(57)【要約】  本発明は、ウイルス回復培地及びウイルス回復培地を具えるウイルス診断キットに関する。このウイルス回復培地は、ホルモンと酵素とが補充される。このホルモンは、好ましくは、グルココルチコイドホルモン、より好ましくはデキサメタゾンである。この酵素は、好ましくはプロテアーゼ、より好ましくはトリプシンである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一のホルモンと、少なくとも一の酵素を補充した細胞培地を具えることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項２】
請求項１に記載のウイルス回復培地において、前記ホルモンが、グルココルチコイドホルモンであることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項３】
請求項２に記載のウイルス回復培地において、前記ホルモンが、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベータメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）、及びアルドステロンから選択されることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項４】
請求項３に記載のウイルス回復培地において、前記ホルモンが、デキサメタゾンであることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項５】
請求項１に記載のウイルス回復培地において、前記酵素が、セリン又はアスパラギン酸プロテアーゼであることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項６】
請求項５に記載のウイルス回復培地において、前記酵素が、トリプシン、キモトリプシン及びペプシンから選択されることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項７】
請求項６に記載のウイルス回復培地において、前記酵素が、トリプシンであることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項８】
請求項１に記載のウイルス回復培地において、前記酵素が、１から５μｇ／ｍＬの範囲の量で、特に２．５μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項９】
請求項１に記載のウイルス回復培地において、前記ホルモンが、１０−４から１０−６Ｍの濃度で、特に約１０−５Ｍの濃度で存在することを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項１０】
ウイルス検出方法において：
（ｉ）    ウイルス接種に好適な細胞株を提供するステップと；
（ｉｉ）  試料に特定の前処理を行って、検出するウイルスを潜在的に含むサンプルを得るステップと；
（ｉｉｉ）検出するウイルスを潜在的に含む試料を細胞に接種するステップと；
（ｉｖ）  前記接種した細胞をインキュベートするステップと；
（ｖ）    前記サンプル培地を少なくとも一のホルモンと、少なくとも一の酵素を補充した細胞培地を具えるウイルス回復培地と交換するステップと；
（ｖｉ）  （ｉｖ）で得た前記サンプルをインキュベートするステップと；
（ｖｉｉ）前記ウイルスを検出するステップと；
を具えることを特徴とするウイルス検出方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記ホルモンが、グルココルチコイドホルモンであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記ホルモンが、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベータメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）、及びアルドステロンから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記ホルモンが、デキサメタゾンであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法において、前記酵素が、セリン又はアスパラギン酸プロテアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のウイルス回復培地において、前記酵素が、トリプシン、キモトリプシン、及びペプシンから選択されることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項１６】
請求項１５に記載のウイルス回復培地において、前記酵素が、トリプシンであることを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項１７】
請求項１０に記載のウイルス回復培地において、前記酵素が、１から５μｇ／ｍＬの範囲の量で、特に２．５μｇ／ｍＬの量で存在することを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項１８】
