(57)【要約】  本発明は、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）の簡単かつ迅速な診断を目的とした異種内部対照系（すなわちＥＧＦＰ−ＲＮＡ）を伴う多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイに関する。ＣＳＦＶに特異的なプライマーおよびＦＡＭで標識されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブは、様々なＣＳＦＶ株の５’−非翻訳領域のコンセンサス配列を分析することによって選択された。分析感度を測定するため、５’ＮＴＲのインビトロ転写産物（Ｔ７−ＰＣ３Ａｌｆ）が構築されかつ試験された。さらに、内部対照配列を検出するためのプライマー−プローブ系が確立され、ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）およびＩＣリアルタイムＰＣＲを用いた多重アッセイを、１チューブアッセイとして感度または特異性の低下を伴うことなく実施できた。
2008529527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号５、および配列番号７のオリゴヌクレオチドのプライマーセット。
【請求項３】
配列番号３または配列番号６のオリゴヌクレオチドのプローブセット。
【請求項４】
標識をさらに含む請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
前記標識が蛍光基、ジゴキシゲニンまたはビオチンである請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号８または配列番号９である請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
生体試料中でＣＳＦＶ核酸を検出するための方法であって、
（ｉ）ＣＳＦＶ核酸を逆転写してＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを得るステップと、
（ｉｉ）前記ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを、２種以上の第１のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと接触させてＰＣＲ産物を生成するステップであって、第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
（ｉｉｉ）前記ＰＣＲ産物を第１の核酸プローブと、前記プローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
（ｉｖ）配列番号１０の内部対照を、前記内部対照にハイブリダイズ可能な少なくとも２種以上の第２のプライマーと接触させるステップであって、少なくとも１種の第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも１種の第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
（ｖ）少なくとも１種の第２の核酸プローブを、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
（ｖｉ）前記ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項８】
前記第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド７５〜１５０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド９０〜１３０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１００〜１２０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１５５〜２０５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１６５〜１９５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１７２〜１９２に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のプローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３０〜１７５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のプローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３５〜１７０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のプローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１４１〜１６６に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６２５〜６７５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６３０〜６６５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６３７〜６５６に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７４０〜７８０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７４５〜７７５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７５０〜７６８に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のプローブが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９０〜６３５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項７に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のプローブが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９５〜７３０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のプローブが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７０３〜７２４に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生体試料中でＣＳＦＶ核酸を検出するための方法であって、
（ｉ）ＣＳＦＶ核酸を逆転写してＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを得るステップと、
（ｉｉ）前記ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを、２種以上の第１のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと接触させてＰＣＲ産物を生成するステップであって、第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
（ｉｉｉ）前記ＰＣＲ産物を第１の核酸プローブと、前記プローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
を含む方法。
【請求項２７】
内部対照をさらに含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記内部対照が配列番号１０である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド７５〜１５０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド９０〜１３０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１００〜１２０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１５５〜２０５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１６５〜１９５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１７２〜１９２に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のプローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３０〜１７５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のプローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３５〜１７０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のプローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１４１〜１６６に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第２のフォワードプライマーをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６２５〜６７５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６３０〜６６５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６３７〜６５６に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
第２のリバースプライマーをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７４０〜７８０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７４５〜７７５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７５０〜７６８に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第２のプローブをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２のプローブが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９０〜６３５に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２のプローブが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９５〜７３０に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２のプローブが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７０３〜７２４に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生体試料中でＣＳＦＶ核酸を検出するための方法であって、
（ｉ）前記ＣＳＦＶ核酸を逆転写して相補的ＣＳＦＶ複合体（すなわちＣＳＦＶ  ｃＤＮＡ）を得るステップと、
（ｉｉ）前記ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを、２種以上の第１のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと接触させてＰＣＲ産物を生成するステップであって、第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１００〜１２０に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１７２〜１９２に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
（ｉｉｉ）前記ＰＣＲ産物を第１の核酸プローブと、前記プローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１４１〜１６６に対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
（ｉｖ）配列番号１０の内部対照を、少なくとも２種以上の第２のプライマーと接触させるステップであって、少なくとも１種の第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６３７〜６５６に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも１種の第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７５０〜７６８に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
（ｖ）少なくとも１種の第２の核酸プローブを、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７０３〜７２４に対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
（ｖｉ）前記ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項５１】
前記第１または第２のプローブがオリゴヌクレオチドプローブである請求項７、２６、または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１または第２のプローブが５０個までのヌクレオチドを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１または第２のプローブが約１０〜３０ヌクレオチド長である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１または第２のプローブが約１５〜２５ヌクレオチド長である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記検出するステップが蛍光の変化を測定するステップである請求項７、２６、または５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記プローブが蛍光標識される請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーが５０個までのヌクレオチドを含む請求項７、２６、または５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが１０〜３０ヌクレオチド長である請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが約１５〜２５ヌクレオチド長である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
