(57)【要約】CAスペーサーペプチド1(SP1)タンパク質前駆体(p25)由来のウイルスGagキャプシド(CA)タンパク質(p24)のプロセシングを破壊することによるHIV-1複製の阻害が開示される。Gag p25タンパク質における変異を含むアミノ酸配列(ジメチルスクシニルベツリン酸またはジメチルスクシニルベツリンによるp25からp24へのプロセシングの阻害の減少をもたらす変異を伴う)、このような変異した配列をコードするポリヌクレオチド、およびこのような変異した配列に選択的に結合する抗体もまた含まれる。阻害の方法、阻害化合物、およびHIV Gagタンパク質のタンパク質分解性プロセシングを標的化する阻害化合物を発見する方法が含まれる。1つの態様において、このような化合物は、プロテアーゼ酵素ではなくGagへの結合によって、GagとのHIVプロテアーゼ酵素の相互作用を阻害する。別の態様において、Gagタンパク質分解部位の領域における変異を含むウイルスまたは組換えタンパク質が、タンパク質分解性プロセシングを標的化する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法において使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に対して有意な影響を与えない化合物を投与する段階を含む、患者におけるHIV-1感染を処置する方法。
【請求項２】
患者における感染細胞から放出されるビリオンの量を有意に減少させない、請求項1記載の方法。
【請求項３】
患者の細胞から放出されるビリオンへのRNAの取り込みの量に対して有意な効果を有さない、請求項1記載の方法。
【請求項４】
化合物が患者の細胞から放出されたビリオンの成熟を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
患者の細胞から放出されたビリオンの大部分が、野生型ビリオンと比較して変化した表現型を示し、該表現型が以下からなる群より選択される、請求項1記載の方法:
(a)ウイルス粒子に関して非中心性である球状の高電子密度コアを有するビリオン;
(b)ウイルス膜のすぐ内側に位置する半月状高電子密度層を有するビリオン;
(c)減少した感染性を有するかまたは感染性を有さないビリオン;および
(d)(a)から(c)までのいずれか1つの組み合わせ。
【請求項６】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を投与する段階を含み、該化合物が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する、患者におけるHIV-1感染を処置する方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが以下からなる群より選択される配列を有する、請求項6記載の方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項８】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を投与する段階を含み、該化合物が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である配列を有するポリペプチドに結合する、患者におけるHIV-1感染を処置する方法:
2008504808.tif 000049
。
【請求項９】
ポリペプチドが以下からなる群より選択される配列を有する、請求項8記載の方法:
2008504808.tif 000050
。
【請求項１０】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を投与する段階を含み、該化合物が、SEQ ID NO:121〜443のいずれか1つから選択される配列を有するポリペプチドに結合する、患者におけるHIV-1感染を処置する方法。
【請求項１１】
患者におけるHIV-1感染が、他のHIV-1治療に応答しないHIV-1の感染を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
HIV-1感染の患者が、そうでもなければ他のHIV-1治療に応答しない、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
患者が免疫調節剤、抗癌剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、またはこれらの組み合わせである付加的な化合物を患者に投与する段階をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
患者が少なくとも1種の他の抗ウイルス剤と組み合わせて化合物を投与される、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
他の抗ウイルス剤が、ジドブジン;ラミブジン;ジダノシン;ザルシタビン;スタブジン;アバカビル;ネビラピン(nevirapine);デラビルジン(delavirdine);エムトリシタビン(emtricitabine);エファビレンツ;サキナビル;リトナビル;インジナビル;ネルフィナビル;アンプレナビル;テノホビル;アデフォビル;アタザナビル(atazanavir);フォサムプレナビル(fosamprenavir);ヒドロキシウレア;AL-721;アンプリゲン(ampligen);ブチル化ヒドロキシトルエン;ポリマンノアセテート(polymannoacetate);カスタノスペルミン(castanospermine);コントラカン(contracan);クリームファーマテックス(creme pharmatex);CS-87;ペンシクロビル(penciclovir);ファムシクロビル(famciclovir);アシクロビル;サイトフォビル(cytofovir);ガンシクロビル;硫酸デキストラン;D-ペニシラミン;トリナトリウムホスホノホルメート(trisodium phosphonoformate);フシジン酸;HPA-23;エフロルニチン(eflornithine);ノノキシノール;ペンタミジンイセチオネート;ペプチドT;フェニトイン;イソニアジド;リバビリン;リファブチン(rifabutin);アンサマイシン(ansamycin);トリメトレキサート;SK-818;スラミン;UA001;エンフュービルタイド(enfuvirtide);gp41由来ペプチド;CD4に対する抗体;可溶性CD4;CD4含有分子;CD4-IgG2;およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に対して有意な影響を与えない化合物を投与する段階を含む、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法。
【請求項１７】
以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する化合物を投与する段階を含む、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが以下からなる群より選択される配列から選択される、請求項17に記載の方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項１９】
以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である配列を有するポリペプチドに結合する化合物を投与する段階を含む、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法:
2008504808.tif 000051
。
【請求項２０】
ポリペプチドが以下からなる群より選択される配列を有する、請求項19記載の方法:
2008504808.tif 000052
。
【請求項２１】
SEQ ID NO:121〜443のいずれか1つから選択される配列を有するポリペプチドに結合する化合物を投与する段階を含む、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法。
【請求項２２】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に対して有意な影響を与えない化合物と、血液製剤を接触させる段階を含む、ヒト血液製剤を処理する方法。
【請求項２３】
阻害が、化合物で処理された感染細胞から放出されるビリオンの量を有意に減少させない、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
阻害が、化合物で処理された感染細胞から放出されるビリオンへのRNAの取り込みの量に対して有意な効果を有さない、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
化合物が、化合物で処理された感染細胞から放出されたビリオンの成熟を阻害する、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
処理された感染細胞から放出されたビリオンの大部分が、野生型ビリオンと比較して変化した表現型を示し、該表現型が以下からなる群より選択される、請求項22記載の方法:
(a)ウイルス粒子に関して非中心性である球状の高電子密度コアを有するビリオン;
(b)ウイルス膜のすぐ内側に位置する半月状高電子密度層を有するビリオン;
(c)減少した感染性を有するかまたは感染性を有さないビリオン;および
(d)(a)から(c)までのいずれか1つの組み合わせ。
【請求項２７】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物と血液製剤を接触させる段階を含み、該化合物が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する、ヒト血液製剤を処理する方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項２８】
ポリヌクレオチドが以下からなる群より選択される配列を有する、請求項27記載の方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項２９】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物と血液製剤を接触させる段階を含み、該化合物が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である配列を有するポリペプチドに結合する、ヒト血液製剤を処理する方法:
2008504808.tif 000053
。
【請求項３０】
ポリペプチドが以下からなる群より選択される配列を有する、請求項29記載の方法:
2008504808.tif 000054
。
【請求項３１】
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物と血液製剤を接触させる段階を含み、該化合物が、SEQ ID NO:121〜443のいずれか1つから選択される配列を有するポリペプチドに結合する、ヒト血液製剤を処理する方法。
【請求項３２】
化合物がHIVプロテアーゼのCA-SP1との相互作用を阻害する、請求項1〜10、16〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
化合物がHIVプロテアーゼのCA-SP1との相互作用を直接的に阻害する、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
化合物がHIVプロテアーゼのCA-SP1との相互作用を間接的に阻害する、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
HIVプロテアーゼのCA-SP1との相互作用が阻害されるように、化合物がウイルスGagタンパク質に結合する、請求項1〜10、16〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
化合物が、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)への切断の部位またはその近傍に結合する、請求項1〜10、16〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
化合物がジメチルスクシニルベツリン酸の誘導体またはジメチルスクシニルベツリンの誘導体である、請求項1〜10、16〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
化合物が、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン;3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸;3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン酸;(3',3'-ジメチルグルタリル)ジヒドロベツリン酸;3-O-ジグリコリル-ベツリン酸;3-O-ジグリコリル-ジヒドロベツリン酸;およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
化合物が下記式I〜IIIのベツリンまたはジヒドロベツリンの誘導体、またはその薬学的に許容される塩ではない、請求項1〜10、16〜31のいずれか1項に記載の方法:
2008504808.tif 000055
式中、
RはC2-C20置換または非置換カルボキシアシルであり、
R'は水素、C2-C10置換もしくは非置換アルキル、またはアリール基であり、
R1はC2-C20置換または非置換カルボキシアシルであり、
R2は水素、C(C6H5)3、またはC2-C20置換もしくは非置換カルボキシアシルであり;および
R3は水素、ハロゲン、アミノ、任意に置換されたモノ-もしくはジ-アルキルアミノ、または-OR4であり、ここでR4は水素、C1-4アルカノイル、ベンゾイル、またはC2-C20置換もしくは非置換カルボキシアシルであり、
点線はC20とC29の間の任意の二重結合を表す。
【請求項４０】
変異型レンチウイルスの複製を3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)に対してより感受性を低くする、Gagをコードする核酸配列中の変異を含む、変異型レンチウイルス。
【請求項４１】
ウイルスのGagポリペプチドが3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に結合しない、請求項40記載の変異型レンチウイルス。
【請求項４２】
変異が、変異型レンチウイルスの複製をDSBによるp25(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害に対しての感受性をさらにより低くする、請求項40記載の該変異型レンチウイルス。
【請求項４３】
Gag p25タンパク質(CA-SP1)をコードするヌクレオチド配列中の変異を含む、請求項40記載の変異型レンチウイルス。
【請求項４４】
Gagポリペプチドをコードし、1つまたは複数のアミノ酸が、CA-SP1領域におけるアミノ酸配列から欠失しているか、またはその中で置換されている、請求項43記載の変異型レンチウイルス。
【請求項４５】
変異が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中で起こる、請求項40記載の変異型レンチウイルス:
2008504808.tif 000056
。
【請求項４６】
変異が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中で起こる、請求項40記載の変異型レンチウイルス:
2008504808.tif 000057
。
【請求項４７】
変異が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一であるヌクレオチド配列中で起こる、請求項40記載の変異型レンチウイルス:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項４８】
変異が、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列中で起こる、請求項40記載の変異型レンチウイルス:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項４９】
CA-SP1における変異が、以下からなる群より選択されるアミノ酸をコードするコドン中で起こる、請求項40記載の変異型レンチウイルス:
(a)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸1(グリシン);
(b)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸2(ヒスチジン);
(c)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸6(バリンまたはイソロイシン);
(d)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸7(ロイシン);
(e)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸8(アラニン);
(f)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸10(アラニン);
(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸11(メチオニン);
(h)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸12(セリン);
(i)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸13(グルタミン);
(j)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸14(バリン);
(k)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸15(スレオニン);
(l)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸16(アスパラギン);および
(m)
2008504808.tif 000058
中のアミノ酸45(アラニン)。
【請求項５０】
CA-SP1配列中の変異が以下からなる群より選択されるコードされたアミノ酸配列の変化を生じる、請求項40記載の変異型レンチウイルス:
(a)GHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のグリシン;
(b)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸2におけるヒスチジンからグルタミン;
(c)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸2におけるヒスチジンからチロシン;
(d)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸6におけるバリンまたはイソロイシンからロイシン;
(e)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸7におけるロイシンからメチオニン;
(f)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸8におけるアラニンからバリン;
(g)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸10におけるアラニンからバリン;
(h)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸11におけるメチオニンからロイシン;
(i)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸12におけるセリンからロイシン;
(j)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸13におけるグルタミンからグルタミン酸;
(k)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸14におけるバリンからアラニン;
(l)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸15におけるスレオニンからロイシン;
(m)SHKARILAEAMSQVTN(SEQ ID NO:116)またはGHKARVLAEAMSQVTN(SEQ ID NO:117)中のアミノ酸16におけるアスパラギンからアラニン;
(n)
2008504808.tif 000059
中のアミノ酸45におけるアラニンからスレオニン。
【請求項５１】
変異がSEQ ID NO:121〜443のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド中で起こる、請求項40記載の変異型レンチウイルス。
【請求項５２】
変異型HIV-1である、請求項40〜51のいずれか1項に記載の変異型レンチウイルス。
【請求項５３】
その複製が3-O-(3'-3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)によって阻害される、組換え非HIV-1レトロウイルス。
【請求項５４】
DSBがウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが他のGagプロセシング段階を有意に阻害しない、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス。
【請求項５５】
ウイルスのGagポリペプチドが3-O-(3',-3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に結合する、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス。
【請求項５６】
以下からなる群に対して少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列を含むp25(CA-SP1)タンパク質を含む、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス:
2008504808.tif 000060
。
【請求項５７】
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むp25(CA-SP1)タンパク質を含む、請求項56記載の組換え非HIV-1レトロウイルス:
2008504808.tif 000061
。
【請求項５８】
以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である、CA-SP1をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項５９】
以下からなる群より選択される配列を有する、CA-SP1をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項６０】
SEQ ID NO:121〜443のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むp25(CA-SP1)を含む、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス。
【請求項６１】
以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス:
(a)SEQ ID NO:90;
(b)SEQ ID NO:92;
(c)SEQ ID NO:94;
(d)SEQ ID NO:96;および
(e)SEQ ID NO:98。
【請求項６２】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルス:
(a)SEQ ID NO:90;
(b)SEQ ID NO:92;
(c)SEQ ID NO:94;
(d)SEQ ID NO:96;および
(e)SEQ ID NO:98。
【請求項６３】
HIV-2、HTLV-I、HTLV-II、SIV、トリ白血病ウイルス(ALV)、内因性トリレトロウイルス(EAV)、マウス乳腺癌ウイルス(MMTV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ビスナ-マエディウイルス、およびネコ白血病ウイルス(FeLV)からなる群より選択されるウイルスから誘導される、請求項53記載の組換え非HIV-Iレトロウイルス。
【請求項６４】
以下からなる群より選択されるウイルスから誘導される、請求項63記載の組換え非HIV-Iレトロウイルス:
(a)SIV;
(b)FIV;
(c)EAIV;
(d)BIV;
(e)CAEV;および
(f)ビスナ-マエディウイルス。
【請求項６５】
請求項53記載の組換え非HIV-1レトロウイルスに感染した適切な非ヒト動物宿主を含む、レンチウイルス感染の動物モデル。
【請求項６６】
非ヒト動物宿主が以下からなる群より選択される、請求項65記載の動物モデル:
(a)ネコ;
(b)サル;
(c)類人猿;
(d)ウマ
(e)ヒツジ;
(f)ヤギ;
(g)ウシ;
(h)マウス;
(i)ラット;および
(j)鳥類。
【請求項６７】
3-O-(3',-3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)に対して感受性ではない非HIV-レンチウイルスからのCA-SP1をコードするポリヌクレオチド配列を、DSB感受性HIV-1ウイルスのCA-SP1をコードする配列で置き換える段階を含む、DSBによる阻害に対して感受性である組換え非HIV-1レンチウイルスを作製する方法。
【請求項６８】
組換え非HIV-1レンチウイルス中のCA-SP1をコードするポリヌクレオチド配列が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である配列を含む、請求項67記載の方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項６９】
組換え非HIV-1レンチウイルス中のCA-SP1をコードするポリヌクレオチド配列が、以下からなる群より選択される配列を含む、請求項68記載の方法:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項７０】
組換えDSB感受性非HIV-1レンチウイルスのCA-SP1タンパク質が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項67記載の方法:
2008504808.tif 000062
。
【請求項７１】
DSB感受性組換え非HIV-1レンチウイルスのCA-SP1タンパク質が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項67記載の方法:
2008504808.tif 000063
。
【請求項７２】
組換えDSB感受性非HIV-1レンチウイルスのCA-SP1タンパク質が、SEQ ID NO:121〜443のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項67記載の方法。
【請求項７３】
以下の段階を含む、請求項67記載の方法:
(a)レンチウイルスのゲノムから、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1370〜1413に対応するヌクレオチドを除去する段階;および
(b)SEQ ID NO:18のヌクレオチド1370〜1413またはSEQ ID NO:19のヌクレオチド1857〜1899を、非HIV-1レンチウイルスの領域に挿入する段階。
【請求項７４】
請求項67〜73のいずれか1項に記載の方法によって産生された組換え非HIV-1レンチウイルス。
【請求項７５】
GagのCA-SP1切断部位またはその近傍において選択的に結合する抗体。
【請求項７６】
以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列を結合する、請求項75記載の抗体:
2008504808.tif 000064
。
【請求項７７】
以下からなる群より選択されるアミノ酸に結合する、請求項75記載の抗体:
2008504808.tif 000065
。
【請求項７８】
SEQ ID NO:121〜443のいずれかから選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項75記載の抗体。
【請求項７９】
3-O-(3'3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害の減少を生じるHIV CA-SP1ポリペプチドにおける変異を含むポリペプチドを選択的に結合する、請求項75記載の抗体。
【請求項８０】
変異が、CA-SP1切断部位もしくはその近傍、またはCA-SP1のSP1ドメインに位置する、請求項79記載の抗体。
【請求項８１】
ポリペプチドが以下からなる群より選択される、請求項79記載の抗体:
2008504808.tif 000066
2008504808.tif 000067
。
【請求項８２】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択されるアミノ酸配列を選択的に結合する、請求項79記載の抗体。
【請求項８３】
以下からなる群より選択される請求項75記載の抗体:
(a)SP1を選択的に結合するがCA-SP1を結合しない抗体;
(b)CA-SP1を選択的に結合するがCAを結合しない抗体;および
(c)CAを選択的に結合するがCA-SP1を結合しない抗体。
【請求項８４】
Gagへの3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸の結合を阻害する、請求項75記載の抗体。
【請求項８５】
以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一である、単離されたCA-SP1ポリペプチド:
2008504808.tif 000068
。
【請求項８６】
以下からなる群より選択される配列と同一である、請求項85記載の単離されたCA-SP1ポリペプチド:
2008504808.tif 000069
。
【請求項８７】
以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約70%同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたCA-SP1ポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項８８】
以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項87記載の単離されたCA-SP1ポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【請求項８９】
SEQ ID NO:121〜443のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列からなる、HIV-1のCA-SP1領域から単離されたポリペプチド。
【請求項９０】
3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25のプロセシングの阻害の減少を生じる変異を含む、HIV CA-SP1ポリペプチドから単離されたポリペプチド。
【請求項９１】
変異がCA-SP1切断部位またはSP1ドメインに位置する、請求項90記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項90記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９３】
3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25のプロセシングの阻害の減少を生じる変異を含み、該変異が以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列中で起こる、請求項90記載の単離されたポリペプチド:
2008504808.tif 000070
。
【請求項９４】
以下からなる群より選択される、請求項90記載の単離されたポリペプチド:
2008504808.tif 000071
2008504808.tif 000072
。
【請求項９５】
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、および10からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドによってコードされる、請求項90記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９６】
キメラまたは融合タンパク質の一部である、請求項90記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９７】
HIV Gag p25タンパク質(CA SP1)の変異を含むアミノ酸配列をコードし、該変異が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害の減少を生じる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９８】
p25のプロセシングの阻害の減少が、GagとのHIV-1プロテアーゼの相互作用の阻害の減少に起因する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９９】
p25のプロセシングの阻害の減少が、Gagへの3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸の結合の減少に起因する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１００】
p25のプロセシングの阻害の減少が、GagのCA-SP1切断部位またはその近傍におけるDSBの結合の減少に起因する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
変異が、CA-SP1切断部位もしくはその近傍、またはCA-SP1のSP1ドメインに位置する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
変異が、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその近傍に位置する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド:
2008504808.tif 000073
。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9からなる群より選択される、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:6からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約95%の同一性を有する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約80%の同一性を有する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約95%の同一性を有する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
SEQ ID NO:10のポリヌクレオチドに対して少なくとも約80%の同一性を有する、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
請求項97記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０９】
請求項108記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１０】
培地中で請求項109記載の宿主細胞をインキュベートする段階、および該培地からポリペプチドを回収する段階を含む、ポリペプチドを産生する方法。
【請求項１１１】
以下の段階を含む、動物の細胞におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定する方法:
(a)CA-SP1切断部位を含むポリペプチドを試験化合物と接触させる段階;
(b)CA-SP1切断部位またはその近傍に選択的に結合する、標識された物質を加える段階;および
(c)該ポリペプチドへの該標識された物質の結合を測定する段階。
【請求項１１２】
化合物がCA-SP1切断部位またはその近傍に結合する、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
化合物が、HIV-1のCA-SP1切断部位との相互作用を阻害する、請求項111記載の方法。
【請求項１１４】
CA-SP1切断部位を含むポリペプチドがポリペプチドフラグメントまたは組換えペプチドである、請求項111記載の方法。
【請求項１１５】
標識された物質がCA-SP1に特異的な標識された抗体であり、対照と比較した、試験化合物の存在下でタンパク質に結合した標識された抗体の量の変化を測定する段階を含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１６】
標識された物質が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸であり、方法が対照と比較して、試験化合物の存在下でタンパク質に結合した標識された3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸の量の変化を測定する段階を含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１７】
標識された物質上の標識が、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質、放射性同位元素、またはこれらの組み合わせである、請求項111記載の方法。
【請求項１１８】
以下の段階を含む、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法:
(a)CA-SP1切断部位を含むポリペプチドを、試験化合物の存在下でプロテアーゼと接触させる段階;および
(b)該ポリペプチドとのプロテアーゼの相互作用を検出する段階。
【請求項１１９】
プロテアーゼがHIV-1プロテアーゼから本質的になる、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
ポリペプチドが2つの蛍光部分で標識され、各々がCA-SP1切断部位の反対側に結合し、ここで、検出する段階が、試験化合物の存在下で1つの部分から他の部分への蛍光エネルギーの移動の測定を含む、請求項118記載の方法。
【請求項１２１】
ポリペプチドの切断に対する試験化合物の効果が、SP1、p24(CA)またはCA-SP1(p25)の少なくとも1つへの抗体の結合を測定することによって検出される、請求項118記載の方法。
【請求項１２２】
標識された抗体が、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質、放射性同位元素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される分子で標識される、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
以下の段階を含む、請求項118記載の方法:
(a)試験化合物の存在下で、HIV-1野生型CA-SP1切断部位を含む第1のポリペプチドを、HIV-1プロテアーゼと接触させる段階;
(b)該試験化合物の存在下で、変異型CA-SP1切断部位または代替のプロテアーゼ切断部位を含む第2のポリペプチドを、HIV-1プロテアーゼと接触させ、ここで該変異型切断部位または代替のプロテアーゼ切断部位の切断は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によって実質的に阻害されない段階;
(c)該第1のペプチドおよび第2のペプチドとのHIV-1の相互作用を検出する段階;ならびに
(d)該第1のポリペプチドの切断を、該第2のポリペプチドの切断と比較する段階。
【請求項１２４】
野生型CA-SP1、変異型CA-SP1、または代替のプロテアーゼ切断部位領域が、ポリペプチドフラグメントまたは組換えペプチド中に含まれる、請求項123記載の方法。
【請求項１２５】
ポリペプチドが蛍光部分および蛍光クエンチング部分で標識され、各々がCA-SP1切断部位の反対側に結合し、検出する段階が蛍光部分からのシグナルを測定することを含む、請求項123記載の方法。
【請求項１２６】
第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチドの少なくとも1つがエピトープタグをさらに含む、請求項123記載の方法。
【請求項１２７】
(a)および(b)が細胞中で行われる、請求項123記載の方法。
【請求項１２８】
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドとの化合物の相互作用を検出する段階がゲル電気泳動を含む、請求項123記載の方法。
【請求項１２９】
