(57)【要約】  虚血性又は他の低酸素事象、出血性脳卒中後の血管狭窄又は血管攣縮による；慢性の高血圧による；及び／又は特発性原因による血流減少を特徴とするか、又は経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるための方法を提供する。このような哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法は、それを必要とする患者にタンパク質キナーゼＣの阻害剤の治療有効量を投与することを含む。ある実施形態において、該阻害剤は、阻害剤に対する患者の脱感作を引き起こすことなく長期に投与できる。虚血性又は他の低酸素事象、出血性脳卒中後の血管狭窄又は血管攣縮による；慢性の高血圧による；及び／又は特発性原因による血流減少を特徴とするか、又は経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血流減少を経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法であって、それを必要とする患者に、δタンパク質キナーゼＣ（δＰＫＣ）の阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記阻害剤が、ペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１、配列番号２に示されたアミノ酸を有するδＶ１−２、配列番号３に示されたアミノ酸を有するδＶ１−５、配列番号４に示されたアミノ酸を有するδＶ５、又はそれらの組合せである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたδＶ１−１のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号２に示されたδＶ１−２のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号３に示されたδＶ１−５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、又は配列番号４に示されたδＶ５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を持つアミノ酸配列を有する請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記血管が、虚血又は再灌流事象にさらされている請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血管が、血管狭窄又は血管攣縮にさらされている請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血流が、前記虚血事象から生じる不完全虚血領域において、前記虚血事象中の血流と比較して増加する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記血流が血管狭窄又は血管攣縮事象による低灌流域において、前記事象中の血流と比較して増加する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記血管が、大脳動脈、毛細血管、又は細動脈である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記大脳動脈が、前大脳動脈、中大脳動脈又は後大脳動脈である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血管が、頚動脈である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記δタンパク質キナーゼＣの阻害剤の治療有効量が、前記阻害剤を投与する前の血流に比して少なくとも約１０％血流を増加させるのに有効な量である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記δＰＫＣの阻害剤の治療有効量が、前記阻害剤を投与する前の血流に比して少なくとも約５０％血流を増加させるのに有効な量である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記δＰＫＣの阻害剤が、キャリヤペプチドにコンジュゲートしている請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記キャリヤペプチドが、配列番号８４又は配列番号８５に示されたアミノ酸配列を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害剤を、非経口経路により投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害剤が、前記阻害剤に対して脱感作を引き起こすことなく長期投与できる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害剤を、患者に複数回投与する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
血流減少を経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるキットであって、δＰＫＣの阻害剤及び前記血管内の血流を増加させるために前記阻害剤を使用するための取扱い説明書を含むキット。
【請求項２１】
前記阻害剤が、ペプチドである請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１である請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１、配列番号２に示されたアミノ酸を有するδＶ１−２、配列番号３に示されたアミノ酸を有するδＶ１−５、配列番号４に示されたアミノ酸を有するδＶ５、又はそれらの組合せである請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたδＶ１−１のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号２に示されたδＶ１−２のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号３に示されたδＶ１−５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、又は配列番号４に示されたδＶ５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を持つアミノ酸配列を有する請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
前記δＰＫＣの阻害剤が、キャリヤペプチドにコンジュゲートしている請求項２１に記載のキット。
【請求項２６】
前記キャリヤペプチドが、配列番号８４又は配列番号８５に示されたアミノ酸配列を有する請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国連邦委託研究に関する表明
本研究は、助成金番号ＮＳ４４３５０の下で国立予防衛生研究所により一部支援されている。したがって、米国政府は本発明のある権利を有することがある。
【０００２】
本明細書に記載された主題は、血流減少を経験している血管内の脳血流を増加させる方法に関する。さらに具体的には、該主題は、デルタタンパク質キナーゼＣ（δＰＫＣ）の阻害剤を投与することによって血管内の脳血流を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
虚血性脳卒中は、脳への血流が妨げられた場合に生じる。脳卒中及び心拍停止などの疾患による脳虚血及び再灌流障害は、米国における身体障害及び死亡の主要原因である。米国のみで年間７０万超の脳卒中が発生しており、２００１年の時点で、４８０万人が脳卒中の後遺症を有して生存している。脳卒中の全死亡率は、ほぼ５８％であり、これらの患者のほぼ５０％が、病院で死亡している（アメリカ心臓協会の心疾患及び脳卒中統計、２００４年更新）。
【０００４】
虚血性脳卒中に加えて、出血性脳卒中（脳内及びくも膜下タイプなど）は、すべての脳卒中事象の１２％となっている。虚血性脳卒中とは異なり、出血性脳卒中は、血管系から実質空間、くも膜下空間又は硬膜下空間への血液喪失による。このタイプの脳卒中は、虚血性脳卒中と比較して、はるかにより高い死亡率（３０日以内に３７〜３８％の死亡率）を招く（アメリカ心臓協会の心疾患及び脳卒中統計、２００４年更新）。出血性脳卒中は、慢性遅発性脳血管狭窄又は脳血管攣縮を生じさせる。実際、くも膜下出血の治療を受けている患者の２／３は、出血後３日目から１３日目の間に脳血管攣縮を起こす。Ｓｕｈａｒｄｊａ，Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃ．、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．１（２）：１１０〜１１６ページ（２００４）。脳血管機能におけるこれらの変化は、より大きな直径の血管（例えば、脳底動脈、中大脳動脈）、及び毛細血管並びに細動脈などのより小さな直径の血管の双方に生じる。血管攣縮は一部、血管拡張物質である酸化窒素（ＮＯ）を隔離させるオキシヘモグロビンなど、血管系の周囲にある反応性血液産物の蓄積による。血管狭窄及び血管攣縮など、脳血流の自己調節の喪失により、血流が制限されることから脳損傷の増大に至り、損傷周囲の領域の脳損傷の悪化を引き起こし、出血性脳卒中患者の転帰不良の一因となる。
【０００５】
脳血管自己調節障害の他の原因としては、慢性の高血圧又は高血圧症が挙げられる。高血圧症は、アメリカ人の５人にほぼ１人（成人の４人に１人）（アメリカ心臓協会の心疾患及び脳卒中統計、２００４年更新）が罹患しており、うっ血性心不全を含む他の慢性疾患に加えて、脳卒中障害の重要な危険因子である。高血圧症は、脳血流の減少と相関付けられている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｇ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ  １８（１）：１３〜２０ページ（１９８７））。したがって、十分な脳灌流の維持は、これらの危険性のある患者において脳保護を管理する上で重要である。脳血流の制御は、偏頭痛、妊娠、コール−フレミング症候群及び中枢神経系の良性血管障害など、脳血管狭窄及び脳血管攣縮の他の特発性原因において脳灌流を維持するためも重要である（Ｓｉｎｇｈａｌ，Ａ．Ｂ．Ｔｏｐ．Ｓｔｒｏｋｅ  Ｒｅｈａｂｉｌ．１１（２）：１〜６ページ（２００４））。
