(57)【要約】  ａ）神経幹細胞接着、分枝および分化を促進するコーティング溶液でヒアルロン酸誘導体を処理するステップと、  ｂ）単離された神経幹細胞をステップａ）で得られたヒアルロン酸誘導体と接触させ、βＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＣＮＴＦ（繊毛様神経栄養因子）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）およびＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）から選択された増殖因子もしくは神経栄養因子またはそれらの混合物の存在下で前記吸収された細胞を培養し、拡張させるステップとによって得ることができる、脊髄または末梢神経傷害を治療するための生体物質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）神経幹細胞接着、分枝および分化を促進するコーティング溶液でヒアルロン酸誘導体を処理するステップと、
ｂ）単離された神経幹細胞をステップａ）で得られたヒアルロン酸誘導体と接触させ、βＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＣＮＴＦ（繊毛様神経栄養因子）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）およびＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）から選択された増殖因子もしくは神経栄養因子またはそれらの混合物の存在下で前記吸収された細胞を培養し、拡張させるステップとによって得ることができる、脊髄または末梢神経の損傷を治療するための生体物質。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸誘導体が、ヒアルロン酸のエステル、アミド、架橋結合、過カルボキシル化および硫酸化誘導体から選択される、請求項１に記載の生体物質。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸誘導体が、エステル化度が７５から１００％の範囲のエステルである、請求項２に記載の生体物質。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸誘導体が、ヒアルロン酸の１００％エステルである、請求項３に記載の生体物質。
【請求項５】
繊維、ゲル、不織布および織布、薄膜および連続壁または多孔壁のいずれかを有するチューブの形態である、請求項１に記載の生体物質。
【請求項６】
前記コーティング溶液がフィブロネクチンおよびラミニンを含む、請求項１に記載の生体物質。
【請求項７】
損傷部位に請求項１から６に記載の生体物質の移植片を含む、脊髄損傷または末梢神経損傷の治療方法。
【請求項８】
請求項１から６に記載の生体物質に移植された神経幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の主題）
本発明は、ヒアルロン酸誘導体のみから形成された足場か、または神経幹細胞が接種された足場を移植した後の脊髄損傷および末梢神経損傷の再生を対象とする。
【０００２】
（発明の背景）
ヒアルロン酸は、遊走細胞および増殖細胞を取り囲む細胞外マトリックスの主要成分である。これは、非常に長い、負に荷電した多糖類であり、その各分子は、グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンによって構成された単純な二糖類の５００００回もの繰り返しから成っている。実際に、創傷治癒、糖尿病性潰瘍、白斑治療、腹腔鏡接着の予防、抗接着性表面コーティング、軟骨再生において、その誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ適用が成功していることに触れるのは重要である。
【０００３】
