(57)【要約】  本発明は、ヒト上皮受容体(HER)アンタゴニストを特徴とする。このアンタゴニストは、HERのリガンドのポリペプチドバリアントである。本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントは、Pan-HERアンタゴニスト特性を有し、該受容体のキナーゼ活性化活性、続いて細胞増殖の阻害など、１種類以上のHERサブタイプの少なくとも１つのHER媒介性生物学的活性を阻害し得る。かかるポリペプチドバリアント、およびこれらのポリペプチドバリアントをコードする核酸は、HER活性の阻害が指示される状況において治療的に使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト野生型上皮増殖因子(EGF)のアミノ酸Gly 39に対応するアミノ酸位置が別のアミノ酸で置換されたHERリガンドポリペプチドを含み、該HERリガンドポリペプチドが少なくとも１つの置換されたドメインをさらに含み、少なくとも１つのPan-HERアンタゴニスト活性を有する、ヒト上皮受容体(HER)-リガンドポリペプチドバリアント。
【請求項２】
HERリガンドポリペプチドがEGFである、請求項１記載のバリアント。
【請求項３】
アミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン酸、およびイソロイシンからなる群より選択される、請求項１記載のバリアント。
【請求項４】
アミノ酸置換がロイシンである、請求項１記載のバリアント。
【請求項５】
置換されたドメインがEGFのアミノ末端である、請求項１記載のバリアント。
【請求項６】
HERリガンドポリペプチドがEGFであり、置換されたドメインが、アミノ酸NSDSEに対応する成熟EGFのアミノ酸1〜5である、請求項１記載のバリアント。
【請求項７】
EGFの置換されたドメインが、アミノ酸SHLVKに対応するHRGβ1の相同アミノ酸で置き換えられた、請求項６記載のバリアント。
【請求項８】
HERリガンドポリペプチドがBiRegulin (BiR)である、請求項１記載のバリアント。
【請求項９】
アミノ酸Gly 39がアミノ酸ロイシンで置き換えられた、請求項８記載のバリアント。
【請求項１０】
野生型ヒトEGFのGly 39に対応するアミノ酸位置以外の位置に少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む、請求項１記載のバリアント。
【請求項１１】
さらなるアミノ酸置換が、野生型ヒトEGFのG18、V35、およびR41または任意のその組合せに対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸置換から選択される、請求項１０記載のバリアント。
【請求項１２】
アミノ酸位置V35にさらなるアミノ酸置換を含む、請求項８記載のバリアント。
【請求項１３】
アミノ酸位置35のバリンがグルタミン酸で置き換えられた、請求項１２記載のバリアント。
【請求項１４】
BiRV35EG39Lを含む、請求項１記載のバリアント。
【請求項１５】
HERl、HER3およびHER4の各々に対する少なくとも１つのアンタゴニスト活性を有する、請求項１記載のバリアント。
【請求項１６】
請求項１５記載のHERリガンドポリペプチドバリアントおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６記載の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、HERの過剰発現を特徴とする疾患を有する患者の処置方法。
【請求項１８】
疾患が癌である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
癌が、神経膠腫、扁平上皮癌、乳癌、黒色腫、浸潤性膀胱癌、結腸直腸癌および食道癌からなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
疾患が乾癬である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
HERリガンドポリペプチドが、ヒト上皮増殖因子(EGF)、トランスホーミング増殖因子-α (TGFα)、ベータセルリン、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)、ニューレグリン、ヘレグリン、アンフィレグリン (AR)およびエピレグリンからなる群より選択される、請求項１記載のバリアント。
【請求項２２】
置換されたドメインがB-ループドメインである、請求項１記載のバリアント。
【請求項２３】
ヒト上皮増殖因子(EGF)、トランスホーミング増殖因子-α(TGFα)、ベータセルリン、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB- EGF)、ニューレグリン、ヘレグリン、アンフィレグリン (AR) およびエピレグリンからなる群から選択される別のHERリガンドポリペプチドの対応するB-ループドメインで置換されたB-ループドメインを有するEGF G39Lを含み、少なくとも１つのPan-HERアンタゴニスト活性を有する、請求項１記載のHERリガンドポリペプチドバリアント。
【請求項２４】
請求項１記載のHERリガンドポリペプチドバリアントおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２３記載のHERリガンドポリペプチドバリアントおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２４記載の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、HERの過剰発現を特徴とする疾患を有する患者の処置方法。
【請求項２７】
疾患が癌である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
癌が、神経膠腫、扁平上皮癌、乳癌、黒色腫、浸潤性膀胱癌、結腸直腸癌および食道癌からなる群より選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
疾患が乾癬である、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つのPan-HERアンタゴニスト活性を有し、ドメインIおよび／またはIIIによる結合を破壊する変異を含む、ヒト上皮受容体(HER)-リガンドポリペプチドバリアント。
【請求項３１】
ドメインIによる結合を破壊する変異を含む、請求項３０記載のバリアント。
【請求項３２】
ドメインIIIによる結合親和性を増強する変異をさらに含む、請求項３１記載のバリアント。
【請求項３３】
ドメインIIIによる結合を破壊する変異およびドメインIによる結合親和性を増強する変異を含む、請求項３０記載のバリアント。
【請求項３４】
受容体結合特異性を調節する変異をさらに含む、請求項３０記載のバリアント。
【請求項３５】
請求項１記載のバリアントをコードする核酸。
【請求項３６】
請求項１４記載のバリアントをコードする核酸。
【請求項３７】
請求項２３記載のバリアントをコードする核酸。
【請求項３８】
