(57)【要約】本発明は、胚性幹細胞からインシュリン生成細胞への分化を誘導することができる簡単な3ステップ培養方法に関する。上記3ステップ培養方法は、ActivinA、RA及び任意に選択したほかの成熟因子との組合せ誘導を基礎とする。また、本発明は、胚性幹細胞からインシュリン生成細胞への分化を誘導する場合に使用されるキットにも関する。
2008535503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培地において胚性幹細胞を培養して胚様体を形成するステップ、
ActivinAと共に上記胚様体をインキュベートするステップ、及び
上記胚様体を、インシュリンを生成するための前駆体細胞に発育させるようにRAと共にインキュベートするステップ、
をこの順に含む胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項２】
上記胚性幹細胞が鼠由来の細胞である場合、上記培地は10%ウシ胎児血清を含有するDMEMであり、上記胚性幹細胞が人由来の細胞である場合、上記培地はCDMであることを特徴とする、請求項１記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項３】
上記Activin Aの濃度が約50-300ng/ml培地であり、上記RAの濃度が約1×10−7-1×10−5mol/L培地であることを特徴とする、請求項１記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項４】
細胞の培地中で胚性幹細胞を培養して胚様体を形成するステップの前に、培地を収容する培養容器をMetrigelでカバーするステップを更に含むことを特徴とする、請求項３記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項５】
培地中の上記Metrigelの質量百分率が約1%であることを特徴とする、請求項４記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項６】
上記胚様体をActivinAとともに20時間から4日間インキュベートした後、ActivinAを含有していない培地中で6時間から8時間培養し、次いで、RAと共に20時間から4日インキュベートして、インシュリンを生成するための前駆体細胞に発育させることを特徴とする、請求項５記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項７】
上記ステップにより取得されたインシュリンを生成するための前駆体細胞を、成熟因子を含有する培地中でインキュベートして、インシュリンを生成するための前駆体細胞を増加するステップを更に含むことを特徴とする、請求項６記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項８】
上記成熟因子がbFGFを含むことを特徴とする、請求項７記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項９】
上記bFGFの濃度が8-12ng/mlであることを特徴とする、請求項８記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項１０】
N2添加物、B27添加物、ラミニン及びニコチンアミドを含有する培地中で、上記増加されたインシュリンを生成するための前駆体細胞をインキュベートして、インシュリン生成細胞に発育させるステップを更に含むことを特徴とする、請求項９記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項１１】
上記培地が、N2添加物、B27添加物、1 μg/mlのラミニン、10 ng/mlのbFGF、インシュリン-トランスフェリン-セリウム-A（1:100）及び10 mmol/Lのニコチンアミドを含有するDMEM/F12又はCDMであることを特徴とする、請求項１０記載の胚性幹細胞の誘導方法。
【請求項１２】
ActivinAとRAを含む、胚性幹細胞を誘導するためのキット。
【請求項１３】
Metrigelを更に含むことを特徴とする、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
一次培地を更に含むことを特徴とする、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
血清を更に含むことを特徴とする、請求項１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞(ES細胞)の誘導方法に関し、具体的には、胚性幹細胞を膵細胞に誘導する方法及びそれを使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、代謝に障害があるとき生ずる病気の一つであり、世界中の約4~5%の人に影響を与える。大まかな総計によれば、2010年に糖尿病の患者が3億5千万を超える見込みがある。I型の糖尿病は、膵島の中のβ細胞が自身免疫破壊を受けて発生する病気である。したがって、多くの研究チームは、このように破壊されたインシュリン生成細胞を取り替えることができる様々な方法に関して鋭意研究した。現在、膵細胞の移植は、インシュリンの注射のほか、I型糖尿病を治すことができる唯一な有効方法である（Serup P, Madsen OD, Mandrup-Poulsen T. Islet and stem cell transplantation for treating diabetes. BMJ 2001;322:29-32）。しかし、移植可能なドナー(donor)である膵島が非常に足りないので、広範な応用は不可能であった。
【０００３】
ES細胞から機能性β細胞を取得することができれば、上述の移植可能な膵島が足りない問題は解決できると認められている。すでに証明されたように、ES細胞は膵島の形の集合体、特に膵β細胞に分解されることができる（Soria B, Roche E, Berna G, et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162;Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394;Assady S, Maor G, Amit M, et al. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 2001;50(8):1691-169.）。Soriaなどは、<細胞トラッピング>方案を通じて最初的にES細胞を誘導して 膵β細胞に分化することに成功した（Soria B, Roche E, Berna G, et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000;49(2):157-162）。しかし、上記方法は、その過程が複雑であり、かつ遺伝因子に関する操作も必要とする。Lumelskyなどは、ES細胞を誘導して、インシュリンを生成する膵島の形の構造に分化させる<5ステップ方法>を設計した（Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394）。該方法は、遺伝因子に関する操作を必要としない。Horiなど（Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC, et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A  2002;99(25):16105-16110） 及びBlyszczuk（Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(3):998-1003）などは、発育調整物質LY294002又はpax4（overexpressing gene）を入れてLumelskyを改善する5ステップ方法を設計した。しかし、上記の 方法は、いずれもある面で複雑でありかつ周期が長い。Hansson などは、<5ステップ方法>を使用するとき,ES細胞が培養過程において 培地中のインシュリンを吸収して誤検出（false positive）を表す場合も存在することを発見した（Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(3):998-1003）。したがって、便利で快速にES細胞を誘導して膵β細胞に分化することができる特異性の誘導因子を求めることが課題になった。
