(57)【要約】【課題】漢方薬である麝香の有効成分とその酢酸塩のアミノ酸配列に関する。【解決手段】ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫ、ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨ、ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＥＲＱ及びＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣ並びにその酢酸塩のごとき漢方薬の麝香の有効成分から得られた酸配列が開示されている。この配列の作成方法と、抗炎症剤または免疫抑制剤としてのその物質の利用法も併せて開示されている。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然麝香の有効成分から分離されたペプチドであって、ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫ及びその酢酸塩（ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫ）Ａｃを含んでいることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
天然麝香の有効成分から分離されたペプチドであって、ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨ及びその酢酸塩（ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨ）Ａｃを含んでいることを特徴とするペプチド。
【請求項３】
天然麝香の有効成分から分離されたペプチドであって、ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＥＲＱ及びその酢酸塩（ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＥＲＱ）Ａｃを含んでいることを特徴とするペプチド。
【請求項４】
天然麝香の有効成分から分離されたペプチドであって、ＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣ及びその酢酸塩（ＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣ）Ａｃを含んでいることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
ペプチドまたはその酢酸塩であって、該ペプチドの配列はＥＣＰＬＬを含んでおり、該ペプチドの配列は請求項１から４のいずれかに記載のペプチドまたはその酢酸塩で少なくとも３０％保存されていることを特徴とするペプチドまたはその酢酸塩。
【請求項６】
薬剤組成物を投与する方法であって、薬剤組成物は請求項１から４のいずれかに記載のペプチドまたはその酢酸塩を含んでおり、該薬剤組成物は抗炎症剤または免疫抑制剤として利用されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のペプチドまたはその酢酸塩の製造法であって、該ペプチドを分離して純化し、薬剤効果を有した活性ペプチドまたはタンパク質を得るステップと、薬力学分析によりそれらの薬効を確定するステップと、そのアミノ酸配列を確定するステップと、動物または植物の活性部分または組織を使用してｃＤＮＡライブラリーを構築し、ペプチドをコード化する標的遺伝子を獲得するステップと、ペプチドのアミノ酸配列を獲得するステップとを含んでいることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は漢方薬である麝香の有効成分とその酢酸塩のアミノ酸配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方薬の有効成分の特定は漢方薬の近代化にとって必須である。出願人は何百種類もの一般的な薬草の主要成分と有効成分とを特定し、多くの有効成分の薬効を確認した。しかし、この点に関する研究はまだ不十分である。例えば、多くの特定された成分の臨床効果は確定されていない。漢方薬の有効成分の根本的な理論と研究技術は改良が必要であり、新理論と新規な技術が求められている。今日、遺伝子技術の発展に伴って、漢方薬のタンパク質とペプチドが漢方薬の有効成分研究の焦点となっている。
【０００３】
