(57)【要約】本発明は、整形外科、歯科、および頭蓋顔面埋め込みによる、ヒトの骨格筋器官の保存、修復、および再生のための人工骨インプラントに関する。より詳しく述べると、本発明は、脊柱分節の安定化および再生された配置のための人工骨インプラントの一部として、生体吸収性のケージにおいて脂肪組織由来の幹細胞と骨伝導性リン酸カルシウムとを含む骨誘導性組成物を用いることに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウムと脂肪組織由来の幹細胞とを含む骨誘導性組成物が存在する、吸収性の多孔性マトリクスを含む人工骨インプラント。
【請求項２】
多孔性マトリクスがPLDLAを含む、請求項1記載の人工骨インプラント。
【請求項３】
多孔性マトリクスがPLDLAからなる、請求項1記載の人工骨インプラント。
【請求項４】
リン酸カルシウムがリン酸二カルシウムである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の人工骨インプラント。
【請求項５】
組成物が、TGF-β、BMP、Osf-1、およびLMP-1からなる群より選択される少なくとも一つの増殖因子をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の人工骨インプラント。
【請求項６】
増殖因子がOsf-1であることを特徴とする、請求項5記載の人工骨インプラント。
【請求項７】
多孔度が少なくとも80％である、前記請求項のいずれか一項に記載の人工骨インプラント。
【請求項８】
吸収性の多孔性マトリクス：骨誘導性組成物の比が約1：10〜10：1の範囲である、前記請求項のいずれか一項に記載の人工骨インプラント。
【請求項９】
骨誘導性組成物における脂肪組織由来の幹細胞：リン酸カルシウムの比率が、約1：10,000〜1：10の範囲である、前記請求項のいずれか一項に記載の人工骨インプラント。
【請求項１０】
脂肪細胞が切除または通常の脂肪吸引によって得られている、人工骨インプラント。
【請求項１１】
骨外科手術のための、特に脊椎固定のための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の人工骨インプラントの使用。
【請求項１２】
新しい骨組織の生長を誘導するための請求項1〜10のいずれか一項に記載の人工骨インプラントの使用。
【請求項１３】
リン酸カルシウムおよび脂肪組織由来の幹細胞を含む骨誘導性組成物。
【請求項１４】
吸収性の多孔性マトリクスと、リン酸カルシウムおよび脂肪組織由来の幹細胞を含む骨誘導性組成物とを組み合わせる段階を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の人工骨インプラントを調製する方法。
【請求項１５】
患者の骨に請求項1〜9のいずれか一項に記載の人工骨インプラントを埋め込む段階を含む、骨外科を行うための方法。
【請求項１６】
脊椎動物から脂肪組織を取り除き、そこから幹細胞を単離する段階、リン酸カルシウム上で幹細胞を播種することによって骨誘導性組成物を製造する段階、人工骨インプラントを提供するために吸収性の多孔性マトリクスを該骨誘導性組成物で充填する段階、および外科的手術によって該脊椎動物に該骨インプラントを導入する段階を含む、新しい骨組織を誘導することによって、脊椎動物における骨欠損を治癒する方法。
【請求項１７】
手術が腰椎固定である、請求項14または15に記載の方法。
【請求項１８】
脊椎動物から脂肪組織を取り除き、そこから幹細胞を単離する段階、リン酸カルシウム上で幹細胞を播種することによって骨誘導性組成物を製造する段階、人工骨インプラントを提供するために吸収性の多孔性マトリクスを該骨誘導性組成物で充填する段階、および外科的手術によって該脊椎動物に該骨インプラントを導入する段階を含む、新しい骨組織を誘導することによって、脊椎動物において骨組織によって軟骨を置換する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、整形外科、歯科、および頭蓋顔面埋め込みによる、ヒトの骨格筋器官の保存、修復、および再生のための人工骨インプラントに関する。より詳しく述べると、本発明は、脊柱分節の安定化および再生された配置のための人工骨インプラントの一部として、生体吸収性のポリ-L-ラクチドおよびポリ-L-D-ラクチドケージにおいて脂肪組織由来の幹細胞と骨誘導性リン酸カルシウムとを含む骨誘導性組成物を用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腰椎骨の不安定性、脊椎すべり症（脊椎のシフトまたは滑り）および変性病態によって、多くの患者において重度の椎間板関連疼痛が起こる。投薬、安静、または理学療法のような通常の処置がそのような患者にとって十分でない場合、これらの患者を処置するために一般的に容認された外科技法は腰椎固定である。当技術分野において「腰椎後方椎体間固定」（PLIF）と呼ばれるこの腰椎固定は、患者の背部から行われて、少なくとも二つの椎体の癒合（硬直）が実現される腰椎骨の手術を含む。PLIF外科の臨床結果は、癒合が実際に起これば成功であると見なされる。しかし、多数の患者においてこの癒合は起こらず、または起こっても程度が不十分である。
【０００３】
要するに、PLIF手術は、それぞれの脊柱分節を外科的に露出する段階、および例えば、椎弓切除（脊椎管を広げるために椎弓を切除する）、椎間孔拡大術（椎間孔を広げる）、および／または椎間板を除去することによって脊柱の欠損を修正する段階を含む。任意で、固定材料（ねじまたは平板）が外科の際に提供される。二つの椎体間の癒合を得るために、異なる外科によって骨盤上口の背側部分から骨材料（海綿骨）を除去する。この骨材料は、一般的に非吸収性である椎間板固定ケージと共に用いられる。ケージは、異なる組成物、形状、および柔軟性を有してもよい。多く用いられる形状は「オープンボックス」構造を有し、予め合成担体材料（通常、リン酸カルシウム）および／または骨増殖因子と任意で混合された自己骨（患者自身の骨）がこれに充填される。
