(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、式Ｉを有する６Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｂ］キノリン化合物を提供する。本発明はさらに、前記化合物を含有する組成物、前記化合物の使用のための方法、及び前記化合物の製造の方法を提供する。【選択図】  なし
2008512458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
2008512458.tif 000009
［式中、
Ａ及びＡ’は、各々独立してＯＨ、Ｈ又はＯＲであり；
各々のＲは、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アルケニル、ベンジル、アシル、アロイル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、スルホニル及びホスホリルから成る群より独立して選択され、前記式中、各々のＲ’は、各々が場合によりＣ1−Ｃ6アルキル又はハロゲンから選択される１−３個の置換基によって置換されている、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又はＣ3−Ｃ10シクロアルキルから独立して選択され；
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、ＣＦ3、Ｃ2−Ｃ7アルケニル及びＣ1−Ｃ6アルコキシから成る群より独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ3、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール及びヘテロアリールから成る群より各々独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキル又はアルケニル部分は、各々、場合によりハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、トリフルオロアルキル、トリフルオロアルコキシ、ＮＯ2又はフェニルから独立して選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキニル部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、トリフルオロアルキル、トリアルキルシリル又はフェニルから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のフェニル、アリール又はヘテロアリール部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、アルキル、アルコキシ、ペルフルオロアルキル又はペルフルオロアルコキシから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく；
各々のＲ10は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、−ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、アミノ、Ｃ1−Ｃ6アルキルアミノ、ジ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、チオール及びＣ1−Ｃ6アルキルチオから成る群より独立して選択され；及び
ｎは、０、１、２又は３であり；
但し、
Ａ及びＡ’の少なくとも１つはＨではなく；
ｎが０である場合、Ｒ3はハロゲンではなく；及び
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の少なくとも１つは、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール又はヘテロアリールである］
を有する式Ｉの化合物、又はそのＮ−オキシド又は製薬上許容されるその塩又はそのプロドラッグ。
【請求項２】
Ａ及びＡ’が各々ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａ及びＡ’の一方がＯＨであり、Ａ及びＡ’の他方がＯＲである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ａ及びＡ’の一方がＯＨであり、Ａ及びＡ’の他方がＯ−Ｃ1−Ｃ6アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ａ及びＡ’が各々ＯＲである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ａ及びＡ’が各々−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ａ及びＡ’の一方がＨであり、Ａ及びＡ’の他方がＯＨ又はＯＲである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ａ及びＡ’の一方がＨであり、Ａ及びＡ’の他方がＯＨ又はＯ−Ｃ1−Ｃ6アルキルであり、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ3及びＲ5が、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル又は先に定義したように、場合により置換されたフェニルである、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ3がＨ以外である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ3が、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルであり；及びＲ5が、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルである、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記Ｒ3の前記フェニルが、場合によりＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＯＣＨ3及びＣＦ3から選択される３個までの置換基で置換されている、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ3が、ハロゲン、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又は−ＣＮである、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ3及びＲ5が、各々独立してハロゲン、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又は−ＣＮである、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ1及びＲ2の１つがハロゲンである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ1及びＲ2の１つがフッ素である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ1及びＲ2の一方がハロゲンであり、Ｒ1及びＲ2の他方がＨである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ1及びＲ2の一方がフッ素であり、Ｒ1及びＲ2の他方がＨである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ1及びＲ2が各々独立してハロゲンである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ1及びＲ2が各々Ｈである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ1及びＲ2が各々フッ素である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ4が、Ｈ、ハロゲン又は−ＣＮである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ4がＨである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ3が、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルであり；
Ｒ5が、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルであり；
Ｒ1及びＲ2の１つがハロゲンであり；及びＲ4がＨ、ハロゲン又は−ＣＮである、
請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ3がハロゲンであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が水素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ3がＯＨであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が水素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ3がＣ2−Ｃ7アルケニルであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が水素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ3がＣＮであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が水素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ3がＣ2−Ｃ7アルキニルであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が水素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ3がＣ1−Ｃ6アルキルであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が水素である、請求項６に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ3が場合により置換されたフェニルであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が水素である、請求項６に記載の化合物。
【請求項３２】
前記フェニルの前記置換基が、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから成る群より選択される、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
ｎが１である、請求項１から２３又は２５から３２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３４】
ｎが１である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項３５】
ａ）３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン−７−オール；
ｂ）７−クロロ−３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｃ）７−ブロモ−３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｄ）７−クロロ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｅ）７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｆ）３，９−ジヒドロキシ−７−ビニル−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｇ）３，９−ジヒドロキシ−７−［（トリメチルシリル）エチニル］−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｈ）３，９−ジヒドロキシ−７−エチニル−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｉ）３，９−ジヒドロキシ−７−エチル−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｊ）７−シアノ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｋ）７−（４−クロロフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｌ）７−（４−シアノフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｍ）３，９−ジヒドロキシ−７−（４−メトキシフェニル）−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｎ）３，９−ジヒドロキシ−７−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｏ）７−（３−クロロフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｐ）３，９−ジヒドロキシ−７−（３−メトキシフェニル）−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン；
ｑ）７−（３−シアノフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン
である化合物、又は製薬上許容されるその塩、キレート、複合体又はプロドラッグ。
【請求項３６】
請求項３５に記載の化合物を含有する組成物。
【請求項３７】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の化合物を含有する組成物。
【請求項３８】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において骨粗しょう症を治療する又は抑制するあるいは骨無機質脱落を抑制する方法。
【請求項３９】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性直腸炎又は大腸炎を治療する又は抑制する方法。
【請求項４０】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物においてコレステロール、トリグリセリド、Ｌｐ（ａ）又はＬＤＬレベルを低下させる；高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、再狭窄又は血管痙攣を抑制する又は治療する；あるいは血管損傷を抑制する方法。
【請求項４１】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において認知機能増強又は神経保護を提供する；あるいは老年痴呆、アルツハイマー病、認知機能低下、卒中、不安又は神経変性疾患を治療する又は抑制する方法。
【請求項４２】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において遊離基が誘導する疾患状態を治療する又は抑制する方法。
【請求項４３】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において膣又は外陰萎縮、萎縮性膣炎、膣乾燥、そう痒、性交疼痛症、排尿障害、頻尿、尿失禁、尿路感染症を治療する又は抑制する方法。
【請求項４４】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において血管運動症状を治療する又は抑制する方法。
【請求項４５】
前記血管運動症状が顔面潮紅である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物における避妊の方法。
【請求項４７】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において関節リウマチ、変形性関節症又は脊椎関節症を治療する又は抑制する方法。
【請求項４８】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において関節鏡検査又は手術処置に続発する関節損傷を治療する又は抑制する方法。
【請求項４９】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において不妊症を治療する又は抑制する方法。
【請求項５０】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において虚血、再灌流障害、喘息、胸膜炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、筋痛、関節痛、不眠症、被刺激性、ブドウ膜炎、敗血症、出血性ショック又はＩＩ型糖尿病を治療する又は抑制する方法。
【請求項５１】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において低カルシウム血症、高カルシウム血症、パジェット病、骨軟化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄腫を治療する又は抑制する方法。
【請求項５２】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において、前立腺肥大、子宮平滑筋腫、乳癌、子宮内膜症、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、良性乳房疾患、腺筋症、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌又はＣＮＳ癌を含む、良性又は悪性異常組織増殖を治療する又は抑制する方法。
【請求項５３】
