(57)【要約】  本発明は、溶液中の１種以上の夾雑物から抗体を分離する方法であって、１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含むマルチモーダルリガンドが固定化された担体からなるクロマトグラフィー樹脂に上記溶液を接触させることを含む。一実施形態では、芳香族又は複素芳香族基の環形成原子は、Ｃ、Ｓ又はＯから選択され、陽イオン交換基は弱陽イオン交換体である。本発明の方法は単段階手順として、又はプロテインＡカラムでの捕獲後の高度精製段階として使用できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の１種以上の夾雑物から抗体を分離する方法であって、１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含むマルチモーダルリガンドが固定化された担体からなるクロマトグラフィー樹脂に上記溶液を接触させて樹脂に抗体及び／又は夾雑物を吸着させることを含んでなる方法。
【請求項２】
芳香族又は複素芳香族基の環形成原子がＣ、Ｓ又はＯから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
陽イオン交換基が弱陽イオン交換体である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂にかけられる溶液が、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、好ましくはそのリガンドがプロテインＡを含む樹脂からの抗体含有溶出液である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
夾雑物が、遊離アフィニティーリガンドと抗体との間で形成された複合体並びに／或いは遊離アフィニティーリガンド及び／又は抗体の凝集体を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
夾雑物がマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に吸着される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
クロマトグラフィー樹脂から抗体及び／又は夾雑物を溶出することを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂と、２種以上の異なる緩衝液と、プロテインＡと抗体との間で形成された複合体及び／又はプロテインＡもしくは抗体の凝集体から抗体を如何に分離するかについて記載された使用説明書とを備え、マルチモーダルリガンドが１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含む、抗体精製用のキット。
【請求項１０】
芳香族又は複素芳香族基の環形成原子がＣ、Ｓ又はＯから選択される、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
液体から抗体を精製するシステムであって、プロテインＡ又はプロテインＧを含むリガンドを有する樹脂が充填された第一のクロマトグラフィーカラムと、１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含むマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が充填された第二のクロマトグラフィーカラムと、第一のカラムにサンプル及び溶出緩衝液を添加する手段と、第一のカラムに由来する溶出液を第二のカラムへ添加する手段と、ポンプ手段と、弁とを備えるシステム。
【請求項１２】
自動化システムである、請求項１１記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の精製方法に関する。具体的には、本発明の方法は、アフィニティー樹脂に起因する夾雑物を除去するため、アフィニティークロマトグラフィーに続く段階として好適に用いられる。本発明は、アフィニティークロマトグラフィー樹脂由来の残渣と抗体との間で形成される夾雑複合体から抗体を精製するキットも包含する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、細菌、寄生虫、真菌、ウイルスの感染及び腫瘍細胞の増殖から身体を共同で保護する多数の相互依存的な細胞型からなる。免疫系の護衛は、宿主の血流を絶えず巡回するマクロファージである。感染又は免疫化に脅かされると、マクロファージは抗原として知られる異分子で標識された侵入者を飲み込むことによって応答する。ヘルパーＴ細胞で媒介されるこの事象は、一連の複雑な応答を起こしてＢ細胞を刺激する。すると、これらのＢ細胞は抗体と呼ばれるタンパク質を産生し、抗体が外来侵入者に結合する。抗体と抗原との結合事象で外来侵入者が標識され、食作用又は補体系の活性化によって破壊される。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのように幾つかの異なるクラスの抗体又は免疫グロブリンが存在する。これらは生理学的役割だけでなく構造においても異なる。構造の面では、ＩｇＧ抗体が、成体の免疫応答において主要な役割を果たすことから、免疫グロブリンの中では最も広範に研究されてきたクラスである。
【０００３】
免疫グロブリンのもつ生物活性は、現在では、ヒト及び動物の診断、健康管理及び治療分野の様々な用途に利用されている。実際この数年において、モノクローナル抗体及び組換え抗体構築物は、現在治療薬及び診断薬として臨床試験で検査され米国医薬品食品局（ＦＤＡ）の認可を受けたタンパク質として最大のクラスとなっている。発現系及び産生計画を補足するものとして、高純度抗体を簡単かつ経済的に得るための精製プロトコルが設計されている。
【０００４】
免疫グロブリンの従来の単離法は、他のタンパク質群を溶解したまま、免疫グロブリンを含むタンパク質画分を選択的に可逆沈殿させることに基づく。典型的な沈殿剤は、エタノール、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウムやリン酸カリウムのようなリオトロピック塩、及びカプリル酸である。通例、これらの沈殿法は極めて不純な生成物を生じるだけでなく、多大な時間と労力を要する。さらに、原料に沈殿剤を添加すると、上清を他の目的に使用するのが難しくなるだけでなく、廃棄処理の問題を生じる。廃棄処理の問題は、免疫グロブリンの大規模精製では特に重要となる。
【０００５】
免疫グロブリンの単離のための別法はクロマトグラフィーであって、これには密接に関連した一群の分離法が包含される。他の大半の理化学的分離法と区別されるクロマトグラフィーの特徴は、２つの互いに非混和性の相を接触させ、一方の相を固定相とし、他方を移動相とすることである。移動相に導入された試料混合物は、移動相によって系内を運搬される際に固定相と移動相の間で何度も一連の相互作用を受ける。相互作用には、試料中の成分の理化学的性質の差が利用される。こうした差が、固定相を収容したカラム内を移動する移動相の影響下での各成分の移動速度を支配する。分離された成分は、固定相との相互作用の低いものから高いものの順に流出する。遅延の最も少ない成分が最初に溶出し、最も強く保持された物質が最後に溶出する。分離は、試料成分がカラムから溶出する際に、ある成分の流出速度が隣接する溶質のゾーンと重ならないように十分に遅くなった場合に達成される。個々の分離目的に最適な固定相を設計するための努力が絶えずなされている。かかる固定相は、一般に、官能基（つまり結合基）を有するリガンドが結合した担体又はベースマトリックスからなる。各々の種類のクロマトグラフィーは、一般に、利用する相互作用の原理に基づいて記述される。
【０００６】
例えば、免疫グロブリンの単離には、イオン交換クロマトグラフィーが多用される。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの負に荷電したアミノ酸側鎖がクロマトグラフィーマトリックスの正に荷電したリガンドと相互作用する。他方、陽イオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの正に荷電したアミノ酸側鎖がクロマトグラフィーマトリックスの負に荷電したリガンドと相互作用する。
【０００７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）も、免疫グロブリンの単離に関して広く記載されている方法である。しかし、疎水性マトリックスは、免疫グロブリンを効率よく結合させるため、原料へのリオトロピック塩の添加を必要とする。連続的又は段階的勾配でリオトロピック塩の濃度を低下させることによって、結合タンパク質はマトリックスから遊離する。高純度製品が目的とされる場合、疎水的クロマトグラフィーを追加の段階と組合せることが推奨される。この方法の短所は、原料にリオトロピック塩を添加する必要があることである。これは、大規模ユーザーでは問題となり、コスト増加をを招く。細胞培養上清以外の原料（例えば、ホエー、血漿及び卵黄）に関しては、原料へのリオトロピック塩の添加は、多くの場合大規模用途での使用が妨げられる。塩を用いると、免疫グロブリン除去後の原料を経済的に使用できなくなるおそれがあるからである。大規模用途での追加の問題は、数千リットルの廃液の処理である。