請求項３０記載のバリアントをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、2005年1月11日に出願された米国仮特許出願第60/643,089号の利益を主張する。上記出願の全体の教示は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
上皮増殖因子（EGF）は、大きな内在性膜タンパク質前駆体からタンパク分解的に切断された53アミノ酸サイトカインである。EGFは哺乳類の細胞の増殖調節において重大な役割を果たす。ヒトEGF（EGF）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、例えば、Hollenberg編,「Epidermal Growth Factor-Urogastrone, A Polypeptide Acquiring Hormonal States」; Academic Press, Inc., New York (1979), pp.69-110；またはUrdea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7461(1983)に開示される。EGFのアミノ酸配列もまた、米国特許第5,102,789号および同時係属中の米国特許出願第10/820,640号に開示され、その両方が全体において参照により本明細書に援用される。
【０００３】
上皮増殖因子受容体（EGFR）を含むヒト上皮受容体（HER）は、受容体チロシンキナーゼの周知の例である。HERとその同種（cognate）リガンド、または構造的に関連のあるリガンドとの相互作用は、キナーゼドメインの二量体化および活性化を導く。これはシグナルカスケードを引き起こし、細胞分裂を導く。HERファミリーメンバーをコードする遺伝子の過剰発現は、乳癌、卵巣癌および頭頸部癌を含むいくつかの癌と関連している。キナーゼ活性を阻害することによって、またはEGFのEGFRへの結合を干渉することによって、EGFR（HER1）を標的とする分子が細胞増殖を抑制することを示し、例えばチロシンキナーゼインヒビターのイレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）およびEGFR特異的モノクローナル抗体のエルビタックスTM（セツキシマブ）などの抗癌治療薬として開発された。ヘルセプチン等のモノクローナル抗体を含むさらなる分子は、HERファミリーの他の個々のメンバーを標的とする。近年、いくつかのモノクローナル抗体および小分子キナーゼインヒビター（例えばパニツズマブ（Panituzumab）およびラパトニブ（Laptnib））は、複数のHER受容体を標的とする分子の例として開発された。これらの治療薬はいくつかの症例で有効であることが示されたが、HER関連の癌に対する新規療法、特に全HERファミリーに干渉する治療用化合物の必要性が尚存在する。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、新規なPan-HERアンタゴニストを特徴とする。「Pan-HERアンタゴニスト」とは、天然もしくは活性HERリガンドとHER、好ましくはHER1、HER2、HER3、および／もしくはHER4ならびにこれらの受容体のバリアントな形態との相互作用または結合を減少させること、干渉すること、ブロックすること、あるいは妨げることによって、多様なHER媒介生物学的活性の阻害、抑制または停止を引き起こす任意の分子を意味する。活性に必要とされる二量体パートナーを排除することによって、HER1、HER3、およびHER4との直接干渉は、HER2との間接干渉を提供し得る。これらのPan-HERアンタゴニストは、HERリガンドポリペプチドバリアントである。本発明の好ましいHERリガンドバリアントは、HERファミリーメンバーの少なくとも1つの生物学的活性をブロックするかまたは妨害すること、例えばHERキナーゼ活性化、シグナル、調節、二量体化、またはHER調節細胞増殖を低下させるかまたは阻害することが可能である非天然由来のポリペプチド分子である。本発明の好ましいリガンドバリアントは、少なくとも1つのHER媒介生物学的活性を選択的に阻害し得るバリアントである。かかるHERリガンドポリペプチドバリアント、およびこれらポリペプチドバリアントをコードする核酸は、HER生物学的活性の抑制が指示される状況、例えば癌で治療上使用され得る。用語「ポリペプチド」は、関連のあるポリペプチド配列の一般用語として本明細書に用いられ、天然タンパク質、断片、ホモログまたはアナログをいう。
【０００５】
一局面において、本発明は、野生型EGF Gly39に対応する39位のグリシン（G39またはGly39）にて少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、別の異なるHERリガンド由来の少なくとも1つのドメイン（「置換されたドメイン」）を有し、少なくとも1つのPan-HERアンタゴニスト活性を有する天然由来のHERリガンドに由来するHERリガンドバリアントを特徴とする。好ましい態様において、グリシンは、好ましくは野生型EGF Gly39に対応する位置でロイシンと置換され（G39L）、置換されたドメインは、好ましくはEGFのアミノ末端ドメインである。
【０００６】
本発明はまた、本発明の少なくとも1つのHERポリペプチドバリアントを含む医薬組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、患者におけるHER過剰発現で特徴付けられた病状の処置方法を特徴とする。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なPan-HERアンタゴニストを特徴とする。これらのPan-HERアンタゴニストは、HERリガンドポリペプチドバリアントである。HERリガンドの例としては、哺乳動物EGF（例えば、ヒト（EGF）、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ウマおよびラット）が挙げられる。HERリガンドの他の例としては、トランスホーミング増殖因子α（TGFα）、ベータセルリン、ヘパリン結合性EGF様増殖因子（HB-EGF）、ニューレグリン、ヘレグリン（HRG）、HRGα、HRGβ1、HRGβ2およびHRG因子（NDF）を含む、アンフィレグリン（AR）ならびにエピレグリンが挙げられる。本発明の好ましいHERリガンドバリアントは、HER媒介性生物学的活性を選択的に阻害し得るヒトHERリガンドポリペプチドバリアントに基づく。
【０００８】
本発明は、39位のグリシンが別のアミノ酸、好ましくはロイシンと置換されるように修飾されたEGF（本明細書では「EGF G39L」という）が、EGFのEGFR（HER1）アンタゴニストになる原因を引き起こすという出願人らの先の発見に基づく（参照によって本明細書に援用される、2005年6月30日に出願され、「上皮増殖因子受容体アンタゴニストおよび使用方法（Epidermal Growth Factor Receptor Antagonists and Methods of Use）」と題された、代理人事件整理番号3530.1002 US2を有する米国通常出願（Utility Application）を参照）。そこで出願人らは、他のHERファミリーリガンドの構造ドメインをEGF G39Lに「交換すること」によって、EGF G39Lのアンタゴニスト活性を保持し、さらなるHER分子が同一のHERリガンドバリアントによる阻害のために標的化され得ることによって付加的な多様性をさらに提供する新規なHERリガンドキメラ分子が結果として生じることを発見した。HER1、HER3およびHER4に特異的な単一のHERリガンドバリアントは、1つ以上のHERファミリーメンバーの望ましくないHER媒介性生物学的活性が関係する多発性癌を標的とする強力な治療法を提供するので、非常に望ましい。
