(57)【要約】【課題】物質を効率よく増幅させるための物質増幅反応装置を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の物質増幅反応装置は、反応液と、反応液よりも比重が小さく、反応液とは混和しない液体とが充填され、第１の流路と第２の流路とが屈曲部を介して接続され、反応液が移動する流路を有する物質増幅反応容器を装着可能な装着部と、流路の第１の流路側の端部の領域である第１領域、屈曲部の領域である第２領域、流路の前記第２の流路側の端部の領域である第３領域をそれぞれ加熱可能な第１〜３加熱部と、第１の配置、第２の配置、及び第３の配置の順で切換える駆動機構と、を含み、第１〜３の配置はそれぞれ第１〜３の領域が下となる配置である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、かつ、前記反応液とは混和しない液体と、が充填され、第１の流路と第２の流路とが屈曲部を介して接続され、前記第１の流路の軸と前記第２の流路の軸とは９０度未満の角度をなしている、前記反応液が移動する流路を有する物質増幅反応容器を装着可能な装着部と、
前記流路の前記第１の流路側の端部の領域である第１領域を加熱可能な第１加熱部と、
前記屈曲部の領域である第２領域を加熱可能な第２加熱部と、
前記流路の前記第２の流路側の端部の領域である第３領域を加熱可能な第３加熱部と、
第１の配置、第２の配置、及び第３の配置の順で切換える駆動機構と、
前記第１の配置に所定時間維持された後に、前記第２の配置が所定時間維持され、その後に前記第３の配置が所定時間維持されるように、前記駆動機構を制御する制御部と、
を含み、
前記第１の配置は、前記第１領域が、前記第２領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる配置であり、
前記第２の配置は、前記第２領域が、前記第１領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる配置であり、
前記第３の配置は、前記第３領域が、前記第１領域及び前記第２領域よりも重力が作用する方向で下となる配置である、
物質増幅反応装置。
【請求項２】
前記第１加熱部は第１の穴を有し、前記第１領域は第１の穴に挿入可能であり、
前記第２加熱部は第２の穴を有し、前記第２領域は第２の穴に挿入可能であり、
前記第３加熱部は第３の穴を有し、前記第３領域は第３の穴に挿入可能である、
請求項１に記載の物質増幅反応装置。
【請求項３】
前記第１乃至第３の穴は前記装着部である、請求項２に記載の物質増幅反応装置。
【請求項４】
前記物質が核酸である、請求項１乃至３に記載の物質増幅反応装置。
【請求項５】
反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、第１の流路と第２の流路とを屈曲部を介して接続され、前記第１の流路の軸と前記第２の流路の軸とは９０度未満の角度をなしている前記反応液が移動する流路を有する物質増幅反応容器を装着可能な装着部と、
前記流路の前記第１の流路側の端部の領域である第１領域を加熱可能な第１加熱部と、
前記屈曲部の領域である第２領域を挿入可能な第２加熱部と、
前記流路の前記第２の流路の端部の領域である第３領域を加熱可能な第３加熱部と、
を含む物質増幅反応装置を使用する物質増幅方法であって、
前記第１領域が、前記第２領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる第１の配置を所定時間維持し、その後に前記第２領域が、前記第１領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる第２の配置に遷移して所定時間維持し、その後に前記第３領域が、前記第１領域及び前記第２領域よりも重力が作用する方向で下となる第３の配置に遷移して所定時間維持する、物質増幅方法。
【請求項６】
前記物質が核酸である、請求項５に記載の物質増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質増幅反応装置及び物質増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速で核酸を増幅させる方法として、円筒状の核酸増幅反応容器中にオイルと少量の核酸増幅反応液を投入し、当該容器の一端を高温、他端を低温に維持し、容器を回転させて、その一端が鉛直方向下となるようにして高温のオイル中に反応液を位置させる状態と、他端が鉛直方向下となるようにして低温のオイル中に反応液を位置させる状態とを交互に切換えることにより、核酸増幅反応液の温度に熱サイクルを高速で発生させる核酸増幅反応装置が知られている（例えば、引用文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載の核酸増幅反応装置は、２ステップＰＣＲを前提にしており、特定の反応条件における増幅効率の低下が発生する可能性があり、また、２０塩基より短いプライマーを