【０００６】
さらに、脳血管疾患の費用は、膨大である。直接的保健費用並びに罹患及び死亡による生産性の損失の双方から、米国における脳卒中の費用は、ほぼ５３６億ドルに達する。（アメリカ心臓協会の心疾患及び脳卒中統計、２００４年更新）。
【０００７】
この大きな臨床的必要性にもかかわらず、脳虚血性障害及び再灌流障害に対する現在の治療の選択肢は限定されている。脳卒中のための臨床的に承認された唯一の薬物治療である組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）は主として短い治療濃度域、並びに脳出血及び死亡の危険性が増大するなどの高いリスクプロファイルにより、全国で患者の約１％から約２％にのみ用いられている。
【０００８】
虚血性脳卒中の薬物又は治療をデザインする上で、患者の脱感作を引き起こすことなく複数回投与できる薬物又は治療をデザインすることが望ましい。ある薬物に対する患者の脱感作は、その薬物を投与し、治療効果がないか、又は薬物投与回数の関数として治療効果が減少する場合に生じる。これは、例えば、心虚血を治療するために使用されるニトログリセリンなど、いくつかの薬物治療に生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、脳血管内の血流を増加させる薬物又は治療法が必要である。さらに、患者の脱感作を引き起こさず、したがって、必要に応じて長期投与を可能にし得る薬物又は治療法が必要である。本発明は、これらの必要性に対応するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
デルタタンパク質キナーゼＣ（δＰＫＣ）の阻害剤が、虚血事象又は他の低酸素事象により脳血流減少を経験している哺乳動物の脳血流を増加させることができることを発見した。したがって、脳血流減少を経験しているこのような哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法を提供する。さらに、脱感作を引き起こさないこのような哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法を提供する。このような哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるためのキットもまた提供する。
【００１１】
本発明の第１の態様において、虚血事象などの疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法を提供する。一形態において、このような脳血管内の血流を増加させる方法は、それを必要とする患者にδタンパク質キナーゼＣの阻害剤の治療有効量を投与することを含む。本発明のある形態において、該阻害剤は、ペプチドであり、さらにδＶ１−１ペプチドである。本発明の別の形態において、該阻害剤は、δＶ１−２ペプチド、δＶ１−５ペプチド又はδＶ５ペプチドである。本発明の方法に有利に使用できる前述のペプチドの断片又は誘導体をさらに記載する。該方法は、脳血流の減少を特徴とする病態における脳血流を有効に増加させるために有利に使用できる。例えば、該方法は、脳血流を増加させ、それによって、虚血性脳卒中などの虚血事象からの障害、或いは出血性脳卒中後の血管狭窄又は血管攣縮からの障害を減少させるために使用できる。該方法は、慢性の高血圧により及び／又は特発性の原因により１つ又は複数の血管内の血流減少を経験している個体など、血流増加が望ましい任意の他の目的のために、インビボで脳血管内の血流を増加させるためにも使用できる。
【００１２】
本発明の一形態において、本明細書に記載されている疾患又は病態によるか、或いは他に当業界に知られている血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法は、それを必要とする患者にδタンパク質キナーゼＣの阻害剤の治療有効量を投与することを含み、該阻害剤は、該阻害剤に対して患者の脱感作を引き起こすことなく長期的投与が可能である。
【００１３】
本発明のさらなる他の形態において、本明細書に記載されている及び／又は当業界に知られている疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法は、該阻害剤に対して患者の脱感作を引き起こすことなく、それを必要とする患者にδタンパク質キナーゼＣの阻害剤の治療有効量を複数回投与することを含む。
【００１４】
本発明の第２の態様において、本明細書に記載されている及び／又は当業界に知られている疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるキットを提供する。一形態において、キットは、本明細書に記載されているδタンパク質キナーゼＣの阻害剤及び１つ又は複数の大脳血管内の血流を増加させるために該阻害剤を使用するための取扱い説明書を含む。
【００１５】
例えば、出血性脳卒中後の虚血事象又は血管狭窄又は血管攣縮などの疾患又は病態による；慢性の高血圧による；及び／又は特発性原因による血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１６】
本明細書に記載されている及び／又は当業界に知られている疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させる方法であって、薬物作用に対して患者の脱感作を引き起こさない方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１７】
本明細書に記載されている及び／又は当業界に知られている疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるキットを提供することが、本発明のさらなる別の目的である。
【００１８】
上記の代表的な態様及び実施形態に加えて、さらなる態様及び実施形態は、図面の参照、及び以下の説明の試験により明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書に記載された主題の理解を助長する目的のために、本明細書の好ましい実施形態を参照にして、具体的な用語を用いて同じことを説明する。それにもかかわらず、当然のことながら、それによって主題のこのような変更及びさらなる修飾、並びに本明細書に例示される原理のさらなる適用について、範囲の限定を意図しておらず、主題に関連する当業者に通常に生じ得ることとして企図される。
【００２０】
疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している脊椎動物の脳血管内の血流を増加させる方法を提供する。該疾患又は病態は、脳血流の減少を引き起こすものである。血流減少は、１）出血性脳卒中後、或いはそれと関連する；２）慢性の高血圧による；３）再灌流による；及び／又は４）特発性原因による、虚血性脳卒中、再灌流、特発性原因又は血管狭窄或いは血管攣縮など、種々の事象から生じ得る。タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の選択されたイソ酵素が、このような哺乳動物の脳血管内の血流を増加させることが発見されている。このようなイソ酵素が、虚血性脳卒中などの低酸素事象による障害、又は出血性脳卒中後の血管狭窄或いは血管攣縮による障害；慢性の高血圧による障害；及び／又は特発性原因による障害など、血流減少を特徴とする病態による細胞損傷、組織損傷又は臓器損傷を、死亡又は他の傷害を減少させるために有利に利用できることもまた発見されている。本明細書における「低酸素事象」又は「低酸素血症」とは、細胞、組織又は臓器が不十分な酸素供給を受けるために生じる事象を意味する。本明細書に用いられる「虚血性脳卒中」、「虚血」又は「虚血事象」とは、特定の細胞、組織又は臓器への不十分な血液供給を称す。血液供給の減少結果、細胞、組織又は臓器への不十分な酸素供給（即ち、低酸素血症）及び不十分な栄養供給となる。
【００２１】
理論により制限を受けないが、虚血事象時及び／又はその事象後、閉塞血管から直接供給される組織を取り巻くか、又は虚血性コアの直接周辺部外側の脳領域にある不完全虚血領域として知られている組織の低灌流領域が存在することが考えられている。虚血コアとして知られている閉塞血管から直接供給されるこの組織領域のいくつかは、虚血事象の開始数分以内で不可逆的に損傷を受けることがあるが、該境界域組織は、血流及び／又は血管開存性を維持することによって救出できることと本明細書では考えている。
【００２２】
低灌流領域はまた、慢性の高血圧による及び／又は特発性原因による出血性脳卒中後の血管狭窄を有する患者に生じ得る。血管狭窄により引き起こされる低灌流により、神経細胞損傷、膠細胞損傷及び血管損傷を誘導し、血流及び／又は血管開存性を改善することによって救出され得ることが本明細書で考えられている。本発明の一形態において、それを必要とする患者に、δタンパク質キナーゼＣ（δＰＫＣ）の阻害剤の治療有効量を投与する方法が含まれる。
【００２３】
δＰＫＣの阻害剤は、該阻害剤に対する脱感作を引き起こすことなく長期投与できることもまた発見されている。したがって、本発明のさらに別の形態において、本明細書に記載された疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している脊椎動物の脳血管内の血流を増加させる方法は、δＰＫＣの阻害剤の治療有効量を、患者に投与することを含み、該阻害剤は、該阻害剤に対する脱感作を生じることなく長期投与できる。本明細書に記載された疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるキットもまた提供する。一形態において、キットには、δＰＫＣの阻害剤及び本明細書に記載された疾患又は病態による血流減少を経験している脊椎動物の脳血管内の血流を増加させるために該阻害剤を使用するための取扱い説明書を含んでいる。
【００２４】
一態様において、疾患又は病態による血流減少を特徴とするか、或いは経験している脊椎動物の脳血管内の血流を増加させる方法もまた提供する。一実施形態において、δＰＫＣの阻害剤の治療有効量を、患者に投与する方法が含まれる。
【００２５】
