(57)【要約】  本発明は、標的細胞においてベクター形質転換を増大させる方法に関する。本発明は、標的細胞に結合し、そして活性化することを容易にする１以上の膜タンパク質を発現できるパッケージング細胞系列の組換え遺伝子操作を提供する。本発明は、１以上のかかる膜タンパク質をパッケージング細胞系列に組換え遺伝子操作することを提供する。かかる細胞系列の使用を介してウイルス粒子中にパッケージされるベクターは、これらのタンパク質を含む外被エンベロープを含むであろう。当該粒子は、標的細胞へ結合しそして標的化するために特に適しており、それらのベクターでの形質転換を促進する。当該標的細胞は、外来から供給された刺激分子の存在下で、パッケージされたベクターにより同時に活性化(刺激)されてもよい。
2008504821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして当該細胞の細胞周期の移行を活性化又は刺激する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、パッケージング細胞内で発現することができる第一核酸分子を含む、組換えレトロウイルス・パッケージング細胞。
【請求項２】
前記パッケージング細胞が、レトロウイルス構造タンパク質又はアクセサリータンパク質を発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
パッケージされるレトロウイルス・ベクターをさらに含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、パッケージング細胞において発現することができる第一核酸分子を含む組換えレトロウイルス・パッケージング細胞であって、第二核酸分子の非存在下でウイルス粒子を産生しない、前記細胞。
【請求項５】
前記レトロウイルス・パッケージング細胞が以下の：
ｉ)  標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合によりウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との融合を媒介するように機能する当該ウイルスリガンドを発現できる異種核酸分子
ｉｉ)ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ８４、ＣＤ８６、又はそれらの組合せを発現できる異種核酸分子
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記標的細胞が、抗原提示細胞(ＡＰＣ)、造血細胞系列の細胞、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、以下の：
ｉ)  Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲ複合体が、天然若しくは人工リガンド又は特異的Ａｂにより結合されるとき、当該Ｔ細胞表面分子に結合してＴ細胞の増殖を活性化する、共刺激分子
ｉｉ)当該細胞表面分子への結合を介して、細胞-細胞接着の役割を果たす分子
である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、前記細胞表面分子を結合した後に、前記標的細胞を活性化して増殖させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、２個のかかるリガンドを含む、請求項１〜６に記載のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、造血細胞のリガンドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、膜貫通タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＢＰ、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０(Ｂ７-１)、ＣＤ８６(Ｂ７-２)、又はＦａｓリガンド(ＦａｓＬ)、ＣＤ７０、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８)、Ｂ７-Ｈ１(ＰＤ-Ｌ１)、Ｂ７-Ｈ２、Ｂ７-Ｈ３(Ｂ７ＲＰ-２)、Ｂ７-Ｈ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ(ＣＤ１５４)、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ５０(ＩＣＡＭ-３)、ＣＤ５４(ＩＣＡＭ-１)、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７Ｌ(４-１ＢＢリガンド)、ＣＤ１５３、ＣＴＬＡ-４(ＣＤ１５２)、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ(ＣＤ１３４)、ＰＤ-１、ＰＤ-Ｌ２(Ｂ７-ＤＣ)、ＳＬＡＭ(ＣＤ１５０)、ＴＩＭ-１、ＴＩＭ-２、ＴＩＭ-３、ＴＩＭ-４、２Ｂ４(ＣＤ２４４)、又はそれらの組合せである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、Ｂ７-Ｈ1、Ｂ７-Ｈ2(ＩＣＯＳ-Ｌ、Ｂ７ＲＰ-１、及びＧＬ５０としても知られている)、Ｂ７-Ｈ3、及びＢ７-Ｈ4などのＢ７関連分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、又はＣＤ１１ａとＣＤ１８の複合体、例えば、ＩＣＡＭ-１(ＣＤ５４)、ＩＣＡＭ-２(ＣＤ１０２)、ＩＣＡＭ-３(ＣＤ５０)、ＩＣＡＭ-４(ＬＷ)、及びＩＣＡＭ-５(テレンセファリン)に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記膜関連非ウイルスリガンドは、ＰＤ-Ｌ2又はＰＤ-Ｌ1などのＰＤ-１リガンド；ＯＸ４０(ＣＤ１３４)に結合するＯＸ４０リガンド；４-１ＢＢ(ＣＤ１３７)に結合する４-１ＢＢリガンド；ＬＦＡ-２(ＣＤ２)に結合する、ＣＤ１５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、又はＣＤ５９などのリガンド；ＣＤ５に結合する、ＣＤ７２などのリガンド；又はＬＦＡ-３(ＣＤ５８)に結合する、ＣＤ２などのリガンドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載される細胞。
【請求項１６】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する抗体又は抗体断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する微生物タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記標的細胞がＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋であり、又はネクチン１を発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記標的細胞がＴ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記標的細胞が樹状細胞又はリンパ節中心におけるＢ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
組換えレトロウイルス・パッケージング細胞を産生する方法であって、当該方法が以下の：
レトロウイルスのパッケージング及び／又は複製に必要とされるウイルス遺伝子産物を、当該パッケージング細胞内で発現できる核酸分子、
標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、当該パッケージング細胞内で発現できる少なくとも１の核酸分子
を細胞内に導入する、を含む、前記方法。
【請求項２４】
ウイルスベクターをパッケージングする方法であって、当該方法が以下の：
レトロウイルス・ベクターをコードするか又は含む第二核酸分子を、請求項１、２、４、又は５のいずれか一項に記載の組換え細胞中に導入し、そして
上記細胞が標的細胞の細胞表面分子に結合する膜関連非ウイルスリガンドを含む粒子中に上記ベクターをパッケージする条件下で、当該細胞を培養する
を含む、前記方法。
【請求項２５】
前記ウイルス遺伝子産物が、標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合により前記ウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との融合を媒介するように機能する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的細胞が、抗原提示細胞、造血細胞系列の細胞、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、以下の：
ｉ)  Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲ複合体が、天然若しくは人工のリガンドにより結合されるか、又は特異的抗体により結合される場合、Ｔ細胞表面分子に結合してＴ細胞増殖を活性化する共刺激分子、及び／又は
ｉｉ)  当該細胞表面分子への結合を介して、細胞-細胞接着の役割を果たす分子
である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、前記細胞表面分子に結合後に、前記標的細胞を活性化して増殖させる、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、２のかかるリガンドを含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、造血細胞のリガンドである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、膜貫通タンパク質である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＢＰ、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０(Ｂ７-１)、ＣＤ８６(Ｂ７-２)、又はＦａｓリガンド(ＦａｓＬ)、ＣＤ７０、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８)、Ｂ７-Ｈ１(ＰＤ-Ｌ１)、Ｂ７-Ｈ２、Ｂ７-Ｈ３(Ｂ７ＲＰ-２)、Ｂ７-Ｈ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ(ＣＤ１５４)、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ５０(ＩＣＡＭ-３)、ＣＤ５４(ＩＣＡＭ-１)、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７Ｌ(４-１ＢＢリガンド)、ＣＤ１５３、ＣＴＬＡ-４(ＣＤ１５２)、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ(ＣＤ１３４)、ＰＤ-１、ＰＤ-Ｌ２(Ｂ７-ＤＣ)、ＳＬＡＭ(ＣＤ１５０)、ＴＩＭ-１、ＴＩＭ-２、ＴＩＭ-３、ＴＩＭ-４、２Ｂ４(ＣＤ２４４)、又はそれらの組合せである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルス遺伝子産物が、ポリオウイルス受容体ＣＤ１５５、野生型単純疱疹ウイルス(ＨＳＶ)-１エンベロープタンパク質、又は他のウイルス・エンベロープタンパク質である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、Ｂ７-Ｈ1、Ｂ７-Ｈ2(ＩＣＯＳ-Ｌ、Ｂ７ＲＰ-１、及びＧＬ５０としても知られている)、Ｂ７-Ｈ3、及びＢ７-Ｈ4などのＢ７関連分子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、又はＩＣＡＭ-１(ＣＤ５４)、ＩＣＡＭ-２(ＣＤ１０２)、ＩＣＡＭ-３(ＣＤ５０)、ＩＣＡＭ-４(ＬＷ)、及びＩＣＡＭ-５(テレンセファリン)などのＣＤ１１ａとＣＤ１８との複合体に結合する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＰＤ-Ｌ２又はＰＤ-Ｌ１などのＰＤ-１リガンドであり；ＯＸ４０(ＣＤ１３４)に結合するＯＸ４０リガンド；４-１ＢＢ(ＣＤ１３７)に結合する４-１ＢＢリガンド；ＬＦＡ-２(ＣＤ２)に結合する、ＣＤ１５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、又はＣＤ５９などのリガンド；ＣＤ５に結合する、ＣＤ７２などのリガンド；又はＬＦＡ-３(ＣＤ５８)に結合する、ＣＤ２などのリガンドである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する抗体又は抗体断片である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する微生物タンパク質である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋であるか、又はネクチン１を発現する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的細胞がＴ細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的細胞が、樹状細胞又はリンパ節中心のＢ細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