長い間、漢方薬のフラボン、ステロールまたはグリコシドのごとき有効成分の一般的な確定方法は化学的分析あるいは物理的分析に限定されてきた。研究者はペプチドやタンパク質にはさほど注目してこなかった。タンパク質とペプチドは様々な生物学的機能を発揮する重要な成分である。生物活性ペプチドとそれらの関連遺伝子は新規な治療薬あるいは医療用先駆物質の発見に導くであろう。
【０００４】
研究によって、麝香は約２５％のタンパク質を含有することが判明したが、麝香のポリペプチドの分子構造はまだ報告されていない。現在のところ、ムスコン、ムスコピリジン、Ｃ１９ステロイドのごとき化学組成物が合成できる。
【０００５】
第６次及び第７次５カ年計画中に、中国政府は一連の重要な科学研究を組織し、天然麝香の組成スペクトルを獲得し、合成麝香を製造する計画を立てた。研究者は天然麝香から麝香のポリペプチドを得た。このポリペプチドは１５種類のアミノ酸を含んでおり、巴豆油で引き起こされたラットの耳の炎症に対して麝香のポリペプチドは、ヒドロコルチゾンの３６倍（ｍｇ/ｋｇ体重ベース）または５００倍（モル濃度ベース）の抑制効果を有することが証明された。麝香ポリペプチドは、麝香が薬効を発揮するのに不可欠な成分であることも証明された。しかし、漢方薬の麝香が新薬承認を得るために当局に提出されたとき、麝香ポリペプチドの合成が失敗したために人工物質で置き換えられた。これは人々がいまだに天然麝香を好む理由の１つである。
【０００６】
麝香のポリペプチドがグリココルチコイドよりも強力な効果を有しているという事実により、麝香のポリペプチドは、アレルギー性喘息、腎炎、全身性エリシマトーデス、リュウマチ性関節炎、膿包性血管炎、筋無力症、糖尿病、等々のごとき免疫介在組織障害及び疾患に対して重要な治療効果を有すると考えられている。今日、これら障害と疾患はいまだにグルココルチコイドで治療されており、ステロイドホルモンにより副作用が引き起こされている。これらの弛緩は治療が非常に困難である。一般的に、麝香のポリペプチドは臨床利用で非常な価値があり、巨大な需要が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は漢方麝香の有効成分から得られるポリペプチド配列の提供及びその製造方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
薬剤として麝香の有効成分を利用するため、本発明は以下のごとき漢方麝香の有効成分から得られたアミノ酸配列を提供する。
【０００９】
ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫ
ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨ
ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＲＱ
ＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣ
及び以下のごときそれらの酢酸塩。
【００１０】
（ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫ）Ａｃ
（ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨ）Ａｃ
（ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＲＱ）Ａｃ
（ＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣ）Ａｃ
【００１１】
本発明は、漢方薬の有効成分のアミノ酸配列を得る方法も提供する。この方法は、漢方薬の有効成分を含有する機能的に活性な部分から抽出されたタンパク質とポリペプチドを分離して純化し、薬学的価値を有する活性ポリペプチドまたはタンパク質を得るステップと、薬力学分析を介して薬効を確認し、アミノ酸配列を特定するステップと、動物と植物の活性部分または組織からｃＤＮＡライブラリーを構築し、活性ペプチドをコード化する標的遺伝子を獲得するステップと、活性ポリペプチドのアミノ酸配列を最終的に獲得するステップとを含んでいる。
【００１２】
その活性部分が漢方薬の有効成分であるタンパク質とポリペプチドを抽出するため（親和クロマトグラム、親水相互作用クロマトグラム、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、質量スペクトロメトリー、等々の）タンパク質とポリペプチドの分離技術及び純化技術を使用した上述手段のごとき純化と分離を実施し、薬学的価値を確定するために薬学試験を通したタンパク質とポリペプチドの薬力学効果を分析し、アミノ酸配列の確定を行う。
