(57)【要約】  小さなパイプライン化されたステップにおいてサンプル・データを処理するために、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）などのハードウェアを用いて、フロー・アナライザ（４２０）からサンプル・データを処理するためのシステムおよび方法。処理は、データの読み取りと書き込みとが同期であり、バッファ・オーバーランまたはデータ損失を回避する循環バッファを含む。このパイプライン処理の方法によって、処理速度を制限することなく、データ取得チャネルまたはさらなる処理ステップを増加させることが可能となる。
2008523354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプリングされたデータを収集するためのサンプル速度で信号をサンプリングし、前記サンプリングされたデータを前記サンプル速度でメモリの中に記憶するステップと、
前記サンプリングされたデータを前記サンプル速度で、前記メモリからプログラマブル論理装置（ＰＬＤ）に読み取るステップと、
前記サンプリングされたデータを、前記ＰＬＤを用いて前記サンプル速度で処理するステップとを含み、前記処理が、前記サンプリングされたデータの論理操作を実行する１つまたは複数のサブステップを含むデータを収集し、処理する方法。
【請求項２】
前記サンプリングされたデータを記憶することとサンプリングすることとが、同期している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メモリは循環バッファを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理するステップは、各々が前記サンプリングされたデータの論理操作を実行する複数のサブステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サブステップのうちの少なくとも１つは演算オペレーションを含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複数の信号は各々のチャネルによって受信され、前記サンプリングするステップ、読み取るステップ、処理するステップが各チャネル上で実行される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
各チャネルからのサンプル・データの前記処理は、複数のパイプライン化されたサブステップを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＬＤは、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フロー・アナライザによって収集されたサンプリングされたデータのセットを、循環バッファ内の複数のデータ記憶領域のうちの１つに書き込むステップと、
同時に、以前にそこに記憶されたサンプリングされたデータの異なるセットを１つのデータ記憶領域から読み取るステップとを含む、フロー・アナライザによって収集されたデータを処理する方法。
【請求項１０】
前記書き込むステップと前記読み取るステップとは、実質的に同じ速度で実施される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記読み取るステップは、サンプリングされたデータの前記異なるセットをプログラマブル論理回路（ＰＬＤ）に読み取ることを含み、前記方法はサンプリングされたデータの前記異なるセットの論理操作を、前記ＰＬＤを使用して実行することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
サンプリングされたデータの前記セットを書き込む前記ステップはアナログ・デジタル変換（ＡＤＣ）速度で実施され、前記論理操作を実行する前記ステップは、より低いＡＤＣ速度、および前記ＰＬＤと前記循環バッファのうちの少なくとも１つのサンプル伝播遅延によって制限された速度で実施される請求項２１に記載の方法。
【請求項１３】
フロー・アナライザによって収集されたサンプリングされたデータの新たなセットを循環バッファに書き込むステップを含み、サンプリングされたデータの前記新たなセットを書き込む前記ステップによって、前記循環バッファ内に記憶されたサンプリングされたデータの最も古いセットが読み取られる、フロー・アナライザによって収集されたデータを処理する方法。
【請求項１４】
サンプリングされたデータの前記新たなセットを書き込む前記ステップは、サンプリングされたデータの最も古いセットが記憶されたところと同じデータ記憶領域に、サンプリングされたデータの前記新たなセットを書き込むことを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプリングされたデータの前記新たなセットを書き込む前記ステップによってさらに、サンプリングされたデータの最も古いセットがプログラマブル論理装置によって処理される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
