(57)【要約】本発明は、特異的腫瘍患者集団の特異的腫瘍組織に生じる特異的な分子改変に基づく、癌の個別および個人の診断および療法に関する。この療法および診断は、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示す、特異的ＥＧＦＲを有する腫瘍組織の増殖および腫瘍成長は抗ＥＧＦＲ抗体によって阻害することができるが、突然変異などの腫瘍組織に生じる他の個々の分子改変は、同じ抗ＥＧＦＲ抗体治療によって影響を受けないという発見に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する癌に罹患している患者が、抗ＥＧＦＲ抗体またはその免疫学的に有効な断片の投与に陽性に応答するかどうかを検出および分析するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記患者から得た腫瘍細胞のプローブ中のＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定すること、および前記患者の腫瘍細胞が増幅したコピー数のＥＧＦＲ遺伝子を示す場合、前記患者を前記抗ＥＧＦＲ抗体の投与の対象として選択することを含む方法。
【請求項２】
ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比として測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記比が４．０と８．２の間の範囲にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記比が５．７と７．１の間の範囲にある、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をＣＥＰ７当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比として測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記比が２を超える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をＦＩＳＨ分析（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって測定する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が前記腫瘍に特異的である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が患者の個々の癌組織のプロファイルに特異的である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記個々の癌組織のプロファイルがさらに分子改変に基づく、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子改変がＥＧＦＲ遺伝子内の点突然変異である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブ（ｍＡｂ  ｃ２２５）、マツズマブ（ｍＡｂ  ｈ４２５）およびパニツムマブ（ｍＡｂ  ＡＢＸ）、またはその特定のネズミ、キメラまたはヒト化型からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
癌が結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、頭部および頸部癌ならびに乳癌である、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
患者の癌を治療するための医薬品を製造するための抗ＥＧＦＲ抗体またはその免疫学的に有効な断片の使用であって、前記癌がＥＧＦＲを過剰発現し、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示す使用。
【請求項１５】
前記ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比として測定し、この比の値が４．０と８．２の間の範囲にある、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記比の値が５．７と７．１の間の範囲にある、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
癌細胞が増幅したＥＧＦＲのコピー数を示さない癌の患者に対する同じ用量の同じ抗体を用いる治療と比較して前記癌の治療がより有効である、請求項１４から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が前記腫瘍に特異的である、請求項１４から１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が患者の個々の癌組織のプロファイルに特異的である、請求項１４から１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記個々の癌組織のプロファイルが遺伝子突然変異に基づく、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＥＧＦＲ発現腫瘍が結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、乳癌ならびに頭部および頸部癌である、請求項１４から２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブ（ｍＡｂ  ｃ２２５）、マツズマブ（ｍＡｂ  ｈ４２５）およびパニツムマブ（ｍＡｂ  ＡＢＸ）、またはその特定のネズミ、キメラまたはヒト化型からなる群から選択される、請求項１４から２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
抗ＥＧＦＲ抗体を用いた投与に対する癌患者の応答を測定するためのアッセイにおいて蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用することによって、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍組織のＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出および測定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、抗表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体による高レベルのＥＧＦＲを発現する腫瘍の診断および療法に関する。本発明はさらに、特定の腫瘍患者集団の特定の腫瘍組織に生じる特異的な分子改変に基づく、ＥＧＦＲを発現する癌の個別および個人の診断および療法に関する。この療法および診断は、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示す、特定のＥＧＦＲを有する腫瘍組織の増殖および腫瘍成長は抗ＥＧＦＲ抗体によって阻害することができるが、特定の遺伝子の突然変異などの、腫瘍組織に生じる他の個々の分子改変は、同じ抗ＥＧＦＲ抗体治療によって影響を受けないという発見に基づく。
【背景技術】
【０００２】
発明の技術的背景
腫瘍細胞の表面上の様々な受容体および他の抗原を対象とする、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）または他のタンパク質／ポリペプチドなどの生物分子、および小さな化合物は、腫瘍療法に適していることが２０年を超えて知られている。抗体手法に関しては、大部分のこれらのＭＡｂをキメラ化またはヒト化して、ヒト免疫系に関する耐性を改善している。ＭＡｂまたは前述の化学物質は腫瘍細胞上のそれらの標的構造に特異的に結合し、多くの場合正常組織上の構造にも結合し、個々の抗原のそのエピトープ特異性および／または機能特性に応じて、異なる影響を引き起こす可能性がある。
【０００３】
ＥｒｂＢ受容体は、１９８０年代に癌と関係があった典型的な受容体チロシンキナーゼである。チロシンキナーゼは、タンパク質基質中のアデノシン三リン酸の末端リン酸のチロシン残基への移動を触媒するクラスの酵素である。チロシンキナーゼは、基質のリン酸化によって、幾つかの細胞機能に関するシグナル伝達において重要な役割を果たすと考えられている。シグナル伝達の正確なメカニズムは依然として明らかではないが、チロシンキナーゼが細胞増殖、発癌および細胞分化における重要な貢献因子であることは示されてきている。受容体型チロシンキナーゼは、細胞外、膜貫通、および細胞内部分を有するが、一方で非受容体型チロシンキナーゼは完全に細胞内である。受容体結合型チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通配列、および細胞質チロシンキナーゼドメインを含む膜貫通タンパク質である。受容体型チロシンキナーゼは、多様な生物活性を有する多数の膜貫通受容体を含む。
【０００４】
受容体型チロシンキナーゼの異なるサブファミリーが同定されてきている。関連チロシンキナーゼには、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ＥｒｂＢの主要なクラスのファミリーの表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体がある。神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）受容体、およびニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）受容体、およびニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）受容体も関係がある。
【０００５】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍の原因として関係してきている。特に、ＥＧＦＲの増大した発現は乳、膀胱、肺、頭部、頸部および胃における癌ならびに膠芽腫において観察されてきている。増大したＥＧＦＲ受容体の発現は、自己分泌刺激経路によって受容体活性化をもたらす同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンド、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）の増大した生成としばしば関係がある（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６４：１２７〜１５４（１９９４））。ＥＧＦ受容体は１７０，０００の分子量を有する膜貫通糖タンパク質であり、多くの上皮細胞型において見られる。ＥＧＦ受容体は少なくとも３つのリガンド、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α（形質転換成長因子α）、およびアンフィレグリンによって活性化される。表皮成長因子（ＥＧＦ）と形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）の両方がＥＧＦ受容体と結合し、細胞増殖および腫瘍増殖をもたらすことが実証されてきている。