【０００８】
プロテインＡ及びプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーは、使用が容易で得られる純度も高いので、免疫グロブリンの単離及び精製（特にモノクローナル抗体の単離）のための広く普及した方法である。イオン交換段階、疎水性相互作用段階、ヒドロキシアパタイト段階及び／又はゲル濾過段階との併用は、特にプロテインＡ系の方法は多くの生物製剤製造会社が選択する抗体捕獲方法となっている。例えば、国際公開第８４／００７７３号及び米国特許第５１５１３５０号を参照されたい。しかし、このように一般に利用され、多数の利点を有しているにもかかわらず、プロテインＡ系クロマトグラフィー樹脂はリガンドのペプチド結合のため、ある程度のアルカリ感受性を示すことが周知である。さらに、細胞培養培地からの抗体精製にプロテインＡ系樹脂を使用する場合、培地中のプロテアーゼの存在によってプロテインＡリガンド又はそのペプチド断片が漏れることがある。漏れたプロテインＡの大半は、依然として抗体と複合体を形成する傾向があり、アフィニティーカラムからの溶出物に含まれる抗体がプロテインＡ−抗体複合体及びプロテインＡで汚染されることがある。
【０００９】
アフィニティークロマトグラフィーマトリックスからのリガンドの漏れを低減する試みが国際公開第０３／０４１８５９号（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａ  ＫＧ）に開示されており、例えばプロテインＡマトリックスを１種以上の界面活性剤で前処理してリガンドの漏れを低減することが提案されている。アフィニティーマトリックスは例えば５〜１５ベッド体積の界面活性剤で処理される。このプロセスの有効性には、接触時間が決定的重要性をもつ。例えば、室温では、漏れの低減には１６時間以上の接触時間が必要とされる。高温では、接触時間は短くできる。
【００１０】
リガンドの漏れの問題に対する別の対策が、米国特許第４９８３７２２号（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．）に開示されており、抗体−プロテインＡ混合物を陰イオン交換材料に付して両成分を吸着させた後、イオン強度が増加する条件下で抗体とプロテインＡを逐次溶出することによって、上記混合物からプロテインＡを選択的に単離する。陰イオン交換体の具体例は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ又はＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）である。
【００１１】
米国特許第５４２９７４６号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）は、抗体精製の一段階として疎水性相互作用クロマトグラフィーを応用することに関する。例えばプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーと任意段階としての陽イオン交換クロマトグラフィー中間段階で、ＨＩＣを使用できることが開示されている。陽イオン交換クロマトグラフィーの例としては弱陽イオン交換体（ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ）が挙げられるが、これは吸着の際はｐＨ５．５に調整され、４０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウムの溶出緩衝液（ｐＨ６）で溶出される。アフィニティークロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー後に、ＨＩＣカラムにかけられる混合物は、免疫グロブリン凝集体、ミスフォールドしたもの、宿主細胞タンパク質、及びアフィニティークロマトグラフィー段階からの残留物のような夾雑物を含むことがある。かかる方法では、抗体はまずプロテインＡクロマトグラフィー担体に吸着させて溶出し、次いで陽イオン交換クロマトグラフィー担体に吸着させて選択的に溶出し、最後にＨＩＣ担体に吸着させて溶出する。
【００１２】
セラミックヒドロキシアパタイトも、免疫グロブリンの高度精製に有用であると示唆されている。具体的には、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、未分画培地中のＩｇＧ１−プロテインＡ複合体からＩｇＧ１を分離できると報告されている（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｔｅｃｈ  ｎｏｔｅ  ２８４９；Ｓ．Ｇ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，２０００  Ａｌｆｒｅｄ  Ｎｏｂｅｌ  Ｄｒｉｖｅ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７  ＵＳＡ）。具体的には、ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）はリン酸カルシウムの一種であり、独特の分離特性を示すことが知られている。  しかし、ヒドロキシアパタイト系マトリックスにはある短所があることも判明している。例えば、酸性ｐＨ値ではＣａ漏れのため不安定であり、ＥＤＴＡのようなキレート剤にも感受性がある。さらに、例えば、大型カラムではヒドロキシアパタイトを充填して性能を維持するのが難しいので、ヒドロキシアパタイト系マトリックスを用いての再現性のあるロバストな精製法を開発し、スケールアップするのは困難であることが判明している。最後に、金属イオン汚染及びカルシウムイオンの交換のため樹脂特性に変動を生じるおそれもあるが、こうした変動は規制当局の大きな懸念となっている。
【００１３】
安定性の問題及びタンパク質系アフィニティーカラムからの漏れを回避するため、選択性の異なる純化学的樹脂が提案されている。例えば、２以上の異なるが共働的な部位で目標と相互作用するマルチモーダルクロマトグラフィーが抗体精製に提案されている。具体的には、メルカプトベンゾイミダゾールスルホン酸リガンドを含む吸着剤であるＭＢＩ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（登録商標）（ＢｉｏＳｅｐｒａ社）は、モノクローナル及びポリクローナル抗体と疎水性及びイオン相互作用を示すと記載されている。疎水性相互作用は芳香族環系に由来するものと推測され、イオン相互作用は強陽イオン交換体として知られるＳＯ３−置換基に由来すると思われる。加えて、ＭＢＩリガンドの芳香族環系の窒素原子は一定の条件下で荷電可能であり、負に荷電した基との相互作用し得る。ＭＢＩ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（登録商標）は、治療用及び診断用抗体の捕獲及び精製のためのプロテインＡ系樹脂の代替物として開示されている。
【００１４】
米国特許第６４９８２３６号（Ｕｐｆｒｏｎｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ社）には、ハイブリドーマ細胞培養上清、動物血漿又は血清のような溶液から免疫グロブリンの単離又は精製法が開示されている。この方法は、リガンドと免疫グロブリンとの分子量の差が小さいこと及びそれらが本来的に結合しようとする傾向に起因する短所をもつと記載されたプロテインＡ、プロテインＧ、合成ペプチドその他の比較的高分子量リガンドを用いる方法の代替法として提案されている。米国特許第６４９８２３６号によれば、リガンドにどのような置換基（例えば、ベンゼン環）が存在するかによって免疫グロブリンがリガンドに結合するか否か左右される。具体的には、開示された方法で用いられる固相マトリックスは、式Ｍ−ＳＰ１−Ｘ−Ａ−ＳＰ２−ＡＣＩＤで表され、式中、Ｍはマトリックス骨格を表し、ＳＰ１はスペーサーを表し、ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、Ａは適宜置換された単環式又は二環式芳香族又は複素芳香族部分を表し、ＳＰ２は任意要素としてのスペーサーを表し、ＡＣＩＤは酸性基を表す。かかるリガンドは、好ましくは、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール及びベンゾオキサゾールからなる群から選択される化合物から誘導される。
【００１５】
国際公開第９７／１０８８７号（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）は、免疫グロブリン、インスリン、第ＶＩＩ因子又はヒト成長ホルモン或いはこれらの類似体、誘導体及びフラグメントのようなタンパク質系材料の精製に有用なアフィニティーリガンド−マトリックスのコンジュゲートに関する。国際公開第９７／１０８８７号の発明は、疎水性成分の複雑さ及び立体構造を増すことによって疎水性リガンドの選択率を高めることができるという発想に基づく。この発想から、包括的な一群のアフィニティーリガンドが開発されたが、かかる群は１以上の環形成原子が窒素である複素芳香族部分を有する構造に限られている。国際公開第９７／１０８８７号に開示されたリガンドは、コンピューターモデリング法及び／又はミメティックリガンドライブラリーのスクリーニングによって設計されたものであり、プロテインＡ又はプロテインＧ（いずれも発酵液からの免疫グロブリンの捕獲のための周知のリガンドである。）の代替用に提案されている。
