(57)【要約】  本発明は、得られたカルバミル化エリトロポイエチンが、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約１０％未満の遊離第１級アミンを有し、Ｌｙｓ−Ｃタンパク質分解に暴露した場合に消化されず、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにおいて１μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さず、座骨神経アッセイで約０．６５未満の静止座骨神経指標を示すようなカルバミル化エリトロポイエチンを生成するための方法に関する。さらに、本発明は、本発明のカルバミル化エリトロポイエチンを含む医薬組成物ならびにその医薬組成物の興奮性組織の症状および疾患を処置するための使用に関する。
2008505184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約１０％未満の遊離第１級アミンを有するカルバミル化エリトロポイエチンを生成するための方法であって、４ｍｇ／ｍｌ未満の濃度の量のエリトロポイエチンを、約０．０５〜２Ｍの濃度のシアン酸カリウムと、約０．０５〜０．５Ｍの濃度のホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７〜１０）と、約３０〜３８℃の温度で約１〜２４時間の期間接触させることを含み、ここで、カルバミル化エリトロポイエチンが、Ｌｙｓ−Ｃタンパク質分解に暴露した場合に消化されず、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにおいて１μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さず、座骨神経アッセイで約０．６５未満の静止座骨神経指標を示す、方法。
【請求項２】
カルバミル化エリトロポイエチンが、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約７．５％未満の遊離第１級アミンを有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カルバミル化エリトロポイエチンが、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約５％未満の遊離第１級アミンを有する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
エリトロポイエチンの濃度が、約１．１〜約２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
エリトロポイエチンの濃度が、約２．２ｍｇ／ｍｌである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
シアン酸カリウムの濃度が、約０．５〜約１．５Ｍである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
シアン酸カリウムの濃度が、約１Ｍである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ホウ酸ナトリウムバッファーの濃度が、約０．１〜約０．５Ｍである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ホウ酸ナトリウムバッファーの濃度が、約０．５Ｍである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
温度が、約３６〜約３８℃である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
温度が、約３７℃である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
期間が、約１４〜２４時間である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
期間が、約１６時間である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
カルバミル化エリトロポイエチンが、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲアッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さない、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
エリトロポイエチンが、組換えエリトロポイエチン、長時間作用性エリトロポイエチン、エリトロポイエチン誘導体、エリトロポイエチン類似体、エリトロポイエチン抱合体、エリトロポイエチン融合タンパク質、化学的修飾エリトロポイエチン、エリトロポイエチン変異タンパク質、発現系が媒介するエリトロポイエチンのグリコシル化修飾体、合成エリトロポイエチン、または天然に存在するエリトロポイエチンである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
エリトロポイエチンが、ヒトエリトロポイエチンである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
エリトロポイエチンが、アシアロエリトロポイエチンである、請求項１８記載の方法。
【請求項１９】
静止座骨神経指標が、約０．６２未満である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
静止座骨神経指標が、約０．６０未満である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
無毒性の治療上有効量のカルバミル化エリトロポイエチンならびに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であって、カルバミル化エリトロポイエチンが、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約１０％未満の遊離第１級アミンを有し、Ｌｙｓ−Ｃタンパク質分解に暴露した場合に消化されず、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにおいて１μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さず、座骨神経アッセイで約０．６５未満の静止座骨神経指標を示す、医薬組成物。
【請求項２２】
カルバミル化エリトロポイエチンが、リジンおよびＮ末端アミノ酸に約７．５％未満の遊離第１級アミンを有する、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
カルバミル化エリトロポイエチンが、リジンおよびＮ末端アミノ酸に約５％未満の遊離第１級アミンを有する、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
カルバミル化エリトロポイエチンが、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さない、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２５】
静止座骨神経指標が、約０．６２未満である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２６】
静止座骨神経指標が、約０．６０未満である、請求項２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
無毒性量の請求項２２記載の医薬組成物を投与することを含む、興奮性組織の症状または疾患の処置方法。
【請求項２８】
興奮性組織が、心臓、眼、または腎臓組織である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
症状または疾患が、視神経炎、眼への鈍的もしくは穿通性損傷、眼の感染、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、黄斑変性、網膜剥離、網膜色素変性、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、冠動脈疾患、心筋梗塞、ドレスラー症候群、狭心症、先天性心疾患、弁膜性心筋症、プリンツメタル型狭心症、心破裂、動脈瘤中隔穿孔、脈管炎、不整脈、うっ血性心不全、心筋症、心筋炎、肺性心、心臓への鈍的もしくは穿通性外傷、毒性中毒、腎不全、血管／虚血、間質病、糖尿病性腎臓疾患、ネフローゼ症候群、腎臓感染、またはヘノッホ・シェーンライン紫斑病である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
カルバミル化エリトロポイエチンが、１０％未満の凝集物を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
カルバミル化エリトロポイエチンが、６％未満の凝集物を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
カルバミル化エリトロポイエチンが、２％未満の凝集物を有する、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
エリトロポイエチンが、以前から認識されている造血活性に加えて組織保護活性を有することが最近発見されている。ＰＣＴ／ＵＳ００／１００１９。エリトロポイエチンの組織保護態様に関する更なる研究により、２つの作用を分けることができ、そしてこれは、エリトロポイエチンのアミノ酸骨格に対する化学的および変異的修飾のような種々の修飾により達成され得るということが示されている。ＰＣＴ／ＵＳ０１／４９４７９およびＰＣＴ／ＵＳ０３／２０９６４。特にリジンまたはＮ末端アミノ酸のうちでエリトロポイエチンの１個以上の第１級アミノ基のカルバミル化により組織保護性サイトカインを作製することができるということが注目されている。ＰＣＴ／ＵＳ０１／４９４７９。
【０００２】
タンパク質アミノ基のカルバミル化は、尿素の存在下で自然に発生する。これは、尿素と平衡状態にあるシアン酸アンモニウムの反応性形態であるイソシアン酸のためであり、Ｎ末端アミノ酸およびリジンの側鎖の第１級アミノ基と反応する。このカルバミル化は、エリトロポイエチン内で同様に観察されている。
【０００３】
タンパク質をカルバミル化する方法は、同様に開示されている。GR Stark、Methods in Enzymology 11: 590-594(1967)、GR Stark、W.H.SteinおよびS.Moore、J.Biol.Chem 235: 3177-3181(1960)。加えて、１つのアミノ基を他のものより優先して選択的にカルバミル化する、すなわちリジンの優先的カルバミル化のための方法が記載されている。Zeng,J.(1991)。カルバミル化およびグアニジン化によるメタロチオネインのリジン修飾、Methods in Enzymology 205: 433-437。エリトロポイエチンのカルバミル化は、そのエリトロポイエチン活性に及ぼすその有害な影響を決定するために評価されている。K.C.MunおよびT.A.Golper(2000)。シアン酸塩カルバミル化により損なわれたエリトロポイエチンの生物学的活性。Blood Purif.18: 13-17; R.Satake、H.Kozutsumi、M.Takeuchi、K.Asano(1990)。エリトロポイエチンの化学的修飾：グアニジン化によるインビトロ活性の増加。Biochim.Biophys Acta 1038: 125-129; およびL.O.Pedersenら、Eur J Immunol 25: 1609-1616(1995)。しかしながら、カルバミル化エリトロポイエチンが何らかの組織保護活性を有するかどうかの認識は全くなく、それがエリトロポイエチンの造血効果に関係するという理由だけで、これらの初期の研究は、単にエリトロポイエチンのリジンのカルバミル化の影響を評価するだけであった。加えて、これらの文献は、エリトロポイエチン内で生じるアミノ酸のカルバミル化の実際の程度とは対照的に、エリトロポイエチンに及ぼすその影響に関してカルバミル化を特徴付けした。
【０００４】