本明細書における「血流」とは、単位時間当たりにそれぞれの血管内を流れる血液の量を一般に意味する。本明細書における「血流を増加させる」とは、特定の時間での血流が、患者が、出血性脳卒中による血管狭窄又は血管攣縮を経験しているか、又は慢性の高血圧を経験している場合を含む、本明細書に記載された及び／又は当業界に知られている虚血、低酸素又は他の細胞、組織又は臓器傷害事象の発症時、又は発症後の指定された時間など、いくつかの予め決められた時点での血流に比して増加することを意味する。血流は、典型的に本明細書に記載された阻害剤による処置後に、このような処置前の血流に比して増加する。「血流減少」とは、特定の時間での血流が、患者が、例えば、出血性脳卒中による血管狭窄又は血管攣縮を経験しているか、又は慢性の高血圧を経験している場合を含む、本明細書に記載された及び／又は当業界に知られている虚血、低酸素又は他の細胞、組織又は臓器傷害事象の発症時前、又は発症後の指定された時間など、いくつかの予め決められた時点での血流に比して減少することを意味する。１つ又は複数の血管内の血流を測定するいくつかの方法が、当業界に知られている。例えば、レーザードップラー流速計（ＬＤＦ）、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を含む陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）及びコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像法は、脳血流を測定するために使用できる（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ．Ｋ．Ｌ．ら、Ｂｒａｉｎ  １１３：２７〜４７ページ（１９９０）；Ｓａｋａｉ．Ｆら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．５：２０７〜２１３ページ（１９８８）；Ｒｅｍｐｐ，Ｋ．Ａ．ら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １９３：６３７〜６４１ページ（１９９４）；Ｂａｉｒｄ，Ａ．Ｅ．及びＷａｒａｃｈ，Ｓ．、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１８：５８３〜６０９ページ（１９９８）；Ｄａｎｕｓ，Ｇ．ら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２１３：１４１〜１４９ページ（１９９９）；Ｃａｌａｍａｎｔｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１９：７０１〜７３５ページ（１９９９）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２（１）：８９〜９８ページ（１９８２）；Ｆｕｋｕｄａ，Ｏ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ３６（２）：３５８〜３６４ページ（１９９５）；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｚｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇ．Ｓｃｉ．１５３（１）：２５〜３１ページ（１９９７）；Ｂｏｒｌｏｎｇａｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０１０（１〜２）：１０８〜１１６ページ（２００４））。これら及び他の既知の方法は、種々の測定法を含み得るが、単位時間当たりの体積に換算して血流を提供し得ないことが認められる。例えば、ＬＤＦは、赤血球数とそれらの速度の積として定義される赤血球量と呼ばれる血流値を提供する。したがって、本明細書に記載される血流は、多種多様のフォーマット及び／又は単位で報告できる。
【００２６】
δＰＫＣの多種多様の阻害剤は、記載された方法において使用することができる。本明細書におけるδＰＫＣの阻害剤とは、δＰＫＣの生物学的活性又は機能を阻害する化合物を意味する。当業界に知られているように、δＰＫＣは、細胞増殖の調節及び遺伝子発現の調節など、種々の細胞過程に関与している。この阻害剤は、例えば、δＰＫＣの酵素活性を阻害できる。該阻害剤は、例えば、δＰＫＣの活性化を防ぐことによってδＰＫＣの活性を阻害できるか、又はδＰＫＣのそのタンパク基質への結合を防ぐことができる。このような酵素活性の阻害剤は、例えば、タンパク質中のアミノ酸のリン酸化を防ぐであろう。該阻害剤は、活性化キナーゼ（ＲＡＣＫ）に対する受容体としても知られている、そのアンカータンパク質へのδＰＫＣの結合、及びδＰＫＣのその細胞内局在への関連した移行を防止できる。
【００２７】
該方法の一形態において、アルカロイドなどの有機分子阻害剤を利用できる。例えば、ケレリトリン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ）、サングイルビン（ｓａｎｇｕｉｒｕｂｉｎｅ）、ケリルビン（ｃｈｅｌｉｒｕｂｉｎｅ）、サングイルチン（ｓａｎｇｕｉｌｕｔｉｎｅ）、及びキリルチン（ｃｈｉｌｉｌｕｔｉｎｅ）などのベンゾフェナントリジンアルカロイドを使用できる。このようなアルカロイドは、市販品として購入できるか、及び／又は、例えば、米国特許第５，１３３，９８１号に記載されているとおり、当業界に知られている植物から単離できる。
【００２８】
ビスインドリルマレイミド類の化合物もまた、δＰＫＣの阻害剤として使用できる。代表的なビスインドリルマレイミド類としては、ビスインドリルマレイミドＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩＶ、ビスインドリルマレイミドＶ、ビスインドリルマレイミドＶＩ、ビスインドリルマレイミドＶＩＩ、ビスインドリルマレイミドＶＩＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩＸ、ビスインドリルマレイミドＸ及びδＰＫＣを阻害するのに有効である他のビスインドリルマレイミド類が挙げられる。このような化合物は、市販品として購入できるか、及び／又は、例えば、米国特許第５，５５９，２２８号及びＢｒｅｎｎｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４（１０）２８８７〜２８９２ページ（１９８８）に記載されているとおり、当業者に知られている方法により合成できる。ロッテリン（ｒｏｔｔｅｒｉｎ）など、カマラ木から得られたδＰＫＣの阻害に有効な抗寄生虫色素もまた利用でき、市販品として購入できるか、又は当業者により合成できる。
【００２９】
該方法のある形態において、δＰＫＣのタンパク質阻害剤を利用できる。タンパク質阻害剤は、ペプチドの形態であり得る。本明細書に使用され、当業界に知られているタンパク質、ペプチド及びポリペプチドは、ペプチド結合により結合されたアミノ酸モノマー鎖から作製された化合物を称す。別に断らない限り、ペプチドの個々の配列は、アミノ酸末端からカルボキシル末端の順序で示す。δＰＫＣのタンパク質阻害剤は、当業者に知られている方法により得ることができる。例えば、該タンパク質阻害剤は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐａｕｌ  Ｌｌｏｙｄら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、フロリダ州（１９９７）に記載されているとおり、当業者に知られている種々の固相合成技術を用いて化学的に合成できる。
【００３０】
或いは、該タンパク質阻害剤は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第２版、コールドスプリングスハーバー、ニューヨーク州（１９８９）、Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｏｂｉｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー州（１９９８）及び常時定期的に更新されているＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編集）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに記載されているとおり、当業界に知られている組換え技術法により製造できる。例えば、発現ベクターを使用して適切な宿主細胞内で所望の阻害剤ペプチドを生成することができ、次いでこの生成物を、知られた方法により単離することができる。該発現ベクターとしては、例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が挙げられ、該ヌクレオチド配列は、プロモーター配列に対して操作可能に結合させる。
【００３１】
本明細書に定義されるように、ヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列と機能的関係で配置させる場合、そのヌクレオチド配列は別のヌクレオチド配列と「操作可能に結合」されている。例えば、コード配列をプロモーター配列に操作可能に結合させる場合、これは一般に、該プロモーターがコード配列の転写を促進できることを意味する。操作可能に結合させるとは、結合させるＤＮＡ配列が、典型的に近接していることを意味し、２つのタンパク質コード化領域を結合させる必要がある場合、近接し、リーディングフレーム内であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、プロモーターから数キロベース離れている場合に作用でき、イントロン配列は、種々の長さであり得るので、いくつかのヌクレオチド配列は、近接はしてないが操作可能に結合できる。さらに本明細書に定義されるように、ヌクレオチド配列は、天然又は合成の線形で連続したヌクレオチド及び／又はヌクレオシドのアレイ、並びにそれらの誘導体を参照することが意図される。用語の「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」及び「コードする（ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ）」とは、ヌクレオチド配列が、転写及び翻訳の機構により細胞に情報を提供し、それにより一連のアミノ酸から特定のアミノ酸配列に構築してポリペプチドを作製できる過程を称する。
【００３２】