【００１６】
さらに、マルチモーダル陽イオン交換媒体の合成法が国際公開第０３／０２４５８８号（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に開示されている。具体的には、２種の官能基を含む足場（好ましくは、ホモシステインチオラクトン）を誘導体化し、固体ベースマトリックスと反応させる。具体的には、２種の官能基の一方（好ましくは硫黄）はマトリックスとの結合に用いられ、第二の官能基はイオン基に変換できるものである。こうして製造されたマルチモーダル媒体は、誘導体化の性質に応じて、イオン相互作用及びさらに別の種類の相互作用（例えば、疎水性相互作用）を示すことができる。実験の部では、製造された陽イオン交換体が、３種のモデルタンパク質（即ち、シトクロムＣ（Ｃｙｔ  Ｃ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ））を用いて試験されている。
【特許文献１】国際公開第８４／００７７３号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５１５１３５０号明細書
【特許文献３】国際公開第０３／０４１８５９号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４９８３７２２号明細書
【特許文献５】米国特許第５４２９７４６号明細書
【特許文献６】米国特許第６４９８２３６号明細書
【特許文献７】国際公開第９７／１０８８７号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０３／０２４５８８号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様では、本発明は抗体精製のためのロバストな方法を提供する。本発明の特定の態様では、アフィニティークロマトグラフィーカラム、例えばプロテインＡカラムからの溶出物から漏れを除去する方法を提供する。これは特許請求の範囲に規定した通り達成できる。
【００１８】
従って、特定の態様では、本発明は、プロテインＡ系アフィニティークロマトグラフィーの補完として有用な高純度モノクローナル又はポリクローナル抗体の精製法を提供する。
【００１９】
別の態様では、かかる方法であって、本発明は現在使用されている高度精製法とは選択性の異なる方法を提供する。
【００２０】
本発明のその他の態様及び利点は、以下の詳細な開示から明らかとなろう。
【００２１】
定義
「抗体」という用語と「免疫グロブリン」という用語は本明細書では同義に用いられる。
【００２２】
「溶出剤」という用語は、当技術分野での通常の意味、つまり分離マトリックスから１種以上の化合物を遊離させるのに適したｐＨ及び／又はイオン強度の緩衝液として使用される。
【００２３】
「アフィニティクロマトグラフィー」という用語は、鍵−鍵穴認識原理による目標生体分子と生体特異的リガンドとの特異的相互作用に基づくクロマトグラフィーを意味する。そこで、目標及びリガンドは抗原／抗体、酵素／受容体などのアフィニティ対をなす。
【００２４】
本明細書で「クロマトグラフィー樹脂」という用語は、リガンドとして知られる官能基が結合した担体を意味するものとして用いる。
【００２５】
「マルチモーダルクロマトグラフィーリガンド」という用語は、結合すべき物質と相互作用する２種以上の互いに異なるが共働的な部位を与えることができるリガンドをいう。これらの部位の一方は、リガンドと目標物質とが互いに引きつけ合う電荷−電荷相互作用を与える。他方は、通例、電子受容体−供与体相互作用並びに／或いは疎水性及び／又は親水性相互作用を与える。電子供与体−受容体相互作用には、水素結合、π−π、陽イオン−π、電荷移動、双極子−双極子、誘起双極子などの相互作用がある。マルチモーダルクロマトグラフィーリガンドは、「混成モード」クロマトグラフィーリガンドとしても知られる。
【００２６】
「電子供与体−受容体相互作用」という用語は、自由電子対を有する電気陰性原子が供与体として作用し、供与体の電子対に対する受容体として作用する電子不足原子と結合することを意味する。（例えば、Ｋａｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｔｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（１９７３年）の４２頁を参照されたい。）
本明細書で「陽イオン交換基」という用語は、負に荷電又は荷電し得る基を意味する。
【００２７】
液体クロマトグラフィーに関して「捕獲」という用語は、分離操作の初期段階をいう。最も一般的には、捕獲段階には、可溶性夾雑物からの清澄化、濃縮、安定化及びかなりの精製が含まれる。捕獲段階の後に、ＤＮＡ、ウイルス及びエンドトキシンを始めとする有意不純物の大半を除去する中間精製を行ってもよい。
【００２８】
液体クロマトグラフィーに関して「高度精製段階」という用語は、微量の夾雑物を除去して安全な活性生成物を残す最終精製段階をいう。高度精製段階で除去される夾雑物は、目標分子の配座異性体又は漏出生成物と思われるものであることが多い。
【００２９】
「Ｆｃ結合タンパク質」という用語は、抗体の結晶性部分（Ｆｃ）に結合し得るタンパク質を意味し、例えば、プロテインＡ及びプロテインＧ、或いは上記の結合性を保持したこれらのフラグメント又は融合タンパク質が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、一態様では、溶液中の１種以上の夾雑物から抗体を分離する方法であって、１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含むマルチモーダルリガンドが固定化された担体からなるクロマトグラフィー樹脂に上記溶液を接触させて樹脂に抗体及び／又は夾雑物を吸着させること含んでなる方法に関する。
【００３１】
好適な実施形態では、夾雑物をマルチモーダルリガンドに吸着させ、抗体の実質的に純粋な画分をフロースルーとして（つまり吸着させずに）回収するか、或いは結合モードで後段の選択溶出によって回収する。これに関して「実質的に純粋」という用語は、夾雑物が実質的にすべて除去されたことを意味する。最も好適には、マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂で夾雑物の約８０％以上、例えば約９５％以上（つまり９５〜１００％）、約９８％以上（つまり９８〜１００％）、好ましくは約９９％以上（つまり９９〜１００％）が除去される。ただし、当業者には自明であろうが、純度は、クロマトグラフィー樹脂にかける溶液中の抗体の濃度及び他の使用条件に依存する。
【００３２】
本発明の方法の特定の実施形態では、マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂にかける溶液は、アフィニティークロマトグラフィー樹脂からの抗体含有溶出液である。好適な実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー樹脂のリガンドは、プロテインＡ（例えば天然又は組換えプロテインＡ）のようなＦｃ結合タンパク質を含む。かかるアフィニティー樹脂は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）のように市販されている。そこで、この実施形態では、除去すべき夾雑物として、遊離プロテインＡ、プロテインＡと抗体との間で形成された複合体、例えばプロテインＡ−ＭＡｂ複合体（２〜４分子の抗体と１分子のプロテインＡ分子が複合体を形成したもののように、プロテインＡ１分子あたり複数の抗体を含むことがある。）、及び遊離プロテインＡ又は抗体の凝集体が含まれることがある。
【００３３】
好適な実施形態では、本発明の方法は、慣用の液体クロマトグラフィー法、つまり溶液をクロマトグラフィーカラムに流すことによって実施される。吸着された物質を回収するため、緩衝液をカラムに流して溶出を行う。必要に応じて、溶出前又は溶出と溶出の中間に１以上の洗浄段階を行ってもよい。当業者には自明であろうが、アフィニティークロマトグラフィーのようなその前の段階で用いられた条件によっては、溶出液を適当な添加剤又は調整によってコンディショニングする必要がある。なお、実用上は好ましくないかも知れないが、プロテインＡカラムからの溶出液を精製する場合、本発明の方法は必ずしもアフィニティークロマトグラフィーの直後に行う必要はないし、同一施設で行う必要もない。
【００３４】
本発明の方法の一実施形態では、所望の抗体を含む溶液をフロースルーモードでマルチモーダルクロマトグラフィーカラムにかける。この場合、抗体の大半は素通りするが、夾雑物は吸着される。フロースルーを得るための条件は、えば精製すべき抗体の電荷及び電荷分布に依存するが、ｐＨの調節などによって、当業者が容易に適応できる。従って、この実施形態は、上述の通りリガンドが免疫グロブリンと効率的に結合するように選択された米国特許第６４９８２３６号とは基本的に異なる。さらに、米国特許第６４９８２３６号に開示された方法は、プロテインＡクロマトグラフィーを補うためのもの、つまり本発明の好適な実施形態であるプロテインＡカラムからの漏れを除去するために提案されたものでもない。本発明と米国特許第６４９８２３６号との別の相違点はリガンドの性状であり、これについては以下の説明からあきらかとなろう。
