(57)【要約】本発明は、新規化学化合物、それらを発見する方法、およびそれらの治療的用途に関する。特に、本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体、ならびに、プログラム細胞死プロセスの誤調節、自己免疫、炎症、および過増殖などに関連した多くの状態を処置するための治療的物質としてベンゾジアゼピン誘導体を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)高増殖性上皮細胞を伴う試料およびベンゾジアゼピン化合物を含む組成物を提供する工程；ならびに、
b)該組成物を該試料に適用する工程；
を含む高増殖性上皮細胞を調節する方法。
【請求項２】
組成物を試料に適用する工程により、該試料中のErk1/2活性化が低下する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
組成物を試料に適用する工程により、該試料中のケラチノサイト増殖を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
組成物が局所的副腎皮質ステロイドをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
局所的副腎皮質ステロイドが、トリアムシノロンアセトニド0.1％クリームおよびジプロピオン酸ベタメタゾン0.05％クリームからなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
組成物がコールタール2〜10％をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
組成物がビタミンD-3類似体をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ビタミンD-3類似体がカルシポトリエンである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
組成物が角質溶解薬をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
角質溶解薬がアントラリン0.1〜1％である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
組成物が局所的レチノイドをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
局所的レチノイドがトレチノインおよびタザロテンからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
試料が生きた対象である、請求項1記載の方法
【請求項１４】
生きた対象が上皮過形成に罹患しているヒトである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
生きた対象が乾癬を有する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ベンゾジアゼピン化合物がBz-423である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
ベンゾジアゼピン化合物がRおよびS鏡像異性形態、ならびにラセミ混合物を含む以下の式を含む、請求項1記載の方法；
2008505913.tif 000063
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され：
水素；CH3；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；
式中、R5は、OH；NO2；OR'からなる群より選択され；
式中、
R'は、以下からなる群より選択され：
直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；
式中、R6は、水素；NO2；Cl；F；Br；I；SR'；およびNR'2からなる群より選択され；式中、R'は、上記R5のように定義され；
式中、R7は、水素；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され；ならびに、
式中、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり；式中、該ベンゼンよりも大きな基は、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。
【請求項１８】
a)上皮過形成を調節するベンゾジアゼピン化合物；および、
b)以下の群よりから選択される薬剤：局所的な副腎皮質ステロイド、角質溶解薬、局所的レチノイド、コールタール2〜10％、およびビタミンD-3類似体；
を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
ベンゾジアゼピン化合物がBz-423である、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ベンゾジアゼピン化合物がRおよびS鏡像異性形態、ならびにラセミ混合物を含む以下の式を含む、請求項18記載の薬学的組成物；
2008505913.tif 000064
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され：
水素；CH3；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；
式中、R5は、OH；NO2；OR'からなる群より選択され；
式中、
R'は、以下からなる群より選択され：
直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；
式中、R6は、水素；NO2；Cl；F；Br；I；SR'；およびNR'2からなる群より選択され；式中、R'は、上記R5のように定義され；
式中、R7は、水素；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され；ならびに、
式中、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり；式中、該ベンゼンよりも大きな基は、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。
【請求項２１】
薬学的組成物が上皮過形成を処置するために使用される、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
上皮過形成が乾癬によって生じる、請求項21記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規化学化合物、それらの発見法、およびそれらの治療的用途に関する。特に本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物、ならびにプログラムされた細胞死、自己免疫、炎症および過増殖などの過程の誤調節に関連した多くの状態を処置するために、ベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物を治療的物質として使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多細胞生物は、細胞数の精密な制御を行っている。細胞増殖と細胞死の間の平衡は、このホメオスタシスを実現している。細胞死は、ネクローシスを介して、またはアポトーシスとして知られている細胞自死型を通して、ほぼ全ての種類の脊椎動物細胞において生じる。アポトーシスは、共通の遺伝的にプログラムされた死の機構に携わる、様々な細胞外および細胞内シグナルにより引き金を引かれる。
【０００３】
多細胞生物は、損傷されたまたは不必要な細胞に、その生物の利益のためにそれらを破壊することを指示するために、アポトーシスを使用する。従って、アポトーシス過程の制御は、例えば、脳内の神経シナプスの形成と同じような、余剰な相互連結(interconnecting)組織のアポトーシスによる制御された除去を必要とする胎児の指およびつま先の発生のように、通常の発生にとって非常に重要である。同様に制御されたアポトーシスは、月経開始時の子宮の内層(子宮内膜)の剥脱(sloughing)にも寄与している。アポトーシスは、組織造形(sculpting)および正常細胞維持において重要な役割を果たしている一方で、これは生物の良好な生存を脅かす細胞および侵略者(例えばウイルス)に対する第一の防御でもある。
【０００４】
多くの疾患が、細胞死の過程の調節不良に関連していることは驚くことではない。異常なアポトーシス調節と、様々な新生物疾患、自己免疫疾患およびウイルス疾患の病因(pathenogenicity)の間の因果関係の実験モデルが確立された。例えば、細胞媒介性免疫応答において、エフェクター細胞(例えば、細胞傷害性Tリンパ球「CTL」)は、感染した細胞がアポトーシスを受けるのを誘導することにより、ウイルス感染した細胞を破壊する。この生物は引き続き、最早エフェクター細胞が必要でなくなった時点で、エフェクター細胞を破壊するためにアポトーシス過程に頼る。自己免疫は、通常アポトーシスを誘導するCTLにより、互いにおよびそれら自身でさえ、妨害される。この過程の欠損は、エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチのような様々な自己免疫疾患に関連している。
【０００５】
多細胞生物は、損傷された核酸(例えばDNA)を伴う細胞に、癌性となる前にそれら自身を破壊することを指示するためにも、アポトーシスを使用する。一部の癌を引き起こすウイルスは、正常なアポトーシス過程を中止するように感染した(形質転換された)細胞を再プログラムすることにより、この防御手段(safeguard)を突破する。例えば、いくつかのヒトパピローマウイルス(HPV)は、p53アポトーシスプロモーターを失活するタンパク質(E6)を産生することにより形質転換された細胞のアポトーシス除去を抑制することにより、子宮頚癌を引き起こすことに関連している。同様に単核細胞症およびバーキットリンパ腫の原因物質であるエプスタインバーウイルス(EBV)は、感染した細胞を、異常な細胞の通常のアポトーシス除去を妨害するようなタンパク質を産生するように再プログラムし、その結果癌細胞の増殖およびその生物全体への拡散をもたらす。
【０００６】
さらに他のウイルスは、癌発生を直接もたらすことはせずに、細胞のアポトーシス機構を破壊的に操作する。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染した個体における免疫系の破壊は感染CD4+ T細胞(100,000個中約1個)が、非感染姉妹細胞にアポトーシスを受けることを指示することを通じて進行すると考えられる。
【０００７】
非ウイルス手段により生じる一部の癌も、アポトーシスによる破壊を回避するための機構を生じている。例えば、骨髄腫細胞は、Apaf-1をコードしている遺伝子の発現を阻害することにより、アポトーシスを回避する。別の癌細胞、特に肺癌および結腸癌の細胞は、異常な細胞のCTLが媒介したクリアランスの開始を阻害する可溶性デコイ分子を高レベル分泌する。アポトーシス機構の誤調節は、様々な変性状態および血管疾患にも関連している。
【０００８】
アポトーシス過程およびその細胞機構の制御された調節は、多細胞生物の生存にとって死活に関わることは明らかである。典型的には、アポトーシス発生を被ることを指示された細胞において生じる生化学的変化は、一連の進行で生じる。しかしながら先に示したように、アポトーシス調節の欠損は、生物において重篤な有害作用を引き起こし得る。
【０００９】
異常な細胞(例えば、癌細胞)においてアポトーシス機構の調節を制御および回復する様々な試みがある。例えば、異常な細胞が増殖する前にこれらを破壊するための細胞毒性物質を開発するために、多くの研究が行われている。細胞毒性物質はそれ自身、ヒトおよび動物の両方の健康にとって広範な利用性があり、かつほぼ全ての型の癌および過増殖性自己免疫障害、例えばエリテマトーデスおよび慢性関節リウマチなどを処置する最初の指針を示している。
【００１０】
臨床用途において多くの細胞毒性物質は、DNAを損傷することにより、それらの作用を発揮する(例えば、シスプラチン(シス-ジアミノジクロプラタニム(cis-diaminodichroplatanim)(II))はDNAに架橋結合するのに対し、ブレオマイシンは鎖切断を誘導する)。この核損傷は、p53システムのような細胞因子が認められるならば、損傷された細胞の死滅につながるアポトーシスカスケードを開始させる。
【００１１】
しかしながら、現存する細胞毒性化学療法剤には、重篤な欠点がある。例えば多くの公知の細胞毒性物質は、健康な細胞と罹患した細胞の間の識別をほとんど示さない。この特異性欠如は、有効性を制限しかつ/または早期死亡をもたらすような重度の副作用を生じることが多い。さらに多くの現存する細胞毒性物質の長期間投与は、更なる投与の有効性を低下させるかまたは無効とする抵抗性遺伝子(例えば、bcl-2ファミリーまたは多剤耐性(MDR)タンパク質)の発現をもたらす。一部の細胞毒性物質は、p53および関連タンパク質に突然変異を誘発する。これらの考察に基づいて、理想的な細胞毒性薬物は、罹患した細胞のみを殺傷し、化学療法抵抗性となりにくいものでなければならない。
【００１２】
罹患した細胞を選択的に殺傷するひとつの戦略とは、罹患した細胞において発現される分子を選択的に認識する薬物の開発である。従って効果的細胞毒性化学療法剤は、疾患の指標となる分子を認識し、かつ(例えば、直接的または間接的のどちらかで)罹患した細胞の死滅を誘導するであろう。一部の型の癌細胞上のマーカーは、治療的抗体および小分子で同定されかつ標的化されているが、ほとんどの癌において、診断的および治療的探索のための独自の特性は分かっていない。さらに狼瘡のような疾患について、創薬のための特異的分子標的は同定されていない。
【００１３】
アポトーシス過程の誤調節を特徴とする疾患および状態(例えば、ウイルス感染、過増殖性自己免疫疾患、慢性炎症状態、および癌)に罹患した対象におけるこれらの過程を調節するための改善された組成物および方法が必要とされている。
【発明の開示】
【００１４】
概要
本発明は、多くの疾患および状態を処置する際の使用を見出し、ならびに研究、化合物スクリーニング、および診断の適用における使用を見出す新規化合物を提供する。また、本発明は、特定の生物反応を誘発する、これらの新規化合物の使用、ならびに公知の化合物の使用(例えば、特定の標的分子と結合し、および/または特定の細胞事象を生じさせる化合物)を提供する。このような化合物および使用を本出願の全体にわたって記述してあり、組成物および適用の多様なコレクションを表す。
【００１５】
特定の好ましい組成物および使用を下記に記述する。本発明は、これらの特定の組成物および使用に限定されるわけではない。
【００１６】
本発明は、本出願の全体にわたって記述したように、多くの有用な組成物を提供する。本関連組成物の一定の好ましい態様は、以下の式を含む組成物を含む：
2008505913.tif 000002
式中、R1は、ナフタルアラニン；フェノール；1-ナフタレノール；2-ナフタレノール；
2008505913.tif 000003
およびキノリン；から選択され、式中、R2は、
2008505913.tif 000004
からなる群より選択され；ならびに、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
【００１７】
本関連組成物のその他の好ましい態様は、以下の式を含む組成物を含む：
2008505913.tif 000005
式中、R1は、H、アルキル、または置換されたアルキルから選択され；式中、R2は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、複素環から選択され；式中、R3は、H、アルキルまたは置換されたアルキルから選択され、かつ式中、多くても1つの置換基が、ヒドロキシル亜族であり；式中、R4は、
2008505913.tif 000006
から選択され、式中、n=0〜5であり；ならびに、式中、R1、R2、R3、およびR4は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
【００１８】
本関連組成物のさらに他の好ましい態様は、以下の式を含む組成物を含む：
2008505913.tif 000007
式中、R1は、H、アルキル、または置換されたアルキルから選択され；式中、R2は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、複素環から選択され；式中、R3はH、アルキル、または置換されたアルキルから選択され、かつ多くても1つの置換基が、ヒドロキシル亜族であり；式中、R4は、
2008505913.tif 000008
から選択され、式中、n=0〜5であり；ならびに、式中、R1、R2、R3、およびR4は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
【００１９】
その他の好ましい態様において、本発明は、薬学的組成物を提供する。このような態様において、本発明は、オリゴマイシン付与タンパク質と結合する化合物および薬剤(例えば、レズベラトロル、ピセタノール、エストロゲン、ランソプラゾール)を提供する。
【００２０】
また、本発明は、細胞死を調節する際に有用な方法および組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、対象および以下からなる群より選択される式を含む組成物を提供する：
2008505913.tif 000009
2008505913.tif 000010
2008505913.tif 000011
式中、Rは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル-、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、および複素環から選択され；かつこのような組成物は、対象に投与される。
【００２１】
さらにその他の好ましい態様において、本発明は、細胞の増殖を調節するための組成物および方法を提供する。このような態様において、本発明は、対象および以下から選択される式を含む組成物を提供する：
2008505913.tif 000012
2008505913.tif 000013
2008505913.tif 000014
式中、Rは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル-、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、および複素環から選択され；かつ組成物は、対象に投与される。
【００２２】
本発明は、細胞、組織、および生物体の運命に影響を与えるための多くの方法を提供する。本発明の一定の好ましい態様は、細胞死を調節するための方法を含む。このような態様において、本発明は、ミトコンドリアを有する標的細胞および以下の式を含む組成物を提供する：
2008505913.tif 000015
式中、R1は、ベンゼンよりも大きな疎水性芳香族基を含み；式中、R2は、フェノール性ヒドロキシル基を含み；ならびに、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。さらなる態様において、細胞は、組成物が該細胞におけるスーパーオキシド・レベルを増大するか、または細胞ATPレベルを変化させるために、オリゴマイシン感受性付与タンパク質と結合するような条件下で組成物に曝露される。
【００２３】
その他の態様において、標的細胞は、インビトロの細胞である。その他の態様において、標的細胞は、インビボの細胞である。さらに他の態様において、標的細胞は、エクスビボの細胞である。さらにその他の態様において、標的細胞は、癌細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、B細胞、T細胞、および顆粒球からなる群より選択される。
【００２４】
細胞死の調節に使用されるその他の態様において、本発明は、また、以下の組成物を提供する：
2008505913.tif 000016
式中、R1は、ナフタルアラニン；フェノール；1-ナフタレノール；2-ナフタレノール；
2008505913.tif 000017
およびキノリンからなる群より選択され；式中、R2は、
2008505913.tif 000018
からなる群より選択され：ならびに、式中、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
【００２５】
本発明により細胞死を調節する好ましい態様において、標的細胞に対する組成物の曝露により、標的細胞の細胞死の増加を生じる。
【００２６】
本発明は、また、細胞の増殖を調節するための方法および組成物を提供する。このような態様において、本発明は、ミトコンドリアを有する増殖性標的細胞、および以下の式を含む組成物を提供する：
2008505913.tif 000019
式中、R1は、ベンゼンよりも大きな疎水性芳香族基を含み；式中、R2は、フェノール性ヒドロキシル基を含み；式中、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含み；ならびに細胞は、組成物が細胞におけるスーパーオキシド・レベルを増大するか、または細胞のATPレベルを変化させるためにミトコンドリアのATP合成酵素複合体と結合するような条件下で組成物に曝露される。好ましい態様において、組成物は、オリゴマイシン感受性付与タンパク質と結合する。
【００２７】
いくつかの態様において、標的細胞は、インビトロの細胞である。その他の態様において、標的細胞は、インビボの細胞である。さらに他の態様において、標的細胞は、エクスビボの細胞である。その他の態様において、標的細胞は、癌細胞である。さらにその他の態様において、標的細胞は、B細胞、T細胞、および顆粒球からなる群より選択される。なおさらなる態様において、標的細胞は、増殖性細胞である。
【００２８】
本発明により細胞の増殖を調節するその他の態様において、本発明は、以下の組成物を提供する：
2008505913.tif 000020
式中、R1は、ナフタルアラニン；フェノール；1-ナフタレノール；2-ナフタレノール；
2008505913.tif 000021
およびキノリンから選択され；式中、R2は、
2008505913.tif 000022
からなる群より選択される。
【００２９】
本発明のさらにその他の好ましい態様は、以下の式を含む組成物(RおよびS鏡像異性体ならびにラセミ混合物を含む)を含む：
2008505913.tif 000023
式中、R1、R2、R3およびR4は、以下からなる群より選択される：水素；CH3；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも１つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R5は、OH；NO2；NR'；OR'からなる群より選択され；式中、R'は、以下からなる群より選択され：直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2���の炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R6は、以下からなる群より選択され：水素；NO2；Cl；F；Br；I；SR'；およびNR'2、式中、R'は、上記R5のように定義され；式中、R7は、以下からなる群より選択され：水素；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；ならびに、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり；式中、該ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含み、かつアリールまたは脂肪族環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的(例えば、ミトコンドリア)に到達するまで、R5の酸素をインビボでの代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位にて代謝されてR5をヒドロキシル基に変換する。
【００３０】
加えて、好ましい態様において、R5は、細胞ミトコンドリアとの相互作用において機能する(すなわち、R5の非存在下において、化合物は、ミトコンドリア成分に対して減少した結合親和性を有する)。さらなる態様において、R1〜R4は、組成物、特にR5のヒドロキシル基の望まれない代謝を防止するように機能する。さらにその他の態様において、R1〜R4は、組成物の細胞ミトコンドリア代謝を促進するように機能する。その他の好ましい態様において、細胞ミトコンドリアと組成物の相互作用には、OSCPを結合することを含む。さらなる態様において、OSCPの結合は、スーパーオキシド・レベルの増加を生じさせる。その他の好ましい態様において、R5は、細胞の増殖の制御および細胞アポトーシス制御において機能する。
【００３１】
また、本発明は、欠陥のある血管を処置するための組成物および方法を提供する。例えば、本発明は、欠陥のある心臓血管を処置するための組成物および方法を提供する。好ましい態様において、欠陥のある血管は、閉塞された血管である。いくつかの態様において、本発明は、薬物を溶出するステント媒体を提供する工程を含む、欠陥のある血管を処置する方法を提供する。好ましい態様において、薬物を溶出するステント媒体は、本発明の薬学的組成物を含む。好ましい態様において、薬学的組成物は、薬物を溶出するステント培体上にコーティングされる。さらなる態様において、薬学的組成物は、薬剤および薬学的に許容される賦形剤を含む。好ましい態様において、薬剤は、本明細書に記述された任意の構造を含む。
【００３２】
欠陥のある血管に罹患している対象における欠陥のある血管を処置するための組成物および方法の範囲において、本発明は、薬物を溶出するステント媒体で該対象を処置する工程、および欠陥のある血管に対して薬学的組成物を適用する工程をさらに含む。いくつかの態様において、該欠陥のある血管上への薬学的組成物の適用により、再狭窄を阻害する。さらにさらなる態様において、薬学的組成物の適用により、平滑筋細胞分化、遊走、および増殖を阻害する。
【００３３】
その他の態様において、薬学的組成物は、接着剤をさらに含む。いくつかの態様において、接着剤は、生体分解性である。さらなる態様において、接着剤は、フィブリンのりである。ある態様において、本発明は、治療的組成物を同定する方法をさらに提供する。いくつかの態様において、本方法は、ミトコンドリアF1F0-ATPaseを含む試料および候補F1F0-ATPase阻害剤を提供する。さらなる態様において、試料を阻害剤と接触させる。さらなる態様において、該ミトコンドリアのF1F0-ATPaseのkcat/Kmを測定し、主にF1F0-ATPase-基質複合体を結合し、かつ該ミトコンドリアF1F0-ATPaseの結合による該ミトコンドリアF1F0-ATPaseの該kcat/Km比を変化させない組成物が治療的組成物として選択される。
【００３４】
一部の好ましい態様において、本方法は、選択された組成物を、低毒性であること、および自己免疫疾患を処置する能力があることを同定するために、動物において試験する工程をさらに含む。
【００３５】
その他の好ましい態様において、試料は、ミトコンドリアをさらに含む。その他の態様において、F1F0-ATPaseは、純粋な酵素である。さらなる態様において、F1F0-ATPaseは、亜ミトコンドリア粒子に位置する。
【００３６】
さらなる好ましい態様において、kcat/Km比は、ATP濃度の関数として、ATP加水分解または合成の割合を決定することによって測定される。さらなる態様において、kcat/Km比は、Km、Vmax、およびkmから算出される。
【００３７】
さらなる好ましい態様において、選択された組成物は、高基質濃度にて高阻害活性および低基質濃度にて低活性を有する。
【００３８】
ある態様において、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法を提供する。このような態様において、対象およびミトコンドリアF1F0-ATPaseに結合することができるが、一方F1F0-ATPase kcat/Km比を変化させない組成物が提供され、組成物は、対象に投与される。
【００３９】
ある態様において、本発明は、高増殖性上皮細胞を伴う試料を提供することを含む、高増殖性上皮細胞を調節する方法であって、組成物は、ベンゾジアゼピン化合物を含み、かつ組成物を試料に適用する方法を提供する。その他の好ましい態様において、組成物は、高増殖性上皮細胞内のROSレベルを増大する薬剤を含む。
【００４０】
好ましい態様において、組成物を試料に適用することにより、試料中のROSレベルを増大する。好ましい態様において、組成物を試料に適用することにより、試料中のErk 1/2活性化を減少させる。好ましい態様において、組成物を試料に適用することにより、試料中のケラチノサイト増殖を阻害する。
【００４１】
好ましい態様において、組成物は、局所的副腎皮質ステロイドをさらに含む。いくつかの態様において、局所的副腎皮質ステロイドは、トリアムシノロンアセトニド0.1％クリーム、およびジプロピオン酸ベタメタゾン0.05％クリームからなる群より選択される。好ましい態様において、組成物は、コールタール2〜10％をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、ビタミンD-3類似体をさらに含む。いくつかの態様において、ビタミンD-3類似体は、カルシポトリエンである。好ましい態様において、組成物は、角質溶解薬をさらに含む。いくつかの態様において、角質溶解薬は、アントラリン0.1〜1％である。好ましい態様において、組成物は、局所的レチノイドをさらに含む。いくつかの態様において、局所的レチノイドは、トレチノイン、およびタザロテンからなる群より選択される。
【００４２】
好ましい態様において、試料は、生きた対象である。好ましい態様において、生きた対象は、上皮過形成に罹患しているヒトである。好ましい態様において、生きた対象は乾癬を有する。
【００４３】
好ましい態様において、薬剤は、Bz-423または本明細書に開示したその他の化合物である。好ましい態様において、薬剤は、RおよびS鏡像異性形態ならびにラセミ混合物を含む以下の式を含む：
2008505913.tif 000024
；式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され；水素；CH3；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R5は、OH；NO2；OR'；からなる群より選択され、式中R'は、以下からなる群より選択され：直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R6は、以下からなる群より選択され：水素；NO2；Cl；F；Br；I；SR'；およびNR'2；式中、R'は上記R5のように定義される；式中、R7は、水素；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され；ならびにR8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり；式中、ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。
【００４４】
ある態様において、本発明は、ベンゾジアゼピン化合物および以下の群から選択される薬剤を含む薬学的組成物を提供する：局所的副腎皮質ステロイド、角質溶解薬、局所的レチノイド、コールタール2〜10％、およびビタミンD-3類似体。その他の好ましい態様において、本発明は、高増殖性上皮細胞内のROSレベルを増大する化合物および以下の群から選択される薬剤を提供する：局所的副腎皮質ステロイド、角質溶解薬、局所的レチノイド、コールタール2〜10％、およびビタミンD-3類似体。
【００４５】
好ましい態様において、ベンゾジアゼピン化合物は、Bz-423である。好ましい態様において、高増殖性上皮細胞内のROSレベルを増大する化合物は、Bz-423である。好ましい態様において、高増殖性上皮細胞内のROSレベルを増大する化合物は、RおよびS鏡像異性形態ならびにラセミ混合物を含む以下の式を含む：
2008505913.tif 000025
；式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され：水素；CH3；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R5は、OH；NO2；OR'からなる群より選択され；式中R'は、以下からなる群より選択される：直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R6は、以下からなる群より選択され：水素；NO2；Cl；F；Br；I；SR'；およびNR'2；式中、R'は、上記R5のように定義され；式中、R7は、水素；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され；ならびにR8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり；式中、ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。