【０００６】
抗ＥＧＦ受容体抗体は、ＥＧＦおよびＴＧＦ−ａが受容体と結合するのを阻害しながら、腫瘍細胞の増殖を抑制するらしいことが実証されてきている。これらの発見を鑑みて、ＥＧＦ受容体に対する幾つかのネズミおよびラットモノクローナル抗体が開発されてきており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞の増殖を抑制するその能力に関して試験されてきている（ＭｏｄｊｔａｈｅｄｉおよびＤｅａｎ、１９９４、Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４、２７７）。いずれもＥＧＦ受容体を対象とする、ヒト化モノクローナル抗体４２５（ｈＭＡｂ４２５、マツズマブ；ＵＳ５，５５８，８６４；ＥＰ０５３１４７２）およびキメラモノクローナル抗体２２５（ｃＭＡｂ２２５）は、臨床試験においてその有効性を示している。Ｃ２２５抗体（セツキシマブ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＧＦ介在性の腫瘍細胞の増殖を抑制し、ヌードマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトの腫瘍形成を抑制することが実証された。抗体および一般に全ての抗ＥＧＦＲ抗体は、特に幾つかの化学療法剤（すなわちドキソルビシン、アドリアマイシン、タクソールおよびシスプラチン）と相乗して作用して、異種移植マウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでヒト腫瘍を根絶するようである（例えば、ＥＰ０６６７１６５を参照）。Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８、７３１）は、ＨＥＲ２受容体を対象とするキメラｍＡｂ２２５とヒト化ｍＡｂ４Ｄ５の両方の組合せを用いて、ヒト卵巣癌細胞を首尾良く治療することができることを報告している。マツズマブとセツキシマブの組合せも、相乗的な抗腫瘍応答を誘導する（ＷＯ０４／３２９６０）。他の完全ヒト抗ＥＧＦＲ抗体は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術によって開発されたパニツムマブ（ｍＡｂ  ＡＢＸ）（例えばＷＯ９８／５０４３３、ＵＳ６，２３５，８８３）である。
【０００７】
キメラモノクローナル抗体ｃ２２５（セツキシマブ）などの抗表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体、および完全ヒト抗体パニツムマブは、化学療法耐性のある転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）を有する患者の約１０％において顕著な臨床活性を示している。これらの物質に対する臨床的効果または耐性の根底にある分子機構は現在知られていない。
【０００８】
転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）、三番目に頻度の高い癌死因に対する治療装備は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインを対象とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて近年実施されている（ＥｒｌｉｃｈｍａｎおよびＳａｒｇｅｎｔ；２００４、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３５１：３９１〜３９２）。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂの中で、キメラ抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））および完全ヒト抗体パニツムマブは、化学療法耐性のあるｍＣＲＣを有する患者の約１０％において顕著な臨床活性をそれぞれ示してきているが、臨床的効果または耐性の根底にある分子機構は現在知られていない。免疫組織化学法によって評価される診断特性も腫瘍ＥＧＦＲ発現の程度も、臨床的効果と関係がない（Ｓａｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ２２：１２０１〜１２０８；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３５１：３３７〜３４５；Ｈｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、Ｐｏｓｔ−Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する臨床感度または耐性の分子基盤を理解することによって、セツキシマブまたはパニツムマブ治療の恩恵を被る可能性がある患者を同定することができる。ＥＧＦＲの生態は、遺伝的手法と生化学的手法の両方を使用して詳細に研究されてきている（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ、２００３、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ３９：１３４８〜１３５４；Ｈｏｌｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ４４：１９５〜２１７）。受容体の細胞外部分とリガンドの結合の最初のステップは、受容体の二量体化およびその酵素活性の活性化を促進し、これによって細胞内ドメインのリン酸化をもたらす。その後、細胞エフェクターは細胞内ドメインのリン酸化残基と結合し、主に原形質膜へのその再局在化によって活性化状態になる。小さなＧタンパク質Ｒａｓ、タンパク質キナーゼＲａｆ、および脂質キナーゼＰＩ３Ｋは、ＥＧＦＲシグナル伝達の細胞内メディエーターとして中心的な役割を果たす。ＥＧＦＲおよびそのエフェクターの遺伝子変化は、様々な癌において以前に発見されている（Ｂａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ３００：９４９；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｎａｔ  Ｍｅｄ１０：７８９〜７９９；Ｂａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００５、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ１５：５〜１２）。
【０００９】
したがって、セツキシマブ、パニツムマブまたはマツズマブなどの幾つかの特異的な抗ＥＧＦＲ抗体に対する臨床的効果は、ＥＧＦＲまたはその即時型細胞内シグナル伝達物質に影響を与える分子の改変と関係がある可能性があるという仮説が浮上し得る。
【００１０】
ｍＣＲＣなどの多くの癌では、免疫組織化学法によって評価される腫瘍の診断特性もＥＧＦＲ発現の程度も、ＥＧＦＲアンタゴニスト、特にセツキシマブ、マツズマブ（ｈＭＡｂ４２５）またはパニツムマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体に対する臨床的効果と関係がない。したがって現在は、大部分の治療患者が、望ましくない副作用を伴う無効な療法の危険に曝されている。セツキシマブ、マツズマブまたはパニツムマブなどの抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂを用いたｍＣＲＣ患者の治療の有効性は、著しい医学上の進歩を表す。しかしながら、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂを用いた治療は、化学療法に対して抵抗性を有する患者に関する臨床試験においてごく一部分の患者でのみ他覚性の応答をもたらし、この療法から恩恵を被る可能性がある患者を同定するための診断ツールは存在しない。結果として、大部分の治療患者が、望ましくない副作用を伴う無効な療法の危険に曝されている。非個別療法は、医療制度に関する多大な経済的負担にもつながる。
【００１１】
したがって、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体に対する患者の異なる応答を説明し、抗ＥＧＦＲ抗体療法から恩恵を被る可能性があるＣＲＣ患者などの癌患者を同定するための戦略を開発する必要がある。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに対するＥＧＦＲ発現癌細胞の応答たは耐性の根底にある分子機構は知られていない。したがって、癌における抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに対する応答が、（ｉ）ＥＧＦＲ遺伝子触媒ドメインに影響を与える突然変異、（ｉｉ）ＥＧＦＲ下流シグナル伝達エフェクターに影響を与える突然変異、または（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ遺伝子座の増幅を含めた生物学的予測因子またはマーカーと関係があるかどうかを示す、診断ツールを提供することがさらに必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の概要
化学療法に対して抵抗性を有する患者を含めた腫瘍患者において腫瘍細胞によって示されるＥＧＦＲ遺伝子のコピー数は、前記腫瘍に対する他覚性の応答を表出する患者の約８９％、および安定または進行性疾患を有する患者のわずか約５．０％において増大することが、本発明によってここで分かった。したがって、ＥＧＦＲ触媒ドメインおよびそのすぐ下流のエフェクターＰＩ３Ｋ、ＲＡＳ、ＲＡＦの突然変異状態は、前記応答とは関係ない。
【００１３】
本発明によれば、結腸直腸癌などの特定の癌の細胞モデルにおいて、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示す細胞の増殖を完全に阻害するセツキシマブ、マツズマブまたはパニツムマブなどの特異的抗ＥＧＦＲ抗体の同じ濃度では、増幅したＥＧＦＲのコピー数を示さない細胞には影響を与えない。
【００１４】
本発明によれば、特定の癌、好ましくはｍＣＲＣに罹患している患者では、パニツムマブ、セツキシマブまたはマツズマブのような特異的抗ＥＧＦＲ抗体（あるいはその任意の免疫有効断片または融合タンパク質）を用いた治療に対する応答は、増幅したコピー数のＥＧＦＲ遺伝子の存在と有意に関係がある可能性がある。言い換えると、抗ＥＧＦＲ治療に対して応答性または感受性が高い患者は、同じ用量で同じ抗体を用いる治療に応答しない患者と比較して、増大したコピー数のＥＧＦＲ遺伝子を有する。さらに、増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数は患者における腫瘍の縮小、前記ｍＡｂを用いた治療による長い生存と関係があることを観察することができる。これらの患者では、腫瘍の増殖はＥＧＦＲ経路によって主に誘導される可能性がある。
