(57)【要約】  石灰化の刺激または強化、および細胞の再生を刺激するためのＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ拮抗剤、Ｗｎｔ阻害剤、または他の関連タンパク質の使用を含む、骨疾患、骨折、骨損傷、および他の骨異常の治療のための組成物および方法。１つのＤｋｋタンパク質、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−２（Ｄｋｋ−２）は、Ｄｋｋ−２によって阻害され、かつ／または拮抗されうるＷｎｔタンパク質とは無関係に骨形成を刺激するように作用する。Ｄｋｋ−２は、特異的ターゲティング能の強化および石灰化を刺激または強化することにおける生物活性の強化を示した。Ｄｋｋ−２は、造血幹細胞および間充織幹細胞の分化および自己再生において、特に骨芽細胞形成および破骨細胞形成においても役割を果たした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項４】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法。
【請求項５】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法。
【請求項６】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物。
【請求項９】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法。
【請求項１６】
Ｗｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法。
【請求項１７】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片、を含む請求項１２〜１６および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、またはｓＦＲＰ３タンパク質の少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項１２〜１６および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６を含む、請求項１２〜１６および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１２〜１６および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項２７】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法。
【請求項３０】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｗｎｔ拮抗剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片を含む、請求項２５〜２９および３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｗｎｔ拮抗剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、またはｓＦＲＰ３タンパク質の少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項２５〜２９および３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｗｎｔ拮抗剤が、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６を含む、請求項２５〜２９および３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項２５〜２９および３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項４０】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法。
【請求項４１】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法。
【請求項４２】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法。
【請求項４３】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物。
【請求項４５】
前記組成物が薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項４９】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項５０】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項５１】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項５２】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項５３】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項５４】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項５５】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項５６】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項５７】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項４７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項４７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する治療用組成物。
【請求項６０】
少なくとも１つのＤｋｋタンパク質を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である治療用組成物。
【請求項６１】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記阻害剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項６５】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記阻害剤がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項６６】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記阻害剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項６７】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記阻害剤がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項６８】
Ｗｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記阻害剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項６９】
Ｗｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記阻害剤がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項７０】
Ｗｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記阻害剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項７１】
Ｗｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記阻害剤がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項７２】
Ｗｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記阻害剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項７３】
Ｗｎｔ阻害剤を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記阻害剤がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項７４】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項６４〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項６４〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記阻害剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する治療用組成物。
【請求項７７】
少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記阻害剤がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である治療用組成物。
【請求項７８】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記阻害剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片を含む、請求項６４〜７３、７６、および７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、またはｓＦＲＰ３タンパク質の少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項６４〜７３、７６および７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６を含む、請求項６４〜７３、７６、および７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項６４〜７３、７６、および７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記拮抗剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項８５】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記拮抗剤がＤｋｋによって拮抗されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項８６】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記拮抗剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項８７】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記拮抗剤がＤｋｋによって拮抗されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項８８】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記拮抗剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項８９】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記拮抗剤がＤｋｋによって拮抗されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項９０】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記拮抗剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項９１】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記拮抗剤がＤｋｋによって拮抗されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項９２】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記拮抗剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項９３】
Ｗｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記拮抗剤がＤｋｋによって拮抗されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項９４】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項８４〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記拮抗剤が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する治療用組成物。
【請求項９６】
少なくとも１つのＷｎｔ拮抗剤を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記拮抗剤がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である治療用組成物。
【請求項９７】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記Ｗｎｔ拮抗剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片を含む、請求項８４〜９３、９５および９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｗｎｔ拮抗剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、またはｓＦＲＰ３タンパク質の少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項８４〜９３、９５および９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｗｎｔ拮抗剤が、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６を含む、請求項８４〜９３、９５および９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｗｎｔ拮抗剤が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項８４〜９３、９５および９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項１０４】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨形成を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項１０５】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項１０６】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項１０７】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項１０８】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項１０９】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項１１０】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞前駆細胞の増殖を調節するための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項１１１】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する方法。
【請求項１１２】
Ｄｋｋ２タンパク質を投与する工程を含む骨芽細胞の分化を直接加速させるための方法であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害され、または拮抗されうるいかなるＷｎｔとも無関係である方法。
【請求項１１３】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項１０３〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記タンパク質が標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用する治療用組成物。
【請求項１１５】
少なくとも１つのＤｋｋ２タンパク質を含む骨疾患、骨折、骨損傷、または骨異常の治療のための治療用組成物であって、前記タンパク質がＤｋｋによって阻害されうるいかなるＷｎｔとも無関係である治療用組成物。
【請求項１１６】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項１１４または１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項１１４または１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
ａ）対象から細胞を得る工程と、
ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）支持細胞層と、
（ｉｉ）前記細胞の再生を刺激するのに十分な量のＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤と、を提供する工程と
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞の自己再生を促進するための方法。
【請求項１１９】
前記支持細胞層が、細胞増殖または分化を促進する間充織幹細胞、間質細胞、または他のタイプの細胞を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記細胞が、造血幹細胞を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記細胞が、調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２４】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、ｓＦＲＰ３タンパク質、またはそれらのいずれかの組合せの少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２５】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、Ｗｎｔ１６、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２６】
哺乳類の対象における疾患の治療のための方法であって、
ａ）前記対象または別の対象から細胞を得る工程と、
ｂ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）支持細胞層と、
（ｉｉ）前記細胞の再生を刺激するのに十分な量のＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤と、の存在下で再生する工程と、を含む方法。
【請求項１２７】
前記支持細胞層が、細胞増殖または分化を促進する間充織幹細胞、間質細胞、または他のタイプの細胞を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記細胞が、造血幹細胞を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記細胞が、調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３１】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３２】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、ｓＦＲＰ３タンパク質、またはそれらのいずれかの組合せの少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３３】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、Ｗｎｔ１６、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３４】
哺乳類の対象における疾患の治療のための方法であって、
ａ）前記対象から細胞を得る工程と、
ｂ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで変換し、特定の疾患に対して耐性を示す少なくとも１つの遺伝子を導入する工程と、
ｃ）前記変換細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）支持細胞層と、
（ｉｉ）前記変換細胞の再生を刺激するのに十分な量のＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤と、の存在下で再生する工程と、
ｄ）前記再生細胞を前記対象へ再投与する工程と、を含む方法。
【請求項１３５】
前記支持細胞層が、細胞増殖または分化を促進する間充織幹細胞、間質細胞、または他のタイプの細胞を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記細胞が、造血幹細胞を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記細胞が、調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３８】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３９】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４０】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、ｓＦＲＰ３タンパク質、またはそれらのいずれかの組合せの少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４１】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、Ｗｎｔ１６、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４２】
哺乳類の対象におけるウイルス感染の治療のための方法であって、
ａ）ウイルスに感染した対象からＣＤ３４＋細胞を得る工程と、
ｂ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで変換し、前記ウイルスに対して耐性を示す遺伝子を導入する工程と、
