適していない腫瘍に対して時々利用されるが、通常は恩恵があっても長続きしない。即ち、原発性肝癌の生存率は、著しく低い。従来の治療法は一般に、肝癌の管理において有効性が証明されていない。
【００１５】
例えば、ＨＣＣでは、切除及び移植を除いて有効な治療の選択肢は存在しないが、これらのアプローチは、ＨＣＣの初期にのみ適用可能であり、ドナー肝臓の入手機会により限定され、そして患者に対する重大なリスクを伴う。更に、これらのアプローチは、極めて費用がかかる。恐らくは有害化合物の解毒及び輸出における正常な肝臓機能のため、これらの癌は、化学療法にはほとんど応答しない。化学塞栓術、凍結療法及びエタノール注入法のような、幾つかの他の治療選択肢は、未だ実験段階にあり、これらの有効性は確立されていない。
【００１６】
よって今までのところ、肝障害及び他の上皮性癌に介入できるようにするための、満足できる治療法は開発されていない。
【００１７】
種々の酸化防止剤が、アルキレン鎖による親油性カチオンへのその共有結合によって、ミトコンドリアを標的にできることは既に知られている（Smith R.A.J.ら, 1999, Eur. J. Biochem., 263: 709-716、及びKelso G.F.ら, 2001, J. Biol. Chem., 276: 4588-4596；James A.M.ら, 2005, J. Biol. Chem., 280: 21295-21312）。このアプローチによって、酸化防止剤は、ランダムに拡散するよりは、細胞内のフリーラジカル及び反応性酸素種の一次産生部位を標的にすることができる。
【００１８】
詳細には、ビタミンＥ及び補酵素Ｑ10の誘導体（US 6,331,532；WO 99/26954、WO 2005/016322及びWO 2005/016323）又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質（WO 2004/014927）の、これらをトリフェニルホスホニウムイオンに結合させることによるミトコンドリアへの標的化が記述されている。インビトロの実験により、［２−（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）エチル］−トリフェニルホスホニウムブロミド（ミト・ビタミンＥ（Mito Vit E））、及びミト・キノール（MitoQuinol）［１０−（３，６−ジヒドロキシ−４，５−ジメトキシ−２−メチルフェニル）デシル］トリフェニルホスホニウムブロミドとミト・キノン（MitoQuinone）［１０−（４，５−ジメトキシ−２−メチル−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエン−１−イル）デシル］トリフェニルホスホニウムブロミドとの混合物（ミトＱ（MitoQ））（Kelso G.F.ら, 上記引用文中、及びSmith R.A.J.ら, 上記引用文中）、又はアニオンがメタンスルホナートであるミトＱ化合物（James A.M.ら, 2005, J. Biol. Chem., 280: 21295-21312；WO 2005/016322及びWO 2005/016323）が、ミトコンドリアにより単離細胞内に急速かつ選択的に蓄積されることが証明された。
【００１９】
更に、スピントラップ剤のフェニル−ｔ−ブチルニトロンのミトコンドリアを標的とした誘導体（ミトＰＢＮ（MitoPBN））が開発されている（Smith R.A.J., Bioenergetics Group Colloquium, 2003, 679th Meeting of the Biochemical Society: 1295-1299）。
【００２０】
重要なことには、ミトコンドリアによるこれらの酸化防止剤の蓄積によって、これらは、非標的化酸化防止剤よりはるかに効果的に酸化損傷から防御されたが、このことは、ミトコンドリア内の生理活性分子の蓄積が、これらの効力を増大させ、また一方では有害な副作用を減少させることを示唆している（Murphy M.P.とSmith R.A.J., 2000, Adv. Drug. Delivery Rev., 41: 235-250）。
【００２１】
更には、単純なアルキルトリフェニルホスホニウムカチオンのＴＰＭＰ、ミト・ビタミンＥ及びミトＱは、脳、心臓、肝臓、及び筋肉内で見込み治療有効濃度を生み出しながら、マウスに安全に長期摂取させることができるということが見い出された（Smith R.A.ら, 2003, PNAS, 100(9): 5407-5412）。
【００２２】
これらの化合物の工業的応用（US 6,331,532、WO 99/26954又はWO 2004/014927、WO 2005/016322及びWO 2005/016323）としては、神経変性疾患（パーキンソン病、フリードライヒ運動失調症（Friedrich's Ataxia）、ウィルソン病（Wilson's disease））、ミトコンドリアＤＮＡ突然変異に伴う疾患、糖尿病、運動ニューロン疾患；脳卒中、心臓発作、臓器移植及び手術における炎症及び虚血再灌流組織傷害に伴うミトコンドリアの酸化ストレス上昇の防止、並びに加齢に伴う気力の非特異的消失の防止における使用について特許請求された。更に、移植中に臓器を保護するための、手術中に起こる虚血再灌流傷害を改善するための、脳卒中及び心臓発作後の細胞損傷を軽減するための予防薬として、あるいは脳虚血を起こしやすい未熟児に与えられる予防薬としてのこれらの化合物の使用が、上述の特許文献に特許請求されている。
【００２３】
アルコール性肝炎（ＡＨ）の治療における酸化防止剤療法の潜在的価値への関心は、アルコール性肝毒性における重要な機序として酸化ストレスが関係しているという一連の証拠の増加の結果として生じた（Stewart S.F.とDay C.P., 2003, Journal of Hepatology, 38: 2-13）。これらの考察は、最近になって、重篤なＡＨの患者における酸化防止剤補給の効果を研究する幾つかの試験につながった（例えば、Philips M.ら, 2001, Journal of Hepatology, 34: 250A）。最新の研究では（Stewart S.F.ら, 2002, Journal of Hepatology, 36: 16）、能動群に、負荷量のＮ−アセチルシステイン１５０mg/kg、続いて１００mg/kg/日を１週間、並びにビタミンＡ〜Ｅ、ビオチン、セレン、亜鉛、マンガン、銅、マグネシウム、葉酸及び補酵素Ｑを毎日６ヶ月間投与した。この酸化防止剤療法は、単独でも、又はステロイドとの併用でも何の有用性も示さなかった。要約すると、これまでに入手可能なデータに基づくと、高用量酸化防止剤療法は、重篤なＡＨの患者に何ら延命効果を及ぼさない（Stewart S.F.とDay C.P., 上記引用文中）。
【００２４】
酸化ストレスはまた、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の病因にも関係している。しかしながら、コリン欠乏飼料給餌ラットによる研究では、広範な酸化状況においてラジカル反応の伝搬をブロックすることにより反応性酸素種（ＲＯＳ）と反応することが知られているビタミンＥが、決して脂肪肝の発生を防ぐことはなく、また酸化ストレスを減少させることもなかった（Oliveira C.P.ら, 2003, Nutr. J., 2(1): 9）。
【００２５】
アルファ−トコフェロール（ＶｉｔＥ群）により処置した、肝硬変でありＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の既往歴を持つ患者による研究では、肝機能の改善も、肝細胞癌発生の抑制も、また累積生存率の改善も見られなかった（Tagaki H.ら, 2003, Int. J. Vitam Nutr. Res., 73(6): 411-5）。
【００２６】
更には、以前の一連のアルファ−インターフェロン処置に対してノンレスポンダーであった、生検で証明された慢性Ｃ型肝炎に罹患している続発性患者１２０名のランダム化多施設試験において、Ｎ−アセチルシステイン（１２００mg/日）及びビタミンＥ（６００mg/日）の経口補給は、アルファ−インターフェロン単独での再治療の効果の乏しさを改善しなかった（Ideo, G.ら, 1999, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11(11): 1203-7）。
【００２７】
発明の要約
本発明は、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療又は予防のための、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含むことを特徴とする、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用に関する。
【００２８】
詳細な説明
今や予期せぬことに、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤、例えば、ビタミンＥ、補酵素Ｑ10の誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質が、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療及び予防において有用であることが見い出された。
【００２９】
最も広い側面において、本発明は、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療及び予防において使用するための、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含む、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤を提供するが、ここで、この酸化防止剤残基は、ミトコンドリア膜を通して輸送することができ、無傷細胞のミトコンドリア内に蓄積することができる。詳細には、本発明の化合物は、ミトコンドリアにおける酸化ストレス（又はフリーラジカル）から生じる細胞損傷を防ぐ。
【００３０】
本発明の「肝疾患」という用語は、肝臓の解剖学的構造、生理機能、代謝、及び／又は遺伝的活性に影響し、全体として又はその一部として、一過性に、一時的に、慢性的に又は永久に、新しい肝細胞の発生及び／又は肝臓の再生に病的に影響する、全種類の障害を意味し、かつこれらを含む。
【００３１】
詳細には、アルコールにより引き起こされる肝疾患（例えば、ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝変化（ＮＡＳＨを含むＮＡＦＬＤなど）、栄養性肝傷害（例えば、飢餓）、他の中毒性肝傷害［例えば、特に限定されないがアセトアミノフェン（パラセタモール）、塩素化炭化水素（例えば、ＣＣｌ4）、アミオダロン（コルダロン）、バルプロ酸、テトラサイクリン（静脈内のみ）、イソニアジドのような薬物により誘導される非特異的肝炎など］（Drug-induced liver disease 2004, Lazerow SK, Abdi MS, Lewis JH. Curr Opin Gastroenterol., 2005, 21(3): 283-292）、又は急性若しくは慢性肝不全で生じる食中毒［例えば、アフラトキシン（好ましくはＢ１アフラトキシン）を含むキノコの摂取、又はある種の金属（銅又はカドミウムなど）若しくは自然薬品中の薬草（オオアザミ（Milk thistle）、チャパラル（Chaparral）、カワカワ（Kawa-Kawa）のようなホメオパシー剤）の摂食による］、ビリルビン代謝の障害、肝炎様症候群、胆汁うっ滞、肉芽腫性病変、肝臓内血管病変及び硬変、外傷及び手術（例えば、プリングル法（Pringle maneuver））、放射性肝傷害（放射線療法により引き起こされるものなど）が含まれる。
【００３２】
肝疾患は、更に、感染性肝疾患［例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染により引き起こされる］、及び自己免疫性肝疾患（例えば、自己免疫性肝炎）を含むものと理解される。更に含まれるのは、敗血症による肝傷害である。
【００３３】
肝疾患は、更に、遺伝性肝障害（ヘモクロマトーシス及びアルファ１−アンチトリプシン欠乏症など）、及び他の遺伝性代謝性肝疾患［例えば、代謝性脂肪性肝炎（ＭＳＨ）］を含むものと理解される。
【００３４】
治療すべき肝障害の好ましい例は、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、急性及び慢性肝炎、ヘモクロマトーシス並びにアルファ１−アンチトリプシン欠乏症を含む。
【００３５】
本発明の意味の範囲内で、本発明の「肝疾患」という用語はまた、腫瘍（原発性肝新生物）及び肝臓の腫瘍様病変（限局性結節性過形成、ＦＮＨなど）を包含する。
【００３６】
肝疾患は、更に、肝腫瘍性疾患［良性肝腫瘍（例えば、肝細胞腺腫）など］、更には肝癌［例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）］を含むものと理解される。ＨＣＣは更に、細胞内タンパク性封入体を特徴とする肝癌、肝細胞脂肪症を特徴とするＨＣＣ、及び線維層板状ＨＣＣを含む、上記障害のサブタイプを含む。例えば、肝細胞のサイズの増大を特徴とするもの（「大細胞」変化）、及び肝細胞のサイズの減少を特徴とするもの（「小細胞」変化）、並びにマクロ再生性（過形成性）結節のような、前癌性病変もまた含まれる（Anthony P.著, MacSweenら編, 2001, Pathology of the Liver, チャーチル・リビングストーン（Churchill Livingstone）, エジンバラ, 英国）。
【００３７】
本発明の意味の範囲内で「上皮性癌」という用語は、肺、腎臓、膵臓、前立腺、皮膚及び乳房よりなる群から選択される、肝臓以外の臓器の癌、並びに胃、腎臓、及び結腸のような胃腸系の癌を含む。本発明の「上皮性癌」という用語は、組織の上皮細胞成分が、変形して、当業者には一般に知られているような標準的診断法により同定される悪性腫瘍が生じる、これらの臓器の障害を意味する。
【００３８】
好ましい実施態様は、肝疾患の治療及び予防における、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含むことを特徴とする、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用に相当し、そしてここで、肝疾患は、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症、放射性肝傷害、肝癌、良性肝腫瘍及び限局性結節性過形成よりなる群から選択される疾患である。
【００３９】
別の好ましい実施態様は、肝疾患の治療及び予防における、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含むことを特徴とする、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用に相当し、そしてここで、肝疾患は、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症、放射性肝傷害よりなる群から選択される疾患である。
【００４０】
本発明は、肝疾患及び上皮性癌の治療又は予防用の医薬の製造における、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含むことを特徴とする、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用に関する。
【００４１】
好ましい実施態様は、肝疾患の治療又は予防用の医薬の製造における、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の使用に相当し、そしてここで、肝疾患は、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症、放射性肝傷害、肝癌、良性肝腫瘍及び限局性結節性過形成よりなる群から選択される疾患である。
【００４２】
更に別の好ましい実施態様は、肝疾患の治療又は予防用の医薬の製造における、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の使用であり、そしてここで、肝疾患は、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症、放射性肝傷害よりなる群から選択される疾患である。