【００１５】
増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数は、核当たりのＥＧＦＲ遺伝子の比および／またはＥＧＦＲ遺伝子のコピーおよびＣＥＰ７（等７染色体セントロメアプローブ）の数によって定義される比を決定することによって、本発明により測定することができる。本発明によれば、ＥＧＦＲ遺伝子のコピー／核の比が４を超える、好ましくは５．７と７．１の間の範囲にある、および／またはＥＧＦＲ遺伝子のコピー／ＣＥＰ７が２を超える腫瘍プローブでは、その腫瘍プローブが由来する患者への抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、示すより低い比として定義されるコピー数の比を有する患者より有効であることが分かっている。増幅されていないまたはごくわずかに増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数（比：１または２未満）を示す腫瘍細胞を有する患者は、抗ＥＧＦＲ抗体療法に応答しないか、あるいは充分に応答しない。
【００１６】
この観察結果は、特異的な分子の改変に基づいた、結腸直腸癌などの特定の癌の個人対象療法に関する最初の範例となる。患者に最も効率良く前記薬剤を投与するために、最も恩恵を被る可能性がある患者を同定するためのツールが今回提供されている。
【００１７】
ＥＧＦＲ触媒ドメインに新規の体細胞突然変異、およびその即時型下流エフェクター（ＫＲＡＳおよびＰＩ３ＫＣＡなど）に幾つかの突然変異が存在し、これらの改変は抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに対する応答性とは関係ないことがさらに分かった。これらの発見には、幾つかの臨床的および生物学的関連がある。ＥＧＦＲを発現および過剰発現する癌では、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに対する応答はおそらくＥＧＦＲ遺伝子の突然変異とはあまり関係ないが、その増大した／増幅したコピー数とより関係がある。これらの結果は、抗ＥＧＦＲ抗体に基づく治療は、点突然変異によって影響を受けずに増幅される標的に対して、最も効率良く働く可能性があることを示唆する。
【００１８】
しかし、点突然変異などの遺伝子変化は、抗ＥＧＦＲ抗体治療の有効性および効率に貢献する可能性がある。
【００１９】
ＣＲＣに関しては、特に、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を有するＣＲＣ細胞の増殖は、セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体によって阻害されるが、一方で非増幅ＥＧＦＲコピー数を有するＣＲＣ細胞は、同じ用量の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体によって影響を受けない。これは癌細胞、特に増幅したＥＧＦＲ遺伝子を有するＣＲＣ細胞は、細胞増殖のためのこの分子改変に依存しさらに常習的であることを示す。
【００２０】
本発明のデータは、ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数のＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）測定は、抗ＥＧＦＲ標的ｍＡｂに応答する可能性があるｍＣＲＣおよび他の癌を有する患者を同定するための実験ツールとなり得ることも示す。さらに、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロッティングなどの半定量アッセイとは反対に、ＥＧＦＲタンパク質の過剰発現および同じ腫瘍内の別々の病巣に局在する増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の場合（図３）、ＦＩＳＨ分析は二染色体腫瘍細胞または正常基質の汚染物質の付随する存在によって影響を受けない。したがって、考えられる非相同型のＥＧＦＲ発現を考慮に入れて、ｍＡｂに対するＩＨＣと臨床応答との間に相関がないことを説明しなければならない（図３）。
【００２１】
言い換えると、本発明によれば、増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数に有意に基づく、セツキシマブ、マツズマブまたはパニツムマブなどの抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂの投与に対して臨床的効果を示す癌患者、好ましくはｍＣＲＣ患者は、前記患者の個々の腫瘍サンプルのＦＩＳＨ分析を使用することによって選択および評価することができることが、初めてさらに示された。言い換えると、ＦＩＳＨに陽性である患者は、ＦＩＳＨに陰性である患者より多くの遺伝子のコピー数を有する。したがって、ＦＩＳＨにより分析して増大したＥＧＦＲのコピー数を示す患者は、少ない遺伝子のコピー数を示す患者より良い生存予測を有すると結論付けることができる。
【００２２】
より一般的な形式で要約すると、本発明は以下の主題に関する。
・患者中のＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）を発現する腫瘍を治療するための方法であって、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を有する前記腫瘍細胞の増殖を阻害するのに充分な量の抗ＥＧＦＲ抗体を、前記患者に投与することによる方法。
・増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示さない腫瘍細胞に適用する、同じ用量の同じ抗体を用いる治療と比較して、前記治療がより有効である関連する方法。
・前記腫瘍細胞が分子改変または遺伝子突然変異をさらに示す、関連する方法。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が前記腫瘍に特異的である、関連する方法。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が、個々の患者の癌組織のプロファイルに特異的である、関連する方法。
・前記個々の癌組織のプロファイルが分子改変に基づく、関連する方法。
・前記ＥＧＦＲ発現腫瘍が結腸直腸癌（ＣＲＣ）である、関連する方法。
・前記結腸直腸癌が転移性（ｍＣＲＣ）である、関連する方法。
・前記抗ＥＧＦＲ抗体がそのネズミ、キメラおよびヒト化型のＭａｂ２２５およびＭａｂ４２５からなる群から選択される、関連する方法。
・増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を有するＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に基づいて、癌を治療するための医薬品を製造するための抗ＥＧＦＲ抗体の使用であって、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を誘導しない腫瘍細胞に適用する同じ用量の同じ抗体を用いる治療と比較して、前記治療がより有効である使用。
・前記腫瘍細胞が分子改変または遺伝子突然変異をさらに誘導する、抗ＥＧＦＲ抗体の関連する使用。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が前記腫瘍に特異的である、関連する使用。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が個々の患者の癌組織のプロファイルに特異的である、関連する使用。
・前記個々の癌組織のプロファイルが分子改変に基づく、関連する使用。
・前記ＥＧＦＲ発現腫瘍が結腸直腸癌（ＣＲＣ）である、関連する使用。
・前記結腸直腸癌が転移性（ｍＣＲＣ）である、関連する使用。
・前記抗ＥＧＦＲ抗体がそのネズミ、キメラおよびヒト化型のＭａｂ２２５およびＭａｂ４２５からなる群から選択される、関連する使用。
・蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用することによって、腫瘍組織のＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出および測定するための方法。
・抗ＥＧＦＲ抗体に応答する腫瘍を有する患者のｉｎ  ｖｉｔｒｏ同定用の、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の使用。
・増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を誘導する腫瘍を有する患者のｉｎ  ｖｉｔｒｏ同定用の、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の使用。
・前記腫瘍が結腸直腸癌（ＣＲＣ）、好ましくは転移性ＣＲＣである、関連する使用。
・前記抗体がそのネズミ、キメラまたはヒト化型の２２５または４２４である、関連する使用。
・ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する癌に罹患している患者が、抗ＥＧＦＲ抗体またはその免疫学的に有効な断片の投与に陽性に応答するかどうかを検出および分析するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記患者から得た腫瘍細胞のプローブ中のＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定すること、および前記患者の腫瘍細胞が増幅したコピー数のＥＧＦＲ遺伝子を示す場合、前記患者を前記抗ＥＧＦＲ抗体の投与の対象として選択することを含む方法。
・ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比として測定する、関連する方法。
・前記核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比が４．０と８．２の間の範囲にある、関連する方法。
・前記核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比が５．７と７．１の間の範囲にある、関連する方法。
・ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をＣＥＰ７当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比として測定する、関連する方法。
