(57)【要約】  本発明は、キュプレドキシン、特に緑膿菌アズリン、および／または緑膿菌シトクロムc551、ならびにウイルス感染、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)による哺乳類細胞の感染の阻害におけるそれらの使用に関する。本発明は、ウイルス感染、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)による感染を阻害する能力を保持しているキュプレドキシンならびにシトクロムcの変異体および誘導体にも関する。本発明は、哺乳類細胞におけるウイルスおよび細菌感染を研究するための研究方法にも関する。【選択図】      なし
2008545398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物であり、哺乳類細胞におけるHIV-1感染の増殖を阻害することができる単離ペプチド。
【請求項２】
前記キュプレドキシンは、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Laz、およびオーラシアニンからなる群より選択される、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
前記キュプレドキシンはアズリンまたはLazである、請求項2に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
前記キュプレドキシンは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、アルカリ糞便菌(Alcaligenes faecalis)、アクロモバクター・キシロソキシダン(Achromobacter xylosoxidan)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、メチロモナス属(Methylomonas sp.)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhea)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)、ブドウピアス病菌(Xylella fastidiosa)、または腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)からなる群より選択される生物体に由来する、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
緑膿菌または淋菌に由来する、請求項4に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
配列番号1〜17からなる群より選択されるペプチドの一部である、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
配列番号1〜17からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項８】
キュプレドキシンまたはシトクロムc551の短縮型である、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは約10残基より多く約100残基未満である、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドは、残基36〜128、残基36〜88、および残基88〜113からなる群より選択されるアズリンの領域を含んでなる、請求項9に記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドは、残基36〜128、残基36〜88、および残基88〜113からなる群より選択されるアズリンの領域からなる、請求項10に記載の単離ペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドは、残基36〜128、残基36〜88、および残基88〜113からなる群より選択されるアズリンの領域に対応するキュプレドキシンの残基を含んでなる、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項１３】
医薬組成物中に少なくとも1のキュプレドキシン、シトクロムc551、または請求項1に記載のペプチドを含んでなる組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物は静脈内投与のために構築される、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
前記キュプレドキシンは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、アルカリ糞便菌(Alcaligenes faecalis)、アクロモバクター・キシロソキシダン(Achromobacter xylosoxidan)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、メチロモナス属(Methylomonas sp.)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhea)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)、ブドウピアス病菌(Xylella fastidiosa)、および腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)からなる群より選択される生物体に由来する、請求項13に記載の組成物。
【請求項１６】
前記キュプレドキシンは緑膿菌または淋菌に由来する、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
前記キュプレドキシンまたはシトクロムc551は配列番号1〜17からなる群より選択される、請求項13に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項13に記載の組成物の治療的に有効な量を患者に投与することを含んでなる、ウイルスまたは細菌に感染した患者を治療するための方法。
【請求項１９】
前記患者は、HIV-1、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、パラインフルエンザウイルスA型、B型、およびC型、肝炎ウイルスA型、B型、C型、およびG型、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、ドーリウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス；SIV、および結核菌からなる群より選択される病原体に感染している、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者はHIV-1に感染している、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者はヒトである、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、吸入、局所的な投与、経皮パッチ、坐剤、および経口投与からなる群より選択される方法により投与される、請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与方法が静脈内注射による、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物は、抗ウイルス薬、抗菌剤、および抗HIV薬からなる群より選択される少なくとも1の薬物の投与後0分〜1週以内に投与される、請求項18に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物は他の抗HIV薬とほぼ同時に投与される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
キュプレドキシン、シトクロムc551、およびキュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物から選択される少なくとも2の単離ポリペプチドを含んでなる組成物。
【請求項２７】
医薬組成物としての請求項26に記載の組成物。
【請求項２８】
バイアル中の請求項13に記載の組成物を含んでなるキット。
【請求項２９】
前記キットは静脈内投与のために設計される、請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
細胞をキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と接触させること；哺乳類細胞を細菌またはウイルスと接触させること；およびウイルスまたは細菌の感染の増殖を測定することを含んでなる方法。
【請求項３１】
前記細胞をキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と接触させるステップは、細胞を細菌またはウイルスと接触させるステップの前に行われる、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞をキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と接触させるステップは、細胞を細菌またはウイルスと接触させるステップの後に行われる、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞はヒトの細胞である、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は、リンパ腫細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスまたは細菌は、HIV-1、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、パラインフルエンザウイルスA型、B型、およびC型、肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス(HDV) A型、B型、C型、およびG型、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、ドーリウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス；SIV、および結核菌からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルスはHIV-1ウイルスである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
請求項1に記載のペプチドをコードする発現ベクター。
【請求項３８】
キュプレドキシンの変異体、誘導体、または構造的な均等物であり；CD4、gp120、ICAM3、およびDC-SIGNからなる群より選択されるタンパク質と結合することができる単離ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、2006年5月18日に共に提出された米国仮特許出願第11/436,590号「キュプレドキシンおよびシトクロムを用いてマラリアを治療するための組成物および方法」；2006年3月10日に提出された米国仮特許出願第60/780,868号；2005年5月20日に提出された米国仮特許出願第60/682,833号；および2005年10月6日に提出された米国特許出願第11/244,105号について、米国特許法第119条および第120条下の優先権を主張する；この最後の基礎出願は、2004年10月7日に提出された米国仮特許出願第60/616,782号、および2005年5月13日に提出された米国仮特許出願第60/680,500号の優先権を主張し、且つ2003年11月11日に提出された米国特許出願第10/720,603号の一部継続出願であり、該親出願は2003年8月15日に提出された米国仮特許出願第60/414,550の優先権を主張し、且つ2002年1月15日に提出された米国特許出願第10/047,710号の一部継続出願であり、該親出願は2001年2月15日に提出された米国仮特許出願第60/269,133号の優先権を主張する。これら先の出願の全ての内容を、本願明細書の一部として援用する。
【政府の利益の陳述】
【０００２】
本願の主題は、アメリカ合衆国メリーランド州ベテスダの国立保健研究所(NIH)からの研究助成金により支援されている(助成金番号AI 16790-21、ES 04050-16、AI 45541、CA09432、およびN01-CM97567)。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【発明の分野】
【０００３】
本発明は、キュプレドキシン、特に緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)アズリン、および／または緑膿菌シトクロムc551、ならびにウイルス感染、特に哺乳類細胞のヒト免疫不全ウイルス(HIV)による感染の阻害におけるそれらの使用に関する。本発明は、ウイルス感染、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)による感染を阻害する能力を保持しているキュプレドキシンおよびシトクロムcの変異体および誘導体にも関する。本発明は、哺乳類細胞におけるウイルス感染および細菌感染を研究するための研究方法にも関する。
【発明の背景】
【０００４】
結果としてAIDSを発症するヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、ヒト集団において相対的に新しい感染症であるが、急速に世界中で主要な健康問題となった。HIV/AIDSは、現在、サハラ砂漠下のアフリカにおいて死の主要な原因であり、世界で4番目に大きな脅威である。2001年の終わりに、世界中で4000万人の人がHIV感染と共に生きていると推定された。疾病管理センター(CDC)は、米国において800,000人近くの人々がAIDSと共に生きており、毎年40,000人の新しい患者が診断されていると見積もった。より良い治療法が患者の命を延長することが現在知られているが、治癒はしない。
【０００５】
新しい抗HIV薬は、HIVライフサイクルのいくつかの異なるステージならびに複製および生存のためにHIVが必要とするいくつかの酵素を標的とする。いくつかの共通に使用される抗HIV薬には、AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、およびアバカビルのようなヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；テノホビルのようなヌクレオチド逆転写酵素阻害剤；ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジンのような非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプリナビル、ロピナビル、およびアタザナビルのようなプロテアーゼ阻害剤；およびエンフビルチド(enfuvirtide)のような融合阻害剤が含まれる。しかしながら、多くのHIV感染患者において、これらの抗ウイルス薬のいずれも、単独または組み合わせて、慢性的な感染症の進行を予防することまたは急性的なAIDSを治療することにおいて有効ではない。HIVウイルスの高い変異割合および薬剤に対して耐性のHIV株の付随した発現が、結果としてHIV感染を効果的に治療することができない1つの大きな要因である。新規且つより良い治療がHIV感染症に対して必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、キュプレドキシンおよび／またはシトクロムc551の組成物および使用方法ならびに哺乳類細胞におけるウイルス感染、特にHIV感染を阻害するためのそれらの使用に関する。詳しくは、本発明は、ペプチド緑膿菌アズリンおよび／またはシトクロムc551、および／またはそれらの変異体および／または誘導体を含んでなる組成物、ならびに哺乳類の細胞および患者におけるHIV-1感染の増殖を阻害するためのこれら組成物およびペプチドの使用方法に関する。本発明は、ウイルス感染、特にHIVによる感染の増殖を阻害する能力を保持したキュプレドキシンおよびシトクロムc551の変異体および誘導体にも関する。
【０００７】
本発明の1つの側面は、キュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物であり、哺乳類細胞においてHIV-1感染の増殖を阻害することができる単離ペプチドである。いくつかの実施形態において、前記キュプレドキシンは、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、Laz、またはオーラシアニンであり、特にアズリンまたはLazである。他の実施形態において、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、アルカリ糞便菌(Alcaligenes faecalis)、アクロモバクター・キシロソキシダン(Achromobacter xylosoxidan)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、メチロモナス属(Methylomonas sp.)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhea)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)、ブドウピアス病菌(Xylella fastidiosa)、または腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)に由来し、特に緑膿菌または淋菌に由来する。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、配列番号1〜17のうちの1つの一部である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、配列番号1〜17における配列と少なくとも約90％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記単離されたペプチドは、キュプレドキシンまたはシトクロムc551の短縮型であってよい。前記ペプチドは、約10残基より多く、且つ約100残基以下であってよい。いくつかの実施形態において、前記単離ペプチドは、残基36〜128、残基36〜88、または残基88〜113であるアズリンの領域を含んでなる。他の実施形態において、前記単離ペプチドは、残基36〜128、残基36〜88、または残基88〜113であるアズリンの領域からなる。他の実施形態において、前記ペプチドは、残基36〜128、残基36〜88、および残基88〜113であるアズリンの領域に対応するキュプレドキシンの残基を含んでなる。
