(57)【要約】【課題】精製臭化水素酸を用いたポリペプチド混合物の精製方法【解決手段】本発明は、不均一なアミノ酸配列を有するポリペプチド混合物を得るための改良された方法を提供する。ここで、各ポリペプチドは、本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びリシンから成り、得られるポリペプチドの混合物は、0.3%未満の臭素化チロシン及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含有する。【選択図】      なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を得るための方法であって、
前記混合物が所望の平均分子量を有し、且つ、該方法の間に、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成る、ポリペプチドの混合物のバッチが、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護され、その改良点として0.5％未満の遊離臭素を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用を具備することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記改良点が、1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用をさらに具備することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を得るための方法であって、
前記混合物が所望の平均分子量を有し、且つ、該方法の間に、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成る、ポリペプチドの混合物のバッチが、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護され、その改良点として1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用を具備することを特徴とする方法。
【請求項４】
各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を生産するための方法であって、
前記混合物が所望の平均分子量を有し、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成るポリペプチドの混合物を、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護することを含む方法。
【請求項５】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、0.1%未満の遊離臭素を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、0.05%未満の遊離臭素を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、0.01%未満の遊離臭素を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、0.001%未満の遊離臭素を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、遊離臭素を含まない、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、500 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、100 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、10 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、金属イオン不純物を含まない、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物がTFA GAである、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液が、10〜36% 臭化水素酸の酢酸溶液である、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶液が、33% 臭化水素酸の酢酸溶液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液が、遊離臭素を除去するための臭素スカベンジャーにより前処理される、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記臭素スカベンジャーがフェノールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶液が、非金属性の反応器中で生産される、請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、ガラス内張反応器又はテフロン（登録商標）内張反応器中で調製される、請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が2000 APHA未満である、請求項１〜２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が1000 APHA未満である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が700 APHA未満である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が500 APHA未満である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の方法によって生産されたトリフルオロアセチル産物。
【請求項２７】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の方法によって生産されたトリフルオロアセチル産物及び担体を含有する組成物。
【請求項２８】
各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物であって、
前記混合物が所望の平均分子量を有し、わずか0.1%の臭素化チロシン及び1000 ppm未満の金属イオン不純物しか含まないことを特徴とするトリフルオロアセチルポリペプチドの混合物。
【請求項２９】
平均分子量2000ダルトン〜40,000ダルトンを有する、請求項２８に記載の混合物。
【請求項３０】
平均分子量4000ダルトン〜19,000ダルトンを有する、請求項２９に記載の混合物。
【請求項３１】
平均分子量7,000±2,000ダルトンを有する、請求項２９に記載の混合物。
【請求項３２】
平均分子量7,000ダルトンを有する、請求項３１に記載の混合物。
【請求項３３】
平均分子量4,700ダルトン〜11,000ダルトンを有する、請求項３０に記載の混合物。
【請求項３４】
前記混合物が、1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項２９〜３３の何れか一項に記載の混合物。
【請求項３５】
前記混合物が、500 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項３４に記載の混合物。
【請求項３６】
前記混合物が、100 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項３５に記載の混合物。
【請求項３７】
前記混合物が、10 ppm未満の金属イオン不純物を含む、請求項３６に記載の混合物。
【請求項３８】
前記混合物が、金属イオン不純物を含まない、請求項３７に記載の混合物。