・前記ＣＥＰ７当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比が２を超える、関連する方法。
・ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をＦＩＳＨ分析（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって測定する、関連する方法。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が前記腫瘍に特異的である、関連法。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が個々の患者の癌組織のプロファイルに特異的である、関連する方法。
・前記個々の癌組織のプロファイルがさらに分子改変に基づく、関連する方法。
・前記分子改変がＥＧＦＲ遺伝子内の点突然変異である、関連する方法。
・前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブ（ｍＡｂ  ｃ２２５）、マツズマブ（ｍＡｂ  ｈ４２５）およびパニツムマブ（ｍＡｂ  ＡＢＸ）、またはその特定のネズミ、キメラまたはヒト化型からなる群から選択される、関連する方法。
・癌が結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、頭部および頸部癌ならびに乳癌である、関連する方法。
・患者の癌を治療するための医薬品を製造するための抗ＥＧＦＲ抗体またはその免疫学的に有効な断片の使用であって、前記癌がＥＧＦＲを過剰発現し、増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示す使用。
・前記ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比として測定し、この比の値が４．０と８．２の間の範囲にある、関連する使用。
・前記核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比の値が５．７と７．１の間の範囲にある、関連する使用。
・癌細胞が増幅したＥＧＦＲのコピー数を示さない癌患者に同じ用量の同じ抗体を用いる治療と比較して、前記癌の治療がより有効であり、関連する使用。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が前記腫瘍に特異的である、関連する使用。
・前記増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数が患者の個々の癌組織のプロファイルに特異的である、関連する使用。
・前記個々の癌組織のプロファイルが遺伝子突然変異に基づく、関連する使用。
・前記ＥＧＦＲ発現腫瘍が結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、乳癌または頭部および頸部癌である、関連する使用。
・前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブ（ｍＡｂ  ｃ２２５）、マツズマブ（ｍＡｂ  ｈ４２５）およびパニツムマブ（ｍＡｂ  ＡＢＸ）、またはその特定のネズミ、キメラまたはヒト化型からなる群から選択される、関連する使用。
・抗ＥＧＦＲ抗体の投与に対する癌患者の応答を測定するためのアッセイにおいて蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用することによって、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍組織のＥＧＦＲ遺伝子のコピー数をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出および測定するための方法。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１は、患者１３の腫瘍中で見られるエクソン２１（Ｇ８５７Ｒ）ミスセンス異型突然変異の図である（表２も参照）。この突然変異は、ＥＧＦＲキナーゼドメインの活性化ループ中に位置する重要な残基に影響を与える。Ｇ８５７Ｒは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）中のゲフィチニブおよびエルロチニブ応答物質において見られる近年記載されたＬ８５８Ｒ突然変異とは別の１アミノ酸である（Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３５０：２１２９〜２１３９；Ｐａｅｚ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：１４９７〜１５００；Ｐａｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０１：１３３０６〜１３３１１）。ＢＲＡＦ遺伝子中の類似の残基（Ｇ５９５Ｒ）に影響を与える突然変異は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）中で以前に検出された（Ｗｉｌｅｙ、Ｄｉａｚ、２００４、Ｊａｍａ２９１：２０１９〜２０２０）。
【００２４】
図２は、ＥＧＦＲ遺伝子（赤色）および染色体７（ＣＥＰ７；緑色）のプローブに関する、二色蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの図である。（Ａ）正常な結腸直腸粘膜における平衡状態の二染色体；（Ｂ）患者２７の腫瘍における平衡状態の二染色体；（Ｃ）患者３の腫瘍における平衡状態の多染色体；（Ｄ）患者５の腫瘍における増幅。
【００２５】
図３は、患者１０の腫瘍におけるＥＧＦＲ増幅およびタンパク質発現の図である。（Ａ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色による従来の組織学。（ＢおよびＣ）同じ腫瘍の対応する領域における、免疫組織化学法（Ｍｏｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ、２００１、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ７：２７７０〜５）によるＥＧＦＲ遺伝子の増幅およびタンパク質の過剰発現。
【００２６】
図４は、患者１において観察した分子的なＥＧＦＲ遺伝子の改変および臨床応答の図である。（Ａ）増大したコピー数を示すＥＧＦＲ遺伝子（赤色）および染色体７（ＣＥＰ７；緑色）のプローブに関する、二色蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ；（Ｂ）患者１の腫瘍、Ａ４３１癌細胞系（ＥＧＦＲ遺伝子／核８．００；ＥＧＦＲ遺伝子／ＣＥＰ７  ２．５７）および非悪性ＲＰＥ（ＥＧＦＲ遺伝子／核１．６０；ＥＧＦＲ遺伝子／ＣＥＰ７  ０．８６）上皮細胞対照において定量ＰＣＲによって測定したＥＧＦＲ遺伝子コピーの相対量；（Ｃ）（Ｄ）患者１におけるｍｏＡｂを用いた処理前（最大径、Ｌライン４．４ｃｍ）および後（最大径、Ｍライン２．３ｃｍ）のＣＴによる肝臓転移の測定。
【００２７】
図５は、セツキシマブによる結腸直腸癌細胞系の増殖の抑制の図である。（Ａ）高濃度のセツキシマブの存在下における、３つの別個の実験における結腸直腸癌細胞系の増殖（平均±ＳＤ）。（Ｂ）個々の細胞系におけるウエスタンブロットによって測定したＥＧＦＲタンパク質のレベル。（Ｃ）結腸直腸癌細胞系においてＦＩＳＨによって評価したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数。（Ｄ）ＤｉＦｉ細胞系において増大したコピー数を示すＥＧＦＲ遺伝子（赤色）および染色体７（ＣＥＰ７；緑色）のプローブに関する、二色蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ。
【００２８】
詳細な説明
用語「コピー数」は、ゲノム当たりの遺伝子の数として通常定義する。本発明によれば、用語「ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数」は、核当たりのＥＧＦＲ遺伝子数の比を意味する。本発明によれば、この数は１．０〜８．２、またはより好ましくは１．５〜７．９で変化する。
【００２９】
本発明によれば、用語「増大または増幅したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数」は、相対的観点で、（抗ＥＧＦＲ抗体治療に応答する）特定の患者と関係がある特定の腫瘍の細胞における前に定義した比が、他の特定の患者と関係がある特定の腫瘍の細胞における個々の比と比較して大きいかあるいは増幅していることを意味する。さらに絶対的な観点では、この用語は比（ＥＧＦＲ遺伝子の数／核）が４．０と８．２、または４．８と８．２、または４．８と７．９、または４．８と７．１、または４．８と６．８、または４．８と５．７の間であることを意味する。好ましくは前記比は５．７と８．２の間であり、より好ましくは５．７と６．８、および最も好ましくは５．７と７．１の間である。
【００３０】
「増大または増幅した」ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数に適用可能なこれらの前述の値によれば、抗ＥＧＦＲ抗体を用いた治療に応答しないかあるいは効果的または陽性に応答しない患者の腫瘍細胞によって示される、相対的に減少または低下したかあるいは非増幅状態のコピー数に関する比の値は、１．６５と２．０、または１．７と１．９の間の範囲にある。
【００３１】
ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数または比：ＥＧＦＲ遺伝子コピー／核は、比ＥＧＦＲ遺伝子コピー／等７染色体セントロメアプローブ（ＣＥＰ７）と関係がある。本発明によれば、このＥＧＦＲ遺伝子／ＣＥＰ７の比は、抗ＥＧＦＲ抗体治療に陽性に応答する患者では２を超え、一方応答しない患者では、この比は通常約１である。
【００３２】
「ミスセンス異型突然変異」は本発明によれば、１アミノ酸のコドンを遺伝子の２つの対立遺伝子の１つに存在する他のアミノ酸を指定するコドンに変える突然変異を意味する。
【００３３】
用語「インフレーム欠失」は本発明によれば、ヌクレオチドの欠失によってｍＲＮＡのリーディングフレームを変える突然変異を意味する。
【００３４】
「ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）」は本発明によれば、クローンＤＮＡと完全な染色体のハイブリダイゼーションを意味し、この場合クローンＤＮＡは蛍光色素で標識されている。これは染色体上の位置、遺伝子のコピー数（増大したコピー数と減少したコピー数の両方）、または染色体上の再編成を割り当てるための一般的な方法である。
【００３５】