該阻害剤は、δＶ１−１などのＰＫＣのイソ酵素から誘導でき、ラトゥスノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からのそのアミノ酸配列は、配列番号１（ＳＦＮＳＹＥＬＧＳＬ）に示されており、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＨ７６５０５に見られるラットδＰＫＣのアミノ酸８〜１７を表す。或いは、該阻害剤ペプチドは、δＶ１−２、δＶ１−５及び／又はδＶ５、又はδＶ１−１、δＶ１−２、δＶ１−５及びδＶ５のいくつかの組合せなどのＰＫＣの他の断片であり得る。ラトゥスノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からのδＶ１−２のアミノ酸配列は、配列番号２（ＡＬＴＴＤＲＧＫＴＬＶ）に示されており、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＨ７６５０５に見られるラットδＰＫＣのアミノ酸３５から４５を表す。ラトゥスノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からのδＶ１−５のアミノ酸配列は、配列番号３（ＫＡＥＦＷＬＤＬＱＰＱＡＫＶ）に示されており、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＨ７６５０５に見られるラットδＰＫＣのアミノ酸１０１から１１４を表す。δＶ５のアミノ酸配列は、配列番号４に示されており、アミノ酸１１（アスパラギン酸）がプロリンで置換されていることを除いてＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ０１３８１に見られるヒトδＰＫＣのアミノ酸５６９〜６２６を表す。
【００３３】
該阻害剤ペプチドとしては、Ｌ−アミノ酸などの天然アミノ酸又はＤ−アミノ酸などの非天然アミノ酸などを挙げることができる。該ペプチド内のアミノ酸は、ペプチド結合により、又は本明細書に記載された修飾ペプチドにおいては非ペプチド結合により結合できる。
【００３４】
アミノ酸を結合するアミド結合に対する多種多様の修飾を成すことができ、当業界に知られている。このような修飾は、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５５５３ページ（２００３）、及びＲｉｐｋａ，Ａ．Ｓ．、Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４４１ページ（１９９８）などの総説で考察されている。これらの修飾をデザインして、ペプチドの効力を増加させることによるか、又はペプチドの半減期を増加させることによりペプチドの性質を改善する。
【００３５】
ペプチドの効力は、ペプチドの立体配座の可動性を制限することにより増加させることができる。これは、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎらのペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）方法及び、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．らのアルファ修飾（Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１３０３ページ（１９９６））などのアミド結合の窒素又はアルファ炭素上にさらなるアルキル基の置換などにより達成できる。アミド窒素及びアルファ炭素は共に結合して、さらなる束縛を提供することができる（Ｓｃｏｔｔら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．６：１６２９〜１６３２ページ（２００４））。
【００３６】
ペプチドの半減期は、ペプチド鎖に非分解性部分を導入することにより延長できる。これは、例えば、尿素残基によるアミド結合の置換（Ｐａｔｉｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：７２７４〜７２８０ページ（２００３））又はアザペプチド結合（Ｚｅｇａ及びＵｒｌｅｂ、Ａｃｔａ  Ｃｈｉｍ．Ｓｌｏｖ．４９：６４９〜６６２ページ（２００２））により達成できる。ペプチド鎖に導入できる非分解性部分の他の例としては、該鎖に対してさらなる炭素（「ベータペプチド」、Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｈ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３１：１７３ページ（１９９８））或いはエテン単位（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８ページ（１９９２））の導入、又はヒドロキシエチレン部分（Ｐａｔａｎｉ，Ｇ．Ａ．、Ｌａｖｏｉｅ，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：３１４７〜３１７６ページ（１９９６））の使用が挙げられ、当業界にもよく知られている。さらに、１つ又は複数のアミノ酸は、例えば、Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎらのピロリノン類（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１１０３７ページ（２０００））、又はテトラヒドロピラン類（Ｋｕｌｅｓｚａ，Ａ．ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．５：１１６３ページ（２００３））などの等配電子部分により置換できる。
【００３７】
該ペプチド類は、主としてラトゥスノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からのアミノ酸配列を参照にして記載されているが、該ペプチド類は、当然のことながら配列番号１〜４に示されている特定のアミノ酸配列に限定されない。変異及び／又は進化の過程により、例えば、アミノ酸の挿入、置換、欠失などにより種々の長さ及び種々の構造を有するポリペプチドは、本明細書に記載されているようにアミノ酸配列相同性及び有利な機能性の理由により本明細書に示された配列に関連するか、又はそれと十分に類似させ得ることが当業者は認識するであろう。用語の「δＶ１−１ペプチド」、「δＶ１−２ペプチド」、「δＶ１−５ペプチド」及び「δＶ５ペプチド」は、本明細書に記載された特徴を有するペプチド類を一般に称するために用いられ、好ましい例としては、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を有するペプチド類が挙げられる。本明細書に記載されている脳血流を増加させる働きをするペプチド類の変異体もまた、この定義及び本発明の範囲内に含まれる。
【００３８】
本明細書に記載された阻害剤ペプチドはまた、少なくともそれと約５０％の同一性を有し、脳血流を増加させる働きをする、本明細書に示されたアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を包含する。本発明に包含された阻害剤ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に示された配列番号１〜４を含むアミノ酸配列に対して、好ましくは、少なくとも約６０％の同一性、さらに少なくとも約７０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも約７５％又は８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８５％又は９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を有する。
【００３９】
同一性パーセントは、例えば、国立予防衛生研究所から入手できる２．２．９．版などの最新のＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定できる。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８ページ及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０ページ（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７ページ；及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２ページ（１９９７）に検討されているアラインメント法に基づいている。手短に言うと、ＢＬＡＳＴプログラムは、２つの配列のうちのより短い方の全シンボル数により割られた同一整列シンボル数（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）として同一性を定義する。該プログラムは、比較されるタンパク質の全長にわたって同一性パーセントを決定するために使用できる。デフォルトパラメータを提供して、例えば、プログラムによるｂｌａｓｔｐにおいてショートクエリー配列により検索を最適化する。該プログラムはまた、Ｗｏｏｔｔｏｎ及びＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１４９〜１６３ページ（１９９３）のＳＥＧプログラムにより決定されたクエリー配列のマスクオフセグメントに対するＳＥＧフィルタの使用を可能にする。
【００４０】
したがって、本明細書に記載された阻害剤ペプチドの断片又は誘導体もまた、有利に利用でき、それらは、脳血流を増加させるために本明細書に記載された配列番号１〜４に対して指定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。例えば、δＰＫＣを阻害するのに有効であり、本明細書に記載されている哺乳動物の脳血流を増加させるδＶ１−１、δＶ１−２、δＶ１−５及びδＶ５の断片又は誘導体もまた、本発明に有利に利用できる。
【００４１】