更に、カルバミル化エリトロポイエチンの治療用途が新たに発見されたので、特に規制基準に従ってそれを製造する目的のための放出アッセイとしてのカルバミル化エリトロポイエチンの治療活性を確認するためのアッセイに関して必要性が存在する。第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４９４７９号、第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２０９６４号、第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２１３５０号、第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１５７３３号、第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１５８６３号および米国特許出願第１０／１８５８４１号（参照として本明細書に組み入れられる）に開示されるように、化合物の組織保護効果、例えば外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、脳卒中モデル、多発性硬化症のためのＥＡＥモデルを評価するためのいくつかのアッセイが開示されている。しかしながら、これらのアッセイには、完了するために相当量の時間および熟練した人材が必要であり、そして化合物の組織保護効果の検証が、アッセイ開始後数週間または数ヶ月ではできないこともある。好ましくは、放出アッセイは、より短時間内に完了でき、そして再現性の高い結果を提供できるべきである。したがって、カルバミル化エリトロポイエチンの治療活性を検証するための迅速かつ再現性のあるアッセイに関する必要性が依然存在する。
【０００５】
望ましくないレベルの凝集物のような夾雑物を含まない一貫したレベルのカルバミル化を呈するカルバミル化エリトロポイエチンを生成するための方法に関する必要性が依然として存在している。生物学的化合物は、十分に特徴付けられ、そして一貫すべきという食品医薬品局の規制要件に鑑みて、カルバミル化エリトロポイエチンの特徴を確認する方法および生物学的化合物の活性を容易に検証するための生物学的放出アッセイに関する必要性が存在する。
【０００６】
本発明は、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約１０％未満の遊離第１級アミンを有するカルバミル化エリトロポイエチンを生成するための方法に関する。該方法は、４ｍｇ／ｍｌ未満の濃度の量のエリトロポイエチンを約０．０５〜２Ｍの濃度のシアン酸カリウムと、約０．０５〜０．５Ｍの濃度のホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７〜１０）と、約３０〜３８℃の温度で、約１〜２４時間の期間接触させることを包含する。得られたカルバミル化エリトロポイエチンは、Ｌｙｓ−Ｃタンパク質分解に暴露した場合に消化されず、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにおいて１μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さず、座骨神経アッセイで約０．６５未満の静止座骨神経指標を示す。最も好ましくは、リジンおよびＮ末端アミノの第１級アミノ基のみがカルバミル化される。
【０００７】
好ましい実施態様では、該方法のカルバミル化エリトロポイエチンは、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約７．５％未満の遊離第１級アミンを有し、最も好ましい実施態様ではカルバミル化エリトロポイエチンは、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約５％未満の遊離第１級アミンを有する。別の実施態様では、カルバミル化エリトロポイエチンは、１０％未満の凝集物、好ましい実施態様では６％未満の凝集物、最も好ましい実施態様では２％未満の凝集物を有する。
【０００８】
本方法の実施態様では、エリトロポイエチンは、組換えエリトロポイエチン、長時間作用性エリトロポイエチン、エリトロポイエチン誘導体、エリトロポイエチン類似体、エリトロポイエチン抱合体、エリトロポイエチン融合タンパク質、化学的修飾エリトロポイエチン、エリトロポイエチン変異タンパク質、発現系が媒介するエリトロポイエチンのグリコシル化修飾体、合成エリトロポイエチン、または天然に存在するエリトロポイエチンである。好ましい実施態様では、エリトロポイエチンはヒトエリトロポイエチンである。別の好ましい実施態様では、エリトロポイエチンはアシアロエリトロポイエチンである。
【０００９】
また、該方法の好ましい実施態様では、反応物中のエリトロポイエチンの濃度は、約１．１〜約２．５ｍｇ／ｍｌであり、更に好ましくは、約２．２ｍｇ／ｍｌである。本方法のシアン酸カリウムは、反応中約０．５〜約１．５Ｍ、最も好ましくは、約１Ｍの濃度で存在する。また、該方法の好ましい実施態様では、ホウ酸ナトリウムバッファーは、反応中約０．１〜約０．５Ｍの濃度で、更に好ましくは、約０．５Ｍの濃度で存在する。加えて、バッファーのｐＨは、好ましくは、ｐＨ８．７〜９．２である。
【００１０】
好ましくは、反応を約３６〜約３８℃の温度で行う。該方法の最も好ましい実施態様では、温度は約３７℃である。好ましい実施態様では、反応を１４〜２４時間、最も好ましい実施態様では約１６時間行う。
【００１１】
該方法の好ましい実施態様では、カルバミル化エリトロポイエチンは、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲアッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さない。別の好ましい実施態様では、カルバミル化エリトロポイエチンの静止座骨神経指標は約０．６２未満であり、最も好ましい実施態様ではカルバミル化エリトロポイエチンの静止座骨神経指標は、約０．６０未満である。
【００１２】
本発明はまた、治療上有効量のカルバミル化エリトロポイエチンならびに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物であって、カルバミル化エリトロポイエチンが、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約１０％未満の遊離第１級アミンを有し、Ｌｙｓ−Ｃタンパク質分解に暴露した場合に消化されず、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにおいて１μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さず、座骨神経アッセイで約０．６５未満の静止座骨神経指標を示す医薬組成物にも関する。
【００１３】
医薬組成物の好ましい実施態様では、カルバミル化エリトロポイエチンは、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約７．５％未満の遊離第１級アミンを有し、最も好ましい実施態様では、カルバミル化エリトロポイエチンは、リジンおよびＮ末端アミノ酸上に約５％未満の遊離第１級アミンを有する。
【００１４】
また、本発明の好ましい実施態様では、医薬組成物中のカルバミル化エリトロポイエチンは、ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性を呈さない。別の実施態様では、医薬組成物は、静止座骨神経指標が０．６２未満、好ましくは、０．６０未満であるカルバミル化エリトロポイエチンを有する。
【００１５】
本発明はまた、無毒性の量の医薬組成物を投与することを含む、興奮性組織の症状または疾患を治療するための方法にも関する。１つの実施態様では、処置され得る興奮性組織は、心臓、眼、または腎臓組織である。別の実施態様では、処置される症状または疾患は、視神経炎、眼への鈍的または穿通性損傷、眼の感染、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、黄斑変性、網膜剥離、網膜色素変性、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、冠動脈疾患、心筋梗塞、ドレスラー症候群、狭心症、先天性心疾患、弁膜性心筋症、プリンツメタル型狭心症、心破裂、動脈瘤中隔穿孔、脈管炎、不整脈、うっ血性心不全、心筋症、心筋炎、肺性心、心臓への鈍的または穿通性外傷、毒性中毒、腎不全、血管／虚血、間質病、糖尿病性腎臓疾患、ネフローゼ症候群、腎臓感染、またはヘノッホ・シェーンライン紫斑病である。
【００１６】
本発明のカルバミル化の方法は、エリトロポイエチンの８個のリジンおよびＮ末端アミノ酸の第１級アミンの選択的カルバミル化を提供する。好ましい実施態様では、本方法は、リジンおよびＮ末端アミノ酸の第１級アミンの独占的なカルバミル化を招き、本明細書では、エリトロポイエチンの完全カルバミル化と称する。本質的には、方法は以下の工程から成る：
Ａ）エリトロポイエチンの濃縮
Ｂ）エリトロポイエチンのカルバミル化
Ｃ）脱塩
Ｄ）完全カルバミル化エリトロポイエチンの精製
Ｅ）完全カルバミル化エリトロポイエチンの分析
Ｆ）インビトロおよびインビボアッセイを用いる非エリトロポイエチン活性および組織保護活性の検証。
【００１７】
Ａ．エリトロポイエチンの濃縮
エリトロポイエチンは、ヒトでは約３４ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質ホルモンである。成熟タンパク質は、約１６５個のアミノ酸を含み、そしてグリコシル化残基は、分子量の約４０％を成す。成熟エリトロポイエチンタンパク質は、８個のリジン残基を有する。Ｎ末端アミノ酸（アラニン）に加えて、これらは、カルバミル化の可能性のある９個の第１級アミノ基を提供する。エリトロポイエチンは、市販により例えば商標ＰＲＯＣＲＩＴでオルト・バイオテック社（ラリタン、ニュージャージー州）から入手可能、ＥＰＯＧＥＮでアムゲン社（サウザンドオークス、カリフォルニア州）から入手可能、およびＲＥＣＯＲＭＯＮでロシュ（バーゼル、スイス）から入手可能である。天然のエリトロポイエチンに加えて、本発明の実施に有用な他の形態のエリトロポイエチンは、ヒトおよび他の哺乳動物エリトロポイエチンの天然、合成、および組換え形態の化学的修飾体、変異タンパク質、および／または発現系が媒介するグリコシル化修飾体を包含する。米国特許第５４５７０８９号および米国特許第４８３５２６０号に記載されるカルボキシ末端でアミノ酸が変化したもの；米国特許第５８５６２９８号に記載されるような分子あたり様々な数のシアル酸残基を有するエリトロポイエチンアイソフォーム；米国特許第４７０３００８号に記載されるポリペプチド；米国特許第５７６７０７８号に記載されるアゴニスト；米国特許第５７７３５６９号および第５８３０８５１号に記載されるようなエリトロポイエチン受容体に結合するペプチド；米国特許第５８３５３８２号に記載されるような小型分子擬似物質；ならびにＰＣＴ／ＵＳ００／１００１９およびＰＣＴ／ＵＳ０３／２０９６４に記載されるようなエリトロポイエチン活性を欠如する化学的修飾エリトロポイエチン（例えばアシアロエリトロポイエチン）または組換えエリトロポイエチン（例えばＳ１００ＥまたはＳ１００Ｅ／Ｋ９７Ａエリトロポイエチン変異タンパク質）などの、分子のエリトロポイエチン活性を改善するように志向された活性を有するエリトロポイエチンの種々の修飾形態が記載されている。加えて、シアル酸残基、グリコシル化部位、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、もしくはその他のタンパク質の一部（融合タンパク質）、または前記の任意の組み合わせの付加により天然に存在するまたは組換えヒトエリトロポイエチンのいずれかよりも大きなインビボ半減期を有するエリトロポイエチンの修飾形態が開発されている。かかる長時間作用性エリトロポイエチンの実例は、アムゲン社（サウザンドオークス、カリフォルニア州）から入手可能なＡＲＡＮＥＳＰ、ロシュ（バーゼル、スイス）から入手可能なＣＥＲＡ、ならびに国際公開公報第０３０２９２９１号で教示されるジグリコシル化およびペグ化エリトロポイエチンである。長時間作用性エリトロポイエチンには、限定するものではないが、米国特許第５８５６２９８号で教示されるようなシアル酸残基の増加、欧州特許第０６４０６１９号に教示されるような糖の付加、国際公開公報第０１０２０１７号および国際公開公報第００３２７７２号に教示されるようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基の付加、米国特許出願番号第２００４０００９９０２号、第２００３０１２４１１５号および第２００３０１１３８７１号ならびに米国特許第６２４２５７０号に教示されるようなエリトロポイエチンとの融合によるタンパク質の付加、化学的修飾、ＰＣＴ出願番号第ＵＳ９４／０２９５７号および米国特許出願番号第２００３００７７７５３号に教示されるような組換えもしくは天然に存在するいずれかのヒトエリトロポイエチンの天然に存在するグリコシル化パターンの修飾、ならびに／または米国特許出願番号第２００２００８１７３４号に教示されるような変異体により、半減期が延長されたエリトロポイエチンが含まれる。更なる長時間作用性エリトロポイエチンには、以下の特許出願：国際公開公報第０１０２０１７号、欧州特許第１０６４９５１号、欧州特許第１３４５６２８号、国際公開公報第０３０２９２９１号、欧州特許第０６４０６１９号、第ＵＳ２００３０７７７５３号、第ＵＳ２００３０１２００４５号、ならびに米国特許第６５８３２７２号および第６３４０７４２号に教示される、ジグリコシル化およびペグ化エリトロポイエチン抱合体が挙げられる。本発明の目的のために、エリトロポイエチンに対する言及には、エリトロポイエチン、長時間作用性エリトロポイエチン、エリトロポイエチン誘導体、エリトロポイエチン類似体、エリトロポイエチン抱合体、エリトロポイエチン融合タンパク質等が挙げられるべきである。
