(57)【要約】  本発明は１以上の目的成分をサンプルより分離する方法を提供する。該方法は下記工程：(ａ)  粒子状および可溶性物質を含有するサンプルを、表面上の活性基が１以上のシランと反応されているシリカフィルター媒体でろ過する、および(ｂ)  同時に粒子状物質の捕捉および目的とする可溶性成分のシリカフィルター媒体への結合を行う、を含有する。結合した可溶性目的成分は次いで、シリカフィルター媒体より溶離される。１の実施態様において本発明は、不要な可溶性成分を処理されたシリカフィルター媒体に捕捉させ、所望の目的成分をろ液から回収する方法を開示する。他の本発明の実施形態においては、複数の目的成分を溶離液とろ液の両方から得る方法を開示する。好ましい処理されたシリカフィルター媒体はシラン処理もみ殻灰、カラスムギ灰または珪藻土である。
2008505742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
(ａ)  粒子状および可溶性物質を含有するサンプルを、表面上の活性基が１以上のシランと反応されているシリカフィルター媒体でろ過する、
(ｂ)  同時に粒子状物質の捕捉および目的とする可溶性成分のシリカフィルター媒体への結合を行う、および
(ｃ)  目的成分をシリカフィルター媒体より溶離する、
を含有する、１以上の目的成分をサンプルより分離する方法。
【請求項２】
下記工程：
(ａ)  粒子状および可溶性物質を含有するサンプルを、表面上の活性基が１以上のシランと反応されているシリカフィルター媒体でろ過する、
(ｂ)  同時に粒子状物質の捕捉および望ましくない可溶性成分のシリカフィルター媒体上への結合を行う、
(ｃ)  ろ液を回収する、および
(ｄ)  ろ液より目的可溶性成分を回収する
を含有する、１以上の目的成分をサンプルより分離する方法。
【請求項３】
下記工程：
(ａ)  粒子状および可溶性物質を含有するサンプルを、表面上の活性基が１以上のシランと反応されているシリカフィルター媒体でろ過する、
(ｂ)  同時に粒子状物質の捕捉および第１の可溶性目的成分のシリカフィルター媒体上への結合を行う、
(ｃ)  ろ液を回収する、
(ｄ)  結合している第１の可溶性目的成分をシリカフィルター媒体より溶離させる、および
(ｅ)  第１の可溶性目的成分を回収する
を含有する、可溶性成分をサンプルより分離する方法。
【請求項４】
さらに可溶性目的成分をろ液流から精製する工程を含む、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記粒子状物質が物理的封じ込めおよび／またはシリカフィルター媒体への結合により捕捉される、請求項１〜３いずれかに記載の方法
【請求項６】
前記粒子状物質が微生物、沈殿物、封入体または結晶である、請求項＠〜＠いずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記微生物がグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌類、酵母、カビ、またはウイルスである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ろ過工程の前に前記サンプルを前記シリカフィルター媒体と前混合する工程を有する、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記可溶性成分がシリカフィルター媒体へ静電、疎水性、または親水性相互作用によって結合される、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記可溶性成分がポリペプチド、脂質、炭水化物、リポタンパク質、多糖、糖、脂肪酸、またはポリヌクレオチドである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記表面の活性基がドライまたはウエット工程により１以上のシランと反応されている、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記シリカフィルター媒体がマクロポーラスシリカである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記シリカフィルター媒体が精製または未精製もみ殻灰、カラスムギ殻灰、または珪藻土である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
下記の群：アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルキルエステル、アリールエステルから選択され、シリカフィルター媒体上の活性基と反応している１以上の加水分解性部分を有するものである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記シランが４級アンモニウム、アリール、エポキシ、アミノ、アミド、スルフリル、尿素、イソシアノ、ウレタン、エーテル、メタクリレート、イミダゾール、カルボニル、イソチオリウム、スルホネートおよびホスホネートからなる群から選択されるさらなる官能基部分を有している、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記アリール部分を有するシランが２-ヒドロキシ-４-(３-トリエトキシシリルプロポキシ)-ジフェニルケトンまたは((クロロメチル)フェニルエチル)トリメトキシシランである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ部分を有するシランが２-(トリメトキシシリルエチル)ピリミジン、N-(３-トリメトキシシリルプロピル)ピロール、またはトリメトキシシリルプロピルポリエチレンイミンである請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記尿素部分を有するシランがN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタンである請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記スルフヒドリル部分を有するシランが３-メルカプトプロピルトリエトキシシランである、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記カルボニル部分を有するシランが３-(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記イソシアノ部分を有するシランがトリス(３-トリメトキシシリルプロピル)イソシアヌレートまたは３-イソシアナートプロピルトリエトキシシランである請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記エーテル部分を有するシランがビス[(３-メチルジメトキシシリル)プロピル]-ポリプロピレンオキシドである請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記エポキシ部分を有するシランが２-(３,４-エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシランである、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記イミダゾール部分を有するシランがN-(３-トリエトキシシリルプロピル)-４,５-ジヒドロイミダゾールである、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
前記スルホネート部分を有するシランが２-(４-クロロスルホニルフェニル)-エチルトリクロロシランである、請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
前記イソチオウリウム(isothiourium)部分を有するシランがトリメトキシシリルプロピルイソチオウロニウムクロライドである、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
前記アミド部分を有するシランがトリエトキシシリルプロピルエチル-カルバメート、N-(３-トリエトキシシリルプロピル)-グルコンアミドまたはN-(トリエトキシシリルプロピル)-４-ヒドロキシブチルアミドである、請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
前記ウレタン部分を有するシランがN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタンまたはO-(プロパルギルオキシ)-N-(トリエトキシシリルプロピル)ウレタンである、請求項１５記載の方法。
【請求項２９】
前記シランが下記：３-(トリメトキシシリル)プロピル-エチレンジアミントリ酢酸トリナトリウム塩；トリメトキシシリルプロピル-エチレンジアミントリ酢酸トリナトリウム塩および３-(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルリン酸ナトリウム塩、からなる群から選択されるイオン性シランである、請求項１５記載の方法。
【請求項３０】
前記１以上のシランが３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸ナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび(３−グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸ナトリウム塩およびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシラン；３−(Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ)−プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(トリメトキシシリルエチル)ピリジンおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび２−ヒドロキシ−４−(３−トリエトキシシリルプロポキシ)−ジフェニルケトン；３−メルカプトプロピルトリエトキシシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；トリメトキシシリルプロピル−エチレンジアミン、トリ酢酸トリナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；および２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
もみ殻灰またはカラスムギ殻灰の表面活性基が下記２-ヒドロキシ-４-(３-トリエトキシシリルプロポキシ)-ジフェニルケトン、((クロロメチル)フェニルエチル)トリメトキシシラン、２-(トリメトキシシリルエチル)ピリミジン、N-(３-トリメトキシシリルプロピル)ピロール、トリメトキシシリルプロピルポリエチレンイミン、N-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン、３-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３-(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物、トリス(３-トリメトキシシリルプロピル)イソシアヌレートまたは３-イソシアナートプロピルトリエトキシシラン、ビス[(３-メチルジメトキシシリル)プロピル]-ポリプロピレンオキシド、２-(３,４-エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン、N-[３-(トリエトキシシリル)プロピル]イミダゾールまたはN-(３-トリエトキシシリルプロピル)-４,５-ジヒドロイミダゾール、２-(４-クロロスルホニルフェニル)-エチルトリクロロシラン、トリメトキシシリルプロピルイソチオウロニウムクロリド、トリエトキシシリルプロピルエチル-カルバメート、N-(３-トリエトキシシリルプロピル)-グルコンアミドまたはN-(トリエトキシシリルプロピル)-４-ヒドロキシブチルアミド、N-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタンまたはO-(プロパルギルオキシ)-N-(トリエトキシシリルプロピル)ウレタン、３-(トリメトキシシリル)プロピル-エチレンジアミントリ酢酸トリナトリウム塩；トリメトキシシリルプロピル-エチレンジアミン、トリ酢酸トリナトリウム塩および３-(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルリン酸ナトリウム塩からなる群から選択される１以上のシランと反応されているシラン処理もみ殻灰またはカラスムギ殻灰。
【請求項３２】
もみ殻灰またはカラスムギ殻灰の表面活性基が下記３-アミノプロピルトリメトキシシランおよびN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン；３-トリヒドロシリルプロピルメチルホスフォネート、ナトリウム塩およびN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン；N-トリメトキシシリルプロピル-N,N,N-Cl、トリメチルアンモニウムクロライドおよび(３-グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン；３-トリヒドロキシシリルプロピルメチルフォスホネート、ナトリウム塩およびビス-(２-ヒドロキシエチル)-３-アミノイソプロピルトリエトキシシラン；３-(N-スチリルメチル-２-アミノエチルアミノ)-プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドおよびN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン；２-(トリメトキシシリルエチル)ピリミジンおよびN-(３-トリエトキシシリルプロピル)-グルコンアミド；N-トリメトキシシリルプロピル-N,N,N-Cl、トリメチルアンモニウムクロライドおよびN-(３-トリエトキシシリルプロピル)-グルコンアミド；N-トリメトキシシリルプロピル-N,N,N-Cl、トリメチルアンモニウムクロライドおよび２-ヒドロキシ-４-(３-トリエトキシシリルプロポキシ)-ジフェニルケトン；３-メルカプトプロピルトリエトキシシランおよびN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン；３-(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物およびN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン；トリメトキシシリルプロピル-エチレンジアミン、トリ酢酸、トリナトリウム塩およびN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン；２-(４-クロロスルホニルフェニル)-エチルトリクロロシランおよびN-(トリエトキシシリルプロピル)-O-ポリエチレンオキシドウレタン；および２-(４-クロロスルホニルフェニル)-エチルトリクロロシランおよびビス-(２-ヒドロキシエチル)-３-アミノイソプロピルトリエトキシシランからなる群から選択される１以上のシランと反応されているシラン処理もみ殻灰またはカラスムギ殻灰。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１以上の目的成分を粒子状物質および可溶性成分を含有するサンプルより分離する方法に関する。より詳細には、本発明はシラン処理シリカフィルター媒体例えば、もみ殻灰をタンパク質の分離および粒子状物質の捕捉を同時に行うために用いる方法に関する。粒子状物質としては微生物が例示される。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野においての物質の製造には、多くの生物学的成分に取り囲まれている特定の物質を単離、分離および生成する工程が必須である。該物質が発酵生成物、組み換え植物植物体または形質転換ヤギのミルクであるかにかかわらず、目的物質は合理的に純粋な状態で回収されなくてはならない。出発物質が非常に複雑である場合、目的成分の単離は特に困難となり得、コストのかかる作業が必要になりがちである。単離にかかる操作を減らし、回収操作を単純化する技術がバイオテクノロジー及びその他の水処理、食品、飲料、化学品産業を含む産業において望まれている。
