(57)【要約】  本発明は、動物への生体作用活性薬剤の安全な送達のための組成物および方法に関する。好ましくは、生体作用活性薬剤がワクチンであり、そしてさらに好ましくは生体作用活性薬剤がウイルスである。
2008526870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンであって、動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物において免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導する、上記ワクチン。
【請求項２】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンであって、動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する、上記ワクチン。
【請求項３】
ウイルスが生ウイルスである、請求項１のワクチン。
【請求項４】
ウイルスが弱毒化ウイルスである、請求項１のワクチン。
【請求項５】
ウイルスが死ウイルスである、請求項１のワクチン。
【請求項６】
ウイルスが呼吸系ウイルスである、請求項１のワクチン。
【請求項７】
ウイルスが、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、およびアデノウイルス、カルシウイルス、アストロウイルス、ノーウォークウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ハンタウイルス、アルファウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスから成る群から選択される、請求項１のワクチン。
【請求項８】
ウイルスがオルトミクソウイルスである、請求項７のワクチン。
【請求項９】
オルトミクソウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項８のワクチン。
【請求項１０】
インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである、請求項９のワクチン。
【請求項１１】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６から成る群から選択される赤血球凝集素抗原（ＨＡ）を有する、請求項１０のワクチン。
【請求項１２】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９から成る群から選択されるノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）を有する、請求項１０のワクチン。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２から成る群から選択されるＨＡ：ＮＡ抗原プロフィールを有する、請求項１０のワクチン。
【請求項１４】
Ａ型インフルエンザウイルスの低用量を含んでなる、請求項１０のワクチン。
【請求項１５】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．００１〜５０００赤血球凝集単位（ＨＡＵ）である、請求項１４のワクチン。
【請求項１６】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．００５〜５００ＨＡＵである、請求項１５のワクチン。
【請求項１７】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．０１〜１００ＨＡＵである、請求項１６のワクチン。
【請求項１８】
動物が哺乳動物である、請求項１のワクチン。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項１８のワクチン。
【請求項２０】
ウイルスが、生ウイルス、弱毒化ウイルスおよび死ウイルスから成る群から選択される２種またはそれ以上のメンバーの組合せを含んでなる、請求項１のワクチン。
【請求項２１】
経路が天然ではない経路である、請求項１のワクチン。
【請求項２２】
経路が、皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口から成る群から選択される、請求項２１のワクチン。
【請求項２３】
請求項１のワクチンを含んでなるキット。
【請求項２４】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンであって、動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導し、そしてさらに該ウイルスが内包ビヒクルに会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）している、上記ワクチン。
【請求項２５】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンであって、動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、そしてさらに該ウイルスが内包ビヒクルと会合している、上記ワクチン。
【請求項２６】
ウイルスが内包ビヒクル内に内包されている、請求項２４のワクチン。
【請求項２７】
ウイルスが、該内包ビヒクル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質と会合される、請求項２４のワクチン。
【請求項２８】
内包ビヒクルが、ゲル、液体または粉体から成る群から選択される１種もしくはそれ以上のメンバーを含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項２９】
内包ビヒクルがナノチューブ内に装入される、請求項２８のワクチン。
【請求項３０】
内包ビヒクルがポリマーを含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項３１】
ポリマーが、動物に投与された場合に毒性ではない、請求項３０のワクチン。
【請求項３２】
ポリマーがウイルスと会合され、それにより周囲環境内への該ウイルスの放出を遅延させる、請求項３０のワクチン。
【請求項３３】
ポリマーがゲルである、請求項３０のワクチン。
【請求項３４】
ゲルがコラーゲンを含んでなる、請求項３３のワクチン。
【請求項３５】
ゲルがヒドロゲルである、請求項３３のワクチン。
【請求項３６】
ヒドロゲルが、アルギネート、ゼラチン、キトサンおよびヒアルロン酸から成る群から選択される、請求項３５のワクチン。
【請求項３７】
ヒドロゲルが、コラーゲン、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースから成る群から選択される、請求項３５のワクチン。
【請求項３８】
ゲルが、アルギネート、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースの１種もしくはそれ以上の組合せを含んでなる、請求項３３のワクチン。
【請求項３９】
ゲルが架橋されている、請求項３３のワクチン。
【請求項４０】
さらに添加剤を含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項４１】
添加剤がポリエチレングリコールである、請求項４０のワクチン。
【請求項４２】
内包ビヒクルがミクロカプセルを含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項４３】
内包ビヒクルがナノカプセルを含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項４４】
内包ビヒクルがナノチューブを含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項４５】
ナノチューブが５００ｎｍまたはそれ以下の直径を有する、請求項４４のワクチン。
【請求項４６】
内包ビヒクルが１種もしくはそれ以上の溶液、粉末またはゲルの組合せを含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項４７】
ウイルスが生ウイルスである、請求項２４のワクチン。
【請求項４８】
ウイルスが弱毒化ウイルスである、請求項２４のワクチン。
【請求項４９】
ウイルスが死ウイルスである、請求項２４のワクチン。
【請求項５０】
ウイルスが呼吸系ウイルスである、請求項２４のワクチン。
【請求項５１】
ウイルスが、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、およびアデノウイルス、カルシウイルス、アストロウイルス、ノーウォークウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ハンタウイルス、アルファウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスから成る群から選択される、請求項２４のワクチン。
【請求項５２】
ウイルスがオルトミクソウイルスである、請求項５１のワクチン。
【請求項５３】
オルトミクソウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項５２のワクチン。
【請求項５４】
インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである、請求項５３のワクチン。
【請求項５５】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６から成る群から選択される赤血球凝集素抗原（ＨＡ）を有する、請求項５４のワクチン。
【請求項５６】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９から成る群から選択されるノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）を有する、請求項５４のワクチン。
【請求項５７】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２から成る群から選択されるＨＡ：ＮＡ抗原プロフィールを有する、請求項５４のワクチン。
【請求項５８】
Ａ型インフルエンザウイルスの低用量を含んでなる、請求項５４のワクチン。
【請求項５９】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．００１〜５０００赤血球凝集単位（ＨＡＵ）である、請求項５８のワクチン。
【請求項６０】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．００５〜５００ＨＡＵである、請求項５９のワクチン。
【請求項６１】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．０１〜１００ＨＡＵである、請求項６０のワクチン。
【請求項６２】
動物が哺乳動物である、請求項２４のワクチン。
【請求項６３】
哺乳動物がヒトである、請求項６２のワクチン。
【請求項６４】
ウイルスが、生ウイルス、弱毒化ウイルスおよび死ウイルスの２種またはそれ以上の組合せを含んでなる、請求項２４のワクチン。
【請求項６５】
経路が天然ではない経路である、請求項２４のワクチン。
【請求項６６】
経路が、皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口から成る群から選択される少なくとも１種のメンバーである、請求項６５のワクチン。
【請求項６７】
請求項２４のワクチンを含んでなるキット。
【請求項６８】
動物へワクチンの送達のためのデバイスであって、（ａ）ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体の量であって、天然でない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導し、（ｂ）該動物へ該ワクチンを送達するための送達デバイスを含んでなるデバイス。
【請求項６９】
動物へのワクチンの送達のためのデバイスであって、（ａ）ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量であって、天然でない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、（ｂ）該動物へ該ワクチンを送達するための送達デバイスを含んでなるデバイス。
【請求項７０】
送達デバイスが中空チューブを含んでなる、請求項６８のデバイス。
【請求項７１】
中空チューブが先細の末端を有する、請求項７０のデバイス。
【請求項７２】
送達デバイスが針を含んでなる、請求項７１のデバイス。
【請求項７３】
中空チューブが場合によりプランジングデバイスに取り付けられる、請求項７０のデバイス。
【請求項７４】
プランジングデバイスが注射器である、請求項７３のデバイス。
【請求項７５】
送達デバイスが遺伝子ガンである、請求項６８のデバイス。
【請求項７６】
送達デバイスがカテーテルである、請求項６８のデバイス。
【請求項７７】
送達デバイスが貼付剤である、請求項６８のデバイス。
【請求項７８】
送達デバイスが吸入デバイスである、請求項６８のデバイス。
【請求項７９】
送達デバイスが粘膜アプリケーターである、請求項６８のデバイス。
【請求項８０】
内包ビヒクルをさらに含んでなる、請求項６８のデバイス。
【請求項８１】
ウイルスが内包ビヒクル内に内包される、請求項８０のデバイス。
【請求項８２】
ウイルスが、内包ビヒクル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質と会合される、請求項８０のデバイス。
【請求項８３】
内包ビヒクルが、ゲル、液体または粉体から成る群から選択される１種もしくはそれ以上のメンバーである、請求項８０のデバイス。
【請求項８４】
内包ビヒクルがナノチューブ内に装入される、請求項８３のデバイス。
【請求項８５】
内包ビヒクルがポリマーを含んでなる、請求項８０のデバイス。
【請求項８６】
ポリマーが、動物に投与された場合に毒性ではない、請求項８５のデバイス。
【請求項８７】
ポリマーがウイルスと会合され、それにより周囲環境内への該ウイルスの放出を遅延させる、請求項８６のデバイス。
【請求項８８】
ポリマーがゲルである、請求項８５のデバイス。
【請求項８９】
ゲルがコラーゲンを含んでなる、請求項８８のデバイス。
【請求項９０】
ゲルがヒドロゲルである、請求項８８のデバイス。
【請求項９１】
ヒドロゲルが、アルギネート、ゼラチン、キトサンおよびヒアルロン酸から成る群から選択される、請求項９０のデバイス。
【請求項９２】
ヒドロゲルが、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースから成る群から選択される、請求項９０のデバイス。
【請求項９３】
ゲルが、コラーゲン、アルギネート、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースの１種もしくはそれ以上の組合せを含んでなる、請求項８８のデバイス。
【請求項９４】
ゲルが架橋されている、請求項８８のデバイス。
【請求項９５】
さらに添加剤を含んでなる、請求項８０のデバイス。
【請求項９６】
添加剤がポリエチレングリコールであある、請求項９５のデバイス。
【請求項９７】
内包ビヒクルがミクロカプセルを含んでなる、請求項８０のデバイス。
【請求項９８】
内包ビヒクルがナノカプセルを含んでなる、請求項８０のデバイス。
【請求項９９】
内包ビヒクルがナノチューブを含んでなる、請求項８０のデバイス。
【請求項１００】
ナノチューブが５００ｎｍまたはそれ未満の直径を有する、請求項９９のデバイス。
【請求項１０１】
内包ビヒクルが１種もしくはそれ以上の溶液、粉末またはゲルの組合せを含んでなる、請求項８０のデバイス。
【請求項１０２】
ウイルスが生ウイルスである、請求項８０のデバイス。
【請求項１０３】
ウイルスが弱毒化ウイルスである、請求項８０のデバイス。
【請求項１０４】
ウイルスが死ウイルスである、請求項８０のデバイス。
【請求項１０５】
ウイルスが呼吸系ウイルスである、請求項８０のデバイス。
【請求項１０６】
ウイルスが、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、およびアデノウイルス、カルシウイルス、アストロウイルス、ノーウォークウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ハンタウイルス、アルファウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスから成る群から選択される、請求項８０のデバイス。
【請求項１０７】
ウイルスがオルトミクソウイルスである、請求項１０６のデバイス。
【請求項１０８】
オルトミクソウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１０７のデバイス。
【請求項１０９】
インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである、請求項１０８のデバイス。
【請求項１１０】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６から成る群から選択される赤血球凝集素抗原（ＨＡ）を有する、請求項１０９のデバイス。
【請求項１１１】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９から成る群から選択されるノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）を有する、請求項１０９のデバイス。
【請求項１１２】
Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２から成る群から選択されるＨＡ：ＮＡ抗原プロフィールを有する、請求項１０９のデバイス。
【請求項１１３】
Ａ型インフルエンザウイルスの低用量を含んでなる、請求項１０９のデバイス。
【請求項１１４】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．００１〜５０００赤血球凝集単位（ＨＡＵ）である、請求項１１３のデバイス。
【請求項１１５】
Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．００５〜５００ＨＡＵである、請求項１１４のデバイス。
【請求項１１６】
Ａ型ウイルスの低用量が、ウイルスの０．０１〜１００ＨＡＵである、請求項１１５のデバイス。
【請求項１１７】
動物が哺乳動物である、請求項８０のデバイス。
【請求項１１８】
哺乳動物がヒトである、請求項１１７のデバイス。
【請求項１１９】
ウイルスが、生ウイルス、弱毒化ウイルスおよび死ウイルスから成る群から選択される少なくとも２種のメンバーを含んでなる、請求項８０のデバイス。
【請求項１２０】
経路が天然ではない経路である、請求項８０のデバイス。
【請求項１２１】
経路が、皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口から成る群から選択される少なくとも１種のメンバーである、請求項１２０のデバイス。
【請求項１２２】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを製造する方法であって、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御量を内包ビヒクルと組合せ、それにより該ワクチンを製造することを含んでなる方法。
【請求項１２３】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを製造する方法であって、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞を内包ビヒクルと組合せ、それにより該ワクチンを製造することを含んでなる方法。
【請求項１２４】
動物内にＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御および／または抗体免疫防御応答を誘発する方法であって、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発する方法。
【請求項１２５】
動物内にＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御応答を誘発する方法であって、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を該動物内に誘発する方法。
【請求項１２６】
動物が哺乳動物である、請求項１２４の方法。
【請求項１２７】
哺乳動物がヒトである、請求項１２６の方法。
【請求項１２８】
ウイルスによる感染に対して動物を防御する方法であって、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与す
ることを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該感染に対して該動物を防御する方法。
【請求項１２９】
ウイルスによる感染に対して動物を防御する方法であって、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該感染に対して該動物を防御する方法。
【請求項１３０】
動物が哺乳動物である、請求項１２８の方法。
【請求項１３１】
哺乳動物がヒトである、請求項１３０の方法。
【請求項１３２】
動物内のウイルス感染を防御する方法であって、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物内のウイルス感染を防御する方法。
【請求項１３３】
動物内のウイルス感染を防御する方法であって、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物内のウイルス感染を防御する方法。
【請求項１３４】
動物が哺乳動物である、請求項１３２の方法。
【請求項１３５】
哺乳動物がヒトである、請求項１３４の方法。
【請求項１３６】
動物内のウイルス感染を処置する方法であって、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物を処置する方法。
【請求項１３７】
動物内のウイルス感染を処置する方法であって、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物を処置する方法。
【請求項１３８】
動物が哺乳動物である、請求項１３６の方法。
【請求項１３９】
哺乳動物がヒトである、請求項１３８の方法。
【請求項１４０】
生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなる組成物であって、動物内に疾患を起こさない経路による該動物への該生体作用活性薬剤の投与の後に、該生体作用活性薬剤が該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導する組成物。
【請求項１４１】
生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなる組成物であって、動物内に疾患を起こさない経路による該動物への該生体作用活性薬剤の投与の後に、該生体作用活性薬剤が該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する組成物。
【請求項１４２】
経路が天然ではない経路である、請求項１４０の組成物。
【請求項１４３】
経路が、皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口から成る群から選択される、請求項１４０の組成物。
【請求項１４４】
生体作用活性薬剤が、該内包ビヒクル内に内包される、請求項１４０の組成物。
【請求項１４５】
生体作用活性薬剤が、該内包ビヒクル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質と会合される、請求項１４０の組成物。
【請求項１４６】
内包ビヒクルが、ゲル、液体または粉体から成る群から選択される少なくとも１種のメンバーを含んでなる、請求項１４０の組成物。
【請求項１４７】
内包ビヒクルがナノチューブ内に装入される、請求項１４６の組成物。
【請求項１４８】
内包ビヒクルがポリマーを含んでなる、請求項１４７の組成物。
【請求項１４９】
ポリマーが、動物に投与された場合に毒性ではない、請求項１４８の組成物。
【請求項１５０】
ポリマーが該生体作用活性薬剤と会合され、それにより周囲環境内への該生体作用活性薬剤の放出を遅延させる、請求項１４８の組成物。
【請求項１５１】
ポリマーがゲルである、請求項１４８の組成物。
【請求項１５２】
生体作用活性薬剤が、微生物およびタンパク質から成る群から選択される、請求項１４０の組成物。
【請求項１５３】
動物に生体作用活性薬剤を投与して安全性を上昇する方法であって、生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなる組成物を該動物へ投与することを含んでなり、ここで該動物内に疾患を起こさない経路による該生体作用活性薬剤の投与の後に該生体作用活性薬剤が該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導し、さらにここで該生体作用活性薬剤が内包ビヒクル内に内包されている方法。
【請求項１５４】
動物に生体作用活性薬剤を投与して安全性を上昇する方法であって、生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなる組成物を該動物へ投与することを含んでなり、ここで該動物内に疾患を起こさない経路による該生体作用活性薬剤の投与の後に該生体作用活性薬剤が該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、さらにここで該生体作用活性薬剤が内包ビヒクル内に内包されている方法。
【請求項１５５】
生体作用活性薬剤が、微生物およびタンパク質から成る群から選択される、請求項１５３の方法。
【請求項１５６】
生体作用活性薬剤の生物学的に有効な量を含んでなる組成物であって、ここで、動物内に疾患を起こさない経路により該動物に該生体作用活性薬剤を投与の後に、該生体作用活性薬剤が該動物内に所望の応答を誘導し、一方ではリスクを低減する組成物。
【請求項１５７】
経路が天然ではない経路である、請求項１５６の組成物。
【請求項１５８】
経路が、皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口から成る群から選択される、請求項１５７の組成物。
【請求項１５９】
生体作用活性薬剤が内包ビヒクル内に内包される、請求項１５６の組成物。
【請求項１６０】
生体作用活性薬剤が、該内包ビヒクル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質と会合される、請求項１５６の組成物。
【請求項１６１】
内包ビヒクルが、ゲル、液体または粉体から成る群から選択される少なくとも１種のメンバーである、請求項１５６の組成物。
【請求項１６２】
内包ビヒクルがミクロカプセル、ナノカプセルまたはナノチューブ内に装入される、請求項１５９の組成物。
【請求項１６３】
内包ビヒクルがポリマーを含んでなる、請求項１５９の組成物。
【請求項１６４】
ポリマーが、動物に投与された場合に毒性ではない、請求項１６３の組成物。
【請求項１６５】
ポリマーが生体作用活性薬剤と会合され、それにより周囲環境内への該生体作用活性薬剤の放出を遅延させる、請求項１６３の組成物。
【請求項１６６】
ポリマーがゲルである、請求項１６３の組成物。
【請求項１６７】
