(57)【要約】  本発明は、リビング重合を使用した比較的低分子量インプリントポリマーの合成方法、および分析化学、薬理学、製薬工業および食品工業におけるそれらの適用を記載する。特に、生物学的受容体、酵素、核酸、細胞、ウイルス、微生物、組織サンプルまたはリビング開始剤を使用する薬物等の鋳型の存在下で、低分子量ポリマーが官能性モノマーの重合によって合成された。リビング重合の条件は、比較的小さいサイズの合成された分子を確かにする。このように合成された分子（二量体、オリゴマー、ポリマー、またはそれらの混合物）は、鋳型に元のモノマーより高い親和性を有しそして生体外および／または生体内で結合可能である。本発明のさらなる形態として、上記のように合成されたポリマーは、薬理学および医薬において薬物として、分析化学（センサー、試験）で受容体に特異的な配位子として、並びにバイオテクノロジー工業、製薬工業および食品工業において、分離ために使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型の存在下で行われる官能性モノマーの鋳型によるリビング重合によって少なくとも一部が該鋳型の少なくとも一部と相補性である相補性ポリマーを生成することを含むポリマーの溶液またはコロイド懸濁液の調製のための方法であって、該溶液またはコロイド懸濁液の調製に好適な相補性ポリマー粒子が形成された場合に、該方法が該リビング重合を停止させることを含む。
【請求項２】
該方法は、該溶液またはコロイド懸濁液を調製するために、該相補性ポリマー粒子を修飾して、少なくとも一部が該鋳型の少なくとも一部と相補性である誘導ポリマー粒子を生成するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該リビング重合技法が、イニファーター重合、安定フリーラジカル媒介重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合から選択される請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該リビング重合技法が、ニトロキシド媒介ラジカル重合である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該リビング重合技法が、イニファーター重合であり、そして該イニファーター重合が、ジチオカルバミル基を有する光イニファーター；およびアゾ基を有する熱イニファーターから選択される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該リビング重合が、
Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ”、Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミンで錯体化されたＣｕ（Ｉ）Ｂｒを有する２−ブロモプロピオニトリル；
Ｃｕ（ｌ）Ｃｌ／ＰＭＤＥＴＡを有するポリスチレンブロモ高分子開始剤；
ＣｕＣｌ/ビピリジンを有する２−ブロモイソ酪酸エチル；
二臭化１、４−ビス（２,６−ジイソプロピルフェニル）アセトナフテンジイミンニッケル（ＩＩ）；
テトラエチルチウラムジスルフィドと組み合わせた２,２−ジメトキシ−２−フェニルアセフェノン；
テトラフェニルビホスフィン；
第３過酸化物（例えば、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル過酸化物）；
ＳｍＭｅ（Ｃ５Ｍｅ５）２（ＴＨＦ）；
ＴｉＣｌ４と結合したスチレンベースのエポキシド；
メチルスチレン四量体ジナトリウム；
ＭｏＯＣｌ４−ｎ−ＢｕＳｎ−ＥｔＯＨ；
ＨＣｌ／ＺｎＣｌ２；
ｐ−トルエンスルホン酸メチル；
メチル２,１０,１５,２０−テトラフェニルポルフィナトアルミニウム；
３−メチル−１,１−ジフェニルペンチルリチウム；
ＴＨＦ中ブチルリチウム；
モリブデンアルキリジン化合物；
二官能性有機ランタニド（ｌｌｌ）；
Ｍｏ（ＣＨ−ｔ−Ｂｕ）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ３）２；
Ｍｏ（ＣＨＣＰｈＭｅ２）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ（ＣＦ３）２）２；
ＨＩ／Ｉ２；
メチルアルミノキサンまたはフェニルボレートのいずれかと組みわせたＺｒ、ＴｉおよびＨｆ錯体；
Ｐｄ、Ｎｉ、ＦｅまたはＣｏのジイミド錯体；
均一Ｔａ、Ｔｉ、Ｍｏ、Ｗカルベン錯体；
メタロセン型または非メタロセン型錯体からなる希土類金属錯体；
カチオン性モノシクロペンタジエニルジルコニウムアセタミジネート錯体；
１つまたは２つのヒドロキシル基を有するエステル化されたフッ素化テロメア；
およびＹｂ［Ｃ（ＳｉＭｅ３）３］２；
から選択された開始剤によって開始される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該相補性ポリマーが、５００〜１、０００,０００Ｄａの分子量を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該方法が、該重合系から該鋳型および相補性ポリマーを含んで成る複合体の分離、続いて該鋳型の除去、の各ステップを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該鋳型の除去が、該溶液のｐＨの変化、該溶液のイオン強度の変化による該ポリマーからの該鋳型の分離、および尿素、グアニジン、または該鋳型と該ポリマーより強く作用する物質を加えること、の１つまたは２つ以上を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該鋳型の除去がろ過、電気泳動、クロマトグラフ分離、洗浄、遠心分離、および透析の１つまたは２つ以上を用いる請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
該方法が、該鋳型に特異的な親和性を有する相補性ポリマー分画を分離するためのアフィニティー分離の使用をさらに含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