【０００９】
受容体およびHERリガンドの有意な構造的類似性を考えると、G39残基または他のHERリガンドのG39残基に対応するアミノ酸は、HERリガンドファミリーを通して同一の役割を果たすと考えられ、したがってG39L置換またはその同等のものを有する任意のHERリガンドが、本発明のHERリガンドポリペプチドバリアント（例えばキメラ）を設計するための出発点として供給され得ると考えられる。
【００１０】
一局面において、本発明は、野生型EGF Gly39に対応する39位のグリシン（G39またはGly39）にて少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、別の異なるHERリガンド由来の少なくとも1つのドメイン（「置換されたドメイン」）を有し、少なくとも1つのPan-HERアンタゴニスト活性を有する天然のHERリガンドに由来するHERリガンドバリアントを特徴とする。この態様において、リガンドは、ドメインIIIによる崩壊された（disrupted）結合で特徴付けられるが、それはドメインIによってその受容体に結合する。好ましい態様において、グリシンは、好ましくは野生型EGF Gly39に対応する位置でロイシンと置換され（G39L）、置換されたドメインは、EGFのアミノ末端ドメインである。本明細書で用いられる場合、「野生型ヒトEGFのアミノ酸G39に対応するアミノ酸位置」という語句は、種々の哺乳類種由来の非修飾HERリガンドを、最適な比較のためにヒト野生型EGFとアラインメントする（align）とき、ヒト野生型EGFのG39に対応する位置またはその近くに現れるグリシンがアラインメントされる（参照によって本明細書に援用される、2005年6月30日に出願され、「上皮増殖因子受容体アンタゴニストおよび使用方法（Epidermal Growth Factor Receptor Antagonists and Methods of Use）」と題された、代理人事件整理番号3530.1002 US2を有する米国通常出願を参照）。
【００１１】
別の局面において、本発明は、野生型EGF Gly39に対応する39位のグリシンにて少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、BiRegulin（図１）として公知の合成ヘレグリン／EGFキメラ等の合成HERリガンドポリペプチドバリアントを特徴とする。BiRegulin（BiR）はキメラEGFホモログであり、ここでEGFのアミノ末端残基（NSDSE）は、HRGβ1（SHLVK）の対応する残基と置き換えられている。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は、ドメインIまたはIIIの1つの結合は崩壊されているが、ドメインIまたはIIIの他方に対する結合は維持されるかまたは増大する合成リガンドポリペプチドバリアントを特徴とする。本明細書に例示されるバリアントのように、これらのバリアントは、ドメインIおよび／またはIIIにおける他のアミノ酸を修飾することによって（例えばR41D）生成され得る。これらのバリアントは、天然受容体の特異性を改変するために、（バリアントがさらなる受容体に結合するように特異性を広げるか、または特異的受容体に対する特異性を標的にするかのいずれかで）有利に修飾され得るかまたは作り変えられ得る。これは、さらなる変異または本明細書に記載されたドメイン交換戦略のいずれかによってなし得る。
【００１３】
本明細書で用いられる場合、「HER媒介性生物学的活性」とは、HERの内在性プロテインチロシンキナーゼ活性および最終的にDNA合成と細胞増殖をもたらすその下流シグナル変換カスケードを意味する。
【００１４】
「Pan-HERアンタゴニスト」とは、天然もしくは活性HERリガンドと1つ以上のHERの亜類型との相互作用または結合を減少させること、干渉すること、ブロックすること、あるいは妨げることによって、HER媒介生物学的活性の阻害、抑制または停止を引き起こす任意の分子を意味する。用語「アンタゴニスト」の使用は、機能的な意味において本明細書で用いられ、本発明を特定の作用機構を有する化合物に限定することを意図しない。例えば用語「アンタゴニスト」は、限定されないが、競合的アンタゴニストとして機能する分子を含む。競合的アンタゴニストはHER受容体に結合するが、HERの生物学的活性を引き起こさない。
【００１５】
本発明のリガンドポリペプチドバリアント（「HERリガンドキメラ（chimerae）」を含む）は、いくつかの有用な特性を有する。例えば、本発明のポリペプチドバリアントは、HERの過剰発現が疾患の病理学的プロセスと関係がある疾患（例えば癌）を処置するために用いられ得る。
【００１６】
本発明によれば、G39は、修飾HERリガンドポリペプチドのPan-HERアンタゴニスト活性がそのままの状態であるように、任意の適切なアミノ酸で置換され得る。例えばG39は、グルタミン酸（G39E）、グルタミン（G39Q）、リシン（G39K）、アスパラギン酸（G39D）、イソロイシン（G39I）またはロイシン（G39L）で置き換えられ得る。特に好ましい態様において、G39はフェニルアラニン（G39F）、ロイシン（G39L）、アスパラギン酸（G39D）またはイソロイシン（G39I）で置き換えられ得る。G39Lが好ましい。
【００１７】
G39アミノ酸修飾に加えて、本発明のHERポリペプチドバリアントは、別の異なるHERリガンド由来の置換されたドメインを含む。好ましい態様において、置換されたドメインは、HRGβ-1由来のSHLVK残基の全てまたは一部であり、EGFにおける類似の残基、好ましくはアミノ酸NSDSEに対応するEGFのアミノ末端のアミノ酸1〜5のいくつかの部分で置換される。本発明の好ましい態様において、HERポリペプチドバリアントは、野生型EGFに対応する39位のグリシンにて少なくとも1つのアミノ酸置換を有するBiRegulin（BiR）であり、ここで野生型EGF Gly39またはG39に対応する39位のグリシンは、ロイシン（BiRG39L）または別の適当なアミノ酸で置き換えられている。別の好ましい態様において、BiRG39Lはさらにアミノ酸位置35で置換され、ここで該位置でのアミノ酸バリンはアミノ酸のグルタミン酸で置き換えられる（BiRV35EG39L）。本発明のかかるHERポリペプチドバリアントはまた、少なくとも1つのPan-HERアンタゴニスト活性を有し、好ましくはHER亜類型の各々、HER1、HER3およびHER4に拮抗し得る。
【００１８】
