(57)【要約】【課題】従来のボラノホスフェート型核酸と比較して、相補鎖との二重鎖形成能に優れた核酸オリゴマーを提供する。核酸オリゴマーを合成するのに適した新規ボラノホスフェート化合物を提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で示されるボラノホスフェート化合物（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｂｓは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、Ｘ＋はカウンターカチオンを表す。）2015093853.tif 000015【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示されるボラノホスフェート化合物。
【化１】
2015093853.tif 000013
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｂｓは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、Ｘ＋はカウンターカチオンを表す。）
【請求項２】
一般式（Ｉ）におけるＢｓが、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン又はシトシンである請求項１に記載のボラノホスフェート化合物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）におけるＲ１が、水酸基の保護基である請求項１又は請求項２に記載のボラノホスフェート化合物。
【請求項４】
少なくとも２つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、該塩基配列に含まれる少なくとも１つの塩基が、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマー。
【請求項５】
一般式（II）で示される構造及び一般式（III）で示される構造のうち少なくとも１つを有する請求項４に記載の核酸オリゴマー。
【化２】
2015093853.tif 000014
（一般式（II）中、Ｒ１は水素原子又は水酸基の保護基を表す。一般式（II）及び一般式（III）中、Ｂｓは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、Ｘ＋はカウンターカチオンを表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボラノホスフェート化合物、及び核酸オリゴマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸と相補的な塩基配列を有するアンチセンス分子は、標的核酸と相補的な二重鎖を形成し、標的核酸からのタンパク質生成を阻害することができる。標的核酸として疾病関連遺伝子を選択した場合には、アンチセンス分子は、疾病関連遺伝子に直接働きかけるため、遺伝子治療に有効な医薬として注目されている。
【０００３】
アンチセンス分子（核酸オリゴマー）は、標的となるタンパク質の生成を効率よく阻害する観点から主として、細胞膜透過性、ヌクレアーゼ耐性、体内（例えば、ｐＨ７．４の環境下）での化学的安定性、及び特定の塩基配列とのみ安定な二重鎖を形成する性質を有することが求められる。アンチセンス分子としては、例えば、ホスホロチオエート化合物を用いて得られる核酸オリゴマー（以下、「ホスホロチオエート型核酸オリゴマー」と称する）が知られている（非特許文献１）。
【０００４】
アンチセンス分子のなかでも、ボラノホスフェート化合物を用いて得られる核酸オリゴマー（以下、「ボラノホスフェート型核酸オリゴマー」と称する）は、優れた水溶性、脂溶性、及び生体内のヌクレアーゼ耐性を有し、かつホスホロチオエート型核酸オリゴマーに比べ、細胞毒性が低いことなどの利点を有することが知られている（非特許文献２）。この観点から、ボラノホスフェート化合物は、アンチセンス分子（核酸オリゴマー）を構成するモノマーとしての使用が提案され、多くの側面から種々検討されている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、ボラノホスフェート及びその他の含リン酸−ホウ素結合修飾型ＲＮＡの効率的な合成に有用なリボヌクレオチドＨ−ボラノホスホネート化合物が開示されている。また、特許文献２〜３及び非特許文献１〜５には、ボラノホスフェート型核酸オリゴマーの効率的な製造に有用なボラノホスフェート化合物及びそれを用いたオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１８４３１８号公報
【特許文献２】特開２０１１−２２５５９８号公報
【特許文献３】特許第４８１４０８４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nucleic Acids, Research, 2010, Vol.38, No.20, pp.7100-7111
【非特許文献２】Chem Rev.,2007, Vol.107, pp.4746-4796
【非特許文献３】J.Org.Chem.,2006, Vol.71,pp.4262-4269
【非特許文献４】J.Org.Chem.,2004, Vol.69,pp.5261-5268
【非特許文献５】Chem.Commun.,2009, pp.2466-2468
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ボラノホスフェート型核酸オリゴマーは、疎水的、かつ立体障害の大きな官能基であるボラノ基（ＢＨ３）を構造上有しているため、ボラノ基を構造上有さない核酸オリゴマーに比べ、相補鎖との二重鎖形成能が低い。
【０００９】
本発明は、従来のボラノホスフェート型核酸オリゴマーと比較して、相補鎖との二重鎖形成能に優れた核酸オリゴマーを提供することを課題とする。
また、本発明は、上記核酸オリゴマーを合成するのに適した新規ボラノホスフェート化合物を提供することを他の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞  下記一般式（Ｉ）で示されるボラノホスフェート化合物。
【００１１】
【化１】
2015093853.tif 000002
【００１２】
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｂｓは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、Ｘ＋はカウンターカチオンを表す。）
＜２＞  一般式（Ｉ）におけるＢｓが、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン又はシトシンである＜１＞に記載のボラノホスフェート化合物。
＜３＞  一般式（Ｉ）におけるＲ１が、水酸基の保護基である＜１＞又は＜２＞に記載のボラノホスフェート化合物。
＜４＞  少なくとも２つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、該塩基配列に含まれる少なくとも１つの塩基が、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマー。
＜５＞  一般式（II）で示される構造及び一般式（III）で示される構造のうち少なくとも１つを有する＜４＞に記載の核酸オリゴマー。