【０００３】
微生物から製品を分離することは非常に重要である、というのは微生物による汚染は醸造、ワイン製造、ジュースおよび飲料、乳業、工業用酵素医薬を含む多くの産業において共通した問題だからである。加熱滅菌およびサイズによるろ過は間違いなく今まで最もよく用いられてきたその解決手段である。これらの方法のそれぞれは、利点と欠点を有している。加熱滅菌の主な欠点は高温で影響を受けない製品にしか使えないということである。サイズを基準としたろ過は、コストと時間がかかるという欠点を有している。さらに、必要な成分が細菌と同じような大きさの場合、例えば酪農食品工業においては用いることができない。
【０００４】
単なる分離のための方法として開発されたものには、膨張層吸着及びクロマトグラフィー法が例示される。膨張層吸着により、可溶性成分と微粒子成分の両方を含む発酵混合物から可溶性成分が捕捉される。この方法はサンプルを膨張層へ適用する前に、前ろ過をする必要がない。発酵混合物は吸収ビーズの層を通って上向きに流される；上向きの流れはビーズを持ち上げ、ビーズが上向きに膨張するに従ってビーズをかき混ぜる。可溶性成分はビーズに捕捉され、一方粒子状物質はビーズの周囲を流れて層の上部より排出される。この技術は今まで広く使われていたわけではない、というのはスケールアップが難しい、安定な層の維持、層の上部からのビーズの持ち出し、発酵混合物によるビーズの汚染、ビーズの洗浄と再利用、ビーズの寿命および吸着工程の種々の圧力低下などさまざまな技術的なハードルがあるからである。
【０００５】
固-液クロマトグラフィーは流体と固体吸着体の間への溶質の分配に基づく方法である。多くの異なる固体吸着体(一般に「固定層パッキング」と呼ばれる)がクロマトグラフィーには用いられる。固定層パッキングの相違により、クロマトグラフィーの種類が相違するが、一般に相互作用の機構により分類されている。相互作用は下記のうちの１以上のものであり得る：電荷(イオン交換クロマトグラフィー)；ファンデルワールス力(疎水性相互作用クロマトグラフィー)；サイズおよび形状(サイズ排除)；親和性(例えばタンパク質-A、ビオチン-アビジン、ビオチン-ストレプトアビジン、抗体、レクチン、抗体、ペクチン、染料、リガンド、固定化金属親和性)(参考："Biochemical Engineering"  Harvey W.BlanchおよびDouglas S.Clark、Marcel Dekker Inc、１９９６；p ５０２-５０６)。カスタム親和性クロマトグラフィークロマトグラフィーは特定のタンパク質を捕捉するようデザインされており、各捕捉したいタンパク質それぞれに対する特異的なリガンドを有する特異的なな親和性を有する媒体を必要とする。一般に、クロマトグラフィーは汚れ成分を除去するための前ろ過工程が必要とされる。
【０００６】
ろ過は仕込んだ流体を多孔性媒体を通過させることによって粒子を除去するものである。粒子は物理的トラップおよび媒体への結合を含む種々の機構によってフィルター媒体に捕捉される。種々の媒体を用いるろ過方法は廃水処理、ワイン醸造、飲料製造および工業用酵素製造等において粒子状物質を除去するために用いられている。
【０００７】
フィルター媒体はフィルターエイドとしても知られ、遊離粒子であっても構造体であってもよい。フィルター媒体はろ過される液体に溶解しない粒子状の固体であってよく。粒子は液体に添加されても、フィルター上もしくはフィルター支持体を被覆してもよい。フィルター媒体を用いる理由は、ろ過のスピードを上げる、フィルター表面の付着物を減少させる、減少させる、フィルター層の割れを減少させる、その他ろ過を改善するというものである。フィルター媒体としてしばしば用いられる物質としては、セルロース繊維、珪藻土、木炭、膨張パーライト、アスベスト繊維などが例示される。
【０００８】
フィルター媒体はしばしば、その物理的形状によって説明される。一部のフィルター媒体は本質的に不連続な膜であり、汚染物質を膜表面上に保持することによって機能する(表面フィルタ)。これらのフィルター媒体はそもそも機械的な張力によって機能し、フィルター媒体の孔のサイズが液体から除去しようとする粒子サイズより小さいことが重要である。かかるフィルター媒体は通常低い流速およびすぐに詰まってしまう傾向がある。
【０００９】
他のフィルター媒体としては多孔性支持体もしくは基板上に形成した微細な繊維状または粒子状物質の多孔性ケーキもしくは層が例示される。ろ過される溶液は微細な物質の隙間に形成された孔の通り道を通って流れ、粒子状の汚染物質がフィルター媒体に保持される。フィルター媒体の深さのために、係るフィルターは深型フィルターと呼ばれる(表面フィルターの反対の意)。深型フィルターはふるい機構および静電粒子捕捉機構により汚染物質を捕捉する。静電捕捉モードにおいては、フィルター媒体が小さな孔径を有する必要がある。かなり大きな孔の大きさを有するフィルター媒体を用いて要求された懸濁粒子状汚染物質の除去が達成できれば、より速い流速で行うことができ、魅力である。さらに、より高い粒子保持能を有するフィルターであれば、詰まる傾向が減る。
本発明ではシラン処理シリカ媒体を用いて、種々の濁り生成性物質および粒子状物質をアルコール、果実および野菜飲料から除去する。
【００１０】
バイオテクノロジーおよびその他の工業において、目的とする成分を単離するコストの安い方法が望まれている。生物分子を分離するために低コストの原材料を用いることが望ましい。
【００１１】
もみ殻灰は稲作農業の副産物であり、米は世界の人口の半分にとっての主食である。現在、食べることのできないもみ殻は燃料源、肥料および詰め物として用いられているもみ殻が焼かれると、構成粒子状物質の表面上に酸性ヒドロキシル部分(OH または粒子-OH)の結合した物質であって、非常に粒子状シリカまたはヒュームドシリカの粒子-OHとよく似た物質が副生成物として得られ、これがフィルターエイドとして有用であることが示されている。米国特許第４,６４５,６０５号はもみ殻灰をフィルター媒体として用いることを開示する。
【００１２】
米国特許第４,６４５,５６７は微細な粒子径の汚染物質を流体からろ過するために、種々の多孔性フィルター媒体を用い、汚染流体をこのフィルター媒体に通す方法を開示する。フィルターとして機能するためには、フィルター媒体は流体(通常水)を通し、粒子を押しとどめしなくてはならない。微粒子の押しとどめは複数のろ過メカニズムによって行うことができる、即ち(a)機械的な押しとどめおよび(b)粒子捕捉。機械的な押しとどめにおいては、微粒子は自身より小さい孔を通過しようとした場合に物理的にトラップされる。粒子捕捉においては、粒子は多孔性フィルター媒体内の表面へぶつかり、近距離引力によって表面上へ保持される。
【００１３】
WO ０２/０８３２７０は受動ろ過のフィルター系を開示する。このシステムには：取り入れ口と排出口を有するハウジング；取り入れ口取り入れ口と排出口の間に設置されたプレート状カーボンフィルターが、流入に応じて蒸気ろ過して放出するために設置されている；そしてこのプレート状カーボンフィルターにはシラン組成物を含有する疎水性溶液が分散されており、これによって水の吸着を阻害し、カーボンフィルターの吸着能、特に高い相対湿度環境で行う場合の吸着能を上げるものである。疎水性溶液はカーボンフィルターの吸着能を下げないように選ばれる。
【００１４】
米国特許第６,５２４,４８９号はより進んだコンポジット媒体を開示する。ここでは不均質の媒体粒子であって、各粒子が：(i)珪藻岩、膨張パーライト、軽石、黒曜石、ピッチストーンおよび火山灰からなる群から選択される機能性成分；および(ii)ガラス、天然および合成結晶鉱物、熱可塑性樹脂、熱にて硬化する熱硬化性樹脂、もみ殻灰、および界面骨針からなる群から選択されるマトリックス成分を含有し；前記マトリックス成分の軟化点が前記機能性成分の軟化点より低い；および前記機能性成分が密接にそして直接前記マトリックス成分に結合しているコンポジット媒体が開示される。この進んでコンポジット媒体をジメチルジクロロシラン、ヘキサメチルジシラザンまたはアミノイソプロピルトリエトキシシランにて処理してもよい。
【００１５】
Snyderらはオルガノシラノール、オルガノジメチルアミンまたはオルガノアルコキシシランと高表面積シリカ支持体とを、重合することなく反応させて得られたクロマトグラフィー結合相パッキングを開示する。(L.Ｒ.SnyderおよびJ.J.Kirkland、Introduction to Modern Liquid Chromatography、２nd edition、Wiley-Interscience、N.Y.１９７９。２７２-２８０)
Ｒoyらl(J.Chrom.Sci.２２：８４-８６(１９８４))はイオン交換(DEAE、カルボキシ、およびスルホン)シリカをグリシドキシプロピルシリルシリカのエポキシ官能基を用いて調製するほう法を開示する；イオン交換シリカはカラムクロマトグラフィーにおいて牛血清アルブミンおよびウシγ-グロブリンを分離するのに用いられる。
【００１６】
一般にSnyderおよびＲoyの開示する処理されたクロマトグラフィー用シリカ大規模の繰り返しろ過および単離工程に用いるには値段が高すぎる。
【００１７】
サンプルから目的成分の単離を大規模に行うのに適した改善された抵コストの工程が望まれている。望まれているのは、低コストの原材料が用いられ、大規模製造に適切に用いられ、サンプルの前処理が不要な方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は１以上の成分、特に目的とする生物分子を粒子状および可溶性物質を含有するサンプルから分離する方法を提供する。本発明の特徴は、１以上のシランで表面が処理されフィルター媒体でサンプルをろ過することにある。好ましいフィルター媒体はシリカフィルター媒体である。本方法は粒子状物質のろ過による捕捉および可溶性物質のシリカフィルター媒体上への結合を同時に達成するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の方法の１態様は下記工程：(a)サンプルを処理されたシリカフィルター媒体でろ過する、(b)シリカフィルター媒体上への粒子の捕捉および目的可溶性成分の結合を同時に行う、および(c)結合された目的可溶性成分をシリカフィルター媒体から溶出する、を含有する。
【００２０】
本発明の方法の別の態様は下記工程：(a)サンプルを処理されたシリカフィルター媒体でろ過する、b)シリカフィルター媒体上への粒子の捕捉および望ましくない可溶性成分の結合を同時に行う、および(c)ろ液を回収する、および(d)ろ液より目的可溶性成分を回収する、を含む方法である。
【００２１】
さらに別の本発明の方法は、下記工程：(a)サンプルを処理されたシリカフィルター媒体でろ過する、(b)粒子成分の除去およびシリカフィルター媒体上への第１の目的可溶性成分の結合を同時に行う(c)ろ液を集める(d)第２の目的可溶性成分をろ液から回収する、(e)結合された目的可溶性成分をシリカフィルター媒体から溶出する、および(f)第１の目的可溶性成分を回収する、を含む方法である。
【００２２】
本発明の実施形態の１つにおいて、粒子状物質は微生物である。シラン処理されたフィルター媒体へ捕捉されるのに加えて、シラン処理されたフィルター媒体に接触した微生物は殺されることがわかっている。
【００２３】
本発明はシラン処理されたフィルター媒体に関する。好ましい処理されたシリカフィルター媒体は４級アンモニウム官能基またはスルホネート基を有するシラン処理もみ殻灰である。
【００２４】
本発明の詳細な説明
本発明は１以上の目的成分をサンプルから分離する方法に関する。本発明の１の実施形態は：下記工程：(a)サンプルを処理されたシリカフィルター媒体でろ過する、(b)シリカフィルター媒体上への粒子の捕捉および目的可溶性成分の結合を同時に行う、および(c)結合された目的可溶性成分をシリカフィルター媒体から溶出する、を含む。この実施形態においては、目的分子は始めにシリカフィルター媒体へ結合し、およびその後溶出により回収される。任意に、不溶性目的成分を粒子状物質から回収してもよい。
【００２５】
本発明の別の実施形態においては下記工程：(a)サンプルを処理されたシリカフィルター媒体でろ過する、b)シリカフィルター媒体上への粒子の捕捉および望ましくない可溶性成分の結合を同時に行う、および(c)ろ液を回収する、および(d)ろ液より目的可溶性成分を回収する、を含む方法である。ろ液から得られた可溶性目的成分はさらに精製してもよい。この実施形態において、可溶性目的成分はシリカフィルター媒体へ結合せず、ろ液から回収される。任意に、不溶性目的成分を粒子状物質から回収してもよい。
【００２６】
本発明のさらに他の実施形態においては下記工程：(a)サンプルを処理されたシリカフィルター媒体でろ過する、(b)粒子成分の除去およびシリカフィルター媒体上への第１の目的可溶性成分の結合を同時に行う(c)ろ液を集める(d)第２の目的可溶性成分をろ液から回収する、(e)結合された目的可溶性成分をシリカフィルター媒体から溶出する、および(f)第１の目的可溶性成分を回収する、を含む方法を提供する。本実施形態においては、第１の目的成分がシリカフィルター媒体へ結合し、第２の目的成分はシリカフィルター媒体へ結合しない。任意に、不溶性目的成分を粒子状物質から回収してもよい。
【００２７】
本発明には任意に更なる工程を有していてもよい。ろ過工程(ステップ(a))に先だって、粒子および可溶性成分を含有するサンプルを最初に処理されたシリカフィルター媒体と、処理されたシリカフィルター媒体表面へ該成分が十分に結合する時間の間、接触させてもよい。サンプルと処理されたシリカフィルター媒体を混合して行う反応は、いかなる機械的混合によって実施してもよく、例えば、かき混ぜ、かくはん、ボルテックスなどが例示される。成分が処理されたシリカフィルター媒体に結合した後、混合物をろ過装置にかけ、サンプルを次いでフィルター媒体でろ過する。
【００２８】