【００４３】
別の好ましい実施態様は、肝疾患が、アルコール性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝疾患である、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用である。
【００４４】
更に別の好ましい実施態様は、肝疾患が、アルコール性脂肪性肝炎又は非アルコール性脂肪性肝炎である、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用に相当する。
【００４５】
別の好ましい実施態様は、肝疾患が、アルコール性脂肪性肝炎である、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用である。
【００４６】
更に別の好ましい実施態様は、肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用である。
【００４７】
本発明の意味の範囲内で「本発明の疾患」という用語は、上記と同義の肝障害及び上皮性癌を包含する。
【００４８】
好ましい実施態様は、親油性カチオンが、トリフェニルホスホニウムカチオンである、本発明の疾患の治療又は予防のための、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用に相当する。
【００４９】
本発明の酸化防止剤に共有結合することができる他の親油性カチオンは、トリベンジル若しくはトリフェニルアンモニウムカチオン、又はトリベンジル若しくは置換トリフェニルホスホニウムカチオンを含む。
【００５０】
別の好ましい実施態様において、該ミトコンドリアを標的とした本発明の化合物は、式：Ｐ（Ｐｈ）3+ＸＲ・Ｚ-［式中、Ｘは、結合基であり、Ｚ-は、アニオンであり、そしてＲは、酸化防止剤残基である］を有しており、そしてこの親油性カチオンは、一般式：
【００５１】
【化７】
2008506667.tif 000003
【００５２】
で示されるような、トリフェニルホスホニウムに相当する。
【００５３】
結合基としてのＸは、炭素鎖、１個以上の炭素環、又はこれらの組合せ、並びに１個以上の炭素原子が酸素（エーテル又はエステルを形成）及び／又は窒素（アミン又はアミドを形成）により置換されている、このような鎖又は環であってよい。
【００５４】
炭素鎖は、アルキレン基であることが一般に好ましいが、１個以上の二重又は三重結合を含む炭素鎖もまた、本発明の範囲に含まれる。また、１個以上の置換基（オキソ、ヒドロキシル、カルボン酸又はカルボキサミド基など）、及び／又は非置換若しくは置換アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基から選択される、１個以上の側鎖若しくは分枝を持つ炭素鎖も含まれる。
【００５５】
好ましくは、Ｘは、Ｃ1−Ｃ30、更に好ましくはＣ1−Ｃ20、最も好ましくはＣ1−Ｃ15炭素鎖である。
【００５６】
好ましくは、Ｘは、（ＣＨ2）n［ここで、ｎは、１〜２０、更に好ましくは約１〜約１５の整数である］である。
【００５７】
幾つかの特に好ましい実施態様において、結合基Ｘは、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン又はデシレン基である。
【００５８】
１つの特に好ましい実施態様において、酸化防止剤残基Ｒは、キノンである。別の好ましい実施態様において、酸化防止剤Ｒ残基は、キノールである。キノン及び対応するキノールは、それぞれ還元及び酸化により相互に変換されるため、均等である。
【００５９】
他の実施態様において、酸化防止剤残基Ｒは、ビタミンＥ及びビタミンＥ誘導体、連鎖破壊型酸化防止剤（ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンを含む）、一般的ラジカルスカベンジャー（誘導体化フラーレンを含む）、スピントラップ剤（５，５−ジメチルピロリンＮ−オキシド、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン、α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン及び関連化合物の誘導体を含む）よりなる群から選択される。
【００６０】
更に別の好ましい実施態様において、酸化防止剤残基Ｒは、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体である。
【００６１】
別の好ましい実施態様において、酸化防止剤残基Ｒは、ブチル化ヒドロキシアニソール又はブチル化ヒドロキシトルエンである。
【００６２】
更になお別の好ましい実施態様において、酸化防止剤残基Ｒは、誘導体化フラーレンを表す。
【００６３】
幾つかの特に好ましい実施態様において、酸化防止剤残基Ｒは、５，５−ジメチルピロリンＮ−オキシド、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン、α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン及びこれらの誘導体である。
【００６４】
好ましくは、Ｚ-は、薬剤学的に許容しうるアニオンである。このような薬剤学的に許容しうるアニオンは、有機又は無機酸から形成される。適切な無機酸は、例えば、ハロゲン酸（塩酸、臭化水素酸など）、硫酸、又はリン酸である。適切な有機酸は、例えば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸又はスルファミン酸であり、例えば、酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸（グルタミン酸又はアスパラギン酸など）、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、ケイ皮酸、アルカンスルホン酸（メタン−又はエタン−スルホン酸など）、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、アリールスルホン酸（ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレン−ジスルホン酸又は２−、３−若しくは４−メチルベンゼンスルホン酸など）、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−若しくはＮ−プロピル−スルファミン酸、又は他の有機プロトン酸（アスコルビン酸など）である。
【００６５】
１つの好ましい実施態様において、Ｚ-は、ハロゲン化物である。別の好ましい実施態様において、Ｚ-は、臭化物である。
【００６６】
更に別の好ましい実施態様において、Ｚ-は、アルカン−又はアリールスルホン酸のアニオンである。１つの特に好ましい実施態様において、Ｚ-は、メタンスルホナートである。
【００６７】
別の特に好ましい実施態様において、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療及び予防に有用なミトコンドリアを標的とした酸化防止剤は、下記式：
【００６８】
【化８】
2008506667.tif 000004
【００６９】
［式中、Ｚ-は、薬剤学的に許容しうるアニオン、好ましくはＢｒ-である］を有する（その全ての立体異性体を含む）。この化合物は、本明細書において「ミト・ビタミンＥ（Mito Vit E）」と称される。
【００７０】
別の好ましい実施態様において、本発明の疾患の治療及び予防に有用なミトコンドリアを標的とした酸化防止剤は、一般式：
【００７１】
【化９】
2008506667.tif 000005
【００７２】
［式中、Ｚ-は、薬剤学的に許容しうるアニオン、好ましくはハロゲンであり、ｍは、０〜３の整数であり、各Ｙは、電子供与性及び受容性を有する、基、鎖並びに脂肪族及び芳香族環から独立に選択され、（Ｃ）nは、場合により１個以上の二重又は三重結合を持ち、そして場合により１個以上の置換基及び／又は非置換若しくは置換アルキル、アルケニル若しくはアルキニル側鎖を含む、炭素鎖を表し、そしてｎは、１〜２０の整数である］を有する。
【００７３】
好ましくは、各Ｙは、アルコキシ、アルキルチオ、アルキル、ハロアルキル、ハロ、アミノ、ニトロ、場合により置換されたアリールよりなる群から独立に選択されるか、あるいはｍが、２又は３であるとき、２個のＹ基は、これらが結合している炭素原子と一緒になって、アリール環に縮合した脂肪族又は芳香族の炭素環又は複素環を形成する。更に好ましくは、各Ｙは、メトキシ及びメチルから独立に選択される。
【００７４】
好ましくは、（Ｃ）nは、式：（ＣＨ2）nのアルキル鎖である。
【００７５】
特に好ましい実施態様において、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤は、本明細書において「ミト・キノール（MitoQuinol）」と呼ばれる、下記式：
【００７６】
【化１０】
2008506667.tif 000006
【００７７】
［式中、Ｚ-は、薬剤学的に許容しうるアニオン、好ましくはＢｒ-である］を有するか、あるいは本明細書において「ミト・キノン（MitoQuinone）」と呼ばれる、この化合物の酸化型（ここで、この式のヒドロキノンが、キノンである）である。種々の量のミト・キノールとミト・キノンとの混合物は、「ミトＱ（MitoQ）」と呼ばれる。
【００７８】
更に好ましくは、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤は、下記式：
【００７９】
【化１１】
2008506667.tif 000007
【００８０】
［式中、薬剤学的に許容しうるアニオンＺ-は、メタンスルホナートである］を有する。この実施態様において、種々の量のミト・キノールとミト・キノンとの混合物は、「ミトＳ（MitoS）」と呼ばれる。
【００８１】
本発明の更に別の好ましい実施態様は、本明細書において「ミトＰＢＮ（MitoPBN）」と呼ばれる、下記式：
【００８２】
【化１２】
2008506667.tif 000008
【００８３】
で示されるスピントラップ剤のフェニル−ｔ−ブチルニトロンのミトコンドリアを標的とした誘導体に相当する。
【００８４】
本発明の別の実施態様において、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤は、有機セレン化合物（即ち、少なくとも１個のセレン原子を含む有機化合物）のような、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質である。好ましい種類の有機セレン系グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質は、ベンゾイソセレナゾロン類、二セレン化ジアリール類及びセレン化ジアリール類を含む。
【００８５】
詳細には、このグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質残基は、本明細書において「エベルセン（Ebelsen）」（２−フェニル−ベンゾ［ｄ］イソセレナゾール−３−オン）と呼ばれる、下記式：
【００８６】
【化１３】
2008506667.tif 000009
【００８７】
で示される。
【００８８】
本発明の好ましい化合物は、下記式：
【００８９】
【化１４】
2008506667.tif 000010
【００９０】
［式中、Ｚ-は、薬剤学的に許容しうるアニオン、好ましくはＢｒ-であり、そしてＬは、単糖である］を有する。
【００９１】
本発明の１つの特に好ましい実施態様は、下記式：
【００９２】
【化１５】
2008506667.tif 000011
【００９３】
［式中、Ｚ-及び（Ｃ）nは、上記と同義であり、Ｗは、Ｏ、Ｓ又はＮＨ、好ましくはＯ又はＳであり、そしてｎは、１〜２０、更に好ましくは３〜６である］を有する。
【００９４】
更に別の側面において、本発明は、肝疾患及び／又は上皮性癌に罹患している患者の治療及び／又は予防に適した薬剤組成物であって、有効量の本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤を、１つ以上の薬剤学的に許容しうる担体又は希釈剤［例えば、生理食塩水、脱塩水、安定化剤（好ましくは１：２の比のβ−シクロデキストリンなど）、及び／又はプロテイナーゼ阻害剤など］と組合せて含むことを特徴とする組成物を提供する。
【００９５】
本明細書において使用されるとき「薬剤学的に許容しうる」という用語は、化合物、成分、材料、組成物、投与量、剤形などに関連し、そしてこれらは、健全な医学的判断の範囲内にあり、問題の対象（好ましくはヒト）の組織と、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴うことなく接触させて使用するのに適しており、妥当な受益性／危険性比率に見合っている。各担体、希釈剤、賦形剤などもまた、処方の他の成分と適合性であるという意味で「許容しうる」ものでなくてはならない。
【００９６】
また更に別の側面において、本発明は、酸化ストレスの減少により恩恵を受けるであろう、肝疾患及び／又は上皮性癌に罹患している患者の治療又は予防の方法であって、該患者に上記と同義のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤を投与する工程を特徴とする方法を提供する。
【００９７】
本発明の意味の範囲内で「治療」という用語は、好ましくは患者を本発明の少なくとも１つの障害から治癒させるか、かつ／又はその障害に関連する１つ以上の症候に関して患者の病態を、一過性に、短期に（数時間〜数日間の程度で）、長期に（数週間、数ヶ月又は数年間の程度で）、又は永久に改善する（ここで、病態の改善とは、全般的な効果が、対照患者に比較して症候の有意な改善であるかぎり、大きさは、一定の、増大する、減少する、連続的に変化又は振動するものであってよい）治療を意味する。
【００９８】
更に、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療との関連で本明細書において使用されるとき「治療」という用語は、一般に、ある所望の治療効果（例えば、症状の進行の阻害）が達成される、ヒト又は動物（例えば、獣医学的適用において）の治療及び療法に関連し、そして進行の速度の低下、進行の速度の停止、症状の改善、及び症状の治癒を含む。
【００９９】
本発明の「治療」という用語は、２つ以上の治療又は療法が、例えば、順次又は同時に組合せられる、併用治療及び療法を含む。予防的手段としての治療（即ち、予防）もまた含まれる。
【０１００】
本発明の治療は、当業者には一般に知られている従来法で、例えば、本発明の薬剤組成物の経口適用を利用して、又は静脈内注射を介して行うことができる。
【０１０１】
治療効果及び毒性、例えば、ＥＤ50及びＬＤ50は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬理学的手順により決定することができる。治療効果及び毒性効果の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50の比により表すことができる。大きな治療指数を示す薬剤組成物が好ましい。用量は、治療される個々の患者の年齢、体重及び症状、並びに投与の経路、投与剤形及び処方計画、及び望まれる結果に対して調整する必要があり、そして当然ながら正確な用量は、担当医が決定すべきである。
【０１０２】
実際の用量は、治療される障害の性質と重篤度に依存し、そして医者の裁量の範囲内であり、そして望まれる治療効果を生み出すために、本発明の特定の状況に対する用量の滴定により変化させることができる。しかし、現在のところ、個々の用量当たり約０．１〜５００mg/kg、好ましくは約０．１〜１００mg/kg、最も好ましくは約０．１〜１０mg/kgの活性成分からなる薬剤組成物が、治療処置に適している。
【０１０３】
一般に、本発明の活性化合物の適切な用量は、処置される対象の体重１キログラム当たり約０．１mg〜約２５０mg／日の範囲である。
【０１０４】
活性成分は、１日に１回又は数回の用量として投与することができる。満足できる結果は、場合によっては、わずか０．１mg/kg静脈内（i.v.）及び１mg/kg経口（p.o.）という用量で得ることができる。好ましい範囲は、０．１mg/kg/日〜約１０mg/kg/日i.v.及び１mg/kg/日〜約１００mg/kg/日p.o.である。
【０１０５】