【００４６】
好ましい態様において、薬学的組成物は、上皮過形成を処置するために使用される。好ましい態様において、上皮過形成は、乾癬によって生じる。
【００４７】
定義
本発明の理解を促進するために、多くの用語および語句を以下に定義する。
【００４８】
本明細書において使用される「ベンゾジアゼピン」という用語は、フェニル環に融合した7員の非芳香族系環状複素環であり、ここで7員環は環状複素環の一部として2個の窒素原子を有するものを意味する。一部の局面において、この2個の窒素原子は、下記一般構造において示されるように、1位および4位にある。
2008505913.tif 000026
【００４９】
ベンゾジアゼピンは、1個のケト基(典型的には2位)、または各々2位および5位で2個のケト基で置換することができる。ベンゾジアゼピンが2位および5位に各々1個ずつ2個のケト基を有する場合、これはベンゾジアゼピン-2,5-ジオンと称される。最も一般的には、ベンゾジアゼピンはさらに、6員のフェニル環もしくは7員の環状複素環のどちらかまたは両方の環上で様々な置換基により置換される。これらの置換基は、本明細書でより完全に記載される。
【００５０】
「ベンゼンより大きい」という用語は、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を意味する。
【００５１】
本明細書において、使用される「置換された脂肪族」という用語は、少なくとも1個の脂肪族水素原子が、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または環(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式など)で置換されている、10個未満の炭素を有するアルカンを意味する。このような例は、1-クロロエチルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５２】
本明細書において使用される「置換されたアリール」という用語は、芳香環、または少なくとも1個は芳香族である3個以下の融合環からなる融合芳香環システムであり、ここで環の炭素上の少なくとも1個の水素原子が、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または環(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式など)で置換されているものを意味する。このような例は、ヒドロキシフェニルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
本明細書において使用される「脂環式」という用語は、8個未満の炭素を有するシクロアルカンまたは3個以下の融合した脂環式環からなる融合環システムを意味する。このような例は、デカリンなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５４】
本明細書において使用される「置換された脂環式」という用語は、少なくとも1個の脂肪族水素原子が、ハロゲン、ニトロ、チオ、アミノ、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式)環で置換されている、8個未満の炭素を有するシクロアルカンまたは3個以下の融合環からなる融合環システムを意味する。このような例は、1-クロロデカリル、ビシクロ-ヘプタン、オクタン、およびノナン(例えばノンルボルニル(nonrbornyl))などを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５５】
本明細書において使用される「複素環」という用語は、少なくとも1個の環炭素原子が酸素、窒素または硫黄により置換されている、8個未満の炭素を有するシクロアルカンおよび/またはアリール環システム、または3個以下の融合環からなる融合環システムを意味する。このような例は、モルホリノなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５６】
本明細書において使用される「置換された複素環」という用語は、少なくとも1個の環炭素原子が酸素、窒素または硫黄により置換され、ならびに少なくとも1個の脂肪族水素原子は、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または環(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式)で置換されている、8個未満の炭素を有するシクロアルカンおよび/またはアリール環システム、または3個以下の融合環からなる融合環システムを意味する。このような例は、2-クロロピラニルを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５７】
本明細書において使用される「リンカー」という用語は、ふたつの異なる構造部分を連結している連続した最大8個の原子からなりかつこれを含む鎖を意味し、ここでそのような原子は、例えば炭素、窒素、酸素または硫黄である。エチレングリコールは、ひとつの限定的でない例である。
【００５８】
本明細書において使用される「アミノ置換された低級アルキル」という用語は、1個の脂肪族水素原子がアミノ基で置換されているような、最大8個の炭素原子からなりかつこれを含むアルキル単位を意味する。このような例は、エチルアミノなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
本明細書において使用される「ハロゲン置換された低級アルキル」という用語は、1個の脂肪族水素原子がハロゲンで置換えられているような、最大8個の炭素原子からなりかつこれを含むアルキル鎖を意味する。このような例は、クロロエチルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６０】
本明細書において使用される「アセチルアミノ」という用語は、アセチル化された第一級または第二級アミノを意味する。このような例は、アセトアミドなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
本明細書において使用される用語である化合物の「誘導体」とは、化学修飾が、化合物の官能基でまたは芳香環上のどちらかに生じるような、化学的に修飾された化合物を意味する。本発明の非限定的な例である1,4-ベンゾジアゼピン誘導体は、この化合物の利用可能な窒素のどちらかに、N-アセチル基、N-メチル基、N-ヒドロキシ基を含んでもよい。追加の誘導体は、フェニル環上にトリフルオロメチル基を有するものを含んでもよい。
【００６２】
本明細書に使用される「上皮過形成」という用語は、表皮組織における正常な配置の正常細胞の数の異常な増殖または増大をいう。上皮過形成は、乾癬を含むが、これに限定されるわけではない多数の障害の特徴である。
【００６３】
本明細書に使用される「ケラチノサイト」という用語は、表皮の角質化された層の皮膚細胞をいう。
【００６４】
本明細書に使用される「線維芽細胞」という用語は、原繊維プロコラーゲン、フィブロネクチン、およびコラゲナーセを分泌する結合組織の中胚葉に由来するレジデント細胞をいう。
【００６５】
本明細書に使用される「ステント」または「薬物溶出ステント」という用語は、処置される内腔壁の部位と接触して配置された場合、フィブリンを内腔壁にも配置して内腔壁にそれを保持すると考えられる任意の装置をいう。これには、特に冠状動脈閉塞を処置し、ならびに脾臓、頚動脈、腸骨、および膝窩の血管の切開または動脈瘤をふさぐために経皮的に送達される装置を含むことができる。また、ステントは、フィブリンが適用される面に基礎をなす重合体もしくは金属構造エレメントを有することができ、またはステントは、重合体と混在したフィブリンの複合体であり得る。例えば、米国特許第4,886,062号(本明細書に参照として組み入れられる)に開示されたものなどの変形可能な金属線ステントは、前述のように1つまたは複数のコートにおいてフィブリンでコーティングするか(すなわち、フィブリノーゲン溶液およびフィブリノーゲン凝固タンパク質の溶液の適用による金属骨格上でのフィブリンの重合)または囲んでいるフィブリンの被膜などの付着されたフィブリン・プレフォームを提供することができる。次いで、ステントおよびフィブリンをバルーンカテーテルの遠位端にてバルーン上に配置し、従来の経皮的手段(例えば、血管形成術法に記載)によって狭窄または閉鎖が処置される部位に送達することができ、次いで、ここでバルーンを膨張させることによってこれを膨張させて体内管腔と接触する。次いで、カテーテルを引っ込めて、本発明のフィブリン・ステントを処置部位にて適所に放置する。したがって、ステントは、処置の部位の内腔のための支持構造、さらには内腔壁にてフィブリンの安全な配置を支える構造の両方を提供し得る。一般に、薬物溶出ステントは、ステント実施部位にて特定の薬物を有効に放出することができる。
【００６６】
本明細書に使用される「カテーテル」という用語は、一般に体腔または血管に接近するために使用されるチューブをいう。
【００６７】
本明細書に使用される「弁」または「血管」という用語は、哺乳動物内の任意の内腔をいう。例には、動脈、静脈、毛細管、および生物学的内腔を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６８】
本明細書に使用される「再狭窄」という用語は、狭くなっている任意の弁をいう。例には、動脈の狭窄した部分を開く努力によって、例えば、動脈のバルーン拡張、切除、粥腫切除、またはレーザー治療などによって生じるその動脈に対する外傷後の末梢または冠動脈の再閉鎖を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６９】
本明細書に使用される「血管形成術」または「バルーン療法」または「バルーン血管形成術」または「経皮的冠動脈形成術」は、血管を大きくし、これにより血流を改善するためのバルーンカテーテルの使用を含む、血管障害を処置する方法をいう。
【００７０】
本明細書に使用される「心臓カテーテル法」または「冠状血管造影図」は、カテーテル法を使用して冠状動脈疾患を診断するために使用される試験をいう。このような手順は、例えば、カテーテルを経て冠動脈に対照色素を注入すること、狭くなったか、または遮断された動脈の可視化を可能にすることを含み得る。
【００７１】
本明細書において使用される「対象」という用語は、本発明の方法で処理される生物を意味する。このような生物は、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど)を含むが、これらに限定されるわけではなく、ヒトが最も好ましい。本発明に関連する「対象」という用語は一般に、アポトーシス過程の調節不良により特徴付けられる状態の処置(例えば、ベンゾジアゼピン化合物の、および任意に1種または複数の他の物質の投与)を受けるであろうまたは受けている個体を意味する。
【００７２】
本明細書において使用される「診断された」という用語は、疾患のその徴候および症状(例えば、従来の療法に対する抵抗性)、または遺伝解析、病理分析、組織学的分析などによる認識を意味する。
【００７３】
本明細書において使用される「抗癌剤」という用語または「通常の抗癌剤」とは、癌の処置において使用される任意の化学療法用化合物、放射線療法、または外科的介入を意味する。
【００７４】
本明細書において使用される「インビトロ」という用語は、人工的環境および人工的環境内において起こる過程または反応を意味する。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物を含むが、これらに限定されるわけではない。「インビボ」という用語は、天然の環境(例えば、動物または細胞)ならびに天然の環境内において起こる過程または反応を意味する。
【００７５】
本明細書において使用される「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボに配置された、任意の真核細胞または原核細胞(例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞)を意味する。
【００７６】
本明細書において使用される「細胞培養物」という用語は、任意のインビトロ細胞培養物を意味する。この用語に含まれるのは、連続する細胞株(例えば、不死化表現型を持つ)、初代細胞培養物、有限増殖細胞株(例えば、形質転換されない細胞)、ならびに卵母細胞および胚を含むインビトロにおいて維持された他の細胞集団である。
【００７７】
好ましい態様において、本発明の組成物および方法の「標的細胞」とは、リンパ系細胞または癌細胞を意味する段階を含むが、これらに限定されるわけではない。リンパ系細胞は、B細胞、T細胞、および顆粒球を含む。顆粒球は、好酸球およびマクロファージを含む。いくつかの態様において、標的細胞は、患者生検標本から得られた連続培養された細胞または連続培養されない細胞である。
【００７８】
癌細胞は、腫瘍細胞、新生物細胞、悪性細胞、転移性細胞、および過形成性細胞を含む。新生物細胞は、良性または悪性であり得る。新生物細胞が浸潤または転移しない場合は、これらは良性である。悪性細胞は、浸潤および/または転移することができるものである。過形成は、構造または機能の重大な変更を伴わない、組織または臓器内の細胞の病的蓄積である。
【００７９】
ひとつの具体的態様において、標的細胞は、病的成長または増殖を示す。本明細書において使用される「病的に増殖するまたは成長する細胞」という用語は、正常な成長の通常の制限によっては支配されないような、動物において増殖する細胞の局在化された集団を意味する。
【００８０】
本明細書において使用される「活性化されていない標的細胞」という用語は、G0相である細胞または刺激が適用されない細胞のどちらかを意味する。
【００８１】
本明細書において使用される「活性化された標的リンパ系細胞」という用語は、シグナル伝達カスケードを引き起こすように、適当な刺激によりプライミングされたリンパ系細胞、あるいは、G0相でないリンパ系細胞を意味する。活性化されたリンパ系細胞は、増殖し、活性化が誘導した細胞死を受けるか、もしくは1つまたは複数の細胞毒、サイトカイン、ならびに細胞型を特徴付ける他の関連した膜会合タンパク質(例えば、CD8+またはCD4+)を産生することができる。これらは、特定の抗原をその表面に提示している標的細胞を認識および結合し、引き続きそのエフェクター分子を放出することも可能である。
【００８２】
本明細書において使用される「活性化された癌細胞」という用語は、シグナル伝達を引き起こすように、適当な刺激によりプライミングされた癌細胞を意味する。活性化された癌細胞は、G0相であっても無くてもよい。
【００８３】
活性化物質は、標的細胞との相互作用時に、シグナル伝達カスケードをもたらす刺激である。活性化刺激の例は、小分子、放射エネルギー、および細胞活性化する細胞表面受容体に結合する分子を含むが、これらに限定されるわけではない。活性化刺激により誘導された反応は、とりわけ、細胞内Ca2+、スーパーオキシド、またはヒドロキシルラジカルレベル；キナーゼもしくはホスファターゼのような酵素の活性；または、細胞のエネルギー状態により、特徴付けることができる。
【００８４】
ひとつの局面において、活性化物質は、細胞表面活性化受容体に結合する物質である。これらは、T細胞受容体リガンド、B細胞活性化因子(「BAFF」)、TNF、Fasリガンド(FasL)、CD40リガンド、増殖誘導リガンド(「APRIL」)、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、アミノ酸(すなわちグルタミン酸)、ステロイド、B細胞受容体リガンド、γ線照射、UV照射、細胞ストレスを増強する物質もしくは条件、または細胞表面活性化受容体を特異的に認識および結合する抗体(例えば、抗CD4、抗CD8、抗CD20、抗TACI、抗BCMA、抗TNF受容体、抗CD40、抗CD3、抗CD28、抗B220、抗CD38、抗CD19、および抗CD21)からなる群より選択することができる。BCMAはB細胞成熟抗原受容体であり、かつTACIは膜貫通アクチベーターおよびCAML相互作用子である(Gross, A. et al.(2000)；Laabi, Y. et al.(1992)およびMadry, C. et al.(1998))。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはそれらの混合物を含む。
【００８５】
T細胞リガンドの例は、MHC分子に結合するペプチド、ペプチドMHC複合体、またはT細胞受容体の成分を認識する抗体を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８６】
B細胞リガンドの例は、B細胞受容体の成分に結合するまたは認識する分子または抗体を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８７】
細胞表面活性化受容体に結合する試薬の例は、これらの受容体のまたはそれらに対して生じた抗体(例えば、抗CD20)の天然のリガンドを含むが、これらに限定されるわけではない。RITUXIN(Genentech社、サンフランシスコ、CA)は、市販の抗CD20キメラモノクローナル抗体である。
【００８８】
細胞ストレスを増強する物質または条件の例は、熱、照射、酸化ストレス、または増殖因子離脱(withdrawal)などを含む。増殖因子の例は、血清、IL-2、血小板由来増殖因子(「PDGF」)などを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８９】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、有益なまたは望ましい結果を作用するのに十分な化合物(例えば、ベンゾジアゼピン)の量を意味する。有効量は、1回または複数回の投与、塗布または用量で投与されうり、かつ特定の製剤または投与経路に限定されることが必ずしも意図されるわけではない。
【００９０】
本明細書において使用される「細胞死の過程の調節不良」という用語は、ネクローシスまたはアポトーシスのどちらかにより細胞死を受ける細胞の能力(例えば、素因)の異常を意味する。細胞死の調節不良は、例えば、自己免疫障害(例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、重症筋無力症、シェーングレン症候群など)、慢性炎症状態(例えば、乾癬、喘息およびクローン病)、過増殖性障害(例えば、腫瘍、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫など)、ウイルス感染症(例えば、ヘルペス、パピローマ、HIV)、ならびに変形性関節症およびアテローム動脈硬化症などのその他の状態のような、様々な状態に関連するかまたは状態により誘導される。
【００９１】
調節不良がウイルス感染症により誘導されるまたはこれに関連する場合に、調節不良が生じるまたは観察される時点で、このウイルス感染症が検出可能であってもなくてもよいことに注目されたい。すなわち、ウイルスが誘導した調節不良は、ウイルス感染症の症状が消失した後であっても生じ得る。
【００９２】
本明細書において使用される「過増殖性障害」という用語は、動物において増殖している細胞の局在化された集団が、正常な成長の通常の制限により支配されないような状態を意味する。過増殖性障害の例は、腫瘍、新生物、リンパ腫などを含む。新生物は、浸潤または転移を受けない場合は良性、およびこれらのどちらかを受ける場合は悪性と称される。転移性細胞または組織とは、細胞が、近傍の体構造を浸潤し、かつ破壊することを意味する。過形成は、構造または機能に重大な変化を伴わない、組織または臓器における細胞数の増加に関与している細胞増殖の形である。化生は、ある種の完全に分化した細胞が、別種の分化した細胞と置き換わるような制御された細胞成長の形である。化生は、上皮細胞または結合組織細胞において生じることができる。典型的化生は、若干無秩序な上皮化生に関連している。
【００９３】
活性化されたリンパ球の病的増殖により、自己免疫疾患または慢性炎症性状態を生じることが多い。本明細書に使用される「自己免疫疾患」という用語は、生物体が生物体の自身の分子、細胞、もしくは組織を認識する抗体または免疫細胞を産生する任意の状態をいう。自己免疫疾患の非限定の例には、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、ベルガー病またはIgA腎症、セリアックスプルー、慢性疲労症候群、クローン病、皮膚筋炎、線維筋痛、移植片対宿主病、甲状腺機能亢進症、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少症紫斑病、扁平苔癬、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、白斑等を含む。
【００９４】
本明細書において使用される「慢性炎症状態」という用語は、生物の免疫細胞が活性化された状態を意味する。このような状態は、病的続発症を伴う難治性の炎症反応を特徴とする。この状態は、単核細胞の浸潤、線維芽細胞および細血管の増殖、増大した結合組織、ならびに組織破壊により特徴付けられる。慢性炎症疾患の例は、クローン病、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症、および喘息を含むが、これらに限定されるわけではない。慢性関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患も、慢性炎症状態をもたらすことがある。
【００９５】
本明細書において使用される「同時投与」という用語は、少なくとも2種の物質(例えば、ベンゾジアゼピン類)または療法の対象への投与を意味する。いくつかの態様において、2種またはそれよりも多い物質/療法の同時投与は、同時進行される。別の態様において、第一の物質/療法の後、第二の物質/療法が投与される。当業者は、使用される様々な物質/療法の投与の製剤および/または経路を変動できることを理解している。同時投与に適した用量は、当業者により容易に決定することができる。いくつかの態様において、物質/療法が同時投与される場合、各々の物質/療法は、それらの単独投与に適したものよりも低い用量で投与される。従って同時投与は、物質/療法の同時投与が有害であることが推定される(例えば毒性)物質の必要量を低下させるような態様に特に望ましい。
【００９６】
本明細書において使用される「毒性」という用語は、毒物投与前の同じ細胞または組織と比べ、細胞または組織にとって不利なまたは有害な作用を意味する。
【００９７】
本明細書において使用される「薬学的組成物」という用語は、特にインビボ、インビボまたはエクスビボにおける診断的または治療的用途に適した組成物を作成する、活性物質の、不活性または活性の担体との組合せを意味する。
【００９８】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝された生理食塩水、水、乳剤(例えば、水中油型または油中水型乳剤)、ならびに様々な種類の湿潤剤のような、任意の標準的薬学的担体を意味する。これらの組成物は、安定剤および保存剤も含むことができる。担体の例は、安定剤およびアジュバントがある(例えば、Martin、Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、Mack Publ社、イーストン、PA [1975]参照)。
【００９９】
本明細書において使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、対象への投与時に、本発明の化合物またはそれらの活性代謝産物もしくは残基を提供する段階が可能である本発明の化合物の薬学的に許容される塩(例えば、酸または塩基)を意味する。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導することができる。酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、ホスホン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを含むが、これらに限定されるわけではない。それら自身は薬学的に許容できないシュウ酸のようなその他の酸は、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る中間体として有用な塩の調製に使用することができる。
【０１００】
塩基の例は、アルカリ金属(例えば、ナトリウム)の水酸化物、アルカリ土類金属(例えば、マグネシウム)の水酸化物、アンモニアおよび式NW4+の化合物(式中、WはC1-4アルキルである)などを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１０１】
塩の例は、下記を含むが、これらに限定されるわけではない：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩(flucoheptanoate)、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩など。その他の塩の例は、Na+、NH4+、およびNW4+(Wは、C1-4アルキル基である)などのような適当なカチオンに複合された、本発明の化合物の化合物アニオンを含む。
【０１０２】
治療的用途に関して、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるものと考えられる。しかしながら、薬学的に許容できない酸および塩基の塩は、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製における使用を認めることができる。
【０１０３】
本明細書において使用される「固相支持体」という用語または「固形支持体」とは、当業者が入手できおよび公知の多くの支持体を意味する最も広範な意味において使用される。固相支持体は、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書において使用される「固形支持体」という用語も、合成抗原を提示しているマトリックス、細胞、リポソームなどを含む。適当な固相支持体は、望ましい最終用途および様々なプロトコールに関する適性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成に関して、固相支持体は、ポリスチレン(例えば、Bachem社、Peninsula Laboratories社などから入手できるPAM樹脂)、POLYHIPE樹脂(Aminotech社、カナダから入手)、ポリアミド樹脂(Peninsula Laboratories社から入手)、ポリエチレングリコールとグラフト重合したポリスチレン樹脂(TENTAGEL、Rapp Polymere社、チュービンゲン、ドイツ)またはポリジメチルアクリルアミド樹脂(Milligen/Biosearch社(カリフォルニア)から入手)のような樹脂を意味する。
【０１０４】
本明細書において使用される「病原体」という用語は、宿主に病態(例えば、感染症、癌など)を引き起こす生物学的物質を意味する。「病原体」とは、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、プリオン、および寄生生物を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１０５】
「細菌」という用語は、原生動物界の全ての門を含む、全ての原核生物を意味する。この用語は、マイコプラズマ、クラミジア、アクチノミセス、ストレプトマイセス、およびリケッチアを含む細菌であると見なされる全ての微生物を包含することが意図されている。球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどを含む細菌の全ての形が、この定義の中に含まれる。グラム陰性またはグラム陽性である原核生物も、この用語に含まれる。「グラム陰性」および「グラム陽性」とは、当技術分野において周知のグラム染色法による染色パターンを意味する(例えば、FinegoldおよびMartin、Diagnostic Microbiology、第6版、CV Mosby、セントルイス、13-15頁[1982]参照)。「グラム陽性菌」とは、グラム染色において使用される一次色素(primary dye)を保持する細菌であり、顕微鏡下で暗青色から紫色に染色された細胞を生じる。「グラム陰性菌」とは、グラム染色において使用される一次色素を保持しないが、対比染色される細菌である。従ってグラム陰性菌は赤色に見える。
【０１０６】
本明細書において使用される「微生物」という用語は、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、および寄生生物を含むがこれらに限定されるわけではない、微生物の任意の種または型を意味する。これに含まれる多くの微生物が対象に対して病原性であり得ることが、本発明により考えられる。
【０１０７】
本明細書において使用される「真菌」という用語は、二相性糸状菌を含む、糸状菌および酵母のような真核生物を意味する。
【０１０８】
本明細書において使用される「ウイルス」という用語は、ある種の例外はあるが、光学顕微鏡では認められず、独立した代謝を欠いており、かつ生存宿主細胞内においてのみ複製することができるような、微小な感染性物質を意味する。個々の粒子(すなわちビリオン)は、典型的には、核酸およびタンパク質の殻または外皮からなり；一部のビリオンは、脂質含有膜も有する。「ウイルス」という用語は、動物、植物、ファージおよび他のウイルスを含む、全てのウイルス型を包含している。
【０１０９】
本明細書において使用される「試料」という用語は、その最も広範な意味で使用される。アポトーシス機能の調節不良を特徴とする状態を示すことが疑われる試料は、細胞、組織または液体、細胞から単離された染色体(例えば中期染色体の塗沫(spread))、(溶液中の、またはサザンブロット分析用のような固形支持体へ結合した)ゲノムDNA、(溶液中の、またはノーザンブロット分析用のような固形支持体へ結合した)RNA、(溶液中の、または固形支持体へ結合した)cDNAなどを含み得る。タンパク質を含むことが疑われる試料は、細胞、組織の一部、1種または複数のタンパク質を含有する抽出液などを含むことができる。
【０１１０】
本明細書において使用される「精製された」という用語または「精製する」とは、試料中の望ましくない成分を除去することを意味する。本明細書において使用される「実質的に精製された」という用語は、それらが通常会合された他の成分を、少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、かつ最も好ましくは90％またはそれよりも多く含まない分子を意味する。
【０１１１】
本明細書において使用される「抗原結合タンパク質」という用語は、特異抗原に結合するタンパク質を意味する。「抗原結合タンパク質」とは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびヒト化された抗体を含む免疫グロブリン、Fab断片、F(ab')2断片、およびFab発現ライブラリーを含むが、これらに限定されるわけではない。ポリクローナル抗体の作成に関して、当技術分野において公知の様々な方法が使用される。抗体産生に関して、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むがこれらに限定されるわけではない様々な宿主動物を、望ましいエピトープに対応するペプチドの注射により免疫処理することができる。好ましい態様において、このペプチドは、免疫原性担体(例えば、ジフテリア毒、ウシ血清アルブミン(BSA)、またはキーホールリンペットヘモシアニン[KLH])に複合されている。フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような界面活性剤表面、プルロニックポリマー、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(カルメット-ゲラン桿菌)および座瘡菌(Corynebacterium parvum)のような可能性のあるヒトアジュバントの使用を含むがこれらに限定されるわけではない、様々なアジュバントを用い、宿主種に応じて免疫応答を増強する。
【０１１２】
モノクローナル抗体の調製に関して、培養物中の連続細胞株により抗体分子産生を提供する任意の技術を使用することができる(例えば、HarlowおよびLane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NYを参照)。これらは、当初KohlerおよびMilsteinにより開発されたハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein、Nature、256：495-497[1975])に加え、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozbor et al, Immunol. Today、4：72[1983]参照)、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole et al, Monoclonal Antibody and Cancer Therapy、Alan R. Liss社、77-96頁[1985]参照)を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１１３】
