(57)【要約】【課題】膜貫通リーダー配列と融合する場合、悪性細胞および形質転換細胞に対し選択的致死性を有する、ヒトｐ５３のアミノ酸残基１２−２６の全部または一部に対応するペプチドを含む組成物を提供する。該ペプチドは、動物、好ましくはヒトにおいて新生物疾患を処置するのに有用である。そのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合した対象ペプチドを投与することにより、患者の新生物疾患を処置する方法をまた提供し、インビトロでの悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞を殺すことにおける対象ペプチドの有効性レベルを評価する方法も提供する【解決手段】対象ペプチドのタンパク質分解を減らすために、１つ以上のＤ−アミノ酸は、対象ペプチドのｐ５３部分および／または膜貫通リーダー配列において、対応するＬ−アミノ酸と置換することができ、さらに、対象ペプチドがタンパク質分解を受けにくくするために、擬似ペプチド結合またはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合は、ｐ５３配列または膜貫通リーダー配列のいずれかまたは両方において、ペプチド結合と置換することができ、さらに、対象ペプチドの膜貫通リーダー配列およびｐ５３部分は、レトロ−インベルソ異性体および部分修飾レトロ−インベルソ異性体を含むことができる。このような異性体は、タンパク質分解の影響をあまり受けず、従って半減期を長くする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続アミノ酸を含むペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体であって、ここで、前記ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、そのカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有し、その中の少なくとも１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸であるか、または少なくとも１つのペプチド結合がイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合であるペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項２】
アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続的なＤ−アミノ酸を含むレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体であって、ここで、前記ＲＩペプチドは、そのカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合し、そして前記ペプチドは、悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するＲＩペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項３】
少なくとも６つの連続アミノ酸を含む部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体であって、ここで、前記少なくとも６つの連続アミノ酸の一部が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸であり、前記ＰＭＲＩペプチドは、そのカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合し、悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するＰＭＲＩペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項４】
アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を含む、請求項１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項５】
アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続的なＤ−アミノ酸を含む、請求項２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項６】
前記少なくとも６つのＤ−アミノ酸が、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた、請求項３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項７】
前記ペプチドのＮ−末端アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項８】
前記膜貫通リーダー配列のカルボキシ末端アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項９】
前記ペプチドのＮ−末端ペプチド結合が、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記膜貫通リーダー配列が、以下に示すものの内の少なくとも１つである、請求項１から請求項９に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体：ペネトラチン（配列番号４）、Ａｒｇ８（配列番号２６）、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリ−Ｒ、ＨＩＶ−１のＴＡＴ（配列番号５）、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号６）、Ｒ−ＴＡＴ（配列番号７）、ＳＶ４０−ＮＬＳ（配列番号８）、ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（配列番号９）、ＨＩＶ  ＲＥＶ（配列番号１０）、ＦＨＶコート（配列番号１１）、ＢＭＶ  ＧＡＧ（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ（ＲＥＸ）（配列番号１３）、ＣＣＭＶ  ＧＡＧ（配列番号１４）、Ｐ２２Ｎ（配列番号１５）；Ｌａｍｂｄａ  Ｎ（配列番号１６）、Ｐｈｉ  Ｎ（配列番号１７）、酵母ＰＲＰ６（配列番号１８）；ヒトＵ２ＡＦ（配列番号１９）、ヒトＣ−ＦＯＳ（配列番号２０）、ヒトＣ−ＪＵＮ（配列番号２１）、酵母ＧＣＮ４（配列番号２２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）、またはｐ−ｖｅｃ（配列番号２４）。
【請求項１１】
前記膜貫通リーダー配列がＤ−アミノ酸を含むか、または少なくとも１つのペプチド結合が、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換されている、請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項１２】
前記膜貫通リーダー配列が、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示された配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含む、請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項１３】
前記膜貫通リーダー配列が、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示された配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸の一部を含む、請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体。
【請求項１４】
薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１から請求項９に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。
【請求項１５】
薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。
【請求項１６】
薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。
【請求項１７】
薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
薬学上受容できる担体と混合された、少なくとも１つの請求項１３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を含む薬剤組成物。
【請求項１９】
治療有効量の、少なくとも１つの請求項１から請求項９に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。
【請求項２０】
治療有効量の、少なくとも１つの請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。
【請求項２１】
治療有効量の、少なくとも１つの請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。
【請求項２２】
治療有効量の、少なくとも１つの請求項１２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。
【請求項２３】
治療有効量の、少なくとも１つの請求項１３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することを含む、被検体の悪性細胞、新生物細胞を選択的に殺す方法。
【請求項２４】
悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１から請求項９に記載のいずれかにペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。
【請求項２５】
悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１０に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。
【請求項２６】
悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１１に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。
【請求項２７】
悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１２に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。
【請求項２８】
悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法であって、
請求項１３に記載のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、