第１の単離された試料中で豚コレラウイルスのウイルス負荷を定量する方法であって、（ｉ）前記第１の試料を、配列番号１またはその相同体あるいはそれらの相補鎖によって規定される標的領域にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイゼーションが第１の検出可能なシグナルをもたらすように接触させ、前記第１のシグナルの強度を測定するステップと、（ｉｉ）既知のＣＳＦＶウイルス負荷を有する第２の対照試料を前記プローブと接触させて第２の検出可能なシグナルをもたらし、前記第２のシグナルの強度を測定するステップと、（ｉｉｉ）前記第１のシグナルの強度と前記第２のシグナルの強度とを比較することにより、前記第１の単離された試料中で豚コレラウイルスのウイルス負荷を定量するステップと、を含む方法。
【請求項６１】
前記ＣＳＦＶがリアルタイムにもしくは前記アッセイの終点にて閉じたチューブ型で独立に検出されうる請求項７、２６、または５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
該当なし。
【０００２】
２．連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
該当なし。
【０００３】
３．コンパクトディスクで提出される資料の参照による援用
該当なし。
【０００４】
４．発明の分野
本発明は、プライマーおよびプローブとして有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、好ましくは単離された生体試料中での豚コレラウイルス核酸の検出を目的としたプライマーおよびプローブを使用する方法ならびにそのための試薬およびキットにも関する。特定の実施形態では、本発明は、豚コレラの簡単かつ迅速な診断を目的とした、内部対照系を有する十分に有効で使用可能な多重リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）アッセイに関する。
【背景技術】
【０００５】
５．発明の背景
豚コレラ（「ＣＳＦ」）は、ブタおよびイノシシの強い伝染性を示す疾患である。ＣＳＦは多数の国々から根絶されているが、世界の異なる地域で絶えず深刻な問題を引き起こしている（モーニング（Ｍｏｅｎｎｉｎｇ）ら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｓ  Ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．」  Ｖｅｔ  Ｊ．２００３年、１６５、１１−２０頁；エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、「Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ：Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｉｔｕａｔｉｏｎ」、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００年、７３、１０３−１９頁）。原因物質であるＣＳＦウイルス（「ＣＳＦＶ」）は、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）の中のぺスティウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属のメンバーである。ぺスティウイルス属の中の他のメンバーは、ウシウイルス性下痢ウイルス（「ＢＶＤＶ」）およびボーダー疾患ウイルス（ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（「ＢＤＶ」）である。ＢＶＤＶおよびＢＤＶにおける自然宿主はそれぞれウシおよびヒツジであるが、両ウイルスはブタにも自然感染しうる。ＢＶＤウイルスおよびＢＤウイルスに対する抗体は、血清学的アッセイにおいてＣＳＦＶと交差反応し、かつ診断的問題を引き起こす可能性がある（テルプストラ，Ｃ．（Ｔｅｒｐｓｔｒａ，Ｃ．）、ヴェンスヴールト，Ｇ．（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．）、「Ａ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｉａｒｒｈｏｅａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎ  Ｐｉｇｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ．」  Ｖｅｔ．Ｑ．、１９９７年、１９、９７−１０１頁；パトン，Ｄ．Ｊ．（Ｐａｔｏｎ，Ｄ．Ｊ．）、ダン，Ｓ．Ｈ．（Ｄｏｎｅ，Ｓ．Ｈ．）、「Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｉｇｓ  Ｗｉｔｈ  Ｒｕｍｉｎａｎｔ−Ｔｙｐｅ  Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ」  Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９４年、１１１、１５１−６３頁；パトン（Ｐａｔｏｎ）ら、「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｉｇｓ  Ａｎｄ  Ｃａｔｔｌｅ  Ｗｉｔｈ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｏｅａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｏｎ  Ａ  Ｆａｒｍ  Ｉｎ  Ｅｎｇｌａｎｄ」、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ、１９９２年、１３１、１８５−８頁）。ＣＳＦＶのみが国際獣疫事務局（Ｏｆｆｉｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓ  Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ）（「ＯＩＥ」）のリストＡ疾患の中に分類されることから、ＣＳＦＶとＢＶＤＶまたはＢＤＶとを区別することが重要である。
【０００６】
ぺスティウイルスは、約１２．５ｋｂの正のセンス一本鎖ＲＮＡを有する小さい被膜ウィルスである。それらのゲノムは高度に保存された５’−および３’−非翻訳領域（「ＮＴＲ」）によって隣接される大きいオープンリーディングフレームを有する。この１０年間では、主に５’ＮＴＲは、ＲＴ−ＰＣＲの使用による種および属の重複ゲノムの増幅における鋳型として機能した（ヴィルチェック（Ｖｉｌｃｅｋ）ら、「Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｐｉｇｓ，Ｃａｔｔｌｅ  Ａｎｄ  Ｓｈｅｅｐ  Ｃａｎ  Ｂｅ  Ａｌｌｏｃａｔｅｄ  Ｉｎｔｏ  Ａｔ  Ｌｅａｓｔ  Ｔｈｒｅｅ  Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．」  Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４年、１３６、３０９−２３頁；サンドビック（Ｓａｎｄｖｉｋ）ら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｕｍｉｎａｎｔ  Ａｎｄ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ  Ｂｙ  Ｎｅｓｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ５’  Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｃｄｎａ  Ｒｅｇｉｏｎ．」  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９７年、６４、４３−５６頁；ヒンドマン（Ｈｙｎｄｍａｎ）ら、「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｓ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｏｅａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎ  Ｆｌｕｉｄｓ  Ｆｒｏｍ  Ａｂｏｒｔｅｄ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｅｔｕｓｅｓ．」  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９８年、７１、６９−７６頁；パトン（Ｐａｔｏｎ）ら、「Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ：Ａ  Ｒｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  Ｔｏ  Ｅｖａｌｕａｔｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００年、７３、１５９−７４頁；パトン（Ｐａｔｔｏｎ）ら、「Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ：Ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｒｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  Ｔｏ  Ｅｖａｌｕａｔｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０００年、７７、７１−８１頁；バーリック・マガンジャ（Ｂａｒｌｉｃ−Ｍａｇａｎｊａ）およびグロム（Ｇｒｏｍ）、「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｏｎｅ−Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｆｒｏｍ  Ｏｔｈｅｒ  Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００１年、９５、１０１−１０頁）。古典的なＲＴ−ＰＣＲは、高感度かつ特異的な診断ツールであることが判明した。しかし、ゲルベースの系によって増幅されたＰＣＲ産物の検出では、交差汚染におけるリスクが生じ、鋳型におけるゲノムコピーの正確な定量が可能ではなく、さらなる特異性試験が含まれない。蛍光発生プローブの導入により、ＰＣＲチューブを開けることなく配列特異的な鋳型の検出をリアルタイム��行うことが可能になる（ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら、「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．」  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６年、６、９９５−１００１頁、ハイド（Ｈｅｉｄ）ら、１９９６年）。リアルタイムＰＣＲがＰＣＲ後の試料処理を必要としないことから、汚染を回避でき、プローブのハイブリダイゼーションにおける特異性が保証される。
【０００７】
ぺスティウイルスの診断において、タックマン（ＴａｑＭａｎ）−プローブは実用的かつ強力であることが判明し、数名の著者らによって用いられた（マックゴールドリック（ＭｃＧｏｌｄｒｉｃｋ）ら、「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｂｙ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｗｉｔｈ  Ａ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｂｅ（ＴａｑＭａｎ）．」  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９８年、７２、１２５−３５頁；１９９９年；ビューデヴィ（Ｂｈｕｄｅｖｉ）およびウェインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ）、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）．」  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３年、１０９、２５−３０頁；ビューデヴィ（Ｂｈｕｄｅｖｉ）およびウェインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ）、「Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ（Ｔａｑｍａｎ）  Ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ．」  Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１年、８３、１−１０頁；リサッティ（Ｒｉｓａｔｔｉ）ら、「Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｂｙ  Ａ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３年、４１、５００−５頁）。５’ＮＴＲの中のぺスティウイルス配列の増幅された標的の検出を目的とした、ここで記載されるあらゆるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、許容される感度および特異性を伴う結果が得られた。しかし、ＲＮＡの単離ステップおよびＲＴ−ＰＣＲを検証する内部対照はこれまでのところ全く用いられていない。２００３年には、ＣＳＦＶを検出するための多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲについて記述され、ここではユニバーサルな陽性対照としてのＢＶＤＶの５’ＮＴＲを含むキメラＣＳＦウイルスが用いられた（ホフマン（Ｈｏｆｍａｎｎ）、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｈｅ  ５’ＵＴＲ  Ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ，Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓ  Ａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．」  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３年、１１４、７７−９０頁）。しかし、かかる完全なキメラビリオンは感染性を示しうることから、ルーチンの診断目的に適しないものと思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＣＳＦの簡単かつ迅速なルーチン診断を目的とした、２つの対照を有する強力、使用可能、高感度で、かつＣＳＦＶに特異的な多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを提供する。第１の対照（陽性対照）がプライマーおよびプローブの効率性を証明する一方、第２の対照（内部対照）は各試験試料でのＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲを検証するように設計される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