生体作用活性薬剤が、微生物およびタンパク質から成る群から選択される、請求項１５６の組成物。
【請求項１６８】
動物に生体作用活性薬剤を投与して安全性を上昇する方法であって、動物内で所望の応答を誘導し同時にリスクを低減する生体作用活性薬剤の量を含んでなる組成物を該動物に投与することを含んでなり、ここで、該生体作用活性薬剤の投与の経路が該動物内に疾患を起こさない経路であり、そしてさらにここで該生体作用活性薬剤を投与する際に該生体作用活性薬剤が内包ビヒクル内で内包されそれにより安全性を上昇する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスワクチンに例示されるがしかしそれらに限定はされない新規のウイルスワクチンに関する。本発明は、さらに、エーロゾルまたは遊離形態で脊椎動物に送達された場合に、脊椎動物に対して好ましくない作用を有するであろう生体作用活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ）薬剤の動物、好ましくは脊椎動物への安全な送達のための新規の組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型インフルエンザウイルスは通常のインフルエンザを起こしそして米国内での致死率の最大の原因となるウイルスである（非特許文献１）。それは免疫無防備状態の個体が、健全な人々と比較してより重くて致死に至るインフルエンザの事例になりやすいという事実に大きく依存する。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、下記のタンパク質をコードする８種の一本鎖ＲＮＡセグメントを含んでなる：赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）と呼ばれる２種の表面糖タンパク質、Ｍ２イオンチャンネルタンパク質、Ｍ１マトリックスタンパク質、ウイルスＲＮＡと会合する核タンパク質、および３種のＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２）（非特許文献２）。ＲＮＡゲノムのエラーを起こし易い性質のために、インフルエンザウイルスは２種の主要な表面タンパク質；ＨＡおよびＮＡ内に変異を蓄積する。Ａ型インフルエンザウイルス群内でＨＡまたはＮＡ内に存在する抗原性差異に基づいて、１６種の異なるＨＡおよび９種の異なるＮＡサブタイプが同定されている。遺伝子多様性の第二のレベルは、感染された宿主内で再構築を受けるＲＮＡフラグメントの能力によるものであり、従ってヒトおよび動物起源のＲＮＡセグメントを含むウイルスを創成する（非特許文献３）。
【０００３】
インフルエンザウイルスの抗原可変性の結果として、ウイルスエンベロープタンパク質、赤血球凝集素（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）の組成は常に変化する。この可変性は、動物種内、または種間のいずれかでの伝染の高い効率をしばしば持つウイルスの出現株をもたらすことが多い。さらに重要なことには、ウイルスの新しい株の生成は、感染の恐れがあるヒト集団内では新しい株に対して向かう免疫性が低いかまたは存在しないので、汎流行に導く（非特許文献４）。この理由により、１９１８−１９１９年の「スペイン風邪」はこれまで最も致死率が高い汎流行となり、全世界で１億人が死亡したと推定される。
【０００４】
最近、種間でのインフルエンザの伝染に関する関心が高くなっている。ヒト集団内で流行する事が見いだされたインフルエンザウイルス株は、主としてＨＡサブタイプ１、２または３およびＮＡサブタイプ１または２を発現する。１９１８年のインフルエンザウイルス汎流行（スペイン風邪）は、Ｈ１Ｎ１ウイルスにより起きた。この荒廃的な流行感染は、その世紀内で他のもの、例えば、１９５７年のアジアインフルエンザ（Ｈ２Ｎ２）および１９６８年の香港風邪（Ｈ３Ｎ２）に引き継がれた。Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ウイルスの遺伝子変種は、人への感染を続けそして毎年流行を起こしている。Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡの他のサブタイプは、水鳥内に維持されている。従って、再構築の過程を通じて、新しいＨＡサブタイプが鳥類貯蔵庫からヒト集団内に導入される可能性があり、その結果、汎流行的感染を起こす。ヒト内での鳥類インフルエンザウイルスの非効率的な複製は、汎流行的感染の発生に対する主要な障害と考えられている。
【０００５】
従来は、ヒトおよび鳥類インフルエンザウイルスはブタ内でのみ再構築されると考えられてきたが、それはブタのみが両方のウイルスにより感染され得る唯一の種であったから
である。しかし、１９９７年に、鳥類からヒトへの直接感染の最初の事例が確認された。このウイルスは、１８人に感染してその中から６人が死亡した（非特許文献４、５）。１９９７年以後、鳥類インフルエンザの３株からヒト集団への６回の発生があり、そしてＨ５Ｎ１株が最も一般的で死亡の危険がある株として現れた（非特許文献５）。この種交差伝染は、それに対していずれの現在利用できるワクチンでもヒトが防御されない汎流行インフルエンザ株が現れるというリスクをもたらす。
【０００６】
新しいインフルエンザウイルス汎流行の可能性に関する関心の増大を考慮して、２種以上のウイルス株に対してヒトを防御できるインフルエンザウイルスワクチンを発見するために大きい努力がなされている。それらの努力は、ウイルスの複製を防止してインフルエンザウイルス感染を処置する効果を有する治療的分子の発見にも向けられている（非特許文献６、７）。この研究は、ＤＮＡに基づくワクチン、インフルエンザウイルス株に対してヒトを防御するように作用するＲＮＡ干渉分子の開発、およびインフルエンザウイルス株に対して有効な新規の抗ウイルス薬剤の開発を目標としている（非特許文献７、８、９、１０）。
【０００７】
現在、米国内でヒトに使用するために市場で入手できる２種類のインフルエンザワクチンがある。一つは、筋肉内注入として投与される死ウイルスワクチンであり、その他は鼻噴霧薬として投与される弱毒化ワクチンである。それらのワクチンの両方共に同じウイルスによるその後の感染を中和する抗インフルエンザ抗体を誘発する。しかし、変種抗原エピトープを発現するウイルスの出現株は、現在の抗体により認識されないであろう。従って、毎年異なるワクチンが製造されて投与されなければならない。
【０００８】
ウイルスライフサイクルの異なる段階を妨害して作用する抗ウイルス薬剤も利用できる。ウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスにより宿主細胞内に入る。エンドソーム内で、低いｐＨがウイルスとエンドソーム膜の融合の引き金を引きそしてＭ２イオンチャンネルがＨ＋イオンの流入を許容しそれは細胞質内へのウイルス遺伝子の放出に導く。２種の抗ウイルス薬アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）およびリマンチジン（ｒｉｍａｎｔｉｄｉｎｅ）は双方共にＭ２イオンチャンネルを遮断し、それによりウイルスの脱外被および細胞質内へのＲＮＡ放出を阻止する。第二の種類の抗ウイルス薬剤は、ＮＡに対して作用しそして細胞からの新規の感染粒子のウイルスパッケージングおよび発芽を妨害する。ＮＡは細胞表面上の受容体を含むシアル酸を除去することにより新規に発生したウイルス粒子が他のウイルス粒子と凝集しないかまたは感染された細胞の表面に付着して残留するように作用する。従って、ＮＡ阻害剤、例えばオセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）およびザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）は、感染された細胞の膜にビリオンを付着したままとさせそして他の細胞への付着、従って感染を防止する。それらの薬剤は、Ｍ２に対する天然の耐性株およびＮＡ遮断剤の存在にもかかわらず、汎流行感染の場合にウイルス拡散を封じ込める方法を提供するであろう（非特許文献１１、１２）。
【０００９】
次の汎流行は、これまでヒトに感染していないＨＡサブタイプを有するウイルスにより起きるであろうことに留意して、ワクチン開発の新しい技術が試験されている。例えば、逆遺伝学が、プラスミド内に候補株のＨＡおよびＮＡ遺伝子をクローンするために使用されている。次いでマスタードナー株の他の６種の遺伝子と一緒にそれらのプラスミドを用いて細胞がトランスフェクションされる。従って、逆遺伝学により産生されたビリオンは、関係する抗原性分子ＨＡおよびＮＡの発現をドナー株の特性（高い収率、寒冷適応、弱毒化株）と複合している。逆遺伝学は候補ワクチンを得るために必要な時日をかなり短くする（非特許文献１３）。しかし、汎流行が起きた場合に、原因ウイルスは米国に一ヵ月以内に到着するであろう（非特許文献４）。従って、この戦略を用いて有効なワクチンを開発するために必要な時日は十分ではないであろう。逆遺伝学に関連する他の欠点は、８種またはそれ以上のプラスミドを１個の細胞内に同時にトランスフェクションすることおよびワクチン製造に承認されている限られた数の細胞系統に関連する困難である。
【００１０】
他の抗ウイルス方法は、インフルエンザウイルス遺伝子の保存された領域に対して向けられる短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用である。ｓｉＲＮＡは長さが２１〜２６ヌクレオチドでありそして同族ｍＲＮＡの配列特異性分解を誘導できるＲＮＡ二重鎖である。核タンパク質または酸性ポリメラーゼに特異性のｓｉＲＮＡの静脈内送達は、マウスに感染するとして知られるインフルエンザウイルス株または病原性が高い鳥類株を用いる、例えばＨ５およびＨ７サブタイプを用いる致死的チャレンジからマウスを防御することが示された（非特許文献９）。ｓｉＲＮＡはインフルエンザウイルスライフサイクルを妨害するけれども、主要な困難はこの技術をヒトに適合させる際に起きる。ｓｉＲＮＡ配列がどのヒト遺伝子配列とも相補性ではなくそしてウイルス遺伝子の活性を遮断するためにｓｉＲＮＡがすべての感染された細胞内で十分なレベルで発現されなければならないことは重要である。全体的に、新しい抗ウイルス技術は、新しいインフルエンザウイルスワクチンまたは治療法の開発のために長期的には成功見込みを有するであろう。しかし、非常に短期間でワクチンの数百万の用量の生産という緊急の要求は、それらの技術を用いては解決されない。
【００１１】
１９９７年に始まって、ヒト集団内の高度病原性鳥類ウイルスＨ５Ｎ１の３回のその後の急激な発生：香港２００３、ベトナム２００４およびタイ２００４があった（非特許文献５）。このインフルエンザウイルスサブタイプに向けたワクチンが生産されそして効力および安全性を試験されている。そのワクチンはＨ５Ｎ１に対してヒトを防御できることが報告されている；しかし防御を誘導するために必要な用量（精製された死ウイルスまたは抗原の９０μｇ）は、通常の季節的インフルエンザウイルスワクチンの場合に使用される量の２倍である。さらに、Ｈ５Ｎ１ワクチンは、４週間の間隔で２回ヒトに投与されなければならない（非特許文献１４）。抗Ｈ５Ｎ１ワクチンの効力を増大しそして抗原の低い用量で対処できるために、異なる戦略、例えばアジュバントの使用またはウイルスの送達の経路の変更が提案されている（非特許文献１５）。
【００１２】
上記のように、インフルエンザウイルス株に対して向けられた現在利用できるワクチンは、筋肉内注入として投与される不活性（死）ワクチンおよび鼻噴霧として投与される弱毒化生ワクチンを含む。それらのワクチンの両方共に抗ウイルス、すなわちウイルス中和抗体産生をもたらす（非特許文献６）。変種抗原性エピトープを発現するウイルスの出現株は、現存の抗体によっては認識されない。従って、これが選択されたワクチン戦略である場合には、毎年ヒトに対して新規のワクチンが開発および投与されなければならない（非特許文献６、非特許文献７）。インフルエンザウイルスの汎流行株が同定されると、新しい株に対して有効な不活性化ワクチンを開発するために少なくとも六ヵ月が必要と予測されている（非特許文献５、非特許文献７）。インフルエンザウイルスの汎流行性株に対してヒトを防御するワクチンを開発するために、ワクチンは、ウイルスに対する抗体応答を誘発できるのみならず、最適には、ワクチンは数種の汎流行株に対する広いスペクトルの特異性を示すＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導しなれければならない。かかるワクチンはウイルスのいずれか一種の汎流行株による実際の感染を防御できないので、それは疾患の重症度を軽減しそれにより感染後の罹患率および致死率を低下させなければならない。
【００１３】
いずれかの生体作用活性物質またはワクチンの開発および使用の成功のために重要な問題は、それが動物およびヒトへの使用に安全であるかどうかである。安全性の評価は、二つのレベルで行われなければならない。一方では、生体作用活性物質またはワクチンは、それが投与される動物に対して毒性であってはならない。他方では、生体作用活性物質またはワクチンを取り扱う人員、例えば物質またはワクチンを投与する人員、物質またはワクチンのレシピエント、および投与の間に居るであろうその他の人員は、生体作用活性物質またはその中に含まれるウイルスにより起こされるどのような不利な作用に対してもリ
スクがあってはならない。後者の状況は、生体作用活性物質がトキシンであるかまたはワクチンが生ウイルスを含んでなる場合に特に重要である。本明細書中で提供される開示から明白なように、この問題は、エーロゾル化によるウイルスの拡散を防止する媒体内に生体作用活性物質またはウイルスを内包することにより解決できる。これを考慮して、種々の組成物の従来技術開示をここに本明細書中で再検討する。
【００１４】
生体適合性ゲルは、薬剤送達、サイトカイン送達（非特許文献１６）、遺伝子治療（非特許文献１７）、および組織操作（非特許文献１８）のために広範に研究および使用されている。多数の生体適合性ポリマーがイン・ビボで使用されている。ワクチン内包のための最近の研究の大部分は、一段免疫化のための世界保健機構（ＷＨＯ）による呼びかけに対応する間欠または持続的放出調剤の使用の利益が強調されている（非特許文献１９）。抗原を放出できるポリマー性ミクロカプセルは、６カ月を越える期間、哺乳動物内に高い免疫応答を誘導することが示されている（非特許文献２０）。それらの調剤による免疫賦活は、アルミニウム塩アジュバントに類似のデポー作用、または抗原提示細胞に直接の抗原送達のいずれかが起きると信じられている。
【００１５】
ヒドロゲルは、水が分散媒体であるコロイドゲルとして一般に定義されている。それらは化学的または物理的のいずれかである各種の異なる結合、例えばイオン性もしくは疎水性相互作用または水素結合により架橋されているポリマーから成る。アルギネートは、褐色海藻から抽出された天然に存在する線状多糖類である。それは１−４連結したα−Ｌ−グルロン酸およびβ−Ｄ−マンヌロン酸残基から成る。アルギネートの異なる起源は、異なるグルロン酸含有量を有し、そしてこれは一方ではアルギネートの性質に影響する。アルギネートは、二価陽イオン、例えばＣａ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋など（Ｍｇ２＋を除く）との反応によりヒドロゲルを形成できる。三価陽イオン、例えばＡｌ３＋およびＦｅ３＋もアルギネートからヒドロゲルを形成するために使用される。それらのヒドロゲルの製造の一般的な方法は、アルギン酸ナトリウム溶液を必要な架橋陽イオンを含む溶液中に滴下して加えることを含む。アルギネート内に内包されたリポソームは、タンパク質送達（非特許文献２１、２２、特許文献１）について研究されておりそして膵島細胞を含む数種の異なる細胞系統（非特許文献２３）および遺伝子操作された繊維芽細胞（非特許文献２４、２５）は、治療用途のためにアルギネート内に内包されている。近年、アルギネートは、組織工学において骨格として使用されている（非特許文献２６）。共有結合されたペプチドを有するアルギネートヒドロゲルは、合成細胞外物質として（非特許文献２７、２８）および組織バルク化剤として（非特許文献２９）研究されている。イオン的に架橋されたアルギネートは、イン・ビトロで時間が経過すると機械的性質を損失し、それは周囲媒体内への架橋イオンの流出によると推測されると報告されている（非特許文献３０）。アルギネートの向イオン性ゲル化の方法は、例えば下記の文献に記載のものを含む；非特許文献２１、２２および３１。
【００１６】
同様のヒドロゲルは、身体内に普通に見いだされるヒアルロンとしても知られるヒアルロン酸から形成できる。ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの負に荷電した線状ポリマーであり、それらの化合物が多価イオンに暴露された場合に形成される（非特許文献３２、３３）。ヒアルロン酸は、関節修復にしばしば適用されることで証明されるように、高度に生物適合活性であることが知られている（非特許文献３４、３５）。薬剤送達への使用のこの化合物に関する研究は少ないが、それはそれが生理学的ｐＨで迅速に溶解するからである（非特許文献３６）。
【００１７】
コラーゲンマトリックスを用いる薬剤の送達は、主としてその固有の生物分解性、弱い抗原性（非特許文献３７）および天然生物ポリマー、例えばアルブミンと比較して優れた生物適合性のためにその重要性を増している。コラーゲンマトリックスは、遺伝子治療（非特許文献３８）、タンパク質の制御放出（非特許文献３９）、抗体（非特許文献４０）、抗生物質（非特許文献４１）および成長因子、例えば形質転換成長因子−ベータ２（ＴＧＦ−β２）（非特許文献４２）の哺乳動物への送達のための担体として使用されている。コラーゲンマトリックスは、血小板誘導成長因子−Ｂ（ＡｄＰＤＧＦ−Ｂ）をコードするアデノウイルスベクターの哺乳動物への送達に使用され（非特許文献４３）、そしてイン・ビボおよびイン・ビトロの双方での創傷治癒におけるコードされた導入遺伝子の発現を増加することが見いだされた。クら（非特許文献４４）は、コラーゲンのマトリックス内に送達されたヒト血小板誘導体体成長因子Ｂをコードするアデノウイルスが、アデノウイルスに対して向けられる抗体応答を誘導することを示した。Ｔ細胞応答は認められなかった。アデノウイルスを含むコラーゲンゲルは、動物への遺伝子の送達のために別の人により公開されている（非特許文献１７）。しかし、それらのゲルは、防御的免疫応答を動物内で誘導する特定の目的のためのワクチン設定には使用されなかった。反対に、ウイルスへの免疫応答がないことがそれらの研究に望まれており、それは応答の存在が動物によるウイルスの拒絶をもたらすと予想され、従って遺伝子送達の望ましい効果が無効になるからであろう。薬剤の制御された放出を行うために、コラーゲンフィブリルは架橋されてマトリックスを形成しなければならない。コラーゲンの個別のフィブリルは、クロムのような三価陽イオン（非特許文献４６）またはアルミニウム（非特許文献４７）を用いるイオン結合の形式、共有結合架橋剤（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナート、ポリエポキシ化合物、カルボジイミド）を用いるかまたは物理的処置（乾燥加熱、紫外線への暴露、γ−線照射、またはｐＨ変更）（非特許文献４８）のいずれかにより架橋できる。
【００１８】
ゼラチンは、ワクチン内の安定剤として使用して成功した少数の物質の一つである（非特許文献４９、５０）。ゼラチンの生物分解性ナノ粒子は、肺臓疾患の処置のための薬剤を送達するため（非特許文献５１）、特異性抗体をゼラチンナノ粒子の表面に接合してＴ細胞を標的とするため（非特許文献５２、５３）、および光力学治療製剤（非特許文献５４）において使用されている。ゼラチンヒドロゲルは、それらの正に荷電した性質およびそれらの生物分解性のために、新しい遺伝子送達システムとして試験されている（非特許文献５５）。ゼラチンの正に荷電した構造は、負に荷電した核酸、タンパク質および薬剤を内包可能とする。それらのゼラチン結合生物分子は、ゼラチンゲルが徐々に分解すると放出される。さらに、レトロウイルスの感染性は、ゼラチンおよびスクロースが添加された場合に、冷凍乾燥により保存できることが示された（非特許文献５６）。
【００１９】
ボレクらは、合成抗原を用いて動物を免疫化することにより同じ動物種のタンパク質と交差反応する抗体の形成を刺激することも可能と考えた（非特許文献５７）。抗原への最初の暴露の後にもたされるアナフィラキシーショックの数例が全世界から報告されている（非特許文献５８、５９、６０）。ハシカ、オタフクカゼ、風疹（ＭＭＲ）ワクチンを接種されていた年齢１７歳の反応は、ワクチンのゼラチン成分に対して向けるＩｇＥ抗体の誘発に帰せられた（非特許文献６１）。ワクチンの熱安定成分としてのゼラチンとアナフィラキシーとの間の関係を引用する他の報告がある（非特許文献６２、６３、６４、６５、６６、６７）。それらの報告は、ゼラチンの形成が改変された場合（非特許文献６８）またはワクチンが完全に除去された場合（非特許文献６９）のアレルギー反応の劇的な低下の観察によりさらに支持された。アナフラキシーの報告された症例の大部分は日本からであって、米国ではない（非特許文献７０）。ゼラチンをベースにしたワクチンへの過敏性は、ゼラチンアレルギーとＨＬＡ−ＤＲ９の間の強い会合により起きると示唆されている（非特許文献７１、これはアジア集団で独特である；非特許文献７２）。プールら（非特許文献７０）も、日本において不十分に加水分解されたゼラチンのジフテリア−破傷風−無細胞百日咳（ＤＴａＰ）ワクチンへの添加が、一部の小児でゼラチンに対する過敏化に貢献して、その後のＭＭＲワクチン接種の際のアナフラキシーのリスクを増大したのではないかと提唱している（非特許文献６６）。米国内で製造されたワクチンに使用されたゼラチンは、完全に加水分解されていることが分かっている。
【００２０】
種々の巨大分子を哺乳動物細胞内に転移させるための一枚壁ナノチューブ（ＳＷＮＴ）の使用に多くの研究が向けられている。例えば、かかるシステムは、小さいペプチド（非特許文献７３）、核酸（非特許文献７４）およびタンパク質、例えばストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ）（非特許文献７５）に関連して使用されている。最近、シカムらは、葉酸領域を用いるＳＷＮＴの機能性化によるガン細胞の破壊を開発している（非特許文献７６）。これは、葉酸受容体腫瘍マーカーを用いて標識されたＳＷＮＴ内部細胞の内部化をもたらす。ガン細胞の死滅は、近赤外線を用いる細胞の照射により達成された。ナギブらは、炭素ナノチューブ構造の表面が、単に合成後処理を改変することにより種々の生物医学的用途を有するように適合できることを示した（非特許文献７７）。同様の結果は、サルバドール−モラレスらによってもかれらの炭素ナノチューブチューブ上のタンパク質吸着に関する研究で報告された（非特許文献７８）。最も重要な事は、ペプチドに対するウイルス特異性中和抗体応答を増進するために炭素ナノチューブの官能性化であることがペンタロットらにより示された（非特許文献７９）。それらの技術を用いて、送達される化合物は、ナノチューブの外面に結合し次いでナノチューブの大きさが化合物の送達をもたらす。
【００２１】
ワクチン技術および一般的に抗ウイルス技術におけるすべての進歩にもかかわらず、ウイルスワクチン、特には安全でありそして迅速で容易に生成できるインフルエンザウイルスワクチンのために当該技術分野で以前から感じられていた必要性は解決されていない。それらのワクチンは、例えばワクチン接種された動物またはヒトがその後のウイルスの有毒株によるチャレンジに対して完全に保護されるように、完全な体液的および細胞的免疫応答を誘発できなければならない。本発明は、この必要を満たす。さらに。致死の可能性がある生体作用活性薬剤、例えば生ウイルスの動物への投与が、薬剤が万一エーロゾル化または漏れても、領域内の他者に不利な影響を与えないであろう。本発明は、かかる薬剤の投与のための組成物および方法を提供して、この問題を解決する。
【特許文献１】米国特許（ＵＳ）第４，９２１，７５７号
【非特許文献１】Ｙｅｗｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：４１４
【非特許文献２】Ｈｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：５９１−６００
【非特許文献３】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８８５１−８８５６
【非特許文献４】Ｅｎｓｅｒｉｎｋ，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：３９２−３９４
【非特許文献５】Ｋａｉｓｅｒ，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：３９４−３９７
【非特許文献６】Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１
【非特許文献７】Ｋａｉｓｅｒ，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：３９５
【非特許文献８】Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：７９６
【非特許文献９】Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐ  ２００４．ＰＮＡＳ，１０１：８６８２−８６８６
【非特許文献１０】Ｔｕｍｐｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＰＮＡＳ，１０１；３１６６
【非特許文献１１】Ｍｏｎｔｏ  ａｎｄ  Ａｒｄｅｎ，１９９２，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：３６２−３６７
【非特許文献１２】Ｋｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌａｎｃｅｔ  ３６４：７５９−７６５
【非特許文献１３】Ｗｅｂｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌａｎｃｅｔ  ３６３：１０９９−１１０３
【非特許文献１４】Ｅｎｓｅｒｉｎｋ，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：９９６
【非特許文献１５】Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｌｌｉｎ，２００５，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９１：１２０７−１２０９
【非特許文献１６】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５１：５３−５７
【非特許文献１７】Ｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４，，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１３０−１３８
【非特許文献１８】Ｔｓａｎｇ  ａｎｄ  Ｂｈａｔｉａ，２００４，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｓ．５６：１６３５−１６４７
【非特許文献１９】Ａｇｕａｄｏ，１９９３，Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：５９６−５９７
【非特許文献２０】Ｐｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，１９７９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：１９３−１９７