「サンプル」の語は液体、溶液、懸濁またはエマルションであって複数の成分の混合物を意味する。サンプルは通常可溶性成分および粒子状成分を含有する。特に対象とされるのは“生物学的サンプル”であり、これは生物組織および／または流体であって、例えば、ポリペプチド、脂質、炭水化物、リポタンパク質、多糖、糖、脂肪酸、ポリヌクレオチドまたはウイルスなどの生物分子を含有するものである。生物学的サンプルには組織切片、例えば組織学評価のための凍結切片が含まれていても良い。本発明に適したサンプルには細胞溶解物、培養液、食品および特に乳製品、血液、飲料(例えばジュース、ビール、ワイン)、および例えば、タンパク質などの生物分子を含有する溶液もしくは懸濁液が例示される。“タンパク質”は天然、合成および操作されたペプチドまたはポリペプチドを意味し、酵素、例えば、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、およびヒドロラーゼ、抗体、ホルモン、サイトカイン、成長因子その他の生物調節因子が例示される。
【００２９】
ろ過は仕込んだ流体を多孔性媒体を通過させることによって粒子を除去するものである。粒子は物理的トラップおよび媒体への結合を含む種々の機構によって媒体に捕捉される。本発明は種々のタイプのシリカ媒体フィルターを用いて以下に限定されるわけではないが、例えば汚水処理、ワイン醸造、ジュースおよび飲料製造、酪農、およびタンパク質例えば酵素の工業的製造など様々な場面で粒子状物質を除去する方法を提供する。
【００３０】
「粒子状物質」の語は肉眼で見える不溶性物質もしくは顕微鏡で見える微細な粒子状物質を意味する。
【００３１】
肉眼で見える粒子はヒトの目で見えるものをいい、限定するものではないが沈殿物、封入体および結晶が含まれる。封入体は細胞内コンパートメントで不溶性で不正に折りたたまれたタンパク質である。結晶は過飽和溶液より規則的かつ繰り返し生じる分子の凝集によっ形成される。沈殿はランダム凝集の非晶質である。肉眼で見える粒子は有機物起源であっても無機物起源であってもよく、タンパク質とタンパク質、塩とタンパク質、塩と塩、タンパク質とポリマー、などの相互作用によって生成される。微細な粒子は顕微鏡下でのみ視認できる粒子である。粒子の例としては、微生物を含む。本発明の方法により好適に捕捉され、生物的サンプルより除くことができる微生物としてはグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、菌、酵母、カビ、ウイルス等が例示される。
【００３２】
本発明の特徴はろ過工程において処理されたシリカフィルター媒体を用い、可溶性物質をシリカフィルター媒体へ結合させ、粒子状物質をろ過によって捕捉するところにある。本発明はしばしば粒子を除去するためのクロマトグラフィー手段を用いる前ろ過工程を必要としない。可溶性成分はシラン処理シリカフィルター媒体上へいくつかのメカニズム例えば、親水性、疎水性、親和性および／または静電相互作用、によって結合する。本発明の方法に用いられるシリカフィルター媒体は、その表面がシラン類に処理されるのに適しており、工業的ろ過に用いるのに適した構造特性を有している。シリカフィルター媒体としては、これらに限定されるわけではないが、もみ殻灰、カラスムギ殻灰、珪藻土、パーライト、,タルク、および粘土が例示される。
【００３３】
もみ殻灰は稲作農の副産物である。米の穀粒は外殻に守られており、これは収穫重量のおよそ１７-２４%を占める。籾殻は７１-８７%(w/w)の有機成分、例えば、セルロースおよび１３-２９%(w/w)の無機成分からなる。この無機分画のかなりの部分、８７-９７%(w/w)はシリカ(SiO２)である。現在、食べられない籾殻は燃料、燃料、肥料、および詰め物として用いられる。籾殻を焼くと、構成されるシリカ成分(通常９０%以上)が副成分として生成する。もみ殻灰(ＲHA)は他の遊離シリカフィルター媒体と比してより大きな表面領域およびより孔の多い構造を有している。これらの性質によりＲHAは本発明において好ましい処理されたフィルター物質である。
【００３４】
珪藻土(珪藻岩珪藻岩)はシリカ沈殿物が堆積したものであり、珪藻、即ち海水もしくは真水環境下に蓄積する単細胞藻類様植物の化石化した骨格から構成される。そのハニカム状のシリカ構造のおかげで珪藻岩は例えば、吸収性、表面面積、化学的安定性および低い嵩密度等の有用な性質を有している。珪藻岩は９０%のSiO２＋Al、Fe、Ca およびMg 酸化物を有している。
【００３５】
パーライトは天然の薄片状火山岩の総称であり、熱処理により膨張させることができるものである。膨張パーライトとしては２ポンド／立方フィート(３２kg/m３)もの軽量のものを製造することができる。パーライトは天然ガラスの一形態であり、化学的に不活性として分類され、おおよそ７のｐＨを有する。パーライトはシリカ、アルミニウム、酸化カリウム、酸化ナトリウム、鉄、酸化カルシウム、およびマグネシウムオキシドを含有する。加工された後、液体から微粒子をろ過して除去するのに好適な多孔質構造を有するパーライトは、深型ろ過に好適に用いられる。
【００３６】
タルク(,タルカム)は天然の水和マグネシウムシリケート、３MgO ４SiO２ H２Oである。粘土は水和アルミニウムシリケート、Al２O３ SiO２ xH２Oである。上記のシリカフィルター媒体物質の混合物を最適なろ過とコストパフォーマンスを達成するために用いるてもよい。もみ殻灰または珪藻土は任意に種々の精製および／または洗浄処理に付した後に表面シラン処理に付してもよい。
【００３７】
シリカフィルター媒体を予め定めた量の機能性シラン(またはシラン類)をその表面へ結合させることによって処理する。処理されたシリカフィルター媒体は液体中の成分を、例えば静電、親水性、疎水性、親和性相互作用、および／または物理的捕獲により捕捉する。静電相互作用によって、荷電したシリカフィルター媒体はサンプル中にある反対の電荷を有する成分吐血号する。親水性相互作用によって、シリカフィルター媒体中の水への強い親和性を有する部分がファンデルワールス相互作用により成分の極性基を引きつける。疎水性相互作用によって、シリカフィルター媒体の炭化水素長鎖を有する部分が成分の非極性基を引きつける。処理されたシリカフィルター媒体は選択的に物質(所望の物質または不要な物質)を分離工程において捕捉し、これによって非処理シリカフィルター媒体を用いる場合と比してより良い分離が達成される。処理されたシリカフィルター媒体は非処理シリカフィルター媒体を用いる場合と比べて好適には同等もしくは改善された流速を示す。
【００３８】
シリカフィルター媒体の基材物質の形状は適用可能であればどのようなものでもよく球、繊維、フィラメント、シート、厚板、ディスク、ブロック、フィルム等が例示される。シリカフィルター基材物質はカートリッジ、ディスク、プレート、膜、織物、スクリーン等に形成されてもよい。未処理シリカフィルター媒体の比表面積は好ましくは１m２/gより大きく、より好ましくは１０m２/gより大きいものである。より大きな表面積を有するシリカフィルター媒体が好ましいというのは、より広い範囲の表面処理が可能だからである。さらに大きな孔を有する媒体であれば、流速が速くなる。しかしながら、孔大きい物質は比較的低い表面積となる。大きな表面積と大きな孔サイズのバランスにより、表面処理と流速を達成する。これらの基材の表面の性質は例えば、NMＲ(核磁気共鳴その他の技術)、SEM(走査電子顕微鏡)、BET(Brunauer-Emmett-Teller)表面積測定技術などで分析でき、炭素-水素-窒素含量は当業者に良く知られた燃焼法で測定することができる。
【００３９】
シリカフィルター媒体の表面処理に有用なシランとしては、いかなるタイプの有機シランであってもよく、イオン型非イオン型いずれでもよい。好適なシランは一般式(Ｒ１)xSi(Ｒ２)３-xＲ３  で示される：
［式中、Ｒ１は典型的にはシリカフィルター媒体表面上の活性基と反応する加水分解性部分(例えば、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、またはアシルアミノ、アルキルエステル、もしくはアリールエステル)であり、好ましい加水分解性部分はアルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシ基である；
１＜X ＜３、１より多いシロキサン結合はフィルター粒子とシランの間に形成される；
Ｒ２は処理工程においてフィルター表面と反応しない炭素含有部分であり、例えば、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルキルシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリルである、
Ｒ３は表面の反応が終了した後にシリコン原子に化学的に結合して残る有機部分であり、好ましくはろ過課程において目的成分と相互作用しうるものである；例えばＲ３は水素、アルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、アリールアルカリル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルエステル、アリールエステル、カルボキシ、スルホネート、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、エポキシ、ホスホネート、イソチオウロニウム、チオウロニウム、アルキルアミノ、４級アンモニウム、トリアルキルアンノミウム、アルキルエポキシ、アルキル尿素、アルキルイミダゾール、またはアルキルイソチオウロニウムであってよい；
ここで、前記アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、および複素環基上の水素はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、またはシアノと置換されていてもよい。
【００４０】
１以上のシランがヒドロキシル基を有する多孔性シリカフィルター媒体の表面に共有結合することができる。シリカフィルター媒体の表面積によりシランの結合量が決まる。
【００４１】
本発明においてシリカを処理するのに有用なシランは好ましくは下記アルコキシ、４級アンモニウム、アリール、エポキシ、アミノ、尿素、メタクリレート、イミダゾール、カルボキシ、カルボニル、イソシアノ、イソチオリウム、エーテル、ホスホネート、スルホネート、ウレタン、ウレイド、スルフヒドリル、カルボキシレート、およびイオン性からなる群から選択される部分を有するものである。アルコキシ部分を有するシランとしてはモノ-、ジ-、またはトリアルコキシシランが例示される。
【００４２】
４級アンモニウム部分を有するシランとしては３−(トリメトキシシリル)プロピルオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、または３−(Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ)−プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドが例示される。アリール部分を有するシランとしては３−(トリメトキシシリル)−２−(ｐ，ｍ−クロロおよびメチル)−フェニルエタン、２−ヒドロキシ−４−(３−トリエトキシシリルプロポキシ)−ジフェニルケトン、((クロロメチル)フェニルエチル)トリメトキシシランおよびフェニルジメチルエトキシシランが例示される。エポキシ部分を有するシランとしては３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランおよび２−(３，４−エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシランが例示される。アミノ部分を有するシランとしては３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−(２−アミノエチル)−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン、２−(トリメトキシシリルエチル)ピリジン、Ｎ−(３−トリメトキシシリルプロピル)ピロール、トリメトキシシリルプロピルポリエチレンイミン、およびビス(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランが例示される。
【００４３】
尿素部分を有するシランとしてはＮ−(トリエトキシシリルプロピル)ウレアおよびＮ−１−フェニルエチル−Ｎ’−トリエトキシシリルプロピルウレアが例示される。メタクリレート部分を有するシランとしては３−(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートが例示される。スルフヒドリル部分を有するシランとしては３−メルカプトプロピルトリエトキシシランが例示される。イミダゾール部分を有するシランとしてはＮ−［３−(トリエトキシシリル)プロピル］イミダゾールおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−４，５−ジヒドロイミダゾールが例示される。イオン性シランとしては３−(トリメトキシシリル)プロピル−エチレンジアミントリ酢酸トリナトリウム塩；  トリメトキシシリルプロピル−エチレンジアミン、トリ酢酸トリナトリウム塩および３−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルリン酸ナトリウム塩が例示される。カルボニル部分を有するシランとしては３−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物が例示される。イソシアノ部分を有するシランとしてはトリス−(３−トリメトキシシリルプロピル)イソシアヌレートおよび３−イソシアナ−トプロピルトリエトキシシランが例示される。エーテル部分を有するシランとしてはビス［(３−メチルジメトキシシリル)プロピル］−ポリプロピレンオキシドが例示される。
【００４４】
スルホネート部分を有するシランとしては２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランが例示される。イソチオウロニウム部分を有するシランとしてはトリメトキシシリルプロピルイソチオウロニウムクロライド。アミド部分を有するシランとしてはａｒｅ  トリエトキシシリルプロピルエチル−カルバメート、Ｎ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド、およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−４−ヒドロキシブチルアミドが例示される。ウレタン部分を有するシランとしてはＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタンおよびＯ−(プロパルギルオキシ)−Ｎ−(トリエトキシシリルプロピル)ウレタンが例示される。
【００４５】
