(57)【要約】【解決手段】本発明は、微生物のプロテアーゼ分泌欠損株の特定方法であって：・繊毛虫類の突然変異体をゲルに加え；・繊毛虫類の突然変異体がタンパク質を分泌する条件下でインキュベートし；・前記の繊毛虫類の突然変異体をゲルから分離し；・ここで、繊毛虫類の少なくとも１つの分泌プロテアーゼの少なくとも１つの基質が前記のゲルに含有され、および／または、前記のゲル自身が基質であり、および／または、基質が後で加えられて、少なくとも一部はゲルに拡散し；かつ、基質に作用したプロテアーゼ活性を測定する、方法に関する。
2008529545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物のプロテアーゼ分泌欠損株の特定方法であって：
・微生物の突然変異体を産生し；
・マイクロタイタープレートのウェルにおいてゲルを製造し；
・微生物の突然変異体を各ウェルのゲル上に加え；
・微生物の突然変異体がタンパク質を分泌する条件下でインキュベーションを行い；
・前記の微生物の突然変異体をゲルから分離し；
ここで、微生物の少なくとも１つの分泌プロテアーゼの少なくとも１つの基質が前記のゲルに含有され、および／または、前記のゲル自身が基質であり、および／または、基質が後で加えられて、少なくとも一部はゲルに拡散し；
かつ、基質に作用したプロテアーゼ活性を測定する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記の微生物が、繊毛虫類、特にテトラヒメナ(Tetrahymena)、酵母、特にピキア・パストリス(Pichia pastoris)、単細胞藻類、特にクラミドモナス(Chlamydomonas)、ウルヴァ属(Ulva)およびユーグレナ属(Euglena)、および原核生物、特にバチルス属(Bacillus)およびエシェリキア属(Escherichia)よりなる群から選択される、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記の微生物の突然変異体が、ランダム突然変異誘発または定方向突然変異誘発によって産生される、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、前記の微生物の突然変異体が、単為生殖の細胞質融合（ＵＰＣ）によって産生される、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法であって、前記の微生物の突然変異体のゲルとのインキュベーションが、培養液中で行われる、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記の培養液が、脱脂粉乳、プロテオースペプトン、酵母抽出物、大豆ペプトン、硫酸鉄／キレート溶液および／またはグルコース一水和物を含有するか、または、合成培地である、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、前記のゲルがゼラチン、アガロース、寒天および／またはポリアクリルアミドゲルである、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、前記のプロテアーゼの基質が、カゼイン、カゼイン誘導体、蛍光標識したカゼインおよび／またはゼラチンよりなる群から選択される、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、前記のインキュベーションが、前記の微生物がプロテアーゼを分泌し、かつ、分泌されたプロテアーゼがゲル中に拡散することができる条件下で行われる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、前記の微生物が、注ぎ出し（デカンテーション）、ピペッティング、吸引および／または洗浄によってゲルから分離される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、基質のタンパク質分解により強度が測定される蛍光シグナルまたは吸収シグナルを産生され、その結果からプロテアーゼ活性を定量する、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法であって、ゲルの層をフィルムに適用し、フィルムの変化を測定し、これらの変化からプロテアーゼ活性を定量する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記のフィルムがＸ線フィルムである、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法であって、前記の方法が自動化されたフォーマットにおいて実施される、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法によって得られる、プロテアーゼ分泌欠損微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物のプロテアーゼ分泌欠損株の特定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーにおいて、タンパク質を大量にかつ生理学的に発生する形態で産生することができる発現系は、必要性が高い。