(57)【要約】【課題】各種実験及び評価等に用いる肝臓細胞又はその前駆細胞由来の細胞の細胞の状態を評価する方法等を提供する。【解決手段】本発明に係る評価方法は、例えば、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9等からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸若しくはその一部を含むプローブ又はプローブセットを用いて、被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の遺伝子発現量を測定する工程を含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸若しくはその一部を含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するためのプローブ又はプローブセット。
（ａ）CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、AHR、NR1I2、CASR、ESR、NR3C1、ABCA1、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6、ABCG2、ABCG5、ABCG8、SLC5A1、SLC5A2、SLC7A5、SLC7A8、SLC10A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A7、SLC17A1、SLC22A1、SLC22A12、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC28A1、SLC28A2、SLC29A1、SLC29A2、SLC31A1、SLC47A1、SLC47A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO4C1、UGT2B4、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B7、UGT2B17、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A4、UGT1A9、UGT1A3、CES1、CES2、CES3、CES5、GSTM1、GSTT1、GSTA1、SULT1A1、SULT1A3、SULT1A4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1、NAT1、ALB、CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、TTR、SERPINA1、TDO2、CPS1、PCK2、OTC、ASS1、HNF4A、GSTP1、TPMT、NR1H4、RXRA、FGFR2、FGFR4、NR5A2、NR0B2、FABP6、SREBF1、SREBF2、PPARA、LDLR、SCARB1、NPC1L1、SLC27A5、SLC51A、SLC51B、BAAT、SULT2A1、PLTP、APOC2、APOC3、ANGPTL3、G6PC、TRIB3、AKT1、GSK3A、GSK3B、FOXO1、COMT、HNF1A、CYP3A7、POU5F1、AFP、THY1、EPCAM、DLK1、CEBPA、YBX1、CD34、KIT、MET、KRT18、CD44、VIM、KRT14、PVRL3、SLC36A6、CDH1、ITGB1、ANPEP、PTPRC、TECR、ITGA6、NGFR、ASGR1、KRK8、KRT19、ONECUT1、HNF1B、STAB2、DMBT1、NOTCH2、DES、CTNNB1、APC、PDGFB、FGF3、FGF4、CSF1R、FLT1、FLT3、EGFR、ERBB2、ERBB4、ABL1、FYN、LYN、RAF1、MOS、HRAS、KRAS、NRAS、MYC、MYCN、MYCL1、MYB、FOS、JUN、REL、ETS1、BCL2、BCL2L1及びSRCからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
【請求項２】
前記（ａ）の核酸が、下記グループ（i）〜(viii)から選択される２以上のグループの核酸の組み合わせからなるものである、請求項１記載のプローブセット。
(i) CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4及びCYP3A5からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(ii) AHR、NR1I2、CASR、ESR及びNR3C1からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(iii) ABCA1、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6、ABCG2、ABCG5、ABCG8、SLC5A1、SLC5A2、SLC7A5、SLC7A8、SLC10A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A7、SLC17A1、SLC22A1、SLC22A12、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC28A1、SLC28A2、SLC29A1、SLC29A2、SLC31A1、SLC47A1、SLC47A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO2A1、SLCO2B1及びSLCO4C1からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(iv) UGT2B4、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B7、UGT2B17、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A4、UGT1A9、UGT1A3、CES1、CES2、CES3、CES5、GSTM1、GSTT1、GSTA1、SULT1A1、SULT1A3、SULT1A4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1及びNAT1からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(v) ALB、CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、TTR、SERPINA1、TDO2、CPS1、PCK2、OTC、ASS1、HNF4A、GSTP1、TPMT、NR1H4、RXRA、FGFR2、FGFR4、NR5A2、NR0B2、FABP6、SREBF1、SREBF2、PPARA、LDLR、SCARB1、NPC1L1、SLC27A5、SLC51A、SLC51B、BAAT、SULT2A1、PLTP、APOC2、APOC3、ANGPTL3、G6PC、TRIB3、AKT1、GSK3A、GSK3B、FOXO1、COMT及びHNF1Aからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(vi) CYP3A7、POU5F1、AFP、THY1、EPCAM、DLK1、CEBPA、YBX1、CD34、KIT、MET、KRT18、CD44、VIM、KRT14、PVRL3、SLC36A6、CDH1、ITGB1、ANPEP及びPTPRCからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(vii) TECR、ITGA6、NGFR、ASGR1、KRK8、KRT19、ONECUT1、HNF1B、STAB2、DMBT1、NOTCH2、DES、CTNNB1、APC及びPDGFBからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(viii) FGF3、FGF4、CSF1R、FLT1、FLT3、EGFR、ERBB2、ERBB4、ABL1、FYN、LYN、RAF1、MOS、HRAS、KRAS、NRAS、MYC、MYCN、MYCL1、MYB、FOS、JUN、REL、ETS1、BCL2、BCL2L1及びSRCからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
【請求項３】
前記（ａ）の核酸が、前記グループ（i）〜(viii)の核酸の組み合わせからなるものである、請求項２記載のプローブセット。
【請求項４】
下記（α）、（β）、（γ）又は（δ）の核酸若しくはその一部を含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するためのプローブ又はプローブセット。
（α）配列番号１〜１９３に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（β）前記（α）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸
（γ）前記（α）又は（β）の核酸の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
（δ）当該（α）、（β）又は（γ）の核酸の塩基配列において１から数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列からなり、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
【請求項５】
前記（α）の核酸が、下記グループ（I）〜(VIII)から選択される２以上のグループの核酸の組み合わせからなるものである、請求項１記載のプローブセット。
(I) 配列番号１〜１０に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(II) 配列番号１１〜１５に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(III) 配列番号１６〜６１に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(IV) 配列番号６２〜８６に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(V) 配列番号８７〜１３０に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VI）配列番号１３１〜１５１に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VII）配列番号１５２〜１６６に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VIII）配列番号１６７〜１９３に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
【請求項６】
前記（α）の核酸が、前記グループ（I）〜(VIII)の核酸の組み合わせからなるものである、請求項５記載のプローブセット。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプローブ又はプローブセットを含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するための核酸マイクロアレイ。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプローブ又はプローブセットを用いて、被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の遺伝子発現量を測定する工程を含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価する方法。
