(57)【要約】  本発明は、（ａ）配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び（ｂ）標的部分と結合した結合部分を含む生物学的複合体であって、配列番号２のチオール基と結合部分中の官能基の間に共有結合を有する生物学的複合体を対象とする。本発明は、（ａ）配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び（ｂ）チオール基を有するアダプタータンパク質を含む結合部分を含む生物学的複合体であって、配列番号２のチオール基とアダプタータンパク質のチオール基の間にジスルフィド結合を有する生物学的複合体を対象とする。本発明は、前述の生物学的複合体中に利用される生物配列、並びに前述の生物学的複合体を使用する医薬調製物及び方法も対象とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のポリペプチド配列をコードする核酸配列からなる単離核酸。
【請求項３】
前記核酸が配列番号１の核酸配列からなる、請求項２に記載の単離核酸。
【請求項４】
配列番号４の配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４のポリペプチド配列をコードする配列を含む単離核酸。
【請求項６】
前記核酸が配列番号３の配列を含む、請求項５に記載の単離核酸。
【請求項７】
配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記配列番号２と前記選択した標的タンパク質のポリペプチド配列の間に位置するリンカー配列をさらに含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
前記標的タンパク質がサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、抗体、及びその断片からなる群から選択される、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記標的タンパク質がヒトＶＥＧＦ、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号６のポリペプチド配列を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号８のポリペプチド配列を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号６のポリペプチド配列をコードする単離核酸。
【請求項１４】
配列番号５の核酸配列を含む、請求項１３に記載の単離核酸。
【請求項１５】
配列番号８のポリペプチド配列をコードする単離核酸。
【請求項１６】
配列番号７の核酸配列を含む、請求項１５に記載の単離核酸。
【請求項１７】
前記標的タンパク質がヒトアネキシンＶ、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１０のポリペプチド配列を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１０のポリペプチド配列をコードする単離核酸。
【請求項２０】
配列番号９の核酸配列を含む、請求項１９に記載の単離核酸。
【請求項２１】
前記標的タンパク質が炭そ菌致死性ベクターの触媒不活性化断片、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１２のポリペプチド配列を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１２のポリペプチド配列をコードする単離核酸。
【請求項２４】
配列番号１１の核酸配列を含む、請求項２３に記載の単離核酸。
【請求項２５】
前記標的タンパク質が配列番号４のタンパク質配列を有するｓｃＶＥＧＦを含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１４のポリペプチド配列を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号１４のポリペプチド配列をコードする単離核酸。
【請求項２８】
配列番号１３の核酸配列を含む、請求項２７に記載の単離核酸。
【請求項２９】
（ａ）配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び
（ｂ）結合部分
を含む生物学的複合体であって、
配列番号２のチオール基と前記結合部分中の官能基の間に共有結合を有する生物学的複合体。
【請求項３０】
前記標的タンパク質がヒトＶＥＧＦ、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項２９に記載の生物学的複合体。
【請求項３１】
前記標的タンパク質が配列番号６又は配列番号８の配列を含む、請求項３０に記載の生物学的複合体。
【請求項３２】
前記標的タンパク質がヒトアネキシンＶ、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項２９に記載の生物学的複合体。
【請求項３３】
前記標的タンパク質が配列番号１０の配列を含む、請求項３２に記載の生物学的複合体。
【請求項３４】
前記標的タンパク質が炭そ菌致死性因子の触媒不活性化断片、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項２９に記載の生物学的複合体。
【請求項３５】
前記標的タンパク質が配列番号１２の配列を含む、請求項３４に記載の生物学的複合体。
【請求項３６】
前記標的タンパク質が配列番号４のタンパク質配列を有するｓｃＶＥＧＦを含む、請求項２９に記載の生物学的複合体。
【請求項３７】
前記標的タンパク質が配列番号１４の配列を含む、請求項３６に記載の生物学的複合体。
【請求項３８】
前記結合部分が薬剤、放射性核種キレート化剤、ポリエチレングリコール、色素、脂質、リポソーム、及び選択した表面からなる群から選択される、請求項２９に記載の生物学的複合体。
【請求項３９】
前記選択した表面がナノ又はミクロ粒子の表面、デンドリマーの表面、組織骨格の表面、生物医学デバイスの表面、及びバイオセンサーの表面からなる群から選択される、請求項３８に記載の生物学的複合体。
【請求項４０】
前記結合部分が相補的アダプタータンパク質を含む、請求項２９に記載の生物学的複合体。
【請求項４１】
前記アダプタータンパク質がＣｙｓ１１８を含む突然変異ヒトＲＮａｓｅＩ、又はその断片である、請求項２９に記載の生物学的複合体。
【請求項４２】
前記アダプタータンパク質が配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、及び配列番号２２からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項４１に記載の生物学的複合体。
【請求項４３】
（ａ）配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び
（ｂ）チオール基を有する前記標的部分と共有結合したアダプタータンパク質を含む結合部分
を含む生物学的複合体であって、
配列番号２のチオール基と前記アダプタータンパク質の前記チオール基の間にジスルフィド結合を有する生物学的複合体。
【請求項４４】
前記標的タンパク質がヒトＶＥＧＦ、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項４３に記載の生物学的複合体。
【請求項４５】
前記標的タンパク質が配列番号６又は配列番号８の配列を含む、請求項４４に記載の生物学的複合体。
【請求項４６】
前記標的タンパク質がヒトアネキシンＶ、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項４３に記載の生物学的複合体。
【請求項４７】
前記標的タンパク質が配列番号１０の配列を含む、請求項４６に記載の生物学的複合体。
【請求項４８】
前記標的タンパク質が炭そ菌致死性ベクターの触媒不活性化断片、又はその突然変異型若しくは切断型を含む、請求項４３に記載の生物学的複合体。
【請求項４９】
前記標的タンパク質が配列番号１２の配列を含む、請求項４８に記載の生物学的複合体。
【請求項５０】
前記標的タンパク質が配列番号４のタンパク質配列を有するｓｃＶＥＧＦを含む、請求項４３に記載の生物学的複合体。
【請求項５１】
前記標的タンパク質が配列番号１４の配列を含む、請求項５０に記載の生物学的複合体。
【請求項５２】
前記アダプタータンパク質がＣｙｓ１１８を含む突然変異ヒトＲＮａｓｅＩ、又はその断片である、請求項４３に記載の生物学的複合体。
【請求項５３】
前記アダプタータンパク質が配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、及び配列番号２２からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項５２に記載の生物学的複合体。
【請求項５４】
前記アダプタータンパク質が放射性核種キレート化剤、ポリエチレングリコール、色素、及び脂質からなる群から選択される物質をさらに含む、請求項４３に記載の生物学的複合体。
【請求項５５】
前記アダプタータンパク質が担体をさらに含む、請求項４３に記載の生物学的複合体。
【請求項５６】
前記担体が治療用、診断用、又は対照物質を充填したリポソームである、請求項５５に記載の生物学的複合体。
【請求項５７】
患者中の標的に選択した物質を選択的に送達するための医薬組成物であって、
（ａ）薬剤として許容される担体、及び
（ｂ）請求項２９又は４３に記載の生物学的複合体
を含む医薬組成物。
【請求項５８】
患者中の標的に選択した物質を選択的に送達するための方法であって、
（ａ）請求項５７に記載の医薬組成物を患者に投与するステップ、及び
（ｂ）前記生物学的複合体と前記標的を接触させて前記患者中の前記標的への前記物質の送達を可能にするステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン含有タグ及び標的タンパク質をコードする核酸及びタンパク質配列を対象とする。本発明は、前述のタンパク質配列及びタンパク質中のシステイン含有タグと共有結合した結合部分を有するタンパク質を含む、生物学的複合体も対象とする。本発明は、選択した治療用、診断用、又は研究用物質と組み合わせて生物学的複合体を含む医薬組成物、及び医薬組成物を患者に投与して患者において治療用、診断用、又は研究用物質の標的送達を実施する方法も対象とする。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質と様々な物質の結合は、幾つかの分野で使用されている。１つの分野は、その有効性を改善しおそらく有害な副作用を最少にするための、患者中の標的細胞への治療用、診断用、又は研究用物質の標的送達である。この分野では、治療用、診断用、及び研究用物質、又はこれらの担体のいずれかを、標的細胞と選択的に結合することができる組換え標的タンパク質と化学結合させる（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ及びＷａｌｋｅｒ、１９９９により総説された）。生成する複合体は、標的タンパク質中のわずかな数個の利用可能な化学基、通常リジン残基のε−アミノ基との化学反応によってランダムに形成されるので、構造的且つ機能的に異種である。ランダムな結合は標的タンパク質中の機能上重要なアミノ酸残基と重要でないアミノ酸残基とを区別しないので、この手順を個別的規模で特別に開発及び最適化して、機能活性タンパク質の比率を増大させるべきである。
【０００３】
別の分野は、生体内環境の幾つかの成分を標的として、環境との表面適合性を改善し、幾つかの生体内成分の親和性又は拒絶反応などの望ましい特徴を調節するタンパク質により、生物医学デバイス又は組織骨格の人工表面及び／又はバルク組成物を誘導体化することである。この分野では、組換えタンパク質を、タンパク質中の機能上重要なアミノ酸残基と重要でないアミノ酸残基の両方が関与する、通常リジン残基のε−アミノ基を介したランダムな化学結合によって物質と共有結合させ、機能活性タンパク質の未知の分画を有する異種産物を生成させる。
【０００４】
同様の問題点を有するなお別の分野は、「作用」タンパク質と環境の標的成分の間の相互作用の結果を、検出可能なシグナル、又は固定化タンパク質の酵素活性の産物だけには限らないが、これらを含めた検出可能な出力に変える、タンパク質誘導体化表面を有する様々なバイオセンサー又は他の機能性デバイスの構築である。この分野では、組換えタンパク質を、これらのデバイスの人造表面とも通常リジン残基のε−アミノ基を介して化学結合させ、機能活性タンパク質の未知の分画を有する異種表面を生成させる。
【０００５】
タンパク質と人造表面を化学結合させるための幾つかの方法が開発されてきている（例えば、Ｍａｌｍｑｖｕｉｓｔへの米国特許第５，４９２，８４０号、Ｍｏｏｒａｄｉａｎらへの米国特許第５，８５３，７４４号、Ｋｅｏｇｈ、Ｍａｎｎら（２００１）；Ｋｕｈｌ及びＧｒｉｆｆｉｔｈ−Ｃｉｍａ、（１９９６）；Ｂｅｎｔｚら（１９９８）への米国特許第６，０３３，７１９号を参照）。これらの方法は個別的規模で開発されて、タンパク質に対する損傷を最小にし、表面の均質性を増大させた。
【０００６】