多くの可能性のうちの１つは、タンパク質を産生し、任意にそれらを翻訳後修飾し、次いでそれらを分泌する微生物における異種発現である。その原理は、異種タンパクを産生するような方法で微生物を遺伝子的に修飾することである。異種発現およびその後に分泌が行われる微生物には、テトラヒメナ(Tetrahymena)等の繊毛虫類およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の酵母類がある。
【０００３】
このような異種発現系の使用は、多くの利点を供する。例えば、テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)を低コストで短時間に細胞濃度を高く培養することが可能である（サリバ(SALIBA)ら、1983年；キイ(KIY)およびティデュケ(TIEDTKE)、1992年）。さらに、生物を遺伝子的に設計する方法が確立され、それによって異種タンパクを大量に産生することができる（トンドラヴィ(TONDRAVI)およびヤオ(YAO)、1986年；ユー(YU)ら、1990年；ゲルティッヒ(GAERTIG)およびゴロフスキ(GOROVSKY)、1992年；ゲルティッヒ(GAERTIG)ら、1994年；カシディ−ハンリー(CASSIDY-HANLEY)ら；1997年）。これらのタンパク質は、ヒトのタンパク質と類似の形態にグリコシル化されるため、医薬用途に興味がもたれる（タニグチら；1985年）。この発現系の本質的な利点の１つは、テトラヒメナ好熱菌によって合成されるタンパク質が培地中に分泌され、タンパク質の精製が容易になることである（キイ(KIY)、1993年）。
【０００４】
しかしながら、このような異種発現系の使用において頻出する問題は、プロテアーゼの自然分泌である。このように、例えば、テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)が培地中に多量のプロテアーゼを自然分泌することが知られている（バンノおよびノザワ、1982年；バンノら、1982年；バンノら、1983年）。これらのプロテアーゼは特性が明らかにされていないことから、さらに得られる情報は殆どない。内因性タンパク質と比較すると、異種発現したタンパク質は、タンパク質分解をかなり受けやすい。対照的に、テトラヒメナ好熱菌の細胞外酵素の機能活性は、本質的には分泌されるプロテアーゼに制限されない（キイ(KIY)、1993b）。タンパク質分解活性の結果、異種発現したタンパク質の収率が著しく低下する。
【０００５】
分解を防ぐため、プロテアーゼ阻害剤またはカゼイン等の競合物質の添加、またはタンパク質分解活性のより低い株の産生等の、様々なアプローチが可能である。しかしながら、例えばテトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)に使用可能なプロテアーゼ分泌欠損株は、現在は存在しない。概して分泌が制限される突然変異体は記載されている（ヒュンゼラー(HUENSELER)ら；1987年）。しかしながら、そのような突然変異体は、プロテアーゼが分泌されない一方で、所望の標的タンパク質もまた分泌されないため、タンパク質の異種発現には適当ではない。
【０００６】
ヒュンゼラー(HUENSELER)ら、1992年によれば、分泌欠損変異体は、スクリーニング法により構築された。このように、寒天プレートにウェルをパンチし、ピペットで吸い取った。次に、細胞培養液をこれらのウェルに加える。この方法は比較的単調で退屈であり、自動化できない。薄い寒天層が傷つくと、交差汚染のリスクもある。また、この方法は大規模での使用または自動化はできない。
【０００７】
概して、発現系を分泌するためには、タンパク質分解活性が低いか全くない株の必要性が大きい。
【０００８】
テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)の過分泌性変異体のスクリーニング法は、開発されている（ハートマン(HARTMANN)、2000年）。この方法では、変異体は９６穴マイクロタイタープレートで培養する。次に細胞を超遠心分離法によって異なる濃度の領域に分ける。ポリマー層（Ficoll）を各培地の下に置き、細胞をこのFicoll中に遠心分離する。上澄をピペットで除去した。酵素試験において、β−ヘキサミニダーゼ(hexaminidase)および酸フォスファターゼ等の分泌タンパク質活性が上昇した変異体を定量した。