前記良性又は悪性異常組織増殖が、前立腺肥大、子宮平滑筋腫、乳癌、癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、良性乳房疾患、腺筋症、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌又はＣＮＳ癌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＣＮＳ癌が、神経膠腫又は神経膠星状芽細胞腫である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において癌、中枢神経系障害又は外傷、骨疾患、老化、炎症性疾患、末梢血管疾患、自己免疫疾患、呼吸窮迫、気腫、ウイルス性肝炎、慢性活動性肝炎、結核、乾癬、成人呼吸促進症候群を治療する又は抑制する方法。
【請求項５６】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において皮膚萎縮、？瘡又は男性型禿頭症を治療する又は抑制する方法。
【請求項５７】
その必要のある哺乳動物に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の１又はそれ以上の化合物の有効量を与えることを含む、その必要のある哺乳動物において白血病、子宮内膜剥離、慢性腎疾患、肝疾患又は凝固疾患又は障害を治療する又は抑制する方法。
【請求項５８】
式ＩＶ：
【化２】
2008512458.tif 000010
［式中、
Ａ及びＡ’は、各々独立してＯＨ、Ｈ又はＯＲであり；
各々のＲは、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アルケニル、ベンジル、アシル、アロイル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、スルホニル及びホスホリルから成る群より独立して選択され、前記式中、各々のＲ’は、各々が場合によりＣ1−Ｃ6アルキル又はハロゲンから選択される１−３個の置換基によって置換されている、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又はＣ3−Ｃ10シクロアルキルから独立して選択され；
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、ＣＦ3、Ｃ2−Ｃ7アルケニル及びＣ1−Ｃ6アルコキシから成る群より独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ3、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール及びヘテロアリールから成る群より各々独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキル又はアルケニル部分は、各々、場合によりハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、トリフルオロアルキル、トリフルオロアルコキシ、ＮＯ2又はフェニルから独立して選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキニル部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、トリフルオロアルキル、トリアルキルシリル又はフェニルから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のフェニル、アリール又はヘテロアリール部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、アルキル、アルコキシ、ペルフルオロアルキル又はペルフルオロアルコキシから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく；
各々のＲ10は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、−ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、アミノ、Ｃ1−Ｃ6アルキルアミノ、ジ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、チオール及びＣ1−Ｃ6アルキルチオから成る群より独立して選択され；及び
ｎは、０、１、２又は３であり；
但し、
Ａ及びＡ’の少なくとも１つはＨではなく；
ｎが０である場合、Ｒ3はハロゲンではなく；及び
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の少なくとも１つは、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール又はヘテロアリールである］
の化合物、又はそのＮ−オキシド又は製薬上許容されるその塩又はそのプロドラッグの製造のための方法であって、
ａ）式ＩＩ：
【化３】
2008512458.tif 000011
の化合物を提供すること；及び
ｂ）式ＩＩの化合物を式ＩＩＩ：
【化４】
2008512458.tif 000012
の化合物と反応させて式ＩＶの化合物を生成すること
の工程を含む方法。
【請求項５９】
式ＩＶの化合物を変性試薬と接触させて、式Ｉ：
【化５】
2008512458.tif 000013
［式中、
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ3、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール及びヘテロアリールから成る群より選択され；
Ｒ3のアルキル又はアルケニル部分は、場合によりハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、トリフルオロアルキル、トリフルオロアルコキシ、ＮＯ2及びフェニルから独立して選択される３個までの置換基で置換されており、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3のアルキニル部分は、場合によりハロゲン、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、トリフルオロアルキル、トリアルキルシリル及びフェニルから選択される３個までの置換基で置換されており、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3のフェニル、アリール又はヘテロアリール部分は、場合によりハロゲン、−ＣＮ、アルキル、アルコキシ、ペルフルオロアルキル又はペルフルオロアルコキシから選択される３個までの置換基で置換されており；
但し、
Ａ及びＡ’の少なくとも１つはＨではなく；
ｎが０である場合、Ｒ3はハロゲンではなく；及び
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の少なくとも１つは、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール又はヘテロアリールである］
の化合物、又はそのＮ−オキシド又は製薬上許容されるその塩又はそのプロドラッグを形成する工程をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の工程の生成物。
【請求項６１】
請求項５９に記載の工程の生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、６Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｂ］キノリン化合物、エストロゲン様物質としてのそれらの使用、及びそれらの製造の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物組織におけるエストロゲンの多面作用は広く文書で証明されており、現在、エストロゲンは多くの器官系に作用することが認識されている（Mendelsohn and Karas, New England Journal of Medicine 340: 1801-1811 (1999), Epperson, et al., Psychosomatic Medicine 61 : 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8: 1155-1166 (1999), Monk and Brodaty, Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11 : 1-10 (2000), Hurn and Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking, et al., Zeitschrift fur Kardiologie 89: 442-453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292-304 (2001)参照）。エストロゲンはいくつかの方法で組織に作用を及ぼすことができ、最も広く特性付けられている作用機構は、遺伝子転写の変化を導くエストロゲン受容体との相互作用である。エストロゲン受容体はリガンド活性化転写因子であり、核内ホルモン受容体スーパーファミリーに属する。このファミリーの他の成員は、プロゲステロン、アンドロゲン、グルココルチコイド及びミネラルコルチコイド需要体を含む。リガンドと結合したとき、これらの受容体は二量体化して、直接ＤＮＡ上の特定配列（応答エレメントとして知られる）に結合することによって又は他の転写因子（例えばＡＰ１）と相互作用して、それが次に特定ＤＮＡ配列と直接結合することによって、遺伝子転写を活性化することができる（Moggs and Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation 351-361 (2000)参照）。「共調節」タンパク質のクラスもリガンド結合受容体と相互作用することができ、さらにその転写活性を調節することができる（McKenna, et al., Endocrine Reviews 20: 321-344 (1999)参照）。エストロゲン受容体は、リガンド依存性及び非依存性の両方で、ＮＦκＢを介した転写を抑制できることも示された（Quaedackers, et al., Endocrinology 142: 1156-1166 (2001), Bhat, et al., Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 67: 233-240 (1998), Pelzer, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153-7 (2001)参照）。
【０００３】
エストロゲン受容体はまた、リン酸化によっても活性化され得る。このリン酸化はＥＧＦなどの増殖因子によって媒介され、リガンドの不在下で遺伝子転写の変化を生じさせる（Moggs and Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)参照）。
【０００４】
エストロゲンが細胞に影響を及ぼし得る、上記ほどには十分に特性付けられていない手段は、いわゆる膜受容体を通してである。そのような受容体の存在は論議の対象となっているが、エストロゲンが細胞から非常に迅速な非ゲノム応答を惹起できることは文書で証明されている。これらの作用を導入する責任を担う分子実体は決定的に単離されていはいないが、少なくとも核内形態のエストロゲン受容体に関連することを示唆する証拠が存在する（Levin, Journal of Applied Physiology 91 : 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinology & Metabolism 10: 374-377 (1999)参照）。
【０００５】
２つのエストロゲン受容体がこれまでに発見されている。最初のエストロゲン受容体は約１５年前にクローン化され、現在ＥＲαと称されている（Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)参照）。２番目の形態のエストロゲン受容体は比較的最近発見され、ＥＲβと呼ばれる（Kuiper, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925-5930 (1996)参照）。ＥＲβに関する初期研究は、様々なリガンドに対するその親和性を定義することを焦点とし、実際に、ＥＲαとのいくつかの相違が認められた。ＥＲβの組織分布はげっ歯動物において広く位置づけられており、ＥＲαとは一致しない。マウス及びラット子宮などの組織は主としてＥＲαを発現し、一方マウス及びラット肺などの他の組織は主としてＥＲβを発現する（Couse, et al., Endocrinology 138: 4613-4621 (1997), Kuiper, et al., Endocrinology 138: 863-870 (1997)参照）。同じ器官内でも、ＥＲαとＥＲβの分布は区分化され得る。例えばマウス卵巣では、ＥＲβが顆粒層細胞において高発現され、ＥＲαは膜及び支質細胞に限定される（Sar and Welsch, Endocrinology 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick, et al., Endocrinology 140: 2581-2591 (1999)参照）。しかし、受容体が共発現される例があり、ＥＲαとＥＲβはヘテロ二量体を形成し得るというインビトロ試験からの証拠が存在する（Cowley, et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862 (1997)参照）。
【０００６】
１７β−エストラジオールの作用を模倣する又はブロックする数多くの化合物が記述されている。最も強力な内因性エストロゲンである１７β−エストラジオールとほぼ同じ生物学的作用を有する化合物は、「エストロゲン受容体アゴニスト」と称される。１７β−エストラジオールと組み合わせて投与したとき、その作用をブロックするものは、「エストロゲン受容体アンタゴニスト」と呼ばれる。実際には、エストロゲン受容体アゴニストとエストロゲン受容体アンタゴニスト作用の間には連続性があり、事実上、一部の化合物は、一部の組織ではエストロゲン受容体アゴニストとして行動し、別の組織ではエストロゲン受容体アンタゴニストとして行動する。混合型活性を有するこれらの化合物は選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭＳ）と呼ばれ、治療上有用な物質である（例えばＥＶＩＳＴＡ（登録商標））（McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S10-S15 (2000), Goldstein, et al., Human Reproduction Update 6: 212-224 (2000)参照）。同じ化合物が細胞特異的作用を有し得る正確な理由は解明されていないが、受容体の立体配座及び／又は共調節タンパク質の環境の相違が示唆されてきた。
【０００７】
エストロゲン受容体はリガンドと結合したとき異なる立体配座をとることが以前から知られている。しかし、これらの変化の結果とその緻密性はごく最近明らかにされた。ＥＲαとＥＲβの三次元構造が、様々なリガンドとの共結晶化によって解明され、受容体と共調節タンパク質の相互作用のために必要なタンパク質配列の立体障害となる、エストロゲン受容体アンタゴニストの存在下でのヘリックス１２の再配置を明らかに示す（Pike, et al., Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau, et al., Cell 95: 927-937 (1998)参照）。加えて、ファージディスプレイの手法が、種々のリガンドの存在下でエストロゲン受容体と相互作用するペプチドを特定するために使用されてきた（Paige, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999-4004 (1999)参照）。例えば、完全なエストロゲン受容体アゴニストである１７β−エストラジオールとジエチルスチルベステロールに結合するＥＲαを識別するペプチドが特定された。異なるペプチドは、ＥＲαとＥＲβに結合するクロミフェンを識別することが示された。これらのデータは、各々のリガンドが潜在的に受容体を、異なる生物活性を有すると考えられる独自の予測不可能な立体配座に置くことを示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、エストロゲンは極めて多様な生物学的過程に影響を及ぼす。加えて、性差が記述されている場合は（例えば疾患発生率、抗原投与に対する応答等）、雄性と雌性の間でのエストロゲンレベルの差が説明に含まれる可能性がある。これらの化合物の重要性を考慮すると、新しいエストロゲン様物質への必要性が存在することがわかる。本発明は、これら並びに他の重要な目的を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、エストロゲン様物質として有用な６Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｂ］キノリン化合物を提供する。ある実施形態では、前記化合物は、式Ｉ：
【化６】
2008512458.tif 000003
［式中、
Ａ及びＡ’は、各々独立してＯＨ、Ｈ又はＯＲであり；
各々のＲは、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アルケニル、ベンジル、アシル、アロイル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、スルホニル及びホスホリルから成る群より独立して選択され、前記式中、各々のＲ’は、各々が場合によりＣ1−Ｃ6アルキル又はハロゲンから選択される１−３個の置換基によって置換されている、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又はＣ3−Ｃ10シクロアルキルから独立して選択され；