以下の段階を含む、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法:
(a)複製が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による阻害に対して感受性である、第1のウイルスで感染した細胞と、試験化合物を接触させる段階;
(b)DSBに対して有意に減少した感受性を有する第2のウイルスで感染した細胞と、試験化合物を接触させる段階;
(c)第1のウイルスおよび第2のウイルスで感染した処理した細胞の表現型を決定する段階;ならびに
(d)第2のウイルスと比較して、第1のウイルスに対してより活性である試験化合物を選択する段階。
【請求項１３０】
表現型が以下からなる群より選択される、請求項129記載の方法:
(a)ウイルス複製;
(b)CA-SP1の切断;および
(c)変化したビリオン表現型の産生。
【請求項１３１】
以下の段階を含む、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法:
(a)複製が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による阻害に対して感受性である、レンチウイルスで感染した細胞に試験化合物を適用する段階;および
(b)該感染した細胞に由来する溶解物を分析して、CA-SP1タンパク質の切断が起こったか否かを決定する段階。
【請求項１３２】
溶解物が以下の少なくとも1つを溶解することによって得られる、請求項131記載の方法:
(a)感染した細胞;または
(b)放出されたウイルス粒子。
【請求項１３３】
分析してCA-SP1タンパク質の切断が起こったか否かを決定する段階が、p25の存在または非存在を測定することを含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３４】
分析してCA-SP1タンパク質の切断が起こったか否かを決定する段階が、ウイルスタンパク質のウェスタンブロットを実行すること、およびp25に対する抗体を使用してp25を検出することを含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３５】
分析してCA-SP1タンパク質の切断が起こったか否かを決定する段階が、ウイルスタンパク質のゲル電気泳動を実行すること、および代謝的に標識されたタンパク質の画像処理を含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３６】
分析してCA-SP1タンパク質の切断が起こったか否かを決定する段階が、イムノアッセイを実行することを含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３７】
イムノアッセイが以下の段階を含む、請求項133記載の方法:
(a)24を選択的に結合する抗体を使用して、基材上でp25およびp24を捕捉する段階;
(b)p25を選択的に結合する抗体を用いて、基材上のp25の存在または非存在を検出する段階。
【請求項１３８】
エピトープタグ配列がSP1に挿入され、分析する段階が、エピトープタグへの抗体を使用するp25の選択的検出を含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３９】
以下の段階を含む、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定する方法:複製が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による阻害に対して感受性である、レンチウイルスで感染した細胞に試験化合物を適用する段階;およびその後に、細胞によって放出されたウイルス粒子を、変化したビリオン表現型について分析する段階。
【請求項１４０】
分析する段階が、透過型電子顕微鏡法を含む、請求項139記載の方法。
【請求項１４１】
変化した表現型が以下からなる群より選択される、請求項139記載の方法:
(a)ウイルス粒子に関して非中心性の球状高電子密度コアを有するビリオン;
(b)ウイルス膜のすぐ内部に位置する半月状の高電子密度層を有するビリオン;
(c)感染性が減少しているか、または感染性を有さないビリオン;および
(d)(a)〜(c)のいずれか1つの組み合わせ。
【請求項１４２】
複製が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による阻害に対して感受性であるレンチウイルスがHIV-1である、請求項129、131または139のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４３】
複製が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による阻害に対して感受性であるレンチウイルスが、HIV-1由来のCA-SP1をコードするヌクレオチドを含む組換え非HIV-1レンチウイルスであり、該レンチウイルスが以下からなる群より選択されるレンチウイルスから誘導される、請求項129、131または139のいずれか1項記載の方法:
(a)SIV;
(b)FIV;
(c)EAIV;
(d)BIV;
(e)CAEV;
(f)ビスナ-マエディウイルス;および
(g)HIV-2。
【請求項１４４】
DSBに対して有意に減少した感受性を有するウイルスが以下からなる群より選択される、請求項131記載の方法:
(a)SIV;
(b)FIV;
(c)EAIV;
(d)BIV;
(e)CAEV;
(f)ビスナ-マエディウイルス;
(g)HIV-2;および
(h)変異型HIV-1。
【請求項１４５】
以下の段階を含む、化合物を同定する方法:
(a)3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)に対して感受性であるレンチウイルスに感染した処置した動物における疾患の進行を測定する段階;
(b)該レンチウイルスに感染した未処理の動物における疾患の進行を測定する段階;
(c)該処置した動物および該未処理の動物の応答を比較する段階。
【請求項１４６】
以下の段階を含む、化合物を同定する方法:
(a)第1のレンチウイルスで感染した動物に化合物を投与し、該第1のレンチウイルスの複製が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)によって阻害される段階;
(b)第2のレンチウイルスで感染した動物に化合物を投与し、該第2のレンチウイルスの複製が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)によって実質的に阻害されない段階;
(c)該第2のレンチウイルスで感染した動物と比較して、該第1のレンチウイルスで感染した動物における疾患の進行を測定および比較する段階。
【請求項１４７】
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する化合物の相互作用を測定する段階を含む、化合物を同定する方法:
2008504808.tif 000074
。
【請求項１４８】
以下の段階を含む、患者がp25プロセシングを阻害する化合物による処置に対して感受性であるHIV-1に感染しているか否かを決定する方法:
(a)患者からの試料を入手する段階;
(b)該試料からCA-SP1をコードするウイルス核酸を入手する段階;
(c)該ウイルス核酸を遺伝子型決定する段階;
(d)該核酸が、そのプロセシングが3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による阻害に対して感受性であるCA-SP1改変体をコードしているか否かを決定する段階。
【請求項１４９】
以下の段階を含む、その必要がある患者における疾患を治療する方法:
(a)ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に対して有意な効果を有さない化合物を同定する段階;
(b)該化合物の販売および使用のための規制認可を得る段階;
販売およびその必要がある患者における疾患の治療のために該化合物をパッケージする段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、HIV感染を阻害する方法、HIV感染のインヒビター、およびHIV感染のインヒビターの発見の方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
連邦政府によって資金援助された研究開発に関する言及
米国政府は、NIH/NIAIDによって授与された助成金番号2R44AI051047-02によって規定されるように、本発明における一括払いライセンス、および妥当な条件に対して他者にライセンス供与を行うことを特許権者に要求するための限られた状況における権利を有してもよい。
【０００３】
背景
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、レトロウイルスのサブファミリーであるレンチウイルスのメンバーである。ウイルスゲノムは、休止細胞と分裂細胞の両方においてその複製の速度をウイルスが制御することを可能にする多くの調節エレメントを含む。最も重要なことは、HIVが免疫系の細胞に感染および侵入し;これが身体の免疫系を破壊し、そして患者を日和見感染および新生物に対して感受性にする。免疫欠損は、数年間で100%に達する高い死亡率を伴って、進行性および不可逆性であるようである。
【０００４】
HIV-1は、細胞表面抗原CD4(OKT4、T4、およびleu3としてもまた知られる)を発現する、免疫系の細胞であるT4リンパ球に対して栄養性かつ細胞変性性である。ウイルスの栄養性は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質gpl20と細胞表面CD4分子との間の相互作用に起因する(Dalgleish et al. Nature 312:763-767(1984))（非特許文献１）。これらの相互作用はHIVによる感受性の高い細胞の感染を媒介するのみならず、感染したT細胞および感染していないT細胞のウイルス誘導性融合物の原因でもある。この細胞の融合は、HIV感染患者において巨大な多核シンシチウムの形成、細胞死、およびCD4細胞の進行性の枯渇を生じる。これらの事象は、HIV誘導性の免疫抑制およびその後の続発症、日和見感染、および新生物を生じる。
【０００５】
CD4+T細胞に加えて、HIVの宿主範囲は単核食細胞系統の細胞を含み(Dalgleish et al., 前出)（非特許文献１）、これには、血液単球、組織マクロファージ、皮膚のランゲルハンス細胞、およびリンパ節中の樹枝状細網細胞が含まれる。HIVはまた、神経栄養性であり、中枢神経系において単球およびマクロファージに感染可能であり、重篤な神経学的損傷を引き起こす。マクロファージおよび単球はHIVの主要なリザーバーである。これらは、CD4保有T細胞と相互作用および融合し得、T細胞枯渇を引き起こし、従ってAIDSの病原性に寄与する。
【０００６】
HIV-1治療のための薬物の開発において顕著な進歩がなされてきた。HIVの治療剤には、以下が含まれるがこれらに限定されない:AZT、3TC、ddC、d4T、ddI、テノホビル、アバカビル、ネビラピン(nevirapine)、デラビルジン(delavirdine)、エムトリシタビン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、アンプレナビル、アタザナビルおよびホスアンプレナビルの少なくとも1つ、または、互いに組み合わせるか、もしくは生物学的に基づく抗レトロウイルス剤もしくは抗体(例えば、gp41由来ペプチド、エンフュービルタイド(enfuvirtide)(Fuzeon;Timeris-Roche)およびT-1249(Trimeris)、または可溶性CD4、CD4に対する抗体、およびCD4もしくは抗CD4の結合体など)と併用するか、または本明細書中にさらに提示されるような、任意の他の抗レトロウイルス剤もしくは抗体。これらの薬物の組み合わせが特に有効であり、血漿中で検出不可能なレベルまでウイルスRNAのレベルを減少させ得、ウイルス耐性の発生を示し、これ伴って患者の健康および寿命の改善がもたらされる。
【０００７】
これらの進歩にも関わらず、現在利用可能な薬物投与計画にはなお問題が存在する。これらの薬物の多くは重大な毒性を示し、他の副作用(例えば、脂肪の再分布)を示し、またはコンプライアンスを減少させる複雑な投薬スケジュールを必要とし、それによって効力を限定する。HIVの耐性株は、しばしば、組み合わせ治療に対してさえ長時間にわたって出現する。これらの薬物の高いコストもまた、とりわけ先進国以外でのそれらの広範囲な使用に対する制限である。
【０００８】
これらの問題を回避するためのさらなる薬物の開発のための広範囲な必要性がなお存在する。理想的には、これらは、組み合わせ治療のために必要な装備一式に加え、ウイルス生活環における異なる段階を標的化し、かつ最少の毒性を示すがより低い製造コストを有する。
【０００９】
HIVビリオンアセンブリーは、ウイルスGagポリタンパク質が蓄積する感染細胞の表面膜で起こり、細胞表面から出芽する未成熟ビリオンのアセンブリーをもたらす。ビリオン中では、Gagがウイルスプロテイナーゼ(PR)によって、マトリックス(MA)タンパク質、キャプシド(CA)タンパク質、ヌクレオキャプシド(NC)タンパク質、およびC末端p6構造タンパク質に切断される(Wiegers K. et al., J. Virol. 72:2846-2854 (1998))（非特許文献２）。Gagプロセシングは、内部ビリオン構造の再組織化、「成熟」と呼ばれるプロセスを誘導する。成熟HIV粒子中で、MAは膜の内部表面に整列するのに対して、CAはNCと複合体形成するゲノムRNAを入れる円錐状コアを形成する。切断および成熟は粒子形成のために必要ではないが、感染性のためには必須である(Kohl, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4686-4690 (1998))（非特許文献３）。
【００１０】
CAおよびNCならびにNCおよびp6は、それぞれ、14アミノ酸および10アミノ酸の短いスペーサーペプチド(p2)(それぞれ、スペーサーペプチド1(SP1)およびSP2)によってGagポリタンパク質上で分離される(Wiegers K. et al., J. Virol. 72:2846-2854(1998), Pettit, S.C. et al., J. Virol. 68:8017-8027 (1994), Liang et al. J. Virol. 76:11729-11737 (2002))（非特許文献２、４、５）。これらのスペーサーペプチドは、粒子成熟の間、それらのN末端およびC末端でPR-媒介性切断によって遊離される。HIV Gagポリタンパク質およびGag-Polポリタンパク質上の個々の切断部位は異なる部位でプロセシングされ、この順次的なプロセシングが最終生成物の前に一時的に現れる中間体を生じる。このような中間体は、ビリオンの形態形成または成熟のために重要であるかもしれないが、成熟ウイルス粒子の構造に寄与しない(Weigers et al. およびPettit, et al., 前出)（非特許文献２、４）。最初のGag切断事象はSP1のC末端で起こり、N末端MA-CA-SP1中間体を、C末端NC-SP2-p6中間体から分離する。CA-SP1からMAを、およびp6からNC-SP2を分離する引き続く切断は、約10倍遅い速度で起こる。CAのC末端からのSP1の切断は遅発性の事象であり、SP1-NC部位での切断よりも400倍遅い速度で起こる(Weigers et al. およびPettit, et al., 前出)（非特許文献２、４）。未切断のCA-SP1中間体タンパク質は代替的に「p25」と名付けられたのに対して、切断されたCAタンパク質は代替的に「p24」と名付けられ、および切断されたSP1ペプチドは代替的に「p2」と名付けられた。
【００１１】
CAのC末端からのSP1の切断は、Gagプロセシングカスケードにおける最後の事象の1つであるようであり、最終的なキャプシド凝縮および成熟した感染性ウイルス粒子の形成のために必要である。成熟ビリオンの電子顕微鏡写真は、高電子密度の円錐形コアを有する粒子を示す。他方、CA-SP1切断を欠くウイルス粒子の電子顕微鏡研究は、球状の高電子密度リボヌクレオタンパク質コアおよびウイルス膜のすぐ内側に位置する半月状の高電子密度層を有する粒子を示す(Weigers et al. 前出)（非特許文献２）。CA-SP1切断部位またはその近傍の変異は、Gagプロセシングおよび通常の成熟プロセスを破壊し、それによって非感染性ウイルス粒子の産生を生じることが示されてきた(Weigers et al. 前出)（非特許文献２）。表現型的には、これらの粒子はGagプロセシングの欠損(これは、ウェスタンブロット分析におけるp25(CA-SP1)の存在においてそれ自体を明らかにする)、および欠損性のキャプシド凝縮から生じる上記の異常な粒子形態を示す。
【００１２】
以前に、ベツリン酸およびプラタン酸(platanic acid)がSyzigium claviflorumから単離され、抗HIV活性を有することが決定された。ベツリン酸およびプラタン酸は、それぞれ1.4μMおよび6.5μMのEC50値で、かつそれぞれ9.3および14の治療指数(T.I.)値で、H9リンパ球細胞中でHIV-1複製に対して阻害活性を示した。ベツリン酸の水素付加はジヒドロベツリン酸を生じ、これは、0.9のEC50値および14のT.I.値で、わずかにより強力な抗HIV活性を示した(Fujioka, T., et al., J. Nat. Prod. 57:243-247 (1994))（非特許文献６）。特定の置換型アシル基(3',3'-ジメチルグルタリル基および3',3'-ジメチルスクシニル基)を有するベツリン酸のエステル化は、増強した活性を有する誘導体を産生する(Kashiwada, Y., et al., J. Med. Chem. 39:1016-1017 (1996))（非特許文献７）。強力な抗HIV剤であるアシル化ベツリン酸およびジヒドロベツリン酸はまた、米国特許第5,679,828号（特許文献１）において記載されている。抗HIVアッセイは、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)-ベツリン酸(DSB)およびジヒドロベツリン酸アナログの両方が急性感染したH9リンパ球中で極度に強力な抗HIV活性を、それぞれ1.7×10-5μM未満のEC50値で実証することを示した。これらの化合物は、それぞれ970,000より高い、および400,000より高い顕著なT.I.値を示した。
【００１３】
米国特許第5,468,888号（特許文献２）は、ルパン(lupane)
の28アミド誘導体を開示し、これはHIV感染細胞に対して細胞保護効果を有するとして記載される。
2008504808.tif 000002
R=H（ベツリン酸）
【００１４】
日本国特許出願第JP 01 143,832号（特許文献３）は、抗癌剤の分野において有用であるベツリンおよびその3,28ジエステルを開示する。
【００１５】
米国特許第6,172,110号（特許文献４）は、以下の式または薬学的に許容されるその塩を有する、ベツリン酸およびジヒドロベツリンの誘導体を開示する。
ベツリンおよびジヒドロベツリンの誘導体
2008504808.tif 000003
ここでR1はC2-C20置換型または非置換型のカルボキシアシルであり、R2はC2-C20置換型または非置換型のカルボキシアシルであり;かつR3は水素、ハロゲン、アミノ、置換されていてもよいモノアルキルアミノもしくはジアルキルアミノ、または--OR4であり、ここでR4は水素、C1-4アルカノイル、ベンゾイル、またはC2-C20置換型もしくは非置換型のカルボキシアシルであり;ここで破線はC20とC29の間の任意の二重結合を表す。
【００１６】
米国特許出願第60/413,451号（特許文献５）は、3,3-ジメチルスクシニルベツリンを開示し、これは参照により本明細書に組み入れられる。Zhu, Y-M. et al., Bioorg. Chem Lett. 11:3115-3118 (2001); Kashiwada Y. et al., J. Nat. Prod. 61:1090-1095 (1998); Kashiwada Y. et al., J. Nat. Prod. 63:1619-1622 (2000); およびKashiwada Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 48:1387-1390 (2000)（非特許文献８〜１１）は、ジメチルスクシニルベツリン酸およびジメチルスクシニルオレアノール酸を開示する。コハク酸を用いるベツリンの3'炭素のエステル化は、HIV-1活性を阻害することが可能な化合物を産生した(Pokrovskii, A.G. et al., Gos. Nauchnyi Tsentr Virusol. Biotekhnol. 「Vector,」9:485-491 (2001))（非特許文献１２）。
【００１７】
公開された国際公開公報第02/26761号（特許文献６）は、真菌感染を処置するためのベツリンおよびそのアナログの使用を開示する。
【００１８】
ウイルスの薬物耐性株に対して有効である新規なHIV阻害方法についての必要性が存在する。本発明のストラテジーは、認可された治療とは異なる方法においてウイルスを阻害する治療方法および化合物を提供することである。
【００１９】
本発明の化合物および方法は、新規な作用のメカニズムを有し、それゆえに、現在の逆転写酵素およびプロテアーゼインヒビターに対して耐性であるHIV株に対して活性である。このようにして、本発明は、HIV/AIDSを処置するための完全に新規なアプローチを提供する。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第5,679,828号
【特許文献２】米国特許第5,468,888号
【特許文献３】日本国特許出願第JP 01 143,832号
【特許文献４】米国特許第6,172,110号
【特許文献５】米国特許出願第60/413,451号
【特許文献６】国際公開公報第02/26761号
【非特許文献１】Dalgleish et al. Nature 312:763-767(1984)
【非特許文献２】Wiegers K. et al., J. Virol. 72:2846-2854 (1998)
【非特許文献３】Kohl, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4686-4690 (1998)
【非特許文献４】Pettit, S.C. et al., J. Virol. 68:8017-8027 (1994)
【非特許文献５】Liang et al. J. Virol. 76:11729-11737 (2002)
【非特許文献６】Fujioka, T., et al., J. Nat. Prod. 57:243-247 (1994)
【非特許文献７】Kashiwada, Y., et al., J. Med. Chem. 39:1016-1017 (1996)
【非特許文献８】Zhu, Y-M. et al., Bioorg. Chem Lett. 11:3115-3118 (2001)
【非特許文献９】Kashiwada Y. et al., J. Nat. Prod. 61:1090-1095 (1998)
【非特許文献１０】Kashiwada Y. et al., J. Nat. Prod. 63:1619-1622 (2000)
【非特許文献１１】Kashiwada Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 48:1387-1390 (2000)
【非特許文献１２】Pokrovskii, A.G. et al., Gos. Nauchnyi Tsentr Virusol. Biotekhnol. 「Vector,」9:485-491 (2001)
【発明の開示】
【００２１】
発明の簡単な概要
一般的に、本発明は、HIV-1 Gagタンパク質のタンパク質分解性プロセシングを標的化する、阻害方法、阻害化合物、および阻害化合物を同定する方法を提供する。1つの態様において、このような化合物は、プロテアーゼ酵素のHIV-1 Gagタンパク質との相互作用を直接的または間接的に阻害しうる。別の態様において、相互作用のこのような阻害は、Gagへの化合物の結合を介して起こる。3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)によるHIV-1のCA-SP1タンパク質のプロテアーゼ切断の阻害は1つの例であるが、他のタンパク質分解部位が、DSBがGagと相互作用するのと同様の様式で基質と相互作用する阻害化合物を使用する同様のアプローチによって標的化され得る。
【００２２】
もう一つの局面は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に効果を有さない方法に指向される。
【００２３】
さらなる局面は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に効果を有さない化合物を同定するための方法に指向される。
【００２４】
一つの局面は、本明細書中に開示されるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法によって同定される化合物または薬学的組成物に及ぶ。
【００２５】
もう一つの局面は、Gag p25タンパク質中に変異を含むアミノ酸配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドに指向され、該変異は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25からp24へのプロセシングの阻害の減少をもたらす。本発明のこの局面はまた、該ポリヌクレオチドを含むベクター、ウイルス、および宿主細胞、ならびに該タンパク質を作製する方法に指向される。
【００２６】
さらなる局面は、Gag p25タンパク質中に変異を含むアミノ酸配列に指向され、該変異は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25からp24へのプロセシングの阻害の減少をもたらす。
【００２７】
なおさらなる局面は、Gag p25タンパク質中に変異を含むアミノ酸配列を選択的に結合する抗体に指向され、該変異は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25からp24へのプロセシングの阻害の減少をもたらす。該抗体を作製する方法、該抗体を産生するハイブリドーマ、および該ハイブリドーマを作製する方法もまた、本発明のこの局面に含まれる。
【００２８】
なおさらなる態様は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を含むキットに関する。
【００２９】
本発明はさらに、処理された感染細胞から放出されたウイルス粒子の成熟をブロックする化合物と該細胞を接触させることによって動物の細胞中のHIV-1感染を阻害する方法に関する。1つの態様において、放出されるウイルス粒子は、凝縮されていないコアおよびウイルス膜の近傍の独特の薄い高電子密度層を示し、かつ減少した感染性を有する。ウイルスGag p25タンパク質のプロセシングを阻害し、かつウイルス粒子の成熟を破壊することの両方を行う化合物と、動物細胞を接触させる方法が含まれる。HIV感染細胞を処理する方法もまた含まれ、ここで、該細胞に感染するHIVは他のHIV治療に応答しない。
【００３０】
本発明はさらに、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に効果を有さない化合物を同定するための方法をさらに含む。この方法は、HIV-1感染細胞を試験化合物と接触させる段階、およびその後で、p25の存在を検出するために、放出されるウイルス粒子を分析する段階を含む。p25を検出するための方法には、ウイルスタンパク質のウェスタンブロッティングおよびp25に対する抗体を使用する検出、ゲル電気泳動、ならびに代謝的に標識されたタンパク質の画像化が含まれる。p25を検出するための方法にはまた、p25またはSP1(p2)またはSP1配列に挿入されたエピトープタグに対する抗体を使用するイムノアッセイも含まれる。
【００３１】
本発明はさらに、化合物を同定するための方法に指向され、この方法は、HIV-1感染細胞を試験化合物と接触させる段階、およびその後で、接触した細胞によって放出されるウイルス粒子を薄片作製および透過型電子顕微鏡によって分析する段階、ならびに凝縮されていないコアおよびウイルス膜近傍の独特な薄い高電子密度層を伴うウィルス粒子が、存在するか否かを特定する段階を含む。
【００３２】
本発明はまた、上述のスクリーニング方法によって同定される化合物に指向される。さらなる態様において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に対して有意な影響を与えない化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を処置する方法に及ぶ。関連する態様において、このような阻害には、異なる観察可能な表現型が付随する可能性がある。例えば、阻害は、処理された感染細胞から放出されるビリオンの量を有意に減少する必要がないかもしれず;および/または該阻害は放出されたビリオンへのRNAの取り込みの量に対して有意な効果をほとんど有さないか、もしくはその効果を全く有さないかもしれず;および/または該阻害は該化合物で処理された感染細胞から放出されたビリオンの成熟を破壊する。関連する態様において、ビリオン構造は影響を受ける可能性があり、処理された細胞から放出されたビリオンの大部分は、ウイルス粒子に関して非中心性である球状の高電子密度コアを示し;および/またはウイルス膜のすぐ内側に位置する半月状高電子密度層を有し;および/または減少した感染性を有するかまたは感染性を有さない。
【００３３】
付加的な態様において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害を生じるが、他のGagプロセシングプロセスに対しては有意な効果を有さない、CA-SP1とのHIVプロテアーゼの相互作用を阻害する化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を処置する方法に及ぶ。このような阻害は、直接的であってもよいし、もしくは代替として、間接的であってもよく;および/またはHIVプロテアーゼのCA-SP1との相互作用が阻害されるようにウイルスGagタンパク質に結合する該化合物を含んでもよい。本発明はまた、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)への切断の部位またはその近傍において結合する化合物を用いて、患者におけるHIVを処置し、それによって、HIVプロテアーゼのCA-SP1切断部位との相互作用を阻害し、およびp25からp24へのプロセシングの阻害を生じる方法に及ぶ。
【００３４】
他の態様において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を処置する方法に及び、該化合物は、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%の同一性を有するか、または同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する:
2008504808.tif 000004
。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を処置する方法に及び、該化合物は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%の同一性を有するか、または同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに結合する:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【００３６】
別の局面において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)のプロセシングを阻害する方法に及ぶ。関連する態様において、このような化合物は、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%の同一性を有するか、または同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する:
2008504808.tif 000005
。
【００３７】
関連する態様において、本発明は、化合物の投与によってウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)のプロセシングを阻害する方法に及び、該化合物は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%の同一性を有するか、または同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに結合する:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【００３８】
本発明は、他のHIV-1治療によって十分には治療されない患者におけるHIVの治療において有用である可能性がある。従って、本発明はまた、HIV-1感染細胞が他のHIV治療に応答しない、治療の必要のある患者を治療する方法に及ぶ。別の態様において、本発明の方法は、HIV感染を治療するために使用される薬物に対して耐性であるHIVに感染した被験体上で実施される。1つの応用において、HIVは、プロテアーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ワクチン、結合阻害剤、免疫調節物質、または他の任意の阻害剤に対して耐性である。別の態様において、本発明の方法は、以下からなる群より選択される、HIV感染を治療するために使用される薬物に対して耐性である、HVに感染した被験体上で実施される:ジドブジン、ラミブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、アバカビル、ネビラピン(nevirapine)、デラビルジン(delavirdine)、エムトリシタビン(emtricitabine)、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、テノホビル、アンプレナビル、アデフォビル、アタザナビル(atazanavir)、フォサムプレナビル(fosamprenavir)、ヒドロキシウレア、AL-721、アンプリゲン(ampligen)、ブチル化ヒドロキシトルエン、ポリマンノアセテート(polymannoacetate)、カスタノスペルミン(castanospermine)、コントラカン(contracan)、クリームファーマテックス(creme pharmatex)、CS-87、ペンシクロビル(penciclovir)、ファムシクロビル(famciclovir)、アシクロビル、サイトフォビル(cytofovir)、ガンシクロビル、硫酸デキストラン、D-ペニシラミン、トリナトリウムホスホノホルメート(trisodium phosphonoformate)、フシジン酸、HPA-23、エフロルニチン(eflornithine)、ノノキシノール、ペンタミジンイセチオネート、ペプチドT、フェニトイン、イソニアジド、リバビリン、リファブチン(rifabutin)、アンサマイシン(ansamycin)、トリメトレキサート、SK-818、スラミン、UA001、およびこれらの組み合わせ。
【００３９】
本発明の化合物はまた、治療の組み合わせの一部として有用である。従って、1つの局面において、本発明は、該患者が、少なくとも1種の抗ウイルス剤と組み合わせて該化合物を投与される、患者におけるHIVを治療する方法に及ぶ。適切な抗ウイルス剤には以下が含まれるがこれらに限定されない:ジドブジン、ラミブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、アバカビル、ネビラピン、デラビルジン、エムトリシタビン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、テノホビル、アデフォビル、アタザナビル、フォサムプレナビル、ヒドロキシウレア、AL-721、アンプリゲン、ブチル化ヒドロキシトルエン、ポリマンノアセテート、カスタノスペルミン、コントラカン、クリームファーマテックス、CS-87、ペンシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、サイトフォビル、ガンシクロビル、硫酸デキストラン、D-ペニシラミン、トリナトリウムホスホノホルメート、フシジン酸、HPA-23、エフロルニチン、ノノキシノール、ペンタミジンイセチオネート、ペプチドT、フェニトイン、イソニアジド、リバビリン、リファブチン、アンサマイシン、トリメトレキサート、SK-818、スラミン、UA001、エンフュービルタイド、gp41由来ペプチド、CD4に対する抗体、可溶性CD4、CD4含有分子、CD4-IgG2、およびこれらの組み合わせ。別の態様において、患者は、免疫調節剤、抗癌剤、抗菌剤、抗真菌剤、またはこれらの組み合わせと組み合わせた該化合物を投与される。
【００４０】
本発明はまた、化合物に指向される。このような化合物は、HIVに感染した患者を処置する方法において;ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するための方法において、またはヒトの血液およびヒト血液製剤を処理するための方法において有用である。本発明において有用であるこのような化合物にはジメチルスクシニルベツリン酸の誘導体もしくはジメチルスクシニルベツリンの誘導体が含まれるがこれらに限定されず、または以下からなる群より選択される:3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン酸、(3',3'-ジメチルグルタリル)ジヒドロベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ジヒドロベツリン酸、およびこれらの組み合わせ。
【００４１】
本発明の化合物は、単独で使用されてもよく、または以下を含む付加的な化合物とともに投与されてもよい:ジドブジン、ラミブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、アバカビル、ネビラピン、デラビルジン、エムトリシタビン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、テノホビル、アデフォビル、アタザナビル、フォサムプレナビル、ヒドロキシウレア、AL-721、アンプリゲン、ブチル化ヒドロキシトルエン;ポリマンノアセテート、カスタノスペルミン;コントラカン;クリームファーマテックス、CS-87、ペンシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、サイトフォビル、ガンシクロビル、硫酸デキストラン、D-ペニシラミン、トリナトリウムホスホノホルメート、フシジン酸、HPA-23、エフロルニチン、ノノキシノール、ペンタミジンイセチオネート、ペプチドT、フェニトイン、イソニアジド、リバビリン、リファブチン、アンサマイシン、トリメトレキサート、SK-818、スラミン、UA001、エンフュービルタイド、gp41由来ペプチド、CD4に対する抗体、可溶性CD4、CD4含有分子、CD4-IgG2、およびこれらの組み合わせ;抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗癌剤、抗菌剤、抗真菌剤、またはこれらの組み合わせ。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物と、該血液製剤を接触させる段階を含む、ヒト血液製剤を処理する方法に指向される。1つの局面において、該化合物は、他のGagプロセシング段階に対して有意な影響を与えない。この方法の関連する態様において、該阻害は、処理された感染細胞から放出されるビリオンの量を有意に減少させず;および/または放出されるビリオンへのRNAの取り込みの量に対して有意な効果をほとんど有さないか、もしくはその効果を有さず;および/または該化合物で処理された感染細胞から放出されたビリオンの成熟を阻害し;および/またはウイルスの形態学に影響を与える。ウイルスの形態学に対するこのような効果には以下が含まれるがこれらに限定されない:ウイルス粒子に関して非中心性である球状の高電子密度コアを有するビリオン;および/またはウイルス膜のすぐ内側に位置する半月状高電子密度層を有するビリオン;および/または減少した感染性を有するかまたは感染性を有さないビリオン。関連する態様において、この方法は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害を生じるが、他のGagプロセシングプロセスに対しては有意な効果を有さない化合物の投与を含む。これは、CA-SP1とのHIVプロテアーゼの直接的、もしくは代替として、間接的な阻害であってもよく;および/またはHIVプロテアーゼのCA-SP1との相互作用が阻害されるようにウイルスGagタンパク質に結合する該化合物を含んでもよく;および/または該化合物がウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)への切断の部位もしくはその近傍において結合し、それによって、HIVプロテアーゼのCA-SP1切断部位との相互作用を阻害し、およびp25からp24へのプロセシングの阻害を生じる。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物と該血液製剤を接触させる段階を含み、該化合物が、以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%の同一性を有するか、または同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、ヒト血液製剤を処理する方法に及ぶ:
