(57)【要約】      （修正有）【課題】プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法、および、これらの方法により得られた多能性幹細胞を用いてキメラ動物を作製する方法を提供する。【解決手段】プライム型多能性幹細胞をＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制状態、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化状態にすることを含んでなる、方法。また、前記方法により製造された多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法であって、プライム型多能性幹細胞をＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制状態、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化状態にすることを含んでなる、方法。
【請求項２】
プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法であって、プライム型多能性幹細胞をＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制状態、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化状態にすることを含んでなる、方法。
【請求項４】
キメラ動物を作製する方法であって、請求項３に記載の方法により製造された多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法。
【請求項５】
Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤とＳＴＡＴ３シグナル活性化剤とを含んでなる、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるための組成物。
【請求項６】
シグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化剤とＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤との組合せ。
【請求項７】
プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするための、請求項６に記載の組合せ。
【請求項８】
プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるための、請求項５または６に記載の組合せ。
【請求項９】
請求項５に記載の組成物または請求項６に記載の組合せを含んでなる、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするための、または、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるための、キット。
【請求項１０】
ＣＤ３１陽性細胞を分画する手段をさらに含んでなる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる、方法。
【請求項１２】
プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法、および、これらの方法により得られた多能性幹細胞を用いてキメラ動物を作製する方法に関する。本発明はまた、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤およびシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化剤を含んでなる組成物およびＳＴＡＴ３シグナル活性化剤とＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤との組合せ、並びに該組成物および該組合せを含んでなるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から得られる多能性幹細胞は、キメラ形成能が高いことで知られているが、より発生段階の進んだ胚（例えば、エピブラスト以降の胚）から得られる多能性幹細胞はキメラ形成能を損なっていると考えられている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
多能性幹細胞には、高いキメラ形成能を有するナイーブ型多能性幹細胞とキメラ形成能が低いプライム型多能性幹細胞が存在する。プライム型多能性幹細胞をナイーブ型に変換（Reversion）することができれば、キメラ形成の際に胚導入細胞として用いることのできる細胞の選択の幅が大きく広がることとなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Brons et al., Nature (2007), 448 (7150): 191-195
【非特許文献２】Tesar et al., Nature (2007), 448(7150): 196-199
【非特許文献３】Han et al., Cell (2010), 143: 617-627
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法、および、これらの方法により得られた多能性幹細胞を用いてキメラ動物を作製する方法を提供する。本発明はまた、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤を含んでなる組成物およびＳＴＡＴ３シグナル活性化剤とＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤との組合せ並びに該組成物および該組合せを含んでなるキットを提供する。
【０００６】
本発明者らは、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することによりプライム型多能性幹細胞が、より未分化な状態になること、具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらには、ナイーブ型多能性幹細胞に効率良く変換することを見出した。本発明者らはまた、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制と組み合わせてさらにＳＴＡＴ３シグナルを活性化させることにより、より効果的に、プライム型多能性幹細胞が、より未分化な状態になること、具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらには、ナイーブ型多能性幹細胞に極めて効率良く変換することを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
【０００７】
すなわち、本発明では、以下の発明が提供される。
（１）プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法であって、プライム型多能性幹細胞をＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制状態、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化状態にすることを含んでなる、方法。
（２）プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための、請求項１に記載の方法。
（３）プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法であって、プライム型多能性幹細胞をＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制状態、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化状態にすることを含んでなる、方法。
（４）キメラ動物を作製する方法であって、上記（３）に記載の方法により製造された多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法。
