(57)【要約】  Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに関する核酸に基づく分析における、標的領域としてのＨＷＰ１遺伝子配列若しくはその断片又は変異体、及び試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを同定するためのプローブとして有用な単離核酸分子。試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＨＷＰ１遺伝子発現の定量の方法もまた記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに関する核酸に基づく分析における、標的領域としてのＨＷＰ１遺伝子配列若しくはその断片又は変異体。
【請求項２】
核酸配列番号２又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマー。
【請求項３】
核酸配列番号３又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマー。
【請求項４】
核酸配列番号４又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプローブ。
【請求項５】
核酸配列番号１２又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマー。
【請求項６】
核酸配列番号１３又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマー。
【請求項７】
核酸配列番号１４又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプローブ。
【請求項８】
核酸配列番号１５又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプローブ。
【請求項９】
核酸配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、プライマー／プローブの組み合わせ。
【請求項１０】
配列番号１〜４及び配列番号１２〜１５、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体のいずれか１以上から選択される核酸配列を含む核酸。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号１〜４及び１２〜１５のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｉｉ）（ｉ）に相補的なヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在を決定するのに十分な長さのヌクレオチド配列（ｉ）の部分；及び
（ｉｖ）（ｉｉｉ）に相補的なヌクレオチド配列
のいずれか１以上から選択される、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを同定するためのプローブとして有用な、単離核酸分子。
【請求項１２】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出方法であって；
試料を単離し；
試料からＤＮＡを抽出するか又は放出させ；
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅技術を用いて、標的配列を増幅し；そして
増幅された標的核酸に対する、核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、他のハイブリッド分子又は抗体を用いて、増幅された標的を検出して、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＨＷＰ１遺伝子発現の定量方法であって；
試料を単離し；
試料からＲＮＡを抽出するか又は放出させ；
逆転写を行って、ｃＤＮＡを産生し；
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅技術を用いて、標的配列を増幅し；そして
増幅された標的核酸に対する、核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、他のハイブリッド分子又は抗体を用いて、増幅された標的を検出して、試料中のＨＷＰ１遺伝子発現を定量する
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出方法であって、試料を単離し、核酸を抽出し、そして増幅された標的核酸に対する、特異的核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、他のハイブリッド分子又は抗体を用いて、核酸を直接検出する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
標的配列が、ＨＷＰ１遺伝子配列若しくはその誘導体又は変異体又は突然変異体である、請求項１２〜１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
標的配列が、核酸配列番号１若しくはその誘導体又は変異体又は突然変異体を含む、請求項１２〜１４のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
標的配列が、核酸配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５又はその逆相補体、若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体のいずれか１以上から選択されるプライマー又はプローブを用いて検出される、請求項１２〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
標的配列が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて検出される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
抗真菌剤、抗真菌剤の組み合わせ、免疫調節薬剤、免疫調節薬剤の組み合わせ、抗真菌薬剤及び／又は免疫調節薬剤の組み合わせの効能を測定する方法であって；
治療の投与前に、臨床試料中の、ＨＷＰ１遺伝子の発現、発現のｍＲＮＡ産物、若しくは発現産物又はその誘導体もしくは突然変異体もしくは変異体へのハイブリダイゼーションから得られるシグナルを定量し、
抗真菌剤、抗真菌剤の組み合わせ、免疫調節薬剤、免疫調節薬剤の組み合わせ、又は抗真菌薬剤及び免疫調節薬剤の組み合わせを投与し；そして