本発明に従い、単鎖抗体の作成について説明された方法(米国特許第4,946,778号；本明細書に参照として組入れられている)を、望ましい特異的単鎖抗体を作成するために適合させることができる。追加の本発明の態様は、望ましい特異性を伴うモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な識別を可能にするために、Fab発現ライブラリーの構築に関する当技術分野において公知の技術を使用する(Huse et al, Science、246：1275-1281[1989])。
【０１１４】
抗体分子のイディオタイプ(抗原結合領域)を含む抗体断片は、公知の技術により作成される。例えば、このような断片は以下を含むが、これらに限定されるわけではない：抗体分子のペプシン消化により作成することができるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド橋の還元により作成することができるFab'断片、ならびに抗体分子のパパインおよび還元剤の処理により作成することができるFab断片。
【０１１５】
抗原結合タンパク質をコードしている遺伝子を、当技術分野において公知の方法により単離することができる。抗体産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野において公知の技術(例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線検定、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(例えばコロイド状金、酵素または放射性同位元素標識の使用)、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、ヘマグルチニン化アッセイなど)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなど)などにより実現することができる。
【０１１６】
本明細書において使用される「免疫グロブリン」という用語または「抗体」とは、特異抗原に結合するタンパク質を意味する。免疫グロブリンは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化抗体、Fab断片、F(ab')2断片、ならびにクラスIgG、IgA、IgM、IgD、IgEの免疫グロブリン、および分泌免疫グロブリン(sIg)を含むが、これらに限定されるわけではない。免疫グロブリンは一般に、二つの同一重鎖および二つの軽鎖を有する。しかしながら「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、単鎖抗体および2本鎖抗体も包含している。
【０１１７】
本明細書において使用される「エピトープ」という用語は、特定の免疫グロブリンとの接触を生じる抗原の部分を意味する。タンパク質またはタンパク質断片が宿主動物の免疫処理に使用される場合、タンパク質の多くの領域は、このタンパク質の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を引き起こすことができ；これらの領域または構造は、「抗原決定基」と称される。抗原決定基は、抗体に結合するために、完全な抗原(すなわち、免疫応答を誘起するために使用される「免疫原」)と競合し得る。
【０１１８】
抗体およびタンパク質またはペプチドの相互作用に関して使用される「特異的結合」という用語または「特異的に結合する」とは、その相互作用が、タンパク質上の特定の構造(すなわち、抗原決定基またはエピトープ)によって決まることを意味し；別の言い方をすると、その抗体は、一般的タンパク質よりもむしろ特異的タンパク質構造を認識しかつ結合する。例えば、抗体がエピトープ「A」について特異的である場合、標識された「A」およびその抗体を含有する反応液中にエピトープA(または遊離、未標識のA)を含むタンパク質が存在することは、その抗体に結合した標識されたAの量を減少するであろう。
【０１１９】
本明細書において使用される「非特異的結合」という用語および「バックグラウンド結合」とは、抗体およびタンパク質またはペプチドの相互作用に関して使用される場合、特定の構造の存在によって左右されない相互作用(すなわち、抗体は、エピトープのような特定の構造よりもむしろ一般的タンパク質に結合する)を意味する。
【０１２０】
本明細書において使用される「変調する」という用語は、化合物(例えば、ベンゾジアゼピン化合物)の活性が、細胞成長、増殖、アポトーシスなどを含むがこれらに限定されるわけではない、細胞機能の様相に対し作用する(例えば、促進または抑制する)ことを意味する。
【０１２１】
本明細書において使用される「結合に競合する」という用語は、第二の分子(例えば、第二のベンゾジアゼピン誘導体またはミトコンドリアATP合成酵素のオリゴマイシン感受性付与タンパク質と結合する別の分子など)と同じ基質(例えば、ミトコンドリアATP合成酵素のオリゴマイシン感受性付与タンパク質)に結合する活性を持つ第一の分子(例えば、第一のベンゾジアゼピン誘導体)に関して使用される。第一の分子による結合の効率(例えば、速度論または熱力学)は、第二の分子に結合する基質の効率と同じ、またはより大きい、またはより少ないことができる。例えば、基質への結合に関する平衡結合定数(KD)は、これら2種の分子について異なり得る。
【０１２２】
本明細書に使用される「該化合物を対象に投与するための説明書」という用語およびこれらの文法的相当語句は、細胞または組織におけるアポトーシスのプロセスの調節不全によって特徴付けられる状態の処置のためのキットに含まれる組成物を使用するための(例えば、投薬量、投与経路、患者特異的特徴を治療行動方針に関連付けるために医師が処置するためのディシジョントリーを提供する)説明書を含む。また、本用語は、具体的には、自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、移植片対宿主疾患、重症筋無力症、シェーグレン症候群など)、慢性炎症性状態(例えば、乾癬、喘息、およびクローン病)、高増殖性障害(例えば、腫瘍、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫など)、ウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、HIV)、ならびにその他の状態(例えば、骨関節炎およびアテローム性動脈硬化症など)を処置するためのキットに含まれる組成物を使用するための説明書をいう。
【０１２３】
「被験化合物」という用語は、体の機能の疾患、疾病、病気、または障害の処置または予防、さもなければ試料の生理的状態もしくは細胞状態(例えば、細胞または組織におけるアポトーシス調節不良のレベル)の変さらに使用することができる、薬学的、薬物などの任意の化学実体を意味する。被験化合物は、公知のおよび可能性のある治療的化合物の両方を含む。被験化合物は、本発明のスクリーニング法を用いることにより、治療的であると決定することができる。「公知の治療的化合物」とは、そのような処置または予防において有効であることが示された(例えば、動物実験またはヒトへ投与する前臨床試験により)治療的化合物を意味する。好ましい態様において、「被験化合物」とは、細胞におけるアポトーシスを変調する物質である。
【０１２４】
本明細書において使用される「第三者」という用語は、アポトーシス過程の調節不良により特徴付けられる状態を処置するための化合物の投与に関して考えられる被験化合物の販売、保管、配送、または小売りに従事した実体を意味する。
【０１２５】
発明の一般的説明
薬物の種類として、ベンゾジアゼピン化合物は、多くの疾患の処置に有効な医用薬剤であることが広範に試験されかつ報告されている。例えば、米国特許第4,076,823号、第4,110,337号、第4,495,101号、第4,751,223号および第5,776,946号は、各々その全体が本明細書に参照として組入れられているが、これらは、ある種のベンゾジアゼピン化合物が鎮痛薬および抗炎症薬として有効であることを開示している。同様に米国特許第5,324,726号および米国特許第5,597,915号は、各々その全体が本明細書に参照として組入れられているが、これらはある種のベンゾジアゼピン化合物が、コレシストキニンおよびガストリンのアンタゴニストであり、その結果ある種の胃腸障害の処置に有用であることを開示している。
【０１２６】
別のベンゾジアゼピン化合物は、とりわけ心筋性虚血、敗血症性ショック症候群のような、ヒト好中球エラスターゼが媒介した状態の処置において、ヒト好中球エラスターゼのインヒビターとして試験されている(例えば、米国特許第5,861,380号参照、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。その全体が本明細書に参照として組入れられている米国特許第5,041,438号は、ある種のベンゾジアゼピン化合物が、抗レトロウイルス薬として有用であることを開示している。
【０１２７】
注目のベンゾジアゼピン化合物が描かれたにも関わらず、種々の疾患を処置するために、本発明が新規ベンゾジアゼピン化合物および関連化合物、および新規化合物、ならびに公知の化合物を使用する方法を提供することが下記の説明から明らかとなるであろう。
【０１２８】
ベンゾジアゼピン化合物は、中枢神経系(CNS)においてベンゾジアゼピン受容体に結合することが公知であり、したがって不安症および癲癇を含む種々のCNS障害を処置するために使用されてきた。また、末梢ベンゾジアゼピン受容体が同定されており、この受容体も、付随的にCNSに存在し得る。本発明は、ベンゾジアゼピンおよび関連化合物が組織培養において増殖する形質転換細胞の処置に有用なプロアポトーシス性および細胞障害性の特性を有することを証明する。これらの化合物の作用経路は、以前に同定されたベンゾジアゼピン受容体を介していない。
【０１２９】
本発明の開発の間に行われた実験により、ベンゾジアゼピン化合物および関連化合物のための新規生物学的標的が同定された(その幾つかは、ベンゾジアゼピン化合物の全体の化学構造に対するこれらの相同性ではなく、これらが細胞の標的分子を結合する能力により関連がある)。特に、本発明は、特定のミトコンドリアのタンパク質と直接または間接的に相互作用して、所望の生物学的効果を誘発する化合物を提供する。
【０１３０】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、所望の生物学的結果を達成するための多数の新規化合物および新規細胞標的に向けられた以前に公知の化合物を提供する。その他の態様において、本発明は、生物学的過程を調節するためにこのような化合物を使用する方法を提供する。また、本発明は、化合物を同定し、かつ最適化するための薬物スクリーニング法を提供する。本発明は、疾患および状態を同定するための、治療処方計画をモニターするための、および/または最適な治療行動方針を同定するための診断マーカーをさらに提供する。これらのおよびその他の、研究および治療的な有用性を下記に記述する。
【０１３１】
発明の詳細な説明
本発明は、新規化学物質、これらの発見のための方法、およびこれらの治療用途を提供する。特に、本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物、ならびにプログラム細胞死、自己免疫、炎症、および過剰増殖などの過程の不完全な制御に関連する多数の状態を処置する治療薬としてベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物を使用する方法を提供する。
【０１３２】
本発明の例示的組成物および方法は、以下の節にさらに詳細に記述する：I.細胞死のモジュレーター；II.細胞増殖および増殖のモジュレーター；III.処置した細胞の発現解析；IV.例示的化合物；V.薬学的組成物、製剤、ならびに例示的投与経路および投薬考察；VI.薬物スクリーン；およびVII.治療適用。
【０１３３】
本発明の実施は、特に明記しない限り、有機化学、薬理学、分子生物学(組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当技術分野の技術内である。このような技術は、「Molecular cloning：a laboratory manual」 Second Edition (Sambrook et al, 1989)；「Oligonucleotide synthesis」 (M.J. Gait, ed., 1984)；「Animal cell culture」 (R.I. Freshney, ed., 1987)；the series 「Methods in enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Handbook of experimental immunology」 (D.M. Weir & CC. Blackwell, eds.)；「Gene transfer vectors for mammalian cells」 (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987)；「Current protocols in molecular biology」 (F.M. Ausubel et al, eds., 1987, and periodic updates)；「PCR：the polymerase chain reaction」 (Mullis et al, eds., 1994)；および 「Current protocols in immunology」 (J.E. Coligan et al, eds., 1991)などの文献に完全に説明されており、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に参照として組み入れられる。
【０１３４】
I.細胞死のモジュレーター
好ましい態様において、本発明は、化合物に対する細胞の曝露を介してアポトーシスを調節する。化合物の効果は、かなり多くの細胞変化を検出することによって測定することができる。細胞死は、本明細書および当技術分野において記述したようにアッセイしてもよい。好ましい態様において、細胞株は、適切な細胞培養条件下(例えば、ガス(CO2)、温度、および培地)で、指数増殖を達成する適切な期間、密度依存的な制約なく維持される。細胞数およびまたは生存度は、トリパンブルー排除法/血球計数、またはMTT色素変換アッセイ法などの標準的技術を使用して測定される。または、細胞をアポトーシスもしくは壊死の異常と関連する遺伝子または遺伝子産物の発現について解析してもよい。
【０１３５】
好ましい態様において、本発明を細胞に曝露するとアポトーシスを誘導する。いくつかの態様において、本発明は、最初に細胞ROSレベル(例えば、O2-)の増大を生じさせる。さらなる態様において、細胞に対する本発明の化合物の曝露により、細胞のO2-レベルの増加を生じさせる。なおさらなる態様において、本発明の化合物によって生じる細胞のO2-レベルの増加は、O2-と特異的に反応する酸化還元感受性薬(例えば、ジヒロエテジウム(DHE))で検出可能である。
【０１３６】
その他の態様において、本発明の化合物によって生じる細胞O2-レベルの増大は、しばらくして減少する(例えば、10分)。その他の態様において、本発明の化合物によって生じる細胞O2-レベルの増大は、しばらくして減少し、後に再び増大する(例えば、10時間)。さらなる態様において、本発明の化合物によって生じる細胞O2-レベルの増大は、1時間で減少し、4時間後に再び増大する。好ましい態様において、本発明の化合物によって生じる早期の細胞O2-レベルの増大、続く細胞O2-レベルの減少、続くさらなる細胞O2-レベルの増大は、異なる細胞過程(例えば、二峰性の細胞機構)による。
【０１３７】
いくつかの態様において、本発明は、細胞ミトコンドリアのΔΨmの崩壊を生じさせる。好ましい態様において、本発明によって生じる細胞ミトコンドリアのΔΨmの崩壊は、ミトコンドリア選択電位差測定プローブ(例えば、DiOC6)で検出可能である。さらなる態様において、本発明によって生じる細胞ミトコンドリアのΔΨmの崩壊は、最初の細胞O2-レベルの増大後に生じる。
【０１３８】
いくつかの態様において、本発明は、カスパーゼ活性化を可能にする。その他の態様において、本発明は、ミトコンドリアからのチトクロームcの放出を生じさせる。さらなる態様において、本発明は、シストリックチトクロームcレベルを変化させる。さらに他の態様において、本発明によって生じるシストリックチトクロームcレベルは、サイトゾル画分を免疫ブロットすることで検出可能である。好ましい態様において、本発明によって生じるシストリックチトクロームcレベルの減少は、しばらくして検出可能である(例えば、10時間)。さらなる好ましい態様において、本発明によって生じるシストリックチトクロームcレベルの減少は、5時間後に検出可能である。
【０１３９】
その他の態様において、本発明は、ミトコンドリアPT孔の開口部を生じさせる。好ましい態様において、本発明によって生じるチトクロームcの細胞放出は、ミトコンドリアΔΨmの崩壊と一致する。なおさらなる好ましい態様において、本発明は、ミトコンドリアのΔΨm崩壊およびチトクロームcの放出後に細胞O2-レベルの増加を生じさせる。さらなる好ましい態様において、細胞O2-レベルの上昇は、本発明によって生じるミトコンドリアΔΨm崩壊およびチトクロームcの放出によって生じる。
【０１４０】
その他の態様において、本発明は、細胞のカスパーゼ活性化を生じさせる。好ましい態様において、本発明によって生じるカスパーゼ活性化は、汎カスパーゼ感受性の蛍光基質(例えば、FAM-VAD-fmk)で測定可能である。なおさらなる態様において、本発明によって生じるカスパーゼ活性化は、ミトコンドリアΔΨmの崩壊と共に追跡する。その他の態様において、本発明は、低二倍体DNAの外見を生じさせる。他の好ましい態様において、本発明によって生じる低二倍体DNAの外見は、カスパーゼ活性化に関して、わずかに遅延性である。
【０１４１】
いくつかの態様において、本発明のための分子標的は、ミトコンドリア内に見出される。さらなる態様において、本発明の分子標的は、ミトコンドリアATPaseを含む。細胞ROSの主要供与源には、酸化還元酵素およびミトコンドリア呼吸鎖(以下にMRC)を含む。好ましい態様において、チトクロームcオキシダーゼ(MRCの複合体IV)阻害剤(例えば、NaN3)は、本発明に依存的な細胞ROSレベルの増大を妨げる。その他の好ましい態様において、MRC複合体III阻害剤(例えば、FK506)のユビキノール-チトクロームcレダクターゼ成分は、本発明依存的なROSレベルの増大を妨げる。
【０１４２】
いくつかの態様において、本発明の化合物による細胞ROSレベルの増大は、ミトコンドリア内の標的に対する本発明の化合物の結合によって生じる。好ましい態様において、本発明の化合物は、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレッセイン(以下にDCF)ジアセタートをDCFに酸化させる。DCFは、ROSを産生することができる酸化還元活性種である。さらなる態様において、本発明によって生じるDCF産生の速度は、遅滞期後に増大する。
【０１４３】
アンチマイシンAは、ユビキノール-チトクロームcレダクターゼを阻害することによってO2-を生じる。好ましい態様において、本発明は、アンチマイシンAに相当する様式でROS産生の速度を増大する。さらなる態様において、本発明は、状態3呼吸を支持する好気条件下で、アンチマイシンAに相当する様式でROS産生の速度を増大する。さらなる態様において、本発明の化合物は、MPT孔を直接標的化しない。さらなる態様において、本発明の化合物は、細胞内S15画分(例えば、サイトゾル；ミクロソーム)に実質的にROSを産生しない。さらなる態様においてさえ、ミトコンドリアが状態4呼吸にある場合、本発明の化合物は、ROSを刺激しない。
【０１４４】
MRC複合体I〜IIIは、ミトコンドリア内のROSの主要供与源である。好ましい態様において、従属する発明によって生じる細胞ROSレベルの増大の主要供与源は、ミトコンドリアのF1F0-ATPaseを阻害する結果として、これらの複合体から発散する。実際に、なおさらなる態様において、本発明は、ウシ亜ミトコンドリア粒子(以下にSMP)のミトコンドリアATPase活性を阻害する。特に好ましい態様において、本発明の化合物は、ミトコンドリアF1F0-ATPaseのOSCP成分と結合する。
【０１４５】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、以下の構造もしくはその鏡像異性体、またはこれらの薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは誘導体を有する：
2008505913.tif 000027
式中、R1は、脂肪族またはアリールであり；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-HC(=O)-R5、または水素結合形成に関与する部分であり、式中R5は、アリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7、または-R6-C(=O)-NH-R7であり、式中、R6は、1〜6炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環式であり；ならびに、それぞれのR3およびR4は、独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換されたアミノ、アシルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、アリール、またはヘテロアリールである。一部の好ましい態様において、式中、R3はヒドロキシ基である場合、R3を含む環上の1つまたは複数のさらなる位置に、インビボでの代謝からヒドロキシル基を保護する化学基(例えば、アルキル鎖)を含む。
【０１４６】
ある態様において、本発明の化合物は、C'4位および芳香環にヒドロキシル基を有していてもよい。好ましい態様において、本発明の化合物は、C'4位および芳香環において、ヒドロキシル基の結果として細胞ROSレベルの増大を生じさせる。さらなる態様において、細胞に基づいたアッセイ法における本発明の能力は、SMPを使用するATPase阻害実験に相関する。実際に、好ましい態様において、本発明は、ミトコンドリアのATPase活性を有意に阻害しない一般的なベンゾジアゼピンおよびPBRリガンド(例えば、PK11195および4-クロロジアゼパム)の細胞障害性濃度(80μM)と比較して、有意にミトコンドリアのATPase活性を阻害する。したがって、好ましい態様において、本発明の分子標的は、ミトコンドリアATPaseである。
【０１４７】
オリゴマイシンは、ミトコンドリアF1F0-ATPaseと結合するマクロライド天然物であり、状態3から4への移行を誘導し、その結果、ROS(例えば、O2-)を産生する。好ましい態様において、本発明の化合物は、ミトコンドリアF1F0-ATPaseのOSCP成分に結合する。好ましい態様において、本発明の化合物は、ミトコンドリアF1F0-ATPaseのOSCPとF1サブユニットとの間の接合部に結合する。いくつかの態様において、本発明の化合物は、F1サブユニットを結合する。ある態様において、本発明のスクリーニングアッセイ法により、OSCP、F1、またはOSCP/F1接合部の結合パートナーの検出が可能になる。OSCPは、内因性蛍光タンパク質である。ある態様において、OSCPを過剰発現させた大腸菌(E. Coli)試料において本発明の試験化合物の溶液を滴定することにより、本質的にOSCP蛍光の消光を生じる。その他の態様において、蛍光性または放射性試験化合物は、結合アッセイ法に直接使用することができる。その他の態様において、競争結合実験を行うことができる。この種のアッセイ法において、試験化合物を、例えばOSCPに対する結合に関して、これらがBz-423と競合する能力について評価される。いくつかの態様において、本発明の化合物は、OSCP遺伝子の制御を介して(例えば、OSCP遺伝子の発現を変化させ)細胞における細胞ROSレベルの増大の減少およびアポトーシスの減少を生じさせる。さらなる態様において、本発明は、ATPaseモーターの分子運動を変化させることによって機能する。
【０１４８】
II. 細胞増殖および細胞成長のモジュレーター
いくつかの態様において、本発明の化合物および方法は、細胞増殖の減少を生じさせる。その他の態様において、本発明の化合物および方法は、細胞増殖の減少およびアポトーシスを生じさせる。例えば、本発明の開発の間に行った細胞培養細胞障害性アッセイ法では、本発明の化合物および方法により、長期間(例えば、3日)の培養後に細胞増殖を防げることを示した。
【０１４９】
III. 処置した細胞における発現解析
本発明の開発の間に、発現プロフィールを作製して処置細胞と未処置細胞とにおいて差動的に発現される遺伝子を同定した。このプロフィールは、本発明の化合物によって誘導される細胞の遺伝子発現フィンガープリントを提供する。このフィンガープリントにより、本発明の化合物に対する応答の際にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺伝子を同定し、薬物スクリーニングのための、および化合物の治療有効性のモニタリングのための診断マーカーであるこのような遺伝子を同定する。また、遺伝子は、本発明の化合物の効果を模倣するための、制御のための標的を提供する。Bz-423の存在下においてアップレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Aに示す。Bz-423の存在下においてダウンレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Bに示す。Bz-OMeの存在下においてアップレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Cに示す。Bz-OMeの存在下においてダウンレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Dに示す。
【０１５０】
例えば、発現プロフィールの解析により、新規治療薬としてオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子アンチザイム1(OAZ1)を提供する。OAZ1は、ポリアミンの合成および細胞への輸送を制御する重要な調節タンパク質であり、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンを含む。細胞におけるポリアミンの合成は、いくつかの酵素の工程を含むが、オルニチンデカルボキシラーゼは、主にこの過程を調節する酵素である。原形質膜に位置するポリアミン輸送体を阻害することよって、およびタンパク分解性分解のためのオルニチンデカルボキシラーゼを標的化することによって、OAZ1は、細胞におけるポリアミンレベルを減少させる。ポリアミンは、生存および細胞成長のために必須である。ポリアミンの異常な蓄積は、腫瘍誘導、癌増殖、および転移に寄与する。ポリアミン生合成の阻害剤、具体的にはジフルオロメチルオルニチン(DFMO)として同定された1つの分子は、これらの抗腫瘍形成および治療可能性を確認するために臨床試験中である。本発明の好ましい態様において、OAZ1は、本発明の化合物で処理される細胞における対照細胞のレベルの16倍以上のレベルに誘導される。OAZ1レベルを、直接的または間接的に誘導するための任意の方法が、本発明によって想定される(例えば、本発明の化合物での処置、遺伝子療法など)。
【０１５１】
OAZ1は、ポリアミン生合成の律速段階を制御するミトコンドリア酵素のオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子(ODC)の阻害剤として作用することによってポリアミンレベルを減少させるポリアミン代謝および機能の重要な制御因子である。アンチザイムでの阻害後、ODCは、プロテアソームによる分解のために標的化される。ポリアミンは、細胞の安定性に密接に関与し、細胞増殖のために必要とされる。ポリアミン合成を阻害すると、増殖が抑制される。したがって、なおさらなる態様において、所望の生物学的効果を誘発するために、ODC発現または活性が減少される(例えば、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子療法、公知のまたは後に同定される阻害剤、本発明の化合物などを使用して)。
【０１５２】
アンチザイム1発現は、転写的に、および転写後レベルで調節される。転写後の制御は、この遺伝子産物の制御において特に重要な役割を果たし、ポリマン(ネガティブフィードバックループを介して)またはアグマチン(アルギニンのもう一つの代謝産物)のいずれかに依存する独特の翻訳フレームシフトによって生じる。ODC活性レベルは、3H-オルニチンを使用してオルニチンのプトレシンへの変換を定量することによって得てもよい。いくつかの態様において、本発明の化合物で細胞を処理することにより、用量依存的様式でODC活性を有意に減少させる。なおさらなる態様において、ODC活性の減少は、同様の条件下で測定されるODCタンパク質レベルの減少に平行している。MnTBAPと共にプレインキュベートした細胞は、ROSレベルを減少させる。いくつかの態様において、本発明の化合物に曝露された、MnTBAPと共にプレインキュベートした細胞は、ODCの逆阻害を示す。
【０１５３】
好ましい態様において、高レベル(例えば、＞10μM)の本発明の化合物で処理した細胞は、細胞の抗酸化剤によって解毒されないほど十分な量のROSを産生し、短時間(例えば、18時間)以内にアポトーシスを生じる。好ましい態様において、低レベル(例えば、＜10μM)の本発明の化合物で処理した細胞は、ROS応答の減少を誘導し、アポトーシスを起動させるには不十分であるが、ODCを阻害するか、またはさもなければ細胞の増殖を遮断することができる。その他の態様において、フェノールのヒドロキシルがClまたはOCH3によって置換された本発明の化合物の誘導体は、細胞傷害性が最小限であり、細胞においてわずかなROS応答を生じて、OSCPとあまりしっかりと結合せず、ODC活性を阻害する。さらに他の態様において、フェノールのヒドロキシルがCl発現によって置換された本発明の化合物の誘導体で処理した細胞は、修飾されていない化合物と同様の範囲で、増殖の減少を受ける。したがって、好ましい態様において、抗増殖効果は、アポトーシスを誘導することなく増殖を遮断する本発明の化合物の化学的誘導体を使用して得られる。
【０１５４】
抗原性または分裂促進性の刺激に応答して、リンパ球は、タンパク質メディエーターを分泌し、その一つは、それがインビトロでマクロファージの遊走を防げるその能力のために遊走阻止因子(MIF)と名付けられている。MIFは、抗腫瘍薬でもあり得る。加えて、MIFがマクロファージの遊走を防げる能力を、創傷を処置するために利用してもよい。MIFは、異なる抗原に対する免疫応答を変化させ得る。MIFは、化学的および免疫学的な解毒系にリンクする。MIFは、Bz-423によっておよそ10倍誘導された。したがって、本発明は、本発明の化合物の標的としてのMIFの使用を想定する。
【０１５５】
プロフィリンは、本発明で処理した細胞において高レベルにて誘導される。プロフィリンは、アクチン単量体と結合し、いくつかのタンパク質およびホスホイノシチドと相互作用して、細胞骨格へのシグナリング経路にリンクする。プロフィリンは、アクチン単量体を隔離して、アクチンに対するADPのATPへの交換を増大し、アクチンフィラメント代謝回転の速度を増大することができる。いくつかの異なる腫瘍化癌細胞株間の非腫瘍形成性株との比較では、一貫して腫瘍細胞において低級プロフィリン1レベルを示す。CAL51乳癌細胞へのプロフィリン1cDNAのトランスフェクションにより、プロフィリン1レベルが上昇し、細胞増殖に対する顕著な効果を有し、ヌードマウスにおいて過剰発現している細胞クローンの腫瘍形成能を抑制した。したがって、プロフィリン1の誘導(例えば、本発明の化合物またはその他による)は、癌細胞の腫瘍形成を抑制し得る。
【０１５６】
インターフェロン調節因子4(IRF-4)は、本発明の化合物で処理した細胞において正常レベルよりも高度に誘導される。IRF-4は、恒常性において必須な役割を果たし、かつ成熟したリンパ球において機能するIRF転写因子ファミリーのリンパ球/骨髄球に制限されたメンバーである。IRF-4発現は、静止初代T細胞において調節されており、TCR架橋またはホルボールエステルおよびカルシウムイオノホア(PMA/イオノマイシン)での処理などの刺激による活性後にmRNAおよびタンパク質レベルにて一過性に誘導される。Jurkat細胞におけるIRF-4の安定な発現は、インターロイキン(IL)-2、IL-4、IL-10、およびIL-13の合成の強力な増強を引き起こす。IRF-4は、Tリンパ球がサイトカインに特有のアレイを生じる能力を制御するリンパ様特異的成分のうちの1つを代表する。アベルソン形質転換されたプロB細胞株において、IRF-4の強制発現は、生殖系列Igk転写を誘導するために十分である。本発明の化合物がIRF-4を誘導する作用は、BおよびT細胞優性過程で自己免疫疾患に対するその影響を、ならびに新生物B細胞クローンの生存に対するその能力を説明し得る。