（５）Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤とシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化剤とを含んでなる、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換するための組成物。
（６）シグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化剤とＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤との組合せ。
（７）プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするための、上記（６）に記載の組合せ。
（８）プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるための、上記（６）または（７）に記載の組合せ。
（９）上記（５）に記載の組成物または上記（６）に記載の組合せを含んでなる、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするための、または、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるための、キット。
（１０）ＣＤ３１陽性細胞を分画する手段をさらに含んでなる、上記（９）に記載のキット。
（１１）プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる、方法。
（１２）プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる、方法。
【０００８】
本発明によれば、プライム型多能性幹細胞を極めて効率良く、より未分化な状態にし、そのキメラ形成能を向上させ、および／または、ナイーブ型多能性幹細胞に変換することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｅ−カドヘリンの強制発現により、マウスエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）がキメラ形成能を向上させることおよびナイーブ型多能性幹細胞に変換されることを示す図である。図１Ａは、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたＥｐｉＳＣにおけるＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）の発現を示す図である。図１Ｂは、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたＥｐｉＳＣがキメラ形成能を有することを示す図である。
【図２】図２Ａは、キメラ形成能を有する細胞がＣＤ３１陽性細胞中に存在することを示す図である。図２Ｂは、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたＥｐｉＳＣの遺伝子発現プロファイルを示す図である。
【図３】Ｅ−カドヘリンの強制発現とＳＴＡＴ３の活性化とを組み合わせることにより、ＥｐｉＳＣがＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）の発現を顕著に増大させることを示す図である。図３Ａは、Ｅ−カドヘリンの強制発現とＬＩＦ刺激とを組み合わせることにより、ＥｐｉＳＣがＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）の発現を顕著に増大させることを示す図である。図３Ｂは、Ｅ−カドヘリンの強制発現とＬＩＦ刺激のいずれかまたはこれらを組み合わせて処理したＥｐｉＣＳにおける、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の割合を示す図である。図３Ｃは、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）の発現の開始時期を示す図である。図３ＤおよびＥは、Ｅ−カドヘリンの強制発現とＬＩＦ刺激とを組み合わせることにより得られたＥｐｉＳＣがキメラを形成すること示す図である。
【図４】図４Ａは、ＩＷＰ−２およびＸＡＶ９３９がＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤として働くことを示す図である。図４Ｂは、ＥｐｉＳＣの処理スキームを示す図である。図４Ｃは、ＬＩＦとＩＷＰ−２を組み合わせて処理することによりＥｐｉＳＣがナイーブ型多能性幹細胞様のコロニーを形成することを示す図である。図４Ｃは、ナイーブ型多能性幹細胞コロニー（ナイーブ様コロニーともいう）の割合を示すグラフである。図４Ｅは、処理後のＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）の発現強度を示す図である。図４Ｆは、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の割合を示すグラフである。図４ＧおよびＨはそれぞれ、得られたナイーブ様コロニーがＥｐｉＳＣ由来であることを示す光学顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。図４Ｉは、得られたキメラ動物の体毛の色を示す写真である。
【図５】図５Ａは、ＬＩＦとＩＷＰ−２またはＸＡＶ９３９とを組み合わせて処理したＥｐｉＳＣがナイーブ様コロニーを形成することを示す図である。図５Ｂは、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）の発現を示す図である。図５Ｃは、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の割合を示すグラフである。図５ＤおよびＥは、ＬＩＦとＩＷＰ−２またはＸＡＶ９３９とを組み合わせて処理したＥｐｉＳＣがキメラに寄与することを示す写真である。
【図６】図６Ａは、プライム型多能性幹細胞マーカーの発現レベルを示す図である。図６Ｂは、ナイーブ型多能性幹細胞マーカーの発現レベルを示す図である。図６Ｃは、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化を確認した図である。「ＥＳＣ」は胚性幹細胞を表し、「Ｅ−ｃａｄ  ｒＥＳＣ」はＥ−カドヘリンを強制発現させたＥｐｉＳＣを表し、「ｗｉｔ−ｒＥＳＣ」は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制し、かつＳＴＡＴ３シグナルを活性化したＥｐｉＳＣを表す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本発明では、「プライム型の多能性幹細胞」とは、プライム型のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞などのプライム型の多能性幹細胞を意味する。本発明では、「多能性幹細胞」としては、特に限定されないが、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類の多能性幹細胞、並びに、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳類の多能性幹細胞などを挙げることができる。本発明で用いられるプライム型の多能性幹細胞は、例えば、哺乳類のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）である。本発明で用いられるプライム型の多能性幹細胞は、例えば、プライム型のヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能は、ナイーブ型多能性幹細胞のキメラ形成能に劣る。
【００１１】
本発明者らは、プライム型の多能性幹細胞が、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することにより、より未分化な状態に変換されること、より具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらにより具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されることを見出した。本発明者らはまた、プライム型の多能性幹細胞が、そのシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することにより、極めて高い効率で、より未分化な状態に変換されること、より具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらにより具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されることを見出した。