2008504808.tif 000006
。
【００４４】
関連する態様において、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物と該血液製剤を接触させる段階を含み、該化合物が、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%の同一性を有するか、または同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに結合する:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(e)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(f)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(g)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(h)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(i)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【００４５】
本発明はまた、HIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法を具体化する。従って、本発明はまた、以下の段階を含む、動物の細胞におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定する方法を含む:CA-SP1切断部位を含むGagタンパク質を試験化合物と接触させる段階;CA-SP1切断部位の近傍に選択的に結合する、標識された物質を加える段階;およびCA-SP1切断部位への試験化合物の結合と標識された物質の結合の間の競合を測定する段階。この方法のさらなる態様において、化合物は、該標的部位への結合によって、標的部位とのHIV-1プロテアーゼの相互作用を阻害する。
【００４６】
これらの方法はまた、CA-SP1切断部位領域がポリペプチドフラグメントまたは組換えペプチド中に含まれ;および/または標識された物質がCA-SP1に特異的な標識された抗体であり、対照と比較して、試験化合物の存在下でタンパク質に結合する標識された抗体の量の変化を測定する態様を含む。標識には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質、放射性同位元素、またはこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【００４７】
動物の細胞におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定する方法はまた、1つの態様において、対照と比較した、試験化合物の存在下でタンパク質に結合した標識された3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸の量の変化を測定することを含み、ここで標識された物質は3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸である。
【００４８】
代替の態様において、本発明は、動物の細胞におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法を含み、この方法は、試験化合物の存在下で、CA-SP1切断部位を含むポリペプチドをプロテアーゼと接触させる段階を含む。好ましくは、プロテアーゼは、HIV-1プロテアーゼに関連し、またはHIV-1プロテアーゼである。1つの態様において、この方法は以下の段階を含む:野生型CA-SP1切断部位を含むポリペプチドを、試験化合物の存在下でプロテアーゼと接触させる段階、およびまた、変異型CA-SP1切断部位を含むポリペプチドまたは代替のプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質を、試験化合物の存在下で、HIV-1プロテアーゼと接触させる段階、切断を検出する段階、ならびに変異型ポリペプチドの切断の量または代替のプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質の切断の量に対して、ネイティブな野生型ポリペプチドの切断の量を比較する段階。この方法の関連する局面において、野生型CA-SP1または変異型CA-SP1または代替のプロテアーゼ切断部位は、ポリペプチドフラグメントまたは組換えペプチド中に含まれる。さらなる関連する局面において、このポリペプチドは、蛍光部分および蛍光クエンチング部分で標識され、各々がCA-SP1切断部位の反対側に結合し、該検出する段階が蛍光部分からのシグナルを測定することを含む。別の関連する態様において、このポリペプチドは2つのポリペプチド部分で標識され、各々がCA-SP1切断部位の反対側に結合し、該検出する段階は、試験化合物の存在下で1つの部分から他の部分への蛍光エネルギーの移動を測定することである。さらなる態様において、ポリペプチドの切断に対する試験化合物の効果が、SP1またはp24(CA)に結合した標識された抗体の量を測定することによって検出される。関連する局面において、CAを結合する標識された抗体、またはSP1を結合する抗体は、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質、放射性同位元素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される分子で標識される。
【００４９】
本発明はまた、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法に指向される。1つの態様において、この方法は以下の段階を含む;野生型ウイルス単離物に感染した細胞、または3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸による阻害に対して有意に減少した感受性を有すウイルス単離物に感染した細胞と、試験化合物を接触させる段階;ならびに、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に対して減少した感受性を有すウイルス単離物と比較して、野生型ウイルス単離物に対してより活性である試験化合物を選択する段階。別の態様において、この方法は、以下の段階を含む;HIV-1感染細胞を試験化合物と接触させる段階;感染細胞または放出されたウイルス粒子を溶解して、溶解物を形成する段階;および溶解物を分析してCA-SP1タンパク質の切断が起こったか否かを決定する段階。この後者の態様において、分析する段階は、p25の存在または非存在を測定することを含んでもよく;ならびに/またはウイルスタンパク質のウェスタンブロットを実行すること、およびp25に対する抗体を使用してp25を検出すること;ならびに/またはウイルスタンパク質のゲル電気泳動を実行すること、および代謝的に標識されたタンパク質の画像処理;ならびに/またはイムノアッセイを実行することを含んでもよい。このようなイムノアッセイは、当技術分野において公知である任意の方法によって実行されてもよく、これには以下が含まれるがこれらに限定されない:
(a)p24を選択的に結合する抗体を使用して、基材上でp25およびp24を捕捉する段階;および
(b)p25を選択的に結合する抗体を使用することによって、基材上のp25の存在または非存在を検出する段階。本発明はまた、当業者に明らかであるような上記のアッセイの改変を含む。
【００５０】
さらなる態様において、本発明に従う化合物を同定する方法は、SP1に挿入されたエピトープタグ配列の使用を含み、p25の選択的検出は、このエピトープタグに対する抗体を使用して実行される。
【００５１】
本発明はまた、以下の段階を含む、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法に指向される:HIV-1感染細胞を試験化合物と接触させる段階、およびその後に、ウイルス粒子を透過型電子顕微鏡法を使用して分析する段階。このような分析は、例えば、ウイルス粒子に関して非中心性の球状高電子密度コアの存在;および/またはウイルス膜のすぐ内部に位置する半月状の高電子密度層を有することを探索することを含む。
【００５２】
付加的な局面において、本発明は、HIV Gag p25タンパク質(CA-SP1)における変異を含むアミノ酸配列をコードする配列を含み、該変異は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による、p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害の減少を生じる。p25のプロセシングの阻害は、GagとのHIV-1プロテアーゼの相互作用の阻害の減少;および/またはGagへの3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸の結合の減少;GagのCA-SP1切断部位もしくはその近傍におけるDSBの結合の減少に起因する可能性がある。適切なポリヌクレオチドにはまた以下が含まれる:CA-SP1切断部位もしくはその近傍、またはCA-SP1のSP1ドメインにおける変異をコードするもの;ならびに/あるいはアミノ酸配列G/SHKARV/ILAEAMSQV(SEQ ID NO:1)またはその近傍における変異をコードするもの;ならびに/あるいはアミノ酸配列GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO:2)またはSHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO:3)をコードするもの;ならびに/あるいはSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド;ならびに/あるいはSEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:6からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約95%の同一性を有するポリヌクレオチド;ならびに/あるいはSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約80%の同一性を有するポリヌクレオチド；ならびに/あるいはSEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも約95%の同一性を有するポリヌクレオチド;ならびに/あるいはSEQ ID NO:10のポリヌクレオチドに対して少なくとも約80%の同一性を有するポリヌクレオチド。付加的な態様において、このポリヌクレオチドは、上記に列挙したポリヌクレオチド配列に対して、約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%より高い同一性を有するか、またはこれらの配列と同一である。
【００５３】
本発明はまた、上記のようなポリヌクレオチドを含むベクター;このようなベクターを含む宿主細胞;ならびに培地中のこのようなベクターを含む宿主細胞をインキュベートする工程、および該培地からポリペプチドを回収する工程を含む、ポリペプチドを産生する方法に指向される。
【００５４】
1つの態様において、本発明は抗体に指向される。このような抗体は、以下からなる群より選択される配列に対して、少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%の同一性を有するか、またはこれらの配列と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し得る:
2008504808.tif 000007
。
【００５５】
さらなる関連する態様において、本発明は、以下からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%の同一性を有するか、またはこのポリヌクレオチドと同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに結合する抗体に及ぶ:
(a)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1243〜1435;
(b)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1729〜1920;
(c)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1344〜1435;
(d)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1828〜1920;
(f)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1370〜1413;
(g)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1857〜1899;
(h)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1419;
(i)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1905;
(j)SEQ ID NO:18のヌクレオチド約1372〜1434;および
(j)SEQ ID NO:19のヌクレオチド約1858〜1920。
【００５６】
1つの態様において、この抗体は、HIV-1のCA-SP1領域のアミノ酸に結合し、該アミノ酸は、SHKARILAEAMSQV(SEQ ID NO:25)またはGHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO:26)を含む。
【００５７】
1つの態様において、本発明は、GagポリペプチドのCA-SP1領域への3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸の結合を阻害する抗体に及ぶ。
【００５８】
本発明はまた、変異型HIVウイルスに及ぶ。1つのこのような態様において、本発明は、該ウイルス中のウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によって有意に阻害されない、単離された変異型組換えHIV-1ウイルスである。関連する態様において、このウイルスは、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によって阻害されない。別の態様において、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸は、このウイルス中でのプロテアーゼのGagポリペプチドとの相互作用を阻害しない。別の態様において、このウイルスは、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に結合しない。さらなる態様において、本発明は、CA-SP1領域のアミノ酸が代替のアミノ酸で置き換えられ、またはアミノ酸がCA-SP1領域に付加され、またはアミノ酸が欠失しているウイルスに及ぶ。1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸が、CA-SP1領域中のアミノ酸配列AEAMSQV(SEQ ID NO:26のアミノ酸番号8〜14)から欠失される。
【００５９】
変異型ウイルスが、本明細書中の別の箇所に記載される本発明の方法において使用されてもよい。例えば、このようなウイルスは、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を同定する方法において有用であり、この方法は、上記に概説した変異型ウイルスの複製と比較して、HIV-1複製を阻害する該化合物の能力を比較する段階を含む。このような阻害は、細胞中で、または動物中で、またはインビトロで試験されてもよい。
【００６０】
本発明はまた、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に対して感受性である非HIV-1レトロウイルスに及ぶ。ある態様において、該レトロウイルスは、CA-SP1切断部位またはその近傍において、配列AEAMSQV(SEQ ID NO:26のアミノ酸番号8〜14)を含むアミノ酸配列を有するCA-SP1ポリペプチドをコードする。別の態様において、このレトロウイルスは、CA-SP1切断部位またはその近傍において、配列VLAEAMSQV(SEQ ID NO:26のアミノ酸番号6〜14)を含むアミノ酸配列を有するCA-SP1ポリペプチドをコードする。別の態様において、このレトロウイルスは、CA-SP1切断部位またはその近傍において、配列GHKARVLAEAMSQV(SEQ ID NO:26)を含むアミノ酸配列を有するCA-SP1ポリペプチドをコードする;別の態様において、このレトロウイルスは、SEQ ID NO:26;SEQ ID NO:90;SEQ ID NO:92;SEQ ID NO:94;SEQ ID NO:96;またはSEQ ID NO:98のポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して、少なくとも60%、70%、80%、90%の同一性を有するか、またはその配列と同一であるアミノ酸配列を含む;別の態様において、このレトロウイルスは、SEQ ID NO:91;SEQ ID NO:93;SEQ ID NO:95;SEQ ID NO:97;またはSEQ ID NO:99の配列に対して、少なくとも60%、70%、80%、90%の同一性を有するか、またはその配列と同一であるアミノ酸配列を含む。別の態様において、このレトロウイルスは、SEQ ID NO:90;SEQ ID NO:92;SEQ ID NO:94;SEQ ID NO:96;またはSEQ ID NO:98の配列に対して、少なくとも70%、80%、90%の同一性を有するか、またはその配列と同一である核酸配列を含む。
【００６１】
本発明のこの態様のレトロウイルスには、HIV-2、HTLV-I、HTLV-II、SIV、トリ白血病ウイルス(ALV)、内因性トリレトロウイルス(EAV)、マウス乳腺癌ウイルス(MMTV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ビスナ-マエディウイルス、またはネコ白血病ウイルス(FeLV)が含まれるがこれらに限定されない。
【００６２】
関連する態様において、本発明は、DSBに対して感受性である組換え非HIV-1レンチウイルスを作製する方法を指向する。この方法は、HIV-1におけるSEQ ID NO:18からのヌクレオチド1370〜1413に対応するヌクレオチドを該レンチウイルスのゲノムから欠失させる段階;および該非HIV-1レンチウイルスの該領域に、SEQ ID NO:18からのヌクレオチド1370〜1413またはSEQ ID NO:19のヌクレオチド1857〜1899を挿入する段階を含む。
【００６３】
この方法によって、構築された、構築される、または構築され得るキメラレンチウイルスの例は、図10に示される。
【００６４】
このようなウイルスは、本明細書の他の箇所に示される本明細書の方法において使用されてもよい。例えば、このような組換え非HIV-1レンチウイルスは、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を同定する方法において使用されてもよく、この方法は、野生型非HIV-1レンチウイルスの複製を阻害する該化合物の能力を、そのDSB感受性組換え改変体と比較する段階からなる。このような阻害は、細胞中;動物中;またはインビトロで行われてもよい。
【００６５】
本発明はまた、3-O-(3'-3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に対して感受性であるレンチウイルスに感染した適切な非ヒト動物宿主を含む、レンチウイルス感染の動物モデルに及ぶ。このような態様において、このレンチウイルスは、SIV;
FIV;EIAV;BIV;CAEV;およびビスナ-マエディウイルスを含み得るがこれらに限定されない。
【００６６】
本発明はまた、単離されたポリペプチドに及ぶ。1つの態様において、本発明は、HIV CA-SP1タンパク質の変異を含むポリペプチドに及び、該変異は、3-O-(3'-3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25のプロセシングの阻害の減少を生じる。関連する態様において、このポリペプチドは、CA-SP1切断部位もしくはその近傍、またはSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、もしくはSEQ ID NO:10によってコードされるSP1ドメインに位置する変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、ならびに/あるいはSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされ;ならびに/あるいはGHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO:2)またはSHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO:3)からなる群より選択される配列を含み;ならびに/あるいはSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、およびSEQ ID NO:10からなる群より選択されるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたヌクレオチドによってコードされ;ならびに/あるいはキメラまたは融合タンパク質の一部である。
【００６７】
本発明はまた、3-O-(3'-3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害の減少を生じる、HIV CA-SP1タンパク質における変異を含むアミノ酸配列に選択的に結合する抗体に及ぶ。1つのこのような態様において、この抗体は、CA-SP1切断部位もしくはその近傍、またはCA-SP1のSP1ドメインに位置する変異に選択的に結合する;別の態様において、この抗体は、GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO:2)またはSHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO:3)からなる群より選択される配列を含む変異に選択的に結合し;別の態様において、この抗体は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択されるアミノ酸配列に選択的に結合する。
【００６８】
別の態様において、本発明は、SP1を選択的に結合するがCA-SP1に結合しない抗体;CA-SP1を選択的に結合するがCAを結合しない別の抗体;CAを選択的に結合するがCA-SP1を結合しない別の抗体;およびCA-SP1切断部位またはその近傍に選択的に結合するさらなる抗体に及ぶ。
【００６９】
本発明はまた、本明細書で説明される方法のいずれかによって同定される化合物に指向される。1つの態様において、この化合物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン酸、(3',3'-ジメチルグルタリル)ジヒドロベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ジヒドロベツリン酸、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物ではない。
【００７０】
本発明はまた、薬学的組成物に及ぶ。1つの態様において、この薬学的組成物は、ジメチルスクシニルベツリン酸またはジメチルスクシニルベツリンの誘導体を含む;別の態様において、この薬学的組成物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン酸、(3',3'-ジメチルグルタリル)ジヒドロベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ジヒドロベツリン酸、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む。別の態様において、この薬学的組成物は、他には列挙されない、本発明の方法に従って同定された1種または複数の化合物;またはその任意の薬学的に許容される塩、エステルもしくはプロドラッグ、および薬学的に許容されるキャリアを含む。別の態様において、この薬学的組成物は、以下の任意の1つを含んでもよい抗ウイルス剤をさらに含む:ジドブジン、ラミブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、アバカビル、ネビラピン、デラビルジン、エムトリシタビン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、テノホビル、アンプレナビル、アデフォビル、アタザナビル、フォサムプレナビル、ヒドロキシウレア、AL-721、アンプリゲン、ブチル化ヒドロキシトルエン;ポリマンノアセテート、カスタノスペルミン;コントラカン、クリームファーマテックス、CS-87、ペンシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、サイトフォビル、ガンシクロビル、硫酸デキストラン、D-ペニシラミン  トリナトリウムホスホノホルメート、フシジン酸、HPA-23、エフロルニチン、ノノキシノール、ペンタミジンイセチオネート、ペプチドT、フェニトイン、イソニアジド、リバビリン、リファブチン、アンサマイシン、トリメトレキサート、SK-818、スラミン、UA001、これらの組み合わせ、任意の他の抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗癌剤、抗真菌剤、抗菌剤、またはこれらの組み合わせ。
【００７１】
本発明はまた、個体が、p25プロセシングを阻害する化合物による処置に対して感受性であるHIV-1で感染しているか否かを決定する方法に及ぶ。1つの態様において、この方法は、患者から血液と採取する段階、ウイルスRNAを遺伝子型決定する段階、およびウイルスRNAがCA-SP1切断部位の領域をコードする配列中に変異を含むか否かを決定する段階を含む。
【００７２】
本発明はまた、以下の段階を含む、その必要がある患者における疾患を治療する方法に及ぶ:
ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に対して有意な効果を有さない化合物を同定する段階;
該化合物の販売および使用のための規制認可を得る段階;
販売およびその必要がある患者における疾患の治療のために該化合物をパッケージする段階。
【００７３】
発明の詳細な説明
本発明は、動物の細胞におけるHIV-1複製を阻害する方法に指向される。より詳細には、本発明は、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24タンパク質(CA)へのプロセシングを阻害する化合物と、感染した細胞を接触させることによって、哺乳動物の細胞におけるHIV-1複製を阻害する方法を含む。より詳細には、このような化合物は、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24タンパク質(CA)へのプロセシングを阻害する。
【００７４】
「他のGagプロセシング段階には有意な効果を有さない化合物」は、問題の化合物がp25からp24へのプロセシングを優先的に阻害するが、他のGagプロセシング段階に対してはさらなる副次的な効果を有する可能性を必ずしも排除する必要はないことを意味する。
【００７５】
「有意な」または「有意に」とは、本明細書中で他に定義されない場合、化合物の非存在下におけるプロセスと比較して観察可能であるかまたは測定可能である変化を意味する。しかし、すべての観察可能であるかまたは測定可能である変化が、必ずしも有意ではないかもしれない。
【００７６】
多数のウイルス表現型が、本発明の方法を実施する際に観察されるかもしれない。感染した細胞を本発明の化合物と接触させることの1つの結果は、非感染性ウイルス粒子の形成であり得る。代替として、または加えて、感染した細胞を、p25からp24へのプロセシングを阻害する化合物と接触させることは、非感染性ウイルス粒子の形成を生じるが、ここで、他のGagプロセシング段階に対して有意な効果はない。これは、処理された細胞から放出されるウイルスの量を有意に減少させないかもしれないし、および/または放出されたビリオンへのRNAの取り込みの量にほとんど効果を有さないか、もしくは有意な効果を有さない。
【００７７】
従って、本発明はまた、p25プロセシングを阻害し、かつまた、上記に記載される他のウイルス表現型に影響を与える化合物と、該細胞を接触させる段階を含む、動物の細胞中でHIV感染を阻害する方法に及ぶ。
【００７８】
CA-SP1切断が欠損している変異型ウイルスは、非感染性であることが示されてきた(Wiegers K. et al., J.Virol. 72: 2846-2854 (1998))。3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)は、p25からp24へのプロセシングを破壊し、かつHIV-1複製を強力に阻害する化合物の1つの例である。この化合物の活性は、p25からp24へのプロセシング段階に特異的であり、Gagプロセシングの他の段階には特異的ではない。さらに、DSB処理は、図3に記載されるように、異常なHIV粒子の形態学を生じる。
【００７９】
1.3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に対する感受性に付随するHIV-1決定基の同定
(a)DSBに対して耐性であるHIV-1ウイルスの生成および選択
CA-SP1切断部位の領域のアミノ酸配列が修飾され、CA-SP1プロセシングを破壊する化合物に対するこれらの株の感受性を減少させる、変異型のHIV-1が生成された。これらの化合物の抗ウイルス活性に関与する野生型Gagのアミノ酸残基を同定するために、これらの変異型ウイルスについてのデータを使用した。1つの態様において、CA-SP1プロセシングを破壊する化合物は、これらのアミノ酸残基を含むGagタンパク質の領域とのHIV-1プロテアーゼの相互作用を直接的または間接的に阻害する。別の態様において、CA-SP1プロセシングを破壊する化合物は、これらのアミノ酸残基を含む領域に結合する。本明細書において使用されるように、「結合する」「結合した」または「結合すること」という用語は、例えば、イオン性交互作用、静電的疎水性相互作用、水素結合などを含む結合または付着を指し;およびまた、例えば、化学カップリングによる共有結合性であり得る結合を含む。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、チオエステル、チオエーテル、ウレタン、アミド、アミン、ペプチド、イミド、ヒドラゾン、ヒドラジン、炭素-硫黄結合、炭素-リン結合などであり得る。「結合した」という用語は、「カップリングした」「結合体化した」および「付着した」などの用語よりも広く、これらの用語を含む。
【００８０】
別の態様において、CA-SP1プロセシングを破壊する化合物は、Gagの別の領域に結合し、それによってCA-SP1切断部位領域とのHIV-1プロテアーゼの相互作用を阻害する。別の態様において、CA-SP1切断部位領域中に変異を含むウイルスまたは組換えタンパク質は、CA-SP1プロセシングを破壊する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法において使用され得る。
【００８１】
1そろいの実験では、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)によるCA-SP1のプロセシングの破壊に関与するHIV-1 Gag中のアミノ酸残基は、DSBに対する耐性について選択されたウイルス単離物のgag-pol遺伝子をスクリーニングすることによって同定された。これらの耐性ウイルスからのアミノ酸配列は、DSB感受性HIV-1単離物からのgag-pol遺伝子配列と比較された。2つの単一のアミノ酸の変化、Gagポリタンパク質(図4を参照されたい)中での、残基364におけるアラニン(Ala)からバリン(Val)への置換(SEQ ID NO:4)および第2の単離物中での残基366における変化(SEQ ID NO:6)がDSB-耐性ウイルス中で同定された。これらの残基は、CA-SP1切断部位のすぐ下流に位置する(SP1のN末端)。アラニンは、Los Alamos National Laboratoryデータベース中に記述されるすべてのHIV-1サブタイプを通してこれらの位置で高度に保存されている。CA-SP1切断部位の上流および下流の5アミノ酸残基もまた、種々のサブタイプ間で高度に保存されている。しかし、多数のクレード中の切断部位の上流の2残基でイソロイシンがバリンに置き換わっている(図4、SEQ ID NO:1を参照されたい)(「HIV Sequence Compendium 2002,」Kuiken et al.編、Los Alamos National Laboratory, Los Alamous, NM)。
【００８２】
DSB耐性についてのウイルスの遺伝的決定基をより広範にマッピングするために、薬物耐性であるウイルスについてインビトロで選択するためのさらなる実験を実施した。ジャーカットT細胞(各5×105)の複数の並行培養を、10〜50ng/ml DSBの存在下または非存在下で、プロウイルスDNAクローンpNLA4-3でトランスフェクトした。細胞を2日毎に継代し、新鮮な薬物を各継代において加えた。ウイルス複製を、培養上清中の逆転写酵素活性を測定することによってモニターした。ウイルスを、選択した時点において収集した培養上清から単離し、ゲノムDNAを、CAのN末端とRTのN末端の間のコード領域にわたるプライマーを使用するRT-PCRによって増幅した。次いで、増幅した産物を、同じプライマーのセットを使用して配列決定した。
【００８３】
1つの実験において、A366V変異を、DSBの存在下で培養したNL4-3ウイルスのSP1領域において同定した(注記:番号付けはGagポリタンパク質に関してである)。さらなる継代に際して、二重変異体を同定し、これは、CAにおけるG357S変異ならびにSP1におけるA366V変異を含んだ。A366V変異は、RF単離物の耐性変異体を選択する実験において以前に同定された。興味深いことに、野生型RF配列もまた、CAにおける357位においてセリン残基を含む(図4)。セリンはDSBに対して感受性である単離物(例えば、RF)中のこの位置に存在するので、CA G357S変異単独が、DSBへの耐性を付与するために十分なわけではない。薬物耐性に対するこれらの変異の各々の寄与を決定するために、A366V変異およびA366V/G357S二重変異を、部位特異的変異誘発によって、野生型NL4-3バックボーンに再操作した。得られる構築物を、ジャーカットT細胞にトランスフェクトし、耐性の選択について上記のようにウイルス複製アッセイにおいて特徴付けした。トランスフェクトされた細胞溶解物および培地中に放出されたウイルスのSDS-PAGE分析は、A366V変異体Gagがプロセスされ、かつ非効率的に細胞から放出され(データ示さず)、従って、薬物の非存在下においてでさえ、非常に乏しく複製されたことを実証した(図11)。しかし、A366V/G357S二重変異体は、DSBの非存在下または存在下において効率的に複製された。これらのデータは、耐性変異体、A366Vが、ウイルス複製に対する有害な効果を補償するために、GagのCA領域中の357位のセリンを必要とすることを示す(図11)。
【００８４】
さらなる実験において、10個の異なる耐性単離物を生成した。これらの単離物の配列決定は、耐性選択実験において以前には見られなかった、4個の付加的な変異を同定した。これらは、CAにおけるH358Y、L363FおよびL363M、ならびにGagのNC領域におけるA402Tであった。これらの変異のいずれも、HIV-1クレードA-Oについてのコンセンサス配列中に存在せず、HIV-1の遺伝的に多様なクレードに対するDSBの活性の幅を反映している。CAにおけるL363M置換はHIV-2についてのコンセンサス配列中に見い出され、これは、部分的には、HIV-1についてのDSBの特異性を説明するかもしれない。
【００８５】
これらの結果は、HIV-1におけるDSB活性についての特異的な遺伝的決定基の存在、およびこれらの決定基がCA-SP1切断部位の周辺に集まっていることを実証する。
【００８６】
(a)DSB感受性のウイルスの遺伝的決定基を同定するために使用されるHIV-1 NL4-3欠失およびSIV挿入研究
インビトロ耐性選択実験からの結果は、DSB HIV-1阻害活性の決定基がCA-SP1切断部位に隣接するGagの領域にマッピングされることを示した。DSBについてのウイルスの遺伝的決定基をより良好に規定するために、HIV-1点欠失変異誘発およびSIV挿入研究に着手し、化合物活性に付随する特定のアミノ酸残基を同定した。この研究は以下のように実行した。残基E365で開始し、残基M377を通して続ける単一の残基の欠失を、感染性HIV-1分子クローンNL4-3のSP1ドメインに操作した(図12)。ウイルス粒子産生、感染性、GagプロセシングおよびDSBへの感受性に対するこれらの点欠失の効果を決定した。これらの実験の結果を使用して、DSB活性と関連するCA-SP1切断部位の領域におけるGag残基を同定した。活性と関連する残基を、DSB耐性ウイルスSIV(Mac239単離物)のCA-SP1切断部位に挿入して、HIV-1、SIVキメラウイルス(SHIV)を生成した。CAタンパク質のN末端からのHIV-1残基の点置換を、DSB活性をレスキューするために必要な最小限の配列が同定されるまで、このキメラウイルスに作製した。DSB活性を得るために必要であるこの最小限の配列は、DSB活性の主要なウイルスの遺伝的決定基と見なされる。これは、DSB活性の分子的決定基を示唆し得る。
【００８７】
1.方法
(a)NL4-3単一点欠失変異体の構築
単一点欠失構築物を、以前に記載されたように、PCR-ライゲーションPCR(PLP)ストラテジーを使用して生成した。SP1の最初の残基を例外として、完全なGag SP1にわたる点欠失を生成するための全てのPCR反応を実行するためにHIV-1 NL4-3プラスミドDNAを鋳型として使用した。
【００８８】
ΔE365を、鋳型としてNL4-3を使用して、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)を用いて、汎用上流プライマー(プライマー2)とともに欠失特異的下流プライマー(プライマー1)を使用することによって生成した(表1)。これから誘導されるフラグメントを、第1の隣接PCRフラグメントと名付けた。第2の隣接フラグメントは、欠失特異的上流プライマー(プライマー3)および汎用下流プライマー(プライマー4)を使用して増幅した(表1)。他の欠失構築物(ΔA366、ΔM367、ΔS368、ΔQ369、ΔV370、ΔT371、ΔN372、ΔP373、ΔA374、ΔT375、ΔI376、およびΔM377)を生成するために、PCR手順を、各特異的な点欠失に対応する欠失特異的下流プライマーおよび上流プライマーを変化させることによって同様に実行した(表1)。
【００８９】
これらの並行する2つの隣接するPCRフラグメントの各々をゲル精製し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)を使用してリン酸化し、およびT4 DNAリガーゼ(NEB)を使用することによってライゲーションした。65℃で15分間の不活性化後、ライゲーション反応を、汎用上流プライマー(プライマー2)および下流プライマー(プライマー4)を用いる引き続く増幅のために使用した。この生成物をゲル精製し、SpeIおよびApaIを用いて消化し、次いで、NL4-3プロウイルスDNAクローンのSpeIおよびApaI部位にライゲーションした。
【００９０】
標準的なPCR条件を上記の反応のために使用した。これらは、95℃で1分30秒間の変性1サイクル、続いて95℃で30秒間の変性、60℃で30秒間、および72℃で30秒間の30サイクルを含んだ。PCR反応は、以下の成分を使用して設定した:
5μL 10×NEB好熱性緩衝液
2μL 10mM dNTP
1μL 100nM MgSO2
1μL 50pmol 上流プライマー
1μL 50pmol 下流プライマー
1μL 50ng/μL 鋳型DNA
0.5μL Vent DNAポリメラーゼ
38.5μL ddH2O。
【００９１】
10μLのアリコートを1.0%アガロースゲル上で泳動し、正確なサイズの産物が増幅されたことを確認した。次いで、PCR産物をゲル単離し、Qiaex IIゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。ゲル精製した2つの隣接するPCRフラグメントを、ライゲーションの前に、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)を使用することによって以下の反応において個々にリン酸化した。リン酸化反応は以下のように設定した:
2μL 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
2μL 10mM ATP
1μL T4ポリヌクレオチドキナーゼ。