【０１５７】
好ましい態様において、細胞死調節タンパク質GRTM19は、本発明の化合物で処理した細胞において正常レベルよりも高度に誘導される。細胞増殖抑制におけるインターフェロン(IFN)経路の重要性は、公知である。研究では、IFNとオールトランスレチノイン酸との組み合わせが、いずれの薬剤単独よりも強力にインビトロおよびインビボでの細胞増殖を阻害することを示した。IFN/RAで誘導される細胞死において役割を果たす特異的遺伝子が、アンチセンス・ノックアウト・アプローチによって同定されており、GRIM遺伝子と呼ばれている。GRIM19は、公知の死遺伝子カテゴリーのいずれにも含まれない新規細胞死関連遺伝子である。この遺伝子は、核に局在化する144-aaタンパク質をコードする。GRIM19の過剰発現は、IFN/RA処置に応答してカスパーゼ-9活性およびアポトーシスの細胞死を増強する。GRIM19は、前立腺腫瘍抑制のために必須なヒト染色体の19p13.2領域に位置し、本タンパク質が新規腫瘍抑制因子であり得ることを示す。本発明の化合物によるGRIM19の誘導は、抗腫瘍効果を生じ得る。
【０１５８】
IV. 例示的化合物
本発明の例示的化合物を下記に提供する。
2008505913.tif 000028
またはその鏡像異性体を有し(式中、R1は、脂肪族またはアリールであり；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、、または水素結合形成に参加する残基であり；ここでR5は、アリール、複素環、および-R6-NH-C(=O)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7であり、ここでR6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環であり、R3およびR4の各々は、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8個の炭素および1〜20個の水素を有する脂肪族基、アリールまたは複素環である。)；または、それらの薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは誘導体である。
【０１５９】
前記構造において、R1は、1〜20個の炭素および1〜20個の水素のヒドロカルビル基である。好ましくはR1は、1〜15個の炭素を有し、より好ましくは1〜12個の炭素を有する。好ましくはR1は、1〜12個の水素を有し、より好ましくは1〜10個の水素を有する。従ってR1は、脂肪族基またはアリール基である。
【０１６０】
「脂肪族」という用語は、通常アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式として公知の基を表わす。本明細書において使用される「アリール」という用語は、フェニル環のような1個の芳香環、または互いに結合された(例えばビスフェニル)または互いに融合された(例えば、ナフタレンまたはアントラセン)2個もしくはそれよりも多い芳香環を表わす。アリール基は任意に、低級脂肪族基(例えば、C1-C4アルキル、アルケニル、アルキニル、またはC3-C6脂環式)により置換することができる。加えて、脂肪族基およびアリール基はさらに、-NH2、-NHCOCH3、-OH、低級アルコキシ(C1-C4)、ハロ(-F、-Cl、-Brまたは-I)のような、1つまたは複数の官能基により置換することができる。R1は第一に非極性部分であることが好ましい。
【０１６１】
前記構造において、R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、または水素結合に参加する部分であることができ、ここでR5は、アリール、複素環、R6-NH-C(=0)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7であり、ここでR6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環である。「脂肪族」および「アリール」という用語は、先に定義されている。
【０１６２】
本明細書において使用される「水素結合に参加する部分」という用語は、プロトンを受容または供給することができ、これにより水素結合を形成する基を表わす。
【０１６３】
水素結合に参加する部分のいくつかの特に非限定的な例は、当技術分野において周知である、フルオロ、酸素含有基および窒素含有基を含む。水素結合に参加する酸素含有基のいくつかの例は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級カルボニル、低級カルボキシル、低級エーテル、およびフェノール基を含む。本明細書において使用される修飾語「低級」とは、各酸素含有官能基が結合している低級脂肪族基(C1-C4)を意味する。
【０１６４】
従って例えば、「低級カルボニル」という用語は、特に、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドを意味する。
【０１６５】
水素結合形成に参加する窒素含有基のいくつかの非限定的な例は、アミノ基およびアミド基を含む。加えて、酸素および窒素の両原子を含む基も水素結合形成に参加することができる。このような基の例は、ニトロ基、N-ヒドロキシ基および亜硝酸(nitrous)基を含む。
【０１６６】
本発明において水素結合受容体は、芳香環のπ電子であることも可能である。しかしながら本発明の水素結合参加者は、ホウ素のような金属原子を含むそのような基は含まない。さらに本発明の実践の範囲内で形成された水素結合は、「二水素結合」として知られている2個の水素の間に形成されたものは含まない(このような二水素結合の更なる説明については、R.H. Crabtree、Science、282：2000-2001[1998]参照)。
【０１６７】
「複素環」という用語は、例えば、1つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員の芳香族または非芳香族の環を表わす。ヘテロ原子は、同じまたは互いに異なることができる。好ましくは、このようなヘテロ原子の少なくとも1個は窒素である。この環状複素環に存在することができる他のヘテロ原子は、酸素および硫黄を含む。
【０１６８】
芳香族および非芳香族の環状複素環は、当技術分野において周知である。いくつかの限定されない芳香族環状複素環の例は、ピリジン、ピリミジン、インドール、プリン、キノリンおよびイソキノリンを含む。限定されない非芳香族複素環化合物の例は、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリジンおよびピラゾリジンを含む。酸素含有環状複素環の例は、フラン、オキシラン、2H-ピラン、4H-ピラン、2H-クロメンおよびベンゾフランを含むが、これらに限定されるわけではない。硫黄含有環状複素環の例は、チオフェン、ベンゾチオフェン、およびパラチアジンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１６９】
窒素含有環の例は、ピロール、ピロリジン、ピラゾール、ピラゾリジン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピリジン、ピペリジン、ピラジン、ピペラジン、ピリミジン、インドール、プリン、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、トリアゾール、およびトリアジンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１７０】
2個の異なるヘテロ原子を含む環状複素環の例は、フェノチアジン、モルホリン、パラチアジン、オキサジン、オキサゾール、チアジン、およびチアゾールを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１７１】
この環状複素環は任意で、脂肪族、ニトロ、アセチル(すなわち、-C(=O)-CH3)、またはアリール基から選択された1つまたは複数の基によりさらに置換される。
【０１７２】
R3およびR4の各々は、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、または置換されたアミノ(例えば低級アルキル置換されたアミノ、またはアセチルアミノもしくはヒドロキシアミノ)、または1〜8個の炭素および1〜20個の水素を有する脂肪族基であり得る。R3およびR4の各々が脂肪族基である場合、これはさらに、前述のようなヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノまたは置換されたアミノ基のような1つまたは複数の官能基により置換することができる。「脂肪族」という用語は先に定義されたものである。あるいはR3およびR4の各々は、水素であり得る。
【０１７３】
多くの1,4-ベンゾジアゼピンが、tile C3位で環状複素環に導入されるキラリティーのために、光学異性体として存在することは周知である。光学異性体は、文献において時には、L異性体またはD異性体として説明されることがある。あるいはこれらの異性体は、R対掌体およびS対掌体(enantiomorph)とも称される。簡便化のために、これらの異性体は、対掌体または鏡像異性体と称する。本明細書において説明される1,4-ベンゾジアゼピン化合物は、それらの鏡像異性体型に加え、ラセミ混合物も含む。従って本明細書において「ベンゾジアゼピンまたはそれらの鏡像異性体」の使用は、全ての対掌体に加えそれらのラセミ混合物を含む、説明されたまたは示されたベンゾジアゼピンを意味する。
【０１７４】
前記説明より、多くの具体例は、前記一般式で表わされることは明らかである。従ってひとつの例において、R1は脂肪族であり、R2は脂肪族であるのに対し、別の例においては、R1はアリールであり、かつR2は水素結合形成に参加する部分である。あるいは、R1は脂肪族であり、かつR2は-NHC(=O)R5であるかまたは水素結合に参加する部分であることができ、ここでR5は、アリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7であり、ここでR6は1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリール、または複素環である。各置換基の位置での特定の基の選択から生じる多種多様な亜組合せが可能であり、このような組合せは全て本発明の範囲内である。
【０１７５】
さらに本開示を通じて与えられた数値の範囲は、その範囲内のあらゆる可能な部分範囲が考えられる融通性のある範囲として構成されることは理解されるべきである。例えば、1個〜10個の炭素の範囲を有する基の説明は、部分範囲、例えば、1個〜3個、1個〜5個、1個〜8個、または2個〜3個、2個〜5個、2個〜8個、3個〜4個、3個〜5個、3個〜7個、3個〜9個、3個〜10個などの炭素を有する基も企図している。従って、1個〜10個の範囲は、多くの可能性のある部分範囲が明確に企図されている範囲の外側境界を表わすこととが理解されるべきである。別の状況における企図される範囲の追加例で、このような範囲がその中に同様の部分範囲を含むようなものを本開示を通じて認めることができる。
【０１７６】
本発明のベンゾジアゼピン化合物のいくつかの具体例には、以下、ならびにジメチルフェニル(全ての異性体)およびジトリフルオロメチル(全ての異性体)を含む：
2008505913.tif 000029
式中、R2は、
2008505913.tif 000030
である。
【０１７７】
また、以下の化合物が想定される。
2008505913.tif 000031
【０１７８】
また、本発明は、化合物Bz-423を提供する。
2008505913.tif 000032
【０１７９】
Bz-423は、C-3に疎水性置換基が存在することにより、臨床用途においてベンゾジアゼピンと異なる。この置換により、末梢ベンゾジアゼピン受容体(「PBR」)に対する結合が弱くなり(Kd ca. 1μM)、中枢ベンゾジアゼピン受容体に対する結合を防げ、そのためBz-423は、鎮静薬ではない。
【０１８０】
いくつかの態様において、R2は、化合物をOSCPに結合させることができる任意の化学基である。一部のこのような態様において、R2は、疎水性芳香族基を含む。好ましい態様において、R2は、ベンゼンよりも大きな疎水性芳香族基(例えば、非水素置換基を有するベンゼン環、2つ以上の芳香環を有する部分、7つ以上の炭素原子を有する部分など)を含む。
【０１８１】
本発明のさらなる具体的ベンゾジアゼピン誘導体例は、以下を含む：
2008505913.tif 000033
2008505913.tif 000034
2008505913.tif 000035
2008505913.tif 000036
2008505913.tif 000037
2008505913.tif 000038
2008505913.tif 000039
2008505913.tif 000040
2008505913.tif 000041
2008505913.tif 000042
2008505913.tif 000043
R1は、Hまたはヒドロキシである
【０１８２】
R2〜R6のそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、ならびに複素環から選択される。
2008505913.tif 000044
【０１８３】
R1〜R10のそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、ならびに複素環から選択される。
2008505913.tif 000045
2008505913.tif 000046
【０１８４】
R1〜R11のそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、ならびに複素環から選択される。
2008505913.tif 000047
【０１８５】
R1〜R10のそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、ならびに複素環から選択される。
2008505913.tif 000048
【０１８６】
R1〜R10のそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、ならびに複素環から選択される。
2008505913.tif 000049
【０１８７】
R1〜R6のそれぞれは、同じであっても、または異なっていてもよく、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、＜10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、ならびに複素環から選択される。
2008505913.tif 000050
2008505913.tif 000051
2008505913.tif 000052
式中、R1は、ナフタルアラニン；フェノール；1-ナフタレノール；2-ナフタレノール；
2008505913.tif 000053
およびキノリンから選択される。
【０１８８】
組成物は、以下の式を含み：
2008505913.tif 000054
式中、R1は、
2008505913.tif 000055
から選択される。
【０１８９】
本発明において実施される全ての誘導体の立体化学は、R、S、またはラセミである。
【０１９０】
本発明のさらなる具体的ベンゾジアゼピン誘導体例は、以下を含む：
以下の式を含む組成物：
2008505913.tif 000056
以下の式を含む組成物：
2008505913.tif 000057
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され：水素；CH3；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R5は、OH；NO2；NR'；OR'からなる群より選択され；式中、R'は、以下からなる群より選択され：直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R6は、水素；NO2；Cl；F；Br；I；SR'；およびNR'2からなる群より選択され；式中、R'は、上記R5のように定義され；式中、R7は、水素；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され；ならびに、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり；式中、ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含み、かつアリールまたは脂肪族は、環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的(例えば、ミトコンドリア)に到達するまで、インビボでR5の酸素を代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位にて代謝されて、R5をヒドロキシル基に変換する。
【０１９１】
要約すると、多数のベンゾジアゼピン化合物および関連化合物が本明細書に示される。これらの化合物の任意の1つまたは複数を、本明細書に他に記述したような細胞死に関連した種々の異常調節障害を処置するために使用することができる。また、上記の化合物は、薬物スクリーニングアッセイ法およびその他の診断法に使用することができる。
【０１９２】
V. 薬学的組成物、製剤、ならびに例示的投与経路および投薬の考察
様々な考えられる医用薬剤および薬学的組成物の例示的態様を、以下に提供する。
【０１９３】
A. 医用薬剤の調製
本発明の化合物は、細胞死の調節不良、異常な細胞成長および過増殖に関連した様々な状態を処置する医用薬剤の調製において有用である。
【０１９４】
さらに、これらの化合物は、化合物の有効性が公知であるまたは推定されるような他の障害を処置する医用薬剤の調製にも有用である。このような障害は、神経障害(例えば、てんかん)または神経筋障害を含むが、これらに限定されるわけではない。化合物の医用薬剤を調製する方法および技術は、当技術分野において周知である。薬学的製剤および送達経路の例を、以下に説明する。
【０１９５】
当業者は、多くの具体的態様を含む、本明細書に説明された化合物の1種または複数が、標準の製薬手法を適用することにより調製されることを理解するであろう。このような医用薬剤は、薬学の技術分野において周知である送達法を用い、対象へ送達することができる。
【０１９６】
B. 薬学的組成物および製剤の例
本発明のいくつかの態様において、これらの組成物は、単独で投与される一方で、一部の別の態様においては、これらの組成物は、少なくとも1種の先に定義したような活性成分/物質(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)を、固形支持体と共に、あるいは1種または複数の薬学的に許容される担体および任意に他の治療的物質共に含有する薬学的製剤において存在することが好ましい。各担体は、その製剤の他の成分と相溶性があり、対象にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。
【０１９７】
企図される製剤は、経口、経直腸、鼻腔内、局所(経皮、頬腔内、および舌下を含む)、膣内、非経口(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)および肺内投与に適したものを含む。いくつかの態様において、製剤は、単位剤形で都合良く提供され、薬局の技術分野内で公知の方法により調製される。このような方法は、活性成分を、1種または複数の補助成分を構成している担体と共に会合させる段階を含む。一般にこれらの製剤は、活性成分を、液体担体もしくは細かく粉砕された固形担体または両方と均一かつ密接に会合(例えば、混合)させ、次に必要であるならば製品に成形することにより調製される。
【０１９８】
経口投与に適した本発明の製剤は、各々は好ましくは、予め定められた量の活性成分を含有する、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤として；散剤または顆粒剤として；水性もしくは非水性液体の液剤または懸濁剤として；または、水中油型液体乳剤もしくは油中水型液体乳剤としてなど、個別の単位として存在することができる。別の態様において、活性成分は、巨丸剤、舐剤またはパスタ剤などとして存在する。
【０１９９】
いくつかの態様において、錠剤は、少なくとも1種の活性成分および任意に1種または複数の補助物質/担体を含有し、これは各物質の圧縮または成形により作製される。好ましい態様において、圧縮錠剤は、粉末または顆粒のような自在流れ型の活性成分を、任意に結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、繊維素(starch)グリコール酸ナトリウム、架橋したポビドン、架橋したカルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤または分散剤と混合し、適当な機械で圧縮することにより調製される。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤により含水した粉末とした化合物(例えば、活性成分)の混合物を適当な機械で成形することにより作製される。錠剤は、任意に被覆してもまたは切り込み線をいれても良く、ならびに例えば望ましい放出プロファイルを提供するために変動する割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いることにより、活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化しても良い。錠剤は任意に、胃ではなく腸管の一部で放出するために、腸溶性コーティングを提供する段階もできる。
【０２００】
口腔内局所投与に適した製剤は、通常ショ糖およびアカシアガムまたはトラガカントガムである矯味矯臭基剤中に活性成分を含有するトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアガムのような不活性基剤中に活性成分を含有する口内錠；ならびに、適当な液体担体中に活性成分を含有する含嗽剤を含む。
【０２０１】
本発明の局所投与のための薬学的組成物は、任意に、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、散剤、液剤、パスタ剤、ゲル剤、噴霧剤、エアロゾルまたは油剤として製剤化される。代替的態様において、局所製剤は、活性成分、および任意に1種または複数の賦形剤または希釈剤が含浸された絆創膏もしくは接着性硬膏のような、貼付剤または包帯を含む。好ましい態様において、局所製剤は、皮膚または他の罹患部位を通じた活性物質の吸収または浸透を増強する化合物を含有する。このような皮膚浸透増強剤の例は、ジメチルスルホキシド(DMSO)および関連した類似体を含む。
【０２０２】
望ましいならば、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも約30質量％の多価アルコール、すなわち、2個またはそれよりも多いヒドロキシル基を有するアルコール、例えばプロピレングリコール、ブタン-1,3-ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールならびにそれらの混合物を含む。
【０２０３】
いくつかの態様において、本発明の油相乳剤は、公知の方法で、公知の成分により構成される。この相は典型的には、単独の乳化剤(さもなければ公知のエマルゲン(emulgent))を含み、いくつかの態様においては、この相のためにさらに、少なくとも1種の乳化剤の脂肪もしくは油分または脂肪および油分の両方との混合物を含有することが望ましい。 
【０２０４】
好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用するように、親油性乳化剤と共に含まれる。いくつかの態様においては、油分および脂肪の両方を含むことも好ましい。まとめると、乳化剤は、安定剤を伴うまたは伴わずに、いわゆる乳化ワックスを製造し、このワックスは、油分および/または脂肪と共に、クリーム製剤において油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を作製する。
【０２０５】
本発明の製剤における使用に適したエマルゲンおよび乳剤安定剤は、Tween 60、Span 80、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリルおよびラウリル硫酸ナトリウムがある。
【０２０６】
薬学的乳剤製剤において使用されるほとんどの油分中の活性化合物/物質の溶解度は非常に低い可能性が高いため、製剤のための適当な油分および脂肪の選択は、望ましい特性(例えば、化粧料的特性)の達成に基づいている。従ってクリーム剤は、チューブまたは他の容器から流れ出ることを避けるのに適した粘稠度を伴う、油っぽくなく、非汚染性でかつ洗浄可能な製品が好ましい。直鎖または分枝鎖の、一塩基性または二塩基性のアルキルエステル、例えばジ-イソアジピン酸エステル、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸2-エチルヘキシル、またはCrodamol CAPとして公知の分枝鎖エステルの配合物を使用することができ、後の三種が好ましいエステルである。これらは、必要とされる特性に応じて、単独で、または組合わせて使用することができる。あるいは、白色軟パラフィンおよび/もしくは流動パラフィンまたは他の鉱油のような高い融点の脂質を使用することができる。
【０２０７】
眼への局所投与に適した製剤も、活性成分が、適当な担体、特にその物質の水性溶媒中に溶解または懸濁された点眼剤を含む。
【０２０８】
経直腸投与のための製剤は、例えばココアバターまたはサリチル酸のような適当な基剤を伴う坐剤として存在することができる。
【０２０９】
膣内投与に適した製剤は、該物質に加え、当技術分野において適していることが公知である担体を含有する、ペッサリー、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡剤またはスプレー剤として存在することができる。
【０２１０】
担体が固形である鼻腔内投与に適した製剤は、鼻から吸い込む、すなわち鼻の傍に持ち上げられた粉末の容器から鼻道を通って迅速吸入(例えば強制)する方法で投与される、例えば約20μm〜約500μmの範囲の粒子サイズを有する、粗末を含む。別の担体が液体である投与に適した製剤は、鼻腔用噴霧剤、液滴、またはネブライザーによるエアロゾルを含むが、これらに限定されるわけではなく、該物質の水性または油性溶液を含む。
【０２１１】
非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方を意図されたレシピエントの血液と等張とする溶質液を含有することができる、水性および非水性の等張の滅菌した注射液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含有することができる、水性および非水性の滅菌懸濁剤、ならびに化合物を血液成分または1つまたは複数の臓器を標的化するようにデザインされているリポソームまたは他の微粒子システムを含む。いくつかの態様において、これらの製剤は、例えば、アンプルおよびバイアルのような、単回投与または反復投与のための密封容器中に存在/製剤化され、ならびに使用直前に、例えば注射用水のような滅菌液体担体の添加のみを必要とする、凍結し乾燥した(凍結乾燥)状態で保存されてもよい。即時調合注射液および懸濁液を、先に説明したような滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【０２１２】
好ましい単位剤形製剤は、物質の、本明細書において先に言及されたような、一日量または単位、分割日量(daily subdose)、またはそれらの適当な画分を含有するものである。
【０２１３】
本発明の製剤は、先に特に言及した成分に加え、問題の製剤の型に関して当技術分野において都合の良い他の物質を含有することができることは理解されるべきであり、例えば経口投与に適したものは、甘味剤、増粘剤および香味剤のような更なる物質を含むことができる。本発明の物質、組成物および方法は、他の適当な組成物および療法と組合わせることができることも意図されている。さらに別の製剤は任意に、食品添加剤(適当な甘味剤、香料、着色料など)、植物栄養剤(phytonutrient)(例えば、亜麻仁油)、鉱物(例えば、Ca、Fe、Kなど)、ビタミン、および他の許容される組成物(例えば、複合リノール酸)、増量剤、および安定剤などを含む。
【０２１４】
C. 例示的投与経路および投与量の考察
例えば、リポソーム封入、微粒子、マイクロカプセル、受容体媒介したエンドサイトーシスなどの、様々な送達システムが知られており、本発明の治療的物質(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)を投与するために使用することができる。送達法は、動脈内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、および経口経路を含むが、これらに限定されるわけではない。特定の態様において、本発明の薬学的組成物が処置が必要な領域に局所的に投与されることが望ましいことがあり；これは、例えば手術時の局所輸注、注射またはカテーテル法により達成されるが、これらに限定されない。
【０２１５】
本明細書においてそれらの意図された目的に関して有効であると確定された物質は、標的細胞の病的成長およびこれに関連した状態に易罹患性または発症のリスクのある対象または個体へ投与することができる。物質がマウス、ラットまたはヒト患者のような対象へ投与される場合、この物質は、薬学的に許容される担体に添加することができ、ならびに全身的または局所的に対象へ投与することができる。有益に処置され得る患者を決定するために、組織試料を患者から採取し、その細胞を、該物質に対する感受性についてアッセイする。
【０２１６】
治療的量は、経験的に決定され、これは処置される病理、処置される対象ならびに物質の有効性および毒性により変更される。動物に送達される場合、この物質の有効性をさらに確認する方法が有用である。動物モデルの一例は、MLR/MpJ-lpr/lpr(「MLR-lpr」)(Jackson Laboratories、バーハーバー、MEから入手可能)である。MLR-lprマウスは、全身性自己免疫疾患を発症する。あるいは他の動物モデルは、例えば、ヌードマウスに本明細書に定義された過増殖性細胞、癌細胞または標的細胞を約105〜約109個、皮下接種することにより、腫瘍成長を誘導することにより発症することができる。腫瘍が確立された時点で、本明細書に説明された化合物が、例えば腫瘍周辺への皮下注射により投与される。腫瘍サイズの縮小を決定するための腫瘍の測定は、1週間に2回、ベニエルキャリパー(venier caliper)を用いて行われる。他の動物モデルも、適宜使用することができる。前述の疾患および状態に関するそのような動物モデルは、当技術分野において周知である。
【０２１７】
いくつかの態様において、インビボ投与は、1回投与、処置過程を通じ連続的または間欠的に実行される。投与の最も有効な手段および用量を決定する方法は、当業者に周知であり、かつ療法に使用される組成物、療法の目的、処置される標的細胞、および処置される対象に応じて変動する。単回または反復投与は、担当医により選択された投与量レベルおよびパターンにより実行される。
【０２１８】
これらの物質の適当な用量剤形および投与法は、当業者により容易に決定される。好ましくは、これらの化合物は、約0.01mg/kg〜約200mg/kg、より好ましくは約0.1mg/kg〜約100mg/kg、さらにより好ましくは約0.5mg/kg〜約50mg/kgで投与される。本明細書に説明された化合物は、別の物質(例えば、増感する物質)と共に同時投与される場合、その有効量は、該物質が単独で使用される場合よりも少なくてよいことがある。
【０２１９】
薬学的組成物は、経口、鼻腔内、非経口または吸入療法により投与することができ、ならびに錠剤、トローチ剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル、坐剤またはエアロゾルの形をとることができる。これらはさらに、水性または非水性希釈剤中の活性成分の懸濁剤、液剤、および乳剤、シロップ剤、顆粒剤または散剤の形をとることもできる。薬学的組成物は、本発明の物質に加え、他の薬学的活性化合物または複数の本発明の化合物を含有することもできる。
【０２２０】
より具体的に述べると、活性成分とも称される本発明の物質は、経口、経直腸、鼻腔内、局所(経皮、エアロゾル、頬腔内および舌下を含むが、これらに限定されるわけではない)、経膣、非経口(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含むが、これらに限定されるわけではない)および肺内を含むが、これらに限定されるわけではないどちらか適当な経路により、療法のために投与することができる。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患により変動することも理解される。