【００１８】
該方法を溶液中でエリトロポイエチンを用いて実施することができるが、溶液の処理容量が少ないことが、反応の速度および完全性に最良である。限定するものではないが、遠心ろ過および攪拌ろ過を含む限外ろ過方法を用いてエリトロポイエチンを濃縮することができる。約１０ｋＤａ以下の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を限外ろ過方法に用いる。濃縮手順の後、エリトロポイエチンは、約２ｍｇ／ｍｌ超約２０ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは約２．２〜約１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、約４〜６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在すべきである。
【００１９】
Ｂ．エリトロポイエチンのカルバミル化
エリトロポイエチンを濃縮した後、エリトロポイエチンのカルバミル化を行う。反応のための試薬は、エリトロポイエチンに加えてシアン酸塩およびバッファーから成る。いくつかの因子が、限定するものではないが、（１）試薬の濃度（エリトロポイエチン、シアン酸塩）；（２）反応のバッファーおよびｐＨ；（３）反応の温度；および（４）反応時間の長さ；を含むカルバミル化手順に影響する。これらを以下で論じる。
【００２０】
（１）試薬の濃度
（ａ）エリトロポイエチン
カルバミル化反応溶液では、エリトロポイエチンの濃度は前記で記した濃度の約半分、すなわち約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは、約２〜４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、約２〜３ｍｇ／ｍｌである。
【００２１】
（ｂ）シアン酸塩
本方法に適切なシアン酸塩には、限定するものではないが、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸アンモニウム、または任意のその他の許容される陽イオンが挙げられる。好ましくは、シアン酸塩はシアン酸カリウムである。またカルバミル化の前に、シアン酸塩をエタノール（５０〜１００％）から再結晶するのが好ましい。加えて、再結晶したシアン酸塩の効力を検証するために、小規模な試験的カルバミル化反応を行って、用いられる再結晶されたシアン酸塩でエリトロポイエチンが完全にカルバミル化されることを検証することができる。反応溶液中のシアン酸塩の濃度は、好ましくは、約０．０５〜１．７５Ｍ、更に好ましくは、約０．５〜１．５Ｍ、最も好ましくは、１Ｍである。
【００２２】
（２）反応のバッファーおよびｐＨ
好ましくは、バッファーは、溶液のｐＨを約７〜１０、最も好ましくは、約８．７〜９．２に維持することができるべきである。適当なバッファーには、限定するものではないが、リン酸塩バッファーおよびホウ酸塩バッファーなどの任意のアミン不含バッファーが含まれる。好ましくは、バッファーは、ホウ酸塩バッファー、更に好ましくは、それはホウ酸ナトリウムバッファーである。カルバミル化反応溶液中のバッファーの濃度は、好ましくは、約０．０５〜０．５Ｍ、最も好ましくは、０．５Ｍである。
【００２３】
（３）反応の温度
反応溶液を適当な温度に維持する。特に溶液の温度を３０〜３８℃、好ましくは、約３６〜３８℃、最も好ましくは、約３７℃に維持してもよい。
【００２４】
（４）反応の時間
エリトロポイエチンのすべてのリジンおよびＮ末端アミノ基のカルバミル化を招くのに十分な時間で反応を行うべきである。約１〜約２４時間、好ましくは、約６〜約２４時間、更に好ましくは、約１４〜約１７時間、そして最も好ましくは、約１６時間反応を行うことができる。
【００２５】
Ｃ．脱塩
カルバミル化反応に続いて反応溶液を脱塩する。これは、限定するものではないが、透析、脱塩カラムまたは遠心ろ過装置などの種々の方法によりこれを達成できる。例えば、反応溶液を、約１００〜１０００倍容量の蒸留水、リン酸塩バッファー（ｐＨ〜７．２）、クエン酸塩バッファー（ｐＨ〜６．８）、または１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．６）に対して、約２〜８℃で透析（複数回交換する）することができる。あるいはＧ−２５セファデックスを含むＰＤ−１０カラム（双方共にアメルシャム・バイオサイエンシズ社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から入手可能）を用いて脱塩を行うことができる。
【００２６】
Ｄ．精製
脱塩後、反応溶液を精製してカルバミル化エリトロポイエチンを単離し、そして凝集物を除去する。反応溶液の精製は、限定するものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過（サイズ排除）クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および限外ろ過技術などの種々のクロマトグラフィー法を用いて達成することができる。上述の方法のいずれか１つまたはこれらの方法の組み合わせを用いて精製を達成することができ、例えばProtein Purification Handbook、18-1132-29，アメルシャム・ファルマシア・バイオテックを参照のこと。例えばセファクリルＳ−１００のようなゲルろ過カラムを用いて０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ約７．０〜７．２）でカルバミル化エリトロポイエチンの精製を達成することができる。
【００２７】
この最終手順の結果は、約１０％未満の遊離第１級アミン（すなわち約９０％超のリジンがホモシトルリンに修飾される）、好ましくは、約７．５％未満の遊離第１級アミン（すなわち約９２．５％超のリジンがホモシトルリンに修飾される）、最も好ましくは、約５％未満の遊離第１級アミン（すなわち約９５％超リジンがホモシトルリンに修飾される）を有するカルバミル化エリトロポイエチンである。加えて、カルバミル化エリトロポイエチンは、溶液中の凝集物が約１０％未満、好ましくは、凝集物が約６％未満、最も好ましくは、凝集物が約２％未満であるべきである。
【００２８】
Ｅ．カルバミル化エリトロポイエチンの分析
カルバミル化手順の完了時に：（１）エリトロポイエチンが完全にカルバミル化されている；（２）カルバミル化エリトロポイエチンが純粋であり凝集物を含まない；および（３）カルバミル化エリトロポイエチンがエリトロポイエチン活性を欠如する；および（４）カルバミル化エリトロポイエチンは、組織保護性である；ことを確認することが必要である。
【００２９】
（１）カルバミル化の完全性
リジンおよびＮ末端アミノ基の完全なカルバミル化を、限定するものではないが、カルバミル化エリトロポイエチンのタンパク質分解（Ｌｙｓ  Ｃ消化、トリプシン消化、酸またはアルカリ加水分解等を用いる）、続く質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（登録商標）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−ＴＯＦ）、トリプル四重極ＴＯＦ、およびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ゲル電気泳動もしくは等電点ゲル電気泳動（ＩＥＦ）、またはアミノ酸分析（ヘモシトルリンに関して）を含むいくつかの技術を用いて検証することができる。
【００３０】
例えばＩＥＦゲルを最初に用いてカルバミル化が成功したことを確認することができる。カルバミル化が成功した場合、カルバミル化エリトロポイエチンのＩＥＦゲルは、約３．５〜５のＰＩを有するエリトロポイエチンと比較して３．５未満のＰＩを示す。
【００３１】
１６％トリシンゲルまたは１８％トリグリシンゲルのようなＰＡＧＥによるカルバミル化エリトロポイエチンのＬｙｓ−Ｃ消化の分析を用いてエリトロポイエチンのカルバミル化の程度の更に正確な測定を行うことができる。Ｌｙｓ−Ｃは、（酸性アミノ酸がそれに続かない場合）未修飾リジン残基の後のタンパク質を切断するエンドペプチダーゼである。エリトロポイエチン分子には、８個のリジン残基が存在するが、そのうちの２個には、グルタミン酸が続く。したがってＬｙｓ−Ｃは、エリトロポイエチンを６個の部位で７個の小型ペプチドに切断し、これらは未消化のカルバミル化エリトロポイエチンよりも速く移動する。６個すべてのリジン残基がカルバミル化された場合、得られたカルバミル化エリトロポイエチンは、Ｌｙｓ−Ｃにより消化されず、そしてＬｙｓ−Ｃ処理カルバミル化エリトロポイエチンは、Ｌｙｓ−Ｃにより消化されていないカルバミル化エリトロポイエチンと同一のスポットに移動する。カルバミル化エリトロポイエチン生成物が完全にカルバミル化されていない場合、それは、Ｌｙｓ−Ｃにより部分的に消化される。したがって、カルバミル化エリトロポイエチン生成物のＬｙｓ−Ｃ消化物のゲル分析によりカルバミル化のレベルが推測される。好ましくは、ＰＮＧａｓｅを用いるカルバミル化エリトロポイエチンの脱グリコシル化の前にＬｙｓ−Ｃ消化を行うことができる。
【００３２】
Ｌｙｓ−Ｃ消化のために試料（２００μｇ）を真空下乾燥させ、そして６ＭグアニジンＨＣｌ、２５０ｍＭトリス（ｐＨ９．５）に溶解する。０．１Ｍジチオエリスリトール（ＤＴＥ）２５μｌを加え、そして暗中３７℃でインキュベーションを続ける。３０分後、ヨードアセタミド（ＩＡＡ）（０．６Ｍ）２５μｌを加え、そして暗中室温で６０分間インキュベーションを続ける。最後に試料を５ｍｌハイトラップＧ２５カラム（アメルシャム−バイオサイエンシズ、リトルチャルフォント、英国）で５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、０．４Ｍ尿素（ｐＨ８．３）に脱塩する。１／４容量（タンパク質５０μｇを超えない）をアクロモバクター・リティカス（ロシュ、マンハイム、ドイツ）のＬｙｓ−Ｃプロテイナーゼ２μｇと共に３７℃で２０時間インキュベートする。消化した試料をＲＰ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＭＥＳバッファー系を用いるＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％、インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）のいずれかで分析する。
【００３３】
加えて、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを用いて完全にカルバミル化されたエリトロポイエチン中に残存する遊離アミノ基（リジンおよびＮ末端アミノ酸）を測定することができる。このアッセイでは、３つのアッセイを実行し、１つはエリトロポイエチン用であり、１つはバッファー（対照）用であり、そして１つはカルバミル化エリトロポイエチンを用いる。各試料を遮光チューブ内でホウ酸塩バッファー（０．３Ｎ、ｐＨ＞９．５）中ＴＮＢＳと混合して、タンパク質に関して０．５ｍｇ／ｍｌ、ＴＮＢＳに関して０．３ｍＭの最終濃度、および全反応容量０．５〜１．０ｍｌを達成する。混合物を室温で１時間反応させ、そして次にマイクロキュベットに移す。次いでキュベットをスペクトロフォトメーターで２００〜４００ｎｍでスキャンする。各試料に関するスキャニング結果を印刷し、そしてピークおよびピーク吸光度を各試料に関して同定する。次いでカルバミル化エリトロポイエチン内の遊離アミノ基のパーセンテージを以下のように計算する。（カルバミル化エリトロポイエチン試料に関するピーク吸光度−ブランクに関するピーク吸光度）／エリトロポイエチンに関するピーク吸光度。この評価の目的のために、エリトロポイエチンが１００％遊離アミノ基を有していると仮定する。完全にカルバミル化されたエリトロポイエチン中の遊離アミノ基のパーセンテージは、約１０％以下であり、好ましくは、完全にカルバミル化されたエリトロポイエチン中の遊離アミノ基のパーセンテージは、７．５％以下であり、最も好ましくは、完全にカルバミル化されたエリトロポイエチン中の遊離アミノ基のパーセンテージは、５％以下である。
