(57)【要約】  本発明は、分子及び細胞生物学、並びに生化学に関する。一つの態様において、本発明は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製する及び使用する方法を提供する。一つの態様において、本発明は、熱安定及び耐熱活性を含む、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらの酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製及び使用する方法を対象とする。本発明のポリペプチドは、多様な薬学、農業、食物及び飼料加工、並びに産業の状況で使用することができる。
2008538176.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５に、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な配列同一性を有する核酸配列を含み、セルラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離または組換え核酸であって、場合により、前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって又は目視検査によって決定される、前記単離または組換え核酸；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５を含む核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離または組換え核酸であって、前記ストリンジェントな条件には０．２xＳＳＣ中、約６５℃の温度で約１５分間洗浄することを含む洗浄工程が含まれ、
場合により、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個若しくはそれ以上の長さの残基であるか、又は遺伝子若しくは転写物の完全長である核酸配列を含む、前記単離または組換え核酸；
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６に記載の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離または組換え核酸；或いは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に相補的である核酸配列を含む単離又は組換え核酸。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５に記載の配列を含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項３】
配列比較アルゴリズムがＢＬＡＳＴバージョン２．２．２アルゴリズムであり、フィルタリング設定がblastall -p blastp -d "nr pataa" -F Fに設定され、他の全てのオプションが初期設定値に設定される、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項４】
セルラーゼ活性がエンドグルカナーゼ活性を含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項５】
セルラーゼ活性がセロビオヒドロラーゼ活性を含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項６】
セルラーゼ活性が、β−グルコシダーゼ又はマンナナーゼ活性を含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項７】
セルラーゼ活性がエンドセルラーゼ活性を含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項８】
セルラーゼ活性が、グルカンを加水分解して、より小さい分子量の多糖又はオリゴマーを生成することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項９】
セルラーゼ活性が、１，４−β−Ｄ−グリコシド結合の加水分解を触媒することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１０】
エンドセルラーゼ活性がエンド−１，４−β−エンドセルラーゼ活性を含む、請求項９記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１１】
１，４−β−Ｄ−グリコシド結合活性が、セルロース、セルロース誘導体、リケニン又は穀類における１，４−β−Ｄ−グリコシド結合の加水分解を含む、請求項１０記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１２】
セルロース誘導体が、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースを含む、請求項１１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１３】
穀類が、β−Ｄ−グルカン又はキシログルカンを含む、請求項１１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１４】
セルラーゼ活性が、グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１５】
セルラーゼ活性が、β−１，４−及び／又はβ−１，３−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項１４記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１６】
セルラーゼ活性が、エンド−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項１４記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１７】
セルラーゼ活性が、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ活性の加水分解を触媒することを含む、請求項１６記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１８】
セルラーゼ活性が、内部エンド−β−１，４−グルカナーゼ結合及び／又はβ−１，３−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項１６記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１９】
セルラーゼ活性が、内部β−１，３−グリコシド結合の加水分解を触媒することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２０】
セルラーゼ活性が、グルコピラノースを含む多糖を加水分解することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２１】
セルラーゼ活性が、１，４−β−グリコシド結合Ｄ−グルコピラノースを含む多糖を加水分解することを含む、請求項２０記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２２】
セルロース活性が、セルロース、セルロース誘導体又はヘミセルロースを加水分解することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２３】
セルラーゼ活性が、木材若しくは紙パルプ、又は木材若しくは紙製品において、セルロース又はヘミセルロースを加水分解することを含む、請求項２２記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２４】
セルラーゼ活性が、飼料、食品又は飲料においてグルカンの加水分解を触媒することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２５】
飼料、食品又は飲料が、穀類系動物飼料、麦芽汁若しくはビール、生地、果実又は野菜を含む、請求項２４記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２６】
セルラーゼ活性が、微生物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、又はセルロース部分を含むあらゆる植物材料のグルカンの加水分解を触媒することを含む、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２７】
セルラーゼ活性が熱安定性である、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２８】
ポリペプチドが、約３７℃〜約９５℃、若しくは約５５℃〜約８５℃、若しくは約７０℃〜約７５℃、若しくは約７０℃〜約９５℃、若しくは約９０℃〜約９５℃の温度範囲を含む条件下でセルラーゼ活性を保持するか、又は約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃又は約３７℃〜約９５℃、９６℃、９７℃、９８℃若しくは９９℃の範囲の温度でセルラーゼ活性を保持する、請求項２７記載の単離又は組換え核酸。
【請求項２９】
セルラーゼ活性が耐熱性である、請求項１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項３０】
ポリペプチドが、３７℃より高く約９５℃まで、５５℃より高く約８５℃まで、若しくは約７０℃〜約７５℃、若しくは９０℃より高く約９５℃の範囲の温度に暴露された後、又は約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約９５℃、９６℃、９７℃、９８℃若しくは９９℃の範囲の温度で暴露された後、セルラーゼ活性を保持する、請求項２９記載の単離又は組換え核酸。
【請求項３１】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定する核酸プローブであっって、請求項１記載の配列の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００若しくは１５０個又はそれ以上の連続する塩基を含み、結合又はハイブリダイゼーションによってセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定し、
場合により、少なくとも約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０、約６０〜１００又は約５０〜１５０個の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含み、
場合により、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５に記載の配列の連続する塩基を含む、
前記核酸プローブ。
【請求項３２】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する増幅プライマー対であって、
（ａ）請求項１記載の配列又はその部分配列を含む核酸を増幅することができるか、又は
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５の最初（5'）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第１メンバーと、第１メンバーの相補鎖の最初（5'）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第２メンバーとを含み、
場合により、前記増幅プライマー対のメンバーが前記配列の少なくとも約１０〜５０個の連続する塩基又は前記配列の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、
前記増幅プライマー対。
【請求項３３】
請求項３２記載の増幅プライマー対を使用したポリヌクレオチドの増幅により生成されるセルラーゼコード核酸であって、場合により、増幅がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による増幅である、前記核酸。
【請求項３４】
遺伝子ライブラリーの増幅により生成される核酸であって、場合により、遺伝子ライブラリーが環境ライブラリーである、請求項３３記載のセルラーゼコード核酸。
【請求項３５】
請求項３３記載のセルラーゼコード核酸によってコードされる単離又は組換えセルラーゼ。
【請求項３６】
請求項３２記載の増幅プライマー対による鋳型核酸の増幅を含む、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法。
【請求項３７】
請求項１記載の配列を含む核酸を含む発現カセット。
【請求項３８】
請求項１記載の配列を含む核酸を含むベクターであって、場合により、ビヒクルが発現ベクターを含む、前記ベクター。
【請求項３９】
請求項１記載の配列を含む核酸を含むクローニングビヒクルであって、
場合により、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体を含み、
場合により、前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含み、
場合により、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１−由来ベクター（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）又は哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）を含む、
前記クローニングビヒクル。
【請求項４０】
請求項１記載の配列を含む核酸、又は請求項３７記載の発現カセット、又は請求項３８記載のベクター又は請求項３９記載のクローニングビヒクルを含む形質転換細胞であって、
場合により、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞である、
前記形質転換細胞。
【請求項４１】
請求項１記載の配列を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、場合によりマウス又はラットである、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４２】
請求項１記載の配列を含むトランスジェニック植物であって
場合により、トウモロコシ、ソルガム、ジャガイモ、トマト、コムギ、アブラナ、ナタネ、ダイズ、イネ、オオムギ、牧草又はタバコである、前記トランスジェニック植物。
【請求項４３】
請求項１記載の配列を含むトランスジェニック種子であって、場合により、トウモロコシ、コムギ、アブラナ、ナタネ、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、イネ、オオムギ、落花生又はタバコの種子である、前記トランスジェニック種子。
【請求項４４】
請求項１記載の配列と相補的であるか又はそれらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列若しくはその部分配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
場合により、約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０、又は約６０〜１００個の塩基の長さを有する、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項１に記載の配列と相補的であるか又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか又は細胞で発現させることを含む、細胞内のセルラーゼメッセージの翻訳を阻害する方法。
【請求項４６】
請求項１記載の配列の部分配列を含む二本鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子であって、
場合により、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含み、
場合により、長さが約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又はそれ以上の二重鎖ヌクレオチドである、
前記二本鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子。
【請求項４７】
請求項４６記載の二本鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を細胞に投与するか又は細胞で発現させることを含む、細胞におけるセルラーゼの発現を阻害する方法。
【請求項４８】
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６と、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または組換えポリペプチドであって、
場合により、前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって又は目視検査によって決定され、場合により、前記配列比較アルゴリズムが、フィルタリング設定がblastall -p blastp -d "nr pataa" -F Fに設定され、他の全てのオプションが初期設定値に設定されたＢＬＡＳＴバージョン２．２．２アルゴリズムである、
前記単離または組換えポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を有し、セルラーゼ活性を有するか、または、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６に記載の配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成することができる免疫原活性を有する、単離または組換えポリペプチド；または、
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）に示したアミノ酸配列又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有し、少なくとも１つのアミノ酸残基の保存的置換を含む単離または組換えポリペプチドであって、
場合により、前記保存的置換が脂肪族アミノ酸を別のアミノ酸に代えること、セリンをトレオニンに代えること、若しくはその逆、酸性残基を別の酸性残基と代えること、アミド基を有する残基をアミド基を有する別の残基と代えること、塩基性残基を別の塩基性残基と交換すること、又は芳香族残基を別の芳香族残基と代えること、又はこれらの組合せを含み、
場合により、前記脂肪族残基がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはこれらの合成同等物を含み、前記酸性残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸若しくはこれらの合成同等物を含み、前記アミド基を含む残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸若しくはこれらの合成同等物を含み、前記塩基性残基が、リシン、アルギニン若しくはこれらの合成同等物を含み、又は前記芳香族残基が、フェニルアラニン、チロシン若しくはこれらの合成同等物を含む、
前記単離又は組換えポリペプチド。
【請求項４９】
セルラーゼ活性がエンドグルカナーゼ活性を含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５０】
セルラーゼ活性がセロビオヒドロラーゼ活性を含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５１】
セルラーゼ活性が、β−グルコシダーゼ又はマンナナーゼ活性を含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５２】
セルラーゼ活性がエンドセルラーゼ活性活性を含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５３】
セルラーゼ活性が、グルカンを加水分解して、より小さい分子量の多糖又はオリゴマーを生成することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５４】
セルラーゼ活性が、１，４−β−Ｄ−グリコシド結合の加水分解を触媒することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５５】
エンドセルラーゼ活性がエンド−１，４−β−エンドセルラーゼ活性を含む、請求項５４記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５６】
１，４−β−Ｄ−グリコシド結合活性が、セルロース、セルロース誘導体、リケニン又は穀類における１，４−β−Ｄ−グリコシド結合の加水分解を含む、請求項５４記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５７】
セルロース誘導体が、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースを含む、請求項５６記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５８】
穀類が、β−Ｄ−グルカン又はキシログルカンを含む、請求項５６記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項５９】
セルラーゼ活性が、グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６０】
セルラーゼ活性が、β−１，４−及び／又はβ−１，３−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項５９記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６１】
セルラーゼ活性が、エンド−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項５９記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６２】
セルラーゼ活性が、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ活性の加水分解を触媒することを含む、請求項６１記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６３】
セルラーゼ活性が、内部エンド−β−１，４−グルカナーゼ結合及び／又はβ−１，３−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒することを含む、請求項６１記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６４】
セルラーゼ活性が、内部β−１，３−グリコシド結合の加水分解を触媒することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６５】
セルラーゼ活性が、グルコピラノースを含む多糖を加水分解することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６６】
セルラーゼ活性が、１，４−β−グリコシド結合Ｄ−グルコピラノースを含む多糖を加水分解することを含む、請求項６５記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６７】
セルロース活性が、セルロース、セルロース誘導体又はヘミセルロースを加水分解することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６８】
セルラーゼ活性が、木材若しくは紙パルプ、又は木材若しくは紙製品において、セルロース又はヘミセルロースを加水分解することを含む、請求項６７記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項６９】
セルラーゼ活性が、飼料、食品又は飲料においてグルカンの加水分解を触媒することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７０】
飼料、食品又は飲料が、穀類系動物飼料、麦芽汁若しくはビール、生地、果実又は野菜を含む、請求項６９記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７１】
セルラーゼ活性が、微生物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、又はセルロース部分を含むあらゆる植物材料のグルカンの加水分解を触媒することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７２】
セルラーゼ活性が熱安定性である、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７３】
ポリペプチドが、約３７℃〜約９５℃、若しくは約５５℃〜約８５℃、若しくは約７０℃〜約７５℃、若しくは約７０℃〜約９５℃、若しくは約９０℃〜約９５℃の温度範囲を含む条件下でセルラーゼ活性を保持するか、又は約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃又は約３７℃〜約９５℃、９６℃、９７℃、９８℃若しくは９９℃の範囲の温度でセルラーゼ活性を保持する、請求項７２記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７４】
セルラーゼ活性が耐熱性である、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７５】
ポリペプチドが、３７℃より高く約９５℃まえ、５５℃より高く約８５℃まで、若しくは約７０℃〜約７５℃、若しくは９０℃より高く約９５℃までの範囲の温度に暴露された後、又は約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、若しくは約３７℃〜約９５℃、９６℃、９７℃、９８℃若しくは９９℃の範囲の温度で暴露された後、セルラーゼ活性を保持する、請求項７４記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７６】
請求項４８記載のポリペプチドを含み、シグナル若しくはリーダー配列、又はプレプロ配列を欠いている、単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７７】
請求項４８記載のポリペプチドを含み、異種シグナル若しくはリーダー配列、又は異種プレプロ配列を有する、単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７８】
セルラーゼ活性が、約３７℃において、タンパク質１mgあたり約１００〜約１０００単位、タンパク質１mgあたり約５００〜約７５０単位、タンパク質１mgあたり約５００〜約１２００単位、又はタンパク質１mgあたり約７５０〜約１０００単位の範囲で比活性を含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項７９】
耐熱性が、高温まで加熱した後セルラーゼの３７℃における比活性の少なくとも半分を保持することを含むか、又は、高温まで加熱した後、タンパク質１mgあたり約５００〜約１２００単位の範囲で３７℃における比活性を保持することを含む、請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項８０】
少なくとも１つのグルコシル化部位を含み、
場合により、前記グリコシル化がＮ−結合グリコシル化であり、
場合により、P. pastoris又はS. pombeで発現した後グリコシル化される、
請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチド。
【請求項８１】
約ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、５．０、ｐＨ４．５若しくは４．０又はより酸性を含む条件下でセルラーゼ活性を保持するか、或いは約ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、５．０、ｐＨ４．５若しくは４．０又はより酸性を含む条件に暴露された後でセルラーゼ活性を保持する、請求項４８記載の単離又は組換えペプチド。
【請求項８２】
約ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０若しくはｐＨ１０．５又はより塩基性を含む条件下でセルラーゼ活性を保持するか、或いはｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０若しくはｐＨ１０．５又はより塩基性を含む条件に暴露された後でセルラーゼ活性を保持する、請求項４８記載の単離又は組換えペプチド。
【請求項８３】
液体、固体又はゲルを含む、請求項４８記載のポリペプチドを含むタンパク質調製物。
【請求項８４】
請求項４８記載のポリペプチド及び第２のドメインを含むヘテロ二量体であって、
場合により、前記第２のドメインがポリペプチドであり、前記ヘテロ二量体が融合タンパク質であり、場合により、前記第２のドメインが、エピトープ、免疫原性ペプチド又はタグを含む、
前記ヘテロ二量体。
【請求項８５】
請求項４８記載のポリペプチドを含むホモ二量体。
【請求項８６】
請求項４８記載の配列若しくはその部分配列を含む固定化ポリペプチド、または、請求項１記載の配列若しくはその部分配列、又は請求項３１記載のプローブを含む固定化核酸であって、
場合により、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ又はキャピラリー管に固定化されている、
前記固定化ポリペプチド又は前記固定化核酸。
【請求項８７】
請求項８６記載の固定化ポリペプチド又は請求項８６記載の固定化核酸を含むアレイ。
【請求項８８】
請求項４８に記載のポリペプチドに特異的に結合している単離又は組換え抗体であって、
場合により、モノクローナル又はポリクローナル抗体である、
前記単離又は組換え抗体。
【請求項８９】
請求項４８記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマ。
【請求項９０】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドを単離又は同定する方法であって、
（ａ）請求項８８記載の抗体を提供する工程；
（ｂ）ポリペプチドを含む試料を提供する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）の試料と工程（ａ）の抗体を、抗体がポリペプチドに特異的に結合できる条件下で接触させ、それによってセルラーゼ活性を有するポリペプチドを単離又は同定する工程、
を含む前記方法。
【請求項９１】
抗セルラーゼ抗体を作製する方法であって、
（ａ）請求項１記載の核酸又はその部分配列を、液性免疫反応を生成するのに十分な量で非ヒト動物投与し、それによって抗セルラーゼ抗体を作製すること、又は
（ｂ）請求項４８記載のポリペプチド又はその部分配列を、液性免疫反応を生成するのに十分な量で非ヒト動物投与し、それによって抗セルラーゼ抗体を作製すること
を含む方法。
【請求項９２】
組換えポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）プロモーターに機能的に結合した、請求項１記載の配列を含む核酸を提供する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の核酸を、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを産生する工程を含み、
場合により、宿主細胞を工程（ａ）の核酸を用いて形質転換し、続いて工程（ａ）の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞に組換えポリペプチドを産生させることを更に含む、
前記方法。
【請求項９３】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）請求項４８記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）セルラーゼ基質を提供する工程；及び
（ｃ）ポリペプチドを工程（ｂ）の基質と接触させ、前記基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出する工程を含み、前記基質の量の減少又は前記反応生成物の量の増加によりセルラーゼ活性を有するポリペプチドを検出する、
前記方法。
【請求項９４】
セルラーゼ基質を同定する方法であって、
（ａ）請求項４８記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）試験基質を提供する工程；及び
（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験基質と接触させ、前記基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出する工程を含み、前記基質の量が減少又は前記反応生成物の量が増加すれば前記試験基質をセルラーゼ基質として同定する、
前記方法。
【請求項９５】
試験化合物がポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する方法であって、
（ａ）請求項１記載の配列を有する核酸又はその核酸を含むベクターを、核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させる工程；
（ｂ）試験化合物を提供する工程；
（ｃ）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；及び
（ｄ）工程（ｂ）の試験化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する工程、
を含む前記方法。
【請求項９６】
試験化合物がポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する方法であって、
（ａ）請求項４８記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）試験化合物を提供する工程；
（ｃ）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；及び
（ｄ）工程（ｂ）の試験化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する工程、
を含む前記方法。
【請求項９７】
セルラーゼ活性の調節因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項４８記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）試験化合物を提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験化合物と接触させ、グルカナーゼの活性を測定する工程を含み、前記試験化合物の不在下における活性と比較して前記試験化合物の存在下で測定されるセルラーゼ活性が変化すれば、前記試験化合物がセルラーゼ活性を調節すると決定する、
前記方法。
【請求項９８】
セルラーゼ活性が、セルラーゼ基質を提供すること、及び、基質の量の減少若しくは反応生成物の量の増加を検出すること、又は、基質の量の増加若しくは反応生成物の量の減少を検出することにより測定され、
場合により、試験化合物を用いない場合の基質又は反応生成物の量と比較して前記試験化合物を用いた場合の基質の量が減少又は反応生成物の量が増加すれば、前記試験化合物をセルラーゼ活性のアクチベーターとして同定し、
場合により、試験化合物を用いない場合の基質又は反応生成物の量と比較して前記試験化合物を用いた場合に基質量が増加又は反応生成物量が減少すれば、前記試験合物をセルラーゼ活性のインヒビターとして同定する、
請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
プロセッサー及びデータ記憶装置を含むコンピュータシステムであって、前記データ記憶装置がポリペプチド配列又は核酸配列を記憶し、前記ポリペプチド配列が請求項４８記載の配列を含むか請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、
場合により、配列比較アルゴリズムと、少なくとも１つの基準配列を記憶するデータ記憶装置とを更に含む、又は前記配列の１つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを更に含み、
場合により、前記配列比較アルゴリズムが多型性を表示するコンピュータプログラムを含む、
前記コンピュータシステム。
【請求項１００】
ポリペプチド配列又は核酸配列が記憶されているコンピュータ読み出し可能媒体であって、前記ポリペプチド配列が請求項４８記載のポリペプチドを含むか又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記コンピュータ読み出し可能媒体。
【請求項１０１】
配列の特徴を同定する方法であって、
（ａ）配列の１つ以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを使用して配列を読み取る工程であって、前記配列がポリペプチド配列又は核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が請求項４８記載のポリペプチドまたは請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む配列である、前記工程；及び（ｂ）コンピュータプログラムにより配列の１つ以上の特徴を同定する工程、
を含む前記方法。
【請求項１０２】
第１の配列を第２の配列と比較する方法であって、
（ａ）配列を比較するコンピュータプログラムを使用して第１の配列及び第２の配列を読み取る工程であって、第１の配列がポリペプチド配列又は核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、含む工程、及び（ｂ）第１の配列と第２の配列との差異をコンピュータプログラムにより決定する工程を含み、
場合により、第１の配列と第２の配列との差異を決定する工程を更に含むか、又は場合により、多型性を同定する工程を更に含むか、又は場合により、配列の１つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを使用することを更に含み、
場合により、コンピュータプログラムを使用して第１の配列を読み取り、前記配列の１つ以上の特徴を同定することを含む、
前記方法。
【請求項１０３】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する方法であって、 
（ａ）請求項３２記載の増幅プライマー対を提供する工程；
（ｂ）環境試料から核酸を単離するか、又は試料内の核酸がハイブリダイゼーションのために増幅プライマー対に接近できるように環境試料を処理する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）の核酸を工程（ａ）の増幅プライマー対と一緒にし、環境試料の核酸を増幅し、それによって環境試料からセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離又は回収する工程、
を含む前記方法。
【請求項１０４】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する方法であって、
（ａ）請求項１記載の配列若しくはその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブ、又は請求項３１記載のプローブを提供する工程；
（ｂ）環境試料から核酸を単離するか、又は試料内の核酸がハイブリダイゼーションのために工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブに接近できるように環境試料を処理する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の単離された核酸又は処理された環境試料を工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；及び
（ｄ）工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによって環境試料からセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離又は回収する工程、
を含む前記方法。
【請求項１０５】
環境試料が、水試料、液体試料、土壌試料、空気試料又は生物学的試料を含み、
場合により、前記生物学的試料が細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞に由来する、
請求項１０３又は請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
セルラーゼ活性有するポリペプチドをコードする核酸の変異体を生成する方法であって、
（ａ）請求項１記載の配列を含む鋳型核酸を提供する工程；及び
（ｂ）鋳型配列の１つ以上のヌクレオチドを改変、欠失、若しくは付加するか、又はこれらの組合せにより、前記鋳型核酸の変種を生成する工程を含み、
場合により、前記核酸の変種を発現して、セルラーゼポリペプチド変種を生成することを更に含み、
場合により、改変、付加又は欠失が、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成びそれらの組合せを含む方法によって導入され、
場合により、前記鋳型核酸によってコードされるポリペプチドから変化した若しくは異なる活性、又は、変化した若しくは異なる安定性を有するセルラーゼが生成されるまで繰り返し反復される、
前記方法。
【請求項１０７】
変種セルラーゼポリペプチドが、（ａ）耐熱性であり、高温に暴露された後、いくらかの活性を保持するか、（ｂ）鋳型核酸でコードされたセルロースと比較して増加したグルコシル化を有するか、又は（ｃ）高温でセルラーゼ活性を有し、鋳型核酸でコードされたセルロースが、高温下で活性ではない、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
（ａ）鋳型核酸のコドン使用頻度から変化したコドン使用頻度を有する配列をコードするセルラーゼが産生されるまで、又は（ｂ）鋳型核酸よりも高い若しくは低いレベルのメッセージ発現又は安定性を有するセルラーゼ遺伝子が作製されるまで、繰り返し反復される、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０９】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を増加させる方法であって
（ａ）セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１記載の配列を含む核酸を提供する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の核酸の非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置換し、それによって前記核酸を改変して宿主細胞における発現を増加させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先コドン又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、
前記方法。
【請求項１１０】
セルラーゼポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変する方法であって、
（ａ）セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１記載の配列を含む核酸を提供する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の核酸のコドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換し、それによってセルラーゼをコードする核酸のコドンを改変する工程、
を含む方法。
【請求項１１１】
セルラーゼポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を増加する方法であって、
（ａ）セルラーゼポリペプチドをコードする、請求項１記載の配列を含む核酸を提供する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の核酸の非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を増加させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先コドン又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、
前記方法。
【請求項１１２】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を減少させる方法であって、
（ａ）セルラーゼポリペプチドをコードする、請求項１記載の配列を含む核酸を提供する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の核酸の少なくとも１つの好ましいコドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドン又は低優先コドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を減少させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンであり、
場合により、前記宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞である、
前記方法。
【請求項１１３】
複数の改変セルラーゼ活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを産生する方法であって、前記改変活性部位又は基質結合部位が第１の活性部位又は第１の基質結合部位をコードする配列を含む第１の核酸に由来し、
（ａ）第１の活性部位又は第１の基質結合部位をコードする第１の核酸を提供する工程であって、前記第１の核酸の配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５に記載される配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はその部分配列を含み、前記第1の核酸がセルラーゼ活性部位又は基質結合部位をコードする核酸である、前記工程；
（ｂ）前記第１の核酸内の複数の標的コドンにおいて天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異導入オリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；および、
（ｃ）前記変異導入オリゴヌクレオチドのセットを使用して、変異が導入されるそれぞれのアミノ酸コドンにおいて一連のアミノ酸の変種をコードする、活性部位コード又は基質結合部位コード核酸変種のセットを生成し、それによって複数の改変されたセルラーゼ活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する工程、
を含み、
場合により、前記変異導入オリゴヌクレオチド又は核酸変種が、最適化定方向進化系、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）又は合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成及びそれらの組合せを含む方法によって生成される、
前記方法。
【請求項１１４】
小分子を作製する方法であって、
（ａ）小分子を合成又は改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程であって、前記酵素のうち１つが請求項１記載の配列を含む核酸によってコードされるセルラーゼ酵素を含む、前記工程；
（ｂ）工程（ａ）の酵素の少なくとも１つに対する基質を提供する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）の基質を、複数の生体触媒反応を促進する条件下で前記酵素と反応させて、一連の生体触媒反応により小分子を生成する工程、
を含む前記方法。
【請求項１１５】
小分子を改変する方法であって、
（ａ）セルラーゼ酵素を提供する工程であって、前記酵素が請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；
（ｂ）小分子を提供する工程；及び
（ｃ）工程（ａ）の酵素を、グルコシダーゼ酵素によって触媒される酵素反応が促進される条件下で、工程（ｂ）の小分子と反応させ、それによってセルラーゼ酵素反応により小分子を改変する工程を含み、
場合により、工程（ｂ）が工程（ａ）の酵素に対する複数の小分子基質を提供し、それによって前記セルラーゼ酵素により触媒される少なくとも１つの酵素反応によって産生される改変小分子のライブラリーを生成することを含み、
場合により、複数の酵素反応により産生される改変小分子のライブラリーを形成するために、酵素による複数の生体触媒反応を促進する条件下で複数の追加の酵素を提供することを更に含み、
場合により、所望の活性を示す特定の改変小分子がライブラリーに存在するかを決定するためにライブラリーを試験する工程を更に含み、
場合により、前記ライブラリーを試験する工程が所望の活性を有する特定の改変小分子の存在又は不在について改変小型分の一部を試験し、所望の活性を有する特定の改変小分子を産生する少なくとも１つの特定の生体触媒反応を同定することによって、ライブラリー内の複数の改変小分子の一部を産生するのに使用される生体触媒反応の一つを除いて全部を系統的に排除する工程を更に含む、
前記方法。
【請求項１１６】
セルラーゼ酵素の機能性フラグメントを決定する方法であって、
（ａ）セルラーゼ酵素を提供する工程であって、前記セルラーゼ酵素が請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、セルラーゼ活性について残りの部分配列を試験し、それによってセルラーゼ酵素の機能的フラグメントを決定する工程を含み、
場合により、セルラーゼ活性がセルラーゼ基質を提供すること、および、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出することにより測定される、
前記方法。
【請求項１１７】
リアルタイム代謝フラックス分析を使用する新たな又は改変された表現型の全細胞操作の方法であって、
（ａ）細胞の遺伝的構成を改変することにより改変細胞を作製する工程であって、前記遺伝的構成が請求項１記載の配列を含む核酸を細胞に添加することにより改変される、前記工程；
（ｂ）前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の細胞培養物をリアルタイムでモニタリングすることにより前記細胞の少なくとも１つの代謝パラメーターを測定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）のデータを分析して、測定パラメーターが類似の条件下で未改変細胞における対応する測定値と異なるか否かを決定し、それによって細胞の操作された表現型をリアルタイム代謝フラックス分析を使用して同定する工程を含み、
場合により、前記細胞の遺伝的構成が、細胞内の配列の欠失若しくは配列の改変、又は遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変され、
場合により、新たに操作された表現型を含む細胞を選択することを更に含み、
場合により、選択された細胞を培養し、それによって新たに操作された表現型を含む新たな細胞株を生成することを更に含む、
前記方法。
【請求項１１８】
以下のアミノ酸配列からなる、単離または組換えシグナル若しくはリーダー配列：
（ａ）請求項４８記載のアミノ酸配列のアミノ末端残基１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜４３又は１〜４４に記載されているアミノ酸配列、又は、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６に記載のアミノ酸配のアミノ末端残基１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜４３又は１〜４４に記載されているアミノ酸配列。
【請求項１１９】
請求項１１８記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド（ＳＰ）又はリーダー配列を含む少なくとも１つの第１のドメインと、異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも１つの第２のドメインとを含むキメラポリペプチドであって、前記異種ポリペプチド又はペプチドは前記シグナルペプチド（ＳＰ）又はリーダー配列と天然には結合しておらず、
場合により、前記異種ポリペプチド又はペプチドはセルラーゼではなく、場合により、前記異種ポリペプチド又はペプチドが前記シグナルペプチド（ＳＰ）又はリーダー配列のアミノ末端、カルボキシ末端又は両端にある、
前記キメラポリペプチド。
【請求項１２０】
キメラポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸であって、前記キメラポリペプチドが、請求項１１８記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド（ＳＰ）又はリーダー配列を含む少なくとも１つの第１のドメインと、異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも１つの第２のドメインとを含み、前記異種ポリペプチド又はペプチドは前記シグナルペプチド（ＳＰ）又はリーダー配列と天然には結合していない、前記単離又は組換え核酸。
【請求項１２１】
請求項１記載の配列を含む、セルラーゼ活性及びシグナル配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離又は組換え核酸。
【請求項１２２】
シグナル配列が、別のセルラーゼ又は非セルラーゼ酵素由来である、請求項１２１記載の単離又は組換え核酸。
【請求項１２３】
シグナル配列を含まず、請求項１記載の配列を含み、セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む、単離又は組換え核酸。
【請求項１２４】
セルラーゼをグリコシル化することを含む、セルラーゼポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を増加させる方法であって、前記ポリペプチドは、請求項４８記載のポリペプチドの少なくとも３０個の隣接するアミノ酸を含む、又は、請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、それによってセルラーゼの耐熱性又は熱安定性を増加させる、前記方法。
【請求項１２５】
請求項１記載の核酸配列を含むベクターを発現することを含む、細胞で組換えセルラーゼを過剰発現させる方法であって、前記過剰発現が高活性プロモーター、２シストロンベクターの使用により、又はベクターの遺伝子増幅により行われる、前記方法。
【請求項１２６】
トラスジェニック植物を作製する方法であって、
（ａ）請求項１記載の配列を含む異種核酸配列を細胞に導入し、それによって形質転換植物細胞を産生する工程；
（ｂ）前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を産生する工程を含み、
場合により、工程（ａ）が植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより異種核酸配列を導入することを更に含み、
場合により、工程（ａ）がＤＮＡ粒子衝撃により、又はアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien)宿主を使用することにより前記異種核酸配列を植物組織に直接導入することを含む、
前記方法。
【請求項１２７】
植物細胞において異種核酸配列を発現させる方法であって、
（ａ）プロモーターに機能的に結合した、請求項１記載の配列を含む異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程；
（ｂ）前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現する条件下で植物を生長させる工程
を含む、前記方法。
【請求項１２８】
グルカンを含む又はセルロースを含む組成物を加水分解する、分解する、又は破壊する方法であって、
（ａ）請求項４８記載のセルラーゼ活性を有するポリペプチド、又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）セルロース又はグルカンを含む組成物を提供する工程；及び
（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを、セルラーゼがグルカンを含む又はセルロースを含む組成物を加水分解する、分解する、又は破壊する条件下で、工程（ｂ）の組成物と接触させる工程を含み、
場合により、前記組成物が植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は動物細胞を含み、
場合により、前記ポリペプチドがエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、
前記方法。
【請求項１２９】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、生地又はパン製品であって、場合により、前記ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、前記生地又はパン製品。
【請求項１３０】
生地又はパン製品を、生地をコンディショニングするのに十分な条件下で、請求項４８記載の少なくとも１つのポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドと接触させることを含む、生地のコンディショニング方法。
【請求項１３１】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む飲料であって、場合により、前記ポリペプチドがエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記飲料。
【請求項１３２】
請求項４８記載の少なくとも１つのポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを、飲料の粘度を減少するのに十分な条件下で飲料又は飲料前駆体に投与することを含む飲料製造方法であって、
場合により前記飲料又は飲料前駆体が麦芽汁又はビールである、
前記方法。
【請求項１３３】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、食物、飼料又は栄養補助食品であって、場合により、前記ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、前記食物、飼料又は栄養補助食品。
【請求項１３４】
動物用食餌に栄養補助食品としてセルラーゼを利用する方法であって、
請求項４８記載のポリペプチドの少なくとも３０個の隣接するアミノ酸又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含むセルラーゼ酵素を含有する栄養補助食品を調製すること；及び
前記栄養補助食品を動物に投与して、動物により摂取される飼料又は食物に含有されたキシランの利用性を増やすこと、を含み、
場合により、前記動物がヒトであるか、又は前記動物が反芻若しくは単胃動物であり、
場合により、前記セルラーゼ酵素が細菌、酵母、植物、昆虫、真菌及び動物からなる群より選択される生物におけるセルラーゼをコードするポリヌクレオチドの発現により調製され、場合により、前記生物がS.ポンベ（S. pombe）, S.セレビシアエ(S. cerevisiae), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), 大腸菌（E. coli）, ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）,バチルス種（ Bacillus sp.）及びラクトバチルス種（Lactobacillus sp）からなる群より選択される、
前記方法。
【請求項１３５】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、食用酵母送達マトリックス又はペレットであって、場合により、ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、前記食用酵母送達マトリックス又はペレット。
【請求項１３６】
顆粒食用担体及び熱安定性組換えセルラーゼ酵素を含む食用酵素送達マトリックス又はペレットを調製すること、及び、前記食用酵素送達マトリックス又はペレットを動物に投与すること、を含む、セルラーゼ補助食品を動物に送達する方法であって、前記ペレットは、含有されているセルラーゼ酵素を水性媒体に容易に分散し、前記組換えセルラーゼ酵素は、請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、
場合により、前記顆粒食用担体は穀物胚、油抜きした穀物胚、干し草、アルファルファ、オオアワガエリ、ダイズ殻、ヒマワリ種子粗粉及びコムギふすまをから選ばれる担体を含み、
場合により、前記食用担体は油抜きした穀物胚を含み、
場合により、前記セルラーゼ酵素はグリコシル化されてペレット化条件下で熱安定性を提供し、
場合により、前記送達マトリックスは穀物胚及びセルラーゼを含む混合物をペレット化して形成され、
場合により、前記ペレット化の条件は蒸気の適用を含み、場合により、前記ペレット化の条件は約８０℃を越える温度を約５分間適用することを含み、前記酵素が酵素の１mgあたり少なくとも３５０〜約９００単位の比活性を保持する、
前記方法。
【請求項１３７】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含むセルロース組成物又はセルロース誘導体組成物であって、場合により、前記ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、
前記セルロース組成物又はセルロース誘導体組成物。
【請求項１３８】
請求項４８記載のセルラーゼ又は請求項１記載の核酸によってコードされるセルラーゼを含む、木材、木材パルプ又は木材製品であって、場合により、前記セルラーゼの活性がエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む、前記木材、木材パルプ又は木材製品。
【請求項１３９】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、紙、紙パルプ、又は紙製品であって、場合により、前記ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、前記紙、紙パルプ、又は紙製品。
【請求項１４０】
紙、木材又は木材製品を、請求項４８記載のセルラーゼ又は請求項１記載の核酸によってコードされるセルラーゼと接触させることを含む、紙、木材又は木材製品においてセルロースの量を低減する方法であって、場合により、前記セルラーゼの活性がエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む、前記方法。
【請求項１４１】
請求項４８記載のセルラーゼ又は請求項１記載の核酸によってコードされるセルラーゼを含む洗剤組成物であって、場合により、前記ポリペプチドが非水性液体組成物、注型成形固体、顆粒形態、粒状形態、圧縮錠剤、ゲル形態、ペースト又はスラリー形態として配合され、
場合により、前記セルラーゼの活性がエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む、
前記洗剤組成物。
【請求項１４２】
請求項４８記載のセルラーゼ又は請求項１記載の核酸によってコードされるセルラーゼを含む医薬組成物又は栄養補助食品であって、
場合により、前記セルラーゼが錠剤、ゲル剤、丸剤、移植錠、液剤、噴霧剤、粉末剤、食物、飼料ペレットとして又はカプセル剤として処方され、
場合により、前記セルラーゼ活性がエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む、
前記医薬組成物又は栄養補助食品。
【請求項１４３】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む燃料であって、
場合により、前記ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有し、
場合により、ジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、コムギ、ビート又はサトウキビを含む植物材料由来であり、
場合により、バイオエタノール又はガソリン−エタノール混合を含む、
前記燃料。
【請求項１４４】
セルロース又は発酵性糖を含む組成物を、請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドと接触させることを含む、燃料を作製する方法であって、
場合により、前記セルロース又は発酵性糖を含む組成物が、植物、植物生成物又は植物由来物を含み、場合により、前記植物又は植物生成物はサトウキビ若しくはサトウキビ生成物、ビート若しくはサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、イネ又はオオムギを含み、
場合により、前記ポリペプチドはセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有し、
場合により、前記燃料がバイオエタノール又はガソリン−エタノール混合物を含む、
前記方法。
【請求項１４５】
セルロース又は発酵性糖を含む組成物を、請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドと接触させることを含む、バイオエタノールを作製する方法であって、
場合により、前記セルロース又は発酵性糖を含む組成物は植物、植物生成物又は植物由来物を含み、場合により、植物又は植物生成物がサトウキビ若しくはサトウキビ生成物、ビート若しくはサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、イネ又はオオムギを含み、
場合により、前記ポリペプチドが、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する、
前記方法。
【請求項１４６】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、セルロース及びヘミセルロースポリマーを代謝可能な炭素部分に脱重合する酵素集合物であって、場合により、前記ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する、
前記酵素集合物。
【請求項１４７】
セルロース又は発酵性糖を含む組成物を、請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドと接触させることを含む、バイオマス材料を加工する方法であって、
場合により、リグノセルロースを含む前記バイオマス材料が、農作物由来であるか、食物若しくは飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース廃棄物であるか、又は植物残渣若しくは、古紙、古紙生成物であり、
場合により、前記ポリペプチドはセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有し、
場合により、前記植物残渣は茎、葉、殻、皮、穂軸、木材、木材チップ、木材パルプ及びおがくずを含み、
場合により、前記古紙が、破棄又は使用済みコピー用紙、コンピュータのプリンタ用紙、ノート用紙、メモパッド用紙、タイプライター用紙、新聞紙、雑誌、厚紙及び紙系包装材料を含み、
場合により、前記バイオマス材料の加工がバイオエタノールを生成する、
前記方法。
【請求項１４８】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む酪農製品であって、場合により、前記酪農製品は牛乳、アイスクリーム、チーズ又はヨーグルトを含み、場合により、前記ポリペプチドはセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する、前記酪農製品。
【請求項１４９】
酪農製品の触感及び風味を改善する方法であって、（ａ）請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（ｂ）酪農製品を提供する工程；及び（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを、セルロースが酪農製品の触感及び風味を改善できる条件下で工程（ｂ）の酪農製品と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１５０】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む織物又は布地であって、場合により、織物又は布地はセルロース含有繊維を含み、場合により、前記ポリペプチドはセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する、前記織物又は布地。
【請求項１５１】
固体又は液体の動物の排泄物を処理する方法であって、
（ａ）場合により、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する、請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）固体又は液体の動物の排泄物を提供する工程；及び
（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを、プロテアーゼが排泄物を処理できる条件下で工程（ｂ）の固体又は液体の排泄物と接触させる工程
を含む、前記方法。
【請求項１５２】
請求項４８記載のポリペプチド又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む処理済み廃棄物であって、場合により、前記ポリペプチドがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する、前記処理済み廃棄物。
【請求項１５３】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む消毒剤であって、前記ポリペプチドが、請求項４８記載の配列を含むか又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、場合により、前記ポリペプチドがエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する、前記消毒剤。
【請求項１５４】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む対生物防御剤又はバイオ解毒剤であって、前記ポリペプチドは請求項４８記載の配列又は請求項１記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、場合により、前記ポリペプチドはエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有する、前記対生物防御剤又はバイオ解毒剤。
【請求項１５５】
配列番号１６３の少なくとも１つのヌクレオチド塩基残基改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸であって、前記改変が以下の１以上を含む、前記単離又は組換え核酸：
位置２６５〜２６７のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧとなる改変；
位置３０７〜３０９のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧとなる改変；
位置３２８〜３３０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧとなる改変；
位置３４０〜３４２のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧとなる改変；
位置４６９〜４７１のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣとなる改変；
位置１４４１〜１４４３のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＴＴ若しくはＴＴＣとなる改変；
位置１６４８〜１６５０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＡＡＴ若しくはＡＡＣとなる改変；又は
位置１７６８〜１７７０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧとなる改変。
【請求項１５６】
配列番号１６４の少なくとも１つのアミノ酸残基改変を含む配列を有する単離又は組換えポリペプチドであって、前記改変が以下の1以上の改変を含む、前記単離又は組換えポリペプチド：
アミノ酸位置８９のメチオニンがアルギニンになる改変；
アミノ酸位置１０３のフェニルアラニンがグリシンになる改変；
アミノ酸位置１１０のプロリンがグリシンになる改変；
アミノ酸位置１１４のチロシンがロイシンになる改変；
アミノ酸位置１５７のアラニンがセリンになる改変；
アミノ酸位置４８１のトリプトファンがフェニルアラニンになる改変；
アミノ酸位置５５０のプロリンがアスパラギンなる改変；又は
アミノ酸位置５９０のグリシンがアルギニンになる改変。
【請求項１５７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５のヌクレオチド残基配列改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸であって、前記改変が以下の1以上の改変を含む、前記単離又は組換え核酸：
配列番号１６３の位置２６５〜２６７のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧになる改変；
配列番号１６３の位置３０７〜３０９のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧになる改変；
配列番号１６３の位置３２８〜３３０のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧになる改変；
配列番号１６３の位置３４０〜３４２のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧになる改変；
配列番号１６３の位置４６９〜４７１のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣになる改変；
配列番号１６３の位置１４４１〜１４４３のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＴＴＴ若しくはＴＴＣになる改変；
配列番号１６３の位置１６４８〜１６５０のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＡＡＴ若しくはＡＡＣになる改変；又は
配列番号１６３の位置１７６８〜１７７０のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧになる改変。
【請求項１５８】
請求項１記載の核酸のヌクレオチド塩基残基改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸であって、前記改変が、以下の１以上の改変を含む、前記単離又は組換え核酸：
配列番号１６３の位置２６５〜２６７のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧになる改変；
配列番号１６３の位置３０７〜３０９のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧになる改変；
配列番号１６３の位置３２８〜３３０のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧになる改変；
配列番号１６３の位置３４０〜３４２のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧになる改変；
配列番号１６３の位置４６９〜４７１のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣになる改変；
配列番号１６３の位置１４４１〜１４４３のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＴＴＴ若しくはＴＴＣになる改変；
配列番号１６３の位置１６４８〜１６５０のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＡＡＴ若しくはＡＡＣになる改変；又は
配列番号１６３の位置１７６８〜１７７０のいずれか１つに相当するヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧになる改変。
【請求項１５９】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６のアミノ酸残基改変を含む配列を有する単離又は組換えポリペプチドであって、前記改変が、以下の１以上の改変を含む、前記単離又は組換えポリペプチド：
配列番号１６４の位置８９のアミノ酸のメチオニンに相当するアミノ酸がアルギニンになる改変；