標的細胞又は組織の細胞表面分子に結合できる少なくとも１の膜関連リガンドを内在的に発現する細胞を含む、レトロウイルスベクターパッケージング細胞。
【請求項４５】
前記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて標的細胞又は組織と相互作用する、請求項４４に記載のパッケージング細胞。
【請求項４６】
前記細胞が骨髄間質細胞であり、前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項４５に記載のパッケージング細胞。
【請求項４７】
前記リガンドがインテグリンであり、そして前記標的細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項４４又は４５に記載のパッケージング細胞。
【請求項４８】
前記リガンドがＳＤＦ-１  ＶＬＡ-４、ＶＬＡ-５、又はＬＦＡ-１であり、そして前記造血幹細胞がＣＤ３４＋及びＣＤ３８-／ＣＸＣＲ４＋、又はＣＤ３４＋、及びＣＤ３８ｌｏ／ＣＸＣＲ４＋である、請求項４７に記載のパッケージング細胞。
【請求項４９】
前記細胞が、レトロウイルス・パッケージング細胞であり、それにより、標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合により当該ウイルスリガンドを含む細胞膜と、当該標的細胞との融合を媒介するように機能する、ウイルスリガンドを発現できる異種核酸分子を含む、請求項４４に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞のベクターによる形質導入を増加させる方法に関する。本発明は、標的細胞への結合及び標的細胞の活性化を促進する１以上の膜タンパク質を発現できるようにパッケージング細胞系列を組換え遺伝子操作することを提供する。或いは、本発明は、１以上のかかる膜タンパク質を内在的に発現する細胞を、パッケージング細胞系列へと組換え遺伝子操作することを提供する。かかる細胞系列を用いてウイルス粒子中にパッケージされたベクターは、これらのタンパク質を含む外被を含むであろう。当該粒子は、標的細胞に結合し、標的化して、ベクターを用いた形質導入を促進するために特に適していよう。外から供給された刺激分子の不存在下又は最小限の存在下において、標的細胞はパッケージされたベクターにより同時に活性化又は刺激されうる。
【０００２】
関連出願
本発明は、２００４年７月１日に出願された米国仮特許出願第６０/５８５，４６４号の優先権の利益を主張し、当該特許出願は完全に記載されているように本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
レンチウイルス・ベクターは、古典的に、ニューロンなどの非分裂細胞を形質導入することがしられており、そして細胞分裂がない状態で標的細胞に遺伝子をデリバリーする当該ベクターの能力は、レンチウイルスに基づくベクターの重要な特徴及び利点の一つである(Naldiniら、1996-１； Naldiniら、1996-２)。しかしながら、細胞分裂している細胞を調和された様式で活性化に導くことは、細胞の全集合を高いレベルで同時に形質導入することを容易にする(Humeauら、2004; Parkら、2000)。第一のレンチウイルスベクターを用いたＴ細胞中への導入効率は、２０〜４０％の導入効率であり(Schroersら、2002; Costelloら、2000; Rangaら、1998; Mitsuasuら、2000)、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を加えてプロウイルス配列の核転座の割合を増加させることにより、６０〜７５％ほどの高さに導入効率を有意に増加させた (Manganiniら、2002; Follenziら、2000; Cavalieriら、2003)。
【０００４】
従来の報告は、標的細胞を用いてベクターを濃縮して遺伝子導入の機会を増大させるスピノキュレーション(spinoculation)、或いは予め細胞を通常３日間刺激し、続いて１回又は複数回ベクターを加えることのいずれかに関する形質導入方法を用いた(Levineら、1997; Levineら、2000)。培養システムが密封されており、そして連続操作が難しい臨床設定においてこのような方法を使用することは難しい。最近開発された形質導入方法は、ベクター、細胞、並びにＴ細胞刺激分子ＣＤ３及びＣＤ２８を同時に加えて、細胞を分裂期に導くことに関する(Luら、2004; Hurneauら、2004)。ＣＤ３及びＣＤ２８への暴露は、ベクター添加前に細胞を予め刺激するために使用される場合、トランス遺伝子の発現を増加させることが以前に示された (Costelloら、2000)。この形質導入と培養開始法の組合せは、９９％の最大形質導入効率をもたらし、かつこうしたレベルを達成するために必要とされる時間を３日に短縮した(Luら、2004)。これらの研究より、治療効果のために十分な形質導入効率を達成する際における細胞刺激の重要な役割が強調される。
【０００５】
形質導入に必要とされる培養時間の短縮はまた、形質導入される細胞の自然効力(natural potency)を維持する際の助けとなる。レンチウイルス・ベクターについての固有の性質は、当該ベクターがゲノム中への挿入のために細胞分裂を必要としないという点である。これは、休止期の細胞標的の遺伝子治療に対して助けとなる。当該標的は、マクロファージ、造血前駆細胞、及び循環しているナイーブＴリンパ球を含み、これらは以下に詳細に提供される本発明により標的されうる。かかる標的は、治療において特に価値がある。なぜなら、これらは体内において長期間に渡り優れた効力を保持するからである。ｅｘ ｖｉｖｏにおいてサイトカイン又は他の刺激分子で過剰に刺激することは、ｉｎ ｖｉｖｏでのその有効性の変化をもたらしうる(Mauriceら、2002; Scaresら、1998)。その結果、ＨＩＶに基づくベクターを用いる場合、休止期のＴ細胞においてＧ0からＧ1bへの移行の切り替えを誘導することは、本来のプロファイルを失うことをもたらす増殖を促進することなくベクター組込みを促進することができる(Dardalhonら、2000)。同様に、最小限の刺激は、造血幹細胞において、血液の再構成能力の喪失を誘導することなく有効な遺伝子導入を促進するであろう。
【０００６】
当該技術分野において最近開発された形質転換法は、従来方法を超える有意な改善を示すが、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の活性化に外来共刺激分子を必要とすることは、体内に注射されてｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効な形質導入を促進する遺伝子治療ベクターの開発に逆行するものである。治療計画として、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて治療分子及びベクターを共投与することをうまく提供する能力に関しては、不確かである。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入を適用する場合では、培地中の外来性共刺激分子についての要件は、さらなる品質制御及び安全性の問題を生じさせる。
【０００７】
上記文献の引例は、前述のいずれかが適切な従来技術であると認めることを意図するものではない。データーについての全ての記載又はこれらの文献の内容についての説明は、出願人が利用できる情報に基づいており、そしてデーター又はこれらの文献の内容の正確性を認めるものではない。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、改良されたパッケージング及びプロデューサー細胞系列、並びにレトロウイルス及びレンチウイルスによる形質導入及び標的化を改善するために当該細胞系列を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施態様では、改良された結合性質及び刺激性質を有し、標的化される細胞において形質導入及び増殖を促進するレンチウイルス粒子を提供するレンチウイルス形質導入システムに関する。他の実施態様では、本発明は、単に高タイターのウイルス粒子及び／又は外来から供給された刺激因子で刺激することに頼ることなく、非分裂性の細胞に形質導入する方法を提供する。本発明はこうして、可溶性の刺激因子又はアクセサリー細胞により提供される因子を必要とすることなく、ex vivo又はin vitroにおいて使用される利点を有する。さらに、本発明は、ベクター又は「負荷量(payloads)」を有するウイルス粒子をデリバリーする直接注射液(direct injectable)としてin vivoで使用されてもよい。
【０００９】
第一態様では、本発明は、標的細胞に結合し及び／又は当該細胞の細胞周期の移行を刺激する能力を有する分子をベクター・エンベロープ中にとり込むことにより、レンチウイルスの形質導入及び標的化を改善する方法を提供する。細胞周期の移行を刺激する能力は、形質導入を増加させることを示し、そして当該能力は、幾つかのin vitro及びex vivo形質導入プロトコルにおいて、ＣＤ３及びＣＤ２８リガンドの機能である。例えば、Ｔ細胞形質導入において使用される抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８結合ビーズは、当該分野の他のものにより使用された(Luら、2004及び Levineら、1997及び2000)。他のグループは、ＩＬ-２及びＩＬ-７(Mauriceら、1999及びVerhoeyenら、2003)などの共刺激分子又は一本鎖抗ＣＤ-３抗体(Mauriceら、2002)を模倣する組換えエンベロープを含むレトロウイルスベクターを作成した。本発明は、レトロウイルスベクターのエンベロープ表面中に細胞表面タンパク質及び分子を取り込むことが、外来性共刺激分子を欠く中で形質導入効率を調節するであろうという認識に一部基づいている。
【００１０】
本発明は、選択した標的細胞に接着し、続いて形質導入、つまり遺伝子導入、をするために最適化されたエンベロープを含むレンチウイルス・ベクターを製造する新規の概念を提供する。これは、組換えエンベロープタンパク質を含むベクターを製造することにより達成されるものではなく(Verhoeyenら、2003; Mauriceら、1999及び2002)、関心の膜関連タンパク質をベクター表面上に発現するように遺伝子操作されたプロデューサー細胞系列を設計及び使用することにより達成される。当該細胞系列において産生されるベクターは、標的細胞に結合し、そして標的細胞を活性化し、そうしてかかる細胞中への遺伝子導入に最適化された能力を有する膜関連タンパク質を獲得する。かかるエンベロープタンパク質は、プロデューサー細胞又は他の細胞においてもともと存在するものであってもよく、そして非限定的な例としてＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ８０、及びＣＤ８６を個々に又は２、３、又は４つ全ての組合せて含んでもよい。
【００１１】
本発明はこうして、共刺激するために外来分子を加える必要性を低下させるか又は取り除き、そして有利なことに、外来から提供された因子の非存在下で形質導入細胞を提供する。これは、形質導入細胞の見込まれる適用及び使用に拡張することができる。本発明はまた、ex vivo形質導入並びにin vivo遺伝子デリバリーのための単純化され、そして臨床的に適したアプローチをもたらす。本発明は、パッケージされた粒子で標的細胞を形質導入する間、合併症を低減するためにも使用されうる。