セツキシマブまたはパニツムマブを用いた治療後に他覚的応答、安定疾患または進行性疾患を得たｍＣＲＣを有する患者（３１）由来の腫瘍は、ＥＧＦＲ遺伝子またはその即時型細胞内エフェクターにおける遺伝子変化に関してスクリーニングする。具体的には、ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数およびＥＧＦＲ触媒ドメインの突然変異プロファイル、同様にｍＣＲＣにおいて突然変異がより頻繁に起こるＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＰＩ３ＫＣＡ遺伝子中のエクソンの突然変異プロファイルを決定することができる。
【００３６】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインの突然変異の分析
ｍＣＲＣにおけるマツズマブ、パニツムマブまたはセツキシマブに対する応答の根底にある分子基盤を同定するために、これらのｍＡｂを用いた治療後に様々な臨床結果を有していた患者の腫瘍試料中のＥＧＦＲ遺伝子の触媒ドメインに対応する、突然変異状態の領域を評価した。ＥＧＦＲエクソン１８、１９および２１のシークエンシングによって、２４週間安定疾患を有していた１人の患者を除いて、体細胞突然変異は明らかにならない（表１および２）。この患者は、触媒作用に重要な領域である活性化ループ中に位置する残基に影響を与える、エクソン２１（Ｇ８５７Ｒ）のミスセンス異型突然変異を示す（図１）。Ｇ８５７Ｒ突然変異は、肺癌中でゲフィチニブおよびエルロチニブ応答物質において見られる近年記載されたＬ８５８Ｒ活性化突然変異と１アミノ酸離れている（Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３５０：２１２９〜２１３９；Ｐａｅｚ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：１４９７〜１５００；Ｐａｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０１：１３３０６〜１３３１１）。
【００３７】
興味深いことに、ＢＲＡＦ遺伝子中の類似の残基（Ｇ５９５Ｒ）に影響を与える突然変異は、結腸直腸癌中で以前に検出された（図１）（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ、２００２、Ｎａｔｕｒｅ４１８：９３４）。
【００３８】
本発明の発見に基づくと、ｍＡｂ療法に対する応答の根底にある主な分子機構は、ＥＧＦＲ触媒ドメイン中の突然変異ではないことは明らかであるようである。したがって、ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の変化は、観察される抗体応答の要因である可能性があると考えられる。
【００３９】
ＥＧＦＲ細胞内エフェクターの突然変異の分析
ＥＧＦＲシグナル伝達と関係がある少なくとも３つの細胞内分子（ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＰＩ３ＫＣＡ）は、結腸直腸癌中の点突然変異によって活性化させることができる。本発明によれば、対応する遺伝子の突然変異状態がセツキシマブ、マツズマブまたはパニツムマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体に対する臨床応答と関係があるかどうかを評価した。３つの遺伝子それぞれに関して、結腸直腸癌において最高頻度で突然変異が生じるエクソンを分析した（ＫＲＡＳエクソン２、ＢＲＡＦエクソン１５、ＰＩ３ＫＣＡエクソン９および２０）。各エクソンに対応するヌクレオチド配列は、腫瘍から抽出したゲノムＤＮＡから増幅させることができ、直接シークエンシングすることができる。活性化突然変異はＫＲＡＳ遺伝子（Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、およびＧ１３Ｄ）、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子（Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ）およびＢＲＡＦ（Ｅ５９９Ｖ）において同定することができるが、それらは抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに対する臨床応答とは関係がない（ＲＡＳエクソン−２：ｐ＝０．６７５；ＰＩ３Ｋエクソン−９：ｐ＝０．３；ＰＩ３Ｋエクソン−２０：ｐ＝１；ＢＲＡＦエクソン−１５：ｐ＝１；全てのこれらの突然変異：ｐ＝０．４４）（表１および２）。
【００４０】
ＦＩＳＨ分析によるＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の分析
ｍＣＲＣでは、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によって測定されるＥＧＦＲタンパク質発現のレベルと、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに対する臨床応答の間には相関性が存在しないことを示すことができる。これらの結果、および突然変異状態のＥＧＦＲおよびその下流エフェクターとの関係の欠如は、パニツムマブ、セツキシマブまたはマツズマブに対する応答はＥＧＦＲ遺伝子の増幅と関係がある可能性があるという仮説につながり得る。
【００４１】
表２および図２中に詳述するように、他覚的応答を有する１０人の患者中、９人の患者がＦＩＳＨによって評価可能であり、８／９（８８．８％）が増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示す（平均ＥＧＦＲ遺伝子／核の比６．８０、範囲１．６５〜３５）；２１人の非応答患者中、２０人の患者がＦＩＳＨによって評価可能であり、１／２０（５．０％）が増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を有していた（平均ＥＧＦＲ遺伝子／核の比１．９２５）。この差異は統計上有意であると見ることができる。
【００４２】
応答物質中、９人のＦＩＳＨによって評価可能な患者のうちの７人で、増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数は２を超えるＥＧＦＲ遺伝子／ＣＥＰ７比と関係がある可能性があり、したがってＨＥＲ２評価のために使用された基準（Ｗｉｌｅｙ、Ｄｉａｚ、２００４、Ｊａｍａ２９１：２０１９〜２０２０）を利用して、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を示すことができる。患者３および９では、７．１０および３．３８のＥＧＦＲ遺伝子／核の比がそれぞれ１．４６および１．１９のＥＧＦＲ遺伝子／ＣＥＰ７比と関係がある可能性があり、したがって等７染色体全体の追加的コピーの存在（多染色体性７）を示す可能性がある（図２Ｃ）。
【００４３】
患者１０の腫瘍は分離状態の病巣に局在し得るＥＧＦＲ遺伝子の著しい増幅を示し、一方で他の悪性領域はおおむね二染色体性である。特に、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を示す領域はＩＨＣによって評価されるＥＧＦＲタンパク質の強い発現をさらに示し、対照的に、二染色体性ＥＧＦＲ遺伝子を示す領域は対応するタンパク質を発現しない（図３）。
【００４４】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の分析
増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数は、ＦＩＳＨによってセツキシマブ、マツズマブまたはパニツムマブに応答する患者において観察することができる。腫瘍試料においてＥＧＦＲ遺伝子座の状態の独立した測定値を得るために、ｑＰＣＲ分析を使用することができる。ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の増大は、応答性疾患を有する患者１において観察することができる（図４）。３未満の遺伝子／染色体比を有する患者由来のサンプル中の、ｑＰＣＲによる増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の検出は結論に至らない。これはおそらく、以前に報告されたように（Ｌａｙｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ、２００３、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ８３：２２７〜２３１；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｇｕｔ５３（１）：１２３〜１２９）、この方法を用いて一貫して検出することができない限られたＥＧＦＲ遺伝子数のためである。さらにｑＰＣＲによる検出は、パラフィン包埋サンプルの解剖中に部分的にのみ回避することができる正常ストロマの汚染ＤＮＡの付随的抽出によって、負の影響を受ける可能性がある。他方で、ＦＩＳＨ分析によって得られるコピー数などの遺伝子のコピー数のｉｎ  ｓｉｔｕ分析は、これらの技術的制約によって影響を受けない。このｑＰＣＲによる遺伝子のコピー数の測定によって増幅を確認する。
【００４５】
正常または増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を有する細胞系に対するセツキシマブの影響
細胞癌モデルを使用した以前の研究は、セツキシマブに対する応答は（ｉ）ＥＧＦＲ受容体の過剰発現、（ｉｉ）受容体の構成的リン酸化、（ｉｉｉ）対応する遺伝子の増幅、および（ｉｖ）遺伝子ファミリーの他の要素の改変と関係がある可能性があることを示唆している。本発明のデータは、ｍＣＲＣにおけるパニツムマブ、マツズマブまたはセツキシマブに対する応答性は、ＥＧＦＲ遺伝子座の増大した遺伝子のコピー数と関係があることを示す。これによって本発明者は、ＦＩＳＨにより測定して正常または増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を示す一群の結腸直腸癌細胞系に対するセツキシマブの影響を評価することを促された（図５）。ＢｒｄＤの取り込みアッセイによって測定した細胞増殖は、高濃度のセツキシマブの存在下で評価する。最高数のＥＧＦＲ遺伝子のコピーを有するＤｉＦｉ細胞系の増殖はセツキシマブによって劇的に抑制され、ＤｉＦｉ細胞の増殖を完全に阻害するセツキシマブの濃度は、非増幅状態のＥＧＦＲのコピー数を有する細胞には影響を与えない。興味深いことに、ＳＷ６２０細胞系はＥＧＦＲ遺伝子の３つのコピーを有しており、ウエスタンブロットによって示されるようにＥＧＦＲタンパク質を発現しない（図５）。したがってＳＷ６２０細胞はＥＧＦＲ遺伝子の機能的ノックアウトを示し、それ故その増殖はセツキシマブによってほとんど影響を受けない。
【００４６】