【０２２１】
理想的には、この物質は、罹患部位で活性化合物の最高濃度を達成するように投与されなければならない。これは、例えば、任意に、生理食塩水内の物質の静脈内注射、または活性成分を含有する、例えば、錠剤、カプセル剤またはシロップ剤などの経口投与により達成される。
【０２２２】
この物質の望ましい血液レベルは、罹患組織内で活性成分の治療的量を提供するための連続輸注により維持してもよい。機能的組合せの使用は、各個別の治療的化合物または薬物が単独で使用される場合に必要とされる量よりも、各抗ウイルス剤成分のより低い総用量を必要とする治療的組合せを提供し、これにより副作用を軽減することが考えられる。
【０２２３】
D. 例示的同時投与経路および投与の考察
本発明は、本明細書において説明された化合物の1種または複数の追加の活性物質との同時投与に関連する方法も含む。実際、本発明の化合物を同時投与することにより、先行技術の療法および/または薬学的組成物を増強する方法を提供する段階は本発明の更なる局面である。同時投与法において、これらの物質は、これらの物質は、同時または逐次に投与することができる。ひとつの態様において、本明細書に説明された化合物は、他の活性物質の前に投与される。薬学的製剤および投与様式は、先に説明されたうちの任意のものであり得る。加えて、2種またはそれよりも多い同時投与された化学物質、生物学的物質または照射は、異なる様式または異なる処方で各々投与することができる。
【０２２４】
同時投与される1種または複数の物質は、処置される状態の種類に応じて決まる。例えば、処置される状態が癌である場合、追加の物質は、化学療法薬または放射線であり得る。処置される状態が自己免疫障害である場合、追加の物質は、免疫抑制剤または抗炎症剤であり得る。処置される状態が慢性炎症である場合、追加の物質は、抗炎症剤であり得る。抗癌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤のような同時投与され、ならびに当技術分野において周知の任意の物質であり得る追加物質は、臨床用途において現在使用されているものを含むが、これらに限定されるわけではない。放射線療法の適当な種類および線量の決定も、当技術分野の技術範囲内であるか、または比較的容易に決定することができる。
【０２２５】
異常なアポトーシスに関連した様々な状態の処置は、一般に、下記のふたつの主要な要因により制限される：(1)薬物耐性の発生、および(2)公知の治療的物質の毒性。ある種の癌において、例えば、化学療法および放射線療法に対する抵抗性は、アポトーシスの阻害に関連していることが示されている。一部の治療的物質は、非特異的リンパ球毒性、腎毒性および骨髄毒性を含む、有害な副作用を有する。
【０２２６】
本明細書に説明された方法は、これらの問題点の両方に対処している。薬剤耐性は、用量増大が治療的恩恵を実現するために必要な場合に、本明細書に説明された化合物を、公知の物質と共に同時投与することにより克服される。本明細書に説明された化合物は、公知の物質に対して標的細胞を増感するように見え(およびその逆も)、従って治療的恩恵を実現するためにより少ないこれらの物質が必要とされる。
【０２２７】
特許請求された化合物の増感機能は、公知の療法の毒性作用に関連した問題点にも対処している。公知の物質が毒性である場合に、全ての症例において、特に薬物耐性が必要量を増大した症例において、投与される用量を制限することが望ましい。特許請求された化合物が公知の物質と同時投与される場合、これらは必要量を減少し、このことは次に有害な作用を軽減する。さらに特許請求された化合物はそれ自身は大用量で有効かつ無毒の両方であるので、これらの化合物の割合が公知の毒性治療薬よりも多い同時投与は、毒性作用を最小化する一方で、所望の作用を実現するであろう。
【０２２８】
VI. 薬物スクリーン
本発明の好ましい態様において、本発明の化合物およびその他の潜在的に有用な化合物を、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分に対するこれらの結合親和性についてスクリーニングする。特に好ましい態様において、化合物は、組換えOSCPタンパク質に対するこれらの結合親和性を測定することによって、本発明の方法に使用するために選択される。受容体に対する薬物およびその他の小分子の結合親和性を測定するための多数の適切なスクリーンが、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、結合親和性スクリーンは、インビトロ系で行われる。その他の態様において、これらのスクリーンは、インビボまたはエクスビボの系において行われる。いくつかの態様において、本発明の化合物の投与後のATPの細胞内レベルを定量化することにより、本方法の有効性の指標を提供する一方で、本発明の好ましい態様において、細胞内ATPまたはpHレベルの定量化は必要ではない。
【０２２９】
さらなる態様は、本発明の特定の想定された方法および化合物の有効性を測定するために、細胞および/または組織におけるスーパーオキシドのレベル(例えば、細胞内)を測定することに向けられる。これに関して、当業者であれば、細胞および/または組織におけるスーパーオキシド・レベルを測定するために有用な多数のアッセイ法および方法を認識し、かつ提供することができる。
【０２３０】
いくつかの態様において、本発明の化合物のOSCPとの結合親和性を予測するために、構造に基づいた仮想スクリーニング法が想定される。
【０２３１】
ベンゾジアゼピンまたはその他の化合物のOSCPに対する結合の速度または親和性を測定することができる任意の適切なアッセイ法を利用してもよい。例には、Bz-423を使用する競争結合法、表面血漿共鳴(SPR)、および放射性免疫沈降アッセイ法(Lowman et al, J. Biol. Chem. 266：10982 [1991])を含むが、これらに限定されるわけではない。表面プラスモン共鳴技術には、金、銀、クロムまたはアルミニウムなどの導電性金属の薄膜でコーティングされた表面を含み、表面プラスモンと呼ばれる電磁波を表面プラスモン共鳴角と呼ばれる特定の角度の金属ガラス界面に対する入射光のビームによって誘導することができる。溶液と捕獲された巨大分子の結合後の金属表面との間の界面の領域の屈折率の変調が、SPR角度の変化を生じさせ、これを直接測定することができるか、またはこれが金属表面の下側から反映される光の量の変化を生じさせる。このような変化は、SPR装置表面に結合する分子の質量およびその他の光学的性質に直接関連し得る。このような原理に基づいたいくつかのバイオセンサー系が開示されている(例えば、国際公開公報第90/05305号を参照されたい)。また、いくつかの市販のSPRバイオセンサーもある(例えば、BiaCore, Uppsala, Sweden)。
【０２３２】
いくつかの態様において、化合物は、これらがミトコンドリアATP合成酵素活性を調整する能力について、細胞培養において、またはインビボ(例えば、非ヒトまたはヒト哺乳動物)においてスクリーニングされる。細胞増殖アッセイ法(例えば、Promega, Madison, WIおよびStratagene, La Jolla, CAから市販)および細胞に基づいた二量体化アッセイ法を含むが、これらに限定されるわけではない任意の適切なアッセイ法を利用してもよい(例えば、Fuh et al, Science, 256：1677 [1992]；Colosi et al, J. Biol. Chem., 268：12617 [1993]を参照されたい)。本発明での使用が見出されるさらなるアッセイ形式は、細胞ATPレベル、および細胞スーパーオキシド・レベルを測定するためのアッセイ法を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２３３】
また、本発明は、望ましい特性(例えば、結合親和性、活性など)を増大するか、または望ましくない特性(例えば、非特異的反応性、毒性など)を最小化するために、本発明の組成物を修飾し、および誘導体化する方法を提供する。化学的誘導体化の原理は、周知である。いくつかの態様において、親化合物から誘導体化される子化合物のライブラリーを作製するために、反復デザインおよび化学合成アプローチが使用される。その他の態様において、ルーチン試験によって結果を確認するより前にインシリコでリガンド-受容体相互作用を予測し、モデルとするために、合理的設計法が使用される。
【０２３４】
VII. 治療適用
A.一般的治療適用
特に好ましい態様において、本発明の組成物(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)は、冒された細胞または組織におけるミトコンドリアATP合成酵素(ミトコンドリアF0F1 ATPaseとも称する)複合体の活性を調整すること(例えば、阻害するか、または促進すること)によって、多数の状態の任意の1つまたは複数に罹患している患者に対して治療的恩典を提供する(例えば、細胞または組織における壊死および/またはアポトーシス過程の調節不全によって特徴付けられる疾患、ならびに異常な細胞増殖および/または過剰増殖などによって特徴付けられる疾患)。さらに好ましい態様において、本発明の組成物は、自己免疫性/慢性炎症性の状態(例えば、乾癬)を処置するために使用される。さらなる態様において、本発明の組成物は、欠陥のある(例えば、閉鎖された)血管を処置するために、狭窄療法と組み合わせて使用される。
【０２３５】
特に好ましい態様において、本発明の組成物は、この多サブユニットタンパク質複合体の特異的サブユニットに結合することによって、ミトコンドリアのATP合成酵素複合体の活性を阻害する。また、本発明は、投与される薬剤の作用のいずれの特定の機構またはいずれの理解にも限定されるわけではないが、いくつかの態様において、本発明の組成物は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分に、0SCP/F1接合部に、またはF1サブユニットに結合することが想定される。同様に、本発明の組成物がOSCPと結合する場合、初期の影響は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体の全体の阻害であること、および下流の結合の結果は、ATPまたはpHレベルの変化および活性酸素種(例えば、O2-)の産生であることが、さらに想定される。さらにその他の好ましい態様において、本発明は、いずれの特定の機構にも、または投与される薬剤の作用のいずれの理解にも限定されるわけではないが、フリーラジカルの産生により、細胞殺害が最終的に生じることが想定される。さらにその他の態様において、本発明は、いずれの特定の機構にも、または投与される薬剤の作用のいずれの理解に限定されるわけではないが、本発明の組成物および方法を使用してミトコンドリアATP合成酵素複合体を阻害することにより、細胞増殖の治療的に有用な阻害を提供することが想定される。
【０２３６】
したがって、本発明において実施される好ましい方法は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分に対する結合を経て冒された細胞または組織におけるミトコンドリアATP合成酵素複合体の活性を調整する(例えば、阻害する、または促進すること)本発明の化合物を提供することによって、患者に治療的恩典を提供することが想定される。重要なことに、OSCP、0SCP/F1接合部、またはF1サブユニットは、それ自体は生物活性を有さない。
【０２３７】
したがって、1つの広い意味において、本発明の好ましい態様は、細胞もしくは組織における壊死および/またはアポトーシス過程の調節不全によって特徴付けられる多くの疾患、または異常な細胞増殖および/または過剰増殖などによって特徴付けられる疾患は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体の活性を、これらのオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)成分に対する結合によって(これを含むが、それに限定されるわけではない)、調整することによって処置することができるという発見に向けられる。しかしながら、本発明は、本明細書に明確に記述された組成物および方法の実施に限定されることは企図されない。実際に、当業者であれば、本明細書に具体的に詳述されていない多くのさらなる化合物(例えば、非ベンゾジアゼピン系誘導体)が、本明細書に開示されたミトコンドリアATP合成酵素の活性の調整方法に使用するために適していることを認識するであろう。
【０２３８】
したがって、本発明は、現在当技術分野において公知か、または後に開発される多くの適切な化合物も、任意に本発明の方法における使用を見出すことができることを具体的に想定する。例えば、オリゴマイシン、オサマイシン、サイトバリシン(cytovaricin)、アポトリジン、バフィロマイシン、レズベラトロル、ピセタノール、およびジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)等を含むが、これらに限定されるわけではない化合物は、本発明の方法における使用が見出される。しかしながら、本発明は、上記に明記した方法または化合物に限定されることは企図されない。一つの態様において、本発明の方法において潜在的に有用なその化合物は、科学文献に記載されているような適切なものから選択してもよい。(例えば 、K.B. Wallace and A. A. Starkov, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 40：353-388 [2000]；A.R. Solomon et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 97(26)：14766-14771 [2000]を参照されたい)。
【０２３９】
いくつかの態様において、本発明の方法において潜在的に有用な化合物は、有効性について国立癌研究所の(NCI-60)癌細胞株に対してスクリーニングされる。(例えば、A. Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83：757-766 [1991]；および K.D. Paull et al., J. Natl. Cancer Inst., 81：1088-1092 [1989]を参照されたい)。さらなるスクリーンに適したスクリーン(例えば、自己免疫疾患モデルなど)は、当技術分野の技術の範囲内である。
【０２４０】
一つの局面において、例示的な化合物またはその他の適切な化合物の誘導体(例えば、薬学的に許容される塩、類似体、立体異性体など)も、本発明の方法に有用であることが想定される。
【０２４１】
その他の好ましい態様において、本発明の組成物は、欠陥のある(例えば、閉鎖された)血管を処置するために、狭窄療法と組み合わせて使用される。さらなる態様において、本発明の組成物は、欠陥のある心臓血管を処置するために、狭窄療法と組み合わせて使用される。
【０２４２】
血管狭窄は、血管(例えば、大動脈弁)が狭くなる場合、発生する状態である。例えば、大動脈弁狭窄は、心臓のより低い左心房(左心室)と大動脈と呼ばれる主要な血管との間の弁が狭くなる場合、発生する心臓病である。この狭細(例えば、狭窄)は、血液が体に流れるためにはあまりに小さな間隔を生じる。通常、左心室は、大動脈を介して体に酸素が豊富な血液をポンピングし、これが体の全体にわたる動脈の系へ枝分れする。心臓がポンピングする場合、大動脈弁の3つのフラップまたは小葉を一方向性に開いて、心室から大動脈へ血液を流すことができる。鼓動の間に、フラップは閉じて密封を形成し、血液が弁を通って後方に漏れないようにする。大動脈弁がダメージを受けている場合、これが狭くなって(狭窄して)、心臓自体を含む体の器官への血流が減少し得る。一旦症候が発生したならば、大動脈弁狭窄を有する人々についての長期の見通しは芳しくない。心不全の症候を発生する未処置の大動脈弁狭窄を有する人々は、通常3年またはそれ以下の平均余命である。
【０２４３】
欠陥のある弁を処置するために、数種類の処置が存在する(例えば、バルーン拡張、切除、粥腫切除、またはレーザー治療)。欠陥のある心臓弁のための処置の1つのタイプは、血管形成術である。血管形成術は、それを開く試みにおいて、狭いか、または遮断された動脈内にバルーンを先端に付けたチューブまたはカテーテルを挿入する段階を含む。数回バルーンを膨張させて、収縮させることよって、医師は、通常、動脈を広げることができる。
【０２４４】
血管形成術または弁膨張法の共通の限界は、再狭窄である。再狭窄は、動脈の狭窄した部分を開く試みによって、例えば動脈のバルーン拡張、切除、粥腫切除、またはレーザー治療などによって引き起こされる、その動脈に対する外傷後の末梢または冠動脈の再閉鎖である。これらの血管形成術法に関しては、再狭窄は、定義、血管位置、病変長、ならびに多数のその他の形態学的および臨床的な変数に応じて、約20〜50％の割合で生じる。再狭窄は、血管形成術法によって生じる動脈壁の傷害に対する自然治癒反応であると考えられる。治癒反応は、傷害の部位における血栓機構で開始する。治癒過程における複雑な工程の最終結果は、動脈が再び狭窄するかまたは閉鎖するまでの、これらの細胞外基質産生と組み合わせた内膜過形成、抑制されない遊走、および中央平滑筋細胞の増殖であり得る。
【０２４５】
再狭窄を防止しようとする試みにおいて、金属血管内ステントが、冠状血管または末梢血管に永久に移植されてきた。ステントは、典型的には、カテーテルによって血管内腔に挿入して、広げられて確実に動脈壁の病気にかかった部分と接触され、これにより内腔に対して機械的支持を提供する。しかしながら、再狭窄は、適所に置かれたこのようなステントでも生じ得ることが分かっている。また、ステント自体が、望ましくない局部的血栓症を生じさせ得る。血栓症の問題に対処するために、ステントを受けている人は、また、抗凝固薬および血小板凝集阻害剤での広範な全身処置を受ける。
【０２４６】
再狭窄問題に対処するために、内皮細胞と共に播種されたステントを提供することが提唱されてきた(Dichek, D. A. et al Seeding of Intravascular Stents With Genetically Engineered Endothelial Cells；Circulation 1989；80：1347-1353)。その実験では、細菌β-ガラクトシダーゼまたはヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のいずれかについて、レトロウイルスを媒介した遺伝子移入を受けたヒツジ内皮細胞をステンレス鋼ステント上に播種して、ステントがカバーされるまで培養した。したがって、細胞を血管壁に送達させ、そこでこれらが治療的タンパク質を提供することができる。また、ステントの手段によって血管壁に治療的物質を提供するその他の方法は、国際公開公報第WO91/12779号「Intraluminal Drug Eluting Prosthesis」および国際公開公報第WO90/13332号「Stent With Sustained Drug Delivery」などにおいて提唱された。これらの出願において、再狭窄の発生率を減少させるために、抗血小板剤、抗血液凝固剤、抗菌薬、抗炎症薬、抗代謝薬、および他剤をステントに供給することができることが示唆されている。さらに、一酸化窒素を放出する薬剤などのその他の欠陥反応性薬も使用することができる。
【０２４７】
再狭窄のさらなる原因は、処置された組織の過剰増殖である。好ましい態様において、本発明の抗増殖特性は、再狭窄を阻害する。薬物溶出ステントは、当技術分野において周知である(米国特許第5,697,967号；米国特許第5,599,352号；および米国特許第5,591,227号を参照されたい；これらのそれぞれが本明細書に参照として組み入れられる)。好ましい態様において、本発明の組成物は、欠陥のある(例えば、閉鎖のある)血管を処置する際に、薬物溶出するステントから溶出される。さらなる態様において、本発明の組成物は、欠陥のある心臓血管の処置における薬物溶出するステントから溶出される。
【０２４８】
薬学的化合物および製剤を調製する当業者であれば、本明細書に開示した方法に使用するための任意の化合物を選択する場合、毒性、安全性、有効性、利用能、および特定の化合物のコストを含むが、これらに限定されるわけではない適合性考慮を含むことを認識するであろう。
【０２４９】
B.自己免疫疾患および慢性炎症性障害医療適用
自己免疫疾患および慢性炎症性障害は、機能障害性細胞の増殖制御および/または細胞のアポトーシス制御から生じることが多い。ミトコンドリアは、細胞のアポトーシスの制御および実行において重要な役割を果たす。ミトコンドリアの透過性移行孔(MPTP)は、内側と外側のミトコンドリアのメンブラン(membrandes)にわたる孔であり、プロアポトーシスの粒子の制御において機能する。一過性MPTP開口により、チトクロームcの放出およびミトコンドリアの膜間腔からのアポトーシス誘導因子を生じ、細胞のアポトーシスを生じる。
【０２５０】
オリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)は、F0F1ミトコンドリアのATP合成酵素/ATPaseのサブユニットであり、ミトコンドリア膜における酵素のF0セクター全体のプロトン勾配のカップリングの際に機能する。好ましい態様において、本発明の化合物は、OSCP、OSCP/F1接合部、またはF1サブユニットに結合し、スーパーオキシドおよびチトクロームcレベルを増大し、細胞のアポトーシスを増大し、ならびに細胞の増殖を阻害する。アデニンヌクレオチドトランスロケーター(ANT)は、内側ミトコンドリア膜にまたがる30kDaタンパク質であり、ミトコンドリアの透過性移行孔(MPTP)において中心的である。チオール酸化剤またはアルキル化剤は、ANTのマトリックス側の3つの不対システインのうちの1つまたは複数を修飾することによって作用するMPTPの強力な活性化因子である。4(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシドは、ANTを阻害する。4(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド
2008505913.tif 000058
は、ANTを阻害する。
【０２５１】
本発明の化合物および方法は、自己免疫疾患および慢性炎症性障害の処置において有用である。このような態様において、本発明は、自己免疫疾患および/または慢性炎症性障害に罹患している対象、ならびに以下の式を含む組成物を提供する：
2008505913.tif 000059
2008505913.tif 000060
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され：水素；CH3；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R5は、OH；NO2；NR'；OR'からなる群より選択され；式中、R'は、以下からなる群より選択され：直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖；式中、R6は、以下からなる群より選択され：水素；NO2；Cl；F；Br；I；SR'；およびNR'2、式中、R'は、上記R5のように定義され；式中、R7は、水素；直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され；ならびにR8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり；式中、該ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含み、かつアリールまたは脂肪族環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的(例えば、ミトコンドリア)に到達するまで、R5の酸素をインビボでの代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位にて代謝されてR5をヒドロキシル基に変換する。
【０２５２】
C.上皮過形成の処置
肥厚する表皮の分断に付随して、表皮の有意な肥厚を引き起こす上皮過形成(例えば、過剰ケラチノサイト増殖)は、乾癬などの疾患の特色であり(例えば、Krueger GC, et al., (1984) J. Am. Acad. Dermatol. 11：937-947；Fry L. (1988), Brit. J. Dermatol. 119：445-461を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、さらに生理学的条件下で(例えば、創傷治癒の間に)生じる。
【０２５３】
また、オールトランスレチノイン酸(RA)またはその前駆体のオールトランスレチノール(ROL)での皮膚の局所処置により、上皮過形成を生じる(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol, 117：1335-1341を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。根底にある病態は異なるが、これらの過形成の全てで、共通して増殖性ケラチノサイトの上皮成長因子(EGF)受容体の活性化がある(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117：1335-1341；Baker BS, et al., (1992) Brit. J. Dermatol. 126：105-110；Gottlieb AB, et al., (1988) J. Exp. Med. 167：670-675；Elder JT, et al., (1989) Science 243：811-814；Piepkorn M, et al., (1998) J Invest Dermatol 111：715-721；Piepkorn M, et al., (2003) Arch Dermatol Res 27：27；Cook PW, et al., (1992) Cancer Res 52：3224-3227を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。正常な上皮増殖は、過形成性増殖ほどEGF受容体機能に依存的であるようには見えない(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117：1335-1341；Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66：253-259を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。同様に、無処置の皮膚における真皮の機能は、EGF受容体機能に依存していない(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117：1335-1341を参照されたい；その全体が、本明細書に参照として組み入れられる)。
【０２５４】
過形成性上皮増殖を調節する際のEGF受容体の中心的役割により、EGF受容体チロシンキナーゼは、抗増殖性の薬剤のための標的となる。同様に、この受容体の下流に関与する一連のシグナリング分子は、ケラチノサイト増殖を中断させることができるさらなる位置である。分裂促進因子で活性化されるプロテインキナーゼ(MAPK)カスケードは、EGF受容体によって活性化される(例えば、Marques, S.A., et al., (2002) J Pharmacol Exp Ther 300, 1026-1035を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。高増殖性表皮では、細胞外シグナル調節キナーゼ1/2(Erk 1/2)は、基底および基底上ケラチノサイトにおいて活性化され、表皮過剰増殖に寄与するが、正常表皮では寄与しない(例えば、 Haase, I., et al., (2001) J Clin Invest 108, 527-536；Takahashi, H., et al., (2002) J Dermatol Sci 30, 94-99を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。培養モデルにおいて、EGF受容体を介したケラチノサイト増殖調節により、MAPK活性の増大を生じる。ケラチノサイトでは、増殖因子刺激MAPK活性も、インテグリン結合に依存的であり、インテグリンに結合する細胞外基質分子は、独立してMAPKを活性化し、ケラチノサイト増殖を増大することができる(例えば、Haase, I., et al., (2001) J Clin Invest 108, 527-536を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。線維芽細胞を含むその他の皮膚細胞の増殖は、Erk 1/2活性にあまり依存しておらず、Erk阻害は、リード化合物を上皮過形成に対する潜在的有用性について評価するための潜在的に有用な特徴となる。
【０２５５】
好ましい態様において、本発明の化合物(例えば、Bz-423)は、上皮過形成を処置するために使用される。Bz-423の強力な抗増殖作用は、狼蒼における疾患徴候を限定する際のその有効性および正常細胞機能に対するその低い毒性指標と合わせて、乾癬およびその他の皮膚障害に存在する上皮細胞の異常増殖を標的化するための使用が見出される。
【０２５６】
好ましい態様において、本発明の化合物(例えば、Bz-423)は、乾癬を処置する際に使用される。乾癬は、通常および慢性の上皮過形成である。プラーク乾癬は、乾癬で最も通常の型であり、銀のかさぶたでカバーされる赤い皮膚および炎症によって特徴付けられる。かゆいか、またはひりひりする環状から卵形の赤色プラークのパッチは、プラーク乾癬の典型である。パッチは、通常、腕、脚、体幹、または頭皮上に見出されるが、皮膚のいずれの部分にも見出され得る。最も典型的な領域は、膝および肘である。乾癬は、接触感染性でなく、遺伝し得る。喫煙、日光曝露、アルコール中毒症、およびHIV感染症などの環境要因は、どのくらいの頻度で乾癬が生じるか、およびどのくらい長く再発が持続するかに影響を及ぼし得る。
【０２５７】
乾癬の処置は、局所的ステロイド、コールタール、角質溶解薬、ビタミンD-3類似体、および局所的レチノイドを含む。局所的ステロイドは、プラーク形成を減少させるために使用される薬剤である。局所的ステロイド薬は、抗炎症効果を有し、深刻かつ多様な代謝活性を生じさせ得る。加えて、局所的ステロイドの薬剤は、多様な刺激に対する体の免疫応答を修飾する。局所的ステロイドの例には、トリアムシノロンアセトニド(Artistocort, Kenalog)0.1％クリーム、およびジプロピオン酸ベタメタゾン(Diprolene, Diprosone)0.05％クリームを含むが、これらに限定されるわけではない。コールタールは、広範囲にわたる関与領域に使用するために、シャンプーまたはローションにおいて処方箋なしで利用できる安価な処置である。コールタールは、特に毛が生えている領域に有用である。コールタールの例は、コールタール2〜10％(DHS Tar, Doctar, Theraplex T)鎮痒薬である。角質溶解薬は、鱗片を除去するために、皮膚を滑らかにし、および角質増殖を処置するために使用される。角質溶解薬の例は、アントラリン0.1〜1％(Drithocreme, Anthra-Derm)である。ビタミンD-3類似体は、以前の療法に対して耐性の病変があるか、または皮膚が薄くなることにより美容上の問題が生じるであろう顔もしくは曝露された面に対する病変がある患者に使用される。ビタミンD-3類似体の例は、カルシポトリエン(Dovonex)である。局所的レチノイドは、濾胞性上皮細胞の凝集を減少させ、有糸分裂活性を刺激して、濾胞性上皮細胞の代謝回転の増加を生じる薬剤である。局所的レチノイドの例は、トレチノイン(Retin-A, Avita)およびタザロテン(Tazorac)を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２５８】
米国の人々のおよそ1〜2％、または約5,500,000人が、プラーク乾癬を有する。また、プラーク乾癬である人々の30％までが、乾癬性関節炎を有する。乾癬性関節炎である個体は、彼らの関節に炎症を有し、その他の関節炎症候も有し得る。時には、プラーク乾癬は、膿疱性乾癬または紅皮症乾癬などのより重篤な疾患に進行し得る。膿疱性乾癬において、皮膚上の赤い領域は、膿汁を伴う疱疹を含む。紅皮症乾癬において、赤く、および鱗片状皮膚の広範な領域が典型であり、これは、かゆく、かつ痛いかもしれない。本発明は、滴状乾癬、爪乾癬、逆位乾癬、および頭皮乾癬を含むが、これらに限定されるわけではない、さらなるタイプの乾癬の処置において有用である。
【０２５９】
VIII. ATPase阻害剤および治療的阻害剤を同定するための方法
本発明は、F1F0-ATPaseを標的化する化合物を提供する。加えて、本発明は、自己免疫疾患のための処置としてF1F0-ATPaseを標的化する化合物、および特に、低毒性である化合物を提供する。本発明は、F1F0-ATPaseを標的化する化合物を同定する方法をさらに提供する。加えて、本発明は、F1F0-ATPaseを標的化する化合物のための治療的適用を提供する。
