(57)【要約】  本出願で開示の対象は、酸化窒素を送達するための酸化窒素放出粒子、及びその医生物学的及び薬学的応用におけるこれらの使用に関する。  【選択図】    図１
2008545714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）酸化窒素供与体、
（ｂ）一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（ｉ）金属クラスター、
（ｉｉ）樹木状ネットワーク、
（ｉｉｉ）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（ｉｖ）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域、及び
（ｃ）外部領域、
からなる酸化窒素放出粒子。
【請求項２】
前記内部領域が、更に、
（ａ）ｐＨ変化に応答する脆弱性リンカー、
（ｂ）電磁放射に敏感な脆弱性リンカー、 
（ｃ）酵素作用による分解を受けやすい脆弱性リンカー、
（ｄ）疎水性リンカー、
（ｅ）両親媒性リンカー、及び
（ｆ）これらの組合せ、
から成る群から選択される有機リンカーを含む請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項３】
前記酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオレイン酸塩、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ニトロソチオール、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシウレア、及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の酸化窒素放出ナノ粒子。
【請求項４】
前記酸化窒素供与体が、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つに共有結合で結合する請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項５】
前記酸化窒素供与体が、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つに封じ込められる請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項６】
前記酸化窒素供与体が、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つと、ファンデルワールス相互作用、静電気的相互作用、水素結合、及びこれらの組合せからなる群から選択される非共有結合的相互作用により結合する請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項７】
前記外部領域が、
（ａ）酸化窒素放出動特性を修飾する部分、
（ｂ）粒子の生体許容性に影響する部分、
（ｃ）粒子の生体内分布に影響する部分、
（ｄ）粒子の標的への運搬に寄与する部分、
（ｅ）粒子の画像又は追跡に寄与する部分、
（ｆ）粒子の溶解性に影響する部分、
（ｇ）治療薬剤、及び
（ｈ）これらの組合せ、
からなる群から選択される１又は２以上の化学部分を含む請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項８】
前記コアが、金属クラスターであり、この金属クラスターが、金、白金、銀、磁性体、量子ドット、及びこれらの組合せから選択される成分構成材料を含む請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項９】
前記金属クラスターが、単層で保護した金クラスターである請求項８に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１０】
前記コアが、樹木状ネットワークであり、この樹木状ネットワークが、
（ａ）ポリプロピレニミンデンドリマー、
（ｂ）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、
（ｃ）ポリアリールエーテルデンドリマー、
（ｄ）ポリペプチドデンドリマー、
（ｅ）ポリエステルデンドリマー、
（ｆ）ポリアミドデンドリマー、
（ｇ）樹木状ポリグリセロール、及び
（ｈ）トリアジンデンドリマー、
からなる群から選択される請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１１】
前記樹木状ネットワークが、超分枝状である請求項１０に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１２】
前記コアが、共凝縮したシリカネットワークからなり、この共凝縮したシリカネットワークが、アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランからなるシラン混合物の凝縮により合成されたものである請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１３】
前記アルコキシシランが、化学式Ｓｉ（ＯＲ）４（式中、Ｒはアルキル基を表す。）で表されるテトラアルコキシシランから成り、
前記アミノアルコキシシランが、
（ａ）化学式 Ｒ’’−（ＮＨ−Ｒ’）ｎ−Ｓｉ（ＯＲ）３（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基、分枝アルキレン基、又はアラルキレン基、ｎは１又は２、Ｒ’’はアルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びアルキルアミンから成る群から選択される。）で表されるアミノアルコキシシラン、
（ｂ）化学式 ＮＨ［Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３］２（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基を表す。）で表されるアミノアルコキシシラン、
（ｃ）化学式 Ｒ’’−Ｎ（ＮＯＮＯ−Ｘ＋）−Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基又はアラルキレン基、Ｒ’’はアルキル基又はアルキルアミン基を表し、Ｘ＋はＮａ＋及びＫ＋からなる群から選択されるカチオンを表す。）で表される、アミン基がジアゼニウムジオレイン酸塩で置換されたアミノアルコキシシラン、及び
（ｄ）これらの組合せ、
から成る群から選択される請求項１２に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１４】
前記シラン混合物が、１０モル％〜９９モル％の前記テトラアルコキシシラン、及び１モル％〜９０モル％の前記アミノアルコキシシランから成る請求項１３に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１５】
前記シラン混合物が、更に０モル％〜２０モル％のフッ素化シラン、０モル％〜２０モル％のカチオン性又はアニオン性シラン、及び０モル％〜２０モル％のアルキルシランを含む請求項１４に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１６】
前記テトラアルコキシシランが、テトラメチルオルソケイ酸塩及びテトラエチルオルソケイ酸塩からなる群から選択される請求項１３に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１７】
前記アミノアルコキシシランが、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、［３−（メチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、Ｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−エチルアミノイソブチルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−シクロヘキシルアミノプロピルトリメトキシシラン、ビス［３−（トリメトキシシリル）プロピル］アミン、及びビス［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミンからなる群から選択される請求項１３に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１８】
前記フッ素化シランが、（ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリエトキシシラン、（３，３，３−トリフルオロプロピル）トリメトキシシラン及び（ペルフルオロアルキル）エチルトリエトキシシランからなる群から選択される請求項１５に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項１９】
前記カチオン性又はアニオン性シランが、Ｎ−Ｎ−ジデシル−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−トリメトキシシリル）アンモニウムクロライド、オクタデシルジメチル−（３−トリメトキシシリルプロピル）アンモニウムクロライド、３−トリヒドロキシシリルプロピルメチルホスホン酸ナトリウム塩及びカルボキシルエチルシラントリオールナトリウム塩からなる群から選択される請求項１５に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２０】
前記アルキルシランが、メチルトリメトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、ブチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン及びオクタデシルトリメトキシシランからなる群から選択される請求項１５に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２１】
前記コアが、共凝縮シリカネットワークからなり、この共凝縮シリカネットワークが、アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランからなるシラン混合物の凝縮により合成され、
前記ＮＯ供与体が、
（ａ）前記酸化窒素供与体が、シラン混合物の共凝縮の後で形成されるポストチャージ法、及び
（ｂ）前記酸化窒素供与体が、シラン混合物の共凝縮の前に前記アミノアルコキシシランから形成されるプレチャージ法、
から選択される方法で形成される請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２２】
前記リンカーが、前記酸化窒素放出粒子に酸化窒素放出のオン／オフ状態を与えることができる官能基を含み、該官能基が、エステル、ヒドラゾン、アセタール、チオプロピオネート、光脆弱性部分、及び酵素分解されるアミノ酸配列からなる群から選択される請求項２に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２３】
前記外部領域が、酸化窒素放出粒子を標的に運搬することができる部分を含む請求項７に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２４】
前記標的が、細胞、組織及び器官からなる群から選択される請求項２３に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２５】
前記細胞が、癌細胞である請求項２４に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２６】
前記酸化窒素放出粒子を標的に運搬することができる部分が、抗体／抗原相互作用の原因となるタンパク質、葉酸、グアニジン、トランスフェリン、ホルモン、炭化水素、アミノ酸配列ＲＧＤを含むペプチド及びＴＡＴペプチドからなる群から選択される請求項２３に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２７】
前記外部領域が、酸化窒素供与体、（ポリ）エチレンオキシド、（ポリ）ウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコ高分子、ラクチド／グリコリドコ高分子（例えば、ＰＬＧＡ）、砂糖、蛍光部分、有機染料、ＭＲＩコントラスト試薬、チオール、メチル基末端のアルキル鎖、抗菌剤、抗腫瘍治療薬、スルホン酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、カチオン性アミン基、第４級アミン基、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される部分を含む請求項７に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２８】
前記粒子の直径が、１ｎｍ〜１０００ｎｍである請求項１に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項２９】
前記粒子の直径が、１ｎｍ〜５ｎｍである請求項９に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項３０】
前記粒子の直径が、２ｎｍ〜１０μｍである請求項１２に記載の酸化窒素放出粒子。
【請求項３１】
患者に酸化窒素を運搬する方法であって、
（ａ）以下から成る酸化窒素放出粒子を提供する段階、及び
（ｉ）酸化窒素供与体、
（ｉｉ）一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（１）金属クラスター、
（２）樹木状ネットワーク、
（３）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（４）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域、及び
（ｉｉｉ）外部領域、
（ｂ）有効量の酸化窒素放出粒子を患者に投与する段階からなる方法。
【請求項３２】
前記内部領域が、更に、
（ａ）ｐＨ変化に応答する脆弱性リンカー、
（ｂ）電磁放射に敏感な脆弱性リンカー、 
（ｃ）酵素作用による分解を受けやすい脆弱性リンカー、
（ｄ）疎水性リンカー、
（ｅ）両親媒性リンカー、及び
（ｆ）これらの組合せ、
から成る群から選択される有機リンカーを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオレイン酸塩、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ニトロソチオール、ヒドロキシルアミン、及びヒドロキシウレアからなる群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記酸化窒素供与体が、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つに共有結合で結合する請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記酸化窒素供与体が、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つに封じ込められる請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記酸化窒素供与体が、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つと、ファンデルワールス相互作用、静電気的相互作用、水素結合、及びこれらの組合せからなる群から選択される非共有結合的相互作用により結合する請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記外部領域が、
（ａ）酸化窒素放出動特性を修飾する成分、
（ｂ）粒子の生体許容性に影響する成分、
（ｃ）粒子の生体内分布に影響する成分、
（ｄ）粒子の標的への運搬に寄与する成分、
（ｅ）粒子の画像又は追跡に寄与する成分、
（ｆ）粒子の溶解性に影響する成分、
（ｇ）治療薬剤、及び
（ｈ）これらの組合せ、
からなる群から選択される１又は２以上の化学成分を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記コアが、金属クラスターであり、この金属クラスターが、金、白金、銀、磁性体、量子ドット、及びこれらの組合せから選択される成分構成材料を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記金属クラスターが、単層で保護した金クラスターである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記コアが、樹木状ネットワークであり、この樹木状ネットワークが、
（ａ）ポリプロピレニミンデンドリマー、
（ｂ）ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、
（ｃ）ポリアリールエーテルデンドリマー、
（ｄ）ポリペプチドデンドリマー、
（ｅ）ポリエステルデンドリマー、
（ｆ）ポリアミドデンドリマー、
（ｇ）樹木状ポリグリセロール、及び
（ｈ）トリアジンデンドリマー、
からなる群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記樹木状ネットワークが、超分枝状である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記コアが、共凝縮したシリカネットワークからなり、この共凝縮したシリカネットワークが、アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランからなるシラン混合物の凝縮により合成されたものである請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アルコキシシランが、化学式Ｓｉ（ＯＲ）４（式中、Ｒはアルキル基を表す。）で表されるテトラアルコキシシランから成り、
前記アミノアルコキシシランが、
（ａ）化学式 Ｒ’’−（ＮＨ−Ｒ’）ｎ−Ｓｉ（ＯＲ）３（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基、分枝アルキレン基、又はアラルキレン基、ｎは１又は２、Ｒ’’はアルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びアルキルアミンから成る群から選択される。）で表されるアミノアルコキシシラン、
（ｂ）化学式 ＮＨ［Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３］２（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基を表す。）で表されるアミノアルコキシシラン、
（ｃ）化学式 Ｒ’’−Ｎ（ＮＯＮＯ−Ｘ＋）−Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基又はアラルキレン基、Ｒ’’はアルキル基又はアルキルアミン基を表し、Ｘ＋はＮａ＋及びＫ＋からなる群から選択されるカチオンを表す。）で表される、アミン基がジアゼニウムジオレイン酸塩で置換されたアミノアルコキシシラン、及び
（ｄ）これらの組合せ、
から成る群から選択される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記シラン混合物が、１０モル％〜９９モル％の前記テトラアルコキシシラン、及び１モル％〜９０モル％の前記アミノアルコキシシランから成る請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記シラン混合物が、更に０モル％〜２０モル％のフッ素化シラン、０モル％〜２０モル％のカチオン性又はアニオン性シラン、及び０モル％〜２０モル％のアルキルシランを含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記テトラアルコキシシランが、テトラメチルオルソケイ酸塩及びテトラエチルオルソケイ酸塩からなる群から選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記アミノアルコキシシランが、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、［３−（メチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、Ｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−エチルアミノイソブチルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−シクロヘキシルアミノプロピルトリメトキシシラン、ビス［３−（トリメトキシシリル）プロピル］アミン、及びビス［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミンからなる群から選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記フッ素化シランが、（ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリエトキシシラン、（３，３，３−トリフルオロプロピル）トリメトキシシラン及び（ペルフルオロアルキル）エチルトリエトキシシランからなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記カチオン性又はアニオン性シランが、Ｎ−Ｎ−ジデシル−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−トリメトキシシリル）アンモニウムクロライド、オクタデシルジメチル−（３−トリメトキシシリルプロピル）アンモニウムクロライド、３−トリヒドロキシシリルプロピルメチルホスホン酸ナトリウム塩及びカルボキシルエチルシラントリオールナトリウム塩からなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記アルキルシランが、メチルトリメトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、ブチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン及びオクタデシルトリメトキシシランからなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記コアが、共凝縮シリカネットワークからなり、この共凝縮シリカネットワークが、アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランからなるシラン混合物の凝縮により合成され、
前記ＮＯ供与体が、
（ａ）前記酸化窒素供与体が、シラン混合物の共凝縮の後で形成されるポストチャージ法、及び
（ｂ）前記酸化窒素供与体が、シラン混合物の共凝縮の前に前記アミノアルコキシシランから形成されるプレチャージ法、
から選択される方法で形成される請求項３１に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンカーが、前記酸化窒素放出粒子に酸化窒素放出のオン／オフ状態を与えることができる官能基を含み、該官能基が、エステル、ヒドラゾン、アセタール、チオプロピオネート、光脆弱性部分、及び酵素分解されるアミノ酸配列からなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項５３】
前記外部領域が、酸化窒素放出粒子を標的に運搬することができる部分を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的が、細胞、組織及び器官からなる群から選択される請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が、癌細胞である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記酸化窒素放出粒子を標的に運搬することができる部分が、抗体／抗原相互作用の原因となるタンパク質、葉酸、グアニジン、トランスフェリン、ホルモン、炭化水素、アミノ酸配列ＲＧＤを含むペプチド及びＴＡＴペプチドからなる群から選択される請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記外部領域が、酸化窒素供与体、（ポリ）エチレンオキシド、（ポリ）ウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコ高分子、ラクチド／グリコリドコ高分子（例えば、ＰＬＧＡ）、砂糖、蛍光部分、有機染料、ＭＲＩコントラスト試薬、チオール、メチル基末端のアルキル鎖、抗菌剤、抗腫瘍治療薬、スルホン酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、カチオン性アミン基、第４級アミン基、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される部分を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項５８】
前記コアが磁鉄鉱からなり、前記方法が標的に磁鉄鉱コアの磁性特性を介して酸化窒素放出粒子を導く段階を含み、前記標的が、細胞、組織及び器官からなる群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項５９】
治療が必要な患者の疾患状態を治療する方法であって、
（ａ）以下から成る酸化窒素放出粒子を提供する段階、及び
（ｉ）酸化窒素供与体、
（ｉｉ）一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（１）金属クラスター、
（２）樹木状ネットワーク、
（３）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（４）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域、及び
（ｉｉｉ）外部領域、
（ｂ）有効量の酸化窒素放出粒子を患者に投与する段階からなる方法。
【請求項６０】
前記疾患状態が、癌、心臓血管疾患、微生物感染、血液を医学的デバイスに曝すことにより引き起こされる血小板凝集と血小板接着、細胞異常増殖に起因する病理学的状態、移植拒絶、自己免疫疾患、炎症、血管疾患、瘢痕組織、創傷の収縮、再発狭窄症、痛み、発熱、胃腸疾患、呼吸器疾患、性機能障害、及び性感染症からなる群から選択される請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記酸化窒素放出粒子が、更に、患者の標的に向けて粒子を運搬することができる標的部分を含み、該標的が細胞、組織又は器官からなる請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