【０００４】
報道によれば、ある因子は、すでに確定された内胚葉の分化を促すことができることがある。TGF-β超科のメンバーの一つであるActivinAは、原腸形成の過程において、内胚葉と中胚葉の形成に重要な作用を奏する。高濃度の場合、主に内胚葉の形成を誘導する（Kumar M, Jordan N, Melton DA, et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259: 109-122; Hill CS. TGF-B signalling pathways in early Xenopus development.Curr Opin Genet Dev 2001;11(5):533-540）。オールトランスレチナ酸（All-trans retinoic acid、 RA）は、十分に表現されたシグナル分子であり、脊椎動物の神経外胚葉と中胚葉の前後パターンの形成過程において重要な作用を奏する（Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. Int Rev Cytol 2001;209:1-77）。目前の研究結果によると、RAも胚胎の内胚葉の分化パターンの調整に参加することが分かる。たとえば、 膵臓芽 (pancreas bud)の形成過程をあげることができる。この様な参加は、膵β細胞とINS-1細胞系中のインシュリンの発現を強化することができる（Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development. Current Biology 2002;12(14):1215-1220; Blumentrath J, Neye H, Verspohl EJ. Effects of retinoids and thiazolidinediones on proliferation, insulin release, insulin mRNA, GLUT2 transporter protein and mRNA of INS-1 cells. Cell Biochem Funct 2001;19:159-169）。また、ツメガエル属蛙のActivinAとRAの組合せ作用により、外胚葉に発育すべきな区域がインシュリンを発現する膵細胞に分化することができることも証明された（Moriya N,Komazaki S,Takahashi S, et al. In vitro pancreas formation from Xenopus ectoderm treated with activin and retinoic acid. Develop Growth Differ 2000;42:593-602）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、胚性幹細胞を膵細胞に誘導する方法を提供することにある。本発明のほかの目的は、胚性幹細胞を膵細胞に誘導する方法に使用できるキット(kit)を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を実現するための本発明の構成は以下のとおりである。
細胞の培地において胚性幹細胞を培養して胚様体(embryonic bodies)を形成するステップ,
ActivinAを利用して胚様体をインキュベートするステップ,
RAに胚様体をインキュベートしてインシュリンを生成する前駆体細胞に発育させるステップ,
を上記の順で含むことを特徴とする胚性幹細胞の誘導方法を提供する。
【０００７】
胚性幹細胞が鼠の細胞である場合、本発明の方法に使用される培地は約10%ウシ胎児血清を含有するDMEMであり、胚性幹細胞が人の細胞である場合、本発明の方法に使用される培地はCDMである。
また、上記ActivinAの濃度は約50-300 ng/ml培地であり、上記RAの濃度は約1×10−7-1×10−5mol/L培地である。
【０００８】
上記方法のほかの実施形態によると、上記ステップのほか、以下のステップを更に含むことができる。即ち、ActivinAを利用して胚様体をインキュベートする前に、培地を収容する培養容器をMetrigelでカバーするステップを更に含むことができる。培地中の上記Metrigelの質量百分率は約1%である。
【０００９】
もう一つの実施形態において、ActivinAを利用して胚様体を20時間から4日までにインキュベートした後、ActivinAを含有していない培地中において6時間から8時間までに培養し、かつRAを利用して20時間から4日までにインキュベートして、インシュリンを生成するための前駆体細胞に発育させる。
【００１０】
もう一つの実施形態において、上記方法は、上記ステップ 上記ステップのほか、以下のステップを更に含むことができる。即ち、成熟因子を含有している培地中ですでに生成されたインシュリン生成前駆体細胞を培養してこれを増加(Expand)させるステップを含むことができる。上記成熟因子は、 濃度が8-12ng/mlのbFGFである。
【００１１】
もう一つの実施形態において、上記方法は、上記ステップのほか、以下のステップを更に含むことができる。即ち、N2添加物、B27添加物、ラミニン(Laminin)及びニコチンアミドを含有する培地中で、上記増加したインシュリンを生成するための前駆体細胞をインキュベートして、インシュリン生成細胞に発育させるステップを更に含むことができる。また、上記培地はN2添加物（1:100， Gibcoから購入可能）、B27添加物（1:50， Gibcoから購入可能）、1 μg/mlのラミニン、10 ng/mlのbFGF、インシュリン-トランスフェリン-セリウム-A（1:100， Gibcoから購入可能） 及び10 mmol/Lのニコチンアミドを含有するDMEM/F12又はCDM培地である。
【００１２】
本発明は、胚性幹細胞を誘導分化させるキットにも関する。
上記キットはActivinAとRAを含有することができる。もう一つの実施形態において、上記キットはMetrigelを含有することもできる。上記キットはまた血清 及び/又は一次培地を含有することもできる。上記Metrigelは上記一次培地をカバーすることもできる。また、Metrigelを単独で提供することもできる。上記一次培地は、成熟因子たとえばbFGFを含有することができる。上記キットはまたbFGFを含有する二次培地を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
今までの研究結果に示されたように、胚性幹細胞は特異性誘導により膵β細胞に分化することができる（Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(3):998-1003；Hansson M, Tonning A, Frandsen U, et al. Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004; 53:2603-2609）。しかし、ほとんどの誘導方案は、約一ヶ月ほど後にインシュリン培養細胞を取得することができる。本発明は、新しい3ステップ培養方法を提供する。上記方法は、ActivinA、RAと、ほかの成熟因子との組合せ作用を基礎とする。上記成熟因子は、例えば、matrigel、ニコチンアミド(nicotinamide)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などを挙げることができる。上記3ステップ培養方法の第3ステップ末期に上述の誘導された細胞が膵島の形の集合構造を形成し、insulin、 pdx1、 glut2、isl1とhnf3Bを含む膵β細胞の標識遺伝因子を発現する。また、移植を通じてSTZ処理を行った糖尿病鼠を救うことができる。