配列番号１６４の位置１０３のアミノ酸のフェニルアラニンに相当するアミノ酸がグリシンになる改変；
配列番号１６４の位置１１０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がグリシンになる改変；
配列番号１６４の位置１１４のアミノ酸のチロシンに相当するアミノ酸がロイシンになる改変；
配列番号１６４の位置１５７のアミノ酸のアラニンに相当するアミノ酸がセリンになる改変；
配列番号１６４の位置４８１のアミノ酸のトリプトファンに相当するアミノ酸がフェニルアラニンになる改変；
配列番号１６４の位置５５０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がアスパラギンになる改変；又は
配列番号１６４の位置５９０のアミノ酸のグリシンに相当するアミノ酸がアルギニンになる改変。
【請求項１６０】
請求項４８記載のポリペプチドのアミノ酸残基改変を含む配列を有する単離又は組換えポリペプチドであって、前記改変が以下の1以上を含む、前記単離又は組換えポリペプチド：
配列番号１６４の位置８９のアミノ酸のメチオニンに相当するアミノ酸がアルギニンになる改変。；
配列番号１６４の位置１０３のアミノ酸のフェニルアラニンに相当するアミノ酸がグリシンになる改変。；
配列番号１６４の位置１１０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がグリシンになる改変。；
配列番号１６４の位置１１４のアミノ酸のチロシンに相当するアミノ酸がロイシンになる改変；
配列番号１６４の位置１５７のアミノ酸のアラニンに相当するアミノ酸がセリンになる改変；
配列番号１６４の位置４８１のアミノ酸のトリプトファンに相当するアミノ酸がフェニルアラニンになる改変；
配列番号１６４の位置５５０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がアスパラギンになる改変；又は
配列番号１６４の位置５９０のアミノ酸のグリシンに相当するアミノ酸がアルギニンになる改変。
【請求項１６１】
請求項４８記載の単離又は組換えポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１６４に記載の配列を有するポリペプチドがアルカリエンドグルカナーゼ／セルラーゼ活性を有するか、
（ｉｉ）配列番号１１０に記載の配列を有するポリペプチドがキシラナーゼ活性を有するか、
（ｉｉｉ）配列番号１２に記載の配列を有するポリペプチドがＮＡＤ結合オキシドレダクターゼ活性を有するか、
（ｉｖ）配列番号１１８に記載の配列を有するポリペプチドが短鎖デヒドロゲナーゼ活性を有するか、
（ｖ）配列番号１４に記載の配列を有するポリペプチドがＮＡＤＨ依存性デヒドロゲナーゼ活性を有するか、
（ｖｉ）配列番号１３８に記載の配列を有するポリペプチドがペプチダーゼ活性を有するか、
（ｖｉｉ）配列番号１６２に記載の配列を有するポリペプチドがアルカリエンドグルカナーゼ活性を有するか、
（ｖｉｉｉ）配列番号４２に記載の配列を有するポリペプチドがシステイニルｔＲＮＡシンセターゼ活性を有するか、
（ｖｉｉｉ）配列番号３２に記載の配列を有するポリペプチドがセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有するか、
（ｉｘ）配列番号５０に記載の配列を有するポリペプチドがｆｄｈｄ／ｎａｒｑオキシドレダクターゼ活性を有するか、
（ｘ）配列番号５４に記載の配列を有するポリペプチドがラジカルＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）メチルトランスフェラーゼ活性を有するか、又は
（ｘｉ）配列番号５８に記載の配列を有するポリペプチドがサブチリシン様プロテアーゼ活性を有する、
前記単離又は組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、エネルギー省により授与された契約番号ＤＥ−ＦＧ０３−０２ＥＲ８３３９５及びＤＥ−ＦＧ０２−０３ＥＲ８３８６５により政府の支援によってなされた。政府はこの発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、分子及び細胞生物学、並びに生化学に関する。一つの態様において、本発明は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製する及び使用する方法を提供する。一つの態様において、本発明は、熱安定及び耐熱活性を含む、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらの酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製及び使用する方法を対象とする。本発明のポリペプチドは、多様な薬学、農業及び産業の状況で使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
セルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能な資源である。反復単位がセロビオースであるβ−１，４−グルコース単位の直鎖から構成され、これは、図５で示される構造を有するグルコース二量体である。このポリマーは、セルロースポリマーを無差別に加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びセルロースから末端セロビオース残基を除去するセロビオヒドロラーゼ（ＣＨＢ）を含む一連の酵素により分解される。セロビオース及びセロ−オリゴ糖は、β−グルコシダーゼ（ＢＧ）により加水分解されてグルコースとなる。これら３つの酵素は、全て、セルロースが完全に分解してグルコースになるのに必要である。これらの３つの酵素には、それぞれ、同じ機能を実施する異なる構造の変種が存在する。加えて、真菌及び細菌は、異なる構造の変種に加えて、同じ構造の変種の複数の形態を産生することが知られている。
【０００４】
この系を更に複雑にしているものは、幾つかの嫌気性細菌及び真菌が、酵素骨格に全て結合している複数の酵素を含む２百万ダルトンを越える分子量の多酵素複合体としてこれらの酵素を産生するという事実である。なぜそのような複雑な系の酵素がこのような単純な分子に必要なのであろうか。一部の研究者は、この複雑性は、基質の頑強な性質に起因すると考えている。セルロース鎖は、隣接する鎖の水素結合により結晶質マトリックスに充填されているミクロフィブリルを形成する。この構造は、化学的又は酵素的分解に対して高度に抵抗性がある。
ＣＢＨは、セルロースを攻撃するこれらの酵素の性質によって、この結晶質セルロースの分解において主要な酵素であると考えられる。ＣＢＨと異なり、ＥＧは、垂直の角度でセルロース鎖を攻撃する開放裂溝を有する。ＣＢＨは、活性部位を含むトンネルを介して鎖を攻撃する。現在の考え方は、セルロース鎖がトンネルの中に入り、同時に隣接する水素結合を分断するというものである。セロビオヒドロラーゼが基質にこの「足場」を確立すると、次にＥＧが入ることができ、より容易に基質を攻撃することができる。
【０００５】
既知のＣＢＨの主な欠陥は、その低い触媒活性である。一部の人々は、低活性は、加水分解のエネルギーが、水素結合を分断して酵素が基質に沿って移動できるようにする動態エネルギーに移行することが原因であると論じている。ＣＢＨは、エキソ作用酵素であり、グリコシルヒドロラーゼの９０個のファミリーのうち６個で見出される。これらには、ファミリー５、６、７、９、１０及び４８が含まれる。ファミリー５は、セルラーゼ、マンナナーゼ及びキシラナーゼが挙げられる、多くの異なる種類のグリコシルヒドロラーゼを含む。このファミリーにおける大部分のセルラーゼは、エンドグルカナーゼであるが、セロビオヒドロラーゼの例もあり、最も注目すべきは、クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）からのＣｅｌＯである。ファミリー６は、エンドグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼしか含まず、エンドグルカナーゼよりもセロビオヒドロラーゼのメンバーが多い。酵素は転化機構を有し、結晶学的研究は、酵素が８個ではなく７個の平行β鎖を含むねじれたα／βバレル構造を有することを示唆する。ファミリー７の酵素は、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの両方から構成され、セロビオヒドロラーゼのほうが多く、唯一の既知のメンバーは真菌からのものである。酵素は機構を保持し、結晶構造は、β−ゼリーロール構造を示唆する。ファミリー９は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼを含み、エンドグルカナーゼが圧倒的である。しかし、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）は、エンド／エキソ−１，４−グルカナーゼを産生し、その結晶構造は、（α／α）6バレルフォールドを示唆する。この酵素は、エンド−とエキソ−グルカナーゼの両方のＣＢＨの特性を有する。ファミリー１０は、主にセロビオヒドロラーゼが記載され、残りがキシラナーゼとして記載される２つのメンバーしか含まない。ファミリー１０のセロビオヒドロラーゼ及びキシラナーゼは、メチル−ウンベリフェリルセロビオシドに対する活性を有する。ファミリー４８は、主に細菌及び嫌気性真菌セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼを含む。構造は、ファミリー９と同様の（α／α）6バレルフォールドである。
【０００６】
道路車両用の燃料において、あまり高価でなく再生可能な供給源の必要性が存在する。新たな燃料供給源は、燃焼後に無害な最終生成物を生じるのであれば、より魅力的である。エタノールは、石油系燃料に対して魅力的な代替案を提供し、デンプン又はリグノセルロース由来の単糖の発酵により得ることができる。しかし、現在の経済状況は、高い生成価格のため、エタノールの広範な使用を後押ししない。価格を減少することを目的とする研究の一つの領域は、リグノセルロースから発酵可能な糖を生成するのに使用できる酵素の技術的な効力を高めることである。供給原料をより効率的に消化する酵素を開発することは、換言するとエタノール生成費用を減少することになる。より効率的な方法は、米国の外国の油に対する依存度を減少し、その依存性に関連しうる価格変動を減少する。バイオエタノールのようなによりきれいな燃料を輸送に使用することは、部分的には地球温暖化の原因であると考えられているＣＯ2の純放出を減少することもできる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼ（ベータ−グルコシダーゼ）、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。一つの態様において、本発明の酵素は、基質加水分解の方法を改善するために増加した触媒速度を有する。触媒速度のこの増加した効率は、産業用途に有用でありうる糖の生成効率の増加をもたらし、例えば、そのように生成された糖は、エタノール生成のために微生物により使用することができる。一つの特徴において、本発明は、高活性（例えば、増加した触媒速度）のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及び／ベータ−グルコシダーゼを提供する。本発明は、酵素費用の減少した、例えばバイオマスをエタノール処理する費用が減少した本発明の酵素を使用する（例えば、バイオマスをエタノールにする）産業用途を提供する。したがって、本発明は、あらゆるバイオマスから、バイオエタノールを生成する、及びバイオエタノールを含む燃料が挙げられるバイオエタノール含有組成物を生成する効率的な方法を提供する。
【０００８】
一つの特徴において、本発明の酵素は、例えば内部エンド−β−１，４−及び／又はβ−１，３−グルカナーゼ結合の加水分解を触媒する、グルカナーゼ、例えばエンドグルカナーゼ活性を有する。一つの特徴において、前記エンドグルカナーゼ活性（例えば、エンド−１，４−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ活性）は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース）における１，４−及び／又はβ−１，３−ベータ−Ｄ−グリコシド結合の加水分解、穀類ベータ−Ｄ−グルカン又はキシログルカン及びセルロース部分を含有する他の植物材料のような混合ベータ−１，３−グルカンにおける、リケニン、ベータ−１，４−結合の加水分解を含む。
【０００９】
一つの特徴において、本発明の酵素は、エンドグルカナーゼ（例えば、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４；エンド−ベータ−１，３（１）−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．６；エンド−ベータ−１，３−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．３９）活性を有し、セルロース及びグルカンにおいて内部β−１，４−及び／又はβ−１，３−グルコシド結合を加水分解して、より小さい分子量のグルコース及びグルコースオリゴマーを生成することができる。本発明は、本発明のこれらの酵素を使用して、より小さい分子量のグルコース及びグルコースオリゴマーを生成する方法を提供する。
一つの特徴において、本発明の酵素を使用して、グルカン、例えば、１，４−β−及び／又は１，３−グリコシド結合Ｄ−グルコピラノースから形成される多糖を生成する。一つの態様において、本発明のエンドグルカナーゼは、食品産業における例えばベーキング、並びに果実及び野菜加工、農業廃棄物の分解、動物飼料の製造、パルプ及び紙の生産、織物の製造、並びに家庭用及び産業用洗浄剤のために使用される。一つの特徴において、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、微生物により、例えば真菌及び／又は細菌により産生される。
【００１０】
一つの特徴において、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、穀類の主要な非デンプン多糖であるベータ−グルカン（β−グルカン）を加水分解するために使用される。多糖のグルカン含有量は、多様な成長条件に応じて著しく変わり得る。多糖の物理化学的特性は、粘性溶液を生じるか又は酸化条件下ではゲルも生じるような特性である。加えて、グルカンは高度な水結合能力を有する。これらの特徴は、全て、醸造、ベーキング、動物栄養を含む幾つかの産業において問題を提示する。醸造用途では、グルカンの存在は、麦芽汁濾過性及び濁り形成の問題をもたらす。ベーキング用途（特に、クッキー及びビスケット）では、グルカンは、機械加工が困難でビスケットのサイズを減らす粘着性の生地を作り出す可能性がある。したがって、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、β−グルカン含有組成物中のβ−グルカンの量を減少することに使用され、例えば、本発明の酵素は、溶液又はゲルの粘度を減少する処理において、組成物、例えばβ−グルカン含有組成物の水結合能力を減少する処理において、醸造処理において（例えば、麦芽汁濾過性を増加し、濁り形成を減少するため）、例えばクッキー、パン、ビスケットなどを作る生地の粘着性を減少する処理において使用される。
加えて、炭水化物（例えば、β−グルカン）は、焼成品の急速な再水和に関連し、新鮮さの消失及び保存寿命の低減をもたらす。したがって、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、あらゆる炭水化物含有食物、飼料又は飲料、例えばβ−グルカン含有食物、飼料又は飲料の新鮮さの保持、新鮮さの増加、又は新鮮さの消失速度の低減、及び保存寿命の増加のために使用される。
【００１１】
本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、例えば穀物食での（例えば、反芻動物のような動物又はヒト）における消化管の内容物の粘度を減少するために使用される。したがって、別の特徴において、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、食物又は飼料の消化率及び動物（例えば、ヒト又は家畜）の成長率に肯定的な影響を与えるために使用され、一つの特徴では、より高い飼料転換効率を生じるために使用される。穀物食餌を用いる単胃動物の飼料用途では、ベータ−グルカンは、消化管内容物の粘度に対する寄与要因であり、それによって飼料の消化率及び動物の成長率に悪影響を与える。反芻動物では、これらのベータ−グルカンは、繊維摂取の実質的な構成要素を表し、グルカンのより完全な消化は、より高い飼料転換効率を促進する。したがって、本発明は、本発明のエンドグルカナーゼを含む動物飼料及び食物を提供し、一つの特徴において、これらの酵素は、動物の消化官、例えば胃及び／又は腸において活性である。
本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、あらゆる植物材料で見出されるものを含む、セルロース又はあらゆるベータ−１，４−結合グルカン含有合成若しくは天然材料を消化するために使用される。本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、例えば、木材加工、パルプ及び／若しくは紙産業において、織物産業において、及び家庭用及び産業用洗浄剤において、並びに／又はバイオマス廃棄物加工において、セルロースを消化するために、商業用の酵素として使用される。
一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組成物（例えば、医薬組成物、食物、飼料、薬剤、栄養補助食品）を提供する。これらの組成物は、多様な形態、例えば、錠剤、ゲル剤、丸剤、インプラント、液剤、噴霧剤、粉末剤、食物、飼料ペレットとして又は任意の形態のカプセル化形態として配合することができる。
【００１２】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３及び配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）を含む本発明の例示的な核酸に、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な（１００％）配列同一性を有する核酸配列を含む単離又は組換え核酸を提供し、別の特徴では、これらの核酸は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードするか、又は本発明のポリペプチドに特異的に結合できる抗体を生成することができるポリペプチドをコードするか、或いはこれらの核酸は、セルラーゼコード核酸を同定若しくは単離するプローブとして、又はセルラーゼ発現核酸の発現を阻害するために使用できる（これらの態様は、全て「本発明の核酸」と呼ばれる）。一つの特徴において、配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視検査によって決定される。
【００１３】
本発明の核酸には、また、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４及び配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）に記載の配列及びその部分配列を有するポリペプチド並びにその変種を含む、本発明の例示的な酵素をコードする単離又は組換え核酸が含まれる。一つの態様において、ペプチドは、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００１４】
一つの特徴において、本発明は、セルラーゼ−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ−、セロビオヒドロラーゼ−及び／又はベータ−グルコシダーゼ−コード核酸を提供し、これらは混合培養物に由来する点において共通の新規性を有する。本発明は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３及び配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）の本発明の例示的な核酸に、少なくとも約５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な（１００％）配列同一性を有する配列を含む、混合培養物から単離されるセルロース分解酵素コード核酸を提供する。
【００１５】
一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素、例えば、本発明の例示的なポリペプチド、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６（下記の表１及び配列表も参照すること）を含む、本発明の例示的なポリヌクレオチド配列（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）及びそれらによりコードされるポリペプチドを含む、セルラーゼ酵素−、例えばエンドグルカナーゼ酵素−、セロビオヒドロラーゼ酵素−及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素−コード核酸を提供し、これらは共通の供給源、例えば環境供給源に由来する点において共通の新規性を有する。一つの態様において、本発明は、セルラーゼ酵素−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ酵素−、セロビオヒドロラーゼ酵素−及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素−コード核酸も提供し、これらは環境供給源、例えば混合環境供給源に由来する点において共通の新規性を有する。 
一つの特徴において、上記配列比較アルゴリズムは、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．２アルゴリズムであり、フィルタリング設定は、blastall -p blastp -d "nr pataa" -F Fに設定され、他の全てのオプションは、初期設定値に設定される。
【００１６】
本発明の別の特徴は、本発明の核酸の連続した塩基を少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００個又はそれ以上含む単離又は組換え核酸、それと実質的に同一の配列、及びそれに相補的な配列を含む単離又は組換え核酸である。
【００１７】
一つの特徴において、単離又は組換え核酸は、熱安定性である、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、約３７℃〜約９５℃、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約９５℃、又は約９０℃〜約９５℃の温度範囲を含む条件下でセルラーゼ活性を保持することができる。前記ポリペプチドは、約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、約３７℃〜約９５℃、９７℃、９８℃、又は９９℃の範囲、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約７５℃、若しくは約９０℃〜約９９℃の範囲、又は９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、若しくは９９℃又はそれ以上の温度でセルラーゼ活性を保持することができる。
【００１８】
別の特徴において、単離又は組換え核酸は、耐熱性であるセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、３７℃より高く約９５℃までの範囲の温度、又は５５℃より高く約８５℃までの範囲のいずれかの温度に暴露された後、セルラーゼ活性を保持することができる。前記ポリペプチドは、約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、約３７℃〜約９５℃、９７℃、９８℃、又は９９℃の範囲、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約７５℃、又は約９０℃〜約９９℃の範囲、又はそれ以上の温度に暴露された後、セルラーゼ活性を保持することができる。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ４．５又はそれ以上で、９０℃より高く約９９℃までの範囲、又は９５℃、９６℃、９８℃若しくは９９℃の温度に暴露された後、セルラーゼ活性を保持する。
【００１９】
本発明は、本発明の例示的な配列、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４も参照すること）に記載の配列、又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む、本発明の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離又は組換え核酸を提供する。一つの特徴において、前記核酸は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記核酸は、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００個若しくはそれ以上の長さの残基であるか、又は遺伝子若しくは転写物の完全長でありえる。一つの特徴において、ストリンジェントな条件は、０．２xＳＳＣ中、約６５℃の温度で約１５分間洗浄することを含む洗浄工程を含む。 
【００２０】
本発明は、セルラーゼ活性、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定又は単離する核酸プローブを提供し、前記プローブは、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む配列の少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個又はそれ以上の連続する塩基を含み、結合又はハイブリダイゼーションにより核酸を同定する。前記プローブは、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む配列の少なくとも約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０又は約６０〜１００個の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００２１】
本発明は、セルラーゼ活性、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定又は単離する核酸プローブを提供し、前記プローブは、本発明の例示的な核酸に少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の、又は完全な（１００％）配列同一性を有する、本発明の核酸、例えばポリヌクレオチドの少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個又はそれ以上の残基の配列を含む核酸を含む。一つの特徴において、配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視検査によって決定される。別の特徴において、前記プローブは、本発明の核酸配列又はその部分配列の少なくとも約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０又は約６０〜１００個の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００２２】
本発明は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を（例えば、ＰＣＲにより）増幅する増幅プライマー対を提供し、このプライマー対は、本発明の配列又はそのフラグメント若しくはその部分配列を含む核酸を増幅することができる。増幅プライマー配列対の１つの又はそれぞれのメンバーは、上記配列の少なくとも約１０〜５０個若しくはそれ以上の連続する塩基、又は上記配列の約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６個若しくはそれ以上の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は、増幅プライマー対を提供し、このプライマー対は、本発明の核酸の最初（5'）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第１のメンバーと、第１メンバーの相補鎖の最初（5'）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第２のメンバーとを含む。
【００２３】
本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるセルラーゼ−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ−、セロビオヒドロラーゼ−及び／又はベータ−グルコシダーゼ−コード核酸を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるセルラーゼ−コード核酸、例えば、エンドグルカナーゼ−、セロビオヒドロラーゼ−及び／又はベータ−グルコシダーゼ−コード核酸を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の作製方法を提供する。一つの特徴において、前記増幅プライマー対は、ライブラリーから、例えば環境ライブラリーのような遺伝子ライブラリーから核酸を増幅する。
本発明は、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法であって、本発明の核酸配列又はそのフラグメント若しくはその部分配列を増幅することができる増幅プライマー配列対により鋳型核酸を増幅することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明は、本発明の核酸配列又はその部分配列を含む発現カセットを提供する。一つの特徴において、前記発現カセットは、プロモーターに機能的に結合した核酸を含むことができる。前記プロモーターは、ウイルス、細菌、哺乳動物又は植物のプロモーターであることができる。一つの特徴において、前記植物プロモーターは、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、コムギ、タバコ又はオオムギのプロモーターであることができる。プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。構成的プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓを含むことができる、別の特徴において、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。一つの特徴において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、又は環境的に調節されるか若しくは生育的に調節されるプロモーターであり得る。したがって、プロモーターは、例えば、種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的又は器官離脱誘導プロモーターであり得る。一つの特徴において、発現カセットは、更に、植物又は植物ウイルス発現ベクターを含む得る。
本発明は、本発明の発現カセット（例えばベクター）又は本発明の核酸を含むクローニングビヒクルを提供する。前記クローニングビヒクルは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含むことができる。クローニングビヒクルは、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１由来ベクター（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）又は哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）を含み得る。
【００２５】
本発明は、本発明の核酸若しくは本発明の発現カセット（例えばベクター）、又は本発明のクローニングビヒクルを含む形質転換細胞を提供する。一つの特徴において、前記形質転換細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞であることができる。一つの特徴において、前記植物細胞は、ダイズ、ナタネ、アブラナ、トマト、サトウキビ、穀類、ジャガイモ、コムギ、イネ、トウモロコシ、タバコ又はオオムギ細胞であり得る。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。一つの特徴において、動物は、マウス、ラット、ブタ、ヤギ又はヒツジである。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック植物を提供する。トランスジェニック植物は、穀類、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、アブラナ、ナタネ、ダイズ、イネ、オオムギ又はタバコであることができる。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック種子を提供する。トランスジェニック種子は、穀類、トウモロコシ、コムギ、アブラナ、ナタネ、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、落花生又はタバコの種子であることができる。
【００２６】
本発明は、本発明の核酸に相補的であるか又は本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、細胞内のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージの翻訳を阻害する方法であって、本発明の核酸に相補的であるか若しくは本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は細胞で発現させることを含む方法を提供する。一つの特徴において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜５０，約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０、又は６０〜１００個の長さの塩基であり、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個又はそれ以上の長さの塩基である。本発明は、細胞内のセルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージの翻訳を阻害する方法であって、本発明の核酸に相補的であるか若しくは本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は細胞で発現させることを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明は、本発明の配列の部分配列を含む二本鎖の阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ又はＲＮＡ干渉）分子（転写を阻害する小型干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ、及び翻訳を阻害するミクロＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含む）を提供する。一つの態様において、ｓｉＲＮＡは、長さが、約２１〜２４個の残基、又は少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個又はそれ以上の二重ヌクレオチドである。本発明は、細胞内のセルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現を阻害する方法を提供し、前記方法は、本発明の配列又は部分配列を含む二重鎖阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）を細胞に投与すること又は細胞内で発現させることを含む。
【００２８】
本発明は、本発明の例示的なポリペプチド又はペプチドと、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０個若しくはそれ以上の残基又はポリペプチドの完全長にわたって、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上又は完全な（１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離又は組換えポリペプチドを提供する。一つの特徴において、配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視検査によって決定される。本発明の例示的なポリペプチド又はペプチド配列には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４及び配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）及びその部分配列、並びにその変種が含まれる。例示的なポリペプチドには、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００個若しくはそれ以上の残基の長さ、又は酵素の完全長にわたるフラグメントも含まれる。本発明のポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の核酸によってコードされる配列が含まれる。本発明のポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の抗体に特異的に結合するポリペプチド若しくはペプチド（例えば、エピトープ）、又は本発明の抗体を生成できるポリペプチド若しくはペプチド（例えば、免疫原）が含まれる。
【００２９】
一つの特徴において、本発明のペプチドは、少なくとも１つのセルラーゼ酵素活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する。別の特徴において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのセルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【００３０】
一つの特徴おいて、本セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、熱安定性である。本ポリペプチドは、約１℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１５℃〜約２５℃、約２５℃〜約３７℃、約３７℃〜約９５℃の範囲、約５５℃〜約８５℃、約７０℃〜約７５℃、又は約９０℃〜約９５℃又はそれ以上の温度範囲を含む条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。別の特徴において、本セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、耐熱性であり得る。前記ポリペプチドは、３７℃より高く約９５℃までの範囲又は５５℃より高く約８５℃までの範囲の温度に暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、９０℃より高く約９５℃までの範囲の温度にｐＨ４．５で暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチド又はペプチド配列の連続した塩基を少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０個又はそれ以上含む単離又は組換えポリペプチド若しくはペプチド、それと実質的に同一の配列、及びそれに相補的な配列を提供する。このペプチドは、例えば、免疫原性フラグメント、モチーフ（例えば、結合部位）、シグナル配列、プレプロ配列、又は活性部位であり得る。
【００３１】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする配列とシグナル配列とを含む単離又は組換え核酸を提供し、前記核酸は本発明の配列を含む。シグナル配列は、別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素から、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼ酵素（異種酵素）に由来し得る。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離又は組換え核酸であって、前記配列がシグナル配列を含まず、本発明の配列を含む、前記単離又は組換え核酸を提供する。一つの特徴において、本発明は、シグナル配列の一部又は全てを欠いている本発明のポリペプチドを含む単離又は組換えポリペプチドを提供する。一つの特徴において、単離又は組換えポリペプチドは、異種セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列のような、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列のような、異種シグナル配列を含む本発明のポリペプチドを含むことができる。
一つの特徴において、本発明は、本発明のシグナル配列を含む第１のドメインと、少なくとも第２のドメインとを含むキメラタンパク質を提供する。このキメラタンパク質は、融合タンパク質であることができる。前記第２のドメインは酵素を含むことができる。前記酵素は非酵素であってもよい。
【００３２】
本発明は、本発明のシグナルペプチド（ＳＰ）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）を含む少なくとも第１のドメインと、異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも第２のドメインとを含むキメラポリペプチドを提供し、前記異種ポリペプチド又はペプチドは、前記シグナルペプチド（ＳＰ）、前記プレプロ配列及び／又は前記触媒ドメイン（ＣＤ）と天然には結合していない。一つの特徴において、前記異種ポリペプチド又はペプチドは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ではない。前記異種ポリペプチド又はペプチドは、前記シグナルペプチド（ＳＰ）、前記プレプロ配列及び／又は前記触媒ドメイン（ＣＤ）のアミノ末端、カルボキシ末端又は両端にあってよい。
本発明は、キメラポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸を提供し、前記キメラポリペプチドは、本発明のシグナルペプチド（ＳＰ）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）を含む少なくとも第１のドメインと、異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも第２のドメインとを含み、前記異種ポリペプチド又はペプチドは、前記シグナルペプチド（ＳＰ）、前記プレプロ配列及び／又は前記触媒ドメイン（ＣＤ）と天然には結合していない。
【００３３】
本発明は、本発明のポリペプチドの、例えば例示的な配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）の残基１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜4３，１〜４４，１〜４５、１〜４６又は１〜４７に記載されている配列からなる、又は前記配列を含む単離又は組換えシグナル配列（例えば、シグナルペプチド）を提供する。一つの特徴において、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ末端残基の最初の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０個又はそれ以上を含むシグナル配列を提供する。
【００３４】
一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、約３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約１２００単位、又はタンパク質１mgあたり約１００〜約１０００単位の範囲で比活性を含む。一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、タンパク質１mgあたり約１００〜約１０００単位、又はタンパク質１mgあたり約５００〜約７５０単位の範囲で比活性を含む。あるいは、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、約３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約７５０単位、又はタンパク質１mgあたり約５００〜約１２００単位の範囲で比活性を含む。一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約５００単位、又はタンパク質１mgあたり約７５０〜約１０００単位の範囲で比活性を含む。別の特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約２５０単位の範囲で比活性を含む。あるいは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、３７℃において、タンパク質１mgあたり約１〜約１００単位の範囲で比活性を含む。
別の特徴において、前記耐熱性は、高温まで加熱した後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の３７℃での比活性の少なくとも半分を保持することを含む。あるいは、前記耐熱性は、高温まで加熱した後、タンパク質１mgあたり約１〜約１２００、又はタンパク質１mgあたり約５００〜約１０００単位の範囲で３７℃での比活性を保持することを含むことができる。別の特徴において、前記耐熱性は、高温まで加熱した後、タンパク質１mgあたり約１〜約５００単位の範囲で３７℃での比活性を保持することを含むことができる。
【００３５】
本発明は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む本発明の単離又は組換えポリペプチドを提供する。一つの特徴において、前記グリコシル化はＮ結合グリコシル化であり得る。一つの特徴において、ポリペプチドを、P.パストリス（P. pastoris）又はS.ポンベ（S. pombe）で発現させて、グリコシル化することができる。
一つの特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ６．５、ｐＨ６、ｐＨ５．５、ｐＨ５、ｐＨ４．５若しくはｐＨ４又はより酸性を含む条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。別の特徴において、ポリペプチドは、約ｐＨ７、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５若しくはｐＨ１１又はより塩基性のｐＨを含む条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ６．５、ｐＨ６、ｐＨ５．５、ｐＨ５、ｐＨ４．５若しくはｐＨ４又はより酸性のｐＨを含む条件に暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。別の特徴において、前記ポリペプチドは、約ｐＨ７、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５若しくはｐＨ１１又はより塩基性のｐＨを含む条件に暴露された後、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持することができる。
一つの態様において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、アルカリ性条件下、例えば腸、例えば小腸のアルカリ性条件下で活性を有する。一つの特徴において、前記ポリペプチドは、胃の酸性ｐＨに暴露された後、活性を保持することができる。
【００３６】
本発明は、本発明のポリペプチド（ペプチドを含む）を含むタンパク質調製物を提供し、前記タンパク質調製物は、液体、固体又はゲルを含む。本発明は、本発明のポリペプチドと、第２のタンパク質又はドメインとを含むヘテロ二量体を提供する。ヘテロ二量体の第２のメンバーは、異なるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、異なる酵素、又は別のタンパク質であることができる。一つの特徴において、第２のドメインはポリペプチドであることができ、ヘテロ二量体は融合タンパク質であることができる。一つの特徴において、第２のドメインはエピトープ又はタグであることができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のポリペプチドを含むホモ二量体を提供する。
【００３７】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する固定化ポリペプチドを提供し、前記固定化ポリペプチドは、本発明のポリペプチド、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明のポリペプチドを含むポリペプチドと第２のドメインとを含む。一つの特徴において、前記ポリペプチドを、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ又はキャピラリー管に固定化することができる。
本発明は、本発明の固定化核酸を含むアレイも提供し、例えば本発明のプローブが挙げられる。本発明は、本発明の抗体を含むアレイも提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する単離又は組換え抗体を提供する。これらの本発明の抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、本発明の抗体、例えば本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマを提供する。本発明は、これらの抗体をコードする核酸を提供する。
【００３８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを単離又は同定する方法であって、（ａ）本発明の抗体を提供する工程；（ｂ）ポリペプチドを含む試料を提供する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の試料を、抗体がポリペプチドと特異的に結合する条件下で工程（ａ）の抗体と接触させ、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを単離又は同定する工程を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明は、抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ酵素抗体を作製する方法であって、本発明の核酸又は本発明のポリペプチド又はその部分配列を、液性免疫反応を生じるのに十分な量で非ヒト動物に投与して、それによって抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ酵素抗体を作製することを含む方法を提供する。本発明は、抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ免疫反応（細胞性又は液性）を作製する方法であって、本発明の核酸又は本発明のポリペプチド又はその部分配列を、非ヒト動物に免疫反応（細胞性又は液性）を生じるのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【００４０】
本発明は、組換えポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）プロモーターに機能的に結合する本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸をポリペプチドの発現が可能である条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを産生する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、この方法は、宿主細胞を工程（ａ）の核酸を用いて形質転換し、続いて工程（ａ）の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞において組換えポリペプチドを産生することを更に含むことができる。
【００４１】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（ｂ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ基質を提供する工程；及び（ｃ）工程（ａ）のポリペプチド若しくはそのフラグメント又は変種を工程（ｂ）の基質と接触させ、前記基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出し、前記基質の減少又は前記反応生成物の量の増加により、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを検出する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、前記基質はセルラーゼ含有化合物である。
【００４２】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素基質を同定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（ｂ）試験基質を提供する工程；及び（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験基質と接触させ、前記基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出し、前記基質の量が減少又は前記反応生成物の量が増加すれば、前記試験基質を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の基質として同定する工程を含む方法を提供する。
【００４３】
本発明は、試験化合物がポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する方法であって、（ａ）核酸又は核酸を含むベクターを、核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させるか（前記核酸は本発明の核酸を含む）、又は本発明のポリペプチドを提供する工程；（ｂ）試験化合物を提供する工程；（ｃ）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；及び（ｄ）工程（ｂ）の試験化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する工程を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性の調節因子を同定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（ｂ）試験化合物を提供する工程；（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験化合物と接触させ、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の活性を測定する工程を含み、前記試験化合物の不在下での活性と比較して前記試験化合物の存在下で測定されるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性が変化すれば、前記試験化合物がセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を調節すると決定する方法を提供する。一つの特徴において、前記セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素基質を提供し、前記基質の量の減少若しくは反応生成物の量の増加、又は前記基質の量の増加若しくは反応生成物の量の減少を検出することによって測定できる。試験化合物を用いない場合の基質又は反応生成物の量と比較して、試験化合物を用いた場合に基質の量が減少又は反応生成物の量が増加すれば、前記試験化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性のアクチベーターとして同定する。試験化合物を用いない場合の基質又は反応生成物の量と比較して、試験化合物を用いた場合に基質の量が増加又は反応生成物の量が減少すれば、前記試験化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性のインヒビターとして同定する。
【００４５】
本発明は、プロセッサーおよびデータ記憶装置を含むコンピュータシステムを提供し、前記データ記憶装置には本発明のポリペプチド配列又は核酸配列（例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又はペプチド）が記憶されている。一つの特徴において、本コンピュータシステムは、更に、配列比較アルゴリズム、及び少なくとも１つの基準配列が記憶されたデータ記憶装置を含むことができる。別つの特徴において、前記配列比較アルゴリズムは、多型性を表示するコンピュータプログラムを含む。一つの特徴において、本コンピュータシステムは、更に、配列の１つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含むことができる。本発明は、本発明のポリペプチド配列又は核酸配列が記憶されているコンピュータ読み出し可能媒体を提供する。本発明は、配列の特徴を同定する方法であって、（ａ）配列の１つ以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを使用して配列を読み取る工程であり、前記配列が本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む、前記工程；及び（ｂ）コンピュータプログラムにより配列の１つ以上の特徴を同定する工程を含む方法を提供する。本発明は、第１の配列を第２の配列と比較する方法であって、（ａ）配列を比較するコンピュータプログラムを使用して第１の配列及び第２の配列を読み取る工程であり、第１の配列が本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む、前記工程、及び（ｂ）第１の配列と第２の配列との差異をコンピュータプログラムにより決定する工程を含む方法を提供する。第１の配列と第２の配列との差異を決定する工程は、更に、多型性を同定する工程を含むことができる。一つの特徴において、この方法は、更に、配列の１つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含むことができる。別の特徴において、この方法は、コンピュータプログラムを使用して第１の配列を読み取り、配列の１つ以上の特徴を同定することを含むことができる。
【００４６】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する方法であって、（ａ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する増幅プライマー配列対を提供する工程（このプライマー対は本発明の核酸を増幅することができる）；（ｂ）環境試料から核酸を単離するか、又は試料内の核酸がハイブリダイゼーションのために増幅プライマー対に接近できるように環境試料を処理する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の核酸を工程（ａ）の増幅プライマー対と一緒にし、環境試料の核酸を増幅し、それによって環境試料からセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離又は回収する工程を含む方法を提供する。前記増幅プライマー配列対の１つの又はそれぞれのメンバーは、例えば本発明の配列の少なくとも約１０〜５０個の連続する塩基を有する、本発明の増幅プライマー配列対を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００４７】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する方法であって、（ａ）本発明の核酸又はその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程；（ｂ）環境試料から核酸を単離するか、又は試料内の核酸がハイブリダイゼーションのために工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブに接近できるように環境試料を処理する工程；（ｃ）工程（ｂ）の単離された核酸又は処理された環境試料を工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；及び（ｄ）工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を環境試料から単離又は回収する工程を含む方法を提供する。前記環境試料は、水試料、液体試料、土壌試料、空気試料又は生物学的試料を含むことができる。一つの特徴において、前記生物学的試料は、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞に由来することができる。
【００４８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を生成する方法であって、（ａ）本発明の核酸を含む鋳型核酸を提供する工程；及び（ｂ）鋳型配列の１つ以上のヌクレオチドを改変、欠失、若しくは付加するか、又はこれらの組合せにより、鋳型核酸の変種を生成する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、この方法は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの変種を生成する核酸の変種を発現することを更に含むことができる。改変、付加又は欠失は、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、染色体飽和変異導入（ＣＳＭ）又はそれらの組合せを含む方法によって導入することができる。別の特徴において、>改変、付加又は欠失は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成びそれらの組合せを含む方法によって導入される。
【００４９】
一つの特徴において、この方法は、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドから変化した若しくは異なる活性、又は変化した若しくは異なる安定性を有するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が産生されるまで繰り返し反復することができる。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの変種は耐熱性であり、高温で暴露された後、いくらかの活性を保持する。別の特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの変種は、鋳型核酸によってコードされるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と比較して、増加したグリコシル化を有する。あるいは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドの変種は、高温でセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素活性を有し、鋳型核酸でコードされたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素は、高温下で活性ではない。一つの特徴において、この方法は、鋳型核酸のコドン使用頻度から変化したコドン使用頻度を有する配列をコードするセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素が産生されるまで、繰り返し反復することができる。別の特徴において、この方法は、鋳型核酸よりも高い又は低いレベルのメッセージ発現又は安定性を有するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド酵素遺伝子が産生されるまで、繰り返し反復することができる。
【００５０】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を増加する方法であって、（ａ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸の非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を増加させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先コドン又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、前記方法を提供する。
【００５１】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変する方法であって、（ａ）本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸のコドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換し、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ核酸をコードする核酸のコドンを改変する工程を含む、前記方法を提供する。
【００５２】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を増加させる方法であって、（ａ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸の非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を増加させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先コドン又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、前記方法を提供する。
【００５３】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における発現を減少させる方法であって、（ａ）本発明の核酸を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の核酸の少なくとも１つの好ましいコドンを同定し、前記コドンを、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドン又は低優先コドンで置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における発現を減少させる工程を含み、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、前記非優先又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである、前記方法を提供する。一つの特徴において、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であることができる。
【００５４】
本発明は、複数の改変セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを産生する方法であって、前記改変活性部位又は基質結合部位が、第１の活性部位又は第１の基質結合部位をコードする配列を含む第１の核酸に由来し、（ａ）第１の活性部位又は第１の基質結合部位をコードする第１の核酸を提供する工程であって、前記第１の核酸の配列は本発明の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、前記核酸が、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性部位又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ基質結合部位をコードする核酸である、前記工程；（ｂ）前記第１の核酸内の複数の標的コドンにおいて天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異導入オリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；及び（ｃ）前記変異導入オリゴヌクレオチドのセットを使用して、変異が導入されるそれぞれのアミノ酸コドンにおいて一連のアミノ酸の変種をコードする活性部位コード核酸変種又は基質結合部位コード核酸変種のセットを生成し、それによって複数の改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する工程を含む、前記方法を提供する。一つの特徴において、この方法は、最適化定方向進化系、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ及びこれらの組合せを含む方法によって、工程（ａ）の第１の核酸に変異を導入することを含む。別の特徴において、この方法は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成及びそれらの組合せを含む方法によって、工程（ａ）の第１の核酸又は変種に変異を導入することを含む。
【００５５】
本発明は、小分子を作製する方法を提供する。前記方法は、（ａ）小分子を合成又は改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程であって、前記酵素のうち１つは本発明の核酸によってコードされるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む、前記工程；（ｂ）工程（ａ）の酵素の少なくとも１つに対する基質を提供する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の基質を、複数の生体触媒反応を促進する条件下で酵素と反応させて、一連の生体触媒反応により小分子を生成する工程を含む方法を提供する。本発明は、小分子を改変する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又はその部分配列を含む、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する工程；（ｂ）小分子を提供する工程；及び（ｃ）工程（ａ）の酵素を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素によって触媒される酵素反応が促進される条件下で工程（ｂ）の小分子と反応させ、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素反応により小分子を改変する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、本方法は工程（ａ）のための小分子基質を多く含むことができ、したがって、セルラーゼ、例えばエンドセルラーゼ、セロビオヒドロゲナーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素によって触媒された少なくとも一つの酵素反応によって製造された改変小分子ライブラリーを形成させる。一つの特徴において、この方法は、複数の酵素反応により産生される改変小分子のライブラリーを形成するために、酵素による複数の生体触媒反応を促進する条件下で複数の追加的な酵素を含むことができる。別の特徴において、この方法は、所望の活性を示す特定の改変小分子がライブラリー内に存在するかを決定するために、ライブラリーを試験する工程を更に含むことができる。ライブラリーを試験する工程は、更に、所望の活性を有する特定の改変小分子の存在又は不在について改変小型分の一部を試験し、所望の活性を有する特定の改変小分子を産生する少なくとも１つの特定の生体触媒反応を同定することによって、ライブラリー内の複数の改変小分子の一部を産生するのに使用される生体触媒反応の一つを除いて全部を系統的に排除する工程を含むことができる。
【００５６】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の機能的フラグメントを決定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又はその部分配列を含むセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性について残りの配列を試験し、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の機能的フラグメントを決定する工程を含む方法を提供する。一つの態様において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ基質を提供し、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出することにより測定される。
【００５７】
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析を使用する新たな又は改変された表現型の全細胞操作の方法であって、（ａ）細胞の遺伝的構成を改変することにより改変細胞を作製する工程であって、前記遺伝的構成が本発明の核酸を細胞に添加することにより改変される、前記工程；（ｂ）前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生成する工程；（ｃ）工程（ｂ）の細胞培養物をリアルタイムでモニタリングすることにより細胞の少なくとも１つの代謝パラメーターを測定する工程；及び（ｄ）工程（ｃ）のデータを分析して、測定パラメーターが類似の条件下で未改変細胞における対応する測定値と異なるか否かを決定し、それによって操作された細胞の表現型をリアルタイム代謝フラックス分析を使用して同定する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、細胞の遺伝的構成は、細胞内の配列の欠失若しくは配列の改変、又は遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変することができる。一つの特徴において、この方法は、新たに操作された表現型を含む細胞を選択することを更に含むことができる。別の特徴において、この方法は、選択された細胞を培養し、それによって新たに操作された表現型を含む新たな細胞株を生成することを含むことができる。
【００５８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドをグリコシル化することを含む、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素ポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を増加させる方法であって、前記ポリペプチドは本発明のポリペプチドの少なくとも３０個の隣接するアミノ酸又は本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドを含み、それによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を増加させる方法を提供する。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の比活性は、約３７℃より高く約９５℃までの温度範囲で熱安定性又は耐熱性であることができる。
【００５９】
本発明は、本発明の核酸又は本発明の核酸配列を含むベクターを発現することを含む、細胞で組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを過剰発現させる方法であって、配列同一性が、配列比較アルゴリズムを用いる分析又は目視検査により決定され、過剰発現が、高活性プロモーター、２シストロンベクターの使用により、又はベクターの遺伝子増幅により実施される方法を提供する。
【００６０】
トランスジェニック植物を作製する方法であって、（ａ）本発明の核酸配列を含む異種核酸配列を細胞に導入し、それによって形質転換植物細胞を産生する工程；及び（ｂ）形質転換細胞からトランスジェニック植物を産生する工程を含む方法を提供する。一つの特徴において、工程（ａ）は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより異種核酸配列を導入することを更に含むことができる。別の態様において、工程（ａ）は、ＤＮＡ粒子衝撃により、異種核酸配列を植物組織に直接導入することを更に含むことができる。あるいは、工程（ａ）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien）宿主を使用することにより、異種核酸配列を植物細胞ＤＮＡに導入することを更に含むことができる。一つの態様において、植物細胞は、サトウキビ、ビート、ダイズ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、タバコ又はオオムギ細胞であってよい  。
【００６１】
本発明は、植物細胞において異種核酸配列を発現させる方法であって、（ａ）プロモーターに機能的に結合した、本発明の核酸を含む異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程；（ｂ）前記異種核酸配列が植物細胞で発現する条件下で植物を生長させる工程、を含む方法を提供する。本発明は、植物細胞において異種核酸配列を発現させる方法であって、（ａ）プロモーターに機能的に結合した、本発明の配列を含む異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程；（ｂ）異種核酸配列が植物細胞で発現する条件下で植物を生長させる工程を含む方法を提供する。