【００９２】
これらの2つの隣接するPCRフラグメントの各々の15μLのゲル精製したDNAで、反応を37℃で1時間インキュベートした。65℃で10分間の不活性化後、次いで、隣接するリン酸化PCRフラグメントを、以下の条件下でT4 DNAリガーゼ(NEB)を使用することによって一緒にライゲーションした:
3μL 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
13μLの各2つの隣接するPCRフラグメント
1μL T4 DNAリガーゼ。
【００９３】
16℃における一晩インキュベーション後、ライゲーション反応生成物を、第2のラウンドのPCR反応において使用して、これら2つの隣接するPCR産物にわたる全長PCRフラグメントを増幅した。第2のラウンドのPCR反応は、汎用上流プライマー(プライマー2)および下流プライマー(プライマー4)のみを使用したこと以外は、上記と同様に実施した。再度、10μLアリコートをアガロースゲル上で泳動し、正しい精製物が増幅されたことを確認した。次いで、全長PCRフラグメントをゲル単離し、QiaexIIキットを使用して精製した。精製した全長PCRフラグメントを、NL4-3とともに、SpeIおよびApaIを用いて、以下の条件下で切断した:
2μL 10×NE緩衝液4(NEB)
1μL ApaI(NEB)
1μL SpeI(NEB)
16μL 全長PCR産物(1μg)またはNL4-3(500ng)。
【００９４】
上記の制限酵素消化混合物を37℃で2時間インキュベートした。全長PCR産物およびNL4-3プラスミドについての消化したDNAフラグメントを個々にゲル単離し、QiaexIIキットを使用して精製した。消化したベクターNL4-3および全長PCRフラグメントを、T4 DNAリガーゼを使用して、以下の手順の下でライゲーションした:
1μL 10×T4 DNAリガーゼ緩衝液
1μL(25〜50ng)消化NL4-3ベクター
7μL消化(200ng〜400ng)消化PCRフラグメント(700bp)
1μL T4 DNAリガーゼ。
【００９５】
このライゲーション反応物を16℃で一晩インキュベートし、ライゲーション生成物を、説明書に従って(Invitorgen)熱ショックによって大腸菌(Escherichila coli)Max Efficiency Stbl2(Invitrogen)に形質転換した。次いで、プロウイルスDNAクローンを、Taq Dye Deoxy Terminator cycle Sequencer Kit(Applied Biosystems)を使用し、個々に内部プライマー(プライマー29および30)を使用して自動化配列決定によってスクリーニングした。変異の確認後、プロウイルスDNAクローンを、種々の将来の研究のために使用した。
【００９６】
1.SIVキメラ変異体の構築
NL4-3 CA-SP1境界領域の種々の残基を有するSIVキメラ構築物のパネルを、SIVmac239分子クローンを使用して、上記のようなPCRおよびクローニング手順を利用することによって生成した。これらの構築物、およびCA-SP1境界領域中のそれらのアミノ酸配列を図15に示す。SIVmac239を、SIV DDおよびDE構築物を生成するために使用した。SIV DD構築物は、SIV DMを生成するために使用した。異なるSIVキメラ構築物を、各キメラに対応するそれぞれの変異誘発性の上流プライマーおよび下流プライマーを変化させることによってPCRにおいて産生した(表1)。これらの並行した2つの隣接するPCRフラグメントの各々をゲル精製し、リン酸化処理なしで、汎用上流プライマー(プライマー31)および下流プライマー(プライマー32)を用いる引き続く増幅のために直接的に使用した。この産物をゲル精製し、BamHIおよびSbfIで消化し、次いで、SIVmac239プロウイルスDNAクローンのBamHIおよびSbfI部位にライゲーションした。次いで、プロウイルスDNAクローンを、Taq Dye Deoxy Terminator cycle Sequencer Kit(Applied Biosystems)を使用して、個々に内部プライマー(プライマー39)を使用して自動化配列決定によってスクリーニングした。変異の確認後、プロウイルスDNAクローンを、種々の将来の研究のために使用した。
【００９７】
2.細胞培養およびDNAトランスフェクション
HeLa細胞を、DMEM(Invitrogen)(10% FBS、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン)中で維持し、コンフルエンスの際に継代した。ジャーカット細胞をRPMI 1640(Invitrogen)(10% FBS、100U/ml ペニシリン、および100μg/ml ストレプトマイシン)中で培養し、2日または3日毎に継代した。
【００９８】
ウイルス粒子産生およびGagポリタンパク質プロセシングに対する欠失または置換の効果を特徴付けするために、野生型HIV-1 NL4-3またはSIVmac239およびそれぞれの変異体プロウイルスDNAを、FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche)を利用することによってHeLa細胞にトランスフェクトした。手短に述べると、細胞を、トランスフェクションの日に60〜80%コンフルエンスに到達するように、トランスフェクションの前日に6ウェルプレート(Corning)にウェルあたり0.5×105の濃度で播種した。各トランスフェクションについて、3μlのFuGENE6を100μlの無血清DMEMに希釈し、1μgのDNAの付加を行った。穏やかに混合した後、DNA-脂質複合体の混合物を、細胞を含有する2mlの完全DMEM培地に穏やかに滴下して加えた。トランスフェクションの24時間後、DNA-FuGENE6複合体を含む培地を除去し、2mlの新鮮なDMEMをトランスフェクトされた細胞に加えた。トランスフェクションの48時間後、Sorvall RT 6000B遠心分離機で、2,000 rpm、4℃、20分間の遠心分離によって、ウイルス粒子を含む培地を収集および清澄化した。次いで、ウイルス粒子を含有する上清を、13,000rpm、4℃、120分間で、微量遠心分離中の20%スクロースクッションを通して濃縮し、ペレットを溶解緩衝液(150mM Tris-HCl、5% TritonX-100、1% デオキシコール酸、pH 8.0)に再懸濁した。野生型NL4-3および点欠失変異体についてのウイルス粒子産生のレベルを、p24抗原捕捉ELISA(ZeptoMetrix, Buffalo, NY)によって決定した。
【００９９】
（DSBの非存在下における）Gagポリタンパク質プロセシングに対する欠失または置換の効果を決定するために、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットを実施した。手短に述べると、ウイルスタンパク質を、12% NuPAGE Bis-Trisゲル(Invitrogen)上で分離し、ニトロセルロースメンブレン(Invitrogen)に転写し、続いて0.5% Tweenおよび5%ドライミルクを含むPBS緩衝液中でブロッキングを行った。このメンブレンを、HIV-1感染患者からの免疫グロブリン(HIV-Ig) (NIH AIDS research and reference reagent program)とともにインキュベートし、ヤギ抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma)とハイブリダイズさせた。SIVタンパク質を含有するメンブレンについては、メンブレンは、SIV感染サルからの参照ポリクローナル免疫血清(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)とともにインキュベートし、ヤギ抗サル西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma)とハイブリダイズさせた。免疫複合体は、製造業者によって供給される説明書に従って、ECLシステム(Amersham Pharmacis Biotech)を用いて可視化した。
【０１００】
CA-SP1プロセシングを阻害するDSBの能力に対する欠失または置換の効果に取り組むために、HeLa細胞を、上記の手順を利用することにより、野生型HIV-1 NL4-3またはSIVmac239およびそれぞれの変異型プロウイルスDNAでトランスフェクトした。1μg/mlの濃度のDSBおよびDMSO対照を、全体の培養を通して維持し、これらのトランスフェクションに由来するウイルスタンパク質を分析するためのSDS-PAGE/ウェスタンブロットを、以前の段落において記載したように実施した。
【０１０１】
1mlあたりの50%-組織培養感染用量(TCID50)を、各欠失変異体の感染性の尺度として使用した。HeLa細胞におけるトランスフェクションに由来する変異型ウイルスを、U87 CD4.CXCR4細胞に感染させるために使用した。各ウイルスストックを、1:10の開始希釈で三連で試験し、続いて4倍の段階希釈を行った。感染の前日に、細胞を3×103細胞/ウェルの密度でプレートした。感染の当日に、培養培地を細胞プレートから除去し、90μlの希釈ウイルスを加えた。感染後1日め、3日目および6日目に、ウイルスをプレートから取り出し、200μlの培養培地を加えた。感染後6日目および8日目に、上清を、p24ELISA分析のために収集した。培養物の50%に感染を起こさせる(TCID50)ウイルス希釈を、Reed and Muenchの方法(Aldovini A. and B. Walker 1990; Dulbecco R. 1988)に従って決定した。
【０１０２】
3.結果
Gag SP1ドメイン中に逐次的点欠失を含むウイルス(図12)を、粒子産生、感染性、GagプロセシングおよびDSBに対する感受性について特徴付けした。これらの実験からの結果は、DSB活性と関連するSP1残基を同定するために使用された。
【０１０３】
予測されたように、ウイルス粒子産生に対する点変異の効果は、タンパク質分解切断部位からの変化の近さの関数として変化した。これらの実験からの結果は、図13に要約する。残基E366、A367およびM368における欠失を有するウイルスは大部分が影響され、野生型ウイルス感染において通常観察される粒子の数の<25%を生成した。インビトロ感染性アッセイは、ウイルス複製を補助する欠失変異体の能力を特徴付けするために使用した。これらの実験は、E365からQ369までの5つの位置のいずれかにおける単一の残基の欠失が、非感染性であるかまたは複製について有意に損なわれていたかのいずれかであったウイルスを生じたことを示した(図13)。対照的に、残基V370で開始し、およびCA-SP1切断部位から離れて伸びると、特徴付けされた点欠失のいずれもがウイルス感染性の減少を生じなかった(図13)。I376位およびM377位における欠失を有するウイルスを例外として、すべての変異体ウイルスが、正常またはほぼ正常なGagプロセシング表現型を示した(図13)。これらの3つのセットの実験からの結果は、DSB活性の遺伝的決定基を同定するための設計および実験の解釈を可能にした。
【０１０４】
DSBに対する感受性は、Gagプロセシングの後期の段階、CA-SP1切断に対するDSBの効果を特徴付ける実験において決定した。具体的には、これらのアッセイは、CA-SP1プロセシングを破壊するDSBの能力を測定した。例えば、実施例8において見られるように、GagプロセシングにおけるDSB誘導性欠損は、ウイルス複製を阻害する化合物の能力と相関した。これらの実験からの結果は、E365からV370までの6つの位置のいずれかにおける単一の残基の欠失が、CA-SP1プロセシングに対するDSBの影響を有意に減少することを示す(図14)。対照的に、T372残基で開始し、およびCA-SP1切断部位から離れて伸びると、特徴付けされた点欠失のすべてがCA-SP1プロセシングのDSB誘導性の破壊に対して完全に感受性である(図14)。
【０１０５】
DSB活性と関連するSP1残基は、E365からV370までの近接する残基からなる。
【０１０６】
残基A364からV370までは、DSB耐性レトロウイルスSIV(Mac239単離物)中のGag SP1ドメインの類似の位置に挿入された。加えて、このキメラウイルスのCAタンパク質のN末端は、HIV-1特異的残基を有するSIVにおいて見い出される残基の累積的な置換によって修飾された。このアプローチは図15に要約する。次に、キメラウイルスの各々のGagプロセシング表現型に対するDSBの効果を決定した。図15に見られるように、SIV.DMウイルスは、DSBに対する感受性を示すGagプロセシング表現型を示す。従って、SHIVにおいてDSB活性をレスキューするために挿入される必要があるHIV-1 CA-SP1特異的残基の最小限の配列は、V362からV370までに広がる。
【０１０７】
(表１)PCR変異誘発プライマー
2008504808.tif 000008
2008504808.tif 000009
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【０１０８】
上記に提示された耐性および変異誘発のデータは、HIV-1 Gag CA-SP1切断部位の領域中のGHKARVL-AEAMSQVアミノ酸配列がDSBに対するウイルス感受性の遺伝的決定基として働くことを示唆する。
【０１０９】
他のレンチウイルスに対するDsbの感受性の決定基の拡張:成熟阻害剤の開発のための動物効力モデルとしてのCa-Sp1キメラ
抗HIV治療の開発は、動物効力モデルの欠如によって妨害されてきた。この動物モデルの欠如は、主として、大部分のHIV-1株が複製が不可能であることに起因し、非ヒト霊長類において疾患を引き起こす。いくつかの例において、この問題は、HIV-1ウイルス標的から非ヒト霊長類における複製を補助するSIVウイルスバックボーンに関心対象の領域を取り込むキメラウイルスの使用を通して克服されてきた。このアプローチの最も注目すべき例は、感染性ウイルスを作るタンパク質が、HIV-1に由来するEnv(gp120/gp41)を例外として、SIVに元来独占的であるHIV-1/SIV(SHIV)キメラウイルスを含む。これらのSHIVエンベロープキメラは、HIV-1ワクチン開発において広範に使用されてきた。
【０１１０】
HIV-1成熟阻害剤は、Gag CA-SP1プロセシングを破壊し、これは、異常なコア形態学を示す非感染性ウイルス粒子の形成および放出を生じる。例えば、Li et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 100:13555-60 (2003)を参照されたい。ベツリン酸誘導体DSBは、このクラスの阻害剤の例である。成熟阻害剤の活性と関連する決定的なウイルスの遺伝的決定基は、HIV-1 CA-SP1切断部位に隣接するアミノ酸残基にマッピングされる。この決定基が、DSB耐性非HIV-1ウイルスのCA-SP1切断部位に導入されると、成熟阻害剤感受性キメラが生じる。これらのCA-SP1キメラウイルスは、HIV-1成熟阻害剤についての動物効力モデルのための基礎として働く。
【０１１１】
成熟阻害剤感受性のために必要であるHIV-1 CA-SP1の領域は、選択されたレンチウイルスに導入される。DSB感受性の決定基であるHIV-1 CA-SP1結合部からのアミノ酸残基を、サル免疫不全ウイルス(SIV)のゲノム中の対応するCA-SP1アミノ酸を置き換えるために使用した。同様に、DSBの決定基であるHIV-1 CA-SP1結合部からのアミノ酸残基は、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、ビスナ-マエディ、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)において置き換えられ得る。表2は、CA-SP1切断部位の領域におけるHIV-1、SIV、FIV、EIAVおよびBIVについてのGagポリペプチド配列を示す。
【０１１２】
（表２）HIV-1のCA-SP1切断部位領域の領域における、SIV、FIV、EIAVおよびBIVとの配列比較
2008504808.tif 000012
【０１１３】
置き換えのために使用したHIV-1 CA-SP1配列は以下の通りである:
2008504808.tif 000013
【０１１４】
SHIV CA-SP1キメラプロウイルスDNAクローンを生成するための上記の方法は、対応する野生型配列を置き換えるHIV-1のCA-SP1領域からの選択された残基または拡張された領域を含む、FIV、EIAVおよびBIVプロウイルスを生成するために使用される(図16)。
【０１１５】
SHIV CA-SP1キメラ-プロウイルスDNAクローンは、標準的な分子生物学的技術を利用する部位特異的変異誘発によって生成された。手短に述べると、CA-SP1領域を取り囲むSIV Gag中の独特な制限酵素部位、すなわち、BamHI(マトリックス中)およびSbf-I(NC中)を同定した。変異誘発が意図されるCA-SP1領域から開始して、2つの重複プライマー、変異を有する配列、すなわち、HIV CA-SP1をそれらの5'末端に組み込んているフォワードプライマーおよびリバースプライマーを合成した。野生型SIVプロウイルスDNAを鋳型として使用して、2つの別々のPCR反応を設定して、変異誘発の部位(CA-SP1領域)からのいずれかの方向でSIV-Gagフラグメントを増幅し、すなわち、変異を有するCA-SP1領域中で重複する2つの増幅されたフラグメント、BamHI-CA-SP1フラグメントおよびCA-SP1-SbfIフラグメントを産生した。第3のPCR反応において、BamHI-SP1フラグメントおよびCA-SP1-SbfIフラグメントを、それらの共通のHIV-CA-SP1配列においてアニールさせ、フォワードSIV BamHIプライマーおよびリバースSIV Sbf-Iプライマーを用いて増幅し、全長キメラSHIV CA-SP1 PCRフラグメントを生成した。このキメラSHIV CA-SP1 gagフラグメントを、SIV-Gag野生型配列を置き換えるSIVプロウイルスクローンのBamHI-Sbf-Iウィンドウにクローニングし、SHIV CA-SP1プロウイルスcDNAクローンを産生した。
【０１１６】
同様に、FIV(Genbankアクセッション番号NC_001482)、EIAV(GA# AF016316)、およびBIV(GA# M32690)ゲノムにおけるCA-SP1領域を取り囲む独特な制限酵素クローニング部位を同定した(図16)。特異的FIV/EIAV/BIV-HIV1CA-SP1キメラプライマーを、特異的クローニング部位を組み込んでいるFIV、EIAVまたはBIVのプライマーとともに合成する。これらのプライマーは、鋳型としての対応するプロウイルスDNA(FIV、EIAVまたはBIAV)とともに、PCR反応において、キメラHIV-1 CA-SP1フラグメントを生成する。キメラHIV-1 CA-SP1フラグメントは、適切な制限酵素で消化し、FIVプロウイルスのSacI-EcoRIウィンドウ;または(ii)EIAVプロウイルスのKasI-EcoRVウィンドウ;または(iii)対応する野生型配列を置き換えるBIVプロウイルスのBsrGI-ApaIウィンドウにクローニングする(図16)。キメラFIV/EIAV/BIV-HIV-1CA-SP1プロウイルスDNAクローンを配列決定して、意図する変異の存在を確認する。DSB感受性の移動を示す観察された結果に基づいて、さらなる構築物が、結果を最適化するために上記のストラテジーを利用して生成される。
【０１１７】
要約すると、HIV-1成熟阻害剤感受性のCA-SP1決定基が、サル免疫不全ウイルス(SIV)におけるGagの類似の領域に置き換えたキメラウイルスが生成された。SIVのゲノムへのHIV-1のこの領域の移動は、成熟阻害剤感受性表現型を生じる。このHIV-1/SIVキメラウイルスでの非ヒト霊長類の感染は、成熟阻害剤の治療的開発のための動物効力モデルを生じるはずである。
【０１１８】
類似のアプローチを使用して、FIV、BIVおよびEIAVを有するHIV-1 CA-SP1キメラを調製および特徴付けする。これらのさらなるDSB感受性キメラウイルスは、HIV-1成熟阻害剤の研究のためのさらなる動物効力モノクローナル抗体であるの開発を可能にするはずである。
【０１１９】
変異型ウイルスおよびキメラウイルスの使用
上記のような本発明の変異型ウイルスおよびキメラウイルスは、種々の細胞ベースのアッセイ、ならびに動物ベースのアッセイにおいて有用である。
【０１２０】
DSBに対して耐性であるウイルスと関連する表現型を、DSBに感受性であるウイルスと比較することによって、DSBのそれと類似のメカニズムによって作用する化合物を同定することが可能である。従って、本発明は、野生型HIV-1においてp25からp24への切断を阻害するが、CA-SP1領域における欠失を含むHIV-1においてCA-SP1プロセシングを阻害しない化合物を同定する方法を含む。このような方法によって得られる化合物もまた本発明に含まれる。
【０１２１】
ヒトに容易には感染しないSIVおよび他のレンチウイルスのキメラはさらなる利点を有する。第1に、これらのウイルスは、実験室の作業者に対して引き起こされる安全性の問題がより低い。結果として、例えば、CA-SP1プロセシングを阻害する新規な化合物を同定するための細胞ベースのアッセイは、より低いリスクで行われ得る。このより低いリスクは、HIVを用いると容易にまたは安全に実行することができなかったアッセイを実行することを可能にすることができ、またこのようなアッセイのコストを下げ得る。
【０１２２】
さらに、このようなキメラウイルスは、動物モデルにおいて有用である。例えば、DSBに対して感受性であるキメラSIVは、CA-SP1プロセシングを阻害する新規な化合物を同定するために、例えば、疾患の治療のための薬学的組成物、投与の経路および投薬レジメンを同定するために;ならびにプロテアーゼ阻害剤を伴うDSBなどの組み合わせ治療の効果を研究するために使用されてもよい。
【０１２３】
SIVは、一般的にサルの感染に限定されるので、さらなるレンチウイルスキメラの生成は、動物研究が、例えば、より安価な動物において実施されること、取り扱いをより容易にすること、より早い疾患の進行を有すること、またはさもなくばヒト疾患の特定の局面のためにより適切であることを可能にする。
【０１２４】
さらに、動物モデルは、コンパニオンアニマルおよび他の高い価値のある動物、例えば、農業用種畜および競走馬の治療において、関心対象の動物疾患の治療のための適切な薬学的組成物を同定するために使用され得る。
【０１２５】
キメラウイルスは任意のレトロウイルスに誘導されてもよい。例えば、HIV-2、HTLV-I、HTLV-II、SIV、トリ白血病ウイルス(ALV)、内因性トリレトロウイルス(EAV)、マウス乳腺癌ウイルス(MMTV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、ビスナ-マエディウイルス、またはネコ白血病ウイルス(FeLV)から誘導される。
【０１２６】
このようなキメラウイルスは、本明細書の他の箇所に記載される本発明の方法において使用されてもよい。例えば、このような組換え非HIV-1レンチウイルスは、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する化合物を同定する方法において使用されてもよく、この方法は、野生型非HIV-1レンチウイルスの複製を阻害する該化合物の能力を、そのDSB感受性組換え改変体と比較する段階からなる。このような阻害は、細胞中、動物中;またはインビトロで行われ得る。
【０１２７】
エピトープタグを有するウイルスまたはポリペプチドの構築および使用
本発明はまた、GagのCA-SP1中にエピトープタグを有する組換えレトロウイルスに及ぶ。エピトープタグは、CAドメインおよび/またはSP1ドメインに挿入されてもよい。適切なタグは当業者に周知であり、赤血球凝集素エピトープHA(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:81)、ブルータングウイルスエピトープVP7(QYPALT)(SEQ ID NO:82)、α-チューブリンエピトープ(EEF)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:83)、およびVSV-G(YTDIEMNRLGK)(SEQ ID NO:84)が含まれる。SP1含有エピトープタグの例は図17に図示される。
【０１２８】
このようなエピトープタグ化ウイルスおよびそのフラグメントは、インビトロでCA-SP1プロセシングを阻害する新規な化合物を同定する際に、細胞ベースのアッセイにおいて、および動物モデルを含むインビボにおいて有用である。このようなエピトープタグ化ウイルスおよびそのフラグメントの付加的な使用は本明細書の他の箇所に記載される。
【０１２９】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%同一であるポリペプチドを含む:
2008504808.tif 000014
【０１３０】
別の態様において、本発明は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、縮重改変体、例えば、コドンの3番目の塩基が異なるが、それにも関わらず「縮重」をコードすることに起因して同じアミノ酸をコードするものを含む。
【０１３１】
「約」という用語は、本明細書で使用されるように、言及される値よりも10%多いかまたは少ない、好ましくは5%多いかまたは少ない値をいう。
【０１３２】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、本発明の方法において有用である。1つの局面において、これらは、GagのCA-SP1領域に結合する化合物を同定するためにインビトロアッセイにおいて使用されてもよい。別の局面において、これらは、本明細書の別の箇所に記載される他の方法において有用である抗体の産生において使用されてもよい。別の局面において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの産生のために、ベクターに、その結果、宿主細胞に挿入されてもよい。上記の態様は例示であって、限定を意図するものではない。
【０１３３】
本発明は、HIV Gag p25タンパク質(CA-SP1)中の変異を含むアミノ酸配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含み、該変異は、DSBによるp25(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングの阻害の減少をもたらす。本発明のポリヌクレオチドは、CA-SP1切断部位にまたはその近傍に任意で位置するか、またはCA-SP1のSP1ドメインに任意で位置する変異を含む。該変異は、GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO:2)およびSHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO:3)からなる群より選択されるアミノ酸配列中に存在し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9として示される配列に及ぶ。本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、ならびに、該細胞を培地中でインキュベートする段階および培地からポリペプチドを回収する段階を含む、該ポリペプチドを産生する方法を含む。
【０１３４】
本発明はさらに、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、またはSEQ ID NO:10もしくは12にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、これは、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25からp24へのプロセシングの阻害の減少を生じ、およびまた、ここで該変異は、CA-SP1にもしくはその近傍に、またはCA-SP1のSP1ドメインに任意で位置する。本発明はまた、該ポリペプチドを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、および該ポリペプチドを産生する方法に指向され、この方法は、培地中で該宿主細胞をインキュベートする段階、および培地から該ポリペプチドを回収する段階を含む。
【０１３５】
「近傍」または「隣接する」とは、ポリペプチドへの言及において本明細書中で使用される場合、言及の点から約50、約25、約20、または約15残基を含むことを意味する。例えば、HIV-1 Gag CA-SP1切断部位のいずれかの側で約50、約25、約20または約15残基;より好ましくは、HIV-1 Gag CA-SP1切断部位のいずれかの側で約10残基;および最も好ましくは、HIV-1 Gag CA-SP1切断部位のいずれかの側で約7残基を含んでもよい。ポリヌクレオチドへの言及においては、「近傍」または「隣接する」という用語は、言及の点から約150、約75、約60、約45、または約30ヌクレオチドをいう。
【０１３６】
「単離された」とは、天然の状態から「人の手によって」変化されることを意味する。組成物または物質が天然に存在し、「単離された」形状で見つかったならば、これはその天然の環境から変化したかまたは取り出されたか、またはその両方である。本発明の「単離された」核酸分子はまた、核酸分子、DNA、またはRNAを意図し、その天然の環境から取り出されている。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分子は、本発明の目的のために単離されると見なされる。単離されたDNA分子のさらなる例には、異種宿主細胞中に維持された組換えDNA分子、または溶液中の精製された(部分的または実質的に)DNA分子が含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロRNA転写物が含まれる。本発明に従う単離された核酸分子はさらに、合成的に産生されたこのような分子を含む。
【０１３７】
「ポリヌクレオチド」とは、一般的に、修飾されていないRNAもしくはDNAまたは修飾されたRNAもしくはDNAであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」には、非限定的に、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子(一本鎖もしくはより代表的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る)が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、RNAもしくはDNA、またはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域をいう。ポリヌクレオチドという用語はまた、1つまたは複数の修飾された塩基を含むDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために修飾されたバックボーンを有するDNAまたはRNAを含む。「修飾された」塩基には、例えば、トリチウム化塩基および通常でない塩基(イノシンなど)が含まれる。種々の修飾がDNAおよびRNAになされてきており、従って、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然において見い出されるようなポリヌクレオチドの、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された型、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学型を含む。「ポリヌクレオチド」また、比較的短いポリヌクレオチドを含み、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【０１３８】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いに結合される2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」とは、一般的にペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと一般的にいわれる短い鎖、およびタンパク質と一般的にいわれるより長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、20種の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」には、天然のプロセス(例えば翻訳後プロセシング)、または当技術分野で周知の化学修飾技術によってのいずれかで修飾されるアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文、ならびに膨大な研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ポリペプチド中のどこでも存在し得、これにはバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端が含まれる。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じかまたは変化した程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドが多くの型の修飾を含み得る。ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果として分枝され得、および分枝を有するかまたは有さない環状であり得る。環状ポリペプチド、分枝ポリペプチド、および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じ得、または合成方法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質への転移RNA媒介付加(例えばアルギニン化)、およびユビキチン結合が含まれる。
【０１３９】
「変異体」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、参照のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとはそれぞれ異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの代表的な変異体は、ヌクレオチド配列で別の参照ポリヌクレオチドとは異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよいし、変化させなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に議論するように、参照配列によってコードされるポリペプチド中でのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および短縮を生じ得る。ポリペプチドの代表的な変異体は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列で異なる。一般的に、参照ポリペプチドおよび改変体の配列が全体として密接に類似し、かつ多くの領域中で同一であるように、違いは限定される。変異体および参照ポリペプチドは、1つまたは複数の、任意の組み合わせの置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものであってもよいし、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は天然に存在してもよいし(例えば対立遺伝子改変体など)、またはこれは天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、変異誘発技術または直接的合成によって作製され得る。
【０１４０】
従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれか1つによってコードされるポリペプチドの変異体(またはその断片、誘導体、またはアナログ)は、(i)少なくとも1つまたは複数のアミノ酸残基が保存性または非保存性のアミノ酸残基(1つの保存性アミノ酸残基、または少なくとも1つであるが10を超えない保存性アミノ酸残基)で置換されており、かつこのような置換型アミノ酸残基が遺伝コードによってコードされているものでもコードされていないものでもよいもの、(ii)1つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、(iii)成熟ポリペプチドが別の化合物(例えば、ポリペプチドの半減期を増加させるための化合物(例えば、ポリエチレングリコール)など)と融合されているもの、または(iv)さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているもの(例えば、IgG:Fc融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製のための利用される配列など)であり得る。このような変異体は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると見なされる。これらの変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。「変異体」は、本明細書中で使用される場合、「改変体」という用語と等価である。
【０１４１】
荷電アミノ酸の別の荷電アミノ酸との置換、および中性または負に荷電したアミノ酸との置換が含まれる。さらに、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基(例えば、アルギニン残基およびリジン残基)の1つまたは複数が、例えば、フリン(furin)またはケキシン(kexin)などのプロテアーゼによる望ましくないプロセシングを除去するために別の残基で欠失または置換され得る。凝集の防止が高度に所望される。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるのみならず、薬学的処方物を調製する際にまた問題である。なぜなら、これらは免疫原性であり得る(Pinckard et al., Clin Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al. Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993))。従って、本発明のポリペプチドは、天然の変異または人為的な操作のいずれかからの、1つまたは複数のアミノ酸、置換、欠失、または付加を含み得る。
【０１４２】
示されるように、変化は、おそらくマイナーな性質、例えば、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意な影響を与えない保存性アミノ酸置換などである(表3を参照されたい)。
【０１４３】
（表３）保存性アミノ酸置換
2008504808.tif 000015
【０１４４】
しかし、ある態様において、アミノ酸の非保存性置換を使用することが所望される。例えば、アミノ酸の非保存性置換は、DSB感受性ウイルスをDSBに対して耐性にするために使用される。
【０１４５】
本発明によって含まれるポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドがCA-SP1タンパク質中の変異を含むアミノ酸をコードし、該変異が3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25からp24へのプロセシングの減少をもたらすならば、参照配列と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%の同一性を有し得る。本発明によってまた含まれるポリヌクレオチドは、「サイレント」である変異を含み、ここでは異なるコドンが同じアミノ酸をコードする(ゆらぎ)。
【０１４６】
「同一性」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。「同一性」という用語は、本明細書中で、「相同性」という用語と交換可能に使用される。一般的に、配列は、最高の整列マッチが得られるように整列される。「同一性」とはそれ自体、当技術分野で認識されている意味を有し、公開された技術を使用して計算され得る。2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の同一性を測定するための多数の方法が存在しているが、「同一性」という用語は当業者に周知である。2つの配列間の同一性または類似性を決定するために一般的に使用される方法には、BaxevanisおよびOullette、Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 第2版、Wiley-Interscience, New York, (2001)において開示される方法が含まれるがこれらに限定されない。同一性および類似性を決定するための方法はコンピュータプログラムにコード化(codified)されている。2つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、GCSプログラムパッケージ(Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1):387, (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215:403, (1990))が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４７】