【０２６０】
真核細胞内の大多数のATPは、ミトコンドリアのF1F0-ATPaseによって合成される(例えば、C.T. Gregory et al., J. Immunol., 139：313-318 [1987]；J.P. Portanova et al., Mol. Immunol., 32：117-135 [1987]；M.J. Shlomchik et al., Nat. Rev. Immunol., 1：147-153 [2001]を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。F1F0-ATPaseは、ATPを合成し、および加水分解するが、正常な生理的状態の間は、F1F0-ATPaseはATPを合成するだけである(例えば、Nagyvary J, et al., Biochem. Educ. 1999；27：193-99を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。ミトコンドリアのF1F0-ATPaseは、3つの主要ドメイン：F0、F1、および周辺固定子で構成される。F1は、触媒部位を含む酵素の部分であり、これは、マトリックスに位置する(Boyer, PD, Annu Rev Biochem.1997；66：717-49を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。このドメインは、高度に保存されており、サブユニット構成α3β3γδεを有する。ウシF1のランドマークX線構造により、そのα3β3がその円柱の中央にγサブユニットを有する六角形の円柱を形成することが明らかになった。F0は、ミトコンドリア膜の内側に位置し、プロトン・チャンネルを含む。内膜空間からマトリックスへのプロトンの転位置により、ATP合成を駆動するためのエネルギーを提供する。周辺固定子は、F1とF0を物理的および機能的に連結するいくつかのタンパク質で構成される。固定子は、高次構造上の変化をF0からATP合成を調節する触媒ドメイン内に伝達する(Cross RL, Biochim Biophys Acta 2000；1458：270-75を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。
【０２６１】
ミトコンドリアのF1F0-ATPase阻害剤は、F1F0-ATPaseの機構の研究のための非常に貴重なツールである(例えば、James AM, et al., J Biomed Sci 2002；9：475-87を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。F1F0-ATPase阻害剤は、たいてい細胞毒であるので、これらは、癌およびその他の高増殖性障害のための薬物として探索されてきた。マクロライド(例えば、オリゴマイシンおよびアポトリジン)は、F1F0-ATPaseの非競合的阻害剤である(例えば、Salomon AR, et al, PNAS 2000；97：14766-71；Salomon AR., et al, Chem Biol 2001；8：71-80を参照されたい；これらの全体が本明細書に参照として組み入れられる)。マクロライドは、F0に結合し、チャンネルを介したプロトンの流れを遮断してF1F0-ATPaseの阻害を生じる。マクロライドは、強力であり(例えば、オリゴマイシンに対するIC50=10nM)、大きな[ATP]の減少を引き起こす。したがって、マクロライドは、容認できないほど狭い治療係数を有し、かつ非常に有毒である(例えば、齧歯類におけるオリゴマイシンに対するLD50は、0.5mg/kgで2回の1日量である)(例えば、Kramar R, et al, Agents & Actions 1984, 15：660-63を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。その他のF1F0-ATPaseの阻害剤には、F1においてOSCPと結合するBz-423を含む(本明細書において他に記述したとおり)。Bz-423は、Ki〜9μMを有する。
【０２６２】
活発に呼吸している細胞(状態3呼吸として公知)では、F1F0-ATPaseを阻害すると、呼吸を遮断し、ミトコンドリアを静止状態(状態4として公知)に配置する。状態4では、MRCが状態3と比較して減少され、複合体IIIにてO2からO2-への還元に有利である(例えば、N. Zamzami et al., J. Exp. Med., 181：1661-1672 [1995]を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。例えば、オリゴマイシンまたはBz-423で細胞を処理することにより、複合体Vを阻害する結果として細胞内O2-の上昇を引き起こす。オリゴマイシンの場合、細胞にATPを補充することにより、死から保護されるが、抗酸化剤ではそうではないことから、細胞死は、ATPの低下によって生じることを示している(例えば、Zhang JG, et al., Arch Biochem Biophys 2001；393：87-96；McConkey DJ, et al., The ATP switch in apoptosis. In：Nieminen La, ed. Mitochondria in pathogenesis. New York：Plenum, 2001：265-77を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。Bz-423で誘導される細胞死は、抗酸化剤によって遮断され、細胞にATPを補充することによる影響を受けないことから、Bz-423は、ROS依存的な死応答に関与することを示している(例えば、N.B. Blatt, et al., J. Clin. Invest., 2002, 110, 1123を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。したがって、F1F0-ATPase阻害剤は、有毒(例えば、オリゴマイシン)か、または治療的(例えば、Bz-423)である。
【０２６３】
本発明は、毒性のF1F0-ATPase阻害剤を治療的F1F0-ATPase阻害剤と区別する方法を提供する。治療的可能性(例えば、Bz-423)があるF1F0-ATPase阻害剤は、新規阻害様式を示す。具体的には、有益なBz-423様の特性を有するF1F0-ATPase阻害剤は、不競合的阻害剤であり、高い基質濃度にて酵素‐基質複合体にのみ結合し、kcat/Km比を変化させない。この知識により、毒性化合物から治療可能性を有するF1F0-ATPase阻害剤を同定して、区別するための根拠が形成される。
【０２６４】
本発明は、自己免疫疾患処置としてF1F0-ATPaseを標的化する化合物を提供する。特に、本発明は、F1F0-ATPaseを標的化するが、kcat/Km比を変化させない化合物を同定する方法を提供する。加えて、本発明は、F1F0-ATPaseを標的化する化合物のための治療的適用を提供する。
【０２６５】
A. ATPaseを阻害する化合物
本発明は、F1F0-ATPaseを阻害する化合物を提供する。いくつかの態様において、本化合物は、遊離のF1F0-ATPaseに結合せず、むしろF1F0-ATPase-基質複合体と結合する。本化合物は、高い基質濃度にて最大活性を、および低い基質濃度にて最小の活性(例えば、F1F0-ATPaseを阻害する)を示す。好ましい態様において、化合物は、F1F0-ATPaseのkcat/Km比を変化させない。本発明のF1F0-ATPase阻害剤の特性は、オリゴマイシンと対照的であり、急性的に有毒かつ致死的なF1F0-ATPase阻害剤である。オリゴマイシンは、非競合的阻害剤であり、遊離のF1F0-ATPaseおよびF1F0-ATPase-基質複合体と結合し、kcat/Km比を変化させる。
【０２６６】
いくつかの態様において、F1F0-ATPaseを阻害するが、kcat/Km比を変化させない本発明の化合物は、本明細書において他に記述した構造を有する。しかしながら、本発明の方法によって治療的阻害剤として同定されたその他の構造の化合物も、本発明に包含される。
【０２６７】
B. ATPase阻害剤の同定
本発明は、自己免疫疾患を処置する際に有用な化合物を同定する(例えば、スクリーニングする)方法を提供する。本発明は、特定のタイプの化合物に限定されるわけではない。好ましい態様において、本発明の化合物は、薬学的組成物、小分子、抗体、大分子、合成分子、合成ポリペプチド、合成ポリヌクレオチド、合成核酸、アプタマー、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されるわけではない。本発明は、自己免疫疾患を処置する際に有用な化合物を同定する特定の方法に限定されるわけではない。好ましい態様において、自己免疫疾患を処置する際に有用な化合物は、F1F0-ATPaseを阻害するために能力を有するが、kcat/Km比を変化させないものとして同定される。
【０２６８】
C. F1F0-ATPase阻害剤での治療的適用
本発明は、障害(例えば、神経変性疾患、アルツハイマー、虚血再灌流傷害、神経筋障害、非ホジキンリンパ腫、リンパ性白血病、皮膚のT細胞性白血病、自己免疫疾患、癌、固形腫瘍、リンパ腫、および白血病)を処置するための方法を提供する。本発明は、特定の処置の形態に限定されるわけではない。好ましい態様において、処置は、症候回復、症候予防、障害予防、および障害回復を含むが、これらに限定されるわけではない。本発明は、インビボ、インビトロ、および/またはエクスビボの設定範囲において適用できる自己免疫疾患を処置する方法を提供する。
【０２６９】
いくつかの態様において、本発明は、標的細胞の阻害を介して自己免疫疾患を処置する。本発明は、特定の形態の細胞阻害に限定されるわけではない。好ましい態様において、細胞阻害は、細胞成長予防、細胞増殖予防、および細胞死を含むが、これらに限定されるわけではない。好ましい態様において、標的細胞の阻害は、標的細胞を本発明のF1F0-ATPase阻害剤と接触させる段階を介して達成される。さらなる態様において、標的細胞阻害は、本発明のF1F0-ATPase阻害剤でのF1F0-ATPaseの標的化を介して達成される。本発明は、特定のF1F0-ATPase阻害剤に限定されるわけではない。好ましい態様において、F1F0-ATPase阻害剤は、F1F0-ATPaseを阻害する能力を有するが、kcat/Km比を変化させない。さらなる好ましい態様において、F1F0-ATPase阻害剤は、Bz-423または本明細書に記述したその他の化合物である。
【０２７０】
本発明は、療法を必要とする対象における標的細胞の病態を選択的に阻害するための方法をさらに提供する。本発明は、標的細胞病態を阻害する特定の方法に限定されるわけではない。好ましい態様において、標的細胞病理学は、本発明の化合物の有効量の投与を介して阻害される。本発明は、特定の化合物に限定されるわけではない。好ましい態様において、化合物は、F1F0-ATPase阻害剤である。さらに好ましい態様において、化合物は、F1F0-ATPaseを阻害するが、kcat/Km比を変化させない。
【０２７１】
実施例
下記実施例は、本発明のある好ましい態様を明らかにし、かつさらに例証するために提供されており、それらの範囲を限定するために構成されるものではない。
【０２７２】
実施例1. 化合物の調製
ベンゾジアゼピン化合物は、固相または可溶性相のどちらかのコンビナトリアル合成法に加え、良く確立された技術の個別の基本を用いて調製される。本明細書に参照として組入れられている、例えば、Boojamra, C.G. et al.,(1996)；Bunin, B.A., et al.(1994)；Stevens, S.Y. et al.,(1996)；Gordon, E.M., et al.,(1994)；ならびに米国特許第4,110,337号および第4,076,823号を参照されたい。例証のために、下記の一般的方法を提供する。
【０２７３】
1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン化合物の調製
様々な1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン誘導体を非常に高い全体収率で調製するために改良された固相合成法が、文献において報告されている(例えば、BuninおよびEllman、J. Am. Chem. Soc.、114：10997-10998[1992]を参照されたい)。これらの改良された方法を用い、1,4-ベンゾジアゼピン-2-オンが、3種の個別の成分：2-アミノベンゾフェノン、α-アミノ酸、および(任意に)アルキル化剤から、固形支持体上で構築される。
【０２７４】
好ましい2-アミノベンゾフェノンは、置換された2-アミノベンゾフェノン、例えば、ハロ置換された、ヒドロキシ置換された、およびハロヒドロキシ置換された2-アミノベンゾフェノン、例えば4-ハロ-4'-ヒドロキシ-2-アミノベンゾフェノンを含む。好ましい置換された2-アミノベンゾフェノンは、4-クロロ-4'-ヒドロキシ-2-アミノベンゾフェノンである。好ましいα-アミノ酸は、20種の一般的天然α-アミノ酸に加え、α-アミノ酸を模倣している構造、例えばホモフェニルアラニン、ホモチロシンおよびチロキシンを含む。
【０２７５】
アルキル化剤は、活性化されたおよび不活性化された求電子試薬両方を含み、その多種多様なものが当技術分野において周知である。好ましいアルキル化剤は、活性化された求電子試薬p-ブロモベンジルブロミドおよびブロモ酢酸t-ブチルを含む。
【０２７６】
このような合成の第一段階において、2-アミノベンゾフェノン誘導体が、ポリスチレン固形支持体のような固形支持体に、周知の方法を用い、かつ市販の[4-(ヒドロキシメチル)フェノキシ]酢酸のような酸で切断可能なリンカーを利用し、ヒドロキシまたはカルボン酸官能基のどちらかを介して結合し、支持された2-アミノベンゾフェノンを得る(例えば、SheppardおよびWilliams、Intl. J. Peptide Protein Res.、20：451-454[1982])。アミノベンゾフェノンの2-アミノ基は、好ましくは連結試薬との反応の前に、例えば、FMOC-Cl(クロロギ酸9-フルオレニルメチル)との反応により、保護され、保護されたアミノ基2'-NHFMOCを得る。
【０２７７】
第二段階において、保護された2-アミノ基は脱保護され(例えば、-NHFMOC基は、ジメチルホルムアミド(DMF)中におけるピペリジン処理により脱保護される)、脱保護された2-アミノベンゾフェノンは、次にα-アミノ酸(そのアミノ基はそれ自身、例えば-NHFMOC基として、保護されている)へのアミド連結を介して連結され、中間体を生じる。一般的固相ペプチド合成において使用される標準の活性化法(例えば、カルボジイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニル活性化エステルの使用)を使用し、カップリングを促進する。しかしながら、好ましい活性化法は、酸捕捉剤4-メチル-2,6-ジ-tert-ブチルピリジンの存在下での、2-アミノベンゾフェノンの、α-N-FMOC-アミノ酸フッ化物の塩化メチレン溶液による処理を使用し、アミド連結を介した完全なカップリングを得る。この好ましいカップリング法は、非反応性アミノベンゾフェノン誘導体であっても有効であることは分かっており、4-クロロおよび3-カルボキシの両不活性置換基を有する誘導体の本質的に完全なカップリングを得る。
【０２７８】
第三の段階において、保護されたアミノ基(アミノ酸に由来する)は最初に脱保護され(例えば、-NHFMOCは、DMF中のピペリジンにより-NH2に転換することができる)、脱保護されたBz-423は、酸、例えばDMF中の5％酢酸で、60℃で処理し、支持された1,4-ベンゾジアゼピン誘導体を得る。この方法を用い、大きく異なる立体特性および電子特性を伴う様々な2-アミノベンゾフェノン誘導体の完全な環化が報告されている。
【０２７９】
任意の第四の段階において、1,4-ベンゾジアゼピン誘導体は、適当なアルキル化剤および塩基によりアルキル化され、支持された完全に誘導体化された1,4-ベンゾジアゼピンを得る。標準のアルキル化法、例えばLDA(リチウムジイソプロピルアミド)またはNaHのような過剰な強塩基を使用する；しかしながらこのような方法は、望ましくない他の酸性官能基の脱プロトン化および過剰なアルキル化を生じることがある。ベンゾジアゼピン誘導体(例えば、エステルおよびカルバメート官能基を伴うもの)の過剰なアルキル化を妨害することができる好ましい塩基は、アニリド官能基を完全に脱プロトン化するのに十分な塩基であるが、アミド、カルバメートまたはエステル官能基を脱プロトン化するのに十分な塩基ではない。このような塩基の例は、リチウム化された5-(フェニルメチル)-2-オキサキソリジノンであり、これはテトラヒドロフラン(THF)中-78℃で1,4-ベンゾジアゼピンと反応される。脱プロトン化された後、前述のような適当なアルキル化剤を添加する。
【０２８０】
最終段階において、十分に誘導体化された1,4-ベンゾジアゼピンが、固形支持体から切断される。これは、例えば、適当な酸、例えばトリフルオロ酢酸、水およびジメチルスルフィドの混合物(容量比85：5：10)へ曝露することにより、実現される(酸不安定な保護基の同時除去と共に)。あるいは、前記ベンゾジアゼピンは、可溶性相で調製される。この合成法は、Gordonらの論文(J. Med. Chem.、37：1386-1401[1994])に説明されており、これは本明細書に参照として組入れられている。簡単に述べると、この方法は、適宜置換された2-アミノベンゾフェノンイミンによるアミノ酸樹脂のトランス-イミド化による、樹脂結合したイミンの生成を含む。これらのイミンは環化され、前述の固相合成における手法に類似した手法によりつながれる。前記方法を用いて調製されたベンゾジアゼピンの一般的純度は、約90％またはそれよりも高い。
【０２８１】
1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンの調製
1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンの固相合成のための一般的方法は、C.J. Boojamraらの論文(J. Org. Chem.、62：1240-1256[1996])に詳細に報告されている。この方法は、本発明の化合物を調製するために使用される。
【０２８２】
Merrifield樹脂、例えば(クロロメチル)ポリスチレンは、4-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシベンズアルデヒドナトリウムによるアルキル化により誘導体化され、樹脂結合したアルデヒドを提供する。α-アミノエステルは次に、1％酢酸のDMF溶液中のNaBH(OAc)3を使用する還元的アミノ化により、誘導体化された支持体に結合される。この還元的アミノ化は、樹脂結合した第二級アミンの形成を生じる。
【０２８３】
第二級アミンは、多種多様な保護されないアントラニル酸によりアシル化され、樹脂結合した3級アミドを生じる。アシル化は、カルボジイミドおよび第三級アミンの塩酸塩の存在下でカップリング反応を行うことにより実現される。ひとつの良好なカップリング剤は、1-エチル-8-[8-(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩である。この反応は、典型的には、無水1-メチル-2-ピロリジノンの存在下で行われる。このカップリング手法は典型的には完全なアシル化を確認するために、再度繰り返される。
【０２８４】
アシル誘導体の環化は、ベンゾジアゼピンの環状複素環の窒素上の1位の置換基の同時導入のためにハロゲン化アルキルと反応することを介し、アニリドアニオンの形成による、塩基触媒によるラクタム化により実現される。アセトアニリドのリチウム塩は、この反応を触媒する良好な塩基である。従って、DMF/THF(1：1)中でアセトアニリドリチウムと30時間反応し、引き続き適当なアルキル化剤と反応したBz-423は、完全に誘導体化された支持体結合したベンゾジアゼピンを提供する。これらの化合物は、TFA/DMS/H2O(90：5：5)を用い、良好な収率および高い純度で、支持体から切断される。
【０２８５】
本発明において使用されるα-アミノエステル出発材料、アルキル化剤、およびアントラニル酸誘導体の例のいくつかは、Boojamra(1996)、前掲、1246によって列記されている。追加の試薬は容易に決定され、かつ市販されているか、もしくは本発明において開示された新規置換基に到達するよう、当業者により容易に調製されるかのどちらかである。
【０２８６】
例えば、Boojamraの論文(前掲)から、以下のことがわかる：アルキル化剤は、R1置換基を提供する；α-アミノエステル出発材料は、R2置換基を提供し、アントラニル酸は、R4置換基を提供する。これらの適宜置換されている出発材料を使用することにより、所望の1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンに到達する。R3置換基は、α-アミノエステル出発材料のアミンの適当な置換により得られる。立体的密集が問題となる場合は、R3置換基は、1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンが単離された後、通常の方法で結合される。
【０２８７】
実施例2. キラリティー
本発明のベンゾジアゼピンの多くは、立体中心がα-アミノ酸およびそのエステル出発材料により導入されるキラリティーのために、光学異性体として存在することは認められるはずである。前述の一般的手法は、α-アミノ酸またはエステル出発材料のキラリティーを保存する。多くの場合において、このように保存されたキラリティーが望ましい。しかしながら、α-アミノ酸またはエステル出発材料の望ましい光学異性体が入手できないかもしくは高価である場合、対応する光学異性体に分離されるラセミ混合物が作成され、望ましいベンゾジアゼピン鏡像異性体が単離される。
【０２８８】
例えば2,5-ジオン化合物の場合、Boojamra(前掲)は、鏡像異性体として純粋なα-アミノエステル出発材料の塩酸塩の、0.3当量のi-Pr2EtNおよび樹脂結合したアルデヒドとの6時間の予備平衡化、その後のNaBH(OAc)3の添加により、完全なラセミ化が実現されることを明らかにしている。前述の合成法の残りは、同じままである。必要ならば、さらに1,4-ベンゾジアゼピン-2-ジオン化合物の場合と同様の段階が使用される。
【０２８９】
個々のベンゾジアゼピンを調製する方法は、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第3,415,814号；第3,384,635号；および、第3,261,828号を参照し、これらは本明細書に参照として組入れられている)。任意の前述の方法において、適宜置換された出発材料を選択することにより、本発明のベンゾジアゼピンが、比較的容易に調製される。
【０２９０】
実施例3. 試薬
Bz-423は、前述のように合成した。FK506は、Fujisawa(大阪、日本)から入手した。N-ベンゾイルカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトン(z-VAD)は、Enzyme Systems社(リバーモア、CA)から得た。ジヒドロエチジウム(DHE)および3,3'-ヨウ化ジヘキシルオキサカルボシアニン(DiOC6(3))は、Molecular Probes社(ユージーン、OR)から得た。FAM-VAD-fmkは、Intergen社(パーチェス、NJ)から得た。マンガン(III)meso-テトラキス(4-安息香酸)ポルフィリン(MnTBAP)は、Alexis Biochemicals社(サンディエゴ、CA)から購入した。ベンゾジアゼピンは、説明されたように合成した(B.A. Bunin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、91：4708-4712[1994]参照)。他の試薬は、Sigma社(セントルイス、MO)から得た。
【０２９１】
実施例4. 動物および薬物送達
雌NZB/Wマウス(Jackson Labs社、バーハーバー、ME)を、処理群および対照群に無作為に分配した。腹腔内注射により、対照マウスは、ビヒクル(50μL DMSO水溶液)を受取り、処理マウスは、ビヒクルに溶解したBz-423(60mg/kg)を与えられた。末梢血を、尾静脈から入手し、血清を調製した。脾および腎の試料は、10％緩衝化ホルマリンまたはOCT中の凍結のどちらかにより保存した。各動物からの追加の脾切片を、単独の細胞懸濁液の調製のために保存した。
【０２９２】
実施例5. 初代脾細胞、細胞株、および培養条件
初代脾細胞は、6ヵ月齢のマウスから、赤血球の等張溶解を伴う、脾の機械的破壊により得た。B細胞が豊富な画分を、CD4、CD8aおよびCD11b被覆されたマイクロビーズ(Miltenyi Biotec社、オーバーン、CA)による磁気セルソーターを用いる陰性選択により調製した。Ramos株は、ATCC(モナシス、GA)から購入した。細胞を、10％熱失活ウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)およびL-グルタミン(290μg/ml)を添加したRPMI中で維持した。初代細胞のための培地は、2-メルカプトエタノール(50μM)も含有した。全てのインビボ試験は、0.5％DMSOおよび2％FBSで行った。インビトロ実験は、2％FBS含有培地において行った。有機化合物は、0.5％DMSO含有培地に溶解した。
【０２９３】
実施例6. 組織学
ホルマリン固定した腎切片を、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色し、糸球体の免疫複合体の沈着を、FITC複合したヤギ抗マウスIgG(Southern Biotechnology社、バーミンガム、AL)で染色した凍結した組織を用いる直接免疫蛍光により検出した。切片を、腎炎およびIgG沈着について0〜4+スケールを用い盲検様式で解析した。リンパ系過形成の程度は、H&Eで染色した脾切片を用い、0〜4+スケールでスコア化した。B細胞を同定するために、切片を、ビオチン化した抗B220(Pharmingen社；1μg/mL)で、その後ストレプトアビジン-Alexa 594(Molecular Probes社；5μg/mL)で染色した。凍結した脾切片を、TUNEL陽性細胞について、インサイチュー細胞死検出キット(Roche社)を用いて分析し、0〜4+スケールを用いて評価した。
【０２９４】
実施例7. TUNEL染色
凍結した脾切片を、インサイチュー細胞死検出キット(Roche Molecular Biochemicals社、インディアナポリス、IN)を用いて分析した。切片は盲検により評価し、TUNEL陽性染色の量に基づいてスコアリングした(0〜4+)。B細胞は、ビオチン化された抗B220(Pharmingen社、サンディエゴ、CA；1μg/mL、1時間、22℃)で、引き続きストレプトアビジン-Alexa 594(Molecular Probes社、ユージーン、OR；5μg/mL、1時間、22℃)で染色することにより同定した。
【０２９５】
実施例8. 処理した動物由来の脾のフローサイトメトリー分析
表面マーカーを、蛍光複合した抗Thy 1.2(Pharmingen社、1μg/mL)および/または抗B220(Pharmingen社、1μg/mL)で検出した(15分間、4℃)。外膜ホスファチジルセリンを検出するために、細胞を、FITC複合したアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)と共に、製造業者(Roche Molecular Biochemicals社)の指示に従いインキュベーションした。フローサイトメトリーによるTUNEL陽性細胞の検出には、APO-BRDUキット(Pharmingen社)を使用した。スーパーオキシドおよびMPTは、細胞を10μMジヒドロエチジウムおよび2μM 3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド(DIOC6(3))(Molecular Probes社)と共に、30分間27℃でインキュベーションすることにより評価した。ヨウ化プロピジウムを用い、生存度およびDNA含量を決定した。試料は、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、サンディエゴ、CA)で分析した。
【０２９６】
実施例9. B細胞刺激
Ramos細胞を、可溶性ヤギFab2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology Associates社、1μg/ml)および/または精製した抗ヒトCD40(Pharmingen社、クローン5C3、2.5μg/ml)で活性化した。マウスB細胞を、培養ウェルに固定したアフィニティー精製したヤギ抗マウスIgM(ICN社、オーロラ、OH；20μg/ml)および/または可溶性精製した抗マウスCD40(Pharmingen社、クローンHM40-3、2.5μg/ml)で活性化した。LPSは10μg/mlで使用した。Bz-423は、刺激を加えた直後に、培養物へ添加した。インヒビターは、Bz-423の30分前に添加した。
【０２９７】
実施例10. 統計解析
統計解析を、SPSSソフトウェアパッケージを用いて行った。統計学的有意性は、Mann-Whitney U検定を用いて評価し、変量間の相関関係は、二元ANOVAにより評価した。報告した全てのp値は片側であり、データは平均±SEMで表わした。
【０２９８】
実施例11. 細胞死および低二倍体DNAの検出
細胞生存度は、ヨウ化プロピジウム(PI、1μg/mL)染色により評価した。PI蛍光は、FACScaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、サンディエゴ、CA)を用いて測定した。低二倍体DNAの測定は、DNA標識液(0.2％Tritonおよび10μg/mL RNAse Aを含有するPBS中のPI 50μg/mL)中で、細胞を4℃で一晩インキュベーションした後に行った。このデータは、総計(aggregate)以外は、CellQuestソフトウェアを用いて解析した。
【０２９９】
実施例12. O2-、Ψmおよびカスパーゼ活性化の検出
O2-を検出するために、細胞を、DHE(10μM)と共に、30分間37℃でインキュベーションし、エチジウム蛍光を測定するフローサイトメトリーにより分析した。ミトコンドリア膜を隔てた電位(Ψm)のフロー分析は、細胞をDiOC6(3)(20nM)で37℃で15分間標識することにより行った。Ψm崩壊に関する陽性対照は、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP、50μM)を用いて確立した。カスパーゼ活性化アッセイは、FAM-VAD-フルオロメチルケトンで行った。この基質の処理は、フローサイトメトリーで評価した。
【０３００】
実施例13. 細胞下画分およびシトクロムc検出
Ramos細胞(250×106細胞/試料)を、Bz-423(10μM)またはビヒクルで1〜5時間処理した。細胞をペレット化し、緩衝液(68mMショ糖、220mMマンニトール、10mM HEPES-NaOH、pH7.4、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、10μg/mLロイペプチン、10μg/mLアプロチニン、1mM PMSF)中に再懸濁させ、氷上で10分間インキュベーションし、ホモジナイズした。ホモジネートを、4℃で5分間(800g)2回遠心し、核およびデブリをペレット化し、ならびに4℃で15分間(16,000g)遠心し、ミトコンドリアをペレット化した。上清を濃縮し、12％SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、Hybond ECL膜(Amersham社、ピスカタウェイ、NJ)に転写した。ブロック後(5％乾燥ミルクおよび0.1％Tweenを含有するPBS)、この膜を、抗シトクロムcモノクローナル抗体(Pharmingen社、サンディエゴ、CA；2μg/mL)で、引き続き抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼで複合した二次抗体(Amersham社)でプロービングし、化学発光により検出した。
【０３０１】
実施例14. 単離されたミトコンドリアにおけるROS生成