生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいたペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない細胞の増殖へのその影響を評価する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生物疾患の処置のための治療モダリティに関する。より具体的には、本発明は、悪性細胞および形質転換細胞を選択的に破壊する合成ペプチド、およびそれに基づく新生物疾患の処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３タンパク質は、細胞サイクルの肝要なレギュレーターである。一部、有糸分裂を誘発するタンパク質の転写をブロックすることによって、および有糸分裂をブロックし、アポトーシスを促進するタンパク質の転写を誘発することによって、ｐ５３タンパク質は、有糸分裂を誘発する多くの腫瘍誘発遺伝子タンパク質の発ガン性効果をブロックする。ｐ５３タンパク質の欠如は、細胞形質転換および悪性疾患と関係する。［非特許文献１］。
【非特許文献１】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ  ＆  Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０
【０００３】
ｐ５３タンパク質分子は、３９３個のアミノ酸でできている。それは、残基９３−３１３からなるＤＮＡ−結合ドメインにおけるＤＮＡの特異的配列に結合するドメインを含んでいる。この領域の結晶構造は、Ｘ線結晶構造解析によって決定された。残基３１２−３９３は、ｐ５３タンパク質のホモテトラマーの形成に関与する。残基１−９３は、活性の調節およびｐ５３タンパク質の半減期に関与する。
【０００４】
ｐ５３タンパク質は、別の重要な調節タンパク質ＭＤＭ−２タンパク質に結合する。ＭＤＭ−２タンパク質をコード化するＭＤＭ−遺伝子は、公知の腫瘍誘発遺伝子である。ＭＤＭ−２タンパク質は、ｐ５３タンパク質と複合体を形成し、そしてそれはユビキネーション（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ）経路によるｐ５３タンパク質の分解をもたらす。ｐ５３タンパク質は、ｐ５３タンパク質の残基１４−２２を含むアミノ酸配列を使ってＭＤＭ−２タンパク質に結合し、そしてそれは不変である。ｐ５３タンパク質の全部のＭＤＭ−２タンパク質結合ドメインは、残基１２−２６に及ぶ。［非特許文献２］。
【非特許文献２】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ  ＆  Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０
【０００５】
ＭＤＭ−２タンパク質が、公知の腫瘍誘発遺伝子の発現生成物であることを考慮すれば、ＭＤＭ−２タンパク質が非常に重要な調節タンパク質であることは驚くべきことではない。さらに、ＭＤＭ−２タンパク質の過剰発現または増幅は、ヒトの胸腫瘍の５０％を含めて、ヒトの悪性腫瘍の４０〜６０％に見いだされた。ｐ５３タンパク質とＭＤＭ−２タンパク質との間の複合体の形成は、ｐ５３タンパク質の活性ドメイン、またはそれの中のＤＮＡ結合部位の活性ドメインをブロックすることによって、ｐ５３タンパク質の転写活性の抑制およびそれによるその分子の抗腫瘍性効果の抑制をもたらし得ることが示唆されている。より一般的には、これらおよび他の実験的観察は、ｐ５３タンパク質の抗腫瘍性効果が、ｐ５３タンパク質にＭＤＭ−２タンパク質が結合することを妨害することができるペプチドによって促進することができることを示唆していると解釈されている。実際、多くの研究者が、ＭＤＭ−２／ｐ５３複合体が合理的な薬剤デザインのための標的であり得ることを示唆している。例えば、［非特許文献３］、および［特許文献１］（Ｐｉｃｋｓｌｅｙら）を参照のこと。
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｗａｓｙｌｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，“ｐ５３  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅａｔｈ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＭＤＭ２  ｂｙ  ａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＭＤＭ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐ５３”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１９２１−３４（１９９９）
【特許文献１】米国特許第５，７７０，３７７号
【０００６】
進化は、天然に存在するタンパク質においてＬアミノ酸がほとんど排他的に存在していることを確証している。従って、事実上、全てのプロテアーゼは、隣接したＬアミノ酸の間のペプチド結合を切断する。そのため、Ｄ−アミノ酸で構成された人工のタンパク質またはペプチドは、タンパク分解性破壊に対して概して抵抗性を有する。例えば、［特許文献２］参照。血清プロテアーゼは、特異性基質要件を有する。プロテアーゼが切断するためには、基質は、Ｌアミノ酸およびペプチド結合の両方を有しなくてはならない（［非特許文献４］）。
【特許文献２】米国特許出願第１０／３９９，１２７号
【非特許文献４】Ｐｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｐｈｅｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１０：１２６８−１２７３
【０００７】
線形修飾レトロペプチド構造は、上記文献に見られ、そして用語「レトロ異性体」は、配列の方向が親ペプチドと比較して逆である異性体を包含すると規定されている。例えば、［非特許文献５］および［特許文献３］（Ｂｏｎｎｙ）を参照のこと。配列の方向が反対であり、そして各アミノ酸残基のキラリティーが逆であるレトロ−インベルソ異性体もまた、上記文献で見られる。
【非特許文献５】Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒｅｔｒｏ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ａｃｃ．ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２（１），１−７（１９７９）
【特許文献３】米国特許出願第１０／３９９，１２７号
【０００８】
報告されるところによれば、Ｊａｍｅｓｏｎらは、最近、これらの２つの特性（逆合成およびキラリティー変更）を組み合わせることによって、ＣＤ４レセプターのヘアピンループのアナログを設計した。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献６］および［非特許文献７］。Ｄ−鏡像体および逆合成を組み合わせることの最終結果は、それぞれのアミド結合におけるカルボニル基およびアミノ基の位置が交換されるということであり、一方、それぞれのα炭素における側鎖基の位置は維持される。Ｊａｍｅｓｏｎらは、報告するところによれば、それらの逆Ｄペプチドに対する生体活性の増加を実証し、そのことは、タンパク質分解に対するその感受性に起因して、その従来の全−Ｌ鏡像体のインビボ活性を限定することと対照をなす。
【非特許文献６】Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ＣＤ４  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）
【非特許文献７】Ｂｒａｄｙ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体を提供する。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。
【００１０】
このようなペプチドの例としては、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログもしくはその誘導体、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログもしくはその誘導体、およびＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログもしくはその誘導体が挙げられる。細胞膜を通って輸送され、そして悪性細胞または形質転換細胞を選択的に殺すために、リーダー配列は、好ましくは、ペプチド、そのアナログもしくはその誘導体のカルボキシル末端に置かれる。好ましくは、リーダー配列は、主に正帯電アミノ酸残基を含む。本発明に従って使われ得るリーダー配列の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ペネトラチン（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ）（配列番号４）；（Ａｒｇ）８（配列番号２６）または（Ｒ）４−（Ｒ）１６（配列番号２７）からの任意のｐｏｌｙ−Ｒ；ＨＩＶ−１  ＴＡＴ（４７−６０）（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５）；Ｄ−ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号６）；Ｒ−ＴＡＴ  Ｇ（Ｒ）９ＰＰＱ（配列番号７）；ＳＶ４０−ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号８）；ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＩＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号９）；ＨＩＶ  ＲＥＶ（３４−５０）−（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）（配列番号１０）；ＦＨＶ（３５−４９）コート−（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）（配列番号１１）；ＢＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ  ＲＥＸ４−１６−（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）（配列番号１３）；ＣＣＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）（配列番号１４）；Ｐ２２  Ｎ（１４−３０）（ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）（配列番号１５）；ＬＡＭＢＤＡ  Ｎ（１−２２）（ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）（配列番号１６）；Ｐｈｉ  Ｎ（１２−２９）（ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）（配列番号１７）；酵母ＰＲＰ６（１２９−１２４）（ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）（配列番号１８）；ヒトＵ２ＡＦ（ＳＱＭＴＲＱＡＲＲＬＹＶ）（配列番号１９）；ヒトＣ−ＦＯＳ（１３９−１６４）ＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭＡＡＡＫＳＲＮＲＲＲＥＬＴＤＴ（配列番号２０）；ヒトＣ−ＪＵＮ（２５２−２７９）（ＲＩＫＡＥＲＫＲＭＲＮＲＩＡＡＳＫＳＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ）（配列番号２１）；酵母ＧＣＮ４（ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ）（配列番号２２）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）；ｐ−ｖｅｃＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＫＡＨＳＫ（配列番号２４）。好ましくは、アンテナペディアタンパク質の貫通リーダー配列の正帯電リーダー配列が使われる。
