(57)【要約】  本発明は、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメインと、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインとを有する新規のポリペプチド並びにＰＤＥ１１モジュレーターの同定方法におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体と、
（ｂ）アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体と
を機能的に結合されて有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドであって、ホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）が、ＰＤＥ１１Ａ１、ＰＤＥ１１Ａ２、ＰＤＥ１１Ａ３、ＰＤＥ１１Ａ４又はそれぞれの機能的に等価な変異体の群から選択されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリペプチドであって、ホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）が、イソ型のＰＤＥ１１Ａ４を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、ＧＡＦAドメインが、配列番号６のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号６の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつＧＡＦAドメインの特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリペプチドであって、ＧＡＦAドメインが、配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、ＧＡＦBドメインが、配列番号８のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号８の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつＧＡＦBドメインの特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリペプチドであって、ＧＡＦBドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の機能的に結合されたＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメイン又はその機能的に等価な変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号１０の配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦドメインの調節特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有し、その際、配列番号６のＧＡＦAドメイン及び配列番号８のＧＡＦBドメインの含まれるアミノ酸配列が、アミノ酸の置換、挿入又は欠失によって最大で１０％だけ変更が加えられていることを特徴とするポリペプチド。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の機能的に結合されたＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体が、
（ａ）ヒトのＰＤＥ１１Ａ４のアミノ酸Ｍ２４からアミノ酸Ｋ５９１までのＮ末端か、又は
（ｂ）配列番号１０
の群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、アデニル酸シクラーゼが、細菌由来のＧＡＦドメイン含有のアデニル酸シクラーゼ又はそれぞれの機能的に等価な変異体であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、アデニル酸シクラーゼが、
（ａ）アナベナ属の種ＰＣＣ７１２０由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｂ）アナベナ・バリアビリＡＴＴＣ２９４１３由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｃ）ノストク・プンクチフォルメＰＣＣ７３１０２由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｄ）トリコデスニウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｅ）ブデロビブリオ・バクテリオボラスＨＤ１００由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｆ）マグネトコッカス属の種ＭＣ−１由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体
の群から選択されるアデニル酸シクラーゼであることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、アデニル酸シクラーゼが、アナベナ属の種ＰＣＣ７１２０由来のアデニル酸シクラーゼのイソ型のＣｙａＢ１又はＣｙａＢ２又はその機能的に等価な変異体であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン又はその機能的に等価な変異体が、配列番号１２のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号１２の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつアデニル酸シクラーゼの触媒特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン又はその機能的に等価な変異体が、
（ａ）ＣｙａＢ１のアミノ酸Ｌ３８６からＫ８５９までのＣ末端であって、ＣｙａＢ１のＬ３８６がＶ３８６によって交換されているもの、又は
（ｂ）配列番号１２
の群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１から１４までのいずれか１項記載のポリペプチドであって、配列番号１もしくは配列番号４のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号１もしくは配列番号４の配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦドメインの調節特性を有する配列を有し、その際、配列番号６のＧＡＦAドメイン、配列番号８のＧＡＦBドメイン及び配列番号１２のアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの含まれるアミノ酸配列が、アミノ酸の置換、挿入又は欠失によって最大で１０％だけ変更が加えられているポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１記載のポリペプチドであって、配列番号１もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１もしくは配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８記載のポリヌクレオチドであって、部分配列として
（ａ）配列番号５又は、配列番号５の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と、
（ｂ）配列番号７又は、配列番号７の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と、
（ｃ）配列番号１１又は、配列番号１１の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と
を有するポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号２の核酸配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号２の核酸配列のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１８から２２までのいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む組み換えプラスミドベクター。
【請求項２３】
請求項２２記載のプラスミドベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項２３記載の組み換え宿主細胞を培養し、請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドを発現及び単離することによる製造方法。
【請求項２５】
ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のモジュレーターの同定方法において、
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の可能性のあるモジュレーターと、請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドとを接触させる工程と、
（ｂ）該可能性のあるモジュレーターが、可能性のあるモジュレーターが不在の場合と比較して請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性を変化させるか否かを測定する工程と、