【請求項９】
請求項７記載の核酸マイクロアレイを用いて、被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の遺伝子発現量を測定する工程を含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価する方法。
【請求項１０】
被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞に、予め被験物質を接触させる工程を含む、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
測定した遺伝子発現量に基づく多変量解析の結果を指標として、肝臓細胞としての機能を評価する工程を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプローブ又はプローブセットを用いて、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞における肝臓細胞としての機能保持に有用な物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
請求項７に記載の核酸マイクロアレイを用いて、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞における肝臓細胞としての機能保持に有用な物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓細胞又はその前駆細胞に由来する細胞の状態を評価する方法、並びに、当該方法に用い得る、肝臓細胞又はその前駆細胞に由来する細胞の状態を評価するためのプローブ又はプローブセット及びマイクロアレイ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、体のいくつもの生命維持に必要な機能を実行しており、この機能には、正常な状態を維持するために重要な多くの物質の調節、合成、および分泌；グリコーゲン（グルコース）、ビタミン、およびミネラルのような重要な栄養素の貯蔵；ならびに老廃物、薬剤、および毒素の浄化、変換、および除去が含まれる。肝臓の中でこれらの機能のほとんどを肝細胞（肝実質細胞）が担っている。
【０００３】
創薬では肝臓の細胞を用いて評価を行うことが多いが、正常な肝細胞はほとんど細胞分裂・増殖することはなく、使用される細胞は手術等で摘出された肝細胞や、癌化・株化した細胞及び胎児の細胞といった前駆細胞や幹細胞から分化させた肝細胞を使用する。その際、使用する細胞がより生体の肝臓に近いほど実験の成果としての確度があがるため、肝細胞としての機能の評価を行うことがある。その評価方法は一般的に肝臓の機能に関連する一部の酵素の活性や（特許文献１）、細胞表面のマーカー等（特許文献２）で、肝細胞の状態や分化の優劣を評価してきた。例えば、分化した細胞が薬物代謝の評価に使用できるかどうかを評価するとき、薬物代謝にかかわるＣＹＰ（Ｐ４５０）ファミリーの一部のタンパク質などの活性のみを測定することがほとんどであるが、実際の肝実質細胞内では、薬物の取り込み、Ｐ４５０ 以外の酵素の働き、代謝された薬物の排出等の様々なメカニズムが関連している。近年では、前述した肝臓の機能に関連する遺伝子を検出するためのマイクロアレイも報告されている（特許文献３）。
【０００４】
しかしながら、肝臓（肝細胞）の機能としては前述した薬物代謝に関わる機能以外にも、造血、糖代謝、脂質代謝、胆汁酸合成等の機能があり、また、胆管等の肝実質細胞以外の細胞の働きもあるため、従来の手法・手段を用いた評価方法では、評価対象となる細胞（肝細胞等由来細胞）が、どの程度肝細胞としての機能を保持した細胞であるか（例えば、どの程度生体内の肝細胞に機能的に近い状態であるか）を判断するのに十分なものではなかった。
【０００５】
また、肝細胞への物質（薬物・薬剤等）の影響を見る場合も、従来は、薬物代謝酵素への影響のみが確認されているにとどまり、上述したような薬物代謝に関わる機能以外の機能について、肝細胞への影響は確認されてはいなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2009-542215号公報
【特許文献２】特表2004-531270号公報
【特許文献３】特開2004-135552号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況下において、例えば創薬等における各種実験及び評価に用いる肝臓細胞又はその前駆細胞由来の細胞について、その細胞の状態を評価する方法、具体的には、例えば、その細胞が肝臓細胞としての機能を十分に保持しているものであるかどうかを客観的かつ適切に評価する方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、肝臓細胞又はその前駆細胞に由来する細胞の状態を評価するためのプローブ又はプローブセット、及びマイクロアレイ、並びに、当該プローブ若しくはプローブセット又はマイクロアレイを用いる、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価する方法、及び肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞における肝細胞としての機能保持に有用な物質をスクリーニングする方法等を提供するものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸若しくはその一部を含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するためのプローブ又はプローブセット。
（ａ）CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、AHR、NR1I2、CASR、ESR、NR3C1、ABCA1、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6、ABCG2、ABCG5、ABCG8、SLC5A1、SLC5A2、SLC7A5、SLC7A8、SLC10A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A7、SLC17A1、SLC22A1、SLC22A12、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC28A1、SLC28A2、SLC29A1、SLC29A2、SLC31A1、SLC47A1、SLC47A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO4C1、UGT2B4、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B7、UGT2B17、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A4、UGT1A9、UGT1A3、CES1、CES2、CES3、CES5、GSTM1、GSTT1、GSTA1、SULT1A1、SULT1A3、SULT1A4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1、NAT1、ALB、CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、TTR、SERPINA1、TDO2、CPS1、PCK2、OTC、ASS1、HNF4A、GSTP1、TPMT、NR1H4、RXRA、FGFR2、FGFR4、NR5A2、NR0B2、FABP6、SREBF1、SREBF2、PPARA、LDLR、SCARB1、NPC1L1、SLC27A5、SLC51A、SLC51B、BAAT、SULT2A1、PLTP、APOC2、APOC3、ANGPTL3、G6PC、TRIB3、AKT1、GSK3A、GSK3B、FOXO1、COMT、HNF1A、CYP3A7、POU5F1、AFP、THY1、EPCAM、DLK1、CEBPA、YBX1、CD34、KIT、MET、KRT18、CD44、VIM、KRT14、PVRL3、SLC36A6、CDH1、ITGB1、ANPEP、PTPRC、TECR、ITGA6、NGFR、ASGR1、KRK8、KRT19、ONECUT1、HNF1B、STAB2、DMBT1、NOTCH2、DES、CTNNB1、APC、PDGFB、FGF3、FGF4、CSF1R、FLT1、FLT3、EGFR、ERBB2、ERBB4、ABL1、FYN、LYN、RAF1、MOS、HRAS、KRAS、NRAS、MYC、MYCN、MYCL1、MYB、FOS、JUN、REL、ETS1、BCL2、BCL2L1及びSRCからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
【００１０】
ここで、上記（１）のプローブセットは、（ａ）の核酸が、例えば、下記グループ（i）〜(viii)から選択される２以上のグループの核酸の組み合わせからなるものであってもよいし、さらに、下記グループ（i）〜(viii)の核酸の組み合わせからなるもの（当該グループすべてを組み合わせたもの）であってもよい。
(i) CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4及びCYP3A5からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(ii) AHR、NR1I2、CASR、ESR及びNR3C1からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(iii) ABCA1、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6、ABCG2、ABCG5、ABCG8、SLC5A1、SLC5A2、SLC7A5、SLC7A8、SLC10A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A7、SLC17A1、SLC22A1、SLC22A12、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC28A1、SLC28A2、SLC29A1、SLC29A2、SLC31A1、SLC47A1、SLC47A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO2A1、SLCO2B1及びSLCO4C1からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(iv) UGT2B4、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B7、UGT2B17、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A4、UGT1A9、UGT1A3、CES1、CES2、CES3、CES5、GSTM1、GSTT1、GSTA1、SULT1A1、SULT1A3、SULT1A4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1及びNAT1からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(v) ALB、CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