（ａ）以下からなる酸化窒素放出粒子、及び
（ｉ）酸化窒素供与体、
（ｉｉ）一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（１）金属クラスター、
（２）樹木状ネットワーク、
（３）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（４）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域、及び
（ｉｉｉ）外部領域、
（ｂ）医薬的に許容された担体、
からなる医薬配合物。
【請求項６３】
前記配合物が、経口配合物、静脈内配合物及び局所的配合物からなる群から選択される請求項６２に記載の配合物。
【請求項６４】
有機高分子及び該酸化窒素放出粒子からなる酸化窒素放出高分子フィルムであって、該酸化窒素放出粒子が、
（ａ）酸化窒素供与体、
（ｂ）一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（ｉ）金属クラスター、
（ｉｉ）樹木状ネットワーク、
（ｉｉｉ）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（ｉｖ）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域、及び
（ｃ）外部領域、
からなる酸化窒素放出高分子フィルム。
【請求項６５】
前記有機高分子がポリウレタンである請求項６４に記載の酸化窒素放出高分子フィルム。
【請求項６６】
酸化窒素放出フィルムからなる医用デバイスであって、該酸化窒素放出高分子フィルムが有機高分子及び該酸化窒素放出粒子からなり、該酸化窒素放出粒子が、
（ａ）酸化窒素供与体、
（ｂ）一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（ｉ）金属クラスター、
（ｉｉ）樹木状ネットワーク、
（ｉｉｉ）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（ｉｖ）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域、及び
（ｃ）外部領域、
からなる医用デバイス。
【請求項６７】
前記医用デバイスの１又は２以上の表面が前記酸化窒素放出フィルムで被覆された請求項６６に記載の医用デバイス。
【請求項６８】
動脈ステント、ガイドワイア、カテーテル、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護板、股関節又は関節置換、導線、生体センサー、探索子、縫合線、外科的ドレープ、外傷用着衣、及び包帯からなる群から選択される請求項６６に記載の医用デバイス。
【請求項６９】
（ａ）酸化窒素供与体、
（ｂ）一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（ｉ）金属クラスター、
（ｉｉ）樹木状ネットワーク、
（ｉｉｉ）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（ｉｖ）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域、及び
（ｃ）外部領域、
からなる酸化窒素放出粒子を含む洗浄剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、２００５年５月２７日出願の米国特許仮出願６０／６８５，５７８の恩恵を主張するものであり、当該出願の開示は引用することにより本明細書に組み込まれているものとする。
本出願で開示の対象は、酸化窒素放出粒子、及び医生物学的及び薬学的応用におけるこれらの使用を提供する。より具体的には、幾つかの実施態様において、本出願で開示した対象物は、制御され、標的を定めた方法で酸化窒素を放出する粒子を提供し、それにより、酸化窒素の治療効果を持続させ、標的細胞及び／又は標的組織への酸化窒素運搬の特異性を改善する。
本発明は国立保健研究所補助金番号ＥＤ０００７０８からの助成を、米国政府から得た。従って、米国政府は、本発明の特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
酸化窒素（ＮＯ）の生物学、生理学、及び病理生理学での多面的な役割（Marletta,M.A..,他、Biofactors,2,219-225(1990)を参照のこと）の発見により、制御された酸化窒素放出が可能な酸化窒素供与体の探索（Keefer,L.K.,Chemtech,28,30-35(1998)を参照のこと）が始められた。今日までに、研究者等は、ＮＯは心血管、胃腸、性尿器、呼吸器、及び中心及び末梢神経系におけるある範囲の生物過程を制御するということを発見した（Ignarro,L.J.,Nitric Oxide:Biology and Pathobiology;Academic Press:San Diego,2000;及びIgnarro,L.J.他、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.、84,9265-9269(1987)を参照のこと）。さらに、ＮＯの血管拡張薬としての発見、及び抗生物質及び殺腫瘍性因子としての同定により、ＮＯは魅力的な医薬品の候補になった。例えば、Radomski,M.W.,他, Br.J.Pharmacol.,92,639-646(1987);Albina,J.E.,及びReichner,J.S.; Canc.Metas.Rev.,17,19-53(1998);Nablo,B.J.,他,J. Am.Chem.Soc.,123,9712-9713 2001);Cobbs,C.S.,他,CancerRes.,55,727-730(1955);Jenkins,D.C.,他、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,92,4392-4396(1955);及びThomsen,L.L.,他、Br.J.Cancer.,72、41-44(1955)を参照のこと。
幾つかの酸化窒素供与体が報告されており、最も有名な供与体はＮ−ジアゼニウムジオレイン酸塩である。一般的に、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩ＮＯ供与体は、高圧下でアミンとＮＯを反応させて合成した小分子であり、また例えば、水溶液中で、自然にＮＯを発生させるために用いられてきた。Hrabie,J.A.及びKeefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154(2002)を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
酸化窒素供与体の活性を検討する、例えば腫瘍細胞を殺す、治療上の戦術は、本技術分野で知られる酸化窒素輸送系が、無差別に酸化窒素を放出又は供与するので、幾分問題を抱えている。従って、酸化窒素輸送系についての技術分野において、酸化窒素の放出又は供与を制御された、及び／又は標的を定めた方法で行い、生理学におけるＮＯの機能についての向上した理解を促進し、ＮＯ関連の治療の開発を提供することが要求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
幾つかの実施態様において、本発明は、酸化窒素供与体、外部領域、及び一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（ｉ）金属クラスター、
（ｉｉ）樹木状ネットワーク、
（ｉｉｉ）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（ｉｖ）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域からなる酸化窒素（ＮＯ）放出粒子である。
【０００５】
幾つかの実施態様において、前記内部領域は、更に、ｐＨ変化に応答する脆弱性リンカー（連結基）、電磁放射に敏感な脆弱性リンカー、酵素作用による分解を受けやすい脆弱性リンカー、疎水性リンカー、両親媒性リンカー、及びこれらの組合せから成る群から選択される有機リンカーを含む。
幾つかの実施態様において、前記ＮＯ供与体は、ジアゼニウムジオレイン酸塩、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ニトロソチオール、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシウレア、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、前記ＮＯ供与体は、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つに共有結合で結合する。幾つかの実施態様において、前記ＮＯ供与体は、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つに封じ込められる。幾つかの実施態様において、前記ＮＯ供与体が、前記内部領域、前記外部領域、前記コア、及びこれらの組合せの一つと、ファンデルワールス相互作用、静電気的相互作用、水素結合、及びこれらの組合せからなる群から選択される非共有結合的相互作用により結合する。
【０００６】
幾つかの実施態様において、前記外部領域は、ＮＯ放出動特性を修飾する部分、粒子の生体許容性に影響する部分、粒子の生体内分布に影響する部分、粒子の標的への運搬に寄与する部分、粒子の画像又は追跡に寄与する部分、粒子の溶解性に影響する部分、治療薬剤、及びこれらの組合せ、からなる群から選択される１又は２以上の化学部分を含む。
幾つかの実施態様において、前記コアは、金属クラスターであり、この金属クラスターが、金、白金、銀、磁性体、量子ドット、及びこれらの組合せから選択される成分構成材料を含む。幾つかの実施態様において、前記金属クラスターは、単層で保護した金クラスターである。
幾つかの実施態様において、前記コアは、樹木状ネットワークであり、この樹木状ネットワークは、ポリプロピレニミンデンドリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリアリールエーテルデンドリマー、ポリペプチドデンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリアミドデンドリマー、樹木状ポリグリセロール、及びトリアジンデンドリマーからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、前記樹木状ネットワークは、超分枝状である。
【０００７】
幾つかの実施態様において、前記コアは、共凝縮したシリカネットワークからなり、この共凝縮したシリカネットワークが、アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランからなるシラン混合物の凝縮により合成されたものである。幾つかの実施態様において、前記アルコキシシランは、化学式Ｓｉ（ＯＲ）４（式中、Ｒはアルキル基を表す。）で表されるテトラアルコキシシランから成り、
前記アミノアルコキシシランが、
（ａ）化学式 Ｒ’’−（ＮＨ−Ｒ’）ｎ−Ｓｉ（ＯＲ）３（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基、分枝アルキレン基、又はアラルキレン基、ｎは１又は２、Ｒ’’はアルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びアルキルアミンから成る群から選択される。）で表されるアミノアルコキシシラン、
（ｂ）化学式 ＮＨ［Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３］２（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基を表す。）で表されるアミノアルコキシシラン、
（ｃ）化学式 Ｒ’’−Ｎ（ＮＯＮＯ−Ｘ＋）−Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３（式中、Ｒはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基又はアラルキレン基、Ｒ’’はアルキル基又はアルキルアミン基を表し、Ｘ＋はＮａ＋及びＫ＋からなる群から選択されるカチオンを表す。）で表される、アミン基がジアゼニウムジオレイン酸塩で置換されたアミノアルコキシシラン、及び
（ｄ）これらの組合せ、
から成る群から選択される。
【０００８】
幾つかの実施態様において、前記シラン混合物は、約１０モル％〜約９９モル％の前記テトラアルコキシシラン、及び約１モル％〜約９０モル％の前記アミノアルコキシシランから成る。幾つかの実施態様において、前記シラン混合物は、更に約０モル％〜約２０モル％のフッ素化シラン、約０モル％〜約２０モル％のカチオン性又はアニオン性シラン、及び約０モル％〜約２０モル％のアルキルシランを含む。
幾つかの実施態様において、前記テトラアルコキシシランは、テトラメチルオルソケイ酸塩及びテトラエチルオルソケイ酸塩からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、前記アミノアルコキシシランが、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、［３−（メチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、Ｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−エチルアミノイソブチルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−シクロヘキシルアミノプロピルトリメトキシシラン、ビス［３−（トリメトキシシリル）プロピル］アミン、及びビス［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミンからなる群から選択される。
【０００９】
幾つかの実施態様において、前記フッ素化シランは、（ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリエトキシシラン、（３，３，３−トリフルオロプロピル）トリメトキシシラン及び（ペルフルオロアルキル）エチルトリエトキシシランからなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、前記カチオン性又はアニオン性シランは、Ｎ−Ｎ−ジデシル−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−トリメトキシシリル）アンモニウムクロライド、オクタデシルジメチル−（３−トリメトキシシリルプロピル）アンモニウムクロライド、３−トリヒドロキシシリルプロピルメチルホスホン酸ナトリウム塩及びカルボキシルエチルシラントリオールナトリウム塩からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、前記アルキルシランは、メチルトリメトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、ブチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン及びオクタデシルトリメトキシシランからなる群から選択される。
【００１０】
幾つかの実施態様において、共凝縮したシリカネットワークコア及びＮＯ供与体を含むＮＯ放出粒子は、ＮＯ供与体がシリカネットワークの凝縮後に作られる"ポストチャージ法"を用いて形成される。また幾つかの実施態様において、共凝縮シリカネットワークコアを含むＮＯ放出粒子は、ＮＯ供与体がシリカネットワークの凝縮前に作られる"プレチャージ法"を用いて形成される。
幾つかの実施態様において、前記有機リンカーは、前記酸化窒素放出粒子に酸化窒素放出のオン／オフ状態を与えることができる官能基を含み、該官能基が、エステル、ヒドラゾン、アセタール、チオプロピオネート、光脆弱性部分、及び酵素分解されるアミノ酸配列からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、前記外部領域は、酸化窒素放出粒子を標的に運搬することができる部分を含む。幾つかの実施態様において、前記標的は、細胞、組織及び器官からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、前記細胞は、癌細胞である。
幾つかの実施態様において、前記酸化窒素放出粒子を標的に運搬することができる部分は、抗体／抗原相互作用の原因となるタンパク質、葉酸、グアニジン、トランスフェリン、ホルモン、炭化水素、アミノ酸配列ＲＧＤを含むペプチド及びＴＡＴペプチドからなる群から選択される。
【００１１】
幾つかの実施態様において、前記外部領域は、酸化窒素供与体、（ポリ）エチレンオキシド、（ポリ）ウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコ高分子、ラクチド／グリコリドコ高分子（例えば、ＰＬＧＡ）、砂糖、蛍光部分、有機染料、ＭＲＩコントラスト試薬、チオール、メチル基末端のアルキル鎖、抗菌剤、抗腫瘍治療薬、スルホン酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、カチオン性アミン基、第４級アミン基、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される部分を含む。
幾つかの実施態様において、前記粒子の直径は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍである。幾つかの実施態様において、前記粒子の直径は、約１ｎｍ〜約５ｎｍである。幾つかの実施態様において、前記粒子の直径は、約２ｎｍ〜約１０μｍである。
【００１２】
幾つかの実施態様において、本発明は、ＮＯを患者に投与するための方法、又は配合を提供する。幾つかの実施態様において、該方法は、有効量のＮＯ放出粒子を患者に投与することからなる方法であり、該粒子は、ＮＯ供与体、外部領域、及び一定容積を持つ内部領域からなり、該内部領域は、少なくともその部分が、
（ａ）金属クラスター、
（ｂ）樹木状ネットワーク、
（ｃ）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（ｄ）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされる。
幾つかの実施態様において、本発明は、疾患の治療が必要な患者の疾患状態を治療する方法を提供するものであり、この方法は、治療の必要な患者に、ＮＯ供与体、外部領域、及び一定容積を持つ内部領域であって、少なくともその部分が、
（ａ）金属クラスター、
（ｂ）樹木状ネットワーク、
（ｃ）共凝縮したシリカネットワーク、及び
（ｄ）これらの組合せ、
から成る群から選択されるコアにより満たされた内部領域からなるＮＯ放出粒子を投与する。
【００１３】
幾つかの実施態様において、疾患状態は、癌、心臓血管疾患、微生物感染、血液を医学的デバイスに曝すことにより引き起こされる血小板凝集と血小板接着、細胞異常増殖に起因する病理学的状態、移植拒絶、自己免疫疾患、炎症、血管疾患、瘢痕組織、創傷の収縮、再発狭窄症、痛み、発熱、胃腸疾患、呼吸器疾患、性機能障害、及び性感染症からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、本発明は、ＮＯ放出粒子を含む高分子フィルムを提供する。幾つかの実施態様において、高分子フィルムは医学的デバイスを被覆するために用いることができる。幾つかの実施態様において、この医学的デバイスは、動脈ステント、ガイドワイア、カテーテル、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護板、股関節又は関節置換、導線、生体センサー、探索子、縫合線、外科的ドレープ、外傷用着衣、及び包帯の中の一つである。
【００１４】
幾つかの実施態様において、本発明は、ＮＯ放出粒子を含む洗浄剤を提供する。
従って、本発明の目的は、ＮＯ放出粒子を提供することである。本発明の他の目的は、特異的細胞及び／又は特異的組織が標的となるようにＮＯ放出粒子を運搬するためのＮＯ放出粒子を提供することである。本発明の更に他の目的は、ＮＯ放出粒子からＮＯの放出を誘導する能力を提供することである。
本発明により全体的又は部分的に扱われ、上記のように本明細書に記載された本出願に開示された対象物の特定の目的、他の目的及び側面は、本明細書で以下に記載するように、添付した実施例と関係して取り上げられた時、記載が進むにつれて明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書では以下の略号を用いる：ＡＦＭ：原子間力顕微鏡；ＡＥＡＰ３：Ｎ−（６−アミノメチル）−アミノプロピルトリメトキシシラン；ＡＥＭＰ３：（アミノエチルアミノメチル）−フェネチルトリメトキシシラン；ＡＨＡＰ３：Ｎ−（６−アミノヘキシル）−アミノプロピルトリメトキシシラン；ＡｉＢＮ：α，α’−アゾビスイソブチロニトリル；ａｔｍ：大気圧；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；℃：摂氏温度；ＣＦＵ：コロニー形成率；ＣＰ／ＭＡＳ：交差分極／マジックアングルスピニング；ＣＴＡＢ：セチルトリメチルアンモニウム臭化物；ＤＥＴ３：Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−ジエチレントリアミン；ＥｔＯＨ：エタノール；ＦＡ：葉酸；ＦＩＴＣ：フルオレッセインイソチオシアナート；ｇ：グラム；ＧＯｘ：グルコースオキシダーゼ；ｈ：時間；ＨＰＵ：親水性ポリウレタン；ＭＡＰ３：メチルアミノプロピルトリメトキシシラン；ＭｅＯＨ：メタノール；ｍｇ：マイクログラム；μｍ：マイクロメーター；ｍｉｎ：分；ｍＬ：ミリリットル；ｍｏｌ％：モル％；ＭＰＣ：単層保護クラスター；ＭＲＩ：磁気共鳴画像法；ＭＴＭＯＳ：メチルトリメトキシシラン；ｎＡ：ナノアンペア；ＮａＯＭｅ：ナトリウムメトキシド；ｎｍ：ナノメートル；ＮＭＲ：核磁気共鳴法；ＮＯ：酸化窒素（＝一酸化窒素）；［ＮＯ］ｍ：酸化窒素最大放出量；Ｏ３：オゾン；ＯＤ：吸光度；ＰＡＭＡＭ：ポリアミドアミン；ｐｍｏｌ：ピコモル；ｐｐｂ：１０億分の１；ＰＰＩ：ポリプロピレンイミン；ｐｐｍ：１００万分の１；ＴＰＵ：ＴＥＣＯＦＬＥＸ（Ｒ）ポリウレタン；ＴＥＭ：透過型電子顕微鏡；ＴＥＯＳ：テトラエチルオルソケイ酸塩；ＴＧＡ：熱重量分析；ＴＭＯＳ：テトラメチルオルトケイ酸塩；ＴＭＲＭ：テトラメチルローダミン；ｔ［ＮＯ］：酸化窒素全量；ＵＶ：紫外線；Ｖｉｓ：可視光
【００１６】
付随する代表的実施態様を示す実施例を参照として、本出願で開示した対象物を本明細書により詳しく説明する。しかしながら、本出願で開示される対象物を異なる形で実施することができる、また本明細書に示された実施態様によって制限されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施態様は、この開示が充分で完全であり、また当業者に対して実施態様の適用範囲を充分に伝達するように、提供されている。
もし他に定義することがなければ、本明細書で用いた全ての技術的及び科学的用語は、本出願で記載する対象物が関わる、当業者の１人に共通に理解される意味と同じである。全ての刊行物、特許申請、及び本明細書に述べた、他の参考文献は、参照文献として全体が取り込まれている。
明細書及び、クレイムを通して、与えられた化学式又は命名は、全ての光学及び立体異性体、及びこの様な異性体及び混合物が存在するラセミ混合物を範囲内に収める。
【００１７】
１．定義
長年にわたる特許法協定に従い、原文の"不定冠詞−ある""定冠詞−その"は、クレイムを含め本出願で用いられる場合、"１又は２以上"を意味する。
本明細書で用いる"両親媒性"という用語は、疎水性領域と親水性領域を持つ化学的成分に対して使われる。
本明細書で用いる"癌腫"という用語は、制御を外れた細胞分裂、及び細胞が転移する、又は他の部位で新しい成長を樹立する力によって引き起こされる疾患を表わす。"悪性"、"悪性腫瘍"、"新生物"、"腫瘍"及びこれらの変異物は、癌腫的な細胞又は癌腫細胞の群を表す。
癌腫の特別なタイプとしては、皮膚癌、結合組織癌、脂肪種、乳癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肛門性器部癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、中枢神経（ＣＮＳ）癌、網膜癌、血液及びリンパ腫瘍等が挙げられるが、これらに制限されない。
本明細書で用いられるように、"電磁放射線"という用語は、ガンマ線、ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線、マイクロ波、レーダー及びラジオ波のような、電気及び磁気波を表すが、これらに限らない。
【００１８】
"疎水性"という用語は、水素結合又は静電的相互作用のような非共有結合によって、ある程度まで水撥性、又は水と相互作用しない化学化合物又は化学的成分に対して使われる。ある化合物は強く疎水的であること、又は弱く疎水的であることができる。化合物又は基の計算による誘電率を、化合物又は化学的成分の疎水生成のレベル又は程度を予想するために用いることができる。より低い誘電率を有する化合物又は基は、より疎水性であろう。特に、"疎水性リンカー（連結基）"は、ＮＯ放出粒子が水性の環境に長時間おかれた時、ＮＯ放出粒子の中の易変性リンカー又はＮＯ供与体を水への暴露から保護する。より疎水的なリンカーは、ＮＯ供与体又は易変性リンカーを長期にわたり水から保護する。
"親水性"という用語は、ある程度まで水と相互作用する化合物又は基に対して使われる。
"イオン化しうる"という用語は、特定の化学的環境（例えば、特定のｐＨ）で電気的に中正である（即ち、無荷電である）が、他の化学的環境で（例えば、高い又は低いｐＨで）イオン化する、又は正又は負の荷電を持つ、基に対して使われる。
【００１９】
本明細書で用いる用語"メソ多孔質"は、約２０〜５００Åの範囲の孔を持つ粒子のような物体を表す。
用語"金属製"は、金属、金属合金、金属塩、及び金属酸化物を表す。従って、金属製という用語は、金、銀、銅、白金、及びチタンのような金属イオンを含む粒子、だけではなく半導体粒子及び磁気性粒子（例えば、酸化鉄を含む粒子）を表すが、これらに制限されない。
"半導体ナノクリスタル"及び"量子ドット"という用語は、本明細書では互換的に使われ、発光性がある（即ち、励起により電磁放射線を放出できる）、無機結晶材料からなり、及び任意に第２の半導体材料の保護膜又は"シェル（殻）"内に含まれている、１又は２以上の第１の半導体材料の内部コア粒子を含む半導体ナノ粒子を表す。半導体のシェルに囲まれた半導体ナノクリスタルコアは、"コア／シェル"半導体ナノ粒子と呼ばれる。周囲のシェル材料は、任意に、コア材料のバンドギャップエネルギーより大きなバンドギャップエネルギーを持つことができて、またコア基質のものに近い原子間隔を持つよう選択されている。
【００２０】