該リビング重合が
ｉ）開始剤とモノマーとの間の化学量論比率；
ｉｉ）該重合反応の持続時間より短い初期の開始期間後のラジカル形成を停止させるために該反応を冷却すること、または該反応のへ照射を停止させること；
ｉｉｉ）該成長する相補性ポリマーとの接触からのモノマーの除去；
ｉｖ）該反応に阻害剤を加えること；および
ｖ）反応溶液を希釈すること
の１つまたは２つ以上の条件下で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
該官能性モノマーが、
ビニルモノマー；
アリルモノマー；
アセチレン；
アクリレート；
メタクリレート；
アミノ酸の誘導体；
ヌクレオシド；
ヌクレオチド；および、
炭水化物
から選択される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
該リビング重合が、
ａ）鋳型の存在下での官能性モノマーの鋳型によるリビング重合；
ｂ）重合を停止させること；
ｃ）異なる官能性モノマーの存在下で重合を再び開始させること；それによって少なくとも一部が該鋳型の少なくとも一部と相補性であるブロックコポリマーである相補性ポリマーを生成すること；および、
ｄ）ａ）〜ｃ）の各ステップを任意選択的に繰り返すこと；
の各ステップを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
該官能性モノマーを架橋結合させるステップをさらに含んで成る請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
該架橋結合が、
ジメタクリル酸エチレングリコール；
メチレンビスアクリルアミド；および、
Ｎ、Ｎ'−ビスアクリロイルピペラジン
から選択された１種または２種以上の架橋剤によって達成される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該ポリマーを表面に付着させるために、ポリマーの該溶液またはコロイド懸濁液と表面とを接触させること；および該ポリマーと該表面との間の反応を達成するために該リビング重合を再び開始させること、の各ステップを含んで成る請求項１〜１６に記載の方法によって調製された溶液またはコロイド懸濁液の使用。
【請求項１８】
請求項１７によって該ポリマーが該表面に付着される付着ポリマーがある表面を有する製品。
【請求項１９】
薬物として、分析化学における受容体に特異的な配位子として、またはバイオテクノロジー工業、もしくは製薬工業もしくは食品工業における分離での使用のための、請求項１８に記載の製品の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって調製されたポリマー、ポリマーの溶液、またはポリマーのコロイド。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか一項によって調製されたポリマー、ポリマーの溶液、またはポリマーのコロイドの薬物としての使用。
【請求項２２】
分析化学における受容体に特異的な配位子として、またはバイオテクノロジー工業、もしくは製薬工業もしくは食品工業における分離での使用のための請求項１〜１６のいずれか一項によって調製されたポリマー、ポリマーの溶液、またはポリマーのコロイドの使用。
【請求項２３】
コントラスト剤、触媒、またはセンサー素子として請求項１〜１６のいずれか一項によって調製されたポリマー、ポリマーの溶液、またはポリマーのコロイドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機合成および高分子化学の分野、および特に鋳型による合成および鋳型重合による有機分子の調製ための方法論についての領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
"鋳型による（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成"の語は、新規な構造の形成ためのパターンとして働く、基材の化学的改変による、または鋳型の存在下で２種または３種以上の分子のカップリングによる新規物質の形成を含む。この方法の最も周知な例は、遺伝子転写である。鋳型による合成の特定例は、ポリマーの受容体（複製）の形成が、別のポリマーまたは小さい分子量の有機物質鋳型の存在下で進行する鋳型重合である。重合の開始前、および重合の間に、モノマーが、鋳型のサイズ、極性および官能性に従って、空間的にモノマー自身を鋳型分子の周りに分配する（自己組織化法）。モノマーは、直鎖または硬い３次元ネットワークのいずれかに重合される。
【０００３】
鋳型重合の具体例は、鋳型（参照文献１,２を参照のこと）の存在下でのビニルまたはアクリルモノマーの重合に基づく分子インプリンティングである。従来のアプローチは、水および有機溶媒に不溶性である高度に架橋したインプリントポリマーの生成を含む。それら固有の不溶性のために、薬理学および医薬において分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を使用する可能性は制限される。
【０００４】
近年、可溶性であるか、または少なくともコロイド形態で存在できる比較的低分子量のインプリントポリマーの調製ための手順を開発するために、幾つかの試みがなされた。この形式は、ポリマーが薬理学および医薬において生物学的活性分子（薬物、エフェクター、変調器、阻害剤）として、およびセンサーもしくはアフィニティー分離における真の"プラスチック抗体"として使用されることを可能にするであろう。
【０００５】