これらの問題は充分に理解されており、長年にわたり、様々な物質の部位特異的結合用の特有のシステイン残基の組換えタンパク質中への導入のための、幾つかの手法が開発されてきている。この戦略は、タンパク質中の固有のシステイン残基は分子内又はサブユニット間ジスルフィド結合と通常関係があり、化学結合に容易に利用可能ではないという観察結果に基づく。理論では、固有のジスルフィド結合の形成に影響を与えない、且つ組換えタンパク質の機能活性に影響を与えない特有のシステイン残基の導入によって、当技術分野で知られている化学的性質により部位特異的結合に利用可能なチオール基を与えることができる。例えば幾つかのグループは、ダイアボディの形成及び／又は様々な物質との部位特異的結合用にこれらのシステイン残基を使用するための、組換え単鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）への、通常Ｃ末端又はその近辺におけるシステインの導入を報告した（Ａｄａｍｓら、１９９３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９４；Ｗａｎｇら、１９９７；Ｍａｒｔｉら、２００１；Ｇｕｐｔａら、２００１；Ｘｕら、２００２；Ｌｉら、２００２；Ｒｅｎａｒｄら、２００２；Ａｌｂｒｅｃｈｔら、２００４）。しかし、ｓｃＦｖに関してさえ、Ｃ末端又はその近辺の非対システインの存在は、タンパク質の収率、可溶性及び機能活性に著しく影響を与える（Ｓｃｈｍｉｅｄｌら、２０００）。Ｆｕｔａｍｉら（２０００）は、ヒトＲＮａｓｅＩのＮ及びＣ末端近辺にシステイン残基を導入し、安定状態のＲＮａｓｅＩをもたらした。しかし、産物の収率及び酵素活性は著しく低下した。さらに、この突然変異ＲＮａｓｅＩ又はその断片は、他の産物中には使用されなかった。
【０００７】
タンパク質の部位特異的修飾のための別の方法は、様々な物質とタンパク質のＣ末端のインテイン介在性結合である（例えば、Ｅｖａｎｓら、１９９９；Ｔｏｌｂｅｒｔ及びＷｏｎｇ２０００；Ｍａｃｍｉｌｌａｎら、２０００；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、２００１；Ｈｏｆｍａｎｎ、及びＭｕｉｒ、２００２；Ｌｏｖｒｉｎｏｖｉｃら、２００３；Ｗｏｏｄら、２００４を参照）。しかし、この方法の適用には、大きなインテインドメインと融合したタンパク質の適切なフォールディング、及びインテイン介在性結合中の非常に厳しい還元状態に耐える能力が必要とされる。さらに、前に論じた両方の手法では、利用可能なシステイン残基との結合は、タンパク質の本体とのその充分な隣接性にもかかわらずタンパク質の活性に干渉しない物質に限られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、治療用、診断用、及び研究用化合物のタンパク質系標的送達の分野、及びタンパク質誘導体化表面を有する様々なデバイス及び骨格の構築の分野では、当技術分野で必要とされているのは、（１）前記タンパク質の機能活性への干渉を最小にする方法で、組換えタンパク質と様々な物質を部位特異的に結合させてより均質な産物を生成させ、（２）様々な当該の組換えタンパク質を部位特異的結合に適した形に容易に変え、（３）当該の組換えタンパク質を結合させる必要がある広く様々な物質と共に利用することができ、（４）ヒトに導入したときに免疫原性又は毒性の問題をもたらさない組成物及び一般的な方法である。本発明は、これらの目的に対する答えであると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では本発明は、配列番号２の配列からなる単離ポリペプチドを対象とする。
【００１０】
別の態様では本発明は、配列番号２のポリペプチド配列をコードする核酸配列からなる単離核酸を対象とする。
【００１１】
別の態様では本発明は、配列番号４の配列を含む単離ポリペプチドを対象とする。
【００１２】
別の態様では本発明は、配列番号４のポリペプチド配列をコードする配列を含む単離核酸を対象とする。
【００１３】
別の態様では本発明は、配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを対象とする。
【００１４】
別の態様では本発明は、配列番号６、８、１０、１２、又は１４のポリペプチド配列をコードする単離核酸を対象とする。
【００１５】
別の態様では本発明は、（ａ）配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び（ｂ）結合部分を含む生物学的複合体であって、配列番号２のチオール基と結合部分中の官能基の間に共有結合を有する生物学的複合体を対象とする。
【００１６】
別の態様では本発明は、（ａ）配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び（ｂ）チオール基を有する標的部分と共有結合したアダプタータンパク質を含む結合部分を含む生物学的複合体であって、配列番号２のチオール基とアダプタータンパク質のチオール基の間にジスルフィド結合を有する生物学的複合体を対象とする。
【００１７】
別の態様では本発明は、患者中の標的に選択した物質を選択的に送達するための、薬剤として許容される担体、及び１つ又は他の前述の生物学的複合体を含む医薬組成物を対象とする。
【００１８】
別の態様では本発明は、患者中の標的に物質を選択的に送達する方法であって、（ａ）前述の医薬組成物を患者に投与するステップ、及び（ｂ）生物学的複合体と標的を接触させて患者中の標的への物質の送達を可能にするステップを含む方法を対象とする。
【００１９】
本発明は、添付の図面と共に考えて、以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
前に示したように本発明は、タンパク質に工学処理したペプチドタグ中に存在する１つのシステイン残基を介した、様々な物質と組換え融合タンパク質の部位特異的結合に有用な、組成物及び方法を含む。当技術分野で知られている現在の結合法は大部分が、例えばタンパク質中に豊富に存在するリジン又はチロシンなどのアミノ酸残基と、様々な物質のランダムな架橋に頼るものである。少量のシステイン残基は、タンパク質の機能活性に必要不可欠な分子内ジスルフィド結合と通常関係があり、したがって結合に利用可能ではない。結果として、結合がタンパク質当たりただ１つのアミノ酸残基に関するものであるときでさえ、最終産物は異なる位置で修飾されたタンパク質の混合物を含み、したがってそれらの活性、薬物動態、薬力学、及び組織分布特性は異質である。さらに、タンパク質中のアミノ酸残基との結合は、タンパク質の機能活性を害する可能性がある障害によって常に制限される。結果として、結合手順を個別的規模で特別に開発しなければならない。しかし、特別に開発された結合法が、例えば同じ画像化試薬の標的送達、又は同じデバイスの表面誘導体化のための、類似の目的で異なるタンパク質を迅速に適合させるための標準化された手法を与えるわけではない。
【００２１】
これら及び他の障害を克服するために、本発明は、組換えタンパク質と様々な物質の部位特異的結合に有用な組成物及び方法を開示する。本発明の方法は、当該のタンパク質のＮ末端又はＣ末端とリンカーペプチドによって融合したＣ４という名称のシステイン含有ペプチドタグを含む融合タンパク質への、当該のタンパク質の転換に基づく。定義によって、有用であるためには、このような融合タンパク質はその機能活性を保持しているべきであり、ペプチドタグ中のシステイン残基は、タグのシステインと共有ジスルフィド結合を形成することができる相補的アダプタータンパク質を含めた様々な物質との、部位特異的結合に利用可能であるべきである。システインチオール基との結合用の様々な化学物質は、当技術分野でよく知られている。例えば、マレイミド基、又はビニルスルホン基、又は化学的活性状態のチオール基で誘導体化した物質は、Ｃ４タグ中のチオール基と結合させることができる。他方でＣ４タグ中のチオール基は、様々な物質上の利用可能なチオール基と反応することができる活性化ジスルフィド結合の形成によって修飾することができ、又はＣ４タグ中のチオール基は、第２の官能基と反応することができる物質との結合用の二官能性試薬によって修飾することができる。
【００２２】
したがって、システイン含有ペプチド融合Ｃ４タグは、このタグと融合したタンパク質に様々な化学成分と化学的に結合する能力を与えることができることが、現在発見されている。Ｃ４タグのシステイン残基は化学成分との共有結合を形成するために使用され、したがって強く安定した結合をもたらす。Ｃ４のシステイン残基を介して、薬剤、薬剤担体、対照物質、対照物質用担体、放射性核種、放射性核種用担体、リポソーム、量子ドット、小及び極小常磁性粒子を含めた様々なナノ及びミクロ粒子、他のタンパク質又はタンパク質断片、核酸、様々な分子量のポリエチレングリコールだけには限らないがそれを含めた様々なタンパク質修飾分子、並びに生物医学デバイス、バイオセンサー、又は人工組織骨格などの様々なデバイスの表面を含めた広く様々な物質と、Ｃ４タグタンパク質の間に安定した結合が形成され得る。一実施形態では、相補的アダプタータンパク質は、ジスルフィド結合によってＣ４タグタンパク質と共有結合している。アダプタータンパク質は、前に記載した様々な物質との結合用のプラットホームとして使用することができる。本発明は、Ｃ４タグタンパク質はタンパク質の機能活性を保持しており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでも機能活性を失わずに様々な物質と部位特異的に結合することができることを開示する。
【００２３】
共有結合の形成は、本発明に幾つかの利点を与える。第１に、Ｃ４タグと共有結合した物質はタンパク質の官能基部分から除去される。さらに相補的アダプタータンパク質は、タンパク質の官能基部分から結合物質をさらに遠ざけることができる。第２に、Ｃ４タグタンパク質と結合した物質が生物流体又は溶液中で容易に解離しないほど、共有結合は強い。第３に、共有結合を形成するための化学的性質及び条件は知られており、容易に再現することができる。第４に、当業者に知られている幾つかの条件下では、共有結合を破壊することができ、成分を解離させることができる。例えば、ジスルフィド結合が形成される場合、適切な条件を選択してこの結合を減らすことができ、Ｃ４タグタンパク質を解離させることができる。本発明のこの特徴は、例えば所定の長さの時間後に誘導体化表面を再生することができる点で利点を与える。
【００２４】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本明細書の主題が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用する「Ｃ４」は、以下の核酸及びアミノ酸配列を有するヒトＲＮａｓｅＩの、突然変異型のＮ末端１５アミノ酸長断片を指す。
【化１】
2008535485.tif 000003
【００２６】
最小限に改変されたヒトペプチドはヒト中において免疫原性があるとは予想されず、したがってシステイン含有タグの好ましい実施形態であるが、幾つかの適用例では免疫原性は問題ではなく、したがってこれらのペプチドは、これらのペプチド内の異なる位置中へのシステイン残基の配置、又は非ヒトリボヌクレアーゼ由来の対応する断片の使用を含めたアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、及びアミノ酸付加により修飾して使用することができることは理解されよう。
【００２７】
本明細書で使用する「標的タンパク質」は、細胞受容体又は他の細胞表面タンパク質と選択的に結合することができるタンパク質、又は遊離状態又は表面と結合した環境の幾つかの成分と選択的に結合することができるタンパク質を指す。
【００２８】
本明細書で使用する用語「リンカー配列」は、核酸又はタンパク質の２つの他の部分と接合する指定のない長さの核酸又はタンパク質を指す。
【００２９】
用語「突然変異」及び「突然変異型」は、天然で見られない核酸又はタンパク質配列を指す。用語「切断型」は、天然で見られる配列より短い核酸又はタンパク質配列を指す。
【００３０】
本明細書で定義する「生物学的複合体」は、標的部分と結合部分の間の複合体を指し、これは共有結合によって安定化する。「標的部分」は、Ｃ４及び標的タンパク質を含むポリペプチドを有するタンパク質を指す。「結合部分」は、標的部分と共有結合することができる任意の物質又は表面を指す。用語「官能基」は、チオール基と化学的に相互作用する天然又は非天然化学基を指す。天然官能基は、チオール基と化学的に相互作用することができる結合部分中に本来見られる化学基を指す。非天然官能基は、人工基が結合部分のチオール基と化学反応性があるように、結合部分に人為的に付加される基を指す（例えば、マレイミド基又はビニルスルホン基をポリエチレングリコールに付加する）。
【００３１】
「アダプタータンパク質」は、相補的（例えば、結合対の一部分）であり、標的部分と相互作用して、それと標的部分の間に特定のジスルフィド結合を形成することができるタンパク質を指す。「融合タンパク質」は、組換えＤＮＡ技術の方法によって適切な宿主中での融合タンパク質の発現を可能にする形に組み合わせたＤＮＡ配列によってコードされる、２つ以上のポリペプチド断片を含む組換えタンパク質を指す。
【００３２】