請求項１０に記載のウイルス回復培地において、前記ホルモンが、１０−４から１０−６Ｍの濃度で、特に約１０−５Ｍの濃度で存在することを特徴とするウイルス回復培地。
【請求項１９】
ウイルス診断キットにおいて：
（ｉ）  少なくとも一のホルモンと、少なくとも一の酵素を補充した細胞培地を具えるウイルス回復培地と；
（ｉｉ）マイクロ滴定トレイアセンブリと；
を具えることを特徴とするウイルス診断キット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のウイルス診断キットにおいて、前記マイクロ滴定トレイアセンブリが、複数の相互接続しているが、取り外し可能なマイクロ滴定トレイを具えることを特徴とするウイルス診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ウイルス回復培地、その使用、及びウイルス回復培地を具えるウイルス診断キットに関する。より具体的には、本発明は、デキサメタゾン等のホルモン、及びトリプシン等の酵素を投与したウイルス回復培地に関する。
【０００２】
ウイルスを同定する従来の診断手順は、ある種のウイルスに対する感受性について選択された特定の細胞株を有するコンテナに播種するステップと、次いで、ウイルスを含有すると推定される生物学的サンプルを細胞培地に接種するステップとを含む。このような生物学的サンプルには、特に、唾液、尿、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ）、呼吸流体、及び口、鼻腔、喉、肌、及び性器等からのぬぐい液が挙げられる。次いで、接種した細胞培地をインキュベートし、ウイルスによって誘発された細胞変性効果について、細胞を検査する。ある種のウイルスは、ある種の細胞でのみ成長するので、細胞変性効果（ＣＰＥ）を誘発する、或いは、細胞変性効果を誘発しない細胞型に基づいて、ウイルスを同定することができる。
【０００３】
ウイルス調製液を接種した細胞を除去するステップと、この細胞をトリプシン処理するステップと、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）分子等のレポータ分子で標識されたウイルス誘発ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体によってウイルスを検出するステップと、を含むこの手順に対する多数の代替のプロトコルがある。更なる代替は、細胞の回復を促進するために、培養チューブ内にカバースリップを具えることである。
【０００４】
従来のチューブ（又は、伝統的には−ドラム）法は、適切な細胞株を播種したスクリューキャップチューブを用いる。約８０％の細胞密度に到達後、チューブに適切な試料が接種され、最大３週間、ＣＰＥについてモニタする。第１週は、ＣＰＥを毎日モニタする必要がある。第２週及び第３週はモニタ頻度を少なくする必要がある。多くの場合、ウイルス回復を促進するために、盲目継代が必要とされる。
【０００５】
従来のチューブ法の一つの欠点は、チューブを毎日モニタする必要があるので、時間及び労働集約的であることである。一般的に、２人の人が、光学顕微鏡によって、ＣＰＥに関して同じチューブを検査して、主観を避けるようにしている。加えて、全てのウイルスが、目で見えるＣＰＥを生じるとは限らず、これらのウイルスは、この方法によって検出されることができない。更に、従来のチューブ法でモニタされるＣＰＥ形成は、細胞株の感受性及び可視ＣＰＥを生成するウイルスの能力に高く依存している。また、試料の毒性は、不都合にも、誤った結果を与えるウイルスＣＰＥに類似した変化を生成することがある。また、いくつかのウイルスは、長期間経過後にのみＣＰＥを生成する（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））。従って、従来のチューブ法によって得られる結果は、主にＣＰＥ検出を基礎としており、別の方法によってルーチン的に確かめられないので、不正確な診断が生じることがある。
【０００６】
従来のチューブ法を用いては、結果としてチューブが溜まってしまうため、試料当たり２又は３以上のチューブを用いることも事実上不可能である（第１週だけで、１日当たり４０の試料で５００のチューブができる）。
【０００７】
シェルバイアル法は、当業者がウイルス回復に用いている、現在最も進んだ方法である。このシェルバイアル法は、半透明のふたが付いた５ｍｌのプラスチックバイアル（直径１６ｍｍ）を用いる。適切な処理に続いて、円形（１３ｍｍ）のカバースリップがバイアル内に挿入される。このバイアルに感受性細胞株が接種され、この株が、カバースリップ上で単一層に育つ。この単一層の密集度が、８０−９０％に達すると、この培地を廃棄して、バイアルに、患者の試料を接種する。次いで、インキュベートしたバイアルを、ＣＰＥについてモニタし、次いで、カバースリップを除去する。次いで、このスリップを、顕微鏡スライドに固定して、モノクローナル抗体によって染色することができる。
【０００８】