【０００９】
本発明のもう1つの側面は、医薬組成物中に、少なくとも1のキュプレドキシン、シトクロムc551、またはキュプレドキシンもしくはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物であり、哺乳類細胞においてHIV-1感染の増殖を阻害することができる単離ペプチドを含んでなる組成物である。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、静脈内投与のために構築される。他の実施形態において、キュプレドキシンは、緑膿菌、アルカリ糞便菌、アクロモバクター・キシロソキシダン、気管支敗血症菌、メチロモナス属、髄膜炎菌、淋菌、蛍光菌、シュードモナス・クロロラフィス、ブドウピアス病菌、または腸炎ビブリオに由来し、特に、緑膿菌または淋菌に由来する。いくつかの実施形態において、前記キュプレドキシンまたはシトクロムc551は、配列番号1〜17から選択される。
【００１０】
本発明のもう1つの側面は、ウイルスまたは細菌に感染した患者を治療する方法であって、医薬組成物中に少なくとも1のキュプレドキシン、シトクロムc551、あるいはキュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物であり、哺乳類細胞におけるHIV-1感染の増殖を阻害することができる単離ペプチドを含んでなる組成物の治療的に有効な量を、患者に投与することを含んでなる方法である。前記患者は、HIV-1、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、パラインフルエンザウイルスA型、B型、およびC型、肝炎ウイルスA型、B型、C型、およびG型、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、ドーリ(Dhori)ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス；SIVまたは結核菌に感染してよく、特にHIV-1であってよい。いくつかの実施形態において、前記患者はヒトである。いくつかの実施形態において、前記組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、吸入、局所投与、経皮パッチ、坐剤、または経口投与により投与されてよく、特に静脈内注射であってよい。前記組成物は、他の抗HIV薬の投与から0分〜1週以内、特に他の抗ウイルス薬、抗菌剤、および／または抗HIV薬とほぼ同時に投与されてよい。
【００１１】
本発明のもう1つの側面は、少なくとも2の単離されたキュプレドキシン、シトクロムc551、およびキュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる組成物である。いくつかの実施形態において、前記組成物は医薬組成物である。
【００１２】
本発明のもう1つの側面は、医薬組成物中に少なくとも1のキュプレドキシン、シトクロムc551、あるいはキュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物であって、哺乳類細胞においてHIV-1感染の増殖を阻害することができる単離ペプチドを含んでなる組成物をバイアル中に含んでなるキットである。いくつかの実施形態において、前記キットは、静脈内投与のために構築される。
【００１３】
本発明のもう1つの側面は、哺乳類細胞におけるウイルス感染および細菌感染を研究する方法であって、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と細胞とを接触させるステップと；細菌またはウイルスと前記細胞とを接触させるステップと；ウイルスまたは細菌の感染の増殖を測定するステップとを含んでなる方法である。いくつかの実施形態において、前記キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と細胞とを接触させるステップは、細胞を細菌またはウイルスと接触させるステップの前に行われる。他の実施形態において、前記キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と細胞とを接触させるステップは、細胞を細菌またはウイルスと接触させるステップの後で行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒトの細胞である。他の実施形態において、前記細胞は、リンパ腫細胞または末梢血単核細胞である。他の実施形態において、前記ウイルスまたはバクテリアは、HIV-1、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、パラインフルエンザウイルスA型、B型、およびC型、肝炎ウイルスA型、B型、C型、およびG型、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、ドーリウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス；SIVまたは結核菌であり、特にHIV-1である。
【００１４】
本発明のもう1つの側面は、キュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物であって、哺乳類細胞においてHIV-1感染の増殖を阻害することができるペプチドをコードする発現ベクターである。
【００１５】
本発明のこれらならびに他の側面、利点、および特徴は、以下の図および特別な実施形態の詳細な説明から明らかであろう。
【００１６】
〔配列の簡単な説明〕
配列番号1：緑膿菌に由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号2：緑膿菌に由来するシトクロムc551のアミノ酸配列
配列番号3：フォルミジウム・ラミノサム(Phormidium laminosum)に由来するプラストシアニンのアミノ酸配列
配列番号4：チオバチルス・フェロオキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans)に由来するラスチシアニンのアミノ酸配列
配列番号5：アクロモバクター・シクロクラステス(Achromobacter cycloclastes)に由来するシュードアズリン(pseudoazurin)のアミノ酸配列
配列番号6：アルカリ糞便菌に由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号7：アクロモバクター・キシロソキシダンス種脱窒菌(denitrificans)Iに由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号8：気管支敗血症菌に由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号9：メチロモナスsp.J.に由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号10：髄膜炎菌Z2491に由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号11：蛍光菌に由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号12：シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)に由来するアズリンのアミノ酸配列
配列番号13：ブドウピアス病菌(Xylella fastidiosa)9a5cに由来するアズリンに由来するアミノ酸配列
配列番号14：キュウリ(Cucumis sativus)に由来するステラシアニン(stellacyanin)のアミノ酸配列
配列番号15：クロロフレクス・オーランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)に由来するオーラシアニン(auracyanin)Aのアミノ酸配列
配列番号16：クロロフレクス・オーランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)に由来するオーラシアニンBのアミノ酸配列
配列番号17：キュウリ(Cucumis sativus)に由来するキュウリ塩基性タンパク質のアミノ酸配列
配列番号18：淋菌(Neisseria gonorrhoeae)F62に由来するLazのH.8領域のアミノ酸配列
配列番号19：淋菌F62に由来するLazのアミノ酸配列
配列番号20：淋菌のLazコード遺伝子(laz)をPCR増幅するための順方向プライマー
配列番号21：淋菌のLazコード遺伝子(laz)をPCR増幅するための逆方向プライマー
配列番号22：pUC18-lazの3.1kb断片をPCR増幅するための順方向プライマー
配列番号23：pUC18-lazの3.1kb断片をPCR増幅するための逆方向プライマー
配列番号24：pUC19-pazの0.4kb断片をPCR増幅するための順方向プライマー
配列番号25：pUC19-pazの0.4kb断片をPCR増幅するための逆方向プライマー
配列番号26：pGST-azu 36-128に対する順方向プライマー
配列番号27：pGST-azu 36-128に対する逆方向プライマー
配列番号28：pGST-azu 36-89に対する順方向プライマー
配列番号29：pGST-azu 36-89に対する逆方向プライマー
配列番号30：pGST-azu 88-113に対する順方向プライマー
配列番号31：pGST-azu 88-113に対する逆方向プライマー
配列番号32：pGST-azu 88-113の調製のための部位特異的突然変異誘発に対するオリゴヌクレオチド
配列番号33：pGST-azu 88-113の調製のための部位特異的突然変異誘発に対するオリゴヌクレオチド。
【００１７】
〔図面の簡単な説明〕
図1：図1は、アズリン、H.8-アズリン(H.8-Az)、およびLazによるHIV-1ウイルスの増殖の阻害を示す。これらの3つのタンパク質は、PBMCと共に異なる濃度でインキュベートされ、3つのサブタイプのHIV-1を添加した。2時間のインキュベーションの後、ウイルスは除去されたが、実施例3で述べるように加え戻した。ウイルス増殖の抑制は、p24のELISA分析により測定した。
【００１８】
図2：図2は、キュプレドキシンのCD4およびHIV-1 gp120との結合パターンを表す表面プラズモン共鳴結合曲線を示す。(A)カルボキシメチルデキストランコートされたゴールドセンサーチップにおける固定化されたCD4と(CD4-CM5)、アズリンおよびGST-Azu 36-128（挿入として示した）との新規且つ特異的な結合を示すSPR滴定曲線。HIV-1 gp120、HIV-1 gag、およびHIV-1 nefは、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして役立った。相対的な結合親和性は、データポイント上を結線するカーブフィットを用いて、データをReq＝Rmax/(1+(Kd/C))に当てはめることにより決定した。CD4結合性Kd値は、36.9±2.0 nM (アズリン)、0.34±0.04 nM (GST-Azu 36-128)、および48.1±3.1 nM (HIV-1 gp120)である。(B)固定化されたアズリン(Az-CM5)がHIVタンパク質と接触する場合の結合滴定。むき出しのAu-CM5チップに対する大きな非特異的な結合性のため、CM5は、溶離剤としてランニングバッファーに加えられた(HBS-EP緩衝液に対して1 mg/ml CM5)。カーブフィットは、25.1±3.1 nM (CD4)、および8.9±0.8 nM (HIV-1 gp120)のKdを与えた。(C) ICAMs (ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、およびNCAM)と固定化されたアズリンとの結合性に対するSPRカーブは、(B)の部分における実験と同様の条件下で測定された。ICAM-3を用いた場合はアズリンの選択的な認識が生じるが、ICAM-1またはICAM-2の場合は生じないことは注目すべきであり、結合強度は19.5±5.4 nMであった。アズリンと結合するNCAMに対するKdは、図に示した通り、20±5.0 nMであった。(D)CM5センサーチップ上に固定化されたCD4を用いたSPR結合競合試験。アズリン＋HIV-1 gp120溶液は、異なるアズリン濃度で(0-4500 nM, [HIV-1 gp120]は242 nM)センサー表面に加えられ、データは、共鳴の割合、％全反応としてプロットされた[Req (アズリン＋HIV-1 gp120)/(Req/(HIV-1 gp120))]。GST-Azu 36-128は、HIV-1 gp120と共に固定化されたCD4に滴定され、同様の方法で分析された。競合データは、アズリンおよびGST-Azu 36-128の固定化されたCD4との結合性について、1：1の化学量論比を示した。
【００１９】
図3：図3は、アズリン、およびGST-アズリン融合とDC-SIGN との相互作用を示す表面プラズモン共鳴結合滴定を示す。(A)アズリン、ICAM-3、およびGST-Azu 36-89とDC-SIGNとの濃度依存性の結合は、DC-SIGN修飾CM5センサー表面上に種々の濃度のタンパク質（0〜100nM）を注入することにより決定され、結合の程度は、共鳴ユニット(RU)として測定された平衡共鳴反応値の関数として評価された。(B)同じセンサーチップおよび部分Aにおいてアズリンについて述べたようなプロトコルを用いたGST-Azu 88-113とDC-SIGNとの結合滴定曲線。GST-Azu 88-113とDC-SIGNとの陽性の相互作用は、アズリンに対する認識配列としてのその潜在的な役割を示す。アズリン、ICAM-3、およびGST-Azu 88-113に対する結合親和性(Kd)は、データをReq＝Rmax/(1+(Kd/C))に当てはめることにより決定され、カーブフィットはこれらのプロットにおけるデータ点を連結する。外挿されたKd値は、0.83±0.05 nM (アズリン)、0.93±0.39 nM (ICAM-3)、および5.98±1.13 nM (GST-Azu 88-113)である。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
〔定義〕
ここで使用される場合、「細胞」という用語には、特に「単一の細胞」と記載しない限り、単数および複数の両方が含まれる。
【００２１】
ここで使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを示すために互換的に使用される。前記用語は1以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的且つ化学的な類似体であるアミノ酸ポリマーに対して適用される。前記用語は天然アミノ酸ポリマーに対しても適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、限定するものではないが、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびADP-リボシル化が含まれる修飾体も包含する。ポリペプチドは、全体が常に直鎖状であるとは限らないことは認識されるであろう。例えば、ポリペプチドはユビキチン結合の結果として分岐する可能性があり、一般的に、天然プロセシングおよび天然には生じないヒトの操作によりもたらされる事象が含まれる翻訳後の事象の結果として、環状（分岐を伴い、または伴わずに）であってよい。環状、分枝状、および分岐環状のポリペプチドは、非翻訳の天然工程および完全に合成的な方法により同様に合成されてよい。
【００２２】
ここで使用される場合、「病理学的状態」という用語は、生物またはその一部の正常な状態の障害を構成し、身体上の機能の性能を妨害または修飾する正常な状態からの解剖的および生理的な異常性が含まれ、種々の因子（例えば、栄養不良、公害、もしくは気候）、特定の感染性の病原体（例えば、虫、寄生性の原虫、細菌、またはウイルス）、生物の本質的な欠陥（例えば遺伝性の異常）、またはそれらの因子の組み合わせに対する反応である。
【００２３】
ここで使用される場合、「状態」という用語には、生物またはその一部の正常な状態の障害を構成し、身体上の機能の性能を妨害または修飾する、正常な状態からの解剖的および生理的な異常性が含まれる。
【００２４】
ここで使用される場合、「〜に罹患した」という用語には、病理学的状態の症状を現在示していること、観察可能な症状はなくても病理学的状態を有していること、病理学的状態からの回復過程にあること、または病理学的状態から回復したことが含まれる。
【００２５】
ここで使用される場合、「治療」という用語には、状態または治療される状態に付随する症状の進行または重症化の防止、低下、停止、または反転させることが含まれる。「治療」という用語には、医学的、治療的、および／または予防的な投与が適宜含まれる。
【００２６】
ここで使用される場合、「HIV感染の増殖を阻害する」という用語は、HIV感染を減少させること、またはヒトの体内における増加を妨げることを意味する。これらの意味には、限定するものではないが、HIV遺伝子の複製の阻害、HIVコートタンパク質の合成および／または構築の阻害、ならびに非感染細胞へのHIVの侵入の阻害が含まれてよい。この定義には、現在既知のHIV治療の作用方法が含まれる。HIV感染の増殖が阻害されたかどうかを測定するための1つの方法は、実施例3において述べる。
【００２７】
「治療的に有効な量」は、治療される患者についての特定の状態において存在する症状の発生を防止もしくは遅延させるのに有効な量、または前記症状を部分的または全体的に緩和するのに有効な量である。治療的に有効な量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００２８】
「実質的に純粋な」という用語は、ポリペプチドまたは他の化合物の用語を修飾するために使用される場合、ここで使用される場合において、例えば、活性のある抑制性の薬剤を実質的に含まないか、もしくは前記薬剤が混ざっていない形態で、培地から単離されたポリペプチドのようなポリペプチドまたは化合物を指す。「実質的に純粋な」という用語は、単離された画分の乾燥重量で少なくとも約75％、または「75％実質的に純粋な」化合物を指す。より詳細に言うと、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で少なくとも約85％が活性化合物である化合物、または「85％実質的に純粋な」化合物を指す。より詳細に言うと、「実質的に純粋な」という用語は、乾燥重量で少なくとも約95％が活性化合物である化合物、または「95％実質的に純粋な」化合物を指す。実質的に純粋なキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体もしくは誘導体は、1以上の他の実質的に純粋な化合物、または他の単離されたキュプレドキシンもしくはシトクロムc551と組み合わせて使用されてよい。