【請求項３９】
請求項２８〜３９の何れか一項に記載の混合物及び担体を含有する組成物。
【請求項４０】
各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、ポリペプチドの混合物を含む薬学的組成物を得るための方法であって、
前記混合物が、所望の平均分子量を有し、
a) チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びN-トリフルオロアセチルリシンのN-カルボキシ無水物を重合して、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；
b) 該保護されたポリペプチドを、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含有する、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護し、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を形成すること；
c) 前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を、水性ピペリジンと反応させて、それぞれが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びリシンから成る、ポリペプチドの混合物の水溶液を形成すること；及び、
d) 前記ポリペプチドの混合物を精製すること；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
前記混合物において、前記アラニンの分子分率が0.427であり、グルタミン酸のモル分率が0.141であり、リシンのモル分率が0.337であり、チロシンのモル分率が0.093である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
以下の工程を具備する、グラチラマーアセテートを生産する方法：
a) チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びN-トリフルオロアセチルリシンのN-カルボキシ無水物を重合して、保護されたグラチラマーアセテートを形成すること；
b) 保護されたグラチラマーアセテートを、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含有する、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護して、トリフルオロアセチルグラチラマーアセテートを形成すること；
c) トリフルオロアセチルグラチラマーを水性ピペリジンと反応させて、グラチラマーアセテートの溶液を形成すること；及び、
d) 前記グラチラマーアセテートを精製すること。
【請求項４３】
請求項４０〜４２の何れか一項に記載の方法であって、5000ダルトン未満の分子量のポリペプチド種を除去するために、前記工程d)の産物を限外濾過に供することをさらに含む方法。
【請求項４４】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、酢酸中10%〜36%の臭化水素酸である、請求項４０〜４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、酢酸中33%の臭化水素酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、遊離臭素を除去するために臭素スカベンジャーで前処理される、請求項４０〜４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記臭素スカベンジャーがフェノールである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、非金属反応器中で生産される、請求項４０〜４７の何れか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記臭化水素酸の酢酸溶液が、ガラス内張反応器又はテフロン（登録商標）内張反応器中で調製される、請求項４０〜４７の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が、2000 APHA未満である、請求項４０〜４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が、1000 APHA未満である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が、700 APHA未満である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記臭化水素酸の酢酸溶液の色が、500 APHA未満である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
以下の工程を具備する、グラチラマーアセテートのサンプル中の臭素化チロシンの割合を解析する方法：
a) グラチラマーアセテートを加水分解して水解物を得ること；
b) 前記水解物をクロマトグラフィーのカラムを通して溶出すること；
c) 前記水解物中のブロモチロシンのレベルを測定すること；
d) グラチラマーアセテート及びブロモチロシンのアミノ酸成分のサンプル溶液を調製すること；
e) 前記サンプル溶液を前記工程b)のカラムを通して溶出すること；及び
f) 前記グラチラマーアセテート中の臭素化チロシンの割合を算出すること。
【請求項５５】
各ポリペプチドが本質的にグルタミン酸、アラニン、チロシン及びリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、ポリペプチドの混合物を含む薬学的組成物を調製する方法であって、
該混合物は、薬学的組成物中に含まれるために許容される所定の割合の臭素化チロシンを有し：
それぞれのポリペプチドが本質的にグルタミン酸、アラニン、チロシン及びリシンから成る、不均一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドの混合物のバッチを得ること；
該バッチの臭素化チロシンの割合を、以下を含む方法によって測定すること
a) 前記バッチを加水分解して水解物を得ること；
b) 前記水解物をクロマトグラフィーのカラムに通して溶出させること；
c) 前記水解物中のブロモチロシンのレベルを測定すること；
d) 前記バッチ及びブロモチロシンのアミノ酸成分のサンプル溶液を調製すること；
e) 該サンプル溶液を前記工程b)のカラムを通して溶出させること；及び
f) 前記バッチ中の臭素化チロシンの割合を算出すること；及び
そのように測定されたその臭素化チロシンの割合が0.3％未満である場合にのみ、前記薬学的組成物中にバッチを含めること；
を具備する方法。
【請求項５６】
前記バッチが、そのように測定された臭素化チロシンの割合が0.2％未満である場合にのみ、前記薬学的組成物中に含まれることを許容される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記バッチが、そのように測定された臭素化チロシンの割合が0.1％未満である場合にのみ、前記薬学的組成物中に含まれることを許容される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリペプチドの混合物がGAである、請求項５５〜５７の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