本明細書で使用する「担体」は、治療用、診断用、又は研究用化合物と共有結合又は非共有結合することができる、天然又は合成分子又はその凝集体を指す。このような担体には、キレート化剤、デンドリマー、コポリマー、誘導体化ポリマーを含めた天然又は合成ポリマー、リポソーム、様々なウイルス及びバクテリオファージ粒子、様々な天然及び製造ナノ及びミクロ粒子、及びビーズがあるが、これらだけには限られない。
【００３３】
本明細書で使用する「ｓｃＶＥＧＦ」は、アラニン残基を介して単鎖タンパク質に頭−尾結合したＶＥＧＦ１２１イソ型の２つの３〜１１２のアミノ酸残基断片を含み、以下のタンパク質及び核酸配列を有する単鎖血管内皮増殖因子を指す。
【化２】
2008535485.tif 000004
【００３４】
しかし、遺伝子コードは重複しているので、配列番号４をコードする任意の核酸は本発明の核酸によって含まれる。
【００３５】
なお別の実施形態では、標的部分は配列番号１４で示すポリペプチド配列を有する。配列番号４で示すポリペプチド配列を有するＣ４と単鎖ＶＥＧＦ（ｓｃＶＥＧＦ）の遺伝的融合体である、このポリペプチド配列は、配列番号１３で示す核酸配列によってコードされる。しかし、遺伝子コードは重複しているので、配列番号１４をコードする任意の核酸は本発明の核酸によって含まれる。ｓｃＶＥＧＦは単鎖分子当たり１６個のシステイン残基を含むが、Ｃ４タグ分子は機能活性のある立体配座にリフォールディングされ、Ｃ４タグ中のシステイン残基は様々な物質と結合し、非修飾ＶＥＧＦの機能活性に匹敵する機能活性を有する複合体をもたらすことができる。
【００３６】
前に示したように、一実施形態において本発明は、（ａ）配列番号２のポリペプチド配列及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び（ｂ）結合部分を含む生物学的複合体であって、配列番号２のチオール基と結合部分中の官能基の間に共有結合を有する生物学的複合体を対象とする。本発明は、（ａ）配列番号２のポリペプチド配列、及び選択した標的タンパク質のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む標的部分、及び（ｂ）チオール基を有する標的部分と共有結合したアダプタータンパク質を含む結合部分を含む生物学的複合体であって、配列番号２のチオール基とアダプタータンパク質のチオール基の間にジスルフィド結合を有する生物学的複合体も対象とする。それぞれのこれらの成分は、以下でより詳細に論じる。
【００３７】
標的部分は、Ｃ４ペプチド及び標的タンパク質を含むポリペプチドを有するタンパク質であることが好ましい。前に示したように、標的部分のＣ４ペプチド部分は、位置４のアルギニンがシステインに置換されている、ヒトＲＮａｓｅＩの突然変異型のＮ末端１５アミノ酸長断片である。この特定のペプチドは、本発明において幾つかの利点を与える。ヒト起源であることによって、ヒト宿主中で強い免疫応答を誘導する可能性が低下する。さらに、ヒトＲＮａｓｅＩのＮ末端断片は、タンパク質のリフォールディング及び精製中に融合タンパク質内の他のシステイン残基とそれがジスルフィド結合を形成するのを妨げる可能性がある、αヘリックスを形成することができる。最後に、ヒトＲＮａｓｅＩの酵素不活性化野生型Ｎ末端及びＣ末端断片は、酵素活性化非共有結合複合体を自然に形成し、これはＣ４タグ中のＣ４残基とジスルフィド結合を形成することができる相補的アダプタータンパク質を開発するために、本発明において利用される現象である。ヒトＲＮａｓｅＩの突然変異型のＮ末端１５アミノ酸長断片は、以下の核酸及びアミノ酸配列を有する。
【化３】
2008535485.tif 000005
【００３８】
標的部分の標的タンパク質部分は、細胞受容体又は他の細胞表面タンパク質と選択的に結合することができる任意のタンパク質、又は環境の幾つかの成分と選択的に相互作用することができる任意のタンパク質であり、これをＣ４ペプチドと遺伝子工学的に融合させる。好ましい実施形態では、標的タンパク質は、ＶＥＧＦ１１０などのヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、又はその突然変異型若しくは切断型、ヒトアネキシンＶ、又はその突然変異型若しくは切断型、炭そ菌致死性ベクターの触媒不活性化断片、又はその突然変異型若しくは切断型、或いは単鎖ＶＥＧＦ誘導体、又はその突然変異型若しくは切断型であってよい。
【００３９】
一実施形態では、標的部分は配列番号６又は８で示すポリペプチド配列を有する。Ｃ４とＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０の遺伝的融合体である、これらのポリペプチド配列はそれぞれ、配列番号５及び７で示す核酸配列によってそれぞれコードされる。しかし、遺伝子コードは重複しているので、配列番号６又は８をコードする任意の核酸は本発明の核酸によって含まれる。さらに、選択したイソ型ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ１２１）は二量体分子当たり１８個のシステイン残基を含むが、タグ分子は機能活性のある立体配座にリフォールディングされ、Ｃ４タグ中のシステイン残基は様々な物質と結合し、非修飾ＶＥＧＦの機能活性に匹敵する機能活性を有する複合体をもたらすことができる。
【００４０】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は幾つかの受容体との相互作用により内皮細胞の増殖を制御し、その中でＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）受容体の発現は大部分が内皮細胞に限られる。成体生物では、様々な病的状態のみにおける黄体の発達以外に、内皮細胞の増殖（血管形成）が起こる。したがって、ＶＥＧＦ又はｓｃＶＥＧＦと部位特異的に結合した、或いは相補的アダプタータンパク質によってＶＥＧＦ又はｓｃＶＥＧＦと結合した、治療用、診断用、対照、及び研究用物質のＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）受容体介在性送達は、様々な病状の療法において有用である可能性がある。他方で、適切なマトリクス、部位特異的ＰＥＧ化ＶＥＧＦ又はｓｃＶＥＧＦ、及びステントなどの生物医学デバイスの表面、又は組織骨格と結合したＶＥＧＦ又はｓｃＶＥＧＦからの長期循環、又は徐放は、虚血状況における血管形成の促進に有用である可能性がある。
【００４１】
別の実施形態では、標的部分は配列番号１０で示すポリペプチド配列を有する。Ｃ４とアネキシンＶの遺伝的融合体であるこのポリペプチド配列は、配列番号９で示す核酸配列によってコードされる。しかし、遺伝子コードは重複しているので、配列番号１０をコードする任意の核酸は本発明の核酸によって含まれる。アネキシンＶは１個のシステイン残基を含むが、タグ分子は機能活性のある立体配座にリフォールディングされ、それによってＣ４タグ中のシステイン残基は様々な物質と結合し、非修飾アネキシンＶの機能活性に匹敵する機能活性を有する複合体をもたらすことができる。アネキシンＶはアポトーシス細胞の表面上に露出したホスファチジルセリンと相互作用し、アポトーシスプロセスの初期マーカーとして使用される。したがって、アネキシンＶと部位特異的に結合した治療用、診断用、又は研究用物質のホスファチジルセリン介在性送達は、アポトーシスの阻害及び促進に有用である可能性がある。
【００４２】
別の実施形態では、標的部分は配列番号１２で示すポリペプチド配列を有する。ＬＦｎとして知られる炭そ菌致死性因子の触媒不活性化断片とＣ４との遺伝的融合体であるこのポリペプチド配列は、配列番号１１で示す核酸配列によってコードされる。しかし、遺伝子コードは重複しているので、配列番号１２をコードする任意の核酸は本発明の核酸によって含まれる。ＬＦｎはシステイン残基を含まないが、タグ分子は機能活性のある立体配座にリフォールディングされ、それによってＣ４タグ中のシステイン残基は様々な物質と結合し、非修飾ＬＦｎの機能活性に匹敵する機能活性を有する複合体をもたらすことができる。炭そ菌致死性因子の触媒不活性化断片、ＬＦｎは、触媒活性化致死性因子／防御抗原（ＬＦ／ＰＡ）の組合せとして同じ細胞受容体と相互作用する、防御抗原（ＰＡ）という名称の他の炭そ菌タンパク質と対形成する。したがって、ＬＦｎと部位特異的に結合した治療用、診断用、又は研究用物質のＰＡ介在性送達は、ＰＡの受容体を用いた部位のマッピング、又は致死性因子の細胞毒性活性に干渉する可能性がある化合物の細胞への送達に有用である可能性がある。
【００４３】
なお別の実施形態では、標的部分は配列番号１４で示すポリペプチド配列を有する。配列番号４で示すポリペプチド配列を有するＣ４と単鎖ＶＥＧＦ（ｓｃＶＥＧＦ）の遺伝的融合体である、このポリペプチド配列は、配列番号１３で示す核酸配列によってコードされる。しかし、遺伝子コードは重複しているので、配列番号１４をコードする任意の核酸は本発明の核酸によって含まれる。前に示したようにｓｃＶＥＧＦは、アラニン残基を介して単鎖タンパク質に頭−尾結合したＶＥＧＦ１２１イソ型の２つの３〜１１２のアミノ酸残基断片を含む。ｓｃＶＥＧＦは単鎖分子当たり１６個のシステイン残基を含むが、タグ分子は機能活性のある立体配座にリフォールディングされ、それによってＣ４タグ中のシステイン残基は様々な物質と結合し、非修飾二量体ＶＥＧＦの機能活性に匹敵する機能活性を有する複合体をもたらすことができる。
【００４４】
前述の標的部分に関して、Ｃ４ペプチドと標的タンパク質の配列の間にリンカー配列を配置することができる。Ｇｌｙ４Ｓｅｒ又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーなどのリンカー配列は、組換えタンパク質の細菌中での発現用に市販のベクター中で工学処理され、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母菌細胞、及びトランスジェニック生物だけには限られないが、これらを含めた他の宿主中での組換えタンパク質の発現用にベクターに容易に工学処理することができる。リンカーが働いて、Ｃ４ペプチドと標的タンパク質の間にある程度有用な距離を与える。示した実施形態ではＣ４タグは標的タンパク質のＮ末端に位置するが、当業者は、一般に知られている遺伝子工学の方法を使用して、このタグを標的タンパク質のＣ末端、又は標的タンパク質の機能上重要でない領域の内側、例えば単鎖抗体の２つの機能性ドメインの間に置くことができることを理解しているはずである。
【００４５】
図１Ａは、Ｇ４Ｓリンカーを介して典型的な発現プラスミド中に見られるマルチクローニングサイト領域と遺伝子工学的に融合させたＣ４タグの、アミノ酸及び核酸配列を示す。図１の図Ａ中に示すように、完全な核酸配列は制御及び転写要素（Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、リボソーム結合部位など）、並びにＣ４タグの核酸配列を含む。リンカー配列はマルチクローニングサイトからＣ４配列を隔て、これを使用して標的タンパク質として機能し得る当該の核酸を導入することができる。Ｔ７停止部位は完全長核酸を終了させる。図１Ｂは、Ｇ４Ｓリンカーを介してＣ４タグと融合させた、融合組換えタンパク質の細菌における発現用のプラスミドの概略図を示す。
【００４６】
生物学的複合体の標的部分は、様々な生物医学又は産業用途において有用である可能性がある、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、抗体、及びその断片、酵素、並びにこれらの組合せであってよい。生物学的複合体の結合部分の一部分は、標的部分のＣ４チオール基又はアダプター／標的部分複合体中のアダプタータンパク質の官能基と共有結合することができる、任意の物質又は表面であってよい。有用な結合部分の例には、薬剤、放射性核種キレート化剤、ポリエチレングリコール、色素、脂質、リポソーム、及び選択した表面があるが、これらだけには限られない。
【００４７】
有用な放射性核種キレート化剤には、画像化又は治療用放射性核種と共に充填するための５−マレイミド−２−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩（ＨＹＮＩＣ）などの化合物がある。ポリエチレングリコールはタンパク質の血中クリアランスを遅延させるのに有用であり、（例えば、マレイミド又はビニルスルホンで修飾された）誘導体化又は非誘導体化形で使用することができる。有用な色素には、例えば近赤外線蛍光画像用のシアニン色素Ｃｙ５．５がある。標的部分のＣ４チオール基又はアダプター／標的部分複合体中のアダプタータンパク質の官能基と結合することができる表面には、ナノ又はミクロ粒子の表面、デンドリマーの表面、組織骨格の表面、生物医学デバイスの表面、及びバイオセンサーの表面がある。結合物質が表面を含むとき、結合物質はそのように使用することができ、又は当技術分野で知られている方法によって表面上に配置した他の化学基を有し得ることは理解される。これらの化学基は、当技術分野で知られている方法によるＣ４タグ又はアダプタータンパク質との結合を可能にする二官能性試薬を用いた修飾に、さらに使用することができる。
【００４８】