【００３４】
加えて、アミノ酸マッピング（ホモシトルリンに関して）および質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＬＣ／ＭＳのような）を用いて８個すべてのリジンおよびＮ末端アミノ酸の第１級アミンがカルバミル化されたことを決定することができる。更に、これらの方法を用いてタンパク質を分析し、そして完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンにおいてリジンおよびＮ末端アミノ酸の第１級アミンのみがカルバミル化されていることを確認することができる。
【００３５】
（２）純度および凝集物の除去
本発明の方法に従ってカルバミル化エリトロポイエチン生成物中の凝集物およびタンパク質含量の不在／低レベルを確認する。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元および非還元条件下）のような電気泳動およびＳＥ−ＨＰＬＣ分析のような液体クロマトグラフィーを用いて凝集物の除去を確認することができる。加えてＵＶスキャニング（Ａ２８０）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてタンパク質含量を確認することができる。
【００３６】
（３）カルバミル化エリトロポイエチン活性の検証
（ａ）造血またはエリトロポイエチン活性の欠如
ＴＦ−１またはＵＴ−７／ＥＰＯＲインビトロアッセイを用いて、修飾されたまたは本明細書に記載したような組換え組織保護サイトカインの非エリトロポイエチン活性を検証することができる。ＴＦ−１アッセイでは、ＴＦ−１細胞、ヒト赤白血病細胞系（ＡＴＣＣから入手可能）を５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ−１６４０完全培地（１０％ＦＣＳ）中ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で成長させる。第１日目に細胞を飢餓培地（ＧＭ−ＣＳＦ不含５％ＦＣＳ）で２回洗浄し、そして１０６セル／ｍｌの密度で懸濁し、続いて１６時間インキュベートする。第２日目に９６ウェルプレートを準備する：（１）滅菌水１００μｌを外側のウェルに加えて湿度を維持する；（２）ブランクとして５個のウェルに飢餓培地（ＧＭ−ＣＳＦ不含５％ＦＣＳ）を単独で加える；（３）試薬を含まない細胞対照として５個のウェルに２５０００セル／ウェルを播種する；（４）漸増濃度のエリトロポイエチン（エリトロポイエチンの濃度あたり５ウェル）を伴って２５０００セル／ウェルを播種する；そして（５）残りのウェルに漸増濃度のカルバミル化エリトロポイエチン試料（カルバミル化エリトロポイエチンの濃度あたり５ウェル）を伴って２５０００セル／ウェルを播種する。攪拌プレートの上部に取り付けた軌道振動プラットフォームを用いて内容物を短時間で、そして注意深く混合する。アッセイで用いるエリトロポイエチンおよびカルバミル化エリトロポイエチンの種々の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌである。次いで９６ウェルプレートを加湿インキュベーター内で５％ＣＯ２を伴って３７℃で４８時間インキュベートする。アッセイの第４日目にＷＳＴ−１細胞増殖試薬（ロシュ）の溶液１５μｌを各ウェルに加え、ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベートする。１分間混合した後、プレートリーダーでプレートを読む（４５０ｎｍでの吸収、６５０ｎｍでのバックグラウンド吸収から引く）。この手順は、テトラゾリウム色素の細胞代謝の間に形成されるホルマザン生成物を測定し、これは、細胞生存性／細胞数と相関する。１μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌカルバミル化エリトロポイエチンの存在下に等しい濃度で細胞が増殖できない場合、カルバミル化エリトロポイエチンの非エリトロポイエチン活性が確認されている。
【００３７】
加えて、ヒトエリトロポイエチン依存性白血病細胞系、ＵＴ−７／ＥＰＯＲを用いてカルバミル化エリトロポイエチンの赤血球効果を決定する。ＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞（ドイツ微生物および培養細胞コレクション（ＤＳＭＺ）、カタログ番号ＡＣＣ  ３６３）は、通常５ｎｇ／ｍｌエリトロポイエチンを補充したＲＰＭＩ−１６４０完全培地（１０％ＦＢＳ）中で成長する。エリトロポイエチンに暴露された細胞の増殖／生存（生存率増加）応答は、ホモ二量体古典的エリトロポイエチン受容体により媒介される。増殖応答は、エリトロポイエチン変種が古典的エリトロポイエチン受容体を刺激する能力の定量的測定値でありそれに相関する。前記で開示したＴＦ−１アッセイと類似しているＵＴ−７／ＥＰＯＲアッセイは、エリトロポイエチン（５ｎｇ／ｍｌ）を補充した新鮮ＲＰＭＩ−１６４０完全培地に細胞を移すことにより行われる。次いでフラスコあたり培養物２０ｍｌの入った７５ｃｍ２フラスコ中で細胞を成長させる。アッセイの第２日目に細胞を２回洗浄し、そして２５ｃｍ２フラスコ中飢餓培地（１０％の代わりに３％血清を含有する）に４×１０５セル／ｍｌの密度で再懸濁する。次いで細胞を加湿インキュベーター内で５％ＣＯ２を伴って３７℃で４時間インキュベートする。４時間のインキュベーションの後、９６ウェルプレートを準備し、そして残りの手順は、ウェルあたり２００００セルを播種する以外は、前記で記したＴＦ−１アッセイと同一である。好ましくは、双方のアッセイにおいてカルバミル化エリトロポイエチンは、１μｇ／ｍｌよりも少ない用量で、更に好ましくは、１０μｇ／ｍｌよりも少ない用量でエリトロポイエチン活性を有さない。
【００３８】
（ｂ）組織保護活性
加えて、本発明は、エリトロポイエチンの組織保護活性を確認するための確固とした効率的で、そして効果的な放出アッセイに関する。特に本発明は、放出として座骨神経アッセイを利用する。
【００３９】
スプラーグ・ドーリーラットを用いて座骨神経アッセイを実施する。イソフルラン麻酔下で防寒用毛布によりラット中核体温を３７℃で制御し、そして実験室の温度は、２３℃以上を維持し、そしてラットの左座骨神経を大腿中央で露出させる。２−０シルク（エチコン６８５Ｇ）の結紮を座骨神経周囲に置き、硬質のポリエチレンチューブおよびて滑車系を介して取り付けた１００ｇの重りで安定化させて１分間牽引する。カルバミル化エリトロポイエチンまたは対照（生理食塩水または組織保護サイトカインと同一の濃度のウシ血清アルブミン溶液）の１回用量を静脈内投与した後、即座に結紮を緩め、そして完全に回復するまで動物を加熱毛布上で維持する。デジタルスキャナに立たせたラットの足跡を３回分析することにより神経学的機能を得点化する（S.Erbayraktarら、Proc Natl Acad Sci USA 100: 6741-6746(2003); G.Grassoら、Med Sci Monit 10(l): BR1-3(2004)）。損傷（左）側対非損傷（右）側に関してパラメーターを比較して静止座骨神経指標（ＳＳＩ；上記）を得た。手術後連続４日間毎日分析を実施し、そして曲線下の面積を計算して動物を得点化する。カルバミル化エリトロポイエチンが組織保護性であれば、カルバミル化エリトロポイエチンで処置したラットに関するＳＳＩは、ＰＢＳ処置したラットに関するＳＳＩより小さくなる。好ましくは、カルバミル化エリトロポイエチンに関するＳＳＩは、０．６５以下であり、更に好ましくは、カルバミル化エリトロポイエチンに関するＳＳＩは、０．６２以下であり、最も好ましくは、０．６０以下である。
【００４０】
先に記載した条件下で本発明の座骨神経アッセイは、再現性のある損傷のレベルおよび一貫した応答を実証しており、したがってこのアッセイは、アッセイ開始の５日以内にカルバミル化エリトロポイエチンの組織保護効果を立証するための確固とした方法を提供する。このアッセイの比較的迅速な読み出しおよびこのアッセイのそのロバスト性を考えると、化合物の用量範囲、投与方法およびその他の薬物動態特性を評価するための現実的でそして便利なメカニズムもまた提供される。
【００４１】
Ｆ．更なる修飾
一度、完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンの特性（（１）エリトロポイエチンが完全にカルバミル化されている；（２）カルバミル化エリトロポイエチンが純粋であり、そして凝集物を伴なわない；および（３）カルバミル化エリトロポイエチンは、エリトロポイエチン活性を欠如し、そして（４）カルバミル化エリトロポイエチンは、組織保護性である）が確認されると、完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンを更なる修飾に供することができる。かかる修飾には、限定するものではないが、脱グリコシル化、ペグ化、その他のタンパク質との融合、および更なる化学修飾が挙げられる。
【００４２】
また、本発明の完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンを哺乳動物の内皮細胞バリアを通る分子の輸送を促進する目的のために別の分子に会合させることにより更に修飾することができる。体内の特定の器官の内皮細胞間の緊密な接合は、特定の分子の侵入に対するバリアを創成する。バリアで囲まれた器官内の種々の症状の治療のために、医薬品の通過を促進するための手段が望ましい。本発明の完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンなどのカルバミル化エリトロポイエチンは、他の分子を血液脳関門およびその他の類似のバリアを越えて分布させるためのキャリヤとして有用である。カルバミル化エリトロポイエチンと共にバリアを通過することが望まれる分子を含む組成物を調製し、そして該組成物の末梢投与がバリアを通る組成物のトランスサイトーシスを招く。バリアを通って輸送されることになっている分子とカルバミル化エリトロポイエチンとの間の会合は、不安定な共有結合でもよく、この場合、分子は、バリアを通過した後にカルバミル化エリトロポイエチンとの会合から放出される。カルバミル化エリトロポイエチンとの会合により分子の望ましい薬理学的活性が維持されるかまたは影響されない場合、かかる複合体を投与することができる。
【００４３】
共有結合、非共有結合およびその他の手段により分子を本発明の完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンおよび前記のその他の薬剤と会合させるための種々の手段は、当業者には認識される。更に組成物の有効性の評価を実験系で容易に決定することができる。分子とカルバミル化エリトロポイエチンとの会合を、不安定な、共有結合、架橋等を含むいくつもの手段により達成することができる。ビオチン／アビジン相互作用を用いることができる。例えばカルバミル化エリトロポイエチンをビオチン化し、そして次にアビジンと所望の輸送される分子との不安定な抱合体と複合体形成させる。先に述べたように、組換えまたは合成手段によりハイブリッド分子、例えば望ましい薬理学的活性を有する分子のドメインおよび組織保護活性変調に寄与するドメインの双方を含む融合またはキメラポリペプチドを調製することができる。その分子にプロテアーゼ切断部位を含むことができる。
【００４４】
多官能性分子、すなわち多官能性架橋剤を介して本発明の完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンに分子を抱合させることができる。本明細書で用いる「多官能性分子」なる用語は、ホルムアルデヒドのような１回以上連続して反応することができる１つの官能基を有する分子、ならびに１つ以上の反応基を有する分子を包含する。本明細書で用いる「反応基」なる用語は、架橋剤と分子（例えば内皮細胞バリアを通って分布するペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、特にホルモン、抗生物質または抗癌剤）との間で共有結合を形成するために、その分子の官能基と反応する架橋剤の官能基を意味する。「官能基」なる用語は、有機化学におけるその標準的な意味を有している。用いることができる多官能性分子は、好ましくは、生体適合性リンカーであり、すなわちそれはインビボで非発癌性、無毒性、および実質的に非免疫原性である。当技術分野において公知のおよび本明細書に記載したもののような多官能性架橋剤を動物モデルにおいて容易に試験してその生体適合性を決定することができる。多官能性分子は、好ましくは、二官能性である。本明細書で用いる「二官能性分子」なる用語は、２つの反応基を有する分子を意味する。二官能性分子は、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性でもよい。ヘテロ二官能性架橋剤によりベクトル的抱合が可能になる。架橋反応がｐＨ６〜８に緩衝された水溶液のような水溶液中で生じるために、そして得られた抱合体がより有効な生体分布のために水溶性のままであるために、多官能性分子が水中で十分に安定であることが特に好ましい。典型的には、多官能性分子は、アミノまたはスルフヒドリル官能基と共有結合する。しかしながら、カルボン酸またはヒドロキシル基のような他の官能基と反応する多官能性分子が本発明において企図される。
