(57)【要約】【課題】治療適用患者の選択や治療効果の追跡等のために、がん組織や免疫組織等におけるＣＤ２６の発現の解析等を可能にする、免疫染色に用いることも可能な、抗ヒトＣＤ２６抗体を提供する。【解決手段】受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、  ・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、又は  ・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合することを特徴とする、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、又は
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合することを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
請求項１に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、
前記抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、又は
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体の相補性決定領域を有することを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項３】
請求項１に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、
前記抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、又は
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、
抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるＹＳ１１０に対して実質的に結合の競合を示さないことを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
ヒトＣＤ２６を検出するための組成物であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むことを特徴とする、
組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、
前記ヒトＣＤ２６の検出が免疫染色による検出であることを特徴とする、
組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、
前記ヒトＣＤ２６の検出が、固定組織標本に対して行われることを特徴とする、
組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、
前記固定組織標本が、ホルマリンを用いた処理により固定されているか、及び／又は、パラフィン包埋されていることを特徴とする、
組成物。
【請求項９】
ヒトＣＤ２６の検出方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び
前記試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップ
を含むことを特徴とする、
検出方法。
【請求項１０】
ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者への、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性の判定方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び
前記試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップ
を含むことを特徴とする、
判定方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の判定方法であって、
さらに、前記免疫染色におけるヒトＣＤ２６の検出の程度に応じて、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性を判定するステップ
を含むことを特徴とする、
判定方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の判定方法であって、
前記ヒトＣＤ２６関連疾患が、がん、免疫病、ウイルス性疾患又は代謝疾患であることを特徴とする、
判定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の判定方法であって、
前記がん、免疫病、ウイルス性疾患又は代謝疾患が、悪性中皮腫、肝臓がん、腎がん、前立腺がん、大腸がん、肺がん、甲状腺がん、Ｔ細胞性悪性リンパ腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、グリオーマ、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、コロナウイルスに起因する疾患、及び、糖尿病、からなる群から選択されることを特徴とする、
判定方法。
【請求項１４】
ヒトＣＤ２６の検出のための、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の使用。
【請求項１５】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、及び、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマからなる群から選択されることを特徴とするハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＤ２６はＴａ１というマウスモノクロナール抗体と反応するヒト末梢血Ｔ細胞表面抗原として報告され、その後、活性化Ｔ細胞に強く発現することから、Ｔ細胞活性化抗原として確立された（非特許文献１、非特許文献２）。一方、以前から、肝臓や腸管粘膜細胞表面にペプチダーゼ酵素活性が存在することが知られており、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）として研究されていたが、１９９２年、遺伝子クローニングにより、ＤＰＰＩＶとＣＤ２６とが同一のものであることが示された（非特許文献２）。ＣＤ２６は７６６のアミノ酸よりなり、Ｎ末端が細胞質内に存在する、いわゆるＩＩ型の膜糖タンパク質である（非特許文献３）。細胞質内には６つのアミノ酸残基のみが存在するが、既存のシグナル関連モチーフ構造は存在しない。アミノ酸配列から予想されるＣＤ２６の平均分子量は約８８ｋＤａであるが、４８〜３２４残基の領域が糖鎖修飾を受けるため、生体では約１１０ｋＤａの糖タンパク質として検出される。６３０番目のセリン残基を活性中心として、セリンプロテアーゼであるＤＰＰＩＶ酵素活性を有し、基質となるペプチドのＮ末端から２番目のプロリン又はアラニンをそのＣ末端側で切断する。
【０００３】
ＣＤ２６は末梢血リンパ球ではメモリーＴ細胞上に強く発現している（非特許文献４、非特許文献５）。静止期にあるＴ細胞上のＣＤ２６の発現をフローサイトメトリーで検討すると、その発現強度は３相性のパターンを示し、ＣＤ２６を高発現する集団（ＣＤ２６ｈｉｇｈ又はＣＤ２６ｂｒｉｇｈｔという）と、ＣＤ２６を中程度に発現する集団（ＣＤ２６ｉｎｔ又はＣＤ２６ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅという）と、ＣＤ２６を発現しない集団（ＣＤ２６ｎｅｇａｔｉｖｅという）との３つの集団に分けることができる。ここで、ＣＤ２６ｈｉｇｈの集団が免疫応答において特に重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献４）。ＣＤ２６ｈｉｇｈの集団はＣＤ４５ＲＯを発現するメモリーＴ細胞に属し、破傷風トキソイドのようなメモリー抗原に反応するほか、Ｂ細胞の抗体産性を誘導し、ＭＨＣクラスＩ特異的なキラーＴ細胞の誘導活性をも有する（非特許文献４）。ＣＤ２６陽性Ｔ細胞はＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ等のサイトカインを分泌するＴＨ１型の細胞である。この細胞は血管内皮細胞間の遊走能を有し、炎症部位への移動、集積を起こし、炎症局所で重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献３、非特許文献６、非特許文献７）。
また、本発明者らは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞においても、ＣＤ２６共刺激によって細胞障害活性が制御されていることを発見した（非特許文献８）。さらに、本発明者らは、ヒト末梢血単核球をＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）に移植して異種ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）を発症したモデルを用いて、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体によるＴ細胞の活性化制御が、ＧＶＨＤの予防や治療に極めて有効であることを発見した（非特許文献９）。ＣＤ２６は、様々ながん、例えば、肺がん、大腸がん、悪性中皮腫、腎がん、前立腺がん、甲状腺がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、Ｔ細胞性悪性リンパ腫、グリオーマ等にも発現している（非特許文献１０）。ＣＤ２６陽性の消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）患者では予後が非常に悪いことも報告されている（非特許文献１１）。
本発明者らは、腎がん、悪性中皮腫、悪性リンパ腫等においてＣＤ２６抗体が極めて有効な抗腫瘍効果を発揮することを報告し、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０を開発して、フランスにて、ＣＤ２６陽性悪性中皮腫及びその他のＣＤ２６陽性腫瘍をターゲットとした第I相臨床試験を行なっている（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体療法）（特許文献１、非特許文献１２、非特許文献１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ ２００８／１１４８７６
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fox DA, Hussey RE, Fitzgerald KA, et al. (1984) Ta1, a novel 105 KD human T cell activation antigen defined by a monoclonal antibody. J Immunol 133: 1250-1256
【非特許文献２】Tanaka T, Camerini D, Seed B, et al. (1992) Cloning and functional expression of the T cell activation antigen CD26. J Immunol 149: 481-486
【非特許文献３】Ohnuma K, Dang NH, Morimoto C (2008) Revisiting an old acquaintance: CD26 and its molecular mechanisms in T cell function. Trends in immunology 29: 295-301
【非特許文献４】Morimoto C, Schlossman SF (1998) The structure and function of CD26 in the T-cell immune response. Immunol Rev 161: 55-70
【非特許文献５】Dang NH, Torimoto Y, Sugita K, et al. (1990) Cell surface modulation of CD26 by anti-1F7 monoclonal antibody. Analysis of surface expression and human T cell activation. J Immunol 145: 3963-3971
【非特許文献６】Masuyama J, Yoshio T, Suzuki K, et al. (1999) Characterization of the 4C8 antigen involved in transendothelial migration of CD26hi T cells after tight adhesion to human umbilical vein endothelial cell monolayers. J Exp Med 189: 979-990
【非特許文献７】Ohnuma K, Inoue H, Uchiyama M, et al. (2006) T-cell activation via CD26 and caveolin-1 in rheumatoid synovium. Mod Rheumatol 16: 3-13
【非特許文献８】Hatano R, Ohnuma K, Yamamoto J, Dang NH, Morimoto C (2013) CD26-mediated co-stimulation in human CD8+ T cells provokes effector function via pro-inflammatory cytokine production. Immunology 138: 165-172
【非特許文献９】Hatano R, Ohnuma K, Yamamoto J, Dang NH, Yamada T, Morimoto C (2013) Prevention of acute graft-versus-host disease by humanized anti-CD26 monoclonal antibody. Br J Haematol 162: 263-277
【非特許文献１０】Havre PA, Abe M, Urasaki Y, Ohnuma K, Morimoto C, Dang NH (2008) The role of CD26/dipeptidyl peptidase IV in cancer. Front Biosci 13: 1634-1645
【非特許文献１１】Umio Yamaguchi, et al. (2008) Distinct Gene Expression-Defined Classes of Gastrointestinal Stromal Tumor. Journal of Clinical Oncology vol. 26, number 25, 4100-4108
【非特許文献１２】Inamoto T, Yamada T, Ohnuma K, et al. (2007) Humanized anti-CD26 monoclonal antibody as a treatment for malignant mesothelioma tumors. Clin Cancer Res 13: 4191-4200
