(57)【要約】  本発明は、Ｌｊｕｎｇａｎウイルス（ＬＶ）を特異的に検出する方法に関する。特に、本発明は、定量的リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲを使用してＬＶを検出する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＧＣＲＹＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＳＧＡＣＡＧＹＧＣ（配列番号１）の配列又はその逆相補配列の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ＬＶを検出する方法。
【請求項２】
検出されるべき前記核酸配列がＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出されるべき前記核酸配列がＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＬＶ  ＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写させる初期工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
検出される前記核酸配列は、配列番号１又はその逆相補配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
検出される前記核酸配列は、配列番号１又は逆相補配列の少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
検出される前記核酸配列は、
ＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＳＧＡＣＡ（配列番号３）
の配列又はその逆相補配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸配列は、配列番号１又はその逆相補配列の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの標識プローブを使用することにより検出される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記標識プローブは、２５ヌクレオチド長未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識プローブは、１７ヌクレオチド長以下である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識プローブは、検出される前記核酸の副溝で結合する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブは、一本鎖ＤＮＡプローブである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブは、エキソヌクレアーゼプローブである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡプライマーは、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の産生を可能にする位置で、前記ＲＮＡ配列へアニーリングされ、該プライマーは、逆転写酵素の作用により伸長される、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーは、ＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡ（配列番号９）の配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、
（ａ）配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列が得られるように、ＬＶ  ＲＮＡを逆転写させる工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ配列を増幅させる工程、及び
（ｃ）前記増幅されたＤＮＡ配列の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項１７】
前記増幅されたＤＮＡ配列は、プローブを使用することにより検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＣＲ反応で使用されるプライマーは、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を増幅させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
ＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧ（配列番号７）の配列又はその少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを有する順方向プライマー、及び
ＣＣＣＣＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＡＴＧＴＣ（配列番号８）の配列又はその少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを有する逆方向プライマー
を含む方法。
【請求項２１】
前記順方向プライマーは、
ＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧ（配列番号１２）
の配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記逆方向プライマーは、
ＴＧＧＴＡＡＣＡＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣ（配列番号９）
の配列を有する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
定量的ＰＣＲが実施される、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
実施される前記ＰＣＲ手順は、リアルタイムＰＣＲ手順であり、エキソヌクレアーゼプローブが、前記増幅されたＤＮＡ配列を検出するのに使用される、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＬＶは、組織サンプル又は体液サンプル中で検出される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルは、筋肉組織サンプル、神経細胞サンプル、内分泌腺サンプル又は白血球サンプルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
サンプル中でＬＶを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルからＲＮＡを単離する工程、
（ｂ）前記ＲＮＡを逆転写させて、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を得る工程、及び
（ｃ）エキソヌクレアーゼプローブを使用した定量的ＰＣＲを実施する工程
を含む方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドへ特異的に結合する少なくとも１つの標識プローブを含むキッ
ト。
【請求項２９】
配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を増幅させるためのプライマー、及び該核酸配列を増幅させるために必要な試薬をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列が得られるようにＬＶ  ＲＮＡを逆転写させるためのプライマー、及び該ＲＮＡを逆転写させるために必要な試薬をさらに含む、請求項２８又は２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌｊｕｎｇａｎウイルス（ＬＶ）を特異的に検出する方法に関する。特に、本発明は、定量的リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲを使用してＬＶを検出する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＶは、ピコルナウイルス科に属し、したがってＲＮＡウイルスである。ＬＶは、ハタネズミ(bank vole)（ヨーロッパヤチネズミ(Clethrionomys glareolus)で最初に同定され、多数の動物において疾患を引き起こすことが知られている。ウイルスの３つの単離株（８７−０１２、１７４Ｆ及び１４５ＳＬ）が、国際特許出願ＷＯ９８／１１１３３号で開示されており、各単離株の部分配列がそこで開示されている。３つのＬＶの完全配列は、後に公表された(Johansson et al., J. Virol., 76, 8920-8930, 2002)。