シリカフィルター媒体さらに１以上のシランにて処理してもよく、例えば３−アミノプロピルトリメトキシシランとＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸、ナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび(３−グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン；３−トリヒドロシリルプロピルメチルリン酸、ナトリウム塩およびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシラン；３−(Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ)−プロピルトリメトキシシランハイドロクロライドおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(トリメトキシシリルエチル)ピリジンおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよびＮ−(３−トリエトキシシリルプロピル)−グルコンアミド；Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｃｌ、トリメチルアンモニウムクロリドおよび２−ヒドロキシ−４−(３−トリエトキシシリルプロポキシ)−ジフェニルケトン；３−メルカプトプロピルトリエトキシシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；３−(トリエトキシシリル)プロピルコハク酸無水物およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；トリメトキシシリルプロピル−エチレンジアミン、トリ酢酸、トリナトリウム塩およびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびＮ−(トリエトキシシリルプロピル)−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン；および２−(４−クロロスルホニルフェニル)−エチルトリクロロシランおよびビス−(２−ヒドロキシエチル)−３−アミノイソプロピルトリエトキシシランのような組合せにより処理してもよい。
【００４６】
シラン処理シリカフィルター媒体は一般式
【化１】
2008505742.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびｘはシリコン(Ｓｉ)に直接結合する基が４以下である限り、上記と同意；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８は独立して水素、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、エーテル、エステルまたはアリールアルカリル；
Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９は置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル基であって、２つの共有結合を形成できる基である。］
【００４７】
シリカフィルター媒体表面のシラノール基は下記一般反応式に沿って処理される：
【化２】
2008505742.tif 000004
【００４８】
［式中、粒子−ＯＨは表面に活性部位を有するフィルター粒子である。Ｒ１は例えばメトキシ(ＣＨ３Ｏ−)またはエトキシ(ＣＨ３ＣＨ２Ｏ−)などの不安定なシランの脱離基であって、粒子表面のヒドロキシ基、または表面に結合していない他の加水分解されたシラン分子の反応性基と相互作用する。１＜ｘ＜３；ｎは反応したＲ１基の数、およびｎ＜ｘ］
【００４９】
過剰量の反応性シランを長時間無水条件下で反応させると、多孔性物質の総活性部位の２５％から５０％のみの反応という結果となる、というのは、さらなる反応は固定化された残基間の立体障害により阻まれ、さらに奥深く埋め込まれた粒子−ＯＨ基へのアクセスもまた阻まれているからである。本発明の目的のため、かかる立体的事情より用いることができる部位を「飽和範囲」と名付けるが、この「飽和範囲」は特定の残基の立体的な要求によって決まる。この飽和範囲の名は１以上の不安定な脱離基を有する反応性シランにつけられるものである。無水条件下では、かかるシランはモノレイヤーを形成し不定飽和度の複数層を形成することはない。しかしながら、水性条件下においては、複数層が多官能シランを有する表面上に形成される。
【００５０】
シリカフィルター媒体表面のシラン処理は本質的に「ウエット」あるいは本質的に「ドライ」な工程のいずれで行ってもよい。本質的にウエットな工程においては溶媒(有機溶媒または水))中のシリカフィルター媒体表面上へシラン基を、所望により加熱して反応させる。加熱または溶媒の添加は反応に不要である。しかしながら、加熱または溶媒により反応速度が改善され、均一な表面被覆が達成される。本質的にドライな工程はシリカフィルター媒体上へシラン基を蒸気相または高度に攪拌した液体相中で、シランとシリカフィルター媒体を直接混合し、次に加熱することによって反応させる。
【００５１】
シリカフィルター媒体をシランで処理する好ましい方法は、反応させるシランを徐々に、直接多孔性シリカフィルター媒体に接触している溶媒を激しく攪拌しているところへ添加するというものである。他の好適な方法は、処理を蒸気相で行うこと、即ち反応性シランの上記がシリカフェイルター媒体へ接触および反応するようにすることである。例えば、多孔性物質を吸引反応槽に置き、吸引下で乾燥する。すばやく反応するシランを次いで、該吸引槽へ蒸気として投入し、該多孔性物質に接触させる；一定の接触時間の後、反応の副生成物を減圧下で除去する。次いで吸引を解消し、多孔性物質を反応槽より取り出す。
【００５２】
実際の処理工程は１分から２４時間の間に行われる。一般に、本発明の目的のためには処理を約３０分から６時間かけて行い、フィルター補助材の表面の均一な処理を確実とすることが好ましい。処理は０〜４００℃の温度範囲で行うことが好ましい。好ましい処理温度は室温(２２〜２８℃)から２００°範囲内の温度である。
【００５３】
本発明で用いられる反応させるシランの量は表面の反応させようとするヒドロキシル基の数およびシランの分子量によって決まる。典型的には、副反応の可能性を見越して利用可能な表面のヒドロキシル基の化学量論の当量プラス多少の過剰量の反応性シランを表面ヒドロキシル基の処理に用いる。より厚く外側表面処理を行うことが望ましい場合には、さらなる反応性シランを用いればよい。典型的には０から１０(好適)、０から２０、または１to ５０倍過剰量の反応性シランが用いられる。しかしながら、１から５００倍過剰を用いることもあり得、この場合には粒子上のより多い処理となる。
【００５４】
加水分解性基を有するシランは粒子-OH基と縮合してこれらの基材の有機基と共有結合を形成する。例えばシランのアルコキシ基は粒子表面上の粒子-OH基と反応する。表面-シラン相互作用は速くそして効率的である。例えば４級アンモニウム部分を有するシランが用いられる場合、プロトン化された正荷電シランは静電力により粒子の脱プロトン化された基に効率よく引きつけられ、速くそして効率の良い反応を達成する。
シラン反応シリカフィルター媒体は好ましくは目的とする成分と反応する官能性部分を有している。官能性部分としては４級アンモニウム、エポキシ、アミノ、尿素、メタクリレート、イミダゾール、スルホネートおよびその他の生物分子と反応することが知られている基が例示される。さらに該官能性部分はさらに良く知られた方法によってさらなる新しい官能基を生成して他の相互作用を起こすべく、反応されていてもよい。４級アンモニウムまたはスルホネート基を官能基として有するシラン反応粒子フィルター媒体を得るための一般的な反応式を下記に示す。
【００５５】
４級アンモニウム基を有するシラン反応粒子フィルター媒体は１段階で調製することができる。所望により、２段階または３段階の工程を採用してもよい。例えば、２段階方法の第１段階で粒子表面をアミノ-官能基を有するシラン、(Ｒ１)xSi(Ｒ２)３-XＲ４N(Ｒ５)２、と反応させる。これは以前に記述した方法にて行う。次のステップで二級アミンはグリシジルトリメチルアンモニウムクロリドのエポキシド基と容易に反応する。(スキーム１参照)
スキーム１  ４級アンモニウム官能性フィルターエイドの合成
【００５６】
【化３】
2008505742.tif 000005
【００５７】
スルホネート官能基を有するシラン反応シリカフィルター媒体も２段階で調製することができる。第一段階では粒子表面を先に説明した方法にてエポキシ−官能基を有するシランと反応させる。次の段階では、エポキシ官能基は容易に重硫酸ナトリウムと反応してスルホネート−官能基を有するシリカフィルター媒体が得られる。(スキーム２参照)。メタ重亜硫酸ナトリウム(Ｎａ２Ｓ２Ｏ５)は水で分解して重硫酸ナトリウム(ＮａＨＳＯ３)となる。
スキーム1  スルホネート−官能性シリカフィルター媒体の合成
【化４】
2008505742.tif 000006
【００５８】
シランで処理された粒子は分離工程において可溶性物質を静電、および／または疎水性、および／または親水性相互作用機能によって捕捉する一方、粒子を除去する。処理されたシリカフィルター媒体の利点はこの分離工程を、ろ過と固相抽出を単一ステップにまとめることによって、手続きを単純化したことにある。望ましい処理されたシリカフィルター媒体の質は、非処理シリカフィルター媒体と比して同等または改善された流速(ろ過性能)を示し、１回の操作で収着により可溶性物質を捕捉することが可能なものである。
【００５９】
本発明の１の実施形態においては、シリカ粒子の表面に特別な荷電基を共有結合させ、これによって静電力によって物質を捕捉する。反対の電荷を有する物資が多孔性処理表面上に結合する。静電力による引力に加えて、疎水性または親水性相互作用により疎水性または親水性リガンドを、結合および／または放出性能を改善するために配してもよい。
【００６０】
処理されたシリカフィルター媒体の性質は、表面積、孔体積および孔のサイズを当業者に公知の方法、例えば、マイクロメトリクス(登録商標Micrometrics)アナライザーを用いる方法にて解析される。例えば、表面積はBET 法にて特徴付けられる。孔の体積および孔の直径はバレット―ジョイナー―ヘレンダ(BarrettJoynerHalenda)分析にて実施可能である。特定の官能基および分子構造はNMＲ分光分析によって決定される。炭素-水素-窒素含量は燃焼法にて決定される；この分析情報から粒子表面の処理レベルを計算することができる。
【００６１】
例えば発酵培養物などのサンプルをシランで処理されたシリカフィルター媒体へ前ろ過処理ナシで適用することができる。１の実施形態において、サンプルは処理されたシリカフィルター媒体と共に何らかの機械的混合手段(例えば、攪拌、かきまぜ、ボルテックスなど)により、成分が処理されたシリカフィルター媒体へ結合するのに十分な時間、混合される。当業者であれば結合のための好適な時間は媒体の孔の特性、標的分子または成分のサイズ、粘度およびその他の大用量輸送制限事項によって決定されることを理解するであろう。一般に、結合が生じるための時間は数分から数時間であるが、結合は１−３日間まで継続し得る。混合物を次いでろ過ユニットを用いてろ過する。他の実施形態においては、サンプルはシランで処理されたシリカフィルター媒体を含有するろ過ユニットを用いて、サンプルとフィルター媒体を先に混合することなく処理することができる。  処理されたシリカフィルター媒体は粒子状物質を捕捉し、特定の可溶性成分を結合する一方で、結合しない可溶性成分は流れ去らせる。結合した成分は溶離溶液をろ過ユニットへ流して溶離させられ、溶離液の流れの中に回収される。有用な溶離液は塩溶液、高  ｐＨ(塩基性)溶液、低ｐＨ(酸性)溶液、カオトロピック塩およびその他の試薬が例示される。または一般的な有機溶媒またはその混合物を、回収される目的とする成分に悪影響を生じない限り、用いても良い。適当な高濃度塩溶液は  ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ等を含む。適当なカオトロピック塩は過塩素酸ナトリウム、グアニジンハイドロクロライド、グアニジンイソチオシアナート、ヨウ化カリウムなどを含む。その他の剤には尿素および合成洗剤が含まれる。対象によっては上記成分の組合せをもちいてもよい。または、溶離溶液を用いてシリカフィルター媒体表面(粒子成分と結合分子を含む)を何らかの機械的混合手段によって、結合成分が放出されるだけの十分な時間再懸濁し、次いでろ過する方法が例示される。
【００６２】
本発明の１の適用態様としてはシラン処理シリカフィルター媒体を微生物を所望の製品より除去するための適用が挙げられる。微生物汚染は醸造所、ワイナリー、ジュースの飲料工業、乳製品、工業用酵素および医薬製造において共通した問題である。出願人は本発明のシラン処理シリカフィルター媒体が抗微生物活性を有することを見いだした。細菌をこのシラン処理シリカフィルター媒体へ接触させることによって、総生細菌カウントが有意に減少する。微生物はまたシラン処理シリカフィルター媒体に捕捉される。即ち、ろ過ステップにより製品よりさらに微生物汚染を除去することが可能なのである。
【００６３】
本発明はシランで処理されたシリカフィルター媒体であって、下記一般式：
【化５】
2008505742.tif 000007
［式中、Ｒ１はアルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、アミノアシル、またはアシルアミノ、アルキルエステル、またはアリールエステル；
Ｒ２は独立して置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル；
Ｒ３は水素、アルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、アリールａｋアリール、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、アミノ、アルキルエステル、アリールエステル、カルボキシ、スルホネート、シアノ、アミノアシル、アシルアミノ、エポキシ、ホスホネート、イソチオウロニウム、チオウロニウム、アルキルアミノ、４級アンモニウム、トリアルキルアンノミウム、アルキルエポキシ、アルキル尿素、アルキルイミダゾール、またはアルキルイソチオウロニウム；(ここで前記アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、および複素環上の水素は任意にハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、またはシアノで置換されていてもよい)；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は独立して水素、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル；
Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９は置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルカリル、アルキルシクロアルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルカリル、シクロアルケニルアリール、アルクシクロアルカリル、アルクシクロアルケニルアリール、またはアリールアルカリル基であって、２つの共有結合を形成可能な基である；
(ここで前記シリカフィルターはもみ殻灰またはカラスムギ殻灰である)］
からなる群から選択される式で示されるものを提供する。
【００６４】
本発明に用いられるシラン反応シリカフィルター媒体は好ましくは目的とする成分と反応可能な官能性部分を有している。この官能性部分は４級アンモニウム、エポキシ、アミノ、尿素、メタクリレート、イミダゾール、スルホネート、および生物学的分子と反応することが知られている他の有機部分からなる群から選択される。
【００６５】