【００１３】
【化２】
2015093853.tif 000003
【００１４】
（一般式（II）中、Ｒ１は水素原子又は水酸基の保護基を表す。一般式（II）及び一般式（III）中、Ｂｓは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、Ｘ＋はカウンターカチオンを表す。）
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来のボラノホスフェート型核酸オリゴマーと比較して、相補鎖との二重鎖形成能に優れた核酸オリゴマーを提供することができる。
また、本発明によれば、上記核酸オリゴマーを合成するのに適した新規ボラノホスフェート化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（Ａ）は、精製前のＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮのイオン交換ＨＰＬＣのグラフである。（Ｂ）は、精製後のＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮのイオン交換ＨＰＬＣのグラフである。
【図２】（Ａ）は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ条件下での相補鎖ＤＮＡとアンチセンス分子（天然型ＤＮＡ、ＰＢＯ−ＤＮＡ、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ）との融解曲線である。（Ｂ）は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ条件下での相補鎖ｍＲＮＡとアンチセンス分子（天然型ＤＮＡ、ＰＢＯ−ＤＮＡ、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ）との融解曲線である。
【図３】（Ａ）は、１Ｍ  ＮａＣｌ条件下での相補鎖ＤＮＡとアンチセンス分子（天然型ＤＮＡ、ＰＢＯ−ＤＮＡ、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ）との融解曲線である。（Ｂ）は、１Ｍ  ＮａＣｌ条件下での相補鎖ｍＲＮＡとアンチセンス分子（天然型ＤＮＡ、ＰＢＯ−ＤＮＡ、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ）との融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のボラノホスフェート化合物は、上記一般式（Ｉ）で示される化合物である。この化合物は、核酸オリゴマーを製造するモノマーとして用いることができる。
また、本発明の核酸オリゴマーは、少なくとも２つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、塩基配列に含まれる少なくとも１つの塩基が、一般式（Ｉ）で示されるボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマーである。
【００１８】
本発明のボラノホスフェート化合物は、リボース構造の２位の炭素原子に結合する酸素原子と４位の炭素原子とがメチレン基を介して環化した所謂固定化核酸（locked nucleic acid：ＬＮＡ）構造を有するボラノホスフェート化合物である。そのため、このボラノホスフェート化合物をモノマーとして用いて得られた核酸オリゴマーは、従来のボラノホスフェート型核酸オリゴマーに比べ、核酸オリゴマーと標的核酸との二重鎖形成能を高めることができる。
【００１９】
一般式（Ｉ）で示される固定化核酸（ＬＮＡ）構造を有するボラノホスフェート化合物を、本明細書では、適宜「ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物」と称する。
本発明において「モノマー」とは、核酸オリゴマーを製造する際に、核酸オリゴマーのヌクレオシド単位を導入するため使用される核酸を意味する。
【００２０】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００２１】
＜ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物＞
本発明のＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物は、下記一般式（Ｉ）で示される。一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｂｓは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、Ｘ＋はカウンターカチオンを表す。
【００２２】
【化３】
2015093853.tif 000004
【００２３】
Ｒ１は、水素原子又は水酸基の保護基を表す。水酸基の保護基としては、例えば、アセチル基、フェノキシアセチル基、ピバロイル基、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、ベンゾイル基、トリフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、４−メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）基、９−フェニルキサンテニル基、トリメチルシリル基、シアノメトキシメチル基、２−（シアノエトキシ）エチル基、シアノエトキシメチル基等を挙げることができる。これらの水酸基の保護基のうち、４，４’−ジメトキシトリチル基が、酸性条件下で容易に除去可能であり、固相合成における鎖長伸長に適しているため、より好ましい。
【００２４】
Ｂｓは保護基を有してもよい核酸塩基を表す。核酸塩基としては、アデニン、ウラシル、チミン、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれる核酸塩基の他、例えば、リボチミジン、５−メチルウリジン等の修飾された核酸塩基を挙げることができる。これらのうち、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン及びシトシンが好ましい。
【００２５】
核酸塩基が保護基を有する場合、保護基の種類は特に限定されない。核酸塩基として、アミノ基を有するアデニン、グアニン、及びシトシンが選択される場合、核酸塩基のアミノ基を保護する観点から、保護基として、例えば、ベンジル基、４−メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、（ジメチルアミノ）メチレン基等を挙げることができる。
【００２６】
Ｘ＋はカウンターカチオンを表す。カウンターカチオンとしては、例えば、有機アミン化合物由来のカチオン、又は金属カチオン等を挙げることができる。有機アミン化合物由来のカチオンとしては、有機溶媒への溶解度、及びカウンターカチオンの揮発性の観点から、例えば、三級アルキルアミン化合物由来のカチオンを挙げることができる。三級アルキルアミン化合物由来のカチオンとしては、例えば、トリエチルアミン由来のカチオン（ＨＮＥｔ３＋）を挙げることができる。金属カチオンとしては、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋等が挙げられる。
【００２７】