【非特許文献２１】Ｗｈｅａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．ＡｐｐｌｉｅｄＰｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４３：２１２３−２１３５
【非特許文献２２】Ｄｈｏｏｔ  ａｎｄ  Ｗｈｅａｔｅｌｅｙ  ２００３，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９２：６７９−６８９
【非特許文献２３】Ｌｉｍ  ａｎｄ  Ｓｕｎ，１９８０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１０：９０８−９１０
【非特許文献２４】Ｔｏｂｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １８：２８７−３０１
【非特許文献２５】Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１９９５−２００３
【非特許文献２６】Ｋｕｏ  ａｎｄ  Ｍａ，２００１，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２：６１１−６１２
【非特許文献２７】Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓ．５０：４０５−４０９
【非特許文献２８】Ｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０：４５−５３
【非特許文献２９】Ｌｏｅｂｓａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓ．５７：５７５−５８１
【非特許文献３０】Ｓｈｉｏｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５０：３７４−３８１
【非特許文献３１】Ｄｈｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．．７１Ａ：１９１
【非特許文献３２】Ｂａｌａｚｓ  ａｎｄ  Ｌａｕｒｅｎｔ，１９９８，Ｉｎ：ＴｈｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｄｅｌｉｖｅｒｔｉｖｅｓ，３２５−３３６
【非特許文献３３】Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ａｂａｔａｎｇｅｌｏ，１９９９，ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．７：７９−８９
【非特許文献３４】Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６６：２８１−２９２
【非特許文献３５】Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：９３−１０３
【非特許文献３６】Ｃａｍｐｏｃｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９：２１０１−２１２７
【非特許文献３７】Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ  ６２：３１３−３２４
【非特許文献３８】Ｃｏｈｅｎ−Ｓａｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９５：３０９−３２０
【非特許文献３９】Ｆｕｊｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３３：３０７−３１５
【非特許文献４０】Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓａｌｔｚｍａｎ，２００１，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０：２９−３６
【非特許文献４１】Ｖｅｒｂｕｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ−Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ａｓ  Ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
【非特許文献４２】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ−Ｔｅｆｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４９：２９１−２９８
【非特許文献４３】Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ  ２：１５３−１６０
【非特許文献４４】Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：６９９−７１１
【非特許文献４５】Ｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：１３０
【非特許文献４６】Ｃｈｖａｐｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．６：１−６１
【非特許文献４７】Ｇｅｒｖａｉｓ−Ｌｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｒｅｓ，２５：１３３９−１３４６
【非特許文献４８】Ｋｈｏｒ，１９９７，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １８：９５−１０５
【非特許文献４９】Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４７２８−４７３５
【非特許文献５０】ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  Ｌｏｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｔａｎｄｅｒｄｉｚａｔｉｏｎ  １６：７１−７６
【非特許文献５１】Ｂｒｚｏｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１８：５６２−５７０
【非特許文献５２】Ｄｉｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６：５８９８−５９０６
【非特許文献５３】Ｂａｌｔｈａｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６：２７２３−２７３２
【非特許文献５４】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６７０−１１３−１２０
【非特許文献５５】Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：１０５６−１０６２
【非特許文献５６】Ｌｅｖｙ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓｔｅｅｌ，１９８２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ，５：１６５−１７１
【非特許文献５７】Ｂｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８８：３１４−３２３
【非特許文献５８】Ｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｍｅｒ，１９７７，Ｌａｎｃｅｔ  １：４６６−４６９
【非特許文献５９】Ｖａｎ  Ａｓｐｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｈｅ  Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ２：３３０−３３１
【非特許文献６０】Ａｕｋｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ａｌｌｅｒｇｙ  ３５：５８１−５８７
【非特許文献６１】Ｋｅｓｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１：８６７−８７２
【非特許文献６２】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８：１０５８−１０６１
【非特許文献６３】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：５６３−６５６
【非特許文献６４】Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００：１３０−１３４
【非特許文献６５】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，１９９８，Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：６８−６９
【非特許文献６６】Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：３２１−３２５
【非特許文献６７】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９６：２８６−２９０
【非特許文献６８】Ｎａｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ａｉｚａｗａ，２０００，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：５９１−５９２
【非特許文献６９】Ｋｕｎｏ−Ｓａｋａｉ  ａｎｄ  Ｋｉｍｕｒａ，２００３．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３１：２４５−２４９
【非特許文献７０】Ｐｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１０：７１
【非特許文献７１】Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：３２７３−３２７６
【非特許文献７２】Ｎａｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｇａｉ，２００４，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１３：１７０−１７１
【非特許文献７３】Ｐａｎｔａｒｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）：１６−１７
【非特許文献７４】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．４：２４７３−２４７７
【非特許文献７５】ＳｈｉＫａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：６８５０−６８５１
【非特許文献７６】ＳｈｉＫａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＰＭＡＳ  １０２：１１６００−１１６０５
【非特許文献７７】Ｎａｇｕｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：５６７−５７１
【非特許文献７８】Ｓａｌｖａｄｏｒ−Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３−１９３−２０１
【非特許文献７９】Ｐａｎｔａｒｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１０：９６１−９６６
【発明の開示】
【００２２】
（発明の要約）
本発明は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを含み、ここで動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導する。
【００２３】
本発明は、さらにウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを含み、ここで動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内の免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する。
【００２４】
ある態様では、ウイルスは生ウイルス、弱毒化ウイルスまたは死ウイルスである。
【００２５】
別の態様では、ウイルスは呼吸系ウイルスである。別の局面では、ウイルスは、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、呼吸器合胞
体ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、およびアデノウイルス、カルシウイルス、アストロウイルス、ノーウォークウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ハンタウイルス、アルファウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスから成る群から選択される。
【００２６】
好ましくは、ウイルスはオルトミクソウイルスさらに好ましくはインフルエンザウイルスであり、そしてもっとさらに好ましくは、ウイルスはＡ型インフルエンザウイルスである。ウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである場合に、ウイルスはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６から成る群から選択される赤血球凝集素抗原（ＨＡ）、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９から成る群から選択されるノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）を有する。さらに好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２から成る群から選択されるＨＡ：ＮＡ抗原プロフィールを有する。
【００２７】
いくつかの態様では、ワクチンは該Ａ型インフルエンザウイルスの低用量を含んでなる。好ましくは、該Ａ型ウイルスの該低用量が、ウイルスの０．００１〜５０００赤血球凝集単位（ＨＡＵ）、さらに好ましくはウイルスの０．００５〜５００ＨＡＵ、もっとさらに好ましくはウイルスの０．０１〜１００ＨＡＵである。
【００２８】
いくつかの態様では、動物が脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。
【００２９】
本発明のワクチンは、生ウイルス、弱毒化ウイルスおよび死ウイルスから成る群から選択される２種またはそれ以上のメンバーのウイルスの組合せを含んでなってもよい。
【００３０】
好ましい態様では、投与の経路が天然ではない経路であり、さらに好ましくは皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口から成る群から選択される。
【００３１】
本発明のワクチンを含んでなるキットも本発明にさらに含まれる。
【００３２】
本発明は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンに関し、ここで動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導し、そしてさらに該ウイルスが内包ビヒクルと会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）されている。
【００３３】
さらに、本発明は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンに関し、ここで動物に疾患を起こさない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内の免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、そしてさらに該ウイルスが内包ビヒクルと会合されている。
【００３４】
好ましい態様では、ウイルスが該内包ビヒクル内に内包され、そして該内包ビヒクル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質と会合されてもよい。別の態様では、内包ビヒクルが、ゲル、液体または粉体から成る群から選択される１種もしくはそれ以上のメンバーを含んでなる。好ましくは、内包ビヒクルがナノチューブ内に装入（ｌｏａｄ）される。
【００３５】
ある態様では、内包ビヒクルがポリマーを含んでなり、そしてさらに好ましくは、動物に投与された場合に毒性ではない。好ましくは、ポリマーが該ウイルスと会合され、それ
により周囲環境内への該ウイルスの放出を遅延させる。
【００３６】
好ましい態様では、ポリマーがゲルでありそしてコラーゲンを含んでなってもよい。ポリマーはヒドロゲルであってもよく、そしてアルギネート、ゼラチン、キトサンおよびヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースから成る群から選択されてもよい。
【００３７】
他の好ましい態様では、ゲルは、コラーゲン、アルギネート、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースの１種もしくはそれ以上の組合せを含んでなる。
【００３８】
好ましくは、ゲルは架橋されていてもよく、そして追加してゲルはさらに添加剤を含んでなってもよい。好ましい態様では、添加剤がポリエチレングリコールである。
【００３９】
別の態様では、内包ビヒクルがミクロカプセルもしくはナノカプセル、またはナノチューブを含んでなる。好ましくは、ナノチューブが直径５００ｎｍまたはそれ以下を有する。
【００４０】
さらに別の態様では、内包ビヒクルが１種もしくはそれ以上の溶液、粉末またはゲルの組合せを含んでなる。
【００４１】
内包ビヒクルは、好ましくは本明細書中の別の箇所に記載のウイルスを含んでなる。
【００４２】
動物へのワクチンの送達のためのデバイスもさらに本発明に含まれ、該デバイスは、（ａ）ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体の量であって、ここで天然でない経路により該動物にウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導し、（ｂ）該動物へ該ワクチンを送達するためのデバイスを含んでなる。
【００４３】
動物へのワクチンの送達のためのデバイスがさらに含まれ、該デバイスは（ａ）ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御量であって、ここで天然でない経路により該動物に該ウイルスの投与の後に該ウイルスが該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、（ｂ）該動物へ該ワクチンを送達するための送達デバイスを含んでなる。
【００４４】
一つの態様では、該送達デバイスが中空チューブを含んでなり、そして好ましくは、該中空チューブが先細の末端を有する。いくつかの態様では、該送達デバイスが針を含んでなる。別の態様では、該中空チューブが場合によりプランジングデバイスに取り付けられ、ここで好ましくは、該プランジングデバイスが注射器、遺伝子ガン、カテーテル、貼付剤、吸入デバイス、または粘膜アプリケーターである。
【００４５】
該デバイスは、好ましくは、本明細書中の別の箇所に記載の内包ビヒクルおよびウイルスを含んでなる。好ましくは、ウイルスが該内包ビヒクル内に内包され、そしてさらに好ましくは、該内包ビヒクル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質と会合される。
【００４６】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを製造する方法が本発明中にさらに含まれる。該方法は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体の免疫防御量を、内包ビヒクルと組合せ、それによりワクチンを製造することを含んでなる。
【００４７】
ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを製造する方法も含まれ、該方法は、ウイルスの免疫防御性の量を内包ビヒクルと組合せ、それにより該ワクチンを製造することを含んでなる。
【００４８】
本発明は、動物内にＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御および／または抗体免疫防御応答を誘発する方法も含む。該方法は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発する。
【００４９】
さらに、動物内にＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御応答を誘発する方法が含まれる。該方法は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を該動物内に誘発する。
【００５０】
それらおよびその他の方法中で、好ましくは、動物が哺乳動物であり、そしてさらに好ましくは、哺乳動物がヒトである。
【００５１】
ウイルスにより感染に対して動物を防御する方法がさらに本発明に含まれる。それは、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発し、それにより該感染に対して該動物を防御する。
【００５２】
さらに、ウイルスによる感染に対して動物を防御する方法であって、ここで該方法が該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該感染に対して該動物を防御する。
【００５３】
動物内のウイルス感染を防御する方法も含まれ、ここで該方法が該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物内のウイルス感染を防御する。
【００５４】
さらに、動物内のウイルス感染を防御する方法が提供される、該方法は、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物内のウイルス感染を防御する。
【００５５】
動物内のウイルス感染を処置する方法もさらに含まれる。該方法は、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物を処置する。
【００５６】
動物内のウイルス感染を処置する方法もさらに含まれ、ここで該方法は、該ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを該動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を該動物内に誘発しそれにより該動物を処置する。
【００５７】
本発明は、生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなる組成物を含み、ここで該動物内に疾患を起こさない経路により該動物への該生体作用活性薬剤の投与の後に、該生体作用活性薬剤が動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導する。
【００５８】
本発明は、生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなる組成物も含み、ここで該動物内に疾患を起こさない経路により該動物への該生体作用活性薬剤の投与の後に、該生体作用活性薬剤が動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する。
【００５９】
好ましい態様では、経路は天然ではない経路であり、そして皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口から成る群から選択されてもよい。生体作用活性薬剤は内包ビヒクル内に内包され、そして好ましくは、生体作用活性薬剤が、該内包ビヒクル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質と会合される。内包ビヒクルは、ゲル、液体または粉体から成る群から選択される少なくとも１種のメンバーを含んでなり、そして好ましくは、内包ビヒクルはナノチューブ内に装入される。該内包ビヒクルがポリマーを含んでなってもよく、そして好ましくは、該ポリマーは、動物に投与された場合に毒性ではない。該ポリマーは該生体作用活性薬剤と会合され、それにより周囲環境内への該生体作用活性薬剤の放出を遅延させてもよい。好ましくは、該ポリマーがゲルでありそして好ましくは、該生体作用活性薬剤が微生物およびタンパク質から成る群から選択される。
【００６０】
さらに、動物に生体作用活性薬剤を投与して安全性を上昇する方法が含まれる。該方法は生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなる組成物を該動物へ投与することを含んでなり、ここで該動物内に疾患を起こさない経路による該生体作用活性薬剤の投与の後に該生体作用活性薬剤が該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導し、そしてさらにここで該生体作用活性薬剤が内包ビヒクル内に内包されている。
【００６１】
動物に生体作用活性薬剤を投与して安全性を上昇する方法もさらに含まれる。該方法は生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなる組成物を該動物へ投与することを含んでなり、ここで該動物内に疾患を起こさない経路による該生体作用活性薬剤の投与の後に該生体作用活性薬剤が該動物内に免疫防御性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、さらにここで該生体作用活性薬剤が内包ビヒクル内に内包されている。
【００６２】
好ましい態様では、生体作用活性薬剤が、微生物およびタンパク質から成る群から選択される。
【００６３】
さらに、生体作用活性薬剤の生物学的に有効な量を含んでなる組成物が本発明に含まれ、ここで、動物内に疾患を起こさない経路により該動物に該生体作用活性薬剤を投与の後に、該生体作用活性薬剤が該動物内に所望の応答を誘導し、一方ではリスクを低減する。
【００６４】
動物に生体作用活性薬剤を投与して安全性を上昇する方法がさらに本発明内に含まれる。該方法は動物内で所望の応答を誘導し同時にリスクを低減する生体作用活性薬剤の量を含んでなる組成物を該動物に投与することを含んでなり、ここで、該生体作用活性薬剤の投与の経路が該動物内に疾患を起こさない経路であり、そしてさらにここで該生体作用活性薬剤を投与する際に該生体作用活性薬剤が内包ビヒクル内に内包されそれにより安全性を上昇する。
【００６５】
発明の詳細な説明
本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する動物、好ましくは脊椎動物、好ましくは哺乳動物、そしてさらに好ましくはヒトの防御のための組成物および新規のワクチン戦略中でのその使用の発見に関する。しかし、本発明はインフルエンザウイルス感染に対する動物の防御のためのワクチン戦略のみに限定されると解釈されてはならず、より正確には、ある経路により投与された場合に、エーロゾル化あるいは暴露をもたらしそして他の脊椎動物に有害なリスクを与えるであろうあらゆる生体作用活性薬剤の投与も含むと解釈