【００１２】
一の代表的な実施態様として、レンチウイルス・ベクターは、その天然の細胞宿主から出芽する天然ＨＩＶエンベロープをできるだけ模倣し、そしてウイルス・エンベロープタンパク質の点でのみ異なるエンベロープを含むように遺伝子操作されうる。非限定的にＣＤ８６及びＣＤ４３などのタンパク質を単独で又は組み合わせてこれらのベクター粒子内に含めることにより、当該粒子は、(ＣＤ８６を介して)標的ＣＤ４Ｔ細胞の刺激のため、及び／又は(ＣＤ５４を介した)細胞-ベクター相互作用を介してベクターの細胞への結合を増加させるために使用されうる。
【００１３】
こうして、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもともと標的細胞に結合する細胞を使用することによって、ベクターのパッケージングを想定してもよい。例えば、Ｔ細胞は、リンパ組織において他のＴ細胞に結合し、そして活性化する分子を含む。その結果、Ｔ細胞又は関連するＴ細胞系列がパッケージング細胞として直接使用されてもよいし、又は改変された後に使用されてもよく、そして次にＴ細胞に結合することを意図されたベクターを生成するためにベクター生成細胞として使用されてもよい。別の例は、造血系前駆細胞を標的化及び形質導入することを意図されたベクターの産生／パッケージングのために、間葉系幹細胞(ＭＳＣ)を使用することであろう。なぜなら、ＭＳＣはｉｎ ｖｉｖｏにおいてこれらの細胞のための支持マトリックスを提供するからである。
【００１４】
非改変細胞の使用の可能性に加えて、本発明は、当該細胞において少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを発現するか又は発現できる第一核酸分子を含む、組換えレトロウイルスパッケージング細胞を提供する。内在性の膜関連非ウイルス性リガンドを増加させる核酸構築物を含む組換え細胞が本発明の実施において使用されてもよいが、当該リガンドは、幾つかの実施態様では非内在性である(又は当該細胞に対して異種性であるか、又はそうでなければ当該細胞内で通常発現されないもの)。非ウイルス性のリガンドは、天然の細胞表面分子であってもよく、そして標的細胞の細胞表面分子を結合する分子である。当該第一核酸分子は、当該細胞に一過的に導入されてもよく、又は前もって安定して当該細胞内に導入されてもよい。安定的に導入された分子は、本発明の実施態様に含まれる。
【００１５】
幾つかの実施態様では、当該少なくとも１の膜関連非ウイルス性リガンドは、当該細胞表面分子への結合を介して細胞-細胞接着の役割を果たし、及び／又は細胞の表面分子の結合後に作用して、当該細胞が細胞周期へと移行することを活性化又は刺激し、成長及び／又は増殖を導く。本発明の幾つかの実施態様において、当該細胞は、少なくとも２個のかかるリガンドを含み、例えばそのうちの一つは、細胞-細胞接着に役割を果たし、そしてもう一つは細胞周期の移行を活性化又は刺激する。本発明の他の実施態様では、当該細胞のＣＤ３／ＴＣＲ複合体が天然又は人工リガンドにより又は特異的な抗体(Ａｂ）により結合される場合、当該リガンドは、Ｔ細胞表面分子を結合して、Ｔ細胞増殖を活性化する共刺激分子である。他の非限定的なリガンドは、造血細胞で見つかったリガンドである。
【００１６】
パッケージング細胞の組換え及びパッケージング特性は、当該細胞が少なくとも１の異種性核酸分子を含み、当該分子がレトロウイルスベクターのパッケージングに必要とされる１以上のウイルス因子を発現するか又は発現できるということを示唆しうる。１以上の因子は、トランスで機能して、ビリオン又はウイルス粒子中へのレトロウイルス核酸のパッケージングを許容する因子である。幾つかの実施態様では、当該因子は、１以上のウイルス構造タンパク質、例えば、マトリックス、キャプシド、又はヌクレオチドキャプシドタンパク質であり、及び／又は１以上のウイルス・アクセサリータンパク質である。当業者に認められるように、パッケージングされるベクターを有するパッケージング細胞は、トランスにおいて必要とされるパッケージング成分がパッケージング細胞由来の核酸配列とベクター由来の核酸配列との組合せにより発現されうるパッケージング・システムとして見なされうる。少なくとも１の異種核酸分子は、当該細胞に一過的に導入されるか、又は前もって安定的に細胞中へ導入されてもよい。安定的に導入された分子は、本発明の実施態様に含められる。
【００１７】
ウイルス因子(単数又は複数)は、レンチウイルス・ベクターのパッケージングを支援しうる。複数の因子(単数又は複数)のうちの任意の一つ又は組合せは、パッケージング細胞中の核酸配列によりコードされてもよく、そのようにコードされていない因子の全ては、当該ベクターの核酸配列によりコードされる。幾つかの実施態様では、因子は、ウイルス・エンベロープタンパク質及び他のトランス因子、例えばＧＡＧ又はＰＯＬタンパク質、並びにレンチウイルスの場合様々なアクセサリータンパク質を含む。更なる実施態様では、本発明のパッケージング細胞は、レンチウイルス・ベクターをパッケージングできるウイルス・エンベロープタンパク質を発現するか、又は発現でき、関心の標的細胞に形質導入できる粒子を生成する。他の実施態様では、パッケージング細胞は、標的細胞の細胞表面分子に結合するウイルスリガンドを発現するか、又は発現できる。
【００１８】
本発明の一の代表的な実施態様では、ウイルス因子は、ウイルス又はベクター粒子と、標的細胞膜との融合を保つか又は仲介するタンパク質である。言い換えると、当該因子は、当該ウイルスリガンドを含む細胞膜と、標的細胞の細胞膜との融合を仲介するように機能する。非限的な例は、ネクチン-１、例えば野生型帯状疱疹ウイルス(ＨＳＶ)-１エンベロープタンパク質を標的とし又は結合する因子を含む。ウイルス及び非ウイルス因子、例えばＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、及び／又はＣＤ１４＋細胞を標的とするか又は結合する因子、ＣＤ１５５／ＰＶＲ又はＣＤ１１２(ネクチン-２はＣＤ３４＋細胞に存在する)を標的とするＣＤ２２６(ＤＮＡＭ-１)タンパク質は、更なる非限定的な例である。
【００１９】
パッケージング細胞の組換え及びパッケージング特性は、パッケージされるベクター配列を欠くと、ウイルス粒子を生成しないと言うことを示唆しうる。ベクター配列は、かかる細胞中における第二核酸分子として見なされてもよく、そして長い末端反復(ＬＴＲ)領域及び／又はレトロウイルスパッケージング又は二量化シグナルを有するレンチウイルス由来のベクターは、本発明を具体化したものである。
【００２０】
さらなる実施態様では、本発明の標的細胞は、非限定的に、抗原提示細胞(ＡＰＣ)、造血系細胞、肝細胞、リンパ球(Ｔ細胞及びＢ細胞、例えばリンパ節中心におけるＴ細胞及びＢ細胞を含む)、ニューロン、内皮細胞、腫瘍細胞、樹状細胞、線維芽細胞、及び非造血幹細胞を含む。
【００２１】
ベクター・エンベロープ中に取り込まれた後のパッケージング細胞の膜関連非ウイルスリガンドは、ビリオン粒子をかかる標的細胞に仕向けるために使用される。いくつかの実施態様においてリガンドは膜貫通タンパク質であるが、それらはパッケージング細胞膜の外表面上のタンパク質であってもよい。当該リガンドは、高等真核細胞のリガンド、それらに基づいた合成又はキメラ(融合)分子、一本鎖抗体又はその断片、或いは微生物用のタンパク質であってもよい。
【００２２】
本発明は、本明細書中で開示されるパッケージング細胞を含む組成物も提供する。かかる組成物は、パッケージング細胞とパッケージされるベクターとの組合せを含む。ベクターは、当該細胞に導入されうる。幾つかの実施態様では、本発明のベクターは、アクセサリータンパク質をコードする核酸を除いたベクター、例えば非限定的に、レンチウイルス・アクセサリータンパク質を発現できる機能配列を欠くレンチウイルスである。かかるタンパク質は、パッケージング細胞を介してトランスで提供されうる。他の組成物は、パッケージング細胞と適切な培地との組合せ、及び／又は当該細胞を増殖させるためのインキュベーション装置を含む。
【００２３】
第二態様では、本発明は、本発明のパッケージング細胞を生成する方法を提供する。かかる方法は、本明細書中に記載されるようにレトロウイルスのパッケージング及び／又は複製に必要とされるウイルス遺伝子産物を発現するか又は発現できる核酸分子を当該パッケージング細胞内に導入すること；並びに、本明細書に記載されるように少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを発現するか又は発現できる核酸分子を当該パッケージング細胞内に導入することを含む。
【００２４】
第三態様では、本発明のウイルスベクター粒子を生成又はパッケージングする方法を提供する。かかる方法は、レトロウイルスベクターをコードするか又は含む核酸分子を、本明細書に記載される組換えパッケージング細胞中に導入することを含む。次に、本明細書に記載されるように、かかる細胞が少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを含む粒子中に当該ベクターをパッケージする条件化において当該細胞を培養する。
【００２５】
第四態様では、本発明は、本明細書に記載されるようにウイルス・パッケージング因子をコードする核酸分子を導入することにより、組換えされるレトロウイルス・ベクターパッケージング細胞を提供する。当該細胞は、標的細胞又は組織の細胞表面分子に結合できる少なくとも１の膜関連リガンドを内在的に発現する細胞である。幾つかの実施態様では、当該細胞は、非接着性である(例えば、懸濁中で増殖されうる)か、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて標的細胞又は組織と相互作用するか又は結合する細胞である。
【００２６】
非限定的な実施態様は、造血幹細胞を標的細胞として用いるベクターをパッケージする骨髄間質細胞を含む。或いは、当該細胞は、ＣＤ３４＋細胞の表面に結合するインテグリンタンパク質を発現する細胞であってもよい。他の実施態様では、パッケージング細胞は、ＳＤＦ-１、ＶＬＡ-４、ＶＬＡ-５、又はＬＦＡ-１から選ばれるリガンドを発現することもあり、そしてパッケージされたベクターは、ａ)ＣＤ３４＋及びＣＤ３８-／ＣＸＣＲ４＋、又はｂ)ＣＤ３４＋及びＣＤ３８ｌｏｗ／ＣＸＣＲ４＋である造血幹細胞に結合する。
【００２７】
本発明は、本明細書に記載されるベクターを場合により伴ってこのようなパッケージング細胞を含む組成物、このような細胞を製造する方法、並びに本明細書に開示されるようにベクターをパッケージするためにこうした細胞を使用する方法を提供する。
【００２８】
第五態様では、本発明は、本発明の細胞、組成物、及び方法により生成されるベクター含有ウイルス粒子を提供する。こうした粒子は、本明細書に記載されるようにリガンド及びパッケージング細胞由来の他の分子を含む外皮を有するであろう。
【００２９】
定義
本明細書に使用される「組換え」という用語は、タンパク質又は核酸などの生物生成物を生産するために遺伝子工学及び／又は分子生物学的技術を用いることを指す。発現される組換え核酸分子の場合、当該用語は、通常自然界において見られない配列を含む非天然分子を指す。このような分子は、もちろん、天然物又は合成物である生体分子を発現するために使用されうる。組換え細胞の場合、当該用語は、内在しないタンパク質を発現するか又は発現できる細胞、又は内在タンパク質を内在しえないレベルで発現するか、又は発現できる細胞を指す。
【００３０】
「ウイルス粒子」又は「ベクター粒子」又は「ビリオン」という用語、又はそのバリエーションは、通常、本明細書に記載されるウイルス又はベクター核酸を封入するか又は含む巨大分子複合体を指す。こうした粒子は、通常、プロデューサー及びパッケージング細胞、並びに本発明の方法により生成される際に獲得される脂質二重膜中に入れられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、レトロウイルスパッケージング細胞及びそれらを含むベクターパッケージングシステムを与える。当該細胞及びシステムは、様々な標的細胞を導入するために使用されうるパッケージされたベクター粒子を製造するために使用されてもよい。
【００３２】
本明細書に記載されるように、本発明を実施する複数の様式が存在する。非限定的な様式は、使用される細胞タイプ、パッケージされるベクターのタイプ、発現されるリガンドのタイプ、リガンドを発現するために使用される構築物及び方法、及びパッケージされたベクターにより標的化される細胞型を含む。もちろん、当業者に理解されることであるが、パッケージング細胞は、ベクターのパッケージングに必要とされる１以上のウイルス因子を発現するか又は発現できる少なくとも１の異種核酸分子を含む。１以上の因子は、トランスで機能して、ウイルス核酸ベクターをビリオン又はウイルス粒子中にパッケージングすることを許容する。