サンプリングされたデータの前記新たなセットを書き込む前記ステップと、サンプリングされたデータの最も古いセットを読み取る前記ステップとは、実質的に同じ速度で実施される請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
（優先権出願）
本出願は、２００４年１１月１７日に出願した第６０／６２８，７１５号「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍａｎａｇｉｎｇ  Ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｌｏｗ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は一般に、例えば検査区域を通るフローからの粒子や細胞に関するデータと、イベント間のバックグラウンド・ノイズに関連するデータを記憶することによって、フロー・アナライザまたはその他のデータ収集デバイスから得られた情報の量を増加させるための装置と方法に関する。特に、本発明はサンプル処理をパイプライン化されたステップに分割し、循環バッファ、または類似のバッファもしくは一時的な記憶機能を使用することによって、蛍光サンプルが取り出される速度を増加させるための装置と方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
フロー・サイトメトリは、狭い検査区域に作用する光ビームを通る細胞および／または粒子の１つまたは複数の光パラメータを迅速に測定するために、便利に使用されている。フロー・サイトメトリについての背景情報は、例えば参照によりその全部が本明細書に組み込まれている「Ｓｈａｐｉｒｏ’ｓ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」、Ａｌａｎ．Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．１９９５年の中に見られる。
【０００４】
従来のフロー・サイトメータでは、サンプルの細胞および／または粒子を含むサンプル液が、サンプルを結合されたストリームの中心部に引き込む、より速く流れるシース液のストリームの中心または中心近くにサンプル・チューブから導入される。流体力学的絞込み(hydrodynamic focusing)として知られているこのプロセスによって、細胞および／または粒子は、フロー細胞の測定ポイントの中心部またはその他の検査区域に再現可能に届けられる。典型的に、細胞および／または粒子はフロー細胞の中で懸濁している。
【０００５】
連続波レーザは、懸濁液ストリームのフローによって、検査区域を通るときに細胞および／または粒子にレーザ・ビームを集中させる。フロー・ストリームの中の関心の対象がレーザ・ビームによって照らされる場合、特定の信号が生じ、検出器によって検知される。例えばこれらの信号は、個々の細胞および／または粒子のサイズに関する情報を提供する前方光散乱強と、個々の細胞および／または粒子の相対的サイズや屈折特性に関する情報を提供する側方光散乱強度とを含む。
【０００６】
検出器によって検知されるその他の信号は、例えばタンパク質もしくはその他のペプチドか、またはその他の生体分子もしくは人工分子に固有のものであるトリプトファンもしくはその他の蛍光アミノ酸、またはその他の分子などの、１つまたは複数の蛍光色素および／またはその他の蛍光分子からの蛍光放射を含む。典型的に、分析方式で複数の異なる蛍光分子が用いられる場合、蛍光放射ピークは、各々の蛍光放射ピークの間のスペクトル重複を最小化するか、または理想的には除去するために選択される。
【０００７】
例えば、理想的には蛍光放射ピークは５０μｍによって異なるが、例えば２０、３０、または４０μｍなどより小さい（またはより大きい）スペクトル分離もまた、有利に適応され、使用されることも可能であり、ここではスペクトル分離が大きいほど、各々の蛍光放射体の間の差異はより大きい。さらに、蛍光分子の選択において量子効率が考慮される。複数の異なる蛍光分子を使用する場合、各々の蛍光放射体の放射の異なる波長のために分離検出器がチューニングされ、使用される。２つ以上の蛍光分子についての励起波長は同じであってもよく、または各々の異なる蛍光分子の励起スペクトルに適合させるために異なる励起波長が使用されてもよい。
【０００８】
分析手順によって生成される光信号は、出力メータおよび／またはデータ記憶手段に送くられる。例えばデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）またはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）による信号処理が、測定された光信号の強度データが出力メータおよび／またはデータ記憶手段に送信される前および／または後に、用いられる。
【０００９】