コア及び／又はシェルのために適切な半導体材料は、元素周期律表の２及び１２族から選択された第１の元素、及び１６族から選択された第２の元素を含む材料を含むが、これらに制限されない。この様な材料としては、ＺｎＳ，ＺｎＳｅ，ＺｎＴｅ，ＣＤｓ，ＣｄＳｅ，ＣｄＴｅ，ＨｇＳ，ＨｇＳｅ，ＨｇＴｅ，ＭｇＳ，ＭｇＳｅ，ＭｇＴｅ，ＣａＳ，ＣａＳｅ，ＣａＴｅ，ＳｒＳ，ＳｒＳｅ，ＳｒＴｅ，ＢａＳ，ＢａＳｅ，ＢａＴｅ，等々が挙げられるがこれらに制限されない。また、適切な半導体材料は元素周期律表１３族から選択した第１元素、及び１５族から選択した第２の元素を含む材料を含む。この様な材料としては、ＧａＮ，ＧａＰ，ＧａＡｓ，ＧａＳｂ，ＩｎＮ，ＩｎＰ，ＩｎＡｓ，ＩｎＳｂ，等々が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、半導体材料は、（Ｇｅ，Ｓｉ、等々）１４族元素を含む材料；ＰｂＳ，ＰｂＳｅ等々の材料；合金及びこれらの混合物を含む。本明細書で用いるように、元素及び族に番号付けするために、元素と族の周期律表に関する全ての参考文献は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，第８１版、（ＣＲＣ出版、２０００）において示されたように、新ＩＵＰＡＣシステムに従う。
【００２１】
"ルミネッセンス（発光）"により、物体から電磁放射線（光）が放出される過程を意味する。系が励起状態から低いエネルギー状態に転移し、対応するエネルギーの放出が光子の形をとる時にルミネッセンスが生ずる。これらのエネルギー状態は、電子的、振動的、回転的、又はこれらのコンビネーションであり得る。ルミネッセンスの原因となる転移は、化学的に系に蓄えられた、又は外部の供給源から系に加えられた、エネルギーの放出を通して刺激される。エネルギーの外部供給源は、化学的、熱的、電気的、磁気的、電磁気的、及び物理的を含め様々なタイプ、又は系を基底状態より高いエネルギー状態に励起させる力のある他のタイプのエネルギー供給源であり得る。例えば、ある系は光の光子を吸収して、電場に置かれて、又は化学的酸化還元反応を通して、励起されうる。ルミネッセンスの間に放出される光子のエネルギーは、低エネルギーのマイクロ波領域から高エネルギーのＸ−線放射の範囲まであり得る。通常、ルミネッセンスはＵＶからＩＲ放射の範囲の光子を表す。
"フルオレッセント（蛍光体）"という用語は、電磁放射に曝した後に光を発光する化合物又は化学基に対して使われる。
【００２２】
"酸化窒素供与体"又は"ＮＯ供与体"という用語は、酸化窒素分子種を供与し、放出し、及び／又は直接又は間接的に移動させ、及び／又はインビボで内部での酸化窒素産生を刺激し、及び／又はインビボで酸化窒素の内部濃度を上昇させ、結果として意図した作用部位に酸化窒素分子種の生物活性が発現されるような、分子種を表す。
"酸化窒素放出性"又は"酸化窒素供与性"と言う用語は、一酸化窒素の３種のレドックス（酸化還元）型（ＮＯ＋，ＮＯ−，ＮＯ）のいずれかを供与する、放出する、及び／又は直接又は間接的に移す方法を表す。幾つかの場合、酸化窒素放出性又は供与性により、意図した作用部位での一酸化窒素分子種の生物活性が発現される。
【００２３】
本明細書で用いる"微生物感染"という用語は、バクテリア、カビ、ウィルス、及び酵母感染を表す。
本明細書で用いられる"約"という用語は、値又は集団の量、を表す場合、重量、時間、容積、又は  割合は、この様な変位が開示した方法を実行する上で適切であるように、±２０％又は±１０％、より好ましくは、±５％、さらにより好ましくは、±１％及び、さらに一段と好ましくは、±０．１％特定の値からの変位を包含する。
本明細書で開示した多くの実施態様における、"病人"又は"患者"は、好ましくはヒト患者であるが、本出願で開示した対象物の原理は、本出願で開示した対象物が、哺乳動物を含め、全ての脊椎動物種に対して有効であると理解すべきであり、 これらについては"病畜"又は"患畜（禽）"と言う用語に含まれていると理解すべきである。此の文脈において、哺乳動物は治療が望まれる全ての哺乳動物種を含むと理解すべきである。哺乳動物種としては、馬、雄牛、物、及びネコのような、農業及び家畜動物種がある。
【００２４】
本明細書で用いられる用語"アルキル基"は、Ｃ１〜２０を表し、線状（即ち、"直鎖"）、分枝型、又は環状、飽和又は少なくとも部分的に及びある場合は完全に不飽和な（即ち、アルケニル基、及びアルキニル基）炭化水素鎖を含み、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル基、ブタジエニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、及びアレニル基が含まれる。"分枝型"とは、メチル基、エチル基、又はプロピル基のような低級アルキル基が直鎖型アルキル鎖に付加したアルキル基を表す。分枝型アルキル基の例としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基があるが、これらに制限されず、"低級アルキル基"は、１から約８個の炭素原子（即ち、Ｃ１〜８アルキル基）、例えば、１，２，３，４，５，６，７，又は８炭素原子を表す。"高級アルキル基"は約１０個から２０個の炭素原子、例えば１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０個の炭素原子を有するアルキル基を表す。ある実施態様では、"アルキル基"は、特にＣ１〜８直鎖アルキル基を表す。他の実施態様において、"アルキル基"は、特にＣ１〜８分枝型アルキル基を表す。
【００２５】
アルキル基は、任意に、同一又は異なる、１又は２以上のアルキル基置換基によって置換される（"置換アルキル基"）。用語"アルキル基置換基"は、アルキル基、置換アルキル基、ハロ基、アリールアミノ基、アシル基、水酸基、アリールオキシル基、アルコキシル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルオキシル基、アラルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基、及びシクロアルキル基が挙げられるが、これらに制限されない。任意に、アルキル鎖に沿って１又は２以上の酸素原子、イオウ原子又は置換又は非置換窒素原子を挿入することができ、ここで、窒素置換基は、水素原子、低級アルキル基（本明細書ではまた"アルキルアミノアルキル基と呼ぶ）又はアリール基である。
従って、本明細書で用いられるように、"置換アルキル基"は、本明細書で定義されたアルキル基を含み、ここで、アルキル基の１又は２個以上の原子又は官能基は、他の原子又は官能基で置換され、官能基としては、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸塩基、及びメルカプト基が挙げられる。
【００２６】
本明細書では、用語"アリール基"は、単一の芳香族環、又は互いに融合した、共有結合で連結した、又は、メチレン基又はエチレン基のような、しかしこれらに制限されない、一般的な基に連結した、多環の芳香族環であることができるような芳香族置換基を表すために用いられる。一般的な連結基としては、またベンゾフェノンにおけるようなカルボニル基、又はジフェニルエーテル基におけるような酸素原子、又はジフェニルアミンにおける窒素原子であることができる。用語"アリール基"は、特に複素環式芳香族化合物を含む。芳香族環（類）は、とりわけフェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ジフェニルエーテル基、ジフェニルアミン基、及びベンゾフェノン基を含む。特別な実施態様において、用語"アリール基"は、約５から約１０個までの炭素原子、例えば、５，６，７，８，９又は１０個の炭素原子、を含む環状芳香族を意味し、また５及び６員環炭化水素及び複素環式芳香族環を含む。
アリール基は、任意に１又は２個以上のアリール基置換基により置換することができて、これらの置換基は同一でも異なっていることも可能で、ここで、"アリール基置換基"は、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、水酸基、アルコキシル基、アリールオキシル基、アラルキルオキシル基、カルボキシル基、アシル基、ハロ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルコキシカルボニル基、アシルオキシル基、アシルアミノ基、アロイルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、アリールチオ基、アルキルチオ基、アルキレン基、及び−ＮＲ’Ｒ’’基、ここでＲ’及びＲ’’は、夫々独立に水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、及びアラルキル基である。
【００２７】
従って、本明細書で用いるように、用語"置換アリール基"は、本明細書において定義したアリール基を含み、このアリール基において、アリール基の１又は２個以上の原子又は官能基は、他の原子又は他の官能基によって置換され、他の官能基としては、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸塩、及びメルカプト基が含まれる。
アリール基の特別な例としては、シクロペンタジエニル基、フェニル基、フラン基、チオフェン基、ピロール基、ピラン基、ピリジン基、イミダゾール基、ベンジミダゾール基、イソチアゾール基、イソオキサゾール基、ピラゾール基、ピラジン基、トリアジン基、ピリミジン基、キノリン基、イソキノリン基、インドール基、カルバゾール基、等々がある。
【００２８】
"環状基"及び"シクロアルキル基"は、約３個から約１０個までの炭素原子、例えば、３，４，５，６，７，８，９又は１０個の炭素原子の、非芳香性単環式系又は多環系を表わす。シクロアルキル基は任意に、部分的に不飽和であることができる。また、シクロアルキル基は、任意に本明細書で定義したようなアルキル基、オキソ基、及び／又はアルキレン基で置き換えることができる。環状アルキル鎖に沿って、１又は２以上の酸素原子、イオウ原子、又は置換又は非置換窒素原子を挿入することができ、ここで窒素置換基としては、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、又は置換アリール基であり、従って、複素環式基を提供する。代表的な単環式のシクロアルキル環としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、及びシクロヘプチル基がある。多環シクロアルキル環としては、アダマンチル基、オクタヒドロナフチル基、デカリン基、ショウノウ、カンファン、及びノラダマンチルがある。
"アルコキシル基"はアルキル−Ｏ−基を表し、ここでアルキル基は前述の通りである。本明細書で用いる用語"アルコキシル基"は、例えば、メトキシル基、エトキシル基、プロポキシル基、イソプロポキシル基、ブトキシル基、ｔ−ブトキシル基、及びペントキシル基を表すことができる。用語"オキシアルキル基"は、"アルコキシル基"と互換性を持って用いることができる。
"アラルキル基"はアリール−アルキルー基を表し、ここでアリール基及びアルキル基は前述の通りであり、また置換アリール基及び置換アルキル基を含む。アラルキル基の例としては、ベンジル基、フェニルエチル基、及びナフチルメチル基がある。
【００２９】
"アルキレン基"は、１から約２０個までの炭素原子、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０個の炭素原子を持つ、直鎖型又は分枝型２価脂肪族炭化水素基を表す。アルキレン基は、直鎖型、分枝型、又は環状であることができる。また、アルキレン基は、任意に不飽和、及び／又は１又は２以上の"アルキル基置換基"により置換されている。アルキレン基に沿って、任意に１又は２以上の酸素原子、イオウ原子、又は置換又は非置換窒素原子を挿入することができて（本明細書ではまた、"アルキルアミノアルキル基と表される）、ここで窒素置換基は前述のアルキル基である。アルキレン基の例としては、メチレン基（−ＣＨ２−）；エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）；プロピレン基（−（ＣＨ２）３−）；シクロヘキシレン基（−Ｃ６Ｈ１０−）；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−基；−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ２）ｒ−基、ここで各ｑ及びｒは、独立に０から約２０までの整数、例えば、０，１，２，３，４，５，６，７，８，９、１０、１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０、であり、Ｒは水素原子又は低級アルキル基であり；メチレンジオキシル基（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）；及びエチレンジオキシル基（−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−）である。アルキレン基は、約２から約３個の炭素原子を有し、さらに６〜２０個の炭素原子を持つことができる。
【００３０】
"アリーレン基"は、２価のアリール基を表す。アリーレン基の例としては、フェニレンがあり、フェニレン基は、互いにオルト、メタ及びパラ位置、即ち、夫々、に結合に使われる環の炭素原子を持つことができる。
【化１】
2008545714.tif 000003
アリーレン基はまたナフチレン基であることができる。アリーレン基は、任意に、本明細書で定義した、同一又は異なる１又は２以上の"アリール基置換基"で、置換することができる（"置換アリーレン基"）。
"アラルキレン基"は、アルキル基及びアリール基を含む２価官能基である。例えば、アラルキレン基は、２個のアルキル基及び１個のアリール基（即ち、−アルキル−アリール−アルキル−）、１個のアルキル基及び１個のアリール基（即ち−アルキル基−アリール基−）、又は２個のアリール基及び１個のアルキル基（即ち、−アリール−アルキル−アリール−）を持つことができる。
【００３１】
用語"アミノ基"及び用語"アミン基"は、ＮＲ３、ＮＨ３、ＮＨＲ２、及びＮＨ２Ｒ基のような窒素含有性官能基を表し、ここでＲはアルキル基、分枝型アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基であることができる。従って、本明細書で用いる"アミノ基"は、１級アミン基、２級アミン基、又は３級アミン基を表すことができる。幾つかの実施態様において、１個のアミノ基のＲは、ジアゼニウムジオレイン酸塩（即ちＮＯＮＯ−）であることができる。
用語"カチオン性アミン基"及び"第４級アミン基"は、付加的な（即ち第４番目）官能基を有するアミノ基を表し、例えば窒素原子に結合した、水素原子又はアルキル基を表す。従って、カチオン性アミン基及び第４級アミン基は、正電荷を担う。
用語"アルキルアミン基"は、−アルキル−ＮＨ２−基を表す。
【００３２】
用語"カルボニル基"は、−（Ｃ＝Ｏ）−基を表す。
用語"カルボキシル基"は、−ＣＯＯＨ基を表し、また用語"カルボン酸塩"は、カルボキシル基、即ち−ＣＯＯ−から作られたアニオンを表す。
本明細書で用いる"ハロ基""ハロゲン化物"又は"ハロゲン原子"はフッ素、塩素、シュウ素及びヨウ素基を表す。
用語"水酸基"及び"ヒドロキシ基"は、−ＯＨ基を表す。
用語"ヒドロキシアルキル基"は、−ＯＨ基で置換されたアルキル基を表す。
"メルカプト基"又は"チオ基"は、―ＳＨ基を表す。
"シリル基"は、ケイ素原子（Ｓｉ）を含む官能基を表す。
【００３３】
本明細書で用いるように、"アルコキシシラン基"はケイ素原子に結合する１，２，３，又は４個のアルコキシ基を含む化合物を表す。例えば、テトラアルコキシシランはＳｉ（ＯＲ）４を表し、ここでＲはアルキル基である。各アルキル基は、同一又は異なることができる。ある"アルキルシラン基"は、アルコキシ基の１個又は２個以上が、１個のアルキル基に置換されたアルコキシシラン基を表す。従って、アルキルシランは、少なくとも１つのアルキル−Ｓｉ結合を含む。用語"フッ素化シラン基"は、アルキル基の１個が１又は２以上のフッ素原子により置換されたアルキルシランを表す。用語"カチオン性、又はアニオン性シラン基"は、アルキル基の１個がさらに正（即ちカチオン性）荷電、又は負（即ちアニオン性）荷電を有するアルキル基置換基に置換され、又は特定の環境（即ち、インビボで）で荷電を持つことができる（即ち、イオン化しうる）アルキルシラン基を表す。
用語"シラノール基"は、Ｓｉ−ＯＨ基を表す。
【００３４】
ＩＩ．酸化窒素放出粒子
本出願で開示した対象物は、酸化窒素放出粒子及び医生物学的及び薬学的応用における使用を提供する。多くの実施態様において、本出願で開示した粒子は制御された、及び／又は標的を定めた方法で酸化窒素を放出し、またそれにより酸化窒素の生物作用及び特異性を改善し、及び持続する。幾つかの実施態様において、本出願で開示した酸化窒素放出粒子は、インビボの細胞、及び／又は組織へ酸化窒素を運搬するための新しい踏み台を提供する。従って、本出願で開示した酸化窒素放出粒子は、酸化窒素供与化学及び酸化窒素放出治療に対するユニークなスカフォード（足場）を提供する。
今、図１を参照すると、本出願で開示した粒子Ｐは、幾つかの実施態様において、コアＣＲ，酸化窒素供与体ＮＯ，外部の内側を含む"内部"又は"内部領域"ＩＲ、及び"外部"又は"外部領域"ＥＲを含む言葉で記述することができる。以下の本明細書において具体的に記述されるように、内部ＩＲはまた、任意に脆弱性部分又は脆弱性基ＬＰを含む、有機リンカーＯＬＫを含む。
【００３５】
外部又は外部領域ＥＲは粒子Ｐの最外部の化学的機能性として定義できる。幾つかの実施態様において、外部ＥＲは、粒子Ｐの酸化窒素放出動特性を制御すること、粒子Ｐの生体適合性を変えること、粒子Ｐの溶解度を調節すること、ＮＯ放出前に意図した場所（例えば、特異的細胞、組織、又は器官）への粒子Ｐの標的特異的な運搬を提供すること、粒子Ｐの画像又は追跡を提供すること、又は付加的な治療試薬（即ち、ＮＯに加えて）を供給すること、ができる成分又は複数の成分を含む。この様な外部ＥＲはＮＯ放出粒子Ｐの機能を制御する、又は"官能基化"すると言うことができる。幾つかの実施態様において、外部領域ＥＲの化学群は、ＮＯ放出粒子Ｐの１以上の機能を制御できる、また外部ＥＲは、"多官能基性"と記述できる。幾つかの実施態様において、粒子Ｐを通して（例えば、コアＣＲ又は内部ＩＲにおいて）化学的成分又は他の構造的特性を、ＮＯ放出動特性、粒子溶解度、標的性、画像、追跡、付加的治療上の力、又は生体適合性に関係する因子又は因子群を制御するために用いることができて、また全粒子Ｐは、多官能基性と記述することができる。
【００３６】
図１に示すように、幾つかの実施態様において、内部領域ＩＲは有機リンカーＬＫを含む。本明細書で用いるように、用語"有機リンカー"又は"リンカー"は粒子コアと、粒子外部の間のギャップを橋渡しする有機つなぎ綱を表す。幾つかの実施態様において、以下の明細書でより具体的に記述するように、有機リンカーＬＫは脆弱性基ＬＰを含むことができる。幾つかの実施態様において、有機リンカーＬＫは、いくらか、又は実質的に疎水性である。幾つかの実施態様において、リンカーＬＫは、分枝している。幾つかの実施態様において、リンカーＬＫは、コアＣＲ，外部ＥＲ又はＮＯ供与体ＮＯのような粒子Ｐの他の構成分の１又は２以上と共有結合で結合している。
本出願で開示した対象物の粒子は、如何なる形もとることができる。従って、粒子は、球状、楕円形状、又は無定型であることができる。粒子のサイズと形は、少なくとも部分的には、自然に（即ち、化学組成）又はコアの合成法によって定められる。幾つかの実施態様において、粒子のサイズは、ＮＯ放出量又は速度に影響を与えるよう細工できる。
【００３７】
幾つかの実施態様において、ＮＯ放出粒子はナノ粒子である。幾つかの実施態様において、用語"ナノ粒子"は、約０．５ｎｍから約１０００ｎｍまでの間の直径を有する粒子を表すことを意味する。幾つかの実施態様において、ナノ粒子は、約１ｎｍから約５００ｎｍまでの間の直径を持つ。幾つかの実施態様において、ナノ粒子は、約２ｎｍから約２００ｎｍまでの間の直径を持つ。幾つかの実施態様において、粒子は、約１ｎｍから約５０ｎｍまでの間の直径を持つ。
幾つかの実施態様において、粒子は１０００ｎｍより大きい。従って、幾つかの実施態様において、粒子はミクロ粒子である。幾つかの実施態様において、粒子は、約２５ミクロンまでの直径を持つ。幾つかの実施態様において、粒子は、約１００ミクロンまでの直径を持つ。
酸化窒素供与体は、粒子のコア、内部、又は外部の一部であることができる。ＮＯ供与体は、コア、内部又は外部の一つをカプセルに包むことができる。ＮＯ供与体は、Van der Waals相互作用、静電的相互作用（双曲子間、又は荷電基間の相互作用のような）、水素結合、又はこれらのコンビネーションのような非共有結合を介して、粒子の特定領域と結合することができる。さらに、ＮＯ供与体は、コア、内部、又は外部の一つと共有結合で結合できる。ＮＯ放出成分のパーセント組成は、希望とする治療結果又は他の結果に対する酸化窒素の有効最大積載量を与えるために、共有結合又はカプセル化によって変えることができる。
【００３８】
ＮＯ放出成分又はＮＯ供与体は、粒子の適切な標的に出会うまで、多量のＮＯを貯蔵しつつ、他の粒子記述子を破壊することのない様に設計できる。本明細書の以下に記載するように、リンカーの脆弱性部分を熱により、又はいかなる分解方法によっても、ＮＯ放出を開始することができる。従って、ＮＯ供与体は、ＮＯを放出しうる如何なる成分でもあることができて、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ニトロソチオール、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシウレア、金属錯体、有機亜硝酸塩、及び有機硝酸塩が挙げられる。Wang,P.G.,他Nitric Oxide Donors:For Pharmaceutical and Biological Applications;Wiley-VCH:Weinheim,Germany,2005;及びWang,P.G.,他、Chem.Rev.,102,1091-1134(2002)を参照されたい。
【００３９】
幾つかの実施態様において、ＮＯ供与体は、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩（即ち、１−アミノ−置換性デアゼン−１−イウム−１，２−ジオレイン酸塩）である。Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩は、生物学的条件下で自発的にＮＯを発生する活性を有するのでＮＯ供与体として特に魅力的である。Hrabie,J.A.,及びKeefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154(2002);及びNapoli,C.及びIgnarro,L.J.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,43,97-123(2003)を参照されたい。以下の反応図１に示すように、幾つかのＮ−ジアゼニウムジオレイン酸塩化合物は、１級及び２級アミン、ポリアミン、及び２級アミノ酸を包含するある範囲の求核残基を用いて合成されてきた。Hrabie,J.A.,及びKeefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154(2002)を参照されたい。Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩の合成において、高圧下で１当量のアミン基が２当量の酸化窒素と反応する。塩基（例えば、メトキシドのようなアルコキシド）はアミン窒素よりプロトンを外し、アニオン性の安定化した［Ｎ（Ｏ）ＮＯ］−基を生成する。室温条件下で安定であるが、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩は、水溶液性の媒体中で自発的に分解し、ｐＨ、温度、及び／又はアミン分子の構造に依存した速度でＮＯを生成する。例えば、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩−修飾プロリン（ＰＲＯＬＩ／ＮＯ）、２−（ジメチルアミノ）−エチルプトレアミン（ＤＭＡＥＰ／ＮＯ），Ｎ，Ｎ’−ジメチルヘキサンジアミン（ＤＭＨＤ／ＮＯ）及びジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ／ＮＯ）は、ｐＨ７．４及び３７℃において、２秒から２０時間という広範囲なＮＯ放出半減期範囲をもつ小分子ＮＯ供与体として開発された。Hrabie,J.A.,及びKeefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154 2002);及びKeefer,L.K.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,43,585-607(2003)を参照されたい。
【００４０】
【化２】
2008545714.tif 000004
反応図１  Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩より合成及びＮＯ放出。
本明細書において間もなくより詳細に記載するように、幾つかの実施態様において、本出願で開示した粒子の"コア"は、以下からなる群：（ａ）金属クラスター；（ｂ）樹木状ネットワーク；及び（ｃ）様々なシラン機能性を有する共凝縮したシリカ（即ち、結合したシロキサン）ネットワーク、から選択した材料を含むが、これらに制限されない。
【００４１】
ＩＩ．Ａ．  金属クラスターよりなるコア
幾つかの実施態様において、本出願で開示した粒子は、金属クラスターよりなる。金属クラスターは、更なる官能化のために不活性化又は"保護化"されることができる全ての金属複合体を含むことができる。例えば、保護化された金属複合体は、幾つかの実施態様において、有機高分子又はシリカによって被覆されることによって作られる。金属複合体は、また、有機分子の単層により保護され、ここで、有機分子は、金属複合体の表面で金属原子に配位する、又は金属原子と共有結合又は非共有結合を形成する官能性を持つ。
金属複合体は、金属、金属合金、金属塩、又は金属酸化物であることができる。幾つかの実施態様において、金属複合体は、金、銀、プラチナ、酸化鉄（即ち、ＦｅＯ，Ｆｅ２Ｏ３，又はＦｅ３Ｏ４）又はＣｄＳｅ等々のような半導体粒子を含む。幾つかの実施態様において、酸化鉄は、磁鉄鉱（即ち、Ｆｅ３Ｏ４）である。幾つかの実施態様において、コアは、単層で保護された金クラスターであり、これは、Ｂｒｕｓｔ法及びＳｃｈｕｌｚ−Ｄｏｂｒｉｃｋ法を含む、当業者に既知の様々な方法により作ることができる。
【００４２】