当該分野で公知のように、HER受容体と結合するリガンドは、3つのカテゴリー：1）HER1に単独で結合するもの（EGF、TGF-a、アンフィレグリン）、2）HER3および／またはHER4に結合するもの（ヘレグリンおよびニューレグリン）ならびに3）HER-1およびHER-4に結合するもの（ベータセルリン、ヘパリン結合性EGF、NRG3、エピレグリン）に分類し得る（RieseおよびStern 1998 Bioessays 20:41）。各HER受容体は、不活性な状態におけるモノマーとして存在する。リガンド結合は、結合した受容体とHERファミリーの他のメンバーとの間で、ホモ二量体化かヘテロ二量体化のいずれかを促進する。種々のEGF様増殖因子は、公知のリガンドを有さず、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成する構造的能力を有するHER2以外の各ErbB受容体に、高い親和力で結合する。ホモ二量体は、一般に腫瘍細胞の増殖に関係しないが、心筋発達および修復に重要である（Dougall et al 1994 Oncogene 9:2109, HynesおよびStern 1994, Biochim Biophys Acta 1198:165, TzaharおよびYarden 1998 Biochim Biophys Acta 1377:M25, Negro et al 2004, Recent Prog Horm Res. 59:1）。HER2は他のHER受容体の好ましいヘテロ二量体パートナーである（Tzahar et al 1996, Mol Cell Biol 16:5276, Beerli et al 1995 Mol Cell Biol 15:6496, Karunagaran et al 1996 EMBO J 15:254, Wang et al 1998, PNAS95:6809）。HER3は、不十分なチロシンキナーゼドメインを有すること（Guy et al 1994 PNAS 91:8132）、および別のHERファミリー受容体と結合してシグナルを引き起こすに相違ない点で、他のHERファミリーメンバーと異なる。
【００１９】
BiRG39LまたはBiRV35EG39L等の本発明のHERポリペプチドバリアントの利点は、それらがHER1、HER3およびHER4等の複数のHER標的に対して特異的であり、これらHER亜類型の各々に拮抗し得ることである。本発明のバリアントはHER2を標的にする必要がなく、なぜなら本発明のバリアントによるHER1、HER3およびHER4の標的化は、効果的に全てのHER2へテロ二量体化パートナーを排除し、それにより望まれないHER2の生物学的活性を抑制する。HER2ホモ二量体化の抑制を避けることは有利であり、なぜならかかる活性が、命を脅かす副作用である心筋症を引き起こすことが示されたからである。
【００２０】
他の「ドメイン交換（swap）」もまた想定され得、本発明に含まれる。例えば、成熟EGFのアミノ酸21〜30に対応するEGFのB-ループは、ヒトトランスホーミング増殖因子α（TGFα）、ベータセルリン、ヘパリン結合性EGF様増殖因子（HB-EGF）、ニューレグリン、ヘレグリン（HRG）、アンフィレグリン（AR）およびエピレグリン等の、別の異なる好ましくはヒトHERリガンドの対応B-ループドメインで置換され得る。対応のB-ループドメインは組み込まれて、アンタゴニストのHER特異性を改変し得る。したがって、EGF G39Lが本発明のHERリガンドポリペプチドを設計するための開始点である場合、EGF G39LのB-ループは、拮抗されるのが意図される特異的HER分子と反応することで知られる異なるHERリガンドのB-ループの対応ドメインで置換される。かかる修飾キメラは、B-ループ交換の起源に基づく改変された結合特異性を有するEGF G39Lバリアントのアンタゴニスト活性を有し得る。
【００２１】
したがって、HER1の標的化が向上した本発明のPan-HERリガンドポリペプチドバリアントを設計するために、EGF B-ループドメインは、TGF-αまたはアンフィレグリン由来の対応するB-ループドメインで置換され得る。HER3および／またはHER4に対する標的化が向上した本発明のPan-HERリガンドポリペプチドを設計するために、EGF B-ループドメインは、ニューレグリン由来の対応ドメインで置換され得る。HER1およびHER4に対する標的化が向上したPan-HERリガンドポリペプチドバリアントは、EGF B-ループドメインをベータセルリン、HB-EGF、NRG3またはエピレグリン由来の対応ドメインで置換され得る。HER2は公知のリガンドを有さないので、それは活性に必要とされるHER1、HER2またはHER4の二量体化パートナーを除去、つまり本発明のポリペプチドバリアントを用いてHER1、HER3およびHER4に拮抗することによって、間接的にダウンレギュレーションで標的化され得る。B-ループ交換のアンタゴニスト特性の例は、図5A〜5Dに示される。
【００２２】
さらに、HERリガンドポリペプチドバリアントのホモログ、アナログおよび断片は、本発明の範囲内である。「ホモログ」とは、かかるホモログがPan-HERアゴニスト活性を保持する限り、ヒト野生型HERリガンドに対して実質的な同一性を有する他の哺乳類種由来のHERリガンドの対応ペプチドを意味する。例えば、種々の哺乳類種に対するEGFポリペプチド配列のホモログは以下の通りである：
2008527978.tif 000002
「アナログ」とは、関連のあるペプチドのEGFRアンタゴニスト特性をなお保持するが、1つ以上のアミノ酸改変、例えばアミノ酸残基の置換、付加または欠失によって異なるペプチドバリアントを含むことを意味する。
【００２３】
EGFのG39位、または他のPan-HERリガンドにおける野生型ヒトEGFのアミノ酸G39に対応するアミノ酸位置での変異に加えて、Pan-HER阻害活性またはPan-HERリガンドポリペプチドバリアントのアンタゴニスト活性を実質的にそのままにするさらなる変異が可能である。これらの変異は単一または複数の置換、欠失または挿入の形態をとり得る。アミノ酸置換は、ポリペプチド上の1つ以上の位置で同類または非同類アミノ酸置換の形態をとり得る。本明細書で用いられる場合、用語「同類アミノ酸置換」とは、配列中に通常存在するアミノ酸を同様の大きさ、電荷または極性を有する異なるアミノ酸で置換されることをいう。同類置換の例としては、イソロイシン、バリンおよびロイシン等の非極性（疎水性）残基の別の非極性残基での置換を含む。同様に、同類置換の例としては、アルギニンとリシン間、グルタミンとアスパラギン間、およびグリシンとセリン間などの、1つの極性（親水性）残基の別の極性残基での置換を含む。さらに、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基の別の塩基性残基での置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの酸性残基の別の酸性残基での置換は、同類置換のさらなる例である。非同類置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）残基のシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基での置換、および／または極性残基の非極性残基での置換を含む。
【００２４】
本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントの治療の質はまた、G39に加えて、またはG39に対する代替としての位置でのアミノ酸の置換、欠失および挿入によってさらに改善され得る。これらの改善された治療の質は、限定されないが、向上した親和力、増大した半減期、増大した溶解性、および増大した生物学的利用能を含む。1つの好ましい態様において、BiRのG18、V35、G39および／もしくはR41位の任意の組み合わせ、または野生型EGFのG18、V35、G39および／もしくはR41に対応する他のHERリガンドの位置での置換、欠失または挿入は、本発明のHERリガンドキメラを設計するときに可能である。結合ドメイン（ドメインIまたはIII）の1つを介した崩壊された結合を有するが、他の結合ドメインを介した増大する結合（向上した親和力）を有するバリアントを調製することが特に好ましい。本発明の好ましいHERリガンドバリアントはBiRV35EG39Lである。