【０００３】
ＬＶプロトタイプ株である８７−０１２、及び２つの他の血清学的に関連されるＬＶ単離株である１７４Ｆ及び１４５ＳＬの比較配列分析により、これらの新たに確定されたスウェーデンＬＶ株のゲノムは、密接に関連され、以下の異常ピコルナウイルス様機構を有することが明らかとなった（Johansson et al., 2002, 上記）：５’ＵＴＲ−ＶＰ０−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ１−２Ａ２−２Ｂ−２Ｃ−３Ａ−３Ｂ−３Ｃ−３Ｄ−３’ＵＴＲ。
【０００４】
系統発生分析により、ＬＶ単離株は、別個の単系統性群を構成し、これはパレコウイルス(Parechovirus)属とともに、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)の他の成員から分離されることが示された（Johansson et al., 2002, 上記; Lindberg and Johansson, Virus Res., 85, 61-70, 2002）。さらに、米国オレゴン州で捕獲された別のハタネズミ種（サンガクハタネズミ(Microtus montanus)）から単離された別のウイルスであるＭ１１４６の完全ゲノム配列により、このウイルスもまた、ピコルナウイルス科の成員であり、スウェーデンで単離されたＬＶに最も密接に関連され、別個のＬＶクラスター内の新たな遺伝子型であることが確証された(Johansson et al., J. Gen. Virol., 84, 837-844, 2003)。
【０００５】
ＬＶは、ヒトで見出されており、様々な疾患を引き起こし得る。スウェーデン及び北アメリカのハタネズミにおけるＬＶの同定により、多数のハタネズミ集団全体にわたる広い地理的範囲に及ぶＬＶの連続した存在が示唆される。現在、ＬＶの７つの既知の株、即ちスウェーデンに源を発する８７−０１２（ＮＣ  ００３９７６；ＡＦ３２７９２０）、１７４Ｆ（ＡＦ３２７９２１）、１４５ＳＬ（ＡＦ３２７９２２）及び３４２ＳＬ（B. Niklasson, 未公開データ）、並びに米国に源を発するＭ１１４６（ＡＦ５３８６８９）、ＮＹ６４−７８５５（未公開データ）及びＮＹ６４−７９４７（未公開データ）が存在する。ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号又は他の供給源が括弧内に示されている。
【０００６】
遺伝的に、ＬＶゲノム及びコードされるポリタンパク質は、他のピコルナウイルスのＶＰ１で通常見出されるものであって、ＶＰ０における保存配列決定因子であるＶＰ０の予測成熟切断の非存在、並びに２つの未関連２Ａタンパク質、即ち２Ａ１及び２Ａ２のクラスターのような幾つかの例外的な特徴を示す（Johansson et al., 2002, 上記）。２Ａ１タンパク質は、カルジオウイルス、エルボウイルス、テスコウイルス及びアフトウイルスの２Ａタンパク質に関連し、２Ａ２タンパク質は、パレコウイルス、コブウイルス及び鳥類脳脊髄炎ウイルスの２Ａタンパク質に関連する（Johansson et al., 2002, 上記; Lindberg and Johansson, Virus Research, 85, 61-70, 2002）。
【０００７】
ＬＶは、そのげっ歯類宿主及び保有宿主において慢性感染又は長時間の感染を特徴とする。ＬＶは、種々の種の動物並びにヒトに感染し、感染は、長時間の感染又は慢性感染をもたらし得る。ＬＶは、多種多様な組織培養細胞において複製して、離散的細胞変性効果（ＣＰＥ）及び低ウイルス産出量（上清１ｍｌ当たり１０００〜１００００００個程度のウイルス粒子）を伴う慢性感染を付与する。
【０００８】
研究室条件下でのウイルス培養により作成されるデータにより、ＬＶは、種々の組織及び種々の種（例えば、ベロサル腎臓、ベロＥ６サル腎臓、ＭＡ−１０４サル腎臓、ＣＶ−１サル腎臓、ＧＭＫサル腎臓、Ａ−５４９ヒト肺、ヒーラヒト子宮頸部組織、ＢＨＫ  ２１ハムスター腎臓、ＲＤヒト筋肉及びＬ−細胞マウス皮膚）に由来する多数の細胞系において増殖／複製することが示される。
【０００９】
動物及びヒトにおいて、ＬＶは、心臓組織を含む筋肉組織で、脳を含む神経細胞で、並びに膵臓のベータ細胞、甲状腺及び副腎を含む内分泌腺で複製する。
【００１０】
ヒト、ハタネズミ、タビネズミ、実験用マウス、ウサギ、モルモット、ホッキョクギツネ及びヘラジカにおけるＬＶ特異的免疫組織化学試験及び薄片電子顕微鏡法を使用したウイルスの検出に基づくデータにより、ＬＶは、内分泌及び外分泌膵臓組織、血管内皮細胞、脳（神経組織を含む）の細胞、肝臓の細胞、胎盤及び臍帯の細胞、筋肉組織、心臓組織及び甲状腺の組織において見出されていることが示される（Niklasson et al., Ann NY Acad Sci, 1005, 170-175, 2003及び未公開データ）。
【００１１】
したがって、ＬＶは、身体のほとんどの細胞種で成長することができ、その結果身体の全ての臓器に感染することができると結論付けることができる。
【００１２】
ＬＶにとって最も密接に関連される動物ウイルスは、カルジオウイルス属のウイルスである。
【００１３】
類似性
カルジオウイルスは、ピコルナウイルス科に属する。
カルジオウイルスは、それらの自然保有宿主としてげっ歯類を有する。
カルジオウイルスは、多種多様な動物種において疾患を引き起こし得る。
カルジオウイルスは、ＬＶと同じ臓器において感染し、疾患を引き起こし得る。
【００１４】
差異
カルジオウイルス及びＬＶは、遺伝的に遠縁である。
ＬＶの二重２Ａは、カルジオウイルスでは存在しない。
カルジオウイルスは、血清学によりＬＶに関連しない。
カルジオウイルスは、げっ歯類以外の動物に感染すると急性疾患（長時間又は慢性ではない）を引き起こす。
カルジオウイルスは、適応なしで組織培養において培養しやすい一方で、ＬＶは多くの場合、組織培養における盲目継代又は乳マウスにおける初代継代なしで、組織培養における乳マウス適応における数回の継代後に培養することは不可能である（Johansson et al., BBRC, 317, 1023-1029, 2004を参照）。
【００１５】
カルジオウイルスは概して、ヒトに感染しない（文献、例えば、Zimmerman, Encephalomyocarditis, In Handbook: Series of Zoonoses, G.B. Beran (Ed.), CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, USA, 1994及びTesh, Am. J. Trop. Med. Hyg., 27, 144-149, 1978においてほんの稀な事例報告）。
【００１６】
種々の大陸におけるＬＶの新たな変異体が同定される可能性がある。ＬＶは、多数の疾患状態と関連付けられるため、ＬＶを検出するための簡素な効率的且つ有効な試験を有することが望ましい。ＬＶのみが検出されて、他のピコルナウイルスは検出されないように、試験は特異的である必要がある。さらに、試験は、全てのＬＶ株を検出するのに使用することができ、高度に特異的であり、且つ高感度であることが望ましい。また、ウイルス負荷が確定され得るように、試験はＬＶの定量測定を可能にすることが望ましい。
【００１７】
国際特許出願ＷＯ２００４／０７３７１０号では、ＬＶ感染により引き起こされる疾患を治療するための抗ウイルス剤の使用が開示されている。ＬＶの存在に関して試験することが可能であることにより、特に試験が定量的である場合に、かかる治療の有効性をモニタリングすることができる。
【００１８】