単層保護のクラスター（ＭＰＣ）金ナノ粒子、又はＭＰＣｓ、(Brust,M.,J.Chem.Soc.,Chem.Comm.,801-802(1994)を参照されたい）はこれらのユニークなサイズ（１ｎｍから５ｎｍまで）、安定性、高度に機能的な設計を理由として、多くの注目を集めた。Feldheim,D.L.及びFoss,C.A.,編,Metal Nanoparticles - Synthesis Characterization,and Applications,Marcel Dekker,Inc:New York, p.360(2000)を参照されたい。図２に示すように、ＭＰＣｓの外部は、望みの官能基を含む他のチオール基と交換することにより、配置を変えることができる。Hostetler,M.I.,他,Langmuir,15, 3782-3789(1999)を参照されたい。
更なる粒子の官能基化により、特異的な抗体―抗原又はリガンドー受容体相互作用を可能にする受容体分子を持つようになり、特異的な組織又は細胞を標的にすることが可能となる。ＮＯ放出ＭＰＣ金ナノ粒子は、そのサイズ及び安定性により、インビボセンサー設計及び創傷治癒の促進、及び／又は皮膚下の血管の拡張に対する局所的クリームを含め、ある範囲の生物医学的及び薬学的応用に適用される。
【００４３】
ＩＩ．Ｂ．デンドリマーを含むコア
デンドリマーは、酸化窒素供与体化学に対してユニークなスカフォード（足場）を提供し、ここで多価の樹木状外部は、如何なる数の材料科学又は生物医学的応用に適するよう官能基化することができる。
デンドリマーは密に分枝化した構造を持ち、多くの反応基を持つ高分子である。デンドリティック高分子には、全て、１又は２以上の分枝点を含む、繰り返し単位の幾つかの層、又は生成源がある。超分枝化した樹木状高分子を含め、デンドリマーは、少なくとも２個の反応基を持つ単量体ユニットの縮合反応によって製造される。一般的に、デンドリマーは、末端表面基、内部分枝接合点、及び隣接した分枝接合点を共有結合で結合させる２価のコネクターからなり、内部分枝接合点は、２に等しい、又は２以上の分枝型官能基を持つ。
デンドリマーは、収束的合成又は発散的合成により製造されることができる。デンドリマーの発散合成には、分子生長過程があり、これは、放射状に外側方向に、幾何学的に進行性の階段状の分枝の上に分枝付加が連続することにより起こり、秩序ある配列を作り出す。従って、各樹木状高分子は、コアセル、１又は２層以上の内部セル、及び表面セルの外層を含むということができて、ここで各セルは、単一の分枝接合点を含む。各セルは、化学構造及び分枝官能基性において、同一又は異なることができる。表面分枝セルは、化学的に反応性のある、又は不活性な官能基を含んでもよい。化学的に反応性のある表面官能基は、更に樹木状成長を拡張するため、又は樹木状分子表面を修飾するために用いることができる。化学的に不活性な官能基は、親水性末端に対する疎水性末端の比を調節するため、及び／又は特定の溶媒に対して樹木状高分子の溶解度を向上させるためのような、物理的に樹木状表面を修飾するために用いてもよい。
【００４４】
デンドリマーの収束的合成は、デンドロン又はデンドリマーの表面になると予想されるものから始まり、及び焦点又はコアの方向へ放射状に進行する、生長過程を含む。樹木状高分子は、理想的であっても、又は非理想的、即ち不完全又は欠陥的、であってもよい。不完全性は、普通不完全な化学反応、又は不可避の競合的副反応の結果である。実際面では、真の樹木状高分子は、一般的に非理想的、即ちある程度の構造的不完全性を含む。
超分枝型樹木状ネットワークは、高レベルの非理想的不規則分枝を含む樹木状高分子のクラスである。具体的には、超分枝型高分子は、全ての繰り返し単位が分枝接合点を持つとは限らない、相対的に多数の不規則な分枝領域を含む。デンドリマー、デンドロン、ランダムな超分枝型高分子、制御された超分枝型高分子及び樹木状グラフト（移植体）についての、合成及び特徴付けについては、よく知られている。デンドリマー及びデンドロンの例、及びこれらの合成方法は、米国特許番号４，５０７，４６６；４，５５８，１２０；４，５６８，７３７；  ４，５８７，３２９；４，６３１，３３７；４，６９４，０６４；４，７１３，９７５；４，７３７，５５０；４，８７１，７７９及び４，８５７，５９９に公示されている。超分枝型高分子の例、及びこの合成法は、例えば、米国特許番号５，４１８，３０１に公示されている。
【００４５】
本出願に開示した粒子のコアスカフォードとしての使用に適切なデンドリマーには、ポリプロピレニミンデンドリマー；ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー；ポリアリールエーテルデンドリマー；ポリリジンデンドリマー；ポリエステルデンドリマー；ポリアミドデンドリマー；樹木状ポリグリセロール及びトリアジンデンドリマーがある。
幾つかの実施態様において、本出願で開示した対象物は、外部の２級アミン基を含む一連のポリプロピレニミン（ＰＰＩ）デンドリマー抱合体を提供する。外部の１級アミン基を持つＰＰＩデンドリマーから１級アミン基をアシル化し、また得られたアミド基のカルボニル基を還元して２級アミン基を合成することによって、この２級アミン基含有ＰＰＩデンドリマーを合成することができる。あるいは、１級アミン基は、既に２級アミン基を含む官能基でアシル化することができる。例えば、ＰＰＩデンドリマーの外部１級アミン基はプロリンでアシル化することができる。
デンドリマーの２級アミン官能基は、強塩基及び気体酸化窒素存在下で、高収率で酸化窒素供与体に変換できる。本明細書が提供するように、デンドリマーサイズ及び表面官能基は、２級アミン基を酸化窒素供与体へのパーセント変換率、及び酸化窒素放出動特性に影響を与える。
【００４６】
ＩＩ．Ｃ．共凝縮シリカネットワークを含むコア
二酸化ケイ素から合成した官能基化したセラミック合成物である、無機―有機混成シリカナノ粒子は、分離、生物的標識、診断、及び薬物、遺伝子、及びタンパク質の制御された運搬のための担体システムに関わる応用のために探求されてきた。Lai,C.-Y.,他、J.Am.Chem.Soc.,125,4451-4459(2003);Munoz, B.,他,Chem. Mater.,15,500-503(2003);Roy,I.,他、Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.,102,279-284(2005);Trewyn,B.G.,他,Nano.Lett.,4,2139-2143 2004);及びYoshitake,H.,New.J.Chem.,29,1107-1117(2005)を参照されたい。シリカ粒子の薬物運搬潜在力は、これらの物理的及び化学的汎用性及び無毒性のために多くの注目を集めた。Sayari,A.,及びHamoudi,S.,,Chem.Mater.,13,3151-3168 (2001);及びStein,A.,他,Adv.Mater.,12,1403-1419(2000)を参照されたい。誘導体を作ることができる分子によって更に官能基化できる、反応性のある有機反応基（例えば、アミン基、カルボン酸塩、チオール基、オレフィン基、ハロゲン化物、及びエポキシド基）で修飾した無機―有機混成シリカの合成が報告されている。Sayari,A.,及びHamoudi.S.,Chem.Mater.,13,3151-3168(2001);及びStein,A..,他、Adv.Mater.,12,1403-1419(2000)を参照されたい。実際、前述の官能基成分を持つ無数のシランカップリング試薬が、薬物及び他の治療薬の（自由なシラノール基を通して）表面グラフト化のために開発された。Ａｎｗａｎｄｅｒ．Ｒ．他、Stud.Surf.Sci.Catal.,117,135-142(1998)を参照されたい。
【００４７】
一例において、Ｍｅｙｅｒｈｏｆｆ及び共同研究者等はフュームドシリカ（融合シリカ）（無定型粒子、直径０．２〜０．３μｍ）の表面にアミン官能基化したシリル化試薬をグラフトすることを報告した。Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，他，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，５０１５−５０２４（２００３）参照。表面に結合したアミン基は、その後、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩ＮＯ供与体に変換された。改善した血液適合性を備えて被覆されたシリコンゴム高分子の合成のために、このＮＯ放出シリカは充填物として使われた。
治療上のＮＯ運搬系のようなスカフォールドの有用性は、多くの理由により妨害されたままである。この修飾は、粒子の外部表面に限られているので、ＮＯ貯蔵力は、本質的に制限され、ＮＯ放出動特性の制御には問題が多く、またＮＯ供与体成分は、生体液中の反応性の化学種（例えば、ラジカル、過酸化物、及び遷移金属）によるコンタミネーションを受けやすい。Keefer,L. K.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,43,585-607(2003);Napoli,C.,及びIgnarro,L.J.,  Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,43,97-123(2003);及びZhou,Z.,及びMeyerhoff,M.E., Biomacromolecules,6,780-789(2005)を参照されたい。
【００４８】
本出願で開示した対象物の粒子は、共凝縮したシリカネットワークを含むことができて、このネットワークはＮＯ貯蔵力を増加させ、またＮＯ放出動特性の制御力を増したＮＯ運搬システムを提供する。幾つかの実施態様において、本出願で開示したＮＯ放出シリカベースの粒子は、"ワンポット"合成法により製造される。Stein,A.,他,Adv.Mater.12,1403-1419(2000); Hatton, B.,他,Acc.Chem.Res.,38,305-312 2005),Lin,H.-P.,及びMou,C.-Y.,Acc.Chem.Res.,35,927-935(2002)を参照されたい。従って、図３に示すように、無機―有機混成シリカ粒子は、ゾルーゲル工程により製造され、この工程はテトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）、又はジ−又はトリ−アミノアルコキシシランを持つ他のアルコキシシランの共凝縮を伴う。この"ゾルーゲル"工程は、２種類の化学反応：アルコキシシランのアルコキシ基がシラノール（即ち、水酸基がＳｉ原子に付加したもの）になる加水分解反応、その後、２個のシラノール又は１個のシラノール、及びアルコキシシランが反応してシロキサン結合（即ち、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）を形成する、縮合反応、を伴う。
"ワン−ポット"合成法の利点は、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩ＮＯ供与体前駆体（即ち、ジ−及びトリ−アミノアルコキシシランのアミノ基）が粒子全体に一様に分布することができることであり、他方、表面グラフティング法により作られたアミン基修飾シリカ粒子の場合は、表面だけに分布する。図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。実際、この直接"ワン−ポット"合成法により、より良い構造的安定性が提供され、またシリカ構造に組み込まれた有機アルコキシシラン量をより直接的に制御することが可能となる。Stein,A.他、Adv.Mater.,12,1403-1419(2000);及びLim,M.H.,及びStein,A.,Chem.Mater.,11,3285-3295(1999)を参照されたい。更に、様々な他の官能基を持つ別なシランが、構造を持つように共凝縮できて、これは、サイズ、溶解度、又は粒子の多孔率に影響を与える。
従って、幾つかの実施態様において、ナノ粒子コアは、アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランの共凝縮体から作成した共凝縮シランネットワークを含む。幾つかの実施態様において、アミノアルコキシシランは、さらに酸化窒素との処理による共凝縮の後、官能基化されて、アミン基がＮ−ジアゼニウムジオレイン酸塩に変化する。図５Ａ参照。幾つかの実施態様において、アミノアルコキシシランは、アルコキシシランとの共凝縮に先立ち酸化窒素で"前処理"又は"プレチャージ（前装填）"される。図５Ｂ参照。"プレチャージ"法は、ＮＯ供与体でより密集して官能基化した共凝縮シリカ粒子を作り出すために用いることができる。
【００４９】
幾つかの実施態様において、アルコキシシランは、化学式Ｓｉ（ＯＲ）４を持つテトラアルコキシシランであり、ここでＲはアルキル基である。Ｒ基は、同一又は異なることができる。幾つかの実施態様において、テトラアルコキシシランは、テトラメチルオルトケイ酸塩（ＴＭＯＳ）又はテトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）から選択される。
幾つかの実施態様において、アミノアルコキシシランは化学式：
Ｒ’’−（ＮＨ−Ｒ’）ｎ−Ｓｉ（ＯＲ）３
を持ち、ここでＲはアルキル基、Ｒ’はアルキレン基、分枝型アルキレン基、又はアラルキレン基であり、ｎは１又は２であり、Ｒ’’はアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、及びアルキルアミン基からなる群より選択される。幾つかの実施態様において、アミノアルコキシシランは、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＨＡＰ３）；Ｎ−（６−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン；（３トリメトキシシリルプロピル（ジ−エチレントリアミン（ＤＥＴ３）；（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン（ＡＥＭＰ３）；［３−（メチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン；Ｎ−ブチルアミノ−プロピルトリメトキシシラン；Ｎ−エチルアミノイソブチルトリメトキシシラン；Ｎ−フェニルアミノ−プロピルトリメトキシシラン；及びＮ−シクロヘキシルアミノプロピルトリメトキシシランから選択される。代表的な適切なアミノアルコキシシランの構造を図６に示す。
いくつかの実施態様において、アミノアルコキシシランは化学式：
ＮＨ［Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３］２
を持ち、ここでＲはアルキル基であり、またＲ’はアルキレン基である。従って、いくつかの実施態様において、アミノアルコキシシランは、ビス−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］アミン及びビス［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミンから選択することができる。
【００５０】
いくつかの実施態様において、本明細書で既に述べたように、アミノアルコキシシランは、ＮＯ放出のためにプレチャージされ、またアミノ基はジアゼニウムジオレイン酸塩により置換される。従って、いくつかの実施態様において、アミノアルコキシシランは、化学式：
Ｒ’’−Ｎ（ＮＯＮＯ−Ｘ＋）−Ｒ’−Ｓｉ（ＯＲ）３
を持ち、ここでＲはアルキル基であり、Ｒ’はアルキレン基又はアラルキレン基であり、Ｒ’’’はアルキル基又はアルキルアミン基、及びＸ＋はＮａ＋，Ｋ＋及びＬｉ＋からなる群より選択されるカチオンである。
シリカネットワークの組成（即ち、アミノアルコキシシランの量又は化学組成）及びＮＯチャージ条件（即ち、溶媒及び塩基）を変えて、酸化窒素放出の量及び持続時間を最適にすることができる。従って、幾つかの実施態様において、本出願で開示したシリカ粒子組成を修飾し、シリカ粒子からのＮＯ放出の半減期を調節することができる。
【００５１】
幾つかの実施態様において、酸化窒素放出シリカ粒子の疎水性を、共凝縮シリカネットワークに様々な官能基を持つ共凝縮シラン前駆体により調節できる。幾つかの実施態様において、他のシラン前駆体を、アルキルシラン、正電荷を持つシラン、負電荷を持つシラン、及びフッ素化したシランを含む群から選択するが、これらに制限されない。幾つかの実施態様において、他のシラン前駆体を、（ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリエトキシシラン；（３，３，３−トリフルオロプロピル）トリメトキシシラン；（ペルフルオロアルキル）エチルトリエトキシシラン；Ｎ−Ｎ−ジデシル−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−トリメトキシシリル）アンモニウムクロライド；オクタデシルジメチル−（３−トリメトキシシリルプロピル）アンモニウムクロライド；３−トリヒドロキシシリルプロピルメチルホスホン酸ナトリウム塩；カルボキシルエチルシラントリオールナトリウム塩；メチルトリメトキシシラン；ブチルトリメトキシシラン；ブチルトリエトキシシラン；プロピルトリメトキシシラン；及びオクタデシルトリメトキシシランから選択することができる。
幾つかの実施態様において、共凝縮シリカネットワークは、約１０モル％から約９９モル％までの間の濃度のテトラアルコキシシラン；約１モル％から約９０モル％の間の濃度のアミノアルコキシシラン；約０モル％から約２０モル％までの間の濃度のフッ素化シラン；約０モル％から約２０モル％までの間の濃度のカチオン性又はアニオン性シラン；及び約０モル％から約２０モル％までの間の濃度のアルキルシランを含む（即ち、上記の濃度の溶液の凝縮から作られる）。
【００５２】
幾つかの実施態様において、シリカネットワークの多孔率及びＮＯ放出能は、鋳型構成成分の存在下でシランを共凝縮することで制御できる。この様な鋳型構成成分は、界面活性剤及びミセルを含むことができる。シリカネットワークの凝縮の後、鋳型構成成分は取り除くことができ、シリカに孔が残る。ＮＯ放出シリカ粒子内に孔を取り込むと、ＮＯ供与体充填に使われる表面積が増加する、又はＮＯ供与体への水の接近性を高めることによりＮＯ放出を増加させる。
例えば、図７は、孔の鋳型としてミセルを用いたメソ多孔質のシリカネットワークの合成の図式的説明である。図７に示すように、ミセルは、制御された溶媒環境中で自己会合し、ミセルロッド、又は多重ロッドのより高度に構造化した配列のような、秩序ある３次元構造を形成する。シランの混合物を含む溶液をミセル溶液に導入することができて、凝縮し、ミセルロッドを取り囲むことができるが、浸透することはできない。シラン混合物の凝縮の後、ミセルは、溶媒抽出により凝縮したシリカより取り除くことができて、シリカ内に孔を残す。
幾つかの実施態様において、本出願で開示した対象物は、官能基化したシリカを提供するが、このシリカを、当業者に既知の様々な化学的カップリング反応により、更に巧妙に作ることができる。幾つかの実施態様において、官能基化したシリカは、アミノ基修飾シリカである。幾つかの実施態様において、官能基化したシリカは、エポキシ基修飾シリカである。
幾つかの実施態様において、本出願で開示したシリカ化学は、ヒドロキシアミン化学と組み合わされる。幾つかの実施態様において、本出願で開示したシリカ化学は、ヒドロキシウレア化学と組み合わされる。
【００５３】
ＩＩＩ．酸化窒素放出粒子より酸化窒素の誘導放出
制御された、及び／又は標的を定めた輸送技術は、活性試薬の放出速度、及び／又は場所を制御することによって、一般的に、活性試薬の効率及び／又は安全性が増す。幾つかの実施態様において、本出願で開示した酸化窒素放出粒子からの酸化窒素の放出は、要求通り、選択的に作動開始又は停止（即ち誘発）することができる。
幾つかの実施態様において、有機リンカーは"脆弱"部分を含む。幾つかの実施態様において、リンカーの誘導的分解が、ＮＯ放出のメカニズム、量、速度、及び持続時間に影響することができる。図１及び８を参照すると、リンカーＬＫの脆弱部分ＬＰを、外部ＥＲに対して様々な位置Ａ，Ｂ又はＣに置くことができて、リンカーＬＫの位置が変わると、さらにＮＯ放出のメカニズム、量、速度、及び持続時間に影響する。例えば、幾つかの実施態様において、図８の位置Ａは、図１のＮＯ放出粒子Ｐの内部ＩＲ内のＮＯ供与体ＮＯに隣接することができ；位置Ｂは、ＮＯ供与体ＮＯと外部ＥＲの間の中央に位置することができ；位置Ｃは、外部ＥＲに近接して位置することができる。従って、幾つかの実施態様において、位置Ｃにおける脆弱基ＬＰは、粒子Ｐが置かれた外部条件によって、より早く分解されることが可能であり、言い換えると、粒子Ｐの内部ＩＲに位置するＮＯ供与体ＮＯを、同じ環境条件により早く曝すことになる。粒子内部ＩＲにより深く、位置Ａ又はＢ、に置かれた脆弱基ＬＰは、幾つかの実施態様において、持続した、又は遅延した放出動特性を提供する。
【００５４】
幾つかの実施態様において、リンカーの"脆弱"部分は、例えば、誘発機構のような、刺激に曝すことにより分解する。幾つかの実施態様において、刺激、又は誘発機構は、ｐＨ，光、及び酵素作用を含む群から選択されるが、これらに制限されない。
リンカーの脆弱部分の分解がｐＨによって誘発されるような実施態様において、リンカーは、エステル基、ヒドラゾン基、アセタール基、及び／又はｐＨ変化に応答する他の有機官能基の様な、官能基を含む。従って、幾つかの実施態様において、リンカーは、あらかじめ定めたｐＨ範囲で分解する。より具体的には、幾つかの実施態様において、リンカーは、エンドサイトシスによる高分子の細胞内移行の結果生ずる細胞構造である、エンドソーム内の増加した酸性ｐＨを利用して、設計される。
幾つかの実施態様において、リンカーの分解は、光露出により誘発される。いくつかの実施態様において、光照射によりリンカー構造が分解する光脆弱成分が様々なリンカー内に作られ、"脆弱"部分が光開裂を受ける。
幾つかの実施態様において、酵素基質がリンカーに組み込まれ、興味のある望みの酵素環境に対する系の特異性を得て、興味のある酵素的経路を通して、リンカーを分解する。
従って、幾つかの実施態様において、リンカーの脆弱性は、ＮＯ放出成分からのＮＯ放出の機構、量、速度及び持続時間を制御するための方法として用いることができる。脆弱なリンカーには、エステル、ヒドロゾン、アセタール、チオプロピオン酸塩、光脆弱成分及び酵素分解を受けるアミノ酸配列がある。
【００５５】
幾つかの実施態様において、有機リンカーは、疎水性リンカーである。粒子が水溶液性の環境に置かれた時、疎水性リンカーは、例えば、ジアゼニウムジオレイン酸塩のような、ＮＯ供与体、及び／又は脆弱性リンカー、を水又はプロトンとの接触から保護する手がかりとして選ぶことができる。従って、疎水性リンカーの長さ、及び正確な化学組成を、ＮＯ放出動特性を制御するために利用することができる。用語疎水性は、非常に疎水性な基（即ち、非常に低い誘電率）であるか、又は僅かに疎水性である基（即ち、粒子の内部に水がゆっくり侵入することを許す）を含むことができる。
あるいは、有機リンカーは、両親媒性であり、疎水性基及び親水性基の両者を含む。この様なリンカーは、粒子内部にチャンネルを提供し、それにより、溶媒の脆弱性リンカー又はＮＯ供与体への接近を亢進する。
ＮＯ放出は、ＮＯ供与体を、ナノ又はミクロ粒子、セル、細胞ゴースト、リポタンパク質、リポソーム、ミセル、微少気泡、微小球体、又は少なくとも部分的に不溶性の又は生物分解可能な性質に作られた粒子、又は合成高分子の様な、担体系内にカプセル化することにより制御できる。この様な系において、体内で担体が分解するに従い、ＮＯは徐々に放出されることができる。一般的に、分解速度は、温度、ｐＨレベル、及び酵素活性のような、患者内の条件により変わる。従って、この様な運搬技術を用いることにより、持続した治療試薬の放出を、長期間維持することができる。
【００５６】
ＩＶ．酸化窒素放出粒子の更なる官能基化
本明細書に提供したように、本出願で開示した粒子の外部、内部、及び／又はコアを官能基化することにより、生体適合性を与える、薬物動態挙動を変える、及び標的を定める官能基性を伝える、更なる治療成分を加える、及び治療薬としてのＮＯの運搬及び研究に関する画像力を与えることができる。幾つかの実施態様において、粒子の外部は、１又は２以上の化学的又は生体分子成分により官能基化が可能である。
外部は、一様な、又は変化のある化学組成であることができる。幾つかの実施態様において、粒子の外部の官能基化は、層又は粒子の内部を囲むコーティング（被膜）の付加から成り立つことができる。幾つかの実施態様において、官能基化は、粒子周辺の幾つかの位置に１又は２以上のペンダント（吊り下がり）基の付加を伴うことができる。従って、以下の明細書でより具体的に記述するように、外部は、粒子のターゲッティング（標的狙い）のための１又は２以上のペンダント抗原から成り立つことができる。また、外部は、溶解度に影響を与える、水酸基、チオール基、メチル末端のアルキル鎖、スルホン酸塩、リン酸塩、カルボン酸塩、及びカチオン性又は４級アミン基のような、個々の化学成分から成り立つことができる。更に、外部は、例えば水溶性の改善を与える親水性高分子、又は既知の生体許容性高分子のような、高分子層を含むことができる。高分子層は、生物分解可能高分子であることができて、これはインビボ又はインビトロで用いた時、一定期間の間ＮＯ供与体を水から保護する。このような高分子コーティングにより、高分子コーティングが分解されるまでの時間の間、ＮＯ放出動特性が影響を受けて、持続的なＮＯ放出が可能となる。本出願で記載した粒子の外部を官能基化するために適切な高分子としては、（ポリ）エチレンオキシド、（ポリ）ウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体、及びラクチド／グリコリド共重合体（例えば、ＰＬＧＡ）がある。
【００５７】
ＩＶ．Ａ．酸化窒素の標的を定めた運搬のための酸化窒素放出粒子
いくつかの実施態様において、粒子の更なる官能基化により、特定の細胞、組織、又は器官のターゲッティング（標的狙い）が可能となる。従って、幾つかの実施態様において、本出願で開示した酸化窒素放出粒子を、その表面又は外部に、選択的な認識因子を付加することにより、更に修飾できる。この様な選択的な認識因子としては、小分子リガンド；抗体及び抗体断片の様な生体分子；及びサイトカイン、ホルモン、炭化水素、砂糖、ビタミン、及びペプチドのような他の因子が挙げられるが、これらに制限されない。
特異的ターゲッティングの成分は、全ての場合に要求されるわけではない。幾つかの実施態様において、位置特異的ターゲッティングは、腫瘍脈管構造に伴う亢進した透過性、及び保持効果（ＥＰＲ）の様な、より受動的方法も含むことができる。位置特異的ターゲッティングは、疾病状態又は特定の器官又は組織に特異的な酵素と接触する場合のみ、ＮＯ放出を誘発するリンカーを含むＮＯ放出粒子を用いることにより、行うことができる。最後に、ターゲッティングは、また、粒子の、例えば、局所的に、直接傷へ、又は腫瘍部位へ直接注射することにより、局所的な運搬によって行うことができる。
【００５８】
一般的に、粒子が、細胞表面成分を通して細胞を標的とする場合、粒子は、受容体を介したエンドサイトシスにより細胞内に取り込まれる。標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面に局在する如何なる成分も、本出願で開示した粒子に利用される。例えば、上記の様な細胞表面成分に対する抗体を用いることができる。あるいは、標的成分は、細胞表面上に存在する受容体に向けられたリガンドであることもでき、逆も可能である。