【００１１】
上述の対象ペプチドのいずれかが、それに対してなされる特異性変化を有し得、そしてその変化は、ペプチドをタンパク質分解に影響されないようにすることを、本発明はさらに意図している。例えば、対象ペプチドは、イソスター擬似ペプチド結合またはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換された１つ以上のペプチド結合を有し得る。本発明の別の実施形態においては、対象ペプチドは、天然ｐ５３タンパク質の対応する部分の方向ペプチド異性体であり得る。本発明のこの実施形態においては、エナンチオペプチド、レトロ−インベルソペプチド、そして部分修飾レトロ−インベルソペプチドが特に意図されている。
【００１２】
よって本発明は、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する上述の対象ペプチド、そのアナログもしくはその誘導体を提供する。そのペプチドは、１つ以上のＤ−アミノ酸を含み、またはイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換された少なくとも１つのペプチド結合を有している。
【００１３】
例えば、Ｄ−アミノ酸は、対象ペプチドのＮ末端に位置することができる。Ｎ末端Ｄ−アミノ酸が存在することで、ペプチドの安定性は増す。これは、Ｎ末端残基に作用するエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。別の実施形態においては、Ｄ−アミノ酸は、対象ペプチドのＣ末端に位置することができる。Ｃ末端Ｄ−アミノ酸が存在することでもまた、ペプチドを安定化させる。これは、Ｃ末端残基に作用するエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。
【００１４】
特に、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の内の少なくとも６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体が提供される。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、膜貫通リーダー配列と融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。そして少なくとも１つのアミノ酸がＤ型であるか、または１つ以上のペプチド結合が、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換される。その例としては、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）、ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を含むペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体が挙げられる。
【００１５】
別の実施形態においては、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する対象ペプチド、そのアナログまたはその誘導体は、ｐ５３タンパク質に見られる天然の配列と逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。このようなペプチドは、本明細書中においてレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドと呼ばれる。
【００１６】
例えば、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の逆順序で組み立てられる少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいるレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体であって、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するものが提供される。好ましい実施形態において、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいる。
【００１７】
ｐ５３配列の一部のみが逆（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｔｅｄ）にされた部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドもまた、提供される。例えば、Ｄ型のアミノ酸の一部のみを有して、そして配列番号１に示されたアミノ酸配列の逆順序で組み立てられた少なくとも６つのアミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。好ましい実施形態においては、少なくとも６つのＤ−アミノ酸の一部は、配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログもしくはその誘導体の逆順序で組み立てられる。
【００１８】
１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含んでいる前述のペプチドの内のいずれかにおいて、または前述のレトロ−インベルソペプチドもしくは部分修飾レトロ−インベルソペプチドのいずれかにおいて、膜貫通リーダー配列もまた、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含むことができる。
【００１９】
別の本発明の実施形態においては、膜貫通リーダー配列は、それ自身、レトロ−インベルソペプチド異性体、または部分修飾レトロ−インベルソペプチド異性体である。レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。部分修飾レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序のＤ型アミノ酸残基の一部を有している。
【００２０】
薬学上受容できる担体と混合される対象ペプチドの内の少なくとも１つを含んでいる薬剤組成物もまた提供される。このような薬剤組成物はまた、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を含有している対象ペプチドのいずれかを含むことができ、対象のレトロ−インベルソペプチドまたは部分修飾レトロ−インベルソペプチドのいずれかもまた含むことができる。さらに、被検体の新生物疾患を処置するための方法、すなわち、選択的に被検体の悪性腫瘍または新生物性細胞を殺す方法が提供される。１つの実施形態において、その方法は、アミノ酸の配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも１つの約６つの連続アミノ酸を含んでいる治療有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を被検体に投与することを含む。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、そのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。別の実施形態においては、その方法は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に示される配列を有する治療有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を被検体に投与することを含む。ここで、膜貫通リーダー配列は、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体のカルボキシ末端に融合する。
【００２１】
その方法のさらなる実施形態では、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合、またはレトロ−インベルソペプチドもしくは部分修飾レトロ−インベルソペプチド、を有している治療有効量の対象ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を被検体に投与することを含む。ここで、膜貫通リーダー配列は、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体のカルボキシ末端に融合する。
【００２２】
インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞を殺すことにおける対象ペプチドの有効性を評価する方法もまた提供される。その方法は、少なくとも１つの対象ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体と、インビトロにおける悪性細胞、新生物細胞または形質転換細胞とを接触させる工程、ならびに生きている細胞と比較した死んだ細胞の比率もしくは百分率に基づいて、ペプチドの有効性レベル、および培養中の形質転換されていない（通常）細胞の増殖へのその影響を評価する工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明によれば、悪性細胞および形質転換細胞は、ｐ５３タンパク質内のアミノ酸配列および単一の連続したポリペプチド鎖としてのリーダー配列を含んでいる合成ペプチドを投与することによって、選択的に破壊されることが見いだされた。この作用のメカニズムは、ＭＤＭ−２タンパク質に結合しているｐ５３タンパク質からは独立していると考えられる。なぜなら、ｐ５３ペプチドは、ｐ５３タンパク質を全く生産しない形質転換細胞を選択的に殺すからである。ｐ５３ペプチドはまた、通常細胞を殺すことなしに、標準レベルまたは高いレベルのｐ５３タンパク質を発現する悪性細胞および形質転換細胞を選択的に殺す。
【００２４】
本発明によれば、ヒトｐ５３のアミノ酸残基１２−２６の全部または一部に対応しているペプチドを含んでいる組成物が提供される。この領域は、ｍｄｍ−２タンパク質と接触することが知られており、そしてｍｄｍ−２に結合されている場合、α−ヘリックス構造を取る。カルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合する場合、対象ペプチドは、悪性ヒト細胞および形質転換ヒト細胞を選択的に殺す。
