(57)【要約】本発明は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法を提供し、この方法は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される。
2008538277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって、該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法。
【請求項２】
ナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって、該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法。
【請求項３】
ナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって：
ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、および
ｂ）該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定すること
を含み、
該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法。
【請求項４】
前記調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減が、ナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに抗体ベースアッセイが用いられる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのにＥＬＩＳＡが用いられる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項７】
ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子であって、該調節因子が、請求項１に記載の方法により、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子であるとして同定される、ナイアシン受容体調節因子。
【請求項８】
前記調節因子が、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである、請求項１、２、３または７に記載の調節因子。
【請求項９】
前記調節因子が、抗脂肪分解性化合物である、請求項１、２、３または７に記載の調節因子。
【請求項１０】
前記調節因子が、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して有意な紅潮効果を有しない、請求項１、２、３または７に記載の調節因子。
【請求項１１】
組成物の製造方法であって、
ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定すること、および
次いで、該調節因子を担体と混合すること
を含み、該調節因子が、請求項１に記載の方法により同定される、方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の調節因子を含むか、請求項７に記載の調節因子から実質的になるかまたは請求項７に記載の調節因子からなる、医薬組成物。
【請求項１３】
被験体において脂質関連障害を予防または治療する方法であって、
該被験体に、有効な脂質改変量の、請求項１に記載の方法により同定される、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記脂質関連障害が、異常脂質血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、アテローム性硬化症、メタボリック・シンドローム、心疾患、卒中または末梢血管疾患である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質関連障害が、異常脂質血症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質関連障害が、アテローム性硬化症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体に、有効量の肥満または糖尿病の治療に使用される薬剤を、有効量の、請求項１に記載の方法により同定される、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が、ヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
治療を必要とする被験体においてＬＤＬレベルを低減する方法であって、該被験体に、有効量の請求項７に記載の調節因子を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
治療を必要とする被験体においてトリグリセリドレベルを低減する方法であって、該被験体に、有効量の請求項７に記載の調節因子を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
治療を必要とする被験体においてＨＤＬレベルを増加させる方法であって、該被験体に、有効量の請求項７に記載の調節因子を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
脂質改変剤として用いるための請求項７に記載の調節因子を含む医薬の製造方法。
【請求項２４】
脂質関連障害の治療に用いるための請求項７に記載の調節因子を含む医薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）およびアテローム性硬化症などの脂質関連障害の治療に関し、より詳細には、紅潮の副作用が低減した、脂質関連障害の治療用の組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アテローム性硬化症は、脂肪物質、コレステロールおよび他の物質の堆積が、動脈の内壁に蓄積するプロセスである。この蓄積物はプラークと呼ばれる。破裂したプラークは、心臓への血流を阻害し得る（心臓発作）か、または脳への血流を阻害（脳卒中）し得る血餅の形成を引き起こす。心臓発作は、アメリカ合衆国の男性および女性の両方において第１の死因であり、脳卒中は第３の死因である［例えば、非特許文献１を参照されたい］。異常に高レベルの循環脂質は、アテローム性硬化症の発症における主要な素因である。高レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、高レベルのトリグリセリドまたは低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールは、独立して、アテローム性硬化症および関連する病理学の危険因子である。
【０００３】
ナイアシン（ニコチン酸、ピリジン−３−カルボン酸、ビタミンＢ３）は、健康、成長および生殖のためにヒトの身体に必要な水溶性ビタミンである。ナイアシンはまた、最も古くから用いられてきた脂質関連障害の治療用の薬物の１つである。これは、実質上全ての上記に列挙した脂質パラメータに好ましく影響するという点で、価値のある薬物である［非特許文献２］。アテローム性硬化症性の心血管疾患の治療または予防におけるナイアシンの有益性は、６つの主な臨床試験に記載されている［非特許文献３］。ナイアシンのアナログまたは誘導体の構造および合成は、非特許文献４に論じられている。
【０００４】
残念ながら、血清脂質レベルを変えるのに必要なナイアシンの用量は極めて多量であり得、これらの用量では、有害な副作用がしばしば伴う。副作用には、胃腸障害、肝毒性、ならびにグルコース代謝および尿酸レベルの乱れが挙げられ得る。しかしながら、ナイアシン療法の最も頻繁かつ際だった副作用は、しばしば皮膚のかゆみ、刺痛および温感を伴う激しい紅潮である。紅潮反応は一般に無害であるが、患者のコンプライアンスを顕著に低減するのに十分不快である。しばしば、３０〜４０％の患者は、治療開始後数日以内に、ナイアシン治療を受けるのをやめてしまう。
【０００５】
治療効力を維持しながら、皮膚紅潮反応を最小化するナイアシンアナログ、投与剤形および治療プロトコールを開発するための努力がなされてきた。しかしながら、今日まで、これらの努力の結果、皮膚紅潮反応を部分的にのみ低減する化合物または方法が得られたにすぎない。さらに、これらの化合物または方法は、他の副作用を生じ得る。例えば、アスピリンなどの化合物は、紅潮を低減することを意図してナイアシンの投与の前に投与され得る。しかしながら、アスピリンは、せいぜい、何人かの患者において紅潮の部分的な低減をもたらすにすぎず、また、アスピリンの胃腸副作用により、その使用は限定される。さらに、ナイアシンの延長または遅延放出処方物が開発され、紅潮の発生率がより低いと報じられている。しかしながら、これらの延長または遅延放出処方物は、紅潮より重篤な副作用である肝毒性をもたらすことが示されている。
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，（２００２）８：１２０９−１２６２
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｈａｒｍｏｎ  ＪＧ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ  ＬＥ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３６，Ｍａｈｌｅｙ  ＲＷ  ａｎｄ  Ｂｅｒｓｏｔ  ＴＰ（２００１）ｐａｇｅｓ  ９７１−１００２
【非特許文献３】Ｇｕｙｔｏｎ  ＪＲ、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９８）８２：１８Ｕ−２３Ｕ
【非特許文献４】ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、ナイアシン治療で見られるようなレベルの紅潮を引き起こすことのない抗脂質性の化合物を同定する化合物および方法が必要とされている。本発明は、この必要性を満たし、かつ、関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本出願人は、ナイアシン受容体調節因子が細胞内のＭＡＰキナーゼ経路を活性化する能力は、調節因子がインビボで紅潮を引き起こすかどうかの予測因子であることを本明細書に開示する。詳細には、本出願人は、ナイアシンよりも少ない程度で分裂促進因子により活性化されたタンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）を活性化するナイアシン受容体調節因子が、インビボでナイアシンよりも少ない紅潮を引き起こすことを開示する。インビボ紅潮アッセイは手間がかかり、時間がかかり、かつ高価であるので、ＭＡＰキナーゼアッセイなどの有効なインビトロ細胞ベースアッセイを用いてそれらの紅潮能力の調節因子をスクリーニングする能力は、非常に有利である。
【０００８】
第１の局面では、本発明は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を提供する。１つの実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して有意な紅潮効果を有しない。１つの実施態様では、当該当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である。他の実施態様では、抗体ベースアッセイが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。さらなる実施態様では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。
【０００９】
第２の局面では、本発明は、ナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を提供する。１つの実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシンと比較して有意な紅潮効果を有しない。１つの実施態様では、当該当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である。他の実施態様では、抗体ベースアッセイが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。さらに実施態様では、ＥＬＩＳＡが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。
【００１０】
第３の局面では、本発明は、ナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって：ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を提供する。１つの実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシンと比較して有意な紅潮効果を有しない。１つの実施態様では、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である。他の実施態様では、抗体ベースアッセイが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。さらなる実施態様では、ＥＬＩＳＡが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。
【００１１】
第４の局面では、本発明は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子であって、当該調節因子が、第１の局面の方法に従って、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す調節因子であると同定される、調節因子を提供する。１つの実施態様では、当該調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該調節因子は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して有意な紅潮効果を有しない。
【００１２】
第５の局面では、本発明は、組成物の製造方法であって、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定すること、次いで、当該調節因子を担体と混合することを含み、当該調節因子が、第１の局面の方法により同定される、方法を提供する。
【００１３】
第６の局面では、本発明は、第４の局面の調節因子を含むか、第４の局面の調節因子から実質的になるか、または第４の局面の調節因子からなる医薬組成物を提供する。
【００１４】
第７の局面では、本発明は、被験体において脂質関連障害を予防または治療する方法であって、当該被験体に、有効な脂質改変量の、第１の局面の方法により同定される、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む、方法を提供する。１つの実施態様では、当該脂質関連障害は、異常脂質血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、アテローム性硬化症、メタボリック・シンドローム、心疾患、卒中または末梢血管疾患である。他の実施態様では、当該脂質関連障害は、異常脂質血症である。さらなる実施態様では、当該脂質関連障害はアテローム性硬化症である。１つの実施態様では、第７の局面の方法は、前記被験体に、有効量の肥満または糖尿病の治療に使用される薬剤を、有効量の、第１の局面の方法により同定される、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子と組み合わせて投与することをさらに含む。１つの実施態様では、被験体は哺乳動物であり、他の実施態様では、被験体はヒトである。
【００１５】
第８の局面では、本発明は、治療を必要とする被験体においてＬＤＬレベルを低減する方法であって、当該被験体に、有効量の第４の局面の調節因子を投与することを含む、方法を提供する。
【００１６】
第９の局面では、本発明は、治療を必要とする被験体においてトリグリセリドレベルを低減する方法であって、当該被験体に、有効量の第４の局面の調節因子を投与することを含む、方法を提供する。
【００１７】
第１０の局面では、本発明は、治療を必要とする被験体においてＨＤＬレベルを増加させる方法であって、当該被験体に、有効量の第４の局面の調節因子を投与することを含む、方法を提供する。
【００１８】
第１１の局面では、本発明は、脂質改変剤として用いるための第４の局面の調節因子を含む医薬の製造方法を提供する。さらに、第１１の局面では、本発明は、脂質関連障害の治療に用いるための第４の局面の調節因子を含む医薬の製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（詳細な説明）
本出願人は、ナイアシン受容体調節因子が細胞内でＭＡＰキナーゼ経路を活性化する能力は、調節因子がインビボで紅潮を誘発する能力に相関することを見出した。本明細書中に示すように、ナイアシンはヒトナイアシン受容体に結合し、これらの細胞内でＭＡＰキナーゼを活性化する（実施例１および図１を参照されたい）。ＭＡＰキナーゼ活性化は、２つのタイプの抗体ベースアッセイ、ＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎブロットアッセイで示された。本明細書中に開示されるように、インビボで紅潮を引き起こすことが知られているナイアシン受容体調節因子は、インビボで紅潮を引き起こさなかった調節因子と比較して、より高いレベルのＭＡＰキナーゼ活性化を有することが示された（実施例２ならびに図３および４を参照されたい）。従って、本出願人は、インビボで紅潮を引き起こす能力が未知のナイアシン受容体調節因子を選択し、これらの調節因子が、ヒトまたはマウスナイアシン受容体を発現する細胞においてＭＡＰキナーゼを活性化する能力を試験した（実施例３を参照されたい）。図５は、代表的な調節因子である化合物１１を示すが、これは、ｃＡＭＰアッセイに基づいて選択された。次いで、この調節因子を、ＭＡＰキナーゼＥＬＩＳＡアッセイで試験し、ナイアシンと比較してＭＡＰキナーゼ活性化のレベルが低いことを示した（上部パネルを参照されたい）。次いで、化合物１１がインビボで紅潮を引き起こす能力を試験した。図５に示すように、右下パネルでは、化合物１１は、マウスにおいてインビボでいかなる有意な紅潮も引き起こさなかった。さらに、本明細書中に開示されるように、化合物１１は抗脂肪分解性（左下パネルを参照されたい）である。本出願人はまたＭＡＰキナーゼアッセイにおいてナイアシンのように挙動するナイアシンアナログは、本発明の方法においてナイアシンの代わりに用いられ得ることを本明細書に開示する。そのような化合物である化合物１２を、図６に示す。
【００２０】
ナイアシンは何年にもわたって脂質関連障害の療法に用いられてきたが、それを介してナイアシンが作用する受容体は、最近まで知られていなかった。最初に、ナイアシンは特異的ＧＰＣＲを介して作用することが提唱された（Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５９：３４９−３５７）。結局、ＨＭ７４ａと呼ばれる公知のオーファンＧＰＣＲが、ニコチン酸受容体であると同定された（例えば、米国特許出願第１０／３１４，０４８号を参照されたい）。ヒトナイアシン受容体のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７７５５１および本明細書に配列番号１として見出され得る。
【００２１】
一般に、リガンドがその受容体に結合するとき（しばしば、受容体の活性化と呼ばれる）、細胞内領域と細胞内Ｇ−タンパク質との間の結合を促進する受容体のコンフォメーションの変化が存在する。他のＧタンパク質が存在するが、現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏが、同定されているＧタンパク質である。乱交雑のＧタンパク質も存在し、これらは、いくつかの分類のＧＰＣＲを、Ｇα１５またはＧα１６などのホスホリパーゼＣ経路に結合させる［Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ＆  Ｓｉｍｏｎ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９５）２７０：１５１７５−８０］か、または多数の異なるＧＰＣＲを、同じ経路に結合するよう設計されたキメラＧタンパク質［Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｒｅｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９）２０：１１８−２４］であるようである。Ｇ−タンパク質に結合したリガンド活性化ＧＰＣＲは、シグナル伝達と呼ばれるシグナリングカスケードプロセスを開始する。正常な条件下では、シグナル伝達は、最終的に、細胞の活性化または細胞の阻害をもたらす。
【００２２】
ナイアシン受容体は、ＧｉＧタンパク質に結合することが知られているので、ナイアシン受容体の拮抗は、細胞内ｃＡＭＰのレベルの低減をもたらす。脂質細胞では、ｃＡＭＰの低減は、ホルモン感受性リパーゼ活性の低減および遊離脂肪酸放出の低減をもたらす。遊離脂肪酸の低減の結果は２倍である。まず、これは、最終的にＬＤＬ−コレステロールを低減し、ＨＤＬ−コレステロールレベルを上昇させるが、これらは独立して、アテローム性硬化症および関連障害の危険因子である。次に、これはインスリン抵抗性または２型糖尿病を有する個体においてインスリン感受性の増加をもたらす。残念ながら、ナイアシンの治療薬としての使用は、紅潮などの多くの関連する有害な副作用により、部分的に限定される。
【００２３】