更に本発明は、活性化合物を適切な薬剤担体と共に混合又は溶解する先行技術において知られている標準法を用いる、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療及び／又は予防に有用な本発明の酸化防止剤化合物を含む医薬の製造に関する。このような方法は、活性化合物を、１種以上の副成分を含むことを特徴とする担体と一緒にする工程を含む。一般に、本発明の処方は、活性化合物を担体（例えば、液体担体、微粉化固体担体）と均質かつ密接に合わせて、次に必要であれば製品に成形することによって調製される。本発明において使用される適切な担体、希釈剤及び賦形剤は、標準的な製剤の教科書に見い出すことができる（例えば、Handbook for Pharmaceutical Additives, 2001, 第2版, M. AshとI. Ash編を参照のこと）。
【０１０６】
本発明の酸化防止剤化合物、例えば、ビタミンＥ、補酵素Ｑ10の誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質は、例えば、US 6,331,532、WO 99/26954、WO 2004/014927又はWO 2003/016323に記載されるこのような化合物の既知の製造方法のいずれかにより合成することができる。
【０１０７】
本発明の組成物、方法及び製造法に、種々の改変を加えうることは、当業者には明らかであろう。よって、そのような改変及び変法が、添付された請求の範囲及びその均等物の範囲に入ってくるならば、本発明は、それらを対象とすることが意図されている。本明細書に引用された全ての刊行物は、引用例としてその全体が取り込まれる。
【０１０８】
本発明の肝疾患の治療及び／又は予防において、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤、例えば、ビタミンＥ、補酵素Ｑ10の誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質の影響を実質的に評価するために、門脈付近の炎症細胞のような形態学的変性（Glisson's trias）の存在及び肝細胞損傷の程度（壊死、細胞骨格の虚脱（実施例３、図１）［特に限定されないが、肝細胞の膨張、濃厚化ケラチン中間径フィラメント（ＩＦ）ネットワークの形成、ケラチンＩＦの密度の低下、及びマロリー小体（ＭＢ）の存在（種々の遺伝性及び後天性肝疾患における最も高頻度のＩＦ関連細胞骨格変性の１つを表す）を含む］を、これらの酸化防止剤での治療を伴うか、又は伴わずに評価する（実施例２及び３）。
【０１０９】
ＭＢを含む形態学的変性は、静真菌性抗微小管薬物のグリセオフルビン（ＧＦ）又はポルフィリン生成剤（porphyrogenic agent）の３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）での慢性中毒によりマウスで再現することができる（Denk H.ら, 1975, Lab. Invest.: 773-776；Tsunoo C.ら, 1987, J. Hepatol., 5: 85-97）。ＭＢ形成は、マウス肝において、ＤＤＣ−又はＧＦ含有飼料を給餌することにより誘導することができる（実施例１を参照のこと）。メチルラジカルにより誘導される酸化傷害は、ＤＤＣ−又はＧＦ給餌動物とＡＳＨ又はＮＡＳＨのヒト肝臓における共通の病理発生原理であると推測されるが、ここでは、エタノールのチトクロムＰ４５０介在性酸化により産生するフリーラジカル、更にはアセトアルデヒド及び遊離脂肪酸過負荷により引き起こされるミトコンドリア傷害が中心的な特色である（Lieber C.S., 2000, J. Hepatol., 32: 113-128；Anguilo P., 2002, N Engl. J. Med., 346: 1221-1231）。
【０１１０】
更に、ＤＤＣ−又はＧＦ給餌マウスにおけるＩＦケラチン細胞骨格並びにＭＢの構造及び化学組成の変性が、ヒトＡＳＨ及びＮＡＳＨにおいて見られる変性と全く同一ではないにしても、非常に類似していることは、広く受け容れられている（Denk H.ら, 2000, J. Hepatol., 32: 689-702）。これに関連して、アルコール含有飼料の給餌に基づくアルコール性肝疾患の他のマウスモデルが、ヒトＡＳＨの脂肪代謝の妨害、及びある程度の炎症を再現するが、ケラチンＩＦ細胞骨格の変性は再現せず、またＭＢ形成にも至らないことは注目に値する。
【０１１１】
１つの型の実験（実施例２）において、典型的には核周辺細胞質領域に局在する大ＭＢの出現は、日常的な免疫組織化学法（ヘマトキシリン及びエオシン染色など）又は標準的な免疫蛍光顕微鏡法（例えば、ｐ６２タンパク質に対する抗体ＳＭＩ３１による）を用いて、試験マウスでは中毒の６〜１０週目に検出される（Zatloukal K.ら, 2002, Am J Pathol. 160(1): 255-63）。ｐ６２は、初めはｐ５６lckのＳＨ２ドメインのホスホチロシン非依存性リガンドとして、及び細胞質非プロテアソームユビキチン結合タンパク質として同定された（Vadlamudi R.K.ら, 1996, J. Biol. Chem., 271: 20235-20237）。ｐ６２発現は、種々のストレス刺激、特に酸化ストレスにより増大するため、細胞ストレス応答におけるｐ６２の一般的な役割が暗示されている（Ishii T.ら, 1996, Biochem Biophys. Res Comm., 226: 456-460）。
【０１１２】
中毒からの回復の４週目には、細胞質ケラチンフィラメントを欠いているが、なお細胞周辺にデスモソームに付随してＭＢの小残留物を含む、肝細胞の群が存在する。マウスをＧＦ又はＤＤＣに再曝露するならば、多数のＭＢが２４〜７２時間以内に再出現する（Stumptner C.ら, 2001, J. Hepatol., 34: 665-675）。再中毒によるこのＭＢの形成増強は、アレルギー反応と同様に、毒性記憶効果と解釈された。
【０１１３】
ＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウス肝臓の初期段階における形態学的変性の回帰に及ぼす本発明の酸化防止剤の影響を評価するために、陽性対照群の動物（ＧＦ又はＤＤＣのみに３〜７日間曝露）を、更に３〜７日間、例えば、それぞれ、ミトＱ（ミト・キノール［１０−（３，６−ジヒドロキシ−４，５−ジメトキシ−２−メチルフェニル）デシル］トリフェニルホスホニウムブロミドとミト・キノン［１０−（４，５−ジメトキシ−２−メチル−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエン−１−イル）デシル］トリフェニルホスホニウムブロミドとの混合物）又はミト・ビタミンＥ［２−（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）エチル］−トリフェニルホスホニウムブロミドで処置したＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウスと比較する。試験したマウスには、本発明の酸化防止剤化合物、例えば、ミトＱ又はミト・ビタミンＥを含む、腹腔内（i.p.）又は静脈内（i.v.）（尾静脈）注射を行い、そしてこれらのマウスをビヒクル注射対照マウス（酸化防止剤の溶解性を維持するのに充分なＤＭＳＯを補足したＰＢＳ）及び他の適切な対照マウスと比較する（実施例３）。
【０１１４】
更に、ミトＱ、若しくはミトＳ（ミト・キノール［１０−（３，６−ジヒドロキシ−４，５−ジメトキシ−２−メチルフェニル）デシル］トリフェニルホスホニウム・メタンスルホナートとミト・キノン［１０−（４，５−ジメトキシ−２−メチル−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエン−１−イル）デシル］トリフェニルホスホニウム・メタンスルホナートとの混合物）のようなミトＱ誘導体、又はミト・ビタミンＥを飼料に補足する。用量は、水又は液体飼料の消費量及びマウスの体重を計測することにより求める（Smith R.A.J.ら, 2003, PNAS, 100(9): 5407-5412）。
【０１１５】
更に別の型の実験では、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒動物の群を同時に本発明の酸化防止剤（例えば、ミトＱ又はミトＳ）で３〜７日間処置し、次に３〜７日間ＤＤＣ又はＧＦのみに曝露した対照群と比較する（実施例３）。
【０１１６】
別のセットの実験では、３〜１２mg/kgのミトＱを、ＤＤＣ中毒マウスに３日間同時に腹腔内投与して、対照動物と比較する。これらの短期実験において本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤（例えば、ミトＱ又はミトＳ）の影響を実際的に評価するために、門脈付近の炎症細胞の存在（又は非存在）（Glisson's trias）及び肝細胞損傷の程度［細胞膨張及び／又はマロリー小体分析（それぞれＤＤＣ又はＧＦへの長期曝露に典型的）の代わりに壊死、細胞骨格の虚脱（図２及び３を参照のこと）など］を適切な対照と比較する（図１〜３）。細胞膨張及びマロリー小体は両方とも、この短期のＤＤＣへの曝露では統計的評価ができる程には形成されないため、これらの実験には適していない。
【０１１７】
全体的に見て、ミトＱ処置下では、類洞に縁取られた肝細胞の索により表される正常な構造が再び現れる。肝細胞の形態は、核のサイズと形態及び細胞質の構造に関して正常である。更に、炎症細胞（例えば、好中球、リンパ球、食細胞、マクロファージ）の数は、本発明の酸化防止剤での処置により著しく減少する（図１〜３）。
【０１１８】
ＤＤＣで８〜１０週間中毒にしたマウスを用いる長期実験では、処置動物の肝臓試料における細胞膨張及び／又はマロリー小体（ＭＢ）の存在（又は非存在）を求めて、対照群の動物と比較する（実施例３、図４〜６）。
【０１１９】
１０週間のそれぞれＤＤＣ又はＧＦでの中毒による、慢性肝代謝疾患及び上皮性癌の治療及び／又は予防における、これらの酸化防止剤の効果を求めるために、試験マウスに、本発明の酸化防止剤化合物（例えば、ミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥ）を含むi.p.又はi.v.（尾静脈）注射を続く７日間投与して、ビヒクル注射対照マウス及び他の適切な対照と比較する（実施例３を参照のこと）。
【０１２０】
あるいは、ＤＤＣ中毒の１０週間後、試験動物にミトＱ（１．２５mg/kg）のi.p.注射を続く７日以内に２回（相当する週の１日目及び４日目）投与して、日常的な組織学法（Luna L.G., 1968, 軍病理学研究所の組織染色方法のマニュアル（Manual of Histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology）, 第3版, マグロー・ヒル（McGraw Hill）, ニューヨークによる標準的ヘマトキシリン／エオシン染色）により分析する。細胞膨張の程度及びマロリー小体の数は、適切な対照と比較すると、ＤＤＣで中毒にしたミトＱ処置動物において大きく減少している（実施例３、図４〜６を参照のこと）。
【０１２１】
更に別のセットの実験では、ＤＤＣ又はＧＦで８〜１０週間中毒にしたマウスに、続く７〜１４日間ミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥをその飲料水中で摂取させる（実施例３）。
【０１２２】
幾つかの他の実験では、本発明の酸化防止剤をマウスに適用して（６週間のＤＤＣ−又はＧＦ中毒と、続く４週間の、それぞれ最大耐量の１０〜５０％のミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥを用いることによる、ミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥでの同時処置）、１０週間ＤＣＣ又はＧＦのみで中毒にした対照群の動物と比較する（実施例３を参照のこと）。
【０１２３】
別のセットの実験では、ＤＤＣ又はＧＦで１０週間中毒のマウスを、続いて４週間回復させる。この実験では、毒性記憶効果（２４〜７２時間のＤＤＣ又はＧＦ中毒への再曝露の結果として）が、本発明の酸化防止剤での同時処置により減少するか又は無くなる。
【０１２４】
本発明の肝障害における酸化防止剤の予防効果を評価するために、ＤＤＣ−又はＧＦ給餌マウスの１群に、例えば、それぞれ最大耐量の１０〜５０％のミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥでの同時処置を行い、次に１０週間ＤＤＣ又はＧＦのみに曝露された対照動物の群と比較する（実施例３）。
【０１２５】
あるいは、４週間の初期回復期間内に、例えば、ミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥの投与を行い、続いて２４〜７４時間ＤＤＣ又はＧＦで中毒にし、そして次に処置マウスを、２．５ヶ月のＤＤＣ−又はＧＦ曝露後に酸化防止剤により処置していない対照動物と比較する。
【０１２６】
酸化防止剤、例えば、補酵素Ｑ、ビタミンＥの誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質の適用により、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒動物の肝臓内の形態学的異常、例えば、肝細胞膨張、異常折り畳み構造のタンパク質の細胞内封入及びＭＢの有意な減少が得られる。これらの結果（実施例３、図１〜６）は、この細胞損傷が、本発明の酸化防止剤化合物のミトコンドリア標的化により軽減されることを証明している。ＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウスモデルは、例えば、ＮＡＳＨ又はＡＳＨに罹患している患者で行われる観察結果に似ており、本発明の疾患の治療又は予防における酸化防止剤、例えば、補酵素Ｑ10及びビタミンＥの誘導体の役割を研究するための強力なインビボ及びインビトロ系を提供する。
【０１２７】
これらのミトコンドリアを標的とした酸化防止剤による本発明の肝障害のヒト患者の治療及び／又は予防は、肝臓病変を有意に縮小し、それによってこれらの障害用の処置として治療的及び／又は予防的効果を提供する。
【０１２８】
対照対ＤＤＣ中毒マウス（本発明の酸化防止剤を使用することによる処置を伴うか、又は伴わない）における酸化ストレスを評価するために、単離肝ミトコンドリア（全ての試験動物群は、実施例３のプロトコールにより調製）中のトコフェロールキノン（ＴＱ）含量（Gille L.ら, 2004, Biochemic. Pharmacology, 68: 373-381）を測定する。マウス肝ミトコンドリアは、Staniek K.とNohl H., 1999, Biochem. et Biophys. Acta, 1413: 70-80；Mela L.とSietz S., 1979, Methods in Enzymology, アカデミック・プレス社（Academic Press Inc.）: 39-46からの改良プロトコールにより調製して、ＴＱ含量は、タンパク質及びチトクロム濃度、並びに複合体Ｉ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ）、複合体II（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、複合体III（チトクロムｂｃ１）及び複合体IV（チトクロムオキシダーゼ）の活性試験を含む幾つかのパラメーターに対して標準化する。全体的に見て、これらの実験は、対照及びミトＱで処置したマウスに比較すると、ＤＤＣ中毒マウスにおけるＴＱレベルの上昇を示している（実施例４）。
【０１２９】
酸化ストレス誘導タンパク質を評価するための更に別の実験設定では、短時間曝露で同時にミトＱで処置した（３日間、実施例５）ＤＤＣ中毒マウスに由来する抽出物を用いることにより、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）発現レベルのウェスタンブロット分析を利用する。ＨＯ−１のＤＤＣ誘導過剰発現（反応性酸素種（ＲＯＳ）により誘導されることが知られている、Suematsu M.とIshimura Y., 2000, Hepatology, 31(1): 3-6）の著しい減少は、本発明の酸化防止剤により肝臓の酸化ストレスが大きく減少することを示唆している（実施例５、図７）。