【００２９】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という語句は、物質が天然の状態で存在する場合に該物質に通常付随する成分が、実質的または本質的に含まれない物質を指す。それ故、本発明による単離ペプチドは、好ましくは、それらのインサイチューの環境においてペプチドに通常付随する物質を含まない。「単離された」領域は、その領域が由来するポリペプチドの全配列を含まない領域を指す。「単離された」核酸、タンパク質、またはそれらの各断片は、例えば、限定するものではないが、核酸配列決定、制限分解、部位特異的な突然変異誘発、および核酸断片を発現ベクターに導入することによるサブクローニング、ならびに実質的に純粋な含量でタンパク質またはタンパク質断片を得ることのように、当業者によって操作され得るように、インビボ環境から実質的に除去されている。
【００３０】
「変異体」という用語は、ペプチドに関してここで使用される場合、野生型のポリペプチドと比較して置換、欠失、または挿入されたアミノ酸を有するアミノ酸配列の変異体を指す。変異体は、野生型ペプチドの短縮型であってよい。それ故、変異体のペプチドは、当該ポリペプチドをコードする遺伝子の操作により作られてよい。変異体は、当該ポリペプチドの塩基組成または特徴を変化させることにより作られてよいが、少なくともその基礎的な活性の一部は変化しない。例えば、アズリンの「変異体」は、哺乳類細胞においてHIV感染の増殖を阻害する能力を保持している突然変異したアズリンであってよい。いくつかの場合において、変異体ペプチドは、ε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基のような非天然のアミノ酸を用いて合成される(Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990))。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ペプチドと比較して20以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有する。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ペプチドと比較して15以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有する。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ペプチドと比較して10以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有する。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ペプチドと比較して6以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有する。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ペプチドと比較して5以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有する。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ペプチドと比較して3以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有する。
【００３１】
「アミノ酸」という用語は、ここで使用される場合、いずれかの天然二存在するアミノ酸または天然に存在しないもしくは合成のアミノ酸残基を含んでなるアミノ酸部分、すなわち、1、2、3、またはそれ以上の炭素原子、典型的には1つの（α）炭素原子により直接結合された少なくとも1のアミノ残基および少なくとも1のカルボキシルを含んでなるいずれかの部分を意味する。
【００３２】
「誘導体」という用語は、ペプチドに関してここで使用される場合、対象のペプチドに由来するペプチドを指す。誘導には、ペプチドがその基礎的な活性のいくつかを今までどおり保持するように化学的に修飾されることが含まれる。例えば、アズリンの「誘導体」は、哺乳類細胞においてHIV感染の増殖を阻害するその能力を保持した化学的に修飾されたアズリンであってよい。関心のある化学的な修飾には、限定するものではないが、ペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール(PEG)修飾、リン酸化、またはグリコシル化が含まれる。加えて、誘導体ペプチドは、ポリペプチドまたはその断片と、限定するものではないが、もう1つのペプチド、薬物分子または他の治療的もしくは薬学的な薬剤、あるいは検出可能なプローブのような化学的な化合物との融合であってよい。
【００３３】
「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」という用語は、2つの配列を整列させた場合、候補配列におけるアミノ酸残基と同一であるポリペプチド中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。％アミノ酸同一性を決定するために、配列は整列され、必要な場合、最大の％配列同一性を達成するためにギャップが導入され；保存的な置換は、配列の同一性の一部とは看做されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アラインメント手法は、当業者に周知である。しばしば、BLAST、BLAST2、ALIGN2、またはMegalign (DNASTAR)ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアが、ペプチド配列をアラインするために使用される。特別な実施形態において、長い複雑性フィルタののデフォルトパラメーター、期待値10、ワードサイズ3、存在11、および拡張11を用いて、Blastp（メリーランド州ベテスダの国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能から商業的に入手可能）が使用される。
【００３４】
アミノ酸配列がアラインされた場合、所定のアミノ酸配列Aの、所定のアミノ酸配列Bに対する％アミノ酸配列同一性（所定のアミノ酸配列Bに対してある一定％のアミノ酸配列同一性を有するまたは含んでなる所定のアミノ酸配列Aのようにも表現される）、以下のように計算される：
％アミノ酸配列同一性＝X/Y＊100
ここで、式中のXは、AおよびBの配列アラインメントプログラムまたはアルゴリズムのアラインメントにより一致する、同一と評価されるアミノ酸残基の数であり、
Yは、Bにおけるアミノ酸残基の全数である。
【００３５】
アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの％アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの％アミノ酸配列同一性と等しくないであろう。より長い配列をより短い配列と比較する場合、より短い配列が「B」配列である。例えば、短縮型ペプチドを対応する野生型のポリペプチドと比較する場合、短縮されたペプチドが「B」配列である。
【００３６】
〔一般〕
本発明は、キュプレドキシンおよび／またはシトクロムc551を含んでなる組成物ならびに哺乳類細胞および哺乳類の患者においてウイルスおよび細菌感染を阻害する方法を提供する。本発明は、特に、キュプレドキシンおよび／またはシトクロムc551を含んでなる組成物、ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染の発達を阻害するためのそれらの使用に関する。本発明は、ウイルス感染、特にHIVによる感染の増殖を阻害する能力を保持した、キュプレドキシンおよびシトクロムc551の変異体、誘導体、および構造的な均等物、ならびにそれらを含んでなる組成物にも関する。より詳細に言うと、本発明は、緑膿菌アズリンおよびシトクロムc551、アズリンおよびシトクロムc551の変異体、誘導体、および構造的な均等物を含んでなる組成物、ならびにウイルスもしくは細菌感染、特にHIV-1感染を有する患者を治療するため、またはそれらの危険にさらされている場合に感染を予防するためのそれらの使用を提供する。最後に、本発明は、細胞が感染する前または後に、該細胞をキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と接触させることにより、ウイルスまたは細菌による哺乳類細胞の感染を研究するための方法、ならびに感染の増殖を測定する方法を提供する。
【００３７】
以前に、緑膿菌により産生される2つのレドックスタンパク質、キュプレドキシンアズリンおよびシトクロムc551(cyt c551)は、共にJ774細胞に選択的に入り、これらの癌細胞に対して有意な細胞障害性の作用を示し、正常細胞には前記作用を示さないことが既知である(Zaborina et al., Microbiology 146:  2521-2530 (2000).)。アズリンは、ヒト黒色腫UISO-Mel-2またはヒト乳癌MCF-7細胞にも選択的に入る(Yamada et al., PNAS 99:14098-14103 (2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004).)。緑膿菌に由来するアズリンは、J774マウス細網細胞肉腫細胞に選択的に入り、複合体を形成することにより腫瘍サプレッサータンパク質p53を安定化し、p53の細胞内濃度を増大させ、アポトーシスを引き起こす(Yamada et al., Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002).)。
【００３８】
驚くべきことに、アズリンは、末梢血単核細胞(PBMC)培養においてHIV-1の増殖の約90％の阻害を引き起こし得ることが現在知られている。実施例3を参照されたい。アズリンは、HIV-1、Bal（USおよび西ヨーロッパで広まっている最も優性のクレードB）、クレードBアフリカン単離RW/92/008/RE1、およびクレードCインディアン単離IN/2167 D15の3つの株の増殖を阻害することが現在知られている。実施例3を参照されたい。加えて、ナイセリア族、Lazに由来するキュプレドキシン様タンパク質は、これら3つのHIV-1株の増殖ならびにLazタンパク質のH.8領域と緑膿菌アズリンとの融合を阻害することも現在知られている。実施例3を参照されたい。最後に、緑膿菌に由来するアズリンおよびシトクロムc551のM44KM64E突然変異体がHIV-1に感染したヒト血液リンパ球におけるHIV感染を阻害し得ることが現在知られている。実施例1を参照されたい。
【００３９】
緑膿菌に由来するアズリンは、ICAM-1（HIV-1粒子中に見られ、HIV-1の感染力を増大させることが既知である）、ICAM-2、およびCD4（HIV-1に対する腫瘍細胞表面受容体）と構造的に類似することが既知である。実施例2を参照されたい。表面プラズモン共鳴実験では、インビトロアズリンが細胞表面受容体CD4に対する有意な結合性を示し、驚くべきことにHIV-1表面リガンドgp120よりもCD4に対して高い親和性を示すことが明らかになっている。実施例4を参照されたい。さらに、GST-Azu 36-128、すなわちアズリンアミノ酸36−128とのグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合は、アズリン自体よりもCD4に対して強い結合性を示す一方で、GST-Azu 88-113はCD4に結合せず、アズリンタンパク質のある部分のみがCD4に対する結合性の原因であることを示唆している。実施例4を参照されたい。gp120は、CD4よりアズリンに対していくらか強い結合性を示し、アズリンはgp120およびCD4の両方に結合することを示唆する。さらに、ICAM-3およびNCAMは、インビトロの表面プラズモン共鳴分析においてアズリンに対する強い結合性を示した。実施例5を参照されたい。最後に、アズリンは、HIV-1の他の受容体、樹状細胞特異的接着受容体(DC-SIGN)と結合することが現在知られている。実施例7を参照されたい。HIV-1に関連する他のタンパク質はgp41のような宿主細胞に入り、アズリンに対する結合性を示さなかった。実施例4を参照されたい。
【００４０】
競合実験を通して、インビトロにおいて、アズリンがgp120とその同種の受容体CD4との結合を妨げ得ることが現在知られている。特に、GST-Azu 36-128はCD4結合についてgp120と競合する有意な能力を示し、GST-Azu 88-113は競合する能力をほとんど示さなかった。実施例6を参照されたい。ナイセリア属に由来するアズリン様タンパク質であるLazは、HIV-1感染の前に加えた場合、PBMC媒質におけるHIV-1感染の増殖を73％阻害し、HIV-1感染の後に加えた場合にはほとんど阻害しないことが現在既知である。実施例8を参照されたい。本発明の操作をいずれか1のメカニズムに限定しないが、アズリンはHIVとICAM、CD4、およびDC-SIGNのような細胞表面受容体との相互作用を妨げ、HIVが細胞に入り、感染させることを阻止することにより、末梢血単核細胞におけるHIV-1感染の増殖を阻害し得ると考えられる。
【００４１】
従って、キュプレドキシン間の高度な構造的な類似性により、他のキュプレドキシンは哺乳類の血液細胞中でHIV-1感染の増殖を同様に阻害し得る。HIV感染に加えて、キュプレドキシンは、構造においてICAM、DC-SIGN、およびCD4と類似する細胞表面受容体に結合するウイルスの他の感染を抑制し得る。例えば、DC-SIGNは、C型肝炎ウイルス(HCV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス(CNV)、および結核菌が含まれる他のウイルスならびに細菌性の病原体の結合受容体でもある (Wang et al., Chin. Med. J. 117:1395-1400 (2004))。
【００４２】
本発明の組成物
本発明は、キュプレドキシンまたは緑膿菌シトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物であるペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは実質的に純粋である。他の実施形態において、前記ペプチドは、ペプチドを含んでなるまたは本質的にペプチドからなる組成物である。他の実施形態において、前記ペプチドは単離される。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、全長のキュプレドキシンまたはシトクロムc551より短く、キュプレドキシンまたはシトクロムc551の機能的な特徴のいくつかを保持している。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、ウイルスまたは細菌感染の増殖を阻害する能力を保持しており、具体的には、末梢血単核細胞におけるHIV-1感染である。特別な実施形態において、シトクロムc551は配列番号2である。もう1つの特別な実施形態において、前記ペプチドは哺乳類、具体的にはヒトにおいて免疫反応を生じない。本発明は、キュプレドキシン、緑膿菌シトクロムc551、またはキュプレドキシンもしくはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物である少なくとも1のペプチドを含んでなる組成物も提供する。本発明は、キュプレドキシン、緑膿菌シトクロムc551、またはキュプレドキシンもしくはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物である少なくとも1のペプチドを含んでなる医薬組成物も提供する。
【００４３】
キュプレドキシン間の高い構造的な相同性のため、HIV-1感染の増殖の阻害に関して、他のキュプレドキシンも緑膿菌アズリンと同様の抗HIV活性を有すると考えられる。いくつかの実施形態において、キュプレドキシンは、限定するものではないが、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、ラスチシアニン、またはオーラシアニンである。特別な実施形態において、アズリンは、緑膿菌、アルカリ糞便菌、アクロモバクター・キシロソキシダンス脱窒菌I (Achromobacter xylosoxidans ssp.denitrificans I)、気管支敗血症菌、メチロモナス属、髄膜炎菌Z2491、淋菌、蛍光菌、シュードモナス・クロロラフィス、ブドウピアス病菌 9a5、または腸炎ビブリオに由来する。非常に特別な実施形態において、アズリンは緑膿菌に由来する。他の特別な実施形態において、キュプレドキシンは、配列番号1、3〜17のアミノ酸配列を含んでなる。他の特別な実施形態において、キュプレドキシンは、髄膜炎菌または淋菌に由来するLazタンパク質である。
【００４４】
本発明は、野生型ポリペプチドと比較して置換、欠失、または挿入されたアミノ酸を有する、キュプレドキシンまたはシトクロムc551のアミノ酸配列の変異体を提供する。本発明の変異体は、野生型ポリペプチドの断片であってよい。いくつかの実施形態において、前記組成物は、全長の野生型ポリペプチドより短いキュプレドキシンまたはシトクロムc551の領域からなるペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記組成物は、約10残基より多い、約15残基より多い、または約20残基より多い切断されたキュプレドキシンまたはシトクロムc551からなるペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記組成物は、約100残基以下、約50残基以下、約40残基以下、または約30残基以下の切断されたキュプレドキシンまたはシトクロムc551からなるペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記組成物は、キュプレドキシンまたはシトクロムc551、具体的には配列番号1〜17に対して少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含んでなる。
【００４５】
