(57)【要約】  本発明は、細胞非含有の電気生理学的なセンサーチップによってＮａ+／Ｃａ2+交換体（ＮＣＸ）タンパク質の活性を測定するための無細胞分析、ＮＣＸタンパク質を有する本センサーチップを含む部品からなるキット、ならびに、本部品からなるキットの製造および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップを、連続して段階的に洗浄処理、非活性化処理および活性化処理し、続いて、非活性化処理から活性化処理へ変化した時の電流を測定する、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するためのインビトロ分析。
【請求項２】
センサーチップは、以下に記載のもの：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６、ＮＣＸ７の少なくとも１種のＮＣＸタンパク質を含む、請求項１に記載の分析。
【請求項３】
センサーチップは、哺乳動物由来のＮＣＸタンパク質、好ましくはラット、マウスまたはヒト由来のＮＣＸタンパク質を含む、請求項２に記載の分析。
【請求項４】
ＮＣＸタンパク質は、ヒトＮＣＸ１タンパク質である、請求項３に記載の分析。
【請求項５】
センサーチップは、組換えＮＣＸタンパク質、または、天然ＮＣＸタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析。
【請求項６】
センサーチップは、金の構造を有するボロフロエートガラスの基板を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析。
【請求項７】
請求項５に記載のセンサーチップは、メルカプタン層で被覆され、１つまたは複数の絶縁層を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析。
【請求項８】
センサーチップの洗浄は、洗浄溶液によって行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析。
【請求項９】
第一の溶液の交換は、洗浄溶液を非活性化溶液に交換することによって行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分析。
【請求項１０】
第二の交換は、非活性化溶液を活性化溶液に交換することによって行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析。
【請求項１１】
第三の溶液の交換は、活性化溶液を非活性化溶液に交換することによって行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分析。
【請求項１２】
第四の溶液の交換は、非活性化溶液を洗浄溶液に交換することによって行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分析。
【請求項１３】
ＮＣＸタンパク質の活性を調節する化合物を同定するための分析であって、
ａ］ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップを提供し；
ｂ］洗浄溶液、非活性化溶液、および、活性化溶液を提供し；
ｃ］それぞれさらに化学物質を含む洗浄溶液、非活性化溶液、および、活性化溶液を３種の溶液全てにおいて同じ濃度で提供し；
ｄ］ａ］に記載のセンサーチップを、ｂ］の洗浄溶液、非活性化溶液、活性化溶液、非活性化溶液および洗浄溶液によって連続して段階的に処理し；
ｅ］ｄ］において非活性化溶液から活性化溶液に交換した際の電流を測定し；
ｆ］ｅ］のセンサーチップを、ｃ］の洗浄溶液、非活性化溶液、活性化溶液、非活性化溶液および洗浄溶液によって連続して段階的に処理し；
ｇ］ｆ］において非活性化溶液を活性化溶液に交換した際の電流を測定し；
それにより、ｅ］からの電流が、ｇ］からの電流と異なる強度を有する場合、ＮＣＸタンパク質の活性が調節されたことが証明される、上記分析。
【請求項１４】
センサーチップは、以下に記載のもの：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６、ＮＣＸ７の少なくとも１種のＮＣＸタンパク質を含む、請求項１３に記載の分析。
【請求項１５】
センサーチップは、哺乳動物由来のＮＣＸタンパク質、例えばラット、マウスまたはヒト由来のＮＣＸタンパク質を含む、請求項１４に記載の分析。
【請求項１６】
ＮＣＸタンパク質は、ヒトＮＣＸ１タンパク質である、請求項１５に記載の分析。
【請求項１７】
センサーチップは、組換え生物学的材料によって生産されたＮＣＸタンパク質を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の分析。
【請求項１８】
センサーチップは、金の構造を有するボロフロエートガラスの基板からなる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の分析。
【請求項１９】
請求項１６に記載のセンサーチップは、メルカプタン層で被覆され、１つまたは複数の絶縁層を有する、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の分析。
【請求項２０】
ａ］ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップ；
ｂ］洗浄溶液；
ｃ］非活性化溶液；
ｄ］活性化溶液、
を含む部品からなるキット。
【請求項２１】
センサーチップは、以下に記載のもの：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６、ＮＣＸ７の少なくとも１種のＮＣＸタンパク質を含む、請求項２０に記載の部品からなるキット。
【請求項２２】
ＮＣＸタンパク質は、哺乳動物由来、例えばラット、マウスまたはヒト由来である、請求項２１に記載の部品からなるキット。
【請求項２３】
ＮＣＸタンパク質は、ヒトＮＣＸ１タンパク質である、請求項２２に記載の部品からなるキット。
【請求項２４】
センサーチップは、組換え生物学的材料によって生産されたヒトＮＣＸタンパク質を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の部品からなるキット。
【請求項２５】
センサーチップは、金の構造を有するボロフロエートガラスの基板からなる、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の部品からなるキット。
【請求項２６】
請求項２３に記載のセンサーチップは、メルカプタン層で被覆され、１つまたは複数の絶縁層を有する、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の部品からなるキット。
【請求項２７】
洗浄溶液は、３０±１５ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４±１.０）；４０±２０ｍＭのＫＣｌ；１００±５０ｍＭのＮａＣｌ；４±２ｍＭのＭｇＣｌ2を含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の部品からなるキット。
【請求項２８】
非活性化溶液は、３０±１５ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４±１.０）；１４０±７０ｍＭのＫＣｌ、４±２ｍＭのＭｇＣｌ2を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の部品からなるキット。