【００２５】
本発明によるHERリガンドポリペプチドバリアントは、多数の方法を用いて設計、生成および試験され得る。ドメイン交換、アミノ酸置換、欠失または挿入は、部位特定的突然変異誘発などの当該分野において公知の方法で達成され得る。次いで、本明細書に記載のもの、または任意の他の適切なスクリーニングアッセイなどのインビトロスクリーニングアッセイを用いて、得られる変異ポリペプチドをPan-HERアンタゴニスト活性に対して試験する。
【００２６】
本明細書に記載され、図５A〜Dに示されたデータは、G39にてアミノ酸置換を有し、アンフィレグリン、ベータセルリン、エピレグリンおよびTGFαなどの別の異なるHERリガンド由来の置換されたドメインを有するEGFに基づくHERリガンドポリペプチドバリアントが、細胞の増殖を抑制することを示す。本発明の候補ポリペプチドの抑制的活性、またはPan-HERアンタゴニスト活性は、任意の他の適切なアッセイまたは他の方法でさらに評価され得、野生型ヒトリガンドポリペプチドの存在下でHER活性と比較され得る。
【００２７】
上記したように、本発明のポリペプチドバリアント、そのホモログおよびアナログは、野生型リガンドに対して実質的な同一性を有する。本明細書に用いられる場合、「実質的な同一性」とは、野生型ヒトリガンドのアミノ酸配列（またはバリアントがドメイン交換で生成されるキメラであるという場合におけるそのドメイン）に対して、少なくとも60%配列同一性、好ましくは少なくとも70%同一性、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%配列同一性を意味するが、HER抑制的活性または他のPan-HERアンタゴニスト活性を保持する。他の態様において、本発明のポリペプチドバリアントは、野生型ヒトリガンドのアミノ酸配列に対して、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、または少なくとも98%アミノ酸配列同一性を有するが、HER抑制的活性または他のPan-HERアンタゴニスト活性を保持する。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性の割合は、最適な比較目的のために配列をアラインメントすること（例えば、ギャップを第一配列の配列中に導入し得る）によって測定され得る。次いで、対応する位置にてアミノ酸は比較され、2つの配列間の同一性の割合は、両配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち同一性の割合＝同一の位置の数／位置の総数x100）である。2つの配列の実際の比較は、例えば数学アルゴリズムを用いた周知の方法で達成され得る。かかる数学アルゴリズムの好ましい非限定例は、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993) に記載される。かかるアルゴリズムは、Schaffer et al., Nucleic Acids Res. 29:2994-3005 (2001) に記載されるように、BLASTNおよびBLASTXプログラム（バージョン2.2）中に組み込まれる。
【００２８】
本発明のポリペプチドバリアントは、いくつかの手法で作製され得る。1つの好ましい態様において、本発明のポリペプチドバリアントは、関連するポリペプチドバリアントをコードする適切な遺伝子の宿主内における発現で生成される。かかる遺伝子は、本明細書に記載されるように野生型ヒト遺伝子の部位特定的突然変異誘発によって最も容易に調製される。しかし、本発明のポリペプチドバリアントは、メリフィールド型合成等の化学合成技術によって、全体的にまたは部分的に生成され得る。本発明の修飾ポリペプチドの全部または一部の化学合成は、ポリペプチドバリアントにおける非天然のアミノ酸置換基の使用の場合に特に望ましくあり得る。
【００２９】
本発明はまた、本発明のHERリガンドポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸分子はRNA、例えばmRNA、またはDNAであり得る。DNA分子は二重鎖または一本鎖であり得る。核酸分子はまた、マーカー配列、例えばポリペプチドの単離または精製において補助するためのポリペプチドをコードする配列と融合し得る。かかる配列としては、限定されないが、グルタチオン-S‐トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質をコードするもの、インフルエンザ由来の赤血球凝集素A（HA）ポリペプチドマーカーをコードするもの、およびHisタグをコードする配列を含む。
【００３０】
当業者には、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および所望のポリペプチドの発現のレベルなどの要素に依存し得ることが認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸分子によってコードされる、融合ポリペプチドを含む本発明の修飾されたポリペプチドが作製される。本発明の修飾されたポリペプチドの組換え作製を行なうための分子生物学技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press); 第3版, 2000)に記載されている。
【００３１】
本発明はまた、本明細書に記載のHERリガンドポリペプチドバリアントを含む医薬組成物に関する。例えば、本発明のポリペプチドバリアントは、医薬組成物を調製するための生理学的に許容され得る担体または賦形剤により製剤化され得る。担体および組成物は滅菌であり得る。製剤は投与様式に適しているべきである。
【００３２】
適当な薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、水、塩溶液(例えば、NaCl)、生理食塩水、バッファー生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼまたはデンプンなどの炭水化物、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、およびその組合せが挙げられる。また、リポソームおよびマイクロエマルジョンなどの担体が使用され得る。本発明のポリペプチドバリアントはまた、ポリペプチドの早すぎるクリアリングを最小にするために、アルブミンなどのタンパク質担体、またはポリエチレングリコールなどのポリマーに共有結合され得る。医薬調製物は、所望により、組成物中の活性剤 (すなわち、本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子) と有害に反応しない補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、バッファー、着色剤、香料および／または芳香性物質などと混合され得る。
【００３３】