【０００９】
この方法は、長時間を要する。さらに、細胞溶解が起こり、非分泌タンパク質が放出されて結果が変わるのを排除することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、タンパク質の異種発現のための改良された分泌系のスクリーニング法を提供することである。特に、本方法は、分泌される異種発現タンパク質の収率が改良された微生物の変異体のスクリーニングを可能にするであろう。
【００１１】
本方法は、多数の突然変異体の短時間かつ安価な試験を可能にするであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
驚くべきことに、本発明の目的は、請求項１〜１５のいずれかによる方法および微生物によって達成される。
【００１３】
概して、本方法は、プロテアーゼを分泌し、異種発現した標的タンパク質の分泌に好適な微生物の突然変異体を用いて実施することができる。「分泌プロテアーゼ」という用語は、野生型の微生物が周囲に分泌するプロテアーゼを意味する。本発明の方法は、インビボでのプロテアーゼ活性の測定を可能にする。
【００１４】
微生物は、好ましくは、繊毛虫類および酵母より成る群から選択される。このような微生物は、プロテアーゼ等の酵素活性を有する内因性タンパク質を発現する。特に好ましい酵母には、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)がある。また、本方法は、単細胞藻類、特にクラミドモナス(Chlamydomonas)、ウルヴァ属(Ulva)およびユーグレナ属(Euglena)、および原核生物、特にバチルス属(Bacillus)およびエシェリキア属(Escherichia)のスクリーニングにも好適である。特に好適な繊毛虫類は、テトラヒメナ属(Tetrahymena)のもの、特にテトラヒメナ(Tetrahymena)好熱菌(thermophila)、マラッセンシス(malaccensis)、エリオッティ(elliotti)、アルファエリオッティ(alphaeliotti)、ピリフォミス(pyriformis)、セトーサ(setosa)、アルファピリフォミス(alphapyriformis)、ベータピリフォミス(betapyriformis)、ロイコフリス(leucophrys)、シルヴァニ(silvani)、ヴォラックス(vorax)、トロピカリス(tropicalis)、アルファトロピカリス(alphatropicalis)、ベータトロピカリス(betatropicalis)、ガンマトロピカリス(gammatropicalis)、デルタトロピカリス(deltatropicalis)、ボレアリス(borealis)、カナデンシス(Canadensis)、ロストラータ(rostrata)、アルファカナデンシス(alphacanadensis)、ベータカナデンシス(betacanadensis)、ミムブレス(mimbres)、アメリカニス(americanis)アメリカニス(americanis)、パラアメリカニス(paraamericanis)、オーストラリス(australis)、ヘゲウィスキ(hegewischi)、ヒペラングラリス(hyperangularis)、ナンネイ(nanneyi)、ニッピシンギ(nippisingi)、ピグメントサ(pigmentosa)、ピグメントサ・オリアシ(pigmentosa oriasi)、ピグメントサ・ユーロピグメントサ(pigmentosa europigmentosa)、ソンネボルニ(sonneborni)、アジアティカ(asiatica)、カプリコルニス(capricornis)、パテュラ(patula)、アレンサエ(allensae)、コスモポリタニス(cosmopolitanis)またはシャンハイエンシス(shanghaiensis)である。
【００１５】
微生物の突然変異体は、ランダム突然変異誘発または定方向突然変異誘発等の、知られている方法によって産生することができる。本方法は、プロテアーゼ分泌欠損株が入手できないか、技術的理由または遺伝情報の不足のため、困難を伴う微生物に、特に有利である。交差遺伝子(cross-genetic)法は特に好ましい。
【００１６】
突然変異体を産生する特に好ましい方法は、単為生殖の細胞質融合である。これは交差遺遺伝子法であり、好ましくは、コール(Cole)およびブランズ(Bruns)によって記載(1992年)されたように実施する。そこに記載された方法は、参照することにより本書に組み込まれる。この方法は、例えば、ヒュンゼラー(Huenseler)らが用いた短絡ゲノム除去法(1987年)と同等に、最大２０回の突然変異の発現を可能にする。従って、突然変異の収率は、２０倍より高い。
【００１７】