６．発明の概要
一実施形態では、本発明はプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを包含する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、異種内部対照ＲＮＡ（すなわちＥＧＦＰ−ＲＮＡ）を用いた多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ技術を用い、生体試料中で豚コレラウイルス核酸を検出するための方法を包含する。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、単離された生体試料中でＣＳＦＶウイルス負荷を定量する方法を包含する。
【００１２】
さらに本発明の別の実施形態は、ＣＳＦＶを検出するためのキットを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
８．発明の詳細な説明
８．１．定義
本明細書中で用いられる「増幅された」または「増幅」という用語は、１個もしくは数個のコピー由来の多数のＤＮＡコピーの生成を示す。
【００１４】
本明細書中で用いられる「生体試料」という用語は、血清、血漿、精液、尿または血液を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
本明細書中で用いられる「相補的」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン・クリック型またはフーグスティーン型塩基対を示し、「結合」という用語は２つのポリペプチドもしくは化合物または関連するポリペプチドもしくは化合物またはこれらの組み合わせの間での物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン相互作用、非イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用を含むがこれらに限定されない。物理的相互作用は、直接的または間接的でありうる。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介しうるかまたはそれらに起因しうる。直接結合は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介してかまたはそれらに起因して生じることがないばかりか他の実質的な化学中間体を伴うことがない相互作用を示す。
【００１６】
本明細書中で用いられる「保存的アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される場合の置換を示す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性の極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００１７】
本明細書中で用いられる「ＣＳＦＶの断片」または「ＣＳＦＶの一部」という用語は、天然ＣＳＦＶまたはその変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むアミノ酸配列を示す。
【００１８】
本明細書中で用いられる「遺伝子」という用語は、生物学的機能を伴う任意のＤＮＡセグメントを示す。したがって、遺伝子は、その発現にとって必要なコーディング配列および／または調節配列を含むがそれらに限定されない。遺伝子は、例えば他のタンパク質に対する認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントも含みうる。遺伝子は、目的のソースからのクローニングあるいは既知のまたは予測された配列情報からの合成を含む種々のソースから入手可能であり、所望のパラメータを有するように設計される配列を含みうる。さらに、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＣＳＦＶをコード化するオープンリーディングフレームを含む核酸分子も示す。
【００１９】
本明細書中で用いられる「異種ポリヌクレオチド」、「異種核酸」、「異種遺伝子」、「異種配列」または「外来性ＤＮＡセグメント」は、外来源（ｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒｅｉｇｎ）から特定の宿主細胞までを由来とするかもしくはもし同じソース由来であればその元の形態から修飾されたポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを示す。宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内在性であっても修飾を受けている遺伝子を含む。したがって、それらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種であるか、または同因子が通常認められない宿主細胞核酸内の位置を除いて細胞に対して相同であるＤＮＡセグメントを示す。例として、酵母細胞に対して天然であってもヒトＣＳＦＶ配列に対して付着されるシグナル配列は異種である。
【００２０】
「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」あるいはそれらの変異体は、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで相同であることを特徴とする配列を示す。相同ヌクレオチド配列は、ペプチドのアイソフォームをコードする同配列をコード化したものである。アイソフォームは、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織内で発現されうる。あるいは、アイソフォームは異なる遺伝子によってコード化されうる。本発明では、相同ヌクレオチド配列は、哺乳動物を含むがそれに限定されないヒト以外の種のＣＳＦＶに対してコード化するヌクレオチド配列を含むことから、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、および他の生物を含みうる。相同ヌクレオチド配列は、天然対立遺伝子変異体および本明細書にて示されるヌクレオチド配列の変異体も含むがこれらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で用いられる「単離された」核酸配列は、本質的に他の核酸配列を含まない、例えば少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは約６０％、さらにより好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％、およびさらに最も好ましくは約９５％純粋な核酸配列を示し、それはアガロースゲル電気泳動によって測定される。例えば、単離された核酸配列を遺伝子操作において用いられる標準のクローニング手順によって得ることで、核酸配列がその天然の位置からそれが再生されることになる異なる部位に再配置されうる。クローニング手順は、ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む所望の核酸断片の切除および単離、断片のベクター分子への挿入、および核酸配列の複数のコピーまたはクローンが複製されることになる宿主細胞への組換えベクターの取り込みを含みうる。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起点、またはこれらの任意の組み合わせに関するものでありうる。
【００２２】
本明細書中で用いられる「多重ＰＣＲ」という用語は、ゲノム全体にわたる複数の位置を標的にすることを意図した２セット以上のＰＣＲプライマーの反応物への添加を含むＰＣＲを示す。すなわち、特に２つの個体における対立遺伝子が同一である確率は試験される多形性遺伝子座の数の増加に伴って減少することから、それはＤＮＡタイピングに有用である。さらに、ＩＣ（例えばＥＧＦＰ−ＲＮＡ）との多重化により、ＰＣＲ全体の内部対照がＣＳＦＶリアルタイムＰＣＲの感度または特異性への影響がない状態で提供される。
【００２３】
本明細書中で用いられる「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの重合体を示す。特に限定されるない限り、それらの用語は、参照核酸と類似した結合特性を有しかつ天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチド類似体を有する核酸を包含する。他に指定されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換体）および相補配列ならびに明示的に示された配列も暗黙的には包含する。特に、縮重コドン置換は、１つもしくは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換される場合の配列を生成することによって行われうる（バッツァー（Ｂａｔｚｅｒ）ら（１９９１年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１頁；オオツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）ら（１９８５年）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８頁；カッソル（Ｃａｓｓｏｌ）ら（１９９２年）；ロッソリーニ（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ）ら（１９９４年）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８頁）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコード化されるｍＲＮＡと同義的に用いられる。本明細書中で用いられる「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ならびにそれらの誘導体、断片および相同体を含むように意図される。
【００２４】
本明細書中で用いられる略語「ｎｔ」はヌクレオチドを意味する。
【００２５】
本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は一連の連結されたヌクレオチド残基を示し、オリゴヌクレオチドはＰＣＲ反応にて用いられるべき極めて多数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムもしくはｃＤＮＡ配列に基づきまたはそれらから設計可能であり、それを用いると、特定の細胞内または組織内で同一の、類似のもしくは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡが増幅され、それらの存在が確認または明示される。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、５０ｎｔ長もしくは１００ｎｔ長、好ましくは約１５ｎｔ長〜３０ｎｔ長を有する核酸配列の一部を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、化学的に合成可能でかつプローブとして使用可能である。
【００２６】
本明細書中で用いられるＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントとの機能的関連性の中に配置される場合、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」と称される。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接し、シグナル配列または融合タンパク質の場合には隣接しかつリーディング相にある。しかし、エンハンサーは、それにより転写調節されるコーディング配列と隣接する必要がない。これに関連し、好都合な制限部位またはその代わりに挿入されるアダプターもしくはリンカー位置でのライゲーションにより連結が行われる。
【００２７】
本明細書中で用いられる「ＰＣＲ」は、一般に、熱安定性ポリメラーゼ、および増幅されるべき配列において一方の末端で（＋）−鎖に相補的なものと他方の末端で（−）−鎖に相補的なものからなる２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列を増幅するための方法を示す。新規に合成されたＤＮＡ鎖またはｃＤＮＡ鎖が結果的に同じプライマー配列における追加的な鋳型として機能しうることから、プライマーのアニーリング、鎖伸長、および解離のラウンドにおける成功が、所望の配列の迅速かつ高度に特異的な増幅をもたらす。
【００２８】
本明細書中で用いられる「プローブ」という用語は、使用に依存し、可変長、好ましくは少なくとも約１０ｎｔ〜約１００ｎｔの核酸配列を示す。プローブは、同一の、類似の、または相補的な核酸配列の検出において用いられる。長い方のプローブは、通常天然または組換えソース（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ）から得られ、高度に特異的であり、ハイブリダイズするのがオリゴマーと比べてはるかに遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖であり、ＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術、好ましくはＰＣＲ、より好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、およびさらにより好ましくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて特異性を有するように設計される場合がある。
【００２９】