下記実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は単に本発明の説明のために用いられることを意図しており、制限的解釈に用いられるべきではない。実施例１から５はシリカフィルター媒体の表面処理を示す。実施例６-１４はシラン処理シリカフィルター媒体を１または複数の目的成分を粒子および可溶性物質を含有するサンプルから分離するのに用いるものである。実施例１５-２２はシラン処理シリカフィルター媒体の殺菌活性およびろ過の結果を示す。
【００６６】
実施例１
バッチ工程における、トリアルコキシシランを用いたもみ殻灰媒体(ｔＲＨＡ)の処理
【００６７】
処理はテフロン（登録商標）シャフトの機械式かくはん器、温度計、温度計を備えた２リットル容三首の丸底反応フラスコおよびフラスコ周囲の加熱マントルを有する器具を用いて行った。反応フラスコに挽いていないＲHA シリカフィルター媒体(表面積：〜３０m２/g)５０g、および２５０mlのIPA(イソプロピルアルコール)／トルエン(１：２)の溶媒混合物を投入した。IPAは必ずしも必要であるわけではなく、反応は水のみで行っても良い。表１に各実施例の反応条件を示した。混合物は数分間、室温で攪拌し、次いで正確な量のシランを直接混合物にゆっくりした投入速度で添加する一方、混合作業を続けることを含む表面改質工程を行った。計算上シランが複数層カバー(高レベル処理)を達成するのに必要な２５０%、または計算上シランが単層カバー(低レベル処理)を達成するのに必要な８５％を正確に添加した。シランの量はその純度によって補正した。投入した濃度を表１に示す。次に、主に安全のために用いられ、生成物に他の影響を及ぼさないＮ２ブランケット下で混合物を加熱および還流した。なお、加熱は特に必要はない。２時間攪拌および還流した後、処理したスラリー状の混合物を放置して冷却させた。次いでワットマン濾紙を敷いた磁器製のブフナー漏斗へ写し、真空フィルターフラッシュにつなげた。処理されたフィルタースラリーをろ過し１５０mlのトルエンで二回および約１５０mlのIPAで二回洗浄した。その後、サンプルをフード内で約２４時間乾燥した。処理したフィルター媒体をパイレックス（登録商標）容器へ移し、シリンジ針でいくつも穴を空けたパラフィンフィルムで覆った。次いで、サンプルを真空オーブン内で６０℃にて２-４時間乾燥した。乾燥したサンプルの表面積、孔の構造および炭素-水素-窒素含量を調べた。
【００６８】
表1：処理用組成物および条件のまとめ
【表１Ａ】
2008505742.tif 000008
【表１Ｂ】
2008505742.tif 000009
【００６９】
実施例２
別のタイプの処理ずみシリカフィルター媒体の調製
【００７０】
さらなる基材として特に、高炭素もみ殻灰、複数種類の超純度珪藻土(Celpure P１０００、Celpure P６５)、Celite ５４５(標準的珪藻土フィルターエイド)、パーライト、およびLＲA II(非-シリカベースの脂質吸収剤)を用いた。表２にこれらのサンプルの処理条件および組成を示す。
【００７１】
種々の基材の処理条件及び組成
【表２】
2008505742.tif 000010
【００７２】
Z-６０３２：３-(N-スチリルメチル-２-アミノエチルアミノ)-プロピルトリメトキシシランハイドロクロライド
AEAPTMS：N-(２-アミノエチル)-３-アミノプロピルトリメトキシシラン
【００７３】
実施例３
親水性４級アンモニウム官能性フィルターエイド(フィルター媒体サンプル４０および４２)製造のための二段階法
【００７４】
処理はテフロン（登録商標）シャフトの機械式かくはん器、温度計、温度計を備えた２リットルの三首丸底反応フラスコおよびフラスコ周囲の加熱マントルを有する器具を用いて行った。反応フラスコへ５０gのアミノ-官能性基を有する前処理ＲHA(サンプル１７または１９)シリカフィルター媒体、および２００ml IPA溶媒を投入した。混合物を数分間室温で攪拌し、次いで表面処理工程正確な量のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド(２.４６g サンプル１７、または２.０２g サンプル１９)を直接混合物へ混合物にゆっくりした投入速度で添加する一方、混合作業を続けることを含む表面改質工程を行った。N２ブランケット下で反応混合物を加熱および還流した。４時間攪拌および還流した後、処理したスラリー状の混合物を放置して冷却させた。次いでWhatman濾紙を敷いた磁器製のブフナー漏斗へ写し、真空フィルターフフラスコにつなげた。処理されたフィルターケーキをろ過し、それぞれ約１５０ｍｌのD１水で４回洗浄した。その後、サンプルをフード内で約２４時間乾燥した。次いで処理したシリカフィルター媒体をパイレックス（登録商標）容器へ移し、シリンジ針でいくつも穴を空けたパラフィンフィルムで覆った。次いで、サンプルを真空オーブン内で６０℃にて２-４時間乾燥した。乾燥したサンプルの表面積、孔の構造、炭素-水素-窒素含量および２９Si NMＲを調べた。
【００７５】
実施例４
親水性スルホネート-官能性フィルターエイド(フィルター媒体サンプル４１)
製造のための二段階法
【００７６】
処理はテフロン（登録商標）シャフトの機械式かくはん器、温度計、温度計を備えた５００ミリリットルの三首丸底反応フラスコおよびフラスコ周囲の加熱マントルを有する器具を用いて行った。反応フラスコへ５０gのエポキシ-官能性基を有する前処理ＲHA(サンプル１５)シリカフィルター媒体、および２００ml のIPA：H２O(５：１)溶媒を投入した。混合物を数分間室温で攪拌し、次いでN２ブランケット下で７０℃まで加熱した。０.５５g のメタ重亜硫酸ナトリウム、０.０７の亜硫酸ナトリウム触媒、および５gの水を添加漏斗より混合物へゆっくりした速度で１-２時間かけて添加する一方で混合作業を続けることを含む表面改質工程を行った。温度をその後およそ８０℃まで加熱し、反応が完了するまで維持した。反応は残存するNaHSO３のヨウ素還元滴定にて行った。おおよそ２２時間攪拌および還流した後、処理したスラリー混合物を放置して冷却させた。次いでWhatman濾紙を敷いた磁器製のブフナー漏斗へ写し、真空フィルターフフラスコにつなげた。処理されたフィルターケーキをろ過し、それぞれ約１５０ｍｌのD１水で４回洗浄した。その後、サンプルをフード内で約２４時間乾燥した。次いで処理したシリカフィルターエイドをパイレックス（登録商標）（登録商標）容器へ移し、シリンジ針でいくつも穴を空けたパラフィンフィルムで覆った。次いで、サンプルを真空オーブン内で６０℃にて２-４時間乾燥した。乾燥したサンプルの表面積、孔の構造、炭素-水素-窒素含量および２９Si NMＲを調べた。表３に２段階法の組成および条件をまとめた。
２段階法の処理条件および組成
【００７７】
【表３】
2008505742.tif 000011
【００７８】
.  処理されたシリカフィルター媒体の解析：BET 表面積、孔体積および孔直径
表面積および多孔度はマイクロメトリクス(Micrometrics、登録商標)ASAP ２０１０アナライザーを用いて行った。分析の前にサンプルを吸引下、１５０℃で圧力が一定になるまで脱気した。分析工程において、N２ガスを７７°Kにてサンプルに吸着させ表面積を吸着したガスの体積から計算した。BETパラメーターはBET等式をASAP-２０１０ソフトウエアを用いて積分して求めた。表面積は０.０５＜P/Po ＜０.３の範囲で等温線の吸着ブランチより計算した。BarrettJoynerHalenda 分析を用いて孔体積および孔直径を計算した。
NMＲ
特定の官能基および分子構造の同定は２９Si 固体NMＲ分光分析をUnity Plus ４００MHz 分光分析機でバリアンVT CPMASプローブおよび７mmのモーターを用いて行った。
炭素-水素-窒素(CHN)
CHN含量はロバートソン・マイクロライト・ラボラトリーズによて燃焼分析法を用いて測定した。この分析で得られる情報から、表面上の処理レベルを計算した。
【００７９】
炭素-水素-窒素(CHN)
CHN含量はロバートソン・マイクロライト・ラボラトリーズによて燃焼分析法を用いて測定した。この分析で得られる情報から、表面上の処理レベルを計算した。
【００８０】
表４：処理されたシリカサンプルの分析結果
【表４】
2008505742.tif 000012
【００８１】
実施例５
シリカフィルターの組成および各種処理条件並びにその特徴分析
表５A-５D はもみ殻灰の各種処理条件および組成、並びにその特性を示す。
表５A-５D はもみ殻灰の各種処理条件および組成、並びにその特性を示す。
【００８２】
【表５Ａ−１】
2008505742.tif 000013
【表５Ａ−２】
2008505742.tif 000014
【００８３】
【表５Ｂ】
2008505742.tif 000015
【００８４】
【表５Ｃ−１】
2008505742.tif 000016
【表５Ｃ−２】
2008505742.tif 000017
【表５Ｃ−３】
2008505742.tif 000018
【００８５】
リガンド密度は元来のもみ殻灰上の炭素により０.４３%Cの補正をした。混合シランサンプルリガンド密度は最初のシランに基づく。
【００８６】
実施例６
タンパク質結合および放出のための表面処理もみ殻灰
目的
表面処理もみ殻灰(ＲHA)を用いてタンパク質の結合および放出を試験する。タンパク質溶液は粒子状物質を含まない、Micrococcus luteus 発酵物より誘導されたものである。
表６にフィルター媒体サンプルおよびその表面処理をまとめた。
【００８７】
【表６】
2008505742.tif 000019
【００８８】
手順：
１．  各サンプルを２ｇ秤量して５０ｍＬの円錐管へ投入した。
２．  ２５mL の２５mM トリス-HCL、pH ８.４バッファーを添加した。
３．  サンプルおよびバッファーを一晩反転させながら混合した。
４．  各ぬらしたサンプルを１５mL の円錐チューブへ移し、次いで２５００g にて５分間遠心分離し、上清をデカンテーションした。得られたサンプルを以下の結合試験に供した。
５．  タンパク質試験溶液の説明および手順：
ソース：下記工程により回収されたMicrococcus luteus 粒子成分フリー濃縮培地：
・発酵培養物を２００ppm のリゾチーム(ニワトリ卵白由来)を用いて溶菌した。
・溶菌培養物をポリカチオン性ポリマーを用いて凝集させ、およびろ過して粒子成分を除去した。
・粒子成分を含有する培養物は限外ろ過により水を除いて濃縮した(Prep/Scale（登録商標）TFF、Millipore)。
【００８９】
６．  上記溶液を２４部の２５mM トリス-HCl pH ８.４バッファーで調製した。
７．  ５mLのタンパク質試験溶液を表面処理もみ殻灰を含有する各チューブへ添加した。
８．  チューブを９０分間反転させて混合した。
９．  混合したチューブを２５００gにて５分間遠心し、上清をデカンテーションした。回収されたフラクションを「濾液」または「ＦＴ」とした。
１０．  ５ｍＬの２５mM トリス-HCl pH ８.４バッファーを各チューブへ添加し、４５分間反転により混合した。
１１．  チューブを２５００g で５分間遠心し、上清をデカンテーションした。回収されたフラクションを「洗浄」とした。
１２．  ５mLの溶離バッファー(２５mM トリス-HCl pH ８.４、２M NaCl含有)を添加し、３０分間混合した。
１３．  ０.５ｍＬの０.５M NaOH を各チューブへ添加した。
１４．  チューブを９０分間反転させて混合した。
１５．  チューブを２５００gにて５分間遠心し、上清をデカンテーションした。回収されたフラクションを「溶離物」とした。
１６．  全フラクションをSDS-PAGEゲル電気泳動(NuPAGE 電気泳動システム、米国特許第５,５７８,１８０、NOVEX electrophoresis GmbH、Germany の手順)にかけた。
【００９０】
観察結果：
図１A(未決号成分の結合および分析)
未結合サンプルが濾液および溶離物の分析により検出されたことは、全てのまたは一部の結合サンプルが溶離プロセスにおいて遊離されることを示す。
【００９１】
FW１２(市販の珪藻土)はフィードしたもの由来ののいずれのタンパク質をも結合しなかった(レーン番号３対レーン番号２)。試験サンプルを事前に濡らすために用いた溶液による希釈により、全てのバンドはほんの少し低い強度となっている。
【００９２】
未処理ＲHAは選択的に６ｋｄ以上で１４.４kd未満のタンパク質を結合する(レーン番号４対レーン番号２)。試験サンプルを事前に濡らすために用いた溶液による希釈により、全てのバンドはほんの少し低い強度となっている。
【００９３】
HQ５０(市販４級アミンイオン交換樹脂)は１４.４kds以下のものを除いて試験溶液からのタンパク質のほとんどを結合する(レーン番号５対レーン番号２)。
処理ＲHAサンプル４は選択的に９７kd 近傍およびそれ以上のもの５５.４と３６.５kdの間、２１kd近傍および１４.４kd近傍のタンパク質を結合する。HQ５０の場合と同様１４.４kd未満のバンドが結合されなかったのは注目すべきである。全てのタンパク質のバンド強度は未処理もみ殻灰およびFW１２と比して低いものであり、処理ＲHAの結合がより多いことを示す。
【００９４】
処理ＲＨＡサンプル６はサンプル４と同様のタンパク質結合選択性を示したが、より低い結合能しかなかった。HQ５０の場合と同様、１４.４kd未満のバンドは捕捉されなかったことは注目に値する。全てのタンパク質のバンド強度は未処理もみ殻灰およびFW１２と比して低いものであった。
【００９５】
図１B(結合成分の放出および分析)
FW１２溶離物は痕跡量のタンパク質であって、物理的にトラップされ、持ち越された液体由来のものであると考えられる(レーン番号２)。
【００９６】
未処理ＲHA に結合していた１４.４ｋｄ未満で６kd以上のタンパク質のバンドが放出された(レーン番号３)。
HQ５０に捕捉されていた全てのタンパク質が放出された(レーン番号４)。
サンプル４からの溶離物は１１６kd以上、５５Kd近傍およびそれ以下および６kd近傍のタンパク質バンドであった。３６.５kd以上のバンドは明らかに結合したままである(レーン番号５)。
【００９７】
サンプル６からの溶離物には主に１１６kd以上および５５kd近傍のバンドであった。他の成分は結合しているままであるかまたは小さすぎてこの分析では検出できないものである(レーン番号６)。
【００９８】
未処理珪藻土はタンパク質-結合能を示さなかった。未処理もみ殻灰は幾ばくかのタンパク質結合能を示した。２種類の処理されたもみ殻灰、サンプル４および６はタンパク質-結合能を示した。
【００９９】
実施例７
タンパク質結合および放出のための表面処理もみ殻灰
目的：
さらなる表面処理もみ殻灰を用いてタンパク質の結合および放出を試験する。タンパク質溶液は粒子状物質を含まない、Micrococcus luteus 発酵物より誘導されたものである。
【０１００】
表７にフィルター媒体サンプルおよびその表面処理をまとめた。
【表７】
2008505742.tif 000020
【０１０１】
手順：
実施例６と同じ。
【０１０２】
観察結果：
サンプル７タンパク質結合および放出(図２A)
２１.５kd近傍を除き、５５kd以下の全てのＭＷのバンドを選択的に結合した(レーン２対レーン３)。
洗浄は濾液と類似のプロファイルを示した。
溶離物は５５kd近傍の非常に軽いバンドを有するが、あまり多くのバンドを有していない。他のバンドは明らかに強く結合し、用いた条件では溶離しなかった。
【０１０３】
サンプル８タンパク質の結合および放出(図２A)
上記サンプル７と同様の結果。７.