【００１４】
3種類の因子、例えばActivinA、RA 及びmatrigelは、本発明の膵β細胞実験の誘導方案において 非常に重要な作用を奏する。ActivinAは初期に確定された内胚葉の発育に重要な作用を奏する。ActivinAは二硫接合が安定な蛋白質であり、TGF-β超科に属する。ActivinAは細胞表面の収容体と接合してmixl1とgoosecoid を含む複数の種類の遺伝因子の発現を誘導することができる。これは、初期の内胚葉の発育に非常に重要な影響を与える（Kumar M, Jordan N, Melton DA, et al. Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Developmental Biology 2003;259: 109-122；Hill CS. TGF-B signalling pathways in early Xenopus development. Curr Opin Genet Dev 2001;11(5):533-540）。Kuboなどは、Activin AがES細胞の確定された内胚葉細胞への分化を誘導することができる報道した（Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development 2004;131:1651-1662）。また、ActivinAは、培養された人の膵島中においてインシュリンの分泌を促進することができる（Florio P, Luisi S, Marchetti P, et al. Activin A stimulates insulin secretion in cultured human pancreatic islets. J Endocrinol Invest 2000;23(4):231-234）。ActivinAは、糖尿病になった生まれたばかりの鼠のβ細胞発育過程において、分化とβ細胞の再生を制御調整することができる（Lei L, Yi Z, Seno M, et al. Activin A and Betacellulin Effect on Regeneration of Pancreatic β-Cells in Neonatal Streptozotocin-Treated Rats. Diabetes 2004; 53:608-615）。ActivinAの上述のような機能の組合せは、これが本発明のシステムにおいてどのように作用を奏するかに関して解釈することができる。RAは、最近、外胚葉と中胚葉の発育を誘導する機能を有するばかりでなく、初期に胚胎膵の発育過程においても重要なシグナル分子として活躍することが証明された（Maden M. Role and distribution of retinoic acid during CNS development. Int Rev Cytol 2001;209:1-77）。ゼブラ魚の発育過程において、RAの上昇調整は、膵と肝臓の内胚葉前端の顕著な増加を誘導することができる。これに対し、BMS493を利用してRAを抑制すると胚胎内胚葉の膵臓への初期分化を抑制することができる(Stafford D, Prince VE. Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development. Current Biology 2002;12(14):1215-1220)。Micallefなどの報道によると、鼠の胚性幹細胞が分化を開始した後で第四日目の日にRAを添加するとpdx1陽性の内胚葉の形成を誘導することができる（Micallef SJ, Janes ME, Knezevic K, et al. Retinoic Acid Induces Pdx1-Positive Endoderm in Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells. Diabetes 2004 Dec 7 [Epub ahead of print]）。膵の成熟に対して、RAが内分泌と膵管細胞分化において主要な作用を奏することは、パラクリン及びpdx1遺伝因子の発現レベルの上昇調整を通じて実現された（Tulachan SS, Doi R, Kawaguchi Y, et al. All-trans retinoic acid induces differentiation of ducts and endocrine cells by mesenchymal/epithelial interactions in embryonic pancreas. Diabetes 2003; 52(1):76-84）。背側膵（dorsal pancreas）の発育において、RAは、外分泌部位の分化を抑制して内分泌部位の発育を促進することが発見された（Chen Y, Pan FC, Brandes N, et al. Retinoic acid signaling is essential for pancreas development and promotes endocrine at the expense of exocrine cell differentiation in Xenopus. Developmental Biology 2004; 271:144160）。これから分かるように、RAは膵前駆体細胞と内分泌細胞の発育を促進することができる。ActivinAがES細胞の内胚葉への分化を誘導する過程において、RAは内胚葉��膵前駆体細胞への特異分化(specialize)をもっと促進することができる。ActivinAとRAを利用して誘導した後、分化された胚性幹細胞は多くの膵前駆体細胞の標識遺伝因子を発現することができる。例えば pdx1、hnf3α及びhnf4βなどがある。これらのデーターが示すように、ActivinAとRAの組合せ作用は、胚性幹細胞の初期に膵細胞への分化を誘導することができる。本発明の結果もActivinAとRAを同時に使用して誘導を行うことがその中の一つのみを使用する場合より有効であることを証明した。Matrigelが膵の体外分化と成熟過程において非常に重要な細胞外マトリックスとして作用することはすでに証明された事実である。Matrigelは、ラミニンなどの細胞外マトリックスと、増殖因子とを含む混合物である。上記増殖因子として、例えばFGFとTGF-βなどがある。Matrigelは、膵原始細胞の引越し、3次元袋状構造の形成、及び膵島芽の形成に際立った作用を奏する（Gao R, Ustinov J, Pulkkinen MA, et al. Characterization of Endocrine Progenitor Cells and Critical Factors for Their Differentiation in Human Adult Pancreatic Cell Culture. Diabetes 2003; 52:2007-2015）。Gittes GKなども、Matrigel中の一番 主要した成分の一つであるラミニンが、鼠胚胎膵管の選択に与ることを証明した（Jiang FX, Cram DS, DeAizpurua HJ, et al. Laminin-1 promotes differentiation of fetal mouse pancreatic betacells. Diabetes 1999; 48:722-730；Crisera CA, Kadison AS, Breslow GD, et al. Expression and role of laminin-1 in mouse pancreatic organogenesis. Diabetes 2000; 49:936-944）。また、Matrigelに 培養された人の膵管上皮細胞は、インシュリン陽性である膵島形集合体構造を形成することができる（Bonner-Weir S, Taneja M, Weir GC, et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:7999-8004）。本発明によって、Matrigelが誘導の間に小さい膵島形集合体の構造を形成することは必要であることが証明された。若しES細胞を単独にラミニン又はゼラチン(gelatin)で培養すると細胞集合体を十分に形成することができない。以下の実施例は、分化された細胞がMatrigelにおいて 成長する場合より、ラミニン又はゼラチンにおいて成長する場合がもっと有効であることを説明する。これは、Matrigelがラミニン又はゼラチンよりもっと多い誘導因子を提供することができるはことを説明する。