一般式（Ｉ）で表されるＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物は、光学的に純粋な化合物、ラセミ体、ジアステレオ混合物等、任意の形態の物質であってもよい。
【００２８】
ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物は、公知の方法で製造することができる。具体的には、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物の製造方法は、ＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸をＨ−ボラノホスフィニル化剤を用いてＨ−ボラノホスフェート化する工程（ボラノホスフェート化工程）を含むことができる。
【００２９】
ＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸とは、ＬＮＡ構造を有するデオキシリボ核酸を意味し、ＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸の有する官能基又は核酸塩基が保護基を有するＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸の誘導体も含まれる。
【００３０】
ボラノホスフェート化工程で使用されるＨ−ボラノホスフィニル化剤としては、例えば、Ｈ−ボラノホスホネートの有機アミン塩等を挙げることができ、Ｈ−ボラノホスホネートの有機アミン塩としては、例えば、ピリジニウム  Ｈ−ボラノホスホネート、トリエチルアンモニウム  Ｈ−ボラノホスホネート等を挙げることができる。Ｈ−ボラノホスフェート化反応におけるＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸とＨ−ボラノホフィニル化剤との量比は、Ｈ−ボラノホスフェート化反応が進行すれば特に限定されないが、ＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸に対して、Ｈ−ボラノホスフィニル化剤が１．２当量以上２．０当量以下、好ましくは２．０当量で使用することができる。
【００３１】
Ｈ−ボラノホスフェート化反応は、副反応の進行を抑制する観点から、縮合剤の存在下で行うことができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（ＢｏｐＣｌ）、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル−トリス（ピロリジン−１−イル）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＴＰ）等を挙げることができ、核酸オリゴマーの伸長効率の点で、Ｎ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（ＢｏｐＣｌ）であることが好ましい。
【００３２】
Ｈ−ボラノホスフェート化反応は、必要に応じて、さらに求核触媒の存在下で行ってもよい。求核触媒としては、例えば、３−ニトロトリアゾール等を挙げることができる。
【００３３】
Ｈ−ボラノホスフェート化反応は、氷冷下（０℃）以上室温（２５℃）以下、数分以上数時間以下、例えば３０分以上１時間以下の範囲で行うことができる。
【００３４】
反応溶媒としては、例えば、含窒素有機溶媒を挙げることができる。含窒素有機溶媒としては、例えば、ピリジン等を挙げることができる。
【００３５】
Ｈ−ボラノホスフェート化工程は、Ｈ−ボラノホスフェート化反応後、反応溶液を不活性有機溶媒で希釈し、その反応溶液を添加して、反応系中に生じた副生成物（例えば、塩化ピリジン、ＢｏｐＣｌの残渣等）を中和して反応を停止することができる。不活性有機溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等を挙げることができる。また、保護基の脱離を抑制する観点から、反応を停止する前に、緩衝溶液を添加することが好ましい。緩衝溶液としては、例えば、炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）溶液、炭酸水素ナトリウム溶液（ＮａＨＣＯ３）、炭酸アンモニウム水溶液（（ＮＨ４）２ＣＯ３）等を挙げることができる。不活性溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等を挙げることができる。
緩衝溶液を添加するのは、反応を停止する前に反応溶媒を留去すると副生成物の酸性によって保護基が脱離する場合があるからである。
【００３６】
また、本発明のＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物の製造方法は、必要に応じて、ボラノホスフェート化工程で得られた一般式（Ｉ）で示されるＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物から水酸基の保護基を脱離する工程（脱離工程）を含むことができる。保護基の脱離工程に用いられる脱離化剤の種類、脱離反応に適用されるｐＨ及びその他の反応条件等については、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物中の保護基の種類により適宜選択することができる。
【００３７】
本発明のＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物の製造方法の一例について説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明のＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物（３ａ−ｄ）は、例えば、以下のスキーム１に従って製造される。なお、スキーム１では、縮合剤としてＮ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（Ｂｏｐ−Ｃｌ）を用いている。また、出発物質として、Ｈ−ボラノホスフィニル化剤（２）及びリボース構造の３位の炭素原子に水酸基が結合したＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸の誘導体（１ａ−ｄ）を用いている。
【００３８】
【化４】
2015093853.tif 000005
【００３９】
スキーム１におけるＢｐｒｏは保護基を有する核酸塩基を表し、Ｒ１１及びＸ＋は各々一般式（Ｉ）中のＲ１及びＸ＋と同義である。
ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物（３ａ−ｄ）は、ＬＮＡ修飾デオキシリボ核酸の誘導体（１ａ−ｄ）をＨ−ボラノホスフィニル化剤（２）によりＨ−ボラノホスフェート化することによって製造することができる。
【００４０】
＜核酸オリゴマー＞
本発明の核酸オリゴマーは、少なくとも２つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、塩基配列に含まれる少なくとも一つの塩基が、一般式（Ｉ）で示されるＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマーである。核酸オリゴマーは、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物をモノマーの１つとして用いて、このモノマーを縮合することにより得られる構造を有する。