【非特許文献１３】Aoe K, Amatya VJ, Fujimoto N, et al. (2012) CD26 overexpression is associated with prolonged survival and enhanced chemosensitivity in malignant pleural mesothelioma. Clin Cancer Res 18: 1447-1456
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、治療薬の有効性や副作用を予測するために、治療薬とセットで使われる診断薬（いわゆる「コンパニオン診断薬」ともいう）を、治療薬とともに早期から開発する動きが活発化している。コンパニオン診断薬は、標的分子の発現や変異の有無、薬剤代謝酵素の遺伝子多型等の診断に利用することができる。抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体を用いた治療に関しても、例えば、治療適用患者の選択や治療効果の追跡等のために、がん組織や免疫組織等におけるＣＤ２６の発現の解析等を行うことが望ましい。かかる解析等を可能にする、免疫染色に用いることも可能な、抗ヒトＣＤ２６抗体の開発の必要性が存在する。
【０００７】
しかしながら、本発明者らがこれまでに開発したマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（４Ｇ８、１Ｆ７、５Ｆ８、２Ｆ９、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１（これらのクローンの詳細は本実施例を参照されたい））は、免疫染色に用いることはできない。
また、免疫染色用に研究用試薬として市販されている様々な抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を検討したところ、ＭＢＬ社のマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４（カタログ番号Ｄ０６８−１）で免疫染色を行っても、明瞭な染色性は示さず、染色される箇所のバラツキが大きいことから、信頼できるものではなかった。
一方、市販されている抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体の検討を行った結果、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１１８０； http://www.rndsystems.com/Products/AF1180）及びＮｏｖｕｓ社のウサギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＮＢ１００−５９０２１； http://www.novusbio.com/CD26-Antibody_NB100-59021.html）は、病理組織の臨床診断に耐え得る明瞭な染色性を示すことが判明した。しかしながら、これらの抗ヒトＣＤ２６抗体はポリクローナル抗体であるため、ロット差が一番の問題となる。すなわち、ポリクローナル抗体では、異なるロットの抗体で染色すると、染色強度や染色パターンに違いが生じるおそれがあることから、例えば安定した結果が常に必要とされる臨床診断薬に、ポリクローナル抗体を用いることは適切ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、上記課題を解決する、新規抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の目的は、
（１） ・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、又は
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合することを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
を提供することによって、達成される。
（２） また、（１）に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、一態様において、
前記抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、又は
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体の相補性決定領域を有することを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であることが好ましい。
（３） また、（１）又は（２）に記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、一態様において、 
前記抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、又は
・受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であることが好ましい。
（４） また、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、一態様において、 
抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるＹＳ１１０に対して実質的に結合の競合を示さないことを特徴とする、
抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であることが好ましい。
（５） 本発明は、別の態様において、ヒトＣＤ２６を検出するための組成物であって、
（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むことを特徴とする、
組成物を提供する。
（６） また、（５）に記載のヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、一態様において、
前記ヒトＣＤ２６の検出が免疫染色による検出であることを特徴とする、
組成物であることが好ましい。
（７） また、（６）に記載のヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、一態様において、
前記ヒトＣＤ２６の検出が、固定組織標本に対して行われることを特徴とする、
組成物であることが好ましい。
（８） また、（７）に記載のヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、一態様において、
前記固定組織標本が、ホルマリンを用いた処理により固定されているか、及び／又は、パラフィン包埋されていることを特徴とする、
組成物であることが好ましい。
（９） 本発明は、別の態様において、ヒトＣＤ２６の検出方法であって、
（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び
前記試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップ
を含むことを特徴とする、
検出方法を提供する。
（１０） 本発明は、別の態様において、ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者への、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性の判定方法であって、
（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び
前記試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップ
を含むことを特徴とする、
判定方法を提供する。
（１１） また、（１０）に記載の判定方法は、一態様において、
さらに、前記免疫染色におけるヒトＣＤ２６の検出の程度に応じて、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性を判定するステップ
を含むことを特徴とする、
判定方法であることが好ましい。
（１２） また、（１０）又は（１１）に記載の判定方法は、一態様において、
前記ヒトＣＤ２６関連疾患が、がん、免疫病、ウイルス性疾患又は代謝疾患であることを特徴とする、
判定方法であることが好ましい。
（１３） また、（１２）に記載の判定方法は、一態様において、
前記がん、免疫病、ウイルス性疾患又は代謝疾患が、悪性中皮腫、肝臓がん、腎がん、前立腺がん、大腸がん、肺がん、甲状腺がん、Ｔ細胞性悪性リンパ腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、グリオーマ、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、コロナウイルスに起因する疾患、及び、糖尿病、からなる群から選択されることを特徴とする、
判定方法であることが好ましい。
（１４） 本発明は、別の態様において、ヒトＣＤ２６の検出のための、（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の使用を提供する。
（１５） 本発明は、別の態様において、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３として寄託されたハイブリドーマ、及び、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４として寄託されたハイブリドーマからなる群から選択されることを特徴とするハイブリドーマを提供する。
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、適宜、任意に組み合わせたものも、本発明に含まれることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、対象由来の試料におけるヒトＣＤ２６の検出、好ましくは、免疫染色によるヒトＣＤ２６の検出に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を含む、ハイブリドーマの培養上清のスクリーニング結果に関する図である。  図１Ａは、フローサイトメトリーによる一次スクリーニング結果に関する。各ハイブリドーマクローンの培養上清をＪｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴと混和した後、二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体）で染色し、フローサイトメーターでヒトＣＤ２６への結合を解析した。図には代表的なクローンによるヒトＣＤ２６への結合のヒストグラムを示した。なお、ＭＦＩは平均蛍光強度の略語であり、データとして取り込んだ全細胞それぞれの蛍光強度の総和を全細胞数で割った値（＝平均値）を示す。フローサイトメトリーのヒストグラムは横軸が蛍光強度、縦軸が細胞数を示しており、蛍光強度が高いほど、一つの細胞あたりにヒトＣＤ２６抗体がたくさん結合していることを意味する。  図１Ｂは、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）による二次スクリーニング結果に関する。非変性の可溶性ヒトＣＤ２６（「ｓＣＤ２６」ともいう）及びウレアバッファーで処理した変性可溶性ヒトＣＤ２６をプレートにそれぞれ固相化し、各ハイブリドーマクローンの培養上清を添加して、結合させた。次いで、二次抗体（西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体）を反応させ、プレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光値（吸収波長）を測定した。図には代表的なクローンによる結果を示した。
【図２Ａ】各ハイブリドーマクローン若しくはＭＢＬ社のクローン４４−４の培養上清、又は、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製ポリクローナル抗体を用いた、病理組織の免疫染色の結果を示す図である。ホルマリン固定した、ヒトＣＤ２６を発現しているヒト正常組織（肝臓、腎臓、前立腺）、及び、悪性中皮腫の各組織標本に対して、各ハイブリドーマクローンの培養上清を用いて免疫染色を行った結果である。
【図２Ｂ】各ハイブリドーマクローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分、又は、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の精製ポリクローナル抗体を用いた、病理組織の免疫染色の結果を示す図である。ホルマリン固定した、ヒトＣＤ２６を発現している肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、大腸腺がん、肺腺がんの各組織標本に対して、各ハイブリドーマクローンの培養上清を精製して得たＩｇＧ画分を用いて、免疫染色を行った結果である。
【図３】抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０との競合を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴを未標識ＹＳ１１０又はコントロールヒトＩｇＧ抗体と混和した後、各ハイブリドーマクローンの培養上清をそれぞれ添加し、次いで、二次抗体（ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）で染色して、フローサイトメーターでヒトＣＤ２６への結合を解析した。ＹＳ１１０で染色する場合のみ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で直接標識したＹＳ１１０を用いた。縦軸の数値が高いほど、ＹＳ１１０との競合が生じなかったことを意味する。
【図４】得られたクローン１８及びクローン１９によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の抗原結合部位を、フローサイトメーターで解析した結果である。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴを、未標識抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（４Ｇ８、１Ｆ７、５Ｆ８、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１）又はコントロールマウスＩｇＧ１抗体とそれぞれ混和した。次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で直接標識した、クローン１８又はクローン１９の培養上清由来の精製ＩｇＧ抗体、又は、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ‐Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−ＰＥ）でそれぞれ染色して、フローサイトメーターでヒトＣＤ２６への結合を解析した。