ｃ）前記変換細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）支持細胞層と、
（ｉｉ）前記変換細胞の再生を刺激するのに十分な量のＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤と、の存在下で再生する工程と、
ｄ）前記再生変換細胞を前記対象へ再投与する工程と、を含む方法。
【請求項１４３】
前記支持細胞層が、細胞増殖または分化を促進する間充織幹細胞、間質細胞、または他のタイプの細胞を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記細胞が、造血幹細胞を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
前記細胞が、調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４６】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４７】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学薬品、または低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環状分子、複素環有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学薬品の断片、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４８】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、以下のタンパク質、すなわちＤｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、ｓＦＲＰ３タンパク質、またはそれらのいずれかの組合せの少なくとも１つ、または前記タンパク質の少なくとも１つの断片を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤が、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、Ｗｎｔ１６、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ウイルス感染が、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、またはＨＩＶ感染を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５１】
前記投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項１２６、１３４、および１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記疾患が、すべてのタイプのウイルス介在または免疫薬介在肝炎、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、または寄生虫感染を含む、請求項１１８、１２６、１３４、および１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ウイルス感染が、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、またはＨＩＶ感染を含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記疾患が、大腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性ループス、骨粗鬆症、非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病、耐糖能異常、肥満、メタボリック・シンドローム、対宿主性移植片病、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、眼疾患、ブドウ膜炎、皮膚疾患、腎疾患、血液疾患、ＩＴＰ、ＰＡ、自己免疫肝疾患、他のリウマチ疾患、内分泌疾患、血管炎、強皮症、ＣＲＥＳＴ、神経疾患、肺疾患、筋炎、耳疾患、重症筋無力症、非ＨＩＶエイズ、エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、強皮症、混合性結合組織疾患、セリアック病、ＣＲＥＳＴ症候群（皮膚石灰沈着症、レイノー症候群、食道機能不全、手指硬化症、および毛細血管拡張症）、もしくは他の免疫関連または免疫介在性障害もしくは疾患を含む、請求項１１８、１２６、１３４、１４２、および１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
疾患を治療するために、哺乳類の対象に投与されるＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連若しくは関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）第１の試験管に調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞、および支持細胞層と、
（ｉｉ）第２の試験管に調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞、およびＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連または関連タンパク質、またはホモログ、および支持細胞層と、
（ｉｉｉ）第３の試験管に調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞、Ｄｋｋタンパク質Ｗｎｔ阻害剤またはＷｎｔ拮抗剤、および支持細胞層と、を提供する工程と、
ｂ）各々の試験管における細胞再生の量を測定する工程と、
ｃ）前記第２の試験管における細胞の量が、第１の試験管における細胞の量よりも多く、かつ前記第３の試験管における細胞の量とほぼ同じであることを確認する工程と、を含むアッセイ。
【請求項１５６】
哺乳類の対象に投与されると石灰化を強化するＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）第１の試験管にＤｋｋ２発現レトロウイルスで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞と、
（ｉｉ）第２の試験管に対照ベクターで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞と、
（ｉｉｉ）第３の試験管にＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞と、を提供する工程と、
ｂ）各々の試験管における石灰化の量を測定する工程と、
ｃ）前記第１の試験管における石灰化の量が、前記第２の試験管における石灰化の量よりも多く、かつ前記第３の試験管における石灰化の量とほぼ同じであることを確認する工程と、を含むアッセイ。
【請求項１５７】
哺乳類の対象に投与されると石灰化を強化するＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）第１の試験管にＤｋｋ２発現アデノウイルスで変換されたＢＭＳ培養物と、
（ｉｉ）第２の試験管に対照アデノウイルスで変換されたＢＭＳ培養物と、
（ｉｉｉ）第３の試験管にＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログで変換されたＢＭＳ培養物と、を提供する工程と、
ｂ）各々の試験管における石灰化の量を測定する工程と、
ｃ）前記第１の試験管における石灰化の量が、第２の試験管における石灰化の量よりも多く、かつ前記第３の試験管における石灰化の量とほぼ同じであることを確認する工程と、を含むアッセイ。
【請求項１５８】
前記ＢＭＳ培養物が、２．３Ｋｂ  Ｃｏｌｌ  Ａ１プロモータによって制御されるＧＦＰ導入遺伝子を有する３月齢のマウスから単離されたＢＭＳ細胞を含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
哺乳類対象に投与されると石灰化を強化するＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイであって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
（ｉ）第１の試験管にＤｋｋ２発現アデノウイルスで変換された石灰化を強化する細胞と、
（ｉｉ）第２の試験管に対照アデノウイルスで変換された石灰化を強化することがない細胞と、
（ｉｉｉ）第３の試験管にＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログで変換された細胞と、を提供する工程と、
ｂ）各々の試験管で石灰化の量を決定する工程と、
ｃ）前記第１の試験管での石灰化の量が、前記第２の試験管での石灰化の量よりも大きく、かつ前記第３の試験管での石灰化の量とほぼ同じであることを確認する工程と、を含むアッセイ。
【請求項１６０】
ａ）再生幹細胞と、
ｂ）Ｄｋｋタンパク質と、
ｃ）支持細胞層と
を含む哺乳類の対象における疾患の治療用の治療用組成物。
【請求項１６１】
ａ）Ｄｋｋタンパク質と、
ｂ）支持細胞層と
を含む哺乳類の対象における疾患の治療用の治療用組成物。
【請求項１６２】
ａ）Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連性または関連性タンパク質、またはホモログと、
ｂ）支持細胞層と
を含む哺乳類の対象における疾患の治療用の治療用組成物。
【請求項１６３】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１６０〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記組成物が、薬剤として許容される担体をさらに含む、請求項１６０〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記組成物が、錠剤、丸剤、糖衣錠、液体、ゲルカプセル、シロップ剤、スラリー、または懸濁液として調製される、請求項１６０〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
哺乳類における疾患を治療するための方法であって、
ａ）前記対象または他の対照から細胞を得る工程であって、前記細胞が調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞を含む工程と、
ｂ）前記細胞を
（ｉ）支持細胞層と、
（ｉｉ）前記細胞の再生を刺激するのに十分な量のＤｋｋタンパク質と、の存在下で再生する工程と、
ｃ）前記再生細胞を前記対象に再投与する工程と、
ｄ）前記対象における細胞の再生を刺激するのに十分な追加の量のＤｋｋタンパク質を前記対象に投与する工程と、を含む方法。
【請求項１６７】
投与する工程が、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻内、粘膜、舌下、局所、直腸もしくは皮下投与、またはそれらの組合せによる投与を含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記Ｄｋｋタンパク質が、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらの組合せを含む、請求項１６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の参照