【請求項２９】
活性化溶液は、３０±１５ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４±１.０）、１４０±７０ｍＭのＫＣｌ、４±２ｍＭのＭｇＣｌ2、０.５±０.２５ｍＭのＣａＣｌ2を含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の部品からなるキット。
【請求項３０】
センサーチップを製造し、ＮＣＸタンパク質を製造し、製造したＮＣＸタンパク質をセンサーチップの表面に固定し、洗浄溶液を製造し、非活性化溶液を製造し、活性化溶液を製造し、そしてＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップ、洗浄溶液、非活性化溶液および活性化溶液を組み合わせてキット単位にする、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の部品からなるキットの製造。
【請求項３１】
ＮＣＸタンパク質の活性を改変する化合物を同定するための、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の部品からなるキットの使用。
【請求項３２】
ＮＣＸタンパク質の活性を測定するための、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の部品からなるキットの使用。
【請求項３３】
吸着させたＮＣＸタンパク質を含む膜を含むセンサーチップを、少なくとも１種のＮＣＸの基質の濃度の迅速な変化に晒す、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するための分析。
【請求項３４】
ＮＣＸの基質は、Ｃａ2+またはＮａ+である、請求項３３に記載の分析。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞非含有の電気生理学的なセンサーチップによって、Ｎａ+／Ｃａ2+交換体（ＮＣＸ）タンパク質の活性、または、その活性の調節を測定するための無細胞分析、ＮＣＸタンパク質を有するセンサーチップを含む部品からなるキット、ならびに該部品からなるキットの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
概要
生命に必要な基本的な要件は、生体膜を用いた区画化であるが、生体膜は、この原理を実現するための自然界の手段である。しかしながら、脂質二重層（細胞膜の基礎をなす構造）は、細胞および生物において生体機能を維持するために輸送が必須であるほとんどのイオンおよび化合物に対して不浸透性である。このパラドックスの答えは、細胞膜の半透性の性質にあり、膜を通過する必要のある溶質は特定の膜タンパク質によって輸送される。これらの輸送体は、イオン濃度勾配の生成および維持、栄養素の摂取、代謝産物の輸送、シグナル伝達分子の再摂取、ならびに、毒性の化合物や廃棄化合物の除去に関与する。それゆえに、これに関連して、病気に関連する異常に直接的な影響を与え得る潜在的な薬剤標的である。
【０００３】
ほとんどの膜輸送体は、それらの輸送サイクルを介しながら電荷をシフトさせる。このシフトは、電荷を有する基質の移動、または、（部分的に）電荷を有するタンパク質成分の移動のいずれかによって生じる可能性がある。
【０００４】
輸送体に関連する電流のモニタリング
場合によって、輸送体に関連する電流は、かなり生理学的な環境では、パッチクランプ実験で直接モニターするか、または、人工的な「黒色脂質膜（ｂｌａｃｋ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」で直接モニターするかのいずれかが可能である。後者の場合、脂質二重層は、それぞれＡｇ／ＡｇＣｌ電極を含む２つの緩衝液の貯留層の間の小さい孔に形成される。この二分子層にタンパク質が取り込まれた後、例えばＡＴＰ誘導体の光活性化によって生物活性（例えば酵素活性）が引き起こされる。しかしながら、その安定性が不足しているために、このシステムを用いては緩衝液を迅速に交換する実験を行うことができないため、このシステムは光活性化可能な基質に限定されてしまう。この安定性の不足は、タンパク質を含む粒子をセンサー表面に固定することによって克服することができる。この事実は、生じた輸送体に関連する電流を検出する、イオンゲート・バイオサイエンシズ社（ＩｏｎＧａｔｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ、フランクフルト・アム・マイン）製のＳｕｒｆＥ2Ｒ(R)（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｉｃ  Ｅｖｅｎｔ  Ｒｅａｄｅｒ）という名称の細胞非含有の電気生理学的な技術の論理的根拠である。
【０００５】
同様に本発明によれば、センサーチップは、トランスデューサーを搭載した基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と、孔を有するカバープレート（タイタープレートのウェルに類似したウェルを形成する）で構成される。適切な基板としては、ガラス製またはポリマー製プレートのいずれかが利用される。ガラス製プレートの場合、トランスデューサーは、表面が化学修飾された（例えばメルカプタンによって）リソグラフィーによって構築された金薄膜で構成され、それに対して、ポリマー基板を用いて、修飾された金薄膜電極もまた用いることができる。適切な基板の範囲で、単一のセンサーチップを製造することができ、同様に、センサー片、または、９６または３８４個のセンサーを有するセンサーアレイプレートも製造することができる。特にポリマーベースのセンサーは、低コストでの大量生産を実現する可能性がある。ＷＯ０２／０７４９８３、および、ＤＥ１０２４４１２９で、具体的な例が開示されている。
【０００６】
これは、金表面に修飾を施した後に、金表面をキャパシタに変換し、ウェルを水溶液で充填した全てのセンサータイプに当てはまる。このキャパシタの特性は、溶液と接触した際に参照電極（Ｐｔ／ＰｔもしくはＡｇ／ＡｇＣｌ、またはインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）など）に流れた電流を用いて決定することができる。その上、センサー表面は、膜フラグメントや小胞に対して高い親水性を有する（すなわち粘着性である）。天然または天然に近い環境で保持される電気発生性のタンパク質、すなわち生物学的な膜のシート、小胞またはプロテオリポソームは、親水性のセンサー表面に容易に吸着し、溶液を包含する内部スペースが、金表面、同様にウェル中の周囲の溶液の両方から電気的に絶縁された区画を形成する。キュベットに挿入すると、チップのウェル（図２Ａ）がフローセル内部の体積の境界となり、センサー表面上での迅速な溶液交換を可能にする。
【０００７】
調査されるタンパク質の基質を含まない溶液から、それらを含む溶液へ交換することにより、上述のキャパシタで、測定可能な一時的な充電電流が発生し、この電流は、典型的には１００ｐＡ〜４ｎＡの範囲内である。
【０００８】