、TTR、SERPINA1、TDO2、CPS1、PCK2、OTC、ASS1、HNF4A、GSTP1、TPMT、NR1H4、RXRA、FGFR2、FGFR4、NR5A2、NR0B2、FABP6、SREBF1、SREBF2、PPARA、LDLR、SCARB1、NPC1L1、SLC27A5、SLC51A、SLC51B、BAAT、SULT2A1、PLTP、APOC2、APOC3、ANGPTL3、G6PC、TRIB3、AKT1、GSK3A、GSK3B、FOXO1、COMT及びHNF1Aからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(vi) CYP3A7、POU5F1、AFP、THY1、EPCAM、DLK1、CEBPA、YBX1、CD34、KIT、MET、KRT18、CD44、VIM、KRT14、PVRL3、SLC36A6、CDH1、ITGB1、ANPEP及びPTPRCからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(vii) TECR、ITGA6、NGFR、ASGR1、KRK8、KRT19、ONECUT1、HNF1B、STAB2、DMBT1、NOTCH2、DES、CTNNB1、APC及びPDGFBからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(viii) FGF3、FGF4、CSF1R、FLT1、FLT3、EGFR、ERBB2、ERBB4、ABL1、FYN、LYN、RAF1、MOS、HRAS、KRAS、NRAS、MYC、MYCN、MYCL1、MYB、FOS、JUN、REL、ETS1、BCL2、BCL2L1及びSRCからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
【００１１】
（２）下記（α）、（β）、（γ）又は（δ）の核酸若しくはその一部を含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するためのプローブ又はプローブセット。
（α）配列番号１〜１９３に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（β）前記（α）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸
（γ）前記（α）又は（β）の核酸の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
（δ）当該（α）、（β）又は（γ）の核酸の塩基配列において１から数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列からなり、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
【００１２】
ここで、上記（２）のプローブセットは、（α）の核酸が、例えば、下記グループ（I）〜(VIII)から選択される２以上のグループの核酸の組み合わせからなるものであってもよいし、さらに、下記グループ（I）〜(VIII)の核酸の組み合わせからなるもの（当該グループすべてを組み合わせたもの）であってもよい。
前記（α）の核酸が、下記グループ（I）〜(VIII)から選択される２以上のグループの核酸の組み合わせからなるものである、請求項１記載のプローブセット。
(I) 配列番号１〜１０に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(II) 配列番号１１〜１５に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(III) 配列番号１６〜６１に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(IV) 配列番号６２〜８６に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(V) 配列番号８７〜１３０に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VI）配列番号１３１〜１５１に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VII）配列番号１５２〜１６６に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VIII）配列番号１６７〜１９３に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
【００１３】
（３）上記（１）又は（２）のプローブ又はプローブセットを含む、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するための核酸マイクロアレイ。
【００１４】
（４）上記（１）又は（２）のプローブ又はプローブセットあるいは上記（３）の核酸マイクロアレイを用いて、被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の遺伝子発現量を測定する工程を含む、
ここで、上記（４）の方法は、例えば、被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞に、予め被験物質を接触させる工程を含む方法であってもよく、また、測定した遺伝子発現量に基づく多変量解析の結果を指標として、肝臓細胞としての機能を評価する工程を含む方法であってもよい。
【００１５】
（５）上記（１）又は（２）のプローブ又はプローブセットあるいは上記（３）の核酸マイクロアレイを用いて、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞における肝臓細胞としての機能保持に有用な物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、各種実験及び評価等に用いる肝臓細胞又はその前駆細胞由来の細胞について、その細胞の状態を評価する、具体的には、例えば、その細胞が肝臓細胞としての機能を十分に保持しているものであるかどうかを客観的かつ適切に評価したり、その細胞が薬剤等の各種物質により与えられる影響を評価する方法を提供することができる。また、本発明によれば、当該評価方法に用いるプローブ又はプローブセット、及びマイクロアレイを提供することができる。さらに、これらプローブ又はプローブセット、及びマイクロアレイを用いることにより、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞における肝細胞としての機能保持に有用な物質をスクリーニングする方法を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】中空繊維束（中空繊維配列体）製造用の配列固定治具を示す概略図である。
【図２Ａ】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｂ】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｃ−１】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｃ−２】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｄ】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｅ−１】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｅ−２】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｆ】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｇ】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【図２Ｈ】本実施例において用いた各細胞の各遺伝子発現量を示す図である。
【００１８】
なお、図２Ａ〜図２Ｈのいずれにおいても、各々プローブ（配列番号１〜１９３）についての測定結果を示す各々のグラフでは、縦軸は、Intensity（Ｃｙ５の蛍光強度）を表し、横軸は、左端から順に下記表３に記載の実験Ｎｏ．Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ１−３、Ａ３−１（２）、Ａ３−２（２）、Ｂ１−１、Ｂ８−１、Ｃ−１及びＤ−１に関する測定結果を示している。
また、図２Ａでは配列番号１〜１０の塩基配列からなるプローブ、図２Ｂでは配列番号１１〜１５の塩基配列からなるプローブ、図２Ｃ−１では配列番号１６〜５５の塩基配列からなるプローブ、図２Ｃ−２では配列番号５６〜６１の塩基配列からなるプローブ、図２Ｄでは配列番号６２〜８６の塩基配列からなるプローブ、図２Ｅ−１では配列番号８７〜１２６の塩基配列からなるプローブ、図２Ｅ−２では配列番号１２７〜１３０の塩基配列からなるプローブ、図２Ｆでは配列番号１３１〜１５０の塩基配列からなるプローブ、図２Ｇでは配列番号１５１〜１６６の塩基配列からなるプローブ、図２Ｈでは配列番号１６７〜１９３の塩基配列からなるプローブ、についての測定結果を示す各々のグラフを列記している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書は、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００２０】
１．本発明の概要
本発明において、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価することとは、被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞より抽出した所定の遺伝子の発現量を測定し、その結果に基づいて、当該細胞の状態を評価及び判断することをいう。
ここで、遺伝子の発現とは、通常、ｍＲＮＡの発現のことである。遺伝子の発現量とは、ｍＲＮＡ量、又はＤＮＡやｍＲＮＡから増幅した核酸の量、あるいはタンパク質量のことであり、遺伝子の発現量を測定することは、ｍＲＮＡ量、又はＤＮＡやｍＲＮＡから増幅した核酸の量、タンパク質量を測定することを意味する。
【００２１】
また、当該細胞の状態とは、特に限定はされないが、例えば、実際の肝臓細胞（いわゆる生体内に存在する肝臓細胞）としての機能をどの程度有する（保持する）ものであるかという意味での状態や、あるいは、予め当該細胞に被験物質を接触させた場合は当該細胞が被験物質の接触前と比べてどの程度肝臓細胞としての機能が変化しているかという意味での状態などが挙げられる。肝臓細胞の機能としては、例えば、薬物、脂質又は糖の取り込みに関する機能や、代謝、排出、造血、胆汁酸合成に関する機能、あるいは胆管、星細胞又は癌化細胞に特有のタンパク質の発現の有無などが挙げられる。
【００２２】
本発明において肝臓細胞とは、肝臓を構成する細胞、及び肝臓へ分化しうる前駆細胞であり、例えば、肝細胞（肝実質細胞）、胆管上皮細胞、星細胞、クッパー細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、中皮細胞、ビット細胞、肝芽細胞、胚様肝細胞、肝腫瘍由来細胞が含まれる。
また、本発明において被験対象となる肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞とは、哺乳動物（特にヒト）の肝臓由来の初代細胞及び細胞株、それらの細胞から遺伝子誘導若しくは薬物誘導した細胞、幹細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、並びに、胎児由来の肝臓細胞及びその前駆細胞又はこれらの細胞株から分化誘導した細胞などが挙げられる。