特別な実施形態において、キュプレドキシンの変異体は、緑膿菌アズリン残基36〜128、アズリン残基36〜88、またはアズリン残基88〜113を含んでなる。他の実施形態において、キュプレドキシンの変異体は、緑膿菌アズリン残基36〜128、アズリン残基36〜88、またはアズリン残基88〜113からなる。他の特別な実施形態において、前記変異体は、アズリン以外のキュプレドキシンに対応する残基からなる。他のキュプレドキシン変異体は、アズリン残基36〜128、アズリン残基36〜88、またはアズリン残基88〜113と同様の活性を有するように設計されてよいことも考えられる。これを行うために、対象のキュプレドキシンのアミノ酸配列は、BLAST、BLAST2、ALIGN2、またはMegalign (DNASTAR)を用いて緑膿菌アズリン配列に対してアラインされ、緑膿菌アズリンのアミノ酸配列に位置する関連する残基、および対象のキュプレドキシン配列に見られる対応する残基、ならびに対応する切断ペプチドが設計された。
【００４６】
前記変異体には、天然でない合成アミノ酸で作られたペプチドも含まれる。例えば、天然でないアミノ酸は、血流中における組成物の半減期を延長または最適化するために、変異体ペプチドに組み込まれてよい。そのような変異体には、限定するものではないが、D,L-ペプチド(ジアステレオマー)(Futaki et al., J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)); 天然には存在しないアミノ酸 (Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004))、および炭化水素のステープリング(stapleing)が続くオレフィン含有の天然には存在しないアミノ酸(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004)) を含有するペプチド、ならびにε-(3,5-ジニトロベンゾイル)-Lys残基を含んでなるペプチドが含まれる。
【００４７】
他の実施形態において、本発明のペプチドは、キュプレドキシンまたはシトクロムc551の誘導体である。キュプレドキシンまたはシトクロムc551の誘導体は、ペプチドの化学的な修飾体であり、該ペプチドはその機能的活性の一部を今まで通り保持している。例えば、アズリンの「誘導体」は、哺乳類細胞においてHIV感染の増殖を阻害する能力を保持した化学的に修飾されたアズリンであってよい。対象の化学的な修飾には、限定するものではないが、ペプチドのアミド化、アセチル化、硫酸化、ポリエチレングリコール(PEG)修飾、リン酸化、およびグリコシル化が含まれる。加えて、誘導体ペプチドは、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と、限定するものではないが、他のペプチド、薬物分子または他の治療的もしくは薬学的な薬剤、あるいは検出可能なプローブのような化学的な化合物との融合であってよい。対象の誘導体には、ペプチドおよび本発明の組成物の血流における半減期が当業者に周知のいくつかの方法により延長または最適化される化学的な修飾が含まれ、限定するものではないが、環化ペプチド(Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004))、N-およびC-末端修飾(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990))、後で炭化水素ステープリングされるオレフィン含有非天然アミノ酸(Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004))が含まれる。
【００４８】
本発明の組成物のペプチドは、キュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、および／または構造的な均等物であってよいと考えられる。例えば、前記ペプチドは、PEG化されたアズリンの断片、すなわち変異体且つ誘導体であってよい。1つの実施形態において、本発明のペプチドは、オレフィンを支えるつなぎを含有するα,α-二置換非天然型アミノ酸を用いて合成され、その後、ルテニウムに触媒されたオレフィンメタセシス反応により全ての炭化水素が「ステープル」される (Scharmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004))。加えて、アズリンの構造的な均等物であるペプチドは、他のペプチドに融合してよく、それ故、構造的な均等物且つ誘導体であるペプチドが作られる。これらの例は、単に説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。キュプレドキシンまたはシトクロムc551の変異体、誘導体、または構造的な均等物は、銅と結合してよく、結合しなくてもよい。
【００４９】
もう1つの実施形態において、前記ペプチドは、キュプレドキシンまたはシトクロムc551の構造的な均等物である。キュプレドキシンと他のタンパク質との間の有意な構造的な相同性を決定する研究の例には、Toth et al. (Developmental Cell 1:82-92 (2001))が含まれる。特に、キュプレドキシンと構造的な均等物との間の有意な構造的な相同性は、VASTアルゴリズムを用いて決定される(Gibrat et al., Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); .Madej et al.,  Proteins 23:356-3690 (1995))。特別な実施形態において、キュプレドキシンと構造的な均等物との構造的な比較によるVAST p値は、約10-3未満、約10-5未満、または約10-7未満である。他の実施形態において、キュプレドキシンとその構造的な均等物との間の有意な構造的な相同性は、DALIアルゴリズムを用いて決定される(Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993))。特別な実施形態において、対の構造比較に対するDALI Zスコアは、少なくとも約3.5、少なくとも約7.0、または少なくとも約10.0である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、緑膿菌アズリンまたはシトクロムc551の機能的な特徴のいくつかを有する。特別な実施形態において、キュプレドキシンまたはシトクロムc551は、ウイルスまたは細菌感染、特に哺乳類細胞、具体的には、HIVに感染した末梢血単核細胞におけるHIV感染の増殖を阻害する。本発明は、ウイルスまたは細菌感染、特に哺乳類細胞におけるHIV感染の増殖を阻害する能力を保持した、キュプレドキシンおよびシトクロムc551の変異体、誘導体、および構造的な均等物も提供する。細胞におけるHIV-1感染の増殖は、商業的なp24酵素イムノアッセイにより、細胞培養液上清においてHIV-1 p24抗原の産生における変化を測定することにより決定されてよい(パーキンエルマーライフサイエンス, Inc., Wellseley, Mass.)。感染の増殖の阻害は、対照の治療と比較した場合に統計学的に有意である、感染が増大する速度の減少または低下である。
【００５１】
キュプレドキシンおよびシトクロムc551がウイルスまたは細菌感染、特にHIVに感染した哺乳類細胞における感染の増殖を制限できることが既知であるため、この抗ウイルスまたは抗細菌活性、特に抗HIV活性を保持したキュプレドキシンの変異体および誘導体を設計することが現在可能である。そのような変異体および誘導体は、例えば、キュプレドキシンおよびシトクロムc551の種々の変異体および誘導体の「ライブラリ」を作り、実施例3における実験的方法のように、当該分野において既知の方法の1つを用いて、それぞれを抗ウイルスまたは抗細菌活性、特に抗HIV活性について試験することにより作られてよい。結果として得られる抗ウイルスまたは抗細菌活性、特に抗HIV活性を有するキュプレドキシンの変異体および誘導体は、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551の代わりにまたはキュプレドキシンもしくはシトクロムc551に加えて、本発明の方法において使用されてよいと考えられる。
【００５２】
いくつかの特別な実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロム、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、非結合性の対照タンパク質とは統計的に異なる結合定数を有するCD4に結合する。ペプチドは、実施例4に記載するように、表面プラズモン共鳴分析を用いることによりその活性について試験されてよい。あるタンパク質が他に結合するかどうかを決定する他の方法は、当業者に周知であり、同様に使用されてよい。
【００５３】
いくつかの特別な実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロム、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、非結合性の対照タンパク質とは統計的に異なる結合定数を有するgp120と結合する。ペプチドは、実施例4に記載するように、表面プラズモン共鳴分析を用いることによりその活性について試験されてよい。あるタンパク質が他に結合するかどうかを決定する他の方法は、当業者に周知であり、同様に使用されてよい。
【００５４】
いくつかの特別な実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロム、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、非結合性の対照タンパク質とは統計的に異なる結合定数を有するICAM3と結合する。ペプチドは、実施例4および5に記載するように、表面プラズモン共鳴分析を用いることによりその活性について試験されてよい。あるタンパク質が他に結合するかどうかを決定する他の方法は、当業者に周知であり、同様に使用されてよい。
【００５５】
いくつかの特別な実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロム、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、非結合性の対照タンパク質とは統計的に異なる結合定数を有するDC-SIGNと結合する。ペプチドは、実施例4および5に記載するように、表面プラズモン共鳴分析を用いることによりその活性について試験されてよい。あるタンパク質が他に結合するかどうかを決定する他の方法は、当業者に周知であり、同様に使用されてよい。
【００５６】
いくつかの特別な実施形態において、本発明のペプチドは、哺乳類癌細胞、具体的にはJ774細胞においてアポトーシスを引き起こす。キュプレドキシンまたは他のポリペプチドのアポトーシスを引き起こす能力は、ミトセンサー(MITOSENSOR：登録商標) アポラート(APOLERT：登録商標) ミトコンドリア膜センサーキット(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.)を用いたミトセンサー(mitosensor) ApoAlert 共焦点顕微鏡法により、Zou et al. (J. Biol. Chem. 274: 11549-11556 (1999))に記載されている方法を使用して、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-3活性を測定することにより、および例えばアポラート(APOLERT：登録商標) DNA フラグメンテーションキット(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.)を用いて、アポトーシスが誘発された核DNAフラグメンテーションを検出することにより観察されてよい。
【００５７】
もう1つの特別な実施形態において、本発明のペプチドは、哺乳類癌細胞、具体的にはJ774細胞において細胞の増殖抑制を引き起こす。細胞の増殖抑制は、Yamada et al. (PNAS 101:4770-4775 (2004))に記載されている方法のように、細胞サイクルの進行の阻害の程度を測定することにより決定され得る。もう1つの特別な実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、哺乳類癌細胞、具体的にはJ774細胞において、細胞サイクルの進行を阻害する。
【００５８】
〔キュプレドキシン〕
これらの小さな青色銅タンパク質（キュプレドキシン）は、細菌の電子伝達鎖に関与する電子伝達タンパク質(10〜20kDa)であるか、または未知の機能のものである。銅イオンは、単独でタンパク質マトリックスと結合する。銅の周りの2つのヒスチジンおよび1つのシステインリガンドに対する特殊なねじれた三方晶の平面配列は、金属部位の非常に特異的な電気的性質および激しい青色を生じる。多数のキュプレドキシンは、中程度から高い解像度において結晶学的に特徴付けられている。
【００５９】
キュプレドキシンは、一般的に、配列相同性は低いが、構造的な相同性は高い(Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000))。例えば、アズリンのアミノ酸配列は、オーラシアニンBのアミノ酸配列に対して31％同一であり、ラスチシアニンのアミノ酸配列に対して16.3％同一であり、プラストシアニンのアミノ酸配列に対して20.3％同一であり、シュードアズリンに対して17.3％同一である。表1を参照されたい。しかしながら、これらのタンパク質の構造的な類似性は、より明白である。アズリンのオーラシアニンBに対する構造の比較のためのVAST p値は、10-7.4であり、ラスチシアニンに対しては10-5であり、プラストシアニンに対しては10-5.6であり、シュードアズリンに対しては10-4.1である。
【００６０】
全てのキュプレドキシンは、8ストランドのギリシャ鍵(Greek key)β-バレルまたはβ-サンドイッチ折りたたみを有し、高度に保存された部位構造を有する(De Rienzo et al., Protein Science 9:1439-1454 (2000))。メチオニンおよびロイシンのような多くの長鎖脂肪族残基の存在により、顕著な疎水性パッチ(patch)は、アズリン、アミシアニン(amicyanin)、ラン藻プラストシアニン、キュウリ塩基性タンパク質、ならびにより低い程度で、シュードアズリン、および真核生物プラストシアニンにおける銅部位の周囲に存在する（同書）。疎水性パッチは、ステラシアニンおよびラスチシアニンの銅部位においてもより低い程度で見られるが、異なる特徴を有する（同書）。
【表１】
2008545398.tif 000003
【００６１】
1アラインされた長さ：2つの構造間で重ねあわされたC-α原子の対応するペアの数、すなわち、3Dの重ね合わせを計算するために使用された残基の数。
【００６２】
2P-VAL：VAST p値は、比較の有意性の程度であり、確率として表される。例えば、p値が0.001である場合、純偶然によりこの質の一致を見ることに対するオッズが1000〜1である。VASTによるp値は、MMDBデータベースに500の独立且つ無関係のドメインがあるという仮定を用いて、多重比較の効果に対して調整される。示されたp値は、500に分けられた各ドメイン対の対比較に対するp値に対応する。
【００６３】
3スコア：VAST構造類似性スコア。この数字は、重ね合わされた2次構造要素の数およびその重ね合わせの質に関連する。より高いVASTスコアは、より高い類似性と相関する。
【００６４】
4RMSD：2乗平均平方根重ね合わせ残余(root mean square superposition residual)(オングストローム)。この数字は、2つの構造の最大の重ね合わせの後、対応するC-α原子間の平均平方距離の2乗根として計算される。全体的な構造の類似性の記述子としてRMSDを使用する場合、RMSD値が構造アラインメントの程度と共に変化すること、およびそのサイズを考慮に入れる必要があることに注目すべきである。
【００６５】
5C.エレガンス(elegans)主要精子タンパク質は、卵母細胞成熟におけるエフリンアンタゴニストであることが分かった(Kuwabara, 2003 “The multifaceted C. elegans major sperm protein: an ephrin signalling antagonist in oocyte maturation” Genes and Development, 17:155-161)。
【００６６】
〔アズリン〕
アズリンは、128アミノ酸残基の銅含有タンパク質であり、ある一定の細菌において電子伝達に関与するキュプレドキシンのファミリーに属する。アズリンには、緑膿菌(PA) (配列番号1)、A. キシロソキシダンス、およびA. 脱窒菌に由来するものが含まれる(Murphy et al.,  J. Mol. Biol. 315:859-871 (2002))。アズリン間のアミノ酸配列の同一性は、60〜90％の間で変化し、これらのタンパク質は強い構造的な相同性を示す。全てのアズリンは、ギリシャ鍵(Greek key)モチーフを有する特徴的なβ-サンドイッチを有し、単一の銅原子は、常にタンパク質の同じ領域に位置する。加えて、アズリンは、銅部位の周りに本質的に中性の疎水性パッチを有する。
【００６７】
〔プラストシアニン〕
プラストシアニンは、分子当り1分子の銅を含有するラン藻類、藻類、および植物の可溶性のタンパク質であり、酸化型は青色である。それらはクロロプラスト中に生じ、電子キャリアとして機能する。1978年に、ポプラプラストシアニンの構造が決定されて以来、藻類（セネデスムス属(Scenedesmus)、アオノリ属(Enteromorpha)、コナミドリムシ(Chlamydomonas)）および植物（フランスマメ）プラストシアニンの構造は、結晶学的方法またはNMRにより決定され、ポプラ構造は1.33オングストロームの解像度に改良された。配列番号3は、高熟性のラン藻であるフォルミジウム・ラミノサム(Phormidium laminosum)に由来するプラストシアニンのアミノ酸配列を示す。
【００６８】
ラン藻類と維管束植物のプラストシアニン間の配列の相違にもかかわらず（例えば、コナミドリムシ(Chlamydomonas)とポプラタンパク質との間の62％の配列同一性)、三次元構造が保護される（例えば、コナミドリムシとポプラタンパク質との間のCα位における0.76オングストロームrmsのずれ)。構造的な特徴には、8ストランドの逆平行のβ-バレルの一方の端におけるひずんだ四面体の銅結合部位、明白な負のパッチ、および平らな疎水性表面が含まれる。銅部位は、電子伝達機能に対して最適化され、負の疎水性パッチは、生理的な反応相手の認識に関与することが提唱されている。化学的な修飾、架橋結合、および部位特異的な突然変異誘発の実験は、シトクロムfとの結合相互作用における負の疎水性パッチの重要性を確認し、プラストシアニンが関与する2つの機能的に有意な電子伝達経路のモデルを確認した。1つの推定上の電子伝達経路は、相対的に短く（約4オングストローム）、疎水性パッチにおいて溶媒にさらされる銅リガンドHis-87を含み、他方は、より長く（約12〜15オングストローム）、負のパッチにおいてほとんど保護された残基Tyr-83を含む（Redinbo et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26:49-66 (1994)）。