本出願人は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する化合物を、当該化合物のＭＡＰキナーゼ活性を決定することによって同定する方法であって、当該化合物により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該化合物がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法を、本明細書中に開示する。例えば、本出願人は、化合物のＭＡＰキナーゼ活性を決定することにより、当該化合物が、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するかどうかを予測する方法であって、当該化合物により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該化合物がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を開示する。
【００２４】
本発明は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を提供する。１つの実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して有意な紅潮効果を有しない。１つの実施態様では、当該当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である。他の実施態様では、抗体ベースアッセイが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。さらなる実施態様では、ＥＬＩＳＡが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。
【００２５】
本発明はまた、ナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を提供する。１つの実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシンと比較して有意な紅潮効果を有しない。１つの実施態様では、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である。他の実施態様では、抗体ベースアッセイが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。さらなる実施態様では、ＥＬＩＳＡが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。
【００２６】
本出願人は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する化合物を同定する方法であって：ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、およびｂ）当該化合物のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該化合物により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該化合物がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法を、本明細書に開示する。例えば、本出願人は、化合物が、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するかどうかを予測する方法であって、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、およびｂ）当該化合物のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該化合物により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該化合物がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法を開示する。本出願人は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することにより同定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を開示する。
【００２７】
本発明は、さらに、ナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定する方法であって、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される、方法を提供する。１つの実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該ナイアシン受容体調節因子は、ナイアシンと比較して有意な紅潮効果を有しない。１つの実施態様では、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である。他の実施態様では、抗体ベースアッセイが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。さらなる実施態様では、ＥＬＩＳＡが、当該ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられる。
【００２８】
本明細書で用いるように、用語「紅潮」は、検出可能な皮膚血管拡張反応を意味する。例えば、紅潮は、ナイアシンまたはナイアシンアナログなどのナイアシン受容体アゴニストの投与により引き起こされ得る。ナイアシンが誘発する紅潮は、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）などのプロスタグランジンにより媒介されると考えられている。紅潮反応は、皮膚の発赤により特徴付けられ、他の症候、例えば、皮膚のかゆみ、刺痛、温感または頭痛も含み得る。紅潮反応は、皮膚上のどこでも、例えば、顔、首または体躯上で起こり得、１箇所または１箇所以上で起こり得る。ヒトにおいて、紅潮反応は、数分〜数時間にわたって続き得る。一般に、ヒトでは、十分な用量のナイアシンまたはナイアシンアナログの経口投与により引き起こされた紅潮反応は、２０分〜８時間以上続き得る。マウスまたはラットでは、紅潮反応は、通常、ナイアシンの投与（注射による）約３分後に最大値に達し、約３０分後に顕著に低減する。
【００２９】
検出可能な紅潮反応を生じるのに必要とされるナイアシンまたはナイアシンアナログの量は、いくつかの変数、例えば、化合物の処方および個々の被験体に依存する。特に、検出可能な紅潮反応を生じるのに必要とされるナイアシンまたはナイアシンアナログの量は、例えば、個体の体重、個体の遺伝的体質または一般的な健康に依存し得る。ヒトにおいて紅潮反応を引き起こし得るナイアシンまたはナイアシンアナログの量は、アテローム性硬化症関連血清脂質の量を低減するのに必要とされる量よりも低く、例えば、１日当たり少なくとも１７５ｍｇ、１日当たり少なくとも２００ｍｇ、１日当たり少なくとも２５０ｍｇ、１日当たり少なくとも５００ｍｇ、１日当たり少なくとも７５０ｍｇ、１日当たり少なくとも１ｇ、１日当たり少なくとも１．５ｇ、１日当たり少なくとも２ｇ、１日当たり少なくとも２．５ｇ、１日当たり少なくとも３ｇ、１日当たり少なくとも３．５ｇ、１日当たり少なくとも４ｇ、１日当たり少なくとも４．５ｇ、１日当たり少なくとも５ｇ、１日当たり少なくとも５．５ｇ、１日当たり少なくとも６ｇ、１日当たり少なくとも６．５ｇ、１日当たり少なくとも７ｇ、１日当たり少なくとも７．５ｇ、１日当たり少なくとも８ｇ以上を含み得る。例えば、１日当たり５００ｍｇ〜２ｇ以上のナイアシンは、ほとんどのヒトにおいて紅潮反応を引き起こし得る。
【００３０】
本明細書で用いる「ナイアシン」は、以下の化学物質形態を有するニコチン酸を意味する：
【００３１】
【化１】
2008538277.tif 000003
用語ナイアシンはまた、ナイアシンの遊離酸形態と同じ特性を有する、ナイアシンの医薬上許容され得る塩および溶媒和物を含む。当業者に理解されるように、ナイアシンは、その薬理学的特性が改変されるように、他の化合物とともに製剤化され得る。例えば、ナイアシンは、ナイアシンに添加した他の化合物に依存して、即時放出（ＩＲ）剤形として、あるいは延長または遅延放出（ＳＲ）剤形として製剤化され得る。
【００３２】
延長または遅延放出処方物は、錠剤またはカプセルから活性成分をゆっくり放出するように設計され、従来のまたは即時の投与形態に関連する代表的な投薬頻度と比較して、投薬頻度を低減することが可能になる。遅い薬物放出は、薬物の血中レベルを低減および延長するように設計されるので、従来の延長または即時放出のナイアシン製剤に関連する紅潮の副作用を最小限にするか低減する。しかしながら、脂質関連障害を有する患者における研究により、いくつかの延長または遅延放出製剤は、即時放出ナイアシンと同程度の有利な脂質変化効果を有さず、実際には、即時放出製剤と比較してより悪い副作用プロファイルを有することが示されている。例えば、延長または遅延放出ナイアシン処方物は、Ｈｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｍ  ＪＭｅｄ，９１：１９９１（１９９１）およびＤａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｍ  ＪＭｅｄ，９３：１０２（１９９２）に記載のように、より高い発生率の肝臓毒性を引き起こすことが知られている。Ｎｉｃｏｂｉｄ（登録商標）カプセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）、Ｅｎｄｕｒａｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖｉｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ならびに米国特許第５，１２６，１４５号および同第５，２６８，１８１（２つの異なるタイプのヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび疎水性成分を含む遅延放出ナイアシン処方物を記載する）に記載された処方物などのナイアシンの延長または遅延放出処方物が開発されている。
【００３３】
本明細書で用いるように、「ナイアシンアナログ」は、ナイアシンと同様のＭＡＰキナーゼプロファイルおよび紅潮効果を有する、ナイアシンと構造的または機能的に関連する化合物を意味する。ナイアシンアナログの例は、化合物１２（図６を参照されたい）である。この化合物は、ナイアシンに構造的に関連するが、テトラゾール基を含むことによりナイアシンと異なる。さらに、この化合物は、ナイアシン受容体に結合するので、ナイアシンと機能的に関連する。さらに、この化合物は、ナイアシンと同様のＭＡＰキナーゼプロファイル（図６を参照されたい）および紅潮効果を有する。従って、この化合物は、ナイアシンの代わりに、参照として本発明の方法において用いられ得る。他のこのようなナイアシンアナログは、当業者に明らかとなろう。
【００３４】
いくつかのナイアシンの構造的アナログが当該分野で公知である。いくつかの実施態様では、ナイアシンの構造的アナログは、少なくとも１つのカルボキシル、テトラゾリルなどの酸性官能基を含む。いくつかの実施態様では、ナイアシンの構造的アナログは、ピリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリルなどに存在する窒素などの、少なくとも１つの窒素環原子を含む。いくつかの実施態様では、ナイアシンの構造的アナログは、少なくとも１つの酸性官能基および少なくとも１つの窒素環原子を含む。これらの基は、インビボで変換されて（例えば、血中で加水分解されることにより）酸性官能基または環窒素を生じるプロドラッグ基を含む。詳細な議論は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｖｏｌ．１４  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓおよび“Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，”ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７（これらは両方とも参照として本明細書中に援用される）に提供される。
【００３５】
ナイアシンアナログはナイアシンに機能的に関連し得、例えば、ナイアシンアナログは、特異的にナイアシン受容体に結合する、またはナイアシン受容体での結合に応答して細胞内シグナルを開始するなどのナイアシンの機能を有し得る。例えば、ナイアシンアナログは、ナイアシン受容体アゴニストであり得る。
【００３６】
ナイアシンのいくつかのアナログまたは誘導体は当該分野で公知であり、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８３）に見出され得る。ナイアシンについて上記したように、ナイアシンアナログは、異なる方法で製剤化されて、それらの薬理学的特性を改変され得る。
【００３７】
「ナイアシン受容体調節因子」は、例えば、ナイアシン受容体に結合したときに細胞内応答を調節または変化するリガンドまたは化合物である材料である。細胞内応答は、例えば、膜へのＧＴＰ結合の変化またはｃＡＭＰなどの第２のメッセンジャーのレベルの調節であり得る。
【００３８】
「アゴニスト」は、例えば、受容体に結合したときに細胞内応答を活性化するリガンドまたは化合物である材料である。細胞内応答は、例えば、膜へのＧＴＰ結合の増強またはｃＡＭＰなどの第２のメッセンジャーのレベルの調節であり得る。いくつかの実施態様では、アゴニストは、受容体に結合したときに細胞内応答を活性化することが以前に知られていなかった材料である（例えば、膜へのＧＴＰγＳ結合を増強するか、または細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させる）。
【００３９】
「部分アゴニスト」は、例えば、受容体に結合したときに、細胞内応答を、全アゴニストよりも程度または範囲が低くではあるが活性化するリガンドまたは化合物である材料である。
【００４０】
本明細書で用いるように、「ナイアシン受容体部分アゴニスト」は、ナイアシン受容体に結合したときに細胞内応答を活性化するが、ナイアシン受容体において、全アゴニストであるナイアシンよりも程度または範囲が低い材料である。技術的には、部分アゴニストとの用語は、相対的な用語であるが、これは、部分アゴニストが、全アゴニストに対して部分応答を生じるからである。新規化合物は、時間と共に発見されるので、全アゴニストは変化し得、以前の全アゴニストが部分アゴニストになり得る。明確性のため、本明細書で用いるナイアシン受容体部分アゴニストは、全アゴニストとしてのナイアシンに対するものである。ナイアシン受容体部分アゴニストは、ナイアシンと比較して検出可能なより低い程度の細胞内応答の活性化を有する（すなわち、ナイアシン受容体部分アゴニストは、最大応答未満の応答を誘発する）。従って、ナイアシン受容体部分アゴニストは、ナイアシンよりも効力が低い。例えば、ナイアシン受容体部分アゴニストは、ナイアシンと比較して９０％以下の効力、ナイアシンと比較して８５％以下の効力、ナイアシンと比較して８０％以下の効力、ナイアシンと比較して７５％以下の効力、ナイアシンと比較して７０％以下の効力、ナイアシンと比較して６５％以下の効力、ナイアシンと比較して６０％以下の効力、ナイアシンと比較して５５％以下の効力、ナイアシンと比較して５０％以下の効力、ナイアシンと比較して４５％以下の効力、ナイアシンと比較して４０％以下の効力、ナイアシンと比較して３５％以下の効力、ナイアシンと比較して３０％以下の効力、ナイアシンと比較して２５％以下の効力、ナイアシンと比較して２０％以下の効力、ナイアシンと比較して１５％以下の効力、またはナイアシンと比較して１０％の効力を有する。例えば、ナイアシン受容体部分アゴニストは、ナイアシンと比較して１０％〜９０％の効力、ナイアシンと比較して２０％〜８０％の効力、ナイアシンと比較して３０％〜７０％の効力、ナイアシンと比較して４０％〜６０％の効力、またはナイアシンと比較して４５％〜５５％の効力を有し得る。測定した応答の大きさである効力は、定義された応答を誘発するのに要する化合物の量である効力により異なる。従って、ナイアシン受容体部分アゴニストは、アゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストと比較してより強いか、弱いか、または等しくあり得る。
【００４１】
ナイアシン受容体部分アゴニストは、当該分野で周知のアッセイを用いて決定され得る。例えば、ナイアシン受容体部分アゴニストは、ｃＡＭＰアッセイを用いて決定され得る。
【００４２】
ナイアシン受容体に関しては、いくつかのナイアシン受容体配列が当該分野で公知である。例えば、ヒトナイアシン受容体ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号ＮＭ＿１７７５５１として見出すことができ、本明細書に配列番号１として列挙されている。また、ナイアシン受容体への限られた改変は、ナイアシン受容体がナイアシンに結合する能力を損なうことなくなされ得ることが理解される。例えば、ナイアシン受容体は、他のナイアシン受容体ポリペプチド、例えば、ヒトナイアシン受容体ポリペプチド（配列番号２）の種ホモログを含むことが意図される。ヒトナイアシン受容体の種ホモログの配列は、データベース中に存在し、例えば、ナイアシン受容体のラットホモログは、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＢＡＣ５８００９に見出し得る。さらに、ナイアシン受容体は、全ナイアシン受容体ポリペプチドのナイアシン受容体機能を実質的に保持するナイアシン受容体のスプライス変異体およびアレル変異体を含む。
【００４３】
さらに、ナイアシン受容体は、変異受容体が野生型ナイアシン受容体ポリペプチドのナイアシン受容体機能を実質的に保持する限り、野生型受容体と比較してアミノ酸変化、例えば、保存アミノ酸変化を含み得る。保存および非保存アミノ酸の変化、ギャップおよびアミノ酸配列への挿入は、デフォルトセッティングを用いるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）などの利用可能なアルゴリズムおよびプログラムを用いて参照配列と比較され得る（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２を参照されたい）。
【００４４】
ナイアシン受容体は、ナイアシンに特異的に結合する。特異的に結合するとの用語は、ポリペプチドが、非関連ポリペプチドへの親和性よりもある程度高い標的ポリペプチドへの親和性を意味することを意図する。受容体結合を検出または測定するいくつかの方法が当該分野で周知であり、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、またはＦＬＩＰＲアッセイなどの読み出し機能を用いるアッセイが挙げられる。
【００４５】
実質的に全ポリペプチドのナイアシン受容体機能を保持するナイアシン受容体のフラグメントは、全ポリペプチドの代わりに用いられ得ることが理解される。例えば、ナイアシン受容体のリガンド結合ドメインは、部分アゴニストのナイアシン受容体への結合を決定するために、全ポリペプチドの代わりに用いられ得る。
【００４６】
「低減した」は、ある程度の量または特定の活性の低減を意味し、用語「低減した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」、「低減すること（ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｎｇ）」、「低減すること（ｌｏｗｅｒｉｎｇ）」および「低減すること（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）」と同義に用いられる。紅潮の量に関しては、低減した紅潮効果は、例えば、紅潮の重篤度の低減および／または他に起こる紅潮現象よりもより少ない紅潮（紅潮の発生率の低減）であり得る。例えば、紅潮の重篤度および／または紅潮の発生率は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、低減され得る。さらに、紅潮は、１００％低減、すなわち、除去され得、その結果、有意な紅潮は検出可能でなくなる。１つの実施態様では、紅潮の強度は、少なくとも約８０％低減される。他の実施態様では、紅潮の低減は、紅潮の完全な低減、すなわち除去である。
【００４７】
いくつかの方法が、紅潮を検出および定量するのに用いられ得る。例えば、紅潮は、視覚的に検出および定量され得る。紅潮を検出および定量する１つの方法は、例えば、Ｐｉｒｉｍｅｄ  ＰｉｍＩＩ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｌｅｒを用いるＬａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒによる方法である。さらに、紅潮および刺痛または温感などの紅潮に関連し得る症候の重篤度を評価するために、被験体の研究を行い得る。紅潮を検出および定量するための他の方法は、血または尿などの被験体由来の生物学的サンプル中のプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）またはプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）のレベルを測定することを含むことができる。さらに、例えば、ＰＧＤ−Ｍのレベル、ＰＧＤ２の主要な尿代謝物は、被験体の尿から測定され得る。プロスタグランジンレベルを測定するためのアッセイは、市販で入手可能であり、例えば、ＰＧＤ２の酵素免疫アッセイは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から入手可能である。
【００４８】