ＬＶの存在に関する現在の試験は、非常に面倒である（例えば、ウイルス培養／単離及び細胞変性効果（ＣＰＥ）の検出）か、又は感度が十分高くなく（例えば、免疫組織化学試験）、これらは全てのＬＶを検出しないか、又はＬＶと他のピコルナウイルスとを有効に識別しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、ＬＶを特異的に検出するための簡素な有効な試験が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、配列：ＣＴＧＣＲＹＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＳＧＡＣＡＧＹＧＣ（配列番号１）の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を検出することを含む、ＬＶを検出する方法を提供する。
【００２１】
上記方法は、全てのＬＶを特異的に検出するように設計された。配列番号１又はその逆相補鎖の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドの存在を検出することにより、全てのＬＶが、特異的に検出され得る。特に、上記方法は、非Ｌｊｕｎｇａｎピコルナウイルスを検出しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
配列番号１は、ＬＶの５’ＵＴＲに存在し、全ての既知のＬＶ株において保存される。この配列は、確実にＬＶのみが検出されるように、他の非Ｌｊｕｎｇａｎピコルナウイルスにおける相当する配列とは十分異なる。
【００２３】
ＬＶという用語は上記で定義する通りであり、好ましくはそのゲノムにおいて２つの未関連２Ａタンパク質をコードするピコルナウイルスを意味する。ウイルスが２つの未関連２Ａタンパク質をコードするかどうかを確定する方法は、Lindberg et al., Virus Res.,
85, 61-70, 2002に記載されている。ＬＶという用語は、全ての現在既知のＬＶ並びに後に同定されるであろうＬＶを包含する。新たなＬＶを同定する方法は、国際特許出願第２００４／０７３７１０号に記載されている。
【００２４】
検出されるべき核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列であり得る。当業者に明らかであるように、ＲＮＡ配列が検出された場合、配列におけるチミジンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドである。好ましくは、ｃＤＮＡ配列が検出される。以下でさらに論述するように、ＬＶ  ＲＮＡは、逆転写酵素を使用することによりｃＤＮＡへ逆転写され得る。
【００２５】
或いは、検出される核酸に応じて、配列番号１の逆相補鎖は、本発明の方法を使用して
検出され得る。
【００２６】
配列番号１の逆相補鎖は、ＧＣＲＣＴＧＴＣＳＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴＲＹＧＣＡＧ（配列番号２）である。
【００２７】
検出される核酸配列は、配列番号１又はその逆相補鎖の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、検出される核酸配列は、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含む。検出される核酸配列は、以下の配列：ＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＳＧＡＣＡ（配列番号３）又はその逆相補鎖を含むことが特に好ましい。
【００２８】
配列番号３の逆相補体は、ＴＧＴＣＳＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣ（配列番号４）である。
【００２９】
本発明のヌクレオチド配列において、標準的な命名法によれば、ＲはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ＳはＧ又はＣである。これらの用語の使用により配列へ導入されるわずかな変動は、確実に全てのＬＶが本発明の方法により検出されるために必要とされる。
【００３０】
核酸配列は、任意の適切な技法を用いて検出され得る。好ましくは、核酸配列は、核酸配列へ特異的に結合する１つ又はそれ以上のプローブを使用することにより検出される。特に、検出される核酸配列が配列の点で多様であり得る場合に、１つより多いプローブが使用され得る。例えば、検出される核酸配列が配列番号３を含む場合、２つのプローブが使用されることが好ましい。第１のプローブは、ＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡ（配列番号５）に特異的にアニーリングし、第２のプローブは、ＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＣＧＡＣＡ（配列番号６）に特異的にアニーリングして、その結果、配列の両方のバージョンを検出することができる。好ましくは、第１のプローブは、配列ＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣ（配列番号７）を有し、第２のプローブは、配列ＴＧＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣ（配列番号８）を有する。或いは、配列番号５及び６の両方にアニーリングすることが可能である１つのプローブを使用することができる。配列番号１において多型が存在し、これはＬＶ単離株を識別するのに使用することができることが既知である。例えば、配列番号１の残基番号２４は、スウェーデンＬＶ単離株に関してはＧであるが、アメリカＬＶ単離株に関してはＣである。種々の配列に対してプローブを区別して標識することにより、どの型のＬＶが存在するかどうか、又はさらには単離株の型間での比を確定することが可能である。
【００３１】
好ましくは、１つ又はそれ以上のプローブは、検出される配列に対して相補的な配列を有する核酸プローブ（オリゴプローブ）である。「相補的な配列」という用語は、実質的に全て（好ましくは全て）の核酸塩基が、検出される核酸配列中のヌクレオチド塩基と塩基対を形成することが可能である配列を意味する。プローブは、任意の適切なサイズであり得るが、好ましくは２５ヌクレオチド長未満、より好ましくは２０ヌクレオチド長未満、最も好ましくは１７ヌクレオチド長以下である。
【００３２】
プローブは、適切な多環式試薬を使用することにより検出される核酸の副溝で結合することが特に好ましい。副溝で結合することにより、プローブの融点は増大して、比較的短いプローブ（２５ヌクレオチド長未満）を設計することを可能にさせる。ＬＶと他のピコルナウイルスとの間の配列が類似しているため、ＬＶの特有の配列が検出され得るように、比較的短いプローブを使用することが望ましい。
【００３３】
プローブは、プラス−センスＲＮＡプローブ、マイナス−センスＲＮＡプローブ及びア
ンチセンスＲＮＡプローブを含む一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ或いはＲＮＡであり得る。
【００３４】
核酸に適した標識としては、放射性標識及び非放射性標識（例えば、蛍光、間接的検出系及び化学発光）が挙げられる。
【００３５】
核酸は、標準的な研究室マニュアル（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A
Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor, 1989又はCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., 定期的に更新される）に記載されるもののような技法を使用して、或いはPromega(Southampton, Hampshire, UK)、Roche(Lewes, East Sussex, UK)、Ambion(Huntingdon, Cambridgeshire, UK)及びBD Biosciences/Clontech(San Jose, CA, USA)により供給されるもののような多数の市販のキットの１つを使用して標識され得る。
【００３６】
放射性標識としては、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、3Ｈ又は任意の他の放射性同位体が挙げられる。核酸は、５’末端標識、３’末端標識、ニックトランスレーション及び例えば、ランダム６量体又はランダム８量体を使用したランダムプライマー標識を含む当業者に既知の多くの方法の１つを使用して、放射標識され得る。
【００３７】