【００２３】
肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価及び判断するにあたり、比較対照としては、実際の肝臓細胞又はその前駆細胞（生体内の肝臓より直接採取（摘出）した肝臓細胞又はその前駆細胞）や、種々の状態の肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞を用いることができる。
【００２４】
本発明では、被験対象としての肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するため、例えば、(i)薬物代謝の水酸化反応に関連する遺伝子、(ii)核内受容体転写に関連する遺伝子、(iii)薬物トランスポーター（取り込み、排出）に関連する遺伝子、(iv)薬物代謝の第二相反応に関連する遺伝子、(v)胆汁酸合成、造血、脂質代謝、糖代謝等の機能に関連する遺伝子、(vi)前駆細胞等からの分化に関連する遺伝子、(vii)胆管細胞等の非実質細胞に関連する遺伝子、(viii)癌細胞に関連する遺伝子等を選択し、プローブとして使用することができる。本明細書等では、これらの遺伝子を肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子という。これら各種遺伝子より選択される少なくとも１種又は少なくとも２種の遺伝子を選択し、当該遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸又はその一部を、プローブ又はプローブセットとして用いることができる。
【００２５】
ここで、上述した肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子としては、例えば、以下のものが挙げられる。
＜肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子＞
CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、AHR、NR1I2、CASR、ESR、NR3C1、ABCA1、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6、ABCG2、ABCG5、ABCG8、SLC5A1、SLC5A2、SLC7A5、SLC7A8、SLC10A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A7、SLC17A1、SLC22A1、SLC22A12、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC28A1、SLC28A2、SLC29A1、SLC29A2、SLC31A1、SLC47A1、SLC47A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO4C1、UGT2B4、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B7、UGT2B17、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A4、UGT1A9、UGT1A3、CES1、CES2、CES3、CES5、GSTM1、GSTT1、GSTA1、SULT1A1、SULT1A3、SULT1A4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1、NAT1、ALB、CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、TTR、SERPINA1、TDO2、CPS1、PCK2、OTC、ASS1、HNF4A、GSTP1、TPMT、NR1H4、RXRA、FGFR2、FGFR4、NR5A2、NR0B2、FABP6、SREBF1、SREBF2、PPARA、LDLR、SCARB1、NPC1L1、SLC27A5、SLC51A、SLC51B、BAAT、SULT2A1、PLTP、APOC2、APOC3、ANGPTL3、G6PC、TRIB3、AKT1、GSK3A、GSK3B、FOXO1、COMT、HNF1A、CYP3A7、POU5F1、AFP、THY1、EPCAM、DLK1、CEBPA、YBX1、CD34、KIT、MET、KRT18、CD44、VIM、KRT14、PVRL3、SLC36A6、CDH1、ITGB1、ANPEP、PTPRC、TECR、ITGA6、NGFR、ASGR1、KRK8、KRT19、ONECUT1、HNF1B、STAB2、DMBT1、NOTCH2、DES、CTNNB1、APC、PDGFB、FGF3、FGF4、CSF1R、FLT1、FLT3、EGFR、ERBB2、ERBB4、ABL1、FYN、LYN、RAF1、MOS、HRAS、KRAS、NRAS、MYC、MYCN、MYCL1、MYB、FOS、JUN、REL、ETS1、BCL2、BCL2L1、SRC
【００２６】
これらの各遺伝子の塩基配列情報等は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information Search term Search database）から取得することができる。各遺伝子名の表記としては、ＮＣＢＩのオフィシャルシンボルを大文字で表記しているが、これにより生物種が限定されるものではない。例えば、ヒトのほか、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、モルモット、サル、イヌ、ネコ等の各種哺乳動物の遺伝子を使用することもできる。
【００２７】
２．プローブ又はプローブセット
プローブとは、一般に、検体（被験試料）中の標的とする遺伝子の核酸（ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ、あるいはこれらのアンチセンス鎖（ａＲＮＡ又はａＤＮＡ））をハイブリダイゼーションにより捕捉し、当該標的核酸を検出するために使用されるものをいう。当該プローブは、通常、核酸プローブであるが、プローブを構成する「核酸」としては、一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどを使用することができ、なかでもＤＮＡが好ましい。
本発明において、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するためのプローブ（又はプローブセット）としては、例えば、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の核酸若しくはその一部を含むものが挙げられる。
【００２８】
（ａ）CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、AHR、NR1I2、CASR、ESR、NR3C1、ABCA1、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6、ABCG2、ABCG5、ABCG8、SLC5A1、SLC5A2、SLC7A5、SLC7A8、SLC10A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A7、SLC17A1、SLC22A1、SLC22A12、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC28A1、SLC28A2、SLC29A1、SLC29A2、SLC31A1、SLC47A1、SLC47A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO4C1、UGT2B4、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B7、UGT2B17、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A4、UGT1A9、UGT1A3、CES1、CES2、CES3、CES5、GSTM1、GSTT1、GSTA1、SULT1A1、SULT1A3、SULT1A4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1、NAT1、ALB、CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、TTR、SERPINA1、TDO2、CPS1、PCK2、OTC、ASS1、HNF4A、GSTP1、TPMT、NR1H4、RXRA、FGFR2、FGFR4、NR5A2、NR0B2、FABP6、SREBF1、SREBF2、PPARA、LDLR、SCARB1、NPC1L1、SLC27A5、SLC51A、SLC51B、BAAT、SULT2A1、PLTP、APOC2、APOC3、ANGPTL3、G6PC、TRIB3、AKT1、GSK3A、GSK3B、FOXO1、COMT、HNF1A、CYP3A7、POU5F1、AFP、THY1、EPCAM、DLK1、CEBPA、YBX1、CD34、KIT、MET、KRT18、CD44、VIM、KRT14、PVRL3、SLC36A6、CDH1、ITGB1、ANPEP、PTPRC、TECR、ITGA6、NGFR、ASGR1、KRK8、KRT19、ONECUT1、HNF1B、STAB2、DMBT1、NOTCH2、DES、CTNNB1、APC、PDGFB、FGF3、FGF4、CSF1R、FLT1、FLT3、EGFR、ERBB2、ERBB4、ABL1、FYN、LYN、RAF1、MOS、HRAS、KRAS、NRAS、MYC、MYCN、MYCL1、MYB、FOS、JUN、REL、ETS1、BCL2、BCL2L1、SRCからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
【００２９】
ここで、上記（ａ）の核酸（肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子）については、当該遺伝子の機能及び種類に基づき、下記グループ（i）〜(viii)のように分類することができる。本発明において、上記（ａ）の核酸としては、下記グループ（i）〜(viii)から選択される２以上のグループの核酸の組み合わせからなるものを用いることが好ましく、下記グループ（i）〜(viii)の核酸すべての組み合わせからなるものがより好ましい。
【００３０】
(i) 薬物代謝の水酸化反応に関連する遺伝子（CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、及びCYP3A5）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(ii) 核内受容体転写に関連する遺伝子（AHR、NR1I2、CASR、ESR及びNR3C1）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(iii) 薬物トランスポーター（取り込み、排出）に関連する遺伝子（ABCA1、ABCB1、ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC6、ABCG2、ABCG5、ABCG8、SLC5A1、SLC5A2、SLC7A5、SLC7A8、SLC10A1、SLC10A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC16A1、SLC16A7、SLC17A1、SLC22A1、SLC22A12、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC28A1、SLC28A2、SLC29A1、SLC29A2、SLC31A1、SLC47A1、SLC47A2、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO2A1、SLCO2B1及びSLCO4C1）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