組成物は、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含有し得る。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、持続放出製剤、または粉末であり得る。組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤および担体により座剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【００３４】
これらの組成物の導入方法としては、限定されないが、経皮、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口および鼻腔内が挙げられる。導入の他の適当な方法としてはまた、遺伝子療法(以下に記載のような)、再充填可能または生分解性デバイス、粒子加速デバイス (「遺伝子銃」)および低速放出ポリマーデバイスが挙げられ得る。本発明の医薬組成物はまた、他の化合物との組合せ治療の一部として投与され得る。
【００３５】
本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントは、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として、通常の手順に従って製剤化され得る。例えば、静脈内投与のための組成物は、典型的には、滅菌等張性水性バッファー中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位の痛みを緩和するための局所麻酔を含み得る。一般に、成分は、別々または単位投薬形態で一緒に混合されてのいずれかで、例えば、活性化合物 (ポリペプチドおよび／または核酸)の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉シールされた容器内に乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、これは、滅菌医薬グレードの水、生理食塩水またはデキストロース/水を含む注入ボトルで分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが成分が投与前に混合され得るように提供され得る。
【００３６】
本明細書に記載のHERリガンドポリペプチドバリアントは、中性または塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来のものなどの遊離アミノ基と形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来のものなどの遊離カルボキシル基と形成されるものが挙げられる。
【００３７】
本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントは治療有効量で投与される。特定の障害または状態の処置において治療的に有効であるポリペプチドの量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。また、最適な投薬量範囲を確認するのを補助するため、インビトロまたはインビボ アッセイが任意に使用され得る。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または状態の症状の重篤性に依存し、担当医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から外入され得る。
【００３８】
本発明はまた、HER過剰発現を特徴とする状態の処置方法 (予防的、診断的および／または治療的) に関する。「HER過剰発現を特徴とする状態」は、本発明のポリペプチドバリアントの存在が治療的である状態である。かかる状態としては、多くの型の癌が挙げられる。例えば、中胚葉および外胚葉起源の多くの腫瘍は、HERファミリーメンバーを過剰発現する。HER受容体は、多くの神経膠腫、扁平上皮癌、乳癌、黒色腫、浸潤性膀胱癌および食道癌で過剰発現されることが示されている。また、原発性ヒト乳腺癌での研究は、高いHER遺伝子発現と、転移の存在、増殖のより高い割合、およびより短い患者の生存との間の相関性を示す。HER遺伝子の過剰発現はまた、乾癬、および線維症などの種々の他の障害に関与し得る。
【００３９】
本明細書で使用される用語「処置」は、疾患または状態と関連する症状の改善だけでなく、疾患の発症の予防または遅延および疾患または状態の症状の重篤性または頻度の低下をいう。1種類より多くの本発明のポリペプチドバリアントが、所望により、同時治療処置養生法として同時に使用され得る。本明細書で使用されるように、「同時治療処置養生法」は、2種類の薬物が、別々もしくは組み合わせた製剤のいずれかで同時に、または数分、数時間もしくは数日離れた異なる時点で逐次で投与されるが、所望の治療応答を提供するようにいくつかの様式で一緒になって作用する処置養生法を意味する。本発明のポリペプチドはまた、HER受容体の種々の異常な活性を阻害する他の薬物と組み合わせて使用され得る。かかるさらなる薬物としては、限定されないが、HER特異的抗体、小分子キナーゼインヒビターおよび伝統的な化学療法剤が挙げられる。
【００４０】
本発明の治療用化合物(１つまたは複数)は、治療有効量 (すなわち、疾患または状態と関連する症状を改善すること、疾患または状態の発症を予防もしくは遅延させることなどによって、および／または疾患または状態の症状の重篤性もしくは頻度を低下させることによっても疾患または状態を処置するのに充分な量)で投与される。特定の個体の疾患または状態の処置において治療的に有効である量は、疾患の症状および重篤性に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。また、最適な投薬量範囲を確認するのを補助するため、インビトロまたはインビボ アッセイが任意に使用され得る。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または状態の重症性に依存し、担当医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から外入され得る。
【００４１】
本発明の治療用化合物は、単独または上記の医薬組成物のいずれかで使用され得る。例えば、本発明の修飾ポリペプチドの遺伝子は、それ自体によって、またはベクターに含めて、細胞が所望のポリペプチドを産生するように、細胞内に導入され得る (インビトロまたはインビボいずれか)。所望により、本発明の核酸分子でトランスフェクトされた細胞は、疾患に罹患した個体内に導入(または再導入され)得る。
【００４２】
ウイルスおよび非ウイルス導入系を含む他の遺伝子導入系が使用され得る。あるいは、リン酸カルシウム共沈降、機械的技術 (例えば、マイクロインジェクション); エレクトロポレーション; リポソームを介する膜融合媒介方導入; または直接DNA取り込みなどの非ウイルス遺伝子導入法もまた、所望の核酸分子を細胞内に導入するために使用され得る。
【実施例】
【００４３】
実施例1 : 方法および材料
クローニングおよび遺伝子発現。ヒト上皮増殖因子遺伝子(EGF)を化学的に合成し、Pet-9aベクター (Novagen)内のNdeIおよびBamHIクローニング部位に連結した。EGF遺伝子は、OmpAリーダー配列、その後にN-末端6x-hisタグ、および必要であれば、後のhis-タグ除去のための第Xa因子切断部位を含み、以下のアミノ酸配列:
2008527978.tif 000003