【００６９】
〔ラスチシアニン〕
ラスチシアニンは、チオバチルス属（現在ではアシディチオバチルス(Acidithiobacillus)と呼ばれる）に由来する青色銅含有単鎖ポリペプチドである。チオバチルスフェロオキシダントに由来する非常に安定且つ高度に酸化されたキュプレドキシンラスチシアニン（配列番号4）の酸化型のX線結晶構造は、多波長異常回折により測定され、1.9オングストロームの解像度に改良された。ラスチシアニンは、6および7ストランドβシートで構成されるコアβ-サンドイッチ折りたたみで構成される。他のキュプレドキシンのように、銅イオンは、ひずんだ四面体中に配置された4つの保護された残基(His 85、Cys138、His143、Met148)のクラスター(cluster)により配位される(Walter, R.L. et al., J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996))。
【００７０】
〔シュードアズリン〕
シュードアズリンは、青色銅含有単鎖ポリペプチドのファミリーである。アクロモバクター・シクロクラステス(Achromobacter cycloclastes)から得られるシュードアズリンのアミノ酸配列は、配列番号5に示す。シュードアズリンのX線構造解析は、タンパク質間の配列の低い相同性にもかかわらず、アズリンと類似の構造を有することを示す。シュードアズリンとアズリンとの全体的な構造には2つの主要な相違が存在する。アズリンに対して、シュードアズリンには、2つのα-ヘリックスからなるカルボキシ末端伸長がある。中間ペプチド領域において、アズリンには伸長されたループが含まれ、シュードアズリンにおいては短縮され、短いα-へリックスを含有するフラップを形成する。銅原子部位における主要な相違は、MET側鎖およびMet-S銅結合長さのコンホメーションのみであり、アズリンよりもシュードアズリンのほうが有意に短い。
【００７１】
〔フィトシアニン〕
フィトシアニンとして同定可能なタンパク質には、限定されるものではないが、キュウリ塩基性タンパク質、ステラシアニン、マビシアニン(mavicyanin)、ウメシアニン(umecyanin)、キュウリの皮のキュプレドキシン(cucumber peeling cupredoxin)、エンドウマメのさやにおける推定上の青色銅タンパク質、およびシロイヌナズナに由来する青色銅タンパク質が含まれる。キュウリ塩基性タンパク質およびエンドウマメのさやのタンパク質以外の全てにおいて、青色銅部位において通常見られるアキシャルメチオニンリガンドは、グルタミンにより置換される。
【００７２】
〔オーラシアニン〕
オーラシアニンA、オーラシアニンB-1、およびオーラシアニンB-2と命名された3つの小さな青色銅タンパク質は、好熱性の緑に輝く光合成細菌であるクロロフレクス・オーランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)から単離された。2つのB型は糖タンパク質であり、相互にほぼ同一の特徴を有しているが、A型とは異なる。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は、見かけ上のモノマー分子量14 (A)、18 (B-2)、および22 (B-1) kDaを示す。
【００７３】
オーラシアニンAのアミノ酸配列は決定され、オーラシアニンが139残基のポリペプチドであることが示された(Van Dreissche et al;. Protein Science 8:947-957 (1999).)。His58、Cys123、His128、およびMet132は、既知の小さな銅タンパク質プラストシアニンおよびアズリンにおけるように進化的に保存された金属リガンドである場合、予想される様式で一定の間隔があけられる。二次構造の予測は、オーラシアニンが、緑膿菌に由来するアズリンおよびポプラの葉に由来するプラストシアニンと同様の一般的なβ-バレル構造を有することも示す。しかしながら、オーラシアニンは、両方の小さな銅タンパク質の配列クラスの配列的な特徴を有するように見える。アズリンのコンセンサス配列との全体的な類似性は、プラストシアニンのコンセンサス配列との場合とおおむね同じであり、すなわち30.5％である。オーラシアニンのN末端配列領域1〜18は、著しくグリシンおよびヒドロキシアミノ酸に富んでいる。同書。クロロフレクス・オーランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)に由来するオーラシアニンのA鎖に対する代表的なアミノ酸配列である配列番号15を参照されたい(NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874)。
【００７４】
オーラシアニンB分子は、標準的なキュプレドキシンの折りたたみ構造を有する。クロロフレクス・オーランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)に由来するオーラシアニンBの結晶構造について研究されている(Bond et al., J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001).)。付加的なN末端鎖を除いて、前記分子は、細菌性のキュプレドキシンであるアズリンに非常に似ている。他のキュプレドキシンと同様に、Cuリガンドの1つはポリペプチドのストランド4に位置し、他の3つはストランド7と8の間の大きなループに沿って位置する。Cu部位の配置は、後者の3つのリガンドの間に位置するアミノ酸に関して述べられている。結晶学的に特徴付けられたオーラシアニンBのCu結合ドメインは、N末端部により細胞質膜の周辺質側とおそらく結合し、いくつかの他の膜結合性の電子伝達タンパク質における既知の鎖と有意な配列同一性を示す。B型のアミノ酸配列は、McManus et al. (J Biol Chem. 267:6531-6540 (1992).)に示されている。クロロフレクス・オーランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)に由来するオーラシアニンのB鎖に対する代表的なアミノ酸配列である配列番号16を参照されたい(NCBI Protein Data Bank Accession No. 1QHQA)。
【００７５】
〔ステラシアニン〕
ステラシアニンは、フィトシアニンのサブクラスであり、植物性のキュプレドキシンの広範に分布するファミリーである。ステラシアニンの代表的な配列には、配列番号14が含まれる。ウメシアニン、セイヨウワサビの根に由来するステラシアニン(Koch et al., J. Am. Chem. Soc. 127:158-166 (2005))、およびキュウリステラシアニン(Hart el al., Protein Science 5:2175-2183 (1996))が既知である。タンパク質は、他のフィトシアニンと同様の全体的な折りたたみ構造を有する。エフリンB2タンパク質外部ドメイン三次構造は、ステラシアニンに対する有意な類似性を有する(Toth et al., Developmental Cell 1:83-92 (2001).)。ステラシアニンの代表的なアミノ酸配列は、受付番号1JER、配列番号14として、国立バイオテクノロジー情報センタータンパク質データバンクにおいて見られる。
【００７６】
〔キュウリ塩基性タンパク質〕
キュウリ塩基性タンパク質に由来する代表的なアミノ酸配列には、配列番号17が含まれる。キュウリ塩基性タンパク質(CBP)、タイプ1青色銅タンパク質の結晶構造は、1.8オングストロームの解像度に改良された。前記分子は、バレルが一方の側において開いており、「β-サンドイッチ」または「β-タコス」と表される方が良いことを除いて、ギリシャ鍵β-バレル構造を有する点において他の青色銅タンパク質と似ている(Guss et al., J. Mol. Biol. 262:686-705 (1996).)。エフリンB2タンパク質外部ドメイン三次構造は、キュウリ塩基性タンパク質に対して高い類似性（50α炭素に対してrms偏差1.5オングストローム）を有する(Toth et al., Developmental Cell 1:83-92 (2001).)。
【００７７】
Cu原子は、結合長さCu-N(His39)＝1.93 A、Cu-S(Cys79)＝2.16 A、Cu-N(His84)＝1.95 A、Cu-S(Met89)＝2.61 Aを有する、通常の青色銅NNSS’配位を有する。ジスルフィド結合(Cys52)-S-S-(Cys85)は、分子構造の安定化において重要な役割を果たしているように見える。ポリペプチドの折りたたみ構造は、青色銅タンパク質のサブファミリー（フィトシアニン）ならびに非金属タンパク質であるブタクサアレルゲンRa3の典型であり、CBPが高い程度の配列同一性を有する。フィトシアニンとして現在同定可能なタンパク質は、CBP、ステラシアニン、マビシアニン、ウメシアニン、キュウリの皮のキュプレドキシン、エンドウマメのさやにおける推定上の青色銅タンパク質、およびシロイヌナズナに由来する青色銅タンパク質である。CBPおよびエンドウマメのさやのタンパク質を除く全てにおいて、青色銅部位に通常見られるアキシャルメチオニンリガンドは、グルタミンにより置換される。キュウリ塩基性タンパク質に対する代表的な配列は、NCBIタンパク質データバンク受付番号2CBP、配列番号17に見られる。
【００７８】
使用方法
本発明は、ウイルス性または細菌性の感染症、特にHIV-1感染症に感染した患者の治療方法であって、上述したように、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物である少なくとも1のポリペプチドを患者に投与することを含んでなる方法を提供する。同様の方法は、限定するものではないが、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、パラインフルエンザウイルスA型、B型、およびC型等、A型、B型、C型、およびG型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、ドーリ(Dhori)と呼ばれるオルソミクソ様昆虫ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス；SIVもしくは結核菌のような他のウイルス性または細菌性の感染を有する患者を治療するのに有効であるとも考えられている。
【００７９】
キュプレドキシンおよびシトクロムcが、一緒に提出した出願に開示されているように、マラリア感染に対しても有効であることが分かっている。さらに、HIVとマラリアの共感染は、世界の多くの地域、特にサハラ以南のアフリカにおいて非常に一般的である。いくつかの実施形態において、HIVに罹患している患者は、マラリア寄生虫による感染にも罹患している。いくつかの実施形態において、本発明の治療方法は、抗マラリア薬を投与することも含んでなる。いくつかの実施形態において、前記抗マラリア薬は一緒に投与される。
【００８０】
本発明の方法は、哺乳類細胞をキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記哺乳類細胞は、HIV-1のようなウイルスまたは細菌に感染している。他の実施形態において、前記哺乳類細胞は、HIV-1のようなウイルスまたは細菌に暴露される。
【００８１】
キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる組成物は、当業者に周知の多くの経路および多くの方法により患者に投与されてよい。特別な実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、静脈内、筋肉内、または皮下に投与される。
【００８２】
1つの実施形態において、前記方法は、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはキュプレドキシンもしくはシトクロムc551の変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる単位用量の組成物、ならびに他の抗ウイルスまたは抗菌、特に抗HIVの薬剤および／または抗マラリア薬を含んでなる単位用量の組成物を共に投与することを含んでよく、どちらかの順序で、ほぼ同時に、または例えば、他方の薬剤の投与後約1〜60分、もしくは他方の薬剤の投与後約1〜12時間のように、他方の薬剤の投与後一定時間内に投与される。
【００８３】
加えて、本発明には、ウイルス性および細菌性の感染を研究するために有用な方法が含まれる。いくつかの実施形態において、前記方法は、ウイルスまたは細菌に感染した哺乳類細胞を、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と接触させること、ならびに細胞における感染の増殖を測定することを含んでなる。他の実施形態において、前記方法は、哺乳類細胞をキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と接触させること、哺乳類細胞をウイルスまたは細菌と接触させること、および細胞における感染の増殖を測定することを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記細菌またはウイルスは、HIV、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、パラインフルエンザウイルスA型、B型、およびC型等、A型、B型、C型、およびG型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス(HDV)、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、ドーリと呼ばれるオルソミクソ様昆虫ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス；SIV、および結核菌である。特別な実施形態において、前記ウイルスは、HIV-1、特に株Bal、2167、または RW/92/008/RE1である。他の実施形態において、前記哺乳類細胞はヒトである。他の実施形態において、前記細胞は血液リンパ球または末梢血単核細胞である。種々の実施形態において、前記細胞は、動物中で接触させるか（インビボ）または動物外で接触させる（インビトロ）。いくつかの実施形態において、前記細胞はインビトロで接触され、それを動物に導入する。
【００８４】
〔キュプレドキシンもしくはシトクロムC551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる医薬組成物〕
キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる医薬組成物は、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖剤の製造、乳化、カプセル化、エントラップ(entrap)、または凍結乾燥の工程のような通常の方法で製造されてよい。実質的に純粋なキュプレドキシンおよび／またはシトクロムc551、ならびにそれらの変異体、誘導体、および構造的な均等物は、当該分野において周知の薬学的に許容可能なキャリアと容易に併用される。そのようなキャリアは、製剤が、錠剤、ピル、糖剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として構築されることを可能にする。適切なキャリアまたは賦形剤には、例えば、充填剤およびセルロース配合物が含まれてもよい。他の賦形剤には、例えば、フレーバー剤、着色剤、粘着防止剤、増粘剤、および他の許容可能な添加剤、アジュバント、または結合剤が含まれてよい。いくつかの実施形態において、前記薬剤は、実質的に保存剤を含まない。他の実施形態において、前記薬剤は、少なくとも1の保存剤を含んでよい。医薬製剤における一般的な方法論は、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999))に見られる。
【００８５】
本発明において使用されるキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる組成物は、注射（例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等）、吸入、局所投与、坐剤、経皮パッチ、または経口投与が含まれる種々の方法で投与されてよい。薬物送達システムについての一般的な情報は、Ansel et al., Id.に見られる。いくつかの実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる組成物は、構築することができ、特に皮下および静脈内注射に対する注射剤として直接的に使用される。注射可能な製剤は、特に、ウイルス性または細菌性の感染、特にHIV-感染を有するリスクがある、有する可能性がある、または有する患者を治療するために有益に使用される。キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる組成物は、ポリプロピレングリコールまたは同様のコーティング剤のような保護剤と混合した後に経口的に投与されてもよい。
【００８６】
注射により投与される場合、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、水溶液中、特に、ハンクス(Hanks)溶液、リンゲル液、もしくは生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液中に配合されてよい。前記溶液は、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような配合剤を含んでよい。あるいは、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、使用前に、適切な溶媒、例えば無菌の発熱物質を含まない水を用いて構成するための粉末形態であってよい。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、アジュバントまたはペプチドにより刺激される免疫反応を増強するために加えられる他の物質を含まない。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、ペプチドとの免疫反応を阻害する物質を含んでなる。
【００８７】
静脈内の液体により投与する場合、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を投与するのに使用する静脈内の液体は、クリスタロイドまたはコロイドで構成されてよい。ここで使用される場合、クリスタロイドは、ミネラル塩または他の水溶性分子の水溶液である。コロイドは、ここで使用される場合、ゼラチンのようにより大きな不溶性の分子も含まれる。静脈内の液体は、無菌であってよい。