本出願は、２００４年５月１９日に出願され、その全体の内容が参照によりその全体が本明細書で援用される、ダン・ウー（Ｄａｎ  Ｗｕ）らによる「骨形成および骨モデリングのための組成物および方法」という名称の特許出願に関する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、石灰化を刺激または強化するための、かつ細胞の再生を刺激するためのＤｉｃｋｋｏｐｆ−２（Ｄｋｋ２）、Ｗｎｔタンパク質の拮抗剤および／または阻害剤であるタンパク質を含む組成物および方法に関する。Ｄｋｋ２は、Ｄｋｋ２によって阻害および／または拮抗されうるＷｎｔタンパク質とは無関係に骨形成を刺激するように作用する。具体的には、Ｄｋｋ２は骨芽細胞分化を、かつしたがって石灰化を刺激する。Ｄｋｋ２は、造血幹細胞および間充識幹細胞の分化および自己再生、特に骨芽細胞形成および破骨細胞形成においても役割を果たす。
【０００３】
本出願において引用または特定されたすべての特許、特許出願、特許刊行物、科学論文などは、本発明が属する従来技術をより完全に記載するためにその全体が参照することにより本明細書で援用される。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ヒトおよびマウスの遺伝学的証拠は、低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＬＲＰ）、ＷｎｔコレセプターＬＲＰ−５１、２が骨再形成において重要な役割を果たすことを示す３−６。さらに、標準Ｗｎｔタンパク質および活性化β−カテニンが、骨芽細胞様細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を刺激する３、７。しかし、標準Ｗｎｔおよびその拮抗剤Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）分子の骨形成の調節における正確な役割は依然として不明のままである。Ｄｋｋタンパク質は骨形成における好ましくない調節因子として機能すると考えられている。Ｄｋｋタンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達の好ましくない調節因子であることが示されているシステインが豊富に分泌されるタンパク質である。４つのＤｋｋタンパク質がヒトにおいて同定されており、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、およびＤｋｋ４と呼ばれている。
【０００５】
ＬＲＰ５突然変異と骨量との間には、人体研究に基づき、相関関係があり、それによって、ＬＲＰ５が骨の発達の調節において重要な役割を果たすことを示す３−６。この結論は、ＬＲＰ−５遺伝子が破壊されているマウスの試験によって、さらにＬＲＰ５の高い骨量の突然変異が骨組織にターゲティングされたマウスにおいて確認された８、９。証拠により、標準Ｗｎｔがβ−カテニンを安定化してＬＥＦ−１／ＴＣＦ転写活性を活性化する能力１０、またはβ−カテニンを安定化して骨芽細胞様細胞のＡＰ活性を刺激する能力３、７のいずれかに基づき分類される。まとめると、これらの所見すべては、骨形成の調節における標準的なＷｎｔシグナル伝達の関与を示す。しかし、標準Ｗｎｔタンパク質が骨形成を調節する機序は依然として不明のままである。
【０００６】
ヒト骨髄は、とりわけ造血幹細胞（ＨＳＣ）および間充織幹細胞（ＭＳＣ）を含有する。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、幹細胞は自己再生の特徴を有し、それらを自ら無制限に再生させることを可能にする。この再生の特徴は、細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長する場合つねに確認されるわけではない。ＭＳＣは、例えば骨芽細胞、軟骨細胞、含脂肪細胞などの間充織組織系統へ分化するが、ＨＳＣは血液細胞を含む多数の細胞系統の前駆体として使用される。単核前駆体細胞は、初期造血幹細胞由来であり、破骨細胞は単核前駆体細胞の融合由来の形態である。ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、Ｔリンパ球の一部であり、これも造血幹細胞由来である。そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による刺激により、ＮＫＴ細胞は高レベルの免疫調節サイトカインを産生し、これは自己免疫、腫瘍拒絶、および移植組織片関連反応の抑制など免疫反応もやはり調節する。
【０００７】
ＭＳＣは、骨髄間質細胞、骨前駆細胞、および骨芽細胞幹細胞としても知られるが、これらは、造血幹細胞の維持、拡大、または再生のための微小環境を調節する支持細胞層としての機能を果たす。骨芽細胞は、その骨内膜表面で造血増殖因子を産生し、それによってＨＳＣ発達に重要な役割を果たすことが認められている間質細胞である。骨芽細胞の数の増大は結果としてＨＳＣ集団の増大をもたらすことが明らかにされている１＊、２＊。
【０００８】
Ｗｎｔ３ａは、標準Ｗｎｔの１つであり、これは幹細胞増殖、特に造血幹細胞増殖の直接の調節において機能することが認められている。Ｗｎｔ３ａは、幹細胞の増殖および自己再生を含む多数の発達イベントに関与する３＊、４＊。Ｗｎｔ３ａは、間質細胞による造血幹細胞系統発達の間接的な調節においても機能する（ヤマネ（Ｙａｍａｎｅ），Ｔら、「Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ」）。外因性Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）は、Ｗｎｔの拮抗剤であり、これは培養間充織幹細胞の増殖を増大させることが明らかにされている。Ｄｋｋ１抗体が添加されると、培養間充織幹細胞の増殖は減少した。同じＤｋｋ１効果は培養ＭＧ−６３骨肉腫細胞においても確認された５＊、７＊。しかし、Ｄｋｋタンパク質の造血幹細胞、ＮＫＴ細胞、および他のタイプの幹細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果は未知である。本発明ではＤｋｋタンパク質のさまざまな幹細胞に対する効果が記載される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の背景
本発明は、骨粗鬆症および他の骨疾患など骨再生に関連した一部の問題に対処する方法および組成物に関する。本発明は、骨折もしくは他の骨の損傷または異常の治癒に役立つ組成物の使用をも提供する。具体的には、本発明は、有効量のＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤を対象に投与する工程を含む哺乳類の対象における骨芽細胞の石灰化を刺激または強化するための方法を提供する。
【００１０】
本発明は、有効量のＤｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤を投与する工程を含む不十分な石灰化によって、またはＤｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の発現の増大をもたらすことによって特徴づけられる臨床症状のための遺伝子治療法をさらに提供する。
【００１１】
本発明の他の態様では、Ｄｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、Ｗｎｔ拮抗剤、または関連タンパク質の遺伝子発現、検出、および定量化は、さまざまな骨疾患の潜在的な診断法としての機能を果たす。
【００１２】
本発明の別の態様では、骨細胞分化を選択的に刺激するが、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する能力を欠くものを含む、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の突然変異体または別の形態が提供される。
【００１３】
本発明は、石灰化の刺激において特異的なターゲティングまたは生物活性の強化を示す、Ｄｋｋの融合タンパク質など他の改良をも提供する。
【００１４】
本発明は、Ｄｋｋ２を過剰発現させるＤｋｋ関連遺伝子導入マウスまたは実験動物の開発をさらに提供する。かかる動物は、突然変異体または改変Ｄｋｋおよび関連融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ評価および特徴づけのモデルとしての機能を果たしうる。
【００１５】
本発明は、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、Ｗｎｔ拮抗剤、または関連タンパク質の造血幹細胞の自己再生、ＮＫＴ細胞、および自己再生幹細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果に対処する方法および組成物にも関する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様では、骨髄移植、および造血幹細胞、ＮＫＴ細胞、および他の幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拡大など、治療用途のＤｋｋタンパク質の開発が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、骨疾患、骨折、骨損傷、および他の骨異常の治療のための方法および組成物を提供する。これは有効量のＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、Ｗｎｔ拮抗剤、または他の関連タンパク質を哺乳類の対象に投与し、石灰化の刺激または強化をもたらす工程によって達成される。
【００１８】
Ｄｋｋは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、またはそれらのいずれかの組合せを含みうる。Ｄｋｋタンパク質は、Ｄｋｋタンパク質によって阻害または拮抗されうるいかなるＷｎｔとも無関係であるタンパク質、標準的なＷｎｔシグナル伝達の調節におけるその役割とは無関係に作用するタンパク質、またはＤｋｋの酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、若しくはホモログをも含む。Ｗｎｔ拮抗剤は、Ｄｋｋ、タンパク質、糖、化学薬品、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ポリペプチド、核酸、低分子化合物、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、Ｗｎｔ１６、または以下のタンパク質の少なくとも１つ、もしくは以下のタンパク質の少なくとも１つの断片、すなわち、Ｄｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、またはｓＦＲＰ３タンパク質を含む。Ｗｎｔ阻害剤は、Ｄｋｋ、タンパク質、糖、化学薬品、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ポリペプチド、核酸、低分子化合物、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、Ｗｎｔ１６、または以下のタンパク質の少なくとも１つ、もしくは以下のタンパク質の少なくとも１つの断片、すなわち、Ｄｋｋタンパク質、ｃｒｅｓｃｅｎｔタンパク質、ｃｅｒｅｂｒｕｓタンパク質、ａｘｉｎタンパク質、Ｆｒｚｂタンパク質、グリコーゲンシンターゼキナーゼタンパク質、Ｔ細胞因子タンパク質、ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質、またはｓＦＲＰ３タンパク質を含みうる。タンパク質もしくはタンパク質断片は、天然の起源に生物学的に由来するものであってもよく、または組換えＤＮＡ法を使用して得ることもできる。ヒト対象の治療のためには、タンパク質もしくはタンパク質断片は非ヒト起源由来であることが好ましい。免疫反応の可能性は、免疫抑制剤による対象の治療によって、または１９９９年７月１６日に出願されたラッバニ（Ｒａｂｂａｎｉ），Ｅ．