(57)【要約】  本発明は、インビトロでの体細胞変異の誘導を促進する方法に関する。本発明の方法には、ＡＩＤ遺伝子の修飾されたバージョンを発現する少なくとも１つのｃＤＮＡの、培養条件下であって、そしてそれに適している培地の中での、変異される細胞の中での発現が含まれる。上記のＡＩＤ遺伝子によって生じる修飾されたバージョンの中では、３つの疎水性アミノ酸ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６が、いずれも、アラニン変異によって置き換えられている。本発明は、バーキットリンパ腫ＢＬ２において変異を誘導するために使用することができる。本発明はまた、不死化した抗体生産細胞（例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって不死化したマウスハイブリドーマ細胞、ヒトハイブリドーマ細胞、またはヒトＢ細胞株）の免疫グロブリン遺伝子の中で変異を誘導するために使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの体細胞変異の誘導を促進させるための方法であって、３つの疎水性アミノ酸ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６が変異によってアラニンに置き換えられているＡＩＤ遺伝子の修飾されたバージョンを発現するｃＤＮＡの、変異される細胞の中での、培養条件下であって、そして前記細胞に適している培地の中での、発現が含まれることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ＡＩＤタンパク質の本質的な核局在化が、ＡＩＤタンパク質のコンセンサス部位の３つの疎水性アミノ酸、すなわち、ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６をアラニンに変異させることによって得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
適切な細胞の中での体細胞変異のインビトロ誘導を得るために、変異される細胞が配列番号１によって示される変異体ＡＩＤ遺伝子でトランスフェクトされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（１）３つの疎水性アミノ酸ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６がアラニンへの変異によって置き換えられているＡＩＤ遺伝子の修飾されたバージョンを発現するｃＤＮＡの、変異される細胞に対する、培養条件下であって、そして前記細胞に適している培地の中での、添加が含まれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも７日間の期間にわたって、好ましくは、約８日間の期間にわたって行われることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記配列によってコードされるペプチドと共に、配列番号１によって示されることを特徴とする、変異体ヒトＡＩＤのヌクレオチドコード配列。
【請求項７】
適切な細胞の中での体細胞変異のインビトロ誘導のための、変異される細胞が配列番号１によって示される変異体ＡＩＤ遺伝子でトランスフェクトされることによる、請求項６に記載の配列番号１の使用。
【請求項８】
タンパク質および／または遺伝子のレベルでインビトロでの超変異原性試験を行うための、請求項１から５のいずれかに記載の誘導方法の使用。
【請求項９】
Ｂリンパ腫、特に、ヒトＢリンパ腫に対して、さらに具体的には、ＢＬ２バーキットリンパ腫において変異を誘導する目的のために適用されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
不死化した抗体産生細胞、特に、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で不死化したマウスハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、およびヒトＢ細胞株から選択される細胞の免疫グロブリン遺伝子の中に体細胞変異を誘導するための、請求項１〜５のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１１】
請求項６に記載の少なくとも１つの配列を含む体細胞変異の促進を誘導するためのシステムを含むことを特徴とする、体細胞変異を誘導するためのキット。
【請求項１２】
ミュータソームの成分の、特に、タンパク質分析による、定性的および／または定量的同定に使用することができることを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
誘導された翻訳後修飾の同定、特に、ミュータソームの成分、特に、前記誘導の間に出
現するタンパク質成分の同定、単離、および分析による同定が含まれることを特徴とする、請求項１１または１２のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項１４】