フロー・サイトメトリでは、細胞または粒子がレーザまたはその他の光源のビームの中を通る場合に「イベント」が生じる。イベントが進行すると、散乱および／または蛍光放射からの測定された光は、細胞または粒子がビームに入ってゆくにつれて増加してゆき、ビームの中心部で最大値に達し、ビームを離れるにつれて公称値にまで次第に減少する。
【００１０】
現状技術のフロー・サイトメータは、イベントを測定するために通常は２つのシステムのうちの１つを使用する。１つのシステムは、イベントから得られた最大信号レベルを維持するため、およびレーザ・ビームを通る細胞および／または粒子に関する光パラメータを測定するために、ピーク保持回路を含むピーク検出器を使用する。一旦ピーク検出器がイベントを検知し、測定すると、アナログ・デジタル（Ａ／Ｄ）コンバータが信号の最大値をデジタル化するのに十分な時間を与えるために、ピーク・ディテクはオフにされる。ピーク検出器がオフにされている時間は「デッド・タイム」と呼ばれ、レーザ・ビーム内で生じるいかなるイベントも検出されなくなる。
【００１１】
第２のシステムは、イベントのために集められたピークを下回る領域を測定するために、インテグレータを使用する。どちらのシステムでも、デッド・タイムの間にサイトメータの光ビームの中でイベントが生じる場合、イベントは検出されなくなる。
【００１２】
通常そのようなイベント検出の不足分は、多数のイベントに対してごく少数のものが見落とされるだけなので、重大な問題になることはない。しかしながら、例えば１０００または１００万の中での１つの特別な細胞または粒子の識別など、稀で重要なイベントの検出を必要とする応用例は、検出と測定のために現世代のフロー・サイトメータが使用される場合に、起こり得る稀なイベントの検出見落としの損害を受ける。処理量が増える程、ユニットの時間周期ごとにそうした重大なイベントが見落とされる可能性が高くなる。
【００１３】
フロー・サイトメトリにおけるサンプルの記憶で生じる問題への１つの解決法は、参照により本明細書に組み込まれているＣｏｒｉｏ他の米国特許第５，５５０，０５８号によって提供される。Ｃｏｒｉｏ他は、フロー・サイトメータで検出されたイベントの分類についての判断を柔軟に制御する手段を提供する。イベントは、デッド・タイムの間に見落とされたイベントの整理を可能にするために、ユーザによる選択が可能なパラメータにしたがって事前に評価を与えられている。しかしながらＣｏｒｉｏ他の言及は、デッド・タイムのイベントが見落とされる可能性をゼロにまで減少させる手段を教示または示唆してはいない。
【００１４】
（参照により組み込まれている）米国特許第６，６５８，３５７号は、「デッド・タイム」問題や、稀なイベントの捕獲に対する解決法を提供する。しかしながら、米国特許６，６５８，３５７号は、サンプル・データを循環バッファに書き込み、循環バッファから読み取るために、非同期のプロセスを用いている。また、蛍光サンプルが取り出されてもよい速度は、ＤＳＰ機能とメモリによって制限される場合がある。例えば蛍光サンプル速度が高まることは、サンプル・データの損失につながることもある、上述のように望ましくない不十分なＤＳＰ帯域幅およびバッファ・オーバーランにつながる可能性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、フロー・サイトメータまたはその他の分析機器を含むフロー・アナライザの分野では、任意のイベントが見落とされる可能性またはバッファ・サイズが増大する可能性を伴わずに、増加された蛍光サンプルを処理する手段を有することが有益である。
【００１６】
さらに、そうした高いサンプリング速度のためのイベント見落としの可能性を減少させながら、サンプル速度を最大にするためのシステムおよび／または方法を、効率的かつ安価に提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上で概説された問題は、本発明によるシステムと方法によって解決される。概して、システムは循環バッファにサンプル・データを書き込み、循環バッファからサンプル・データを読み取るための同期プロセスを含む。サンプルは、循環バッファに同期してクロックされ、出される。サンプルを循環バッファに書き込むことによって、最も古いサンプルは循環バッファから除去され、処理される。したがって、サンプル速度は循環バッファ・サイズ、および例えばＦＰＧＡなどのハードウェア資源によって制限されることはなく、チャネル数を増加させることが可能である。循環データ・バッファは同じ速度で満たされ、空にされるので、バッファ・オーバーランや損失データの生じる可能性はない。
【００１８】