【００１５】
本発明は、短い期間内にES細胞から機能性インシュリン生成細胞への分化を誘導することができる3ステップ培養方法を提供した。上記方法は、ActivinA、RA及びほかの任意の成熟因子の組合せを基礎とする。結果から分かるように、TGF-β とRAシグナルは膵β細胞の発育と成熟にキーポイント的な作用を奏する。インシュリン陽性細胞は、特異性のある膵β細胞標識遺伝因子を発現することができる。例えばinsulinI、pdx1、glut2、hnf3β 及びisl1などである。本発明において、インシュリン促進剤の下流側(DOWN STREAM)に位置するEGFPリポーター遺伝因子を携えるキャリヤーを利用すると誤検出率を低減することができ、したがってES細胞からインシュリン生成細胞への分化をもっと確定的に誘導することができる。また、以下の実施例が証明したように、腎被膜(renal capsule)部位に 移植する場合、本発明を通じて、STZ誘導された糖尿病付け鼠を救うことができる。上述の誘導システムは、膵β細胞の形成と分化メカニズムの研究に新しい体外誘導パターンを提供すると同時にI型糖尿病の移植にも潜在的なインシュリン生成細胞の源を提供した。
【００１６】
上述の内容は、本発明に 対する総合的な説明である。以下の実施例を通じて本発明の内容をもっと深く理解することができると考える。これらの実施例は、本発明の例のみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１７】
実施例
実施例1 鼠の胚性幹細胞からを膵細胞への誘導
次の実施例において、百分率とは、別に説明がない限り質量百分率を意味する。
20%ウシ胎児血清(FBS)(Gibco-BRL)、1000 U/ml白血病抑制因子(LIF, Gibco-BRL)を含有するDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL)培地において、 すでに幅広く検出されたES細胞系-- ES-R1(Nagy A, Rossant J, Nagy R, et al. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90:8424-8428)を培養した。
【００１８】
１．ES細胞の培養と分化の条件
ES細胞を膵β細胞に分化する方法は、次のとおりである(3ステップ培養方法、図1Aを参照)。
第1ステップで、胚様体(EB)の形成を誘導するため、 トリプシンを利用してES細胞を通常消化(dissociated)して、これをLIFがない10％FBS/DMEM培地を含有するペトリ（Petri）皿(Alpha medical instrument)に 懸濁された。24時間から48時間の後(図1Bを参照)、EBを収集して、LIFがない10％FBS/DMEM培地を含有するとともに1% Matrigel (BD Biosciences)がカバーされたペトリ皿に移動した。２時間の後、EBの増加が開始され、100 ng/mlActivinA(Sigma)を含有する10% FBS/DMEM培地中において24時間までに培養した。また、EBを10% FBS/DMEM培地に移動して6-8時間培養して間欠期とした。間欠期の後、10-6 M RA (Sigma)を含有する10% FBS/ DMEM培地を利用して,分化されたEB細胞を24時間までに更に培養した。
【００１９】
第2ステップで、インシュリンを生成するための前駆体細胞を増加(expand)するため、10 ng/ml bFGF (Sigma)を含有する10% FBS/ DMEM培地を利用して、分化されたEB細胞を3-5日培養した。該期間にほとんどの細胞は上皮形の構造を表した(図1Cを参照)。
【００２０】
第3ステップで、インシュリン生成細胞の成熟のため、第2ステップにおいて 増加された細胞をN2添加物(1:100,Gibco-BRL)、B27添加物(1:50 Gibco-BRL),1 μg/ml ラミニン (Sigma)、10 ng/ml bFGF (Sigma) 及び10 mM ニコチンアミド (Sigma)を含有するDMEM/F12 培地(Gibco-BRL)に移動して 3-5日に更に培養した（Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001;292:1389-1394）。NIKON位相差顕微鏡 (TS-100)で細胞の形態を観察した。その結果、培養された細胞が集合体構造を形成したことが分かった (図1Dと図1Eを参照)。
【００２１】
２．RT-PCRを利用して分化された細胞の遺伝因子の発現状況を検出
Catrimox-14 RNA キット(TaKaRa)を利用して、第2ステップ又は第3ステップにおいて得られたActivinAとRAにより誘導された細胞と,ActivinAとRAの誘導を行わなかった細胞と、ActivinAとRA中の一つのみにより誘導された細胞との総計RNAを得た。MMLV逆転写酵素 (Promega)を利用してRNAをcDNAに逆転写した。PCR緩衝液中のEx Taq重合酵素(TaKaRa)システムを利用してPCR反応を完成した。循環条件は、次のとおりである。94℃において 5分 反応した後 35周期 循環した(94℃において 50秒 までに変性、56-58℃において 30秒までにアニーリングし、72℃において 40秒までに延長)。最後に、72℃において 4分 培養した。Prime Premier 5.0を利用してpdx1、glut2、isl1、β-アクチン など PCR  premierをデザインした。PCR  premierの配列は、次のとおりである(センスとアンチセンスをそれぞれ表示した)。
【００２２】
InsulinI: TAGTGACCAGCTATAATCAGAG (SEQ ID No.1) 和ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC (288bp) (SEQ ID No.2); 
hnf3β: ACCTGAGTCCGAGTCTGACC (SEQ ID No.3)和GGCACCTTGAGAAAGCAGTC (345bp) (SEQ ID No.4); 
pdx1: CTTAGCGTGTCGCCACAGCCCTCCA (SEQ ID No.5)和TCCAACAGCCGCCTTTCGTTATTCT (472bp) (SEQ ID No.6); 
glut2: GGATAAATTCGCCTGGATGA(SEQ ID No.7)和TTCCTTTGGTTTCTGGAACT (299bp) (SEQ ID No.8); 
isl1: ATTTGCCACCTAGCCACAGCACC (SEQ ID No.9)和CGCATTTGATCCCGTACAACCTG (335bp) (SEQ ID No.10); 
β-actin: CCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAA (SEQ ID No.11)和ATACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA (480bp) (SEQ ID No.12); 
hnf4α: ACACGTCCCCATCTGAAG (SEQ ID No.13)和CTTCCTTCTTCATGCCAG (269bp) (SEQ ID No.14)。