されるべきである。本発明は、さらに、動物の呼吸器もしくは胃腸管を介して宿主に感染または侵入する他のＲＮＡウイルス、およびいくつかの場合には、動物の呼吸器もしくは胃腸管を介して宿主に感染または侵入するＤＮＡウイルスを含み、それらに限定はされない他のウイルス感染に対する防御を与えるワクチン戦略を含む。本明細書中の別の箇所にさらに詳細に記載されるように、本発明のワクチン戦略は、単独もしくは新規の調剤および送達システムと組み合わされるいずれかの場合に、慣用のワクチン接種に現在使用される経路または動物内へのウイルスの天然の侵入の経路とは異なる投与の経路による脊椎動物への生ウイルスの低い用量の投与が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体を含んでなる強力な免疫応答を誘導するという発見に関し、それはその後の感染性ウイルスによるチャレンジに対する動物の有効な防御のために重要である。例えば、天然の感染の経路とは異なる経路による動物へのインフルエンザウイルスの投与が、一般に動物内に疾患を起こさないことは知られている。しかし、動物に対して筋肉内投与される現在の死インフルエンザワクチンは、体液性のみそしてＴ細胞免疫応答を弱く誘導するかもしくは全く誘発しない。鼻経由（即ち天然の経路）で投与される弱毒化インフルエンザウイルスワクチンは、弱いＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘発するに過ぎない。従って、現在のワクチンは、標的集団の約３０％を保護するに過ぎない。本発明は、皮下または皮内での低い用量の生インフルエンザウイルスワクチンの投与が、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し従って現在のワクチンより優れているという発見を含む。言い換えると、本発明は、動物内への生体作用活性薬剤の侵入の天然の経路ではない経路による脊椎動物への生体作用活性薬剤の投与を含み、ここで、防御免疫応答は、その後の生体作用活性薬剤を用いるチャレンジの際に疾患に対して動物を防御するように動物内に誘発される。本発明は、さらに、エーロゾル化するかまたは他の暴露リスクを起こす材料の能力を本質的に低下し、それにより材料が存在しない場合よりさらに安全な生体作用活性薬剤の投与をもたらす、材料内への生体作用活性薬剤の内包を含む。本発明のそれらまたはその他の局面は、本明細書中に提供される開示の閲読により明らかになるであろう。
【００６６】
定義
本明細書中に使用される場合に、下記の各用語は本節内において関連する意味を有する。
【００６７】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的な対象の一つまたは一つを越える（すなわち少なくとも一つ）を指すとして本明細書中では使用される。例えば、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１個の要素または１個を越える要素を意味する。
【００６８】
本明細書中に使用される場合に、疾患、障害または状態を「回避」するとは、疾患、障害または状態の１種もしくはそれ以上の症状の重症度を低下させることを意味する。
【００６９】
本明細書中に使用される場合に、「処置」とは、動物、好ましくは脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトにより疾患の症状が経験される頻度を低下させることを意味する。
【００７０】
本明細書中で使用される場合に、「アプリケーター」の用語では、脊椎動物に本発明の組成物を投与するための、針、カテーテル、皮下注射器、遺伝子ガン（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）、貼付剤、ナノチューブ、粘膜アプリケーター、またはそれらのいずれかの組合せを含み、それらに限定はされないあらゆるデバイスを意味する。
【００７１】
本明細書中に使用される場合に、「生体作用活性薬剤」の用語では、脊椎動物に投与された場合に、脊椎動物にある作用を起こすいずれかの薬剤を意味する。起こされる作用は、薬剤が脊椎動物に投与された場合に脊椎動物に有利または不利であってもよい。生体作用活性薬剤の例は、それらに限定はされないが、脊椎動物、好ましくはヒトへワクチン、免疫原、薬剤もしくは他の治療剤として投与できる、生ウイルス、弱毒化または死ウイルス、不活性化ウイルス、生、弱毒化または死んでいる微生物、ペプチド、タンパク質、核酸、または小さい有機もしくは無機化学薬品を含む。
【００７２】
本明細書中に使用される場合に、生体作用活性薬剤、例えばワクチンまたはその他の組成物の「有効な量」とは、所望の応答を誘発するいずれかの量を意味する。ワクチンの場合に、この用語は、脊椎動物に投与された場合に、脊椎動物内で生体作用活性薬剤内の抗原に対して向けられるＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を誘発する生体作用活性薬剤のいずれかの量を意味する。
【００７３】
本明細書中に使用される場合に、「生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御性の量」とは、脊椎動物に投与された場合に、生体作用活性薬剤に対して向けられるＣＤ８＋Ｔ細胞応答および／または抗体応答を誘発する生体作用活性薬剤の量を意味し、その際、脊椎動物が、通常のコースでは脊椎動物に不利な作用物質を有する経路を通って生体作用活性薬剤を用いてチャレンジされた場合に、同様にチャレンジされたがしかし生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御量を投与されなかった第二のその他では同様の脊椎動物よりも、該脊椎動物がチャレンジする生体作用活性薬剤により起きるより低いかもしくはより厳しくない疾患の症状を示す。
【００７４】
本明細書中に使用される場合に、「生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量」とは、脊椎動物に投与された場合に、生体作用活性薬剤に対して向けられるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する生体作用活性薬剤の量を意味し、その際、脊椎動物が、通常のコースでは脊椎動物に不利な作用物質を有する経路を通って生体作用活性薬剤を用いてチャレンジされた場合に、同様にチャレンジされたがしかし生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御量を投与されなかった第二のその他では同様の脊椎動物よりも、該脊椎動物がチャレンジする生体作用活性薬剤により起きるより低いかもしくはより厳しくない疾患の症状を示す。
【００７５】
本明細書中に使用される場合に、「遺伝子」および「組換え遺伝子」の用語は、最低でも、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる核酸分子を指す。
【００７６】
本明細書中に使用される場合に、「指示材料」は、本明細書中に記載の種々の疾患または障害の回避を起こすためのキット内に、本発明の生体作用活性薬剤、ワクチンまたはその他の組成物の有用性を伝えるために使用できる出版物、記録、図表、またはその他の表現媒体を含む。場合により、またはその代わりに、該指示材料は、脊椎動物の細胞または組織内の疾患または障害を回避する１種もしくはそれ以上の方法を記載してもよい。本発明のキットの指示材料は、例えば、本発明の生体作用活性薬剤、ワクチンもしくはその他の組成物を含む容器に貼付しても、または生体作用活性薬剤、ワクチンもしくは組成物を含み容器と一緒に発送されてもよい。あるいは、指示材料と化合物が受領者により協同して使用されるという意図で、該指示材料は容器とは別に発送されてもよい。
【００７７】
本明細書中に使用される場合に、「特異的に結合する」の用語では、試料内の特定の分子を認識して結合するが、しかし他の分子を本質的に認識または結合しない化合物、例えばタンパク質、核酸、抗体などを意味する。
【００７８】
本明細書中に使用される場合に、「導入遺伝子」の用語では、外因性核酸がトランスジェニック細胞または哺乳動物によりコードされる外因性核酸配列を意味する。
【００７９】
ウイルスに関して本明細書中に使用される場合に、「生」の用語では、ウイルスが宿主
細胞内で感染および複製しそして動物内で疾患を起こす能力があることを意味する。
【００８０】
これは、ウイルスに関して本明細書中に使用される場合に、「弱毒化」の用語とは対照的であり、その用語は、ウイルスが宿主細胞で感染の能力はあるが、しかし動物内に疾患を起こす能力が著しく低いかまたはないことを指す。
【００８１】
ウイルスに関して本明細書中に使用される場合に、「死（ｋｉｌｌｅｄ）ウイルス」の用語は、ウイルスが宿主細胞内で感染および複製の能力がなくそして動物内に疾患を起こすこともほとんど不能であるウイルスである。
【００８２】
本明細書中に使用される場合に、「ワクチン」の用語では、ワクチンが投与された脊椎動物内に免疫応答を誘発する抗原、すなわち生体作用活性薬剤、好ましくはウイルスもしくはその他の微生物またはタンパク質を意味する。好ましくは、免疫応答は、同じかまたは類似の生体作用活性薬剤を用いるその後のチャレンジに対抗して脊椎動物にいくらかの有利で防御的な作用を与える。さらに好ましくは、免疫応答は、生体作用活性薬剤と関連する疾患の少なくとも一つの症状の発生を防止するかもしくは改善し、またはその後のチャレンジの際に生体作用活性薬剤と関連する疾患の少なくとも１種の症状の重症度を低下させる。さらに好ましくは、免疫応答は、その後のチャレンジの際に生体作用活性薬剤と関連する疾患の１種を越える症状の発生を防止するかもしくは改善する。
【００８３】
「疾患を起こさない方法または経路」の用語では、薬剤が天然には生物体に有害、有毒または生物体に感染する機構または侵入点とは異なる方法で生物体に薬剤を提示する様式で生体作用活性薬剤を投与することを意味する。限定ではない例示として、ヒトの天然の感染の間のインフルエンザウイルスの侵入点は、非内包ウイルスとして気道を通過するものである。この範囲内で、「疾患を起こさない方法または経路」は、好ましくは皮下または皮内によるウイルスの注入であり、ここでウイルスは内包組成物内に内包されている。
【００８４】
本明細書中に使用される場合に、「天然ではない経路」の用語は、ウイルスによる動物の天然の感染の間のウイルスの侵入点ではない、動物の身体内へのウイルスの侵入点を意味する。例として、ヒトの天然の感染の間のインフルエンザウイルスの侵入点は気道である。従って、侵入の皮下または皮内経路はインフルエンザウイルスの侵入の天然ではない経路である。
【００８５】
「感染の天然の経路」では、ウイルスの天然の拡散の間にウイルスが動物に感染する経路を意味する。
【００８６】
「生体作用活性薬剤の天然の侵入の経路」では、通常、生体作用活性薬剤への動物の暴露がそれと関連する疾患の症状を起こす経路を意味する。
【００８７】
ウイルスの「低用量」の用語では、ウイルスが投与された脊椎動物内で防御的ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘発するために十分なウイルスの量を意味する。熟練した医師は、それぞれの状況において投与すべきウイルスの正確な量を知っており、そしてその量は、使用される特定のウイルスの悪性度、ウイルスが投与される動物の年齢および全体的健康、ウイルスの調剤、およびウイルスの投与に使用されるデバイスも含み、それらに限定はされない多数の因子のいずれか一つまたはそれ以上に依存して変化する。インフルエンザウイルスの場合に、低用量は約０．０００１赤血球凝集単位（ＨＡＵ）から約５０００ＨＡＵの範囲であろう。好ましくは、低用量は約０．０００５〜約５００ＨＡＵ、さらに好ましくは約０．００１〜約１００ＨＡＵ、そしてさらに好ましくは約０．０５〜約１０ＨＡＵの範囲およびその間のいずれかの整数または部分（ｐａｒｔｉａｌ）整数であろう。
【００８８】
本明細書中に使用される場合に、「呼吸系ウイルス」の用語では、動物に感染した際に、侵入点として主として気道を用いるか、および／または気道を主標的としそして動物に呼吸器疾患を起こすウイルスを意味する。
【００８９】
本明細書中に使用される場合に、「胃腸内ウイルス」の用語では、脊椎動物への感染の際に、胃腸管を侵入点として使用するかおよび／または胃腸管を主標的としそして脊椎動物に胃腸疾患を起こすウイルスを意味する。
【００９０】
「皮下」は、皮膚の真皮層とその下の筋肉組織の間にある脂肪組織の領域を指す。
【００９１】
「皮内」は、表皮とその下の皮下脂肪層の間にある真皮層を指す。皮内部位は、多数の抗原提示細胞を含みそして皮下部位と比較してリンパ系内へのより迅速な放出をもたらす。これは免疫応答、抗原／生体作用活性薬剤クリアランス、および皮内および皮下注入部位の間に必要な用量の形式および大きさに相違をもたらす。
【００９２】
本明細書中に使用される場合に、「ワクチン単位」または「ワクチンの単位」の用語では、脊椎動物に投与された場合に、脊椎動物内に防御的免疫応答の誘発を開始させるワクチンの量を意味する。ワクチン単位は、脊椎動物内に完全な防御的免疫応答の誘発を開始しても、または完全な応答のためには追加のワクチン単位が必要な不完全な応答を開始してもよい。
【００９３】
本明細書中に使用される場合に、「内包（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）ビヒクル」の用語は、脊椎動物に生体作用活性薬剤、ワクチンもしくはその他の組成物の投与のための組成物を意味し、ここで、組成物は、薬剤がその非内包状態で存在するものよりも追加の材料を含んでなるように、薬剤を被覆、包囲、包含、あるいはそれと会合する。
【００９４】
「生物適合性ポリマー」の用語は、動物に投与された際に、動物に一般的に不利な応答を誘導しないポリマーを意味する。この用語は、「無毒性」の用語と本明細書中では同義的に使用される。
【００９５】
本明細書中に使用される場合に、「ミクロカプセル」の用語では、生体作用活性薬剤を包囲あるいはそれと関連するビヒクルを意味しそして薬剤と環境との間の障壁を提供する。ミクロカプセルの大きさは、約１から数百μｍおよびその間のあらゆる整数または部分整数の程度である。ミクロカプセルの形状は種々であってもよく、そして球状、楕円体および多面体形状を含み、それらに限定はされない。内包の形態は、マトリックス中に均等に配置され、しばしばミクロスフェアと呼ばれるものから、一部分に極限され、例えば生体作用活性薬剤を充填した中空ミクロカプセルの場合がある。
【００９６】
本明細書中に使用される場合に、「ナノカプセル」の用語では、寸法が約１μｍ〜約１μｍおよびその間のあらゆる整数または部分整数の範囲であるミクロカプセル様の構造を意味する。
【００９７】
本明細書中に使用される場合に、「ナノチューブ」の用語では、１より大きい長さと幅の比率を有し、いずれかの形状の断面（円形、楕円形、正四角形、多角形またはその他）を有し、ここで一つの寸法は、１００ｎｍまたはそれ以下であるがしかし１μｍまでであることも可能で、そしてその間のあらゆる整数または部分整数でもよい。
【００９８】
本明細書中に使用される場合に、「送達デバイス」の用語では、脊椎動物の皮膚の少なくとも最も外層を通過しそして薬剤を脊椎動物の内部組織に送達できるデバイスを意味す
る。あるいは、送達デバイスは生体作用活性薬剤を脊椎動物の粘膜組織内に送達できる。送達デバイスの限定ではない例は、針、注射器、カテーテル、遺伝子ガン、ナノチューブ、貼付剤、粘膜アプリケーターなどである。
【００９９】
本明細書中に使用される場合に、「安全な送達ビヒクルまたはデバイス」とは、脊椎動物に有害の可能性がある生体作用活性薬剤を送達する手段であり、ここで脊椎動物が安全ではないモード、一般的にはエーロゾルまたは遊離粉末形態で生体作用活性薬剤に暴露された場合には、生体作用活性薬剤は脊椎動物に不利な作用を有するであろう。
【０１００】
詳細な説明
Ｉ．ウイルスおよびその他の生体作用活性薬剤
本発明は、マウス内の生インフルエンザウイルスの低用量皮下または皮内投与が、その後に鼻内に投与される感染性インフルエンザウイルスによるチャレンジに対してマウスを防御するマウス内の強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答および抗体応答を誘導するという発見に基づく。本発明は、さらに、有害なエーロゾルを形成する能力を有する生体作用活性薬剤の投与に関連するリスクが、生体作用活性薬剤のエーロゾル化を防止する材料内に生体作用活性薬剤が内包された場合に最小となり得るという発見に基づく。
【０１０１】
本発明は、インフルエンザウイルスに対して向けられるワクチンの使用のみに限定して解釈するべきではなく、より正確には、他のウイルス、特には呼吸系および胃腸内ウイルスに対するワクチンの開発を含むと解釈されるべきである。さらに、本発明は、脊椎動物への生体作用活性薬剤の投与を含むと解釈されるべきであり、ここで、該薬剤は、エーロゾルまたは粉末形態では有害となる可能性がある。さらに、本発明は、ウイルスに対するのみでなく、細菌を含みそれらに限定はされない他の微生物に対して向けられるワクチンを含むと解釈されるべきである。本発明は、タンパク質もしくは脂質を含んでなり、それらに限定はされない他の分子、化合物または構造体に対して向けられるワクチンの投与を含むとさらに解釈されるべきである。
【０１０２】
本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載するように、本発明は与えられた生体作用活性薬剤に対する防御的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、もしくは防御的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、または抗体応答、または各応答の２種またはそれ以上の組合せを誘導できるワクチンを含む。
【０１０３】
本発明のワクチン内に含まれるその他のウイルスは、それからの防御のためのＴ細胞応答、すなわちＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答、および／または抗体応答に同様に依存するものである。かかるウイルスは、それらに限定はされないが、ＲＮＡウイルス、呼吸器感染を起こすＲＮＡウイルス、およびある場合にはＤＮＡウイルスを含む。それらのウイルスの限定ではない例は、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス（ピコルナウイルス、例えばポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスを含み、それらに限定はされない）、パルボウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、アルボウイルスおよびアレナウイルス、例えばフラビウイルス、フィロウイルス、ハンタウイルス、アルファウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどを含む。
【０１０４】
従って、インフルエンザウイルスが本開示を通じて例示されているけれども、本発明は、本開示の一体となる部分として追加のウイルスおよびその他の微生物ならびにその他の潜在的に有害な生体作用活性薬剤も含むと解釈されなければならないと認められるべきである。本発明を一旦理解すると、感染性ウイルスによりその後にチャレンジされた際に免疫化個体に有利な防御的ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答および／または抗体応答を誘導できる性質を有する追加のウイルス組成物およびワクチンを開発するのは、熟練者の技術の範囲内に十分入る。動物およびヒトに対して薬剤の安全な投与をさせる追加のビヒクル／薬剤の組合せを開発するのもさらに熟練者の技術の範囲内に十分入る。
【０１０５】
それを考慮して、インフルエンザウイルスに主として焦点を当てた本開示は、明瞭性の目的のみでありそして、その病原、複製および／または感染性疾患サイクルが既知でありそして当該技術分野のものと共同して本明細書中に開示する一般手順に従って効果的なワクチンを生成するように操作できる他の生体作用活性薬剤、微生物およびウイルスにも一般的に適用可能であると解釈するべきである。それらの手順の概観については、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｆｉｅｌｄｓ編集によるＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｄ  ＫｎｉｐｅＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、第３版（１９９６）を参照のこと。
【０１０６】
種々の細胞または他の系、例えばインフルエンザウイルスの場合にはタマゴ内での種々のウイルスの増殖および評価がワクチン生産のためにウイルスを生成するために使用されることを教示する当該技術分野内の多数の情報がある。各ウイルスは大量に生産されるそれ自体の系を有し、そしてそれらの系は周知であり熟練者には容易に利用できる。ワクチンに使用するために大量の生ウイルスが生産された場合に、生産されたウイルスは宿主細胞に感染しそしてその中で複製できなければならない。さらに、生ウイルスワクチンの場合に、感染した宿主内に疾患を起こすウイルスの能力は、感染の天然の経路による場合には、熟練者には容易に利用できる方法を用いて評価される。複製、単離できるウイルスは細胞を感染でき、そして感染の天然の経路を使用した場合に動物内に疾患を起こすウイルスは、本発明の生ウイルスワクチンに使用するための候補である。天然の感染経路を使用した場合に細胞を感染できるが、しかし動物内に明白な疾患を起こさない弱毒化ウイルスとして複製および単離できるウイルスは、本発明の弱毒化ウイルスワクチンに使用するための候補である。天然の感染経路が使用された場合に、動物内で細胞を感染できずそして疾患を起こさないように複製、単離および死滅できるウイルスは、本発明の死ウイルスワクチンに使用するための候補である。最後に、野生型、弱毒化または死生物体およびウイルスのいずれかとして天然経路による侵入の後に疾患を起こし得る他の微生物は、本発明のワクチン内に使用されるための候補である。
【０１０７】
ウイルスがワクチン内に使用される場合に、該ウイルスは典型的には動物、好ましくは哺乳動物、そしてさらに好ましくはヒトに投与される。しかし、本発明はネコ、イヌ、ウマ、乳牛、牧牛、ヒツジ、ヤギ、鳥、例えばチキン、アヒル、ガチョウ、および魚を含み、それらに限定はされない各種の動物への、ウイルス、他の微生物、または生体作用活性薬剤の投与を含むと解釈されるべきである。
【０１０８】
２種のインフルエンザウイルスワクチンが、現在世界的に使用されている。それらは、（ｉ）死ウイルスの筋肉内注入および（ｉｉ）弱毒化ウイルスの鼻内投与である。どちらのワクチンの投与も、その後のウイルス感染に対して防御的であるウイルスに対する強い抗体応答を誘導する。
【０１０９】
両方のワクチンに関連する数種の欠点がありそれらを本明細書中に記載する。（ａ）誘導された抗体応答は、それ自体においてまたはそれに関して、ウイルスによるその後の感染に対する十分な防御を与えない。ウイルスに対して向ける防御的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答も要求される。かかるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、流行している感染株により感染された場合にウイルスに対する抗体を有する健康な個体内には誘導され得るが、しかし免疫無防備状態の個体または非常に若いかまたは老齢者には誘導されないであろう。（ｂ）ワクチン投与の後に誘導される抗体応答は、免疫原として使用されるウイルスの株に対して強く特異性である。従って、集団を免疫化するためには毎年新しいワクチンを同定、製造および投与
することが必要となる。いずれかの与えられた年にワクチンに使用したウイルス株が流行している感染株とは異なった場合には、集団の大部分が流行している株に対して防御されていないので、インフルエンザウイルス感染の罹患率および致死率が上昇する。（ｃ）いずれかの与えられた年でインフルエンザウイルスに対する防御的抗体応答を効率的に誘導することが要求されるウイルスの量が多く、製造は複雑でそして頻繁なので、集団の大部分を十分に免疫化するために必要な時間内に十分なワクチンを生産できない。
【０１１０】
本発明のワクチンは、皮内または皮下経路により脊椎動物に投与される生の感染性ウイルスの低用量を含んでなる。皮下とは、皮膚の真皮層とその下の筋肉組織の間にある脂肪組織を指す。皮内とは、表皮とその下の皮下脂肪層の間にある真皮層を指す。皮内部位は、多数の抗原提示細胞を含みそして皮下部位と比較してリンパ組織内へのより迅速な放出を与える。これは、免疫応答、抗原／生体作用活性薬剤クリアランス、および皮内と皮下注入部位との間の所要用量の形式および大きさに差異をもたらすであろう。本開示を読んで明らかになるように、現在使用されているものに対して、本ワクチンを用いることにはいくつもの利点がある。第一に、本発明のワクチンは抗体応答の外にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を被接種者内に誘導するので、本発明のワクチンはすべての被接種者に防御的免疫応答を与え、それはその後のウイルス感染に対するさらに完全な防御のために重要なものである。第二に、インフルエンザウイルス株の多数の内部セグメント／遺伝子が抗原性Ｔ細胞エピトープを共有するので、本ワクチンにより誘導される防御性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が各個別のウイルス血清型に対する特異性が低くなり、ウイルスの個別株に対するワクチンの特異性は重要性が低くなる。第三に、ウイルスの低用量で十分であり従っていずれか特定のウイルスの多量生産に関連する困難が低下する。流行中の株が一旦単離されると、大量のワクチンが迅速に製造でき従って罹患の恐れがある大きい集団が、現状で可能なよりも迅速に免疫化できる。第四に、生ウイルスの一回の注入が免疫応答を誘発し、それは追加の免疫化によりさらに補強できる。現在のワクチンは、防御的免疫応答を誘発するために複数回のワクチン接種を必要とする。
【０１１１】
本発明でワクチンとして使用されるウイルスは、好ましくは「生」ウイルスである。しかし、弱毒化ウイルスおよび死ウイルス、またはそれらのウイルスのいずれかもしくはすべての組合せ、またはＣＤ８＋細胞応答および／または抗体応答を誘発するあらゆる生体作用活性薬剤も本発明に予期される。インフルエンザウイルスの場合に、ワクチンに使用されるウイルスの形式は、好ましくはＡ型インフルエンザウイルスであるが、しかし既知または現在は未知の他のインフルエンザウイルスも本発明に含まれる。本明細書中の別の箇所で考察するように、現在、Ａ型インフルエンザウイルスの多数の異なる血清型が存在し、そしてヒトおよびその他の動物内で疾患を起こしそして免疫性を誘導するそれらの能力は、ウイルスのエンベロープ内のＨＡおよびＮＡ抗原の形式により大部分が支配される。本発明は、それらのウイルス株が宿主の天然の感染の間に産生されるか、異なる種の感染の結果としてＨＡおよびＮＡ抗原の再構築により産生されるか、またはウイルスの抗原構造が通常の分子生物学技術を用いて可能なように特異的に設計されたかもしくはランダムな組換えにより生成されたかのいずれかである組換え手段により産生されたかには関係なく、ウイルスエンベロープ内のＨＡおよびＮＡ抗原のあらゆる組合せを有するあらゆるウイルスを含むと解釈するべきである。好ましくは、本発明に有用なインフルエンザウイルスは、脊椎動物内で広いスペクトルのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘発できるものである。最も好ましくは、ウイルスは、それらに限定はされないが、インフルエンザの潜在的な汎流行株（例えばＨ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３またはＨ７Ｎ７）、過去の汎流行（例えばＨ２Ｎ２またはＨ１Ｎ１）、または非汎流行ウイルス（例えばＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２またはＨ３Ｎ２）のものから成る。