【００３３】
こうして一の様式において、本発明は、パッケージング細胞内で、標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを発現することができる第一核酸分子を含む組換えレトロウイルスパッケージング細胞を提供する。いくつの実施態様では、当該細胞は、ウイルス因子を発現するか又はベクター配列を発現するか若しくはベクター配列である第二核酸分子が存在しない状態では、ウイルス粒子を生成しない。別の様式では、本発明は、標的細胞又は組織の細胞表面分子に結合できる少なくとも１の膜関連リガンドを内在的に発現するレトロウイルス・ベクター・パッケージング細胞を提供する。
【００３４】
本発明は、様々な細胞で実施されうる。実施態様は、哺乳動物細胞を含むが、レトロウイルス及びレンチウイルス・ベクターのパッケージングを支援する他の真核細胞のタイプが使用されてもよい。細胞型は、懸濁細胞、及び非限定的にＣＯＳ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０、Ｍｖ-１-Ｌｕ、及びヒト２９３細胞系列などの細胞を含む。上記細胞の誘導体又は天然細胞が使用されてもよい。
【００３５】
更なる実施態様では、パッケージング細胞は、トランスにおいてベクター・パッケージングに必須である１以上のウイルスタンパク質を発現する。幾つかの実施態様では、レトロウイルスパッケージング細胞は以下の：
ｉ)  標的細胞の細胞表面分子を結合し、そして場合により当該ウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との結合又は融合を媒介し、及び/又はＧｐからＧ１ｂへの細胞周期の移行を刺激するように機能するウイルス又は非ウイルス・リガンドを発現できる異種核酸分子
ｉｉ)  ＣＤ２２６(ＤＮＡＭ-１)、野生型単純疱疹ウイルス(ＨＳＶ)-１エンベロープタンパク質、又は他のウイルエンベロープタンパク質を発現できる異種核酸分子
を含む。
【００３６】
レトロウイルスパッケージング細胞がｉｉ)を含む場合、標的細胞は、造血幹細胞；ＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋であり、ネクチン１又はネクチン様タンパク質を発現する細胞；Ｔ細胞；樹状細胞、又はリンパ節の中心におけるＢ細胞；又は線維芽細胞である。他の実施態様では、本発明のパッケージング細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞又は組織と相互作用する細胞に由来する。
【００３７】
トランス作用タンパク質の非限定的な例は、構造タンパク質、エンベロープ(ｅｎｖ)タンパク質、アクセサリータンパク質、標的細胞膜との融合を促進するタンパク質、及び任意のレトロウイルス又はレンチウイルス、例えば非限定的に、モロニー・マウス白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＲＤ１１４、ＢａＥＶ、ＧＡＬＶ、ＳＳＡＶ、ＦｅＬＶ-Ｂ、両種性マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ-Ａ)、ヒト免疫不全ウイルス、トリ白血病ウイルス、及びＮＺＢウイルス、のＧａｇ及び／又はＰｏｌタンパク質を含む。ＧＡＧ及び／又はＰＯＬタンパク質は改変、合成、又はキメラ(ＧＡＧ／ＰＯＬ)構築物であってもよい。
【００３８】
エンベロープタンパク質の例は、非限定的に、両種性エンベロープ、同種性エンベロープ、又は異種性エンベロープを含み、又は両種性及び同種性部分を含むエンベロープであってもよい。当該タンパク質はまた、上記レトロウイルス及びレンチウイルスのいずれかのタンパク質であってもよい。或いは、エンベロープタンパク質は、改変、合成、又はキメラエンベロープ構築物であってもよいし、或いは水疱性口内炎ウイルス及びＨＶＪウイルスなどの非レトロウイルスから得てもよい。具体的な非限定的な例は、モロニー・マウス白血病ウイルス(ＭＭＬＶ)、ラウス肉腫ウイルス、及びネコ内在性ウイルスＲＤ１１４のエンベロープ；テナガザル白血病ウイルス(ＧＡＬＶ)エンベロープ；ヒヒ内在性ウイルス(ＢａＥＶ)エンベロープ；サル肉腫随伴ウイルス(ＳＳＡＶ)；両種性マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ-Ａ)エンベロープ；ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ；トリ白血病ウイルスエンベロープ；内在性異種性ＮＺＢウイルスエンベロープ；及びパラミクソウイルスファミリーのエンベロープ、例えば非限定的にＨＶＪウイルスエンベロープなどを含む。
【００３９】
パッケージされるベクターのタイプは、任意のウイルスに基づくベクターを含む。レトロウイルス、例えばトリ細網内皮症ウイルス(アヒル感染性貧血性ウイルス、脾臓壊死ウイルス、Ｔｗｉｅｈａｕｓ株網膜内皮症ウイルス、Ｃ型レトロウイルス、網膜内皮症ウイルスＨｕｎｇａｒｙ-２(ＲＥＶ-Ｈ-２))、及びネコ白血病ウイルス(ＦｅＬＶ))由来のベクターは、非限定的な一例である。レトロウイルスゲノムは、ベクターとして使用するために改変された(Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA. 81:6349-6353, (1984))。本発明ベクターとして使用されうるレトロウイルス又はレトロウイルス科ファミリーは、レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ-１及びＨＩＶ-２)、ネコ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス(ＳＩＶ)、マエディ/ビスナウイルス、ヤギ関節炎/脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス (ＥＩＡＶ)、及びウシ免疫不全ウイルス(ＢＩＶ)；トリＣ型レトロウイルス、例えばトリ白血病ウイルス(ＡＬＶ)；ＨＴＬＶ-ＢＬＶレトロウイルス、例えばウシ白血病ウイルス(ＢＬＶ)、ヒトＴ細胞白血球ウイルス(ＨＴＬＶ)、及びサルＴ細胞白血球ウイルス；哺乳動物Ｂ型レトロウイルス、例えばマウス乳癌ウイルス  (ＭＭＴＶ)；  哺乳類Ｃ型レトロウイルス、例えばマウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、ネコ肉腫ウイルス(ＦｅＳＶ)、マウス肉腫ウイルス、ギボンザル白血病ウイルス、ギニアブタＣ型ウイルス、ブタＣ型ウイルス、ウーリー・サル肉腫ウイルス、及び毒ヘビレトロウイルス；スプマウイルス(泡沫状ウイルス群)、例えばヒトスプマウイルス(ＨＳＲＶ)、ネコ合胞体形成ウイルス(ＦｅＳＦＶ)、ヒト泡沫状ウイルス、サル泡沫状ウイルス、及びウシ合胞体ウイルス；及びＤ型レトロウイルス、例えばメイソン-ファイザー・サル・ウイルス(ＭＰＭＶ)、リスザル・レトロウイルス、及びラングール・サル・ウイルスを含む。
【００４０】
「ベクター」又は「プラスミド」という用語は、異なる細胞環境又は遺伝環境間で、核酸配列の受け渡しを可能にする核酸分子を指す。非制限的なベクターは、その中に、自己複製及び発現核酸配列を可能にする配列を含む。ベクターは、使用される細胞システムに適した選別マーカーを場合により含んでもよい。本発明の実施において使用するためのベクターの一のタイプは、染色体外での複製を可能にする核酸であるエピソームとして維持される。本発明を実施する際に使用するためのベクターの一のタイプは、エピソームとして維持され、当該エピソームは、細胞外複製を可能にする核酸である。別のタイプは、ベクターが導入された細胞のゲノム内に安定して組み込まれるベクターである。
【００４１】
本発明のベクターは、パッケージング細胞及び/又はベクターを標的細胞にデリバリーした後に標的細胞において発現される「ペイロード」をコードする遺伝物質である。ベクターが粒子内にパッケージされる事実は、「ペイロード」、又は当該「ペイロード」をコードする遺伝物質の発現の際に生成される生物生成物が、標的細胞へのデリバリーのためにパッケージ粒子内に取り込まれることを許容する。本発明の１の「ペイロード」は、ベクター・ゲノムによりコードされる治療物質である。もちろんポリペプチド又は核酸(例えば、ＲＮＡ)である「ペイロード」は、パッケージング細胞内で発現されてもよいし、そして標的細胞内で発現されることに加えて、又は発現されることに代えてパッケージ粒子内に物理的に存在してもよい。幾つかの実施態様では、「ペイロード」は、使用されるパッケージング細胞にとって毒性ではないか、又は最小限の毒性しか有さない。
【００４２】
治療物質をコードする遺伝物質の非制限的な例は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)遺伝子、例えばＴＮＦ-α；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、及びインターフェロン-ガンマをコードする遺伝子；インターロイキン、例えば、ＩＬ-１、ＩＬ-１β、及びインターロイキン２〜１４をコードする遺伝子：ＧＭ-ＣＳＦをコードする遺伝子；アデノシン・デアミナーゼ(ＡＤＡ)をコードする遺伝子；細胞増殖因子、例えばリンパ球の増殖因子であるリンフォカインをコードする遺伝子；上皮成長因子及びケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)をコードする遺伝子；可溶性ＣＤ４をコードする遺伝子；第八因子；第九因子；シトクロームｂ；グルコセレブロシダーゼ；Ｔ細胞受容体；ＬＤＬ受容体、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＡＩ、及びコレステロール輸送及び代謝に関与する他の遺伝子；アルファ-１アンチトリプシン(α１ＡＴ)遺伝子；インスリン遺伝子；ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子；ＣＦＴＲ遺伝子；陰性選別マーカー、又は「自殺」遺伝子、例えばウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子、例えば単純疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルス・ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子、及び水痘帯状疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子；抗体の抗原結合性ドメインのＦｃ受容体、ウイルス複製を阻害するアンチセンス配列、例えばＢ型肝炎又は非Ａ型非Ｂ型肝炎ウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列；ｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド・アンチセンス；及び抗酸化物質、例えば非限定的に、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼ(Ｍｎ-ＳＯＤ)、カタラーゼ、銅-亜鉛-スーパーオキシドジスムターゼ(ＣｕＺｎ-ＳＯＤ)、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(ＥＣ-ＳＯＤ)、及びグルタチオン還元酵素をコードする遺伝子；多剤耐性(ＭＤＲ)遺伝子；リボザイムをコードするポリヌクレオチド；アンチセンス・ポリヌクレオチド；アンジオテンシン変換酵素の競合的阻害剤、血管平滑筋カルシウムチャネルの競合的阻害剤、アドレナリン受容体の競合的阻害剤として作用する分泌性ペプチドをコードする遺伝子をコードするポリヌクレオチド、及び中枢神経系においてアミロイド・プラークを破壊する酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００４３】
以下の：組織プラスミノゲンアクチベータ(ｔＰＡ)；尿プラスミノーゲン活性化因子(ウロキナーゼ)；ヒルジン；フェニルアラニン水酸化酵素遺伝子；ニューロンＮＯ合成酵素；内皮ＮＯ合成酵素；血管作動性ペプチド；血管新生ペプチド；抗-血管由来ペプチド；ドーパミン遺伝子；ジストロフィン遺伝子；β-グロビン遺伝子；α-グロビン遺伝子；ＨｂＡ遺伝子；プロトオンコジーン、例えばｒａｓ、ｓｒｃ、及びｂｃｌ遺伝子；腫瘍抑制遺伝、例えば、ｐ５３及びＲｂ；ＬＤＬ受容体；乳癌、子宮癌、胃癌、上皮癌の治療用のヘレグリン-αタンパク質遺伝子；及びＴ細胞抗原受容体のβ-鎖内に含まれるエピトープに特異的なモノクローナル抗体をコードする遺伝物質が使用されてもよい。しかしながら、本発明の範囲が特定の治療物質に限定されるべきでないということが理解され様。