参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、95%「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異を含み得ること、参照配列のヌクレオチドの5%までが欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得ること、または参照配列の全ヌクレオチドの5%までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得ること以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'末端もしくは3'末端の位置で起こり得るか、あるいは、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、または参照配列中の1つもしくは複数の連続する基において分散して、これらの末端位置の間で起こり得る。
【０１４８】
同様に、参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、95%「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、ポリペプチド配列が参照アミノ酸の各100アミノ酸あたり5つまでの変化を含み得ること以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。参照アミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中のアミノ酸残基の5%までが欠失もしくは別のアミノ酸で置換され得、または参照配列の全アミノ酸残基の5%までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で起こり得るか、あるいは、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列中の1つもしくは複数の連続する基において分散して、これらの末端位置の間で起こり得る。参照(問い合わせ)配列は本発明の配列または任意のポリヌクレオチド断片(例えば、本発明のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび/またはC末端欠失)のいずれか1つの全体のヌクレオチド配列であり得る。
【０１４９】
いずれかの特定の核酸分子が、例えば本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性またはこれに同一の、を有し、同一であるか否かは、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix用バージョン8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)などの公知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に決定され得る。BESTFITは、2つの配列間の相同性の最良のセグメントを見い出すためにSmithおよびWaterman(Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981))の局所的相同性アルゴリズムを使用する。BESTFITまたは他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明の配列に従う参照配列に95%同一である場合、パラメーターは、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、および参照配列中のヌクレオチドの総数の5%までの相同性のギャップが許容されるように設定される。
【０１５０】
特定の態様において、本発明の配列と対象配列の間の同一性(全体的配列アラインメントともいわれる)は、Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1999))のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムを使用して決定される。同一性の割合(%)を計算するためにDNA配列のFASTDBアラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは:Matrix=Unitary、k-tuple=4、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=30、Randomization Group Length=0、Cutoff Score=1、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty 0.05、Window Size=500または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方。この態様に従って、対象配列が、内部の欠失ではなく5'または3'欠失のために参照配列よりも短い場合、FASTDBプログラムは同一性の割合(%)を計算する際に対象配列の5'切断および3'切断を説明しないという事実を考慮するために手動の修正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対して5'末端または3'末端で切断された対象配列について、同一性の割合(%)は、問い合わせ配列の全塩基の割合(%)として一致/整列化されない対象配列の5'および3'である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって修正される。ヌクレオチドが一致/整列化されるか否かの決定はFASTDB配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージが同一性の割合(%)から減算され、特定のパラメーターを使用して上記のFASTDBプログラムによって計算され、最終的な同一性の割合(%)スコアに到達する。修正されたスコアは、この態様の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致/整列化されない、FASTDB配列によって示されるような対象配列の5'塩基および3'塩基の外側の塩基のみが、同一性の割合(%)スコアを手動で調整する目的のために計算される。例えば、90塩基の対象配列が同一性の割合(%)を決定するために100塩基問い合わせ配列に対して整列化される。欠失が対象配列の5'末端に存在し、FASTDBアラインメントは5'末端の最初の10塩基の一致/アラインメントを示さない。10個の対合しない塩基は配列の10%を表し(5'末端および3'末端の一致しない塩基の数/問い合わせ配列中の塩基の総数)、従って、10%がFASTDBプログラムによって計算される同一性の割合(%)スコアから減算される。残りの90塩基が完全に一致する場合、最終的な同一性の割合(%)は90%である。別の例において、90塩基の対象配列が100塩基の問い合わせ配列と比較される。今回は欠失が内部欠失であり、その結果、問い合わせ配列と一致/整列化されない、対象配列の5'または3'上の塩基は存在しない。この場合、FASTDBによって計算される同一性の割合(%)は手動で修正されない。問い合わせ配列と一致/整列化されない対象配列の5'および3'塩基のみが手動で修正される。他の手動の修正は、この態様の目的のためにはなされない。
【０１５１】
本出願は、少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸分子か、またはそれらが開示された機能的活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わりなく、本明細書中に開示される核酸配列またはその断片に対して同一である核酸分子に対して指向される。これは、特定の核酸分子が、開示された機能的活性を有するポリペプチドをコードしない場合であっても、以前として当業者はいかにして核酸分子を使用するか(例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとして)を知っているからである。開示された機能的活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、とりわけ、(1)cDNAライブラリー中のその改変体の単離;(2)開示された配列の細胞内局在または存在を決定するためのインサイチューハイブリダイゼーション(例えば、「FISH」)、および(3)特定の組織中でmRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析が含まれる。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、「PCR」という用語は、Mullisらに対する米国特許第4,683,195号および4,683,202号の対象であるポリメラーゼ連鎖反応、ならびに現在当技術分野において公知の改良をいう。本発明に従って、当技術分野の技術の範囲内にある従来的な分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術が利用され得る。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook, J.およびRussell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。
【０１５３】
「ストリンジェントな条件」という用語は、本明細書中で使用される場合、ハイブリダイゼーションにおける相同性が、塩、温度、有機溶媒、およびハイブリダイゼーション反応において代表的に制御される他のパラメーターの合わせた条件に基づき、かつ当技術分野において周知である(Sambrook, et al., 前出)ことをいう。本発明は、ストリンジェントな条件下で、上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部、例えば、本明細書中に記載されるような、任意のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片のコード配列および/または非コード配列(すなわち、転写され、翻訳されない配列)に相補的な配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、50%ホルムアミド、5×SSC(750mM NaCl、75mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH 7.6)、5×デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液、またはこれらからなる溶液中における42℃で一晩のインキュベーション、その後の0.1×SSC中で約65℃での洗浄が意図される。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１５４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスを含み、ここでウイルスは該ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスを含み、ここでこのレトロウイルスは、HIV-1、HIV-2、HTLV-I、HTLV-II、SIV、トリ白血病ウイルス(ALV)、内因性トリレトロウイルス(EAV)、マウス乳腺癌ウイルス(MMTV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、またはネコ白血病ウイルス(FeLV)からなる群のメンバーであり得る。
【０１５５】
本発明はさらに、CA-SP1タンパク質中に変異を含むポリペプチドを含み、該変異は3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25からp24へのプロセシングの阻害の減少を生じ、また、該変異は、任意で、CA-SP1切断部位にまたはその近傍に位置するか、またはCA-SP1タンパク質をコードするSEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:7(親のポリヌクレオチド配列)のSP1ドメインに位置する。該ポリペプチドは、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされ得るか、またはGHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO:2)およびSHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO:3)からなる群より選択される配列を含み得る。本発明のポリペプチドはさらに、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明はまた、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、またはSEQ ID NO:10もしくは12からなる群より選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含み、これは、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp25からp24へのプロセシングの阻害の減少をもたらす変異を含み、また、該変異は、任意で、CA-SP1にもしくはその近傍またはCA-SP1のSP1ドメインに位置する。本発明のポリペプチドは、キメラタンパク質または融合タンパク質の一部であるポリペプチドをさらに含む。該キメラタンパク質は、以下を含むがこれらに限定されない種に由来し得る:霊長類(類人猿およびヒトを含む);齧歯類(ラットおよびマウスを含む);ネコ;ウシ;ヤギおよびヒツジ(sheep)を含むヒツジ(ovine);イヌ;またはブタ。融合タンパク質は、合成ペプチド配列、二官能性抗体、上記の種由来のタンパク質またはリンカーペプチドと連結したペプチドを含み得る。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識;金属化合物;コファクター;クロマトグラフィー分離タグ(例えば、ヒスチジン、プロテインAなどであるがこれらに限定されない)、またはリンカー;血液安定化成分(例えば、トランスフェリンなどであるがこれらに限定されない);治療剤などとさらに連結され得る。
【０１５６】
本発明はまた、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸によるp24(CA)へのp25(CA-SP1)のプロセシングの阻害の減少をもたらすCA-SP1タンパク質の変異を含むアミノ酸を選択的に結合する抗体を含み、また、ここで該変異は、任意でCA-SP1にもしくはその近傍またはCA-SP1のSP1ドメインに位置する。本発明はまた、GHKARVLVEAMSQV(SEQ ID NO:2)またはSHKARILAEVMSQV(SEQ ID NO:3)の1つである配列を含む変異を有するポリペプチドを選択的に結合する抗体を含む。該抗体は、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを選択的に結合し得る。該抗体はまた、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:9からなる群より選択されるポリヌクレオチドに、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを選択的に結合し得る。本発明はまた、SP1を選択的に結合する抗体を含み、これは、CA-SP1(p25)からSP1を区別することを可能にする。本発明はまた、CA(p24)を選択的に結合する抗体を含み、これは、CA-SP1からCAを区別することを可能にする。本発明はまた、CA-SP1を選択的に結合する抗体を含み、これは、CA-SP1からCAを区別することを可能にする。本発明はさらに、CA-SP1切断部位またはその近傍に選択的に結合する抗体を含む。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体であり得るか、または該抗体は、キメラもしくは二官能性、または融合タンパク質の一部であり得る。本発明はさらに、本発明の抗体の一部を含み、これには、単鎖、軽鎖、重鎖、CDR、F(ab')2、Fab、Fab'、Fv、sFv、またはdsFv、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、抗体は、それが標的ペプチドに結合し、かつ関連しないタンパク質に有意に結合しない場合に「選択的に結合する」。「選択的に結合する」という用語はまた、天然の標的配列と比較して、抗体が標的変異体配列に選択的に結合するか否かを決定することを含む。標的配列に「選択的に結合する」抗体は、本明細書中で使用される場合、標的ペプチドに「特異的である」抗体と等価である。抗体は、それが標的ペプチドと実質的に相同でない他のタンパク質にも結合する場合でさえ、このようなタンパク質が抗体のペプチド標的の断片またはドメインとの相同性を有する限り、依然としてペプチドに選択的に結合すると見なされる。この場合において、ペプチドに結合する抗体は、ある程度の交差反応性にも関わらず、なお選択的であることが理解される。別の態様において、抗体が変異体標的配列に選択的に結合するか否かの決定は(a)変異体標的配列および天然の標的配列についての抗体の結合アフィニティーを決定する段階、ならびに(b)そのように決定された結合アフィニティーを比較する段階を含み、天然のアフィニティーよりも高い変異体標的配列のアフィニティーの存在は、抗体が変異体標的配列に選択的に結合することを示す。
【０１５８】
本発明はさらに、本明細書中に開示される抗体のいずれかを含む不溶性キャリア上に固定化された抗体に及ぶ。不溶性キャリア上に固定化された抗体には、複数ウェルプレート、培養プレート、培養管、試験管、ビーズ、球、フィルター、電気泳動材料、電子顕微鏡スライド、メンブレン、またはアフィニティークロマトグラフィー媒体が含まれる。
【０１５９】
本発明はまた標識された抗体を含み、これには、検出可能なシグナルが含まれる。本発明の標識された抗体は検出可能な分子で標識され、これは、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質、および放射性同位元素、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１６０】
本発明はさらに、CA-SP1タンパク質中の変異を含むアミノ酸配列を選択的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳動物B細胞と、哺乳動物ミエローマ細胞を誘導する段階を含む、ハイブリドーマを産生する方法を含み、該変異は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸、および本明細書中に開示されるモノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマによる、p25からp24へのプロセシングの阻害の減少をもたらす。本発明はさらに、当技術分野において周知であるように、適切な培地中で本明細書中に開示されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを増殖させる段階、および培地から抗体を単離する段階をさらに含む。本発明はまた、ポリクローナル抗体の産生のために有用な当技術分野において公知の任意の動物(マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、シカ、モルモット、または霊長類を含むがこれらに限定されない)への、本発明のポリペプチドのいずれかの、単回または複数回のいずれかの注射、およびそこから産生された血清中で抗体を回収する段階を含むポリクローナル抗体の産生を含む。本発明は、そこから産生された高結合活性または高アフィニティーの抗体を含む。本発明はまた、本明細書中に開示されるようなモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造のために細胞融合手順においてさらに使用される、列挙された種からの産生されるB細胞を含む。
【０１６１】
本発明はさらに、本明細書中に開示されるような抗体またはその一部、該抗体を含む容器、および使用のための指示書を含むキット、本明細書のポリペプチドおよび使用のための指示書を含むキット、ならびに本発明のポリヌクレオチドおよび使用のための指示書をを含むキット、ならびにそれらの任意の組み合わせに及ぶ。これらのキットは、PCRキットおよびイムノアッセイキットを利用してもよいし、利用しなくてもよい核酸検出キットを含むがそれらに限定されない。このようなキットは、臨床的診断のために有用であり、現在の臨床実務において必要とされるような標準化された試薬を提供する。これらのキットは、処理の前に変異が存在することまたは存在しないことに関する情報を提供するか、または治療の間に患者の進行をモニターするかのいずれかであり得る。本発明のキットはまた、実験研究における使用のための標準化された試薬を提供するために使用され得る。
【０１６２】
本発明の化合物
1つの局面において、本発明はまた、化合物、化合物を使用する方法、化合物を同定するための方法などに指向される。
【０１６３】
「1つの」「1個の」または「1の」(「a」「an」または「one」)という用語は、本発明において使用される場合、単数形または複数形のいずれかを言及してもよい。例えば、「1つの化合物」は、1つまたは複数の化合物を含む。
【０１６４】
本発明の方法において有用な化合物には、それぞれ米国特許第5,679,828号および6,172,110号、ならびに米国特許出願第60/443,180号および10/670,797号(これらは参照により本明細書に組み入れられる)において提示されるベツリン酸またはベツリンの誘導体が含まれる。さらなる有用な化合物には、Zhu et al. (Bioorg. Chem. Lett. 11:3115-3118 (2001))によって開示されるオレアノール酸誘導体; Kashiwada et al. (J. Nat. Prod. 61:1090-1095 (1998))によって開示されたオレアノール酸誘導体およびプロモール酸(promolic acid)誘導体; Kashiwada et al. (J. Nat. Prod. 63:1619-1622 (2000))によって開示された3-O-アシルウルソル酸誘導体; およびKashiwada et al. (Chem. Pharm. Bull. 48:1387-1390 (2000))によって開示される3-アルキルアミド-3-デオキシ-ベツリン酸誘導体が含まれる(すべての引用文献は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１６５】
ある態様において、本発明において有用な化合物には、下記の一般式Iを有するジヒドロベツリン酸誘導体および式IIのジヒドロベツリン酸誘導体、またはこれらの薬学的に許容される塩が含まれるがこれらに限定されない:
2008504808.tif 000016
式中、
RはC2-C20置換型または非置換型のカルボキシアシルであり、
R'は水素またはC2-C10置換型もしくは非置換型のアルキル基もしくはアリール基である。好ましい化合物は、Rが以下の表4の置換基の1つであり、R'が水素である化合物である。
【０１６６】
他の態様において、有用な化合物には、下記式IIIのベツリンおよびジヒドロベツリンの誘導体、またはこれらの薬学的に許容される塩が含まれる:
2008504808.tif 000017
式中、
R1はC2-C20置換型または非置換型のカルボキシアシル、またはそのエステルであり;
R2は水素、C(C6H5)3、またはC2-C20置換型もしくは非置換型のカルボキシアシルであり;かつ
R3は水素、ハロゲン、アミノ、置換されていてもよいモノアルキルアミノもしくはジアルキルアミノ、または-OR4であり、ここでR4は水素、C1-4アルカノイル、ベンゾイル、またはC2-C20置換型もしくは非置換型のカルボキシアシルであり;
ここで破線はC20とC29の間の任意の二重結合を表す。
【０１６７】
本発明において有用である好ましい化合物は、R1が表4における置換基の1つであり、R2が水素または表4における置換基の1つであり、かつR3が水素であるものである。
【０１６８】
（表４）R、R'、R1、R2のための好ましい置換基
2008504808.tif 000018
【０１６９】
より好ましい化合物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン、および3-O-(3',3'-ジメチルスクシニルまたはグルタリル)ジヒドロベツリンである。
【０１７０】
特に好ましい化合物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸である。
【０１７１】
ある態様において、本発明において有用な化合物は、下記式IV、V、VIおよびVIIによって説明される。
2008504808.tif 000019
R11=-OR14または-NHR15であり;
R12=COOR17、COO-A+、またはCH2OR17であり
R13=-H、ハロゲン、アミノ、置換されてもよいモノ-もしくはジ-アルキルアミノ、または-OR16であり;
R14=-H、C2-C20置換型または非置換型のカルボキシアシルであり;
R15=-H、C2-C20置換型または非置換型のカルボキシアシルであり;
R16=-H、C4-C7アルカノイル、ベンジロイル、またはC2-C20置換型もしくは非置換型のカルボキシアシルであり;
R17=-H、C(C6H5)3、またはC2-C20置換型もしくは非置換型のカルボキシアシルであり;
ここで破線はC20とC29の間の任意の二重結合を表し、および
A=Na+、K+または他のカチオンであり、
2008504808.tif 000020
ここで、R21=
2008504808.tif 000021
である。
2008504808.tif 000022
2008504808.tif 000023
2008504808.tif 000024
2008504808.tif 000025
【０１７２】
水素以外のR38部分は、カルボニル炭素への共有結合によってR33酸素に結合される。
【０１７３】
好ましい化合物は、R38が水素でないものである。
【０１７４】
さらなる態様において、R38、R40および/またはR41のいずれかがメチルである。
【０１７５】
ある態様において、本発明の方法において有用である化合物はまた、参照により全体的に本明細書に組み入れられる米国仮出願番号60/559,358に記載される方法を含む。1つの局面において、これらの化合物は、以下の化合物VIIIからXIへの参照によって記載される。
【０１７６】
ある態様において、本発明において有用な化合物は、下記の一般式VIII:
2008504808.tif 000026
またはその薬学的に許容される塩またはエステルを有し、
ここでAは下記式の縮合環であり:
2008504808.tif 000027
ここでAの式においてxおよびyと名付けられた環炭素は、式VIIIにおけるxおよびyと名付けられた環炭素と同じであり;
R51はカルボキシアルカノイルであり、ここで、アルカノイル鎖は、1つまたは複数のヒドロキシもしくはハロによって任意に置換されることができ、または窒素、硫黄、もしくは酸素原子、またはそれらの組み合わせが挿入され得;
R52、R53およびR54は、独立して、水素、メチル、ハロゲン、またはヒドロキシル、カルボニルもしくは-COOR66であり、ここでR66はアルキルまたはカルボキシルアルキルであり、ここで、アルキル鎖は、1つもしくは複数のヒドロキシルもしくはハロによって任意に置換されることができ、または窒素、硫黄、もしくは酸素原子、またはそれらの組み合わせが挿入され得;
R55はカルボキシアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルカノイルオキシメチル、カルボキシアルカノイルオキシメチル、アルコキシメチルまたはカルボキシルアルコキシメチルであり、それらのいずれかは、1つもしくは複数のヒドロキシもしくはハロであり、またはR55はカルボキシルもしくはヒドロキシメチルであり;
R56は水素、メチル、ヒドロキシまたはハロゲンであり;
R57およびR58は、独立して、水素またはC1-6アルキルであり;
R59はCH2またはCH3であり;
R60は水素、ヒドロキシまたはメチルであり;
R61はメチル、メトキシカルボニル、カルボキシアルコキシカルボニル、アルカノイルオキシメチル、アルコキシメチルまたはカルボキシアルコキシメチルであり、これらのいずれかが1つまたは複数のヒドロキシまたはハロによって任意に置換され;
R62は水素またはメチルであり;
R63は水素またはメチルであり;
R64は水素またはヒドロキシであり;
R65は、C12およびC13が単結合を形成する場合には水素であり、またはR65は、C12およびC13が二重結合を形成する場合には存在せず;および
ここで、直線の破線は、C12とC13、またはC20とC29の間の任意の二重結合を表し;
Aが
2008504808.tif 000028
であるならば、R51は、二重結合がC12とC13の間に存在するときに、グルタリルまたはスクシニルではあり得ず;
Aが(ii)でありかつR61がメチルであるならば、R51はスクシニルではあり得ず;
Aが(iii)でありかつR52、R53およびR63が各々水素であるならば、R51はスクシニルではあり得ないという条件を伴い;ならびに
R52およびR53が両方ともメチルであり、C12とC13の間に二重結合が存在するならば、A(i)は
2008504808.tif 000029
ではあり得ないという条件を伴う。
【０１７７】
ある態様において、R51は、カルボキシ(C2-6)アルキルカルボニル基またはカルボキシ(C2-6)アルコキシ(C1-6)アルキルカルボニル基である。適切な基は、以下からなる群より選択される:
2008504808.tif 000030
【０１７８】
本発明に従うと、ある態様において、化合物は下記式IXを有する:
2008504808.tif 000031
ここで、R51、R54、R55、R56、R57、R58およびR64は、式VIIIについて上記に定義したのと同様である。1つの態様において、R56はβ-メチルであり、R58は水素であり、R55はヒドロキシメチルであり、およびR51は3',3'-ジメチルグルタリル、3',3'-ジメチルスクシニル、グルタリル、またはスクシニルである。別の態様では、R56は水素であり、R57およびR58は共にメチルであり、R55はカルボキシルであり、およびR51は3'3-ジメチルグルタリル、3'3-ジメチルスクシニル、グルタリル、またはスクシニルである。
【０１７９】
ある態様において、R55は、カルボキシアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルカノイルオキシメチル、カルボキシアルカノイルオキシメチル、アルコキシメチルもしくはカルボキシアルコキシメチルであり、そのいずれかが1つもしくは複数のヒドロキシによって置換されてもよく、またはR55は、カルボキシルもしくはヒドロキシメチルである。ある態様において、R55は、カルボキシル、ヒドロキシメチル、-C02(CH2)nCOOH、-C02(CH2)nCH3、-CH2OC(O)(CH2)nCH3、-CH2OC(O)(CH2)nCOOH、-CO(CH2)nCH3および-CO(CH2)nCOOHからなる群より選択される。ある態様において、R55は、以下からなる群より選択される:
2008504808.tif 000032
【０１８０】
ある態様において、R55はヒドロキシメチルである。ある態様において、R55はカルボキシルである。ある態様において、nは0〜20、および好ましくは0〜6である。ある態様において、nは1〜10である。ある態様において、nは2〜8である。ある態様において、nは1〜6である。ある態様において、nは2〜6である。
【０１８１】
ある態様において、本発明において有用である化合物は下記式Xを有する:
2008504808.tif 000033
ここで、R51、R59、R60、およびR61は、式VIIIについて上記に定義したのと同様である。1つの態様において、R51は3',3'-ジメチルグルタリル、3',3'-ジメチルスクシニル、グルタリル、またはスクシニルである。
【０１８２】
ある態様において、R61は、メチル、メトキシカルボニル、カルボキシアルコキシカルボニル、アルカノイルオキシメチル、アルコキシメチルもしくはカルボキシアルコキシメチルであり、そのいずれかが1つもしくは複数のヒドロキシもしくはハロによって置換されてもよい。ある態様において、R61は、メチル、-C02(CH2)nCOOH、-COC(O)(CH2)nCH3、-CO(CH2)nCH3および-CO(CH2)nCOOHからなる群より選択される。
【０１８３】
ある態様において、nは0〜20、および好ましくは0〜6である。ある態様において、nは1〜10である。ある態様において、nは2〜8である。ある態様において、nは1〜6である。ある態様において、nは2〜6である。ある態様において、R61はメチルである。ある態様において、R61はメトキシカルボニルである。ある態様において、R61はメトキシメチルおよびエトキシメチルからなる群より選択される。ある態様において、R61において見い出されるメチル基はハロゲンまたはヒドロキシで置換することができる。
【０１８４】
ある態様において、本発明において有用である化合物は下記式XIを有する:
2008504808.tif 000034
ここで、R51、R52、R53、R54、およびR63は、式VIIIについて上記に定義したのと同様である。1つの態様において、R51は3',3'-ジメチルグルタリル、3',3'-ジメチルスクシニル、グルタリル、またはスクシニルである。1つの態様において、R52とR53の両方がメチルである。
【０１８５】
式VIIIの範囲に入る任意のトリテルペンを使用することができる。本発明に従うと、ある態様において、式VIIIの化合物は、ウバオール、ウルソル酸、エリスロジオール、オレアノール酸、スマレシノール酸(sumaresinolic acid)、ルペオール(lupeol)、ジヒドロルペオール、ベツリン酸メチルエステル、ジヒドロベツリン酸メチルエステル、17-α-メチルアンドロスタンジオール、アンドロスタンジオール、および4,4-ジメチルアンドロスタンジオールの誘導体からなる群より選択される。
【０１８６】
ある態様において、本発明の化合物は、式VIIIに定義され、ここでR52およびR53は両方ともメチルである。ある態様において、本発明の化合物は、式VIIIに定義され、ここでR51は3',3'-ジメチルスクシニルである。ある態様において、本発明の化合物は、式VIIIに定義され、R51はスクシニル、すなわち、
2008504808.tif 000035
である。
【０１８７】
本発明に従うと、ある態様において、側鎖置換基の立体化学が重要である。ある態様において、本発明の化合物は式VIIIに定義され、ここで、Aは(i)であり、R55はβ位にある。ある態様において、本発明の化合物は式VIIIに定義され、Aは(i)であり、R56はβ位にある。ある態様において、本発明の化合物は式VIIIに定義され、Aは(i)であり、R64はα位にある。ある態様において、本発明の化合物は式VIIIに定義され、Aは(i)であり、R57はα-メチルであり、およびR58は水素である。ある態様において、本発明の化合物は式VIIIに定義され、Aは(i)であり、R58はα-メチルであり、およびR57は水素である。ある態様において、本発明の化合物は式VIIIに定義され、Aは(i)であり、R57とR58は両方ともメチルである。ある態様において、本発明の化合物は式VIIIに定義され、Aは(ii)であり、R61はβ位にある。
【０１８８】
ある態様において、3',3'-ジメチルスクシニルはC3位にある。ある態様において、式IXの化合物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ウバオール;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)エリスロジオール;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)エキノシスチン酸(echinocystic acid)または3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)スマレシノール酸である。ある態様において、式Xの化合物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ルペオール;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロルペオール;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)17β-メチルエステルベツリン酸;または3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)17β-メチルエステルジヒドロベツリン酸である。ある態様において、式XIの化合物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)4,4-ジメチルアンドロスタンジオール;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)17α-メチルアンドロスタンジオール;3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)アンドロスタンジオールである。
【０１８９】
さらなる態様において、本発明は、式XIIの化合物を使用する化合物および方法を含む:
2008504808.tif 000036
ここでR72は以下のうちの1つであり:
2008504808.tif 000037
ここで、
Zはヒドロキシまたはハロゲンであり;および
R73は、メチル、エチルまたはプロピルなどの低級アルキルである。
【０１９０】
さらなる態様において、本発明において有用である化合物は、式XIIIのベツリン誘導体化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはそのプロドラッグであり:
2008504808.tif 000038
ここで、
R51は、C3-C20アルカノイル、カルボキシアルカノイル、カルボキシアルケノイル、アルコキシカルボニルアルカノイル、アルケニルオキシカルボニルアルカノイル、シアノアルカノイル、ヒドロキシアルカノイル、アミノカルボニルアルカノイル、ヒドロキシアミノカルボニルアルカノイル、モノアルキルアミノカルボニルアルカノイル、ジアルキルアミノカルボニルアルカノイル、ヘテロアリールアルカノイル、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルカルボニルアルカノイル、ヘテロアリールアミノカルボニルアルカノイル、シアノアミノカルボニルアルカノイル、アルキルスルホニルアミノカルボニルアルカノイル、アリールスルホニルアミノカルボニルアルカノイル、スルホアミノカルボニルアルカノイル、ホスホノアミノカルボニルアルカノイル、テトラゾリルアルカノイル、ホスホノ、スルホ、ホスホノアルカノイル、スルホアルカノイル、アルキルスルホニルアルカノイル、もしくはアルキルホスホノアルカノイルであり;
R82は、ホルミル、カルボキシアルケニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、-CH2SR94、
2008504808.tif 000039
であり;
【０１９１】
R83は、ヒドロキシル、イソプロペニル、イソプロピル、1'-ヒドロキシイソプロピル、1'-ハロイソプロピル、1'-チオイソプロピル、1'-トリフルオロメチルイソプロピル、2'-ヒドロキシイソプロピル、2'-ハロイソプロピル、2'-チオイソプロピル、2'-トリフルオロメチルイソプロピル、1'-ヒドロキシエチル、1'-(アルコキシ)エチル、1'-(アルコキシアルコキシ)エチル、1'-(アリールアルコキシ)エチル;1'-(アリールカルボニルオキシ)エチル、1'-(オキソ)エチル、1'-(ヒドロキシル)-1'-(ヒドロキシアルキル)エチル、1'(オキソ)オキサゾリジニル、1',2'-エポキシイソプロピル、2'-ハロイソプロペニル、2'-ヒドロキシイソプロペニル、2'-アミノイソプロペニル、もしくは
2008504808.tif 000040
であり、
ここで、Yは-SR111もしくは-NR113R114であり;
R111はメチルであり;
R112は水素もしくはヒドロキシルであり;
R113およびR114は、独立して、水素、アルキル、アルカノイル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールスルホニルもしくはアリールカルボニルであり;または
R113およびR114は、それらが結合してヘテロ環を形成する窒素と一緒になることができ、ここで、ヘテロ環は、1つもしくは複数のさらなる窒素、硫黄もしくは酸素原子を任意に含むことができ;
mは0〜3であり;
R84は水素であり;または
R83およびR84は、一緒になって、オキソ、アルキルイミノ、アルコキシイミノもしくはベンジルオキシイミノを形成することができ;