【０１０４】
サンプル９タンパク質の結合および放出(図２B)
１４kd未満のものを除きほとんど全てのタンパク質を結合した(レーン１対レーン２)。
洗浄フラクションにはタンパク質バンドが検出できなかった。
溶離物フラクションのほとんどが５５kd近傍のバンドであり、他のバンドは結合したままである。これは、５５kd近傍のバンドの選択的放出を示し、バンド強度に基づくタンパク質純度は>９０+%であった。
【０１０５】
サンプル１０タンパク質の結合および放出(図２B)
上記サンプル９と同様の結果。
サンプル１１タンパク質の結合および放出(図２C)
いくつかの低分子量バンドを除きほとんど全てのバンドを結合した。これは選択的なタンパク質の結合を示す。(レーン１対レーン３)洗浄フラクションにはタンパク質バンドは検出されなかった。
【０１０６】
用いた条件下でほとんどの結合したバンドが溶離された(レーン５)。
明らかに他の表面処理もみ殻灰に比して強い結合能を有する。
サンプル１２タンパク質の結合および放出(図２C)
上記サンプル９と同様の結果。
【０１０７】
結論
ユニークなタンパク質の結合および放出が表面処理もみ殻灰で認められた。選択的結合が観察された(サンプル７およびサンプル８)。選択的放出(サンプル９およびサンプル１０)によりタンパク質純度が>９０%のフラクションが得られた。
【０１０８】
実施例８
タンパク質の結合および放出のための表面処理もみ殻灰
目的
さらなる表面処理もみ殻灰を用いてタンパク質の結合および放出の試験を行う。本試験のデザインはイオン交換をベースとする。タンパク質溶液は粒子状物質を含まない、Micrococcus luteus 発酵物より誘導されたものである。
表８にフィルター媒体サンプルおよびその表面処理をまとめた。
【０１０９】
【表８】
2008505742.tif 000021
【０１１０】
手順：
１．  各表面処理もみ殻灰を２ｇ秤量して５０ｍＬの円錐管へ投入し、４０mLの平衡バッファー(２５mM トリス-HCl pH ８.４)を添加した。チューブを３０分間反転させて混合した。
２．  チューブを２５００xg で５分間遠心し、上清をデカンテーションした。
３．  タンパク質試験溶液源：粒子成分フリー濃縮培地は実施例１と同様の手順で調製し、次いで１０１０ppmのプロテアーゼにて消化した。
４．  上記溶液は２４部の２５mM トリス-HCl pH ８.４バッファーにて調節した。
５．  ２０ｍＬのタンパク質試験溶液各調製された表面処理もみ殻灰へ添加した。
６．  サンプルを反転させて３０分間混合した。
７．  サンプルを２５００xgで５分間遠心し、上清をデカンテーションした。回収されたフラクションを「濾液またはFT」とした。
８．  ２０ｍＬの２５mM トリス-HCl pH ８.４バッファーをサンプルへ添加し、反転により１５分間混合した。
９．  サンプルを２５００xgで５分間遠心し、上清をデカンテーションした。回収されたフラクションを「洗浄」とした。
１０．  ２０ｍＬの溶離バッファー(２５mM トリス-HCl pH ８.４、１M NaCl含有)を各サンプルへ添加し、およびサンプルを反転させて３０分間混合した。
１１．  サンプルを２５００xgで５分間遠心し、上清をデカンテーションした。回収されたフラクションを“溶離物＃１”とした。
１２．  ステップ９および１０を１０ｍＬの同じ溶離バッファー+５０mM NaOH.を用いて繰り返した。回収されたフラクションを“溶離物＃２”とした。
１３．  全ての全てのフラクションをSDS-PAGE電気泳動にて分析した。
【０１１１】
観察結果：
サンプル１４タンパク質の結合および放出(図３A)
・  濾液フラクションは比較的低いタンパク質バンド強度を示した、これはサンプル１４が比較的良い結合能を有することを意味する(レーン番号６対レーン番号１)。
・  １４.４kd 未満のバンドは濾液中に残り、選択的結合であることが示された。
・  結合タンパク質の一部は１M NaClで溶離された。
・  NaOH を１M NaClを含有するバッファーに添加し、結合タンパク質を溶離した。
【０１１２】
サンプル１３タンパク質の結合および放出(図３B)
・  全ての投入したタンパク質が結合した(レーン番号３対レーン番号２)。
・  少量の結合タンパク質のみが１M NaClにて溶離された(レーン番号５)、これは結合がイオン交換によって行われたのではないことを示唆する。
・  苛性成分を１M NaCl 溶離バッファーへ添加したところ、結合タンパク質が溶離できた。
・  挙動はサンプル１４と類似していた。
【０１１３】
サンプル１７タンパク質の結合および放出(図３C)
・  レーン番号７濾液フラクションに見られるように、比較的良好な結合を示した。
・  選択的に１４kd未満のタンパク質を結合しなかった。
・  溶離には高NaCl/NaOH 比が必要であった。
サンプル１８タンパク質の結合および放出(図３C)
・  レーン番号１濾液フラクションに示されるように、比較的良好な結合が得られた。
・  選択的に１４kd未満のタンパク質を結合しなかった。
・  溶離には高NaCl/NaOH 比が必要であった。
・  結果はサンプル１７と類似していた。
【０１１４】
サンプル１９タンパク質の結合および放出(図３D)
・  低いタンパク質を有するレーン番号７濾液フラクションに見られるように、比較的良好な結合を示した。
・  選択的に１４kd未満のタンパク質を結合しなかった。
・  ほとんどの結合タンパク質は１ＭNaClにて溶離された。
・  NaOHを１M NaCl 含有バッファーへ添加すると、さらに５５kd 近傍のバンドが溶離された。
【０１１５】
サンプル２０タンパク質の結合および放出(図３E)
・  レーン番号３濾液フラクションの低いタンパク質バンドから、比較的良好な結合であることが示される
・  洗浄操作において漏出が認められた(レーン番号４)。
・  選択的に１４kd未満のタンパク質を結合しなかった(レーン番号３)。
・  結合タンパク質は主に１ＭNaClにて溶離された(レーン番号５)。
・  結果はサンプル１９と類似していた。
【０１１６】
結論
上記の試験した表面処理もみ殻灰サンプルを、陰イオン交換に基づく結合および高塩濃度および／または高pHによる放出条件下で試験した場合に、３つの一般的な結合/放出挙動が観察された：
比較的良好な結合、溶離剤NaCl/NaOH：
サンプル１４(３-(N-スチリルメチル-２-アミノエチルアミノ)-プロピルトリメトキシシランハイドロクロライド処理)
サンプル１３(３-(N-スチリルメチル-２-アミノエチルアミノ)-プロピルトリメトキシシランハイドロクロライド処理)
サンプル１７(３-アミノプロピルトリメトキシシラン処理)
サンプル１８(３-アミノプロピルトリメトキシシラン処理)
比較的良好な結合、溶離剤NaCl：
サンプル１９(N-(２-アミノエチル)-３-アミノプロピルトリメトキシシラン処理)
サンプル２０(N-(２-アミノエチル)-３-アミノプロピルトリメトキシシラン処理)
結合／溶離試験は陰イオン交換挙動を調べるためにデザインしたものである。観察結果はＲＨＡ表面処理と関連した。
【０１１７】
サンプル１４およびサンプル１３の応答はイオン交換および疎水性の性質に沿ったものである。
サンプル１７およびサンプル１８についても種々の挙動を調べた。
サンプル１９およびサンプル２０は陰イオン交換性の作用を結合および溶離において示す。
【０１１８】
実施例９
タンパク質の結合および放出のための表面処理もみ殻灰(カチオン交換)
目的
表面処理もみ殻灰を用いてタンパク質の結合および放出を試験する。タンパク質溶液はAspergillus niger 発酵産物より得た粒子フリーの溶液である。
表９にサンプルの番号および表面処理についてまとめた。
【０１１９】
【表９】
2008505742.tif 000022
【０１２０】
手順：
１．  ２ｇの各表面処理もみ殻灰を５０mLの円錐管へ投入し、４０mLの平衡バッファー(１００mM 酢酸ナトリウム、pH ４.０)を添加した。チューブを３０分間反転させて混合した。
２．  チューブを２５００xgで５分間遠心し、上清をデカンテーションした。
３．  タンパク質試験溶液の説明および調製：
ａ．  ソース：Aspergillus niger 粒子フリーの濃縮培養液で、下記工程にて得たものである：
ｉ  培養液をろ過して細胞を除いた。
ｉｉ  細胞フリーの培養液を限外ろ過(脱水(Prep/Scale（登録商標）TFF、Millipore)して脱水した。
ｂ．  上記溶液を１４部の１００mM 酢酸ナトリウム、pH ４.０バッファーで調節した。
４．  ２０ｍＬのタンパク質試験溶液を各調製された表面処理もみ殻灰へ添加した。
５．  サンプルを反転させて７分間混合した。
６．  サンプルを２５００xgで５分間遠心し、上清をデカンテーションした。集めたフラクションを「濾液」または「FT」とする。.
７．  ２０ｍＬの１００mM 酢酸ナトリウムpH ４.０バッファーを各サンプルへ添加し、サンプルを１５分間反転しながら混合した。
８．  サンプルを２５００xgで５分間遠心し、上清をデカンテーションした。集められたフラクションを「洗浄＃１」と名付けた。
９．  ステップ７および８を繰り返し、集めたフラクションを“洗浄＃２”と名付けた。
１０．  ２０ｍＬの溶離バッファー(１００mM 酢酸ナトリウムpH ４.０buffer、１M NaCl含有)を添加し、サンプルを反転させて６０分間混合した。
１１．  サンプルを２５００g にて５分間遠心し、上清をデカンテーションした。集めたフラクションを「溶離物＃１」とした。
１２．  ステップ９および１０を１０ｍＬの同じ溶離バッファー+５０mM NaOHを用いて繰り返した。回収されたフラクションを“溶離物番号２”とした。
全てのフラクションをSDS-PAGE電気泳動にて分析した。
【０１２１】
観察結果：
サンプル４１タンパク質の結合および溶離(図４A)
・  選択的に９７kd近傍および３１kd未満のバンドを結合する。
・  「洗浄＃１および＃２」それぞれにはタンパク質バンド全く無いあるいは比較的低い強度のものしか認められなかった(レーン番号３およびレーン番号４それぞれ参照)。これは、結合が特異的で強かったことを意味する。
・  結合タンパク質は１M NaCl含有バッファーにて溶離した。
未処理ＲＨＡタンパク質の結合および溶離(図３A)
・  ９７kd近傍および３１kd未満のバンドは濾液中には存在しなかった。しかしながら、溶離物＃１または溶離物＃２のいずれにもタンパク質は溶離されなかった。
【０１２２】
多孔性ＨＳ５０：タンパク質の結合および溶離(図４B)
・選択的に９７kdおよび３１kd未満のバンドを結合した。
・  「洗浄＃１および＃２」それぞれにはタンパク質バンド全く無いあるいは比較的低い強度のものしか認められなかった(レーン番号３およびレーン番号４それぞれ参照)。これは、結合が特異的で強かったことを意味する。
・  結合タンパク質は１M NaCl含有バッファーにて溶離した。
【０１２３】
結論
表面処理もみ殻灰サンプル４１はポジティブコントロールと非常に良く似た結合および溶離性能を示した。
【０１２４】
実施例１０
タンパク質の結合および溶離のための表面処理されたシリカフィルター媒体(イオン交換)
目的：
表面処理シリカフィルター媒体を用いてタンパク質の結合および放出の試験を行う。本試験のデザインはイオン交換をベースとする。タンパク質溶液は粒子状物質を含まない、Micrococcus luteus 発酵物より誘導されたものである。
表１０にサンプル番号と表面処理をまとめた。
【０１２５】
【表１０】
2008505742.tif 000023
【０１２６】
手順：
サンプル２９、サンプル３０およびCelPure P１００は実施例８と同じ手順で行い、下記の変化をつけた：
タンパク質試験溶液は１００X(対２５X)に希釈した。
ステップ４および５を繰り返し、集めた洗浄フラクションを「洗浄＃２」とした。
【０１２７】
観察結果：
用いた試験条件下ではタンパク質試験溶液の量は過剰であった。その結果、全ての濾液フラクションはフィードした試験溶液と同様のタンパク質バンドパターンを示した。各試験したシリカフィルター媒体サンプルのタンパク質結合能の定性的な解析をする努力はしなかった。下記結果は溶離物フラクションのみのものである。
【０１２８】
サンプル４２(図５A)
ほとんどの結合タンパク質は１M NaClにて溶離された(レーン番号５)。
【０１２９】
サンプル４０(図５B)
ほとんどの結合タンパク質は１M NaClにて溶離された(レーン番号５)。
【０１３０】
サンプル３４(図５C)
有意な量のタンパク質は１M NaClでは溶離されなかった。
【０１３１】
その後高ｐＨを用いた場合に少量のタンパク質が溶離された。
【０１３２】
サンプル２９(図５D)
両方の溶離物フラクションにはタンパク質を含有しており、その組成は各フラクションで類似しているようである(レーン番号５は１M NaCl溶離物およびレーン番号６は高ｐＨ溶離物)。
【０１３３】
未処理AgriSilica ＲＨＡ(図５B)
溶離フラクションは特に１４.４kd未満のタンパク質を含有していた。
【０１３４】
Celite ５１２(図５C)
１Mで溶離して得た溶離物フラクションには９７kd近傍、５５kd近傍およびそれ未満および特に１４.４kdと６kdの間のバンド(レーン番号１０)が含まれていた。
【０１３５】
結論
サンプル４０および４２(表面処理もみ殻灰)およびサンプル２９および３４(表面処理珪藻土)は未処理の対象物と比較してより高いタンパク質-結合能を示す。
【０１３６】
実施例１１
動的タンパク質の結合および溶離のための表面処理もみ殻灰(イオン交換)
目的：
表面処理もみ殻灰サンプル９を用いて動的タンパク質の結合および溶離を試験する。本試験はイオン交換に基づきデザインされたものである。タンパク質溶液は粒子状物質を含まない、Micrococcus luteus 発酵物より誘導されたものである。
【０１３７】
手順：
１．  ６gのサンプル９を５０mL円錐管へ投入した。
２．  ５０mLの平衡バッファー(２５mM トリス-HCl pH ８.４)を添加し、サンプルを反転させて３０分間混合した。
３．  サンプルを２５００gで５分間遠心し、上清をデカンテーションした。
４．  ３０ｍＬの平衡バッファーを添加し、サンプルを反転させながら良く混合した。
５．  サンプルを重力流カラムへ注いだ。
６．  表面処理もみ殻灰を放置して落ち着かせ、１０mL容積にパックした。
７．  プレフィルターをパック層上へ載せた。
８．２０mlの平衡バッファーを添加した。
９．  ２５ｍＬのタンパク質試験溶液を添加した(実施例６と同じ方法で調製)。
１０．  濾液フラクションを１５mL円錐チューブに取った。
１１．  ３０ｍＬの平衡バッファーを添加し、「洗浄」フラクションを１５ｍｌの円錐管へ集めた。
１２．  下記工程を連続して行って、表１１に示した複数の溶離物の選択および回収をした：
ａ  ０.２M NaCl を含む平衡バッファーを添加した。
ｂ  ２M NaCl を含む平衡バッファーを添加した。
ｃ  ０.１M NaOH を添加した。
１３．  全てのフラクションをSDS-PAGE電気泳動にて分析した。
【０１３８】
観察結果：(図６)
・  適用した溶液は容量を超えたものであったので、顕著な急騰がFT フラクションに認められた(レーン３、４および５)
・  表面処理もみ殻灰サンプル９は良好な流動性を有していた。上記全てのステップを重力による流動にて容易に実施可能であった。
・  図６は１０mLをロードした場合に、フィードした溶液は１０mL のパックしたサンプル９を明らかに突破したことを示す。
・  試験した結合条件下において、サンプル９は明らかに選択的に９６kd近傍、５５kd近傍、５５kd未満の２つのバンド、および１４.４kdと６kdの近傍およびその間のバンドを選択的に結合した。
．  下記結果が３つの溶離ステップにて観察された：
＊３つのバンド(９７kd近傍、５５kd近傍、および１４.４kd未満)が０.２Mで溶離された。
＊２M NaClで、９７kd近傍および５５kd近傍のバンドが溶離された。
＊０.１M NaOHで、５５kd近傍、３１kd未満のバンドおよび１４.４kd近傍のタンパク質が溶離された。
表１１に結合試験で回収されたフラクションをまとめた。
【０１３９】
【表１１】
2008505742.tif 000024
【０１４０】
結論：
本実施例は表面処理もみ殻灰がタンパク質の結合および溶離のための重力流れのみで処理できるパック層クロマトグラフィーの態様で、およびフィルターエイドとして有用であることを示すものである。結合および溶離性質はバッチ態様と同じである。本実施例はまた、複数の溶離バッファーを採用することにより、選択的溶出が可能であることも示す。  
【０１４１】
実施例１２
同時に粒子を捕捉し、可溶性成分を捕捉／溶離するための表面処理もみ殻灰
目的：
同時に粒子状物質のろ過とタンパク質の結合および溶離を行う表面処理もみ殻灰の性質を調べる。表面処理もみ殻灰のサンプル番号はサンプル１９であり、イオン交換性能を有することを確認したものである(実施例８参照)。未処理もみ殻灰をまた、並べて試験した。
【０１４２】
バッファー
平衡バッファー：２５mM トリス-HCl、pH ８.４.