グラチラマーアセテート(glatiramer acetate)(GA)と称される、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではないポリペプチドの混合物が、Copaxone(R)という商標で販売されており、これはL-グルタミン酸、L-アラニン、L-チロシン及びL-リシンをそれぞれ平均モル分率0.141、0.427、0.095及び0.338で含有するポリペプチドの酢酸塩を含む。Copaxone(R)の平均分子量は、4,700〜11,000ダルトンである（「Copaxone」, Physician's Desk Reference, (2000), Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ) , 3115.)）。化学的にはグラチラマーアセテートは、L-アラニン、L-リシン、L-チロシン、酢酸（塩）を有するL-グルタミン酸ポリマーを指す。その構造式は：
【化１】
2008512494.tif 000002
【０００２】
（「Copaxone」、Physician's Desk Reference, (2000) , Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ) , 3115）である。
【０００３】
グラチラマーアセテートは、再発-緩解多発性硬化症の患者における再発の頻度の減少について認められている。多発性硬化症は、自己免疫性疾患として分類されている。グラチラマーアセテートは、他の自己免疫性疾患（公開番号US 2002/0055466 Al、R. Aharoni et al.）、炎症性非自己免疫疾患（公開番号US 2005/0014694 Al、V. Wee Yong et al.；及び米国特許出願第2002/0077278 Al, 公開June 20, 2002 (Young et al. )）の治療における使用について、及び、神経再生の促進及び／又は第一次神経系傷害に続く二次的な変性の予防又は阻害（公開番号US 2003/0004099 Al、M. Eisenbach-Schwartz et al.；及び米国特許出願2002/0037848 Al、公開March 28, 2002 (Eisenbach- Schwartz))）のための使用についても開示されている。さらに、グラチラマーアセテートは、免疫が媒介する疾患の治療（例えば、米国特許第6,514,938 B1、2003年2月4日発行(Gad et al.)；PCT 国際公開番号WO 01/60392、公開2001年8月23日(Gilbert et al.)；及びPCT 国際公開番号WO 00/27417、公開2000年5月19日(Aharoni et al.)）並びに髄鞘脱落に関連する疾患の治療（PCT国際公開番号WO-1/97846、公開2001年12月27日(Moses et al.)）についても開示されている。
【０００４】
上記特許における詳細な製造方法は、保護されたポリペプチドを３３％臭化水素酸の酢酸溶液と反応させることを含む（米国特許第5,800,808、発行1998年9月1日、Konfino, et al.）。この脱保護反応は、グルタメート残基の5-カルボキシレートからガンマベンジル保護基を除去し、ポリマーをより小さいポリペプチドに切断してトリフルオロアセチルポリペプチドを形成する（米国特許第5,800,808、発行1998年9月1日、Konfino, et al.）。7,000±2,000ダルトンの適切な平均分子量のＧＡを得るためには、反応温度及び保護されたグラチラマーアセテートの分子量プロフィールに依存して、時間が必要である（米国特許第5,800,808、発行1998年9月1日、Konfino, et al.）。脱保護は、20℃〜28℃の温度で生じる（米国特許第5,800,808、発行1998年9月1日、Konfino, et al.）。固有の分子量プロフィールのトリフルオロアセチルポリペプチドを達成するために、与えられた温度で必要な時間を決定するために、バッチ毎に異なる時間で試験反応が行われる（米国特許第5,981,589、発行1999年11月9日、Konfino, et al.）。反応に必要な時間は、例えば、10〜50時間に及ぶ（米国特許第5,800,808、発行1998年9月1日、Konfino, et al.）。加えて、米国特許第5,981,589号、同第6,048,898号、同第6,054,430号、同第6,342,476号、同第6,362,161号、及び同第6,620,847号も、GAを含むポリペプチドの混合物の組成物及び製造のための方法に関する。
【０００５】
本発明は、改良された製造方法を提供する。
【発明の開示】
【発明の概要】
【０００６】
本願を通して、種々の刊行物がそれらの引用によって参照される。本発明が属する分野の状況をより完全に記述するために、それらの刊行物の全開示が参照によって本願に援用される。
【０００７】
本発明は、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を得るための方法を提供する。ここで、各ポリペプチドは、本質的に、アラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、前記混合物は、所望の平均分子量を有し、また、該方法の間に、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成る、ポリペプチドの混合物のバッチが、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護され、その改良点として0.5％未満の遊離臭素を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用を具備する。
【０００８】
また、本発明は、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を得るための方法であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、且つ、該方法の間に、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成る、ポリペプチドの混合物のバッチが、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護され、その改良点として1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用を具備することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を生産するための方法であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成るポリペプチドの混合物を、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護することを含む方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、本発明の方法の何れか一つで生産されたトリフルオロアセチル産物及び担体を含む組成物を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、わずか0.1%の臭素化チロシン及び1000 ppm未満の金属イオン不純物しか含まないことを特徴とするトリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を提供する。また、本発明は、トリフルオロアセチルポリペプチド及び担体を含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、ポリペプチドの混合物を含む薬学的組成物を得るための方法であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、
a) チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びN-トリフルオロアセチルリシンのN-カルボキシ無水物を重合して、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；