微生物の突然変異体のゲルとのインキュベーションは、好ましくは、好適な水性媒体、好ましくは培養液中で行われる。いずれにせよ、生理学的条件と類似の条件（ｐＨ値、イオン濃度等）を実施すべきであり、その結果、微生物の死滅および溶解が抑制される。
【００１８】
好ましい態様において、微生物のゲルとのインキュベーションは、２時間〜２週間、特に１〜５日間実施される。
【００１９】
好適な培養液は、脱脂粉乳、プロテオースペプトン、酵母抽出物、大豆ペプトン、硫酸鉄／キレート溶液（100X、シグマ）および／またはグルコース一水和物であるか、または、それらを含有する。また、個々の成分の正確な組成に従った既知組成培地（ＣＤＭ）を使用してもよい。
【００２０】
好ましい態様において、ゲルとして、ゼラチン、アガロース、寒天および／またはポリアクリルアミドゲルが使用される。細孔の大きさまたは架橋度は、プロテアーゼ等の分泌タンパク質がゲル中に拡散でき、一方で微生物が実質的にゲルから除かれるように選択される。
【００２１】
好ましい態様において、プロテアーゼの基質は、カゼイン、カゼイン誘導体、蛍光標識したカゼインおよび／またはゼラチンよりなる群から選択される。特に好適なものは、BODIPY FLカゼインおよびBODIPY TR-Xカゼイン（モレキュラー・プローブス社(Molecular Probes Inc.)、米国）または同様に蛍光標識したペプチドまたはタンパク質である。
【００２２】
インキュベーションは、好ましくは、微生物がプロテアーゼを分泌し、かつ、分泌されたプロテアーゼがゲル中に拡散することができる条件下で行われる。
【００２３】
微生物のゲルからの分離は、好ましくは、注ぎ出し（デカンテーション）、ピペッティング、吸引および／または洗浄によって行われる。
【００２４】
好ましい態様において、基質のタンパク質分解は、強度が測定される蛍光または吸収シグナルを産生し、その結果からプロテアーゼ活性が定量される。
【００２５】
さらに好ましい態様において、ゲルの層はフィルム、特にＸ線フィルムに適用される。プロテアーゼが基質と反応した後、フィルムの変化を測定し、その変化からプロテアーゼ活性を定量する。
【００２６】
本発明の方法は、マイクロタイタープレートを用いて実施される。ゲルは、プレートの各ウェルにおいて製造される。これは、通常、溶液、例えばアガロース溶液をウェル中に注ぎ、その後冷却することによって行われる。通常の９６穴のマイクロタイタープレートが好ましい。本発明の方法は、自動化することができ、かつ／または、試験する多数の突然変異体を用いて実施することができる。１つの突然変異体をマイクロタイタープレートの各ウェルに加える。このことは、細胞を１つだけ加えることを意味する必要はない。また、同一のＤＮＡを有する多数の細胞を加えてもよい。このような多数の細胞は、１つの細胞を単離し、続いてそれを増殖することによって製造される。
【００２７】
本発明の方法は、非活性または活性が弱いプロテアーゼを培地中に特異的に分泌し、一方、他のタンパク質および少なくとも異種発現したタンパク質の分泌は好ましくは制限されないか、わずかだけ制限される突然変異体の選択的スクリーニングを可能にする。アッセイの機能には、プロテアーゼが不活性な形態で分泌されるか、全く分泌されないかは無関係である。要点は、プロテアーゼ活性の低下により、標的タンパク質の収率が増加することである。
【００２８】
ランダム突然変異誘発による繊毛虫類の突然変異体の産生方法は確立されている（クルーガー(CRUEGER)およびクルーガー(CRUEGER)、1989年）。また、突然変異が発現され得る交差遺伝子手法が記載されている（コール(COLE)およびブランズ(BRUNS)、1989年）。これらの方法は、テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)の核二形性の故に、必要である。さらに、分配装置およびポワソン分布(Poisson lottery)を用いて、９６穴マイクロタイタープレートに突然変異体を分配することが可能である。
【００２９】
本発明の方法は、知られている方法を越える、幾多の有利点を有する：
【００３０】
分泌系が概して悪い影響を受け、ゆえに他のタンパク質の異種分泌に好適でない突然変異体が確立されないため、本方法は固有のものである。
【００３１】
培地中に分泌されたプロテアーゼの活性によって、シグナルが単独で生成される。アッセイ条件が穏やかであるため、スクリーニングの間、細胞溶解は起こらず、従って細胞内プロテアーゼによって結果がバイアスされない。
【００３２】
種々の非特異的プロテアーゼ基質を使用することができる。このことは、例えば繊毛虫類において、分泌されるプロテアーゼの基質特異性について殆ど知られていないことから、有利である。従って、スクリーニング収率は、全体のプロテアーゼ活性に影響する。
【００３３】