本明細書中で用いられる「プライマー」という用語は、増幅されるべきゲノム断片の始まりおよび末端と正確にマッチする、通常では５０ｂｐ以下、好ましくは１８〜２５ｂｐヌクレオチド（ＤＮＡが通常は二本鎖であることからその長さは塩基対単位で測定され、一本鎖ＤＮＡの長さは塩基もしくはヌクレオチド単位で測定される）の短い人工のオリゴヌクレオチド鎖を示す。プライマーは、ＤＮＡ鋳型に開始点および終結点でアニール（付着）し、そこではＤＮＡポリメラーゼが結合し、新しいＤＮＡ鎖の合成を開始する。プライマーの長さおよびそれらの融解温度（Ｔｍ）の選択は数多くの検討に依存する。プライマーの融解温度は、ＰＣＲプロセスの第１のステップにおけるＤＮＡの融解温度と混同されるべきではなく、それ未満ではプライマーがＤＮＡ鋳型にアニールし、それを超えるとプライマーがＤＮＡ鋳型から解離（分離）することになる温度と定義される。融解温度は、プライマーの長さとともに高くなる。プライマーが短すぎると長いＤＮＡ鋳型上の数か所の位置でアニールされ、非特異的なコピーが生じることになろう。他方、プライマーの長さはそれを融解させるのに要する温度によって制限を受ける。融解温度が高すぎると（すなわち８０℃超）ＤＮＡポリメラーゼの活性が低下することから、かかる温度も問題を引き起こしうる。最適な融解温度は６０℃〜７５℃である。フォワード配列決定プライマーはリバースプライマーに対して５’でアニールし、リバース配列決定プライマーはフォワードプライマーに対して３’でアニールする。プライマーと参照配列の間の関連性は、用いられる座標系に依存する。座標系ではフォワードプライマーがリバースプライマーに対して論理的に左になることから、フォワードプライマーのアニーリング位置は通常、リバースプライマーのアニーリング位置よりも小さいことになる。
【００３０】
本明細書中で用いられる「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼへの結合に関与するＤＮＡの領域を示す。
【００３１】
本明細書中で用いられる「組換え」という用語は、遺伝子またはＤＮＡの新たな組み合わせを有する、形質転換を受けている細胞、組織または生物を示す。
【００３２】
本明細書中で用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリダイズするが他の配列とは全くハイブリダイズしないという条件を示す。ストリンジェントな条件は、配列に依存しかつ異なる環境下で異なることになる。長い方の配列は、短い方の配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特異的配列に対して熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に対して相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。標的配列は一般にＴｍで過剰に存在することから、５０％のプローブは平衡時に占有される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、かつ温度は、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）において少なくとも約３０℃、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドにおいて少なくとも約６０℃である場合の条件ということになる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加によっても実現されうる。ストリンジェントな条件は、当業者にとって既知であり、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）（ニューヨーク）（１９８９年）、６．３．１−６．３．６の中に見出されうる。好ましくは、同条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性を示す配列が典型的には互いにハイブリダイズされた状態であるようなものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の限定されない例として、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡを６５℃で含有する高塩緩衝液中でのハイブリダイゼーションと、それに続く５０℃、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での１回または複数回の洗浄が挙げられる。
【００３３】
本明細書中で用いられる「被験者」という用語は、ヒトあるいは動物、好ましくはブタ、ウシ、ヒツジまたはイノシシでありうる。
【００３４】
本明細書中で用いられる「タックマン（ＴａｑＭａｎ）」という用語は、一般にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼの５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を用いることにより、ＰＣＲ産物内の特異的配列を検出するのに使用されるプローブを示す。タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブ（約２０〜３０ｂｐ）は、３’末端側での伸長から使用不可であり、蛍光レポーター色素および蛍光クエンチャー色素で標識された部位特異的配列からなる。ＰＣＲの間、タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブは、ＰＣＲ標的内のそれに相補的な一本鎖ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。増幅が生じる場合、タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブはタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼの５’−＞３’のエキソヌクレアーゼ活性が原因で劣化し、それにより伸長する間にクエンチャーをレポーターから分離する。レポーター上での消光効果の放出に起因し、レポーター色素の蛍光強度は増加する。増幅プロセス全体にわたり、この光放射は指数関数的に増加し、最終レベルはＰＣＲの終了後に分光測光によって測定される。レポーター色素の蛍光強度の増加がプローブのハイブリダイゼーションおよび標的配列の増幅が生じている場合に限ってなされることから、タックマン（ＴａｑＭａｎ）アッセイは、特異的配列の存在または非存在を測定するための高感度な方法を提供する。したがって、この技術は、試料における好ましい特徴の存在または取り込みについてのスクリーニングおよび病原体および疾患の検出などの診断用途において特に有用である。検出にはゲル電気泳動を全く必要としないことから、タックマン（ＴａｑＭａｎ）アッセイは試料の高スループットを可能にする。タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブは、ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性に依存し、標的のアンプリコンにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを加水分解する。特に、タックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブは、５’末端側に付着される蛍光レポーター色素および３’末端側に共役されるクエンチャー部分を有するオリゴヌクレオチドである。これらのプローブは、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイズされていない状態では、蛍光レポーター分子と消光分子が接近することにより、プローブからの蛍光シグナルの検出が阻止される。ＰＣＲの間、ポリメラーゼがタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブが結合した鋳型を複製する場合、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される。これにより蛍光および消光色素が分離され、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がもはや生じない。したがって、各サイクルにて蛍光は増大し、それはプローブの切断量に比例する。
【００３５】
本明細書中で用いられる「熱安定性ポリメラーゼ酵素」という用語は、熱に対して安定で耐熱性を示し、ヌクレオチドの組み合わせを適切な様式で触媒する（容易にする）ことで各核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成する酵素を示す。一般に、合成は、プライマーの３’末端側で開始されかつ合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５’方向に進行することで異なる長さの分子が生成されることになる。しかし、上記と同じプロセスを用いて５’末端側で合成を開始しかつもう一方の方向に進行する熱安定酵素が存在しうる。本明細書における好ましい熱安定酵素は、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されるＤＮＡポリメラーゼである。その様々な株は、米国菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））から入手可能であり、Ｔ．Ｄ．ブロック（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９６９年）９８：２８９−２９７頁およびＴ．オシマ（Ｔ．Ｏｓｈｉｍａ）、Ａｒｃｈ．Ｍｉｒｃｏｂｉｏｌ．（１９７８年）１１７：１８９−１９６頁の中に記載されている。これらの好ましい株の１種はＹＴ−１株である。
【００３６】
本明細書中で用いられる「形質転換」という用語は、核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）の細胞への移行を示す。本明細書中で用いられる「遺伝的形質転換」という用語は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの細胞への移行および取り込みを示す。
【００３７】
「変異体」は、参照核酸または参照ポリペプチドと異なるがそれらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたは核酸を示す。一般に、変異体は、参照核酸または参照ポリペプチドと全体的に酷似し、かつ多数の領域内で同一である。
【００３８】
本明細書中で用いられる「ベクター」という用語は、広義には外来核酸をコード化する任意のプラスミド、ファージミドまたはウイルスを示す。同用語は、核酸の例えばポリリシン化合物などのビリオンまたは細胞への移行を促進する非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物を含むようにも解釈される。ベクターは核酸またはその変異体の細胞への送達のための送達媒体として適するウイルスベクターであるか、あるいはベクターは同じ目的に適する非ウイルスベクターでありうる。ＤＮＡの細胞および組織への送達を目的としたウイルスおよび非ウイルスベクターの例は、当該技術分野で周知であり、例えばマ（Ｍａ）ら（１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６頁）の中に記載されている。ウイルスベクターの例として、組換え種痘ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換え鶏痘ウイルスなどが挙げられるがこれらに限定されない（クラナージュ（Ｃｒａｎａｇｅ）ら、１９８６年、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３０５７−３０６３頁；１９９４年８月１８日に公表された国際公開第９４／１７８１０号パンフレット；１９９４年１０月２７日に公表された国際公開第９４／２３７４４号パンフレット）。非ウイルスベクターの例として、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
本明細書中で用いられる「野生型」という用語は、天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示す。
【００４０】
８．２．発明の実施形態の説明
８．２．１．本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、プライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを包含する。プローブとして使用される場合、オリゴヌクレオチドが標識を含むことは好ましい。例示的実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして有用である。本発明の特定の実施形態は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、および配列番号７のオリゴヌクレオチドのプライマーセットを包含することが好ましい。本発明の別の特定の実施形態は、配列番号３、配列番号６、配列番号８、または配列番号９のオリゴヌクレオチドのプローブセットを包含する。別の実施形態では、本発明のプローブは標識をさらに含む。特定の実施形態では、標識は蛍光基、ジゴキシゲニンまたはビオチンである。
【００４１】
本発明の具体的なオリゴヌクレオチドは以下のヌクレオチド配列を有する。
配列番号２：５’−ＡＴＧＣＣＣＡＹＡＧＴＡＧＧＡＣＴＡＧＣＡ−３’
配列番号３：５’−ＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＡＧＴ−３’
配列番号４：５’−ＣＴＡＣＴＧＡＣＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＡＣ−３’
配列番号５：５’−ＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣ−３’
配列番号６：５’−ＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡ−３’
配列番号７：５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧ−３’
配列番号８：５’−ＦＡＭ−ＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＡＧＴ−ＴＡＭＲＡ−３’
配列番号９：５’−ＨＥＸ−ＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡ−ＢＨＱ１−３’
【００４２】
