(57)【要約】  本発明は、バイオセンサーのための新規な二相の生物適合型の半透過性膜に関し、より具体的には酵素によるグルコースのインビボセンシングにおける使用のための均質膜に関する。前記膜は、内部に分散したポリジメチルシロキサンの分離した粒子を含む、水膨潤可能なポリウレタンの連続的な親水性相で構成される。さらに、インビボにおける血中グルコース値のバイオセンサーの連続的な決定において、外膜として使用するための良好な性質を有する膜が、非常に多数（例えば20工程以上）の噴霧工程におけるポリマー溶液の噴霧によって調製され得る。
2008510154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のポリマー（または混和性ポリマーの混合物）の連続相と、高い酸素透過性（酸素に対する透過性）を示す第二の高分子量のポリマーの分離したドメイン相とを含む膜であって、各相におけるポリマーが不混和性であり、かつ第二の高分子量のポリマーが約20μm〜約1nm、好ましくは約10μm〜約10nm、より好ましくは約5μｍ〜約50nmの範囲内におけるドメインサイズを有し、前記膜生成物が、グルコースオキシダーゼに基づいたバイオセンサーの高密度または大部分が高密度の外膜として使用され、その結果、
ａ）3より大きなシグナル対ノイズ比、
ｂ）0.4 nA/mM/mm2より大きな感度、
ｃ）グルコースの測定値についての延長された線形性範囲、
ｄ）良好な化学的安定性、および
ｅ）良好な機械的安定性
を、前記グルコースオキシダーゼに基づいたバイオセンサーを使用してグルコースの測定を行うインビボ使用期間中にもたらす膜。
【請求項２】
前記二つのポリマーのうちの一つが、親水性ポリマーである請求項１に記載の膜。
【請求項３】
前記二つのポリマーのうちの一つが、疎水性ポリマーである請求項１または２に記載の膜。
【請求項４】
前記親水性ポリマーが、水膨潤性ポリウレタンまたはポリウレタンのブロックコポリマーの組成物、例えば、ポリウレタン／ポリエチレンオキシド、ポリウレタン／ポリテトラメチレンエーテルグリコール、またはポリウレタン／ポリジメチルシロキサンである請求項１〜３のいずれか一項に記載の膜。
【請求項５】
前記ポリウレタン−ポリシロキサンのブロックコポリマーが、ポリシロキサンドメインの安定化のための相溶化剤／乳化剤として使用される請求項１〜４のいずれか一項に記載の膜。
【請求項６】
不混和性ポリマーの一つが、PU/PEO または PU/ポリテトラメチレングリコール（PTMGと表記）コポリマーである請求項１〜５のいずれか一項に記載の膜。
【請求項７】
前記親水性ポリマーが、好ましくは、脂肪族の、ポリエーテルに基づいたポリウレタンのファミリー由来のポリマー（Thermedics 社のTecophilic、より好ましくはThermedics 社のTecophilic HP60D-20）である請求項１〜６のいずれか一項に記載の膜。
【請求項８】
前記疎水性ポリマーが、ポリジメチルシロキサン、好ましくはDow CorningのDC360（粘度12,500 cSt, Medical grade)である請求項１〜７のいずれか一項に記載の膜。
【請求項９】
前記膜が、その乾燥樹脂重量当り約1％〜約50％、好ましくは約5％〜約40％、より好ましくは約10％〜約30％、最も好ましくは約20％まで膨潤する親水性ポリマーから調製される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１０】
一以上の親水性ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１１】
前記疎水性ポリマーの分子重量が、少なくとも約10 kDa、好ましくは少なくとも約20 kDa、より好ましくは少なくとも約30 kDa、最も好ましくは約42 kDa、および好ましくは約60 kDa以下である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１２】
約1μm〜約60μm、好ましくは約5μm〜約50μm、より好ましくは約20μm〜約40μm、最も好ましくは約35μmの厚みを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１３】
約0.01×10-10 m3〜約250×10-10 m3、好ましくは約0.5×10-10 m3〜約150×10-10 m3、より好ましくは約10-10 m3〜約50×10-10 m3、最も好ましくは約5×10-10 m3の体積を有する請求項１〜１２のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１４】
約0.1 MPa〜約50 MPaの範囲、好ましくは約1 MPa〜約40 MPaの範囲、より好ましくは約2 MPa〜約30 MPaの範囲、最も好ましくは約8 MPaの、明細書中に定義されたような湿潤条件における最大引張強度を有する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１５】
前記ポリマーの最大伸長が、その元の長さの約150％〜約800％、好ましくは約200％〜約700％、より好ましくは約250％〜約600％の範囲内にある、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１６】
本明細書中に定義されたようなインビボでの十分な生体適合性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１７】
前記親水性の水膨潤性材料が、ポリウレタンである請求項１〜１６のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１８】
前記疎水性材料の含有量が、全重量当り約1％〜約50％（重量／重量）、好ましくは約5％〜約25％、より好ましくは約8％〜約20％、最も好ましくは約18.6％である請求項１〜１７のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１９】
前記膜が、約7×10-12〜約7×10-10cm3×cm/(cm2×s×Pa)、好ましくは約1.4×10-11 〜約3.5×10-10cm3×cm/(cm2×s×Pa)、より好ましくは約2.3×10-11〜約2.1×10-10cm3×cm/(cm2×s×Pa)、最も好ましくは約7×10-11cm3×cm/(cm2×s×Pa)の酸素に対する透過性を有する疎水性ポリマーを使用して調製される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の膜。
【請求項２０】
前記膜が、望まれない状態において性質を変化させない、線量2×25 kGyを使用してEビーム滅菌され得る、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の膜。
【請求項２１】
前記膜が、生産後少なくとも232日間の長期間の安定性を示す請求項１〜２０のいずれか一項に記載の膜。
【請求項２２】
前記膜が、6℃〜45℃の範囲内において相転移を示さない請求項１〜２１のいずれか一項に記載の膜。
【請求項２３】
前記膜が、約5000センチストーク以上、好ましくは約10,000センチストーク以上、より好ましくは約12,000センチストーク以上の粘度を有する疎水性材料から調製される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の膜。
【請求項２４】
被検物質と酸素との反応を測定するための移植可能なバイオセンサーであって、前記センサーの作動電極が酵素の層を含み、前記バイオセンサーが請求項１〜２３のいずれか一項に記載の膜からなる外膜を備えることを特徴とする移植可能なバイオセンサー。
【請求項２５】
前記被検物質が、グルコースであることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか一項に記載の移植可能なバイオセンサー。
【請求項２６】
前記酵素が、グルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求項２４または２５に記載の移植可能なバイオセンサー。
【請求項２７】
本明細書中に定義されたような十分に短い起動時間を有する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の移植可能なバイオセンサー。
【請求項２８】
皮下組織中に挿入されたとき、3日間にわたる安定なバイオセンサーの応答を示す、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の移植可能なバイオセンサー。
【請求項２９】
二重層膜のうち、最内層が電流測定バイオセンサー（図１を参照）において電極に最も近接し、かつPU/PDMSまたはPUから作製され、最外層がPU-PEO、PU-PTMG、PU-PEO/PDMS、PU-PTMG/PDMS、PU/PU-PEO/PDMS、またはPU/PU-PTMG/PDMSから作製される二重層膜を含む請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の移植可能なバイオセンサー。
【請求項３０】
三重層膜のうち、最内層がPU、PU-PEOまたはPU-PTMGからなり、第二の層がPU-PEO/PDMS、PU-PTMG/PDMS、PU/PU-PEO/PDMS、PU/PU-PTMG/-PDMSからなり、第三の層がPU-PEOまたはPU-PTMGからなる三重層膜を含む請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の移植可能なバイオセンサー。
【請求項３１】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の膜からなる二相以上の生物適合性の膜。
【請求項３２】
二つの不混和性ポリマーからなる層を基板上に置く方法、例えば、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の膜を調製する方法であって、以下の工程を特徴とする方法。
ａ）溶媒を使用し、一以上のポリマーを含む溶液または懸濁液を調製する工程と、
ｂ）前記溶媒の一定量がポリマー溶液／懸濁液が基板に到達する前に蒸発するように、前記ポリマー溶液または懸濁液の一部をスプレーノズルを通して前記基板に塗布する工程と、
ｃ）ポリマー溶液または懸濁液の残りの部分が基板に到達した後、ポリマー溶液／懸濁液中に存在する溶媒の残りの量の実質的部分を蒸発させる工程と、
ｄ）前記溶媒の一定量がポリマー溶液／懸濁液が基板に到達する前に蒸発するように、前記ポリマー溶液または懸濁液の一部をスプレーノズルを通して前記基板に塗布する工程と、
ｅ）ポリマー溶液または懸濁液の残りの部分が基板に到達した後、ポリマー溶液／懸濁液中に存在する溶媒の残りの量の実質的部分を蒸発させる工程と、
ｆ）工程ｂ）に記載されたように溶液または懸濁液を前記基板に塗布し、かつ工程ｂ）およびｃ）に記載されたように溶媒を蒸発させる工程を、合計で少なくとも約30工程にわたってこの順番で繰り返す工程。