特異的ターゲティング成分（即ち、特定の細胞、組織、又は器官に粒子を向けるために設計した粒子に結合した成分）を用いる粒子の実施態様において、ターゲッティング成分は、任意に粒子の外部と結合する。ターゲッティング成分は、例えば、アミン基、アルコール、カルボン酸塩、イソシアン酸塩、リン酸塩、チオール基、ハロゲン化物、又はエポキシド基のような、外部の有用な反応基を通して、外部に直接結合できる。例えば、標的細胞を認識する成分には必要ではないアミン基を含む、又は誘導化して含むターゲッティング成分は、カルボジイミド化学を用いて、粒子外部上に存在するカルボン酸塩と直接結合することができる。ターゲッティング成分はまた、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩(SPDP,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois,United State of Americaより商品として入手可能）のような、短い２価官能性のリンカーにより粒子の外部上の反応基に連結することができる。あるいは、EMD Bioscience,Inc.(La Jolla,California,USA)又はShearwater polymers(Huntsville,Alabama,USA)から商品として入手可能な、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ベースの２価のリンカーより長い２価のリンカーを用いることができる。
【００５９】
癌細胞を標的とする使用のためのターゲッティング成分は、腫瘍特異的抗原の周囲に設計できるが、このような腫瘍特異的抗原としては、本出願に開示した対象物に使用される、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、チロシナーゼ、ｒａｓ、シアル化ルイス抗原、ｅｒｂ、ＭＡＧＥ−１，ＭＡＧＥ−３，ＢＡＧＥ，ＭＮ，ｇｐ１００，ｇｐ７５，ｐ９７，プロテイナーゼ３，粘液素、ＣＤ８１，ＣＩＤ９，ＣＤ６３；ＣＤ５３，ＣＤ３８，ＣＯ−０２９，ＣＡ１２５，ＧＤ２，ＧＭ２，及びＯ−アセチルＧＤ３，Ｍ−ＴＡＡ，Ｍ−胎児又はＭ−泌尿器が挙げられるが、これらに制限されない。あるいは、ターゲッティング成分は、腫瘍抑制因子、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍特異的受容体リガンド、受容体、アポトーシス誘導体、又は分化誘導因子の周囲に設計できる。更に、腫瘍成長に血管新生過程が重要とすると、幾つかの実施態様において、ターゲッティング成分は、血管新生と結びついた因子を標的とするよう開発できる。従って、ターゲッティング成分は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）のような既知の血管新生因子と相互作用するように設計できる。Brannon-Peppas,L.及びBlanchette,J.O.,Advanced Drug Delivery Reviews,56,1649-1659(2004)を参照されたい。
ターゲッティングのために提供される腫瘍抑制タンパク質には、ｐ１６，ｐ２１，ｐ２７，ｐ５３，ｐ７３，Ｒｂ，Ｗｉｌｍｓ（ウィルム）腫瘍（ＷＴ−１），ＤＣＣ，神経線維腫症タイプ１（ＮＦ−１），ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ（フォンヒッペルリンダウ）（ＶＨＬ）病腫瘍抑制因子，Ｍａｓｐｉｎ（マスピン・転移抑制因子），Ｂｒｕｓｈ（ブラッシュ）−１，ＢＲＣＡ−１，ＢＲＣＡ−２，多重腫瘍抑制因子（ＭＴＳ），ヒト・メラノーマのｇｐ９５／ｐ９７抗原，腎細胞癌関連Ｇ２５０抗原、ＫＳ１／４広汎癌抗原、卵巣癌関連抗原（ＣＡ１２５），前立腺特異的抗原、メラノーマ抗原ｇｐ７５，ＣＤ９，ＣＤ６３，ＣＤ５３，ＣＤ３７，Ｒ２，ＣＤ８１，ＣＯ０２９，ＴＩ−１，Ｌ６及びＳＡＳがあるが、これらに制限されない。勿論、これらは例として示す腫瘍抑制因子であり、本出願で開示した対象物は、当業者に腫瘍抑制因子、又は、腫瘍抑制因子になるであろうと知られている他の如何なる因子とも関連して用いることができることは想像つく。
【００６０】
幾つかの実施態様において、腫瘍遺伝子により発現される因子に向けてターゲッティングが行われる。これらの物としては、Ｓｒｃファミリーのメンバーのような膜関連及び細胞質型両方のチロシンキナーゼ；Ｍｏｓ，成長因子の様な、セリン／スレオニンキナーゼ；及び血小板由来成長因子（ＰＤＤＧ）の様な受容体；ｒａｓファミリーメンバーを含む小ＧＴＰａｓｅ（Ｇタンパク質）；サイクリン依存型プロテインキナーゼ（ｃｄｋ）；ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ，及びＬ−ｍｙｃを含むｍｙｃファミリーのメンバー；及びｂｃｌ−２とそのファミリーメンバーがあるが、これらに制限されない。
本出願で開示した粒子によりターゲティングされるサイトカインとしては、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬＡ  １，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１４，ＩＬ−１５，ＴＮＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，β−インターフェロン及びγ−インターフェロンがあるが、これらにより制限されない。ケモカインとしては、Ｍ１Ｐ１α、Ｍ１Ｐ１β、及びＲＡＮＴＥＳがあるが、これらにより制限されない。
標的とされる酵素としては、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトースー１ーリン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセルブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチキジンキナーゼ、及びヒトチミジンキナーゼがあるが、これらにより制限されない。
【００６１】
本出願で開示された対象物の文脈で使用される受容体、及びこれに関連する関連リガンドとしては、葉酸受容体、アドレナリン作用性の受容体、成長ホルモン受容体、黄体形性ホルモン受容体、エストロゲン受容体、上皮成長因子受容体、繊維芽細胞成長因子受容体、等々が挙げられるが、これらに制限されない。幾つかの実施態様において、ターゲッティング成分は、葉酸、グアニジン、トランスフェリン、炭化水素、及び砂糖からなる群より選択される。幾つかの実施態様において、ターゲッティング成分は、アミノ酸配列ＲＧＤ及びＴＡＴペプチドからなる群から選択されるペプチドである。
例えば、葉酸は、癌細胞を標的とする特に有用なターゲッティング成分であることができる。癌性腫瘍細胞は、その細胞表面に、葉酸受容体の過剰発現がある。葉酸（ＦＡ）は、様々な割合の修飾を伴ってナノ粒子外部に結合し、ＮＯ放出ナノ粒子のＦＡを標的とする運搬に寄与する。そのサイズが小さいので、多くの葉酸リガンドが、粒子表面に付加される。Ｗｉｅｎｅｒは、葉酸が付加したデンドリマーは、高親和性葉酸受容体（ｈＦＲ）を欠く対照細胞では葉酸誘導化デンドリマーの顕著な集積はないが、特にｈＦＲを発現する腫瘍細胞の表面及び内部に集積することを報告している。Wiener,E.C.他、Invest. Radiol.,32(12),748-754(1997)を参照されたい。葉酸は、カルボジイミドカップリング反応により、粒子外部のアミン基に付加することができる。
【００６２】
葉酸より大きいが、なお相対的に小さいターゲティング成分は、５３個のアミノ酸残基を持つ単鎖ペプチドである上皮性成長因子（ＥＧＦ）である。リンカーＳＰＤＰを持つＥＧＦと連結したＰＡＭＡＭデンドリマーは、ヒト・グリオーマ細胞の細胞表面に結合し、エンドサイトーシスが行われ、リゾソームに集積する。Capala,J.,他、Bioconjugate Chem.,7(1),7-15 (1996)を参照されたい。ＥＧＦ受容体密度は、正常細胞に比べて、脳腫瘍細胞上では、１００倍まで高いので、ＥＧＦは、これらの種類の腫瘍細胞には、有用なターゲッティング試薬となる。ＥＧＦ受容体は、また、乳癌及び直腸癌で過剰発現しているので、これらの細胞でもまたターゲッティング試薬として使われることができる。同様に、繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）は、また相対的に小さなポリペプチド（ＦＧＦ）と結合し、また乳癌細胞株で高レベル発現することが知られている（特に図１，２及び４）。Penault-Llorca,F.,他、Int.J Cancer,61(2),170-176(1995)を参照されたい。
ホルモンとその受容体としては、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激（ＡＣＴＨ）、アンギオテンシンＩ，アンギオテンシンＩＩ，β−エンドルフィン、β−メラノサイト刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）、コレチストキニン、エンドセリンＩ，ガラニン、胃炎阻害ホルモン（ＧＩＰ），グルカゴン、インシュリン、アミリン、リポトロピン、ＧＬＰ−１（７−３７）ニューロフィジン、及びソマトスタチンが挙げられるが、これらに制限されない。
【００６３】
本出願で開示した対象物の目論見によると、ナノデバイスのターゲティング構成成分に置かれたビタミン類（脂溶性及び非脂肪可溶性）をある種類の細胞を標的にする為に用いることができて、その細胞は、これらのビタミン類に対する受容体を持つ、又はそうでなければ、これらのビタミン類を取り込む細胞である。ビタミンＤ及びこの類似体、ビタミンＥ，ビタミンＡ等々、又はビタミンＣ等々の様な、水溶性ビタミンは、この観点から特に好ましい。
様々な生物標的（例えば、感染源、腫瘍細胞、正常細胞）上の抗原又は免疫源（例えば、腫瘍、組織又は感染源特異的抗原）を標的とするために、抗体を作ることができる。本出願で開示した対象物の幾つかの実施態様において、ターゲッティング成分は、抗体又は抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂユニット）である。従って、"抗体"としては、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらにより制限されない。
【００６４】
多くの癌（乳癌ＨＥＲ２腫瘍も含め）の表面に見出される良く研究された抗原の１例として、糖タンパク質ｐ１８５があり、これは、専ら悪性細胞に発現される。Press,M.F.他、Oncogene5(7)、953-962(1990)を参照されたい。組み換えたヒト化抗−ＨＥＲ２モノクロナル抗体（rhuMabHER2)は、Genentech(South SanFrancisco,California,USA)から、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）の名前で、商品として入手可能である。本出願で開示した対象物の使用のために適切な他の代表的な抗体には、ＣＤ１４及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するＩｇＣ−型抗体である６０ｂｃａ及びＪ５９１（全
て本明細書に参考文献として取り込まれている、Baker,J.R.,Jr.,Biomacromolecules,5,2269-2274(2004)を参照されたい）、及び乳腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ−３のＥｒｂＢ２成長因子に結合する、抗体Ｆ５及びＣ１があるが、これらに制限されない。
本明細書に既に記載したように、粒子の持つ標的特異的なＮＯ運搬能は、粒子外部に付加したペンダント（吊り下がった）ターゲティング因子を含む実施態様のみに制限されない。粒子の非外部付加の特性もまた、ターゲティングのために使用される。従って、幾つかの実施態様において、亢進した透過性及び保持（ＥＰＲ）効果が、ターゲティングのために使われる。このＥＰＲ効果は腫瘍の超透過性脈管構造、及び乏しいリンパ排液を原因とする腫瘍ミクロ環境における高分子、及び小粒子の選択的集積である。幾つかの実施態様において、ＥＰＲを高めるために、粒子外部を、親水性高分子で塗布し、又は結合させ、粒子の循環半減期を高め、プラズマタンパク質の粒子への付着を阻む。
【００６５】
幾つかの実施態様において、ターゲッテング成分は、磁鉄鉱のような磁化成分であることができる。幾つかの実施態様において、粒子のコアは磁鉄鉱を含む。幾つかの実施態様において、磁鉄鉱コアは、さらに、ＮＯ供与体を含む、又は含むように官能基化されることができる、共凝縮したシリカネットワークを含むシェルで被覆される。患者に一度投与されると、磁石を利用して磁化粒子をその標的、即ち、ＮＯ放出を望む部位、に向けることができる。この様な磁石は、外部（即ち、病人又は患者の外から）から適用できる。
標的を定めた薬剤運搬の、更なる方法の例として、特に、癌治療のための標的狙いの系があり、Brannon-Peppas,L.及びBlanchette,J.O.,Advanced Drug Delivery Reviews,56,1649-1659(2004)及び米国特許番号６，４７１，９６８、これらは、本明細書に参考文献として全体が取り込まれている。
【００６６】
ＩＶ．Ｂ  酸化窒素放出粒子の画像
幾つかの実施態様において、ＮＯ放出粒子は、インビボ又はインビトロにおいて粒子の画像又は追跡を助ける成分を含むことができる。粒子の追跡は、酸化窒素放出効率を決める上で、疾病を治療する上で、又は粒子のターゲティングの特異性を評価する上で有効であることができる。画像化又は追跡成分は、粒子のコア、内部、又は外部の何れかと結合することが可能である。幾つかの実施態様において、画像化又は追跡成分は、粒子のコア、内部、又は外部の一つと共有結合している。幾つかの実施態様において、追跡試薬又は成分は、例えば、量子ドットコアを持つ粒子の例のように、コアの部分である。
幾つかの実施態様において、画像化試薬の追跡は、蛍光分子、有機染料、又は放射性同位元素の一つである。
幾つかの実施態様において、画像化試薬は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）コントラスト試薬であることができる。従って、幾つかの実施態様において、粒子の外部は、例えば、通常ＭＲＩ試薬として使われるＧｄ（ＩＩＩ）−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡ）のキレート基である、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の様な、常磁性イオンとキレートすることができる基を含むよう官能基化されることは知られている。此の文脈で有用であることができる、他の常磁性イオンとしては、ガドリニウム、マンガン、銅、クロムイオン、鉄、コバルト、エルビウム、ニッケル、ユーロピウム、テクニチウム、インジューム、サマリウム、ジスプロシウム、ルテニウム、イッテルビウム、イットリウム、及びホルミウムイオン、及びこれらのコンビネーションがあるが、これらに制限されない。
【００６７】
ＩＶ．Ｃ．付加的治療試薬
幾つかの実施態様において、１又は２以上の付加的治療試薬を、本出願で記述した粒子のＮＯ供与体と組み合わせて用いることができる。このような付加的試薬は、粒子自体の中に取り込まれることができ；粒子を含む調剤の部分に取り込まれることができ；又は前、後、に分離した薬剤配合物として、又は同時の粒子を含む薬剤配合物として、服用量の部分として取り込まれることができる。このような付加的治療薬剤として、特に、抗癌治療薬、抗菌剤、苦痛緩和剤、抗炎症薬、血管拡張薬、及び免疫抑制剤、さらに、疾患又は治療される状態の軽減を亢進するであろう全ての他の既知の治療薬が挙げられる。
ＮＯ放出粒子に付加的治療因子又は薬剤が組み込まれる実施態様において、付加的治療薬は、粒子の外部、内部、又はコアの何れかと関係づけられることができる。例えば、付加的薬剤は、コア又は粒子の内部のリンカー内にカプセル化できる。付加的薬剤は、粒子のコア、内部又は外部に共有結合で結合できる。更に、付加的因子の結合は、放出誘発法と関連させることができて、ここで、脆弱性リンカーを介して付加的薬剤を粒子に繋げることができて、これにより、好ましくは望みの作用部位（例えば、腫瘍細胞など）において、水との接触、ｐＨの上昇、又は酵素的又は光開裂、によって試薬を放出する。
ＮＯ放出粒子と組み合わせて用いられる付加的治療薬剤の選択は、様々な因子によると考えられ、考慮する因子としては、疾病の種類、年齢、及び患者の一般的健康状態、疾病進行の激しさ、及び患者の組合せを含む薬剤への許容力が挙げられるが、これらに制限されない。
【００６８】
"抗腫瘍"薬又は"化学療法薬"と記載される様々な化合物が、癌治療で用いられる、本出願で開示されたＮＯ放出粒子と組み合わせて、又は組み込まれて用いることができる。この様な化学療法化合物としては、アルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、タンパク質合成阻害剤、ＤＮＡ又はＲＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ塩基類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管新生阻害剤、及びテロメラーゼ阻害剤又はテロマー化ＤＮＡ結合化合物があるが、これらに制限されない。例えば、適切なアルキル化剤としては、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホン酸塩；ベンゾジゼパ、カルボクオン、ムチュレデパ、及びウレデパのようなアジリジン；アルトゥレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンティオホスホラミド、及びトリメチロールメラミンのようなエチレニミン及びメチルメラミン；クロランブシル、クロルナファジン、サイクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドゥニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンのようなニトロソウレアが挙げられる。
【００６９】
癌の治療に用いられる抗生物質としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、イダルビシン、ブレオマイシン硫酸塩、マイトマイシン、プリカマイシン、及びストレプトゾシンがある。化学療法抗体謝剤としては、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドゥリビン、フルダラビンリン酸塩、フルオロウラシル（５−ＦＵ），フロクスウリジン、シタラビン、ペントスタチン、メトトゥレキセート、及びアザチオプリン、アシクロビル、アデニンβ−１−Ｄ−アラビノシド、アメトプテリン、アミノプテリン、２−アミノプリン、アフィジコリン、８−アザグアニン、アザセリン、６−アザウラシル、２’−アジド−２’−デオキシヌクレオシド、５−ブロモデオキシシチジン、シトシンβ−１−Ｄ−アラビノシド、ジアゾオキシノルロイシン、ジデオキシヌクレオシド、５−フルオロデオキシシチジン、５−フルオロデオキシウリジン、及びヒドロキシウレアがある。
【００７０】
化学療法蛋白合成阻害剤としては、アブリン、アウリントリカルボキシル酸、クロランフェニコール、コリシンＥ３，シクロヘキシミド、ジフテリア毒素、エデニンＡ，エメチン、エリスロマイシン、エチオニン、フッ化物、５−フルオロトリプトファン、フシジン酸、グアニリルメチレンジホスホン酸塩、及びグアニリルイミドジホスホン酸塩、カナマイシン、カスガマイシン、キロマイシン、及びＯ−メチルスレオニンがある。更なるタンパク質合成阻害剤としては、モデクシン、ネオマイシン、ノルバリン、パクタマイシン、パラモマイシン、ピューロマイシン、リシン、志賀菌毒素、ショウドマイシン、スパルソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チオストレプトン、及びトリメトプリムがある。ＤＮＡ合成阻害剤は、本出願で開示した癌治療の一部分として用いることができて、該阻害剤としては、ジメチル硫酸、マイトマイシンＣ，ナイトロジェン及びサルファーマスタード、等のアルキル化剤；アクリジン色素、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アントラセン、ベンゾピレン、エシジュームブロマイド、プロピジュームジイオダイド−インタートワイニングなどのインターカレート薬剤、ディスタマイシン及びネトロプシンのような薬剤がある。トポイソメラーゼ阻害剤、細胞分裂阻害剤、及び、ＲＮＡ合成阻害剤は、また、本出願で開示した対象物の粒子と組み合わせて、又は組み込むことができて、適切な癌治療を提供するが、トポイソメラーゼ阻害剤としては、クメルマイシン、ナリジクス酸、ンボビオシン、オキソリン酸があり；細胞分裂阻害剤としては、コルセミド、コルヒチン、ビンブラスチン、及びビンクリスチンがあり；ＲＮＡ合成阻害剤としては、アクチノマイシンＤ，α−アマニチン、及び、他のカビのアマトキシン、コルディセピン（３’−デオキシアデノシン）、ジクロロリボフラノシルベンジミダゾール、リファンピシン、ストゥレプトバリシン、及びストゥレプトリディジンがある。
【００７１】
従って、本出願が記載するＮＯ放出粒子の一部として、又は組み合わせて用いることができる、現代の化学療法薬剤としては、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ），エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ，マイトマイシン、シスプラチン、過酸化水素、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、クロランブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、タモクシフェン、タキソール、トランスプラチナム、ビンブラスチン、及びメトトゥレキセート、等々がある。
【００７２】
本明細書で用いた様に、用語"抗菌剤"は、バクテリア、カビ、酵母菌、又はヴィールスを殺す、成長を阻害する、又は成長を阻止する如何なる薬剤に対しても用いられる。本出願で開示したＮＯ放出粒子に組み込まれることができて、微生物感染の治療を助ける、又は感染を阻害する適切な抗菌剤には、バンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、及びアミカシンがあるが、これらに制限されない。他の抗菌剤としては、２−ｐ−スルファニリーアニリノエタノール、４，４’−スルフィニルージアニリン、４−スルファニルアミドサリチル酸、アセジアスルフォン、アセトスルフォン、アミカシン、アモキシシリン、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、アパルシリン、アピシクリン、アプラマイシン、アルベカシン、アスポキシシリン、アジダムフェニコール、アジスロマイシン、アズトゥレオナム、バシトラシン、バンベルマイシン（複数）、ビアペネム、ブロジモプリム、ブチロシン、カプレオマイシン、カルベニシリン、カルボマイシン、カルモナム、セファドゥロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セフブペラゾン、セフクリジン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメット、セフィクシム、セフェメノキシム、セフェニノクス、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタクシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピローム、セフプロジル、セフロクサジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフトリアクソン、セフゾナム、セファレクシン、セファログリシン、セファロスポリンＣ、セファラジン、クロランフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロクサシン、クラリスロマイシン、クリナフロクサシン、クリンダマイシン、クリンダマイシンリン酸塩、クロモサイクリン、コリスチン、シクラシリン、ダプソン、デメクロサイクリン、ジアシモスルフォン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、エノクサシン、エンビオマイシン、エピシリン、エリスロマイシン、フロモクセフ、フォルチマイシン（複数）、ゲンタイマイシン（複数）、グルコスルフォン、ソラスルフォン、グラミシジンＳ、グラミシジン（複数）、グレパフロクサシン、グアメサイクリン、ヘタシリン、イミペネム、イセパミシン、ホサマイシン、カナマイシン（複数）、ロコマイシン（複数）、リンコマイシン、ロメフロクサシン、ルセンソマイシン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メロペネム、メタサイクリン、ミクロノマイシン、ミデカマイシン（複数）、ミノサイクリン、モクサラクタム、ムピロシン、ナジフロクサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ノルフロクサシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、パニペネム、パロモマイシン、パズフロクサシン、ペニシリンＮ，ピパサイクリン、ピペミジン酸、ポリミクシン、プリマイシン、キナシリン、リボスタマイシン、リファミド、リファンピン、リファマイシンＳＶ，リファペンチン、リファキシミン、リストセチン、リティペネム、ロキタ���イシン、ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、サラゾスルファジミジン、サンサイクリン、シソマイシン、スプラフロクサシン、スペクチノマイシン、スパルマイシン、ストレプトマイシン、スクシスルフォン、スルファクリソイジン、スルファロキシン酸、スルファミドクリソイジン、スルファニル酸、スルフォクソン、テイコプラニン、テマフロクサシン、テモシリン、テトラサイクリン、テトロクソプリム、チアンフェニコール、チアゾールスルフォン、チオストレプトン、チカルシリン、チゲモナム、トブラマイシン、トスフロクサシン、トリメトプリム、トロスペクトマイシン、トロバフロクサシン、ツベラアクチノマイシン、及びバンコマイシンが挙げられる。抗菌薬剤には、また、アンフォテリシンＢ、アザセリン、カンジシジン（複数）、クロルフェネシン、デルモスタチン（複数）、フィリピン、フンジクロミン、メパルトリシン、ニスタチン、オリゴマイシン（複数）、ペリマイシンＡ，チュベルシジン、イミダゾール、トリアゾール、及びグリーソフルビンのような、抗カビ薬剤も含まれる。
【００７３】
Ｖ．治療方法