【００４４】
本発明の幾つかの実施態様では、血友病の治療において有用な凝血因子(例えば第八因子又は第九因子)をコードする遺伝子でありうるか、又は当該遺伝子は、別の治療効果を有する１以上の生成物をコードすることもある。適切な遺伝子の例は、ＴＮＦ、インターロイキン(インターロイキン１２)、インターフェロン(α、β、及びγ-インターフェロン)、Ｔ細胞受容体タンパク質、及び抗体に結合するＦｃ受容体などのサイトカインをコードするものを含む。
【００４５】
本発明のベクターは、非限定的にＨＩＶ及びヘルペス感染などのウイルス感染などの感染性疾患、癌、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、血友病、糖尿病、α-抗トリプシン欠損症、アルツハイマー病などの脳障害、並びに成長障害及び心臓疾患などの他の疾患であって、コレステロール代謝の変化及び免疫系の欠陥により引き起こされるものを含む様々な疾患の治療に有用である。
【００４６】
別の実施態様では、本発明のベクターは、陰性選別マーカー、例えば、ウイルス・チミジン・キナーゼ、例えば単純疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ(ＴＫ)遺伝子を含んでも良い。かかるベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ヒト患者の癌細胞(特に腫瘍細胞)に投与されうる。当該ベクターは、次に腫瘍細胞に形質導入させる。ベクターが腫瘍細胞に形質導入させた後に、患者は、相互作用剤(interaction agent)、例えばガンシクロビル又はアシクロビルを投与される。これの薬剤は、複製をしている細胞(つまり、癌又は腫瘍細胞)であって、陰性選別マーカーをコードするベクターで形質導入された細胞の全てを殺すために、陰性選別マーカーにより発現されるタンパク質と相互作用する。
【００４７】
本発明のベクターは、関心の標的細胞を結合し、そして当該細胞に感染するように設計される。いくつかの実施態様では、標的細胞は、抗原提示細胞(ＡＰＣ)、造血細胞系列、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である。標的が造血幹細胞である場合、パッケージング細胞は場合により骨髄間質細胞である。造血幹細胞標的は、ＣＤ３４＋及びＣＤ３８-／ＣＸＣＲ４＋、或いはＣＤ３４＋及びＣＤ３８１ｏｗ／ＣＸＣＲ４＋であってもよい。他の幹細胞は、骨髄間質細胞又は肝臓などの胎児組織から単離されたＣＤ３４+細胞、ＣＤ３４+ヒト胚性前駆幹細胞(ｈＥＳＣ)、造血系の、又は上記の他の起源のＣＤ１３３＋幹細胞、又はサイド・ポピュレーション(ＳＰ)表現系を示す細胞を含む。リガンドは、場合によりＳＤＦ-１、ＶＬＡ-４、ＶＬＡ-５、又はＬＦＡ-１である。本発明は、インテグリンをリガンドとして使用することにより、ＣＤ３４＋細胞を標的することを含む。
【００４８】
本発明はまた、標的細胞の表面分子に結合し、そしてウイルス粒子の標的細胞への形質導入を促進する、様々な天然又は人工膜関連リガンドを用いて実施されうる。かかるリガンドは、当該リガンドを含む細胞膜と、標的細胞の細胞膜との融合を媒介するように機能しうる。実施態様は、細胞-細胞接着の役割を有するか、又は標的細胞上の刺激活性(細胞周期又は細胞増殖又は細胞成長への進行又は移行を誘導する)を有すると知られている任意のリガンドを含む。ＣＤ３／ＴＣＲ複合体が天然リガンド又は特異的抗体(Ａｂ)により結合される間、Ｔ細胞増殖において相乗的作用を有すると知られている共刺激分子が含まれる。こうして、Ｔ細胞表面分子に結合してＴ細胞増殖を活性化させる共刺激分子は、Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲ複合体が天然又は人工リガンドにより、又は特異的Ａｂにより結合される場合、本発明を実施する際に使用されても良い。いくつかの実施態様において、パッケージング細胞は、少なくとも２個のかかるリガンド、例えば、非限定的に、細胞-細胞接着を促進するリガンド、及び標的細胞の刺激を促進するリガンドを発現する。別の実施態様では、膜関連非ウイルスリガンドは、造血細胞のリガンド又は膜貫通タンパク質である。
【００４９】
膜関連リガンドの他の非限定的な例は、キメラ、ヒト化、モノクローナル、一本鎖形態を含む抗体及びその断片であって、本明細書に記載されるように膜関連リガンドとして機能するものである。非限定的な例は、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、又はＣＤ４３に結合する抗体又は抗体断片を含む。さらなる非限定的な例は、本明細書に記載されるようにリガンドとして機能する微生物成分である。ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、又はＣＤ４３に結合する微生物タンパク質は、非限定的な例を示す。
【００５０】
具体的な例、及びリガンドの非限定的な例は、ＣＤ２８；ＣＤ２８ＢＰ(Lazeticら、J. Biol. Chem., 277(41):38660-38668 (2002));Ｂ７-Ｈ1、Ｂ７-Ｈ2(ＩＣＯＳ-Ｌ、Ｂ７ＲＰ-１、ＧＬ５０として知られている)、Ｂ７-Ｈ3、Ｂ７-Ｈ4、及び他の関連するＢ７分子；ＰＤ-１結合分子、例えばＰＤ-Ｌ2及びＰＤ-Ｌ1；ＯＸ４０リガンド(ＣＤ１５４)(ＯＸ４０／ＣＤ１３４に結合する)；４-１ＢＢリガンド(４-１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合する)；(ＣＤ１１ａとＣＤ１８との複合体である)ＬＦＡ-１結合分子、例えばＩＣＡＭ-１／ＣＤ５４、ＩＣＡＭ-２／ＣＤ１０２、ＩＣＡＭ-３／ＣＤ５０、ＩＣＡＭ-４／ＬＷ、又はＩＣＡＭ-５／テレンセファリン；ＬＦＡ-１、ＣＤ１１a、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、又はＣＤ４３に結合する抗体又は微生物分子；ＣＤ２(ＬＦＡ-２)のリガンド、例えばＣＤ１５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、又はＣＤ５９についてのリガンド；ＣＤ５についてのリガンド、例えばＣＤ７２；及びＣＤ５８(ＬＦＡ-３)についてのリガンド、例えばＣＤ２を含む。もちろん、かかるリガンドの任意の組合せは、本発明の実施において使用されても良い。
【００５１】
他の代表的及び非限定的な例は、標的Ｔ細胞及び他の細胞、例えばＢ細胞(例えばＣＤ４０を介して)、ＣＤ３４発現造血前駆細胞(例えばＣＤ６２Ｌを介して)、及びレトロウイルス及び／又はレンチウイルスの感染／複製に感受性のある他の細胞の表面に結合するリガンドを含む。リガンドとして使用する細胞表面分子のさらなる例は、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８とも呼ばれる)；ＦａｓＬ(Ｆａｓリガンド)；  ＣＤ７０；Ｂ７-Ｈ１(ＰＤ-Ｌ１とも呼ばれる)；Ｂ７-Ｈ２；Ｂ７-Ｈ３(Ｂ７ＲＰ-２とも呼ばれる)；Ｂ７-Ｈ４；ＣＤ２；ＣＤ３、又はＣＤ３／ＴＣＲ複合体；ＣＤ１１ａ；ＣＤ２６；ＣＤ２７；ＣＤ２８；ＣＤ３０Ｌ；ＣＤ３２；ＣＤ３８；ＣＤ４０Ｌ(ＣＤ１５４とも呼ばれる)；ＣＤ４５；ＣＤ４９；ＣＤ５０(ＩＣＡＭ-３とも呼ばれる)；ＣＤ５４(ＩＣＡＭ-１とも呼ばれる)；ＣＤ８０(Ｂ７.１とも呼ばれる)；ＣＤ８６(Ｂ７.２とも呼ばれる)；ＣＤ１００；ＣＤ１２２；ＣＤ１３７Ｌ(４-１ＢＢリガンドとも呼ばれる)；ＣＤ１５３；ＣＴＬＡ-４(ＣＤ１５２とも呼ばれる)；ＩＣＯＳ；ＯＸ４０Ｌ(ＣＤ１３４とも呼ばれる)；ＰＤ-１；ＰＤ-Ｌ２(Ｂ７-ＤＣとも呼ばれる)；ＳＬＡＭ(ＣＤ１５０とも呼ばれる)；ＴＩＭ-１；ＴＩＭ-２；ＴＩＭ-３；ＴＩＭ-４；及び２Ｂ４(ＣＤ２４４とも呼ばれる)を含む。幾つかのリガンドは、場合によりＭＨＣクラスＩＩと共発現してもよい。もちろん、かかるリガンドの任意の組合せは、本発明を実施する際に使用されてもよい。
【００５２】
本発明において使用するリガンド又はウイルス因子をコードする核酸は、既知の配列のＰＣＲ増幅を含む適切な又は都合のよい既知の方法のいずれかにより獲得されるか又は製造されてもよい。
【００５３】
リガンド分子の一のタイプは、Ｂ７-１(Ｂ８として以前から知られており、そしてＣＤ８０としても知られている)及びＢ７-２(ＣＤ８６としても知られている)などの刺激又は共刺激分子であって、ＣＤ２８に結合する分子である。Ｂ７-１及びＢ７-２は、免疫グロブリン・スーパーファミリーの一員である関連ホモダイマー糖タンパク質である。他の刺激又は共刺激分子は、抗-ＣＤ２８抗体又はその機能性部分であり、ＣＤ２８に結合するＦａｂ部分を含む。幾つかの実施態様では、パッケージング細胞は、ＣＤ５４ではなくＣＤ８６をリガンドとして発現する。
【００５４】
他のタイプのリガンドは、細胞-細胞接着分子である。これらは、様々なＩＣＡＭ分子を含み、これらは、細胞内接着分子(ＩＣＡＭ)ＩＣＡＭ-１、ＩＣＡＭ-２、ＩＣＡＭ-３、白血球機能関連抗原(ＬＦＡ)ＬＦＡ-１及びＬＦＡ-３を含む。ＩＣＡＭ関連メンバーは、全て、Ｔ細胞インテグリン、ＬＦＡ-１に結合する。樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞を含むＡＰＣ上に発現されることに加えて、ＩＣＡＭ-１及びＩＣＡＭ-２は、内皮細胞上で発現され、それにより、細胞接着を媒介し、そして本発明のパッケージされたベクターを用いた形質導入を可能にする。ＩＣＡＭ-３は、白血球上でのみ発現し、そうして本発明のリガンドとの結合について標的化される。いくつかの実施態様では、パッケージング細胞は、ＩＣＡＭ-１(ＣＤ５４)、ＩＣＡＭ２、又はＩＣＡＭ-３をリガンドとして発現せず、ＣＤ８６をリガンドとして発現する。
【００５５】
ＩＣＡＭ-１、-２、及び-３の間の相互作用は、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８)及びＬＦＡ-２(ＣＤ２)と、ＬＦＡ-１(ＣＤ１１ａ及びＣＤ１８)との間の第二結合相互作用と相乗的であることが観察された。こうして、これらのＩＣＡＭ分子は、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、及びＣＤ１８、或いはＣＤ２と共発現されて、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ及びＣＤ１８、或いはＣＤ２に結合する表面分子で細胞の標的化を許容する。いくつかの実施態様では、ＬＦＡ-１、ＬＦＡ-２、又はＬＦＡ-３は、ＣＤ８６と共発現しない。
【００５６】
ＩＣＡＭ-１、-２、及び-３との間の相互作用は、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８)及びＬＦＡ-２(ＣＤ２)とＬＦＡ-１(ＣＤ１１ａ及びＣＤ１８)との間の第二結合相互作用と相乗的であると観察された。これらのＩＣＡＭ分子は、こうして、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ及びＣＤ１８、又はＣＤ２と共発現して、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ及びＣＤ１８、又はＣＤ２に結合する表面分子を用いて細胞を標的化することを許容する。
【００５７】
本発明は、生存分子をリガンドとして使用して実施されうる。生存分子は、細胞死の刺激から誘導にわたる細胞応答において役割を果たす分子である。生存分子は、細胞の表面に晒されるタンパク質であってもよいし、又は他の細胞表面巨大分子、例えば炭水化物又は脂質などであってもよい。かかる細胞表面分子はまた、細胞表面上の受容体とも呼ばれる。本発明を実施する際に使用するための生存分子は、Ｆａｓリガンドを含む。
【００５８】
他の分子は、ＴＮＦ受容体、ＴＮＦ、及びＣＤ７０、ＩＩ型膜貫通タンパク質であって、ＣＤ２７に結合するＴＮＦファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。ＣＤ２７は休止中のＴ及びＢ細胞上に発現される一方、ＣＤ７０は活性型Ｔ及びＢ細胞上において発現される。ＣＤ７０のその受容体、ＣＤ２７への結合は、Ｔ細胞共刺激を誘導し、そして当該相互作用は、非刺激Ｔ細胞プールからのＴ細胞のリクルートに重要でありうる。他のある条件下では、ＴＮＦによるＴＮＦ受容体の活性化は、同様の応答をもたらす。
【００５９】