を含む方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法において、工程（ａ）で、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の可能性のあるモジュレーターの他に、ｃＧＭＰと請求項１から１７までのいずれか１項記載のポリペプチドとを接触させる方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６記載の方法において、アデニル酸シクラーゼ活性の測定を、放射線活性標識されたＡＴＰ又は蛍光標識されたＡＴＰの転化の測定によって行うことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２５から２７までのいずれか１項記載の方法において、モジュレーターの存在下に、アデニル酸シクラーゼ活性の低下を、モジュレーターの不在と比較して測定し、そして該モジュレーターがＰＤＥ１１アンタゴニストを表すことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２５から２８までのいずれか１項記載の方法において、モジュレーターの存在下に、アデニル酸シクラーゼ活性の増大を、モジュレーターの不在と比較して測定し、そして該モジュレーターがＰＤＥ１１アゴニストを表すことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２５から２９までのいずれか１項記載の方法において、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの直接的なモジュレーターの排除のために、請求項２５から２７までのいずれか１項記載の方法を、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインを有するが、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の機能的なＧＡＦドメインを有さないポリペプチドを使用して実施することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２５から３０までのいずれか１項記載の方法において、該方法を、細胞性アッセイとして、請求項２３記載の宿主細胞の存在下で実施することを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法において、該方法を、高スループットの観点で使用することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメインとアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインとを有する新規のポリペプチド並びに該ポリペプチドをＰＤＥ１１モジュレーターの同定方法において用いる使用に関する。
【０００２】
従来技術
ホスホジエステラーゼ類（＝ＰＤＥ類）は、真核タンパク質であり、環状ヌクレオチドであるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰのモジュレーターとして知られている。ＰＤＥ類は、３つのクラス（Ｉ、ＩＩ、そしてＩＩＩ）に分類され、そのうち哺乳動物では１１種のＰＤＥファミリー（ＰＤＥ１〜１１と呼ばれる）を有するクラスＩのみが存在する。
【０００３】
ＧＡＦドメインは、あらゆる生物界において偏在し、かつ該ドメインは、ＡｒａｖｉｎｄとＰｏｎｔｉｎｇ（Ａｒａｖｉｎｄ Ｌ．ａｎｄ Ｐｏｎｔｉｎｇ Ｃ．Ｐ：Ｔｈｅ ＧＡＦ ｄｏｍａｉｎ：ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９７，ＴＩＢＳ，２２，４５８−４５９）によってタンパク質構造比較とタンパク質配列比較に基づいて定義された。ＰＤＥ２、ＰＤＥ５及びＰＤＥ６は、いわゆるｃＧＭＰ結合性ＧＡＦドメインを有し、該ドメインは、ＰＤＥ類のアロステリックな活性化において役割を担う。
【０００４】
ヒトＰＤＥ１１から、種々のイソ型がクローニングされ、特性決定された（Ｈｅｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０００，９７，１２８９１〜１２８９５及びＳｏｎｄｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０００，１２，１７４−１７９）。
【０００５】
アデニル酸シクラーゼ類（＝ＡＣ類）は、あらゆる生物の範囲においてＡＴＰからｃＡＭＰへの転化を触媒する（Ｃｏｏｐｅｒ Ｄ．Ｍ．：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅｓ ａｎｄ ｃＡＭＰ．２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３７５（Ｐｔ３），５１７−２９；Ｔａｎｇ Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ Ａ．Ｇ．：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｇｓα ａｎｄ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ．１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，１７６９−１７７２）。配列比較と構造の考察に基づいて、アデニル酸シクラーゼは、５つのクラス（Ｉ〜Ｖ）に分類される。シアノバクテリア由来の、特にネンジュモ属の種ＰＣＣ７１２０由来の細菌性のクラスＩＩＩのＡＣ類であって、ＣｙａＢ１も所属するＡＣ類が生物学的に関心が持たれている。シアノバクテリアのＡＣ類であるＣｙａＢ１及びＣｙａＢ２は、同様にＮ末端のＧＡＦドメインを有し、該ドメインは、ＰＤＥ類のそれに構造的に類似しているが、ｃＡＭＰを活性化リガンドとして有する。ヒトのクラスＩＩＩのＡＣ類の９つの公知のファミリーは、全て膜結合性であり、かつＧタンパク質を介して調節される（Ｔａｎｇ Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ Ａ．Ｇ．：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｇｓα ａｎｄ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ．１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，１７６９−１７７２）。ＧＡＦドメインとの組合せは、知られていない。
【０００６】
ラットＰＤＥ２のＧＡＦドメインとアデニル酸シクラーゼＣｙａＢ１の触媒中心とからのキメラの構築は、既に記載されている（Ｋａｎａｃｈｅｒ Ｔ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ Ａ．，Ｌｉｎｄｅｒ Ｊ．Ｕ．ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｊ．Ｅ．：Ａ ＧＡＦ−ｄｏｍａｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｎａｂａｅｎａ ｉｓ ａ ｓｅｌｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃＡＭＰ ｓｗｉｔｃｈ．２００２，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１，３６７２−３６８０）。
【０００７】
ヒトＰＤＥ１１と細菌のアデニル酸シクラーゼとからのキメラは、知られていない。同様に、係るキメラをＰＤＥ１１モジュレーターの同定方法において用いる使用は従来技術から知られていない。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明の課題は、ＰＤＥ１１モジュレーターの同定方法を提供することにある。
【０００９】
前記課題は、（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン又はそれらの機能的に等価の変異体と、（ｂ）アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体とを機能的に結合されて有する本発明によるポリペプチドを提供すること並びにＰＤＥ１１モジュレーターの同定方法においてそれらを使用することによって解決される。
【００１０】
驚くべきことに、Ｎ末端のヒトＰＤＥ１１−ＧＡＦドメインとアデニル酸シクラーゼのＣ末端触媒中心とからのキメラタンパク質がエフェクター分子として適していることが確認された。該キメラタンパク質において、ＧＡＦドメインは、リガンドの結合に際してそのコンフォメーションを変化させ、それにより読み出しとして役立つアデニル酸シクラーゼドメインの触媒活性を変調する活性化ドメインである。
【００１１】
更に、驚くべきことに、ｃＧＭＰは、ＰＤＥ１１のＧＡＦドメインをアゴニストとして選択的に活性化することが見出された。
【００１２】
前記の結果が特に驚くべきことであるのは、例えばＰＤＥ１１Ａ４のＧＡＦドメインが、たった２６％だけの同一性をＣｙａＢ１のＧＡＦドメインに対して示すに過ぎないことと、ＰＤＥ１１Ａ４のＧＡＦドメインの機能的な活性化リガンドが今まで知られていなかったことからである（Ｙｕａｓａ Ｋ．，Ｋａｎｏｈ Ｙ．，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｋ．，Ｏｍｏｒｉ Ｋ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ＰＤＥ１１Ａ ｇｅｎｅ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｙ ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ＰＤＥｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＧＡＦ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，２６８，１６８−７８）。
【００１３】
本発明は、ＰＤＥ１１の触媒中心の結合と遮断を介して作用せずに、ＰＤＥ１１のＮ末端での、すなわちＧＡＦドメインでのアロステリック調節によって作用するＰＤＥ１１モジュレーター、すなわちＰＤＥ１１アンタゴニスト又はＰＤＥ１１アゴニストの同定を可能にする。
【００１４】
上述のように、本発明は、
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体と、
（ｂ）アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体と