幾つかの実施態様において、本出願で開示した対象物は、本明細書で定義したように、酸化窒素を患者まで運搬する方法を提供し、この方法は、幾つかの実施態様において、その治療が必要な患者の疾患又は健康状態を治療することを意図するものである。幾つかの実施態様において、本出願で開示した対象物は、患者の特定の部位に、酸化窒素の標的を定めた運搬のための方法を提供する。この様な部位は、特定の細胞、組織、器官であっても良い。従って、本出願で開示した対象物は、任意に少なくとも１つの付加的な治療薬剤と組み合わせて酸化窒素供与体を投与することにより、癌、心血管疾患及び微生物感染を治療する方法；血液を医学的デバイスに曝すことに起因する血小板凝集及び血小板接着を阻害する方法；異常な細胞増殖に起因する病理学的状態を治療する方法；移植拒絶、自己免疫性、炎症性、増殖的、超増殖的、血管疾患；再発狭窄症の予防、及び／又は治療処理を含め、瘢痕組織の減少、又は創傷の収縮のための方法；を提供する。本出願で開示した対象物は、また、炎症、痛み、発熱、胃腸障害、呼吸器障害、性機能障害、及び性的感染症を治療する方法を提供する。
【００７４】
Ｖ．Ａ．患者
幾つかの実施態様において、本出願で開示した対象物の方法は、本明細書で定義した、患者の治療に有用であることができる。本出願で開示した対象物で治療される患者は、多くの実施態様において、ヒト患者であるが、本出願で開示した対象物の原理により、本出願で開示した対象物は、哺乳動物を含め、全ての脊椎動物種に関して有効であると言うことを理解すべきであり、哺乳動物も用語"患畜"に含まれる事を意図している。此の文脈において、哺乳動物は、治療が望まれる、特に農業及び家庭内の疾患のある、哺乳動物種全てを含むと理解される。
従って、本明細書で用いるように、用語"患者"は全ての無脊椎又は脊椎動物種を表す。本出願で開示した対象物の方法は、温血脊椎動物の治療において特に有用である。従って、本出願で開示された対象物は、哺乳動物及び鳥類に関与する。より具体的には、ヒトのような哺乳動物、及び（シベリアタイガーのように）絶滅の危機にある、（ヒトによる消費のために農場で飼育される動物のように）経済的に重要である、及び／又は例えば、ヒト以外の肉食動物（ネコ及び犬のように）、（豚、ホッグ、及びイノシシのような）スワイン、（畜牛、雄牛、羊、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダのような）反芻動物、及び馬のように（ペット又は動物園で保持されている動物）ヒトにとって社会的に重要であると言う理由で、重要な哺乳動物の治療、及び／又は診断が提供される。また、動物園で保護されて絶滅の危機にある種類の鳥、及びヒトにとって経済的に重要であるので、ニワトリ、特に例えば七面鳥、チキン、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥の様な家禽である、家畜としてのニワトリの治療が、提供される。従って、家畜としてのスワイン（豚及びイノシシ）、反芻動物、馬、鶏、等々を含む、がこれらに制限されない、家畜の治療が提供される。
【００７５】
Ｖ．Ｂ．配合剤
本出願で開示した治療組成物は、幾つかの実施態様において、本出願で開示した酸化窒素放出ナノ粒子及び医薬的に許容された担体を含む組成物からなる。適切な組成物としては、抗酸化剤、緩衝液、抗菌剤、殺菌性抗生物質を含む水溶液性及び非水溶液性無菌注射液、及び配合剤を意図した受益者の体液と等張にする溶質；及び懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性無菌懸濁物が挙げられる。
幾つかの実施態様において、本出願で開示した治療組成物は、酸化窒素放出ナノ粒子と組み合わせた付加的治療薬剤からなり、ここで付加的治療薬剤は、付加的な希望の治療特性を持つ、又は酸化窒素放出ナノ粒子の治療効果を促進する。付加的治療薬剤は、同一、又は異なる治療組成物で投与される。従って、用語"と組み合わせて"は、活性薬剤を単一組成物としての投与又は１又は２以上の分離した組成物での投与を表すことができる。
本出願で開示した方法において用いられる組成物は、油性又は水溶液性媒体中の懸濁物、溶液、又は乳濁液のような形をとり、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散性薬剤のような、製剤用作用物質を含むことができる。あるいは、活性な構成要素は、粉末状であり、使用前に、適切な媒体、例えば無菌パイロジェンフリー水、と共に組成体を作ることができる。
【００７６】
治療用組成物は、例えば、密封したアンプル又は水薬ビンのようなコンテナ中に単位用量又は複数用量入れることができて、冷凍条件、又は使用直前に無菌液体担体を加えるだけの凍結乾燥状態で保存できる。
経口投与のために、組成物は、結合薬剤（例えば、前もってゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微細結晶化セルロース又はカルシウムリン水素酸塩）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、又はシリカ）；錠剤分解物質（例えば、ポテトデンプン又はグリコール酸ナトリウムデンプン）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような、医薬的に許容された賦形剤を伴って従来型の技術により製造される、例えば、錠剤又はカプセルの形をとることができる。錠剤は、既知の技術により被覆される。例えば、治療薬剤は、ヒドロクロロチアジドと組み合わせて形作られ、また治療薬が標的器官に到着するまで治療薬剤を保護する、腸溶性、又は遅延放出被覆を施されたｐＨに安定化したコアとして形作られることができる。
経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、又は懸濁液の形をとることができる、又は乾燥産物として与えることができて、使用前に水又は他の適切な媒体と伴に調製される。この様な液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルローズ誘導体又は水素化した食用油）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水溶液性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画した植物油）；及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）のような、医薬的に許容された付加物を伴って、従来の技術により製造することができる。この製剤は、また、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色料及び甘味料を含むことができる。経口投与のための製剤は、適切に配合されて、活性化合物の制御された放出を行うことができる。舌下剤投与に対して、組成物は、従来様式で配合される錠剤又はトローチ剤の形をとることができる。
【００７７】
化合物をまた、埋め込み、又は注射のための調剤として配合することができる。従って、例えば、化合物は、適切な高分子又は疎水性材料（例えば、許容された油を使った乳濁液として）、又はイオン交換樹脂、又は難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）配合することができる。化合物はまた、直腸の組成物（例えば、座薬、ココアバター又は他のグリセリドのような従来の座薬の塩基を含む滞留浣腸）、クリーム又はローション、又は経皮パッチ中に配合できる。
医薬的配合物はまた、吸入による、噴霧剤としての投与に適切なものを供与する。これらの配合物は、本明細書で記載したＮＯ放出粒子の溶液又は懸濁液を含む。好みの配合物を、小チャンバーに入れることができ、噴霧する。噴霧は、圧縮した空気、又は超音波エネルギーで行うことができて、ＮＯ放出粒子を含む複数の液体ドロップ又は固体粒子を作る。例えば、本出願で開示したＮＯ放出粒子は、吸入により投与ができて、嚢胞性線維症に関係する細菌感染を治療する。嚢胞性線維症関連の細菌感染としては、Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa)感染があるが、これに制限されない。
【００７８】
Ｖ．Ｃ．投与量
本明細書で用いる用語"有効量"は、測定できる生物的応答を作り出すに充分な治療薬組成物（例えば、酸化窒素放出粒子を含む組成物）の量を表す。本出願で開示した対象物の活性組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、及び／又は適用に対する好ましい応答を得るに有効な活性化合物を投与するために、変えることができる。選択した用量レベルは、組成物の活性、配合物、投与経路、他の薬剤又は治療との組合せ、治療される健康状態の重篤さ、及び治療を受ける患者の物理的状態及び医療前歴を含めて多くの因子に依存すると考えられる。好ましくは、最小容量を投与し、最小の有効量まで、毒性をもたらさない用量まで用量を増やす。有効量の決定及び修正、及びこの様な修正を何時どの様に行うかについての評価、は医療における当業者に既知である。
本明細書で開示した組成物の投与に対し、齧歯動物モデルへの投与用量に基づきヒト用量へ外挿する従来の方法は、マウス用量をヒト用量へ変換するための変換因子を用いて行うことができる：ヒトｋｇ当たりの用量＝マウスｋｇ当たりの用量ｘ１２．Freireich他、Cancer Chemother Rep.50,219-244(1966)を参照されたい。薬剤用量はまた、体表面積平方メートル当たりのミリグラムでも得ることができて、その理由は、この方法は、体重を用いるより、ある種の代謝及び排泄機能に対しよい相関をもたらすからである。更に、体表面積は、成人、子供だけでなく異なる動物種への薬剤用量に対する共通分母として用いることができる。Freireich他、Cancer Chemother Rep.50,219-244(1966)を参照されたい。手短に述べると、如何なる与えられた動物種においても、ｍｇ／ｋｇ用量を等価なｍｇ／ｓｑｍ用量で表すためには、用量に適切なｋｍファクターを乗じなさい。成人において、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇｘ３７ｋｇ／ｓｑｍ＝３７００ｍｇ／ｍ２である。
【００７９】
配合物と用量に関して更なる手引きとしては、米国特許番号5,326,902;5,234,933;国際公開WO 93/25521; Berkow他、The Merck Manual of Medical Information,Home編,Merck Research Laboratories:Whitehouse Station,New Jersey(1997);Goodman他,Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics,第9版.McGraw-Hill Health Professions Division:New York(1996);Ebadi,CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology, CRC Press, Boca Raton, Florida(1998);Katzung,Basic & Clinical Pharmacology,第8版.Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub. Division: New York(2001);Remington他,Remington's Pharmaceutical Sciences,第15版.Mack Pub.Co.:Easton,Pennsylvania(1975);及びSpeight他,Avery's Drug Treatment:A Guide to the Properties,Choice,Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management,第4版.Adis International:Auckland/ Philadelphia(1997);Duch他,Toxicol.Lett.,100-101,255-263(1998)を参照されたい。
【００８０】
Ｖ．Ｄ．投与の経路
本出願で開示した対象物の組成物を患者に投与するに適切な方法には、全身投与、非経口投与（血管内、筋肉内、動脈内投与のような）、経口運搬、舌下運搬、皮下投与、吸入、気管支内導入、外科的な埋め込み、経皮的運搬、局所注射、及び超高速注射／照射があるが、これらに制限されない。適用可能な箇所では、連続的な輸液は、標的部位での薬剤の蓄積を高めることができる（米国特許番号６，１８０，０８２を参照されたい）。
本出願で開示した対象物の方法に基づいて使われる薬剤投与の特別な様態は、薬剤、及び／又は使う担体、治療を受ける健康状態の重篤性、及び投与後の活性薬剤の代謝又は除去のメカニズムを含むが、これらに制限されない、多くの因子に依存する。
【００８１】
ＶＩ．ＮＯ放出粒子を含む組成物
幾つかの実施態様において、ＮＯ放出粒子を、高分子フィルムに取り込むことができる。この様な取り込みは、高分子表面への粒子の静電気的相互作用を介した、又は高分子表面の反応基への粒子の共有結合による結合による、高分子表面への粒子の物理的な埋め込みでできる。あるいは、粒子は、液体高分子前駆体の溶液に混ぜ合わされ、高分子が硬化した時、高分子マトリクスに取り込まれることができる。重合可能基は、粒子外部を官能基化するために用いることができて、これによって、粒子を重合過程に高分子の中で共―重合化することができる。ＮＯ放出粒子を取り込むことができる適切な高分子としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、及びポリビニリデンのような、ポリオレフィン、さらにポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン等々がある。特に、ポリウレタンは、医学的に区分されたポリウレタンを含むことができる。医学的に区分されたポリウレタンの一般的構造を図９Ａに示す。この様なポリウレタンとしては、固い区分、即ち、相対的に硬い部分、及び柔らかい区分、即ち、変化し、相互変換する配置で存在できるより多くの自由度を持つ部分を挙げることができる。医学的に区分されたポリウレタンは、また、高分子に更なる長さ又は重さを加える、アルキレン鎖の様な、１又は２以上の拡張部分を含むことができる。この様なポリウレタンは、また非毒性である。医学的に区分されたポリウレタンの例は、ＴＥＣＯＦＬＥＸ（Ｒ）である。図９Ｂを参照されたい。
【００８２】
ＮＯ放出粒子を含む高分子フィルムは、特に外科的道具、生物センサー、及び医学的埋め込み物のような、様々な品物を被覆するために用いることができて、血小板凝集を防ぎ、細菌感染を防ぎ、血管拡張剤として働く。これらの記事は血管の医療用デバイス、尿路の医療用デバイス、胆管の医療用デバイス、胃腸の医療用デバイス、外科的手術部位の配置場所に適合した医療用デバイス、及び皮膚創傷又は皮膚開口の配置場所に適合した医療用デバイスに用いられる。従って、この高分子は、動脈ステント、ガイドワイアー、カテーテル、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護メッキ、腰及び関節交換、電気導線、生体センサー、プローブ、縫線、外科用ドレープ、傷用包帯及び包帯を被覆するために用いることができる。
幾つかの実施態様において、被覆されたデバイスは、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、チタン、アルミニウム、銅、金、銀、白金、及びこれらのコンビネーションのような金属表面を持つことができる。幾つかの実施態様において、ＮＯ放出粒子を含むフィルム又は高分子は、ガラス又は繊維（例えば、布又は紙）のような非金属表面を被覆するために用いることができる。
更に、ＮＯ放出粒子を含む高分子は、デバイス自体を作るために用いることができる。例えば、高分子は、血液又は組織の保管用バッグ用に、又は傷用包帯として形作ることができる。
【００８３】
更に、ＮＯ放出粒子は、抗菌石鹸のような、しかしこれに制限されない、界面活性剤中に取り込まれることができる。例えば、棒石鹸に埋め込まれた粒子の中のＮＯ放出は、使用時に水との接触、及び／又はｐＨの低下により誘発される。棒石鹸の外部表面は、すり減り、又は溶けるので、棒石鹸中のさらなる粒子が、その後の棒石鹸の使用のために露出される。ＮＯ放出粒子は、また液体石鹸中に懸濁できる。この様な石鹸又は界面活性剤は、個人的な衛生のために使われ、又は繊維に対する抗菌処理を提供するために使用できる。この様な、石鹸、又は界面活性剤は、家庭用の表面、又は病院、又は細菌、カビ、又はウィルスに曝される可能性のある、他の医療環境すべての表面を処理するために用いることができる。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例に含まれることは、本出願で開示した対象物の代表的実施態様を実行する上での、当業者に対する手引きを提供することである。本出願の開示と、一般的な技術レベルを踏まえて、以下の実施例は例を示しただけであり、本出願で開示した対象物の範囲から離れることなく、無数の変化、修飾、改変が可能であることを、当業者は認識することができる。
【００８５】
実施例１  アミン基で官能基化した金ナノ粒子の合成
金ナノ粒子を２段階過程でアミン官能基化し、第１段階では、金ナノ粒子コアにＢｒ官能基化したチオールリガンドを交換し、次の段階で、Ｂｒとの反応でアミン基を付加する。図２を参照されたい。試料の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが合成の各段階に対して得られ、図１０に示す。
より具体的には、水素化ホウソナトリウムの存在下で、水素テトラクロロ金酸塩とヘキサンチオールの反応を経たＢｒｕｓｔ法により、金ナノ粒子を合成した。Hostetler,M.I.他、Langmuir,14,17-30(1998)を参照されたい。３０分後、水を加えて反応を停止させた。ナノ粒子を濾過により集め、アセトニトリルで洗浄し、その後位置交換法により、臭素末端のアルカンチオールを用いて官能基化した。Hostetler,M.I.他、Langmuir,15,3782-3789(1999)を参照されたい。
入ってくる臭素末端リガンド（本明細書の以下に記載する実施例２に合成された１１−ブロモ−１−ウンデカンチオール）（Troughton,B.B.他、Langumuir、4,365-385(1988）を参照されたい)を金ナノ粒子のメチレンクロライド溶液に加え（メチル基末端に対する臭素末端の比が３：１のアルカンチオール）、３０分間攪拌した。溶媒を回転蒸発により取り除き、金ナノ粒子をアセトニトリルで精製した。リガンド交換の程度を、ＮＭＲでモニターし、反応時間、及び／又は臭素―アルカンチオールの濃度を変えることによりコントロールした。次ぎに、臭素官能基化した金ナノ粒子をトルエン、又はメチレンクロライドに溶かしエチレンジアミン、ブチルアミン、ヘキサンジアミン、又はジエチレントリアミンと反応させた。官能基化したナノ粒子のＮＭＲスペクトルにおいて、−ＣＨ２Ｂｒピークが消えることは、反応の完了を示す（図１０を参照のこと）。次ぎに、アミン官能基化した金ナノ粒子をメタノール及びメトキシドナトリウム塩基の溶液に懸濁し、常に攪拌しながら３日間、５気圧ＮＯの圧を掛け、ジアゼニウムジオレイン酸塩ＮＯ供与体の合成を進行させた。Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾の単層で保護されたクラスター（ＭＰＣｓ）を濾過し、過剰なメタノールで洗浄し、使用まで−４℃に保存した。
【００８６】
ＭＰＣ金ナノ粒子のサイズ及び安定性については、熱重量分析（ＴＧＡ），ＵＶ−Ｖｉｓスペクトロスコピー、及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、特性を調べた。ヘキサンジアミン修飾金ナノ粒子の有機含量は、約２２％であると測定され、２２％と言う値は、５３個のチオールリガンドで保護された１４０個の金原子（コア）を含むヘキサンジオール−ＭＰＣｓについての過去の報告と一致した。Hostetler,M.I.他、Langumuir,14,17-30(1998)を参照されたい。
ＮＯは非常に反応性が高く、金イオウ結合を壊す可能性があるので、(Hrabie,J.A.及びKeefer,L.K.,Chemical Review、102,1135-1154(2002)を参照されたい）高圧ＮＯに曝した後のヘキサンチオール−ＭＰＣｓの安定性を、ＴＧＡ及びＵＶ−Ｖｉｓスペクトロスコピーを用いて評価し、ジアゼニウムジオレイン酸塩形成に必要な条件が、ナノ粒子全体性を損ねない事を裏付けた。ナノ粒子の有機含量（ＴＧＡで分析）及びＵＶ−Ｖｉｓスペクトルが、ＮＯへの暴露後同じであったことは、単層の安定性に（ＮＯは）殆ど影響を与えないことを示す。透過型電子顕微鏡像により更に、ナノ粒子のコア直径は、アミン誘導体化又はジアゼニウムジオレイン酸塩形成と無関係に、一定（２．１±０．９ｎｍ）であることを確認した。これらの研究は、ＭＰＣ金ナノ粒子の構造的な全体性は、ＮＯ供与体の合成、及びＮＯ放出能の導入に必要な条件により損なわれない事を示唆する。
【００８７】
実施例２  １１−ブロモ−１−ウンデカンチオールの合成
１１−ブロモ−１−ウンデカンチオールを、２段階で合成した（図１１を参照のこと）。第１に、１１−ブロモ−１−ウンデセン（５．０ｇ）をトルエン（５０ｍＬ）中で、ＡｉＢＮ（１．５ｇ）及びチオ酢酸（１０ｍＬ）との反応により、チオ酢酸塩に変換した。反応は、Ａｒ気流中で行い、２時間還流した。溶液を過剰な水で洗浄し、回転蒸発により、トルエンを除いた。１１−ブロモ−１−ウンデカンチオアセテートを乾燥ＨＣｌに暴露して、チオ酢酸塩を、チオールに変換した。塩化アセチル（６ｍＬ）をＡｒ気流中で、氷浴中の乾燥メタノールに滴下して加えた。この溶液を室温まで温め、反応を約６時間進行させた。塩化メチレン及び水を加え、塩化メチレン層を水で数回洗浄した。溶媒を回転蒸発で除いた。
【００８８】
実施例３  酸化窒素放出測定のための一般的手順
本出願で開示したＮＯ放出粒子の酸化窒素放出を、以下の一般的手順に従い測定した。図１２を参照し、所定の容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４，３７℃）を容器、例えば丸底フラスコ、に入れた。容器の入口を窒素ガス、出口を窒素と酸化窒素の混合ガスのため以外密封した。出口を化学発光酸化窒素分析器と溶液により接続した。ジアゼニウムジオレイン酸塩化学種溶液の一部をＰＢＳ緩衝液に注入した。化学発光酸化窒素分析器により、ＮＯはオゾン（Ｏ３）と反応し、励起ＮＯ２＊を作り、反応図２に示すように、ＮＯ２＊は電磁波（ｈν）を発光することにより、ＮＯ量を測定した。
【化３】
2008545714.tif 000005
反応図２．化学発光によるＮＯの測定
【００８９】
実施例４  アミン誘導化単層により保護された金ナノ粒子からの酸化窒素放出の測定
酸化窒素放出は、リン酸緩衝液塩溶液中で、生理的温度及びｐＨにおいて、Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＮＯＡＴＭ  化学発光酸化窒素分析器(Boulder,Colorado,USA)を用いて測定した。以下の表１及び図１３に示すように、ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾金ナノ粒子からのＮＯ放出は、置換したアミン基リガンドの数、及び／又は化学構造を変えることにより、調節できる。官能基化した単層で保護されたクラスター（ＭＰＣ）金ナノ粒子からの酸化窒素放出を示す図式を図１４に示す。
【表１】
2008545714.tif 000006
【００９０】
実施例５  単層保護の金ナノ粒子からなるＮＯ放出粒子からの結果
表１及び図１３を再度参照すると、エチレンジアミンリガンドの濃度を１４から２１％に上げると、対応して全ＮＯ放出量（９７５０から１９，３００ｐｍｏｌＮＯ／ｍｇＭＰＣ）及びＮＯ放出持続時間（２００から３００分）の増加をもたらす。特別な操作理論によるなく、ＮＯ放出の増加は、アミン基の濃度増加によるＮＯ供与体形成の増加に起因すると言うことが示唆される。ヘキサンチオールＭＰＣ対照から、また少量のＮＯ（４００ｐｍｏｌ／ｍｇ）が測定された。しかしながら、このＮＯ放出は、５分間以上の長い時間では無視できるので、ジアゼニウムジオレイン酸塩合成に必要な条件（５気圧ＮＯ）で、少量のＮＯが恐らく疎水性アルキル鎖の間にインターカレートするが、このようなＮＯは溶液内において急速に放出されることが示唆される。
ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾ＭＰＣｓはまた、暖かい（３７℃）の窒素ガス気流中で低レベルのＮＯを放出するので、熱分解機構の関与が示唆される。しかしながら、ＮＯ放出のレベルは、緩衝液中の方が大きいので、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾ナノ粒子は、プロトン駆動、及び熱分解の両者を受けることが示唆される。ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾ＭＰＣＳは、窒素中に−４℃で保存すると、１４日間まで（研究した最大期間）は、完全なＮＯ放出特性を保持する。
【００９１】
ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾ＭＰＣｓからのＮＯ放出はまた、アミン基前駆体構造を変えることで調節される。アルキル鎖を伸ばして、窒素を２から６メチレン基ユニット遠ざけると、ＮＯ放出の全量が増加する（表１及び図１３ｄ及びｆを参照のこと）（エチレンジアミン−及びヘキサンジアミン−修飾ＭＰＣｓに対し、夫々１９，３００から８７，０００ｐｍｏｌＮＯ／ｍｇＭＰＣ）ので、ＮＯ放出／ジアゼニウムジオレイン酸塩構造関係が示唆される。
実際、半減期データ（表１）より、アミン基の間を離すと、小分子ジアゼニウムジオレイン酸塩に対して報告された分解挙動と類似して、ＮＯの放出もより急速になることが分かる。Hrabie,J.A.,他,J.Org.Chem.,58,1472-1476(1993);Davies,K.M.他,J.Am.Chem.Soc.,123,5473-5481(2001)を参照されたい。
ジエチレントリアミン修飾ＭＰＣＳからのＮＯ放出の全量（３８，０００ｐｍｏｌＮＯ／ｍｇ）は、エチレンジアミン−及びヘキサンジアミン−修飾ＭＰＣｓに対して測定した値の間にある。ジエチレントリアミンにおいて、窒素を離すアルキル鎖の長さは短いままである（２メチレンユニット）が、付加的に２級アミン基が存在するので、エチレンジアミンと比較して、ＮＯ供与体形成（及び放出能）が増加するのであろう。
２級モノアミン誘導体であるブチルアミン修飾ＭＰＣｓは、全てのアミン基修飾ＭＰＣｓの中で最少の全ＮＯ放出することで特徴付けられる。アミン基を付加的することによって、ジアゼニウムジオレイン酸塩形成が促進される。Hrabie,J.A.,他、J.Org.Chem.,58,1472-1476(1993);Davies,K.M.,他、J.Am.Chem.Soc.,123, 5473-5481(2001)を参照されたい。特に、アミン基修飾ＭＰＣｓのジアゼニウムジオレイン酸塩への変換率は、アミン構造に関わりなく、１％以下であると計算された。