【００２３】
その結果は、図2A-2Cに示すようである。図2Aの第1行は、第2ステップ末期に得た、ActivinAのみで誘導した細胞が主にhnf3βとpdx-1を発現することを表し、第2行は、第2ステップ末期に得たRAのみを利用して誘導した細胞はhnf3βのみを発現することを示した。図2Bは、第2ステップ末期に得た、ActivinAとRAを同時に利用して誘導した細胞が標識遺伝因子pdx-1、hnf3β，insulinI及びhnf4αを発現することを示した。図2Cは、第3ステップ末期にActivinAとRAを同時に利用して誘導した細胞がinsulinI、pdx-1、isl1、glut2 及びhnf3βを発現することを示した(第3コース<＋>)。図2A-2Cの中、 RTは逆転写を行っていない、陰性対照例を表示し、空白は陰性対照において水のみ 使用した例を示す。図2Cの中、第1コースの<膵>は、成熟した鼠膵細胞の陽性対照であり、第2コースの符号<->は第3ステップにおいて ActivinAとRAを利用して誘導していない鼠ES-R1細胞を表示し、符号<+>は第3ステップにおいて ActivinAとRAを利用して誘導した鼠ES-R1細胞を示す。
【００２４】
上記細胞は、ほかの膵内分泌細胞(非β細胞) の標識,例えば グルカゴン又はソマトスタチンを発現しない。該結果はTGF-βとRAシグナルが膵β細胞の発育と成熟に 特異性をもっている可能性があることを示す。その以外、誘導過程がActivinAとRA対して厳格な依存性をもっていることを発見した。若し、両者の中一つがない場合、細胞集合体をほとんど形成しないし、誘導された細胞がインシュリン（pdx1、isl1、glut2 及びhnf3β）を発現しないかまたは微弱に発現する (図2Cの第2コースを参照)。また、若しmatrigelの代わりにラミニン又はゼラチンを使ってペトリ皿をカバーすると、第3ステップにおいて小さい細胞集合体が形成しないことも発見した。
【００２５】
３．免疫組織化学上の分析
誘導されたインシュリン培養細胞がC-ペプチドを発現することができることを証明するために、免疫組織化学上の分析を行った。第3ステップから得た誘導された細胞を4%パラホルムアルデヒドに固定しPBS清浄を3回 行った後、 10% 通常なヤギ又はウサギ血清で室温において 20分 インキュベートした。ヤギ血清を除去した後、それぞれインシュリン一次抗体(ウサギ多クローン、IgG、1:200、Santa Cruz)又はC-ペプチド一次抗体(Linco)を添加し、4℃において細胞を一晩培養した。続いて、ローダミン接合ヤギ抗ウサギ-二次抗体IgG、FITC接合ウサギ抗ヤギ-二次 抗体IgG(1:200、Santa Cruz)又はビオチン接合IgG(作業溶液、Santa Cruz)を利用してインキュベートした。ビオチン接合IgGを二次抗体に使用した場合、反応マトリックスとして DABを使用した。Olympus位相差顕微鏡（Olympus IX-71）によって画像を取得した。その結果、細胞がインシュリンのみでなく、C-ペプチドも発現することが分かった (図3A,3Bを参照)。
【００２６】
DTZ染色（Shiroi A, Yoshikawa M, Yokota H, et al. Identification of insulin-producing cells derived from embryonic stem cells by Zinc-Chelating Dithizone. STEM CELLS 2002;20(4):284-292）を通じて上記3ステップ培養方法によって培養した細胞又はActivinAとRAの誘導を行わなかって発育した細胞(対照組)を検出した。その結果、3ステップ処理を行った後、DTZ陽性の細胞集合体(ローズピンク)が出現した(図3Dを参照)。しかし、対照組においてはDTZ培養細胞集合体が出現しなかった(図3Cを参照)。該結果は、得られた細胞集合体がインシュリン陽性の細胞を含有していることを説明する。
４．EGFPリポーター遺伝因子の構成及びES細胞のトランスフェクション(transfection)
ES細胞の後代が培地 のインシュリンを吸収してインシュリン抗体によって陽性に染色されることができるはことは、すでに証明された事実である(Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC, et al. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A  2002;99(25):16105-16110)。インシュリンが本当に誘導された細胞集合体から生成された物質であることを確定するために、EGFPリポーターシステムを利用してインシュリンの発現を検出した。EGFPリポーターキャリヤを利用してR1 ES細胞をトランスフェクションした。その中、一つのインシュリン促進剤によって駆動された緑色蛍光蛋白質cDNAを含有する。G418を利用して上記キャリヤに引き入れたES細胞を選別し、ActivinAとRAを利用して誘導を行った。具体的な方法は、次のとおりである。
人インシュリン促進剤とEGFPキャリヤとの接合を構成した。pFOXCAT-362 hIns（Odagiri H, Wang JH, and German MS. Function of the Human Insulin Promoter in Primary Cultured Islet Cells. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 1996;271(4):19091915）から切り出した0.4kbの 人 インシュリン 促進剤を含有するXba IとHind IIIフラグメントを、CMV促進剤がすでにAseIにHindIIIにより切り出されたpCMV-EGFPN3キャリヤ(BD Biosciences)と接合した。上記ネオマイシン抵抗性を有するキャリヤーを電気穿孔方法(electroporation)を通じてES R1細胞系に トランスフェクションし、 250 μg/ml G418 (Gibco-BRL)に陽性ESクローンを選別した。選別した鼠ES-R1陽性クローンをまずActivinAとRA 因子に刺激し、生成された小さい細胞集合体に対してEGFPを利用して検出を行った。EGFP結果は、図3Eと3Gに 示すことと同じである。得られた小さい細胞集合体重において、EGFPの発現を検出することができた。また、その発現パターンはインシュリン 発現と一致していた(図3Fと3Hを参照,第3ステップの免疫組織化学上の分析方法に 基づいて検出)。上述のデーターから分かるように、ActivinAとRA及びほかの成熟因子の組合せ作用は、ES細胞から膵細胞にへの分化を誘導することができる。
【００２７】
５．ELISAによるインシュリン 分泌量の検出
誘導された細胞のインシュリン 分泌量がブドウ糖に 対して依存性を有するかを検出するために、二つの種類の濃度(5.5 mMと27.7 mM)のブドウ糖を使用した。2.5 Mmのブドウ糖を含有するKrebs-Ringer緩衝液(pH 7.4)によって37℃において 細胞を90分 予備インキュベートした。インシュリンの放出を誘導するために、また27.7mMブドウ糖を含有するKrebs-Ringer緩衝液で37℃において 15分 インキュベートした(サンプルA)。ほかの組の細胞をまず2.5 Mmのブドウ糖を含有するKrebs-Ringer緩衝液によって37℃において細胞を90分予備インキュベートした後 、インシュリンの放出を誘導するために、5.5mMブドウ糖を含有するKrebs-Ringer緩衝液で37℃において 15分 インキュベートした(サンプルB,対照例にする)。調整された培地を収集した。Rat/Mouse Insulin ELISA キット(CRYSTAL CHEM INC)を利用して二つの培地サンプルのインシュリン 分泌量を検出した。細胞総計蛋白質量をBCATM Protein Assay キット(PIERCE)で検出した。その結果、高濃度のブドウ糖中に細胞のインシュリン分泌量が低濃度ブドウ糖より 5倍ほど高いことが証明された(図3Iを参照,図3I中 インシュリンの含有量単位はngインシュリン/mg細胞の総計蛋白質量である。その中、コラムAは27.7 mMブドウ糖によって処理した後のインシュリン分泌レベルを示すが、コラムB(5.5 mMブドウ糖により処理)より5倍ほど高い)。上記結果が示したように、ESのインシュリン培養細胞が行うインシュリンの分泌もブドウ糖濃度に よって調整することができる。