その一例では、ＭＩＰ分子は、生物学的受容体、酵素、核酸、細胞、ウイルス、微生物、組織サンプルまたは薬物（米国特許第６８５２８１８号明細書を参照のこと）の辺りで、アミノ酸とヌクレオチドとの重縮合によって合成された。もう一つの例では、オリゴマーＭＩＰおよびポリマーＭＩＰ（米国特許第６１２７１５４号明細書を参照のこと）を生成するために、異なる方法が使用された。従来技術における大部分の例は、可溶性または溶液中で安定なコロイド粒子を供給するために、加水分解を必要とする高分子量架橋ポリマーの調製を記載する。その一例として（米国特許６１２７１５４号明細書を参照のこと）、研究者らは、照明でカップリング可能な、光活性パーフルオロフェニルアジド基を含有する特に設計された化合物を使用した。この場合オリゴマーは、可溶性粒子として合成可能であった。これら場合すべてにおいて、合成された化合物は、あまり制御されていないサイズおよび特性がある分画を有する。生物学的活性を有するＭＩＰの合成ための他のアプローチは、生物学的活性分子が、鋳型インプリントポリマーの存在下で調製され、次いで別の鋳型、通常はヘパリン等の薬物の存在下で調製される、国際公開第９６/４０８２２号パンフレットおよび米国特許第５６３０９７８号明細書に記載される。生じた複製は薬物分子の構造に類似する。このように合成された分子の活性が、元の鋳型の活性より顕著になれることはほとんど期待できない。
【０００６】
イニファーター重合、ニトロキシド媒介ラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）および可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合等のリビングフリーラジカル重合技術は、制御された比較的低分子量（参照文献３〜９を参照のこと）を有するポリマーの合成に、新規な経路を開く。
制御された/リビング重合技法は、系中のフリーラジカルの濃度を効果的に減少させ、そして停止の程度を最小化させる休止状態種と活性種との間の繊細なバランスに基づく。リビング重合は停止および鎖移動等の副反応がないことが可能で、従って良好に規定された分子量分布および構造を有するポリマーを生成可能である。同じアプローチを、コポリマーに適用可能であり、従ってモノマー付加の適切な連鎖によってフリーラジカル重合によるブロックコポリマーの生成を可能にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リビング重合は、バルクグラフト化されたＭＩＰ（参照文献１０,１１を参照のこと）の生成で、従来使用されてきた。可溶性ポリマーもリビング重合により生成され、そしてＭＩＰ生成（参照文献１２を参照のこと）でのちに使用された。しかし、これまでのところ、誰もリビング重合による可溶性ＭＩＰを開発してこなかった。
【０００８】
参考資料は以下の参照文献に見出せる。
Ｉ．Ｗｕｌｆｆ、Ｇ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．、１９９３、７０／７１、２８５。
２．Ｖｌａｔａｋｉｓ、Ｇ．ら．Ｎａｔｕｒｅ、１９０３、３６１、６４５。
３．Ｍｏａｄ、Ｇ．；ＲｉｚｚａｒｄｏＥ．；Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９８２、１５、９０９；
４．Ｍａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ、Ｋ．；Ｘｉａ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１、１０１、２９２１。
５．Ｋａｍｉｇａｉｔｏ、Ｍ．；Ａｎｄｏ、Ｔ．；Ｓａｗａｍｏｔｏ、Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１、１０１、３６８９。
６．Ｈａｗｋｅｒ、Ｃ．Ｊ．；Ｂｏｓｍａｎ、Ａ．Ｗ．；Ｈａｒｔｈ、Ｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１、１０１、３６６１。
７．Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｈ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１、１０１、３５８１。
８．Ｏｔｓｕ、Ｔ．；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ａ．Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９９８、１３６、７５〜１３７。
９．Ｍｏａｄ、Ｇ．ら．Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．２０００、４９、９９３〜１００１。
１０．Ｒｕｃｋｅｒｔ、Ｂ．；Ｈａｌｌ、Ａ．Ｊ．；ＳｅｌｌｅｒｇｒｅｎＢ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．２００２、１２、２２７５。
１１．Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｋ．ら．Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２００４、２３３、１６９。
１２．Ｌｉ、Ｚ．；Ｄａｙ、Ｍ．；Ｄｉｎｇ、Ｊ．Ｆ．；Ｆａｉｄ、Ｋ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００５、３８、２６２０。
１３．Ｊａｇｕｒ−Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｉ、Ｊ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ＆ＦｕｎｃｔｉｏａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ．２００１、１、１。
１４．Ｓｈｉｍ、Ｓ．Ｅ．ら．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００３、３６、７９９４〜８０００。
１５．Ｙｕ、Ｑ．；Ｚｅｎｇ、Ｆ．；ＺｈｕＳ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００５、３４、１６１２。
１６．米国特許第５９９４１１０号明細書。