８．２．１．１．オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成はルーチン化している。核酸合成の詳細な説明として、ゲイト，Ｍ．Ｊ．（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．」ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、英国）を参照のこと。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、既知の固相合成における支持体上で合成される。あるいは、それらは溶液中で合成される。当業者は、標識、未標識および／または修飾オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの合成類似体）のいずれもが容易に入手できることを理解するであろう。それらを市販の器具および試薬を使用して合成するかまたはカスタム製オリゴヌクレオチドの商用ベンダーから購入してもよい。核酸の合成および標識のための様々な組成物、支持体および方法論について考察している特許には、米国特許第５，４７６，９２５号明細書、米国特許第５，４５３，４９６号明細書、米国特許第５，４４６，１３７号明細書、米国特許第５，４１９，９６６号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書、米国特許第５，３９１，６６７号明細書、米国特許第５，３８０，８３３号明細書、米国特許第５，３４８，８６８号明細書、米国特許第５，２８１，７０１号明細書、米国特許第５，２７８，３０２号明細書、米国特許第５，２６２，５３０号明細書、米国特許第５，２４３，０３８号明細書、米国特許第５，２１８，１０３号明細書、米国特許第５，２０４，４５６号明細書、米国特許第５，２０４，４５５号明細書、米国特許第５，１９８，５２７号明細書、米国特許第５，１７５，２０９号明細書、米国特許第５，１６４，４９１号明細書、米国特許第５，１１２，９６２号明細書、米国特許第５，０７１，９７４号明細書、米国特許第５，０４７，５２４号明細書、米国特許第４，９８０，４６０号明細書、米国特許第４，９２３，９０１号明細書、米国特許第４，７８６，７２４号明細書、米国特許第４，７２５，６７７号明細書、米国特許第４，６５９，７７４号明細書、米国特許第４，５００，７０７号明細書、米国特許第４，４５８，０６６号明細書および米国特許第４，４１５，７３２号明細書が含まれ、これらの各々は参照により援用される。
【００４３】
８．２．２．本発明の方法
本発明は、１つもしくは複数のＣＳＦＶ遺伝子をコード化するＲＮＡを逆転写して相補的ＣＳＦＶ（「ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡ」）を得るステップと、ＰＣＲ産物を生成する条件下で、２種以上のプライマーを使用して該ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを増幅するステップであって、少なくとも１種のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖の第１の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズしかつ少なくとも１種のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖の第２の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、該ＰＣＲ産物を核酸プローブと、該プローブがＰＣＲ産物またはその相補鎖にハイブリダイズしてハイブリダイズされたプローブをもたらすように接触させるステップと、ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、を含む、被験者の単離された生体試料中でＣＳＦＶ核酸を検出するための方法も包含する。
【００４４】
例示的実施形態では、本発明は、生体試料中でＣＳＦＶ核酸を検出するための方法であって、
（ｉ）該核酸を逆転写してＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを得るステップと、
（ｉｉ）該ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを２種以上のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと接触させてＰＣＲ産物を生成するステップであって、該プライマーがｃＤＮＡにハイブリダイズするような条件下で少なくとも１種のフォワードプライマーおよび少なくとも１種のリバースプライマーを含み、少なくとも１種のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド７５〜１５０、好ましくはヌクレオチド９０〜１３０、および最も好ましくはヌクレオチド１００〜１２０に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも１種のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１５５〜２０５、好ましくはヌクレオチド１６５〜１９５、および最も好ましくはヌクレオチド１７２〜１９２に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物を第１の核酸プローブと、該プローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３０〜１７５、好ましくはヌクレオチド１３５〜１７０、および最も好ましくはヌクレオチド１４１〜１６６に対応する標的部位でＰＣＲ産物にハイブリダイズしてハイブリダイズされたプローブをもたらすように接触させるステップと、
（ｉｖ）該ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法を包含する。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、プラスミドベクターｐＥＧＦＰ−１のＥＧＦＰ−配列の内部対照（すなわち配列番号１０）を添加するステップをさらに包含する。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１種の第２のフォワードプライマーおよび少なくとも１種の第２のリバースプライマーを加え、該添加プライマーにハイブリダイズさせるステップをさらに含む。
【００４７】
別の例示的実施形態では、第２のフォワードプライマーは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６２５〜６７５、好ましくはヌクレオチド６３０〜６６５、および最も好ましくはヌクレオチド６３７〜６５６に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第２のリバースプライマーは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７４０〜７８０、好ましくはヌクレオチド７４５〜７７５、および最も好ましくはヌクレオチド７５０〜７６８に対応する標的部位にハイブリダイズする。
【００４８】
本発明の別の例示的実施形態は、第２の核酸プローブを添加するステップを包含し、ここで該プローブは配列番号１０またはその相補鎖にハイブリダイズする。
【００４９】
別の例示的実施形態では、第２の核酸プローブは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９０〜７３５、好ましくはヌクレオチド６９５〜７３０、および最も好ましくはヌクレオチド７０３〜７２４に対応する標的部位にハイブリダイズする。
【００５０】
本発明の別の例示的実施形態は、生体試料中でＣＳＦＶ核酸を検出するための方法であって、
（ｉ）該核酸を逆転写して相補的ＣＳＦＶ複合体（すなわちＣＳＦＶ  ｃＤＮＡ）を得るステップと、
（ｉｉ）該ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを、２種以上の第１のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと接触させてＰＣＲ産物を生成するステップであって、第１のフォワードプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１００〜１２０に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第１のリバースプライマーが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１７２〜１９２に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
（ｉｉｉ）該ＰＣＲ産物を第１の核酸プローブと、該プローブが配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１４１〜１６６に対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
（ｉｖ）内部対照および少なくとも２種以上の第２のプライマーを、少なくとも１種の第２のフォワードプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６３７〜６５６に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも１種の第２のリバースプライマーが配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７５０〜７６８に対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
（ｖ）少なくとも１種の第２の核酸プローブを、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７０３〜７２４に対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
（ｖｉ）該ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法を包含する。
【００５１】
本発明の方法における別の特定の実施形態では、プローブをリアルタイムにまたはアッセイの終点にて閉じたチューブ型で独立に検出してもよい。本発明の方法におけるさらに別の特定の実施形態では、少なくとも２種以上の独立に検出可能なＰＣＲ産物は、同じ試料および同じアッセイにて目的の２種以上の標的分子（例えばＣＳＦＶ核酸）を同時に検出、同定または定量化するのに用いられる単一の多重アッセイにおいて存在する。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、ＣＳＦＶ遺伝子をコード化するＲＮＡを逆転写してＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを得るステップと、少なくとも１種のフォワードプライマー（すなわち第１のフォワードプライマー）および少なくとも１種のリバースプライマー（すなわち第１のリバースプライマー）を用いて、該プライマーが該ｃＤＮＡにハイブリダイズしてＰＣＲ産物を形成するような条件下で、該ＣＳＦＶ  ｃＤＮＡを増幅するステップであって、少なくとも１種のフォワードプライマーが配列番号１の第１の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも１種のリバースプライマーが配列番号１の第２の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、該ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物またはその相補鎖とハイブリダイズしてハイブリダイゼーションプローブを形成する第１の核酸プローブと接触させるステップと、該ハイブリダイゼーションプローブの存在を検出するステップとを含む、生体試料中でのＣＳＦＶ核酸の多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出のための方法を包含する。本発明は、配列番号１０の内部対照ならびに２種以上のさらなるフォワードプライマー（すなわち第２のフォワードプライマー）および２種以上のさらなるリバースプライマー（すなわち第２のリバースプライマー）の存在をさらに含み、ここで、少なくとも１種のさらなるフォワードプライマーは配列番号１０またはその相補鎖の第１の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズしかつ少なくとも１種のさらなるリバースプライマーは配列番号１０またはその相補鎖の第２の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、ならびに配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド群に対応する標的部位にハイブリダイズする第２の核酸プローブの添加をさらに含む。
【００５３】
例示的実施形態では、第１のフォワードプライマーは、配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド７５〜１５０、好ましくはヌクレオチド９０〜１３０、および最も好ましくはヌクレオチド１００〜１２０に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第１のリバースプライマーは、配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１５５〜２０５、好ましくはヌクレオチド１６５〜１９５、および最も好ましくはヌクレオチド１７２〜１９２に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第１のプローブは、配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３０〜１７５、好ましくはヌクレオチド１３５〜１７０、および最も好ましくはヌクレオチド１４１〜１６６に対応する標的部位にハイブリダイズする。
【００５４】