b) 該保護されたポリペプチドを、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含有する、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護し、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を形成すること；
c) 前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を、水性ピペリジンと反応させて、それぞれが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びリシンから成る、ポリペプチドの混合物の水溶液を形成すること；及び、
d) 前記ポリペプチドの混合物を精製すること；
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、以下の工程を具備する、グラチラマーアセテートを生産する方法を提供する：
a) チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びN-トリフルオロアセチルリシンのN-カルボキシ無水物を重合して、保護されたグラチラマーアセテートを形成すること；
b) 保護されたグラチラマーアセテートを、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含有する、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護して、トリフルオロアセチルグラチラマーアセテートを形成すること；
c) トリフルオロアセチルグラチラマーを水性ピペリジンと反応させて、グラチラマーアセテートの溶液を形成すること；及び、
d) 前記グラチラマーアセテートを精製すること。
【００１４】
本発明はまたさらに、以下の工程を具備する、グラチラマーアセテートのサンプル中の臭素化チロシンの割合を分析する方法を提供する：
a) グラチラマーアセテートを加水分解して水解物を得ること；
b) 該水解物をクロマトグラフィーカラムを通して溶出すること；
c) 前記水解物中のブロモチロシンのレベルを測定すること；
d) グラチラマーアセテートのアミノ酸成分及びブロモチロシンのアミノ酸成分のサンプル溶液を調製すること；
e) 該サンプル溶液を前記工程b)のカラムを通して溶出すること；及び
e) 前記グラチラマーアセテート中の臭素化チロシンの割合を算出すること。
【００１５】
本発明はまた、各ポリペプチドが本質的にグルタミン酸、アラニン、チロシン及びリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、ポリペプチドの混合物を含む薬学的組成物を調製する方法であって、
該混合物は、薬学的組成物中に含まれるために許容される所定の割合の臭素化チロシンを有し：
それぞれのポリペプチドが本質的にグルタミン酸、アラニン、チロシン及びリシンから成る、不均一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドの混合物のバッチを得ること；
該バッチの臭素化チロシンの割合を、以下を含む方法によって測定すること
a) 前記バッチを加水分解して水解物を得ること；
b) 前記水解物をクロマトグラフィーのカラムに通して溶出させること；
c) 前記水解物中のブロモチロシンのレベルを測定すること；
d) 前記バッチ及びブロモチロシンのアミノ酸成分のサンプル溶液を調製すること；
e) 該サンプル溶液を前記工程b)のカラムを通して溶出させること；及び
f) 前記バッチ中の臭素化チロシンの割合を算出すること；及び
そのように測定されたその臭素化チロシンの割合が0.3％未満である場合にのみ、前記薬学的組成物中にバッチを含めること；
を具備する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本発明は、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を得るための方法であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、且つ、該方法の間に、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成る、ポリペプチドの混合物のバッチが、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護され、その改良点として0.5％未満の遊離臭素を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用を具備することを特徴とする方法を提供する。
【００１７】
一つの態様において、該改良点は、1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用をさらに具備する。
【００１８】
本発明はさらに、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を得るための方法であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、且つ、該方法の間に、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成る、ポリペプチドの混合物のバッチが、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護され、その改良点として1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液の使用を具備することを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を生産するための方法であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、それぞれが本質的にアラニン、γ-ベンジルグルタメート、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成るポリペプチドの混合物を、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護することを含む方法を提供する。
【００２０】
一つの態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、0.1%未満の遊離臭素を含む。  
他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、0.05%未満の遊離臭素を含む。  
さらなる態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、0.01%未満の遊離臭素を含む。  
さらに他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、0.001%未満の遊離臭素を含む。  
さらなる態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、遊離臭素を含まない。
【００２１】
他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
さらに他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、500 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
一つの態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、100 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、30 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