１つの実施態様では、本発明の方法では、化合物または調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差である。図４に示すように、ナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルから少なくとも２標準偏差のＭＡＰキナーゼ活性の低減は、右の矢印により示される全ての公知の非紅潮化合物を同定した。当業者に理解されるように、異なるカットオフ値は、当業者の必要に応じて選択され得る。例えば、当業者が、あらゆる非紅潮化合物を捕捉することを確認したい場合、いくつかのものはインビボで試験した場合に最終的に低減した紅潮効果を有しないであろうとの考えのもとでより多くの化合物を同定する立場で、誤りを選択し得る。この場合、当業者は、ナイアシンまたはナイアシンアナログからの２標準偏差を超えて、例えば、１．５標準偏差超のナイアシンまたはナイアシンアナログに、カットオフを設定し得るであろう。逆に、当業者が紅潮活性を有するいかなる化合物も避けたい場合は、カットオフはナイアシンまたはナイアシンアナログからの２標準偏差未満、例えば、例えば、ナイアシンまたはナイアシンアナログの２．５標準偏差未満に設定されるであろう。本発明の異なる実施態様では、調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、ナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルの少なくとも１、１．２、１．４、１．６、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８または５．０標準偏差未満である。カットオフ値はまた、範囲として表すこともでき、例えば、調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性の低減は、例えば、ナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性のレベルの１と少なくとも４との間、２と少なくとも３との間、または２．５と少なくとも３との間の標準偏差未満であり得る。
【００４９】
ＭＡＰキナーゼ活性を決定するための任意のアッセイが、本発明の方法において用いられ得る。例えば、ＭＡＰキナーゼの基質であるミレイン（ｍｙｌｅｉｎ）などの塩基性タンパク質を用いるアッセイなどの基質活性アッセイを、本発明の方法において用いられ得る。１つの実施態様では、ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに、抗体ベースアッセイが用いられ得る。このようなアッセイは当該分野で周知であり、例えば、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、蛍光分極アッセイ（ＦＰＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイなどが挙げられ得る。１つの実施態様では、ＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられるアッセイは、ＥＬＩＳＡである。１つの実施態様では、本発明の方法においてＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられるアッセイは、ヒトナイアシン受容体を用いる。
【００５０】
本発明はまた、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子であって、当該調節因子が、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法であって、ナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性が低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子であると同定される、調節因子を提供する。例えば、本発明は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子であって、当該調節因子が、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、ナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性が低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子であると同定される、調節因子を提供する。さらに、本発明は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子であって、当該調節因子が、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含み、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子であると同定される、調節因子を開示する。
【００５１】
１つの実施態様では、当該調節因子は、ナイアシン受容体アゴニストまたは部分アゴニストである。他の実施態様では、当該調節因子は、抗脂肪分解性化合物である。さらなる実施態様では、当該調節因子は、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して有意な紅潮効果を有しない。
【００５２】
本発明は、組成物の製造方法であって、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定すること、および次いで、当該調節因子を担体と混合することを含む方法をさらに提供するが、ここで、当該調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、同定される。さらに、本発明は、組成物の製造方法であって、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を同定すること、および、次いで、当該調節因子を担体と混合することを含む方法を開示するが、ここで、当該調節因子は、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定すること、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法に従って、同定される。
【００５３】
本発明はまた、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を含むか、当該調節因子から実質的になるか、または当該調節因子からなる医薬組成物を提供するが、ここで、当該調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法により、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子であると同定される。本発明はまた、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を含むか、当該調節因子から実質的になるか、または当該調節因子からなる医薬組成物を開示するが、当該調節因子は、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定する、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法により、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子であると同定される。
【００５４】
本明細書で用いる「組成物」は、少なくとも１つの成分を含む材料を意味する。医薬組成物は、組成物の１つの例である。医薬組成物は、少なくとも１つの活性成分を含む組成物を意味し、ここで、当該組成物は、被験体（例えば、ヒト）における特定の有効な結果の研究に従う。当業者は、活性成分が、当業者の必要性に基づいて望まれる有効な結果を有するかどうかを決定するのに適した技術を理解し評価するであろう。
【００５５】
本明細書に記載された組成物は、医薬上または生理学的に許容され得る担体を含み得る。適切な医薬上許容され得る担体は、当業者が入手可能である；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｏｎｓ，（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）を参照されたい。本発明の化合物は、予防または治療に用いるため、未加工のまたは純粋な化学物質として投与されるのに代替で使用され得るが、医薬処方物または組成物として化合物または活性成分を提供することもまた望ましくあり得る。
【００５６】
従って、本発明は、本発明の化合物あるいはその医薬上許容され得る塩または誘導体を、１つ以上のその医薬上許容され得る担体および／または予防の成分と共に含む医薬処方物をさらに提供する。担体は、処方物の他の成分と適合性であるという意味で「許容され得」、レシピエントに過度に有害ではない。
【００５７】
医薬処方物には、経口投与、経直腸投与、経鼻投与、局所（経頬および舌下が挙げられる）投与、経膣投与または非経口（筋肉内、皮下および静脈内が挙げられる）投与に適切なもの、あるいは吸入または送気による投与に適切な剤形のものが挙げられる。
【００５８】
本発明の化合物は、従来のアジュバント、担体または希釈剤と共に、医薬処方物およびその単位用量の剤形にされ得、当該剤形においては、錠剤または充填したカプセルなどの固体として用いられ得るか、あるいは、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル、ゲルなどの液体または当該液体を充填したカプセルとして用いることができ、全て、経口用途、直腸投与のための坐剤の剤形、局所用途のための液体、ゲル、ローションまたは軟膏の剤形、あるいは非経口（皮下を含む）用途のための無菌の注射可能な溶液の剤形に用いられ得る。このような医薬組成物およびその単位投与剤形は、従来の成分を、従来の割合で、追加の活性化合物または主剤と共にまたはこれらを非含有で含むことができ、このような単位投与剤形は、用いられる意図される毎日の投与範囲に適合する、任意の適切な有効量の活性成分を含み得る。
【００５９】
本発明の化合物から医薬組成物を製造するには、医薬上許容され得る担体は、固体または液体のいずれでもあり得る。固体剤形の処方物には、粉末、錠剤、ピル、カプセル、カシェ、坐剤および分散可能な顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、滑剤、懸濁剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤またはカプセル化材料としても作用し得る１つ以上の物質であり得る。粉末においては、担体は、微細に分割された活性成分を有する混合物中の微細に分割された固体であり得る。錠剤においては、活性成分は、適切な割合の必要な結合能を有する担体と混合し、所望の形状およびサイズに圧縮することが可能である。
【００６０】
粉末および錠剤は、種々の百分率の量の活性化合物を含むことが可能である。粉末または錠剤中の代表的な量は、０．５〜約９０％の活性化合物を含むことが可能である；しかしながら、当業者は、この範囲外の量がいつ必要とされるかを知るであろう。粉末および錠剤に適した担体は、カルボン酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。用語「製剤」は、活性化合物と、担体としてカプセルを提供するカプセル化材料との処方物（ここで、担体を有するかまたは有しない活性成分は、担体に包囲されるので、担体と関連する）を含むことを意図する。同様に、カシェおよびロゼンジも含まれる。錠剤、粉末、カプセル、ピル、カシェおよびロゼンジは、経口投与に適した固体製剤として用いられ得る。
【００６１】
坐剤を製造するには、まず、脂肪酸グリセリドの混合物またはカカオバターなどの低融点ワックスが溶融され得、そして、撹拌などにより、活性成分が、その中に均一に分散され得る。次いで、溶融した均一の混合物は、簡便な大きさの型に注ぎ、冷却することによって固化され得る。経膣投与に適した処方物は、活性成分に加えて適切な当該分野で公知の担体などをさらに含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレーとして提供され得る。
【００６２】
液体剤形の製剤には、溶液、懸濁液およびエマルジョン、例えば、水溶液または水−プロピレングリコール溶液が挙げられる。例えば、非経口注射液製剤は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液として処方され得る。注射可能な製剤、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液は、当該分野で用いられる適切な分散剤または湿潤剤に従って製剤化され得る。無菌の注射可能な製剤はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の無菌で注射可能な溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であり得る。許容され得るビヒクルおよび溶媒のなかでも、用いられ得るのは、水、リンガー溶液および等張性の塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の硬化油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドなどの任意のブランドの硬化油を用いられ得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射可能な製剤における使用を見出される。
【００６３】
従って、本発明の組成物は、非経口投与（すなわち、注射、例えば、ボーラス注射または連続灌流による）用に製剤化され得、アンプル、予め充填したシリンジ、少量灌流または複数回投与容器中の単位投与剤形で、さらなる追加の保存剤と共に提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの剤形をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェン非含有水）を用いて構成するための、無菌の固体または溶液からの凍結乾燥物の無菌単離により得られる粉末剤形であり得る。
【００６４】
経口用途に適した水溶液は、活性成分を水に溶解し、所望であれば適切な着色剤、香料、安定化剤および濃厚化剤を添加することにより調製され得る。経口用途に適した水性懸濁液は、微細に分割された活性成分を、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの粘性の材料、あるいは他の周知の懸濁剤と共に水に分散させることにより、調製され得る。また、使用の直前に経口投与のために液体剤形の製剤に変換されることを意図した固体剤形の製剤も含まれる。このような液体剤形には、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝液、人工および天然甘味料、分散剤、濃厚化剤、可溶化剤などを含み得る。
【００６５】
皮膚への局所投与のために、本発明の組成物は、軟膏、クリームまたはローション、あるいは経皮パッチとして製剤化することができる、。軟膏およびクリームは、例えば、水性または油性基剤に適切な濃厚化剤および／またはゲル化剤を添加することにより製剤化され得る。ローションは、水性または油性基剤を用いて製剤化され得、一般に、１つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、濃厚化剤または着色剤を含み得る。
【００６６】
口腔内の局所投与に適した処方物には、味付けした基剤（通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント）中に活性剤を含む、ロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含む、トローチ；および適切な液体担体中に活性成分を含む、マウスウォッシュが挙げられる。
【００６７】
溶液または懸濁液は、通常、例えば、ドロッパー、ピペットまたはスプレーを用いることにより鼻腔に直接適用され得る。処方物は、単回または複数回投与剤形で提供され得る。ドロッパーまたはピペットの後者の場合、これは、適切な所定の容積の溶液または懸濁液を個別に投与することにより達成され得る。スプレーの場合、これは例えば、計量噴霧スプレーポンプにより達成され得る。気道への投与はまた、活性成分が適切な推進剤と共に圧縮容器に入れられたエアロゾル処方物によっても達成され得る。医薬組成物が、エアロゾル、例えば、経鼻エアロゾルまたは吸入として投与される場合、投与は、例えば、スプレー、ネブライザー、ポンプネブライザー、吸入装置、計量インヘラーまたは乾燥粉末インヘラーを用いて行われ得る。本発明の組成物のエアロゾルとしての投与のための医薬剤形は、当業者に周知のプロセスにより製造され得る。それらの調製物、例えば、本発明の化合物の水、水／アルコール混合物または適切な生理食塩水溶液中の溶液または分散物には、通常の添加剤、例えば、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増加させるための吸収促進剤、可溶化剤、分散剤など、ならびに、適切であれば、通常の推進剤（例えば、二酸化炭素、ＣＦＣ（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタンまたはジクロロテトラフルオロエタンが挙げられる））；などが用いられ得る。エアロゾルは、レシチンなどの界面活性剤を簡便に含み得る。薬物の用量は、計量バルブを備えることにより制御され得る。
【００６８】
鼻内処方物を含む気道への投与を意図した処方物では、化合物は、一般に、例えば、１０ミクロン以下の規模の小さい粒径を有するであろう。このような粒径は、当該分野で公知の手段、例えば、微粒子化により得られ得る。所望であれば、活性成分の遅延放出を与えるのに適した処方物を用い得る。
【００６９】
あるいは、活性成分は、乾燥粉末、例えば、化合物の、適切な粉末基剤（例えば、乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのデンプン誘導体、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中の粉末混合物の剤形で提供され得る。簡便には、粉末担体は、鼻腔中のゲルの剤形であり得る。粉末組成物は、単位投与剤形で（例えば、ゼラチン、または粉末がインヘラーによりそこから投与され得るブリスターパックのカプセルまたはカートリッジなどで）提供され得る。
【００７０】
上記処方物に加えて、化合物はまた、デポー処方物としても製剤化され得る。このような長期作用処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内移植）または筋肉内注射により投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容され得る油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、あるいは易可溶性誘導体、例えば、易可溶性塩を用いて製剤化され得、さらに、組成物は、ポンプなどの制御放出系により送達され得る。
【００７１】
さらに、組成物は、治療剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの制御放出系を用いて送達され得る。種々の遅延放出材料が確立されており、かつ、当業者に周知である。制御放出カプセルは、それらの化学物質の性質に依存して、化合物を数週間から１００日を超えるまで放出し得る。化学物質の性質および治療剤の生物学的安定性に依存して、調節因子を安定化するための追加のストラテジーを用いられ得る。
【００７２】
被験体への適切な投与の経路には、当該分野で公知の方法を用いる、経口、局所、経鼻、経直腸、経粘膜または経腸投与、非経口送達（筋肉内、皮下、延髄内注射、ならびにくも膜下腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内、肺内（吸入）または眼内注射が挙げられる）が挙げられる。投与の他の経路は、エアロゾルおよびデポー処方物である。１つの実施態様では、投与の経路は経口である。
【００７３】
本発明は、被験体において脂質関連障害を予防または治療する方法であって、当該被験体に、有効な脂質改変量の、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を提供するが、当該ナイアシン受容体調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法により、同定される。例えば、本発明は、被験体において脂質関連障害を予防または治療する方法であって、当該被験体に、有効な脂質改変量の、ナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を提供するが、当該ナイアシン受容体調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法により、同定される。本発明はまた、被験体において脂質関連障害を予防または治療する方法であって、当該被験体に、有効な脂質改変量の、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む、方法を開示するが、当該ナイアシン受容体調節因子は、ａ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法により、同定される。
【００７４】
１つの実施態様では、当該脂質関連障害は、異常脂質血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、アテローム性硬化症、メタボリック・シンドローム、心疾患、卒中または末梢血管疾患である。他の実施態様では、当該脂質関連障害は、異常脂質血症である。さらなる実施態様では、当該脂質関連障害は、アテローム性硬化症である。
【００７５】