を機能的に結合されて有するポリペプチドに関する。
【００１５】
ヒトのホスホジエステラーゼ又はＰＤＥとは、ヒト由来の酵素であってｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを相応の不活性な５′−モノホスフェートに転化しうる酵素を表す。それらの構造と特性に基づいて、ＰＤＥ類は、種々のファミリーに分類される。ヒトのホスホジエステラーゼ１１又はＰＤＥ１１とは、特にヒト由来の酵素ファミリーであってｃＧＭＰを不活性な５′−モノホスフェートに転化できる酵素ファミリーを表す。
【００１６】
本発明によれば、ＰＤＥ１１としては、ＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメインを有するＰＤＥ１１全体が該当する。ＰＤＥ１１のそれらのＧＡＦドメインは、タンデムとしてＮ末端でタンパク質中に局在している。Ｎ末端に最も近いＧＡＦドメインを、ＧＡＦAと呼称し、すぐ後続のものを、ＧＡＦBと呼称する。ＧＡＦドメインの開始と終わりは、タンパク質配列比較をもとに決定することができる。ＳＭＡＲＴ配列比較（Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｊ．，Ｍｉｌｐｅｔｚ Ｆ．，Ｂｏｒｋ Ｐ．ａｎｄ Ｐｏｉｎｔｉｎｇ Ｃ．Ｐ．：ＳＭＡＲＴ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｏｄｕｌａｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ．１９９８，ＰＮＡＳ，９５，５８５７−５８６４）により、例えばイソ型ＰＤＥ１１Ａ４のＧＡＦAについては：Ｌ２４０〜Ｌ４０３（配列番号６）であり、かつＧＡＦBについては：Ｖ４２５〜Ｋ５９１（配列番号８）であった。
【００１７】
アデニル酸シクラーゼとは、ＡＴＰをｃＡＭＰに転化できる酵素を表す。それに相応して、アデニル酸シクラーゼ活性とは、規定時間において本発明によるポリペプチドによって転化されたＡＴＰの量あるいは形成されたｃＡＭＰの量を表す。
【００１８】
アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインとは、アデニル酸シクラーゼのアミノ酸配列の部分であって、アデニル酸シクラーゼが、ＡＴＰをｃＡＭＰに転化するその特性をなおも有するために必要であり、従って実質的に機能的であり、それゆえアデニル酸シクラーゼ活性を有する部分を表す。
【００１９】
アミノ酸配列の繰り返しの短縮と引き続いてのアデニル酸シクラーゼ活性の測定によって、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインを簡単に決定することができる。
【００２０】
アデニル酸シクラーゼ活性の測定は、例えば放射線活性の［α−32Ｐ］−ＡＴＰから［α−32Ｐ］−ｃＡＭＰへの転化の測定によって行うことができる。
【００２１】
一般に、アデニル酸シクラーゼ活性は、生成されるｃＡＭＰを抗体結合を介して測定することによって簡単に可能である。そのためには、種々の市販のアッセイキット、例えばｃＡＭＰ［3Ｈ−］又は［125−Ｉ］Ｂｉｏｔｒａｋ（登録商標）ｃＡＭＰ ＳＰＡアッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ（登録商標）社）又はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）もしくはＬａｎｃｅ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）社）が存在する：これらは全て、ＡＴＰからのＡＣ反応時に未標識のｃＡＭＰが生ずる原理に基づいている。これは、外与的に添加された3Ｈで標識されたｃＡＭＰ、125Ｉで標識されたｃＡＭＰ又はビオチンで標識されたｃＡＭＰと、ｃＡＭＰ特異抗体への結合を巡って競合する。放射線活性でないＬａｎｃｅ（登録商標）アッセイの場合には、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒと抗体が結合されており、それはトレーサーによって６６５ｎｍでＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを生ずる。未標識のｃＡＭＰがより多く結合されれば、標識されたｃＡＭＰによって引き起こされるシグナルは弱くなる。標準曲線をもって、シグナル強度を、相応のｃＡＭＰ濃度に割り当てることができる。
【００２２】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社の、ＩＭＡＰテクノロジーを基礎とする高効率蛍光偏光（ＨＥＦＰ（商標））−ＰＤＥアッセイと同様に、放射線活性の代わりに、蛍光標識された基質を使用することもできる。ＨＥＦＰ−ＰＤＥアッセイの場合に、フルオレセイン標識されたｃＡＭＰ（Ｆｌ−ｃＡＭＰ）が使用され、それはＰＤＥによってフルオレセイン標識された５′ＡＭＰ（Ｆｌ−ＡＭＰ）に転化される。Ｆｌ−ＡＭＰは、特殊なビーズに選択的に結合し、それによって蛍光が強く偏光される。Ｆｌ−ｃＡＭＰは、該ビーズに結合しないので、偏光の増加は、生ずるＦｌ−ＡＭＰの量に比例する。相応のＡＣテストのために、蛍光標識されたＡＴＰをＦｌ−ｃＡＭＰの代わりに使用し、かつＦｌ−ｃＡＭＰの代わりにＦｌ−ｃＡＭＰに選択的に結合するビーズ（例えばｃＡＭＰ抗体で負荷されているビーズ）を使用することができる。
【００２３】
規定の機能を有するポリペプチドもしくはドメイン、すなわちポリペプチドの配列断片の"機能的に等価な変異体"とは、以下に記載されるように構造的に異なるが、なおも同じ機能を満たすポリペプチドもしくはドメインを表す。ドメインの機能的に等価な変異体を、当業者は、以下に詳細に記載されるようにして、相応のドメインのバリエーションと機能試験によって、他の公知のタンパク質の相応のドメインとの配列比較によって、又は前記ドメインをコードする相応の核酸配列と別の生物由来の好適な配列とのハイブリダイゼーションによって容易に見つけ出すことができる。
【００２４】
"機能的な結合"とは、ドメインの結合、有利には共有結合であって、ドメインがその機能を満たしうる配置に導く結合を表す。例えば、ＧＡＦAドメインと、ＧＡＦBドメインと、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインとの機能的な結合とは、ＧＡＦドメインがリガンド結合に際して、例えばｃＧＭＰ又はＰＤＥ１１モジュレーターの結合に際してそのコンフォメーションを変化させ、それによりアデニル酸シクラーゼの触媒活性が変調する配置に導くドメインの結合を表す。更に、ＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメインとの機能的な結合とは、ＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメインとが一緒になってＧＡＦドメインとしてリガンド結合に際して、例えばｃＧＭＰ又はＰＤＥ１１モジュレーターの結合に際してそのコンフォメーションを変化させる配置に導くドメインの結合を表す。
【００２５】
有利には、ＧＡＦドメインであるＧＡＦA及びＧＡＦBについて該当するヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）は、イソ型ＰＤＥ１１Ａ（アクセッション番号：ＮＰ＿０５８６４９／ＢＡＢ１６３７１）、ＰＤＥ１１Ａ１（アクセッション番号：ＢＡＢ６２７１４／ＣＡＢ８２５７３）、ＰＤＥ１１Ａ２（アクセッション番号：ＢＡＢ１６３７２）、ＰＤＥ１１Ａ３（アクセッション番号：ＢＡＢ６２７１３）及びＰＤＥ１１Ａ４（アクセッション番号：ＢＡＢ６２７１２）の群又はそれぞれの機能的に等価な変異体から選択され、特にイソ型ＰＤＥ１１Ａ４のＧＡＦドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体の本発明による使用が好ましい。
【００２６】
好ましい一実施態様においては、本発明によるポリペプチドのＧＡＦAドメインは、配列番号６のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベル配列番号６の配列とで少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、有利には少なくとも９２％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９４％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９６％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％の同一性を有し、かつＧＡＦAドメインの特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有する。
【００２７】
配列番号６の代わりに、全記載について配列番号１５も同様に使用することができる。配列番号１５の場合に、ＧＡＦAドメインのＮ末端は、配列番号６に対して１つのアミノ酸（Ｌ２４０）だけ短縮されている。
【００２８】
それは、前記のように別のタンパク質との配列の同一性比較によって見つけ出すことができるＧＡＦAドメインの天然の機能的に等価な変異体であるか、又は配列番号６の配列から出発して人工的な改変、例えばアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって変更を加えた人工的なＧＡＦAドメインであってよい。
【００２９】
概念の"置換"とは、本願においては、１つ又は複数のアミノ酸を１つ又は複数のアミノ酸によって交換することを表す。有利には、いわゆる保存的交換が行われ、その際には、交換されたアミノ酸は、本来のアミノ酸と同様の特性を有しており、例えばＧｌｕのＡｓｐによる交換、ＧｌｎのＡｓｎによる交換、ＶａｌのＩｌｅによる交換、ＬｅｕのＩｌｅによる交換、ＳｅｒのＴｈｒによる交換である。
【００３０】
欠失は、アミノ酸を直接的な結合によって交換することである。好ましい欠失の位置は、ポリペプチドの末端と、個々のタンパク質ドメイン間の結合部である。
【００３１】
挿入は、アミノ酸をポリペプチド鎖中に導入することであり、その際、形式的には直接的な結合が１つ又は複数のアミノ酸によって交換される。