【００３５】
別の実施形態では、所望の抗体を含む溶液を結合条件下でマルチモーダルクロマトグラフィーカラムにかけるが、この場合マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に抗体と夾雑物が吸着される。この場合も、所望の結合を得るための条件は、例えばｐＨ及び／又は塩濃度つまり溶液の導電率の調節などによって当業者が容易に適応できる。
【００３６】
本発明の方法で用いるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、当業者が容易に製造できる。簡単に説明すると、樹脂は、マルチモーダルリガンドが有機又は無機担体（ベースマトリックスともいう）に直接又はスペーサーを介して結合したものからなる。担体は、粒子（例えば略球形の粒子など）、モノリス、フィルター、膜、表面、キャピラリーなどの形態を有し得る。一実施形態では、担体は、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラゲナン、ジェラン、アルギン酸塩などの架橋炭水化物材料のような天然ポリマーから製造される。高い吸着容量を得るため、担体は好ましくは多孔性であり、リガンドは外表面及び細孔表面の両方に結合する。かかる天然高分子担体は、逆懸濁ゲル化（（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））のような常法で容易に製造される。別法として、担体は、合成ポリマー、例えばスチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの架橋合成ポリマーから製造される。かかる合成ポリマーは常法で容易に製造することができる。例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”  （Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））参照。多孔性天然又は合成ポリマー担体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ）のような市販品供給元からも入手できる。
【００３７】
マルチモーダルリガンドでの抗体精製に有用な担体の具体例は、流動床吸着用の担体、つまり高密度フィラー（好ましくはステンレス鋼フィラー）を含むポリマー担体である。かかる流動層吸着樹脂は、捕獲段階におけるモノクローナル抗体のような抗体の捕獲にも有用である。
【００３８】
上述の通り、本発明の方法で用いるクロマトグラフィー樹脂のマルチモーダルリガンドは１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含む。芳香族環系は目標分子と疎水性相互作用できるもので、１又は２つの環構造からなり、１個以上の原子で隔てられていても、或いは例えばナフチル基として存在していてもよい。さらに、環系は、例えばメトキシ基のようなアルキルオキシ基で適宜置換されていてもよい。
一実施形態では、芳香族又は複素芳香族環系は、環構造の構成原子として窒素原子を全く含んでおらず、炭素原子、硫黄原子及び酸素原子に限定される。そこで、好適な実施形態では、芳香族又は複素芳香族基の環形成原子は、Ｃ、Ｓ及びＯからなる群から選択される。
【００３９】
一実施形態では、本発明の方法で用いられる樹脂は以下の通り表される。
【００４０】
Ｓｕ−スペーサー−Ｘ−陽イオン交換基−スペーサー−芳香族又は複素芳香族環
式中、Ｓｕは担体であり、スペーサーは任意要素であり、ＸはＯ、Ｓ又はＮのようなカップリング原子である。好適なスペーサー及びかかるスペーサーをもたらすカップリング化学は当技術分野で周知である。従って、この実施形態は、陽イオン交換基として作用する酸性基が芳香族基の置換基である上述の米国特許第６４９８２３６号とは実質的に異なる。例えば、本実施形態で用いる樹脂は、その構造上芳香族官能基と陽イオン官能基との間隔が広いので、目標化合物と空間的に一段と広い異なる種類の結合を与えると予測される。理論に束縛されるものではないが、このマトリックスは、抗体の吸着に対して至適化されたと記載されている米国特許第６４９８２３６号よりも、比較的大きな含抗体複合体の一段と好ましい吸着をもたらすと仮定し得る。
【００４１】
陽イオン交換基は、好ましくは弱陽イオン交換基、つまり一定のｐＨ値でプロトン化できる基である。弱陽イオン交換体とは対照的に、強陽イオン交換基はあらゆるｐＨ値で電荷を維持する基からなる。そこで、一実施形態では、マルチモーダルリガンドはカルボキシル基（例えば１又は２つのカルボキシル基）を含む。
【００４２】
ただし、当業者には自明であろうが、上述のマルチモーダルリガンドはさらに追加の相互作用（例えば水素結合など）を与え得る。上述の基に加えて、本発明の方法で用いるマルチモーダルクロマトグラフィーリガンドは１以上のスルホニル基、アミン又はカルボニル基を含んでいてもよいが、これらは夾雑物及び抗体との相互作用に寄与することもあれば寄与しないこともある。
【００４３】
本発明の方法で用いるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を製造するため上述の担体とカップリングさせるリガンドは、例えば、上述の国際公開第０３／０２４５８８号（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に記載の通り合成することができ、弱陽イオン官能基を含むマルチモーダルリガンドがホモシステインチオラクトンを出発原料として合成される。マルチモーダルリガンドの合成に関するさらに詳しい説明については、例えば国際公開第０２／０５９０５９号（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を参照されたい。リガンドは、スペーサーとして知られる適当な離隔要素を介して担体にカップリングしてもよい。この目的に有用なカップリング法の総説としては、例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍａｌｌｉａ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ，１９９２を参照されたい。当技術分野で周知の通り、リガンド密度又は置換度、担体の細孔径などのパラメーターを変更することによって、所望の性質をもつクロマトグラフィー樹脂を得ることができる。
【００４４】
本方法は、マウス、齧歯類、霊長類及びヒトのような哺乳類宿主由来の抗体、又はハイブリドーマのような培養細胞由来の抗体のようなモノクローナル又はポリクローナル抗体の回収に有用である。一実施形態では、回収される抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。かかる抗体はどのクラスのものでもよく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択できる。一実施形態では、精製すべき抗体は、プロテインＡ又はＦｃ含有抗体フラグメントもしくは融合タンパク質に結合できる抗体である。特定の実施形態では、回収される抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。これに関して、「抗体」という用語には、抗体フラグメント並びに抗体又は抗体フラグメントを含む融合タンパク質も包含される。そこで、本発明は、上述の抗体のいずれかのフラグメント並びにかかる抗体を含む融合タンパク質の精製も包含する。本発明に従って単離される抗体は、特定の個人の治療のために設計された薬剤を提供するため、パーソナライズドメディスンのような医薬品として有用である。本発明に従って単離される抗体は、研究及び診断分野でも有用である。
【００４５】
一実施形態では、本発明の方法は、上述のプロテインＡクロマトグラフィー樹脂での第一の捕獲段階と、続くマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂での高度精製段階とを含む。プロテインＡ段階にかける溶液は細胞培養液又は発酵ブロスでよく、適宜、濾過、ｐＨ及び／又は導電率のような調整によるコンディショニングのような前処理に付しておいてもよい。こうして、捕獲段階では、細胞残渣、タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシンなどの宿主細胞残留物が除去され、高度精製段階では主に捕獲段階からの残留物としての夾雑物、例えば上述のプロテインＡ−抗体凝集体が除去される。従って、本発明は、例えばプロテインＡ系クロマトグラフィーの後に２つの追加段階を開示した上述の米国特許第５４２９７４６号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）よりも簡単な手順を提供する。さらに、プロテインＡ系クロマトグラフィーの代替案として示唆された小さな有機リガンドと比較すると、本発明は、選択性及び容量に関するプロテインＡの利点を実質的に保持しつつ、高純度の抗体生成物を得ることができる。
【００４６】