本明細書で用いる、障害に関する用語「治療する」は、特定の障害に関連する１つ以上の症候の重篤度を低減することを意味する。従って、障害を治療するとは、障害に関連する全ての症候の重篤度を低減することを必ずしも意味せず、また、障害に関連する１つ以上の症候の重篤度を完全に低減することを必ずしも意味しない。同様に、用語「予防する」は、特定の障害に関連する１つ以上の症候の発生または発症を予防することを意味するが、障害の完全な予防を必ずしも意味しない。本発明の方法は、ナイアシン応答性障害（例えば、本明細書中に記載の脂質関連障害が挙げられる）を治療するのに用いられ得る。
【００７６】
本明細書で用いる「被験体」は、哺乳動物を含めたあらゆる動物を意味し、例えば、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマまたは霊長類（例えば、ヒト）が挙げられる。１つの実施態様では、被験体は、哺乳動物である。他の実施態様では、被験体は、ヒトである。
【００７７】
本明細書で用いる、ナイアシン受容体調節因子の量に関する用語「有効な脂質改変量」は、被験体において、アテローム性硬化症関連血清脂質の量を検出可能に変化させる、例えば、ＬＤＬ−コレステロール、ＶＬＤＬ−コレステロール、血清リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））またはトリグリセリドの量を減少させるか、あるいはＨＤＬ−コレステロールを増加させるのに十分な調節因子の量を意味する。例えば、有効な脂質改変量のナイアシン調節因子は、ＨＤＬ−コレステロールの量を増加させるか、またはＬＤＬ−コレステロールの量を低減し得る。さらに、例えば、有効な脂質改変量のナイアシン調節因子は、ＨＤＬ−コレステロールの量を増加させ、かつＬＤＬ−コレステロールの量を低減され得る。血中のこれらの脂質の量を測定するための標準的な研究室でのアッセイは、当該分野で周知である。
【００７８】
コレステロールは、ＶＬＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロールおよび高密度リポタンパク質−コレステロール（ＨＤＬ−コレステロール）などのリポタンパク質複合体により、血中で輸送される。ＬＤＬは、血中で、コレステロールを、血管壁の内皮下腔に運ぶ。血管壁の内皮下腔でのＬＤＬ−コレステロールの過酸化は、アテローム性硬化症プラーク形成をもたらすと考えられている。一方、ＨＤＬ−コレステロールは、プラーク形成に抗い、心血管疾患およびアテローム性動脈硬化の症候の発生を遅延または予防すると考えられている。今日まで、ＨＤＬ１−コレステロール、ＨＤＬ２−コレステロールおよびＨＤＬ３−コレステロールなどのＨＤＬ−コレステロールのいくつかのサブタイプが同定されている。
【００７９】
ＨＤＬがアテローム性硬化症の進展に対して保護し得るメカニズムがいくつか存在する。インビトロでの研究により、ＨＤＬは、細胞からコレステロールを除去され得ることが示された［Ｐｉｃａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，６，４３４−４４１］。この性質のデータは、ＨＤＬの１つの抗アテローム形成性は、それが過剰な遊離のコレステロールの組織を枯渇させ、最終的にこのコレステロールを肝臓に送達する能力に起因し得ることを示した［Ｇｌｏｍｓｅｔ，（１９６８）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，９，１５５−１６７］。このことは、ＨＤＬからのコレステロールの肝臓への効率的な移動を示す実験により支持された［Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８  ７１６１−  ７１６７；ＭｃＫｉｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６，２５４８−２５５２］。さらに、ＨＤＬは、トリグリセリド富化リポタンパク質の迅速な代謝に必要なアポタンパク質のための循環におけるリザーバとして働き得る（Ｇｒｏｗ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄ，（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３，１８３４−１８４１；Ｌａｇｏｃｋｉ  ａｎｄ  Ｓｃａｎｕ，（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，３７０１−３７０６；Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，（１９８２）２３，１２５９−１２７３］。
【００８０】
一般に、総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール（すなわち、ＴＣ／ＨＤＬ）比は、個体にアテローム性硬化症、メタボリック・シンドローム、心疾患または卒中などの状態が起こり得るリスクについての有用な予測因子を表し得る。血漿脂質レベルの現在の分類を、表Ｂに示すが、これらの分類は、より新しいリスクデータの分析とともに変化される：
【００８１】
【化２】
2008538277.tif 000004
従って、推奨される総コレステロール／ＨＤＬ−Ｃ（すなわち、ＴＣ／ＨＤＬ）比は、３．５以下の比が理想的であり、４．５を超える比は「リスク有」と考えられることを示す。ＴＣ／ＨＤＬ比を決定することの価値は、個体が「正常な」ＬＤＬおよび総コレステロールを示すが低いＨＤＬ−コレステロールを有する状況において明確である。個体は、ＬＤＬおよび総コレステロールに基づいては治療を受けることが適さない場合があり得るが、ＨＤＬ−コレステロールレベルを考慮する場合、より正確なリスク評価が得られ得る。従って、個体のＨＤＬ−コレステロールレベルが、比が４．５を超えるようなものである場合、治療または予防の介入を保証され得る。
【００８２】
ＬＤＬ−コレステロールレベルについては、米国心臓学会は、１００ｍｇ／ｄＬ未満のＬＤＬ−コレステロールレベルが最適であり、１００〜１２９ｍｇ／ｄＬは最適に近く、１３０〜１５９ｍｇ／ｄＬはボーダーラインの高さであり、１６０〜１８９ｍｇ／ｄＬは高いと考えており、１９０ｍｇ／ｄＬは非常に高レベルのＬＤＬ−コレステロールであると考えられる。トリグリセリドレベルについては、米国心臓学会は、１５０ｍｇ／Ｌ未満が正常であり、１５０〜１９９ｍｇ／ｄＬはボーダーラインの高さであり、２００〜４９９ｍｇ／ｄＬは高いと考えており、５００ｍｇ／ｄＬは非常に高レベルのトリグリセリドであると考えられる。
【００８３】
アテローム性硬化症関連血清脂質の量を変動させるために必要とされるナイアシン調節因子の量は、化合物の処方物および個体に応じて変動するであろう。特に、アテローム性硬化症関連血清脂質の量を変動させるために必要とされるナイアシン調節因子の量は、例えば、個体の体重、個体の遺伝的性質または個体の一般的な健康状態に依存し得る。アテローム性硬化症関連血清脂質の量を変動させ得るナイアシン調節因子の量には、例えば、１日当たり少なくとも５００ｍｇ、１日当たり少なくとも７５０ｍｇ、１日当たり少なくとも１ｇ、１日当たり少なくとも１．５ｇ、１日当たり少なくとも２ｇ、１日当たり少なくとも２．５ｇ、１日当たり少なくとも３ｇ、１日当たり少なくとも３．５ｇ、１日当たり少なくとも４ｇ、１日当たり少なくとも４．５ｇ、１日当たり少なくとも５ｇ、１日当たり少なくとも５．５ｇ、１日当たり少なくとも６ｇ、１日当たり少なくとも６．５ｇ、１日当たり少なくとも７ｇ、１日当たり少なくとも７．５ｇ、１日当たり少なくとも８ｇ、それ以上が挙げられる。１つの実施態様では、ナイアシン調節因子の当該脂質改変量は、１日当たり少なくとも５００ｍｇである。他の実施態様では、ナイアシン調節因子の当該脂質改変量は、１日当たり１〜３グラムである。
【００８４】
本明細書で用いる用語「脂質関連障害」は、被験体における、アテローム性硬化症関連血清脂質、例えば、ＬＤＬ−コレステロール、ＶＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、Ｌｐ（ａ）またはトリグリセリドの非最適レベルに関連するいずれかの障害を意味する。従って、脂質関連障害は、例えば、上昇したレベルのＬＤＬ−コレステロール、低減したレベルのＨＤＬ−コレステロール、またはアテローム性硬化症関連血清脂質の非最適レベルにより少なくとも部分的に引き起こされる障害、例えば、アテローム性硬化症、メタボリック・シンドローム、心臓麻痺（心筋梗塞）または卒中であり得る。アテローム性硬化症関連血清脂質の最適レベルは、上記で論じられ、これらの脂質の最適な比より低い非最適レベルは、脂質関連障害であると考えられる。
【００８５】
アテローム性硬化症とは、大動脈および中型動脈の壁の最内層上における、コレステロールおよび脂質を含むアテローム性プラークの堆積により特徴付けられる、血管疾患の剤形を意味する。アテローム性硬化症は、医学の関連分野で診療している医師により認識および理解される血管の疾患および症状を包含する。アテローム性動脈硬化・心血管疾患（再血管形成手順後の再狭窄を含む）、冠状動脈心疾患、脳血管疾患（多発性梗塞痴呆を含む）および末梢血管疾患（勃起不全を含む）は全てアテローム性硬化症の臨床的徴候であるので、アテローム性硬化症との用語に包含される。
【００８６】
異常脂質血症は、ＨＤＬ（低）、ＬＤＬ（高）、ＶＬＤＬ（高）、トリグリセリド（高）、リポタンパク質（ａ）（高）、遊離脂肪酸（高）および他の血清脂質などの血清脂質またはその組み合わせの異常な濃度についての一般的な用語である。例えば、異常脂質血症を有する個体は、最適なレベルと比較して高レベルの総コレステロールを有し得る（高コレステロール血症）。さらに、例えば、異常脂質血症を有する個体は、高レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはトリグリセリド（高トリグリセリド血症）などの血清脂質を有し得る。さらに、例えば、異常脂質血症を有する個体は、低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）などの血清脂質を有し得る。異常脂質血症を有する個体は、総コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリドまたはＨＤＬなどの１つ以上の血清脂質のレベルの変化を有し得る。
【００８７】
高脂血症は、コレステロール、トリグリセリドおよびリポタンパク質などの血漿中の脂質のいずれかまたは全ての上昇した濃度についての一般的な用語であり、脂質関連障害である。高脂血症は、後天性または先天性であり得る。高脂血症の特異的形態には、例えば、高コレステロール血症、家族性βリポタンパク質代謝異常、糖尿病性異常脂質血症、ネフローゼ異常脂質血症および家族性混合性高脂血症が挙げられ得る。高コレステロール血症は、血清低密度リポタンパク質コレステロールおよび血清総コレステロールの上昇により特徴付けられる。家族性βリポタンパク質代謝異常はまた、ＩＩＩ型高脂血症としても知られ、血清中での超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬコレステロール）粒子（β−ＶＬＤＬとも呼ばれる）の蓄積により特徴付けられる。正常なアポリポタンパク質Ｅ３の異常なアイソフォームアポリポタンパク質Ｅ２での置換もまた、この症状に関連する。糖尿病性異常脂質血症は、ＶＬＤＬ−コレステロールの過産生、異常なＶＬＤＬトリグリセリド脂質分解、低減したＬＤＬ−コレステロール受容体活性、そして時々ＩＩＩ型高脂血症などの複数のリポタンパク質異常により特徴付けられる。ネフローゼ異常脂質血症は、治療するのが難しく、しばしば、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症を含む。家族性混合性高脂血症は、高脂血症の複数のフェノタイプ、すなわち、ＩＩａ型、ＩＩｂ型、ＩＶ型、Ｖ型またはアポβリポタンパク質血症により特徴付けられる。
【００８８】
アテローム性硬化症関連血清脂質の非最適レベルにより少なくとも部分的に引き起こされる障害は、脂質関連障害の定義に含まれる。当該障害には、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）または冠状動脈心疾患、うっ血性心不全、狭心症、動脈瘤、虚血性心疾患、心筋梗塞および卒中が挙げられる。脂質関連障害には、冠状動脈心疾患などの心疾患を挙げることができるが、これらは、血液を心臓に供給する小血管が狭くなることを含む障害であり、心臓が血液を効率的に送り出すその能力を失った場合は、うっ血性心不全である。脂質関連障害には、血管の部分的または完全な封鎖によって低減した組織または器官への血流により引き起こされる障害が挙げられ得る。このような障害には、例えば、狭心症、虚血性心疾患、心筋梗塞および卒中が挙げられる。脂質関連障害には、弱くなった血管により引き起こされる障害、例えば、アテローム性硬化症によってしばしば引き起こされる血管中の弱くなった領域である動脈瘤が挙げられ得る。
【００８９】
心疾患には、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患および高い血圧（高血圧）が挙げられるが、これらに限定されない。末梢血管疾患は、心臓および脳の外側の血管の疾患を意味する。器官の末梢血管疾患は、炎症および組織損傷などの血管における構造変化により引き起こされる。末梢動脈疾患は１つの例である。末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、冠状動脈疾患および頚動脈疾患に類似する症状である。ＰＡＤでは、脂肪堆積物が動脈壁に沿って蓄積し、血液循環、主に脚につながる動脈に影響を与える。その早期の段階では、一般的な症候は、活動中の脚および臀部の痙攣または疲労である。このような痙攣は、ヒトが安静にすると治まる。これを「間欠性跛行」と呼ぶ。ＰＡＤを有するヒトは、血餅のリスクにより、卒中および心臓麻痺で死亡するリスクがより高い。
【００９０】
メタボリック・シンドロームはまた、シンドロームＸとも呼ばれ、１人のヒトにおける代謝危険因子の群により特徴付けられる。これらには、中心性肥満（腹内または腹周囲の過剰な脂肪組織）、アテローム生成性異常脂質血症（血清脂質障害−主に高トリグリセリドおよび低ＨＤＬコレステロール）、上昇した血圧（１３０／８５  ｍｍＨｇ以上）、インスリン抵抗性またはグルコース不耐性、プロトロンビン状態（例、血中の高フィブリノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤阻害剤）および炎症誘発性状態（例、血中の上昇した高感受性Ｃ反応性タンパク質）が挙げられる。
【００９１】
本発明の方法および組成物は、被験体において脂質関連障害を予防または治療するのに用いられ得る。脂質関連障害の予防に用いられる場合、被験体は最適レベルの脂質を有し得るが、他の理由、例えば、脂質関連障害の家族歴により、脂質関連障害のリスクを有し得る。本発明の方法および組成物は、任意の年齢の被験体、例えば、脂質関連障害を発症する危険因子である肥満または糖尿病を有する小児または成人における脂質関連障害の予防において、予防的に用いられ得る。
【００９２】
本発明は、治療を必要とする被験体においてＬＤＬレベルを低減する方法であって、当該被験体に、有効量のナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を提供するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法により、同定される。本発明は、治療を必要とする被験体においてＬＤＬレベルを低減する方法であって、当該被験体に、有効量の、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を開示するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子は、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定する、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法により、同定される。
【００９３】
本発明はまた、治療を必要とする被験体においてトリグリセリドレベルを低減する方法であって、当該被験体に、有効量の、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を提供し、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法により、同定される。本発明はまた、治療を必要とする被験体においてトリグリセリドレベルを低減する方法であって、当該被験体に、有効量の、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を開示するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子は、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定する、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法により、同定される。
【００９４】
本発明はまた、治療を必要とする被験体においてＨＤＬレベルを増加する方法であって、当該被験体に、有効量のナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を提供するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法により、同定される。本発明はまた、治療を必要とする被験体においてＨＤＬレベルを増加する方法であって、当該被験体に、有効量のナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含む方法を開示するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子は、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定する、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することが、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することを示す方法により、同定される。
【００９５】
本発明は、脂質改変剤として用いるための、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を含む医薬の製造方法を提供するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、同定される。本発明は、脂質改変剤として用いるための、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を含む医薬の製造方法を開示するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子は、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定する、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、同定される。
【００９６】
本発明は、脂質関連障害の治療に用いるための、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を含む医薬の製造方法を提供するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、同定される。本発明はまた、脂質関連障害の治療に用いるための、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を含む医薬の製造方法を開示するが、当該ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有する調節因子は、ａ）ナイアシン受容体調節因子を同定する、およびｂ）当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定する方法であって、当該調節因子により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性がナイアシンまたはナイアシンアナログにより誘発されるＭＡＰキナーゼ活性と比較して低減することにより、当該調節因子がナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有することが示される方法に従って、同定される。
【００９７】
本発明はまた、ナイアシン受容体調節因子化合物に加えて、他の治療化合物を含む組み合わせ療法を開示する。他の治療化合物には、例えば、被験体において、さらに紅潮を低下するのに用いられ得る化合物、またはアテローム性硬化症関連血清脂質の量をさらに低下するのに用いられ得る化合物が挙げられ得る。
【００９８】
ナイアシン受容体調節因子と組み合わせられ得る治療用化合物には、例えば、プロスタグランジン合成（ＰＧＤ２合成など）を低減する化合物が挙げられ得る。このような化合物には、例えば、特異的ＰＧＤ２アンタゴニスト、より一般的な剤（非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）など）が挙げられ得る。ＮＳＡＩＤの例には、以下のものが挙げられる：アスピリン、サリチル酸塩、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ケトプロフェン、フェノプロフェン、オキサプロジン、スリンダク、フルルビプロフェン、エトドラク、ジクロフェナク、ケトロラク、トルメチン、ナブメトン、スプロフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、アクロフェナク、フェンクロフェナク、ゾメピラク、メクロフェナマート、メファナミド酸、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾンおよびピロキシカム。さらに、ＣＯＸ−１阻害剤との組み合わせに、治療用化合物は、セレコキシブまたはロフェコシブなどの選択的ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせられ得る。