【０００４】
ケージの主な目的は、脊柱の力学的特性の回復に向けられ、すなわちケージは、椎間板の当初の間隙が回復するように、矢状面が整列するように、および前柱の支持力が回復するように設計される。この理由から、通常の方法では、この機能にとって十分に強い金属製（例えば、チタン）のケージがしばしば用いられる。
【０００５】
しかし、このタイプの固定ケージの剛性と強さのために同時に、ケージ内部のインプラント材料のいわゆる応力遮蔽が発生し、これはインプラント材料が脊柱から圧力を受けない現象であり、骨形成およびその後の癒合の速度および程度に有害な影響を及ぼす。応力遮蔽は、多くの場合、癒合が成功しないおよびPLIF外科が成功しない理由の一つである。
【０００６】
PLIF外科について起こるもう一つの問題は、骨盤上口からのドナー骨の除去のために、有意な数の患者（10〜50％）が重篤な問題を経験することである。問題は、骨採取部位の血腫および多くの痛みを伴う永続的なドナーの病的状態から、骨盤の不安定性および骨折にさえ及ぶ。これらの問題を防止するためおよびPLIF外科の成功を増加させるために、ケージおよび骨移植のための代用材料が望ましい。
【０００７】
このように、吸収性であって、脊椎骨と類似の弾性係数を有するPLLAおよびポリ-L/D-ラクチド（PLDLA；ポリL-乳酸と30％ポリ-D-乳酸の混合物）材料のようなケージ材料が、現在公知である。これらの吸収性のケージは、ケージが体によって吸収されると、新たに形成された骨材料が徐々にますますロードされることから、移植材料の応力遮蔽の発生を減少させる。
【０００８】
骨密度および骨量を増加させるために様々な材料および方法が用いられている。現在、自己骨を用いることは最も信頼できる方法であり、この骨は効率的なインプラント材料である。しかし、先に述べたように、欠点はドナー部位での病的状態および利用率が限定的である点である。同種異系および異種骨インプラントを用いることは、免疫学的問題およびウイルス混入のリスクの結果として、ますますより信頼できなくなりつつある。
【０００９】
合成担体材料（例えば、ヒドロキシアパタイト）のみを用いることは、そのような担体材料が骨伝導特性のみを有して、骨誘導性特性を有しないという欠点を有する。脊椎分節の癒合を提供するための細胞は、まず、環境から足場に拡散する必要があるか、または新しい血管の内殖によって足場に供給される必要があると思われる。
【００１０】
本発明は、ここで上記の問題の一つまたは複数に対する解決策を提供する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
第一の局面において、本発明は、その中にリン酸カルシウムおよび脂肪組織由来の幹細胞を含む骨誘導性組成物が存在する吸収性の多孔性マトリクスを含む、人工骨インプラントを提供する。好ましくは、この多孔性マトリクスは、PLDLAを含み、リン酸カルシウムは、リン酸二カルシウムである。骨誘導性組成物は、TGF-β、BMP、Osf-1およびLMP-1からなる群より選択される増殖因子、好ましくはOsf-1をさらに含んでもよい。
【００１２】
もう一つの局面において、本発明は、骨外科、特に脊椎固定のために本発明に係る人工骨インプラントを用いることを提供する。
【００１３】
本発明のもう一つの局面は、吸収性の多孔性マトリクスと、リン酸カルシウムおよび脂肪組織由来の幹細胞を含む骨誘導性組成物とを組み合わせる段階を含む、骨外科において用いるための人工骨インプラントを調製する方法に関する。
【００１４】
なおもう一つの局面において、本発明は、本発明に係る人工骨インプラントを患者の骨に埋め込む段階を含む、骨外科、例えば腰椎固定を行うための方法に関する。
【００１５】
本発明はさらに、脊椎動物から脂肪組織を取り除き、そこから幹細胞を単離する段階、これらの幹細胞をリン酸カルシウム上に播種することによって骨誘導性組成物を製造する段階、および外科手術によって脊椎動物に骨インプラントを導入する段階を含む、脊椎動物において新しい骨組織の生長を誘導することによって、骨欠損を治癒する方法に関する。
【００１６】
本発明はさらに、脊椎動物から脂肪組織を取り除き、そこから幹細胞を単離する段階、これらの幹細胞をリン酸カルシウム上に播種することによって骨誘導性組成物を製造する段階、人工骨インプラントを提供するために吸収性の多孔性マトリクスを骨誘導性組成物で充填する段階、および外科手術によって脊椎動物にこの骨インプラントを導入する段階を含む、新しい骨組織の生長を誘導することによって脊椎動物において軟骨を骨組織によって置換する方法に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる「合成充填剤」または「担体材料」は、骨形成細胞または組織のための骨支持（骨伝導性）接着基質としての作用能を有する、しばしば多孔性で顆粒状、線維様、もしくは粉末様の、または少なくとも一時的に混合可能なもしくは可塑性の物質または固体物質である。本発明において、「合成充填剤」または「担体材料」は、足場の形で用いられる（下記を参照されたい）。本発明に係る態様において、骨伝導性担体材料は好ましくはリン酸カルシウムである。
【００１８】
本明細書において用いられる「足場」または「組織足場」は、個々の骨形成細胞または骨形成組織のその物理的な支持能または保持能に関して合成充填剤または担体材料を機能的に記述したものである。骨形成細胞が担体材料に接着する場合、足場と呼ばれ、足場は好ましくは骨細胞の形成、遊走、滞留、および／または増殖を促進するための、および創傷治癒の際の構造的支持体を提供するための特異的構築を有する。
【００１９】
「癒合ケージ」、「ケージ」、または「マトリクス」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、本明細書において、その中に足場がローディングされうる、骨のための誘導材料を受け入れる内腔を有する、形状を保持する、実質的に閉鎖の、好ましくは多孔性の被覆または枠組みとして定義される。