【００９２】
実施例６  酸化窒素放出デンドリマーの合成
【化４】
2008545714.tif 000007
反応図３．親油性テイルを持つデンドリマーの一般的手順
ポリプロピレニミンヘキサデカアミンデンドリマー（ＤＡＢ−Ａｍ−１６、Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin, USAより入手可能）（図１５を参照のこと）に、ＮａＯＭｅ存在下に、３日間、５気圧の酸化窒素をチャージした。この操作により、０．７４モル酸化窒素／モル  デンドリマー（２．３％変換率）及び２．３ｘ１０−８モル酸化窒素放出がもたらされた。
ポリプロピレニミンテトラヘキサコンタアミンデンドリマー（ＤＡＢ−Ａｍ−６４，Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin, USAより入手可能）（図１６を参照のこと）を、ＮａＯＭｅ存在下に、５気圧酸化窒素で、３日間チャージした。この手順により、４．９４モル酸化窒素／モル  デンドリマー（３．９％変換率）を得た、また１．１８ｘ１０−８モル  酸化窒素が放出された。
【００９３】
ＤＡＢ−Ｃ７−１６（以下の反応図４を参照のこと）に、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ（反応図５）存在下に、３日間、５気圧の酸化窒素をチャージした。この操作により、１２モル酸化窒素／モル  デンドリマー（３７．９％変換率）を得た、また３．７４ｘ１０−７モル酸化窒素が放出された。
【化５】
2008545714.tif 000008
反応図４．ＤＡＢ−Ｃ７−１６の合成
【化６】
2008545714.tif 000009
反応図５．ＤＡＢ−Ｃ７−１６ジアゼニウムジオレイン酸塩の合成
【００９４】
ＤＡＢ−Ｃ７−６４に、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ存在下に、３日間、５気圧の酸化窒素をチャージした。この操作により、４５モル酸化窒素／モル  デンドリマー（３５．６％変換率）を得た、また１．４８ｘ１０−７モル酸化窒素が放出された。
図１７に、ＤＡＢ−Ｃ７−１６ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨの場合の、時間の関数として酸化窒素放出を示すグラフを示す。同様に、図１８に、ＤＡＢ−Ｃ７−６４ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨに対する時間の関数として酸化窒素放出を示すグラフを示す。
ＤＡＢ−Ａｃ−１６（反応図６）に、ＮａＯＭｅ存在下に、３日間、５気圧の酸化窒素をチャージした。この操作により、０．０３９モル酸化窒素／モル  デンドリマー（０．１２％変換率）を得た、また４．９５ｘ１０−１０モル酸化窒素が放出された。
【化７】
2008545714.tif 000010
反応図６．ＤＡＢ−Ａｃ−１６の合成
【００９５】
ＤＡＢ−Ａｃ−６４に、ＮａＯＭｅ存在下に、３日間、５気圧の酸化窒素をチャージした。この操作により、０．２２モル酸化窒素／モル デンドリマー（０．１７％変換率）を得、また３．７５ｘ１０−１０モル酸化窒素が放出された。
ＤＡＢ−Ｐｒｏ−１６（反応図７）に、ＮａＯＭｅ存在下に、３日間、５気圧の酸化窒素をチャージした。この操作により、４２モル酸化窒素／モル デンドリマー（１３０％変換率）を得た、また１．９２ｘ１０−７モル酸化窒素が放出された。
【化８】
2008545714.tif 000011
反応図７．ＤＡＢ−Ｐｒｏ−１６の合成
ＤＡＢ−Ｐｒｏ−６４に、ＮａＯＭｅ存在下に、３日間、５気圧の酸化窒素をチャージした。この操作により、４８０モル酸化窒素／モル デンドリマー（３７７％変換）及び４．７９ｘ１０−７モル酸化窒素放出がもたらされた。
【００９６】
実施例７  アミン誘導化デンドリマーから酸化窒素放出の測定
実施例６の記載のように合成されたアミン誘導化デンドリマーからのＮＯ放出は、実施例３に概説された手順に従って測定された。表２に結果をまとめる。
【表２】
2008545714.tif 000012
【００９７】
実施例８  ジアゼニウムジオレイン酸塩化した材料からの酸化窒素放出の測定
多くのＮＯ放出材料からのＮＯ放出を、実施例３に概説した手順に従い測定した。結果を表３に示す。以下の実施例９の記載のように、フュームドシリカ表面をＮ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランにグラフト化し、その後ＮＯ気体で２級アミン基のジアゼニウムジオレイン酸塩化を行い、ジアゼニウムジオレイン酸塩化したフュームドシリカ粒子を合成した。
【表３】
2008545714.tif 000013
【００９８】
実施例９  ＮＯ放出シリカ粒子への合成ルート
図１９を参照して、粒子サイズが薬２００ｎｍから約３００ｎｍの範囲であるＮＯ放出シリカ粒子を参考文献Ｚｈａｎｇ，Ｈ．他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，５０１５（２００３）に記載された方法に従い合成した。
【００９９】
実施例１０  ＮＯ供与体前駆体の共凝縮に基づくシリカの合成
試薬及び材料：テトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ），テトラメチルシラン（ＴＭＳ），及びナトリウムメトキシド（ＮａＯＭｅ）は、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン（ＡＥＭＰ３），Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＨＡＰ３），Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＡＰ３），及びＮ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（ＤＥＴ３）を含むシランは、Gelest(Tullytown, Pennsylvania, USA)より購入した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、Sigma Chemical Company(St.Louis, Missouri, USA)より購入した。メタノール（ＭｅＯＨ），エタノール（ＥｔＯＨ），トルエン、及びアンモニア溶液（ＮＨ４ＯＨ、水溶液中３０重量％）は、Fisher Scientific(Fair Lawn,NewJersey,USA)より購入した。酸化窒素（ＮＯ，９９．５％）、アルゴン（Ａｒ），及び窒素（Ｎ２）ガスは、AGA Gas(Maumee,Ohio,USA)、又はNational Welders Supply(Raleigh, North Carolina, USA)より得た。他の溶媒及び化学試薬は、分析試薬用の薬品であり、そのまま用いた。Millipore Milli-Q UV Gradient A10 System(Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, USA）を用いて、蒸留水を精製し、最終的に比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ及び全有機物含量<６ｐｐｂを得た。
【０１００】
酸化窒素放出シリカナノ粒子の合成：２．７８ｍｍｏｌ（６２０μＬ）ＴＥＯＳと異なる濃度のＡＥＡＰ３，ＡＨＡＰ３，ＡＥＭＰ３，又はＤＥＴ３（０〜２０モル％に相当する０〜０．７０ｍｍｏｌ、バランスＴＥＯＳ）を１０分間混合して、シラン溶液を調製した。このシラン溶液を２２ｍＬのＥｔＯＨ、及び６ｍＬアンモニア（水溶液中３０重量％）と混合し、室温で３０分間激しく攪拌した。白色沈殿物を遠心（５０００ｒｐｍ、５分間）して集め、ＥｔＯＨで繰り返し洗浄し、真空中で、一晩乾燥した。
得られたアミン官能基化シリカを、ＮａＯＭｅ（０．３２〜０．７０ｍｍｏｌ；シリカ混合物の２級アミン基に同一当量ＮａＯＭｅを加える）の存在下に、１８ｍＬＤＭＦ、及び２ｍＬＭｅＯＨ中に懸濁し、攪拌棒を備えた１０ｍＬバイアル内に入れた。このバイアルをＰａｒｒビン（２００ｍＬ）内に置き、インハウスＮＯ反応器と接続し、懸濁液中の酸素を取り除くために、６回Ａｒによりフラッシュした。その後、反応ボトルにＮＯガスを、５気圧で、チャージし、３日間攪拌しながら密封した。痕跡量のＮＯ分解物を除くために、ＮＯガスをＫＯＨペレット上に２時間保ち精製した。シリカ粒子を取り出す前に、未反応のＮＯをＡｒにより、反応器から一掃した。Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾シリカ粒子を、５０００ｒｐｍ、５分間の遠心で集め、エタノールで繰り返し洗浄し、室温で１時間乾燥し、−２０℃で、使用まで密封した容器内で貯蔵した。
【０１０１】
実施例１１  官能基化したシリカの特性
固体状態交差分極／マジックアングルスピニング（ＣＰ／ＭＡＳ）２９Ｓｉ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、大広径マグネット（トリプルアクシス  パルスフィールドグラディエント  ２重共鳴プローブ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ３６０ＭＨｚＤＭＸスペクトロメーター（Billerica, Massachusetts, USA）を用いて、２９３Ｋで得た。シリカ混合粒子（０，１０，１３，及び１７モル％ＡＥＡＰ３，バランスＴＥＯＳ）を、４ｍｍのローター（二重共鳴振動数７１．５４８ＭＨｚ）に充填し、８．０ｋＨｚの速度で回転させた。化学シフトは、ＴＭＳ外部標準に相対的に、ｐｐｍで測定した。
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像の場合、シリカ粒子を、トルエン中に懸濁し、新たに劈開した雲母表面の上に置き、室温条件で３時間乾燥させた。Ingor Pro(Wavemetrics;Lake Oswergo, Oregon, USA)の下で使われるＭＦＰ−３Ｄソフトウェアで制御された分子力プローブ３Ｄ原子間力顕微鏡（Asylum Research;Santa Barbara, California, USA）を用いて、接触法によるＡＦＭ画像を空気中で得た。名目的バネ定数０．１２Ｎ／ｍ−１及び共鳴振動数２０ｋＨｚ（Veeco;Santa Barbara, California, USA）をもつ三角形シリコン窒化物カンティレベールを用いて、高さ／トポグラフィー画像を０．５Ｈｚ走査速度で得た。Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾シリカナノ粒子の酸化窒素放出プロフィールを、Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＮＯＡ２８０ｉ化学発光酸化窒素分析器（Boulder, Colorado, USA）を用いて、脱酸素化リン酸緩衝塩液中で、ｐＨ３．３，４．３，５．３，６．０、７．４及び９．５で、測定した。シリカより放出した酸化窒素を、反応セルを通過するＮ２（２００ｍＬ／ｍｉｎ）のガス流により分析器へ移動した。装置をゼロフィルターを通した空気（０ｐｐｍＮＯ）及び２４．１ｐｐｍＮＯ標準ガス（ＡＧＡ  ＧＡＳより購入したバランスＮ２）によりキャリブレートした。
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＳＡ３１００  表面積及び孔サイズ分析器（Fullerton, California, USA）でデーターを回収した窒素吸着／脱着等温線（Huh.S., 他、Chem.Mater.,15,4247-4256(2003)）により、シリカの表面積及び孔容積を測定した。表面積及び孔容積を、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）及びＢａｒｒｅｔｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）法により計算した。測定前に、全てのシリカ試料を２００℃、３時間、脱気した。
【０１０２】
実施例１２  ＮＯ供与体前駆体の共凝縮に基づくＮＯ放出シリカナノ粒子の物理的特性
シリカナノ粒子のサイズは、用いるアミノアルコキシシランの種類及び濃度を変えることにより調節できる。異なるシラン組成を持つシリカ球体の接触法原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）画像を、図２０Ａ〜２０Ｅに示す。対照（ＴＥＯＳのみ）シリカ粒子の直径は、２５０±２０ｎｍであった。ＴＥＯＳ溶液に１０モル％ＡＨＡＰ３を加えて変えると、粒子の直径は２０±２ｎｍに減少する。ＡＥＡＰＳ３及びＴＥＯＳから合成したシリカ粒子は、対照よりおよそ２倍大きい（ｄ＝５００±４５ｎｍ）。ＡＥＡＰ３のモル％が、１０より１７モル％（バランスＴＥＯＳ）に増えると、粒子の直径は、９２±１６ｎｍに減少し、シリカサイズとアミノアルコキシシラン濃度の間の擬線型関係を表す（図２０Ｆ）。同様なサイズにおける傾向が、調べた各アミノアルコキシシランシステムに見られる。粒子のサイズは、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩合成後には変化しないので、シリカ粒子の構造的な全体性は、ＮＯ供与体形成及びＮＯ放出能導入に必要な条件により損なわれないことを示す。
【０１０３】
図２１Ａ〜２１Ｃに示すように、固体２９Ｓｉ核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて、アミノアルコキシ官能性のシリカネットワークへの導入を確認し、またこのリガンドの表面被覆率（ＳＣ）を測定した。交差分極及びマジックアングルスピニング（ＣＰ／ＭＡＳ）技術を用いて、シグナル分解能と感度が上昇した。０から１７モル％ＡＥＡＰ３（バランスＴＥＯＳ）から合成した、対照及びアミン官能基化したシリカ粒子を解析した。ＴＥＯＳ対照シリカの場合、２９ＳｉＮＭＲスペクトル中に３本の特徴的なピークが、−９０、−１０１，及び−１０９ｐｐｍに観測され、これらはそれぞれＱ２（ゲミナルシラノール；−Ｏ２Ｓｉ（ＯＨ）２），Ｑ３（シングルシラノール；−Ｏ３Ｓｉ（ＯＨ））及びＱ４（シロキサン；−Ｏ４Ｓｉ）シリコンの代表例である。Huh,S.,他、Chem.Mater.,15,4247-4256(2003);及びAlbert,K.,and Bayer,E.J.,J.Chromatogr.,544,345-370(1991)を参照されたい。アミノアルコキシシラン修飾シリカ粒子の場合、５本のピークがスペクトルにおいて観測され、３本の付加的なシリコン化学的環境（図２１Ａのグラフｂ〜ｄ）を示す。約−５２及び−６５ＰＰＭの化学シフトにおけるピークは、夫々、Ｔ２（−Ｏ２Ｓｉ（ＯＨ）Ｒ）及びＴ３（−Ｏ３ＳｉＲ）構造の代表例である（ここでＲはアミノエチルアミノプロピル基である）。Huh,S.,他、Chem. Mater.,15,4247-4256(2003);及びAlbert,K.,及びBayer,E.J.,J.Chromatogr.,544,345-370(1991)を参照されたい。Ｔｎバンドが存在することは、アミノアルコキシ基とシリカ骨組みの間に共有結合があることを示唆する。Ｑ２，Ｑ３及びＱ４を表わす共鳴線はまた、予期した位置に同定できた。ＡＥＡＰ３含量が１０から１７モル％に増すと、アミノアルコキシリガンドの表面被覆率［ＳＣ＝（Ｔ２＋Ｔ３）／（Ｔ２＋Ｔ３＋Ｑ２＋Ｑ３）；Huh,S.,他、Chem.Mater.,15,4247-4256(2003);及びRadu,D.R.,他.J.Am.Chem.Soc.,126,1640-1641(2004)］が、対応して、２１から３７％に増えた。図２１Ｃを参照されたい。注目すべきことは、各ピークの強度が、交差分極及びプロトン緩和時間の効率に依存するので、これらの構造の定量的解析は複雑である。Bruch,M.D.及びFatumbi,H.O.,J.Chromatogr.A,1021,61-70(2003)を参照されたい。
前記のように、窒素吸着−脱着等温線を用いて、シリカナノ粒子の表面積及び孔容積を見積もった。Huh,S.,他、Chem. Mater.,15,4247-4256(2003)を参照されたい。予期したように、アミン官能基化シリカは、１０〜２０ｍ２ｇ−１の表面積（ＳＢＥＴ）及び０．０２〜０．０６ｍＬ・ｇ−１（ｐ／ｐ０＝０．９８において）の孔容積を（Ｖｐ）もつ非孔性であることが証明された。
【０１０４】
実施例１３  ＮＯ供与体前駆体の共凝縮に基づくＮＯ放出シリカナノ粒子の結果
ＮＯ全量（ｔ［ＮＯ］）、ＮＯ放出の半減期（ｔ１／２）、ＮＯ放出の最大流速［ＮＯ］ｍ及び［ＮＯ］ｍに到達するに必要な時間（ｔｍ）を、アミノアルコキシシラン構造及び量の関数として見積もった。結果を以下の表４に示す。
【表４】
2008545714.tif 000014
【０１０５】
ＮＯ放出を、リン酸緩衝塩液（ＰＢＳ）中で、生理的温度（３７℃）及びｐＨ（７．４）において、化学発光酸化窒素分析器を用いて測定した。Beckman,J.S.,及びConger,K.A.,Methods Companion MethodsEnzymol.,7,35-39(1995)を参照されたい。２種類の代表的なシリカナノ粒子（ＡＨＡＰ３及びＡＥＡＰ３を夫々１０及び１７モル％、バランスＴＥＯＳ）のＮＯ放出プロフィールを図２２において比較した。注目すべきことに、ＮＯ"最大積載量"及び放出速度は、シリカナノ粒子合成に用いたアミン基リガンドの濃度及び化学構造により顕著に影響された。調べた、４種のアミノアルコキシシランシステム（例えば、ＡＥＡＰ３，ＡＨＡＰ３，ＡＥＭＰ３及びＤＥＴ３）のうちで、ＡＥＡＰ３シリカは、最大量のＮＯを放出した。ＡＥＡＰ３のモル％を１０から１７モル％に増すと、対応してｔ［ＮＯ］及び［ＮＯ］ｍが増加した（夫々、１４５から６００ｎｍｏｌ／ｍｇ及び１４から１４０ｐｐｂ／ｍｇに）。しかしながら、ｔ１／２及びｔｍはどちらも、アミノアルコキシシラン濃度が増加すると減少した（１０から１７モル％ＡＥＡＰ３の増加に対して、それぞれ１２から３．４時間及び８．０から２．１時間）。ＮＯ放出の持続は、１０及び１７モル％ＡＥＡＰ３に対して、より少量ではあるが、３０時間まで顕著なレベルが続いた。
【０１０６】
このようなＮＯ放出挙動の一つの可能性として、粒子サイズに帰すことができる。本明細書で記述した幾つかの粒子の直径及び表面積を下記の表５に示す。与えられたアミノアルコキシシランに対して（アミノアルコキシシラン濃度が高くなるにつれて）、粒子の直径が減少するに従い、内部のＮＯ供与体リガンドまでの水拡散距離は小さくなることが予想される。従って、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩のＮＯへの分解は、水の取り込みに従うので、ＮＯ放出はより早くなる。とりわけ、これらシリカ粒子のＮＯ放出特性は、小分子Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩、及び表面グラフティングにより調製されたＢＯ放出シリカの特性と異なる。実際、同様のアミン前駆体（即ち、アミノヘキシルアミノリガンド）を用いて合成したシリカであるが、類似した小分子ＤＭＨＤ／ＮＯのｔ１／２は０．０５時間であり、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（Zhang,H.他、J.Am.Chem.Soc.,125、5015-5024(2003）を参照されたい）で合成した、表面グラフトされたシリカＮＯ供与体のｔ１／２は０．７２時間であり、ＡＨＡＰ３シリカのｔ１／２は０．８５時間でありこれらより長い。同様に、"ワンポット"合成で調製したＡＥＡＰ３ベースのシリカ粒子のｔ１／２は３．４〜１２時間であるのに対し、表面グラフトされたＡＥＡＰ３シリカ（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．他により、２Ｎ［２］と呼ばれる）のｔ１／２は２．４時間と報告されている。Zhang,H.他、J.Am.Chem.Soc.,125、5015-5024(2003)を参照されたい。
【０１０７】
【表５】
2008545714.tif 000015
シリカ粒子骨格からのＮＯ放出動特性に対するｐＨの効果も図２３にあるように調べた。小分子Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩の挙動と一致して（Davies,K.M.他、J.Am.Chem.Soc.,123,5473-5481(2001)を参照されたい）、ＮＯ放出は、酸性条件下（ｐＨ３．３）で、加速した。反対に、上昇したｐＨ（９．５）では、ＮＯ放出はかなり減速し、従って、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩の顕著な劣化無しに、ＮＯ供与体ナノ粒子を貯蔵及び輸送する簡単な方法を示す。ｔ［ＮＯ］は、すべてのｐＨで同様であったが、ＮＯ放出動特性は、低いｐＨで劇的に上昇した。ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ３．３では、ＮＯ放出の最大流量（［ＮＯ］ｍ）は９倍上昇した。この様な挙動、及びＮ−ジアゼニウムジオレイン酸塩分解のｐＨ依存性に基づき、シリカ骨格の場合、ＮＯ放出の主要な機構はプロトンにより開始されると確認されたように見える。
【０１０８】
実施例１４  ＮＯ放出メソ多孔質ＡＥＡＰ３−シリカ粒子の合成における鋳型としてのＣＴＡＢの使用
セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）を、メソ多孔質ＡＥＡＰ３シリカ合成の際の鋳型として用いた。メソ多孔質シリカを、１０モル％ＡＥＡＰ３、を用いて、実施例１０に記載したように合成した。更に、ＡＥＡＰ３／ＴＥＯＳ塩溶液は０．０１Ｍ  ＣＴＡＢを含んだ。シラン混合物の凝縮の後、粒子を７５℃、２４時間、ＥｔＯＨに溶かした１Ｍ  ＨＣｌで処理し、ＣＴＡＢを除いた。メソ多孔質ＮＯ放出シリカ粒子の計画された断面図を図２４Ａに示す。
この粒子を実施例１１に記載したように、原子間力顕微鏡を用いて解析した。図２４Ｂ参照。酸化窒素放出をまた、実施例１１に記載したように測定した。３７℃における、ＰＢＳ中、３ｍｇのメソ多孔質粒子に対して、時間（ｈｒ）の関数としてＮＯ放出（ｐｐｂ）を図２５に示す。
【０１０９】
実施例１５  プレチャージしたＮＯ供与体の共凝縮に基づくシリカ粒子の合成
ＮＯ供与体前駆体（"合成後チャージ法"又は単に"ポストチャージ法"とも呼ばれる）の共凝縮で合成されたシリカナノ粒子からのＮＯ放出レベルは、小分子ジアゼニウムジオレイン酸塩からのものより顕著に高いが、ナノ粒子合成に用いられるアミノアルコキシシランの含量は、高濃度のアミノシラン濃度では、粒子が凝集するので、<２０モル％に制限された。特別な理論によらずに、この凝集は、アミン基と隣接したシラノール間、及び／又は他のアミン基との水素結合による相互作用に帰することができると信じられる。
アミノアルコキシシラン、及び従って、粒子のＮＯ供与体含量の濃度を増すために、本出願で開示した対象物のシリカナノ粒子を合成するための更なる方法として、ジアゼニウムジオレイン酸塩を含むシランの共凝縮がある。従って、シリカナノ粒子を最初に合成し、その後、ジアゼニウムジオレイン酸塩ＮＯ供与体（"ポスト合成チャージ法"又は単に"ポストチャージ法"とよばれる）合成に必須なＮＯガスを装填（"チャージ"）した、実施例１０に記載した方法とは異なり、ジアゼニウムジオレイン酸塩は、シリカナノ粒子の共凝縮前にもまた合成することができる（即ち、"プレチャージ法"）。図５Ｂ参照。
【０１１０】
要約すると、適切な量のアミノアルコキシシランをＥｔＯＨ、ＭｅＯＨ及びＮａＯＭｅ混合物に溶解して、アミノアルコキシシラン溶液を調製する。攪拌しつつ溶液に、ＮＯを加圧（５気圧、３日間）し、ジアゼニウムジオレイン酸塩修飾アミノアルコキシシランを合成した。ＴＥＯＳと異なる割合（１０〜７５モル％、バランスＴＥＯＳ）のジアゼニウムジオレイン酸塩修飾アミノアルコキシシランシラン溶液を混合して、シラン溶液を調製した。このシラン溶液を、アンモニア触媒存在下で、ＥｔＯＨ溶媒に加えた。得られた白色沈殿を遠心により集め、ＥｔＯＨで洗浄し、室温で乾燥し、使用まで、−２０℃で、密封容器内に保管した。この結果より、アミノアルコキシシランは最初ジアゼニウムジオレイン酸塩に変換され、それにより粒子形成の間にアミン位置と相互作用することから免れるので、プレチャージ法により、凝集を減らすということが示唆される。従って、このアプローチにより、ＮａＯＭｅ及びＮＯが、アミン前駆体により多く接近することが可能となり、アミノアルコキシシラン前駆体モル数あたりの高いＮＯ収量がもたらされる。
【０１１１】
実施例１６  プレチャージ法のＮＯ供与体の共凝縮で合成された粒子のＮＯ放出特性
実施例１５に記載したプレチャージ法により合成したジアゼニウムジオレイン酸塩修飾シリカナノ粒子のＮＯ放出特性を、表６にまとめる。注目すべきことに、全ＮＯ放出（ｔ［ＮＯ］）及びＮＯ放出の最大量（［ＮＯ］ｍ）は、同一アミノアルコキシシラン濃度で、ポストチャージ法により合成したＮＯ放出シリカと比べて、かなり増加した（表４を参照のこと）。例えば、１７モル％ＡＥＡＰ３に対して、ｔ［ＮＯ］及び［ＮＯ］ｍは、夫々６００から８００ｎｍｏｌ／ｍｇに、また１４０ｐｐｂ／ｍｇから１２００ｐｐｂ／ｍｇに増加した。如何なる理論にこだわることなしに、図５Ｂに示すように、ＮＯ放出の増加は、ジアゼニウムジオレイン酸塩ＮＯ供与体がより均一にシリカ粒子上を分布しているためと解釈される。より重要なことは、プレチャージ法では、アミノアルコキシシラン含量を、凝集無しに、４５モル％まで増加できて、結果的にｔ［ＮＯ］及び［ＮＯ］ｍが相伴って増加した。
メチル基末端２級アミンを含むアミノアルコキシシランである、メチルアミノプロピル−トリメトキシシラン（ＭＡＰ３）をまた、ＮＯ放出シリカ粒子を合成するために使った。１級アミン基及び水素結合相互作用を除くことで、合成の際用いる溶媒によって、ＭＡＰ３アミノアルコキシシラン濃度が７５モル％まで、及び粒子サイズが８０〜４００ｎｍの粒子が合成可能である。更に、ＭＡＰ３濃度を１０から７５モル％まで増加すると、ＮＯ放出特性が増加する（例えば、ｔ［ＮＯ］は１６００から１０２００ｎｍｏｌ／ｍｇ増加した）。更に、ＭＡＰ３ベースのシリカ粒子のＮＯ放出は、より大きな初期のＮＯ放出バースト、及びより短い全体的ＮＯ放出半減期（夫々、３３０００〜１７７０００ｐｐｂ／ｍｇ、及び〜５分間）で特徴付けられる。
【０１１２】
【表６】
2008545714.tif 000016
【０１１３】
実施例１７  卵巣癌研究
ＮＯ供与体シリカナノ粒子の殺腫瘍性能を評価するために、不死化正常（Ｔ２９）及び癌（Ａ２７８０及びＯＶＣＡＲ−３）ヒト卵巣上皮細胞に対する対照及びＮＯ放出シリカ粒子の細胞毒性を調べた。以下に記載のように、ＭＴＴ細胞生存率アッセイを行った。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）増殖アッセイを用いて、ＯＶＣＡＲ−３細胞のＰＹＲＲＯ／ＮＯへの相対的感受性を測定した。細胞を６セットの９６ウェルマイクロタイタープレートに１〜５ｘ１０３細胞／ウェルに蒔種し、一晩インキュベートし、幾つかの濃度のＮＯ供与体及び対照ピロリジン溶液で４８時間処理した。その後、ＮＯ放出培地を除き、ＭＴＴ溶液に置き換え、細胞を更に４時間、３７℃でインキュベートした。ＭＴＴ除去後、ＤＭＳＯを加え、マイクロプレートリーダーを用いて、溶液の５６０ｎｍの吸光度を測定した。