本明細書に記載されたアミノ酸配列において、保存的アミノ酸置換を成すことができ、本発明に有利に利用し得るペプチド誘導体を得ることができる。当業界に知られており、本明細書に参照される保存的アミノ酸置換は、例えば、構造、サイズ及び／又は化学的性質に関して同様の側鎖を有するアミノ酸によりタンパク質内のアミノ酸を置換することを含む。例えば、各々以下の群内のアミノ酸は、同一群の他のアミノ酸と交換できる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンなどの脂肪族側鎖を有するアミノ酸；セリン及びトレオニンなどの非芳香族ヒドロキシル含有側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性側鎖を有するアミノ酸；グルタミン及びアスパラギンなどのアミド側鎖を有するアミノ酸；リシン、アルギニン及びヒスチジンなどの塩基性アミノ酸；フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンなどの芳香族環側鎖を有するアミノ酸；及びシステイン並びにメチオニンなどの硫黄含有側鎖を有するアミノ酸。さらに、アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン及びグルタミンなどのアミド側鎖を有するアミノ酸と交換可能であることが本明細書で考えられている。
【００４２】
したがって、δＰＫＣの有効な阻害及び脳血流の同時増加をもたらすことが予想されるδＶ１−１の修飾としては、下段に示される配列番号１に対する以下の変更：ｔＦＮＳＹＥＬＧＳＬ（配列番号５）、ａＦＮＳＹＥＬＧＳＬ（配列番号６）、ＳＦＮＳＹＥＬＧｔＬ（配列番号７）が挙げられ、ｔＦＮＳＹＥＬＧｔＬ（配列番号８）などのこれら３つの置換の任意の組合せを含む。他の可能性のある修飾としては、ＳｙＮＳＹＥＬＧＳＬ（配列番号９）、ＳＦＮＳｆＥＬＧＳＬ（配列番号１０）、ＳＮＳＹｄＬＧＳＬ（配列番号１１）、ＳＦＮＳＹＥＬｐＳＬ（配列番号１２）が挙げられる。
【００４３】
本発明において機能を果たすペプチドを生じると予想される他の可能な修飾は、ＳＦＮＳＹＥｉＧＳｖ（配列番号１３）、ＳＦＮＳＹＥｖＧＳｉ（配列番号１４）、ＳＦＮＳＹＥＬＧＳｖ（配列番号１５）、ＳＦＮＳＹＥＬＧＳｉ（配列番号１６）、ＳＦＮＳＹＥｉＧＳＬ（配列番号１７）、ＳＦＮＳＹＥｖＧＳＬ（配列番号１８）、ａＦＮＳＹＥＬＧＳＬ（配列番号１９）、上記の修飾の任意の組合せ、及び本明細書に記載された他の保存的アミノ酸置換などの１つ又は２つのＬからＩ又はＶへの変更が挙げられる。
【００４４】
δＶ１−１の断片及び断片の修飾：ＹＥＬＧＳＬ（配列番号２０）、ＹｄＬＧＳＬ（配列番号２１）、ｆｄＬＧＳＬ（配列番号２２）、ＹｄｉＧＳＬ（配列番号２３）、ｉＧＳＬ（配列番号２４）、ＹｄｖＧＳＬ（配列番号２５）、ＹｄＬｐｓＬ（配列番号２６）、ＹｄＬｇｉＬ（配列番号２７）、ＹｄＬＧＳｉ（配列番号２８）、ＹｄＬＧＳｖ（配列番号２９）、ＬＧＳＬ（配列番号３０）、ｉＧＳＬ（配列番号３１）、ｖＧＳＬ（配列番号３２）、ＬｐＳＬ（配列番号３３）、ＬＧｉＬ（配列番号３４）、ＬＧＳｉ（配列番号３５）、ＬＧＳｖ（配列番号３６）なども企図されている。
【００４５】
したがって、さらに本明細書に用いられる用語の「δＶ１−１ペプチド」とは、配列番号１によって識別されるペプチドを称し、限定はしないが、配列番号５〜１９に示されたペプチドなど、配列番号１のアミノ酸配列に対して本明細書に記載されている指定の同一性パーセントを持つアミノ酸配列を有するペプチドを称し、限定はしないが、配列番号２０〜３６により例示されるように、本明細書に記載された脳血流を増加させるために活性を保持するこれらのペプチドの任意の断片を称す。
【００４６】
δＰＫＣの有効な阻害及び脳血流の同時増加をもたらすことが予想されるδＶ１−２の修飾としては、下段に示される配列番号２に対する以下の変更：ＡＬｓＴＤＲＧＫＴＬＶ（配列番号３７）、ＡＬＴｓＤＲＧＫＴＬＶ（配列番号３８）、ＡＬＴＴＤＲＧＫｓＬＶ（配列番号３９）、及びこれら３つの置換の組合せのＡＬＴＴＤＲｐＫＴＬＶ（配列番号４０）、ＡＬＴＴＤＲＧｒＴＬＶ（配列番号４１）、ＡＬＴＴＤｋＧＫＴＬＶ（配列番号４２）、ＡＬＴＴＤｋＧｋＴＬＶ（配列番号４３）、１つ又は２つのＬからＩ又はＶへの変換並びにＶからＩ又はＬへの変換及び上記の任意の組合せが挙げられる。特に、Ｌ及びＶは、Ｖ、Ｌ、ＩＲで置換でき、Ｄ、Ｅは、Ｎ又はＱで置換できる。当業者は、本明細書の説明に鑑みてδＶ１−２の他の誘導体を達成するために成され得る他の保存的置換に気づくであろう。
【００４７】
したがって、さらに本明細書に用いられる用語の「δＶ１−２ペプチド」とは、配列番号２によって識別されるペプチドを称し、限定はしないが、配列番号３７〜４３に示されたペプチドなど、配列番号２のアミノ酸配列に対して本明細書に記載されている指定の同一性パーセントを持つアミノ酸配列を有するペプチドを称し、本明細書に記載された脳血流を増加させるために活性を保持するこれらのペプチドの任意の断片を称す。
【００４８】
δＰＫＣの有効な阻害及び脳血流の同時増加をもたらすことが予想されるδＶ１−５の修飾としては、下段に示される配列番号３に対する以下の変更：ｒＡＥＦＷＬＤＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号４４）、ＫＡｄＦＷＬＤＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号４５）、ＫＡＥＦＷＬｅＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号４６）、ＫＡＥＦＷＬＤＬＱＰＱＡｒＶ（配列番号４７）、ＫＡＥｙＷＬＤＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号４８）、ＫＡＥＦＷｉＤＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号４９）、ＫＡＥＦＷｖＤＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号５０）、ＫＡＥＦＷＬＤｉＱＰＱＡＫＶ（配列番号５１）、ＫＡＥＦＷＬＤｖＱＰＱＡＫＶ（配列番号５２）、ＫＡＥＦＷＬＤＬｎＰＱＡＫＶ（配列番号５３）、ＫＡＥＦＷＬＤＬＱＰｎＡＫＶ（配列番号５４）、ＫＡＥＦＷＬＤＬＱＰＱＡＫｉ（配列番号５５）、ＫＡＥＦＷＬＤＬＱＰＱＡＫｌ（配列番号５６）、ＫＡＥＦＷａＤＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号５７）、ＫＡＥＦＷＬＤａＱＰＱＡＫＶ（配列番号５８）、ＫＡＥＦＷＬＤＬＱＰＱＡＫａ（配列番号５９）が挙げられる。
【００４９】
ＫＡＥＦＷＬＤ（配列番号６０）、ＤＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号６１）、ＥＦＷＬＤＬＱＰ（配列番号６２）、ＬＤＬＱＰＱＡ（配列番号６３）、ＬＱＰＱＡＫＶ（配列番号６４）、ＡＥＦＷＬＤＬ（配列番号６５）、及びＷＬＤＬＱＰＱ（配列番号６６）を含むδＶ１−５の断片もまた企図されている。
【００５０】
δＶ１−５の断片に対する修飾もまた企図されており、完全長断片並びに本明細書に記載された他の保存的アミノ酸置換について示された修飾を含む。さらに本明細書に用いられる用語の「δＶ１−５ペプチド」とは、配列番号３を称し、配列番号３のアミノ酸配列に対して本明細書に記載されている指定の同一性パーセントを持つアミノ酸配列を有するペプチドを称し、並びに本明細書に記載された脳血流を増加させるために活性を保持するそれらの断片を称す。
【００５１】
δＰＫＣの有効な阻害及び本明細書に記載されている脳血流の同時増加をもたらすことが予想されるδＶ５の修飾としては：Ｑにより３位のＲを置換すること；Ｔにより８位のＳを置換すること；Ｗにより１５位のＦを置換すること；Ｌにより６位のＶを置換すること；Ｅにより３０位のＤを置換すること；Ｒにより３１位のＫを置換すること；Ｄにより５３位のＥを置換すること、並びにこれらの修飾の種々の組合せ、及び本明細書の説明に鑑みて当業者により成し得る他の修飾など、１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を作製することが挙げられる。
【００５２】
δＶ１−５の断片もまた企図されており、例えば、以下の：ＳＰＲＰＹＳＮＦ（配列番号６７）、ＲＰＹＳＮＦＤＱ（配列番号６８）、ＳＮＦＤＱＥＦＬ（配列番号６９）、ＤＱＥＦＬＮＥＫ（配列番号７０）、ＦＬＮＥＫＡＲＬ（配列番号７１）、ＬＩＤＳＭＤＱＳ（配列番号７２）、ＳＭＤＱＳＡＦＡ（配列番号７３）、ＤＱＳＡＦＡＧＦ（配列番号７４）、ＦＶＮＰＫＦＥＨ（配列番号７５）、ＫＦＥＨＬＬＥＤ（配列番号７６）、ＮＥＫＡＲＬＳＹ（配列番号７７）、ＲＬＳＹＳＤＫＮ（配列番号７８）、ＳＹＳＤＫＮＬＩ（配列番号７９）、ＤＫＮＬＩＤＳＭ（配列番号８０）、ＰＦＲＰＫＶＫＳ（配列番号８１）、ＲＰＫＶＫＳＰＲ（配列番号８２）、及びＶＫＳＰＲＰＹＳ（配列番号８３）が挙げられる。
【００５３】
δＶ５の断片に対する修飾もまた企図されており、完全長断片並びに本明細書に記載された他の保存的アミノ酸置換に示された修飾を含む。さらに本明細書に用いられる用語の「δＶ５ペプチド」とは、配列番号４を称し、配列番号４のアミノ酸配列に対して本明細書に記載されている指定の同一性パーセントを持つアミノ酸配列を有するペプチドを称し、並びに本明細書に記載された脳血流を増加させるために活性を保持するそれらの断片を称す。本明細書の治療に使用される阻害剤は、本明細書に記載されているペプチドの組合せを含むことができる。
【００５４】
δＰＫＣの阻害剤として作用できる小分子など、他の好適な分子又は化合物は、当業界に知られた方法により測定できる。例えば、このような分子は、δＰＫＣのその細胞内局在への移行を阻害する能力により同定できる。このようなアッセイは、例えば、蛍光標識酵素及び蛍光顕微鏡を利用して、特定の化合物又は薬剤が、δＰＫＣの細胞移行を促進させ得るかどうかを判定することができる。このようなアッセイは、例えば、Ｓｃｈｅｃｈｔｍａｎ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１６）：１５８３１〜１５８４０ページ（２００４）に記載されており、選択された抗体の使用を含んでいる。細胞移行を測定する他のアッセイとしては、Ｄｏｒｎ，Ｇ．Ｗ．ＩＩら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２２）：１２７９８〜１２８０３ページ（１９９９）並びにＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．及びＭｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．７６（４）：６５４〜６３ページ（１９９５）に記載されているウェスタンブロット解析が挙げられる。