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、ＣＦ3、Ｃ2−Ｃ7アルケニル及びＣ1−Ｃ6アルコキシから成る群より独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ3、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール及びヘテロアリールから成る群より各々独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキル又はアルケニル部分は、各々、場合によりハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、トリフルオロアルキル、トリフルオロアルコキシ、ＮＯ2又はフェニルから独立して選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキニル部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、トリフルオロアルキル、トリアルキルシリル又はフェニルから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のフェニル、アリール又はヘテロアリール部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、アルキル、アルコキシ、ペルフルオロアルキル又はペルフルオロアルコキシから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく；
各々のＲ10は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、−ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、アミノ、Ｃ1−Ｃ6アルキルアミノ、ジ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、チオール及びＣ1−Ｃ6アルキルチオから成る群より独立して選択され；及び
ｎは、０、１、２又は３であり；
但し、
Ａ及びＡ’の少なくとも１つはＨではなく；
ｎが０である場合、Ｒ3はハロゲンではなく；及び
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の少なくとも１つは、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール又はヘテロアリールである］
又はそのＮ−オキシド又は製薬上許容されるその塩又はそのプロドラッグを有する。
【００１０】
本発明の化合物は、少なくとも部分的にエストロゲンの欠損又は過剰によって媒介される、又はエストロゲン様物質の使用を通して治療又は抑制され得る状態、障害又は疾患状態の治療又は抑制において有用なエストロゲン受容体調節剤である。それ故、一部の態様では、本発明は、疾患、例えば骨粗しょう症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性直腸炎、大腸炎、エストロゲン依存性の癌、高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、老年痴呆、アルツハイマー病、不安障害、神経変性疾患、不妊症又は関節炎の治療又は予防における本発明の化合物の使用を対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、６Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｂ］キノリン化合物、前記化合物を含有する組成物、及びエストロゲン様物質としての前記化合物の使用のための方法を提供する。本発明の化合物は、エストロゲン受容体、特にＥＲβに関連する疾患の治療及び予防において有用である。一部の実施形態では、本発明のエストロゲン様化合物は、式Ｉ：
【化７】
2008512458.tif 000004
［式中、
Ａ及びＡ’は、各々独立してＯＨ、Ｈ又はＯＲであり；
各々のＲは、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アルケニル、ベンジル、アシル、アロイル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、スルホニル及びホスホリルから成る群より独立して選択され、前記式中、各々のＲ’は、各々が場合によりＣ1−Ｃ6アルキル又はハロゲンから選択される１−３個の置換基によって置換されている、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又はＣ3−Ｃ10シクロアルキルから独立して選択され；
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、ＣＦ3、Ｃ2−Ｃ7アルケニル及びＣ1−Ｃ6アルコキシから成る群より独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ3、Ｃ1−Ｃ6ペルハロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール及びヘテロアリールから成る群より各々独立して選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキル又はアルケニル部分は、各々、場合によりハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、トリフルオロアルキル、トリフルオロアルコキシ、ＮＯ2又はフェニルから独立して選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のアルキニル部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、トリフルオロアルキル、トリアルキルシリル又はフェニルから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく、前記フェニルは、場合により独立して選択される３個までのＲ10基で置換されており；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のフェニル、アリール又はヘテロアリール部分は、各々、場合によりハロゲン、−ＣＮ、アルキル、アルコキシ、ペルフルオロアルキル又はペルフルオロアルコキシから選択される３個までの置換基で置換されていてもよく；
各々のＲ10は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、−ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、アミノ、Ｃ1−Ｃ6アルキルアミノ、ジ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、チオール及びＣ1−Ｃ6アルキルチオから成る群より独立して選択され；及び
ｎは、０、１、２又は３であり；
但し、
Ａ及びＡ’の少なくとも１つはＨではなく；
ｎが０である場合、Ｒ3はハロゲンではなく；及び
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の少なくとも１つは、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル、フェニル、アリール又はヘテロアリールである］
又はそのＮ−オキシド又は製薬上許容されるその塩又はそのプロドラッグを有する。
【００１２】
一部の実施形態では、Ａ及びＡ’は各々ＯＨである。一部のさらなる実施形態では、Ａ及びＡ’の一方はＯＨであり、Ａ及びＡ’の他方はＯＲである。一部のさらなる実施形態では、Ａ及びＡ’の一方はＯＨであり、Ａ及びＡ’の他方はＯ−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。一部のさらなる実施形態では、Ａ及びＡ’は各々ＯＲである。さらなる実施形態では、Ａ及びＡ’は各々−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。さらなる実施形態では、Ａ及びＡ’の一方はＨであり、Ａ及びＡ’の他方はＯＨ又はＯＲである。さらなる実施形態では、Ａ及びＡ’の一方はＨであり、Ａ及びＡ’の他方はＯＨ又はＯ−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。
【００１３】
一部の実施形態では、Ｒ3及びＲ5は、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、アシル又は先に述べたような、場合により置換されたフェニルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ3はＨ以外である。
【００１４】
一部の実施形態では、Ｒ3は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6アルキル（すなわちＣ1−Ｃ6アルコキシ）、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルであり；及びＲ5は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ3のフェニルは、場合によりＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＯＣＨ3及びＣＦ3から選択される３個までの置換基で置換されている。
【００１５】
一部の実施形態では、Ｒ3は、ハロゲン、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又は−ＣＮである。一部のさらなる実施形態では、Ｒ3及びＲ5は、各々独立してハロゲン、Ｃ2−Ｃ7アルキニル又は−ＣＮである。
【００１６】
一部の実施形態では、Ｒ1及びＲ2の１つはハロゲンである。一部の好ましい実施形態では、Ｒ1及びＲ2の１つはフッ素である。一部のさらなる実施形態では、Ｒ1及びＲ2の一方はハロゲンであり、Ｒ1及びＲ2の他方はＨである。一部のさらなる実施形態では、Ｒ1及びＲ2の一方はフッ素であり、Ｒ1及びＲ2の他方はＨである。一部のさらなる実施形態では、Ｒ1及びＲ2は各々独立してハロゲンである。一部のさらなる実施形態では、Ｒ1及びＲ2は各々フッ素である。一部のさらなる実施形態では、Ｒ1及びＲ2は各々Ｈである。
【００１７】
一部の実施形態では、Ｒ4は、Ｈ、ハロゲン又は−ＣＮであり、好ましくはＨである。
【００１８】
一部の実施形態では、Ｒ3は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルであり；Ｒ5は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ2−Ｃ7アルキニル、−ＣＮ、−ＣＨＯ、又は場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮから選択される３個までの基で置換されたフェニルであり；Ｒ1及びＲ2の１つはハロゲンであり；及びＲ4はＨ、ハロゲン又は−ＣＮである。
【００１９】
一部の実施形態では、好ましくは、Ａ及びＡ’は各々ＯＨであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は水素であり、及びＲ3はハロゲンであるか、又はＲ3はＯＨであるか、又はＲ3はＣ2−Ｃ7アルケニルであるか、又はＲ3はＣＮであるか、又はＲ3はＣ2−Ｃ7アルキニルであるか、又はＲ3はＣ1−Ｃ6アルキルであるか、又はＲ3は場合により置換されたフェニルであり、好ましくはフェニルの置換基は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ペルフルオロアルキル及びＣＮである。
【００２０】
前記の各々の一部の実施形態では、ｎは１である。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の１又はそれ以上の化合物、又は製薬上許容されるその塩、キレート、複合体又はプロドラッグを含有する組成物を提供する。
【００２２】
本発明に従った化合物は、ここで示す式において示されるように、それらの遊離塩基形態で、又はその塩及び／又は水和物として、特にその製薬上許容される塩として存在し得ることが了解されるべきである。製薬上許容される塩は、水和物と同様に、当技術分野において公知であり、当業者は、当技術分野で認識されている手法を用いてそのような塩を製造することは慣例的であることを理解する。製薬上許容される塩は、本発明の化合物が塩基性部分を含むときは、有機及び無機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、及び同様に公知の許容される酸から形成され得る。塩はまた、本発明の化合物が酸性部分を含むときは、有機及び無機塩基、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウム、リチウム又はカリウム）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、１−６個の炭素原子を含むアルキルアンモニウム塩又は各々のアルキル基内に１−６個の炭素原子を含むジアルキルアンモニウム塩、及び各々のアルキル基内に１−６個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム塩から形成され得る。例示的な塩は、酸付加塩、例えばＨＣｌ、Ｈ2ＳＯ4、ＨＢｒ、ＨＩ、ＨＮＯ3、Ｈ3ＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、Ｈ3ＰＯ3、ＮａＨ2ＰＯ3、Ｎａ2ＨＰＯ4、Ｈ2ＳＯ4、ＮａＨＳＯ4、カルボン酸、例えば酢酸、マロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸等、及び他の薬理学的に耐容される塩をさらに含む。水和物は、半水和物、一水和物、二水和物等を含む。ここで異なる変更が為されない限り、遊離塩基式の使用はその塩及び／又は水和物を包含することが意図されている。
【００２３】
本発明はまた、ここで開示する化合物のＮ−オキシド誘導体を包含する。これらのＮ−オキシドは、類似化合物を製造するための公知の方法によって製造できる。例えば前記化合物を過酸、過酸化水素、アルカリ金属過酸化物又はアルキル過酸化物で酸化し得る。１つの有用なＮ−オキシド誘導体は、キノリン環の窒素原子がＮ−オキシド基を形成する組成物である。
【００２４】
本発明はまた、プロドラッグ誘導体を包含する。「プロドラッグ誘導体」又は「プロドラッグ」は、インビボで本発明の化合物の対応する非誘導体化形態に変換される、本発明の化合物の誘導体を意味する。
【００２５】
ここで使用する、「アルキル」という用語は、単独で使用されるか又はもう１つ別の基の一部として使用されるかに関わらず、脂肪族炭化水素鎖を指し、明白に異なる規定がない限り、１−１２個の炭素原子、好ましくは１−６個の炭素原子を含む直鎖及び分枝鎖を含むが、これらに限定されない。例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等は、「アルキル」の用語に包含される。
【００２６】
ここで定義において使用する炭素原子の数は、その成分の炭素骨格及び炭素分枝を指すが、成分の置換基、例えばアルコキシ置換基等の炭素原子を含まない。
【００２７】
ここで使用する、「アルケニル」という用語は、単独で使用されるか又はもう１つ別の基の一部として使用されるかに関わらず、脂肪族炭化水素鎖を指し、２−８個の炭素原子、例えば２−７個の炭素原子を有し、及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖及び分枝鎖を含むが、これらに限定されない。好ましくは、アルケニル部分は１又は２個の二重結合を有する。例えばビニル、アリル、１−メチルビニル等が「アルケニル」の用語に包含される。そのようなアルケニル部分はＥ又はＺ立体配座で存在し得るが、本発明の化合物は両方の立体配座を含む。
【００２８】
ここで使用する、「アルキニル」という用語は、単独で使用されるか又はもう１つ別の基の一部として使用されるかに関わらず、脂肪族炭化水素鎖を指し、２−８個の炭素原子、例えば２−７個の炭素原子を有し、及び少なくとも１つの三重結合を含む直鎖及び分枝鎖を含むが、これらに限定されない。好ましくは、アルキニル部分は１又は２個の三重結合を有する。例えばエチニル、プロピニル等が「アルキニル」の用語に包含される。
【００２９】
「アシル」という用語は、例えばアルキルがここで定義されるとおりである場合の、アルキルカルボニル基を指す。「ベンジル」という用語は、フェニルメチル基としてのその慣例的な意味を有する。「アロイル」という用語は、カルボニル基、例えばベンゾイル基を通して結合されたアリール部分を指す。
【００３０】
変数Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ａ及びＡ’に関してここで述べるアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、アロイル、アシル及びフェニル基は、場合により１又はそれ以上の置換基、好ましくは３個までの置換基で置換され得る。置換基は独立して選択され、ニトロ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルアルコキシ、アルコキシアルコキシ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオ、Ｓ（Ｏ）s−アリール（式中、ｓ＝０−２）、Ｓ（Ｏ）s−ヘテロアリール（式中、ｓ＝０−２）、又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’［式中、Ｒ’は先に述べたとおりである］を含む。本発明のある実施形態では、好ましい置換基は、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、トリフルオロアルキル、トリフルオロアルコキシ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、ＮＯ2及びフェニルを含み、前記フェニルは、場合により、ここで述べるような独立して選択される３個までのＲ10基で置換されている。
【００３１】
例えば、アルキル又はアルケニル部分が置換されているとき、それらは、典型的には一、二、三又は過置換され得る。ハロゲン置換基の例は、１−ブロモビニル、１−フルオロビニル、１，２−ジフルオロビニル、２，２−ジフルオロビニル、１，２，２−トリフルオロビニル、１，２−ジブロモエタン、１，２−フルオロエタン、１−フルオロ−２−ブロモエタン、ＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3等を含む。