【０１３０】
更には、肝細胞損傷の高感度マーカーに相当する脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）のタンパク質発現レベル（Monbaliu D.ら, 2005, Transplant Proc., 37(1): 413-416）は、対照群に比較すると、ＤＤＣ中毒マウスのＦＡＢＰタンパク質の有意な低下を示している。この群の動物のミトＱ処置下で、ＦＡＢＰタンパク質発現は、ほぼ対照マウスＦＡＢＰ発現値に到達するが、これは再び本発明の疾患の治療又は予防におけるミトＱの効果を示唆している（実施例５）。
【０１３１】
ＤＤＣ−又はＧＦ中毒対対照マウスにおける本発明の酸化防止剤の効果を調査するための別の実験設定では、肝特異的酵素の血清レベルを、例えば、アクチテスト（Actitest）（バイオプレディクティブ（Biopredictive）、ウイユ（Houilles）、フランス）で、肝損傷及び特に線維症（本発明の幾つかの疾患に特徴的である）の尺度を提供するものとしてモニターする（実施例６を参照のこと）。例えば、ａ2−マクログロブリン、ハプトグロビン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、総ビリルビン、アポリポプロテインＡ１及びアラニンアミノトランスフェラーゼの血清レベルは、ＤＤＣ−又はＧＦ処置、対照、及びミトコンドリアを標的とした酸化防止剤にも曝露した対応するＤＤＣ−又はＧＦ処置動物から、Poynardら, 2003, Hepatology 38: 481-492に記載される方法を用いて、実施例３の一般的な時間軸方策により測定する。
【０１３２】
肝損傷、特に線維症の尺度としてヒト血清でも行われるアクチテストは、本発明の酸化防止剤でのこれらの疾患の患者の治療の効果をモニターするために同様に利用する。
【０１３３】
あるいは、種々の試験動物群からの血清において、肝損傷を示す以下のパラメーター、即ち、ビリルビン、アラニン−アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ／ＧＯＴ）及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）を、市販のキットを利用して臨床診断の標準プロトコールにより測定する（実施例６）。本発明の化合物で処置した動物の血清肝酵素（例えば、アラニン−及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼなど、図８を参照のこと）の減少は、このような処置試料における肝損傷の減少を示しており、そして本発明の疾患におけるこれらの化合物の治療効果を支持する。
【０１３４】
反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を評価するために、例えば、標準プロトコール（Brandes RPら, Free Radic Biol Med. 2002; 32(11): 1116-1122）により、対照及びＤＤＣ−又はＧＦ中毒動物から調製される肝切片（例えば、凍結切片）のジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色を利用することができる。このアプローチにより、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒動物の肝臓におけるインビボのＲＯＳ産生の誘導を証明することができるが、これは本発明の疾患に罹患している患者で行われる観察結果に似ている（実施例７）。ＤＤＣ−又はＧＦ給餌マウスにおけるＲＯＳ形成を評価するための他の可能性は、例えば、ルシゲニン化学ルミネセンスアッセイを含む（Goerlach A.ら, 2000, Circ Res., 87(1): 26-32）。
【０１３５】
この実験設定は、本発明の標的化酸化防止剤で処置したＤＤＣ−又はＧＦ−給餌動物に更に適用される（実施例６）。試験動物のＤＤＣ−又はＧＦ中毒及びその酸化防止剤での処置に関する、時間軸及び処方計画の一般的方策は、実施例３のＤＤＣ−又はＧＦ中毒動物の肝臓内の形態学的異常、例えば、異常折り畳み構造のタンパク質の細胞内封入及びＭＢの測定のために使用された実験的アプローチと同一である。
【０１３６】
実施例７の一般的プロトコールを用いる、酸化防止剤、例えば、ビタミンＥ、補酵素Ｑ10の誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質の適用は、ＲＯＳ形成の有意な減少を提供し、そして本発明の肝障害における治療的有用性を有する（実施例８）。
【０１３７】
場合により、ヘパトーマ細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２又はＨｅｐ３Ｂ）、肝細胞癌に由来するＳＮＵ−３９８細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２３３、ＬＧＣプロモケム（LGC Promochem）、ドイツ）、ＨＵＨ−７ヒト癌細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク（Japanese Collection of Research Bioresources）、ＪＣＲＢ  ０４０３）又はＴｉｂ−７３マウス胎生細胞株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ７３＝ＢＡＬ／ｃマウス由来のＢＮＬ  ＣＬ２、メリーランド州、米国）を利用するインビトロ実験により、ＤＤＣ中毒による肝細胞中のＲＯＳ産生が測定できる（実施例９）。グルタチオン合成阻害剤のＬ−ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシミン（ＢＳＯ）は、内因性酸化ストレスを上昇させるための代替物として適用することができる（Kito M.ら, 2002, Biochem Biophys Res Commun., 291(4): 861-867）。
【０１３８】
ＣｏＣｌ2がミトコンドリアに影響を及ぼすことが最近証明されている（Jung JYとKim WJ., 2004, Neurosci Lett., 371: 85-90）ので、分化した細胞株におけるＲＯＳ産生を測定するために、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５、メリーランド州、米国）を代わりに１００μM  ＣｏＣｌ2（シグマ（Sigma））によって刺激することができる（Bel Aiba RSら, 2004, Biol. Chem. 385: 249-57）。
【０１３９】
培養細胞で（並びに単離細胞小器官又は全組織中で）充分に確立した別のアプローチは、Chem Biol Interact. 2000 Jul 14; 127(3): 201-217にしたがいアンチマイシンＡ（Antimycin A）により（図１０）、又はルシゲニン化学ルミネセンスアッセイを用いてロテノンにより（Goerlach A.ら, 2000, Circ Res., 87(1): 26-32）誘導されるＲＯＳ産生の測定を可能にする。
【０１４０】
ＤＤＣ（濃度＝５０μg/ml培地）、ＢＳＯ（１００μM以下）、又はアンチマイシンＡ（又はロテノン）で、あるいはＣｏＣｌ2（１００μM）で３日間中毒にした肝細胞培養物により、インビトロのＲＯＳ産生の誘導が証明されたため、これらは、本発明の疾患に罹患している患者で行われる観察結果に似ている別の適切なモデルを提供している。
【０１４１】
実施例９の標準プロトコールを利用することにより、ＤＤＣ、ＢＳＯ、アンチマイシンＡ（又はロテノン）又はＣｏＣｌ2（１００μM）で中毒にし、そして同時にそれぞれミトＱ又はミト・ビタミンＥ［ミトＱではＥＣ50＝０．５１nM及びミト・ビタミンＥではＥＣ50＝４１６nMに相当する濃度（Jauslin M.L.ら, 2003, FASEB J., (13): 1972-4による）又は後者の場合には０．５〜１０μMの範囲の濃度］で処置した分化した細胞株（例えば、ヘパトーマ細胞）は、ＲＯＳ形成の有意な減少を提供し、そして本発明の肝障害におけるミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の治療的有用性を更に裏付けている（図９、実施例１０を参照のこと）。
【０１４２】
ＭＢはまた、原発性胆汁性肝硬変及び原発性硬化性胆管炎のような慢性胆汁うっ滞においても見い出される。慢性胆汁うっ滞症状の治療及び／又は予防における本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の効果を測定するために、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウスに関して上述の治療パラダイム（実施例３）にしたがう。回復した薬物処理動物は、一般的な胆管結紮（ＣＢＤＬ）又はコール酸（ＣＡ）補足飼料の給餌に７日間以内（Fickert P.ら, 2002, Am. J. of Pathology, 161(6): 2019-2026）それぞれミトＱ及びミト・ビタミンＥを伴うか又は伴わずに付して、適切な対照群と比較する。
【０１４３】
肝線維症及び肝硬変の治療及び／又は予防におけるミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の効果を測定するための一般的な方策は、本発明の酸化防止剤で処理した、マウス又はラットモデルにおける四塩化炭素（ＣＣｌ4）誘導肝損傷（Arias I.M.ら, 1982, The Liver Biology and Pathobiology, レイブン・プレス（Raven Press）, ニューヨーク）を利用する。
【０１４４】
例えば、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウスについて上述の治療パラダイムにしたがい、上皮性癌の治療及び／又は予防における本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の効果を測定するために、代わりにヒト上皮細胞癌異種移植片をもつ免疫不全状態のマウスを利用する（ヌードマウス腫瘍異種移植片、例えば、チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Charles Rivers Laboratories）（米国）のＣＤ１  ν／νマウスなど）。先行技術において知られている標準法（Li K.ら, 2003, Cancer Res., 63(13): 3593-3597）により皮下に異種移植される腫瘍は、特に限定されないが、結腸腺癌、浸潤性乳管癌、小細胞及び非小細胞肺癌、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍及び胃腫瘍を含む。
【０１４５】
このようなマウスの処置は、腫瘍の増殖の縮小、腫瘍の壊死の増大及び腫瘍異種移植片の脈管化の減少を立証する。同様に、ヌードマウス腫瘍異種移植片におけるＲＯＳのレベルを上述のようにモニターすると、本発明の酸化防止剤で処置した異種移植片腫瘍では減少する（実施例１１）。
【０１４６】
肝障害並びに肝臓及び他の上皮性癌の治療又は予防の技術の現状に比較すると、本発明の処置の方法は、驚くべきことに、改善され、持続性でかつより効果的な治療法を提供する。
【０１４７】
本発明は、本発明の好ましい実施態様及び特色を表す図と実施例を活用して（本発明をこれらに制限することなく）以下に更に説明される。
【０１４８】
実施例
実施例１：  マロリー小体（ＭＢ）の実験的誘導
ＭＢは、種々のマウス系統：例えば、オスのスイスアルビノ（Swiss Albino）マウス：Ｈｉｍ  ＯＦ１  ＳＰＦ系（実験動物研究所（Institute of Laboratory Animal Research）、ウィーン大学（University of Vienna）、ヒンベルク（Himberg）、オーストリア）の、３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン（１，４−ジヒドロ−２，４，６−トリメチルピリジン−３，５−二炭酸ジエチルエステル、ＤＤＣ、カタログ番号１３７０３−０、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、シュタインハイム、ドイツ）又はグリセオフルビン（ＧＦ、カタログ番号８５，６４４−４、シグマ・アルドリッチ）での慢性中毒によりマウス肝臓において誘導することができる。
【０１４９】
２．５％  ＧＦ又は０．１％  ＤＤＣを含む標準飼料（スニッフ特殊飼料社（Sniff Spezialdiaeten GmbH）、ゾースト（Soest）、ドイツ）は、スニッフ社によりペレットとして製造される。
【０１５０】
動物は、１２時間の昼夜サイクルで、従来のケージ、又は無菌アイソレーターで飼う。動物は、全米科学アカデミー（National Academy of Sciences）により作成され、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により公表（ＮＩＨ発表８６−２３、1985年改訂）された「実験動物の世話及び使用に関するガイド（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）」に概略が述べられる基準により動物愛護に沿う世話を受ける。
【０１５１】
マウス（８週齢）に、０．１％  ＤＤＣ又は２．５％  ＧＦのいずれかを含む標準飼料を最大２．５ヶ月間給餌する。
【０１５２】
マウス肝臓は、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒に反応して、最初は肝細胞の膨張及び濃厚化ケラチンＩＦネットワークの形成が起こる。約６週間の中毒後、膨張肝細胞は、ケラチンＩＦの密度の低下を示し、初期ＭＢが、ケラチンＩＦネットワークに結合した微細な粒子として観察できる。中毒を続けると、典型的には核周辺細胞質領域に局在する大ＭＢの出現に至る。大ＭＢを含む多くの肝細胞は、細胞質ＩＦケラチンネットワークが著しく減少しているか、又は検出できないことさえある。中毒を停止すると、ＭＢは数週間以内に消失する。中毒からの回復の４週目には、細胞質ケラチンフィラメントを欠いているが、なお細胞周辺にデスモソームに付随してＭＢの小残留物を含む、肝細胞の群が存在する。このようなマウスをＤＤＣ又はＧＦに再曝露するならば、多数のＭＢが２４〜７２時間以内に再出現する（Stumptner C.ら, 2001, J. Hepatol., 34: 665-675）。再中毒によるこのＭＢの形成増強は、アレルギー反応と同様に、毒性記憶効果と解釈された。
【０１５３】
中毒の様々な時点で頸椎脱臼によりマウスを殺処分して、肝臓は、免疫蛍光法のために液体窒素で前もって冷却したメチルブタン中で直ちに瞬間凍結するか、又は日常的な組織学及び免疫組織化学法のための４％緩衝ホルムアルデヒド液中に固定する。
【０１５４】
実施例２：  肝臓変性の評価；マロリー小体（ＭＢ）の検出。
実施例１により調製した肝臓試料を、ヘマトキシリン及びエオシンによるような簡易な組織染色のために使用する（Luna L.G., 1968, 軍病理学研究所の組織染色方法のマニュアル（Manual of Histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology）, 第3版, マグロー・ヒル（McGraw Hill）, ニューヨーク）。更には、単一標識免疫組織化学又は二重標識免疫蛍光顕微鏡法が、試験動物においてＭＢを検出するために行われる。
【０１５５】