【００９９】
ナイアシン受容体調節因子と組み合わせられ得る治療用化合物には、例えば、被験体においてアテローム性硬化症関連血清脂質の量を低減する化合物が挙げられ得る。このような化合物には、例えば、α−グルコシダーゼ阻害剤、アルドース還元酵素阻害剤、ビグアナイド、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、スクアレン合成阻害剤、フィブラート、ＬＤＬ異化促進剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、インスリン分泌促進剤およびチアゾリジンジオンが挙げられる。
【０１００】
α−グルコシダーゼ阻害剤は、膵臓および小腸でα−アミラーゼ、マルターゼ、α−デキストリナーゼ、スクラーゼなどの消化酵素を競合的に阻害する薬物の分類に属する。α−グルコシダーゼ阻害剤による可逆的な阻害は、デンプンおよび糖の消化を遅らせることによって、血糖値を遅延、低下または低減する。α−グルコシダーゼ阻害剤のいくつかの例示的な例には、アカルボース、Ｎ−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロピル）バリオラミン（ジェネリック名；ボグリボース）、ミグリトールおよび当該分野で公知のα−グルコシダーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１０１】
アルドース還元酵素阻害剤は、ポリオール経路の第１段階の速度制限酵素を阻害する薬物である。アルドース還元酵素阻害剤の例には、トルレスタット；エパレスタット；３，４−ジヒドロ−２，８−ジイソプロピル−３−チオキソ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−４−酢酸；２，７−ジフルオロスピロ（９Ｈ−フルオレン−９，４’−イミダゾリジン）−２’，５’−ジオン（ジェネリック名：イミレスタット）；３−［（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）メチル］−７−クロロ−３，４−ジヒドロ−２，４−ジオキソ−１（２Ｈ）−キナゾリン酢酸（ジェネリック名：ゼナレスタット）；６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−２’，５’−ジオキソ−スピロ［４Ｈ−１−ベンゾピラン−４，４’−イミダゾリジン］−２−カルボキサミド（ＳＮＫ−８６０）；ゾポレスタット；ソルビニル；および１−［（３−ブロモ−２−ベンゾフラニル）スルホニル］−２，４−イミダゾリジンジオン（Ｍ−１６２０９）、および当該分野で公知のアルドース還元酵素阻害剤が挙げられる。
【０１０２】
ビグアナイドは、嫌気性糖分解を刺激し、末梢組織においてインスリンへの感受性を増加させ、小腸からのグルコース吸収を阻害し、肝臓での糖新生を抑制し、かつ、脂肪酸酸化を阻害する薬物の分類である。ビグアナイドの例には、フェンホルミン、メトホルミン、ブホルミンおよび当該分野で公知のビグアナイドが挙げられる。
【０１０３】
スタチン化合物は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素を阻害することにより血中コレステロールレベルを低下させる薬物の分類である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、コレステロール生合成における速度制限酵素である。この還元酵素を阻害するスタチンは、ＬＤＬ受容体の活性をアップレギュレートすることにより血清ＬＤＬ濃度を低下させ、血液からＬＤＬを浄化するのに関与する。スタチン化合物の例には、ロスバスタチン、プラバスタチンおよびそのナトリウム塩、シンバスタチン、ロバスタチン、アトロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンおよび当該分野で公知のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が挙げられる。
【０１０４】
スクアレン合成阻害剤は、スクアレンの合成を阻害することにより血中コレステロールレベルを低下させる薬物の分類に属する。スクアレン合成阻害剤の例には、（Ｓ）−α−［ビス［２，２−ジメチル−ｌ−オキソプロポキシ）メトキシ］ホスフィニル］−３−フェノキシベンゼンブタンスルホン酸モノカリウム塩（ＢＭＳ−１８８４９４）および当該分野で公知のスクアレン合成阻害剤が挙げられる。
【０１０５】
フィブレート化合物は、肝臓でのトリグリセリド合成および分泌を阻害し、かつリポタンパク質リパーゼを活性化することにより血中コレステロールレベルを低下させる薬物の分類に属する。フィブレートは、ペルオキシソーム増殖因子で活性化された受容体を活性化し、かつ、リポタンパク質リパーゼの発現を誘発することが知られている。フィブレート化合物の例には、ベザフィブレート、ベクロブレート、ビニフィブレート、シプロフィブレート、クリノフィブレート、クロフィブレート、クロフィブリン酸、エトフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、ニコフィブレート、ピリフィブレート、ロニフィブレート、シムフィブレート、テオフィブレートおよび当該分野で公知のフィブレートが挙げられる。
【０１０６】
ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）異化促進剤は、ＬＤＬ受容体の数を増加させることにより血中コレステロールレベルを低下させる薬物の分類に属し、例えば、当該分野で公知のＬＤＬ異化促進剤が挙げられる。
【０１０７】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、アンギオテンシン変換酵素を阻害することにより血糖値を部分的に低下させ、かつ血圧を低下させる薬物の分類に属する。アンギオテンシン変換酵素阻害剤の例には、カプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、デラプリル；ラミプリル、イシノプリル、イミダプリル、ベナゼプリル、セロナプリル、シラザプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、モベルトプリル、ペリンドプリル、キナプリル、スピラプリル、テモカプリル、トランドラプリル、および当該分野で公知のアンギオテンシン変換酵素阻害剤が挙げられる。
【０１０８】
本発明は、被験体において脂質関連障害を予防または治療する方法であって、当該被験体に、有効な脂質改変量のナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を投与することを含み、当該被験体に、有効量の肥満または糖尿病の治療に使用される剤を、有効量のナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子と組み合わせて投与することをさらに含む方法を提供するが、当該調節因子は、当該調節因子のＭＡＰキナーゼ活性を決定することを含む方法により同定される。
【０１０９】
リパーゼ阻害剤には、例えば、オルリスタット（ゼニカル（商標））などの抗肥満化合物が挙げられる。オルリスタットは、脂肪吸収を直接的に阻害するが、高い頻度で、下痢および鼓腸などの不快な胃腸の副作用を生じる傾向がある。
【０１１０】
他の分類の抗肥満薬物には、セロトニンおよび／またはノルアドレナリン放出剤または再取り込み阻害剤が挙げられる。例えば、シブトラミン（メリディア（商標））は、混合型５−ＨＴ／ノルアドレナリン再取り込み阻害剤である。シブトラミンの主な副作用は、幾人かの患者における血圧および心拍数の上昇であり得る。セロトニン放出剤／再取り込み阻害剤であるフェンフルラミン（ポンディミン（商標））およびデキサフェンフルラミン（レダックス（商標））は、長期間（６ヶ月を超える）にわたって食物取り込みおよび体重を減少させることが報告されてきた。しかしながら、いずれの製品も、それらの使用に関連した心臓弁異常が予備試験の証拠で報告された後、使用が廃止された。
【０１１１】
インスリン分泌促進剤は、膵β細胞からのインスリンの分泌を促進する特性を有する薬物の分類に属する。インスリン分泌促進剤の例には、スルホニルウレア（ＳＵ）が挙げられる。スルホニルウレア（ＳＵ）は、細胞膜中のＳＵ受容体を介してインスリン分泌のシグナルを伝達することにより、膵β細胞からのインスリンの分泌を促進する薬物である。スルホニルウレアの例には、トルブタミド；クロロプロパミド；トラザミド；アセトヘキサミド；４−クロロ−Ｎ−［（ｌ−ピロリジニルアミノ）カルボニル］−ベンゼンスルホンアミド（ジェネリック名：グリコピラミド）またはそのアンモニウム塩；グリベンクラミド（グリブリド）；グリクラジド；１−ブチル−３−メタニリルウレア；カルブタミド；グリボヌクリド；グリピジド；グリキドン；グリソクセピド；グリブチアゾール；グリブゾール；グリヘキサミド；グリミジン；グリピナミド；フェンブタミド；トルシクラミド、グリメピリドおよび当該分野で公知の他のインスリン分泌促進剤が挙げられる。他のインスリン分泌促進剤には、Ｎ−［［４−（ｌ−メチルエチル）シクロヘキシル］カルボニル］−Ｄ−フェニルアラニン（ナテグリニド）；（２Ｓ）−２−ベンジル−３−（ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−イソインドリニルカルボニル）プロピオン酸カルシウム  二水和物（ミチグリニド、ＫＡＤ−１２２９）；および当該分野で公知の他のインスリン分泌促進剤が挙げられる。
【０１１２】
チアゾリジンジオンは、より一般的にはＴＺＤとして知られている薬物の分類に属する。チアゾリジンジオンの例には、ロシグリタゾン、ピオグリタゾンおよび当該分野で公知のチアゾリジンジオンが挙げられる。
【０１１３】
さらに、ナイアシン受容体調節因子は、例えば、ナイアシン応答性障害を予防または治療するために、被験体に投与され得る。ナイアシン応答性障害は、受容体調節因子により予防または治療され得る障害または疾患である。ナイアシン応答性障害には、例えば、本明細書中に記載された脂質関連障害が挙げられ得る。例えば、脂質関連障害には、少量の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）−コレステロール、上昇した量の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール、上昇した量のトリグリセリド、またはアテローム性硬化症、心疾患または卒中などの、非最適レベルのアテローム性硬化症関連血清脂質により少なくとも部分的に引き起こされる障害が挙げられ得る。
【０１１４】
ナイアシン応答性障害の他の例は、月経困難症または月経痛である。ある報告では、月経痛の痙攣に罹患している８０名の女性の群に、月経開始の７〜１０日前から、重度の痙攣の間は２〜３時間おきに、１００ｍｇのナイアシンを１日２回補給した［Ｈｕｄｇｉｎｓ，（１９５２）Ａｍ  Ｐｒａｃｔ  Ｄｉｇ  Ｔｒｅａｔ  ３：８９２−８９３；Ｈｕｄｇｉｎｓ（１９５４）Ｗｅｓｔ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ６２：６１０−６１１］。約９０％の被験体は、有意な緩和を経験した。重度の痙攣の間に必要とされる投与（２〜３時間おきに１００ｍｇ）は、幾人かの女性においては紅潮を引き起こすのに十分に高い。この場合、本発明の方法および組成物は、紅潮の副作用なくナイアシン応答性障害を治療するのに用いられ得る。
【０１１５】
本発明は、脂質関連障害を予防または治療するため、消費者に用いられるキットを開示する。キットは、本発明の医薬組成物および脂質関連障害を予防または治療するための医薬組成物の使用方法を記載した指示書を含み得る。例えば、キットは、ナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子の少なくとも１つの投与単位を含み得る。さらに、キットは、本発明の組成物と組み合わせて用いられる他の治療剤を含み得る。
【０１１６】
本発明の組成物は、広範な経口、局所または非経口投与剤形で投与され得る。当該投与剤形は、活性成分として、本発明の化合物または本発明の化合物の医薬上許容され得る塩を含み得ることが当業者に明らかである。
【０１１７】
予防または治療に用いるため必要とされる活性成分、あるいはその活性塩または誘導体の投与は、選択された特定の塩によってのみならず、投与経路、治療される症状の性質ならびに個体の年齢および状態によっても変動するであろうし、最終的には担当の内科医または臨床医の判断によるであろう。一般に、当業者は、モデル系、代表的には動物モデルで得られたインビボでのデータを、ヒトなどの他のモデルにどのように外挿するのかを理解する。いくつかの状況では、これらの外挿は、哺乳動物、好ましくはヒトなどの他のモデルと比較した動物モデルの体重に基づくだけであり得るが、しかしながら、より頻繁には、これらの外挿は、単に体重に基づくだけでなく、種々の要因を含める。代表的な要因には、個体の種別、年齢、体重、性別、食事および医学的症状、疾患の重篤度、投与経路、用いる特定の化合物の活性、効力、薬物動態学的および毒性学的プロファイルなどの薬理学的考慮、薬物送達システムが用いられるかどうか、急性または慢性の疾患症状が治療されているかどうか、あるいは予防が行われているかどうか、あるいは組み合わせ療法が用いられているかどうかが挙げられる。疾患状態を本発明の化合物および／または組成物で予防または治療するための投与計画は、上記の種々の要因に従って選択される。従って、用いる実際の投与計画は、広範に変動し得るので、好ましい投与計画から逸脱し得、当業者は、これらの代表的な範囲の外の投与および投与計画は、試験され得、かつ、適切であれば、本発明の方法に用いられ得ることを理解するであろう。
【０１１８】
所望の用量は、適切な間隔、例えば、１日当たり２回、３回、４回以上の小用量で、単回用量または分割用量で簡便に提供され得る。小用量自体は、例えば、多くの不連続なしっかり決まっていない間隔での用量にさらに分割され得る。毎日の用量は、特に比較的大量が投与される場合、適切と考えられるならば、いくつか、例えば、２、３または４回の部分用量に分割され得る。適切な場合、個体の挙動に依存して、示された毎日の用量から上方または下方に逸脱することが必要となる場合があり得る。
【０１１９】
キットは、本発明の医薬組成物を含むための容器を含むことができ、かつ、仕切り付きボトルまたは仕切り付きホイル袋などの仕切り付き容器を含み得る。容器は、医薬上許容され得る材料から作製される、任意の通常の形状または当該分野で公知の形態、例えば、紙箱または段ボール箱、ガラスまたはプラスチックのボトルまたはジャー、再密封可能な（例えば、異なる容器に移すための錠剤の「詰め替え」を保持するための）袋、または治療計画に従って個々の用量を包装の外部に押し出すブリスターパックであり得る。用いられる容器は、関与する正確な投与剤形に依存し得、例えば、通常の段ボール箱は、液体懸濁液を保持するのには通常用いられないであろう。１つ以上の容器を単回パッケージに用いて、単回投与剤形が販売され得ることが実現可能である。例えば、錠剤は、ボトルに入れられ、次いで箱に入れられ得る。
【０１２０】
このようなキットの例は、いわゆるブリスターパックである。ブリスターパックは、包装産業で周知であり、医薬の単位投与剤形（錠剤、カプセルなど）の包装に広範に用いられている。ブリスターパックは、一般に、好ましくは透明なプラスチック材料の箔で被覆された比較的硬い材料のシートからなる。包装プロセスの間、プラスチック箔に凹部が形成される。凹部は、パックされる個々の錠剤またはカプセルのサイズまたは形状を有するか、またはパックされる複数の錠剤および／またはカプセルに適合したサイズまたは形状を有し得る。次に、錠剤またはカプセルを凹部に配置し、比較的硬い材料のシートを、プラスチック箔の表面で、箔に対して（これは、凹部が形成された方向とは逆の方向である）に密封する。結果として、錠剤またはカプセルは、プラスチック箔とシートとの間の凹部に、所望に応じて個別に密封されるかまたは集合的に密封される。一般に、シートの強度は、手で凹部に圧力を加えることにより、シートの凹部の箇所に開口部が形成されて、錠剤またはカプセルをブリスターパックから取り出され得る程度の強度である。次いで、錠剤またはカプセルは、当該開口部から取り出され得る。
【０１２１】
書面による記憶補助を設けることが好ましくあり得、ここで、当該書面による記憶補助は、医師、薬剤師または被験体のための情報および／または指示を含むタイプのもの、例えば、錠剤またはカプセルに続く数字の形態であって、当該数字が、そのように特定された錠剤またはカプセルを服用すべきである投与計画の日に対応するようなものであるか、または、同様のタイプの情報を含むカードである。そのような記憶補助の他の例は、「最初の週、月曜日、火曜日」．．．など．．．「次の週、月曜日、火曜日」などのようにカードに印刷されたカレンダーである。他の記憶補助のバリエーションは、容易に理解されるであろう。
【０１２２】
キットの他の特異的な実施態様は、毎日の用量を一度に分配するように設計されたディスペンサーである。ディスペンサーは、投与計画へのコンプライアンスをさらに容易にするため、記憶補助を備え得る。このような記憶補助の例は、分配された毎日の用量の数を示す機械的カウンターである。このような記憶補助の他の例は、液晶読み出し部と一体化した電池式マイクロチップメモリ、または最後の毎日用量が服用された日付を読み上げるかまたは次の用量をいつ服用すべきかを思い出させる可聴式リマインダーシグナルである。
【０１２３】
本発明の１つの局面は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療の方法に用いるための、本明細書中に記載されたようなナイアシン受容体調節因子に関する。
【０１２４】
本発明の他の局面は、療法によるヒトまたは動物の治療の、脂質関連障害の治療方法に用いるための、本明細書中に記載されたようなナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子に関する。本発明の他の局面は、脂質関連障害の治療方法であって、当該状態に罹患している被験体に、治療上有効量の本明細書中に記載されたようなナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を、好ましくは医薬組成物の剤形で投与することを含む、方法に関する。
【０１２５】
本発明の１つの局面は、脂質関連障害の治療方法であって、当該状態に罹患している被験体に、治療上有効量の本明細書中に記載されたようなナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子を、好ましくは医薬組成物の剤形で投与することを含む、方法に関する。本発明の他の局面は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療の、脂質関連障害の治療方法に用いるための、本明細書中に記載されたようなナイアシンまたはナイアシンアナログと比較して低減した紅潮効果を有するナイアシン受容体調節因子に関する。
【０１２６】
本願に示した化合物は、市販で入手可能であるか、または、ｖａｎ  Ｈｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４６：３９４５−３９５１（２００３）またはＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８９２０に記載されるような当該分野で公知の方法を用いて合成され得る。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定を意味するものではない。当業者は、本明細書中の開示に基づき同等のアッセイを設計し得るであろうし、そして、その全ては、本発明の部分を形成する。
【０１２８】
（実施例１）
ＭＡＰキナーゼの誘導を決定するための抗体ベースアッセイ
この実施例は、ナイアシン（図１参照）またはナイアシンおよびナイアシン受容体調節因子化合物８（図２参照）により誘発されるＭＡＰキナーゼ活性を決定するのに用いられ得るＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎブロットアッセイを示す。
【０１２９】
ＭＡＰキナーゼＥＬＩＳＡ：
Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（ホスホＥＲＫｌ／２  ｐＴｌ  ８５ｐＹｌ  ８７  ＥＬＩＳＡ、カタログ番号ＫＨＯ−００９１）のキットを、以下のプロトコールに従って使用した。
【０１３０】
細胞を化合物で刺激する前に、細胞を一晩、血清欠乏させた。
【０１３１】
１．化合物の調製および細胞の処理：
Ａ．化合物をＤＭＳＯに溶解した。高いＤＭＳＯ濃度は細胞にストレスを与えてＭＡＰＫを活性化するので、ＤＭＳＯは１％を超えてはならない。ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして用いた。
【０１３２】
Ｂ．細胞ディッシュをインキュベーターから取り出し、揺動機に入れて穏やかに揺動するよう設定した（設定速度４）。化合物を慎重に添加し、細胞をインキュベーターに戻して５分間インキュベートした。化合物を添加するため、４．５分で、培地をディッシュから吸引した。次いで、２ｍｌの冷ＰＢＳを添加し、穏やかに攪拌することにより、過剰の培地を除去した。ＰＢＳを吸引し、１ｍｌのＰＢＳを添加した（コンフルエント６ｃｍディッシュにつき１ｍｌ）。
【０１３３】
２．細胞回収および抽出：氷上で
Ａ．細胞を、ラバーポリスマンでディッシュから掻き出し、マイクロ遠心分離管に移し、次いで、３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。
【０１３４】
Ｂ．ＰＢＳを吸引し、細胞ペレットを、細胞抽出緩衝液（０．１％のＳＤＳ）（コンフルエントな６ｃｍディッシュにつき２５０〜３００μｌ）中、氷上で、１０分間隔で激しく撹拌しながら３０分間溶解させた。
【０１３５】
Ｃ．次いで、混合物を、最大速度（１６，０００×Ｇ）で１５分、４℃にわたって遠心分離した。