本発明の一実施形態では、生物学的複合体は、Ｃ４ペプチド（配列番号２）のチオール基と結合部分中に本来存在する官能基の間に共有結合を有する。したがって、安定した共有結合が形成されるように、Ｃ４ペプチドのチオール基が結合部分中の反応基と直接化学反応することが企図される。代替の実施形態では、Ｃ４ペプチドのチオール基と反応する反応基は、例えば当技術分野で知られている二官能性架橋剤を使用することによって、人為的に導入することができる。例えば、マレイミド基はポリエチレングリコール又は脂質中に導入することができ、Ｃ４ペプチドのチオール基との反応に使用することができる。
【００４９】
代替の実施形態では、本発明の生物学的複合体は、標的部分と共有結合したアダプタータンパク質を含む結合部分を含む。一般にアダプタータンパク質は、位置１１８にシステイン（Ｃｙｓ１１８）を含む突然変異ヒトＲＮａｓｅＩ、又はその断片である。本発明において有用なアダプタータンパク質の例には、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、及び配列番号２２で示すポリペプチド配列を有するタンパク質があり、これらは以下でより詳細に記載する。
【００５０】
Ｃ４タグ中のＣ４残基とジスルフィド結合を形成することができる、アダプタータンパク質の４つの特に好ましい実施形態を図２中に示し、この場合図２Ａは、Ｃ４タグ融合組換えタンパク質と相補的アダプタータンパク質の間の、部位特異的結合の概略図を与える。図２Ｂは、Ｔ２４Ｎ、Ｖ１１８Ｃ突然変異ヒトＲＮａｓｅＩに基づくアダプタータンパク質のファミリーの概略図を示す。第１の実施形態は、ＨｕＳ（Ｃ１１８）という名称のＴ２４Ｎ、Ｖ１１８Ｃ突然変異ヒトＲＮａｓｅＩの断片である（配列番号１５及び１６）。ＨｕＳ（Ｃ１１８）のアミノ基は、ＨｕＳ（Ｃ１１８）とＣ４タグタンパク質の部位特異的結合の前に、当技術分野で知られている方法を使用する様々な物質との結合に使用することができる。第２の実施形態は、ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）という名称のＮ８８Ｃ置換を含むＴ２４Ｎ、Ｖ１１８Ｃ突然変異ヒトＲＮａｓｅＩの断片である（配列番号１７及び１８）。ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）中のＣ８８チオール基は、ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）とＣ４タグタンパク質の部位特異的結合の後に、当技術分野で知られている方法を使用する様々な物質との結合に使用することができる。第３及び第４の実施形態は、数箇所の位置でヒトＲＮａｓｅＩの対応する断片と異なる１〜２９ａａ断片のウシＲＮａｓｅＡ、及び３０〜１２７ａａ断片のヒトＲＮａｓｅＩを含むキメラＢＨ−ＲＮａｓｅに基づく（Ｇａｙｎｕｔｄｉｎｏｖら、２００３）。第３の実施形態は、ＢＨＲ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ１１８）という名称のＦ８Ａ及びＱ１１Ｐ置換を含むＢＨ−ＲＮａｓｅのＶ１１８Ｃ突然変異体であり（配列番号１９及び２０）、これはＣ４タグタンパク質との部位特異的結合の前に２０個のＮ末端アミノ酸残基の除去を必要としない。ＢＨＲ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ１１８）のアミノ基は、ＨｕＲ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ１１８）とＣ４タグタンパク質の部位特異的結合の前に、当技術分野で知られている方法を使用して様々な物質を用いて誘導体化することができる。第４の実施形態は、ＢＨＲ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ８８、Ｃ１１８）という名称のＡ８、Ｐ１１、及びＣ８８を含むＶ１１８Ｃ突然変異ＢＨ−ＲＮａｓｅであり（配列番号２１及び２２）、これはＣ４タグタンパク質との部位特異的結合の前に２０個のＮ末端アミノ酸残基の除去を必要としない。ＢＨＲ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ８８、Ｃ１１８）中のＣ８８チオール基は、ＢＨＲ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ８８、Ｃ１１８）とＣ４タグタンパク質の部位特異的結合の後に、当技術分野で知られている方法を使用する様々な物質との結合に使用することができる。当技術分野で知られている方法を使用することによって、Ｃ４タグタンパク質と部位特異的結合することができるヒトＲＮａｓｅＩに基づく他のアダプタータンパク質を構築すること、及び様々な物質を用いた誘導体化に好都合なプラットホームを与えることは容易であるはずである。当業者は、ヒトＲＮａｓｅＩに基づく他のアダプタータンパク質を、本明細書で明確に記載するタンパク質以外に使用することができることを理解しているはずである。例えば当業者は、他のリボヌクレアーゼ、例えばウシＲＮａｓｅＡに基づくアダプタータンパク質を、これらのアダプタータンパク質がＣ４タグ、又は他のリボヌクレアーゼのＮ末端断片に基づく同様のタグとの複合体を形成する能力を保持している限り、構築することができることを理解しているはずである。
【００５１】
図２Ｃは、Ｃ４−ＶＥＧＦの二量体分子における１個又は２個のアダプターＨｕＳ（Ｃ１１８）とＣ４タグの結合に対応する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦという名称のサンプルにおいてＤＴＴ感受性の新しいタンパク質バンドの出現をもたらす、ジスルフィド結合によるＣ４−ＶＥＧＦとＨｕＳ（Ｃ１１８）の結合の証拠を与える。図２Ｄは、リボヌクレアーゼ活性は化学結合の形成によって復元されるが、ＨｕＳ（Ｃ１１８）アダプタータンパク質とＣ４タグ融合組換えタンパク質の物理的混合によっては復元されない証拠を与える（図２Ｄ）。
【００５２】
アダプタータンパク質を機能性物質の宿主を用いて誘導体化して、望ましい結果を得ることができる。例えば一実施形態では、アダプタータンパク質を、光学画像化用のＣｙ５．５色素などの色素、又はアダプタータンパク質と治療用、診断用、又は研究用化合物の担体として働くリポソームを結合させるための脂質を用いて誘導体化することができる。一実施形態では、リポソームはドキソルビシンを有するか、又は充填することができる（「ＤＯＸＩＬ」）。
【００５３】
生物学的複合体を薬剤として許容される担体と組み合わせて、患者中の標的に治療用、研究用、又は診断用化合物を選択的に送達するための医薬組成物を生成することができる。このような医薬組成物は患者に投与することができ、生物学的複合体を標的と接触させて、患者中の標的に化合物を送達することができる。これらの実施形態では、有用な薬剤として許容される担体は、水、ゼラチン、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ガム、アルコール、バセリンなどの物質を含む。本発明の医薬調製物は、所望の活性に有効な量の生物学的複合体を含むはずである。有効用量は利用する個々の生物学的複合体の活性に依存するはずであり、したがって任意の特定の宿主哺乳動物又は他の宿主生物を決定するための、当技術分野の通常の技術の範囲内にある。
【００５４】
一般に、薬剤として有効な量の生物学的複合体を、従来の方式で薬剤として許容される担体と組み合わせて医薬組成物を生成する。本発明の医薬組成物は、従来の医薬調製物の形で、例えば前に記載した有機及び／又は無機不活性担体を含む従来の経腸又は非経口用の薬剤として許容される賦形剤の形で、内部、例えば静脈内に投与することが好ましい。医薬調製物は、従来の固体形、例えば錠剤、糖衣錠、座薬、カプセルなど、又は従来の液体形、例えば懸濁液、乳濁液などであってよい。望むならば、これらを滅菌処理することができ、且つ／或いはこれらは、浸透圧を調節するために使用される防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、又は塩などの、従来の医薬アジュバントを含むことができる。医薬調製物は、他の治療活性がある物質を含むこともできる。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は例示を目的とするものであり、決して本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。他に明確に述べない限り、全ての部及びパーセンテージは重量によるものであり、全ての温度は摂氏温度である。
【００５６】
（実施例１）
Ｃ４及びＡリンカーペプチドを含む発現ベクターの構築及び使用
１．細菌菌株及びプラスミド
大腸菌菌株ＤＨ５α−Ｔ１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＵＳＡ）から市販されている。大腸菌菌株Ｂ１２１（ＤＥ３）及びＮｏｖａＢｌｕｅは、Ｎｏｖａｇｅｎ（ＵＳＡ）から市販されている。ｐＥＴ２９ａ（＋）細菌発現ベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎ（ＵＳＡ）から得た。１２１アミノ酸残基イソ型のヒトＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列を含むｐＬｅｎ−１２１プラスミドは、その全容が参照として本明細書に組み込まれる米国特許第５，２１９，７３９号中に記載されており、Ｄｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ（Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）から得た。ヒトアネキシンＶをコードするＤＮＡ配列を含むｐＰＡＰ１−１．６プラスミドは、Ｄｒ．Ｊ．Ｔａｉｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、シアトル、ＷＡ）から得た。炭そ菌致死性因子（ＬＦｎ）の非毒性Ｎ末端断片をコードするＤＮＡ配列を含むｐＧＥＸ−ＫＧ  ＬＦ２５４プラスミドは、Ｄｒ．Ｓ．Ｌｅｐｐｌａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＨ、ベセスダ、ＭＤ）から得た。
【００５７】
２．ＤＮＡ操作
本明細書で使用する制限及び修飾酵素は米国内で市販されており、製造者の教示書に従い使用した。コンピテント細胞の調製、形質転換、及び細菌培地はＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．（１９８９）「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」：「研究室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に従ったか、又は製造者の教示書に従った。プラスミドの精製は、製造者の教示書に従いＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ又はＭａｘｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して行った。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製は、製造者の教示書に従いＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎキット（Ｂｉｏ１０１、ＵＳＡ）を使用して行った。
【００５８】
３．Ｃ４タグと融合したタンパク質の発現用のベクターの構築
（Ｇ４Ｓ）３リンカーによってタンパク質のＯＲＦと融合したＮ末端Ｈｕ−タグを有する組換えタンパク質の発現用に、ｐＥＴ／Ｈｕ（Ｇ４Ｓ）３ベクターを記載されたように構築した（Ｂａｃｋｅｒら、２００４）。Ｇｅｎｅ−Ｔａｉｌｏｒ部位特異的突然変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する部位特異的突然変異誘発によって、ｐＥＴ／Ｈｕ（Ｇ４Ｓ）３ベクターのＨｕ−タグ中にＲ４Ｃアミノ酸置換を導入した。プライマー（配列番号２３及び配列番号２４）は、Ｒ４Ｃ突然変異を導入するために使用した。生成したベクターはシークエンシングによって確認し、ｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４（Ｇ４Ｓ）３と明示した。
【化４】
2008535485.tif 000006
【００５９】
Ｃ４−Ｇ４ＳをコードするＤＮＡを、鋳型としてｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４（Ｇ４Ｓ）３ベクターＤＮＡ、ＸｂａＩ部位を導入したセンスプライマー配列番号２５、及びＮｃｏＩ部位を導入したアンチセンスプライマー配列番号２６を使用するＰＣＲによって増幅させた。挿入体はＸｂａＩ及びＮｃｏＩで切断されたｐＥＴ２９ａ（＋）ベクター断片にクローニングした。生成したベクターはシークエンシングによって確認し、ｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４−Ｇ４Ｓと明示した。
【化５】
2008535485.tif 000007
【００６０】