１７．国際公開第９６／４１１７３号パンフレット。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、溶解性またはコロイド状ＭＩＰ粒子を生成するためのリビング重合の適用を記載する。一つの態様において、本発明は、鋳型、好ましくは分子鋳型の存在下で行われる官能性モノマーの鋳型によるリビング重合によって少なくとも一部が該鋳型の少なくとも一部と相補性である相補性ポリマーを生成することを含むポリマーの溶液またはコロイド懸濁液の調製のための方法であって、該溶液またはコロイド懸濁液の調製に好適な相補性ポリマー粒子が形成された場合に、該方法が該リビング重合を停止させることを含むこと、を提供する。
【００１０】
一つの形態では、該溶液またはコロイド懸濁液を調製するために、該相補性ポリマー粒子を修飾して、少なくとも一部が該鋳型の少なくとも一部と相補性である誘導ポリマー粒子を生成するステップを含む。
【００１１】
該リビング重合技法は、好ましくはイニファーター重合、安定フリーラジカル媒介重合（ｓｔａｂｌｅ  ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）、原子移動フリーラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合から選択される。
【００１２】
該リビング重合技法が、イニファーター重合である場合、イニファーターが、：ジチオカルバミル基を有する光イニファーター；およびアゾ基を有する熱イニファーターから選択される。
【００１３】
一つの形態では、該方法が、該重合系から該鋳型および相補性ポリマーを含んで成る複合体を分離すること；続いて該鋳型の除去の各ステップを含む。好ましくは、鋳型の除去が、溶液のｐＨの変化、溶液のイオン強度の変化によるポリマーから鋳型の分離、および鋳型とポリマーより強く作用する尿素、グアニジン、または物質を加えること、の１つまたは２つ以上を含む。例えば、該鋳型の除去がろ過、電気泳動、クロマトグラフ分離、洗浄、遠心分離、および透析の１つまたは２つ以上を用いる。一つの形態では、方法が、鋳型に特異的な親和性を有する相補性ポリマー分画を分離するためのアフィニティー分離の使用をさらに含む。
【００１４】
一つの形態では、リビング重合が、
ａ）鋳型の存在下で官能性モノマーの鋳型によるリビング重合；
ｂ）重合を停止させること；
ｃ）異なる官能性モノマーの存在下で重合を再び開始させること；それによって該鋳型の少なくとも一部と相補性であるブロックコポリマーの少なくとも一部である相補性ポリマーを生成すること；および、
ｄ）ａ）〜ｃ）の各ステップを任意選択的に繰り返すこと；
の各ステップを含む。
【００１５】
一つの形態では、方法は、官能性モノマーを架橋結合させるステップをさらに含んでもよい。
【００１６】
一つの形態では、本発明は、本発明の方法によって調製されるポリマー、薬物、分析化学における受容体に特異的な配位子、またはバイオテクノロジー工業、もしくは製薬工業もしくは食品工業における分離での使用のため、コントラスト剤、触媒、またはセンサー素子としての使用、そして好ましくは薬物としての使用を提供する。
【００１７】
一つの形態では、本発明は、該ポリマーを表面に付着させるために、ポリマーの該溶液またはコロイド懸濁液と表面とを接触させること；および該ポリマーと該表面との間の反応を達成するために該リビング重合を再び開始させること、の各ステップを含んで成る請求項に記載の方法によって調製された溶液またはコロイド懸濁液の使用を含む。本発明は、付着したポリマーがある表面を有する製品、ポリマーがこの方式で表面に付着していること、および薬物として、分析化学で受容体に特異的な配位子として、またはバイオテクノロジー工業、もしくは製薬工業もしくは食品工業において分離を行う際に使用するためのそれらの使用も含む。
【００１８】
広範の生物学的活性分子（薬物、エフェクター、変調器、阻害剤）の合成方法が記載される。本明細書に記載された方法において、リビング重合技法を使用する鋳型の存在下でＭＩＰを生成する。合成される分子のサイズが比較的小さい場合、重合反応は初期段階で停止される。そうした方法の生成物は、可溶性であるか、または溶液中で安定なコロイド形態で存在可能である。これはもちろん、重合をその全工程で行わせることで通常生じるであろうゲル形態からの特徴である。この発明によるＭＩＰのコロイド懸濁液または溶液は、水性または有機液体のいずれかであってもよい。
【００１９】
合成された分子は、元の鋳型の分子に対して相補性構造を有し、そして当然に高い親和性で結合する能力を有する。これらの合成分子（ポリマーおよびオリゴマー）は、所定の親和性および特異性、ランダムに合成されたポリマー比べてより優れた活性を有し、そして特異的に設計された離散した有機構造よりはるかに容易に調製可能である。この発明に記載されたように合成された分子（二量体、オリゴマー、ポリマー、またはそれらの混合物）は、薬理学および医薬で薬物として、分析化学（センサー、試験）における受容体に特異的な配位子として、並びにバイオテクノロジー工業、製薬工業および食品工業における分離のために使用可能である。薬物設計における従来の努力は、典型的には大きな数の化学的構造の構造活性関係の面倒な調査に基づいて、行われてきた。本発明は、（従来の薬物設計および発見方法と比較して）大きな利点を有するであろう、生物学的活性物質を設計するための、より簡便でかつ直接的な方法−リビングインプリンティング重合、並びにアフィニティー分離、センサーおよび触媒作用ための有用な配位子を記載する。
【００２０】
本発明の重要な面は、
（１）生物学的受容体、核酸、細胞、ウイルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、糖タンパク質、グルコサミノグリカン、ステロイド、免疫抑制剤、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミンまたは薬物であることができる鋳型の存在下で、リビング重合による生物学的活性分子の合成、
（２）比較的小さいサイズの合成された粒子を生成するための反応条件の最適化、