使用されたワークステーションにおいて、溶液を交換する実験を行うのに必要な全ての構成要素は、ＰＣ制御などの方法で制御されたワークステーションに搭載される。従来のシステムでは、非活性化（すなわち基質非含有）溶液、同様に、活性化溶液はガラスボトル中に保存される。ボトルに空気圧を加えることにより、溶液を電気機械的に操作されるバルブシステムに通過させ、さらにフローセルに通過させる。あるいは、オートサンプラーを用いて、数種の溶液を自動化様式で処理してもよい。
【０００９】
Ｎａ+／Ｃａ2+交換体（ＮＣＸ）
本発明の状況における用語「ＮＣＸタンパク質」または「ＮＣＸ」は、単独または互いに組み合わせた以下に列挙するＮａ+／Ｃａ2+交換タンパク質のいずれか一種：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６、ＮＣＸ７を意味するものとする。特に好ましくは、ＮＣＸ１、ＮＣＸ２および／またはＮＣＸ３である。このようなＮＣＸタンパク質は、あらゆる脊椎動物、具体的には哺乳動物種（例えば、イヌ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ニワトリ、類人猿、ヒトなど）から誘導することができる。ＮＣＸは、このような脊椎動物の組織プローブから単離してもよいし、または、ＮＣＸタンパク質を発現することができる組換え生物学的材料によって製造してもよい。
【００１０】
用語「生物学的材料」は、遺伝情報を含み、それ自身で増殖可能であるか、または、生物系中で増殖可能なあらゆる材料を意味する。組換え生物学的材料とは、当業者周知の組換え技術によって生産されたか、変化させたか、または、改変されたあらゆる生物学的材料である。
【００１１】
以下の参考文献は、特定のＮＣＸタンパク質をクローニングした例である：イヌのＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ１は、Ｎｉｃｏｌｌ，ＤＡ．等によってクローニングされている（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５０（４９８０）：５６２〜５，１９９０；題名：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  Ｎａ（＋）−Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ．）。ヒトＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ１は、Ｋｏｍｕｒｏ，Ｉ．等によってクローニングされ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１０），４７６９〜４７７３，１９９２；題名：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎａ+／Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｃＤＮＡ）、さらに、Ｋｏｆｕｊｉ，Ｐ．等によってクローニングされている（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２）：Ｃ１２４１−Ｃ１２４９，１９９２；題名：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａ−Ｃａ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎａ−Ｃａ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）。ヒトＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ２は、Ｌｉ，Ｚ．等によってクローニングされている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２６）：１７４３４〜９，１９９４；題名：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＣＸ２  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｎａ（＋）−Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）。ラットＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ３は、Ｎｉｃｏｌｌ，ＤＡ．等によってクローニングされている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４０）：２４９１４〜２１．１９９６；題名：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔｈｉｒｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎａ+−Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ，ＮＣＸ３）。ヒトＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ３は、Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ，Ｎ．等によってクローニングされている（Ｇｅｎｅ．２９８：１〜７，２００２；題名：Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＳＬＣ８Ａ３  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎａ+／Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ３  ｉｓｏｆｏｒｍｓ）。
【００１２】
ナトリウム／カルシウム交換体は、様々な細胞からＣａ2+を除去するための重要なメカニズムである。心臓において、この交換体は、Ｃａ2+チャンネルを介して入ったＣａ2+を排出して、収縮を起こす。心臓血管疾患におけるこの交換体の関連性は、例えば、Ｈｏｂａｉ，ＪＡおよびＯ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｂ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，１３，６５３〜６６４で説明されている。それゆえに、医薬産業において、ＮＣＸを阻害する化合物が開発されており、例えば、Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｔ．等（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，７５４４〜７５５３で説明されている化合物である。例えばＨｉｎａｔａ，Ｍ．等（２００２）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４５，４５３〜４６１で電気生理学的な手段によって示されているように、Ｎａ+／Ｃａ2+交換体は、逆方向に動くＣａ2+１個毎に３〜４個のＮａ+を電気を発生させて輸送する。ＮＣＸは、細胞質内のＣａ2+濃度（［Ｃａ2+］in）を、細胞外のＣａ2+濃度（［Ｃａ2+］out）より３〜４桁低く維持することができる。それにもかかわらず、正味のＣａ2+輸送の方向は、電気化学的なＮａ+濃度勾配に依存する。Ｎａ+およびＣａ2+の転移に関して、同時および連続輸送モデルが示唆されており、証拠の大部分が後者を支持している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