【００２８】
６．インシュリン生成細胞の鼠腎被膜への移植
ES細胞のインシュリン培養細胞が糖尿病鼠を救うことができるかを検出するために、分化細胞をSTZ誘導性の糖尿病鼠の左側腎被膜に移植した(n=9)。具体的な方法は、次のとおりである。
【００２９】
細胞又はPBSを移植する前に 6-8周の129匹の雄鼠の腹腔内に50mg/kgのストレプトゾトシン(STZ,Sigma)を5日連続して注射することにより、実験糖尿病の形成を誘導した。STZ処理を行った鼠血液のブドウ糖濃度が13.9 mMより高い場合、鼠の左側腎被膜に１×１０６個のインシュリン生成細胞を移植した。対照組(n=12)に 対してPBS処理を行った。GlucoTREND2 (Roche)を利用して切り出された尾中の血液のブドウ糖濃度を検出した。手術を行った腎臓を冷凍スライスし、 腎被膜中の移植細胞のインシュリン発現に対して免疫組織化学上の分析を行った。その結果、分化細胞によって処理された糖尿病鼠(n=9)の生存期間がもっと長くなり、生存率が70%に達した。これに対し、PBSを移植した糖尿病鼠(n=12,実線)の生存率は、25%であった(図4Aを参照)。生存した鼠は正常な体重を維持することができた。約二週の後、細胞移植を受けた糖尿病鼠の血液中のブドウ糖濃度が普通レベル(13.9 mMより低い)に回復された。これに対し、PBS移植を受けた鼠(n=3)の血液中のブドウ糖濃度は常に比較的に高いレベル(13.9 mMより高い)を維持した(図4Bを参照)。細胞移植を受けた左側腎臓を切り出した後、鼠の血液のブドウ糖濃度は14 mMまで上昇された。PBS注射された左側腎臓には、インシュリン一次抗体によりインシュリン培養細胞が検出されなかった (図5Aを参照)。分化細胞処理を行ったSTZ-糖尿病鼠の腎臓のみにおいてインシュリン培養細胞が検出された(図5Bを参照)。上記結果は、ES細胞のインシュリン培養細胞が糖尿病鼠を救うことができることを証明する。
【００３０】
実施例2 人の胚性幹細胞から膵細胞への誘導
本発明は、人ES細胞系、H1又はH9を使用した(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998;282:1145-1147.)。上記細胞の培養温度は37℃である。
【００３１】
培養システムは、化学上の組成成分が確定された培地である（CDM：50%IMDM (Gibco)、50%F12 (Gibco)、モノチオグリセリン(sigma)450umol/L、インシュリン-トランスフェリン-セリウム-A (ITS、Gibco)、アルブミンフラグメントV (Sigma) 5mg/ml）。簡単に説明すると、hES細胞をCDMに 引き入れて分化した。次いで、ActivinAとRAを利用してhES細胞から膵前駆体細胞への分化を誘導した。続いて、 mES誘導方法において説明した膵島培養条件を利用して、hESの膵β細胞を更に成熟させた。
【００３２】
分化を行うために、実験は以下のように設計した。
第1ステップ、hES細胞を1% Matrigel (B&D Biosciences)によってカバーされた組織ペトリ皿(Nunc)に移行(passage)した。次いで、 改良されたCDM（11）により上述の培地を代わった。上記改良されたCDM（11）は、50% IMDM (Gibco)と50% F12 NUT-MIX (Gibco)を含有し、インシュリン-トランスフェリン-セリウム-A (1:100、Gibco)、450μMモノチオグリセリン(sigma)及び5mg/mlアルブミンフラグメントV (Sigma)が添加されている。二日後、50 ng/mlActivinA (Sigma) を含有するCDM培地に上述の細胞を4日誘導した。
第2ステップ,ActivinAを4日誘導した後、細胞を10-6 M RA（Sigma）を含有するCDMに移動して更に4日誘導した。
第3ステップ、培地をCDMから改良された膵島成熟培地(12)に変換した。上記膵島成熟培地(12)の組成は、次のとおりである。DMEM/F12 (Gibco)、インシュリン-トランスフェリン-セリウム-A(1:100、Gibco)、2mg/mlアルブミンフラグメントV (Sigma),及び10 ng/ml bFGFである。細胞を上記培地に3日培養した後、DMEM/F12 (Gibco)、インシュリン-トランスフェリン-セリウム-A (1:100、Gibco),2 mg/mlアルブミンフラグメント V (Sigma) 及び10 mM ニコチンアミド(Sigma)を含有する培地に引き入れ2日培養した。次いで、0.5 mg/mlの分散酵素(dispase、Gibco)を利用して上述の細胞を消化し、これを低付着ペトリ皿で5日放置することで、懸濁液を形成して膵島の成熟を完成した。
【００３３】
２.分化細胞中の遺伝因子発現に関するRT-PCR分析
実施例1の第2部分において説明した方法に基づいて、RT-PCRを利用してソマトスタチン(SST),Glut2、アミラーゼ(Amy)、Sox17、Hnf4α、pdx-1、インシュリン(INS)、Hb9、グルコキナーゼ(GCK)、IFABPなどの分化細胞と対照組細胞(ActivinAとRAの誘導を含まないCDM中で培養)中の発現を検出した。上記分化細胞は、上述の3ステップ培養方法に基づいて取得した成熟β細胞を指す。対照組細胞はActivinAとRA中の一つによって誘導された細胞を指す。PCRpremierの配列は、次のとおりである(センスとアンチセンスをそれぞれ表示する)。
【００３４】
gapd: GTCATTGAGAGCAATGCCAG (SEQ ID No.15) とGTGTTCCTACCCCCAATGTG (200bp) (SEQ ID No.16);
sox17: CAGTGACGACCAGAGCCAGACC  (SEQ ID No.17) とCCACGACTTGCCCAGCATCTT (292bp) (SEQ ID No.18);
pdx1: ACCAAAGCTCACGCGTGGAAA  (SEQ ID No.19) とTGATGTGTCTCTCGGTCAAGTT (200bp) (SEQ ID No.20);
hlxb9: CCTAAGATGCCCGACTTCAACTCCC (SEQ ID No.21) とGCCCTTCTGTTTCTCCGCTTCCTG (276bp) (SEQ ID No.22);
hnf4α: ATCAGAAGGCACCAACCTCAAC (SEQ ID No.23) とTGTCTTTGTCCACCACGCACT (197bp) (SEQ ID No.24);
インシュリン: GAGGCCATCAAGCACCATCAC  (SEQ ID No.25) とGGCTGCGTCTAGTTGCAGTA (373bp) (SEQ ID No.26);
glut2: GCTACCGACAGCCTATTCTA  (SEQ ID No.27) とCAAGTCCACTGACATGAAG (267bp) (SEQ ID No.28);
アミラーゼ (amy): CTGACAACTTCAAAGCAAA  (SEQ ID No.29) とTACAGCATCCACATAAATACGA (358bp) (SEQ ID No.30) ;
ソマトスタチン (SST): GATGCTGTCCTGCCGCCTCC (SEQ ID No.31) とTGCCATAGCCGGGTTTGA (292bp) (SEQ ID No.32);
sur1: TTGCCGAAACCGTAGAAGGA  (SEQ ID No.33)とTTGGAGACCATTAGGGCGTAG (268bp) (SEQ ID No.34);