【００３２】
２つのタンパク質間の同一性とは、それぞれのタンパク質全長にわたるアミノ酸の同一性を表し、特に米国ウィスコンシン州マジソンにあるＤＮＡＳＴＡＲ，ｉｎｃ．社のＬａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを用いた比較によってＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ，Ｓｈａｒｐ ＰＭ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９ Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）を使用して以下のパラメータ：
多重アラインメントパラメータ：
ギャップペナルティ                        １０
ギャップ長ペナルティ                      １０
ペアワイズアラインメントパラメータ：
Ｋタプル                                    １
ギャップペナルティ                          ３
ウィンドウ                                  ５
保存された対角                              ５
を設定して計算される同一性を表す。
【００３３】
配列番号６の配列とアミノ酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質又はドメインとは、それに相応して、タンパク質又はドメインであってその配列と配列番号６の配列とを、特に上述のパラメータ群を用いた上述のプログラムアルゴリズムに従って比較した場合に少なくとも９０％の同一性を有するものを表す。
【００３４】
ＧＡＦAドメインの特性とは、特にその機能、特にＧＡＦBドメインと一緒にｃＧＭＰを結合する機能を表す。
【００３５】
更なる好ましい一実施態様においては、本発明によるポリペプチドのＧＡＦAドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００３６】
好ましい一実施態様においては、本発明によるポリペプチドのＧＡＦBドメインは、配列番号８のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号８の配列と少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、有利には少なくとも９２％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９４％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９６％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％の同一性を有し、かつＧＡＦBドメインの特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有する。
【００３７】
それは、前記のように別のタンパク質との配列の同一性比較によって見つけ出すことができるＧＡＦBドメインの天然の機能的に等価な変異体であるか、又は配列番号６の配列から出発して人工的な改変、例えば前記のようにアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって変更を加えた人工的なＧＡＦBドメインであってよい。
【００３８】
ＧＡＦBドメインの特性とは、特にダイマー形成を担いうるその機能を表し、特にＧＡＦAと一緒にｃＧＭＰの結合によってＰＤＥ１１を活性化できるその特性又はＰＤＥ１１モジュレーターの結合によってＰＤＥ１１活性を変調できるその特性、すなわち該活性を高める又は低める特性を表す。
【００３９】
更なる好ましい一実施態様においては、本発明によるポリペプチドのＧＡＦBドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。
【００４０】
本発明によるポリペプチドの更なる好ましい一実施態様においては、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の機能的に結合されたＧＡＦAドメイン及びＧＡＦBドメイン、すなわち完全なＧＡＦドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号１０の配列と少なくとも７０％、有利には少なくとも７５％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも９０％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％の同一性を有し、かつヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦドメインの調節特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有し、その際、配列番号６のＧＡＦAドメインと配列番号８のＧＡＦBドメインの含まれるアミノ酸配列は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失によって、最大で１０％だけ、有利には最大で９％だけ、有利には最大で８％だけ、有利には最大で７％だけ、有利には最大で６％だけ、有利には最大で５％だけ、有利には最大で４％だけ、有利には最大で３％だけ、有利には最大で２％だけ、有利には最大で１％だけ、有利には最大で０．５％だけ変更が加えられている。
【００４１】
殊に、配列番号１０の特に好ましいＧＡＦドメインのＮ末端残基は、そのＮ末端から配列番号６のＧＡＦAドメインまで自由に変更を加えることができ、かつ特に短縮可能である。有利には、配列番号１０の特に好ましいＧＡＦドメインのＮ末端残基は、１００アミノ酸だけ、有利には９０アミノ酸だけ、有利には８０アミノ酸だけ、有利には７０アミノ酸だけ、有利には６０アミノ酸だけ、有利には５０アミノ酸だけ、有利には４０アミノ酸だけ、有利には３０アミノ酸だけ、有利には２０アミノ酸だけ、有利には１０アミノ酸だけ、有利には５アミノ酸だけＮ末端で短縮することができる。
【００４２】
配列番号６のＧＡＦAドメイン及び配列番号８のＧＡＦBドメインのアミノ酸部分配列は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失によって、それぞれ前記の機能を失うことなく、最大で１０％だけ、有利には最大で９％だけ、有利には最大で８％だけ、有利には最大で７％だけ、有利には最大で６％だけ、有利には最大で５％だけ、有利には最大で４％だけ、有利には最大で３％だけ、有利には最大で２％だけ、有利には最大で１％だけ、有利には最大で０．５％だけ変更を加えることができる。
【００４３】
有利には、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の機能的に結合されたＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメイン、すなわち完全なＧＡＦドメイン又はそれらの機能的に等価な変異体は、
（ａ）ヒトのＰＤＥ１１Ａ４のアミノ酸Ｍ２４からアミノ酸Ｋ５９１までのＮ末端か、又は
（ｂ）配列番号１０
の群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４４】
本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの部分のためには、有利には天然形においてＧＡＦドメインを有するアデニル酸シクラーゼが使用される。特に好ましいアデニル酸シクラーゼは、細菌由来の、特にシアノバクテリア由来のアデニル酸シクラーゼであって、特に天然形においてＧＡＦドメインを有するもの又はそれぞれの機能的に等価な変異体である。
【００４５】
特に好ましいアデニル酸シクラーゼは、
（ａ）アナベナ属の種ＰＣＣ７１２０由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｂ）アナベナ・バリアビリ（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉ）ＡＴＴＣ２９４１３由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｃ）ノストク・プンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）ＰＣＣ７３１０２由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｄ）トリコデスニウム・エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）ＩＭＳ１０１由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｅ）ブデロビブリオ・バクテリオボラス（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ）ＨＤ１００由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体、
（ｆ）マグネトコッカス属の種ＭＣ−１由来のアデニル酸シクラーゼ又はその機能的に等価な変異体
の群から選択される。
【００４６】
殊に好ましいアデニル酸シクラーゼは、アナベナ属の種ＰＣＣ７１２０由来のイソ型ＣｙａＢ１又はＣｙａＢ２の、特にＣｙａＢ１のアデニル酸シクラーゼ（アクセッション番号：ＮＰ＿４８６３０６，Ｄ８９６２３）又はその機能的に等価な変異体である。
【００４７】
好ましい一実施態様においては、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン又はその機能的に等価な変異体は、配列番号１２のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号１２の配列と少なくとも９０％、有利には少なくとも９１％、有利には少なくとも９２％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９４％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９６％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％の同一性を有し、かつアデニル酸シクラーゼの触媒特性を有する配列を有するアミノ酸配列を有する。