【０１４３】
溶離バッファー：２５mM トリス-HCl、１M NaCl、pH ８.４；１M NaOH；１M HCl
【０１４４】
試験溶液
凝集Micrococcus luteus 培養液を「フィード」といい、下記のとおり調製した：
・  収穫後、培養物を１００ppm リゾチーム(ニワトリ卵白)で溶菌した。
・  溶菌下培養物をポリカチオン性ポリマーにて凝集させた。
・  試験前に凝集させたサンプルを１部の平衡バッファーで希釈した。
【０１４５】
手順：
１．  表面処理もみ殻灰試料：
・  ５gの未処理ＲＨＡを５０ｍｌの円錐管２本にそれぞれ投入した。
・  ４０mL の平衡バッファーを添加し、円錐管を反転させながら３０分間混合した。
２．  未処理もみ殻灰のステップ番号１でチューブを２５００xgで５分間遠心し、上清をデカンテーションしした。
３．  ５０ｍＬの調製した試験溶液「フィード」を各調製したもみ殻灰へ添加した。
４．  チューブを３０分間室温にて反転させて混合した。
５．  １mLのサンプルを卓上型遠心分離器を用いて遠心分離し(４min)上清を集めた(「ベンチFT」とする)。
６．  ０.４５μmの２５０mL-Nalgenユニットをろ過のために調製した。
・  該ユニットを家庭用吸引装置のアウトレットにつないだ。
・  他のもみ殻灰を５０ｍＬの平衡バッファーへ懸濁した。
・  懸濁物をろ過ユニットへ注ぎ、家庭用吸引装置をかけてプレコート(ケーキ)を調製した。
・  ろ液溜めを空にした。
・  ろ液溜めを再度つないでろ過試験に備えた。
７．  ステップ４で得たタンパク質溶液もみ殻灰混合物を調製したろ過ユニットに投入し、ろ過を開始するために再度吸引をかけた。回収したろ過サンプルを「FTろ液」とした。
８．  吸引を止め、５０ｍＬの平衡バッファーを添加し、攪拌して混合した。再度吸引を行いろ過を開始した。ろ過されたサンプルを集め、「洗浄」とした。
９．  ステップ８を５０ｍＬの溶離バッファーを用い、１５分間混合した後吸引をかけてろ過した。ろ過されたサンプルを集め、「溶離物」とした。
１０．  全てのフラクションをMES移動バッファーを用いた４-１２%トリス-ビスSDS-PAGE ゲル電気泳動にかけた(操作については別添のエクセルファイル参照)。
１１．  未処理もみ殻灰についてステップ１-１０を繰り返した。
【０１４６】
観察結果/コメント
１．  表面処理もみ殻灰サンプル１９は明らかに未処理もみ殻灰より薄いケーキ厚を有していた。
２．  両方のもみ殻灰の全ての回収したフラクション(ＦＴ濾液、洗浄および溶離物)は清澄で、粒子状物質を含んでいなかった。
３．  表面処理もみ殻灰サンプル１９は未処理もみ殻灰のろ過速度に匹敵する粒子ろ過速度有している：
・  サンプル１９：１２.８mL/分
・  未処理ＲＨＡ：１４.０mL/分
４．  サンプル１９は未処理ＲＨＡより良い捕捉および溶離を示した：
・  未処理ＲＨＡ(図７Ａ)
＊  「FT濾液」(レーン番号４)はフィード(レーン番号２)と非常によく似たプロファイルであった。全てのバンドはフィードよりほんの少し薄く、これはもみ殻灰の調整のために用いたバッファーの影響である。
＊  もみ殻灰内に物理的にトラップされたタンパク質溶液を置き換え、これを「洗浄」フラクション(非常にかすかなタンパク質バンドを含む、レーン番号５参照)とした。
＊  溶離物(レーン番号６)中にはタンパク質が痕跡量しかなかった。
５．  サンプル１９(図７Ｂ)
・  タンパク質の良好な結合および結合タンパク質の良好な回収が可能であった。
「FT濾液」フラクション(レーン番号４)中のタンパク質バンドは非常に少ないかまたは全く無かった。「ベンチＦＴ」上清(レーン番号３)には「FT濾液」と比べるとかすかなタンパク質認められ、これはケーキを通り抜ける際にタンパク質が捕捉されたことを示す。
・  洗浄(レーン番号５)のタンパク質バンドは非常に少ないかまたは全く無かった。
・  溶離物(レーン番号６)はフィードと類似のパターンであるがほんの少し強度の弱いバンドパターンを示した。
【０１４７】
結論：
表面処理もみ殻灰は、投入されたタンパク質溶液から可溶性目的タンパク質をイオン交換により捕捉し、同時に粒子状物質を分離した。捕捉されたタンパク質は次いで表面処理もみ殻灰から、高塩濃度バッファーにより溶離して溶出することができる。
【０１４８】
この結果は表面処理もみ殻灰が粒子状物質含有タンパク質溶液を３つに分けることができることを示した：
表面処理もみ殻灰プレコートおよび本体内にトラップされた粒子状物質、
表面処理もみ殻灰へ結合した非タンパク質成分、および
表面処理もみ殻灰へ結合し、溶離されるタンパク質成分。
【０１４９】
実施例１３
粒子状成分の捕捉と可溶性成分の捕捉／溶離の両方を行うための表面処理もみ殻灰
目的：
・  実施例１２をAspergillus niger 培養液を用い、実施例１２と同じ表面処理もみ殻灰(サンプル１９)と未処理もみ殻灰を用いて繰り返す。
【０１５０】
試験溶液：
Aspergillus niger 培養液を４部のＤＩ水で希釈し、ｐＨを８.０６へNaOHを用いて調節した。
【０１５１】
手順：
・  実施例１２と同様の手順。試験溶液の体積は１００mLとした。
【０１５２】
観察結果/コメント
表面処理もみ殻灰サンプル１９は未処理もみ殻灰に匹敵するろ過スピードを示した。
【０１５３】
両方のもみ殻灰での全ての回収されたフラクション(ＦＴ濾液、洗浄および溶離物)は透明で粒子状物質フリーであった。
【０１５４】
試験した条件下で用いた試験溶液の量は結合能を超えていた。その結果サンプル１９および未処理ＲＨＡ両方の濾液フラクション(「ベンチＦＴ」および「ろ過FT」の両方)とフィード溶液との間に顕著な差はなかった。図８参照、レーン番号２、３および４対レーン番号１は未処理ＲＨＡおよびレーン番号７、８および９対レーン番号１はサンプル１９。
【０１５５】
以下の結果が観察された：サンプル１９は未処理ＲＨＡを超えるタンパク質-結合能を有している(図８参照)。
未処理ＲＨＡ洗浄(レーン番号５)にはサンプル１９(レーン番号１０)より多くのタンパク質が含まれている。
【０１５６】
サンプル１９(レーン番号１１)から溶離されたフラクションは未処理ＲＨＡ(レーン番号６)から溶離されたフラクションより、より強いバンド強度を有していた。
【０１５７】
結論：
本実施例は表面処理もみ殻灰はAspergillus niger 由来のフィードタンパク質溶液から、イオン交換による可溶性目的タンパク質の捕捉と粒子状物質の分離を同時に行ったことを示す。捕捉されたタンパク質は次いで表面処理もみ殻灰より高塩濃度のバッファーにて溶離して、抽出することができる。
【０１５８】
この結果は表面処理もみ殻灰が粒子状成分含有タンパク質溶液を３つに分けることができることを示す：
表面処理もみ殻灰プレコートおよび本体内にトラップされた粒子状物質、
表面処理もみ殻灰へ結合した非タンパク質成分、および
表面処理もみ殻灰へ結合し、溶離されるタンパク質成分。
【０１５９】
実施例１４：        タンパク質結合試験
材料
MilliQ H２O
タンパク質溶液(ろ過されたカタラーゼDFC)
５０mL オークリッジチューブ
Sorval SA６００ローターを有するSorval ＲC ５B プラス遠心分離器  
BCA タンパク質アッセイキット(Pierce)
Compat-Able タンパク質アッセイ試薬セット(Pierce)
予め希釈したタンパク質アッセイ標品、牛血清アルブミンフラクションV セット(Pierce)
５μm シリンジフィルター(Sartoris、Minisart、番号１７５９４)
手順：
１．  １ｇの各シラン処理もみ殻灰サンプル番号５４-６７を５０mLオークリッジチューブへ投入した。
２．  ２０mLのMilliQ H２O を各チューブへ投入した。.
３．  各チューブの内容物を８rpmにて反転させながら１０分、室温にて混合した。
４．              各チューブを１６,０００rpm、にて１５分間遠心した。
５.  上清を注意深くプラスチック製の移動ピペットを用いて除いた。.
６.  １部のタンパク質溶液を２４部のMilliQ H２O(フィード)で希釈した。
７.  １０mL フィードを各チューブへ投入した。(１０%w/v固形分)。
８．  各チューブを室温にて２時間、８rpmにて反転させつつインキュベートした。
９．  各チューブを１６,０００rpm、１５℃にて３０分間遠心した。.