シェルバイアル法の利点は、播種後遠心分離にかけることによって、ウイルス回復が促進されることである。早ければ２−３日で結果を得るのにかかる時間を短縮することができる。更に、このシェルバイアル法を用いると、可視ＣＰＥを待つ必要がない。カバースリップを第２日目、第３日目で除去して、結果、適当なモノクローナル抗体（特異的ＣＰＥ）を染色することができ、抗体−抗原染色を用いることによって確認できる。
【０００９】
しかし、このシェルバイアル法も多数の欠点を有している。カバースリップが、特定の処理：洗剤とアセトンで複数回洗浄した後、蒸留水での洗浄及び殺菌を必要とするので、時間がかかる。また、カバースリップを、バイアルに手動で挿入しなければならない。
【００１０】
シェルバイアル法のもう１つの欠点は、従来のチューブ法のように、ＣＰＥについて毎日観察することが必要なことである。更に、免疫蛍光染色が必要である場合、必要な手順は複雑で時間がかかる。シェルバイアル由来の培地は廃棄しなければならず、カバースリップは（特定の鉗子を用いて）手動で除去し、気燥して、顕微鏡スライドに（真空グリースを用いて）固定する。カバースリップは雑な取扱によって破壊されたり、或いは、非意図的に回転して、単一層を有する顕微鏡スライドに逆さまに取り付けられることがあるので、カバースリップの除去は面倒である。もう１つの複雑さは、カバースリップの底で成長し、従ってバイアルに固定している播種した細胞に起因して起こる。このようなカバースリップの除去は、非常に手間がかかる。
【００１１】
実際、チューブが蓄積するため、このシェルバイアル法を用いて、試料毎に２又は３以上のチューブを用いることは不可能である（１日当たり４０の試料で、１週間当たり５００のシェルバイアルができる）。更に、円形の１３ｍｍのカバースリップをカバーするためには、免疫蛍光染色に大量のモノクローナル抗体を必要とする。
【００１２】
９６ウエルプレート法は、同じ細胞株で増殖する複数のウイルス（例えば、ウエルをパラインフルエンザのＬＬＣ−ＭＫ２細胞株回復で播種され、インフルエンザウイルスの播種も可能である場合）の回復用の限定したケースでのみ用いられる別の方法である。モノクローナル抗体は、９６ウエルプレートと共に診断に用いられる。
【００１３】
この方法は、細胞株を用いて播種した場合、サンプルが比較的容易に操作でき：多数の試料を、同じプレート上に接種することができ；遠心分離による促進が可能であり；少量の培地を必要とするのみであり（シェルバイアルで用いられる１−１．５ｍＬの代わりに０．２ｍＬのみ）；結果の確認に抗原−抗体技術を用いることができ；この方法は、ＣＰＥのモニタを「読む」ことが容易である：という利点がある。
【００１４】
しかし、９６ウエルプレート法は、一般的に実用的ではない抗原−抗体検出に全体のプレートを用いる必要がある。また、試料数がプレート全体に必要な数よりも少ない場合でさえ、全プレートを同日に用いなければならない。これは、毎日、別の新しいプレートセットを用いられなければならないことを意味している。更に、一般的に、１つ又は２つの異なる細胞株を、プレート毎に用いることができるだけである（同じタイプの試料をこのプレート上に播種する）。このように、ウイルスの検出を確認する方法を、全プレート上で同時に行わなければならない。これは、検出が完了すると、誤りがある場合、又はインキュベート時間が長引いた後に、繰り返しの手順に利用できる残りの細胞がないという状況となり、不利である。
【００１５】
上記の方法では、使用される細胞培地に、しばしば改良したウイルス回復を可能にする添加剤が投与される。ホルモンと酵素の双方を投与した細胞培地が、細胞株の感受性を最大に維持し、細胞壁へのウイルスの付着、及びいくつかのケースでは、結果を得るのにかかる時間の低減を助けることによってウイルス回復を有利に最適化することを、本発明者が発見した。これは、以下に記載されているように、細胞培養に好適な全てのウイルスの回復に有利に用いられることができる本発明のウイルス回復培地につながっている。
【００１６】
本発明はまた、公知のマイクロ滴定トレイアッセンブリの欠点を多少なりとも解決し、好ましくは、実施する特定の診断に応じて、容易に変更される強化したウイルス回復を提供する、迅速で、効率的かつ安価な手段を容易にするキットを提供することを目的とする。また、本発明は、本発明のウイルス回復培地を用いたウイルス検出方法に関する。有利なことに、本発明は、今まで知られていなかった使用の選択枝の融通性を提供する。
【００１７】
従って、本発明は、少なくとも一のホルモンと少なくとも一の酵素を添加した細胞培地を含むウイルス回復培地を提供する。
【００１８】
本明細書で用いられているように、用語「ウイルス回復培地」、又は「複数のウイルス回復培地」は、ウイルス増殖及び単離に用いられる培地又は複数の培地をいう。例えば、ウイルス回復培地は、維持培地を含む。
【００１９】
細胞培地に加える酵素は、特に限定されないが、当業者は好適な酵素を同定できる。いくつかの実施例では、用語「酵素」は、タンパク質分解酵素をいう。これらの実施例では、この酵素は、好ましくは、セリン又はアスパラギン酸プロテアーゼである。例示の酵素は、トリプシン、キモトリプシン、又はペプシンを含む。好ましい実施例では、この酵素はトリプシンである。
【００２０】