治療後の臨床試料中の、ＨＷＰ１遺伝子の発現、発現のｍＲＮＡ産物、又は発現産物へのハイブリダイゼーションから得られるシグナルを定量する
工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
臨床試料中のＨＷＰ１遺伝子の発現レベルを、ある期間監視する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
臨床試料が、血液、痰、尿、ＢＡＬ、唾液、糞便試料、膣及び口腔スワブ、歯周組織、又は骨、環境試料、製造工程試料、及び発売予定の無菌注射製剤のいずれか１以上から選択される、請求項１９又は２０記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌感染の治療及び／又は予防のための抗真菌化合物をスクリーニングする方法であって、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を用いて、該抗真菌化合物での処理前及び処理後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌感染の治療及び／又は予防のための抗真菌化合物の組み合わせをスクリーニングする方法であって、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を用いて、該抗真菌化合物での処理前及び処理後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌感染の治療及び／又は予防のための免疫調節剤化合物をスクリーニングする方法であって、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を用いて、該免疫調節剤化合物での処理前及び処理後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌感染の治療及び／又は予防のための抗真菌化合物及び免疫調節剤化合物の組み合わせをスクリーニングする方法であって、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を用いて、抗真菌化合物及び免疫調節剤化合物の該組み合わせでの処理前及び処理後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２６】
試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在を検出するための、ＨＷＰ１遺伝子配列を含む、診断キット。
【請求項２７】
ＨＷＰ１遺伝子配列が、配列番号１若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を含む、請求項２６記載の診断キット。
【請求項２８】
試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在を検出するための、配列番号２〜４又は１２〜１５のいずれか１以上から選択される核酸配列を含む、診断キット。
【請求項２９】
試料が、臨床、獣医学的、環境、産業、製造工程及び食品の試料のいずれか１以上から選択される、請求項２６〜２８のいずれか記載のキット。
【請求項３０】
試料が、血液、痰、尿、ＢＡＬ、唾液、糞便試料、膣及び口腔スワブ、歯周組織、又は骨、環境試料、製造工程試料、発売予定の無菌注射製剤のいずれか１以上から選択される、請求項２６〜２８のいずれか記載のキット。
【請求項３１】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出における、配列番号１〜４及び１２〜１５、若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体のいずれか１以上から選択される核酸配列の使用。
【請求項３２】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出において使用するための、ＨＷＰ１遺伝子、ＨＷＰ１  ＲＮＡ、若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体の使用。
【請求項３３】
ＨＷＰ１遺伝子が、順方向ＤＮＡ鎖及びそれに相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出における、請求項２〜９のいずれか記載の、プローブ及び／又はプライマー若しくはプローブ／プライマーの組み合わせ、若しくはその逆相補体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの検出に有用な、新規の核酸に基づく遺伝子標的配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌感染は、抗真菌薬剤の使用の拡大及び耐性株の出現のため、近年、どんどん蔓延している。これらの感染は、免疫低下宿主及び免疫適格宿主における発病及び死亡の重要な原因である。最もよく知られるＣａｎｄｉｄａ属種であるＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓは、真菌疾患と関連する最も一般的な生物である。米国院内感染監視システムの最近のデータでは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、血流感染の４番目に一般的な原因にランクされている。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、表在疾患及び全身疾患の原因となり、そして抗真菌治療を用いた場合であっても、侵襲性カンジダ症患者の死亡率は、最大４０％になりうる（１）。感染に最も感受性である患者としては、癌患者、臓器移植レシピエント及びＨＩＶ陽性個体を含む免疫低下患者があげられる。
【０００３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの診断のための標準的な方法としては、培養及び組織病理診断があげられるが、当該方法の感度及び特異性は限定される。多くの場合、陽性結果が得られるまでに疾患はずいぶん進行している。形態学的及び代謝的特性の慣用法を用いた、臨床試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの同定には、単離後、検出のために、１日〜数日を要する。この緩慢な検出時間を克服するため、抗体検出（２）、細胞壁マンナン（３）及びＰＣＲに基づく方法と組み合わせた特異的抗体（４）を含むいくつかの方法が開発された。最近、様々なＰＣＲ分析が開発されてプローブ・ハイブリダイゼーション技術と組み合わされてきている（５、６）。当該分析は、慣用的な方法に勝る、いくつかの利点を提供するが、なおも、インキュベーション時間が長く、洗浄工程が煩雑であるため、臨床状況における使用を制限するといった、いくつかの問題が存在する。標的として１８ＳｒＤＮＡ遺伝子又は内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ２）を用いる、リアルタイムＰＣＲ分析が開発されている（７、８、９、１０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