【００４１】
核酸オリゴマーの長さ（塩基長）については、２つ以上の塩基を有する核酸オリゴマーであれば特に制限はなく、標的核酸の種類、長さ等に応じて所望の長さを適宜選択できる。本発明の核酸オリゴマーの長さは、特に限定されないが、アンチセンス医薬への応用の観点から、１０量体以上３０量体以下であることが好ましく、１０量体以上２１量体以下が好ましい。
核酸オリゴマーの塩基配列は、標的核酸の塩基配列に基づいて設定される。二重鎖形成能の観点から、核酸オリゴマーの塩基配列は、標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列となるように適宜選択されるが、場合によって、異なる塩基を１つ以上含む塩基配列であってもよい。
【００４２】
核酸オリゴマーは、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物のみに由来する核酸オリゴマーであってもよく、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物と、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物中のヌクレオシド構造以外のヌクレオシド構造を有する核酸を含む核酸オリゴマー（キメラオリゴマー）であってもよい。本明細書では、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物中のヌクレオシド構造以外のヌクレオシド構造を有し、核酸オリゴマーを製造する際にモノマーとして使用可能な核酸を、単に「核酸誘導体」と称する場合がある。
【００４３】
キメラオリゴマーの場合、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物の位置については、特に制限はなく、核酸オリゴマー中に連続して存在してもよく、前記核酸誘導体を介在させて不連続に存在してもよい。
【００４４】
核酸オリゴマーは、５’末端及び３’末端の少なくとも一方にＬＮＡ構造を有することが好ましく、５’及び３’の両末端にＬＮＡ構造を有することがより好ましい。５’末端及び３’末端の両末端に存在しうるＬＮＡ構造を有するヌクレオシドは、それぞれ独立に、リボース構造の２’位の炭素原子にフッ素原子、水酸基、及びメトキシ基から選択されるいずれか１つが結合したヌクレオシドであってもよい。
【００４５】
核酸オリゴマーが他の核酸誘導体を含む場合、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物の核酸オリゴマー全体における含有数については、特に制限はなく、核酸オリゴマーの長さによって異なるが、１０量体以上３０量体以下の核酸オリゴマーの場合、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物由来のヌクレオシドの数は３以上１０以下が好ましい。
【００４６】
核酸オリゴマーは、核酸オリゴマーにおけるＨ−ボラノホスフェート基の塩基性溶液中での安定性の観点から、一般式（Ｉ）で示される構造のＨ−ボラノホスフェート基（−Ｏ−（ＢＨ３）ＰＨ（Ｏ-Ｘ＋）−）を酸化した酸化型のボラノホスフェート基（−Ｏ−（ＢＨ３）Ｐ（Ｏ-Ｘ＋）−Ｏ−：以下、酸化型ボラノホスフェート基と称する場合がある）を有するヌクレオシド構造中の塩基を含むことが好ましい。
【００４７】
前記酸化型のボラノホスフェート基を含む核酸オリゴマーは、以下の構造、すなわち一般式（II）で示される構造及び一般式（III）で示される構造のうち少なくとも１つを有することができる。なお、一般式（II）で示される構造は、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基が、核酸オリゴマーの５’末端の塩基である場合を意味する。一般式（II)で示される構造が核酸オリゴマー中に含まれる場合、核酸オリゴマーは通常、一般式（II)で示される構造を１つのみ含む。一般式（III）で示される構造は、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基が、核酸オリゴマーの５’末端及び３’末端以外の塩基である場合を意味する。一般式（III)で示される構造が核酸オリゴマー中に含まれる場合、核酸オリゴマーは、一般式（III)で示される構造を１つ以上含むことができる。
【００４８】
【化５】
2015093853.tif 000006
【００４９】
一般式（II）及び（III）中、Ｒ１、Ｂｓ及びＸ＋は、一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｂｓ及びＸ＋と同義である。
【００５０】
核酸オリゴマーは、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物以外のモノマー（以下、単に「他のモノマー」と称する場合がある）に由来する他のヌクレオシド構造中の塩基を含むことができる。
核酸オリゴマーを得る際に用いる他のモノマーについては特に制限はなく、例えば、以下の一般式（IV）で表されるボラノホスフェート化合物（以下、ＬＮＡ未修飾ボラノホスフェート化合物」と称する）、一般式（Ｖ）で表される核酸、一般式（VI）で表されるＬＮＡ修飾核酸などを挙げることができる。
【００５１】
【化６】
2015093853.tif 000007
【００５２】
一般式（IV）〜(VI）中、Ｒ２、Ｒ３及びＲ５は一般式（Ｉ）中のＲ１と同義であり、Ｒ６は、水素原子、保護基を有する水酸基、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子）、アルコキシ基（例えば、メトキシ基）を表し、Ｂｓ２は一般式（Ｉ）中のＢｓと同義であり、Ｘ＋は一般式（Ｉ）中のＸ＋と同義である。
【００５３】
前記他のモノマーの由来するヌクレオシド構造は、核酸オリゴマーのいずれの位置に存在してもよい。例えば、一般式（VI）で表されるモノマーは、Ｒ５が水素原子を表す場合、核酸オリゴマーの３’末端のヌクレオシドとして使用されてもよい。
【００５４】
本発明の核酸オリゴマーは、標的核酸の塩基配列と相補的な塩基配列となるように、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基を少なくとも１つ以上を用いて、公知の製造方法を用いて得ることができる。具体的には、本発明の核酸オリゴマーの製造方法は、３’末端のＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物を少なくとも１つ含むモノマーから、標的核酸の塩基配列に相補的となる塩基配列となるようにモノマーを選択して、３’末端の塩基となる塩基を含むモノマーに他のモノマーを順次縮合させる工程（縮合工程）を含む。
【００５５】
前記縮合工程では、核酸オリゴマーのヌクレオシド構造中のリボース構造の５’位の炭素原子に結合する水酸基とモノマーのリン酸部とが縮合する。
前記縮合工程では、縮合剤を用いることができる。
縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾニル）ホスフィン酸クロライド、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル−トリス（ピロリジン−１−イル）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＴＰ）、又は１，３、−ジメチル−２−（３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−２−ピロリジン−１−イル−１，２，３−ジアザホスホリジウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＭＮＴＰ）等を挙げることができる。このうち、副反応を抑制し、かつ反応が速やかに完結する観点から、ＭＮＴＰが好ましい。