用いた場合には増幅が困難であるという課題があった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、物質を効率よく増幅させるための物質増幅反応装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施態様は、反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、かつ、前記反応液とは混和しない液体と、が充填され、第１の流路と第２の流路とが屈曲部を介して接続され、前記第１の流路の軸と前記第２の流路の軸とは９０度未満の角度をなしている、前記反応液が移動する流路を有する物質増幅反応容器を装着可能な装着部と、前記流路の前記第１の流路側の端部の領域である第１領域を加熱可能な第１加熱部と、前記屈曲部の領域である第２領域を加熱可能な第２加熱部と、前記流路の前記第２の流路側の端部の領域である第３領域を加熱可能な第３加熱部と、第１の配置、第２の配置、及び第３の配置の順で切換える駆動機構と、前記第１の配置に所定時間維持された後に、前記第２の配置が所定時間維持され、その後に前記第３の配置が所定時間維持されるように、前記駆動機構を制御する制御部と、を含み、前記第１の配置は、前記第１領域が、前記第２領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる配置であり、前記第２の配置は、前記第２領域が、前記第１領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる配置であり、
前記第３の配置は、前記第３領域が、前記第１領域及び前記第２領域よりも重力が作用する方向で下となる配置である、物質増幅反応装置である。前記第１加熱部は第１の穴を有し、前記第１領域は第１の穴に挿入可能であり、前記第２加熱部は第２の穴を有し、前記第２領域は第２の穴に挿入可能であり、前記第３加熱部は第３の穴を有し、前記第３領域は第３の穴に挿入可能であってもよい。前記第１乃至第３の穴は前記装着部であってもよい。
【０００７】
本発明の他の一実施態様は、反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、第１の流路と第２の流路とを屈曲部を介して接続され、前記第１の流路の軸と前記第２の流路の軸とは９０度未満の角度をなしている前記反応液が移動する流路を有する物質増幅反応容器を装着可能な装着部と、前記流路の前記第１の流路側の端部の領域である第１領域を加熱可能な第１加熱部と、前記屈曲部の領域である第２領域を挿入可能な第２加熱部と、前記流路の前記第２の流路の端部の領域である第３領域を加熱可能な第３加熱部と、を含む物質増幅反応装置を使用する物質増幅方法であって、前記第１領域が、前記第２領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる第１の配置を所定時間維持し、その後に前記第２領域が、前記第１領域及び前記第３領域よりも重力が作用する方向で下となる第２の配置に遷移して所定時間維持し、その後に前記第３領域が、前記第１領域及び前記第２領域よりも重力が作用する方向で下となる第３の配置に遷移して所定時間維持する、物質増幅方法である。
【０００８】
いずれの場合も、物質は核酸であってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、物質を効率よく増幅させるための物質増幅反応装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】一実施形態に係る物質増幅反応装置内における物質反応容器とヒーターの模式図である。
【図２】一実施形態に係る物質増幅反応装置を用いた物質増幅方法を示す模式図である。
【図３】一実施形態に係る物質増幅反応装置を用いた処理の手順を表すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて以下の順序に従って説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００１２】
１．一実施形態に係る物質増幅反応装置
本実施形態において、物質増幅反応装置は、物質増幅反応容器を装着可能な３つの加熱部と、この加熱部の配置を切り換えることが可能な駆動機構とを有する。
【００１３】
図１は、本実施形態に係る物質増幅反応装置内の、第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部４００に物質増幅反応容器１０が固定された状態を示す模式断面図である。
【００１４】
図１に示すように、物質増幅反応容器１０は、第１の流路１６と第２の流路１８とを有し、第１の流路１６の軸１６ａと第２の流路１８の軸１８ａとは、角度ａをなしている。角度ａは９０度未満である。
【００１５】