真菌感染の早期検出のためのいかなる迅速な診断試験も重要な治療的可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の説明
本発明では、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに関する核酸に基づく分析における、標的領域としてのＨＷＰ１遺伝子配列又はその断片を提供する。本発明の１の態様では、ＨＷＰ１遺伝子配列は、配列番号１若しくはその断片又は変異体の核酸配列を含む。
【０００６】
本発明はまた、核酸配列番号２又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマーも提供する。
本発明はまた、核酸配列番号３又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマーも提供する。
本発明はさらに、核酸配列番号４又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプローブを提供する。
本発明はまた、核酸配列番号１２又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマーも提供する。
本発明はまた、核酸配列番号１３又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプライマーも提供する。
本発明はさらに、核酸配列番号１４又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプローブを提供する。
本発明はさらに、核酸配列番号１５又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、ＨＷＰ１遺伝子由来のプローブを提供する。
本発明はまた、核酸配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５又はその逆相補体、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体を含む、プライマー／プローブの組み合わせも提供する。
【０００７】
本発明はまた、配列番号１〜４及び配列番号１２〜１５、若しくはその誘導体、変異体又は突然変異体のいずれか１以上から選択される核酸配列を含む核酸も提供する。
本発明の１つの側面は、
（ｉ）配列番号１〜４及び１２〜１５のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）（ｉ）に相補的なヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在を決定するのに十分な長さのヌクレオチド配列（ｉ）の部分；及び
（ｉｖ）（ｉｉｉ）に相補的なヌクレオチド配列
のいずれか１以上から選択される、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを同定するプローブとして有用な、単離核酸分子を提供する。
【０００８】
本発明の他の側面は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出方法であって；
試料を単離し；
試料からＤＮＡを抽出するか又は放出させ；
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅技術を用いて、標的配列を増幅し；そして
増幅された標的核酸に対する、核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、他のハイブリッド分子又は抗体を用いて、増幅された標的を検出して、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでのＨＷＰ１遺伝子発現の定量方法であって；
試料を単離し；
試料からＲＮＡを抽出するか又は放出させ；
逆転写を行って、ｃＤＮＡを産生し；
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅技術を用いて、標的配列を増幅し；そして
増幅された標的核酸に対する、核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、他のハイブリッド分子又は抗体を用いて、増幅された標的を検出して、試料中のＨＷＰ１遺伝子発現を定量する
工程を含む、前記方法も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出方法であって、試料を単離し、核酸を抽出するか又は放出させ、そして増幅された標的核酸に対する、特異的核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、他のハイブリッド分子又は抗体を用いて、核酸を直接検出する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１１】
本発明の１の態様では、標的配列は、ＨＷＰ１遺伝子配列若しくはその誘導体又は変異体又は突然変異体である。好ましくは、標的配列は、核酸配列番号１若しくはその誘導体又は変異体又は突然変異体を含む。
【００１２】
本発明の１の態様では、標的配列は、核酸配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５又はその逆相補体、若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体のいずれか１以上から選択されるプライマー又はプローブを用いて検出される。
【００１３】
好ましくは、標的配列は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて検出される。
本発明はまた、抗真菌剤の効能を測定する方法であって；
治療の投与前に、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体又は突然変異体又は変異体の発現を定量し、
抗真菌剤を投与し；そして
抗真菌治療後の、ＨＷＰ１遺伝子の発現を定量する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様では、ＨＷＰ１遺伝子の発現を、抗真菌治療の組み合わせ投与後に監視する。
本発明のさらなる態様では、ＨＷＰ１遺伝子の発現を免疫調節薬剤の投与後に監視する。