ただし、本明細書に記載したマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いる抗体の精製は単一段階としてもうまく使用でき、この場合上記で例示した夾雑物をすべて除去し得る。かかる単一段階法に用いられるマルチモーダルリガンドは、上述のマルチモーダルＭＢＩ（商標）ＨｙｐｅｒＣｅｌリガンドとは、本発明のリガンドの芳香族環系の構成原子が炭素原子に限定或いは炭素原子、硫黄原子及び酸素原子からなる群から選択されるという点、つまり環に窒素原子が全く存在しない点で異なる。かかる窒素は荷電し得るので、特定の条件下ではＭＢＩ（商標）ＨｙｐｅｒＣｅｌリガンドの特性は本発明のリガンドの特性とは実質的に異なる。さらに、ＭＢＩ（商標）ＨｙｐｅｒＣｅｌのあらゆるｐＨ値で荷電した強ＳＯ３−とは対照的に、本発明のマルチモーダルリガンドは弱陽イオン交換基しか含まない。
【００４７】
第二の態様では、本発明は、１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含むマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂と、２種以上の緩衝液と、どのように抗体を精製するかについて説明した使用説明書と別々の区画に備えるキットである。好適な実施形態では、使用説明書には、プロテインＡと抗体との間で形成された複合体から抗体を分離するためのキットの使用法の詳細が記載される。一実施形態では、芳香族又は複素芳香族基の環形成原子はＣ、Ｓ又はＯから選択される。本発明のキットは、上述の抗体精製法のいずれかに使用し得る。好適な実施形態では、樹脂は、例えばポリプロピレンのような生体適合性プラスチックや、ガラスのような慣用材料からなるカラム内に存在する。カラムはラボスケールに適した大きさのものでも、抗体の大規模精製に適した大きさのものでもよい。特定の実施形態では、カラムは、ルアーアダプタ、チューブコネクタ及びドームナットを備える。一実施形態では、カラムは無菌である。特定の実施形態では、カラムは使い捨てである。
【００４８】
最後に、本発明の別の態様は、抗体の精製システム、好ましくは細胞培養由来の液体中の細胞成分及び／又は夾雑物からの抗体の精製システムである。そこで、一実施形態では、本発明は、プロテインＡ又はプロテインＧを含むリガンドを有する樹脂が充填された第一のクロマトグラフィーカラムと、１以上の陽イオン交換基と１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含むマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が充填された第二のクロマトグラフィーカラムと、サンプル及び溶出緩衝液を第一のカラムに添加する手段と、第一のカラムから生じる溶出液を第二のカラムに添加する手段と、ポンプ手段と、弁とを備える、液体からの抗体精製システムである。第一及び第二のクロマトグラフィーカラム用の樹脂は上述の通りでよい。好適な実施形態では、本発明のシステムは自動化される。かかる自動化システムはプロセス制御のための慣用ツールで制御し得る。
【００４９】
図面の詳細な説明
以下のクロマトグラム（図１〜６、７及び９）では、色表示は以下の通りである。
青又は赤線（ＸＸ）：Ａ２８０ｎｍ、緑線（ＹＹ）：蛍光、茶線（ＺＺ）：導電率（ｍＳ／ｃｍ）、灰線（ＯＯ）：ｐＨ。
【００５０】
図１は以下の実施例２（ａ）に記載の対照実験１の結果を示す。２ｍｌ  ＭＡｂ−プロテインＡ混合物の注入はバイパスを介して行い、０．５ｍｌ画分を回収した。図１からＡ２８０曲線と蛍光発光の相対的大きさがよく一致していることは明らかである。
【００５１】
図２は以下の実施例２（ａ）に記載の対照実験２の結果を示す。２ｍｌの蛍光標識プロテインＡを含む溶液を対照樹脂ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むカラムに注入した。勾配溶出を用い、１ｍｌの画分を回収した。ここでも、Ａ２８０曲線と蛍光発光とはよく一致していた。
【００５２】
図３は以下の実施例２（ａ）に記載の対照実験３の結果を示す。プロテインＡ溶液を以下の実施例２の「材料」及び「方法」に記載のマルチモーダル媒体プロトタイプＵ７９０Ｐ７３に注入した。勾配溶出を用い、１ｍｌの画分を回収した。ここでも、Ａ２８０曲線と蛍光発光とはよく一致していた。
【００５３】
図４は以下の実施例２（ｂ）に記載の結合モードでのＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す。ここでも、マルチモーダル媒体プロトタイプＵ７９０Ｐ７３を用いた。溶出には２０カラム体積（ＣＶ）の０〜１００％Ｂの勾配を用いた。緩衝液Ａ（平衡）はｐＨ５．０で使用し、緩衝液Ｂは以下の実施例２の「材料」及び「方法」に記載の通りであった。
【００５４】
図５は以下の実施例２（ｂ）に記載のさらに至適化した条件を用いたＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す。マルチモーダル媒体プロトタイプＵ７９０Ｐ７３を用いた。０ＣＶの０〜７７％Ｂ、３０ＣＶで７７％Ｂ及び７７〜１００％Ｂ  ＣＶの最適化勾配を用いた。緩衝液Ａ（平衡化用）はｐＨ４．５で使用し、緩衝液Ｂは以下の実施例２の「材料」及び「方法」に記載の通りであった。
【００５５】
図６は以下の実施例２に記載のＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００でのゲル濾過によるピーク分析の結果を示す。分析したピークは図５に示す。具体的には、図６Ａは、画分Ａ９（メインＵＶピークの頂点）のゲル濾過で得られた結果を示し、図６Ｂは画分Ｃ７（蛍光ピークの頂点）のゲル濾過で得られた結果を示す。図６Ａでは、ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体は検出できなかった。図６Ｂでは、ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体が、クロマトグラムにおけるＭＡｂピークの前の２つのピークで検出可能であった。これは、本発明のマルチモーダルクロマトグラフィー法を用いてＭＡｂ−プロテインＡ凝集体をＭＡｂから分離できることをよく表している。
【００５６】
図７は以下の実施例２（ｃ）に記載のフロースルーモードでの純粋ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す。プロトタイプマルチモーダルリガンドＵ７９０Ｐ７３を用いた。サンプル体積は６．５ｍｌ（４．４ｍｇ  ＭＡｂ／ｍｌ）とした。サンプルにはＭＡｂを含め、非標識（青線）又は蛍光標識（赤線）プロテインＡを添加した。９７％Ｂ＝０．１３Ｍ  ＮａＣｌ（平衡）を用いた。緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂは、以下の「材料」及び「方法」に記載の通りであった。
【００５７】
図８は実施例２に記載のＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００でのゲル濾過によるピーク分析の結果を示す。分析したピークは図７に示す。サンプル体積は１００μｌ、流速は０．５ｍｌ／分とし、緩衝液は以下の「材料」及び「方法」に記載の通りであった。具体的には、図８Ａは、非標識プロテインＡを用いたランで得た画分Ａ７、フロースルーピークの頂点を示し、図８Ｂは非標識プロテインＡを用いたランで得た画分Ｂ３、溶出ピークの頂点を示し、図８Ｃは蛍光標識プロテインＡを用いたランで得た画分Ｂ３を示す。赤色の曲線はＵＶを示し、緑色のプロットは蛍光を示す。
【００５８】
図９は以下の実施例２（ｃ）に記載のフロースルーモードでの純粋ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す。プロトタイプＵ７９０Ｐ７３を用いた。サンプルは、上記の図７で用いたものよりも相当多かった。すなわち、５０ｍｌのＭＡｂ４．２ｍｇ／ｍｌ（総計２１０ｍｇ  ＭＡｂ、蛍光標識プロテインＡを添加）。実験条件：９７％Ｂ＝０．１３Ｍ  ＮａＣｌ（平衡化用）。緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂは以下の「材料」及び「方法」に記載の通りであった。青線：ＵＶ（２８０ｎｍ）、茶線：導電率、緑プロット：蛍光。
【００５９】
図１０は実施例２に記載のＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００でのゲル濾過で得られた図９のピークの分析結果を示す。
【００６０】
フロースルー画分：Ａ２、Ａ５、Ａ８、Ａ１１、Ａ１５、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ９及びＢ１１。
【００６１】
溶出画分：Ｃ２。サンプル体積は１００μＬとし、流速は０．５ｍｌ／分とした。緩衝液は以下の「材料」及び「方法」に記載の通りであった。図１０Ａは、図９から所定の画分のゲル濾過で得られたクロマトグラムのオーバーレイを示し、図１０Ｂは図１０Ａの拡大表示である。溶出ピークではＭＡｂ−プロテインＡ凝集体が検出可能であったが、フロースルー画分では検出可能ではなかった。この結果は、実質的にすべてのＭＡｂ−プロテインＡ凝集体がカラムに吸着し、導電率の増加によって再度溶出されることを示している。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、特許請求の範囲で規定される本発明の技術的範囲を限定するものではない。本明細書で引用した文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００６３】