本発明の方法は、簡単かつ迅速に実施することができ、繊毛虫類培養物をその培養液中で試験することができる。従って、ハートマン(Hartmann)らの方法(2000年)における遠心分離等の生成工程は省略される。この単純な方法により、例えば９６穴スケールで、多量の突然変異体の細胞外プロテアーゼ活性試験が可能になる。
【００３４】
特に多数の突然変異体が単為生殖の細胞質融合（ＵＰＣ）によって産生される場合、非常に高い効率が達成される。
【００３５】
本方法は、後にそれらの分泌特性をより厳密に分析できる突然変異体をもたらす。得られる菌株は、その後、異種発現系として利用することができる。
【００３６】
本方法は、発現されたプロテアーゼのゲル中への拡散を利用する。プロテアーゼがゲルに移動する、プロテアーゼの検出方法は、例えばパーチ(Paech)ら(1993年)の先行技術において既に知られていた。これらは、プロテアーゼが、一方では、ゲルに入る前に精製され、他方では、ゲル中の電気泳動によって分離される方法である。本発明の方法は、プロテアーゼの精製が不要であり、かつ、電気泳動または電界の適用が行われないことから、完全に異なる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の通り実施することができる：
【００３８】
突然変異体を、９６穴マイクロタイタープレートのウェル中で生育させる。培養物は、アガロース層の下の、液体培養液中である。インキュベーションの間、プロテアーゼを含む細胞外酵素は、部分的にアガロース中に拡散する。細胞を含む培養液を取り出した後、カゼイン誘導体をアガロースに加えるが、これももまた部分的にアガロース中に拡散する。このカゼイン誘導体がタンパク分解活性によって開裂する場合、プロテアーゼ活性に比例する蛍光シグナルが生ずる。シグナルの強度は、例えば、終点決定の範囲内でのマイクロタイタープレート蛍光リーダーによって、または、反応動態(the kinetics)を記録することによって、検出することができる。蛍光シグナルの弱いものが、プロテアーゼ分泌欠損株を示す。
【００３９】
さらなる態様において、本発明のスクリーニング方法は以下の通り実施することができる：
【００４０】
マイクロタイタープレートにおいて既に暫時培養した培養物を、完全に露光し現像したＸ線フィルムのゼラチンでコートした側に、８チャネルピペットで所々に適用する。滴は培養液から成り、その中には細胞外酵素がインキュベーションの間に既に分泌されていた。さらに、細胞は培地中に存在する。細胞溶解を防ぐため、滴が乾固しないよう注意を払うべきである。滴は暫時ゼラチン上に残るので、後者は存在するプロテアーゼによって加水分解され得る。次いで滴がフィルムから洗い落とされ、その後フィルムを特別な緩衝液中に入れる際に、ゼラチンが加水分解された場所で洗浄ハロゲン化物が形成される。従って、このような洗浄ハロゲン化物は、細胞外プロテアーゼの高活性を示す。
【００４１】
本発明の方法は、細胞を含まない上澄を得るための複雑な方法を必要とせずに、プロテアーゼの活性を上澄中で選択的に検出するという特徴がある。さらに、非特異的基質（カゼイン誘導体、ゼラチン）を使用するため、さらなる特徴がない菌株のプロテアーゼ活性を試験することが可能である。両方法は、迅速に実施され、低コストであるという特徴があり、従って、多数の突然変異体を試験することができる。
【実施例】
【００４２】
方法１：
化学的ランダム突然変異誘発によって突然変異を起こし、その後、コール(COLE)およびブランズ(BRUNS)(1992年)による単為生殖の細胞質融合（簡単に：ＵＰＣ）の交差遺伝子法によって発現させる。このように、突然変異体を産生した。突然変異体を調製した後、スクリーニングのためのマイクロタイタープレートを以下の通り調製した：
【００４３】
９６穴マイクロタイタープレートのウェルに、無菌条件下でアガロース（１％；ｗ／ｖ）を注ぐ。凝固させた後、アガロースを培養液層で覆う。ウェルのテトラヒメナ(Tetrahymena)の突然変異株とのインキュベーションを、以前に調製した、クローンを育成したマイクロタイタープレート由来の、自己調製した９６スタンプによって実施する。３０℃で３日間インキュベーションした後、細胞を含む培養液を取り出し（デカントし）、ウェルを緩衝液（トリス-HCl; 50mM; pH7.4）で２回洗浄する。酵素反応の基質として、ウェル中に、それぞれ１００μｌの蛍光色素を入れる。基質として、エンズチェック・プロテアーゼ・アッセイ・キット(EnzChek Protease Assay Kit)Ｅ−６６３８（モレキュラー・プローブス社(Molecular Probes Inc)、米国）に含まれるものを使用する。色素は、製造元の使用説明書に従って使用し、使用する溶液は同梱の緩衝液で１：２に希釈する。希釈により、試験の感受性に影響することなく、試料数を有意に増やすことができる（図１）。
【００４４】