雄のLong Evansラットを一晩絶食し、断頭により屠殺した。肝試料を、氷冷した緩衝液A(250mMショ糖、10mM Tris、0.1mM EGTA、pH7.4)中でホモジナイズし、核および細胞デブリをペレット化した(10分間、830g、4℃)。ミトコンドリアを、遠心(10分間、15,OOOg、4℃)により収集し、上清をS15画分として収集した。ミトコンドリアペレットを、緩衝液B(250mMショ糖、10mM Tris、pH7.4)で3回洗浄し、緩衝液Bで20mg/mL〜30mg/mLになるよう再懸濁した。ミトコンドリアは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸(DCFH-DA、1μM)を含有する緩衝液C(200mMショ糖、10mM Tris、pH7.4、1mM KH2PO4、10μM EGTA、2.5μMロテノン、5mMコハク酸)で希釈した(0.5mg/mL)。ステート3測定に関して、ADP(2mM)を緩衝液中に含有し、Bz-423添加の前に、ミトコンドリアを2分間チャージさせた(charge)。ステート4を誘導するために、オリゴマイシン(10μM)を、緩衝液Cに添加した。DCFHの2',7'-ジクロロフルオレセイン(DCF)への酸化を、37℃で、蛍光分光計(λex：503nm；λem：522nm)でモニタリングした。O2-およびΔΨmに対する作用を検出するために、ミトコンドリアを、DHE(5μM)またはDIOC6(3)(20 nM)を含有する、ビヒクル、Bz-423、またはCCCPを伴う、緩衝液C中で、37℃で15分間インキュベーションし、アリコートを蛍光顕微鏡による分析のために取り出した。
【０３０２】
実施例15. 脾細胞のフローサイトメトリー分析
脾細胞を、機械的破壊により調製し、赤血球を等張溶解により除去した。細胞を、蛍光複合した抗Thy 1.2(Pharmingen社；1μg/mL)および/または抗B220(Pharmingen社；1μg/mL)で、4℃で15分間染色した。外膜ホスファチジルセリンを検出するために、細胞を、FITC複合したアネキシンVおよびPI(Roche Molecular Biochemicals社、インディアナポリス、IN；1μg/mL)と共にインキュベーションした。
【０３０３】
実施例16. ROSのインビボ決定
脾臓を、Bz-423またはビヒクルで処理した4ヵ月齢のNZB/Wマウスから摘出し、OCT中で凍結させた。ROS産生は、E.D. Kerverらにより説明されたように、3,3,9-ジアミノベンジジンマンガン(II)を用いて測定した(E.D. Kerver et al, Histochem. J.、29：229-237[1997]参照)。
【０３０４】
実施例17. IgG力価、BUN、およびタンパク尿
抗DNAおよびIgG力価を、P.C. Swansonらにより説明されたように、ELISAにより決定した(P.C. Swanson et al, Biochemistry、35：1624-1633[1996]参照)。血清BUNは、ミシガン大学病院(University of Michigan Hospital)の臨床検査室で測定した。タンパク尿は、ChemStrip 6(Boehringer Mannheim社)を用いモニタリングした。
【０３０５】
実施例18. ベンゾジアゼピン研究
動物でのベンゾジアゼピン研究は、2001年8月23日に公表された米国特許公開第20010016583号に記述されており、その全体が本明細書に参照として組み入れられる。
【０３０６】
実施例19. アポトーシスを誘導するBz-423のメディエーター
Bz-423に関与する死滅機構を特徴付けるために、細胞内ROS、ΔΨm、チトクロームc放出、カスパーゼ活性化、およびDNA断片化を時間と共に測定した(示した結果は、B細胞に関するものであるが、多くの異なる細胞タイプにおける反応を特徴付ける)。Bz-423に対する曝露後に検出される最初の事象は、O2-と特異的に反応する酸化還元感受性薬のジヒロエテジウム(DHE)で染色される細胞の画分の増大である。
【０３０７】
O2-レベルの増大は、1時間の早期最大値後に減少され、次いで4時間の連続した処理後に再び増大する。この二峰性パターンは、O2-を制限する細胞の機構を示し、「初期」および「後期」のO2-最大が異なる過程によって生じたことを示唆した。
【０３０８】
ΔΨmの崩壊は、DiOC6(3)(ミトコンドリア選択電位差測定プローブ)を使用して検出した。段階的変化は、早期O2-応答後に開始し、5時間までに細胞の＞90％において観察された。
【０３０９】
カスパーゼを活性化させることができる重要な工程であるミトコンドリアからのチトクロームc放出は、サイトゾルの画分を免疫ブロットすることによって研究した。媒体で処理した細胞における量以上のサイトゾル・チトクロームcのレベルが、5時間まで検出された。この放出は、ΔΨmの破壊と一致して、それと共に、これらの結果は、PT孔の開口と一致していた。実際に、O2-の後期増大は、ΔΨm崩壊およびチトクロームcの放出と共に進行し、O2-の二次的上昇は、これらの過程によって生じることを示唆する。
【０３１０】
カスパーゼ活性化は、汎カスパーゼ感受性の蛍光基質FAM-VAD-fmkのプロセシングによって測定した。カスパーゼ活性化は、ΔΨmと共に進行するが、低二倍体DNAの外見は、カスパーゼ活性化に関してわずかに遅延した。総合して、これらの結果は、Bz-423がミトコンドリア依存的アポトーシスの経路を誘導することを示した。
【０３１１】
実施例20. ミトコンドリアを直接標的化するBz-423
初期O2-は、その他の細胞事象に先行するため、このROSが調節の役割を有する可能性があった。非食作用細胞において、酸化還元酵素は、MRCと共に、ROSの主要供与源である。この反応に関する基礎を決定するために、これらの系の阻害剤をBz-423で誘導されるO2-を調節する能力についてアッセイした。これらの試薬のうち、主にチトクロームcオキシダーゼに対して作用するNaN3(ミトコンドリアの呼吸鎖、MRCの複合体IV)、およびMRC複合体IIIのユビキノール-チトクロームcレダクターゼ成分によるO2-の形成を遮断するミクロモル量のFK506だけが、Bz-423を調整した。これらの知見は、ミトコンドリアが、Bz-423で誘導されるO2-の供与源であること、およびMRCの成分が応答に関与することを示唆した。FK506による阻害は、カルシニューリンまたはFK506-結合タンパク質のいずれかに対する結合によって生じ得るが、これらのタンパク質(それぞれ、ラパマイシン、およびシクロスポリンA)としっかりと結合する天然物は、Bz-423 O2-応答を減少させなかった。
【０３１２】
Bz-423によるO2-産生は、ミトコンドリア内のタンパク質またはミトコンドリアにシグナルを伝えてROSを産生する別のコンパートメントの標的に結合することによって生じ得る。これらの選択肢間を区別するために、単離したラット肝ミトコンドリアを、Bz-423の有無において2',7'-ジクロロジヒドロフルオレッセインジアセタートの、2',7'-ジクロロフルオレッセインへの酸化をモニターすることによってROS産生についてアッセイした。このアッセイ法では、DCF産生の割合は、内因性の減少する等価物が消費され、かつプローブ上の酢酸部分が加水分解されて2',7'-ジクロロジヒドロフルオレッセイン(酸化還元活性種)を生じる遅滞期後に増大した。状態3呼吸を支持する好気条件下では、ユビキノール-チトクロームcレダクターゼを阻害することによってO2-を産生するアンチマイシンA、およびBz-423は両方とも、それぞれの曲線の勾配を対照に対して比較することに基づくと、誘導期後のROS産生の割合をほとんど2倍に増大した。膨張は観察されず、Bz-423がMPT孔を直接標的化しないことを証明する。Bz-423も、アンチマイシンAも、細胞下のS15画分(サイトゾルおよびミクロソーム)において実質的にROSを産生せず、またBz-423は、ミトコンドリアが状態4である場合には、アンチマイシンAがこれらの条件下で活性な場合であってもROSを刺激しない。合わせると、これらの実験は、ミトコンドリアがBz-423のための分子標的を含み、かつO2-応答のために状態3呼吸が必要にされることを示す。
【０３１３】
実施例21. ミトコンドリアに由来するBz-423で誘導されるROS
MRC複合体IおよびIIIは、ミトコンドリア内のROSの主要供与源である。上で提示した証拠は、Bz-423で誘導されるROSがミトコンドリアに由来することを示唆する。この仮説を試験するために、MRC機能をノックアウトして、生じる細胞をBz-423に対する応答の際のROSについて調べた。MRCの複合体I〜IVは、部分的にミトコンドリアDNA(mtDNA)によってコードされる。臭化エチジウムの存在下において長期間にわたって細胞を培養するとmtDNAが除去されることから、mtDNAでコードされるタンパク質は産生されず、MRCに沿った電子伝達は生じないことを示唆している(mtDNAおよび関連するタンパク質を欠いた細胞は、ρ0細胞と呼ばれることが多い)。臭化エチジウムは、ラモス細胞に有毒であるので、これらの実験は、Namalwa B細胞(別の成熟B細胞株)で行った。Namalwaρ0細胞をBz-423で処理してもROS応答を生じず、そのことはラモスおよびNamalwaρ+細胞においても観察された。
【０３１４】
初期ROSは、Bz-423で誘導されるアポトーシスに重要であるため、Namalwaρ0細胞で検出される結果は、外見的には、これらの細胞がBz-423の毒作用から保護されるであろうことを予測させるであろう。しかしながら、6時間後、MPTがトリガーされて、Namalwaρ0細胞はBz-423に応答してアポトーシスを受けた。ρ+細胞では、MRCによるプロトン・ポンピングにより、ミトコンドリアの勾配ΔΨmを維持した。機能的MRCは、ρ0細胞には存在しないので、ΔΨmは、ATPaseとして機能する複合体V(F1F0-ATPase)によって指示されている(ρ0細胞におけるサブユニット6およびbの欠失は、この酵素の合成酵素活性をなくす)。この場合、複合体V ATPaseの阻害は、勾配およびその後の細胞死の崩壊を生じさせる。
【０３１５】
実施例22. ミトコンドリアのF1F0-ATPaseを標的化するBz-423
オリゴマイシン(ミトコンドリアのF1F0-ATPaseと結合するマクロライド天然物)は、状態3〜4移行を誘導し、Bz-423のようにO2-を産生する。これらの類似性に基づくと、F1F0-ATPaseは、またBz-423のための分子標的であるかもしれない。この仮説を試験するために、亜ミトコンドリア粒子(SMP)におけるATPase活性に対するBz-423の効果を調べた。実際に、Bz-423は、ED 50 ca. 5μMで、ウシSMPのミトコンドリアのATPase活性を阻害した。
【０３１６】
生物活性のために必要とされるこの新規薬剤に対するエレメントを決定するためにBz-423の＞40の誘導体を開発した。細胞全体アポトーシス・アッセイ法でこれらの化合物を評価することにより、概略的に、ナフチル部分のサイズのC'4位のヒドロキシ基および芳香環が有用であったことが明らかになった。細胞に基づいたアッセイ法におけるこれらの類似体の能力は、SMPを使用するATPase阻害実験におけるED50値と相関した。これらの観察は、ミトコンドリアのATPaseがBz-423の分子標的であることを示した。これらの誘導体が細胞障害性である濃度(80μM)にて、その他のベンゾジアゼピンおよびPBRリガンド(例えば、PK11195および4-クロロジアゼパム)は、ミトコンドリアのATPase活性を有意に阻害せず、Bz-423の分子標的が、これらのその他の化合物の分子標的とは異なっていることを示唆する。
【０３１７】
実施例23. OSCPに対して結合するBz-423
Bz-423の機構研究の初期群の一部のように、ビオチンが共有結合で付着したヘキシルアミノリンカーとNメチル基を置換することによって(この修飾では、Bz-423の活性を変化させなかった)、ビオチン化された類似体を合成した。この分子を、T7ファージの先端に融合タンパク質として発現されるヒト乳癌cDNA(Invitrogen)のディスプレイ・ライブラリーをプローブするために使用した。新たなFK506結合タンパク質を同定するために、KF506のビオチン化されたバージョンを使用して、Austinおよび同僚によって記述されたスクリーニング法に従って、ミトコンドリアのF1F0-ATPaseのOSCP成分をBz-423に対する結合タンパク質として同定した(図1)。
【０３１８】
Bz-423が、実際にOSCPに結合するかどうか、および相互作用の親和性を決定するために、ヒトOSCPを大腸菌に過剰発現させた。OSCP内でBz-423の溶液を滴定することにより、固有のタンパク質蛍光の消光を生じ、200±40nM(図2)のKdをもたらした。また、いくつかのBz-423類似体の結合を測定して、OSCPに対するこれらの親和性が、細胞全体の細胞障害性アッセイ法、ならびにSMPを使用するATPase阻害実験の両方におけるこれらの能力に匹敵することが判明した。これらのデータは、Bz-423が、ミトコンドリアATPaseでOSCPに結合することについて説得力のある証拠を与えた。Bz-423は、OSCPに対する結合を介して機能する唯一の公知のATPaseの阻害剤である。OSCPは、ATP結合部位を含まず、プロトン・チャンネルを含まないので、Bz-423は、ATPaseモーターの分子運動を変化させることによって機能する可能性がある。
【０３１９】
実施例24. Bz-423で誘導される細胞死から保護するOSCPのRNAiノックアウト
上に記述した化学的および生化学的な標的の同定および確証研究を補完するために、細胞全体のOSCPをノックアウトするための実験を行った。インビトロにて、ATPaseからOSCPを除去することにより、酵素の加水分解活性を変化させることなく合成酵素機能がなくなる。酵母では、OSCPノックアウトが致死ではなく；これらの細胞では、ATPの加水分解により、化学ポテンシャルがもたらされてΔΨmを補助し、これによりミトコンドリア統合性を維持する。酵母OSCPは、哺乳動物タンパク質に対する配列相同性が限られているので(〜30％)、これらの実験は、ヒト起源の細胞株において行った。
【０３２０】
OSCPは、核コードされるので、転写後遺伝子サイレンシングを達成することができる技術であるRNA干渉(RNAi)を使用してこのタンパク質をノックアウトした。これらの実験のために、HEK293細胞を、オリゴフェクトアミンを使用してOSCP配列に特異的な3つの化学的に合成した低分子干渉RNA分子(siRNA)のそれぞれをトランスフェクトした。これらの細胞には、オリゴフェクトアミンによって効率の高い(90％)様式でトランスフェクトされる。OSCP発現は、トランスフェクションの24h、48h、72h、および96h後に免疫ブロットによって解析した。OSCP発現の最大サイレンシング(64％)は、トランスフェクションの72h後にて生じた(図3)。OSCP siRNAがトランスフェクトされたHEK293細胞は、減少したBz-ROSを有して、細胞に対するBz-423関連物に応答するアポトーシスは、スクランブルされた配列対照siRNAでトランスフェクトした。これらの結果は、siRNAが、OSCPを減少させるのに有効なことを示し、Bz-423を媒介した細胞死シグナリングにはOSCPが関与することを示唆した。
【０３２１】
実施例25. 細胞増殖に対するBz-423の効果
大部分の1,4-ベンゾジアゼピンと同様に、Bz-423は、ウシ血清アルブミン(BSA)に対して強く結合し、これにより、溶液中で遊離の薬物の有効濃度が減少してしまう。例えば、10％(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を含む組織培地では、薬物のおよそ99％がBSAに結合する。したがって、細胞培養細胞障害アッセイ法は、BSAに対する結合を減少させて、遊離の[Bz-423]を増大するために、2％のFBSである培地中で行われる。これらの条件下では、用量反応曲線はかなり鋭く、その結果、Bz-423が部分的に有効なだけである限られた濃度範囲が存在する。いくつかのベンゾジアゼピンは、抗増殖特性を有することが公知であるので、＜ED50濃度のBz-423の効果を慎重に解析し、アポトーシスを誘導することに加えて、Bz-423が培養において3d後に細胞増殖を防げたことが観察された。これらの低血清条件では、細胞障害性および抗増殖効果が重なり、それぞれの効果を独立して研究することが困難になる。しかしながら、[BSA]を増大すること、またはFBSを10％まで増大することによって、用量反応曲線は平らになり(および細胞障害性ED50が増大された)、Bz-423で誘導される細胞障害を増殖に対する効果と明らかに区別することができる。より少量の薬物(例えば、10〜15μM)では、Bz-423は、最小の細胞障害性を有したが、濃度＞20μMでは、アポトーシスだけを観察した(死滅経路は、上に記述してあり、二峰性ROS応答を含み、10％のFBSを含む培地においても観察された)。また、より多量の薬物では増殖を遮断し得るが、これは増殖に対する効果を観察することができる前に、十分にアポトーシスを生じさせた。用量反応曲線は、10％のFBSを含む培地をシミュレートするために2％のFBSを含む培地にBSAを添加した実験と同様であり、抗細胞増殖および細胞障害は、血清のその他の成分による影響を受けなかったことが証明された。
【０３２２】
処理の3d後の対照細胞と比較した細胞数の減少が、増殖が減少したためであり、増殖によりバランスをとった細胞死ではないことを確認するために、細胞計数に加えて、細胞分裂を調査した。PKH-67は、細胞膜に不可逆的に結合し、細胞分裂によって娘細胞間に同程度に分配される蛍光プローブであり、フローサイトメトリーによって細胞分裂を定量化することができる。PKH67で染色し、Bz-423で処理したラモス細胞は、やや細胞障害性の濃度においてあまり細胞分裂がなく、これにより、細胞数の減少が、抗増殖性作用および細胞死以外のためであったことを確認した。Bz-423で誘導される抗増殖性がラモス細胞に特異的かどうかを決定するために、細胞計数および細胞周期実験を他のB細胞株および固形腫瘍に由来するその細胞株において行った。表3に示したように、増殖の遮断に対する効果は、リンパ球に独特ではなく、標的が、複数の組織型に共通して、増殖の遮断を媒介することを示唆した。
【０３２３】
(表３)10％のFBSを含む培地中で72h間処理した細胞の抗細胞増殖に対するED50(μM)。研究のための細胞には、ラモス細胞、ならびにBcl-2およびBcl-XLを過剰発現するようにトランスフェクトしたクローン、ヌルp53である卵巣細胞(SKOV3)；神経芽細胞腫細胞株(IMR-32、Lan-1、SHEP-1)；ならびに悪性B細胞株を含んだ。
2008505913.tif 000061
【０３２４】
実施例26. Bz-423で処理した遺伝子プロファイリング細胞
Bz-423が細胞の増殖を遮断する機構をプローブするために、遺伝子プロファイリング実験を行った。タンパク質合成の阻害剤としてシクロヘキサミドを使用する研究において、Bz-423で誘導される細胞死は、新たなタンパク質合成に依存しないことが判明した。したがって、遺伝子発現の変化は、抗増殖機構にのみに関連している可能性が高かった。下流の効果ではなく、シグナル-応答カップリングに関与する変化を検出する可能性を増大するために、Bz-423で3h間処理した細胞のプロフィールを作った。これは、ROS早期最大値の直後であるが、ミトコンドリア透過性孔の開口を含むその他の細胞変化が生じる前に位置する。
【０３２５】
Bz-423の病原性細胞型に対するプロアポトーシス性の、細胞障害性および増殖阻害性特性の発見により、このクラス薬剤が自己免疫疾患、癌、およびその他の腫瘍疾患に対して治療的である可能性を同定した。この薬剤によって誘導される遺伝子発現の変化の解析に由来するさらなる実験証拠により、この化合物の作用の機構の理解が広がり、それが調整する治療有効性の収集に加わった。
【０３２６】
Bz-423によって誘導される遺伝子発現(mRNAのレベルで)の変化を決定するためのラモス細胞でのインビトロでの試験を、1mlあたり500,000細胞の密度にて細胞を培養することによって行った。溶媒対照(DMSO、0.1％終濃度V/V])、Bz-423、またはBz-OMe(10μM)を細胞に添加した。4h後、細胞を収集して、製造業者のプロトコルに従ってTrizol Reagent(#15596-018, Life Technologies, Rockville, MD)およびRNeasy Maxi Kit(# 75162, Qiagen, Valencia, CA)を使用してRNAを調製した。開始総RNA試料に存在するポリ(A)RNAを使用して、逆転写によって一本鎖cDNAを合成した。一本鎖cDNAを二本鎖cDNAに変換し、次いでビオチン化されたUTPおよびCTPの存在下においてインビトロ転写を行って、ビオチン標識されたcRNAを作製した。cRNAをMg2+の存在下において断片化して、ヒトゲノムU133A Genechipアレイ(Affymetrix)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション結果は、GeneArrayスキャナを使用して定量化し、Affymetrixによって提供される説明書に従って解析を行った。
【０３２７】
Bz-423、Bz-OMe、または媒体対照で処理した細胞から単離されたRNAを使用した発現プロファイリングを、約22,000のヒト遺伝子を表すHGU133A Affymetrix遺伝子チップで行った。ρ＜0.01を含む基準を使用して、16遺伝子が、対照細胞よりも8倍またはそれ以上に発現された。Bz-423の分子標的に基づいて予想されるとおり、これらの遺伝子の多くは、解糖に関与した。
【０３２８】
データを解析して、媒体対照試料と比較し、ログ形質転換された平均シグナルが処理にて少なくとも4倍変化し、かつ対照値に関する変異係数(n=4)が10％未満であったという基準に従って、遺伝子変化Bz処理を検出した。これらの遺伝子は、治療応答を媒介し得る標的を表す。
【０３２９】
遺伝子発現は、Bz-423およびBz-OMe(それぞれ、独特の情報のフィンガープリントを提供する)に関して生じる。Bz-OMeの構造は、以下のとおりである。
2008505913.tif 000062
【０３３０】
いくつかの遺伝子の発現は、Bz-423およびBz-OMeに対する曝露後と同様に変化する。したがって、2つの化合物間で共通に調節される遺伝子は、化合物のより一般的なクラスを介した遺伝子調節を理解するために特に適する。図4は、Bz-423およびBz-OMeによって処理した細胞のデータを示す遺伝子発現プロフィールを示す。
【０３３１】
実施例27. ODCレベルおよび活性に対するBz-423の効果
RNAプロファイリング・データによって示唆されるように、ODC活性およびポリアミン代謝が、Bz-423による影響を受けるかどうかを決定するために、Bz-423で処理した細胞におけるODC活性を媒体対照と比較して直接測定した。これらの実験では、オルニチンのプトレシンへの変換を、3H-オルニチンを使用して定量化した。比較のために、対照細胞を媒体対照またはオルニチンデカルボキシラーゼの強力な阻害剤であるジフルオロメチルオルニチン(DFMO)(Bz-423のように、DFMOは、強力な抗増殖薬である)で処理した。図3に示したように、Bz-423で4h間の処理細胞は、用量依存的様式でODC活性を有意に減少し、これは、とりわけ、RNAプロファイリングによって示唆されたとおり、アンチザイム1の増大と一致している。ODC活性の減少は、同じ条件下で測定されるODCタンパク質レベルの減少に平行していた。
【０３３２】
上述のとおり、Bz-423で誘導されるアポトーシスは、状態3〜4移行の結果として、MRC複合体IIIから生じたROS応答によってシグナル伝達された。次に、アポトーシスのために重要なROS応答が、ODCに対するこれらの効果をも媒介したかどうかについて決定するために調査した。ROSがODC活性の減少のために必要とされる場合、同様に、潜在的にBz-423に対する抗増殖応答の一部として関係するであろう。これを試験するために、ラモス細胞をBz-423、DFMO、または媒体対照で4h間処理した。平行して、細胞の第2の群をMnTBAPと共にプレインキュベートしてROSを制限し、次いで、Bz-423、DFMO、および媒体対照と共に培養した。MnTBAPは、Bz-423によって有意にODCの阻害を逆転させた。
【０３３３】
総合して、これらのデータは、高い[Bz-423](例えば＞10μM)では、細胞の抗酸化剤によって解毒することができないほど十分な量のROSを産生し、18h以内にアポトーシスを生じるという解釈が可能なことを示唆した。低い[Bz-423]では、比例的に少ないROS応答を誘導し、アポトーシスをトリガーするには不十分であった。しかしながら、この場合、ROSは、ODCを阻害するか、またはさもなければ細胞の増殖を遮断することができるかもしれない。
【０３３４】
この仮説と一致して、フェノールのヒドロキシルがClによって置換されている化合物(Bz-Clと名付けられた)は、最小限の細胞障害性であり(活性は、Bz-423と比較してca 80％まで減少した)、細胞においてわずかなROS応答を生じたが、一方で、また、OSCPに対してあまりしっかりと結合しなかった(Kdは5μMに近似)。上記の仮説によって予測されるとおり、この化合物は、またODC活性を阻害した(図3)。増殖停止を媒介する際のBz-423で誘導されるROSの提唱された役割および性質を考慮して、表2の細胞のパネルに対してBz-Clを試験して、3d後にこれがBz-423と同様の範囲で相当するED50値で増殖を減少させることが判明した。これらの結果は、アポトーシスを誘導することなく増殖を遮断するBz-423の化学的類似体を使用して、これらの化合物の抗増殖効果を得ることができることを証明した。
【０３３５】
実施例28. 新規細胞障害性ベンゾジアゼピンの構造活性研究
これらのBz-423の特性に基づいて、Bz-423誘導体の範囲を合成して、結合および活性のために重要なこの新規化合物の構造エレメントをプローブした。Nメチル基または塩素を水素で置換しても、培養における不死化されたラモスB細胞またはJurkat T細胞に対するリンホトキシン活性に対して、ほとんど効果を有さなかった。同様に、Bz-423の両方の鏡像異性体は、等効力であり、Bz-423とその分子標的との間の相互作用が二点結合を含むことを示す。これらのデータとは対照的に、ナフタルアラニンを除く(表1を参照されたい)。本発明は、特定の機構に限定されるというわけではなく、かつ機構の理解は、本発明を実施するために必要ではないが、それにも関わらず、部分またはフェノール性水酸基を水素と置換すると、全ての細胞傷害活性がなくなることが想定される(表1)。これらの観察に基づいて、C'3およびC'4位に対する変化を調査した。1-ナフトールを2-ナフトで置換しても、細胞殺害に対してほとんど効果を有さない。同様に、ナフチルアラニンを相当するサイズのその他の疎水基で置換しても、Bz-423の細胞障害特性に対してほとんど効果を有さなかった。対照的に、キノリン7〜9は、それぞれのBz-423よりも強力であった。本発明は、特定の機構に限定されるわけではなく、かつ機構の理解は、本発明を実施するために必要でないが、それにも関わらず、題目データは、Bz-423のための結合部位内の疎水性置換基に対する優先を示すことが想定される。より小さなC3置換基は、Bz-423よりもいくらか強力なだけであったが、酸素を含む芳香族基を有する化合物は、細胞傷害性が有意に少なかった。これらのデータは、明らかに、大きな疎水性芳香族置換基が、最適な活性のために有用なことを示す。
【０３３６】
メチル基をヒドロキシルに対してオルトに配置しても、Bz-423の活性を変化させないが、ヒドロキシルをC'4位置へ移動すると、能力を2倍減少させた(表2)。対照的に、ヒドロキシルを塩素もしくはアジドで置換するか、またはフェノールをメチル化すると、Bz-423の細胞傷害活性が効率的になくなる。本発明は、特定の機構に限定されるわけではなく、かつ機構の理解は、本発明を実施するために必要ではないが、それにも関わらず、これらのデータは、C'4炭素に位置するヒドロキシル基が、おそらく標的結合による重要な接触を作製することによって、最適な活性のために必要とされることを示すことが想定される。しかしながら、フェノールの下部構造を有する分子も、MRC内の代替電子伝達体としても作用することができる。このような薬剤は、MRC酵素から電子を受けとり、これをより高い還元電位の位置の鎖に移す。このタイプの「酸化還元サイクリング」により、ピリミジンヌクレオチドと共に内因性の還元相当物(例えば、グルタチオン)を消費し、細胞死を生じる。これら二者間を区別するために、標準的なNADHおよびNAD(P)H酸化アッセイ法を使用する亜ミトコンドリア粒子の存在下においてBz-423が酸化還元サイクルするかどうかを決定した。正の対照(ドキソルビシンおよびメナジオン)とは異なり、Bz-423は、基質酸化を引き起こさず、これは、酸化還元サイクルしないことを強く示唆する。本発明は、特定の機構に限定されるわけではなく、かつ機構の理解は、本発明を実施するために必要ではないが、それにも関わらず、総合して、データは、化合物18〜20の活性の減少がその標的タンパク質に対するBz-423の結合を媒介する相互作用を除去することによって生じることを示すことが想定される。
【０３３７】
細胞は、Bz-423に応答して迅速にO2-を産生し、このシグナルを遮断することにより(例えば、Bz-423に応答してO2-を産生する酵素であるユビキノール・チトクロームcレダクターゼを阻害することによる)アポトーシスを防げる。Bz-423誘導体が、Bz-423に類似した様式で細胞を死滅させる(おそらく、共通の分子標的に対する結合の結果として)かどうかを決定するために、FK506がユビキノール・チトクロームcレダクターゼを阻害する能力(そのマイクロモルの量が、効率的に細胞死から保護する)を調べた。FK506による阻害は(約60％)、ベンゼンよりも大きな疎水性C3側鎖を有する化合物である3〜6、12、13、16、および17について観察されるだけであった。また、これらの化合物(Bz-423を含む)のそれぞれによって誘導される細胞死は、18、19、または20(＞40μMにて)のいずれかで細胞を前処理することによって阻害された(約60％まで)。化合物18、19、および20は、表2に一覧表に記載されたその他のベンゾジアゼピンの細胞傷害活性(約20％の阻害)を遮断することに対して効果を有さなかった。本発明は、特定の機構に限定されるわけではなく、かつ機構の理解は、本発明を実施するために必要ではないが、それにも関わらず、これらのデータは、Bz-423が、3〜6、12、13、16、および17と共に標的タンパク質内の同じ部位を結合して、共通の機構を介してアポトーシスを誘導することを強く示唆することが想定される。その他の化合物は、この部位に結合せず、異なる経路を介して死反応を誘導しない。
【０３３８】
実施例29. ATPase活性の測定  ミトコンドリアは、前述したように新たに屠殺したウシの心臓から単離した(例えば、Graham, J.M., Subcellular Fractionation and Isolation of Organelles：Isolation of Mitochondria from Tissues and Cells by Differential Centrifugation, in Current Protocols in Cell Biology. 1999, John Wiley & Sons, Inc：New York. p. 3.3.3-3.3.4を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。全ての緩衝液は、2-メルカプトエタノール(5mM)を含んだ。亜ミトコンドリア粒子(SMP)は、ミトコンドリアの懸濁液のそれぞれの部分を、超音波処理間を2分の間隔にして40秒間3回超音波処理したことを除いては、Misonix超音波処理器3000を使用して、チタンプローブにおいて0.5で、エネルギー状況8.5にて、Walker et al(例えば、 Walker, J.E., et al., Methods Enzymol, 1995. 260：p. 163-90を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)に従って牛肉心臓ミトコンドリアの超音波処理によって調製した。ミトコンドリアF1F0-ATPase活性は、ADPの産生をピルビン酸キナーゼおよび乳酸脱水素酵素反応を経たNADHの酸化に連関させ、次いで、NADH酸化の割合を分光光度的に340nmにて30℃でモニターすることによって測定した(例えば、McEnery, M.W. et al., J Biol Chem, 1986. 261(4)：p. 1745-52；Harris, D.A., Spectrophotometric Assays, in Spectrophotometry and Spectrofluorimetry, D.A. Harris, Bashford, C.L., Editor. 1987, IRL Pressを参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。反応混合物(0.25mLの最終体積)は、以下を含んだ：Tris-HCl(100mM)、pH 8.0、ATP(0〜2mM)、MgCl2(2mM)、KCl(50mM)、EDTA(0.2mM)、NADH(0.2mM)、ホスホエノールピルビン酸(1mM)、ピルビン酸キナーゼ(0.5U)、および乳酸脱水素酵素(0.5U)。それぞれの試料は、Bz-423(または媒体対照)の種々の濃度とプレインキュベートされた(30℃にて5分)SMP(7μg)または精製されたF1-ATPase(0.29μg)を含んだ。
【０３３９】
実施例30. 過形成実験のための試薬