少なくとも１つの遺伝子、特に、目的のタンパク質のコード遺伝子を提供する工程が含まれ、ここでは、変異を誘導することが望ましいが、前記遺伝子は、プロモータとＩｇＧの重鎖または軽鎖をコードする遺伝子のエンハンサとを含むカセットの中に含まれており、一方、前記遺伝子は、リンパ腫細胞、特に、ＢＬ２バーキットリンパ腫細胞の中にトランスフェクトされることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
任意の配列を変異させるために、変異される配列に、好ましくは変異カセットの中で、Ｉｇのプロモータとエンハンサとが隣接させられることを特徴とする、請求項１３または１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
ヒトＡＩＤの３つの疎水性アミノ酸ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６がアラニンへの変異によって置き換えられている修飾されたＡＩＤ遺伝子を発現することを特徴とする、ｃＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は生物学に関し、さらに具体的には、生物界に特異的な定方向突然変異による適応の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、インビトロでの体細胞変異の誘導を促進すること、およびそのような技術の改良によって可能になる適用に関する。
【０００２】
特定の実施形態においては、本発明は、ＢＬ２バーキットリンパ腫の中での変異の誘導に関する。
【０００３】
別の態様においては、本発明は、不死化した抗体産生細胞、すなわち、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で不死化したマウスハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、またはヒトＢ細胞株の中での変異の誘導に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の技術的背景
便宜上、以下にＢＬ２バーキットリンパ腫について言及する。しかし、これは、単に対象となる技術や請求される本発明の概念の説明を容易にするためにすぎず、これによって本発明がこの態様に限定されることはないことを強調しておかなければならない。
【０００５】
Ｉ型ＢＬ２バーキットリンパ腫細胞株は、中心芽Ｂ細胞の特徴を有している。この細胞株は、胚中心芽細胞（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｃｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｓ）の最も近い不死化対応物である。胚中心の起源は、バーキットリンパ腫のＶＨ免疫グロブリン遺伝子の中の体細胞変異の存在によって確認されている。
【０００６】
適切な培養物の中でのＢＬ２細胞の均質性および安定性が指摘されている（Ｓ．Ｄｅｎｅｐｏｕｘら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．６，３５−４６，１９９７）。中心芽細胞の表現型と一致して、ＢＬ２はいくつかの体細胞変異期を経験した胚中心芽細胞の形質転換によって生じると考えられることが提案されている。
【０００７】
さらに、Ｂ細胞は、中心芽細胞の段階で超変異を受けると考えられている（Ｖ．Ｐａｓｃｕａｌら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０．３２９−３３９（１９９４））。
【０００８】
免疫グロブリン超変異現象は、Ｔ依存性抗原でのＢ細胞の刺激の後に、胚中心で生じる。
【０００９】
具体的には、Ｓ．Ｄｅｎｅｐｏｕｘら（前出）は、リンパ腫細胞（特に、ＢＬ２細胞）が、培養の１週間後に、それらの表面受容体の凝集、および予備のＴ細胞または増殖Ｔ細胞との共培養の後に、超変異プロセスを誘発できることを証明した。ＢＬ２細胞の繰り返しの活性化によるこの事象においては、変異の頻度を増大させることが可能であると結論された。加えて、これらの著者らは、ＢＬ２の中でインビトロで誘導された変異はＩｇＭの定常領域に影響を与えることはなく、そして抗原特異的選択の状況を引き起こすことはないことを強調していた。
【００１０】
さらに、Ｊ．Ｙｅｌａｍｏｓら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７６，ｐｐ．２２５−２２９（１９９５）には、免疫グロブリンのＶ遺伝子断片は超変異に必須ではないこと、そして、したがって、人工的な変異基質の構築を簡易化できることを示す傾向がある実験が報告されている。
【００１１】
したがって、バーキットリンパ腫に由来するＢＬ２株は、目的の遺伝子を変化させるための標的化突然変異誘発ツールとして使用することができる。
【００１２】
先行技術におけるこれらの開発にもかかわらず、これらの現象を研究し、それらから実際的結果を得るため（具体的には、診断および／またはフォローアップ、ならびに、腫瘍のプロセスの処置の目的のための）、実行可能性と速度を満足する有効な手段はない。
【００１３】