【００５５】
該阻害剤は、融合タンパク質の一部とすることによって修飾することができる。融合タンパク質としては、阻害剤ペプチドの細胞取込みを増加させる機能を果たすか、治療効果などの別の所望の生物学的効果を有するか、又はこれらの機能の双方を有し得るタンパク質又はペプチドを挙げることができる。例えば、δＶ１−１ペプチド、又は本明細書に記載された他のペプチドを、所望の生物学的応答を誘発するサイトカイン又は他のタンパク質にコンジュゲートさせるか、又は結合させることが望ましいと考えられる。融合タンパク質は、当業者に知られた方法により生成し得る。阻害剤ペプチドを、当業界に知られた種々の方法で別のペプチドに結合させるか、又はコンジュゲートさせることができる。例えば、阻害剤ペプチドを、細胞透過性キャリヤペプチド又は本明細書に記載された他のペプチドなどのキャリヤペプチドに架橋により結合でき、融合タンパク質の両ペプチドは、それらの活性を保持する。さらなる例として、該ペプチドは、１つのペプチドのＣ末端から他のペプチドのＮ末端にアミド結合により互いに結合、又はコンジュゲートさせることができる。阻害剤ペプチドと融合タンパク質の他のメンバーとの間の結合は、ペプチド結合により非開裂性とするか、例えば、エステル又は当業界に知られている他の開裂性結合により開裂性とすることができる。
【００５６】
さらに、本発明の他の形態において、細胞透過性キャリヤペプチド、又は阻害剤ペプチドの細胞取込みを増加し得る他のペプチドなどのキャリヤタンパク質は、例えば、配列番号８４（ＣＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）に示され、Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８〜７１６７ページ（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：１０８６ページ（１９９６）に検討されているＮ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合による架橋により阻害剤に結合し得るショウジョウバエ−アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）のホメオドメイン誘導配列であり得る。或いは、該阻害剤は、Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０〜１６０１７ページ（１９９７）、米国特許第５，８０４，６０４号Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＴ４８０７０に記載されている１型ヒト免疫不全症ウイルスから；又はＭｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．５６：３１８〜３２５ページ（２０００）及びＲｏｔｈｂａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６：１２５３〜１２５７ページ（２０００）に記載されているポリアルギニンにより、トランス活性化調節タンパク質（Ｔａｔ）誘導輸送ポリペプチド（配列番号８５、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲに示されるＴａｔのアミノ酸４７〜５７からなど）により修飾できる。阻害剤の細胞取込みを増加させるために、該阻害剤は、当業者に知られた他の方法により修飾できる。
【００５７】
該阻害剤は、種々の形態で有利に投与できる。例えば、該阻害剤は、舌下投与用の錠剤形態、液剤又は乳濁剤で投与できる。該阻害剤はまた、製薬的に許容できる担体又は媒体により混合できる。該媒体は、例えば、水、生理食塩水又は他の水溶液などの非経口投与に好適な液剤であっても、油剤又はエーロゾル剤であってもよい。該媒体としては、静脈内投与又は動脈内投与用に選択でき、当業界に知られた保存剤、制菌剤、緩衝剤及び抗酸化剤を含むことができる滅菌水溶液又は非水溶液を挙げることができる。エーロゾル形態において、該阻害剤は、最適の分散性のために当業界に知られている粒径、形態及び表面エネルギーなどの性質を有する粉剤として使用できる。錠剤形態において、固体媒体としては、例えば、ラクトース、澱粉、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成又は天然カルシウムアロケート、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母又はそれらの組合せが挙げられる。錠剤は、経口溶解を促進する１種又は複数種の試剤を含むことが好ましい。該阻害剤は、当業界に知られた他の同様の薬物を投与する形態でも投与できる。
【００５８】
利用される該阻害剤は、阻害剤に対する患者の脱感作を引き起こすことなく、長期投与することが可能である。即ち、該阻害剤は、複数回又は１日、２日又は３日以上；１週、２週、又は３週以上又は数カ月の持続期間後、患者に投与でき、それぞれ血管内の血流の増加を引き起こし続ける。
【００５９】
該阻害剤は、種々の経路により患者に投与できる。例えば、該阻害剤は、腹腔内；静脈内；動脈内；皮下；又は筋肉内など非経口的に投与できる。該阻害剤はまた、直腸及び膣内などの粘膜表面；鼻腔内；経口又は鼻腔内の吸入；舌下などの経口；眼内及び経皮を経て投与できる。これらの投与経路の組合せもまた、想定される。好ましい投与様式は、閉塞又は部分的閉塞大脳動脈、又はこのような閉塞又は部分的閉塞動脈に結合する動脈を通した注入液又は再灌流による。本明細書における「部分的閉塞大脳動脈」とは、脳血管に影響を及ぼす血流減少事象後、このような事象又は発作前の血流と比較して、血流が減少している脳動脈を意味する。このような血流減少事象としては、虚血性発作又は他の低酸素事象、例えば、出血性脳卒中に続いて起こる可能性がある血管狭窄又は血管攣縮が挙げられる。その血管に関するベースライン又は標準的血流率と比較して、血流が減少する大脳動脈は、「部分的閉塞大脳動脈」の定義内に含まれる。このような血流率は、当業者に知られている。
【００６０】
該阻害剤の治療有効量が提供される。本明細書に用いられる該阻害剤の治療有効量は、哺乳動物の脳血管内の血流を増加させ、及び／又は出血性脳卒中後；慢性の高血圧により；及び／又は特発性原因によるなど、虚血性発作、血管狭窄又は血管攣縮を含む種々の細胞損傷事象により生じる細胞損傷、組織損傷或いは臓器損傷又は死亡を減少させるのに必要な阻害剤の量である。当業界に知られているように、この量は、投与時期（例えば、虚血事象前、該事象の発症時又は発症後）、投与経路、治療期間、使用される具体的な阻害剤、及び患者の健康状態によって変わる。当業者は、最適な投与量を判定できるであろう。一般に、典型的に利用される阻害剤の量は、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るが、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇまでが好ましい。
【００６１】
阻害剤の量は、例えば、虚血事象の発症時、又は前述の事象の発症後の指定された時間後、即ち発症後約２４時間までなどの治療の前の血流と比較して、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約２５％、さらに少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらに少なくとも約１００％増加させるのに十分であることが好ましい。前述の事象の発症時、又は該事象の発症の約２時間後、約３時間後、或いは約６時間後と比較した場合、典型的に上記の列挙されたレベルにより血流は増加する。当然のことながら、上記に列挙されたものよりも大きな血流増加もまた得られる可能性がある。
【００６２】
血流が増加され得る血管は、血流増加が望ましいいずれの脳血管をも含む。また、このような血管としては、閉塞に感受性であり得る全面的又は部分的に閉塞され得るもの、並びに虚血性脳卒中などの低酸素事象、グルコースなどの細胞栄養物の送達を減少させる血管狭窄又は血管攣縮などの他の事象にさらされた血管が挙げられる。このような血管としては、例えば、前大脳動脈、中大脳動脈及び後大脳動脈などの脳動脈が挙げられる。脳血管、又は他の脳血管に血液を供給する他の血管はまた、本明細書に記載されるように血流を増加させるために治療できる。このような血管としては、例えば、内頚動脈などの椎骨動脈及び頚動脈、通常の頚動脈及び外頚動脈が挙げられる。前述の動脈から分枝している動脈内の血流もまた、本発明に記載されているように増加させ得る。例えば、中大脳動脈から分枝しているレンズ核線条体動脈は、本明細書に記載された方法に従って治療できる。さらに、脳微小血管の毛細血管及び細動脈において血流を増加でき、このような血管は、当業界によく知られている。脳血管内の脳血流を増加させる治療に受入れられるこの脳血管のリストは、十分ではない。本明細書の説明に鑑みて、当業者は、本明細書に記載された方法に従って治療し得る他の脳血管に気づいている。
【００６３】
治療を受ける患者は典型的に、虚血事象又は低酸素事象などの多くの事象のうちの１つから脳血流減少を起こしやすいか、又は経験している患者、或いは他にこのような事象の結果、細胞損傷、組織損傷又は臓器損傷を招く可能性のある患者など、このような治療を必要とする患者である。該患者としては、出血性脳卒中後の血管狭窄又は血管攣縮；慢性の高血圧及び／又は特発性原因により脳血流減少を経験している者、又は経験を受けやすい者を挙げることができる。該患者はさらに、典型的には脊椎動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物である。治療を受けることができる他の動物としては、ウマ、ヒツジ、ウシ、及びブタなどの家畜動物が挙げられる。治療を受けることができる他の代表的な動物としては、ネコ、イヌ；マウス、ラット、スナネズミ、ハムスター及びモルモットなどのげっ歯目からのものなどのげっ歯類；ウサギ及び野ウサギなどのウサギ目のメンバー、このような治療から利益を得ることができる任意の他の哺乳動物が挙げられる。患者は、好ましくは虚血事象の発症時に、インビボで治療されることが好ましい。患者はまた、約１分から約１０時間後、好ましくは約１分から約２時間の間、さらに好ましくは、低酸素及び／又は細胞栄養物の欠乏に導く虚血事象又は他の事象の発生後、約２４時間以内に治療を受けることができる。
【００６４】