ＨＡ誘導体の１種は、自己架橋多糖類と呼ばれる。この場合、ポリマーの安定性は、架橋結合が生じることによって得られたが、他の化学物質はヒアルロン酸鎖の架橋形成には関与しなかった。安定化は、ポリマー鎖のグルクロン酸のカルボキシル基の一定の割合を同じまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシル基で直接エステル化することによって実現した。これらの物質は、濃度が３０〜６０ｍｇ／ｍＬの間で変動可能な、自己網状化微粒子の滅菌蒸留水による粘度の高い懸濁液である。
【０００４】
ＨＡ誘導体を得る他の方法は、多糖類の特定の官能基（例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、Ｎ−アセチル基）がエステル化、硫酸化、アミド化などの化学反応によって修飾されるカップリング反応の使用を伴う。
【０００５】
これらのＨＡ修飾生体物質はすべて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて酵素活性または加水分解によって自然に分解され、ＨＡ分子の断片および以前に結合していた官能基（ベンジルまたはエチルアルコール、アミドなど）を生じる。
【０００６】
ＨＡ誘導体の合成は通常、２ステップ法、ＨＡの４級塩の調製および非プロトン性溶媒中における制御された温度での化学薬剤とのその後の反応（エステル化、アミド化など）を伴う。様々なアルコールをエステル化に使用することができる（脂肪族、芳香族脂肪族、脂環式など）。アミド化ＨＡは、ＥＰ１０９５０６４に従って調製することができる。ヒアルロン酸エステルは、例えば、ＥＰ２１６４５３によって知られている。ＨＡのＯ−硫酸化誘導体は、ＥＰ７０２６９９によって知られている。
【０００７】
ＨＡの過カルボキシル化誘導体は、ＥＰ１３３９７５３によって知られている。
【０００８】
化学反応中に置換された化学基によって（および置換の割合によっても）、得られた生体物質はまったく異なった機械的特性をもたらすことができた。例えば、エステル化ＨＡの場合、疎水性を増加させ、カルボキシル基の負電荷を減少させることによって滞留時間が増加する。
【０００９】
角化細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、間葉幹細胞、内皮細胞、肝細胞、尿路上皮細胞および神経細胞は、ＨＡ修飾生体物質上に効果的に増殖することがわかってきた。しかし、すでに説明した架橋ＨＡ誘導体の大部分は、非常に水和化された物質であり、細胞接着性がなく、この理由のため、最初、手術癒着防止用の吸収可能な物質として考えられた。
【００１０】
本発明者らの最初の組織工学の取り組みは、完全に生分解できる生体物質のこの重要な多様性を試験することであった。ＨＡをベースにした生成物は、臨床適用について欧州共同体の承認を受け、３種の生成物はＦＤＡに承認された。
【００１１】
ＳＣＩ（脊髄損傷）の特徴は、組織破壊、不完全修復および損傷部位周囲の創傷治癒の連続的なプロセスの結果である。かなり多くの証拠が、ＳＣＩは３つの相：急性、続発性および慢性相によって生じることを示唆している。初期のコア障害は徐々に拡張し、ＳＣＩは慢性相へと進展する。白質は、伝導不足に関係する部分的または完全な髄鞘脱落を示す。ＳＣＩ患者の約２５％が中枢に徐々に拡張する嚢腫を発症し、脊髄空洞症を引き起こす。
【００１２】
さらに他の組織病理学的特徴には、灰白質溶解、結合組織沈着および神経膠腫が含まれる。損傷の範囲および位置は、神経障害全般、過剰興奮性の発症、および慢性疼痛症候群を決定する。
【００１３】
研究上興味のある主な領域が損傷の生理学的応答または続発性損傷の病態生理学であるならば、研究者は、ヒトＳＣＩと非常によく似ているので、挫傷モデルを選択することができる。しかし、挫傷モデルにおいて再生軸索を明瞭に示すこと、特に温存軸索および再生軸索の描写は、新たな難題を提起する。
【００１４】
行動研究および運動−感覚経路回復の統計学的評価も、挫傷モデルの非常に重要なステップとなることができ、そのモデルでは、動物対照群（損傷はしているが、治療はされていない）は欠如した神経結合の一部を自然に回復する。
【００１５】
装置を提供しなければならない場合、部分的または完全な切断モデルが装置設置に最も適している。ある種の実験例では、モデルの組合せを計画することができる。例えば、軸索再生を探索する実験計画の初期段階では、再生軸索を明瞭に示し、最も有望な治療を確認するために、切断モデルを使用し、次に分析技術によって挫傷モデルで試験することができる。
【００１６】