【請求項３３】
本明細書中に記載された任意の新規な特徴または複数の特徴の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーの生産に有用な新規な多相系生物適合型の半透過性材料に関し、より具体的にはグルコースのインビボセンシングのための移植可能なバイオセンサーに適した外膜に関する。さらに、本発明は、上記膜を調製するための方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
真性糖尿病において、膵臓は、インシュリンを製造および分泌するその能力を失い、代謝の不均衡を導く。この状態の結果として、体は血液のグルコース含有量を調節する能力を失う。歴史上、真性糖尿病は、インシュリン注射、食事、運動および経口投薬によって治療されてきた。
【０００３】
患者にこれらの代謝調節を向上させる手段を提供するために、血液のグルコース含有量を連続的にモニターできる装置を開発する必要がある。そのような装置は、患者に移植される一以上のバイオセンサーを含まなければならないであろう。
【０００４】
バイオセンサーは、特定の生物学的成分(細胞、酵素、組織など)および認知事象を検出可能なシグナルに変換する物理学的成分(電気的、音響的、光学的、熱的なものなど)の組合せを組み込む分析的装置である。典型的には、センサーは、被検物質の濃度と定量的に関係づけられるシグナルを生ずる。多種多様な被検物質に使用される多くの種類のバイオセンサーがある。電気化学的バイオセンサーは、典型的には酵素を使用して濃度を電気的シグナルに変換する。免疫学的バイオセンサーは、被検物質の分子認識（例えば抗体）に依存する ( Principles of Chemical and Biological Sensors, Chemical Analysis vol. 150, John Wiley & Sons, Inc., 1998; Biosensors in the Body, D. M. Fraser, John Wiley & Sons, 1997を参照 ) 。
【０００５】
バイオセンサーの種類にかかわらず、バイオセンサーを構成する各材料は、インビボにおいて機能し、かつ十分なシグナルを提供するという一定の性質を有する必要がある。第一に、組織に接触するバイオセンサーの最外面は、生体適合性でなければならない、すなわち、特定の適用において適切な宿主応答を示さなければならない (Williams, "A model for biocompatibility and its evaluation", J. Biomed. Eng., 185-191, 11 (1989))。生体適合性は、生体組織に対して直接的な傷を引き起こさない、あるいは小さなまたは中程度の傷のみを引き起こす、その他、任意の有害反応、他の有害全身性効果を引き起こさず、あるいは有害効果を遅延させる(Wallin, "Global biocompatibility", Med. Dev. Tech, 34-38, 6 (1995))。実用的であるために重要なことは、バイオセンサーシグナルが安定であり、かつタンパク質、電解質、薬物および他の潜在的な妨害化合の存在によって悪影響を受けないことである。タンパク質からの妨害を防ぐために、センサーの外膜はタンパク質の付着を抑制するべきである。さらに、センサーは、潜在的な妨害化合物をセンサーの活性部位から離れた状態に保つ一以上の層を使用するべきである。
【０００６】
いくつかのバイオセンサーは、機能する複数の化学種に依存している。この一つの著名な例は、補基質として酸素を使用する酸化還元酵素を使用する電流測定のグルコースセンサーである。より多くの化学種がセンサーの適切な機能のために必要とされる場合、興味の対象となる種(被検物質)が、補基質を必要とすることよりもむしろ、センサーの出力を制限することは致命的である。酸化還元酵素を使用するグルコースセンサーについて、過剰な酸素(グルコースと比較して)が存在することは、有効な読み取りを行うために重要である。これは、「酸素欠乏問題」として以下に言及される。糖尿病患者の組織における典型的なグルコース濃度は、酸素濃度よりも約40〜100倍高いが、「酸素欠乏問題」は、酸素に対する透過性がグルコースに対する透過性よりも高い膜材料を選択することによって解決されうる。要約すると、酸化還元酵素を使用するグルコースセンサーの有効な膜は、生体適合性であって、妨害化学種を遮蔽し、かつグルコースに対する透過性よりも酸素に対する透過性の方が高くなければならない。
【０００７】
文献において、多数の例が、酸化還元酵素を使用するグルコースに適した膜系について提供されている。
【０００８】
米国特許第4,759,828号は、「酸素欠乏問題」を解決するためのミクロポーラスな膜を開示している。ミクロポーラスな膜は、短期間の実験中ではうまく機能するであろう。しかしながら、タンパク質の付着による膜材料の劣化が、長期にわたる安定性に影響を及ぼすおそれがある。さらに、有孔性により、センサーの電極および酵素が、タンパク質を含む体液にさらされる。タンパク質は、電極の劣化および活性酵素の悪化によりセンサーの性能を急速に低下させる。
【０００９】
米国特許第4,484,987号は、疎水性材料が親水性膜中に組み込まれた分離したドメインをもつ組み合わせ膜を使用している。単純に記載されたとおりに実験室で試験すると、長期間にわたる安定性、十分な透過性および十分な機械的強度を有する作動膜が、不十分な凝集を示す大きな構造の形成により、生成するのが非常に難しいことがわかった。
【００１０】
米国特許第5,882,494号および第5,777,060号は、少なくとも1つのジイソシアナート、少なくとも1つの親水性のジオールまたはジアミン、および少なくとも1つのシリコーン材料の反応生成物である、均質なポリマー組成物について説明する。この特許における多孔質膜は、一つのポリマーに2つの異なる種類の結合および成分を組み込む。ジイソシアナートおよびジオールの反応は、ウレタン結合を作り、同じイソシアナートはジアミンと反応し、尿素結合を作る。従って、これらの特許において、シロキサンは反応生成物の一部である。
【００１１】
溶液からのコーティング物および膜の生産は、当該技術分野において広く知られた十分に確立された技術である。液浸または塗布のような非常に単純な手法はまた、しばしば十分な品質を有するコーティングをもたらす。しかし、複雑な幾何学構造がコートされるかまたは特別な要求が塗布プロセスにある場合、スプレーコーティングが好ましい戦略になるであろう。米国特許第2,378,148号は、コーティング材料を塗布する前に加熱しなければならない特別な噴霧コーティング系のためのレイアウトを与える。噴霧プロセスを増強する手段として加熱することは、米国特許第4,505,957号においても行われている。
【００１２】
米国特許第4,484,987号の教示による厚みのある膜（すなわち、疎水性ドメインを含む膜）の生産での1つの主要な障害は、疎水性相と親水性相との間の凝集が不十分であることです。従って、膜が溶液から生成される場合、得られる膜は不均一であり、おそらく多孔性である。不均一性は、疎水性分子が膜溶液の蒸発中にドメインを形成する事実からの結果である。これらのドメインは、膜の弛緩により形成されたボイドのための核生成中心のようにふるまう。
【００１３】
米国特許第5,882,494号には、疎水性／親水性ブロックコポリマーが膜の生産において使用される方法を開示している。ポリマー鎖の親水性バックボーンへの疎水性ブロックの不動化により、この方法は、親水性マトリックスにおける小さな疎水性ドメインの均質な分散を保証する。ブロック共重合体の使用は均質な膜を保証するが、単一のブロック共重合体系の使用は、一般的な場合において、特定のポリマー系を特定の適用に合わせる可能性を失うので有利ではない。さらに、米国特許第5,882,494号に記載されたポリマーは、このポリマー系におけるグルコースのかなり制限された輸送により、比較的薄い膜をを必要とする。薄い膜のために、センサーが組織に直接的にさらされることから保護される必要がある。最後に、実験によって、この種類の膜がタンパク質の付着を受け易く、使用中に感度が低下することが示された。
【００１４】
単純に記載されたとおりに実験室で試験すると、長期間にわたる安定性、十分な透過性および十分な機械的強度を有する作動膜が、生成するのが非常に難しいことがわかった。
【００１５】
ミクロの多孔質膜は、短期の実験中では十分に作動するであろう。有孔性により、センサーの電極および酵素が、タンパク質を含む体液にさらされる。タンパク質は、電極の劣化および活性酵素の悪化によりセンサーの性能を急速に低下させる。
【００１６】
センサーの劣化を防ぐために同定された唯一の方法は、均質かつ密な膜を使用し、タンパク質がセンサーの内部に達することを妨げる。ポリウレタンは、この材料の立証された生物学的適合性質により、適切な材料として知られている (G. W. Shaw, D.J.Claremont and J.C. Pickup, Biosensors and Bioelectronics, 401-406, 6 (1991);  D. S. Bindra, Y. Zhang, G. S. Wilson, R. Sternberg, D. R. Thevenot, D. Moatti and G. Reach, Analytical Chemistry, 1692, 63 (1991);  および M. Shichiri, Y. Yamasaki, K. Nao, M. Sekiya and N. Ueda, Horm. Metab. Res., Suppl. Ser., 17, 20 (1988)) 。安定かつ機械的強度のあるセンサーに対する要求は満たされたものの、例えばポリウレタンの密な膜で覆われたセンサーは、本明細書の前段で述べた酸素欠乏問題によりグルコースセンサーとして適切ではない。
【００１７】
文献から、米国特許第4,484,987号(図3を参照)において言及された原理を使用して、十分な強度、寿命および酸素透過性を有する膜が、ポリシロキサン(sil)と混合したポリウレタン(PU)（PU/silと表記）に基づいて生成され得ることが結論づけられた。
【００１８】
上述の明細書中に言及されたように、有孔性あるいはその他の不完全な膜は、長期にわたる使用には適していない。また、非常に薄い膜は、本質的に非常に脆いので避けるべきである。薄く脆い膜を扱うための溶液は、文献中に見出される (例えば、「フレキシブル基板上に組み立てられた電気酵素的グルコースセンサー」、 J. J. Mastrototaro et al., Sensors and Actuators B, 139-144, 5 (1999)) 。これは、センサーが可能な限り小型で効率的なものとして作製される場合、明らかに実行可能な方法ではない。
【００１９】
グルコースの拡散を増強するための利点が、米国特許第5,322,063号のアランによって提示されたスキームから得られる。ポリエチレンオキシド(PEO)で修飾されたポリウレタン(PU)系は、グルコースおよび酸素の拡散を増強するために使用される。
【００２０】