【００１２】
本発明では、プライム型多能性幹細胞を、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルが抑制状態であり、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルが活性化状態である細胞にすればよい。従って、本発明では、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルが抑制されているプライム型多能性幹細胞に対しては、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化だけを行なえば同等の発明の効果が発揮され、すでにＳＴＡＴ３シグナルが活性化されているプライム型多能性幹細胞に対しては、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制だけを行なえば同等の発明の効果が発揮されることは容易に理解できることである。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、β−カテニンの分解や核内のβ−カテニンの存在量により確認することができる。ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は例えば、リン酸化ＳＴＡＴ３の存在により確認することができる。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、下記の通りに行なってもよい。ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、下記の通りに行なってもよい。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制とＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、プライム型多能性幹細胞が備えた性質であることもあり得る。
【００１３】
ＳＴＡＴ３シグナルの活性化方法を説明する。ＳＴＡＴ３シグナルは、ＩＬ−６ファミリーのタンパク質によりｇｐ１３０（すなわち、ＣＤ１３０）およびｇｐ１３０と会合する受容体を介して活性化されると考えられている。従って、ＳＴＡＴ３シグナルは、例えば、ＩＬ−６ファミリーのタンパク質および／またはｇｐ１３０アゴニストを細胞に接触させることにより活性化することができる。ＩＬ−６ファミリーのタンパク質としては、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、およびＩＬ−１１が挙げられ、本発明で用いられ得る。
【００１４】
Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制方法を説明する。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルが活性化されると、βカテニンの核内移行が促進される。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、例えば、βカテニンの核内移行を阻害することにより達成することができる。βカテニンの核内移行の阻害は、βカテニンの細胞質での分解の促進により達成することができる。従って、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、例えば、βカテニンの細胞質での分解の促進および／またはβカテニンの核内移行の抑制により行なうことができる。
【００１５】
βカテニンの核内移行を抑制するためには、βカテニンの核内移行抑制剤で細胞を処理することができる。βカテニンの核内移行抑制剤としては、例えば、ＩＷＰ−２が挙げられる。ＩＷＰ−２は、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミドの別名を有し、Ｐｏｒｃｕｐｉｎと呼ばれるタンパク質を阻害することによりβカテニンの核内移行を抑制すると考えられる。当業者であれば、既知のβカテニンの核内移行抑制剤を用いて適宜βカテニンの核内移行を抑制することができる。
【００１６】
βカテニンの細胞質での分解を促進するためには、βカテニンの分解促進剤で細胞を処理することができる。βカテニンの分解促進剤としては、例えば、ＸＡＶ９３９が挙げられる。ＸＡＶ９３９は、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オンの別名を有し、Ａｘｉｎ（アキシン）と呼ばれるタンパク質に結合して、βカテニン結合タンパク質の分解を促進すると考えられる。当業者であれば、既知のβカテニンの分解促進剤を用いて適宜βカテニンの核内移行を抑制することができる。
【００１７】
その他、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤として知られる分子を用いて適宜行なうことができる。当業者であれば、既知のＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤を用いてβカテニンの核内移行を適宜抑制することができる。
【００１８】
プライム型多能性幹細胞において、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＰｅｃａｍ１（すなわち、ＣＤ３１）の発現が増強され、細胞のキメラ形成能が向上し、かつ、細胞の遺伝子発現がナイーブ型多能性幹細胞の遺伝子発現プロフィールに近づく。このことから、プライム型多能性幹細胞はＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞へのリバーション（reversion）を起すことが分かった。
【００１９】
プライム型多能性幹細胞において、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＰｅｃａｍ１（すなわち、ＣＤ３１）の発現が増強され、細胞のキメラ形成能が向上し、かつ、細胞の遺伝子発現がナイーブ型多能性幹細胞の遺伝子発現プロフィールに近づく。このことから、プライム型多能性幹細胞はＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞へのリバーション（reversion）を起こすことが分かった。そして、その効果は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルだけを抑制することと比べると顕著であった。
【００２０】
従って、本発明のある態様では、プライム型多能性幹細胞において、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することを特徴とする、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法、およびプライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞（具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞）を製造する方法が提供される。また、本発明のより好ましい態様では、プライム型多能性幹細胞において、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することを特徴とする、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法、およびプライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞（具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞）を製造する方法が提供される。
【００２１】