【００１３】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、有効成分を含有した動物及び植物の組織を採集し、細胞からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ技術を使用してｃＤＮＡを獲得し、発現キャリヤーに全ｃＤＮＡフラグメントをクローン処理する。理論的にはｃＤＮＡライブラリーは細胞の異なるｃＤＮＡフラグメントまたは全遺伝子フラグメントの全クローンのコレクションである。ｃＤＮＡから、または直接的にｍＲＮＡから、漢方薬の遺伝子コード化ポリペプチドとタンパク質がＰＣＲ技術で得られ、遺伝子が配列されて確認された後にアミノ酸配列が導き出される。ポリペプチドは化学的に合成できる。遺伝子配列を原核細胞あるいは真核細胞の発現キャリヤーにクローン処理し、組換プラスミドを構築し、ホスト細胞を変性させ、エンジニアドバクテリアを様々なスクリーニングマーカーで獲得し、組換活性ポリペプチドとタンパク質をエンジニアドバクテリアの発酵処理と純化処理で得られる。
【００１４】
漢方薬の有効成分の遺伝子は麝香ポリペプチドをコード化する遺伝子である。麝香は麝香鹿の麝香腺から得られる乾燥分泌物である。それは一般的に使用される貴重な漢方薬であり、病気の治療に２０００年の歴史を有する。麝香は神龍本草経(Shen Long Ben Cao Jing)でトップランクされており、漢方の最も古い漢方薬であり、過去の幾つかの王朝の医学本に記録されている。麝香は精神を活気付け、血流を促し、腫れを引かせ、痛みを和らげる。少量でも効果が高く、失神、痛痒または炎症のごとき緊急時の治療に有効である。近年、中国において人工麝香の製造とその薬効にすばらしい進歩が見られるが、研究者は麝香の有効成分、麝香のポリペプチド及びその遺伝子よりもムスコンのごとき基本的化学組成物に合成に焦点を当ててきた。化学技術または遺伝子工学による麝香ポリペプチドの合成は、代替物としてのファングオス(fanghuosu)を使用することの限界を克服でき、漢方薬の遺伝子資源を保存して開発させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１〜図６参照
【００１６】
麝香の有効ポリペプチドの合成と薬学研究
まず標的物質を確定させるため、天然麝香の水溶性部分を分離して純化し、その薬効を分析した。図７と以下でこの手順の詳細を説明する。
【００１７】
１．クロマトグラム分析（図１）とゲル電気泳動分析（図２）
９５％エタノール等の有機溶剤による抽出後に、天然麝香を殺菌水に溶解させ、分析用サンプルとした。サンプルの上澄みを採取し、サンプルの遠心分離後に０．２２μｍ膜で濾過した。トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、銀汚染手段で結果を確定させた。その結果、その後の実験計画の基礎となる天然麝香に存在するタンパク質あるいはペプチドの基本分子量を得た。この研究では、クロマトグラムを８ｋＤａにてその部分に対して実行した。クロマトグラフカラムはスーパーデックスペプチドＨｒ１０/３０（ファーマシア社）であり、カラムを２つの床体積ｄｄＨ２Ｏで平衡処理した。サンプルの２００μＬをカラムに入れ、１．５床体積のｄｄＨ２Ｏを使用してカラムを流速０．５ｍｌ/分で洗浄した。全４溶出ピークを収集した（図１．Ａ：ＵＶ吸収曲線、Ｂ：コンダクタンス曲線、１：溶出ピーク１、２：溶出ピーク２、３：溶出ピーク３、４：溶出ピーク４）。この分子量範囲では４群が存在することを示す。薬学研究をその４群に対して実行し、電気泳動をそれら薬効を確認できた群に対して実行した後、得られたシングルバンド（図２．１と２、サンプル分析、Ｍ：タンパク質分子量測定器）をアミノ酸配列分析に使用した。
【００１８】
２．ＨＰＬＣ分析
予想される溶出されたピーク成分を高圧液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）で分析し、各群が１成分で成るか否かを調べる。もし複数成分であれば、ＨＰＬＣを実施し、１成分となるまでさらに分離処理と純化処理を実行する。このように得られた１成分はアミノ酸配列の分析に直接的に利用できる。また、必要であれば質量スペクトルにも利用できる。
【００１９】
３．質量スペクトルとアミノ酸配列測定
質量スペクトル技術は得られた１成分の検査に使用でき、アミノ酸の成分のデータと配列を得る。アミノ酸配列のさらなる分析によって、アミノ酸の完全配列が確定できる。その結果、コード化された遺伝子配列が導き出され、化学分析と遺伝子工学に利用できる。
【００２０】
４．遺伝子配列の獲得
遺伝子配列を導き出す上記の方法は変性コドンによって多くの可能な配列に導く。その問題は次の２つの方法で解消できる。