【図５】得られた本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の、ヒトＣＤ２６削除変異体に対する結合を示す図である。ヒトＣＤ２６全長、及び、５種類のヒトＣＤ２６削除変異体を、ＣＯＳ−７細胞にそれぞれ発現させた。次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で直接標識した、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０、クローン１８又はクローン１９の培養上清由来の精製ＩｇＧ抗体でそれぞれ染色した後、フローサイトメーターで、ヒトＣＤ２６全長又はヒトＣＤ２６削除変異体への結合をそれぞれ解析した。数字は取込んだ全細胞数に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７陽性細胞数の割合を％で示したものである。
【図６】抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０との競合を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴを未標識ＹＳ１１０又はコントロールヒトＩｇＧ抗体と混和した後、各ハイブリドーマクローンの培養上清をそれぞれ添加し、次いで、二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体）で染色してから、フローサイトメーターでヒトＣＤ２６への結合を解析した。ＹＳ１１０で染色する場合のみ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で直接標識したＹＳ１１０を用いた。図にはヒトＣＤ２６への結合のヒストグラムを示した。
【図７】得られた本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の、各種抗ＣＤ２６モノクローナル抗体との競合を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴを各ハイブリドーマクローンの培養上清（クローン１６、クローン１８、クローン１９）又はコントロールマウスＩｇＧ１抗体と混和した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で直接標識した、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（２Ｆ９、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１、クローン１９の培養上清の精製ＩｇＧ抗体）、又は、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色し、フローサイトメーターでヒトＣＤ２６への結合を解析した。図にはヒトＣＤ２６への結合のヒストグラムを示した。
【図８】得られた本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の、ヒトＣＤ２６削除変異体に対する結合を示す図である。ヒトＣＤ２６全長、及び、５種類のヒトＣＤ２６削除変異体を、ＣＯＳ−７細胞にそれぞれ発現させた。次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で直接標識した、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０、クローン１８又はクローン１９の培養上清由来の精製ＩｇＧ抗体でそれぞれ染色した後、フローサイトメーターでヒトＣＤ２６全長又はヒトＣＤ２６削除変異体への結合をそれぞれ解析した。図にはヒトＣＤ２６への結合のヒストグラムを示した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合可能な免疫グロブリン分子を指してよい。抗体は、完全体のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を指してよい。抗原結合性断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗原結合性断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれている。
一態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体であり、例えば、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ２抗体等であってよい。
【００１３】
抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域及び／又は抗体重鎖の可変領域を意味してよい。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結される４つのフレームワーク領域(ＦＲ)からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ(例えば、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ(Al-lazikani et al., 1997 J. Molec. Biol. 273:927-948)が挙げられる。これらの２つのアプローチを組合せて用いてもよい。
抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域及び／又は抗体重鎖の定常領域を意味してよい。
【００１４】
「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野において当業者に周知の用語であり、抗体等の、抗原やエピトープに対する特異的な結合を決定するための方法も周知である。例えば、特異的にＣＤ２６のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片は、他のエピトープ又は非エピトープ部分に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、及び/又は、より長時間持続して、このＣＤ２６エピトープに結合可能であると理解される。しかしながら、第１の標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片は、第２の標的に特異的に結合することを排除しない。
【００１５】
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味してよい。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる抗原や異なるエピトープを標的とする典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープを標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。
【００１６】
免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）とは、抗体又はその断片を用いて、組織標本中の抗原を検出する組織学（組織化学）的手法を指し、特定の抗原を認識する抗体を用いて可視化し、その局在を光学顕微鏡又は電子顕微鏡等を用いて観察する染色法である。本明細書において、用語「免疫染色」は、免疫組織染色又は免疫組織化学（ＩＨＣ）と互換的に用いられてもよい。
【００１７】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）の抗体、又は、それらの抗原結合性断片であってよく、一態様においては、非ヒト哺乳動物の抗体であるのが好ましい。キメラ抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変領域だけを取ってきて、ヒト抗体の定常領域に導入した抗体であって、可変領域は非ヒト由来、定常領域はヒト由来の抗体を指してよい。ヒト化抗体は、抗原と直接結合する部分である超可変領域（相補性決定領域ともいう）だけを非ヒト（例えば、マウス）型にした抗体を指してよい。ヒト抗体は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン遺伝子をノックアウトした非ヒト動物（例えば、マウス）と、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した非ヒト動物どうしを交配させて、ヒト免疫グロブリンだけを産生する非ヒト動物を作製し、かかるヒト免疫グロブリンを産生する非ヒト動物から調製した抗体を指してよい。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、場合により、単量体、二量体又は多量体の形態であってよい。
【００１８】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、種々の方法で製造することができる。モノクローナル抗体の製造方法は当該技術分野で当業者に周知である（例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照）。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、当業者に周知の、例えば、「Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495」に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して製造してよい。ハイブリドーマ法においては、例えば、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を、抗原である（ヒト）ＣＤ２６又はその断片等で免疫する（感作する）ことにより、当該宿主動物に、当該抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）を作らせてよい。抗体力価を高めるために、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、脂質系アジュバント、グルカン多糖系アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、又は、合成コポリマー系アジュバント等を添加してもよい。抗体産生細胞は脾臓に多く存在するため、一般的には、脾臓から脾細胞を取り出した後に、脾細胞を腫瘍細胞（例えば、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）酵素を欠損した９−アザグアニン耐性株であるミエローマ細胞）と細胞融合させることで不死化させて、ハイブリドーマを作製する。細胞融合は、センダイウイルス、ポリエチレングリコール又は電気刺激等により行ってよい。ハイブリドーマを作製後、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で培養することにより、脾細胞と腫瘍細胞のハイブリドーマを選択できる。選択したハイブリドーマを１個／ウェルで播種し直すことで、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。培養上清は、さらに、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、又は、プロテインＡ／Ｇクロマト法等を用いて精製することで、例えば、ＩｇＧ画分（ＩｇＧ抗体）へと精製してもよい。
免疫に用いる抗原（ＣＤ２６又はその断片等）に関して、ヒトＣＤ２６は７６６のアミノ酸よりなり、Ｎ末端の６つのアミノ酸残基のみが細胞質内に存在することから、かかる細胞質内に存在するアミノ酸残基を少なくとも全て削除した変異タンパク質（例えば、ヒトＣＤ２６のＮ末端側３番目から９番目のアミノ酸残基を削除したもの）を作製することで、ヒトＣＤ２６を可溶性としてもよい。当該変異タンパク質（可溶性ヒトＣＤ２６）は、当該変異タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、又は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等に遺伝子導入することで、培養上清中に分泌させた後に、適宜、クロマトグラフィー等で精製することができる。
一態様において、精製した可溶性ヒトＣＤ２６は、例えばウレアバッファー（例えば、８Ｍ  ウレア、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）、グアニジン塩（例えば、６Ｍ  塩酸グアニジン）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（例えば、１％ＳＤＳ）等の変性剤で、５〜８時間、例えば、４℃〜３７℃で変性処理させた後に、免疫に用いてもよい。当業者は、変性に必要な時間、条件等を適宜設定することができる。ウレアバッファーによる抗原の変性処理に関しては、例えば、「Torigoe T. at al., (2012) Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: usually high frequency of down-regulation in breast cancer tissue. Pathology International 62; 303 - 308」を参照してもよい。
【００１９】
一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、例えば、本発明のハイブリドーマ（すなわち、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託したハイブリドーマであるクローン１９（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２）、クローン１８（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３）、クローン１６（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４）（受託日（寄託日）は、いずれも、２０１３年７月３日））から産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であってよい。あるいは、これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって認識（結合）されるエピトープに結合する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であってよい。これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と、当該抗体によって認識されるエピトープに結合する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とは、実質的に又は完全に同一のエピトープを認識し結合するのが好ましい。実質的に同一のエピトープとは、抗体又はその抗原結合性断片の結合性には影響を与えないアミノ酸の修飾、置換、付加、欠失等を有するエピトープを指してもよい。あるいは、これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の相補性決定領域を有する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片も、本発明の範囲内に含まれる。これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と、当該抗体の相補性決定領域を有する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とは、実質的に又は完全に同一の相補性決定領域を有するのが好ましい。実質的に同一の相補性決定領域とは、抗体又はその抗原結合性断片の結合性には影響を与えないアミノ酸の修飾、置換、付加、欠失等を受けている相補性決定領域を指してもよい。