【０１１２】
本明細書中の別の箇所に記載のように、本発明は、ワクチンとして生ウイルスの使用のみに限定されると解釈してはならない。弱毒化ウイルス、ならびに死ウイルス、または弱
毒化ウイルス、死ウイルスおよび生ウイルスの組合せも本発明に有用でありそして包含されると考えられる。その他の生、死または弱毒化微生物体も、本発明に有用でありそして包含されると考えられる。熟練した医師は、本明細書中に提供する開示に基づいて、一つのワクチン内のウイルスの異なる形態の組合せが、一定の場合には、ウイルス抗原型の広いスペクトルに対する防御のために必要な動物内での体液性および細胞性免疫応答の両者を増大することを理解するであろう。
【０１１３】
投与の経路および頻度
本発明において、ワクチンの投与の経路は、動物内のワクチンにより誘導される防御性免疫応答の範囲に関与することが発見されている。実施例の部分に提出したデータを調べて明らかとなるように、インフルエンザウイルスによるその後のチャレンジに対する防御性免疫の高いレベルは、皮下または皮内経路のいずれかによりウイルスを投与された動物内で得られた。従って、本発明のワクチンはそれらの経路のいずれか一つに限定されるとは解釈するべきではなく、インフルエンザウイルスの皮下または皮内投与が好ましい経路であってインフルエンザウイルス以外またはその他の微生物またはその他の生体作用活性薬剤のためにも好ましい経路である。しかし、投与のその他の経路も本発明内に含まれ、特に天然ではない経路が好ましい。限定ではない例として、特にワクチン内に含まれるワクチンがインフルエンザウイルスでない場合に、筋肉内、鞘内、腹腔内、鼻内、直腸、経口、非経口、局所、肺臓、口中、粘膜内およびその他の投与の経路が、動物への本発明のワクチンの投与のために本発明内に含まれる。投与の経路は、免疫が望まれそして身体の部位が保護されなければならない病原性ウイルスの種類に依存して組合せ、または所望の場合には調整されてもよい。
【０１１４】
ワクチンとして使用される場合のいずれか特定のウイルスの投与の最善の経路を評価するために、実験詳細の部に記載のプロトコールには、かかるプロトコールが例示としてのみ提供されそしてそれらは本明細書中に記載し請求される本発明に対してどのような限定的効果も持たないと解釈されるべきであるということを当然ながら認めた上で従ってもよい。それらの実験は、生ウイルスを用いる皮下および皮内接種が、いかなる疾患の臨床的兆候を示すことなく、ウイルスの非常に低い用量でもインフルエンザウイルスに対して向けられた非常に強力な免疫応答を誘発することを確証する。従って、それらの実験は、生ウイルスの投与の皮下または皮内経路がインフルエンザウイルスの潜在的な汎流行に対する有用なワクチン戦略であることを確認する。
【０１１５】
ウイルスワクチンの用量および有効な量は、条件、選択されたウイルス、動物の年齢、体重および健康などの因子に依存するであろうし、そして動物宿主間でも変動するであろう。個体に投与される本発明のウイルスの適当な力価は、抗体およびＴ細胞応答を含むウイルスに対する防御的免疫応答を誘発できる力価である。有効な力価は、個体にワクチンの投与の後の免疫エフェクター細胞の活性を決定するためのアッセイを用いるか、または周知のイン・ビボ診断アッセイを用いて治療の有効性を測定して決定できる。
【０１１６】
ワクチンは、一日に数回の頻度で動物に投与してもよく、またはそれはより低い頻度、例えば一日一回、一週間に一回、二週間に一回、一月に一回、またはさらに低い頻度、例えば数カ月に一回、または一年に一回で投与されてもよい。理想的には、ワクチンは動物に一回または多くても二回投与される。投与の頻度は、熟練者には直ちに明らかであり、そして多数の因子、例えば、それらに限定はされないが、対抗して免疫化される疾患の種類および重症度、動物の種類および年齢などに依存する。
【０１１７】
ウイルスワクチンの免疫原性、すなわち病原性ウイルス株を用いる致死的チャレンジからの動物の防御を与える動物内の抗ウイルス抗体およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成は、本明細書中の実験の部に記載のようにして決定される。要約すると、ワクチンを動物の一群
に投与する。選択された期間の後、抗体およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を群内の一部の動物について測定する。群内の他の動物は、病原性ウイルスを用いてチャレンジされそしてウイルス疾患の何れかの症状の進展を測定する。ウイルスの病原性株を用いてチャレンジされた後に動物へのワクチンにより生成された免疫応答および得られた防御的効果は、ワクチンを投与されなかった対照動物と、ワクチンを投与された動物で得られた結果とを比較して評価される。
【０１１８】
ＩＩＩ．調剤
本明細書中に記載の方法に従って生産された生体作用活性薬剤、例えばワクチンは、本明細書中に記載の種々の方法で調剤できる。
【０１１９】
生体作用活性薬剤の基本的な調剤は、生体作用活性薬剤を製薬学的担体、例えば、それらに限定はされないが、生体作用活性薬剤を組み合わせることができそして組合せの後に動物へ生体作用活性薬剤を投与するために使用できる化学的組成物内で組み合わせることを含む。製薬学的組成物は、製薬学的組成物のあらゆるその他の成分と相容性であり、そして組成物が投与される動物に有害ではないあらゆる生理学的に許容できるエステルまたは塩を含んでもよい。本明細書中に記載の製薬学的組成物の調剤は、製薬学の技術分野で既知または今後開発されるいずれかの方法により調製されてもよい。一般に、かかる調製方法は有効成分を担体または１種もしくはそれ以上の補助成分内と会合させる工程、次いで、必要または望ましい場合には、所望の単回または複数回投与単位に製品を成形または包装する工程を含む。
【０１２０】
それらの調剤中で、他の物質は、調剤の成分と共重合体、ブレンドまたはアロイを形成するために使用でき、それにより調剤の物理的性質を改変しそしてさらに内包／放出プロフィールを調整することを含んでもよい。それらの調剤は、樹状細胞のような抗原提示細胞を誘引および保持するかまたはトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストもしくはアンタゴニストのような抗原提示細胞の挙動を変更するケモカインのような物質を含んでもよい。
【０１２１】
本明細書中に提供される製薬学的組成物の記述は、ヒトへの指示投与に適する製薬学的組成物に主として向けられるけれども、かかる組成物はすべての種類の動物への投与に一般的に適することは熟練者により理解されるであろう。種々の動物への投与に適する組成物を与えるためにヒトへの投与に適する製薬学的組成物の変更はよく理解されており、そして通常の技術の獣医薬剤師は、必要なら単に通常の実験を用いてかかる変更を設計および実行できる。本発明の製薬学的組成物の投与が意図される対象は、それらに限定はされないが、ヒトおよびその他の霊長類、商業的関連がある哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、およびイヌおよびその他の脊椎動物、例えば鳥類を含む哺乳動物を含むと意図する。
【０１２２】
本発明の製薬学的組成物は、バルク、単一単位用量として、または複数の単一用量単位として、製造、包装、または販売されてもよい。本明細書中に使用される場合に、「単位用量」とは、生体作用活性薬剤の所定の量を含んでなる製薬学的組成物の分離された量である。生体作用活性薬剤の量は、一般に、動物に投与される生体作用活性薬剤の投与、またはかかる用量の便利な分割、例えばかかる用量の半分、三分の一に等しい。
【０１２３】
本明細書中に開示の本発明の製薬学的組成物として含まれる一部の調剤は、投与される生体作用活性薬剤が周囲の組織内に迅速に放出されるか、または時間をかけて緩徐に放出されるように設計される。さらに、本明細書中に開示される多数のものは、生体作用活性薬剤を一つの温度では保持し、一方別の温度では放出する追加の利点を有する。例えば、体温以下の温度にあるゲル内に含まれる生体作用活性薬剤はゲル内に保持されるが、しかし体温では周囲の組織内に放出される。さらに、本発明の生体作用活性薬剤は、複数投与
内で単一用量が投与されるように調剤できる。放出プロフィールおよび／または単回に対する複数回投与の戦略は、投与される生体作用活性薬剤に基づいて当該技術分野の熟練者により決定される。さらに、生体作用活性薬剤は、それらを含む材料を破裂させて放出されるか、および／または超音波、光もしくは熱の形状でエネルギーを与えるかまたはｐＨを変化させて条件を変化して放出を制御できる。
【０１２４】
以下に記載の調剤の前に、生体作用活性薬剤、生、弱毒化もしくは死ウイルスは、熟練したウイルス学者には周知でありそして例えばＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（上記）に記載の凍結乾燥技術を用いて場合により冷凍乾燥または凍結乾燥されてもよい。
【０１２５】
動物およびヒトへの生ウイルスワクチンのような生体作用活性薬剤の投与は、注入過程の間のウイルスのエーロゾル化の可能性のために極近くの人員に健康脅威を与える可能性がある。この問題を解決するために、本発明は、有害生体作用活性薬剤、例えば生ウイルス接種の安全への関心に対処するために設計された新規の送達調剤およびデバイスを含む。さらに、かかる調剤および送達デバイスは、動物の組織内への生体作用活性薬剤の放出のための別の戦略を与える。例えば、徐放調剤を使用してもよく、または生体作用活性薬剤を組織内に直接放出する調剤を使用してもよい。
【０１２６】
生体作用活性薬剤、例えば生ウイルスの内包のための無毒性、天然または合成ポリマーを含んでなる内包ビヒクルが本明細書中に提供される。好ましくはそれらのポリマーは、ミクロカプセル、ナノカプセル、ナノチューブと組み合わせた生ウイルスのミクロカプセル化またはナノカプセル化に有効である。さらに好ましくは、それらのポリマーは、それらを生体作用活性薬剤と組み合わせると、生体作用活性薬剤のエーロゾル化が回避され、従って動物に投与する際の生ウイルスワクチンの安全性を上昇するという追加的な性質を有する。
【０１２７】
内包ビヒクルは、それらに限定はされないが、天然および合成ポリマー、例えばアルギネート、ヒアルロン酸、キサンタンガム、ジェランガム、コラーゲン、キトサン、ラミニン、エラスチン、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）ＴＭ、ビトロゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ、ポリメチルメタクリレート、ポリ〔１−ビニル−２−ピロリドン−コ−（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）〕、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリグリセリルアクリレート、アクリル酸コポリマー（例えばＴＲＩＳＡＣＲＹＬ）；多糖類、例えばデキストランおよびその他の増粘性ポリマー、例えばカルボキシメチルセルロース；ポリエチレングリコール、ポリ酪酸およびそれらのコポリマーを含む。上記のマクロポリマーのオリゴマー組成物は、それらがエーロゾル形成を抑制するために適当な粘弾性性質を有する限り含まれる。
【０１２８】
さらに、生体作用活性薬剤自体も、ビヒクル内に内包される前に当該技術分野の熟練者には公知のミクロカプセルもしくはナノカプセルのいずれかの形状内に含まれることができる。かかるコンテナーは、それらに限定はされないが、リポソーム、ポリマー性ミクロカプセル、例えばポリ（ヒドロキシ酸）から成るもの、ヒドロゲルカプセルまたはミクロチューブおよびナノチューブを含む。あるいは、ゲル内に含まれる生体作用活性薬剤は、ミクロカプセル、ナノカプセルまたはナノチューブ内に加えられることもできる。
【０１２９】
一つの態様では、内包ビヒクルを生ウイルス粒子と混合しそして針を通って注入されるために十分なほど小さい内包ウイルスのカプセルを生成させる。カプセルの大きさおよびカプセル内のウイルスの量は、使用するポリマー、ウイルス、および投与の経路に応じて最適化できる。
【０１３０】
別の態様では、ゲル状内包ビヒクルおよび生ウイルスを含んでなる円筒が、単一の投与針またはその他の注入デバイスの内部に生成される。この工程は本明細書中ではイン・シトゥ・ゲル化と称する。イン・シトゥ・ゲル化法は、内包ウイルスの非常に小さい円筒を皮下あるいは皮内に注入できる即時使用可能単位を提供する。この態様において、内包ビヒクルは、それが室温では固体の注入可能ゲルに止まるがしかし体温では内包されたウイルスを放出するように、またはあらかじめプログラムされた放出プロフィールでワクチン送達の選択された経路に基づいて所望のゲル強度を達成するように設計される。針の大きさ、最初のゲル濃度、円筒を外す手段、およびその中に含まれるウイルスの量は、使用されるポリマーの種類、ウイルス、および投与の経路に応じて最適化される。
【０１３１】
温度およびｐＨは、エーロゾル抑制の望ましい性質、適当な粘弾性および放出速度を達成するために変化できる別の可能な因子である。さらに、ゲルおよびミクロカプセル、ナノカプセルもしくはナノチューブを含んでなる内包ビヒクルは、超音波、光もしくは熱の形態のエネルギーの適用またはｐＨ変化の生成により条件を変化させてコンテナーの破裂および／または放出制御により生体作用活性薬剤の放出を制御れ得る。
【０１３２】
生ウイルスを内包する際に使用される例示的なポリマーは、以下にさらに詳細に記載され、そして、限定はされないが、アルギネート、ヒアルロン酸、セルロース、デキストランおよびコラーゲンマトリックスを含む。
【０１３３】
他の用途のための内包ポリマーを生成するために設計される方法は、送達されるウイルスが生ウイルスである場合に、ウイルスは本質的に不活性化されずおよび／または内包状態の間に免疫原性を失ってはならないことを条件に、本発明に適合できる。同様な制限は、包膜化が所望の活性を保存しなければならない場合にも生体作用活性薬剤に適用される。
【０１３４】
「本質的に不活性化される」の用語では、ウイルスが少なくとも幾らかの感染性を保持し従って宿主細胞内で感染および複製可能であることを意味する。
【０１３５】
本明細書中に記載の内包ビヒクルは、生ウイルスワクチン戦略に有用であるだけでなく、対象者へのいずれかの生物学的の生体作用活性薬剤の安全な送達のためにも有用であることは熟練者には理解されるであろう。
【０１３６】
内包ビヒクルの限定ではない例をここに記載する。内包ビヒクルを生成するために有用な実験条件およびワクチンへのそれらの使用は、本明細書中の別の箇所の実験実施例中にさらに詳細に記載されている。本発明中で有用な内包ビヒクルは、投与の間にウイルスのエーロゾル化を防止することにより生体作用活性薬剤に安全の一定のレベルを与える。さらに、内包ビヒクルは、生体作用活性薬剤の即時または徐放調剤の生成を容易にする。さらに、ウイルスは、生体作用活性薬剤／内包ビヒクルの組合せが投与の前に送達デバイス内に前装入されるか否かにかかわらず、使用の前に内包ビヒクル内で安全に保管されてもよい。
【０１３７】
本発明は、本発明のウイルスワクチンのための内包ビヒクルとしてのゼラチンポリマーの使用を含む。本発明のワクチン内で有用なゼラチンの濃度は、水に対するゼラチンの約０．０５％〜約２５％（ｗ／ｗ）の範囲およびその間のすべての完全または部分整数であってもよい。種々の濃度でゼラチンがウイルスと混合されそして得られた溶液を送達デバイス、例えば、それらに限定はされないが、針または注射器内に装入される。装入の前、その間またはその後のゼラチンのゲル化は、当該技術分野では公知の方法に従って誘導される。本発明におけるゼラチン使用の利点は、架橋が架橋剤としての温度のみを介しておきるので、ゼラチンの架橋がどのような添加化学薬品がなくても起き得るということにある。
【０１３８】
ウイルス−ゼラチン混合物を動物に接種しそして免疫応答に対する効果が本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載されるようにして評価される。好ましくは、ゼラチンは凍結乾燥されそして滅菌するためにγ線照射またはその他の滅菌方法を受ける。使用されるゼラチンの濃度は、動物への投与の後のゲルからのウイルスの望ましい放出速度に依存して変化されそして本発明を理解した熟練者には明らかであろう。
【０１３９】
場合により、コポリマー、ポリマーブレンドまたはアロイ、例えば、それらに限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、ゼラチンと関連して使用されてもよい。ＰＥＧはゲルからの水の損失を低下させるように作用する。約５００〜約５０，０００の範囲のＰＥＧの大きさおよびその間のすべての完全または部分整数が本発明に有用であり、ここで好ましい分子量は、ＰＥＧの約１００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００および１０，０００である。ＰＥＧは、ゼラチン−ウイルス混合物中にＰＥＧゼラチンのほぼ０．１〜２０％ｗ／ｗで含まれることができるが、この範囲は、ゼラチンの強度、ワクチン内に使用されるウイルス、送達経路などを含みそれらに限定はされない多数の因子に依存して変化してもよい。従って、ＰＥＧ／ゼラチンの０．１〜２０％ｗ／ｗの範囲は、その間のあらゆる完全または部分整数を含むと解釈される。
【０１４０】
コラーゲンゲルを含んでなる内包ビヒクルも本発明に使用されている。コラーゲンゲルは、本明細書中の他の箇所に記載のようにして合成および特性決定されてもよい。ワクチン製造のためのゲル内で有用なコラーゲンの濃度は、約０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ（コラーゲン）溶液およびその間のすべての完全または部分整数で変化してもよい。コラーゲンの架橋は、熟練者には周知の技術を用いて達成されそして本明細書中の別の箇所にさらに詳細に記載されている。
【０１４１】
ウイルス−コラーゲン混合物は動物に接種されそして免疫応答に対する効果は、本明細書中の別の箇所にさらに詳細に記載されている方法により評価される。好ましくは、コラーゲンは凍結乾燥されそしてそれを滅菌するためにγ線照射されることができる。使用されるコラーゲンの濃度は、動物に投与の後のゲルからのウイルスの望ましい放出速度に依存して変化しそして本発明を熟知した熟練者には明らかである。
【０１４２】
場合により、コポリマー、ポリマーブレンドまたはアロイ、例えば、それらに限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、コラーゲンと関連して使用されてもよい。約５００〜約５０，０００の範囲のＰＥＧの大きさおよびその間のすべての完全または部分整数のすべてでありが本発明に有用であり、ここで好ましい分子量は、ＰＥＧの約１００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００および１０，０００である。ＰＥＧは、コラーゲン−ウイルス混合物中にＰＥＧコラーゲンのほぼ０．１〜２０％ｗ／ｗで含まれることができるが、この範囲は、コラーゲンの強度、ワクチン内に使用されたウイルス、送達経路などを含みそれらに限定はされない多数の因子に依存して変化してもよい。従って、ＰＥＧ／コラーゲンの０．１〜２０％ｗ／ｗの範囲は、その間のあらゆる完全および部分整数を含むと解釈される。
【０１４３】
本発明の内包ビヒクルは、アルギネートを含んでもよい。種々の粘度のアルギネートがその分子量に従って入手できる。アルギネートの濃度および種類を変更して異なる粘度の溶液を生産することも可能である。種々の強度の架橋ゲルは、本明細書中の実験の部に記載のようにしてイオン架橋剤の濃度および種類を変化させて生産できる。アルギネートの種類の相違には、ポリマー骨格内のグルロン酸：マンヌロン酸比を変化させた組成を有す
るものも含む。本発明に使用するための最適なアルギネート組成を評価する方法は、本明細書中の実験実施例の部に記載されている。
【０１４４】
典型的には、アルギネート濃度はアルギネートの約０．１％〜約２０％およびその間のすべての完全または部分整数の範囲である。好ましい濃度は、使用されるアルギネートの種類に依存して約０．５％、１％または１．５％もしくは２％または２０％までのアルギネートを含む。アルギネートはキトサンのような他のポリマーと組み合わされて所望の性質を有するゲルを生成できる。それはポリＬ−リシンのようなポリカチオンとも相互作用ができる。ＰＥＧ−アルギネートのような変性アルギネートも利用できる。
【０１４５】
本明細書中の他の箇所で考察するように、好ましいワクチンは、ビヒクルがミクロカプセル、ナノカプセルまたはナノチューブ内に装入されたゲル、溶液または粉末を含んでなるものである。従って、本発明は、寸法が１から数百μｍ、好ましい大きさは１０〜１００μｍの程度のミクロカプセルの合成および装入を含む。本発明は、大きさが１ｎｍ未満から１μｍまで、好ましい大きさ１００ｎｍ〜１μｍを有するナノカプセルの合成および装入も含む。本発明は、ナノチューブが約１ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは２０〜５００ｎｍおよびその間のすべての完全または部分整数の直径の範囲を有するナノチューブの合成および装入も含む。２００ｎｍより大きい直径を有するナノチューブは、インフルエンザウイルスの大きさの粒子を保持および放出できる構造の生成を容易にする。本発明中で使用のために好ましいナノチューブは、マルチ壁ナノチューブ（ＭＷＮＴ）である。ナノチューブは、熟練者には利用可能でありそして例えばミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１２３３５−１２３４５）に開示された技術を用いて合成できる。
【０１４６】
本発明のナノチューブ内に装入されたウイルスは、管の内腔から検知できるほどは拡散して出てはならない。好ましくは、ナノチューブは水より粘度が高い液体を用いて装入される。さらに、ナノチューブは、ゲル内で内包または粘性または半粘性溶液中および本明細書中の別の箇所に記載されたもの、例えばゼラチン、コラーゲン、アルギネートまたは体温で周囲の組織内にウイルスを放出できるその他のゲル内に含まれるウイルスを装入されてもよく、それにより本発明のワクチンに追加の安全性およびその他の利益を与える。ナノチューブは、粉末、例えば、それらに限定はされないが、冷凍乾燥された生体作用活性薬剤を用いて装入されてもよい。生体作用活性薬剤内包ゲルを内部に装入されたナノチューブは、本発明中に記載のいずれかのデバイスを用いてまたは送達の安全性を保持する望ましい作用を生成できるその他のデバイスを用いて安全に投与できる。あるいは、生体作用活性薬剤を装入されたナノチューブをゲル内に内包し、次いで以下にさらに詳細に記載する種々のデバイスを用いて送達できる。
【０１４７】
ＩＶ．デバイス
本発明は、生体作用活性薬剤の貯蔵および動物、好ましくは哺乳動物そしてさらに好ましくはヒトへの生体作用活性薬剤の送達のための種々のデバイスの使用を含む。かかるデバイスは、それらに限定はされないが、針、注射器、カテーテル、遺伝子ガン、ナノチューブ、貼付剤、粘膜アプリケーター等を含み、それらは所望の生体作用活性薬剤をあらかじめ、すなわち、動物に生体作用活性薬剤を投与する前に装入されるか、または動物に生体作用活性薬剤を投与する時点で生体作用活性薬剤ワクチンを装入される。
【０１４８】
本発明は、動物の組織を浸透しそして内部動物組織内に薬剤を送達する機能で作動する、現在知られているかまたは将来発見されるすべてのデバイスの使用を含む。従って、本発明は、針、注射器、針と注射器の組合せ、遺伝子ガンなどのすべての単独または複数を含む。
【０１４９】
それらデバイスそれぞれは、生体作用活性薬剤単独または本明細書中に記載のようにして内包された生体作用活性薬剤で装入できる。それらのデバイスの装入は、動物への薬剤の投与の直前に行うことができ、または別の時点で行うことができ次いでデバイスは発送および使用まで保管される。
【０１５０】
本明細書中の別の箇所で考察するように、好ましいワクチンはナノチューブ内に装入されたものである。従って、本発明は炭素ナノチューブの合成および装入を含み、ここでナノチューブは約５０ｎｍ〜約２５０およびその間のすべての完全または部分整数の範囲の直径を有する。より大きい直径のナノチューブは、インフルエンザウイルスの大きさの粒子を保持および放出できる構造体の生成を容易にする。本発明に使用するために好ましいナノチューブは、マルチ壁ナノチューブ（ＭＷＮＴ）である。ナノチューブは、熟練者には利用できそして例えばミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１２３３５−１２３４２）中に開示されている技術を用いて合成できる。本発明のナノチューブ内に装入されるウイルスは、管の内腔から検知されるほどは拡散して外に出てはならない。好ましくは、ナノチューブは水より粘度が高い液体を用いて装入される。さらに、ナノチューブは、ヒドロゲル内および本明細書中の別の箇所に記載されたもの、例えばゼラチン、コラーゲン、アルギネートまたは体温で周囲の組織内にウイルスを放出できるその他のヒドロゲル内に内包されているウイルスで装入されてもよく、それにより本発明のワクチンに追加の安全性およびその他の利益を与える。
【０１５１】
Ｖ．方法
本発明は、脊椎動物、好ましくはヒト内でＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を誘発する方法をさらに含む。該方法は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを脊椎動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答が該脊椎動物内に誘発される。脊椎動物に投与されるウイルスは、呼吸系ウイルスでありそして好ましくはＡ型インフルエンザウイルスである。投与の経路はあらゆる経路であり、そしてウイルスがＡ型インフルエンザウイルスの場合には、投与の好ましい経路は皮下または皮内である。ウイルスは、本明細書中に定義された用語である製薬学的に許容できる組成物中で、またはいずれかの内包調剤中でそして本明細書中の別の箇所に記載のいずれかのデバイスを用いて投与されてもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答が脊椎動物内で誘発されているかどうかを決定するために、本明細書中の実験実施例中に記載の手順に従う。
【０１５２】
またウイルスによる感染に対して脊椎動物を防御する方法も本発明に含まれる。その方法は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを脊椎動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答が脊椎動物内に誘発されそれにより脊椎動物を感染に対して防御する。脊椎動物に投与されるウイルスは、呼吸系ウイルスでありそして好ましくはＡ型インフルエンザウイルスである。投与の経路はあらゆる経路であり、そしてウイルスがＡ型インフルエンザウイルスの場合には、好ましい投与の経路は皮下または皮内である。ウイルスは、本明細書中に定義された用語である製薬学的に許容できる組成物中で、またはいずれかの内包調剤中でそして本明細書中の別の箇所に記載のいずれかのデバイスを用いて投与されてもよい。その後のウイルス感染に対する脊椎動物の防御は、本明細書中の別の箇所に記載されている。
【０１５３】