アランによって提示された手法によって示唆された実験は、グルコースに対して十分な透過性を有するPU/PEOコポリマーに基づいた系が作製され得ることを明らかにした。しかしながら、実験はまた  このスキームによって実行可能なセンサーを生産することができないことを示した。なぜなら、グルコースおよび酸素が同じ相を通して拡散し、その結果、酸素と比較したグルコースの透過性が固定され、グルコースの透過性が酸素の透過性と比較して高くなりすぎるという事実があるからである。
【００２１】
驚くべきことに、PU/PEOコポリマーを使用する実験は、さらなる予期し得ない優位性を示した。PEO含有量により、PU/PEOコポリマーは、水を吸収する(膨潤)。膨潤したポリマーが水を非常に効率的に内部に輸送するので、システムの起動時間を劇的に短縮させる。膨潤ポリマー系のさらなる利益は、生成中に膜に誘導された引張応力が、体積膨張によって部分的にまたは完全に平衡化され、その結果、使用状況における膜系が内部応力から自由になることである。 
グルコース・バイオセンサーのさらなる記載は以下の文献に見出すことができる: “In vivo characteristics of Needle Type Glucose Measurements of subcutaneous glucose concentrations in Human Volunteers", Shinchri et al, Horm. Metab. Res., Suppl Ser., 17-20, 20 (1988); "In vivo measurements of subcutaneous glucose concentrations with an enzymatic glucose sensor and a wick method", Bruckel et al., Klin. Wochenschr., 491-495, 67 (1989); "In vivo molecular sensing in diabetes mellitus: an implantable glucose sensor with direct electron transfer", Pickup et al., Diabetologia, 213-217, 32 (1989); "Biosensors in the Body", Fraser, John Wiley & Sons, 1997; "Implanted Electrochemical Glucose Sensors for the Management of Diabetes", Heller, Annu. Rev. Biomed. Eng., 153-175 (1999); "A new amperometric glucose microsensor: In vitro and short term in vivo evaluation", Ward et al., Biosensors and Bioelectronics, 181-189, 17 (2002); "Materials and Techniques for Electrochemical biosensor design and construction", S. Zhang et al., Biosensors and Bioelectronics, 273-282, 15, (2000); "An electroenzymatic glucose sensor fabricated on a flexible substrate", J. J. Mastrototaro et al., Sensors and Actuators B, 139-144, 5 (1999); "Enzyme-Based Biosensors for in Vivo Measurements", G. S. Wilson and Y. Hu, Chem. Rev. 2693-2704, 100 (2000); "A Subcoutaneous Glucose Sensor with Improved Longevity, Dynamic Range, and Stability of Calibration", Updike et al., Diabetes Care, 208-214, 23 (2000); "A Continuous Glucose Sensor Based on Wired Enzymed(商標) Technology - Results from a 3-Day Trial in Patients with Type 1 Diabetes”, Feldman et al., Diabetes Technology & Therapeutics, 769-779, 5 (2003); これらの全ての文献は参照によって本明細書中に組み込まれる。
【発明の目的】
【００２２】
本発明の目的は、補基質として酸素を使用する酵素に基づいたグルコースセンサーの外膜として適切な多相の材料を考案することである。本発明は、一以上の酸化還元酵素を使用する経皮的なセンサーに特に適している。
【００２３】
さらなる他の目的は、膜の高い機械的強度を保証し、かつ実際の使用状況におけるシステムの機械的統合性を保証することである。
【００２４】
本発明のさらなる他の目的は、生体適合性性質を有する膜を提供することである。
【００２５】
さらに、本発明の目的は、複数の不混和性ポリマーを含む溶液から等方性(isotropic)の膜（例えば、本発明の膜）の生産を可能にする新規な方法を考案することである。本発明の目的は、多くの工程において膜を塗布することによって達成される。各工程には希釈された膜材料の塗布と後の乾燥が含まれる。膜を多くの連続した工程において塗布することによって、拡散および相分離が妨げられ、実質的に均質な膜を産生する。
【００２６】
さらなる他の目的は、疎水性酸素輸送ドメインと系の生体適合性を増強する親水性ドメインの両方を含む多相膜（例えば、本発明の膜）の生産を可能にすることである。
【００２７】
本発明のさらなる他の目的は、インビボでの使用中に良好な長期間にわたる安定性を有する膜（例えば、本発明の膜）を提供することである。
【発明の概要】
【００２８】
簡潔には、本発明の目的は、酸素に対して高い透過性を示すが、センサー内で酸化された化学種に対しては他のポリマーへの低い透過性を示すポリマー、あるいは酸素に対して透過性を示す混和性のポリマーと第一のポリマーと不混和性ポリマーとの混合物から作製されたドメインの封入によって膜の酸素の透過性を増強することによって達成される。
【００２９】
上述した目的（すなわち、膜に関係したもの）のいくつかを達成するために、本発明は、膜が以下の請求項１により詳しく定義された少なくとも二つの不混和性ポリマーの混合物からなる独自のバイオセンサーのための膜系を含む。不混和性ポリマーの一つは、好ましくはPU/PEO または PU/ポリテトラメチレングリコール (PTMG) コポリマーであり、好ましくはもう一方の不混和性ポリマーは酸素の透過を増強するポリマーである。
【００３０】
本発明の膜は、電流測定のグルコースセンサーのためのいくつかの主要な性質、すなわち高感度（高シグナル対ノイズ比）、大きな線形性範囲、インビボ使用に必要な高い化学的および機械的安定性、および生体適合性を併せ持つ。
【００３１】
好ましくは、膜中に分散した粒子を形成する不混和性酸素増強ポリマーは、約10 kDaの分子量をもつ液体または固体である。
【００３２】
さらに、上述した目的（すなわち、膜に関係したもの）のその他を達成するために、本発明は、膜が少なくとも二つの不混和性ポリマーからなる等方性化合物から作製される（例えば、本発明の膜）独自のバイオセンサーのための膜系の適用のための方法を含む。
【００３３】
膜の厚みと匹敵するサイズを有するドメインの沈降を防ぐために、膜は多くの連続的工程において作製され、各工程は材料の塗布と後の溶剤の蒸発からなる。塗布工程間の溶剤の蒸発によって、大きなドメインの沈降が妨げられ、実質的に等方性の膜をもたらす。本発明の一実施態様において、膜は30以上、より好ましくは100以上、さらにより好ましくは500以上の連続的な塗布／蒸発工程によって調製される。
【００３４】
塗布前にポリマーの均質な混合を容易にするために、これらの少なくとも一つが溶解される。もう一方の不混和性ポリマーは第一の不混和性ポリマーとともに溶解されるかまたは粒子として溶液中に懸濁される（またはその両方である）。
【００３５】
この文脈において、溶剤は、純粋な化合物（例えば、エーテル）かまたは化合物の混合液（例えば、アルコールと水）であり、溶剤は少なくとも一つの不混和性ポリマーを溶解でき、好ましくは、最終ポリマー溶液が25℃で約50 cSt以下の粘度、より好ましくは25℃で約20 cSt以下の粘度を示すことを特徴とする。
【００３６】
必ずではないが、膜の層を、例えば、基板に塗布された最初の層のいくつかがグルコースに対して低い透過性を示し、一方、基板に塗布された後のまたは最後の層のいくつかがグルコースに対して高い透過性を示すように変化させてもよい。
【定義】
【００３７】
本明細書中、本発明の生成物の試験のために使用される「電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサー」は、白金粒子のペーストから作製された350μm×40μmの最大断面積を有する作動電極と、Ag/AgCl ポリマーペーストから作製された300μm×40μmの最大断面積を有する参照電極とを含む、二つの電極をもつ電気化学的センサーを意味する（図１を参照）。皮膚への移植を目的とした電極の長さは約15mmであり、被覆されていない作動電極は約2.4 mmであり、被覆されていない参照電極は約11 mmである。電極は、ペーストをスクリーンプリンティングすることによって作製され、目的に応じてカスタマイズされる。電極は、約500μm×180μmの断面積を有するポリイミド基板の対辺にプリントされる。作動電極は、1〜8μmの厚みを有する、セルローストリアセテートおよびNafion(登録商標)の混合物の内膜によって覆われる。内膜の上部には、グルコースオキシダーゼおよびグルタルアルデヒドから作製された厚み1〜8μmの酵素膜が堆積される。誘電性ペーストは、導体トラックを絶縁し、電極領域を制限し、パッドと接触する。本明細書中に記載され、かつ外膜として表わされた生成物は、電極、基板、誘電性ペーストおよび他の膜を完全に覆うように塗布される。センサーは、0.6Vの一定電圧で起動する双極子として構成される。上述に定義されたセンサーはまた、「電気化学的グルコースセンサー」と等しい。
【００３８】