用語「ＥｒｂＢ受容体アンタゴニスト／阻害剤」は、ＥｒｂＢ受容体と結合しかつそれを阻害または抑制する、生物学的に有効な分子を指す。したがって、受容体を阻害することによって、アンタゴニストはＥｒｂＢリガンド（アゴニスト）の結合、およびアゴニスト／リガンド受容体複合体の活性化を妨げる。ＥｒｂＢアンタゴニストはＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）およびＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を対象とすることができる。本発明の好ましいアンタゴニストは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１）を対象とする。ＥｒｂＢ受容体アンタゴニストは抗体、抗体融合タンパク質（免疫複合体）、あるいは抗体または抗体融合タンパク質の免疫療法上有効な断片であってよい。本発明による好ましいＥｒｂＢ受容体アンタゴニストは、抗ＥＧＦＲ抗体、特におよび好ましくは、その免疫学的に有効な断片（Ｆａｂ、Ｆｖ）および免疫複合体、特に免疫性サイトカインを含めた、前および後ろで述べる抗ＥＧＦＲ抗体、そのネズミ、キメラまたはヒト化型のセツキシマブ、パニツムマブおよびマツズマブである。
【００４７】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、一群の実質的に均質な抗体から得られる抗体を指す、すなわちその群を含む個々の抗体は、少量存在し得ると考えられる本来存在する可能性のある突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、１つの抗原部位を対象とする。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の１つの抗原決定基を対象とする。それらの特異性以外に、それらを他の抗体によって汚染されない状態で合成することができる点で、モノクローナル抗体は有利である。モノクローナル抗体を作製するための方法には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６、４９５）によって、および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８５、Ｂｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｄｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１３、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム）中に記載されたハイブリドーマ法があり、またはよく知られている組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。モノクローナル抗体は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８、１〜５９７（１９９１）中に記載された技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４８】
用語「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定種に由来する抗体中あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかあるいは相同的であり、一方で鎖の残り部分は他種に由来する抗体中あるいは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにそれらが望ましい生物活性を示す限りこのような抗体の断片の対応する配列と同一であるかあるいは相同的である抗体を意味する（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。キメラおよびヒト化抗体を作製するための方法も、当技術分野で知られている。例えば、キメラ抗体を作製するための方法には、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）による特許（米国特許第４，８１６，３９７号、米国特許第４，８１６，５６７号）中に記載された方法がある。
【００４９】
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、非ヒト（例えば、げっ歯類）キメラ抗体の形である。その大部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）由来の残基がマウス、ラット、ウサギ、または望ましい特異性、親和性および能力を有する非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見られない残基を含み得る。これらの修飾を施して抗体の性能をさらに向上させる。一般にヒト化抗体は、全てまたはほぼ全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのループに対応し、全てまたはほぼ全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインのほぼ全てを含むはずである。ヒト化抗体は、少なくとも一部分の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部分も場合によっては含むはずである。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えばＷｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）およびＢｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、米国特許第４，８１６，３９７号）によって記載されている。
【００５０】
「抗体断片」は完全抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびＦｃ断片、ダイアボディー、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体がある。「完全」抗体は、抗原結合可変領域および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体である。完全抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有することが好ましい。パパインによる抗体の消化によって、２つの同一の抗原結合断片、それぞれが１つの抗原結合部位およびＣＬおよびＣＨ１領域を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる断片、およびその名称が容易に結晶化するその能力を表す残りの「Ｆｃ」断片が生じる。抗体の「Ｆｃ」領域はＣＨ２、ＣＨ３およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体主要クラスのヒンジ領域を原則として含む。ヒンジ領域は、ＣＨ１領域とＣＨ２−ＣＨ３領域が組み合わさった約１５アミノ酸残基の群である。「Ｆａｂ」断片は軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含み、１つの抗原結合部位のみを有する。
【００５１】
「Ｆａｂ’」断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基を加えることによってＦａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として本来生成された。抗体断片の他の化学結合も知られている（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６；米国特許第４，３４２，５６６号を参照）。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶおよびＶドメインを含み、これらのドメインは１つのポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによってｓｃＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成することができる。例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ｐｐ．２６９〜３１５（１９９４））、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；米国特許第５，５８７，４５８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、５８７９）またはＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０、１０３８）からの、単鎖ＦＶ抗体が知られている。
【００５２】
本発明は好ましくは結腸または結腸直腸癌（ＣＲＣ）に関するものであるが、本発明は主として、ＥＧＦＲを発現または過剰発現し、異なるＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を有する患者に存在し、他のＥｒｂＢアンタゴニストを用いて治療される（例えば、肺癌はＩＲＥＳＳＡ（登録商標）を用いて治療される：例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２００５、４）、他の癌および腫瘍に適用可能である。
【００５３】
したがって、用語「癌」および「腫瘍」は、制御不能な細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を言及または記載する。本発明による医薬組成物によって、乳、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸管、および肝臓の腫瘍などの、腫瘍を治療することができる。好ましくは本発明による抗体分子を用いて治療することができる腫瘍は、乳癌、前立腺癌、頭部および頸部癌、ＳＣＬＣ、膵臓癌などの、ＥｒｂＢ受容体、特にＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）受容体を多量に発現する固形腫瘍または腫瘍転移である。
【００５４】
用語「生物学的／機能的有効」または「治療有効（量）」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物機能または生物機能の変化を引き起こし、哺乳動物中、好ましくはヒト中の疾患または障害を治療するのに指定量で有効である薬剤／分子を指す。癌の場合、治療有効量の薬剤は、癌細胞の数を減らす、腫瘍の大きさを低下させる、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延させる、および好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅延させる、および好ましくは停止させる）、腫瘍の増殖をある程度阻害する、かつ／または癌に付随する１つまたは複数の症状をある程度軽減することができる。