【００４８】
それは、前記のように別のアデニル酸シクラーゼとの配列の同一性比較によって見つけ出すことができるアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの天然の機能的に等価な変異体であるか、又は配列番号１２の配列から出発して人工的な改変、例えば前記のようにアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって変更を加えた人工的なアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインであってよい。
【００４９】
アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの特性とは、アデニル酸シクラーゼの前記の触媒特性、特にＡＴＰをｃＡＭＰへと転化する能力を表す。
【００５０】
有利には、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン又はその機能的に等価な変異体は、
（ａ）ＣｙａＢ１のアミノ酸Ｌ３８６からＫ８５９までのＣ末端であって、ＣｙａＢ１のＬ３８６がＶ３８６によって交換されているもの、又は
（ｂ）配列番号１２
の群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５１】
特に好ましい一実施態様において、本発明によるポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号４のアミノ酸配列又は当該配列からアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって誘導される配列であって、アミノ酸レベルで配列番号１もしくは配列番号４の配列と少なくとも７０％、有利には少なくとも７５％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも９０％、有利には少なくとも９３％、有利には少なくとも９５％、有利には少なくとも９７％、有利には少なくとも９８％、有利には少なくとも９９％の同一性を有し、かつヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のＧＡＦドメインの調節特性を有する配列を有し、その際、配列番号６のＧＡＦAドメイン、配列番号８のＧＡＦBドメイン及び配列番号１２のアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの含まれるアミノ酸配列は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失によって最大で１０％だけ変更が加えられている。
【００５２】
配列番号４の代わりに、全記載について配列番号１３も同様に使用することができる。配列番号１３の場合は、配列番号４に対してアミノ酸Ａ１０２０を欠いている。
【００５３】
殊に、特に好ましい配列番号１と配列番号４の本発明によるポリペプチドのＮ末端残基は、そのＮ末端から配列番号６のＧＡＦAドメインまで自由に変更を加えることができ、かつ特に短縮可能である。有利には、特に好ましい配列番号１もしくは配列番号４の本発明によるポリペプチドのＮ末端残基は、１００アミノ酸だけ、有利には９０アミノ酸だけ、有利には８０アミノ酸だけ、有利には７０アミノ酸だけ、有利には６０アミノ酸だけ、有利には５０アミノ酸だけ、有利には４０アミノ酸だけ、有利には３０アミノ酸だけ、有利には２０アミノ酸だけ、有利には１０アミノ酸だけ、有利には５アミノ酸だけＮ末端で短縮することができる。
【００５４】
配列番号６のＧＡＦAドメイン、配列番号８のＧＡＦBドメイン及び配列番号１２のアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインのアミノ酸部分配列は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失によって、それぞれ前記の機能を失うことなく、最大で１０％だけ、有利には最大で９％だけ、有利には最大で８％だけ、有利には最大で７％だけ、有利には最大で６％だけ、有利には最大で５％だけ、有利には最大で４％だけ、有利には最大で３％だけ、有利には最大で２％だけ、有利には最大で１％だけ、有利には最大で０．５％だけ変更を加えることができる。
【００５５】
特に有利には、本発明によるキメラポリペプチドのＭ２４〜Ｋ５９１のＮ末端では、ヒトのＰＤＥ１１Ａ４（アクセッション番号：ＢＡＢ６２７１２）のＮ末端を有する。そこにＣ末端で、クローニング切断部位の挿入でＬ３８６から突然変異させたＶ３８６から、ＣｙａＢ１（アクセッション番号：ＮＰ＿４８６３０６）のＣ末端のＫ８５９までが引き続く。
【００５６】
特に、配列番号１もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含む本発明によるポリペプチドが好ましい。
【００５７】
殊に好ましい本発明によるポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００５８】
更なる一実施態様においては、本発明は更に、前記の本発明によるポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド（以下に核酸とも呼ばれる）に関する。
【００５９】
発明の詳細な説明に挙げられる全てのポリヌクレオチド又は核酸は、例えばＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列であってよい。
【００６０】
特に好ましい本発明によるポリヌクレオチドは、部分配列として
（ａ）配列番号５又は、配列番号５の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と、
（ｂ）配列番号７又は、配列番号７の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と、
（ｃ）配列番号１１又は、配列番号１１の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と
を有する。
【００６１】
配列番号５は、配列番号６の特に好ましいＧＡＦAドメインをコードする特に好ましい部分核酸配列を表す。
【００６２】
配列番号７は、配列番号８の特に好ましいＧＡＦBドメインをコードする特に好ましい部分核酸配列を表す。
【００６３】
配列番号１１は、配列番号１２の特に好ましいアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインをコードする特に好ましい部分核酸配列を表す。
【００６４】
前記のドメインをコードする核酸もしくは部分核酸についての他の天然の例は、更に、前記の部分核酸配列から出発して、特に、ゲノム配列が知られていない種々の生物由来の配列番号５、７又は１１の配列から出発して、ハイブリダイゼーション技術によって自体公知のように容易に見つけ出すことができる。
【００６５】
ハイブリダイゼーションは、中程度の（低い厳密性）又は有利にはストリンジェントな（高い厳密性）条件下で実施することができる。
【００６６】
係るハイブリダイゼーション条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第二版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，９．３１〜９．５７ページ又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。
【００６７】
例えば、洗浄工程の間の条件は、低い厳密性（２×ＳＳＣ、５０℃）での条件と、高い厳密性（０．２×ＳＳＣ、５０℃、有利には６５℃）（２０×ＳＳＣ：０．３Ｍのクエン酸ナトリウム、３Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）での条件とによって区切られる条件範囲から選択することができる。
【００６８】
更に、洗浄工程の間の温度を、室温、つまり２２℃での中程度の条件から、６５℃でのストリンジェントな条件まで増加させることができる。
【００６９】
両方のパラメータ、塩濃度及び温度は、同時に変更でき、また両方のパラメータの１つを一定に保持して、もう一方のみを変更することもできる。ハイブリダイゼーションの間に、変性剤、例えばホルムアミド又はＳＤＳを使用してもよい。５０％のホルムアミドの存在下で、ハイブリダイゼーションは、有利には４２℃で実施される。
【００７０】
ハイブリダイゼーション及び洗浄工程のための幾つかの例示される条件を、以下に示す：
（１）例えば以下によるハイブリダイゼーション条件
（ｉ）４×ＳＳＣを６５℃で、又は
（ｉｉ）６×ＳＳＣを４５℃で、又は
（ｉｉｉ）６×ＳＳＣを６８℃で、１００ｍｇ／ｍｌの変性された魚精子ＤＮＡ、又は
（ｉｖ）６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌの変性され、断片化されたサケ精子ＤＮＡを６８℃で、又は
（ｖ）６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌの変性され、断片化されたサケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミドを、４２℃で、又は
（ｖｉ）５０％のホルムアミド、４×ＳＳＣを４２℃で、又は
（ｖｉｉ）５０％（容量／容量）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のＦｉｃｏｌｌ、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを４２℃で、又は
（ｖｉｉｉ）２×又は４×のＳＳＣを、５０℃で（中程度の条件）、又は
（ｉｘ）３０〜４０％のホルムアミド、２×又は４×のＳＳＣを４２℃で（中程度の条件）、
（２）例えば以下によりそれぞれ１０分間の洗浄工程
（ｉ）０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＳＤＳを５０℃で、又は