【００８８】
静脈内投与のために使用されてよいクリスタロイドの液体には、限定するものではないが、表2に記載するように、通常の生理食塩水（0.9％濃度の塩化ナトリウム溶液）、リンゲルラクテートまたはリンゲル液、およびしばしばD5Wと称される5％デキストロース水溶液が含まれる。
【表２】
2008545398.tif 000004
【００８９】
＊リンゲルラクテートは、28 mmol/L ラクテート、4 mmol/L K+、および3 mmol/L Ca2+も有する。
【００９０】
吸入により投与する場合、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適切なガスのような適切な噴霧剤を用いた加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達されてよい。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することにより決定されてよい。吸入器または注入器において使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、タンパク質とラクトースもしくはデンプンのような適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有するように構築されてよい。
【００９１】
局所投与により投与する場合、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、当該分野において周知のように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、ゼリー、懸濁液等として構築されてよい。いくつかの実施形態において、前記投与は経皮パッチによる。坐剤（例えば、直腸または膣）により投与する場合、キュプレドキシンおよび／またはシトクロムc、ならびにそれらの変異体および誘導体の組成物は、通常の坐剤ベースを含有する組成物として構築されてよい。
【００９２】
経口投与される場合、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、該キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物と当該分野において周知の薬学的に許容可能なキャリアとを混合することにより、容易に構築されてよい。マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム等の固体のキャリアが使用されてよく、そのようなキャリアは、キュプレドキシンおよび／またはシトクロムc、ならびにそれらの変異体および誘導体が、治療される患者による経口摂取のための錠剤、ピル、糖剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として構築されることを可能にする。例えば、散剤、カプセル剤、および錠剤のような経口的な固体の製剤に対して、適切な賦形剤には、糖、セルロース配合物、顆粒化剤、および結合剤のような充填剤が含まれる。
【００９３】
当該分野において周知の他の好都合なキャリアには、細菌莢膜の多糖類、デキストラン、または遺伝的に操作されたベクターのような多価のキャリアも含まれる。加えて、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含む徐放性の製剤は、延長された時間に渡るキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物の放出を可能にし、徐放性の製剤でない場合、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、例えば、プロテアーゼおよび単純な加水分解により、治療的な効果を誘発または増強する前に患者の系から消失し、および／または分解される。
【００９４】
本発明の組成物の血流における半減期は、当該分野において周知のいくつかの方法により延長または最適化することができ、限定するものではないが、環状(circularized)ペプチド (Monk et al., BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004))、D,L-ペプチド(ジアステレオマー), (Futaki et al., J. Biol. Chem.  Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo et al., Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller et al., Biochem. Pharmacol. 36(1):169-76, (1987)); 非天然アミノ酸を含有するペプチド(Lee et al., J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004))、N-およびC-末端修飾(Labrie et al., Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990))、および炭化水素ステープリング(stapling) (Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al., Science 305:1466-1470 (2004))が含まれる。特に関連するのは、d-異性化（置換）およびD-置換またはL-アミノ酸置換を介したペプチド安定性の修飾である。
【００９５】
種々の実施形態において、前記医薬組成物には、キャリアおよび賦形剤（限定するものではないが、緩衝剤、糖、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはグリシンのようなアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、キレート化剤、懸濁剤、増粘剤、および／または保存剤が含まれる）、水、油、生理食塩水、水性デキストロース、およびグリセロール溶液、緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤等の生理的な条件に近づけるために必要とされる他の薬学的に許容可能な補助物質が含まれる。当業者に既知のいずれの適切なキャリアも本発明の組成物を投与するために使用されてよいが、キャリアのタイプは投与方法に依存して変化すると解されるであろう。化合物は、周知の技術を用いて、リポソーム中に封入されてもよい。生分解性のミクロスフェアも、本発明の医薬組成物のためのキャリアとして使用されてよい。適切な生分解性のミクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号; 5,075,109号; 5,928,647号; 5,811,128号; 5,820,883号; 5,853,763号; 5,814,344号、および5,942,252号に開示されている。
【００９６】
前記医薬組成物は、通常の、周知の滅菌技術により滅菌されてよく、または滅菌ろ過されてよい。結果として得られる水溶液は、そのまま使用するために包装されるか、または凍結乾燥されてよく、凍結乾燥された製剤は、投与前に無菌溶液と混合される。
【００９７】
〔キュプレドキシンもしくはシトクロムC551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物の投与〕
キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、医薬組成物として構築されて投与されてよく、例えば、経口、頬、吸入、舌下、直腸、膣、経尿道、鼻腔、局所、経皮、または非経口（静脈内、筋肉内、皮下、および冠内が含まれる）の投与のような適切な経路により投与されてよい。それらの医薬製剤は、その意図する目的を達成するのに有効な量で投与されてよい。具体的には、前記組成物は、治療的に有効な量で投与されてよい。特別な実施形態において、前記治療的に有効な量は、一般的に、約0.01〜20mg/日/kg体重である。
【００９８】
キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、単独または他の活性薬剤と組み合わせて、HIV感染もしくは他のウイルス性の感染症または細菌性の感染症の治療および／または予防に有用である。適切な用量は、もちろん、例えば、使用するキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物、宿主、投与方法、および治療される状態の性質および重症度に依存して変化してよい。しかしながら、一般的に、ヒトにおいて好ましい結果は、約0.01〜20mg/日/kg体重の一日用量で得られることが示されている。示されたヒトにおける一日用量は、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物の化合物の約0.7mg〜約1400mgの範囲であり、例えば、1日量、週単位の用量、月単位の用量、および／または連続的な投与で都合よく投与される。1日量は、1日に1〜12回の別々の用量であってよい。あるいは、用量は、1日おき、3日おき、4日おき、5日おき、6日おき、毎週、および同様に31日おきまでで投与されてよい。あるいは、投与は、パッチ、静脈投与等を用いて継続的に行われてよい。
【００９９】
キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を患者に導入する方法は、いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤含有カクテルのように、抗HIV薬を導入するために現在使用されているものと同様である。そのような方法は、当該分野において周知である。特別な実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、他の抗HIV治療薬を含むカクテルの部分であるか、または抗HIV治療薬と共に投与される。他の抗HIV薬には、限定するものではないが、逆転写酵素阻害剤：AZT (ジドブジン[レトロビル])、ddC (ザルシタビン[ハイビット]、ジデオキシイノシン)、d4T (スタブジン[ゼリット])、および3TC (ラミブジン[エピビル])、非核酸系逆転写酵素阻害剤(NNRTIS): デラビルジン(レスクリプター)およびネビラピン(ビラミューン)、プロテアーゼ阻害剤: リトナビル(ノービア)、ロピナビル・リトナビル配合剤(カレトラ)、サキナビル(インビラーゼ)、硫酸インジナビル(クリキシバン)、アンプレナビル(アゲネラーゼ；Agenerase)、およびネルフィナビル(ビラセプト)が含まれる。現在、高活性抗レトロウイルス療法(HAART)が、HIVを有する人々を治療するために使用されている。
【０１００】
キュプレドキシンもしくはシトクロム、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を患者に導入する方法は、いくつかの実施形態において、キュプレドキシンもしくはシトクロム、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を、マラリア治療に対して使用される薬剤と共に投与することである。そのような方法は、当該分野において周知である。特別な実施形態において、キュプレドキシンおよび／またはシトクロムcは、マラリア治療薬を含有するカクテルの一部であるか、またはマラリア治療薬と共に投与される。問題とするマラリア治療薬には、限定するものではないが、プログアニル、クロロプログアニル、トリメトプリム、クロロキン、メフロキン、ルメファントリン、アトバコン、ピリメタミン-スルファドキシン、ピリメタミン-ダプソン、ハロファントリン、キニーネ、キニジン、アモジアキン、アモピロキン、スルホンアミド、アルテミシン、アルテフレン(arteflene)、アーテメター、アーテスネート、プリマキン、ピロナリジン、プログアニル、クロロキン、メフロキン、ピリメタミン-スルファドキシン、ピリメタミン-ダプソン、ハロファントリン、キニーネ、プログアニル、クロロキン、メフロキン、1,16-ヘキサデカメチレンビス(N-メチルピロリジニウム)ジブロミド、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１０１】
正確な配合、投与経路、および用量は、患者の状況の観点から、病院の医師により決定される。投与量および投与間隔は、哺乳類の治療効果が十分である活性キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物の血漿レベルを提供するために、個々に調節されてよい。一般的に、望ましいキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、意図される投与経路および標準的な医薬実務に関して選択される薬学的なキャリアとの混合物として投与される。
【０１０２】
1つの側面において、キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、DNAとして送達され、ポリペプチドがインサイチューで産生される。1つの実施形態において、前記DNAは、「むきだし」であり、例えばUlmer et al., (Science 259:1745-1749 (1993))に記載されており、Cohen (Science 259:1691-1692 (1993))により概説されている。むきだしのDNAの取り込みは、例えば生分解性のビーズのようなキャリアの上にDNAをコーティングすることにより増大してよく、その後、効率的に細胞に輸送される。そのような方法において、DNAは当業者に既知の種々の送達システムの何れかの中に存在してよく、核酸発現系、細菌性およびウイルス性の発現系が含まれる。DNAをそのような発現系に組み込むための技術は、当業者に周知である。例えば、WO90/11092、WO93/24640、WO 93/17706、および米国特許第5,736,524号を参照されたい。
【０１０３】
遺伝物質を生物体から生物体に移動させるために使用されるベクターは、2つの一般的な分類に分けられる：クローニングベクターは、適切な宿主細胞中における増殖に必要な領域を有する複製プラスミドまたはファージであり、外来性のDNAが挿入されてよく；ベクターの構成要素であった場合、前記外来性のDNAは複製され、増殖する。発現ベクター（プラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノム等）は、キュプレドキシンのDNAのような外来性のDNAを転写および翻訳するために、宿主細胞または組織に外来性の遺伝物質を導入するために使用される。発現ベクターにおいて、導入されたDNAは、挿入されたDNAを高度に転写するために宿主細胞に信号を送るプロモーターのような要素に動作可能に結合する。特定の因子に反応して遺伝子転写を調節する誘導性のプロモーターのようないくつかのプロモーターは、格別に有用である。キュプレドキシンおよび／またはシトクロムc、ならびにそれらの変異体および誘導体のポリヌクレオチドが誘導性のプロモーターに動作可能に結合することにより、特定の因子に対するキュプレドキシンおよび／またはシトクロムcならびにそれらの変異体および誘導体の発現を調節することができる。古典的な誘導性のプロモーターの例には、α-インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、およびグルココルチコイドのようなステロイドに応答性のもの(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511(1990))ならびにテトラサイクリンが含まれる。他の望ましい誘導性のプロモーターには、構築物が導入される細胞に対して内在性でないが、導入薬剤が外因的に供給される場合それらの細胞に応答性であるものが含まれる。一般的に、有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドである。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターが考えられる。
【０１０４】
ベクターの選択は、使用される生物体または細胞、およびベクターの望ましい結末により決定される。一般的に、ベクターは、シグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、ポリリンカー部位、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列を含んでなる。
【０１０５】
〔キュプレドキシンもしくはシトクロムC551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなるキット〕
1つの側面において、本発明は、パッケージまたは容器に以下に示す1以上を含有するキットを提供する：(1)少なくとも1のキュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物を含んでなる生物学的に活性のある組成物；(2)限定するものではないが、逆転写酵素阻害剤: AZT (ジドブジン[レトロビル])、ddC (ザルシタビン[ハイビッド]、ジデオキシイノシン)、d4T (スタブジン[ゼリット])、および3TC (ラミブジン[エピビルEpivir])、非核酸系逆転写酵素阻害剤(NNRTIS): デラビルジン(レスクリプター)およびネビラピン(ビラミューン)、プロテアーゼ阻害剤: リトナビル(ノービア)、ロピナビル・リトナビル配合剤(カレトラ)、サキナビル(インビラーゼ)、硫酸インジナビル(クリキシバン)、アンプレナビル(アゲネラーゼ；Agenerase)、およびネルフィナビル(ビラセプト)が含まれる抗ウイルス薬または抗菌薬、特に抗HIV薬；(3)薬学的に許容可能な賦形剤；(4)シリンジのような投与のための媒体；(5)投与のための説明書。(1)〜(5)の2以上の要素が同じ包装または容器中に見られる実施形態も考えられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、前記キットは、抗マラリア治療薬も含んでなる。問題とするマラリア治療薬には、限定するものではないが、プログアニル、クロロプログアニル、トリメトプリム、クロロキン、メフロキン、ルメファントリン、アトバコン、ピリメタミン-スルファドキシン、ピリメタミン-ダプソン、ハロファントリン、キニーネ、キニジン、アモジアキン、アモピロキン、スルホンアミド、アルテミシン、アルテフレン、アーテメター、アーテスネート、プリマキン、ピロナリジン、プログアニル、クロロキン、メフロキン、ピリメタミン-スルファドキシン、ピリメタミン-ダプソン、ハロファントリン、キニーネ、プログアニル、クロロキン、メフロキン、1,16-ヘキサデカメチレンビス(N-メチルピロリジニウム)ジブロミドが含まれる。
【０１０７】