本発明の１つの好ましい実施形態は、循環バッファにサンプル・データを書き込み、循環バッファからサンプル・データを読み取るための同期プロセスを使用して、フロー・アナライザ、フロー・サイトメータ、その他の測定装置において損失データの生じる機会を減少させながら、データ量を増加させるシステムと方法を提供する。サンプルは同期して環バッファにクロックされ、出される。サンプルを循環バッファに書き込むことによって、最も古いサンプルは循環バッファから除去され、処理される。それは、処理が同期での書き込みと読み取りプロセスを維持するようにするサンプリングである。デュアル・ポートＲＡＭが使用されるので、読み取りプロセスと書き込みプロセスとの間で競合は存在しない。書き込みプロセスと読み取りプロセスとは同期されるので、バッファ・オーバーランの生じる可能性はなく、バッファ・サイズは特定のプロセスのアルゴリズムのために必要とされるデータによって定められる。ＦＡＤＣ（フィルタ、増幅、デジタル化、変換）チャネルの数が増加することは、チャネルが並行して処理されることから、サンプル処理量を減少させることはない。プロセスの中のサンプル数（例えば流量の合計）が増加することは、各々の到着するサンプルによって流量がリアル・タイムで更新されることから、処理量を減少させることはない。
【００１９】
１つの形式においてデータ処理は、例えばパイプライン処理がサンプル・データについて論理および演算オペレーションを実行する小さなパイプライン化されたステップに分割される。このサンプル・データのパイプライン処理は、プログラマブル論理装置（ＰＬＤ）が十分な内部論理と外部ピンとを有する場合、できる限り多くのチャネルについてのアナログ・デジタル変換（ＡＤＣ）サンプル速度で、ＦＰＧＡまたはＡＳＩＣなどのＰＬＤによって実行される。このハードウェア方法によって、高いサンプル速度は、ＡＤＣ時間がより少ないこと、またはＡＤＣの読み取りにおける本質的な伝播遅延によってのみ制限される。さらに、チャネル数がＰＬＤ資源によってのみ制限される一方で、チャネルを付加することが計器の速度を制限することはない。サンプル・データ処理はＰＬＤの内部で行われるものなので、処理量には影響を与えずに、処理のサブステップをパイプラインに付加することが可能である。最後に、サンプル・データの書き込みと読み取りとは同期しているので、バッファ・オーバーランまたはデータの損失の可能性を伴わずに、循環バッファは同じ速度で満たされ、空になる。
【００２０】
本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を参照することで明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１を参照すると、動作する、例えばフロー・サイトメータなどのフロー・アナライザ４２０の概略図が示されている。レーザ４００からのレーザ光ビーム４０２が、フロー・キュベットの検査区域４０４を通るときに粒子４０６に作用するように示されている。散乱され、放射され（例えば蛍光放射）、屈折されるか、またはその他で作り出される光４２２、４２４は、その時１つまたは複数の検出器４０８、４１０によって検知され、その後１つまたは複数の検出器４０８、４１０は、それらのデータ４２６、４２８をそれらの各々のＦＡＤＣ（フィルタリング、増幅、デジタル変換）ユニット４１２、４１４に送信する。次いでＦＡＤＣは、それらの結果として生じたデジタル化データの各々を、最終的なデータ処理のためにＦＰＧＡ、ＡＳＩＣまたはその他のデータプロセッサ４１６などからなるプログラマブル論理装置（ＰＬＤ）に送信する（４３０、４３２）。そのようなＰＬＤは、ＤＳＰなどのプロセッサと組み合わせられて、または組み合わせられずに、論理および演算オペレーションを実行するための論理コンポーネントを有する半導体装置である。ＦＰＧＡまたはその他のプロセッサ４１６による処理の結果は、その後最終的な、処理されたデータ４１８として出力される（４３６）。４１６ではＤＳＰなどのプロセッサが使用されるであろうが、本発明のプロセスの１つの利点は、ハードウェアの論理解法を使用し、ＤＳＰの帯域幅の大部分を使用する内部ＤＳＰメモリの中でサンプル・データを削除し、読み込み、記憶し、チャネル数または処理時間を制限することが可能なことである。
【００２２】
図２を参照すると、例示的なパイプライン・プロセスが示されている。図２の中で、各機能ブロックは記憶ブロックと処理ブロックとを含んでいる。１つまたは複数のデータ要素は処理ブロックで操作され、出力されるように、記憶ブロックから処理ブロックに渡される。図２のパイプライン・プロセスでは、プロセスは蛍光データを受信し、データの流量合計を計算し、流量合計からバックグラウンド・データを差し引く。各パイプライン・プロセスは、好ましくは１つまたは複数の循環バッファを含むが、そのような循環バッファは複数の物理装置か、または複数のバッファに分割された単一のデータ装置であってもよいことを理解されたい。循環バッファの代わりにその他の装置または方法が使用されてもよく、その他の装置または方法が、本明細書で説明される成果を成し遂げることが可能であるということを認識することが重要である。米国特許第６，６５８，３５７号は「循環バッファ」について説明しており、当業者にはまた、循環バッファがサンプル・データの連続ストリームを受け入れるために設計された任意のメモリを構成し、物理的に連続するメモリを構成することは必要とせず（すなわち「仮想」循環バッファ）、循環バッファを構成するためにメモリが動的に割り当てられてもよいことを理解されたい。
【００２３】