また、本発明によれば、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞は高効率でキメラ動物に寄与する。従って、本発明によれば、キメラ動物を作製する方法であって、哺乳動物のプライム型多能性幹細胞のＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、得られた多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。さらに、本発明によれば、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞は高効率でキメラ動物に寄与する。従って、本発明の好ましい態様によれば、キメラ動物を作製する方法であって、哺乳動物のプライム型多能性幹細胞のシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、得られた多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。
【００２２】
また、本発明によれば、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にすることに用いるための、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための、または、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換することに用いるための、組成物が提供される。本発明の組成物は、少なくともＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤を含んでなる。本発明の組成物は、より好ましくは、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤をさらに含んでなる。本発明で用いられるＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤は、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化する作用を有していてもよい。
【００２３】
Ｅ−カドヘリンは、プライム型多能性幹細胞に導入すると、そのキメラ形成能を向上させた。従って、本発明では、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる方法が提供される。本発明ではまた、Ｅ−カドヘリンを導入する手段（例えば、Ｅ−カドヘリン発現ベクターまたはＥ−カドヘリンタンパク質）を含んでなる、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための組成物が提供される。本発明の方法は、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化することをさらに含んでいてもよい。本発明ではさらに、Ｅ−カドヘリンを導入する手段と本発明の組成物との組合せが提供される。本発明の組合せは、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いられ得る。本発明の組合せはまた、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型幹細胞に変換することに用いられ得る。
【００２４】
また、本発明によれば、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にすることに用いるための、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤とＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤との組合せ、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤とＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤との組合せ、および、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換することに用いるための、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤とＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤との組合せが提供される。
【００２５】
本発明の組合せは、組成物中に混合物として含まれていてもよい。従って、本発明によれば、本発明の組合せを含んでなる組成物が提供される。本発明の組合せはまた、別々の形態で提供されていてもよい。本発明の組成物は、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするため、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるため、および／または、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換するために用いることができる。
【００２６】
本発明によればまた、本発明の組合せを含んでなる、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にすることに用いるためのキットまたは試薬、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるためのキットまたは試薬、または、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換することに用いるためのキットまたは試薬が提供される。キットまたは試薬には、細胞への組合せの適用法が記載された説明書を付属させてもよい。本発明のキットは、ＣＤ３１陽性細胞を分画するための手段（例えば、ソーティング用の蛍光標識抗体などの抗ＣＤ３１抗体）をさらに含んでいてもよい。
【００２７】
本発明によれば、上述のように、キメラ動物を作製する方法であって、本発明の方法によりキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を得ることと、得られた多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。本発明の方法によれば、細胞を導入して得られた胚を非ヒト仮親動物の母胎中で発生させて胎児または産仔を得ることをさらに含んでいてもよい。キメラ哺乳動物の作製は、一般的には、哺乳動物のＥＳ細胞などのキメラ形成能を有する細胞を、哺乳動物の胚に導入すること、得られた胚を仮親動物の子宮に移植すること、および仮親動物からキメラの産仔を得ることを含んでなる。本発明では、非ヒト仮親動物は、細胞を導入する胚と同種であり得る。
【００２８】
遺伝子改変動物の作製においては、キメラ形成能を有する多能性幹細胞が求められるが、本発明は、高いキメラ形成能を有する多能性幹細胞を提供するものである。従って、本発明によれば、例えば、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法であって、(i)非ヒト動物のプライム型多能性幹細胞の遺伝子を改変することと、(ii)上記(i)により得られた細胞のＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、(iii)上記(ii)により得られた細胞を非ヒト動物胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。本発明の好ましい態様によれば、例えば、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法であって、(i)非ヒト動物のプライム型多能性幹細胞の遺伝子を改変することと、(ii)上記(i)により得られた細胞のシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、(iii)上記(ii)により得られた細胞を非ヒト動物胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。
【００２９】