グルカゴン (GCG): AGGCAGACCCACTCAGTGA  (SEQ ID No.35) とAACAATGGCGACCTCTTCTG (308bp) (SEQ ID No.36);
グルコキナーゼ (GCK): AGGGAATGCTTGCCGACTC  (SEQ ID No.37) とCACTGGCCTCTTCATGGGT (375bp) (SEQ ID No.38)。
【００３５】
上記結果は図7Aと7Bに示したようである。これは、分化されたES細胞は、成熟β細胞の標識遺伝因子例えば インシュリン、pdx-1,グルコキナーゼ 及びglut2を発現することができることを証明する（図7Aを参照）。これに対し、対照組は、ほとんどどんな標識遺伝因子も発現しないことが分かる(図7Bを参照)。
【００３６】
３.免疫組織化学上の分析
4%パラホルムアルデヒドに誘導された細胞を固定しPBSに三回清浄した後、 0.3% tritonX-100 (Sigma)と10%正常血清を含有するPBS中に室温で細胞を40分インキュベートした。次いで、ヤギ抗人(goat anti-human)sox17抗体(1:40、R&D SYSTEMS) 一次抗体、鼠抗人インシュリンモノクローン抗体(1:100、CHEMICON)一次抗体、ウサギ抗人C-ペプチド抗体(1:200、Linco) 一次抗体,グルカゴン（ヤギ多クローンIgG、1:200、Santa Cruz）一次抗体、pdx1（ヤギ多クローンIgG、1:200、Santa Cruz）一次抗体、アミラーゼ（ウサギ多クローンIgG、1:500、Sigma）一次抗体、ngn3（ヤギ多クローンIgG、1:200、Santa Cruz）一次抗体又はソマトスタチン（ヤギ多クローンIgG、1:200、Santa Cruz）を利用して4℃において一晩インキュベートした。その後、次の二次抗体を利用してインキュベートした。TRITC-接合ヤギ抗ウサギIgG，FITC-接合ウサギ抗ヤギIgG，FITC接合ヤギ抗鼠IgG，FITC 接合ロバ抗ヤギIgG又はTRITC-接合ロバ 抗ウサギIgG（1:200，全部Jackson ImmunoResearch、INC.から購入）。DAPI (Sigma)染色を利用して細胞核を検出した。Olympus位相差顕微鏡（Olympus IX-71）によって画像を取得した。Image-Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics)を利用してC-ペプチド培養細胞の百分率を計算した。
【００３７】
その結果、上述の細胞が膵β細胞の遺伝因子例えばC-ペプチド、pdx-1などを 発現することができることが表明された(図8を参照)。
【００３８】
４.インシュリン生成細胞の腎被膜への移植
ES細胞のインシュリン培養細胞が体内環境において正常的に機能をはっきすることができることを証明するために、STZ誘導による糖尿病鼠の左側腎被膜(n=12)に分化細胞を移植した。具体的な方法は次のとおりである。
【００３９】
動物に対する操作は、すべて中国北京大学の動物看護及び使用委員会の同意を得た。細胞又はPBS移植前に、4週から6週のBALB/cヌードの雄鼠腹腔内に 40mg/kg用量のストレプトゾトシン(STZ、Sigma)を連続的に5日注射して実験糖尿病の形成を誘導した。STZ処理を行った鼠が糖尿病鼠に転換したとき約１×１０６個の誘導細胞を左側腎被膜に移植した。ActivinAとRA誘導を行わなかったPBS又は細胞を実験対照用によって使用した。一晩断食の後、i.g.ブドウ糖(2.5 gkg−１体重)を利用してブドウ糖耐性を検出した。GlucoTREND2 (Roche)を利用して切り出した尾の血液のブドウ糖レベルを検出した。手術を行った腎臓を冷凍スライスし、 免疫組織化学上の分析を通じて細胞が移植された腎被膜中のC-ペプチド発現を確認した。鼠抗人核モノクローン抗体(1:30、CHEMICON)を利用してhESの細胞を検出した。Olympus位相差顕微鏡（Olympus IX-71）によって画像を取得した。その結果PBSを注射した腎臓においてはインシュリン培養細胞が発見されなかった。移植鼠の結果を図11Aと11Bに示した。人ES由来の分化細胞を移植した実験例においては、C-ペプチドを発現することができた(図11Aを参照)。C-ペプチド培養細胞は人核特異性抗体によって染色された。これは、上述の細胞が人のES細胞より由来したことをを示す。
【００４０】
人の胚性幹細胞から膵β細胞への実験誘導は、I型糖尿病の移植治療に潜在なソースを提供した。本発明による3ステップ培養方法は、hES細胞の機能性インシュリン生成細胞への分化を誘導することができる。hES細胞を化学上の成分が確定された培地(CDM),ActivinA、RA及びほかの成熟因子(図6を参照)中で培養することを基礎とする方法は、体内膵発育のシグナル伝達を模擬した。RT-PCR検出を通じて、hES由来の細胞が膵β細胞標識遺伝因子例えばpdx1,インシュリン、グルコキナーゼ 及びglut2を発現することができることが分かる(図7を参照)。上述の細胞はC-ペプチド、pdx1、グルカゴン、ソマトスタチン又はアミラーゼ陽性などである。C-ペプチド陽性は、インシュリンが免疫組織化学上の検出方法によって吸収される可能性を除外した(図8を参照)。誘導された細胞のインシュリン分泌がブドウ糖依存型であるかどうかを分析するために、二種類の濃度のブドウ糖を使用した(2.5 mMと27.5 mM)。Krebs-Ringer緩衝液によって37℃で細胞を90分予備インキュベートした後、2.5mMブドウ糖を含有するKrebs-Ringer緩衝液で37℃で15分予備インキュベートした。インシュリンの放出を誘導するために、27.5mMブドウ糖によって15分インキュベートした。すでに調整された培地をそれぞれ収集した。Rat/Mouse Insulin ELISA キット(Linco)を利用して二つの培地サンプルのインシュリン分泌量を検出した。細胞内 C-ペプチド濃度をHuman C-ペプチド ELISA キット(Linco)で検出した。細胞総計蛋白質量をBCATM Protein Assay キット(PIERCE)で検出した。その結果、懸濁培養中で誘導された細胞の高濃度ブドウ糖培地中においてのインシュリン分泌量は、低濃度ブドウ糖培地より200%向上した(図9Aを参照)。また、懸濁培養を通じて生成された細胞の細胞内C-ペプチド含有量も増加された(図9Bを参照)。しかし、付着培養を通じて取得した細胞のインシュリン分泌はブドウ糖の刺激に応答しなかった(図9A,9Bを参照)。上記のデーターは、付着培養に比べて懸濁培養のほうが、膵島形細胞のもっと有効な成熟を引き起こしたことを説明する。
【００４１】
誘導された細胞が体内において機能を発揮するかを研究するために、糖尿病ヌードの鼠の腎被膜に分化細胞を移植した。誘導された細胞を移植した鼠中の30%は約6周間血液ブドウ糖が正常なレベルを維持した（<13.9 mM）（図10Aを参照）。ブドウ糖耐性検出結果によると、対照操作を行った鼠に比べて、上記30%の救出(rescue)されたヌードの鼠はブドウ糖制御能力を改善する効果も取得した(図10Bを参照)。移植して一ヶ月後、上記3ステップ培養方法を通じて誘導された細胞を移植した腎被膜においてC-ペプチド培養細胞を検出した。人核特異性抗体を利用して上述の細胞を染色した。その結果、上記C-ペプチド培養細胞は、注射されたhES細胞の細胞から由来したことが証明された (図11Aと11Bを参照)。
【００４２】
上述の結果は、hES細胞由来のインシュリン生成細胞は生存可能であるばかりでなく、体内で30%のSTZによって誘導された糖尿病鼠を救うこともできるはことを明確に証明した。該発見は、人間の膵島細胞の発育メカニズムの研究に新規体外モデルを提供しており、hES細胞のインシュリン生成細胞は未来でI型糖尿病移植治療にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】図1Aは本発明によるES細胞のインシュリン培養細胞への分化を誘導することができる３ステップ培養方法を示す図面である。