Ａ）  パラフィン包埋切片の単一標識免疫組織化学法：切片（４μm厚）をキシレン中で脱パラフィンして、段階的エタノール（１００％、９０％、８０％、７０％、５０％エタノール）及びＰＢＳ（５０mMリン酸カリウム、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０〜８．５）に再水和する。抗原回復のために、再水和切片を０．１％  XXIV型プロテアーゼ（シグマ、シュタインハイム、ドイツ）と共に１０分間室温で（ユビキチン・ダコ（ubiquitin Dako）一次抗体について）、又は７５０Ｗのマイクロウェーブ（出力調節付きの従来の家庭用電子レンジ）で１０分間１０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で（ポリクローナルＫ８／１８抗体５０Ｋ１６０、モノクローナルＫ８抗体Ｋ８．８［ネオマーカーズ（Neomarkers）］、モノクローナルＫ１８抗体ＤＣ−１０［ネオマーカーズ］及びｐ６２ＣＴ［ｐ６２のＣ末端ペプチド配列に対するポリクローナルモルモット抗体；Zatloukal K.ら, 2002, Am. J. Pathol., 160:255-263］について）インキュベートする。ＰＢＳ中で洗浄後、内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中の１％  Ｈ2Ｏ2（メルク（Merck））中で１０分間インキュベートすることによりブロックして、次いでＰＢＳ中で洗浄する。次の工程において、切片は、一次抗体と共に加湿チャンバー（ヌンク（Nunc））中で室温で６０分間インキュベートして、ＰＢＳで３回洗浄する。次に切片は、ＰＢＳ中に１：１００希釈した、マルチ・リンク・ブタ抗ヤギ、マウス、ウサギ（Multi Link Swine anti-Goat, Mouse, Rabbit）イムノグロブリン（ダコ（Dako））と共に室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄して、ストレプトアビジン（Streptavidin）・ビオチン・西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体ＡＢＣ／ＨＲＰ（ダコ；ＳｏｌＡ  １：１００及びＳｏｌＢ  １：１００  ＰＢＳ中）と共に３０分間インキュベートする。あるいは、ＰＢＳ中に１：１００希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗モルモットイムノグロブリン二次抗体（ダコ）と共に３０分間インキュベートを実施し、続いてＰＢＳで３回洗浄する。次に、増幅希釈液中の１：５０ビオチニルチラミド溶液（ＴＳＡ（登録商標）ビオチン・システム（TSATM Biotin System）、ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ州、米国）を５分間適用することによりチラミド増幅を実施し、ＰＢＳで３回洗浄し、続いてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ溶液（ＰＢＳ中１：１００）と共に３０分間インキュベートする。
【０１５６】
ｐ６２ＣＴ抗体結合は、ＴＳＡ（登録商標）ビオチン・システムを用いて検出する。ユビキチン及びＫ８／１８抗体の反応性は、ＡＢＣ複合体（ABComplex）システム（ダコ）を用いて検出し、水道水で濯ぎ、続いてマウント剤のアクアテックス（Aquatex）（登録商標）（メルク）でカバースリップの切片に適用する。
【０１５７】
発色には、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ、ダコ）と共に５分間インキュベートを実施し、続いてＰＢＳ中で３回洗浄して、マイア（Mayr）のヘマローン（haemalaun）で対比染色し、次に水道水で濯いで、アクアテックス（登録商標）（メルク）でカバースリップをマウントする。
【０１５８】
Ｂ）  凍結切片の二重標識免疫蛍光顕微鏡法：凍結切片（３μm厚）は、クリオカット（Cryocut）（ライカ（Leica）ＣＭ３０５０、ライカ、ヌスロッホ（Nussloch）、ドイツ）を用いて切り出し、空気乾燥して、アセトン中に−２０℃で１０分間固定する。あるいは（特に核構造の保存が必要であるならば）、切片は、ＰＢＳ緩衝化４％ホルムアルデヒド中に室温で１５分間固定し、続いて−２０℃で５分間アセトン固定する。切片は、固定後空気乾燥するか、ＰＢＳ中で濯ぐ。
【０１５９】
次に、第１の一次抗体ｐ６２ＣＴ（ｐ６２のＣ末端ペプチド配列に対するポリクローナルモルモット抗体（Zatloukal K.ら, Am. J. Pathol., 2002, 160: 255-263））、Ｋ８（Ｋｓ８．７、プロジェン（Progen）、ハイデルベルク、ドイツ）、Ｋ１８（Ｋｓ１８．０４、プロジェン）、Ｋ８／１８（５０Ｋ１６０）、及びユビキチン（ＩＤ研究所（ID Labs Inc.）、ロンドン、オンタリオ州、カナダ）に対する抗体を、湿ったチャンバー（バイオアッセイ（Bioassay）プレート、ヌンク、ロシルデ（Roshilde）、デンマーク）中で室温で３０分間適用する。あるいは、抗体を４℃で一晩適用し、続いてＰＢＳで５分間３回洗浄する。
【０１６０】
次の工程では、第１の二次抗体を、加湿チャンバー中で遮光下で室温で３０分間適用し、続いてＰＢＳで５分間３回洗浄する。第２の一次抗体を湿ったチャンバー中で遮光下で室温で３０分間適用し、続いて再びＰＢＳで５分間３回洗浄する。更に、第２の二次抗体の適用を湿ったチャンバー中で遮光下で室温で３０分間実施し、続いて再びＰＢＳで５分間３回洗浄する。最後の抗体インキュベーション後、スライドを蒸留水、次にエタノールで数秒間濯いで空気乾燥する。
【０１６１】
使用される二次抗体は、例えば、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ザイメド（Zymed）、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）又はアレクサ（Alexa）４８８nm結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）、ライデン、オランダ）及びテトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）、又はＦＩＴＣ結合ブタ抗ウサギＩｇ（ダコ、グロストルップ（Glostrup）、デンマーク）及びＴＲＩＴＣ結合ウサギ抗モルモットＩｇ（ダコ）である。
【０１６２】
最後に標本は、モヴィオール（Mowiol）（１７％モヴィオール４−８８［カルビオケム（Calbiochem）、番号４７５９０４］、３４％グリセロール、ＰＢＳ中）又は他の市販のマウント剤でマウントする。
【０１６３】
全ての抗体は、ＰＢＳ中に希釈して、逐次インキュベーションに別々に適用する。蛍光色素結合抗体は、１６，０００×ｇで５分間遠心分離することにより、スライドへの適用の前に凝集体を除去する。陰性対照には、第１の抗体を、それぞれ、ＰＢＳ、免疫前血清又はアイソタイプ適合イムノグロブリンにより置換する。
【０１６４】
免疫蛍光標本は、レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ５１０レーザー走査顕微鏡、ツァイス（Zeiss）、オーバーコッヘン（Oberkochen）、ドイツ）で分析する。共局在化分析（デュアル標識化）のために、マルチトラック方式を用いてイメージを取得する。まとめられた画像は、共局在化の部位で黄色を含む緑色／赤色疑似カラーとして現れる。スライドは、遮光して＋４℃で貯蔵する。
【０１６５】
実施例３：  肝臓病変に及ぼす本発明の酸化防止剤の効果。
ＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウス肝臓の初期段階における形態学的変性の回帰に及ぼす本発明の酸化防止剤の影響を評価するために、陽性対照群の動物（ＤＤＣ又はＧＦのみに３〜７日間曝露）を、それぞれ、ミトＱ（ミト・キノール［１０−（３，６−ジヒドロキシ−４，５−ジメトキシ−２−メチルフェニル）デシル］トリフェニルホスホニウムブロミドとミト・キノン［１０−（４，５−ジメトキシ−２−メチル−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエン−１−イル）デシル］トリフェニルホスホニウムブロミドとの混合物）（キー・オーガニクス社（Key Organics Ltd）、ロンドン、英国により提供）、又はミト・ビタミンＥ［２−（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）エチル］−トリフェニルホスホニウムブロミド（キー・オーガニクス社、ロンドン、英国により提供）で更に３〜７日間処置したＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウスと比較する。
【０１６６】
注射には、ミトＱ又はミト・ビタミンＥを、酸化防止剤の溶解性を維持するのに充分なＤＭＳＯ（好ましくは１％）を補足したＰＢＳに溶解する。腹腔内又はi.v.（尾静脈）注射をマウスの対に与えて、ビヒクル注射対照と比較する。これらは、Smith R.A.J.ら, 2003, PNAS, 100(9): 5407-5412による２０mgのミトＱ/kg/日（７５０nmol）及び６mgのミト・ビタミンＥ/kg/日（３００nmol）の最大耐量に相当する。
【０１６７】
ミトＱ、若しくはミトＳ（ミト・キノール［１０−（３，６−ジヒドロキシ−４，５−ジメトキシ−２−メチルフェニル）デシル］トリフェニルホスホニウム・メタンスルホナートとミト・キノン［１０−（４，５−ジメトキシ−２−メチル−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエン−１−イル）デシル］トリフェニルホスホニウム・メタンスルホナートとの混合物）のようなミトＱ誘導体、又はミト・ビタミンＥを飼料に補足する。用量は、水又は液体飼料の消費量及びマウスの体重を計測することにより求める。マウスには、その飲料水に入れて３〜７日間、肉眼的な何の中毒の徴候もなしに、５００μM若しくは１mMのミトＱ若しくはミトＳ（それぞれ、２３２μmol/kg/日又は３４６μmol/kg/日の最大耐量、５００μM及び１mM飼料についての１５４及び２３０mg/kg/日に相当）、又は５００μMミト・ビタミンＥ（６０mgのミト・ビタミンＥ/kg/日に相当する１０５μmol/kg/日の最大耐量）を摂取させる（Smith R.A.J.ら, 2003, PNAS, 100(9): 5407-5412による）。
【０１６８】
更に別の試験では、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒動物の群を同時にミトＱ（ミトＳ）又はミト・ビタミンＥで３〜７日間処置して、ＤＤＣ又はＧＦのみに３〜７日間曝露した対照群と比較する。
【０１６９】
別のセットの実験では、ＰＢＳ中の１％のＤＭＳＯに溶解した３〜１２mg/kgのミトＱをＤＤＣ中毒マウスに３日間同時に腹腔内投与して、対照動物と比較する（陽性対照群は、ＤＤＣ中毒マウスに相当し、一方陰性対照は、非ＤＤＣ中毒であるがビヒクル注射動物に相当する）。
【０１７０】
これらの短期実験において、本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤（例えば、ミトＱ又はミトＳ）の影響を実際的に評価するために、細胞膨張及び／又はマロリー小体分析（典型的にはそれぞれＤＤＣ又はＧＦに長期曝露）の代わりに、門脈周辺の炎症細胞（Grisson's Trias）の存在（又は非存在）、及び壊死、細胞骨格の虚脱のような肝細胞損傷の程度（図２及び３を参照のこと）を陽性対照と比較する。細胞膨張及びマロリー小体は両方とも、この短期のＤＤＣへの曝露では統計的評価ができる程に形成されないという事実により、これらの実験には相応しくない。
【０１７１】
全体的に見て、ミトＱ処置下では、類洞に縁取られた肝細胞の索により表される正常な構造が再び現れる。肝細胞の形態は、核のサイズと形態及び細胞質の構造に関して正常である。更に、炎症細胞（例えば、好中球、リンパ球）の数は、本発明の酸化防止剤での処置により著しく減少する。
【０１７２】
ＤＤＣで中毒にした（８〜１０週間）マウスを用いる長期実験では、処置動物の肝臓試料中の細胞膨張及び／又はマロリー小体（ＭＢ）の存在（又は非存在）を求めて、対照群の動物と比較する。
【０１７３】
１つのセットの実験では、ＤＤＣ又はＧＦでの１０週間の中毒直後、試験動物にミト・ビタミンＥ又はミトＱ（又はミトＳ）のi.p.又はi.v.（尾静脈）注射を続く７日間投与する（マウスの対に与え、ビヒクル注射対照と比較する）。
【０１７４】
別のセットの実験では、１０週間のＤＤＣ中毒後、試験動物にミトＱ（１．２５mg/kg）を続く７日以内に２回（対応する週の１日目と４日目）i.p.注射を投与し、日常的な組織学法（Luna L.G., 1968, 軍病理学研究所の組織染色方法のマニュアル（Manual of Histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology）, 第3版, マグロー・ヒル（McGraw Hill）, ニューヨークによる標準的ヘマトキシリン／エオシン染色）により分析する。細胞膨張の程度及びマロリー小体の数は、適切な対照と比較すると、ＤＤＣで中毒にしたミトＱ処置動物において大きく減少している（図４〜６）。
【０１７５】
更に別のセットの実験では、ＤＤＣ又はＧＦで８〜１０週間中毒にしたマウスに、続いての７〜１４日間ミトＱ（ミトＳ）又はミト・ビタミンＥをその飲料水に入れて摂取させる。
【０１７６】
また別のセットの実験では、ミトＱ（ミトＳ）又はミト・ビタミンＥを、６週間ＤＤＣ又はＧＦで中毒にしたマウスに適用して（続く４週間、更なるＤＤＣ又はＧＦと同時に、それぞれ最大耐量の１０〜５０％のミト・ビタミンＥ又はミトＱ（ミトＳ）を用いることによる）、１０週間ＤＤＣ又はＧＦのみで中毒にした対照群の動物と比較する。
【０１７７】
別のセットの実験では、ＤＤＣ又はＧＦで１０週間中毒のマウスを、続いて４週間回復させる。次に同時のＤＤＣ又はＧＦでの再中毒とミト・ビタミンＥ又はミトＱ／ミトＳでの処置によって、毒性記憶効果（２４〜７２時間のＤＤＣ又はＧＦ中毒への再曝露の結果として）が、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤での処置により減少するか又は無くなることが明らかになる。
【０１７８】
肝障害における酸化防止剤の予防効果を評価するために、ＤＤＣ−又はＧＦ給餌マウスの１群に、それぞれ最大耐量の１０〜５０％のミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥでの同時処置を行い、次に１０週間のＤＤＣ−又はＧＦ中毒のみに曝露した対照動物と比較する。
【０１７９】
１つのセットの実験では、初期回復期間（４週間）内に、ミトＱ、ミトＳ又はミト・ビタミンＥの投与を行い、続いて次の２４〜７４時間ＤＤＣ又はＧＦで中毒にし、そして対照の非処置動物と比較する。
【０１８０】
この一般的プロトコールに種々の改変を加えることができることは、当業者には明らかであろう。
【０１８１】
全体的に見て、それぞれＤＤＣ又はＧＦでの短期及び長期の中毒の両方で、肝臓の顕著な変性が、肝疾患及び／又は上皮性癌の治療又は予防に使用される本発明の酸化防止剤の適用によって、大きく改善又は縮小する。
【０１８２】
実施例４：  本発明の酸化防止剤による処置を伴うか、又は伴わない、ＤＤＣ中毒マウスに由来する単離ミトコンドリアにおける酸化ストレスの測定（トコフェロールキノン含量の測定）
４．１．  マウス肝ミトコンドリア（ＭＬＭ）の単離
ラット心ミトコンドリアの方法（Staniek K.とNohl H., 1999, Biochem. et Biophys. Acta, 1413: 70-80；Mela L.とSietz S., 1979, Methods in Enzymology, アカデミック・プレス社（Academic Press Inc.）: 39-46）を、実施例３の種々の動物群から単離したマウス肝臓（ラット肝臓に比較して重量約１０％）に適応させる。肝臓の単離は、４℃で実施する。各肝臓は、細かく切り出し、貯蔵のために液体窒素（Ｎ2）中でショック凍結する。調製緩衝液（０．３Ｍショ糖、１mM  ＥＤＴＡ、２０mMトリエタノールアミン、ｐＨ７．４）に加えてトコフェロール酸化を防ぐために１０mg/L  ＢＨＴ（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドロキシトルエン）及び１mMジエチレントリアミン五酢酸（Ｆｅキレート剤）中で解凍後、組織を小片に切り出し、調製緩衝液で４×洗浄し、ポッターピストゥル（Potter pistil）により１５ml緩衝液中で５×穏やかにホモジナイズし、３０mlに希釈して、５７０ｇで１０分間遠心分離する。上清を２層のチーズクロスで濾過する。このミトコンドリアを７４００ｇで１０分間ペレット化し、手動で３０ml緩衝液中に穏やかに再懸濁し、再びペレットにして上記のように再び洗浄し、最後に約２００ml緩衝液に再懸濁する。タンパク質濃度は、３〜６mgの収量を期待して、ビウレット（Biuret）法（標準としてＢＳＡ、二重測定には少なくとも２００mgのタンパク質を要する）により測定する。