【００５５】
用語「免疫療法上有効」は、哺乳動物において免疫応答を引き起こす生物分子を指す。より詳細にはこの用語は、抗原を認識し抗原と結合することができる分子を指す。典型的には、それらの抗原結合部位（相補性決定領域、ＣＤＲ）を含む抗体、抗体断片および抗体融合タンパク質は、免疫療法上有効である。
【００５６】
典型的には、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片の治療有効量は、生理的に許容される組成物で投与すると、１ミリリットル（ｍｌ）当たり約０．０１マイクログラム（μｇ）〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、および通常は約５μｇ／ｍｌの血漿濃度を得るのに充分であるような量である。別の言い方をすると、用量は１日または数日間の１日当たり１回または複数回の用量投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで変わる可能性がある。好ましい血漿モル濃度は、約２マイクロモル（μＭ）〜約５ミリモル（ｍＭ）、および好ましくは約１００μＭ〜１ｍＭの抗体アンタゴニストである。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、本発明の併用療法（「補助療法」）に伴う、例えば抗癌剤の毒性効果を低下させる物質、例えば骨再吸収抑制剤、心臓保護物質だけには限られないが、これらを含めた、副作用を低下させるかまたは回避する物質を用いた対象の治療を含む語句を含むことができる。前記補助物質は化学療法、放射線療法または手術に付随する悪心および嘔吐の発生を妨げるかまたは減少させ、あるいは骨髄抑制抗癌剤の投与に付随する感染の発生を減少させる。補助物質は当技術分野でよく知られている。本発明による免疫療法剤は、ＢＣＧのようなアジュバントおよび免疫系刺激物質と共に追加的に投与することができる。さらに組成物は、細胞毒性効果のある放射標識同位体、または他の細胞毒性物質、例えば細胞毒性ペプチド（例えばサイトカイン）または細胞毒性薬剤などを含むものを含めた、免疫療法剤または化学療法剤を含むことができる。
【００５８】
本発明の他の特徴および利点は、例えば本発明の原理を例示する以下のより詳細な実施例から明らかとなるはずである。特に、前および後に示す具体的な値または用語は本発明を制限するわけではなく、当業者がそれに関する理由を見出す場合は推定することができる。
【００５９】
実施例
実施例１：患者および抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を用いた治療
Ｏｓｐｅｄａｌｅ  Ｎｉｇｕａｒｄａ  Ｃａ’  Ｇｒａｎａｄａにおいて、ＥＧＦＲ発現ｍＣＲＣを治療するための抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂパニツムマブまたはセツキシマブの臨床試験に登録した患者の中で、放射線医学によって示されたこの療法に対する腫瘍感受性または耐性を有する３１人の患者を、我々は評価した（表１）。この試験に充分な腫瘍組織の入手し易さに基づいて、患者を選択した。全ての患者がＥＧＦＲ発現ｍＣＲＣを有しており、各臨床プロトコルの中央研究所におけるＤＡＫＯ  ＥＧＦＲＰｈａｒｍＤＸキットを使用するＩＨＣにより評価して、ＥＧＦＲに関して染色された１％以上の悪性腫瘍細胞を示した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３５１：３３７〜３４５）。セツキシマブ（キメラＩｇＧ１  ｍｏＡｂ；エルビタックス（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ、ミラノ、イタリア）およびパニツムマブ（完全ヒトＩｇＧ２  ｍｏＡｂ；Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）は両方とも、ＥＧＦＲのリガンド結合ドメインを標的とする。それらの臨床活性は、完全ヒトパニツムマブを用いて見られる注入反応の低い発生率以外は比較可能であると予想され、したがって、いずれかのｍｏＡｂを用いて治療した患者はこの試験では一緒に分析した。抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を用いた治療は、セツキシマブ単独療法（ｎ＝１２）、セツキシマブおよびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏ（登録商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ、ミラノ、イタリア）による化学療法（ｎ＝９）、またはパニツムマブ単独療法（ｎ＝１０）からなっていた。特に、単独物質セツキシマブ（４００ｍｇ／ｍ2静脈内投与量、および次いで進行状態まで毎週２５０ｍｇ／ｍ2）は、ＥＭＲ２０２−６００第ＩＩ相試験中の第一段階療法物質として、またはイリノテカン抵抗性患者用のＢＯＮＤ第ＩＩ相試験の単独療法部分中の第三段階療法物質のいずれかとして与えた。セツキシマブ（単独療法と同じ用量およびスケジュール）およびイリノテカン（ｍＣＲＣが耐性があることが個別に実証された同じ用量およびスケジュール）を、イリノテカン抵抗性患者用のＢＯＮＤ試験とＭＡＢＥＬ第ＩＩ相試験の組合せ部分中の、第三段階療法物質として進行状態まで与えた。後者のプロトコルでは、イリノテカンに対する抵抗性は、イリノテカン投与計画後３ヶ月中あるいはそれ以内の文書で裏付けされた疾患の進行状態として定義される。単独物質パニツムマブ（進行状態まで２週間毎に６ｍｇ／ｋｇ静注）は、第ＩＩＩ相ＡＢＸ−ＥＧＦ２００２０４０８および交差ＡＢＸ−ＥＧＦ２００２０１９４試験中のオキサリプラチンとイリノテカンの両方を含むレジメンに耐性がある患者用の、第三段階または第四段階療法物質として与えた。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅはこの治療プロトコルを承認し、ＥＧＦＲの分析および試験療法を受けることに関する文書化したインフォームドコンセントを患者に与えた。臨床プロトコルに従った協会および個々の放射線学者によるＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準を利用して、一貫した画像化技法（ＣＴまたはＭＲＩ）によって腫瘍応答を評価した。
【００６０】
実施例２：突然変異の分析
パラフィン包埋サンプルからＤＮＡを抽出した。それぞれの患者に関して、１０  切片を調製した。他の代表的な切片は脱パラフィン化し、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、詳細な形態を分析した。腫瘍組織を示す領域を記し、０．２ＭのＮａＯＨ／１ｍＭのＥＤＴＡを用いて組織を抽出し、次いで１００ｍＭのトリス−ＴＥを用いて中和した。抽出後、製造者の教示書に従いＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０４）を使用してＤＮＡを精製した。エクソン特異的およびシークエンシングプライマーは、プライマー３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を使用して設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）によって合成した。各エクソンのプライマー配列：正方向、逆方向およびシークエンシングプライマーは以下の通りであった：
ＥＧＦＲ−Ｅｘ１８
ＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＣ；ＡＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴＧＧ；ＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＣＡＧＴ；
ＥＧＦＲ−Ｅｘ１９
ＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣ；ＣＣＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣ；ＧＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＧＡ；
ＥＧＦＲ−Ｅｘ２１
ＴＧＡＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＡＧＣＡＧ；ＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣ；ＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧ；
ＰＩ３Ｋ  ＣＡ−Ｅｘ９
ＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣ；ＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴ；ＴＡＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡ；
ＰＩ３Ｋ  ＣＡ−Ｅｘ２０
ＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧ；ＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＣ；ＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＡＴＴＣＧ
Ｒａｓ  ｅｘ２
ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＣ；ＡＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡ；ＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧ。
【００６１】
腫瘍ゲノムＤＮＡからＰＣＲによってエクソン特異的領域を増幅させるための条件、および突然変異を同定するための条件は以前に記載されている（Ｂａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ３００：９４９）。以前に記載されたのと同様の（Ｐａｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０１：１３３０６〜１３３１１）タッチダウンＰＣＲプログラムを使用して、２０μＬの容積中でＰＣＲを実施した。精製ＰＣＲ産物はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してシークエンシングし、３７３０ＡＢＩキャピラリー電気泳動システムを用いて分析した。突然変異の分析は、前に記載したのと同様に実施した。患者１３由来の腫瘍組織は量が限られており、突然変異の分析は技術的に全てのエクソンに可能なわけではなかった。