遺伝子改変動物を作製する方法としては、例えば、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物を作製する方法が周知である。遺伝子改変動物では、遺伝子改変された多能性幹細胞（例えば、遺伝子改変されたＥＳ細胞）を胚盤胞の卵割腔に導入し、仮親の子宮に移植してキメラ動物である産仔を得る。ノックアウト動物を得る場合には、キメラ動物を得た後は、野生型動物と交配させて、キメラ動物からさらに遺伝子改変されたゲノムをヘテロで有する産仔を得る、あるいは、得られたヘテロの産仔同士をさらに掛け合わせて遺伝子改変されたゲノムをホモで有する産仔を得ることができる。
【００３０】
本発明の方法でも、プライム型多能性幹細胞を遺伝子改変し、得られた遺伝子改変された細胞を非ヒト動物（例えば、げっ歯類以外の非ヒト哺乳動物または鳥類などの脊椎動物）の胚（８細胞期、桑実胚期または胚盤胞期の胚）に導入して、胚を仮親の子宮に戻すことによりキメラ動物を作製することができる。キメラ動物中では、導入したプライム型多能性幹細胞は生殖系列に寄与するから、本発明によれば、げっ歯類以外の哺乳動物においてプライム型多能性幹細胞を胚導入細胞として用いて遺伝子改変動物を得ることができる。遺伝子改変動物の作製においては、好ましくは、導入される細胞と胚との関係は同種である。得られた遺伝子改変された細胞は、胚に導入される前および／または後にシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、および／または、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することができる。
【００３１】
本発明の方法により得られた細胞は、胚盤胞補完を利用した臓器の再生に用いることができる（引用することにより本出願の一部とされるWO2008/102602およびWO2010/021390を参照）。これらの方法では、胚盤胞と胚導入細胞との関係は、同種であっても異種であってもよい。本発明者らは、マーモセットｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞に導入してキメラ動物を得ることができることを確認済である。また、本発明の方法により得られた細胞は、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する動物を胚盤胞補完により生殖可能年齢まで成長させる方法に用いることができる（引用することにより本出願の一部とされるWO2009/104794を参照）。この方法によれば、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する非ヒト動物同士（例えば、ノックアウト非ヒト哺乳動物）の交配により、次世代では生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する産仔を理論上１００％の確率で得ることが可能である。従って、この方法によれば、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する哺乳動物（ファウンダー哺乳動物）を得ることができる。この方法では、胚盤胞と胚導入細胞との関係は、同種であることが好ましい。
【００３２】
本発明では、「臓器」とは、動物の内臓を構成する器官をいう。臓器としては、特に限定されないが、例えば、心臓、肺、腎臓、膵臓、胸腺、脾臓、肝臓、小脳、小腸、結腸および膀胱などが挙げられ、例えば、膵臓、腎臓または胸腺とすることができる。
【００３３】
本発明では、「身体部分」とは、身体のいずれかの部分をいう。身体部分としては、血管、血液、リンパ球、骨および毛髪などが挙げられ、リンパ球または毛髪とすることができる。本明細書では、組織も身体部分に含まれる。
【００３４】
本発明では、「該非ヒト動物とは異個体の動物の細胞」とは、非ヒト動物の胚が有する異常または欠陥を補完できる細胞をいい、例えば、野生型の細胞および蛍光タンパク質等を発現する細胞などが挙げられる。
【００３５】
また、本発明によれば、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞からＣＤ３１陽性細胞を分画し、得られたＣＤ３１陽性細胞を胚に導入すると、非常に高い確率でキメラ動物を作製することができた。また、本発明によれば、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞からＣＤ３１陽性細胞を分画し、得られたＣＤ３１陽性細胞を胚に導入すると、非常に高い確率でキメラ動物を作製することができた。すなわち、ＣＤ３１陽性画分には、キメラ形成能の高い多能性幹細胞が多く存在する。従って、本発明のいずれの方法も、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞、より好ましくは、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞からＣＤ３１陽性細胞を分画すること（選別すること）をさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【００３６】
実施例１：エピブラスト幹細胞の調製
本実施例では、マウスエピブラスト幹細胞を調製した。
【００３７】
実施例に用いたエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）は、ＢＤＦ１由来およびＥＢ３ＤＲ由来のＥｐｉＳＣの２株である。ＢＤＦ１由来のＥｐｉＳＣ（ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ）は、マウスの系統であるＣ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２マウスを交配して得た雑種第一代（Ｆ１）のエピブラスト胚から樹立した。また、ＥＢ３ＤＲ由来のＥｐｉＳＣ（ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ）は、ＥＢ３ＤＲ−ＥＳ細胞に由来し、ＣＡＧ発現ユニットの制御下にＤｓＲｅｄ−Ｔ４遺伝子が連結された遺伝子を有するＥｐｉＳＣである。ＥＢ３ＤＲマウスＥＳ細胞株は丹羽仁史博士（理化学研究所発生・再生センター）より供与を受けた。ＥＢ３ＤＲをマウス胚に移植して作製したキメラエピブラスト胚よりＥｐｉＳＣを樹立したのち、ＦＡＣＳを用いてＤｓＲｅｄ発現細胞を単離した。いずれのＥｐｉＳＣ株もTesar et al., Nature (2007), 448(7150): 196-199に記載の方法に基づいて作製した。すなわち、細胞は、マウスのエピブラストを切り裂いて得た細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で解離させた後に、マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）コートプレートに播種し、次いで増殖したコロニーをクローン化してＥｐｉＳＣ株を樹立した。
【００３８】
得られたＥｐｉＳＣは、１５％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１％非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、２ｍＭ  グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）またはＬ−グルタミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Life Technologies社製）、および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Peprotech社製）を添加したＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｄ−ＭＥＭ培地中で維持した。ＥｐｉＳＣは、完全にコンフルエントになる前に３〜５日おきに継代した。
【００３９】
実施例２：Ｅ−カドヘリンの強制発現による多能性幹細胞のリバーション
本実施例では、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを強制発現させて、得られた多能性幹細胞の性質を確認した。
【００４０】
実施例２−１：Ｅ−カドヘリン遺伝子を導入したプライム型多能性幹細胞の調製