【００２５】
本発明の第１の態様においては、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。ここで、少なくとも約６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチドは、リーダー配列に融合させられる。好ましくは、ペプチドは、少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸残基を含んでいる。好ましい実施形態においては、配列番号１での配列の少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸を含んでいるペプチドは、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）を有する。別の好ましい実施形態においては、配列番号１に示された配列の少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸を含んでいるペプチドは、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）を有する。さらに別の好ましい実施形態においては、配列番号１で示された配列の少なくとも約８個から少なくとも約１５個のアミノ酸を含んでいるペプチドは、次のアミノ酸配列：ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を有する。
【００２６】
本発明のペプチドを細胞の中に組み込むように機能するリーダー配列は、様々なソースから得ることができる。好ましくは、リーダー配列は、主に正帯電のアミノ酸残基を含んでいる。これは、正帯電リーダー配列は、対象ペプチドのα−ヘリックスを安定させるからである。本発明のペプチドと結合できるリーダー配列の例は、［非特許文献８］に記載されており、その例としては、以下に限定されないが、次の膜貫通リーダー配列（多くの場合、タンパク質のリーダー配列を構成しているアミノ酸残基の番号が、タンパク質の名前の直ぐ後に挿入して示される。）が挙げられる：
ペネトラチン（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ）（配列番号４）；（Ａｒｇ）８（配列番号２６）もしくは（Ｒ）４−（Ｒ）１６からの任意のポリ−Ｒ（配列番号２７）；ＨＩＶ−Ｉ  ＴＡＴ（４７−６０）（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５）；Ｄ−ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号６）；Ｒ−ＴＡＴ  Ｇ（Ｒ）９ＰＰＱ（配列番号７）；ＳＶ４０−ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号８）；ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＩＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号９）；ＨＩＶ  ＲＥＶ（３４−５０）−（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）（配列番号１０）；ＦＨＶ（３５−４９）コート−（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）（配列番号１１）；ＢＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ  ＲＥＸ  ４−１６−（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）（配列番号１３）；ＣＣＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）（配列番号１４）；Ｐ２２  Ｎ（１４−３０）（ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）（配列番号１５）；ＬＡＭＢＤＡ  Ｎ（１−２２）（ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）（配列番号１６）；Ｐｈｉ  Ｎ（１２−２９）（ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）（配列番号１７）；酵母ＰＲＰ６（１２９−１２４）（ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）（配列番号１８）；ヒトＵ２ＡＦ（ＳＱＭＴＲＱＡＲＲＬＹＶ）（配列番号１９）；ヒトＣ−ＦＯＳ（１３９−１６４）ＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭＡＡＡＫＳＲＮＲＲＲＥＬＴＤＴ（配列番号２０）；ヒトＣ−ＪＵＮ（２５２−２７９）（ＲＩＫＡＥＲＫＲＭＲＮＲＩＡＡＳＫＳＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ）（配列番号２１）；酵母ＧＣＮ４（ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ）（配列番号２２）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）；ｐ−ｖｅｃ  ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＫＡＨＳＫ（配列番号２４）。他の膜貫通リーダー配列もまた、使用することができる。このような配列は、広く入手することが可能であり、例えば、以下に記載されている：［非特許文献９］および［非特許文献１０］。
【非特許文献８】Ｆｕｔａｋｉ，Ｓ．ら（２００１）Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，：５８３６−５８４０
【非特許文献９】Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６０４３−６０４９
【非特許文献１０】Ｅｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６９：２３７−２４４
【００２７】
好ましくは、アンテナペディアタンパク質の貫通リーダー配列の正帯電リーダー配列が使用される。このリーダー配列は、次のアミノ酸配列：ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）を有する。好ましくは、このリーダー配列は、ｐ５３ペプチドのカルボキシル末端に結合させ、合成ペプチドが、形質転換細胞および悪性細胞を殺すことができるようにする。
【００２８】
タンパク分解への感受性を減らすために、上述の対象ペプチド、すなわち配列番号１〜３（ｐ５３ペプチド）または配列番号４〜２５もしくは２６〜２７（膜貫通リーダー配列）のいずれかは、１つ以上のＤ型アミノ酸を含むことができ、および／または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくは１つ以上のレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を含むことができる。そのため、例えば、対象ペプチドの１つのみのアミノ酸または全てのアミノ酸までもがＤ型であることが可能である。好ましくは、Ｄ−アミノ酸は、対象ペプチドのＮ末端に位置する。このような位置は、ペプチドがＮ末端残基に作用するエキソペプチダーゼにさらに低感度となるようにする。なぜなら、このようなエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。Ｄ−アミノ酸はまた、膜貫通リーダー配列のＣ末端に位置することもできる。そしてその配列は、そのカルボキシ末端においてｐ５３ペプチドと融合する。このようなＤ−アミノ酸の位置は、ペプチドを安定させるのを助ける。これは、Ｃ末端残基に作用しているエキソペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸を基質として利用することができないからである。
【００２９】
あるいは、本発明の対象ペプチドは、逆配列だけでなく、Ｄ−アミノ酸全ても含んでいるレトロ−インベルソペプチド（ＲＩ）として合成することができる。この実施形態においては、ペプチドは、逆配列および全ての不斉中心における逆の立体配置の両方を含んでいる。
【００３０】
さらに別の実施形態においては、対象ペプチドは、ｐ５３の配列または膜貫通リーダー配列の一部のみが逆になっている部分修飾レトロ−インベルソペプチド（ＰＭＲＩ）として合成することができる。例えば、Ｄ型のアミノ酸の一部のみを有し、そして逆順序で組み立てられた少なくとも６つのアミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。
【００３１】
特に、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも６つの連続アミノ酸を含んでいるペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体が提供される。ここで、当該ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有する。そして少なくとも１つのアミノ酸は、Ｄ型であり、または１つ以上のペプチド結合は、イソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合で置換される。その例としては、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）、ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を含むペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体が挙げられる。
【００３２】
別の実施形態においては、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体は、ｐ５３タンパク質に見られる天然の配列と逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。このようなペプチドは、本明細書中においてレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドと呼ばれる。
【００３３】
例えば、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の逆順序で組み立てられる少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいるレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体であって、膜貫通リーダー配列に融合し、そして悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有するものが提供される。好ましい実施形態において、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）の逆順序で組み立てられた少なくとも６つの連続Ｄ−アミノ酸を含んでいる。