さらに詳細には、図２は、１つの機能ブロックの出力が次の機能ブロックの入力となるように配置された機能ブロックの連続を示す。したがって図２では、パイプライン・プロセスは機能ブロック５１０から蛍光データを受信し、５２０でデータの流量合計を計算し、５３２で流量合計からバックグラウンド・データを差し引く一方で、５４０でピークの流量合計を検出する。
【００２４】
図２のデータ記憶ブロック５１４、５２６、５４４はデータ入力バス、データ出力バス、読み取りアドレス・バス、書き込みアドレス・バス、アドレス・カウンタを有する同期の単純なデュアル・ポートＲＡＭからなる循環バッファである。各記憶ブロック５１４、５２６、５４４は実行されるべき処理によって必要とされる、異なる奥行と幅とを有している。デュアル・ポートＲＡＭは、読み取りアドレスと書き込みアドレスが同じ場合に、書き込まれる細胞の古いコンテンツを出力するように設計されているので、循環バッファに書き込まれる各々の新たなデータ値によって、最も古いデータ値は同期プロセスの中で循環バッファから出力される。
【００２５】
処理は、特定数の過去のサンプルを保存すること、特定数のサンプルの流量合計を計算し、保存すること、最も新しい流量合計から前の流量合計を差し引くこと、バックグラウンドで訂正された流量合計のピーク値を検索することを含んでいるが、それらを必要とするわけではない。図２のパイプライン・プロセスは単なる典型的な例であって、その他のステップが必要に応じて付加され、取り去られるか、または変更されてもよい。
【００２６】
図１は２つのデータ・チャネルを有するフロー・アナライザ４２０を示しているが、本発明の目的は、例えばチャネル数またはサンプル速度を増加させることによって、蛍光データの処理用を最大にすることである。したがってフロー・アナライザ４２０は、典型的には並行して処理される複数のＦＡＤＣチャネルを有するが、図２〜４は、説明のための単一のチャネルから取り出されるデータの例である。
【００２７】
図３、４は、図２のパイプラインの中でサンプルがどのように処理されるのかを示す。新たに到着するＡＤＣデータ・サンプルは、ＡＤＣデータ、流量合計、バックグラウンドで訂正された合計とピーク合計に対する更新を開始することによって、パイプラインを更新する。一例として、循環バッファ５１４は、ＡＤＣデータとラベルを付けられた列のサンプル１２から１９までの中で示されるデータを含み、５２６は合計とラベルを付けられた列のサンプル１２から１９までの中で示される値を含む。以下で、図３のサンプル２０の値がどのようにして計算されるのかを説明する。サンプル１９を見ると、流量合計ブロック５２０は、５２２での入力３３７１と、５１６での入力１０４０とともに２５２０４を含み、５２４で新たなサンプル２０の合計値２７５３５＝２５２０４＋３３７１−１０４０を作り出す。バックグラウンド減算ブロック５３２は、５３４での２５２０４の入力と、５３０での５４９９とを有し、５３６で新たなサンプル２０の出力合計ＢＫＧ値１９７０５＝２５２０４−５４９９を作り出す。ピークの検出および保持ブロック５４０は、前のピーク値１２８８３を含む。５３６で現れ、１２８８３よりも大きいバックグラウンド訂正値１６６１０は、新たなピーク・サンプル２０の値として１２８８３と入れ替わる。ＡＤＣ変換がＡＤＣデータ・サンプル２０の値２６２３を循環バッファ５１４に記録する場合、ＡＤＣ変換はまた２７５３５を循環バッファ２５６に、１９７０５を５３２に、１６６１０を５４０に記録する。
【００２８】
この開示の利益を有する当業者には、この発明がフロー・アナライザにおいてデータを管理するためのシステムと方法を提供するものとされていることを理解されたい。さらに、本発明の様々な態様の変更形態と代替の実施形態は、この説明より当業者には明らかとなろう。したがって、この説明は例示としてのみ解釈されるべきものであり、発明を実行するための一般的な方法を当業者に教示するためのものである。本明細書で示され、説明された発明の形態は、現時点での好ましい実施形態として考えられるべきものであることを理解されたい。この発明の説明の利益を得た後で当業者には明らかなように、要素と材料は、本明細書で示され、説明されたものとは別のものが用いられてもよく、部品とプロセスは入れ替えられてもよく、本発明の特定の機能はそれぞれに利用されてもよい。冒頭の特許請求の範囲で説明されている本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本明細書で説明されている要素に変更がなされてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明によるフロー・アナライザの概略図である。
【図２】本発明による例示的プロセスのフロー図である。
【図３】図１のプロセスのためのサンプル値の表である。
【図４】図１のプロセスのための図２のサンプル値を曲線で描くグラフである。
【図１】
2008523354.tif 000003
【図２】
2008523354.tif 000004
【図３】
2008523354.tif 000005
【図４】
2008523354.tif 000006
【国際調査報告】
2008523354.tif 000007
2008523354.tif 000008