【００４５】
ホモ二官能性分子は、少なくとも２個の反応性官能基を有し、それは同一である。ホモ二官能性分子の反応性官能基には、例えばアルデヒド基および活性エステル基が挙げられる。アルデヒド基を有するホモ二官能性分子には、例えばグルタルアルデヒドおよびサブアルアルデヒドが挙げられる。架橋剤としてのグルタルアルデヒドの使用は、Poznanskyら、Science 223: 1304-1306(1984)に開示された。少なくとも２つの活性エステル単位を有するホモ二官能性分子には、ジカルボン酸およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルが挙げられる。かかるＮ−スクシンイミジルエステルのいくつかの例には、スベリン酸ジスクシンイミジルおよびジチオ−ビス−（プロピオン酸スクシンイミジル）、およびその可溶性ビス−スルホン酸ならびにそのナトリウムおよびカリウム塩のようなビス−スルホン酸塩が挙げられる。これらのホモ二官能性試薬は、ピアース（ロックフォード、イリノイ州）から入手可能である。
【００４６】
ヘテロ二官能性分子は、少なくとも２つの異なる反応基を有する。反応基は、例えばカルバミル化エリトロポイエチンおよび分子に存在する異なる官能基と反応する。ヘテロ二官能性架橋剤の反応基と反応するこれらの２つの異なる官能基は、通常アミノ基、例えばスルフヒドリル基、例えばシステインのチオール基；カルボン酸、例えばアスパラギン酸のカルボキシラート；またはヒドロキシル基、例えばセリンのヒドロキシル基である。
【００４７】
無論、カルバミル化エリトロポイエチンは、特定の架橋剤との使用に利用可能な適当な反応基を有していない可能性があるが、当業者は、本発明の完全にカルバミル化されたエリトロポイエチンにおける架橋に利用可能な基に基づく架橋剤を選択について十分な認識がある。
【００４８】
ヘテロ二官能性分子の反応基がアミノ基と共有結合を形成する場合、共有結合は、通常アミドまたはイミド結合である。アミノ基と共有結合を形成する反応基は、例えば活性化されたカルボン酸基、ハロカルボニル基、またはエステル基でもよい。好ましいハロカルボニル基は、クロロカルボニル基である。エステル基は、好ましくは、例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基のような反応性エステル基である。
【００４９】
その他の官能基は、典型的には、チオール基、チオール基に変換され得る基、またはチオール基と共有結合を形成する基のいずれかである。共有結合は、通常チオエーテル基またはジスルフィドである。チオール基と共有結合を形成する反応基は、例えばチオール基または活性化ジスルフィドと反応する二重結合でもよい。チオール基と反応することができる二重結合を含有する反応基は、マレイミド基であるが、アクリロニトリルのようなその他のものもまた可能である。反応性ジスルフィド基は、例えば２−ピリジルジチオ基または５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）基でもよい。反応性ジスルフィド結合を含有するヘトロ二官能性試薬のいくつかの例には、３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（Carlssonら、Biochem J.173: 723-737(1978)）、Ｓ−４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチルベンジルチオ硫酸ナトリウムおよび４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエンが挙げられる。３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応基を含むヘテロ二官能性試薬のいくつかの例には、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジルおよびｍ−マレイミド安息香酸スクシンイミジルが挙げられる。
【００５０】
その他のヘテロ二官能性分子には、３−（マレイミド）プロピオン酸スクシンイミジル、４−（ｐ−マレイミド−フェニル）酪酸スルホスクシンイミジル、４−（Ｎ−マレイミドメチル−シクロヘキサン）−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルが挙げられる。ｍ−マレイミド安息香酸スクシンイミジルのスルホン酸ナトリウム塩が好ましい。多くの先に述べたヘテロ二官能性試薬およびそのスルホン酸塩がピアースケミカル社（ロックフォード、イリノイ州、米国）から入手可能である。
【００５１】
先に記載した抱合体が可逆的または不安定であるための必要性は当業者により容易に決定され得る。組織保護活性および望ましい薬理学的活性の双方に関してインビトロで抱合体を試験することができる。抱合体が双方の特性を保持する場合、次いでその適合性をインビボで試験することができる。抱合体分子が活性に関してカルバミル化エリトロポイエチンから分離される必要がある場合、カルバミル化エリトロポイエチンとの不安定な結合または可逆的な会合が好ましい。また不安定性の特徴を標準的なインビトロ手順を用いてインビボ試験の前に試験することもできる。
【００５２】
これらおよびその他の多官能性試薬の作製および使用の仕方に関する更なる情報を以下の出版物または当技術分野において利用可能なその他のものから得ることができる。
【００５３】
【表１】
2008505184.tif 000003
【００５４】
加えて、架橋の方法は、MeansおよびFeeney、Bioconjugate Chem.1: 2-12(1990)により概説されている。
先に記載した本発明の方法および組成物が越えるバリアは、限定するものではないが、血液脳関門、血液眼関門、血液精巣関門、血液卵巣関門、および血液子宮関門が挙げられる。
【００５５】
内皮細胞バリアを通る輸送のための候補分子には、例えば、ホルモン（例えば、成長ホルモン）、神経栄養因子、抗生物質、抗ウイルス剤、または抗菌剤、例えば、通常脳およびその他のバリアに囲まれた器官から排除されるもの、ペプチド放射性医薬品、アンチセンス薬物、生物学的に活性な薬剤に対する抗体および抗ウイルス剤、医薬品、ならびに抗癌剤が挙げられる。かかる分子の非限定例には、成長ホルモンのようなホルモン、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ１）、形質転換成長因子β２（ＴＧＦβ２）、形質転換成長因子β３（ＴＧＦβ３）、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、およびインターロイキン６、ＡＺＴ、腫瘍壊死因子に対する抗体、およびシクロスポリンのような免疫抑制剤が挙げられる。加えて、診断目的で脳およびその他のバリアに囲まれた器官内にある細胞、組織、または器官を可視化するために、色素またはマーカーを本発明のエリトロポイエチンまたは組織保護サイトカインの１つに結合させることができる。例としては、患者のアルツハイマー病の進行を決定するために、脳内のプラークを可視化するために用いられるマーカーをエリトロポイエチンまたは組織保護サイトカインに結合させることができる。
【００５６】
本発明はまた、トランスサイトーシスを介して内皮細胞の緊密な接合バリアを通って輸送される分子および前記したようなカルバミル化エリトロポイエチンを含む組成物にも関する。本発明は、更に先に記載したバリアを越えて分子を分布させるための医薬組成物の調製のための、先に記載したような分子とカルバミル化エリトロポイエチンとの間の抱合体の使用に関する。
【００５７】
医薬組成物
カルバミル化エリトロポイエチンの組織保護活性は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４９４７９号、第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２０９６４号、第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２１３５０号、第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１５７３３号、および第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１５８６３号、ならびに米国特許出願第１０／１８５８４１号（これら全ては参照として本明細書に組み入れられる）に記されている。一般に、本方法から得られたカルバミル化エリトロポイエチンは、主に神経学的または精神医学的徴候を有する中枢神経系または末梢神経系のヒト疾患、眼科疾患、心血管疾患、心肺疾患、呼吸器疾患、腎臓、泌尿および生殖器疾患、骨疾患、皮膚疾患、消化管疾患、ならびに内分泌および代謝異常の治療的または予防的処置に有用である。特に、かかる症状および疾患には低酸素症が挙げられ、これは、興奮性組織、すなわち第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２０９８４号および米国特許出願第１０／１８５８４１号に開示するようなカルバミル化エリトロポイエチンの組織保護効果に応答する組織、例えば、限定するものではないが、中枢神経系組織、末梢神経系組織、または心臓組織もしくは網膜組織または腎臓組織、例えば、脳、心臓、網膜／眼、または腎臓のような興奮性組織に悪影響を及ぼす。
【００５８】
したがって、本発明の医薬組成物を用いて、限定するものではないが、網膜虚血、黄斑変性、網膜剥離、網膜色素変性、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧、糖尿病性網膜症、神経毒中毒の処置（例えば甲殻類ドーモイ酸中毒、ニューロラチリズム、およびグアム病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病）、気分障害、不安障害、抑うつ、自閉症、注意欠陥多動障害、認知機能障害、睡眠障害（例えば睡眠時無呼吸および旅行に関連する傷害）、クモ膜下および動脈瘤出血、低血圧ショック、震盪性損傷、敗血症性ショック、アナフィラキシーショック、および種々の脳炎および髄膜炎の後遺症（例えば狼瘡のような結合組織関連の脳炎）、塞栓性または虚血性損傷のための術後処置；全脳照射、鎌状赤血球クライシス、子癇、吸入中毒の処置（例えば一酸化炭素および煙吸入）、重篤な喘息、成人呼吸窮迫症候群、窒息および溺水、インスリンの不適切な投与で生じ得るまたはインスリン生成新生物（インスリノーマ）を伴う低血糖症、ミトコンドリア機能障害、加齢性の認知機能の喪失および老人性認知症、慢性発作性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、結節性硬化症、ウィルソン病、脳および進行性核上性麻痺、グアム病、レビー小体型認知症、プリオン病（例えば海綿様脳症、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病）、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、フリードリッヒ運動失調およびその他の運動失調、ジルドラトゥレット症候群、発作性障害（例えばてんかんおよび慢性発作性障害）、卒中、脳または脊髄外傷、ＡＩＤＳ認知症、アルコール中毒、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害（例えば高血圧および睡眠障害）、精神神経障害（例えば統合失調症、統合失調感情障害、注意欠陥障害、気分変調性障害、大うつ病性障害、躁病、強迫性障害、精神活性物質使用障害、恐怖症、パニック障害ならびに単極性および双極性気分障害）、ニューロパチー（例えば糖尿病性ニューロパチーまたは化学療法誘起のニューロパチー）、敗血症、ならびに創傷治癒（褥瘡を含む）を含む種々の症状および状況における低酸素症状の結果である興奮性組織に対する傷害を治療または予防することができる。かかる症状および状況の非限定例を本明細書以下の表にて提供する。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