蛍光強度の検出には、励起波長および検出波長に合わせた一対のフィルターを有する、リーダー(Reader)ＦＬｘ８００（バイオテック・インストルメンツ社(BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.)）を使用する。プロテアーゼ活性の測定として、基質を加えた後に反応動態を直接的に記録することができ、ここで勾配は蛍光シグナルに比例し、従ってプロテアーゼ活性にも比例する。
【００４５】
あるいは、室温で１時間インキュベーションした後、終点測定を実施することが可能である。このようにして得られた絶対値もまた、蛍光強度またはプロテアーゼ活性を反映する。
【００４６】
実施例２：
化学的ランダム突然変異誘発によって突然変異を起こし、その後、コール(COLE)およびブランズ(BRUNS)(1992年)による単為生殖の細胞質融合（簡単に：ＵＰＣ）の交差遺伝子法によって発現させる。このように、突然変異体を産生した。突然変異体を調製した後、スクリーニングのためのマイクロタイタープレートを以下の通り調製した：
【００４７】
ゼラチンでコートしたＸ線フィルム（フェラニア(Ferrania)）を露光し、現像して固定する。使用に先立ち、フィルムを緩衝液（トリス−ＨＣｌ；50mM；pH7.5）で１０分間湿らせる。この前処理の後、緩衝液の残部を濾紙で慎重に除去しなければならない。ゼラチンでコートした側に、３０μｌの３日齢のテトラヒメナ(Tetrahymena)培養物を、８チャネルピペットで適用する。滴が他に滲み出ないよう、注意すべきである。滴を適用したフィルムを３０℃で１時間インキュベートする間に、培地中に存在するプロテアーゼがゼラチンを加水分解するが、ここで滴中の細胞は生存する。インキュベーション時間の経過後、蒸留水で滴をフィルムからすすぎ落とす。グリシン緩衝液（0.1M; pH10.0; 50℃）中でフィルムをもう１分間インキュベーションする際に、ゼラチンが分解した場所で洗浄ハロゲン化物を観察することができる。ゼラチン層がない場合は、黒く染色される銀化合物を洗い流す。従って、洗い流すか否かは、分泌されるプロテアーゼの活性レベルに依存する。また、ゼラチンの分解は、パラメータのインキュベーション時間およびインキュベーション温度に影響されるため、試験はそれぞれに広く行われている条件に適合させなければならない。
【００４８】
これらの新規なスクリーニング法を用いて、テトラヒメナ(Tetrahymena)の突然変異体であって、培養液中に明らかに活性のより低いプロテアーゼを分泌し、一方で、β−ヘキサミニダーゼおよび酸フォスファターゼ等の他の酵素の分泌が実質的に低下しないものを単離することができた。
【００４９】
従って、新規なスクリーニング法を用いて、プロテアーゼについて排他的に分泌が欠損するが、周囲の培地中にタンパク質を放出する能力は概して制限されない突然変異体を調製することができる。このことは、新規なスクリーニング法で得られる代表的な突然変異体の分泌動態を、野生型菌株の分泌動態と比較すると明確になる。
【００５０】
図３および４は、突然変異体の分泌動態を、野生型菌株（野生型菌株Ｘおよび野生型菌株ＣＵ４３８．１）と比較して示す。突然変異体について２つの代表的な分泌リソソーム酵素である、β−ヘキソサミニダーゼおよび酸ホスファターゼの容量活性は、野生型の容量活性と同等である。図５は、１つの突然変異体と２つの野生型のプロテアーゼについての分泌動態を示す。野性型菌株と比較して、突然変異体は、培養期間中に周囲の培地中に放出するプロテアーゼが明らかにより少ないことが明確になる。
【００５１】
参照文献
バンノ,Y.およびノザワ,Y.(1982年)：テトラヒメナ・ピリフォミス(Tetrahymena pyriformis)における低温順化の間の粒子と結合したプロテアーゼ活性の変化(Changes in particulate-bound protease activity during cold acclimation in Tetrahymena pyriformis)；Biochim. Biophys. Acta 719巻: 20-28頁
バンノ,Y.、ヤノ,K.およびノザワ,Y.(1982年)：テトラヒメナ・ピリフォミス(Tetrahymena pyriformis)ＷＨ−１５における生育の間の分泌プロテアーゼの生化学的特性：細胞外プロテアーゼの細胞内プロテアーゼとの比較(Biochemical characterization of secreted proteases during growth in Tetrahymena pyriformis WH-15: Comparison of extracellular with intracellular proteases)；J. Protozool. 29巻: 91-98頁
バンノ,Y.、ヤノ,K.およびノザワ,Y.(1983年)：テトラヒメナ・ピリフォミス(Tetrahymena pyriformis)の分泌プロテアーゼの精製および特性(Purification and characterization of a secreted protease from Tetrahymena pyriformis)；Eur. J. Biochem.