らによる「対象における疾患を予防し治療するための非選択的免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）介在翻訳過程、およびＳＩＤＲ確立に有用な訓練され、またはプログラムされた細胞、組織、または器官を含む組成物（Ｎｏｖｅｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｏｗｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  （ＳＩＤＲ）  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｕｂｊｅｃｔ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍａｔｔｅｒ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｔｒａｉｎｅｄ  ｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｒ  Ｏｒｇ��ｎｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ＳＩＤＲ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）」という名称の特許出願第０９／３５６，２９４号明細書に記載された薬剤特異的免疫操作の適用によって最小限に抑えられ、または削減されうる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態においては、特定のＤｋｋタンパク質、Ｄｋｋ２タンパク質が骨の疾患、骨折、損傷、および異常の治療に使用される。Ｄｋｋ２は、石灰化を刺激または強化することにおいて特異的なターゲティング能の強化および生物活性の強化を示した。従来技術において、Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２はＷｎｔの阻害剤として作用し、結果として骨形成、刺激、強化、または再生阻害をもたらすことがわかった。具体的には、Ｄｋｋ１（より強い阻害剤）もしくはＤｋｋ２（より弱い阻害剤）が前骨芽細胞期前に添加されると、骨の刺激または強化は発生しなかった。本発明は、Ｄｋｋ２（より強い刺激剤）もしくはＤｋｋ１（より弱い刺激剤）が添加されると、骨形成の刺激または強化が認められることを示す。Ｄｋｋ２は、Ｗｎｔシグナル伝達の拮抗剤としてのその役割と無関係である経路によって培養骨芽細胞の石灰化を刺激した。Ｄｋｋ２は、Ｄｋｋ１（より強いＷｎｔ拮抗剤）もＡｘｉｎ（細胞内Ｗｎｔ阻害剤）も、Ｆｒｚｂもまた石灰化を刺激することが確認されなかったため、この非Ｗｎｔ経路により機能すると考えられている。骨芽細胞分化は、Ｄｋｋ２の発現のアップレギュレーションによって達成された。骨芽細胞の分化の刺激に加えて、Ｄｋｋ２は産生されるＷｎｔをも阻害した。
【００２０】
Ｗｎｔタンパク質が骨芽細胞前駆細胞の自己再生を刺激することが確認された。Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ３ａ、およびＷｎｔ１を含むＷｎｔタンパク質は、骨芽細胞特異的２．３ｋｂ  ＣｏｌｌＡ１プロモータを活性化することによって、骨形成原細胞再生を刺激するだけではなく、骨芽細胞分化を刺激することもわかった。本発明は、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ３ａ、およびＷｎｔ１を含む標準Ｗｎｔが骨芽細胞分化において重要な役割を果たすことを提供する。Ｗｎｔが前骨芽細胞に添加されると、前骨芽細胞は骨芽細胞へ分化した。Ｄｋｋ２が石灰化を刺激し、または強化する段階でＷｎｔをｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟骨芽細胞に添加しても、石灰化はＷｎｔによって刺激または強化されなかった。
【００２１】
骨芽細胞は、幹細胞も見出される適所に局在する。この場所では、造血幹細胞が継続的に自己再生する。骨芽細胞はＷｎｔ、特にＷｎｔ７ｂを産生し、かつＷｎｔ７ｂはｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞を増加させることがわかっているため２５、２６、骨芽細胞は造血幹細胞の自己再生を刺激する２７、２８。Ｗｎｔ、もしくはＷｎｔを産生する骨芽細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞に添加すると、細胞は自己再生を示した。Ｄｋｋ２はＷｎｔを阻害することがわかったため、Ｄｋｋ２をこれらの細胞に添加すると、細胞の再生は停止し、それらは分化を開始した。
【００２２】
本発明は、Ｄｋｋ２がｉｎ  ｖｉｖｏで骨芽細胞の数を増加させることを示した。骨芽細胞は造血幹細胞の自己再生を刺激することがわかっているため２７、２８、Ｄｋｋ２も幹細胞を異なる機序または経路によって再生させるはずである。
【００２３】
不十分な石灰化によって特徴づけられる臨床症状は、遺伝子工学、遺伝子操作、または他の遺伝子治療法の使用によって治療されうる。これらの方法としては、新しい遺伝子の導入、生物に存在する遺伝子の削除、または結果として発現の増加または減少をもたらす対象に存在する遺伝子の追加のコピーの導入が挙げられる。例えば、所望の結果がＤｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、Ｗｎｔ拮抗剤、または関連タンパク質の増加もしくは過剰発現である場合は、石灰化が刺激され、または強化される。このことはＤｋｋ２を過剰発現させる遺伝子導入マウスを開発した場合に示された。本発明は、これら改変マウスを突然変異体、もしくは改変Ｄｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤、および関連融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ評価および特徴づけのためのモデルとして使用することを可能にする。これら融合タンパク質は、石灰化を刺激または強化することにおいて特異的ターゲティングまたは生物活性を強化することがわかっている。これらの突然変異体、改変、または融合タンパク質としては、骨細胞分化または増殖を選択的に刺激するが、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する能力を欠くものが挙げられる。
【００２４】
遺伝子操作は、新しい遺伝特徴の一時的発現、または永続的な導入のいずれかによって実行されうる。操作はｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞で実行後、細胞の対象への導入によって実行されうる。逆に言えば、操作はｉｎ  ｖｉｖｏで実行されうる。ｅｘ  ｖｉｖｏでの一時的発現の方法としては、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養への適用、またはアデノウイルスなど一時的発現に一般的に使用されるベクターによる感染が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの永続的な発現に使用されうる方法としては、１９９５年１２月１５日に出願されたラッバニ（Ｒａｂｂａｎｉ），Ｅ．らによる「治療および診断用途の組成物をもたらす新規特性および／または同組成物を示す新規特性（Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｅｆｆｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｓｅｓ）」という名称の特許出願第０８／５７４，４４３号明細書に記載されたリガンド介在取込み、選択可能なマーカーとの発現ベクターによる細胞培養の形質転換、またはウイルスベクターとの感染が挙げられる。これらの例としては、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な標的細胞への材料の導入のための向性は公知の方法を使用して変更されうる。
【００２５】
Ｄｋｋ２発現の減少または削除をもたらす遺伝子導入マウスモデルが開発されたとき、最終的には骨密度の減少という結果になった。したがって、Ｄｋｋ２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養モデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入マウスモデルにおける骨形成の調節において重要な役割を果たすことがわかった。
【００２６】
さらに、骨芽細胞および破骨細胞の減少がＤｋｋ２ノックアウトマウスにおいて確認された。この減少は、次いで、任意のＤｋｋ２細胞のその後の産生の減少をもたらした。これは、Ｄｋｋ２が骨芽細胞形成および破骨細胞形成において重要であることを示す。破骨細胞および骨芽細胞はそれぞれ造血幹細胞（ＨＳＣ）および間充織幹細胞（ＭＳＣ）由来であり、かつ存在する造血幹細胞の数は存在する骨芽細胞の数に比例するため、骨芽細胞または破骨細胞の減少は結果としてＨＳＣまたはＭＳＣの減少をもたらす。Ｄｋｋは増殖および骨髄からの成人幹細胞の細胞周期へのリエントリーに必要であることがわかっている。Ｄｋｋ２タンパク質は造血および間充織幹細胞由来の系統の発育および増殖において重要な役割を果たすため、Ｄｋｋ２がＨＳＣおよびＭＳＣの増殖、分化、および自己再生に関与していると思われる。Ｗｎｔ７ｂは骨芽細胞分化中にアップレギュレートされることもわかっているため、Ｗｎｔ７ｂも細胞の分化および増殖に対する効果を有する。最近、一定の条件下で、ヒトＮＫＴ  Ｖα２４細胞が活性化され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化または増殖しうることも証明されている８＊、９＊。したがって、Ｄｋｋタンパク質、Ｄｋｋ誘導体、Ｗｎｔ阻害剤、Ｗｎｔ拮抗剤、および他の関連タンパク質は、造血幹細胞、ＮＫＴ細胞、および他のタイプの細胞の再生用の治療薬として開発されうる。
【００２７】
これらの治療薬は、それらを直接、疾患、骨折、または異常の部位へ導入することによる骨髄移植など特定の用途で使用されうる。それらは、間接的に、治療薬と（対象から除去された）細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで組合わせることによって使用され、それによって細胞を増殖させ、次いで最初の細胞および増殖細胞を対象へ再導入させることもできる。具体的には、所望の細胞は罹患対象から除去され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで支持細胞層を伴う所望の細胞の再生を刺激するのに有効な量のＤｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、Ｗｎｔ拮抗剤、または関連タンパク質とともに配置されうる。支持細胞層は、細胞増殖または分化を促進する間充織幹細胞、間質細胞、または他のタイプの細胞を含んで成りうる。次いで、再生細胞は対象へ再導入される。細胞は他の対象から除去され、再生され、かつ罹患対象へ再導入をもされうる。
【００２８】
本発明は、感染性疾患の治療のための組成物および方法をも記載する。これらの疾患は、すべてのタイプのウイルス介在または免疫薬介在肝炎、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、または寄生虫感染を含む。ウイルス感染はＨＢＶ、ＨＣＶ、またはＨＩＶ感染でありうる。治療は、変換細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生を含む。細胞は、治療されている特定の疾患に対して耐性を示す少なくとも１つの遺伝子を導入するために変換される。
【００２９】