他の非制限的な細胞表面結合性の分子は、ＦＬＴ-３リガンド、ＴＰＯ、及びＫｉｔリガンド受容体に対する抗体又はリガンドであり、これらは、受容体を発現する細胞、例えば造血幹細胞を、ベクターによる形質導入についてより受容性にする。さらなる非制限的な細胞表面結合分子は、ＧＭ-ＣＳＦ及びＩＬ-４受容体に対する抗体又はリガンドであり、これらは、樹状細胞又はその前駆細胞、例えば単球、ＣＤ３４陽性幹細胞、又は樹状細胞系列における分化始原細胞などを、ベクターによる形質導入についてより受容性とする。他の細胞表面結合性分子は、別の細胞表面に結合する細胞表面上に見られる分子を含む。
【００６０】
細胞表面結合分子のさらなる実施態様は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、及びイオンを含み、それら全ては場合により他の物質と複合体形成している。幾つかの実施態様では、当該分子は、血液細胞の表面上に見られる因子、例えば、
【化１】
2008504821.tif 000003
に結合する。小文字(例えば「ａ」又は「ｂ」)は、複数の遺伝子産物から構成されるか、又は構造的に関連するタンパク質のファミリーに属する複合体化したＣＤ分子を指す。「ｗ」という表記法は、未だ十分に確認されていない推定のＣＤ分子を指す。ＣＤ分子のより完全なリストは、http:// at mpr.nci.niri.gov/prow/に見出される。もちろん、かかるリガンドの任意の組合せを、本発明を実施する際に使用してもよい。
【００６１】
他の非制限的な例は、リンパ球、Ｔ細胞、及び白血球の表面上に見出される因子、例えば、
【化２】
2008504821.tif 000004
に結合する分子である。もちろん、かかるリガンドの組合せは、本発明の実施に置いて使用されてもよい。
【００６２】
様々な構築物及び方法は、本発明のリガンド及びウイルス因子を発現するために使用されうる。非制限的な構築物は、使用されるパッケージング細胞においてリガンドの発現を制御する安定なプロモーターを含む構築物である。当該構築物は、本明細書に記載されるリガンド及びウイルス因子をコードする核酸配列に、作動可能なように結合される誘導性及び構成的プロモーターを含む。
【００６３】
本発明は、本明細書に記載されるウイルス因子及びリガンドを発現できる実質的に純粋な形態のプラスミド発現ベクターを使用して実施される。当該リガンド及びウイルス因子をコードする配列は、対応する組換えタンパク質を生成するために使用される。かかる配列の発現を仕向けることができるヘルパー・ベクターは、「発現ベクター」又は「発現プラスミド」と呼ばれてもよい。
【００６４】
発現ベクターは、宿主において挿入された配列の転写を促進する(当該配列に作動可能なように結合する)制御領域においてプロモーター配列を含む。当該配列は、本発明のリガンド又は「ペイロード」をコードしてもよい。ベクターは、構成的にある配列を発現する細胞に対する選択圧を制限するために、誘導性プロモーターを含んでもよい。発現ベクターはまた、複製起源並びに典型的に形質転換された細胞の表現系についての選択を可能にする特異的遺伝子を含む。作動可能なように結合されたという用語は、機能エレメント、例えば制御領域内の応答エレメント、と本明細書に記載されるコード配列及びプロモーターとの結合をもたらすために、核酸配列を共有結合されることを指す。
【００６５】
本発明において使用するためのベクターは、真核細胞に適合するベクターでありうる。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野において知られており、そして本発明のウイルス因子及びリガンドをコードする配列を発現するためのプロモーターを含む。これらの発現ベクターは、成熟ｍＲＮＡを生成するための任意のスプライシング・シグナル並びに正確かつ十分なポリアデニル化に必要とされる区別される配列エレメントを含んでもよい。これらは、場合により、コードされた遺伝子の発現レベルを増加させるために、ウイルスレプリコンを含む。高レベルの発現は、誘導性プロモーター、例えば非限定的に、メタロチオニンＩＩＡプロモーター及び熱ショックプロモーターを用いて達成されてもよい。
【００６６】
本発明は、組換えレトロウイルスパッケージング細胞を産生する方法も提供する。当該方法は、１）レトロウイルスの複製及び／又はパッケージングに必須であるウイルス遺伝子産物を当該パッケージング細胞内に発現できる核酸分子、及び２）標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、当該パッケージング細胞内に発現できる少なくとも１の核酸分子を、細胞中に導入することを含む。さらなる方法は、１）レトロウイルスのパッケージング及び／又は複製に必須であるウイルス遺伝子産物を当該パッケージング細胞内に発現できる核酸分子、及び２）標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、当該パッケージング細胞内に発現増加できる少なくとも１の核酸分子を、細胞内に誘導することを含む。
【００６７】
幾つかの実施態様において、本発明は、組換えリガンド及びウイルス因子の長期間に渡り高収率の産生をもたらす安定的なトランスフェクションをさらに提供する。安定的なトランスフェクションは、遺伝物質が次に起こる細胞複製及び細胞分裂の細胞周期の進行に渡り失われることがないように、遺伝物質を細胞ゲノムに組み込むことを指す。或いは、細胞は一過的にトランスフェクションされ、その結果、当該物質は次に生じる細胞複製及び細胞分裂の細胞周期の間、細胞から失われることもある。
【００６８】
パッケージング細胞は、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター及びエンハンサー配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)、及び場合により選択マーカーにより制御されるｃＤＮＡで形質転換されうる。当該選択マーカーは、選別への抵抗性を与え、そして細胞が安定してプラスミドを細胞の染色体に組み込むこと及び細胞系列に行き渡ったクローンを形成するように増殖することを許容する。
【００６９】
本発明は、同じベクター内に存在し、そして一つの又は別々の(場合により複数の)制御エレメント、例えばプロモーターの制御下で存在するリガンド及び／又はウイルス因子をコードする１を超える配列の存在も考慮に入れる。こうして、本発明のウイルス因子タンパク質及び／又は組換えリガンドをパッケージング細胞内で産生するためのヘルパー・ベクター構築物の全ての可能な組合せが考慮される。
【００７０】
パッケージされたベクターにより標的される細胞型(つまり標的細胞)は、非限定的に、初代細胞、例えば、有核血液細胞の全ての形態を含む血液細胞；肝細胞；内皮細胞；リンパ球；及び悪性及び良性腫瘍細胞を含む腫瘍細胞を含む。こうした細胞への投与のために、パッケージされたベクターは、ヒトなどの動物に、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ技術を介して投与されてもよい。
【００７１】
さらに、本発明は、ウイルスベクターを生成又はパッケージングする方法を提供する。本方法は、１)本発明のパッケージング細胞中に、レトロウイルス・ベクターをコードするか又は含む核酸分子を導入し、そして２)パッケージング細胞の１以上の膜関連非ウイルスリガンドを含む粒子内に当該ベクターをパッケージする条件下で、当該細胞を培養することを含む。当該リガンドは、本明細書に記載されるとおりであり、そして標的細胞の細胞表面分子に結合することもある。幾つかの実施態様では、レトロウイルス・ベクターをコードするか又は含む核酸分子は、パッケージング細胞内に導入される「第二」核酸である。
【００７２】
本発明を一般的に記載したが、例示により提供され、そして他に記載がない限り本発明を限定するものとして意図されない以下の実施例を参照して、同じものはより容易に理解されよう。
【実施例】
【００７３】
実施例１：レンチウイルス・ベクターの膜にとり込まれたＣＤ５４により媒介される形質導入の増加
ＶＲＸ４９４は、ｃｐｐｔ／ＣＴＳ配列、ＨＩＶエンベロープ遺伝子に狙いを定めた９３７塩基アンチセンス・ペイロード、及び更なる実施態様において取り除かれうるＧＦＰ-マーカー遺伝子を含むＨＩＶに基づく最小のレンチウイルス・ベクターである。後者二つの核酸配列は、両方ともＬＴＲプロモーターの制御下で発現される。ＶＲＸ４９４を、論文に示された方法(Ｌｕら、２００４)に従って、一のヘルパー・プラスミドの存在下で２９３ＦＴ細胞を一過的にトランスフェクションすることにより産生して、Ｇタンパク質偽型ウイルス粒子をもたらした。パッケージング細胞の細胞表面上におけるＣＤ５４の発現が、ベクター膜エンベロープ上での発現をもたらし、そうして形質転換を高めるかを試験するために、ＣＤ５４発現構築物(ＶＲＸ５８８)を作成した。ＶＲＸ４９４を、ＶＲＸ５８８の存在下又は不存在下のいずれかで産生して、ウイルス粒子エンベロープ膜表面においてＣＤ５４を含むか又は含まないベクターをもたらした。ベクター含有上清を、様々な間隔で回収し、貯蔵し、そして遠心した。ベクターペレットを、緩衝液中で再構成し、そして次に論文に発表された方法(Ｌｕら、２００４)に従ってＨｅＬａ-ｔａｔ細胞上で滴定した。
【００７４】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球をＭＡＣＳ陽性選別によりヒトＰＢＭＣから単離した。精製された細胞を、Ｔ細胞培地中で一晩１ウェルあたり１×１０6の濃度で、１セルあたり３ビーズの割合でＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で培養した。これにより、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８(ＬＦＡ-１)構造が影響を受けて、ベクター粒子上のＣＤ５４(ＩＣＡＭ-１)による結合に対しより受容性になった。形質導入は、レトロネクチンの存在下又は不存在下で、２０のＭＯＩで三回行った。培養物を、５％ＣＯ2中で３７℃で３日間、ベクターの存在下でインキュベーションした。使用されなかったベクターを洗い流し、そして細胞を次に１ｍｌあたり０.５×１０6細胞で再び蒔いた。ある体積の培養培地を適切な容器に移すことにより細胞を最大７日間維持した。７日目に培養物を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、計数し、そしてＳＯＰに従ってＴａｑＭａｎＰＣＲを用いて、細胞あたりの平均ベクター・コピー数を決定するために１０6細胞／バイアルで乾燥ペレット化した。
【００７５】
形質導入を高める能力について知られている化合物であるレトロネクチンの存在下では、ＣＤ５４の存在は、ＣＤ５４なしの対照に比べて標的初代ＣＤ４Ｔリンパ球において約７倍にコピー数を増大させた。レトロネクチンの非存在下では、ＣＤ５４は、標的コピー数をＣＤ５４なしの対照の１０倍に高めた。形質導入の同等のレベルは、レトロネクチンの存在下又は不存在下において、ＣＤ５４陽性ベクターにより形質導入された細胞について達成された(図１)。このことは、ＣＤ５４の存在が主要な効果を有する一方、レトロネクチンが形質転換に関して比較的小さいプラスの効果しか有さないということを示唆する。
【００７６】
実施例２：ベクター膜上に発現されたＣＤ８６と共にパッケージされたレンチウイルス・ベクターを用いた形質導入後における細胞刺激及び増殖の増加
２９３細胞は、当該タンパク質をコードする発現構築物を用いて、細胞にトランスフェクションさせることにより、ＣＤ５４、ＣＤ８６、又はその両方を含むように改変された。幾つかの点について、フリーサイトメトリーによる評価により、トランスフェクションされた細胞を試験して、細胞表面上に正しくタンパク質が発現しているかを確認した。細胞を、抗ＣＤ５４-ＰＥ又は抗ＣＤ８６-ＰＥで染色し、そして生存率についてヨウ化プロピジウムで染色した。イソ型対照である抗-マウスＩｇＧ１−ＰＥ及び抗-マウスＩｇＧ２ａをベースライン染色を検出するために使用した。
【００７７】
刺激及び増殖の評価について、ヒト・アフェレーシス生成物から単離され、続いて(Miltenyi装置を用いた)ＣＤ４＋濃縮によりＣＤ４Ｔ細胞について精製された凍結ＣＤ４＋Ｔ細胞を、５％ヒトＡＢ血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ-２、及び１.６ｍｇ／ｍｌのＮ-アセチルシステイン(ＮＡＣ)を含むＸ-ｖｉｖｏにおける１５の培地中で培養した。細胞を、次の３個の条件：添加なし、５ｍｇ／ｍｌの濃度での抗ＣＤ３抗体(クローンＯＫＴ-３)、又は１セルあたり３ビーズの濃度の抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズのうちの１つの条件において、１×１０6細胞／ｍｌの濃度で蒔いた。これらの３種の条件について、ベクターなし、対照ベクター、又はその膜にＣＤ５４、ＣＤ８６、又はこれらの両タンパク質を一緒に含む対照ベクターを試験した。