【００２０】
あるいは、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような、遺伝子組換え技術により作製されてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号及び第６，２６５，１５０号）。本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用といった、従来的な方法を使用することで、単離し、配列決定することができる。当該ＤＮＡを単離後に発現ベクターに組み込んで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は、当該発現ベクターが導入されない限り免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞に遺伝子導入することにより、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を産生させてもよい。
【００２１】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の抗原結合性断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、二重特異性抗体、及び、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。これらは、当業者に公知の製造方法に基づいて、遺伝子組換え技術又は化学合成技術等により製造してもよい。
例えば、抗原結合性断片は、完全体の抗体のタンパク質消化を介して得ることができ（例えば、Morimotoet al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117等）、又は組換え宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、又は、大腸菌等の原核生物）により直接産生させてもよい。例えば、Ｆａｂ’‐ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させることによってＦ（ａｂ’）２断片を形成させてもよい（Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167）。また、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の組み立てを促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成させてもよい。また、ｓｃＦｖを化学合成技術で生産する場合には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖを遺伝子組換え技術で生産する場合には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、又は、大腸菌等の原核生物）に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の周知の操作により作製してもよい。その結果生じるｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離してもよい。
【００２２】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、所望により、修飾してもよい。抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシート又はヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性の状態；又は、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等）によって達成してよい。
本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。
例えば、天然に存在するアミノ酸残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失又は置換を適宜行ってもよい。
また、抗体の適切な立体構造を維持するのには関与しない任意のシステイン残基を置換することにより（通常はセリンと置換する）、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋形成を防いでもよい。逆に、抗原結合性断片がＦｖ断片等の抗体断片である場合、システイン結合を抗原結合性断片に付加することにより、抗原結合性断片の安定性を向上させることができる。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾は、１つ以上のアミノ酸の変化又は修飾であってもよく、可変領域等の領域の完全な再設計であってもよい。可変領域における変化は、結合親和性及び/又は特異性を変化させ得る。一実施態様において、１〜５個以下の保存的なアミノ酸置換をＣＤＲ上で行ってよい。他の実施態様において、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲ３上で行ってよい。さらなる別の実施態様において、ＣＤＲはＣＤＲＨ３及び/又はＣＤＲＬ３であってよい。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化又はリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ‐結合型又はＯ‐結合型のいずれかである。Ｎ‐結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン‐Ｘ‐セリン、アスパラギン‐Ｘ‐スレオニン、及び、アスパラギン‐Ｘ‐システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体又はその抗原結合性断片に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ‐結合型グリコシル化は、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又は、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリン又はスレオニン）への結合であってよく、場合により、５‐ヒドロキシプロリン又は５‐ヒドロキシリジンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、さらに、当業者に公知の技術常識に基づいて、その他の修飾方法により、単独又は組み合わせて、修飾されてよい。
【００２３】
本明細書において、ＣＤ２６はヒトＣＤ２６であることが好ましく、抗ＣＤ２６抗体は抗ヒトＣＤ２６抗体であることが好ましい。本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＣＤ２６（好ましくは、ヒトＣＤ２６）に結合するのが好ましい。
一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、その他の抗体、好ましくは抗ＣＤ２６抗体とセットで（、すなわち、同時又は異時に組み合わせて）用いてよい。例えば、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、治療用抗体である抗ヒトＣＤ２６抗体（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるのが好ましく、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であるのがさらに好ましい。）やその他の抗ヒトＣＤ２６抗体（例えば、本発明者らがこれまでに開発した抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体４Ｇ８、１Ｆ７、５Ｆ８、２Ｆ９、１６Ｄ４Ｂ又は９Ｃ１１等であってよい。）に対して実質的に結合の競合を示さない（交叉反応性を有さない）、すなわち、非競合的にＣＤ２６に結合することが好ましい。あるいは、逆に、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、これらの抗体と結合の競合を示す（交叉反応性を有する）、すなわち、競合的にＣＤ２６に結合することが好ましい。
また、競合的アッセイを用いて、２つの抗体（抗体の一方は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用い、抗体の他方は、比較しようとしている抗体を用いてよい。）が同一又は立体的に重複するエピトープを認識することにより同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。例えば、抗原であるＣＤ２６をマルチウェルプレート上に固定し、非標識抗体が標識抗体の結合を遮断する性能を測定してもよい。そのような競合的アッセイのための一般的な標識は、放射性標識又は酵素標識であってよい。さらに、当業者に周知のエピトープマッピング技術を用いることにより、抗体が結合するエピトープを決定することができる。
【００２４】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、当業者に公知の方法に従って、精製又は単離されてよい。精製又は単離の方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的又はクロマトグラフィー的手法等が挙げられ、具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、又は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、あるいは、等電点電気泳動等が挙げられる。
【００２５】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、又は、それを含む本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物を適用する（例えば、接触させる）対象は、限定はされないが、哺乳動物（ヒト、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）；非哺乳動物（例えば、魚類、爬虫類、両生類又は鳥類））、植物、昆虫、細菌、又はそれらに由来する（生物）試料（すなわち、細胞（培養細胞を含む）、組織、器官、臓器、それらの断片又はそれらを含む物質）であってよい。あるいは、当該対象は、人工的な環境（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応系等）であってもよい。本発明における対象は、哺乳動物、特にはヒト、に由来する試料であるのが好ましい。一態様において、かかる試料は、ＣＤ２６を発現している腫瘍細胞又は免疫細胞等の組織を含むか、含んでいたか、又は、含む疑いを有することが好ましい。
【００２６】
本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含み、かつ、ＣＤ２６を検出し得る組成物であれば、特に限定されない。本明細書において、ＣＤ２６（の発現）を検出するとは、定性的にＣＤ２６を検出してもよいし、又は、定量的にＣＤ２６を検出する（すなわち、ＣＤ２６の発現量を測定する）ことを意味してもよい。
一態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はＣＤ２６の過剰発現を検出できるのが望ましい。ＣＤ２６の過剰発現とは、ＣＤ２６を通常は発現している細胞又は組織に関して、それらの細胞又は組織内での通常のＣＤ２６の発現量と比較してＣＤ２６の発現量が増加していること、及び、ＣＤ２６を通常は発現していない組織又は細胞内でＣＤ２６が発現していることの両方が含まれると理解される。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、又は、それを含むヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、一態様において、
ＣＤ２６の対象内の動態（分布）、発現、局在性等の検出又は解析；
ＣＤ２６の発現量の変化又は異常(例えば、対照群である正常組織と比較しての、ＣＤ２６の発現量の増加又は減少)の検出又は解析；
ヒトＣＤ２６関連疾患を同定する指標となる情報の検出又はそれに基づく診断；
治療用抗体である抗ヒトＣＤ２６抗体（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるのが好ましく、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であるのがさらに好ましい。）を用いたヒトＣＤ２６関連疾患の治療に適し得る患者（好ましくはヒト）の選択；又は、
治療用抗体である抗ヒトＣＤ２６抗体（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるのが好ましく、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であるのがさらに好ましい。）を用いたヒトＣＤ２６関連疾患の治療中又は治療後の治療効果（例えば、経過観察、治療有効性の確認、又は、患者（例えば再発例や抗体治療無効例）におけるヒトＣＤ２６の発現評価）の追跡；
等に利用できる。
例えば、対照群である正常組織におけるＣＤ２６の発現量に比べて、試料においてＣＤ２６が高発現している場合、当該試料の由来となる対象（好ましくはヒト）がヒトＣＤ２６関連疾患に罹患しているか、又は、ヒトＣＤ２６関連疾患への罹患リスクが高いと決定、診断され得る。また、例えば治療用抗体を用いてヒトＣＤ２６関連疾患に罹患する患者を治療中又は治療後に、治療の対象となる病変部位を採取して、ＣＤ２６の発現量の推移を測定、観察することにより、当該ヒトＣＤ２６関連疾患の進行度や悪性度を判定したり、当該治療抗体による治療の有効性の指標とすることができる。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、又は、それを含む本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物は、ＣＤ２６を標的とした治療方針や治療結果ヘの影響に関して安定した結果が求められる、臨床診断薬又は患者層別マーカーとして有利に用いることができる。
【００２７】
本発明のヒトＣＤ２６を検出するための組成物を調製するために、必要に応じて、例えば、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、防腐剤等を添加してよい。これらの添加剤は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の活性を阻害せず、検出対象となる抗原ＣＤ２６と非反応性であるのが好ましい。添加剤は、当業者に標準的なものを用いてよく、限定はされないが、例えば、生理的食塩水、トリス緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、水、又は、アルブミン製剤、油/水エマルジョン等のエマルジョン等であってよい。