Bz-423は、前述したように合成し(Lattmann, E., et al., (2002) Drug Des Discov 18, 9-21を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、ジメチルスルホキシド(DMSO)水溶液に20mg/mlで溶解した。DMSOは、全ての実験において0.5％(v/v)以下の終濃度で存在した。この研究に使用した他の全てのベンゾジアゼピンは、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から得た。RAは、Sigma-Aldrichから得た。レチノイドは、DMSOに20mg/mlに希釈して、凍結させて貯蔵した。使用時に、RA保存液を培地に希釈して、1.0μg/mlの終濃度にて使用した。細胞内シグナリング研究に使用した試薬には、EGF受容体の全体およびリン酸化された形態、ならびに全体およびリン酸化Erk 1/2に対する抗体を含んだ(Cell Signaling Technologies, Inc.；Bever1y, MAから得た)。β-チューブリンに対する抗体は、Santacruz Biotech (Santa Cruz, CA)から得た。その他の全ての化学試薬は、示したものを除き、Sigma-Aldrichから購入した。
【０３４０】
実施例31. 過形成実験のためのヒト皮膚器官培養
太陽光線保護された臀部皮膚の複製した2mmの全層パンチ生検は、若年成人ボランティアから得た。このプロジェクトへのヒト対象の参加は、University of Michigan Institutional Review Boardにより承認され、全ての対象には、彼らが研究に参加する前に書面にしたインフォームドコンセントを提供した。生検直後に、組織をケラチノサイト基礎培地(KBM)(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD)からなる培地に浸漬した。KBMは、低Ca2+であり、MCDB-153培地の血清なし修飾により、高密度ケラチノサイト増殖のために最適化される。最終Ca2+濃度を1.4mMにするために、CaCl2を補充した。氷上で研究室に輸送後、生検を250μlのCa2+を補ったKBMを、さらなる処理(例えば、RAおよび/またはBz-423)と共に、または伴わずに含む24穴・ディッシュ内でインキュベートした。培養は、95％の空気および5％のCO2の雰囲気において37℃にてインキュベートした。最小体積の培地中で組織を維持する以外に、厳密な気相液相界面を保証するために何もさらに行わなかった。一日おきに培地の交換および新鮮な処理をしながら8日間インキュベーションした。インキュベーション期間終了後、組織を10％の緩衝ホルマリン中で固定して、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色後、組織学的に調べた。それぞれの組織切片において5箇所の部位にて上皮の厚み測定を行って、平均した。未処理の、レチノイド曝露した、レチノイド・プラスBz-423を処理した生検のための平均厚さ値を決定した。器官培養手順は、過去に記述されている(例えば、Varani J, et al., (1993) Amer. J. Pathol. 142：189-198, 1993；Varani J, et al., (1994) J. Clin. Invest. 94：1747-1753を参照されたい；それぞれのその全体が本明細書に参照として組み入れられる)。
【０３４１】
実施例32. 過形成実験のための単層培養におけるヒト表皮ケラチノサイトおよび経皮線維芽細胞
新生児の環状切除法によって得られた包皮組織を表皮ケラチノサイトおよび経皮線維芽細胞の供与源として使用した。このプロジェクトにおける包皮組織の使用は、University of Michigan Institutional Review Boardにより承認された。表皮ケラチノサイトは、以前に記述したとおり(例えば、Varani J, et al., (1994) J. Clin. Invest. 94：1747-1753を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、包皮組織から単離した。初代および初期の継代細胞は、ケラチノサイト培養培地(KGM)(Cambrex Bioscience.)中で維持した。KGMは、KBMと同じ基本培地を含むが、mlあたり0.1ng EGF、mlあたり0.5μgインスリン、および0.4％のウシ下垂体抽出物を含む成長因子の混合物をさらに補ってある。同じ包皮組織から得られる線維芽細胞は、非須アミノ酸および10％のウシ胎児血清(DMEM-FBS)を補ったダルベッコ修飾最小基本培地を使用して、単層培養にて培養した。ケラチノサイトおよび線維芽細胞は、95％の空気および5％のCO2の雰囲気において37℃にて維持した。細胞をトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)に曝露することによって二次培養して、継代2〜3にて使用した。
【０３４２】
実施例33. 過形成実験のための過形成実験のための増殖アッセイ法
ケラチノサイトは、培地としてKGMを使用して24穴プレートにおいてウェルあたり5×10-4細胞で播種した。細胞が付着した後、図レジェンドに示したように、これらを洗浄し、次いで異なる濃度のBz-423またはその他のベンゾジアゼピンと共にKGM中でインキュベートした。増殖は、トリプシン/EDTAで細胞を遊離させ、粒子計数器を使用してこれらを数え上げることによって3日目に測定した(Coulter Electronics, Hialeah, FL)。1.4mM Ca2+を補ったKBMを培地として使用したこと以外は、線維芽細胞増殖研究は、同様に行った。
【０３４３】
実施例34. 細胞可溶化物の調製および過形成実験のためのシグナリング中間体の免疫ブロット分析
ケラチノサイトは、細胞培地としてKGMを使用して、6穴ディッシュのウェルにウェルあたり3×105でプレートにまいた。細胞を一晩付着させた。その翌日、これらを洗浄し、次いでEGF(10ng/ml)およびBz-423(0.5または1.0μg/ml)と共に、または伴わずにKBM中でインキュベートした。5または15分間のインキュベーション後、細胞を20mM Tris-HCl(pH 7.4)、2mMバナジウム酸ナトリウム、1.0mMフッ化ナトリウム、100mM NaCl、1％のNP-40、0.5％のデオキシコール酸ナトリウム、25μg/mlのそれぞれのアプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチン、ならびに2mM EDTAおよびEGTAからなる1×細胞溶解緩衝液に溶解した。溶解は、4℃にて溶解緩衝液内で細胞をこすり、試料を超音波処理することによって行った。細胞可溶化物を氷上で30分間インキュベートし、次いで16000gにて15分間マイクロ遠心分離によって透明にした。上澄み液を収集して、BioRad DCタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を推定した(BioRad, Hercules, CA)。
【０３４４】
等量のタンパク質(レーンあたり40μgの総タンパク質)を含む細胞抽出物を10％のSDS-ポリアクリルアミド・ゲルにおいて電気泳動した。以前に記述したように、EGF受容体の全体およびリン酸化された形態、ならびに総Erk 1/2およびリン酸化Erk 1/2についてウエスタンブロット法を行った(例えば、Zeigler ME, et al., (1999) J Cell Physiol 180：271-284を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。
【０３４５】
実施例35. 過形成実験のための細胞内活性酸素種(ROS)の検出
2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセタート(DCFH-DA, Molecular Probes, Eugene, OR)は、それぞれの使用の前にDMSOに10mM保存液として調製した。DCFH-DA(100μM)を負荷した(30分、37℃)48ウェルプレート中で増殖している細胞を直接培地に添加して、洗浄し、次いで処理前に新鮮な培地中においた。示した処理の後、酸化された産物2',7'-ジクロロフルオレッセイン(DCF)の蛍光をFACSCalibur(BD Bioscience, San Diego, CA)を使用して、フローサイトメトリーによってモニターした。それぞれの試料について、10,000事象を記録し、データを解析して蛍光強度中央値を決定した。
【０３４６】
実施例36. 過形成実験のための器官培養においてRA処理したヒト皮膚の上皮の厚みを減少させるBz-423
器官培養においてインキュベートした健常ボランティア由来のヒト皮膚の2mmのパンチ生検は、正常皮膚の組織学的特色を8日間維持した(図5Aおよび5D)。同じ対象由来の複製生検をRA(1μg/ml、0.01％のDMSO媒体中の終濃度)を連続的に存在させて培養した場合、上皮過形成を発生した(図5Bおよび5E)。生検材料をRA(1μg/ml)およびBz-423(0.5μg/ml)の両方を含む培地において培養した場合、上皮の高い増殖応答が阻害された(図5Cおよび5F)。
【０３４７】
5人の別々のヒト・ドナーからの皮膚での平均上皮の厚み測定では、Bz-423によるRAで誘導される上皮肥厚の減少が明らかになった(図5、下段パネル)。未処置の皮膚では、平均上皮の厚みは、23±3μm2であった。RA(1μg/ml)の存在下において、上皮の厚みは、50±4μm2に増大したが、RA(1μg/ml)さらにBz-423(0.5μg/ml)の存在下では、上皮の厚みは、33±3μm2(p＜0.05)であった(図5、下段パネル)。器官におけるBz-423で処理した生検材料の慎重な顕微鏡学的評価では、Bz-423に基づくさらなる組織学的変化がなかった。特に、細胞性または真皮の構造の相違はなく、経皮の表皮界面における変化はなく、ならびにケラチノサイト分化および角化に対して効果がないことが同定された。加えて、Bz-423処理した検体は、アポトーシス性細胞が増大されることがないことは注目すべきである。
【０３４８】
さらなる研究において、RAに曝露された皮膚を種々の濃度のBz-423で処理して、上皮の厚みについて調べた。0.1μg/mlでは、上皮の肥厚は減少したが、0.5μ/mlのレベル未満であった。また、上皮の厚みの減少が、より高いBz-423濃度(例えば、1および5μg/ml)で観察された。5μg/mlでは、壊死が観察された。
【０３４９】
実施例37. ケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるROSを増大するBz-423
処理の1時間以内に、Bz-423は、用量依存的な様式でリンパ球におけるROS産生を増大した。ケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるBz-423に対する抗増殖応答が同様にROS産生に関与するかどうかを決定するために、Bz-423処理した細胞における細胞内ROSレベルを測定した。図6に示したように、平均細胞蛍光として評価されるROS応答は、250nM程度と低いBz-423の用量にて、両方の細胞タイプにおいて観察された。ROS応答は、両方の細胞タイプにおける用量依存的な様式で増大される。試験した全ての濃度にて、ケラチノサイトは、線維芽細胞よりも大きなROS応答を生じた(図6)。ROS産生を平均細胞蛍光ではなくベースライン以上の細胞の画分に関して評価したときも、同様の知見が得られた。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、リンパ球における従来の知見と同様で、これらの結果は、Bz-423に対する曝露によりケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるROSレベルの早期上昇を証明する。したがって、Bz-423の作用機序(以前にリンパ球において、ミトコンドリアROS産生標的に対する直接の結合に関与することが決定された)は、ケラチノサイト増殖および上皮性の過形成の減少に関与する。
【０３５０】
実施例38. ケラチノサイトにおけるEGF受容体発現およびErkリン酸化に対するBz-423の効果
MAPキナーゼ経路を介したEGF受容体活性化および下流のシグナリングは：i)ケラチノサイト増殖を誘導する刺激に応答して活性化され、およびii)上皮過形成の発生において役割を果たしているので、Bz-423処理したケラチノサイトでは、EGF受容体活性化およびMAPキナーゼ(Erk1/2)シグナリングに影響を及ぼすことと仮定された。この可能性を試験するために、EGF受容体の全体およびリン酸化された形態を、分裂促進因子刺激後に未処理の細胞およびBz-423処理した細胞で測定した。増殖因子を枯渇させたケラチノサイトをBz-423(0、0.5、または1.0μM)と共に10分間プレインキュベートし、次いでEGF(10ng/ml)で刺激した。EGF添加直前複製試験試料から調製した可溶化液を、EGF刺激後5分および15分に、A：全体およびリン酸化されたEGF受容体発現、ならびにB：全体およびリン酸化されたERK1/2発現について解析した。タンパク質の相対的レベルを走査濃度測定によって定量化した。全体またはリン酸化されたEGF受容体のレベルにおける相違は、検出されなかった。同様に、ケラチノサイトの分裂促進因子刺激前の、およびの直後のErk1/2のリン酸化状態をBz-423の有無において評価した。全体Erk1/2タンパク質において変化は観察されなかったが、EGFで誘導されるErk-リン酸化は、用量依存的な様式でBz-423によって減少した。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、これらの結果は、ケラチノサイトにおけるBz-423の抗増殖作用が、Erk活性化が減少されることと関連するが、効果は、EGF受容体発現の下流を媒介することを示す。これらの知見は、Erk1/2自体を含む、活性化されたEGF受容体とErk1/2との間のシグナル伝達に関与する1つまたは複数のキナーゼ/ホスファターゼが、Bz-423によって(直接または間接的にROSを介して)調節されることを示す。
【０３５１】
実施例39. 過形成実験のための考察
過去の研究では、上皮過形成(乾癬などの疾患において、ならびに局所的レチノイド療法の結果として生じる)が、EGF受容体のためのリガンドの皮内産生および自己分泌またはパラ分泌EGF受容体活性化を含むことを確信させる証拠が提供された(例えば、Gottlieb AB, et al., (1988) J. Exp. Med. 167：670-675；Elder JT, et al., (1989) Science 243：811-814；Piepkorn M, et al., (1998) J Invest Dermatol 111：715-721；Piepkorn M, et al., (2003) Arch Dermatol Res 27：27；Cook PW, et al., (1992) Cancer Res 52：3224-3227；Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66：253-259を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。EGF受容体遮断の存在下では、生理学的ケラチノサイト増殖が続くため(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117：1335-1341；Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66：253-259を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、また経皮機能は、EGF受容体活性にも依存的ではないため(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117：1335-1341；Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66：253-259；Tavakkol A, et al., (1999) Arch. Dermatol. Res. 291：643-651を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、EGF受容体活性化および付随する下流のシグナリング事象は、過形成性状態の療法のための標的を提供する。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、本発明の経過の間に行われた実験は、Bz-423、新規ベンゾジアゼピン類似体、および関連化合物が線維芽細胞機能に対して有害効果を伴わずにヒト皮膚器官培養においてレチノイドで誘導される上皮過形成を阻害することを証明する。
【０３５２】
Bz-423は、最初に、自己免疫疾患および一定の悪性腫瘍に対して有効なプロアポトーシス性薬剤として開発された。両方の状況において、企図された標的細胞の細胞障害が目標であった。これらの過去の研究では、細胞傷害活性に加えて、Bz-423が、いくつかの条件下で細胞増殖抑制性でもあったことが見出された。本適用(例えば、正常な表皮または経皮事象を抑制することなく表皮における過形成性増殖を阻害すること)には、この分子の細胞分裂停止能を利用する。
【０３５３】
本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、Bz-423が過形成性の上皮増殖を抑制する機構は、完全にはよく理解されていない。悪性Bリンパ球で行った研究では、低レベルの細胞内ROS産生が、増殖阻害およびより多量の細胞障害性を有するROSの産生と相関されることを証明した。同様に、Bz-423に応答する細胞内ROS産生は、皮膚においても生じ得る。単層培養における表皮ケラチノサイトにおけるROS産生を誘導したBz-423の濃度は、器官培養における過形成を抑制した濃度と同じであった。最後に、細胞を透過する2つの抗酸化剤の使用は、ケラチノサイトにおけるBz-423の抗増殖効果を部分的に逆転させた。過去の研究では、紫外線に対する表皮ケラチノサイトの曝露により、活性酸素産生に依存する過程でEGF受容体リン酸化を誘導することが示された。Bz-423での処理の結果として、EGF受容体のリン酸化状態に変化は観察されなかった。一方で、Erkリン酸化は、同じ処理によってダウンレギュレートされた。Erk活性化(リン酸化によって証明される)は、EGF受容体活性化の下流の標的であるが、多数のその他の受容体-リガンド相互作用の下流の結果としても生じる(例えば、Alpin AE, et al., (1998) Pharmacol. Rev. 50：197-263を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、細胞内ROS産生は、多数の異なる起始点から発するシグナリング事象に連関しないことが想定される。
【０３５４】
経皮機能に影響を及ぼすことなくレチノイドで誘導される上皮過形成を妨害する能力は、治療的経路を提供する。RAの局所適用後に生じる皮膚の過形成は、いくつかの様式において、レチノイド処理に伴う付随する皮層刺激の原因であることが、一般に認められている。レチノイドで誘導される皮層刺激の主要な徴候は、発赤およびフレーキングである(例えば、Kang S, et al., (1995) J Invest Dermatol. 105：549-556を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。刺激応答の基礎をなす細胞事象および分子事象は、完全にはよく理解されていない。部分的には、これらは、迅速に増殖するケラチノサイト集団におけるインターロイキン-1(IL-1)およびその他のサイトカインの産生を反映し得る(例えば、Maas-Szabowski N, et al., (2000) J. Invest. Dermatol. 114：1075-1084；Wood LC, et al., (1996) J. Invest. Dermatol. 106：397-403を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。これらのサイトカインは、血管機能において、局在性変化を生じ(例えば、Nguyen M, et al., (2001) Cell Biol. 33：960-970を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、これは、次に、皮膚が赤くなる直接の原因であると考えられている浮腫および炎症細胞流入を促進する。一方、フレーキングは、単に皮膚からの過剰な表皮の分断を反映し得る。一時は、表皮および真皮におけるレチノイド作用は、同じ経路を介して生じると考えられていた。したがって、真皮におけるレチノイド処理の有益効果(例えば、線維芽細胞活性化、増大されたプロコラーゲン産生、および減少されたマトリックス・メタロプロテイナーゼの産生)(例えば、Griffiths CEM, et al., (1993) New Eng. J. Med. 1993：329：530-534；Fisher GJ, et al., Datta SC, et al., (1996) Nature, 379：335-338；Varani J, et al., (2000) J. Invest. Dermatol. 114：480-486；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)と皮層刺激とは、分離不可能であると考えられた。しかしながら、最近の研究では、EGF受容体チロシンキナーゼ活性の拮抗作用により、真皮における有益効果を妨害することなく上皮過形成を抑制することを証明した(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117：1335-1341を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。その他の研究では、下流のシグナリングを阻害することにより、線維芽細胞機能を遮断することなくケラチノサイト増殖を阻害することができることも示した(例えば、BhagavathulaN, et al., (2004) J. Invest. Dermatol.122：130-139を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、Bz-423および関連化合物は、EGF受容体活性化から増殖を引き起こす経路の中間シグナリング事象(Erk活性化)を妨害することによって同様の効果を有し得る。上皮過形成を防止するために、完全にErk活性化を抑制することは必要でない。実際に、Erkリン酸化の完全な抑制は、細胞分裂停止ではなく細胞障害性に関連する(例えば、Zeigler ME, et al., (1999) J Cell Physiol., 180：271-284を参照されたい；その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。
【０３５５】
本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、EGF受容体を媒介して上皮過形成を妨害する薬剤は、抗乾癬薬としての使用が見出される。乾癬の引き金となる事象は、免疫系欠陥であるが(例えば、Valdimarsson H, et al., (1995) Immunology Today. 16：145-149；Austin LM, et al., (1999) J. Invest. Dermatol. 113：101-108を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、過形成を誘発する下流の事象は、損傷性皮膚表皮におけるEGF受容体の自己分泌またはパラ分泌活性化を含むことを、多くのアプローチが示している(例えば、Gottlieb AB, et al., (1988) J. Exp. Med. 167：670-675；Elder JT, et al., (1989) Science 243：811-814；Piepkorn M, et al., (1998) J Invest Dermatol 111：715-721；Piepkorn M, et al., (2003) Arch Dermatol Res 27：27；Cook PW, et al., (1992) Cancer Res 52：3224-3227；Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66：253-259を参照されたい；それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。
【０３５６】
Bz-423は、培養において多数の細胞タイプに対して細胞障害能および細胞分裂停止効果を有するベンゾジアゼピン類似体である。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、本発明の経過の間に行った実験は、Bz-423および関連化合物での器官培養におけるヒト皮膚の処置により、随伴するレチノイド処置によって生じる上皮過形成を抑制することを証明する。ヒト皮膚器官培養においてレチノイドで誘導される過形成を抑制する能力は、皮膚におけるレチノイド刺激反応を緩和するための組成物および方法を提供する。
【０３５７】
上記明細書において言及した全ての刊行物および特許は、本明細書に参照として組み入れられる。本発明は、特定の好ましい態様に関して記述するが、特許請求したような本発明は、このような特定の態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるはずである。実際に、関連した分野の当業者に明らかである記述された本発明を実施するための様式の種々の修飾は、以下の請求項の範囲内であることが企図される。
【図面の簡単な説明】
【０３５８】
【図１】OSCP成分がBz-423に対して結合するタンパク質であることを証明するデータを示す。
【図２】Bz-423および精製したヒトOSCPの結合等温線を示すグラフである。
【図３】OSCPのsiRNA制御を示す。
【図４】本発明の化合物によって処理した細胞の遺伝子発現プロフィールを示すデータを示す。Bz-423の存在下においてアップレギュレーションされる遺伝子についての発現解析からのデータを図4Aに示す。Bz-423の存在下においてダウンレギュレートされる遺伝子についての発現解析からのデータを図4Bに示す。Bz-OMeの存在下においてアップレギュレートされる遺伝子についての発現解析からのデータを図4Cに示す。Bz-OMeの存在下においてダウンレギュレートされる遺伝子についての発現解析からのデータを図4Dに示す。
【図５】Bz-423がレチノイドで誘導される上皮過形成を遮断することを示す。上段パネル：組織学的外見。皮膚の2mmのパンチ生検を器官培養において8日間インキュベートして、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色後、光学顕微鏡によって調べた。AおよびD：未処置の皮膚は、正常な組織学的外見を維持した。BおよびE：RA(1μg/ml)の持続的存在下において培養した皮膚が顕著な上皮過形成を示した。CおよびF：RAで誘導される上皮肥厚は、RA(1μg/ml)およびBz-423(1μg/ml)を含む培地において培養された検体において実質的に減少していた。A-C 160X、D-F 400X)。下段パネル：定量的データ。示した値は、5つの異なる対象に由来する器官培養に基づく平均および標準誤差である。
【図６】Bz-423が処置の1時間以内の細胞におけるROSを増大することを示す。ケラチノサイト(白正方形)および線維芽細胞(黒丸)の単層培養には、ROS特異的な指標DCFHで負荷して、解析の1時間前に示した濃度のBz-423と共にインキュベートした。一回の実験の平均DCF蛍光強度±標準偏差を3回のデータポイントで示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図４Ａ−４】
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【図４Ａ−５】
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【図４Ａ−６】
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【図４Ａ−７】
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【図４Ａ−８】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｂ−３】
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【図４Ｂ−４】
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【図４Ｂ−５】
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【図４Ｂ−６】
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【図４Ｂ−７】
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【図４Ｂ−８】
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【図４Ｂ−９】
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【図４Ｂ−１０】
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【図４Ｂ−１１】
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【図４Ｂ−１２】
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【図４Ｂ−１３】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｃ−４】
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【図４Ｃ−５】
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【図４Ｃ−６】
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【図４Ｃ−７】
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【図４Ｃ−８】
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【図４Ｃ−９】
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【図４Ｃ−１０】
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【図４Ｃ−１１】
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【図４Ｃ−１２】
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【図４Ｃ−１３】
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【図４Ｃ−１４】
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【図４Ｃ−１５】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図４Ｄ−３】
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【図４Ｄ−４】
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【図４Ｄ−５】
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【図４Ｄ−６】
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【図４Ｄ−７】
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【図４Ｄ−８】
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【図４Ｄ−９】
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【図４Ｄ−１０】
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【図４Ｄ−１１】
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【図４Ｄ−１２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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