脊椎動物内の感染を防御する方法もさらに含まれる。該方法は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを脊椎動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答が脊椎動物内に誘発されそれにより脊椎動物内のウイルス感染を防御する。脊椎動物に投与されるウイルス
は、呼吸系ウイルスでありそして好ましくはＡ型インフルエンザウイルスである。投与の経路はあらゆる経路であり、そしてウイルスがＡ型インフルエンザウイルスの場合には、好ましい投与の経路は皮下または皮内である。ウイルスは、本明細書中に定義された用語である製薬学的に許容できる組成物中で、またはいずれかの内包調剤中でそして本明細書中の別の箇所に記載のいずれかのデバイスを用いて投与されてもよい。
【０１５４】
さらに、脊椎動物内のウイルス感染を処置する方法も含まれる。該方法は、ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫防御性の量を含んでなるワクチンを脊椎動物に投与することを含んでなり、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答が脊椎動物内に誘発されそれにより脊椎動物を感染に対して処置する。脊椎動物に投与されるウイルスは、呼吸系ウイルスでありそして好ましくはＡ型インフルエンザウイルスである。投与の経路はあらゆる経路であり、そしてウイルスがＡ型インフルエンザウイルスの場合には、好ましい投与の経路は皮下または皮内である。ウイルスは、本明細書中に定義された用語である製薬学的に許容できる組成物内で、またはいずれかの内包調剤内でそして本明細書中の別の箇所に記載のいずれかのデバイスを用いて投与されてもよい。この本発明の方法は、汎流行、特にはヒトおけるイベントで特に有用である。ヒトを処置しそしてさらに重い病気から防御するために、ワクチンは症状の発生の時点でヒトに投与できる。
【０１５５】
本発明は生体作用活性薬剤を動物に投与する場合に安全性を上昇する方法も含む。該方法は、生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性および／または抗体免疫防御性の量を含んでなる組成物を動物に投与することを含んでなり、ここで生体作用活性薬剤は、動物内に疾患を起こさない経路による生体作用活性薬剤の投与に続いて動物内に免疫防御的ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体応答を誘導し、そしてさらにここで生体作用活性薬剤は内包ビヒクル内に内包されている。
【０１５６】
生体作用活性薬剤を動物に投与する場合に安全性を上昇する方法も含まれ、ここで該方法は生体作用活性薬剤のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫防御性の量を含んでなる組成物を動物に投与することを含んでなる。生体作用活性薬剤は、動物内に疾患を起こさない経路による生体作用活性薬剤の投与の後に動物内に免疫防御的ＣＤ８＋Ｔ応答を誘導する。
【０１５７】
それらの方法のそれぞれにおいて、生体作用活性薬剤は内包ビヒクル内に内包されそして生体作用活性薬剤は微生物およびタンパク質からなる群から選択される。
【０１５８】
生体作用活性薬剤を動物に投与する場合の安全性を上昇させる方法も含まれる。該方法は、動物内でリスクを低減させながら所望の応答を誘導する生体作用活性薬剤の量を含んでなる組成物を動物に投与することを含んでなる。生体作用活性薬剤の投与経路は、動物内に疾患を起こさない経路であって、さらに生体作用活性薬剤は内包ビヒクル内に内包されてそれにより生体作用活性薬剤を投与した場合の安全性を上昇させる。
【０１５９】
本発明の各方法は、あらゆる動物、好ましくは非常に老齢、非常に若いおよびその他の免疫無防備状態のヒト、および健康なヒトも含むヒトに対して行うことができる。
【０１６０】
ＶＩ．その他の組成物
本発明は、生体作用活性薬剤の生物学的な有効量を含んでなる組成物をさらに含み、ここで生体作用活性薬剤は動物内に所望の応答を誘導し、一方では動物内に疾患を起こさない経路による動物への生体作用活性薬剤の投与の後に動物内でリスクを低減する。好ましくは、該経路は天然ではない経路でありそしてさらに好ましくは、該経路は皮下、皮内、筋肉内、粘膜および経口からなる群から選択される。
【０１６１】
組成物内の生体作用活性薬剤は、内包ビヒクル内に内包されてもよくそして内包ビヒク
ル内に内包される前にナノチューブ、リポソームまたはタンパク質を会合させてもよい。内包ビヒクルは、ゲル、液体または粉末からなる群から選択される少なくとも一種のメンバーであり、そしてミクロカプセル、ナノカプセルまたはナノチューブ内に装入されてもよい。内包ビヒクルはポリマーを含んでなってもよく、そして好ましくは、ポリマーは動物に投与された場合に毒性ではない。ポリマーは、好ましくは生体作用活性薬剤とで会合されそれにより周囲の環境への生体作用活性薬剤の放出を遅延させる。さらに好ましくは、ポリマーはゲルである。生体作用活性薬剤は、好ましくは微生物、およびタンパク質からなる群から選択される。
【０１６２】
ＶＩＩ．キット
本発明は本発明の生体作用活性薬剤およびワクチンを含んでなる種々のキットを含む。本発明のキット中には、本発明の方法におけるワクチンの使用を記載した指示材料も含まれる。例示のキットを以下に記載するが、その他の有用なキットの内容は、本発明を参照して熟練者には明らかであろう。いずれのキットも本発明内に含まれる。
【０１６３】
本発明は、脊椎動物内にＣＤ８＋Ｔ細胞および／または抗体免疫応答を誘発；ウイルスによる感染に対して脊椎動物を防御するため；脊椎動物内のウイルス感染を防御するため；および脊椎動物内のウイルス感染を処置するための方法中に使用されるキットを含む。
【０１６４】
本発明のキットは、動物に直ちに投与できる生体作用活性薬剤をあらかじめ添加したデバイスおよびその使用のための指示材料を含んでなる。あるいは、キットは、デバイス、冷凍乾燥されてもされてなくてもよい生体作用活性薬剤の製剤、生体作用活性薬剤の懸濁のための溶液およびデバイス、生体作用活性薬剤および溶液の組合せのための指示材料、およびさらに脊椎動物、好ましくはヒトへの上記の投与に関する指示を含む。生体作用活性薬剤は、場合により内包ビヒクル製剤を含む製薬学的に許容できる担体内に懸濁されてもよい。あらかじめ添加されるデバイスは、針、および注射器、針と注射器の組合せ、またはナノチューブ、または上記のいずれかの組合せであってもよい。
【０１６５】
実施例
本発明は、下記の実験実施例を参照してさらに詳細に記述される。それらの実施例は、説明のためのみに提示され、そして特に断らない限り限定であるとは考えられない。従って、本発明は下記の実施例によりいかなる様式でも限定されると解釈されないが、しかしさらに正確には、本明細書中に提供される教示の結果として明らかになるすべての変化を包含すると解釈すべきである。
【０１６６】
本発明に有用な実験方法を先ず以下に記載する。
【０１６７】
動物、抗体およびインフルエンザウイルス感染
動物研究は、ＩＡＣＵＣの承認の下で行った。特定の病原を持たない８〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）野生型マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ．ＯＨ）から入手できる。Ｃ５７Ｂｌ／１０ＳｇＳｎＡｉＲａｇ−／−γｃ−／−（以下ではＲａｇ−／−γｃ−／−と記載する）およびＣ５７Ｂｌ／１０雌マウスはＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手できる。すべてのマウスは、Ｄｒｅｘｅｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｒｅｘｅｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにあるＡＡＡＬＡＣ承認隔離施設内に飼育された。一般に、９匹の動物が一つの群に含まれた。インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）ウイルス株（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８およびＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）ウイルス株（Ｈ３Ｎ２）のＸ３１組換え株を実験に使用した。それらのウイルス株は、異なる表面赤血球凝集素（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）タンパク質を発現し従ってそれらのウイルスに対する抗体応答は、互いに交差反応せず、それは動物を再チャレンジする実験では重要なことである。それらのウイルスの６個の内部遺伝子は、異なる株間で類似しており、従って再チャレンジ実験においてＣＴＬ応答の評価を可能とする。一般に、マウスは、ウイルス株Ｘ３１の１２赤血球凝集素単位（ＨＡＵ）を用いて鼻内に感染された。二次応答の場合には、マウスはＰＲ８株（１０００ＨＡＵ）を用いてＩＰに注入されそしてＸ３１株の１２ＨＡＵを用いて鼻内に再チャレンジされた。安全性および再チャレンジ研究は、マウスに毒性が高いＡ／ウマ／ロンドン／１４１６／７３ウイルス（Ｈ７Ｎ７）を用いて行った。肺臓および脾臓単核細胞の調製、ＮＰ３６６−特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の発現型分析、細胞質内サイトカイン染色、フローサイトメトリー、細胞毒性アッセイ、抗インフルエンザ抗体力価および肺臓ウイルス力価アッセイは、以前の記載（Ｈａｌｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５３６−５４１）のようにして行った。
【０１６８】
肺臓、脾臓単核細胞の調製
肺臓は、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および４０Ｕ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）内で９０分間、３７℃で消化し、そして得られた組織を１００μｍナイロンメッシュを通し次いで洗浄した。脾臓は、Ｃｏｒｎｉｎｇｗａｒｅ  Ｇｌａｓｓ組織破壊器（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて単一細胞懸濁液にホモジナイズした。次いで、肺臓および脾臓の双方から得たリンパ球を、Ｈｙｓｔｏｐａｑｕｅ  １０８３（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて密度勾配遠心分離により分離した。
【０１６９】
ＮＰ３６６−特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型分析および測定
細胞はＡＰＣ標識したＮＰ３６６四量体を用いて染色した。細胞は、表面マーカー、すなわち抗ＣＤ３−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、抗−ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および抗−ＣＤ４−Ｃｙｃｈｒｏｍ（Ｃｙ５ＰＥ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対するＦＩＴＣ−、ＣＹ５ＰＥ−およびＰＥ−共役抗体の組合せを用いて、３０分間、氷上で同時染色した。洗浄およびパラホルムアルデヒド中に固定の後、２ｘ１０５個の細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｒ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。一部の場合には、ＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の１０回までの色分析を３−レーザーＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｒ）高速細胞ソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行うことができる。
【０１７０】
ビオチニル化Ｈ−２Ｄｂ／β２ｍ／ペプチド複合体
ビオチニル化Ｈ−２Ｄｂ／β２ｍ／ペプチド複合体は、記載（Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６）のようにして製造した。Ｈ−２Ｄｂ制限Ａ型インフルエンザ核タンパク質ＮＰ（３６６−３７４）免疫優性エピトープ（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号１））（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４４：９５９−９６８）をＨ−２Ｄｂ内に複合化して、本研究に使用するＮＰ３６６四量体を製造した。
【０１７１】
細胞毒性アッセイ
ＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ）は、Ａ型インフルエンザペプチドＮＰＰ３６６−３７４、ＮＳ２１１４−１２１、Ｍ１１２８−１３５およびＰＡ２２４−２３３の１μｇ／ｍｌを用いて３７℃で６時間インキュベーションしてペプチドで負荷された。インキュベーションの後、細胞を洗浄しそしてＮａ２５１ＣｒＯ４（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて７５分間、３７℃で標識し次いで再度洗浄した。次いでそれらのＥＬ細胞を１０４（１００μｌ）／ウエルで９６ウエル丸底マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に加えた。次いで、エフェクターおよび標的細胞を１００：１、５０：１、２５：１および１０：１の比率でプレートし、そして６時間、３７℃でインキュベーションした。次いでプレートを遠心分離しそして上清の３０μｌを９６ウエルＬｕｍａＰｌａｔｅｓ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）に移しそしてＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレート・シンチレーション計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）内で計数した。比細胞毒性は、次式を用いて決定した。
【０１７２】
【数１】
2008526870.tif 000003
【０１７３】
最大５１Ｃｒ放出は、５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて標的細胞を溶解して決定した。自発５１Ｃｒ放出は、媒体のみを用いてインキュベーションした標的細胞を用いて決定した。
【０１７４】
細胞質内サイトカイン染色
細胞質内サイトカイン染色のために、１０６／ｍｌ／ウエルの肺リンパ球、脾臓単核細胞、または精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌ  ＮＰＰ３６６−３７４、ＮＳ２１１４−１２１、Ｍ１１２８−１３５およびＰＡ２２４−２３３ペプチド、抗ＣＤ３抗体またはＰＭＡ（２５ｍｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いて２．５μＭモネンシンの存在下で５時間刺激し、次いで４％パラホルムアルデヒドを用いて１０分間、４℃で固定した。細胞を２回洗浄しそして０．１％サポニンを用いて４℃で１０分間、透過性を上げた。次いで細胞を洗浄しそして抗ＩＦＮγ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄しそして１％パラホルムアルデヒド中に固定し次いで２ｘ１０５イベントをＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｒ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に捕集しそしてＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて解析した。
【０１７５】
インフルエンザウイルス力価アッセイ
肺臓をホモジナイズしそして１５００ｘｇで１５分間のホモジネートの遠心分離の後にウイルス懸濁液を捕集しそして次の分析まで−８０℃で冷凍した。ウイルス上清の希釈物を３ｘ１０４Ｍａｄｉｎ  Ｄｅｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞／ウエル（９６ウエルＵ底プレート）に加えた。ＭＤＣＫの２４時間、３７℃での感染の後、媒体を各ウエルから吸引し（ＭＤＣＫは細胞に付着する）そして血清を含まない媒体を加えた。ウイルス力価は、４日後に、既知ウイルス濃度の標準曲線およびＴＣＩＤのＲｅｅｄ−Ｍｕｎｉｃｈ計算を用いて、上清がチキン赤血球を凝集しなくなる希釈度を決定して決定した。ウイルス力価を測定するために使用できる第二の方法は、以前に記載（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：１７９−１８８）のようにして実時間ＰＣＲを用いる。
【０１７６】
ロバスト（Ｒｏｂｕｓｔ）免疫応答の同定
マウスにワクチンを投与した際のロバスト免疫応答を同定するために使用した特定の基準は：インフルエンザウイルスを用いる鼻内再チャレンジの際に、再チャレンジの７日目の肺臓内で全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する２０％を越えるＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞または１ｘ１０６を越えるＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／または血清中和抗体の力価（赤血球凝集阻害アッセイにおいて）の１／５００以上の誘導が観察されるはずである。それまで免疫化されていないナイーブなマウスは、一般に、感染の７日目において肺臓内で３％未満のＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞および１０５未満のＮＰ３６６特異性
ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【０１７７】
統計解析
データは、ＪＭＰ統計ガイド（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定、二標本データに対するＷｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定、Ｓｔｕｄｅｎｔ検定およびＳｐｅａｒｍａｎのロー相関を用いて解析した。
【０１７８】
安全性
いずれのワクチンの安全性も、野生型およびＲＡＧ−／−γｃ−／−動物について試験できる。安全性は、動物の一般外観、体重減少の試験により、および肺臓およびその他の組織の病状の評価により評価される。肺臓、脾臓、肝臓おび脳から得られるウイルス負荷は、実時間ＰＣＲを用いて評価される。それらの研究は、ＰＲ８およびＡ／ウマ／ロンドン／１４１６／７３  Ｈ７Ｎ７ウイルス（ロンドン株）を用いて、生ウイルスのＳＱおよびＩＤ送達の後に行える。各群には９匹の動物を含むことができる。鼻内に投与されると全身性および脳感染を起こす高度に病原性のＡ／ウマ／ロンドン／１４１６／７３ウイルス（Ｋａｗａｏｋａ，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３８９１−３８９４；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１６９０−１１６９６）の使用は、ＳＱおよびＩＤで投与されたウイルスの評価のための非常に厳しい試験を提供する。動物は、３０日間、毎日観察および計量される。動物は、ウイルスＩＤまたはＳＱの１、０．１、０．０１および０．００１ＨＡＵで免疫化されそして３０日間追跡される。動物は臨床的徴候および体重減少を評価される。動物は、目視により一日２回監視される。動物は毎日計量される。動物は、動物が下記の基準に適合すると除外される：１）外部刺激に応答しない、２）１時間を越える疲弊、３）苦しい息づかい、４）永続するふるえ、５）動物が継続して背を曲げる。すべての観察を記録する。除外した動物は、生存分析では非生存として数える。死亡はそれらの研究の終点ではない。動物は３０日間追跡される。このような実験の実験誤差の範囲内で動物内の５％を越える体重減少を誘導せずそして動物の９０％生存をもたらした場合に、ワクチンは安全と考えられる。
【０１７９】
ウイルス感染および投与経路
生ウイルスワクチン接種を研究するために、投与経路が抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞応答に有する効果を研究した。８週齢マウスをＡ型インフルエンザウイルスのＰＲ８株を用いて腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＱ）で免疫化しそしてインフルエンザウイルスのＸ３１株を用いて３０〜４５日後に鼻内再チャレンジした。二次応答のピーク（７日目）でマウスを屠殺しそしてインフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ３６６）ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を試験した。図１は、ＩＤおよびＳＱ経路によるウイルスの投与が、肺臓内においてＩＭおよびＩＰ経路よるウイルス投与によるものよりも強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答をもたらしたことを描いている。図１に示した数字は平均±標準偏差であり、そしてＩＤおよびＳＱ経路に対してはそれぞれ５．０４±１．１７ｘ１０６および５．７１±０．７９ｘ１０６ウイルス特異性８＋Ｔ細胞であり、これはＩＰおよびＩＭ経路に対するそれぞれ３．６５±１．２１ｘ１０６および３．４１±０．１８ｘ１０６ウイルス特異性８＋Ｔ細胞と比較される。それらの結果は、生ウイルスを用いる免疫化の経路が、全体的抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞応答の範囲に影響し、そしてＩＤ経路が最も強い応答を誘導することを示す。最も重要なことは、マウスに対する生インフルエンザウイルスの投与のＩＤまたはＳＱ経路の使用が動物内で臨床的疾患をもたらさないと観察されたことである。次いで、用量応答研究が、免疫応答において観察された差異がウイルスのさらにかなり低い用量でも明瞭かどうかを決定するために行われた。マウスは、ウイルスの順次低下する濃度を用いてＩＰまたはＩＤ注入により生インフルエンザウイルスを投与された。次いで、インフルエンザウイルスによる二次チャレンジに対するウイルス特異性応答を試験した。ＩＰおよびＩＤ初回抗原刺激マウスの肺臓内の肺ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＮＰＰ＋ＣＤ８＋）を描いた代表的なＦＡＣＳプロットを図２に示す。マウスにＩＰで投与された生インフルエンザウイルスの減少する用量は、ＭＨＣクラスＩ四量体により測定して肺臓内でウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少する数（高用量で３．６５±１．２１ｘ１０６細胞そして低用量では０．３５±０．１１ｘ１０６細胞のみ）およびＮＰ３６６ペプチド特異性ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞（高用量で２．８１±０．１ｘ１０６そして低用量では０．１８±０．０５ｘ１０６）をもたらした。ＩＤで投与された生インフルエンザウイルスの減少する用量は、抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞応答の上昇をもたらした（高用量で５．０５±１．１８ｘ１０６、これに対して低用量では７．２±０．４６ｘ１０６のウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞および高用量で４．０６±０．７９ｘ１０６、これに対して低用量では４．８３±０．２４ｘ１０６のＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞）。従って、生インフルエンザウイルスＩＰの低用量の投与は、弱いウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、一方同じ用量のＩＤの投与は、非常に強いウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発した。それらの結果は、ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する生インフルエンザウイルスのＩＰ投与と比較して、ＩＤ投与の上昇する効率を証明しそしてそれらは、ＩＤまたはＳＱ経路が使用されると、生ウイルスの非常に低い投与が非常に強い応答を誘発できることを示す。
【０１８０】
ＩＤおよびＳＱ免疫化をさらに比較するために、８週齢Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、生Ａ型インフルエンザウイルス株ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）の低用量（１ＨＡＵ）を用いて腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＱ）、または皮内（ＩＤ）で免疫化し、４５日後にインフルエンザウイルスヘテロサブタイプＸ３１（Ｈ３Ｎ２）を用いて鼻内で再チャレンジした。再チャレンジの後、二次免疫応答のピークでマウスを屠殺した（再チャレンジの７日後）。ＮＰから誘導した免疫優性エピトープに相当するペプチド（ＮＰ３６６）のアミノ酸３６６−３７４（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ）（配列番号１））を添加したＭＨＣクラスＩ四量体を用いてＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価した（Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：６８３−６９１）。回収されたＮＰ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率および全数に基づくと、ＩＰで免疫化されたマウスと比較して、投与のＩＤおよびＳＱ経路は、再チャレンジされたマウスの肺臓内により強い免疫応答をもたらした（図３Ａ）。ＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ３．７６±３．７ｘ１０６および５．８±４．３ｘ１０６細胞の濃度でＳＱ（ｎ＋６）またはＩＤ（ｎ＋６）免疫化されたマウスの肺臓から回収された。対照的に、ＩＰ免疫化マウス（ｎ＝５）からは１．９±１．６ｘ１０６のＮＰ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞のみが回収された（図３Ｂ）。それらの結果は、生ウイルスの低用量が、特にＩＤまたはＳＱで送達された場合には強いＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発することを示す。ヒト内のＳＱ免疫化は実行容易なことを留意して、この送達経路を効力および安全性に対するワクチンの最初の試験に使用すると決定した。
【０１８１】