【００３４】
ｐ５３配列の一部のみが逆にされた部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドもまた、提供される。例えば、Ｄ型のアミノ酸の一部のみを有して、そして配列番号１に示されたアミノ酸配列の逆順序で組み立てられた少なくとも６つのアミノ酸を含んでいるペプチドが提供される。好ましい実施形態においては、少なくとも６つのＤ−アミノ酸の一部は、配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログもしくはその誘導体の逆順序で組み立てられる。
【００３５】
１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含んでいる前述のペプチドの内のいずれかにおいて、または前述のレトロ−インベルソペプチドもしくは部分修飾レトロ−インベルソペプチドのいずれかにおいて、膜貫通リーダー配列は、細胞膜を通り抜け、そして特に、悪性細胞、形質転換細胞または新生物細胞を殺すために、ペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体のカルボキシル末端の終端に位置している。しかし、ｐ５３ペプチドのＮ末端に膜貫通リーダー配列を有しているペプチドは、本明細書中で記述されたインビトロ実験のような種々の実験におけるコントロールペプチドとして有用である。さらに、膜貫通リーダー配列はまた、１つ以上のＤ−アミノ酸または１つ以上のイソスター擬似ペプチド結合もしくはインベルソ擬似ペプチド結合を含むことができる。
【００３６】
別の本発明の実施形態においては、膜貫通リーダー配列は、それ自身、レトロ−インベルソペプチド異性体、または部分修飾レトロ−インベルソペプチド異性体である。レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。部分修飾レトロ−インベルソ型の膜貫通リーダー配列は、配列番号４〜２４または配列番号２６〜２７に示される配列のいずれかと逆順序のＤ型アミノ酸残基の一部を有している。
【００３７】
ＲＩペプチドおよびＰＭＲＩペプチドの合成は、結果として２つの非アミノ酸残基を新たに形成した異性体に導入することをもたらす。その残基は、それぞれ形質転換配列のアミノ側およびカルボキシ側におけるｇｅｍ−ジアミノアルキル（ｇＸａａ）残基および２−アルキルマロニル（ｍＸａａ）残基である。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献１１］，（この全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる）。［非特許文献１２］に記載されているように、方向変換残基を含まない立体化学ペプチド異性体および方向ペプチド異性体は、合成が困難であることを示さない。このようなペプチドは、適切なＮα−および側鎖保護されたＬアミノ酸およびＤアミノ酸を使った固相ペプチド合成方法を用いて得ることができる。［非特許文献１３］を参照のこと。［非特許文献１２］Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．（２００３）および［非特許文献１３］Ｃｈａｎら（２０００）の両方は、その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。
【非特許文献１１】Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ．  ＆  Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ．（２００３）Ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ
【非特許文献１２】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．（２００３）“Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｓｏｍｅｒｓ：Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ４：３３９−３５６
【非特許文献１３】Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【００３８】
しかし、ＰＭＲＩペプチドの合成は、方向反転するｇＸａａ残基およびｍＸａａ残基の側面に位置する様々なタイプおよび数のアミノ酸残基のためにいっそう困難である。ただし、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．（２００３）は、本発明のＰＭＲＩペプチドを合成することにおいて使用するためのペプチドアセンプリだけでなく、ｇＸａａモノマーおよびｍＸａａモノマーの調製のための応用スキームも提供している。
【００３９】
構造上関係するアミノ酸配列は、本発明の実施において配列番号１、２、３、または４で示される開示された配列と置換することができる。そのアナログまたは誘導体を含めた配列番号１、２または３に示された配列のいずれかが、リーダー配列（例として、配列番号４が挙げられるが、これに限定されない。）と結合する場合、本明細書中において「合成ペプチド」と記される。これらの合成ペプチドの３次元構造を模倣する堅固な分子は、ペプチドミメティックスと呼ばれ、そして本発明の範囲の中にまた含まれている。ｐ５３ペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシル端末のいずれかもしくは両方におけるαヘリックス安定化アミノ酸残基は、それがＭＤＭ−２タンパク質に結合している場合、ｐ５３タンパク質のこの領域の構造であることが知られているαヘリックス構造を安定させるために加えることができる。αヘリックス安定化アミノ酸残基の例としては、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ（特にヘリックスのアミノ末端の上において）、Ｍｅｔ、およびＰｈｅが挙げられる。
【００４０】
本発明のペプチドのアミノ酸挿入誘導体は、単一または多数のアミノ酸配列内の挿入だけでなく、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合を含んでいる。挿入アミノ酸配列変異体は、１つ以上のアミノ酸残基が、対象ペプチド中の所定の部位に導入されるものである。しかし、ランダムな挿入もまた、得られた生成物の適切なスクリーニングで可能である。欠損変異体は、１つ以上のアミノ酸を対象ペプチドの配列から取り除くことによって作ることができる。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が取り除かれ、その場所に異なった残基が挿入されたものである。一般的な置換は、以下の表１のとおりに作られたものである。
【００４１】
【表１】
2008505846.tif 000002
【００４２】
合成ペプチドがアミノ酸置換によって誘導体化される場合、アミノ酸は、一般に、疎水性、親水性、電気陰性度、大きい側鎖などのような同様の特性を有する他のアミノ酸によって置換される。本明細書中で使われる用語「誘導体」、「類似体」、「アナログ」、「フラグメント」、「部分」および「同様の分子」は、配列番号１、２、３、または４に示したアミノ酸配列を有し、当該の誘導体、アナログ、部分、または同様の分子が、形質転換細胞または新生物細胞に浸入し、選択的に殺す能力を維持する限り、アミノ酸の置換、挿入、付加または除去を伴う対象ペプチドを意味する。
【００４３】
本発明の合成ペプチドは、多くの公知の技法により合成することができる。例えば、ペプチドは、最初にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）によって［非特許文献１４］において記述された固相技法を使って調製することができる。他のペプチド合成技法は、［非特許文献１５］および当業者が容易に入手できる他の参考文献に見出すことができる。ペプチド合成技法の概説は、［非特許文献１６］に見出すことができる。ペプチドはまた、［非特許文献１７］に記載されている溶液法によって合成することもできる。様々なペプチド合成における使用に適した保護基は、上記の文献ならびに［非特許文献１８］に記載されている。本発明のペプチドはまた、ｐ５３タンパク質のより大きい部分から、またはｐ５３タンパク質の全長から化学的切断または酵素切断によって調製することができる。同様に、本発明の合成ペプチドにおける使用のためのリーダー配列は、このようなリーダー配列がそれから得られるタンパク質の全長またはより大きい部分から化学的切断または酵素切断によって調製することができる。
【非特許文献１４】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４
【非特許文献１５】Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，第２版，（１９７６）
【非特許文献１６】Ｊ．Ｓｔｕｒａｒｔ  ＆  Ｊ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ，（１９８４）
【非特許文献１７】Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，第３版，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，編，１０５−２３７頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．（１９７６）
【非特許文献１８】Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．（１９７３）
【００４４】
さらに、本発明のペプチドはまた、組換えＤＮＡ技法によって調製することができる。タンパク質を構築するために使われる大部分のアミノ酸に関して、１以上のコード化ヌクレオチドのトリプレット（コドン）は、特定のアミノ酸残基に対しコード化することができる。遺伝情報のこの特性は、冗長性として公知である。従って、多くの様々な異なったヌクレオチド配列は、悪性哺乳動物細胞、形質転換哺乳動物細胞に選択的に致死性を有する特定の対象ペプチドに対してコード化することができる。本発明はまた、遺伝子コード化を規定するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、すなわち、そこから本発明のペプチドを酵素で、または化学的に切断することができる対象ペプチドまたはキメラペプチドを発現することができるＤＮＡ分子もまた意図されている。
【００４５】
１つ以上のＤ型アミノ酸を有している対象ペプチドは、天然Ｌアミノ酸の代わりに１つ以上のＤ−アミノ酸をペプチド鎖に組み込むことによって合成することができる。線形Ｄ型ペプチドの合成は、自動手順による合成を含めたペプチド合成の従来のプロトコルを使って調製することができる。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献１９］。
【非特許文献１９】Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ．  ＆  Ｃｈｏｒｅｖ，Ｊ．（２００３）Ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｒｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ
【００４６】
還元されたイソスター擬似ペプチド結合は、わずかな生体活性の損失で、または全く生体活性を損失しないで、タンパク分解切断に対する安定性を向上させる擬似ペプチド結合である。そのため、対象ペプチドは、１つ以上のペプチド結合がイソスター擬似ペプチド結合で置換されていることを除いて、配列番号１〜３（ｐ５３ペプチド）のいずれか、または配列番号４〜２４もしくは２６〜２７（膜貫通リーダー配列）のいずれかに示されたアミノ酸配列を有するＬアミノ酸ペプチドと同一であり得る。１つ以上の還元イソスター擬似ペプチド結合でペプチドを合成する方法は、当技術分野で周知である。以下を参照のこと：［非特許文献２０］（その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
【非特許文献２０】Ｃｏｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４
【００４７】
ペプチド結合はまた、レトロインベルソ擬似ペプチド結合で置換することができる。そのため、対象ペプチドは、１つ以上のレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合がペプチド結合と置換していることを除いて、配列番号１〜３（ｐ５３ペプチド）または配列番号４〜２４もしくは２６〜２７（膜貫通リーダー配列）のいずれかに示されるアミノ酸配列を有しているＬアミノ酸ペプチドと同一であり得る。１つ以上のレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を有するペプチドを合成するための手順は、既存の文献から得ることができる。例えば、以下を参照のこと：
［非特許文献２１］（その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
【非特許文献２１】Ｄａｌｐｏｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｉｎ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：５６１−５６６
【００４８】
対象ＲＩペプチドは、Ｄ−アミノ酸を使って、そしてレトロ−インベルソペプチドアナログにおけるアミノ酸配列が、モデルの役割をする選択されたペプチドの配列と正反対であるように、ペプチド鎖の中にアミノ酸を結合させることで、合成することができる。よって、配列番号１に示されるペプチドのレトロ−インベルソペプチドは、次の配列：ＬＬＫＷＬＤＳＦＴＥＱＳＬＰＰ（配列番号２８）で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。配列番号２に示されるペプチドのレトロ−インベルソペプチドは、次の配列：ＳＦＴＥＱＳＬＰＰ（配列番号２９）で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。配列番号３に示されるペプチドのレトロ−インベルソペプチドは、次の配列：ＬＬＫＷＬＤＳＦＴＥ（配列番号３０）で組み立てられたＤ−アミノ酸全てを含んでいる。
【００４９】
レトロ−インベルソペプチドは、Ｆｍｏｃ−２，４−ジメチルオキシ−４’＆（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン樹脂におけるＦｍｏｃ化学によって合成することができる。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献２２］（その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
【非特許文献２２】Ｂｒｉａｎｄ，Ｊ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）“Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅ：ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０，１１９２１−１１９２６
【００５０】
レトロ−インベルソのペプチドのＮＨ２−末端は、アセチル化することができる。酸切断の後に、粗ペプチドは、分取ＨＰＬＣ装置を使ったカラムクロマトグラフィーのような標準的な方法によって精製することができる。レトロ−インベルソのペプチドの純度は、分析用ＨＰＬＣまたは当技術分野で周知の他の方法により決定することができる。
【００５１】
ＲＩペプチド（およびＰＲＭＩペプチドの中のＲＩ配列）におけるＬ−ＩｌｅおよびＬ−Ｔｈｒの適切な立体異性体は、これらのアミノ酸において２つの不斉中心が存在するために、Ｄ−アロＩｌｅおよびＤ−アロＴｈｒである。
【００５２】
対象ＰＭＲＩ−ペプチドの合成に関しては、溶液ベースの方法が好ましい。溶液ベースの化学により、種々の周知の反応によってＰＭＲＩ−ペプチドの合成のために必要とされる適切に保護されたｇｅｍ−ジアミノアルキル部分および２−アルキルマロニル部分を生成することができる。次いで、生成された粗構築ブロックおよび擬似ペプチドユニットは、精製および特性評価にかけることができる。
ＨＯ−Ａｌａ−（ＲＳ）−ｍＰｈｅ−（Ｒ）−Ｌｙｓ（Ｎ２−Ｂｏｃ）−ＮＨ２またはＨＯ−ｍＧｌｙ−（Ｒ）−Ｐｈｅ−ＮＨ２のような前駆体を組み込んで樹脂上にＰＭＲＩユニットを生成させること、または前もって形成させたＰＭＲＩ単位ＰＧ−Ｘａａ１Ψ［ＮＨＣＯ］Ｘａａ２−ＯＨ（Ψ＝擬似ペプチド結合）を構築ブロックとして組み込むことのいずれかによる固相合成によってもまた、ＰＭＲＩ−ペプチドを作製することができる。しかし、遅い反応速度、副反応、および反応条件と固体支持体との間の適合性の欠如が、ＰＭＲＩ−ペプチドの固相合成を複雑にし、それが選択すべき方法とはならない。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献２３］。本明細書中で引用された全ての特許、論文および書籍の章の開示は、その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。
【非特許文献２３】Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ．  ＆  Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ．（２００３）Ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ
【００５３】
培養で増殖した細胞に適用される場合、合成ペプチドは、悪性細胞または形質転換細胞に対し選択的に致死性を有し、細胞数の用量依存減少をもたらす。この効果は、一般に２〜３時間以内、最大でも４８時間で観察することができる。培養で増殖したラット膵臓腺房細胞（ＢＭＲＰＡ７４３０）の細胞株は、Ｋ−ｒａｓで形質転換された。通常の培養細胞株は、膵臓腺房細胞に特有の構造を示す；形質転換細胞（ＴＵＣ−３）は、一般的な膵臓ガン細胞として現われて、腺房細胞の分化モルフォロジーを欠いている。ＢＭＲＰＡ．４３０細胞が、リーダー配列の配列番号４とカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドで５０μｇ／ｍｌの用量において処理された場合、その細胞は影響を受けなかった。しかし、ＴＵＣ−３細胞が、リーダー配列の配列番号４とカップリングした配列番号１の一次構造を有するペプチドで１００μｇ／ｍｌの用量において処理された場合、その細胞は、３から４日以内に死んだ。配列番号１を配列番号２または配列番号３のいずれかと置き換えた以外は同じ実験を行った場合も、同様の結果が得られた。さらに、形質転換細胞および悪性細胞の細胞死は、リーダー配列の配列番号４とカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドで１００μｇ／ｍｌの用量において処理されたヒトの乳ガン細胞株および黒色腫およびヒーラ細胞で観察された。それと対照的に、同じ用量における同じ合成ペプチドは、悪性でない、そして形質転換していないヒトの胸細胞株もしくは線維芽細胞株に対しては影響を与えなかった。
【００５４】
配列番号４に示されたリーダー配列が、ＰＮＣ２９（次のアミノ酸の配列：ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有しているコントロールタンパク質）のカルボキシ末端に位置する場合、悪性細胞または通常細胞に対する影響はなかった。
【００５５】
さらに、配列番号４に示されたリーダー配列にカルボキシ末端において融合する配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、成長因子の存在下でｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ細胞株に分化するヒト幹細胞の能力に影響を与えない。このことは、化学療法薬として投与されるとき、このペプチドが骨髄細胞に有害ではないことを示す。以下を参照のこと：［非特許文献２４］（この開示は、その全体が記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれる。）。
【非特許文献２４】Ｋａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１年１０月２３日）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（２２）；１２４３８−１２４４３
【００５６】
培養されたガン細胞が、リーダー配列と結合していない配列番号１の一次構造を有するペプチドで１００μｇ／ｍｌの用量において処理された場合、細胞は影響を受けなかった。同様に、培養されたガン細胞が、リーダー配列の配列番号４（現在のところ好ましいリーダー配列）で同じ用量において処理された場合も、細胞はまた影響されなかった。これらの結果は、合成ペプチドのリーダー配列が処理される細胞の細胞膜を合成ペプチドが通り抜けることを可能にし、そして合成ペプチドの効果は細胞内である必要があることを示す。
【００５７】
合成ペプチドが、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ−２タンパク質との結合を妨害することにより作用するかどうか決定するために、合成ペプチドを、同種接合欠失によりｐ５３タンパク質を作る能力をなくされた形質転換結腸直腸腺ガン細胞に対してテストした。驚くべきことに、合成ペプチドは、選択的に形質転換細胞を殺したが、普通の細胞に影響を有しなかった。これらの結果は、作用機構がＭＤＭ−２タンパク質に結合するｐ５３タンパク質から独立しているように考えられることを示す。これは、ｐ５３ペプチドは、ｐ５３タンパク質を全く生産しない形質転換細胞を選択的に殺すからである。これらの結果は、ＭＤＭ−２タンパク質へのｐ５３タンパク質の結合を妨害することが、合成ペプチドが悪性細胞および形質転換細胞の選択的な死を引き起こすメカニズムではないかもしれないことを示す。本明細書中で開示された合成ペプチド、それらの誘導体、アナログ、そしてペプチド模倣分子は、ガンのような新生物疾患の処置に有用であるけれども、形質転換細胞および悪性細胞に対する作用に関するメカニズムは、見いだされていない。
【００５８】