【００５６】
前記縮合工程、さらに塩基性化合物の存在下で行うことができる。
塩基性化合物としては、例えば、１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（ＤＭＡＮ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（ＴＭＰ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、２，６−ルチジン、２，４,６−トリメチルピリジン等を挙げることができる。このうち、副反応を抑制する観点から、２，６−ルチジンが好ましい。
【００５７】
前記縮合工程における縮合反応は、氷冷下（０℃）以上室温（２５℃）以下、好ましくは２０℃以上２５℃以下の範囲で、数分以上数時間以下、例えば１５分以上１時間以下の範囲で行うことができる。
【００５８】
反応溶媒としては、例えば、不活性溶媒等を挙げることができる。不活性溶媒のうち、アセトニトリル等を挙げることができる。
【００５９】
本発明の核酸オリゴマーの製造方法は、固相担体を用いた反応により核酸オリゴマーを製造することができる（固相法）。
固相反応により核酸オリゴマーを製造する場合、核酸オリゴマーの３’末端の塩基を含むモノマーは、リボース構造の３’位の炭素原子に結合する酸素原子を介して、固相担体と結合することができる。この場合、モノマーと固相担体との間には、必要に応じてリンカーが存在してもよい。
【００６０】
前記固相担体の種類は特に限定されず、例えば、定孔ガラス、オキサリル化−定孔ガラス、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体、高架橋アミノメチルポリスチレン、Ｐｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合体等を挙げることができる。前記固相担体とモノマーとの連結には、固相担体上のアミノ基を利用することができる。前記固相担体上のアミノ基としては、３−アミノプロピル基、長鎖アルキルアミノ基（ＬＣＡＡ）等を挙げることができる。前記固相担体とモノマーとの間には、リンカーが存在してもよい。前記リンカーとしては、スクニシル基、オキサリル基等を挙げることができる。
【００６１】
本発明の核酸オリゴマーの製造方法は、縮合工程で得られた核酸オリゴマーを酸化剤により酸化する酸化工程を含んでもよい。
酸化剤としては、例えば、（＋）−カンフォリルスルホニルオキサジリジン（ＣＳＯ）（＋）−（８，８−ジクロロカンフォリルスルホニル）−オキサジリジン（ＤＣＳＯ）、メチルエチルケトン過酸化物、及びポジティブハロゲン試薬（四塩化炭素、四臭化炭素、ヨウ素、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド等）などを挙げることができる。
酸化反応は塩基性化合物存在下で行ってもよい。塩基性化合物としては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン等を挙げることができる。
【００６２】
本発明の核酸オリゴマーの製造における縮合工程は、核酸オリゴマーのヌクレオチド構造中のリボース構造の５’位の炭素原子に結合する水酸基とモノマーのリン酸部とが縮合する反応を含む。このため、５’位の炭素原子に結合する水酸基が保護基を有する場合、脱保護試薬と反応させて保護基を脱離させる工程（第１の保護基脱離工程）を含む。第１の保護基脱離工程は、核酸オリゴマーの製造における縮合反応の前に行う。
前記第１の保護基脱離工程には、脱保護剤を用いることができる。第１の保護基脱離工程で使用し得る脱保護剤としては、例えば、ハロゲン化アルキルカルボン酸等を挙げることができる。ハロゲン化アルキルカルボン酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸等を挙げることができる。保護基を有する核酸オリゴマーが２〜１００当量の脱保護剤と反応することが好ましい。
【００６３】
また、核酸オリゴマーの製造方法に用いられるモノマー中の塩基に保護基を有する場合、前記製造方法は、塩基の保護基を脱離させる工程（第２の保護基脱離工程）を更に含む。第２の保護基脱離工程は、最終的に得られる核酸オリゴマー中の塩基が保護基を有さないようにすれば、どの段階で行うかは特に限定されない。
第２の保護基脱離工程では、例えば、モノマー又は核酸オリゴマーをアンモニア水で処理することができる。第２の保護基脱離工程で用いられるアンモニア水としては、例えば、２５質量％アンモニア水又は２５質量％アンモニア水−エタノール混合溶液（３：１、ｖ／ｖ）が挙げられる。
【００６４】
得られた核酸オリゴマーは、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）、イオン交換ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の精製方法により精製することができる。
【００６５】
本発明の核酸オリゴマーの製造方法の一例について説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。以下のスキーム２は、固相担体に連結された核酸オリゴマー（スキーム２では二量体）を製造する工程の一例を示す。
【００６６】
【化７】
2015093853.tif 000008
【００６７】
ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物（３ａ−ｄ）と固相担体に連結した他のモノマー（４）とを塩基の存在下で縮合剤を用いて、反応させて核酸オリゴマー（ＬＮＡＰＢＨ−ＤＮＡ（二量体））（５ａ−ｄ）を得る。
【００６８】
他のモノマー（４）のＢｐｒｏはＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物（３ａ−ｄ）の有するＢｐｒｏと同義である。
他のモノマー（４）の有するＲ６は、水酸基、保護基を有する水酸基、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子）、又はアルコキシ基（例えば、メトキシ基）を表す。Ｒ６が保護基を有する水酸基を表す場合、その保護基は、一般式（Ｉ）中のＲ１の表す水酸基の保護基と同義である。
核酸オリゴマー（ＬＮＡＰＢＨ−ＤＮＡ（二量体））（５ａ−ｄ）中のＲ１１及びＢｐｒｏは、各々一般式（Ｉ）中のＲ１及びＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物（３ａ−ｄ）中のＢｐｒｏと同義である。
核酸オリゴマー（５ａ−ｄ）は、その後、標的核酸と相補鎖な塩基配列となるように、モノマーを適宜選択し、この反応を繰り返して行うことにより、所望の配列を有する核酸オリゴマーを得ることができる。
【００６９】
また、縮合工程で得られた核酸オリゴマーは、更に酸化して酸化型の核酸オリゴマーとしてもよい。一例として、以下のスキーム３に、上記スキーム２で得られた二量体の核酸オリゴマー（ＬＮＡＰＢＨ−ＤＮＡ）から、酸化型の核酸オリゴマー（ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ）（６ａ−ｄ）を得る工程を示す。