本発明のさらなる態様では、ＨＷＰ１遺伝子の発現を免疫刺激薬剤の投与後に監視する。
本発明のさらなる態様では、ＨＷＰ１遺伝子の発現を、抗真菌治療と共に、免疫調節薬剤又は免疫刺激薬剤の組み合わせ投与後に監視する。
【００１５】
本発明の１の態様では、ＨＷＰ１遺伝子の発現レベルをある期間監視する。
本発明の１の態様では、臨床試料は、血液、痰、尿、ＢＡＬ、唾液、糞便試料、膣及び口腔スワブ、歯周組織、又は骨、環境試料、製造工程試料、発売予定の無菌注射製剤（例えば医薬品産業又はバイオテクノロジー産業で製品発売されている注射可能薬剤）のいずれか１以上から選択される。
【００１６】
本発明はさらに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌感染の治療及び／又は予防のための抗真菌化合物をスクリーニングする方法であって、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を用いて、当該抗真菌化合物での処理前及び処理後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を検出する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌感染の治療及び／又は予防に関して、免疫調節薬剤又は免疫刺激薬剤と組み合わせて、抗真菌化合物をスクリーニングする方法であって、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を用いて、該抗真菌化合物及び免疫調節剤化合物での処理前及び処理後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を検出する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ真菌感染の治療及び／又は予防のための抗真菌化合物の組み合わせをスクリーニングする方法であって、ＨＷＰ１遺伝子若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を用いて、抗真菌化合物の当該組み合わせでの処理前及び処理後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在又は非存在を検出する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在を検出するための、ＨＷＰ１遺伝子配列を含む、診断キットも提供する。１の態様では、ＨＷＰ１遺伝子配列は、配列番号１若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体を含む。
【００２０】
本発明の他の態様では、診断キットは、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在を検出するための、配列番号２〜４及び１２〜１５のいずれか１以上から選択される核酸配列を含む。
【００２１】
好ましくは、試料は、臨床、獣医学的、環境、産業、製造工程又は食品試料のいずれか１以上から選択される。試料は、血液、痰、尿、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、唾液、糞便試料、膣及び口腔スワブ、又は骨、若しくは環境又は産業又は製造工程・スワブ試料の形態であってもよい。
【００２２】
本発明はまた、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出における、配列番号１〜４及び１２〜１５、若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体のいずれか１以上から選択される核酸配列の使用も提供する。
【００２３】
本発明はまた、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出で使用する、ＨＷＰ１遺伝子、ＨＷＰ１ ＲＮＡ、若しくはその誘導体、突然変異体又は変異体の使用も提供する。好ましくは、ＨＷＰ１遺伝子は、順方向ＤＮＡ鎖及びそれに相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
本発明はさらに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出における、本明細書で上記したような、プローブ及び／又はプライマー若しくはプローブ／プライマーの組み合わせ、若しくはその逆相補体の使用を提供する。
【００２５】
本発明は、添付の図を参照し、以下の説明から、より明らかに理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明者らは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの迅速な分子診断試験の開発に適する遺伝子標的（ＨＷＰ１）配列を同定した。
【００２７】
ＨＷＰ１（菌糸壁タンパク質１）遺伝子は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓで、発生的に発現される遺伝子として、Ｓｔａａｂ及びＳｕｎｄｓｔｒｏｍ（１１）により最初に報告された。彼らは、その後、当該遺伝子が、細胞表面に暴露されたＮＨ２末端ドメイン及び細胞壁Ｂ−グルカン内への共融合するＣＯＯＨ末端特性を備えた、外部マンノプロテインＨｗｐ１をコードすると報告した。１９９８年、同じ著者ら（１２）が、さらに、Ｈｗｐ１タンパク質の機能をさらに報告した（１３）。この遺伝子はその後、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの形態学的発生において、ＥＦＧ１、ＴＵＰ１及びＲＢＦ１制御因子下流で機能するものとして同定された（１４）。
【００２８】
本発明者らは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに特異的なＨＷＰ１遺伝子配列を同定した。したがって、この遺伝子は、真菌病原体Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを検出するための、核酸に基づく診断試験の開発に有用な診断標的であろう。この標的配列の重要な利点は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する特異性である。５０％を超える真菌感染が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに起因する（１４）ため、これは重要である。
【００２９】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増幅、同定、及び検出のため、該生物のＨＷＰ１遺伝子から、新規オリゴヌクレオチド・プライマー及びプローブを設計した。