切断モデルでは、再生軸索から温存軸索を区別する能力は問題ではない。ある種の適用では、片側切断損傷を完全切断の実行可能な代替とすることができる。このアプローチの主な利点は、脊髄の片側の構造的強度および機能を維持できることである。片側脊髄温存は通常、膀胱および腸機能を維持するのに十分で、術後動物の看護が緩和される。
【００１７】
これらの理由のため、ラットの脊髄片側切断を、損傷後およびエステル化ＨＡで形成された足場移植後の脊髄再生を試験するための実験動物モデルとして使用したが、一方、末梢神経再生の試験のためには、座骨神経の完全切断を実施した。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
ヒアルロン酸から得られた膜および繊維：多成分足場
本発明の実験の最初のステップは、ヒアルロン酸の様々な種類、部分的および全体的エステル化型、Ｎ−硫酸化型、部分的アミド化型（ゲル）、過カボキシル化型、およびいくつかの自己架橋型（ゲル）の間の一般的なｉｎ ｖｉｔｒｏにおける比較である。本明細書で説明した本発明に特に適しているのは、ＨＡエステル類、特にベンジルエステル（ＨＹＡＦＦ（登録商標）１１）であることがわかった。
【００１９】
様々な割合でエステル化されたＨＡ（エステル化度＞７０％、好ましくは７５から１００％、さらにより好ましくは１００％）は、堅くて部分的に柔軟な構造、不織網および不織平行繊維から織物状チューブ構造およびその他の研究および組織工学応用で皮膚、管状組織、軟骨の再生にすでに利用されている薄膜までの範囲で提供された。ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング実験はすべて、ＮＳＣ（神経幹細胞）の採集および拡張のために確立されたプロトコルに従って実施された。
【００２０】
実験プロトコルを以下に説明する
−  類似の３次元足場のみを比較した(すなわち、繊維は繊維と、薄膜は薄膜と比較)
−  混合細胞集団に対して幹細胞の可能な限り高い割合を維持するために、接種２日前に神経幹細胞を機械的分離した
−  場合によっては、ＨＡ足場を様々なコーティング溶液、マウスラミニン（５μｇ／ｃｍ2）、ヒトフィブロネクチン（１０μｇ／ｃｍ2）、ラミニンおよびフィブロネクチン混合物に浸漬した
−  １条件当たり総細胞数２０００００〜３０００００個を接種し、培地２０μｌに濃縮した
−  各足場をこの高濃度細胞溶液のみに３０分間浸漬した
−  ｂＦＧＦを含有する培地を最終濃度２０ｎｇ／ｍｌで添加した
−  ３日後、培地をＣＮＴＦおよびＢＤＮＦ構成培地（いずれの場合も２０ｎｇ／ｍｌ）に替えた
−  ２日毎に培地を交換した
−  播種して７日後および１４日後にＭＴＴ測定法によって細胞生存率を試験した
−  細胞が生存している場合、共焦点倒立蛍光顕微鏡による染色イメージングを実施した
−  マウスおよびヒト幹細胞を使用した。
【００２１】
図１では、生細胞ＭＴＴ染色によって、完全にエステル化されたＨＡで形成された１本の不織繊維および薄膜の青色が明瞭に認められる。
【００２２】
この青色は、生きているミトコンドリアがＭＴＴ試薬によって産生した不溶性青色ホルマザン産物によるものである。繊維は、生細胞によって完全に被覆されている。スケールバーは５００μｍである。
【００２３】
試験したコーティング溶液の中で、一緒に混合したフィブロネクチンおよびラミニンが最高の細胞生存率を示し、この比較は同一の細胞培養用培地を維持している前述の生体物質すべてについて実施された。したがって、このコーティング溶液は、次に続くｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの実験すべてのための標準プロトコルの一部としてこの時点から採用された。
【００２４】
次のステップとして、ＮＳＣ増殖、ニューロン表現型への分化を促進するため、およびｉｎ ｖｉｖｏ実験において神経系再生を促進することがわかっている蛋白質を選択するために、培地で希釈した増殖因子および神経栄養因子の様々な組合せを試験した。
【００２５】
したがって、細胞増殖に対する効果を試験した
βＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）
βＦＧＦ＋ＣＮＴＦ（繊毛様神経栄養因子）