（ｉｉ）０．１×ＳＳＣを６５℃で、又は
（ｉｉｉ）０．１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを６８℃で、又は
（ｉｖ）０．１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５０％のホルムアミドを４２℃で、又は
（ｖ）０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを４２℃で、又は
２×ＳＳＣを６５℃で（中程度の条件）。
【００７１】
本発明によるポリペプチドをコードする特に好ましい本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列を有する。
【００７２】
本発明によるポリペプチドをコードする殊に好ましい本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列を有する。
【００７３】
本発明によるポリペプチドは、有利には、本発明によるポリペプチドをコードする前記のポリヌクレオチドを、好適な発現ベクターにクローニングし、宿主細胞に前記発現ベクターを形質転換し、この宿主細胞を発現させて本発明によるポリペプチドを発現させ、そして引き続き本発明によるタンパク質を単離することで製造することができる。
【００７４】
従って、本発明は、本発明によるポリペプチドを、組み換え宿主細胞を培養し、本発明によるポリペプチドを発現させ、そして単離することによって製造する方法に関する。
【００７５】
形質転換法は、当業者に公知であり、かつ例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第二版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，９．３１〜９．５７ページに記載されている。
【００７６】
更に本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする本発明によるポリヌクレオチドを有する組み換えプラスミドベクター、特に発現ベクターに関する。
【００７７】
発現ベクターの種類は重要ではない。相応の宿主細胞において所望のポリペプチドを発現できるあらゆる発現ベクターを使用することができる。好適な発現系は、当業者に公知である。
【００７８】
好ましい発現ベクターは、ＰＱＥ３０（Ｑｕｉａｇｅｎ社）、ｐＱＥ６０（Ｑｕｉａｇｅｎ）ｐＭＡＬ（ＮＥＢ）ｐＩＲＥＳ．ＰＩＶＥＸ２．４ａ（ＲＯＣＨＥ社）、ＰＩＶＥＸ２．４ｂ（ＲＯＣＨＥ社）、ＰＩＶＥＸ２．４ｃ（ＲＯＣＨＥ社）、ｐＵＭＶＣ１（Ａｌｄｅｖｒｏｎ社）、ｐＵＭＶＣ２（Ａｌｄｅｖｒｏｎ社）、ＰＵＭＶＣ３（Ａｌｄｅｖｒｏｎ社）、ＰＵＭＶＣ４ａ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ社）、ＰＵＭＶＣ４ｂ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ社）、ｐＵＭＶＣ７（Ａｌｄｅｖｒｏｎ社）、ＰＵＭＶＣ６ａ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ社）、ｐＳＰ６４Ｔ、ｐＳＰ６４ＴＳ、ｐＴ７ＴＳ、ｐＣｒｏ７（Ｔａｋａｒａ社）、ｐＫＪＥ７（Ｔａｋａｒａ社）、ｐＫＭ２６０、ｐＹｅｓ２６０、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙである。
【００７９】
更に、本発明は、本発明によるプラスミドベクターを有する組み換え宿主細胞に関する。前記の組み換え宿主細胞は、有利には、本発明によるポリペプチドを発現することができる。
【００８０】
宿主細胞の種類は重要ではない。原核性の宿主細胞も、真核性の宿主細胞も適している。相応の発現ベクターによって所望のポリペプチドを発現できるあらゆる宿主細胞を使用することができる。発現ベクターと宿主細胞からの好適な発現系は、当業者に公知である。
【００８１】
好ましい宿主細胞は、例えば原核細胞、例えば大腸菌、コリネバクテリア、酵母、ストレプトミセス科細菌又は真核細胞、例えばＣＨＯ、ＨＥＫ２９３又は昆虫細胞系統、例えばＳＦ９、ＳＦ２１、アフリカツメガエル卵母細胞である。
【００８２】
形質転換された宿主細胞の培養条件、例えば培養培地組成及び発酵条件は、当業者に公知であり、かつ選択された宿主細胞の種類に左右される。
【００８３】
ポリペプチドの単離と精製は、標準的な方法に従って実施することができ、例えば"Ｔｈｅ ＱｕｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔｓ（登録商標），第五版、２００３年６月"に記載されている。
【００８４】
本発明によるポリペプチドを発現する前記の形質転換された宿主細胞は、特に以下に記載される細胞性アッセイでのＰＤＥ１１モジュレーターの同定方法の実施のためにも適している。このためには、更に、相応の宿主細胞を固体担体上に固定化し、かつ／又は相応のスクリーニング法を高スループットの観点で実施する（ハイスループットスクリーニング）ことが好ましいことがある。
【００８５】
上述の全ての核酸配列は、当業者によって知られた、例えば酵素的な方法によって公知の核酸配列から切り出すことができかつ公知の核酸配列とともに新たに組み立てて、製造することができる。更に、上述の全ての核酸は、自体公知のようにして化学合成によって、ヌクレオチド構成単位から、例えば二重らせんの個々の重複した相補的な核酸構成単位の断片縮合によって製造することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば公知のようにして、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，第二版、Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，８９６〜８９７頁）に従って実施することができる。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて、ライゲーション反応並びに一般的なクローニング法による合成オリゴヌクレオチドの付加と、間隙の補填は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００８６】
更に本発明は、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のモジュレーターの同定方法において、
（ａ）ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の可能性のあるモジュレーターと、本発明によるポリペプチドとを接触させる工程と、
（ｂ）該可能性のあるモジュレーターが、可能性のあるモジュレーターが不在の場合と比較して本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性を変化させるか否かを測定する工程と、
を含む方法に関する。
【００８７】
本発明による方法の好ましい一実施態様において、工程（ａ）では、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の可能性のあるモジュレーターの他に、ｃＧＭＰと本発明によるポリペプチドとを接触させる。
【００８８】
本発明による方法では、可能性のあるＰＤＥ１１モジュレーターを、有利には精製されていることが好ましい本発明によるポリペプチドと、特に有利にはｃＧＭＰと一緒にインビトロでインキュベートし、そして本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性が、ＰＤＥ１１モジュレーター不在の試験バッチに対して変わった変化を測定する。
【００８９】
それに代えて、アデニル酸シクラーゼ活性の変化は、本発明によるポリペプチドと、場合によりｃＧＭＰとを含有する試験バッチに、可能性のあるＰＤＥ１１モジュレーターを添加した後に測定することができる。ＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性は、以下に詳細に記載されるように、定義された量のＡＴＰがｃＡＭＰに転化されたことを介して測定される。
【００９０】
ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）のモジュレーター（以下にＰＤＥ１１モジュレーターとも呼称される）とは、ＰＤＥ１１のＧＡＦドメインへの結合を介してＰＤＥ１１活性を変調することができる、すなわち変更することができる物質を表し、ここでは測定はアデニル酸シクラーゼ活性の変化を介して行われる。従ってＰＤＥ１１モジュレーターは、ＰＤＥ１１のアロステリック中心を介して作用するのであって、ＰＤＥ１１の触媒中心を介して作用せず又は決して作用しない。該モジュレーターは、ＰＤＥ１１の触媒活性を高めるアゴニスト（ＰＤＥ１１アゴニスト）又はＰＤＥ１１の触媒活性を低めるアゴニスト（ＰＤＥ１１アンタゴニスト）であってよい。
【００９１】
例えば、本発明による方法によって、以下に説明されるように、驚くべきことに、ｃＧＭＰはＰＤＥ１１アゴニストであることを示すことができた。
【００９２】
更に、好ましいＰＤＥ１１モジュレーターは、例えばペプチド、ペプチドミメティック、タンパク質、特に抗体、特にＧＡＦドメインに対するモノクローナル抗体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチド、特に有利にはいわゆる"小分子"又はＳＭＯＬ類である。好ましいＳＭＯＬ類は、有機又は無機の化合物、例えばヘテロ有機化合物又は有機金属化合物であって、１０００ｇ／モルの分子質量、特に２００〜８００ｇ／モルの分子質量、特に有利には３００〜６００ｇ／モルの分子質量を有する化合物である。
【００９３】
本発明によれば、ＰＤＥ１１モジュレーターは、有利には本発明によるポリペプチド（ＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラ）中のＧＡＦドメインに結合し、そして本発明によるポリペプチド（ＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラ）のアデニル酸シクラーゼ活性の変化を直接もたらすか、又はＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラからのｃＧＭＰの排除によってＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性の変化をもたらす。