蛍光標識としては、フルオレセイン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）又は任意の他の蛍光色素（例えば、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（２，７−ジメチルオキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）及びＨＥＸ（ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）が挙げられる。
【００３８】
デンドリマーベースの標識系が存在する。この標識方法はデンドリマーを使用して、２００個又はそれ以上の蛍光標識を結合させて、少数の標的分子の検出を可能にする。かかるデンドリマー技術は、例えば、Genisphere, Bala, Cynwyd, PA, USAにより生み出されている。
【００３９】
或いは、「Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ」又は「Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｂｅａｄｓ」という名称の下で製造されるナノ粒子のような既知の粒子を適用させてもよい。Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓは、例えば、Quantum Dot Corporation, Hayward, CA, USAから入手され得る。
【００４０】
国際公開第００／１８９６５号は、突然変異又は多型の存在の検出を対象にする方法を開示している。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び蛍光標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して、ハイブリダイゼーションプローブの融解曲線分析に基づいて突然変異及び多型を同定する。使用されるフルオロフォアは、適切であると当該技術分野で既知の多数の種々の化合物（臭化エチジウム、ＹＯ−ＰＲＯ−１及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含む）の１つである。
【００４１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、２つのハイブリダイゼーションプローブの隣接したアニーリングに依存する(Lay and Wittwer, Clin. Chem., 43, 2262-2267, 1997)。第１のプローブは、その３’末端にドナー色素を含有し、他方は、その５’末端にアクセプター色素を含有する。光が外部源から加えられると、ドナー色素は励起されて、蛍光共鳴エネルギー移動のプロセスでエネルギーをアクセプター色素へ移動させる。両方のプローブが近接近してアニーリングする場合のみ、エネルギー移動が可能である。したがって、かかる技法により、特異的配列への相補的なプローブの結合の検出が可能となる。
【００４２】
別の検出系は、エキソヌクレアーゼプローブを使用することを含む。かかるプローブは、レポーター及びクエンチャー色素を含み、ここでクエンチャーは、レポーター由来の任
意のシグナルを防止する。プローブは、標的配列を含有する領域がＰＣＲにより増幅される方法で使用される。プローブは、所望の標的部位へ結合して、ポリメラーゼがプローブに至ると、ポリメラーゼは、プローブを障害として扱い、プローブを小さく切断することによりプローブを除去する。続いて、クエンチャーは、レポーターから分離されて、レポーターが検出され得る。
【００４３】
間接的検出系は、内部組込み、末端標識又は化学修飾のいずれかによる、プローブ分子へのハプテン修飾されたヌクレオチドの組込みを含む。ハプテンの例としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、スルホン化塩基及びジニトロフェノールが挙げられる。ハプテンは、いったんプローブへ組み込まれると、アルカリホスファターゼのようなシグナル伝達酵素に共有結合された親和性リガンドにより検出される。一般的に使用されるリガンドとしては、ストレプトアビジン、アビジン及び抗体（モノクローナル及びポリクローナル）が挙げられる。或いは、ビオチンへ共有結合された核酸挿入部分であるソラレンを使用することができる。ソラレン−ビオチンは、核酸（一本鎖又は二本鎖）内に挿入して、続いて、長波長ＵＶ光による照射により共有結合される。
【００４４】
直接的検出方法は、核酸プローブ、通常は合成オリゴヌクレオチドへのシグナル伝達酵素の直接的共有結合を使用する。この直接的結合は、二次試薬を添加する必要性を排除して、検出工程の数及びシグナル対ノイズの問題を低減させる。シグナル伝達酵素、例えばビオチンは、ビオチン化されたプライマーを用いた酵素重合により、又はビオチン化されたヌクレオチド三リン酸の存在下での重合により、直接的に核酸プローブへ組み込ませることができる。
【００４５】
フコース標識系は、任意のスルフィドリル反応性化合物を連結させることができる普遍的な光活性化可能部分又は熱活性化可能部分を結合させることにより、ハプテン、蛍光色素又は親和性リガンドを、任意の核酸へ結合させるのに使用され得る。ＦａｓｔＴａｇ核酸標識系のようなフコース標識キットが、Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA.
USAで市販されている。
【００４６】
好ましくは、プローブは、一本鎖ＤＮＡプローブである。
【００４７】
ＬＶはＲＮＡウイルスであるため、核酸配列の検出に先立って、逆転写が実施されることが好ましい。逆転写は、当業者に既知の標準的な技法である。ＤＮＡプライマーは、ＲＮＡ配列へアニーリングされて、プライマーは、逆転写酵素の作用により伸長される。プライマーの配列は、ＲＮＡ配列に相補的でなくてはならない。プライマーは、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むｃＤＮＡ配列の生産を可能にする位置で、ＲＮＡ配列へアニーリングしなくてはならない。当業者は、かかるＤＮＡ配列の生産を可能にする適切なプライマーを容易に確定することができる。
【００４８】
好ましくは、プライマーは、配列番号１に近いＬＶの保存配列へ（例えば、配列番号１を有する２００個のヌクレオチド内で）アニーリングする。ＬＶの保存配列へアニーリングすることにより、方法の特異性はさらに改善される。
【００４９】
特に好ましい実施形態では、配列ＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡ（配列番号９）を含むプライマーが、ＬｊｕｎｇａｎウイルスＲＮＡを逆転写させるのに使用される。
【００５０】
ＬｊｕｎｇａｎウイルスＲＮＡを逆転写させることにより、ウイルスＲＮＡへのプライマーアニーリングの特異性が、特異性のレベルを増大させるため、検出方法が改善される。ウイルスＲＮＡがプライマーに相補的な配列を有さなくてはならないだけでなく、逆転
写されたＤＮＡ配列は、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含まなくてはならない。
【００５１】
本発明の方法は以下の工程を含むことが特に好ましい。
（ａ）配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列が得られるように、ＬＶ  ＲＮＡを逆転写させる工程、
（ｂ）上記ＤＮＡ配列を増幅させる工程、及び
（ｃ）上記増幅されたＤＮＡ配列の存在を検出する工程。
【００５２】
上述するように、増幅されたＤＮＡ配列は、任意の既知の方法により検出され得る。好ましくは、増幅されたＤＮＡ配列は、プローブを使用することにより検出される。
【００５３】
ＬＶ  ＲＮＡは、任意のＲＮＡであり得るが、但し、逆転写されると、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列が得られる。ＬＶ  ＲＮＡは、上述するように逆転写され得る。
【００５４】
逆転写により得られるＤＮＡ配列は、任意の適切な方法により増幅され得る。好ましくは、ＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される。任意の適切なプライマーが、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を増幅させるためにＰＣＲ反応で使用され得る。
【００５５】