実施例１：マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂
以下に示すマトリックスの体積は、沈降ベッド体積をいう。グラム単位で示すマトリックスの重量は吸引（ウォーターポンプ）乾燥重量をいう。ただし、これらのマトリックスは依然として水で溶媒和した材料である。磁気攪拌子を使用するとビーズが傷つきやすいので、以下に記載の攪拌は懸架式電動攪拌機で行った。ビーズ上の官能基の分析及びイオン交換基のアリル化度、エポキシ化度又は置換度の測定は慣用法によったが、これらは当業者に周知である。以下の方法は、最終的にゲルの元素分析（特に硫黄原子についての）によって補完した。
【００６４】
【表１】
2008505851.tif 000002
【００６５】
実施例１（ａ）リガンドプロトタイプＵ１０１２０５４
本実施例では、３−アミノ−４−（プロピルスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸をどのようにＮＨＳ−活性化アガロース担体にカップリングしたかについて説明する。
【００６６】
チオプロピオン酸Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの調製：
アリル活性化（０．３ｍｍｏｌアリル／ｍｌ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）ゲル１００ｍｌ、４ｇのＡｃＯＮａ及び１００ｍｌの蒸留水からなる攪拌懸濁液に、黄色が現れ続けるまで臭素を添加した。次いで、懸濁液の色が完全に消えるまでギ酸ナトリウムを添加した。反応混合物を濾過し、ゲルを５００ｍｌの蒸留水で洗浄した。活性化ゲルを直ちに反応器に移し、５０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１１．５に調整しておいた１７．５ｍｌのチオプロピオン酸（アリル基当たり６当量）と１２ｇのＮａＣｌの水溶液（５０ｍｌ蒸留水）で処理した。反応混合物を攪拌しながら５０℃で１８時間放置した。反応混合物を濾過し、５００ｍｌの蒸留水で洗浄して、置換度０．２９ｍｍｏｌＣＯ２Ｈ基／ｍｌゲルのチオプロピオン酸Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルを得た。
【００６７】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによるゲルの活性化：
得られたチオプロピオン酸Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ１００ｍｌを３００ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌ、５００ｍｌの５０％アセトン水溶液、５００ｍｌのアセトンで逐次洗浄した。洗浄後、ゲルをアセトン中で沈降させ、上清を吸引除去し、沈降ビーズを２０ｍｌのアセトンを用いて反応器に移した。次いで、８０ｍｌアセトン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１５．２ｇの溶液、及び別の８０ｍｌアセトン中のシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を一緒に添加した。反応スラリーを攪拌しながら３０℃で１８時間放置した。濾過後、ゲルを１５０ｍｌのイソプロパノールでゆっくりと（重力流）一日がかりで１０回洗浄した。ＮＨ４ＯＨとの反応後のＮＨＳ活性化度は約８０％と推定されたが、これは約０．２３ｍｍｏｌ  ＮＨＳ官能基／ｍｌゲルの活性化に相当する。
【００６８】
ＮＨＳ活性化チオプロピオン酸Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへのリガンドのカップリング：
３−アミノ−４−（プロピルスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸を国際公開第０２／０５９５９号（リガンド１２）に記載の通り製造した。２ｍｌ蒸留水中の５６５ｍｇの３−アミノ−４−（プロピルスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸（２．２７ｍｍｏｌ）の溶液、２ｍｌの１Ｍ  ＮａＨＣＯ３及び２ｍｌのエタノールの可溶性混合物を調製し、５０％ＮａＯＨを注意深く添加してｐＨ８．５に調整した。
【００６９】
ＮＨＳ活性化チオプロピオン酸Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（１０ｍｌ）を２０ｍｌの氷冷１ｍＭ  ＨＣｌ溶液で手早く洗浄した。次いで、ゲルを三角フラスコに移し、チエニルセリン溶液を添加した。反応混合物を室温で振盪テーブル（１５０ｒｐｍ）上に１８時間放置した。
【００７０】
反応混合物の濾過後、ゲルを蒸留水４０ｍｌ、エタノール２０ｍｌ、０．２５Ｍエタノールアミン水溶液２０ｍｌ、蒸留水２０ｍｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液２０ｍｌ及び蒸留水２０ｍｌで逐次洗浄した。
【００７１】
実施例１（ｂ）〜（ｄ）
以下の実施例１（ｂ）〜（ｄ）では、国際公開第０３／０２４５８８号に記載の通り、Ｄ，Ｌ−ホモシテインチオラクトンを足場として用いてプロトタイプリガンドＵ７９０Ｐ６５、Ｕ７９０Ｐ７１及びＵ７９０Ｐ７３を製造した。簡単に説明すると、ホモシテインチオラクトンをアシルクロリド又はアンヒドリドと反応させて結合アミドを形成した後、塩基性加水分解でチオラクトンの開環を行い、得られた化合物を活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））とカップリングさせた。
【００７２】
実施例１（ｂ）：リガンドプロトタイプＵ７９０Ｐ７３
ジクロロメタン（ＤＣＭ、１２０ｍｌ）中のＤ，Ｌ−ホモシテインチオラクトン（１１．５ｇ、７５ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２６ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）の溶液に、３０ｍｌのＤＣＭ中の塩化ベンゾイル（８．７ｍｌ、７５ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下した。混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、反応残渣を酢酸エチル（３００ｍｌ）で抽出した。有機相を１０％クエン酸水溶液（ｗ／ｗ、２００ｍｌ）、１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液（２００ｍｌ）、水（２００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒を除去して白色固体（１３．８ｇ、８３％）を得た。２７６ｍｇ（１．２５ｍｍｏｌ）の白色固体に５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５ｍｌ）を０℃で添加し、混合物を室温でさらに２時間攪拌した。アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（２５０μｍｏｌ／ｍｌ）から出発して周知の手順で得た臭素化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１０ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、リガンドのアルカリ溶液（上記）と混合して５０℃に一晩加温した。反応後、ゲルを濾過し、水（２×１５０ｍｌ）、エタノール（２×１５０ｍｌ）、０．２Ｍ酢酸（２×１５０ｍｌ）及び水（２×１５０ｍｌ）で洗浄した。次いで、酸基の滴定でゲルのイオン容量を測定したところ、ゲル１ｍｌ当たり１０３μｍｏｌであった。
【００７３】
実施例１（ｃ）：リガンドプロトタイプＵ７９０Ｐ６５
ジクロロメタン（ＤＣＭ、６ｍｌ）中のＤ，Ｌ−ホモシテインチオラクトン（１．５８ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３．５８ｍｌ、２０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、４ｍｌのＤＣＭ中の３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド（２．３７ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下した。混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、反応残渣を酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。有機相を１０％クエン酸水溶液（ｗ／ｗ、３０ｍｌ）、１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液（３０ｍｌ）、水（３０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒を除去して白色固体（２．２１ｇ、６９％）を得た。０℃で、３８９ｍｇ（１．２５ｍｍｏｌ）の白色固体に５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５ｍｌ）を添加し、混合物を室温でさらに２時間攪拌した。アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（２５０μｍｏｌ／ｍｌ）から出発して周知の手順で臭素化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１０ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、リガンドのアルカリ溶液（上記）と混合して５０℃に一晩加温した。反応後、ゲルを濾過し、水（２×１５０ｍｌ）、エタノール（２×１５０ｍｌ）、０．２Ｍ酢酸（２×１５０ｍｌ）及び水（２×１５０ｍｌ）で洗浄した。次いで、ゲルのイオン容量を測定したところ、５９μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【００７４】