【０１３６】
Ｄ．澄明になった溶解物を新たなマイクロ遠心分離管に移し、タンパク質濃度を測定した。タンパク質を測定するために、サンプルを細胞抽出緩衝液で１ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、次いで５分間沸騰させた。冷却後、これらを最大速度で５分間、室温で遠心分離した。溶解物を標準希釈剤緩衝液で１：１０に希釈して濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ（０．０１％のＳＤＳ最終）にし、１００μｌをサンプルウェル（１０μｇ／ウェル）に２回充填した。溶解物は、−８０℃で保存され得る。
【０１３７】
３．剤の調製および保存：
Ａ．ホスホＥＲＫ１／２標準の再構成および希釈：
１．ホスホＥＲＫ１／２標準を、１．２ｍｌ標準希釈緩衝液で再構成し、穏やかに混合し、１０分間静置して、完全な再構成を確認した。このストックは１００Ｕ／ｍｌである。
【０１３８】
２．１２５μｌの標準希釈剤緩衝液を、マスタープレート（ＥＬＩＳＡプレートではない）のウェルＢ−Ｈに重複して添加した。２５０μｌの１００Ｕ／ｍｌストックをウェルＡに添加した。
【０１３９】
３．順次希釈（１：２）を、ウェルＡ中の１２５μｌの１００Ｕ／ｍｌをウェルＢに移し、混合し、ウェルＢの１２５μｌをウェルＣに移し、ウェルＧまで同様に続けることによって行った。ウェルＨは希釈しない（０Ｕ／ｍｌ）。
【０１４０】
Ｂ．αウサギＩｇＧ  ＨＲＰの保存および最終希釈：
１．αウサギＩｇＧ  ＨＲＰ濃縮物を室温に戻し、穏やかに混合した。次いで、アッセイで使用される各８ウェルストリップについて１０μｌの濃縮物混合物を１ｍｌのＨＲＰ希釈剤と混合した。
【０１４１】
Ｃ．洗浄緩衝液の希釈：
１．２５×の洗浄緩衝液濃縮物を室温に戻し、混合して完全な再構成を確認した。洗浄緩衝液濃縮物を、脱イオン水（４０ｍｌの２５×／９６０ｍｌのＨ２Ｏ）で希釈した。
【０１４２】
４．アッセイ方法：
手順および計算：
標準およびサンプルの適用：
Ａ．すべての試剤を室温におき、使用の前に混合した。
【０１４３】
Ｂ．マイクロタイタープレートを、箔袋を開封する前に室温におく。アッセイに必要な８ウェルストリップの数を決定し、袋を密封して４℃に戻した。
【０１４４】
Ｃ．１００μｌの標準（３Ａ２中で調製した）を、２回添加した（２つの８ウェルストリップ）。
【０１４５】
Ｄ．２つのウェルを、色素原ブランク用に空にした。
【０１４６】
Ｅ．１００μｌのサンプルをサンプルウェルに２回添加した。
【０１４７】
Ｆ．プレートをプレートカバーで覆い、プレートの側面を穏やかに叩いて混合した。
【０１４８】
Ｇ．プレートを室温で２時間インキュベートした。（プレートは一晩４℃でインキュベートしてもよい）。
【０１４９】
洗浄
Ａ．ウェルからの液体を、アスピレーターで吸引した。
【０１５０】
Ｂ．ウェルを、２００μｌの希釈した洗浄緩衝液で満たした。３０分のインキュベーション後、液体を吸引した。これを４回繰り返した。
【０１５１】
抗体の検出
Ａ．１００μｌのαホスホＥＲＫｌ／２溶液を、色素原ブランクを除いて各ウェルにピペットで入れた。カバーを取り替え、穏やかに叩いて混合した。
【０１５２】
Ｂ．インキュベーションを、１時間、室温にて行った。
【０１５３】
洗浄
Ａ．ウェルを、上記のように４回洗浄した。
【０１５４】
αウサギＩｇＧ  ＨＲＰ。
【０１５５】
Ａ．１００μｌのαウサギＩｇＧ  ＨＲＰ作動溶液を、色素原ブランク以外の各ウェルに添加した。カバーを交換し、穏やかに叩いて混合した。
【０１５６】
Ｂ．インキュベーションを、３０分、室温にて行った。
【０１５７】
洗浄
Ａ．ウェルを、上記のように４回洗浄した。
【０１５８】
色素原
Ａ．１００μｌの安定化色素原を、各ウェルに添加した。
【０１５９】
Ｂ．インキュベーションを、２０分、室温にて、暗所で行った（ホイルまたは金属は用いないこと）。
【０１６０】
停止溶液
Ａ．１００μｌの停止溶液を、各ウェルに添加し、穏やかに叩いてプレートを混合した。
【０１６１】
プレートの読み取り
Ａ．プレートを、吸光度４５０ｎｍで読み取った。
【０１６２】
細胞抽出緩衝液：
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４    ５ｍｌ（１Ｍ）
１００ｍＭ  ＮａＣｌ                １０ｍｌ（５Ｍ）
１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０      １ｍｌ（０．５Ｍ）
２０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７              １００ｍｌ（１００ｍＭ）
１％  ＴＸ−１００                  ５ｍｌ（１００％）
１０％グリセロール                  ５０ｍｌ（１００％）
０．１％  ＳＤＳ                    ５ｍｌ（１０％）
０．５％  デオキシコール酸          ２．５ｇ
最終体積５００ｍｌ
新鮮な
２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４          １ｍｌ（１００ｍＭ）
１ｍＭ  ＰＭＳＦ              ２５０ｕｌ（２００ｍＭ）
２５ｕｇ／ｍｌロイペプチン    １２５ｕｌ（１０ｕｇ／ｕｌ）
２５ｕｇ／ｍｌ  アプロチニン  １２５ｕｌ（１０ｕｇ／ｍｌ）
最終体積５０ｍｌ
を添加する。
【０１６３】
ＭＡＰキナーゼＷｅｓｔｅｒｎブロット：
１．サンプル調製物：
Ａ．以下の工程を、氷上で行った。培地を吸引して細胞を除去し、細胞をＰＢＳですすいだ。
【０１６４】
Ｂ．細胞を、適切な体積の１％  ＮＰ−４０リシス緩衝液（体積は、ディッシュのサイズ、細胞密度などに依存する）中で採取した。代表的には、５００μｌを、コンフルエント６ｃｍディッシュに用いた。
【０１６５】
Ｃ．溶解物を、マイクロ遠心分離管に移した。管を激しく撹拌し、氷上で３０分インキュベートした。遠心分離は最大速度で、４℃にて１０分行った。
【０１６６】
２．タンパク質アッセイ：
Ａ．ストックタンパク質標準ＢＳＡを、水中で１．４１μｇ／μｌで調製した。
【０１６７】
Ｂ．１４．２μｌのストック標準を、４８５．８μｌの水に添加して４０μｇ／ｍｌとした。
【０１６８】
Ｃ．２００μｌの４０μｇ／ｍ標準を、ウェル９Ａおよび９Ｂに添加した。
【０１６９】
Ｄ．１００μｌの水を、１〜８、列ＡおよびＢに添加した。
【０１７０】
Ｅ．連続希釈を、１００μｌの４０μｇ／ｍｌを２０μｇ／ｍｌのウェルに添加し、混合し、０．３１μｇ／ｍｌのウェルに到達するまで、１００μｌを次のウェルに移すことにより行った。０．３１ｕｇ／ｍｌウェルからの最後の１００μｌを捨てた。
【０１７１】
Ｆ．９９μｌの水を、未知と指定されたウェルに添加した。
【０１７２】
Ｇ．１μｌの未知のサンプルを、ウェルに３回添加した。
【０１７３】
Ｈ．２５μｌの５×  Ｂｒａｄｆｏｒｄ染色剤を、標準および未知のサンプルに添加した。
【０１７４】
Ｉ．インキュベーションを、室温で少なくとも５分行った。
【０１７５】
Ｊ．吸光度は５９５λで読み取った。
【０１７６】
３．サンプル希釈および添加用調製物：
Ａ．サンプルを、１μｇ／μｌの最終濃度まで、水またはリシス緩衝液で希釈した。
【０１７７】
Ｂ．５×  Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を添加し、サンプルを攪拌し、５分間沸騰させた。
【０１７８】
４．ＮＯＶＥＸゲルの設定：
Ａ．ゲル底部の白色の粘着剤剥離紙を剥がした。
【０１７９】
Ｂ．コームを静かに引き抜いた。
【０１８０】
Ｃ．ゲルを水ですすぎ、ゲルボックスに入れた。
【０１８１】
Ｄ．内部レザバーをランニング緩衝液で満たし、外部レザバーを、ゲル開口部（白色剥離紙があったところ）の上まで満たした。
【０１８２】
Ｅ．ウェルをシリンジで流した。
【０１８３】
５．充填サンプル：
Ａ．サンプルを、隣接するウェルにこぼさないように注意深く添加した。
【０１８４】
Ｂ．標準マーカーを充填し、空のウェルに１×サンプル緩衝液を添加した。
【０１８５】
６．ゲルの作動：
Ａ．ゲルを１５０Ｖで１．５時間作動させた。
【０１８６】
７．ニトロセルロースへの移動（孔径０．２μｍ）：
Ａ．１×トランスファー緩衝液を調製した。
【０１８７】
Ｂ．ゲル、スポンジ、Ｗｈａｔｍａｎ紙およびニトロセルロース膜をトランスファー緩衝液に浸漬した。
【０１８８】
Ｃ．以下の順番で層形成した：陽電極、スポンジ、膜、ゲル、スポンジ、陰電極。
【０１８９】
Ｄ．外部および内部チャンバーにトランスファー緩衝液を充填した。
【０１９０】
Ｅ．移動を２５  Ｖで１．５時間行った。
【０１９１】
８．膜のブロッキング：
Ａ．移動装置を破壊した。
【０１９２】
Ｂ．ニトロセルロース膜をＢＬＯＣＫＯに置き、一晩、４℃で、揺動機にてインキュベートした。
【０１９３】
９．一次抗体：
Ａ．膜を、揺動機上で、１回×１０分、ＴＢＳ／ツイーンで洗浄した。
【０１９４】
Ｂ．一次抗体を、ＢＬＯＣＫＯで希釈した。
【０１９５】
Ｃ．インキュベーションを、揺動機上で、２時間、室温にて行った。
【０１９６】
１０．二次抗体：
Ａ．膜を、揺動機上で、２回×１５分、ＴＢＳ／ツイーンで洗浄した。
【０１９７】
Ｂ．二次抗体を、ＴＢＳ／ツイーンで希釈した。
【０１９８】
Ｃ．インキュベーションを、揺動機上で、１時間、室温にて行った。
【０１９９】
１１．検出：
Ａ．膜を、揺動機上で、３回×１５分、ＴＢＳ／ツイーンで洗浄した。
【０２００】
Ｂ．膜を、水で１回すすいだ。
【０２０１】
Ｃ．化学発光検出剤を添加し（膜当たり１０ｍｌのＥＣＬ剤＋５μｌのＨ２Ｏ２（３０％））、２分間揺動した。
【０２０２】
Ｄ．膜を、プラスチックシートの保護材上に置き、過剰な検出剤および泡を絞り出した。
【０２０３】
Ｅ．膜を、フィルムに露光した。
【０２０４】
１％  ＮＰ−４０リシス緩衝液：
１％  ＮＰ−４０
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
１ｍＭ  ＰＭＳＦ
２００μＭＮａ３ＶＯ４
１０Ｕ／ｍｌ  アプロチニン
１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン。
【０２０５】
５×  Ｌａｅｍｍｌｉ  サンプル緩衝液：
３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ６．８
２５％  グリセロール
１０％  ＳＤＳ
０．０５％  ブロモフェノールブルー
ストック２−βＭＥの最終体積１２０ｕｌ／ｍｌ。
【０２０６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  泳動緩衝液：
１４．４ｇのグリシン
３．０３ｇのトリス塩基
１ｇまたは５ｍｌ（２０％）のＳＤＳ
水を加えて１リットルにする。
【０２０７】
１０×トランスファー緩衝液：
０．２Ｍ  トリス塩基
１．９２Ｍ  グリシン。
【０２０８】
１×トランスファー緩衝液：
１００ｍｌ  １０×のトランスファー緩衝液
２００ｍｌのＭｅＯＨ
７００ｍｌの水。
【０２０９】
１０×ＴＢＳ：
６０．５ｇのトリス塩基
８７．５ｇのＮａＣｌ
水を加えて１リットルにする。
【０２１０】
ＴＢＳ／ツイーン：
１００ｍｌの１０×ＴＢＳ
９００ｍｌの水
５００ｕｌのツイーン２０（１００％）。
【０２１１】
ＢＬＯＣＫＯ：
ＴＢＳ／ツイーン中４％ＢＳＡ。
【０２１２】
（実施例２）
ＭＡＰキナーゼ活性と、ナイアシン受容体調節因子のインビボでの紅潮効果との相関性
本実施例は、インビボでの既知の紅潮効果を有する化合物が、インビボで有意な紅潮を引き起こさないことが知られていた化合物よりも高レベルのＭＡＰキナーゼ活性を有したことを示す（図３および４を参照されたい）。図３において、化合物１はナイアシンであることに留意されたい。
【０２１３】
図３中の表については、インビボでの紅潮およびｃＡＭＰを、実質的に以下のように測定した。ＭＡＰキナーゼは、実施例１のＥＬＩＳＡプロトコールを用いて測定した。
レーザードップラーを用いる、マウスにおける紅潮：
雄性Ｃ５７Ｂ１６マウス（約２５ｇ）を、ｌ０ｍｇ／ｍｌ／ｋｇのネムブタールナトリウム（Ａｂｂｏｔｔ  ｌａｂｓ）で麻酔した。１０分後、動物をレーザー下に置き、耳を後ろに折り曲げて腹側を曝露した。レーザーを耳の中心に位置決めし、強度８．４〜９．０Ｖ（これは、一般に耳の約４．５ｃｍ上である）に焦点を当てた。ベースラインの読み取り値を３分間記録した。データ取得を、１５×１５画像フォーマット、自動インターバル、６０画像および２０秒の遅延時間で、中間の解像度で開始した。１０個目の画像の後、試験化合物を、注射により腹腔に投与した。画像１〜１０を動物のベースラインと考え、データを、ベースライン平均強度の平均値に正規化した。用いたレーザードップラーは、Ｐｉｒｉｍｅｄ  ＰｉｍＩＩであった。
【０２１４】
環状ＡＭＰアッセイ
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（カタログ番号ＳＭＰ００４Ｂ）の、９６ウェルのアデニリルシクラーゼ活性化キットを用いた。ＣＨＯ細胞用の細胞培養培地は、１０％の仔ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ−１２  Ｋａｉｇｈｎ変性細胞培養培地であった。
【０２１５】
試剤調製物
○５０／５０アッセイ緩衝液を作製した（刺激緩衝液／ＰＢＳ；刺激緩衝液は、Ｆｌａｓｈプレートキットに含まれることに留意されたい）。
【０２１６】
○ＰＢＳ中２％ＤＭＳＯを作製した。
【０２１７】
○１００００ｐｍｏｌ／ｍｌ（１０μＭ）ｃＡＭＰ標準ストック溶液を、ｃＡＭＰ粉末１ボトルを１ｍＬの刺激緩衝液に溶解することにより作製した。以下の表に記載した順次希釈を行い、８つの標準濃度を得た：
【０２１８】
【化３】
2008538277.tif 000005
○２０μＭのフォルスコリンを、１０ｍＭのストック（冷凍保存）を１：５００で刺激緩衝液に希釈することにより作製した。
【０２１９】
○４０μＭのナイアシンを、２％のＤＭＳＯ／ＰＢＳ中で調製した。
【０２２０】
連続的な５×希釈化合物（９６ウェルプレート中）の調製
○５μｌの２０ｍＭ化合物を、カラム番号２において１００％ＤＭＳＯ中に入れ、１つのプレートは、最大８化合物を有し得る。
【０２２１】
○２４５μｌのＰＢＳを、化合物を含むカラム番号２のウェルに添加し、ピペット操作で上下させることにより混合した。２００μｌの２％ＤＭＳＯ／ＰＢＳを、カラム（番号３〜番号１１）に添加した。
【０２２２】
○カラム番号２からの５０μｌをカラム番号３に移し、上記のように混合し、カラム番号１１まで順次希釈を繰り返した（希釈毎にピペットチップを交換した）。ここで、カラム番号２〜番号１１は、２％のＤＭＳＯ中、４００μＭ〜２０４．８ｐＭにわたる化合物を有した（１００μＭ〜５１．２ｐＭの最終アッセイ濃度の４倍である）。
【０２２３】
細胞の採取
○培養培地を、Ｔ−１８５細胞培養フラスコから吸引した。細胞を、１０ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、フラスコ１つ当たり５ｍＬの温（３７℃）細胞解離溶液を添加した。細胞を剥離した後、５ｍＬの温（３７℃）５０／５０緩衝液をフラスコに添加し、細胞をフラスコから５０ｍＬのコニカルチューブに移した。
【０２２４】
○細胞を、１１００ｒｐｍで、室温にて６分遠心分離した。上清を吸引し、細胞を５０／５０のアッセイ緩衝液に再懸濁した。細胞をカウントし、温（３７℃）５０／５０のアッセイ緩衝液で１×１０６細胞／ｍｌの密度に希釈した。
【０２２５】
試剤の添加
○２００μｌの２％  ＤＭＳＯ／ＰＢＳを、カラム番号１の最初の４列に添加し、２００μｌの４０μＭナイアシンをカラム番号１の最後の４列に添加し、ｃＡＭＰ標準を、化合物プレート上のカラム番号１２に添加した。
【０２２６】
○２５μＬを、化合物プレートから、３つの別々のアッセイプレートの全てのウェルに移動した。
【０２２７】
○５０μｌの５０／５０（刺激／ＰＢＳ）を、アッセイプレートのカラム番号１２に添加した。
【０２２８】
○５０μｌの細胞を、カラム番号１〜カラム番号１１に添加し、最終密度は５０，０００細胞／ウェルであった。
【０２２９】
○２５μｌの２０μＭフォルスコリンを、ナイアシン受容体を発現する細胞を含む全てのウェルに添加し（５μＭの最終濃度）、カラム番号１以外（カラム１は、ネガティブコントロール受容体を発現する細胞を含むからである）の全てのウェル、列Ｅ〜Ｈに、２５μｌの刺激緩衝液を添加した。
【０２３０】
○プレートを、振盪器に１時間、室温で入れ、上部プレートを、ホイルで覆った。
【０２３１】
○５０μｌの［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰを１１ｍｌまで希釈し、検出緩衝液（キット中）、および１００μｌの希釈されたトレーサーを各ウェルに添加した。
【０２３２】
○プレートをプラスチックカバーで覆い、室温で２時間振盪器に入れた。
【０２３３】
○プレートを、１２５Ｉ  ＦｌａｓｈＰｌａｔｅＰｒｏｔｏｃｏｌを用いてＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏｂｅｔａカウンター１４５０中でカウントし、１２５Ｉを検出した。
【０２３４】
（実施例３）
ＭＡＰキナーゼアッセイの予測能力
この実施例は、ｃＡＭＰアッセイに基づいて選択された化合物が、それがインビボで紅潮を引き起こす能力についての知識なしに、ナイアシンと比較したＭＡＰキナーゼを誘発する能力を試験されたことを示す。化合物（化合物１１）は、ナイアシンと比較してＭＡＰキナーゼを誘発する能力が低減されたことが見出されたので、実施例２に記載のレーザードップラーアッセイを用いて、マウスのインビボでの紅潮活性を試験した。本発明の方法により予測されるように、化合物はインビボで紅潮を引き起こさなかった。従って、ＭＡＰキナーゼアッセイは、インビボで試験したときに、化合物が紅潮を引き起こすかどうか予測し得た。さらに、化合物が遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を低減する能力を試験した。
【０２３５】
本実施例では、実施例１に記載されたＭＡＰキナーゼＥＬＩＳＡを用いて、ＭＡＰキナーゼ活性を測定した。ヒトナイアシン受容体（図５、左上パネルを参照されたい）またはマウスナイアシン受容体（右上パネルを参照されたい）のいずれかを発現するＣＨＯ細胞を用いるＥＬＩＳＡアッセイを用いた。マウスにおけるレーザードップラー紅潮アッセイの結果を、図５の右下パネルに示す。遊離脂肪酸放出アッセイを、以下に記載するように行った。
【０２３６】
ＦＦＡアッセイ
マウスに、ビヒクルまたは種々の用量の化合物１１を与えた。１０分後、マウスを安楽死させ、血液を採取した。血液サンプルを加工し、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）アッセイ（Ｗａｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡのＮＥＦＡ−Ｃ  アッセイキット）を用いて、遊離脂肪酸の放出を試験した。ＮＥＦＡアッセイを、製造者が推奨するプロトコールに従って行った。ビヒクルサンプルについて測定した遊離脂肪酸の濃度は、化合物１１よりも高かったが、これは、化合物１１での処理が、遊離脂肪酸の放出の低減を引き起こしたことを示す。従って、化合物１１は、抗脂肪分解性化合物であると考えられ得る。
【０２３７】
（実施例４）
化合物１２、ナイアシンアナログ
本実施例は、例えば、本発明の方法においてナイアシンの代わりに用いられ得るナイアシンアナログ（化合物１２）の例を示す。
本実施例では、化合物１２のＭＡＰキナーゼ活性を、実施例１に記載されたＭＡＰキナーゼＥＬＩＳＡを用いて測定した。ヒトナイアシン受容体（図６、左パネルを参照のこと）またはマウスナイアシン受容体（右パネルを参照のこと）のいずれかを発現したＣＨＯ細胞を用いるＥＬＩＳＡアッセイを用いた。図６に示すように、化合物１２は、ＭＡＰキナーゼ活性化アッセイにおいてナイアシンのプロファイルと密接に適合する。
【０２３８】
（実施例５）
ラットにおける遊離脂肪酸レベルおよびヒト脂肪細胞における脂質分解の測定
本実施例は、遊離脂肪酸レベルを、ラットにおいて測定され得ることを示す。本実施例はまた、ヒト脂肪細胞において遊離脂肪酸レベルを測定され得ることも示す。
【０２３９】
ラットアッセイ
カテーテルを、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの頚静脈に外科手術で移植する。ラットを２、３日、移植手術から回復させ、次いで、次の日、ラットを絶食させ、約１６時間後、ビヒクルまたはナイアシン［ＮＡ］のいずれかを、１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまたは４５ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内（ＩＰ）注射する。ナイアシンアナログは、同様の様式で試験され得る。血液を種々の時点で採取し（約２００ｍｌ）、血漿を、遠心分離後に取り出す。次いで、血漿ＦＦＡを、製造者の仕様に従って、ＮＥＦＡ  Ｃキット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ）により測定する。
【０２４０】
ヒト脂肪細胞脂肪分解アッセイ：
脂肪細胞を、ＺｅｎＢｉｏ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）から入手し、脂肪分解アッセイを、製造者のプロトコールに従って行う。細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇およびホルモン感受性リパーゼによる脂肪分解の同時の活性化を、イソプロテレノールを実験的に決定された濃度および回数で用いることにより達成する。脂肪分解を、目的の化合物（例えば、ナイアシンまたはナイアシンアナログ）の存在下または非存在下で、所望の時間にわたって継続させる。少なくとも５つの化合物濃度を試験して非線形回帰分析およびＥＣ５０値の決定を可能にする。グリセロール産生の百分率を、比色法により測定し、標準（ＺｅｎＢｉｏ）と比較する。