本発明のペプチドは、インビボにおける新生物細胞に対して有効である。例えば、膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡｌ．ＴＵＣ−３を異種移植され、約３〜６ミリの発達した腫瘍の大きさを有するマウスは、対象合成ペプチド（例えば、カルボキシ末端においてリーダー配列と融合した配列番号３で示したアミノ酸配列を有しているペプチド）の投与の後に腫瘍の大きさが劇的に減少した。
【００５９】
本発明のペプチドの観察された特性と一致して、対象ペプチドは、新生物細胞または悪性細胞、すなわち、動物、特にヒトにおけるガン細胞を選択的に殺す。そのため、本発明の合成ペプチドは、被検体の動物またはヒトにおける新生物細胞を殺すために有効な量で投与される。
【００６０】
本発明の合成ペプチドは、薬学上受容できる担体と共に、治療有効用量の本発明の少なくとも１つの合成ペプチドを含んでいる薬剤組成物として好ましくはヒトの患者に投与することができる。用語「治療有効量」または「薬学的有効量」は、新生物細胞または悪性細胞、すなわち、ガン細胞を選択的に殺すことを含めた増殖抑制を個体においてもたらすのに必要とされる用量を意味する。
【００６１】
好ましくは、１つ以上の本発明のペプチドを含有する組成物は、選択的に新生物性細胞を殺し、それにより、ガンのような新生物疾患または悪性疾患を処置
する目的のために、静脈内に投与される。１つ以上の本発明のペプチドを使って効果的に処置することができる種々のガンの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頸管ガン、大腸ガン、黒色腫、膵臓ガンおよび全ての固体の組織腫瘍（上皮細胞腫瘍）、ならびに血液のガン（リンパ腫および白血病が例とされるがそれらに限定されない）。
【００６２】
本発明の合成ペプチドの投与は、経口、静脈内、鼻腔内、坐薬、筋肉内、腹腔内、皮内投与もしくは皮下投与、または注入もしくは移植によって可能である。このような方法で投与される場合、本発明の合成ペプチドは、担体および／またはアジュバントのような他の成分と組み合わせることができる。それらが薬学上受容できて、それらの意図される投与のために有効である必要があり、組成物の活性成分の活性を劣化する可能性がなく、そして細胞の中に対象ペプチドを導入することを妨げる可能性がないことを除いて、他の成分の性質については制限がない。このペプチド組成物はまた、経皮パッチの中に浸み込ませるか、または好ましくは液体状または半液体状の皮下挿入物に含ませることができ、そのパッチまたは挿入物は、治療有効量の１つ以上の対象合成ペプチドを時限放出する。
【００６３】
注射に適した製薬の形態としては、無菌注射用の溶液または分散液を即座に調製するための無菌水溶液もしくは無菌分散液および無菌粉末が挙げられる。いかなる場合であっても、最終的な溶液形態は、無菌で、そして流動性である必要がある。一般的な担体としては、例えば、以下のものを含有する溶媒もしくは分散媒が挙げられる：水緩衝水溶液、すなわち、生体適合性緩衝液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、界面活性剤または植物油。殺菌法は、当技術分野で認められる任意の技法を利用して達成することができ、例としては、濾過または抗菌剤もしくは抗カビ剤の添加が挙げられるが、それらに限定されない。このような添加剤の例としては、パラベン、クロロブタノール（ｃｈｌｏｒｂｕｔａｎｏｌ）、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールが挙げられる。糖類または塩化ナトリウムのような等張剤もまた、対象組成物に組み入れることができる。
【００６４】
本明細書中で使われる「薬学上受容できる担体」としては、任意の、および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤薬および抗カビ剤、等張剤などが挙げられる。このような媒体および添加剤の使用は、当技術分野で周知である。
【００６５】
対象合成ペプチドを含んでいる無菌注射用溶液の作製は、必要とされる量の１つ以上の上記の主題合成ペプチドを、１つ以上の上記に列挙された種々の成分と共に適切な溶媒に溶かし込み、必要に応じて殺菌、好ましくは濾過殺菌を続けることにより達成される。無菌粉末を得るためには、必要に応じて上記の溶液を真空乾燥または凍結乾燥する。
【００６６】
不活性希釈剤および／または吸収可能な食用担体などは、ペプチドが経口投与される場合、薬剤組成物の一部であり得る。薬剤組成物は、硬いまたは柔らかい殻ゼラチンカプセルの中にあってもよく、錠剤に圧縮することができ、またはエリキシル剤、懸濁液、シロップなどの形であってもよい。
【００６７】
そのため、対象合成ペプチドは、便利および効果的に薬学的有効量で投与するために、治療有効用量の適切な薬学上受容できる担体と混合される。薬学的有効量の例としては、少なくとも約２５ｕｇ／ｍｌから少なくとも約３００ｕｇ／ｍｌの範囲にあるペプチド濃度が挙げられる。
【００６８】
ヒトに適用される本発明の方法で使われる合成ペプチドの正確な治療有効量は、新生物疾患の段階の変化、腫瘍の大きさおよび悪性度、転移の存在または程度などのために一概に述べることができない。さらに、個人の体重、性別および全体的な健康状態は、考慮されなくてはならず、用量に影響するであろう。しかし、本発明の合成ペプチドを、１服用あたり少なくとも約１０ｍｇ、より好ましくは１服用あたり１０００ｍｇまでの量で投与することが、一般に言える。本発明のペプチド組成物は、最終的に血流から除去されるから、薬剤組成物の再投与が指示され、そしてそれが好ましい。
【００６９】
本発明の合成ペプチドは、服用調剤と適合性のある手法で、治療に有効である量で投与することができる。全身への用量は、患者の年齢、体重および体調、ならびに投与経路に依存する。成人への投与のための例示的な適切用量は、体重１キログラムあたり約０．１〜約２０ｍｇの範囲である。好ましくは、その用量は、体重１キログラムあたり約０．１〜約１０ｍｇである。
【００７０】
本発明に従って、新生物疾患を処置する方法もまた提供される。その方法は、治療有効量の上述の合成ペプチド（そのアナログと誘導体を含む。）を、このような処置を必要としている被検体に投与することを含む。そのため、例えば、１つの実施形態において、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号１で示した少なくとも約６つの連続アミノ酸を含む有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体は、被検体に投与することができる。別の実施形態においては、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号１に示した少なくとも約８個から少なくとも約１０個の連続アミノ酸を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することができる。例えば、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号１に示したアミノ酸配列を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することができる。そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号２に示したアミノ酸配列を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体もまた、被検体に投与することができる。さらに別の実施形態においては、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合した、配列番号３に示したアミノ酸配列を含んでいる有効量のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体を、被検体に投与することができる。１つ以上のＤ−アミノ酸またはイソスター擬似ペプチド結合もしくはレトロ−インベルソ擬似ペプチド結合を含んでいる対象ペプチドのいずれか、またはカルボキシル末端において膜貫通リーダー配列と融合している前述のＲＩペプチドまたはＰＭＲＩペプチドのいずれかもまた、被検体における悪性細胞または新生物細胞を殺す方法において使用することができる。
【００７１】
処置方法に従って、合成ペプチドの混合物を投与することができる。そのため、例えば、有効量の上述のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体の内の１つを投与することに加えて、２つ以上の上述のペプチドまたはそのアナログもしくはその誘導体の混合物を被検体に投与することもまたできる。
【００７２】
本発明により、インビトロでの悪性細胞、形質転換細胞、または新生物細胞を選択的に殺すことにおけるペプチドの有効性レベルを評価する方法もまた提供される。その方法は、悪性細胞、形質転換細胞、または新生物細胞を上述のペプチドのいずれかと接触させる工程、生きている細胞と比べた死んだ細胞の割合またはパーセンテージに基づいて有効性レベルを評価する工程、およびそして培養中の形質転換していない（通常）細胞の増殖に対するペプチドの効果を評価する工程を含んでいる。従って、インビトロにおける悪性細胞、形質転換細胞、または新生物細胞を殺すが、培養中の形質転換していない細胞または通常細胞に対しては悪影響を与えないようなペプチドは、新生物疾患で苦しんでいる患者を処置するのに使用するための価値ある候補であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
以下の実施例は、本発明をさらに例証するものであり、その範囲を限定することは意図していない。
【実施例１】
【００７４】
アミノ末端に結合しているリーダー配列を有する対象ペプチドの有効性を比較するために、以下の実験を行った。上述のように、カルボキシル末端上におけるリーダー配列で合成されたペプチドは、ＭＤＭ−２に結合されている場合に、このペプチドのｐ５３部分の活性構造であるペプチド中のα−ヘリックス形成を促進した。上述されるように、配列番号１、２、および３に示されたアミノ酸配列を有する対象ペプチドは、同型接合でｐ５３遺伝子−欠損されたものを含めて、多種多様なヒトのガン細胞に、強く毒性を有する。配列番号１〜３に示された配列を有している各ペプチドに対するα−ヘリックス確率分析を、２つの異なる方法を使って行った。一つは、タンパク質データベース［非特許文献２５］からヘリックス確率を使ったものである。そしてもう一つは、ヘリックスの核生成（σ）および成長（ｓ）に基づいたイジングモデルを使ったものである。それは、２０個の天然Ｌアミノ酸の各々に対するブロックコポリマーから実験的に決定された平衡定数であり、［非特許文献２６］および［非特許文献２７］に記述されるこれらのパラメータに対する帯電の効果を包含することにより修正されている。確率分析は、リーダー配列がアミノ末端上にある場合、ペプチドが細胞膜を通り抜けたとしても、α−へリックス構造の含有量は、ずっと低いことを示した。
【非特許文献２５】Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：８４６−８５６
【非特許文献２６】Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２６：３５１−３７２）
【非特許文献２７】Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２６：３７３−３９３）