当業界の現状では、ＮＣＸタンパク質の活性は、生きた細胞によって測定できることがわかっている。この目的のために、ＮＣＸタンパク質を細胞で発現させ、その細胞を増殖させなければならない。このようなシステムは、例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３」中に、Ａｘｘａｍ  Ｓ．ｒ．ｌ．（マイラント，イタリア）によって、Ｐｏｎｔｒｅｓｉｎａ  ｏｎ  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｎｒ．Ｐ２５（題名：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＩＰＲ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  Ｋ+ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎａ+／Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ）で開示されている。これらのＫ+依存性Ｎａ+／Ｃａ2+交換体は、目の組織から単離されており、異なる輸送メカニズムを示し、さらに心臓組織での発現が見出されていない点で、ＮＣＸタンパク質とは異なっている。細胞中、または細胞分析におけるＮａ+／Ｃａ2+シンポートシステムを電気化学的に測定するための測定方法が知られている。このようなシステムの不利点は、実行される分析に干渉する可能性があるあらゆる種類の高分子の混合物を含む複雑な生物学的なバックグラウンドを前提に、タンパク質活性を測定しなければならない点である。Ｎａ+およびＣａ2+が流出および流入する電流は、数種の異なるタンパク質によって移動する。それゆえに、１種のタンパク質のみを対象とした測定は、バックグラウンドが大きいため妨げられる。このような不利点がない方法は、プロテオリポソームにおけるＮａ+／Ｃａ2+シンポートシステムを電気化学的に測定する方法である（Ｅｉｓｅｎｒａｕｃｈ，Ａ．等．；Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）１４５：１５１〜１６４；題名：Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｎａ／Ｃａ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｆｒｏｍ  ｌｏｂｓｔｅｒ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｏｎ  ｂｌａｃｋ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａ2+）。この方法の明らかな不利点は、溶液の交換が迅速に行えない点と予想される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のシステムは、細胞のバックグラウンドの外側でＮＣＸタンパク質を装置に固定し、迅速な溶液交換を可能にすることによって、ＮＣＸタンパク質に関するこれらの不利益を回避するものである。続いて、電流の測定によってタンパク質の活性を測定する。さらに、迅速な溶液交換が可能である。
【００１５】
それゆえに、本発明の主題の一つは、ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップを、連続して段階的に洗浄処理、非活性化処理および活性化処理し、続いて、非活性化処理から活性化処理へ変化した時の電流を測定する、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するための分析に関する。
【００１６】
用語「センサーチップ」は、本発明において特に他の説明が無い限り、細胞非含有の電気生理学的なセンサーチップを意味し、例えば、ＷＯ０２／０７４９８３、具体的には請求項および／または図１および／または２、加えて本ＰＣＴ出願の図面の説明で説明されているようなセンサーチップである（これらを参照により本発明に加入させる）。
【００１７】
具体的には、本分析は、ＮＣＸタンパク質を含む膜の効率的な製造を可能にするプロトコール、ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップの効率的な製造のためのプロトコール、同様に、ＮＣＸ活性測定を可能にする溶液交換プロトコールを含む。
【００１８】
一般的に、用いられるＮＣＸタンパク質は、上述のような哺乳動物由来のものであり、具体的にはヒト由来のものである。ＮＣＸタンパク質は、ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６、および／または、ＮＣＸ７から選択され、具体的にはＮＣＸ１、ＮＣＸ２、および／または、ＮＣＸ３である。好ましい実施形態において、ＮＣＸタンパク質はヒトＮＣＸ１タンパク質である。このようなＮＣＸタンパク質は、当業者既知の組換え方法によって製造してもよいし（以下、「組換えＮＣＸタンパク質」と称する）、または、天然の組織プローブから回収してもよい（以下、「天然ＮＣＸタンパク質」と称する）。
【００１９】
好ましい実施形態において、本センサーチップは、金の構造を有するボロフロエート（ｂｏｒｏｆｌｏａｔｅ）ガラスの基板（ｂａｓｉｃ  ｂｏｄｙ）を含む。さらに本センサーチップは、好ましくは、メルカプタン層で被覆され、１つまたは複数の絶縁層を有していてもよい。このようなセンサーチップ（例えば、円形の金の構造を有するボロフロエートガラスチップ（直径１〜３ｍｍ）、および、接触域）は、イオンゲート・バイオサイエンシズ社（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｐａｒｋ  Ｈoｃｈｓｔ，Ｄ  ５２８，Ｄ−６５９２６フランクフルト・アム・マイン，ドイツ）から市販されている。
【００２０】
特に好ましいプロトコールは、以下の通りである：例えばＮＣＸを含む膜フラグメント１０〜３０μｌをアプライし、センサーチップ上で循環させ、好ましくは４℃で少なくとも１２時間インキュベートする。好ましい実験条件としては、ＮＣＸタンパク質は、ヒトＮＣＸ１タンパク質である。タンパク質を搭載したセンサーチップのキャパシタンスは、好ましくは約１００ｎＦｃｍ-2であり、コンダクタンスＧ1Sは、好ましくは約１０ｎＳｃｍ-2である。本分析の原理は、阻害剤の非存在下で、続いて、阻害剤の存在下で、電気的なＮＣＸタンパク質の活性を試験することである。この理由のため、ＮＣＸ−センサーチップは、ＮＣＸを活性化する一連の溶液でリンスされる。一般的に、阻害剤が可逆的であるかどうかを試験することができる。この場合、阻害剤を適用した後に、溶液を阻害剤非含有の状態に戻す。この実験の前に、チップの溶液の貯留層は、以下の好ましい溶液で充填される：洗浄緩衝液：４０ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４）；非活性化溶液：１４０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４）；活性化溶液：１４０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４）、０.５ｍＭのＣａＣｌ2。阻害剤を用いた測定のために、３種全ての溶液に、阻害剤を同じ濃度で添加する。非活性化溶液から活性化溶液に換えると、ＮＣＸの活性化が起こり、負電流が発生し、ベースラインまで減衰する。３回の測定サイクルでＮＣＸシグナルの平均振幅が一定になったら、溶液を阻害剤を含む溶液に換え、同じプロトコールを繰り返す。その後、この溶液を阻害剤非含有の状態に戻して、阻害剤が可逆的であるかどうかを試験することもできる。