４．ｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４（Ｇ４Ｓ）３及びｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４−Ｇ４Ｓベクターへの当該のタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片のサブクローニング
ｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４（Ｇ４Ｓ）３及びｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４−Ｇ４ＳベクターのＤＮＡを、ＮｃｏＩを用いて別々に切断し、脱リン酸化した。前述のベクターにおいてクローニングする全ＤＮＡ断片を、増幅ＤＮＡ断片の両端にＮｃｏＩ部位を導入したプライマーを使用してＰＣＲによって増幅させた。１２１−ａａイソ型のヒトＶＥＧＦをコードするＤＮＡは、プライマー（配列番号２７及び配列番号２８）を使用してｐＬｅｎ−１２１プラスミドＤＮＡから増幅させた。炭そ菌致死性因子（ＬＦｎ）の１〜２５４−ａａ長のＮ末端断片をコードするＤＮＡは、プライマー（配列番号２９及び配列番号３０）を使用してｐＧＥＸ−ＫＧ  ＬＦ２５４プラスミドＤＮＡから増幅させた。ヒトアネキシンＶをコードするＤＮＡは、プライマー（配列番号３１及び配列番号３２）を使用してｐＰＡＰ１−１．６プラスミドから増幅させた。それぞれの増幅させたＤＮＡ断片はＮｃｏＩを用いて切断し、精製し、ベクターｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４（Ｇ４Ｓ）３及びｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４−Ｇ４ＳのＮｃｏＩ部位にクローニングした。正しい方向のクローニングＯＲＦを有するクローンを、Ｔ７プロモーター系センスプライマーを使用するＰＣＲによって選択し、シークエンシングによって確認した。
【化６】
2008535485.tif 000008
【００６１】
５．Ｃ４タグを有する組換え融合タンパク質の発現及び精製
全てのタンパク質が、ＬＢ培地（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）中で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌において発現した。６００ｎｍにおいて０．５〜０．７単位の光学濃度で、１ｍＭのＩＰＴＧによって発現を誘導した。誘導後、３００ｒｐｍで振盪させながら３７℃で２．５〜３時間、培養物を増殖させ、次いで遠心分離によって採取し、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５（Ａｖｅｓｔｉｎ、オタワ、カナダ）を使用して破壊した。
【００６２】
Ｃ４−ＶＥＧＦを不溶形で発現させ、以下のように精製した：封入体を８Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＮａ２ＳＯ３、１０ｍＭのＮａ２Ｓ４Ｏ６、１０ｍＭのＤＴＴ中に溶かし、攪拌しながら４℃で６〜８時間インキュベートし、次いで２．５ｍＭのトリス［２カルボキシエチル］ホスフィン（Ｐｉｅｒｃｅ）を補い、４℃で１６〜１８時間インキュベートした。溶解したタンパク質は、最初に、１０倍容の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２Ｍの尿素、０．５Ｍのアルギニン、１ｍＭの還元型グルタチオン、０．４ｍＭの酸化型グルタチオン中において４℃で１０〜１２時間、第２に、５０倍容の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中において４℃で２４時間、及び第３に、５０倍容の２０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）中において４℃で２４時間の３ステップの透析によってリフォールディングさせた。透析後、溶液を遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間）によって浄化し、ヘパリンＨＰセファロース（１ｍｌ、予め充填したカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上でのクロマトグラフィーによってＣ４−ＶＥＧＦを精製した。結合用に、Ｃ４−ＶＥＧＦ中のＣ４チオール基を、４５分間３４℃で１．２モル過剰のＤＴＴを使用して適度なＤＴＴ処理によって脱保護した。
【００６３】
原型ＶＥＧＦ１２１中の位置１１６に存在するシステイン残基の可能性のある関与を最小にするために、本発明者らは、当技術分野で知られている方法を使用して、位置１１２において切断型のＣ４−ＶＥＧＦを調製した。切断型タンパク質は１１０アミノ酸（３〜１１２ａａ断片のＶＥＧＦ１２１）を含み、したがってそれはＣ４−ＶＥＧＦ１１０と名付けた。Ｃ４−ＶＥＧＦ１１０を発現させ、前に記載したのと同様に精製し、それは組織培養アッセイにおいてＣ４−ＶＥＧＦの活性と同等の活性を示した。
【００６４】
Ｃ４タグＶＥＧＦをさらに最適化するために、本発明者らは、Ｇ４Ｓリンカーペプチドによって１つのＣ４ペプチドタグと融合した単鎖ＶＥＧＦを構築した（Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ）。一般に、モノマータンパク質の工学処理、発現、リフォールディング、及び精製は、オリゴマー、又はさらに二量体、ＶＥＧＦの原型イソ型などより簡潔である。さらに、ｓｃＶＥＧＦを設計して、二量体ＶＥＧＦの調製において通常存在するＶＥＧＦの不活性モノマーの形成を回避し、ＶＥＧＦの任意のタンパク質の再工学処理を簡潔にし、発現、リフォールディング及び精製を簡潔にし、結合部分と１つのＣ４タグの結合を簡潔にした。最初に、ｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４−Ｇ４ＳベクターＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、脱リン酸化した。ヒトＶＥＧＦの３〜１１２ａａ長断片をコードするＤＮＡは、ＶＥＧＦコドン３のすぐ上流にＢａｍＨＩ部位を導入したセンスプライマー（配列番号３３）、並びにＶＥＧＦのコドン１１２のすぐ下流に停止コドン、及び停止コドンの直後にＢａｍＨＩ部位を導入したアンチセンスプライマー（配列番号３４）を使用してｐＬｅｎ−１２１プラスミドから増幅させた。増幅させたＤＮＡ断片を精製し、ＢａｍＨＩを用いて切断し、ｐＥＴ／Ｈｕ−Ｃ４−Ｇ４ＳベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。正しい方向のクローニングＯＲＦを、Ｔ７プロモーター系センスプライマーを使用するＰＣＲによって選択した。選択したクローンから製精したプラスミドＤＮＡをシークエンシングによって確認し、ｐＥＴ／Ｃ４（Ｇ４Ｓ）ＶＥＧＦ１１０と明示した。
【化７】
2008535485.tif 000009
【００６５】
ｐＥＴ／Ｃ４（Ｇ４Ｓ）ＶＥＧＦ１１０ベクターのＤＮＡをＮｃｏＩで切断し、脱リン酸化した。ヒトＶＥＧＦの３〜１１２ａａ断片をコードするＤＮＡは、ＶＥＧＦコドン３のすぐ上流にＮｃｏＩ部位を導入したセンスプライマー（配列番号３５）、並びにＶＥＧＦのコドン１１２のすぐ下流に（ＯＲＦシフトを補うために）シトシン、及び導入したシトシンの直後にＮｃｏＩ部位を導入したアンチセンスプライマー（配列番号３６）を使用してｐＬｅｎ−１２１プラスミドから増幅させた。増幅させたＤＮＡ断片を精製し、ＮｃｏＩを用いて切断し、ｐＥＴ／Ｃ４（Ｇ４Ｓ）ＶＥＧＦ１１０ベクターのＮｃｏＩ部位にクローニングした。２つのＶＥＧＦ１１０コピーを有するクローンを、Ｔ７プロモーター系センスプライマー及びＴ７ターミネーター系アンチセンスプライマーを使用するＰＣＲによって選択した。４個のランダムに選択したクローンから単離したＤＮＡをシークエンシングし、頭部から尾部のＶＥＧＦ１１０方向でＶＥＧＦ１１０タンデムを含むクローンを、増殖用に選択した。ｐＥＴ／Ｃ４（Ｇ４Ｓ）ｓｃＶＥＧＦと明示した選択したプラスミドは、タンパク質発現用にコンピテント大腸菌細胞菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【化８】
2008535485.tif 000010
【００６６】
Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦを発現させ、前に記載したのと同様に精製し、それは組織培養アッセイにおいてＣ４−ＶＥＧＦの活性と同等の活性を示した。Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦを回収し、５０％までのＣ４チオール基が結合に利用可能であった。結合用に、Ｃ４−ＶＥＧＦ中のＣ４チオール基を、０．５モル当量のＤＴＴを用いて適度なＤＴＴ処理によって脱保護した。
【００６７】
Ｃ４−ＬＦｎを可溶細胞質形で発現させ、以下のように精製した。細菌溶解物の可溶部分を、４℃で２０時間、２００倍容の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に対して透析し、遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間）によって浄化し、セファロースＱＦＦカラムに通した。Ｃ４−ＬＦｎ含有画分を１つに集め、４℃で２０時間、１００倍容の２０ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ６．５に対して透析し、ヘパリンＨＰセファロース、次にブチルＦＦセファロース（１ｍｌ、予め充填したカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上での疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。Ｃ４−ＬＦｎの収量は８〜１０ｍｇ／Ｌであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ次にＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって純度は９８％を超えていた。
【００６８】
Ｃ４−アネキシンを、Ｈｕ−アネキシンに関して記載されたように精製した（Ｂａｃｋｅｒら、２００４）。リンカー、及びタンパク質の性質に応じて、Ｃ４タグ中のシステイン残基は、リフォールディングバッファーの酸化還元成分との混合ジスルフィドと様々な程度で関係がある。必要なときには、各Ｃ４タンパク質用に最適化した条件下でＤＴＴを用いて、システイン残基を脱保護することができる。
【００６９】
６．アダプタータンパク質の構築及び発現。
６．１．ウシＲＮａｓｅＡの１〜２９ａａ断片及びヒトＲＮａｓｅＩの３０〜１２７ａａ断片を含む、キメラ１−２９Ｂ／３０−１２７Ｈ−ＲＮａｓｅ（ＢＨ−ＲＮａｓｅ）を、記載されたのと同様に（Ｇａｙｎｕｔｄｉｎｏｖら、２００３）構築し、発現させ精製した。Ｇｅｎｅ−Ｔａｉｌｏｒ部位特異的突然変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びプライマー（配列番号３７及び配列番号３８）を使用する部位特異的突然変異誘発によって、Ｖ１１８Ｃ突然変異をｐＥＴ２９／１−２９Ｂ／３０−１２７Ｈ−ＲＮａｓｅプラスミドＤＮＡ中に導入した。ＶＣ１１８の置換はシークエンシングによって確認し、このタンパク質はＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ｃ１１８）と明示した。ＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ｃ１１８）は、野生型ＢＨ−ＲＮａｓｅに関して記載されたのと同様に（Ｇａｙｎｕｔｄｉｎｏｖら、２００３）発現させ精製した。反応性チオール基の存在は、チオール試薬Ｎ−（１−ピレン）−マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）との反応、次に記載されたのと同様のＲＰ  ＨＰＬＣ分析（Ｂａｃｋｅｒら、２００２）によって試験した。ＨｕＳ（Ｃ１１８）アダプタータンパク質は、ＢＨ−ＲＮａｓｅに関して記載されたのと同様に（Ｇａｙｎｕｔｄｉｎｏｖら、２００３）、サブチリジン（Ｓｉｇｍａ）を用いたＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ｃ１１８）の制限酵素による消化によって得た。
【化９】
2008535485.tif 000011
【００７０】
６．２．ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）
プライマー（配列番号３９及び配列番号４０）を使用する部位特異的突然変異誘発によって、ｐＥＴ２９／１−２９Ｂ／３０−１２７Ｈ−ＲＮａｓｅ（Ｖ１１８Ｃ）プラスミドＤＮＡ中にＮ８８Ｃ突然変異を導入した。Ｎ８８Ｃの置換はシークエンシングによって確認し、このタンパク質はＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ｃ８８、Ｃ１１８）と明示した。ＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ｃ８８、Ｃ１１８）は、ＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ｃ１１８）に関して前に記載したのと同様に発現させ、精製し、サブチリジンによって消化してＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）アダプタータンパク質を得た。