患者は典型的に、脳血流増加の利益を得ることができる者である。例えば、虚血性脳卒中などの低酸素事象を経験した患者、又は慢性の高血圧及び／又は特発性原因による出血性脳卒中後の血管狭窄又は血管攣縮を有する患者は、本明細書に既に記載された不完全虚血領域に対する血流増加の利益を得ることができる。
【００６５】
可能性として救出し得る組織である不完全虚血領域は、当業者に知られている方法により患者に確認できる。例えば、不完全虚血領域は、Ｄｕｏｎｇ，Ｔ．Ｑ．及びＦｉｓｈｅｒ，Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌ．Ｒｅｐ．６：２６７〜２７３ページ（２００４）に記載されている灌流加重画像及び拡散荷重画像により規定された異常領域の差異を観察することにより確認できる。規定された領域の差異は灌流／拡散ミスマッチとして知られている。灌流／拡散ミスマッチ領域は不完全虚血領域に近似すると推定される。血管狭窄及び血管攣縮は通常、当業界に知られているデジタル減法血管造影法を用いて検出される。
【００６６】
本発明のさらに別の態様において、例えば、出血性脳卒中後の虚血事象、血管狭窄又は血管攣縮などの疾患又は病態による；慢性の高血圧による；及び／又は特発性原因による血流減少を特徴とするか、又は経験している哺乳動物などの脊椎動物の脳血管内の血流増加用キットを提供する。一形態において、キットには、δＰＫＣの阻害剤及びそれぞれの脳血管内の血流を増加させるために本明細書に記載された阻害剤を使用するための取扱い説明書を含む。本発明のある形態において、阻害剤は、本明細書に記載されているδＶ１−１、δＶ１−２、δＶ１−５又はδＶ５ペプチドであるか、又は本明細書に記載されたこれらペプチド類の断片或いは誘導体であるか、又はこれらペプチド類、それらの断片及び／又はそれらの誘導体のいくつかの組合せである。キットにはさらに、該阻害剤を投与するための当業界に知られたシリンジ又は他の同様のデバイスを含む。キットの構成材料は、ボックスなどの容器に入れられ、各構成材料は、ボックス内で互いに比較的に間隔をおいて配置されている。阻害剤は、滅菌バイアル又は同様の容器内に含ませることができる。阻害剤が、乾燥又は凍結乾燥形態で提供され、再構成を必要とする場合、キットにはさらに、滅菌バイアル又は同様の容器内に、本明細書で既に記載された製薬的に許容できる担体を含む。好ましい担体は、阻害剤を溶解させるために本明細書に記載された滅菌液である。
【００６７】
ここで、上記の本発明を例証する具体的な実施例を参照する。当然のことながら、実施例は、好ましい実施形態を例証するために提供され、それによって特許請求の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
虚血性／再灌流障害にさらされたラットにおける脳血流の増加
本実施例は、δＶ１−１ペプチドによりラットを処置することによって、ラット中大脳動脈において血流増加が達成されたことを示す。
【００６９】
材料
オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２８０〜３２０ｇ；ｎ＝８）を、脳虚血及び再灌流、その後の脳血流をモニタリングするために用いた。Ｔａｔ又はδＶ１−１ペプチドを合成し、既に記載されているように（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２５（２０）：１１１１４〜１１１１９ページ（２００１）；Ｉｎａｇａｋｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１（１０８）：２３０４〜２３０７ページ（２００３））、Ｃｙｓ  Ｓ−Ｓ結合を介して結合させた。手法直後にイソフルランの過剰投与によりラットを殺処理した。
【００７０】
方法
虚血及び再灌流は、Ｍａｉｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９４（１）：９０〜９６ページ（２００１）に記載されている閉塞腔内縫合を用いてオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに誘導した。手短に言うと、フレームにより丸みを付けたチップを有するコーティングのない３−０ナイロンモノフィラメント縫合糸の３０ｍｍ長のセグメントを外頚動脈の断端に挿入し、二分枝から内頚動脈に１９〜２０ｍｍ進行させて中大脳動脈（ＭＣＡ）の小孔を閉塞させた。縫合糸の配置後、創傷を閉じ、動物をケージ内に２時間戻した。この時間後、動物を再度麻酔にかけ、縫合糸を取り除き、脳の再灌流を可能にした。
【００７１】
再灌流直後、ラットを定位固定枠内に置き、虚血領域に対応する同側半球上のブレグマに対し頭蓋１ｍｍ後方及び６ｍｍ側方に骨孔をあけた。脳血流（ＣＢＦ）は、マイクロマニピュレータにより制御されたレーザードップラープローブを用いてこの骨孔を経て測定した（Ｌａｓｅｒｆｌｏ  ＢＰＭ４０３Ａレーザードップラー流量計、Ｖａｓａｍｅｄｉｃ、セントポール、ミネソタ州）。ディスプレイはデジタルのみであり、１秒当たり８つのデータポイントを採取し、０．１秒毎に移動平均データを得るために設定した（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｚｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇ．Ｓｃｉ．１５３（１）：２５〜３１ページ（１９９７）：Ｂｏｒｌｏｎｇａｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０１０（１〜２）：１０８〜１１６ページ（２００４））。ＣＢＦリーディングは、再灌流の発生から３０分で開始した。ベースラインＣＢＦを確立するための２０〜３０分の時間後、δＰＫＣ阻害剤であるδＶ１−１ペプチド（送達用にＴａｔに結合した）を腹腔内ボーラスにより注入し、血流をさらに２０〜３０分間モニターした。偽性処理動物は、虚血を受けないが、その他は同様に処置された。
【００７２】
結果
δＶ１−１ペプチドのボーラス腹腔内送達は、図２に示されるように虚血／再灌流障害にさらされたラットにおいて、３０分以内に脳血流を増加させることが判明した。偽性処置動物は、図１に見られるように送達３０分以内に、δＶ１−１ペプチドによる処置後の血流に変化を示さなかった。さらに、生理食塩単独又はＴａｔ対照ペプチドの送達は、偽性又は虚血処置動物のいずれにおいてもＣＢＦに対して効果を示さなかった（データは示していない）。
【００７３】
（実施例２）
虚血／再灌流障害にさらされたラットにおける脳血流に対するδＰＫＣの阻害剤の長期投与の効果
本実施例により、虚血／再灌流障害にさらされ、δＶ１−１ペプチドにより複数回処置されたラットは、阻害剤に対して脱感作にならなかったことを示している。実験は、実施例１に記載されたとおり実施した。
【００７４】
結果
δＶ１−１ペプチドの反復腹腔内投与により、図３に示されるように血流をさらに増加した。
【００７５】
（実施例３）
虚血／再灌流障害にさらされたラットにおける脳組織の顕微鏡検査
本実施例は、脳卒中後のδＶ１−１−ＴＡＴの送達が、脳血管病状を改善することを示している。より具体的には、中大脳動脈の閉塞後のδＶ１−１−ＴＡＴの腹腔内送達により、開存微小血管数を増加させ、脳卒中後の虚血領域における微小血管病状を改善した。
【００７６】
方法
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１２０分ＭＣＡ閉塞を行い、次いで４時間の再灌流を行った。再灌流の発生時に、ラットはボーラス腹腔内注入によりＴＡＴ又はδＶ１−１−ＴＡＴペプチドにより処置した（１ｍＬ中０．２ｍｇ／ｋｇ、１群当たりｎ＝４）。偽性動物を同様に処置したが、虚血は行わず、ペプチドも投与しなかった（Ｎ＝４）。再灌流期間後、ラットを高濃度のイソフルランで麻酔し、０．７％のＮａＣｌ／ＰＢＳを用いてトランス心灌流を行い、次いで０．７％のＮａＣｌ／ＰＢＳ中４％のホルムアルデヒドを投与した。
【００７７】
脳を取り出し、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３中の２％ホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド中、４℃で一晩維持した。次いで、脳切片（約１ｍｍ３）を、同側皮質（レーザードップラー流量計により測定された領域に相当する）上のブレグマに対し約１ｍｍ前方／約６ｍｍ側方で皮質表面から切開した。組織を、１％四酸化オスミウム中１時間、後固定し、水で洗浄し、１％酢酸ウラニル液で染色した。組織をエタノール勾配、次いで１００％酸化プロピレンを用いて脱水し、Ｅｐｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｅｄ  ８１２媒体に浸潤させ、鋳型に入れ、スライスする前に６５℃で一晩重合化させた。切片（７５ｎｍと９０ｎｍ）を、ｆｏｒｍｖａｒ／ＣａｒｂｏｎでコーティングされたＣｕグリッド上に取り上げ、アセトン中１：１超飽和酢酸ウラニル（７．７％）中、１５秒間着色し、次いで０．２％クエン酸鉛中３分から４分間染色した（すべての試薬はＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州から入手）。組織は、ＪＥＯＬ  １２３０透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により８０ｋＶで観察し、Ｇａｔａｎ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ７９１デジタルカメラを用いて写真を撮った。
【００７８】
開存血管数を定量するために、１０〜１５個の非重複視野（１２００×倍率）を、各動物から得た２〜３枚のスライスから写真に撮った。血管を確認し、管腔及び内皮層が明らかな場合、カウントした。血管は、より高い倍率でこれらの視野にわたって走査することによって確認した。血管数の評価は、処置群に対して盲検化された観察者により実施した。次いで１視野当たりの血管数を、各動物群（１群当たりｎ＝４）に対して平均した。群間の統計的な差は、対のないｔ検定を用いて解析した。高倍率画像（５０００〜１５０００×）を撮って、微小血管形態を評価した。
【００７９】
結果