a)選択された発現システムとホスト細胞のコドンバイアスに基づいて、遺伝子配列を設計及び合成し、その配列を確定し、合成配列を確証する。
b)導かれた遺伝子配列に従って、プライマーを合成し、麝香鹿のタンパク質またはポリペプチドをコード化する遺伝子を獲得する。まず、森の麝香鹿の麝香腺を収集し、ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを実施する。得られたｃＤＮＡはｃＤＮＡライブラリーの構築に使用できる。あるいはＰＣＲの手段で標的遺伝子配列を直接的に獲得する。
【００２１】
５．アミノ酸配列の獲得
いくつかのアミノ酸配列が上記の遺伝子配列から得られた。生物学的情報技術を活用して、候補配列が薬効に基づいて選択された。候補配列はＣＬ（ＸＩＡＮ）ＢＩＯ．ＳＣＩＥＮＣＥ  ＣＯ．，ＬＴＤによって化学的に合成された。合成物の品質は質量スペクトメトリーによって確認された（図３から図６）。合成されたポリペプチド配列は次を含む。
【００２２】
ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫ
ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨ
ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＥＲＱ
ＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣ
【００２３】
４つのポリペプチド配列の比較によって、各配列がＥＣＰＬＬを含んでおり、３０％以上の保存セグメントを含み、上記の配列を有したポリペプチドは同じ特性の抗炎症と免疫抑制活性を有していることが示された。例えば、第１配列ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫと第２配列ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨでは、これら２配列の同一性に関する限り、前者は５３％の保存率で、後者は４７％の保存率であった。第１配列ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫと第３配列ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＥＲＱの同一性の比較で、前者は５３％保存され、後者は３１％の保存であることが知れた。第１配列ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫと第４配列ＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣの比較では、前者は７３％が保存され、後者は３４％が保存されていることが示された。
【００２４】
上記の配列に関係するポリペプチドは多様な形態の塩を形成できる。その中で酢酸塩はもっとも普通である。データは酢酸塩が溶解性と活性を改善する役割を担い、普通は１０％から１５％の酢酸を含んでいることを示す。そのようなポリペプチド酢酸塩は次を含む。
（ＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫ）Ａｃ
（ＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨ）Ａｃ
（ＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＥＲＱ）Ａｃ
（ＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣ）Ａｃ
【００２５】
６．ポリペプチド合成物の薬効研究
（１）マウスの耳の炎症の実験研究−ジメチルベンゼンによるマウスの耳の腫れ誘発
【００２６】
非検対象はクラスＩＩ  Ｋ．Ｍ．マウスの雄であり、体重２０ｇから２４ｇで、中山大学の動物実験センターにより提供された。モデルコントロール群、ポジティブ（ヒドロコルチコイド）コントロール群及びサンプル群が存在した。ジメチルベンゼン誘発急性炎症に対するサンプルの抑制機能が観察された。耳の腫れ程度がインデックスであった。サンプル１００μｇが必要な濃度に無菌ＰＢＳで希釈され、ＩＶ注射で投与された。結果は、サンプルがマウスの耳の腫れに対して優れた抑制効果を有することを示した。これで上述の活性ペプチドが抗炎症において非常に薬効が高いことが証明された。
【００２７】
（２）マウスのＬＰＳ誘発炎症の実験研究