本明細書中、「グルコースの測定のための線形性範囲」は、グルコース添加10分後、5分平均をとることによって、異なるグルコース濃度 (1、2.00、2.99、4.98、6.95、9.90、14.8、19.6、24.4、29.1、33.8、および38.5 mM グルコース) に対応する電流を計算することによって得られうる。平均および標準偏差の両方が計算されるべきである。範囲内の予期されたアウトライアーは、有意レベル5％でDixon’s Q 試験で試験される (”Statistics for Analytical Chemistry”, Miller and Miller, 3rd edition, Ellis Horwood Ltd., 1993)。線形性範囲（電流＝感度×グルコース濃度＋バックグラウンド）は、直線回帰で最初の三つのデータに合わせる。線形への適合から10％以上逸脱する点（相対誤差）が存在しない場合、次の点を加えることによって続ける。適合値と電流値との間の相対誤差が10％を越えるまで点を加える。線形性適合はこれらの点について行われる。全ての点が新たな適合線に対して10％の誤差の範囲内にある場合、次の濃度についての電流値が同様に試験される。線形性範囲とは、全ての点が線形性回帰適合に対して相対的に10％未満で逸脱する範囲として定義される。
【００３９】
本明細書中、「シグナル対ノイズ比」について、ノイズは電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーの電流のゆらぎとして定義される。一定のバックグラウンドは平均電流から減算される。時間の変動は、グルコース以外の物質、例えば干渉性物質（例えば、アスコルビン酸、アセトアミノフェン、および尿酸）の電流に起因する。これらは前記バックグラウンドには含まれないが、測定された電流に無視し得る変化しか与えないものと考えられる。
【００４０】
本明細書中、用語「グルコースの測定値についての延長された線形性範囲」は、試験材料の外膜を有する電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーの線形性範囲と、試験材料と同一の材料（但し、高い酸素透過性材料は含まれない）の外膜を有する電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーの線形性範囲とを比較したとき、グルコース添加に対する電流応答が範囲5mMにおいてより広範囲で線形になることを意味する。この試験は、温度37℃、減少した酸素分圧下(pO2=60 mm Hg)で攪拌された(Magnetic stirrer, IKA(登録商標) color squid magnetic stirrer, stirring speed setting: 10 o’clock)標準PBSバッファー(pH 7.4, 150 mM NaCl) において行われる。
【００４１】
本明細書中、用語「湿潤条件下における最大引張強度」は、20ニュートンの測定ヘッドを有するLloyds機器張力装置LR5Kを使用して、約10 mm幅 × 20 mm長 × 〜30 μm厚の寸法を有するポリマー薄層フィルムを、破断するまで30 mm/分で伸長させることによって決定される。ポリマーは、引張試験前に、PBSバッファー(pH 7.4, 150 mM NaCl)において少なくとも6時間にわたって浸漬された。引張試験は、バッファーから薄層フィルムを取り出した後5分以内に行われる。
【００４２】
本明細書中、用語「十分なインビボ生体適合性」は、デバイスが特定の適用において適切な宿主応答を示し、その結果、皮下（例えば、腕または腹部）に移植されたとき、安定なバイオセンサー応答が保証されることを意味する。
【００４３】
本明細書中、用語「酸素に対する透過性」または酸素透過性は、ポリマーフィルムを介した酸素分子の伝達を意味する。透過度Pの定義は、P=（浸透物質の量、ここでは酸素）×フィルム厚／（フィルム面積×時間×フィルムを横切る圧力または濃度降下）である。透過物質の量は、典型的には質量、モル、または標準温度（273.15K）および圧力(1.013×105 Pa)(STP)での気体体積によって表わされる。本明細書中に与えられた量はSTPでの体積において与えられる。実験の詳細については、Stern and Bhide, J. Appl. Polymer Sci., 2131, 38 (1989); Stern et al., J. Polym. Sci. B, 1263, 25 (1987) を参照されたい。
【００４４】
本明細書中、用語「望まれない状態において性質を変化させない」は、本発明による生成物の試験のために使用される電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーが、グルコース、反応時間、安定性および他の性質に関して、例えばEビーム照射の前後でその線形性範囲を保持することを意味する。
【００４５】
本明細書中、用語「十分に短い起動時間」は、本発明の生成物の試験のために使用される電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーが、グルコース含有液体中に浸漬後１時間以内にその平衡状態に達することを意味する。
【００４６】
本明細書中、用語「バイオセンサーの安定な応答」（または安定なバイオセンサー応答）は、グルコースセンサー、例えば電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーとして上述に定義されたセンサーが、皮下組織中に3日間挿入された後、検出可能なグルコースシグナル、すなわち、3より大きいシグナル対ノイズ比および0.4 nA/mM/mm2より大きい感度を、一日当り20％未満のシグナル減衰とともに有することを意味する。皮下組織（皮膚表面の約2mm下）へのセンサーの挿入は、センサーに損傷を与えることなく皮膚を貫通でき、かつ使用後に取り出すことができる針状挿入デバイスによって行われる。腹部の皮下組織は、典型的には測定部位として使用されるが、他の部位（例えば、上腕）も使用されうる。
【００４７】
本明細書中、用語「長期間にわたる安定性」は、図1に記載されたセンサーおよび「電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサー」の定義において上述に例証されたセンサーであって、本発明による外膜を有するセンサーが、減少した酸素分圧下(30〜60 mmHg)のPBSバッファー(pH 7.4, 150 mM 塩化ナトリウム(NaCl))においてインビトロで測定されたとき、膜の生成後の所定の時間（数ヶ月、例えば6ヶ月、または数年、例えば2年）で少なくとも20 mMグルコースまで線形性を示し、少なくとも0.4 nA/mM/mm2 の感度を与えることを意味する。さらに、シグナルは、センサーが製造後の所定の時間に測定されるとき3日間にわたって一日当り20％以上減少しない。
【００４８】
本明細書中、用語「良好な化学的安定性」は、センサー、例えば、上記に定義された本発明の外膜を備えた電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーが、本明細書中で定義された安定な応答と本明細書中で定義された長期間にわたる安定性の両方を示すことを意味する。
【００４９】
本明細書中、用語「良好な機械的安定性」は、本発明の外膜が、電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーの定義において例証されたセンサー上に適用されたとき、皮下組織に3日間の挿入後に離層または破断しないことを意味する。本発明には、例えば、例６に言及された手順によって測定される強度および最終的伸長をもたらす外膜についての範囲が含まれる。
【００５０】
本明細書中、用語「ポリウレタン」とは、少なくとも二つのウレタン結合を含むポリマーをいう。
【発明の詳細な説明】
【００５１】
本発明は、第一のポリマー（または混和性ポリマーの混合物）の連続相と、該連続相中に分散して存在する、高い酸素透過性（酸素に対する透過性）を示す第二の高分子量のポリマーのドメインとを含む膜であって、いずれの相におけるポリマーも不混和性であり、かつ第二の高分子量のポリマーは、約20μm〜約1nm、好ましくは約10μm〜約10nm、より好ましくは約５μｍ〜約50nmの範囲内におけるドメインサイズを有し、前記膜生成物は、グルコースオキシダーゼに基づいたバイオセンサーの高密度または大部分が高密度な外膜として使用され、その結果、
ａ）3より大きなシグナル対ノイズ比、
ｂ）0.4 nA/mM/mm2より大きな感度、
ｃ）グルコースの測定値についての延長された線形性範囲、
ｄ）良好な化学的安定性、および
ｅ）良好な機械的安定性
を、本明細書中に定義された前記グルコースオキシダーゼに基づいたバイオセンサーを使用するグルコースの測定のためのインビボ使用中にもたらす膜に関する。
【００５２】
本明細書中における用語「不混和性」は、連続相が、分散したドメインを形成するポリマーと混合しないかまたはわずかしか混合しないことを意味する。言い換えれば、第二のポリマーの分散したドメインは、連続相または実質的な連続相を形成するポリマーまたはポリマー混合物中に存在する。
【００５３】
一実施態様において、本発明の膜は、二つのポリマーのうち一つが親水性ポリマーである膜である。
【００５４】
一実施態様において、本発明の膜は、二つのポリマーのうち一つが疎水性ポリマーである膜である。
【００５５】
一実施態様において、本発明の膜は、連続相が親水性であり、かつ分散したドメインが疎水性である膜である。
【００５６】
一つの側面において、本発明の膜には、一つのポリマー（または混和性ポリマーの混合物）の連続相と、第二の高分子量ポリマーの分散したドメインとが含まれ、それぞれの相におけるポリマーが不混和性である。ポリマーは、その疎水性／親水性性質を通して不混和性になり得る。本発明の膜の一実施態様において、疎水性ポリマーはポリシロキサン、フロロカーボンポリマーまたはこれらのブロック共重合体である。
【００５７】
本発明の膜を調製する一つの方法は、液体ポリシロキサンを溶解したポリウレタンと混合し、噴霧乾燥後に外膜としてセンサーに容易に適用できる溶液にすることによって行われる。ポリウレタンおよびポリシロキサンの不混和性（前者は親水性であり、後者は疎水性である）のために、材料６（図４を参照）は、溶剤が蒸発するときにもう一方の材料７中においてドメインとして沈降し、分散した多相系（図４を参照）を形成する。疎水性ドメイン６の平均ドメインサイズは好ましくは、約20μm〜約1nm、より好ましくは約10μm〜約10nm、より好ましくは約5μm〜約50nmの範囲内にある。
【００５８】
一実施態様において、本発明の膜は、疎水性ポリマーの分子量が、約10 kDa〜約100 kDa、好ましくは約20 kDa〜約80 kDa、より好ましくは約30 kDa〜約60 kDa、最も好ましくは約42 kDaである膜である。一実施態様において、本発明の膜は、疎水性ポリマーの分子重量が、少なくとも約10 kDa、好ましくは少なくとも約20 kDa、より好ましくは少なくとも約30 kDa、最も好ましくは約42 kDa、および好ましくは約60 kDa以下である膜である。
【００５９】
図7aは、本発明の膜の走査電子顕微鏡画像を示す。図7aに観察された小さな明色のドメインは、ポリジメチルシロキサンの小さな疎水性ドメインである。疎水性ドメインを強調するために（図7b中の相2）、これらのドメインは黒色（暗色）に色づけされ、それらを可視化した。
【００６０】