【００７８】
１日目及び２日目において、全てのウェル内の細胞を、ゆっくり再懸濁して、全ての凝集を破壊した。３日目において、細胞を２回洗浄し、そして計数し、そしてＺ２Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて大きさを計測した。７日目において、細胞を計数し、そして再び大きさを計測し、そして緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)の発現について分析した。ＧＦＰは、使用したレンチウイルス・ベクターにより発現される遺伝子のマーカーである。この時点で、活性化マーカーであるＣＤ２５及びＣＤ６９の発現を、抗-ＣＤ２５-ＰＥ又は抗-ＣＤ６９-ＰＥ、及びヨウ化プロピジウムを使用し、ベースライン染色についてＩｇＧＫ１-ＰＥイソ型対照を用いて、試験した。
【００７９】
２セットの実験を行った。最初の実験は、上で記載される２９３細胞において産生されたベクターを使用した。２回目の実験は、細胞系列を前もって樹立することなく、単純な一過的コトランスフェクション技術を用いて、細胞内で産生されたベクターを使用した。これらの実験の増殖結果をそれぞれ図２及び３に示す。可溶性抗-ＣＤ３抗体と組み合わせて、ＣＤ８６-表面発現レンチウイルス・ベクターで処理された細胞は、通常(未改変)ベクターで処理した細胞を超える有意に高い増殖を示した。ＣＤ５４は、細胞増殖を高めるか又は遅延させる役割を果たすようには見えなかった。２９３Ｆ細胞系列を用いて、又は一過的トランスフェクションを介して産生されるベクターで処理された細胞間で観察される有意差は存在しなかった。
【００８０】
ＣＤ８６及びＣＤ５４を発現する２９３細胞の共培養は、ＣＤ５４のみを発現する２９３細胞に比べて、ＣＤ４＋Ｔ細胞上での活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の発現を高めた(図４及び５に示される)。これらの結果は、ＣＤ８６発現細胞に晒された細胞における改善された増殖が細胞活性化の結果であるという発見を支持した。
【００８１】
最後に、ベクターの表面上にＣＤ８６を発現することは、２９３Ｆ細胞系列により又は上で記載されるように一過的トランスフェクションにより産生されるベクターについて、７日目でＧＦＰ発現レベルを高めた。ＣＤ８６と組み合わせたＣＤ５４がベクター挿入の細胞あたりのコピー数を改善することが前に示されたが、この実験において、ＣＤ５４は、ＣＤ８６のみに比べた場合、ベクターで誘導された細胞の全体の割合へ寄与しないように思える。ＣＤ８６のみの存在は、１０％未満から約３０％まで、形質導入割合を増大させた。
【００８２】
これらのデーターを合わせると、ベクター粒子の表面に刺激リガンドをとり込むことが、細胞刺激及び増殖を高めることができるということが明らかに示される。
【００８３】
本明細書に引用される参考文献、例えば特許、特許出願、及び公開は、本明細書中で具体的に援用されているかどうかに関わらず、その全てを本明細書中に援用する。
【００８４】
本発明を十分に記載してきたが、本発明の本質及び範囲から逸脱せず、そして過度の実験を必要とすることなく、本発明と同一物が、同等のパラメーター、濃度、及び条件の広い範囲内で行われうるということが、当業者により認められよう。
【００８５】
本発明が、その具体的実施態様に関して記載された一方、さらなる改変が可能であることが理解されよう。本出願は、本発明が属する技術分野における既知又は慣用事項になる場合、並びに本明細書に記載された本質的特徴に適用される場合、一般的に本発明の原理に従い、そして本開示からのかかる逸脱を含む本発明の任意の変化、使用、又は適用に及ぶことが意図される。
【００８６】
参考文献
【化３】
2008504821.tif 000005
【化４】
2008504821.tif 000006
【化５】
2008504821.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ＣＤ５４を発現する細胞中でパッケージされたウイルスベクターを使用することにより、ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球中への遺伝子導入(導入レベル)を増大させる能力について示す。ＨＩＶに基づくレンチウイルス・ベクターを、膜内でＣＤ５４タンパク質を発現するか又は発現しない細胞内で産生した。ベクターは、レトロネクチンの存在下又は非存在下において形質導入した後に、標的細胞中でＴａｑＭａｎ(登録商標)ＰＣＲに基づく検出を使用してコピー数を評価することにより、遺伝子導入について比較した。ｎ＝３
【図２】図２は、通常のヒト・アフェレーシスから単離されたＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞の、以下の３種の条件：培地のみ(ｎａｄａ)、抗-ＣＤ３抗体溶液(ＣＤ３)、又は抗-ＣＤ３／２８抗体被覆ビーズ(Ｂ)のうちの一つに晒した後の細胞増殖曲線を示す。３種の条件の各群由来の細胞を、２０の感染多重度(ＭＯＩ)で以下の５種のベクター調製品：ベクター緩衝液のみ(ＮＶ)、未改変対照ベクター(ＣＶ)、又は膜表面上においてＣＤ５４を発現する細胞中にパッケージされたベクター(５４)、又は膜表面上においてＣＤ８６を発現する細胞中にパッケージされたベクター(８６)、又はその両方を発現する細胞中にパッケージされたベクター(５４／８６)のうちの一つに晒した。細胞を、２１日間の間、Ｚ２コールター・カウンター(Ｚ２ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ)を用いて細胞をモニターした。ｎ＝３
【図３】図３は、通常のヒト・アフェレーシスから単離されたＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞の、以下の３種の条件：培地のみ(ｎａｄａ)、抗ＣＤ３抗体溶液(ＣＤ３)、又は抗ＣＤ３／２８抗体被覆ビーズ(Ｂ)の条件のうちの１つに晒した後の細胞増殖曲線を示す。３種の条件のうちの各群からの細胞を、２０のＭＯＩで５種の異なるベクター調製品：ベクター緩衝液のみ(ＮＶ)、未改変対照ベクター(ＣＶ)、又はＣＤ５４(５４)若しくはＣＤ８６(８６)、又はその両方で組み合わせた２９３Ｆ細胞中で一過的にトランスフェクションすることにより産生されたベクターのうちの一つに晒した。細胞を、２１日間の間増殖についてＺ２コールター・カウンターを用いてモニターした。ｎ＝３
【図４】図４は、通常のヒト・アフェレーシス産物から単離された初代ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞の活性化の亢進であって、ＣＤ５４のみに比較した場合に活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ８６及びＣＤ５４をその膜表面で発現する２９３細胞で共培養した後に、活性化マーカーＣＤ２５の発現増加により計測された亢進を示す。細胞を刺激性抗ＣＤ３抗体の不存在下で、又は５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗ＣＤ３抗体濃度の範囲でインキュベーションした。ＣＤ２５の発現(頻度及び平均蛍光)を、培養開始後４日目で計測した。ｎ＝３、及び平均からの標準誤差を示す。
【図５】図５は、通常のヒト・アフェレーシス産物から単離された初代ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞の活性化の亢進であって、ＣＤ５４のみに比べた場合に、その膜上にＣＤ８６及びＣＤ５４を発現する２９３細胞と共培養した後に、活性化マーカーＣＤ６９の発現増加により計測される亢進を指す。細胞を、刺激性抗ＣＤ３抗体の非存在下で、又は５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体の範囲でインキュベーション下。ＣＤ６９発現(頻度及び平均蛍光)を培養開始後４日目で計測した。ｎ＝３、及び平均からの標準誤差を示す。
【図６】図６は、通常のヒト・アフェレーシス産物から単離された初代ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞における形質導入の効果であって、ＧＦＰをマーカー遺伝子として発現する未改変又は改変レンチウイルス・ベクターに晒した後の効果を示す。細胞を、刺激性抗体なし(ｎａｄａ)、抗-ＣＤ３抗体溶液(ＣＤ３)、又は抗ＣＤ３／２８抗体被覆ビーズ(Ｂ)に晒した。３種の条件についての各群を、２０のＭＯＩで、幾つかのベクター群：非改変対照ベクター(ＣＶ)、ＣＤ５４(５４)、ＣＤ８６(８６)、又はその両方(５４／８６)を発現する細胞系列において産生されるベクターのうちの一つに晒した。改変細胞の割合として計測されたＧＦＰ発現レベルに加えて、相対ＣＤ２５及びＣＤ６９タンパク質レベルが示される。ｎ＝３及び平均値からの標準誤差を示す。
【図７】図７は、通常のヒト・アフェレーシス産物から単離された初代ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞における形質導入の効果であって、ＧＦＰをマーカー遺伝子として発現する未改変又は改変レンチウイルス・ベクターに晒した後の効果を示す。細胞を、刺激性抗体なし(ｎａｄａ)、抗-ＣＤ３抗体溶液(ＣＤ３)、又は抗ＣＤ３／２８抗体被覆ビーズ(Ｂ)に晒した。３種の条件についての各群を、２０のＭＯＩで、幾つかのベクター群：非改変対照ベクター(ＣＶ)、ＣＤ５４(５４)、ＣＤ８６(８６)、又はその両方(５４／８６)を一過的に発現する細胞系列において産生されるベクターのうちの一つに晒した。改変細胞の割合として計測されたＧＦＰ発現レベルに加えて、相対ＣＤ２５及びＣＤ６９タンパク質レベルが示される。ｎ＝１
【図１】
2008504821.tif 000008
【図２】
2008504821.tif 000009
【図３】
2008504821.tif 000010
【図４】
2008504821.tif 000011
【図５】
2008504821.tif 000012
【図６】
2008504821.tif 000013
【図７】
2008504821.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月9日(2007.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして当該細胞の細胞周期の移行を活性化又は刺激する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、パッケージング細胞内で発現することができる第一核酸分子を含む、組換えレトロウイルス・パッケージング細胞。
【請求項２】
前記パッケージング細胞が、レトロウイルス構造タンパク質又はアクセサリータンパク質を発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
パッケージされるレトロウイルス・ベクターをさらに含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、パッケージング細胞において発現することができる第一核酸分子を含む組換えレトロウイルス・パッケージング細胞であって、第二核酸分子の非存在下でウイルス粒子を産生しない、前記細胞。
【請求項５】
前記レトロウイルス・パッケージング細胞が以下の：
ｉ)  標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合によりウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との融合を媒介するように機能する当該ウイルスリガンドを発現できる異種核酸分子
ｉｉ)ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はそれらの組合せを発現できる異種核酸分子
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記標的細胞が、抗原提示細胞(ＡＰＣ)、造血細胞系列の細胞、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、以下の：
ｉ)  Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲ複合体が、天然若しくは人工リガンド又は特異的Ａｂにより結合されるとき、当該Ｔ細胞表面分子に結合してＴ細胞の増殖を活性化する、共刺激分子
ｉｉ)当該細胞表面分子への結合を介して、細胞-細胞接着の役割を果たす分子