物質増幅反応容器１０には液体１５と、反応液１４とが充填されている。液体１５は、反応液１４とは混和しない、すなわち混ざり合わない性質であるため、図１に示すように、反応液１４は液体１５の中に液滴の状態で保持されている。反応液１４は、液体１５よりも比重が大きいため、物質増幅反応容器１０の重力方向における最下部の領域に位置している。液体１５としては、例えば、ジメチルシリコーンオイル又はパラフィンオイルを使用できる。反応液１４は反応に必要な成分を含む液体１５である。反応がＰＣＲである場合には、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ（標的核酸）、ＤＮＡを増幅するために必要なＤＮＡポリメラーゼ、並びにプライマー等が含まれる。例えば、液体１５としてオイルを用いてＰＣＲを行う場合には、反応液１４は上記の成分を含む水溶液であることが好ましい。
【００１６】
第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部４００は、図示しないヒーターから発生した熱を物質増幅反応容器１０に伝える部材である。本実施形態ではアルミニウム製のヒートブロックである。ヒートブロックをアルミニウム製とすることで、物質増幅反応容器１０を効率よく加熱できる。また、ヒートブロックに加熱ムラが生じにくいので、精度の高い熱サイクルを実現できる。また、加工が容易なのでヒートブロックを精度よく成型でき、加熱の精度を高めることができる。したがって、より正確な熱サイクルを実現できる。
【００１７】
第１加熱部２００、第２加熱部３００、及び第３加熱部４００にはそれぞれ穴があり、第１加熱部２００、第２加熱部３００、及び第３加熱部４００の各穴に物質増幅反応容器１０の第１領域２０、第２領域３０、第３領域４０をそれぞれ図１に記載されたように挿入する。第１領域２０は、物質増幅反応容器１０の端部であって、第１の流路１６の端部の領域、第２領域３０は、物質増幅反応容器１０の第１の流路１６と第２の流路１８との間に位置する領域、第３の領域２０は、物質増幅反応容器１０の端部であって、第２の流路１８の端部の領域である。
【００１８】
第１加熱部２００の穴には、物質増幅容器１０の第１領域２０を挿入する。熱サイクル処理時には、第１加熱部２００によって物質増幅反応容器１０の第１領域２０を加熱して、第１領域２０内のオイルを第１の温度に昇温させる。第１の温度は、例えば、９２〜９７℃である。
【００１９】
第２加熱部３００の穴には、物質増幅反応容器１０の第２領域３０を挿入する。熱サイクル処理時には、第２加熱部３００によって物質増幅反応容器１０の第２領域３０を加熱して、第２領域３０内のオイルを第２の温度に昇温する。第２の温度は、５５〜７２℃である。
【００２０】
第３加熱部４００の穴には、物質増幅反応容器１０の第３領域４０を挿入する。熱サイクル処理時には、第３加熱部４００によって物質増幅反応容器１０の第３領域４０を加熱して、第３領域４０内のオイルを第３の温度に昇温する。第３の温度は、６５〜８０℃である。
【００２１】
第１加熱部２００、第２加熱部３００、及び第３加熱部４００の温度は、温度センサー及び後述する制御部によって制御される。
【００２２】
本実施形態の物質増幅反応装置には、駆動機構が設けられている。この駆動機構は、３つの加熱部を第１の配置、第２の配置及び第３の配置に切り換える機構である。駆動機構はモーター及び駆動軸を含み、駆動軸は、第２加熱部３００に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として第１加熱部２００、第２加熱部３００および第３加熱部４００が位置関係を維持したまま回転する。
【００２３】
本実施形態の物質増幅反応装置は、制御部を含む。制御部は駆動機構の動作を制御することによって、第１加熱部２００、第２加熱部３００、及び第３加熱部４００を所定の配置に所定の時間保持されるように制御する。
【００２４】
物質増幅反応装置における制御部は電子制御であって、上記項目を全て制御してもよい。制御部は図示しないＣＰＵ等のプロセッサー、及び、ＲＯＭ（Read Only Memory）やＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶装置を含む。記憶装置には上記各項目を制御するための各種プログラム、データ等が記憶されている。また、記憶装置は各種処理の処理中データ、処理結果などを一時的に記憶するワークエリアを有する。
【００２５】
２．物質増幅反応装置を用いた熱サイクル処理
図２Ａ〜Ｃは、本発明に係る物質増幅反応装置を用いて３ステップＰＣＲを行う場合を模式的に表した図であり、図２Ａは第１の配置、図２Ｂは第２の配置、図２Ｃは第３の配置を示す。図２Ａ〜Ｃは、矢印ｇの方向（図における下方向）が重力の作用する方向である。図３は、処理の手順を表すフローチャートである。
【００２６】
なお、本明細書で、２点が、「重力の作用する方向で上」または「重力の作用する方向で下」というのは、重力の作用する方向に関してのみ位置に差があればよく、２点を結んだ直線が重力の作用する方向と平行であってもよく、平行でなくてもよい。
【００２７】