一実施態様において、本発明の膜は、不混和性ポリマーの一つが、PU/PEO または PU/ポリテトラメチレングリコール（PTMGと表記）コポリマーである膜である。本発明による膜系は、少なくとも二つの不混和性ポリマーからなる化合物から作製され、ポリマーの少なくとも一方がPU/PEOまたはPU/PTMGコポリマーであり、かつもう一方のポリマーが酸素に対して高い透過性を有する膜系である。一実施態様において、本発明は、約7×10-12〜約7×10-10 cm3 (273.15K, 1.013×105 Pa)×cm/(cm2×s×Pa)、好ましくは約1.4×10-11 〜約3.5×10-10 cm3 (273.15K, 1.013×105Pa)×cm/(cm2×s×Pa)、より好ましくは約2.3×10-11〜約2.1×10-10 cm3 (273.15K, 1.013×105 Pa)×cm/(cm2×s×Pa)、最も好ましくは7×10-11 cm3 (273.15K, 1.013×105 Pa)×cm/(cm2×s×Pa) の範囲内の酸素に対する透過性を有する疎水性ポリマーを使用して調製される上述した生成物に関する。
【００６１】
本発明を特徴づける新規性は、特に、シロキサンが任意のコポリマーを形成せずにポリウレタンの連続相中に分散したドメインとして存在する膜にあることは、上述した記載から明らかである。グルコースおよび酸素の透過性は任意に調整され得、ポリウレタン中のシリコーンの濃度を単に変化させることによって非媒介型(non-mediated)電子化学的グルコースセンサーの線形性領域を増加させる。一実施態様において、本発明は、疎水性材料の含量が、全重量当り約1%〜約50%(重量／重量)、好ましくは約5%〜約25%、より好ましくは約8%〜約20%、最も好ましくは約18.6%である上述した生成物に関する。
【００６２】
本発明において使用されるPU/PEOまたはPU/PTMGコポリマーは、一実施態様において、ポリウレタンのファミリーに属するポリマーである。本明細書中で使用されるとき、用語「ポリウレタン」は、少なくとも二つのウレタン結合を含むポリマーを意味する。PU/PEOまたはPU/PTMGコポリマーは、商業的供給源、例えばThermedics（例えば、Tecophilicの名前で販売されている）から容易に入手可能である。一つの実施態様において、本発明は、上述したような生成物であって、親水性ポリマーが水膨潤性ポリウレタンである生成物に関する。ポリウレタンには、ヒドロゲル、例えばポリビニルアルコール、ポリ(2-ヒドロキシル-メタクリラート) (ポリHEMA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、またはポリエチルオキシド（polyethyleoxide）(PEO)が含まれうる。一実施態様において、本発明は、少なくとも一つの親水性ポリマーを含む上述した生成物に関する。
【００６３】
一実施態様において、本発明の膜は一以上の層を含む。ここで、本発明は二重層膜であって、最内層が、電流測定バイオセンサー（図１を参照）において電極に近接し、PU/PDMSまたはPUから作製され、かつ最外層が、PU-PEO、PU-PTMG、PU-PEO/PDMS、PU-PTMG/PDMS、PU/PU-PEO/PDMS、またはPU/PU-PTMG/PDMSから作製される二重層膜を含む。本発明はさらに三重層膜であって、最内層がPU、PU-PEOまたはPU-PTMGからなり、第二の層がPU-PEO/PDMS、PU-PTMG/PDMS、PU/PU-PEO/PDMS、PU/PU-PTMG/-PDMSからなり、第三の層がPU-PEOまたはPU-PTMGからなる。従って、PDMSはポリジメチルシロキサンである。
【００６４】
典型的には、ポリウレタンは、ジイソシアナートとアルコールおよび／またはアミンとを組み合わせることによって形成される。例えば、イソホロンジイソシアナートとPEG 600およびアミノプロピルポリシロキサンとを重合条件下で組み合わせることによって、ウレタン（カルバメート）結合と尿素結合の両方を有するポリウレタン／ポリ尿素組成物が提供される。芳香族および脂肪族ジイソシアナートを含む、生物適合性のポリウレタンの調製に役立つジイソシアナートは、Szycher (Seminar on advances in medical grade polyurethanes. Technomic Publishing, (1995)) において詳細に記載されている。適切な芳香族ジイソシアナートの例には、トルエンジイソシアナート、4,4’-ジフェニルメタンジイソシアナート、および3,3’-ジメチル-4,4’-ビフェニルジイソシアナートが含まれる。適切な脂肪族ジイソシアナートには、例えば1,6-ヘキサメチレンジイソシアナート(HDI)、トリメチルヘキサメチレン ジイソシアナート(TMDI)、トランス-1,4-シクロヘキサンジイソシアナート(CHDI)、1,4-シクロヘキサンビス(メチレン イソシアナート)(H6XDI)、イソホロンジイソシアナート(IPDI)、および4,4'-メチレンビス(シクロヘキシルイソシアナート)が含まれる。多数のこれらのジイソシアナートは、商業的供給源、例えばAldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis, USA) から入手可能であり、あるいは文献の手順を使用して標準的な合成方法によって容易に調製可能である。
【００６５】
ポリマーの均質な混合を容易にするために、PU/PEOまたはPU/PTMGコポリマーが溶剤中に溶解される。もう一方の不混和性ポリマーは、第一の不混和性ポリマーとともに溶解されるか、粒子として溶液中に懸濁されるか、あるいは全分散の均質な混合液を可能にするそれ自体の溶媒中に溶解される。この文脈において、溶剤は、純粋な化合物（例えばエーテル）であるかまたは化合物の混合液（例えばアルコールと水）であり、溶剤は少なくとも一つの不混和性ポリマーを溶解できることを特徴とする。
【００６６】
一定の水の取り込みを示すポリウレタンを選択することによって、ポリウレタンはその乾燥樹脂重量当り約1％〜約50％まで膨潤する。好ましくは約5〜約40％、より好ましくは約10〜約30％、最も好ましくは約20％まで膨潤する。膜の降伏応力および最大伸長は、任意の与えられた用途に合わせて設計できる。一実施態様において、本発明は、上述した膜であって、湿潤条件における最大引張強度が約0.1 MPa〜約50 MPaの範囲、好ましくは約1 MPa〜約40 MPaの範囲、より好ましくは約2 MPa〜約30 MPaの範囲、最も好ましくは約8 MPaである膜に関する。ポリマーの最大伸長は、その元の長さの約150％〜約800％、好ましくは約200％〜約700％、より好ましくは約250％〜約600％まで変化する。
【００６７】
さらに、根底にある新規性は、特に、非常に大きな分子量と粘度（膜内のシリコーンの移動を制限する）を有するシリコーンの選択にある。ポリウレタンおよびシリコーンは、最小のインビボ応答を保証する生物適合性材料である。一実施態様において、本発明は、上述した生成物であって、約5000センチストーク以上、好ましくは約10,000センチストーク以上、より好ましくは約12,000センチストーク以上の粘度を有する疎水性材料から調製される生成物に関する。
【００６８】
一実施態様において、本発明の膜は、任意の親水性ポリマーが、ポリウレタンのブロックコポリマー、例えば、ポリウレタン／ポリエチレンオキシド、ポリウレタン／ポリテトラメチレンエーテルグリコール、またはポリウレタン／ポリジメチルシロキサン(polydimethylsiloxene) の、水膨潤性ポリウレタンまたは組成物である膜である。
【００６９】
一実施態様において、本発明の膜は、ポリウレタン−ポリシロキサンのブロックコポリマーが、ポリシロキサンドメインの安定化のための相溶化剤／乳化剤として使用される膜である。
【００７０】
一実施態様において、本発明の膜は、親水性ポリマーが、好ましくは、脂肪族の、ポリエーテルに基づいたポリウレタンのファミリー由来のポリマー（Thermedics 社のTecophilic、より好ましくはThermedics 社のTecophilic HP60D-20）である膜である。
【００７１】
一実施態様において、本発明の膜は、疎水性ポリマーが、ポリジメチルシロキサン、好ましくはDow Corning のDC360 (粘度12,500 cSt, Medical grade) である膜である。
【００７２】
一実施態様において、本発明の膜は、その乾燥樹脂重量当り約1％〜約50％、好ましくは約5％〜約40％、より好ましくは約10％〜約30％、最も好ましくは約20％まで膨潤する親水性ポリマーから調製された膜である。
【００７３】
一実施態様において、本発明の膜は、少なくとも一以上の親水性ポリマーを含む膜である。
【００７４】
一実施態様において、本発明の膜は、懸濁液または溶液中のポリマーが約0.1％〜約10％、より好ましくは約0.25％〜約2％（重量／重量）の範囲内にある膜である。
【００７５】
一実施態様において、本発明の膜は、溶剤が、THF、ジメチルホルムアミド、アルコールもしくは水、または上述した溶剤の混合液である膜である。
【００７６】
一実施態様において、本発明の膜は、溶剤および／または溶剤が、酸化防止剤（例えば、ブチル化されたヒドロキシトルエン（本明細書中ではBHTとして表記））を含む膜である。
【００７７】
一実施態様において、本発明の膜は、THFの含有量が、約60％〜約100％（重量／重量）、より好ましくは約70％〜約90％の範囲にある膜である。
【００７８】
一実施態様において、本発明の膜は、ポリジメチルシロキサンのための溶剤が、好ましくはヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、またはこれらの混合物からなる群から選択される膜である。
【００７９】
一実施態様において、本発明の膜は、本明細書中で定義された十分なインビボ生体適合性の膜である。
【００８０】
一実施態様において、本発明の膜は、親水性水膨潤材料がポリウレタンである膜である。
【００８１】
一実施態様において、本発明の膜は、疎水性材料の含有量が、全重量当り約1％〜約50％（重量／重量）、好ましくは約5％〜約25％、より好ましくは約8％〜約20％、最も好ましくは約18.6％である膜である。
【００８２】
一実施態様において、本発明は、本発明の膜からなる二相以上の生体適合性の膜に関する。
【００８３】
膜被覆バイオセンサー（図１を参照）、特にグルコースと酸素との反応に作用するグルコースオキシダーゼを使用するグルコースセンサーが、当該技術分野において知られている。図１は、皮下使用のために設計された酸化還元酵素を使用する電流測定の2電極電気化学的グルコースセンサーの例を示す。該センサーは、ポリマー基板１、電極２、非干渉性膜3、酵素膜4、および外膜5で構成される。該酵素は、層として堆積され得（図１に示した通り）、あるいは非干渉性膜中に埋め込まれ得る。図２は、電流測定のグルコースセンサーの酵素層において行われる反応を示す。酵素の存在のために、分子酸素によるβ-D-グルコースの酸化が触媒され、触媒反応を介してグルコノ-σ-ラクトンおよび過酸化水素を生成する：