【０２４１】
（実施例６）
マウスアテローム性硬化症モデル
アジポネクチン遺伝子をノックアウトすることにより作製したアジポネクチン欠損マウスは、アテローム性硬化症にかかりやすく、かつインスリン抵抗性であることが示されている。マウスはまた、虚血性心疾患に適したモデルである［Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）Ｊｕｌｙ，およびそこに開示された参考文献（それらの開示は、その全体が参照として本明細書に援用される）］。
アジポネクチンノックアウトマウスを、２２℃および相対湿度５０％の標準的な実験室的条件下で収納する（かご当たり７〜９匹のマウス）。マウスに微細浸透圧ポンプにより投与し、イソフルラン麻酔を挿入して、本発明の化合物、生理食塩水、または無関係の化合物を、マウスに皮下的に（ｓ．ｃ）与える。新生内膜の肥厚化および虚血性心疾患を、異なる時間間隔で犠牲にしたマウスの異なる群について決定する。群間の有意な差異（本発明の化合物を生理食塩水処置群と比較する）を、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−検定を用いて評価する。
【０２４２】
上記アテローム性硬化症のマウスモデルを例示のために提供するが、限定するものではない。さらなる例として、アポリポタンパク質Ｅ−欠損マウスもはまた、アテローム性硬化症にかかりやすいことが示されている［Ｐｌｕｍｐ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９２）７１：３４３−３５３；その開示の全体は、参照として本明細書に援用される］。
用いられ得る他のモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｊマウスにおける食餌誘発性のアテローム性硬化症であり、食餌誘発性のアテローム性動脈硬化の病変形成にかかりやすいことが知られている近交系株である。このモデルは、当業者に周知である［Ｋａｍａｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ（２００１）８：１−６；Ｇａｒｂｅｒ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ（２００１）４２：５４５−５２；Ｓｍｉｔｈ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭｅｍＭｅｄ（１９９７）２４２：９９−１０９；それぞれの開示の全体は、参照として本明細書に援用される］。
【０２４３】
（実施例７）
ＨＤＬ−コレステロールおよびアテローム性硬化症のインビボブタモデル
脂質関連障害の予防または治療における本発明の化合物の医薬としての有用性を、例えば、化合物が、インビボブタモデルにおいてＨＤＬ−コレステロールに対する総コレステロールの比を低下する活性、ＨＤＬ−コレステロールを上昇させる活性またはアテローム性硬化症から保護する活性により示す。ブタを動物モデルとして使用するが、これは、ブタはほとんどの他の動物モデルよりも密接にヒトの生理学、特に脂質代謝を反映するからである。限定を意図しない例示のインビボブタモデルを、本明細書に示す。
【０２４４】
ヨークシャーアルビノブタ（体重２５．５±４ｋｇ）に、２％のコレステロールおよび２０％の牛脂を補充した標準の食餌から構成される飽和脂肪酸富化およびコレステロール富化した（ＳＦＡ−ＣＨＯ）食餌を５０日間与える（体重３５ｋｇのブタ１匹当たり１ｋｇの食餌）［Ｒｏｙｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０００）３０：８４３−５２；その開示の全体は、参照として本明細書に援用される］。不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比を、正常なブタ食餌の０．６から、ＳＦＡ−ＣＨＯ食餌の１．１２まで変化させる。動物を２つの群に分け、１つの群（ｎ＝８）にはＳＦＡ−ＣＨＯ食餌を与えてプラシーボで処置し、他方の群（ｎ＝８）にはＳＦＡ−ＣＨＯ食餌を与えて調節因子（３．０ｍｇｋｇ−１）で処置する。コントロール動物に、５０日間、標準の食餌を与える。血液サンプルを、ベースライン（動物の入手２日後）で回収し、５０日後、食餌を開始する。血中脂質を分析する。動物を犠牲にし、死体解剖する。
【０２４５】
あるいは、上記分析は、それぞれ異なる用量の目的化合物で処置された複数の群で行う。用量には、例えば：０．１ｍｇｋｇ−１、０．３ｍｇｋｇ−１、１．０ｍｇｋｇ−１、３．０ｍｇｋｇ−１、１０ｍｇｋｇ−１、３０ｍｇｋｇ−１および１００ｍｇｋｇ−１が挙げられる。あるいは、上記分析は、複数の時点、例えば、１０週、２０週、３０週、４０週および５０週で行う。
【０２４６】
ＨＤＬ−コレステロール
血液を、クエン酸三ナトリウム中で回収する（３．８％、１：１０）。遠心分離（１２００ｇ、１５分）後に血漿を得、すぐに加工する。総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロールＬおよびＤＬ−コレステロールを、自動分析器Ｋｏｄａｋ  Ｅｋｔａｃｈｅｍ  ＤＴシステム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて測定する。範囲を超えるパラメータ値を有するサンプルを、製造者により供給される溶液で希釈し、次いで再分析する。総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比を決定する。群間のＨＤＬ−コレステロールレベルを比較する。群間の総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比を比較する。
【０２４７】
目的化合物の投与におけるＨＤＬ−コレステロールの上昇または総コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比の低減を、上記の有用性を有する化合物の指標と考える。
【０２４８】
アテローム性硬化症
胸部および腹部大動脈を無傷で取り出し、腹側面に沿って長手方向に開き、組織学的検査および脂質組成物および合成の研究のために、胸部および腹部大動脈内の標準的な部位を切り取った後、中性緩衝化ホルマリン中で固定する。固定後、大動脈全体をＳｕｄａｎ  ＩＶで染色し、平らにピンで留め、コンピュータ画像分析システム（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ；Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）に接続したＴＶカメラを用いてデジタル画像を得、アテローム性動脈硬化病変に関与する大動脈表面の割合を決定する［Ｇｅｒｒｉｔｙ  ＲＧ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００１）５０：１６５４−６５；Ｃｏｒｎｈｉｌｌ  ＪＦ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５）５：４１５−２６；その開示の全体は、参照として本明細書に援用される］。アテローム性動脈硬化病変に関与する大動脈表面の割合を、群間で比較する。
【０２４９】
目的化合物の投与におけるアテローム性動脈硬化病変に関与する大動脈表面の割合の低減を、上記の有用性を有する化合物の指標とする。
【０２５０】
血漿遊離脂肪酸
当業者の誰もが、上記インビボブタモデルは、限定されることなく、化合物が血漿遊離脂肪酸を低減する活性を調べるため容易に改変されることを容易に理解するであろう。
【０２５１】
（実施例８）
ＧＰＣＲ活性化の決定のためのアッセイ
ヒトＧＰＣＲ活性化の評価のために種々のアプローチが利用可能である。以下は例示である；当業者は、当業者の必要性に優先して有益であるこれらの技術を決定する能力を保証されている。
【０２５２】
１．膜結合アッセイ：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質結合受容体がその活性化状態にある場合、リガンド結合または構成的活性化の結果のいずれかとして、受容体はＧタンパク質に結合し、ＧＤＰの放出および引き続くＧＴＰのＧタンパク質への結合を刺激する。Ｇタンパク質受容体複合体のαサブユニットはＧＴＰアーゼとして作用し、ＧＴＰからＧＤＰへと緩やかに加水分解するが、この時点で、受容体は正常に不活性化する。活性化した受容体は、ＧＤＰをＧＴＰに変換し続ける。非加水分解性ＧＴＰアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの活性化した受容体を発現する膜への増強した結合を示すのに用いられ得る。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いることの利点は：（ａ）これは全てのＧタンパク質結合受容体に広く適用可能である；（ｂ）これは膜表面の近傍にあるので、細胞内カスケードに影響を与える分子をつかむ可能性が少なくなる。
【０２５３】
アッセイは、Ｇタンパク質結合受容体が、関連する受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激する能力を利用する。従って、アッセイは、内因性のＧＰＣＲおよび非内因性の構造的に活性化されたＧＰＣＲに対する候補化合物をスクリーニングするための直接的な同定方法において用いられ得る。アッセイは総括的であり、全てのＧタンパク質結合受容体における薬物発見への用途を有する。
【０２５４】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭと約２０ｍＭとの間のＭｇＣｌ２（２０ｍＭが好ましいが、この量は、結果の最適化のため調整され得る）（ｐＨ  ７．４）、約０．３と約１．２ｎＭとの間の［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳの結合緩衝液（１．２が好ましいが、この量は、最適化のため調整され得る）および１２．５〜７５μｇの膜タンパク質（例、ＧＰＲ３５を発現する２９３細胞；この量は、最適化のため調整され得る）ならびに１０μＭのＧＤＰ（この量は、最適化のため調整され得る）中で１時間インキュベートする。次いで、小麦胚芽アグルチニンビーズ（２５μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、混合物をさらに３０分、室温でインキュベートする。次いで、管を１５００×ｇで５分、室温で遠心分離し、次いでシンチレーションカウンター中でカウントする。
【０２５５】
２．アデニリルシクラーゼ
Ｆｌａｓｈプレート（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、細胞ベースアッセイ用に設計されているが、粗製血漿膜での使用のために改変され得る。Ｆｌａｓｈプレートウェルは、シンチラントコーティングを含むことができ、これはまた、特異的抗体認識ｃＡＭＰを含み得る。ウェル内で産生したｃＡＭＰは、放射性活性ｃＡＭＰトレーサーのｃＡＭＰ抗体への結合のための直接的な競合により定量され得る。以下は、受容体を発現する全細胞におけるｃＡＭＰレベルの変化を測定するための簡単なプロトコールとして役に立つ。
【０２５６】
一過性の形質移入の約２４時間後に、形質移入細胞を採取する。培地を慎重に吸引除去して捨てる。１０ｍｌのＰＢＳを、それぞれの細胞のディッシュに穏やかに添加し、次いで、慎重に吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰＢＳを、それぞれのプレートに添加する。細胞をピペットでプレートから除き、細胞懸濁液を、５０ｍｌ円錐遠心分離管に回収する。次いで、細胞を、室温にて、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適切な体積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）中に慎重に再懸濁する。次いで、細胞を血球計数器を用いて計数し、追加のＰＢＳを添加して、適切な数の細胞を（約５０μｌ／ウェルの最終体積で）得る。
【０２５７】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１μＣｉのトレーサー［１２５］ＩｃＡＭＰ（５０μｌ）を１１ｍｌの検出緩衝液に含む）を調製し、製造者の指示に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニング用に新たに調製し、これは５０μｌの刺激緩衝液、３μｌの候補化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を含む。アッセイ緩衝液を、使用するまで氷上に保存する。アッセイは、好ましくは、例えば、９６ウェルプレート中で行い、５０μｌのｃＡＭＰ標準を適切なウェルに添加し、次いで、５０μｌのＰＢＳＡをウェルＨ１１およびＨ１２に添加することにより開始する。５０μｌの刺激緩衝液を、全てのウェルに添加する。ＤＭＳＯ（または選択された候補化合物）を、３μｌの化合物溶液を分配され得るピン工具を用いて、１２μＭの候補化合物の最終アッセイ濃度および１００μｌの総アッセイ体積で適切なウェルに添加する。次いで、細胞をウェルに添加し、室温で６０分インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含む１００μｌの検出混合物を、ウェルに添加する。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、次いで、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターでカウントする。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値を標準ｃＡＭＰ曲線から外挿し、これをそれぞれのアッセイプレートに入れる。
【０２５８】
３．Ｇｉ結合した標的ＧＰＣＲのための細胞ベースｃＡＭＰ
ＴＳＨＲは、活性化によりｃＡＭＰの蓄積を引き起こす、ＧＰＣＲに結合したＧｓである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３（すなわち、アラニン残基からイソロイシン残基への変化）を変異させることにより、構造的に活性化され得る。Ｇｉが結合した受容体は、アデニリルシクラーゼを阻害することが予測されるので、ｃＡＭＰ産生のレベルを減少させ、このことがｃＡＭＰレベルの評価を難しいものにしている。Ｇｉが結合した受容体の活性化の指標としての、ｃＡＭＰの産生における減少を測定するための有効な技術は、非内因性の構造的に活性化したＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（または内因性の構造的に活性Ｇｓが結合した受容体）を「シグナルエンハンサー」としてＧｉが結合した標的ＧＰＣＲと共に同時形質移入して、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確立することにより、達成され得る。Ｇｉ結合受容体の内因性または非内因性バージョンの創製の際、次いで、標的ＧＰＣＲを、シグナルエンハンサーと共に同時形質移入するが、スクリーニングに用いられ得るのは、この材料である。いくつかの実施態様では、このアプローチは、好ましくは、Ｇｉ結合受容体に対する候補化合物を直接同定するのに用いられる。Ｇｉ結合ＧＰＣＲについて、このアプローチを用いる場合には、標的ＧＰＣＲの逆アゴニストは、ｃＡＭＰシグナルを増加させ、アゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少させることが留意される。
【０２５９】
第１日目に、２×１０４個の２９３細胞／ウェルを平板培養する。第２日目に、２つの反応管を調製する（それぞれの管の後に示す割合は、１プレート当たりである）：管Ａを、合計４μｇのＤＮＡ（例、ｐＣＭＶベクター；変異ＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を有するｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲ等）に対して、２μｇ  ＤＮＡへの哺乳動物細胞へのそれぞれの受容体形質移入体を１．２ｍｌの血清非含有ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）に混合することにより、調製する；管Ｂを、１２０μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を１．２ｍｌの血清非含有ＤＭＥＭに混合することにより、調製する。次いで、管ＡおよびＢを、反転（数回）により混合し、次いで、室温で３０〜４５分間インキュベーションする。混合物は、「形質移入混合物」と呼ばれる。平板培養した２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、次いで、１０ｍｌの血清非含有ＤＭＥＭを添加する。次いで、２．４ｍｌの形質移入混合物を細胞に添加し、次いで、３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベーションする。次いで、形質移入混合物を吸引により除去し、次いで、２５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清を添加する。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。２４時間のインキュベーション後、細胞を採取し、分析に用いる。
【０２６０】
Ｆｌａｓｈプレート（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、細胞ベースアッセイ用に設計されているが、当業者の必要に応じて粗製血漿膜での使用のために改変され得る。Ｆｌａｓｈプレートウェルは、シンチラントコーティングを含むことができ、これはまた、特異的抗体認識ｃＡＭＰを含む。ウェル内で産生したｃＡＭＰは、放射性活性ｃＡＭＰトレーサーのｃＡＭＰ抗体への結合のための直接的な競合により定量され得る。以下は、目的の受容体を発現する全細胞におけるｃＡＭＰレベルの変化を測定するための簡単なプロトコールとして役に立つ。
【０２６１】
一過性の形質移入の約２４時間後、形質移入細胞を採取する。培地を慎重に吸引除去して捨てる。１０ｍｌのＰＢＳを、それぞれの細胞のディッシュに穏やかに添加し、次いで、慎重に吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰＢＳを、それぞれのプレートに添加する。細胞をピペットでプレートから除き、細胞懸濁液を、５０ｍｌ円錐遠心分離管に回収する。次いで、細胞を、室温にて、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適切な体積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）中に慎重に再懸濁する。次いで、細胞を血球計数器を用いて計数し、追加のＰＢＳを添加して、適切な数の細胞を（約５０μｌ／ウェルの最終体積で）得る。
【０２６２】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１μＣｉのトレーサー［１２５］ＩｃＡＭＰ（５０μｌ）を１ｍｌの検出緩衝液に含む）を調製し、製造者の指示に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニング用に新たに調製し、これは５０μｌの刺激緩衝液、３μｌの候補化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を含む。アッセイ緩衝液を、使用するまで氷上に保存する。アッセイは、５０μｌのｃＡＭＰ標準を適切なウェルに添加し、次いで、５０μｌのＰＢＳＡをウェルＨ１１およびＨ１２に添加することにより開始することができる。５０μｌの刺激緩衝液を、全てのウェルに添加する。選択した化合物（例、ＴＳＨ）を、３μｌの化合物溶液を分配し得るピン工具を用いて、１２μＭの候補化合物の最終アッセイ濃度および１００μｌの総アッセイ体積で適切なウェルに添加する。次いで、細胞をウェルに添加し、室温で６０分インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含む検出混合物１００μｌを、ウェルに添加する。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、次いで、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターでカウントする。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値を標準ｃＡＭＰ曲線から外挿し、これをそれぞれのアッセイプレートに入れる。
【０２６３】
４．レポーターベースアッセイ
ａ．ＣＲＥ−ＬＵＣレポーターアッセイ（Ｇｓ関連受容体）