特許請求される方法の特異性を増大させるために、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を増幅させるのに使用されるプライマーは、ＬＶ  ＲＮＡから逆転写されるＤＮＡのみが増幅され、別のウイルスに由来するＲＮＡ又はＤＮＡは増幅されないように選択することが好ましい。プライマー間の距離は、ＤＮＡ配列を増幅させるのに使用されるＴａｑポリメラーゼの限界に依存する。好ましくは、ＤＮＡ配列を増幅させるのに使用されるプライマー間の距離はは、２００ヌクレオチド未満である。
【００５６】
好ましくは、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を増幅するのに用いられるプライマーは、以下の：
配列ＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧ（配列番号１０）又はその少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを有する順方向プライマー、及び
配列ＧＡＣＡＴＧＣＣＴＴＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧ（配列番号１１）又はその少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを有する逆方向プライマー
を含む。
【００５７】
好ましくは、順方向プライマーは、配列番号１０の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、逆方向プライマーは、配列番号１１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
【００５８】
特に好ましい実施形態では、順方向プライマーは、配列：
ＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧ（配列番号１２）
を有する。
【００５９】
特に好ましい実施形態では、逆方向プライマーは、配列：
ＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡ（配列番号９）
を有する。
【００６０】
好ましくは、ＰＣＲで使用される逆方向プライマー及びＬＶ  ＲＮＡを逆転写させるのに使用されるプライマーは同一であり、それによりたった２つのプライマー、好ましくは上述した順方向プライマー及び逆方向プライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲをＬＶ  ＲＮＡで実施することが可能となる。
【００６１】
サンプル中のＬＶの量を確定することを可能にする定量的ＰＣＲが実施されることが特に好ましい。さらに、サンプル中のＬＶの量を確定することが可能であることにより、Ｌｊｕｎｇａｎウイルス感染の進行又は後退が判定され得る。これにより、研究者が治療の有効性をモニタリングすることが可能となる。
【００６２】
定量的ＰＣＲ手順は、当業者に既知である。特に、リアルタイムＰＣＲ手順及びカイネティックＰＣＲ手順。
【００６３】
実施されるＰＣＲ手順は、エキソヌクレアーゼプローブ（ＴａｑＭａｎプローブとしても既知）を使用したリアルタイムＰＣＲ手順であることが特に好ましい。エキソヌクレアーゼプローブの使用は上述されている。
【００６４】
本発明の方法は、ＬＶに感染されている疑いのある任意のサンプルで実施され得る。適切なサンプルとしては、組織サンプル及び体液サンプルが挙げられる。特に好ましいサンプルとしては、筋肉組織サンプル（特に心臓組織）、神経細胞サンプル（特に、脳細胞）、内分泌腺サンプル（例えば、膵臓のベータ細胞、甲状腺又は副腎サンプル）及び白血球（例えば、バフィコート）が挙げられる。白血球が最も好ましいサンプルである。ＲＮＡは、任意の標準的な手順を使用して、例えばＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキット(Qiagen,
Hilden, Germany)を使用することによりかかるサンプルから抽出することができる。
【００６５】
本発明の特に好ましい一実施形態では、サンプル中でＬＶを検出する方法であって、
（ａ）上記サンプルからＲＮＡを単離する工程、
（ｂ）配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を得るために上記ＲＮＡを逆転写させる工程、及び
（ｃ）エキソヌクレアーゼプローブを使用した定量的ＰＣＲを実施する工程
を含む方法が提供される。
【００６６】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットであって、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドへ特異的に結合する少なくとも１つの標識プローブを含むキットを提供する。
【００６７】
好ましくは、本発明のキットはまた、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を増幅させるためのプライマー、及び上記核酸配列を増幅させるための必須試薬を含む。適切な試薬は、当業者に既知であり、緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチドが挙げられる。上記キットはまた、配列番号１の少なくとも１３個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列が得られるようにＬＶ  ＲＮＡを逆転写させるためのプライマー、及び上記ＲＮＡを逆転写させるための必須試薬を含んでもよい。適切な試薬は、当業者に既知であり、緩衝液、逆転写酵素及びデオキシヌクレオチドが挙げられる。
【００６８】
ここで、本発明は、以下の図面を参照するとともに以下の実施例を参照することにより記載される。
【実施例１】
【００６９】
研究設計及びサンプル
ＬＶは、これまでに記載されたようにAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からのハタネズミのＢＨＫ−２１細胞において単離された(Niklasson et al., Virology,
255,86-93, 1999)。細胞培養上清は、ミドリザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ）に対して継代し、又は１日齢乳マウスにおいて脳内注射することで増殖させた。設計したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを試験するために、乳マウス脳（ＳＭＢ）から調製されたＬＶプロトタイプ株８７−０１２由来のＲＮＡを、外部標準ＰＣＲ対照として使用した（ＴＣＩＤ50：６．２×１０3）。標準曲線は、インハウスＬＶ挿入片組換えプラスミドの１０倍段階希釈物を使用して作成した。特異性試験は、陽性対照として使用した６つの異なるＬＶ株のストックから単離されたウイルスＲＮＡを用いて実施したのに対して、種々のウイルスで感染させた１９個の細胞培養上清、２つの臨床検体及び他のウイルス（最も密接に関連されるヒトパレコウイルス１型、脳心筋炎ウイルス−ＥＭＣＶ及びタイレルマウス脳脊髄炎ウイルス−ＴＭＥＶを含む）の１つのＤＮＡ標準由来の核酸を陰性対照として使用した（表２を参照）。
【００７０】
ＬＶ株１４５ＳＬで腹腔内的に感染させた６匹の研究室マウス、及び１週後に屠殺した４匹の非感染マウス由来の６０個の異なる組織サンプル（脳、肝臓、肺、腎臓、膵臓及び心臓から収集）、妊娠中にＬＶに感染して、子宮内死（ＩＵＤ）の症状を示した５匹の研究室マウスの胎盤サンプル、ＩＨＣによりＬＶ陽性であると予めわかっている子癇前症を伴う４人のスウェーデン人患者の６つの異なるサンプル（胎盤／臍）、並びにセミネステッドＲＴ−ＰＣＲによりＬＶ陽性であると予めわかっているブタ（ＳＭＢ  ９４１）由来の１つのＳＭＢ単離株においてＬＶ感染の存在を確認するために新たなＰＣＲアッセイを適用した（サンプルは全て、Apodemus AB, Stockholm, Swedenによりご好意により提供された）。
【００７１】
オリゴヌクレオチド設計及び合成