本発明の医薬組成物を本発明のカルバミル化エリトロポイエチンと、限定するものではないがその他の組織保護サイトカインなどの他の治療薬との混合物から作ることができることは当業者には、理解されよう。
【００６１】
１つの実施態様では、カルバミル化エリトロポイエチンのかかる医薬組成物を全身投与して標的細胞、組織または器官を保護または強化することができる。かかる投与は、非経口的、吸入を介して、または経粘膜的、例えば経口、経鼻的、経直腸的、膣内、舌下、粘膜下、または経皮的でもよい。好ましくは、投与は、非経口的、例えば静脈内または腹腔内注射により、そしてまた限定するものではないが、動脈内、筋肉内、皮内、および皮下投与を含む。
【００６２】
潅流液の使用、器官への注射、またはその他の局部投与によるなどの他の投与経路用に、先に記載したような組織保護サイトカインの類似のレベルを招く医薬組成物が提供される。約１５ｐＭ〜３０ｎＭのレベルが好ましい。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、治療上有効量のカルバミル化エリトロポイエチンと、医薬的に許容される担体とを含み得る。好ましくは、治療上有効量のカルバミル化エリトロポイエチンは、無毒性である。具体的な実施態様では、「医薬的に許容される」なる用語は、連邦政府の監督官庁または州政府により承認されたこと、または動物、更には特にヒトにおける使用のための米国薬局方もしくはその他の一般的に認識されている外国の薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」なる用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。かかる医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の石油、動物性、植物性または合成起源のものを含む水および油中の生理食塩溶液のような滅菌液体でもよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、生理食塩溶液が好ましい担体である。生理食塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液を液体担体として、特に注射用溶液に用いることもできる。適切な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。所望により組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤等の形態をとることができる。組成物を従来の結合剤およびトリグリセリドのような担体と共に坐剤として処方することができる。本発明の組成物を中性または塩の形態として処方することができる。医薬的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるものなどの遊離アミノ基で形成されたもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミンノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるものなどの遊離カルボキシル基で形成されたものを含む。適切な医薬担体の例は、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaeutical Sciences」に記載されている。かかる組成物は、治療上有効な量の化合物を、好ましくは精製された形態で、患者への投与に適切な形態を提供するための適当な量の担体と一緒に含有する。処方は、投与様式に適合させるべきである。
【００６４】
経口投与に適合させた医薬組成物をカプセル剤もしくは錠剤として；粉末剤もしくは顆粒剤として；液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤として（水性または非水性液体中）；食用泡状物もしくはホイップとして；または乳剤として提供することができる。錠剤または硬ゼラチンカプセル剤は、ラクトース、デンプンまたはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸またはその塩を含み得る。軟ゼラチンカプセル剤は、植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液体ポリオール等を含み得る。液剤およびシロップ剤は、水、ポリオール、および糖を含み得る。
【００６５】
経口投与が意図される活性薬剤を、消化管における活性薬剤の崩壊および／または吸収を遅延させる材料でコーティングまたはそれらと混合することができる（例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを用いることができる）。したがって、何時間にもわたって活性薬剤の徐放を達成することができ、そして必要により活性薬剤を胃内での分解から保護することができる。具体的なｐＨまたは酵素条件により経口投与用の医薬組成物を、特定の消化管位置での活性薬剤の放出を促進するために、処方することができる。
【００６６】
経皮投与に適合させた医薬組成物を、受容者の表皮に長時間密接に接触したままであることが意図される個々のパッチ剤として提供することができる。局所投与に適合させた医薬組成物を軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油として提供することができる。皮膚、口、眼、またはその他の外部組織への局所投与のために、局所用軟膏剤またはクリーム剤を用いるのが好ましい。軟膏剤に処方する場合、活性成分をパラフィンまたは水混和性軟膏基剤のいずれかと共に用いることができる。あるいは、活性成分を水中油基剤または油中水基剤と共にクリーム剤に処方することができる。眼への局所投与に適合させた医薬組成物には、点眼薬が含まれる。これらの組成物では、活性成分を適当な担体、例えば水性溶媒に溶解または懸濁することができる。口の局所投与に適合させた医薬組成物には、トローチ剤、パステル剤、および洗口液が挙げられる。
【００６７】
鼻および肺投与に適合させた医薬組成物は、粉末（好ましくは、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子径を有する）のような固体担体を含み得る。鼻に近づけた粉末の容器から鼻を介して急速に吸入することにより鼻から吸い込む様式で粉末を投与することができる。あるいは、鼻投与に適合させた組成物は、液体担体、例えば、鼻スプレーまたは点鼻薬を含み得る。あるいは、直接肺への化合物の吸入は、深い吸入またはマウスピースを介する中咽頭への誘導により達成することができる。これらの組成物は、活性成分の水性または油性溶液を含み得る。吸入による投与のための組成物を、限定するものではないが、所定の用量の活性成分を提供するように構成することができる加圧エアロゾル、ネブライザー、または吸入器などの特別に適合させた装置で供給することができる。好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物を鼻腔に直接投与するかまたは鼻腔もしくは中咽頭を介して肺に投与する。
【００６８】
直腸投与に適合させた医薬組成物を坐剤または浣腸剤として提供することができる。膣投与に適合させた医薬組成物をペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、またはスプレー製剤として提供することができる。
【００６９】
非経口投与に適合させた医薬組成物には、水性および非水性滅菌注射用液剤または懸濁剤が含まれ、それは抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および組成物を意図される受容者の血液と実質的に等張にする溶質を含有すことができる。かかる組成物に存在し得るその他の構成要素には、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が挙げられる。非経口投与に適合させた医薬組成物を単位投与または多回投与用容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提示でき、そして使用の直前に滅菌液体担体、例えば注射用の滅菌生理食塩溶液の添加のみを必要とする凍結乾燥した（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時調製用注射液剤および懸濁剤を滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。１つの実施態様では、カルバミル化エリトロポイエチンの注射用液剤を含む自動注入装置を救急車、緊急治療室、および戦場による緊急使用に、更に、特に芝刈り機の不注意な使用によるような外傷性切断の可能性が生じ得る家庭環境における自己投与用に提供することができる。
【００７０】
好ましい実施態様では、組成物をヒトに静脈内投与するために適合させた医薬組成物として従来の手順に従って処方する。典型的には、静脈内投与用の組成物は滅菌等張水性バッファーの溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤およびリドカインのような注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤を含み得る。一般に成分は、別個に、または単位投与形態で一緒に混合してのいずれかで、例えば活性薬剤の量を示したアンプルまたは小袋のような密封した容器中、乾燥凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給される。組成物を注入により投与すべき場合、それを滅菌医薬用等級の水または生理食塩水の入った注入用ビンで投薬することができる。組成物を注射により投与する場合、投与前に成分を混合できるように滅菌生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００７１】
坐剤は、一般に０．５〜１０重量％の範囲の活性成分を含有し、経口製剤は、好ましくは、１０〜９５％の活性成分を含有する。
【００７２】
潅流液組成物を、移植器官浴で使用するために、イン・シトゥー潅流用に、または器官を採る前に器官の供与者の血管系に投与するために、提供することができる。かかる医薬組成物は、個体への急性もしくは慢性の局所または全身投与に適当でないレベルのカルバミル化エリトロポイエチンを含んでもよいが、死体、器官浴、器官潅流液、またはイン・シトゥー潅流において本明細書で意図される機能を提供し、その後、そこに含有されたカルバミル化エリトロポイエチンの濃度を除去するかまたは低下させてから、処置された器官または組織を通常の循環に暴露するかまたは戻す。
【００７３】
本発明は、低酸素症、虚血、外傷、および／または炎症に関連する１つ以上の病徴の治療、予防および改善のための医薬組成物を提供する。具体的な実施態様では、組成物は、カルバミル化エリトロポイエチン、またはカルバミル化エリトロポイエチンおよびその他の組織保護サイトカインを含む。別の実施態様では、組成物は、カルバミル化エリトロポイエチン、またはカルバミル化エリトロポイエチンおよび１種以上の組織保護サイトカイン、ならびに組織保護サイトカイン以外の１種以上の予防用または治療用薬剤を含み、この予防用または治療用薬剤は、炎症、低酸素症、虚血、または外傷に関連する１つ以上の病徴の予防、治療または改善に有用な、または用いられたことがあるか、または現在用いられていることが知られている。
【００７４】
好ましい実施態様では、本発明の組成物は、医薬組成物である。かかる組成物は、予防用または治療用に有効な量の１種以上の予防用または治療用薬剤（例えば組織保護サイトカインまたはその他の予防用もしくは治療用薬剤）および医薬的に許容される担体を含む。１つの実施態様では、「治療上有効量」なる用語は、薬剤を単独で投与する場合に必ずしも有効である必要はないが、その他の薬剤と一緒に同時投与した場合に有効である薬剤の量を含むことを意味する。本発明のカルバミル化エリトロポイエチンの治療上有効量は、組織保護サイトカイン１ｐｇ〜５ｍｇ、５００ｐｇ〜５ｍｇ、１ｎｇ〜５ｍｇ、５００ｎｇ〜５ｍｇ、１μｇ〜５ｍｇ、５００μｇ〜５ｍｇ、または１ｍｇ〜５ｍｇおよび医薬的に許容される担体を含む。好ましい実施態様では、組織保護サイトカインの量は、約１ｐｇ〜１ｍｇの範囲内である。
【００７５】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１種以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む医薬用パックまたはキットをも提供する。場合により医薬的または生物学的生成物の製造、使用、または販売を規制する行政機関により指示された形態の通知をかかる容器に随伴させることができ、その通知は、ヒト投与のための製造、使用、または販売の機関によるに承認を反映する。