実施例１（ｄ）：リガンドプロトタイプＵ７９０Ｐ７１
ジクロロメタン（ＤＣＭ、６ｍｌ）中のＤ，Ｌ−ホモシテインチオラクトン（１．５８ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）とジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３．５８ｍｌ、２０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、４ｍｌのＤＣＭ中のフェニルグルタル酸無水物（１．９６ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下した。混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、反応残渣を直ちに５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（１０ｍｌ）で処理し、室温でさらに２時間攪拌した。アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（２５０μｍｏｌ／ｍｌ）から出発して周知の手順で臭素化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１０ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン、ウプサラ））を、上述のリガンドのアルカリ溶液１．４ｍｌと混合して５０℃に一晩加温した。反応後、ゲルを濾過し、水（２×１５０ｍｌ）、エタノール（２×１５０ｍｌ）、０．２Ｍ酢酸（２×１５０ｍｌ）及び水（２×１５０ｍｌ）で洗浄した。次いで、ゲルのイオン容量を測定したところ１１０μｍｏｌ／ｍｌゲルであったが、これは５５μｍｏｌ／ｍｌゲルのリガンド置換度に相当する。
【００７５】
実施例２：抗体の分離
材料
クロマトグラフィーシステム：  ＵＮＩＣＯＲＮ  ｖ．４．０ソフトウェアを備えたＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
分光光度計：  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ（商標）３０００ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
蛍光分光計：  ＪＹ  Ｈｏｒｉｂａ社（米国ニュージャージー州エジソン）製ＳＰＥＸ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３。
酢酸：  Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０００６３（米国ペンシルバニア州）（Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｓｉ）。
コハク酸Ｎａ  ＢＤＨ、カタログ番号３０２１９。
ＮａＣｌ：  Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０６４０４（米国ペンシルバニア州）。
Ｔｒｉｓ：  Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０８３８２（米国ペンシルバニア州）。
ＮａＯＨ：  Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０６４６９（米国ペンシルバニア州）。
ＭＥＳ：  ＳＩＧＭＡカタログ番号Ｍ３６７１。
Ｎａ２ＣＯ３：  Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０６３９２．１０００（米国ペンシルバニア州）。
水：  ＭｉｌｌｉＱ水を使用。
Ｃｙ５反応性色素：  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ。
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（対照）：  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  １０／３００（ゲル濾過）：  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ。
【００７６】
結合条件下での純粋ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離には以下の緩衝液を用いた。
緩衝液Ａ（平衡）：１００ｍＭ酢酸、２０ｍＭ  コハク酸ＮａｐＨ４．５〜５．０。
緩衝液Ｂ：１００ｍＭ酢酸、２０ｍＭ  コハク酸Ｎａ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．４。
【００７７】
フロースルーモードでの純粋ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離には以下の緩衝液を用いた。
緩衝液Ａ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７。
緩衝液Ｂ：５０ｍＭ  ＭＥＳ  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０。
【００７８】
ゲル濾過には、以下の条件を用いた。
５０ｍＭ  リン酸緩衝液、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０。
【００７９】
モノクローナルヒト化ＩｇＧ１抗体ｐＩ９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製）をプロテインＡ媒体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）での初期精製に付した。
【００８０】
天然プロテインＡはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社（バッチＮＤＰ１０２３）から入手した。
【００８１】
方法
カラム充填及び試験：  ゲルスラリーをＨＲ５／５カラムに流し込み、ＭｉｌｌｉＱ水で部分的に満たした。ゲルを圧縮せずにゲル表面に向かってトップアダプターを下げた。次いで、ゲルを１．２ｍｌ／分でベッドが安定するまでパックした。次いで、アダプターを下げてゲル表面に接触させた。２％アセトン２５μｌを注入して、充填性能（すなわち、プレート数及び非対称性）を評価した。
【００８２】
プロテインＡの蛍光標識：  ２００μｌのプロテインＡ溶液（約５０ｍｇ／ｍｌ）を１０００μｌの０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ９．３で希釈した。
【００８３】
溶液をＣｙ５反応性色素のバイアルに移した。室温で３０分間インキュベートし、続いてＰＤ１０カラムで脱塩し、１００ｍＭ  ＨＡｃ、２０ｍＭ  コハク酸Ｎａ，ｐＨ５．０で平衡化した。次いで、標識プロテインＡを非標識プロテインＡで１：５に希釈し、最終濃度約４１ｍｇ／ｍｌとした。
【００８４】
サンプル調製：  ＭＡｂ−サンプルの３つの複製を、分光光度計で２８０ｎｍで測定した。吸光度の平均値を濃度決定に用いた。ＭＡｂ濃度は、以下の式に従って、４．４ｍｇ／ｍｌと決定した。
【００８５】
Ｃ＝Ａ／（ｌ×ε）
式中、
Ｃ＝ＩｇＧの濃度、
Ａ＝２８０ｎｍでの吸光度、
ｌ＝光路長、
ε＝ＭＡｂのモル吸光係数、ｍｇｍｌ−１＝１．４６。
【００８６】
蛍光標識プロテインＡ溶液をＭＡｂサンプルに１：１０００（ｗ／ｗ）の割合で添加した。
【００８７】
フロースルーモードでは、ＮａＣｌの添加でイオン強度を調整した（詳細は、以下参照）。
【００８８】
プロテインＡの検出のための蛍光測定：
回収した画分中の相対的プロテインＡ濃度の測定は、蛍光分光計（ＳＰＥＸ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３）を用いて実施した。Ｃｙ５の励起は６３０ｎｍで行い、蛍光発光の検出は６７０ｎｍで行った。
【００８９】