プライマー及び副溝結合体（ＭＧＢ）プローブを慎重に設計した。選択したプライマー組は、ＬＶゲノムの５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）における１８７ｂｐフラグメントを増幅する。以下のＬＶヌクレオチド配列（それぞれのＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号又は他の供給源を伴う）がプライマー及びプローブ設計に関するアラインメント研究に含まれた：ＬＶ  ８７−０１２（アクセッション番号ＮＣ  ００３９７６、ＡＦ３２７９２０）、１７４Ｆ（アクセッション番号  ＡＦ３２７９２１）、１４５ＳＬ（アクセッション番号  ＡＦ３２７９２２）、Ｍ１１４６（アクセッション番号  ＡＦ５３８６８９）及びＮＹ６４−７８５５（未公開データ）。
【００７２】
使用したプライマーは、５'−ＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１２）（順方向、ｎｔ２５５〜２７４）及び５'−ＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡ−３’（配列番号９）（逆方向、ｎｔ  ４４２〜４２４）であった。アンプリコン特異的ＭＧＢプローブは、５’末端で蛍光レポーター色素ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）及び３’末端でダーククエンチャーＭＧＢ（副溝結合体）で標識された５’−ＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号７）（ＭＧＢc、ｎｔ  ３０６〜２９０）並びに５’−ＴＧＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号８）（ＭＧＢg、ｎｔ３０６〜２９０）であった。ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ配列ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ  ００３９７６を参照する。プライマーは、TIB MOLBIOL(Berlin, Germany)から、またプローブは、Applied Biosystems（Warrington-Cheshire,
UK）から入手した。
【００７３】
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
サンプルからのＲＮＡは、種々の商業用キット（例えば、Qiagen）により、或いは特に繊維組織サンプルに関しては、ＣｓＣｌクッションに通したグアニジニウムチオシアネー
ト溶解産物の超遠心に関するChirgwinのプロトコル(Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979)により単離され得る。汚染は、Schowengerdt et al., J. Heart Lung
Transplant., 15, 111-123, 1996によりこれまでに記載されているように、サンプルの均質化の間制御された。
【００７４】
ｃＤＮＡを得るために、サンプルＲＮＡ５μｌを、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１２５ｍＭ（それぞれ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、ＲＮａｓｉｎ(Promega, Mannheim, Germany)１０Ｕ、マウス白血病ウイルス逆転写酵素(Invitrogen,
Karlsruhe, Germany)５０Ｕ並びに０．１２５μＭ  逆方向プライマーを含有する最終反応容量１０μｌ中で逆転写させた。サイクルパラメータは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  ＴＲＩＯサーモブロックサイクラー(Biometra，Gottingen，Germany)上で６０℃で５分、３７℃で２０分及び９５℃で５分であった。
【００７５】
リアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲは、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマット(ABgene,
Epsom-Surrey, UK)で実施した。ＰＣＲミックスは、ｃＤＮＡ鋳型２．５μｌ、５０ｍＭ
トリス塩酸塩（ｐＨ９）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ（それぞれ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)０．５Ｕ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)１．２５Ｕ、０．１μＭ（それぞれ）の順方向プライマー及び逆方向プライマー、０．１μＭ（それぞれ）の蛍光標識したＭＧＢプローブ並びに受動的参照としての１．０μＭ  ＲＯＸを含有する２５μｌの容量で構成させた。５０℃で２分間のアンプリコン相互汚染を回避するためのＵＮＧ処理、及び９５℃で１０分間の初期変性後に、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出器(Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA)上で３５回の２段階サイクル（９５℃で１５秒、６０℃で３０秒）により、ＤＮＡを増幅させた。
【００７６】
臨床サンプルからのＲＮＡ調製物の品質は、Radonic et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 313, 856-862, 2004によりこれまでに記載されているように、ヒトグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＰＩＩ）に特異的な２つの参照遺伝子定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにより試験した。
【００７７】
インハウスＬＶ挿入片コントロールプラスミドの生成
ＬＶ  ８７−０１２からの外部標準ＰＣＲ対照のＴａｑポリメラーゼ増幅ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により調べた。単一の分離している１８７ｂｐバンドを、アガロースゲルから切除して、製造業者の指示書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Hilden, Germany)で抽出した。
【００７８】
抽出したＰＣＲ産物を、ベクタープラスミドへクローニングして製造業者の指示書に従って(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ  ＴＡ発現キットで形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞へ伝播させた。１８７ｂｐフラグメントの挿入片コントロールは、Ｔ７及びＢＧＨ逆方向シーケンシングプライマーを用いて行った。ＬＶ挿入片を有するプラスミドは、製造業者の指示書に従ってＱＩＡＧＥＮプラスミドＭｉｎｉキット(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、陽性Ｅ．ｃｏｌｉコロニーから単離された。
【００７９】
配列分析
アンプリコンは、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Hilden, Germany)を使用
して精製して、３７７  ＤＮＡ自動シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA)上でＢｉｇ  Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, Warrington-Cheshire, UK)を用いて直接配列決定して、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴソフトウェア(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)で分析した。
【００８０】
結果
