(57)【要約】【解決課題】本発明は癌患者、化学療法や放射で癌治療を受けた重症骨髄抑制患者を含む重症骨髄抑制患者とヒト血球、及びその活性化に関する。【解決手段】ヒト血球を活性化して、投与するプロトコルを含んでいる。そのプロトコルは、サイトカイン及びイオノフォアなどのような活性化因子のあるもとでの血球培養を含むことがある。【選択図】図９
2008512454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重症骨髄抑制者を治療する方法は、体外培養血球を患者に投与して血液成分の濃度を高めることを含む。
【請求項２】
請求項１の方法の患者が人間である。
【請求項３】
請求項1の方法の骨髄抑制が癌病状に関連している。
【請求項４】
請求項1の方法の血液欠乏が好中球減少症、白血球減少症、血小板減少症、またはその組み合わせを含む。
【請求項５】
請求項1の方法の血液欠乏が重症や慢性の血小板減少症を含む。
【請求項６】
請求項1の方法の骨髄抑制が放射や化学療法で誘発されたものである。
【請求項７】
請求項1の方法では、治療効果のある量の血球が患者に投与される。
【請求項８】
請求項1の方法では、血球がサイトカインとイオノフォアのある下で培養される。
【請求項９】
請求項1の方法では、血球がサイトカインとA23187を含むイオノフォアのある下で培養される。
【請求項１０】
請求項1の方法では、血球がインターロイキン-2を含むサイトカインのある下で培養される。
【請求項１１】
請求項1の方法では、血球がマクロファージコロニー刺激因子を含むサイトカインのある下で培養される。
【請求項１２】
請求項1の方法では、培養がおよそ2日間未満実行される。
【請求項１３】
請求項1の方法では、血球が患者に対して自系や同種異系である。
【請求項１４】
請求項1の方法では、血球が遠心分離法によって血液血清から切り離される。
【請求項１５】
請求項1の方法では、血球が末梢血単核白血球である。
【請求項１６】
請求項1の方法では、血球が哺乳類の血清のある下で培養される。
【請求項１７】
請求項1の方法では、血球が免疫学的に許容できるドナーから採取された。
【請求項１８】
請求項1の方法では、投与が静脈注入で実行される。
【請求項１９】
請求項1の方法では、体外培養血球の投与が複数回投与を含む。
【請求項２０】
請求項1の方法では、精製した末梢血単核白血球が体外培養血球を形成するために培養された。
【請求項２１】
請求項1の方法では、血球がインターロイキン、細胞刺激因子及びイオノフォアのある下で培養される。
【請求項２２】
請求項1の方法では、血球が少なくとも三種類の細胞を含む。
【請求項２３】
請求項1の方法では、精製した末梢血単核白血球がleukopheresisによって得られた細胞収集から精製されて、体外培養血球を形成するために培養された。
【請求項２４】
請求項1の方法では、精製した末梢血単核白血球が培養の間、付着細胞と非付着細胞に分けられて、付着細胞や非付着細胞のどちらも体外培養血球の形成に使用される。
【請求項２５】
請求項1の方法では、体外培養血球が多分化造血を誘発する。
【請求項２６】
好中球減少症制者を治療する方法は、体外培養血球を患者に投与して血液成分の濃度を高めることを含む。
【請求項２７】
請求項26の方法では、患者に対して放射や化学療法の形で癌治療を行った。
【請求項２８】
請求項26の方法では、治療効果のある量の血球が患者に投与される。
【請求項２９】
請求項26の方法では、血球がサイトカインとイオノフォアのある下で培養される。
【請求項３０】
請求項26の方法では、血球がマクロファージコロニー刺激因子を含むサイトカインのある下で培養される。
【請求項３１】
請求項26の方法では、血球が患者に対して自系や同種異系である。
【請求項３２】
請求項26の方法では、血球が末梢血単核白血球である。
【請求項３３】