β-D-グルコース＋O2  →  グルコノラクトン＋H2O2。
【００８４】
グルコノラクトンはさらに水と反応し、ラクトン環を加水分解してグルコン酸を生成する。従って、酸素の一分子が消費され、過酸化水素の一分子が各グルコース分子のために生成される。電気化学的方法は、酸素または過酸化水素の変化を検出し、測定されたシグナルをグルコースの濃度と関係づける。過酸化水素(H2O2)は、以下に示す0.6Vの印加電位をもつ電極表面上で電気化学的に反応する：
H2O2  →  O2＋2e-＋2H+。
【００８５】
酸素が過剰に存在する条件下において、この反応の速度はグルコースの濃度と比例する。それゆえ、最終電流は、酵素と反応するグルコースの量と比例する。図９は、酸素減圧下（30〜60 mm Hg）でPBSバッファー(pH7.4, 150 mM NaCl)に浸漬されたグルコースセンサーからの電流を示す。センサーの外膜は、本発明に従って生成される。グルコースの追加に対する反応は直線的であり、「酸素欠乏問題」の兆候はない。さらに、図5aおよび5bは、インビボ（ブタ）で測定された連続的なセンサーの電流とこれに対応する血漿値を示す。図5aは、ポリウレタン中にシリコーンが分散されておらず、反応において約10 mMまでの線形にとどまる。一方、18.6 wt% PDMS (DC360, 12500 cSt, Dow Corning) を添加すると、少なくとも20 mMグルコースまで線形性範囲をはっきりと増強する。
【００８６】
さらなる側面において、本発明は、上述した生成物からなる外膜を有する移植可能なバイオセンサーに関する。従って、本発明はまた、センサーの作動電極が酵素の層を含む、被検物質と酸素との反応を測定するための移植可能なバイオセンサーに関する。本発明のバイオセンサーは、本発明の膜からなる外膜を有することを特徴とする。
【００８７】
基本的に、本発明は、バイオセンサーの構成に依存せず、むしろ、センサー素子を覆うための本発明の二相の生体適合性膜の使用に依存する。一実施態様において、本発明は、約1μm〜約60μm、好ましくは約5μm〜約50μm、より好ましくは約20μm〜約40μm、最も好ましくは約35μmの範囲の厚みを有する上述した膜に関する。バイオセンサーの電極上に噴霧堆積された膜の例は、図6、図7aおよび図7bに示す。環境探査電子顕微鏡写真（図６を参照）において、外膜の断面は、画像上部の暗色領域として観察される。膜は100％RHで完全に水和され、完全に膨潤することが予測される。膜は均質かつ高密度であることが解る。一実施態様において、本発明は、約0.01×10-10 m3〜約250×10-10 m3、好ましくは約0.5×10-10 m3〜約150×10-10 m3、より好ましくは約10-10 m3〜約50×10-10 m3、最も好ましくは約5×10-10 m3の体積を有する上述した膜に関する。
【００８８】
他の側面において、本発明は、センサーの作動電極が酵素の層を含む、被検物質および酸素の反応を測定するための移植可能なバイオセンサーに関する。本発明のバイオセンサーは、本発明の膜からなる外膜を有する。他の実施態様において、本発明は、被検物質がグルコースである上述した移植可能なバイオセンサーに関する。他の実施態様において、本発明は、酵素がグルコースオキシダーゼである上述した移植可能なバイオセンサーに関する。
【００８９】
一実施態様において、本発明は、十分なインビボ生体適合性を有する上述した生成物に関する。ヒトの皮下組織（胃）に3日間にわたって移植された本発明の外膜を備えた移植されたグルコースセンサーは、あらゆる有害な事象（アレルギー反応または他の免疫反応）を引き起こさなかった。さらに、一日後の一回の較正セット（感度、バックグラウンド電流、および血液と皮下血液値との間の時間の遅れ）が、2日間および3日間にわたるグルコース値の二つのセット間の対応づけを達成するために必要であった（図11を参照）。従って、3日後のシグナル減衰の不在は、膜の安定性および生体適合性を際立たせる。
【００９０】
一実施態様において、本発明は、望まれない状態において性質を変化させない、線量2×25 kGyを使用するEビーム滅菌され得る上述した生成物に関する。
【００９１】
一実施態様において、本発明は、生産後少なくとも232日間の長期間の安定性を有し、その結果、ポリシロキサンの移動が起こらないと思われることが際立つ膜に関する。
【００９２】
一実施態様において、前記生成物は、6℃〜45℃の範囲内において膜の性質を変えうる任意の相転移を示さず、所定の期間中の温度変化に対して安定である。この結果は、図10に示された本発明のフィルム膜の示差走査熱量測定によって明らかにされた。
【００９３】
他の実施態様において、本発明は、本明細書中に定義された十分に短い始動時間を有する、上述した移植可能なバイオセンサーに関する。
【００９４】
一実施態様において、本発明の移植可能なバイオセンサーは、皮下組織内に挿入されたとき、3日間にわたって安定なバイオセンサー応答を示すセンサーである。
【００９５】
一実施態様において、本発明の移植可能なバイオセンサーは、二重層膜を含むセンサーであって、前記二重層膜において、最内層が電流測定バイオセンサー（図１を参照）において電極に近接し、PU/PDMSまたはPUから作製され、かつ最外層がPU-PEO、PU-PTMG、PU-PEO/PDMS、PU-PTMG/PDMS、PU/PU-PEO/PDMS、またはPU/PU-PTMG/PDMSから作製されるセンサーである。
【００９６】
一実施態様において、本発明の移植可能なバイオセンサーは、三重層膜を含むセンサーであって、前記三重層膜において、最内層がPU、PU-PEOまたはPU-PTMGからなり、第二の層がPU-PEO/PDMS、PU-PTMG/PDMS、PU/PU-PEO/PDMS、PU/PU-PTMG/-PDMSからなり、第三の層がPU-PEOまたはPU-PTMGからなるセンサーである。
【００９７】
本発明の方法は、二つの不混和性ポリマーからなる層を基板上に置く方法、例えば、先の膜クレームのいずれか一つに従って膜を調製する方法であって、以下の工程を特徴とする方法である。
【００９８】
ａ）溶媒を使用し、一以上のポリマーを含む溶液または懸濁液を調製し、
ｂ）前記溶媒の一定量がポリマー溶液／懸濁液が基板に到達する前に蒸発するように、前記ポリマー溶液または懸濁液の一部をスプレーノズルを通して前記基板に塗布し、
ｃ）ポリマー溶液または懸濁液の残りの部分が基板に到達した後、ポリマー溶液／懸濁液中に存在する溶媒の残りの量の実質的部分を蒸発させ、
ｄ）前記溶媒の一定量がポリマー溶液／懸濁液が基板に到達する前に蒸発するように、前記ポリマー溶液または懸濁液の一部をスプレーノズルを通して前記基板に塗布し、
ｅ）ポリマー溶液または懸濁液の残りの部分が基板に到達した後、ポリマー溶液／懸濁液中に存在する溶媒の残りの量の実質的部分を蒸発させ、および
ｆ）工程ｂ）に記載された溶液または懸濁液を前記基板に塗布し、かつ工程ｂ）およびｃ）に記載されたように溶媒を蒸発させる工程を、合計で少なくとも約30工程にわたってこの順番で繰り返す。
【００９９】
本発明の方法において、コーティング材料を溶解させるために使用される溶媒は、溶媒の沸点温度以上に加熱され、過剰な量の溶媒の必要性を減少させる。
【０１００】
溶媒の量を減少させ、スプレーコーティングをより効率的に行う多数の例が文献中に存在する。本発明は、効果的プロセス、すなわち、厚いコーティングを可能にするプロセスが必要とされない点が特徴である。他方では、多数の薄いコーティングが必要とされ、コーティングの結果得られるミクロ構造に対していくつかの制御を可能にする。
【０１０１】
本発明の方法は、コーティングを塗布する方法に依存せず、むしろ塗布工程および蒸発工程からなる多数のコーティング工程の使用に依存している。一側面において、本発明の方法は、基板上に少なくとも二つの不混和性ポリマーからなる層を置く方法に関する。一実施態様において、本発明の方法は、グルコースセンサーの外膜の生産を含む。好ましい基板には、スクリーンプリンティング技術または薄相フィルム技術によって形成された電極が含まれる。前記基板は、任意的には他の膜層、例えば酵素層または他のポリマー膜で被覆される。基板はポリイミドまたはポリエステルにすることができ、電極は白金を含みうる。
【０１０２】
一以上のポリマーを含む溶液または懸濁液は、スプレーノズルを通して基板に塗布される。ポリマー溶液／懸濁液中に存在する一定量の溶媒は、ポリマー溶液／懸濁液が基板に到達する前に蒸発する。ポリマー溶液／懸濁液の残りの部分が基板に到達した後、ポリマー溶液／懸濁液中に存在する、溶媒の残りの量の実質的部分が蒸発する。その後、新たな量のポリマー溶液／懸濁液が、ポリマーの先の層で被覆された基板上に噴霧される。ある量のポリマー溶液／懸濁液が基板に達する時間から、次の量のポリマー溶液または懸濁液が基板に達する時間までの時間期間は、約50ミリ秒〜約10秒の範囲内が好ましい
この方法において、ポリマー溶液／懸濁液は、好ましくは少なくとも約30工程、好ましくは少なくとも約100工程、最も好ましくは少なくとも約500工程にわたって基板上に繰り返し塗布される。各工程で堆積される層の厚みは、好ましくは約5μｍ未満、好ましくは約１μｍ未満およびより好ましくは約100μｍ未満である。
【０１０３】
本発明の方法の一実施態様において、ポリマー溶液／懸濁液が基板に到達する前に蒸発する溶媒の量は、約80％〜約99％（体積／体積）の範囲内にある。従って、一工程で塗布されるポリマー溶液／懸濁液中に残る溶媒の量は、約19％（体積／体積）未満、好ましくは約10％未満、最も好ましくは約１％未満である。その後、さらなる量のポリマー溶液／懸濁液が次の工程において塗布される。
【０１０４】
ポリマー溶液または懸濁液の塗布に使用される本発明の方法は、粒子生成プロセス、例えば、空気供給手段を備えたノズルが使用されるスプレープロセスになり得る。この実施態様において、一以上のスプレーノズルが同時に使用され得、二以上の異なるポリマー溶液または懸濁液を同時にまたは実質的に同時に同じ基板上に噴霧させる可能性を与える。一以上のスプレーノズルはまた経時的にも使用され得る。これは、各ノズルスプレーが異なるポリマー溶液または懸濁液と対応している場合、層状構造を作る利点を与えうる。
【０１０５】
本発明の目的において、コーティングは、少なくとも一つのポリマーが可溶性である、少なくとも二つの不混和性ポリマーからなる化合物から作製される。本発明の方法の実施態様において、可溶性ポリマーは、ポリウレタンのファミリーに属する。本明細書中で使用されるとき、用語「ポリウレタン」とは、少なくとも二つのウレタン結合を含むポリマーをいう。PU/PEO（PUはポリウレタンであり、かつPEOはポリエチレンオキシドである）コポリマーは、商業的な供給源、例えばThermedics から容易に入手可能である（例えば商品名Tecophilic HP-60D-20）。ポリウレタン／ポリジメチルシロキサン コポリマーは、商業的供給源、例えばThe Polymer Technology Group から容易に入手可能である（例えば商品名PurSil）。本発明の方法の実施態様において、溶液または懸濁液中のポリマーの量は、約0.1％〜約10％（重量／重量）の範囲内、およびより好ましくは約0.25％〜約2％（重量／重量）の範囲内である。