図２６に示すように、Ａ２７８０卵巣上皮腫瘍細胞を様々な用量（０．０１３〜１．０ｍｇ／ｍＬ）の対照及びＮＯ放出ＡＨＡＰ３シリカ粒子で４８時間処理した。Ａ２７８０細胞の生存率は、低用量のＮＯ放出ＡＨＡＰ３シリカ処理により減少し、またＡ２７８０細胞の増殖は、用量０．５０ｍｇ／ｍＬ［<５％生存率における最小阻害濃度（ＭＩＣ）；０．７５ｍＭ  ＮＯに対応］のＮＯ放出ＡＨＡＰ３シリカにより殆ど完全に阻害された。更に、ＮＯ供与体ＡＨＡＰ３シリカのＩＣ５０用量（５０％阻害濃度）は０．０２ｍｇ／ｍＬ（０．０３ｍＭ  ＮＯ）であった。特に、ＮＯ放出シリカの阻害濃度は、小分子ＮＯ供与体のこれらの値より顕著に低かった（例えば、ＰＹＲＲＯ／ＮＯのＭＩＣ及びＩＣ５０は、夫々４．４及び２ｍＭ  ＮＯであった。）
【０１１４】
対照シリカナノ粒子もまた、腫瘍細胞に対して細胞毒性効果を示した（ＩＣ５０＝０．１２ｍｇ／ｍＬ）、しかしながらＮＯ放出対応物より低かった。特別な理論に拠ることなく、１級アミン基は毒性を持つことが知られているので、対照担体の好ましくない細胞毒性は、シリカ構造の表面のフリー１級アミン基に帰すると推量できる。Shi,X.,他、Colloids Surf.A,272,139-150(2006)．対照及びＮＯ放出ナノ粒子の１級アミン基による細胞毒性を減らすために、ＭＡＰ３アミノシラン（２級アミン基のみ含む）を用いて、より生体許容性のある担体を作成した。予期したように、ＭＡＰ３対照の不死化（Ｔ２９）及び腫瘍（Ａ２７８０）細胞に対する細胞毒性は、低かったが、ＮＯ放出ＭＡＰ３シリカは、Ｔ２９及びＡ２７８０両細胞に対し細胞毒性を示した。図２７参照。ＯＶＣＡＲ−３卵巣アデノカルシノーマ細胞もまた、増加する濃度のＮＯ放出シリカナノ粒子に対し同様な細胞毒性傾向を示した。
ナノ粒子サイズが細胞毒性に対して影響を与えるか調べるために、異なる粒子サイズ（直径８０及び３５０ｎｍ、以後夫々ｓ−ＭＡＰ３及びＬ−ＭＡＰ３と表わす）を持つ２種のシリカナノ粒子（７５モル％ＭＡＰ３，バランスＴＥＯＳ）、を合成した。シリカ直径は、ゾルーゲル過程において溶媒系（例えば、アルコール）を変えることで容易に調節できる。Harris,M.T.,他、J.Non-Cryst.Solids,121,397-403(1990)を参照されたい。合成過程で用いるアルコールの分子量（ＭＷ）を増すと、対応して、粒子サイズは増加した（例えば、ｓ−ＭＡＰ３及びＬ−ＭＡＰ３を合成するために、夫々１００％（ｖ／ｖ）エタノール及び５０／５０％（ｖ／ｖ）エタノール／ブタノール混合物を用いた）。Ｔ２９及びＡ２７８０をＮＯ非放出対照ＭＡＰ３粒子（８０ｎｍ）、ｓ−ＭＡＰ３，又はＬ−ＭＡＰ３（０．４ｍｇ／ｍＬ）で４８時間処理して、細胞生存率を測定した。図２８参照。特に、小直径ＮＯ放出シリカ（ｓ−ＭＡＰ３）は、不死化（Ｔ２９）及び癌（Ａ２７８０）細胞に対して細胞毒性を示した（夫々、１２±１．１及び５±．２％生存率）。これに対し、大直径ＮＯ放出シリカ（Ｌ−ＭＡＰ３）は健康細胞より腫瘍細胞に対して顕著により強い細胞毒性を示した（Ｔ２９細胞及びＡ２７８０細胞に対し、夫々、３７±２．０、及び６±１．２％生存率）。Ｔ２９細胞に対して、より大きなＮＯ運搬担体が低い毒性を示すことは、健康細胞に最小限の効果を持つ殺腫瘍性濃度のＮＯを放出することができるナノデバイスを開発する上での主要な段階を表す。
【０１１５】
実施例１８  細胞取り込み
ＮＯ放出シリカ粒子の細胞内取り込みについて共焦点蛍光顕微鏡を用いて調べた。要約すると、Ａ２７８０卵巣癌細胞をＭＥＴ−ＴＥＣ（Ｒ）ガラス底の顕微鏡プレートに〜２０％飽和密度に蒔種し、一晩培養した。顕微鏡観察前に、培養緩衝液を廃棄し、Ａ２７８０癌細胞のミトコンドリアを選択的に染色するために（３０分インキュベーション）、１００ｎＭテトラメチルローダミン色素（ＴＭＲＭ）を含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔイメージ用緩衝液［１０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ７．４］に置き変えた。ＮＯ放出シリカナノ粒子を３種のシラン前駆体：フルオレッセインイソチオシアン酸塩（ＦＩＴＣ）修飾のアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ），ジアゼニウムジオレイン酸塩ＭＡＰ３，及びＴＥＯＳ，の共凝縮により蛍光標識した。
Ｚｅｉｓｓレーザー走査顕微鏡（LSM510;Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Germany）を用いて蛍光測定を行った。ＴＭＲＭの赤色蛍光（５４３ｎｍにおけるヘリウム−ネオンレーザー励起）を、５分、６０分の時点でモニターし、ミトコンドリアの細胞内位置、及びＡ２７８０核の輪郭のマップを作った。図２９Ｃ及び２９Ｄを参照されたい。イメージ用緩衝液に溶かしたＦＩＴＣ標識ＮＯ放出ＭＡＰ３シリカナノ粒子の１００μＬを直接顕微鏡台上の細胞に加え、ナノ粒子濃度を０．１ｍｇ／ｍＬとした。直ちに、ＦＩＴＣ標識シリカナノ粒子の緑色蛍光が５２０ｎｍに観察でき、Ａ２７８０癌細胞の輪郭が表れた。共焦点画像を５分間隔で集め、細胞の緑色蛍光ナノ粒子の取り込みをモニターした。図２９Ａは、ＦＩＴＣ標識ＭＡＰ３シリカ粒子と５分インキュベートした時点での細胞を示す。１時間後、かなりな量のナノ粒子の蓄積が観察された。図２９Ｂ参照。更に、ミトコンドリア生存の特性である赤色蛍光は、６０分後、多くの細胞内で消えた（図２９Ｄを参照のこと）、また細胞のサイズは縮み始め、細胞死を示す。
【０１１６】
実施例１９  抗菌活性研究
Pseudomonas aeruginosa(ATCC#19143, American Type Culture Collecti on Company, Manassas, Virginia, USAより）、グラム陰性日和見病原体の１種、をトリプチソイブロス（ＴＳＢ）中で、吸光度（ＯＤλ＝６００ｎｍ）約０．２（〜１．０ｘ１０８コロニー形成単位［ＣＦＵ］ｍＬ，系列稀釈法で確認）まで培養した。細菌を遠心によりペレットにした後、ＴＳＢ培養液を廃棄し、細菌を無菌リン酸緩衝塩液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に再懸濁した。ＰＢＳ中の１０倍系列稀釈法により細菌濃度を１０３ＣＦＵ／ｍＬに調節した。この細菌懸濁液の一部（２００μＬ）を無菌ミクロピペットバイアル中に分配し、２００μＬのＮＯ放出４５モル％ＡＥＡＰ３シリカナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ），対照（ＮＯ非放出）、ＡＥＡＰ３シリカナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ）、又は無菌ＰＢＳ（ブランク）を各バイアルに加えた。３７℃１時間インキュべーション後、各懸濁液の１００μＬをトリプティックソイ栄養寒天培地の上にプレートし、３７℃で一晩培養した。次の日、各プレート上にできた細菌のコロニー数をカウントし、代表的栄養プレートの写真撮影をした。図３０に示すように、シリカナノ粒子から放出される酸化窒素は、ブランク（図３０Ａ）及び対照（ＮＯ非放出）シリカナノ粒子（図３０Ｂ）と比べて、生存細菌の数を劇的に減少させた（図３０Ｃを参照のこと）。定量的には、ブランク及び対照懸濁液を示すプレートに形成したコロニー数はほぼ同数（〜３６０）であった。ＮＯ放出シリカナノ粒子を加えた懸濁液からは、９コロニーだけが形成した。このことは、ブランク及び対照懸濁液に比べて、ＮＯ放出ナノ粒子を加えた懸濁液中の生存細菌の数は、９８％減少したことを示す。
ＮＯ放出シリカナノ粒子の抗細菌活性をより定量的に評価するために、ＰＢＳ中の系列稀釈により、細菌濃度を１０３ＣＦＵ／ｍＬに調節し、培養細菌を対照シリカナノ粒子（ＮＯ非放出）、ＮＯ放出シリカナノ粒子、又は無菌ＰＢＳ（ブランク）に曝した。３７℃、１時間培養後、懸濁液の１００μＬをトリプティックソイ栄養寒天培地の上に蒔種し一晩培養した。図３１に示すように、シリカナノ粒子から放出されたＮＯは、生存細菌の数を顕著に減少させた。２ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＮＯ放出粒子は、対照に比べて殺細菌効果を顕著に増した（ｐ＝９．５ｘ１０−４）。１時間インキュベーション時間内に放出されるＮＯの量は、化学発光による測定では、約１μモルＮＯであった。従って、本明細書に示したシリカナノ粒子は、インビトロ殺細菌効果を示し、感染した傷に関する微生物を殺すための幾つかの濃度のＮＯを運搬するための担体を表わす。
【０１１７】
実施例２０  ＮＯ放出の磁性シリカナノ粒子の合成
磁気性ＮＯ放出シリカナノ粒子は、図３２に示す合成に従って調製した。簡単には、実施例１０の方法を変えて、ＴＥＯＳ及び１０モル％ＡＨＡＰ３又は１７モル％ＡＥＡＰ３を含む溶液中で約２０ｎｍから３０ｎｍまでの間の直径を持つ磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）粒子の包含に適用した。シランの共凝縮により、磁鉄鉱粒子は、シリカのシェルで覆われた。この粒子をＮＯ下に置きジアゼニウムジオレイン酸塩を作成した。
磁鉄鉱／シリカＡＨＡＰ３粒子の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）像を図３３に示す。粒子の直径は、８５±１１ｎｍと測定された。この粒子のＮＯ放出プロフィールを、図３４に示す。磁鉄鉱／シリカ粒子を含むＰＢＳ溶液を用いた実験は、磁石を適用すると、粒子の移動を制御できることを示す。
【０１１８】
実施例２１  ＮＯ放出シリカナノ粒子を含むポリウレタンフィルム
ＮＯ放出シリカナノ粒子は、約３ｍｇから約１８ｍｇまでの間のＮＯ放出粒子を、重合化前に５００μＬのＴＨＦ及びエタノールに１０ｍｇの１：１（ｗ／ｗ）ＴＥＣＯＦＬＥＸ（Ｒ）ポリウレタン（ＴＰＵ）／親水性ポリウレタン（ＨＰＵ）を含む高分子前駆体溶液に加えて作成したポリウレタンフィルムに取り込んだ。
高分子前駆体溶液に６ｍｇのナノ粒子を加えて作成したフィルムを調べて、前記の細菌接着に対する抵抗能を測定した。Marxer,S.M.他、Chem.Mater.、15,4193-4199(2003)を参照されたい。定常的なＮＯ放出を開始するためにこのフィルムを前処理し、その後Pseudomonas aeruginosa(ATCC#19143,American Type Culture Collection Company, Manassas, Virginia, USAより）を含む細胞懸濁液に、３７℃で３０分間浸した。その後、フィルの表面を水でリンスし、２％グルタルアルデヒド溶液で１５分間固定した。表面の画像をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００倒立顕微鏡（Carl Zeiss Optical, Chester, Virginia, USA）を用いた位相差顕微鏡研究によって得た。対照フィルム及びＮＯ放出粒子含有フィルムの位相差顕微鏡像を図３５Ａ及び３５Ｂに示す。
【０１１９】
実施例２２  ＮＯ放出層をもつグルコースセンサー
グルコースオキシダーゼベースのグルコースバイオセンサーにより、グルコースと酸素の間のグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）触媒反応により産生した過酸化水素を電気酸化して、血液グルコースを検出できる。図３６に図示するように、グルコースセンサーは、ＮＯ放出層を持って合成される。センサー３６００は、Ｐｔ電極３６０２上にスタックした４層を提供する。最内部の層３６０４は、２５μＬ ＭＴＭＯＳ，６ｍｇグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、１００μＬ ＥｔＯＨ及び５０μＬ Ｈ２Ｏを含む溶液の濃縮により作られる。カバーするＧＯｘ層３６０４は、疎水性ＴＥＣＯＦＬＥＸ（Ｒ）ポリウレタン（ＴＰＵ）及び親水性ポリウレタン（ＨＰＵ）前駆体（即ちＴＰＵ／ＨＰＵブレンド）の１：１（ｗ／ｗ）混合物の重合により調製した保護層３６０６である。ＮＯ放出層３６０８を、５００μＬ ＴＨＦ／ＥｔＯＨ中に１０ｍｇ ＴＰＵ／ＨＰＵ及び６ｍｇジアゼニウムジオレイン酸塩修飾シリカナノ粒子を含む溶液の重合により調製した。ＮＯ放出層３６０８は、さらに５００μＬ ＴＨＦ／ＥｔＯＨ中に１０ｍｇ ＴＰＵ／ＨＰＵ混合物で調製したＴＰＵ／ＨＰＵバリアー層３６１０を重層した。
図３６を続けると、挿入図は、ＮＯ放出層３６０８と外部の保護層３６１０の境界での相互作用を示すもので、ここでジアゼニウムジオレイン酸塩基３６２２を持つＮＯ放出シリカ粒子３６２０は酸化窒素３６２４を放出するが、グルコース分子３６２６は、ＧＯｘ−含有層３６０４への途上ＮＯ放出層３６０８に吸収される。
ＮＯ放出層を持つグルコースセンサーの応答を評価するために、２種の対照電極を作成した：保護層及びＧＯｘ層のみ持つ対照センサー、及びＮＯ供与体を含まないシリカナノ粒子のみで調製した４層すべてを含むセンサー。様々なセンサーの感度を適用電圧＋７Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌを用いて、ＰＢＳ（０．０５Ｍ，ｐＨ７．４）中で評価した。対照及び２層センサーの感度は、５４．５ｎＡ／ｍＭ（ｒ＝０．９９８０）、ＮＯ非放出シリカナノ粒子を持つ４層センサーの感度は、６１．３ｎＡ／ｍＭ（ｒ＝０．９９３８）であり、ＮＯ放出層を持つセンサーの感度は、５７．９ｎＡ／ｍＭ（ｒ＝０．９９８９）であった。これらの結果は、ＮＯ放出はＧＯｘベースのグルコース検知には干渉しないことを示す。
【０１２０】
参考文献
以下に記載した参考文献、及び本明細書に引用した全ての参照文献は、これらが補足し、説明し、背景を提供し、又は方法、技術、及び／又は本明細書で使用される化合物を教示する限り、本明細書に参照文献として取り込まれている。本申請に関する全ての引用した特許及び刊行物は、本明細書に参考文献として明示的に取り込まれる。
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以前に権利主張された対象物の様々な詳細については、本明細書で権利主張した対象物の観点から離れない限り変更されうることは理解されるであろう。さらに、前述の記載は、例示の目的だけに行われ、制限することを目的にしたものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】コアＣＲ、内部領域ＩＲ，脆弱部分ＬＰを持つリンカーＬＫ、酸化窒素（ＮＯ）供与体ＮＯ及び外部ＥＰを含む、酸化窒素（ＮＯ）放出粒子の図式的説明である。
【図２】本出願で開示したＮＯ放出性単層の保護クラスター（ＭＰＣ）金ナノ粒子を製造するための合成スキームである。
【図３】アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランの混合物からシリカネットワークの共凝縮の後、共凝縮したシリカネットワークをＮＯガスで処理することによる、ＮＯ放出粒子の合成の図式的説明である。
【図４Ａ】表面グラフト法により合成されたＮ−ジアゼニウムジオレイン酸塩（より濃い球体）修飾シリカ粒子中のＮＯ供与体分布の範囲についての図式的説明である。
【図４Ｂ】アルコキシシラン及びアミノアルコキシシランを含むシラン混合物からシリカネットワークの"ワンポット"共凝縮により合成された、Ｎ−ジアゼニウムジオレイン酸塩（より濃い球体）−修飾シリカ粒子中のＮＯ供与体分布の範囲についての図式的説明である。
【図５Ａ】シリカネットワークを作るための共凝縮の後に、アミノアルコキシシランがＮＯ気体と反応する、"ポストチャージング"法を用いたＮＯ放出共凝縮シリカ粒子の合成ついての図式的説明である。
【図５Ｂ】シリカネットワークを作るための共凝縮に先立って、アミノアルコキシシランがＮＯ気体と反応する、"プレチャージング"法を用いたＮＯ放出共凝縮シリカ粒子の合成ついての図式的説明である。
【図６Ａ】Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＡＰ３）の構造である。
【図６Ｂ】（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン（ＡＥＭＰ３）の構造である。
【図６Ｃ】Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＨＡＰ３）の構造である。
【図６Ｄ】Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（ＤＥＴ３）の構造である。
【図７】孔形成のために鋳型試薬としてミセルを用いた、メソ多孔質共凝縮シリカネットワークの鋳型合成の図式的説明である。
【図８】図１で既に述べたようなＮＯ放出粒子の部分の図式的説明であり、さらにリンカーＬＫの脆弱部分ＬＰは粒子外部ＥＰから様々な距離に置くことができることを示す。部位Ａは外部から最も遠く、部位Ｂはリンカーの中央に在り、また部位Ｃは粒子の外部に最も近い。
【図９Ａ】医学的に分割されたポリウレタンの一般的構造を示す。柔らかいユニットを、影のある長円で示し、固いユニットを影のある矩形で示し、またエキスパンダーユニットを影のある円で示す。
【図９Ｂ】ＴＥＣＯＦＬＥＸ（Ｒ）ポリウレタンの構造を示し、ｎ及びｎ’は整数である。
【図１０Ａ】ヘキサンチオール官能基の付いた金ナノ粒子の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１０Ｂ】臭素官能基の付いた金ナノ粒子の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。−ＣＨ２Ｂｒピークは３．４ｐｐｍに表れる。
【図１０Ｃ】エチレンジアミン官能基の付いた金ナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。−ＣＨ２ＮＨピークは２．５から３．０ｐｐｍに表れる。
【図１１】１１−ブロモ−１−ウンデカンチオールの２段階合成のスキームを表す。
【図１２】酸化窒素測定の解析方法の図式的説明である。
【図１３】様々なジアミン誘導化単層保護クラスター（ＭＰＣ）金ナノ粒子からの酸化窒素放出プロフィールを示すプロットである。ラインａは非誘導化ＭＰＣ金ナノ粒子の酸化窒素放出プロフィールである。ラインｂは１４％エチレンジアミン誘導化ＭＰＣ金ナノ粒子からの酸化窒素放出プロフィールである。ラインｃは２１％エチレンジアミン誘導化ＭＰＣ金ナノ粒子からの酸化窒素放出プロフィールである。ラインｄは２１％エチレンジアミン誘導化ＭＰＣ金ナノ粒子からの酸化窒素放出プロフィールである。ラインｅは２１％ジエチレントリアミン誘導化ＭＰＣ金ナノ粒子からの酸化窒素放出プロフィールである。ラインｆは２１％ヘキサンジアミン誘導化ＭＰＣ金ナノ粒子からの酸化窒素放出プロフィールである。
【図１４】官能基化単層保護クラスター（ＭＰＣ）金ナノ粒子から放出されたＮＯを示す、図式的説明である。
【図１５】ポリプロピレニミンヘキサデカアミンデンドリマー（ＤＡＢ−Ａｍ−１６）の化学構造の図式的説明である。
【図１６】ポリプロピレニミンテトラヘキサコンタアミンデンドリマー（ＤＡＢ−Ａｍ−６４）の化学構造の図式的説明である。
【図１７】ＤＡＢ−Ｃ７−１６ ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨについて酸化窒素放出プロフィールを示すグラフである。
【図１８】ＤＡＢ−Ｃ７−６４ ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨについて酸化窒素放出プロフィールを示すグラフである。
【図１９】Ｚｈａｎｇ、Ｈ．他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，５０１５（２００３）に記載された方法によるＮＯ放出シリカ粒子に至る合成ルートである。
【図２０Ａ】対照シリカ（ＴＥＯＳのみ）の接触法原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図２０Ｂ】１０モル％のＡＨＡＰ３と一体となったシリカ（バランスＴＥＯＳ）の接触法原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図２０Ｃ】１粒子を示す図２９Ｂからの拡大した原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図２０Ｄ】１０モル％ＡＥＡＰ３の接触法原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図２０Ｅ】雲母表面上の１７モル％ＡＥＡＰ３シリカ粒子の接触法原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図２０Ｆ】シリカ混合物のＡＥＡＰ３含量、及び得られる粒子サイズの間の関係を示すグラフである。
【図２１Ａ】様々な量のＡＥＡＰ３：（ａ）０％ＡＥＡＰ３（対照）、（ｂ）１０モル％ＡＥＡＰ３（バランスＴＥＯＳ），（ｃ）１３モル％ＡＥＡＰ３（バランスＴＥＯＳ）；及び１７モル％ＡＥＡＰ３（バランスＴＥＯＳ）；と共凝縮したシリカの固体状態２９Ｓｉ交差分極／マジックアングルスピニング（ＣＰ／ＭＡＳ）ＮＭＲスペクトルを示すプロットである。
【図２１Ｂ】ＡＥＡＰ３修飾シリカ混合物の表面のシリコン化学環境に関係する構造を示す図式である。
【図２１Ｃ】ＡＥＡＰ３修飾シリカ混合物の合成の間、加えられたＡＥＡＰ３含量に対する、共凝縮したアミンリガンドの％表面開裂（ＳＣ）のプロットを示す。
【図２２】１０モル％ＡＨＡＰ３（破線）及び１７モル％ＡＥＡＰ３（実線）を含む共凝縮シリカからのＮＯ放出のＮＯ放出プロフィールである。挿入図は同じ２種類のシリカ型の時間に伴う積算したＮＯ放出のプロットを示す。
【図２３】ＡＥＡＰ３を含む共凝縮シリカナノ粒子の３７℃におけるｐＨの関数で表すＮＯ放出のプロットである。挿入図は、積算したＮＯ放出のプロットである。
【図２４Ａ】鋳型として界面活性剤セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）を用いた鋳型合成により製造したメソ多孔質ＮＯ放出シリカ粒子の断面図を示す図式的説明である。影の領域は、共凝縮シリカネットワークを表し、他方、小さな影のある円は、共凝縮シリカネットワーク内のＮＯ供与体を表す。影のない領域は、シラン凝縮反応後、ＣＴＡＢ鋳型を除去した後に作られた粒子内の孔を表わす。
【図２４Ｂ】セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）を鋳型として製造したメソ多孔質Ｎ−（６−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＡＰ３）−シリカ粒子の接触法原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図２５】メソ多孔質Ｎ−（６−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＡＰ３）−シリカ（３７℃でリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中３ｍｇの粒子）の酸化窒素放出プロフィールを示すプロットである。
【図２６】対照（黒色円）、及び４５モル％ＡＨＡＰ３との反応で製造したＮＯ放出シリカ（白色円）の卵巣上皮腫瘍細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図２７】対照（黒色矩形）及びＮＯ放出するＭＡＰ３共凝縮（白色円）シリカナノ粒子の正常（不死化、Ｔ２９）細胞に対する細胞毒性、及び対照（黒色円）及びＮＯ放出するＭＡＰ３共凝縮（白色円）シリカナノ粒子の腫瘍（Ａ２７８０）細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図２８】正常Ｔ２９（灰色棒）細胞株及び腫瘍Ａ２７８０（縞模様棒）細胞株に対する細胞毒性へのシリカ粒子サイズ（７５モル％ＭＡＰ３，バランスＴＥＯＳ）の効果を示す棒グラフである。対照ＭＡＰ３処理群と比較して、Ｐ<０．００１であった。対照ＭＡＰ３シリカ（角括弧で示す）は、ＮＯ非放出性であり、直径８０ｎｍであり、ｓ−ＭＡＰ３シリカは直径８０ｎｍであり、Ｌ−ＭＡＰ３シリカは直径３５０ｎｍである。
【図２９Ａ】ＦＩＴＣ標識付ＭＡＰ３シリカナノ粒子とインキュベーション５分後に撮ったＡ２７８０卵巣癌細胞のレーザー走査顕微鏡画像である。
【図２９Ｂ】ＦＩＴＣ標識付ＭＡＰ３シリカナノ粒子とインキュベーション６０分後に撮ったＡ２７８０卵巣癌細胞のレーザー走査顕微鏡画像である。
【図２９Ｃ】１００ｎｍテトラメチルローダミン（ＴＭＲＭ）ミトコンドリア染色液とインキュベーション５分後に撮ったＡ２７８０卵巣癌細胞のレーザー走査顕微鏡画像である。
【図２９Ｄ】１００ｎｍテトラメチルローダミン（ＴＭＲＭ）ミトコンドリア染色液とインキュベーション６０分後に撮ったＡ２７８０卵巣癌細胞のレーザー走査顕微鏡画像である。
【図３０Ａ】無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）と３７℃でインキュベート後、栄養寒天培地上に形成したP.aeruginosaのコロニーを示す写真である。
【図３０Ｂ】対照（ＮＯ非放出性）ＡＥＡＰ３シリカナノ粒子と３７℃でインキュベート後栄養寒天培地に形成したP.aeruginosaのコロニーを示す写真である。
【図３０Ｃ】ＮＯ放出４５モル％ＡＥＡＰ３シリカナノ粒子と３７℃でインキュベート後栄養寒天培地に形成したP.aeruginosaのコロニーを示す写真である。
【図３１】ナノ粒子濃度の関数として、ＮＯ放出シリカナノ粒子（４５モル％ＡＥＡＰ３，バランスＴＥＯＳ）のP.aeruginosaに対するインビトロ殺細菌活性を示すプロットである。
【図３２】ＮＯ供与体を形成できる、アミン基を含む共凝縮シリカ層で覆われた磁鉄鉱コアを持つＮＯ放出ナノ粒子の合成の図式的説明である。
【図３３】磁鉄鉱／Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＨＡＰ３，１０モル％）官能性シリカ粒子の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図３４】磁鉄鉱／シリカコア粒子（下部の線）の、磁鉄鉱なしの同じシリカ組成のコアを持つ粒子（上部の線）のＮＯ放出プロフィール、と比較したＮＯ放出プロフィールを示すグラフである。挿入図はＮＯ放出積算量のグラフである。
【図３５Ａ】対照フィルム（ＮＯ非放出ポリウレタン）に対するP.aeruginosa接着（黒色領域）を示す位相差光顕微鏡像である。拡大率はｘ５．
【図３５Ｂ】ＮＯ放出粒子を含むフィルムに対するP.aeruginosa接着（黒色領域）を示す位相差光顕微鏡像である。拡大率はｘ５．
【図３６】ＮＯ放出共凝縮シリカナノ粒子を含む重合したフィルムから作られたＮＯ放出層を持つグルコースセンサーのＰｔ電極を示す構造の図式的説明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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