【００７６】
特に、本発明は、１種以上の予防用もしくは治療用薬剤、または本発明の医薬組成物を薬剤の量を示したアンプルまたは小袋のような密封容器に詰めることを提供する。１つの実施態様では１種以上の予防用もしくは治療用薬剤、または本発明の医薬組成物を乾燥滅菌した凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として密封容器中で供給し、そして対象に投与するために、例えば水または生理食塩水で適切な濃度に再構成することができる。好ましくは、１種以上の予防用もしくは治療用薬剤、または本発明の医薬組成物を密封容器中の乾燥滅菌した凍結乾燥粉末として、少なくとも５ｍｇ、更に好ましくは、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇの単位投与量で供給する。凍結乾燥した予防用もしくは治療用薬剤、または本発明の医薬組成物をその元の容器中２〜８℃の間で保存すべきであり、そして予防用もしくは治療用薬剤、または本発明の医薬組成物を再構成後、１週間以内、好ましくは、５日以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与すべきである。代替の実施態様では、１種以上の予防用もしくは治療用薬剤、または本発明の医薬組成物を薬剤の量および濃度を示した密封容器中の液体形態で供給する。好ましくは、投与される組成物の液体形態を密封容器中少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで供給する。液体形態をその元の容器中２℃〜８℃の間で保存すべきである。
【００７７】
所望により、活性成分を含有する１つ以上の単位投与形態を含有し得るパックまたはディスペンサーで組成物は存在することができる。パックは、例えばブリスター包装のような金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与に関する指示書を伴うことができる。
一般に、本発明の組成物の成分は、種起源またはかかる組成物の受容者としての種反応性が同一である対象から誘導される。
【００７８】
別の実施態様では、例えばカルバミル化エリトロポイエチンを制御された放出系で分配することができる。例えば静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたはその他の投与様式を用いて、そのポリペプチドを投与することができる。１つの実施態様では、ポンプを用いることができる（Langer、上記；Sefton、CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14: 201(1987); Buchwaldら、Surgery 88: 507(1980); Saudekら、N.Engl.J.Med.321: 574(1989)参照）。別の実施態様では、化合物をベシクル、特にリポソームで分配することができる（Langer、Science 249: 1527-1533(1990); Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-BeresteinおよびFidler(編）、リス、ニューヨーク、353〜365頁(1989)；国際公開公報第９１／０４０１４号；米国特許第４７０４３５５号；Lopez-Berestein、同上３１７−３２７頁参照；一般的には、同上を参照のこと）。別の実施態様ではポリマー材料を用いることができる（Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise（編）、ＣＲＣプレス：ボカラートン、フロリダ（1974); Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall（編）、ワイリー：ニューヨーク（１９８４）；RangerおよびPeppas、J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23: 61(1953)参照; Levyら、Science 228: 190(1985); Duringら、Ann.Neurol.25: 351(1989); Howardら、J.Neurosurg.71: 105(1989)もまた参照）。
【００７９】
更に別の実施態様では、制御された放出系を治療標的、すなわち標的細胞、組織または器官の近位に置くことができ、したがって全身用量のわずかしか必要としない（Goodson、Medical Applications of Controlled Release 2巻115〜138頁 上記(1984)）。その他の制御された放出系は、Langer(Science 249: 1527〜1533(1990)）により概説で論じられている。
別の実施態様では、適切に処方された場合、カルバミル化エリトロポイエチンを経鼻、経口、直腸、膣、または舌下投与により投与することができる。
【００８０】
具体的な実施態様では、本発明のカルバミル化エリトロポイエチンを、治療を必要とする部分に局部的に投与することが望ましく、これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局部注入、例えば手術後の創傷被覆材と組み合わせた局所適用により、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、またはインプラントを用いて達成することができ、前記インプラントは、シラスティック膜のような膜または繊維などの多孔性、無孔性、またはゼラチン様材料のものである。
【００８１】
好ましい有効量の選択は、当業者に公知であるいくつかの要因の考慮に基づいて当業者により容易に決定される。かかる因子には、エリトロポイエチンまたは組織保護サイトカインの特定の形態、およびバイオアベイラビリティー、代謝、半減期等のような薬物動態パラメーターが挙げられるが、それらは医薬化合物の規制認可を得るときに典型的に用いられる通常の開発手順の間に確立されている。用量を考えるときの更なる要因には、処置されるべき症状もしくは疾患、または正常な個体で達成されるべき利点、患者の体重、投与経路、投与が急性または慢性であるか、併用薬、および投与される医薬品の有効性に影響することが周知である他の因子が挙げられる。ゆえに正確な用量は、医師の判断および各患者の状況に従って、例えば個々の患者の症状および免疫状態に依存して、ならびに標準的な臨床技術に従って決定されるべきである。
【００８２】
本発明の別の態様では、潅流液または潅流溶液は潅流および移植用の器官の保存のために提供され、潅流溶液は応答細胞および関連する細胞、組織または器官を保護するのに有効な量のカルバミル化エリトロポイエチンを含む。移植には、限定するものではないが、異種移植〔この場合器官（細胞、組織またはその他の身体部分を含む）を一の供給者から採り、異なる受容者に移植する〕；およびベンチ手術手順（ここでは器官を取り出し、そしてエキソビボであるが、切除、修復またはそうでなければ腫瘍除去のためのような操作を行い、そして次に元の位置に戻すことができる）などの自己移植（この場合器官を身体の一の部分から取り出し、そして別の場所に置き換える）が挙げられる。１つの実施態様では、潅流溶液は、約１〜約２５Ｕ／ｍｌカルバミル化エリトロポイエチン、５％ヒドロキシエチルデンプン（約２００，０００〜約３００，０００の分子量を有し、そして実質的にエチレングリコール、エチレンクロロヒドリン、塩化ナトリウムおよびアセトンを含まない）；２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；３ｍＭグルタチオン；５ｍＭアデノシン；１０ｍＭグルコース; １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー；５ｍＭグルコン酸マグネシウム；１．５ｍＭ  ＣａＣ１２；１０５ｍＭグルコン酸ナトリウム；２００，０００単位／ｍｌペニシリン；４０単位／ｍｌインスリン；１６ｍｇ  デキサメタゾン；１２ｍｇ／ｍｌフェノールレッドを含有し；そしてｐＨ７．４〜７．５および浸透圧約３２０ｍＯｓｍ／ｌであるウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液（米国特許第４７９８８２４号）である。その溶液を用いて移植前の死体腎および膵臓を維持する。その溶液を用いて死体腎保存に推奨される３０時間限界を超えて保存を延長させることができる。この特定の潅流液は、有効量のカルバミル化エリトロポイエチンを含めることにより本使用に適合させることができる多くのかかる溶液の単なる説明にすぎない。更なる実施態様では、潅流溶液は、約１〜約５００ｎｇ／ｍｌカルバミル化エリトロポイエチン、または約４０〜約３２０ｎｇ／ｍｌカルバミル化エリトロポイエチンを含有する。先に述べたように、いずれかの形態のエリトロポイエチンまたは組織保護サイトカインを本発明のこの態様に用いることができる。
【００８３】
本明細書全体にわたる目的のためのカルバミル化エリトロポイエチンの好ましい受容者はヒトであるが、本明細書の方法は他の哺乳動物、特に飼い慣らされた動物、家畜、コンパニオンアニマル、および動物園の動物に同等に適用される。しかしながら、本発明は、そのように限定されるものではなく、そして任意の哺乳動物に利益を適用することができる。
【００８４】
エキソビボの本発明の更なる態様では、カルバミル化エリトロポイエチンおよび限定するものではないが、先に記載したもののような任意の組織保護サイトカインを用いることができる。
本発明の別の態様では、内皮細胞バリアにより血管系から単離されていない細胞、組織、または器官の生存性を強化するための方法および組成物は、細胞、組織または器官をカルバミル化エリトロポイエチンを含む医薬組成物に直接暴露するか、またはカルバミル化エリトロポイエチンを含有する医薬組成物を組織もしくは器官の血管系に投与もしくは接触させることにより提供される。処置される組織または器官の応答細胞の活性の強化は陽性の効果を奏するのに寄与する。
【００８５】
本発明のカルバミル化エリトロポイエチンをエキソビボ適用のために、または神経組織、網膜組織、心臓、肺、肝臓、腎臓、小腸、副腎皮質、副腎髄質、毛細管内皮、精巣、卵巣、または子宮内膜細胞もしくは組織のような応答細胞を処置するために用いる先述の実例では、本発明は、血管系より遠位の応答細胞、組織または器官の保護または強化のために適合させた投与単位で医薬組成物を提供する。
【００８６】
本発明の例として提供する以下の非限定的な実施例を参照することにより、本発明をよりよく理解できる。本発明の好ましい実施態様を更に十分に説明するために以下の実施例を提示する。しかしながら、それを本発明の広い範囲を制限するものと決して解釈すべきでない。
【実施例１】
【００８７】
以下の手順に従ってエリトロポイエチンをカルバミル化した。
最初にシアン酸カリウム（ＫＯＣＮ、分子量８１．１２）を水およびエタノールから再結晶した。次にｐＨ８．７〜９．２のホウ酸ナトリウムバッファーの１Ｍ溶液をホウ酸（Ｈ３ＢＯ３、分子量６１．８４）およびテトラホウ酸ナトリウム十水和物（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、分子量３８１．４）から調製した。限外ろ過膜フィルター（１００００分子量、フィルターコード：ＰＢＣＧ、アミコン）を有する攪拌式限外ろ過セル（８２００モデル、アミコン）エリトロポイエチンを６ｍｇ／ｍｌの濃度まで濃縮した（この実施例では容量１７．７ｍｌ）。
【００８８】
カルバミル化のためにエリトロポイエチンを最初に５０ｍｌプラグシールキャップチューブ中で等容量の１Ｍホウ酸塩バッファーで希釈した。次に十分量の再結晶シアン酸カリウムを加えてその濃度を１Ｍにした。次いでチューブを３７．０〜３８．０℃の間の温度に設定したインキュベーター内に置き、そして１６時間インキュベートした。
カルバミル化に続いて直ぐにエリトロポイエチンを脱イオン水１００容量に対する透析により水を複数回交換して脱塩した。透析したカルバミル化エリトロポイエチンを次いでＡＫＴＡｐｒｉｍｅ系（アマーシャム・ファルマシア）に取り付けたセファクリルＳ−１００カラム（ＨｉＰｒｅｐ２６／６０アマーシャム・ファルマシア）を用いてリン酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．２±０．１、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む）で精製した。ろ過カラムからプールした分画を遠心ろ過装置、アミコンウルトラ遠心フィルター装置（１００００ＭＷＣＯ）を用いてメガフュージ１．０Ｒ遠心機（ヘレウス・インストラメンツ）で濃縮した。
【００８９】
カルバミル化エリトロポイエチンに関するインビトロ放出試験の結果