当該標的は、この重要な臨床病原体に関する新規遺伝子標的配列を提供する。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ特異的遺伝子標的が同定されると、より革新的な分析の開発が見込まれる。
【００３０】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ上のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲ分析の開発のため、ＨＷＰ１遺伝子（配列番号１）を標的として用いた。該分析は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに１００％特異的であり、いかなる他の非Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ属種又は他の一般的に存在する臨床病原体とも全く交差反応しないことが見出された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）等の増幅技術を使用する系は、増幅工程を使用しない方法よりも明らかに感度が高い。本明細書に記載する本発明の実施例はＰＣＲ工程を使用し、ＰＣＲプライマーを用いた後、ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出する。核酸に基づく技術は２つの分類に属する。最初の分類は、分子法を用いて試料又は継代培養された微生物分離株で標的配列を直接検出する。第二の分類は、検出前に標的配列を増幅する核酸増幅技術を伴う。どちらの方法を使用するかは、労働コスト、迅速な結果の必要性及び終点適用を含む、いくつかの要因に依存する。実施例は後者の戦略を用いるが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに関する診断分析の開発では、本発明の核酸標的配列はどちらのカテゴリーでも好適に用いることができ、核酸に基づく全ての技術は、本発明の範囲内に含まれることが理解されるであろう。
【００３１】
得られた配列情報から、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＨＷＰ１標的配列の増幅のためのＰＣＲプライマーを設計した。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の工程で、ＬＣ６４０で標識されたプライマー及びフルオレセインで標識されたプローブの組み合わせを用いて、増幅された標的の検出を達成した。
【００３２】
地理的に区別できる一群のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ参照株及び臨床分離株と他のＣａｎｄｉｄａ属及び非Ｃａｎｄｉｄａ属真菌種から抽出したＤＮＡを用いて、プライマー及びプローブの組み合わせの特異性を検証した。一群の細菌種及びヒトＤＮＡから抽出したＤＮＡに対して、特異性をさらに照合した。分析は、試験したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ分離株のＨＷＰ１遺伝子配列に特異的であることが示された（図３及び４）。分析の検出限界を確立し（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標準株由来の連続希釈ＤＮＡを用いた）たところ、当該分析は、１〜１０コピーの間の遺伝子を確実に検出できる（図５）。したがって、ＨＷＰ１遺伝子は、特異的な標的配列であるだけでなく、低コピー数での検出に適した高感度標的に相当する。
【００３３】
今日、臨床医が直面する大きな問題は、現在利用可能な微生物診断法が、臨床的に有用な情報を提供するにはあまりにも緩慢であることである。この情報は、第一に、適切な治療を投与するのに必要であり、そして第二に、投与した薬剤の効能を監視するのに必要である。分子診断法で得られている進歩は、医学の実施に大変革を起こすのに十分迅速に利用できる結果を保証する。新規診断アプローチは、患者の管理をより確実にし、健康管理上のコストを減少させて抗生物質耐性の蔓延に影響を及ぼすはずである。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲ等の迅速な診断試験を用いて、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓが早期に検出されれば、予防的抗真菌剤の必要性が低下し、タイムリーな診断及び適切な感染治療につながる。
【００３５】
記載する遺伝子標的を用いると、試料中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを検出するための、迅速な診断試験ができる。これは、適切な診療が早期に導かれる可能性を提供する。
当該遺伝子標的は、他のＣａｎｄｉｄａ属種と交差反応を示さず、リアルタイムＰＣＲは、１コピー数の標的遺伝子を検出するため、非常に高感度の分析を提供することができる。さらに、当該遺伝子標的から転写されるＲＮＡは、生存及び非生存生物間を区別することもできる。
【００３６】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに関する、ＲＮＡに基づく定量的逆転写酵素リアルタイムＰＣＲ分析を開発するために、遺伝子標的を用いる可能性もまたある。こうした分析は、遺伝子の発現を測定して抗真菌治療、抗真菌治療の組み合わせ、免疫調節治療又は抗真菌治療及び免疫調節治療両方の組み合わせに対する反応を監視する、治療診断（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）マーカーとして用いられる見込みもある。遺伝子発現の低下は、治療に対する十分な反応を示すであろう。
【００３７】
本発明は、以下の実施例から、より明確に明らかになるであろう。
【実施例】
【００３８】
特異的標的ＨＷＰ１を用いたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓリアルタイムＰＣＲ分析
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ上で用いるため、特異的遺伝子標的ＨＷＰ１を用いたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのリアルタイムＰＣＲ分析を開発した。当該分析は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の工程で作動する、標識プライマー−プローブの組み合わせを用いる。分析を以下のように開発した：