【０１０６】
一実施態様において、本発明の方法は、可溶性ポリマーがセルローストリアセテートおよびNafionの組み合わせである方法に関する。
【０１０７】
ポリマーの一つが選択された溶媒中において可溶性ではない場合、このポリマーは、溶液中において懸濁されなければならない。溶解されたポリマーにおける活性粒子の懸濁液は特別なものではなく(例えば、米国特許第6,355,058号を参照)、本発明の方法において使用される粒子は、好ましくはそのサイズが最終コーティングの厚みの約1/10より小さくなければならない（すなわち、好ましくは約5μm未満、およびさらにより好ましくは約1μm未満）点において特別である。粒子の中で、シロキサンおよびフルオロポリマーは、これらの材料中において高い酸素透過性があるので好ましい。本発明の方法の一実施態様において、例えば、Dow Corning から入手可能な商品名DC360(Medical grade)のポリジメチルシロキサンは、少なくとも600cStの粘度、より好ましくは少なくとも約12,500cSt の粘度が使用される。
【０１０８】
ポリマーを溶媒和するために、一以上の溶媒が使用され得る。いくつかの有機溶媒は、例えばテトラヒドロフラン、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、ジメチルホルムアミド、へキサン、およびヘプタン単独またはその組み合わせで使用され得る。さらに、水は、一以上の有機溶媒と組み合わせて使用され得る。本発明の方法の一実施態様において、溶媒は、テトラヒドロフラン、ヘキサメチルジシロキサンおよび水を、60〜100%のテトラヒドロフラン、0〜25%のヘキサメチルジシロキサンおよび0〜10%の水、好ましくは、70〜90%のテトラヒドロフラン、10〜20%のヘキサメチルジシロキサンおよび0〜10%の水の割合（重量／重量）で混合した溶媒である。
【０１０９】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリマーの一つがポリウレタンまたはポリウレタンのコポリマーの組成物、例えば、ポリウレタン／ポリエチレンオキシドまたはポリウレタン／ポリジメチルシロキサンである方法である。
【０１１０】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリマーの一つが、Thermedics社製のTecophilic HP-60D-20である方法である。
【０１１１】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリマーの一つが、The Polymer Technology Group社製のPursilである方法である。
【０１１２】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリマーの一つが、セルローストリアセテートまたはセルローストリアセテートおよびNafionの組成物である方法である。
【０１１３】
一実施態様において、本発明の方法は、もう一つのポリマーが、ポリジメチルシロキサン、フルオロポリマー（flouropolymer）、およびシロキサンからなる群から選択される方法である。
【０１１４】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリジメチルシロキサンが少なくとも約600cStの粘度、より好ましくは少なくとも約12,500cSt の粘度を有する方法である。
【０１１５】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリジメチルシロキサンがDow Corning社製のDC360(12,500cSt, Medical grade)である方法である。
【０１１６】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリマーのうちの一つが、約90％以上、好ましくは約95％以上、より好ましくは約99％以上が溶媒中に溶解する方法である。
【０１１７】
一実施態様において、本発明の方法は、最終層が3または4つの異なるポリマーからなる方法である。
【０１１８】
一実施態様において、本発明の方法は、一以上の工程b）、d）等において、3つの異なるポリマーを含む溶液または懸濁液が使用される方法である。
【０１１９】
一実施態様において、本発明の方法は、工程a）による溶液または懸濁液中のポリマーの量が約0.1％〜約10％、より好ましくは約0.25％〜約2％（重量／重量）の範囲内にある方法である。
【０１２０】
一実施態様において、本発明の方法は、基板が、他の膜層、例えば酵素層または他のポリマー膜で任意的にコートされた電極を含む方法である。
【０１２１】
一実施態様において、本発明の方法は、膜が、スクリーンプリンティング技術または薄相フィルム技術によって形成された電極に塗布される方法である。
【０１２２】
一実施態様において、本発明の方法は、電極が白金を含む方法である。
【０１２３】
一実施態様において、本発明の方法は、溶媒が、テトラヒドロフラン、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、ジメチルホルムアミド、へキサン、ヘプタン、および二以上のこれらの溶媒の混合物からなる群から選択される方法である。
【０１２４】
一実施態様において、本発明の方法は、溶媒が水および2以上の有機溶媒の混合物からなる方法である。
【０１２５】
一実施態様において、本発明の方法は、使用される溶媒がテトラヒドロフラン、ヘキサメチルジシロキサンおよび水の混合物である方法である。
【０１２６】
一実施態様において、本発明の方法は、テトラヒドロフランの含有量が、約60%〜約100%(重量／重量)の範囲、好ましくは約70%〜約90%(重量／重量)の範囲内にある方法である。
【０１２７】
一実施態様において、本発明の方法は、ヘキサメチルジシロキサンの含有量が、約0%〜約25%(重量／重量)の範囲、好ましくは約10%〜約20%(重量／重量)の範囲内にある方法である。
【０１２８】
一実施態様において、本発明の方法は、溶媒中の水の含有量が、約約0%〜約10%(重量／重量)の範囲内にある方法である。
【０１２９】
一実施態様において、本発明の方法は、工程b)、d)等によるポリマー溶液または懸濁液の塗布が、粒子生成プロセスによって行われる方法である。
【０１３０】
一実施態様において、本発明の方法は、工程b)、d)等による溶液または懸濁液の塗布が、給気手段を備えたノズルを使用する噴霧プロセスによって行われる方法である。
【０１３１】
一実施態様において、本発明の方法は、溶媒の約80%〜約99%(体積／体積)の範囲内の量が、ポリマー溶液／懸濁液が基板に到達する前に蒸発する (すなわち、工程 b)、d) 等において蒸発する) 方法である。
【０１３２】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリマー溶液または懸濁液中に存在する溶媒の残りの量の実質的な部分を蒸発させる開始工程から、ポリマー溶液または懸濁液中に存在する溶媒の残りの量の実質的な部分を蒸発させる上述の工程（例えば、工程b）の開始から工程d)の開始まで）までの時間期間が、約50ミリ秒〜約10秒の範囲内にある方法である。
【０１３３】
一実施態様において、本発明の方法は、工程b)、c)、d)、e)等の総数が少なくとも約30、好ましくは少なくとも約100、より好ましくは少なくとも約500である。
【０１３４】
一実施態様において、本発明の方法は、工程b）、d)等において塗布されるポリマー溶液または懸濁液が同一または実質的に同一の組成物を有する方法である。
【０１３５】
一実施態様において、本発明の方法は、工程b）、d）等において塗布されるポリマー溶液または懸濁液が同一または実質的に同一の組成物を有しない方法である。
【０１３６】
一実施態様において、本発明の方法は、塗布された最初の層が一つのポリマーのプライマーであり、次の層が他のポリマー溶液から作製される方法である。
【０１３７】
一実施態様において、本発明の方法は、一以上のスプレーノズルが、同一または異なるポリマー溶液で、同時にまたは経時的に使用される方法である。
【０１３８】
一実施態様において、本発明の方法は、最終工程で塗布されたポリマー溶液または懸濁液中の溶媒の濃度が、約19％（体積／体積）未満、好ましくは約10％未満、より好ましくは約1％未満であり、その後、工程a) に記載された調製されたポリマー溶液または懸濁液のさらなる量が次の工程において塗布される方法である。
【０１３９】
一実施態様において、本発明の方法は、層が一相のポリマーからなり、ポリマーの第二相が分散している方法である。
【０１４０】
一実施態様において、本発明の方法は、分散したポリマーが、約5μｍ未満、好ましくは約１μｍ未満のドメインサイズを有する方法である。
【０１４１】
一実施態様において、本発明の方法は、堆積した層の厚みが、約5μm未満、好ましくは約１μｍ未満、より好ましくは約100nm未満である方法である。
【０１４２】
一実施態様において、本発明の方法は、懸濁液または溶液中のポリマーの量が、約0.1％〜約10％、好ましくは約0.25％〜約2％（重量／重量）の範囲内にある方法である。
【０１４３】
一実施態様において、本発明の方法は、使用される溶媒が、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アルコール、もしくは水、または上述した溶媒の混合液のいずれかである方法である。
【０１４４】
一実施態様において、本発明の方法は、溶媒および／または使用された溶媒が、酸化防止剤、例えばブチル化ヒドロキシトルエンを含む方法である。
【０１４５】
一実施態様において、本発明の方法は、使用された溶液中のテトラヒドロフランの含量が、約60％〜約100％（体積／体積）、より好ましくは約70〜約90％の範囲内にある方法である。
【０１４６】
一実施態様において、本発明の方法は、ポリジメチルシロキサン用の溶媒が、好ましくはヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、およびこれらの混合物からなる群から選択される方法である。
【０１４７】
本発明は、溶液中のグルコース濃度の決定において第一に言及してきたが、本発明の膜がこの材料の使用に限定されず、他の化合物の濃度決定について使用され得ることが理解される。
【０１４８】
上述の一般的記載および下記の詳細な記載は、本発明の例証的かつ説明的な記載であり、本発明を限定するものではないことが当業者によって理解されるであろう。従って、本発明の主要な利点を犠牲にしない付随するクレームの範囲および精神の範囲内で様々なバリエーションが作製されうる。
【０１４９】
参照文献の本明細書中の言及は、それが先行技術を構成することを何ら承認しない。
【０１５０】