【００６２】
本発明は、本発明のポリペプチドを含む又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む飼料又は食物を提供する。一つの特徴において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、食物、飼料、液体、例えば飲料（例えばフルーツジュース又はビール）、パン若しくは生地若しくはパン製品、又は飲料前駆体（例えば、麦芽汁）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドを含む、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、動物用の食物又は栄養補助食品を提供する。
【００６３】
一つの態様において、食物又は栄養補助食品中のポリペプチドは、グリコシル化されていてよい。本発明は、本発明のポリペプチドを含む、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、食用酵素送達マトリックスを提供する。一つの特徴において、送達マトリックスはペレットである。一つの特徴において、ポリペプチドはグリコシル化されていてよい。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、耐熱性である。別の特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性は、熱安定性である。
本発明は、本発明のポリペプチドを含む食物、飼料又は栄養補助食品を提供する。本発明は、動物用食餌に栄養補助食品としてセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を利用する方法であって、本発明のポリペプチドの少なくとも３０個の隣接するアミノ酸を含むセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含有する栄養補助食品を調製すること；及び栄養補助食品を動物に投与することを含む方法を提供する。前記動物は、ヒトであるか、反芻動物又は単胃動物であってよい。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、細菌、酵母、植物、昆虫、真菌及び動物からなる群より選択される生物において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを発現することにより調製できる。前記生物は、S.ポンベ（S. pombe）、S.セレビシアエ（S. cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）、バチルス種（Bacillus sp.）及びラクトバチルス種（Lactobacillus sp.）からなる群より選択することができる。
【００６４】
本発明は、熱安定性組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、例えば本発明のポリペプチドを含む食用酵素送達マトリックスを提供する。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素栄養補助食品を動物に送達する方法であって、顆粒食用担体及び熱安定性組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む食用酵素送達マトリックスをペレットの形態で調製すること、および、前記食用酵素送達マトリックスを動物に投与することを含み、前記ペレットが、含有されているセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を水性媒体に容易に分散する、前記方法を提供する。前記組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、本発明のポリペプチドを含むことができる。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をグリコシル化して、ペレット化条件下で熱安定性をもたらすことができる。送達マトリックスは、穀物胚及びセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む混合物をペレット化することにより形成できる。ペレット化条件は、蒸気の適用を含むことができる。ペレット化条件は、約８０℃を越える温度を約５分間適用することを含むことができ、酵素は、酵素の１mgあたり少なくとも３５０〜約９００単位の比活性を保持する。
【００６５】
一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。一つの特徴において、前記医薬組成物は、消化補助剤として作用する。
【００６６】
特定の特徴において、セルロース含有化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する本発明のポリペプチドと、約ｐＨ３．０〜９．０の範囲、１０．０、１１．０又はそれ以上のｐＨで接触させる。他の特徴において、セルロース含有化合物を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と、約５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃又はそれ以上の温度で接触させる。
【００６７】
本発明の１つ以上の特徴の詳細が、添付図面及び以下の記載により説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、記載及び図面から、並びに請求項から明白となる。
本明細書で引用される全ての出版物、特許、特許出願、GenBank配列及びＡＴＣＣ寄託は、全ての目的において引用により本明細書に明確に組み込まれる。
図面は本発明の態様を説明し、請求項に包含される本発明の範囲を制限することを意図しない。
種々の図面中の同じ参照記号は同じ要素を示している。
（詳細な説明）
【００６８】
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを作製及び使用する方法を提供する。本発明は、セルラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、これらの酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用も提供する。
一つの特徴において、本発明は、触媒率が高まり、基質の加水分解処理が改善された、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼを提供する。この触媒率の効率の高まりは、後で微生物によりエタノール生成のために用いられる糖を生成する効率を高める。一つの特徴において、本発明の酵素を生じる微生物は、エタノール生成微生物と共に使用される。したがって、本発明は、エタノール生成の方法、及びエタノールに基づく「クリーン燃料」を、例えばバイオエタノールを使用する輸送のために作製する方法を提供する。
一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組成物（例えば、酵素調製物、飼料、薬剤、栄養補助食品）を提供する。これらの組成物は、多様な形態、例えば、液剤、ゲル剤、丸剤、錠剤、噴霧剤、粉末剤、食物、飼料ペレットとして又はナノカプセル化形態を含むカプセル化形態として配合することができる。
【００６９】
例えば、ポリペプチドがセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するかを決定するために、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を測定するアッセイは、当該技術において周知であり、かつ本発明の範囲内である（例えば、Baker WL, Panow A, Estimation of cellulase activity using a glucose-oxidase-Cu(II) reducing assay for glucose, J Biochem Biophys Methods. 1991 Dec, 23(4):265-73; Sharrock KR, Cellulase assay methods: a review, J Biochem Biophys Methods. 1988 Oct, 17(2):81-105; Carder JH, Detection and quantitation of cellulase by Congo red staining of substrates in a cup-plate diffusion assay, Anal Biochem. 1986 Feb 15, 153(1):75-9; Canevascini G., A cellulase assay coupled to cellobiose dehydrogenase, Anal Biochem. 1985 Jun, 147(2):419-27; Huang JS, Tang J, Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal Biochem. 1976 Jun, 73(2):369-77を参照すること）。
【００７０】
本発明で利用される反応条件のｐＨは、本発明が提供する別の変数パラメーターである。特定の態様において、反応のｐＨは、約３．０〜約９．０の範囲で実施される。別の態様において、ｐＨは約４．５であるか、又はｐＨは約７．５であるか、又はｐＨは約９である。アルカリ性条件下で実施される反応条件も、例えば本発明の酵素の幾つかの産業又は医薬用途において有益でありうる。
本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを多様な形態又は配合で提供する。本発明の方法において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドは、多様な形態又は配合で使用される。例えば、精製されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを、バイオエタノール生成又は医薬若しくは飲食補助用途で用いる酵素調製物に使用することができる。あるいは、本発明の酵素を、バイオエタノールの生成、クリーン燃料の製造、バイオマスの処理、食物、液体又は飼料の処理などに直接使用することができる。
【００７１】
あるいは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを、当該技術で周知の手順を使用し微生物において発現させることができる。他の態様において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドを、本発明の方法で使用する前に、固体支持体に固定化することができる。酵素を固体支持体に固定化する方法は、当該技術で一般的に知られており、例えば、J. Mol. Cat. B: Enzymatic 6 (1999) 29-39; Chivata et al. Biocatalysis: Immobilized cells and enzymes, J Mol. Cat. 37 (1986) 1-24: Sharma et al., Immobilized Biomaterials Techniques and Applications, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (1982) 837-54: Laskin (Ed.), Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnologyである。
【００７２】
核酸、プローブ及び阻害性分子
本発明は、単離及び組換え核酸（例えば、下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表を参照すること）；本発明の例示的なポリヌクレオチド配列を含む、ポリペプチドをコードする核酸を提供する（例えば、本発明の核酸を含む発現ベクター及び多様なクローニングビヒクルのような発現カセットを含む、表１及び配列表を参照すること）。本発明は、本発明の核酸を使用して、新たなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチド配列を発見、同定又は単離する方法も含む。本発明は、本発明の核酸を使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子及び転写物の発現を阻害する方法も含む。
【００７３】
また、提供されるものは、例えば、合成連結再アッセンブリ、最適化定方向進化系及び／又は遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）のような飽和変異導入により、本発明の核酸の変種を作ることを含む、核酸を改変する方法である。用語「飽和変異導入」、遺伝子部位飽和変異導入又は「ＧＳＳＭ」には、下記で詳細に記載される、ポリヌクレオチドへ点変異を導入するために縮退オリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法が含まれる。用語「最適化定方向進化系」又は「最適化定方向進化」には、関連する核酸配列、例えば関連する遺伝子のフラグメントを再集合する方法が含まれ、下記で詳細に説明される。用語「合成連結再アッセンブリ」又は「ＳＬＲ」には、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的様式で連結する方法が含まれ、下記で詳細に説明される。用語「変種」は、１つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エキソン又はアミノ酸残基が（それぞれ）改変されているが、依然として本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼの生物学的活性を保持する本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。変種は、例えば、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、ＧＳＳＭ及びこれらの任意の組合せのような方法を含む、幾つかの方法により産生できる。
【００７４】
本発明の核酸は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、ＰＣＲによるメッセージ又はゲノムＤＮＡの増幅などによって、作製、単離及び／又は操作することができる。例えば、本発明の例示的な配列は、当初は環境供給源に由来する。したがって、一つの特徴において、本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード核酸及びそれらによってコードされるポリペプチドを提供し、これらは共通の供給源、例えば環境、混合培養物又は細菌供給源に由来する点において共通の新規性を有する。
本発明の方法を実施するに際し、相同遺伝子は、本明細書で記載されているように、鋳型核酸を操作することによって改変できる。本発明は、化学及び特許文献で十分に記載されている、当該技術で既知の方法又はプロトコール又は装置のいずれかにより実施することができる。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、語句「核酸」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、若しくはこれらのいずれかのフラグメントを意味するか、又は一本鎖若しくは二本鎖であることができ、センス若しくはアンチセンス（相補的）鎖を表すことができるゲノム由来若しくは合成のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は由来が天然若しくは合成である任意のＤＮＡ様若しくはＲＮＡ様材料を意味する。語句「核酸」又は「核酸配列」には、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、若しくはこれらのいずれかのフラグメントが含まれ、又は一本鎖若しくは二本鎖であってよくセンス若しくはアンチセンス鎖を表し得るゲノム由来若しくは合成のＤＮＡ若しくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉＲＮＡ）が含まれ、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は例えば、ｉＲＮＡ、リボ核タンパク質（例えば、二本鎖ｉＲＮａ、例えばｉＲＮＰ）を含む、天然由来若しくは合成の任意のＤＮＡ様若しくはＲＮＡ様材料が含まれる。この用語は、核酸、すなわち、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。この用語は、合成骨格を有する核酸様構造も包含する（例えば、Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照すること）。「オリゴヌクレオチド」には、化学的に合成できる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれも含まれる。そのような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、したがって、キナーゼの存在下でＡＴＰによりリン酸を付加しないと、別のオリゴヌクレオチドに連結することはない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結することができる。
【００７６】
特定のポリペプチド又はタンパク質の「コード配列」又はそれを「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される核酸配列である。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し、それは、コード領域の前後に領域（リーダー及びトレイラー）を含み、並びに当てはまる場合には、個別のコードセグメント（エクソン）の間に介在配列（イントロン）を含む。プロモーター配列は、プロモーターで転写を開始するＤＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡに転写するとき、コード配列に「機能的に結合」している。本明細書で使用されるとき、「機能的に結合」しているとは、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的な関係を意味する。これは、転写調節配列と転写される配列の機能的な関係を意味することができる。例えば、プロモーターは、適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、本発明の核酸のようなコード配列に機能的に結合している。一般に、転写配列に機能的に結合しているプロモーター転写調節配列は、転写された配列と物理的に隣接しており、すなわち、これらはシス作用性である。しかし、エンハンサーのような幾つかの転写調節配列は、それらが転写を強化しようとするコード配列に物理的に隣接しているか又は近接して配置される必要はない。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、用語「発現カセット」は、ヌクレオチド配列に適合性のある宿主において、構造遺伝子（すなわち、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素のようなタンパク質コード配列）の発現に影響を与えることができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、少なくともポリペプチドコード配列に機能的に結合するプロモーター、及び場合により他の配列、例えば転写終結シグナルが含まれる。例えば、エンハンサー、アルファ因子のような発現を実施するのに必要であるか又は助けになる追加の因子を使用することもできる。したがって、発現カセットには、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなども含まれる。「ベクター」には、細胞に感染、トランスフェクト、一過性又は永久的に形質導入することができる核酸が含まれる。ベクターは、裸の核酸、又はタンパク質若しくは脂質と複合体を形成した核酸でありうることが理解される。ベクターは、場合により、ウイルス若しくは細菌の核酸及び／若しくはタンパク質、並びに／又は膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含む。ベクターには、ＤＮＡフラグメントが結合し複製できるようになったレプリコン（例えばＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）が含まれるが、これらに限定はされない。したがって、ベクターには、自律的自己複製性環状又は直鎖状のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えばプラスミド、ウイルスなど、例えば、米国特許第５，２１７，８７９号を参照すること）が含まれるが、これらに限定はされず、発現と非発現の両方のプラスミドが含まれる。組換え微生物又は培養細胞が「発現ベクター」の宿主として記載されている場合は、このベクターには、染色体外環状及び直鎖状ＤＮＡと、宿主染色体に取り込まれたＤＮＡの両方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持される場合、ベクターは、自律性構造物として有糸分裂時に細胞により安定的に複製されることができるか、又は宿主のゲノム内に取り込まれている。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、用語「組換え」は、その天然の環境では隣接していない「骨格」核酸に隣接する核酸を包含する。一つの特徴において、「濃縮」されているためには核酸は核酸骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約５％以上を表す。本発明の骨格分子には、発現ベクター、自律的複製核酸、ウイルス、組み込み核酸、及び目的の核酸の維持又は操作に使用される他のベクター又は核酸のような核酸が含まれる。一つの特徴において、濃縮核酸は、組換え骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約１５％以上を表す。一つの特徴において、濃縮核酸は、組換え骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約５０％以上を表す。一つの特徴において、濃縮核酸は、組換え骨格分子の集団中の核酸挿入の数の約９０％以上を表す。
【００７９】
本発明の一つの態様は、本発明の配列の１つ、又は本発明の核酸の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個、又はそれ以上の連続した塩基を含むフラグメントを含む単離若しくは組換え核酸である。単離又は組換え核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡが挙げられるＤＮＡを含むことができる。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖である場合は、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であることができる。あるいは、単離又は組換え核酸はＲＮＡを含む。
本発明の単離又は組換え核酸は、本発明のポリペプチドの１つを調製するために、又は本発明のポリペプチドの１つの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントを調製するために使用できる。したがって、本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドの１つをコードする、又は本発明のポリペプチドの１つの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントの１つをコードする単離又は組換え核酸である。これらの核酸のコード配列は、本発明の核酸の１つのコード配列の１つと同一であることができるか、或いは、遺伝子コードの重複又は縮重の結果、本発明のポリペプチドの１つの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を有する本発明の１つのフラグメントをコードする、異なるコード配列であることができる。遺伝子コードは、当業者には周知であり、例えば、B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997の２１４頁で得ることができる。
【００８０】
本発明のポリペプチドをコードする核酸には、本発明の核酸のコード配列、及びリーダー配列又はプロタンパク質配列のような追加のコード配列、及びイントロンのような又はコード配列の5'及び／若しくは3'非コード配列のような非コード配列が含まれるが、これらに限定はされない。したがって、本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチド、並びに追加のコード及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
一つの特徴において、本発明の核酸配列には、部位特異的変異導入のような従来の技術、又は当業者に慣用の他の技術を使用して変異を導入し、本発明のポリヌクレオチドにサイレント変化を導入する。本明細書で使用されるとき、「サイレント変化」には、例えば、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を変えない変化が含まれる。そのような変化は宿主生物で頻繁に起こり、コドン又はコドン対の導入によりポリペプチドをコードするベクターを含有する宿主細胞により産生されるポリペプチドのレベルを増加するために、望ましい場合がある。
【００８１】
本発明は、また、本発明のポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらすヌクレオチドの変化を有する、ポリヌクレオチドに関する。そのようなヌクレオチドの変化は、部位特異的変異導入、ランダム化学変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失及び他の組換えＤＮＡ技術のような技術を使用して導入することができる。あるいは、そのようなヌクレオチドの変化は、本明細書で提供される高度、中程度又は低度のストリンジェントな条件下で、本発明の配列（またはこれに相補的な配列）の１つの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の連続した塩基を含むプローブに特異的にハイブリダイズする核酸を同定することにより単離される、天然に存在する対立変種であり得る。
【００８２】
一般的技術
本発明を実施するのに使用される核酸は、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルス又はそれらのハイブリッドであっても、多様な供給源から単離すること、遺伝子的に操作すること、増幅すること、及び／又は組み替えにより発現／生成することができる。これらの核酸から生成される組換えポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）は、個別に単離又はクローン化すること、及び所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫又は植物細胞発現系を含む、任意の組換え発現系を使用することができる。
あるいは、これら核酸は、例えば、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859;米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているように、周知の化学合成技術によりインビトロで合成することができる。
【００８３】
核酸を操作する技術、例えばサブクローニング、プローブの標識（例えば、クレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは、科学及び特許文献に十分に記載されている（例えば、Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照すること）。
【００８４】
本発明の方法の実施に使用される核酸を入手及び操作するのに有用な別の手段は、ゲノム試料からのクローン化、及び望ましい場合には、例えばゲノムクローン若しくはｃＤＮＡクローンから単離又は増幅した挿入物のスクリーニング及び再クローン化である。本発明の方法で使用される核酸の供給源には、例えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）（例えば、米国特許第５，７２１，１１８号、同第６，０２５，１５５号を参照すること）、ヒト人工染色体（例えば、Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335を参照すること）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体（例えば、Woon (1998) Genomics 50:306-316を参照すること）、Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ）（例えば、Kern (1997) Biotechniques 23:120-124を参照すること）、コスミド、組換えウイルス、ファージ又はプラスミドに含まれるゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーが含まれる。
【００８５】
一つの特徴において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列と共に適切な態様で構築される。
本発明は、融合タンパク質及びそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドを、安定性の増強又は精製の簡便化のような所望の特性を付与する、Ｎ−末端識別ペプチドのような異種ペプチド又はポリペプチドと融合させることができる。本発明のペプチド及びポリペプチドは、例えば、より強い免疫原性をもつペプチドを産生する、組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離する、抗体及び抗体発現Ｂ細胞を同定及び単離するなどのために、それらに結合した１つ以上の追加のドメインを有する融合タンパク質として合成及び発現させることもできる。検出及び精製を容易にするドメインには、例えば、固定化金属上での精製を可能にするポリヒスチジン鎖及びヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにFLAGS伸長/アフィニティー精製系（Immunex Corp, Seattle WA）で利用されるドメインが含まれる。精製ドメインとモチーフ含有ペプチド又はポリペプチドとの間に、Ｘａ因子又はエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA）のような切断可能リンカー配列を含めることは、精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、６個のヒスチジン残基と、それに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位に結合したエピトープコード核酸配列を含むことができる（例えば、Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414を参照すること）。ヒスチジン残基は、検出及び精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクター及び融合タンパク質の適用に関する技術は、科学及び特許文献に十分に記載されている（例えば、Kroll  (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53を参照すること）。
【００８６】
転写及び翻訳制御配列
本発明は、ＲＮＡ合成／発現を誘導又は調節するために発現（例えば、転写又は翻訳）制御配列、例えばプロモーター又はエンハンサーに機能的に結合した本発明の核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を提供する。発現制御配列は、発現ベクターに存在することができる。例示的な細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ及びｔｒｐが含まれる。例示的な真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ及びマウスのメタロチオネインＩが含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」には、細胞、例えば植物又は動物細胞においてコード配列の転写を駆動できる全ての配列が含まれる。したがって、本発明の構築物で使用されるプロモーターには、遺伝子の転写のタイミング及び／又は速度の調節又は調整に関与するシス作用性転写制御エレメント及び調節配列が含まれる。例えば、プロモーターは、転写調節に関わる、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組み込み配列、5'及び3'非翻訳領域又はイントロン配列を含むシス作用性転写制御エレメントであることができる。これらのシス作用性配列は、タンパク質又は他の生物学的分子と相互作用して、転写（転写のＯＮ／ＯＦＦ、調節又は調整など）を実行する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で、及び生育又は細胞分化の状態で連続的に発現を駆動するプロモーターである。「誘導性」又は「調節可能」プロモーターは、環境条件又は生育条件の影響下で本発明の核酸の発現を誘導する。誘導性プロモーターにより転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気的条件、高温、乾燥又は光の存在が含まれる。
【００８７】
「組織特異的」プロモーターは、例えば植物又は動物の特定の細胞又組織又は器官でのみ活性がある転写制御エレメントである。組織特異的調節は、所定の組織に特異的なタンパク質をコードする遺伝子が発現することを確実にする特定の固有因子によって達成できる。そのような因子は、哺乳動物及び植物に存在し、特定の組織を発達させることが知られている。
細菌でのポリペプチド発現に適切なプロモーターには、E. coliのｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、及びマウスのメタロチオネインＩプロモーターが含まれる原核若しくは真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターも使用することができる。細菌でのポリペプチド又はそのフラグメントの発現に適切なプロモーターには、 E. coliのｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰRプロモーター、ラムダＰLプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真菌プロモーターには、α因子プロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、及びマウスのメタロチオネインＩプロモーターが含まれる。原核若しくは真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターも使用することができる。
【００８８】
組織特異的植物プロモーター
本発明は、組織特異的な方法で発現させることができる、例えば組織特異的な方法で、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を発現させることができる発現カセットを提供する。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を組織特異的な方法で発現する植物又は種子も提供する。組織特異性は、種子特異的、茎特異的、葉特異的、根特異的、果実特異的などであることができる。
用語「植物」には、植物体全体、植物の部分（例えば、葉、茎、花、根など）、植物のプロトプラスト、種子及び植物細胞、並びにこれらの子孫が含まれる。本発明の方法で使用できる植物の部類は、一般的に、形質転換技術を施しやすい高等植物の部類と同様に広く、被子植物（単子葉及び双子葉植物）並びに裸子植物が含まれる。これには、倍数体、二倍体、半数体及び半接合状態が挙げられる多様な倍数性レベルを有する植物が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「トランスジェニック植物」には、異種核酸配列、例えば本発明の核酸及び種々の組換え構築物（例えば、発現カセット）が挿入された植物又は植物細胞が含まれる。
【００８９】
一つの特徴において、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターを、植物若しくは種子の特定の部分又は植物全体における発現に使用することができる。例えば、過剰発現のために、植物の幾つかの又は全ての組織、例えば再生植物で核酸の発現を誘導する植物プロモーターフラグメントを用いることができる。そのようなプロモーターは、本明細書では「構成的」プロモーターと呼ばれ、ほとんどの環境条件下及び生育又は細胞分化状態で活性である。構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Agrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡ由来１’−又は２’−プロモーター、及び当業者に既知の種々の植物遺伝子の他の転写開始領域が含まれる。そのような遺伝子には、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のＡＣＴ１１（Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139）;ArabidopsisのＣａｔ３（GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203）；アブラナ（Brassica napus）のステアロイル−アシル担体タンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176);トウモロコシのＧＰｃ１（GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208:551-565);トウモロコシのＧｐｃ２（GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112);米国特許第４，９６２，０２８号、同第５，６３３，４４０号に記載された植物プロモーターが含まれる。
【００９０】
本発明は、ウイルス由来の組織特異的又は構成的プロモーターを使用する。これは、例えば、トバモウイルスのサブゲノムプロモーター（Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683）；感染したイネの師部細胞でのみ複製し、強力な師部特異的レポーター遺伝子発現を駆動するプロモーターを有する、イネのツングロかん菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）；維管束エレメント、葉の葉肉細胞及び根の先端で最も強い活性を有する、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣＶＭＶ）プロモーター（Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139）を含む得る。
一つの特徴において、植物プロモーターは、特定の組織、器官又は細胞型においてセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現核酸の発現を誘導するか（すなわち、組織特異性プロモーター）、そうでなければ、より厳密な条件下若しくは生育制御下、又は誘導性プロモーターの制御下で前記発現を誘導し得る。転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気性条件、高温、光の存在、又は化学物質／ホルモンの噴霧が含まれる。例えば、本発明には、トウモロコシの乾燥誘導性プロモーター（Busk (1997) supra）；ジャガイモの低温、乾燥及び高塩誘導性プロモーター（Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897 909）が組み込まれる。
【００９１】
一つの特徴において、組織特異的プロモーターは、組織内において生育段階の一定の期間内でのみ転写を促進する。例えば、ArabidopsisのＬＥＡＦＹ遺伝子のプロモーターを特徴決定する、Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800を参照すること。また、A. thalianaの花の分裂組織同一性遺伝子ＡＰ１のプロモーター領域中の保存配列モチーフを認識する転写因子ＳＰＬ３について記載している、Cardon (1997) Plant J 12:367-77、及び分裂組織プロモーターｅＩＦ４について記載している、 Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp 995-1004を参照すること。特定の組織の生活環の全体を通して活性である組織特異的プロモーターを使用することができる。一つの特徴において、本発明の核酸は、主に綿繊維細胞でのみ活性であるプロモーターに機能的に結合している。一つの特徴において、本発明の核酸は、例えばRinehart (1996) supraに記載されているように、主に綿繊維細胞の伸張期間に活性であるプロモーターに機能的に結合する。核酸は、綿繊維細胞で優先的に発現されるＦｂｌ２Ａ遺伝子プロモーターに機能的に結合することができる（同書）。また、綿繊維細胞特異的プロモーター及びトランスジェニック綿植物を構築する方法が記載されている、John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al.、米国特許第５，６０８，１４８号及び同第５，６０２，３２１号を参照すること。根特異的プロモーターを本発明の核酸の発現に使用することもできる。根特異的プロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが含まれる（DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60）。本発明の核酸を発現するのに使用できる他のプロモーターには、例えば、胚珠特異的、胚特異的、内胚葉特異的、珠皮特異的、種子外皮特異的プロモーター又はこれらの幾つかの組合せ；葉特異的プロモーター（例えば、トウモロコシの葉特異的プロモーターが記載されている、Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295を参照すること）；アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のＯＲＦ１３プロモーター（根で高い活性を示す。例えばHansen (1997) supraを参照すること）；トウモロコシの花粉特異的プロモーター（例えば、Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168を参照すること）；果実成熟時、葉及び頻度は低いが花の老化及び離脱時に活性であるトマトのプロモーター（例えば、Blume (1997) Plant J. 12:731 746を参照すること）；ジャガイモのＳＫ２遺伝子のめしべ特異的プロモーター（例えば、 Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425 431を参照すること）；トランスジェニックアルファルファの栄養及び花茎頂の表皮組織で活性であり、活発に生長しているシュート又は繊維の表皮層で外来遺伝子の発現を標的にするのに有用なツールとなる、エンドウマメのＢｌｅｃ４遺伝子；珠皮特異的ＢＥＬ１遺伝子（例えば、Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944を参照すること）；並びに／又は、分裂組織及び／若しくは急速に分裂している細胞で高レベルの転写を付与することができる植物プロモーター領域について記載している、米国特許第５，５８９，５８３号（Klee）のプロモーターが含まれる。
【００９２】
一つの特徴において、本発明の核酸を発現させるためにオーキシンのような植物ホルモンへの暴露により誘導することができる植物プロモーターが使用される。例えば、本発明は、ダイズ（Glycine max L.）のオーキシン応答エレメントＥ１プロモーターフラグメント（ＡｕｘＲＥ）（Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407）；オーキシン応答ArabidopsisＧＳＴ６プロモーター（サリチル酸及び過酸化水素にも反応性である）（Chen (1996) Plant J. 10: 955-966）；タバコのオーキシン誘導性ｐａｒＣプロモーター（Sakai (1996) 37:906-913)）；植物ビオチン応答エレメント（Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937）；及びストレスホルモンアブシジン酸に応答するプロモーター（Sheen (1996) Science 274:1900-1902）を使用することができる。
【００９３】
本発明の核酸は、除草剤又は抗生物質のような、植物に適用できる化学試薬への暴露により誘導することができる植物プロモーターに機能的に結合していることもできる。例えば、ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される、トウモロコシのＩｎ２−２プロモーターを使用することができ（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）、異なる除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、及び茎頂分裂組織での発現を含む、別個の遺伝子発現パターンが誘導される。コード配列は、例えばAvena sativa L.（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むタバコのトランスジェニック植物について記載されたように（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）、例えばテトラサイクリン誘導プロモーターの制御下に、又はサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下に置くことができる。化学的に（例えばホルモン又は殺虫剤によって）誘導されるプロモーター、すなわち野外でトランスジェニック植物に適用することができる化学物質に対して応答するプロモーターを使用して、本発明のポリペプチドの発現を、植物の生育の特定の段階で誘導することができる。したがって、本発明は、また、その宿主域が、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ダイズ、トマト、コムギ、ジャガイモ又は他の農作物のような標的植物種に限定される、農作物の任意の生育段階で誘導可能な本発明のポリペプチドをコードする誘導性遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供する。
当業者は、組織特異的植物プロモーターが、標的組織以外の組織で機能的に結合した配列の発現を駆動することができることを理解するであろう。したがって、一つの特徴において、組織特異的プロモーターは、標的組織又は細胞型で優先的に発現を駆動するが、他の組織でも同様にある程度の発現をもたらすことができるプロモーターである。
【００９４】
本発明の核酸は、化学試薬への暴露により誘導される植物プロモーターに機能的に結合することもできる。これらの試薬には、例えば、除草剤、合成オーキシン又は抗生物質が含まれ、これらはトランスジェニック植物に適用すること、例えば噴霧することができる。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素産生核酸の誘導性発現によって、栽培者は最適なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ発現及び／又は活性を有する植物を選択することが可能になる。したがって植物の部分の生育を制御することができる。このようにして、本発明は、植物及び植物の部分の収穫を促進する手段を提供する。例えば、様々な実施態様において、ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される、トウモロコシのＩｎ２−２プロモーターが使用され（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）、異なる除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、及び茎頂分裂組織での発現を含む、別個の遺伝子発現パターンが誘導される。本発明のコード配列は、また、例えばAvena sativa L.（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含有するタバコのトランスジェニック植物について記載されたように（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）、テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下、又はサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下である。
幾つかの態様において、適切なポリペプチド発現には、コード領域の３’末端のポリアデニル化領域を必要とする場合がある。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、多様な他の植物（若しくは動物、若しくは他の）遺伝子、又はアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡの遺伝子に由来することができる。
【００９５】
発現ベクター及びクローニングビヒクル
本発明は、本発明の核酸、例えば本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする配列を含む発現ベクター及びクローニングビヒクルを提供する。本発明の発現ベクター及びクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びＳＶ４０の誘導体）、Ｐ１系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、並びに目的の特定宿主（例えば、バチルス、アスペルギルス及び酵母）に特異的な他の任意のベクターを含むことができる。本発明のベクターは、染色体配列、非染色体配列及び合成ＤＮＡ配列を含むことができる。多数の適切なベクターが当業者に知られており、市販されている。例示的なベクターには、細菌系：pQE（商標）ベクター（Qiagen）、pBLUESCRIPT（商標）プラスミド、pＮＨベクター、（ラムダ−ＺＡＰベクター（Stratagene）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Pharmacia）；真核細胞系：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Pharmacia）が含まれる。しかし、あらゆる他のプラスミド又は他のベクターも、それらが宿主内で複製可能かつ生存可能である限り、使用することができる。低コピー数又は高コピー数ベクターを、本発明において用いることができる。「プラスミド」は、市販されているか、制限なく公的に入手可能であるか、又は発表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築することができる。本明細書に記載されたものと同等なプラスミドが当該技術で既知であり、当業者には明白である。
【００９６】
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含むことができる。ベクターは、発現を増幅させるために、適切な配列を含むこともできる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を含むことができる。幾つかの態様において、ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
一つの特徴において、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。そのような選択可能なマーカーには、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を付与する遺伝子、E. coliではテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS. cerevisiaeのＴＲＰ１遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベクター又は選択可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、望ましい任意の遺伝子から選択することができる。
【００９７】
一つの特徴において、真核細胞でポリペプチド又はそのフラグメントを発現させるベクターは、発現レベルを高めるためにエンハンサーを含む。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、長さが約１０〜約３００bpであることができる。これらはプロモーターに作用してその転写を高めることができる。例示的なエンハンサーには、複製起点の後期側１００bp〜２７０bpにあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる
核酸配列を多様な手順によってベクターに挿入することができる。一般に、配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物及びベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑末端を連結することもできる。例えばAusubel and Sambrookに記載されているように、多様なクローニング技術が当該技術で既知である。そのような手順及び他の手順は、当業者の技術範囲内であると認められる。
【００９８】
ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子又はファージの形態をであることができる。他のベクターには、染色体配列、非染色体配列及び合成ＤＮＡ配列、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞及び真核細胞宿主で使用される多様なクローニングベクター及び発現ベクターは、例えばSambrookに記載されている。
使用できる具体的な細菌ベクターには、周知のクローニングベクターのｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、ＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐＤ１０、ｐｓｉＸ１７４ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia）、ｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７の遺伝子エレメントを含む、市販のプラスミドが含まれる。具体的な真核細胞ベクターには、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Pharmacia）が含まれる。しかし、任意の他のベクターを、宿主細胞内で複製可能かつ生存可能である限り使用することができる。
【００９９】
本発明の核酸を、発現カセット、ベクター又はウイルスで発現させることができ、植物細胞及び種子で一過性又は安定的に発現させることができる。一つの例示的な一過性発現系は、エピソーム発現系、例えば、スーパーコイルＤＮＡを含むエピソームミニ染色体の転写によって核内で生成されるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）のウイルスＲＮＡを使用する（例えば、Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637を参照すること）。あるいは、コード配列、すなわち本発明の配列の全又は部分フラグメントを植物宿主細胞ゲノムに挿入して、宿主染色体ＤＮＡの一部分となることができる。センス又はアンチセンス転写物を、この方法で発現させることができる。本発明の核酸からの配列（例えば、プロモーター又はコード配列）を含むベクターは、植物細胞又は種子に選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むことができる。例えば、マーカーは、殺生剤耐性、例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性のような抗生物質耐性、又はクロロスルフロン若しくはBasta対する耐性のような除草剤耐性をコードすることができる。
【０１００】
植物で核酸及びタンパク質を発現することができる発現ベクターは、当該技術で周知であり、例えば、Agrobacterium spp、ジャガイモウイルスＸ（例えば、Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3684を参照すること）、タバコモザイクウイルス（例えば、Casper (1996) Gene 173:69-73を参照すること）、トマトブッシースタントウイルス（例えば、Hillman (1989) Virology 169:42-50を参照すること）、タバコエッチウイルス（例えば、Dolja (1997) Virology 234:243-252を参照すること）、ビーンゴールデンモザイクウイルス（例えば、Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476を参照すること）、カリフラワーモザイクウイルス（例えば、Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101を参照すること）、トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子（例えば、Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161194を参照すること）、及びトウモロコシサプレッサー−ミューテーター（Ｓｐｍ）転移因子（例えば、Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725を参照すること）、並びにこれらの誘導体のベクターを含むことができる。
【０１０１】
一つの特徴において、発現ベクターは、２つの生物、例えば、発現のため哺乳動物細胞又は昆虫細胞で維持され、クローニング及び増幅のために原核細胞宿主で維持されることが可能なように、２つの複製系を有することができる。更に、組み込み発現ベクターでは、発現ベクターは宿主細胞ゲノムと相同性のある少なくとも１つの配列を含むことができる。この発現ベクターは、発現構築物にフランキングする２つの相同性配列を含むことができる。組み込みベクターは、ベクター内に含まれる適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞の特定の座位を指向することができる。組み込みベクターのための構築物は、当該技術でよく知られている。
本発明の発現ベクターは、形質転換された細菌株の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含むこともでき、例えば、遺伝子は、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンのような薬剤に対して耐性にする遺伝子である。選択可能なマーカーは、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路の遺伝子のような、生合成遺伝子を含むこともできる。
【０１０２】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に機能的に結合して、ＲＮＡ合成を誘導する。特に指定される細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰR、ＰL及びｔｒｐが含まれる。真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ及びマウスのメタロチオネインＩが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者の技能の範囲内である発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含むこともできる。ベクターは、発現を増幅させるために、適切な配列を含むこともできる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベクター又は選択可能なマーカーを有する他のベクターを使用して、望ましい任意の遺伝子から選択できる。加えて、一つの態様において、発現ベクターは、真核細胞培養においてジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性のような形質転換宿主細胞を選択するための表現型特性を与えるため、又はE. coli.においてテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性を与えるため、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【０１０３】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を含むこともできる。幾つかの態様において、ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
真核細胞でポリペプチド又はそのフラグメントを発現させるベクターは、発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むこともできる。エンハンサーは、通常長さが約１０〜約３００bpである、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、その転写を高めるプロモーターとして作用する。例には、複製起点の後期側１００bp〜２７０bpにあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
加えて、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。そのような選択可能なマーカーには、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を付与する遺伝子、E. coliではテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS. cerevisiaeのＴＲＰ１遺伝子が含まれる。
【０１０４】
幾つかの態様において、本発明のポリペプチド又は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントの１つをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列と共に適切な局面で構築される。一つの態様において、核酸は、本発明のポリペプチド又は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むフラグメントの１つが、安定性の増強又は精製の簡便化のような所望の特性を付与するＮ−末端識別ペプチドのような異種ペプチド又はポリペプチドと融合する、融合ポリペプチドをコードすることができる。
【０１０５】
適切なＤＮＡ配列を、多様な手順でベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物及びベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑末端を連結することもできる。多様なクローニング技術が、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989）で開示されている。そのような手順及び他の手順は、当業者の技術範囲内であると認められる。
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であることができる。他のベクターには、染色体配列、非染色体配列及び合成ＤＮＡ配列、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞及び真核細胞宿主で使用される多様なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)に記載されている。
【０１０６】
宿主細胞及び形質転換細胞
本発明は、本発明の核酸配列、例えば本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする配列、又は本発明のベクターを含む形質転換細胞も提供する。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を含む、当業者に周知の宿主細胞のいずれであってもよい。例示的な細菌細胞には、ストレプトミセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）若しくはバチルス（Bacillus）のいずれかの種、又は例示的な種の大腸菌（E. coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）が含まれる。例示的な昆虫細胞には、ドロソフィラS2（Drosophila S2）及びスポドプテラSf9（Spodoptera Sf9）を含む、Spodoptera又はDrosophilaのいずれの種も含まれる。例示的な動物細胞には、ＣＨＯ、ＣＯＳ若しくはボーズメラノーマ、又は任意のマウス若しくはヒト細胞株が含まれる。適切な宿主の選択は当業者の技能の範囲内である。多種多様な高等植物種を形質転換する技術は周知であり、技術及び科学文献に記載されている。例えば、Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477;米国特許第５，７５０，８７０号を参照すること。
【０１０７】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃又はＴｉ媒介遺伝子伝達を含む、多様な技術のうちのいずれを使用して宿主細胞に導入してもよい。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが含まれる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))。
一つの特徴において、本発明の核酸又はベクターは、スクリーニングのために細胞に導入され、したがって核酸はその後の核酸の発現に適した方法で細胞に入る。導入方法は、主に標的細胞型によって決定される。例示的な方法には、ＣａＰＯ4沈殿、リポソーム融合、リポフェクション（例えばLIPOFECTIN（商標））、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが含まれる。候補核酸は、宿主細胞ゲノムに（例えば、レトロウイルス導入により）安定的に組み込まれるか、又は細胞質に一過性若しくは安定的に存在することができる（すなわち、慣例的なプラスミドを使用し、標準的な調節配列、選択マーカーなどを利用する）。多くの医薬的に重要なスクリーニングでは、ヒト又はモデル哺乳動物細胞の標的が必要なので、そのような標的にトランスフェクトすることができるレトロウイルスベクターを使用することができる。
【０１０８】
適切な場合には、操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切なように改変した従来の栄養培地で培養し、形質転換体を選択するか、又は本発明の遺伝子を増幅することができる。適切な宿主株を形質転換し、適切な細胞密度に宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを、適切な手段（例えば温度シフト又は化学的誘導）によって誘導し、細胞を更なる期間培養して所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生させることができる。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的又は化学的手段により破壊することができ、得られた粗抽出物は更なる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来の方法によって破壊することができる。そのような方法は当業者に周知である。発現されたポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法により組換え細胞培養から回収及び精製することができる。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して必要に応じて使用することができる。望ましい場合には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。
【０１０９】
宿主細胞内の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子生成物を産生させることができる。組換え生産手順で用いる宿主細胞に応じて、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることも、グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドは、また、最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことも、含まないこともある。
無細胞翻訳系を本発明のポリペプチドの産生に利用することもできる。無細胞翻訳系は、ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に機能的に結合したプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用することができる。いくつかの態様において、ＤＮＡ構築物を、インビトロ転写反応を実施する前に直鎖化することができる。次に転写ｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球抽出物のような適切な無細胞翻訳抽出物と共にインキュベートして、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生する。
発現ベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼのような形質転換宿主細胞を選択する表現型特性をもたらすため、又は真核細胞培養でネオマイシン耐性をもたらすため、又はE. coli.においてテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性をもたらすために、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。
目的のポリヌクレオチド、例えば本発明の核酸を含む宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切なように変更した従来の栄養培地で培養し、形質転換体を選択するか、又は遺伝子を増幅することができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明白である。次に、特定の酵素活性を有することが同定されるクローンを配列決定して、高められた活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を同定することができる。 
【０１１０】
本発明は、本発明の核酸、例えば、少なくとも約１００個の残基の領域にわたって、本発明の例示的な配列と、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸を含む発現ベクターを含む細胞において、組換えセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を過剰発現する方法を提供する。前記配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析により、若しくは目視検査により決定されるか、又は本発明の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列により決定される。過剰発現は、任意の方法、例えば高活性プロモーター、２シストロンベクターの使用により、又はベクターの遺伝子増幅により実施することができる。 
【０１１１】
本発明の核酸を、インビトロ又はインビボ発現系のいずれかで発現又は過剰発現させることができる。細菌、昆虫、酵母、真菌又は哺乳動物培養を含む任意の細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現又は過剰発現させることができる。過剰発現は、プロモーター、エンハンサー、ベクター（例えば、レプリコンベクター、２シストロンベクターの使用（例えば、Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:295-8を参照すること））、媒質、培養系などを適切に選択することによって実施できる。一つの態様において、細胞系における選択マーカー、例えばグルタミンシンセターゼ（例えば、Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66:55-63を参照すること）を用いた遺伝子増幅を使用して、本発明のポリペプチドを過剰発現する。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を含む、当業者に周知の宿主細胞のいずれであってもよい。適切な宿主の選択は当業者の技能の範囲内である。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃又はＴｉ媒介遺伝子伝達を含む、多様な技術のうちのいずれを使用して宿主細胞に導入してもよい。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが含まれる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))。
【０１１２】
適切な場合には、操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切なように変更した従来の栄養培地で培養し、形質転換体を選択するか、又は本発明の遺伝子を増幅することができる。適切な宿主株を形質転換し、適切な細胞密度に宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを、適切な手段（例えば温度シフト又は化学的誘導）によって誘導することができ、細胞を更なる期間培養して、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生させることができる。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的又は化学的手段により破壊することができ、得られた粗抽出物は更なる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来の方法によって破壊することができる。そのような方法は当業者に周知である。発現されたポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養から回収及び精製することができる。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して、必要に応じて使用することができる。望ましい場合には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。
多様な哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現することもできる。哺乳動物発現系の例には、サル類腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Gluzman, Cell, 23:175, 1981に記載されている）、及びＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株のような同等のベクターからタンパク質を発現することできる他の細胞株が含まれる。
【０１１３】
宿主細胞内の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子生成物を産生することができる。組換え産生手順で用いる宿主細胞に依存して、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることもされないこともある。本発明のポリペプチドは、また、最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことも、含まないこともある。
あるいは、例えば下記で考察されるような従来のペプチド合成により、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含む本発明のポリペプチド又はフラグメントを合成的に作製することができる。他の特徴において、ポリペプチドのフラグメント又は一部分を用いて、ペプチド合成により対応する完全長ポリペプチドを作製することができ、したがって、完全長ポリペプチドを作製する中間体としてこれらのフラグメントを用いることができる。
ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に機能的に結するプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用して、無細胞翻訳系を用いて本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０又はそれ以上の連続したアミノ酸を含むそのフラグメントの１つを作製することもできる。いくつかの特徴において、インビトロ転写反応を実施する前にＤＮＡ構築物を直鎖化することができる。次に転写ｍＲＮＡをウサギ網状赤血球抽出物のような適切な無細胞翻訳抽出物と共にインキュベートして、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生する。
【０１１４】
核酸の増幅
本発明を実施するに際し、本発明の核酸、及び本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸、又は本発明の改変核酸を、増幅、例えばＰＣＲによって複製することができる。増幅は、本発明の核酸のクローン化又は改変にも使用することができる。したがって、本発明は、本発明の核酸を増幅する増幅プライマー配列対を提供する。当業者は、これらの配列の任意の部分又は完全長のために増幅プライマー配列対を設計することができる。
【０１１５】
一つの特徴において、本発明は、本発明の増幅プライマー対により、例えば本発明の核酸の最初（５’）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基、及びその相補鎖の最初（５’）の約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基により記載されるプライマー対により増幅される核酸を提供する。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する増幅プライマー配列対を提供し、前記プライマー対は、本発明の配列又はそのフラグメント若しくはその部分配列を含む核酸を増幅することができる。増幅プライマー配列対の１つ又はそれぞれのメンバーは、配列の少なくとも約１０〜５０個若しくはそれ以上の連続する塩基、又は配列の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は、増幅プライマー対を提供し、前記プライマー対は、本発明の核酸の最初（’５）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第１のメンバーと、第１メンバーの相補鎖の最初（’５）の約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５個又はそれ以上の残基により記載される配列を有する第２のメンバーとを含む。
【０１１６】
本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるセルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を使用する増幅、例えばＰＣＲによる、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の作製方法を提供する。一つの態様において、増幅プライマー対は、ライブラリーから、例えば環境ライブラリーのような遺伝子ライブラリーから核酸を増幅する。
【０１１７】
増幅反応は、試料中の核酸の量（例えば、細胞試料中のメッセージの量）の定量化、核酸の標識化（例えば、核酸をアレイ又はブロットに適用する）、核酸の検出、又は試料中の特定の核酸の量の定量化のために使用することができる。本発明の一つの特徴において、細胞又はｃＤＮＡライブラリーから単離したメッセージが増幅される。
当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択及び設計することができる。増幅方法は、また、当該技術で周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990)及びPCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.を参照すること）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117を参照すること）、転写増幅（例えば、 Kwoh (1989)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173を参照すること）、自己持続性配列複製（例えば、 Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874を参照すること）、Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491を参照すること）、自動Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271を参照すること）、及び他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontarioを参照すること）が含まれる（また、Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; 米国特許第第4,683,195号及び同第4,683,202号; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564を参照すること）。
【０１１８】
核酸及びポリペプチドの配列同一性の決定
本発明は、本発明の例示的な核酸（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）と、少なくとも約５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０個又はそれ以上の残基の領域にわたって、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性（相同性）を有する配列を含む核酸を提供する。本発明は、本発明の例示的なポリペプチド（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）と、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを提供する。前記配列同一性（相同性）の程度は、ＢＬＡＳＴ  ２．２．２又はＦＡＳＴＡ  ｖｅｒ．３．０ｔ７８のような本明細書に記載されたものを含む、任意のコンピュータプログラム及び付属のパラメーターを初期設定値パラメーターと共に使用して、決定することができる。
【０１１９】
本発明の核酸配列は、本発明の例示的な配列及びそれと実質的に同一の配列の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。本発明の核酸の相同性の配列及びフラグメントは、これらの配列と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性（相同性）を有する配列を指すことができる。前記相同性（配列同一性）は、初期設定値パラメーターを伴うＦＡＳＴＡ  ｖｅｒ．３．０ｔ７８を含む、本明細書に記載された任意のコンピュータプログラム及びパラメーターを使用して決定することができる。相同性配列は本発明の核酸配列においてチミンがウリジンに代わっているＲＮＡ配列も含む。相同性配列は本明細書に記載されている任意の手順を使用して得ることができるか、シークェンシングエラーの修正からも生じ得る。本明細書の核酸配列は、伝統的な一文字様式（Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の内側を参照すること）又は配列内のヌクレオチドの実体を記録する他の任意の様式で表現することができることが理解される。
【０１２０】
多様な特徴において、本明細書で確認された配列比較プログラムを、本発明のこの特徴において、すなわち、核酸又はポリペプチド配列が本発明の範囲内であるかを決定するために使用される。しかし、タンパク質及び／又は核酸配列同一性（相同性）は、当該技術で既知の任意の配列比較アルゴリズム又はプログラムを使用して評価することができる。そのようなアルゴリズム又はプログラムには、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ及びＣＬＵＳＴＡＬＷが含まれるが、決してこれらに限定はされない（例えば、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993を参照すること）。
【０１２１】
一つの特徴において、相同性又は同一性は、配列分析ソフトウエアを使用して測定される（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705を参照すること）。そのようなソフトウエアは、種々の欠失、置換及び他の改変に対する相同性の程度を決めることにより、類似の配列をマッチさせる。一つの特徴において、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して用語「相同性」及び「同一性」は、比較ウインドウ又は指定の領域上で、任意の数の配列比較アルゴリズムを使用するか又は手動アラインメント及び目視検査により測定にして最大一致を求めて比較及びアラインメントを実施したとき、同じであるか又は特定の率のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドが同じである２つ以上の配列を意味する。一つの態様において、配列比較では、一方の配列は基準配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験及び基準配列はコンピュータに入力され、必要な場合には部分配列同等物が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。初期設定値プログラムパラメーターを使用することができるか、又は代替パラメーターを指定することもできる。次に配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一率を計算する。
【０１２２】
本明細書で使用されるとき、「比較ウインドウ」には、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに通常には約１００〜約１５０からなる群より選択される隣接位置の数の任意の数のセグメントに対する参照が含まれ、配列を、２つの配列の最適アラインメントが実施された後、同じ数の隣接位置の基準配列と比較することができる。配列比較のアラインメントを実施する方法は当該技術でよく知られている。配列比較のための最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970の相同性アラインメントアルゴリズム、person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）又は手動アラインメントと目視検査により実施することができる。相同性又は同一性を決定する他のアルゴリズムには、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）に加えて、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ(Analysis of Multiply Aligned Sequences)、ＡＭＰＳ(Protein Multiple Sequence Alignment)、ＡＳＳＥＴ(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ(Biological Sequence Comparative Analysis Node)、ＢＬＩＭＰＳ(BLocks IMProved Searcher)、ＦＡＳＴＡ、Intervals & Points、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、Smith-Watermanアルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、Las Vegasアルゴリズム、ＦＮＡＴ(Forced Nucleotide Alignment Tool)、Framealign、Framesearch、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ(Fristensky Sequence Analysis Package)、ＧＡＰ(Global Alignment Program)、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、GenQuest、ＩＳＳＣ(Sensitive Sequence Comparison)、ＬＡＬＩＧＮ(Local Sequence Alignment)、ＬＣＰ(Local Content Program)、ＭＡＣＡＷ(Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench)、ＭＡＰ(Multiple Alignment Program)、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、ＳＡＧＡ(Sequence Alignment by Genetic Algorithm)及びＷＨＡＴ−ＩＦが含まれる。そのようなアラインメントプログラムを、ゲノムデータベースをスクリーニングするために使用して、実質的同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定することもできる。多数のゲノムデータベースが入手可能であり、例えば、ヒトゲノムの実質的な部分が、 Human Genome Sequencing Project  (Gibbs, 1995)の一部として入手可能である。例えば、M. genitalium (Fraser et al., 1995)、M. jannaschii (Bult et al., 1996)、H. influenzae (Fleischmann et al., 1995)、E. coli (Blattner et al., 1997)及び酵母(S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997)並びにD. melanogaster (Adams et al., 2000)を含む、少なくともの２１個の他のゲノムが既に配列決定されている。また、顕著な進展が、マウス、C. elegans及びArabadopsis sp.ようなモデル生物体のゲノムの配列決定において起きている。幾つかの機能的情報の注釈をもつゲノム情報を含む幾つかのデータベースが、種々の機関で維持されており、インターネットでアクセスすることができる。
【０１２３】
一つの特徴において、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムが使用され、これらは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウエアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列内の長さがＷの短いワードを同定することによって高スコアをもつ配列対（ＨＳＰ）を最初に同定し、これは、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するか又はいくらかの正の値をもつ閾値スコアＴの条件を満たす。Ｔは近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., supra）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索開始のシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下降したとき；累積スコアが、１つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために０若しくはそれ以下になったとき；又はどちらかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定値として１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照すること）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【０１２４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、また、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993を参照すること）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される一つの類似性測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然によって生じる確率を示す。例えば、試験核酸と基準核酸の比較で最小合計確率が約０．２未満、更に一つの態様では、約０．０１未満、更には一つの態様において約０．００１未満である場合、核酸は基準配列と類似であると考えられる。
【０１２５】
一つの態様において、タンパク質及び核酸配列の相同性は、Basic Local Alignment Search Tool（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して評価される。特に、５つの特別なＢＬＡＳＴプログラムを使用して以下のタスクを実施することができる：
（１）ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴ３は、アミノ酸の問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチドの問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸは、問い合わせヌクレオチド配列（その両方の鎖）の仮想的な６つのフレームの翻訳生成物をタンパク質配列データベースと比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは、問い合わせタンパク質配列（両方の鎖）を全ての６つの読み枠で翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する；及び
（５）ＴＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチド問い合わせ配列の６つの読み枠翻訳物をヌクレオチド配列データベースの６つの読み枠翻訳物と比較する。
【０１２６】
ＢＬＡＳＴプログラムは、類似のセグメントを同定することにより相同性のある配列を同定し、これは、本明細書では、問い合わせアミノ酸又は核酸配列と試験配列との間の「高スコアセグメント対」と呼ばれ、一つの態様では、タンパク質又は核酸配列データベースから得られる。高スコアセグメント対は、一つの態様では、その多くが当該技術で既知であるスコアリングマトリックスにより同定される（すなわち、アラインメントが実施される）。一つの態様において、使用されるスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Gonnet (1992) Science 256:1443-1445; Henikoff and Henikoff (1993) Proteins 17:49-61）。一つの態様において、好ましさは劣るが、ＰＡＭ又はＰＡＭ２５０も使用することができる（例えば、Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships:  Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundationを参照すること）。ＢＬＡＳＴプログラムは、U.S. National Library of Medicineを通して利用可能である。 
上記のアルゴリズムで使用されるパラメーターは、研究される配列の長さ及び相同性の程度に応じて適合することができる。幾つかの態様において、パラメーターは、ユーザーからの指示が不在の場合では、アルゴリズムにより使用される初期設定値パラメーターであることができる。
【０１２７】
コンピュータシステム及びコンピュータプログラム製品
本発明は、本発明の核酸及びポリペプチド配列を記録又は記憶した、コンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータ読み出し可能媒体、コンピュータプログラム製品などを提供する。加えて、本発明の方法を実施するに際し、例えば、配列同一性（核酸が本発明の範囲内であるかを決定すること）、構造的相同性、モチーフなどをコンピュータシステムで決定及び同定するために、本発明の核酸又はポリペプチド配列を、コンピュータによって読み取り及びアクセスすることができる任意の媒体に記憶し、記録し、媒体により操作することができる。
【０１２８】
本明細書で使用されるとき、「記録」及び「記憶」という言葉は、コンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを意味する。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録するあらゆる既知の方法を容易に適用して、本発明の１つ以上の核酸及び／又はポリペプチド配列を含む製品を生じることができる。本明細書で使用されるとき、用語「コンピュータ」、「コンピュータプログラム」及び「プロセッサ」は、最も広い一般的な状況において使用され、下記に詳細に記載されるような装置が全て組み込まれる。特定のポリペプチド又はタンパク質の「コード配列」又はそれを「コードする配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される核酸配列である。
【０１２９】
本発明のポリペプチドは、本発明の例示的な配列、及びそれに実質的に同一の配列、並びに前記の配列のいずれかの部分配列（フラグメント）を含む。一つの特徴において、実質的に同一性又は相同性のポリペプチド配列は、本発明の例示的な配列と、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性（相同性）を有するポリペプチド配列を意味する。
【０１３０】
相同性（配列同一性）は、本明細書に記載される任意のコンピュータプログラム及びパラメーターを使用して決定することができる。本発明の核酸又はポリペプチドを、コンピュータにより読み取り及びアクセスできる任意の媒体に記憶すること、記録すること、及び媒体で操作することができる。本明細書で使用されるとき、「記録」及び「記憶」という言葉は、コンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを意味する。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録する現在知られているいずれかの方法を容易に適用して、本発明の１つ以上の核酸配列、本発明の１つ以上のポリペプチド配列を含む製品を生じることができる。本発明の別の特徴では、本発明の少なくとも２、５、１０、１５若しくは２０個、又はそれ上の核酸又はポリペプチド配列を記録する、コンピュータ読み取り可能媒体である。
【０１３１】
本発明の別の特徴は、本発明の１つ以上の核酸配列が記録されているコンピュータ読み出し可能媒体である。本発明の別の態様は、本発明の１つ以上のポリペプチド配列が記録されているコンピュータ読み出し可能媒体である。本発明の別の態様は、上記の少なくとも２、５、１０、１５若しくは２０個、又はそれ上の核酸又はポリペプチド配列を記録する、コンピュータ読み出し可能媒体である。
コンピュータ読み出し可能媒体には、磁気により読み出し可能な媒体、光学的に読み出し可能な媒体、電子的に読み出し可能な媒体、及び磁気／光学媒体が含まれる。例えば、コンピュータ読み出し可能媒体は、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、又は読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）、並びに当業者に既知の他のタイプの他の媒体であることができる。
【０１３２】
本発明の別の特徴には、システム（例えば、インターネットを利用したシステム）、例えば、本明細書に記載される配列情報を記憶し、操作するコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステム１００の一つの例が、図１のブロック線図に示されている。本明細書で使用されるとき、「コンピュータシステム」は、本発明の核酸配列のヌクレオチド配列、又は本発明のポリペプチド配列の分析に使用される、ハードウェア構成部分、ソフトウエア構成部分及びデータ記憶構成部分を意味する。一つの特徴において、コンピュータシステム１００は、配列データを処理し、それにアクセスし、それを操作するプロセッサを含む。プロセッサ１０５は、例えばIntel CorporationのPentium（登録商標）III又はSun、Motorola、Compaq、AMD若しくはInternational Business Machinesからの同様のプロセッサのような、周知のタイプの中央演算ユニットのいずれかであることができる。
【０１３３】
一つの特徴において、コンピュータシステム１００は汎用システムであり、プロセッサ１０５及びデータを記憶する１つ以上の内部データ記憶構成部分１１０、及びデータ記憶構成部分に記憶されたデータを検索する１つ以上のデータ検索装置を含む。当業者は、現在入手可能なコンピュータシステムのいずれも適していることを容易に理解することができる。
【０１３４】
一つの特定の特徴において、コンピュータシステム１００は、メインメモリー１１５（一つの態様では、ＲＡＭとして提供される）に接続しているバス接続したプロセッサ１０５、及び１つ以上の内部データ記憶装置１１０、例えばハードドライブ、及び／又はそれにデータが記録される他のコンピュータ読み出し可能媒体を含む。幾つかの態様において、コンピュータシステム１００は、更に、内部データ記憶装置１１０に記憶されたのデータを読み取るための１つ以上のデータ検索装置１１８を含む。
データ検索装置１１８は、例えばフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、又は（例えば、インターネットを介した）遠隔データ記憶システムなどに接続することができるモデムを示すことができる。幾つかの態様において、内部データ記憶装置１１０は、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどのような取り外し可能なコンピュータ読み出し可能媒体であり、制御ロジック及び／又はそれに記録されたデータを含む。コンピュータシステム１００は、有利には、データ検索装置にいったん挿入されたデータ記憶構成部分から制御ロジック及び／又はデータを読み出すための適切なソフトを含むか、又はソフトによってプログラムされることができる。
コンピュータシステム１００は、コンピュータのユーザーに出力結果を表示するために使用されるディスプレー１２０を含む。コンピュータシステム１００は、他のコンピュータシステム１２５ａ−ｃとネットワーク又は広域ネットワークで連結されて、コンピュータシステム１００への中央アクセスを提供することができることに留意するべきである。
【０１３５】
本発明の核酸配列のヌクレオチド配列又は本発明のポリペプチド配列にアクセスし、処理するためのソフトウエア（例えば、検索ツール、比較ツール、及びモデリングツール）は、実行の際にはメインメモリー１１５に存在することができる。
幾つかの特徴において、コンピュータシステム１００は、更に、コンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列をコンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている基準ヌクレオチド又はポリペプチド配列と比較する配列比較アルゴリズムを含むことができる。「配列比較アルゴリズム」は、データ記憶手段内に記憶されている他のヌクレオチド配列及び／又は化合物とヌクレオチド配列を比較するために、コンピュータシステム１００に（端末又は遠隔端末から）提供される１つ以上のプログラムを意味する。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている本発明の核酸のヌクレオチド配列又は本発明のポリペプチド配列をコンピュータ読み出し可能媒体に記憶されている基準配列と比較して、相同性又は構造モチーフを同定することができる。
【０１３６】
図２は、新たなヌクレオチド又はタンパク質配列とデータベースの配列を比較し、新たな配列とデータベースの配列との間の相同性のレベルを決定する方法２００の一つの態様を示す流れ図である。データベースの配列は、コンピュータシステム１００に記憶された個人的なデータベースであるか、又はインターネットを介して利用可能なジェンバンクのような公的なデータベースであることができる。
プロセス２００は、開始状態２０１で始まり、次に比較される新たな配列がコンピュータシステム１００のメモリーに記憶される状態２０２に移行する。上記で考察したように、メモリーは、ＲＡＭ又は内部記憶装置を含む任意のタイプのメモリーであることができる。
次にプロセス２００は、状態２０４に移行し、ここで配列のデータベースが分析及び比較のために開かれる。次にプロセス２００は、データベースに記憶されている第１の配列がコンピュータのメモリーに読み出される状態２０６に移行する。次に比較が状態２１０で実施され、第１の配列が第２の配列と同じであるかが決定される。この工程は、新たな配列とデータベースの第１の配列との間の正確な比較の実施に限定されないことに留意することが重要である。２つのヌクレオチド配列又はタンパク質配列を、たとえそれらが同一ではなくても比較する周知の方法は、当業者には既知である。例えば、ギャップを１つの配列に導入して、これら２つの試験配列間の相同性のレベルを高めることができる。比較の際にギャップ又は他の特徴を配列に導入するかどうかを制御するパラメーターは、通常はコンピュータシステムのユーザーによって入力される。
【０１３７】
いったん２つの配列の比較が状態２１０で実施されたら、決定の状態２１０で２つの配列が同じかの決定が下される。当然のことながら、用語「同じ」は完全に同一である配列に限定されない。ユーザーによって入力された相同性パラメーターの範囲内にある配列は、プロセス２００で「同じ」と示される。
２つの配列が同じであると決定が下されると、プロセス２００は状態２１４に移行し、ここで、データベースからの配列の名称がユーザーに表示される。この状態は、表示された名称の配列が入力した相同性の制約を満たすことをユーザーに知らせる。記憶配列の名称がいったんユーザーに表示されたら、プロセス２００はそれ以上の配列がデータベースに存在するかの決定が下される決定状態２１８に移行する。それ以上の配列がデータベースに存在しない場合には、プロセス２００は終了状態２２０で終了する。しかし、配列がデータベースに更に存在する場合はプロセス２００は状態２２４に移行し、ここでポインターは、データベースの次の配列に移動し、それを新たな配列と比較することができる。このようにして、新たな配列がアラインメントを実施され、データベースのあらゆる配列と比較される。
配列が相同でないという決定が決定状態２１２で下された場合、プロセス２００は、直ちに決定状態２１８に移行し、データベース内に比較される他の配列が存在するかが決定されることに留意するべきである。
【０１３８】
したがって、本発明の一つの態様は、プロセッサ、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を記憶するデータ記憶装置、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列と比較される基準ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列、及び比較を実施する配列コンペアラーを検索可能に記録するデータ記憶装置を含むコンピュータシステムである。配列コンペアラーは、比較される配列間の相同性レベルを示すか、又は本発明の核酸配列若しくは本発明のポリペプチド配列の上記の核酸コードの構造モチーフを同定することができるか、或いは、これらの核酸コード及びポリペプチドコードと比較される配列内の構造モチーフを同定することができる。幾つかの態様において、データ記憶装置は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の配列を記憶することができる。
【０１３９】
本発明の別の特徴は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列と基準ヌクレオチド配列との間の相同性のレベルを決定する方法である。この方法には、相同性を決定するコンピュータプログラムの使用によって核酸コード又はポリペプチドコードと基準ヌクレオチド又はポリペプチド配列を読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コード又はポリペプチドコードと基準ヌクレオチド又はポリペプチド配列との間の相同性レベルを決定することが含まれる。コンピュータプログラムは、本明細書に特に列挙されているもの（例えば、初期設定値パラメーター又は任意の変更パラメーターを伴うＢＬＡＳＴ２Ｎ）を含む、相同性レベルを決定する多数のコンピュータプログラムのいずれかであることができる。この方法は、上記に記載されたコンピュータシステムを使用して適用することができる。この方法は、コンピュータプログラムの使用により少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の上記の本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を読み取ること、及び核酸コード又はポリペプチドコードと基準ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列との間の相同性を決定することにより実施することもできる。
【０１４０】
図３は、２つの配列が相同であるかを決定するコンピュータ処理２５０の一つの態様を示す流れ図である。プロセス２５０は開始状態２５２で始まり、次に比較される第１の配列がメモリーに記憶される状態２５４に移行する。次に比較される第２の配列が状態２５６でメモリーに記憶される。次にプロセス２５０は状態２６０に移行し、そこで第１の配列中の第１の記号が読み取られ、次に状態２６２に移行し、そこで第２の配列の第１の記号が読み取られる。配列がヌクレオチド配列の場合、記号は通常、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ又はＵのいずれかであることが理解されるべきである。配列がタンパク質配列の場合は、一つの特徴では記号は一文字のアミノ酸コードであり、それによって第１及び第２の配列を容易に比較することができる。
【０１４１】
次に２つの記号が同じであるかの決定が決定状態２６４で下される。それらが同じである場合、プロセス２５０は状態２６８に移行し、そこで第１及び第２の配列の次の記号が読み取られる。次に、次の記号が同じであるかの決定が下される。それらが同じものである場合には、プロセス２５０は２つの記号が同じでなくなるまでこのループを繰り返す。次の２つの記号が同じではないという決定が下された場合、プロセス２５０は決定状態２７４に移行して、いずれかの配列に読み取られる記号がそれ以上存在するかどうかが決定される。
読み取られる記号がそれ以上存在しない場合はプロセス２５０は状態２７６に移行し、そこで第１と第２の配列の間の相同性のレベルがユーザーに表示される。相同性レベルは、第１の配列内の記号の総数のうち同じであった配列間の記号の割合を計算することによって決定される。したがって、第２の配列のあらゆる記号と最初の１００個のヌクレオチド配列のあらゆる記号とのアラインメントが達成された場合、相同性レベルは１００％となるであろう。
【０１４２】
あるいは、このコンピュータプログラムは、本発明に記載の核酸のヌクレオチド配列と１つ以上の基準ヌクレオチド配列とを比較して、本発明の核酸コードが１つ以上の位置で基準核酸配列と異なるか否かを決定するコンピュータプログラムであることができる。場合により、そのようなプログラムは基準ポリヌクレオチド又は本発明の核酸配列のいずれかの配列に対して、挿入、欠失又は置換されたヌクレオチドの長さ又は実体を記録する。一つの特徴において、このコンピュータプログラムは本発明の核酸配列が、基準ヌクレオチド配列に対して単一のヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）を含むかを決定するプログラムであることができる。 
【０１４３】
したがって、本発明の別の特徴は、本発明の核酸配列が基準ヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドと異なっているかを決定する方法であって、核酸配列間の相違を同定するコンピュータプログラムの使用により核酸コード及び基準ヌクレオチド配列を読み取る工程、及びコンピュータプログラムにより核酸コードと基準ヌクレオチド配列の間の相違を同定する工程を含む。幾つかの態様において、このコンピュータプログラムは単一のヌクレオチド多型性を同定するプログラムである。この方法は、上記に記載されたコンピュータシステム及び図３に示された方法により適用することができる。この方法は、コンピュータプログラムの使用により少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の本発明の核酸配列及び基準ヌクレオチド配列を読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コードと基準ヌクレオチド配列の間の相違を同定することによって実施することもできる。
【０１４４】
他の特徴において、コンピュータを使用するシステムは、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の特徴を同定するアイデンティファイヤーを更に含むことができる。「アイデンティファイヤー」は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の特定の特徴を同定する１つ以上のプログラムを意味する。一つの態様において、アイデンティファイヤーは、本発明の核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するプログラムを含むことができる。
【０１４５】
図４は、配列中に特徴が存在するかを検出するためのアイデンティファイヤ−プロセス３００の１つの特徴を示す流れ図である。プロセス３００は開始状態３０２で始まり、次に状態３０４に移行し、そこで特徴についてチェックされる第１の配列がコンピュータシステム１００のメモリー１１５に記憶される。次にプロセス３００は状態３０６に移行し、そこでで配列特徴のデータベースが開かれる。そのようなデータベースは、それぞれの特徴の属性リストを特徴の名称とともに含むであろう。例えば、特徴の名称は「開始コドン」であり、その属性は「ＡＴＧ」でありうる。別の例では、特徴の名称は「ＴＡＡＴＡＡボックス」であり、特徴の属性は「ＴＡＡＴＡ」であろう。そのようなデータベースの例は、ウィスコンシン大学のGenetics Computer Groupによって作製されている。あるいは、特徴は、アルファへリックス、ベータシートのような構造的なポリペプチドモチーフ又は酵素活性部位のような機能的ポリペプチドモチーフ、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、又は当業者に既知の他のモチーフであることができる。
【０１４６】
いったん特徴のデータベースが状態３０６で開かれると、プロセス３００は状態３０８に移行し、そこで第１の特徴がデータベースから読み取られる。次に第１の特徴の属性と第１の配列との比較が状態３１０で実施される。次に特徴の属性が第１の配列内で見出されるかの決定が、決定状態３１６で下される。属性が見出された場合、プロセス３００は状態３１８に移行し、そこで見出された特徴の名称がユーザーに表示される
次にプロセス３００は決定状態３２０に移行し、そこでそれ以上の特徴がデータベースに存在するかの決定が下される。それ以上の特徴が存在しない場合には、プロセス３００は終了状態３２４で終了する。しかしそれ以上の特徴がデータベースに存在する場合、プロセス３００は状態３２６で次の配列特徴を読み取り、状態３１０に戻り、そこで次の特徴の属性が第１の配列に対して比較される。特徴の属性が決定状態３１６の第１の配列で見出されない場合、プロセス３００は決定状態３２０に直接移行し、特徴がそれ以上データベースに存在するかを決定することに留意するべきである。
【０１４７】
したがって、本発明の別の特徴は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列の特徴を同定する方法であって、特徴を同定するコンピュータプログラムの使用により核酸コード又はポリペプチドコードを読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コード内の特徴を同定することを含む。一つの態様において、コンピュータプログラムは、オープンリーディングフレームを同定するコンピュータプログラムを含む。この方法は、コンピュータプログラムの使用により、単一の配列を読み取るか、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０若しくは４０個、又はそれ以上の本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を読み取ること、及びコンピュータプログラムにより核酸コード又はポリヌクレオチドコードの特徴を同定することによって実施することもできる。
【０１４８】
本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を、種々のデータプロセッサプログラムにより多様な様式で記憶及び操作することができる。例えば、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列を、Microsoft WORD（商標）又はWORDPERFECT（商標）のようなワードプロセッシングファイルでテキストとして、又はDB2（商標）、SYBASE（商標）又はORACLE（商標）のような当業者に周知の多様なデータベースプログラムでアスキーファイルとして記憶することができる。加えて、多くのコンピュータプログラム及びデータベースを、配列比較アルゴリズム、アイデンティファイヤー、又は本発明の核酸配列若しくは本発明のポリペプチド配列と比較される基準ヌクレオチド配列若しくはポリペプチド配列の供給源として使用することができる。以下のリストは、本発明を制限することを意図せず、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列に有用であるプログラム及びデータベースの指針を提供することを意図する。
【０１４９】
使用できるプログラム及びデータベースには、以下が含まれるが、これらに限定はされない：MACPATTERN（商標）(EMBL)、DISCOVERYBASE（商標）(Molecular Applications Group)、GENEMINE（商標）(Molecular Applications Group)、LOOK（商標）(Molecular Applications Group)、MACLOOK（商標）(Molecular Applications Group)、BLAST及びBLAST2 (NCBI)、BLASTN及びBLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990)、FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988)、FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、CATALYST（商標）(Molecular Simulations Inc.)、Catalyst/SHAPE（商標）(Molecular Simulations Inc.)、 Cerius2.DBAccess（商標）(Molecular Simulations Inc.)、HYPOGEN（商標）(Molecular Simulations Inc.)、INSIGHT II（商標）(Molecular Simulations Inc.)、DISCOVER（商標）(Molecular Simulations Inc.)、CHARMm（商標）(Molecular Simulations Inc.)、FELIX（商標）(Molecular Simulations Inc.)、DELPHI（商標）(Molecular Simulations Inc.)、QuanteMM（商標）(Molecular Simulations Inc.)、Homology (Molecular Simulations Inc.)、MODELER（商標）(Molecular Simulations Inc.)、ISIS（商標）(Molecular Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.)、WebLab (Molecular Simulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.)、Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.)、SeqFold (Molecular Simulations Inc.)、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medicinal Chemistryデータベース、Derwents's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース及びGenseqnデータベース。本発明の開示を考慮すると、他の多くのプログラム及びデータベースが当業者には明白であろう。
上記のプログラムを使用して検出することができるモチーフには、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターンーヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファヘリックス、ベータシート、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックスのような転写調節に関与する配列、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位及び酵素切断部位をコードする配列が含まれる。
【０１５０】
核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の例示的な配列（例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３又は配列番号１６５（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること））にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離又は組換え核酸を提供する。前記ストリンジェントな条件は、本明細書に記載されている高いストリンジェンシー条件及び低いストリンジェンシー条件を含む、高度にストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件及び／又は低度にストリンジェントな条件であり得る。一つの態様において、下記に考察されるように、核酸が本発明の範囲内のものであるかを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。
【０１５１】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が相補的な鎖と塩基対合によって結合する過程を意味する。ハイブリダイゼーション反応は敏感で選択性があり、そのため目的の特定の配列を、その配列が試料中で低い濃度でしか存在しなくても同定することができる。適切にストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーション溶液中の塩若しくはホルムアミドの濃度によって、又はハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、それれは当該技術でよく知られている。別の特徴において、ストリンジェンシーは、塩濃度の減少、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇によって高めることができる。別の特徴において、本発明の核酸は本明細書で記載される多様な（例えば高度、中程度及び低度の）ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
【０１５２】
一つの態様において、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２℃で約５０％のホルムアルデヒドを含む。一つの態様において、ハイブリダイゼーション条件は、約３０℃〜３５℃での約３５％〜２５％のホルムアルデヒドの低ストリンジェンシー条件を含む。一つの特徴において、ハイブリダイゼーション条件は、例えば４２℃で約５０％ホルムアミド、５xＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ及び２００n/mlのせん断変性サケ精子ＤＮＡという高ストリンジェンシー条件を含む。一つの特徴において、ハイブリダイゼーション条件はこれらの低ストリンジェンシー条件を含むが、３５℃という下げた温度にて３５％のホルムアルデヒド条件を含む。ストリンジェンシーの特定のレベルに対応する温度範囲は、目的の核酸でのプリンとピリミジンの比率を計算し、それに応じて温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記の範囲及び条件の変動は当該技術で周知である。
別の特徴において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される本発明の核酸は、約５個の残基から本発明の核酸の完全長の間であることができ、例えば、これらは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個又はそれ以上の残基の長さであり得る。完全長よりも短い核酸も含まれる。これらの核酸は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、標識プローブ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプローブ、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ（一本若しくは二本鎖）、アンチセンス、又は抗体結合ペプチド（エピトープ）、モチーフ、活性部位などをコードする配列として有用であることができる。
【０１５３】
一つの特徴において、本発明の核酸は、約３７℃〜４２℃で約５０％のホルムアミドの条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。一つの特徴において、本発明の核酸は、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％のホルムアミドの条件を含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
あるいは、本発明の核酸は、４２℃で約５０％ホルムアミド、５xＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ及び反復配列ブロック核酸、例えば、ｃｏｔ−１又はサケ精子ＤＮＡ（例えば２００n/mlのせん断変性サケ精子ＤＮＡ）の条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。一つの態様において、本発明の核酸は、３５℃〜４２℃の低温で３５％〜４０％のホルムアミドを含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
【０１５４】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するのに使用される条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に応じて変わる。例えば、核酸のハイブリダイズされる領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列構成（例えば、ＧＣ対ＡＴの含有量）及び核酸型（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）を、ハイブリダイゼーション条件を選択するに際して考慮することができる。追加的な考慮は、核酸の１つが例えばフィルター上に固定化されているかということである。
【０１５５】
ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーの条件下で実施することができる。核酸ハイブリダイゼーションの例として、固定化変性核酸を含むポリマー膜を、最初に、０．９M  ＮａＣｌ、５０mM  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０、５．０mM  Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０xデンハルト液及び０．５mg/mlのポリリボアデニル酸からなる溶液中、４５℃で３０分間プレハイブリダイズする。次に、およそ２x１０7cpm（比活性４〜９x１０8cpm/ug）の32Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを、溶液に加える。１２〜１６時間のインキュベーションの後、膜を、０．５％ＳＤＳを含有する１xＳＥＴ（１５０mM  ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸塩、ｐＨ７．８、１mM  Ｎａ2ＥＤＴＡ）中、室温で３０分間、続いて、オリゴヌクレオチドプローブのために、新鮮な１xＳＥＴ中、Ｔm−１０℃で３０分間洗浄する。次に膜を、ハイブリダイゼーションシグナルの検出のため、オートラジオグラフフィルムに露出する。前記のハイブリダイゼーションは、全て、高ストリンジェンシー条件下であると考えられる。
【０１５６】
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを洗浄して、非特異的に結合した検出可能なあらゆるプローブを除去することができる。フィルターを洗浄するのに使用するストリンジェンシーは、ハイブリダイズされる核酸の性質、ハイブリダイズされる核酸の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列構成（例えば、ＧＣ対ＡＴの含有量）及び核酸型（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）の応じて変えることもできる。漸進的に高くなるストリンジェンシー条件洗浄の例は、以下である：２xＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で１５分間（低ストリンジェンシー）；０．１xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で３０分間から１時間（中ストリンジェンシー）；０．１xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ハイブリダイゼーション温度、  と６８℃の間で１５〜３０分間（高ストリンジェンシー）；及び０．１５M  ＮａＣｌ、７２℃で１５分間（超高ストリンジェンシー）。最終の低ストリンジェンシー洗浄は、０．１xＳＳＣ中、室温で実施することができる。上記の例は、フィルターを洗浄するのに使用できる一組の条件を説明したに過ぎない。当業者は、多数の異なるストリンジェンシー洗浄の処方が存在することを知っているであろう。他の幾つかの例を下記に示す。
一つの特徴において、ハイブリダイゼーション条件は、１x１５０mM  ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸塩、ｐＨ７．８、１mM  Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳを含む溶液中、室温で３０分間の洗浄、続いて新たな溶液中で３０分間の洗浄を含む。
【０１５７】
プローブにハイブリダイズされた核酸は、オートラジオグラフィー又は他の従来の技術により同定される。
上記の手順を、プローブ配列に対する配列同一性（相同性）のレベルが低い核酸を同定するために、変更することができる。例えば、検出可能なプローブ配列に対して低い配列同一性（相同性）を持つ核酸を得るために、ストリンジェントの程度が低い条件を使用することができる。例えば、ハイブリダイゼーション温度を、およそ１MのＮａ＋濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中、６８℃から４２℃に５℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを２xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによりハイブリダイゼーション温度で洗浄することができる。これらの条件は、５０℃を越える場合「中程度」の条件、５０℃未満の場合「低度」の条件と考えられる。「中程度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが５５℃で実施される場合である。「低度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが４５℃で実施される場合である。
【０１５８】
あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含む６xＳＳＣのような緩衝液中、４２℃の温度で実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミドの濃度を５０％から０％まで５％ずつ減少させて、プローブに対して低いレベルの相同性を有するクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを６xＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにより５０℃で洗浄することができる。これらの条件は、ホルムアルデヒドが２５％を越える場合「中程度」の条件、ホルムアルデヒドが２５％未満である場合「低度」の条件と考えられる。「中程度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが３０％のホルムアルデヒドで実施される場合である。「低度」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが１０％のホルムアルデヒドで実施される場合である。
【０１５９】
しかし、ハイブリダイゼーションの様式の選択は重要ではなく、核酸が本発明の範囲内であるかを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明の範囲内である核酸を同定するのに使用される洗浄条件には、例えば以下が含まれる：ｐＨ７で塩濃度約０．０２M及び少なくとも約５０℃又は約５５℃〜約６０℃の温度；或いは、塩濃度約０．１５M  ＮａＣｌ、７２℃で約１５分間；或いは、塩濃度約０．２xＳＳＣ、少なくとも約５０℃又は約５５℃〜約６０℃の温度で約１５〜２０分間；或いは、ハイブリダイゼーション複合体を０．１％ＳＤＳを含有する約２xＳＳＣの塩濃度の溶液により室温で１５分間２回洗浄し、次に０．１％ＳＤＳを含有する約０．１xＳＳＣにより６８℃で１５分間２回洗浄する；或いは同等な条件。ＳＳＣ緩衝液及び同等な条件について記載は、Sambrook, Tijssen and Ausubelを参照すること。
【０１６０】
これらの方法は、本発明の核酸を単離又は同定するために使用することができる。例えば、前述の方法は、本発明の配列又は１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００個の連続した塩基を含むそのフラグメント及びそれに相補的な配列の１つからなる群より選択される核酸配列に、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性（相同性）を持つ配列を有する核酸を単離又は同定するために使用できる。配列同一性（相同性）は、アラインメントアルゴリズムを使用して測定することができる。例えば、相同性のポリヌクレオチドは、本明細書で記載されているコード配列の１つの天然に存在する対立変種であるコード配列を有すし得る。そのような対立変種は、本発明の核酸と比較したとき、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有し得る。加えて、上記の手順は、配列アラインメントアルゴリズム（例えば、初期設定値パラメーターを伴うＦＡＳＴＡ  ｖｅｒ．３．０ｔ７８アルゴリズム）を使用して決定した場合、本発明のポリペプチド、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個の連続したアミノ酸を含むそのフラグメントに、少なくとも約９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％又は少なくとも５０％の配列同一性（相同性）を有するポリペプチドをコードする核酸を単離するために使用できる。
【０１６１】
オリゴヌクレオチドプローブ及びそれらの使用方法
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、又はそのフラグメントを、例えば同定、増幅又は単離するため、或いはセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子を同定するために使用できる核酸プローブも提供する。一つの態様において、プローブは、本発明の核酸の少なくとも約１０個の連続する塩基を含む。あるいは、本発明のプローブは、本発明の核酸で記載される配列の少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０個、又は約１０〜５０個、約２０〜６０個、約３０〜７０個の連続した塩基であることができる。プローブは、結合及び／又はハイブリダイゼーションにより核酸を同定する。プローブは、例えば、キャピラリーアレイを含む本発明のアレイで使用することができる（下記の考察を参照すること）。本発明のプローブは、他の核酸又はポリペプチドを単離することにも使用できる。
【０１６２】
本発明の単離又は組換え核酸、それに相補的な配列、又は本発明の配列の１つの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の連続した塩基を含むフラグメント、又はそれに相補的な配列を、土壌試料のような生物学的試料が本発明の核酸配列を有する生物又は前記核酸が由来する生物を含むかを決定するプローブとして使用することもできる。そのような手順では、前記核酸が単離された生物を含むかもしれない生物学的試料を得て、その試料から核酸を得る。プローブが試料中に存在する相補性配列のいずれかと特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、前記核酸をそのプローブと接触させる。
【０１６３】
必要な場合には、プローブが相補性配列と特異的にハイブリダイズすることを可能にする条件は、プローブと、相補性配列を含むことが判明している試料からの相補性配列および相補的配列を含まない制御配列とを接触させることによって決定することができる。ばハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度又はハイブリダイゼーションの温度のようなハイブリダイゼーション条件を変えて、プローブが相補性核酸と特異的にハイブリダイズすることを可能にする条件を同定することができる。
【０１６４】
試料が、核酸が単離された生物体を含む場合、プローブの特異的なハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、プローブを、検出可能な作用物質、例えば放射性同位元素、蛍光染料又は検出可能な生成物の形成を触媒できる酵素で標識することにより検出できる。
標識プローブを使用して試料中の相補性核酸の存在を検出する多くの方法が、当業者にはよく知られている。これらには、サザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法及びドットブロットが含まれる。これらの手順のそれぞれのプロトコールが、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. (1997)及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989）で提供されている。 
【０１６５】
あるいは、２つ以上のプローブ（そのうちの少なくとも１つは核酸試料に存在する任意の相補性配列と特異的にハイブリダイズすることができる）を増幅反応で使用して、試料が本発明の核酸配列を含む生物体（例えば、核酸が単離された生物体）を含むか決定することができる。一つの特徴において、プローブはオリゴヌクレオチドを含む。一つの特徴において、前記増幅反応はＰＣＲ反応を含むことができる。ＰＣＲプロトコールは、Ausubel and Sambrook, supraに記載されている。あるいは、増幅は、リガーゼ連鎖反応、３ＳＲ又は鎖置換反応を含むことができる。（例えば、Barany, F., “The Ligase Chain Reaction in a PCR World”, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991; E. Fahy et al., “Self-sustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR”, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991; and Walker G.T. et al., “Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique”, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992を参照すること）。そのような手順において、試料中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を実施し、得られた増幅生成物のいずれかを検出する。増幅生成物は、反応生成物のゲル電気泳動を実施し、ゲルを臭化エチジウムのような挿入剤で染色することによって検出することができる。あるいは、１つ以上のプローブを放射性同位元素で標識し、ゲル電気泳動の後で放射性増幅生成物の存在を検出してもよい。
本発明の配列の末端近くの配列に由来するプローブを染色体ウォーキング法で使用して本発明の配列に隣接して位置するゲノム配列を含むクローンを同定することもできる。そのような方法は宿主生物体からの更なるタンパク質をコードする遺伝子の単離を可能にする。
【０１６６】
一つの特徴において、本発明の単離又は組換え核酸、それに相補的な配列、本発明の配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個、又はそれ以上の連続した塩基を含むフラグメント、又はそれに相補的な配列は、関連する核酸を同定及び単離するプローブとして使用される。幾つかの特徴において、関連する核酸は、核酸が単離された生物以外の他の生物からのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであることができる。例えば、他の生物は関連する生物であり得る。そのような手順において、プローブが関連配列と特異的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で核酸試料をプローブと接触させる。次に、プローブと関連生物からの核酸とのハイブリダイゼーションが、上記に記載した方法のいずれかを使用して検出される。
【０１６７】
検出可能なプローブにハイブリダイズするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのような核酸を同定するために使用されるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることによって、プローブに異なるレベルの相同性を有する核酸を同定し、単離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの溶融温より低い温度を変えてハイブリダイゼーションを実施することによって変えることができる。溶融温度Ｔmは、標的配列の５０％が、完全に相補的なプローブとハイブリダイズする（定義されたイオン強度及びｐＨでの）温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴmの約５℃以下で選択される。 プローブの溶融温度は、以下の式を使用して計算することができる。
【０１６８】
１４〜７０個のヌクレオチドの長さプローブでは、溶融温度（Ｔm）は、以下の式を使用して計算される：Ｔm＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さである。
ハイブリダイゼーションが、ホルムアミドを含有する溶液中で実施される場合、融解温度は以下の等式を使用して計算できる：Ｔm＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さである。
プレハイブリダイゼーションは、６xＳＳＣ、５xデンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μgの変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、又は６xＳＳＣ、５xデンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μgの変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド中で実施することができる。ＳＳＣ及びデンハルト溶液の配合は、Sambrook et al., supraに列挙されている。
【０１６９】
一つの特徴において、ハイブリダイゼーションは、検出プローブを上記に挙げたプレハイブリダイゼーション溶液に添加することによって実施される。プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前に変性される。一つの特徴において、プローブがそれと相補的又は相同的な配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズできるように十分な時間フィルターをハイブリダイゼーション溶液と接触させる。２００個のヌクレオチドを超える長さのプローブでは、ハイブリダイゼーションはＴmより１５〜２５℃低く実施することができる。オリゴヌクレオチドプローブのようなより短いプローブでは、ハイブリダイゼーションはＴmより５〜１０℃低く実施することができる。一つの特徴において、６xＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションはおよそ約６８℃で実施される。通常、５０％ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションではハイブリダイゼーションはおよそ４２℃で実施される。
【０１７０】
セルラーゼ酵素の発現阻害
本発明は、本発明の核酸、例えばセルラーゼ酵素コード核酸、例えばアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムを含む核酸と相補的な核酸（例えば、アンチセンス配列）を提供する。アンチセンス配列を含む本発明の核酸は、セルラーゼ酵素コード遺伝子の輸送、スプライシング又は転写を阻害することができる。阻害は、ゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを標的とすることによって達成することができる。標的とされた核酸の転写又は機能は、例えばハイブリダイゼーション及び／又は切断によって阻害することができる。本発明により提供される一つの例示的なインヒビターのセットには、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子又はメッセージに結合することができるオリゴヌクレオチドが含まれ、いずれの場合でもセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の産生又は機能を防止又は阻害する。この会合は配列特異的ハイブリダイゼーションによる可能性がある。別の有用なインヒビターの部類には、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージの不活化又は切断を引き起こすオリゴヌクレオチドが含まれる。このオリゴヌクレオチドは、リボザイムのように、そのような切断を引き起こす酵素活性を有することができる。オリゴヌクレオチドを、化学的に改変するか、又は相補性核酸を切断することができる酵素若しくは組成物と結合させることができる。多くの異なるそのようなオリゴヌクレオチドを含むプールを、所望の活性を有するものについてスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、核酸及び／又はタンパク質レベルでセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素発現を阻害する多様な組成物、例えば、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列、並びに本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ抗体を含む、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムを提供する。
【０１７１】
セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現の阻害は、多様な産業用途を有することができる。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現の阻害は、変質を遅延又は防止することができる。一つの特徴において、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現及び／又は活性を阻害する本発明の組成物、例えば、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの使用は、変質を遅延又は防止する。したがって、一つの特徴において、本発明は、変質の遅延又は防止のために、植物又は植物生成物（例えば、穀類、穀粒、果実、種子、根、葉など）に本発明の抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮａを適用することを含む方法及び組成物を提供する。これらの組成物は、植物（例えば、トランスジェニック植物）又は別の生物体（例えば、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子で形質転換された細菌又は他の微生物）によって発現させることもできる。
セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素発現を阻害する本発明の組成物（例えば、アンチセンス、ｉＲＮＡ、リボザイム、抗体）を、医薬組成物として、例えば抗病原剤として使用することができるか、又は例えばSalmonella用の例えば抗菌剤として他の療法において使用することができる。 
【０１７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージと結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、一つの特徴では、ｍＲＮＡを標的にすることによってセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する戦略は、科学文献及び特許文献に十分に記載されており、当業者は、本発明の新規な試薬を使用してそのようなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素オリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするジーンウォーキング／ＲＮＡマッピングプロトコールは当該技術において周知である（例えば、強力なアンチセンス配列選択のために簡単で信頼できる方法を提供する、標準的な分子技術に基づいているＲＮＡマッピングアッセイを記載している、Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183を参照すること）。Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198も参照すること。
【０１７３】
天然に存在する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の長さであることができ、別の特徴では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜１００，約１０〜８０、約１５〜６０、約１８〜４０である。最適な長さは日常的なスクリーニングにより決定することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の濃度で存在することができる。最適な濃度は日常的なスクリーニングにより決定することができる。この潜在的な問題に対処することができる、多種多様な合成された天然に存在しないヌクレオチド及び核酸類似体が知られている。例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位のような非イオン性骨格を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用することができる。WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)に記載されているような、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することもできる。本発明によって提供される合成ＤＮＡ骨格類似体を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドには、上記で記載されたように、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−Ｎ−カルバメート及びモルホリノカルバメート核酸を含めることもできる。