ＨＷＰ１遺伝子から設計したプライマー（ＨＷＰ１５及びＨＷＰ６）を用いて、ＨＷＰ１遺伝子を増幅して、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの６つの株の部分的ＨＷＰ１配列を生成した（図２）。
【００３９】
【化１】
2008535513.tif 000002
【００４０】
熱周期条件としては、９５℃１０分間の変性工程、その後、４５周期の５０℃１５秒間の増幅及び７２℃１０秒間の伸長があげられた。生じたすべてのＰＣＲ産物の配列を決定した。配列決定前、ＰＣＲ産物配列決定前キット（ＵＳＢ）を用いて産物を処理して、一本鎖ＤＮＡ及び遊離ヌクレオチドを除去した。
２．得られた配列情報から、以下のように、標識プライマー−プローブＦＲＥＴ対（ＨＷＰ６−ＬＣ６４０及びＨＷＰ１ａ−ｆｌｕ）を設計した。
【００４１】
【化２】
2008535513.tif 000003
【００４２】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ上、ＨＷＰ１５順方向プライマーと組み合わせて、プライマー−プローブＦＲＥＴ対を用いた。この組み合わせは、標識プローブから標識プライマーへの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって働く。ＦＲＥＴは、ドナー蛍光体（ＨＷＰ１ａプローブ上のフルオレセイン）が光度測定的に励起されて、そのエネルギーをアクセプター蛍光体（ＨＷＰ６上のＬＣ−６４０）に移動させる際に生じる。アクセプター蛍光体は、より長い波長で光を放出し、この光が装置によって検出される。この標識プライマー−プローブの組み合わせは、慣用的な二重標識プローブ設定ほど頻繁には用いられないが、標識プライマーが産物の増幅に関与する以外は、全く同じ方式で作動する。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）でＰＣＲ増幅及び検出を行った。増幅には、LightCycler Faststart DNA Master Hybridization Probeキット（Roche）を用いた。２μｌの鋳型ＤＮＡに加えて、４ｍＭＭｇＣｌ２、０．２μＭハイブリダイゼーションプローブ、０．５μＭプライマーの最終濃度を用いた。熱周期条件としては、９５℃１０分間の変性工程後、４５周期の５０℃１５秒間の増幅及び７２℃１０秒間の伸長があげられた。融解曲線プロフィールは以下の通りであった：９５℃６０秒間、４５℃６０秒間及び８０℃０秒間。蛍光獲得は連続的であった。４０℃への１の冷却周期もまた含まれた。
３．地理的に区別される一群のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ参照株及び臨床分離株（表１）から、他のＣａｎｄｉｄａ属及び非Ｃａｎｄｉｄａ属真菌種、細菌種並びにヒトＤＮＡから抽出したＤＮＡを用いて、プライマー（ＨＷＰ１５／ＨＷＰ６−ＬＣ６４０）及びプローブ（ＨＷＰ１ａ−ｆｌｕ）の組み合わせの特異性を検証した。
【００４３】
【表１】
2008535513.tif 000004
【００４４】
*Centraalbureau voor Schimmelcultures
**National Collection of Pathogenic Fungi
***Belgian Co-ordinated Collection of Microorganisms
****University College Hospital Galway
【００４５】
試験した真菌種としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉがあげられた。
【００４６】
試験した細菌種としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａがあげられた。
【００４７】
ヒトゲノムＤＮＡもまた試験した。
製造者の使用説明書により、細菌及び真菌用のMagNA Pure LC DNA単離キットIII（Roche）を用い、MagNA Pure LC自動化核酸抽出系（Roche）を用いて、当該一群の生物からＤＮＡの抽出を行った。２６０ｎｍで分光光度的にＤＮＡを定量した。分析では試験したすべてのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ分離株で特異的であることが示された（図３及び４）。試験した他の真菌種又は細菌種のいずれにも融解ピークは全く得られず、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに関するＨＷＰ１標的の特異性が示された。さらに、融解ピークはヒトＤＮＡでも得られなかった。これは、プライマー／プローブの組み合わせがＨＷＰ１標的配列に特異的であり、非特異的ＤＮＡ等の試料中の他の物質とは交差反応しないことを示す。
【００４８】
分析の検出限界を確立し（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標準株由来の連続希釈ＤＮＡを用いた）たところ、当該分析は、１〜１０コピーの間の遺伝子を確実に検出できる（図５）。したがって、ＨＷＰ１遺伝子は、特異的な標的であるだけでなく、低コピー数での検出に適した高感度標的にも相当する。
【００４９】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の希釈を用いた分析の検出限界を確立した。生物の一晩培養（１０９細胞／ｍｌ）から連続希釈を調製して製造者の使用説明書により、細菌及び真菌用のMagNA Pure LC DNA単離キットIII（Roche）を用いて、各希釈からＤＮＡを抽出した。該ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ分析で用いた。この方法を用いた場合、本分析は１０細胞を確実に検出できる（図６）。
【００５０】
血中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを検出するための分析の検出限界もまた確立した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を血中に混ぜて製造者の使用説明書により、細菌及び真菌用のMagNA Pure LC DNA単離キットIII（Roche）を用いて、各希釈からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ分析で用いた。この方法を用いると、本分析は、１０細胞を確実に検出できる（図７）。
【００５１】