【００６２】
実施例３：蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＥＧＦＲ遺伝子の分析
Ｈｅｒ２  ＦＩＳＨ検出キット（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、ＤＫ）に使用された手順に従い、組織切片を処理した。サンプルは前処理溶液中に９６℃で３０分間置き、次いで室温で３０分間ペプシン溶液を用いて消化した。二色、二標的のＦＩＳＨアッセイを、ＬＳＩ  ＥＧＦＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ／ＣＥＰ７  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎプローブ（Ｖｙｓｉｓ、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を使用して実施した。簡単に言うと、１０μＬのプローブ溶液で覆った組織切片を７５℃で５分間インキュベートして、ＥＧＦＲとＣＥＰ７プローブを同時変性させて、３７℃で一晩ハイブリダイズさせた。同時変性とハイブリダイゼーションはいずれも、マイクロプロセッサー制御システム（Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｒ、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、ＤＫ）において逐次的に実施した。ハイブリダイゼーション後の厳密な洗浄は、６５℃で１０分間水浴中において実施した。二回洗浄し室温で１５分間乾燥させた後、組織切片をクロマチン対比染色用に４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ  ＩＩ、Ｖｙｓｉｓ）で覆い、顕微鏡によって調べた。Ｃｈｒｏｍｏｗｉｎワークステーション（Ａｍｐｌｉｍｅｄｉｃａｌ、ミラノ、イタリア）を備える蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）を用いて分析を実施した。ＥＧＦＲ遺伝子はテトラメチル−ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）フィルターを用いて赤いシグナルとして目に見える状態にし、染色体７α−セントロメア（ＣＥＰ７）配列はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルターを用いて緑色のシグナルとして目に見える状態にし、核はＤＡＰＩフィルターを用いて青色のシグナルとして目に見える状態にした。各試料の代表的な画像は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ５８９５チルドＣＣＤカメラ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．、ニューヨーク、ＵＳＡ）を用いて単色層で得て、Ｃａｓｔｉ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＦＩＳＨ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒソフトウェア（Ａｍｐｌｉｍｅｄｉｃａｌ）によって後にマージした。２つの別個の観察者（ＳＭＶおよびＲＢ）は、予め定義した記録指標を使用して少なくとも２００の非重複状態の中間期の核を記録した。観察者は、患者の臨床特性および試料の互いの評価および記録を知らなかった。それぞれの核において、ＥＧＦＲのコピーおよび染色体７プローブの数は別々に評価した。ＥＧＦＲ遺伝子の状態は、ＥＧＦＲ／核およびＥＧＦＲ／ＣＥＰ７比として記録した。正常な対照は培養した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞系、および個々の悪性腫瘍と接触する正常な結腸直腸粘膜からなっていた。増幅ＥＧＦＲ遺伝子対照は、Ａ４３１ヒト類表皮癌細胞系からなっていた。増大したＥＧＦＲ遺伝子のコピー数は、３以上のＥＧＦＲ遺伝子のコピー数／核として任意に定義した。患者４および１５由来の試料は１０μの部分としてのみ利用可能であり、かつ多数回の試みにもかかわらず、過剰な組織の厚さのためＦＩＳＨ分析は結論に至らなかった。
【００６３】
実施例４：定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によるＥＧＦＲ遺伝子の分析
ＥＧＦＲ遺伝子座に対応するコピー数は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してリアルタイムＰＣＲによって測定した。ＤＮＡ含量はＬｉｎｅ−１、前に記載したのと同様に（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２００２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９９：１６１５６〜１６１６１）二倍体ゲノム当たりのコピー数が全てのヒト細胞（正常または悪性）間で類似している反復要素のＤＮＡ含量に標準化した。式２(Dt-Dline)-(Nt-Nline)であって、前式でＤｔが腫瘍細胞から抽出したＤＮＡにおいて実験用プライマーに関して観察した平均閾値サイクル数であり、かつ実験用プライマーＤｌｉｎｅが腫瘍細胞から抽出したＤＮＡにおいてＬｉｎｅ−１プライマーに関して観察した平均閾値サイクル数であり、ＮｔがＲＰＥ細胞から抽出した正常な参照において観察された閾値サイクル数であり、ＮｌｉｎｅがＲＰＥ細胞から抽出した正常な参照ＤＮＡにおいてＬｉｎｅ−１プライマーに関して観察した閾値サイクル数である式を使用して、コピー数の変化を計算した。増幅に関する条件は以下の通りであった：１０分間９５℃の１サイクル、次に１５秒間９５℃、１分間６０℃の４５サイクル。閾値サイクル数は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システムソフトウェアを使用することによって得た。各プライマーセットに関するＰＣＲは三連で実施し、閾値サイクル数を平均化した。ＥＧＦＲ遺伝子用の（１００〜２００ｂｐの非反復領域に及ぶように設計した）プライマーは以下の通りであった：正方向ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣおよび逆方向ＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＴＣ。Ｌｉｎｅ−１反復要素用のプライマーは以下の通りであった：正方向ＡＡＡＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧおよび逆方向ＴＧＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧ。
【００６４】
実施例５：細胞増殖抑制アッセイおよびウエスタンブロッティング
結腸直腸細胞系（ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、ＤＬＤ−１、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、およびＬｏＶｏ細胞）はＡＴＣＣ貯蔵所からのものであり、ＤｉＦｉ細胞はＪｏｓｅ  Ｂａｓｅｌｇａ、Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、バルセロナ、Ｅ）の贈呈品であった。１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質を補ったＦ−１２培地中で増殖させたＤｉＦｉ細胞以外、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を補ったＤＭＥＭ中で細胞を増殖させた。細胞増殖抑制アッセイ用に、９６ウエルの黒色プレート（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（商標）９６Ｆ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）内において２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中で細胞を増殖させ、（Ｋｏｍｔｕｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｄから購入した）０．０１〜１００ｎＭのセツキシマブと共に５日間インキュベートした。化学発光ＥＬＩＳＡ法（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１６６９９１５）を使用して、ＢｒｄＤの取り込みによって細胞増殖を測定した。ウエル当たりの細胞接種密度は以下の通りであった：ＤｉＦｉ、４０００；ＬｏＶｏ、４０００；ＤＬＤ、５００；ＨＣＴ１１６、１０００；ＨＴ２９、１０００；ＳＷ４８０、１０００；ＳＷ３８７、４０００；ＳＷ４８、５００；ＳＷ６２０、５００。ＢｒｄＤアッセイは製造者の教示書に従い実施し、標識溶液の添加後２０時間で終了した。三連で３つの別個の実験を、各細胞系に関して設定した。各セツキシマブ濃度（試験）における細胞増殖の割合は、以下の式：（試験細胞−ブランク）／（対照−ブランク）×１００を使用して計算した、前式で対照は培地のみの（薬剤を含まない）培地中の細胞増殖を示し、ブランクはＤＭＥＭ内の０．０２％のＴｒｉｔｏｎＸ中の細胞増殖を示す。以前に記載されたのと同様に（ＬｙｎｃｈおよびＹａｎｇ、２００２、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ２９：４７〜５０）、ウエスタンブロッティングを実施した。
【００６５】
【表１】
2008535508.tif 000002
【００６６】
【表２】
2008535508.tif 000003
【００６７】
【表３】
2008535508.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】患者１３の腫瘍中で見られるエクソン２１（Ｇ８５７Ｒ）ミスセンス異型突然変異の図である。
【図２】ＥＧＦＲ遺伝子（赤色）および等７染色体（ＣＥＰ７；緑色）のプローブに関する、二色蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの図である。
【図３】患者１０の腫瘍におけるＥＧＦＲ増幅およびタンパク質発現の図である。
【図４】患者１において観察した分子的なＥＧＦＲ遺伝子の改変および臨床応答の図である。
【図５】セツキシマブによる結腸直腸癌細胞系の増殖の抑制の図である。
【図１】
2008535508.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008535508.tif 000010
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