【００９４】
本発明による方法を、ｃＧＭＰ又はｃＡＭＰだけで、試験されるべき物質として、ＰＤＥ１１モジュレーターなくして実施する場合に、図５による用量作用曲線が得られる。ＰＤＥ１１Ａ４／ＣｙａＢ１キメラは、１ｍＭのｃＧＭＰによって約４倍活性化される。それは、４００の％基準値に相当し、かつｃＧＭＰが、ＰＤＥ１１Ａ４−ＧＡＦアゴニストであることを示す。ｃＡＭＰは、１ｍＭでは活性化せず、約１５０の％基準値を有する、すなわちそれはＧＡＦアゴニストでもアンタゴニストでもない。
【００９５】
ｃＧＭＰを含まない試験バッチ中のＰＤＥ１１モジュレーターによるアデニル酸シクラーゼ活性の変調、従って変化、従って増大又は低下は、％基準値として以下の式に従って計算される：
【数１】
2008531025.tif 000002
【００９６】
１００μＭの可能性のあるＰＤＥ１１モジュレーターが使用される場合に％基準値が５０未満である場合に、ＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラ中のＧＡＦドメインに結合するＰＤＥ１１アンタゴニストを指すが、％基準値が２００より高いものはＰＤＥ１１アゴニストを指す。
【００９７】
従って、本発明は、モジュレーターの存在下に、アデニル酸シクラーゼ活性の低下を、モジュレーターの不在と比較して測定し、そして該モジュレーターがＰＤＥ１１アンタゴニストを表す特に好ましい本発明による方法に関する。
【００９８】
更に、本発明は、モジュレーターの存在下に、アデニル酸シクラーゼ活性の増大を、モジュレーターの不在と比較して測定し、そして該モジュレーターがＰＤＥ１１アゴニストを表す特に好ましい本発明による方法に関する。
【００９９】
本発明による方法の特に好ましい一実施態様において、アデニル酸シクラーゼ活性の測定は、放射線活性標識されたＡＴＰ又は蛍光標識されたＡＴＰの転化の測定によって行われる。
【０１００】
本発明によるポリペプチド、つまりＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性の測定は、放射線活性の［α−32Ｐ］−ＡＴＰから［α−32Ｐ］−ｃＡＭＰへの転化の測定によって行うことができる。
【０１０１】
一般に、アデニル酸シクラーゼ活性は、生成されるｃＡＭＰを抗体結合を介して測定することによって簡単に可能である。そのためには、種々の市販のアッセイキット、例えばｃＡＭＰ［3Ｈ−］又は［125−Ｉ］Ｂｉｏｔｒａｋ（登録商標）ｃＡＭＰ ＳＰＡアッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ（登録商標）社）又はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）もしくはＬａｎｃｅ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）社）が存在する：これらは全て、ＡＴＰからのＡＣ反応時に未標識のｃＡＭＰが生ずる原理に基づいている。これは、外与的に添加された3Ｈで標識されたｃＡＭＰ、125Ｉで標識されたｃＡＭＰ又はビオチンで標識されたｃＡＭＰと、ｃＡＭＰ特異抗体への結合を巡って競合する。放射線活性でないＬａｎｃｅ（登録商標）アッセイの場合には、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒと抗体が結合されており、それはトレーサーによって６６５ｎｍでＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを生ずる。未標識のｃＡＭＰがより多く結合されれば、標識されたｃＡＭＰによって引き起こされるシグナルは弱くなる。標準曲線をもって、シグナル強度を、相応のｃＡＭＰ濃度に割り当てることができる。
【０１０２】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社の、ＩＭＡＰテクノロジーを基礎とする高効率蛍光偏光（ＨＥＦＰ（商標））−ＰＤＥアッセイと同様に、放射線活性の代わりに、蛍光標識された基質を使用することもできる。ＨＥＦＰ−ＰＤＥアッセイの場合に、フルオレセイン標識されたｃＡＭＰ（Ｆｌ−ｃＡＭＰ）が使用され、それはＰＤＥによってフルオレセイン標識された５′ＡＭＰ（Ｆｌ−ＡＭＰ）に転化される。Ｆｌ−ＡＭＰは、特殊なビーズに選択的に結合し、それによって蛍光が強く偏光される。Ｆｌ−ｃＡＭＰは、該ビーズに結合しないので、偏光の増加は、生ずるＦｌ−ＡＭＰの量に比例する。相応のＡＣテストのために、蛍光標識されたＡＴＰをＦｌ−ｃＡＭＰの代わりに使用し、かつＦｌ−ｃＡＭＰの代わりにＦｌ−ｃＡＭＰに選択的に結合するビーズ（例えばｃＡＭＰ抗体で負荷されているビーズ）を使用することができる。
【０１０３】
本発明による方法の更に好ましい実施態様において、変化した％基準値が、物質のＧＡＦモジュレーター効果によって引き起こされるか又はＡＣ触媒中心の直接的な変調によって引き起こされるかどうかを区別するためには、更にカウンタースクリーニングを実施する。
【０１０４】
更に本発明は、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの直接的なモジュレーターの排除のために、アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインを有するが、ヒトのホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）の機能的なＧＡＦドメインを有さないポリペプチドを使用して実施される好ましい本発明による方法に関する。
【０１０５】
有利には、そのためには、％基準値は、前記の方法と同様にして、有利にはＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラによる代わりに、有利には
ａ）ＡＣ触媒中心を有するか、又は
ｂ）ＧＡＦ機能に必須のアミノ酸に突然変異を有するか、又は
ｃ）Ｎ末端でＧＡＦドメインだけ短縮されている
タンパク質によってのみで測定される。
【０１０６】
ａ）についての一例は、配列番号１のアミノ酸を有するが、但し、Ｎ末端でＡ２〜Ｌ７７５を欠失しているポリペプチドである。
【０１０７】
ｂ）についての一例は、配列番号１のアミノ酸を有するが、但し、突然変異Ｄ３５５Ａを有するポリペプチドである。
【０１０８】
ｃ）についての一例は、配列番号１のアミノ酸を有するが、但し、Ｌ２４０〜Ｋ５６８の部分配列を欠失しているポリペプチドである。
【０１０９】
１００μＭの物質が、ａ、ｂもしくはｃにより改変されたタンパク質と一緒に％基準値５０未満を生じる場合に、ＡＣ触媒中心の阻害があり、かつ純粋なＧＡＦ拮抗作用を排除することができる。
【０１１０】
本発明による方法の更に好ましい実施態様において、該方法は、細胞性アッセイとして、前記の本発明による宿主細胞の存在下に実施される。
【０１１１】
それについて、生成するｃＡＭＰを、アデニル酸シクラーゼ活性の尺度として、細胞性アッセイにおいても測定でき、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ．著のＣｅｌｌｕｌａｒ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ＨＴＳ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９０，１０７−１６．（２００２）及びＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ．及びＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ．著のＣｅｌｌｕｌａｒ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ＨＴＳ：ｔｈｒｅｅ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．７，３５３−６３．（２００２）に記載されている。
【０１１２】
そのために、有利には本発明によるポリペプチド、つまりＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラのｃＤＮＡは、好適な切断部位を介してトランスフェクションベクター中に挿入され、そして生ずるベクター構築物によって、好適な細胞、例えばＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２８３細胞にトランスフェクションされる。本発明によるポリペプチドを安定に発現する細胞クローンが選択される。
【０１１３】
トランスフェクションされた細胞クローンの細胞内ｃＡＭＰ濃度は、本発明によるポリペプチドのアデニル酸シクラーゼ活性によって決定的に影響される。ＧＡＦアンタゴニストは、アデニル酸シクラーゼ活性の阻害によって、細胞内ｃＡＭＰの低下を引き起こし、そしてＧＡＦアゴニストは、細胞内ｃＡＭＰの増大を引き起こす。
【０１１４】
ｃＡＭＰ量は、細胞の溶解後に前記の方法（ＢｉｏＴｒａｋ（登録商標）、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）又はＨＥＦＰ（登録商標））によって測定でき、又は直接的に細胞中で測定できる。そのためには、該細胞系統において、有利にはレポーター遺伝子がＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答要素）にカップリングされる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｐ．著のＣｅｌｌｕｌａｒ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ＨＴＳ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９０，１０７−１６．（２００２））。高められたｃＡＭＰ濃度は、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質）のＣＲＥ調節因子への高められた結合と、こうしてレポーター遺伝子の高められた転写をもたらす。レポーター遺伝子としては、例えば緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼを用いることができ、その発現レベルは、蛍光測定的に、測光的に又は発光測定的に測定することができ、例えばＧｒｅｅｒ，Ｌ．Ｆ．及びＳｚａｌａｙ，Ａ．Ａ．著のＩｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １７，４３−７２（２００２）又はＨｉｌｌ，Ｓ．他著のＲｅｐｏｒｔｅｒ−ｇｅｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１，５２６−５３２（２００１）に記載されている。