本発明のインハウスＬＶ挿入片プラスミドの１０倍希釈物（希釈物１つ当たり６つの複製）を使用して、希釈物に対して閾値サイクル値（ＣT）をプロットする標準曲線を作成した（図１）。代表的な標準曲線は、１０個のコピーの検出限界で、６桁、即ち１〜１０6個のコピー／アッセイにわたるリアルタイムＰＣＲアッセイにおける高い線形相関を実証する（Ｒ2＝０．９９５６）。アッセイ内の精度は、１回の実験（３シリーズ）において６回、インハウスＬＶ挿入片プラスミドの３つのウイルス陽性対照調製物（１０1、１０2及び１０3個のコピー／アッセイ）を１人の作業者が加工処理することにより評価し、アッセイ間精度は、異なる作業者（それぞれ１シリーズ）により実施される３つの異なる実験において６回、同じ対照を加工処理することにより評価した。各アッセイに関する平均ＣT値及び標準偏差（ＳＤ）は、表１で比較されており、結果が非常に再現可能であることを示している。
【００８１】
上記方法の特異性は、陽性対照として６つの異なるＬＶ株から精製されたＲＮＡを、またさらに陰性対照として２２個の異なるウイルスサンプル由来の核酸を使用して評価した。ＬＶ  ｃＤＮＡサンプルは全て、ＰＣＲで陽性であり、アンプリコンは配列分析から単離することができたのに対して、陰性対照はいずれも、リアルタイムＰＣＲ分析における偽陽性シグナルに寄与しなかった（表２）。陽性ＰＣＲの結果は、ＰＣＲ産物の配列分析により確認することができ、「スウェーデン」ＬＶ株と「非スウェーデン」ＬＶ株とで識別され得る（データは示さず）。
【００８２】
新たな定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを適用させて、げっ歯類及びヒトの両方由来の種々のサンプル型におけるＬＶ感染の存在を確認した。ＬＶ株１４５ＳＬで腹腔内的に感染させ、１週後に屠殺した６匹の研究室マウスの種々の臓器から収集した３６個の組織サンプルのうち３３個（９２％）が、ＰＣＲスクリーニングでＬＶ陽性であった。高いウイルス負荷は、初期サンプル重量に対して組織１ｍｇ当たり最大１０7個のウイルスコピーを有する脳組織サンプルで見出すことができる一方で、４匹の非感染研究室マウスはいずれも、試験した臓器のいずれにおいても陽性ではなかった（データは示さず）。さらに、妊娠中にＬＶ感染されて、ＩＵＤの症状を示す５匹の研究室マウスの全ての胎盤サンプルにおいて、ＬＶゲノム配列は、この新たな方法により検出することができ、組織１ｍｇ当たり２．４×１０3個のウイルスコピーと５．０×１０6個のウイルスコピーとの間のウイルス負荷（平均値１．８×１０6個のコピー）を示した（データは示さず）。さらに、ＩＨＣによりＬＶに関して陽性であると予めわかっている子癇前症を伴う4人のスウェーデン人の患者由来の６個の胎盤／臍サンプルのうち２個（３３％）において、及びセミネステッドＲＴ−ＰＣＲによりＬＶ陽性であると予めわかっている１つのブタ単離株（ＳＭＢ  ９４１）において、ＬＶゲノム配列は、この確立されたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより確認することができる（表３）。相対的に、全ての試験において使用されるＬＶ  ８７−０１２のＬＶ外部標準ＰＣＲ対照におけるウイルス負荷（表２を参照）は、これらの弱い陽性サンプルよりも７０倍高かった。それにもかかわらず、陽性ＰＣＲの結果は、ＬＶプロトタイプ株８７−０１２に対して９８％を上回る配列相同性を有するＰＣＲ産物の配列分析により確認することができる（データは示さず）。
【００８３】
考察
ＬＶは、げっ歯類に保因されるヒト疾患の原因物質とみなされるため、動物及びヒトの両方由来の様々な種類の組織又は液体においてウイルスを検出するための信頼性が高く且
つ高感度のアッセイが必要とされる。
【００８４】
３つの作業が、本明細書で提示される５’−ＵＴＲ−ＰＣＲアッセイの設計に必須であった：
１．ＬＶの全ての株に特異的であるが、ピコルナウイルスの他の考え得る型の検出を排除する５’−ＵＴＲにおける適切な／保存標的配列を見出すこと；
２．１回のアッセイで同時に、ＬＶの全ての既知のスウェーデン株及びアメリカ株、並びにまた多岐にわたる株を検出すること；及び
３．動物及びヒト患者の両方由来の種々の型のサンプルにおいてＬＶゲノムの低いウイルス負荷でさえ定量化すること。
【００８５】
７個の既知のＬＶ株のうちの５個に関する配列データに基づいて、本発明者等は、全ての既知のＬＶ株（ヌクレオチド位置３０２で多型であるとみなされる、グアニジンは、スウェーデンＬＶ株を表し、シトシンは、アメリカＬＶ株を表す（ＮＣＢＩ配列ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ  ００３９７６を参照））を専ら検出することが可能な保存５’−ＵＴＲに特異的な２つのＭＧＢプローブを包含する新たな定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発した。標的配列におけるほんの短い一続きの保存ＤＮＡに起因して、本発明者等は、ＬＶ特異的核酸の検出用に従来のＴａｑ−Ｍａｎ（登録商標）プローブ（およそ２０〜３０量体）に代わってＭＧＢ−プローブ（１７量体）を使用することに決めた。使用されるプローブは、３’末端で非蛍光クエンチャーを有するため、ＭＧＢ技術は、蛍光レポーター色素の正確な検出を容易にする。さらに、副溝結合体は、プローブの融点を増大させて、より短いプローブを設計することが可能であり、したがってそれらの標的配列に対するミスマッチの危険性を回避する(Kutyavin et al., Nucleic Acids Res., 28, 655-661, 2000)。１回のアッセイで全ての既知のＬＶ株及び他の多岐にわたるＬＶ株を検出するために、本発明者等は、２つの異なるＭＧＢ結合された蛍光原ＤＮＡプローブを適用した（整列されたＬＶゲノム配列において、配列番号１におけるヌクレオチド位置２４でグアニン又はシトシンのどちらか一方の多型であるとみなされる）。一塩基多型に特異的であり、且つ同じ蛍光レポーター色素と結合された２つの異なるＭＧＢプローブの同時適用は、新規であるとみなされる。プライマー及びプローブ設計に関するそれらの算出に基づいて、選択される標的配列及び確立されるアッセイは、上述の要求に応じてＬＶの５’−ＵＴＲ特異的配列のスクリーニングに関する最適な適用を表す。５’−ＵＴＲ内部の他の領域を使用することによる他の代替手段は、特にプローブを位置付ける際に困難を招く。
【００８６】
新たなアッセイは、１０個のウイルスコピー／アッセイの検出限界で高感度を有し、サンプル材料から直接単離した６桁にわたるＬＶ  ＲＮＡの信頼性できる定量化を可能にする。ＬＶ陰性対照（最も密接に関連されるヒトパレコウイルス１型、ＥＭＣＶ及びＴＭＥＶを含む）はいずれも、特異性試験で陽性として検出されることはなかった。アッセイの高い特異性は、リアルタイムＰＣＲに関して選択されるプライマー及びプローブにより、及びｃＤＮＡ合成を開始させるのに使用される特異的プライマーにより保証される。さらに、アッセイ内精度及びアッセイ間精度に関する結果は、このアッセイが高い再現性を有することを示す。
【００８７】
このアッセイは、げっ歯類及びヒトの両方由来の種々の研究室サンプル並びに臨床サンプルで試験されて、ＬＶゲノム配列に関して高い検出スコアをもたらした。ＩＨＣによりＬＶに関して陽性であると予めわかっている６個のヒト胎盤／臍プローブのうち２個、及びセミネステッドＲＴ−ＰＣＲによりＬＶ陽性であると予めわかっているブタ由来の１つのＳＭＢ単離株はまた、この新たなアッセイにより弱陽性と検出され、配列分析によりＬＶに関連すると確認することができた。
【００８８】
免疫組織学的に事前試験した胎盤／臍サンプルの３３％のみが、この高感度ウイルス核酸検出技法により確認することができ、ＩＨＣによるウイルス抗原検出のような従来の検出方法は、概してこの方法に関して一般的な問題である他のピコルナウイルスとの交差反応に起因して幾つかの偽陽性の結果をもたらし得ることを示唆する。例えば細胞変性効果（ＣＰＥ）のウイルス単離及び検出のような他の現在の試験は、非常に面倒であり、効率的にＬＶを検出しない(Johansson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 317, 1023-1029, 2004)。しかしながら、この研究における結果により、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＬＶ  ＲＮＡ負荷が低いものも含めて種々の型のサンプルに適用することができることが示された。
【００８９】