R85は、C2-C20アルキル、アルケニル、C2-C20カルボキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル。ジアルキルアミノアルキル、アルコキシアルキル、シアノ、シアノアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリルアルキル、スルホ、ホスホノ、スルホアルキル、ホスホノアルキル、アルキルスルホニル、アルキルホスホノ、アルカノイルアミノアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニルアルキル、ジアルキルアミノカルボニルアルキル、ヘテロシクリルカルボニルアルキル、シクロアルキルカルボニルアルキル、ヘテロアリールアルキルアミノカルボニルアルキル、アリールアルキルアミノカルボニルアルキル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニルアルキル、カルボニルアルキルアミノカルボニルアルキル、アリールスルホニルアミノカルボニルアルキル、アルキルスルホニルアミノカルボニルアルキル、アリールホスホノアミノカルボニルアルキル、アルキルホスホノアミノカルボニルアルキル、もしくはヒドロキシイミノ(アミノ)アルキルであり;
R86は、水素、ホスホノ、スルホ、シアノ、アルキル、スルホアルキル、ホスホノアルキル、アルキルスルホニル、アルキルホスホノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、もしくはシアノアルキルであり;
R87もしくはR88は、独立して、水素、アルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アミノアルコキシアルキル、アルキルカルボニルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールカルボニルアミノアルキル、もしくはシクロアルキルであり、またはR87およびR88は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリール基を形成することができ、ここで、ヘテロシクリルまたあはヘテロアリールは、1つもしくは複数のさらなる窒素、硫黄もしくは酸素原子を任意に含むことができ;
R89は、水素、ホスホノ、スルホ、シアノ、アルキル、アルキルシリル、シアノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルオキシアルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、シアノアルキル、ホスホノアルキル、スルホアルキル、アルキルスルホニル、アルキルホスホノ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、もしくはジアルコキシアルキルであり;
R90およびR91は、独立して、水素、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、アミノ、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、カルボキシル、カルボキシアルキル、アルカノイルオキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アミノアルコキシアルキル、アルキルカルボニルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールカルボニルアミノアルキル、アリールスルホニル、もしくはシクロアルキル、または1つもしくは複数の酸素原子が挿入されたアルキルであり、あるいはR90およびR91は、それらが結合する窒素原子と一緒になってヘテロシクリル基を形成することができ、ここで、このヘテロシクリルは、1つもしくは複数のさらなる窒素、硫黄、もしくは酸素原子を任意に含むことができ;
R92およびR93は、独立して、水素、アルキル、アルコキシカルボニル、アルコキシアミノアルキル、シクロアリールオキシ、ヘテロシクリルアミノアルキル、シクロアルキル、シアノアルキル、シアノ、スルホ、ホスホノ、スルホアルキル、ホスホノアルキル、アルキルスルホニル、アルキルホスホノ、アルコキシアルキル、ヘテロシクリルアルキルであり、またはR92およびR93は、それらが結合する窒素原子と一緒になってヘテロシクリル基を形成することができ、ここで、このヘテロシクリルは、1つもしくは複数のさらなる窒素、硫黄もしくは酸素原子を任意に含むことができ、またはR92およびR93は、それらが結合する窒素原子と一緒になってアルキルアゾ基を形成することができ、ならびにbは1〜6であり;
R94は、水素、アルキル、アルケニル、アリールアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルケニル、アルコキシカルボニルアルキル、アルケニルオキシカルボニルアルキル、シアノアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシベンジル、アミノカルボニルアルキルであり;
R95およびR96は、独立して、水素、アルキル、アルコキシカルボニル、アルコキシアミノアルキル、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクリルアミノアルキル、シクロアルキル、シアノアルキル、シアノ、スルホ、ホスホノ、スルホアルキル、ホスホノアルキル、アルキルスルホニル、アルキルホスホノ、アルコキシアルキル、ヘテロシクリルアルキルであり、またはR95およびR96は、それらが結合する窒素原子と一緒になってヘテロシクリル基を形成することができ、ここで、このヘテロシクリルは、1つもしくは複数のさらなる窒素、硫黄もしくは酸素原子を任意に含むことができ、またはR95およびR96は、それらが結合する窒素原子と一緒になってアルキルアゾ基を形成することができ;
R97は、水素、アルキル、アルケニル、カルボキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、シアノアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルカノイルアミノアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニルアルキル、ジアルキルアミノカルボニルアルキル、ヘテロシクリルカルボニルアルキル、シクロアルキルカルボニルアルキル、ヘテロアリールアルキルアミノカルボニルアルキル、アリールアルキルアミノカルボニルアルキル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキルアミノカルボニルアルキル、アリールスルホニルアミノカルボニルアルキル、アルキルスルホニルアミノカルボニルアルキル、もしくはヒドロキシイミノ(アミノ)アルキルであり;
R98およびR99は、独立して、水素、メチルもしくはエチルであり、好ましくは水素もしくはメチルであり;ならびにdは1〜6である。
【０１９２】
本発明の化合物のアルキル基およびアルキル含有基は、直鎖状または分枝状アルキル基であることができ、好ましくは、1〜10個の炭素原子を有する。ある態様において、本発明の化合物のアルキル基およびアルキル含有基は、C3-7シクロアルキル基で置換され得る。ある態様において、このシクロアルキル基には、シクロブチル基、シクロペンチル基またはシクロヘキシル基が含まれてもよいがこれらに限定されない。
【０１９３】
本発明の化合物の非毒性の薬学的に許容される塩もまた、本発明の範囲内に含まれる。これらの塩は、化合物の最終的な単離および精製の間にインサイチューで、またはその遊離酸型の精製した化合物を適切な有機塩基もしくは無機塩基と別々に反応させること、およびこのように形成した塩を単離することによって調製することができる。これらには、アルカリ金属およびアルカリ土類金属に基づくカチオン、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、N-メチルグルカミンなどを含むがこれらに限定されない、非毒性アンモニウム、四級アンモニウムおよびアミンカチオンが含まれ得る。
【０１９４】
本発明の化合物の非毒性の薬学的に許容されるエステルもまた、本発明の範囲内に含まれる。エステル基は、好ましくは、生理学的条件下で比較的容易に加水分解される型が好ましい。本発明の化合物の薬学的に許容されるエステルの例には、アルキル基が直鎖または分枝鎖である、C1-6アルキルエステルが含まれる。許容されるエステルにはまた、C5-7シクロアルキルエステル、ならびに例えば、ベンジルであるがこれに限定されないアリールアルキルエステルが含まれる。C1-4アルキルエステルが好ましい。ある態様において、エステルは、アルキルカルボン酸エステル、例えば、酢酸エステル、およびモノ-またはジアルキルリン酸エステル、例えば、メチルリン酸エステルまたはジメチルリン酸エステルからなる群より選択される。本発明の化合物のエステルは、従来的な方法に従って調製することができる。
【０１９５】
特定の化合物は、「プロドラッグ」と呼ばれる上記に列挙した誘導体である。これは、例えば、式VIIIからXIの範囲内に含まれる化合物を含む。「プロドラッグ」という表現は、酵素的または化学的なプロセスによって、例えば、血中での加水分解によってインビボで迅速に転換され、上記式の親の化合物を生じる化合物をいう。徹底的な議論は、Higuchi, T. and V. Stella in Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A. C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987によって与えられている。有用なプロドラッグは、例えば、式VIII、IX、X、およびXIの化合物のエステルであり得る。あるプロドラッグの態様において、低級アルキル基が、1つまたは複数のヒドロキシル基またはハロ基で、適切な酸によって置換される。適切な酸には、例えば、カルボン酸、スルホン酸、リン酸またはその低級アルキルエステル;およびホスホン酸またはその低級アルキルエステルが含まれる。例えば、適切なカルボン酸には、アルキルカルボン酸、例えば、酢酸、アリールカルボン酸およびアリールアルキルカルボン酸が含まれる。適切なスルホン酸には、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸およびアリールアルキルスルホン酸が含まれる。適切なリン酸およびリン酸エステルは、メチルまたはエチルエステルである。
【０１９６】
ある態様において、C3'位にジメチル基または酸素を有するC3アシル基は、最も活性な化合物であり得る。この観察は、これらの型のアシル基が増強した抗HIV活性のために重要であり得ることを示唆する。
【０１９７】
1つの態様において、本発明は、式IからXIIIまでの化合物である、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を治療する方法に及ぶ。
【０１９８】
1つの態様において、本発明は、DSBを例外とした式IからXIIIまでの化合物である、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を治療する方法に及ぶ。
【０１９９】
1つの態様において、本発明は、式IからVIIまでの化合物ではなく、または式IからXIIIまでの化合物ではない、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を治療する方法に及ぶ。1つの態様において、本発明は、式IからXIまでの化合物ではなく、または他の態様において式IからXIIIまでの化合物ではない、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物を投与することによって、患者におけるHIV-1感染を治療する方法に及ぶ。
【０２００】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからXIIIまでの化合物である、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法に及ぶ。
【０２０１】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからVIIまでの化合物ではなく、または他の態様において式IからXIIIまでの化合物ではない、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法に及ぶ。
【０２０２】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからXIまでの化合物ではなく、または他の態様において式IからXIIIまでの化合物ではない、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法に及ぶ。
【０２０３】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからXIIIまでの化合物である、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害することによって、ヒトの血液または血液製剤を処理する方法に及ぶ。
【０２０４】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからVIIまでの化合物ではなく、または他の態様において式IからXIIIまでの化合物ではない、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害することによって、ヒトの血液または血液製剤を処理する方法に及ぶ。
【０２０５】
Dsbの合成および関連化合物 
ベツリン酸およびジヒドロベツリン酸のジメチルコハク酸無水物との反応は、3-O-(2',2'-ジメチルスクシニル)およびそれぞれ3-O-(2',2'-ジメチルスクシニル)-ベツリン酸およびジヒドロベツリン酸の混合物を生じた。混合物は、純粋な試料を産生する調製スケールHPLCによって首尾よく分離された。これらの異性体の構造は長範囲1H-13C COSY試験によって与えられた。
【０２０６】
本発明のベツリン酸およびジヒドロベツリン酸の誘導体は、無水ピリジン(5-10mL)中、ベツリン酸またはジヒドロベツリン酸、ジメチルアミノピリジン(1等量モル)、および適切な無水物(2.5-10等量モル)の溶液を還流することによってすべて合成した。次いで、反応混合物を氷水で希釈し、CHCl3で抽出した。有機層を水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムまたは準調製(semi-preparative)スケールHPLCを使用するクロマトグラフィーに供して生成物を収集した。
【０２０７】
3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸の調製:
収率70%(542mgのベツリン酸で開始);MeOHからの結晶化は無色針状結晶を与えた。
2008504808.tif 000041
【０２０８】
3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸:
収率24.5%(155.9mgのジヒドロベツリン酸で開始);MeOH-H2Oからの結晶化は無色針状結晶を与えた。
2008504808.tif 000042
【０２０９】
3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン酸の合成は、COMPOUND No.4として米国特許第5,679,828号に開示された。
【０２１０】
3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ジヒドロベツリン酸:
収率93.3%(100.5mgのジヒドロベツリン酸で開始);MeOH-H2Oからの結晶化は無色針状結晶を与えた。
2008504808.tif 000043
【０２１１】
3-O-ジグリコリル-ベツリン酸の合成は、COMPOUND No.5として米国特許第5,679,828号に開示された。
【０２１２】
3-O-ジグリコリル-ジヒドロベツリン酸:
収率79.2%(103.5mgのジヒドロベツリン酸で開始);灰色がかった白色のアモルファス粉末。
2008504808.tif 000044
【０２１３】
3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリンおよび3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリンの合成は、米国特許出願第10/670,797号に開示された。
【０２１４】
化合物でHivを阻害する方法
「HIVを阻害する」または「HIVの阻害」の方法は、本明細書で使用される場合、本発明の方法を使用して、HIVの任意の干渉、阻害、および/または予防を意味する。このようなものとして、阻害の方法は、HIVの感染性の阻害、p25プロセシングの阻害、ウイルス成熟の阻害、変化した表現型を示すビリオンの形成などにおいて有用である。好ましくは、本発明の方法は、動物の細胞中においてp25プロセシングに作用するが、作用の方法によっては限定されない。
【０２１５】
化合物を用いてHIVを阻害する方法は、患者におけるHIV感染の方法に関連し得る。それゆえに、化合物を用いてHIVを阻害する方法は、同様に、患者を治療するために使用され得る。
【０２１６】
動物の細胞中でのHIV-1複製を阻害する方法は、感染した細胞を、上記の式IからXIIIの化合物と接触させる段階を含む。関連する態様は、式IからXIIIの化合物の投与を含む、患者のHIV-1感染を治療する方法;p25プロセシングを阻害する化合物の投与によって、細胞中、インビボ、および/またはインビトロでのいずれかで該p25プロセシングを阻害する方法;ならびに式IからXIIIの化合物を投与することによってヒトの血液または血液製剤を処理する方法を含む。p25プロセシング、HIV成熟、HIV感染性、HIVビリオン表現型などのいずれか1つを阻害する化合物を同定する方法もまた含まれる。
【０２１７】
1つの態様において、本発明の化合物は、ベツリン酸、ベツリン、またはジヒドロベツリン酸もしくはジヒドロベツリンであり、およびこれらは、表4の好ましい置換基を含む。好ましい化合物は以下を含むがこれらに限定されない:3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン酸、(3',3'-ジメチルグルタリル)ジヒドロベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ベツリン酸、および3-O-ジグリコリル-ジヒドロベツリン酸。
【０２１８】
1つの態様において、本発明は、式IからXIIIまでの化合物である、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物と、感染した細胞を接触させることによって、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する方法に及ぶ。
【０２１９】
1つの態様において、本発明は、DSBを例外とした、式IからXIIIまでの化合物である、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物と、感染した細胞を接触させることによって、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する方法に及ぶ。
【０２２０】
1つの態様において、本発明は、式IからVIまでの化合物を除外したものである、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物と、感染した細胞を接触させることによって、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する方法に及ぶ。1つの態様において、本発明は、式IからXIIIまでの化合物以外である、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えない化合物と、感染した細胞を接触させることによって、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する方法に及ぶ。
【０２２１】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからXIIIまでの化合物である、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法に及ぶ。
【０２２２】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからVIまでの化合物ではない、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法に及ぶ。
【０２２３】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからXIIIまでの化合物ではない、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法に及ぶ。
【０２２４】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからXIまでの化合物ではない、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害する方法に及ぶ。別の態様において、本発明は、化合物が式IからXIIIまでの化合物である、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害することによって、ヒトの血液または血液製剤を処理する方法に及ぶ。
【０２２５】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからVIまでの化合物以外の化合物である、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害することによって、ヒトの血液または血液製剤を処理する方法に及ぶ。
【０２２６】
別の態様において、本発明は、化合物が式IからVIIIまでの化合物以外の化合物である、他のGagプロセシング段階に有意な影響を与えることなく、細胞中でウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害することによって、ヒトの血液または血液製剤を処理する方法に及ぶ。
【０２２７】
本明細書中に開示される方法は、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗癌剤、免疫刺激剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1種または複数の薬物と、該細胞を接触させる段階をさらに含む。本方法はヒト血液産物の処理を含み得る。
【０２２８】
本発明はまた、動物への1種または複数の抗新生物剤の投与、癌細胞殺傷量の放射線への動物の曝露、または両方の組み合わせを含む癌を処置する方法と組み合わせて使用され得る。
【０２２９】
化合物を同定するための方法
本発明はさらに、本明細書中に開示される動物の細胞中でHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法を含む。1つの態様では、該方法は以下の段階を含む:
(a) CA-SP1切断部位を含むGagポリペプチドを試験化合物と接触させる段階;
(b) CA-SP1切断部位またはその近傍で選択的に結合する標識された物質を加える段階;および
(c) CA-SP1切断部位またはその近傍での試験化合物の結合を測定する段階。
【０２３０】
標識された物質には、標識された抗体または標識されたDSBが含まれ、標識には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質(例えば、金、四酸化オスミウム、鉛、またはウラニルアセテート)、および放射性同位元素、このような物質分子で標識された抗体、またはこれらの組み合わせが含まれる。アッセイ法には、当技術分野において公知であるような、ELISA、シングルおよびダブルサンドイッチ技術、免疫拡散、または免疫沈殿技術が含まれ得るがこれらに限定されない(「Immunoassay Handbook, 第2版」D. Wild, Nature Publishing Group, (2001))。該同定の方法はまた、ウェスタンブロットアッセイ、比色定量アッセイ、光学顕微鏡技術および電子顕微鏡技術、共焦点顕微鏡法、または当技術分野において公知である他の技術を含み得るがこれらに限定されない。
【０２３１】
動物の細胞中でHIV複製を阻害する化合物を同定する方法はさらに以下の段階を含む:
(a) 野生型CA-SP1切断部位を含むGagタンパク質を、試験化合物の存在下でHIV-1プロテアーゼと接触させる段階;
(b) 別々に、変異型CA-SP1切断部位を含むGagタンパク質または代替のプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質を、試験化合物の存在下でHIV-1プロテアーゼと接触させる段階;
(c) 変異型Gagタンパク質の切断量または代替のプロテアーゼ切断部位を含むタンパク質の切断量に対する天然の野生型Gagタンパク質の切断量を比較する段階。
【０２３２】
上記の段階(b)は、直接的に結合し得、それゆえにプロテアーゼ酵素を阻害する化合物を除去するための対照として実行される。上記の方法はまた、野生型CA-SP1、変異体CA-SP1、または代替のプロテアーゼ切断部位がポリペプチド断片または組換えペプチド中に含まれる方法を含む。
【０２３３】
本明細書中に開示されるHIV-1を阻害する化合物を同定するための方法はまた、該ペプチドまたはタンパク質が蛍光部分および蛍光消光部分で標識され、各々がCA-SP1切断部位の反対側に結合し、ここで検出する段階が蛍光部分からのシグナルを測定すること、または該ペプチドまたはタンパク質が2つの蛍光部分で標識され、各々がCA-SP1切断部位の反対側に結合し、ここで検出する段階は、試験化合物およびHIV-1プロテアーゼの存在下で1つの部分から他の部分への蛍光エネルギーの移動を測定すること、およびCA-SP1切断部位中に変異を含む配列を含むかまたは別の切断部位を含む配列を含むペプチドに同じ手順が適用された場合に観察される、該蛍光エネルギーの移動を比較することを含む。プロテアーゼ活性の蛍光に基づくアッセイ法の例は当技術分野において周知である。1つのこのような例において、プロテアーゼ基質はグリーン蛍光色素分子で標識され、これは、基質がプロテアーゼ酵素によって切断されるときに蛍光を発する(Molecular Probes, Protease Assay Kit)。
【０２３４】
上記の切断を比較する方法はまた、試験化合物がCA-SP1を阻害する程度を測定するために、CAまたはSP1またはCA-SP1に選択的に結合する標識された抗体を使用することを含む。この抗体は、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質、および放射性同位元素、またはこれらの組み合わせから選択される分子で標識され得る。この方法はまた、当技術分野における標準的な方法に従って、そのエピトープタグについてのアミノ酸配列が操作されたCA-SP1(p25)またはSP1を選択的に検出するための特異的エピトープタグ配列に対する抗体の使用を含む。適切なタグは当業者に周知であり、赤血球凝集素エピトープHA(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:81)、ブルータングウイルスエピトープVP7(QYPALT)(SEQ ID NO:82)、α-チューブリンエピトープ(EEF)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:83)、およびVSV-G(YTDOEMNRLGK)(SEQ ID NO:84)が含まれる。SP1含有エピトープタグの例は図17に図示される。
【０２３５】
例として、FLAGエピトープタグ(Sigma-Aldrich)が、Gag発現プラスミドのオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によってGagのp2(SP1)領域に挿入される。次いで、細胞発現タンパク質中のSP1ドメインの存在は、市販されている抗FLAGモノクローナル抗体(Sigma-Aldrich)を使用して検出される(Hopp, T.P. Biotechnology 6: 1204-1210 (1988))。
【０２３６】
CA-SP1切断を破壊する化合物を同定する方法はまた、HIV-1で感染した細胞への化合物の付加、ならびに細胞または放出されたビリオンを溶解および分析することによるCA-SP1切断生成物の検出を含む。本発明に含まれる方法は、ウイルスタンパク質のウェスタンブロット分析、およびp25に対する抗体を使用するp25の検出を用いて実行されることができ、または、ここで該混合物は、ウイルスタンパク質のゲル電気泳動の実行および代謝的に標識されたタンパク質の画像化によって分析され、または、混合物は、p24からp25を区別するために、p25を選択的に結合するかもしくは選択的に結合する抗体を用いるイムノアッセイを使用して分析される。本発明は、p25またはSP1を選択的に検出するために、SP1のC末端ドメインに挿入された特異的エピトープタグに対する抗体の使用を含む。例えば、サンドイッチELISAが実行されることができ、ここでは、界面活性剤により可溶化されたウイルス中のp25およびp24が、複数ウェルプレートに結合されるGagのCA領域に選択的に結合する抗体を使用して捕捉される。洗浄段階後、結合したp25は、適切な検出試薬(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイのためのアルカリホスファターゼ)に結合体化される、SP1に挿入されたエピトープタグに対する抗体を使用して検出される。このメカニズムを介して作用する化合物で処理された細胞によって放出されたウイルスは、一般的に、処理されていないビリオンと比較して、増加したレベルのp25を有する。
【０２３７】
開示された方法は、p25を選択的に結合する抗体、またはSP1を選択的に結合する抗体、またはSP1に挿入されたエピトープタグ配列に対する抗体に及び、これは、酵素、蛍光物質、化学発光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、高電子密度物質、および放射性同位元素、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される分子で標識される。
【０２３８】
「感染細胞」は、本明細書中で使用される場合、膜融合およびその後の細胞へのウイルスゲノムの挿入によって天然に感染した細胞、または人工的手段を通してウイルス遺伝子物質を用いる細胞のトランスフェクションを含む。これらの方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または感染が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３９】
本発明は、適切な培養条件下で、かつ様々な期間の間、HIVの感染性株を用いてかつ試験化合物の存在下で、インビトロで標的細胞に感染することによって実施され得る。感染細胞または上清の液体は、当技術分野において周知である方法によって処理され得、かつウイルスレベルの検出のためにポリアクリルアミドゲルにロードされ得る。非感染細胞および未処理細胞は、それぞれ、ネガティブ感染対照およびポジティブ感染対照として使用され得る。代替的には、本発明は、HIV株を用いる細胞の感染の前に、試験化合物の存在下で標的細胞を培養することによって実施され得る。
【０２４０】
本発明はまた、動物の細胞中におけるHIV-1複製を阻害する化合物を同定するための方法を含み、この方法は以下の段階を含む:
(a) 試験化合物を野生型ウイルス単離物と、および別々に、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に対して減少した感受性を有するウイルス単離物と接触させる段階;ならびに
(b)3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸に対して減少した感受性を有するウイルス単離物と比較して、野生型ウイルス単離物に対してより活性である試験化合物を選択する段階。
【０２４１】
本発明はさらに、上述のメカニズムのいずれかによって作用する化合物を同定するための方法を含み、この方法は、当技術分野において周知である標準的な方法によって、HIV-1感染細胞またはHIV-1トランスフェクト細胞を化合物で処理する段階、次いで、放出されるウイルス粒子を薄片作製および透過型電子顕微鏡によって分析する段階を含む。ウイルス粒子に関して非中心性の球状の凝集したコア、および/またはウイルス膜のすぐ内側の半月状の高電子密度層を示す粒子が検出されるならば、化合物は上記のメカニズムによって作用する。
【０２４２】
電子顕微鏡研究のために、上清液体から得られた感染細胞または遠心分離したウイルスペレットが、グルタルアルデヒド、新しく調製されたパラホルムアルデヒド、および/または四酸化オスミウムなどの固定剤、または当技術分野において公知である他の電子顕微鏡適合可能な固定剤と接触され得る。上清液体または細胞からのウイルスは脱水され、エポキシ樹脂またはメタクリレートなどの電子密度の低いポリマー中に包埋され、ウルトラミクロトームを使用して薄片作製され、ウラニルアセテートおよび/またはクエン酸鉛などの高電子密度染色を使用して染色し、および透過型電子顕微鏡で観察した。非感染細胞および未処理細胞は、それぞれ、ネガティブ感染対照およびポジティブ感染対照として使用され得る。代替的には、本発明は、HIV株を用いる細胞の感染の前に、試験化合物の存在下で標的細胞を培養することによって実施され得る。本発明の化合物によって引き起こされる成熟欠損は、本明細書中に記載されるように、対照と比較した、形態学的に異常なウイルス粒子の存在によって決定される。
【０２４３】
細胞培養研究のために、ウイルス感染細胞は、シンシチウムの形成について観察され、または上清はHIV粒子の存在について試験され得る。上清中に存在するウイルスは、感染性を決定するために他の未処理の培養物に感染させるために収集され得る。
【０２４４】
個体がHIV-1に感染しているか否か、p25プロセシングを阻害する化合物による処理に感受性であるか否か、を決定する方法もまた本発明に含まれ、この方法は、患者から血液を採取する段階、ウイルスRNAを遺伝子型解析を行う段階、およびウイルスRNAがCA-SP1切断部位中の変異を含むか否かを決定する段階を含む。
【０２４５】
本発明はまた、上述のメカニズムによって作用する化合物を同定するための方法を含み、この方法は、本明細書中に開示される方法の組み合わせによって試験する段階を含む。
【０２４６】
上述のアッセイ法における使用のためのHIV Gagタンパク質およびその断片は、当業者によく知られている種々の方法を使用して発現または合成され得る。Gagはウサギ網状赤血球溶解物を使用するインビトロ転写および翻訳系において産生され得る。この系において発現されるGagは、感染細胞中で観察されるのと類似のパターンで逐次的にプロセスされることが示された(Pettit, S.C. et al. J. Virol. 76:10226-10233 (2002))。さらに、この方法によって発現されるGagは、異種D型レトロウイルス細胞質自己アセンブリードメインに融合した場合に未成熟ウイルス粒子にアセンブルすることが可能である(Sakalian, M. et al., J. Virol. 76:10811-10820 (2002))。NIH AIDS Reagent Programから利用可能であるプラスミドpDAB72は、この目的のために使用され得る(Erickson-Viitanen, S. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses. 5:577-91 (1989); Sidhu M.K. et al., Biotechniques, 18:20, 22, 24 (1995))。コムギ胚芽または細菌溶解物に基づく他のインビトロ転写/翻訳系もまた、この目的のために使用され得る。HIV Gagはまた、種々の市販の発現ベクターを使用してトランスフェクトされた細胞中で発現され得る。NIH AIDS Reagent Programから利用可能であるプラスミドp55-GAG/GFPは、薬物相互作用研究において哺乳動物細胞中でGag-グリーン蛍光タンパク質融合タンパク質を発現するために使用され得る(Sandefur, S. et al., J. Virol. 72:2723-2732 (1998))。この構築物は、GFP特異的モノクローナル抗体を使用してGag融合タンパク質の捕捉および精製を可能にする。さらに、Gagは、組換えウイルスベクターを使用する細胞(例えば、ワクシニアウイルス系、アデノウイルス系、またはバキュロウイルス系において使用されるものなど)中で発現され得る。Gagはまた、HIVを細胞に感染させることによって、またはプロウイルスDNAで細胞をトランスフェクトすることによって発現され得る。最後に、Gagは、適切な発現ベクターで形質転換された酵母細胞または細菌細胞中で発現され得る。
【０２４７】
細胞中でまたは細胞溶解物を使用してインビトロで発現されるGagタンパク質に加えて、Gagの種々の領域に対応するペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用することから、商業的に合成され得る。
【０２４８】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定される化合物、および/または本発明の方法に従ってHIV-1複製を阻害する化合物、および本明細書中に開示されるような1種または複数の化合物を含む薬学的組成物、またはこれらの薬学的に許容される塩、エステル、もしくはプロドラッグ、および薬学的に許容されるキャリアを含む。
【０２４９】
薬学的組成物
本発明に従う化合物は、抗レトロウイルス活性、特に抗HIV-活性を有することが見い出された。本発明の塩および他の処方物は、改善された水溶性、および増強された経口的生物学的利用能を有することが予測される。また、改善された水溶性に起因して、本発明の塩を薬学的調製物に処方することがより容易である。さらに、本発明に従う化合物は、改善された生物分布特性を有することが予測される。
【０２５０】
1つの態様において、本発明の化合物は、式IからXIIIまでの化合物であり、別の態様において、これらは、式IからXIIIの化合物以外の化合物である。
【０２５１】
本発明はまた、ウイルスGag p25タンパク質(CA-SP1)からp24(CA)へのプロセシングを阻害するが、他のGagプロセシング段階に対して有意な効果を有さない化合物、または処理された感染細胞から放出されたウイルス粒子の成熟を阻害する化合物、例えば、式IからXIIIまでの化合物を含む薬学的組成物を含む。本発明は、本明細書中に開示される1種または複数の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エステル、またはプロドラッグ、および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物を含み、ここで、該化合物は上記の式IからXIIIまでの化合物であり、または好ましくは、該化合物は、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン、3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ジヒドロベツリン酸、3-O-(3',3'-ジメチルグルタリル)ベツリン酸、(3',3'-ジメチルグルタリル)ジヒドロベツリン酸、3-O-ジグリコリル-ベツリン酸、および3-O-ジグリコリル-ジヒドロベツリン酸からなる群より選択される。本発明に従う薬学的組成物は、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗癌剤、または免疫刺激剤から選択される1種または複数の薬物をさらに含む。
【０２５２】
本発明の薬学的組成物は、本明細書中に開示される式IからXIIIの化合物の少なくとも1種を含み得る。本明細書に従う薬学的組成物はまた、例えば、以下であるがこれらに限定されない他の抗ウイルス剤:AZT(ジドブジン、RETROVIR(登録商標)、GlaxoSmithKline)、3TC(ラミブジン、EPIVIR(登録商標)、GlaxoSmithKline)、AZT+3TC(COMBIVIR(登録商標)、GlaxoSmithKline)、AZT+3TC+アバカビル(TRIZIVIR(登録商標)、GlaxoSmithKline)、ddI(ジダノシン、VIDEX(登録商標)、Bristol-Myers Squibb)、ddC(ザルシタビン、HIVID(登録商標)、Hoffmann-La Roche)、D4T(スタブジン、ZERIT(登録商標)、Bristol-Myers Squibb)、アバカビル(ZIAGEN(登録商標)、GlaxoSmithKline)、テノホビル(VIREAD(登録商標)、Gilead Sciences)、ネビラピン(VIRAMUNE(登録商標)、Boehringer Ingelheim)、デラビルジン(Pfizer)、エムトリシタビン(EMTRIVA(登録商標)、Gilead Sciences)、エファビレンツ(SUSTIVA(登録商標)、DuPont Pharmaceuticals)、サキナビル(INVIRASE(登録商標)、FORTOVASE(登録商標)、Hoffmann-La Roche)、リトナビル(NORVIR(登録商標)、Abbott Laboratories)、インジナビル(CRIXIVAN(登録商標)、Merck and Company)、ネルフィナビル(VIRACEPT(登録商標)、Pfizer)、アンプレナビル(AGENERASE(登録商標)、GlaxoSmithKline)、アデフォビル(PREVEON(登録商標)、HEPSERA(登録商標)、Gilead Sciences)、アタザナビル(Bristol-Myers Squibb)、フォサムプレナビル(LEXIVA(登録商標)、GlaxoSmithKline)およびヒドロキシウレア(HYDREA(登録商標)、Bristol-Meyers Squibb)、または互いに組み合わせるかもしくは生物学的なベースの治療剤と結合した任意の他の抗レトロウイルス薬物もしくは抗体、例えば、gp41由来ペプチドエンフュービルタイド(FUZEON(登録商標)、Roche and Trimeris)およびT-1249、または、可溶性CD4、CD4に対する抗体、およびCD4もしくは抗CD4の結合体をさらに含むことができ、または本明細書中でさらに提示される。