ＨＷＰ１遺伝子標的はまた、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの、ＲＮＡに基づく分析の開発に用いられる見込みがある。当該生物の逆転写酵素リアルタイムＰＣＲ分析を用いて、ＨＷＰ１遺伝子発現を定量し、抗真菌治療の効能を監視する治療診断マーカーを提供する。ＨＷＰ１遺伝子発現の低下は、感染が治療に応答していることを示し、その後に必要な場合、治療を修正する適切な工程を選択することもできる。
【００５２】
ＨＷＰ１遺伝子のＲＮＡに基づく分析
ＲＮＡに基づく分析で使用するＨＷＰ１標的の可能性を立証するため、当該遺伝子のコード領域からさらにプライマー及びプローブを設計した（図１）。
【００５３】
他のプライマー及びプローブ配列は以下の通りである。
【００５４】
【化３】
2008535513.tif 000005
【００５５】
地理的に区別できる一群のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ参照株及び他のＣａｎｄｉｄａ属種（表２）、細菌種並びにヒトＤＮＡから抽出したＤＮＡを用いて、このプライマー（ＨＷＰｘ／ＨＷＰｙ）及びプローブ（ＨＷＰｚ−ｆｌｕ／ＨＰＷｗ−ＬＣ）の組み合わせの特異性を検証した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ装置（Roche）上、ＰＣＲ増幅及び検出を行った。増幅には、LightCycler Faststart DNA Master Hybridization Probeキット（Roche）を用いた。２μｌの鋳型ＤＮＡに加えて、４ｍＭＭｇＣｌ２、０．２μＭハイブリダイゼーションプローブ、０．５μＭプライマーの最終濃度を用いた。熱周期条件としては、９５℃１０分間の変性工程、その後、４５周期の５０℃１５秒間の増幅及び７２℃１０秒間の伸長があげられた。融解曲線プロフィールは以下の通りであった：９５℃６０秒間、４５℃６０秒間及び８０℃０秒間。蛍光獲得は連続的であった。４０℃への１つの冷却周期もまた含まれた。
【００５６】
【表２】
2008535513.tif 000006
【００５７】
試験した真菌種としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉがあげられた。
【００５８】
試験した細菌種としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａがあげられた。
【００５９】
分析は、試験した全てのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ分離株に特異的であることが示された（図９）。試験した他の真菌種（図９）又は細菌種（図１０）のいずれも融解ピークは全く得られず、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＨＷＰ１標的の特異性が示された。さらに、融解ピークはヒトＤＮＡでも得られなかった。これは、プライマー／プローブの組み合わせが、ＨＷＰ１標的配列に特異的であり、そして非特異的ＤＮＡ等の試料中の他の物質とは交差反応がないことを示す。
【００６０】
分析の検出限界を確立し（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標準株由来の連続希釈ＤＮＡを用いた）たところ、当該該分析は、１０〜１コピーの間の遺伝子を確実に検出できる（図１１）。したがって、この分析は、試料中の低コピー数、すなわち低細胞数のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出に適している。
【００６１】
ＲＮＡに基づく分析のため、Ambion RiboPure Yeastキット（Ambion）を用いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ標準株５６２の一晩培養からＲＮＡを抽出した。DNAfree（Ambion）でＲＮＡを処理して、ゲノムＤＮＡ混入が確実に存在しないようにした。Agilent Bioanalyzer（Ａgilent UK）上で、使用前のＲＮＡの分析を行った。これにより、ＲＮＡの収量及び純度を確認した。ゲノムＤＮＡを含まないことが検証されたＲＮＡに対して、ｃＤＮＡ合成を行った。上記のように、プライマーＨＷＰｘ／ｙ及びプローブＨＷＰｚ−ｆｌｕ／ＬＣプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ分析で、鋳型として該ＲＮＡを用いて、ＲＮＡがＤＮＡ不含であることを検証した。当該分析でシグナルを生じないＲＮＡをＤＮＡ不含と同定した。変性のため、０．０５μＭの逆プライマー（ＨＷＰｙ）とＲＮＡを、８０℃でインキュベーションし、続いて、直ちに氷上で冷却してｃＤＮＡを生成した。ＭＭＬＶ逆転写酵素（１００Ｕ）（Ambion）、２μｌ反応緩衝液、４００ｎＭ ｄＵ：ｄＮＴＰを混合物に添加して４２℃で１時間インキュベーションした。当該反応で生じたこの一本鎖ｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ分析で鋳型として用いた。図１２は、リアルタイムＰＣＲ分析で用いた、このｃＤＮＡの希釈で得た定量化曲線を示す。図１３は、当該希釈から生成した標準曲線を示す。当該分析は、治療診断マーカーを提供するＨＷＰ１遺伝子の発現を監視し、生存及び非生存生物間を区別するために用いられる見込みがある。
【００６２】
本発明にはまた、その範囲内に、真菌疾患の診断、抗真菌ワクチンの構成要素に有用な試薬であり、及び／又は抗真菌薬剤及び／又は免疫調節薬剤の標的として有用な試薬である、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＨＷＰ１遺伝子由来の単離核酸及びポリペプチド、並びにハイブリッドＰＮＡ配列も含まれる。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生活環に干渉するか、又はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染を阻害する機能について、抗真菌治療、免疫調節薬剤及び／又は他の薬剤／治療を含む化合物等の化合物をスクリーニングするために、本発明の方法を用いてもよい。
【００６３】
本発明の範囲内で用いられうる、試料中の標的配列を検出する他の方法としては、検出する生物に固有に存在する核酸配列に特異的な核酸プローブを利用する、核酸に基づく非増幅直接試験が含まれる。プローブは通常、蛍光又は化学発光標識若しくは検出及び定量を容易にする他の標識で標識される。試料を処理すると、存在する場合は、標的生物から核酸が放出される。その後、標識ＤＮＡプローブが標的配列と特異的に化合して、安定なプローブ−標的配列ハイブリッドを形成する。ハイブリダイズしていない標的及びプローブからハイブリッドを分離するか又は識別して、当該ハイブリッド中の標識で放出されるシグナルを測定する。
【００６４】
本発明は、上記本明細書の態様には限定されず、詳細が多様であってもよい。