キットが供給される場合、組成の異なる成分は、別々の容器に包装され、使用の直前に混合されてよい。そのような別々の成分の包装は、活性成分の機能が失われることなく、長い期間の保存を可能にする。
【０１０８】
キットに含まれる試薬は、異なる成分の寿命が維持され、容器の物質により吸着または変質されないように、いくつかの種類の容器に供給されてよい。例えば、密封ガラスアンプルには、凍結乾燥されたキュプレドキシンおよび／またはシトクロムcならびにそれらの変異体および誘導体、または窒素のような中性の非反応性の気体の存在下で入れられた緩衝剤が含まれてよい。アンプルは、ガラス、ポリカーボネートまたはポリスチレン等の有機ポリマー、セラミック、金属のような適切な物質のいずれか、または同様の試薬を保持するために典型的に使用されるいずれの他の物質からなってよい。適切な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から製造され得る簡素なボトル、およびアルミニウムもしくは合金のようなホイルの裏地を内側に含んでなる包みが含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジ等が含まれる。皮下注射針により貫通させることができるストッパーを有する瓶のように、容器は無菌の入り口を有してよい。他の容器は、除去することにより成分が混合される、容易に除去可能な膜により分離される2つのコンパートメントを有してよい。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム等であってよい。
【０１０９】
キットは、説明書と共に供給されてもよい。説明書は、紙もしくは他の物に印刷されるか、および／またはフロッピー（登録商標）ディスク、CD-ROM、DVD-ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、フラッシュメモリー装置等の電子読み取り可能な媒体として供給されてよい。詳細な説明は、物理的にキットに付随していなくてよく、その代わり、ユーザーは、キットの製造業者または販売者により明記されるインターネットウェブサイトに向けられるか、または電子メールとして供給されてよい。
【０１１０】
〔キュプレドキシンおよび／またはシトクロムCならびにそれらの変異体および誘導体の修飾〕
キュプレドキシンもしくはシトクロムc551、またはそれらの変異体、誘導体、もしくは構造的な均等物は、化学的に修飾され、または遺伝的に変化し、上記で説明したような変異体および誘導体を生成する。そのような変異体および誘導体は、標準的な技術により合成されてよい。
【０１１１】
キュプレドキシンおよびシトクロムc551の天然の突然変異体に加えて、変化は、キュプレドキシンまたはシトクロムc551をコードする配列に突然変異により導入され、コードされたキュプレドキシンまたはシトクロムc551のアミノ酸配列に変化を与えるが、哺乳類細胞においてウイルスもしくは細菌性の感染、特にHIV感染の増殖を阻害するキュプレドキシンまたはシトクロムcの能力は大きくは変化しない。
【０１１２】
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなくキュプレドキシンの野生型配列から変化させることができる配列であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、そのような生物学的活性のために必要とされる。例えば、キュプレドキシンの中で保存されるアミノ酸残基は、変化を特に受けにくいことが予想され、それ故「必須」である。
【０１１３】
ポリペプチドの活性を変化させない保存的な置換をすることができるアミノ酸は、当該分野において周知である。有用な保存的な置換は、表3に「好ましい置換」として示す。1つの種類のアミノ酸が同じタイプの他のアミノ酸で置換されても、前記置換が化合物の生物学的な活性を実質的に変化させない限り、保存的な置換は本発明の範囲内である。
【表３】
2008545398.tif 000005
【０１１４】
(1)β-シートまたはα-へリックスコンホメーションのようなポリペプチド骨格の構造、(2)電荷、(3)疎水性、または(4)標的部位の側鎖の容積に影響を与える非保存的な置換は、細胞障害性因子の機能を修飾し得る。残基は、表4に示すように、共通の側鎖の性質に基づいてグループに分けられる。非保存的な置換は、これらの分類の1つの構成要素を他の分類に交換することが必要である。置換は、保存的な置換の部位または特に非保存的な部位に導入されてよい。
【表４】
2008545398.tif 000006
【０１１５】
変異体のポリペプチドは、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、およびPCR突然変異誘発のような、当該分野において既知の方法を用いて作られてよい。キュプレドキシンまたはシトクロムc551変異体DNAを作るために、部位特異的な突然変異誘発(Carter, Biochem J. 237:1-7(1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154:329-350 (1987))、カセット(cassette)突然変異誘発、制限選択突然変異誘発(Wells et al., Gene 34:315-323 (1985))、または他の既知の技術が、クローン化DNA上で行われてよい。
【０１１６】
キュプレドキシンおよびシトクロムc551の既知の突然変異は、本発明の方法において使用するための変異体のキュプレドキシンおよびシトクロムc551を作るために使用されてもよい。例えば、アズリンのC112DおよびM44KM64E変異体は、細胞毒性および天然のアズリンとは異なる増殖抑制活性を有し、そのような変化した活性は、本発明の治療方法において有用であり得る。本発明の方法の1つの実施形態は、ウイルス性または細菌性の感染、特に哺乳類細胞におけるHIV感染の増殖を阻害する能力を保持しているキュプレドキシンおよび／またはシトクロムc551、ならびにそれらの変異体および誘導体を利用する。もう1つの実施形態において、本発明の方法は、M44KM64E変異体のような、細胞増殖抑制を引き起こす能力を有するキュプレドキシン変異体を利用する。
【０１１７】
本発明のより完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することにより得られる。実施例は、専ら例証の目的のために記載されたものであり、本発明を限定することを意図するものではない。形態における変化および均等物の置換は、状況が示唆し、または好都合である場合に考えられる。ここでは特定の用語が使用されるが、そのような用語は、記述的な意味が意図されており、限定する目的ではない。上述したように、本発明の修飾および変異は、それらの精神および範囲から離れることなく実施することができ、それ故、そのような限定は、付属の実施形態により示されるように課されるべきである。
【実施例】
【０１１８】
例1：アズリン変異体およびシトクロムC551による、リンパ球のHIV感染のインビボ阻害
アズリンのM44KM64E変異体は、1：1の基準でシトクロムc551と混合した(1μM アズリン: 1μM シトクロムc551)。HIVに感染したヒト血液リンパ球を、0, 500〜1000μg/ml タンパク質の濃度で、混合したアズリン/シトクロムc551タンパク質と共に7日間インキュベートした。その後、HIV p24のレベルを、感染したリンパ球において測定された。p24のレベルは、感染した血液中のHIVウイルスと共線(collinear)であることが既知である。血中のp24における変化を測定することは、血中のHIVウイルス力価の変化を示す。非感染性のヒト血液リンパ球を用いた対照も、平行の挙動を示した。7日間のインキュベーションの後、感染したリンパ球におけるHIV p24のレベルは、0μg/mlのアズリンおよびシトクロムc551を有する対照の感染したリンパ球と比較して、25％〜90％減少した。非感染性の対照細胞において、タンパク質混合物との7日間のインキュベーションの後、細胞死も細胞毒性も見られなかった。
【０１１９】
例2：アズリンが示す、HIV-1に由来するICAM-1との構造的な類似性
以前の研究(Gough & Chothia, Structure 12:917-925 (2004); Stevens et al., J. Mol. Recognit. 18:150-157 (2005))は、キュプレドキシンが免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの可変ドメインに対して構造的な類似性を示すことが見出されている。DALIアルゴリズム(Holm & Park, Bioinformatics 16:566-567 (2000))は、緑膿菌に由来するアズリン(1JZG)の構造的相同体についての3Dデータベースを検索するために使用された。表5を参照されたい。アズリンは、PfMSP1-19との複合体形成におけるモノクローナル抗体のfab断片のみならず、大脳マラリアに関与するICAM-1（表5）に対しても構造的な類似性を示す(Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1766-1771 (2000); Franke-Fayard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11468-11473 (2005))。
【０１２０】
ICAM-1は、P. falciparumに感染した赤血球を隔離するための脳の微小血管における内皮細胞および他の組織上の受容体として意味をなすだけでなく、宿主細胞を介した継代の間にHIV-1粒子中に見られ、ウイルス物質の細胞基質の送達を促進することによりHIV-1感染力を増強することが知られている(Fortin et al., J. Virol. 71:3588-3596 (1997); Tardif & Tremblay, J. Virol. 77:12299-12309 (2003))。ICAM-1は、ラノウイルスおよびコクサッキーウイルスの主要な群に対する受容体としても知られている(Bella & Rossmann, J. Struct. Biol. 128:69-74 (1999))。
【０１２１】
アズリンは、HIV-1に対する主要な宿主細胞表面受容体であるCD4（表5）に対する構造的な類似性を示す(Maddon et al., Cell 47:333-348 (1986))。この例は、アズリンを含むキュプレドキシンが、向かい合って充填され、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの可変ドメインならびに細胞接着分子(ICAM)およびそれらのリガンドにジスルフィド結合により結合した2つの逆平行のβシートを有することにおいて、構造的な類似性を有することを示す。
【表５】
2008545398.tif 000007
【０１２２】
アズリンの構造アラインメントは、DALI (Holm & Park, Bioinformatics 16:566-567 (2000))を用いて行われた。DALIzスコアが＜2である構造対は、非類似であると考えられる。
【０１２３】
RMSD-アラインされた部分の構造対間のオングストロームでの主鎖残基の二乗平均偏差。
【０１２４】
例3：HIV-1侵入およびウイルス増殖におけるアズリン、H.8-アズリン、およびLazの効果
末梢血単核細胞(PBMCs)、Bal、RW/92/008/RE1クレードA、およびIN/2157 D15クレードCにおける3つのサブタイプのHIV-1の増殖に対する種々の濃度のアズリン、H.8-アズリン、およびLazの効果。
【０１２５】
Pazおよびlaz遺伝子のクローニングおよび発現。淋菌(Neisseria gonorrhoeae)に由来するlaz遺伝子を、その既知の配列（配列番号19）に基づいてクローン化した。緑膿菌アズリン遺伝子（配列番号1）、すなわちpaz、および淋菌に由来するlazのH.8エピトープの配列（配列番号18）は、インフレームでH.8エピトープ遺伝子をクローン化するために使用され、pazの5’末端においてクローン化した場合はH.8-pazが産生され、またpazの3’末端においてクローン化した場合はpaz-H.8が産生される。ここで使用され、実施例に関連する菌種および遺伝的な構築物については、表6を参照されたい。
【表６】
2008545398.tif 000008
【０１２６】
アズリン遺伝子のクローニングおよび過発現について記載されている(Yamada, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Punj, et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004))。淋菌のLaz-コード化遺伝子(laz)は、鋳型DNAとして淋菌株F62のゲノムDNAを用いてPCRにより増幅された。使用される順方向および逆方向のプライマーは、5’-CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3'（配列番号20）および5'-GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3'（配列番号21)であり、KpnIおよびEcoRIの付加的に導入された制限部位には、それぞれアンダーラインを引いた。1.0 kbの増幅されたDNA断片は、EcoRIおよびKpnIを用いて切り離され、pUC18ベクターの対応する部位に挿入され(Yanisch-Perron, et al., Gene 33:103-119 (1985))、laz遺伝子がlacプロモーターの下流に位置することにより、発現プラスミドpUC18-lazを産生した（表6）。
【０１２７】
淋菌Lazおよび緑膿菌(Paz)のアズリンの融合H.8を発現するプラスミドは、鋳型としてpUC19-pazおよびpUC18-lazを用いてPCRにより構築された。H.8-Paz融合について、3.1 kbの断片が鋳型としてのpUC18-lazならびにプライマー5'-(リン酸化)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3'（配列番号22）および5'-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3'（配列番号23）を用いて増幅され、ここで、SalI部位に下線を引いた。PCR増幅された0.4 kbの断片は、鋳型としてpUC19-pazならびにプライマー5'-(リン酸化)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3'（配列番号24）および5'-TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3'（配列番号25）から得られ、ここで、XhoI部位に下線を引いた。pUC18-lazに由来するSalI切断PCR断片およびpUC19-paz に由来するXhoI切断PCR断片は、発現プラスミドpUC18-H.8-pazを産生するためにクローン化された（表6）。
【０１２８】
大腸菌JM109は、アズリンおよびその誘導体遺伝子の発現のための宿主株として使用された。組換え大腸菌株は、100μg/ml アンピシリン、0.1 mM IPTG、および0.5 mM CuSO4を含有する2X YT培地において、37℃で16時間培養し、アズリンタンパク質を産生した。
【０１２９】
アズリンについて述べたように、これらのプラスミドを有する大腸菌株がIPTG、溶解した細胞、および精製されたタンパク質の存在下で培養された場合(Yamada, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Punj, et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004);Yamada, et al., Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005))、H.8含有タンパク質（約17 kDa）は前に述べたように異常な移動を示したが、種々のアズリン誘導体は単一の成分としてSDS-PAGE上に移動した(Cannon, Clin. Microbiol. Rev. 2:S1-S4 (1989); Fisette, et al., J. Biol. Chem. 278:46252-46260 (2003))。
【０１３０】
HIV-1抑制試験。アズリン、H.8-アズリン、およびLazは、0.45μMフィルターを通してろ過滅菌した。末梢血単核細胞(PBMC)は、ポリブレン(5μg/ml)を用いて1時間処理し、マイクロタイタープレートに250,000 細胞/ウェルで蒔いた。前記プレートを800rpmで5分間遠心分離し、細胞を回収した。上清を取り除き、タンパク質(0.3、0.6、1.2、6.0、および30μMの濃度)を有する媒質を加えた(100μl)。その後、細胞を1時間培養した。AZT (25μM)を対照として使用した。タンパク質を細胞上に残し、100μlのウイルス(Bal、2167、またはRW/92/008/RE1)を加え、2時間インキュベートした。プレートを再び800rpmで5分間遠心分離し、タンパク質およびウイルスを除去した。タンパク質および媒質を全量100μlになるように加え戻し、5日間インキュベートした。5日間の終わりに、HIV/p24について培養上清をELISAにより試験した。
【０１３１】
図1における結果は、6.0μMの濃度でアズリンがHIV-1 Bal、USおよび西ヨーロッパで広まっている最も主要なクレード(clade)Bである、クレードBアフリカ分離菌(African isolate)RW/92/008/RE1、およびクレードCインド分離菌(Indian isolate) IN/2167 D15の増殖を約90％抑制したことを示す。しかしながら、H.8-アズリン(N末端にH.8エピトープを有するアズリン)は0.3μMの低い濃度で3つのサブタイプ全て、特にアフリカおよびインドサブタイプに対して高い阻害活性を有していた（図1）。
【０１３２】
ナイセリアのタンパク質Lazは、ナイセリアアズリン相同体のN末端部分にH.8エピトープを有し(Gotschlich & Seiff FEMS Microbiol. Lett. 43:253-255 (1987); Kawula et al., Mol. Microbiol. 1:179-185 (1987))、3つのサブタイプ、特にアフリカおよびインドサブタイプに対して同様の阻害活性を有しており（図1）、アズリンにより増大された抗HIV-1活性を促進するH.8エピトープの役割を示す。宿主細胞(PBMC)の死において影響がないことは、MTT試験(Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Punj et al., Oncogene 23:2367-2378 (2004))により、これら3つのタンパク質の全ての濃度に対して認められ、HIV-1増殖の阻害が宿主細胞の死によるものではないことを示している。