好ましい実施形態は、ウイルスに感染した対象からＣＤ３４＋細胞を得て、そのウイルスに対して耐性を示す遺伝子を導入するために細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで変換する工程を含む。次いで、変換細胞は、支持細胞層と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで変換細胞の再生を刺激するのに十分な量のＤｋｋ、Ｗｎｔ阻害剤、Ｗｎｔ拮抗剤、または関連タンパク質を提供する工程を含む条件下に培養される。細胞が増殖すると、それらは感染対象へ再導入される。
【００３０】
本発明は、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイをも提供する。好ましい実施形態では、第１の試験管にＤｋｋ２発現レトロウイルスで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞、第２の試験管に対照ベクターで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞、および第３の試験管にＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞が提供される。各々の試験管における石灰化の量が測定される。第１の試験管における石灰化の量が第２の試験管における石灰化の量よりも多く、かつ第３の試験管における石灰化の量とほぼ同じである場合には、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログは、石灰化を強化または刺激するように機能する。
【００３１】
別の実施形態では、第１の試験管にＤｋｋ２発現アデノウイルスで変換されたＢＭＳ培養物細胞、第２の試験管に対照ベクターで変換されたＢＭＳ培養物細胞、および第３の試験管にＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログで変換されたＢＭＳ培養物細胞を含むＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイが提供される。各々の試験管における石灰化の量が測定される。第１の試験管における石灰化の量が第２の試験管における石灰化の量よりも多く、かつ第３の試験管における石灰化の量とほぼ同じである場合には、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログは、石灰化を強化または刺激するように機能する。
【００３２】
さらに、疾患を治療する哺乳類の対象に投与されるＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連もしくは関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのための別の実施形態では、第１の試験管に調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞、および支持細胞層、第２の試験管に調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞、およびＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、若しくはホモログ、および第３の試験管に調節、免疫調節、またはＮＫＴ細胞、Ｄｋｋタンパク質、および支持細胞層が提供される。３つの試験管の各々における細胞再生の量が測定される。第２の試験管における細胞の量が第１の試験管における細胞の量よりも多く、かつ第３の試験管における細胞の量とほぼ同じである場合には、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、若しくはホモログは、細胞を再生させ、または増殖させるように機能する。
【００３３】
Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのための別の実施形態は、（１）ＭＣ３Ｔ３細胞を対照ベクターで変換する工程と、（２）ＭＣ３Ｔ３細胞をＤｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログを含むレトロウイルスで変換する工程とを含む。次いで、変換細胞はアリザリンレッドで石灰化に対して染色される。対照（１）が石灰化を示すことがなく、かつ（２）示す場合は、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログは石灰化を強化し、または刺激するように機能する。
【００３４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイの好ましい実施形態は、前記方法におけるＭＣ３Ｔ３細胞の代わりにＢＭＳ培養物細胞の使用、およびアリザリンレッドの代わりにキシレノールオレンジによる染色を含む。
【００３５】
本発明は、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔ阻害剤、またはＷｎｔ拮抗剤の酵素ホモログ、類似機能を有する非関連タンパク質、またはホモログのＤｋｋ２ノックアウトマウスへの添加により石灰化の強化または刺激がもたらされるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイをも提供する。
【００３６】
材料と方法
ＢＭＳ細胞培養および骨形成分化の誘導
３か月齢マウスからのＢＭＳ細胞培養を先に記載したように生成した１１。ＢＭＳ細胞を、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ＦＣＳ含有α培地中１０×１０６細胞／ウェルの密度で一時的に培養した。５日後、培養物を４％パラホルムアルデヒドで４℃下１０分間固定した。骨芽細胞コロニー形成をＡＰ（シグマ・ディアグノスティックス（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））に対して染色することによって視覚化した。細胞がコンフルエントになったら、それらを１０ｎＭデキサメタゾン、８ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、および５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸の存在下で骨形成分化を受けるように誘導した。培地を２日置きに交換した。培養物を固定後にフォン・コッサ（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）硝酸銀またはアリザリンレッドで染色することによって視覚化した。
【００３７】
骨髄細胞および破骨細胞分化の誘導
マウスの骨髄からの細胞を、抗生物質、１０％ＦＣＳ、３０ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦ、および６０ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬ含有α培地中５×１０５細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。培地を２日置きに交換した。６日目、骨芽細胞を４％パラホルムアルデヒドで４℃下１０分間固定し、ＴＲＡＰ染色（シグマ・ディアグノスティックス（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））によって視覚化した。
【００３８】
マウス頭蓋冠からの骨芽細胞培養：
マウス頭蓋冠を５−８日齢マウスから除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ含有ＰＢＳ溶液で消化し、骨芽細胞を放出させた。骨芽細胞を遠心分離によって収集し、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、および１％非必須アミノ酸を有するＤＭＥＭ中２×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。７日後、細胞はコンフルエントになった。培地を抗生物質、１０％ＦＣＳ、５ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、および２５ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸含有α培地に交換した。培地は毎日交換した。生きた細胞培養物を２０ｎＭキシレノールオレンジで染色することによって石灰化を視覚化した。
【００３９】
免疫染色
ＢＭＳ細胞を６ウェルプレートのカバースリップに播種した。カバースリップをさまざまな時点で固定し、ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製のブロッキング試薬によってブロッキングした。次いで、細胞を透過化し、抗Ｄｋｋ２モノクローナル抗体で染色した後、ローダミン抱合二次抗体で染色した。
【００４０】
ＱＰＣＲおよびノーザン分析
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、メーカーの指示に従って単離した。ＱＰＣＲ分析のために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ファースト・ストランド合成システム（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でＲＮＡを逆転写した。ＱＰＣＲをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲグリーンＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＤＮＡエンジンＯＰＴＩＣＯＮ（商標）（ＭＪリサーチ社（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．））インスツルメントで実行した。β−アクチンを各々の試料の内部基準として使用した。先に記載した式を使用し２４、ｍＲＮＡレベルの相対変化をｐ−アクチンｍＲＮＡレベルに対して標準化した。ノーザン分析のために、ＲＮＡ（１０μｇ）をアガロースゲルによって分離し、［３２Ｐ］標識プローブでプロービングされたナイロン膜に移した。
【００４１】
ＳｉＲＮＡおよびＤｋｋ発現
Ｈ１プロモータベースのｓｉＲＮＡ産生単位を、次いでレトロウイルスを製造するために使用されたレトロウイルスベクターへ挿入した。ＭＣ３Ｔ３細胞をレトロウイルスに感染させた。ベクターで安定して変換された細胞をハイグロマイシン（カルビオケム・ノババイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．））によって選択した。ハイグロマイシン耐性クローンを試験のためにプールした。
【００４２】
ＢＭＳ細胞におけるＷｎｔ１、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、およびｓＦＲＰ３の過剰発現のために、Ｗｎｔ１、ｍＤｋｋ１、ｍＤｋｋ２、またはｓＦＲＰ３発現カセット含有アデノウイルスを生成した。ＢＭＳ細胞培養をアデノウイルスで変換し、生きた細胞培養物を２０ｎＭキシレノールオレンジで染色することによって視覚化した。
【００４３】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、およびＷｎｔ７ｂの完全長コード領域を使用し、アンチセンスおよびセンスプローブを合成した。ＲＮＡ標識キット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州（ＩＮ）、米国）を使用してジゴギジゲニンでプローブを標識した。３週齢マウスからの脛骨の切片を脱ろうし、再水和し、４％パラホルムアルデヒドで再度固定した。切片を２％グリシンおよびプロテイナーゼＫで処置し、無水酢酸／ＴＥＡ溶液を使用してアセチル化した後、ジゴギジゲニン標識プローブでハイブリダイゼーションした。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および５％ＳＤＳで３０分間７０℃下に切片を２回、かつ５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで３０分間６５℃下に洗浄後、切片を抗ジゴギジゲニンアルカリホスファターゼ抗体でインキュベートした後、ニトロブルーテトラゾリウム／４−ブロモ−５−クロロ−インドリルリン酸塩でインキュベートし、これにより紫青色が得られる。切片はメチルグリーン（核）およびオレンジＧ（細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａ））で対比染色もされた。