核酸オリゴマー（ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（二量体））（６ａ−ｄ）中のＲ１１、Ｒ６及びＢｐｒｏは、各々核酸オリゴマー（ＬＮＡＰＢＨ−ＤＮＡ（二量体））（５ａ−ｄ）中のＲ１１、Ｒ６及びＢｐｒｏと同義である。
【００７０】
【化８】
2015093853.tif 000009
【００７１】
本発明の核酸オリゴマーは、標的核酸の塩基配列に相補的となるように設計することにより、標的核酸に対する二本鎖形成能に優れたアンチセンス分子として使用することができる。例えば、標的核酸が疾患関連遺伝子の部分配列に相当する場合には、本発明の核酸オリゴマーは、翻訳阻害能の高いアンチセンス医薬等の医薬用途に好ましく用いられる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例にて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
各種分析器は以下に示した機種を用いた。
１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）：バリアン  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００（３００ＭＨｚ）
１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲ）：バリアン  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００（７５ＭＨｚ）
３１Ｐ−核磁気共鳴スペクトル（３１Ｐ−ＮＭＲ）：バリアン  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００（１２１．５ＭＨｚ）
なお、１Ｈ−ＮＭＲにはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を、１３Ｃ−ＮＭＲにはＣＤＣｌ３（δ７７．１６ｐｐｍ）を内部標準として用い、３１Ｐ−ＮＭＲは８５％Ｈ３ＰＯ４を外部標準として用いた。
【００７３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ： ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＯＦ／ＴＯＦＴＭ  ５８００  Ｓｙｓｔｅｍ
紫外可視分光光度計：ＪＡＳＣＯ  Ｖ−５５０  ＵＶ／ＶＩＳ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
イオン交換ＨＰＬＣ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０Ｓ
カラムクロマトグラフィーに充填するシリカゲルには、ＫＡＮＴＯ  ＣＨＥＭＩＣＡＬのＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎを用いた。
逆相ＨＰＬＣに使用したカラム（分析）：ｗａｔｅｒ  μ−ＢＯＵＮＤＡＳＰＨＥＲＥ，Ｃ１８  ５μｍ，１００Å，３．９ｍｍ×１５９ｍｍ
イオン交換ＨＰＬＣに使用したカラム（分析・分取）：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＭｉｎｉＱＴＭ  ４．６／５０ＰＥ，  ３μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ）
【００７４】
なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。実施例中、ＨＮＥｔ３はトリエチルアミンを示し、Ｂｐｒｏは保護基を有する核酸塩基を示し、ＴｂｚはＮ３−ベンゾイルチミン−１−イルを示し、ＡｂｚはＮ６−ベンゾイルアデニン−９−イルを示し、ＣｉｂｕはＮ４−イソブチリルシトシン−１−イルを示し、Ｇｃｅ，ｉｂｕはＯ６−シアノエチル−Ｎ２−イソブチリルグアニン−９−イルを示し、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチルを示し、Ｂｏｐ−Ｃｌはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライドを示し、その他の略号は上記説明中のものと同義である。
【００７５】
＜ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物の合成＞
以下、スキーム４に従って、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物（９）を合成した。
【００７６】
【化９】
2015093853.tif 000010
【００７７】
（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）−３−（Ｎ３−ベンゾイルチミン−１−イル）−１−ジメトキシトリチルオキシメチル−７−ヒドロキシ−２，５−ジオキサビシクロ[２．２．１]へプタン（７）０．６９ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とピリジニウム  Ｈ−ボラノホスホネート（８）０．３０ｇ（２．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で、ピリジン（２ｍｌ×３）で共沸乾燥してピリジン（１０ｍｌ）に溶解した。得られたピリジン溶液を氷浴下（０℃）にて撹拌しつつＢｏｐ−Ｃｌ：０．５１ｇ（２．０ｍｍｏｌ）を加え、その後反応温度を室温（２５℃）に上げ、２０分間撹拌した。この溶液をジクロロメタン５０ｍｌで希釈した後、溶液に１Ｍ  炭酸アンモニウム水溶液  （５０ｍＬ）を添加した。水層をジクロロメタン（２００ｍｌ×２）で逆抽出した。有機層に再度、１Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝溶液（１００ｍｌ×３）を添加した。水層をジクロロメタン（５００ｍｌ×１）で抽出し、有機層中の水分を無水硫酸ナトリウムを用いて除去した。次いで、有機層の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン（２：１＝ｖ／ｖ）中トリエチルアミン０．５％〜ジクロロメタン−メタノール０．５％、トリエチルアミン０．５％）で分離精製することにより、目的化合物を得た。収率７５％。