に対応する。
【００４４】
pMLPPlと指定するこのオリジナルのクローンを、QuickChange変異誘発キット(Stratagene)を用いて、すべてのPan HERリガンドバリアント(置換、欠失、挿入およびドメインスワップバリアントを含む)を作製するための基礎として使用した。タンパク質作製のため、EGFプラスミドを大腸菌株BL21 (DE3) pLysS (Novagen)内に形質転換した。
【００４５】
リガンドバリアントの作製。単一のコロニーを振とうフラスコ内の15ml LB + Km25 + Cm30を含む培養物に接種した。一晩成長後、培養物の試料をストックのため、およびEGFバリアント遺伝子挿入物の同定を確認するためのプラスミド調製(prep)のために凍結した。Terrificブイヨン + Km25 + Cm30中の作製培養物を播種するため、残留する培養物を使用した。細胞を初期対数期中に0.2 mM IPTGで誘導し、培養物を一晩成長させた。培養上清みを遠心分離によって回収し、一次抗体:1:1000マウス抗ペンタhis 抗体 (Qiagen cat#34660)を用い、
Mouse Western Breeze Chromogenic Immunodection System (Invitrogen cat#WB7103)を用いてドットブロットによって産生を確認した。
【００４６】
EGFタンパク質精製。3mlのNi-NTA樹脂(Qiagen #30230)を用い、PBS pH8.0で平衡化した5mlカラム(Qiagen cat#34964)を充填した。培養上清みを、カラムにかける前に1N HCLでpH7.5〜8.0に調整した。カラムをPBSおよびPBS+10mMイミダゾールで洗浄し、EGFバリアントタンパク質をPBS + 250mMイミダゾールでカラムから溶出した。タンパク質濃度をモニターするためにBradfordタンパク質アッセイを使用した。
【００４７】
タンパク質濃縮物およびバッファー交換。カラム溶出物を4℃のPBSのバッファー中で透析し、1回バッファー交換し、次いで、3000 MWCO Macrosep遠心デバイス (ISC# OD003C41)で濃縮した。BCA法を用いてタンパク質濃度を、SDS-PAGEによって純度を最終生成物を試験した。
【００４８】
実施例2: 細胞増殖刺激アッセイ
ヒトEGF受容体を発現するように安定にトランスフェクトされたマウス線維芽細胞株 (NR-6株由来)であるHER5細胞株は、M.C. Hung博士(MD アンダーソン癌センター)によって提供された。HER5のストック培養物を、加湿5%CO2雰囲気中、37℃で水ジャケットを取り付けたインキュベーター内で、10%ウシ胎児血清、100単位/mlのペニシリンおよび100 ug/mlのストレプトマイシンを含有するD-MEM/F12培地中に播種した。HER5増殖アッセイのため、細胞を血清なしのDMEM/F12に24時間交換した。次いで、細胞をトリプシン処理し、1E5細胞/mlで懸濁した。EGF (PeproTech, Rocky Hill, NJ)の連続希釈物、およびHERリガンドポリペプチドバリアントを、無血清 DMEM/F12中で最終濃度の2倍で調製し、96-ウェルプレートのウェルで培養した。50マイクロリットルの細胞懸濁液(5000細胞)を適切なウェルに添加し、所望の濃度で全容量を100 ulにした。プレートを48時間の増殖期間インキュベートした。10 ul/ウェルのWST-I Cell Proliferation Reagent (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)の添加によって、増殖期間の最後の3時間に細胞増殖を測定した。WST-1は、生細胞内でミトコンドリアデヒドロゲナーゼによってホルマザン色素に切断されるテトラゾリウム塩である。ホルマザンの量をMRX Revelationソフトウエアとともにマイクロプレートリーダー (Dynex Technologies) を用いて450 nmで測定した。
【００４９】
MCF-7細胞は、American Type Culture Collection (ATCC)から得た。MCF-7のストック培養物を1%ITS-X (Invitrogen)および10%ウシ胎児血清を添加したイーグルMEM中に維持した。増殖アッセイのため、MCF-7細胞を24時間無血清培地 (SFM)に移し、次いでトリプシン処理し、SFM中に1E5細胞/mLで懸濁した。50マイクロリットルの細胞懸濁液(5000細胞)を96ウェルマイクロタイタープレート内のウェルごとに培養した。HERリガンドまたは変異タンパク質の連続希釈物をSFM中で最終濃度の2倍で調製し、50 ulをウェルに添加し、所望の最終濃度で最終容量を100 ulにした。加湿5%CO2雰囲気中、72時間37Cでプレートをインキュベートした。10 ul/ウェルのWST-I Cell Proliferation Reagent (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)の添加によって、増殖期間の最後の3時間に細胞増殖を測定した。
【００５０】
試験したHERリガンドポリペプチドバリアントは、BiRegulin、BiRV35EG39LならびにBループドメインが、アンフィレグリン (G39L+Amp ds)由来の対応するドメインで置換されたEGF G39L、Bループドメインが、ベータセルリン (G39L+BTC ds) 由来の対応するドメインで置換されたEGF G39L; Bループドメインが、エピレグリン(G39L+Epi ds) 由来の対応するドメインで置換されたEGF G39L;およびBループドメインが、TGF-α (G39L+TGF-alpha ds) 由来の対応するドメインで置換されたEGF G39Lであった。
【００５１】
EGFRの2種類の拮抗的リガンドEGFおよびBiRegulinによって刺激された上皮癌細胞株であるA431細胞におけるEGFRの自己リン酸化を図2に示す。また、図3は、置換V35EおよびG39Lを有するBiRegulinは、自己リン酸化を刺激しないことを示す。
【００５２】
HER5細胞(ヒトEGFRを過剰発現するマウス線維芽細胞細胞)およびMCF-7細胞(HER2およびHER3を発現するヒト乳癌細胞株)の刺激を、それぞれ図3および4に示す。HER5細胞は、EGFおよびBiRによって刺激され得るがHRGには刺激されない。MCF-7細胞は、BiRおよびHRGによって刺激され得るがEGFには刺激されない。どちらの細胞株もBiRV35EG39Lによって刺激されない。
【００５３】
図5に示すように、結果は、ドメインスワップが、EGF G39Lアンタゴニスト活性を保持し、続けて細胞増殖を阻害することを示す。
【００５４】
本明細書に示す特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に示されたすべての米国特許および公表または未公表米国特許出願は参照により本明細書に援用される。本明細書に示されたすべての公表された外国特許および特許出願は参照により本明細書に援用される。本明細書に示されたすべての他の公表された参考文献、文献、原稿および科学文献は参照により本明細書に援用される。
【００５５】