【００４４】
ＢＭＤ測定
Ｄｋｋ２ノックアウトマウスモデルを作製した。２か月齢マウスをＰＩＸＩｍｕｓ小動物ＤＥＸＡシステム（ＧＥ−ルナー（Ｌｕｎａｒ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））による二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ）を使用してそれらの骨石灰化密度について検査した。
【実施例】
【００４５】
１．標準Ｗｎｔによる骨芽細胞の石灰化の刺激
骨髄間質（ＢＭＳ）細胞を、その発現が骨芽細胞および骨細胞に限定される、２．３Ｋｂ  ＣｏｌｌＡ１プロモータによって制御された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子（２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰ）１１を有する３か月齢マウスから単離した。したがって、ＧＦＰは、骨芽細胞のマーカーとして使用されうる。１０日目、ＢＭＳ培養物を対照アデノウイルス発現ルシフェラーゼ、またはアデノウイルス発現Ｗｎｔ１のいずれかに感染させた。２０日目、培養物を固定し、フォン・コッサ（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）銀染色またはアリザリンレッド染色で石灰化に対して染色した。骨芽細胞分化の広く使用されている２つのマーカー、骨シアロタンパク質（ｂｏｎｅ  ｓａｉｌｉｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＳＰ）およびオステオカルシン（ＯＣ）もノーザンブロット分析を使用して検査した。
【００４６】
Ｗｎｔ１発現アデノウイルスによる変換またはＷｎｔ３ａ馴化培地（ＣＭ）の処置は、骨形成インデューサ、デキサメタゾン、アスコルビン酸、およびβ−グリセロリン酸塩の存在下で一次ＢＭＳ培養物の石灰化における増加をもたらした（図１Ａ）。この石灰化における増加は、最終的な分化マーカーとして作用する骨細胞の増加によるものであった。ＢＳＣおよびＯＣマーカーの発現は、Ｗｎｔ１アデノウイルスに感染した細胞においても増加した（図１Ｂ）。
【００４７】
２．標準Ｗｎｔは骨形成原細胞におけるＡＰ活性を刺激する。
骨髄間質（ＢＭＳ）細胞を、２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰを有する３か月齢マウスから単離した。１０日目、ＢＭＳ培養物を対照アデノウイルス発現ルシフェラーゼ、またはアデノウイルス発現Ｗｎｔ１のいずれかに感染させた。１５日目、細胞をその後にＡＰ活性に対して染色した。
【００４８】
図１Ａ−ａに示されているように、Ｗｎｔ１発現アデノウイルス（Ａｄ−Ｗｎｔ１）に感染させたＢＭＳ培養物は、対照ウイルスに感染させた培養物よりもＡＰ染色を示すように思われた。コロニー数の計算は、Ｗｎｔ−１感染が結果としてコロニーの数よりもむしろサイズの増加をもたらすことを示した。この結果は、標準ＷｎｔがＡＰ活性を刺激し３、７（おそらく骨芽細胞前駆細胞の増殖を刺激することによって）、かつＬＲＰ−５欠乏が骨芽細胞前駆細胞の増殖を減少させる８以前の所見と一致する。
【００４９】
３．ＢＭＳ培養物における内因性標準Ｗｎｔの識別
ＢＭＳ培養物におけるＷｎｔの発現パターンを識別するために、一次ＢＭＳ培養物からの１９種類のＷｎｔのｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＲＮＡを異なる時点でマウスＢＭＳ培養物から抽出した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用し、１９個のＷｎｔのｍＲＮＡレベルを測定した。ＢＭＳ培養物におけるＤｋｋ１およびＤｋｋ２の発現もリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検査した。
【００５０】
Ｗｎｔ７ｂ  ｃＤｋｋもリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してクローン化し、ＬＥＦ−１−ルシフェラーゼリポーターアッセイによって標準Ｗｎｔであることを検証した。Ｗｎｔ７ｂ、Ｄｋｋ１、およびＤｋｋ２をｉｎ  ｖｉｖｏで識別するために、Ｗｎｔ７ｂ、Ｄｋｋ１、およびＤｋｋ２をプローブとして使用することによりマウス長骨切片でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【００５１】
それらの結果は、標準Ｗｎｔの中で、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ７ｂ  ＲＮＡのみが一次ＢＭＳ培養物において検出可能であった。Ｗｎｔ１の発現は辛うじて検出可能であり、その量は全分化周期中に変化することはなかった。対照的に、Ｗｎｔ７ｂの発現レベルは分化中に大幅に変化した。Ｗｎｔ７ｂ  ｍＲＮＡは５日目の分化培地の添加後８日目にピークに達し、次いで図２Ａに示されているように低レベルに減少した。Ｄｋｋ２  ｍＲＮＡのレベルは分化中に大幅に増加したが、Ｄｋｋ１  ｍＲＮＡのレベルは分化の最終段階でのみ増加した（図２Ａ）。
【００５２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果は、骨細胞におけるＤｋｋ１（図２Ｂ）および骨芽細胞におけるＤｋｋ２およびＷｎｔ７ｂ発現を示した。骨形成原細胞分化中、Ｗｎｔ５ａおよび５ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに示されているように大幅に増加した。
【００５３】
４．骨形成原細胞におけるＷｎｔ機能に対するＤｋｋの拮抗作用
ＢＭＳ細胞を２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰを有する３か月齢マウスから単離した。６日目、組換えＤｋｋ１タンパク質（１μＭ）または対照バッファーをＢＭＳ培養物に添加した。ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡検査を使用して検査した。Ｄｋｋ１タンパク質で処置した細胞は、対照細胞（図４Ｂ）と比べＧＦＰ発現（図４Ａ）における減少を示した。２．３Ｋｂ  ＣｏｌｌＡ１プロモータによって制御されたＧＦＰ導入遺伝子を有するマウスにおけるＧＦＰ発現と石灰化との間に強い相関関係が確認された１１。Ｄｋｋ１タンパク質によるＧＦＰ発現の減少は、標準Ｗｎｔによって介在される骨形成原細胞分化の早期段階がＤｋｋ１によって遮断されうることを示す１、１２、１３。
【００５４】
５．標準Ｗｎｔは骨芽細胞分化の後期段階で石灰化を刺激することはない。
ＢＭＳ細胞を２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰを有する３か月齢マウスから単離した。１５日目、ＢＭＳ培養物をＷｎｔ１を有するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスのいずれかに感染させた。１７日目、ＢＭＳ培養物をキシレノールオレンジによって石灰化に対して染色した。
【００５５】
結果は、ＢＭＳ培養の後期段階で、標準Ｗｎｔの添加は、図５に示されているように石灰化に対する効果を有することはないことを示した。
【００５６】
６．標準Ｗｎｔは骨形成原細胞の分化中にＤｋｋ２発現をアップレギュレートする。
もとは頭蓋冠培養由来のＭＣ３Ｔ３細胞を骨形成分化を受けさせることができる。ＭＣ３Ｔ３細胞の石灰化はＢＭＳ培養物で確認されたほど強固ではなかったが、ＯＣ、ＢＳＰ、およびコラーゲンＩを含む骨芽細胞分化マーカーの多くは、一次培養のものと同様の発現パターンを示した。ＭＣ３Ｔ３細胞をＷｎｔ１−アデノウイルスまたは対照アデノウイルスのいずれかで変換した。細胞ｍＲＮＡを分化中に異なる時点で単離した。ノーザンブロット分析を使用し、Ｄｋｋ２発現を分析した。
【００５７】
２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰマウスからのＢＭＳ細胞培養物を１０日目にＷｎｔ３ａＣＭまたは対照ＣＭで処置し、ＧＦＰを１１日目に検査した。ＢＭＳ細胞をアッセイのためにカバースリップに播種した。ＧＦＰが発現した場合、細胞を抗Ｄｋｋ２モノクローナル抗体およびローダミン（レッド）標識二次マウス抗体で免疫染色した。ＧＦＰおよびローダミンを共焦点顕微鏡法によって検査した。
【００５８】
Ｗｎｔ１変換ＭＣ３Ｔ３におけるＤｋｋ２  ｍＲＮＡのレベルは、対照細胞におけるものと比べ大幅に増加した（図６Ａ）。図６Ｂは、標準Ｗｎｔが２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰに刺激しうることを示す。Ｄｋｋ２発現は、２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰと共局在化される（図６Ｃ）。
【００５９】
７．Ｄｋｋ２は培養骨形成原細胞の後期段階中に石灰化を刺激する。
早期骨芽細胞増殖および分化におけるＤｋｋ２の役割を検査するために、ｓｉＲＮＡを使用してＤｋｋ２の発現をノックダウンさせた１４。Ｈ１ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータが特にＤｋｋ２をターゲティングするヘアピン二本鎖ｓｉＲＮＡの合成を推進するｉｎ  ｖｉｖｏｓｉＲＮＡ製造法を採用した１５（ＳｕｐＤｋｋ２）。ＭＣ３Ｔ３細胞をＤｋｋ２  ｓｉＲＮＡで安定して変換させ、レトロウイルスまたは対照レトロウイルスを生成し、分化させた。Ｄｋｋ２発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって異なる時点で測定し、石灰化をフォン・コッサ（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）銀染色によってモニタリングした。
【００６０】
ＢＭＳ培養物を８日目に分化させ、１３日目にＤｋｋ２発現アデノウイルスまたは対照アデノウイルスのいずれかで変換し、１７日目にキシレノールオレンジで石灰化に対して染色した。
【００６１】
ＳｕｐＤｋｋ２（ＳｕｐＤｋｋ２細胞）で安定して変換されたＭＣ３Ｔ３細胞は、分化誘導後６日目までに低レベルのＤｋｋ２  ｍＲＮＡを示した（対照細胞のレベルの約３分の１）（図７Ａ）。意外にも、Ｄｋｋ２  ｍＲＮＡレベルは９日目にＳｕｐＤｋｋ２細胞において上昇を開始し、１２日目には、ＳｕｐＤｋｋ２細胞におけるＤｋｋ２  ｍＲＮＡレベルは対照ｓｉＲＮＡベクターで安定してトランスフェクトされたＭＣ３Ｔ３細胞におけるものよりも５倍高かった（図７Ａ）。対照的に、分化中に対照ＭＣ３Ｔ３細胞におけるＤｋｋ２の発現レベルには大幅な変化が確認されなかった（図７Ａ）。ＳｕｐＤｋｋ２細胞は、２０日目に近づき石灰化を示し始め、その数日後には石灰化の大きな増加を示した（図７Ｂ）。非変換ＭＣ３Ｔ３細胞および対照ベクターを含有するものは、それらを３５日後に分析した場合でもバックグラウンド石灰化のみを示した（図７Ｃ）。ＳｕｐＤｋｋ  ＭＣ３Ｔ３細胞は、Ｄｋｋ２発現パターンおよび石灰化能に関して、対照ＭＣ３Ｔ３細胞よりも一次ＢＭＳ培養物により酷似していた。これらの結果は、ＭＣ３Ｔ３細胞においては、ｓｉＲＮＡによるＤｋｋ２発現の阻害が、通常はＤｋｋによって阻害される標準的なＷｎｔシグナル伝達活性を増加しうることで説明されうる。Ｗｎｔシグナル伝達のかかる増加はＤｋｋ２発現をアップレギュレートし、ｓｉＲＮＡ抑制からの最終的な回避をもたらす。このＤｋｋ２の高いレベルがＭＣ３Ｔ３をさらに分化させる。