【００２０】
本発明の文脈において、「多孔性」という用語は、細胞をその中に入れるため、および材料における腔を通して細胞浮遊液を浸透させるために十分な寸法の腔（孔）を有すると定義される。腔は、実質的に均一な開放型の堅固な構造における線維または足場の粒子、またはケージ、または穴（セルとも呼ばれる）のあいだの間質容積であってもよい。
【００２１】
本明細書において用いられるように「骨誘導性足場」は、脂肪由来の骨形成性幹細胞と骨伝導性担体との組み合わせを含む。
【００２２】
「骨形成性幹細胞」は、骨形成性経路を通して分化誘導されている幹細胞、または遺伝子が発現されうるその幹細胞において骨増殖因子をコードする組換え型遺伝子が存在した結果として骨形成性経路を通しての分化能を有する幹細胞、骨増殖因子が幹細胞の分化誘導を引き起こす濃度で同様に存在する環境に存在する幹細胞、または骨増殖因子による誘導後に骨形成性経路による分化能を有する幹細胞である。
【００２３】
本明細書において用いられる「骨欠損を修復する」という表現は、骨障害または骨欠損を修復するように向けられる作用に限定されず、同様に形成、再建、および美容外科において行われるように、それが望ましい部位で新しい骨材料を作製するように向けられる作用も意味する。特に、この表現は、脊椎固定の供給において用いられるように、骨組織による軟骨組織の置換に向けられる。
【００２４】
本発明に係る人工骨インプラントは、吸収性の多孔性マトリクスまたはケージを含む。ケージは、任意の望ましい形状を有してもよく、主にインプラントの形状を保存するように、およびインプラントを望ましい位置に配置するように作用する。好ましくは、ケージは二つの椎骨を癒合するために用いられるような癒合ケージであるが、これは本質的ではない。他のケージ、例えば頭蓋外科、顎の外科、股関節外科、または他の骨外科のような骨手術において用いることができるケージも同様に、骨誘導性組成物に強度または支持を与える限り、当業者は開発することができ、なお存在する骨要素による、および同様に望ましければ骨要素の配置は、ケージによって可能となる。
【００２５】
本発明の態様におけるケージ材料は、生体吸収性の材料において用いられる。PLLAまたはPLDLAのような材料が非常に適している。好ましくはPLDLAを用いる。これらの材料は、脊椎骨と類似の弾性係数を有する。さらなる長所は、これらの材料がX線透過性である点であり、そのため、X線および／またはCTおよびMRIスキャンによる追跡も全く可能である。PLLAおよびPLDLAに関して、それらは、天然の経路を通して吸収され、それによって外来材料が長期間にわたって癒合分節に残らないことが証明されている。
【００２６】
ケージ材料として生体吸収性の材料を用いる例は、通常に用いられる金属ケージにおいて起こるように、インプラント材料のいわゆる応力遮蔽が、かなり減少した程度に起こる、または全く起こらないという点である。PLLAおよびPLDLAケージのような生体吸収性のケージのさらなる長所は、それらの場合ではチタンケージと比較して骨癒合の速度および数の増加が起こる点である。さらに、これらのケージは、低い免疫原性を有する。
【００２７】
例えばPLLAから生体吸収性のケージを製造するために、乳酸をジラクチドに変換した後、ポリ-L-ラクチド（PLLA）をエステル化によって調製して、例えば欧州特許第1 138 285号に記述されるように、ケージの製品にすることができる。
【００２８】
PLLAまたはPLDLAの他に、任意で、ポリグラクチン910（Vicryl）または異なる適した吸収性の材料も同様に用いてもよい。
【００２９】
本発明に係る人工骨インプラントは、リン酸カルシウムおよび幹細胞を含む骨誘導性組成物をさらに含む。
【００３０】
リン酸カルシウムに関して、それらが生きている骨と良好に相互作用することが証明されている。したがって、自己幹細胞のための骨伝導性担体材料として、リン酸カルシウムは非常に適切に用いられうる。最も広く研究されているリン酸カルシウム形状は、ヒドロキシアパタイト（HA）ならびにリン酸二および三カルシウム（BCPおよびTCP）である。BCPおよびTCPは生体分解性であるが、HA、特に焼結型は非吸収性であると考えられている。以下に言及するようにBCP、TCP、および他の成分の比率を変化させることによって、より多くまたはより少ない多孔性および／または結晶セメントを製造することができる。生体適合性のリン酸カルシウム足場からは、如何なる免疫反応も予期することができない。
【００３１】
好ましくは、足場の孔は、直径200〜1000μm、より好ましくは400〜600μmを有する。接合部は好ましくは直径50〜200μm、より好ましくは120〜150μmを有する。容積に対する表面の比は、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％の多孔度が得られるようになる。
【００３２】
好ましくは、BCP複合体（リン酸二カルシウムおよび40％ヒドロキシアパタイトからなる）を担体材料として用いる。より好ましくは、BCP BiCalPhOS（登録商標）（Medtronic Sofamor Danek Memphis, Tn, USA）を用いる。選択の最適化は、この材料を用いることによって、他の担体と比較してより急速な吸収／リモデリングが起こるという事実にある。
【００３３】
骨伝導性担体材料に加えることができる他の成分は、例えば材料の密度および強度を任意で増加させるための生体適合性ポリマー、細胞の接着を促進する物質、増殖因子、および抗菌物質である。
【００３４】
本発明において、幹細胞として、脂肪組織由来の幹細胞を用いる。骨髄由来の幹細胞を用いることに対して、脂肪組織由来の幹細胞を用いる長所は、後者を得る場合、実際の脊柱外科の前に、別の外科手術、すなわち非常に痛みを伴い不快な骨髄採取が必要でないこと、および骨髄幹細胞のインビトロ拡大のために、研究室での労力がかかり、リスクの高い、費用のかかる、かつ時間がかかる幹細胞の増殖を必要としない点である。