結論として、これらの結果により、ヒト疾患におけるＬＶの判定を達成することができることが示される。幾つかの人獣共通感染症で見られるように、ヒトは多くの場合、行き止まり宿主であり、患者からよりも、保有宿主又はベクターから病原体を単離することは、より容易であり得る。また、初期感染と疾患の発症との間の時間は、感染因子は非常に少量でのみ存在し得るか、或いは存在し得ない。しかしながら、本明細書で示されるように、本発明の方法の適用を使用して、種々の種類の組織及び液体において少量のウイルス核酸でさえ検出することができ、本発明の方法の適用は、血清学的分析及びＩＨＣのほかに、多数の疾患に関するヒト病原体としてのＬＶの役割を解明するのを助ける。種々のげっ歯類集団及び臨床サンプル由来の大量の環境サンプルにおけるＬＶの同定は、幾つかの地理的領域におけるＬＶの分布に関するより正確な図画を導くはずであり、ヒト集団に関してもたらされる危険性を算出するのを助けるはずである。
【実施例２】
【００９０】
非近交系ＣＤ１マウス（ＣＤ−１（ＩＣＲ）Ｂｒ Charles River laboratories, Germany）を、出生の１日後におよそ１０００ＩＤ50を有するＬＶ株１４５ＳＬ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ番号．ＡＦ３２７９２２）で腹腔内的に感染させた。動物は、Astrid Fagraeus Laboratory, Swedish Institute for Infectious Disease Control (Stockholm, Sweden)で保持して、感染後の種々の時点で屠殺した。臓器を取り出して、それぞれ凍結させる（第１の部分）か、或いはＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）緩衝液(Ambion, USA)中に即座に入れた（第２の部分）。組織は、ＰＣＲ分析のためにRobert Koch-Institute (Berlin,
Germany)へ発送した。ＲＮＡ抽出は、上述のように実施した。抽出したＲＮＡを逆転写して、ウイルス負荷は、上述したように判定した。抽出手順を確証するために、全ての臓器は、逆転写及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ(TibMolBiol, Berlin, Germany)により、ハウスキーピング遺伝子としてのヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）ｍＲＮＡに関して試験した。試験した臓器は全て、ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡに関して陽性であった。
【００９１】
研究の第１の部分では、未知の性の６匹の感染マウスを、感染の６日後（６ｄｐｉ）に屠殺して、全てが、脳炎の臨床的徴候を有した。脳、心臓、膵臓、肺、腎臓及び肝臓は、組織学及びＰＣＲにより分析した。組織学的観察により、脳において組織損傷が示された。最高のウイルス負荷は、脳（１０7個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ））、続いて心臓及び膵臓（およそ１０4,5個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ））で見られた。肺及び肝臓では、およそ１０4個のウイルスコピー／μｇ（総ＲＮＡ）を検出することができた。最低のウイルス負荷は、腎臓（１０3個のコピー）で見られた（図２）。
【００９２】
４匹の非感染対照マウス由来の臓器は全て、ＬＶに関して陰性であった。
【００９３】
この研究中、本発明者等は、性及びストレスが、研究室マウス並びにハタネズミにおいてＬＶ感染の結末にとって重要な役割を果たし得るという研究室観察からの証拠を得た。性及びストレスが重要な要因であるか不明な研究の第１の部分と対比して、第２の部分で
は、雄マウスのみを包含して、ストレス下で保持した。すなわち、３〜４匹の動物を２５日目から一緒に保持した。２〜４匹のマウスを種々の時点で屠殺して、脳、心臓、膵臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓及び糞便を、上述したようにウイルスＲＮＡに関して分析した（１３ｄｐｉ：ｎ＝４；１７、２７、５６、９８、１３０及び１７４  ｄｐｉ：ｎ＝４）。膀胱及び胸腺サンプルは、可能である場合に収集した。
【００９４】
感染の急性期に、動物は、同じ組織像により同様に脳炎の臨床的症状を有した。脳炎を生き延びた動物（死亡率  およそ３０％）は糖尿病を発症した。
【００９５】
研究した臓器は全て、第１の研究と同様に感染の急性期において類似したウイルス負荷を伴ってＬＶに関して陽性であると試験された。最高のウイルスコピーは、同様に脳（１０6個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ）  １３ｄｐｉ）、続いて心臓（１０4個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ）  １３ｄｐｉ）で見られた。最低のウイルスコピーは、肝臓及び腎臓（約５×１０2個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ）  １３ｄｐｉ）で見られた。時間が経つにつれ、ウイルス負荷は、全ての臓器において減少して、低レベル（１０〜１０3個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ））を持続した（図３）。胸腺では、ウイルス負荷は、他の臓器と比較して低かった（それぞれ、２００個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ）  １３ｄｐｉ及び３個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ）  ５６ｄｐｉ）。膀胱は、加齢動物から取り出すことができた（それぞれ、９８及び１３０ｄｐｉ）。これらの臓器における検出ウイルス負荷は、それぞれ３００個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ）（９８ｄｐｉ）及び９０個のコピー／μｇ（総ＲＮＡ）（１３０ｄｐｉ）であった。
【００９６】
本研究により、研究室マウスにおけるＬＶ感染は、ＰＣＲを使用して検出することができることが示される。
【実施例３】
【００９７】
本発明者等は、上述のＰＣＲ法を使用して１型糖尿病を最近発症した子供から得られた白血球サンプルにおいてＬＶを検出した（試験した８人のうち８人が陽性）。ＬＶはまた、多発性硬化症を伴う１２人の患者のうち１２人において検出された。対照患者では、ＬＶは、試験した３０人の患者のうち１人で見られた。検体は全て、白血球サンプルであった。ＬＶ陽性ＰＣＲの結果は、ＰＣＲ産物の配列分析により確証されている。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
上記で引用した文献は全て、参照により本明細書に援用される。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ＬＶリアルタイムＰＣＲアッセイに関する標準曲線を示す図である。ＬＶ挿入片コントロールプラスミドの１〜１０6個のコピー（ｃｐｓ）を用いたＰＣＲ反応を実施して、希釈物１つ当たり６つの複製それぞれに関する閾値サイクル値（ＣT）を、相当する初期鋳型濃度のｌｏｇ10に対してプロットした。
【図２】感染後６日目のＬＶ感染したマウスからの種々のマウス臓器（脳、心臓、肝臓：ｎ＝６；膵臓、肺：ｎ＝５；腎臓：ｎ＝４）におけるＬｊｕｎｇａｎウイルス（ＬＶ）ＲＮＡを示す図である。ウイルス負荷は、抽出した総ＲＮＡ収量１μｇに対して標準化した（平均値及び平均値の標準誤差）。ウイルス陽性鎖ＲＮＡは、本明細書中に記載するようにＲＴ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲにより判定された。
【図３】ストレスへ暴露させたＬＶ感染した雄研究室マウスからの種々の臓器（１３ｄｐｉ後：脳、心臓、肺、肝臓  ｎ＝４；膵臓、腎臓、脾臓、糞便  ｎ＝３；全ての臓器に関して他の時点  ｎ＝２）におけるＬｊｕｎｇａｎウイルス（ＬＶ）ＲＮＡを示す図である。ウイルス負荷は、抽出した総ＲＮＡ収量１μｇに対して標準化した（平均値、図の明瞭性のために標準誤差棒はなし）。ウイルス陽性鎖ＲＮＡは、本明細書中に記載するようにＲＴ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲにより判定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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