本明細書中の「comprise」なる用語は、「include」、「contain」または「comprehend」を意味するものとして広く解釈されるべきである (vide, for example, Guidelines for Examination in the European Patent Office, 2000, part C, chapter III, 4.13)。
【０１５１】
本明細書中で参照した全ての文献は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１５２】
以下の例は、例証のために提供され、本発明の範囲を制限するものではない。
【例】
【０１５３】
例１
この例は、ポリマー溶液の混合液を基板上に噴霧し膜を得る、グルコースを検出するバイオセンサーにおける使用を目的とした本発明の膜を製造する方法を図示する。
【０１５４】
乾燥樹脂重量と比較して20％膨潤する商業的に利用可能なポリウレタンを、9.5THF:0.5H2O中に溶解させる。これに対し、ヘキサメチルジシロキサン中に溶解された18.65重量％（ポリマーの全乾燥重量当り）のポリジメチルシロキサンを、前記ポリウレタン溶液中に分散させ、本発明の膜を得た。
【０１５５】
40ml ミリＱ水を760mlテトラヒドロフランに加え、724gの総質量を得る。その後、55℃で少なくとも3時間にわたってオーブン中で乾燥された3.64gのポリウレタン（Thermedics から購入したtecophilic HP-60D-20）を溶媒に加える。9.5THF中の0.5％ tecophilic HP-60D-20：0.5H2O溶液を、少なくとも60時間にわたって攪拌する。
【０１５６】
4.5g ポリジメチルシロキサン（Dow Corning から購入されたDC360, 12500cSt) を、900ml ヘキサメチルジシロキサン（Dow Corning から購入されたOS10）に加え、ヘキサメチルジシロキサン中において0.65重量％のポリジメチルシロキサンを得る。
【０１５７】
128.41gの、ヘキサメチルジシロキサン中において0.65重量％のポリジメチルシロキサンを、9.5THF中の800mlの0.5重量％のtecophilic：0.5H2O溶液に加え、該溶液をシロキサンの完全な溶媒和になるまで攪拌を続ける（約30分間）。シロキサンとポリマーの総量との関係が、その後に計算されて18.65%になる。
【０１５８】
該溶液は、0.3mmノズルを使用して2バールの圧力を示す空気流によって運ばれる1.8E-4 m3/hの材料の流れで噴霧される。噴霧中、被覆される対象が33RPMで回転する回転台上に載せられ、連続した被覆の間に約1.8秒間の蒸発時間が与えられる。
【０１５９】
膜は約70分間にわたって噴霧され、約30μmの膜の全厚に達する。2310層が塗布される。生成物のATR-FTIR（減衰全反射フーリエ変換赤外分光）スペクトル（図８を参照）は、ポリウレタンおよびポリジメチルシロキサンから予想されたバンドを示す。
【０１６０】
例２
この例は、本発明によって構成された膜被覆されたバイオセンサーの評価を例証する。
【０１６１】
外膜が例１に記載された組成物で約35μmの厚みの膜でスプレーコートされた、二つの電極系（電流測定の酸化還元酵素に基づいたバイオセンサーの定義を参照）。  該センサーは、減少した酸素分圧下（30-60mm Hg）で標準的なPBSバッファー（pH 7.4, 150ｍM NaCl）に浸漬され、1.1ボルトの初期パルスが360秒間にわたって印加される。センサーは、残りの測定の間0.6Vに保たれる。さらに60〜70分間経過後、センサーは、一定のバックグラウンドに達した。グルコースを、1、2.00、2.99、4.98、6.95、9.90、14.8、19.6、24.4、29.1、33.8、および38.5 mMの濃度で溶液に添加し、反応の線形性を測定する。各濃度でのグルコースの添加後、溶液を10分間にわたって平衡状態で放置する。溶液は連続的に攪拌される（Magnetic stirrer, IKA (登録商標) color squid magnetic stirrer, stirring speed setting: 10 o’clock)。典型的なセンサー応答が、図９によって示されたグラフに示される。センサー応答は、1〜40mMの間で線形性を示す。この結果は、センサー応答が酸素濃度に限定されないことをはっきりと示す。ポリウレタンにポリシロキサンを添加しない膜は、より低濃度でのシグナルの飽和を示す。
【０１６２】
例３
この例は、いかにしてポリウレタンおよびシリコーンからなる膜が浸漬コーティングによって電極に塗布され得るかについて例証する。
【０１６３】
膜溶液中に浸漬する前に、電極を表面増強剤中に浸漬し、最終製品の膜の均一性を最適化する。エタノール中に溶解された15wt％のTriton X-100 (Sigma-Aldrich) は、表面増強剤として使用される。膜溶液は、テトラヒドロフラン中に溶解された4.45wt％のTecoflex EG-80A (Thermedics Inc.) および 0.85wt％ポリジメチルシロキサン（DC360、12500cSt, Dow Corning）からなる。膜は、一回の垂直方向の浸漬によって塗布され、10μmの厚みを有する膜を得る。
【０１６４】
例４
この例は、いかにして二種類のポリウレタンおよび一種類のシリコーンを含む膜が構成され得るのかについて例証する。
【０１６５】
1.82gのTecoflex EG-80Aおよび1.82gのTecophilic HP-60D-20 (両方ともThermedics Inc. から購入されたポリウレタン) を800mlの9.75THF:0.25H2O中に溶解する。この溶液は、少なくとも60時間にわたって攪拌する。その後、128.41gのポリジメチルシロキサン溶液（例１に記載されたように調製）を前記溶液に加え、ポリマーの総乾燥重量当り18.65％のシロキサンを得る。作動電極が約4μmの厚みを有するグルコースオキシダーゼの層でプレコートされた二つの電極系は、この例において記載された溶液でスプレーコートされ、約20μmの厚みを有する本発明の膜に達する。
【０１６６】
例５
この例は、いかにしてポリジメチルシロキサンを各々含む二種類のポリウレタンの二層を含む膜が構成され得るのかを例証する。
【０１６７】
3.64gのTecoflex EG-80Aを800ml THF中に溶解し、これに、例１において調製された128.41gのポリジメチルシロキサンの溶液を加える。作動電極がグルコースオキシダーゼの層でコートされた二つの電極系は、上記に記載された溶液でスプレーコートされ、Tecoflex層が1〜5μmの厚みを有する膜層に達する。その後、続けて例１に記載された溶液がこの膜の頂部に1〜25μmの厚みで噴霧され、0.4 nA/mM/mm2 を超える感度を達成する。
【０１６８】
例６
この例は、いかにして本発明の薄層ポリマーフィルムの張力試験を行うかについて例示する。
【０１６９】
この目的のために、本発明の外膜に相当しうる厚み（30μm）をもつ商業的なポリマーInspire（商標）2301 (www.inspirecomponents.com) を使用し、該方法を実証して参照のポイントとした。ポリマーの薄層フィルムを、約10×20mm2の大きさの小片に切断し、±1μmの正確性を有する高精度のマイクロメーター測定機器を使用して厚みを測定した。先の実験が、使用されたポリウレタン−シリコーンフィルムについて最終的な張力強度に達するのに必要な力が1〜10ニュートンの範囲内にあることを示したので、張力試験は、Lloyds機器張力装置LR5K上で測定のための20ニュートンの測定ヘッドを使用して行われた。応力を、フィルムが破断するまで30mm／分の伸長度でポリマーフィルムに印加した。応力をσ、サンプル上での力の割合をＰ、初期断面領域をＡ0として定義すると、σ＝Ｐ／Ａ0となる。歪みをε、サンプルの長さの変化の割合をΔＩ、その初期の長さをＩ0として定義すると、ε＝ΔＩ／Ｉ0となる。
【０１７０】
図１２は、商業的なポリウレタンInspire(商標)2301について得られた応力−歪みの曲線を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図1は、皮下内または静脈内使用のために設計された酸化還元酵素を使用する電流測定のグルコースセンサーを図示する。
【図２】図２は、外膜下の、センサーの酵素含有層中で行われる反応を図示する。
【図３】図３は、米国特許第4,484,987号の図2によって記載された膜を図示する。
【図４】図４は、本発明による膜の拡大図を示す。
【図５】図５aおよび5bは、純粋なポリウレタン膜 (Thermedics HP60D-20)と、該ポリウレタン膜中に18.6wt %のポリジメチルシロキサン(DC360) が分散した膜についてのインビボ（ブタ）でのセンサーシグナルを示す。ポリジメチルシロキサンの添加は、センサー応答を、わずか10 mM（図5a）から約20 mM（図5b）まではっきりと増強する。
【図６】図６は、グルコースセンサー上の外膜(完全に水和されたThermedics HP60D-20中18.6 wt % DC360)のESEM画像を示す。
【図７ａ】図７aは、平坦基板（この図では見えない）上に噴霧溶着された本発明の膜の断面（外膜表面に対して垂直な）の走査電子顕微鏡画像である。白色の封入物（ドメイン）は、親水性ポリウレタンの連続的マトリックス中における疎水性シリコーンドメイン (PDMS 12500 cSt) を表わす。
【図７ｂ】図７bは、シリコーンドメインが暗色に色づけされた図７aの膜の拡大図である。
【図８】図８：膜（Thermedics HP60D-20中18.6 wt % DC360)：最終加工された膜中に同定されたシリコーンおよびポリウレタンのATR-FTIR測定値。
【図９】図９は、本発明の外膜を有する、PBSバッファー中のグルコースに対する電流測定のバイオセンサーの電流応答を示す。
【図１０】図１０は、本発明の膜のDSC測定値を示す。
【図１１】図１１は、分散した血中グルコースの測定値（Hemocue）についての、本発明において記載された外膜を備えた皮下に移植された電流測定のグルコースセンサーの応答と、挿入2日後および3日後の例１において例証された応答との比較を示す。一回の較正が挿入24時間後に行われた。
【図１２】図１２は、薄層ポリマーフィルムの張力試験の例を示す。
【図１３】図１３は、米国特許第4,484,987号に提示された手順に従って調製されたポリウレタンおよびポリジメチルシロキサン（以後、PDMSと表記）から剥離された膜を図示する。大きな空隙が膜と基板との境界面に存在することに留意されたい。これらの空隙は溶剤の蒸発中に脆弱なPDMS相の粘着力の喪失が原因で形成されるものと考えられる。
【図１４】図１４は、ポリウレタンおよびPDMSから作製された図３において図示されたものと類似の膜の表面である。多数の可視的な空隙および間隙の存在に留意されたい。これらは、溶剤の蒸発中に脆弱なPDMS相の粘着力の喪失が原因で形成されるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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