カシディ−ハンリー(CASSIDY-HANLEY),D.、ボーウェン(BOWEN),J.、リー(LEE),J.H.、コール(COLE),E.、ヴェルプランクト(VERPLANKT),L:A.、ゲルティッヒ(GAERTIG),J.、ゴロウスキ(GOROWSKY),M.A.およびブランズ(BRUNS),P.J.(1997年)：粒子衝撃によるテトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena  thermophila)を交配する生殖細胞系列および体細胞形質転換(Germline and somatic transformation of mating Tetrahymena thermophila by particle bombardment)；Genetics 146巻: 135-147頁
コール(COLE),E.S.およびブランズ(BRUNS),P.J.(1992年)：単為生殖の細胞質融合：早期性成熟を伴う、テトラヒメナ(Tetrahymena)のホモ接合大核発現への小核突然変異をもたらす新規な方法(Uniparental Cytogamy: A novel method for bringing micronuclear mutations of Tetrahymena into homozygous macronuclear expression with precocious sexual matury)；Genetics 132巻: 1017-1031頁
クルーゲル(CRUEGER),W.およびクルーゲル(CRUEGER),A.(1989年)：Biotechnologie−Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie- 3. Aufl.: 3. Stammentwicklung: 7-54; オルデンブルグ・ベルラグ社(Oldenburg Verlag GmbH)、ミュンヘン
ゲルティッヒ(GAERTIG),J.およびゴロフスキ(GOROVSKY),M.A.(1992年)：接合個体のエレクトロポレーションによるテトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena  thermophila)の効率的大量形質転換(Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89巻: 9196-9200頁
ゲルティッヒ(GAERTIG),J.、グ(GU),L.、ハイ(HAI),B.およびゴロフスキ(GOROVSKY),M.A.(1994年)：テトラヒメナ(Tetrahymena)における高頻度のベクター媒介形質転換および遺伝子置換(High frequent vector-mediated transformation and gene replacement in Tetrahymena)；Nucleic Acids Res. 22巻: 5391-5398頁
ハートマン(HARTMANN),M.、グーベルマン(GUBERMANN),A.、フローリン−クリステンセン(FLORIN-CHRISTENSEN),M.およびティデュケ(TIEDTKE),A.(2000年): テトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena  thermophila)のホスホリパーゼＡ1過分泌性突然変異体のスクリーニングおよび特性化(Screening for and characterization of phospholipase A1 hypersecretory mutants of Tetrahymena thermophila)；Appl. Microbiol. Biotechnol. 54巻: 390-396頁
ヒュンゼラー(HUNSELER),P.、シェイドゲン−クレイボルヅ(SCHEIDGEN-KLEYBOLDT),G.およびティデュケ(TIEDTKE),A.(1987年):リソソーム酵素の分泌を遮断したテトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena  thermophila)の突然変異体の単離および特性化(Isolation and characterization of a mutant of Tetrahymena thermophila blocked in secretion of lysosomal enzymes)；J. Cell Sci. 88巻: 47-55頁