細胞培地に加えるホルモンは、特に限定されないが、当業者は好適なホルモンを同定できる。いくつかの実施例では、用語「ホルモン」は、副腎皮質ステロイド、好ましくはグルココルチコイドをいう。より好ましくは、このホルモンは、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベータメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）、及びアルドステロンから選択される。好ましい実施例では、このホルモンは、デキサメタゾンである。このホルモンは、合成されたものでも天然に産出するものでも良い。
【００２１】
ホルモンと酵素の組み合わせは、最も好ましい実施例であるが、代替的に、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とＤＥＡＥ（デキストラン）も有用であることが分かっている。
【００２２】
培地に加える酵素の量は、好ましくは、１−５μｇ／ｍｌの範囲内であり、好ましくは、約２．５μｇ／ｍｌである。培地中のホルモンの濃度は、好ましくは１０−４Ｍ−１０−６Ｍの範囲内であり、好ましくは、約１０−５Ｍである。しかし、好ましいデキサメタゾンとトリプシンの場合、約１０−５Ｍの濃度で約２．５μｇ／ｍｌのトリプシンとデキサメタゾンを補充した細胞培地が、最適な結果を与えることが分かった。
【００２３】
従って、本発明の特定の実施例は、約１０−５Ｍの濃度で２．５μｇ／ｍｌのトリプシンとデキサメタゾンを補充した細胞培地を具えるウイルス回復培地を提供する。
【００２４】
本発明によって用いられる細胞培地は、特に限定されない。例えば、これらは、培地−１９９、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０又はＭＥＭ−ＥＡＧＬＥを含んでいてもよい。しかし、既に認識されているように、細胞の増殖を支持し、当業者が容易に利用可能である幅広い種類の様々な培地がある。しかし、好ましい実施例によれば、細胞培地は、ＭＥＭ−ＥＡＧＬＥである。
【００２５】
細胞培地には、細胞とウイルスの増殖を支持する添加剤が補充され、このような添加剤は、当業者に公知である。特定の細胞株及び／又はウイルスは、最適な増殖及び生存率のために特定の添加剤が必要であることが知られている。例示的添加剤は、Ｌ−グルタミン酸、アミノ酸、抗生物質、血清、ハンクス平衡塩、Ｄ−グルコースのような糖類、無機塩類、ビタミン類、フェニルレッド（ｐｈｅｎｙｌ  ｒｅｄ）、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液、及びＴｗｅｅｎ８０等の界面活性剤を含む。
【００２６】
上記のウイルス回復培地は、従来のチューブ法及びシェルバイアル法等のウイルスを同定する従来の診断手順に用いることができる。代替的に、ウイルス回復培地を以下に述べる方法に用いることができる。
【００２７】
本発明の別の実施例によれば、ウイルス検出方法に上記のウイルス回復培地を使用することが提供されている。
【００２８】
従って、ウイルス検出方法が提供されており、この方法は：
（ｉ）    ウイルス播種に好適な細胞株を提供するステップと；
（ｉｉ）  試料に特定の前処理を行って検出されるウイルスを潜在的に含むサンプルを得るステップと；
（ｉｉｉ）検出されるウイルスを潜在的に含むサンプルを細胞に播種するステップと；
（ｉｖ）  播種した細胞をインキュベートするステップと；
（ｖ）    試料培地を、少なくとも一のホルモンと、少なくとも一の酵素を補填した細胞培地を具えるウイルス回復培地で交換するステップと；
（ｖｉ）  （ｉｖ）で得たサンプルをインキュベートするステップと；
（ｖｉｉ）前記ウイルスを検出するステップと；
を具える。
【００２９】
この細胞株は、特定のウイルスの増殖及び単離に好適であるように選択することができる。例えば、細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２はパラインフルエンザウイルス類の検出に好適であり、インフルエンザウイルス類についてはＭＤＣＫ；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）についてはＨＥＰ−２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エンテロウイルス及びライノウイルスについてはＭＲＣ−５が好適である。当業者は、与えられたウイルスの増殖及び単離用の適切な細胞株を選択することができるであろう。
【００３０】
本明細書で用いられているように、用語「検出するウイルスを潜在的に含むサンプル」は、ウイルスに感染している、又はしていない対象から得たサンプル試料を含む。従って、このサンプルは、検出可能なウイルスを含んでいてもよく、ウイルスを含んでいなくてもよい。好適なサンプルは、唾液、血清、尿、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ）、気管支肺胞洗浄及び鼻咽頭吸引物等の呼吸器液、及び口、鼻腔、喉、肌、及び性器由来のぬぐい液等から得ることができる。サンプル試料は、細胞株とウイルスに適合する好適な培地で希釈して使用するように調製してもよい。
【００３１】