コンビナトリアル化学方法論を使用して、膨大な数のオリゴヌクレオチドを作り出すことができ、それらは、本発明のセンス及びアンチセンスのセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列のような任意の標的に対して適切な結合親和性及び特異性を有する特定のオリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングすることができる（例えば、Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584を参照すること）。
【０１７４】
阻害性リボザイム
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージと結合することができるリボザイムを提供する。これらのリボザイムは、例えばｍＲＮＡを標的にして、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を阻害することができる。リボザイムを設計し、ターゲティングのためにセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素特異的アンチセンス配列を選択する戦略は、科学文献及び特許文献に十分に記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を使用してそのようなリボザイムを設計することができる。リボザイムは、標的ＲＮＡを切断するＲＮＡの酵素部分に近接して保持されているリボザイムの標的ＲＮＡ結合部分を介して標的ＲＮＡと結合することによって作用する。したがって、リボザイムは相補性塩基対合により標的ＲＮＡを認識し、これに結合し、正確な部位に結合すると酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断し、不活性化する。切断がコード配列で発生すると、そのような方法による標的ＲＮＡの切断は、コードされるタンパク質の合成を誘導するその能力を破壊する。リボザイムがそのＲＮＡ標的と結合し、それを切断した後、リボザイムはＲＮＡから遊離して新たな標的への結合及びその切断を繰り返すことができる。
【０１７５】
いくつかの環境下では、リボザイムの酵素的性質は、他の技術、例えばアンチセンス技術（ここで、核酸分子は核酸標的に単に結合してその転写、翻訳又は別の分子との結合を阻止するだけである）に比べて有利であり得る。なぜなら、治療処置を実施するのに必要なリボザイムの有効濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも低くなり得るからである。この潜在的な利点は、リボザイムが酵素的に作用する能力に反映している。したがって、単一のリボザイム分子が、多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。一つの特徴において、リボザイムは高度に特異的なインヒビターであり、阻害の特異性は結合の塩基対合機構だけでなく、リボザイムが結合するＲＮＡの発現を分子が阻害する機構にも依存している。すなわち、阻害はＲＮＡ標的の切断によって引き起こされ、したがって特異性は非標的ＲＮＡの切断速度に対する標的ＲＮＡの切断速度の比として定義される。この切断機構は、塩基対合が関与する要因に加えた要因に依存する。したがって、リボザイム作用の特異性は同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも高い可能性がある。
【０１７６】
本発明のリボザイム、例えば酵素リボザイムＲＮＡ分子は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、肝炎デルタウイルスモチーフ、グループＩイントロンモチーフ及び／又はＲＮＡガイド配列と結合したＲＮａｓｅＰ様ＲＮＡモチーフとして形成することができる。例えば、ハンマーヘッドモチーフの例は、Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183によって、ヘアピンモチーフの例は、Hampel (1989) Biochemistry 28:4929及びHampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299によって、肝炎デルタウイルスモチーフの例は、Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; the RNaseP motif by Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849によって、並びにグループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号（Cech）によって記載されている。これらの特定のモチーフの記載は、それらに限定することを意図したものではない。当業者は、本発明のリボザイム、例えば本発明の酵素ＲＮＡ分子は、標的遺伝子のＲＮＡ領域の１つ以上と相補的な特定の基質結合部位を有することができることを認識するであろう。本発明のリボザイムは、基質結合部位の中又はその周辺に分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することができる。
【０１７７】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列を含むＲＮＡ阻害分子、いわゆる「ＲＮＡｉ」分子を提供する。ＲＮＡｉ分子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡを含むことができる。ＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子の発現を阻害することができる。一つの態様において、ＲＮＡｉ分子は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれ以上の長さの二重鎖ヌクレオチドである。本発明はいずれの特定の作用機構にも限定されないが、ＲＮＡｉは細胞内に入り、内因性ｍＲＮＡを含む類似又は同一の配列の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の分解を引き起こすことができる。細胞が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に暴露されるとき、相同性遺伝子に由来するｍＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる過程によって選択的に分解される。ＲＮＡｉの背後にある可能な基本的機構は、特定の遺伝子配列と一致する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、短小干渉性ＲＮＡと呼ばれる短い断片に分解し、この緩衝RNAがその配列と一致するｍＲＮＡを分解する引き金となる。一つの特徴において、本発明のＲＮＡｉは遺伝子サイレンシング治療で使用される（例えばShuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046を参照すること）。一つの特徴において、本発明は、本発明のＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡを使用して選択的にＲＮＡを分解する方法を提供する。この方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで実施することができる。一つの特徴において、本発明のＲＮＡｉ分子を使用して、細胞、器官又は動物の機能喪失型変異を生じることができる。選択的にＲＮＡを分解するＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡを作製及び使用する方法は、当該技術で既知である（例えば、米国特許第６，５０６，５５９号、同第６，５１１，８２４号、同第６，５１５，１０９号、同第６，４８９，１２７号を参照すること）。
【０１７８】
核酸の改変−本発明の酵素変種の作製
本発明は、本発明の核酸の変種、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードするものを生成する方法を提供する。これらの方法は、鋳型核酸によりコードされたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素から変化した若しくは異なる活性、又は変化した若しくは異なる安定性を有する、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を生成するために、反復することができるか又は多様な組合せで使用することができる。これらの方法は、例えば遺伝子／メッセージ発現、メッセージ翻訳又はメッセージ安定性における変種を生成するために、反復することができるか又は多様な組合せで使用することができる。別の特徴において、細胞の遺伝的構成は、例えば相同遺伝子のエクスビボでの改変、続く細胞への再挿入によって変更される。
【０１７９】
例えば、一つの特徴において、本発明は、配列番号１６３の少なくとも１つのヌクレオチド塩基残基の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供する。前記改変は、以下の変化：位置２６５〜２６７のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧとなること；位置３０７〜３０９のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧとなること；位置３２８〜３３０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧとなること；位置３４０〜３４２のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧとなること；位置４６９〜４７１のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣとなること；位置１４４１〜１４４３のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＴＴＴ若しくはＴＴＣとなること；位置１６４８〜１６５０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＡＡＴ若しくはＡＡＣとなること；又は位置１７６８〜１７７０のいずれか１つのヌクレオチドが改変されてＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧとなることの１つ以上を含む。別の特徴において、本発明は、配列番号１６４の少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供し、ここで前記改変は、以下の変化：アミノ酸位置８９のメチオニンが改変されてアルギニンになること；アミノ酸位置１０３のフェニルアラニンが改変されてグリシンになること；アミノ酸位置１１０のプロリンが改変されてグリシンになること；アミノ酸位置１１４のチロシンが改変されてロイシンになること；アミノ酸位置１５７のアラニンが改変されてセリンになること；アミノ酸位置４８１のトリプトファンが改変されてフェニルアラニンになること；アミノ酸位置５５０のプロリンが改変されてアスパラギンなること；又はアミノ酸位置５９０のグリシンが改変されてアルギニンになることの１つ以上を含む。
【０１８０】
別の特徴において、本発明は、本発明の例示的な配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１など）のヌクレオチド残基配列の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供する。前記改変は、以下の変化：配列番号１６３の位置２６５〜２６７のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３０７〜３０９のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３２８〜３３０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３４０〜３４２のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧに変わること；配列番号１６３の位置４６９〜４７１のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣに変わること；配列番号１６３の位置１４４１〜１４４３のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＴ若しくはＴＴＣに変わること；配列番号１６３の位置１６４８〜１６５０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＡＡＴ若しくはＡＡＣに変わること；又は配列番号１６３の位置１７６８〜１７７０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わることの１つ以上を含む。別の特徴において、本発明は、本発明の任意の核酸のヌクレオチド残基配列の改変を含む配列を有する単離又は組換え核酸を提供する。ここで前記改変は、以下の変化：配列番号１６３の位置２６５〜２６７のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３０７〜３０９のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３２８〜３３０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ若しくはＧＧＧに変わること；配列番号１６３の位置３４０〜３４２のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ若しくはＣＴＧに変わること；配列番号１６３の位置４６９〜４７１のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣに変わること；配列番号１６３の位置１４４１〜１４４３のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＴＴＴ若しくはＴＴＣに変わること；配列番号１６３の位置１６４８〜１６５０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＡＡＴ若しくはＡＡＣに変わること；又は配列番号１６３の位置１７６８〜１７７０のいずれか１つに相当するヌクレオチドがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧに変わることの１つ以上を含む。
【０１８１】
別の特徴において、本発明は、本発明の例示的な配列（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０など）のアミノ酸残基の改変を含む配列を有する単離又は組換えポリペプチドを提供する。ここで前記改変は、以下の変化：配列番号１６４の位置８９のアミノ酸のメチオニンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わること；配列番号１６４の位置１０３のアミノ酸のフェニルアラニンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１４のアミノ酸のチロシンに相当するアミノ酸がロイシンに変わること；配列番号１６４の位置１５７のアミノ酸のアラニンに相当するアミノ酸がセリンに変わること；配列番号１６４の位置４８１のアミノ酸のトリプトファンに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに変わること；配列番号１６４の位置５５０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がアスパラギンに変わること；又は配列番号１６４の位置５９０のアミノ酸のグリシンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わることの１つ以上を含む。
【０１８２】
別の特徴において、本発明は、本発明の任意のポリペプチドのアミノ酸残基の改変を含む配列を有する単離又は組換えポリペプチドを提供する。ここで前記改変は、以下の変化：配列番号１６４の位置８９のアミノ酸のメチオニンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わること；配列番号１６４の位置１０３のアミノ酸のフェニルアラニンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がグリシンに変わること；配列番号１６４の位置１１４のアミノ酸のチロシンに相当するアミノ酸がロイシンに変わること；配列番号１６４の位置１５７のアミノ酸のアラニンに相当するアミノ酸がセリンに変わること；配列番号１６４の位置４８１のアミノ酸のトリプトファンに相当するアミノ酸がフェニルアラニンに変わること；配列番号１６４の位置５５０のアミノ酸のプロリンに相当するアミノ酸がアスパラギンに変わること；又は配列番号１６４の位置５９０のアミノ酸のグリシンに相当するアミノ酸がアルギニンに変わることの１つ以上を含む。
【０１８３】
本発明の核酸は、あらゆる方法により変更することができる。例えば、ランダム若しくは確率論的な方法、又は非確率論的方法、又は「定方向進化」方法である（例えば、米国特許第６，３６１，９７４号を参照すること）。遺伝子のランダム変異の方法は当該技術で周知である（例えば、米国特許第５，８３０，６９６号を参照すること）。例えば、変異原を使用して遺伝子をランダムに変異させることができる。変異原には、例えば、紫外線若しくはガンマ線の照射、又は化学的変異原、例えばマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、単独又は組合せて、組換えによって修復されやすいＤＮＡ破壊を誘導する。他の化学的変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン又はギ酸が含まれる。その他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似体、例えばニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン又はアクリジンである。これらの作用物質は、ＰＣＲ反応においてヌクレオチド前駆体の代わりに添加され、それによって配列を変異させることができる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのような挿入剤も使用することができる。
【０１８４】
分子生物学の任意の技術、例えばランダムＰＣＲ変異導入（例えば、Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471を参照すること）又はコンビナトリアルマルチカセット変異導入（例えば、Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196を参照すること）を使用することができる。あるいは、核酸、例えば遺伝子を、ランダム又は「確率論的」にフラグメント化した後で再集合させることができる（例えば、米国特許第６，２９１，２４２号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２８７，８６１号、同第５，９５５，３５８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１１，２３８号、同第５，６０５，７９３号を参照すること）。別の特徴において、改変、付加又は欠失は、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリＰＣＲ、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート改変ＤＮＡ変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限−選択変異導入、制限−精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸多量体作生成、染色体飽和変異導入（ＣＳＭ）及び／又はそれらの組合せ、並びに他の方法によって導入される。
【０１８５】
以下の出版物は、本発明の方法に組み込むことができる多様な反復組換え手順及び／又は方法を記載している：Stemmer (1999) “Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties” Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) “Evolution of a cytokine using DNA family shuffling“ Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) “Protein evolution by molecular breeding“Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling” Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution“ Nature 391:288-291; Crameri (1997) “Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling,” Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) “Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines” Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling” Nature Medicine 2:100-103; Gates et al. (1996) “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ‘headpiece dimer’” Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes” BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) “Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides” Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) “The Evolution of Molecular Computation” Science 270: 1510; Stemmer (1995) “Searching Sequence Space” Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370:389-391;及びStemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: “In vitro recombination for molecular evolution.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
【０１８６】
多様性を生じる変異法には、例えば以下が含まれる：部位特異的変異導入(Ling et al. (1997) “Approaches to DNA mutagenesis: an overview” Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) “In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) “Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229:1193-1201; Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237:1-7;及びKunkel (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); ウラシル含有鋳型を使用する変異導入(Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367-382;及びBass et al. (1988) “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities” Science 242:240-245);オリゴヌクレオチド特異的変異導入(Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100:468-500;及びZoller (1987) “Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154:329-350); ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異導入(Taylor (1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) “Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers (1988) “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16:791-802;及びSayers et al. (1988) “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16: 803-814); ギャップ含有二重鎖を使用する変異導入(Kramer et al. (1984) “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA” 154:350-367; Kramer (1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations” Nucl. Acids Res. 16: 7207;及びFritz (1988) “Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)。
【０１８７】
本発明を実施するために使用できる追加的なプロトコールには、以下が含まれる：点ミスマッチ修復(Kramer (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38:879-887),修復欠損宿主株を使用する変異導入(Carter et al. (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; 及びCarter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154: 382-403),欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) “Use of oligonucleotides to generate large deletions” Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells et al. (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), 全人工遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) ” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34:315-323;及びGrundstrom et al. (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316),二本鎖切断修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)。上記の方法の多くに関する更なる詳細は、Methods in Enzymology Volume 154で見出すことができ、これは、種々の変異導入の方法に関する問題を解決するための有用な管理について記載している。
【０１８８】
本発明を実施するにのに使用できるプロトコールは、例えば以下に記載されている：米国特許第5,605,793号（Stemmer）(Feb. 25, 1997), “Methods for In Vitro Recombination”；米国特許第5,811,238号（Stemmer et al.）(Sep. 22, 1998) “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”；米国特許第5,830,721号（Stemmer et al.）(Nov. 3, 1998), “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”；米国特許第5,834,252号（Stemmer, et al.）(Nov. 10, 1998) “End-Complementary Polymerase Reaction”；米国特許第5,837,458号（Minshull, et al.）(Nov. 17, 1998), “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”； WO 95/22625, Stemmer and Crameri, “Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”； WO 96/33207 by Stemmer and Lipschutz “End Complementary Polymerase Chain Reaction”； WO 97/20078 by Stemmer and Crameri “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”； WO 97/35966 by Minshull and Stemmer, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”； WO 99/41402 by Punnonen et al. “Targeting of Genetic Vaccine Vectors”； WO 99/41383 by Punnonen et al. “Antigen Library Immunization”； WO 99/41369 by Punnonen et al. “Genetic Vaccine Vector Engineering”； WO 99/41368 by Punnonen et al. “Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”； EP 752008 by Stemmer and Crameri, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”； EP 0932670 by Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”； WO 99/23107 by Stemmer et al., “Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”； WO 99/21979 by Apt et al., “Human Papillomavirus Vectors”； WO 98/31837 by del Cardayre et al. “Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”； WO 98/27230 by Patten and Stemmer, “Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”； WO 98/27230 by Stemmer et al., “Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection,” WO 00/00632, “Methods for Generating Highly Diverse Libraries,“ WO 00/09679, “Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences,“ WO 98/42832 by Arnold et al., “Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers,“ WO 99/29902 by Arnold et al., “Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences,“ WO 98/41653 by Vind, “An in Vitro Method for Construction of a DNA Library,“ WO 98/41622 by Borchert et al., “Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling,“及びWO 98/42727 by Pati and Zarling, “Sequence Alterations using Homologous Recombination”。
【０１８９】
本発明を実施するのに使用できるプロトコール（種々の多様性を生じる方法に関する詳細を提供する）は、例えば以下に記載されている：米国特許出願(USSN) 09/407,800, “SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES” by Patten et al. filed Sep. 28, 1999; “EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION” by del Cardayre et al.,米国特許第6,379,964号; “OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION” by Crameri et al.,米国特許第6,319,714号;同第6,368,861号;同第6,376,246号;同第6,423,542号;同第6,426,224号及びPCT/US00/01203; “USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING” by Welch et al.,米国特許第6,436,675号; “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” by Selifonov et al., filed Jan. 18, 2000, (PCT/US00/01202) and, e.g. “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” by Selifonov et al., filed Jul. 18, 2000 (U.S. Ser. No. 09/618,579); “METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS” by Selifonov and Stemmer, filed Jan. 18, 2000 (PCT/US00/01138); and “SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION” by Affholter, filed Sep. 6, 2000 (米国特許出願09/656,549);及び米国特許第6,177,263号;同第 6,153,410号。
【０１９０】
例えば、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）、合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）又はこれらの組合せのような飽和変異導入を含む非確率論的又は「定方向進化」方法を使用して、本発明の核酸を改変し、新たな又は変化した特性（例えば、極めて酸性又はアルカリ性の条件下、高温又は低温の条件下などでの活性）を有するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を生成する。改変された核酸によりコードされるポリペプチドは、グルカン加水分解又は他の活性について試験する前に、活性についてスクリーニングすることができる任意の試験様式又はプロトコールを、例えばキャピラリーアレイ台を用いて使用することができる。例えば、米国特許第６，３６１，９７４号、同第６，２８０，９２６号、同第５，９３９，２５０号を参照すること。 
【０１９１】
遺伝子部位飽和変異導入又はＧＳＳＭ
本発明は、本明細書に記載されているように、また、米国特許第６，１７１，８２０号及び同第６，５７９，２５８号に記載されているように、遺伝子部位飽和変異導入又はＧＳＳＭを使用して酵素を作製する方法を提供する。一つの特徴において、縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含むコドンプライマーを使用して、ポリヌクレオチド、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、又は本発明の抗体に点変異導入を導入し、それによって子孫ポリペプチドのセットを生成する。前記セットにおいては、全範囲の単一のアミノ酸置換がそれぞれのアミノ酸の位置、例えば、改変の標的となる酵素活性部位又はリガンド結合部位のアミノ酸残基で表れる。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第１の相同性配列、縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列、及び場合によって第２の相同性配列を含むことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して得られる下流の子孫翻訳生成物には、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列の縮退が２０個全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化が含まれる。一つの特徴において、１つのそのような縮退オリゴヌクレオチド（例えば、１つの縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットから構成される）を使用して、親のポリヌクレオチド鋳型中の元のコドンのそれぞれが全範囲のコドン置換に付される。別の特徴において、（同じオリゴヌクレオチドか又は別のオリゴヌクレオチド中にある）少なくとも２つの縮退カセットが、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも２つの元のコドンを全範囲のコドン置換に付すために使用される。例えば、２つ以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を１つのオリゴヌクレオチドに含ませ、２つ以上の部位でアミノ酸変異を導入することができる。この複数のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列は、直接隣接していてもよく又は１つ以上の更なるヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。別の特徴において、付加及び欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドを単独で又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含むコドンと組合せて使用して、アミノ酸付加、欠失及び／又は置換の任意の組合せ又は順列が導入される。
【０１９２】
一つの特徴において、隣接するＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレット、すなわち縮退(N,N,G/T)n配列を含むオリゴヌクレオチドを使用して２つ以上の隣接するアミノ酸位置の同時変異導入が行われる。別の特徴において、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列よりも小さい縮退度を有する縮退カセットが使用される。例えば、いくつかの場合では、ただ１つのＮを含む縮退トリプレット配列を（例えば、オリゴヌクレオチドで）使用することが望ましい場合があり、ここで前記Ｎは、トリプレットの第１、第２又は第３の位置に存在できる。任意の組合せ及び順列を含む他の任意の塩基も、トリプレットの残りの２つの位置で使用することができる。あるいは、いくつかの場合において、縮退Ｎ,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列を（例えば、オリゴで）使用することが望ましい場合がある。
【０１９３】
一つの特徴において、縮退トリプレット（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレット）の使用によって、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置について全範囲の可能な天然アミノ酸（合計２０個のアミノ酸）の系統的で容易な生成が可能になる（別の特徴においては、本方法は、各アミノ酸残基についてコドンの位置における可能な全ての置換よりも少ない置換の生成も含む）。例えば、１００個のアミノ酸のポリペプチドの場合、２０００個の別個の種（すなわち、各位置につき２０個の可能なアミノ酸x１００個のアミノ酸位置）を生成することができる。縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレットを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのセットを使用することによって、３２個の個別の配列が２０個の可能な天然のアミノ酸を全てコードすることができる。したがって、親のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのそのようなオリゴヌクレオチドを用いて飽和変異導入に付される反応容器において、２０個の別個のポリペプチドをコードする３２個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入での非縮退オリゴヌクレオチドの使用は、各反応容器につきただ１つの子孫ポリペプチド生成物を生じるだけである。場合により、非縮退オリゴヌクレオチドを開示の縮退プライマーと組合せて使用することができ、例えば、非縮退オリゴヌクレオチドを使用して対象のポリヌクレオチド中に特定の点変異導入を行うことができる。これは、特定のサイレント点変異導入、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異導入、並びに終止コドン及びポリペプチドフラグメントの対応する発現を発生させる点変異導入を生じさせる１つの方法を提供する。
【０１９４】
一つの特徴において、それぞれの飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異が導入されたコドンの位置に一致する特定の１つのアミノ酸位置において２０個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも２０個の子孫ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の態様では、２０個未満の天然の組合せの全てが使用される）。それぞれの飽和変異導入反応容器から生成される３２倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば、適切な宿主、例えばE. coli宿主に例えば発現ベクターを使用してクローン化し）、発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（親のポリペプチドと比較したとき、例えばアルカリ性又は酸性条件下でグルカン加水分解活性が増加している）、子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
【０１９５】
一つの特徴において、本明細書に開示しているように、飽和変異導入を使用して親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置に変異を導入すると、好ましいアミノ酸変化を２つ以上のアミノ酸位置において同定することができる。これら好ましいアミノ酸置換の全て又は一部分の組合せを含む１つ以上の新たな子孫分子を生成することができる。例えば、２つの特定の好ましいアミノ酸変化がポリペプチドの３つのアミノ酸位置のそれぞれで同定される場合、並べ換えには、それぞれの位置及び３つの位置で３つの可能性（元のアミノ酸から変化のないもの、及び２つの好ましい変化をもつそれぞれのもの）が含まれる。したがって、３x３x３、又は合計２７の可能性が存在し、これらは以前に調べられた７つ−６つの単一の点変異導入（すなわち、３つの位置でそれぞれ２つ）及びいずれの位置においても変化のないものを含む。 
さらに別の特徴において、位置飽和変異導入を、スクリーニングを伴って、シャッフリング、キメラ化、組換え及び他の変異導入法と一緒に使用することができる。本発明は、飽和変異導入を含む任意の変異導入法を繰り返して使用することを提供する。一つの例示において、任意の変異導入法を繰り返して使用することは、スクリーニングと組合せて使用される。
【０１９６】
本発明は、専用コドンプライマー（縮退Ｎ，Ｎ，Ｎ配列を含む）を使用してポリヌクレオチドに点変異導入を導入し、それによって子孫ポリペプチドのセットを生成することも提供し、そこでは、全範囲の単一アミノ酸置換がそれぞれのアミノ酸位置で表れる（遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ））。使用されるオリゴは、連続する第１の相同性配列、縮退Ｎ，Ｎ，Ｎ配列及び必ずしも必要ではないが一つの態様では第２の相同性配列から構成されている。そのようなオリゴを使用して得られる下流の子孫翻訳生成物には、Ｎ，Ｎ，Ｎ配列の縮退が２０個全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化が含まれる。
一つの特徴において、１つのそのような縮退オリゴ（１つの縮退Ｎ，Ｎ，Ｎカセットから構成される）が、親のポリヌクレオチド鋳型中のもとのコドンのそれぞれを全範囲のコドン置換に付すために使用される。別の特徴において、（同じオリゴか又は別のオリゴの中にある）少なくとも２つの縮退Ｎ，Ｎ，Ｎカセットが、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも２つの元のコドンを全範囲のコドン置換に付すために使用される。したがって、２つ以上のＮ，Ｎ，Ｎ配列を１つのオリゴに含ませ、２つ以上の部位でアミノ酸変異を導入することができる。この複数のＮ，Ｎ，Ｎ配列は、直接隣接していてもよく１つ以上の更なるヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。別の特徴において、付加及び欠失の導入に役立つオリゴを、単独で又はＮ，Ｎ，Ｎ配列を含むコドンと組合せて使用して、アミノ酸付加、欠失及び／又は置換の任意の組合せ又は順列が導入される。
【０１９７】
一つの特徴において、隣接するＮ，Ｎ，Ｎトリプレット、すなわち縮退(N,N,N)n配列を含むオリゴを使用して、２つ以上の隣接するアミノ酸位置で同時に変異を導入することが可能である。別の特徴において、本発明は、Ｎ，Ｎ，Ｎ配列よりも小さい縮退度を有する縮退カセットの使用を提供する。例えば、いくつかの場合では、ただ１つのＮを含む縮退トリプレット配列を（例えば、オリゴで）使用することが望ましい場合があり、ここでＮは、トリプレットの第１、第２又は第３の位置に存在できる。任意の組合せ及び順列を含む他の任意の塩基も、トリプレットの残りの２つの位置で使用することができる。あるいは、いくつかの場合において、縮退Ｎ,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を（例えば、オリゴで）使用することが望ましい場合がある。 
【０１９８】
一つの特徴において、縮退トリプレット（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列）の使用は、幾つかの理由で有益である。一つの特徴において、本発明は、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置において全範囲の可能なアミノ酸（合計２０個のアミノ酸）の置換を、系統的でかなり容易に生成する方法を提供する。したがって、１００個のアミノ酸ポリペプチドでは、本発明は、２０００個の別個の種（すなわち、各位置につき２０個の可能なアミノ酸x１００個のアミノ酸位置）を、系統的でかなり容易に生成する方法を提供する。縮退Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を含むオリゴの使用によって、２０個の可能なアミノ酸のためにコードする３２個の個別の配列が提供されることが理解される。したがって、親のポリヌクレオチド配列が、そのようなオリゴを使用して飽和変異導入に付される反応容器において、２０個の別個のポリペプチドをコードする３２個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入での非縮退オリゴの使用は、各反応容器につきただ１つの子孫ポリペプチド生成物を生じるだけである。
本発明は、場合により、開示されている縮退プライマーと組合せて使用することができる、非縮退オリゴの使用も提供する。幾つかの場合において、対象のポリヌクレオチドに特定の点変異導入を生じさせるために、非縮退オリゴを使用することが有利であることが理解される。これは、特定のサイレント点変異導入、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異導入、並びに終止コドン及びポリペプチドフラグメントの対応する発現を発生させる点変異導入を生じる方法を提供する。 
【０１９９】
したがって、本発明の一つの特徴において、それぞれの飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異が導入されるコドンの位置に一致する特定の１つのアミノ酸位置において２０個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも２０個の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む。それぞれの飽和変異導入反応容器から生成される３２倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば、発現ベクターを使用して適切なE. coli宿主にクローン化し）、発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（親のポリペプチドと比較したとき）、子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
【０２００】
一つの特徴において、本明細書に開示しているように、飽和変異導入を使用して親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置に変異を導入すると、好ましいアミノ酸変化が２つ以上のアミノ酸位置において同定される。これら好ましいアミノ酸置換の全て又は一部分の組合せを含む、１つ以上の新たな子孫分子を生成することができる。例えば、２つの特定の好ましいアミノ酸変化がポリペプチドの３つのアミノ酸位置のそれぞれで同定される場合、順列には、それぞれの位置及び３つの位置で３つの可能性（元のアミノ酸から変化のないもの、及び２つの好ましい変化をもつそれぞれのもの）が含まれる。したがって、３x３x３、又は合計２７の可能性が存在し、これらは以前に調べられた７つ−６つの単一の点変異導入（すなわち、３つの位置でそれぞれ２つ）及びいずれの位置においても変化のないものを含む。
【０２０１】
本発明は、更なる変異化法と組合せた飽和変異導入の使用を提供し、それは、２つ以上の関連するポリヌクレオチドを、ハイブリッドヌクレオチドが組換え及び還元的再組合せにより生成されるように、適切な宿主細胞に導入する方法である。
遺伝子の配列全体に沿って変異導入を実施することに加えて、本発明は、変異導入を使用して、ポリヌクレオチド配列における任意の数の塩基をそれぞれ代えることができ、変異を導入する塩基の数は、一つの態様において、１５〜１００，０００の全ての整数である。したがって、分子に沿った各位置に変異を導入する代わりに、各塩基又は不連続な数の塩基（一つの特徴において、合計１５〜１００，０００になるサブセット）を変異導入に付すことができる。一つの特徴において、ポリヌクレオチド配列に沿ったそれぞれの位置又は位置の群に変異を導入するために別個のヌクレオチドが使用される。変異が導入される３つの位置の群は、コドンであってよい。変異は、変異導入カセットとも呼ばれる、異種カセットを含む変異導入プライマーを使用して導入することができる。例示的なカセットは、１〜５００個の塩基を有することができる。そのような異種カセットにおけるそれぞれのヌクレオチド位置は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｇ又はＥであり、ここでＥは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴではない任意の塩基である（Ｅは、デザイナーオリゴと呼ぶこともできる）。 
【０２０２】
一つの特徴において、飽和変異導入は、変異が導入される定義されたポリヌクレオチド配列（ここで、変異が導入される配列は、一つの態様では、約１５〜１０００，０００個の塩基の長さである）において、変異導入カセットの完全なセット（ここで、それぞれのカセットは、一つの態様では、約１〜５００個の塩基の長さである）に変異を導入することから構成される。したがって、変異の一群（１〜１００の範囲の変異）が、変異が導入されるそれぞれのカセットに導入される。一つのカセットに導入される変異のグループ化は、一連の飽和変異導入の適用の際に、第２のカセットに導入される変異の第２のグループ化と異なる又は同一であることができる。そのようなグループ化は、欠失、付加、特定のコドンのグループ化、及び特定のヌクレオチドカセットのグループ化によって例示される。
【０２０３】
一つの特徴において、変異が導入される定義された配列には、全遺伝子、経路、ｃＤＮＡ、全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び全プロモーター、エンハンサー、リプレッサー／トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーター又は任意のポリヌクレオチド官能基が含まれる。一般に、この目的において「定義された配列」は、任意のポリヌクレオチドであることができ、１５塩基ポリヌクレオチド配列及び長さが１５塩基〜１５，０００塩基（本発明は、その間のあらゆる整数を具体的に指定する）のポリヌクレオチド配列である。コドンのグループ化の選択の際の考慮には、縮退変異導入カセットによりコードされるアミノ酸の種類が含まれる。
一つの特徴において、変異導入カセットに導入できる変異のグループ化のために、本発明は、特に、それぞれの位置で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０個のアミノ酸のために（縮退オリゴを使用して）コードする縮退コドン置換、及びそれらによりコードされるポリペプチドのライブラリーを提供する。 
【０２０４】
合成連結再アッセンブリ（ＳＬＲ）
本発明は、「合成連結再アッセンブリ」又は単に「ＳＬＲ」、「定方向進化プロセス」と呼ばれる、新たな又は改変された特性を有するポリペプチド、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は抗体を生成する非確率論的遺伝子改変システムを提供する
ＳＬＲは、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的に一緒に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、鎖状に連結される又はキメラ化されるのではなく、むしろ非確率論的に構築されるという点で確率的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なる。例えば、米国特許第６，７７３，９００号、同第６，７４０，５０６号、同第６，７１３，２８２号、同第６，６３５，４４９号、同第６，６０５，４４９号、同第６，５３７，７７６号を参照すること。一つの態様において、ＳＬＲは以下の工程を含む：（ａ）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記鋳型ポリヌクレオチドが相同遺伝子をコードする配列を含む、前記工程；（ｂ）複数の構築ブロックポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記構築ブロックポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと予め定められた配列で交差再集合を生じるように設計され、構築ブロックポリヌクレオチドが相同遺伝子の変種配列及び前記変種配列にフランキングする、前記鋳型ポリヌクレオチドと相同な配列を含む、前記工程；（ｃ）構築ブロックポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと交差再集合して相同遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを生成するように、前記構築ブロックポリヌクレオチドと前記鋳型ポリヌクレオチドとを組み合わせる工程。
【０２０５】
ＳＬＲは、再配列されるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することに依存しない。したがって、本発明の方法は、１０100を超える異なるキメラから構成される子孫分子のライブラリー（又はセット）を非確率論的に生成するために使用できる。ＳＬＲを使用して、１０1000を超える異なる子孫キメラを含むライブラリーを生成することができる。したがって、本発明の態様は、設計に従って選択された全体的なアッセンブルの順番を有する、完成したキメラ核酸分子のセットを生成する非確率論的方法を含む。この方法は、互いに適合する連結可能な利用可能な末端を有する複数の特定の核酸構築ブロックを設計に従って生成する工程、及び設計した全体的な集合（アッセンブリ）の順番が達成されるように核酸構築ブロックを集合させる工程を含む。
【０２０６】
集合される互いに適合する核酸構築ブロックの連結可能な末端は、これらが構築ブロックを予め定められた順序で結合させることができる場合、この種類の順序づけられた集合に対して「利用可能」であると考えられる。したがって、核酸構築ブロックが結合され得る全体的な集合の順番は、連結可能な末端の設計によって特定される。２つ以上の集合工程が使用される場合、核酸構築ブロックが結合し得る全体的な集合の順番は、集合工程の一連の順番によっても特定される。一つの態様において、アニールされた構築片が、リガーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）のような酵素で処理されて、構築片の共有結合が達成される。
【０２０７】
一つの特徴において、オリゴヌクレオチド構築ブロックの設計は、完成キメラポリヌクレオチドの子孫セットを生成する基礎として役立つ、核酸配列鋳型の祖先セットを分析することによって得られる。したがって、これらの親のオリゴヌクレオチド鋳型は、変異が導入される、例えばキメラ化又はシャッフルされる核酸構築ブロックの設計の助けになる配列情報源として役立つ。この方法の一つの特徴において、複数の親核酸鋳型の配列でアラインメントを実施して、１つ以上の境界点が選択される。境界点は相同領域に位置することができ、１つ以上のヌクレオチドから構成される。これらの境界点は、一つの特徴では、少なくとも２つの祖先鋳型によって共有される。それによって境界点は、親ポリヌクレオチドの再配列のために生成されるオリゴヌクレオチド構築ブロックの境界線を引くために使用することができる。祖先分子中で同定及び選択される境界点は、完成キメラ子孫分子の構築における潜在的キメラ化点として機能する。境界点は、少なくとも２つの親ポリヌクレオチド配列によって共有される相同領域であり得る（少なくとも１つの相同的なヌクレオチド塩基から構成される）。あるいは、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも半分によって共有される相同領域であり得るか、又は親ポリヌクレオチド配列の少なくとも３分の２によって共有される相同領域であり得る。さらに一つの特徴において、利用可能な境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも４分の３によって共有される相同領域であるか、又は親ポリヌクレオチド配列のほぼ全てによって共有されることができる。一つの特徴において、境界点は親ポリヌクレオチド配列の全てによって共有される相同領域である。
【０２０８】
一つの特徴において、連結再集合工程は、子孫キメラポリヌクレオチドの網羅的ライブラリーを生成するために網羅的に実施される。換言すると、完成したキメラ核酸分子のセット中で、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが提示される。同時に、別の特徴では、各組合せにおける集合の順番（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5'から3'方向における各構築ブロックの集合の順番すなわち、完成したキメラ核酸のそれぞれの配列の５’から３’方向における各構築ブロックの集合の順番）は、上記に記載したように、設計に従った（又は非確率論的な）ものである。本発明の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は著しく低減される。
【０２０９】
別の特徴において、連結再アッセンブリ法は系統的に実施される。例えばこの方法は、系統的に、例えば１つずつスクリーニングすることができる区画を有する区画化によって、系統的に区画化された子孫分子のライブラリーを生成するために実施される。換言すると、本発明は、連続工程による構築反応の選択的及び慎重な使用と併せて、特定の核酸構築ブロックを選択的及び慎重に使用することによって、特定の子孫生成物のセットが幾つかの反応容器のそれぞれで作製される設計が得られることを提供する。このことによって、系統的な調査及びスクリーニング手順を実施することが可能になる。したがって、これらの方法は、潜在的に非常に多数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。特に祖先分子間で低レベルの相同性が存在するときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な方法でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、これらの方法は多数の子孫分子から構成されるライブラリー（又はセット）の生成を提供する。本発明の連結再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は、一つの態様では、設計に従って選択された全体的な集合の順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。飽和変異導入及び最適化された定方向進化方法も、異なる子孫分子種を生成することに使用できる。本発明は、境界点、核酸構築ブロックのサイズ及び数、並びに結合の大きさ及び設計に関して選択と制御の自由を提供することが理解される。更に、本発明の実施可能性に関して、分子間相同性の要件は大きく緩和されることが理解される。事実、境界点はほとんど又は全く分子間相同性がない領域においても選択することができる。例えば、コドンの揺らぎのために、すなわち、コドンの縮退のために、対応する祖先鋳型でもともとコードされていたアミノ酸を変更することなく、ヌクレオチド置換をアミノ酸構築ブロックに導入することができる。あるいは、コドンを、元のアミノ酸のコードが変わるように変更することができる。本発明は、分子間相同境界点の出現を高めるために、したがって構築ブロック間で達成される結合数を高めるため、次いで、生成される子孫キメラ分子数の増加を可能にするため、そのような置換が核酸構築ブロックへ導入できることを提供する。
【０２１０】
合成遺伝子再アッセンブリ
一つの特徴において、本発明は、合成遺伝子再アッセンブリと呼ばれる非確立論的な方法を提供し、これは、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル又は連鎖又はキメラ化されるのではなく、むしろ非確率論的に構築されるということを別として、確率的シャッフリングといくらか関連する。例えば、米国特許第６，５３７，７７６号を参照すること。
合成遺伝子再アッセンブリ法は、シャッフルされるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することに依存しない。本発明の方法は、１０100を超える異なるキメラから構成される子孫分子のライブラリー（又はセット）を非確率論的に生成するために使用できる。おそらく、合成遺伝子再アッセンブリを使用して、１０1000を超える、異なる子孫キメラから構成されるライブラリーを生成することもできる。
したがって、一つの特徴において、本発明は、設計に従って選択された全体的な構築の順番を有する、完成したキメラ核酸分子のセットを生成する非確率論的方法を提供する。前記方法は、互いに適合する連結可能な利用可能な末端を有する複数の特定の核酸構築ブロックを設計に従って生成する工程、及び設計した全体的な構築の順番が達成されるように核酸構築ブロックを生成する工程から構成される。
【０２１１】
構築される互いに適合する核酸構築ブロックの連結可能な末端は、これらが構築ブロックを予め定められた順序で結合させることができる場合、この種類の順序づけられた集合に対して「利用可能な」ものであると考えられる。したがって、一つの態様において、核酸構築ブロックを結合できる全体的な集合の順番は、連結可能な末端の設計によって特定され、２つ以上の構築工程が使用される場合、核酸構築ブロックを結合できる全体的な集合の順番は、集合工程の連続的な順番によっても特定される。本発明の一つの特徴において、アニールされた構築片がリガーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）のような酵素で処理されて、構築片の共有結合が達成される。
【０２１２】
別の特徴において、核酸構築ブロックの設計は、完成したキメラ核酸分子の子孫セットを生成する基礎として役割を果たす核酸鋳型の祖先セットの配列を分析することによって得られる。したがって、祖先核酸鋳型は、変異が導入される、例えばキメラ化又はシャッフルされる核酸構築ブロックの設計の助けとなる配列情報源として役立つ。
一つの例示として、本発明は、関連する遺伝子のファミリー及び関連する生成物のコードされたファミリーのキメラ化を提供する。特定の例示において、コードされた生成物は酵素である。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素には、本明細書に記載された方法に従って、変異を導入することができる。
【０２１３】
本発明の一つの特徴によると、１つ以上の境界点を選択するために複数の祖先核酸鋳型（例えば、本発明ポリヌクレオチド）にアラインメントを実施する。この境界点は相同領域に位置し得る。境界点は、生成される核酸構築ブロックの境界線を引くために使用することができる。したがって、祖先分子中で同定及び選択される境界点は、子孫分子の構築における潜在的キメラ化点として機能する。
一つの特徴において、利用可能な境界点は少なくとも２つの祖先鋳型によって共有される相同領域（少なくとも１つの相同性核酸塩基から構成される）であるが、境界点は少なくとも半分の祖先鋳型、少なくとも３分の２の祖先鋳型、少なくとも４分の３の祖先鋳型、及びある特徴ではほぼ全ての祖先鋳型によって共有される相同領域であり得る。さらにある特徴においては、利用可能な境界点は全ての祖先鋳型によって共有される相同領域である。 
【０２１４】
一つの特徴において、遺伝子再アッセンブリ法は、網羅的ライブラリーを生成するために網羅的に実施される。換言すると、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成したキメラ核酸分子のセットで提示される。同時に、各組合せにおける集合の順番（すなわち、完成したキメラ核酸のそれぞれの配列の５’から３’の方向における各構築ブロックの集合の順番）は、設計に従った（又は非確率論的な）ものである。この方法の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は著しく低減される。
別の特徴において、本方法は、遺伝子再アッセンブリ法を系統的に実施して、例えば、系統的に、例えば１つずつスクリーニングすることができる区画を有する系統的に区画化されたライブラリーを生成することを提供する。換言すると、本発明は、連続工程による集合反応の選択的及び慎重な使用と併せて、特定の核酸構築ブロックを選択的及び慎重に使用することによって、特定の子孫生成物のセットが幾つかの反応容器のそれぞれで作製される実験的設計が得られることを提供する。このことによって、系統的な調査及びスクリーニング手順を実施することが可能になる。したがって、この方法は、潜在的に非常に多数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。
【０２１５】
特に祖先分子間で低レベルの相同性が存在するときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な方法でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、本発明は多数の子孫分子から構成されるライブラリー（又はセット）の生成を提供する。本発明の遺伝子再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は、一つの特徴では、設計に従って選択された全体的な集合の順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。特定の態様において、そのように生成されたライブラリーは、１０3を越え１０1000を越えるまでの種々の子孫分子種から構成される。
一つの特徴において、記載されたように産生された完成したキメラ核酸分子のセットは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される。一つの特徴によると、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、人工遺伝子であり得る。一つの特徴によると、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、人工遺伝子経路であり得る。本発明は、本発明により生成される１つ以上の人工遺伝子を、真核生物（植物を含む）において操作可能な経路のような人工遺伝子経路に組み込むことができることを提示する。
【０２１６】
別の例示において、構築ブロックが生成される工程の合成的な性質が、核酸（例えば、コドン又はイントロン又は制御配列でありうる、１つ以上のヌクレオチド）の設計及び導入を可能にし、後で場合によりインビトロ過程（例えば、変異導入）又はインビボ過程（例えば、宿主生物体の遺伝子スプライシングの能力を利用すること）により除去することができる。多くの場合において、これらのヌクレオチドの導入は、利用可能な境界点を作り出す潜在的な利益に加えて、その他多くの理由のために望ましい場合もあることが理解される。
【０２１７】
したがって、別の特徴によると、本発明は、核酸構築ブロックを使用してイントロンを導入できることを提供する。したがって、本発明は、機能性イントロンを本発明の人工遺伝子に導入できることを提供する。本発明は、機能性イントロンを本発明の人工遺伝子経路に導入できることも提供する。したがって、本発明は、１つ（又はそれ以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。
本発明は、１つ（又はそれ以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成も提供する。一つの特徴において、人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能的に役立つような方法で、遺伝子スプライシングにおいて１つ以上の宿主細胞で機能する。本発明は、組換え及び／又はスプライシングのために宿主生物体に導入される、人工イントロン含有ポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。
【０２１８】
本発明を使用して作製された人工遺伝子は、別の核酸による組換えのための基質としても機能することができる。同様に、本発明を使用して作製された人工遺伝子経路は、別の核酸による組換えのための基質としても機能することができる。一つの特徴において、前記組換えは、人工イントロン含有遺伝子と、組換えパートナーとして機能する核酸との間の相同領域により促進されるか又はその領域で発生する。一つの特徴において、前記組換えパートナーは、人工遺伝子又は人工遺伝子経路を含む、本発明により生成される核酸であることもできる。組換えは、人工遺伝子に人工的に導入された１つ（又はそれ以上）のイントロンに存在する相同領域により促進されるか、又は前記領域で発生し得る。 
一つの特徴において、本発明の合成遺伝子再アッセンブリ方法は、一つの態様ではそれぞれ２つの連結可能な末端を有する複数の核酸構築ブロックを利用する。それぞれの核酸構築ブロックの２つの連結可能な末端は、２つの平滑末端（すなわち、それぞれゼロ核酸のオーバーハングを有する）、又は一つの特徴では、１つの平滑末端と１つのオーバーハング、又はなおさらに一つの特徴では、２つのオーバーハングであることができる。一つの特徴において、この目的に有用なオーバーハングは、３’オーバーハング又は５’オーバーハングである。したがって、核酸構築ブロックは、３’オーバーハングか、あるいは５’オーバーハングか、あるいは２つの３’オーバーハングか、あるいは２つの５’オーバーハングを有することができる。核酸構築ブロックが再集合されて完成したキメラ核酸分子を形成する全体的な順番は意図的な実験設計により決定され、ランダムではない。
【０２１９】
一つの特徴において、核酸構築ブロックは、２つの１本鎖核酸（一本鎖オリゴとも呼ばれる）の化学合成、及びアニーリングさせて二本鎖核酸構築ブロックを形成するようにそれらを接触させることによって生成される。二本鎖核酸構築ブロックは多様なサイズであってよい。これらの構築ブロックのサイズは大型であっても小型であってもよい。構築ブロックの例示的なサイズは、１塩基対（あらゆるオーバーハングを含まない）から１００，０００塩基対（あらゆるオーバーハングを含まない）の範囲である。他の例示的なサイズも提供され、これらは、下限の１bp〜１０，０００bp（その間の全ての整数を含む）及び上限の２bp〜１００，０００bp（その間の全ての整数を含む）を有する。
【０２２０】
本発明に役に立つ二本鎖核酸構築ブロックを生成できる多くの方法が存在し、それらは当該技術で既知であり、当業者によって容易に実施することができる。一つの特徴によると、二本鎖核酸構築ブロックは、最初に２つの１本鎖核酸を生成し、それらをアニーリングさせて二本鎖核酸構築ブロックを形成することによって生成される。２本鎖核酸構築ブロックの２本の鎖は、オーバーハングを形成するもの以外の全ての核酸と相補的であってよく、したがって、オーバーハング以外のミスマッチを含まなくてよい。別の特徴によると、２本鎖核酸構築ブロックの２本の鎖は、オーバーハングを形成するもの以外の全ての核酸よりは少ない核酸と相補的である。したがって、この特徴によると、２本鎖核酸構築ブロックをコドン縮退を導入するために使用できる。ある特徴において、コドン縮退は、本明細書に記載されている部位飽和変異導入を使用し、１つ以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットを用いて、あるいは１つ以上のＮ，Ｎ，Ｎカセットを用いて導入される。
【０２２１】
本発明のインビボ組換え法は、不明のハイブリッドのプール又は特定のポリヌクレオチド若しくは配列の対立遺伝子のプールで盲目的に実施することができる。しかし、特定のポリヌクレオチドの実際のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を知ることは必ずしも必要ではない。遺伝子の混合集団内で組換えを使用する手法は、任意の有用なタンパク質、例えば本発明のセルラーゼ又はその変種の生成に有用でありうる。この手法を使用して、変更された特異性又は活性を有するタンパク質を生成することができる。この手法はハイブリッド核酸配列、例えば、遺伝子のプロモーター領域、イントロン、エクソン、エンハンサー配列、３'非翻訳領域又は５'非翻訳領域の生成に有用であることもできる。したがって、この手法を使用して発現速度の増加した遺伝子を生成することができる。この手法は反復ＤＮＡ配列の研究においても有用でありうる。最後に、この手法は本発明のリボザイム又はアプタマーの作製に有用でありうる。
一つの特徴において、本明細書に記載されている本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は組換えにより得たタンパク質のような高度な複合体直線状配列の定方向分子進化を可能にする、還元的再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用を対象とする。