（３）ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アミノ酸の誘導体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および炭水化物の１種または２種以上を含むことができる官能性モノマーからの生物学的活性分子の合成、
（４）クロマトグラフィー、ろ過および電気泳動によって合成された粒子の分離、
（５）合成された分子の特性または機能を変更するために、インプリントポリマーが他のタイプの分子で改質される場合、連鎖的合成、
（６）薬理学および医薬における薬物として、分析化学（センサー、試験）における受容体に特異的な配位子としてバイオテクノロジー工業、製薬工業および食品工業における分離のための、合成された分子の適用、
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、鋳型、受容体、酵素または核酸等の小さい分子または大きい分子の存在下で調製された可溶性ＭＩＰの形成を記載する。ＭＩＰ調製への従来のアプローチと対照的に、このように調製されたポリマーは、鋳型のエフェクター（活性化剤、阻害剤または基材）に類似し、そして生物学的活性を有することができる。そうしたポリマーは、例えば、薬理学および医薬における薬物として使用可能である。
【００２２】
一つの形態では、本発明は、生物学的受容体、核酸、細胞、ウイルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、糖タンパク質、グルコサミノグリカン、ステロイド、免疫抑制剤、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミン、または薬物であることができる鋳型の存在下の、リビングラジカル重合（ＬＲＰ）またはリビングアニオンまたはカチオン重合による生物学的活性分子の合成に関する。通常は適当な有機溶媒または水に可溶性の鋳型は、官能性モノマー、架橋剤、およびリビング開始剤であることができるものの１つと共に混合される。
【００２３】
重合は、加熱、また好ましくはＵＶ照射によって開始でき、そして通常は種の反応性によって数分または数時間をかかる。制御された／”リビング"重合の幾つかの異なる形態は、本発明によって範囲とされている。それらはすべて、休止状態の種を鎖延長物として働く反応性フリーラジカルまたはイオンにする熱的、化学的、または光化学的刺激による可逆的転化に基づく。このために、反応の平衡定数は、休止状態の種に有利にシフトしており、そして休止状態の種とフリーラジカルとの間の速い交換を可能にすることが好ましい。従ってラジカルの濃度は非常に低く、そしてそれらの滞留時間は非常に短いであろうし、成長するポリマー鎖の停止となる副反応の可能性を減少させる。
【００２４】
リビング重合のいくつかの例は、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）および可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）を含むが、決してこれらに限られない。例えばＮＭＰでは、ポリマー鎖末端ラジカルを有するニトロキシドラジカルの非常に速いカップリング反応は、ニトロキシドおよびポリマーラジカルＰ*（例えば、図１を参照のこと）を再生させるために、一時的にキャップされたリビングポリマーの遅く、熱的に起こる断片化と組み合わされる。ＲＡＦＴ重合は、活性種と休止状態種との間の交換がある可逆的付加開裂連鎖移動平衡に基づく。生成されたラジカルが成長し始め、そして連鎖移動剤として働く分子が出会う場合、可逆的方法で分子を加える。
【００２５】
一般的に、重合にリビングの性質を与えるために、任意選択的に従来の開始剤と結合して生成可能であるイニファーター（開始剤、連鎖移動剤、停止剤）の使用を可能にする。このイニファーターは、ジチオカルバミル基を有する光イニファーターおよび炭素炭素またはアゾ基（例えば、参照文献１３を参照のこと）を有する熱イニファーターであることができる。好ましい種類のイニファーターは、一方で反応性の炭素ラジカル、そして他方で例えばジチオカルバミルラジカルといったより反応性が低いまたは非反応性の炭素ラジカル、というように異なるラジカルを与えるものである。通常はベンジルラジカルである炭素ラジカルは、重合を開始するために、ビニルモノマーと反応可能である。ジチオカルバミルラジカルは、成長するポリマー鎖（例えば、参照文献１４を参照のこと）と再混合することによって重合を停止可能なものである。
【００２６】
本発明の範囲で対象とする異なるタイプのリビング重合（原子移送、アニオン性、カチオン性等）のために開始剤として使用可能であろう他の化合物は、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ”、Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミンで錯体化されたＣｕ（Ｉ）Ｂｒを有する２−ブロモプロピオニトリル、Ｃｕ（ｌ）Ｃｌ／ＰＭＤＥＴＡを有するポリスチレンブロモ高分子開始剤；ＣｕＣｌ/ビピリジンを有する２−ブロモイソ酪酸エチル；二臭化１、４−ビス（２,６−ジイソプロピルフェニル）アセトナフテンジイミンニッケル（ＩＩ）；テトラエチルチウラムジスルフィドと組み合わせた２,２−ジメトキシ−２−フェニルアセフェノン；テトラフェニルビホスフィン；例えば、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル過酸化物等の第３過酸化物；ＳｍＭｅ（Ｃ5Ｍｅ5）2（ＴＨＦ）；ＴｉＣｌ4と結合したスチレンベースのエポキシド；メチルスチレン四量体ジナトリウム；ＭｏＯＣｌ4−ｎ−ＢｕＳｎ−ＥｔＯＨ；ＨＣｌ／ＺｎＣｌ2；ｐ−トルエンスルホン酸メチル；メチル２,１０,１５,２０−テトラフェニルポルフィナトアルミニウム；３−メチル−１,１−ジフェニルペンチルリチウム；ＴＨＦ中ブチルリチウム；モリブデンアルキリジン化合物；二官能性有機ランタニド（ｌｌｌ）；Ｍｏ（ＣＨ−ｔ−Ｂｕ）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ3）2およびＭｏ（ＣＨＣＰｈＭｅ2）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ（ＣＦ3）2）2；ＨＩ／Ｉ2；メチルアルミノキサンまたはフェニルボレートのいずれかと組みわせたＺｒ、ＴｉおよびＨｆ錯体；Ｐｄ、Ｎｉ、ＦｅまたはＣｏのジイミド錯体；均一Ｔａ、Ｔｉ、Ｍｏ、Ｗカルベン錯体；メタロセン型または非メタロセン型錯体からなる希土類金属錯体；カチオン性モノシクロペンタジエニルジルコニウムアセタミジネート（ａｃｅｔａｍｉｄｉｎａｔｅ）錯体；銅媒介リビング重合ために開始剤として１つまたは２つのヒドロキシル基とエステル化されたフッ素化テロメア；Ｙｂ［Ｃ（ＳｉＭｅ3）3］を含むがこれらに限られない。