【０１１５】
特に好ましい一実施態様においては、前記の本発明による方法は、特に細胞性アッセイとして高スループットの観点で使用される。
【０１１６】
以下の実施例は、本発明を具体的に示すが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【０１１７】
実施例１
ＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラをコードする組み換えＤＮＡの製造
クローニングは標準的方法に従って実施した。ヒトのＰＤＥ１１Ａ４についての遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＢＡＢ６２７１２）を有するオリジナルクローンを、ベクター中に提供した。ＰＣＲによって、Ｋａｎａｄｉｅｒ他著のＥＭＢＯ Ｊ．２００２で記載されるＰＤＥ２−ＧＡＦキメラのクローニングと同様に行った。特異的プライマーを用いて、遺伝子断片ｈＰＤＥ１１Ａ４1-391を増幅させ、該断片は、ＧＡＦAドメインを有するＰＤＥ１１Ａ４のＮ末端をコードし、かつＮ末端にＢｇｌＩＩ切断部位を有し、かつＣ末端にＸｂａＩ切断部位を有する。同様にして、遺伝子断片ｈＰＤＥ１１Ａ４392-569を増幅させ、該断片は、ＧＡＦBドメインをコードし、かつＮ末端にＸｂａＩ切断部位を有し、かつＣ末端にＳａｌＩ切断部位を有する。両方の断片を、サブクローニング工程を経て、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）中にＸｂａＩ切断部位を介してｈＰＤＥ１１Ａ４1-569につないだ。遺伝子断片ｈＰＤＥ１１Ａ４1-569に、ＳａｌＩ切断部位を介してＣ末端で、ＰＣＲによって生成された遺伝子断片ＣｙａＢ１386-859を、アデニル酸シクラーゼＣｙａＢ１の触媒ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｄ８９６２３）と連結した。その際に、ｈＰＤＥ１１Ａ４1-569のＮ末端ＳａｌＩ切断部位を、ＣｙａＢ１386-859のＣ末端ＸｈｏＩ切断部位にクローニングし、そしてＣｙａＢ１のＬ３８６をＶに突然変異させた。全てのクローニング工程は、大腸菌Ｘｌ１ｂｌｕｅＭＲＦ′において行った。
【０１１８】
ＰＤＥ１１−ＧＡＦキメラについての遺伝子を、発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）中に再クローニングした。
【０１１９】
実施例２
ポリペプチドの発現と精製
ＰＤＥ１１−ＧＡＦキメラについての遺伝子を有するｐＱＥ３０ベクターを、大腸菌ＢＬ２１細胞に再形質転換した。該タンパク質の発現と精製は、"Ｔｈｅ ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（登録商標）"、第五版、２００３年６月と同様に実施した。その際、発現条件：２５μＭのＩＰＴＧでの誘導、１６℃でのインキュベーション、引き続いての大腸菌のフレンチプレス処理で最適なタンパク質収率が達成された。
【０１２０】
実施例３
アッセイの実施
ＰＤＥ１１Ａ４／ＣｙａＢ１キメラのアデニル酸シクラーゼ活性を、調査されるべき物質を使用して、かつ使用せずに測定する。その際、アデニル酸シクラーゼ活性は、規定量のＡＴＰがｃＡＭＰに転化したことをもって測定され、そしてそのクロマトグラフィー分離は、２つのカラムステップを通じてＳａｌｏｍｏｎ他に従って定める。転化の検出のために、放射線活性トレーサー［α−32Ｐ］−ＡＭＰを使用し、そして生成した量の［α−32Ｐ］−ｃＡＭＰを測定する。3Ｈ−ｃＡＭＰを、回収率についての内部標準として用いる。インキュベーション時間は、１〜１２０分であることが望ましく、インキュベーション温度は２０〜４５℃であることが望ましく、Ｍｇ2+−補因子濃度は、１〜２０ｍＭ（相応量のＭｎ2+を補因子としても使用できる）であることが望ましく、かつＡＴＰ濃度は、０．５μＭ〜５ｍＭであることが望ましい。物質を用いない場合に対する物質を用いた転化率の増大は、ＧＡＦ−拮抗作用を指し示す。転化が物質添加によって阻害される時には、該物質のＧＡＦ拮抗作用を示す。ＧＡＦ拮抗作用は、またＰＤＥ１１Ａ４／ＣｙａＢ１キメラの活性化の遮断を介して、本来のＧＡＦリガンドであるｃＡＭＰによって測定することもできる。このために、ｃＡＭＰ濃度を高めつつ、物質を用いて、かつ物質を用いずに転化率が測定される。物質を用いた転化率が、物質を用いない場合より低い場合に、該物質のＧＡＦ拮抗作用を示す。
【０１２１】
反応バッチは：
・  ５０μｌのＡＣ試験カクテル（グリセリン４３．５％（Ｖ／Ｖ）、０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ2）
・  ４０−ｘμｌの酵素希釈物（活性に応じて、０．１％（Ｗ／Ｖ）のＢＳＡ水溶液中に０．１〜０．３μｇのＰＤＥ１０／ＣｙａＢ１−キメラを含有する）
・  ｘμｌの物質
・  １６〜３０ｋＢｑの［α−32Ｐ］−ＡＴＰを含む１０μｌの７５０μＭのＡＴＰ開始溶液
を含有する。
【０１２２】
タンパク質試料と前記カクテルを、１．５ｍｌの反応容器中で氷上で混合し、反応をＡＴＰを用いて開始させ、そして３７℃で１０分間インキュベートする。１５０μｌのＡＣ停止バッファーによって反応を停止させ、反応容器を氷上に置き、１００Ｂｑの［２，８−3Ｈ］−ｃＡＭＰと７５０μｌの水を含む１０μｌの２０ｍＭのｃＡＭＰを添加する。
【０１２３】
各試験バッチに２回実施する。ブランクとして、酵素の代わりに水を有する試験バッチを用いた。物質とｃＧＭＰを有さない試験バッチを用いて、酵素基準活性を測定する。ＡＴＰとｃＡＭＰの分離のために、それぞれの試料を１．２ｇのＤｏｗｅｘ−５０ＷＸ４−４００を有するガラスカラムに入れて、浸透後に３〜４ｍｌの水で洗浄する。引き続き、５ｍｌの水を用いて酸化アルミニウムカラム（１．０ｇのＡＬ2Ｏ3を有する９×１ｃｍのガラスカラム、９０活性、中性）に溶出させ、そしてこれを４ｍｌの０．１ＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて、４ｍｌのシンチレーターＵｌｔｉｍａ ＸＲ Ｇｏｌｄが供されたシンチレーション容器中に溶出させた。慎重に混合した後に、液体シンチレーションカウンター中で計数した。放射線活性標識されたｃＡＭＰとＡＴＰの使用される量は、3Ｈ−と32Ｐ−のトータルとして、直接的に５ｍｌの溶出バッファーと４ｍｌのシンチレーター中で計数される。転化率は、酵素活性として以下の式：
【数２】
2008531025.tif 000003
に従って計算される。
【０１２４】
該物質による酵素の阻害又は活性化は、％基準値として以下の式：
【数３】
2008531025.tif 000004
に従って計算される。
【０１２５】
１００μＭの物質の場合に％基準値が５０未満である場合に、ＡＣ触媒中心の阻害を排除すれば、ＧＡＦアンタゴニストを示し、一方で２００より大きい％基準値はＧＡＦアゴニストを示す。
【０１２６】
１００μＭのｃＧＭＰを有する試験バッチにおいて、１００μＭの調査されるべき物質が使用される場合に％基準値が９０未満であればＧＡＦアンタゴニストが存在する。
【０１２７】
カラムは、使用後に以下のように再生した：
Ｄｏｗｅｘカラム：５ｍｌの２ＮのＨＣｌ、２×５ｍｌの水
酸化アルミニウムカラム：２×５ｍｌの０．１ＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
アッセイを、試験されるべき物質としてｃＧＭＰ又はｃＡＭＰを用いて実施すると、図５による用量作用曲線が得られる。ＰＤＥ１１Ａ４／ＣｙａＢ１キメラは、１ｍＭのｃＧＭＰによって約４倍活性化される。それは、４００の％基準値に相当し、かつｃＧＭＰが、ＰＤＥ１１Ａ４−ＧＡＦアゴニストであることを示す。ｃＡＭＰは、１ｍＭでは活性化せず、約１５０の％基準値を有する、すなわちそれはＧＡＦアゴニストでもアンタゴニストでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、ＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラのｃＤＮＡ配列を示す。
【図３】図３は、精製後のＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラのタンパク質配列を示す。イタリック体＝発現ベクターからの精製タグ（Ｑｕｉａｇｅｎ社のＰＱＥ３０）；ボールド体＝ＰＤＥ１１−ＧＡＦドメインを有するＮ末端；ボールド体で下線＝ＧＡＦAドメインとＧＡＦBドメイン；Ｖ３８６を、クローニング切断部位の挿入のためにＬ３８６から突然変異させた；下線＝触媒ドメインを有するＣｙａＢ１のＣ末端。
【図４】図４は、キメラＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１−ポリペプチドの概略図を示す。
【図５】図５は、環状ヌクレオチドによるＰＤＥ１１／ＣｙａＢ１キメラの活性化を示す。
【図１】
2008531025.tif 000005
【図２】
2008531025.tif 000006
【図２】
2008531025.tif 000007
【図３】
2008531025.tif 000008
【図４】
2008531025.tif 000009
【図５】
2008531025.tif 000010
【配列表】
2008531025000001.app
【国際調査報告】
2008531025.tif 000011
2008531025.tif 000012
2008531025.tif 000013
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