【００６２】
アデノウイルスで変換されたＢＭＳ細胞におけるＤｋｋ２の過剰発現は結果として、対照アデノウイルスで変換されたＢＭＳ細胞によって示される石灰化の欠如と比べ、図７Ｄに示されているように、石灰化の刺激をもたらす（図７Ｅ）。
【００６３】
８．骨芽細胞における石灰化に対するＷｎｔ阻害剤ｓＦＲＰ３の効果
ｓＦＲＰ３は、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗する可溶性Ｗｎｔ結合タンパク質として作用する。ここでのその使用は、石灰化に対するその効果の観察に役立つ３５、３６。ＢＭＳ培養物を１３日目にｓＦＲＰ３発現アデノウイルスまたは対照アデノウイルスのいずれかで変換し、１７日目にキシレノールオレンジで石灰化に対して染色した。
【００６４】
結果は、ｓＦＲＰ３アデノウイルスで変換されたＢＭＳ細胞と対照アデノウイルスで変換されたＢＭＳ細胞との間に石灰化の差がないことを示した。ｓＦＲＰ３は特定の骨芽細胞期においてＢＭＳ細胞培養における石灰化に対する効果を有さないが、Ｄｋｋ２は同段階で石灰化を刺激しうると思われる。これは、この段階において、Ｗｎｔの阻害が石灰化に影響を及ぼさないことを示す（図８）。
【００６５】
９．Ｄｋｋ２ノックアウトマウスにおける骨密度の減少
総骨ミネラル密度をＰＩＸＩｍｕｓ小動物ＤＥＸＡシステム（ＧＥ−ルナー（Ｌｕｎａｒ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））による二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ）によって、野生型雄マウスおよびＤｋｋ２ノックアウト雄マウスにおいて５５日齢の時点で測定した。
【００６６】
表１は、Ｄｋｋ２ノックアウトマウスの総骨密度が野生型マウスにおける総骨密度よりも７．２８６％少ないことを示す。これらの結果は、Ｄｋｋ２が発育中の骨形成において重要な役割を果たすことを示す。
【００６７】
【表１】
2008516892.tif 000002
【００６８】
１０．石灰化はＤｋｋ２ノックアウトマウスからの骨芽細胞培養において減少する。
骨芽細胞培養物をマウス頭蓋冠（野生型およびＤｋｋ２ノックアウト）から得た。６日目、１ｍＭアスコルビン酸および５ｍＭ  β−グリセロリン酸塩を培地に添加することによって分化させた。１５日目、細胞培養をキシレノールオレンジで石灰化に対して細胞培養物を染色した。
【００６９】
１５日目までに、Ｄｋｋ２ノックアウトマウスからの細胞培養物には石灰化は検出されなかった（図９ｃおよび図９ｆ）が、野生型マウス（図９ａおよび図９ｄ）またはヘテロ接合マウス（図９ｂおよび図９ｅ）からの細胞培養物には強い石灰化が生じた。図９ｄ、図９ｅ、および図９ｆは、顕微鏡下に透過光の石灰化像を示す。
【００７０】
１１．  骨芽細胞および破骨細胞における形成はＤｋｋ２ノックアウトマウスにおいて減少する。
野生型マウス、Ｄｋｋ２ノックアウトマウス、およびヘテロ接合マウスからのＢＭＳ細胞培養物を５日目にＡＰ活性に対して染色し、骨芽細胞コロニー形成をモニタリングした。破骨細胞形成のために、３０ｎｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および６０ｎｇ／ｍｌレセプターアクティベーターの核因子ＫａｐｐａＢ（ＮＦ−ｋａｐｐａＢ）リガンド（ＲＡＮＫＬ）を培地に添加することによって骨髄細胞培養を分化させた。６日目、破骨細胞を酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）によって染色し、顕微鏡下に多核化細胞形態についてチェックした。  
【００７１】
骨芽細胞コロニーの数は、野生型マウス（図１０Ａ）またはヘテロ接合マウス（図１０Ｂ）からの培養におけるものと比べ、Ｄｋｋ２ノックアウトマウス（図１０Ｃ）からの培養において大幅に減少した。
【００７２】
同様に、破骨細胞数も野生型マウス（図１１Ａ）またはヘテロ接合マウス（図１１Ｂ）からの培養におけるものと比べ、Ｄｋｋ２ノックアウトマウス（図１１Ｃ）からの培養において大幅に減少した。破骨細胞の起源は骨芽細胞のものと異なる。前者は造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞の子孫であるが、後者は間充織幹細胞の子孫である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】骨形成原細胞増殖および分化の標準的なＷｎｔ刺激を示す図である。図１Ａは、対照もしくはＷｎｔ１アデノウイルスに感染し、またはＷｎｔ３ａ  ＣＭで処理された２．３Ｋｂ  ＣｏｌｌＡ１プロモータによって制御された、ＧＦＰ導入遺伝子を有する３か月齢マウスから単離された骨髄間質（ＢＭＳ）を示す。細胞を５日後にＡＰ活性に対して染色し、または固定し、指示された時点で石灰化に対して染色した（ｂ、フォン・コッサ（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）銀染色、ｃ、アリザリンレッド染色）、図１Ｂは、異なる分化段階での骨形成マーカーＯＣおよびＢＳＰの発現のノーザン分析である。
【図２】骨形成原細胞におけるＤｋｋ１、Ｄｋｋ２、およびＷｎｔ７ｂを示す図である。図２Ａは、最初にＤｋｋ１およびＤｋｋ２の発現が増大し、かつＷｎｔ７ｂの発現が増大し、次いでＢＭＳ細胞分化中に減少することを示すリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション像でのマウス長骨部を示す図である。図２Ｂは、Ｄｋｋ１が主に骨細胞において発現することを示す。図２Ｃは、Ｄｋｋ２が主に骨芽細胞において発現することを示す。図２Ｄは、Ｗｎｔ７ｂが骨芽細胞において発現することを示す。
【図３】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用するＢＭＳ細胞分化中のＷｎｔ５ａおよびＷｎｔ５ｂを示す図である。図３Ａおよび図３Ｂは、骨形成原細胞分化中に、Ｗｎｔ５ａとＷｎｔ５ｂの両方の発現が最初に増加し、次いで減少することを示す。
【図４】Ｄｋｋ１が初期段階で骨芽細胞分化を抑制しうることを示す図である。２．３  ＣｏｌｌＡ１からのＢＭＳ培養物を組換えＤｋｋ１タンパク質（１μＭ）または対照バッファーのいずれかで処置した。ＧＦＰの発現を指示された時点で検査した。図４Ａは、Ｄｋｋ１処置培養におけるＧＦＰレベルが対照（図４Ｂ）におけるよりもはるかに低いことを示す。これらの結果は、骨芽細胞分化が指示時点でＤｋｋ１タンパク質によって阻害されることを示す（図４Ｃ）。
【図５】標準Ｗｎｔが骨芽細胞分化の後期段階に影響を及ぼすことがないことを示す図である。図５Ａは、石灰化が、指示時点で対照アデノウイルス（図５Ｂ）によって処置されたＢＭＳ培養物におけるものと比べ、Ｗｎｔ１アデノウイルスで変換されたＢＭＳ培養物において増加または減少しないことを示す（図５Ｃ）。
【図６】Ｄｋｋ２が骨芽細胞における標準Ｗｎｔによってアップレギュレートされることを示す。図６Ａはノーザンブロットの結果であり、Ｄｋｋ２ｍＲＮＡレベルがＷｎｔ１アデノウイルスで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞培養で大幅に増加し、かつＤｋｋ２  ｍＲＮＡが対照アデノウイルスで処置されたＭＣ３Ｔ３細胞培養では検出されなかったことを示す。図６Ｂは、２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰマウスからのＢＭＳ細胞におけるＧＦＰがＷｎｔ３ａＣＭの添加によって２４時間以内に変化されうることを示す。この結果は、標準Ｗｎｔが骨芽細胞分化を刺激しうることを示す。図６Ｃは、Ｄｋｋ２抗体で免疫染色された２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰマウスからのＢＭＳ細胞培養の像を示す。発現されたＤｋｋ２タンパク質が、骨芽細胞分化マーカーである２．３Ｃｏｌ−ＧＦＰで共局在化されている。
【図７】石灰化のＤｋｋ２刺激を示す図である。すなわち、図７Ａは、ＳｕｐＤｋｋ２または対照ベクターで変換されたＭＣ３Ｔ３細胞における分化のさまざまな時点でのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定された相対Ｄｋｋ２レベルを示す。図７Ｂは、ＳｕｐＤｋｋ２で変換されたＭＣ３Ｔ３細胞の石灰化を示す。図７Ｃは、対照ベクターでトランスフェクトされたＭＣ３Ｔ３細胞の石灰化を示す。これらの結果は、Ｄｋｋ２発現と石灰化との間に強い相関関係があることを示す。図７Ｄは、Ｄｋｋ２発現アデノウイルスで変換され、指示時点でキシレノールオレンジで染色されたＢＭＳ培養物を示す（図７Ｆ）。図７Ｅは、対照アデノウイルスに感染し、指示時点でキシレノールオレンジで染色されたＢＭＳ培養物を示す。石灰化の独自のパターンがＤｋｋ２変換細胞培養において確認された。
【図８】Ｗｎｔ阻害剤であるｓＦＲＰ３は石灰化を刺激できないことを示す図である。ｓＦＲＰ３発現アデノウイルスまたは対照アデノウイルスのいずれかでＢＭＳ培養物を処置した。図７Ｅで確認された独自の石灰化パターンがここでは確認されなかった。
【図９】Ｄｋｋ２が石灰化に必要であることを示す図である。マウス頭蓋冠からの骨芽細胞培養を分化させた。１５日後、細胞培養をキシレノールオレンジで石灰化に対して染色した。野生型マウス（図９ａおよび図９ｄ）またはヘテロ接合マウス（図９ｂおよび図９ｅ）からの細胞培養は強い石灰化を示した。対照的に、Ｄｋｋ２ノックアウトマウスからの培養（図９ｃおよび図９ｆ）はまったく石灰化を示すことはなかった。図９ｄ、図９ｅ、および図９ｆは顕微鏡下に透過光による像である。
【図１０】Ｄｋｋ２が前骨芽細胞形成の好ましい調節因子であることを示す図である。野生型マウス、Ｄｋｋ２ノックアウトマウス、およびヘテロ接合マウスからのＢＭＳ細胞培養を５日目にＡＰに対して染色し、骨芽細胞コロニー形成をモニタリングした。骨芽細胞コロニーの数は、野生型マウス（図１０Ｂ）またはヘテロ接合マウス（図１０Ｃ）からの培養におけるものと比べ、Ｄｋｋ２ノックアウトマウス（図１０Ａ）からの培養において大幅に減少した。
【図１１】Ｄｋｋ２の破骨細胞形成に対する効果を示す図である。マウスの骨髄からの培養をＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの培地への添加によって分化させた。６日後、破骨細胞を酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）によって染色し、顕微鏡下に多核化細胞形態についてチェックした。破骨細胞数は、野生型マウス（図１１Ａ）またはヘテロ接合マウス（図１１Ｂ）からの培養における破骨細胞数と比べ、Ｄｋｋ２ノックアウトマウス（図１１Ｃ）からの培養において大幅に減少した。
【図１２】骨形成の調節における標準ＷｎｔおよびＤｋｋタンパク質の役割に対するモデルを示す図である。標準Ｗｎｔ（例えば、Ｗｎｔ７ｂ）の発現は前骨芽細胞段階で増加する。標準Ｗｎｔは前骨芽細胞の増殖および骨芽細胞への分化を刺激する。分化中、Ｄｋｋ２発現はアップレギュレートされ、さらに分化をも刺激する。このＤｋｋ２効果は、骨芽細胞成熟の増殖期中にＷｎｔシグナル伝達に対するその拮抗作用と無関係である。
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月28日(2005.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2008516892.tif 000003
【図２】
2008516892.tif 000004
【図３】
2008516892.tif 000005
【図４】
2008516892.tif 000006
【図５】
2008516892.tif 000007
【図６】
2008516892.tif 000008
【図７】
2008516892.tif 000009
【図８】
2008516892.tif 000010
【図１２】
2008516892.tif 000011