さらに他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、20 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
さらなる態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、10 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、金属イオン不純物を含まない。
【００２２】
さらに他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、トリフルオロアセチルグラチラマーアセテート（「TFA GA」）である。
【００２３】
一つの態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、10%〜36%の臭化水素酸の酢酸溶液である。他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、16%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；18%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；20%〜37%の臭化水素酸の酢酸溶液である；20%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；22%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；24%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；25%〜35%の臭化水素酸の酢酸溶液である；26%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；28%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；30%〜34%の臭化水素酸の酢酸溶液である；30%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；又は32%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である。さらなる態様において、該溶液は、33%の臭化水素酸の酢酸溶液である。他の態様において、該溶液は、16%の臭化水素酸の酢酸溶液である。
【００２４】
他の態様において、該溶液は、遊離臭素を除去するために臭素スカベンジャーで前処理される。  
一つの態様において、該臭素スカベンジャーはフェノールである。  
さらなる態様において、該溶液は、非金属反応器中で生産される。  
他の態様において、該溶液は、ガラス内張反応器又はテフロン（登録商標）内張反応器中で調製される。
【００２５】
さらに他の態様において、該臭化水素酸の酢酸溶液の色は、2000 APHA未満である。  
さらなる態様において、該臭化水素酸の酢酸溶液の色は、1000 APHA未満である。  
他の態様において、該臭化水素酸の酢酸溶液の色は、700 APHA未満である。  
さらに他の態様において、該臭化水素酸の酢酸溶液の色は、500 APHA未満である。
【００２６】
本発明はまた、開示された方法の何れか一つによって生産されたトリフルオロアセチル産物を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、開示された方法の何れか一つによって生産されたトリフルオロアセチル産物及び担体を含む組成物を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びトリフルオロアセチルリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物であって、前記混合物が所望の平均分子量を有し、わずか0.1%の臭素化チロシン及び1000 ppm未満の金属イオン不純物しか含まないことを特徴とするトリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を提供する。
【００２９】
一つの態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が2000ダルトン〜40,000ダルトンである。  
他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が4000ダルトン〜18,000ダルトンである。  
さらなる態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が4000ダルトン〜13,000ダルトンである。  
他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が13,000ダルトン〜19,000ダルトンである。  
さらに他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が13,500ダルトン〜18,500ダルトンである。  
さらなる態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が7,000±2,000ダルトンである。  
またさらなる態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が7,000ダルトンである。  
他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が14,000ダルトンである。  
さらに他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、平均分子量が4,700〜11,000ダルトンである。
【００３０】
さらなる態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、1000 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
さらに他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、500 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
さらなる態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、100 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、30 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
さらなる態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、20 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、10 ppm未満の金属イオン不純物を含む。  
さらに他の態様において、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物は、金属イオン不純物を含まない。
【００３１】
また本発明は、前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物及び担体を含む組成物を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、各ポリペプチドが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、ポリペプチドの混合物を含む薬学的組成物を得るための方法であって、前記混合物が、所望の平均分子量を有し、
a) チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びN-トリフルオロアセチルリシンのN-カルボキシ無水物を重合して、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；
b) 該保護されたポリペプチドを、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含有する、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護し、トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を形成すること；
c) 前記トリフルオロアセチルポリペプチドの混合物を、水性ピペリジンと反応させて、それぞれが本質的にアラニン、グルタミン酸、チロシン及びリシンから成る、ポリペプチドの混合物の水溶液を形成すること；及び、
d) 前記ポリペプチドの混合物を精製すること；
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００３３】
一つの態様において、該混合物の平均モル分率は、グルタミン酸が0.129〜0.159；アラニンが0.392〜0.462；チロシンが0.086〜0.100；及びリシンが0.300〜0.374である。具体的な態様において、該混合物中のグルタミン酸の平均モル分率は0.141であり、アラニンの平均モル分率は0.427であり、チロシンの平均モル分率は0.093であり、リシンの平均モル分率は0.337である。
【００３４】
本発明はまた、以下の工程を具備する、グラチラマーアセテートを生産する方法を提供する：
a) チロシン、アラニン、γ-ベンジルグルタメート及びN-トリフルオロアセチルリシンのN-カルボキシ無水物を重合して、保護されたグラチラマーアセテートを形成すること；
b) 保護されたグラチラマーアセテートを、0.5％未満の遊離臭素及び1000 ppm未満の金属イオン不純物を含有する、臭化水素酸の酢酸溶液で脱保護して、トリフルオロアセチルグラチラマーアセテートを形成すること；
c) トリフルオロアセチルグラチラマーを水性ピペリジンと反応させて、グラチラマーアセテートの溶液を形成すること；及び、
d) 前記グラチラマーアセテートを精製すること。
【００３５】
一つの態様において、前記工程d)の産物は、分子量5000ダルトン未満のポリペプチド種を除去するために、さらに限外濾過に供される。
【００３６】
一つの態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、10%〜36%の臭化水素酸の酢酸溶液である。他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、16%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；18%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；20%〜37%の臭化水素酸の酢酸溶液である；20%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；22%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；24%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；25%〜35%の臭化水素酸の酢酸溶液である；26%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；28%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；30%〜34%の臭化水素酸の酢酸溶液である；30%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である；又は32%〜33%の臭化水素酸の酢酸溶液である。さらなる態様において、該溶液は、33%臭化水素酸の酢酸溶液である。他の態様において、該溶液は、16%臭化水素酸の酢酸溶液である。
【００３７】
他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、遊離臭素を除去するために臭素スカベンジャーで前処理される。  
さらに他の態様において、該臭素スカベンジャーはフェノールである。  
さらなる態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、非金属反応器内で生産される。  
他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液は、ガラス内張反応器又はテフロン（登録商標）内張反応器中で調製される。
【００３８】
一つの態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液の色は、2000 APHA未満である。  
他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液の色は、1000 APHA未満である。  
さらに他の態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液の色は、700 APHA未満である。  
さらなる態様において、前記臭化水素酸の酢酸溶液の色は、500 APHA未満である。
【００３９】
本発明はさらに、以下の工程を具備する、グラチラマーアセテートのサンプル中の臭素化チロシンの割合を解析する方法を提供する：
a) グラチラマーアセテートを加水分解して水解物を得ること；
b) 前記水解物をクロマトグラフィーのカラムを通して溶出すること；
c) 前記水解物中のブロモチロシンのレベルを測定すること；
d) グラチラマーアセテート及びブロモチロシンのアミノ酸成分のサンプル溶液を調製すること；
e) 前記サンプル溶液を前記工程b)のカラムを通して溶出すること；及び
f) 前記グラチラマーアセテート中の臭素化チロシンの割合を算出すること。
【００４０】
本発明はまた、各ポリペプチドが本質的にグルタミン酸、アラニン、チロシン及びリシンから成り、全てが同じアミノ酸配列を有するわけではない、ポリペプチドの混合物を含む薬学的組成物を調製する方法であって、
該混合物は、薬学的組成物中に含まれるために許容される所定の割合の臭素化チロシンを有し：
それぞれのポリペプチドが本質的にグルタミン酸、アラニン、チロシン及びリシンから成る、不均一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドの混合物のバッチを得ること；
該バッチの臭素化チロシンの割合を、以下を含む方法によって測定すること
a) 前記バッチを加水分解して水解物を得ること；
b) 前記水解物をクロマトグラフィーのカラムに通して溶出させること；
c) 前記水解物中のブロモチロシンのレベルを測定すること；
d) 前記バッチ及びブロモチロシンのアミノ酸成分のサンプル溶液を調製すること；
e) 該サンプル溶液を前記工程b)のカラムを通して溶出させること；及び
f) 前記バッチ中の臭素化チロシンの割合を算出すること；及び
そのように測定されたその臭素化チロシンの割合が0.3％未満である場合にのみ、前記薬学的組成物中にバッチを含めること；
を具備する方法を提供する。
【００４１】
一つの態様において、該バッチは、そのように測定された臭素化チロシンの割合が0.2%未満である場合にのみ、前記薬学的組成物中に含まれることを許容される。  
他の態様において、該バッチは、そのように測定された臭素化チロシンの割合が0.1%未満である場合にのみ、前記薬学的組成物中に含まれることを許容される。  