βＦＧＦ＋ＣＮＴＦ＋ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）
βＦＧＦ＋ＣＮＴＦ＋ＢＤＮＦ＋ＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）
これら最後に記載した増殖因子はすべて、濃度２０ｎｇ／ｍｌで試験した。
【００２６】
表１では、不織繊維および薄膜足場の両方について、神経栄養因子の最も完全な組合せで得られた（生ＮＳＣの）吸収最高値が明白に示されている。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
培地に含まれる栄養因子は、生細胞集団（ｎ＝８）の最終的な大きさに強い影響を及ぼした。値は、吸収単位で表す。ＭＴＴ測定法におけるこれらの傾向はすべて、ヒトＮＳＣを使用しても再現された。
【００２９】
薄膜および繊維足場上での細胞形態および組織分布は、マウスおよびヒト両方の細胞について、すでに説明した実験すべてにおいて、正立および倒立光学顕微鏡によって評価した。
【００３０】
図２は、１００％エステル化ＨＡの極細繊維（ａ、ｂ）および薄膜（ｃ、ｄ）に接種したヒト神経幹細胞の播種５日後の染色を示す。細胞核（ｂ、ｄ）は、ＤＡＰＩで青色に染色される。左の列では、ニューロンおよび星状膠細胞は、ｂチューブリン抗体で緑色（ａ、ｃ）に、ＧＦＡＰ抗体で赤色（ｃのみ）に染色する。繊維の場合、分化するＮＳＣがどのように本体を伸長し、各繊維の縦軸に沿って分枝を伸ばすかを示すことができる。スケールバーは５０μｍである。
【００３１】
蛍光標識も３次元足場における細胞形態の試験に欠かせないことがわかり、この場合、蛍光および共焦点蛍顕微鏡によってイメージングが実施された。
【００３２】
十分均一な細胞分布は、不織繊維および薄膜足場に到達し、不織網および織物チューブは、定常状態（すなわち、人工的培地流に暴露されていない細胞および足場）で均一に接種されることが困難であることがわかった。
【００３３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験終了までに、接着ＮＳＣでＨＡ繊維をほとんど完全に被覆することが可能であった。そのために、細胞増殖および繊維間の自発的な移動を刺激するために、増殖因子を使用した。
【００３４】
共焦点顕微鏡法は、細胞足場３次元イメージングおよび高分解能走査による細胞計数に必須の技術であることがわかった。
【００３５】
（抗接着適用のために計画された）自己架橋ＨＡ、アミド化ＨＡおよび６５％および５０％エステル化されたＨＡで形成されたゲル生体足場も試験し、これらはすべて粉末状で、蒸留水で様々に希釈して試験した。
【００３６】
好ましい条件は、自己架橋ＨＡの乾燥粉末を（ｂＦＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦを含有する）培地および前記で開示したようなコーティング溶液（好ましくはフィブロネクチンおよびラミニンを含む）と混合することを含み、著しい細胞接着および分枝形成（図３参照）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ネットワーク形成の開始は、これらの条件を使用して得られた。
【００３７】
特に、図３は播種４日後の自己架橋ＨＡゲルに接種されたＮＳＣの相対照光学イメージングを示す。図３の（ａ）では、ＨＡを蒸留水で希釈し、（ｂ）ではＨＡを前記の分化培地およびラミニンおよびフィブロネクチンで形成されたコーティング溶液で希釈した。（ａ）で認められた円形状の細胞は、細胞接着、分枝および分化がまったくないことを示し、これは通常、細胞アポトーシスまたは老化を引き起こし、他方、（ｂ）で示された分枝細胞はＮＳＣ分化および生存により都合のよい環境の手がかりを提供する。スケールバーは５０μｍである。
【００３８】
（動物モデルおよび足場設計）
前述の理由のため、ラットの脊髄片側切断を、損傷後およびＨＹＡＦＦ(登録商標)１１で形成された足場の移植後の脊髄再生を試験するための実験動物モデルとして使用した。
【００３９】
末梢神経損傷実験における結果の信頼性を確実にするために、ラットの座骨神経の完全切断を実施した。ＳＣＩおよびＰＮＴ(末梢神経切断)の両方のために、３種類の異なる動物群、障害のみを有するラット(対照群)、障害を有し、生体高分子基質上で分化したヒト(時々マウス)ＮＳＣを移植されたラットおよび足場のみを与えられたラットを作製した。