【００２８】
また、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ２６の検出方法に用いることができ、具体的には、上述のようなＣＤ２６の検出、発現量の解析又は追跡、患者の選択等に用いることができる。例えば、本発明のヒトＣＤ２６の検出方法は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び、前記試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップを含んでよい。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体である抗ヒトＣＤ２６抗体（抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であるのが好ましく、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であるのがさらに好ましい。）の投与前又は投与開始後に、対象由来の試料に接触させることで、ＣＤ２６の発現を検出してもよい。例えば、当該治療用抗体を複数回投与することを意図している場合には、治療用抗体の投与間隔、投与回数を適宜調整してよく、治療の合間に、１回又は複数回、ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者の対象由来の試料におけるヒトＣＤ２６の発現を検出してもよい。本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が認識（結合）するエピトープが、当該治療用抗体が認識（結合）するエピトープと異なる場合には、結合の競合を示さない（交叉反応が生じない）ことから、当該治療用抗体の投与開始後にも、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて、ＣＤ２６を正確に検出、評価し得るので有利である。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の必要量や濃度、検出する対象由来の試料の調製の条件、当該試料と抗体との接触条件、検出条件等は、目的に応じて、当業者が適宜、選択しかつ決定することができる。
【００２９】
また、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者への、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性の判定方法に用いることができる。例えば、当該判定方法は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、対象由来の試料に接触させるステップ、及び、当該試料に含まれ得るヒトＣＤ２６を、免疫染色によって検出するステップを含んでよく、場合により、当該免疫染色におけるヒトＣＤ２６の検出の程度に応じて、ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の投与の適合性を判定するステップをさらに含んでよい。「ヒトＣＤ２６の検出の程度に応じて」という用語は、治療用抗体の投与の適合性の判定基準と関係し、その判定基準を、当業者は目的に応じて任意に設定することができる。例えば、試料においてＣＤ２６が検出された場合にヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体の適用を肯定的に判断し、一方、検出されなかった場合には否定的に判断するという判定基準を設けてもよい。ヒトＣＤ２６関連疾患を罹患しているか、又は、その疑いのある患者とは、好ましくはヒト患者であって、ヒトＣＤ２６関連疾患を現在罹患しているか、過去に罹患していたか、又は、現在もしくは将来、ヒトＣＤ２６関連疾患に罹患する可能性がある患者を意味してよい。ヒトＣＤ２６関連疾患の治療用抗体は、抗ヒトＣＤ２６抗体であってよく、好ましくは抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体であってよく、さらに好ましくは抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０であってよい。
【００３０】
本発明において、ヒトＣＤ２６関連疾患とは、ＣＤ２６の発現が関連する疾患又は状態を指してよく、ＣＤ２６が発現している細胞の増殖が関連する疾患又は状態であってもよい。ヒトＣＤ２６関連疾患は、限定はされないが、例えば、がん、免疫病、ウイルス性疾患、代謝疾患、又は、炎症性疾患であってよい。
当該がんとしては、限定はされないが、良性腫瘍、あるいは、原発性又は転移性の、かつ、浸潤性又は非浸潤性の、癌、肉腫、中皮腫等が挙げられる。当該がんは、例えば、悪性中皮腫、肝臓がん、腎がん、前立腺がん、大腸がん、肺がん、甲状腺がん、Ｔ細胞性悪性リンパ腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、グリオーマ、又は、ＣＤ２６の発現を伴うその他の悪性腫瘍であってよい。
当該免疫病は、例えば、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、又は、バセドー病）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、又は、ＣＤ２６の発現を伴うその他の免疫病であってよい。なお、自己免疫疾患とは、限定はされないが、異物を認識し排除するための役割を持つ免疫系が、自分自身の正常な細胞や組織に対しても過剰に反応し攻撃を加えることで生じる疾患又は状態を意味してよい。
当該ウイルス性疾患は、例えば、コロナウイルスに起因する疾患であってよい。
当該代謝疾患は、例えば、糖尿病、又は、メタボリックシンドロームであってよい。
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いてＣＤ２６を検出するのに用いる対象由来の試料とは、ＣＤ２６を発現する、上述のヒトＣＤ２６関連疾患を有するか、有していたか、有する可能性のある細胞、組織、器官、臓器、それらの断片又はそれらを含む物質であるのが好ましい。
【００３１】
抗体又はその抗原結合性断片の、ＣＤ２６への結合親和性を決定する方法は、当該技術分野において当業者に公知の方法を用いてよい。例えば、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、フローサイトメトリー、蛍光消光、蛍光転移、酵母ディスプレイ、及び/又は、免疫染色を使用して決定してよい。さらに、結合親和性は、適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングしてもよい。ＣＤ２６への結合親和性が高い抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を選択するために、これらの方法を単独又は組み合わせて、検出量（ＣＤ２６の発現量）が高いものをスクリーニングし、絞り込んでもよい。
好ましい一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＣＤ２６（有利には、ヒトＣＤ２６）を検出するのに用いることができ、免疫染色に適しているのが特に好ましい。
【００３２】
一実施態様において、ＣＤ２６のフローサイトメトリーによる結合親和性の評価は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、未標識で評価の対象とする標本（ここで、標本とは、例えば、個体、臓器、組織、細胞又はそれらの断片等を含む生物試料を指してよい。）と結合させた後、蛍光色素結合二次抗体で検出することもでき、又は、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に蛍光色素(例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７等)を直接標識して検出することもできる。
【００３３】
一実施態様において、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いたＣＤ２６の免疫染色は、評価の対象とする標本を固定して作製した、固定組織標本に対して行われるのが好ましい。「固定」とは、標本を、自己融解や腐敗による劣化から保護するための化学処理を意味してよい。かかる固定により、生化学反応が停止し、場合により物理的強度や化学的安定性が向上することも期待される。
【００３４】
固定は、主には、研究、検査を目的として、生物試料の変性、劣化等を防いで、できるだけその形態を天然の状態に近いまま維持することを目的として行われてよい。固定により、生物試料中の内在性の生体分子、特にタンパク質分解酵素を不活化させ；外来性の損傷から保護し；場合により、細菌等の微生物に対して毒性を示すか、又は、生物試料を微生物が栄養にしにくい形態に化学的に修飾し；及び／又は、生物組織自体の強度や安定性を向上させることが好ましい。
固定の種類（固定剤の選択等）や条件（固定する標本の大きさ、標本の切片作製手段、標本の変形防止手段、固定剤の量、固定時間、固定に使用する容器、固定の温度、時間、ｐＨ等）を、目的に応じて当業者は適宜選択することができる。生物試料中の内在性の生体分子の不活化の手段として、例えば、それらの生体分子を変性させてもよい。また、ゲルやゾルの状態にある生物試料を完全に固体とすることで形態を固定化して安定化させてもよい。このような固定には、温度や圧力による物理的な変性（例えば、煮沸やマイクロウェーブ照射による熱凝固、又は、凍結等）を利用してもよいが、固定剤による化学的な処理が好ましい。固定剤（固定液）は、単独で、又は、組み合わせて用いてもよく、適宜、ｐＨ変化を和らげる緩衝剤、浸透圧又は粘性を調節する塩や糖などと組み合わせて用いてよい。
固定液は、限定はされないが、例えば、アルデヒド系固定液、酸を含む固定液、金属塩を含む固定液、又は、脱水剤・有機溶媒系固定液等が挙げられる。アルデヒド系固定液としては、限定はされないが、１０〜２５％ホルマリン（ホルムアルデヒド飽和水溶液）固定液を用いてよく、場合により、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム、臭化アンモニウム、塩化カルシウム又は硫酸亜鉛等を添加物として加えてもよい。あるいは、１０％リン酸緩衝ホルマリン固定液、４％パラホルムアルデヒド固定液、又は、１〜５％グルタルアルデヒド固定液等を用いてもよい。酸を含む固定液としては、限定はされないが、例えば、ブアン固定液（例えば、ピクリン酸飽和水溶液：ホルマリン：氷酢酸＝１５：５：１で含む）、ザンボニ固定液、又は、２％オスミウム液固定液（四酸化オスミウムを用いる）等が挙げられる。金属塩を含む固定液としては、限定はされないが、例えば、亜鉛固定液又はＨｏｌｌａｎｄｅ固定液等が挙げられる。脱水剤・有機溶媒系固定液としては、限定はされないが、例えば、アルコール（エタノール等）固定液、アルコール・ホルマリン混合液、ＦＡＡ固定液（例えば、ホルマリン：氷酢酸：５０％エタノール＝１：１：１８で含む）、又は、アセトン固定液等が挙げられる。好ましい固定液としては、１０〜２５％ホルマリン固定液、２〜５％パラホルム固定液、８０〜１００％エタノール、８０〜１００％メタノール又は１００％アセトン等が挙げられる。
固定する標本の大きさとしては、組織片は薄く、小さい方が、固定剤（固定液）が浸透しやすいので一般には好ましく、標本の表面積が大きい方が好ましい。一態様において、標本の厚さは、１．５ｃｍ以下が好ましく、５ｍｍ以下であることがより好ましい。固定剤の量としては、特に限定はされないが、標本に対して十分量があればよく、例えば、５倍〜１０倍以上あればよい。固定時間は、固定剤の種類、標本の大きさや性質により異なり得る。固定が不十分な場合、組織収縮、細部構造の崩壊が生じ得、一方、固定が過剰な場合、組織片の脆弱化による組織収縮や膨化が生じ得る。当業者は、適宜、固定の最適な時間を決定でき、例えばそれは、６時間〜４８時間であってよい。固定の温度は、例えば、４℃又は室温であってよい。高温である場合、固定時間は短くなり得るが、温度が高すぎると標本が硬化するおそれが生じ得る。
固定するための手法としては、生物試料を固定液に浸けておく浸漬法の他に、十分量の固定液を心臓等に注入し血流に乗せる灌流法が挙げられ、後者は、例えば、マウス等を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ病態モデル実験で用いてもよい。
【００３５】
固定された生物試料は標本として保存することができ、あるいは、さらに、例えば、切り出し、脱水、包埋、薄切、及び／又は染色等を行った後に、例えば光学顕微鏡等で観察することができる。
切り出しは、標本のサイズが大きい場合に顕微鏡で観察できるサイズに標本を小さくし、あるいは、標本中の病変部や正常部が観察しやすくなるように行ってよく、適宜、標本を切断してよい。
顕微鏡で標本を観察できるように、又は、標本中に存在する中空部位を埋めて標本の変形を防ぐために、適当な包埋剤（例えば、パラフィン、セロイジン等）中に標本を包埋して標本に強度を与えてよい。包埋の手法としては、限定はされないが、例えば、パラフィン包埋法、セロイジン包埋法、ＯＣＴコンパウンド包埋法、ゼラチン包埋法、又は、合成樹脂包埋法等が挙げられ、これらのすべてが当業者に公知である。一態様において、パラフィン包埋法が好ましい。包埋を行う際に、水分が標本中に存在すると、その部分に包埋剤が浸透しないので、当該水分をアルコール（エタノール等）を用いて除去してもよい。
例えば、パラフィン包埋法を用いる場合には、脱水過程で標本中に浸透したアルコールを除去するために、キシレン又はクロロホルム等による透徹を行うことが好ましい。次いで、パラフィンを標本中に浸透させてパラフィンのみが含まれるようにしたら、冷却して標本を硬化させ、パラフィンブロックを作製してよい。
標本を薄切にするためにはミクロトームを用いてもよい。
顕微鏡下での標本の観察を容易にするために、薄い組織切片にした標本を染色する（抗原ＣＤ２６を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を可視化する。）ことが好ましい（以下、可視化に関して、当該抗体は、場合により、抗原結合性断片であってもよいことが当業者には理解される。）。
【００３６】
また、例えば、パラフィン包埋法を用いてパラフィンブロックを作製した場合には、例えば、キシレン、アルコール（エタノール等）を用いて脱パラフィンを行った後、場合により、標本中の目的抗原（ＣＤ２６）を賦活化することで、染色を強化してよい。
例えば、ホルマリンで固定しパラフィンに包埋させた標本では、その標本作製過程において組織や細胞中に存在する抗原をマスキングする架橋結合が生じ、抗原の免疫原性が失われ、これによって、抗体による抗原認識が阻害され得る。したがって、かかる免疫原性の低下を防ぐために、抗原賦活化処理を行ってよい。抗原賦活化の方法としては、特に限定はされないが、例えば、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ又はプロテインキナーゼＫ等のタンパク質分解酵素処理；マイクロウェーブ、オートクレーブ又は煮沸等による加熱処理；アルカリや酸（例えば塩酸又はギ酸）による処理等が挙げられる。賦活化の方法、抗原賦活溶液の種類、ｐＨ、濃度、賦活時間、賦活温度等を、目的に応じて、当業者は適宜選択し決定することができる。例えば、加熱処理により抗原を賦活化する場合には、限定はされないが、ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０のトリス塩酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、ＥＤＴＡ溶液、尿素、又は、市販の種々の抗原賦活溶液を使用することができ、例えば、９０℃〜１３０℃で１０分間〜１時間加熱してよい。タンパク質分解酵素処理により抗原を賦活化する場合には、タンパク質分解酵素の濃度を当業者は適宜決定してよく、例えば、４℃〜３７℃で、５分間〜数時間程度、酵素処理してもよい。