【００７５】
配列番号３で示した配列を有しているペプチドを、アミノ末端と結合しているリーダー配列により固相合成によって合成した。このペプチドは、下の表２でＰＮＣ２８’と記される。ＰＮＣ２８’ペプチドを、３つの異なった濃度、すなわち、２５、５０および１００μｇ／ｍｌにおいて形質転換した膵臓がん（ＴＵＣ−３）細胞と共にインキュベートした。２週間のインキュベーションの後に、ペプチドの最も高い用量において、細胞死が起こらず、そして細胞の約半分が腺房を形成するのが見られ、そして形質転換していないモルフォロジー表現型を示した。同じ現象は、５０μｇ／ｍｌにおいても観察され、そして２５μｇ／ｍｌにおいては非常に少しの細胞が元の状態に戻ることが見られた。それとは対照的に、リーダー配列がペプチドのカルボキシル末端に結合している場合（表２でのＰＮＣ２８）、５０および１００μｇ／ｍｌの用量において１００％の細胞死が約４日以内に起こった。
【００７６】
これらの結果は、リーダー配列を優先的にｐ５３ペプチドのＭＤＭ−２部分のカルボキシル末端に加えれば、ペプチドが細胞膜を通り抜け、特に悪性細胞を殺すことができることを示す。表２において、リーダー配列は、ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）である。
【００７７】
【表２】
2008505846.tif 000003
【００７８】
これらの結果は、対象ペプチドの特異性を示す。すなわち、正帯電残基のリーダーまたはクラスターは、ガン細胞毒性のためには、任意のエフェクターペプチドのカルボキシ末端に置かれなければならない。
【実施例２】
【００７９】
２０〜２２ｇの重さのＮｕ／Ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナポリス、インディアナ州、ｎ＝１０）に、生の膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／マウス）を左の後ろ足部分の皮下（ｓ．ｃ．）に異種移植した。腫瘍が発達して増大することを可能にし、そして毎日の試験の間に、全てのマウスが非常に類似の成長速度で腫瘍を発達させたことを観察した。
【００８０】
１２日後、腫瘍は、直径３〜６ｍｍの大きさに達していた。そしてマウスをそれぞれ５匹の２つのグループに分けた。各グループは、Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプの皮下移植を行い、２０ｍｇ／マウスの濃度で各ペプチドを含んでいる全体容量０．０９５ｍｌの通常生理食塩溶液を一定の割合で１４日の規定期間にわたって送達した。マウスの１つのグループには、そのカルボキシ末端においてペネトラチンリーダー配列（配列番号４）と融合しているＰＮＣ−２８（配列番号３に示されるアミノ酸を有しているペプチド）を与えた。そしてもう一つのグループには、次のアミノ酸の配列：ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有する同様の大きさのコントロールペプチドを与えた。ポンプを、製造業者のガイドラインに従い、そして無菌条件下で充填した。マウスの皮下に微小ポンプを差し込むポケットを作ることによって、麻酔されたネズミの左側面にポンプを皮下移植した。各ポケットを簡単な縫合で閉じた。それらの内部チャンバーから、ポンプはそれぞれのマウスの中に連続的に０．２５μｌ／時間の量を送達した。マウスが動物施設の隔離区域に返されたときに、外科手術から回復するまでマウスを観察した。その動物はＮｕ／Ｎｕマウスであり、そのため免疫性欠陥であったから、病原体に曝された場合、それらは大いに感染しやすい。従って、外科手術および全ての術前および術後の処置は、無菌のボンネット環境で行った。
【００８１】
図１に明らかに示されるように、４８〜７２時間の期間以内のマウスへの送達で、ＰＮＣ−２８は、効果的に腫瘍成長を抑制する。それと対照的に、コントロールペプチドＰＮＣ−２９は、通常細胞または腫瘍細胞に影響を与えなかった。ＰＮＣ−２９によって処理されたマウスにおいては、腫瘍は一定の割合で増大し続け、結果として、２週間の処置の期間およびポンプがそれ以上のペプチド溶液を放出することを停止したそれ以後の期間に、直径１０〜１６ｍｍの腫瘍をもたらした。マウスの両方のグループにおける腫瘍の大きさの測定結果の統計上分析により、ｐ＜０．００１というそれらの間の有意性を得た。
【実施例３】
【００８２】
実施例２と同じ方法を使って、生きている膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／ネズミ）をマウス（ｎ＝１０）の中に移植するのと同時に、ポンプを始動させた。５匹のマウスにＰＮＣ２８を投与し、そして５匹のネズミは、まったく処置しなかった（擬似処置）。結果を以下の表にした。
【００８３】
【表３】
2008505846.tif 000004
【実施例４】
【００８４】
実施例２と同じ方法を使って、生きている膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／ネズミ）を５匹のマウスの腹腔に移植した。腫瘍細胞移植と同時に、ポンプを右の肩部分に配置した。５匹全てのマウスにおいて、３週間後に目に見える腫瘍はなかった。
【実施例５】
【００８５】
配列番号２または３に示したアミノ酸配列を有しているペプチドを、カルボキシ末端と結合している膜貫通リーダー配列との固相合成によって、１つ以上のＤ型アミノ酸で合成した。固相ペプチド合成法は、Ｃ末端アミドを有するペプチドを生じさせるジシクロヘキシルカルボジミドによる活性化により、それぞれの保護されたアミノ酸残基を、樹脂支持体、好ましくは４−メチル−ベンズヒドリルアミン樹脂にカップリングさせることを伴う。側鎖官能基を、以下のようにして保護した：セリン、トレオニン、グルタミン酸およびアスパラギン酸に対してベンジル；ヒスチジンおよびアルギニンに対してトシル；リシンに対して２−クロロベンジルオキシカルボニル、ならびにチロシンに対して２，６−ジクロロベンジル。カップリングの後に、加えられたアミノ酸のαアミノ基におけるｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を、トリフルオロ酢酸による処理によって除去し、続いてジイソプロピルエチルアミンで中和する。次いで、次の保護された残基を、ペプチド鎖を増殖させて、遊離アミノ基にカップリングさせる。最後の残基を結合させた後、保護されたペプチド樹脂をフッ化水素で処理し、樹脂からペプチドを切断し、そして側鎖官能基を脱保護する。粗生成物は、逆相ＨＰＬＣによってさらに精製することができる。ペプチドを、３つの異なった濃度、すなわち２５、５０、および１００μｌ／ｍｌにおいて膵臓ガン細胞（ＴＵＣ３）のような悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞とインキュベーションして、これらの濃度においてこのような細胞を殺すことの有効性レベルを評価することができる。
【実施例６】
【００８６】
配列番号２または配列番号３に示されたアミノ酸配列の逆順序で組み立てられたＤ−アミノ酸を全て有しているレトロ−インベルソ（ＲＩ）ペプチドを、Ｄ−アミノ酸を使って合成する。レトロ−インベルソ型は、ＡＢＩ  ４３３Ａペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア、米国）を使った標準的なＦｍｏｃ化学によって合成する。以下を参照のこと：［非特許文献２８］。粗生成物を、Ｃ１８分取カラム（Ｖａｒｉａｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア、米国）による逆相ＨＰＬＣによってさらに精製する。ペプチドの識別を質量分析により確認する。ペプチドをそのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合させ、そして３つの異なった濃度、すなわち２５、５０、および１００μｌ／ｍｌにおいて膵臓ガン細胞（ＴＵＣ３）のような悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞とインキュベーションして、これらの濃度においてこのような細胞を殺すことの有効性レベルを評価することができる。
【非特許文献２８】Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３９：３２３−３３１
【実施例７】
【００８７】
アミノ酸の全てがＤ型ではない部分および配列番号２または３に示された配列の逆順序ではない部分を有する部分修飾レトロ−インベルソ（ＰＭＲＩ）ペプチドを、ＰＭＲＩ−ペプチドの合成のために必要とされる、適切に保護されたｇｅｍ−ジアミノアルキル部分および２−アルキルマロニル部分を生成するための溶液ベースの化学を使って合成する。例えば、以下を参照のこと：［非特許文献２９］。アシルアジドおよびアシルアミドのクルチウス転位およびホフマン転位をＰＭＲＩ−ペプチドの合成のために利用する。転位基は、転移の間その構造を維持し、トポグラフィー的に補足的なｇｅｍ−ジアミノアルキル誘導体に光学的に純粋なアミノ酸を変換するための手段を与える。イソシアネート中間体を、過剰のカルボン酸によるＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｉｃｋ型反応においてトラップし、Ｎ，Ｎ’−ジアシル化ｇｅｍ−ジアミノアルキル残基との付加体を得る。イソシアネートをＮ−保護アミノ酸でトラップすることにより、レトロ−インベルソ擬似ペプチドユニットを得る。生成した粗構築ブロックおよび擬似ペプチドユニットを精製および特性評価にかける。ペプチドを、そのカルボキシ末端において膜貫通リーダー配列と融合させ、そして３つの異なった濃度、すなわち２５、５０、および１００μｌ／ｍｌにおいて膵臓ガン細胞（ＴＵＣ３）のような悪性細胞、形質転換細胞もしくは新生物細胞とインキュベーションし、これらの濃度においてこのような細胞を殺すことの有効性レベルを評価することができる。
【非特許文献２９】Ｓｃｈｅｉｂｌｅｒ，Ｌ．およびＣｈｏｒｅｖ，Ｍ（２００３）Ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｖｏｌ．２２Ｃ）（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，編），５２８−５５１頁，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ
【００８８】
前述の明細書およびその中で報告された実験結果は、例示的なものであり、本出願人の発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本出願人の発明から外れないで、種々の改変ができることは認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】膵臓ガン細胞を異種移植された同種接合ＮＵ／ＮＵマウスにおけるＰＮＣ−２８（そのカルボキシ末端において配列番号４に融合された配列番号３）のインビボ腫瘍抑制効果を図式的に示す。星印の付いた矢印は、腫瘍増殖期間の１３日目（正確には１３．５日）における皮下ポンプ移植の時点を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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