キイ(KIY),T.およびティデュケ(TIEDTKE),A.(1992年)：還流式バイオリアクターにおける繊毛虫類の原生動物テトラヒメナ(Tetrahymena)の連続的高細胞濃度発酵(Continous high-cell-density fermentation of the ciliated protozoon Tetrahymena in a perfused bioreactor)；Appl. Microbiol. Biotechnol. 38巻: 141-146頁
キイ(KIY),T.(1993年)：Fermentation von Ciliaten zur Produktion biogene Wertstoffe; Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades; Institut fur Allgemeine Zoologie und Genetik, Westfalische Wilhelms-Universitat Munster
ピーチ(PAECH),C.、クリスチャンソン(CHRISTIANSON),T.およびマウラー(MAURER),K.-H.(1993年)：電気泳動後の非変性ポリアクリルアミドゲルより現像フィルムで製造したプロテアーゼのザイモグラム(Zymogram of proteases made with developed film from non-denaturing polyacrylamide gels after electrophoresis)；Analyt. Biochem. 208巻: 249-254頁
タニグチ,T.、ミズオチ,T.、バンノ,Y.、ノザワ,Y.およびコバタ,A.(1995年)：テトラヒメナ・ピリフォミス(Tetrahymena pyriformis)により分泌されるリソソーム酵素の炭水化物(Carbohydrates of lysosomal enzymes secreted by Tetrahymena pyriformis)；J. Biol. Chem. 260 (26)巻: 13941-13946頁
トンドラヴィ(TONDRAVI),M.M.およびヤオ(YAO),M.-C.(1986年): リボソームＲＮＡ遺伝子のマイクロインジェクションによるテトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena  thermophila)の形質転換(Transformation of Tetrahymena thermophila by microinjection of ribosomal RNA genes)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA83巻: 4369-4373頁
ユ(YU),G.L.、ブラッドリー・アッタルディ(BRADLEY, ATTARDI),L.D.およびブラックバルン(BLACKBURN),E.H.(1990年)：突然変異テトラヒメナ(Tetrahymena)テロメラーゼＲＮＡによって起こるテロメア配列および老化のインビトロ変性(In vitro alteration of telomere sequences and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs)；Nature 344巻: 126-132頁
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、本発明の蛍光スクリーニング法の概略図を示す。
【図２】図２は、スクリーニングを実施した後のＸ線フィルムを示す。
【図３】図３は、１つの突然変異体および２つの野生型菌株ＸおよびＣｕ４３８．１の、細胞を含まない上澄中のβ−ヘキソサミニダーゼの分泌動態を、容量活性で示す。
【図４】図４は、１つの突然変異体および２つの野生型菌株ＸおよびＣｕ４３８．１の、細胞を含まない上澄中の酸ホスファターゼの分泌動態を、容量活性で示す。
【図５】図５は、１つの突然変異体および２つの野生型菌株ＸおよびＣｕ４３８．１の、細胞を含まない上澄中のプロテアーゼの分泌動態を、容量活性で示す。
【図１】
2008529545.tif 000003
【図２】
2008529545.tif 000004
【図３】
2008529545.tif 000005
【図４】
2008529545.tif 000006
【図５】
2008529545.tif 000007
【国際調査報告】
2008529545.tif 000008
2008529545.tif 000009
2008529545.tif 000010
2008529545.tif 000011
2008529545.tif 000012
2008529545.tif 000013
2008529545.tif 000014
2008529545.tif 000015
2008529545.tif 000016
2008529545.tif 000017