【００２１】
本発明の状況における用語「電流」は、非活性化溶液の活性化溶液への交換に応答するピーク電流を意味するものとし、例えば、これらに限定されないが、最大ピーク電流が挙げられる。電流振幅は１０〜１００ｍｓの範囲で上昇し、続いて、約２秒以内にそれよりゆっくり減衰する。電流の極性は、輸送されたイオンの極性、および／または、タンパク質のシフトした成分の極性、および、それらの輸送のベクトル方向、または、区画の膜を超えるかその範囲内のシフトに応じて正の場合もあるし、または、負の場合もある。活性化溶液を非活性化溶液で交換した際に生じた電流、または、非活性化溶液を洗浄溶液で交換した際に生じた電流は、ＮＣＸ活性の測定に関して考慮しない。流速およびインターバルは、非活性化溶液を活性化溶液で交換したことに対する電流応答が、他の交換工程によって生じた電流応答の影響を受けないように選択される。
【００２２】
好ましくは、洗浄溶液を非活性化溶液で交換すると、ＮＣＸタンパク質を含む膜を超えてＮａ+濃度勾配を誘導し得る。その後、非活性化溶液を活性化溶液（すなわちＣａ2+を含む溶液）で交換すると、ＮＣＸ活性を選択的に開始させ得る。続いて、溶液を逆の順番で交換すると、センサーチップはその最初の状態に戻る。
【００２３】
一般的に、センサーチップの洗浄は、ナトリウムを含むがカルシウムを含まない緩衝溶液（洗浄溶液）中でセンサーチップをインキュベートすることを意味し、それにより、好ましくは小胞の区画中にＮａ+が蓄積される。再度、膜を超えてＮａ+濃度勾配を確立することは、洗浄溶液を非活性化溶液で交換し、それによってセンサーチップをＮａ+濃度の迅速な変化に晒すことによって行われる。好ましくは、ＮＣＸの活性化は、非活性化溶液を活性化溶液で交換し、それによってセンサーチップをＣａ2+濃度の迅速な変化に晒すことによって行われる。
【００２４】
その他の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するための分析に関し、ここにおいて、第一の溶液の交換は、洗浄溶液を非活性化溶液に交換することによって行われ、および／または、第二の交換は、非活性化溶液を活性化溶液に交換することによって行われ、および／または、第三の溶液の交換は、活性化溶液を非活性化溶液に交換することによって行われ、および／または、第四の溶液の交換は、非活性化溶液を洗浄溶液に交換することによって行われる。
【００２５】
本発明はさらに、ＮＣＸタンパク質の活性を調節する化合物を同定するための分析（スクリーニング分析）に関し、ここにおいて、
ａ］ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップを提供する；
ｂ］洗浄溶液、非活性化溶液、および、活性化溶液を提供する；
ｃ］それぞれさらに化学物質を含む洗浄溶液、非活性化溶液、および、活性化溶液を提供する（３種の溶液全てにおいて同じ濃度で）；
ｄ］ａ］に記載のセンサーチップを、ｂ］の洗浄溶液、非活性化溶液、活性化溶液、非活性化溶液および洗浄溶液によって連続して段階的に処理する；
ｅ］ｄ］において非活性化溶液から活性化溶液に交換した際の電流を測定する；
ｆ］ｅ］のセンサーチップを、ｃ］の洗浄溶液、非活性化溶液、活性化溶液、非活性化溶液および洗浄溶液によって連続して段階的に処理する；
ｇ］ｆ］において非活性化溶液を活性化溶液に交換した際の電流を測定する；
ここにおいて、ｅ］からの電流が、ｇ］からの電流と異なる強度を有する場合、ＮＣＸタンパク質の活性が調節されたことが証明される。
【００２６】
工程ｄ）、ｅ）およびｆ）における連続した段階的な処理は、連続的なフロー、または、ほぼ連続的なフローで行うことができる。
【００２７】
ＮＣＸタンパク質の活性の調節は、ＮＣＸタンパク質の活性を刺激または阻害することで構成されていてもよい。
【００２８】
ｇ］からの電流よりもｅ］からの電流が大きい場合、活性が刺激されたことを示す。
ｇ］からの電流よりもｅ］からの電流が小さい場合、活性が阻害されたことを示す。
【００２９】
このプロトコールの好ましい実施形態は、すでに上述した通りであり、さらに以下の実施例および請求項でも説明される。
【００３０】
本発明はさらに、部品からなるキットに関し、本キットは、以下を含む：
ａ］ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップ；
ｂ］洗浄溶液；
ｃ］非活性化溶液；
ｄ］活性化溶液。
【００３１】
また、このキットの好ましい実施形態も、すでに上述した通りであり、さらに以下の実施例および請求項でも説明される。
【００３２】
本発明はさらに、上述の部品からなるキットの製造に関し、ここにおいて、センサーチップを製造し、ＮＣＸタンパク質を製造し、製造したＮＣＸタンパク質をセンサーチップの表面に固定し、洗浄溶液を製造し、非活性化溶液を製造し、活性化溶液を製造し、さらに、ＮＣＸタンパク質を含むセンサーチップ、洗浄溶液、非活性化溶液および活性化溶液をまとめてキット単位にする。
【００３３】
このキット単位は、例えば使用者のための説明書を含む１個または数個の部品で構成してもよい。
【００３４】
本発明はさらに、ＮＣＸタンパク質の活性を改変する（すなわち、阻害または活性化する）化合物を同定するための、または、ＮＣＸ１タンパク質の活性を測定するための、上述の部品からなるキットの使用に関する。
【００３５】
本発明はさらに、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するための分析に関し、ここにおいて、吸着させたＮＣＸタンパク質を含む膜を含むセンサーチップは、少なくとも１種のＮＣＸの基質（例えば、Ｃａ2+またはＮａ+）の濃度の迅速な変化に晒される。
【００３６】
以下の図および実施例で、保護範囲を制限することなく本発明をさらに詳細に説明する。
【００３７】
図面の説明
図１：
図１は、ヒトＮＣＸ１のｃＤＮＡ配列を含むベクターｐＶＬ１３９３のポリヌクレオチド配列を示す。それに一致するオープンリーディングフレームは、関連するアミノ酸配列を表示することによってマークした。示された配列は、配列番号１に相当する。ヒトＮＣＸ１に関するｃＤＮＡを含むｐＶＬ１３９３のＤＮＡは、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆuｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；マシェローダーヴェーク１ｂ；Ｄ−３８１２４ブラウンシュバイク）に、ＤＳＭ１６５８８として寄託されている。
配列番号１：ｐＶＬ１３９３のポリヌクレオチド配列
寄託された生物学的材料：
ＤＳＭ１６５８８：ヒトＮＣＸ１に関するｃＤＮＡを含むｐＶＬ１３９３のＤＮＡ
ＤＳＭ  ＡＣＣ２６７０：Ｆｌｐ−Ｉｎ−Ｔ−Ｒｅｘ−２９３−ＮＣＸ！。
寄託は、ブダペスト条約の規則に従って、生物学的材料をＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆuｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；マシェローダーヴェーク１ｂ；Ｄ−３８１２４ブラウンシュバイク）に送付して行われた。