【００３７】
抗原抗体反応を可視化する方法（染色方法）としては、抗体に特定の酵素を標識しておき、後で、基質を反応させて形成された色素生成物の呈色を光学顕微鏡等で観察する酵素抗体法を用いてよい。光学顕微鏡で観察する場合、例えば、染色される部分（シグナル部分）と染色されない部分（ノイズ部分）のコントラスト（シグナル／ノイズ比）を、目視で観察してもよい。また、バーチャルスライドを作成し、染色部位の定量的解析を行う事で、染色部分を評価してもよい。
酵素抗体法は、大まかには、抗原に直接反応する抗体（一次抗体）を標識し、抗原抗体反応を１度しか行わない直接法と、標識していない一次抗体を用いて１度目の抗原抗体反応を行い、一次抗体自体を抗原とする別の抗体（二次抗体）を標識して、さらに反応させて２回以上（多くは２回、場合により３回）抗原抗体反応を行う間接法とが挙げられる。また、間接法の変法として、ペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ抗体の可溶性免疫複合体（ＰＡＰ）を用いるＰＡＰ法（Sternberger LA et al. (1970). "The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry: preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes". J Histochem Cytochem 18 (5): 315-33. PMID 4192899.）、ＬＡＢ（Linked Avidin-Biotin）法、アビジン・ビオチン複合体を用いるＡＢＣ法（Hsu SM, Raine L, Fanger H (1981). "Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures". J Histochem Cytochem 29 (4): 577-80.）、ストレプトアビジンを用いるＬＳＡＢ(Linked Streptavidin-Biotin)法、ＴＳＡ（tyramide signal amplification）法、又は、ＣＡＲＤ（catalyzed reporter deposition）法等を用いてもよい。
酵素抗体法での発色方法としては、限定はされないが、例えば、標識酵素としてペルオキシダーゼ（西洋ワサビパーオキシダーゼ等）を発色基質のジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応させるＤＡＢ法（褐色に染色）（Graham RC Jr, Karnovsky MJ. (1966). "The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique". J Histochem Cytochem 14 (4): 291-302）；ニッケルイオン存在下でＤＡＢ法を行う、より高感度の、ニッケルＤＡＢ法；ペルオキシダーゼを発色基質のアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）と反応させる方法（赤色に染色）；あるいは、標識酵素としてアルカリホスファターゼを、発色基質のＢＣＩＰ／ＮＢＴと反応させる方法（青紫色に染色）、発色基質のＦａｓｔ  Ｒｅｄと反応させる方法（赤色に染色）、又は、発色基質のＦａｓｔ  Ｂｌｕｅと反応させる方法（青色に染色）等を挙げてもよい。
一実施態様において、染色方法がＤＡＢ法である場合、染色前に、抗原賦活化した標本を、例えば過酸化水素水含有メタノール等に浸すことで、標本中の内在性ペルオキシダーゼの不活化を行なうことが好ましい。
染色の手法、温度、染色時間等の各種条件を、当業者は目的に応じて、適宜、選択し、決定することができる。染色は、例えば、一次抗体として、本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を標本に添加して、例えば、４℃〜室温で１時間から一晩反応させた後に当該一次抗体を洗浄し、次いで、二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗体又はアルカリホスファターゼ標識抗体を添加して、例えば、４℃〜室温で３０分間から一晩反応させた後に当該二次抗体を洗浄してから、発色させてもよい。あるいは、検出感度を高めるために、ＡＢＣ法を利用してもよい。あるいは、検出感度を高めるために、標識していない一次抗体（本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片）を用いて１度目の抗原抗体反応を行い、次いで、一次抗体自体を抗原とする標識していない二次抗体を用いて２度目の抗原抗体反応を行い、次いで、二次抗体自体を抗原とする、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識した三次抗体を添加し、例えば、４℃〜室温で１時間から一晩反応させた後に、当該三次抗体を洗浄してから発色させてもよい。
【００３８】
あるいは、抗原抗体反応を可視化する方法としては、上述の抗原抗体反応の他に、抗体に放射性同位元素を結合（「標識」という）しておき、後で印画紙に感光させるオートラジオグラフィー法；金粒子等の可視物質に抗体を結合させておき、電子顕微鏡等で観察する金コロイド法；又は、抗体に蛍光色素を標識しておき、抗原抗体反応の後で励起波長を当てて蛍光発色させ蛍光顕微鏡で観察する蛍光抗体法を用いてもよい。
【００３９】
別の実施態様において、本発明は、ハイブリドーマ（すなわち、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託したハイブリドーマであるクローン１９（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２）、クローン１８（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３）、クローン１６（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４）（受託日は、いずれも、２０１３年７月３日））に関するが、これらのハイブリドーマは、細胞分裂による子孫を含み、子孫は、突然変異等により親細胞と必ずしも同一でなくてもよい。
【００４０】
別の実施態様において、本発明は、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）、当該ＤＮＡを含むベクター、又は、当該ベクターを含む宿主細胞をも提供する。それらの製造方法、取得方法、ベクターや宿主細胞の種類は、当業者に周知である。
【００４１】
本発明のハイブリドーマ、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体、その抗原結合性断片、当該抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）、当該ＤＮＡを含むベクター、又は、当該ベクターを含む宿主細胞は単離されている、すなわち、天然には存在しない形態をしていてよく、人工的に精製したものであってよい。一実施態様において、これらは、他の不純物を含まず、実質的に純粋（ｐｕｒｅ）であるのが好ましい。
【００４２】
技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の一又は複数を、適宜組み合わせて、本発明を実施してよいことを当業者は理解する。さらに、技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、好ましい又は有利なあらゆる態様を、適宜組み合わせて、本発明を実施することが好ましいであろうことを当業者は理解する。
【００４３】
本明細書中に引用される文献は、参照により、それらのすべての開示が、明確に本明細書に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、それらの文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解できる。
【００４４】
本明細書中に引用される文献は、本出願の出願日前の関連技術の開示のみを目的として提供され、本発明者らが、先行発明又は任意の他の理由によって、かかる開示に先行する権利を持たないことを自認するものとして解釈されてはならない。これらの文献のすべての記述は、本出願人が入手可能であった情報に基づいており、これらの記述内容が正確であるという自認を何ら構成しない。
【００４５】
本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００４６】
本明細書において用いられる「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記載された事項（部材、ステップ、要素又は数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素又は数字等）が存在することを排除しない。「を含む」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」及び／又は「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語で記載される態様を包含する。
【００４７】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００４８】
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
【００４９】
第１の、第２の等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はこれらの用語自身によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００５０】
本明細書において、成分含有量や数値範囲等を示すのに用いられる数値は、特に明示がない限り、用語「約」で修飾されているものと理解されるべきである。例えば、「４℃」とは、特に明示がない限り、「約４℃」を意味するものと理解され、その程度を、当業者は技術常識と本明細書の文意に従って、合理的に理解できることは当然である。
【００５１】
文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形で表される各態様は、技術的に矛盾しない限り、複数形であってもよいことが理解され、逆もまた真である。
【００５２】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。関連技術分野の当業者は、本発明の精神又は範囲を変更させることなく、様々な改変、付加、欠失、置換等を伴って本発明を実施できる。
【実施例】
【００５３】
１．研究方法
（１）  研究に用いた抗ヒトＣＤ２６抗体
抗ヒトＣＤ２６抗体として、本発明者らがこれまでに開発したマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体である、
（ｉ）ヒトＣＤ２６の１〜２４７アミノ酸に結合する４Ｇ８、
（ｉｉ）ヒトＣＤ２６の２４８〜３５８アミノ酸に結合する１Ｆ７、及び、同様の部位に結合する１４Ｄ１０の相補性決定領域を元に作製した抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ２６の３５８アミノ酸周辺に結合する５Ｆ８及び２Ｆ９、
（ｉｖ）ヒトＣＤ２６の４５０〜５７７アミノ酸に結合する１６Ｄ４Ｂ、及び、
（ｖ）ヒトＣＤ２６の３５９〜６５３アミノ酸に結合する９Ｃ１１
を用いた。ＹＳ１１０はワイズセラピューティックス株式会社（東京、日本）から入手可能である。
４Ｇ８、１４Ｄ１０、２Ｆ９、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１に関しては、例えば、「Dong RP, Tachibana K, Hegen M, et al. (1998) Correlation of the epitopes defined by anti-CD26 mAbs and CD26 function. Mol Immunol 35: 13-21」を参照されたい。
１Ｆ７に関しては、「Morimoto C, et al. (1989) 1F7, A novel cell surface molecule, involved in helper function of CD4 cells. J Immunol 143: 3430-3439」やＷＯ ２００２／０９２１２７等を参照されたい。
５Ｆ８に関しては、例えば、「Torimoto Y et al. (1992) Biochemical characterization of CD26 (dipeptidyl peptidase IV): Functional comparison of distinct epitopes recognized by various anti-CD26 monoclonal antibodies. Molecular Immunology Vol. 29, No. 2., 183-192」やＷＯ ２００２／０９２１２７等を参照されたい。
１４Ｄ１０に関しては、例えば、ＷＯ ２００７／０１４１６９を参照されたい。
抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の受託番号ＰＴＡ−７６９５で特定され、ｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４８（ｘ４１１)と命名された株により生産される抗体であり、その詳細は、例えば、特許文献１を参照されたい。
また、本研究で新たに樹立した本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の比較対照として、免疫組織染色可能なマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体として市販されているＭＢＬ社のモノクローナル抗体クローン４４‐４（カタログ番号Ｄ０６８−１）及びＲ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１１８０）を用いた。
【００５４】
（２）  免疫抗原（ヒトＣＤ２６タンパク質）の調製