したがって、迅速に、そして信頼できる体細胞超変異試験を行うことができる手段が依然として必要とされている。さらに具体的には、Ｖ遺伝子に適用することができるが、（特に、ヒトにおいて）腫瘍プロセスに関係している可能性がある他の遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−６およびＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）遺伝子）にもまた適用することができる体細胞変異誘導モデルを提供する手段が必要とされている。
【００１４】
本出願人は、免疫グロブリン遺伝子変異を、免疫グロブリン遺伝子の超変異プロセスの開始（抗ＩｇＭ抗体での刺激、ならびに予備のＴ細胞との共培養、または抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２１抗体とビオチニル化抗ＩｇＭ抗体（これは、その後、ストレプトアビジンを結合させた磁気ビーズを使用して凝集させることができる）での刺激）を模倣するシグナルによって誘導することができることを以前に明らかにした。
【００１５】
本発明者らはまた、この技術の使用は通常はＥＳ（胚性幹細胞）株、または鳥類のリンパ腫ＤＴ４０に由来する株に限られるが、この株の中で相同組み換えを誘導することができることを以前に明らかにした。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
我々は、ここで、体細胞変異を誘導するための方法を見出した。ここでは、上記変異は、特に、バーキットリンパ腫に由来するＢＬ２株の中で、それ自体がＡＩＤ遺伝子（省略語ＡＩＤは、「活性化によって誘導されるシチジンデアミナーゼ」を表す）の修飾されたバージョンを発現するｃＤＮＡを発現させることによって促進される。この目的のために、我々は、本発明の一部でもある、特別に適合させたＡＩＤの修飾型ｃＤＮＡを開発した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
ＡＩＤ遺伝子（図１を参照のこと）は、免疫グロブリンＶ遺伝子のシチジンを脱アミノ化してウラシルにすることによって超変異プロセスの開始に関与している。これによって、ＤＮＡの中にこれらの異常な塩基の修復または誤った複製が生じる。
【００１８】
ＡＩＤは、本質的には細胞質タンパク質であり、その脱アミノ化活性を発揮するためには、細胞の核に標的化させられなければならない。しかし、ＡＩＤは、核と細胞質を絶えず往復しており（例えば、Ｓ．Ｉｔｏら，ＰＮＡＳ，２００４年２月１７日，Ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．７，ｐｐ．１９７５−１９８０を参照のこと）、そしてその細胞質での局在化は、ＣＲＭ１タンパク質によって行われる核からの活発な輸送によって生じる（例えば、Ｋ．Ｍ．ＭｃＢｒｉｄｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ，１９９，Ｎｏ．９，２００４年５月３日，ｐｐ．１２３５−１２４４を参照のこと）。後者によって、ＡＩＤタンパク質の中に存在しているコンセンサス部位が同定された。
【００１９】
我々は、この輸送を妨害し、そしてＡＩＤタンパク質のこのコンセンサス部位の中の３
つの疎水性アミノ酸（すなわち、ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６）をアラニンに変異させることによってＡＩＤタンパク質の本質的な核局在化を得ることができることを、ここで見出した。
【００２０】
したがって、我々は、免疫グロブリン遺伝子座で観察された突然変異形成は、上記の既知の技術を使用して（全て条件が同じとして）得られた変異率と比較すると５倍〜１０倍一貫して高いことを実験的に見出した。
【００２１】
適切な位置に上記に示される変異を有しているヒトＡＩＤをコードするヌクレオチド配列が、上記配列によってコードされるペプチドと共に、配列番号１によって示される。これには、ＡＩＤの配列の中に、３つのアミノ酸ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６のアラニンへの変異が含まれている。
【００２２】
この突然変異形成は、当業者に周知の方法を使用して行われる。
本発明の方法によって得られる効果は、添付の図２Ａ〜Ｂの図表にまとめられる実験の結果（当業者に既知の慣例にしたがって、通常通り行われた）によって確認される。
【００２３】
したがって、我々は、プロセスを行うために長い時間がかかり、面倒であるか、あるいは、わずかな変異の促進を得るために他の技術が必要である類似のプロセスに従う先行技術のデータとは対照的に、リンパ腫細胞、特に、ＢＬ２細胞がそれらの免疫グロブリン遺伝子の中での超変異プロセスの急激な促進を誘発することができることを見出した。さらに、本発明の方法によっては、得られる変異の数に顕著な分布が生じる（図２Ｂを参照のこと）。
【００２４】
変異頻度（１００塩基対あたり）は、図１に示す配列の野生型ヒトＡＩＤでトランスフェクトした細胞についてのわずか０．０５％と比較して、３つのアミノ酸１８９、１９３、および１９６だけがアラニンで置換されている本発明の変異体ＡＩＤ遺伝子（すなわち、配列番号１）でトランスフェクトした細胞については、０．２２％であることが明らかになった。
【００２５】