【０１３３】
例4：表面プラズモン共鳴により研究される、アズリンとgp120およびCD4との結合
表面プラズモン共鳴実験は、CD4だけでなく、HIV-1の侵入に関与することが知られているgp120またはgp41のようなHIV-1表面タンパク質および細胞内ウイルス増殖に関与するNefまたはGagのような他のタンパク質に対するアズリンの結合性の程度を決定するために行われた。
【０１３４】
融合GSTタンパク質に対するプラスミド構築物。融合グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)-短縮型wt-アズリン(azu)誘導体を発現するプラスミドは、プルーフリーディングDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により構築された。pGST-azu 36-128について、増幅されたPCR断片は、商業的なGST発現ベクターpGEX-5X (アマシャムバイオサイエンス, Piscataway, NJ)のBamHlおよびEcoRl部位に導入された。前記断片は、鋳型としてpUC19-azuならびにプライマー5’-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3’(配列番号26)および5’-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3’ (配列番号27)を用いて増幅され、付加的に導入されたBamHlおよびEcoRI部位にはそれぞれ下線を引いた。azu遺伝子のカルボキシル末端切断は、クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて停止コドンを導入することにより累積的に行われた。
【０１３５】
pGST-azu 36-89に対して、停止コドンはGly90に導入された。pGST-azu 36-128を有するプラスミドは、鋳型DNAとして使用された。部位特異的な突然変異誘発に対する3組のオリゴヌクレオチドは以下に示すとおりである。pGST-azu 36-89について: 5’-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGAAGG ACT CGG TGA CC-3’ (配列番号28)、および5’-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3 (配列番号29)。
【０１３６】
pGST-azu 88-113について、azu遺伝子のカルボキシル末端切断は、クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて停止コドンを導入することにより累積的に行われた。pGST-azu 88-113に対して、停止コドンはPhe114に導入された。pGST-azu 88-128を有するプラスミドは、鋳型として使用された。pGST-azu 88-128について、増幅されたPCR断片は、商業的なGST発現ベクターpGEX-5X (アマシャムバイオサイエンス)のBamH1およびEcoR1部位に導入された。前記フラグメントは、鋳型としてpUC19-azuならびにプライマー5’-CGGGGATCC CCG GCT CGG GCG AGA AGG AC-3’ (配列番号30)および5’-CGGGAATTC TCC ACT TCA GGG TCA GGG TG-3’ (配列番号31)を用いて増幅され、付加的に導入されたBamH1およびEcoR1部位にはそれぞれ下線を引いた。
【０１３７】
部位特異的な突然変異誘発に対する1組のオリゴヌクレオチドは、pGST-azu 88-113の調製に対して以下に示す通りである：5’-GTT CTT CTG CAC CTA GCC GGG CCA CTC CG-3’ (配列番号32)および5’-CGG AGT GGC CCG GCT AGG TGC AGA AGA AC-3’ (配列番号33)。pGST-azu 88-113は、大腸菌XL-1 青株(Blue strain)を形質転換するために使用された。プラスミド抽出は、商業的なキット(Qiagen, Venlo, The Netherlands)を用いて行われ、PCRシークエンシングは、プラスミド挿入およびトランスフェクションを評価するために行われた。
【０１３８】
大腸菌BL21 (DE3)は、gstおよびその融合誘導体の発現のための宿主株として使用された。pGST-azuプラスミドで形質転換された大腸菌株XL1-ブルーは、アンピシリンを有するLB培地において37℃で3時間培養され、IPTG誘導(0.4mM)は、発現レベルを最大にするために、37℃で2〜4時間、引き続いてインキュベートを行った。細胞を遠心分離により分離され、25mlの1X PBS緩衝液中に再懸濁した。引き続く細胞溶解は、超音波処理を介した細胞懸濁（氷上で20分）およびアセトン-ドライアイスバスにおける熱冷ショック(heat-cold shick)の2つの逐次的な処理を含んでいた（適切なプロテアーゼ阻害剤を使用して）。細胞溶解混合物の上清が分離され、新しく充填され、PBSで平衡化された1 mLグルタチオン-セファロース 4B（アマシャムバイオサイエンス）カラムを通過させた。カラムを洗浄した後、20 mM Tris-HCl pH 8中における10 mM グルタチオンを用いてGST-azu生成物を続いて溶出した。GST-Azu 88-113の純度は、クーマシーブリリアントブルー R 試薬により染色した10％ SDS-PAGE Tris-Gly ゲルを用いて電気泳動することにより試験した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法を用いて決定した。
【０１３９】
表面プラズモン共鳴(SPR)試験。インビトロでのタンパク質-タンパク質相互作用は、ビアコア(Biacore)ABインターナショナル(Uppsala, Sweden)からのビアコアX分光計を用いて評価した。全ての実験は、HBS-EP ランニングバッファー(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20))中、25℃で、ビアコアから購入したAu-CM5 センサーチップを用いて行われた。タンパク質保存溶液は、G-75カラムにおいて脱塩した後、PBS中で調製され、プレ濃縮および緩衝液を交換するために凍結乾燥した。
【０１４０】
CM5チップにおけるタンパク質固定化は、アミンカップリング法に従って行われた。タンパク質架橋結合効率における違いにより、CM5表面のNHS/EDCプレ活性化の後、タンパク質が種々の条件下において固定化された: アズリン(510μM)の50μl注入、またはCD4 (25μM, 2×)の35μl注入、またはHIV-1 gp120 (10μM)。エタノールアミン(1M, pH 8.8)を用いたCM5表面の引き続く処理により、結合性試験の前に、架橋結合していないタンパク質を除去した。結合性試験は、注入の終わりに120秒の時間遅延を有する30μl/分の流速で、タンパク質-CM5表面にタンパク質溶離剤を注入することにより行った。タンパク質溶離剤には、CD4 (Protein Sciences Corp., Meriden, CT)、HIV-1 gp120 (Immunodiagnostics Inc., Woburn, MA)、HIV-1 gp41 (Bioclone Inc., San Diego, CA)、HIV-1 gagおよびHIV-1-nef (Chemicon International, Temecula, CA)、ならびにGST-アズリン融合タンパク質(GST, GST-Azu 36-128、GST-Azu 36-89、およびGST-Azu 88-113,発明者の研究室において発現)が含まれていた。センサーチップ表面は、100 mM NaOH (10μl注入パルス)を用いて、タンパク質注入の間に再生された。全ての結合性試験は、非特異的な結合効果を補正するために、むき出しのAu-CM5を含有する負の流路に対して行われた。結合性試験について、溶離剤として役立つCD4およびHIV-1 gp120(固定化されない)、1 mg/mLのカルボキシメチルデキストラン(CarboMer Inc., San Diego CA)がランニングバッファーに加えられ、むき出しのAu-CM5流路表面に結合している非特異的なタンパク質を減少させた。
【０１４１】
結合定数のデータを作成するために、タンパク質溶離剤(0.05〜2000 nM)の濃度を増大させた注入による滴定試験が設計され、データが収集された。SPRデータは、ラングミューアー型平衡結合モデル[Req = Rmax/(1＋Kd/C]に適合し、それから結合定数(Kd)を決定した。上述した結合定数試験と同様に、CD4-CM5を用いた競合試験は、同様のプロトコルであるが、HIV-1 gp120＋競合タンパク質(アズリン、GST-Azu 36-128、およびGST-Azu 88-113)の注入を用いて行われた。
【０１４２】
センサーチップに固定化されたCD4に対して、アズリンおよびgp120は共に、CD4に対する有意な結合性を示した（図2A）。アズリンは、結合性のCD4に対して(Kd = 36.9 nM)、HIV-1 リガンド gp120(Kd = 48.1 nM)よりも高い親和性を示した。GST-Azu 88-113のようなGST-アズリン融合が結合性を示さない一方で（図2A）、もう1つのGST-アズリン融合タンパク質であるGST-Azu 36-128は、0.34 nMのKd値を有するアズリン自体よりもずっと強い結合性を示し（図4A）、アズリンの部分が全長タンパク質よりも強い結合親和性を保持し得ることを示す。アズリンがセンサーチップ上に固定化された場合、gp120はCD4よりもアズリンに対するいくらか強い結合性を示し（図2B）、アズリンがgp120およびCD4の両方に強い親和性で結合することを明確に示す。興味深いことに、宿主細胞へのHIV-1の侵入に関与するgp41は、アズリンに対して結合性を示さなかった（図2B）。同様の結合性の欠如は、GagおよびNefに対しても示された。
【０１４３】
例5：表面プラズモン共鳴による研究におけるICAMおよびCD5とアズリンとの結合性
アズリンとICAMsの間には構造的な類似性があり（表5）、受容体としてHIV-1感染に関与していることが既知である(Liao et al.,. AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:355-366 (2000); Hioe et al., J. Virol. 75:1077-1082 (2001))。ICAM-3は、HIV-1転写およびウイルス産生を刺激することに関与し、それ故、細胞内でのウイルス増殖に付加的に貢献する(Barat et al., J. Virol. 78, 6692-6697 (2004))。アズリンとICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、およびNCAMのようなICAMとの間の、SPRにより測定された場合のタンパク質-タンパク質相互作用が研究されている。CM5チップに固定化されたアズリンを用いると、ICAM-3 (図2C, Kd＝19.5±5.4 nM)およびNCAM (図2C)は強い結合性を示すが、ICAM-1およびICAM-2は示さなかった。本発明の操作はいずれか1のメカニズムに限定されないが、HIV-1の増殖を抑制するアズリンの部分は、ICAM-3またはNCAMとの相互作用を通して媒介されてもよい。
【０１４４】
例6：表面プラズモン共鳴により研究した場合の、CD4に対するアズリンとgp120との競合
gp120と比較した場合にアズリンのCD4に対するより高い結合親和性により（図2A）、競合実験は、同種の受容体CD4とのgp120の結合をアズリンが阻害することができるかどうかを見るために行われた。固定化されたCD4チップに吸着される固定された濃度のgp120の存在下で競合タンパク質（アズリン、GST-Azu 36-128、またはGST-Azu 88-113)の濃度が増大した場合、アズリンとGST-Azu 36-128は共に、CD4-CM5チップからgp120の全タンパク質結合が有意に減少することを示した（図2D）。チップからのgp120のそのような明らかな排除は、GST-Azu 88-113の場合には観察されなかった（図2D）。GST-Azu 88-113は、CD4に結合しないことが知られている（図2A）。本発明の操作はいずれか1のメカニズムに限定されないが、これは、アズリンまたはGST-Azu 36-128融合タンパク質がgp120とCD4との間の複合体形成をうまく阻害することを示している。
【０１４５】
例7：表面プラズモン共鳴により試験した場合の、アズリンおよびICAM-3のDC-SIGNとの結合性
アズリンと、gp120、CD4、およびICAM-3との強い結合性は（図2）、DC-SIGN (DC-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin)およびDC-SIGN/Rと呼ばれる関連タンパク質として既知の、樹上細胞(DC)の表面に位置する他の非常に重要なHIV-1結合性タンパク質の結合性を模擬する。DC-SIGNは、DC上に大量に発現されるが、DC-SIGN/Rは、主に類洞壁細胞および内皮細胞上に発現される。DC-SIGNは、専門の抗原提示細胞であるDC上に存在することによりHIV-1免疫病理学において主要な役割を果たし、HIV-1を含む病原体を捕獲し、T細胞表面のICAM-3との相互作用を介して休止T細胞に提示する(Geijtenbeek et al., Cell 100, 575-585 (2000); Soilleux, Clin. Sci. 104, 437-446 (2003); Geijtenbeek et al., Placenta 22, S19-S23 (2001))。DC-SIGNは、HIV-1エンベロープタンパク質gp120によく結合することを示し、それ故、HIV-1を捕捉し、それをCD4+ T細胞に運び、HIV-1が自由に複製される(Snyder et al., J. Virol. 79:4589-4598 (2005))。
【０１４６】
センサーチップ上に固定化されたDC-SIGNを用いたSPR実験において、アズリン(Kd=0.83±0.05 nM)およびICAM-3 (Kd=0.93±0.39 nM)は共にDC-SIGNに強く結合する（図3A）。GST-融合誘導体GST-Azu 36-89が非常にわずかな結合性を示す一方で（図3A）、もう1つのGST-融合誘導体GST-Azu 88-113は、相対的に強い結合性を示し(Kd=5.98±1.13 nM)、DC-SIGNの結合性におけるアズリンのC末端部分の関与を示す（図3B）。しかしながら、GST-Azu 88-113は、CD4とは結合せず（図2A）、アズリンの異なる部位は異なる結合特異性を有することを示す。
【０１４７】
本発明の操作はいずれか1のメカニズムに限定されないが、そのようなDC-SIGNとの結合性は、HIV-1とDCとの結合を妨げるアズリンの潜在的な能力を示す。それ故、HIV-1を粘膜細胞からリンパ球T細胞へ渡すためのDC表面における重要な分子であるDC-SIGNは、gp120、CD4、およびICAM-3ともよく結合するアズリンまたはLazの中に強い競合相手を見出す。
【０１４８】
例8：HIV-1感染症の侵入段階におけるアズリン／Lazの作用
アズリンがHIV-1感染症の侵入時に作用するのか、または侵入段階の後で作用するのかを決定するために、HIV-1のインド単離IN/2167におけるLazの効果を調べた。1つの実験において、活性化されたPBMC (25,000細胞/ウェル)を6.0μM LazおよびHIV-1と共に2時間インキュベートした。混合物を遠心分離し、LazおよびHIV-1を除去し、Lazを含まない新鮮な培地を加え戻し、5日間培養した。HIV-1の増殖は、培養液上清においてp24の測定によりモニターした。この条件下において、Laz (6.0μM)はHIV-1の増殖を43％抑制した。より高い濃度のLaz (30μM)を用いた場合、抑制の程度は76％であった。対応する実験において、HIV-1感染およびその除去の後にLaz (6または30μM)をPBMCに加えた場合、非常にわずかなウイルス増殖抑制が観察された。正の対照として、Laz (6.0μM)が感染の間およびウイルスの除去の後新鮮な培地で5日間培養する間の両方において存在する場合、抑制の程度は93％であった。本発明の操作はいずれか1のメカニズムに限定されないが、このようなデータは、アズリンまたはLazが主に感染の侵入段階において影響を及ぼすことを明確に示している。
【０１４９】
例9：アズリンを用いたHIV感染患者の治療
24のAIDS患者は、PCRにより測定した場合に血漿において低い〜検出不可能なHIVウイルス負荷(RNA PCR)および増大したCD4+数を呈する。次に、CD4+ RO+細胞は、磁気分離およびFACS選別により濃縮され、未処置且つ非感染性の細胞共培養実験に関して感染力を決定するために分析される。このCD4+ RO+記憶細胞の分析は、感染性のHIVの存在を示す。
【０１５０】
それ故、アズリンは、記憶細胞を含むCD4+細胞が低いレベルになるまで、2週間に一度、3ヶ月間、静脈内注入により4 mg/m2の用量で20の患者に投与される。4の患者はプラセボ注入を受ける。アズリンの投与の間およびその後約1〜2ヶ月の間、またはCD4+細胞が回復するまで、患者は抗生物質および抗菌剤の治療が維持される。幹細胞または前駆細胞置換は、骨髄移植およびサイトカイン治療を介して提供され、両方とも通常の技術により行われる。
【０１５１】
治療の間および治療後、患者は、頻繁な間隔でフォローされ、CD34細胞レベル、CD4+の再構築、およびCD4+RO+細胞の定量化についてモニターされる。加えて、患者の血漿は、細胞共培養実験によりウイルス負荷について分析される。活性のあるウイルス負荷の減少および記憶CD4+ T細胞の低いまたは検出不可能な濃度までの減少において、患者はアズリンから離脱される。3ヶ月後、患者は抗生物質および抗真菌剤の治療から離脱される。この後、患者は6ヶ月の間隔をおいて、ウイルス量について試験した。結果は、HIV感染を有する患者に対するアズリン治療の有効性を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図1は、アズリン、H.8-アズリン(H.8-Az)、およびLazによるHIV-1ウイルスの増殖の阻害を示す。
【図２】図2は、キュプレドキシンのCD4およびHIV-1 gp120との結合パターンを表す表面プラズモン共鳴結合曲線を示す。
【図３】図3は、アズリン、およびGST-アズリン融合とDC-SIGN との相互作用を示す表面プラズモン共鳴結合滴定を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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