【００４０】
３Ｄ方向への細胞増殖および分化を誘導しようと、ＳＣＩおよびＰＮＴの両方について類似の足場を設計し試験した。
【００４１】
−  １００％ＨＡベンジルエステルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において有望な結果が得られ（前章参照）、所望する目標に近い推定生分解時間（２〜３カ月）であったので、足場の主要成分として選択した。
【００４２】
−  縦に方向付けられた神経線維へのほとんどの脊髄路および末梢神経の細胞構築を簡単にするために、(前章において示された)細胞方向付けに影響を与え、内因的神経突起の空間的再生を修正することができる３Ｄ支持物として、空間的に方向付けられた繊維（２０μｍ〜５０μｍ）を採用した。
【００４３】
本質的に開放型多孔性構造で、機械的剛性が乏しいので、ＰＮＴの場合、これらの繊維で形成された基質は、連続壁または多孔壁のいずれかを有する幅２ｍｍの（類似の生体物質で形成された）チューブに挿入された。前記チューブは、チューブ内への膠細胞の貫通を可能にし、神経再生を容易にする増殖因子を放出するために、レーザー穿刺を施すことができる。ＨＹＡＦＦ（登録商標）１１繊維から構成される小チューブはすでに公知で、例えば、尿道の再生のために使用されている(Ｉｔａｌｉａｎｏ Ｇ.他、Ｕｒｏｌ Ｒｅｓ、１９９７、２６：２８１〜２８４)。ＥＰ５７１４１５は、ＨＡから常に構成されるらせん状線で支持され、増殖因子が濃縮されたＨＹＡＦＦ(登録商標)１１の円柱を開示している。ＥＰ６５２７７８は、ＨＡチューブを支持する数本の織物線の網目であって、より小型にするために前記線が同一物質から構成され、チューブ本体に挿入されている網目を開示し、この場合も増殖因子は存在している。これら公知の足場は、神経線維の再生のために開発されたが、柔軟性および神経路への適応性の欠如を考慮すると、末梢神経の複雑な再生プロセスに従う順応性について重大な欠陥がある。
【００４４】
ＳＣＩモデルでは、繊維足場は損傷部位にまず配置され、次に傷害周囲の組織からの結合細胞および筋肉細胞の有害な浸潤から再生部位を隔離するために、方形の薄膜がパッチとして使用された。ＰＮＴの場合チューブは神経断片に縫合され、ＳＣＩではパッチはフィブリン接着剤（通常臨床外科で使用される生物学的糊剤）によって封止された。
【００４５】
ＳＣＩの手術の概要を図４に示す。ＰＮＴモデルとの主な違いは、損傷部位(座骨神経)、神経の間隙の長さ(１ｍｍ)、外部足場成分(薄膜の代わりにチューブ)および宿主組織に移植片を貼り付けるためにフィブリン接着剤の代わりに縫合を使用することである。
【００４６】
ＮＳＣをＨＡ足場上に接種し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで２日間培養した。切開によって脊髄の損傷を形成した直後に、細胞および繊維を脊髄路の縦軸に沿って配置した。次に、ＨＡ膜を封止するためにフィブリン接着剤を使用した。
【００４７】
詳細なプロトコルは、培地およびコーティングについて最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を使用する。
【００４８】
−  神経球（またはＮＳＣの集団）を接種２日前に機械的に分離した。
【００４９】
−  細胞接種前日に、足場の各成分をラミニン（２５μｇ／ｍｌ）およびフィブロネクチン（５０μｇ／ｍｌ）で形成されたコーティング溶液に浸漬し、一晩放置した。
【００５０】
−  ＮＳＣ ５×１０5〜７．５×１０5個を培地２０μｌに再懸濁した。この細胞懸濁液を足場に注ぎ、予備接着ステップとして３７℃＋で３０分間放置した。
【００５１】
−  次に、接種した細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでβＦＧＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦを含有する培地で２日間培養した。
【００５２】
生体高分子＋細胞を雌のスプラーグドーリー成体ラット（２５０グラム）の脊髄の急性損傷部（片側切断およびＴ９脊髄路の半分３ｍｍの組織除去）に挿入し、フィブリン接着剤で接着した。