１０．  各上清を０.４５μm シリンジフィルターでろ過した。
１１.  フィードおよびろ過上清(ステップ１０)中のタンパク質濃度をマイクロタイタープレート法に沿ってBCA アッセイにて測定した。結果を表１２として示した。
【０１６０】
【表１２】
2008505742.tif 000025
【０１６１】
結果
フィード物質のタンパク質濃度は該フィード物質をサンプル番号５４〜６７と混合し、遠心し、ろ過した後には減少した。この結果はシラン処理シリカサンプル番号５４〜６７および未処理ＲＨＡの全てがフィードタンパク質溶液からタンパク質を結合させたことを意味する。
【０１６２】
実施例１５
殺菌性活性試験(Bacillus subtilis )
試験微生物：Bacillus subtilis 
試験フィルター媒体：フィルター媒体サンプル４３、４４、４およびＦＷ１２(未処理珪藻土)
手順：
・  Bacillus subtilis培養液を滅菌ＰＢＳにて〜１０４ＣＦＵ／ｍＬへと希釈した(１ＯＤ≒５＊１０８ＣＦＵ／ｍＬ  の基準を培養液中の  ＣＦＵ／ｍＬ値を決めるのに用いた)。
・  ０．５ｇフィルター媒体／５ｍＬ  液体(１０％固形分)を用いた。
・  希釈培養物サンプルの連続的希釈(滅菌０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ中)をＬＡプレート上に播き、実際に用いたＣＦＵ／ｍＬを決定した。プレートを３４℃で一晩培養した。
２.  フィルター媒体および希釈細菌サンプル(またはPBSコントロール)を滅菌した１２５mL バッフルフラスコ内で２時間半、３０℃、２００rpmにて攪拌した。
３.  処理したサンプルの液体部分(２)をLAプレート上に播き(各サンプルにつき５プレート、１のプレートをコントロールとする)一晩３４℃にてインキュベートした。
４.  プレート上の細菌を計数した。
【０１６３】
結果：
表１３に結果をまとめた。細菌をサンプル４および４４のフィルターと混合することによって、ＣＦＵは減少したが、これはフィルター媒体サンプル４および４４が抗微生物活性を有し、接触することにより細菌を殺したことを意味する。
【０１６４】
【表１３】
2008505742.tif 000026
【０１６５】
凡例：
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水(細胞が浸透圧ショックによって溶菌されるのを防止)
ＣＦＵ：コロニー形成ユニット(生細胞数)
ＴＦＴＣ：少なすぎてカウント不能
ＣＦＵ／ｍＬは：平均±差(プレート数)で示す［差は平均と平均から最も遠い値との差である］．
２０３００コロニーのプレートのみ計数した。
【０１６６】
実施例１６
殺菌性活性試験(Bacillus subtilis)
試験微生物：Bacillus subtilis
被検フィルター媒体：フィルター媒体サンプル１、４、６、４４、および４５.
【０１６７】
手順：
Bacillus subtilis の培養液を滅菌PBSで希釈して〜１０４ＣＦＵ／ｍＬとした。
０.５g フィルター媒体/５mL 液体(１０%固体)を用いた。
１.  サンプルの培養液を連続的希釈したもの(滅菌０.９%w/v NaCl)をLAプレートに播き、実際に用いるＣＦＵ／ｍＬを決定した。プレートを一晩３４℃にてインキュベートした。
２.  フィルター媒体および希釈細菌サンプル(１５mL 液体)を滅菌した２５０mL バッフルフラスコ内で混合した。各フィルター媒体それぞれにつき２つのフラスコを用いた。
(細菌サンプルではなくPBSを投入したサンプルもまた下記フィルター媒体サンプルに含まれる：サンプル１、６および４５)
３.  上記を２時間、３０℃、２５０rpmにて混合した。
４.  処理サンプル(液体部分)をLAプレート上に播いた(各サンプル４または５プレート)。プレートを一晩、３４℃にてインキュベートした。
４.  プレート上の細菌を計数した。
【０１６８】
結果：
結果を表１４にまとめた。細菌とフィルター媒体サンプル１、４、６、４４、および４５とを混合することによってCFUは有意に減少した。
【０１６９】
【表１４】
2008505742.tif 000027
【０１７０】
実施例１７
殺菌活性およびろ過試験(Lactobacillus brevis)。
試験微生物：Lactobacillus brevis
被検フィルター媒体：サンプル４、４３、４５およびFW１２.
０.５ｇのフィルター媒体／５ｍＬ培養物(１０％固体)を用いた。
【０１７１】
手順：
１.  Lactobacillus brevis の一晩培養物を２段階で希釈して〜１０５ＣＦＵ／ｍＬとした(１OD６００≒２.７*１０８ＣＦＵ／ｍＬを基準)―第１段の希釈は滅菌ラクトバチルスMＲS培地にて行い、第２段の希釈を滅菌PBSにて行った。
２.  培養物の段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製した(第２段の希釈)。
３.  希釈されたサンプルをラクトバチルスMＲS培地プレート上に播き、実際の開始ＣＦＵ／ｍＬを決定した。
４．  フィルター媒体および希釈細菌サンプル(１０mL 液体)を滅菌１２５mL バッフルフラスコ内へ投入し、パラフィルムで密封し、２時間１５分室温にてオービットシェイカー上で混合した(~６０rpm)。
５.  処理サンプルの段階希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、ラクトバチルスMＲS培地プレート上に播いた。
６.  選択されたサンプル/サンプル４、４３および４５の希釈物を５μm フィルターでろ過した。
７.  ろ過したサンプルをLactobacillus brevis 培地プレート上に置き、キャンドルジャー内で３０℃にて２日間培養した。
８.  プレートを計数した。
【０１７２】
結果：
結果を表１５にまとめた。CFUはサンプル４、４３、および４５と細菌を混合することによって減少した。５μｍのフィルターでろ過することにより、CFUはさらに減少した。
【０１７３】
【表１５】
2008505742.tif 000028
【０１７４】
実施例１８
抗菌活性試験(E.coli)。
試験微生物：E.coli(MG１６５５)
試験フィルター媒体：FW１２、サンプル４３、１、４、６、４４および４５.
【０１７５】
手順：
０.５g フィルター媒体/５mL フィード(=１０%固体)。
１.  E.coli 培養物(未だ定常期に至らず)を２段階で希釈して〜１０５ＣＦＵ／ｍＬ(１OD６００≒５*１０８ＣＦＵ／ｍＬを基準)とした第１段の希釈はthe first滅菌LB培地を用い、第２段の希釈は滅菌PBS(これがフィード)にて行った。
２.  フィードの段階希釈物(０.９%w/v NaCl)を調製した。
３.  １００μLの希釈フィードサンプルをLAプレート上に播き、実際の開始ＣＦＵ／ｍＬを決定した。
４.  フィルター媒体および１０mLフィードを滅菌１２５mL バッフルフラスコ内へ投入し２時間、２５℃、２００rpm(４分の３インチストローク)にて混合した。
５.  混合サンプルの段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、それぞれ１００μl をLAプレートに播き、３０℃で一晩培養した。
６.  プレートの計数を行った。.
【０１７６】
結果：
結果を表１６にまとめた。
【０１７７】
【表１６】
2008505742.tif 000029
【０１７８】
実施例１９
殺菌活性およびろ過試験(Lactobacillus brevis)。
試験微生物：Lactobacillus brevis 保存株(ATCC番号１４８６９)
試験フィルタ媒体：サンプル４３、４、および４４
【０１７９】
手順：
０.５gのフィルター媒体/５mL フィード(=１０%固体)
１．  Lactobacillus brevis 培養物を〜１０５ＣＦＵ／ｍＬ(１OD６００≒２.７＊１０８ＣＦＵ／ｍＬを基準)へと、２段階で希釈した。第１段階の希釈は滅菌Lactobacillus MＲS 培地で行い、第２段階は滅菌PBS(これがフィードである)で行った。
２.  フィードの段階希釈物(０.９%w/v NaCl)を調製した。
３.  希釈したサンプル１００μLLactobacillus MＲS培地プレート上へ播き、実際の開始ＣＦＵ／ｍＬを決定した。
４.  フィルター媒体および５mLフィードを滅菌した１５mL円錐チューブへ投入し、２時間、２５℃、２５０rpm(２分の１インチストローク)混合した。
５.  混合サンプルの段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、Lactobacillus MＲS 培地プレート上へ播いた(各１００μl)。
６.  全サンプルを５μmシリンジフィルターでろ過した。
７.  ろ過サンプルの段階的希釈物(０.９%w/v NaCl内)を調製し、Lactobacillus MＲS 培地プレート上へ播いた。
８.  プレートをキャンドルジャー内で３０℃にて２日間インキュベートした。
９.  プレートの計数を行った。.
【０１８０】
結果：
結果を表１７にまとめた。CFUはサンプル４、４３、および４４と細菌を混合することによって減少した。５μｍのフィルターでろ過することにより、CFUはさらに減少した。
【０１８１】
【表１７】
2008505742.tif 000030
【０１８２】
実施例２０
抗菌活性試験(Lactobacillus brevis)
試験した微生物：：Lactobacillus brevis
試験したフィルター媒体：サンプル４８、５０、５１、および５２.
【０１８３】
手順：
１.  Lactobacillus brevis(グラム陽性)培養物をMＲS寒天培地上に画線し、好気条件下２６℃にて十分に増殖するまでインキュベートした。
２.  ＭＲＳプレートから取ったコロニーを０.１%ペプトンで希釈して５x １０４ＣＦＵ／ｍＬとなるようにして作業用種菌菌液を調製した。
３.  ０.５gフィルター媒体を３０ｍＬガラス管中の接種菌液へ添加した。(５%)。
４.  ガラス管を密封し、室温にて３０分間、混合(８反転/分)。しながらインキュベートした。
５.  １：１０の段階的希釈物を０.９%NaClにて調製し、細菌集団を数えるためにMＲS寒天と共に流し平板法にてプレートを作成した。
６.  プレートを２６℃、好気条件下(GasPak)にて十分な数へと増殖するまでインキュベートした。
７.  ２０-２００コロニーを有するプレートの計数を行った。結果を表１８にまとめた。
【０１８４】
実施例２１
抗菌活性試験(Acetobacter pasteurianus(グラム陰性))
試験した微生物：：Acetobacter pasteurianus(グラム陰性)
試験したフィルター媒体：サンプル４８、５０、５１、および５２。
【０１８５】
手順：
１.  Acetobacter pasteurianus(グラム陰性)培養物をMＲS寒天上に画線し、好気条件下２７℃十分に増殖するまでインキュベートした。
２.  寒天培地上のコロニー１ｍｌループを９９ｍｌｎｏＭＲＳ培地へ添加し、２７℃でインキュベートして培養物をストックした。
３.  作業用接種菌液をMＲS ストック培養物のアリコートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または０.１%ペプトンにて希釈して調製した。
４.  ０.５ｇのフィルター媒体を１０mL 接種菌液へ３０mLのガラス管中で添加した。
５.  ガラス管を密封し、室温にて３０分間、混合(８反転/分)。しながらインキュベートした。
６.  １：１０の段階的希釈物を０.１%ペプトンにて調製し、細菌集団を数えるためにMＲS寒天と共に流し平板法にてプレートを作成した。
７.  プレートを２７℃、好気条件下(GasPak)にて十分な数へと増殖するまでインキュベートした。
２０−２００コロニーを有するプレートの計数を行った。結果を表１８にまとめた。
【０１８６】
実施例２２
抗菌活性試験(Saccharomyces diastaticus(酵母))
試験した微生物：：Saccharomyces diastaticus(酵母)
試験したフィルター媒体：サンプル４８、５０、および５１.
【０１８７】
手順：
１.  Saccharomyces diastaticus(酵母)培養物をＹM寒天培地上へ画線し、好気条件、３０℃にて十分に増殖するまでインキュベートした。
２.  作業用接種菌液をＹＭプレート上のコロニーをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて３x １０４ＣＦＵ／ｍＬを目標として希釈し、調製した。
３.  ０.５ｇのフィルター媒体を１０mL 接種菌液へ３０mLのガラス管中で添加した。
４.  ガラス管を密封し、室温にて３０分間、混合(８反転/分)。しながらインキュベートした。
５.  １：１０の段階的希釈物を０.９%NaClにて調製し、細菌集団を数えるためにMＲS寒天と共に流し平板法にてプレートを作成した。
６.プレートを３０℃、好気条件下(GasPak)にて十分な数へと増殖するまでインキュベートした。
７.  ２０-２００コロニーを有するプレートの計数を行った。結果を表１８にまとめた。
【０１８８】
【表１８】
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【０１８９】
発明の好ましい実施形態と共に発明を説明したが、発明の範囲内でさまざまな改変をし得ることを確認されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１Ａはタンパク質結合、および図１Ｂ  はタンパク質放出、未処理珪藻土(ＦＷ１２)、未処理もみ殻灰、ＨＱ５０(市販の第４級アミン陰イオン交換樹脂)および表面処理もみ殻灰(シリカフィルター媒体サンプル４および６)。
【図２】図２はタンパク質結合およびタンパク質放出を表面処理もみ殻灰を用いて行ったものである。図２Ａ  はシリカフィルター媒体サンプル７および８の結果。図２Ｂ  はサンプル９および１０の結果。図２Ｃ  はサンプル１１および１２の結果である。
【図３】図３はタンパク質結合およびタンパク質放出を表面処理もみ殻灰を用いて行ったものである。図３Ａ  はサンプル１４の結果。図３Ｂ  はシリカフィルター媒体サンプル１３および１５の結果。図３Ｃ  はサンプル１６および１７の結果。図３Ｄ  はサンプル１８および１９、図３Ｅ  はサンプル２０の結果である。
【図４】図４はタンパク質結合およびタンパク質放出を表面処理もみ殻灰を用いて行ったものである。図４Ａ  はシリカフィルター媒体サンプル４１および未処理ＲＨＡのの結果。図４Ｂ  は多孔性ＨＳ５０の結果である。
【図５】図５はタンパク質結合およびタンパク質放出を示す。図５Ａ  はシリカフィルター媒体サンプル４２の結果。図５Ｂ  はサンプル４０および未処理ＲＨＡの結果。図５Ｃ  はセライト５１２の結果。図５Ｄ  はサンプル２９および未処理ＲＨＡの結果である。．
【図６】図６は動的タンパク質結合およびタンパク質放出を表面処理ＲＨＡ(サンプル９)を用いて行った結果である。
【図７】図７Ａは未処理もみ殻灰および図７Ｂ  はシリカフィルター媒体サンプル１９で、粒子ろ過および可溶性成分捕捉／放出を同時に行うためのものを示す。
【図８】図８はシリカフィルター媒体サンプル１９および未処理ＲＨＡで、粒子ろ過および可溶性成分放出を同時に行うためのものを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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