２９３または２９３Ｔ細胞を、ウェル当たり密度が２×１０４細胞の９６ウェルプレート上で平板培養し、次の日、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試剤（ＢＲＬ）を用いて形質移入する。ＤＮＡ／脂質混合物を、それぞれ、６ウェル形質移入のために、以下のように調製する：１００μｌのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌのＤＭＥＭ中の２μｌの脂質（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、５０ｎｇの内因性の受容体または非内因性の受容体を含むｐＣＭＶあるいはｐＣＭＶ単独、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３中ＧＰＲＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる）中で穏やかに混合する。８×ＣＲＥ−ＬｕＣレポータープラスミドを、以下のように調製する：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）を、ＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位で、ｐβｇａｌ−ＢａｓｉｃＶｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中でクローニングすることにより得る。ｃＡＭＰ応答エレメントの８つのコピーを、アデノウイルステンプレートＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：１８８３−１８９３（１９９６）を参照されたい；その開示の全体は、本明細書中で参照として援用される）からＰＣＲにより得、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位においてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにクローン化して、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターを得る。８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位で、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得たルシフェラーゼ遺伝子と置き換えることにより、８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを産生する。室温でのインキュベーションの３０分後、ＤＮＡ／脂質混合物を、４００μｌのＤＭＥＭで希釈し、１００μｌの希釈混合物を、各ウェルに添加する。４時間細胞培養インキュベーター中でインキュベートした後に、１０％ＦＣＳを有する１００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに添加し、翌日、形質移入細胞を、１０％ＦＣＳを有する２００μｌ／ウェルのＤＭＥＭで変化させる。８時間後、ウェルを、ＰＢＳで１回洗浄した後、フェノールレッドを用いることなく１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭに変えた。次の日、ＬｕｃＬｉｔｅ（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を製造者の指示に従って用いてルシフェラーゼ活性を測定し、１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションおよび蛍光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）上で読み取った。
【０２６４】
ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣが、それらのプロモーター中にＡＰ１因子を含む遺伝子の活性化を引き起こす既知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＡＰ−１  ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２１９０７３）を、カルシウムリン酸沈殿物の成分が４１０ｎｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰであること以外はＣＲＥＢレポーターアッセイに関して上述したプロトコールに従って用いられ得る。
【０２６５】
ｃ．ＳＲＦ−ＬＵＣレポーターアッセイ（Ｇｑ関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための１つの方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣが、プロモーター中に血清応答因子を含む遺伝子の活性化を引き起こす既知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、Ｇｑ結合活性、例えば、ＣＯＳ７細胞のアッセイに用いられ得る。細胞を、系のプラスミド成分、および製造者の指示に従って哺乳動物形質移入（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号２００２８５）を用いて内因性または非内因性のＧＰＣＲをコードする、指示された発現プラスミドを用いて形質移入した。簡便には、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌したアルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性を、形質移入細胞の培地中で測定して、サンプル間の形質移入効力における変化を制御する）を、製造者の指示に従って、カルシウムリン酸沈殿中で合わせる。沈殿の半分を、９６ウェルプレート中の３つのウェルに均等に分配し、血清非含有培地中の細胞上で２４時間保持する。最後の５時間、細胞を、例えば、１μＭの候補化合物でインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６０１６９１１）および“Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ”液体シンチレーションおよび蛍光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を製造者の指示に従って用いることによってアッセイする。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて分析され得る。
【０２６６】
ｄ．細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ関連受容体）
第１日目に、目的の（内因性または非内因性の）受容体を含む細胞を、通常１×１０５細胞／ウェル（この数は最適化され得る）の２４ウェルプレート上で平板培養され得る。第２日目に、まず０．２５μｇのＤＮＡを５０μｌの血清非含有ＤＭＥＭ／ウェルに混合し、２μｌのリポフェクタミンを５０μｌの血清非含有ＤＭＥＭ／ウェルに混合することにより、細胞を形質移入され得る。溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜３０分インキュベートする。細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４００μｌの血清非含有培地を形質移入培地に混合し、細胞に添加する。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で３〜４時間インキュベートし、次いで、形質移入培地を除去し、１ｍｌ／ウェルの通常の生育培地で置き換える。第３日目に、細胞を３Ｈ−ミオイノシトールで標識する。簡便には、培地を除去し、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。次いで、０．５ｍｌのイノシトール非含有／血清非含有培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）に、１ウェル当たり０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオイノシトール／ウェルを添加し、細胞を、３７℃／５％ＣＯ２で一晩１６〜１８時間にわたってインキュベートする。第４日目に、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、セロトニン受容体を含むコントロール構築物を用いる場合、０．４５ｍｌのアッセイ培地（イノシトール非含有／血清非含有培地、１０μＭのパージリン、１０ｍＭの塩化リチウムまたは０．４ｍｌのアッセイ培地および５０μｌの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を、１０μＭの最終濃度まで添加する。次いで、細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２００μｌの新鮮な氷冷停止溶液（１ＭのＫＯＨ；１８ｍＭのホウ酸Ｎａ；３．８ｍＭのＥＤＴＡ）をウェルに添加する。溶液を氷上で５〜１０分または細胞が溶解するまで維持し、次いで、２００μｌの新鮮な氷冷中和溶液（７．５％のＨＣＬ）で中和する。次いで、溶解物を１．５ｍｌエッペンドルフ管に移動し、１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）を管に添加する。溶液を１５秒間攪拌し、上部相をＢｉｏｒａｄ  ＡＧｌ−Ｘ８（商標）アニオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に付与する。最初に、樹脂を１：１．２５  Ｗ／Ｖで水で洗浄し、０．９ｍｌの上部相をカラムに装填する。カラムを１０ｍｌの５ｍＭミオイノシトールおよび１０ｍｌの５ｍＭ  Ｎａホウ酸／６０ｍＭ  Ｎａギ酸で洗浄する。イノシトールトリスリン酸を、２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを有する１０ｍｌのシンチレーションカクテルを含むシンチレーションバイアルに溶出させる。カラムを、１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムで洗浄し、蒸留Ｈ２Ｏで２回すすぐことにより再生し、水中に４℃で保存する。
【０２６７】
ｅ．細胞内カルシウム濃度の測定のための蛍光画像形成プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ
標的受容体（実験的）および対応するクローナル株から安定に形質移入したｐＣＭＶ（ネガティブコントロール）細胞を、ポリ−Ｄ−リジンで前処理した９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、番号３５６６４０）を、次の日のアッセイのために、５．５×１０４細胞／ウェルで、完全培養培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ）と共に播種する。ナイアシン受容体はＧｉに結合しているので、ナイアシン受容体を含む細胞は、さらにＧα１５、Ｇα１６またはキメラＧｑ／Ｇｉαサブユニットを含み得る。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｆ１４２０２）インキュベーション緩衝液ストックを調製するために、１ｍｇのＦｌｕｏ４−ＡＭを、４６７μｌのＤＭＳＯおよび４６７μｌのプルオロニック酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｐ３０００）に溶解して、−２０℃で１ヶ月保存が可能な１ｍＭストック溶液を得る。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指示染料である。
【０２６８】
候補化合物を、洗浄緩衝液（ｐＨ  ７．４の１×  ＨＢＳＳ／２．５ｍＭプロベニシド／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で製造する。
【０２６９】
アッセイのとき、培養培地をウェルから除去し、細胞に１００μｌの４μＭ  Ｆｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭＨＥＰＥＳ／完全培地をｐＨ  ７．４で添加する。３７℃／５％ＣＯ２でのインキュベーションを６０分進行させる。
【０２７０】
１時間のインキュベーション後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーション緩衝液を除去し、細胞を１００μｌ洗浄緩衝液で２回洗浄する。それぞれのウェルに１００μｌの緩衝液を残す。プレートを、３７℃／５％ＣＯ２で６０分にわたってインキュベーターに戻す。
【０２７１】
ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を、３０秒の時点で５０μｌの候補化合物を添加し、かつ追加の１５０秒にわたって候補化合物により生じる細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の一過性の変化を記録するようにプログラムする。総蛍光変化計数を用い、ＦＬＩＰＲソフトウェアを用いてアゴニスト活性を決定する。装置のソフトウェアにより、蛍光の読み取りが正規化されて、０点における等価な最初の読み取り値が提供される。
【０２７２】
上記は、安定に形質移入された細胞を用いるアゴニスト活性のＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者は、アンタゴニスト活性を特徴付けするためにアッセイを容易に改変され得るであろう。あるいは、当該当業者は、一過性の形質移入細胞を用い得ることを容易に理解するであろう。
【０２７３】
（実施例９）
受容体結合アッセイ
記載された本明細書中に記載された方法に加えて、候補化合物を評価する他の手段は、ナイアシン受容体への結合親和性を決定することによる。この型のアッセイは、一般に、ナイアシン受容体への放射標識リガンドを必要とする。
【０２７４】
放射標識ナイアシンなどの放射標識化合物は、化合物を同定／評価するためのスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。一般的な用語では、新規に合成されるまたは同定される化合物（すなわち、候補化合物）は、放射標識ナイアシンのナイアシン受容体への結合を低減する能力を評価され得る。従って、ナイアシン受容体への結合について放射標識ナイアシンと競合する能力は、候補化合物のナイアシン受容体への結合親和性に直接的に相関する。
【０２７５】
ナイアシン受容体について受容体結合を決定するためのアッセイプロトコール：
Ａ．ナイアシン受容体の調製
例えば、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト腎臓、ＡＴＣＣ）は、本明細書中に記載されたナイアシン受容体と共に、一過性でまたは安定に形質移入され得る。例えば、２９３細胞は、１０μｇのヒトナイアシン受容体および６０μｌのリポフェクタミン（１５ｃｍディッシュ当たり）と共に一過性の形質移入がなされ得、培地を変えてディッシュ内で２４時間（７５％コンフルエンシー）生育させ得る。細胞を、１０ｍｌ／ディッシュのＨｅｐｅｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）を用いて除去する。次いで、細胞をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  遠心分離器で２０分、１７，０００ｒｐｍ（ＪＡ−２５．５０回転子）で遠心分離する。次いで、ペレットを２０ｍＭのＨｅｐｅｓ＋１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ  ７．４）に再懸濁し、５０ｍｌのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズして、再び遠心分離する。上清を除去した後、ペレットを結合アッセイに用いるまで−８０℃で保存する。アッセイへの使用時、膜を氷上で２０分冷凍し、次いで、１０ｍＬのインキュベーション緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を添加する。次いで、膜を攪拌して粗製膜ペレットを懸濁し、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＰＴ−３１００  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーで１５秒間、設定６でホモジナイズする。膜タンパク質の濃度を、ＢＲＬ  Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて決定する。
【０２７６】
Ｂ．結合アッセイ
総結合については、総体積が５０μｌの適切に希釈された膜（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＥＤＴＡ；５〜５０μｇタンパク質を含むアッセイ緩衝液で希釈）を、９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに添加し、次いで１００μｌのアッセイ緩衝液および５０μｌの放射標識ナイアシンを添加する。非特異的結合については、１００μｌの代わりに５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、かつ、追加の５０μｌの１０μＭ冷ナイアシン受容体を、５０μｌの放射標識ナイアシンを添加する前に添加する。次いで、プレートを室温で６０〜１２０分インキュベートする。アッセイプレートをＢｒａｎｄｅｌｌ  ９６ウェルプレート回収器を備えたＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＧＦ／Ｃ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ濾過プレートを通して濾過し、次いで冷却した５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４、０．９％のＮａＣｌ含有）で洗浄することにより結合反応を終結させる。次いで、濾過プレートの底部を密封し、５０μｌのＯｐｔｉＰｈａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを各ウェルに添加し、プレートの頂部を密封し、プレートをＴｒｉｌｕｘＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数する。化合物競合の研究のため、１００μｌのアッセイ緩衝液を添加する代わりに、１００μｌの適切に希釈された候補化合物を適切なウェルに添加し、次いで、５０μｌの放射標識ナイアシンを添加する。
【０２７７】
Ｃ．算出
候補化合物を、最初に１および０．１μＭで、次いで、放射標識ナイアシン結合（すなわち、ＩＣ５０）の約５０％の阻害を起こすように選ばれた濃度範囲で、アッセイする。候補化合物（Ｂｏ）の非存在下での特異的結合は、総結合（ＢＴ）から非特異的結合（ＮＳＢ）を差し引いた差異であり、かつ、同様に特異的な結合（候補化合物の存在下で）（Ｂ）は、置換結合（ＢＤ）から非特異的結合（ＮＳＢ）を差し引いた差異である。阻害応答曲線（％Ｂ／Ｂｏ対候補化合物の濃度のロジット−ログプロット）からＩＣ５０を決定する。
【０２７８】
Ｋｉを、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｔｏｆｆの変換により算出する：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［Ｌ］／ＫＤ）
（式中、［Ｌ］は、アッセイに用いた放射標識ナイアシンの濃度であり、ＫＤは、同様の結合条件で独立して決定される放射標識ナイアシンの解離定数である）。
【０２７９】
本出願人は、本発明の実施態様のいずれかからいずれかの１つまたはそれ以上の化合物を除外する権利を留保する。本出願人はまた、例えば、ナイアシン、ナイアシンアナログまたはナイアシン受容体アゴニスト、いずれかのナイアシン受容体部分アゴニスト、あるいはいずれかの組み合わせ療法のいずれかの処方物または量を除外する権利を留保する。
【０２８０】
本出願の全体にわたって、種々の刊行物、特許および公開特許出願が引用されている。本出願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許出願の開示は、それらの全体が、本明細書中で本開示に参考として援用される。刊行物、特許または公開特許出願の本出願人による本明細書での引用は、本出願人が当該刊行物、特許または公開特許出願を先行技術であると認めるものではない。
【０２８１】
当業者の範囲内での開示された発明の改変および拡張は、上記開示および以下の特許請求の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２８２】
【図１】ヒトナイアシン受容体を発現するＣＨＯ細胞においてナイアシンが誘発するＭＡＰキナーゼ活性化を、ＥＬＩＳＡおよびＷｅｓｔｅｒｎブロットにより示す。
【図２】ナイアシンおよび化合物８によりヒトナイアシン受容体を発現するＣＨＯ細胞におけるＭＡＰキナーゼ活性化を、ＥＬＩＳＡを用いて示す。
【図３】以下のアッセイを用いて、ナイアシン（化合物１）と、いくつかのナイアシン受容体調節因子とを比較した表を示す：マウスにおけるインビボでの紅潮、ヒトナイアシン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるｃＡＭＰアッセイ、およびＥＬＩＳＡによる、ヒトナイアシン受容体を発現するＣＨＯ細胞におけるＭＡＰキナーゼ活性化。最後のカラムは、ＭＡＰキナーゼＥＣ５０のｃＡＭＰ  ＩＣ５０に対する比を示す。
【図４】ヒトナイアシン受容体を発現するＣＨＯ細胞における、いくつかのナイアシン受容体調節因子のＭＡＰキナーゼ活性化のグラフを示す。大きな矢印は、マウスにおいて紅潮を示した化合物を示し、小さな矢印は、マウスにおいて紅潮を示さなかった化合物を示す。水平方向の点線は、ナイアシンから２標準偏差低いことを示す。
【図５】ヒト（左上パネル）上のＭＡＰキナーゼの低い活性化のために選択された化合物１１およびＣＨＯ細胞において発現するマウス（右上パネル）ナイアシン受容体のナイアシン受容体調節因子を示す。化合物は、ナイアシン（右下パネル）と比較して有意な紅潮を有しなかったこと、およびマウスにおいて遊離脂肪酸レベルが低減したこと（左下パネル）が後に示された。
【図６】ナイアシンアナログ化合物である化合物１２が、ＭＡＰキナーゼアッセイにおいてＣＨＯ細胞に発言されるヒトナイアシン受容体（右のパネル）およびマウスナイアシン受容体に対しナイアシンのように挙動することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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