プライム型多能性幹細胞としては、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを用いた。Ｅ−カドヘリン遺伝子（Cdh1, Genbank Assession No. BC098501）は、Ｔｅｔ−ｏｎ  ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ誘導性レンチウイルスベクター（ＡｉＬＶ；Yamaguchi et al, PLOS ONE, 2012）を用いて細胞に導入した。具体的には、Ｔｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶは、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答エレメントおよびリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｅｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｒｔＴＡ））を用いて構築した。この系では、テトラサイクリンやその誘導体であるドキシサイクリンの添加により、細胞内でＥ−カドヘリンを発現させることができる。なお、ウイルスがインテグレートした細胞としていない細胞とを見分けるために、このＴｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶには、ヒトユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーターにより駆動されるｒｔＴＡにＥＧＦＰを発現可能に導入した。
【００４１】
その後、遺伝子導入がなされたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣをＥＧＦＰの蛍光強度を指標として分画した。分画は、ＭｏＦｌｏ（ベックマン・コールター社）またはＡｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて行なった。このようにして得られたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを以降ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１と表記する。
【００４２】
対照としては、ＥＧＦＰを導入したＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを用いた。ＥＧＦＰを導入したＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣは、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣにＣＡＧプロモーター下にＥＧＦＰ遺伝子を発現可能に組み込んだレンチウイルスベクターを感染させて得た。上述と同じ方法でＥＧＦＰの蛍光を指標として遺伝子導入がなされたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを分画した。このようにして得られたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを以降ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＧＦＰと表記する。
【００４３】
以下、ＥＧＦＰを単にＧＦＰと呼ぶことがある。
【００４４】
実施例２−２：プライム型多能性幹細胞のリバーションの評価
次に、得られた細胞にＥ−カドヘリンを強制発現させてそのリバーションを評価した。
【００４５】
まず、実施例２−２で得られたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１およびＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＧＦＰを、通常の培地（Dox(-)）または１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した培地（Dox(+)）で４日間培養した。その後、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Life Technologies社）で完全に解離したのち、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）に対する蛍光標識抗体（ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３１−ＡＰＣ抗体）で染色し、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ（ベクトン・ディッキンソン社製）で解析した。ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）は、マウスＥＳ細胞は発現しているがＥｐｉＳＣでは発現しない、ナイーブ型多能性幹細胞マーカーである。
【００４６】
その結果、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＧＦＰでは、Dox(+)の条件でもＣＤ３１陽性の細胞はほとんど観察されなかったが、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１では、Dox(+)の条件ではＣＤ３１陽性の細胞集団が出現した（図１Ａ〜Ｄ、特に図１ＢおよびＤ）。このことから、Ｅ−カドヘリンを強制発現させると、プライム型多能性幹細胞はＣＤ３１陽性細胞に変化することが明らかとなった。
【００４７】
次に、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１（図１Ｄに対応）を、ＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））とＣＤ３１陰性細胞（ＣＤ３１（−））とにソーティングして、それぞれのキメラ形成能を検証した。
【００４８】
まず、ＢＤＦ１またはＩＣＲ系統マウスの胚をＭｅｄｉｕｍ２（ミリポア社製）で培養して、８細胞期または桑実胚期とした。得られた胚をＫＳＯＭ培地（ミリポア社製）中に移動し、２４時間培養して胚盤胞期まで発生させて、マウスの胚盤胞を得た。
【００４９】
次に、得られた胚盤胞に、ソートして得たＣＤ３１陽性細胞とＣＤ３１陰性細胞をそれぞれ導入した。具体的には、顕微鏡下で、ピエゾに基づくマイクロマニピュレータを用いて透明体に穴を空け、帯下の空間に胚当り約１０個のＥｐｉＳＣを注入して、キメラ胚を作製した。その後、偽妊娠のレシピエントＩＣＲメスマウスの子宮に移植した。キメラ胚は移植から７日後、妊娠後９．５日相当の発生段階でレシピエントから摘出した。摘出した胚は、蛍光顕微鏡（ライカ社製）により観察した。
【００５０】
その結果、ＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））では、ＧＦＰを発現する胚が高頻度で観察されたのに対して、ＣＤ３１陰性細胞（ＣＤ３１（−））では、ＧＦＰシグナルが観察されなかった（図１ＦおよびＧ）。このことから、Ｅ−カドヘリンを導入することによりＣＤ３１を発現するに至ったプライム型多能性幹細胞は、そのキメラ形成能を向上させていることが明らかとなった。一方、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１をＣＤ３１を指標としたソーティングをしないで胚盤胞に導入しても高いキメラ形成が観察された。キメラ形成率を図２Ａに示す。
【００５１】
これらの結果から、Ｅ−カドヘリンの強制発現により、プライム型多能性幹細胞がキメラ形成能を向上させることが明らかとなった。キメラ形成能は分化が進むと失われると考えられていることから、Ｅ−カドヘリンの強制発現により、プライム型多能性幹細胞は、より未分化な状態になったと考えられる。
【００５２】
さらに、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたプライム型多能性幹細胞の遺伝子発現プロファイルを調べた。
【００５３】