【化１０】
2008535485.tif 000012
【００７１】
６．３  ＨｕＲ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ１１８）
Ｑ１１Ｐ及びＦ８Ａ突然変異を、それぞれプライマー配列番号４１〜４４を使用する部位特異的突然変異誘発によって、ｐＥＴ２９／１−２９Ｂ／３０−１２７Ｈ−ＲＮａｓｅ（Ｖ１１８Ｃ）プラスミドＤＮＡ中に必然的に導入した。両方の置換をシークエンシングによって確認し、このタンパク質はＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ１１８）と明示した。ＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ａ８、Ｐ１１、Ｃ１１８）は、ＢＨ−ＲＮａｓｅ（Ｃ１１８）に関して前に記載したのと同様に発現させ、精製した。
【化１１】
2008535485.tif 000013
【００７２】
７．アッセイで使用したタンパク質の構築及び発現。
７．１．ＳＬＴ−ＶＥＧＦ。
Ｎ末端Ｓ−タグ及びＨｉｓ−タグを有するＳＬＴ−ＶＥＧＦ融合タンパク質をコードするｐＥＴ／ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／Ｌプラスミドが以前に記載された（Ｂａｃｋｅｒ及びＢａｃｋｅｒ、２００１）。ＳＬＴ−ＶＥＧＦ  ＤＮＡコード配列は、ＮｄｅＩ部位を導入したプライマー（配列番号４５）及びＸｈｏＩ部位を導入したプライマー（配列番号４６）を使用して、ｐＥＴ／ＶＥＧＦ１２１−ＳＬＴ／ＬプラスミドＤＮＡからＰＣＲによって増幅させた。精製したＰＣＲ産物はＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、精製し、ｐＥＴ２９ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングした。生成したプラスミドはシークエンシングによって確認し、ｐＥＴ２９／ＳＬＴ−ＶＥＧＦと明示した。Ｃ４含有タンパク質に関して前に記載したのと同様に、ＳＬＴ−ＶＥＧＦをＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ、以下のように精製した：封入体を８Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＮａ２ＳＯ３、１０ｍＭのＮａ２Ｓ４Ｏ６、１０ｍＭのＤＴＴ中に溶かし、攪拌しながら４℃で６〜８時間インキュベートし、次いで５ｍＭのトリス［２カルボキシエチル］ホスフィン（Ｐｉｅｒｃｅ）を補い、４℃で１６〜１８時間インキュベートした。溶解したタンパク質は、最初に、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２Ｍの尿素、０．５Ｍのアルギニン、１ｍＭの還元型グルタチオン、０．４ｍＭの酸化型グルタチオンの１０体積中において４℃で８〜１０時間、第２に、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＮＰ−４０の１００体積中において４℃で２４時間、及び第３に、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌの１００体積中において４℃で２４時間の３ステップの透析によってリフォールディングさせた。透析後、溶液を遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間）によって浄化し、ＨｉＴｒａｐ  Ｑセファロース（１ｍｌ、予め充填したカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上でのクロマトグラフィーによってＳＬＴ−ＶＥＧＦを精製した。
【化１２】
2008535485.tif 000014
【００７３】
７．２．Ｈｕ−ＶＥＧＦ。
Ｎ末端野生型Ｈｕ−タグを有するＨｕ−ＶＥＧＦ１２１融合タンパク質を、Ｂａｃｋｅｒら、２００３中に記載されたのと同様に構築した。Ｈｕ−ＶＥＧＦ１２１を発現させ、以下の修飾でＣ４−ＶＥＧＦに関して前に記載したのと同様に、封入体からリフォールディングさせた：封入体からのリフォールディングは２ステップの透析によって行った。最初に、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２Ｍの尿素、０．５Ｍのアルギニン、１ｍＭの還元型グルタチオン、０．４ｍＭの酸化型グルタチオンの１０体積中において４℃で８〜１０時間、第２に、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０の５０体積中において４℃で２４時間。さらに、最終的なＨｕ−ＶＥＧＦ１２１の精製のために、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰセファロースＦＦ、次にヘパリンＨＰセファロースクロマトグラフィー（１ｍｌ、予め充填したカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を実施した。
【００７４】
８．Ｃ４タグを有する組換え融合タンパク質の機能活性
Ａ．ＶＥＧＦの活性。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ系複合体の機能活性を２つのアッセイにおいて試験した。第１のアッセイ、ＶＥＧＦＲ−２自己リン酸化の刺激は以下のように実施した：一晩の飢餓状態（ＤＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ）の後にほぼ融合状態の２９３／ＫＤＲ細胞を、３７℃において２０分間０．５ｍＭのバナジン酸ナトリウムを含む無血清ＤＭＥＭに移し、次いで３７℃において１０分間ＶＥＧＦで刺激し、溶解させ、抗ホスホチロシンＲＣ２０：ＨＲＰＯ複合体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）を使用してウエスタンブロッティングによって分析した。第２のアッセイ、ＳＬＴ−ＶＥＧＦの細胞毒性効果からの２９３／ＫＤＲ細胞の保護は以下のように実施した。２９３／ＫＤＲ細胞は、１０００個の細胞／ウエルで、実験の２０時間前に９６ウエルプレート上に平板培養した。様々な量のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ系複合体を完全培養培地中でＳＬＴ−ＶＥＧＦと混合させ、１ｎＭのＳＬＴ−ＶＥＧＦの最終濃度で三連のウエルにおいて細胞に加えた。生存細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって９６時間後に定量化した。
【００７５】
Ｂ．アネキシンＶの活性。Ｃ４−アネキシン及びＨｕＳ−Ｃ４−アネキシンの機能活性を、記載されたように（Ｔａｉｔら、１９９５）安定状態のヒト血液（４Ｃ  Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）のホスファチジルセリン提示赤血球との結合に関してＦＩＴＣ−アネキシン（Ｓｉｇｍａ）と競合するそれらの能力によって試験した。簡単に言うと、１千万個の赤血球を、室温で１５分間結合バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）中で、５ｎＭのＦＩＴＣ−アネキシンＶ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＤ）の存在下で様々な量のアネキシンと共にインキュベートした。細胞をスピンダウンし、５ｍＭのＥＤＴＡを補った結合バッファー中に再懸濁させ、再度スピンダウンした。上清中のＦＩＴＣ−アネキシンの蛍光性はλｅｘ４８５ｎｍ／λｅｍ５２０ｎｍで測定した。
【００７６】
Ｃ．ＬＦｎ活性。Ｃ４−ＬＦｎ及びＨｕｓ−Ｃ４−ＬＦｎを、ＰＡの存在下で完全長ＬＦの細胞毒性効果からＲＡＷ細胞を保護する、それらの能力に関して試験した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、実験の２０時間前に１５×１０３個の細胞／ウエルで９６ウエルプレート上に平板培養した。様々な量のＬＦｎ、Ｃ４−ＬＦｎ、又はＨｕｓ−Ｃ４−ＬＦｎを、ＤＭＥＭ完全培養培地中でＬＦ及びＰＡ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＵＳＡ）と混合させ、２ｎＭのＰＡ及び０．２ｎＭのＬＦの最終濃度で三連のウエルにおいて細胞に加えた。５％ＣＯ２中での３７℃におけるインキュベーションの２．５時間後、生存細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。
【００７７】
９．細胞系。
ＨＥＫ２９３ヒト形質転換胚腎細胞（ＣＲＬ−１５７３）及びＲＡＷ２６４．７マウス単核（ＴＩＢ−７１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）からのものであった。２．５×１０６個のＶＥＧＦＲ−２／細胞を発現する２９３／ＫＤＲ細胞は、ＳｉｂＴｅｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｉｎｇｔｏｎ、ＣＴ；Ｂａｃｋｅｒ及びＢａｃｋｅｒ、２００１ａ）において開発されてきた。全ての細胞は、１０％のウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ、ＵＳＡ）、２ｍＭのグルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を補ったＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）中に３７℃、５％ＣＯ２で保った。
【００７８】
（実施例２）
Ｃ４タグタンパク質とアダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ１１８）の部位特異的結合。
このプロトコルは、Ｃ４タグタンパク質とアダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ１１８）の部位特異的結合、及び組織培養中の複合体の機能活性の試験を含んでいた。
【００７９】
前に記載したのと同様に調製したＨｕＳ（Ｃ１１８）、及びＣ４−ＶＥＧＦ、又はＣ４−アネキシン、又はＣ４−ＬＦｎなどのＣ４タグタンパク質を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含むバッファー中で混合させ、４℃で１６時間インキュベートし、次いで還元及び非還元状態下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。非還元状態下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、インキュベーション中に混合物中に形成された新たなタンパク質産物が明らかになった（図２Ｃ、ＤＴＴなしレーン）。これらのバンド中のタンパク質の分子量は、親タンパク質当たりそれぞれ１つ又は２つのＨｕＳ分子を有する複合体の分子量に対応した。還元状態下ではこれらのバンドは消失し、親タンパク質及び１２−ｋＤａのＨｕＳ（Ｃ１１８）に対応するバンドのみが検出可能であった（図２Ｃ、ＤＴＴを含むレーン）。複合体はＨｕ−ペプチドカラム上で最初に精製して遊離ＨｕＳ（Ｃ１１８）を除去し、必要なときは、イオン交換クロマトグラフィーによって遊離した親タンパク質を除去した。
【００８０】
複合体の機能活性を、前に記載した組織培養アッセイにおいて試験した。ＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の活性は、２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化の誘導においてＣ４−ＶＥＧＦの活性と同等であった（図３Ａ）。ＨｕＳ−Ｃ４−アネキシン複合体は、Ｔａｉｔら、（１９９５）によって報告されたように、安定状態のヒト血液のホスファチジルセリン提示赤血球とＩＣ５０の１１＋３ｎＭの結合対ＩＣ５０の９＋４ｎＭの組換えアネキシンＶの結合に関して、ＦＩＴＣ−アネキシンとの競合において活性があった（図３Ｂ）。ＰＡの存在下でのＬＦからのＲＡＷ２６４．７細胞の保護において、ＨｕＳ−Ｃ４−ＬＦｎはＣ４−ＬＦｎと同程度に活性があった（図３Ｃ）。１つにするとこれらのデータは、アダプタータンパク質と異なるＣ４タグタンパク質の結合は、それらの活性を損ねないことを示す。
【００８１】
（実施例３）
Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＣ４−ｓｃＶＥＧＦと放射性核種キレート化剤、５−マレイミド−２−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩の部位特異的結合。