本発明を、その好ましい態様を参照して具体的に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、EGF、HRGβ1およびBiRの配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、EGFR、EGFおよびBiRegulinに対して2つの拮抗関係のリガンドで刺激された、上皮癌細胞株のA431細胞におけるEGFRの自己リン酸化を示すグラフである。置換V35EおよびG39Lを有するBiRegulinは、自己リン酸化を刺激しない。
【図３】図３は、HER5細胞（ヒトEGFRを過剰発現するマウス線維芽細胞）の刺激を示すグラフである。HER5細胞は、EGFおよびBiRで刺激され得るが、HRGでは刺激され得ない。細胞株は、BiRV35EG39Lで刺激されない。
【図４】図４は、MCF-7細胞（HER2およびHER3を発現するヒト乳癌細胞株）の刺激を示すグラフである。MCF-7細胞は、BiRおよびHRGで刺激され得るが、EGFでは刺激され得ない。細胞株は、BiRV35EG39Lで刺激されない。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントの存在下での細胞増殖アッセイを示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントの存在下での細胞増殖アッセイを示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントの存在下での細胞増殖アッセイを示すグラフである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、本発明のHERリガンドポリペプチドバリアントの存在下での細胞増殖アッセイを示すグラフである。
【図１】
2008527978.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2008527978.tif 000010
【図５Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月31日(2007.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト野生型上皮増殖因子(EGF)のアミノ酸Gly 39に対応するアミノ酸位置が別のアミノ酸で置換されたHERリガンドポリペプチドを含み、該HERリガンドポリペプチドが少なくとも１つの置換されたドメインをさらに含み、少なくとも１つのPan-HERアンタゴニスト活性を有する、ヒト上皮受容体(HER)-リガンドポリペプチドバリアント。
【請求項２】
HERリガンドポリペプチドがEGFである、請求項１記載のバリアント。
【請求項３】
アミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン酸、およびイソロイシンからなる群より選択される、請求項１記載のバリアント。
【請求項４】
アミノ酸置換がロイシンである、請求項１記載のバリアント。
【請求項５】
置換されたドメインがEGFのアミノ末端である、請求項１記載のバリアント。
【請求項６】
HERリガンドポリペプチドがEGFであり、置換されたドメインが、アミノ酸NSDSEに対応する成熟EGFのアミノ酸1〜5である、請求項１記載のバリアント。
【請求項７】
EGFの置換されたドメインが、アミノ酸SHLVKに対応するHRGβ1の相同アミノ酸で置き換えられた、請求項６記載のバリアント。
【請求項８】
HERリガンドポリペプチドがBiRegulin (BiR)である、請求項１記載のバリアント。
【請求項９】
アミノ酸Gly 39がアミノ酸ロイシンで置き換えられた、請求項８記載のバリアント。
【請求項１０】
野生型ヒトEGFのGly 39に対応するアミノ酸位置以外の位置に少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む、請求項１記載のバリアント。
【請求項１１】
さらなるアミノ酸置換が、野生型ヒトEGFのG18、V35、およびR41または任意のその組合せに対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸置換から選択される、請求項１０記載のバリアント。
【請求項１２】
アミノ酸位置V35にさらなるアミノ酸置換を含む、請求項８記載のバリアント。
【請求項１３】
アミノ酸位置35のバリンがグルタミン酸で置き換えられた、請求項１２記載のバリアント。
【請求項１４】
BiRV35EG39Lを含む、請求項１記載のバリアント。
【請求項１５】
HERl、HER3およびHER4の各々に対する少なくとも１つのアンタゴニスト活性を有する、請求項１記載のバリアント。
【請求項１６】
HERリガンドポリペプチドが、ヒト上皮増殖因子(EGF)、トランスホーミング増殖因子-α (TGFα)、ベータセルリン、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)、ニューレグリン、ヘレグリン、アンフィレグリン (AR)およびエピレグリンからなる群より選択される、請求項１記載のバリアント。
【請求項１７】
置換されたドメインがB-ループドメインである、請求項１記載のバリアント。
【請求項１８】
ヒト上皮増殖因子(EGF)、トランスホーミング増殖因子-α(TGFα)、ベータセルリン、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB- EGF)、ニューレグリン、ヘレグリン、アンフィレグリン (AR) およびエピレグリンからなる群から選択される別のHERリガンドポリペプチドの対応するB-ループドメインで置換されたB-ループドメインを有するEGF G39Lを含み、少なくとも１つのPan-HERアンタゴニスト活性を有する、請求項１記載のHERリガンドポリペプチドバリアント。
【請求項１９】
請求項１、１５または１８記載のHERリガンドポリペプチドバリアントおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
HERの過剰発現を特徴とする疾患を処置するための請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
疾患が癌である、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
癌が、神経膠腫、扁平上皮癌、乳癌、黒色腫、浸潤性膀胱癌、結腸直腸癌および食道癌からなる群より選択される、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
疾患が乾癬である、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２４】
少なくとも１つのPan-HERアンタゴニスト活性を有し、ドメインIおよび／またはIIIによる結合を破壊する変異を含む、ヒト上皮受容体(HER)-リガンドポリペプチドバリアント。
【請求項２５】
ドメインIによる結合を破壊する変異を含む、請求項２４記載のバリアント。
【請求項２６】
ドメインIIIによる結合親和性を増強する変異をさらに含む、請求項２５記載のバリアント。
【請求項２７】
ドメインIIIによる結合を破壊する変異およびドメインIによる結合親和性を増強する変異を含む、請求項２４記載のバリアント。
【請求項２８】
受容体結合特異性を調節する変異をさらに含む、請求項２４記載のバリアント。
【請求項２９】
請求項１、１４、１８または２４記載のバリアントをコードする核酸。