【０２５３】
本発明の式IからXIIIの化合物の1つを用いる最適な使用のためにさらなる適切な抗ウイルス剤には以下が含まれ得るがこれらに限定されない:アムホテリシン B(FUNGIZONE(登録商標));Hemispherx Biopharmaによって開発されたアンプリゲン(ampligen)(ミスマッチRNA);BETASERON(登録商標)(β-インターフェロン、Chiron);ブチル化ヒドロキシトルエン;Carrosyn(ポリマンノアセテート(polymannoacetate));カスタノスペルミン(Castanospermine);コントラカン(Contracan)(ステアリン酸誘導体);クリームファーマテックス(Creme Pharmatex)(ベンズアルコニウム含有);ジドブジンの5-非置換誘導体;ペンシクロビル(penciclovir)(DENAVIR(登録商標)、Novartis);ファムシクロビル(famciclovir)(FAMVIR(登録商標)、Novartis);アシクロビル(ZOVIRAX(登録商標)、GlaxoSmithKline);サイトフォビル(cytofovir)(VISTIDE(登録商標)、Gilead);ガンシクロビル(CYTOVENE(登録商標)、Hoffman LaRoche);硫酸デキストラン;D-ペニシラミン(3-メルカプト-D-バリン);FOSCARNET(登録商標)(トリナトリウムホスホノホルメート(trisodium phosphonoformate);Astra Zeneca);フシジン酸;グリチルリジン(カンゾウ根の成分);HPA-23(アンモニウム-21-タングスト-9-アンチモネート);ORNIDYL(登録商標)(エフロルニチン(eflornithine);Aventis);ノノキシノール;ペンタミジンイセチオネート(PENTAM-300);ペプチドT(オクタペプチド配列;Peninsula Laboratories);フェニトイン(Pfizer);INHまたはイソニアジド;リバビリン(VIRAZOLE(登録商標)、Valeant Pharmaceuticals);リファブチン(rifabutin)、アンサマイシン(ansamycin)(MYCOBUTIN(登録商標)、Pfizer);CD4-IgG2(Progenics Pharmaceuticals)または他のCD4含有またはCD4ベースの分子;トリメトレキサート(Medimmune);スラミンおよびそのアナログ(Bayer);およびWELLFERON(登録商標)(α-インターフェロン、GlaxoSmithKline)。
【０２５４】
本発明の薬学的組成物はまた、免疫調節物質をさらに含み得る。本発明に従って、本発明のベツリン酸またはベツリン誘導体を用いる最適な使用のための適切な免疫調節物質には以下が含まれ得るがこれらに限定されない:ABPP(Bropririmine);アンプリゲン(ミスマッチRNA)Hemispherx Biopharma;抗ヒトインターフェロン-α-抗体;アスコルビン酸およびその誘導体;インターフェロン-β;Ciamexon;シクロスポリン;シメチジン;CL-246,738;GM-CSFを含むコロニー刺激因子;ジニトロクロロベンゼン;HE2000(Hollis-Eden Pharmaceuticals);インターフェロン-γ;グルカン;超免疫γ-グロブリン(Bayer);イムチオール(immuthiol)(ジエチルチオカルバメートナトリウム);インターロイキン-1(Hoffmann-La Roche; Amgen)、インターロイキン-2(IL-2)(Chiron)；イソプリノシン(イノシンプラノベクス);クレスチン;LC-9018(Yakult);レンチナン(Yamanouchi);LF-1695;メチオニン-エンケファリン;ミノファーゲンC;ムラミルトリペプチド、MTP-PE;ナルトレキソン(Barr Laboratories);RNA免疫調節物質(Nippon Shingaku);REMUNE(登録商標)(Immune Response Corporation);RETICULOSE(登録商標)(Advanced Viral Research Corporation);ショウサイコトウ;人参;胸腺液性因子;サイモペンチン(Thymopentin);サイモシン因子5;サイモシン1(ZADAXIN(登録商標)、SciClone)、サイモスチムリン(thymostimulin)、TNF(腫瘍壊死因子、Genentech)、およびビタミン調製物。
【０２５５】
本発明の薬学的組成物はまた、抗癌治療剤をさらに含み得る。最適な使用のための抗癌治療剤には、新生物を阻害するために有効な抗癌組成物が含まれ、これには、組み合わせ治療のために使用され得る化合物、または薬学的に許容される塩、または該抗癌剤のプロドラッグが含まれ、アルキル化剤(例えば、ブスルファン)、シスプラチン、マイトマイシンC、およびカルボプラチン、有糸分裂阻害剤(例えばコルヒチン)、ビンブラスチン、タキソール(例えば、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Meyers Squibb)、ドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Aventis))、topoIインヒビター(例えば、カンプトテシン、イリノテカン、およびトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、GlaxoSmithKline)、topoIIインヒビター(例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびエトポシド(例えば、VP16));RNA/DNA代謝拮抗物質(例えば、5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、およびメトトレキサート)、DNA代謝拮抗物質(例えば、5-フルオロ-2'-デオキシ-ウリジン)、ara-C、ヒドロキシウレア、チオグアニン、および抗体(例えば、トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標)、Genentech)およびリツキシマブ(RITUXAN(登録商標)、Genentech and Biogen-Idec))、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ビンクリスチン、マイトグアゾン、エピルビシン、アクラルビシン、ブレオマイシン、ミトキサントロン、エリプチニウム、フルダラビン、オクトレオチド、レチノイン酸、タモキシフェン、アラノシン、およびこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【０２５６】
本発明はさらに、本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩と組み合わせる使用のための、抗菌治療剤、抗寄生生物治療剤、および抗真菌治療剤を提供するための方法を提供する。抗菌治療剤の例には、ペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン、シクラシリン、エピシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、カルベニシリン、セファレキシン、セファラジン、セファドキシル、セファクロル、セフォキシチン、セフォタキシム、セフィチゾキシム、セフィネノキシム、セフトリアキソン、モキサラクタム、イミペネム、クラブラネート、チメンチン、スルバクタム、エリスロマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、キノロン、リファンピン、スルホンアイド、バシトラシン、ポリミキシンB、バンコマイシン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、アムホテリシン B、シクロセリン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、イソニアジド、エタンブトール、およびナリジクス酸、ならびにこれらの各化合物の誘導体および変化型などの化合物が含まれる。
【０２５７】
抗寄生生物治療剤の例には、ビチオノール、クエン酸ジエチルカルバマジン、メベンダゾール、メトリホネート、ニクロサミン、ニリダゾール、オキサムニキン、および他のキニン誘導体、クエン酸ピエラジン、プラジカンテル、ピランテルパモエート、およびチアベンダゾール、ならびにこれらの各化合物の誘導体および変化型が含まれる。
【０２５８】
抗真菌治療剤の例には、アムホテリシン B、クロトリアゾール、エコナゾールニトレート、フルシトシン、グリセオフルビン、ケトコナゾール、およびミコナゾール、ならびにこれらの各化合物の誘導体および変化型が含まれる。抗真菌化合物にはまた、アキュレアシンAおよびパピュロカンジンBが含まれる。
【０２５９】
本発明の好ましい動物被験体は哺乳動物である。「哺乳動物」という用語によって、哺乳綱に属する個体を意味する。本発明は特に、ヒト患者の処置において特に有用である。
【０２６０】
「処置する、処理する、治療する」という用語は、式IからXIIIまでの化合物、または本発明における1つまたは複数のアッセイ法によって同定される化合物を、レトロウイルス関連病理の予防、寛解、または治療を含み得る目的のために被験体に投与することを意味する。本発明における1つまたは複数のアッセイ法によって同定される、被験体を処置するための該化合物は、本明細書中に記載されたGagプロセシングを破壊する能力を有する化合物として同定される。
【０２６１】
「相互作用を阻害する」という用語は、本明細書中で使用される場合、1つまたは複数の分子、ペプチド、タンパク質、酵素、またはレセプターの直接的または間接的な結合を妨害するか、またはその速度を減少すること、あるいは1つまたは複数の分子、ペプチド、タンパク質、酵素、またはレセプターの通常の活性を妨害または減少することを意味する。
【０２６２】
医薬は、それらが同時に患者に供給される場合、または各医薬の投与の間の時間が生物学的活性の重複を可能にするようなものである場合に、互いに「組み合わせて」供給される。
【０２６３】
1つの好ましい態様において、上記の式IからXIIIまでの少なくとも1つの化合物が単一の薬学的組成物を含む。
【０２６４】
本発明に従う投与のための薬学的組成物は、上記の式IからXIIIまでの少なくとも1つの化合物、または本発明における1つまたは複数のアッセイ法によって同定される化合物を含み得る。本発明における1つまたは複数のアッセイ法によって同定される、被験体を処置するための該化合物は、本明細書中に記載されるGagプロセシングを破壊する能力を有する化合物として同定される。本発明に従う化合物は、薬学的に許容されるキャリアと任意で組み合わせた、薬学的に許容される型にさらに含まれる。これらの組成物は、それらが意図される目的を達成する任意の手段によって投与され得る。本発明に従う式IからXIIIまでの化合物の投与のための量および投与計画は、レトロウイルス病理学を処置する臨床分野における当業者によって容易に決定され得る。
【０２６５】
例えば、投与は、非経口的、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、経粘膜的、眼、直腸、膣内、または口腔の経路によってであり得る。代替的に、または同時に、投与は経口経路によってであり得る。投与は、経口もしくは鼻腔スプレーとして、または局所的に、例えば散剤、軟膏、ドロップ、もしくはパッチなどであり得る。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、以前のまたは同時に実行される処置の型、もしあれば、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。
【０２６６】
本発明の化合物および方法は、さらなるやり方において有用である。例えば、このような化合物は、感染のリスクを最小化するために、予防的に使用されてもよい。別の態様において、化合物は、感染した人からの疾患の伝播を最小化するために使用されてもよい。
【０２６７】
本発明はまた、感染した個体におけるHIVを治療する新規な方法に指向される。1つの態様において、本発明は、HIVに感染した人における免疫応答を刺激する際に特に有用である。例えば、感染した細胞から非感染性ビリオンが放出されることを可能にすることによって、このような感染細胞は抗原を露出し続け、免疫系またはこのような抗原に対して向けられる他の治療によって効果的に標的とされてもよい。別の例において、非感染性ウイルスの放出を可能にすることを継続することによって、感染した個体は、このようなウイルスの有害な効果に苦しむことなく、該ウイルスに対する免疫応答を発生させ続ける。
【０２６８】
本発明はまた、治療の範囲を広げる際に有用であり、その必要がある患者において疾患を治療する新規な手段を提供する。別の態様において、本発明は、ウイルス耐性以外の理由のための他の治療に対して応答しない患者において実施されてもよい。例えば、当技術分野において公知であるように、HIVを治療する従来的な方法には、有害な副作用が付随する。1つの態様において、本発明の方法および組成物は、1つまたは複数の有害な副作用を減少を有さない患者を治療する際に有用である。1つの態様において、本発明は、特定の副作用を有さないか、またはより少ない特定の副作用を有する化合物を用いて、患者を治療する方法を含む。
【０２６９】
薬物の生物学的利用能もまた、治療において関連性がある。1つの態様において、本発明は、化合物が感染細胞により効率的に吸収されるように実施されてもよい。1つの態様において、本発明は、HIVに感染した細胞に薬物を送達する改善された方法を含む。
【０２７０】
本発明の範囲内にある組成物は、本発明に従う上記の式IからXIIIまでの少なくとも1つの化合物を含むすべての組成物を、その意図される目的を達成するために有効な量で含む。個々の必要性は変化するが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当業者の範囲内にある。例えば投薬量は、約0.0001mgから約10g/kg体重を含んでもよい。代表的な投薬量は、約0.1から約100mg/kg体重を含む。好ましい投薬量は、活性成分の約1から約100mg/kg体重を含む。より好ましい投薬量は、約5から約50mg/kg体重を含む。
【０２７１】
本発明の化合物の投与はまた、任意で、免疫系ブースターまたは免疫調節物質を使用する、事前の、同時の、その後の、または付加的な治療を含み得る。薬理学的に活性な化合物に加えて、本発明の薬学的組成物はまた、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物のプロセシングを容易にする賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容されるキャリアを含み得る。好ましくは、調製物、特に経口的に投与され得、かつ好ましい投与の型(例えば、錠剤、糖衣錠、およびカプセル)のために使用され得る調製物、およびまた、直腸的に投与され得る調製物(例えば、坐剤など)、ならびに注射による投与または経口的な投与のための溶液は、賦形剤とともに、活性化合物の約0.01から99%、好ましくは約20から75%を含む。
【０２７２】
本発明の薬学的調製物は、それ自体公知である様式で、例えば従来的な混合、顆粒化、糖衣錠混合、溶解、または凍結乾燥のプロセスによって製造される。従って、経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤と活性化合物を混合すること、任意で得られる混合物を粉砕すること、および錠剤または糖衣錠のコアを得るために、望ましいかまたは必要である場合、適切な助剤を加えた後で顆粒の混合物を加工することによって得られ得る。
【０２７３】
適切な賦形剤は、例えば、増量剤、例えば、サッカリド(例えば、ラクトース、マンニトール、またはソルビトール);セルロース調製物および/またはリン酸カルシウム(例えば、リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム)など;ならびに結合剤、例えば、スターチペースト(例えば、トウモロコシスターチ、コムギスターチ、ライススターチ、ポテトスターチを使用する)、ゲラチン、トラガカント、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドンである。所望される場合、崩壊剤が加えられ得、これは例えば、上記に言及したスターチ、およびまた、カルボキシメチルスターチ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩(例えばアルギン酸ナトリウムなど)などである。助剤は、上記のすべて、流動調節剤、および滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸およびその塩(例えばステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム)、および/またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアには適切なコーティングが提供され、これは、所望される場合、胃液に耐性である。この目的のために、濃縮サッカリド溶液が使用され得、これは、任意でアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。胃液に対して耐性であるコーティングを作製するために、適切なセルロース調製物(例えば、アセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート)の溶液が使用される。染料および色素は、例えば、同定のため、または活性化合物用量の組み合わせを特徴付けするために錠剤または糖衣錠のコーティングに加えられ得る。
【０２７４】
経口的に使用される他の薬学的調製物は、ゼラチン製の押し込み式カプセル、ならびにゼラチン製のソフトな密封されたカプセル、およびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤を含む。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの増量剤、スターチなどの結合剤、および/またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意で、安定剤とともに混合され得る顆粒型で活性化合物を含み得る。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は、適切な液体(例えば、脂肪オイルまたは液体パラフィンなど)中に溶解または懸濁される。さらに、安定剤が加えられ得る。
【０２７５】
直腸で使用され得る可能な薬学的調製物は、例えば、坐剤ベースとの活性化合物の組み合わせからなる坐剤を含む。適切な坐剤ベースは、例えば、天然または合成のトリグリセリド、またはパラフィン炭化水素である。さらに、ベースと活性化合物の組み合わせからなるゼラチンカプセルを使用することもまた可能である。可能なベース材料には、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素が含まれる。
【０２７６】
非経口投与のための適切な処方物には、水溶性型の活性化合物(例えば、水溶性塩)の水溶液が含まれる。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油(例えば、ゴマ油)、または合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチル)、トリグリセリド、またはグリコール-400が含まれる。懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る水性注射懸濁液には、例えば、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および/またはデキストランが含まれる。任意で、この懸濁液は安定剤を含み得る。
【０２７７】
経口投与のための液体投薬形態には、薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが含まれる。活性化合物に加えて、液体投薬形態は、当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤(例えば、水または他の溶媒など)、溶解剤および乳化剤(例えば、水または他の溶媒など)、安定剤および乳化剤(例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル(例えば、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油など)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリプロピレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など)を含み得る。
【０２７８】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、セルロース、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキサイド、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、ならびにこれらの組み合わせなどの懸濁剤を含み得る。
【０２７９】
局所的投与のための薬学的組成物には、皮膚、粘膜、肺の表面、または眼への投与のために適切な処方物が含まれる。組成物は、加圧されたかまたは加圧されていない、乾燥粉末、液体、または懸濁液として調製され得る。加圧されていない粉末処方物中の活性成分は、薬学的に許容される不活性キャリア中に微細に分割された形態で混合され得る。このキャリアには、マンニトール、フルクトース、デキストロース、スクロース、ラクトース、サッカリン、または他の糖または甘味料が含まれるがこれらに限定されない。
【０２８０】
加圧された組成物は、圧縮されたガス(例えば、窒素または液化ガス噴霧剤)を含み得る。この噴霧剤はまた、液体または固体の非イオン性またはアニオン性の剤である界面活性成分を含み得る。アニオン性剤はナトリウム塩の形態であり得る。
【０２８１】
眼における使用のための処方物は、薬学的に許容される眼科的キャリア(例えば、軟膏、オイル(植物油など)、またはカプセル化物質など)を含む。処置される眼の領域には、角膜領域、または内部領域(例えば、虹彩、レンズ、毛様体、前眼房、後眼房、眼房水、硝子体液、脈絡膜、または網膜など)が含まれる。
【０２８２】
直腸投与のための組成物は、坐剤の形態であり得る。膣中での使用のための組成物は、坐剤、クリーム、フォーム、または留置膣内挿入物の形態であり得る。
【０２８３】
本発明の組成物はリポソームの形態で投与され得る。リポソームは、当技術分野において公知であるように、天然または人工の、リン脂質、ホスファチジルコリン(レシチン)または他の類脂質性化合物から作られ得る。リポソームを形成することが可能である、任意の非毒性の薬理学的に許容される脂質が使用され得る。リポソームは、多重膜または単層膜であり得る。
【０２８４】
本発明に従う全身投与のための薬学的処方物は、経腸的、非経口、または局所的投与のために処方され得る。実際は、3つすべての型の処方が、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。
【０２８５】
経口投与のための適切な処方物には、硬質または軟質のゼラチンカプセル、糖衣錠、丸薬、錠剤(コートされた錠剤を含む)、エリキシル、懸濁液、シロップ、または吸入剤、およびこれらの制御放出型が含まれる。
【０２８６】
上記に記載の化合物、または本発明における1つもしくは複数のアッセイ法によって同定され、かつGagプロセシングを破壊する能力を有する化合物はまた、生物分解可能な遅延放出キャリアと化合した場合に、移植物の形態で投与され得る。代替的には、本発明の化合物は、活性成分の継続的放出のための経皮パッチとして処方され得る。
【０２８７】
以下の実施例は例示のみであって、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の方法において種々の改変および変化がなされ得ることは当業者には明らかである。従って、本発明の改変および変化が添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内にあるならば、本発明は、それらの改変および変化を包含することが意図される。
【０２８８】
実施例
実施例1
一次HIV-1単離物に対する抗ウイルス活性
頑強なウイルス阻害アッセイを使用して、PMBC中で増殖した一次HIV-1単離物に対するDSBの抗ウイルス活性を評価した。手短に述べると、DSBの段階希釈を96ウェル組織培養プレート中で作製した。25-250TCID50のウイルスおよび5×105PHA刺激PBMCを各ウェルに加えた。感染後1、3、および5日後に、培地を各ウェルから除去し、適切な濃度でDSBを含む新しい培地で置き換えた。感染後7日目に、ウイルス複製のp24検出のための培養上清を取り出し、50%阻害濃度(IC50)を標準的な方法によって計算した。
【０２８９】
表5は、一次HIV-1単離物のパネルに対するDSBの強力な抗ウイルス活性を示す。DSBは、並行して試験した認可された薬物と同様の活性のレベルを示す。重要なことに、DSBの活性はコレセプター使用によって制限されなかった。
【０２９０】
（表５）一次Clade B HIV-1単離物のパネルに対する、DSBおよび2種の認可された薬物の阻害活性(IC50)
2008504808.tif 000045
*で示された臨床的HIV-1単離物はPanacosで単離された。すべての他のウイルス単離物はNIH AIDS Reference Repositoryから得られた。
注記:R5およびX4はそれぞれケモカインレセプターCCR5およびCXCR4を示す。
【０２９１】
DSBの毒性を、一定の範囲の濃度で7日間、PHA刺激PBMCとともにインキュベートすること、次いで、XTT法を使用して細胞生存度を決定することによって分析した。50%細胞傷害性濃度は>30μMであり、約5000のインビトロ治療指数に対応した。
【０２９２】
実施例2
薬物耐性HIV-1単離物に対するDSBの抗ウイルス活性
DSBの活性を、認可された薬物に耐性であるHIV-1単離物のパネルに対して試験した。これらのウイルスを、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手した。アッセイ法を、p24終点(上記)を用いて、PBMC中で増殖したウイルスを使用して、または細胞株標的(MT-2細胞)および細胞殺傷終点を使用して実行した。MT-2アッセイ形式は以下の通りであった。DSBまたは各認可された薬物の段階希釈を95ウェルプレート中で調製した。各試料ウェルに、3×105細胞/mLのMT-2細胞を含む培地、および感染5日後(PI)で細胞標的の80%の殺傷を生じるために必要な濃度のウイルス接種物を加えた。感染後5日目に、ウイルス誘導性細胞殺傷をXTT法によって決定し、そして化合物の阻害活性を決定した。
【０２９３】
表6は、薬物耐性HIV-1単離物のパネルに対するDSBの強力な抗ウイルス活性を示す。これらの結果は、野生型単離物のパネルを用いて得られた結果(表5)とは有意には異ならず、DSBが、認可された薬物の主要なクラスのすべてに対して耐性であるウイルス株に対してその活性を保持していることを実証した。
【０２９４】
（表６）薬物耐性HIV-1のパネルに対する、DSBの阻害活性(nM IC50)
2008504808.tif 000046
アッセイ法は、NNRTI-耐性単離物がMT-2細胞中で細胞生存度(XTT)終点を用いて実行された以外は、p24終点を用いて新しいPBMC中で行われた。
*耐性の倍数
注記:R5およびX4はそれぞれケモカインレセプターCCR5およびCXCR4を示す。
【０２９５】
実施例3
DSBによるウイルス生活環後期段階でのHIV-1複製阻害
初期および後期の複製標的に対するDSBの阻害活性を区別するために、ガラクトシダーゼ指標(MAGI)アッセイの多核活性化を使用した。このアッセイ法において、標的はHeLa細胞であり、これは、CD4、CXCR4、CCR5、および短縮型HIV-1 LTRによって駆動されるガラクトシダーゼ遺伝子(核に局在するように改変されている)からなるレポーター構築物を安定に発現する。これらの細胞の感染は、β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の活性化を駆動するTatの発現を生じる。感染細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの発現は、色素原性基質X-galを使用して検出される。表7に示されるように、エントリーインヒビターT-20、NRTI AZT、およびNNRTIネビラピンは、Tatタンパク質発現に影響を与えるウイルス発現の初期の段階を破壊するそれらの能力に起因して、HIV-1感染したMAGI細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現の有意な減少を引き起こした。対照的に、プロテアーゼインヒビターインジナビルはウイルス複製の後期段階(Tat発現の後)を標的とし、この系においてはβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現を妨害しない。インジナビルを用いた場合と同様の結果がDSBを用いて得られ、このことは、DSBが、プロウイルスDNA組み込みおよびウイルストランス活性化タンパク質の合成の完了後の時点でウイルス複製をブロックすることを示した(表7)。
【０２９６】
（表７）HIV-1感染MAGI細胞中のβ-ガラクトシダーゼの発現に対する、DSBならびにエントリー(gp41ペプチドT-20)、RT(AZTおよびネビラピン)、およびプロテアーゼ(インジナビル)のインヒビターの効果
2008504808.tif 000047
DMSO対照は薬物を含まなかった。
【０２９７】
Kanamoto et al. (Antimicrob. Agents Chemother. April; 45(4):1255-30, (2002))もまた、DSBがHIV複製の後期段階で作用することを報告した。しかし、彼らはこの化合物が慢性的に感染した細胞からのウイルスの放出を阻害すると報告した。対照的に、本発明者らのデータは、種々の実験系を使用してDSBがウイルス放出に対して有意な効果を有さないことを示す(例えば、実施例6)。
【０２９８】
実施例4
DSBはHIV-1プロテアーゼ活性を阻害しない
以前に、合成ペプチド基質の切断を追跡することによる酵素活性を特徴付けた無細胞フルオロメトリーアッセイを使用して、DSBがHIV-1プロテアーゼ機能に対して効果を有さないことが決定した。これらの実験の結果は、50μg/mLまでの濃度では、DSBはプロテアーゼ機能に効果を有さないことを示した。DSBが後期段階でウイルス複製をブロックするという観察の結果として、最初のアッセイ法において使用された合成ペプチド基質よりもより関連性のある系である、組換え型のGagタンパク質を使用する研究をまた実行した。基質としての組換えGagタンパク質の使用は、同様の実験的結果を生じた。これらの実験において、DSBは、50μg/mLまで高い濃度で、プロテアーゼ媒介Gagタンパク質プロセシングを破壊しなかった。対照的に、予想されたように、プロテアーゼインヒビターインジナビルはGagタンパク質プロセシングを5μg/mLでブロックした(図1)。
【０２９９】
実施例5
DSBによって引き起こされる、ウイルス成熟欠損と関連したGagプロセシングの最終段階(CA-SP1切断)の欠損
DSBの作用のメカニズムをより良好に規定するために、DSBで処理されたHIV-1感染細胞から産生されたウイルスの詳細な試験を実行した。手短に述べると、HIV-1IIIB単離物に慢性的に感染したH9細胞を、1μg/mLのDSBで48時間の間処理した。インジナビルを対照として使用した。48時間の時点で、使用済み培地を除去し、化合物を含む新しい培地を加えた。新しい化合物付加の24時間、48時間、および72時間後に、分析のために細胞と上清の両方を回収した。培養上清中のウイルスのレベルを決定し、ウェスタンブロットを使用して、細胞結合ウイルスおよび無細胞ウイルスの両方におけるウイルスタンパク質産生を特徴付けした。以前の実験において観察されたように、DSBは、慢性的に感染したH9細胞によって産生されるウイルスの量の有意な減少を引き起こさなかったが、細胞結合ウイルスおよび無細胞ウイルスの両方において、Gagプロセシングの欠損が存在した。この欠損は、ウェスタンブロットにおいてp25に対応するさらなるバンドの型を取った(図2)。このp25バンドは、キャプシドCA-SP1前駆体の不完全なプロセシングから生じる。HIV-2およびSIVで慢性的に感染した細胞株のDSB処理は、これらのウイルスに対する抗ウイルス活性の欠如の観察と一致した正常なGagプロセシングを示した。DSBの存在下で見られたGagプロセシング欠損は、プロテアーゼインヒビターインジナビルを用いて観察されたものと完全に区別される(図2)。上記に議論したように、プロセシングを妨害するp24切断部位へのp25の変異は、ウイルスの成熟および感染性の欠損と関連する(Wiegers K. et al., J. Virol. 72:2846-54 (1998))。
【０３００】
以前に議論されたように(C.T. Wild et al., XIV Int. AIDS Conf. Barcelona, Spain, Abstract MoPeA3030, (July 2002))、異常なp25からp24へのプロセシングはまた、他の成熟出芽欠損において見られる。これらには、Gag後期ドメイン(PTAP)の変異または出芽を破壊するTSG-101媒介ウイルスアセンブリーの欠損が含まれる(Garrus, J.E. et al., Cell 107:55-65, (2001); Demirov, D.G. et al., J. Virology 76:105-117, (2002))。しかし、これらの変異はウイルス放出の阻害を引き起こすのに対して、DSB処理はウイルス放出に対して有意な効果を有さない。これらの成熟/出芽変異体の形態学はまた、DSB処理後のものとは完全に区別される(実施例6を参照されたい)。
【０３０１】
さらに、ウイルスRNAダイマー化を妨害し、かつ欠損性コア構造を有する未成熟ウイルスの産生をもたらす変異は、同様のGagプロセシング表現型を与える(Liang, C. et al., J. Virology, 73:6147-6151, (1999))。しかし、これらの場合において、RNA取り込みは阻害され、放出された粒子の形態はDSB処理後のものとは区別される(実施例6を参照されたい)。
【０３０２】
実施例6
DSB処理によりもたらされる電子顕微鏡法(EM)によって決定されるようなHIV-1成熟
p25からp24へのプロセシングを破壊するHIV-1 Gagの変異は、正常ウイルスから区別される内部形態学によって特徴付けられる非感染性ウイルス粒子を生じることが実証された(Wiegers K. et al., J. Virol. 72:2846-54 (1998))。DSBの存在下で生成したウイルスがこの独特の形態学を示すか否かを決定するために、以下の実験を実行した。
【０３０３】
HeLa細胞にHIV-1感染性分子クローンpNL4-3を感染させ、以前に記載されたようにDSBで処理した。処理後、DSB処理感染細胞をグルタルアルデヒド中に固定し、EMによって分析した。この分析の結果を図3に示す。
【０３０４】
これらの結果は、p25からp24へのプロセシングを破壊する化合物と一致し、これは非感染性の形態学的に異常なウイルス粒子を生成する。
【０３０５】
3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)は、p25からp24へのプロセシングを破壊し、かつHIV-1複製を強力に阻害する化合物の例である。しかし、この化合物は、PR活性を阻害せず、かつその作用はp25からp24へのプロセシング段階に特異的であり、Gagプロセシングの他の段階には特異的ではない。さらに、DSB処理は、上記の異常なHIV粒子形態学を生じる。
【０３０６】
実施例7
CAスペーサーペプチド1タンパク質前駆体からのウイルスGagキャプシド(CA)タンパク質のプロセシングを破壊する化合物に耐性であるHIV-1単離物のインビトロ選択
HIV-1成熟のインヒビターである3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)による阻害に耐性であるウイルスを選択するために、一連の実験を実行した。各実験について、NL4-3またはRFのいずれかの単離物を使用して、2つの細胞培養物に感染させた。感染後、1つの培養物を、DSBを含む増殖培地中に維持したのに対し、他方の培養物を、DSBを欠く増殖培地中で並行して維持した。
【０３０７】
1つの実験において、RFウイルスで感染させたH9細胞を、増加濃度のDSB(0.05から1.6μg/mL)の存在下または非存在下で維持した。細胞を、2〜3日毎に、新しい薬物を添加して継代した。ウイルス複製を7日毎にp24 ELISAによってモニターした。この時点で、高レベルのp24を有するDSB処理培養物を、1:1の細胞比で、新しい感染していないH9細胞とともに、元々のDSB濃度の1×または2×の存在下で、同時培養によって継代した。同時培養の8週間後、無細胞ウイルスを、1.6μg/mLの濃度でDSBを含む培養物から収集し、新しいH9細胞に感染させるために使用した。7日毎に、高レベルのp24を含む培地からのウイルスを、元々のDSB濃度の1×または2×の存在下で、無細胞感染によって継代した。無細胞継代の5週間後に、3.2μg/mL DSBを含む培養物からのウイルスを収集し、MT-2細胞に感染させるために使用した。MT-2細胞中のウイルス複製を、シンシチウム形成顕微鏡で観察することによってモニターした。1〜3日毎に、インプットウイルスを除去するために洗浄し、そして新しい薬物を選択下で培養物に加えた。3〜4日毎に、選択下の培養中での広範なシンシチウムの出現後、各培養からの上清を収集し、0.45μmフィルターを通して細胞細片を除去した。次いで、この濾過されたウイルス上清を使用して、新しい薬物の存在下または非存在下で新しいMT-2細胞に感染させた。4回の無細胞感染の後(約2週間の培養)、薬物の濃度は3.2μg/mLであり、ウイルスストックを収集し、さらなる分析のために凍結した。
【０３０８】
第2の実験において、分子クローンpNL4-3(5.7×104TCID50)に由来するウイルスのストックを使用してMT-2細胞(6×106細胞)に感染させ、そして培養を、1.6μg/mlの濃度のDSBの存在下または非存在下で維持した。1〜3日毎に、インプットウイルスを除去するために洗浄し、そして新しい薬物を選択下で培養物に加えた。ウイルス複製を、シンシチウム形成顕微鏡で観察することによってモニターした。3〜7日毎に、選択下の培養中での広範なシンシチウムの出現後、各培養からの上清を収集し、0.45μmフィルターを通して細胞細片を除去した。次いで、この濾過されたウイルス上清を使用して、新しい薬物の存在下または非存在下で新しいMT-2細胞に感染させた。5回の無細胞感染の後、およびその後の他の回毎に、薬物の濃度は倍化した。10回の無細胞感染の後(約7週間の培養)、このとき薬物の濃度は12.8μg/mLに達し、ウイルスストックを収集し、さらなる分析のために凍結した。
【０３０９】
実施例8
CA-スペーサーペプチド1タンパク質前駆体からのウイルスGagキャプシド(CA)タンパク質のプロセシングを破壊する化合物に耐性であるとして選択されるHIV-1単離物の特徴付け
上記に由来するウイルスストックを、それらの薬物耐性の性質を特徴付けするために表現型的および遺伝子型解析的の両方でさらに分析した。3-O-(3',3'-ジメチルスクシニル)ベツリン酸(DSB)に対するウイルスの耐性を、ウイルス複製アッセイにおいて決定した。手短に述べると、ウイルスストックを最初にH9細胞中で、感染8日後の培養物中のp24のレベルを、ウイルスの4倍段階希釈を用いて定量することによって(ELISAによって)力価決定した。次いで、ウイルスインプットを、各ウイルスが薬物の4倍段階希釈の存在下で8日間培養される第2のアッセイ法について標準化した。各ウイルスについてのIC50を、薬物なしの対照と比較した場合にp24終点を50%減少する薬物の希釈として決定した。これらのアッセイにおいて、2つの独立して誘導されたウイルスストックは、薬物の非存在下で並行して培養されたウイルスについての0.02μMのIC50と比較して、DSBについて2μMよりも高いIC50値を生じた。引き続く実験のシリーズにおいて、A364V変異は、HIV-1 NL4-3プロウイルスDNAに操作され、これは、引き続いてHeLa細胞にトランスフェクトされた。得られるウイルスを収集し、上記のように、ウイルス複製アッセイにおいてDSBの活性を試験するために使用した。これらのアッセイにおいて、DSB耐性ウイルスは0.1μMのIC50値を生じたのに対して、野生型NL4-3は、0.01μMのIC50値を与えた。
【０３１０】
耐性ウイルスが、野生型ウイルス中でDSBによって引き起こされるCA-SP1切断欠損を回避することが可能か否かを決定するために、薬物の存在下または非存在下のいずれかで増殖させた各ウイルスのストックをウェスタンブロットによって分析した。ウイルスを、感染の60時間後、および細胞を洗浄し新しい薬物を加えた18時間後に収集した濾過した培養上清から20%スクロースクッションを通してペレット化した。ウイルスを溶解し、各ウイルスの量を、各試料中のp24レベルを定量することによって標準化した。各試料中のウイルスタンパク質のウェスタンブロット分析は、薬物耐性ウイルスがDSBの存在下でCA-SP1生成物を含まないことを実証し、これらのウイルスがこの切断事象に対する薬物の効果にたいせいであったことを確証した。