【００３２】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。
【００３３】
例示的なシクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル等を含む。一部の実施形態では、シクロアルキル基は３−１０個の炭素原子を有する。好ましくは、シクロアルキル基は３−７個の炭素原子を有する。ここで使用するとき、シクロアルキル基は、不飽和シクロアルキル基、すなわちシクロアルケニル基をさらに含む。例示的な不飽和シクロアルキル基は、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等を含む。
【００３４】
アリール基は、ヘテロ（すなわち非炭素）環原子を含まない少なくとも１個の芳香環を有する成分である。「アリール」という用語は、例えば６−１５個の炭素原子の、単環式及び多環式芳香環系、例えばフェニル、ナフチル等を含む。アリール基は、芳香環に縮合された完全又は部分的飽和環を有し得る。それ故、例示的なアリール基は、フェニル、ナフチル、ピレニル、５，６，７，８−テトラヒドロナフト−１−イル等を含む。
【００３５】
ヘテロアリールという用語は、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される少なくとも１個の非炭素環原子（例えば１−３個のヘテロ原子）を含み、例えば５−１４個の環原子を有する、芳香環系を意味することが意図されている。例示的なヘテロアリール基は、ピロリル、イミダゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、キノリル、クオキサリニル（quoxalinyl）、キナゾリニル、チオフェニル、フラニル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、ピラニル、チオピラニル、ベンゾフラニル、インドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、インダゾリル、ピリドピロリル等を含む。
【００３６】
一部の実施形態では、Ａ又はＡ’の−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’部分のＲ’基はＣ1−Ｃ6アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ’はＣ1−Ｃ4アルキルである。一部の実施形態では、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’部分はｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）である。
【００３７】
本発明に従って使用するとき、本発明によってカバーされる化合物又は物質を提供することに関して、「与える」という用語は、そのような化合物又は物質を直接投与すること、又は体内で有効量の化合物又は物質を形成するプロドラッグ、誘導体又は類似体を投与することを意味する。
【００３８】
以下で述べるような、標準薬理試験手順で得られた結果に基づき、本発明の化合物は、少なくとも部分的にはエストロゲンの欠損又は過剰によって媒介される、又はエストロゲン様物質の使用を通して治療又は抑制され得る状態、障害又は疾患状態の治療又は抑制において有用なエストロゲン受容体調節剤である。本発明の化合物は、生産される内在性エストロゲンのレベルが大きく低下する閉経周辺期、閉経期又は閉経後患者において特に有用である。閉経期は一般に、最後の自然月経期間と定義され、血流中の循環エストロゲンの実質的な減少を導く、卵巣機能の停止によって特徴付けられる。ここで使用するとき、閉経はまた、外科手術によって、化学的に、又は卵巣機能の早発低下又は停止を導く疾患状態によって引き起こされ得るエストロゲン産生低下の状態を含む。
【００３９】
従って、本発明の化合物は、正味の骨量減少を導く、個体における新しい骨組織の形成とより古い骨組織の吸収の不均衡から生じ得る、骨粗しょう症を治療する又は抑制する上で及び骨無機質脱落の抑制において有用である。そのような骨量減少は、様々な個人において、特に閉経後女性、両側卵巣摘出術を受けた女性、長期にわたるコルチコステロイド療法を受けている又は受けたことがある個人、生殖器発育不全を経験している個人、及びクッシング症候群に罹患している個人において起こる。骨折、骨構造欠陥を有する個人、及び骨関連手術及び／又はプロテーゼの移植を受ける個人において、歯及び口腔骨を含む骨置換の特殊な必要性も、これらの化合物を使用して対応できる。上述した問題に加えて、これらの化合物は、変形性関節症、脊椎関節症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、パジェット病、骨軟化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄腫及び骨組織への有害作用を有する他の形態の癌の治療又は抑制において使用できる。
【００４０】
本発明の化合物はさらに、関節鏡検査又は手術処置に続発する関節損傷を治療する又は抑制する上で有用である。
【００４１】
本発明の化合物はまた、前立腺肥大、子宮平滑筋腫、乳癌、子宮内膜症、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、良性乳房疾患、腺筋症、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌又はＣＮＳ癌、例えば神経膠腫又は神経膠星状芽細胞腫を含む、良性又は悪性異常組織増殖を治療する又は抑制する上で有用である。
【００４２】
本発明の化合物は心臓保護性であり、それらは、コレステロール、トリグリセリド、Ｌｐ（ａ）リポタンパク質及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを低下させる；高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、再狭窄及び血管痙攣を抑制する又は治療する；及び免疫を介した血管損傷へと導く細胞事象から生じる血管壁損傷を抑制する上で有用である。これらの心臓血管保護特性は、骨粗しょう症を抑制するために閉経後患者をエストロゲンで治療するとき及びエストロゲン療法を指示されたときの男性において非常に重要である。
【００４３】
本発明の化合物はまた、抗酸化性であり、それ故遊離基が誘導する疾患状態を治療する又は抑制する上で有用である。抗酸化薬治療が正当であると指示される特定状況は、癌、中枢神経系障害、アルツハイマー病、骨疾患、老化、炎症性疾患、末梢血管疾患、関節リウマチ、自己免疫疾患、呼吸窮迫、気腫、喘息、胸膜炎、ブドウ膜炎、敗血症、出血性ショック、再灌流障害の予防、ウイルス性肝炎、慢性活動性肝炎、結核、乾癬、全身性エリテマトーデス、成人呼吸促進症候群、中枢神経系外傷及び卒中を有する状況である。
【００４４】
本発明の化合物はまた、認知機能増強を提供する上で、及び神経保護又は認知機能増強を与えて、老年痴呆、アルツハイマー病、認知機能低下、神経変性疾患を治療する又は抑制する上で有用である。
【００４５】
本発明の化合物はまた、炎症性腸疾患、潰瘍性直腸炎、クローン病及び大腸炎；閉経関連状態、例えば顔面潮紅、膣又は外陰萎縮、萎縮性膣炎、膣乾燥、そう痒、性交疼痛症、排尿障害、頻尿、尿失禁、尿路感染症、筋痛、関節痛、不眠症、被刺激性等を含む、血管運動症状；男性型禿頭症；皮膚萎縮；？瘡；ＩＩ型糖尿病；機能不全性不正子宮出血；及び不妊症を治療する又は抑制する上で有用である。
【００４６】
本発明の化合物はまた、無月経が好都合である疾患状態、例えば白血病、子宮内膜剥離、慢性腎又は肝疾患、あるいは凝固疾患又は障害において有用である。
【００４７】
本発明の化合物は、特にプロゲスチンと組み合わせたとき、避妊薬として使用することができる。
【００４８】
特定疾患状態又は障害の治療又は抑制のために投与するとき、有効用量は、使用する特定化合物、投与様式、治療する状態及びその重症度、並びに治療する個人に関連する様々な身体的因子に依存して異なり得ることが了解される。本発明の化合物の有効な投与は、約０．１ｍｇ／日から約１，０００ｍｇ／日の経口用量で実施し得る。好ましくは、投与は、単回投与あるいは２又は３回の分割投与で、約１０ｍｇ／日から約６００ｍｇ／日、より好ましくは約５０ｍｇ／日から約６００ｍｇ／日である。提案される１日用量は投与経路によって異なると予想される。
【００４９】
そのような用量は、ここで述べる活性化合物を受容者の血流に導入するのに有用な方法で、例えば経口的に、移植によって、非経口的に（静脈内、腹腔内及び皮下注射を含む）、直腸経路、鼻内経路、膣経路で及び経皮的に、投与し得る。
【００５０】
本発明の活性化合物を含有する経口製剤は、錠剤、カプセル、口腔形態、トローチ、ロゼンジ及び経口液体、懸濁液又は溶液を含む、何らかの慣例的に使用される経口剤型を含み得る。カプセルは、本発明の活性化合物と不活性充填剤及び／又は希釈剤、例えば製薬上許容されるデンプン（例えばトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、糖、人工甘味料、粉末セルロース、例えば結晶及び微結晶セルロース、小麦粉、ゼラチン、ゴム等の混合物を含み得る。有用な錠剤製剤は、従来の圧縮、湿式造粒又は乾式造粒法によって製造でき、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石、ラウリル硫酸ナトリウム、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギン酸、アカシアゴム、キサンタンガム、クエン酸ナトリウム、複合ケイ酸塩、炭酸カルシウム、グリシン、デキストリン、スクロース、ソルビトール、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、滑石、乾燥デンプン及び粉糖を含むがこれらに限定されない、製薬上許容される希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、表面修飾剤（界面活性剤を含む）、懸濁化剤又は安定剤を使用する。好ましい表面修飾剤は、非イオン性及び陰イオン性表面修飾剤を含む。表面修飾剤の代表的な例は、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴル乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム及びトリエタノールアミンを含むが、これらに限定されない。ここで述べる経口製剤は、活性化合物の吸収を変化させるために標準徐放性又は持続放出性製剤を使用し得る。経口製剤はまた、必要に応じて、適切な可溶化剤又は乳化剤を含む、水又は果汁中で有効成分を投与することで構成され得る。
【００５１】
一部の場合は、化合物をエーロゾルの形態で気道に直接投与することが望ましいと考えられる。
【００５２】
本発明の化合物はまた、非経口的に又は腹腔内に投与し得る。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としてのこれらの活性化合物の溶液又は懸濁液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合した水中で製造できる。分散も、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物において製造できる。通常の保存及び使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【００５３】
注射剤としての使用に適する医薬剤型は、無菌注射用溶液又は分散の即時調製のための無菌水溶液又は分散及び無菌粉末を含む。全ての場合に、剤型は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度に流動性でなければならない。製造及び保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用に対して保護されていなければ成らない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物及び植物油を含む溶媒又は分散媒質であり得る。
【００５４】
本開示のために、経皮投与は、上皮及び粘膜組織を含む身体の表面及び身体通路の内層を横切る全ての投与を包含すると理解される。そのような投与は、親化合物、そのＮ−オキシド、そのプロドラッグ、又は製薬上許容されるその塩を使用して、ローション、クリーム、泡、パッチ、懸濁液、溶液及び坐薬（直腸及び膣）中で実施され得る。
【００５５】
経皮投与は、活性化合物、及び活性化合物に対して不活性であり、皮膚に非毒性であり、皮膚を通した血流中への全身的吸収のための作用物質送達を可能にする担体を含有する経皮パッチの使用を通して達成され得る。担体はどのような形態をとってもよく、例えばクリーム及び軟膏、ペースト、ジェル及び閉鎖装置の形態をとり得る。クリーム及び軟膏は、粘性液体あるいは水中油型又は油中水型の半固体乳剤であり得る。有効成分を含有する、石油又は親水性石油に分散した吸収性粉末から成るペーストも適切であり得る。様々な閉鎖装置、例えば担体と共に又は担体なしで有効成分を含有するレザバーを覆う半透膜、又は有効成分を含有するマトリックスは、有効成分を血流中の放出するために使用し得る。他の閉鎖装置は文献において公知である。
【００５６】
坐薬製剤は、坐薬の融点を変化させるためのろうの添加を伴う又は伴わない、ココアバター、及びグリセリンを含む伝統的な材料から製造し得る。水溶性坐薬基剤、例えば様々な分子量のポリエチレングリコールも使用し得る。
【００５７】
本発明の化合物の合成
本発明の化合物は、有機化学の技術分野において公知の方法によって製造することができる。本発明の化合物の製造において使用する試薬は、市販のものを入手し得るか又は文献に述べられている標準手順によって製造できる。
【００５８】
本発明の代表的な例の合成を以下のスキーム１−４で述べる。スキーム１−４において言及する合成方法Ａ−Ｍは、以下の実施例の中で説明する。
【化８】
2008512458.tif 000005
2008512458.tif 000006
2008512458.tif 000007
【００５９】
実施例
本発明の代表的化合物の合成：一般的方法
Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｕｒｅ  Ｓｅａｌ（商標）は、さらなる精製を行わずに無水で、ここで述べる反応のために使用することができ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し得る。全ての反応を窒素雰囲気下で実施した。クロマトグラフィーは、２３０−４００メッシュのシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  Ｇｒａｄｅ  ６０，Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて実施した。薄層クロマトグラフィーは、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（  ）からのＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ254プレートで実施した。1Ｈ及び19Ｆ  ＮＭＲスペクトルは、ジュウテリウム化溶媒、例えばＣＤＣｌ3、ＤＭＳＯ−ｄ６又はアセトン−ｄ６中、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭ−４００又はＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−３００装置（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で得た。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からの百万分の１（ｐｐｍ）低磁場で表わす。融点はＴｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ装置で測定し、補正しない。赤外（ＩＲ）スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ回折格子又はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ７８４分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）で記録した。質量スペクトルは、Ｋｒａｔｏｓ  ＭＳ  ５０又はＦｉｎｎｉｇａｎ  ８２３０質量分析計で記録した。化合物の命名法は、一般にＢｅｉｌｓｔｅｉｎ  Ａｕｔｏｎｏｍ（商標）プログラムを使用して決定した。
【実施例１】
【００６０】
３−（３−メトキシ−フェノキシ）−プロピオン酸（１）
方法Ａ：水（１００ｍＬ）中の３−ブロモプロピオン酸（１４．７０ｇ、１１８ｍｍｏｌ）の混合物にＮａＨＣＯ3（８．４０ｇ、１００ｍｍｏｌ）を緩やかに添加し、生じた混合物を５分間攪拌した。この溶液に、ＮａＯＨ水溶液（４．６７ｇ、１１９ｍｍｏｌ）中の３−メトキシフェノール（１４．７０ｇ、９６ｍｍｏｌ）の７０ｍＬ溶液を添加し、生じた混合物を１００℃で３時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を１Ｎ ＨＣｌで酸性にし、Ｅｔ2Ｏで抽出した。Ｅｔ2Ｏ層をＮａＨＣＯ3水溶液で洗った（３×）。水層を１Ｎ ＨＣｌで再び酸性にし、Ｅｔ2Ｏで抽出した。Ｅｔ2Ｏ層を水、ブラインで洗い、乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、濃縮して粗褐色固体を得、それを再結晶化して（Ｅｔ2Ｏ／−２０℃）、純粋な生成物を黄色固体として得た。収量：１７０．０ｇ（２３％）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ２．８５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），４．２４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），６．５０（ｍ，３Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），１１．４５（ｂｒ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１９５（［Ｍ−Ｈ］-）；Ｃ10Ｈ12Ｏ4について算定した分析値：Ｃ：６１．２２，Ｈ：６．１６。実験値：Ｃ：６１．２４，Ｈ：６．１２。