【０１８３】
標準化の目的で、チトクロム濃度は、０．２％（v/v）トリトンＸ−１００による膜の可溶化後に、亜ジチオン酸還元−空気酸化したものの差スペクトル（アミンコ（Aminco）ＤＷ２０００光度計、二重測定には約０．５〜１mgのミトコンドリアタンパク質を要する）（Williams J.N.,Jr., 1964, Archives of Biochemistry and Biophysics, 107: 537-543）から計算する；ラット肝ミトコンドリアから外挿される、健常ミトコンドリア中のＣｙｔ（ａ＋ａ3）、Ｃｙｔ  ｃ、Ｃｙｔ  ｃ1及びＣｙｔ  ｂの予想濃度：０．１〜０．３nmol/mg各タンパク質（Wakabayashi T.ら, 2000, Pathology International, 50: 20-33）。
【０１８４】
対照として、全ての細胞膜を含む未加工ホモジネート（最初のホモジネート後）のアリコートを保持すべきである。最も軽い画分（ミクロソーム）を含む膜全体を、Murias M.ら, 2005, Biochemical Pharmacology, 69: 903-912により１６５，０００ｇで４０分間ペレット化（超遠心分離）し、洗浄して５mLの調製緩衝液中で再ペレット化して、最後に約２００mLの緩衝液に再懸濁する。タンパク質濃度は、上記のように測定する。
【０１８５】
４．２．  トコフェロールキノン（ＴＱ）の分析
全ＭＬＭ（パラグラフ４．１．を参照のこと）を使用することができる。１ml  Ｈ2Ｏ中の２〜５mgの量のタンパク質（ミトコンドリア、膜全体又は種々の画分）を、５mM  ＳＤＳ及び２nmol  ＵＱ6（ユビキノン−６、内部標準として）と混合して、３mlの無気エタノール／ヘキサン（２：５）で抽出する。有機相をアルゴン下で留去して、残渣を１２０mlエタノールに溶解する。４０mlを、ＨＰＬＣ分析（１試料当たり二重分析）のためにＣ１８カラムを持つウォーターズ（Waters）ＬＣ１モジュールに載せて使用する。キノン及びトコフェロールは、エタノール／メタノール／アセトニトリル／ＨＣｌＯ4（４００：３００：３００：１）中の５０mM  ＮａＣｌＯ4で１ml/分で溶出して、光学的（ＴＱには２６８nm、ＵＱ6並びに内因性ＵＱ9及びＵＱ10には２７５nm）又は電気化学的（＋０．６Ｖ、トコフェロール及びキノールについて）に、Gille L.ら, 2004, Biochemical Pharmacology, 68: 373-381により検出する；健常ミトコンドリア中の予想ＴＱ含量は、トコフェロール又はユビキノンに対して１〜５％である（Gille L.ら, 2004, Biochemical Pharmacology, 68: 373-381）。
【０１８６】
全体的に見て、これらの実験は、対照及び本発明の酸化防止剤で処置したＤＤＣマウスに比較すると、ＤＤＣ中毒マウスのミトコンドリアではＴＱレベルの上昇を示している。
【０１８７】
４．３．  マウス肝ミトコンドリア（ＭＬＭ）中の追加の酵素複合体の分析
種々の群の動物に由来するＭＬＭ（実施例３のプロトコールを参照のこと）を凍結して、２〜３回解凍することにより、膜を破砕して種々の試薬（下記を参照のこと）が接近できるようにする（Fato R.ら, 1996, Biochemistry, 35: 2705-2716による）。光度測定法は、２５℃で実施することができ（アミンコＤＷ２０００デュアル波長光度計）、１回のアッセイ当たり約５〜２０mgのミトコンドリアタンパク質を要する：
【０１８８】
ａ）  アコニターゼ（スーパーオキシド損傷のマーカー）（James A.M.ら, 2005, JBC, 2005年3月23日にManuscript M501527200として公表）。このアッセイは、０．６mM  ＭｎＣｌ2、５mMクエン酸Ｎａ、０．２mM  ＮＡＤＰ+、０．１％トリトンＸ−１００、０．４U/mLイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及び５０mMトリス（ｐＨ７．４）を含む。ＮＡＤＰＨ生成を３４０〜４１０nmで追跡する；健常ミトコンドリアの予想活性：単離ミトコンドリア１mg当たり約６０nmol/分、Senft A.P.ら, 2002, Toxicology and Applied Pharmacology 178: 15-21による。
【０１８９】
ｂ）  複合体Ｉ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ）（Estornell E.ら, 1993, FEBS, 332, No.1,2: 127-131からの改変）：このアッセイは、０．１mM  ＮＡＤＨ、０．０５mMデシルユビキノン、２mM  ＫＣＮ、２０mMアンチマイシンＡ及び２０mMトリス（ｐＨ７．５）を含む。ＮＡＤＨ崩壊を３４０〜４１０nmで追跡する。２mg/mLロテノンによる阻害によって、非特異的キノン還元を補正する；健常ミトコンドリアの予想活性：約１００〜３００nmol/(分・mg)、Stuart J.A.ら, 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745及びBarreto M.C., 2003, Toxicology Letters, 146: 37-47による。
【０１９０】
ｃ）  複合体II（コハク酸デヒドロゲナーゼ）（Gille 2001からの改変）：このアッセイは、２mMコハク酸、０．０５mMデシルユビキノン、２mM  ＫＣＮ、２０mMアンチマイシンＡ及び２０mMトリス（ｐＨ７．５）を含む。キノン崩壊を２７５−３２０nmで追跡する。２５mMマロン酸による阻害によって、非特異的キノン還元を補正する；健常ミトコンドリアの予想活性：単離ミトコンドリア１mg当たり約７０〜１００nmol/分、Barreto M.C., 2003, Toxicology Letters, 146: 37-47による。
【０１９１】
ｄ）  複合体III（チトクロムｂｃ1）（Stuart J.A.ら, 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745の改変プロトコール）。このアッセイは、０．０５mMデシルユビキノール（デシルユビキノンから、亜ジチオン酸還元及びヘキサン抽出により調製）、１５mM  Ｃｙｔ  ｃ、mM  ＫＣＮ及び２０mMトリス（ｐＨ７．５）を含む。Ｃｙｔ  ｃ還元は、５５０−５４０nmで追跡する。２０mMアンチマイシンＡによる阻害によって、非特異的キノール酸化を補正する；健常ミトコンドリアの活性：単離ミトコンドリア１mg当たり約８０nmol/分、Stuart J.A.ら, 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745による。
【０１９２】
ｅ）  複合体IV（チトクロムオキシダーゼ）（Stuart J.A.ら, 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745から改変）。このアッセイは、１５mM還元Ｃｙｔ  ｃ（亜ジチオン酸還元及び過剰亜ジチオン酸の空気酸化により調製）及び２０mMトリス（ｐＨ７．５）を含む。Ｃｙｔ  ｃ酸化は、５５０−５４０nmで追跡する；健常ミトコンドリアの活性：単離ミトコンドリア１mg当たり約１mmol/分（Stuart J.A.ら, 2005, Free Radical Biology & Medicine, 38: 737-745）。
【０１９３】
実施例５：  酸化ストレス誘導タンパク質（ヘムオキシゲナーゼＩ）の評価。
酸化ストレスにより誘導されることが知られているヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）タンパク質発現（Suematsu M.とIshimura Y., 2000, Hepatology, 31(1): 3-6）を評価するために、同時にミトＱ（ＰＢＳ中の１％  ＤＭＳＯに希釈）又はビヒクルだけで３日間処置したＤＤＣ中毒マウスに由来するタンパク質抽出物を用いて、標準的ウェスタンブロット分析を実施する（実施例３のプロトコールを参照のこと）。
【０１９４】
肝組織は、２μg/mlロイペプチン、２μg/mlペプスタチン、２μg/mlアプロチニン、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、及び２mMジチオトレイトールを補足した氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０mM  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、１％デオキシコール酸、１％  ＮＰ−４０）に再懸濁し、続いて氷上での超音波処理によりホモジナイズする（５秒間の２回バースト）。氷上で２０分間インキュベーション後、溶解物は、４℃で１３，０００rpmで１５分間の微小遠心管での２回の遠心分離工程により清澄にして、上清を回収する。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Bradford）アッセイ（バイオラッド（Biorad））により、ウシ血清アルブミンを標準として用いて測定する。等量のタンパク質（典型的には１０〜３０μg）を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、セミドライ（Semidry）−ブロッティング（ＴＥ７０、アマーシャム（Amersham））によりポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ハイボンド−Ｐ（Hybond-P）、アマーシャム）に電気泳動で移す。この膜を室温でブロッキング液［ＴＢＳ−Ｔ（２５mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３７mM  ＮａＣｌ、３mM  ＫＣｌ、０．１％トゥイーン−２０を含む）中の５％ミルク］中で室温で１時間ブロックして、一次抗体液（ＴＢＳ−Ｔ／１％ミルク中で調製）と共に４℃で一晩撹拌しながらインキュベートする。下記抗原に特異的な抗体を使用する：ＨＯ−１（１：１０００希釈；ストレス遺伝子（Stress Gene））（構成的に発現するアイソホームのＨＯ−２（３６kDa）と交差反応する）、及びβ−アクチン（１：５０００、シグマ）。一次抗体液の除去及びＴＢＳ−Ｔ中での数回の洗浄後、膜をＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合二次抗体（ウサギ抗マウス、１：１０００；ダコ）と共に室温で１時間インキュベートする。ＴＢＳ−Ｔ中で数回洗浄後、化学ルミネセンス（ＥＣＬ、アマーシャム）により検出を実施してＸ線フィルムに感光させる（図７）。バンドの強度は、ケミイメージャー５５００（ChemiImager 5500）ソフトウェア（アルファ・イノテック（Alpha Innotech））を用いて密度測定により分析することができ、各シグナルは、対応するＨＯ−２の強度（ＤＤＣ中毒群の動物に比較すると、ミトＱ処置によりＨＯ−１の７倍減少を示している）、あるいはβ−アクチンに対して標準化する。
【０１９５】
ミトＱ処置下でのヘムオキシゲナーゼ１のＤＤＣ誘導過剰発現の著しい減少（図７）は、本発明の酸化防止剤により酸化ストレスが大きく減少することを示唆している。
【０１９６】
長期実験では、ＤＤＣ中毒中のマウスで増大することが知られているサイトケラチン８（Stumptner C.ら, 2001, Journal of Hepatology, 34: 665-675）及び／又は（Ｎ）ＡＳＨ患者における減少が報告されているカタラーゼ（Videla L.A.ら, 2004, Clinical Science, 106: 261-268）のタンパク質発現レベルを評価することができる。
【０１９７】
肝細胞損傷の高感度マーカーに相当する脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）のタンパク質発現レベル（Monbaliu D.ら, 2005, Transplant Proc., 37(1): 413-416）を測定する。ウェスタンブロット分析は、正常マウスに比較すると、ＤＤＣ中毒マウスにおけるＦＡＢＰタンパク質の有意な低下を示す。更に、ＤＤＣ中毒動物のミトＱ処置下ではＦＡＢＰは、ほぼ対照マウスＦＡＢＰタンパク質発現値（対照は、ビヒクルのみで処置した非中毒群の動物に相当する、実施例３を参照のこと）に達しており、そしてこのことは、本発明の疾患の治療又は予防におけるミトＱの効果を示唆している。
【０１９８】
本発明の酸化防止剤で処置したＤＤＣ中毒マウスに由来するクリオスタット切片中のアポトーシス細胞の量は、先行技術において知られている抗カスパーゼ３免疫組織化学標準法（Brekkenら, 2003, The Journal of Clinical Investigation, 111, 4: 487-495）により半定量し、適切な対照と比較することができる。
【０１９９】
更に、酸化防止剤で処置したＤＤＣ中毒マウスのホモジェネート中のプロトポルフィリンレベルは、蛍光アッセイ（Stumptner C.ら, 2001, Journal of Hepatology, 34: 665-675）を用いることにより測定して、適切な対照と比較することができる。
【０２００】
実施例６：  血液パラメーターに及ぼす本発明の酸化防止剤の効果の評価。
本発明の肝損傷の尺度を提供する、肝特異的酵素の血清レベルをアクチテスト（Actitest）（バイオプレディクティブ（Biopredictive）、ウイユ（Houilles）、フランス）でモニターする。ａ2−マクログロブリン、ハプトグロビン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、総ビリルビン、アポリポプロテインＡ１及びアラニンアミノトランスフェラーゼの血清レベルは、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒、対照、及び標的化酸化防止剤でも処置した対応するＤＤＣ−又はＧＦ曝露動物から、Poynardら, 2003, Hepatology 38: 481-492に記載される方法を用いて、実施例３の一般的な時間軸方策により測定する。
【０２０１】
肝損傷、特に線維症の尺度としてヒト血清でも行われるアクチテストは、本発明の酸化防止剤によるこれらの疾患の患者の治療の効果をモニターするために同様に利用することができる。
【０２０２】
種々の試験動物群からの血清において、肝損傷を示す以下のパラメーター、即ち、ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ／ＧＯＴ）及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）を、市販のキット（番号：１１５５２４１４；１１８７６８０５２１６；１１８７６８４８２１６；１１９２９９９２；全てロッシュＡＧ（Roche AG）、スイスから購入）を日立／ロッシュ（Hitachi/Roche）９１７分析機で利用して臨床診断の標準プロトコールにより測定する。
【０２０３】
本発明の化合物で処置した動物の血清肝酵素（例えば、アラニン−及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼなど、図８を参照のこと）の減少は、このような処置試料における肝損傷の減少を示しており、そして本発明の疾患におけるこれらの化合物の治療効果を支持する。
【０２０４】
実施例７：  組織切片における反応性酸素種（ＲＯＳ）の測定
ＤＤＣ−又はＧＦ中毒及び対照組織からの肝臓標本におけるＲＯＳのインサイチュー生成を検出するために、ジヒドロエチジウムによる蛍光顕微鏡撮影法（ＤＨＥ、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes））を標準プロトコール（例えば、Brandes R.P.ら, 2002, Free Radic Biol Med., 32(11): 1116-1122）により実施する。ＤＨＥは、細胞に自由に透過でき、Ｏ2の存在下ではエチジウムに酸化されるが、ここでＤＮＡに挿入されることにより核内に捕捉される。エチジウムは、４８８nmで励起され、６１０nmの発光スペクトルを持つ。
【０２０５】