図２：
Ａ）金の構造と流体区画を有する３ｍｍのバイオセンサーチップであり、Ｂ〜Ｄ）は、バイオセンサーのサンドイッチ構造の組み立てのスキームであり、Ｂ）金表面、Ｃ）化学リンカーと脂質での被覆、Ｄ）膜の吸着である。
図３：
Ａ）組換えによって発現されたＮａ+／Ｃａ2+交換体のイオン輸送活性により誘導された充電電流である。Ｂ）本発明に係る細胞非含有の電気生理学的なセンサーチップを用いて得られた、Ｎａ+／Ｃａ2+交換体（阻害剤）のＩＣ50である。全てのエラーは、標準誤差（ＳＥＭ）で示した。
【実施例】
【００３８】
１．哺乳動物細胞系の作製
Ｆｌｐ−ＩｎTM  Ｔ−ＲｅｘTM発現系（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），１６００ファラデー・アベニュー，私書箱６４８２，カールスバッド，カリフォルニア州９２００８，米国）を利用して、安定してトランスフェクションされた細胞系の迅速な作製を達成した。この目的のために、（ヒト）心臓のナトリウム／カルシウム交換体（ＮＣＸ−１、すなわちＳＬＣ８Ａ１ＰＤＢ−エントリーＮＭ＿０２１０９７）をコードするｃＤＮＡを、Ｆｌｐ−ＩｎTMＴ−ＲｅｘTM発現ベクター（インビトロジェン社，１６００ファラデー・アベニュー，私書箱６４８２，カールスバッド，カリフォルニア州９２００８，米国）にクローニングし、続いてＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクションした。この細胞を、１０％ウシ胎仔血清（バイオクロム社（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ），私書箱４６  ０３  ０９，１２２１３ベルリン，ドイツ）、５０ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン（インビトロジェン社，１６００ファラデー・アベニュー，私書箱６４８２，カールスバッド，カリフォルニア州９２００８，米国）、および、１０ｍｇ／ｍｌのブラスチシジン（インビトロジェン社，１６００ファラデー・アベニュー，私書箱６４８２，カールスバッド，カリフォルニア州９２００８，米国）が添加されたＤ−ＭＥＭ（インビトロジェン社，１６００ファラデー・アベニュー，私書箱６４８２，カールスバッド，カリフォルニア州９２００８，米国）中で、標準的な条件下での培養で維持した（３７℃、８％ＣＯ2を混合した空気）。
【００３９】
細胞を分離させるために、３〜４日毎に細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（バイオクロム社，私書箱４６  ０３  ０９，１２２１３ベルリン，ドイツ）に通過させた。膜調製の少なくとも１２〜２４時間前に、細胞を、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｃｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），１２９０テラ・ベラ・アベニュー，マウンテンビュー，カリフォルニア州９４０４３，米国）で処理して、ＮＣＸ発現を増強させた。
【００４０】
ＮＣＸ−１を発現するＦｌｐ−Ｉｎ−Ｔ−Ｒｅｘ−２９３−ＮＣＸ１細胞系を、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ；マシェローダーヴェーク１ｂ，Ｄ−３８１２４ブラウンシュバイク）にＤＳＭ  ＡＣＣ２６７０として寄託した。
【００４１】
２．昆虫細胞系の作製
Ｂａｃ３０００発現系（ＥＭＤバイオサイエンシズ社（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．），ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）のブランド，４４１チャーマニードライブ，マディソン，ウィスコンシン州５３７１９，米国）を利用して、一時的にトランスフェクションした細胞系迅速な作製を達成した。この目的のために、（ヒト）心臓のナトリウム／カルシウム交換体（ＮＣＸ−１、すなわちＳＬＣ８Ａ１ＰＤＢ−エントリーＮＭ＿０２１０９７）をコードするｃＤＮＡを、Ｂａｃ３０００発現ベクター（ＥＭＤバイオサイエンシズ社，ノバジェンのブランド，４４１チャーマニードライブ，マディソン，ウィスコンシン州５３７１９，米国）にクローニングした。製造方法に従ってウイルスを作製した後、３倍以上の濃度のウイルスストックを用いて、Ｓｆ９昆虫細胞をトランスフェクションさせた。この細胞を、適切な培地中で標準的な条件下での培養で維持した（２７℃）。トランスフェクションの３日後に膜を回収した。このストック細胞培養物を、製造方法に従って維持した。
【００４２】
具体的には、この方法は以下のように行うことができる：
２．１組換えウイルス製造のためのコトランスフェクション
コトランスフェクションのために、高度に精製した滅菌プラスミドＤＮＡ約１０μｇを製造した。コトランスフェクションのための細胞を提供するために、各トランスフェクションに対し、加えてポジティブおよびネガティブコントロールに対し、６ウェルのプレートを組み立てた。各キャビティーに、無血清培地中の１×１０6個のＳｆ９細胞を播種した。通常１時間かけて、細胞を付着させた。細胞が付着している間、ノバジェン製のバックベクター３０００（ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００）１５μｌ［０，０２μｇ／μｌ］、セルフェクション（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）３０μｌ（インビトロジェン）、組換えドナープラスミドＤＮＡ  ｐＶＬ＿ＮＣＸ１（０.４μｇ）からなり、蒸留水を加えて５０μｌにしたトランスフェクション混合物を製造した。インキュベートは、室温で２０分間行った。この期間の後、各混合物に培地０.５ｍｌを添加した。細胞が付着している場合、古い培地を除去し、キャビティーにトランスフェクション混合物を１滴ずつ添加した。２７℃で４時間インキュベートした後、新しい培地（１０％血清を含む）１ｍｌを添加し、さらに２７℃で４〜５日間インキュベートを続けた。
【００４３】
２．２モノクローナル組換えウイルスクローンを単離するためのプラーク精製
上記５日間の後、コトランスフェクションプレートの上清（いわゆるウイルスストックＶＳ０）を回収した。プラークをスクリーニングして組換えウイルスを同定するために、各キャビティーあたり１×１０6個のＳｆ９細胞を含む別個の６ウェルプレートを組み立てた。細胞を少なくとも３０分間静置した。その間に、１０3、１０4、１０5、１０6および１０7の希釈度で、ウイルスを１ｍｌのアリコートに希釈した。細胞をプレートに十分に付着させた後、培地を吸引して除いた。６ウェルプレートの各ウェルに、迅速に希釈したウイルス１ｍｌを添加した。プレートを振盪型のプラットフォームに移し、少なくとも２〜３時間ゆっくり振盪させた。その間に、低融点アガロースで上塗り用アガロースを製造した（使用の直前に）。以下の混合物を用いた：２０％ウシ胎仔血清が添加された２×グレース培地（１部）、および、再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）中の３％シープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）アガロース（１部）。アガロースをマイクロ波で完全に溶解させた。この１：１混合物を３８℃の水浴中に置いた。ここで、キャビティーから全ての培地を吸引して除き、ウェルの向こう側の壁に上塗り混合物をスライドさせて落としプレート上に乗せることによって、各ウェルに１ｍｌの上塗り混合物を添加した。細胞に上塗りを被せた後、フード内でプレートを３０分間放置した。この期間の後、各キャビティーに培地１ｍｌを添加して、干上がるのを防いだ。２７℃、９８％湿度に制御されたインキュベーター中にプレートを少なくとも３日間置いた。