３ステップＰＣＲは、３段階の温度処理を繰り返し反応液に施すことにより、反応液中の核酸を増幅させる手法である。高温の処理においては２本鎖ＤＮＡの解離が、低温の処理においてはアニーリング（プライマーが１本鎖ＤＮＡに結合する反応）が、中温の処理においては伸長反応（プライマーを始点としてＤＮＡの相補鎖が形成される反応）が行われる。
【００２８】
３ステップＰＣＲにおける高温はおよそ９２℃から９７℃の間の温度、低温はおよそ５５℃から７２℃の間の温度、中温はおよそ６５℃から８０℃の間の温度である。各温度における処理は所定時間行われる。使用する試薬の種類や量によって、適切な時間、温度およびサイクル数は異なるので、試薬の種類や反応液１４の量を考慮して適切なプロトコルを決定した上で反応を行うことが好ましい。
【００２９】
まず、液体１５及び反応液１４が充填された物質増幅反応容器１０を、第１加熱部２００、第２加熱部３００、第３加熱部４００に固定する（ステップＳ１０１）。第１加熱部２００は第１領域２０を、第２加熱部３００は第２領域３０を、第３加熱部４００は第３領域４０を、それぞれ含む位置において物質増幅反応容器１０に接している。
【００３０】
本実施形態においては、ステップＳ１０１における第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部４００の配置は第１の配置である。図２Ａに示すように、第１の配置は、第１領域２０が、第２領域３０及び第３領域４０よりも重力が作用する方向で下となる配置である。第１の配置においては、重力の作用する方向における流路１６の最下部に第１領域２０が位置し、液体１５よりも比重の大きい反応液１４は、第１領域２０に位置している。
【００３１】
ステップＳ１０２では、第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部により物質増幅反応容器１０を加熱する。第１加熱部２００と第２加熱部３００と第３加熱部４００は、物質増幅反応容器１０の異なる領域を異なる温度に加熱する。すなわち、第１加熱部２００は第１領域２０を第１の温度に加熱し、第２加熱部３００は第２領域３０を第２の温度に加熱し、第３加熱部４００は第３領域４０を第３の温度に加熱する。これにより、第１領域２０と第２領域３０と第３領域との間には、第１の温度と第２の温度と第３の温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。本実施形態の熱サイクル処理は３ステップＰＣＲであるので、第１の温度は２本鎖ＤＮＡの解離に適した温度、第２の温度はアニーリングに適した温度及び第３の温度は伸長反応に適した温度とすることが好ましい。
【００３２】
ステップＳ１０２における、第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部の配置は第１の配置であるので、ステップＳ１０２において物質増幅反応容器１０を加熱すると、反応液１４は第１の温度に加熱される。したがって、ステップＳ１０２においては、反応液１４に対して第１の温度における反応が行われる。
【００３３】
ステップＳ１０３では、第１の配置において、第１の時間が経過したか否かを判定する。本実施形態においては、判定は図示しない制御部によって行われる。第１の時間は、第１の配置を保持する時間である。本実施形態において、ステップＳ１０１に続いてステップＳ１０３が行われる場合、すなわち１回目のステップＳ１０３が行われる場合には、物質増幅反応装置を作動させてからの時間が第１の時間に達したか否かが判定される。第１の配置においては、反応液１４は第１の温度に加熱されるので、第１の時間は、目的とする反応において反応液１４を第１の温度で反応させる時間とすることが好ましい。本実施形態においては、２本鎖ＤＮＡの解離に必要な時間とすることが好ましい。
【００３４】
ステップＳ１０３において、第１の時間が経過したと判定した場合（ｙｅｓ）は、ステップＳ１０４へ進む。第１の時間が経過していないと判定した場合（ｎｏ）は、ステップＳ１０３が繰り返される。
【００３５】
ステップＳ１０４では、物質増幅反応装置の駆動機構によって、第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部４００の配置を第１の配置から第２の配置へ切換える。第２の配置は、第２領域３０が、第１領域２０及び第３領域４０よりも重力が作用する方向で下となる配置である（図２Ｂ）。本実施形態のステップＳ１０４では、図２Ａの状態から図２Ｂの状態へ第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部の配置を切り換える。
【００３６】