【００３１】
(iv) 薬物代謝の第二相反応に関連する遺伝子（UGT2B4、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B7、UGT2B17、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A4、UGT1A9、UGT1A3、CES1、CES2、CES3、CES5、GSTM1、GSTT1、GSTA1、SULT1A1、SULT1A3、SULT1A4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1及びNAT1）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(v) 胆汁酸合成、造血、脂質代謝、糖代謝等の機能に関連する遺伝子（ALB、CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、TTR、SERPINA1、TDO2、CPS1、PCK2、OTC、ASS1、HNF4A、GSTP1、TPMT、NR1H4、RXRA、FGFR2、FGFR4、NR5A2、NR0B2、FABP6、SREBF1、SREBF2、PPARA、LDLR、SCARB1、NPC1L1、SLC27A5、SLC51A、SLC51B、BAAT、SULT2A1、PLTP、APOC2、APOC3、ANGPTL3、G6PC、TRIB3、AKT1、GSK3A、GSK3B、FOXO1、COMT及びHNF1）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(vi) 前駆細胞等からの分化に関連する遺伝子（CYP3A7、POU5F1、AFP、THY1、EPCAM、DLK1、CEBPA、YBX1、CD34、KIT、MET、KRT18、CD44、VIM、KRT14、PVRL3、SLC36A6、CDH1、ITGB1、ANPEP及びPTPRC）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
【００３２】
(vii) 胆管細胞等の非実質細胞に関連する遺伝子（TECR、ITGA6、NGFR、ASGR1、KRK8、KRT19、ONECUT1、HNF1B、STAB2、DMBT1、NOTCH2、DES、CTNNB1、APC及びPDGFB）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
(viii) 癌細胞に関連する遺伝子（FGF3、FGF4、CSF1R、FLT1、FLT3、EGFR、ERBB2、ERBB4、ABL1、FYN、LYN、RAF1、MOS、HRAS、KRAS、NRAS、MYC、MYCN、MYCL1、MYB、FOS、JUN、REL、ETS1、BCL2、BCL2L1及びSRC）からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を構成する塩基配列からなる核酸
【００３３】
また、上記（ｂ）の核酸も、上記（ａ）の核酸と同様に、本発明における肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価等に用いることができる。上記（ｂ）の核酸については、上記（ａ）の核酸の相補鎖の塩基配列からなること以外は、上述した（ａ）の核酸に関する説明が同様に適用され得る。
さらに、上記（ｃ）の核酸も、上記（ａ）及び（ｂ）の核酸と同様に、本発明における肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価等に用いることができる。
【００３４】
ここで、上記（ｃ）の核酸において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」とは、例えば、前記（ａ）又は（ｂ）の核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸の、全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られる核酸をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
【００３５】
また、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件が挙げられる。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件が挙げられる。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件が挙げられる。なお、本発明においては、具体的には、「ストリンジェントな条件」は、塩基鎖長が６５塩基の場合、バッファーの１価陽イオン濃度が９７．５〜３２００ｍＭ、温度が３７〜８０℃の条件が好ましく、より好ましくは、１価陽イオン濃度が９７．５〜８００ｍＭ、温度が５０〜７０℃の条件であり、さらに好ましくは、バッファーの１価陽イオン濃度が１９５ｍＭ、温度が６５℃等の条件であるが、これらに限定されるわけではない。
【００３６】
このような「ストリンジェントな条件」においては、温度を上げるほど、高い相同性を有する核酸を効率的に得ることができる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間、イオン強度、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３７】
なお、ハイブリダイゼーションにおいて、市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％ (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズした核酸を検出することができる。
【００３８】
上記以外にハイブリダイズ可能な核酸としては、FASTA及びBLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、前記（ａ）の核酸の塩基配列と、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上又は99.9％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸を挙げることができる。
【００３９】
なお、塩基配列の相同性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, p. 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, p. 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., vol. 215, p. 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、word length=12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００４０】
さらに、上記（ｃ）の核酸において、「肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる」とは、上記（ａ）において列挙した遺伝子の塩基配列やその相補鎖の塩基配列のいずれかをハイブリダイゼーションにより捕捉することができることであることを意味する。
上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の核酸は、当該核酸の全長に限らず、その一部をプローブとして使用することもできる。当該核酸の一部とは、例えば、３０〜５０００塩基からなる核酸、４０〜１０００塩基からなる核酸、５０〜５００塩基からなる核酸が挙げられ、好ましくは６０塩基〜２００塩基からなる核酸が挙げられる。
【００４１】
また、本発明においては、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価するためのプローブ（又はプローブセット）としては、例えば、以下の（α）、（β）、（γ）及び（δ）の核酸を含むものも挙げられる。
【００４２】
（α）配列番号１〜１９３（下記表１及び２参照）に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（β）前記（α）の核酸に対し相補的な塩基配列からなる核酸
（γ）前記（α）又は（β）の核酸の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
（δ）当該（α）、（β）又は（γ）の核酸の塩基配列において１から数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列からなり、かつ肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる核酸
【００４３】
【表１】
2015008686.tif 000002
【００４４】
【表２】
2015008686.tif 000003
【００４５】
上記（α）で列挙した配列番号１〜１９３に示される塩基配列は、前述した（ａ）の核酸における各遺伝子の塩基配列の一部に相当する塩基配列である。よって、上記（α）の核酸も、本発明における肝細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態の評価等のためのプローブ（又はプローブセット）として有用なものである。
【００４６】
また、上記（α）の核酸としては、下記グループ（I）〜(VIII)のように分類することができる。本発明において、上記（α）の核酸としては、下記グループ（I）〜(VIII)から選択される２以上のグループの核酸の組み合わせからなるものを用いることが好ましく、下記グループ（I）〜(VIII)の核酸すべての組み合わせからなるものがより好ましい。ここで、下記グループ（I）〜(VIII)における各配列番号に示される塩基配列は、それぞれ、前述したグループ（i）〜(viii)の核酸における各遺伝子の塩基配列の一部に相当する塩基配列である。
【００４７】
(I) 配列番号１〜１０に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(II) 配列番号１１〜１５に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(III) 配列番号１６〜６１に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(IV) 配列番号６２〜８６に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
(V) 配列番号８７〜１３０に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VI）配列番号１３１〜１５１に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VII）配列番号１５２〜１６６に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