肝臓試料は、ＯＴＣ組織テック（OTC Tissue Tek）（サクラ・ファインテック・ヨーロッパ（Sakura Finetek Europe）、ズーテルワウデ（Zoeterwoude）、オランダ）に包埋して、液体窒素冷却イソペンタンを用いて凍結する。次に試料を切片（５μm〜３０μm）に切り出し、ガラススライド上に載せる。ジヒドロエチジウム（５〜２０μmol/L）を各組織切片に適用する。このスライドを次に、遮光した加湿チャンバー中で３７℃で３０分間インキュベートして、３７℃で緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する（２〜３回）。次に切片にカバーガラスを載せる。蛍光顕微鏡法又は５８５nmロングパスフィルターによるレーザー走査共焦点イメージングを用いて、ＤＨＥの画像を得る。
【０２０６】
当該分野において確立している別のアプローチにより、ルシゲニン化学ルミネセンスアッセイを用いて、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒肝組織対対照肝組織におけるＲＯＳ産生の測定が可能である（Goerlach A.ら, 2000, Circ Res., 87(1): 26-32）。肝組織の標本を、１mlの５０mmol/L  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１３５mmol/L  ＮａＣｌ、１mmol/L  ＣａＣｌ2、１mmol/L  ＭｇＣｌ2、５mmol/L  ＫＣｌ、５．５mmol/Lグルコース、及び５μmol/Lルシゲニン（電子受容体として）を含むバイアル中で平衡化する。スーパーオキシドとルシゲニンの間の光反応は、化学ルミネセンスリーダーを用いて検出する。化学ルミネセンスシグナルは、１５〜３０分間にわたり測定した乾燥組織１mg当たり１分間当たりの平均カウントとして表される。化学ルミネセンスシグナルデータは、標本の非存在下で観測されるバックグラウンドの化学ルミネセンスを差し引いた後に明らかになる。
【０２０７】
このアプローチにより、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウスに由来する肝臓中のＲＯＳの上昇を立証することができるが、これは、本発明の疾患に罹患している患者で行われる観察結果に似ている。
【０２０８】
実施例８：  ＤＤＣ又はＧＦに曝露されたマウスにおける反応性酸素種（酸化損傷）の減少に及ぼす本発明の酸化防止剤の効果。
試験動物のＤＤＣ−又はＧＦ中毒に関する、及びその酸化防止剤での処置に関する時間軸及び処方計画の一般的方策は、形態学的異常の測定のために使用された実験設定と同一である（実施例３を参照のこと）。
【０２０９】
本発明の酸化防止剤、例えば、ビタミンＥ、補酵素Ｑ10の誘導体又はグルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質の適用は、ＤＤＣ又はＧＦに曝露された肝臓におけるＲＯＳレベルの有意な減少を提供する。この結果は、更に肝損傷におけるＲＯＳの影響を意味しており、この損傷が、ＲＯＳの主要な細胞内供給源であるミトコンドリアに対して、例えば、ミトＱ／ミトＳ又はミト・ビタミンＥを標的化することにより緩和されることを立証している。標的化酸化防止剤での処置による、実施例７の方法で測定されるＲＯＳのレベルの減少は、本発明の疾患に対するこれらの化合物の治療効果を示している。
【０２１０】
実施例９：  肝細胞株における反応性酸素種（ＲＯＳ）の測定
ヘパトーマ細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２又はＨｅｐ３Ｂ）、ＳＮＵ−３９８肝細胞癌由来細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２３３、ＬＧＣプロモケム（LGC Promochem）、ドイツ）、ＨＵＨ−７ヒト癌細胞由来細胞株（ＪＣＲＢ細胞バンク（Japanese Collection of Research Bioresources）、ＪＣＲＢ  ０４０３）又はＴｉｂ−７３マウス胎生肝細胞株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ７３＝ＢＡＬ／ｃマウス由来のＢＮＬ  ＣＬ２、メリーランド州、米国）を利用する別の簡単なセットの実験により、ＤＤＣ中毒によるこれらの細胞中のＲＯＳ産生が測定できる。グルタチオン合成阻害剤のＬ−ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシミン（ＢＳＯ）は、内因性酸化ストレスを上昇させるための代替物として利用される（Kito M.ら, 2002, Biochem Biophys Res Commun., 291(4): 861-867）。
【０２１１】
ＣｏＣｌ2がミトコンドリアに影響を及ぼすことが最近証明されている（Jung JYとKim WJ., 2004, Neurosci Lett., 371: 85-90）ので、分化した細胞株におけるＲＯＳ産生を測定するために、ＨｅｐＧ２を代わりに１００μM  ＣｏＣｌ2（シグマ（Sigma））によって刺激する（Bel Aiba RSら, 2004, Biol. Chem. 385: 249-57）。
【０２１２】
培養細胞で（並びに単離細胞小器官又は全組織中で）充分に確立した別のアプローチは、Chem Biol Interact. 2000 Jul 14; 127(3): 201-217にしたがいアンチマイシンＡにより（図１０）、又はルシゲニン化学ルミネセンスアッセイを用いてロテノンにより（Goerlach A.ら, 2000, Circ Res., 87(1): 26-32）誘導されるＲＯＳ産生の測定を可能にする。
【０２１３】
例えば、ヘパトーマ細胞株におけるＲＯＳ産生を測定するために、実施例８の標準的実験プロトコールが適用される。試験ヘパトーマ細胞は、９６ウェルプレートで培地（１０％  ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ、ギブコ（Gibco））中で８０％コンフルエンシーまで増殖させ、次にＨＢＳＳで洗浄して、暗所でＤＨＥ（１０〜５０μM）と共に３７℃で１０分間インキュベートする。次に細胞をハンクス液（Hank's balanced salt solution）（ＨＢＳＳ、ギブコ）で２回洗浄することにより、過剰の染料を除去する。蛍光は、蛍光顕微鏡（オリンパス（Olympus）、ハンブルク、ドイツ）でモニターする。
【０２１４】
あるいは、ＲＯＳの生成は、蛍光ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ；Djordjevic T.ら, 2004, Antioxidants & Redox Signaling, 6: 713-720）に変換される、蛍光プローブの５−（及び６）−クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸アセチルエステル（ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡ、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）、ゲッティンゲン（Goettingen）、ドイツ）を用いることにより測定される。マイクロプレートリーダー（テカン（Tecan）、クライスハイム（Crailsheim）、ドイツ）でＤＣＦ蛍光を測定するために、細胞（例えば、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ又はＳＮＵ−３９８）を９６ウェルプレートで８０％コンフルエンシーまで増殖させる。次に細胞をハンクス液（ＨＢＳＳ、ギブコ）で２回洗浄して、Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ、１０μM）を含むＨＢＳＳに溶解したＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡ（８．５μM）と共に暗所で３７℃で１０分間インキュベートすることにより、ＮＯの形成を防ぐ。過剰の染料を除去するためにＨＢＳＳで数回洗浄後、４８０nm励起及び５４０nm発光波長を用いて蛍光をモニターする。ＤＣＦ蛍光は、アラマー・ブルー（Alamar Blue）試験を製造業者の取扱説明書により用いて生存細胞の数に対して標準化する（バイオソース（Biosource）、ニベル（Nivelles）、ベルギー）。簡単に述べると、細胞をアラマー・ブルーと共にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で３７℃でインキュベートすることにより、指示薬を酸化型（青色）から完全還元型（赤色）に変化させる。次に吸光度を５８０nmの波長で測定する。
【０２１５】
場合により、ＲＯＳ産生は、ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡ染色細胞のフローサイトメトリー分析により評価する。細胞を取り出し、トリプシン処理により回収し、遠心分離により集めて、ＨＢＳＳに１×１０6細胞/mlの濃度で再懸濁する。次に細胞に、刺激前に暗所で３７℃で１５分間８．５μM  ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡを加える。ＤＣＦ蛍光は、フローサイトメーター（パルテック（Partec）、ミュンスター（Muenster）、ドイツ）で４８０nm励起及び５４０nm発光波長を用いて、１０，０００細胞を分析することによりモニターする。
【０２１６】
ＤＤＣ（ＥＣ50＝５０μg/ml培地）、又は１００μM以下のＢＳＯを補足した培地（ＤＭＥＭ及び１０％  ＦＣＳ、ギブコ）中で７２時間以内インキュベートしたヘパトーマ細胞株は、本発明の疾患に罹患している患者で行われる観察結果に似ている、別の適切なインビトロモデルである。
【０２１７】
実施例１０：  ＤＤＣ−、ＢＳＯ−、アンチマイシンＡ−（又はロテノン−）中毒又はＣｏＣｌ2誘導培養細胞の酸化損傷の減少に及ぼす本発明の酸化防止剤の効果。
標準プロトコールを利用し、そして実施例９の時間軸の一般的な方策にしたがうことにより、それぞれＤＤＣ又はＢＳＯで中毒にして、同時にミトＱ／ミトＳ又はミト・ビタミンＥ［ミトＱではＥＣ50＝０．５１nM及びミト・ビタミンＥではＥＣ50＝４１６nMに相当する濃度（Jauslin M.L.ら, 2003, FASEB J., 2003, (13): 1972-1974による）］で処置したヒト細胞株は、ＲＯＳ形成が有意に減少する。
【０２１８】
別の実験では、１００μM  ＣｏＣｌ2（シグマ）により刺激されたＨｅｐＧ２を使用する（Bel Aiba R.S.ら, 2004, Biol. Chem. 385: 249-57）。実施例９に記載された実験設定により、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートで培養して、実験の前の１６時間血清を欠乏させる。次にＨｅｐＧ２をＨＢＳＳ（ハンクス液、ギブコ）で１回洗浄して、０．５〜１０μMの濃度範囲のミトＱ又はそれぞれの量のＤＭＳＯ（シグマ）と共にインキュベートする。１５分後、ＤＣＦを細胞に加え（最終濃度８μM）、細胞を染料と共に１０分間インキュベートする。装填後、培地を除去して、ミトＱ及びＣｏＣｌ2（１００μM）を含む新鮮ＨＢＳＳを加える。蛍光は、プレートリーダー（テカン・サファイア（Tecan Safire））で０、１０、２０及び３０分後に測定する（Djordjevic T.ら, 2005, Free Radic Biol Med. 38: 616-30）。
【０２１９】
５μMミトＱで処置した非刺激細胞は既に、基礎量のＲＯＳ産生の減少を示す。ＣｏＣｌ2刺激ＲＯＳ産生（１００μM  ＣｏＣｌ2）は、５μMミトＱにより有意に低下するが、このことは、本発明の酸化防止剤が、これらの細胞における基礎量及びＣｏＣｌ2刺激ＲＯＳレベルを有意に低下させることを示唆している（図９）。
【０２２０】
別のアプローチは、例えば、ＨＵＨ−７又はＴｉｂ−７３においてルシゲニン化学ルミネセンスアッセイ（実施例９と同様の実験設定）を用いることにより、アンチマイシンＡ又はロテノンにより誘導されたＲＯＳ産生の測定を可能にする。ＨＵＨ−７細胞は、６ウェルプレートでインキュベートして、ＤＭＥＭ（ギブコ）に溶解した０〜１０００nmolの濃度範囲のミトＱ（又はミトＳ）を同時に伴うか、又は伴わずに、０〜２５μM（好ましくは０、１及び５μM）の濃度のアンチマイシンＡを使用することにより、３７℃で３時間刺激する。３回連続洗浄後、細胞は、１mlの５０mmol/L  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１３５mmol/L  ＮａＣｌ、１mmol/L  ＣａＣｌ2、１mmol/L  ＭｇＣｌ2、５mmol/L  ＫＣｌ、５．５mmol/Lグルコース、及び５μmol/Lルシゲニン（電子受容体として）を含むプレート中で平衡化する。化学ルミネセンスリーダー（ルミスター（Lumistar）、ＢＭＧラボラトリーズ、ドイツ）を用いて、スーパーオキシドとルシゲニンの間の光反応を検出する。化学ルミネセンスシグナルは、１分当たりの平均カウントとして表し、細胞カウンター（キャシー・テクノロジー機器（Casy Technology Instrument）、シャルフェ・システム（Schaerfe-System）、ドイツ）により求めた細胞数に対して標準化する。
【０２２１】
全体的に見て、これらの実験は、ＲＯＳ形成の有意な減少を示しており（図１０）、そして本発明の肝障害におけるミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の治療的有用性を更に裏付けている。
【０２２２】
実施例１１：  ヌードマウスに及ぼす酸化防止剤化合物の効果の評価。
上皮性癌の治療及び／又は予防における本発明のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の効果を求めるための一般的方策は、ＤＤＣ−又はＧＦ中毒マウスに関して上述の治療パラダイム（実施例２〜７による）にしたがうが、代わりにヒト上皮細胞癌異種移植片をもつ免疫不全マウスを利用する（例えば、チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Charles Rivers Laboratories）（米国）からのＣＤ１  ν／νマウスに適用したヌードマウス腫瘍異種移植片）。標準法（Li K.ら, 2003, Cancer Res., 63(13): 3593-3597）により皮下に異種移植される腫瘍細胞株又は原発性腫瘍は、結腸腺癌、浸潤性乳管癌、小細胞及び非小細胞肺癌、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍及び胃腫瘍を含む。
【０２２３】
腫瘍由来細胞株（ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で増殖）は、対数期増殖に回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、１ml  ＰＢＳに再懸濁（２．５×１０7細胞/ml）して、ヌードマウス（Ｈｓｄ：無胸腺ν／ν、ハーラン・ウィンケルマン（Harlan Winkelmann）；５週齢と６週齢の間）の右わき腹に５×１０6細胞／マウス（０．２ml）で皮下注射する。腫瘍増殖は、１日おきに所定の期間（細胞タイプに応じて）モニターする。腫瘍サイズは、２つの垂直な直径及び皮膚表面上の高さの積により求める。
【０２２４】
例えば、ミトＱ（ミトＳ）でのこのようなマウスの処置は、腫瘍の増殖の縮小、腫瘍の壊死の増大及び腫瘍異種移植片の脈管化の低下を立証する。同様に、ヌードマウス腫瘍異種移植片におけるＲＯＳのレベルを上述のようにモニターすると、本発明の酸化防止剤で処置した異種移植腫瘍ではこれが減少する。
【０２２５】
当業者には、本発明の組成物及び方法に種々の改変を加えうることは明らかであろう。よって、そのような改変及び変法が、添付された請求の範囲及びその均等物の範囲に入ってくるならば、本発明は、それらを対象とすることが意図されている。本明細書に引用された全ての刊行物は、引用例としてその全体が取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】ＤＤＣへの短期（３日間）曝露によるマウス肝臓の肝細胞損傷の程度に及ぼすミトＱの効果  正常肝臓は、多くは中心静脈（三角形として注記）に配向する索として配置された肝細胞、及びこれらの肝細胞の索の間に位置する類洞（Ｃ、原本は白色、赤血球を表す幾つかの赤色の点を伴う）を特徴とする。肝細胞の核（Ａ、原本はＨ＆Ｅ染色で青色）は、大きいが、濃厚でなく、多くは１個の隆起した核小体を示し、細胞質（Ｂとして注記）は、Ｈ＆Ｅ染色で比較的均質な桃色に染まる。門脈（アスタリスクとして注記）付近にリンパ球又は顆粒球による浸潤は検出されない（倍率２００×）。