【実施例２】
【００６１】
７−メトキシ−クロマン−４−オン（２）
方法Ｂ：０℃の３−（３−メトキシ−フェノキシ）−プロピオン酸（１）（７．００ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）を含む反応容器にトリフルオロメタンスルホン酸（１５ｍＬ）を緩やかに添加した。反応混合物を、自然に室温まで温めながら３時間攪拌した。０℃に冷却した後、反応混合物を破砕氷でクエンチングし、その後Ｅｔ2Ｏで抽出した（２×３００ｍＬ）。有機層を水（２×）、ＮａＨＣＯ3水溶液、水、ブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、濃縮して粗油を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物を黄色固体として得た。収量：４．２６ｇ（６７％）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ２．７６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），４．５２（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１７９（［Ｍ＋Ｈ］+）。
【実施例３】
【００６２】
３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン−７−オール（３）
方法Ｃ：Ｐｈ2Ｏ（１０ｍＬ）中の２−アミノ−５−メトキシ安息香酸（１．８３９ｇ、１１．００ｍｍｏｌ）と７−メトキシ−クロマン−４−オン（２）（１．９６０ｇ、１１．００ｍｍｏｌ）の混合物を１７０℃で１時間及び２００℃で７時間加熱した。室温に冷却した後、ヘキサンを添加した。形成された黄色沈殿物をろ過によって収集し、ヘキサンとＥｔ2Ｏで連続的に洗って、真空中で乾燥した。収量：２．１７１ｇ（６４％）。融点２９８℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．８２（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），５．１７（ｓ，２Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），１１．５６（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３０８（［Ｍ−Ｈ］-），３１０（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ18Ｈ15ＮＯ4について算定した計算値３１０．１０７４（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３１０．１０６８。
【実施例４】
【００６３】
７−クロロ−３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（４）
方法Ｃ：３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン−７−オール（３）（１２４ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）とＰＯＣｌ3（１ｍＬ）の混合物を還流で１時間加熱した。冷却後、過剰のＰＯＣｌ3を減圧下で除去した。水、次にＫ2ＣＯ3水溶液を固体残留物に緩やかに添加し、その反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、濃縮して粗固体を得、それをシリカゲルの短いパッドに通して、再結晶化し（高温ヘプタン／−２０℃）、純粋な生成物を黄色粉末として得た。収量：１２４ｍｇ（９５％）；融点１９０−１９１℃；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．８５（ｓ，３Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），５．５０（ｓ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３２８／３３０（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ18Ｈ14ＣＩＮＯ3について算定した計算値３２８．０７３５（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３２８．０７２８；Ｃ18Ｈ14ＣＩＮＯ3について算定した分析値：Ｃ：６５．９６，Ｈ：４．３１，Ｎ：４．２７．実験値：Ｃ：６５．７１，Ｈ：４．１７，Ｎ：３．９２。
【実施例５】
【００６４】
７−ブロモ−３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（５）
方法Ｅ：ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン−７−オール（３）（１．０２５ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）とＰＯＢｒ3（１．４３０ｇ、５．００ｍｍｏｌ、１．５当量）を７０℃で３０分間加熱した。室温に冷却した後、水、次にＫ2ＣＯ3水溶液を緩やかに添加し、その反応混合物を温かいＣＨＣｌ3で抽出した（２×）。有機層を水（２×）及びブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、シリカゲルの短いパッドを通してろ過し、濃縮して、粗黄色固体を得、それを再結晶化して（高温ＥｔＯＡｃ／−２０℃）、純粋な生成物を黄色針状物質として得た。収量：１．１２７ｇ（９１％）；融点１９６−１９７℃；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．８５（ｓ，３Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），５．４８（ｓ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３７２／３７４（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ18Ｈ14ＢｒＮＯ3について算定した計算値３７２．０２３０（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３７２．０２２８；Ｃ18Ｈ14ＢｒＮＯ3について算定した分析値：Ｃ：５８．０８，Ｈ：３．７９，Ｎ：３．７６．実験値：Ｃ：５７．９４，Ｈ：３．６８，Ｎ：３．７３。
【実施例６】
【００６５】
７−クロロ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（６）
方法Ｆ：１，２−ジクロロエタン（３ｍＬ）中の７−クロロ−３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（４）（６８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2中のＢＢｒ3（１．０Ｍ、１ｍＬ、１ｍｍｏｌ）の溶液を緩やかに添加した。反応混合物を室温で３０分間攪拌し、次に４０℃で２時間攪拌した。氷浴で冷却した後、反応を停止するために強く攪拌しながらＮａＨＣＯ3水溶液を非常に緩やかに添加し、生じた反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、シリカゲルの短いパッドを通してろ過し、濃縮して、黄色固体を得、それを再結晶化した（ＴＨＦ／ヘキサン）。収量：５６ｍｇ（９０％）；融点２３５℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．４７（ｓ，２Ｈ），６．４０（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），１０．１０（ｓ，１Ｈ），１０．３５（ｓ，１Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ16Ｈ10ＣＩＮＯ3について算定した計算値３００．０４２２（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３００．０４１１。
【実施例７】
【００６６】
７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）
方法Ｇ：１，２−ジクロロエタン（２０ｍＬ）中の７−ブロモ−３，９−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（５）（８８１ｍｇ、２．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｌＣｌ3（３．１６ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）及びＥｔＳＨ（２．７ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）を緩やかに添加し、反応混合物を室温で３時間攪拌した。氷浴で冷却した後、反応を停止するために強く攪拌しながらＮａＨＣＯ3水溶液を非常に緩やかに添加し、生じた反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。形成された沈殿物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）でろ過した。有機層をブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、濃縮して、粗黄色固体を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物を橙色固体として得た。収量：４７８ｍｇ（５９％）；融点２４０℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．４４（ｓ，２Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），１０．０９（ｓ，１Ｈ），１０．３５（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３４２／３４４（［Ｍ−Ｈ］-），３４４／３４６（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ16Ｈ10ＢｒＮＯ3について算定した計算値３４３．９９１７（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３４３．９９１１。
【実施例８】
【００６７】
３，９−ジヒドロキシ−７−ビニル−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（８）
方法Ｈ：トルエン（１．５ｍＬ）中の７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）（３４．５ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）、トリブチル（ビニル）スズ（３８ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＰｄ（ＰＰｈ3）4（１１．６ｍｇ、０．０１００ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）の混合物を、全ての出発物質が消費されるまで（１−２時間）窒素下で還流した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）でろ過し、シリカゲルの短いパッドを通すことによって精製して、純粋な生成物を橙色粉末として得た。収量：２４ｍｇ（８３％）；融点１６０℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．３６（ｓ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１７．９，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝１７．７，１１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），９．９４（ｓ，１Ｈ），９．９５（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２９０（［Ｍ−Ｈ］-），２９２（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ18Ｈ13ＮＯ3について計算値２９２．０９６８（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値２９２．０９６２。
【実施例９】
【００６８】
３，９−ジヒドロキシ−７−［（トリメチルシリル）エチニル］−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（９）
方法Ｉ：トルエン（２ｍＬ）中の７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）（５１．６ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、（トリメチルシリルエチニル）トリブチルスズ（７０ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＰｄ（ＰＰｈ3）4（１７ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）の混合物を、全ての出発物質が消費されるまで（１−２時間）窒素下で還流した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）でろ過し、シリカゲルの短いパッドを通すことによって精製して、純粋な生成物を赤色固体として得た。収量：５４ｍｇ（９９．６％）；融点１６０℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）δ０．４３（ｓ，９Ｈ），５．５３（ｓ，２Ｈ），６．５２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），８．９４（ｓ，１Ｈ），９．１６（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３６０（［Ｍ−Ｈ］-），３６２（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ21Ｈ19ＮＯ3Ｓｉについて算定した計算値３６２．１２０７（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３６２．１２０７。
【実施例１０】
【００６９】
３，９−ジヒドロキシ−７−エチニル−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１０）
方法Ｊ：ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の３，９−ジヒドロキシ−７−［（トリメチルシリル）エチニル］−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（９）（５４ｍｇ、０１５ｍｍｏｌ）にＫ2ＣＯ3（１０４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。反応混合物をＮＨ4Ｃｌ水溶液（５ｍＬ）でクエンチングした。メタノール（ＭｅＯＨ）を減圧下で除去し、反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水及びブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、濃縮して粗黄色固体を得、それをシリカゲルの短いパッドに通すことによって精製し、純粋な生成物を赤紫色粉末として得た。収量：２７ｍｇ（６３％）；融点２２０℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．２７（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），１０．０４（ｓ，１Ｈ），１０．２３（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２８８（［Ｍ−Ｈ］-），２９０（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ18Ｈ11ＮＯ3について算定した計算値２９０．０８１２（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値２９０．０８０８。
【実施例１１】
【００７０】
３，９−ジヒドロキシ−７−エチル−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１１）
方法Ｋ：ＥｔＯＡｃ／ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中の３，９−ジヒドロキシ−７−エチニル−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１０）（１３ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）とＰｄ／Ｃ（１０重量％）の混合物を水素雰囲気（１気圧、バルーン）下で３０分間攪拌した。反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）でろ過し、濃縮して黄色固体を得、それを再結晶化した（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／−２０℃）。収量：１３ｍｇ（９８％）；融点１４５℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．１８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），２．９５（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），５．４１（ｓ，２Ｈ），６．３８（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），９．９０（ｓ，１Ｈ），９．９３（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２９２（［Ｍ−Ｈ］-），２９４（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ18Ｈ15ＮＯ3について算定した計算値２９４．１１２５（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値２９４．１１２３。