（VIII）配列番号１６７〜１９３に示される塩基配列のうちの少なくとも１種の塩基配列からなる核酸
【００４８】
また、上記（β）の核酸も、上記（α）の核酸と同様に、本発明における肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態の評価等に用いることができる。上記（β）の核酸については、上記（α）の核酸の相補鎖の塩基配列からなること以外は、上述した（α）の核酸に関する説明が同様に適用され得る。
また、上記（γ）の核酸も、上記（α）及び（β）の核酸と同様に、本発明における肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態の評価等に用いることができる。
【００４９】
上記（γ）の核酸は、前記（α）又は（β）の核酸の塩基配列に対して、70％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸であるが、さらに、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上又は99.9％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸であることが好ましい。なお、塩基配列の相同性に関する説明については、前述した（ｂ）の核酸における説明が同様に適用され得る。
【００５０】
なお、上記（γ）の核酸において、「肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる」とは、前述した（ａ）において列挙した各遺伝子の塩基配列やその相補鎖の塩基配列のいずれかをハイブリダイゼーションにより捕捉することができることであることを意味する。
さらに、上記（δ）の核酸も、上記（α）、（β）及び（γ）の核酸と同様に、本発明における肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態の評価等に用いることができる。
【００５１】
上記（δ）の核酸は、上記（α）、（β）及び（γ）の核酸の塩基配列において１から数個（例えば、１〜１５個、１〜１０個、又は１〜５個、あるいは１〜２個）の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列である。例えば、上記（α）、（β）及び（γ）の核酸の塩基配列の末端に、リンカーとなる塩基（ポリＴなど）を修飾したものや、当該塩基配列の一部に別の塩基を挿入したり、当該塩基配列の一部の塩基を欠失させたり、当該塩基配列の一部の塩基を別の塩基に置換したもの等が挙げられる。
【００５２】
このように、所望の塩基を付加、欠失又は置換した変異配列、特に変異置換型の核酸については、例えば、上記「Moleculer cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.」や「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)」等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Prime STAR(登録商標) Mutagenesis Basal kit、Mutan(登録商標)-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
【００５３】
なお、上記（δ）の核酸において、「肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子を検出することができる」とは、上記（γ）の核酸に関する説明が同様に適用され得る。
上記（α）、（β）、（γ）及び（δ）の核酸は、前述した（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の核酸と同様に、当該核酸の全長に限らず、その一部をプローブとして使用することができる。
本明細書において記載した各種核酸の入手方法は、特に限定はされず、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能であり、例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いる等して得ることができる。
【００５４】
また、プローブとして使用し得る各種核酸は、適宜、修飾されたものであってもよく、例えば、末端ビニル化（アクリロイル化、メタクリロイル化）又は末端アミノ化がなされたものや、リンカーとなる塩基（ポリＴなど）で修飾されたもの等が挙げられる。また、各種核酸の塩基配列の一部へ別の塩基を挿入したり、当該塩基配列の一部の塩基を欠失させたり、又は別の塩基に置換したり、あるいは塩基以外の物質に置換して、使用することもできる。ここで、塩基以外の物質としては、例えば、色素（蛍光色素、インターカレーター）、消光基、塩基架橋剤が挙げられる。
【００５５】
３．核酸マイクロアレイ
核酸マイクロアレイとは、担体上に多数の核酸プローブを高密度にそれぞれ独立に固定化したものである。核酸マイクロアレイは、複数の核酸塩基配列に関する発現量や、特定の核酸塩基配列の配列自体を網羅的に解析するために利用されるシステムである。
本発明の核酸マイクロアレイは、上述した本発明のプローブ（又はプローブセット）が搭載されたものである。本発明の核酸マイクロアレイは、支持体上に、本発明のプローブが固定されたものであれば、限定はされない。例えば、前述した肝臓細胞又はその前駆細胞発現遺伝子（前述した（ａ）において列挙した各遺伝子）に由来する各々のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ（あるいはこれらのａＤＮＡ又はａＲＮＡ）等とハイブリダイズし得るプローブをそれぞれ支持体に固定しておくことにより、複数の当該遺伝子の発現の検出や定量を同時に行うことができる。
【００５６】
核酸マイクロアレイについて、その支持体の形態は特には限定されず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，４６７−４７０（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，  ７６７−７７３（１９９１）等参照）。
【００５７】
他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、プローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られる核酸マイクロアレイが好ましく例示できる。この核酸マイクロアレイは、貫通孔基板にプローブを固定化したタイプのものと説明することができ、いわゆる「貫通孔型マイクロアレイ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等、本願図１を参照）。
支持体へのプローブの固定化方法は特には限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定化することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定化することもできる。
【００５８】
以下、中空繊維による貫通孔型核酸マイクロアレイについて、詳細に説明する。このマイクロアレイは、例えば、下記（工程ｉ）〜（工程ｉｖ）の工程を経て作製することができる。
（工程ｉ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
（工程ｉｉ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
（工程ｉｉｉ）プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
（工程ｉｖ）中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４−１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
【００５９】
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程ｉ）。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報を参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報を参照）等が挙げられる。
【００６０】
製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程ｉｉ）。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、プローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程ｉｉｉ）。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
【００６１】
ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程ｉｖ）。このようにして得られた薄片は、核酸マイクロアレイとして使用できる。当該アレイの厚みは、０．０１ｍｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。当該貫通孔型マイクロアレイとしては、例えば、三菱レイヨン社製の核酸マイクロアレイ（GenopalTM（ジェノパール（登録商標）））等が好ましく挙げられる。
【００６２】
上記ジェノパール（登録商標）の場合、各対応配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、高密度に固定化されており、生体試料由来のＲＮＡからＴ７  オリゴｄＴプライマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成を行った後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりａＲＮＡを合成する。ａＲＮＡ合成の際にビオチンを取り込み、サンプルを標識する。ビオチン標識ａＲＮＡを断片化してＤＮＡアレイにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後に蛍光色素を修飾したストレプトアビジンなどによりａＲＮＡを検出する。蛍光検出機で蛍光を読み取り、得られたアレイイメージを数値化し、各遺伝子の発現量を比較・定量することができる。また、使用する核酸マイクロアレイは上述の方法に限るものではなく、当業者が入手可能な複数種の核酸マイクロアレイを用いて同様の解析が可能である。
【００６３】
４．肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価する方法
本発明においては、正常な肝臓細胞（臓器より摘出した肝臓細胞）の遺伝子の発現量（対照）と、被験対象としての細胞（肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞）の遺伝子の発現量との測定結果を対比し、遺伝子の発現量の差（増加又は減少）を評価することにより、上記肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価することができる。