Ｅ−カドヘリンを強制発現させて得られたＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））とＣＤ３１陰性細胞（ＣＤ３１（−））とから常法によりそれぞれｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。その後、Ｔａｑｍａｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｒｒａｙ（Life Technologies社製）を用いて製造者マニュアルに従って遺伝子発現パターンを比較した。
【００５４】
その結果、Ｅ−カドヘリンを強制発現させて得られたＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））では、Ｒｅｘ１やＰｅｃａｍ１などのナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られる遺伝子の発現が高まっていた（図２Ｂ）。また、Ｔなどのプライム型多能性幹細胞のマーカーとして知られる遺伝子の発現が低下していた（図２Ｂ）。
【００５５】
このことから、Ｅ−カドヘリンの強制発現により、プライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に変換していること（すなわち、リバーションしていること）が示された。
【００５６】
実施例３：Ｅ−カドヘリンの強制発現とＳＴＡＴ３シグナルの活性化の組合せによるリバーション効率の向上
本実施例では、Ｅ−カドヘリンの強制発現に加えて、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化することでリバーションの効率が顕著に向上することを示す。
【００５７】
ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、細胞をＬＩＦで刺激することにより行なった。
【００５８】
ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣには、実施例２−１と同じ方法でドキシサイクリン依存性Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ誘導系を得た（以後、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１と表記する）。
【００５９】
ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１を、通常の培地（Dox(-)）または１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した培地（Dox(+)）で、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはＬＩＦの存在下で、７日間培養して、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で細胞を剥離し、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３１抗体で染色したのち、ＦＡＣＳで解析を行った。
【００６０】
その結果、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１では、ＬＩＦ刺激およびＥ−カドヘリンの強制発現の両方を組み合わせた場合にのみ、高い割合でＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞が観察された（図３ＡおよびＢ）。ｂＦＧＦを含む培地でもＣＤ３１の発現は誘導されたもののそのレベルは限定的であった。また、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の出現の経時的変化を確認したところ、図３Ｃに示されるように、ＬＩＦ刺激およびＥ−カドヘリンの強制発現の両方を組み合わせた場合には、わずか４日間でＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）を発現する細胞が出現することが明らかとなった。
【００６１】
実施例２−２に記載の方法で、Ｅ−カドヘリンを強制発現させ、ＬＩＦで刺激したＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１からＣＤ３１陽性細胞をソーティングし、キメラ形成能を確認した。すると、図３Ｅに示されるように、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１に由来するＤｓＲｅｄの蛍光が観察され、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣがキメラ形成能を獲得していることが明らかとなった。特に強い蛍光が観察された個体を図中では点線により囲んだ（図３Ｅ）。
【００６２】
このように、Ｅ−カドヘリンの強制発現に加えて、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化すると、プライム型多能性幹細胞はそのキメラ形成能を劇的に向上させることが明らかとなった。
【００６３】
実施例４：Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制と多能性幹細胞のリバーション
本実施例では、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤として、ＩＷＰ−２およびＸＡＶ９３９を用いて、そのリバーションに対する効果を確認した。
【００６４】
まず、ＩＷＰ−２のＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制効果を確認するために、ウェスタンブロットでβカテニンのタンパク質量を確認した。培養条件は上記の通りとしてＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣを培養し、ＩＷＰ−２（終濃度５ｎＭ）を添加してさらに２日間培養した。対照にはＩＷＰ−２の代わりに同量のＤＭＳＯを添加した。次に、Nuclear/Cytosol Fractionation Kit (Bio Vision, Mountain View, CA)を用いて製造者マニュアルに従って細胞質分画と核分画とを分離した。さらに得られたそれぞれの分画をLaemmli Sample Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA)に溶解し、SDS-PAGEを行った。SDS-PAGEによって分離されたタンパクは、PVDF転写膜 (Millipore社製)  にブロットし、一次抗体反応を行った。一次抗体としては、Cell Signaling Technology社から購入した抗β−カテニン抗体(#9562, 1:1000)、抗β−アクチン抗体(#3770, 1:1000)、抗ヒストンＨ３抗体 (#4499, 1:2000)を用いた。二次抗体として、抗β−カテニン抗体および抗ヒストンＨ３抗体に対しては、抗ラビットＩｇＧHorseradish peroxidase-conjugated抗体 (NA934V, 1:100, GE Healthcare UK, Little Chalfont, UK)で反応させ、抗β−アクチン抗体に対しては、抗マウスＩｇＧHorseradish peroxidase-conjugated抗体 (NA931V, 1:1000, GE Healthcare UK, Little Chalfont, UK)に反応させたあと、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo, Rockford, IL)で二次抗体が結合したバンドを検出した。この結果、ＩＷＰ−２によって核分画におけるβ−カテニンの量が減少し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルが抑制されていることが確認できた（図４Ａ）。
【００６５】
１，０００Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦおよび１μＭのＰＤ０３２５９０１  (Axon, Groeningen, The Netherlands) を添加したＮ２Ｂ２７培地（Ying et al., Nature(2008), 435, 519-523）中でＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣを培養した。５ｎＭのＩＷＰ−２（Wako, Osaka, Japan）を添加して、またはＩＷＰ−２の代わりにＧＳＫ３βの抑制剤として知られるＣＨＩＲ若しくは同量のＤＭＳＯを添加して、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣに対する影響を確認した。