対象は、ウイルスに感染しているかもしれないあらゆる種の動物である。例えば、対象は鳥類、魚類、又はほ乳類であってよい。いくつかの実施例では、対象が、ほ乳類である。好適なほ乳類には、ヒツジ、ウシ、ブタ、シカ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット等のペット、マウス、ラット、サル等の実験動物、動物園で飼育されている動物のような捕獲動物、及びヒトが挙げられる。好ましいほ乳類はヒトである。その他の実施例では、対象は、鳥類、特に鶏類や七面鳥類等の家禽である。ウイルス検出に好適なサンプルを得るための試料の特定の前処理方法は、当業者に公知であり、限定はされないが、超音波処理及び遠心分離が挙げられる。
【００３２】
本発明によるウイルス回復培地は、細胞培養に好適である多くの様々なウイルスの回復に用いられることができる。当業者は、このようなウイルスに、限定はされないが、呼吸器系ウイルス類であるパラインフルエンザウイルス１、２、３、４（ＰＩ  １、２、３、４）、インフルエンザＡ、Ｂ（Ｉｎｆ  Ａ、Ｂ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤ）、ライノウイルス（ＲＨ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びエコーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス及びポリオウイルスから成るエンテロウイルス群（ＥＮＴ）由来のウイルス群、及び、限定されないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１、２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、お多福風邪、麻疹（Ｍｅａｓｅｌｓ）、ロタウイルス、及びポリオーマウイルス等の非呼吸器系ウイルスが含まれることを認識している。
【００３３】
本発明の方法では、播種した細胞を、公知の条件を用いて、サンプルと共にインキュベートする。例えば、播種した細胞は、細胞がウイルスに感染する４５乃至９０分、特に６０分、といった時間、３７℃でインキュベートする。インキュベートはインキュベータで行ってもよく、或いは、遠心分離を用いて実施してもよい。
【００３４】
免疫蛍光、染色、ＣＰＥの可視化等の免疫検出技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、及び核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）等の一般的に用いられている分子技術等の公知の一般的な検出方法を用いて、ウイルスを検出することができる。
【００３５】
本発明によるウイルス回復培地は、マルチウエルマイクロ滴定トレイアセンブリで、比較的容易に有利に用いられることができる。しかし、容易に認識されるように、幅広い種類の様々な細胞培養トレイアッセンブリが存在し、これらは、当業者に容易に入手可能である。例えば、マルチプルウエルを含むマイクロタイタープレートがよく知られている。一の実施例では、豪州国イノベーション特許第２００１１００２４２号に記載されているトレイアッセンブリを用いてもよい。代替的に、また、好ましい実施例によれば、このマイクロ滴定トレイアセンブリは、各々が複数のレセプタクルを有する第１、第２、及び第３のトレイユニットと；このレセプタクルを相補の複数のサンプルウエルであって、各ウエルが、複数のレセプタクルのそれぞれのレセプタクル内に個別に分離して保持できると共に、それぞれのレセプタクルから取り除くことができるサンプルウエルと；を具え、第２、及び第３のトレイユニットは、各々、第１のトレイユニットと、第２のトレイユニット、及び／又は第３のトレイユニットから成るマイクロ滴定トレイのアッセンブリを可能にする第１のトレイユニットを脱着可能に係合するように構成されている。
【００３６】
当然のことながら、長方形のトレイユニットが一般的に好ましいが、第１、第２、及び第３の各トレイユニットは、任意の好適な形状を取ってもよい。レセプタクルの種々のアレイを提供して、サンプルウエルに分析される溶液を収容するために、好ましい実施例では、第１のユニットトレイは、６×８行列の４８レセプタクルのアレイを具え、第２のユニットトレイは、６×８行列の４８レセプタクルのアレイを具え、第３のユニットトレイは、２×８行列の１６レセプタクルのアレイを具える。従って、６×８の２倍（即ち、１２×８）のマイクロ滴定トレイを、第１のトレイユニットと、第２のトレイユニットを用いて形成することができ、８×８マイクロ滴定トレイを、第１のトレイユニットと第３のトレイユニットを用いて形成することができ、１４×８マイクロ滴定トレイを、３つのトレイユニット全てを用いて形成することができる。当然のことであるが、追加で挿入したトレイユニットを含めて、所望するようにレセプタクル又はウエルの部材を拡張することができる。
【００３７】
第１のトレイへの第２、及び第３のトレイユニットの取付は、好適な手段によって行われる。例えば、これには、スナップ嵌め係合等が挙げられる。好ましい実施例によれば、第２、及び第３のトレイユニットは、第１のトレイユニットと係合するときに、第１のトレイユニットの両側に隣接させる。好ましくは、第２、及び第３のトレイユニットは、第１のトレイユニットの両側に相補的スリーブを脱着可能に係合する周囲アームを具える。
【００３８】