参考文献
【００６５】
【化４−１】
2008535513.tif 000007
【００６６】
【化４−２】
2008535513.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、寄託番号Ｕ６４２０６のＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌糸壁タンパク質１（ＨＷＰ１）遺伝子の全長配列、及び、寄託番号Ｕ２９３６９のＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ菌糸壁タンパク質１（ＨＷＰ１）部分配列並列（アラインメント）を示し、当該配列は共に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースwww.ncbi.nlm.nih.gov /Genbank/index.htmlで入手できる。配列番号２及び１２〜１５のプライマー及びプローブの位置を示す。
【図１ａ】図１は、寄託番号Ｕ６４２０６のＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌糸壁タンパク質１（ＨＷＰ１）遺伝子の全長配列、及び、寄託番号Ｕ２９３６９のＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ菌糸壁タンパク質１（ＨＷＰ１）部分配列並列（アラインメント）を示し、当該配列は共に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースwww.ncbi.nlm.nih.gov /Genbank/index.htmlで入手できる。配列番号２及び１２〜１５のプライマー及びプローブの位置を示す。
【図１ｂ】図１は、寄託番号Ｕ６４２０６のＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌糸壁タンパク質１（ＨＷＰ１）遺伝子の全長配列、及び、寄託番号Ｕ２９３６９のＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ菌糸壁タンパク質１（ＨＷＰ１）部分配列並列（アラインメント）を示し、当該配列は共に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースwww.ncbi.nlm.nih.gov /Genbank/index.htmlで入手できる。配列番号２及び１２〜１５のプライマー及びプローブの位置を示す。
【図２】図２は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの６つの株で生成した部分的ＨＷＰ１配列である。プライマーＨＷＰ１５、及び、標識プローブＨＷＰ１ａ−ｆｌｕ（下線）と組み合わせて用いられる標識されたＨＷＰ６−ＬＣ６４０（斜字）の位置を示す。
【図３】図３は、ＨＷＰ１特異的標識プライマー−プローブの組み合わせを用いた、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ臨床分離株で生成したＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ融解曲線データを示すグラフである。試験した全ての分離株で、およそ５７℃の単一の融解ピークが生じた。
【図４】図４は、ＨＷＰ１特異的標識プライマー−プローブの組み合わせを用いた、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ参照株で生成したＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ融解曲線データを示すグラフである。試験した全ての分離株で、およそ５７℃の単一の融解ピークが生じた。
【図５】図５は、特異的標識プライマー−プローブの組み合わせを用いて生成した、ＨＷＰ１分析に関する感度データを示すグラフである。示した定量化データは、１０５〜１コピーのＨＷＰ１遺伝子標的の検出に相当する。
【図６】図６は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の連続希釈を用いて生成した、ＨＷＰ１分析に関する感度データを示すグラフである。
【図７】図７は、血中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出のための分析の検出限界を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ分離株に関する、ＲＮＡに基づく分析の特異性を示すグラフである。
【図９】図９は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ分離株に関する、ＲＮＡに基づく分析の特異性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに関するＨＷＰ１標的の特異性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＲＮＡに基づく分析を用いた、１０４〜１コピーのＨＷＰ１遺伝子標的の検出に相当する定量化データを示す。
【図１２】図１２は、リアルタイムＰＣＲのＲＮＡに基づく分析で用いるｃＤＮＡの定量化曲線を示す。
【図１３】図１３は、図１２で得た希釈から生成した標準曲線を示す。
【図１】
2008535513.tif 000009
【図１（ａ）】
2008535513.tif 000010
【図１（ｂ）】
2008535513.tif 000011
【図２】
2008535513.tif 000012
【図３】
2008535513.tif 000013
【図４】
2008535513.tif 000014
【図５】
2008535513.tif 000015
【図６】
2008535513.tif 000016
【図７】
2008535513.tif 000017
【図８】
2008535513.tif 000018
【図９】
2008535513.tif 000019
【図１０】
2008535513.tif 000020
【図１１】
2008535513.tif 000021
【図１２】
2008535513.tif 000022
【図１３】
2008535513.tif 000023
【配列表】
2008535513000001.xml
【国際調査報告】
2008535513.tif 000029
2008535513.tif 000030
2008535513.tif 000031
2008535513.tif 000032
2008535513.tif 000033
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