【実施例１２】
【００７１】
７−シアノ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１２）
方法Ｌ：無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）（４７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とＣｕＣＮ（３７０ｍｇ、４．１３ｍｍｏｌ）の混合物を、全ての出発物質が消費されるまで（５時間）封管において２００℃で加熱した。室温に冷却した後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）に通してろ過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。ろ液に水を添加し、反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水（２×）及びブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、濃縮して粗固体を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して純粋な生成物を褐色粉末として得た。収量：９ｍｇ（２３％）；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．５２（ｓ，２Ｈ），６．４４（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），１０．１９（ｓ，１Ｈ），１０．６３（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２８９（［Ｍ−Ｈ］-），２９１（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ17Ｈ10Ｎ2Ｏ3について算定した計算値２９１．０７６４（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値２９１．０７５８。
【実施例１３】
【００７２】
７−（４−クロロフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１３）
方法Ｍ：ＤＭＥ（３ｍＬ）中の７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）（４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＰＰｈ3）4（７ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）の混合物を室温で１０分間攪拌した。この混合物に４−クロロフェニルボロン酸（２２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＮａ2ＣＯ3水溶液（２Ｍ溶液、５当量）を連続的に添加し、反応混合物を、全ての出発物質が消費されるまで（２−３時間）還流した。冷却後、ＮＨ4Ｃｌを添加し、反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水及びブラインで洗い、その後乾燥して（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、濃縮して粗固体を得、それを、シリカゲルの短いパッドを通過させることによって精製して、純粋な生成物を赤色粉末として得た。収量：４１ｍｇ（９４％）；融点２１５−２１８℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．０１（ｓ，２Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），９．８２（ｓ，１Ｈ），９．９８（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３７４／３７６（［Ｍ−Ｈ］-），３７６／３７８（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ22Ｈ14ＣＩＮＯ3について算定した計算値３７６．０７３５（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３７６．０７２８。
【実施例１４】
【００７３】
７−（４−シアノフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１４）
この化合物は、７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）から、方法Ｍに従って４−シアノフェニルボロン酸を使用して製造した。象牙色粉末；収率：９６％；融点２９５℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ４．９９（ｓ，２Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），９．８６（ｓ，１Ｈ），９．９９（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３６５（［Ｍ−Ｈ］-），３６７（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ23Ｈ14Ｎ2Ｏ3について算定した計算値３６７．１０７７（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３６７．１０７４。
【実施例１５】
【００７４】
３，９−ジヒドロキシ−７−（４−メトキシフェニル）−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１５）
この化合物は、７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）から、方法Ｍに従って４−メトキシフェニルボロン酸を使用して製造した。黄色粉末；収率：８４％；融点１９５℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．８７（ｓ，３Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），９．８０（ｓ，１Ｈ），９．９８（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３７０（［Ｍ−Ｈ］-），３７２（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ23Ｈ17ＮＯ4について算定した計算値３７２．１２３０（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３７２．１２２６。
【実施例１６】
【００７５】
３，９−ジヒドロキシ−７−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１６）
この化合物は、７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）から、方法Ｍに従って４−トリフルオロメチルフェニルボロン酸を使用して製造した。黄色粉末；収率：９５％；融点１７５−１７７℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．００（ｓ，２Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），９．８４（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ）；19Ｆ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−６１．４３（ｓ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４０８（［Ｍ−Ｈ］-），４１０（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ23Ｈ14Ｆ3ＮＯ3について算定した計算値４１０．０９９９（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値４１０．０９９２。
【実施例１７】
【００７６】
７−（３−クロロフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１７）
この化合物は、７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）から、方法Ｍに従って３−クロロフェニルボロン酸を使用して製造した。橙色粉末；収率：９４％；融点１６２−１６５℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ５．０１（ｓ，２Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄｄ，Ｊ＝３．９，１．６，Ｈｚ，２Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），９．８６（ｓ，１Ｈ），９．９８（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３７４／３７６（［Ｍ−Ｈ］-），３７６／３７８（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ22Ｈ14ＣＩＮＯ3について算定した計算値３７６．０７３５（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３７６．０７２１。
【実施例１８】
【００７７】
３，９−ジヒドロキシ−７−（３−メトキシフェニル）−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１８）
この化合物は、７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）から、方法Ｍに従って３−メトキシフェニルボロン酸を使用して製造した。黄色粉末；収率：８７％；融点１５５−１５８℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．８２（ｓ，３Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０４（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），６．３５（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．２，７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），９．８０（ｓ，１Ｈ），９．９６（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３７０（［Ｍ−Ｈ］-），３７２（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ23Ｈ17ＮＯ4について算定した計算値３７２．１２３０（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３７２．１２２３。
【実施例１９】
【００７８】
７−（３−シアノフェニル）−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（１９）
この化合物は、７−ブロモ−３，９−ジヒドロキシ−６Ｈ−クロメノ［４，３−ｂ］キノリン（７）から、方法Ｍに従って３−シアノフェニルボロン酸を使用して製造した。黄色粉末；収率：７４％；融点２７５℃（分解）；1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ４．９８（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄｔ，Ｊ＝７．８，１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄｔ，Ｊ＝７．７，１．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），９．８７（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３６５（［Ｍ−Ｈ］-），３６７（［Ｍ＋Ｈ］+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）Ｃ23Ｈ14Ｎ2Ｏ3について算定した計算値３６７．１０６６（［Ｍ＋Ｈ］+）、実験値３６７．１０８３。
【００７９】
薬理試験手順
エストロゲン様活性の実証
本発明の代表的な例を、ＥＲα及びＥＲβの両方に関して１７β−エストラジオールと競合するそれらの能力に関して評価した。使用した試験手順は、特定化合物がエストロゲン受容体と結合するかどうか（及び、それ故、「エストロゲン様」であるかどうか）及びＥＲα及びＥＲβに対して選択性があるかどうかを判定することを可能にする。代表的化合物例の結果を、ＩＣ50として報告され得られた数値と共に、以下の表１に示す。ＩＣ50は、総１７β−エストラジオール結合を５０％低下させる化合物の濃度と定義される。使用した手順を簡単に述べる。ヒトＥＲα及びＥＲβのエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（Ｄ、Ｅ及びＦ）を発現する大腸菌の粗溶解産物を作製した。受容体と化合物の両方を、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加した１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）に希釈した。高結合マスクマイクロタイタープレートを使用して、受容体１００μＬ（１μＧ／ウエル）を２ｎＭ［3Ｈ］−１７β−エストラジオール及び様々な濃度の化合物と組み合わせた。室温で５−１５時間後、プレートをＤＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで洗い、液体シンチレーション計数によって結合放射能を測定した。
【表１】
2008512458.tif 000008
【００８０】
薬理試験手順において得られた結果は、本発明の化合物がエストロゲン様化合物であり、その多くがＥＲβ受容体に対して強い選択的親和性を有することを明らかにする。本発明の化合物は、ＥＲαに比べてＥＲβ受容体に高い選択的親和性を有するものから、両方の受容体に対してほぼ等しい親和性を有するものまでに及ぶ。それ故、本発明の化合物は、少なくとも一部では、それらの受容体親和性の選択性プロフィールに基づく様々な活性範囲にわたる。加えて、各々の新規受容体リガンド複合体はユニークであり、それ故様々な共調節タンパク質との相互作用も独特であるので、本発明の化合物は、それらが存在する細胞環境に依存して異なる調節行動を示す。例えば、一部の細胞型では、化合物はエストロゲンアゴニストとして振る舞うが、他の組織ではアンタゴニストとして行動することが可能である。そのような活性を有する化合物は、時としてＳＥＲＭ（選択的エストロゲン受容体調節剤）と称されてきた。多くのエストロゲンと異なり、しかしながら、ＳＥＲＭの多くは子宮湿重量の上昇を生じさせない。これらの化合物は子宮では抗エストロゲン性であり、子宮組織におけるエストロゲンアゴニストの栄養作用に完全に拮抗し得る。しかしながら、これらの化合物は、骨、心臓血管及び中枢神経系ではエストロゲンアゴニストとして働く。これらの化合物のこの組織選択的性質の故に、それらは、哺乳動物、例えばヒト、例えば女性において、エストロゲン欠損（例えば骨又は心臓血管などのある種の組織における）又はエストロゲンの過剰（例えば子宮又は乳腺における）によって引き起こされる又はそれに関連する疾患状態又は症候群を治療する又は予防する上で有用である。
【００８１】
そのような細胞特異的調節を越えて、本発明の化合物はまた、ある受容体型に対してはアゴニストとして行動するが、別の受容体型にはアンタゴニストとして行動する潜在的可能性を有する。例えば化合物が、ＥＲαに対してはアゴニストであるが、ＥＲβに対してはアンタゴニストであり得ることが明らかにされた（Meyers, Marvin J. et al., J. Med. Chem. 42(13): 2456-2468 (1999)参照）。そのようなＥＲＳＡＡ（エストロゲン受容体選択的アゴニストアンタゴニスト）作用は、このシリーズの化合物の中で薬理学的に異なるエストロゲン活性を提供する。
【００８２】
本発明の代表的化合物の活性プロフィールを測定するために他の薬理試験手順も容易に使用可能である。以下は、いくつかの代表的試験手順を簡単に要約する。ＳＥＲＭについての薬理試験手順はまた、各々その全体が参照してここに組み込まれる、米国特許第４，４１８，０６８号及び同第５，９９８，４０２号においても記述されている。
【００８３】
ラット子宮肥大／抗子宮肥大試験手順
化合物のエストロゲン様及び抗エストロゲン特性は、未成熟ラットの子宮肥大試験（４日間）において測定することができる（L.J. Black and R. L. Goode, Life Sciences 26: 1453 (1980)参照）。未成熟Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雌性、１８日齢）を６匹ずつの群において試験した。注射用賦形剤としての５０％ＤＭＳＯ／５０％食塩水と共に、１０μｇ化合物、１００μｇ化合物、１００μｇ化合物＋１μｇ  １７β−エストラジオール（抗エストロゲン性を調べるため）、及び１μｇ  １７β−エストラジオールによる連日腹腔内注射によって動物を処置した。４日目に、動物をＣＯ2窒息によって犠牲死させ、子宮を切除して過剰の脂質を取り除き、液体を除去して、湿重量を測定する。１つの子宮角の小さな切片を組織学的検査に供し、残りは補体成分３の遺伝子発現を評価するために全ＲＮＡを単離するのに使用した。