本発明者らが作製した可溶性ヒトＣＤ２６（ヒトＣＤ２６（配列番号１）のＮ末端側３番目から９番目のアミノ酸残基を削除したもの）を発現するプラスミドをＣＨＯ細胞株に遺伝子導入し、ヒトＣＤ２６を安定して分泌するＣＨＯ細胞株をクローン化した（Tanaka T, Duke-Cohan JS, Kameoka J, et al. (1994) Enhancement of antigen-induced T-cell proliferation by soluble CD26/dipeptidyl peptidase IV. Proc Natl Acad Sci USA 91: 3082 - 3086）。可溶性ヒトＣＤ２６が分泌された培養上清を、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を固定化したセファロースカラムに通すことで、可溶性ヒトＣＤ２６のアフィニティー精製を行った（同上文献）。精製した可溶性ヒトＣＤ２６をウレアバッファー（８Ｍ  ウレア、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）中で５〜８時間、室温で緩やかに撹拌することにより、変性化したヒトＣＤ２６を調製した。
【００５５】
（３）  マウスへの免疫とハイブリドーマの作製
変性化した可溶性ヒトＣＤ２６の溶媒をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で置換した後、１００μｇ／５０μｌの濃度に調整し、合成コポリマー系アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．）５０μｌと混合して、１匹あたり１００μｌ／ｄｏｓｅでＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。２週間ごとに合計７回皮下注射を行い、最後に尾静脈に上記の半量である５０μｌを静脈注射した。３日後にマウスを解剖して得た粗精製脾細胞と、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞とを、１：１で混合し、ポリエチレングリコールで細胞融合してハイブリドーマを作製した。細胞を洗浄した後、１０％  ＦＣＳ（牛胎児血清）、５％  ＢｒｉＣｌｏｎｅ（ＮＩＣＢカタログ番号ＢＲＢＲ００１）、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に当該細胞を懸濁してから、９６ウェル平底プレートに播種した。生育したハイブリドーマの培養上清を回収し、フローサイトメトリーとＥＬＩＳＡによって、抗ヒトＣＤ２６抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行い、陽性であったハイブリドーマを選出した後、免疫染色の検討を行った。免疫染色可能であったハイブリドーマを９６ウェル平底プレートに１個／ウェルで播種し直し、複数の単クローンを選出した。培養に用いる培地を無血清のＧＩＴ培地（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に置換した後、目的の抗体を含む細胞培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＩｇＧ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＩｇＧ画分を精製した。
【００５６】
（４）  フローサイトメトリー
本発明者らが作製したヒトＣＤ２６を組み込んだＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴ）（Tanaka T, Kameoka J, Yaron A, Schlossman SF, Morimoto C (1993) The costimulatory activity of the CD26 antigen requires dipeptidyl peptidase IV enzymatic activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90: 4586-4590）を用いてヒトＣＤ２６への結合を検討した。一次抗体として、ハイブリドーマ培養上清もしくはＭＢＬ社の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４を１００μｌ/サンプル、又は、マウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン５Ｆ８を２０μｇ/ｍｌに希釈した溶液を５０μｌ／サンプルで添加し、４℃で２５分間静置した。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、二次抗体としてＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を４００ｎｇ/ｍｌに希釈した溶液を５０μｌ／サンプルで添加し、４℃で２５分間静置した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、フローサイトメーターであるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で解析した。
【００５７】
（５）  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）
精製した可溶性ヒトＣＤ２６（非変性ヒトＣＤ２６）又はウレアバッファーで処理した可溶性ヒトＣＤ２６（変性ヒトＣＤ２６）を炭酸塩／重炭酸塩バッファー（ＣＢＢ）で４μｇ／ｍｌに希釈し、イムノプレート（ＮＵＮＣ）に５０μｌ／ウェルで添加して４℃で一晩静置した。陰性コントロールとしてＣＢＢバッファーのみを添加し、可溶性ヒトＣＤ２６をコートしない群を用意した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、３％  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）含有ＰＢＳ−Ｔを１００μｌ／ウェルで添加して、室温で１時間静置することでプレートをブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、一次抗体としてＰＢＳ−Ｔで３倍に希釈したハイブリドーマ培養上清、又は、ＭＢＬ社の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４を５０μｌ／ウェル、あるいは、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体、又は、マウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン５Ｆ８をＰＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍｌに希釈した溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、又は、ＨＲＰ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を１６０ｎｇ／ｍｌに希釈した溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を５０μｌ／ウェルで添加し、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を２５μｌ／ウェルで添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。
【００５８】
（６）  免疫組織染色
１０〜２５％ホルマリン固定液又はアルコール系固定液等で固定し、パラフィンに包埋させた切片から５μｍ厚の標本を準備し、パラフィンを溶かした後、賦活化した。賦活化の方法としては、
（１）ｐＨ６．０  １０ｍＭ  クエン酸緩衝液中で、１２０℃で２０分間オートクレーブするか、
（２）ｐＨ６．０  １０ｍＭ  クエン酸緩衝液中で、１００℃で１０分間煮沸するか、
（３）０．０１〜０．１％  トリプシンで、室温又は３７℃で５〜６０分間処理するか、又は、
（４）０．０１〜０．０４％  プロテインキナーゼＫで、室温又は３７℃で５〜３０分処理する、
のいずれかで行った。図２Ａ及び図２Ｂの結果は、（１）の賦活化の方法で行った。
その後、賦活化した標本を過酸化水素水含有メタノールに浸して内在性ペルオキシダーゼの不活化を行い、２．５％ウマ血清でブロッキングを行った。その後、当該標本に、一次抗体として各ハイブリドーマ若しくはＭＢＬ社の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４の培養上清を１００μｌ／サンプル、あるいは、各ハイブリドーマの培養上清から精製したＩｇＧ抗体又はＲ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体を０．２％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０μｇ/ｍｌに希釈した溶液を１００μｌ／サンプルで添加し、４℃又は室温で１時間から一晩反応させた。洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ結合ウマ抗マウスＩｇＧ抗体又はＨＲＰ結合ウマ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を１００μｌ／サンプルで添加し、４℃又は室温で３０分から一晩反応させた。さらに、洗浄後、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）（Ｄｏｊｉｎｄｏ）と過酸化水素で発色させ、Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１光学顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
ヒトＣＤ２６の染色結果に関する評価は、病理専門医２名で行い、ヒトＣＤ２６を発現しているヒト正常組織（肝臓、腎臓、前立腺）、及び、ヒトがん組織（悪性中皮腫、肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、大腸腺がん、肺腺がん）のヒトＣＤ２６の染色パターンを、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体で染色した場合とそれぞれ比較することで行った。
【００５９】
（７）  抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体及び既存の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体との競合の解析
Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴを用いて、得られた本発明の複数の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体と抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０との競合の解析を、フローサイトメトリーにより、それぞれ、行った。すなわち、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴに、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０又はコントロールヒトＩｇＧ抗体（献血ベニロン（登録商標）−Ｉ静脈用、化学及血清療法研究所）を５０μｇ／ｍｌに希釈した溶液を５０μｌ／サンプルで添加し、４℃で３０分間静置した。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、上述したハイブリドーマ培養上清を１００μｌ／サンプルで添加し、４℃で２５分静置した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体としてＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を４００ｎｇ/ｍｌに希釈した溶液を５０μｌ／サンプルで添加し、４℃で２５分間静置した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定を行った。
同様に、それぞれエピトープが異なる５種類の既存のモノクローナル抗体（４Ｇ８、１Ｆ７、５Ｆ８、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１）と、下記記載の「２．結果」において後述するクローン１８又はクローン１９によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体との結合の競合解析をフローサイトメトリーにて行った（「Dong RP, Tachibana K, Hegen M, et al. (1998) Correlation of the epitopes defined by anti-CD26 mAbs and CD26 function. Mol Immunol 35: 13-21」を参照されたい。）。すなわち、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ２６ＷＴに、上記の５種類の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体又はコントロールマウスＩｇＧ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンMG１-４５、カタログ番号４０１４０４）を５０μｇ／ｍｌに希釈した溶液を５０μｌ／サンプルで添加し、４℃で３０分静置した。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ−２０１８６）を用いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７の直接標識を行った、クローン１８又はクローン１９の培養上清由来の精製ＩｇＧ抗体を０.６μｇ／ｍｌ、５０μｌ／サンプルで添加して、４℃で２５分間静置した後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定を行った。
【００６０】
（８）  エピトープマッピング
ヒトＣＤ２６全長、及び、５種類のヒトＣＤ２６削除変異体を作製し、これらのプラスミドをそれぞれＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入して、ヒトＣＤ２６全長タンパク質及び５種類のヒトＣＤ２６変異タンパク質をそれぞれ発現させた。５種類のヒトＣＤ２６削除変異体は、それぞれ、ヒトＣＤ２６全長（１〜７６６アミノ酸残基）のうち、１〜２４７アミノ酸残基のみからなる削除変異体、１〜３５８アミノ酸残基のみからなる削除変異体、１〜４４９アミノ酸残基のみからなる削除変異体、１〜５７７アミノ酸残基のみからなる削除変異体、１〜７３９アミノ酸残基のみからなる削除変異体に関する（「Dong RP, Tachibana K, Hegen M, et al. (1998) Correlation of the epitopes defined by anti-CD26 mAbs and CD26 function. Mol Immunol 35: 13-21」を参照されたい。）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で直接標識した、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０、クローン１８又はクローン１９の培養上清由来の精製ＩｇＧ抗体を、これらのＣＯＳ−７細胞にそれぞれ０.６μｇ／ｍｌ、５０μｌ／サンプルで添加して、４℃で２５分間静置した後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ヒトＣＤ２６全長又はヒトＣＤ２６削除変異体に対する抗体の結合をそれぞれ解析した。