【００６６】
その結果、ＩＷＰ−２を添加した条件下では、培養７日目までにナイーブ型多能性幹細胞様の形態を示すコロニーの出現が観察され、培養１４日目にはその頻度が増加した（図４Ｃ）。また、培養１４日目におけるナイーブ型多能性幹細胞に特徴的なコロニー（図４Ｃ中の矢じり）の出現頻度は、ＩＷＰ−２添加によって有意に上昇した（図４ＣおよびＤ）。また、その後長期間継代を続けても、この形質を維持させたまま培養することが可能であった（データ省略）。このことから、ＬＩＦとＩＷＰ−２の処理により、ＥｐｉＳＣがナイーブ型多能性幹細胞に変換されたことが明らかとなった。
【００６７】
次に、これらの細胞でのＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）の発現を解析した。ＡＰＣ標識ラット抗マウスＣＤ３１抗体（eBioscience社製,17-0311）を用いてＣＤ３１の発現量をＦＡＣＳにより確認した。その結果、ＬＩＦとＩＷＰ−２の存在下では短期間に高頻度にＣＤ３１を発現することが分かった（図４ＥおよびＦ）。また、これらのＣＤ３１発現細胞のコロニーをクローニングして継代培養すると、マウスＥＳ細胞様の形態を示し（図４Ｇ）、マウスＥＳ細胞と同様に長期間継代を続けることが可能であった。該細胞はＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣに由来するので、ＤｓＲｅｄを発現している（図４Ｈ）。
【００６８】
さらに、ＬＩＦとＩＷＰ−２で処理したＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣのキメラ形成能を確認した。具体的には、ＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ；ＤＢＡ１  Ｆ１）系統マウスの胚をＭｅｄｉｕｍ２（ミリポア社製）で培養して、８細胞期または桑実胚期とした。得られた胚をＫＳＯＭ培地（ミリポア社製）中に移動し、２４時間培養して胚盤胞期まで発生させた。胚に注入するため、該細胞はトリプシン処理によって単一細胞にまで解離し、培地で懸濁した。顕微鏡下で、ピエゾに基づくマイクロマニピュレータを用いて透明体に穴を空け、帯下の空間に胚当り約１０個の細胞を注入して、キメラ胚を作製した。注入後、胚を割球になるまでＫＳＯＭ培地中で培養し、その後、偽妊娠のレシピエントＩＣＲメスマウスの子宮に移植した。キメラ形成は、毛の色により確認した。ＢＤＦ１×Ｃ５７ＢＬ／６由来の細胞は黒色の毛をはやし、１２９／Ｏｌａ由来の細胞は茶色の毛（アグーチ(Agouti)の色）をはやす。出生後のマウスの毛色を確認したところ、黒色と茶色とがキメラとなっており、毛色から得られたマウスはキメラマウスであることが確認できた（図４Ｉ）。すなわち、ＩＷＰ−２で処理したＥｐｉＳＣはキメラ形成能を向上させており、キメラ動物の作製が可能なナイーブ型多能性幹細胞へと変換されたことが明らかとなった。
【００６９】
さらに、他のＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤を用いて細胞のリバーションを確認した。
【００７０】
Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤として、ＩＷＰ−２の代わりにＸＡＶ９３９ (Sigma-Aldrich, S.Louis, MO, USA )を用いる以外は、上記と同じ方法で、ナイーブ様コロニー形成およびキメラ形成を確認した。
【００７１】
すると、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、ＬＩＦと組み合わせると細胞が処理７日後にはナイーブ様コロニーを形成した（図５Ａ）。また、ＣＤ３１の発現を確認すると、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、ＣＤ３１陽性細胞が高頻度に観察された（図５Ｂ）。また、処理７日後にＣＤ１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の割合を確認したところ、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、ＬＩＦと組み合わせるとＣＤ１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の割合が顕著に増加した（図５Ｃ）。また、キメラ動物を形成させると、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、キメラ動物が形成された（図５Ｅ）。
【００７２】
実施例５：リバーションした細胞の遺伝子発現プロファイル
実施例４でＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制し、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化したプライム型多能性幹細胞（ｗｉｔ−ｒＥＳＣ）の遺伝子プロファイルを確認した。
【００７３】
遺伝子プロファイルは、実施例２−２に記載した通りに行なった。比較対象として、マウスＥＳ細胞（ＥＳＣ）、実施例２で得たＥ−カドヘリン強制発現細胞（Ｅ−ｃａｄ  ｒＥＳＣ）およびＥｐｉＳＣを用いた。
【００７４】
プライム型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＬｅｆｔｙ１とＦｇｆ５の発現を調べると、実施例２および４で得られたＣＤ３１陽性の多能性幹細胞（ｗｉｔ−ｒＥＳＣおよびＥ−ｃａｄ  ｒＥＳＣ）はいずれもＥＳ細胞と同等レベルまで発現を低下させていた（図６Ａ）。
【００７５】
ナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＲｅｘ１、Ｐｅｃａｍ１、Ｋｉｔなどの発現を調べると、実施例２および４で得られた多能性幹細胞（ｗｉｔ−ｒＥＳＣおよびＥ−ｃａｄ  ｒＥＳＣ）はいずれもＥＳ細胞と同等レベルまで発現を増加させていた（図６Ｂ）。
【００７６】
このことから、遺伝子発現プロファイルにおいても、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制とＳＴＡＴ３の活性化を行なったプライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されていることが理解できる。また、Ｅ−カドヘリンを強制発現させ、ＳＴＡＴ３の活性化を行なったプライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されていることが理解できる。
【００７７】
また、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣをＬＩＦで刺激して刺激２日後の細胞を回収し、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化をウェスタンブロット法により確認した。ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、リン酸化型Ｓｔａｔ３の存在により確認した。リン酸化型Ｓｔａｔ３は、一次抗体としてリン酸化型Ｓｔａｔ３を特異的に認識する抗Ｐ−Ｓｔａｔ３抗体（#9145, 1:2000, Cell Signaling Technology社製）（1:1000）を用いて検出した。
【００７８】
すると、ＬＩＦ非存在下ではＳＴＡＴ３シグナルの活性化は確認されなかったが、ＬＩＦ存在下では、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化が確かに認められた（図６Ｃ）。また、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、ＩＷＰ−２またはＸＡＶ９３９の存在下でも認められた（図６Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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