次いで紫外可視分光光度計、島津ＵＶ−１６０１を用いてカルバミル化エリトロポイエチンをＵＶスキャンして、Ａ２８０を用いてタンパク質含量を決定した。カルバミル化エリトロポイエチンは、２７８〜２８３ｎｍで最大吸収、２４９〜２５４ｎｍで最低吸収を有し、＞３２０ｎｍで吸収なしであった（図１）。２倍希釈したカルバミル化エリトロポイエチンに関してＡ２８０は０．８５３であった。希釈した生成物のＡ２８０の読みに基づいて、式：（ｍｇ／ｍｌ）＝（Ａ２８０×希釈倍数）／０．７４３を用いてタンパク質含量を計算した。計算結果によりタンパク質含量が２．３ｍｇ／ｍｌであったことが示された。
【００９０】
カルバミル化エリトロポイエチンでＩＥＦゲル分析を実施した。２×ＩＥＦ試料バッファー（ｐＨ３〜７、ノーベックス試料バッファー、ＬＣ５３７１）およびＩＥＦマーカー（サーバリキッドミックスＩＥＦマーカー３−１０、インビトロゲン３９２１２−１０）を含むカルバミル化エリトロポイエチンの試料をＩＥＦゲル（ノーベックスＩＥＦゲル、ＥＣ６６５５Ｂ、ノーベックスＩＥＦカソードバッファー、ＬＣ５３７０、ノーベックスＩＥＦアノードバッファー、ＬＣ５３００）に充填した。次いでゲルを１００Ｖで４５分間、２００Ｖで更に４５分間、そして５００Ｖで１５分間泳動させた。泳動の完了時にゲルをロッキングシェーカー上で固定溶液（水中１２（重量／容量）％トリクロロ酢酸および３．５％  ５−スルホサリチル酸）中に室温で１０〜１５分間置いた。次いでゲルを脱イオン水１００〜１５０ｍｌで２〜３回濯いだ。次いでゲルを染色溶液（０．１％クーマシーブルーＲ−２５０、５０％メタノールおよび１０％酢酸）２０〜３０ｍｌを用いて室温で５〜６分間染色し、そして次にメタノール−酢酸（５０％および７％）溶液２０〜３０ｍｌで２〜３回濯いだ。次いでゲルをメタノール−酢酸（１０％〜７％）溶液５０〜１００ｍｌ中で２〜３回脱染し、そして次に脱イオン水１００〜１５０ｍｌで２〜３回濯いだ。次いでドライイレースゲル乾燥システム（インビトロゲン）を用いてゲルを乾燥させた。ＩＥＦゲル分析（図２）によれば、生成物に関するｐＩは３．５未満であり、そしてｐＩが３．５〜５の範囲であり、６−７アイソフォームバンドを示すＥＰＯと重複しなかった。これはカルバミル化エリトロポイエチンが成功裏に実施されたことを示している。
【００９１】
次いでカルバミル化エリトロポイエチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて非還元および還元条件下で分析した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、２×トリス−グリシンＳＤＳ試料バッファー（インビトロゲン、ＬＣ２６７６）１０μｌと混合し８５〜９５℃で３〜５分間加熱したカルバミル化エリトロポイエチンの試料をトリス−グリシンゲル（１０％、インビトロゲン、ＥＣ６０７５）に充填した。ゲルを１２５Ｖで９０分間泳動させ、その時点でゲルをメタノール−酢酸（５０％および７％）溶液１００〜２００ｍｌで１５分間固定した。次いでゲルを１００〜２００ｍｌで、各回で何分間もかけて４回洗浄した。次いでロッキングシェーカー上で穏やかに振盪しながらゲルコード青色染色試薬溶液（ピアース）２０〜３０ｍｌを用いて少なくとも１時間ゲルを染色した。次いで、ゲルを、脱イオン水を用いてバックグラウンドが透明になるまで数回洗浄し、次にドライイレースゲル乾燥システムを用いて乾燥させた。還元条件では、試料を０．２Ｍ  ＤＴＴを含有する２×トリス−グリシンＳＤＳ試料バッファー１０μｌと混合した。非還元および還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で認められるように（図３）、生成物に関して明白な凝集物は検出されなかった。カルバミル化エリトロポイエチンに関して見かけの分子量約３６ｋＤａに１本のバンドが移動し、その前駆体エリトロポイエチンと同一であった。
【００９２】
次にウォーターズ１５２５バイナリーＨＰＬＣポンプ、ウォーターズ２４８７デュアル吸光度検出器、ウォーターズ７１７自動サンプラーおよびショーデックスＧＦＣカラム（プロテインＫＷ−８０３、８．０ｍｍ×３００ｍｍ）を用いてカルバミル化エリトロポイエチンに関してＳＥ−ＨＰＬＣ分析を実行した。カルバミル化エリトロポイエチンの試料をＴＳＫバッファー（８．１１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０±０．１０）で０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、そしてＨＰＬＣで、６０分間、流速０．５ｍｌ／分、１００％ＴＳＫバッファーの溶媒で、圧力上限４０００ＰＳＩおよび圧力下限０ＰＳＩで流した。ＵＶ検出器設定は１波長および２４８７チャンネル１吸光度を使用可能に設定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析（図４）により、検出可能な凝集物を含有せず、タンパク質純度がほぼ１００％であることを確認した。
【００９３】
次いでカルバミル化エリトロポイエチンの試料をＮ−脱グリコシル化、続いてＬｙｓ−Ｃ消化に供して、すべての切断可能なリジンがカルバミル化されたことを決定した。最初に試料（５０μｇ）を１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ５μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μｌおよび脱イオン水１μｌと混合した。次いで混合物を約５０〜５５℃で２０分間加熱し、次いで更に１５〜２０分間周囲温度で維持し、その後更に０．５Ｍ  ＩＡＡ  ０．５μｌを混合物に加え、そして混合物を暗中周囲温度で更に２０分間インキュベートした、ＰＮＧａｓｅＦ（Ｎ−グリコシダーゼＦ、ＥＣ３．５．１．５２、分子量３６ｋＤａ、カルビオケム＃３６２１８５)１μｌを混合物に加え、そして次に水浴中３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。次いでカルバミル化エリトロポイエチンの脱グリコシル化を、１６％トリシンゲルを用いて確認した（１７−２７ｋＤａで１本の主要なバンド）。次に脱グリコシル化カルバミル化エリトロポイエチン２５μｌをＬｙｓ−Ｃ（リシルエンドペプチダーゼ、ＥＣ３．４．２１．５０、分子量２７−３０ｋＤａ、和光１２５−０２５４３）０．５μｌと混合し、そして水浴中３７±０．５℃で１８〜２４時間インキュベートすることにより、脱グリコシル化カルバミル化エリトロポイエチンをＬｙｓ−Ｃ消化に供した。得られた生成物を次いで１６％トリシンゲルで泳動した。脱グリコシル化された生成物のＬｙｓ−Ｃ消化物のトリシンゲル分析を図５に示した。未修飾リジン残基の存在によりＥＰＯは６．５ｋＤａフラグメント未満に消化された。しかし本発明のカルバミル化エリトロポイエチンは、その切断可能なリジン残基が完全にカルバミル化され、したがってＬｙｓ−Ｃによる酵素消化に抵抗したので消化されなかった。
【００９４】
カルバミル化エリトロポイエチン、エリトロポイエチンおよびブランクを前記で記したＴＮＢＳアッセイに供した。アッセイの結果を以下の表内に記す。
【００９５】
【表３】
2008505184.tif 000009
【００９６】
先に列挙した手順に従ってＵＴ−７／ＥＰＯＲ細胞生存性アッセイにより残留するエリトロポイエチン活性に関してカルバミル化エリトロポイエチンを試験した。図６で認められるように、カルバミル化エリトロポイエチンに関して１０μｇ／ｍｌの濃度でエリトロポイエチン活性は検出されなかった。
【００９７】
カルバミル化エリトロポイエチンに関するインビボ放出試験の結果
座骨神経アッセイを用いて任意の組織保護活性に関して生成物を更に試験した。１０匹のスプラーグ・ドーリーラット（２００〜３００ｇ）（１群あたり５匹−カルバミル化エリトロポイエチン処置群およびＰＢＳ処置群）をアッセイで用いた。最初にイソフルラン（バクスターＮＰＣ１００１９−７７３−６０）およびテーブルトップ実験室麻酔システム（フローメーターを５５ｐｓｉで２〜３リットル／分に設定）を少なくとも３分間用いてラットを麻酔することによりアッセイを実施した。次いでラットを恒温毛布上に置き、そして直腸プローブを挿入してラットの中核体温をモニタリングして、手術中の中核体温が３５〜３７℃に維持されることを確実にした。これを補助するために、手術室の温度を少なくとも２３℃に維持した。次に大腿中央で大腿四頭筋切開により右座骨神経を暴露させた：１５ブレード外科用メスを用いて大腿四頭筋上で平行に皮膚を通って２ｃｍ切開し、１丁の切開用ハサミを用いて大腿四頭筋を切断して座骨神経を暴露させ、そして神経を周囲の膜から外した。Ａ２−０シルク編み糸（エチコン、６８５−Ｇ）を神経の下に通し、そして縫合糸の末端を縛り、そして神経に対して垂直に維持したガイドに通した。次いで縫合糸の末端を非伸縮性のコードに縛り、次いでこれを滑車系（安定化装置を伴うＭＴＤ１／４”Ｂ（ＰＯ番号０４１７４−０１）を担持するＮＹＬ滑車）の周囲に垂らし、そして非伸縮性のコードに付けた１００グラムの重りをゆっくりと放した。重りを１分間つるした後、シルクの縫合糸を切断して重りを放した。１／２ｃｃのインスリンシリンジを用いて１０μｇ／ｍｌの用量のカルバミル化エリトロポイエチンまたはＰＢＳ尾静脈および筋肉に注射し、そして外科的切開を閉じ、そして乳酸加リンゲル液５ｍｌをラットに皮下注射した。回復の間加熱毛布を用いてラットの中核体温を３５〜３７℃に維持した。
【００９８】
次の４日間にわたって、デジタルスキャナのスキャニング表面の直径３０ｃｍのアクリルチューブにラットを置くことによりラットの後足趾の広がりを決定した。ラットを順応させるために５分間待った後、５本の足趾すべてが明らかに表示されたラットの後肢のスキャンを取った。各ラットの利用可能なスキャンを３回取った。スキャンから足趾広がり（第１足趾の球と第５足趾の球の間の距離）および中間足趾広がり（第２足趾の球と第４足趾の球の間の距離）を測定した（図７）。次いで静止座骨神経指標をS.Erbayraktarら、Proc Natl Acad Sci USA 100: 6741-6746(2003)に従って計算し、そして結果に関して統計分析を完了した。図８で認められるように、カルバミル化エリトロポイエチンに関する静止座骨神経指標は０．６５未満であり、そしてＰＢＳ処置ラットに関する静止座骨神経指標（０．６８）よりも有意な改善が示された。
【００９９】
本発明は、本発明の個々の態様の単なる説明として意図される、記載した具体的な実施態様により範囲が限定されることはなく、そして機能的に均等な方法および組成物は本発明の範囲内である。実際に本明細書で示し、そして記載したものに加えて本発明の種々の修飾が前記の記載および添付の図面から当業者には、明白になる。かかる修飾は添付の請求の範囲の範囲内に入ることを意図する。
本明細書で引用したすべての参照文献は、すべての目的に関してその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】実施例１に詳記するような本方法に従って製造されたカルバミル化エリトロポイエチンのＵＶ吸収を示す。
【図２】実施例１の方法に従って製造されたカルバミル化エリトロポイエチンの等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルの結果を示す。
【図３】凝集物の不在を示す、実施例１の方法に従って製造されたカルバミル化エリトロポイエチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】凝集物の不在を確認する、実施例１の方法に従って製造されたカルバミル化エリトロポイエチンのサイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図５】リジンのカルバミル化が完了したことを示す、実施例１による脱グリコシル化カルバミル化エリトロポイエチンの１６％トリシンゲルの結果を示す。
【図６】化合物がエリトロポイエチン活性を欠如することを示す、実施例１のカルバミル化エリトロポイエチンのＵＴ−７アッセイの結果を示す。
【図７】座骨神経アッセイにおいてカルバミル化エリトロポイエチンおよび生理食塩水で処置したラットの足趾広がりおよび中間足趾広がりを示す。
【図８】カルバミル化エリトロポイエチンが組織保護活性を有することを示す、実施例１のカルバミル化エリトロポイエチンの座骨神経アッセイの結果を示す。
【図９】ＴＮＢＳアッセイにおけるエリトロポイエチンのＵＶ吸収を示す。
【図１０】ＴＮＢＳアッセイにおけるブランクのＵＶ吸収を示す。
【図１１】ＴＮＢＳアッセイで実施例１に詳記したような本方法に従って製造されたカルバミル化エリトロポイエチンのＵＶ吸収を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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