生ウイルスのＳＱ投与が宿主動物内に疾患を誘導するかどうかを試験するために、野生型Ｃ５７Ｂ１／６ＪマウスおよびＴ、ＢおよびＮＫ細胞を欠失するマウス（株Ｃ５７Ｂｌ／１０ＳｇＳｎＡｉＲａｇ−／−γｃ−／−、以後はＲａｇ−／−γｃ−／−と記す）を免疫化した。後者のマウスはウイルスに対するＮＫ媒介または適合免疫応答を装備（ｍｏｕｎｔ）できなかった。１ＨＡＵの生ＰＲ８ウイルスの皮下投与の後、３０日間にわたって、Ｒａｇ−／−γｃ−／−もＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスも感染のいかなる徴候も示さずそしてさらにマウスのどちらの組も活性ウイルス感染の指標である体重減少を示さなかった。１００ＨＡＵの生ＰＲ８ウイルスの用量がＲａｇ−／−γｃ−／−またはＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスに疾患を誘導できるかどうかを試験するために、５匹のＲａｇ−／−γｃ−／−およびＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスを１００ＨＡＵのＰＲ８インフルエンザウイルスを用いて免疫化しそしてそれらの体重を連続１７日間記録した。日常的な免疫化に提示されるものよりも１００倍高いウイルス用量のＳＱ注入は安全でもあり、そしてＲａｇ−／−γｃ−／−またはＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス中に体重減少を誘導しなかった（図４）。しかし、１ＨＡＵ  ＰＲ８インフルエンザウイルスを用いるＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスの鼻内（ＩＮ）感染は感染を誘導しそして感染後６日目に始まり１０日目にピークに達したＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス中の進行性体重減少（ｎ＝５）を予想通りに誘導した。鼻内感染の１１日後から始まって、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスは回復を始めた（図４）。
【０１８２】
これまでのデータは、哺乳動物への生ウイルスの投与のためのＳＱ経路が、野生型または免疫欠損マウス内に活性ウイルス感染または全身性疾患を誘導しないことを示す。従って、この投与経路は安全であると考えられる。理論に拘束されることは望まないが、それらの発見は、インフルエンザウイルスを用いる全身感染の間の制御点は呼吸器感染に続くウイルス血症のレベルであると示差する研究（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５９０３−５９１１）を支持する。それらのデータは、別の天然ではない経路を介する生ウイルスの投与が、直接静脈内経路により投与されないかぎり明白な疾患をもたらさないという仮説（Ｓｗａｙｎｅ  ａｎｄ  Ｓｌｅｍｏｎｓ，１９９４，Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：２３７−２４５）も支持する。
【０１８３】
追加の安全性データ
生ウイルスワクチン戦略の実行性および効力を支持する追加のデータをここに提出する。生インフルエンザウイルス戦略は、インフルエンザウイルスの高度に病原性株（ロンドン株）を用いて試験された。得られたデータは哺乳動物へのウイルスの皮下送達が安全であることを確証する。さらに、該データは、アルギネートゲル内に捕捉された生インフルエンザウイルスが、被接種哺乳動物内で強力なインフルエンザ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを確証する。重要なことには、該データは、哺乳動物への生ウイルス皮下の投与が抗体応答を誘発することを確証し、ここで中和抗体力価が、ウイルスの単回用量の投与の後に哺乳動物内に誘導されることをさらに確証する。加えて、本明細書中に提出するデータは、５０ｎｍサイズの量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ，ＱＤｏｔｓ）を含むアルギネートゲルをナノチューブに装入することが可能であることを確証し、従って、ナノチューブ内へのウイルスとアルギネートの装入が可能なことを示す。さらに、本明細書中の別の箇所に記載の条件下での（超）音波処理がナノチューブをより小さく、さらに好ましい破片に破断することが本明細書中で確証される。
【０１８４】
ＲＡＧ−／−γｃ−／−（Ｔ細胞、Ｂ細胞もしくはＮＫ細胞も持たないマウス）および野生型マウス内への皮下での生インフルエンザウイルスの送達の安全性に関する追加のデータを以下に記載する。図５で、野生型およびＲＡＧ−／−γｃ−／−動物（すべての群でｎ＝５）をＰＲ８インフルエンザウイルスの新しくそしてさらに強力なバッチまたは高度に病原性のＡ／ウマ／ロンドン／１４１６／７３  Ｈ７Ｎ７ウイルス（ロンドン株）を用いて感染させた。ＰＲ８またはロンドン株の０．１ＨＡＵで鼻内感染された野生型動物は、インフルエンザウイルス感染の症状を示しそしてそれらの体重の３０％以下を失った。この時点で、瀕死となった一部の動物を安楽死させた。対照的に、ＲＡＧ−／−γｃ−／−マウス（図５）および野生型動物を１０ＨＡＵの生ウイルス（すなわち鼻内感染に使用した用量の１００倍）を用いて皮下接種した場合には、それらは体重が減少せずそしてそれらを追跡したその後３０日間以上も病気の徴候を示さなかった。それらのデータは、ウイルスの投与の経路が接種手順の安全性のために重要であることを確証する。
【０１８５】
ゼラチンポリマーゲル内で送達されたワクチンの効力および安全性
ポリマーゲル内の生ウイルスがその免疫原性を保持できるという基本前提を試験するために、ゼラチンの３％（ｗ／ｗ）溶液をＰＢＳ中の生ＰＲ８インフルエンザ（１０ＨＡＵ／μｌ）ウイルスと３０℃で混合しそして１ｍｌ注射器内に装入した。ゼラチン／ウイルス比は、各ゼラチンゲルの１００μｌが約１０ＨＡＵの生ウイルスを含むように決定された。ゼラチンのゲル化は、注射器を氷上で３０分間インキュベーションして誘導した。Ｃ５７Ｂ１／６マウスを生ウイルスと混合した１００μｌゼラチン（ｎ＝２）または１００μｌゼラチンのみ（ｎ＝２）を用いて皮下で免疫化した。対照として、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの一群（ｎ＝２）をＰＲ８生ウイルスの１０ＨＡＵを用いて皮下で免疫化した。免疫化の３０日後に、ゼラチン中の生ウイルスを受けたマウスは鼻内に投与される生インフルエンザウイルス株Ｘ３１を用いて再チャレンジされた。二次免疫応答のピーク（再チャレンジの７日後）において、再チャレンジされたマウスの肺臓（図６Ａ）および脾臓（図６Ｂ）から単離されたＮＰ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度および全数を評価した。ゼラチンゲル内に含まれた（３％ｗ／ｗ）１０ＨＡＵの生ウイルスまたは１０ＨＡＵの生ウイルスのみを用いて皮下免疫化されたマウスの肺臓内に、存在するリンパ球の全数の約３０〜４０％に相当するＣＤ８＋Ｔ細胞の大量の蓄積があった（ＣＤ８＋ゲートの外に書かれた百分率、図６Ａ）。さらにウイルスのみまたはゼラチンゲル内に組み込まれたウイルスを受けたマウスの肺臓から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の約半分は、免疫優性ＮＰ３６６ウイルスエピトープに対して特異性であった（ＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞ゲートの内に書かれた百分率、図６Ａ）。対照的に、ゼラチンのみを受けたマウス中では、肺臓に浸透したＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、存在する全リンパ球の約１７％のみに相当しそして存在するＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は２％のみであり、それは７日目のウイルスへの一次免疫応答と一致する（図６Ａ）。ゼラチン内に含有される生ウイルスを用いて免疫化されたマウスの脾臓を検査すると、ＣＤ８＋Ｔの約１０％がＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞であった（図６Ｂ）。対照的に、ウイルスのみで免疫化されたマウスでは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の約２２％がＮＰ３６６特異性であった。ゼラチンを用いて免疫化されたマウスの脾臓内のＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、１％以下であった（図６Ｂ）。
【０１８６】
実験の次の組は、ゼラチンゲル内に組み込まれた生ウイルスを用いる免疫化により誘導されたＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞が機能性でありそしてペプチド抗原を用いて刺激された場合にはＩＦＮγを産生したかどうかを決定するために行われた。非操作またはウイルス単独、ゼラチン内に組み込まれたウイルス、またはゼラチン単独を用いる免疫化のいずれかであるマウスからの全脾臓をＮＰ３６６−３７４ペプチドおよびブレフェルジン（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａの存在下で６時間、カルチャー内で刺激した。ＩＦＮγの産生を、ペプチドを用いる６時間の刺激の間に細胞内部に蓄積されたＩＦＮγに結合する蛍光共役抗ＩＦＮγ抗体を用いるフローサイトメトリーにより評価した。ＮＰ３６６−３７４ペプチドでイン・ビトロ刺激をすると、マウスの脾臓内のＣＤ８＋Ｔ細胞の約８％がゼラチンゲル内に組み込まれたウイルスで免疫化され、そしてマウスの脾臓内のＣＤ８＋Ｔの約１７％が生ウイルス単独で免疫化され、ＩＦＮγを産生した（図６Ｃ）。対照的に、ゼラチンゲルのみで免疫化されたマウス中ならびに非操作マウス中では、ＣＤ８＋脾臓細胞の１％以下がＩＦＮγを産生した。ペプチド刺激が存在しないと、ＩＦＮγを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率はすべての試料の１％未満であった。従って、ゼラチンポリマーは、身体内のウイルスの放出を容易にしそしてウイルスの免疫原性を改変しないが、それは、免疫化のこのモードを用いて処理されたマウスは、生ウイルス単独で免疫化されたマウスに類似する大きさのロバスト免疫応答を装備したからである。
【０１８７】
ゼラチンポリマー内で送達された生ウイルスの安全性を試験するために、Ｒａｇ−／−γｃ−／−マウスを、１０ＨＡＵの生ウイルスを含む１００μｌゼラチンまたはゼラチンのみを用いてＳＱ免疫化した。すべてのＲａｇ−／−γｃ−／−マウスは３０日間を健康で残りそして体重が減少せず、従って、ゼラチンゲルは毒性ではなくそして送達のＳＱ経路は活性ウイルス感染を起こさないことを確認する。
【０１８８】
コラーゲンゲル
ゲル内包ウイルス粒子の送達に関する予備的な研究は、ウイルスおよび担体材料を含むゼラチンポリマーの一団をマウスへ皮下送達して行われた。コラーゲンは、他の状況で生体高分子として良く確立されたその用途のために、担体材料として開発された。捕捉されたウイルス粒子の放出のためのコラーゲンの分解速度は、コラーゲンの架橋度の制御によりおよび架橋剤の選択により制御できる（ｖａｎ  Ｗａｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９
１，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １２：２１５−２２３）。しかし、架橋剤の細胞毒性（ｖａｎ  Ｌｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓ．２６：１０９１−１１；ｖａｎ  Ｌｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １３：１０１７−１０２４）および石灰沈着に対する悪化効果（Ｇｏｌｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１２７：１２２−１３０）は、一部の架橋剤の有用性を低下させる。さらに、架橋が架橋剤とコラーゲンフィブリルのアミノ酸部分との間に共有結合形成を含むので、ウイルス粒子の表面タンパク質分子はウイルスの不活性化をもたらす同じ過程に関与すると予想されるであろう。それらの潜在的問題にもかかわらず、コラーゲンゲルのマトリックス内に懸濁されたウイルス粒子は、ＤＮＡトランスフェクションおよびタンパク質発現および送達の効率を改善することが示されている（Ｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１３０−１３８；Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：６９９−７１１）。
【０１８９】
ＳＱまたはＩＤ経路を用いて哺乳動物の身体内に生ウイルスを送達するために、コラーゲンゲルは、ステンレス針（３０Ｇ１／２）内部で合成される。原料コラーゲンは、中性ｐＨに達するために１０Ｘ  ＰＢＳ緩衝液および１Ｎ  水酸化ナトリウムと混合された後に約４℃で液体のままの酸性溶液である。この溶液を注射器を用いて針に移し、そして装入された針を３７℃で約３０分間インキュベーションすると、コラーゲンは繊維状ゲルとなる。ゲルを調製しそしてそれを注射器に装入する２種の方法が研究された。一つは、ミクロ遠心分離管内でのゲルの調製を含み（バルクキャスティング）、そして他の方法では、中和されたコラーゲン溶液を針内に取り込み次いでインキュベーションすると、これによりゲルは針の内側にキャストされる（マイクロキャスティング）。針の先端をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の厚い板を用いて覆い、それはインキュベーション期間に針からの材料の漏洩を防止する。６ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌコラーゲンのマイクロキャスティングにより調製されたヒドロゲルの電子顕微鏡写真をＰｈｉｌｌｉｐｓ  ＸＬ３０低真空走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）を用いて撮影し、その結果を図７ａおよび７ｂにそれぞれ示す。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）試料調製のために、ゲルを針を通して押し出しそして白金を用いて被覆した後に冷凍乾燥した。コラーゲン濃度を６ｍｇ／ｍｌに維持した場合に、細孔の大きさは５００ｎｍ〜２μｍの程度であることが見いだされた。出発物質として１０ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを使用した場合には、出発物質として６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを使用した場合の充填密度と比較してフィブリルの充填密度に著しい増加があった（図７ａ）。１０ｍｇ／ｍｌのコラーゲンで形成されたゲルの細孔の大きさは約２００ｎｍ未満ないしそれに等しかった。それらの結果は、ウイルス粒子の放出速度が出発コラーゲン材料の性質に依存して制御できることを証明する。
【０１９０】
低真空走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）が、ナノスケールで流体力学過程を研究するために使用できることが示されている（Ｂａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １：２８４−２８８；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４：９８９−９９３）。水の存在下での生物物質を撮影する能力はナノスケールでの構造の検査を容易とし、一方試料をその自然の状態に維持しそして破壊的な試料調製時間を短縮する。従来のモードおよび湿潤モード（ＥＳＥＭ）において走査電子顕微鏡により検査されるゲルの形態の相違を解明するために、１０ｍｇ／ｍｌのコラーゲン初期溶液を用いてマイクロキャスティングによりゲルを調製した。両システム中で顕微鏡写真が得られた。顕微鏡写真の比較から、二つの方法で評価されたゲル形態が、試料調製および検査モードが異なるにもかかわらず同様であることを明らかにした（図７ｂおよび７ｃ）。ポリマーブレンドに固有の融通性の例として、図７ｄにおいて、比率１：４（コラーゲン：ＰＥＧ）でのコラーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）およびポリエチレングリコール（分子量２０，０００、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒより）の冷凍乾燥ブレンドが示される。ヒロゲルの細孔の大きさは１００〜５００ｎｍの間で変化し、それは単一成分コラーゲンゲルと比較すると増加を示す。
【０１９１】
それらの予備的な結果は、最初の密度を操作することによりそしてポリマーブレンド／コポリマー（すなわち本明細書中に記載のＰＥＧブレンド）を用いることによってもコラーゲンゲル内の細孔の大きさを調節できることを示す。細孔の大きさは、ポリマーにウイルス放出の能力を与えそして防御免疫応答の誘発に重要なイベントであるその後の樹状細胞取り込みを容易とする重要な因子である。
【０１９２】
アルギネートポリマー
接種注射器の針の内部にイン・シトゥでの固化（ｓｅｔ）をウイルス含有ゲルにさせるヒドロゲル内包システムを開発するために、アルギネートポリマーの使用を検討した。ＳＱまたはＩＤ経路のいずれかによるゲルの直接注入は、エーロゾル化の最低のリスクを伴う哺乳動物への生ウイルスの投与を容易とし従って用量を投与する人員への最小の暴露とならなければならない。
【０１９３】
３種のアルギン酸ナトリウム粉末試料をＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒから入手した。種々の粘度のアルギネート溶液は、アルギネートの濃度および種類を変えて合成できる。架橋したアルギネートゲルの強さも、架橋イオンの濃度を変えて変更できる。アルギン酸ナトリウムの０．５％、１％、または１．５％（ｗ／ｖ）溶液を脱イオン水（ＤＩ）中で調製しそして溶液を０．４５μｍ注射器フィルターを通す濾過により滅菌した。ゲル化は、オートクレーブ処理により滅菌されたメタリン酸ナトリウムを含む溶液を添加して開始された。アルギネート（５ｍｌ）を５０ｍｌコニカル・チューブに移しそしてＣａＳＯ４の８、４または２μｇ／ｍｌ（０．４ｇ／ｍｌのスラリーから）を加えた。チューブの内容物を激しく振とうしてアルギネートとＣａＳＯ４スラリーの完全な混合を確実にし、そして注射器を丁度満たす混合物の少量のアリコートを２２Ｇ針を取り付けた５ｍｌ注射器内に引き上げ、そして針末端とプランジャーの間に１ｍｌの空気空間を残した。垂直に取り付けた注射器ポンプ内に注射器を取り付けそして６３ｍｌ／分の一定速度で注射器の内容物を押し出した。この手順は、すべての調剤に関して調和した圧力を保証する。ゲル化したアルギネートを射出するために要した時間およびゲルの目視外観を記録する。結果を図８Ｂに示す。
【０１９４】
アルギネート粘度は、分子量が低下すると低下する。従って、ゲルは射出が容易となる（例えば、８μｇ／ｍｌＣａＳＯ４および１％ゲルで、射出の時間は高粘度＝６５秒＞中粘度＝６２秒＞低粘度＝２５秒である）。アルギネートとカルシウムの比率が低下すると、通常、ゲルが形成されない限界に達する（例えば、高粘度／０．５％カラムを通過降下：カルシウム濃度が２．０μｇ／ｍｌまで低下するとゲルは形成されない）。ゲルが形成されない限界カルシウム濃度は、高粘度アルギネートで最低である。例外は、すべて３種のアルギネートに対するカルシウム濃度でゲルが形成される１％アルギネートであった。１％アルギネート濃度のすべての場合に、カルシウム濃度が低下するとさらに容易に注射器から射出された固いゲルが形成された。１％溶液の結果をグラフにプロットすると（図８Ａ）、高および中粘度アルギネートが非常に類似した様式で挙動し、そして低粘度アルギネートは容易に針から排除されることが明らかである。
【０１９５】
アルギネートポリマーからのウイルスの放出
アルギネートポリマーからのウイルス放出の能力を評価するために、下記の実験を行った。本明細書中に記載のデータは、アルギネートゲルの機械的性質を変更するためのパラメーターを提供する。それらのデータに基づいて、量子ドット（ＱＤｏｔ）がウイルスの内包のための便利なモデルであることが決定された。量子ドットは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳの内部コアとの接合を容易にするための機能基を有する外殻からなる直径１０〜２０ｎｍのナノ結晶である。量子ドットの大きさおよび形状が本明細書中に記載の用途に理想的であ
るばかりでなく、量子ドットの蛍光強度はその検出および定量を容易にさせる。
【０１９６】
４μｇ／ｍｌのＣａＳＯ４と量子ドットを含む１％アルギネートゲルとの混合物を用いて、試料を５ｍｌ注射器の２２Ｇ針内に引き取り、そして本明細書中の別の箇所に記載のようにして固化させた。次いで、量子ドットを含むゲルペレットを、ＰＴＩ蛍光測定器内に収容されたキュベット内に保持されたリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）４ｍｌ中に射出した。蛍光は射出の時点から測定された。図９ａおよび９ｂ中で、明確な二つの分離した蛍光プロフィールが示される。低粘度アルギネートは、それがＰＢＳ内に注入されると直ちにその内容物を放出する。蛍光強度は５０秒、すなわち射出の時点で極大に上昇する。高粘度ゲルは、注入の５０秒後に徐々にその内容物を放出し、４００秒後に放出を完了する。
【０１９７】
ゲル内包ウイルスからの活性ウイルス放出のイン・ビトロアッセイ
アルギネートゲルからのウイルス粒子の放出を試験するためにイン・ビトロアッセイを開発した。ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザウイルスを含む種々のウイルスの増殖を支援する付着細胞系統である。予備研究において、ＭＤＣＫ細胞はアルギネートポリマー中に捕捉された生ウイルスと一緒に５日間培養され次いで感染を評価するためにチキン赤血球細胞懸濁液を用いる赤血球凝集アッセイで試験した。アルギネート単独を使用する負の対照では、ウイルスは検出されなかった（赤血球凝集が存在しない）。対照的に、アルギネートゲル中の５０％および７５％ウイルス、ならびに溶液中のウイルスの６ＨＡＵおよび３ＨＡＵが評価された正対照中で強い赤血球凝集が観察された。それらの研究は、インフルエンザウイルスの感染性がアルギネートゲル内で保存されそして生で感染性のものが３７℃でゲルから放出されることを証明する。
【０１９８】
アルギネートゲル内に捕捉されたウイルス
アルギネートゲルは、一般的に安全とみなされるとして（ＧＲＡＳ）、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている。本明細書中に提示するデータは、アルギネート内に捕捉された生インフルエンザウイルスが免疫原性でありそして哺乳動物内で細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびウイルス中和抗体を誘発することを確証する（図１０）。図１０において、アルギネートゲル内で投与された生ＰＲ８ウイルスがマウス中でＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強力に刺激することが認められる。多数の肺臓ＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、アルギネートゲル内の生ウイルスを用いて皮下接種され次いでＸ３１インフルエンザウイルスを用いてその後再チャレンジされた動物内で誘発される。非操作（すなわち対照マウス）のマウスの群からまたはＰＲ８ウイルス単独、アルギネート単独もしくはアルギネート内に内包されたＰＲ８生ウイルスで皮下に接種されたマウスの群からの肺臓を、Ｘ３１インフルエンザウイルスを用いる鼻内再チャレンジの７日後に分析した。マウスから得られた単細胞懸濁液を抗ＣＤ８抗体および免疫優性ＮＰ３６６−３７４ペプチドを認識するＭＨＣクラスＩ／ＮＰ３６６−３７４四量体複合体を用いて染色した。染色した細胞をフローサイトメトリーで分析した。図１０に示す値は、群あたりにマウス２匹から得られた平均を表す。
【０１９９】
さらに、マウスにおけるＩｇＧ抗体応答も高い力価で発現され、図１１に示す通りである。またはアルギネートゲル内に内包された単独ＰＲ８ウイルスを用いて免疫化されたＣ５７Ｂ１／６マウスの血清内に存在する抗ＰＲ８抗体は、捕捉抗原としてＰＲ８ウイルスを用いるＥＬＩＳＡにより検出された。１／２７０の初期血清希釈は、さらに３倍の順次希釈により希釈され、そしてプレート結合ＰＲ８ウイルスに加えられた。非感染動物はＰＲ８ウイルスに対して抗体応答を示さなかった。
【０２００】
最も防御的なワクチンは、ウイルスでのその後の感染を遮断する宿主内で中和抗体を生成して作用する。図１２に示すデータは、アルギネートゲル内に捕捉された生インフルエ
ンザウイルスが、図１０に示す細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に加えてマウスに中和抗体の高い力価を誘発することを確証する。図１２中で、赤血球凝集阻害アッセイは、ＰＲ８、チキン赤血球および免疫化動物から得た血清の希釈を用いて行われた。赤血球凝集阻害を示した最高の血清希釈は、アルギネートゲル内の生ウイルスを用いて免疫化された動物で示された。非免疫化動物からの血清は赤血球凝集阻害を示さなかった。
【０２０１】
ナノチューブ
本明細書中の別の箇所で考察したように、好ましいワクチンはナノチューブ内に装入されたものである。種々の直径（５０〜２５０ｎｍ）の炭素ナノチューブを合成することが可能である（Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔ  Ｓｅｒｖｅｒ，Ｍｉｓｃｅｌｌ．：１−６，ＣＰＳ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／０３０３００２；Ｂａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １：２８４−２８８；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４：９８９−９９３）。大きい直径を有するナノチューブ（２５０ｎｍ）の合成のための鋳型は、商業的に入手できる。大きい直径を有するナノチューブは、インフルエンザウイルスの大きさの粒子を保持および放出できる構造の生成を容易とする。本出願に好ましいナノチューブの種類は、マルチ壁ナノチューブ（ＭＷＮＴ）として知られるが、しかしこの種類の管は、金属触媒化学蒸着（ＣＶＤ）法を用いて合成されるナノチューブに通常見られる適切な結晶構造を欠く。ナノチューブは、ミラーらにより確立されたテンプレート支援方法に従って合成された（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１２３３５−１２３４２）。図１３には、本明細書中に記載の方法を用いて合成された典型的な大径ナノチューブの断面が示されている。
【０２０２】