【００５３】
対照動物には、細胞を含まない足場を与えるか、または損傷のみを施した。手術後、動物に免疫抑制剤としてシクロスポリンを毎日投与した。
【００５４】
機能障害の実態を評価するために、動物を週２回モニターし、移植後１〜２または６カ月して殺処分した。
【００５５】
ＰＦＡ４％で心臓潅流した後、脊髄を取り出して、組織化学分析用に処理した。
【００５６】
ＰＮＴモデルでは、座骨神経の完全切断を実施し、神経組織の長さ１ｍｍの切片を取り出し、細胞および足場で形成された架橋（繊維およびチューブ）を両断片に縫合した。この場合も、対照動物群を使用した（細胞を含まない足場、処理を行わない手術）。
【００５７】
ＨＹＡＦＦ(登録商標)１１をベースにした足場のｉｎ ｖｉｖｏ適用：結果
ＳＣＩモデルでは４０匹超の動物を使用した。手術の日毎に各群の動物の少なくとも１匹を手術した。動物を殺処分し、脊髄組織をＰＦＡ４％に包埋し、冠状断面および縦断面の凍結切片を作製した。次に形態学的および免疫組織化学的分析を実施した。
【００５８】
移植細胞への望ましくない免疫応答を防御するために、殺処分の日まで動物に毎日シクロスポリンを投与した。
【００５９】
移植用に様々な細胞株、ヒト神経幹細胞、マウスＮＳＣ、（宿主組織の凍結切片に局在化させるために、核内でマーカー、β−ガラクトシダーゼが発現するように改変された）トランスジェニックマウスＮＳＣを使用した。
【００６０】
移植後初期の週に、単球、Ｔ細胞およびその他の免疫応答関連細胞の通常の（ＳＣＩの生理学的追跡のための）浸潤が認められた。図５に処理３週間後のこの細胞および足場の冠状切片に含まれる酸性成分のブルートルイジン染色（主なＨＡ繊維−大きな点、細胞核−小さな点）を示す。宿主細胞浸潤は繊維の間の間隙を満たした。いくつかの繊維の周りの再吸収された灰色の影は、足場に対する宿主免疫反応の最終段階を証明する。スケールバーは５０μｍである。
【００６１】
しかしこの反応はそのうち停止した（＞２カ月）。足場のみを移植した動物と細胞を接種した足場を移植した動物とでは、これらの基質の生体適合性の有意な違いは認められなかった。
【００６２】
他方、移植されたＮＳＣはこの反応によってあまり劇的な影響を受けないようである。
【００６３】
図６は移植されたトランスジェニックＮＳＣの核染色を示す。移植部位の冠状切片：術後２０日、青色に標識された核を有する細胞は、修飾ＨＡの繊維の間に接着し、分枝している（白丸）。スケールバーは５０μｍである。
【００６４】
この図６では、術後２０日の障害部位の冠状切片（足場のほぼ中央）を見ることができ、移植されたトランスジェニック細胞はＸ−ｇａｌ反応によって青色で標識されており、これは移植されたトランスジェニックＮＳＣによって自発的に生じたβ−ガラクトシダーゼ酵素を示している。
【００６５】
損傷を受けて６カ月後、ＮＳＣはまた、障害の後端および先端から採取された切片に存在し、したがって足場から宿主組織へ移動する能力が本来備わっていることが示された。
【００６６】
最も重要なことは、障害内部での神経組織の再増殖は、神経細線維を化学的に染色するために通常使用される技術(軸索用Ｂｉｅｌｓｈｏｗｓｋｙ銀染色)によって試験された。
【００６７】
治療された動物は、障害部位を取り囲む領域からの神経線維の侵入を示し、この効果は移植後１カ月を過ぎるまでは認められなかった。
【００６８】
図７は障害５０日後の脊髄傷害部位の横断切片の神経細線維染色を示す。神経線維は暗褐色に染色される。低（ａ）および高（ｂ）倍率では、ヒトＮＳＣおよびＨＹＡＦＦ(登録商標)１１足場を移植された動物における神経再生の詳細を示している。（ａ）ＨＡ極細繊維によってできた円形はまだ明瞭に認識することができ、神経線維は左(手術によって損なわれていない左半分)から足場へ侵入している。画像の右部分は依然として孔で満ちている(＝繊維)。（ｂ）ＨＡ極細繊維の中で再生するニューロンの高倍率画像。いくつかの神経束において、単一繊維が認められる。
【００６９】
図８は、損傷を受け、移植された脊髄の連続的縦断切片の（ａ）神経細線維および（ｂ）ヘマトキシリン−エオジン染色を示す。動物は、術後６カ月で殺処分した。「Ｒ」は、脊髄の頭方側を示す。形態染色（ｂ）において移植部位は、赤い曲線で丸く囲ってある。（ａ）の黒線は、使用した銀染色プロトコルによるアーチファクトである。神経線維（暗褐色の線）は、頭方側から損傷部位に侵入した。