【００３５】
したがって、本発明に係る人工骨インプラントは、脂肪組織由来の幹細胞を含む骨伝導性組成物を含む。様々な組織に存在する幹細胞が広い可塑性を有することがますます示されている。多能性幹細胞が胚組織および成体組織において同定されている。しかし、胚幹細胞を用いることは、広い倫理的検討を必要とし、しかもごく少量を得ることができるに過ぎない。
【００３６】
成体個体の骨髄から得られた幹細胞の発達および分化能は、造血系を超えて広がって見え、血管形成性、間葉、非間葉および内胚葉方向を含む。さらに、同様に広い発達可能性を有する幹細胞も同様に、ニューロンまたは筋を含む非造血起源を有しうることが見いだされた。後者は、おそらく広範囲の適用を有する新しい研究分野を開発するが、間葉細胞および組織への分化可能性を有する幹細胞源としての骨髄の役割は、より長い歴史を有する。過去10年において、骨髄から得られた間葉幹細胞（MSC）は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨髄芽球、および骨芽細胞への分化能を有することが証明されている。
【００３７】
間葉の分化能によって、その目的が骨形成不全の小児の骨芽細胞系列における分化を回復することである臨床試験においていくつかの成功が認められ、MSCに基づく治療に対するさらなる研究が行われた。しかし、骨髄から得たMSC細胞を用いることに関する最も重要な障害は、患者の不快感の他に、低い発生率（接着する間質細胞105個あたりMSC約1個）であり、このために細胞の拡大を必要とし、これは時間、費用、および混入のリスクの公知の全ての欠点、ならびに拡大の代わりに幹細胞分化のリスクを有する。
【００３８】
ヒト脂肪組織由来の間質細胞はインビトロで骨芽細胞分化の何らかの特徴を示すことが知られている。骨髄から得たMSCのように、脂肪組織から得た細胞は、正しい細胞系列特異的誘導因子によって誘導すれば、軟骨細胞、脂肪細胞、骨髄芽球および骨芽細胞への分化能を有する。脂肪組織の幹細胞は、骨髄から得た細胞の上記の欠点の多くを有しない。
【００３９】
脂肪組織幹細胞は、切除によっておよび脂肪吸引の吸引液（通常の方法で、または超音波による脂肪吸引によって）から得ることができ、これは最小の不快感で、長時間の精製方法を必要とせず、しかも高い収率で（吸引液300 ccは細胞2〜6×108個の収率を生じる）得ることができる。これによって、骨髄細胞の場合に必要である、関連するリスクを伴うインビトロ拡大の必要性がなくなる。好ましくは、脂肪細胞は、切除によって得るか、または通常の脂肪吸引を用いる。
【００４０】
脂肪組織幹細胞は、明らかな細胞死もなく、インビトロで長期間維持することができ、自己幹細胞として、それらは本来免疫適合性である。
【００４１】
脂肪組織の吸引（脂肪吸引）は、その目的に関して公知の任意の方法を用いることによって、例えば最近記述されている方法によって行うことができ、そこから幹細胞を得るための方法をさらに参照されたい（Halvorsen et al., 2001, Tissue Eng 7:729〜41；Mizuno et al., 2002, Plast Reconstr. Surg. 109:199〜209；Zuk et al., 2001 Tissue Eng 7:211〜228）。吸引液は腹部、太腿、または臀部のような体の異なる部分から得ることができる。当業者は、採取した幹細胞の量および質が、脂肪組織の吸引の採取部位および深さに従って変化しうることを容易に決定することができると考えられる。同様に、幹細胞の十分量を得るために、最小の吸引量を決定することができる。吸引液は直ちにさらに処理することができ、または短期間保存することができる。当業者は、保存後の吸引液から幹細胞の十分な量および質を得ることができるように、保存条件を選択することができると考えられる。好ましくは吸引液は、直ちに処理される。
【００４２】
次に、リン酸カルシウムおよび幹細胞を、例えばこれらを適した比率で混合することによって、またはリン酸カルシウムを幹細胞浮遊液に受動的に含浸させることによって、混合することによって、骨誘導性組成物を調製することができる。この段階はまたリン酸カルシウム上での幹細胞の播種とも呼ばれる。骨誘導組成物における幹細胞：リン酸カルシウムの重量比は、好ましくは1：10,000〜1：10である。
【００４３】
骨誘導組成物は、幹細胞を骨形成性経路を通して分化誘導するために、抗生物質、接着物質、生長促進物質、抗生物質または骨生長刺激タンパク質（骨増殖因子）のような治療物質をさらに含んでもよい。
【００４４】
任意で、担体材料と混合する前に、幹細胞を、骨芽細胞に分化誘導することができる。このために用いることができる適した誘導培地は、例えば10％ウシ胎児血清（FBS；GibcoBRL-カタログ番号10437-028）を添加して、さらに0.1 mMデキサメタゾン、50 mMアスコルビン酸-2-リン酸、10 mMグリセロリン酸、および1重量％抗生物質または抗真菌剤を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；GibcoBRL-カタログ番号11965-084）である。分化は、例えば、幹細胞を37℃で5％CO2において、この決定のために最適な日数インキュベートすることによって行ってもよい。
【００４５】
好ましくは、担体材料と混合する前または後に、またはマトリクスに骨誘導性組成物を満たした後に、骨増殖因子を用いることによって、幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する。
【００４６】
この目的のために、幹細胞をその中で骨芽細胞に分化誘導するために、中でも骨増殖因子を骨誘導性組成物に加えてもよい。同様に、脂肪幹細胞を最初に骨増殖因子と接触させて、その後骨誘導性組成物を提供するための担体材料と混合することができる。代わりの態様において、幹細胞の分化の誘導は、外科的埋め込みの前に、またはインプラントが患者に埋め込まれた後に、骨増殖因子によって骨インプラント上で行うことができる。