磁性（Ｋｏｒｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５：８７９−８８４）または蛍光性ナノ粒子（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５：８７３−８７８）を用いて炭素ナノチューブを装入する能力は、２７５±２５ｎｍの小さい管直径およびその結果としての毛管作用にもかかわらず、かなり簡単な方法論で最近証明された。それらの実験のためのナノチューブは、ＣＶＤ法により合成された。管内の溶剤の蒸発速度は、ナノチューブの壁に沿う粒子の沈降をもたらす捕捉された粒子の置換によるよりも、はるかに大きいことが示されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５：８７３−８７８）。これは、自然により設計された安全手段である。従って、ナノチューブの内部に装入されたウイルスは、管の内腔から自由には拡散して出ないであろう。それらの研究のそれらの結果は、直径２５０ｎｍのナノチューブが凝縮により種々の水溶液で装入できることを確証する（Ｂａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．上記文献、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記文献）。好ましくは、本発明において、ナノチューブは、水よりも粘度が高い液体で装入される。しかし、液体はグリセロール程度の粘度でありそしてエチレングリコールは他の状況で装入に成功しているので、それはいかなる問題も生じないと予想される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，上記文献）。
【０２０３】
本明細書中に提出する実験は、体温でウイルスを放出するポリマー、例えばコラーゲンマトリックス、アルギネート、ゼラチンポリマー内でナノ内包生ウイルスの使用を適用可能とすると考えるべきである。それらの方法は、空気感染性ウイルスをワクチンとしての用途にさらに安全性を与え、一方ワクチン接種された個体内に防御的免疫応答を誘導するために必要な非常に低い用量の利益を有する。
【０２０４】
整列された炭素ナノチューブの合成
要約すると、石英反応容器内に配置されたアルミナ膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ａｎｏｄｉｓｃ  直径１３ｍｍ、および細孔の大きさ２５０ｎｍ）は、炭素ナノチューブが成長するための鋳型として振る舞う。少なくとも１０００℃に達することができる管状炉が、アルミ
ニウム膜上で２０ｓｃｃｍの速度で流れるエチレンとアルゴンガスの混合物を分解するために使用される。６７０℃におけるエチレンガスの分解が、アルミナ膜の内壁の周囲に炭素の沈着をもたらし、従って沈着した炭素層の厚さは、加工時間に依存する。意図する目的には６時間の反応時間が適当である。膜の側面上の炭素の層は、温和な超音波処理（４７ｋＨｚ、浴式超音波処理機）を用いて除去される。炭素ナノチューブを含む膜は、鋳型の完全な除去のために１Ｍ  ＮａＯＨ中に少なくとも１２時間完全に浸漬される。ナノチューブは、鋳型除去の後に、１μｍの細孔の大きさを有するポリカーボネート膜フィルター（ＳＰＩ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）を通して濾過して懸濁液から除去される。本プロセスの図表示を図１４に示す。
【０２０５】
ナノチューブ装入
液体およびゲルをナノチューブ内に効率的に装入することを可能とする装入方法を開発した。本明細書中に示すデータは、ウイルスを含むアルギネートゲルのナノチューブ内への装入が可能であることを確証する。ほぼウイルス粒子の大きさである量子ドット（直径約５０〜１００ｎｍ）を含むアルギネートゲルをナノチューブ内に装入した。図１５および１６から分かるように、量子ドットはナノチューブ内部に装入される。ナノチューブは透明でありそして量子ドット蛍光が管壁を通して伝達されることに注意するべきである。対照として、アルギネートおよび量子ドットの溶液と混合されそして装入操作を受けなかったナノチューブを示した（図１７）後者の状況においては、量子ドットは管の内部ではなく外部で背景として蛍光を発する。それらの実験の詳細は以下である。
【０２０６】
図１５は、アルギン酸ナトリウムおよび量子ドットを充填した炭素ナノチューブの共焦点画像を示す。ナノチューブは５０ｎｍ量子ドットを含むアルギネートゲルと混合され次いで装入プロセスを受けた。管内部の蛍光の存在は、量子ドットを含むゲルでの管の装入を示す。矢印は個々の管を指している。
【０２０７】
図１６は、アルギン酸ナトリウムおよび量子ドット（ＱＤｄｏｔ）を含む炭素ナノチューブの一連の走査電子顕微鏡写真を示す。ゲルおよび量子ドットが管の内部に明瞭に見える（図１６ａおよび１６ｂ）。両方の写真のスケール・バーは、２μｍである。
【０２０８】
図１７は、量子ドットを含むアルギネートゲルと単に混合されたナノチューブが装入されていないことを示す。アルギン酸ナトリウムおよび量子ドットの存在下での共焦点画像を示す。ナノチューブは、５０ｎｍ量子ドットは含むアルギン酸ゲルを混合されたがしかし装入プロセスは受けていない。量子ドットからの蛍光は背景として見られそして黒く見えるナノチューブ内部には見えない。矢印は個々の管を指している。
【０２０９】
超音波処理はナノチューブを５００ｎｍ未満の長さに破断する
生体作用活性薬剤放出戦略の一つの重要な要素は、生体作用活性薬剤の制御された放出が投与された動物内で起きるように超音波を用いてナノチューブを破壊する能力にある。生体作用活性薬剤を放出するために、ナノチューブは、管内の毛管力が周囲組織内へのゲルおよび生ウイルス双方の放出を促進する大きさに破断されなければならない。図１８には、１．３６ＭＨｚで３０秒間超音波処理された長さ１０〜１２μｍのナノチューブが約１μｍ未満の大きさを有する非常に短い管に破断されていることを示す。熟練者は、本明細書中に提示した実験に基づいて、ナノチューブの内容物の周囲組織中への放出を調節する実験条件をどのようにして最適化するかを知っているであろう。図１８で、１．３６ＭＨｚで３０秒間の超音波処理前の炭素ナノチューブ（図１８ａ、ｘ１０００倍率）および超音波処理後のナノチューブ（図１８ｂ、ｘ１０，０００倍率）の電子顕微鏡写真を示す。超音波処理前には、ナノチューブは長さ１０〜２０μｍであった（図１８ａ）。超音波処理後ではナノチューブは長さ１μｍ未満であった（図１８ｂ）。
【０２１０】
アルギネート・ヒドロゲル
本明細書中に記載のイン・シトゥ・ゲル化の方法は最適化できそしてＣａ２＋以外の多価陽イオン、例えば不溶性塩、例えば炭酸、リン酸もしくは硫酸バリウム、およびリン酸もしくは水酸化アルミニウムが硫酸カルシウムを代替して使用してゲル性質への影響を研究するために拡張できる。種々の分子量および組成（ポリマー骨格内のグルロン酸：マンヌロン酸比率）のアルギネート。注入の容易さヘの影響、および量子ドットの放出プロフィール（ウイルス粒子に対して容易に定量できるモデル）は、イン・ビトロ赤血球凝集アッセイおよび結局はマウス内のイン・ビトロ研究の両者を用いるウイルス送達の効率の研究の端緒となる（上記参照）。平行する研究は、ＨＡまたはアルギネートおよびキトサンの他の混合物、または当該技術分野の熟練者には公知の他の組成物を用いて行うことができる。
【０２１１】
コラーゲンゲル
コラーゲンゲル合成の予備的データに基づいて、イン・ビボで投与された場合に特定の速度でウイルスを内包、貯蔵よび放出するためのそれらの能力に関してヒドロゲルを合成および特性研究できる。コラーゲン出発物質の順次増加する密度を有するゲル（４、６、８および１０ｍｇ／ｍｌ）は、本明細書中の別の箇所に開示される手順に従って合成でき、そしてバルクキャスティングおよびミクロキャスティングの双方によりキャストできる。ゲルは、臨界点乾燥の標準プロトコール（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＸＬ３０）に従って乾燥されそして細孔大きさの変化について走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で検査される。コラーゲンゲルは、蛍光量子ドット粒子（ＱＤｏｔ）の計算された量の存在下でも合成される。それらの量子ドットは、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入できる。ゲルを分離しそして使用前にＰＢＳ緩衝液を用いて数回洗浄する。ゲルからの量子ドットの拡散速度は、ゲルを３７℃に維持している間に、量子ドットの射出スペクトルに従って推定できる。温度制御可能なキュベットホルダーを有するＵＶ−可視光分光分析計が種々の時点での射出スペクトルを集めるために使用される。ＳＥＭから得た拡散速度データおよび多孔度情報を比較しそして捕捉されたウイルス粒子の所要の放出速度に適合する最適コラーゲン濃度を決定するために使用される。最適コラーゲン濃度に到達した後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００００、８０００、６０００および１，０００）を合成プロセスの間に添加剤として加える。コラーゲン／ＰＥＧ組成物を、本明細書中に記載と同じ方法を用いて量子ドットの存在下で合成する。ＰＥＧの濃度は、コラーゲンのＰＥＧに対する比率を以下の順序、１：０．５、１：１、１：２および１：４に変化させて変化できる。拡散の初期の速度を保持するがしかし均質度を上昇しそして相分離を最小化する比率が、イン・ビボ試験のための配合として選択できる。ＰＥＧ添加の後のヒドロゲル中の形態変化は、ＳＥＭにより監視できる。
【０２１２】
ゼラチンヒドロゲル
ウイルスを内包するために使用するゼラチンに関して本明細書中に提出するデータに基づいて、イン・ビボで投与される場合にウイルスを内包、貯蔵および放出できるヒドロゲルが合成および特性決定できる。冷凍乾燥およびγ線照射されたゼラチンが、本明細書中の別の箇所に開示のようにしてヒドロゲルを調製するために使用される。水中のゼラチンの濃度は、最適放出速度を達成するために変化される（１〜３％ｗ／ｖ）。貯蔵の間のヒドロゲルからの水の損失は、ゼラチンヒドロゲルの収縮をもたらす。これは、ゲル形成の間にＰＥＧ（ゼラチンの１〜１０％ｗ／ｗ）オリゴマー（分子量４００〜１０００）の計算された量を加えて低下できる。ゲル強度および物理的寸法の測定は、収縮速度を決定するために使用される。振動レオメーター試験機（Ｂｏｈｌｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を用いるゲルの粘度および架橋密度の定期的測定は、ゲルの粘弾性における変化を明らかにするであろう。二枚の円板の間にゲルを配置して、この計器中の底部の円板が振動すると、ゲルを通して周波数が伝達されそしてトルクが上部の円板により測定される。コラーゲンおよびＱＤ（量子ドット）のために本明細書中に記載された同様の手順は、ウイルスの大きさの粒子の放出速度を決定するためにゼラチンおよびＱＤと一緒に使用できる。
【０２１３】
安全性評価の方法
エーロゾル化の可能性を排除するために、エーロゾル創成を測定する必要がある。この目的で、５０ｎｍの量子ドットを添加したポリマーゲルをペトリ皿上に噴出させる。音波フローポンプと一緒に作動するように設計されそしてバイオエーロゾルを特に効率的に捕集するＳＫＳ  Ｂｉｏｓａｍｐｌｅｒを用いて、空気試料を採取する。Ｂｉｏｓａｍｐｌｅｒはガラス製でありそして臨界オリフィスとして作用する３個のタンジェンシャルノズルを装備し、それぞれは周辺空気４．２リットルを通過させそれは１２．５ｌ／分の全流量となる。バイオエーロゾルは、ＰＢＳ、水または培地の渦流流体トラップ内に捕捉される。Ｂｉｏｓａｍｐｌｅｒは、高容量音速フローポンプを使用して以後の分析のために空気中に浮動している生存微生物を補足する。エーロゾルの試料採取は、ポリマーゲルが渦流されている表面上の直前の１０ｃｍおよび１００ｃｍで行われそして最高の可能放出量を表す。空気試料は、粒子を捕集するために２０ｍｌ  ＰＢＳ（量子ドットに対して）または培地（ウイルスに対して）を通す。溶液を１０倍に濃縮してアッセイする。量子ドット実験のために、蛍光が蛍光計を用いて測定される。ウイルスを用いる研究のために、捕集された試料がＭＤＣＫ細胞内で５日間、２ｍｌ（１０倍濃縮）試料の培養の後にチキンＲＢＣアッセイ内で赤血球凝集を示さない場合にポリマーは安全と考えられる。ウイルスを添加されたポリマーの免疫原性および安全性は、非内包ウイルスに対して本明細書中で記載されたようにしてアッセイされる。同様のまたは当該技術分野の熟練者には容易に同定できる手順はいずれの生体作用活性薬剤に対しても使用できる。量子ドットの使用は、ウイルス粒子の大きさの光学的バイオセンサーの簡単な例である。エーロゾル形成を評価するためにウイルス粒子の大きさのいずれの光学、磁気、電気的標識を使用してもよい。
【０２１４】
ナノチューブ
ゲルに捕捉された生体作用活性薬剤のための可能性がある送達ビヒクルとしてナノチューブを研究するために、下記の実験を行うことができる。ポリマーゲルを装入されたナノチューブのナノ流体的装入および放出特性およびナノチューブからのポリマーの制御された放出のための条件は、下記のようにして評価できる。安全性および免疫原性は、本明細書中の他の箇所に記載のようにして評価される。生体作用活性薬剤を含むポリマーゲルを装入されたナノチューブは、一般的に使用されている送達の慣用の注射器および針使用法からの薬剤送達の別の戦略である。
【０２１５】
１分間、適当な液体中でポリカーボネート２００ｎｍ膜上でナノチューブを浸漬し、次いで温和な真空を適用すると、液体およびポリマーがナノチューブ内に装入される。この手順を５回繰り返す。５０ｎｍの大きさの銀ナノチューブが使用される場合には、このプロセスはコロイド状粒子の３０〜４０％の装入効率となる。
【０２１６】
ナノチューブのナノ流体装入を研究するために、ゲル中に種々の濃度で内包された５０ｎｍ量子ドットをゲルの装入効率を定量するために使用する。十分に洗浄した後のナノチューブの蛍光強度が量子ドット濃度を測定するために使用される。装入されたナノチューブの数は、共焦点顕微鏡写真により定量される。ナノチューブ壁はＵＶ光に透明であり、従って管内の蛍光は目視できる。ポリマーゲルを装入するために、重合の前にゲルをナノチューブと混合しそして真空を数サイクル適用する。次いで、使用するポリマーに応じて、架橋剤、または架橋を触媒作用する温度にナノチューブを暴露する。
【０２１７】
ゲル装入されたナノチューブの放出特性は、超音波処理（２０ｋＨｚ〜１．３ＭＨｚ）を用いるかまたは用いないで研究した。５０ｎｍ量子ドットを含むゲルが、放出量子ドッ
トを測定するために蛍光光度計を用いて評価された。しかし、共焦点顕微鏡写真は、量子ドットを装入されたか、または超音波処理の後にそれらを放出したナノチューブの数の定量を可能にした。
【０２１８】
量子ドットを含むポリマーをナノチューブ内に装入する最適条件の決定に続いて、生ウイルスを含むポリマーを装入されたナノチューブが、本明細書中の別の箇所に記載されそしてここには繰り返さない方法によりイン・ビトロおよびイン・ビボで試験された。
【０２１９】
ナノチューブに基づく送達システムは、従来法と比較するといくつかの利点を有する。ウイルス粒子は管の内側に捕捉されるので、予想されない洩れが起き得ず従って近くの人員の安全性が高くなる。管内の溶剤の蒸発速度は捕捉粒子の移動よりもはるかに高く、ナノチューブの壁に沿った量子の沈降をもたらし、自然により設計された安全手段を創成する。
【０２２０】
本明細書中に引用されたそれぞれおよびあらゆる特許、特許出願、および出版物の開示は、その全体を引用することにより本明細書に編入される。
【０２２１】
本発明は特定の態様と関連させて説明されたが、本発明の他の態様及び変種も、本発明の真の精神および範囲から外れることなく、当該技術分野の熟練者によって案出されることは明らかである。添付の請求範囲は、すべてのかかる態様および等価の変種を含むと解釈されると考える。
【０２２２】
本発明の上記の要約ならびに詳細な説明は、添付する図面と関連させるとさらに良く理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好まれている態様を図面で示す。しかし、本発明は記載された正確な配置および計器装備に限定はされないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス内の二次ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するインフルエンザウイルスの４種の異なる投与経路の効果を描いたグラフである。マウスは、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）または皮下（ＳｕｂＱ）注入経路によりＰＲ８インフルエンザの１００赤血球凝集単位（ＨＡＵ）を用いて初回抗原刺激された。Ｘ３１Ａ型インフルエンザウイルスを用いる再チャレンジの７日後に組織を採取しそして免疫優性Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質ＮＰ３６６−３７４（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号１））を添加されたＭＨＣ−クラス１四量体を用いて肺臓組織の調製物内で、ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を評価した。
【図２】図２は、図２Ａおよび図２Ｂを含んでなり、マウス内の用量応答研究の結果を提出する。本研究において、二次ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＩＰまたはＩＤ注入経路のいずれかにより投与されたＰＲ８インフルエンザウイルスの種々の用量を用いて初回抗原刺激されたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス内で評価された。組織は、Ａ型インフルエンザウイルスの鼻内再チャレンジの７日後に採取された。ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、免疫優性Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質ＮＰ３６６−３７４（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号１））またはＩＦＮγ細胞内株を添加されたＭＨＣ−クラス１四量体を用いて肺臓組織の肺調製物内で検出された。図２Ａは、ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを描いている。図２Ｂは、ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の用量応答曲線を描いている。点は、群あたりに三匹の動物に対する平均±標準偏差（＊ｐ＜０．０５）である。
【図３】図３は、図３Ａおよび図３Ｂを含んでなり、ＩＰ、ＳＱまたはＩＤで送達された生インフルエンザウイルスの１ＨＡＵに対するウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を描いた一連のグラフである。異なる感染経路：ＩＭ、ＳＱまたはＩＤによりＰＲ８インフルエンザウイルスの１ＨＡＵを用いて初期抗原刺激されたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス内での二次ウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答。肺臓は、Ｘ３１インフルエンザウイルスを用いる鼻内再チャレンジの７日後に採取されそしてウイルス核タンパク質：ＮＰ３６６−３７４（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号１））から誘導された免疫優性ペプチドエピトープを添加されたＭＨＣ−クラス１四量体複合体を用いてウイルス特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。全ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ａ）およびＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の全数（Ｂ）をそれぞれ３種の免疫化条件で算出した。水平線は平均値を示す。
【図４】図４は、ＳＱで投与された生インフルエンザワクチンの安全性を描いたグラフである。野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ（白、菱形）または免疫欠損Ｒａｇ−／−γｃ−／−マウス（白、円形）を生ＰＲ８インフルエンザウイルスの１００ＨＡＵを用いてＳＱ免疫化した。対照として、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの群（黒、菱形）を、ＰＲ８インフルエンザウイルスの１ＨＡＵを用いてＩＮ感染させた。マウスの体重は引き続く１７日間記録しそして体重減少百分率を感染後の日数に対してプロットした。
【図５】図５は、皮下投与されたＡ型インフルエンザウイルスが安全でありそして疾患を起こさないことを描いたグラフである。野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスをＰＲ８（黒、四角形）またはロンドン株（黒、三角形）の低用量（０．１ＨＡＵ）により鼻内にインフルエンザウイルスを投与した。免疫欠損Ｒａｇ−／−γｃ−／−マウスは、ＰＲ８（白、菱形）またはロンドンウイルス（黒、円形）の高用量（１−ＨＡＵ）を用いて皮下に注入された。マウスの体重を接種後３０日間測定した。接種の後の平均体重減少を示す。瀕死のマウスは３０％体重減少で安楽死させた（＋）。すべての群でｎ＝５である。
【図６】図６は、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃを含んでなり、ＳＱ投与されたゼラチンゲル内の生ウイルスがマウス内でＣＤ８＋Ｔ細胞を効率的に刺激することを描いた一連のフローサイトメトリー写真である。非操作マウスマウスからまたはゼラチンのみ、ゼラチンおよびウイルス（１０ＨＡＵ）もしくはウイルス単独（１０ＨＡＵ）を用いて３０日間免疫化されたマウスからの肺臓（図６Ａ）および脾臓（図６Ｂ）を、Ｘ３１インフルエンザウイルスを用いる鼻内再チャレンジの７日後に分析した。単独細胞懸濁液は、抗ＣＤ８抗体およびＭＨＣクラスＩ／ＮＰ３６６−３７４四量体複合体を用いて染色しそしてフローサイトメトリーで分析した。全リンパ球内のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、ゲートの外側に示され、一方全ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、ボックス内に示される。（図６Ｃ）指定されたマウス内の脾臓細胞をＮＰ３６６−３７４ペプチドを用いて６時間イン・ビトロ刺激した。ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生は、抗ＩＦＮγ抗体を用いる細胞内染色およびフローサイトメトリー分析により評価した（ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を四分の一象限内に示した）。
【図７】図７は、図７ａ、図７ｂ，および図７ｃおよび図７ｄを含んでなり、種々のポリマー濃度および架橋剤含有量により産生された異なる細孔の大きさを有するコラーゲンポリマーを描いた一連の電子顕微鏡写真である。コラーゲン６ｍｇ／ｍｌ（図７ａ）、コラーゲン１０ｍｇ／ｍｌ（図７ａ）、コラーゲン１０ｍｇ／ｍｌを含むコラーゲンゲル（湿式モードＥＳＥＭ）（図７ｃ）、および比１：４の冷凍乾燥コラーゲン：ＰＥＧヒドロゲル（図７ｄ）を含む針内部に調製された冷凍乾燥コラーゲンゲルのＳＥＭ顕微鏡写真。
【図８】図８は、図８Ａおよび図８Ｂを含んでなり、射出時間に対するポリマー性質およびＣａ２＋濃度（すなわちビヒクル性質）の影響を描いたグラフ（図８Ａ）および表（図８Ｂ）である。
【図９】図９は、図９ａおよび図９ｂを含んでなり、ポリマーの性質がナノ粒子放出速度を制御することを描いた一連のグラフである。量子ドット（２０ｎｍの大きさ）が、低粘度（図９ａ）および高粘度（図９ｂ）のアルギネートポリマーから放出された。低粘度ポリマーは迅速に量子ドットを放出するが、一方高粘度リマーはかなり遅い速度で量子ドットを放出する。
【図１０】図１０は、アルギネートゲル内に送達された生ＰＲ８ウイルスがマウス中にＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強力に刺激することを描いたグラフである。多数の肺臓ＮＰ３６６特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、生ウイルスを皮下接種されそして有毒ウイルスを用いてチャレンジされた動物内に誘発された。非操作マウスからまたはＰＲ８生ウイルスのみ、アルギネートのみ、もしくはアルギネート内に内包されたＰＲ８生ウイルスを用いて皮下に接種されたマウスからの肺臓は、Ｘ３１ウイルスを用いる鼻内再チャレンジの７日後に分析された。単細胞懸濁液を抗ＣＤ８抗体およびＭＨＣクラスＩ／ＮＰ３６６−３７４ペプチドを用いて染色しそしてフローサイトメトリーで分析した。図示した値は、群あたりに２匹おマウスから得た平均値を表す。
【図１１】図１１は、アルギネートゲル内に送達された生ＲＰ８ウイルスがインフルエンザウイルス特異性抗体の産生を有効に刺激することを描いたグラフである。ＰＲ８ウイルスのみまたはアルギネートゲル内に内包されたものを用いて免疫化されたＣ５７Ｂ１／６マウスの血清内に存在する抗ＰＲ８抗体は、捕捉抗原としてＰＲ８ウイルスを用いるＥＬＩＳＡにより検出された。最初１／２７０に希釈された血清をさらに３倍づつ順次希釈しそしてプレート結合ＰＲ８ウイルスに加えた。非感染動物はＰＲ８ウイルスに対して抗体応答を示さなかった。
【図１２】図１２は、アルギネートゲル内に内包された生ウイルスを用いるマウスのワクチン接種が、動物の血清内に中和抗体を誘発することを描いたグラフである。アルギネート内に内包された生ウイルスを用いて感染されたマウスからの血液を系統的に希釈し（１／２の系統的希釈）、そしてＰＲ８ウイルスの２ＨＡＵによるチキン赤血球凝集を阻害する能力について試験した。ウイルスを用いて接種されなかった動物からの血清は、赤血球凝集を示さなかった。
【図１３】図１３は、６７０℃におけるエチレンの鋳型支援熱分解により合成された炭素ナノチューブの走査型電子顕微鏡写真である。管の直径は、鋳型の細孔直径により決定され、それはこの場合には２５０ｎｍであった。ナノチューブ壁の厚さは約２０ｎｍである。
【図１４】図１４は、化学蒸着法による炭素ナノチューブ合成の略図である。
【図１５】図１５は、図１５ａおよび図１５ｂを含んでなり、ナノチューブが量子ドットを含むアルギネートゲルを装入できることを描いた一連の共焦点顕微鏡写真である。アルギン酸ナトリウムおよび量子ドットを充填された炭素ナノチューブの共焦点写真を示す。ナノチューブは５０ｎｍ量子ドットを含むアルギネートゲルと混合され次いで装入プロセスを受けた。ナノチューブ内側の蛍光の存在は、装入の証拠である。矢印は個々の管を指す。
【図１６】図１６は、図１６ａおよび図１６ｂを含んでなり、ナノチューブ内に装入されたアルギネートゲル内の量子ドットの一連の写真である。アルギン酸ナトリウムおよび量子ドットを含む炭素ナノチューブのＳＥＭ写真を示す。ゲルおよび量子ドットは、管の内側に明瞭に見える。両方の図内のスケールバーは、２μｍである。
【図１７】図１７は、図１７ａおよび図１７ｂを含んでなり、量子ドットと混合されたがしかし装入はされていないナノチューブの一連の共焦点写真である。ナノチューブを５０ｎｍ量子ドットを含むアルギネートゲルと混合したが、しかし装入プロセスは受けなかった。量子ドットの蛍光は背景中には明瞭であるが、管内ではない。矢印は個別の管を示す。
【図１８】図１８は、図１８ａおよび図１８ｂを含んでなり、ナノチューブが超音波処理により破断できることを描いた一連のＳＥＭである。図１８ａ−超音波処理前、図１８ｂ−１３．６ＭＨｚ、３０分間の超音波処理後（倍率１０，０００）。超音波処理前には、管は長さ１０〜２０μｍであった。超音波処理後には、管は１μｍ未満の長さであった。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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