ステップＳ１０４において、第１の配置から第２の配置へ切換えられた際は、反応液１４は重力の作用によって第１領域２０から第２領域３０へと移動する。第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部４００の配置が第２の配置に達したら、ステップＳ１０５が開始される。ステップＳ１０５では、第２の配置において、第２の時間が経過したか否かを判定する。第２の時間は、第２の配置に第１加熱部２００及び第２加熱部３００を保持する時間である。本実施形態においては、第２領域３０はステップＳ１０２において第２の温度に加熱されているので、本実施形態のステップＳ１０５においては、配置が第２の配置に達してからの時間が第２の時間に達したか否かが判定される。第２の配置においては、反応液１４は第２領域３０に保持されるので、第２の配置に保持されている時間、反応液１４は第２の温度に加熱される。したがって、第２の時間は、目的とする反応において、反応液１４を第２の温度に加熱する時間とすることが好ましい。本実施形態においては、アニーリングに必要な時間とすることが好ましい。
【００３７】
ステップＳ１０５において、第２の時間が経過したと判定した場合（ｙｅｓ）は、ステップＳ１０６へ進む。第２の時間が経過していないと判定した場合（ｎｏ）は、ステップＳ１０５が繰り返される。
【００３８】
ステップＳ１０６では、物質増幅反応装置の駆動機構によって、第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部４００の配置を第２の配置から第３の配置へ切換える。第３の配置は、第３領域４０が、第１領域２０及び第２領域３０よりも重力が作用する方向で下となる配置である（図２Ｃ）。
【００３９】
ステップＳ１０６において、第２の配置から第３の配置へ切換えられた際は、反応液１４は重力の作用によって第２領域３０から第３領域４０へと移動する。第１加熱部２００、第２加熱部３００及び第３加熱部４００の配置が第３の配置に達したら、ステップＳ１０７が開始される。ステップＳ１０７では、第３の配置において、第３の時間が経過したか否かを判定する。第３の時間は、第３の配置を保持する時間である。本実施形態においては、第３領域４０はステップＳ１０２において３の温度に加熱されているので、本実施形態のステップＳ１０７においては、配置が第３の配置に達してからの時間が第３の時間に達したか否かが判定される。第３の配置においては、反応液１４は第３領域４０に保持されるので、第３の配置に保持されている時間、反応液１４は第３の温度に加熱される。したがって、第３の時間は、目的とする反応において、反応液１４を第３の温度に加熱する時間とすることが好ましい。本実施形態においては、伸長反応に必要な時間とすることが好ましい。
【００４０】
ステップＳ１０７において、第３の時間が経過したと判定した場合（ｙｅｓ）は、ステップＳ１０８へ進む。第３の時間が経過していないと判定した場合（ｎｏ）は、ステップＳ１０７が繰り返される。
【００４１】
本実施形態では、物質増幅反応容器１０に屈曲部を有し、この屈曲部を挟んで反応液が移動する第１の流路１６と第２の流路１８とを有し、第１の流路の軸１６ａと第２の流路の軸１８ａとは９０度未満の角度をなしており、第１領域２０、第２領域３０及び第３領域４０を各温度に維持することができるため、物質増幅反応容器中のオイル内で反応液を移動させることにより、物質を高速で増幅させることができる。
【００４２】
ステップＳ１０８では、熱サイクルの回数が所定のサイクル数に達したか否かを判定する。具体的には、ステップＳ１０３からステップＳ１０７までの手順が、所定回数完了したか否かを判定する。本実施形態においては、ステップＳ１０３及びステップＳ１０７が完了した回数は、「ｙｅｓ」と判定された回数で判定される。ステップＳ１０３からステップＳ１０７までが１回行われると、反応液１４に熱サイクルが１サイクル施されるので、ステップＳ１０３からステップＳ１０７が行われた回数を、熱サイクルのサイクル数とすることができる。したがって、ステップＳ１０８により、目的とする反応に必要な回数の熱サイクルが施されたか否かを判定できる。
【００４３】
ステップＳ１０８において、熱サイクルが予定のサイクル数行われた（ｙｅｓ）と判定した場合には、処理を完了する（ＥＮＤ）。熱サイクルが予定のサイクル数行われていない（ｎｏ）と判定した場合には、ステップＳ１０９へ移行する。
【００４４】
ステップＳ１０９では、第３の配置から第１の配置へ切換える。第１の配置に達したら、ステップＳ１０３が開始される。
【００４５】
ステップＳ１０９に続いてステップＳ１０３が行われる場合、すなわち２回目以降のステップＳ１０３においては、第１の配置に達してからの時間が第１の時間に達したか否かが判定される。
【００４６】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００４７】
１０…物質増幅反応容器、１４…反応液、１５…液体、１６…第１の流路、１６ａ…第１の流路の軸、１８…第２の流路、１８ａ…第２の流路の軸、２０…第１領域、３０…第２領域、４０…第３領域、２００…第１加熱部、３００…第２加熱部、４００…第３加熱部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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