さらなる態様において、前記ポリペプチドの混合物は、グラチラマーアセテート（「GA」）である。
【００４２】
［用語］
本出願で用いられる「平均分子量」という用語は、該混合物がHPLCゲル浸透カラムでの分子量による分離に供されたとき、高い相対割合で混合物中に存在する（即ち、最大ピーク）ポリペプチド種の分子量を意味する。この値は、例えば、較正されたカラムでの保持時間；ピークの位置と定義された配列及び分子量の共クロマトグラフィーコポリマーマーカーの位置との間の関係からなどの、幾つかの方法で得ることができる。光散乱によるような、平均分子量を決定する他の方法も用いることができ、最大ピークから得られる値に実質的に相当する。
【００４３】
本発明に従うポリペプチド混合物は、例証したように、４つの活性化アミノ酸誘導体（うち二つ、L-グルタミン酸及びL-リシンは保護される）：L-グルタミン酸(L-GIu)、L-アラニン（L-Ala)、L-チロシン（L-Tyr)及びL-リシン（L-Lys）（うち二つは保護される、即ち、5Bz-グルタメート誘導体及び6N-TFA-リシン誘導体)を特定の割合で化学的に反応させることによって調製された合成ポリペプチドの酢酸塩である。本明細書で用いられる「混合物」という用語は、通常、L-グルタミン酸、L-アラニン、L-チロシン、及びL-リシンを含有する「本発明のポリペプチドの混合物」におけるものを指し、いずれの用語も、製造方法から残存する不純物を含むことを意味する。
【００４４】
各アミノ酸残基のモル分率の範囲は：L-GIu 0.129〜0.153、L-AIa 0.392〜0.462、L-Tyr 0.086〜0.100及びL-Lys 0.300〜0.374である。
【００４５】
100%完遂して全ての不純物が実際に除去される反応は存在せず、少量は残存する。そのような不純物は、以下の３つのタイプのものである：
・構造関連物質、これは、5-BZ-L-グルタミル残基及び／又はN6-TFA-L-リシル残基のような保護されたアミノ酸残基であり、保護基の不完全な除去に由来する。加えて、本発明の分子のポリペプチド混合物は、HBr/酢酸試薬中の遊離臭素の存在のために、生産の間に形成した、臭素化L-チロシル残基を含み得る。
【００４６】
同定された構造関連不純物の分子構造は、関与するモノマー、即ち開始物質に由来する。
【００４７】
それらの同定された不純物は、特定の参照標準と比較して定量され（化学的転換後に）、それは誘導体又は不純物自体の一部のいずれかである：
−残留トリフルオロアセチル化合物（フルオリドと表される）
−残留ベンジル化グルタミル残基（ベンジルブロミドと表される）
−残留臭素化チロシル残基（ブロモチロシンと表される）。
【００４８】
・非同定関連物質（RP-HPLCによって決定された)：それらは、同じ構造を有する同じ起源の小さい分子サイズのポリペプチドである。それらの物質は、恐らく、同様の反応要素を有し、それぞれの不純物の濃度（％）は、ピークエリアを本発明のポリペプチド混合物のピークエリアと比較して％として算出できる。
【００４９】
不純物の性質決定は、L-トリプトファン標準と比較したそれらの相対クロマトグラフィー保持時間（RRT）に基づく。
【００５０】
・残渣溶媒及び無機不純物は、残留溶媒1,4 ジオキシン、残留ピペリジン及び重金属のような規格（specification）に含まれる。
【００５１】
［考察］
遊離臭素
ＧＡのようなポリペプチドの混合物の製造方法において、33%臭化水素酸の酢酸溶液が保護されたＧＡの脱保護のために用いられる。例えば、ＧＡの生産方法の展開の間、トリフルオロアセチルGA (TFA GA)中及びGA中のチロシン残基の中には臭素化されるものがあることが発見された。この不純物が単離され、実施例で詳細に述べた分析方法を用いて同定された。このチロシン残基は、臭素と反応して2-ブロモチロシン又は3-ブロモチロシンの何れかを含むモノブロモチロシン成分を形成することがわかった。
【００５２】
多くの調査の後に本発明者らは、臭素化チロシン不純物がHBr/酢酸中の遊離臭素によってＧＡ中に導入されることを発見した。遊離臭素は、供給者から購入して生産方法で用いた33% HBr/酢酸中に存在した。
【００５３】
33% HBr/酢酸中の遊離臭素のレベルを低下させるために測定を行った。例えば、HBr/酢酸の臭素スカベンジャーによる前処理は、HBr/酢酸溶液から遊離臭素をいくらか除去するのに有効であった。
【００５４】
HBr精製方法において使用した臭素スカベンジャーの一つはフェノールであった。フェノールに加えて、重亜硫酸ナトリウムのような他の減少剤を使用することができる。フェノールは、それ及び臭素とそれの反応産物（ブロモフェノール）がいずれも、保護されたGAのような保護されたポリペプチド、TFA GAのようなTFAポリペプチド、及びGAのようなポリペプチドと本質的に非反応物であるために、並びに、それらが精製方法の間にＧＡの溶液から容易に除去されるために、臭素スカベンジャーとして選択される。同様に、任意の臭素スカベンジャー剤は、それとその臭素との反応産物が、保護されたＧＡのような保護ポリペプチド、TFA GAのようなTFAポリペプチド、及びGAのようなポリペプチドと反応せず、最終精製方法の間に容易に除去可能であれば用いることができる。
【００５５】
金属不純物
GAは、二つの医薬品剤形、凍結乾燥粉末及び予め充填されたシリンジで市販されている。このシリンジは、商標Copaxone(R)インジェクションの下に市販されており、通常、清澄な溶液を含んでいる。貯蔵はシリンジを冷蔵で維持するよう指示している。しかしながら、Copaxone(R)の予め充填された水溶液中に赤色が検出された。該溶液中の色の源は不明であった。
【００５６】
該溶液を室温で１２〜２４時間維持した場合に色が現れた。
【００５７】
金属器具中でのHBrの生産は、HBr中の微量金属イオン不純物をもたらすことが判定された。HBrが後に保護されたGAと混合されたとき、HBr中の該金属イオン不純物はTFA GA及びGAによってキレートされた。それらのTFA GA及びGA/金属錯体が呈色に寄与した。
【００５８】
結果として、例えばＧＡ産物の純度を保証するその他の測定は、33% HBr/酢酸溶液の生産のために非金属反応器を使用することであった。HBr/酢酸溶液の生産のために用いられる反応器は、例えばＧＡなどの純度に後で影響し得る不純物の形成を防ぐため、ガラス内張反応器である。HBr溶液と金属との接触を防ぐため、パイピングの一部にテフロン（登録商標）内張が用いられる。同様に、他のタイプの非反応、酸耐性非金属装置が、HBr/酢酸溶液中の微量金属イオンの形成を防ぐために使用することができる。HBr/酢酸溶液の生産のための非金属器具の使用によりＧＡから赤色を排除することが成功した。非金属器具がHBr/酢酸溶液の生産のために用いられた場合、その溶液は本質的に金属イオンを含まず、赤いＧＡが形成されなかった。
【００５９】
さらに、HBr/酢酸の各バッチの色が、保護されたGAの脱保護のために用いられる前の不純物のレベルを判定するために測定される。HBr溶液中の金属イオン不純物のレベルは、可視的分析によって判定可能であることが分かった。2000 APHA未満の色を有するHBr溶液は、赤色なしでグラチラマーアセテートを生産することが示された。
【００６０】
本発明は、以下の実施例によって例証されるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
［実施例１］HBR/酢酸中の臭素濃度がTFA GA中及びGA中の臭素化チロシン成分に及ぼす影響
臭化水素酸／酢酸中の遊離臭素がTFA-GA中及びGA中の臭素化チロシン成分のレベルに及ぼす影響を測定するために、酢酸中の臭化水素酸に種々の量の臭素を混入した。実験において、臭素スカベンジャーで前処理されていないHBrを製造方法中に用いた。種々のレベルの臭素不純物（HBr／酢酸溶液の割合として測定した）を加えた。TFA GA中及びGA中の臭素化チロシン成分のレベルは、TFA GA及びGAをそのアミノ酸成分に加水分解し、次いで、HPLCを用いてTFA GA及びGAに関してブロモチロシンの量を定量することによって測定した。