【図１Ｂ】図1Bは鼠ES-R1細胞から形成されたEB細胞集合体の写真である。
【図１Ｃ】図1Cは3ステップ培養方法の第2ステップ中の膵前駆体細胞が上皮の形の構造を示す状態の写真である。
【図１Ｄ】図1Dは3ステップ培養方法の第3ステップにおいて示す細胞集合体の形の構造の写真である。
【図１Ｅ】図1Eは3ステップ培養方法の第3ステップにおいて示す細胞集合体の形の構造の写真である。
【図２Ａ】図2AはRT-PCR検出を通じて第2ステップ末期にActivin A又はRAによってそれぞれ誘導された分化細胞標識遺伝因子の発現状況を示す図面である。
【図２Ｂ】図2BはRT-PCR検出を通じて第2ステップ末期にActivin A とRAによって誘導された分化細胞標識遺伝因子の発現状況を示す図面である。
【図２Ｃ】図2CはRT-PCR検出を通じて第3ステップ末期の分化細胞標識遺伝因子の発現状況を示す図面である。
【図３Ａ】図3Aは3ステップ培養方法によって得られた細胞がインシュリン一次抗体によって染色された免疫組織化学上の検出結果である。
【図３Ｂ】図3Bは3ステップ培養方法によって得られた細胞がC-ペプチド一次抗体によって染色された免疫組織化学上の検出結果である。
【図３Ｃ】図3CはActivin A とRAの誘導を行わなかった細胞のインシュリンジアミノベンジダインテトラ塩酸塩(DAB)の染色検出結果である（200×）。
【図３Ｄ】図3DはActivin A とRAの誘導を行った細胞のインシュリンDABの染色検出結果である（200×）。
【図３Ｅ】図3Eと3Gは3ステップ培養方法によって誘導された、EGFPリポーター遺伝因子がトランスフェクション(transfection)されたES-R1細胞のEGFP発現状態を示す図面である。その中 E,Gはそれぞれ異なる構造を示す（200×）。
【図３Ｆ】図3Fと3Hは3ステップ培養方法によって誘導された、EGFPリポーター遺伝因子がトランスフェクションされたES-R1細胞がインシュリン一次抗体によって染色された免疫組織化学上の分析結果を示す図面である。その中、F、Hはそれぞれ異なる構造を示す（200×）。
【図３Ｇ】図3Eと3Gは3ステップ培養方法によって誘導された、EGFPリポーター遺伝因子がトランスフェクションされたES-R1細胞のEGFP発現状態を示す図面である。その中 E,Gはそれぞれ異なる構造を示す（200×）。
【図３Ｈ】図3Fと3Hは3ステップ培養方法によって誘導された、EGFPリポーター遺伝因子がトランスフェクションされたES-R1細胞がインシュリン一次抗体によって染色された免疫組織化学上の分析結果を示す図面である。その中、F、Hはそれぞれ異なる構造を示す（200×）。
【図３Ｉ】図3IはELISAを通じて検出したインシュリン放出結果である。
【図４Ａ】図4Aは分化細胞が移植された糖尿病鼠(n=9)とPBSが移植された糖尿病鼠(n=12)の生存率の比較結果を示す図面である。
【図４Ｂ】図4Bは分化細胞が移植された糖尿病鼠(n=5)とPBSが移植された糖尿病鼠(n=3)の血液ブドウ糖レベルの分析結果である。
【図５Ａ】図5AはPBSが移植された鼠のインシュリン発現の免疫組織化学上の分析結果である（200×）。
【図５Ｂ】図5Bは分化細胞が移植された鼠のインシュリン発現の免疫組織化学上の分析結果である（200×）。
【図６】図6は人の胚胎幹(hES)細胞の誘導過程を示す図面である。
【図７Ａ】図7AはCDM作用/RA方法によって誘導されたhESの標識遺伝因子の発現状況を示す図面である。
【図７Ｂ】図7BはCDMのみを利用して培養した対照hESの標識遺伝因子の発現状況を示す図面である。
【図８Ａ】図8A-Dは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとPdx1を発現する写真である (400×)。
【図８Ｂ】図8A-Dは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとPdx1を発現する写真である (400×)。
【図８Ｃ】図8A-Dは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとPdx1を発現する写真である (400×)。
【図８Ｄ】図8A-Dは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとPdx1を発現する写真である (400×)。
【図８Ｅ】図8E-Hは誘導終了されたhES細胞のグルカゴンとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｆ】図8E-Hは誘導終了されたhES細胞のグルカゴンとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｇ】図8E-Hは誘導終了されたhES細胞のグルカゴンとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｈ】図8E-Hは誘導終了されたhES細胞のグルカゴンとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｉ】図8I-Lは誘導終了されたhES細胞のアミラーゼとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｊ】図8I-Lは誘導終了されたhES細胞のアミラーゼとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｋ】図8I-Lは誘導終了されたhES細胞のアミラーゼとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｌ】図8I-Lは誘導終了されたhES細胞のアミラーゼとC-ペプチドを発現する写真である (400×)。
【図８Ｍ】図8M-Pは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとソマトスタチンを発現する写真である (400×)。
【図８Ｎ】図8M-Pは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとソマトスタチンを発現する写真である (400×)。
【図８Ｏ】図8M-Pは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとソマトスタチンを発現する写真である (400×)。
【図８Ｐ】図8M-Pは誘導終了されたhES細胞のC-ペプチドとソマトスタチンを発現する写真である (400×)。
【図９Ａ】図9Aは懸濁と付着培養を通じて得られた末端分化細胞のインシュリン分泌量の比較結果である。
【図９Ｂ】図9B は懸濁と付着培養を通じて得られた末端分化細胞C-ペプチド放出量の比較結果である。
【図１０Ａ】図10Aは誘導された細胞を移植した糖尿病のあるヌードマウスとPBSを移植した鼠、及び誘導を行わなかった細胞を移植した鼠の血液中のブドウ糖レベルの比較した結果である。
【図１０Ｂ】図10Bは操作される鼠の腹腔内のブドウ糖耐性の検出結果である。
【図１１Ａ】図11Aは誘導された細胞中の人の C-ペプチドを発現する写真である(400×)。
【図１１Ｂ】図11Bは人の核の特異性抗体の染色結果であり、C-ペプチド培養細胞が人のES細胞由来であることを示す(400×)。
【図１】
2008535503.tif 000003
【図２】
2008535503.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2008535503000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月17日(2007.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008535503000001.app
【国際調査報告】
2008535503.tif 000024
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