【００７８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ・８．００−７．９３（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．４１−７．３０（ｍ，６Ｈ），７．３６（ｂｒ  ｄ，１ＪＰＨ＝３９９Ｈｚ，１Ｈ），７．２４−７．２１（ｍ，１Ｈ），６．８９−６．８５（ｍ，４Ｈ），６．２１（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｓ，１Ｈ），４．７９（ｄｄ，Ｊ＝７８，６．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｑ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．７８−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｄｄ，Ｊ＝２７，１１Ｈｚ，２Ｈ），２．９０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，７．５Ｈ），１．６７（ｄｄ，，Ｊ＝６．０，０．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１１Ｈ），０．９０−０．００（ｂｒ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６９．２，１６３．２，１５８．９，１４９．１，１４９．１，１４４．７，１４４．６，１３５．７，１３５．６，１３５．５，１３５．３，１３５．３，１３４．７，１３４．７，１３１．７，１３１．６，１３０．９，１３０．８，１３０．４，１３０．３，１３０．２，１２９．５，１２９．４，１２８．４，１２８．４，１２８．３，１２８．２，１２７．３，１１３．７，１１３．６，１１０．７，１１０．７，８８．４，８８．４，８８．３，８７．８，８６．９，７９．０，７８．９，７７．８，７７．６，７７．４，７７．０，７５．０，７４．８，７２．６，７２．４，７１．９，５８．２，５７．９，５５．５，４５．７，１３．０，１２．９，８．７；３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０７．５（ｍ）．
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒＣ３９Ｈ３９ＢＮ２Ｏ１０Ｐ−［Ｍ−Ｈ］−；７３７．２４４１，ｆｏｕｎｄ；７３７．２４４３．
【００７９】
＜ＰＢＯ−ＤＮＡの合成方法＞
下記スキーム５に従って、上記化合物（７）に代えてデオキシリボ核酸（１０ａ−ｄ）を用いること以外はＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物と同様にして、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンの各塩基を有するＬＮＡ未修飾ボラノホスフェート化合物（１１ａ−ｄ）をそれぞれ合成した。
【００８０】
【化１０】
2015093853.tif 000011
【００８１】
＜ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）の合成方法−固相法−＞
アポＢ（ａｐｏＢ）蛋白質をコードするｍＲＮＡの一部、アポＢ蛋白質ｍＲＮＡ（３’−ＣＧＵ  ＡＡＣ  ＣＡＵ  ＡＡＧ−５’：相補鎖ＲＮＡ、配列番号１）（アポ蛋白質Ｂ−１００：Ｎａｔｕｒｅ，２００６，Ｖｏｌ．４４１，ｐｐ１１１−１１４）と、対応するアポＢ蛋白質ＤＮＡ（３’−ＣＧＴ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＡＡＧ−５’：相補鎖ＤＮＡ、配列番号２）を標的核酸として選択した。相補鎖ＲＮＡ及び相補鎖ＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有し、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物由来の塩基を含むアンチセンス分子、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮを以下のようにして合成した。
【００８２】
５’-Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｎ３-ベンゾイルチミジンをスクシニルリンカーを介して担持させた固相担体（０．５μｍｏｌ）を、３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液（１ｍＬ）で１５秒間反応させて保護基を脱離させた後、反応溶液を除去した。同様の操作を４回繰り返した後、ジクロロメタン（１ｍＬ）で４回、アセトニトリル（１ｍＬ）で４回洗浄を行い、固相担体の真空乾燥を行った。
【００８３】
次に、以下の（ｉ）工程と（ii）の組み合わせを１１回繰り返すことでオリゴマーの鎖長伸長反応を行った。なお、モノマーは、標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列となる順序で、塩基配列におけるチミジンには上記で合成したＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物（９）を選択し、塩基配列におけるチミジン以外の塩基には上記合成のＬＮＡ未修飾ボラノホスフェート化合物（１１ａ−ｄ）を選択し、５’末端となるモノマーは、５’位に遊離の水酸基と、塩基としてグアニンを有するヌクレオシドとした。
【００８４】
（ｉ）工程：  配列に応じて選択されたモノマー（２０μｍoｌ）、ＭＮＴＰ（５０μｍoｌ)、及び２，６−ルチジン（１００μｍoｌ）を、アセトニトリル（０．２ｍＬ）で混合し、１分間反応させた。１分後、反応溶液を除去し、反応後の固相担体を、アセトニトリルで４回、ジクロロメタンで４回洗浄を行った。
【００８５】
（ii）工程：  前記（ｉ）工程後の固相担体を、３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン―トリエチルシラン（１：１、ｖ／ｖ）溶液（１ｍＬ）で５秒間反応させた。同様の操作を６回繰り返した後、ジクロロメタン（１ｍＬ）で４回、アセトニトリル（１ｍＬ）で４回洗浄を行い、固相担体を真空乾燥させた。
【００８６】
鎖長伸長後の固相担体に、トリエチルアミン（０．１Ｍ）／四塩化炭素−２，６−ルチジン−Ｈ２Ｏ（５：１２．５：１，ｖ／ｖ／ｖ）溶液を０．２ｍＬ加え、１時間反応させた。その後、反応後の固相担体を、アセトニトリル（１ｍＬ）で４回、ジクロロメタン（１ｍＬ）で洗浄した。
その後、洗浄後の固相担体に対して、２５％アンモニア水−エタノール（３：１、ｖ／ｖ）を５０℃下１２時間反応させることで、核酸塩基部位の保護基の除去と固相担体からの核酸オリゴマーの切り出しを行った。固相担体をろ別し、ろ液を回収した後、減圧留去した。残留物を４ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、クロロホルム（５００μＬ）で６回洗浄した。
【００８７】
得られた核酸オリゴマー（１２量体、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ）を、イオン交換ＨＰＬＣにて分離精製した。分離精製前後のイオン交換ＨＰＬＣの結果を図１に示す。イオン交換ＨＰＬＣ及び分離精製は、室温下、０〜１Ｍ  ＮａＣｌ、５０〜２５％アセトニトリルの１０ｍＭ  トリスＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）を流速０．８ｍｌ／分、２０分間の条件で行われた。図１（Ａ）に分精精製前のイオン交換ＨＰＬＣのグラフを示す。図１（Ａ）のメインピークに相当するフラクションを分取し精製した。図１（Ｂ）に分離精製後のイオン交換ＨＰＬＣのグラフを示す。
収率７％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ−Ｈ］−；  ３７６７．０２，  ｆｏｕｎｄ；  ３７６７．０６．
【００８８】
得られた核酸オリゴマー（１２量体、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ）は、ｄＧＣＡＴ'Ｔ'ＧＧＴ'ＡＴ'Ｔ'Ｃ（Ｔ'はＬＮＡ修飾したチミジンを表す。配列番号３）の塩基配列を有するアンチセンス分子である。