このプロトコルは、Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＣ４−ｓｃＶＥＧＦと化学的に活性がある放射性核種キレート化剤５−マレイミド−２−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ、サンディエゴ、ＣＡ）の部位特異的結合、及び組織培養中の複合体の試験を含んでいた。
【００８２】
前に記載したのと同様に調製したＣ４−ＶＥＧＦを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含むバッファー中でモル比ＨＹＮＩＣ／タンパク質３：１で、本明細書で以後ＨＹＮＩＣと明示するジメチルホルムアミドに溶かした５−マレイミド−２−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩と混合させ、室温で１時間インキュベートした。ＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ＶＥＧＦと明示された産物を、０．１１４Ｍのトリシン、ｐＨ６．９で平衡状態にしたＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）において精製した。分析ＲＰ  ＨＰＬＣ（図４Ａ）を使用して、２１６ｎｍでの光学濃度の検出によってタンパク質の濃度、及び３１０ｎｍでの光学濃度の検出によってＨＹＮＩＣの濃度を測定した。選択した条件下において、精製ＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ＶＥＧＦ中のＨＹＮＩＣのＣ４−ＶＥＧＦに対する比は〜１であった。
【００８３】
前に記載したのと同様に調製したＣ４−ｓｃＶＥＧＦをＨＹＮＩＣと結合させ、前に記載したのと同様に精製し、ＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ＶＥＧＦと明示する精製産物中のＨＹＮＩＣとＣ４−ｓｃＶＥＧＦの比は〜１であった。
【００８４】
ＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ中のＶＥＧＦ部分の機能活性を、前に記載した２つの組織培養アッセイ、２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化の誘導（図４Ｂ）、及びＳＬＴ−ＶＥＧＦの細胞毒性活性からの２９３／ＫＤＲ細胞の保護（図４Ｃ）において試験した。両方のアッセイにおいて、ＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦの活性は非修飾Ｃ４−ＶＥＧＦの活性に匹敵し、Ｃ４−ＶＥＧＦ又はＣ４−ｓｃＶＥＧＦとＨＹＮＩＣの結合は、タンパク質の活性を損ねないことが示された。
【００８５】
（実施例４）
Ｃ４−ＶＥＧＦとポリエチレングリコールの部位特異的結合。
このプロトコルは、Ｃ４−ＶＥＧＦ１１０と化学的に活性があるマレイミド基で官能性を与えたポリエチレングリコール（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の部位特異的結合、及び組織培養中の複合体の試験を含んでいた。
【００８６】
前に記載したのと同様に調製したＣ４−ＶＥＧＦ１１０を、ＰＥＧとタンパク質の比３：１で２０ｋＤａ又は４０ｋＤａいずれかのポリエチレングリコールマレイミド（ＰＥＧ）と混合させ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含むバッファー中で室温において１時間インキュベートした。ＰＥＧ２０−Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＰＥＧ４０−Ｃ４−ＶＥＧＦと明示された産物を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で平衡状態にしたカラムにおいてＨＰＬＣゲル濾過によって未反応Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＰＥＧから精製した。分析ＲＰ  ＨＰＬＣを使用して、２１６ｎｍでの光学濃度の検出によってタンパク質の濃度を測定した。ＶＥＧＦに対する抗体を用いた還元ＰＥＧ化ＶＥＧＦ産物のウエスタンブロット分析によって、５５ｋＤａの見た目の分子量に対応するバンド、及び非修飾ＶＥＧＦモノマーに対応するほぼ等しい強度のバンドが明らかになり（図５Ａ）、大部分のＶＥＧＦ二量体において、ただ１つのＣ４タグがＰＥＧと結合したことが示された。
【００８７】
ＰＥＧ−Ｃ４−ＶＥＧＦの機能活性を、２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化の誘導の組織培養アッセイにおいて試験した（ＰＥＧ４０−Ｃ４−ＶＥＧＦに関する図５Ｂ）。このアッセイにおいて、ＰＥＧ−Ｃ４−ＶＥＧＦの活性は非修飾Ｃ４−ＶＥＧＦの活性に匹敵し、Ｃ４−ＶＥＧＦとポリエチレングリコールの部位特異的結合は、タンパク質の活性を損ねないことが示された。
【００８８】
（実施例５）
シアニン色素Ｃｙ５．５とＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の部位特異的結合。
このプロトコルはＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）の調製、Ｃ４−ＶＥＧＦとのその結合、生成したＨｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の精製、及びＣｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦという名称の複合体を生成する前記複合体とシアニン色素Ｃｙ５．５の結合を含んでいた（図６Ａ）。比較目的で、Ｃ４−ＶＥＧＦをアミノ基においてＮＨＳ−Ｃｙ５．５で１：１の比にランダムに修飾し、又はＣ４タグ中のＣ４残基においてマレイミド−Ｃｙ５．５で修飾した。全てのＣｙ５．５含有複合体中のＶＥＧＦ部分の機能活性を、前に記載した２つの組織培養アッセイ、ＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化の誘導（図６Ｂ）、及びＳＬＴ−ＶＥＧＦの細胞毒性活性からの２９３／ＫＤＲ細胞の保護（図６Ｃ）において試験した。両方のアッセイにおいて、Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の活性のみが非修飾Ｃ４−ＶＥＧＦの活性に匹敵し、タンパク質の誘導体化のためにＣ４タグと結合することができるアダプタータンパク質の使用の有効性が根底にあった。
【００８９】
画像化に関するＣｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦの有用性を、皮下４Ｔ１マウス乳腺癌腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃメスマウスにおいて試験した。６３０ｎｍにおけるバンドパスフィルター及び７００ｎｍにおけるロングパスフィルターを備えるＫＯＤＡＫ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ２０００ＭＭを用いて得た画像は、Ｃｙ５．５−ＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体は原発性腫瘍の末梢に優先的に局在したことを示した（図６Ｄ）。この優先的局在は、腫瘍中のＶＥＧＦＲ−２陽性細胞を破壊するＳＬＴ−ＶＥＧＦタンパク質で予備治療したマウスにおいて阻害され（Ｂａｃｋｅｒら、提示済）、腫瘍中のＣｙ５．５−ＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の蓄積はＶＥＧＦ受容体介在性であり、腫瘍脈管構造の具体的な画像化に使用することができることが示された。
【００９０】
（実施例６）
標的型薬剤送達用の薬剤充填リポソームを含むＶＥＧＦ誘導型複合体を構築するための、Ｃ４タグ及びこのタグと共有結合したアダプタータンパク質の使用。
このプロトコルはＨｕＳ（Ｃ１１８）の調製、ＰＥＧ−脂質−マレイミドとのその結合、Ｌｉｐ／ＨｕＳ（Ｃ１１８）という名称の標準的な構築体をもたらすドキソルビシン充填リポソーム中への脂質化ＨｕＳ（Ｃ１１８）の挿入、及びＬｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦをもたらしたこの構築体とＣ４−ＶＥＧＦの結合を含んでいた（図７Ａ）。Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体中のＶＥＧＦ部分の機能活性を、前に記載した組織培養アッセイ、２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシンリン酸化の誘導において試験した（図７Ｂ）。このアッセイにおいて、Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦリポソームのＶＥＧＦの活性は非修飾Ｃ４−ＶＥＧＦの活性に匹敵し、タンパク質の誘導体化のためにＣ４タグと結合することができるアダプタータンパク質の使用の有効性が根底にあった。
【００９１】
２９３／ＫＤＲ細胞をＬｉｐ／ＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦに１５分間曝すことによって細胞増殖の用量依存的阻害をもたらしたが（図７Ｃ）、一方ＨｕＳ（Ｃ１１８）のみで誘導体化した等量の非標的ドキソルビシン充填リポソーム（商品名「ＤＯＸＩＬ」で市販されている）は、これらの細胞に対して毒性ではなく、Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ標的型リポソームの細胞毒性のＶＥＧＦ受容体介在性機構が示された。用量依存的にＬｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦの細胞毒性を阻害するＶＥＧＦの能力によって、この機構をさらに確認した（図７Ｄ）。
【００９２】
（実施例７）
標的型薬剤送達用の薬剤充填リポソームを含むＳｃｖｅｇｆ誘導型複合体を構築するためのＣ４タグの使用。
このプロトコルはＣ４−ｓｃＶＥＧＦの調製、ＰＥＧ−脂質−マレイミドとのその結合、及びドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）中への脂質化Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦの挿入を含んでいた（図８Ａ）。Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ複合体中のＶＥＧＦ部分の機能活性を、前に記載した組織培養アッセイ、２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシンリン酸化の誘導において試験した（図８Ｂ）。このアッセイにおいて、Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦリポソームのＶＥＧＦの活性は非修飾Ｃ４−ＶＥＧＦの活性に匹敵し、Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ使用の有効性が根底にあった。
【００９３】
２９３／ＫＤＲ細胞をＬｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦに１５分間曝すことによって細胞増殖の用量依存的阻害をもたらしたが（図８Ｃ）、一方等量の非標的ドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）はこれらの細胞に対して毒性ではなく、Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ標的型リポソームの細胞毒性のＶＥＧＦ受容体介在性機構が示された。用量依存的にＬｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦの細胞毒性を阻害するＶＥＧＦの能力によって、この機構をさらに確認した（図８Ｄ）。
【００９４】
参考文献
【化１３−１】
2008535485.tif 000015
【化１３−２】
2008535485.tif 000016
【化１３−３】
2008535485.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】Ｇ４Ｓリンカーによってマルチクローニングサイト領域と遺伝子工学的に融合させたＣ４タグの、アミノ酸及び核酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】Ｇ４ＳリンカーによってＣ４タグと融合させた、融合組換えタンパク質の細菌における発現用のプラスミドの概略図である。
【図２Ａ】Ｃ４タグ融合組換えタンパク質と、ＨｕＳ（Ｃ１１８）という名称の相補的アダプタータンパク質間の、部位特異的結合の概略図である。
【図２Ｂ】組換えタンパク質と遺伝子工学的に融合させたＣ４タグ中のシステイン残基との部位特異的結合が可能である、ヒトＲＮａｓｅＩに基づくアダプタータンパク質のファミリーの概略図である。