【０３１１】
最後に、DSB耐性の遺伝的決定要因を同定するために、ウイルスゲノムの全体のGagおよびPRコード領域を、配列決定のための高忠実度RT-PCRによって増幅した。ウイルスRNAを、上記のように調製した各ウイルス溶解物から精製し、DNaseを用いて消化していかなる夾雑DNAをも除去した。次いで、RT-PCR産物をゲル精製して、いかなる非特異的PCR産物をも除去した。最後に、得られるDNA断片の両方の鎖を、重複する一連のプライマーを使用して配列決定した。DSBに対する耐性を独立して付与し得る2つのアミノ酸変異が同定された。これらは、NL4-3単離物中の残基364、およびRF単離物中の残基366の、Gagポリタンパク質中のアラニンからバリンへの置換である。これらは、CA-SP1切断部位の下流(SP1のN末端)のそれぞれ第1および第3の残基である。アラニンは、データベース中のすべてのHIV-1クレードを通してこれらの位置の各々で高度に保存されている。
【０３１２】
実施例9
HIV-1成熟インヒビターDSBの活性の決定基はGagタンパク質CA-SP1ドメインにマッピングされる
DSB活性の分子的決定基をさらに定義するために、DSB感受性ウイルスからのCA-SP1切断部位に対して近接している残基が、DSB耐性レトロウイルス、SIVのGagタンパク質の類似の領域に挿入された一連のキメラウイルスを調製した。DSB活性に関するこれらのSIV/HIVキメラ(SHIV)の特徴付けは、DSB活性のために必要かつ十分の両方である最小限のHIV-1 Gag配列のさらなる同定を可能にした。
【０３１３】
材料および方法
SHIV DNAクローンの構築
SHIVの3つのパネルを、バックボーンとしてSIVmac239を使用して、DSB感受性HIV-1 pNL4-3のGag CA-SP1領域からの残基と組み合わせて生成した。これらのSHIV構築物についてのCA-SP1配列を図20に示す。すべてのDNA変異誘発を、PCR重複PCRストラテジー(Ho, S. N. , H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, and L. R. Pease (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77: 51-59)および他の標準的な分子クローニングアプローチ(Sambrook, J. , E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)を使用して実行した。
【０３１４】
細胞培養およびDNAトランスフェクション
HeLa細胞を、DMEM(Invitrogen)(10% FBS、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンを補充)中で維持し、コンフルエンスの際に継代した。すべてのプラスミドDNAは、ミニプレップキット(Qiagen)を使用して調製した。HeLa細胞を、FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche)を利用することにより、野生型SIVmac239、HIV-1 pNL4-3またはSHIVプロウイルスDNAでトランスフェクトした。手短に述べると、細胞を、使用する前日に6ウェルプレート(Corning)にウェルあたり1.5×105の濃度で播種し、トランスフェクションの日に60〜80%コンフルエンスに到達させた。各トランスフェクションについて、3μlのFuGENE6を100μlの無血清DMEMに希釈し、続いて1μgのDNAの付加を行った。穏やかに混合した後、DNA-脂質複合体の混合物を、1.5mlの完全DMEM培地中の細胞に穏やかに滴下して加えた。トランスフェクションの24時間後、DNA-FuGENE6複合体を含む培地を除去し、1.5mlの新鮮なDMEMをトランスフェクトされた細胞に加えた。トランスフェクションの48時間後、細胞と培養上清の両方をさらなる分析のために収集した。
【０３１５】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット
ウイルス粒子産生およびGagポリタンパク質プロセシングに対する、HIV-1のCA-SP1ドメインからの残基のSIVへの取り込みの効果を特徴付けるために、ウェスタンブロットを実施した。手短に述べると、トランスフェクションの48時間後において、Sorvall RT 6000B遠心分離機で、2,000 rpm、4℃、20分間の遠心分離によって、ウイルス粒子を含む培地を収集および清澄化した。次いで、ウイルス粒子を含有する上清を、13,000rpm、4℃、120分間で、微量遠心分離中の20%スクロースクッションを通して濃縮し、ペレットを溶解緩衝液(150mM Tris-HCl、5% Triton X-100、1% デオキシコール酸、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、pH 8.0)に再懸濁した。細胞溶解物については、トランスフェクションの48時間後、細胞をPBSで1回洗浄し、溶解し(150mM Tris-HCl、5% Triton X-100、1% デオキシコール酸、pH 8.0)、続いて核画分を除去するために、13,000rpm、4℃、5分間の遠心分離を行った。ウイルスペレットおよび細胞溶解物を、12% NuPAGE Bis-Trisゲル(Invitrogen)上で分離し、ニトロセルロースメンブレン(Invitrogen)に転写し、続いて0.5% Tweenおよび5%ドライミルク粉末を含むPBS緩衝液中でブロッキングを行った。このメンブレンを、抗SIVmac251 p27 McAb(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)とともにインキュベートし、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma)とハイブリダイズさせた。HIV-1タンパク質を含有するメンブレンについては、メンブレンは、HIV-1感染患者からの免疫グロブリン(HIV-Ig)(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)とともにインキュベートし、ヤギ抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma)とハイブリダイズさせた。免疫複合体は、製造業者によって供給される説明書に従って、ECLシステム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて可視化した。
【０３１６】
SHIV Gagプロセシングに対するDSBの効果
CA-SP1プロセシングを阻害するDSBの能力に対するGag置換の効果に取り組むために、HeLa細胞を、上記の手順を利用することにより、野生型SIVmac239、HIV-1 pNL4-3またはSHIVプロウイルスDNAでトランスフェクトした。1μg/mlの濃度のDSBおよびDMSO(薬物なし対照)を、全体の培養の期間を通して維持し、これらの培養に由来するウイルスタンパク質を分析するためのSDS-PAGE/ウェスタンブロットを、上記のように実施した。
【０３１７】
DSBの効果に対して完全に感受性であったウイルスのみを感受性であると点数付けしたのに対して、残渣の耐性を有するものは耐性と点数した。このようなものとして、実験9における点数付けは、完全に耐性ではなかったウイルスが感受性であると点数付けした点で、以前の点数付けとは異なる。この理由のために、SHIV.DMは、実験9においてはDSB耐性として点数付けされたが、以前にはDSB感受性として点数付けした。
【０３１８】
結果
Gag SHIVの特徴付け
HIV-1/SIV Gagキメラの3つのパネルを調製した(図20)。パネル1は、HIV-1 SP1ドメインからの残基が挿入されたSIVバックボーンを含むウイルスからなった。これらのキメラにおけるHIV-1挿入物は、単一の点変異(SHIV DA)から、HIV-1由来のSP1配列を有するSIV SP1ドメインの完全な置換(SHIV DN)までのサイズの範囲であった。パネル2は、同じSP1置換プラスHIV-1からの2つのC末端CA残基(LMからVL)を含めることを含むウイルスからなった。パネル3SHIVは、SP1ドメインに加えて、HIV-1からの2つのC末端CA残基(LMからVL)における変異以外は、パネル2におけるものと同一であり、これらのキメラの各々はまた、CA-SP1切断部位から上流の6番目の位置(P6)にQ(SIV)からH(HIV-1)への変化を組み込んだ。
【０３１９】
トランスフェクト細胞からの放出されたウイルス粒子のレベルおよびSHIVの各々についてのGagプロセシングプロフィールを決定した(図21)。ずべてのパネル1 SHIVは、粒子産生およびGagプロセシングに関して同様の挙動を示した;これらのキメラウイルスは、野生型に近いレベルの粒子産生および親のSIVと比較して正常なGagプロセシングプロフィールを示した。パネル2におけるキメラの大部分は、正常なGagプロセシングプロフィールによって特徴付けられたのに対し、SHIV FCおよび11の細胞発現はいくぶん減少した(図21A)。すべてのパネル2 SHIVについて、細胞関連発現と比較したウイルス産生の量は、親のSIVと比較し得るものであった。パネル1および2のSHIVとは対照的に、パネル3におけるキメラの大部分は、Gagプロセシングの欠損を示した。これらのSHIVのうち、GH、GIおよび23のみが正常なGagプロセシングプロフィールを示した。CA-SP1切断部位から6残基上流のQからHへの変化が、キメラGagタンパク質をプロセスするSIV PRの能力に影響を与えることが明らかである。
【０３２０】
SP1ドメインとCAドメインの両方におけるHIV-1残基を含むウイルスからなるSHIVパネル2からの結果を図21に示す。以前に記載したように、SHIVのこのパネルは、SP1ドメインにおける置換に加えて、これらのキメラの各々がまた、2つのHIV-1 CA C末端残基を組み込んでいる(HIV-1からのVLがSIVからのLMを置き換えている)以外はパネル1と同一である。パネル1におけるウイルスと同様に、パネル2におけるキメラは、正常なGagプロセシングプロフィールによって特徴付けられたのに対し(図21)、SHIV FCおよび11の細胞発現はいくぶん減少し(図21A)、これらのSHIVをコードするDNAでトランスフェクトされた細胞の上清において見い出されたウイルスの割合は、すべてのパネル2ウイルスについて観察されたウイルスの放出のレベルに比例した。
【０３２１】
GagSP1ドメインとCAドメインの両方におけるHIV-1残基を含むウイルスを有するSHIVパネル3からの結果を図21に示す。SHIVのこのパネルは、SP1ドメインにおける置換に加えて、これらのキメラの各々がまた、HIV-1からの2つのC末端残基(HIV-1からのVLがSIVからのLMを置き換えている)プラスCA-SP1切断部位から上流の6番目の位置にQ(SIV)からH(HIV-1)への変化を組み込んでいる以外はパネル1と同一である。最初の2つのパネルとは異なり、パネル3のキメラの大部分は、Gagプロセシングの欠損を示した(図21)。これらのSHIVのうちで、GH、GIおよび23のみが正常なGagプロセシングプロフィールを示した。CA-SP1切断部位から6残基上流のQからHへの変化が、得られるキメラGagタンパク質をプロセスするSIVプロテアーゼの能力に影響を与えることが明らかである。
【０３２２】
DSBに対するGag SHIVの感受性
パネル1、2および3におけるSHIVの各々が、DSBに対するそれらの感受性について特徴付けされた。上記のように、DSBはHIV-1 CA-SP1切断を破壊し、異常なコア形態学を示す非感染性ウイルス粒子の放出をもたらす(Li, F., R. Goila-Gaur, K. Salzwedel, N. R. Kilgore, M. Reddick, C. Matallana, A. Castillo, D. Zoumplis, D. E. Martin, J. M. Orenstein, G. P. Allaway, E. O. Freed, and C. T. Wild. (2003) PA-457: a potent HIV inhibitor that disrupts core condensation by targeting a late step in Gag processing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:13555-13560)。現在の研究において、SHIV発現細胞は、48時間の期間の間、1μg/mlの濃度のDSBの存在下で培養した。その時間の最後にウイルスを培養上清から収集し、各キメラウイルスについてのGagプロセシングプロフィールを分析し、化合物の非存在下におけるGagタンパク質プロセシングと比較した(図22)。
【０３２３】
図22において見ることができるように、SP1 SHIV(パネル1)のいずれもがDSBに対する感受性を示さなかった。完全なHIV-1 SP1ドメインを含むSHIV DNでさえ、組織培養で決定されたIC50を超えた濃度の化合物の存在下で正常なGagプロセシングプロフィールを示した(図22)(Li et al.)。パネル1キメラからのこれらの結果は、DSB活性の決定基は、SP1ドメインの外側のHIV-1 Gagの領域を含むことを実証する。パネル2 SHIVからの結果は、パネル1について観察された結果と同一である。詳細には、これらのCA-SP1のいずれもがDSB感受性を示した(図22)。パネル2のウイルスは、HIV-1からのSP1配列に加えて、C末端VLアミノ酸残基を含んだので、これらの結果は、CA-SP1切断部位に直接隣接するもの以外のHIV-1 Gag残基がDSB感受性において役割を果たしていることを実証する。
【０３２４】
図22Aにおいて示されるように、DSBは、パネル3 SHIVのサブセットについてCA-SP1プロセシングを破壊する。これらのキメラウイルスのうち、SHIV 23およびGIは、プロトタイプHIV-1単離物NL4-3と比較し得るレベルのDSB感受性を示した(図22A)。反復実験において、CAに対するCA-SP1の相対的比率によって決定されるように、これらのウイルスの各々に対する化合物の効果の規模は、ほぼ同一であった。また、パネル3において、SHIV GHは、ある程度のレベルのDSB感受性を示したが、定性的なレベルにおいては、このウイルスに対して観察された活性は、SHIV23およびGIを用いて観察されたものと比較して減少した。SHIV GHについては、Gagプロセシングに対するDSBの効果は、イムノブロットにおいて観察された非常にかすかなCA-SP1バンドが図22Aにおいて見られない点まで減少した。ゲルにロードするウイルスタンパク質の量の5倍増加は、SHIV GHについてのDSB媒介性のプロセシング欠損を観察可能にしたレベルまで、ウェスタンブロットアッセイの感度を増強した(図22B)。パネル3におけるウイルスの残りについては、化合物の効果は、配列に関連するGagプロセシングの欠損によって決定付けることができなかった(図21B)。パネル3 SHIVからの結果は、CA-SP1切断部位から上流の6位におけるHis残基がDSB感受性において重要な役割を果たしていること、および切断部位のすぐ近傍の向こう側のCAとSP1の両方の有意な部分がDSB活性のために必要であることを示す。
【０３２５】
考察
SIV/HIV-1キメラの3つのパネルを調製し(図20)かつ特徴付けした。パネル1および2のすべてのSHIVは、Gagタンパク質プロセシング、ウイルス粒子放出およびDSBに対する感受性に対するSP1またはCA/SP1置換の効果に関して、同様に振る舞った(図21および22)。パネル2におけるウイルスのいくつかは(ずなわち、FDおよび11)ウイルス粒子産生のレベルの減少によって特徴付けされたが、この効果は、トランスフェクトされた細胞によって生成されるウイルスの量の全体的な減少に起因する可能性が最も高かった(図21A)。これらのパネル1および2のSHIVのいずれもが、CA-SP1プロセシングに対する化合物の効果によって決定されるように、DSBに対して感受性でなかったという事実は、HIV-1 CA-SP1切断部位のすぐ近傍の外側のGag配列がDSB活性において決定的な役割を果たしていることを示す。
【０３２６】
パネル1および2におけるウイルスとは対照的に、パネル3 SHIVの3つのメンバーは、ある程度のDSB感受性を示した。これらのウイルスの間で、SHIV 23およびGIはDSBに対するNL4-3様の感受性を示したのに対し、SHIV GHは、この化合物に対していくぶん減少したレベルの感受性を示した。さらなるパネル3のウイルスでは、Gagプロセシングに対するCA-SP1置換の効果が、残りのキメラに対する化合物の効果を決定することを不可能にした。
【０３２７】
これらの3パネルのCA-SP1 SHIV Gagプロセシングプロフィールに対するDSBの効果は、化合物活性の決定基が、CA-SP1切断部位に隣接するGagの比較的大きな領域を含むことを示唆する。パネル2 SHIV 11(非感受性)に対するDSBの活性のパネル3 SHIV 23（感受性）との比較は、切断部位から上流の6番目のCAの位置に位置するHis残基がDSB活性に決定的であることを示す(図22B)。この観察と一致して、インビトロ耐性選択研究は、ある程度のDSB非感受性を付与するこの位置における変異を同定した。
【０３２８】
本実施例における結果は、CA-SP1領域における高親和性と低親和性の両方の結合部位の存在を提供する。低親和性相互作用は部分的なDSB活性を生じるのに対して(すなわち、SIVm3)、高親和性結合は、完全な化合物感受性を与える(すなわち、SHIV23)。
【０３２９】
実施例10
ウイルス単離物の遺伝子型決定
上記に示したように、HIVにおける配列多型は、DSBの存在下で複製するウイルスの能力に対応することが実証された。多くの配列多型は、gag中で、とりわけ、CA-SP1をコードする領域中でクラスター化されている。従って、ウイルス単離物の遺伝子型決定は、このようなウイルスがDSBまたはp25プロセシングに干渉する任意の他の化合物によって阻害される可能性があるか否かを容易に決定するために使用してもよい。
【０３３０】
このような遺伝子型決定の結果は、例えば、このようなウイルスがDSBもしくは同様の様式でp25プロセシングに干渉する任意の他の化合物によって治療され得るか否かを容易に決定する際に、またはDSBを用いる処理の過程の間に耐性改変体の出現を決定する際に有用である。
【０３３１】
遺伝子型決定は、多数の方法によって実施されてもよい。ある態様において、遺伝子型決定は、配列決定によって実施される。
【０３３２】
方法
血漿の単一の凍結アリコート(約1.2ml体積)を各患者から入手する。血漿試料を、プロセシングのために準備ができるまで、-70℃に保存する。各試料を、3桁の患者のID番号を使用して同定する。
【０３３３】
プロセシングの日に、各血漿試料を37℃ウォーターバスで迅速に融解し、次いで氷上に配置する。血漿の140μlのアリコートをQIAamp Mini Viral RNA Purification Kit (Qiagen)を使用する核酸精製のために別々のチューブに取り出す。残りの血漿試料を別のチューブに移し、手短に低速遠心分離を行って(3分間、8,000rpm)血漿を清澄化した。次いで、清澄化した上清の1mlを新鮮なチューブに移し、2時間、高速で遠心分離して(13,000rpm)ウイルスをペレット化する。ピペットを用いて上清を注意深く取り出し、ウイルスペレットの破壊の可能性に対する予防措置として、-70℃での保存のために別のチューブに移す。ウイルスペレットを140μlのPBS中に再懸濁し、十分なRT-PCR産物が非ペレット化血漿の初期のアリコートから得られない場合のバックアップ試料として、-70℃で保存した。
【０３３４】
（表８）HIV-1 Gagプライマー
2008504808.tif 000048
【０３３５】
精製後、ウイルスRNAを約60μlの最終体積で溶出する。このストックの7μlのみを、StrataScript First Strand Synthesis System (Stratagene)を使用する逆転写のための鋳型として最初に使用する。残りのRNAストックはバックアップとして-70℃に保存する。逆転写のためのプライマー(R+625)は、CA-SP1切断部位の約625bp下流にアニールする。このプロジェクトにおけるRT-PCRおよび配列決定のために使用されるすべてのプライマーは、クレードB HIV単離物間で高度に保存されているgagの領域にアニールするように設計され、42例の異なる患者からの血漿試料を使用して確認した。
【０３３６】
逆転写反応は50μlの総容量で実施する。この反応物の5μlのみを、PicoMaxx High Fidelity PCR Master Mix (Stratagene)を使用する、CA-SP1領域のPCR増幅のための鋳型として最初に使用する。反応物の残りは、バックアップとして-20℃で保存する。高収率の非常に清澄なDNA産物を提供することが見い出されている、2段階「ネスト化」PCRストラテジーを使用する。第1ラウンドのPCR増幅のためのフォワードおよびリバースプライマー(F-625およびR+525)は、それぞれ、CA-SP1切断部位の約625bp上流および525bp下流にアニールする。この第1のPCR反応後には、アガロースゲル分析によって、生成物が代表的には見られない。
【０３３７】
最初のPCR反応は50μlの総容量で実施する。サイクル後、この反応物の5μlを取り出し、最初のプライマー対がアニールする領域の内部であるgagの領域にアニールする、プライマーF-575およびR-450を使用する第2ラウンドの「ネスト化」PCR反応における鋳型として使用する。第1ラウンドのPCR反応物の残りは、バックアップとして-20℃で保存する。第2ラウンドのPCR反応のためのフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ、CA-SP1切断部位の約575bp上流および450bp下流にアニールする。最終の「ネスト化」PCR反応物の5μlを、アガロースゲル電気泳動によるDNA生成物の分析のために取り出す。予測されたように、反応物が所望の産物についての予測サイズ(〜1.1kb)の1つのみの顕著なバンドを含み、かつ収率が配列決定を可能にするために十分であると見積もられるならば(すなわち、〜200ng総量）、40μlの反応物を、MinElute PCR Purification Kit (Qiagen)を使用するDNA産物の精製のために取り出す。残りの〜5μlの反応物はバックアップとして-20℃で保存する。精製したDNA産物の溶出後、適切な量(少なくとも40ngのDNAに対応する)を2つのチューブに移し、各々が異なる配列決定プライマーを含む(DNAの各々の鎖のために1つ)。「+」鎖配列決定プライマー(F-300)は、CA-SP1切断部位の約300bp上流にアニールする。「-」鎖配列決定プライマー(R+275)は、CA-SP1切断部位の約275bp下流にアニールする。鋳型/プライマー混合物は、配列決定および分析のために発送する。精製したDNA産物の残りはバックアップとして-20℃で保存する。得られる配列分析は、任意の単独の配列決定反応におけるあいまいさの解決を補助するために、各DNA鎖についての重複する読み取りを提供する。
【０３３８】
あいまいさが両方の配列決定反応において見い出される場合、もともとの配列決定プライマーがアニールするgagの領域の不均一さに問題がある場合には、交互に確認した配列決定プライマーを使用して、さらなる配列決定反応を分析する。これらは、それぞれ、CA-SP1切断部位の約375bpおよび125bp上流にアニールする2つの「+」鎖プライマー(F-375およびF-125)、ならびにCA-SP1切断部位の約100bpおよび400bp下流にアニールする2つの「-」鎖プライマー(R+100およびR+400)を含む。
【０３３９】
最終の「ネスト化」PCR反応が、アガロースゲル上で分析したときに顕著なバックグラウンドバンドを含む場合(すなわち、全体の収量の約10%より高い)、または配列決定が明瞭な結果を得ることに失敗する場合、所望のDNA産物は、アガロースゲル上で全体のPCR反応物(必要な場合、バックアップ試料から再増幅する)を泳動すること、および所望のバンドを切除することによって精製する。次いで、DNAを、QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用してアガロースから精製し、溶出産物を上記のように配列決定のために調製する。
【０３４０】
PCR反応が配列決定のために十分な産物を生じることに失敗する場合、必要ならば、上記に概説したバックアップ試料およびさらなる確認したプライマーセットを使用して、さらなるRT-PCRまたはPCR反応を実行することができる。これらのプライマーセットには、CA-SP1切断部位の約550、375、300、および125bp上流にアニールする4つのフォワードプライマー(F-550、F-375、F-300およびF-125)ならびにCA-SP1切断部位の約400、275、および100bp下流にアニールする3つのリバースプライマー(R+400、R+275およびR+100)が含まれる。例えば、優秀な結果は、逆転写のためのプライマーR+525を使用し、ならびに単一ラウンドのPCR増幅のためにプライマーF-575およびR+450を使用して得られた。プライマーF-550およびR+400もまた、PCR増幅のために十分に機能する。
【０３４１】
次いで、得られる遺伝子型を、本明細書の他の箇所に同定されるウイルスの遺伝子型とマッチさせて、ウイルスがDSBによって阻害されているか、または阻害されていないかを決定する。遺伝子型決定の結果のさらなる確認は、フォローアップ実験によって、例えば、ウイルス単離物に対する直接的な実験によって得られてもよい。
【０３４２】
実施例11
DSBを用いる処理の間の遺伝的変化
DSBを用いる処理の過程の間のHIV-1の遺伝子型の変化を決定するために、投薬の前および研究の最後に(28日目)、各患者におけるウイルス集団の遺伝子型を得て、任意の変化が治療の過程の間に起こったか否かを決定する。研究の最後の試料において変異が同定され、これが投薬の前に存在しなかったならば、投薬後7日目および10日目に採取した中間試料もまた、変異が起こった時期を決定するために遺伝子型決定する。
【０３４３】
この方法を使用して、研究の過程の間に全体のウイルス集団において起こる可能性のある変異を決定する。変異は、所定のコドンについてのアミノ酸の割り当てにおいて、25%の変動よりも高いものとして同定する。一旦変異が同定されると、生のデータのクロマトグラムが、副次的なウイルス集団におけるその位置のアミノ酸の同一性を決定するために再調査される。上記に列挙された耐性変異いずれもがこれらの判断基準を使用して同定されない場合、各反応からのクロマトグラムは、任意の副次的な種(全体の集団の25%未満)が関連する位置のいずれかにおいて存在するか否かを決定するために再調査される。
【０３４４】
これまで本発明を十分に記載してきたが、本発明の範囲またはそのいかなる態様にも影響を与えることなく、広範かつ等価な範囲の状態、処方、および他のパラメーターの中で本発明が実施され得ることが当業者に理解される。本明細書中に引用されるすべての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に完全に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０３４５】
【図１】DSBは50μg/mLの濃度でHIV-1の活性を破壊しない。DSB含有試料において、組換えGagは正確にプロセスされる。対照的に、インジナビルは、p24およびMA-CA前駆体に対応するバンドの非存在によって証明されるように、5μg/mLの濃度においてプロテアーゼ活性をブロックする。
【図２】DSB(1μg/mL)、インジナビル(1μg/mL)または対照(DMSO)の存在下で、慢性的に感染したH9/HIV-1IIIB、H9/HIV-2ROD、およびH9/SIVmac251に由来するビリオン結合Gagのウェスタンブロットである。Gagタンパク質は、HIV-Ig(HIV-1)またはサル抗SIVmac251血清(HIV-2およびSIV;NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)を使用して可視化した。
【図３】DSB処理したHIV-1感染細胞のEM分析である。EMデータは、DSB処理試料と未処理試料の間の2つの主要な違いを示す。DSBの存在下で生成したビリオンは、円錐形の成熟コアの非存在によって特徴付けられる。これらの試料において、コアは、均一に球状でありかつしばしば非中心性である。第2に、多くのビリオンは、脂質二重層であるがコアの外側である高電子密度層を示す(DSB処理試料のパネルにおける矢印で示される)。DSB処理試料において、成熟ウイルス粒子は観察されなかった。
【図４】DSB感受性HIV-1単離物NL4-3およびRF(#1;SEQ ID NO:1)およびDSB耐性HIV-1単離物(#2;SEQ ID NO:2(NL4-3)および#3;SEQ ID NO:3(RF))からのCA-SP1切断部位の領域におけるアミノ酸配列を示す。ネイティブな配列とDSB耐性配列の間の違いは、CA-SP1切断部位(-|-)からの、第1の下流残基(#2)におけるアラニンからバリンへの変化、および第3の下流残基(#3)におけるアラニンからバリンへの変化を含む。これらの残基は、同定の容易さのために、下線を付しかつ太字とした。
【図５】A364V DSB耐性NL4-3変異体(SEQ ID NO:4)についての+センスコンセンサス配列を示し、これは、gagの最初の部分で開始し、polに続き、全体のプロテアーゼコード配列を含む。野生型NL4-3 GENBANK M19921配列中に見い出されないミスセンス変異は、太字でかつ灰色の影付きである。コンセンサスCA-SP1切断部位領域についてのコード配列に下線を付す。切断部位を含む影を付けた領域はSP1配列を示す。第1の変異はA364V変異である。  第2のアミノ酸の変化(プロテアーゼ中)もまた、親のクローンにおいて見い出され、もともとのGENBANKエントリーにおける配列決定のエラーに対応することが確認された。それゆえに、変異は実際にはプロテアーゼ中には存在しなかった。
【図６】A364V変異体単離物と並行して、薬物の非存在下で継代したDSB感受性NL4-3の親の単離物(SEQ ID NO:5)についての+センスコンセンサス配列を示す。
【図７】gagの開始点で開始し、polまで連続し、全体のプロテアーゼコード配列を含むA366V DSB耐性HIV-1 RF変異体(SEQ ID NO:6)についての+センスコンセンサス配列を示す。野生型HIV-1 RF GENBANK M17451配列中に見い出されないミスセンス変異は、太字でかつ灰色の影付きである。CA-SP1切断部位の領域に下線を付す。同一であるように継代したDSB感受性単離物においてもまた見い出されない唯一のミスセンス変異は、CA-SP1切断部位におけるA366V変異である。
【図８】A366V変異体単離物と並行して、薬物の非存在下で継代したDSB感受性HIV-1 RFの親の単離物(SEQ ID NO:7)についての+センスコンセンサス配列を示す。
【図９】本明細書でSEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3と名付けられたポリペプチドをそれぞれコードする、ポリヌクレオチドSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9を示す。SEQ ID NO:10および12は、SEQ ID NO:1と名付けられた親のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を示す。SEQ ID NO:1は、NL4-3およびRFからの領域の配列に基づくコンセンサス配列である。
【図１０】10A.レンチウイルスのCA-SP1領域におけるアミノ酸配列である(それぞれ、SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:14;SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:20;SEQ ID NO:27;SEQ ID NO:28;SEQ ID NO:29;SEQ ID NO:30;SEQ ID NO:30)。  10B:HIV-1株RF(SEQ ID NO:11)およびNL4-3(SEQ ID NO:13)におけるCA-SP1領域のアミノ酸配列である。  10C-10D:gag遺伝子キメラSIVのヌクレオチド配列である。CA-SP1切断部位の上流の7つのアミノ酸および下流の7つのアミノ酸をコードする42個のヌクレオチド配列である。  10E-H:本発明に従って作製される、キメラFIV、EIAVおよびBIVのgag遺伝子のヌクレオチド配列である。CA-SP1切断部位の上流の7つのアミノ酸および下流の7つのアミノ酸をコードする42個のヌクレオチド配列に下線を付し、かつ太字で示す(ヌクレオチド配列:SEQ ID NO:16;アミノ酸配列SEQ ID NO:17)。  10F.HIV CA-SP1領域を含むキメラネコ免疫不全ウイルス(FIV)のGAG遺伝子のヌクレオチド配列である:キメラFIV-GAG遺伝子のヌクレオチド1〜1353は、キメラFIVゲノムのヌクレオチド628〜1980に対応する。ヌクレオチド配列SEQ ID NO:94は、アミノ酸SEQ ID NO:95をコードする。  10G.HIV1 CA-SP1領域を含むキメラウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)のGAG遺伝子のヌクレオチド配列である:キメラEIAV-GAG遺伝子のヌクレオチド1〜1587は、キメラEIAVゲノムのヌクレオチド450〜1910に対応する。ヌクレオチド配列SEQ ID NO:96は、アミノ酸SEQ ID NO:97をコードする。  10H.HIV CA-SP1領域を含むキメラウシ免疫不全ウイルス(BIV)のGAG遺伝子のヌクレオチド配列である:キメラBIV-GAG遺伝子のヌクレオチド1〜1471は、キメラBIVゲノムのヌクレオチド316〜1746に対応する。ヌクレオチド配列SEQ ID NO:98は、アミノ酸SEQ ID NO:99をコードする。
【図１１】PA-457(DSB)耐性変異体の複製反応速度論である。
【図１２】DSB活性のために必要である残基を同定するために使用される、NL4-3の状況における逐次的SP1点欠失である。NL4-3におけるSP1ドメインのアミノ酸配列を示す。「Δ」は欠失を示し、「-」は点欠失変異体とNL4-3の間で同一である残基を意味する(それぞれ、SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:86;SEQ ID NO:87;SEQ ID NO:88;SEQ ID NO:89;SEQ ID NO:100;SEQ ID NO:101;SEQ ID NO:102;SEQ ID NO:103)。
【図１３】点欠失変異体の粒子産生および感染性の要約である。
【図１４】DSBの存在下(+)および非存在下(-)における、SP1中での点欠失を含むウイルスについてのウェスタンブロットである。
【図１５】SIVmac239へのHIV-1 CA-SP1残基VL-AEAMSQV(SEQ ID NO:32)の置換は、SIVmac239をDSBに対して感受性にする(それぞれ、SEQ ID NO:14;SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:20;SEQ ID NO:27;SEQ ID NO:28;SEQ ID NO:13)。  (上のパネル)CA-SP1切断部位(全体のSP1領域を含む)の近傍のアミノ酸配列を、SIVmac239、HIV-1 NL4-3および一連のSIV変異体について示し、これらに種々のNL4-3残基(下線部)が挿入された。ダッシュ(「-」)はSIVmac239におけるものと同じであることを示す。  （下のパネル）DSBの存在下(+)および非存在下(-)における、この一連のウイルスについてのCAタンパク質およびCA-SP1タンパク質を示すウェスタンブロットである。
【図１６】レンチウイルスのCA-SP1領域における配列保存性である:FIV、EIAVまたはBIVの対応するGag領域にHIV-1特異的CA-SP1残基を置換する。
【図１７】エピトープでタグ化されたHIV-1 NL4-3 SP1である。挿入されたペプチドタグを有するSP1ペプチドの配列を示す。「Δ」は欠失を示し、「-」は残基がNL4-3 SP1におけるそれと同一であることを意味する(図17(1);それぞれ、SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:106;SEQ ID NO:107);(図17(2);それぞれ、SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:108;SEQ ID NO:109);(図17(3);それぞれ、SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:110;SEQ ID NO:111);(図17(4);それぞれ、SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:112;SEQ ID NO:113;SEQ ID NO:114);(図17(5);それぞれ、SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:115)。
【図１８】図18A〜C:HIV-1株RFポリヌクレオチド配列である。Gagポリタンパク質のヌクレオチド配列に下線を付し、かつ太字で示す。CA-SP1切断部位の上流の7つのアミノ酸および下流の7つのアミノ酸をコードする42個のヌクレオチド配列を緑色で強調表示している。CAにおける切断部位の上流の付加的な129ヌクレオチド(43アミノ酸残基)およびSP1における残りの21ヌクレオチド(7アミノ酸残基)を強調表示している。
【図１９】図19A〜E:HIV-1株NL4-3ポリヌクレオチド配列である。Gagポリタンパク質のヌクレオチド配列に下線を付し、かつ太字で示す。CA-SP1切断部位の上流の7つのアミノ酸および下流の7つのアミノ酸をコードする42個のヌクレオチド配列を緑色で強調表示している。CAにおける切断部位の上流の付加的な129ヌクレオチド(43アミノ酸残基)およびSP1における残りの21ヌクレオチド(7アミノ酸残基)を強調表示している。
【図２０】本研究において使用したSHIVのGagタンパク質およびCA-SP1配列の模式図である。SIV Mac239およびHIV-1 NL4-3についてのCA-SP1切断部位に隣接する配列を、配列の表の上端および下端に示す。破線(-)は親のSIV MAC239と同一である残基を表し、デルタ(Δ)はSHIV中で欠失しているSIV残基を表す。
【図２１】パネル1〜3のSHIVについてのGagプロセシングプロフィールのウェスタンブロット分析である。図21Aは、細胞結合ウイルスからのGagプロセシングを示すのに対して、図21Bは、無細胞ビリオンについてのGagプロセシングプロフィールを示す。正常なGagプロセシングはプラス記号(+)で示すのに対して、欠損性プロセシングプロフィールはマイナス記号(-)で示す。
【図２２】キャプシド前駆体CA-SP1の、成熟キャプシドタンパク質への転換に対する、1μg/mlのDSBの効果のウェスタンブロット分析である。パネルAにおいて、ウェスタンブロッティングのためのウイルスは、一定の体積の細胞培養上清を使用して得た。これは、ウイルス産生のレベルにおけるSHIV間の違いに起因して、ウイルスタンパク質バンドの強度の変動性を生じた。パネルBは、増加量のウイルスタンパク質がウェスタンブロット分析のために使用されるときに得られたGagプロセシングプロフィールを示す。正常なGagプロセシングを示すSHIVのみをここに含めた。パネルAにおける星印(*)は、オートラジオグラフにおいて観察されたSHIV GIについてのかすかなCA-SP1バンドを見ることができなかったが、このウイルスについてのDSB感受性は、増加量のタンパク質を使用して分析が実施されたときに観察された結果に基づいて、+/-に点数付けされることを示す(パネルB)。
【図２３】図23A-H.「HIV Sequence Compendium 2002」Kuiken et al. eds.Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. (www.hiv.lanl.gov)から得られたHIV-1臨床的単離物におけるCA-SP1領域のアラインメントである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008504808.tif 000096
【図１６】
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【図１７】
2008504808.tif 000098
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２３Ｈ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月17日(2007.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008504808000001.app
【国際調査報告】
2008504808.tif 000263
2008504808.tif 000264
2008504808.tif 000265