【００８９】
＜ＰＢＯ−ＤＮＡ（１２量体）の合成方法−固相法−＞
ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮと同様にして標的核酸（アポＢ蛋白質）の塩基配列と相補的な配列となるようにＮ４−イソブチリルシチジンと、アデニン、グアニン、チミン又はシトシンを塩基として有するＬＮＡ未修飾ボラノホスフェート化合物（１１ａ−ｄ）を用いて、順次、保護基を有する水酸基の脱保護反応、縮合反応を１２量体が得られるまで繰り返し行った後、酸化反応及び核酸塩基の脱保護反応を行い、ＰＢＯ−ＤＮＡ（１２量体）を得た。
得られたＰＢＯ−ＤＮＡ（１２量体）を含む溶液を、２５％ＮＨ３  −エタノール水溶液（３：１  ｖ／ｖ）で処理し、エタノール（２ｍｌ×４）で洗浄した。水溶液は減圧下で溶媒を留去した。残渣を水（４ｍｌ）に溶解し、クロロホルム（５００μＬ×６）で洗浄した。逆相ＨＰＬＣにて分離精製した。逆相ＨＰＬＣ及び分離精製は、３０℃で、０〜６０％アセトニトリルの０．１Ｍ  酢酸トリメチルアンモニウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）を流速０．５ｍｌ／分で６０分間行われた。
収率４４％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ−Ｈ］−；  ３６２７．０５，  ｆｏｕｎｄ；  ３６２６．８２．
【００９０】
得られたＰＢＯ−ＤＮＡ（１２量体）は、ＬＮＡ修飾ボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造を含まず、ＧＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＣの塩基配列を有するアンチセンス化合物である。
【００９１】
＜実施例１＞
相補鎖ＤＮＡの最終モル数が０．６０ｎｍｏｌとなるように、及び上記合成方法で得たＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）の最終濃度が４．０μＭとなるように、相補鎖ＤＮＡ及びＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）を１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解し、測定試料を調製した。この測定試料の塩濃度を１００ｍＭ  ＮａＣｌに調整した。その後、測定試料を光路長１ｃｍのセルに入れ、可視紫外分光光度計により２６０ｎｍにおける吸光度を、０．５℃／ｍｉｎの速度で温度を０℃から９０℃まで変化させて測定した。そして、１００ｍＭ  ＮａＣｌにおける相補鎖ＤＮＡとＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）との融解曲線を得た。その結果を図２（Ａ）に示す。この融解曲線から、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。その結果を表１に示す。
なお、融解温度（Ｔｍ）は、中線法で求めた。具体的には、得られた融解曲線の前遷移領域及び後遷移領域にそれぞれにおいて２点を指定し、回帰計算によりベースラインを求め、２つのベースラインの中線と融解曲線との交点を融解温度とした。
【００９２】
相補鎖ＤＮＡを相補鎖ｍＲＮＡに変更した以外は上記と同様にして、１００ｍＭ  ＮａＣｌにおける相補鎖ｍＲＮＡとＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）との融解曲線を得て、二重鎖融解温度を決定した。それらの結果を図２（Ｂ）及び表１に示す。融解温度は、実施例１と同様に決定した。
【００９３】
塩濃度を１Ｍに変更した以外は上記と同様にして、１Ｍ  ＮａＣｌにおける相補鎖ＤＮＡ又は相補鎖ｍＲＮＡとＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）との融解曲線を得て、二重鎖融解温度を決定した。それらの結果をそれぞれ図３（Ａ）及び図３（Ｂ）、並びに表１に示す。
【００９４】
＜比較例１＞
ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）に代えて、標的核酸と相補的な塩基配列を有する天然型ＤＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして、１００ｍＭ又は１Ｍの塩濃度における相補鎖ＤＮＡ又は相補鎖ｍＲＮＡと天然型ＤＮＡとの融解曲線を得て、二重鎖融解温度を決定した。それらの結果を図２〜図３及び表１に示す。
【００９５】
＜比較例２＞
ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）に代えて、標的核酸と相補的な塩基配列を有するＰＢＯ−ＤＮＡ（１２量体）を用いた以外は、実施例１と同様にして、１００ｍＭ又は１Ｍの塩濃度における相補鎖ＤＮＡ又は相補鎖ｍＲＮＡとＰＢＯ−ＤＮＡ（１２量体）との融解曲線を得て、二重鎖融解温度を決定した。それらの結果を図２〜図３及び表１に示す。
【００９６】
なお、表１中のΔＴｍ（℃）は天然型ＤＮＡの二重鎖融解温度との差を示す。図２〜図３の各図において、実線は天然型ＤＮＡを用いた場合の融解曲線を表し、点線はＰＢＯ−ＤＮＡ（１２量体）を用いた場合の融解曲線を表し、一点鎖線はＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（１２量体）を用いた場合の融解曲線を表す。
【００９７】
【表１】
2015093853.tif 000012
【００９８】
表１に示すように、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１Ｍ  ＮａＣｌのいずれの条件下においても、ＰＢＯ−ＤＮＡ（比較例２）の相補鎖ＤＮＡ又は相補鎖ｍＲＮＡに対する二重鎖溶解温度は、天然型ＤＮＡ（比較例１）の相補鎖ＤＮＡ又は相補鎖ｍＲＮＡに対する二重鎖溶解温度に比べ低い。このことから、天然型ＤＮＡへのボラノ基（ＢＨ３）導入により二重鎖形成能が低減することがわかる。
【００９９】
これに対して、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮ（実施例１）は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１Ｍ  ＮａＣｌのいずれの条件下においても、天然型ＤＮＡ（比較例１）及びＰＢＯ−ＤＮＡ（比較例２）に比べ、高い二重鎖融解温度を示した。このことから、ＰＢＯ−ＤＮＡへのＬＮＡ修飾により、ボラノ基導入による二重鎖形成能の低減を抑制し、かつ二重鎖形成能を高めていることがわかる。
【０１００】
このように、ＬＮＡＰＢＯ−ＯＤＮは優れた二本鎖形成能を有する核酸オリゴマーであり、有用なアンチセンス分子として使用可能であることが示された。
従って、本発明によれば、従来のボラノホスフェート型核酸オリゴマーと比較して、相補鎖との二重鎖形成能に優れた核酸オリゴマーと、この核酸オリゴマーを合成するのに適した新規ボラノホスフェート化合物を提供することができる。
【図１】
2015093853.tif 000016
【図２】
2015093853.tif 000017
【図３】
2015093853.tif 000018
【配列表】
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