別の例示的実施形態では、第２のフォワードプライマーは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６２５〜６７５、好ましくはヌクレオチド６３０〜６６５、および最も好ましくはヌクレオチド６３７〜６５６に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第２のリバースプライマーは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７４０〜７８０、好ましくはヌクレオチド７４５〜７７５、および最も好ましくはヌクレオチド７５０〜７６８に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第２のプローブは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９０〜７３５、好ましくはヌクレオチド６９５〜７３０、および最も好ましくはヌクレオチド７０３〜７２４に対応する標的部位にハイブリダイズする。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明は、１チューブプロトコルにおける異種内部対照（「ＩＣ」）を含む、ＣＳＦＶゲノムの検出を目的とした、標準化された高感度のＣＳＦＶに特異的な多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを包含する。本発明の実施形態によると、１００％マッチングするオリゴヌクレオチドを示す７８種の異なるＣＳＦＶ株の５’−ＮＴＲコンセンサス配列を用い、両方のプライマー（例えば、フォワードおよびリバースプライマー）ならびにタックマン（ＴａｑＭａｎ）−プローブが選択され、少数のＣＳＦＶ単離物が公表されたＣＳＦＶ配列と比べて最大で１個のヌクレオチド交換を含むプライマー結合部位を有しただけだった。ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）のＣＳＦＶプライマーおよびタックマン（ＴａｑＭａｎ）−プローブでは、プローブ領域内で２つまでのミスマッチを含むゲノム配列の検出が可能であった。「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」は、プライマー対のＣＳＦ１００−Ｆ／ＣＳＦ１９２−ＲとＦＡＭで標識されたプローブのＣＳＦ−プローブ１（ＣＳＦ−Ｐｒｏｂｅ１）とからなり（図１、表１）、ＣＳＦＶ（アルフォート（Ａｌｆｏｒｔ）１８７株［登録番号Ｘ８７９３９］；図１）の５’−ＮＴＲにおける１００〜１９２ｎｔの９３ｂｐの断片を増幅する。すべての異なるＣＳＦＶ株および単離物の検出が考えられ、異なる遺伝子型の大量のＣＳＦＶを伴うすべての試験で、ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）におけるすべてのＣＳＦＶ株および単離物に対する検出能が示された。ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）の種特異性を証明するため、大量の異なるＢＤＶ、ＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２および非定型ぺスティウイルスについて試験し、１００％のＣＳＦ特異性が得られた。
【００５６】
ＩＣは、ＲＮＡ分解または阻害作用に起因する偽陰性の結果を回避するのに用いられる（ホフマン（Ｈｏｆｍａｎｎ）、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｈｅ  ５’ＵＴＲ  Ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ，Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓ  Ａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ」  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３年、１１４、７７−９０頁）。インビトロで転写されたＥＧＦＰ  ＲＮＡは、独立したプライマー／プローブ系を用いて検出されたものであり、内部対照として使用されうる。このＩＣをさらに他の病原体を対象とする多重ＰＣＲアッセイにおいて用いてもよい。あるいは、ハウスキーピング遺伝子または標的のＣＳＦＶ配列を模倣する内部対照を用いてもよい（ゴルゼルニック（Ｇｏｒｚｅｌｎｉｋ）ら、「Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．」  Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．、２００１年、３３、６２５−６２７頁；コリムボーカス（Ｋｏｒｉｍｂｏｃｕｓ）ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｕｇａｒｃａｎｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｖｉｒｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ（Ｔａｑｍａｎ）ＲＴ−ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ．」  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００２年、１０３、１０９−１２０頁）。しかし、ハウスキーピング遺伝子は、それらの濃度が特に血漿または血清のような細胞を含有しない試料中では未知であるという欠点を有する。最近公表されたＣＳＦＶ多重ＰＣＲ（例えばホフマン（Ｈｏｆｍａｎｎ）、２００３年）と異なり、感染性の遺伝子操作されたＣＳＦＶの使用が回避されることから、本発明のＩＣ系は標準のバイオセーフティーレベル２の研究所でなくても使用されうる。異種のインビトロで転写されたＲＮＡのＩＣとしての使用は、パッケージングされたＲＮアーゼから保護されたウイルスＲＮＡからのＲＮＡ抽出を完全にシミュレートすることはない（ドロステン（Ｄｒｏｓｔｅｎ）ら、２００１年、「Ｔａｑｍａｎ  ５’  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｗｉｔｈ  Ｐｈａｇｅ−Ｐａｃｋａｇｅｄ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｏｎｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．」  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００１年、３９、４３０２−４３０８頁）。ＣＳＦＶ  ＲＮＡの抽出において重要なのは、抽出ステップの間でのＩＣ  ＲＮＡの分解でもＲＮＡのビリオンからの放出でもない。したがって、本発明は、ユニバーサルな非感染性のＩＣ  ＲＮＡを提供し、それは４０回の凍結／解凍サイクル後であっても安定であることが示された。
【００５７】
本発明は、極めて低い濃度のＩＣ、極めてわずかな量のＩＣプライマー、およびＩＣアンプリコンの使用を可能にし、ＩＣアンプリコンはＣＳＦＶに特異的なアンプリコンよりも有意に長いように選択されることで、一方ではＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）の高感度が実現され、もう一方では多重アッセイにおけるＩＣの相対的に一定の増幅が可能になる。その結果、単一および多重ＣＳＦアッセイにおいて同一の分析感度を実現できる。インビトロで転写された陽性ＲＮＡのｌｏｇ２−希釈を用い、単一および多重系においてＲＴ−ＰＣＲ反応当たり８コピーの平均検出限界が９回のｌｏｇ１０ステップの広範なダイナミックレンジと組み合わせて得られる。それにもかかわらず、膨大な量の標的ＲＮＡを用いると、ＩＣ増幅の阻害が観察される可能性があった。ＩＣは大量のＣＳＦＶ標的ＲＮＡの場合に不適切な偽陰性の結果を除外するために用いられることから、ＩＣ増幅におけるこの部分的または完全な阻害は許容される（ホフマン（Ｈｏｆｍａｎｎ）、２００３年、上記参照）。さらに、ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）多重ＲＴ−ＰＣＲの感度は、ＣＳＦ診断における「ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」と見なされるウイルス単離の感度に匹敵する。さらに、「ゴールドスタンダード」として用いられる細胞培養系の感度が計算にとって重要であることから、ＣＳＦＶアルフォート（Ａｌｆｏｒｔ）１８７のような細胞培養に適する株における結果がＣＳＦＶフィールド単離物の場合と比べて異なる可能性がある。
【００５８】
多重バージョンのＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）を用いた様々な遺伝子型の３６種のＣＳＦＶ単離物の分析によると、すべてのＣＳＦＶにおいて類似の検出特性が示された。遺伝子型３．４  ＣＳＦＶ「カナガワ（Ｋａｎａｇａｗａ）」株の場合であっても、蛍光シグナルおよび閾値サイクルに関する差異が全く観察されなかった。発明者らのＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）と異なり、公表されたＣＳＦＶに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイは、５’ＮＴＲ内の下流の方に位置する配列をベースとするものであり、「カナガワ（Ｋａｎａｇａｗａ）」株の場合に浅い蛍光曲線のみが生成された（マックゴールドリック（ＭｃＧｏｌｄｒｉｃｋ）ら、１９９８年）。
【００５９】
ＣＳＦＶプライマーおよびタックマン（ＴａｑＭａｎ）−プローブの効率的な調節のため、プラスミドをベースとする非感染性の陽性対照が構築される。ＣＳＦＶ陽性の試料中に含有されるウイルスＲＮＡを定量するための標準として、インビトロで転写された陽性対照ＲＮＡの段階希釈物が用いられる。したがって、本発明の多重ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）における両対照（ＩＣおよびＰＣ）は、インビトロで転写された非感染性のＲＮＡである。
【００６０】
本発明は、（ａ）「１チューブ」ＲＴ−ＰＣＲ反応、（ｂ）有効かつ高効率なＲＴ−ＰＣＲキットの使用、（ｃ）安定で非感染性のＩＣの統合、（ｄ）定量可能な非感染性のＰＣの使用、および（ｅ）高感度かつＣＳＦＶに特異的な２色の多重ＲＴ−ＰＣＲ反応としての完全系の検証を包含する２色の多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲシステムをさらに包含する。
【００６１】
特に、本発明のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ブタの一時的な感染を可能にし、この場合、ＣＳＦＶの臨床的徴候が細胞培養物の単離方法の場合よりも早期に、高頻度に、かつ長期間にわたって検出されることは全くない。標準化されたＰＣＲシステムを、撲滅キャンペーンまたは緊急の場合でのＣＳＦＶの高感度かつ特異的な検出における強力なツールとして用いてもよい。
【００６２】
８．２．２．１．多重分析
本発明の好ましい実施形態では、多重ハイブリダイゼーションアッセイが行われる。多重分析は、アッセイの間またはアッセイ後での試料成分またはそれらに関連するデータを分類する能力に依存している。本発明の好ましい実施形態では、明確な独立に検出可能な部分を用いて、２つ以上の異なる複合体の成分が標識される。明確に（独立に）標識された各複合体と標的配列とのハイブリダイゼーションに相関するデータが、試料中で検出されるべき検索対象である各々の標的配列または標的分子の存在、非存在または量と相関する可能性があることから、独立に検出可能な各部分間で識別しかつ／または各部分を定量する能力により、ハイブリダイゼーションアッセイを多重化するための手段がもたらされる。
【００６３】
それ故、同じ試料および同じアッセイにおいて２つ以上の標的配列または標的分子の存在、非存在または量を同時検出するのに本発明の多重アッセイの利用が可能である。複合体が自動的（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ）であり、かつ独立に検出可能であるように設計されうることから、本発明の多重アッセイを閉じたチューブ型にて行い、同じアッセイにおいて目的の２種以上の標的配列または標的分子に対する試料の同時リアルタイムおよび終点分析についてのデータを得てもよい。加えて、アッセイを単分子プローブの取り込みによってさらに多重化し、それによってアッセイ性能を確認するか、またはアッセイを用いて目的の標的配列または標的分子に特異的な特徴を同定してもよい。
【００６４】
８．２．２．２．多重用途
以下の実施例によって説明されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドセットを含む用途に対して特に有用であり、この場合、各オリゴヌクレオチドは少なくとも１種の独立に検出可能な部分を含む。好ましくは、独立に検出可能な部分は独立に検出可能なフルオロフォアである。例えば、１つもしくは複数の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を用い、４つの異なる標的配列の各々の検出が可能であり、この場合、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドは１つもしくは複数の独立に検出可能なフルオロフォアを含む。この例においては、混合物が目的試料とともにインキュベートされた後、異なる独立に検出可能な各フルオロフォアの検出および／または定量により、異なる標的配列の存在、非存在または量の検出がなされうる。既に考察したように、アッセイにおいてオリゴヌクレオチドも使用可能であり、この場合、独立に検出可能な部分を用い、同じアッセイにおいて生じる同じまたは異なるプロセスの作用が区別される。かかる多重アッセイは、オリゴヌクレオチドがプローブまたはプライマーのいずれとして使用されるかについて対応可能である。
【００６５】
８．２．３．本発明のプローブ
本発明の別の実施形態は、配列番号１またはその相補鎖の標的領域にハイブリダイズする第１のプローブを包含しかつ検出可能なシグナルを提供する。本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１０またはその相補鎖の標的領域にハイブリダイズする第２のプローブを包含しかつ検出可能なシグナルを提供する。
【００６６】
より特定の実施形態では、第１のプローブは、配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３０〜１７５に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の特定の実施形態では、第１のプローブは、配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１３５〜１７０に対応する標的部位にハイブリダイズする。さらに別の特定の実施形態では、第１のプローブは、配列番号１またはその相補鎖のヌクレオチド１４１〜１６６に対応する標的部位にハイブリダイズする。
【００６７】
別の特定の実施形態では、第２のプローブは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９０〜７３５に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の特定の実施形態では、第２のプローブは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド６９５〜７３０に対応する標的部位にハイブリダイズする。さらに別の特定の実施形態では、第２のプローブは、配列番号１０またはその相補鎖のヌクレオチド７０３〜７２４に対応する標的部位にハイブリダイズする。
【００６８】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明のプローブはオリゴヌクレオチドプローブである。より特定の実施形態では、プローブは５０個までのヌクレオチドを含み、好ましくはプローブは約１０〜３０ヌクレオチド長であり、かつより好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは約１５〜２５ヌクレオチド長である。さらにより特定の実施形態では、プローブの配列は配列番号３または配列番号６である。別の特定の実施形態では、プローブは蛍光標識される。