さらに正確にいうと、我々はモデルとしてＢＬ２細胞を用いることにより、変異させられる細胞を、上記および配列番号１で示される変異体ＡＩＤ遺伝子の少なくとも１つ、上記配列によってコードされるペプチドを示す配列表の中の配列番号２を用いてトランスフェクトすることによって、極めて例外的な速度および効率で、適切な細胞の中での体細胞変異の誘導をインビトロで得ることができることを予想外に見出した。
【００２６】
したがって、本発明の第１の目的は、インビトロまたはエキソビボでの体細胞変異の誘導を促進するための方法である。この方法には、（１）３つの疎水性アミノ酸ｌｅｕ１８９、ｐｈｅ１９３、およびｌｅｕ１９６がいずれもアラニンへの変異によって置き換えられているＡＩＤ遺伝子の修飾されたバージョンを発現するｃＤＮＡの、変異される細胞に対する、培養条件下であって、そして上記細胞に適している培地の中での、添加が含まれる。
【００２７】
１つの特徴によると、本発明による体細胞変異の誘導は、少なくとも７日間の期間にわたって、より好ましくは、約８日間の期間にわたって行われる。
【００２８】
有利な特徴によると、本発明の方法には、別の細胞型の細胞（特に、Ｔ細胞）との共培養の使用が含まれない。
【００２９】
特異的な特徴によると、本発明の方法は、ＢＬ２バーキットリンパ腫において変異を誘
導するために使用される。
【００３０】
本発明の別の目的は、タンパク質および／または遺伝子のレベルでインビトロで超変異原性試験を行うために体細胞変異を誘導するためのこの方法の使用である。
【００３１】
本発明にしたがって体細胞変異を促進させるための方法の使用に最も適している実施手順は当業者には周知であり、彼らは、必要に応じてパラメータを調節するための日常的に行われている手段および／または試験手段を利用する。
【００３２】
本発明の第１の態様においては、この使用は、Ｂリンパ腫（特に、ヒトＢリンパ腫）に対して、より具体的には、ＢＬ２バーキットリンパ腫において変異を誘導する目的のために適用される。
【００３３】
本発明の別の態様においては、この使用は、他の不死化した抗体生産細胞（すなわち、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で不死化したマウスハイブリドーマまたはヒトＢ細胞株）に適用される。
【００３４】
本発明の別の目的は、不死化した抗体生産細胞（特に、エプスタイン・バーウイルスで不死化したマウスハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、およびヒトＢ細胞株から選択されるもの）の免疫グロブリン遺伝子の中に体細胞変異を誘導するための本発明の方法の使用である。バーキットリンパ腫について推奨される技術と同様の技術がこの目的のために使用される。
【００３５】
実際、インビトロで（特に、本発明のＢＬ２細胞の中で）体細胞変異を誘導するためには、細胞のトランスフェクションは、当業者に周知の技術を使用して行われる。
【００３６】
本発明の別の目的は、体細胞変異を誘導するためのキットであり、これは、上記で定義したように、体細胞変異の促進を誘導するシステムを含むことを特徴とする。
【００３７】
本発明の別の目的は、ミュータソーム（ｍｕｔａｓｏｍｅ）の成分の（特に、タンパク質分析による）定性的および／または定量的同定のためのこのキットの使用である。
【００３８】
１つの実施形態においては、本発明によるキットの使用には、誘導された翻訳後修飾の同定、特に、ミュータソームの成分、特に、上記誘導の間に出現するタンパク質成分の同定、単離、および分析による同定が含まれる。
【００３９】
好ましい実施の特徴にしたがうと、この使用には、少なくとも１つの遺伝子、特に、目的のタンパク質のコード遺伝子を提供することが含まれる。ここでは、変異を誘導することが望ましいが、上記遺伝子は、プロモータとエンハンサ（ＩｇＧの重鎖または軽鎖をコードする遺伝子のエンハンサ）とを含むカセットの中に含まれており、一方、上記遺伝子は、リンパ腫細胞、特に、ＢＬ２バーキットリンパ腫細胞の中にトランスフェクトされる。
【００４０】
有利な実施形態にしたがうと、任意の配列を変異させるために、変異させられる配列に、好ましくは変異カセットの中で、Ｉｇのプロモータとエンハンサとが隣接させられる。
【００４１】
したがって、当業者は、上記の情報と彼／彼女自身の知識に基づいて、本発明の範囲を逸脱することなく、類似または同等の試験システムおよび種々の具体的な使用を想定することができる。これらは、本明細書中に記載されるものに関係している場合も、また関係していない場合もある。
【００４２】
【表１】
2008512107.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、自然界に存在しているヒトＡＩＤのヌクレオチドコード配列と、この配列によってコードされるペプチドを示す。
【図２】それぞれ、野生型ＡＩＤでトランスフェクトした細胞の中、および変異体ＡＩＤ（本発明の配列番号１）でトランスフェクトした細胞の中の、所定の数の変異を有しているＢＬ２株中のＶＨ配列のそれぞれの割合の表示である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008512107.tif 000007
2008512107.tif 000008
2008512107.tif 000009
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