また、同様の手法で肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞の状態を評価することにより、当該細胞に任意の被験物質（例えば、各種化合物、医薬品、医薬品候補物質、食品成分）を接触させた場合（例えば、培養液中に添加した場合）の当該細胞への影響を評価することもできる。
【００６４】
（１）被験細胞
本発明に使用される細胞（肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞）は、限定されるものではなく、哺乳動物（特にヒト）の肝臓由来の初代細胞及び細胞株、それらの細胞から遺伝子誘導若しくは薬物誘導した細胞、幹細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、並びに、胎児由来の肝臓細胞及びその前駆細胞又はこれらの細胞株から分化誘導した細胞などが挙げられる。評価における比較の対照とする細胞は、より肝臓の機能を反映するためにも肝臓から直接採取した細胞が好ましい。また、被験細胞の培養前後や保存前後における状態の評価を行う場合は、対照とする細胞としては、上記培養又は保存前の被験細胞そのものを用いてもよい。なお、本発明でいう肝臓細胞とは、前記１.項で記載したとおりのものである。
【００６５】
（２）核酸の抽出と反応液調製方法
細胞より抽出した生体試料中のｍＲＮＡの量は、生体試料から核酸を抽出して測定する。核酸の抽出の詳細な条件や抽出した核酸の処理方法はそれぞれ発現量の測定方法に適した方法で行う。
ＲＮＡ抽出する一般的な方法としては、−８０℃や液体窒素で凍結した臓器若しくは細胞に０．５ｇ／１０ｍｌとなるように４Ｍグアニジンチオシアネイト溶液を加えホモジナイズする。そこに２Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、フェノールを１０ｍｌ、クロロホルムを１０ｍｌ添加し、よく混和する。それを１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、水層を回収する。そこに等量のイソプロパノールを加えさらに１００００ｒｐｍで１０分遠心し、ＲＮＡを沈殿する。再び４Ｍグアニジンチオシアネイト  １０ｍｌに溶解し、そこに２Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、フェノールを５ｍｌ、クロロホルムを１ｍｌ添加し、よく混和する。先の水層回収と同様の操作で水層を回収し、等量のイソプロパノールを添加してＲＮＡを神殿する。その沈殿物に７０％エタノールを２０ｍｌ添加して懸濁し、遠心してＲＮＡを沈殿する。この沈殿物に５ｍｌのＴＮＥＳ緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ）に溶解し、２００μｇ／ｍｌとなるようにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加え、３７℃で３０分反応し、酸性フェノール抽出、クロロホルム抽出を行いエタノールで沈殿する。
【００６６】
また、他の抽出手段として、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離する場合は、市販品の試薬キットであるＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することもでき、その場合は付属のプロトコルにしたがってＲＮＡを抽出することもできる。
さらに、場合により、ａＲＮＡを増幅する場合は、市販品でのキットであるＭｅｓｓａｇｅ  ＡｍｐＩＩ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、付属のプロトコルに従って増幅したａＲＮＡを調製することもできる。
【００６７】
（３）ｍＲＮＡ量、又はＤＮＡ若しくはｍＲＮＡから増幅した核酸の量の測定方法
本発明において、遺伝子の発現量とは、ｍＲＮＡ量、又はＤＮＡ若しくはｍＲＮＡから増幅した核酸の量、あるいはタンパク質量のことであり、遺伝子の発現量を測定することは、ｍＲＮＡ量、又はＤＮＡ若しくはｍＲＮＡから増幅した核酸の量、タンパク質量を測定することを意味する。当該測定の手法として、下記(3-1)〜(3-3)に具体例を示す。
【００６８】
(3-1)逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）
ＲＴ−ＰＣＲ法の場合、生体試料から抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを合成し、測定対象の遺伝子配列に相補的な２種類のＤＮＡ断片をプライマーとしたＰＣＲ法により測定対象の遺伝子の一部配列を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を検出することで、ｍＲＮＡ量を定量することができる。使用するプライマーは、測定対象の遺伝子の塩基配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように設計・合成することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーの設計・合成は当業者が容易に実施することができる。例えば、ＰＣＲ法においては、２つのプライマーの一方が測定対象遺伝子の２本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが２本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。プライマーの長さとしては、例えば、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基とする。具体的に、プライマーは、ＧｅｎｂａｎｋやＮＣＢＩなどのデータベースより各遺伝子のアクセッション番号により登録された１種以上の塩基配列に基づき設計し、化学合成できる。プライマーの調製は常法に従って実施できる。ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動の後、ＤＮＡに特異的に結合するエチジウムブロマイドやＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮなどの蛍光物質で標識することにより視覚化し、定量することができる。
【００６９】
(3-2)リアルタイムＰＣＲ法
ＡＢＩＰＲＩＳＭ７５００（アプライドバイオシステムズ社製）などのリアルタイムＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行うことで、増幅産物をリアルタイムに検出・モニタリングし、測定対象の遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）をより定量的に測定することが可能である。増幅されるＤＮＡは前述のＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮなどの蛍光物質で標識することにより検出できる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、通常の２種類のプライマーと合わせてＴａｑＭａｎプローブを用いる方法が、核酸増幅の特異性及び測定の感度を上げる方法としてより好ましい。予めクエンチングされたＦＡＭ、ＶＩＣなどの蛍光物質で標識されているＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを含めた３種のＤＮＡ断片を用いることにより、測定対象の遺伝子配列を特異的に増幅し、高感度に検出することが可能である。ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法は周知であり、使用するプローブとプライマーの選択は当業者が容易に実施することができる。遺伝子特異的なプローブ及びプライマーは、各遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列情報に基づいて、Ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社製）などの作製ソフトを使用することにより設計することが可能である。また、既に特定の遺伝子を検出するために特異的にデザインされ、製品化されたプローブ及びプライマーを用いることもできる。
【００７０】
(3-3)ノーザンブロッティング及びドットブロット
測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を用いて測定することができる。この解析方法において使用されるＤＮＡ断片の長さは、特に限定されないが、測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。
【００７１】
ＤＮＡ断片の長さとしては、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
【００７２】
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、この解析法で使用するＤＮＡ断片は、上記遺伝子群に含まれる遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズする塩基配列であればよく、最も好ましくは、上記遺伝子群に含まれる遺伝子の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列として設計することができる。
【００７３】
また、この解析法で使用するＤＮＡ断片は、上記遺伝子群に含まれる遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズするならば、上記遺伝子群に含まれる遺伝子の塩基配列の相補鎖に対して高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する塩基配列として設計することもできる。ここで、特異的にハイブリダイズするとは、上述したストリンジェントな条件と言い換えることができる。さらに、この解析法で使用するＤＮＡ断片としては、上述した遺伝子の塩基配列に基づいて設計するが、これら遺伝子において知られるＳＮＰ等の多型を含まないように設計することが好ましい。これによりＤＮＡ断片を用いた遺伝子の検出誤差を低く抑えることができる。さらにまた、遺伝子発現量を測定する手段としては、特に限定されず、生体由来試料に由来するｃＤＮＡを固定化したメンブレンフィルター又はリボプローブを用いたＲＮＡプロテクションアッセイ等の従来公知の手段を適用することができる。
【００７４】
（４）測定結果の解析
測定結果で評価に使用するデータは、判定値以上の値のみを使用することが好ましい。判定値はそれぞれの測定方法にしたがった方法を使用することができる。例えば、ネガティブコントロールの平均値Ｘを用いることができ、さらにはＸに標準偏差σを足した値、さらにはＸ＋２σ、さらにはＸ＋３σが望ましい。ネガティブコントロールとは、被験細胞からの試料で検出されるはずのない遺伝子であり、例えば被験細胞と異なる他種細胞の遺伝子で、且つ、検出対象の遺伝子との結果に相互作用のない遺伝子が好ましい。相互作用がないとは、例えばＰＣＲに用いるプライマーや検出に用いるプローブがストリンジェントな条件化でハイブリダイゼーションしないことである。得られたデータの各測定間の誤差をハウスキーピング遺伝子（ｇａｐｄｈ、ａｃｔｉｎ、ａｒｂｐ等）の値で補正し、補正したデータを用いてｍＲＮＡ量の変動を判定する。ｍＲＮＡ量の変動は検定により統計的に判定する。各被験細胞より試料をｎ＝３以上取得し、ｔ検定を行う。Ｐ値が０．０５以下の場合に、さらには０．０１以下の場合に有意に変動（増加又は減少）したと判定する。
【００７５】
（５）細胞状態の評価