【０２２２】
最適化定方向進化系
本発明は、「最適化定方向進化系」と呼ばれる、新たな又は改変された特性を有する本発明のポリペプチド、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は抗体を生成する非確率論的遺伝子改変系を提供する。一つの特徴において、最適化定方向進化は、組換えによる核酸の定方向分子進化を可能にする、還元的再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用を対象とする。
最適化定方向進化は、進化したキメラ配列の大集団の生成を可能にする。生成された前記集団は、所定数の交差事象を有する配列が著しく豊富である。交差事象は、一方の親の変種から別の親の変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列内の点である。そのような点は、通常、２つの親からのオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。この方法は、完成キメラ配列集団が選択した数の交差事象を豊富に含むように、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、所定数の交差事象を有するキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
【０２２３】
加えて、この方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種スペースの探索のための都合のよい手段を提供する。以前は、反応の際に例えば１０13個のキメラ分子が生成された場合、そのような多くの数のキメラ変種を特定の活性について試験することは極めて困難であったであろう。更に、子孫集団の相当な部分が、特定の活性のレベルが増加している可能性が少ないタンパク質をもたらす非常に多数の交差事象を含むであろう。この方法を使用することによって、キメラ分子集団は、特定の数の交差事象を有する変種を豊富に含むことができる。したがって、反応の際に１０13個のキメラ分子が生成されたとしても、更なる分析のために選択されるそれぞれの分子は、例えば３つの交差事象だけを有する可能性が高くなる。得られた子孫集団が所定数の交差事象を持つように偏らせることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界線が下がる。これによって、元の親のポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を与える原因であるかを計算するときに、より操作しやすい数の変数が提供される。
【０２２４】
キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作り出す１つの方法は、それぞれの親の配列のフラグメント又は部分に対応するオリゴヌクレオチドを作り出すことである。一つの特徴において、オリゴヌクレオチドは、それぞれ固有の重複領域を含み、これによりオリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって、それぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントが正しい順番で集合した新たな変種をもたらす。本発明のこれらの方法を実施する代替的なプロトコールは、米国特許第６，７７３，９００号、同第６，７４０，５０６号、同第６，７１３，２８２号、同第６，６３５，４４９号、同第６，６０５，４４９号、同第６，５３７，７７６号、同第６，３６１，９７４号で見出すことができる。
それぞれの親変種について生成されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作り出されたキメラ分子で得られる交差の総数と関係がある。例えば、３つの親のヌクレオチド配列変種が提供され、連結反応を受けて、例えば高温でより高い活性をもつキメラ変種を見つけることができる。一つの例としては、５０個のオリゴヌクレオチド配列のセットをそれぞれの親変種のそれぞれの部分に対応して生成することができる。したがって、連結再アッセンブリ過程の間に、それぞれのキメラ配列の中に５０個までの交差事象が存在することができる。生成されたそれぞれのキメラポリヌクレオチドが、それぞれの親変種からのオリゴヌクレオチドを交互に含む確率は非常に低いそれぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントが連結反応で同じモル量で存在する場合、いくつかの位置で同じ親からのオリゴヌクレオチドが互いに並んで連結され、したがって交差事象を生じない可能性がある。それぞれの親からのそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度が、この例のいずれの連結工程でも一定に保たれる場合、同じ親変種からのオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結され、交差を生じないチャンスは１／３である（３つの親と仮定した）。
【０２２５】
したがって、親変種セットの数、それぞれの変種に対応するオリゴヌクレオチドの数、及び連結反応の各工程におけるそれぞれの変種の濃度が与えられたならば、連結反応の各工程で生じる可能性がある交差事象をもつ集団を予測するために確率密度関数（ＰＤＦ）を決定することができる。ＰＤＦの決定の背景にある統計学及び数学は以下に記載される。これらの方法を利用することによって、そのような確率密度関数を計算することができ、したがって特定の連結反応から生じる所定の数の交差事象のためにキメラ子孫集団を豊富にすることができる。更に、交差事象の標的数を予め定めることができ、次に、所定数の交差事象に集中する確率密度関数をもたらすように、連結反応の各工程におけるそれぞれの親オリゴヌクレオチドの出発量を算出するために系をプログラミングすることができる。これらの方法は、組換えによりポリペプチドをコードする核酸の定方向分子進化を可能にする還元的再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用に関する。この系は、進化したキメラ配列の大集団の生成を可能にし、生成された集団は、所定数の交差事象を有する配列が著しく豊富である。交差事象は、一方の親の変種から別の親の変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列内の点である。そのような点は、通常、２つの親からのオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。この方法は、完成キメラ配列集団が選択した数の交差事象を豊富に含むように、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、所定数の交差事象を有するキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
【０２２６】
加えて、これらの方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種スペースの探索のための都合のよい手段を提供する。本明細書に記載されている方法を使用することによって、キメラ分子集団は、特定の数の交差事象を有する変種を豊富に含むことができる。したがって、反応の際に１０13個のキメラ分子が生成されたとしても、更なる分析のために選択されるそれぞれの分子は、例えば３つの交差事象だけを有する可能性が高くなる。得られた子孫集団が所定数の交差事象を持つように偏向させることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界線が下がる。これによって、元の親のポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を与える原因であるかを計算するときに、より扱い易い数の変数が提供される。
【０２２７】
一つの特徴において、本方法は、それぞれの親の配列のフラグメント又は部分に対応するオリゴヌクレオチドを作り出すことによってキメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作り出す。一つの態様において、各オリゴヌクレオチドは、それぞれ固有の重複領域を含み、これによりオリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって、それぞれのオリゴヌクレオチドフラグメントが正しい順番で構築された新たな変種をもたらす。例えば、米国特許第６，７７３，９００号、同第６，７４０，５０６号、同第６，７１３，２８２号、同第６，６３５，４４９号、同第６，６０５，４４９号、同第６，５３７，７７６号、同第６，３６１，９７４号も参照すること。
【０２２８】
交差事象の決定
本発明の特徴には、所望の交差確率密度関数（ＰＤＦ）、再集合される親遺伝子の数及び再集合におけるフラグメント数を入力としての受け取るシステム及びソフトが含まれる。このプログラムの出力は、再集合遺伝子を作製するための処方を決定するために使用することができる「フラグメントＰＤＦ」及びこれら遺伝子の推定交差ＰＤＦである。本明細書に記載されている処理は、一つの特徴では、プログラミング言語及びテクニカルコンピューティングのための開発環境である、MATLAB（商標）（The Mathworks, Natick, Massachusetts）で実施される。
【０２２９】
反復プロセス
本発明の任意のプロセスは繰り返し反復することができ、例えば、本発明の改変された又は新たなセルラーゼ表現型、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸は、同定され、再単離され、再び改変され、活性について再試験されることができる。このプロセスは、所望の表現型が作り出されるまで繰り返し反復することができる。例えば、完全な生化学的同化作用又は異化作用経路を、細胞の中に操作して入れることができ、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性が含まれる。
同様に、特定のオリゴヌクレオチドが、所望の属性（例えば、新たなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素表現型）対して全く影響を与えないことが確定される場合、除去すべき配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することによって、変数としてのこのオリゴヌクレオチドを除去することができる。配列をより大きな配列内に組み込むことによってあらゆる交差事象が防止されるので、子孫ポリヌクレオチド中にはこの配列の変種はもはや全く存在しないであろう。どのオリゴヌクレオチドが所望の属性と最も関係があり、どのオリゴヌクレオチドが無関係であるかを決定するこの反復実施は、特定の属性又は活性を提供する可能性がある全ての可能なタンパク質変種のより効率的な探索を可能にする。
【０２３０】
インビボシャッフリング
多様な特徴の中で、分子のインビボシャッフリングは、本発明のポリペプチドの変種、例えば本発明の抗体、又は本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素などを提供する本発明の方法で使用される。インビボシャッフリングは、多量体を組換える細胞の天然の特性を利用して実施することができる。インビボ組換えは、分子の多様性をもたらす主要な天然の経路を提供してきたが、遺伝子組換えは、１）相同性の認識；２）鎖の切断、鎖の侵襲、及び組換えキアズマの生成をもたらす代謝工程；最後に３）キアズマを分離した組換え分子に解離させることを含む比較的複雑なプロセスを維持したままである。キアズマの形成は相同配列の認識を必要とする。
【０２３１】
別の特徴において、本発明は、少なくとも第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを産生する方法を含む。本発明を使用して、少なくとも１つの部分的な配列相同性の領域を共有する第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド（例えば、１つ又はその両方は、本発明の例示的なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード配列である）を適切な宿主細胞に導入することによってハイブリッドポリヌクレオチドを産生することができる。部分的な配列相同性の領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを産生する配列認識をもたらすプロセスを促進する。本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」は、本発明の方法によりもたらされ、かつ少なくとも２つの元のポリヌクレオチド配列からの配列を含む任意のヌクレオチド配列である。そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子間の配列統合を促進する分子間組換え事象により生じることができる。加えて、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、反復配列を利用してＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列を変更する分子内還元的再組合せプロセスにより生じることができる。
【０２３２】
一つの特徴において、  in vivo再組合せは、包括的に“組換え”と称される“分子間”過程（細菌では一般的に“RecA-依存”現象とみなされる）に集約される。本発明は、配列の組換え及び再組合せを生じる宿主細胞の組換え過程に依存するか、又は欠失により細胞内で準反復配列の複雑度を減少させる還元過程を媒介する細胞の能力に依存することができる。この「還元的再組合せ」過程は、「分子内」ＲｅｃＡ依存性プロセスにより生じる。
本発明の別の特徴において、新規ポリヌクレオチドは還元的再組合せの過程により生成することができる。この方法は、連続配列（元のコード配列）、適切なベクターへのそれらの挿入、続く適切な宿主細胞へのそれらの導入を含む構築物を生成することに関わる。個々の分子実体の再組合せは、相同性領域を含む構築物中の連続配列間、又は準反復単位間のコンビナトリアルプロセスにより生じる。再組合せプロセスは反復配列を組換え及び／又は反復配列の複雑度及び程度を低減し、新規分子種の産生をもたらす。多様な処理を適用して、再組合せの速度を向上することができる。これらは、紫外線による処理、又はＤＮＡ損傷化学物質、及び／又は上昇した「遺伝子不安定性」レベルを示す宿主細胞の使用を含むことができる。したがって、再組合せプロセスは、自己の進化を誘導するために相同組換え又は準反復配列の天然の特性を含み得る。
【０２３３】
反復又は「準反復」配列は、遺伝子不安定性において役割を果たす。一つの特徴において、「準反復」は、元の単位構造に限定されない反復である。準反復単位は構築物中に配列のアレイとして表れることができ、類似の配列の連続単位である。いったん連結すると、連続配列の間の接合部は、実質的に可視化され、得られた構築物の準反復特性は、ここで、分子レベルで連続性となる。欠失プロセスでは、細胞は、準反復配列間で作用する、得られた構築物の複雑度を低減するために機能する。準反復単位は、スリッページ事象が起こると、実質的に制限のない鋳型のレパートリーを提供する。一つの態様において、準反復を含む構築物は、したがって、十分な分子弾性を有効に提供し、欠失（及び潜在的には挿入）事象は、準反復単位内で実質的にどこでも起きることができる。 
準反復配列が同じ配向で、例えばヘッドからテールへ又はその逆の配向で全て連結される場合、細胞は個別の単位を区別することができない。したがって、還元性プロセスは配列の全体にわたって生じ得る。対照的に、例えば、単位がヘッドからテールではなくヘッドからヘッドで表れている場合、この逆位により隣接単位の終点が線引きされ、これによって欠失形成は個別の単位欠失を優先するようになる。したがって、配列が同じ配向であることが本発明にとって好ましい。準反復配列のランダム配向は、再組合せ効率の損失をもたらし、一方、配列の一貫性配向は最高の効率を提供するであろう。しかし、同じ配向で隣接した配列が少なくなると効率が減少するが、新規分子の有効な回収にとって依然として十分な弾力性が得られるであろう。構築物を同じ配向の準反復配列を有するように作製して、より高い効率を可能にすることができる。
【０２３４】
配列は、以下を含む多様な方法のいずれかを使用してヘッドからテールの配向で集合させることができる： 
ａ）ポリＡヘッド及びポリＴテールを含む（一本鎖で作製される場合に配向を提供する）プライマーを利用することができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製（したがってRnaseHで容易に除去できる）することにより達成される。
ｂ）固有の制限切断部位を含むプライマーを利用することができる。マルチ部位、一連の固有の配列及び反復合成、並びに連結工程が必要であろう。
ｃ）プライマーの内部の幾つかの塩基をチオール化し、エキソヌクレアーゼを使用して適切にテールを切った分子を産生することができる。
【０２３５】
一つの特徴において、再組合せされた配列の回収は、低減した反復指数（ＲＩ）を有するクローニングベクターの同定に依存している。次に再組合せコード配列を増幅により回収することができる。生成物を再クローン化し、発現させる。低減したＲＩを有するクローニングベクターの回収は、以下のようにして実施することができる：
１）構築物の複雑度が低減したときにのみ安定して維持されるベクターの使用。
２）物理的な手順による短縮ベクターの物理的回収。この場合、クローニングベクターは、標準的なプラスミド単離手順の使用及びアガロースゲル又は標準的手順を利用した低分子量カットオフのカラムによるサイズ分画を使用して回収される。
３）挿入物の大きさが減少したときに選択できる中断遺伝子を含有するベクターの回収。
４）発現ベクターによる直接選択技術及び適切な選択の使用。
【０２３６】
関連する生物からのコード配列（例えば、遺伝子）は高度な相同性を示し、非常に多様なタンパク質生成物をコードすることができる。これらの種類の配列は、準反復として本発明において特に有用である。しかし、下記に示される例は、ほぼ同一の元のコード配列（準反復）の再組合せを示すが、このプロセスはそのようなほぼ同一の反復に限定されない。
【０２３７】
以下の例は、本発明の例示的な方法を示す。３つの固有種由来のコード核酸配列（準反復）が記載される。それぞれの配列は、特性の別個のセットを有するタンパク質をコードする。それぞれの配列は、配列中の独自の位置で単一又は数個の塩基対により異なっている。準反復配列は、別々に又は集合的に増幅され、ランダム集合物へ連結され、これによって全ての順列及び組合せが連結分子の集団で利用可能になる。準反復単位の数は、構築条件により制御することができる。構築物中の準反復単位の平均数は、反復指数（ＲＩ）として定義される。 
いったん形成されるたなら、構築物を公表されたプロトコールに従ってアガロースゲルでサイズ分画して、あるいはせずに、クローニングベクターに挿入すること及び適切な宿主細胞にトランスフェクションすることができる。次に細胞を増殖させ、「還元的再組合せ」を実行する。還元的再組合せプロセスの速度は、望ましい場合はＤＮＡ損傷の導入により刺激することができる。ＲＩの低減が、「分子内」機構による反復配列の間の欠失形成によって媒介されるか、又は「分子間」機構を介した組換え様事象により媒介されるかは、重要ではない。最終結果は、可能な全ての組合せへの分子の再組合せである。
【０２３８】
場合により、この方法はシャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングして、例えば、タンパク質レセプター、オリゴ糖、ビリオン又は他の所定の化合物若しくは構造のような所定の高分子と、結合するか、そうでなければ相互作用するか又は特定の反応を触媒する（例えば、酵素の触媒ドメイン）能力を有するシャッフルされた個別のライブラリーメンバーを同定することを含む。
そのようなライブラリーから同定されたポリペプチドを、治療診断、研究及び関連する目的（例えば、触媒、水溶液などの浸透圧を増加する溶質）に使用することができ、並びに／又はシャッフリング及び／若しくは選択の１つ以上の追加のサイクルに付すことができる。 
【０２３９】
別の特徴において、組換え又は再組合せの前又はその間に、本発明の方法により生成されたポリヌクレオチドを、変異を元のポリヌクレオチドに導入することを促進する作用物質又はプロセスに付すことができる。そのような変異の導入は、得られるハイブリッドポリヌクレオチド及びそれらによりコードされるポリペプチドの多様性を増大する。変異導入を促進する作用物質又はプロセスは、以下を含むことができるが、これらに限定はされない：（＋）−ＣＣ−１０６５、又は（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）のような合成類似体Ａｄｅｎｉｎｅ（Sun and Hurley, (1992)を参照すること）；ＤＮＡ合成を阻害することができるＮ−アセチル化又は脱アセチル化４’−フルオロ−４−アミノビフェニル付加物（例えば、van de Poll et al. (1992)を参照すること）；又はＤＮＡ合成を阻害することができるＮ−アセチル化又は脱アセチル化４−アミノビフェニル付加物（van de Poll et al. (1992), pp. 751-758も参照すること）;ＤＮＡ複製を阻害することができる三価クロム、三価クロム塩、多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）ＤＮＡ付加物、例えば、７−ブロモエチル−ベンズ〔ａ〕アントラセン（「ＢＭＡ」）、トリス（２，３−ジブロモプロピル）ホスフェート（「Ｔｒｉｓ−ＢＰ」）、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン（「ＤＢＣＰ」）、２−ブロモアクロレイン（２ＢＡ）、ベンゾ〔ａ〕ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９−１０−エポキシド（「ＢＰＤＥ」）、白金（ＩＩ）ハロゲン塩、Ｎ−ヒドロキシ−２−アミノ−３−メチルイミダゾ〔４，５−ｆ〕−キノリン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＩＱ」）及びＮ−ヒドロキシ−２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ〔４，５−ｆ〕−ピリジン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＰｈＩＰ」）。ＰＣＲ増幅を遅延又は停止させる例示的な手段は、ＵＶ光線（＋）−ＣＣ−１０６５及び（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）からなる。特に包含される手段は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドプールからのＤＮＡ付加物を含むＤＮＡ付加物又はポリヌクレオチドであり、これらは更に処理される前にポリヌクレオチドを含む溶液を加熱することを含むプロセスにより放出又は除去できる。
別の特徴において、本発明は、本発明の条件下で野生型タンパク質をコードする二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含む試料を処理することによって、生物学的活性を有する組換えタンパク質を産生する方法を対象とし、これは、ハイブリッド又は再組合せポリヌクレオチドの産生のために提供される。
【０２４０】
配列変種の作製
本発明は、本発明の核酸（例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）配列の配列変種を作製する追加的な方法も提供する。本発明は、本発明の核酸及びポリペプチドを使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を単離する追加的な方法も提供する。一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード配列（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ又はメッセージ）の変種を提供し、これは、例えば、上記で記載したランダム若しくは確率論的方法又は非確率論的若しくは「定方向進化」方法を含むあらゆる方法によって変更することができる。 
【０２４１】
単離された変種は、天然に存在し得る。変種はインビトロで作り出すこともできる。変種は、部位特異的変異導入、ランダム化学変異導入、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失手順及び標準的クローニング技術のような遺伝子工学技術を使用して作り出すことができる。あるいは、そのような変種、フラグメント、類似体又は誘導体は、化学的合成又は改変手順を使用して方法を使用して作り出すことができる。変種を作製する他の方法も当業者にはよく知られている。これらには、天然の単離物から得られた核酸配列を改変して、それらの産業的価値又は実験室適用を高める特徴を有するポリペプチドをコードする核酸を生成する手順が含まれる。そのような手順において、天然の単離物から得られた配列に対して１つ以上のヌクレオチドの相違を有する多数の変種配列が生成され、特徴が決定される。これらのヌクレオチド相違は、天然の単離物の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸変化をもたらすことができる。
【０２４２】
例えば、変種は、エラープローンPCRを使用して作り出すことができる。エラープローンPCRの一つの態様において、ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの複写忠実性が低い場合、高率の点変異がＰＣＲ生成物の全長に沿って得られるような条件下で実施される。エラープローンPCRは、例えば、Leung (1989) Technique 1:11-15) and Caldwell (1992) PCR Methods Applic. 2:28-33に記載されている。簡潔には、そのような手順では、変異が導入される核酸を、ＰＣＲプライマー、反応緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2、Ｔａｑポリメラーゼ及び適切な濃度のｄＮＴＰと混合し、ＰＣＲ生成物の全長に沿って高率の点変異が達成される。例えば、反応は、２０fmoleの変異が導入される核酸、３０pmoleの各ＰＣＲプライマー、５０mM  ＫＣｌ、１０mMトリス（ｐＨ８．３）及び０．０１％ゼラチンを含む反応緩衝液、７mMのＭｇＣｌ2、０．５mMのＭｎＣｌ2、５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．２mMのｄＧＴＰ、０．２mMのｄＡＴＰ、１mMのｄＣＴＰ、並びに１mMのｄＴＴＰを使用して実施される。ＰＣＲは、９４℃で１分間、４５℃で１分間、及び７２℃で１分間の３０サイクルにより実施することができる。しかし、これらのパラメーターは、適切であれば変えることができることが理解される。変異導入核酸は、適切なベクターにクローンされ、変異導入核酸によりコードされたポリペプチドの活性が評価される。
【０２４３】
一つの特徴において、変種は、目的の任意のクローン化ＤＮＡに部位特異的変異を生成するオリゴヌクレオチド特異的変異導入を使用して作り出される。オリゴヌクレオチド変異導入は、例えば、Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57に記載されている。簡潔には、そのような手順において、クローン化ＤＮＡに導入される１つ以上の変異をもつ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異が導入されるクローン化ＤＮＡに挿入される。一つの特徴において、変異が導入されたＤＮＡを含むクローンが回収され、発現され、それらによりコードされたポリペプチドの活性が評価される。
変種を生成する別の方法は、アッセンブリＰＣＲである。アッセンブリＰＣＲは、小型のＤＮＡフラグメントの混合物からＰＣＲ生成物を構築することを含む。多数の異なるＰＣＲ反応が同じバイアル中で並行して起こり、１つの反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングする。アッセンブリＰＣＲは、例えば米国特許第５，９６５，４０８号に記載されている。
【０２４４】
一つの特徴において、セクシュアルPCR変異導入は、本発明の変種を生成する例示的な方法である。一つの特徴において、セクシュアルＰＣＲ変異導入強制相同組換えが、配列相同性に基づくＤＮＡ分子のランダムなフラグメント化、それに続くＰＣＲ反応におけるプライマーの伸長による交差の固定の結果として、異なっているが高度に関連しているＤＮＡ配列をもつＤＮＡ分子間でインビトロにおいて生じる。セクシュアルＰＣＲ変異導入は、例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751で記載されている。簡潔には、そのような方法では、組換えられる複数の核酸をＤＮａｓｅで消化して、平均サイズが５０〜２００ヌクレオチドのフラグメントを生成する。所望の平均サイズをもつフラグメントを精製し、ＰＣＲ混合物に再懸濁する。ＰＣＲは、核酸フラグメント間の組換えが促進される条件下で実施される。例えば、ＰＣＲは、０．２mMの各ｄＮＴＰ、２．２mMのＭｇＣｌ2、５０mMのＫＣＬ、１０mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０及び０．１％トリトンＸ−１００の溶液中、濃度１０〜３０ng/μlで精製フラグメントを再懸濁することによって実施することできる。反応混合物１００μlあたり２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、ＰＣＲを、以下のレジメンを使用して実施した：９４℃で６０秒間、９４℃で３０秒間、５０〜５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間（３０〜４５回）及び７２℃で５分間。しかし、これらのパラメーターは、適切であれば変えることができることが理解される。幾つかの特徴において、オリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に含めることができる。他の特徴において、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを、ＰＣＲ反応の最初のセットで使用し、Ｔａｑポリメラーゼをその後のＰＣＲ反応セットで使用することができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０２４５】
一つの特徴において、変種をインビボ変異導入により作り出す。幾つかの態様において、目的の配列におけるランダム変異は、１つ以上のＤＮＡ修復経路に変異をもつ細菌株、例えばE. coli株で目的の配列を繁殖させることによって生成される。このような「ミューテーター」株は、野生型の親よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の１つでＤＮＡを繁殖させることによって、最終的にはＤＮＡ内にランダム変異が生成される。インビボ変異導入での使用に適切なミューテーター株は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／１６４２７（１９９１年１０月３１日公開、表題“Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Population”）に記載されている。
変種は、カセット変異導入を使用して生成することもできる。カセット変異導入において、二本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域が、天然の配列と異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”に代えられる。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全及び／又は部分的に無作為化抽出された天然の配列を含む。
【０２４６】
再帰的アンサンブル変異導入を使用して変種を生成することもできる。再帰的アンサンブル変異導入は、表現型的に関連する変種の多様な集団（そのメンバーはアミノ酸配列が異なる）を産生するために開発された、タンパク質工学（タンパク質変異導入）のためのアルゴリズムである。この方法は、フィードバック機構を使用して、連続する一連のコンビナトリアルカセット変異導入を制御する。再帰的アンサンブル変異導入は、例えば、Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815で記載されている。
幾つかの特徴において、変種は、エクスポネンシャル変異導入を使用して作り出される。エクスポネンシャル変異導入は、独自で機能的な変種の割合の高いコンビナトリアルライブラリーを生成する方法であり、残基の小グループが並行してランダム化され、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸がそれぞれの変更された位置で同定される。エクスポネンシャル変異導入は、例えばDelegrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552に記載されている。ランダム及び部位特異的変異導入は、例えば、Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455に記載されている。
幾つかの特徴において、変種は、シャッフリング手順を使用して作り出され、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分が一緒に融合されて、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を作り出し、米国特許第５，９６５，４０８号（１９９６年７月９日出願、表題“Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis”及び米国特許第５，９３９，２５０号（１９９６年５月２２日出願、表題“Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagenesis”）に記載されている。
【０２４７】
本発明のポリペプチドの変種は、本発明のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸残基（一つの態様では、保存アミノ酸残基）で置換されており、そのような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされているものでも、いないものでもよい変種であり得る。
一つの特徴において、保存的置換は、ポリペプチド内の所定のアミノ酸が同様な特徴の別のアミノ酸により置換されるものである。一つの特徴において、本発明の保存的置換は以下の置き換えを含む：アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのような脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸に置き換えること；セリンをトレオニンに置き換えること、又はその逆；アスパラギン酸及びグルタミン酸のような酸性残基を別の酸性残基に置き換える；アスパラギン及びグルタミンのようなアミド基をもつ残基を別のアミド基をもつ残基に置き換えること；リシン及びアルギニンのような塩基性残基を別の塩基性残基に交換すること；並びにフェニルアラニン、チロシンのような芳香族残基を別の芳香族残基に置き換えること。
【０２４８】
他の変種は、本発明のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものである。一つの態様において、他の変種は、ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と結合しているものである。追加的な変種は、リーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列又はポリペプチドの精製、濃縮若しくは安定化を促進する配列のような、追加のアミノ酸がポリペプチドと融合しているものである。
幾つかの特徴において、フラグメント、誘導体及び類似体は、本発明のポリペプチドと同じ生物学的機能又は活性を保持する。他の態様において、フラグメント、誘導体又は類似体はプロタンパク質を含み、これによって、フラグメント、誘導体又は類似体はプロタンパク質部分の切断により活性化され、活性ポリペプチドを産生することができる。
【０２４９】
宿主細胞における高レベルのタンパク質発現を達成するためのコドンの最適化
本発明は、コドン使用頻度を改変（例えば、最適化）するために、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード核酸を改変する方法を提供する。一つの特徴において、本発明は、宿主細胞における発現を増加又は減少するために、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸中のコドンを改変する方法を提供する。本発明は、また、宿主細胞において発現を増加するように改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸、そのように改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、及び改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の作製方法を提供する。この方法は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素コード核酸において「非優先」又は「低優先」コドンを同定し、１つ以上のこれらの非優先又は低優先コドンを、置き換えられるコドンと同じ核酸をコードする「優先コドン」で置き換え、核酸中の少なくとも１つの非優先又は低優先コドンが、同じ核酸をコードする優先コドンで置き換えられていることを含む。優先コドンとは、宿主細胞の遺伝子のコード配列において過剰提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンとは、宿主細胞の遺伝子のコード配列において過小提示されるコドンである。
【０２５０】
本発明の核酸、発現カセット及びベクターを発現するための宿主細胞には、細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が含まれる（上記の考察を参照すること）。したがって、本発明は、これら全ての細胞におけるコドンの使用を最適化する方法、コドン変更核酸及びコドン変更核酸により作製されるポリペプチドを提供する。例示的な宿主細胞には、大腸菌（Escherichia coli）のようなグラム陰性細菌、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）のようなグラム陽性細菌が含まれる。例示的な宿主細胞には、真核生物体、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）及びクレイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）を含むサッカロミセス種（Saccharomyces sp.）のような種々の酵母、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、哺乳動物細胞及び細胞株、並びに昆虫細胞及び細胞株も含まれる。したがって、本発明は、これらの生物体及び種での発現を最適化する核酸及びポリペプチドも含む。
【０２５１】
例えば、細菌細胞から単離されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードする核酸のコドンは、核酸が、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が由来する細菌と異なる細菌細胞、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞で最適に発現するように改変される。コドンを最適化する方法は、当該技術でよく知られている（例えば、米国特許第5,795,737号; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253を参照すること）。また、マウス系におけるコドンの最適化を記載するNarum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253：酵母におけるコドンの最適化を記載するOutchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24；E. coliにおけるコドンの最適化を記載するFeng (2000) Biochemistry 39:15399-15409；E. coliにおける分泌に影響を与えるコドン使用頻度の最適化を記載するHumphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264を参照すること。
【０２５２】
トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）、発現カセット若しくはベクター、又はトランスフェクション若しくは形質転換細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明は、これらのトランスジェニック非ヒト動物の作製及び使用方法も提供する。
トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、本発明の核酸を含むイヌ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ（全てのブタ（swine、hog）及び関連する動物を含む）、ウシ、ラット及びマウスであることができる。これらの動物は、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を研究するインビボモデルとして、又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性をインビボで変える作用物質をスクリーニングするためのモデルとして使用できる。トランスジェニック非ヒト動物で発現されるポリペプチドのためのコード配列は、構成的であるように、又は組織特異的、生育特異的若しくは誘導性転写調節因子の制御下にあるように設計することができる。
【０２５３】
トランスジェニック非ヒト動物は、当該技術で既知のいずれかの方法を使用して設計及び生成することができる（例えば、形質転換細胞及び卵、並びにトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ及びウシの作製及び使用を記載する、米国特許第６，２１１，４２８号、同第６，１８７，９９２、同第６，１５６，９５２号、同第６，１１８，０４４号、同第６，１１１，１６６号、同第６，１０７，５４１号、同第５，９５９，１７１号、同第５，９２２，８５４号、同第５，８９２，０７０号、同第５，８８０，３２７号、同第５，８９１，６９８号、同第５，６３９，９４０号、同第５，５７３，９３３号、同第５，３８７，７４２号、同第５，０８７，５７１を参照すること）。また、例えば、トランスジェニック乳畜のミルクにおける組換えタンパク質の産生を記載する、Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157、及びトランスジェニックヤギの作製を示す、Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461を参照すること。米国特許第６，２１１，４２８号は、ＤＮＡ配列を含む核酸構築物を脳の中で発現するトランスジェニック非ヒト動物の作製及び使用を記載する。米国特許第５，３８７，７４２号は、クローン化した組換え又は合成ＤＮＡ配列を受精マウス卵へ注入すること、注入卵を偽妊娠雌へ移植すること、及びトランスジェニックマウスと呼べるまで増殖させることを記載する。米国特許第６，１８７，９９２号は、トランスジェニックマウスの作製及び使用を記載する。
【０２５４】
「ノックアウト動物」も本発明の方法を実施するために使用できる。例えば、一つの態様において、本発明のトランスジェニック又は改変動物は、「ノックアウト動物」、例えば、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を発現する遺伝子に代えられているか又は本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む融合タンパク質に代えられている、内因性遺伝子を発現しないように操作された「ノックアウト動物」を含む。
【０２５５】
トランスジェニック植物及び種子
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）、発現カセット若しくはベクター、又はトランスフェクション若しくは形質転換細胞を含むトランスジェニック植物及び種子を提供する。本発明は、また、発明の核酸及び／又はポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）を含む植物生成物、例えば、油、種子、葉、抽出物などを提供する。トランスジェニック植物は、双子葉植物（双子葉類）又は単子葉植物（単子葉類）であることができる。本発明は、これらのトランスジェニック植物及び種子の作製及び使用方法も提供する。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物及び種子細胞は、当該技術で既知のいずれかの方法に従って構築することができる。例えば、米国特許第６，３０９，８７２号を参照すること。
本発明の核酸及び発現構築物は、任意の手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、核酸及び発現構築物を、所望の植物宿主のゲノムに導入することができるか、又は核酸若しくは発現構築物はエピソームであることができる。所望の植物のゲノムへの導入は、宿主のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素産生が、内因性の転写又は翻訳制御エレメントによって調節されるような導入であることができる。本発明は、また、例えば相同組換えによる遺伝子配列の挿入が内因性遺伝子の発現を破壊した「ノックアウト植物」を提供する。「ノックアウト」植物を生成する方法は当該技術でよく知られている（例えばStrepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365を参照すること）。下記のトランスジェニック植物につての考察を参照すること。
【０２５６】
本発明の核酸を使用して、実質的にあらゆる植物、例えばジャガイモ、トマト、ダイズ、ビーツ、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギなどのデンプン生成植物に所望の属性を付与することができる。本発明の核酸を使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の宿主の発現を最適化又は変更するために植物の代謝経路を操作することができる。これは、植物におけるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を変えることができる。あるいは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をトランスジェニック植物の生成に使用して、その植物により天然に生成されない化合物を生成することができる。このことは、生産費用を下げるか、又は新規の生成物を作り出すことができる。
一つの特徴において、トランスジェニック植物産生の第１の工程は、植物細胞で発現する発現構築物を作製することを含む。これらの技術は当該技術でよく知られている。これらには、プロモーターの選択及びクローニング、リボソームのｍＲＮＡへの効率的な結合を促進するコード配列の選択及びクローニング、及び適切な遺伝子ターミネーター配列の選択が含まれる。構成的プロモーターの一例は、カリフラワーモザイクウイルスに由来するＣａＭＶ３５Ｓであり、一般に植物において高度な発現をもたらす。他のプロモーターは、より特異的であり、植物の内部又は外部環境の合図に反応する。例示的な光誘導性プロモーターは、主要な葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質をコードするｃａｂ遺伝子に由来するプロモーターである。
【０２５７】
一つの特徴において、核酸は、植物細胞におけるより大きな発現を達成するために改変される。例えば、本発明の配列は、植物で見られるＡ−Ｔヌクレオチド対と比較して高い割合でＡ−Ｔヌクレオチド対を有する可能性があり、一部の植物は、Ｇ−Ｃヌクレオチド対を好む。したがって、コード配列におけるＡ−Ｔヌクレオチドを、アミノ酸配列を著しく変えることなくＧ−Ｃヌクレオチドで置換して、植物細胞における遺伝子生成物の産生を高めることができる。
選択可能なマーカー遺伝子を遺伝子構築物に付加して、導入遺伝子を組み込むことに成功した植物細胞又は組織を同定することができる。このことは、植物細胞において遺伝子の取り込み及び発現の達成が稀な事象であり、ごく僅かの割合の標的組織又は細胞でしか起こらないので必要である。選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質又は除草剤のような植物に通常毒性である作用物質に対して抵抗性を提供するタンパク質をコードする。適切な抗生物質又は除草剤を含有する培地で増殖させたとき、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ植物細胞のみが生存する。他の挿入遺伝子のように、マーカー遺伝子も適切な機能のためにプロモーター及び終結配列を必要とする。
【０２５８】
一つの特徴において、トランスジェニック植物又は種子を作製することは、本発明の配列、及び場合によりマーカー遺伝子を標的発現構築物（例えば、プラスミド）へ組み込むことを、プロモーター及びターミネーター配列を配置することと共に含む。これは、適切な方法により改変遺伝子を植物に移すことを含むことができる。例えば、構築物は、植物細胞のプロトプラストのエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションのような技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができるか、又は構築物は、ＤＮＡ粒子衝撃のような弾道法を使用して植物組織に直接導入することができる。例えば、導入遺伝子をコムギに導入する粒子衝撃の使用を記載する、Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69；及びＹＡＣを植物細胞に導入する粒子衝撃の使用について、Adam (1997) supraを参照すること。例えば、Rinehart (1997) supraは、粒子衝撃を使用してトランスジェニック綿植物を生成した。粒子を加速する装置は、米国特許第５，０１５，５８０号に記載され、BioRad (Biolistics) PDS-2000粒子加速機として市販されている（例えば、裸子植物の粒子媒介形質転換を記載する、米国特許第５，６０８，１４８号（John）及び米国特許第５，  ６８１，７３０号（Ellis）も参照すること）。
【０２５９】
一つの特徴において、プロトプラストを固定化して、核酸、例えば発現構築物をインジェクションすることができる。プロトプラストから植物を再生させることは穀類では容易ではないが、マメ科植物ではプロトプラスト由来カルスから体細胞胚形成を使用して植物の再生が可能である。器官化した組織は、遺伝子銃技術を使用して裸のＤＮＡにより形質転換することができ、この場合、ＤＮＡはタングステンの微小発射体上に被覆され、細胞のサイズの１／１００の弾丸で発射され、ＤＮＡを細胞及び細胞小器官の奥深くに運ぶ。次に形質転換組織を、通常体細胞胚形成により誘導して再生する。この技術は、トウモロコシ及びイネを含むいくつかの穀類種で成功した。 
【０２６０】
核酸、例えば発現構築物は、組換えウイルスを使用して、植物細胞に導入することもできる。植物細胞は、例えばタバコモザイクウイルス由来ベクター（Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999）ようなウイルスベクター使用して形質転換することができる（Porta (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants,” Mol. Biotechnol. 5:209-221を参照すること）。
あるいは、核酸、例えば発現構築物を、適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組合せて、従来のAgrobacterium tumefaciens宿主ベクターに導入することができる。Agrobacterium tumefaciens宿主の病原性機能は、細胞が細菌に感染したとき、植物細胞ＤＮＡへの構築物及び隣接するマーカーの挿入を指令する。無力化及びバイナリーベクターの使用を含むAgrobacterium tumefaciens媒介形質転換技術は、科学文献で十分に記載されている。例えば、Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)を参照すること。A. tumefaciens細胞のＤＮＡは、細菌の染色体中に、並びにＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドとして知られている別の構築物中に含まれている。Ｔｉプラスミドは、感染過程で植物細胞に移行するＴ−ＤＮＡ（約２０kbの長さ）と呼ばれる一続きのＤＮＡ及び感染過程を誘導する一連のｖｉｒ（病原性）遺伝子を含む。A. tumefaciensは、傷から植物に感染することしかできない：植物の根又は茎が傷を受けたとき、特定の化学的シグナルを発し、それに応答してA. tumefaciensのｖｉｒ遺伝子は活性化され、Ｔｉプラスミドから植物染色体へのＴ−ＤＮＡの移行に必要な一連の事象を誘導する。次にＴ−ＤＮＡが傷から植物細胞に進入する。一つの推測は、Ｔ−ＤＮＡは植物ＤＮＡが複製又は転写されるまで待機し、次に露出した植物ＤＮＡに自身を挿入するということである。A. tumefaciensを導入遺伝子ベクターとして使用するためには、Ｔ−ＤＮＡ境界領域及びｖｉｒ遺伝子を保持しつつ、Ｔ−ＤＮＡの腫瘍誘導部分を除去しなければならない。次に、導入遺伝子をＴ−ＤＮＡ境界領域の間に挿入する（この場合、トランスジーンは植物細胞に移入し、植物染色体に組み込まれる）。
【０２６１】
本発明は、本発明の核酸を使用した、重要な穀類を含む単子葉植物の形質転換を提供する（ゲノムＤＮＡへのＴ−ＤＮＡの組み込みについて考察している、Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205218.  See also, e.g., Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148を参照すること）。また、穀類又は他の単子葉植物の細胞で機能する遺伝子を含むＤＮＡを安定して組み込むための方法を記載する、米国特許第５，７１２，１３５号（D'Halluin）を参照すること。 
【０２６２】
一つの特徴において、第３の工程は、取り込まれた標的遺伝子を次の世代に伝達することができる全植物体の選択及び再生を含む。そのような再生技術では、組織培養の増殖培地において特定の表現型の操作を使用することができる。一つの特徴において、その方法は、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生剤及び／又は除草剤マーカーを使用する。培養プロトプラストからの植物再生は、Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生は、植物カルス、外植片、器官又はその部分から得ることもできる。そのような再生技術は、一般に、Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486で記載されている。未熟胚のようなトランスジェニック組織から全植物体を得るために、これらを栄養素及びホルモンを含有する一連の培地中で環境制御条件下で増殖させることができ、これは組織培養として既知の方法である。全植物体が再生され、種子を生じたなら、子孫の評価を開始する。
【０２６３】
一つの特徴において、発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後、この発現カセットを有性交配によって他の植物に導入することができる。交配される種に応じて、多くの標準的育種技術のいずれかを使用することができる。本発明の核酸の遺伝子導入発現は表現型に変化をもたらすので、本発明の組換え核酸を含む植物を第２の植物と有性交配して、最終生成物を得ることができる。したがって、本発明の種子は、本発明の２つのトランスジェニック植物間の交配、又は本発明の植物と別の植物との間の交配由来し得る。所望の効果（例えば、本発明のポリペプチドを発現させて開花の挙動の変化した植物を生み出すこと）は、両方の親植物が本発明のポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）を発現するときに強化できる。所望の効果は、将来の植物世代に標準的な繁殖手段によって伝えることができる。
【０２６４】
一つの特徴において、本発明の核酸及びポリペプチドを、任意の植物又は種子で発現させるか又はそれに挿入する。本発明のトランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であることができる。本発明のトランスジェニック単子葉植物の例は、牧草、例えばイチゴツナギ（ブルーグラス、Poa）、飼い葉用草類、例えばウシノケグサ、ドクムギ、寒地型牧草、例えばAgrostis、並びに穀類、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、ソルガム及びトウモロコシ（コーン）である。本発明のトランスジェニック双子葉植物の例は、タバコ、ルピナスのようなマメ類、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメ、インゲンマメ及びダイズ、カリフラワーのような十字花植物（Brassicaceae科）、ナタネ、並びに近縁のモデル生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である。したがって、本発明のトランスジェニック植物及び種子には、アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス、アトロパ（Atropa）、アベナ（Avena）、ブラシカ（Brassica）、シトラス、シトルルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルサムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コフェア（Coffea）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cuurbita）、ダウクス（Daucus）、エレイス（Elaeis）、フラガリア（Fragaria）、ダイズ（Glycine）、ワタ（Gossypium）、ヘリアンサス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピナス、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ、オレア（Olea）、イネ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パニセツム（Panisetum）、ペルセア（Persea）、ファセオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ソラマメ（Vicia）、ブドウ（Vitis）、アズキ（Vigna）、およびゼア（Zea）属の種が含まれるが、これらに限定はされない広範囲の植物が含まれる。
【０２６５】
別の態様において、本発明の核酸は、例えば、綿、シルクコットンツリー（Kapok、Ceiba pentandra）、砂漠ヤナギ、クレオソートブッシュ、ウィンターファット、バルサ、カラムシ、ケナフ、アサ、ローゼル、ジュート、サイザルアバカ及びアマが挙げられる繊維細胞を含む植物で発現する。代替的実施態様において、本発明のトランスジェニック植物は、G.アロボレウム（G. arboreum）、G.ヘルバセウム（G. herbaceum）、G.バルバデンス（G. barbadense）及びＧ．ヒルスタム（G. hirsutum）のような任意のゴシピウム（Gossypium）種のメンバーを含むゴシピウム（Gossypium）属のメンバーであることができる。
【０２６６】
本発明は、多量の本発明のポリペプチド（例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は抗体）を産生するために使用されるトランスジェニック植物も提供する。例えば、Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296（オーキシン誘導性二方向性マンノピンシンターゼ（ｍａｓ１’，２’）プロモーターを使用する、Agrobacterium tumefaciens媒介葉ディスク形質転換法による、トランスジェニックなジャガイモにおける母乳タンパク質のベータカゼインの産生）を参照すること。
既知の手順を使用して、当業者は、トランスジェニック植物で導入遺伝子ｍＲＮＡ又はタンパク質の増加又は減少を検出することによって、本発明の植物をスクリーニングすることができる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の検出及び定量化の方法は、当該技術でよく知られている。
【０２６７】
ポリペプチド及びペプチド
一つの態様において、本発明は、本発明の例示的な配列、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４又は配列番号１６６（下記の表１、２及び３、実施例１及び４、並びに配列表も参照すること）に記載の配列を有するタンパク質に、配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、又は完全な（１００％）配列同一性若しくは相同性）を有する単離又は組換えポリペプチドを提供する。前記同一性の百分率は、ポリペプチドの完全長にわたることができるか、又は前記同一性は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００個又はそれ以上の残基の範囲にわたることができる。
【０２６８】
本発明のポリペプチドは、また、例示的なポリペプチドの完全長よりも短いこともあり得る。別の特徴において、本発明は、サイズが約５からポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素のような酵素）の完全長の間のサイズの範囲のポリペプチド（ペプチド、フラグメント）を提供する。例示的な前記サイズは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００個又はそれ以上の残基、例えば、本発明の例示的なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の隣接する残基である。本発明のペプチド（例えば、本発明の例示的なポリペプチドの部分配列）は、例えば、標識プローブ、抗原（免疫原）、トレラゲン、モチーフ、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性部位（例えば、「触媒ドメイン」）、シグナル配列、及び／又はプレプロドメインとして有用でありうる。
【０２６９】
別の特徴において、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、特定の構造要素を共有するポリペプチド族のメンバーである。前記特定の構造要素とは、例えば、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性と相関するアミノ酸残基である。これらの共有構造要素を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ変種の日常的な生成に使用することができる。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素のこれらの共有構造要素を、本発明のポリペプチド族の範囲内のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ変種の日常的な生成のための指針として使用することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ」は、セルラーゼ、又は、セルラーゼ若しくはリグノセルロース材料の改変物、例えばリグノセルロースを含むバイオマス材料、の完全な若しくは部分的な分解及び／又は加水分解を触媒することができるあらゆるポリペプチド又は酵素を包含する（例えば、本発明の例示的なポリペプチド、また、下記の表１、２及び３、実施例１及び４を参照すること）。
【０２７０】
幾つかの特徴において、本発明のポリペプチドは、例えば下記の表３で記載される代替的な酵素活性を有することができる。例えば、下記で示されているように、例えば配列番号１６３によってコードされる、配列番号１６４に記載される配列を有するポリペプチドは、アルカリエンドグルカナーゼ／セルラーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１０９によってコードされる、配列番号１１０に記載される配列を有するポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１１によってコードされる、配列番号１２に記載される配列を有するポリペプチドは、ＮＡＤ結合オキシドレダクターゼ活性を有することができ、例えば配列番号１１７によってコードされる、配列番号１１８に記載される配列を有するポリペプチドは、短鎖デヒドロゲナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１３によってコードされる、配列番号１４に記載される配列を有するポリペプチドは、ＮＡＤＨ依存性デヒドロゲナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１３７によってコードされる、配列番号１３８  に記載される配列を有するポリペプチドは、ペプチダーゼ活性を有することができ、例えば配列番号１６１によってコードされる、配列番号１６２に記載される配列を有するポリペプチドは、セルラーゼ活性に加えて、アルカリエンドグルカナーゼ活性を有することができ、例えば配列番号４１によってコードされる、配列番号４２に記載される配列を有するポリペプチドは、システイニルｔＲＮＡシンセターゼ活性を有することができ、例えば配列番号３１によってコードされる、配列番号３２に記載される配列を有するポリペプチドは、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有することができ、例えば配列番号４９によってコードされる、配列番号５０に記載される配列を有するポリペプチドは、ｆｄｈｄ／ｎａｒｑオキシドレダクターゼ活性を有することができ、例えば配列番号５３によってコードされる、配列番号５４に記載される配列を有するポリペプチドは、ラジカルＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）活性を有することができ、例えば配列番号５７によってコードされる、配列番号５８に記載される配列を有するポリペプチドは、サブチリシン様プロテアーゼ活性を有することができる。 
【０２７１】
表３
2008538176.tif 000003
【０２７２】
表３つづき
2008538176.tif 000004
【０２７３】
表３つづき
2008538176.tif 000005
【０２７４】
表３つづき
2008538176.tif 000006
【０２７５】
表３つづき
2008538176.tif 000007
【０２７６】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、又はこれらのいずれかのフラグメント、部分、若しくはサブユニット及び天然に存在する分子又は合成分子を意味する。「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」には、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、又はこれらのいずれかのフラグメント、部分、若しくはサブユニット及び天然に存在する分子又は合成分子が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合により互いに結合しているアミノ酸（すなわちペプチド同配体）を意味し、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外に改変アミノ酸を含むことができる。翻訳後プロセッシングのような天然のプロセスによるか又は化学改変技術によりポリペプチドを改変することができ、これらは当該技術でよく知られている。改変は、ペプチド骨格、アミン酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのあらゆる場所で生じることができる。同じ種類の改変が、所定のポリペプチドの幾つかの部位で同じ程度又は異なる程度で存在しうることが理解される。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の改変を有することができる。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラバンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストレル化、酸化、PEG化、グルカンヒドロラーゼプロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及びアルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介付加が含まれる。（Creighton, T.E., Proteins  Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)を参照すること）。本発明のペプチド及びポリペプチドには、下記で更に詳細に記載されている、全ての「模倣」及び「ペプチド模倣」形態も含まれる。
【０２７７】
本明細書で使用されるとき、用語「単離」されているとは、物質（例えば、本発明のタンパク質又は核酸）がその元々の環境（例えば、天然に存在する場合は天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然系で共存している物質の一部又は全てから分離している同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又はそのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、そのようなベクター又は組成物は、その天然の環境の一部ではないという点において依然として単離されている。本明細書で使用されるとき、用語「精製された」とは完全な純度を必要とせず、むしろ相対的な定義として意図される。ライブラリーから得た個別の核酸は電気泳動的に均一に慣用的に精製されている。これらのクローンから得た配列は、ライブラリー又は全ヒトＤＮＡのいずれからも直接には得ることはできない。本発明の精製された核酸は生物体のゲノムＤＮＡの残りから少なくとも１０4〜１０6倍で精製されている。一つの特徴において、用語「精製された」には、ライブラリー又は他の環境にあるゲノムＤＮＡ又は他の配列の残りから、少なくとも１桁のオーダーで、例えば、一つの態様では、２若しくは３桁、又は４若しくは５桁の大きさで精製された核酸が含まれる。
【０２７８】
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生された、すなわち、所望のポリペプチド又はタンパク質をコードする外来性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されたポリペプチド又はタンパク質を意味する。「合成」ポリペプチド又はタンパク質は、化学合成により調製されるものである。固相化学ペプチド合成法を使用して、本発明のポリペプチド又はフラグメントを合成することもできる。そのような方法は１９６０年代前半から当該技術で知られており（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963）（また、Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12を参照すること）、最近、市販の実験室用のペプチド設計及び合成キット（Cambridge Research Biochemicals）に用いられている。そのような市販の実験室用キットは、一般に、H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)の教示を利用し、全て単一のプレートに接続されている多数の「ロッド」又は「ピン」の先端でペプチドの合成を提供する。
【０２７９】
２つの核酸又はポリペプチドの文脈における語句「実質的に同一」は、既知の配列比較アルゴリズムの１つ又は目視検査を使用して測定して、最大一致のために比較しアラインメントを実施したときに、例えば少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の核酸又はアミノ酸残基（配列）同一性を有する２つ以上の配列を意味する。別の特徴において、実質的な同一性は少なくとも約１００個又はそれ以上の残基の領域にわたって存在し、最も一般的には、これらの配列は少なくとも約１５０〜２００個又はそれ以上の残基にわたって実質的に同一である。幾つかの特徴において、配列はコード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【０２８０】
加えて、「実質的に同一」なアミノ酸配列は、１つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失又は挿入により基準配列と異なっている配列である。一つの特徴において、置換は、分子の活性部位ではない部位で生じるか、あるいは置換は、ポリペプチドがその機能（酵素）特性を実質的に保持するのであれば、分子の活性部位である部位で生じる。保存的アミノ酸置換は、例えば１つのアミノ酸を同じ部類の別のアミノ酸で置換する（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンのような１つの疎水性アミノ酸を別のもので置換する、又は１つの極性アミノ酸を別のもので置換する、例えばアルギニンをロイシンで、グルタミン酸をアスパルギン酸で、又はグルタミンをアスパラギンで置換する）。１つ以上のアミノ酸を、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドから欠失して、ポリペプチドの構造に、その生物学的活性を実質的に変えることなく改変をもたらすことができる。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の生物学的活性に必要ではないアミノ末端又はカルボキシル末端アミノ酸を除去することができる。本発明の改変ポリペプチド配列は、改変ポリペプチド配列を基質と接触させ、改変ポリペプチドがアッセイ中の特定の基質の量を減少するか、又は機能性セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドと基質との酵素反応のバイオ生成物を増加するかを決定することを含む多くの方法のいずれかによって、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の生物学的活性のためにアッセイすることができる。
【０２８１】
本明細書で使用されるとき、「フラグメント」は、少なくとも２つの異なるコンフォメーションで存在することができる天然に存在するタンパク質の部分である。フラグメントは、天然に存在するタンパク質と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有することができる。天然に存在するタンパク質と異なる三次元構造を有するフラグメントも含まれる。この例は、切断による改変で有意に高い活性を有する成熟した酵素を産生できる、低活性プロタンパク質のような「プロ形態」分子である。
一つの態様において、本発明は、本発明のタンパク質及びペプチド、例えばセルラーゼの結晶（三次元）構造を提供し、これらは当該技術で周知の日常的なプロトコールを使用して作製及び分析することができ、例えばMacKenzie (1998) Crystal structure of the family 7 endoglucanase I (Cel7B) from Humicola insolens at 2.2 A resolution and identification of the catalytic nucleophile by trapping of the covalent glycosyl-enzyme intermediate, Biochem. J. 335:409-416; Sakon (1997) Structure and mechanism of endo/exocellulase E4 from Thermomonospora fusca, Nat. Struct. Biol 4:810-818; Varrot (1999) Crystal structure of the catalytic core domain of the family 6 cellobiohydrolase II, Cel6A, from Humicola insolens, at 1.92 A resolution, Biochem. J. 337:297-304に記載されており、これらは、本発明のセルラーゼ変種の日常的な生成の指針として、及び本発明の範囲内の酵素種を同定する指針として、特定の構造要素を説明し同定する。
【０２８２】