【００７０】
神経線維は、足場の側方（図７ａｂ）および頭方（図８ａ）の両方から障害部位に侵入した。
【００７１】
特に、脊髄縦軸に沿って神経線維伸長プロセスの著しい再生を認めることができ（図８ａ）、神経再生を方向付ける方向付け極細繊維を使用する考え方が支持される。
【００７２】
図８ｂでは、形態学的免疫組織化学染色(ヘマトキシリン−エオジン反応)を使用して、原形質および細胞核を着色した。障害部位は赤色の曲線によって人工的に縁取りされている。足場繊維によって組織に平行な空洞ができ、これはＣＮＳ組織に移植されたときに１００％エステル化ＨＡの生体分解時間が長いためにもたらされたことに注意されたい。
【００７３】
今まで、足場はすべて、ＮＳＣが接種されているかどうかにかかわらず、試験した動物すべてにおいて、損傷のみ受けた動物で認められた結果である水性嚢胞およびグリア性瘢痕の形成を妨害した。図９ａｂは、損傷を受けた脊髄（対照群）の連続的縦断切片の（ａ）ヘマトキシリン−エオジン染色および（ｂ）神経細線維染色を示す。動物は術後６カ月で殺処分した。「Ｒ」は脊髄の頭方側を示す。左の写真は、非常に巨大な組織破壊を示し、神経線維から完全に遊離した円形の嚢胞がある（ｂ）。両方の写真には使用したプロトコルのアーチファクトとして連続線が存在する。
【００７４】
３動物群（細胞を接種された足場、足場単独および神経切断し処置せず）の前戦略を採用して、９匹の動物に対して末梢神経切断（座骨神経）プロトコル（前章参照）も実施した。移植された動物の損傷部位にのみ、神経線維侵入、再生繊維の再ミエリン化および血管再生が術後６カ月で認められた（図１０）。
【００７５】
特に、図１０は、切断され、ヒトＮＳＣを接種した１００％エステル化ＨＡ足場を移植された座骨神経の横断切片のトルイジンブルー反応を示している。同切片を障害６カ月後に低（ａ）および高（ｂ）倍率でイメージングした。足場繊維は、まだ存在し（ＨＡで標識した円）、それらの間に再生した神経線維が大量に存在する（ａ）。（ｂ）では単一の神経線維が濃い縁の小円である。繊維のシートが厚ければ厚いほどより再ミエリン化している。（ｂ）では血管も赤い楕円によって囲われている。
【００７６】
足場繊維の間に見いだされる神経線維はすべて、座骨神経切断に使用した完全切断モデルによって再生された繊維であると推定することができる。
【００７７】
したがって結果は以下の通りである
−  選択された生体物質は、中枢神経系および末梢神経系に十分許容され、慢性免疫応答またはアポトーシスは持続しなかった
−  ＳＣＩおよびＰＮＴモデルにおいて、神経再生はＨＡ繊維内で生じた
−  計画した足場は、神経線維の自発的再生に空間的に影響を及ぼした
−  ＰＮＴモデルにおいて、神経線維は部分的にミエリン化した
−  ＮＳＣは、移植して６カ月は生存し、障害部位の外側に移動した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】生細胞ＭＴＴ染色による、不織線維及び薄膜の青色を示す。
【図２】１００％エステル化ＨＡの極細線維および接種したヒト神経肝細胞の播種５日後の染色を示す。
【図３】播種４日後の自己架橋ＨＡゲルに接種されたＮＳＣの相対照光学イメージングを示す。
【図４】ＳＣＩの手術の概要を示す。
【図５】処理３週間後の細胞および足場の冠状切片に含まれる酸性成分のブルートルイジン染色を示す。
【図６】移植されたトランスジェニックＮＳＣの核染色を示す。
【図７】障害５０日後の脊髄傷害部位の横断切片の神経細線維染色を示す。
【図８】損傷を受け、移植された脊髄の連続的銃弾切片の（ａ）神経細線維及び（ｂ）ヘマトキシリン−エオジン染色を示す。
【図９】損傷を受けた脊髄(対照群)の連続的縦断切片の（ａ）ヘマトキシリン−エオジン染色および（ｂ）神経細線維染色を示す。
【図１０】切断され、ヒトＮＳＣを接種した１００％エステル化ＨＡ足場を移植された座骨神経の横断切片のトルイジンブルー反応を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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