【００４７】
骨増殖因子は、細胞の生長および細胞機能を調節することによって体における合成および分解プロセスに影響を及ぼす特異的タンパク質である。骨の形成に関係する増殖因子は二つの群に分けることができる：骨誘導性および骨産生性増殖因子。骨形態形成タンパク質（BMP）を含む骨誘導性（無骨環境における新しい骨の発達）増殖因子は、未分化の幹細胞を骨前駆細胞（前骨芽細胞）に分化させることができる。トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、インスリン様増殖因子（IGF）、および血小板由来増殖因子（PDGF）を含む骨産生性増殖因子は、分化した骨細胞数を増加させる（増殖させる）、または骨マトリクス形成細胞（骨芽細胞）にさらに分化させることができる。
【００４８】
原則として、いずれのタイプの増殖因子も、本発明に係る態様において用いることができる。様々な概要の刊行物（Bonewald, 2002, Bilezikian et al., (eds)「Principles of Bone Biology」, Academic Press, San Diego, pp.903〜18；Rosen and Wozney, 2002, In Bilezikian et al., (eds)「Principles of Bone Biology」, Academic Press, San Diego, pp.919〜28；Reddi, 2000, Tissue Eng. 6:351〜9；Boden, 2000, Tissue Eng. 6:383〜99；Deuel et al, 2002, Arch Biochem. Biophys. 397:162〜172）において記述されているように、多くの増殖因子を本発明に係る態様において用いることができる。好ましくは、TGF-β（中でもTGF-β1-5）群からの増殖因子およびBMPを用いる。特に好ましいのは、骨芽細胞刺激因子-1（Osf-1）、組換え型ヒトBMP-2（rhBMP-2）およびLIM無機化タンパク質-1（LMP-1）の一つまたは複数の増殖因子を用いる。さらにより好ましくは、Osf-1（同様にHB-GAM、プレイオトロフィンとしても知られる）を用いる。この因子は、様々な機能をモニターして、Osf-1形質導入幹細胞の担体材料表面への迅速かつ強い接着を確実にして、それによって骨芽細胞の分化が加速される18-kDaのサイトカインである。さらに、Osf-1は、インプラントの環境から骨芽細胞を動員して、修復速度を確実に改善するために血管形成を促進する。
【００４９】
増殖因子は二つの方法で得ることができる。一つの方法は、組織または組織液（自己、同種異系または異種）からの抽出であり、もう一つは、培養において急速に分裂する細胞における改変DNAの遺伝子転写によって合成する方法（組換え技術）である。第一の方法の例は、体自身の増殖因子（主にPDGFおよびTGF-β）を血液から得るPRP（血小板に富む血漿）である。
【００５０】
癒合を誘導するためにインプラント部位で骨形成性増殖因子を用いることによって、骨形成性因子の高い拡散速度および短い半減期に至る場合があり、誘導が起こる部位で骨形成性因子の閾値が維持されるのはこれに関連して短期間となる。さらに、増殖因子の拡散の結果として、癒合領域の外側で骨形成が最終的に起こりうる。同様に、この型の癒合誘導では、脊椎分節の癒合を提供すべき細胞は最初に、環境から足場に拡散する必要がある、または血管の内殖によって足場に供給される必要があると思われる。この機会は、生物学的半減期がより短くなるおよび／または拡散速度がより速くなるにつれて小さくなる。もう一つの短所は、（組換え型）骨形成性因子が高価であり、感作を生じうる点である。
【００５１】
上記の非常に高価な増殖因子を用いることは、例えば組換えによって導入された骨形成性因子をコードする遺伝子の一時的または非一時的発現を用いることによって回避することが可能である。したがって、好ましくは、欧州特許第0 890 639号および米国特許第2002102728号に記述されるように、それ自身が関連する増殖因子を産生することができる幹細胞を形成する。この目的のために、幹細胞を、例えば骨形成性増殖因子の関連遺伝子が導入されているアデノウイルスベクターにトランスフェクトさせてもよく、ベクターを幹細胞において発現させることができる。
【００５２】
本発明に係る人工骨インプラントを調製するために、吸収性の多孔性マトリクスを、本明細書において先に記述された骨誘導性の組成物と非常に適切に混合して、本発明に係る人工骨インプラントを提供することができる。このように、多孔性マトリクスは、非常に適切に拡散、電気泳動、遠心力、またはクロスリンクによって骨誘導性組成物と組み合わせることができる。
【００５３】
本発明に係る人工骨インプラントは任意で、その製造後に、例えば粉砕、研磨、ねじ穴もしくはフックのような付着可能性の提供、または破砕によって、さらに加工してもよい。
【００５４】
本発明に係る人工骨インプラントは、複雑な幾何形状を有してもよい。形状は例えば切片、内腔、凹部、または凸部を有してもよい。骨インプラントは、特異的骨、複数の特異的骨、もしくはその一部、または骨のあいだの空間もしくは骨における腔が置換されうるまたはそれによって充填されうるような形状であってもよい。骨インプラントは、特定の患者に関して特別に外科前に寸法を測定して形成することができる。同様に、骨インプラントは、外科手術の際に外科医が形成することが意図されるブロックのような単純な形状を有してもよい。骨インプラントは、骨欠損部に適合するように形成することができ、先細りとなってもよく、斜面で仕上げてもよく、または適合を増強するために咬み合わせる部品と共に提供してもよい。
【００５５】
脂肪組織から得た幹細胞を用いる本発明に係る人工骨インプラントは、多くの魅力的な長所を提供する。医学的な見地から、この新しい骨インプラントの長所および関連する応用可能性には、以下が含まれる。