【００４４】
この後、６ウェル培養皿の各ウェルに１％ニュートラルレッド溶液１ｍｌを用いてプラークを染色した。少なくとも４時間、プレートをインキュベーターに戻した。この期間中、プラークは、染色された細胞のなかで透明なスポットとして出現した。滅菌パスツールピペットを用いて、１個のプラーク（または２個以上）を拾い、総計２6個のＳｆ９細胞を含む２５ｃｍ2のＴ−フラスコ（培養体積は５％ＦＣＳ４ｍｌ）に移した。インキュベートを２７℃で５〜６日間行った。培養上清（いわゆるウイルスストックＶＳ１）を回収し、次の工程：ウイルスのタイター測定に用いた。
【００４５】
２．３．ウイルスのタイター測定のためのプラーク分析
２．２で説明した手法と同じ手法を用いた。
プラークを計数し、以下の方程式を用いてタイターを計算した（例として、２０個のプラークを計数した）。
【数１】
2008510150.tif 000002
【００４６】
２．４．ラージスケール（すなわち１Ｌ）での組換えウイルスの増殖
ウイルスを増殖させるために、通常、０.１のＭ．Ｏ．Ｉ．（重複感染度）（１０個のＳｆ９  細胞につき１個のウイルスの比率を意味する）を用いた。ウイルスは、第二の感染サイクルに入る可能性があるため、増幅時間は約７日間とした。この期間の間、ウイルスは指数関数的に増幅し、細胞培養物の生存率は２０〜３０％に減少した。高いウイルスのタイターを得るためには、５％ＦＣＳの補給が推奨され、泡を立てずに通気しながら超遠心培養容器を用いた。１週間後、培養上清（いわゆるウイルスストックＶＳ２）を回収した。これは、より大量のウイルスストックであり、数回の発現研究を行うのに十分な量で、かつ４℃で遮光して数ヶ月（〜１年）保存することができる。
【００４７】
２．５．組換えタンパク質ＮＣＸ１の発現
全ての発現実験のために、３のＭ．Ｏ．Ｉ（比率：１個のＳｆ９細胞につき３個のウイルス粒子）が推奨され、２７℃で７２時間インキュベートした。
【００４８】
３．膜／タンパク質の製造
天然の組織または組換え発現系からの細胞を、周囲の環境（ボトルまたは基板）の表面からの機械的な分離によって回収した。細胞を破壊し、続いて遠心分離工程および／またはスクロース濃度勾配遠心分離によって、膜フラグメントを製造した。
【００４９】
具体的には、この方法は以下のように行うことができる：
３．１  昆虫細胞膜／タンパク質の製造
細胞を遠心分離によって回収した後、Ｓｆ９懸濁培養からの細胞（湿重量で約２ｇ）のアリコートを液体窒素中で急速凍結し、さらなる調製のために−８０℃で保存した。
【００５０】
この細胞ペレットを氷上で融解させ、氷冷した緩衝液（０.２５Ｍのスクロース、５ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）、２ｍＭのＤＴＴ、５０ｍｌあたり１個のコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ・ダイアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム，ドイツ））に移した。
【００５１】
細胞を破壊することによって膜フラグメントを製造した。パール細胞破砕器（パール・インスツルメント社（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ），イリノイ州，米国）を利用した窒素細胞破砕方法、または、ダウンス型ホモジナイザー（７ｍｌ，ノボダイレクト社（Ｎｏｖｏｄｉｒｅｃｔ  ＧｍｂＨ）製，ケール・アム・ライン，ドイツ）を利用したダウンス型細胞破砕法で、細胞をホモジナイズし、懸濁液を４℃、６８０ｇで１０分遠心分離した。上清を回収し、ＳＷ４１遠心ローター中で４℃、１０００００ｇで１時間、再度遠心分離した。
【００５２】
ペレットをｐＨ７.５の５ｍＭのトリス（約２ｍｌ）に懸濁した。この懸濁液を、８７％スクロース（５ｍＭのトリス中）を用いて５６％に調節した。ここで、スクロース濃度勾配は、底部から５６％分画（２ｍｌ）、続いて４５％スクロース（３ｍｌ）、３５％（３ｍｌ）、および、１６％スクロース（２ｍｌ）のように構成した。
【００５３】
再度、４℃、１０００００ｇで２.５時間（またはさらにそれ以上）遠心分離し、濃度勾配のバンドをパスツールピペットで慎重に吸引し、１００ｍＭのＮａＣｌ、１.５ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）（５ｍｌ）と共に新しいチューブに回収した。
【００５４】
その他の遠心分離工程は以下の通りである：３０分、１５００００ｇ、４℃。
【００５５】
得られたペレットを１００ｍＭのＮａＣｌ、１.５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）、１０％グリセロールに再懸濁した。
【００５６】
４．センサーチップの製造
本チップは、全ての場合においてＮＣＸタンパク質を含み、ＮＣＸタンパク質は、チップに付着させるか、または、結合させる。これは、例えば疎水性、親水性、イオン性または共有結合力によって達成してもよい。
【００５７】
このような分析のセンサーチップは、例えば、金の構造を有するボロフロエートガラス製の基板からなる。この装置は、さらに、メルカプタン層で被覆され、１つまたは複数の絶縁層を有していてもよい。
【００５８】
好ましい実施形態において、金の構造を有するボロフロエートガラスを、メルカプタン層と脂質膜で被覆し、この脂質膜は、８００重量単位のｎ−デカンに溶解させた６０重量単位の２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＡＶＡＮＴＩ８５０  ３５６）、および、１重量単位のオクタデシルアミン（ＦＬＵＫＡ）からなる（詳細には：１５０μｌのＰＣ（ストックの２０ｍｇ／ｍｌのヘキサン溶液、または、ＡＶＡＮＴＩで分散させたＣＨＣｌ3＋オクタデシルアミン（５ｍｇ／ｍｌのヘキサン溶液）１０μｌを窒素で蒸発させ、ｎ−デカン４００μｌに溶解させた）。これを達成するために、センサーチップを、メルカプタン３０μＬと共に１５分インキュベートし、次にイソプロパノール（３×７０μＬ）で洗浄し、真空で乾燥させた。数時間後、センサーチップの上部に、脂質２μＬ＋ＤＴＴ緩衝液（２ｍＭ，ＤＴＴ（１,５４２ｍｇ）／緩衝液Ｃ（５０ｍＬ））３０μＬをピペットで載せ、２０分インキュベートした。機能的なセンサーチップを作成するために、対象の膜１０μＬ＋ＤＴＴ緩衝液１２０μＬを混合し、氷上で、３０秒の中止を含む２×１０回の単位（０.５／３０）で超音波処理した。続いてセンサーチップからこの緩衝液を除去し、ピペットで吸引、排出させて膜を含む緩衝液３０μＬで交換し、４℃で少なくとも１２時間保存した。
【００５９】
５．溶液交換プロトコール
活性を測定するために、ＮＣＸタンパク質を洗浄溶液、非活性化溶液および活性化溶液溶液で連続して処理し、充電処理から活性化処理に変化した際の電流を測定した。プレインキュベート溶液（ナトリウムを含むがカルシウムを含まない緩衝溶液）を、充電溶液（ナトリウムを減少させたカルシウムを含まない緩衝溶液）で交換することによって、ＮＣＸタンパク質を含む膜を超えたＮａ+濃度勾配を形成した。その後、この溶液を活性化溶液（Ｃａ2+を含む溶液）で交換することによって、ＮＣＸ活性を引き起こした。その後、溶液を逆の順番で交換して、センサーチップを最初の状態に戻した。