モデルコントロール群、ポジティブ（ヒドロキシコルチコイド）コントロール群、及びサンプル群が形成された。サンプルは、ＬＰＳ誘発された初期急性炎症を有した動物によって分泌された炎症関係サイトカインの活性、生合成及び放出に対して抑制効果を発揮した。バルブ/ｃマウスは中山大学の動物実験センターから提供された。ＥＬＩＳＡ法が使用され、マウスのサイトカインが測定された。サンプル量は２５μｇから１００μｇであった。結果は活性ポリペプチドが炎症に関与するサイトカイン（ＩＬ−６、ＮＴＦ−α、ＩＦＮ−γ）の抑制に重大な機能を発揮することを示した。サンプルの抑制効果は炎症サイトカインのグルココルチコイドの５００倍であった。これでこの物質が炎症抑制と自己免疫異常に実効があることがわかった。
【００２８】
表１  ＬＰＳ誘発炎症モデルマウスの血清のＩＬ−６レベルに対する活性ポリペプチドの抑制効果
2008504223.tif 000003
【００２９】
２．５ｍｇ/ｋｇのＬＰＳ（シグマ社）が腹腔注射で注入された。注射後０．５時間で、５群がランダムに形成された。（１）ネガティブコントロール群（ＬＰＳ）：腹腔注射による生理食塩水注射、（２）ポジティブコントロール群（ＬＰＳ＋Ｈ．Ｃ）：腹腔注射で２．５ｍｇ/ｋｇのヒドロキシコルチコイド注射、（３）少量活性ペプチド群（Ｌ）：２．５μｇ/ｋｇの腹腔注射、（４）中量活性ペプチド群：５０μｇ/ｋｇの腹腔注射、（５）大量活性ペプチド群：１００μｇ/ｋｇの腹腔注射。２時間後、ＥＬＩＳＡが全群の血清のＩＬ−６レベルを測定するために使用された。
【００３０】
表２  ＬＰＳ誘発炎症モデルマウスの血清のＩＦＮ−γレベルに対する活性ポリペプチドの抑制効果
2008504223.tif 000004
【００３１】
２．５ｍｇ/ｋｇのバクテリオトキシン（シグマ社）が腹腔注射で注射された。０．５時間後に、次の５群がランダムに形成された。（１）ネガティブ群（ＬＳＰ）：腹腔注射による生理食塩水の注射、（２）ポジティブコントロール群（ＬＰＳ＋Ｈ．Ｃ）：腹腔注射による２．５ｍｇ/ｋｇのヒドロキシコルチコイド注射、（３）少量活性ペプチド群（Ｌ）：２．５μｇ/ｋｇの腹腔注射、（４）中量活性ペプチド群：５０μｇ/ｋｇの腹腔注射、（５）大量活性ペプチド群：１００μｇ/ｋｇの腹腔注射。２時間後にＥＬＩＳＡが全群の血清のＩＦＮ−γレベルを測定するために使用された。
【００３２】
（３）ラットのアジュバント関節炎の研究
これはＴ細胞仲介自己免疫障害のモデルである。このモデルはしばしば鎮痛と免疫抑制剤の研究に使用された。フロインドＦＣＡが右踵裏に経皮的に注射された。まず、局部急性炎症が現れ、遅れて全身変成変化が現れ、多関節炎となった。テストインデックス：足の腫れ、耳介紅班、及び尻尾の炎症結節並びに体重変動。クラスＩＩの雄ラットが使用された。体重１８０ｇ±２０ｇであった。第１軍医科大学動物実験センター提供（証明書番号００００８３０と００００８５８）。ポジティブコントロールとしてのインドメタシン。結果はサンプルが１．２μｇ/ｋｇから６μｇ/ｋｇの投与で関節炎に対して大きな抑制効果を発揮することを示す。
【００３３】
（４）マウスの急性毒性試験
クリーンクラスＮＩＨ型マウス（証明書番号２００２Ａ０２２）が使用された。半分は雄で半分は雌であった。体重は２０ｇから２２ｇで、広東医学動物実験センターから提供された。マウスの尻尾にＩＶ注射され、急性毒性反応が直ちに観察された。試験は１週間反復された。マウスは１匹も死なず、全マウスに毒性症状の兆候はなかった。結果はＬＤ50＞５ｍｇ/ｋｇであり、サンプルは安全であることが証明された。
【００３４】
（５）神経皮膚炎
慢性神経皮膚炎のボランティアがサンプルを使用し、良い結果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は本発明の麝香ペプチドのクロマトグラム分析を示す。
【図２】図２は図１の配列から分離されたストリップを示す。
【図３】図３はＳＤＳＥＣＰＬＬＣＥＶＷＩＬＫの質量スペクトグラフィーを示す。
【図４】図４はＳＤＳＥＣＰＬＬＰＲＱＧＴＧＳＬＨの質量スペクトグラフィーを示す。
【図５】図５はＩＤＣＥＣＰＬＬＥＡＫＣＰＳＦＰＬＷＰＱＧＲＥＥＥＲＱの質量スペクトグラフィーを示す。
【図６】図６はＳＤＳＥＣＰＬＬＬＮＧＴＮＴＳＳＲＦＥＳＩＮＣＶＦＬＳＴＥＥＧＣの質量スペクトグラフィーを示す。
【図７】図７はアミノ酸配列獲得の技術フローチャートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008504223.tif 000013
2008504223.tif 000014
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