（i）患者のための一段階方法
（ii）患者のための外科的方法そのものに重要な変化ないこと
（iii）体内に外来材料を長期間放置することなく、吸収性のX線透過性のケージ材料を用いること
（iv）医学的利用に応用可能な、再現可能で確認可能な工業的標準に従って無限に産生することができる、不活性の吸収性の担体材料のみがケージに留置されること
（v）骨盤上口骨移植片の採取に関連した有害な副作用が防止されながら、同じ外科手術の際に最小の浸潤的技術によって得られた自己幹細胞調製物による自己移植片の置換
（vi）自己幹細胞は本来免疫適合性であり、胚幹細胞を用いる場合とは対照的にその利用に関連した倫理的問題はないこと
【００５６】
経済的見地から、長所には以下が含まれる。
（vii）一段階外科を行うことができるが、骨髄から得た幹細胞を用いることは通常、予め骨髄吸引を必要とし、これには診療所での数回の診察を伴う。さらに、実際の脊柱外科には、費用の高い骨髄細胞の精製および増殖技術（ソーキング）が必要である。
（viii）外科時間は延長されず、おそらく短縮される。
（ix）非常に高価な増殖因子を用いることが回避されうる。
【００５７】
本発明に係る骨外科法は、脊椎動物における骨欠損を修復する任意の方法、好ましくは腰椎固定を含む。
【００５８】
本発明に係る骨外科法は、例えば本明細書において先に記述した脂肪吸引によって、脊椎動物から脂肪組織を除去する段階を含む。
【００５９】
さらに、本発明に係る骨外科法は、そこから幹細胞を単離する段階を含む。そのような方法は当業者に公知である（中でも、Halvorsen et al., 2001, Tissue Eng 7:729〜41；Mizuno et al., 2002, Plast Reconstr. Surg. 109:199〜209；Zuk et al., 2001 Tissue Eng 7:211〜228を参照されたい）。
【００６０】
幹細胞を脂肪組織から得た後、その目的のために意図される誘導培地によってこれらの幹細胞を骨芽細胞に分化誘導することによって、骨形成性細胞集団を得ることができる。誘導の目的は、骨形成性経路によって発達するように幹細胞を誘導すること、すなわち幹細胞または骨前駆細胞（骨前駆細胞）から骨芽細胞に分化させることである。インビトロ骨形成に基づいて、幹細胞段階から完全に機能的な骨マトリクス-合成骨芽細胞への骨前駆細胞の発達プロセスは、三段階に分けられる：1）増殖、2）細胞外骨マトリクスの発達および成熟、ならびに3）無機化。
【００６１】
本発明に係る骨外科法はその後、リン酸カルシウム上に幹細胞を播種することによって、骨誘導性組成物を製造する段階、および吸収性の多孔性マトリクスをこの骨誘導性組成物で充填して人工骨インプラントを提供する段階を含む。外科法は最終的に、外科手術による脊椎動物への骨インプラントの導入を含む。
【００６２】
細胞を分化誘導する段階は、原則として任意の所定の時期に行ってもよい。好ましくは、分化誘導段階は、担体材料上に幹細胞を播種する前に行われる。
【００６３】
本発明に係る移植物を用いることによって、自己骨インプラントに関連した欠点がなく、脊柱の機能性のより迅速な回復が起こると考えられる。
【００６４】
さらに、本発明は一段階外科的方法を可能にする。これは、脂肪組織から得た幹細胞を用いた結果として、骨髄から得た幹細胞と比較して、かなりより高い収率の幹細胞を得ることができるためである。その結果、実験的培養によって幹細胞を拡大させる必要がない。脂肪吸引段階は、PLIF外科的方法において行うことができ、そこからの幹細胞の抽出、分化誘導、およびリン酸カルシウム上での播種は、1〜1.5時間以内に行うことができる。
【００６５】
本発明に係る方法および用途の長所は、外科的方法に重要な変化を行う必要がないように、外科の実施にあたって既存の段階を維持することができる点である。さらに、一段階方法によって、患者は二回目の入院および外科を行う必要がなく、大きい個人的（患者にとって）および社会経済的長所を有する。さらに、成体幹細胞を用いることによる倫理的問題は予想されず、高価な増殖因子を用いる必要もない。
【００６６】
本発明の方法および材料は、骨移植が必要である全ての分野において、例えば整形外科分野および神経外科分野において用いることができ、歯科においても用いることができる。一般的に、本発明の方法および材料は、例えば外傷、腫瘍、感染症、および動揺関節インプラントの結果としての骨欠損を修復するために用いることができる。
【００６７】
本発明の方法および材料を用いることは、存在する軟骨が問題を引き起こす部位、および骨が軟骨の機能を引き継ぐ必要がある部位で骨生長を誘導することが望ましい症例において特に有利である。これは、脊柱固定を行うために、すなわち強直性脊椎において最も重要に用いられる。
【００６８】
実施例
実施例1：
異なる脂肪貯蔵物由来の幹細胞の単離および用いる回収方法の効果
脂肪組織は通常大量に利用でき、異なる外科手術を通して得ることができる。最も一般的に用いられている三つの方法は、一括切除、真空または通常の脂肪吸引、および超音波による（高周波振動による）脂肪吸引である（Illouz, 1983, 1984；Dolsky, 1984；Scuderi, 1987；Topaz, 2001；Miller, 1991；Suslick, 1990）。三つの外科的方法によって、患者の負荷は最小限であり、脂肪採取部位での合併症は少ない。本発明者らは、脂肪幹細胞の収率および生長特徴が、採取部位および単離法によって影響を受けるか否かを試験した。
【００６９】