【００６９】
８．２．３．１．標識
本発明のプローブに付着される標識は、少なくとも１つのドナーおよび少なくとも１つのアクセプター部分を含む、１セットのエネルギーまたは電子移動部分を含む。標識は、標識を識別する任意のタイプ（例えば、ＣＳＦに特異性を示さない核酸配列）、検出可能な分子（例えば、フルオレセインイソチオシアネートを例として用いる既知の方法によって挿入可能な蛍光基）、またはジゴキシゲニン、あるいは（例えばオリゴヌクレオチドがストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合されうるという手段による）ビオチンなどの固定化可能な分子でありうる。
【００７０】
典型的には、標識は単一のドナー部分および単一のアクセプター部分を含むであろう。それにもかかわらず、標識は２つ以上のドナー部分および／または２つ以上のアクセプター部分を含みうる。例えば、１セットは３つの部分が含みうると思われる。部分１は、ドナーフルオロフォアである可能性があり、放出されて部分２と極めて近い位置にある場合、次いで標識の部分２へのエネルギー移動を起こしうる。その後、部分２は、励起されて部分３と極めて近い位置にある場合、標識の部分３へのエネルギー移動を起こしうる。その結果、３つすべての部分間でエネルギー移動が起こる。このセットでは、部分２は部分１からのエネルギーのアクセプターでありかつ部分３へのエネルギーのドナーでもある。
【００７１】
ドナーおよびアクセプター部分は、１つもしくは複数のアクセプター部分が１つもしくは複数のドナー部分からのエネルギー移動を受けるかそれ以外では１つもしくは複数のドナー部分からのシグナルをクエンチするように作用する。標識の密接に関連した部分間の衝突（非ＦＲＥＴ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの非放射プロセスを介してエネルギー移動が発生しうる。ＦＲＥＴの発生におけるドナーおよびアクセプター部分間のエネルギー移動では、部分間が空間的に近くかつドナーの放射スペクトルがアクセプターの吸収スペクトルとの実質的な重複部を有することが必要とされる（ヤロン（Ｙａｒｏｎ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９５、２２８−２３５頁（１９７９年）の特に２３２頁、ｃｏｌ．１〜２３４頁、ｃｏｌ．１を参照）。あるいは、極めて密接に関連したドナーおよびアクセプター部分間では、ドナー部分の放射スペクトルがアクセプターの吸収スペクトルとの実質的な重複部を有するか否かに無関係に非ＦＲＥＴエネルギー移動が発生しうる（ヤロン（Ｙａｒｏｎ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９５、２２８−２３５頁（１９７９年）の特に２２９頁、ｃｏｌ．１〜２３２頁、ｃｏｌ．１を参照）。ドナーおよびアクセプター部分の直接接触によってクエンチングが引き起こされると考えられていることから、このプロセスは分子内衝突（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ）と称される。
【００７２】
好ましいドナーおよびアクセプター部分は、それぞれフルオロフォアおよびクエンチャーの組み合わせである。極めて多くのアミン反応性標識試薬は市販されている（例えば、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）））。好ましい標識試薬は、カルボン酸またはカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシニジルエステルとして供給されるであろう。好ましい蛍光色素（フルオロフォア）としては、５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、シアニン２（Ｃｙ２）色素、シアニン３（Ｃｙ３）色素、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）色素、シアニン５（Ｃｙ５）色素、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）色素、シアニン７（Ｃｙ７）色素、シアニン９（Ｃｙ９）色素（シアニン２、３、３．５、５および５．５はアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（イリノイ州アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ））からのＮＨＳエステルとして入手できる）またはアレキサ（Ａｌｅｘａ）色素シリーズ（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）））が挙げられる。最も好ましいフルオロフォアは、フルオレセインの誘導体であり、特に５および６−カルボキシフルオレセインである。アクセプター部分は第２のフルオロフォアでありうるが、好ましくはアクセプター部分はクエンチャー部分である。クエンチャー部分は、フルオロフォアなどのドナー部分からの検出可能なシグナルをクエンチしうる部分である。最も好ましくは、クエンチャー部分は、１つもしくは複数のアゾ基またはニトロ基と置換される芳香族または複素芳香族部分である。最も好ましいクエンチャー部分は、４−（（−４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル）である。
【００７３】
８．２．４．本発明のキット
本発明は、本発明に従うプライマーを含むＣＳＦＶを検出するためのキットおよびＰＣＲを行うための別々にパッケージ化された試薬も包含する。かかるキットは、好ましくは少なくとも１種の、プライマーによって増幅される領域内でＣＳＦＶを検出する標識オリゴヌクレオチドを含む。キットのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号７でありうる。キットの標識オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３、配列番号６、配列番号８または配列番号９でありうる。ここで配列番号３および配列番号６は、必要に応じて標識されるものである。
【００７４】
本発明の好ましいキットは、ＰＣＲ反応を行うためのすべての試薬を含み、ここでキットの各標識プローブは、試料におけるＣＳＦＶの存在、非存在または量について監視するのに使用される。好ましい実施形態では、キットの１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして機能する。
【００７５】
典型的なキットは、少なくとも２種のプライマー、少なくとも１種のプローブ、三リン酸ヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素（好ましくは熱安定性ポリメラーゼ）および（イオン強度の調節、マグネシウム含量の調節およびｐＨ調節因子を伴う）緩衝溶液を含むことになる。
【実施例】
【００７６】
９．実施例
Ａ．実施例１：ウイルスおよび細胞
この試験で使用するウイルス（９×ＢＤＶ、２２×ＢＶＤＶ  １、１９×ＢＶＤＶ  ２、３６×ＣＳＦＶ、非定型ぺスティウイルスジラフ（Ｇｉｒａｆｆｅ）（アヴァロス（Ａｖａｌｏｓ）ら、２００１年）、非定型ぺスティウイルスＤ３２／００「ＨｏＢｉ」［スキルマイアー（Ｓｃｈｉｒｒｍｅｉｅｒ）ら、２００４年］）は、フリードリッヒ・レフラー・インスティテュート（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ−Ｌｏｅｆｆｌｅｒ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）（インゼルリームス（Ｉｎｓｅｌ  Ｒｉｅｍｓ）、ドイツ）に位置するＣＳＦを対象とするナショナル・リファレンス・ラボラトリー（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のウイルスバンクの中に挙げられる。単離物の一部をＣＳＦを対象とするコミュニティ・リファレンス・ラボラトリー（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ハノーバー獣医科大学（ＴｉＨｏ  Ｈａｎｎｏｖｅｒ）（ドイツ））から入手した。ブタ腎細胞（ＰＫ−１５）を用いてすべてのＣＳＦＶ株を培養する一方、ウシ腎細胞（ＭＤＢＫ）またはヒツジ胸腺細胞（ＳＦＴ−Ｒ）を用いてＢＤＶおよびＢＶＤＶを増殖させた。細胞系は、コレクション・オブ・セル・ラインズ・イン・ベテリナリー・メディスン（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＣＣＬＶ）（インゼルリームス（Ｉｎｓｅｌ  Ｒｉｅｍｓ）（ドイツ））により供与を受けた。
【００７７】
Ｂ．実施例２：細胞培養を用いたウイルス単離
細胞培養物にウイルス株の異なる希釈物を接種し、３７℃でインキュベートした。４日後、細胞の単層を熱固定し、ぺスティウイルスに特異的なモノクローナル抗体Ｃ１６で染色した（ピーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ）ら、１９８６年）。すべてのウイルス単離を２通りに行った。ＣＳＦＶの力価をｌｏｇ１０希釈ステップを用いて４通りに測定した。ウイルス力価を１ｍｌ当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として計算した。
【００７８】
Ｃ．実施例３：ＲＮＡの単離および内部対照の添加
ＱＩＡアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ウイルスＲＮＡキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を製造業者の使用説明書に従って使用し、ウイルスＲＮＡを細胞培養物から抽出し、内部対照（ＩＣ）ＲＮＡの添加により修飾した。つまり、細胞培養上清１４０μｌを溶解緩衝液５６０μｌに添加し、ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。次いで、５μｌのインビトロで転写したＩＣ  ＲＮＡ（２×１０５コピー／μｌ）を添加した。５分後、エタノール５６０μｌを添加し、溶液をＱＩＡアンプ（ＱＩＡａｍｐ）スピンカラムにより遠心した。カラムを適切な緩衝液で２回洗浄後、ＲＮＡを溶出緩衝液５０μｌを用いて溶出し、−２０℃で保存した。
【００７９】
Ｄ．実施例４；プライマー、プローブおよびタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）ソフトウェアパッケージ（ＧＣＧウィスコンシン（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））を用い、異なるＣＳＦＶ配列の整列を行った。整列に基づくプライマーおよびプローブの選択をソフトウェアパッケージビーコン・デザイナー（Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）２．０６（プレミア・バイオソフト（ＰｒｅｍｉｅｒＢｉｏｓｏｆｔ））で対応した。すべてのオリゴヌクレオチドをＭＷＧバイオテックＡＧ（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）（エバースバーグ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）、ドイツ）によって合成し、使用するまで−２０℃で保存した。表１は、本報のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを示す。
【００８０】
交差汚染のリスクを最小限にするため、市販のクアンチテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）（商標）プローブ（Ｐｒｏｂｅ）ＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用し、１ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコルを選択した。全容量２５μｌを用い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを最適化した。つまり、単一のウェルにおいて、３．２５μｌのＲＮアーゼを含有しない水、１２．５μｌの２×クアンチテクト・プローブＲＴ−ＰＣＲマスター・ミックス（２×  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、０．２５μｌのクアンチテクト・プローブＲＴミックス（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ  Ｍｉｘ）、２μｌのＣＳＦに特異的なプライマー−プローブの混合物（０．６μＭのＣＳＦに特異的なプライマー＋０．１μＭのＣＳＦに特異的なプローブ）および２μｌのＩＣに特異的なプライマー−プローブの混合物（０．２μＭ  ＥＧＦＰに特異的なプライマー＋０．１μＭのＥＧＦＰｌ−ＨＥＸプローブ）をマスター混合物として貯蔵し、最後に５μｌのＲＮＡ鋳型を添加した。
【００８１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ｉサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ）ＩＱ（商標）リアルタイム・ディテクション・システム（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ））において、５０℃で３０分（逆転写）、９５℃で１５分（逆転写酵素の不活化／タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼの活性化）、次いで９４℃で１５秒の４２サイクル（変性）、５７℃で３０秒（アニーリング）および６８℃で３０秒（伸長）という温度プロフィールに従って行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの全試験において同一の温度プロフィールを用い、アニーリングステップの間に蛍光値を収集した。
【００８２】
Ｅ．実施例５：プラスミドＤＮＡのインビトロ転写
リボプローブ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）（登録商標）システム（Ｓｙｓｔｅｍ）−ＳＰ６／Ｔ７（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を製造業者の使用説明書に従って使用し、線形化およびゲル精製されたプラスミドＤＮＡのインビトロ転写を行った。Ｔ７で転写された陽性対照およびＳＰ６で転写された内部対照を、供給したＤＮアーゼで消化し、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して精製した。転写されたＲＮＡの正確な長さをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動によって確認し、濃度を分光測光によって測定した。式（Ｘｇ／μｌ  ＲＮＡ／［転写産物のヌクレオチド長×３４０］）×６．０２２×１０２３＝Ｙ分子／μｌを用い、正確なＲＮＡ分子数を計算した。