虚血領域（ブレグマに対して１ｍｍ後方／６ｍｍ側方）に対応する脳皮質の定義された領域を調べた。最初に低倍率画像（１２００×）を用いて微小血管数を定量し、これらの画像を図４Ａ〜４Ｃに示している。認識可能な微小血管管腔及び周囲の内皮層が確認される場合、血管をカウントした。ＴＡＴペプチドにより処置した虚血動物において、δＶ１−１−ＴＡＴ処置組織と比較して血管数の有意な減少が見られた（ＴＡＴ、１．６±０．６本の血管／視野；δＶ１−１−ＴＡＴ。３．１±０．６本の血管／視野；ｐ＜０．０５；ｎ＝４；図５及び図４Ｄ〜４Ｆ）。虚血にさらされ、次いで再灌流でδＶ１−１−ＴＡＴ処置された動物の微小血管数は、偽性動物のものと同様であった（偽性、３．８＋／−０．４本の血管／視野；ｎ．ｓ．；ｎ＝４；図５及び図４Ｃ対図４Ａ）。
【００８０】
健常な微小血管構造の特徴を、偽性対照動物の対照組織において高倍率ＴＥＭを用いて観察した。これらは、無傷の基底層、明瞭で開存性血管管腔並びに異常な血管周囲空間の欠如を含んだ（図４Ｄ、４Ｇ、４Ｊ）。虚血動物由来の脳組織における超構造損傷の証拠（図４Ｉ、４Ｊ）により、血管浮腫の兆候、膨潤星状細胞のエンドフット過程、拡大内皮細胞核、基底層の破壊、血管管腔の圧縮、及び管腔表面の不規則性などが見られた。しかしながら、再灌流のみでδＶ１−１−ＴＡＴ（０．２ｍｇ／ｋｇ）により処置された虚血動物において、微小血管構造は、有意に損傷が少なく現れ（図４Ｆ、４Ｉ、４Ｌ）；いくつかの星状細胞のエンドフットの膨潤が、少数の血管に見られたが（図４Ｆ）、大部分の血管は、正常に見えた（図４Ｉ、４Ｌ）。
【００８１】
多くの代表的な態様及び実施形態を上記に検討したが、当業者は、ある一定の修飾、置換、付加及びそれらの副次的組合せを認識するであろう。したがって、以下の添付請求項及び以後導入された請求項は、それらの真の精神及び範囲内にあるすべてこのような修飾、置換、付加及び副次的組合せを含むように解釈されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例１に十分に示されるように、δＶ１−１ペプチドの治療量により処置された偽性（非脳卒中）ラットにおける時間の関数としての脳血流（ＣＢＦ）を示すグラフである。矢印は、δＶ１−１ペプチドの送達を示す。偽性処置ラットは、δＶ１−１ペプチドにより処置し、ＣＢＦは、すべて実施例１に記載されたとおり測定した。
【図２】実施例１に十分に示されるように、中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞による虚血性／再灌流障害に供され、δＶ１−１ペプチドの治療量により処置されたラットにおける時間の関数としてのＣＢＦを示すグラフである。矢印は、δＶ１−１ペプチドの送達を示す。
【図３】実施例２に十分に示されるように、虚血性／再灌流障害にさらされ、δＶ１−１ペプチドの治療量の反復投与で処置されたラットにおける時間の関数としてのＣＢＦを示すグラフである。矢印は、δＶ１−１ペプチドの送達を示す。
【図４】虚血性／再灌流障害に供されない対照（健常）ラットからの脳組織（図４Ａ、４Ｄ、４Ｇ、４Ｊ）、及び中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞による虚血性／再灌流障害にさらされ、ＴＡＴペプチド（図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈ、４Ｋ）又はδＶ１−１−ＴＡＴ（図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉ、４Ｌ）により処置されたラットからの脳組織を示すコンピュータ生成顕微鏡写真である。
【図５】中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞による虚血性／再灌流障害にさらされ、ＴＡＴペプチド又はδＶ１−１−ＴＡＴ−処置組織により処置された動物に関する顕微鏡視野における平均微小血管数を示す棒グラフである。偽性処置動物は、同様に処置されたが、虚血性／再灌流障害又はペプチドの送達に供されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
2008526750.tif 000014
【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月24日(2007.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血流減少を経験している哺乳動物の脳血管内の虚血又は再灌流障害を治療する薬剤の製造のためのδタンパク質キナーゼＣ（δＰＫＣ）の阻害剤の使用であって、前記薬剤の投与は脳血管内の血流を増加させる使用。
【請求項２】
前記阻害剤が、ペプチドである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１、配列番号２に示されたアミノ酸を有するδＶ１−２、配列番号３に示されたアミノ酸を有するδＶ１−５、配列番号４に示されたアミノ酸を有するδＶ５、又はそれらの組合せである請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたδＶ１−１のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号２に示されたδＶ１−２のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号３に示されたδＶ１−５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、又は配列番号４に示されたδＶ５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を持つアミノ酸配列を有する請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記血管が、血管狭窄又は血管攣縮にさらされている請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記虚血事象から生じる不完全虚血領域における血流が、前記虚血事象中の血流と比較して増加する請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
血管狭窄事象又は血管攣縮事象による低灌流域における血流が、前記事象中の血流と比較して増加する請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記血管が、大脳動脈、毛細血管、又は細動脈である請求項１から８までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記大脳動脈が、前大脳動脈、中大脳動脈又は後大脳動脈である請求項１０に記載の使用。
【請求項１１】
前記血管が、頚動脈である請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記薬剤を、前記薬剤を投与する前の血流に比して少なくとも約１０％血流を増加させるのに有効な量で投与する請求項１から１１までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬剤を、前記阻害剤を投与する前の血流に比して少なくとも約５０％血流を増加させるための有効な量で投与する請求項１から１２までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記δＰＫＣの阻害剤が、キャリヤペプチドにコンジュゲートしている請求項１から１３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記キャリヤペプチドが、配列番号８４又は配列番号８５に示されたアミノ酸配列を有する請求項１５に記載の使用。
【請求項１６】
前記阻害剤を、非経口経路により投与する請求項１から１５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記阻害剤が、前記阻害剤に対して脱感作を引き起こすことなく長期投与できる請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記阻害剤を、患者に複数回投与する請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
血流減少を経験している哺乳動物の脳血管内の血流を増加させるキットであって、δＰＫＣの阻害剤及び前記血管内の血流を増加させるために前記阻害剤を使用するための取扱い説明書を含むキット。
【請求項２０】
前記阻害剤が、ペプチドである請求項２０に記載のキット。
【請求項２１】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１である請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたアミノ酸を有するδＶ１−１、配列番号２に示されたアミノ酸を有するδＶ１−２、配列番号３に示されたアミノ酸を有するδＶ１−５、配列番号４に示されたアミノ酸を有するδＶ５、又はそれらの組合せである請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列番号１に示されたδＶ１−１のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号２に示されたδＶ１−２のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、配列番号３に示されたδＶ１−５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、又は配列番号４に示されたδＶ５のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を持つアミノ酸配列を有する請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
前記δＰＫＣの阻害剤が、キャリヤペプチドにコンジュゲートしている請求項２０から２３までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記キャリヤペプチドが、配列番号８４又は配列番号８５に示されたアミノ酸配列を有する請求項２４に記載のキット。
【国際調査報告】
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2008526750.tif 000019
2008526750.tif 000020
2008526750.tif 000021
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