本発明のポリペプチド及びペプチドを天然の供給源から単離することができ、合成又は組換え的に生成されたポリペプチドでもあり得る。ペプチド及びタンパク質をインビボ又はインビトロで組換え的に発現させることができる。本発明のペプチド及びポリペプチドを、当該技術で既知の任意の方法を使用して作製及び単離することができる。本発明のポリペプチド及びペプチドを、当該技術で周知の化学的な方法を使用して、全体的又は部分的に合成することもできる。例えば、Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PAを参照すること。例えば、ペプチド合成は、多様な固相技術を使用して実施することができ（例えば、Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13を参照すること）、自動合成は、例えばBI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を使用し、製造会社から提供された説明書に従って達成することができる。
本発明のペプチド及びポリペプチドをグリコシル化することもできる。グリコシル化は翻訳後に化学的又は細胞生合成機構によって付加することができ、後者には、既知のグリコシル化モチーフの使用が組み込まれ、これは、配列にとって天然のものであってよく、又はペプチドとして若しくは核酸コード配列に付加することができる。このグリコシル化は、Ｏ−結合又はＮ−結合であり得る。
【０２８３】
上記で定義された本発明のペプチド及びポリペプチドには、全ての「模倣体」及び「ペプチド模倣体」形態が含まれる。用語「模倣体」及び「ペプチド模倣体」は、本発明のポリペプチドと実質的に同じ構造及び／又は機能特性を有する、合成化学化合物を意味する。模倣体は、アミノ酸の合成で非天然の類似体から完全に構成されていることができるか、又は部分的に天然のペプチドアミノ酸及び部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子である。模倣体は、天然アミノ酸の保存的置換を、そのような置換が模倣体構造及び／又は活性を実質的に変えない限り任意の量で組み込むこともできる。本発明のポリペプチドの保存的変種又はメンバーである本発明のポリペプチドでは（例えば、本発明の例示的な配列に対して約５０％以上の配列同一性を有する）、慣用的な実験によって模倣体が発明の範囲内であるか、すなわち、その構造及び／又は機能が実質的に変わっていないかが決定される。したがって、一つの態様において、模倣体組成物は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する場合は、本発明の範囲内である。
【０２８４】
本発明のポリペプチド模倣体組成物は、任意の組合せの非天然構造成分を含むことができる。別の特徴において、模倣体組成物は以下の３つの構造原子団の１つ又は全てを含む：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基結合基；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基；又はｃ）二次構造的模倣体を誘導する、すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス立体構造などを誘導若しくは安定化させる残基。例えば、本発明のポリペプチドは、その残基の全て又は幾つかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合される場合に、模倣体として特徴づけることができる。個別のポリペプチド模倣残基を、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のような、ペプチド結合、他の化学的結合、又はカップリング手段により結合することができる。伝統的なアミノ酸結合（「ペプチド結合」）の代替案となることができる結合基には、例えば、ケトメチレン（例えば-C(=O)-NH-の代わりに-C(O=)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド又はエステルが含まれる（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, “Peptide Backbone Modifications,” Marcell Dekker, NYを参照すること）。 
【０２８５】
本発明のポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに、全て又は幾つかの非天然の残基を含むことによって、模倣体として特徴づけることもできる。非天然残基は、科学文献及び特許文献で十分に記載されており、天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な例示的な幾つかの非天然組成物及び指針を下記に記載する。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば、Ｄ−又はＬ−ナフチルアラニン；Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−又はＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−１、−２，３−若しくは４−ピレニルアラニン；Ｄ−又はＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；及びＤ−又はＬ−アルキルアラニンにより置き換えて生成することができ、ここでアルキルは、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、sec−イソチル、イソ−ペンチル又は非酸性アミノ酸で置換されうるか又は非置換であることができる。非天然アミノ酸の芳香環には、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル及びピリジル芳香環が含まれる。
【０２８６】
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば陰性荷電を維持している非カルボキシレートアミノ酸、（ホスホノ）アラニン、硫酸トレオニンで置換することによって生成できる。カルボキシル側鎖基（例えば、アスパルチル又はグルタミル）を、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（R'-N-C-N-R'）との反応で選択的に改変することができる。アスパルチル又はグルタミルも、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することができる。塩基性アミノ酸の模倣体は、（リジン及びアルギニンに加えて）、例えばアミノ酸オルニチン、シトルリン、又は（グアニジノ）−酢酸若しくは（グアニジノ）アルキル−酢酸による置換で生成することができ、ここで、アルキルは上記で定義されたとおりである。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）でアスパラギン又はグルタミンを置換することができる。アスパラギニル及びグルタミニル残基を、対応するアスパルチル又はグルタミル残基に脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルを、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロ−ヘキサンジオン又はニンヒドリンを含む、例えば１つ以上の従来の試薬と、一つの態様では、アルカリ性条件下で反応させることによって生成することができる。チロシン残基模倣体は、チロシルを、例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を、例えば２−クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなアルファ−ハロアセテート及び対応するアミンと反応させて、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得ることによって生成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を、例えばブロモ−トリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによって生成することもできる。リジン模倣体（及びアミノ末端残基の改変は）は、リジニルを、例えばコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させることによって生成することができる。リジン及び他のアルファ-アミノ含有残基模倣体は、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロ−ベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンとの反応、及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によって生成することもできる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドによる反応によって生成することができ��。プロリンの模倣体には、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−又は４−ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３−若しくは４−メチルプロリン又は３，３−ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体は、ヒスチジルを、例えばジエチルプロカーボネート又はパラ−ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することができる。他の模倣体には、例えばプロリン及びリシンのヒドロキシル化；セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リシン、アルギニン及びヒスチジンのアルファ−アミノ基のメチル化；Ｎ−末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化若しくはＮ−メチルアミノ酸による置換；又はＣ−末端カルボキシル基のアミド化によって生成することができるものが含まれる。
【０２８７】
一つの特徴において、本発明のポリペプチドの残基、例えばアミノ酸を、反対のキラリティーをもつアミノ酸（又はペプチド模倣残基）に代えることもできる。一つの態様において、Ｌ型構造で天然に存在する任意のアミノ酸（化学成分の構造に応じてＲ又はＳと呼ぶこともできる）を、Ｄ−アミノ酸と呼ばれるが、Ｒ−又はＳ−型と呼部こともできる、同じ化学構造型又はペプチド模倣であるが反対のキラリティーのアミノ酸に代えることができる。
本発明は、また、本発明のポリペプチドを、翻訳後プロセッシングのような天然の過程（例えば、リン酸化、アセチル化など）又は化学的改変技術のいずれかによって改変する方法、及び得られた改変ポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミン酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのあらゆる場所で生じることができる。同じ種類の改変が、所定のポリペプチドの幾つかの部位で同じ程度又は異なる程度で存在しうることが理解される。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の改変を有することができる。一つの態様において、改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラバンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストレル化、酸化、PEG化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及びアルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介付加が含まれる。例えば、Creighton, T.E., Proteins  Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)を参照すること。
【０２８８】
固相化学ペプチド合成法を使用して、本発明のポリペプチド又はフラグメントを合成することもできる。そのような方法は１９６０年代前半から当該技術で知られており（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963）（また、Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12を参照すること）、最近、市販の実験室用のペプチド設計及び合成キット（Cambridge Research Biochemicals）に用いられている。そのような市販の実験室用キットは、一般に、H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)の教示を利用し、全て単一のプレートに接続されている多数の「ロッド」又は「ピン」の先端でペプチドの合成を提供する。そのような系を利用するときは、ロッド又はピンのプレートは逆さまにされ、適切なアミノ酸をピン又はロッドの先端に結合又は固着させるための溶液を含んでいる対応するウエル又はレザーバーの第二のプレートに挿入される。そのような処理工程、すなわちロッド又はピンの先端を逆さまにして適切な溶液に挿入する工程を繰り返すことによって、アミノ酸が所望のペプチドの中に構築される。加えて、多数のＦＭＯＣペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチド又はフラグメントの構築は、Applied Biosystems, Inc.のModel 431A（商標）自動ペプチド合成機を使用して、固体支持体で実施することができる。そのような装置は、直接合成によるか、又他の既知の技術を使用して結合できる一連のフラグメントの合成によって、本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
【０２８９】
本発明のポリペプチドは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を活性又は不活性形態で含む。例えば、本発明のポリペプチドは、「成熟」する前、又は例えば「活性」な成熟タンパク質を生成するプロタンパク質コンバターゼのようなプロタンパク質プロセッシング酵素でプレプロ配列をプロセッシングする前のプロタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、他の理由で不活性なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、例えば、翻訳後プロセッシング事象により、例えばエンド−若しくはエキソペプチダーゼ又はプロテイナーゼ作用、リン酸化事象、アミド化、グリコシル化又は硫酸化、二量体化事象などにより「活性化」される前に含む。本発明のポリペプチドは、活性部分配列、例えば酵素の触媒ドメイン又は活性部位を含む、全ての活性形態を含む。
【０２９０】
本発明は、固定化セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ抗体、並びにこれらのフラグメントを含む。本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を、ドミナントネガティブ変種又は本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは抗ベータ−グルコシダーゼ抗体を使用して阻害する方法を提供する。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含むヘテロ複合体、例えば、融合タンパク質、ヘテロニ量体などを含む。
【０２９１】
本発明のポリペプチドは、例えば極度のｐＨ及び／又は温度、酸化剤などの多様な条件下で、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有することができる。本発明は、例えば、温度、酸化剤及び変化する洗浄条件に対して種々の触媒効率及び安定性を有する、代替的なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素調製物をもたらす方法を提供する。一つの特徴において、部位特異的変異導入及び／又はランダム変異導入の技術を使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素変種を作製することができる。一つの特徴において、定方向進化を使用して、代替的な特異性及び安定性を有する、多種多様なセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素変種を産生することができる。
【０２９２】
本発明のタンパク質は、また、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素調節因子、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性のアクチベーター又はインヒビターを同定する研究試薬として有用である。簡潔には、試験試料（化合物、ブロス、抽出物など）を、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素アッセイに加えて、基質の切断を阻害するその能力を決定する。この方法で同定されるインヒビターを産業及び研究で使用して、望ましくないタンパク質分解を低減又は防止することができる。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素によって、インヒビターを組合せて活性のスペクトルを広げることができる。
本発明の酵素は、また、タンパク質を消化する研究試薬として、又はタンパク質の配列決定において有用である。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を使用して、例えば自動配列決定装置を使用する配列決定のために、ポリペプチドをより小型のフラグメントに分解することができる。
【０２９３】
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド及び抗体を使用して、新たなセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を発見する方法も提供する。一つの特徴において、ファージミドライブラリーは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現に基づく発見のために、スクリーニングされる。別の特徴において、ラムダファージライブラリーは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の発現に基づく発見のために、スクリーニングされる。ファージ又はファージミドライブラリーのスクリーニングは、毒性クローンの検出、基質の改善された利用、ライブラリーの大量の切り出しよりもたらされるあらゆる偏りの可能性を迂回する、宿主を操作する必要性の低減、及び低クローン密度でより速い増殖を可能にすることができる。ファージ又はファージミドライブラリーのスクリーニングは、液相又は固相においてであることができる。一つの態様において、本発明は、液相でのスクリーニングを提供する。これによってアッセイ条件におけるより大きな融通性、更なる基質の融通性、弱いクローンに対する感度の強化、及び固相スクリーニングを超える自動化の容易さが提供される。
本発明は、高レベルの正確さ及び再現性を担保しながら、短時間、例えば１日あたり何千もの生物触媒反応及びスクリーニングアッセイの実施を可能にする、本発明のタンパク質及び核酸、並びにロボットによる自動化を使用するスクリーニング方法を提供する（下記のアレイの考察を参照すること）。その結果、誘導化合物ライブラリーを数週間で産生することができる。小分子を含む分子の改変の更なる教示には、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９１７４、米国特許第６，２４５，５４７号を参照すること。
【０２９４】
一つの特徴において、本発明のポリペプチドのフラグメントは、生化学濃縮又は精製処理によって得られる。可能性のある相同性ポリペプチド又はフラグメントの配列は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼアッセイ（例えば、下記の実施例１、２及び３を参照すること）、ゲル電気泳動及び／又はマイクロシークエンシングにより決定することができる。本発明の予想されるポリペプチド又はフラグメントの配列を、上記で記載されたプログラムのいずれかを使用して、例えば少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個、又はそれ以上の連続アミノ酸を含む本発明の例示歴なポリペプチド又はフラグメントと比較することができる。
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドの酵素機能を保持する、本発明のフラグメント又は変種を同定するアッセイである。例えば、前記ポリペプチドのフラグメント又は変種を使用して、生化学反応を触媒することができ、このことは、フラグメント又は変種が本発明のポリペプチドの酵素活性を保持することを示す。フラグメント又は変種が本発明のポリペプチドの酵素活性を保持することを決定する例示的なアッセイは以下の工程を含む：ポリペプチドフラグメント又は変種をポリペプチドフラグメント又は変種が機能することを可能にする条件下で基質分子と接触させる工程、及び基質のレベルの減少又はポリペプチドと基質との反応での特定の反応生成物のレベルの増加のいずれかを検出する工程。
【０２９５】
本発明は、酵素の独自の触媒特性を利用する。化学転換における生体触媒（すなわち、精製又は粗触媒、非生細胞又は生細胞）の使用は、一般的に特定の出発化合物と反応する特定の生体触媒の同定を必要とするが、本発明は、選択された生体触媒を使用し、小分子のような多くの出発化合物に存在する官能基に特異的な反応条件を使用する。それぞれの生体触媒は、１つの官能基に又は幾つかの関連する官能基に特異的であり、この官能基を含む多くの出発化合物と反応することができる。
一つの特徴において、生体触媒反応は単一の出発化合物から誘導体の集団を産生する。これらの誘導体を別の一連の生体触媒反応に付して、誘導体化合物の第２集団を生み出す。生体触媒誘導体化のそれぞれの繰り返しにより元の小分子又は化合物の何千もの変種を作製することができる。
【０２９６】
酵素は、分子の残りの部分に影響を与えることなく出発化合物の特定の部位に反応する。このプロセスは、伝統的な化学法を使用して達成することが困難である。生体触媒の高度な特異性は、ライブラリー内で単一の活性化合物を同定する手段を提供する。ライブラリーは、それを産生するために使用された一連の生体触媒反応(いわゆる「生合成歴」)により特徴づけられる。ライブラリーを生物学的活性についてスクリーニングし、生合成歴を追跡することにより、活性化合物を生成する特定の反応系列が明らかにされる。この反応系列が繰り返され、合成された化合物の構造が決定される。この決定様式は、他の合成及びスクリーニング手法と異なり、固定化技術を必要とせず、化合物を合成し、実質的にあらゆる種類のスクリーニングアッセイを使用して溶液中で遊離状態で試験することができる。酵素反応の官能基に対する高度な特異性により、生体触媒的に産生されたライブラリーを構築した特定の酵素反応の「追跡」が可能となることに留意することは重要である。
【０２９７】
一つの特徴において、この手順の工程は、１日あたり数千の生体触媒反応及び／又はスクリーニングの実施を可能にし、同様に高レベルの正確性及び再生を確実にする、ロボットによる自動化を使用して実施される。ロボットによる自動化を使用して、ポリペプチドが本発明の範囲内であるかを決定するためにセルラーゼ活性をスクリーニングすることもできる。その結果、一つの特徴において、「伝統的な」化学又は酵素スクリーニング法を使用すると作製するのに何年もかかるところ、誘導体化合物のライブラリーを数週間で作製することができる。
特定の特徴において、本発明は、本明細書で記載されたポリヌクレオチドでコードされたポリペプチド又はその酵素的に活性なフラグメントを小分子と接触させて、改変小分子を産生することを含む、小分子の改変方法を提供する。改変小分子のライブラリーを試験して、所望の活性を示す改変小分子が、ライブラリー中に存在するかを決定する。所望の活性をもつ改変小分子を産生する特定の生体触媒反応は、ライブラリーの一部を産生するのに使用されたそれぞれの生体触媒反応を系統的に排除すること、次に、ライブラリーの前記一部中の産生された小分子を、所望の活性を有する改変小分子の存在又は不在について試験することによって同定される。所望の活性をもつ改変小分子を産生する特定の生体触媒反応は、場合により反復される。生体触媒反応は、小分子の構造内で見出される個別の構造部分と反応する生体触媒の一群で実施され、それぞれの生体触媒は、１つの構造部分又は関連する構造部分の一群に特異的であり、それぞれの生体触媒は、別個の構造部分を含む多くの異なる小分子と反応する。
【０２９８】
セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列、プレプロ及び触媒ドメイン
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列（例えば、シグナルペプチド（ＳＰ））、プレプロドメイン及び触媒ドメイン（ＣＤ）を提供する。本発明のＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤは、単離若しくは組換えペプチド、又は例えばキメラタンパク質の異種ドメインのような融合タンパク質の一部であり得る。本発明は、これらの触媒ドメイン（ＣＤ）、プレプロドメイン及びシグナル配列（ＳＰ、例えば本発明のポリペプチドのアミノ末端残基を含む／からなる配列を有するペプチド）をコードする核酸を提供する。
【０２９９】
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の例示的なポリペプチドの１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜４３、１〜４４、１〜４５、１〜４６若しくは１〜４７個、又はそれ以上の残基で記載される配列からなるか又はそれらを含む単離又は組換えシグナル配列（例えば、シグナルペプチド）を提供する（また表３、下記の実施例１及び４、並びに配列表を参照すること）。例えば、上記の表３は、本発明の例示的なシグナル（リーダー）配列を記載し、例えば、配列番号１６３によってコードされる配列番号１６４で記載される配列を有するポリペプチドは、アミノ酸末端３０残基を含む（又はからなる）シグナル配列又はＭＳＣＲＴＬＭＳＲＲＶＧＷＧＬＬＬＷＧＧＬＦＬＲＴＧＳＶＴＧを有する。追加のシグナル配列も同様に表３に記載されている。
【０３００】
一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ末端残基の最初の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０個又はそれ以上を含むシグナル配列を提供する。 
【０３０１】
本発明は、シグナル配列及び／又はプレプロ配列を有するか又は有さないポリペプチドを含む。本発明は、異種シグナル配列及び／又はプレプロ配列を有するポリペプチドを含む。プレプロ配列（異種プレプロドメインとして使用される本発明の配列を含む）を、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に配置することができる。本発明は、本発明の配列を含む単離又は組換えシグナル配列、プレプロ配列及び触媒ドメイン（例えば「活性部位」）も含む。本発明のシグナル配列を含むポリペプチドは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、或いは別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、又は別の酵素、又は他のポリペプチドであることができる。「プレプロ」ドメイン配列及びシグナル配列を同定する方法は、当該技術でよく知られている（例えば、Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136を参照すること）。例えば、プレプロ配列を同定するために、タンパク質を細胞外間隙から精製し、Ｎ−末端タンパク質配列を決定し、プロセッシングされていない形態と比較する。
【０３０２】
本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロ配列は、単離若しくは組換えペプチドであることができるか、或いは別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼと、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼポリペプチドと結合した配列、例えば融合（キメラ）タンパク質であることができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列を含むポリペプチドを提供する。一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素シグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロを含むポリペプチドは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と異種である配列を含む（例えば、本発明のＳＰ及び／又はプレプロと、別のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ、又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／若しくは非ベータ−グルコシダーゼタンパク質からの配列とを含む融合タンパク質）。一つの特徴において、本発明は、異種ＳＰ及び／又はプレプロ配列、例えば酵母シグナル配列を含む配列を有する、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、異種ＳＰ及び／又はプレプロを、ベクター、例えばｐＰＩＣシリーズベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）の中に含むことができる。
【０３０３】
一つの特徴において、新規セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼポリペプチドの同定に続いて本発明のＳＰ及び／又は配列が同定される。タンパク質が選別されてそれらの細胞内の適切な配置に輸送される経路は、しばしばタンパク質標的化経路と呼ばれる。これら全ての標的化系において最も重要な要素の一つは、シグナル配列と呼ばれる、新たに合成されたポリペプチドのアミノ末端にある短いアミノ酸配列である。このシグナル配列はタンパク質をその適切な細胞内の配置場所に向かわせ、輸送中に又はタンパク質がその最終目的地に到達したときに除去される。ほとんどのリソソームタンパク質、膜たんぱく質又は分泌タンパク質は、小胞体管腔への移送のための目印となるアミノ末端シグナル配列を有する。シグナル配列は、アミノ酸残基の長さにして約１０〜６５個又はそれ以上に変動し得る。シグナル配列を認識する多様な方法が当該技術で知られている。例えば、一つの態様において、新規セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素シグナルペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰと呼ばれる方法により同定される。ＳｉｇｎａｌＰは、シグナルペプチドとそれらの切断部位の両方を認識する複合神経ネットワークを使用する。(Nielsen (1997) "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites."  Protein Engineering 10:1-6）。
【０３０４】
幾つかの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、ＳＰ及び／又はプレプロ配列または「ドメイン」を有さない。一つの特徴において、本発明は、ＳＰ及び／又はプレプロドメインの全て又は一部を欠いている、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。一つの特徴において、本発明は、異なるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の核酸配列に機能的に結合した、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素からのシグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロをコードする核酸を提供するか、或いは、場合により非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／又は非ベータ−グルコシダーゼタンパク質からのシグナル配列（ＳＰ）及び／又はプレプロドメインが望ましい場合がある。
【０３０５】
本発明は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）、並びに異種配列を含む単離又は組換えポリペプチドも提供する。前記異種配列は、ＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤと（例えば、酵素と）天然には結合していない配列である。ＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤと天然には結合していない前記配列は、ＳＰ、プレプロドメイン及び／若しくはＣＤのアミノ末端、カルボキシ末端、並びに／又はＳＰ及び／又はＣＤの両末端に存在することができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）を含むポリペプチドを含む（又はこれからなる）単離又は組換えポリペプチドを提供する。ただし、それらが天然に結合しているいずれの配列（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列）とも結合していないことを条件とする。同様に、一つの態様において、本発明は、これらのポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸を提供する。したがって、一つの態様において、本発明の単離又は組換え核酸は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）、並びに異種配列（すなわち、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（ＣＤ）と天然には結合していない配列）のコード配列を含む。異種配列は、ＳＰ、プレプロドメイン及び／又はＣＤコード配列の３’末端、５’末端及び／又はその両末端に存在することができる。
【０３０６】
ハイブリッド（キメラ）セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、並びにペプチドライブラリー
一つの特徴において、本発明は、ペプチドライブラリーを含む、本発明の配列を含むハイブリッドセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、並びに融合タンパク質を提供する。本発明のペプチドライブラリーを使用して、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素基質、レセプター、酵素のような標的のペプチド調節因子（例えば、アクチベーター又はインヒビター）を単離することができる。本発明のペプチドライブラリーを使用して、リガンド、例えばサイトカイン、ホルモンなどのような標的の正式な結合パートナーを同定することができる。一つの特徴において、本発明は、本発明のシグナル配列（ＳＰ）、プレプロドメイン及び／若しくは触媒ドメイン（ＣＤ）、又はこれらの組合せ、並びに異種配列を含むキメラタンパク質を提供する（上記を参照すること）。
【０３０７】
一つの特徴において、本発明の融合タンパク質（例えば、ペプチド部分）は、立体構造的に安定化され（直線状ペプチドと比較して）、標的に対するより高い結合親和性を可能にする。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素と、既知のペプチド及びランダムペプチドを含む他のペプチドとの融合を提供する。それらは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の構造が顕著には乱されず、ペプチドが代謝的に又は構造的で立体配置的に安定化されるように融合することができる。このことは、細胞内でのその存在及び量の両方を容易にモニタリングできるペプチドライブラリーを作り出すことを可能にする。
【０３０８】
本発明のアミノ酸配列変種は、変種の予め定められた性質、つまり天然に存在する形態、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素配列の対立変種又は種間変種とそれらを区別する特徴によって特徴づけることができる。一つの特徴において、本発明の変種は、天然に存在する類似体と同じ定性的生物学的活性を示す。あるいは、変種は修正された特徴を有するものについて選択することができる。一つの特徴において、アミノ酸配列の変異を導入する部位又は領域が予め決定されているが、変異それ自体は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位における変異の成果を最適化するために、ランダム変異導入を標的コドン又は領域で実施し、発現されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素変種を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位に置換変異を作る技術は周知であり、本明細書で考察されているように、例えばＭ１３プライマー変異導入及びＰＣＲ変異導入である。変種のスクリーニングは、例えばグルカン加水分解のアッセイを使用して実施することができる。別の特徴において、アミノ酸置換は、単一の残基であることができ、挿入は約１〜２０個のアミノ酸のオーダーであることができるが、はるかに大きな挿入も実施することができる。欠失は、約１〜約２０、３０、４０、５０、６０、７０個の残基又はそれ以上の範囲であることができる。最適な特性を有する最終的な誘導体を得るために、置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組合せを使用することができる。一般に、これらの変化は、分子の変更を最小限にするため、数個のアミノ酸に対して実施される。しかし、特定の環境ではより大きな変化も容認されうる。
【０３０９】
本発明は、ポリペプチド骨格構造、二次若しくは三次構造、例えばアルファ−ヘリックス又はベータ-シート構造が改変されている、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を提供する。一つの態様において、電荷又は疎水性が改変されている。一つの特徴において、側鎖の嵩が改変されている。保存性の低い置換を選択することによって、機能又は免疫学的同一性に実質的な変化がもたらされる。例えば、以下に対してより顕著な影響を与える置換を実施することができる：変更領域のポリペプチド骨格構造、例えばアルファ−ヘリックス又はベータ−シート構造；活性部位に存在し得る、分子の荷電又は疎水性部分；又は側鎖。本発明は、本発明のポリペプチドに以下のような置換を提供する：（ａ）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルで疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、バリル又はアラニルを置換する（又は前者を後者で置換する）；（ｂ）システイン又はプロリンで他の任意の残基を置換する（又は前者を後者で置換する）；（ｃ）陽性荷電側鎖をもつ残基、例えばリシル、アルギニル又はヒスチジルで陰性荷電残基、例えばグルタミル又はアスパルチルを置換する（又は前者を後者で置換する）；或いは（ｄ）嵩の大きな側鎖、例えばフェニルアラニンで側鎖をもたない残基、例えばグリシンを置換する（又は前者を後者で置換する）。変種は、同じ定性的生物学的活性（すなわち、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性）を示すことができるが、変種を選択してセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の性質を必要に応じて改変することができる。
【０３１０】
一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、エピトープ若しくは精製タグ、シグナル配列又は他の融合配列などを含む。一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、ランダムペプチドと融合して融合ポリペプチドを形成することができる。本明細書において、「融合」又は「機能的に結合」しているとは、ランダムペプチドとセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素構造の安定性の破壊を最小限にするような方法で、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を保持するような方法で、一緒に結合することを意味する。融合ポリペプチド（又は融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）は、複数のループに存在する複数のペプチドを含む更なる成分を含むこともできる。
【０３１１】
一つの特徴において、ペプチド及びそれらをコードする核酸はランダム化され、それは、完全なランダム化であるか、又はランダム化は、例えばヌクレオチド／残基頻度において全体的に若しくは位置毎に偏っている。「ランダム化された」は、各核酸及びペプチドがそれぞれ本質的にランダムヌクレオチド及びアミノ酸からなることを意味する。一つの特徴において、ペプチドを生じる核酸は化学的に合成することができ、したがって、任意の位置に任意のヌクレオチドを組み込むことができる。したがって、核酸が発現されてペプチドを形成するとき、任意の位置に任意のアミノ酸残基を組み込むことができる。合成プロセスは、ランダム化された核酸が生成されるように設計して、核酸の全長にわたって可能な全ての又は大半の組合せを形成し、したがってランダム化された核酸ライブラリーの形成を可能にすることができる。ライブラリーは、構造的に十分にランダム化された多様な発現生成物集団を提供し、所望の反応を示す１つ以上の細胞の提供のために確率的に十分な範囲の細胞反応に影響を与えることができる。したがって、本発明は、ライブラリーメンバーの少なくとも１つが幾つかの分子、タンパク質又は他の因子に対する親和性を与える構造を有することができるように、十分に大きな相互作用ライブラリーを提供する。
【０３１２】
一つの特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、シグナルペプチド、炭水化物結合モジュール、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素触媒ドメイン、リンカードメイン並びに／又は触媒ドメインを含むマルチドメイン酵素である。
本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）をコードすることができるキメラポリペプチドを生成する方法及び配列を提供する。一つの特徴において、元のポリヌクレオチド（例えば、本発明の例示的な核酸）は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする。一つの特徴において、本発明の方法は、生じるハイブリッドポリペプチドが元の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、本発明のセルラーゼ又は抗体）に由来するがそれとは異なる活性を示すポリペプチドをコードするように、元のポリヌクレオチドの配列を組み込む細胞性過程を利用して新規ハイブリッドポリペプチドを産生する。例えば、元のポリヌクレオチドは、種々の微生物からの又はそれらに見出される特定の酵素（例えば、セルラーゼ）をコードし得る。１つの生物からの第１のポリヌクレオチドでコードされた酵素又は変種は、例えば、特定の環境条件下、例えば高塩度で有効に機能することができる。種々の生物からの第２のポリヌクレオチドでコードされた酵素又は変種は、異なる特定の環境条件下、例えば超高温で有効に機能することができる。第１及び第２の元のポリヌクレオチドからの配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドでコードされた両方の酵素の性質を示す酵素をコードすることができる。したがって、本発明のハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第１及び第２ポリヌクレオチドでコードされたそれぞれの酵素により共有された環境条件下、例えば、高塩度及び極限温度で有効に機能することができる。
【０３１３】
一つの特徴において、本発明の方法により生成されるハイブリッドポリペプチドは、元の酵素では示されない特別な酵素活性を示すことができる。例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの組換え及び／又は還元的再組合せの後、それぞれの元の酵素から得られた、特定の非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ及び／又は非ベータ−グルコシダーゼ酵素活性、例えば、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、ホスホリダーゼなどの活性について、得られたハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドをスクリーニングすることができる。一つの特徴において、ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、ハイブリッドポリペプチドが機能する温度、ｐＨ又は塩濃度のような、元の親ポリペプチドからハイブリッドポリペプチドを識別する化学機能性を確認する。
【０３１４】
一つの特徴において、本発明は、以下のようにして、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドを産生し、高められた活性についてそのようなポリペプチドをスクリーニングする方法に関する：
１）機能的結合した第１のポリペプチド及び機能的結合した第２のポリヌクレオチド（少なくとも第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは少なくとも１つの部分配列相同性の領域を共有する）を適切な宿主細胞へ導入する；
２）機能的結合したハイブリッドポリヌクレオチドを生じさせる配列再編成を促進する条件下で前記宿主細胞を増殖させる；
３）前記ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドを発現させる；
４）前記ハイブリッドポリペプチドを、高められた生物学的活性の同定を促進する条件下でスクリーニングする；及び
５）前記ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する。
【０３１５】
セルラーゼ酵素の単離及び発見
本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素、並びにそれらをコードする核酸を単離及び発見する方法を提供する。ポリヌクレオチド又は酵素は、個別の生物体から（「単離物」）、定義された培地（「濃縮培地」）で増殖された生物の集合物から、又は未培養生物（「環境試料」）から単離することができる。これらの生物は、例えば、インビボバイオパニングにより単離することができる（下記の考察を参照すること）。環境試料から新規生物活性をコードするポリヌクレオチドを得る培養非依存性手法は、生物多様性のある未利用の供給源を利用できるので、最も好ましい。ポリヌクレオチド又は酵素は、多数の生物体のいずれか、例えば細菌から単離することもできる。ポリヌクレオチド又は酵素は、全細胞に加えてこれらの生物、例えば細菌の培養物から得られる粗酵素調製物から単離することができる。
「環境ライブラリー」は環境試料から生成され、適切な原核細胞宿主で増殖することができる適切なクローニングベクターに収容された天然に存在する生物のゲノム集合体を代表する。環境試料からクローン化ＤＮＡが最初に直接抽出されるので、ライブラリーは純粋培養で増殖できる原核細胞画分が少量であることに限定されない。加えて、これらの試料に存在する環境ＤＮＡの正規化は、元の試料に存在する全ての種に対してＤＮＡがより平等に表れることを可能にする。これは、優勢な種と比較して数桁低く過小提示されているかもしれない試料の微小構成成分から興味深い遺伝子を効率的に見出すことを劇的に増やすことができる。
一つの特徴において、１つ以上の未培養微生物から生成される遺伝子ライブラリーを目的の活性についてスクリーニングする。目的の生体活性分子をコードする潜在的な経路は、最初に遺伝子発現ライブラリーの形態で原核細胞に捕獲される。一つの態様において、目的の活性をコードするポリヌクレオチドをそのようなライブラリーから単離し、宿主細胞の中に導入する。組換え及び／又は還元的再組合せを促進する条件下で宿主細胞を増殖させて、新規の又は高められた活性を有する潜在的に活性な生体分子を作り出す。
【０３１６】
インビボバイオパニングは、ＦＡＣＳに基づき、非光学（例えば磁気）に基づく機械を利用して実施することができる。一つの特徴において、複合遺伝子ライブラリーは転写ＲＮＡを安定化させるエレメントを含むベクターで構築される。例えば、ＲＮＡの転写領域をフランキングするように設計された、ヘアピンのような二次構造によってもたらされる配列を含むことは安定性を向上させるのに役立ち、したがって、細胞内の半減期を延長するであろう。バイオパニングプロセスで使用されるプローブ分子は、プローブが標的分子と結合したときだけ蛍光するレポーター分子で標識されているオリゴヌクレオチドからなる。これらのプローブは、幾つかの形質転換法のうちの１つを使用して、ライブラリーからの組換え細胞に導入される。プローブ分子は転写標的ｍＲＮＡに結合して、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖分子をもたらす。プローブの標的への結合は蛍光シグナルを生じ、そのシグナルが検出され、スクリーニングプロセスの際にFACS装置によって選別される。
【０３１７】
一つの特徴では、目的の配列を更に単離するためサブクローニングを行う。サブクローニングにおいて、ＤＮＡの一部は、増幅され、一般に制限酵素により消化されて、所望の配列が切除され、所望の配列はレシピエントベクターと連結され、増幅される。サブクローニングのそれぞれの工程では、ＤＮＡの一部を目的の活性について調べ、構造タンパク質をコードするＤＮＡが排除されていないことを確認する。挿入物はサブクローニングの任意の工程で（例えばベクターへの連結前にゲル電気泳動によって）、またはレシピエントベクター含有または非含有細胞を例えば抗生物質（前記はレシピエントベクターを含まない細胞を死滅させる）を含む選択培地に入れる工程で精製してもよい。ベクターへのｃＤＮＡ挿入物をサブクローニングする具体的な方法は、当該技術でよく知られている（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）。別の特徴において、本発明の酵素はサブクローンである。そのようなサブクローンは、例えば長さ、変異、タグ又は標識によって、親クローンと異なることがある。
【０３１８】
ポリヌクレオチドを発見、単離又は調製することができる微生物には、真正細菌及び古細菌のような原核微生物、並びに真菌、一部の藻類及び原生動物のような低級真核微生物が含まれる。ポリヌクレオチドを、環境試料から発見、単離又は調製することができ、この場合、核酸は、生物体を培養することなく回収することができるか、又は１つ以上の培養生物体から回収することができる。一つの態様において、そのような微生物は、超好熱菌、好冷菌、低温菌、好塩菌、好圧性細菌及び好酸球のような好極限性細菌であることができる。好極限性微生物から単離される酵素をコードするポリヌクレオチドを使用することができる。本発明の酵素は、例えば、陸上の温泉及び深海熱孔で見出されるもののように、１００℃を越える温度で機能することができるか、又は北極海で見出されるもののように、０℃より低い温度で機能することができるか、例えば死海で見出されるものように、飽和塩環境で機能することができるか、例えば石炭体積及び地熱硫黄豊富温泉で見出されるものように、約０のｐＨ値で機能することができるか、又は例えば下水汚泥で見出されるもののように、１１を越えるｐＨ値で機能することができる。一つの特徴において、本発明の酵素は、広範囲の温度及びｐＨを通して高い活性を有する。
【０３１９】
本明細書上記で記載されたように選択及び単離されたポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は、組換え及び／又は還元的再組合せを促進することができる任意の細胞である。選択されたポリヌクレオチドは、一つの特徴では、適切な制御配列を含むベクターの中に予め存在する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高級真核細胞、又は酵母細胞のような低級真核細胞であってよく、或いは一つの特徴では、宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション又はエレクトロポレーションにより実施することができる。
例示的な宿主には、E. coli、Streptomyces、Salmonella typhimuriumのような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Drosophila S2及びSpodoptera Sf9のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はボーズメラノーマのような動物細胞；アデノウイルス；並びに植物細胞が含まれる（上記の考察を参照すること）。適切な宿主の選択は、本明細書の教示によって当業者の技能の範囲内であると認められる。
【０３２０】
多様な哺乳動物細胞培養系を用いて組換えタンパク質を発現することができ、哺乳動物発現系の例には、“SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants” (Gluzman, 1981)に記載されているサル類腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株及び同等のベクターを発現することができる他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター及びエンハンサー、また必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、並びに５’フランキング非転写配列を含むことができる。ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
【０３２１】
別の特徴において、本発明の核酸、ポリペプチド及び方法は、生化学経路で使用されるか、或いは１つ以上のオペロン、又は遺伝子クラスター、若しくはその一部から、生化学経路をコードする新規ポリヌクレオチドを生成するために使用される。例えば、細菌及び多くの真核生物は、その生成物が関連するプロセスに関わる遺伝子を調節する協調機構を有する。遺伝子は、単一の染色体上に「遺伝子クラスター」と呼ばれるクラスターを構成し、クラスター全体の転写を開始する単一のプロモーターを含む単一の調節配列の制御下で一緒に転写される。したがって、遺伝子クラスターは、通常それらの機能に関して同一または関連する隣接する遺伝子の一群である（遺伝子クラスターによってコードされている生化学的経路の例はポリケチドである）。
【０３２２】
一つの態様において、遺伝子クラスターＤＮＡは種々の生物体から単離され、ベクター、例えば、連結遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質又はタンパク質関連アレイ活性の産生を制御及び調節することができる発現調節配列を含むベクターに連結される。外来性ＤＮＡ導入のために著しく大きな容量を有するベクターの使用は、そのような遺伝子クラスターの使用のために適切であろう。そのようなベクターには大腸菌（E. coli）のｆ因子（又は稔性因子）が含まれることが一例として本明細書に記載される。このF因子は、接合中にそれ自体の高頻度の伝達に影響を与えるプラスミドであり、大きなDNAフラグメント、例えば混合微生物サンプルの遺伝子クラスターの安定的な増殖の達成に理想的である。ある特徴では「フォスミド」と呼ばれるクローニングベクター又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターが使用される。これらはE. coliのｆ因子に由来し、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントを安定的に組み込むことができる。混合未培養環境試料からのＤＮＡを組み込むと、大型のゲノムフラグメントを安定した「環境ＤＮＡライブラリー」の形態で得ることが可能になる。本発明で使用される他の種類のベクターはコスミドベクターである。コスミドベクターは、元々はゲノムＤＮＡの大きなセグメントをクローン及び繁殖するために設計された。コスミドベクターへのクローニングは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に詳細に記載されている。適切なベクターに連結されると、異なるポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む２つ以上のベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。遺伝子クラスターで共有される部分配列同一性の領域はハイブリッド遺伝子クラスターをもたらす配列再編成を生じるプロセスを促進する。次に新規のハイブリッド遺伝子クラスターを、元の遺伝子クラスターでは見られなかった、高められた活性についてスクリーニングすることができる。
多様な酵素活性についてスクリーニングする方法は、当業者には既知であり、本明細書全体を通して考察されている（例えば、下記の実施例１、２及び３を参照すること）。そのような方法は、本発明のポリペプチド及びポルヌクレオチドを単離するときに用いることができる。
一つの特徴において、本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ、又はこれらの酵素の活性を改変する化合物を、全細胞手法を使用して発見及び単離する方法を提供する（下記の考察を参照すること）。ゲノムＤＮＡライブラリーからのセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼをコードする推定クローンをスクリーニングすることができる。
【０３２３】
スクリーニングの方法論及び「オンライン」モニター装置
本発明の方法の実施に際して、多様な装置及び方法論を本発明のポリペプチド及び核酸と併せて使用して、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性についてポリペプチドをスクリーニングすること、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性の潜在的な調節因子、例えばアクチベーター又はインヒビターとして化合物をスクリーニングすること、本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸について、本発明のポリペプチドを発現する細胞についてスクリーニングすることができる。試料をスクリーニングする下記で詳細に記載されるアレイ様式に加えて、代替的なフォーマットを使用して、本発明の方法を実施することもできる。そのようなフォーマットには、例えば、質量分析計、クロマトグラフィー、例えばハイスループットＨＰＬＣ及び液体クロマトグラフィーの他の形態、並びに１５３６ウエルプレート、３８４ウエルプレートなどのより小型のフォーマットが含まれる。ハイスループットスクリーニング装置を、本発明の方法を実施するために適合させ使用することができる（例えば、米国特許出願第２００２０００１８０９号、同第２００５０２７２０４４号を参照すること）。 
【０３２４】
キャピラリーアレイ
本発明の核酸又はポリペプチドを、アレイに固定化するか又は適用することができる。アレイを使用して、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸又はポリペプチドと結合する能力又はそれらの活性を改変する能力についてスクリーニング又はモニタリングすることができる。GIGAMATRIX（商標）, Diversa Corporation, San Diego, CAのようなキャピラリーアレイ及び例えば米国特許出願第２００２００８０３５０Ａ１号、ＷＯ０２３１２０３Ａ、ＷＯ０２４４３３６Ａに記載されるアレイは、試料を保持及びスクリーニングする代替的な装置を提供する。一つの特徴において、キャピラリーアレイは、隣接するキャピラリーのアレイを形成する複数のキャピラリーを含み、それぞれのキャピラリーは、試料を保持する管腔を仕切る少なくとも１つの壁を含む。前記管腔は、壁が液体又は試料を保持する管腔を形成する限り、円筒状、正方形、六角形又は他の幾何学的形状のいずれであってもよい。キャピラリーアレイのキャピラリーは、近接して一緒に保持され、平面構造を形成することができる。キャピラリーを、融合（キャピラリーがガラス製である場合）、接着、結合又は並べて固定することによって一緒に束ねることができる。加えて、キャピラリーアレイはアレイ内の隣接するキャピラリーの間に配置された間隙物質を含み、それによって複数の貫通孔を含む固体平面装置を形成することができる。
【０３２５】
キャピラリーアレイを、任意の数の個別のキャピラリーで、例えば１００〜４，０００，０００本のキャピラリーの範囲で形成することができる。更に、約１００，０００本以上の個別のキャピラリーを有するキャピラリーアレイを、標準的実験室用装置の付属部品である標準的な大きさ及び形状のMicrotiter（登録商標）プレートに形成することができる。管腔を、毛管作用又は細い針を用いるマイクロインジェクションのいずれかを使用して、手動又は自動で充填する。続いて目的の試料を個別のキャピラリーから取り出して、更なる分析又は特徴決定に付すことができる。例えば、細い針のようなプローブを、選択したキャピラリーと液体連通する位置に置いて、管腔に材料を添加するか、又はそれから引き抜く。
【０３２６】
単一ポットスクリーニングアッセイにおいて、キャピラリーアレイに挿入する前に、アッセイ構成成分を混合して、目的の溶液を得る。少なくともアレイの一部が目的の溶液に浸されると、管腔が毛管作用により充填される。各キャピラリーにおける化学的若しくは生物学的反応及び／又は活性を、検出可能な事象についてモニタリングする。検出可能な事象は、多くの場合に「ヒット」と呼ばれ、通常、「ノンヒット」を生じるキャピラリーと光学的検出によって区別することができる。したがって、キャピラリーアレイは、「ヒット」の大規模並行検出を可能にする。
複数ポットスクリーニングアッセイにおいて、ポリペプチド又は核酸、例えばリガンドを第１成分に導入することができ、これをキャピラリーアレイのキャピラリーの少なくとも一部に導入する。次に気泡を第１のキャピラリーの第１の成分の後に導入することができる。次に第２の成分をキャピラリーに導入することができ、ここで第２の成分は、第１の成分と気泡によって分離される。次にキャピラリーアレイの両側に静水圧を適用し気泡を破裂させることによって、第１及び第２の成分を混合することができる。次にキャピラリーアレイを、２つの成分の反応又は未反応によりもたらされる検出可能な事象についてモニタリングする。
【０３２７】
結合スクリーニングアッセイにおいて、目的の試料を、検出可能な粒子で標識した第１の液体としてキャピラリーアレイのキャピラリーに導入することができ、ここでキャピラリーの管腔は、管腔に検出可能な粒子が結合するために結合物質で被覆されている。次に第１の液体をキャピラリー管から取り出すことができ、結合された検出可能な粒子は、キャピラリーの中に残り、第２の液体をそのキャピラリー管に導入することができる。次にキャピラリーを、粒子と第２の液体との反応又は未反応によりもたらされる検出可能な事象についてモニタリングする。
【０３２８】
アレイ又は「バイオチップ」
本発明の核酸又はポリペプチドを、アレイに固定化するか又は適用することができる。アレイを使用して、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸又はポリペプチドと結合する能力又はそれらの活性を改変する能力についてスクリーニング又はモニタリングすることができる。例えば、本発明の一つの態様において、モニタリングパラメーターは、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素遺伝子の転写発現である。細胞の１つ以上若しくは全ての転写物は、細胞の転写物を含む試料のハイブリダイゼーションによって測定することができるか、又は、細胞の代表的な若しくは細胞の転写物と相補的な核酸は、アレイ若しくは「バイオチップ」に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。マイクロチップの核酸「アレイ」を使用することによって、細胞の転写物の幾つか又は全てを同時に定量することができる。あるいは、ゲノム核酸を含むアレイを、本発明の方法によって新たに操作された株の遺伝子型を決定することにも使用できる。「ポリペプチドアレイ」を、複数のタンパク質の同時定量化に使用することもできる。本発明は、「マイクロアレイ」若しくは「核酸アレイ」若しくは「ポリペプチドアレイ」若しくは「抗体アレイ」若しくは「バイオチップ」又はこれらの変型ともよばれる、既知の「アレイ」のいずれかを用いて実施することができる。アレイは、一般に複数の「スポット」又は「標的エレメント」であり、それぞれの標的エレメントは、試料分子、例えばｍＲＮＡ転写物に特異的に結合している基板表面の確定された領域に固定化されている１つ以上の生物学的分子、例えばオリゴヌクレオチドの確定された量を含む。
【０３２９】
本明細書で使用されるとき、用語「アレイ」又は「マイクロアレイ」又は「バイオチップ」又は「チップ」は、複数の標的エレメントであり、それぞれの標的は、基質表面の定義された領域に固定化されている１つ以上のポリペプチド（抗体を含む）又は核酸の定義された量を含み、下記に更に詳細に考察されている。
本発明の方法の実施に際して、既知のアレイ並びに／又はアレイの製造及び使用方法のいずれかを全体的に若しくは部分的に又はその変型を取り込むことができ、例えば以下に記載されている： 米国特許第第6,277,628号;同第6,277,489号;同第6,261,776号;同第6,258,606号;同第6,054,270号;同第6,048,695号;同第6,045,996号;同第6,022,963号;同第6,013,440号;同第5,965,452号;同第5,959,098号;同第5,856,174号;同第5,830,645号;同第5,770,456号;同第5,632,957号;同第5,556,752号;同第5,143,854号;同第5,807,522号;同第5,800,992号;同第5,744,305号;同第5,700,637号;同第5,556,752号;同第5,434,049号;例えば以下も参照すること：WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958;例えば以下も参照すること：Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32。米国特許出願第20010018642号；同第20010019827号;同第20010016322号;同第20010014449号;同第20010014448号;同第20010012537号;同第20010008765号も参照すること。
【０３３０】
抗体及び抗体に基づくスクリーニング方法
本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素に特異的に結合する単離又は組換え抗体を提供する。これらの抗体は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素又は関連するポリペプチドを単離する、同定する又は定量化するために使用することができる。これらの抗体は、本発明の範囲内にある他のポリペプチド又は他の関連するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素を単離するために使用することができる。これらの抗体は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又ははベータ−グルコシダーゼ酵素の活性部位と結合するように設計することができる。したがって、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、本発明の抗体を使用して阻害する方法を提供する（本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ−グルコシダーゼ酵素組成物の適用に関する上記の考察を参照すること）。
【０３３１】
用語「抗体」には、抗原又はエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントから誘導される、それらを模倣した、又はそれらにより実質的にコードされるペプチド又はポリペプチドが含まれる（例えば、Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson  (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97を参照すること）。抗体という用語には、抗原結合タンパク質、すなわち、抗原に結合する能力を保持する「抗原結合部位」（例えば、フラグメント、部分配列、相補性決定領域（CDR））が含まれ、（ｉ）VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメントであるFabフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合している２つのFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab')2フラグメント；（ｉｉｉ）VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一腕のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント；（ｖ）VHドメインからなるdAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；並びに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（CDR）が含まれる。単鎖抗体も、用語「抗体」に含まれる。
【０３３２】
本発明は、本発明のポリペプチドの免疫原性フラグメント（例えば、部分配列）を含む、本発明の酵素のフラグメント（例えば、ペプチド）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチド又はペプチド、及び佐剤又は担体を含む組成物を提供する。
抗体は、免疫沈降、染色、イムノアフィニティーカラムなどで使用することができる。望ましい場合、特異的な抗原をコードする核酸配列を、免疫、続くポリペプチド又は核酸の単離、増幅又はクローニング、及びポリペプチドの本発明のアレイ上への固定化によって生成することができる。あるいは、本発明の方法を使用して、改変される細胞により産生される抗体の構造を改変することができ、例えば、抗体の親和性を増加又は減少させることができる。更に、抗体を作製又は改変する能力は、本発明の方法により細胞を操作して付与した表現型でありうる。
【０３３３】
免疫化、抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）の産生及び単離の方法は当業者に既知であり、科学文献及び特許文献に記載されている（例えば、Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照すること）。抗体は動物を使用する伝統的なインビボ方法に加えて、例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレーライブラリーを使用して、インビトロで生成することができる。例えば、Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45を参照すること。
【０３３４】
本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントを使用して、ポリペプチド又はフラグメントに特異的に結合する抗体を生成することができる。得られた抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィー方法で使用して、ポリペプチドを単離又は精製すること、又はポリペプチドが生物学的試料に存在するかを決定することができる。そのような方法において、抽出物のようなタンパク質調製物又は生物学的試料を、本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントの１つと特異的に結合することができる抗体と接触させる。
【０３３５】
イムノアフィニティー方法では、抗体を、ビーズ又は他のカラムマトリックスのような固相に付着させる。タンパク質調製物を、抗体が本発明のポリペプチド又はそのフラグメントの１つと特異的に結合する条件下で、抗体と接触させる。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶離させる。
生物学的試料中のタンパク質が抗体と結合する能力は、当業者に周知の多様な方法のいずれかを使用して決定することができる。例えば、結合は、抗体を蛍光物質、酵素標識又は放射性同位元素のような検出可能な標識で標識化して決定することができる。あるいは、抗体と試料との結合は、そのような検出可能な標識を有する二次抗体を使用して検出することができる。具体的なアッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントに対して生成されるポリクローナル抗体は、動物、例えば非ヒト動物にポリペプチドを直接注入することによって又は動物にポリペプチドを投与することによって得ることができる。そのようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体と結合することができる。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、完全な天然のポリペプチドと結合することができる抗体の生成に使用できる。次にそのような抗体を使用して、ポリペプチドを発現している細胞からポリペプチドを単離することができる。 
【０３３６】
モノクローナル抗体の調製では、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が含まれる。
単鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適応して、本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントに対する単鎖抗体を産生することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを使用して、これらポリペプチド又はそのフラグメントに対するヒト化抗体を発現させることができる。
本発明のポリペプチド又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続アミノ酸を含むそのフラグメントに対して生成された抗体を、他の生物体及び試料からの同様のポリペプチドのスクリーニングに使用することができる。そのような技術では、生物体からのポリペプチドを抗体と接触させ、抗体と特異的に結合するポリペプチドが検出される。上記に記載した方法のいずれも抗体結合の検出に使用することができる。そのようなスクリーニングアッセイの一つが、“Methods for Measuring Cellulase Activities”, Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116に記載されている。
【０３３７】
キット
本発明は、組成物、例えば本発明の核酸、発現カセット、ベクター、細胞、トランスジェニック種子又は植物若しくは植物部分、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ酵素）及び／又は抗体を含むキットを提供する。キットは、本明細書に記載されているように、本発明の方法論、並びに産業用途、医療用途及び飲食用途を教示する指示資料を含むことができる。
【０３３８】
全細胞操作及び代謝パラメーターの測定
本発明の方法は、細胞の遺伝的構成を改変することによって、新たな表現型、例えば新たな又は改変されたセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性を有する新たな細胞株を開発するために、細胞の全細胞進化又は全細胞操作を提供する。米国特許出願第２００４００３３９７５号を参照すること。
遺伝的構成は、細胞に、本発明の核酸、例えば本発明の酵素のコード配列を加えることによって改変することができる。例えば、ＷＯ０２２９０３２、ＷＯ０１９６５５１を参照すること。 
新たな表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも１つの代謝パラメーターが細胞において「リアルタイム」又は「オンライン」の時間枠でモニタリングされる。一つの態様において、細胞培養のような複数の細胞が、「リアルタイム」又は「オンライン」でモニタリングされる。一つの特徴において、複数の代謝パラメーターが、「リアルタイム」又は「オンライン」でモニタリングされる。代謝パラメーターは、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を使用してモニタリングすることができる。