【００８３】
数千回のＲＴ−ＰＣＲにとって十分な５０μｌでのインビトロ転写手順において、通常、１０１２〜１０１３個のＲＮＡ分子を得た。インビトロで転写されたＲＮＡのストック溶液を−７０℃で保存し、希釈使用溶液を−２０℃で保存した。
【００８４】
Ｆ．実施例６：ＣＳＦに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの設計
第１のステップでは、異なるＣＳＦＶ株の５’ＮＴＲの７８種の配列を整列し、コンセンサス配列を計算した（図１）。比較されたＣＳＦＶ株の４種以上において相違した関連するゆらぎヌクレオチド（図１での下線部）のみをプライマーおよびプローブの選択において検討した。相違するヌクレオチドがいずれも単一のＣＳＦＶ株の５’ＮＴＲの一部でない場合、コンセンサス配列内の２つの関連するゆらぎヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドのみを用いた。第２のステップでは、ＣＳＦＶに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲシステムを設計し、「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」と名づけた。「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」は、プライマー対ＣＳＦ１００−Ｆ／ＣＳＦ１９２−ＲとＦＡＭで標識されたプローブのＣＳＦ−プローブ１（ＣＳＦ−Ｐｒｏｂｅ１）とからなり（図１、表１）、ＣＳＦＶ（アルフォート（Ａｌｆｏｒｔ）１８７株［登録番号Ｘ８７９３９］；図１）の５’−ＮＴＲにおける１００〜１９２ｎｔの９３ｂｐの断片を増幅する。
【００８５】
チェッカーボード（ｃｈｅｑｕｅｒｂｏａｒｄ）アッセイにて「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」の両プライマーおよびプローブを滴定することで最大蛍光値と定義される最適な濃度が同定され、それは最初の閾値サイクルと組み合わされた。「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」において、プライマーの０．６μＭ／反応およびプローブの０．ｌμＭ／反応がＣＳＦＶゲノムの検出における最適値として同定された。
【００８６】
Ｇ．実施例７：陽性および内部対照プラスミドの構築
プライマーＣＳＦｌ００−ＦおよびＣＳＦ３８３−Ｒ（表１）を使用し、ＣＳＦＶアルフォート（Ａｌｆｏｒｔ）／１８７（登録番号Ｘ８７９３９）の５’−ＮＴＲの２８４ｂｐ断片をＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、精製し、標準のクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー（Ｔｅａｓｙ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に挿入した。得られたプラスミドｐＧＥＭ−ＰＣ３ａｌｆ（図２）を陽性対照（ＰＣ）ＲＮＡのインビトロ転写において使用した。内部対照（ＩＣ）プラスミドを同様に構築した。プライマーＥＧＦＰｌ−ＦおよびＥＧＦＰ２−Ｒ（表１）を使用し、ｐＥＧＦＰ−１標準ベクター（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））の１３２ｂｐ断片をＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔイージー（Ｔｅａｓｙ）クローニングベクターにクローニングした（図２）。得られたＩＣプラスミドをｐＧＥＭ−ＥＧＦＰ１と名づけた。両方のプラスミドをＭ１３標準プライマーを用いた配列決定によって調節した。ｐＧＥＭ−ＰＣａｌｆ内のＣＳＦＶの５’−ＮＴＲ断片をフォワード方向にライゲートし、それによってＥＧＦＰ断片がｐＧＥＭ−ＥＧＦＰ１にリバース方向に挿入されたことになる。
【００８７】
Ｈ．実施例８：「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」の分析感度
「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」の分析感度をインビトロで転写されたＰＣ−ＲＮＡの段階希釈によって測定した。インビトロで転写されたＰＣ−ＲＮＡの最初の１０倍ずつの段階希釈では、「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」によりＰＣが９９．８％のＰＣＲ効率で１０１コピー／ウェルから１０９コピー／ウェルまで線形的に増幅されることが確認された（図３ａおよびｂ）。より詳細な分析では、ＰＣ−ＲＮＡの２倍ずつの段階希釈を用い、アッセイに特異的な分析感度限界を測定した。最終的に、単一の「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」アッセイにおいて約８コピー／ウェルの検出限界が検出された（表２）。
【００８８】
Ｉ．実施例９：内部対照の増幅および検出のためのＥＧＦＰに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの設計
ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲの双方に関連する各々の試料または試料プールの内部対照に対し、異種ＩＣ−ＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを設計した。インビトロで転写されたＩＣを、ＲＮＡの単離前またはＲＴ−ＰＣＲ前に各試料に添加することができ、ＥＧＦＰに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて増幅し、「ＩＣ−システム１（ＩＣ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」と名づけた。プライマー対ＥＧＦＰ１−Ｆ／ＥＧＦＰ２−Ｒの１３２ｂｐのアンプリコンをＨＥＸで標識されたプローブＥＧＦＰ１−ＨＥＸ（表１）を使用して検出した。チェッカーボードアッセイでは、プライマーとプローブの双方における濃度を滴定し、「ＩＣ−システム１（ＩＣ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」の分析感度をインビトロで転写されたＩＣ−ＲＮＡの段階希釈を用いて分析した。最終的に、ＩＣアッセイの感度限界として１０〜１００コピー／ウェルが測定された（データは示さず）。
【００８９】
ＣＳＦＶに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲシステムの最大感度を得るため、「ＩＣ−システム１（ＩＣ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」のプライマーを限定する必要があった。閾値サイクルの有意な増大を伴うことなくＥＧＦＰ断片を増幅するプライマーの最小濃度を、多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの微調整を意図して測定した。最終的に、ＥＧＦＰフォワードおよびリバースプライマーとして０．２μＭ／反応ならびにプローブとして０．１μＭ／反応を、多重アッセイにおけるＩＣの検出のために使用した。
【００９０】
Ｊ．実施例１０：多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」と「ＩＣ−システム１（ＩＣ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」の併用
最適な単一のＣＳＦに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいてプライマーおよびプローブ濃度を測定しかつＩＣに特異的なプライマーにおける限界濃度を同定した後、最適化されたＣＳＦに特異的な多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプロトコルを確立した。したがって、単一および多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの分析感度を比較した。第１に、ＰＣ−ＲＮＡの２倍ずつの段階希釈物のバッチをＩＣ−ＲＮＡの共増幅を伴う場合または伴わない場合で増幅した。単一および多重アッセイにおいて、ＲＴ−ＰＣＲのウェル当たり１０００コピーのＰＣ−ＲＮＡから開始し、ＲＴ−ＰＣＲ反応当たり８コピーの同一の感度限界を検出できた（表４）。第２に、抽出されたＣＳＦＶ−ＲＮＡの段階希釈物をＩＣの共増幅を伴う場合または伴わない場合で増幅した。これらの実験では、両方の系で類似の結果が得られた。例として、ＣＳＦＶ株「パダーボーン（Ｐａｄｅｒｂｏｒｎ）」（遺伝子型２．１．）のＲＮＡの段階希釈物を増幅した後の蛍光シグナルを図３ａに示す。黒線は単一アッセイのＦＡＭ−蛍光値を示す一方、四角を伴うグレイ線はＩＣの共増幅を含む多重アッセイのＦＡＭ−蛍光値を示す。内部対照（ＩＣ）の増幅は、それとは別に図３ｂに描かれる。ＩＣの共増幅を伴うすべてのＲＴ−ＰＣＲ反応が検出可能なＨＥＸ蛍光シグナルを示したことに言及する必要があり、ＩＣ−ＲＮＡの量を約３０の閾値サイクル（ＴＣ）に達するように調節した。多重アッセイにおけるＩＣにおいて観察されたＴＣ範囲は２９〜３２であり（図３ｂ）、試験ではＣＳＦＶゲノムのコピー数が増加していくにつれてＩＣのＴＣスコアは高まった（図３ｂ）。それにもかかわらず、ＩＣ増幅の競合阻害がＣＳＦＶ−ＲＮＡの量の増加という好ましい増幅によって引き起こされることが観察された（図３ｂ）。
【００９１】
Ｋ．実施例１１：「ゴールドスタンダード」のウイルス単離と比較される多重「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」の感度
「ＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）」と「ゴールドスタンダード」のウイルス単離との比較試験において、ＣＳＦＶ陽性の細胞培養上清における１０倍ずつの段階希釈物を調製した（表２）。ウイルス単離のために各段階希釈物からの一定分量を用い、ＲＮＡの単離および多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のために第２の一定分量を用いた。試験には異なるＣＳＦＶ遺伝子型についての数種の株を含め、結果では多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイが高感度であることが明示された。ほとんどの場合、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの感度は、少なくとも同一であるか（ＣＳＦＶ−ウェルゼン（Ｕｅｌｚｅｎ）、遺伝子型２．３）またはウイルス単離よりもさらに高かった（ＣＳＦＶ−コズロフ（Ｋｏｚｌｏｖ）、遺伝子型１．２；ＣＳＦＶ−パダーボーン（Ｐａｄｅｒｂｏｒｎ）、遺伝子型２．１）（表３）。しかし、細胞培養に適合した株アルフォート（Ａｌｆｏｒｔ）１８７（遺伝子型１．１）の場合、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの感度はウイルス単離と比べて約１０倍低めであった（表３）。
【００９２】
Ｌ．実施例１２：ＣＳＦ−リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの特異性
多重アッセイにおけるＣＳＦＶとＢＶＤＶ、ＢＤＶまたは非定型ぺスティウイルスとを識別する能力を評価するため、９０種の異なるぺスティウイルス株の１群について試験した（表３）。あらゆる既知のＣＳＦＶ遺伝子型のメンバーである全部で３６種の異なるＣＳＦＶ株を正確に検出し（表３）、さらにすべての場合に急峻に増加する曲線の蛍光シグナルが観察された（データは示さず）。遺伝子型３．４のＣＳＦＶであるＣＳＦＶ株「カナガワ（Ｋａｎａｇａｗａ）」の場合であっても、ＴＣ値および蛍光シグナルに顕著な差異は全く観察されなかった（データは示さず）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの特異性もまた所定の陰性のブタ集団由来の血清試料（ｎ＝１００）を用いて証明された。ＲＮＡを試料から単離し、ＣＳＦＶに特異的な多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて試験した。すべての試料が陰性と記録され、バックグラウンドの蛍光レベルのみが観察された。
【００９３】
本発明は、本発明の幾つかの態様の例示目的の実施例において開示された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、機能的に等価な任意の実施形態は本発明の範囲内にある。実際には、本明細書中で示されかつ記載された改良だけでなく本発明における様々な改良は、当業者にとって明白であり、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるものである。
【００９４】
本願中で参照されるすべての引用の特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
【表２】
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【００９７】
【表３】
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【００９８】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
７．図面の簡単な説明
【図１】７８種のＣＳＦＶ株の５’−ＮＴＲのコンセンサス配列およびＣＳＦＶに特異的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ１の局在について図示する。ヌクレオチドの単一の文字コードを用いてコンセンサス配列が示された。下線の付いた文字は、特異的ヌクレオチドに対する選択性を有するゆらぎ配列を示した。比較された７８種のヌクレオチドのうちの１〜３種のみが相違した。太字で印字されたゆらぎ配列でアラインメントを特徴づけ、それは４種以上のヌクレオチド内で相違した。
【図２】インビトロで転写されたＰＣの１０倍ずつの段階希釈に基づくＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）の分析感度。増幅ブロット（Ａ）およびそれに関連する標準曲線グラフ（Ｂ）が示された（ＮＴＣ＝対照鋳型なし）。
【図３】単一アッセイと比較されるＣＳＦ−システム１（ＣＳＦ−Ｓｙｓｔｅｍ１）多重アッセイの感度。図３Ａでは、両アッセイのＦＡＭ蛍光値が示される。図３Ｂでは、ＩＣ−ＲＮＡの共増幅が示された。多重アッセイに限り、ＨＥＸ蛍光値が観察された（黒線＝単一アッセイ；四角を伴うグレイ線＝多重アッセイ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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