【００６０】
バイオセンサーシステムの緩衝液容器Ａ、ＢおよびＣをそれぞれ、「活性化」緩衝液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４）、１４０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2、０，５ｍＭのＣａＣｌ2）、「非活性化」緩衝液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４）、１４０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）、および、「洗浄」緩衝液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.４）、４０ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）で充填した後に、センサーホルダーにダミーをマウントし、このシステムを全ての緩衝液で洗い流して、流体のシステム全体から気泡を除去した。次に、空のセンサーまたはブラインドのセンサーを、ＮＣＸ１を含むＨＥＫ膜フラグメント（直径３ｍｍの化学修飾された金表面；イオンゲート・バイオサイエンシズ社，フランクフルト／Ｍ．，ドイツ）を予めローディングした標準的なガラスベースのセンサーで交換した。緩衝液容器に空気圧を加えることによって、液体をセンサーのフローセルを含む流体のシステムに通過させて輸送した。
【００６１】
通常、測定は、約３００μｌ／秒の流速が生じる２００ｍｂａｒの超過圧力で行われる。活性を測定するために、ＮＣＸタンパク質を含む膜を、「洗浄」、「非活性化」および「活性化」溶液で連続して処理した。「洗浄」溶液を「非活性化」溶液に交換することによって、ＮＣＸタンパク質を含む膜を超えてＮａ+濃度勾配を誘導した。その後、「非活性化」溶液を「活性化」溶液に交換することによって、ＮＣＸ活性が引き起こされ、従って、「非活性化」から「活性化」処理に変化した際に誘導された電流を測定した。その後、溶液を逆の順番で交換して、センサーチップをその最初の状態に戻した。コントロールソフトウェアによって順番を定義して、センサーの表面上に、「洗浄」緩衝液（０.５秒）、続いて「非活性化」緩衝液（２.０秒）、「活性化」緩衝液（２.０秒）、「非活性化」緩衝液（２.０秒）および「洗浄」緩衝液（２.０秒）を流した。その過程の間中ずっと、電流応答をデジタル化し（２０００サンプル・秒-1）、データファイルに保存した。用量応答実験のために、阻害剤をそれぞれ「活性化」、「非活性化」および「活性化」緩衝液に溶解させた。全ての化学物質は、分析グレードのものか、または、それより優れたものを用いた。
【００６２】
ＮＣＸ１測定のために、以下の設定が用いられた：
【表１】
2008510150.tif 000003
５分間の中断。
【００６３】
【表２】
2008510150.tif 000004
５分間の中断、および、解析する化合物の添加。
【００６４】
【表３】
2008510150.tif 000005
５分間の中断。
【００６５】
【表４】
2008510150.tif 000006
５分間の中断、および、上記と同じ化合物（他の濃度で）またはその他の化合物などの添加。
【００６６】
６．実験
上記プロトコールにより、バイオセンサー表面に結合したＮＣＸを含む膜フラグメントを、一過性の充電電流を生じる迅速なＣａ2+濃度の変化に晒した（図３ａ）。留意すべきことは、再度、この実験の結果に関して特に好ましいのは、ナトリウム濃度勾配を形成するために、実験前にバイオセンサーに直接適用された過剰な小胞内のＮａ+が減少することである。電流が速く減衰する理由は、不活性化、および／または、輸送体の膜フラグメント表面への容量結合によるものである。作用中、定常電流が、バイオセンサーのサンドイッチ構造を充電し、それによって、ある程度の状態までの充電だけが可能な電場が生じる（これは、ＤＣ電流源がキャパシタを充電するのと同様である）。
【００６７】
図３Ａは、ＮＣＸに特異的な阻害剤で阻害する前（黒色のトレイ）と、その後（灰色のトレイ）を記録する、典型的な無細胞の電気生理学的なＮＣＸバイオセンサーを示す。全ての溶液中の１０μＭの阻害剤Ａの非存在または存在下で、バイオセンサーを迅速なＣａ濃度の変化に晒したところ、それぞれシグナルの特異性を示す３００ｐＡまたは２０ｐＡのＮＣＸピーク電流を生じた。１０μＭの阻害剤を適用したところ、ＮＣＸに特異的なシグナルが９０.５％±５.１％（ｎ＝５）減少した。図３Ｂに、得られた用量応答曲線を示す。０.０１、０.１、１、５および１０μＭの濃度の阻害剤を適用して、ＩＣ50値（ｎ＝５）を記録した。５０％阻害の値を計算したところ、０.８６μＭ±０.２２μＭであった。ヒル係数を計算したところ、０.７±０.０３であった。それに続く阻害剤の非存在下での実験では、最初のシグナルの振幅の１００％に至るＮＣＸピーク電流が生じ、これは、阻害剤の可逆性を証明している。
【００６８】
コントロール実験において、適用されたＣａ2+の変化の減少と、非特異的なＮＣＸ１ブロッカーであるＮｉ2+（５ｍＭ）の適用によって、電流が減少する可能性がある。さらに、ＮＣＸ１を発現しない細胞膜では、同様の実験条件下では電流を生じなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１−１】ヒトＮＣＸ１のｃＤＮＡ配列を含むベクターｐＶＬ１３９３のポリヌクレオチド配列を示す。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図１−４】図１−３の続きである。
【図１−５】図１−４の続きである。
【図１−６】図１−５の続きである。
【図１−７】図１−６の続きである。
【図１−８】図１−７の続きである。
【図１−９】図１−８の続きである。
【図１−１０】図１−９の続きである。
【図１−１１】図１−１０の続きである。
【図１−１２】図１−１１の続きである。
【図１−１３】図１−１２の続きである。
【図１−１４】図１−１３の続きである。
【図１−１５】図１−１４の続きである。
【図１−１６】図１−１５の続きである。
【図１−１７】図１−１６の続きである。
【図１−１８】図１−１７の続きである。
【図１−１９】図１−１８の続きである。
【図１−２０】図１−１９の続きである。
【図１−２１】図１−２０の続きである。
【図１−２２】図１−２１の続きである。
【図１−２３】図１−２２の続きである。
【図１−２４】図１−２３の続きである。
【図１−２５】図１−２４の続きである。
【図２】Ａ）金の構造と流体区画を有する３ｍｍのバイオセンサーチップであり、Ｂ〜Ｄ）は、バイオセンサーのサンドイッチ構造の組み立てのスキームである。
【図３】Ａ）組換えによって発現されたＮａ+／Ｃａ2+交換体のイオン輸送活性により誘導された充電電流であり、Ｂ）本発明に係る細胞非含有の電気生理学的なセンサーチップを用いて得られた、Ｎａ+／Ｃａ2+交換体（阻害剤）のＩＣ５０である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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