である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、前記細胞表面分子を結合した後に、前記標的細胞を活性化して増殖させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、２個のかかるリガンドを含む、請求項１〜６に記載のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、造血細胞のリガンドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、膜貫通タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＢＰ、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０(Ｂ７-１)、ＣＤ８６(Ｂ７-２)、又はＦａｓリガンド(ＦａｓＬ)、ＣＤ７０、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８)、Ｂ７-Ｈ１(ＰＤ-Ｌ１)、Ｂ７-Ｈ２、Ｂ７-Ｈ３(Ｂ７ＲＰ-２)、Ｂ７-Ｈ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ(ＣＤ１５４)、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ５０(ＩＣＡＭ-３)、ＣＤ５４(ＩＣＡＭ-１)、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７Ｌ(４-１ＢＢリガンド)、ＣＤ１５３、ＣＴＬＡ-４(ＣＤ１５２)、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ(ＣＤ１３４)、ＰＤ-１、ＰＤ-Ｌ２(Ｂ７-ＤＣ)、ＳＬＡＭ(ＣＤ１５０)、ＴＩＭ-１、ＴＩＭ-２、ＴＩＭ-３、ＴＩＭ-４、２Ｂ４(ＣＤ２４４)、又はそれらの組合せである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、Ｂ７-Ｈ1、Ｂ７-Ｈ2(ＩＣＯＳ-Ｌ、Ｂ７ＲＰ-１、及びＧＬ５０としても知られている)、Ｂ７-Ｈ3、及びＢ７-Ｈ4などのＢ７関連分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
ＩＣＡＭ-１(ＣＤ５４)、ＩＣＡＭ-２(ＣＤ１０２)、ＩＣＡＭ-３(ＣＤ５０)、ＩＣＡＭ-４(ＬＷ)、及びＩＣＡＭ-５(テレンセファリン)などの前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、つまりＣＤ１１ａとＣＤ１８の複合体、に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記膜関連非ウイルスリガンドは、ＰＤ-Ｌ2又はＰＤ-Ｌ1などのＰＤ-１リガンド；ＯＸ４０(ＣＤ１３４)に結合するＯＸ４０リガンド；４-１ＢＢ(ＣＤ１３７)に結合する４-１ＢＢリガンド；ＬＦＡ-２(ＣＤ２)に結合する、ＣＤ１５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、又はＣＤ５９などのリガンド；ＣＤ５に結合する、ＣＤ７２などのリガンド；又はＬＦＡ-３(ＣＤ５８)に結合する、ＣＤ２などのリガンドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する抗体又は抗体断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する微生物タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記標的細胞がＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋であり、又はネクチン１を発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記標的細胞がＴ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記標的細胞が樹状細胞又はリンパ節中心におけるＢ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
組換えレトロウイルス・パッケージング細胞を産生する方法であって、当該方法が以下の：
レトロウイルスのパッケージング及び／又は複製に必要とされるウイルス遺伝子産物を、当該パッケージング細胞内で発現できる核酸分子、
標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドを、当該パッケージング細胞内で発現できる少なくとも１の核酸分子
を細胞内に導入することを含む、前記方法。
【請求項２４】
ウイルスベクターをパッケージングする方法であって、当該方法が以下の：
レトロウイルス・ベクターをコードするか又は含む第二核酸分子を、請求項１、２、４、又は５のいずれか一項に記載の組換え細胞中に導入し、そして
上記細胞が標的細胞の細胞表面分子に結合する膜関連非ウイルスリガンドを含む粒子中に上記ベクターをパッケージする条件下で、当該細胞を培養する
を含む、前記方法。
【請求項２５】
前記ウイルス遺伝子産物が、標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合により前記ウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との融合を媒介するように機能する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、造血細胞系列の細胞、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、以下の：
ｉ)  Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲ複合体が、天然若しくは人工のリガンドにより結合されるか、又は特異的抗体により結合される場合、Ｔ細胞表面分子に結合してＴ細胞増殖を活性化する共刺激分子、及び／又は
ｉｉ)  当該細胞表面分子への結合を介して、細胞-細胞接着の役割を果たす分子
である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、前記細胞表面分子に結合後に、前記標的細胞を活性化して増殖させる、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１の膜関連非ウイルスリガンドが、２のかかるリガンドを含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、造血細胞のリガンドである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、膜貫通タンパク質である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＢＰ、ＣＤ４０、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０(Ｂ７-１)、ＣＤ８６(Ｂ７-２)、Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ)、ＣＤ７０、ＬＦＡ-３(ＣＤ５８)、Ｂ７-Ｈ１(ＰＤ-Ｌ１)、Ｂ７-Ｈ２、Ｂ７-Ｈ３(Ｂ７ＲＰ-２)、Ｂ７-Ｈ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ(ＣＤ１５４)、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ５０(ＩＣＡＭ-３)、ＣＤ５４(ＩＣＡＭ-１)、ＣＤ１００、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７Ｌ(４-１ＢＢリガンド)、ＣＤ１５３、ＣＴＬＡ-４(ＣＤ１５２)、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ(ＣＤ１３４)、ＰＤ-１、ＰＤ-Ｌ２(Ｂ７-ＤＣ)、ＳＬＡＭ(ＣＤ１５０)、ＴＩＭ-１、ＴＩＭ-２、ＴＩＭ-３、ＴＩＭ-４、２Ｂ４(ＣＤ２４４)、又はそれらの組合せである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルス遺伝子産物が、ポリオウイルス受容体ＣＤ１５５、野生型単純疱疹ウイルス(ＨＳＶ)-１エンベロープタンパク質、又は他のウイルス・エンベロープタンパク質である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、Ｂ７-Ｈ1、Ｂ７-Ｈ2(ＩＣＯＳ-Ｌ、Ｂ７ＲＰ-１、及びＧＬ５０としても知られている)、Ｂ７-Ｈ3、及びＢ７-Ｈ4などのＢ７関連分子である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＩＣＡＭ-１(ＣＤ５４)、ＩＣＡＭ-２(ＣＤ１０２)、ＩＣＡＭ-３(ＣＤ５０)、ＩＣＡＭ-４(ＬＷ)、及びＩＣＡＭ-５(テレンセファリン)などの前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、つまりＣＤ１１ａとＣＤ１８との複合体に結合する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＰＤ-Ｌ2又はＰＤ-Ｌ1などのＰＤ-１リガンド；ＯＸ４０(ＣＤ１３４)に結合するＯＸ４０リガンド；４-１ＢＢ(ＣＤ１３７)に結合する４-１ＢＢリガンド；ＬＦＡ-２(ＣＤ２)に結合する、ＣＤ１５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、又はＣＤ５９などのリガンド；ＣＤ５に結合する、ＣＤ７２などのリガンド；又はＬＦＡ-３(ＣＤ５８)に結合する、ＣＤ２などのリガンドである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する抗体又は抗体断片である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記膜関連非ウイルスリガンドが、ＬＦＡ-１、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、及びＣＤ４３に結合する微生物タンパク質である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋であるか、又はネクチン１を発現する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的細胞がＴ細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的細胞が、樹状細胞又はリンパ節中心のＢ細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
標的細胞又は組織の細胞表面分子に結合できる少なくとも１の膜関連リガンドを内在的に発現する細胞を含む、レトロウイルスベクターパッケージング細胞。
【請求項４５】
前記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて標的細胞又は組織と相互作用する、請求項４４に記載のパッケージング細胞。
【請求項４６】
前記細胞が骨髄間質細胞であり、前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項４５に記載のパッケージング細胞。
【請求項４７】
前記リガンドがインテグリンであり、そして前記標的細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項４４又は４５に記載のパッケージング細胞。
【請求項４８】
前記リガンドがＳＤＦ-１  ＶＬＡ-４、ＶＬＡ-５、又はＬＦＡ-１であり、そして前記造血幹細胞がＣＤ３４＋及びＣＤ３８-／ＣＸＣＲ４＋、又はＣＤ３４＋、及びＣＤ３８ｌｏ／ＣＸＣＲ４＋である、請求項４７に記載のパッケージング細胞。
【請求項４９】
前記細胞が、レトロウイルス・パッケージング細胞であり、そのため標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合によりウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との融合を媒介するように機能するウイルスリガンドを発現できる異種核酸分子を含む、請求項４４に記載の細胞。
【国際調査報告】
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