ゲル濾過：  ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体について調べるために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を充填したプレパックカラムを用いてゲル濾過を実施した。プロトタイプランから所定の画分を分析した。サンプル体積は１００μｌとし、流速は０．５ｍｌ／分とした。
平衡化：２カラム体積（ＣＶ）緩衝液（初回用）。
平衡化：０．１ＣＶ緩衝液（ラン間）。
サンプル注入：１００μｌ。イソクラティック溶出：１．２ＣＶ緩衝液。
【００９０】
プロテインＡ濃度の分析：  サンプルを２００μｌサンプル＋８００μ希釈剤の割合で希釈した（プロテインＡアッセイ用のサンプル希釈剤で）。混合後、試験管を水浴中で１０分間煮沸した後、再度混合した。サンプルをプロテインＡ含量の分析に付した。
【００９１】
実施例２（ａ）：結合条件下での対照実験
蛍光標識プロテインＡを、上記のＭＡｂ溶液と混合した。蛍光標識が、プロテインＡのクロマトグラフィーの特性に影響を及ぼさなかったことを確認するため、及びＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における正確な遅れ値を設定するために、３種の異なる対照実験を以下のように実施した。
【００９２】
対照実験１：  ＭＡｂ−プロテインＡ混合物のバイパスからの注入及び０．５ｍｌ画分の回収。回収した画分における吸光度曲線と蛍光の比較。図１に示す通り、システム遅延体積の設定を補正した後、Ａ２８０曲線と蛍光発光の相対的な大きさはよく一致していた。
【００９３】
対照実験２：  プロテインＡ溶液２ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗへの注入。勾配溶出及び画分回収（１ｍｌ／画分）。回収した画分の２８０ｎｍでの吸光度及び蛍光測定によってプロテインＡの溶出をモニターした。ここでも、Ａ２８０曲線と蛍光発光とはよく一致していた（図２参照）。
【００９４】
対照実験３：
プロテインＡ溶液を媒体プロトタイプＵ７９０Ｐ７３（上記の実施例１（ｂ）参照）に注入した点を除いて、対照２と同様。マルチモーダル媒体プロトタイプを用いてもＡ２８０曲線と蛍光発光とはよく一致しており（図３）、非標識プロテインＡと標識プロテインＡとの分離は得られなかった。
【００９５】
実施例２（ｂ）：
結合モードでのＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離
ＭＡｂ−プロテインＡ混合物２ｍｌを種々の媒体プロトタイプに注入した。勾配溶出及び画分回収は上記の通りであった。ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体の溶出は２８０ｎｍでの吸光度及び溶出導電率のモニターリング、及び回収画分での蛍光測定によって追跡した。各プロトタイプについて吸光度曲線と蛍光発光との間での保持体積の差を計算した。結果を表２及び図４に示す。データ点数が少なく、変動が比較的大きい場合にも、溶出導電率が高いほど、ＵＶピークと蛍光ピークとの間（すなわち、ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との間）の良好な分離が得られると結論付けられる。対照マトリックスＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでは分離は得られなかった。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
プロトタイプＵ７９０Ｐ７３で得られる分離を、サンプルのｐＨを調整してさらに至適化したが、分離には僅かな影響しかなかったので、勾配を至適化した。ある実験（結果は示さず）では、浅い勾配、つまり２０ＣＶの代わりに４０ＣＶを用いることで、ｄＲｔが６ｍｌに増加した。段階的溶出によって、分離が格段に向上した（図５）。こうして、蛍光部分をメインピークと完全に分離できた。クロマトグラムの様々な画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００でのゲル濾過によって分析した（図６）。ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体は蛍光ピーク、つまりクロマトグラムのＭＡｂピークの前の２つのピークで検出できたが、メインＵＶピークでは検出できなかった。この結果は、マルチモーダルリガンドを用いると、ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体とＭＡｂが分離できることを示す。
【００９８】
実施例２（ｃ）：
フロースルーモードでのＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離
非標識プロテインＡ及び蛍光標識プロテインＡの添加を用いて、フロースルーモードでの２通りの実験を行った（条件：９７％Ｂ＝０．１３Ｍ  ＮａＣｌ）。結果は、クロマトグラムはほとんど同一であった（図７）。上述の通り、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００でのゲル濾過によって様々な画分を分析した（図８Ａ〜Ｂ）。ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体は溶出ピークで検出できたが、フロースルーでは検出できなかった。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）画分での蛍光発光は、クロマトグラムの２つの小さなピークでは検出できたが、メインＭＡｂピークでは検出できなかった（図８Ｃ）。従って、これらの結果は、ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体とＭＡｂをフロースルーモードで分離できることを示す。従って、プロテインＡ−抗体凝集体の大半は吸着するが、約９５％のＭＡｂはカラムを素通りした。
【００９９】
ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体とのフロースルーモードでの分離に関する本発明の方法の可能性をさらに検討するため、ＭＡｂ−プロテインＡ混合物５０ｍｌ（総計２１０ｍｇ  ＭＡｂ）を１ｍｌカラムにかけた（図９）。９８．４％のタンパク質（ｍＡＵ＊ｍｌに基づく）がカラムをそのまま通過し、導電率の増加によって小さなピーク（１．６％）が溶出された。これらの画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００でのゲル濾過及び蛍光発光の検出によって分析した。さらに、プロテインＡ分析用のサンプルを上述の通り調製した。
【０１００】
ゲル濾過の結果を図１０に示す。上述の通り、溶出ピークではＭＡｂ−プロテインＡ凝集体が検出できたが、フロースルー画分では検出できなかった。この結果は、ＭＡｂ−プロテインＡ凝集体の大半がカラムに吸着し、導電率の増加によって再度溶出されることを示す。
【０１０１】
蛍光測定の結果は、蛍光発光つまりプロテインＡ含量がサンプル添加時のフロースルーで徐々に増加したことを示す。しかし、蛍光の９０％は溶出ピークにみられた。この観察結果はプロテインＡ濃度の分析でも確認した（表３）。従って、４０ｍｇ  ＭＡｂ／ｍｌ吸着剤をロードするとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体の約９９％が除去され、最高サンプルロード（２１０ｍｇ／ｍｌ）では９６％であった。
【０１０２】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】実験の項に記載した通り、遅延体積が正しいことを確認するためカラムの代わりにキャピラリーにＭＡｂ−プロテインＡ混合物を流した対照実験の結果を示す図。
【図２】実験の項に記載した通り、対照マトリックス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にプロテインＡ溶液を流した第二の対照実験の結果を示す図。
【図３】実験の項に記載した通り、プロテインＡ溶液をマルチモーダル樹脂にかけた第三の対照実験の結果を示す図。
【図４】実験の項に記載した通り、結合モードでのＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す図。
【図５】実験の項に記載した通り、最適化溶出スキームを用いて至適化した結合モードでのＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す図。
【図６】実験の項に記載した通り、図５のピークのゲル濾過による分析を示す図。
【図７】上述の「フロースルーモード」つまりＭＡｂが吸着されずにカラムを通過する際の純粋ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す図。
【図８】実験の項に記載した通り、図７のピークのゲル濾過による分析を示す図。
【図９】実験の項に記載した通り、フロースルーモードにおいてではあるが、図７においてよりも相当に大きなサンプル量を用いる、純粋ＭＡｂとＭＡｂ−プロテインＡ凝集体との分離を示す図。
【図１０】実験の項に記載した通り、図９のピークのゲル濾過分析の結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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