【００６２】
［方法］
標準溶液の調製
2 μg/mLのブロモチロシンを含有する標準溶液を、蒸留水を用いて調製した。アミノ酸標準ストック溶液は、以下のアミノ酸を用いて調製した：
【表Ａ】
2008512494.tif 000003
アミノ酸を水に溶解した。数滴の5 N NaOHを加え、水を加えて最終容量25 ｍLにした。
【００６３】
加水分解
10 mgのグラチラマーアセテート及び10 mgのTFA GAを、それぞれ別々に5 mLの加水分解バイアル中に秤量した。ネガティブコントロールのバイアルを、5 mLの加水分解バイアルに0.5 mLのアミノ酸標準ストック溶液を加えて調製した。0.5 mLの水及び1%のフェノールを含有する0.5 mLの濃HClを各バイアルに加えた。バイアルをN2雰囲気下で110℃に２４時間熱した。次いでサンプルを室温まで冷却した。それぞれの水解物を5 mLのメスフラスコに移し、蒸留水で容積まで満たした。
【００６４】
クロマトグラフィー
ブロモチロシン標準、及びそれぞれの水解物を、アセトニトリル：水：酢酸が４：９５：１の割合の溶出液を用いてHPLCカラムを通して個々に溶出した。このカラムを、ＵＶ検出器及びデータ記録システムに備えた。アミノ酸標準を、ブロモチロシンに対応するグラチラマーアセテート水解物中のピークを決定するためのネガティブコントロールとして用いる。
【００６５】
データ分析
TFA GA及びGAサンプルのそれぞれにおける臭素化チロシン成分の割合を、以下のように算出した：
Ｐ＝ブロモチロシン標準の純度（パーセント）
Ａｓ＝ブロモチロシン標準ピークエリア
Ａｐ＝各サンプルにおけるブロモチロシンピークエリア
Ｃｓ＝ブロモチロシン標準の濃度(μg/mL)
Ｃｐ＝グラチラマーアセテートの濃度（又はTFA GAの)
【化２】
2008512494.tif 000004
【００６６】
表１は、TFA グラチラマーアセテート中及びグラチラマーアセテート中における臭素化チロシン成分のレベルに及ぼす遊離臭素の影響を示す。
【表１】
2008512494.tif 000005
【００６７】
結果
上記の実施例から、臭素によるHBrの汚染は、臭素が加えられなかった標準反応と比較して、TFA GA中及びGA中に高レベルの臭素化チロシン成分をもたらすと言うことができる。臭素が加えられない場合、HBrが臭素スカベンジャーで処理されていないために、いくらかの遊離臭素がなお有効であり（available）、GA及びTFA GAの臭素化チロシン成分汚染がやはり表れた。
【００６８】
0.2％未満のレベルでの臭素化チロシン成分不純物を有するGAを調製するためには、HBr中の遊離臭素のレベルが臭素スカベンジャーの添加によって低下されなければならない。
【００６９】
［実施例２］33% HBRの酢酸溶液の生産
ガラス内張反応器は酢酸ですすぎ、次いで空にする。1013 kgの酢酸を該反応器に加える。酢酸を10〜20℃の温度で維持する。溶液を混合しながら、522 kgのHBrガスを該反応器中に導入する。ガスを導入した後、該溶液をさらに３０分間混合する。HBr含有量が33%であるか否かを判定するために該溶液を試験する。
【００７０】
［実施例３］フェノールを臭素スカベンジャーとして用いる、HBR/酢酸溶液の精製
33% HBrの酢酸溶液を、ガラス内張反応器に注いだ。フェノールを秤量し、該HBr溶液に重量比1〜100で加えた。次いで該溶液を12〜24時間撹拌した。次いで、精製されたHBr溶液を、保護されたグラチラマーアセテートに加える。保護GAとのHBrの反応は、TFA GAを形成する。該TFA GAはピペリジンと反応してGAを形成する。
【００７１】
［実施例４］種々のバッチにおける臭素化チロシンのレベル
グラチラマーアセテートの種々のバッチにおける臭素化チロシン成分のレベルを実施例１に記載の方法を用いて測定した。
【表Ｂ】
2008512494.tif 000006
結果
実施例２の方法のように新規の方法を用いて生産し、実施例３のようにフェノールで処理したHBrは、臭素及び金属不純物を含まなかった。それ故、生産されたグラチラマーアセテートは実質的に臭素化チロシン成分を含まなかった。
【００７２】
外部の供給者から購入したHBr（従来方法）は不純物を有し、それ故、それを用いて生産したグラチラマーアセテートも、フェノールをチロシンスカベンジャーとして用いてさえ、臭素化チロシン成分不純物を有した。
【００７３】
［実施例５］色判定
HBr/酢酸溶液の色を、標準可視色判定技術を用いて判定した。
【００７４】
米国公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）色指数は、それぞれのＡＰＨＡユニットが白金コバルト（PtCo）の500 ppmストック溶液の希釈に基づいた、単一数の黄色度指数である（HunterLab, APHA Background, Applications Note, Insight on Color November 16-30, 1996, Vol. 8, No. 16. available at http: //www.hunterlab.com/appnotes/anll 96br2.pdf.）。APHA測定は、前記溶液を管理された量の塩化白金酸カリウム及び塩化コバルトを含有するPtCo標準と可視的に比較することによって判定される。各数ユニットは、溶液１リットル当り1 mg（ppm）の白金の当量である。標準及び相当する測定値は、それらのppm測定値に従って命名される。即ち、第20 APHA標準は、20 ppmの白金を含有すし（American Chemical Society, General Directions及びProcedures: Measurement of Physical Properties available at http://pubs.acs.org/reagent demo/sec o002.html.）、蒸留水はAPHA値が０であり、ストック溶液はAPHA値が500 ppmである（HunterLab, APHA Background, Applications Not, Insight on Color, November 16-30, 1996, Vol. 8, No. 16. available at http: //www.hunterlab. com/appnotes/anll 96br2.pdf.）。APHA測定は、当該分野で周知の種々の機器で行うことができる。
【００７５】
APHA色標準「500」及びAPHA色標準「1000」を調製した。APHA色標準「500」は、1.246 gの塩化白金酸カリウム、K2PtCl6（50 mgの金属白金に相当する）及び1.00 gの結晶化塩化コバルト、CoCl2-6H2O（約250 mgの金属コバルトに相当）を、100 mlの濃HClと共に蒸留水に溶解し、蒸留水で1000 mLに希釈して調製した。
【００７６】
APHA色標準「1000」は、2.492 gの塩化白金酸カリウムK2PtCl6及び2.00 gの結晶化塩化コバルトCoCl2-6H2Oを200 mLの濃HClと共に蒸留水に溶解し、蒸留水で1000 mLに希釈して調製した。
【００７７】
以下のバッチは、先に記載したように、非金属器具を用いて生産した。それらのサンプルは、白い背景に対して垂直に100 mLネスラーチューブを見ることによって、色標準に対して視覚的に色を試験した。
【表Ｃ】
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それらのHBr/酢酸のバッチの色は、それらが臭素及び金属イオン不純物を本質的に含まないことを示した。色が2000 APHA未満であったため、それらのバッチは、金属イオン不純物を本質的に含まないとみなされた。
【国際調査報告】
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