【００６１】
２．結果
（１）  ハイブリドーマ培養上清のスクリーニング
上述のとおり、ウレアバッファーで変性処理を行った可溶性ヒトＣＤ２６を免疫させたマウスの粗精製脾細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞とを細胞融合させ、生育したハイブリドーマからマウス抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を含むハイブリドーマ培養上清を回収し、フローサイトメトリーによる一次スクリーニングとＥＬＩＳＡによる二次スクリーニングを行うことで、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマの絞り込みを行った。その結果、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡによってヒトＣＤ２６を検出可能な３１のハイブリドーマクローンが得られた。代表的なクローンのフローサイトメトリーの結果を図１Ａに、非変性可溶性ヒトＣＤ２６及びウレアバッファーによる変性可溶性ヒトＣＤ２６に対するＥＬＩＳＡの結果を図１Ｂに示した。
【００６２】
（２）  ハイブリドーマ培養上清及び精製ＩｇＧ抗体による免疫染色
上述のスクリーニングで得られた３１のハイブリドーマクローンの培養上清を用いてヒトＣＤ２６の免疫染色を検討した。
まず、ＭＢＬ社の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４は、ＭＢＬ社の添付文書に則った方法で染色を試みたが（http://ruo.mbl.co.jp/dtl/A/D068-1/）、染色性が弱く、また、まばらにしか染色されないため、信頼性に欠け、ヒトＣＤ２６抗体療法適用患者を選択するための（コンパニオン）診断薬としては不適切であることが明らかとなった（図２Ａ）。なお、ＭＢＬ社の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４を用いてウェスタンブロット法を行っても、ヒトＣＤ２６を検出できなかった（データは示さず。）。
次に、本発明者らが作製した、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡに使用可能な抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を産生する上記３１のハイブリドーマクローンの培養上清を用いて、ヒト正常組織（肝臓、腎臓、前立腺）、及び、悪性中皮腫の免疫染色を検討した結果、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のポリクローナル抗体と同様に、肝臓の毛細胆管、近位尿細管の刷子縁、前立腺の管腔側等に、ヒトＣＤ２６の染色が認められる６クローンを得た。このうち代表的な３クローン（クローン１６、クローン１８、クローン１９）及び陰性対照例として１クローン（クローン３）を用いた免疫組織染色の結果を図２Ａに示した。クローン１６、クローン１８、クローン１９によって産生される、抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を含む培養上清のいずれもが、ヒト正常組織（肝臓、腎臓、前立腺）、及び、悪性中皮腫のいずれの組織においても、ＭＢＬ社の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４と比較して、ヒトＣＤ２６の染色強度が高く（褐色に染色された）、バックグラウンドが低かった。
さらに、クローン１８、クローン１９のハイブリドーマ培養上清を精製して得たＩｇＧ画分（ＩｇＧ抗体）を用いて、ヒトＣＤ２６陽性腫瘍である肝細胞がん、腎細胞がん、前立腺がん、大腸腺がん、肺腺がんの免疫染色を検討した結果、いずれのがん組織に対しても、クローン１８及びクローン１９由来の精製抗体が、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のポリクローナル抗体と同等の明瞭な染色を示すことが認められた（図２Ｂ）。
【００６３】
ハイブリドーマであるクローン１９、クローン１８、クローン１６を、それぞれ、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（受託日はいずれも、２０１３年７月３日であった。クローン１９について：受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４２；クローン１８について：受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４３；クローン１６について：受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ‐０１６４４）。
【００６４】
（３）  抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体との競合の解析
ハイブリドーマである、クローン１６、クローン１８、クローン１９の培養上清を用いて、臨床試験を行っている抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０との競合の解析を、フローサイトメトリーにより行った。その結果、クローン１６、クローン１９の培養上清に含まれる抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０で前処理した場合に、ヒトＣＤ２６への結合が全く阻害されなかった（、すなわち、ＹＳ１１０と結合の競合を示さなかった）のに対し、クローン１８の培養上清に含まれる抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、ＹＳ１１０で前処理した場合、ヒトＣＤ２６への結合が完全に阻害されることが示された（図３）。それぞれのフローサイトメトリーの解析結果を図６に示した。これらのことから、得られた３クローンの中でも特に明瞭な染色性を示したクローン１９によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０で結合が阻害されずにヒトＣＤ２６を認識できることが判明したため、このクローンは、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０を投与した患者検体の臨床検査に特に有用であろう。
【００６５】
（４）  エピトープマッピング
抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０との競合の結果をより確実なものにするために、明瞭な染色結果が得られた代表的な２クローン（クローン１８、クローン１９）を用いて、それぞれのエピトープの同定を行った。
その結果、クローン１８によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２６全長タンパク質の２４８〜３５８アミノ酸残基に結合するＣＤ２６モノクローナル抗体１Ｆ７によって、ヒトＣＤ２６への結合が完全に阻害された。一方、クローン１９によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２６全長タンパク質の１〜２４７アミノ酸残基に結合する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体４Ｇ８によって、ヒトＣＤ２６への結合が完全に阻害されることが示された（図４）。
さらに、ヒトＣＤ２６全長、及び、５種類のヒトＣＤ２６削除変異タンパク質をそれぞれＣＯＳ−７細胞に発現させ、クローン１８、クローン１９によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体の、これらのタンパク質に対する結合を、フローサイトメトリーを用いてそれぞれ解析した。クローン１８によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体はヒトＣＤ２６の１〜３５８アミノ酸部分には結合するが、１〜２４７アミノ酸部分には全く結合しないことから、ヒトＣＤ２６の２４８〜３５８アミノ酸残基上のエピトープに結合することが判明した（図５、図８）。一方、クローン１９によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、ＣＤ２６全長、及び、５種類のＣＤ２６削除変異タンパク質のいずれに対しても結合したことから、ヒトＣＤ２６の１〜２４７アミノ酸残基上のエピトープに結合することが判明した（図５、図８）。
これらの結果は、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０との競合の解析結果（図４）と完全に一致した結果であり、クローン１８によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体が、ヒトＣＤ２６の２４８〜３５８アミノ酸に結合する抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０で完全に阻害され、クローン１９は結合が阻害されなかったこと（図３、図６）とも合致した結果であった。
また、クローン１６に関しても、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０との競合を解析した結果、クローン１６によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２６の４５０〜５７７アミノ酸残基に結合するＣＤ２６モノクローナル抗体（１６Ｄ４Ｂ）のヒトＣＤ２６への結合をほぼ完全に阻害し、さらに、ヒトＣＤ２６の３５９〜６５３アミノ酸残基に結合する抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（９Ｃ１１）のヒトＣＤ２６への結合を完全に阻害することが示されたことにより（図７）、３５９〜６５３アミノ酸残基上のエピトープに結合することが判明した。これらの結果も、クローン１６によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体が、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０では結合が阻害されなかったこと（図３、図６）と合致していた。
【００６６】
３．考察
従来の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体では、固定組織標本の免疫染色を行うことができなかった。Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社及びＮｏｖｕｓ社の抗ヒトＣＤ２６ポリクローナル抗体のみが免疫染色に使用可能だが（http://www.rndsystems.com/Products/AF1180；http://www.novusbio.com/CD26-Antibody_NB100-59021.html）、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の抗体は、可溶性ヒトＣＤ２６によるアフィニティー精製した抗体であるため、Ｎｏｖｕｓ社の抗体よりも、良好であるとされている。しかしながら、これらの抗ヒトＣＤ２６抗体はポリクローナル抗体であるため、ロット差が一番の問題となり、研究用試薬としては許容されたとしても、ＣＤ２６を標的とした治療方針や治療結果ヘの影響に関して安定した結果が求められる、臨床診断薬、患者層別マーカーとしては不適切である。
ＭＢＬ社から抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４が研究用として販売されているが（http://ruo.mbl.co.jp/dtl/A/D068-1/）、固定組織標本における免疫染色では染色性が極めて弱く、しかも、まばらにしか染色することができないため、安定した結果が必要不可欠な臨床診断薬としては不適切である（図２）。
今回、本発明者らは、種々のヒトＣＤ２６陽性腫瘍の免疫染色に適し、かつ、アフィニティー精製したＲ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のポリクローナル抗体と同程度の染色パターンを示す、コンパニオン診断薬としても利用可能な、新規抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を同定した。
まず、ウレアバッファーで変性させた組換え可溶性ヒトＣＤ２６をマウスに免疫してハイブリドーマの作製を行った。その結果、ＭＢＬ社の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体クローン４４‐４（http://ruo.mbl.co.jp/dtl/A/D068-1/）では染色が極めて微弱であったのに対し、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のポリクローナル抗体と同等の染色性を発揮する、新規抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体を得ることが出来た。
免疫染色可能な、代表的な３クローンのエピトープマッピングを行った結果、それらのエピトープは非常に多様性に富んでいることが示された。クローン１６又はクローン１９によって産生される抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体は、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０とは異なるエピトープを持つことが明らかになった。抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体ＹＳ１１０と競合することなく、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、及び、免疫染色に使用することができるこれらの抗体は、ＹＳ１１０を用いた抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体療法の治療適用患者の選択、抗ヒトＣＤ２６ヒト化抗体療法後の治療効果の追跡（例えば、経過観察や、再発例や抗体治療無効例におけるヒトＣＤ２６の発現評価）等のための、（コンパニオン）診断薬として特に好ましい。さらに、ＣＤ２６の研究においても、これらの抗体は、ＹＳ１１０を投与後の、腫瘍やヒト免疫細胞におけるＣＤ２６の発現を解析（例えば、経過観察）するのに利用可能である。例えば、マウス等を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ病態モデル実験で、ＹＳ１１０投与後のＴ細胞や腫瘍におけるＣＤ２６の発現を、フローサイトメトリーや免疫染色で経過観察する際に、ＹＳ１１０で結合が阻害される抗体を使用すると、それらＴ細胞や腫瘍がＣＤ２６を発現している場合であってもＣＤ２６を正確に検出、評価できないことから、これらの抗体はＣＤ２６の研究発展にも有用である。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、医療分野及びＣＤ２６の研究分野において有利に利用することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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