【００８４】
６週間の卵巣摘出ラット試験手順−骨及び心臓保護
卵巣摘出又は擬似卵巣摘出術を実施した雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ＣＤラットを、手術の１日後にＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ＮＹ）より入手する（２４０−２７５ｇ）。動物を１２／１２（明／暗）スケジュールの部屋に３又は４匹のラット／ケージで収容し、食餌（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ（登録商標）５Ｋ９６Ｃラット飼料）と水は自由に摂取させる。全ての試験に関して、処置は動物の到着の１日後に開始し、毎週７日間６週間にわたって投与する。年齢が適合する、いかなる処置も受けない擬似手術ラットの群を、各々の試験についての無傷エストロゲン充実（replete）対照群として使用する。
【００８５】
全ての処置は、処置容量が０．１ｍＬ／１００ｇ体重になるように、定義された濃度の通常生理食塩水中１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０で調製する。１７β−エストラジオールをトウモロコシ油（２０μｇ／ｍＬ）に溶解し、０．１ｍＬ／ラットで皮下送達する。全ての用量は、群平均体重測定に従って３週間の間隔で調整する。
【００８６】
処置の開始から５週間後及び試験終了の１週間前に、各々のラットを骨塩密度（ＢＭＤ）に関して評価する。近位脛骨の全及び小柱密度を、ＸＣＴ−９６０Ｍ（ｐＱＣＴ（  ）；Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ，Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して麻酔ラットにおいて評価する。測定は以下のように実施する：走査の１５分前に、各々のラットを４５ｍｇ／ｋｇケタミン、８．５ｍｇ／ｋｇキシラジン及び１．５ｍｇ／ｋｇアセプロマジンの腹腔内注射で麻酔する。
【００８７】
右後脚を直径２５ｍｍのポリカーボネートチューブに通し、９０°の角度の足根関節及び１８０°の膝関節と共にアクリルフレームにテープで貼る。ポリカーボネートチューブを、ｐＱＣＴの開口部に対してそれを垂直に維持する、スライドプラットフォームに貼付する。大腿骨の遠位端及び脛骨の近位端が走査野にはいるようにプラットフォームを調整する。二次元調査観測を長さ１０ｍｍにわたって０．２ｍｍの直線分解能で実施する。調査観測がモニターに表示された後、脛骨の近位端を位置づける。この点から３．４ｍｍの距離でｐＱＣＴスキャンを開始する。ｐＱＣＴスキャンは１ｍｍの厚さで、０．１４０ｍｍのボクセル（三次元でのピクセル）サイズを有し、切片を通る１４５投影（projection through the slice）から成る。
【００８８】
ｐＱＣＴスキャンが完了した後、画像をモニターに表示する。脛骨を含むが腓骨を除外した対象領域が鳥瞰される。軟組織は反復アルゴリズムを用いて自動的に除去される。残りの骨の密度（全密度）をｍｇ／ｃｍ3で報告する。骨の外側５５％を同心円らせん状にはぐ。残りの骨の密度（小柱密度）をｍｇ／ｃｍ3で報告する。ＢＭＤ評価の１週間後に、ラットを二酸化炭素窒息によって安楽死させ、コレステロール測定のために血液を採集する。子宮を切除し、重量を計測する。Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＨＰキットを使用してＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１１臨床分析器で全コレステロールを測定する。統計は、ダネット検定による一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。
【００８９】
ＭＣＦ−７／ＥＲＥ抗増殖試験手順
試験化合物（通常０．１Ｍ）の保存溶液をＤＭＳＯ中で調製し、その後ＤＭＳＯで１０−１００倍希釈して、１又は１０ｍＭの作業溶液を作製する。ＤＭＳＯ保存溶液を４℃（０．１Ｍ）又は−２０℃（＜０．１Ｍ）のいずれかで保存する。ＭＣＦ−７細胞を週に２回増殖培地［１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン及び２ｍＭ  ｇｌｕｔａＭａｘ−１を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地］で継代する。細胞を、５％ＣＯ2／９５％加湿空気インキュベータの内部で３７℃の通気フラスコに保持する。処置の１日前に、細胞を９６穴プレートに２５，０００／穴で増殖培地にプレートし、３７℃で一晩インキュベートする。
【００９０】
細胞を、実験培地［１０％（ｖ／ｖ）熱不活化チャコール処理ウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭ  ｇｌｕｔａＭａｘ−１、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地］中の１：１０希釈のアデノウイルス５−ＥＲＥ−ｔｋ−ルシフェラーゼ５０μｌ／穴に３７℃で２時間感染させる。次にウエルを実験培地１５０μｌで１回洗う。最後に、細胞を、１５０μｌ／穴の賦形剤（≦０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯ）又は実験培地に≧１０００倍希釈した化合物により、８穴／処理の同型培養で、３７℃で２４時間処理する。
【００９１】
単独で（アゴニストモード）又は０．１ｎＭ １７β−エストラジオール（ＥＣ80；アンタゴニストモード）と組み合わせて試験する、試験化合物の初期スクリーニングを、１μＭの単回用量で実施する。各々の９６穴プレートはまた、賦形剤対照群（０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯ）及びアゴニスト対照群（０．１又は１ｎＭ １７β−エストラジオール）を含む。用量反応実験を、１０-14から１０-5Ｍまでの対数上昇の活性化合物に関してアゴニスト及び／又はアンタゴニストモードで実施する。これらの用量反応曲線から、ＥＣ50及びＩＣ50値をそれぞれ作製する。各々の処置群の最後のウエルは、ＥＲアンタゴニスト対照として３×１０-5Ｍ ＩＣＩ−１８２，７８０（１０-6Ｍ最終濃度）５μｌを含む。
【００９２】
処置後、２５μｌ／穴の１×細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に振とう機で１５分間細胞を溶解する。細胞溶解産物（２０μｌ）を９６穴ルミノメータープレートに移し、１００μｌ／穴のルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９６  Ｐルミノメーター（ＥＧ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でルシフェラーゼ活性を測定する。基質を注入する前に、各々のウエルについて１秒間のバックグラウンド測定を行う。基質の注入後、１秒間の遅延時間後、ルシフェラーゼ活性を１０秒間測定する。データをルミノメーターからＭａｃｉｎｔｏｓｈパソコンに移し、ＪＭＰソフトウエア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて解析する；このプログラムは、各ウエルについてのルシフェラーゼ測定からバックグラウンド読取り値を差し引き、各々の処置に関する平均値と標準偏差を決定する。
【００９３】
ルシフェラーゼデータを対数によって変換し、フーバーのＭ推定量を使用して範囲外の変換所見値の加重を低下させる（down-weight）。ＪＭＰソフトウエアを使用して、変換した加重データを一方向ＡＮＯＶＡ（ダネット検定）に関して解析する。化合物の処置を、アゴニストモードでの賦形剤対照結果又はアンタゴニストモードでの陽性アゴニスト対照結果（０．１ｎＭ １７β−エストラジオール）と比較する。初期単回投与実験に関しては、化合物処置が適切な対照と有意に異なる（ｐ＜０．０５）場合は、結果を１７β−エストラジオール対照に対するパーセントとして報告する［すなわち（（化合物−賦形剤対照）／（１７β−エストラジオール対照−賦形剤対照）×１００）。ＪＭＰソフトウエアはまた、非線形用量反応曲線からＥＣ50及び／又はＩＣ50値を決定するためにも使用する。
【００９４】
ＬＤＬ酸化の阻害−抗酸化作用
ブタ大動脈を食肉処理場から入手し、洗浄して、深冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で運搬し、大動脈内皮細胞を採集する。細胞を採集するために、大動脈の肋間脈管を結紮し、大動脈の一方の端をクランプで締める。新鮮な無菌ろ過した０．２％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｉ型）を脈管に入れ、脈管の他方の端をクランプで挟んで閉じた系を形成する。大動脈を３７℃で１５−２０分間インキュベートし、その後コラゲナーゼ溶液を収集して、２０００×ｇで５分間遠心分離する。各々のペレットを、チャコール処理ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；５％）、ＮｕＳｅｒｕｍ（登録商標）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０００Ｕ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）及びゲンタマイシン（７５μｇ／ｍｌ）を添加したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／ハム(Ham's)のＦ１２培地から成る内皮細胞培養培地７ｍＬに懸濁し、１００ｍｍペトリ皿に接種して、５％ＣＯ2中３７℃でインキュベートする。２０分後、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮培地を添加して、２４時間目にもう一度新鮮培地を添加する。約１週間後に細胞は集密になる。内皮細胞に、２週間に１回定期的に給餌し、集密になったとき、トリプシン処理して、１：７比で接種する。１２．５μｇ／ｍＬ ＬＤＬの細胞を介した酸化を、評価する化合物（５μＭ）の存在下に３７℃で４時間進行させる。結果は、遊離アルデヒドの分析のためのＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）法(Yagi K., Biochem Med 15:212-216 (1976))によって測定した酸化工程の阻害パーセントとして表わす。
【００９５】
Ｄ１２視床下部細胞試験手順
Ｄ１２ラット視床下部細胞をＲＣＦ１７親細胞系からサブクローニングし、凍結保存する。それらをＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）、ｇｌｕｔａＭＡＸ−１（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、プラス１０％ＦＢＳ中で常套的に増殖させる。細胞を、２−１０％チャコール処理ＦＢＳを含むフェノールレッド不含培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２、ｇｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン−ストレプトマイシン）に集密以下の密度で（１−４×１０6細胞／１５０ｍｍ皿）プレートする。２４時間後に、２％チャコール処理血清を含む培地を細胞に供給する。アゴニスト活性を試験するために、細胞を１０ｎＭ １７β−エストラジオール又は様々な用量の試験化合物（１ｍＭ又は１ｐＭ−１ｍＭの範囲）で処理する。アンタゴニスト活性に関して試験するために、様々な用量（１００ｐＭ−１ｍＭ）の試験化合物の不在下又は存在下で、細胞を０．１ｎＭ １７β−エストラジオールで処理する。対照皿も、陰性対照としてＤＭＳＯで処理する。ホルモン添加の４８時間後に、細胞を溶解し、結合試験手順を実施する。
【００９６】
各々の結合試験手順のために、タンパク質１００−１５０ｍｇを１５０ｍＬ容量中の１０ｎＭ 3Ｈ−Ｒ５０２０＋１００倍過剰のＲ５０２０と共にインキュベートする。３セットの反応物（Ｒ５０２０を含むものを３、Ｒ５０２０を含まないもの３）を９６穴プレートにおいて調製する。タンパク質抽出物を最初に添加し、次に3Ｈ−Ｒ５０２０又は3Ｈ−Ｒ５０２０＋１００×非標識Ｒ５０２０を添加する。反応を室温で１−２時間実施する。ＴＥ、ｐＨ７．４中の低温５％チャコール（Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ−４）、０．５％デキストラン６９Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１００ｍＬの添加によって反応を停止させる。室温で５分後、結合リガンドと非結合リガンドを遠心分離（５分間、１０００ＲＣＦ、４℃）によって分離する。上清溶液（〜１５０ｍｌ）を取り、シンチレーションバイアルに移す。シンチレーション液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ＋）の添加後、試料をシンチレーションカウンターで１分間計数する。
【００９７】
ＣＮＳ視索前野におけるプロゲステロン受容体
６０日齢の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに卵巣摘出術を実施する。動物を、１２時間明、１２時間暗の照明時間で動物飼育施設に収容し、水道水とげっ歯動物試料を自由に摂取させる。
【００９８】
卵巣摘出した動物を、賦形剤（５０％ＤＭＳＯ、４０％ＰＢＳ、１０％エタノール賦形剤）、１７β−エストラジオール（２００ｎｇ／ｋｇ）又は試験化合物を注射する群に無作為に分ける。この化合物のアンタゴニスト特性を評価するため、付加的な動物に、１７β−エストラジオールの注射の１時間前に試験化合物を注射する。皮下注射の６時間後に、動物を致死量のＣＯ2で安楽死させ、それらの脳を収集して、凍結する。
【００９９】
動物から収集した組織を−１６℃の低温保持装置上で切断し、シラン被覆した顕微鏡スライドガラスに収集する。次に切片を封入したスライドガラスを、４２℃に保持したスライド加温機で乾燥し、−８０℃の乾燥スライド箱で保存する。処理の前に、スライド上での凝縮形成を排除し、それにより組織及びＲＮＡの分解を最小限に抑えるために、乾燥スライド箱を室温まで緩やかに温める（−２０℃、１２−１６時間；４℃、２時間；室温、１時間）。乾燥スライドガラスを金属ラックに負荷し、４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ９．０）において５分間後固定して、先に述べたように処理する。
【０１００】
ラットＰＲ  ｃＤＮＡ９の８１５ｂｐフラグメント（リガンド結合ドメイン）を含むプラスミドを線状にし、ラットＰＲ  ｍＲＮＡの一部に相補的なＳ  ３５−ＵＴＰ標識プローブを作製するために使用する。処理した切片封入スライドガラスを、リボプローブ（４−６×１０6ＤＰＭ／スライド）及び５０％ホルムアルデヒドを含むハイブリダイゼーション混合物２００ｍＬとハイブリダイズし、５５℃の加湿チェンバーで一晩インキュベートする。午前中に、スライドガラスを金属ラックに置き、それを２×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）／１０ｍＭ  ＤＴＴに液浸する。ラックを全て大きな容器に移し、静かに攪拌しながら室温で１５分間、２×ＳＳＣ／１０ｍＭ  ＤＴＴ中で洗浄する。次にスライドガラスを３７℃で３０分間、ＲＮアーゼ緩衝液中で洗浄し、３７℃で３０分間、ＲＮアーゼＡ（２ｍｇ／ｍｌ）で処理して、室温の１×ＳＳＣ中で１５分間洗浄する。その後、非特異的標識を除去するためにスライドガラスを０．１×ＳＳＣ中６５℃で洗浄し（２×３０分間）、室温の０．１×ＳＳＣ中で１５分間すすいで、段階的な一連のアルコール：酢酸アンモニウム（７０％、９５％及び１００％）で脱水する。空気乾燥したスライドガラスを３日間Ｘ線フィルムに露出し、その後写真処理する。アッセイ間の条件の変動による相違を排除するために、全ての動物からのスライドガラスを一緒にハイブリダイズし、洗浄して、露出し、写真処理する。
【０１０１】
ラットの潮紅−ＣＮＳ作用
卵巣摘出した雌性の６０日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを手術後に入手する。手術は最初の処置の少なくとも８日目に実施する。動物を１２／１２時間の明／暗周期の下で個別に収容し、標準ラット試料と水を自由に摂取させる。
【０１０２】
それぞれの試験に２つの対照群を含める。用量は、ゴマ油中の１０％ＤＭＳＯ（皮下試験）又は食塩水中の１．０％トゥイーン８０（（経口）試験）のいずれかにおいてｍｇ／ｋｇ平均群体重に基づいて調製する。動物に０．０１−１０ｍｇ／ｋｇ平均群体重の範囲の用量で試験化合物を投与する。賦形剤及びエチニルエストラジオール（ＥＥ）（０．１ｍｇ／ｋｇ、皮下又は０．３ｍｇ／ｋｇ、経口）対照群を各々の試験に含める。化合物をそれらのアンタゴニスト活性に関して試験するときは、ＥＥを、皮下又は経口試験に関してそれぞれ０．１又は０．３ｍｇ／ｋｇで同時投与する。試験化合物は、尾の皮膚温度を測定する日まで投与する。
【０１０３】
４日間の順化期間後、動物を対象化合物で１日１回処置する。処置群当り１０匹の動物とする。化合物の投与は、首の項部における０．１ｍｌの皮下注射によって又は０．５ｍｌの容量で経口的に実施する。処置の３日目に、モルヒネペレット（硫酸モルフィン７５ｍｇ）を皮下に移植する。処置の５日目に、１又は２個の追加のモルヒネペレットを移植する。８日目に、動物の約半数にケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）を注射し、ＭａｃＬａｂ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＰＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に接続した熱電対を尾の根元から約１インチの尾上にテープで止める。このシステムは尾の皮膚温度の連続測定を可能にする。基線温度を１５分間測定し、次にモルヒネの作用をブロックするためにナロキソン（１．０ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与して（０．２ｍＬ）、その後１時間、尾の皮膚温度を測定する。９日目に、残りの動物を同様に設定して、分析する。