脂肪を異なる領域から採取した：腹部、股関節および太腿、背部および胸部（Zuk et al, 2001に従う方法）。トリパンブルー排除試験を用いて、方法あたりの生存細胞数を決定したところ、これは採取部位と用いた採取方法の双方に関連した。細胞の81±2％（平均値±平均値の標準偏差（SEM））が生存していることが見いだされた。細胞の収率は、異なる採取部位で類似であった：腹部細胞0.7×106±0.1×106個/脂肪組織g（平均値±SEM、n＝16）、股関節および太腿細胞0.5×106±0.07×106個/g（平均値±SEM、n＝11）、背部細胞1.1×106±0.3×106個/g（平均値±SEM、n＝2）、および胸部脂肪細胞0.6×106±0.3×106個/g（平均値±SEM、n＝4）（図1A）。異なる採取方法のあいだに差を認めなかった（股関節／太腿および腹部領域において試験）。脂肪組織1 gあたりの生存細胞の収率は、一括切除の場合0.7×106±0.1×106個（平均値±SEM、n＝13）、通常の脂肪吸引の場合0.5×106±0.1×106個/g（平均値±SEM、n＝8）、および超音波による脂肪吸引の場合0.6×106±0.2×106個/g（平均値±SEM、n＝6）であった。
【００７０】
限界希釈試験を用いて、単離法の影響下での単離された細胞画分における幹細胞発生率を決定した。切除された脂肪の単離された細胞画分において、細胞の6.3±1.7％（平均値±SEM、n＝8）が幹細胞特性（接着およびクローン性の増殖）を示したのに対し、通常の脂肪吸引および超音波による脂肪吸引の場合ではこれはそれぞれ、2.9±1.9％および0.4±0.2％（平均値±SEM、それぞれn＝4および5）であった（図2）。対数生長期における集団の細胞倍加時間は、切除を通して得られた脂肪に関して2.4±0.34日（平均値±SEM、n＝4）、通常の脂肪吸引を通して採取した脂肪に関して2.8±0.64日（平均値±SEM、n＝4）であり、および超音波による脂肪吸引では26.1±4.6日（平均値±SEM、n＝4）もの長さであった（他の二つの方法より有意に低い（双方に対してp＝0.007））。
【００７１】
実施例2：
新たに単離した脂肪幹細胞の組換え型ヒトBMP-2による短時間（15〜30分間）刺激によって、骨形成性表現型の誘導が起こる
切除によって得られた脂肪を本明細書において先に記述したように処理して、幹細胞単離物を、10％仔ウシ胎児血清（FCS）、500μg/mlストレプトマイシン、600μg/mlペニシリン、50μg/mlゲンタマイシン、2.5μg/mlアンフォテリシンB、0.1 mg/mlビタミンC（vit.C）および10 mMβグリセロリン酸（β-GP）を添加したDMEM培地において、異なる用量（1〜1000 ng/ml）の組換え型ヒト骨形態形成タンパク質-2（rhBMP-2）によって15または30分間刺激した。対照として、rhBMP-2を含まない同じ培地を含めた。次に、培地を除去して、細胞を、BMP-2、vit. C、およびβ-GPを含まない上記の培地において4日間培養した。4日後、総RNAを細胞から単離して、標準的な方法（Transcriptor（登録商標）逆転写酵素およびランダムプライマーをそれぞれ用いる、Trizol（登録商標）方法およびcDNA合成）に従ってcDNAを合成して、リアルタイム逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法を用いて、LightCycler（登録商標）（Roche）の助けを借りて、骨形成性マーカーであるアルカリホスファターゼ（ALP）、オステオポンチン（OPN）およびI型コラーゲン（col1A1）のmRNA発現レベルを定量した。対照としてのハウスキーピング遺伝子として、18Sを用い、これに対して骨形成性マーカーの値を標準化した。その結果を図3に「対照に対する処置」（T/C）の値として示し、ここで「処置」はrhBMP-2処置を含み、「対照」はrhBMP-2を含まない培地を意味すると理解される。
【００７２】
新しく単離された幹細胞調製物のrhBMP-2によるこれらの非常に短時間の刺激は、骨形成性表現型を誘導するために既に十分であるように見えるが（示した骨形成性マーカーのmRNA発現の＞27倍増加までを特徴とする）、最適なrhBMP-2用量は（生理的な値）1〜10 ng/mlの間にあるようである。
【００７３】
これらの実験は、rhBMP-2の生理的用量による新しく単離された幹細胞調製物の非常に短時間の刺激によって既に、骨形成性表現型への誘導が起こりうることを示しており、このことは骨形成性刺激を一段階外科的方法に適合させることができることを意味する。
【００７４】
実施例3：
BCP（登録商標）担体材料における幹細胞調製物の「播種」
脂肪幹細胞（新たに単離されたまたは培養された）を、製造元によって記述された方法に従って、蛍光色素PKH26（登録商標）（Sigma）によって標識した。次に、蛍光標識された細胞をPBSに浮遊させて、密度を1〜1.5×106個/mlとした。この浮遊液のうち、0.5 mlを12ウェルプレートにおいて特別製のBiphasic Calcium Phosphate（BCP（登録商標））ディスク（φ1.4 cm、高さ4 mm；Medtronic-Bakken Research Center, Maastricht）に滴下して、様々な時間インキュベートして、接着時間を決定した。細胞膜に蓄積するPKH26標識によって、固定およびメタクリル酸メチル（MMA；プラスチック抱埋剤）切片における抱埋後の細胞分布を分析するために直接評価法を用いることができる。さらに、BCP（登録商標）ディスクを固定して乾燥させ、走査型電子顕微鏡（SEM）によって細胞の存在および分布を分析した。これらの分析物の例を図4に示す。
【００７５】
毛細管作用により、細胞はBCP（登録商標）材料の中を非常に均一に分布するように思われ、接着は10分以内に起こりうるように思われる。
【００７６】
実施例4：
動物モデル、ヤギにおける一段階方法における生体吸収性のポリラクチド（PLDLA）ケージ、BCP（登録商標）担体材料、および新たに単離した幹細胞調製物を用いるインビボ脊椎固定