好ましい実施例では、各ウエルは、個々のレセプタクル内で、弾性的に保持できる。例えば、各ウエルは、摩擦係合によって、個々のレセプタクル内で、弾性的に保持できる。即ち、各ウエルは、テーパ型であり、ウエルの底部を個々のレセプタクル内に挿入することができるが、ウエルの直径が増大することによって、ウエルが、その個々のレセプタクル内に留まる。その他の代替は、当業者によって、容易に決めることができる。例えば、各ウエルは、その外側面に、摩擦係合を引き起こす第１、第２、及び／又は第３のトレイユニットの各レセプタクルの内壁に係合する少なくとも一のリッジを具えていてもよい。
【００３９】
好ましくは、少なくとも一のトレイユニットに、レセプタクルに保持されているサンプルウエルを同定する同定手段が設けられている。具体的には、この同定手段は基準グリッドを具えていてもよく、複数のレセプタクルの各列に、相当するコード文字を設け、複数のレセプタクルの各行に、相当するコード番号が設けられている。
【００４０】
第１、第２、及び第３のトレイユニット、又はこれらの任意の組み合わせに、好ましくは、各サンプルウエルに個々のカバーを設けるように構成した相補的カバーを設けることができる。具体的には、このカバーが各サンプルウエルの開口部を囲み、それぞれトレイユニットに配置されるときに、ウエルに保持されているサンプルを実質的に封入する。各リッジは、このカバーが複数の環状リッジを具えることが好ましい。
【００４１】
別の実施例では、このサンプルウエルは個別に分離して保持されておらず、むしろサンプルウエルの小ユニットとして保持されている。このサンプルウエルユニットは小さく、好ましくは、４つまでのサンプルウエルを含む。
【００４２】
従って、好ましくは、マイクロ滴定トレイアッセンブリは、各々が複数のレセプタクルを有する第１、第２、及び第３のトレイユニットと；複数のサンプルウエルユニットであって、各サンプルウエルユニットが、各レセプタクルと相補的である４つまでのサンプルウエルとを具え、各サンプルウエルユニットは、サンプルウエルユニットのサンプルウエルの数に相当する複数のレセプタクルの多数のレセプタクル内でユニットとして維持でき、多数のレセプタクルから取り外すことができ；第２、及び第３の各トレイユニットが、第１のトレイユニットに脱着可能に係合して、第１のトレイユニット及び第２のトレイユニット、及び／又は第３のトレイユニットから成るマイクロ滴定トレイのアッセンブリを可能にするように構成されている複数のサンプルウエルユニットを具える。
【００４３】
この実施例によれば、４つまでのサンプルウエルを含むサンプルウエルユニットは、実施される特定の診断に応じて構成することができる。例えば、二重アッセイを実施するように、サンプルを二重に与えることが望ましい。ある実施例では、このトレイユニットは、アッセンブリの各列又は各行のレセプタクルの数が、各サンプルウエルユニットのサンプルウエルの数に相当するように構成されている。
【００４４】
サンプルウエルユニットは、所望のように製造できる。その際に、各サンプルウエルユニットのサンプルウエルは、一体的に形成されるか、或いは、互いに脱着可能として個々のサンプルウエルを形成するようにしてもよい。これらの２つの選択枝の後者では、個々のサンプルウエルの連結が、小さいプラスチック製品を相互に脱着可能に連結するのに用いられる任意の手段を用いて達成できると理解するべきである。
【００４５】
本発明の更に別の態様によれば、本発明のウイルス回復培地と、上記のマイクロ滴定トレイアッセンブリと、選択的に、マイクロタイタープレートからサンプルウエル又はサンプルウエルユニットを取り除くことを容易にするように構成した鉗子と、を具えるウイルス診断キットが提供されている。
【００４６】
この鉗子は、４つまでのサンプルウエルを含む個々のサンプルウエル又はサンプルウエルユニットの安全な保持を容易にするのであれば、どのような好適な形状を取ってもよい。好ましい実施例では、この鉗子は、この目的のために特に構成されており、ウエルに挿入される第１の部分と、第１の部分と連携し、ウエルの外表面をつかむ第２の部分を具える。第１の部分は、好ましくは、断面円形であり、ウエルに挿入するときに、ウエルの内壁から最小クリアランスのみを提供するようなサイズである。
【００４７】
上記のアッセンブリ及びウイルス回復培地は、現在利用できる公知の方法及びアッセンブリを越えた特に有利な点を提供することができる。具体的には、このアッセンブリ及び溶液は、同じ試料に対して５つ又はそれ以上の非常に特異的な細胞株を用いて、感受性を強化することができる。また、遠心分離による強化を利用可能である。その際、遠心力は、ウイルスのケースで最大１０倍までウイルスの吸収を強化し、ウイルス検出時間を短くする。加えて、８−１６の試料を１つのプレートに播種して、１人のオペレータによって扱われる試料をより多くすることができる。更に、第１、第２、及び第３のトレイユニットによってアッセンブリのデザインのフレキシビリティが大きくなる。
【００４８】
蛍光又は酵素標識による即時検出技術を用いて、１−２日で入手できる確かな結果（一般的なウイルスの８０％）を作るアッセンブリ及び溶液を用いた方法によって高い客観性が得られる。その際、このアッセンブリは、最大１４の異なる細胞株を用いることができ、異なるモノクローナル抗体の組み合わせを用いて広範囲のウイルスの検出を可能にする点で、用途が広い。また、ＣＰＥをモニタすることもできる。更に、試料は、異なる細胞株内に播種することができるので、種々のモノクローナルを種々の細胞株に、異なる時間フレーム内で用いることができる。誤りが生じた場合、播種した試料を有する別のウエルを、利用して、追加の試験を行うことができる。