【００２７】
従来のラジカル重合に対比したリビング重合の一つの利点は、リビング重合は低速で且つ観察できる自己加速がないが、従来のラジカル重合はしばしば強力に自己加速（例えば参照文献１５を参照のこと）しで進行することである。通常のメカニズムおよびリビングメカニズムを通して進行するフリーラジカル重合の典型的な重合速度プロファイルが図２にある。バルク中の通常のフリーラジカル重合より、リビング重合を制御することがはるかに容易であることは明らかである。本発明は、比較的低分子量のポリマーの形成に有利である状況でリビング重合を行うことによってこれを生かす。典型的には分子量５００〜１００００００Ｄａを有するポリマーを生成する初期段階で反応を停止させる。
【００２８】
一つの形態では、本発明は、比較的小さいサイズを有する粒子を生成させるための反応の条件の最適化に関する。方法の重要な部分は、適当なリビング開始剤の選択および重合反応の条件の最適化である。ＬＲＰの有名な例は、オレフィンのニトロキシド媒介リビングフリーラジカル重合を含む。別の例は、ＣｕＣｌ／ｂｐｙおよびベンゼン塩化スルホニルの系を含む。
【００２９】
リビングラジカル重合開始剤は、離散した有機分子からまたは高分子から調製可能である。実際には、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはアミノ基を含む大部分の化合物は、開始剤に転化でき、従ってポリマーに容易に取り込まれる。これは、モノ官能性開始剤の場合はポリマーの末端、または多官能性開始剤の場合はポリマーの中のいずれかにあることができる。
【００３０】
比較的低分子量のポリマーの生成に有利な反応条件は、（ｉ）開始剤とモノマーとの間の化学量論比を使用すること；（ｉｉ）反応の初期段階でラジカル形成を停止するであろう、反応を冷却またはＵＶもしくは他の照射を停止すること；（ｉｉｉ）例えば、ろ過またはクロマトグラフィーによる、成長するポリマー鎖との接触からのモノマーの除去；（ｉｖ）阻害剤を反応に加えること；（ｖ）非常に希釈された液中で重合を行うこと、を含むがこれらに限られない。好ましい選択枝は、照射を停止することであろう。制御されたリビング重合ＭＩＰ粒子の結果として、可溶性または少なくともコロイド形態で存在できるサイズ５００〜１００００００Ｄａを有して形成可能である。
【００３１】
一つの形態では、本発明は、ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アミノ酸の誘導体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および炭水化物を含むＭＩＰ調製のために使用可能であるモノマーに関する。
【００３２】
鋳型と相補性であるように、生じる複製分子の構造を固定または安定化させることが必要な場合、架橋結合モノマーも使用できる。ＭＩＰに好適な架橋剤の典型的な例は、ジメタクリル酸エチレングリコール、メチレンビスアクリルアミド、およびＮ、Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンを含む。当業者は、特別な系ために好適なモノマーおよび架橋剤を選択可能であろう。あるいは種々の組み合わせ法および計算法が、この選択を補助するために使用可能であろう。
【００３３】
一つの形態では、本発明は、クロマトグラフィー、ろ過および電気泳動によるリビング重合で合成された粒子の分離に関する。合成されたポリマーの分離は、親和性クロマトグラフィーによって、固定化した鋳型が、鋳型に最も高い親和性を有するポリマー分画の精製に使用される場合、異なるサイズのポリマー分画を分離するゲル浸透クロマトグラフィーによって、達成可能である、これは溶液ｐＨ、イオン強度の変化によって、または尿素、グアニジン、もしくはポリマーより強力に鋳型と相互作用する物質の添加を通して、またはろ過、電気泳動、クロマトグラフ分離、洗浄、遠心分離もしくは透析によって、達成される。
【００３４】
親和性クロマトグラフィーは、特に強力な道具であり、そして鋳型への狭い分布の親和性を有するＭＩＰの調製を可能とするため、特に好ましい。これは、現在のところ従来のＭｌＰでは達成不可能である。
【００３５】
非反応モノマーおよび鋳型からＭＩＰを分離するために、抽出（液体または固体相）の使用を可能にするであろう、特定の特性、例えば、高いまたは低い疎水性を有する開始剤を使用するリビング重合を行うこともできる。
【００３６】
あるいは、抽出または他の分離形態を促進するであろうＭＩＰに対する特定の特性を導入する意図で、成長するポリマー鎖を別のポリマーまたは官能基で改質可能である。この例は、疎水性の末端を有するポリマーであることが再度可能であり、例えば、有機溶媒による水溶液からのポリマー抽出を可能にするであろう。例えば、ビオチンといった特定の結合基を導入することが可能であり、親和性吸着剤によってポリマーの選択的な除去を可能にするであろう。当業者は、この改変および対応する分離を可能にする実験の手順の多くに精通する。
【００３７】