本発明においては、肝臓細胞等由来細胞の状態の評価は、例えば、臓器より摘出した肝臓細胞おける遺伝子発現量プロファイルと、肝臓細胞等由来細胞（例えば、培養した肝臓細胞等）における遺伝子発現量プロファイルとを比較解析することによって行うことができる。対比する場合の対照となる遺伝子発現量プロファイルは、同一由来のものであっても複数の異なる被験細胞のものであってもよく、またデータベースに予め蓄積されたものであってもよい。本発明の方法では、複数の被験細胞由来の試料を用いてｍＲＮＡのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験細胞（１次母集団）において上記ｍＲＮＡ量を測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる単数又は複数の被験細胞由来の試料のｍＲＮＡ量とを比較することができる。比較は、ｍＲＮＡ量の増減を比較することだけでなく、ｍＲＮＡの発現の有無を比較することも含む。例えば、基本データでは発現しておらず、被験細胞で発現するｍＲＮＡについて、各試料を比較することを含む。
【００７６】
また、上記測定された被験細胞由来のデータを前記母集団の値に組み込んでｍＲＮＡ量レベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる被験細胞（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、ｍＲＮＡ量の臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる。
さらに、同種類の被験細胞の遺伝子発現量の測定結果を蓄積したデータベースを作成し、遺伝子発現量の変化をパターンとして評価することができる。好ましくは、同じ種類の細胞を用いて既知の成分の効果を測定したデータベースを作成し、遺伝子発現量の変化をパターンとして評価することが好ましい。このような方法としては、上述したように多変量解析を用いて行うことがを用いた方法が挙げられる。例えば主成分分析、因子分析、判別分析、数量化理論（I類，II類，III類，IV類）、クラスター分析、多次元尺度構成法（MDS）、重回帰分析、コンジョイント分析、マハラノビス・タグチシステム（MT法）を用いたパターンの比較、効果の予測等が挙げられる。
【００７７】
本発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置をも提供することができる。このような解析装置によれば、当該データベースから蓄積データを取り出し、測定された被験細胞のデータと比較するだけで、被験細胞の眼疾患の状態をいつでも簡便に評価することができる。
遺伝子発現量プロファイルとは、例えば、採取された生体試料中のｍＲＮＡ量を測定し、測定された各遺伝子の発現量を絶対値及び／又は相対値で示すことである。
【００７８】
５．スクリーニング方法
本発明においては、本発明のプローブ又はプローブセットあるいは核酸マイクロアレイを用いて、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞における肝臓細胞としての機能保持に有用な物質をスクリーニングする方法も提供することができる。
当該スクリーニングは、具体的には、例えば、肝臓細胞又はその前駆細胞由来細胞を、候補物質を接触させた後又は接触させながら、培養あるいは保存（凍結保存など）をし、その後、当該細胞における遺伝子発現量を測定し、対照の遺伝子発現量と比較解析することによってスクリーニングをすることができる。ここでいう接触とは、例えば、培養細胞の培養液中に候補物質を添加することをいう。
【００７９】
対照としては、例えば、生体から採取した実際の肝臓細胞又はその前駆細胞そのものの他、候補物質を接触させずに培養した場合の細胞、培養せずに候補物質を接触させた場合の細胞、あるいは培養せず候補物質も接触させない場合の細胞等が挙げられる。
なお、スクリーニングに用い得る候補物質としては、任意の各種化合物が挙げられ、天然由来のものであっても人工的に作製したものであってもよく、限定はされない。
【００８０】
対照となる遺伝子の発現量データは、同一の被験対象から取得したものであっても複数の異なる同一種の被験対象から取得したものであってもよく、またデータベースに予め蓄積されたものであってもよい。また、測定された被験対象由来の発現量データを母集団（被験対象）の値に組み込んで発現量レベルを再度データ処理し（平均値化等）、母集団の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、発現量の臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、スクリーニングの精度を高めることができる。
【００８１】
細胞に接触させる候補物質の濃度や量は、候補物質や被験対象の種類等に応じて適宜設定及び選択することができるが、核酸抽出に障害となる影響を及ぼさないよう、候補物質による毒性が被験対象に生じない濃度や量で行うのが好ましい。毒性が生じないとは、培養細胞の場合、少なくとも細胞生存率が９０％以上であることが挙げられる。
【００８２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８３】
１．核酸マイクロアレイ
本実施例では、表１及び２に記載のプローブ（配列番号１〜１９８）を搭載した核酸マイクロアレイ（ジェノパール（登録商標）、三菱レイヨン株式会社）を用いた。なお、配列番号１〜１９８のうち配列番号１９４〜１９８の塩基配列は、ハウスキーピング遺伝子及び酵母、大腸菌の一部に相当する配列であり、ポジティブコントロール又はネガティブコントロールのプローブとして用いた。
【００８４】
２．細胞と培養条件
本実施例に用いた細胞の種類と、その培養条件を、下記表３及び４に示した。培養容器はコラーゲンコート２４ｗｅｌｌプレート（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ社製）を用い、培養環境は共通して、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターでの培養とした。表３の細胞を、市販品の試薬キットであるＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＴｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。抽出条件は付属のプロトコルの肝臓組織の条件に従った。
【００８５】
【表３】
2015008686.tif 000004
【００８６】
【表４】
2015008686.tif 000005
【００８７】
３．検体液の調製
上記細胞より摘出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ及び参照として肝ガン細胞のＨｅｐＧ２のＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇ  より合成Ｍｅｓｓａｇｅ  Ａｍｐ  ＩＩ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコルに従って、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）の調製を行った。得られたａＲＮＡ  ５μｇをプラスチックチューブに入れ、Ｍｅｓｓａｇｅ  ＡｍｐＩＩ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社製）付属の５ｘ  Ａｒｒａｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅを４μｌ添加し、２０μｌにメスアップしてよく混合した後、９４℃で７．５分間加熱して断片化を行った。ジェノパールと反応させる検体調製は、２４μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（インビトロジェン社製）、２４μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ナカライテスク社製）及び２０μｌの０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液をそれぞれ混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで１８０μｌにメスアップしたのち、断片化後の溶液  ２０μｌを混合し、検体液を調製した。
【００８８】
４．測定
調製した検体液に、前記核酸マイクロアレイを浸漬し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った。核酸マイクロアレイからハイブリダイゼーションに用いた検体液を除去した後、そのアレイを６５℃の０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液）中に浸漬し（２０分間×２回）、次いで、６５℃に温めた０．１２Ｍ  ＴＮ溶液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ）に１０分間浸漬して、洗浄した。当該アレイにおけるシグナルの検出は、核酸マイクロアレイ検出装置（横河電機製：ＭＢ−Ｍ３Ａ、レーザー波長：６３３ｎｍ）を用い、Ｃｙ５の蛍光強度を測定した（露光時間：０．１秒，  １秒，  ４秒，  ４０秒）。
【００８９】
５．データ解析
データの解析は、下記の手順で行った。
（ｉ）  バックグランドの平均値を減算した。
（ｉｉ）  ポジティブコントロール遺伝子（β−ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬＰ０）で補正した。
（ｉｉｉ）  補正後の平均値及び発現比、Ｐ値を算出した（発現比はＣＴＲを基準に示している）。
（ｉｖ）  有意に変動した遺伝子（Ｐ値０．０５以下）をピックアップした。
【００９０】
６．結果
測定結果を図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ−１、２Ｃ−２、２Ｄ、２Ｅ−１、２Ｅ−２、２Ｆ、２Ｇ及び２Ｈに示した。上記表３において分類したＡ群の結果とＢ群、Ｃ群、Ｄ群の結果とを比較することで細胞種の違いを遺伝子で見分けることができた。また、実験Ｎｏ．Ａ１−１〜Ａ１−３の結果と、実験Ｎｏ．Ａ３−１(２)及びＡ３−２(２)の結果とを比較することで、細胞へ薬物を添加して培養した場合の変化を遺伝子で観測することができた。さらに、実験Ｎｏ．Ｂ１−１の結果と実験Ｎｏ．Ｂ８−１の結果とを比較することで、培養を継続することによる肝臓としての機能の低下を遺伝子で確認することができた。
また、本実施例で得られた測定結果と各遺伝子の機能に基づいて、前述の「２．プローブ又はプローブセット」の項で列挙した８種のグループ（グループ(i)〜(viii)）に分類した。この分類は、どの遺伝子の組み合わせでも、少なくとも１つは細胞種間の差（１．２倍以上の遺伝子発現量の差）を確認できる遺伝子が含まれる組み合わせとなり得る分類であることが確認された。
【符号の説明】
【００９１】
１１  孔部
２１  多孔板
３１  中空繊維
４１  板状物
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ−１】
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【図２Ｅ−２】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【配列表】
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