【図２Ｃ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦという名称のサンプル中のＤＴＴ感受性の新しいタンパク質バンドの出現をもたらす、Ｃ４−ＶＥＧＦとＨｕＳ（Ｃ１１８）の間のジスルフィド結合による自発的結合を示す図である。
【図２Ｄ】リボヌクレアーゼ活性は化学結合の形成によって復元されるが、アダプタータンパク質とＣ４タグ組換え融合タンパク質の物理的混合によっては復元されないことを示す図である。
【図３Ａ】幾つかのＣ４タグ組換え融合タンパク質及び相補的アダプタータンパク質と結合したＣ４タグ組換え融合タンパク質の機能活性は、親タンパク質の機能活性に匹敵することを示す図である。２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシンリン酸化アッセイでは、Ｃ４タグ血管内皮増殖因子（Ｃ４−ＶＥＧＦ）、Ｃ４タグ単鎖血管内皮増殖因子（Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ）、及びＨｕＳ（Ｃ１１８）−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体（ＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）の機能活性は、Ｃ４タグを含まないＶＥＧＦの機能活性に匹敵することを示す図である。
【図３Ｂ】幾つかのＣ４タグ組換え融合タンパク質及び相補的アダプタータンパク質と結合したＣ４タグ組換え融合タンパク質の機能活性は、親タンパク質の機能活性に匹敵することを示す図である。Ｃ４タグアネキシンＶ（Ｃ４−アネキシン）及びＨｕＳ（Ｃ１１８）−Ｃ４−アネキシンＶ複合体（ＨｕＳ−Ｃ４−アネキシン）の機能活性は、赤血球結合アッセイにおけるアネキシンＶの機能活性に匹敵することを示す図である。
【図３Ｃ】幾つかのＣ４タグ組換え融合タンパク質及び相補的アダプタータンパク質と結合したＣ４タグ組換え融合タンパク質の機能活性は、親タンパク質の機能活性に匹敵することを示す図である。炭そ菌致死性因子のＣ４タグ触媒不活性化断片、Ｃ４−ＬＦｎ、及び対応するＨｕＳ（Ｃ１１８）−Ｃ４−ＬＦｎ複合体（ＨｕＳ−Ｃ４−ＬＦｎ）の能力は、炭そ菌毒素ＬＦ／ＰＡの細胞毒性活性からのＲＡＷ細胞の保護におけるＬＦｎの能力に匹敵することを示す図である。
【図４Ａ】ＨＹＮＩＣ−マレイミド（５−マレイミド−２−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩）、９９ｍＴｃ用のキレート化剤とＣ４−ＶＥＧＦ及びＣ４−ｓｃＶＥＧＦ融合タンパク質の部位特異的結合、並びにこのような複合体の機能活性を示す図である。ＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ複合体の機能活性は、２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化アッセイにおいて、親Ｃ４−ＶＥＧＦの機能活性に匹敵することを示す図である。
【図４Ｂ】ＨＹＮＩＣ−マレイミド（５−マレイミド−２−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩）、９９ｍＴｃ用のキレート化剤とＣ４−ＶＥＧＦ及びＣ４−ｓｃＶＥＧＦ融合タンパク質の部位特異的結合、並びにこのような複合体の機能活性を示す図である。ＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ＶＥＧＦ及びＨＹＮＩＣ−Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ複合体は、毒素−ＶＥＧＦ融合タンパク質の細胞毒性から２９３／ＫＤＲ細胞を保護するその能力が親Ｃ４−ＶＥＧＦに匹敵することを示す図である。
【図５Ａ】２０ｋＤａ又は４０ｋＤａのマレイミド−ポリエチレングリコール（相応じてＰＥＧ２０及びＰＥＧ４０）とＣ４−ＶＥＧＦの部位特異的結合、及びＰＥＧ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の機能活性を示す図である。ＰＥＧ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図５Ｂ】２０ｋＤａ又は４０ｋＤａのマレイミド−ポリエチレングリコール（相応じてＰＥＧ２０及びＰＥＧ４０）とＣ４−ＶＥＧＦの部位特異的結合、及びＰＥＧ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の機能活性を示す図である。ＰＥＧ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の機能活性は、２９３／ＫＤＲ細胞におけるＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化アッセイにおいて、親Ｃ４−ＶＥＧＦの機能活性に匹敵することを示す図である。
【図６Ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏの標的とする近赤外線蛍光画像用のシアニン色素Ｃｙ５．５を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）の使用を示す図である。Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体を構築及び特徴付けするためのフローチャートである。
【図６Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏの標的とする近赤外線蛍光画像用のシアニン色素Ｃｙ５．５を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）の使用を示す図である。Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の機能活性は、ＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化アッセイにおいて親Ｃ４−ＶＥＧＦの機能活性に匹敵するが、一方でＣ４タグＶＥＧＦ当たり同等量のＣｙ５．５の部位特異的（Ｃｙ５．５−Ｃ４−ＶＥＧＦ）又はランダムな結合（Ｃｙ５．５−ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦの活性を低下させることを示す図である。
【図６Ｃ】ｉｎ  ｖｉｖｏの標的とする近赤外線蛍光画像用のシアニン色素Ｃｙ５．５を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）の使用を示す図である。Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体は、毒素−ＶＥＧＦ融合タンパク質の細胞毒性から２９３／ＫＤＲ細胞を保護するその能力が親Ｃ４−ＶＥＧＦの能力に匹敵するが、一方でＣ４タグＶＥＧＦ当たり同等量のＣｙ５．５の部位特異的（Ｃｙ５．５−Ｃ４−ＶＥＧＦ）又はランダムな結合（Ｃｙ５．５−ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦの活性を低下させることを示す図である。
【図６Ｄ】ｉｎ  ｖｉｖｏの標的とする近赤外線蛍光画像用のシアニン色素Ｃｙ５．５を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｃｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ８８、Ｃ１１８）の使用を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍脈管構造の画像化のためのＣｙ５．５−Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の使用を示す図である。
【図７Ａ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ１１８）の使用を示す図である。Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体を構築及び特徴付けするためのフローチャートである。
【図７Ｂ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ１１８）の使用を示す図である。Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の機能活性は、ＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化アッセイにおいて親Ｃ４−ＶＥＧＦの機能活性に匹敵することを示す図である。
【図７Ｃ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ１１８）の使用を示す図である。ＶＥＧＦ標的型ドキソルビシン充填リポソーム（Ｌｉｐ／ＨｕＳ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）は、非標的ドキソルビシン充填リポソームがＬｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の毒性の無効な根底の受容体介在性機構である濃度範囲内で、ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対して毒性であることを示す図である。
【図７Ｄ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４タグ及び相補的アダプタータンパク質ＨｕＳ（Ｃ１１８）の使用を示す図である。ＶＥＧＦは、Ｌｉｐ／Ｈｕｓ−Ｃ４−ＶＥＧＦ複合体の細胞毒性活性から２９３／ＫＤＲ細胞を保護することを示す図である。
【図８Ａ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦの使用を示す図である。Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ複合体を構築及び特徴付けするためのフローチャートである。
【図８Ｂ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦの使用を示す図である。ＶＥＧＦＲ−２チロシン自己リン酸化アッセイでは、Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ複合体の機能活性は、親Ｃ４−ＶＥＧＦの機能活性に匹敵することを示す図である。
【図８Ｃ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦの使用を示す図である。Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦは、非標的ドキソルビシン充填リポソームがＬｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ複合体の毒性の無効な根底の受容体介在性機構である濃度範囲内で、ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対して毒性であることを示す図である。
【図８Ｄ】標的型薬剤送達用のドキソルビシン充填リポソーム（「ＤＯＸＩＬ」）を含むＶＥＧＦ誘導型複合体（Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ）を構築するための、Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦの使用を示す図である。ＶＥＧＦは、Ｌｉｐ／Ｃ４−ｓｃＶＥＧＦ複合体の細胞毒性活性から２９３／ＫＤＲ細胞を保護することを示す図である。
【図１Ａ】
2008535485.tif 000018
【図１Ｂ】
2008535485.tif 000019
【図２Ａ】
2008535485.tif 000020
【図２Ｂ】
2008535485.tif 000021
【図２Ｃ】
2008535485.tif 000022
【図２Ｄ】
2008535485.tif 000023
【図３Ａ】
2008535485.tif 000024
【図３Ｂ】
2008535485.tif 000025
【図３Ｃ】
2008535485.tif 000026
【図４Ａ】
2008535485.tif 000027
【図４Ｂ】
2008535485.tif 000028
【図５Ａ】
2008535485.tif 000029
【図５Ｂ】
2008535485.tif 000030
【図６Ａ】
2008535485.tif 000031
【図６Ｂ】
2008535485.tif 000032
【図６Ｃ】
2008535485.tif 000033
【図７Ａ】
2008535485.tif 000034
【図７Ｂ】
2008535485.tif 000035
【図７Ｃ】
2008535485.tif 000036
【図７Ｄ】
2008535485.tif 000037
【図８Ａ】
2008535485.tif 000038
【図８Ｂ】
2008535485.tif 000039
【図８Ｃ】
2008535485.tif 000040
【図８Ｄ】
2008535485.tif 000041
【配列表】
2008535485000001.app
【国際調査報告】
2008535485.tif 000042