一つの形態では、本発明は、合成された分子の特性または機能を変更するために、インプリントポリマーが他のタイプの分子で改質される場合の連鎖的重合に関する。成長するポリマー鎖を、その分離を容易にするために別のポリマーまたは官能基で改質できることを既に記載した。リビング重合の一つの重要な特性は、例えば単に反応混合物のＵＶ照射を停止することによって反応を停止させ、そして後で続けさせる能力である。成長するポリマー鎖の末端は、重合の新たなラウンドを開始させるために、再び活性になれる開始剤を含む。従って成長するポリマー鎖は、別のモノマーに曝されることが可能であろうし、そして重合は、ブロックポリマーの生成となり続ける。新たなモノマーは、新たな官能性をポリマーに導入できるであろう。従って第１のＭＩＰによって提供される第１の鋳型への親和性に加えて、延長されたポリマーは、系に導入された第２の鋳型への親和性を有することができるであろう。延長されたブロックポリマーは、診断において有用であろう末端基に結合された蛍光タグを有することができるであろう。
【００３８】
他のタイプの改変も、殺生物剤特性、触媒基、同位体ラベル、固定化に有用な基、検知等を有する活性種を生成可能であるなどの、他の官能性を導入することが可能である。これらの官能性も、対応する官能性開始剤を使用することによって、ポリマーに導入可能であろう。
【００３９】
一つの形態では、本発明は、薬理学および医薬で薬物として、分析化学（センサー、試験）における受容体に特異的な配位子として、バイオテクノロジー工業、製薬工業および食品工業における分離のための、合成された分子の適用に関する。合成されたポリマーの可溶性の性質は、ポリマーを薬物としての使用ための理想的な目的物にする。酵素、受容体または他の生物学的分子への選択的な結合は、これらの分子の生物学的機能に影響を与えるために使用可能であろう。従ってリビング重合によって合成されたＭＩＰは、生物学的方法の調節ために生体内で使用可能であろう。同位体または蛍光タグと結合する場合、ＭＩＰは、選択的なコントラスト剤として、または他の診断形態で使用可能であろう。ある状況例えば、単一の分子酸素において生成可能である配位子と統合されたＭＩＰは、選択的な殺生物剤として使用可能であろう。抗生物質特性をリビング重合によって調製されたＭＩＰに導入するために、種々の他の改変が当業者によって提案できるであろう。
【００４０】
合成されたＭＩＰは、異なる形態の試験およびセンサーにおける天然抗体および受容体への代用品として使用可能であろう。幾つかの特徴は、リビング重合によって調製されたＭＩＰを、センサーにおける適用で特に魅力的な物にする。従って合成されたＭＩＰ分子は、ポリマーを固体表面に共有結合で結合させるために使用可能である開始剤を依然含む。従って単なるＵＶ照射は、ＭＩＰを二重結合で覆われた表面に結合させるのに充分であろう。
【００４１】
異なる親和性でＭＩＰ配位子をいくつかの分画に分離させる親和性クロマトグラフィーの使用するための能力は、検出範囲を変化させることで、センサー/評価の調製ために好都合であろう。いくつかの適用のために、鋳型の不存在下でリビング重合によって調製されたブランクのポリマーも使用可能であろう。しかし、ある親和性またはこの特別な適用に必要な他の特性を有するモノマーを使用してそうしたポリマーを調製することは必要であろう。当業者は、例えば計算アプローチまたは組み合わせアプローチを使用することによって、どのようにそうしたモノマーを選択するかを知っている。本発明の範囲内にある態様１〜６に記載された方法で調製されたＭＩＰおよびブランクポリマーの両方を使用することを明らかにすることが必要である。
本発明は、特に以下の限定されない例を参照して、さらに記載されるであろう。
【実施例】
【００４２】
例１：６−メチル−１、３、５−トリアジン−２、４−ジアミンに親和性を有するＭＩＰ粒子の合成
１.１７ｇアセトニトリル、０.３２ｇメタクリル酸、０.０４６ｇ６−メチル−１、３、５−トリアジン−２、４−ジアミン（鋳型）、０.３６ｇトリメタクリル酸トリメチロールプロパン（ＴＲＩＭ）、０.３６ｇジメタクリル酸エチレングリコール（ＥＧＤＭＡ）および０.０８７ｇジエチルジチオカルバミン酸ベンジルエステル（リビング開始剤）の混合物を窒素でパージし、そして密閉したガラス瓶中でＵＶ放射（０.１６３Ｗ／ｃｍ2強度を有するＵＶＡＰＲＩＮＴ  １００  ＣＶＩ  ＵＶ光源、Ｄｒ.Ｈｏｎｌｅ）下で２.５分間で重合させた。生じた可溶性ポリマー分子を、Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−６８５  ２３０＊１５  ｍｍ  カラムに充填したＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＨＷ５５Ｓ吸着剤を使用するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって分離した。アセトニトリル／水＝９０/１０％の混合物を溶離液として使用し、そしてＨＰＬＣポンプ（ヒューレットパッカードシリーズ１０５０）によって０.６ｍｌ／分の流速で供給した。カラムに反応混合物を載せ、そして分画を５分毎に集めた。コントロール（ブランク）ポリマーを鋳型の不存在下だが、同様の方法で調製した。合成されたポリマーの全重量は、０.０３４ｇ（収率〜３％）であった。ほぼ同じ収率をブランクポリマーで達成した。分画の分子量を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ中分子量ポリスチレン標準（範囲１３〜１０４ｋＤａ）で較正されたサイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  Ｓ  ２０００）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣを使用して決定した。使用した移動相は、０.７ｍｌ／分の流速のＴＨＦであった。注入した体積は４０μｌであった。吸光度を、ポリスチレンでは２５６ｎｍそしてＭＩＰ粒子では２３０ｎｍで測定した。合成されたポリマーの分画は、１０〜１５分の分画では９０ｋＤａ；１５〜２０分の分画では６７ｋＤａ；２０〜２５分の分画では１３ｋＤａの平均分子量を有した。
【００４３】
例２：合成されたポリマーのアフィニティー分離
ａ）親和性吸着剤の調製鋳型類似物の固定化。