ヤギあたり、一段階外科的方法を以下のように行った。腰椎骨の高さで切開部を作製した後、脂肪組織（40〜80 g）を腎臓の周囲から採取した。次に、脂肪組織を本明細書において先に記述したように処理した。この処理期間のあいだ、脊椎固定法（後部腰椎椎体間固定；この場合は、腰椎L3とL4のあいだの椎間板の除去の後に、その中に脂肪幹細胞を播種したBCP（登録商標）顆粒を充填したPLDLAケージの埋め込み）を、ケージ埋め込み段階の直前までに、言い換えればケージを正しい位置に置く埋め込みトンネルを作製するまでおよび作製することを含む段階の直前までに、さらに準備した。幹細胞調製物の処理後、細胞200万個をPKH26（実施例3を参照されたい）によって標識して、洗浄後（rhBMP-2刺激において、PKH26標識後、10 ng/ml rhBMP-2による15分間のインキュベーション段階を導入することができる）無血清培地1.5 mlに浮遊させた。生体吸収性のケージ構築物の調製に関して、新しく採取した血液の薄層をケージに導入したが、これは凝固により下面の密封を提供した。その後、ケージにBCP（登録商標）顆粒を充填して、細胞浮遊液をケージに滴下した。最初の接着は、構築物を少なくとも45分間放置することによって得られた（図5A）。血液の層を滴下して、PLDLAケージの上面で凝固させることによって構築物の「仕上げをした」後、ケージ／BCP（登録商標）幹細胞構築物を、このために調製した埋め込みトンネルに埋め込むことによって、脊椎固定法を完了して、この後傷口を閉じた。最初の切開から埋め込みまでの総方法は、このシリーズの実験において約3時間を要したが、これはおそらく実践経験および方法の一部のコンピューター化によって今後低減させることができる。ヤギを4日後（PKH26標識細胞の可視化を保証するため）または28日後（初回骨形成を可視化するため）に屠殺した。下背部を解剖して、x-線写真を撮影し、癒合された脊椎分節（椎間板L3-L4＋腰椎L3およびL34自身の半分）を様々な矢状切片で観察して、写真を撮影し、組織学のために処理した。4日目の試料では、標識された幹細胞の存在を確認することができ（図5B）、このように一段階外科スキームの実現可能性が確認された。それによって、脂肪幹細胞を採取、処理、および（標識または非標識であれ）ケージに導入することができ、そこで、それらはいずれの場合においても4日間生存してその場に存在することが証明可能であることが示された。
【００７７】
28日目の試料では、幹細胞上のPKH26蛍光がもはや検出されないことが見いだされた。この時点で可能であったのは、ゴルドナー染色および複合アルカリホスファターゼ（ALP）／酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP）染色によって骨形成および骨分解を観察することであった。本明細書において、高い初回骨形成活性（とりわけ、高いアルカリホスファターゼ活性および骨-類骨形成を特徴とする）および高いBCP（登録商標）担体材料分解活性が観察可能であった（多数のTRAP陽性骨および無機質吸収細胞、多核破骨細胞によって可視化される）。したがって、このことから、当初存在した軟骨を置換することおよび部位での骨形成を誘導することが可能であるように思われる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】座（A）および採取方法（B）に従って分けた新鮮な細胞単離物における生存細胞の数。生存細胞は、トリパンブルー排除試験によって同定した。それぞれの点は、個々の単離を表す。レーン：群における平均細胞収率。採取部位（A；p＝0.3；一元ANOVA）および異なる採取方法（B；p＝0.69；一元ANOVA）のあいだに細胞回収率の差を認めなかった。省略語：AT＝脂肪組織；SVF＝細胞単離物；RS＝切除；T-LS＝通常の脂肪吸引；US-LS＝超音波による脂肪吸引。
【図２】細胞単離物における幹細胞発生率に及ぼす採取方法の効果。脂肪組織を、切除（RS）、通常の脂肪吸引（T-LS）、または超音波による脂肪吸引（US-LS）によって採取した。幹細胞の発生率は、限界希釈法を用いて決定し、採点は21日後に行った。接着細胞が10個より多い群を陽性として計算した。発生率は、60％より少ない陽性が認められた培養ウェルのその列について計算した。RS群とUS-LS群のあいだに有意差（p＞0.05；独立した試料のt-検定）が検出された。
【図３】アルカリホスファターゼ（ALP）、オステオポンチン（OPN）、およびI型コラーゲン（ColA1）のmRNA発現に及ぼす、新たに単離された脂肪幹細胞集団を、異なる用量のrhBMP-2（ng/ml）によって15または30分刺激した後に基本培地において4日間培養後の効果。データは、対照に関する「増加倍数（T/C）」、または増加係数として表記し、「処置」（T）は、rhBMP-2処置を含み、「対照」（C）は、rhBMP-2を含まない培地を意味すると理解される。
【図４】BCP（登録商標）材料上でのPKH26蛍光標識細胞の「播種」。左の枠、上および下：BCP（登録商標）上に播種した脂肪幹細胞。白い矢印は個々の細胞を示す。中央および右の枠、下および上：異なる二つの倍率であり、細胞はBCP（登録商標）材料上で小さい球体として目に見える。上の倍率は接着の10分後であり、下の倍率は接着30分後である。
【図５】脂肪幹細胞による脊椎固定（埋め込み後4日および28日）の組織学的評価。（A）埋め込みの前に、BCP（登録商標）顆粒および脂肪幹細胞浮遊液を充填したPLDLAケージ。（B）二つの腰椎L3およびL4のあいだの椎間板を通しての矢状切断面の肉眼写真、その中にインプラントが留置されている。（C）埋め込み後4日目のケージ空間におけるPKH26標識脂肪幹細胞。白い矢印は個々の細胞を示す。（D）インビボで28日後のインプラントの切断面のTRAP/ALP染色。TRAP染色は赤色であり、骨分解性および無機質分解性の破骨細胞（黒い矢印）を染色する。ALP染色は青色であり、骨芽細胞（黒い三角）における骨形成活性を示す。新たに形成された骨を白い矢印で示す。SCは担体材料である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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