【０３３９】
代謝フラックス分析（ＭＦＡ）は既知の生化学的フレームワークに基づいている。線形独立な代謝マトリックスを、細胞内代謝物に対する質量保存の法則及び見掛けの定常状態仮説（ＰＳＳＨ）に基づいて構築する。本発明の方法の実施に際して、以下を含む代謝ネットワークが確立される：
全ての経路の基質、生成物及び中間代謝物の実体；
経路の代謝物を変換する全ての化学反応の実体、前記経路の反応の化学量論；
反応を触媒する全ての酵素の実体、前記酵素反応のキネティクス；
経路の構成要素間の調節的相互作用、例えばアロステリック相互作用、酵素−酵素相互作用など；
酵素の細胞内区画局在性又は酵素の分子レベルを超えるその他の機構；及び
代謝物、酵素又はエフェクター分子の何らかの濃度勾配又はそれらの移動に対する拡散障壁の存在。 
【０３４０】
ある株について代謝ネットワークがいったん確立されると、オンライン代謝物データが利用可能な場合は、マトリックス表記による数学的表現を導入して細胞内代謝フラックスを評価することができる。代謝表現型は、細胞内の全体的な代謝ネットワークの変化に依存する。代謝表現型は、環境条件、遺伝的調節、生育状態及び遺伝子型などに対応する経路利用の変化に左右される。本発明の方法の一つの態様において、オンラインＭＦＡ計算の後、細胞の動的態様、細胞の表現型及び他の特性が、経路の利用を精査することによって分析される。例えば、酵母の発酵時にグルコースの供給が増加し、酸素が減少する場合、呼吸経路の利用は低下及び／又は停止し、発酵経路の利用が優先的になるであろう。細胞培養の生理学的状態の制御は、経路分析の後で可能になるであろう。本発明の方法は、基質供給、温度、インデューサーの使用などをどのように変化させて、細胞の生理的条件を制御して所望の方向に向かわせるかを決定することによって、発酵の操作方法の決定に役立つことができる。本発明の方法の実施に際して、ＭＦＡの結果を、代謝の操作又は遺伝子シャッフリングなどのために、実験及びプロトコールを設計するトランスクリプトーム及びプロテオームのデータと比較することもできる。
本発明の方法を実施するに際し、細胞の新たな又は改善された特性を含む、あらゆる改変又は新たな表現型を付与及び検出することができる。代謝又は増殖のあらゆる態様をモニタリングすることができる。
【０３４１】
ｍＲＮＡ転写物発現のモニタリング
本発明の一つの態様において、操作された表現型は、細胞において、ｍＲＮＡ転写物（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素メッセージ）発現の増加若しくは減少、又は新たな（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）転写物の生成を含む。この発現の増加又は低下は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の存在について試験することによって、又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性アッセイによって追跡することができる。ｍＲＮＡ転写物又はメッセージは、ノーザンブロット、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーションなどを含む当該技術で既知のいずれかの方法によって検出及び定量化することもできる。定量的増幅反応には、例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応又はＲＴ−ＰＣＲを含む定量的ＰＣＲ；定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ又は「リアルタイムキネティックＲＴ−ＰＣＲ」が含まれる（例えば、Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplantation 72:907-914を参照すること）。
【０３４２】
本発明の一つの態様において、操作される表現型は、相同遺伝子の発現をノックアウトすることによって生成される。遺伝子のコード配列又は１つ以上の転写制御エレメント、例えばプロモーター又はエンハンサーをノックアウトすることができる。したがって、転写物の発現は、完全に除去されるか又は単に減少させることができる。
本発明の一つの特徴において、操作される表現型は、相同遺伝子の発現の増加を含む。これは、シス−又はトランス−で作用する転写調節エレメントを含む負の制御エレメントのノックアウト、又は正の制御エレメントの変異導入によって実施できる。細胞の１つ以上若しくは全ての転写物は、細胞の転写物又は細胞の代表的転写物若しくは細胞の転写物と相補的な核酸を含む試料のアレイに固定化された核酸へのハイブリダイゼーションによって測定することができる。
【０３４３】
ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸の発現のモニタリング
本発明の一つの態様において、操作される表現型は、細胞における、ポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素）の発現の増加若しくは低下、又は新たなポリペプチドの生成を含む。この発現の増加又は低下は、存在するセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素の量を決定することによって、又はセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素活性アッセイによって追跡することができる。ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸を、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、分光光度法、ラジオグラフィー（タンパク質放射標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば、免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、抗体による染色、蛍光活性化細胞分類装置（ＦＡＣＳ）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光分析、ラマン分光分析、ＧＣ−ＭＳ、並びにＬＣ−エレクトロスプレー及びｃａｐ−ＬＣ−タンデム−エレクトロスプレー質量分析などを含む、当該技術で既知の方法のいずれかによって検出及び定量化することもできる。新規な生物活性は、米国特許第６，０５７，１０３号に記載された方法又はその変形を使用してスクリーニングすることもできる。更に、下記で詳細に考察されるように、細胞のポリペプチドの１つ以上又は全てを、タンパク質アレイを使用して測定することができる。
【０３４４】
産業用途、エネルギー用途、医薬用途及び他の用途
本発明のポリペプチド（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼを有する）は、セルロースの分解を触媒することができる。本発明の酵素は、高度に選択的な触媒であることができる。本発明は、例えば、医薬又は栄養素補給（栄養補助食品）産業において、エネルギー産業において（「クリーン」なバイオ燃料を作るため）、食物及び飼料産業において、例えば食物及び飼料生成物、並びに食物及び飼料添加物を作製する方法において、本発明の酵素を使用する産業プロセスを提供する。一つの態様において、本発明は、例えば、医薬品、又はダイエット補助食品若しくはサプリメント、又は栄養補助食品及び食品添加物を作製するために、医療産業に本発明の酵素を使用するプロセスを提供する。加えて、本発明は、「クリーン」燃料の生成を含む、バイオエタノールでの本発明の酵素を使用する方法を提供する。
本発明の酵素は、鋭敏な立体選択性、部位選択性及び化学選択性を持って反応を触媒することができる。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を操作して、多様な溶媒で機能し、極限ｐＨ（例えば、高ｐＨ及び低ｐＨ）、極限温度（例えば、高温及び低温）、極限塩度（例えば、高塩度及び低塩度）で作用し、天然の生理学的基質と構造的に無関係の化合物との反応を触媒することができる。
【０３４５】
バイオマス変換及びクリーンバイオ燃料の生成
本発明は、バイオマス（例えば、リグノセルロース材料）を燃料（例えば、バイオエタノール）及び化学物質へ変換するための酵素及び方法を提供する。したがって、本発明の組成物及び方法は、石油系生成物の使用に対する有効で持続可能な代替物を提供する。本発明は、天然のバイオマス変換に関わる化学サイクルに参加する、本発明の酵素を発現する生物体を提供する。一つの特徴において、変換のための酵素及び方法を、セルロース及びヘミセルロースポリマーが代謝可能な炭素分子へ有効に脱重合されるために酵素集合物(ensemble;アンサンブル)に使用する。上記で考察したように、本発明は、これらの重要な新たな「バイオマス変換」及び代替エネルギーの産業プロセスを可能にする、最も効果的な酵素を発見及び適用する方法を提供する。
一つの特徴において、本発明のポリペプチド、例えばセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質が、リグノセルロースバイオマスをエタノールに変換するプロセスで使用される。本発明はリグノセルロースバイオマスを含む組成物からエタノール（「バイオエタノール」）を作製する方法を提供する。リグノセルロースバイオマス材料は、食物又は飼料生産の副産物として農作物から、又は植物残渣及び古紙のようなリグノセルロース廃棄生成物として得ることができる。本発明のポリペプチドでの処理に適切な植物残渣には、茎、葉、殻、皮、穂軸など、並びに木材、木材チップ、木材パルプ及びおがくずが含まれる。本発明のポリペプチドでの処理に適切な古紙の例には、破棄コピー用紙、コンピュータのプリンタ用紙、ノート用紙、メモパッド用紙、タイプライター用紙など、並びに新聞紙、雑誌、厚紙及び紙系包装材料が含まれる。
一つの特徴において、本発明の酵素及び方法は、バイオマスからエタノールを作製する、より「伝統的な」方法、例えば、乾燥リグノセルロース材料を反応器中で強酸及び金属塩の稀釈溶液から構成される触媒に付すことによってリグノセルロース材料を加水分解することを含む方法と併せて使用することができ、これは、セルロース加水分解の活性化エネルギー又は温度を下げて糖を高収量で得ることができる（例えば米国特許第６，６６０，５０６号、同第６，４２３，１４５号を参照すること）。
【０３４６】
本発明の酵素の使用が組み込まれる別の例示的な方法は、ヘミセルロース、セルロース及びリグニンを含有するリグノセルロース材料を、第１段階加水分解工程においてセルロースをグルコースに大きく脱重合することなく主にヘミセルロースの脱重合を実施するように選択された温度及び圧力で水性媒体中で加水分解することを含む。この工程はスラリーを生じさせ、そこでは、液体水性相はヘミセルロースの脱重合でもたらされた溶解した単糖を含有し、固体相はセルロース及びリグニンを含有する。第２段階の加水分解工程は、少なくともセルロースの主要な部分が脱重合するような条件を含むことができ、そのような工程は、セルロースの溶解／可溶性脱重合生成物を含有する液体水相をもたらす。例えば、米国特許第５，５３６，４２５号を参照すること。本発明の酵素は、この例示的なプロセスのいずれかの段階で添加することができる。 
本発明の酵素の使用が組み込まれる別の例示的な方法は、リグノセルロース含有バイオマス材料を、１つ以上の希酸加水分解の段階で約０．４％〜２％の強酸を用いて処理し、酸加水分解バイオマスの未反応固体リグノセルロース成分をアルカリ脱リグニンして、生分解性熱可塑性の前駆体及び誘導体を生成することを含む。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号を参照すること。本発明の酵素は、この例示的なプロセスのいずれかの段階で添加することができる。
【０３４７】
本発明の酵素の使用が組み込まれる別の例示的な方法は、リグノセルロース材料を前加水分解反応器において前加水分解すること、酸性液体を固体リグノセルロース材料に添加して混合物を作製すること、前記混合物を反応温度に加熱すること、前記反応温度を、リグノセルロース材料がリグノセルロース材料からのリグニンを少なくとも２０％含有する可溶性部分とセルロースを含有する固体画分に分画するのに十分な時間保持すること、反応温度又はそれに近い温度で固体画分から可溶化部分を除去すること（前記固体画分中のセルロースが酵素消化を受けやすくなる）、および、可溶化部分を回収することを含む。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号を参照すること。本発明の酵素は、この例示的なプロセスのいずれかの段階で添加することができる。
【０３４８】
本発明は、本発明の酵素又は方法を使用して作製される、燃料等級アルコールとブレンドする液体炭化水素に基づくモーター用（火花点火モーター用）の燃料組成物を作成する方法を提供する。一つの特徴において、本発明の酵素の使用により作製される燃料は、例えば石炭ガス、液体又は天然ガス、液体−エタノールブレンドを含む。一つの特徴において、共溶媒は、バイオマス誘導２−メチルテトラヒドロフラン（ＭＴＨＦ）である。例えば、米国特許第６，７１２，８６６号を参照すること。
リグノセルロースの酵素分解のための、例えばリグノセルロース材料からエタノールを生成するための本発明の方法は、バイオマス材料の超音波処理の使用を含むこともできる（例えば米国特許第６，３３３，１８１号を参照すること）。
本発明の酵素を使用した、エタノールを含むバイオ燃料を作製する別の例示的な方法は、少なくともヘミセルロース及びセルロースを含むリグノセルロース供給原料を含む出発材料を前処理することを含む。一つの特徴において、出発材料は、ジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、コムギ、ビート若しくはサトウキビ、又は成分、若しくは廃棄物、若しくは食物、若しくは飼料製造の副産物を含む。出発材料（「供給原料」）を、植物の繊維構造を分断してヘミセルロース及びセルロースの少なくとも部分的な加水分解を実施する条件下で反応させる。分断条件は、例えば、出発材料を、平均温度の１８０℃〜２７０℃、ｐＨ０．５〜２．５で約５秒間〜６０分間、又は２２０℃〜２７０℃の温度、ｐＨ０．５〜２．５で５秒間〜１２０分間、又は同等の条件に付すことを含むことができる。これは、本発明の酵素、例えばセルラーゼ酵素により消化されることが更に容易になる供給原料を生成する。米国特許第６，０９０，５９５号。
リグノセルロース材料のセルラーゼ加水分解における例示的な条件には、約３０℃〜４８℃の温度及び／又は約４．０〜６．０のｐＨでの反応が含まれる。他の例示的な条件には、約３０℃〜６０℃の温度及び約４．０〜８．０のｐＨが含まれる。
【０３４９】
動物飼料及び食物又は飼料添加物
ヒトが使用するダイエット補助食品物若しくはサプリメント、又は栄養補助食品及び食品添加物を提供することに加えて、本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明のセルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、並びに／又は本発明の抗体を有するタンパク質を使用して、動物飼料、並びに食物又は飼料添加物を処理する組成物及び方法も提供する。本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、並びに／又は本発明の抗体を含む動物飼料、食物、及び添加物を提供する。動物は、任意の家畜又は任意の動物であり得る。
【０３５０】
本発明の動物飼料添加物は、飼料成分と容易に混合することができる顆粒酵素生成物であってよい。あるいは、本発明の飼料添加物は、プレミックスの成分の形態であることができる。本発明の顆粒酵素生成物は、被覆されていても非被覆であってもよい。酵素顆粒の粒径は、飼料及びプレミックス成分と適合性であってよい。これは、酵素を飼料に組み入れるために安全で都合のよい手段を提供する。あるいは、本発明の動物飼料添加物は、安定化された液体組成物であることができる。これは、水性又は油性スラリーであることができる。例えば、米国特許第６，２４５，５４６号を参照すること。
動物飼料又は食物の改変における本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、食物又は飼料を、インビトロ（飼料又は食物の成分を改変する）又はインビボのいずれかで飼料又は食物を処理することができる。本発明のポリペプチドを動物飼料又は食物組成物に加えることができる。 
【０３５１】
一つの特徴において、本発明の酵素は、別の酵素、例えばベータ−ガラクトシダーゼ、 カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼと組合せて添加される。これらの酵素消化生成物は、動物でさらに消化されやすい。したがって、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、飼料若しくは食物の利用可能なエネルギーに、又はセルラーゼにより分解される食物若しくは飼料の消化性に寄与することができる。
【０３５２】
別の特徴において、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、穀粒、穀類、トウモロコシ、ダイズ、ナタネ、ルピナスなどのような、トランスジェニック飼料作物（例えば、トランスジェニック植物、種子など）で直接酵素を発現させることによって供給することができる。上記で考察したように、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物、植物部分及び植物細胞を提供する。一つの態様において、核酸を、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が回収可能な量で産生されるように発現させる。セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、あらゆる植物又は植物部分から回収できる。あるいは、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、例えば食物又は飼料の質を改善するため、例えば栄養価、嗜好性などを改善するために使用できる。
【０３５３】
一つの特徴において、本発明の酵素送達マトリックスは、分離した複数個の粒子、ペレット又は顆粒の形態である。「顆粒」とは、例えば、ペレット化、押出し、又は同様の凝縮により圧縮又は凝縮されて、マトリックスから水分を除去した粒子を意味する。そのような粒子の圧縮又は凝縮は、粒子の粒子内凝集力も促進する。例えば、顆粒は、穀粒系基質をペレットミルでペレット化して調製することができる。それによって調製されたペレットを粉砕するか又崩壊させて、動物飼料の添加物としの使用に適切な大きさの顆粒にする。マトリックスはそれ自体飼料での使用が認可されているので、動物飼料で酵素を送達するための稀釈剤として使用することができる。
一つの特徴において、本発明の酵素送達マトリックス及び方法に含まれるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、高温及び／又は蒸気がペレット化酵素送達マトリックスを調製するために使用されうる製造の際に、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素が不活性化に耐性であるように、本明細書に記載されている熱安定性のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素である。本発明の酵素送達マトリックスを含有する飼料の消化の際に、水性消化液が活性酵素の放出を引き起こす。他の種類の熱安定性酵素及び熱安定である栄養補助食品を、あらゆる水性条件下で放出するために送達マトリックスを組み込むこともできる。
一つの特徴において、動物飼料に風味又は栄養補助を加えるため、動物飼料補充物及び酵素の放出を胃の条件下で遅らせるためなどのような多くの異なる目的で酵素マトリックス粒子に被覆がなされる。一つの特徴において、機能的な目標を、例えばマトリックス粒子から酵素の放出を遅らせることが望ましい場合、又は酵素が放出される条件を制御することを達成するために被覆がなされる。被覆材料の組成は、感受性のある作用物質（例えば、熱、酸若しくは塩基、酵素又は他の化学物質）により選択的に分解されるようなものでありうる。あるいは、そのような異なる分解作用物質に感受性のある２つ以上の被覆を、マトリックス粒子に連続して適用することもできる。
【０３５４】
本発明は、酵素放出マトリックスの調製方法にも関する。本発明によると、この方法は、酵素放出マトリックスとして使用するのに適切な粒径を持つ穀粒系基質の分離した複数の粒子を提供することを含み、粒子は、本発明のアミノ酸配列によってコードされるセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む。一つの特徴において、この方法には、酵素放出マトリックスの粒子を凝縮又は圧縮して顆粒にすることを含み、一つの特徴において、ほとんどの場合はペレット化により達成される。成形抑制剤及び凝集剤は、使用する場合、任意の適切なときに添加することができ、一つの特徴では、穀粒系基質のペレット化の前に、所望の割合で穀粒系基質と混合される。一つの特徴において、ペレットミル中の飼料の水分量は、完成品の水分量に対して上記で記載した範囲であり、一つの特徴では約１４〜１５％である。一つの特徴において、水分を、酵素の水性調製物の形態で供給原料に添加し、供給原料をこの水分量にする。一つの特徴において、ペレットミルの温度を蒸気で約８２℃にする。ペレットミルを、供給原料がペレットを提供するのに十分な処理を付与するあらゆる条件下で作動することができる。ペレット化プロセスそれ自体は、酵素含有組成物から水を除去する費用効果の高い方法である。
【０３５５】
本発明の組成物及び方法は、プレバイオティクスの投与と併せて実施することができる。プレバイオティクスは、高分子量の糖であり、例えばフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ＧＲＡＳ（安全性の確認された（Generally Recognized As Safe））材料である。これらのプレバイオティクスは、一部のプロバイオティック乳酸菌（ＬＡＢ）により代謝されうる。これらは大多数の腸内微生物によっては消化されない。
【０３５６】
食物処理及び食物加工
本発明は、本発明の酵素を含む食物及び飼料、並びに食物及び飼料の加工において本発明の酵素を使用する方法を提供する。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素は、食品加工産業において多数の用途を有する。本発明は、例えば植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、若しくは動物細胞、又は任意の植物若しくは植物部分、又は任意の食物若しくは飼料、廃棄生成物などを含む、セルラーゼ含有組成物を加水分解する方法を提供する。
例えば、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む飼料又は食物を提供し、例えば、飼料、液体、例えば飲料（例えばフルーツジュース若しくはビール）、パン若しくは生地若しくはパン製品、又は飲み物（例えばビール）若しくは飲料前駆体（例えば麦芽汁）である。
【０３５７】
本発明の食物処理方法は、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３５８】
一つの特徴において、本発明は、液体（液化）及び顆粒デンプンを加水分解する酵素及び方法を提供する。そのようなデンプンは、任意の供給源、例えばビート、サトウキビ、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、マイロ、ソルガム、ライムギ又はブルガーに由来し得る。本発明は、液化（例えばバイオエタノールを作製するため）に有用である任意の植物デンプン供給源、例えば穀物デンプン供給源に適用され、液化に適切なデンプンを生成することが知られている他の任意の穀物又は植物供給源が含まれる。本発明の方法は、イネ、発芽イネ、トウモロコシ、オオムギ、マイロ、コムギ、マメ類、ジャガイモ、ビート、サトウキビ及びサツマイモのようなあらゆる天然材料からのデンプンを液化する（例えば、ビオエタノールを作製する）ことを含む。液化プロセスは、デンプンを実質的に加水分解してシロップを生成することができる。液化の温度範囲は、デンプンの液化を実施することが知られている任意の液化温度であることができる。例えば、デンプンの温度は、約８０℃〜約１１５℃、約１００℃〜約１１０℃、約１０５℃〜約１０８℃でよい。本発明の酵素及び方法を使用して作製されたバイオエタノールを、アルコール飲料を含む食物及び飼料での使用（又はそれらの作製）に加えて、下記で考察するように、燃料として又は燃料の中に（例えば、自動車燃料）使用することができる。
【０３５９】
廃棄物処理
本発明は、廃棄物処理における酵素の使用を提供する。本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を、多様な廃棄物処理、又は関連する産業用途、例えば燃料を生成するバイオマス変換に関連する廃棄物処理で使用することができる。例えば、一つの特徴において、本発明は、本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を使用する、固体及び／又は液体廃棄物消化プロセスを提供する。この方法は、実質的に未処理の固体廃棄物の質量及び容量を低減することを含むことができる。固体廃棄物を、制御した温度で、酵素溶液（本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ酵素を含む）の存在下で、酵素消化プロセスによって処理することができる。これによって、添加微生物による明確な細菌発酵のない反応がもたらされる。固体廃棄物が、液化廃棄物及び任意の残留固体廃棄物に変換される。得られた液化廃棄物を前記の残留凝固廃棄物から分離することができる。例えば、米国特許第５，７０９，７９６号を参照すること。
一つの特徴において、本発明の組成物及び方法は、例えば、ブタ農場の動物排泄物ラグーンにおいて、他の動物排泄物管理系において、又は任意の産業用途若しくは食品加工用途において臭気除去、臭気防止、又は臭気低減に使用される。
【０３６０】
バイオマス（例えば、リグノセルロース材料）を燃料（例えば、バイオエタノール）へ変換する酵素及び方法は自治体の固体廃棄物材料の処理／再利用を組み込むことができ、前記固体廃棄物には自治体から直接得た廃棄物、以前は埋められていたがその後回収された一般固体廃棄物、又は例えば相当量のセルロース材料を含む下水汚泥ケーキの形態の下水汚泥が含まれる。下水汚泥ケーキは、通常、実質的な量の再利用材料（アルミニウム、ガラス、プラスチックなど）を含まないので、濃硫酸により直接処理して（廃棄物のセルロース成分の重金属含有量を低減し）、エタノール生成系で処理することができる。例えば、米国特許第６，２６７，３０９号、同第５，９７５，４３９号を参照すること。
廃棄物材料から有機及び無機物を回収する本発明の酵素を使用する別の例示的な方法は、固体有機物を滅菌し、それを熱及び圧力に付して軟化させることを含む。この例示的な方法は、最初に廃棄物材料を撹拌し、次にそれを熱及び圧力に付し、滅菌し、含有された有機物を軟化することによって実施することができる。一つの特徴において、圧力下で加熱した後、圧力を有孔チャンバから突然放出させて、軟化有機物を容器の貫通を通して外側に押し出し、このようにして固体無機物から有機物を分離することができる。次に軟化した滅菌有機物を、例えば本発明の酵素を使用して、発酵チャンバで発酵させて、例えばマッシュ(mash)を形成する。マッシュを、遠心分離、蒸留カラム及び／又は嫌気性消化装置により更なる処理に付して、エタノール及びメタノールのような燃料、並びに動物飼料添加物を回収することができる。例えば、米国特許第６，２５１，６４３号を参照すること。
【０３６１】
本発明の酵素を、処理、例えば前処理に使用して、産業廃棄物又は畜産施設から生じる排泄物などの臭気を低減することができる。例えば、本発明の酵素を使用して排泄物貯蔵施設の動物排泄物を処理し、臭気を下げながら多量の有機物の効率的な分解を強化することができる。このプロセスは、硫化物を利用する細菌及び有機物を消化する細菌、並びに溶菌酵素（本発明の酵素に加えて）による接種も含むことができる。例えば、米国特許第５，９５８，７５８号を参照すること。
本発明の酵素は、移動系、例えば水性有害廃棄物のバイオレメディエーションためのバッチ型反応器で使用することもでき、例えば、米国特許第５，８３３，８５７号に記載されている。バッチ型反応器は、循環機能を有する大型の容器であってよく、細菌（例えば、本発明の酵素を発現する）が、反応器に投入される栄養素により十分な状態に維持される。廃液が反応器に送達されるか又は反応器が排水処理系に組み込まれるような系を、使用することができる。本発明の酵素を、小型又は一時的に遠隔地で使用される処理系、例えば携帯用の高容量高能率で汎用の排水処理系で使用することもできる。 
【０３６２】
本発明の廃棄物処理プロセスは、他のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／若しくはベータ−グルコシダーゼ酵素、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むことができる。
【０３６３】
洗剤組成物
本発明は、１つ以上の本発明のポリペプチド（セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性）を含む洗剤組成物、並びにこれらの組成物の製造及び使用方法を提供する。本発明には、洗剤組成物を製造及び使用する全ての方法が組み込まれる（例えば、米国特許第６，４１３，９２８号、同第６，３９９，５６１号、同第６，３６５，５６１号、同第６，３８０，１４７号を参照すること）。洗剤組成物は、１成分及び２成分水性組成物、非水性組成物、注型固体、顆粒形態、粒状形態、圧縮錠剤、ゲル及び／又はペースト、並びにスラリー形態であることができる。本発明は、これらの洗剤組成物を使用した、ひどい食物の汚れ、食物の残渣及び他のわずかな食物組成物の膜を迅速に除去できる方法も提供する。本発明の酵素は、デンプン多糖類の触媒的加水分解によりデンプン性の汚れの除去を促進することができる。本発明の酵素を、皿洗い洗剤、織物の洗濯洗剤として使用することができる。
洗剤溶液が所望の酵素活性を有すると仮定すると、実際の活性酵素の含有量は洗剤組成物の製造方法によって左右され、重要ではない。一つの特徴において、最終溶液に存在するグルコシダーゼの量は製剤組成物１ｇあたり約０．００１mg〜０．５mgの範囲である。本発明の方法及び組成物での使用のために選択される特定の酵素は、製品の物理的形態、使用ｐＨ、使用温度、及び分解又は変更される汚れの種類を含む最終的な利用条件によって左右される。酵素は、所定の利用条件のいずれに対しても最適な活性及び安定性を提供するように選択することができる。一つの特徴において、本発明のポリペプチドは、約４〜約１２のｐＨ範囲、約２０℃〜約９５℃の温度範囲で活性である。本発明の洗剤は、カチオン性、半極性非イオン性若しくは双性イオン性界面活性剤、又はこれらの混合物を含むことができる。
【０３６４】
本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を、約０．０１〜約５質量％（好ましくは０．１質量％〜０．５質量％）で４．０〜１２．０のｐＨを有する粉末又は液体洗剤に配合することができる。これらの洗剤組成物は、既知のプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、又はエンドグリコシダーゼのような他の酵素、並びにビルダー及び安定化剤を含むこともできる。本発明の酵素を従来の洗浄組成物へ添加することは、特別な使用制限をもたらさない。換言すれば、ｐＨが上記の範囲内であり、温度が記載された酵素の変性温度を下回る限り、この洗剤に適した任意の温度及びｐＨも本発明の組成物に適切である。加えて、本発明のポリペプチドは、洗剤を含まない洗浄組成物において、この場合でも、単独で又はビルダー及び安定化剤と組合せて使用することができる。
本発明は、硬質表面を洗浄する洗剤組成物、布地を洗浄する洗剤組成物、皿洗い組成物、口内洗浄組成物、義歯洗浄組成物、及びコンタクトレンズ洗浄溶液を含む洗浄組成物を提供する。
一つの特徴において、本発明は、洗浄のために十分な条件下で対象物を本発明のポリペプチドと接触させることを含む、対象物の洗浄方法を提供する。本発明のポリペプチドは洗剤添加剤として含めることができる。本発明の洗剤組成物は、例えば、本発明のポリペプチドを含む手洗い又は機械洗濯洗剤組成物として配合することができる。汚れの付着した布地の前処理に適切な洗濯添加剤は、本発明のポリペプチドを含むことができる。生地柔軟剤組成物は、本発明のポリペプチドを含むことができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、一般的な家事用硬質表面洗浄作業で使用される洗剤組成物として配合することができる。別の特徴において、本発明の洗剤添加剤及び洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、別のグルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、別のセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラクターゼ及び／又はペルオキシダーゼのような、１つ以上の他の酵素を含むことができる。本発明の酵素の特性は、選択した洗剤に適合するように（すなわち、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分との適合性など）選択され、酵素は有効量で存在する。一つの特徴において、本発明の酵素を使用して、布地から悪臭物質が除去される。本発明の実施に使用できる種々の洗剤組成物及びそれらの作製方法は、例えば、米国特許第６，３３３，３０１号、同第６，３２９，３３３号、同第６，３２６，３４１号、同第６，２９７，０３８号、同第６，３０９，８７１号、同第６，２０４，２３２号、同第６，１９７，０７０号、同第５，８５６，１６４号に記載されている。
【０３６５】
本発明の洗剤及び関連する方法は、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３６６】
布地及び織物の処理
本発明は、１つ以上の本発明のポリペプチド、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素を使用する、布地及び織物の処理方法を提供する。本発明のポリペプチドは、任意の布地処理方法で使用することができ、これは当該技術でよく知られている（例えば、米国特許第６．０７７，３１６号を参照すること）。例えば、一つの特徴において、布地の感触及び外観は、布地を本発明の酵素と溶液中で接触させることを含む方法によって改善される。一つの特徴において、布地は、溶液中、圧力下で処理される。
一つの特徴において、本発明の酵素は、織物を織っている間、若しくは織った後で、又は脱サイズ工程の間又は１つ以上の追加的な布地加工工程で適用される。織物が織られている間、糸は強い機械的歪みに曝される。織機で織る前に、縦糸は、多くの場合、サイズ用デンプン又はデンプン誘導体で被覆されて、その引張り強さが高められ破断が防止される。本発明の酵素は、これらのサイズ用デンプン又はデンプン誘導体を除去するために適用することができる。織物を織り上げた後、布地を脱サイズ工程へ進めることができる。この後に、１つ以上の追加的な布地加工工程が続くことができる。脱サイズは、織物からサイズを除去する作業である。織った後、均質性及び耐洗浄性を確実にするために布地を更に加工する前に、サイズ被覆を除去しなければならない。本発明は、本発明の酵素の作用によるサイズの酵素的加水分解を含む、脱サイズ方法を提供する。
【０３６７】
本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を、例えば水性組成物中で洗剤添加剤として使用して、綿含有布地を含む布地の脱サイズに使用することができる。本発明は、インジゴ染色デニム布地及び衣料にストーンウォッシュ加工した外観を生じる方法を提供する。衣服の製造のために、布地を切断して衣服又は衣料に縫製することができ、これは処理の終了後に完成される。特に、デニムのジーンズ製造の場合、異なる酵素仕上げ方法が開発されている。デニムの衣料の仕上げは、酵素による脱サイズ工程から始まり、その間、衣料はデンプン分解酵素作用に付されて、柔軟さが布地に提供され、綿をその後の酵素仕上げ工程に馴染みやすくする。本発明は、本発明の酵素を使用して、デニムの衣料を仕上げる方法（例えば「バイオストーニング工程」）、酵素的脱サイズ及び布地に柔軟さをもたらす方法を提供する。本発明は、脱サイズ及び／又は仕上げ工程でデニム衣料を迅速に柔軟化する方法を提供する。
本発明は、本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を含む消毒剤も提供する。
【０３６８】
本発明の布地又は織物処理プロセスは、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３６９】
紙又はパルプ処理
本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）は、紙若しくはパルプ処理、又は紙脱インキも可能である。例えば、一つの特徴において、本発明は、本発明の酵素を使用した紙処理プロセスを提供する。一つの特徴において、本発明の酵素を使用して紙の中のデンプンを改変し、それによってそれを液化形態に変換する。別の特徴では、再生コピー用紙の紙成分を化学及び酵素脱インキするプロセスである。一つの特徴において、本発明の酵素は、他のセルラーゼ（他のエンドグルカナーゼ、セルビオヒドロラーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ）を含む他の酵素と組合せて使用することができる。木材、紙、紙製品又はパルプを以下の３つのプロセスにより処理することができる：１）本発明の酵素の存在下での分解；２）脱インキ化学物質及び本発明の酵素による分解；及び／又は３）本発明の酵素に浸した後での分解。本発明の酵素で処理した再生紙は、セルラーゼだけで処理された紙と比較して、トナー粒子が除去されているために高い明度を有することができる。本発明はいずれの特定の機構に限定されるものではないが、本発明の酵素の効果は、パルプ懸濁液中の界面活性剤としてのその働きによるものでありうる。
【０３７０】
本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドを使用して紙及び紙パルプを処理する方法を提供する。本発明のポリペプチドは、任意の紙処理及びパルプ処理方法で使用することができ、これは当該技術でよく知られている（例えば、米国特許第６，２４１，８４９号、同第６，０６６，２３３号、同第５，５８２，６８１号を参照すること）。例えば、一つの態様において、本発明は、染料を含む印刷された紙を脱インキ及び脱色する方法を提供し、それは、印刷された紙をパルプ化してパルプスラリーを得て、本発明の酵素（他の酵素を添加することができる）の存在下でインクをパルプスラリーから除去することを含む。別の態様において、本発明は、本発明の酵素を含む（他の酵素、例えばペクチナーゼ酵素を含むこともできる）酵素混合物をパルプに添加すること、及び酵素処理パルプを生成する反応を起こす条件下で処理することによって、パルプ、例えば二次繊維から製造されたパルプのろ水度を高める方法を提供する。酵素処理パルプのろ水度は、明度が低下することなく二次繊維パルプの最初のろ水度より高められる。
【０３７１】
本発明の紙、木材若しくはパルプ処理、再生利用プロセスは、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３７２】
再パルプ化：リグノセルロース材料の処理
本発明は、リグノセルロース繊維の処理方法も提供する。前記方法において、繊維はその繊維特性を改善するのに十分な量の本発明のポリペプチド（セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）により処理される。本発明の酵素は、デンプン補強古紙及び厚紙から、パルプ、紙及び厚紙のようなリグノセルロース材料を製造又は再生利用する場合に使用することもでき、特に、再パルプ化又は再生利用が７を超えるｐＨで実施され、本発明の酵素が廃棄物材料の分解を補強デンプンの分解により促進できる場合に使用することができる。本発明の酵素は、デンプン被覆印刷紙から製紙用パルプを製造する方法において有用でありうる。この方法は、例えばＷＯ９５／１４８０７で記載されているように実施することができる。例示的な方法は、紙を分解してパルプを生成し、分解前、分解中又は分解後にデンプン分解酵素で処理し、分解処理及び酵素処理後にインク粒子をパルプから分離することを含む。例えば、米国特許第６，３０９，８７１号及びそれに引用された他の米国特許も参照すること。したがって、本発明は、再生紙パルプを酵素で脱インキする方法を含み、ポリペプチドが繊維表面の効果的な脱インキに有効な量で適用される。
【０３７３】
醸造及び発酵
本発明は、本発明の酵素、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素を含む、ビールを醸造（例えば、発酵）する方法を提供する。一つの例示的な方法において、デンプン含有原料を分解及び処理してモルトを形成する。本発明の酵素は発酵処理の任意の時点で使用される。例えば、本発明の酵素をオオムギモルトの加工時に使用することができる。ビール醸造の主要な原料はオオムギモルトである。これは３段階のプロセスであることができる。第１に、オオムギの穀粒を浸漬して、水分含有量を例えば約４０％程度に増加させる。第２に、穀粒を３〜６日間、１５〜２５℃でインキュベートすることによって発芽させることができ、その間ジベレリンの制御下で酵素合成が刺激される。この期間中に酵素レベルは顕著に上昇する。一つの態様において、本発明の酵素はプロセスのこの段階（又は他の任意の段階）で添加される。酵素の作用は発酵可能な還元糖の増加をもたらす。これはジアスターゼ能力（ＤＰ）として表すことができ、ＤＰは、１２℃で５日間でおよそ８０から１９０に上昇することができる。
本発明の酵素は、米国特許第５，７６２，９９１号、同第５，５３６，６５０号、同第５，４０５，６２４号、同第５，０２１，２４６号、同第４，７８８，０６６号に記載されているように、任意のビール製造方法で使用することができる。
【０３７４】
地下層からの産出流体流の増加
本発明は、本発明の酵素（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を使用する方法も含み、この方法は、産出作業中に形成され、完成した井孔を取り巻く地下層内で見出される粘稠なデンプンを含有する有害な流体を除去することによって、地下層から生じる産出流体流を増加させる。したがって、本発明のこの方法は、産出流体を井孔から流出させる。本発明のこの方法は、また、地下層からの産出流体流を予想される流速を下回って低下させる有害な流体の問題に対処する。一つの態様において、本発明は、水性流体と本発明のポリペプチドを一緒にブレンドすることによって酵素処理物を配合し（本発明の酵素を使用する）、酵素処理物を井孔内の所望の場所にポンプで送り込み、酵素処理物で粘稠なデンプン含有有害流体を分解させ、それによって地下層から井戸表面までの流体を除去することを提供し、ここで酵素処理物はデンプン含有流体中のアルファグルコシド結合の攻撃に有効である。
【０３７５】
本発明の地下層酵素処理プロセスは、トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ベータ−１，４−ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ−ラッカーゼ、エンド−ベータ−１，３（４）−ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノロキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はトランスグルタミナーゼのような他の酵素との任意の組合せの使用を含むこともできる。
【０３７６】
医薬組成物及び栄養補助食品
本発明は、本発明のセルラーゼ、（例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を含む、医薬組成物及び栄養補助食品（例えば、ダイエット補助食品）も提供する。セルラーゼ活性は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を含む。一つの態様において、医薬組成物及び栄養補助食品（例えば、ダイエット補助食品）は、例えば、高セルロース又はリグノセルロース成分を有する食物及び飼料の消化を改善するために、経口摂取用に配合される。
例えば、米国特許第６，７７６，９７９号で記載されているように、歯周病治療化合物は本発明の酵素を含むことができる。例えば、米国特許第６，４６８，９６４号で記載されているように、酸性胃症候群を治療又は予防する化合物及び方法は、本発明の酵素を含むことができる。
【０３７７】
別の特徴において、創傷包帯、インププラントなどは、本発明の酵素（例えば本発明の例示的な配列を含む）を含む抗菌（例えば、抗生活性）酵素を含む。本発明の酵素は、アルギン酸被覆材、抗菌バリヤ被覆材、熱傷被覆材、圧迫包帯、診断ツール、ゲル被覆材、ヒドロ選択性被覆材、ヒドロセルロース（泡）被覆材、ヒドロコロイド被覆材、Ｉ．Ｖ．被覆材、切開ドレープ、低付着被覆材、臭気吸収被覆材、ペーストバンデージ、手術後被覆材、瘢痕管理、スキンケア、透明フィルム被覆材、及び／又は創傷閉鎖に使用することもできる。本発明の酵素を、創傷洗浄、創傷床調製物、圧迫潰瘍の治療、下腿潰瘍、熱傷、糖尿病性潰瘍、瘢痕、ＩＶ固着、手術創及び非主要創傷に使用することができる。本発明の酵素を、滅菌酵素的壊死組織除去組成物、例えば軟膏に使用することができる。多様な特徴において、セルラーゼは、錠剤、ゲル剤、丸剤、移植錠、液剤、噴霧剤、粉末剤、食物、飼料ペレットとして又はカプセル剤として配合される。
【０３７８】
対生物防御用途
他の特徴において、本発明のセルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を有する酵素）を、生物防御（例えば、リグノセルロース材料を含む胞子又は細菌の破壊）に使用することができる。生物防御用途における本発明のセルラーゼの使用は、現在不明の又は将来的のあらゆる細菌との戦いに対して極めて迅速に開発できる点において、著しい利益を提供する。加えて、本発明のセルラーゼを、影響を受けた環境の汚染除去に使用することができる。一つの態様において、本発明は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む生物防御又はバイオ解毒剤を提供し、ここでポリペプチドは、本発明の配列（例えば、本発明の例示的な配列を含む）又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド（例えば、本発明の例示的な配列を含む）を含み、場合によりポリペプチドは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はベータ−グルコシダーゼ活性を含む活性を有する。
【０３７９】
参照リスト
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【０３８０】
以下の実施例は、説明のために提供され、本発明の請求の範囲を制限しない。
【０３８１】
実施例
実施例１：GIGAMATRIX（商標）スクリーニング
ある特徴において、本発明の方法は、Diversa Corporationが独自に開発したGIGAMATRIX（商標）プラットフォームを使用する。ＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／３８５８３；米国特許出願第２００５００４６８３３号；同第２００２００８０３５０号；米国特許第６，９１８，７３８号；意匠特許第Ｄ４８０，８１４号を参照のこと。例えば、ある特徴において、GIGAMATRIX（商標）は、あるポリペプチドがセルラーゼ活性を有し本発明の範囲内にあるかどうかを決定する方法に用いられ、また、セルラーゼ活性を有するペプチドを同定し単離するのに用いられる。
GIGAMATRIX（商標）プラットフォームは、従来の９６ウエルプレートの次元を有する１００，０００ウエルマイクロプレートに基づいたウルトラハイスループットスクリーニングを含むことができる。この実施例では、GIGAMATRIX（商標）スクリーニングを、ＣＢＨにより予め活性が示されていることに基づいて、２つの基質を使用して適用した。メチル−ウンベリフェリルセロビオシド（ＭＵＣ）及びメチルウンベリフェリルラクトシド（ＭＵＬ）を試験した。基質が細胞内に拡散し、蛍光がより容易に検出できると思われるので、ファージミド型の種々のクローンをスクリーニングした。ラクトシド基質に対する活性を減少させるため、ベータ−ガラクトシダーゼを欠いている宿主株を使用した。ラクトシド基質は、僅かなヒットしかもたらさず、セロビオース基質よりも特異的であることが認められた。加えて、ラクトシド基質は僅かなベータ−ガラクトシダーゼヒットしかもたらさなかった。これらの基質をスクリーニングに使用することの可能性を試験するために、１４個のライブラリーを、これらのライブラリーが以前のスクリーニングプログラムでエンドグルカナーゼヒットを生じたという事実に基づいて、スクリーニングのために選択した。スクリーニングしたライブラリーのうち、スクリーニングした１１個のライブラリーから合計５０個の一次ヒットがあった。二次スクリーニングは、クローンをアガープレートで平板培養し、次にコロニーを取り出して、培地及びＭＵＬを含有する３８４ウエルプレートに入れることから構成された。ＭＵＬに対して活性なクローンを不活性クローンのバックグラウンドと区別した。次に個別のクローンを一晩増殖させ、蛍光を測定し、最も活性なヒットを配列決定のために取り出した。
【０３８２】
ヒットからの全てのゲノムクローン挿入物を配列決定した。一般に、ヒットは、１、２、５、６、１０及び１６を含む幾つかの異なるグリコシルヒドロラーゼファミリーからであった。幾つかの他のヒットは、オープンリーディングフレームがあらゆる既知のグリコシルヒドロラーゼファミリーと相同ではない場合に発見された。加えて、幾つかのヒットは、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ遺伝子をコードしていた。
【０３８３】
表１．GIGAMATRIX（商標）ヒットの概要
2008538176.tif 000008
2008538176.tif 000009
2008538176.tif 000010
略語：ＣＢＭ−炭水化物結合モジュール
【０３８４】
酵素及び基質活性の特徴決定
GIGAMATRIX（商標）スクリーニングで発見された３９ヒット（上記の表１を参照すること）を、最初にセロヘキサオースに対してスクリーニングして、セルロースオリゴマーに対する作用パターンを決定した。ゲノムクローンは多数のオープンリーディングフレームを含むであろうＤＮＡ挿入物全体を有するクローンとして定義される。例えば、上記の表１において、そのようなゲノムクローンの一つは酵素番号２２及び２２ａと注釈が付けられている２つのオープンリーディングフレームを含み、前記のオープンリーディングフレームは、それぞれ配列番号３７及び配列番号３５と示されている配列を有する。別のそのようなゲノムクローンは３つのオープンリーディングフレームを含み、酵素２７、２７ａ及び２７ｂと注釈が付けられている。サブクローンはゲノムクローンに由来し、単一のオープンリーディングフレームのみを含み得る。ゲノムクローンを抗体を含有するＴＢ培地で一晩増殖し、細胞を溶解し、溶解産物を遠心分離により清澄にした。サブクローンをＯＤ６００＝０．５に増殖し、適切なインデューサーで誘導し、次に更に３時間増殖させてから、細胞を溶解し、溶解産物を清澄にした。ゲノムクローンは、一般にサブクローンよりも活性が低いであろうが、広範囲のクローンで活性を評価するより容易な方法である。初期の研究は、通常２４時間実施される終点反応で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して実施した。また酵素を、酸処理による膨張でより無定形になった結晶質セルロースであるリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）に対して試験した。
【０３８５】
環境ライブラリーからクローン化された多数のセルラーゼは、ＰＡＳＣに対して活性であったが、セルトリオース及び／又はグルコースだけでなくセロビオースを放出した。GIGAMATRIX（商標）発見作業からのゲノムクローンも、ＰＡＳＣ及びセロヘキサオース（生化学, 日本）のようなセルロース基質に対して試験した。図６及び７で示されているように、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）実験は幾つかのゲノムクローンがセロヘキサオースを加水分解できることを示した。これらのクローンのうち多くのものは最終生成物としてグルコースを生成することができ、このことは、これらがベータ−グルコシダーゼを含むグリコシルヒドロラーゼファミリー１と配列同一性を有するという事実と一致している。幾つかの酵素はセロビオース及び／又は大型のフラグメントを産生するが、産生パターンの正確な特性はＴＬＣ実験からは識別することができず、したがってキャピラリー電気泳動（ＣＥ）方法を開発した。
【０３８６】
実施例２：キャピラリー電気泳動
幾つかの態様において、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は酵素活性をスクリーニングするアッセイで使用され、例えばＣＥは、ポリペプチドがセルラーゼ活性を有し、本発明の範囲内であるかを決定する方法、又はセルラーゼ活性を有するポリペプチドを同定及び単離する方法で使用される。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、より速い作動時間及びより大きいアッセイ感度という利点を提供する。ＣＥ方法は、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）を蛍光体として使用し、糖及び糖オリゴマーと共に使用して最適化された（Guttman (1996) High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Anal. Biochem 233:234-242）。セロヘキサオースに対して活性であることを示した酵素を、リン酸膨張セルロース、並びにセロヘキサオースでの試験に付した。遺伝子をサブクローニングし、発現させ、ニッケルキレートカラムを使用して精製した。酵素を基質と共に１時間インキュベートし、生成物を１０cm〜４８cmのキャピラリーを使用して分析した。セロヘキサオースを、１０及び４８cmのキャピラリーでそれぞれ２及び９分間溶離した。４８cmのキャピラリーは、糖の量が低い場合又は混合物に汚染物が存在する場合に生成物のより良好な分離を提供した。ＣＥ方法をＴＬＣ検出によってセロヘキサオースに対する良好な活性を示したGIGAMATRIX（商標）発見からの酵素についての研究に適用した。
【０３８７】
酵素２２／２２ａ（上記の表１を参照）は、ＰＡＳＣに対して良好な機能を示し（データは図８にグラフの形態でまとめられている）、主にセロビオースを遊離する。加えて、酵素２２／２２ａは、AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）（FMC Corporation, Philadelphia, PA）（データは図９にグラフの形態でまとめられている）からセロビオースを遊離することができた。配列分析により、酵素２２及び２１は、約９２％同一であり、グリコシルヒドロラーゼファミリー５に属することが示された。ファミリー５は、主にエンドグルカナーゼを含むが、セロビオヒドロラーゼの例も存在する。クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）のＣｅｌＯは、非晶質及び結晶質セルロースからセロビオースしか遊離しない活性に基づいて、セロビオヒドロラーゼとして特徴決定された（Zverlov (2002) A newly described cellulosomal cellobiohydrolase, CelO, from Clostridium thermocellum: investigation of the exo-mode of hydrolysis, and binding capacity to crystalline cellulose. Microbiology 148:247-255）。
これら３つの酵素は、全て、アシドテルムス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）のエンドグルカナーゼと比較すると、基質結合部位に近接した挿入を有する。この挿入は、基質結合部位を含むループを形成することができ、それによりこの酵素をエンドグルカナーゼからセロビオヒドロラーゼに変換しているのであろう。これらの酵素をセロヘキサオースに対して試験したとき、これらは、少量のセロトリオースを伴って、主にセロビオースを産生した。これらの結果は、セロビオヒドラーゼが、セロビオースとセロトリオースの両方を産生する能力を有するという事実によって説明される（Harjunpaa (1996) Cello-oligosaccharide hydrolysis by cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Association and rate constants derived from an analysis of progress curves. Eur. J Biochem 240:584-591）。 
【０３８８】
実施例３：配列に基づいた発見
本発明は、本発明の配列を使用して、セルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼを同定及び単離する方法を提供する。一つの例示的な方法において、セロビオヒドロラーゼを含む３つのリコシルヒドロラーゼファミリーの保存領域に相同性であるプライマーを使用して、ポリヌクレオチドライブラリー又は真菌試料由来のＤＮＡのいずれかをスクリーニングした。プライマーをファミリー４８の保存領域に対して設計し、９６個のライブラリーをスクリーニングして、１つのヒットを確認した。加えて、プライマーをファミリー６及びファミリー７に対して設計した。真菌ライブラリーをこれらのプライマーでスクリーニングして、ファミリー６で１ヒット、ファミリー７で５６ヒットを得た。ファミリー７のうちの一つを研究用に選択して、配列の完全長を抽出した。完全長配列を成功裏に得て、これはPenicillium janthinellumのエキソ−セロビオヒドロラーゼＩと７３％の同一性を示した。
【０３８９】
実施例４：セロビオヒドロラーゼ活性を有する酵素の遺伝子操作
この実施例は、本発明の例示的な酵素の遺伝子操作を記載した。この酵素を、バイオマスの燃料及び化学物質への変換において、並びに石油系生成物に対する有効で持続可能な代替物を作製するために使用できる。この酵素を、天然のバイオマス変換に関わる化学サイクルに参加するため、生物体（例えば、細菌のような微生物）で発現させることができる。一つの特徴において、この酵素は、セルロース及びヘミセルロースポリマーを代謝可能な炭素分子へ有効に脱重合するために「酵素集合物（アンサンブル）」として使用される。上記で考察したように、本発明は、これらの重要な新たな「バイオマス変換」及び代替エネルギーの産業プロセスを可能にする、最も効果的な酵素を発見及び適用する方法を提供する。
米国特許第６，９３９，６８９号に記載されているメタゲノム発見及び定方向進化の非確率論的方法（「DIRECTEVOLUTION（登録商標）」と呼ばれる）を使用する。これらには遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）（上記で考察されており、米国特許第６，１７１，８２０号及び同第６，５７９，２５８号も参照すること）及び可変遺伝子再アッセンブリ（ＴＧＲ）（例えば、米国特許第６，５３７，７７６号を参照すること）技術が含まれる。この作業は、セルロースがグルコース、セロビオヒドロラーゼに還元するために重要な酵素成分を発見し、最適化することに集中していた。
【０３９０】
酵素発見スリーニングを、Diversa CorporationのGIGAMATRIX（商標）ハイスループット発現スクリーニングプラットフォーム（上記で考察した）を使用して適用し、基質としてメチルウンベリフェリルセロビオシドを用いてセロビオヒドロラーゼを同定した。合計１００個の複合環境ライブラリーをスクリーニングして、主にグリコシルヒドロラーゼファミリー５及び１０からの２５個の確認されたセロビオヒドロラーゼヒットを得た。これらのヒットを、AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）（FMC Corporation, Philadelphia, PA）に対する活性について特徴決定した。この性能特性に基づいて、１つの酵素配列番号１６２（例えば配列番号１６１でコードされている）を、遺伝子部位飽和変異導入（ＧＳＳＭ）技術を使用して、最適化のための酵素として選択した。しかし、ＧＳＳＭ進化を実施する前に、シグナル配列（アミノ酸１〜３０）を配列番号１６２から除去し、開始メチオニンを付加した。本明細書以降で「野生型」と呼び、配列番号１６４（例えば配列番号１６３でコードされている）で表されるシグナルのない配列を親配列とし、ＧＳＳＭ技術を使用して最適化した。上記で考察したように、ＧＳＳＭ技術は、タンパク質中の全てのアミノ酸を迅速に１９個の他のアミノ酸に連続的に突然異変させることができる。変種を、繊維系アッセイを使用してスクリーニングし、単一のアミノ酸変化を表す潜在的な上方変異体（upmutant）を同定した。これらの上方変異体を合わせて、上方変異体の組合せを表す新たなライブラリーとした。このライブラリーをスクリーニングし、商業化のために幾つかの候補酵素を同定した。
【０３９１】
研究の概要
GIGAMATRIX（商標）スクリーニング
GIGAMATRIX（商標）スクリーニングプラットフォームは、従来の９６ウエルプレートの大きさを有する１００，０００ウエルマイクロプレートに基づいたウルトラハイスループット方法である（詳細はフェーズＩＩ出願を参照すること）。スクリーニングは蛍光基質を用いて行う。ＧＭｘスクリーニングを、以前にセルラーゼで活性を示したことに基づいて２つの基質を使用して適用した。メチルウンベリフェリルセロビオシド（ＭＵＣ）をスクリーニング基質として使用した。加えて、レソルフィン−ベータ−グルコピラノシドもスクリーニングに含めて、両方の基質に活性を有し、かつベータ−グルコシダーゼであると推定されるクローンを排除した。 
増幅されたファージ又はファージミド型の標的ライブラリーをスクリーニングした。ベータ−グルコシダーゼ遺伝子を欠いている２つの宿主株（ＣＥＨ６及びＧＡＬ６３１）を使用して、基質に対する内在性宿主活性を減少させた。１００個のライブラリーを、これらのライブラリーが以前のスクリーニングプログラムでセルラーゼヒットを生じたという事実に基づいて、スクリーニングのために選択した。スクリーニングしたライブラリーのうち、スクリーニングした６９個のライブラリーから合計３５５個の主要なヒットがあった。 
【０３９２】
二次スクリーニングは、クローンをアガープレートで平板培養し、次にコロニーを取り出して、培地及びメチルウンベリフェリルセロビオシド（ＭＵＣ）を含有する３８４ウエルプレートに入れることから構成され、「ブレイクアウト（breakout）」と名付けた。図１０は、典型的なGIGAMATRIX（商標）（GMx）ブレイクアウトを示すデータをグラフの形態で示す。このデータを生成するために、ＭＵＣに対して活性な（すなわち、メチルウンベリフェリルセロビオシドを加水分解できる）クローンを、不活性クローンのバックグラウンドと区別した。次に個別のクローンを一晩増殖し、蛍光を測定し、最も活性なヒットを配列決定のために取り出した。図１０では、Ｘ軸は、試料の名称を示し、Ｙ軸は相対的蛍光単位である。陽性の「ヒット」をアガープレート上に置き、次にコロニーを取り出して、ＬＢ＋抗体と５０μMのＭＵＣを含有する３８６ウエルプレートに入れ、一晩増殖した。
【０３９３】
表２．GIGAMATRIX（商標）（GMx）ヒットの概要
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【０３９４】
ヒットからの全てのゲノムクローン挿入物を配列決定した。上記の表１のように、同じゲノムクローンが１つ以上のオープンリーディングフレームを含んだ。例えば、そのようなゲノムクローンの一つが、酵素番号Ｈ８及びＨ８ａと注釈が付けられている２つのオープンリーディングフレームを含み、前記のオープンリーディングフレームは、それぞれ配列番号６７及び配列番号６９と示されている配列を有する。スクリーニングされた１７個のライブラリーから合計２５個のグリコシルヒドロラーゼヒットがあった。一般に、ヒットは、５及び１０を含む幾つかの異なるグリコシルヒドロラーゼファミリーからであった。表２（上記）は、ヒット及び／又はその実体を提示している。幾つかの他のヒットが発見され、それらのオープンリーディングフレームは既知のいずれのグリコシルヒドロラーゼファミリーとも相同ではなかった。加えて、幾つかのヒットはＧＴＰシクロヒドロラーゼ遺伝子をコードしていたが、これは基質の分解にかかわらず蛍光を発するのでこの系において偽陽性であることが知られている。総体的に、スクリーニングはＭＵＣに対して活性であった酵素を同定することに成功した。
【０３９５】
特徴決定
GIGAMATRIX（商標）スクリーニングで発見された遺伝子を配列決定して、データを分析した。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ソフトウエアシステムを使用して注釈を付けた。Ｃ末端ＨｉｓタグをコードするＤＮＡを導入してＯＲＦを適切なベクターにサブクローニングした。構築ＤＮＡで適切なE. coli宿主を形質転換し、特徴決定研究のために発現させた。遺伝子生成物をリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）に対してスクリーニングした。ＰＡＳＣは酸処理による膨張でより無定形になった結晶質セルロースである。ＰＡＳＣはAVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）から調製した。サブクローンを増殖させ、発現させ、溶解した。溶解物をＰＡＳＣと共にインキュベートし、反応生成物をビシンコニン酸（ＢＣＡ）還元糖アッセイを使用して分析した。最も活性なサブクローンを大規模増殖及び精製のために選択した。これらのサブクローンの特異的活性をＰＡＳＣに対して決定した。
サブクローンをキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によっても分析した。溶解物を基質と共に３０時間インキュベートした。反応生成物を蛍光体１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）により誘導体化した。この生成物を４８cmのキャピラリーを使用して分析した。セロビオースが６分間で溶離した。図１１はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析によりＰＡＳＣに対する選択された酵素の活性を示すデータをグラフ形態で示している。試料Ｈ９〜Ｈ１は個別のクローンである。図１１では、多数の試料が進化した酵素の代表的な反応生成物特性を有した。この進化酵素は、セロビオース／（グルコース＋セロトリオース）≧１０の比率を有すると定義される。最も活性な２つの強力な進化酵素は、ＰＡＳＣに対する比活性がそれぞれ０．３５及び０．０４Ｕ／mgであった。
【０３９６】
ピキア（Pichia）における真菌ＣＢＨ
新たに発見されたファミリー６及び７の真菌セロビオヒドロラーゼの遺伝子でP.パストリス（P. pastoris）を形質転換し、形質転換体を固体アガープレートに広げた。１６０個のコロニーをそれぞれの構築物のために選択した。試料を増殖及び誘導し、上澄みをＰＡＳＣと共にβ−グルコシダーゼの存在下でインキュベートした。反応生成物を、グルコース−オキシダーゼアッセイを使用して分析した。グリコシルヒドロラーゼファミリー６のセロビオヒドロラーゼは、P. pastorisで成功裏に異種発現された。
【０３９７】
エキソ−エンド作用セルラーゼ
野生型酵素である、酵素スクリーニングで発見されたファミリー９のグリコシルヒドロラーゼは、テルモノスポラ・フスカ（Thermomonospora fusca）Ｅ４と相同性である。Ｅ４は、エンド活性とエキソ活性の両方を有することが示されている。野生型酵素の初期試験は、それがＰＡＳＣとAVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）の両方に活性であることを示した。反応生成物のＨＰＬＣ分析は、主要な生成物がグルコース及びセロビオースであることを示した。野生型酵素はマルチドメインタンパク質であり、グリコシルヒドロラーゼファミリー９触媒ドメイン、ファミリー３セルロース結合ドメイン及び細胞付着に関連していると思われる３つの細菌Ｉｇ様ドメインを含む。野生型酵素の３つの追加的なサブクローン変種を試験して、活性に対するドメインの効果を決定した。野生型酵素を、１）触媒ドメイン単独（ＣＤ）、２）触媒ドメイン及び炭水化物ドメイン（ＣＣＤ）、並びに３）触媒ドメイン及び炭水化物結合ドメイン＋１１個の下流アミノ酸（ＣＣＤ＋１１）を用いてサブクローン化した。完全長タンパク質及び３個のサブクローン変異体を、VICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）でアッセイし、反応生成物をＢＣＡ還元糖アッセイにより分析し、データを図１２においてグラフの形態でまとめた。図１２に示されたデータは、AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）と共に３７℃、ｐＨ５で７４時間インキュベートした、野生型酵素及び切断変異体のＢＣＡにより生成した。ＣＢＨ１は陽性対照である。陰性対照は挿入物のない宿主である。
野生型酵素である完全長タンパク質（例えば配列番号１６３でコードされている配列番号１６４）が最も活性であった。完全長タンパク質をＧＳＳＭ進化のために選択した。触媒及び炭水化物結合ドメインを進化させた。
【０３９８】
ＧＳＳＭスクリーニング
ＧＳＳＭ技術（上記で考察された）を使用して、標的タンパク質の触媒及び炭水化物結合ドメインの核酸を１９個の他のアミノ酸に迅速及び連続的に変異させた。ＧＳＳＭスクリーニングの目標は、不溶性微晶質セルロースの加水分解の程度を増大する変異体を同定することであった。ＧＳＳＭスクリーニングプロセスを促進するためにロボットを使用したスクリーニングの方法が開発された。
変異構築物からのＤＮＡでＤＨ１０ｂ宿主細胞を形質転換した。個別のコロニーを取り出して、自動コロニー取り出しシステムを使用して１５０uLのＬＢ／アンピシリンを含有する９６ウエルプレート（浅い）に入れた。プレートを３７℃、４００rpmで２４時間インキュベートした。１５uLの培養をそれぞれのウエルから誘導プレートに移した。誘導プレートの各ウエルは、１３５uLのＬＢ／アンピシリンと１．１mMのＩＰＴＧを含有した。誘導プレートを３７℃、４００rpmで２４時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、上澄みを廃棄した。
この時点でアッセイの自動化部分を開始した。ロボットにより、細胞を溶解して再懸濁した。１５０uLの溶解緩衝液（１２５uLの水＋０．２mg/mlリゾチーム及び２０単位/ml  ＤＮａｓｅＩを含有する２５uLのＢＰＥＲ）をそれぞれのウエルに加えた。１５uLの溶解物をそれぞれのウエルから反応プレートに移した。反応プレートの各ウエルは、１８５uLの反応混合物（１％AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）、５０mM酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）を含有させた。反応プレートを、９５％湿度、３７℃で３０時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを遠心分離し、１５uLの上澄みをＢＣＡプレートに移した。ＢＣＡプレートは、１ウエルあたり、５０uLの試薬Ａ、５０uLの試薬Ｂ及び８０uLの４００mM炭酸緩衝液をｐＨ１０で含有させた。プレートをゴム製のシール材で覆い、８０℃で３０分間インキュベートし、次に遠心分離により冷却し、吸光度をＡ５６０で読み取った。
【０３９９】
結果
少なくとも８０個のランダム変異コロニーを、それぞれのアミノ酸部位でスクリーニングした。一次ＧＳＳＭ（商標）スクリーニングデータの例が、図１３でグラフにより示されている。カラム６は野生型試料を含み、カラム１２は宿主／ベクター陰性対照を含んだ。AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）と共に３０時間インキュベートした後、野生型試料から生成されたシグナルは、およそ０．５３であり、標準偏差は０．０７であった。陰性対照は平均シグナルの０．２９を有した。陽性対照の平均＋２x標準偏差よりも高いシグナルを有する試料は、主要なヒットとみなした。このスクリーニングプレートから約１０個の主要なヒットを二次確認スクリーニングのために選択した。
主要なヒットを二次アッセイで再確認した。このアッセイは一次スクリーニングと同一であった。しかし試料を四重にアッセイした。二次ＧＳＳＭスクリーニングデータの例が、図１４でグラフにより示されている。ウエル中の試料Ｅ３−Ｈ３、Ａ４−Ｄ４、Ａ７−Ｄ７は、平均して、野生型よりも高い活性を有した。試料を四重にアッセイしたので、これらの１２個のウエルは３つのヒットに相当する。これらの試料は、図１３のウエルＥ４、Ｇ２及びＨ３で示される主要なヒットであった（プレート２９８０５−ＡＡ８９ＢＣＡプレート）。
二次スクリーニングからは７７個のヒットがあった。これらの試料を四重に実施した。３５個の試料ではアミノ酸の変化があり、２２個は、トランスポゾンの挿入があり、残りは野生型であるか又は欠失があった。 
二次スクリーニングからのヒットを更に分析した。ＧＳＳＭ上方変異体をT. fuscaＥ４の結晶構造上にマッピングした。試料に、アミノ酸の位置、アミノ酸の変化及び改善スコア倍数に基づいて優先順位をつけた。８個の上方変異体を、ＧＳＳＭスクリーニングから選択し、遺伝子再アッセンブリ進化、すなわち上記で考察した可変遺伝子再アッセンブリ（ＴＧＲ）（米国特許第６，５３７，７７６号も参照すること）のために選択した。
【０４００】
表２．部位特異的変異導入再集合のために選択された上方変異体
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【０４０１】
上方変異体のブレンド
遺伝子再集合（可変遺伝子再アッセンブリ（ＴＧＲ））技術を使用して、上記の表２で示されている上方変異体をブレンドして、最良の活性を有する候補を同定した。活性アッセイは、野生型酵素に対して上方変異体の活性を増加するように反応を更に稀釈した以外は、ＧＳＳＭスクリーニングと同一であった。図１５は、混合又は「ブレンド」ＧＳＳＭ（商標）スクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【０４０２】
まとめると、本発明は、配列番号１６４（例えば配列番号１６３でコードされている）に基づいた以下の配列を有するセルラーゼ活性を有する酵素を提供する。
【０４０３】
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【０４０４】
本発明の多数の態様を記載してきた。それにもかかわらず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく多様な変更を行えることが理解される。したがって、他の態様も請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０４０５】
【図１】コンピュータシステムのブロック図である。
【図２】新規なヌクレオチド又はタンパク質配列とデータベースの配列を比較し、新規配列とデータベース配列との間の相同性を決定する方法の一つの態様を示す流れ図である。
【図３】２つの配列が相同であるかを決定するためのコンピュータ処理の一つの態様を示す流れ図である
【図４】配列中に特徴が存在するかを検出するためのアイデンティファイヤ−プロセス３００の一つの態様を示す流れ図である。
【図５】セロビオースの構造を示す。
【図６】実施例１で詳細に考察されている、セロヘキサオースからの反応生成物のＴＬＣ分析の結果を示す。
【図７】実施例１で詳細に考察されている、セロヘキサオースからの反応生成物のＴＬＣ分析の結果を示す。
【図８】実施例２で詳細に考察されている、本発明の例示的な酵素２２／２２ａ（ＣＨＢ）によるＰＡＳＣからのセロビオースの放出を示すデータをグラフの形態で示す。
【図９】実施例２で詳細に考察されている、本発明の例示的な酵素２２／２２ａ（ＣＨＢ）によるＡＶＩＣＥＬ（商標）ＭＣＣからのセロビオースの放出を示すデータをグラフの形態で示す。
【図１０】典型的なGIGAMATRIX（商標）ブレイクアウトを示すデータをグラフの形態で示す。実施例４で詳細に考察されているように、メチルウンベリフェリルセロビオシドを加水分解できる酵素を発現する活性クローンが同定される。
【図１１】実施例４で詳細に考察されている、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析によるリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）に対する選択された酵素の活性を示すデータをグラフの形態で示す。
【図１２】AVICEL（登録商標）微晶質セルロース（ＭＣＣ）における本発明の例示的な酵素及びサブクローン変異体のアッセイからのデータをグラフの形態で示す。実施例４で詳細に考察されているように、反応生成物はＢＣＡ還元糖アッセイにより分析された。
【図１３】実施例４で詳細に考察されている、一次ＧＳＳＭスクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【図１４】実施例４で詳細に考察されている、二次ＧＳＳＭスクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【図１５】実施例４で詳細に考察されている、混合又は「ブレンド」ＧＳＳＭスクリーニングアッセイからのデータをグラフの形態で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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