固定化した鋳型類似物を有するポリマーを、５ｇＤＭＦ、５ｇＥＧＤＭＡ、０.３０ｇ２、４−ジアミノ−６−（メタクリロイロキシ）エチル−１）３、５−トリアジンおよび０.１ｇ１,１'−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）を混合することによって調製した。２、４−ジアミノ−６−（メタクリロイロキシ）エチル−１、３、５−トリアジンは、重合可能な二重結合を含有する鋳型類似物である。この混合物を窒素でパージし、そしてＵＶ（０.１６３Ｗ／ｃｍ2強度を有するＵＶＡＰＲＩＮＴ  １００  ＣＶＩ  ＵＶ光源、Ｄｒ.Ｈｏｎｌｅ）で２０分間重合した。生じた親和性ポリマーをすりつぶし、そしてメタノール中で湿式ふるいにかけた。サイズ２５〜１０６μｍを有する粒子を収集し、そしてソックスレー抽出器中で４８時間メタノールで洗浄し、そしてＢｕｃｈｉ  Ｂ−６８５２３０*１５ｍｍカラムに充填した。
【００４４】
ｂ）親和性クロマトグラフィー
合成されたＭＩＰの精製した分画を、例２ａ）に記載したように調製した親和性カラムに載せ、そしてＨＰＬＣポンプ（ヒューレットパッカードシリーズ１０５０）によって供給される２ｍｌ/分の流速のアセトニトリルで溶出した。１０分後で、溶離液をアセトニトリル中０.０５％酢酸の溶液に変更して高い親和性ポリマーを溶出した。ＭＩＰポリマーを、例１に記載されたようなＧＰＣによる追加分離によって、酢酸およびいくらかの残留する鋳型から精製した。ＭＩＰおよびブランクポリマーの両方を同じ方法で処理した。
【００４５】
例３：合成されたＭＩＰおよびブランクポリマーの固体相への固定化
ａ）固定化ための固体相（ＴＲＩＭポリマー）の調製
５ｇＴＲＩＭ、５ｇアセトニトリルおよび０.１ｇ１、１'−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）の混合物を窒素でパージし、そしてＵＶ（０.１６３Ｗ／ｃｍ2の強度を有するＵＶＡＰＲＩＮＴ  １００  ＣＶＩ  ＵＶ光源、Ｄｒ.Ｈｏｎｌｅ）で２.５分間重合し、多数の非反応二重結合を準備した。生じたポリマーをすりつぶし、そしてメタノール中で湿式ふるいにかけた。サイズ２５〜１０６μｍを有する粒子を収集し、そしてソックスレー抽出器中で２４時間メタノールで洗浄した。ＦＴＩＲ分析の確認で、大量の有用な二重結合（〜３６％）がポリマー中に残った。
【００４６】
ｂ）ＴＲＩＭポリマーの上へのＭＩＰおよびブランクポリマーの固定化
分画サイズ９０ｋＤａを有する７１μｇのＭＩＰ粒子を含有する４ｍｌのアセトニトリル/水溶液（９０/１０％）を、１０ｍｌガラス瓶中で上記のように調製した１８０ｍｇのＴＲＩＭポリマーに加えた。溶液を１分間窒素で脱気し、そして８分間ＵＶ下に置いた。ＵＶ曝露後に行われた液相のＨＰＬＣ分析は、８８.８％のＭＩＰ粒子が固定化し、固定化したポリマーで０.３５ｍｇ/ｇＴＲＩＭの密度を与えたことを示した。生じたポリマーを、次に１ｍｌのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳＰＥ管に置き、そして５体積の１％酢酸を有するアセトニトリルそして２０体積のアセトニトリルで洗浄し、そして８０℃で３０分乾燥した。手順を非インプリント粒子で繰り返した。
【００４７】
例４：親和性テスト
７０ｍｇの固定化したＭＩＰおよびブランク粒子を有するＴＲＩＭポリマーを２ｍｌのＨＰＬＣバイアルに入れた。１〜１２５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する１ｍｌ鋳型溶液をポリマーに加え、そして１２時間培養した。培養後に溶液中の鋳型濃度をＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。ＭＩＰおよびブランクポリマーの結合実験の結果を使用して、二重逆数プロットによって解離定数を計算した。計算によって、ＭｌＰを有する解離定数および結合サイトの濃度は、それぞれ７.７×１０<-8Ｍおよび０.９７×１０-6モル／ｇであった。ブランクポリマーでは、解離定数を、１.９×１０-5Ｍおよび結合サイトの濃度を１.５×１０-5モル/ｇと決定した。これらの結果は、合成されたＭＩＰが、ブランク（〜２５０回）より実質的に高い親和性を有することを明らかに示す。
【００４８】
例５.選択性テスト
７０ｍｇの固定化したＭＩＰおよびブランク粒子を有するＴＲＩＭポリマーを、２ｍｌＨＰＬＣバイアル中に置いた。濃度４０ｎｇ／ｍｌを有する１ｍｌ検体溶液を、ポリマーに加え、そして１２時間培養した。培養後の溶液中の検体濃度を、ＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。テストされた検体は、６−メチル−１，３、５−トリアジン−２、４−ジアミン（鋳型）、およびその類似物：アトラジン、メトリブジンおよびシマジンを含んだ。ポリマーによって吸着されたそれぞれの化合物の量を、ｎｍｏｌ／ｇポリマーについて表１に記載する。
表１.ＭＩＰおよびブランクポリマーによる検体の吸着、および鋳型のパーセンテージと比較した結合のパーセンテージで表されたそれらのクロス反応性
【００４９】
結果は、インプリントポリマーが、その構造的な類似物に比較して、ターゲット鋳型に対するはるかに高い選択性を有することを明らかに示す。
例６.照射時間におけるポリマーの収率の依存性
【表１】
2008545846.tif 000002
重合混合物を、鋳型の不存在下でセクション例１に記載したように調製した。一定分量のモノマー混合物をＵＶ照射０,２０,６０,９０,１５０および１７０秒後に集め、ＴＨＦ中で２００倍希釈し、そして例１に記載されたようにＧＰＣで分析した。表２中の結果は、主分画（３〜１００ｋＤａ）の収率を示す。
表２.異なる照射時間におけるポリマーの収率の依存性
【表２】
2008545846.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ニトロキシ媒介重合の図式モデルおよびニトロキシラジカルＴＥＭＰＯ−４−ｏｎｅの構造を示す。
【図２】図２は、バルクラジカル重合（ａ）およびリビング重合（ｂ）での重合速度プロファイルを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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