【００４９】
また、このアッセンブリと溶液の使用を取り入れた方法は、結果を１−３日で入手できるようにすることによって、時間削減効果も提供することができる。このような方法は、実務を大きく助ける。また、アッセンブリは、例えば、一のテストに少量のモノクローナル抗体のみが必要であるといった、費用対効果の高い試験を可能にする（シェルバイアル法を用いた一の試験に必要とされる６０−８０μｌのモノクローナル抗体と比較して２０μｌを要する）。
【００５０】
使用時には、プレートに、複数の細胞株を播種する。検出に用いる細胞株の選択は、試料のタイプ及び予想されるウイルスの存在に依存している。例えば、本発明を特定の細胞株に限定することなく、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞株は、パラインフルエンザウイルス類；インフルエンザウイルス類用のＭＤＣＫ；ＲＳＶ用のＨＥＰ−２、及びＣＭＶ、ＨＳＶ、エンテロウイルス、及びライノウイルスの単離用のＭＲＣ−５細胞株の検出に用いることができる。播種に続いて、各試料を、プレートの異なる列に播種することができる。例えば、このプレートが８×１２の場合、８つの異なる試料を、各プレートに接種することができ、各試料が、最大１２の異なる細胞株上の所定の列の１２ウエルに接種される。これは、少なくとも１２のウイルスの検出を有利に促進する。しかし、この９６ウエルプレート構成を、特定の診断の必要性によって変えることができることが認識されよう。これは、検出するウイルスに対する特殊性を維持するために、単純に細胞株選択に対して適切な変形を必要とする。
【００５１】
本発明を、次の非限定的図面、及び／又は例を参照して、更に詳述する。
【００５２】
図１を参照すると、第１のトレイユニット１１と、第２のトレイユニット１２と、第３のトレイユニット１３と、を具えるトレイアッセンブリ１０が設けられている。このトレイユニット１１、１２、及び１３は各々、個々のサンプルウエル（図５参照）、又は４つまでの個々のサンプルウエルから形成されているサンプルユニットを受けるように構成されている複数のレセプタクル１４を具える。
【００５３】
第１のトレイユニット１１は、その外縁に沿ってスリーブ１５を具える。スリーブ１５は、一方の側で、第２のトレイユニットの周囲アーム１６を、反対側で、第３のトレイユニットの周囲アーム１７を受けるように構成されている。このように、第２の、及び第３のトレイユニット１２、１３は、周囲アーム１６、１７を第１のトレイユニット１１のスリーブ１５内に摺動させることによって、図２に最もよく示されているように、第１のトレイユニット１１と着脱可能に係合することができる。第１、及び第２のトレイユニットの係合は、図３に特によく示されている。
【００５４】
図５を参照すると、各サンプルウエル５０は、テーパ体５１と、ベース５２と、ウエル５０の開口部を規定する環状リップ５３を有利に具える。この構成を用いて、各ウエルは、第１、第２、又は第３のトレイユニットの各レセプタクル内に弾力的に保持され、必要に応じて取り除かれる。
【００５５】
図６は、検出するウイルス、関連する細胞株及び各株についての除去日数のリストを含む、典型的な１２×８のウエルプレート構成（即ち、２×６×８）の一例を示す。
【００５６】
図６から分かるように、このプレートは、次の順で種々の細胞株を播種することができる：
行１−３    ＬＬＣ−ＭＫ２
行４，５    ＭＤＣＫ
行６        Ｈｅｐ２
行７        Ａ５４９
行８        ＲＫｌ３
行９−１２  ＭＲＣ−５
【００５７】
この方法でセットアップしたプレートは、例えば、限定はされることなく、呼吸器系ウイルスであるパラインフルエンザ１、２、３、４（ＰＩ  １、２、３、４）、インフルエンザＡ、Ｂ（Ｉｎｆ  Ａ、Ｂ）ＲＳＶ、アデノウイルス（ＡＤ）、ライノウイルス（ＲＨ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びエコーウイルス（Ｅｃｏ）、コクサッキーウイルス（ｃｏｘ）、エンテロウイルス（Ｅｎｔ）及びポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏ）から成るエンテロウイルス群（ＥＮＴ）由来のウイルス群の選択が可能であり、同様に、限定されることなく、非呼吸器系ウイルスである単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１、２、及び水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の選択が可能である。
【００５８】
更なる例では、６×８ウエルプレートの構成は、次の順で播種された細胞株でできているものでもよい：
行１−３  Ａ５４９
行４−６  ＭＲＣ−５
これは、例えば、ＣＭＶ、ＨＳＶ１、２、ＶＺＶ、ＡＤ等のウイルス、及びエンテロウイルス群等のウイルスの検出を可能にするであろう。
【００５９】