【図２】ＤＤＣへの短期（３日間）曝露によるマウス肝臓の肝細胞損傷の程度に及ぼすミトＱの効果  ＤＤＣで３日間中毒後、肝臓の構造は重篤に損傷される：肝細胞の規則正しい配置は消失する。特に門脈（アスタリスクとして注記）付近は、リンパ球及び顆粒球による浸潤が見られる（矢印として注記）。肝細胞は、細胞損傷の種々の指標を示す：細胞は、他の細胞への接触を失い、核は濃厚化して、細胞質はアポトーシスの指標として帯青桃色になる。細胞は、サイズが増大（膨張）して、細胞質は不均質になり、サイトケラチンの塊が現れる。更に、細胞は、壊死の別の指標としてその原形質膜を失う。注記Ａ、Ｂ、Ｃは、図１と同一である。門脈（アスタリスクでマーク）付近では、炎症細胞（矢印でマーク）及び損傷肝細胞（明確な細胞境界が認識できない、細胞膨張）が検出される。プロトポルフィリンの沈着（小さな褐色の点）は、プロトヘム・フェロリアーゼ（protohaem ferrolyase）に及ぼすＤＤＣ特異的効果を表す。注記Ａ、Ｂ、Ｃは、図１と同一である（倍率：４００×）。
【図３】ＤＤＣへの短期（３日間）曝露によるマウス肝臓の肝細胞損傷の程度に及ぼすミトＱの効果  ミトＱ（ＰＢＳ／１％  ＤＭＳＯ中ミトＱ（６mg/kgに相当する２２５nmol/動物/日））での同時処置後、類洞に縁取られた肝細胞の索を持つ正常構造が再び現れる。肝細胞の形態は、核のサイズと形態、及び細胞質の構造に関して正常である（実施例３）。門脈（アスタリスクでマーク）付近の炎症細胞の非存在；細胞膨張及びプロトポルフィリンの沈着のわずかな指標を除き、肝細胞は正常に見える。注記Ａ、Ｂ、Ｃは、図１及び２と同一である（倍率：４００×）。
【図４】ＤＤＣへの長期（１０週間）曝露によるマウス肝臓の肝細胞損傷の程度に及ぼすミトＱの効果  正常な非ＤＤＣ中毒マウス（月齢４ヶ月）では、肝臓の構造は一般に図１Ａに描かれている幼体非ＤＣＣ中毒マウスの構造と似ている（Ａ＝核、Ｂ＝細胞質、Ｃ＝類洞を参照のこと）。門脈（アスタリスク）付近の炎症は存在せず、肝細胞は索として配置されている。細胞の細胞質は、規則正しく染色され、同じサイズである；細胞の膨張やマロリー小体形成も見られない（倍率：４００×）。
【図５】ＤＤＣへの長期（１０週間）曝露によるマウス肝臓の肝細胞損傷の程度に及ぼすミトＱの効果  構造は、図１〜４と同一であり（Ａ＝核（原本は青色）、Ｂ＝細胞質（原本は桃色）、Ｃ＝類洞（原本は白色、赤色点を伴う）を参照のこと）、そして原本は褐色のＤは、胆管内の色素（大部分はプロトポルフィリン）を表す。ＤＤＣでの１０週間の中毒と、これに続くＤＤＣなしの１週間の回復後、肝細胞の配置はなお乱れている。肝細胞は、細胞骨格の崩壊から細胞膨張及びマロリー小体の形成（矢印）にわたる種々の程度の細胞損傷を示す。プロトポルフィリンの蓄積は、特に胆管（矢じり）において見られる、倍率：４００×。
【図６】ＤＤＣへの長期（１０週間）曝露によるマウス肝臓の肝細胞損傷の程度に及ぼすミトＱの効果  １０週間のＤＤＣ中毒後、回復期（ＤＤＣなし１週間）において、ミトＱの２回の注射による処置が行われる。回復中の改善は著しい；肝細胞形態のほんのわずかな変性が見られる。肝細胞の大多数は、正常に見え、そして細胞膨張及び／又はマロリー小体形成は存在しない。胆管の門脈（アスタリスク）の近くのプロトポルフィリンの蓄積もまた著しく減少する。構造は、図１〜５と同一であり（Ａ＝核（原本は青色）、Ｂ＝細胞質（原本は桃色）、Ｃ＝類洞（原本は白色、赤色点を伴う）を参照のこと）、原本は褐色のＤは、色素（大部分はプロトポルフィリン）を表す。倍率：４００×。
【図７】ミトＱで処置したＤＤＣ中毒マウスにおける誘導型のヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）の発現  ＨＯ−１（３２kDa、矢印により注記）のウェスタンブロット分析は、ＤＤＣ中毒下の著しい誘導（ＤＤＣを伴う溶媒対照を表すレーン番号４、５、６）を示すが、ミトＱによる処置（レーン７、８＝ＤＤＣなしの１１２mmol/kgミトＱ及びレーン９、１０＝ＤＤＣを伴う１１２mmol/kgミトＱ）によって、ＨＯ−１タンパク質発現の大幅な減少が起こる。レーン番号１〜３は、ＤＤＣなしの溶媒対照を表す。低分子量タンパク質マーカー（２２、３６、５５、６４、９８及び１４８kDa）を使用する。  レーン１〜１０のＨＯ−１タンパク質発現を標準化するために、ケミイメージャー５５００（ChemiImager 5500）ソフトウェア（アルファ・イノテック（Alpha Innotech））を用いることにより構成的に発現されるアイソホームのＨＯ−２（３６kDa）に対する比較を実施すると、ミトＱで処置したＤＤＣ中毒動物では、ＤＤＣ中毒マウスにより表される対照群に比較してＨＯ−１が７倍の減少を示している。全体的に見て、このセットの実験では、ＰＢＳ／１％ＤＭＳＯ中のミトＱを毎日注射（i.p.）したＤＤＣ中毒マウス（３日間）を分析して、適切な対照と比較する。
【図８】同時ミトＱ処置下のＤＣＣ中毒マウスの血清パラメーター  種々の動物群からの血清において、肝損傷を示す血清肝酵素、即ち、ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＧＰＴ；図中白の棒グラフにより表す）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ／ＧＯＴ；図中黒の棒グラフにより表す）の活性を、臨床診断の標準プロトコールにより、市販のキット（番号：１１５５２４１４；１１８７６８０５２１６；１１８７６８４８２１６；全てロッシュＡＧ（Roche AG）、スイスから購入）を日立／ロッシュ（Hitachi/Roche）９１７分析機で利用することにより測定する。  レーン：番号１及び２は、それぞれ非ＤＣＣ中毒群の動物及びＤＤＣ中毒マウスを表す。レーン３〜５は、ＤＣＣ中毒（３日間）及び同時ミトＱ処置動物（３、６及び１２mg/kgの濃度で）を表す。酵素活性の最も顕著な低減は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＧＰＴ、白の棒グラフにより注記）、次いでアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＧＯＴ、黒の棒グラフにより注記）を示し、一方ビリルビン活性は何の変化もないままである（データは示していない）。
【図９】同時にミトＱで処置したＨｅｐＧ２細胞における１００μM  ＣｏＣｌ2（０、１０、２０、３０分）によるＲＯＳ産生  ５μMミトＱは、未刺激細胞に既にある基礎量のＲＯＳ産生を減少させることができる。（レーン２を参照のこと）。ＣｏＣｌ2誘導ＲＯＳ産生（１００μM  ＣｏＣｌ2）は、５μMミトＱにより低下する。これらの結果は、５μMミトＱが、ＨｅｐＧ２細胞における基礎量及びＣｏＣｌ2刺激ＲＯＳレベルを有意に低下させることができることを立証している（実施例１０）。注記「Ａ」（レーン４、５、６）は、ＣｏＣｌ2で刺激したＨｅｐＧ２細胞を表す。ｘ軸は、ミトＱの濃度範囲［μM］を表し、そしてｙ軸は、相対ＤＣＦ蛍光［％］を表す。*ｐ＜０．０５、未刺激（０μMミトＱ）に対して；#ｐ＜０．０５、ＣｏＣｌ2に対して。
【図１０】ルシゲニン化学ルミネセンスアッセイを用いる、１μMアンチマイシンでのＨＵＨ−１細胞の刺激  ＨＵＨ−７細胞を６ウェルプレートでインキュベートして、３７℃で３時間、ＤＭＥＭ（ギブコ（Gibco））に溶解した濃度範囲０〜１０００nmolのミトＱを同時に伴うか、又は伴わない、濃度０〜２５μM（０、１及び５μM）のアンチマイシンＡで刺激する。スーパーオキシドとルシゲニンの間の光反応を検出する。ｘ軸は、ミトＱの濃度範囲［nM］を表し、一方ｙ軸は、細胞カウンターにより求めた細胞数に対して標準化後の１分当たりの平均カウント［cpm］として表される化学ルミネセンスシグナルを表す。全体的に見て、この図は、ＲＯＳ形成の有意な減少を示しており、そして本発明の肝障害におけるミトコンドリアを標的とした酸化防止剤の治療的有用性を更に裏付けている。
【図８】
2008506667.tif 000018
【図１０】
2008506667.tif 000019
【図１】
2008506667.tif 000020
【図２】
2008506667.tif 000021
【図３】
2008506667.tif 000022
【図４】
2008506667.tif 000023
【図５】
2008506667.tif 000024
【図６】
2008506667.tif 000025
【図７】
2008506667.tif 000026
【図９】
2008506667.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月16日(2007.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝疾患及び上皮性癌の治療又は予防用の医薬の製造における、酸化防止剤残基に共有結合した親油性カチオンを含むことを特徴とする、ミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用。
【請求項２】
親油性カチオンが、トリフェニルホスホニウムカチオンである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
化合物が、下記式：
【化１】
2008506667.tif 000028
［式中、Ｘは、結合基であり、Ｚ-は、アニオンであり、そしてＲは、酸化防止剤残基である］で示される、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
酸化防止剤残基Ｒが、キノン又はキノールである、請求項３記載の使用。
【請求項５】
化合物が、下記式：
【化２】
2008506667.tif 000029
で示される、請求項４記載の使用。
【請求項６】
酸化防止剤残基Ｒが、グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質である、請求項３記載の使用。
【請求項７】
グルタチオンペルオキシダーゼ模倣物質残基が、下記式：
【化３】
2008506667.tif 000030
で示される、請求項６記載のミトコンドリアを標的とした化合物の使用。
【請求項８】
酸化防止剤残基Ｒが、ビタミンＥ及びビタミンＥ誘導体、連鎖破壊型酸化防止剤（ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンを含む）、一般的ラジカルスカベンジャー（誘導体化フラーレンを含む）、スピントラップ剤（５，５−ジメチルピロリンＮ−オキシド、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン、及びα−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンの誘導体を含む）よりなる群から選択される、請求項３記載の使用。
【請求項９】
酸化防止剤残基Ｒが、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体である、請求項３記載の使用。
【請求項１０】
化合物が、下記式：
【化４】
2008506667.tif 000031
で示される、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
酸化防止剤残基Ｒが、ブチル化ヒドロキシアニソール又はブチル化ヒドロキシトルエンである、請求項３記載の使用。
【請求項１２】
酸化防止剤残基Ｒが、誘導体化フラーレンである、請求項３記載の使用。
【請求項１３】
酸化防止剤残基Ｒが、５，５−ジメチルピロリンＮ−オキシド、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン、α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン及びこれらの誘導体である、請求項３記載の使用。
【請求項１４】
化合物が、下記式：
【化５】
2008506667.tif 000032
で示される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
結合基Ｘが、Ｃ1〜Ｃ30炭素鎖（場合により１個以上の二重又は三重結合を含み、そして場合により１個以上の非置換又は置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル側鎖を含む）である、請求項３記載の使用。
【請求項１６】
結合基Ｘが、（ＣＨ2）n（ここで、ｎは、１〜２０の整数である）である、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
結合基Ｘが、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン又はデシレン基である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
アニオンＺ-が、薬剤学的に許容しうるアニオンである、請求項３〜１７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
Ｚ-が、ハロゲン化物である、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
Ｚ-が、臭化物である、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
Ｚ-が、アルカン−又はアリールスルホン酸のアニオンである、請求項１８記載の使用。
【請求項２２】
Ｚ-が、メタンスルホナートである、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
化合物が、下記式：
【化６】
2008506667.tif 000033
で示される、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
肝疾患が、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症、放射性肝傷害、肝癌、良性肝腫瘍及び限局性結節性過形成よりなる群から選択される疾患である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２５】
肝疾患が、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪症、胆汁うっ滞、肝硬変、栄養性肝傷害、中毒性肝傷害、感染性肝疾患、敗血症の肝傷害、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、アルファ１−アンチトリプシン欠乏症及び放射性肝傷害よりなる群から選択される疾患である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２６】
肝疾患が、アルコール性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝疾患である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２７】
肝疾患が、アルコール性脂肪性肝炎又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２８】
肝疾患が、アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１〜２３のいずれか１項記載のミトコンドリアを標的とした酸化防止剤化合物の使用。
【請求項２９】
肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項３０】
肝疾患が、感染性肝疾患である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項３１】
肝疾患が、Ｃ型肝炎である、請求項１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【国際調査報告】
2008506667.tif 000034
2008506667.tif 000035
2008506667.tif 000036
2008506667.tif 000037
2008506667.tif 000038
2008506667.tif 000039