【０１０４】
単離したラット大動脈輪における血管運動神経機能
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２４０−２６０ｇ）を４つの群に分ける：
１．正常非卵巣摘出（無傷）
２．卵巣摘出（ｏｖｘ）賦形剤処置
３．卵巣摘出１７β−エストラジオール処置（１ｍｇ／ｋｇ／日）
４．試験化合物（すなわち１ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した卵巣摘出動物。
【０１０５】
動物を処置の約３週間前に卵巣摘出する。各々の動物に、１％トゥイーン８０を含む蒸留脱イオン水に懸濁した１７β−エストラジオール硫酸塩又は試験化合物のいずれか１ｍｇ／ｋｇ／日を胃瘻栄養によって投与する。賦形剤処置動物には、薬剤処置群で使用する賦形剤の適切な容量を投与する。
【０１０６】
動物をＣＯ2吸入と瀉血によって安楽死させる。それらの胸大動脈を迅速に切除し、以下の組成物（ｍＭ）を含む３７℃の生理的溶液に入れる：最終ｐＨ７．４となるようにＣＯ2−Ｏ2、９５％／５％を供給したＮａＣｌ（５４．７）、ＫＣｌ（５．０）、ＮａＨＣＯ3（２５．０）、ＭｇＣｌ2−２Ｈ2Ｏ（２．５）、Ｄ−グルコース（１１．８）及びＣａＣｌ2（０．２）。外膜を外側表面から切除し、血管を２−３ｍｍ幅の輪に切断する。輪を、一方の末端を浴の底部に接着し、他方の末端を力変換器に接続して、１０ｍＬ組織浴に懸濁する。輪に１グラムの静止張力をかける。シグナルを獲得し、分析しながら、輪を１時間平衡させる。
【０１０７】
平衡後、輪を漸増濃度のフェニレフリン（１０-8−１０-4Ｍ）に暴露し、張力を記録する。次に浴を新鮮緩衝液で３回洗浄する。洗い流し後、２００ｍＭ  Ｌ−ＮＡＭＥを阻止局に添加し、３０分間平衡させる。その後フェニレフリン濃度反応曲線を反復する。
【０１０８】
８アームの放射状アーム迷路−認知機能増強
到着時に体重２００−２５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ＣＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＹ）を使用する。１週間、ラットをケージ当り６匹ずつ収容し、標準実験動物試料と水を自由に摂取させる。収容施設は、午前６時から照明する１２／１２時間の明／暗周期で２２℃に保持したコロニー室である。施設への順化後、動物を個別に収容し、自由摂取体重の８５％に維持する。ひとたび安定な体重が達成されれば、ラットを８アームの放射状迷路に順化させる。
【０１０９】
迷路の構造は、Peele and Baron [Pharmacology, Biochemistry, and Behavior 29:143-150 (1988))からの応用である。迷路は、７５．５ｃｍの高さまで上昇しており、互いに等距離にある、中心から放射状に広がる８本のアームによって取り囲まれた円形部分から成る。各々のアームは長さ５８ｃｍ×高さ１３ｃｍである。各々のセッションの開始前には、動物を迷路の中心部分に閉じ込めるための透明なプレキシガラス円柱が下りている。迷路の各々のアームは、データ獲得ユニットに接続された３組の光電池を備え、データ獲得ユニットはコンピュータに接続されている。光電池を使用して迷路内でのラットの動きを探知する。各々のアームの先端の試料カップの上に位置するペレット供給装置は、アームの外側の光電池が所与のセッションで最初に作動されたときに２個の４５ｍｇのチョコレートペレットを配給する。迷路は、視覚的合図の役割をする、各々の壁面に黒白の幾何学的ポスターが貼付された試験室に位置する。全ての訓練及び試験手順の間は、白色雑音が聞こえる（〜７０ｄｂ）。
【０１１０】
訓練手順は５段階から成り、各々の段階は５又は１０分間続く毎日のセッションを含む。ラットを迷路の中心部分に入れる時点とセッションを開始するために円柱を挙げるときまでに１０秒間の遅延時間を置く。第Ｉ段階の間は、４５ｍｇチョコレート飼料ペレットを迷路の８本のアーム全体に撒き散らして、食餌制限されたラットの対を１０分間迷路上に置く。第ＩＩ段階では、ペレットを中心の光電池から各々のアームの飼料カップまで撒き散らして、各々のラットを個別に１０分間迷路上に置く。第ＩＩＩ段階の間は、飼料ペレットを各々のアームの飼料カップの中とその周囲にだけ置いて、各々のラットを１０分間迷路上に置く。第ＩＶ段階では、各々のラットを放置して各々のアームから２個のペレットを集めさせる。１本のアームに再び入ることはエラーとみなす。ラットが、３日間連続の訓練で合計２回又はそれ以下のエラーという判定基準成績を達成するまで、毎日このように訓練する。順化と訓練の合計期間は約３週間である。
【０１１１】
試験化合物をリン酸緩衝食塩水中で調製し、１ｍｇ／ｋｇの容量で投与する。臭化水素酸スコポラミン（０．３ｍｇ／ｋｇ皮下）を、エラー率の上昇（記憶障害）を生じさせる損傷剤として使用する。試験化合物は、所与の試験日に最初に迷路に接触する３０分前に、スコポラミンと同時に腹腔内投与する。
【０１１２】
試験化合物を評価するにあたって、最小数の動物で高い実験効率を達成するために、反復測定のための８×８釣り合い型ラテン方格法を設計する。週に２回ずつ、８回の実験セッションを、各々のセッション内で無作為化した８つの処置（賦形剤、スコポラミン、スコポラミンと組み合わせた３つの用量の試験化合物）に関して実施する。各々の処置に続いて他の処置を同じ回数実施する。それ故、それぞれの処置の残留効果を評価することができ、直接処置効果から離れることができる。ＡＮＯＶＡに従って、調整した平均値に関してダネットの両側検定を用いて多重比較を実施する。
【０１１３】
最初の接触時に５分以内に４回正しい選択をしない動物、又は２回目の接触の終了までに合計８回の選択をしなかった動物は、そのセッションに関して「時間切れ（timed-out）」とみなす。試験化合物の２つ以上の用量の投与後に「時間切れ」となった動物は、分析から除外する。
【０１１４】
神経保護
一次皮質ニューロン培養物における時間依存性細胞死の阻害
一次皮質ニューロンを、Monyer et al., Brain Research 483:347- 354 (1989)が述べた方法の変法を用いて０−１日齢のラット脳から作製した。分散させた脳組織をＤＭＥＭ／１０％ＰＤＨＳ（妊娠ドナーウマ血清）中で３日間増殖させ、その後、夾雑グリア細胞を除去するためにシトシンアラビノシド（ＡＲＣ）で２日間処理した。５日目に、ＡＲＣ培地を除去し、ＤＭＥＭ／１０％ＰＤＨＳと交換した。神経細胞を使用前にさらに４−７日間培養した。
【０１１５】
対照一次神経培養物は、培養の１２日目から１８日目までに漸進的な細胞死を示す。９日目にＤＭＥＭ及び１０％ＰＤＨＳ中に保持した６つの培養物に試験化合物を添加し、残りの培養物を対照として保持した後、１２の培養物を１２日目と１６日目に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）酵素のレベルに関して評価した。Wroblewski et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90:210-213 (1955)による方法の変法を用いてＬＤを検定した。ＬＤは、組織生存率を測定するために臨床及び基本研究の両方において一般的に使用されるサイトゾル酵素である。培地ＬＤの上昇は細胞死に直接関連する。
【０１１６】
低血糖によって誘導される細胞傷害に対する神経保護
米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ）から入手したＣ６神経膠腫細胞を、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）２５ｃｍ2組織培養フラスコ中１×１０6細胞／ｍＬの濃度で、ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地にプレートした。低血糖の発症の４時間前に、維持培地を廃棄し、単層を適切な培地中で２回洗い、その後無血清中又は無血清＋試験化合物中、３７℃で４時間インキュベートした。クレブス‐リンガーリン酸緩衝液を使用して単層を２回洗った後、適切なグルコース添加処理を実施した。ＲＰＭＩ培地は２ｍｇグルコース／ｍＬを含む；フラスコを６つの群に分け、各々１００％グルコース（２ｍｇ／ｍｌ）、８０％グルコース（１．６ｍｇ／ｍｌ）、６０％グルコース（１．２ｍｇ／ｍｌ）又は０％グルコース（緩衝液）を添加するか、又は試験化合物を添加した。全てのフラスコを２０時間培養し、その後トリパンブルーを使用して総細胞数、生細胞数及び死細胞数を評価した。
【０１１７】
興奮毒性アミノ酸に対する神経保護
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫を含む５つの培養皿を試験化合物で処理し、５つの培養皿をＲＰＭＩ培地で処理した。４時間後、全ての細胞をＮＭＤＡ（５００μＭ）で５分間処理した。その後、総生細胞及び死細胞を測定した。
【０１１８】
酸素−グルコース欠乏に対する神経保護−アポトーシスを測定するための凝縮核の分析
Ｅ１８ラット胎仔から皮質ニューロンを作製し、ポリ−Ｄ−リシン（１０ｎｇ／ｍｌ）及び血清で前被覆した８穴チェンバースライドに１００，０００細胞／穴の密度でプレートする。１０％ＦＣＳを含む高グルコースＤＭＥＭに細胞をプレートし、３７℃、１０％ＣＯ2／９０％空気のインキュベータ内に保持する。翌日、培地を、Ｂ２７添加物を含む高グルコースＤＭＥＭと交換することによって血清を除去し、実験の当日までさらなる培地交換を行わずに細胞をインキュベータ内に保持する。６日目に、スライドを対照群とＯＧＤ群の２群に分ける。対照群の細胞には、グルコースと特別誂えのＢ２７（抗酸化剤を含まない）を添加したＤＭＥＭを与える。ＯＧＤ群の細胞には、真空下で１５分間脱ガスした、特別誂えＢ２７を添加した無グルコースＤＭＥＭを与える。細胞を気密チェンバーにおいて１０分間９０％Ｎ2／１０％ＣＯ2で洗い、３７℃で６時間インキュベートする。６時間後、対照とＯＧＤ細胞の両方を、特別誂えＢ２７を添加したグルコース含有ＤＭＥＭ中に賦形剤（ＤＭＳＯ）又は試験化合物のいずれかを含む培地との交換に供する。細胞を３７℃の酸素正常状態のインキュベータに戻す。２４時間後、細胞を４℃で４％ＰＦＡ中に１０分間固定し、Ｔｏｐｒｏ（蛍光核結合染料）で染色する。レーザー走査サイトメーターを用いて凝縮核を測定することによってアポトーシスを評価する。
【０１１９】
細胞死の指標としてのＬＤＨ放出の測定
Ｅ１８ラット胎仔から皮質ニューロンを作製し、ポリ−Ｄ−リシン（１０ｎｇ／ｍｌ）及び血清で前被覆した４８穴培養プレートに１５０，０００細胞／穴の密度でプレートする。１０％ＦＣＳを含む高グルコースＤＭＥＭに細胞をプレートし、３７℃、１０％ＣＯ2／９０％空気のインキュベータ内に保持する。翌日、培地を、Ｂ２７添加物を含む高グルコースＤＭＥＭと交換することによって血清を除去する。６日目に、細胞を対照群とＯＧＤ群の２群に分ける。対照群の細胞には、グルコースと特別誂えのＢ２７（抗酸化剤を含まない）を添加したＤＭＥＭを与える。ＯＧＤ群の細胞には、真空下で１５分間脱ガスした、特別誂えＢ２７を添加した無グルコースＤＭＥＭを与える。細胞を気密チェンバーにおいて１０分間９０％Ｎ2／１０％ＣＯ2で洗い、３７℃で６時間インキュベートする。６時間後、対照とＯＧＤ細胞の両方を、特別誂えＢ２７を添加したグルコース含有ＤＭＥＭ中に賦形剤（ＤＭＳＯ）又は試験化合物のいずれかを含む培地との交換に供する。細胞を３７℃の酸素正常状態のインキュベータに戻す。２４時間後、培地へのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の細胞放出を測定することによって細胞死を評価する。ＬＤＨアッセイのために、培地５０μｌのアリコートを９６穴プレートに移す。０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１４０μｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ ＮＡＤＨ  １００μｌの添加後、プレートを室温で２０分間暗所に放置する。ピルビン酸ナトリウム１０μｌを添加して反応を開始させる。プレートを直ちにＴｈｅｒｍｏｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において３４０ｎＭで読み取る。ＮＡＤＨ濃度の指標である吸光度を６秒ごとに５分間記録し、ＮＡＤＨ消失の速度を示す勾配を使用してＬＤＨ活性を算定する：
ＬＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）＝（ΔＡ／分）（ＴＣＦ）（２０）（０．０８３３）／（．７８）
［式中、
０．０８３３＝比例定数及び
０．７８＝装置の光路長（ｃｍ）］。
【０１２０】
ＨＬＡラット試験手順−クローン病及び炎症性腸疾患
雄性ＨＬＡ−Ｂ２７ラットをＴａｃｏｎｉｃより入手し、飼料（Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ（登録商標）ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）５００１）と水を自由に摂取させる。試験の開始時に、ラットは２２−２６週齢である。
【０１２１】
ラットに、以下に列記する製剤の１つを１日１回７日間にわたって皮下投与する。各々の群に５匹のラットとし、最後の用量を投与した２時間後に安楽死させる。
・賦形剤（５０％ＤＭＳＯ／５０％ダルベッコのＰＢＳ）；
・１７α−エチニル−１７β−エストラジオール（１０μｇ／ｋｇ）；又は
・試験化合物。
【０１２２】
糞便の質を毎日観察し、以下の尺度に従って等級付ける：下痢＝３；軟便＝２；正常便＝１。試験手順の終了時に、血清を採集し、−７０℃で保存する。組織学的分析のために結腸の切片を調製し、付加的な分節をミエロペルオキシダーゼ活性に関して分析する。
【０１２３】
ミエロペルオキシダーゼ活性を測定するために以下の方法を使用する。結腸組織を採集し、液体窒素中で瞬間凍結する。試料間の一貫性を確保するために結腸全体の代表試料を使用する。組織を使用時まで−８０℃で保存する。次に、組織を計量し（約５００ｍｇ）、１：１５  ｗ／ｖの５ｍＭ  Ｈ2ＫＰＯ4（ｐＨ６）洗浄緩衝液中で均質化する。組織をＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  ５Ｂ遠心分離機において２−８℃で４５分間、２０，０００×ｇで遠心する。その後上清を廃棄する。細胞内ＭＰＯを可溶化するのを助けるために、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％Ｈｅｘ臭化アンモニウムを添加した（１：５  ｗ／ｖ）５０ｍＭ  Ｈ2ＫＰＯ4  ２．５ｍＬ中に組織を再懸濁し、均質化する。液体窒素中で組織を凍結し、３７℃の水浴で解凍して、膜溶解を確実にするために１５秒間超音波処理する。この手順を３回反復する。その後試料を２０分間氷上に保持し、２−８℃で１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離する。上清をこれらの工程に従って分析する。
【０１２４】
０．０００５％Ｈ2Ｏ2及び０．１６７  Ｏ−ジアニシジン／ｍｌと共に５０ｍＭ  Ｈ2ＫＰＯ4  ２．９ｍＬを反応チューブに添加することによって試験混合物を調製する。過酸化水素が分解するとき、Ｏ−ジアニシジンが酸化され、４６０ｎｍで濃度依存的に吸光する。混合物を２５℃に加熱する。組織上清１００μＬを反応チューブに添加し、２５℃で１分間インキュベートして、その後１ｍｌを使い捨てプラスチックキュベットに移す。光学密度（ＯＤ）を、反応混合物２．９ｍＬ及び０．５％臭化アンモニウム溶液１００μＬを含むブランクに対して４６０ｎｍで反応時間２分ごとに測定する。
【０１２５】
４６０ｎｍでの吸光度を、精製ヒトＭＰＯ  ３１．１単位／バイアルに関して作成した標準曲線と比較して酵素活性単位を定量する。ＭＰＯを再溶解し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％Ｈｅｘ臭化アンモニウムと５０ｍＭ  Ｈ2ＫＰＯ4を使用して４つの既知濃度に連続希釈する。活性を決定するために試料の吸光度をこの曲線と比較する。
【０１２６】
組織学的分析を以下のように実施する。結腸組織を１０％中性緩衝ホルマリンに液浸する。結腸の各々の標本を評価のために４つの試料に分ける。ホルマリン固定組織を、パラフィン包埋するために真空浸透プロセッサー（vacuum infiltration processor）で処理する。試料を５μｍの切片にし、Ｂｏｕｇｈｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈに従って修正したスケールを用いる盲検化組織学的評価のためにヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。評点が完了した後、試料を非盲検化し、データを表にして、多重平均比較を伴うＡＮＯＶＡ線形モデリングによって解析する。
【０１２７】
ここで述べるような、標準薬理試験手順で得られた結果に基づき、本発明の化合物は、少なくとも部分的にはエストロゲンの欠損又は過剰によって媒介される、又はエストロゲン様物質の使用を通して治療又は抑制され得る状態、障害又は疾患状態の治療又は抑制において有用なエストロゲン受容体調節剤である。
【０１２８】
本特許出願書類において言及する、特許、特許出願、及び書籍を含む印刷刊行物の各々は、それらの全体が参照してここに組み込まれることが意図されている。本出願は、その全体が参照してここに組み込まれる、２００４年９月７日出願の米国特許仮出願第６０／６０７，７６６号の優先権を主張する。
【０１２９】
当業者に認識されるように、本発明の精神から逸脱することなく本発明の好ましい実施形態に数多くの変更及び修正を施し得る。そのような変更は本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【国際調査報告】
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