最後に、１４×８ウエルの構成は、ＰＩ１、２、３、４；Ｉｎｆ  Ａ、Ｂ；ＲＳＶ；ＡＤ；ＲＨ；ＥＮＴ（Ｅｃｈｏ、ｃｏｘ、Ｅｎｔ、Ｐｏｌｉｏ）；ＨＳＶ１、２；ＶＺＶ；風疹；お多福風邪；麻疹（Ｍｅａｓｅｌｓ）；ロタウイルス；ポリオーマウイルスのような病原体の検出を最終的に可能にし、他にも適切な細胞株を用いた病原体ウイルスの検出も可能にする。
【００６０】
ウエルの個々の性質に起因する細胞株の除去は、問題になっている特定のウイルス検出に適切な時間スケジュールに応じて選択できる。具体的には、ＰＩ１−４の検出が必要な場合、列Ａを例に取ると、２日目に、ウエルＡ１からＡ３が取り除かれる。同様に、Ｉｎｆ  Ａ、Ｂの検出が必要な場合、２日目に、ウエルＡ４及びＡ５が取り除かれる。しかし、エンテロの検出が必要な場合、適切な日（１−３）に、ウエルＡ１１が取り除かれる。個々のウエルの特定の性質は、この選択的除去とウイルス検出を容易にする。
【００６１】
ここで、本発明の一の態様のキットを用いて続いて行われる、次の具体的な手順を参照すると、これらの多くのステップが選択的であり、決して本発明を限定していると考えるべきではない。
【００６２】
真空無菌のガラスパスツールピペットを用いて、培地を、接種する全部のウエルから吸引する。大きなシャープスコンテナのパスツールピペットの処理は、有利に促進される。
【００６３】
使い捨てのピペットを用いて、ウエルプレートの適切な数のウエルは、１ウエル当たりほぼ１５０−２００μｌの試料を接種する。残りの試料は、−７０℃で保存する。次いで蓋がプレート上に置かれ、日付を、プレートの接種したウエルの上に書く。
【００６４】
次いで、このプレートの重量を、電子天秤で量り、全プレートが等しい重量となり（＋／−０．５ｇ）遠心分離機内で平衡を保つことができるまで、バランスプレートとカードでバランスを取る。遠心分離機を約３７℃、３５００ｒｐｍで６０分間作動させる。真空で無菌のパスツールピペットを用いて、各試料を、各ウエルから吸引し、各試料に、新しい使い捨てのピペットを用いて、各ウエルを、本発明のウイルス回復培地で満たす。
【００６５】
次いで、ＣＯ２インキュベータ内にプレートを注意深く置き、最後の試料の接種後７日までの間、試料を３７℃でインキュベートすることによって、ＣＯ２インキュベータ（５％）で３７℃に加湿した環境でインキュベートする。
【００６６】
免疫蛍光染色は、特異的モノクローナル抗体を用いて、シングルウエル内の特定のウイルスの検出に有利に用いられる。一般的に、次の手順に従う：真空吸引を用いて、培地を適切なウエルから取り除き、特別な鉗子を用いて、このウエルをプレートから取り除き、別の容器に移す。次いで、これらを５分間空気乾燥させる。次いで、３００μｌの冷アセトンを各ウエルに添加し、−２０℃で１５分間固定させる。次いで、固定液を捨てて、サンプルを再び２−３分間空気乾燥させる。特異的モノクローナル抗体（一次）を各ウエルに添加し、カバープレートを適所に置いて、サンプルを３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、このサンプルをインキュベータから取り除き、各ウエルをＰＢＳで満たす。次いで、ＰＢＳを捨てる。このプロセスを４回以上繰り返す。二次抗体を各ウエルに添加した後、このサンプルを再度５分間、空気乾燥させる。この後、再び、サンプルのインキュベートを実施し、次いで、上述したようにＰＢＳで繰り返し処理し、蒸留水で２回最終的な洗浄をする。次いで、少量（１滴）の特別に調製した封入剤を添加し、結果物を蛍光顕微鏡下で観察する。
【００６７】
本明細書、及びこれに続く特許請求の範囲を通して、このコンテキストが他に要求しない限り、用語「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、規されている完全体の完全体群、又はステップ群を包含することを意味するが、別の完全体、又は完全体群又はステップ群を除外することを意味するものではないことが理解される。
【００６８】
当業者には、本明細書に記載された発明が、特に記載されているもの以外の変形例及び変更例に影響を受けやすいことは自明である。本発明は、このような変形例及び変更例を全て含むと理解されるべきである。また、本発明は、本明細書で個別に又は集合的に参照されている、又は示されている全てのステップ、特徴、組成物、及び化合物、前記ステップ又は特徴の２つ又はそれ以上の任意の及び全ての組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
ここで、添付の図面を参照して、本発明の一の態様のキットに用いるウイルス回復培地に有用なトレイの実施例を示す。
【００７０】
【図１】図１は、分解した形状の第１、第２、及び第３のトレイユニットを示す。
【図２】図２は、組み立てた形状の第１、第２、及び第３のトレイユニットを示す。
【図３】図３は、半組み立て形状の第１、及び第２のトレイユニットを示す。
【図４】図４は、組み立てた形状の第１、及び第３のトレイユニットを示す。
【図５】図５は、複数のサンプルウエルを示す。
【図６】図６は、１２×８行列の一般的なウエル構成を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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