請求項26の方法では、血球がインターロイキン、細胞刺激因子及びイオノフォアのある下で培養される。
【請求項３４】
請求項26の方法では、血球が少なくとも三種類の細胞を含む。
【請求項３５】
請求項26の方法では、精製した末梢血単核白血球がleukopheresisによって得られた細胞収集から精製されて、体外培養血球を形成するために培養された。
【請求項３６】
請求項26の方法では、精製した末梢血単核白血球が培養の間、付着細胞と非付着細胞に分けられて、付着細胞や非付着細胞のどちらも体外培養血球の形成に使用される。
【請求項３７】
請求項26の方法では、体外培養血球が多分化造血を誘発する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は再生不良性貧血、貧血及び重度血小板減少症を含む骨髄抑制患者に対する療法に関している。特に、この発明は重度骨髄抑制患者に対する体外活性化免疫細胞療法に関している。その上、当発明は、活性化細胞のアプローチ及び対応する細胞培養のアプローチに関する。
【０００２】
関連出願
当特許出願は、「骨髄抑制患者に対する体外活性化細胞療法の構成と応用」と題する2004年9月10日ヤンにファイルされ、そして同時係属の米国特許出願番号No. 10/939,302及び「骨髄抑制患者に対する体外活性化免疫細胞療法の構成と応用」と題する2004年9月10日ヤンにファイルされ、そして同時係属の米国特許出願番号No. 10/939,302に関係している。
【背景技術】
【０００３】
再生不良性貧血は骨髄抑制患者の造血不良を特徴とする病気である。患者の各種類の血球生成に異なった程度の異常がある。病気の原因は多くの場合未知であるが、放射、ベンゼンベースの化合物、ウイルス(例えば、肝炎)、環境毒素及び店頭販売と処方箋薬物は骨髄損害の引き起こして骨髄幹細胞のアポトーシスに至って骨髄抑制を引き起こすと疑われた。根底の問題にかかわらず、患者は同様の臨床症状と病気進展経過を示している。再生不良性貧血は主として男女共に青年と年配の人に影響する。毎年、この疾患を発病する人は世界中の100万人あたりに2〜6人いる。ヨーロッパや米国と比べて、アジア諸国の有病率はより高い。再生不良性貧血のいくつかの病因が仮定される：先天的、妊娠、ウイルス、ドラッグ及び化学物質など。
【０００４】
再生不良性貧血の最も頻繁に言及された病因は再生不良性貧血の基礎となる骨髄抑制に繋がるドラッグや化学照射である。クロラムフェニコール、ベンゼン、電離放射線及び抗腫瘍薬などの病因は人の重症度薬剤用量に依存した無形成症を引き起こすこともある。これらの場合では、通常、病因中止の後に骨髄回復が起こる。殺虫剤、いくつかの抗けいれん薬及び殺菌薬を含む他の病因は、薬剤投与の間、血液学的検査で予測できない用量に依存しない反応を引き起こす。ドラッグの投与の間、無形成症は薬物療法の休止の後にさえ起こることもある。特発性再生不良性貧血の患者と比較して、薬物又は毒物に暴露された患者は、臨床又は人口学的特性からみて相似しており、同様の予後診断がだされ、治療に対し大体一定の反応がみられる。
【０００５】
ベンゼン誘発性の再生不良性貧血の場合では、通常、患者がベンゼンへの暴露を中止した後に、軽度から中程度の病徴が見えなくなる。しかしながら、重症骨髄障害患者や絶えず輸血を必要とする患者にとって、有効で安全な処理が従来利用可能ではない。これまで、骨髄移植は唯一の既知の治療法である。
【０００６】
軽度骨髄無形成患者に対しては限られた療法で治療が行われている。軽度骨髄無形成患者に対する最低限治療の論理的根拠は病因を取り除いて、その結果、自然治癒を可能にする。 重症貧血症を発病する若い患者では、HLA 適合ドナーによる骨髄移植は最適な治療法である。 骨髄移植効果はおよそ80%の場合完全回復の効果がある。しかしながら、ドナーと移植者は二つ以上の遺伝子座で不一致のとき、成功率は10-20%に減る。移植と関連する合併症は組織不適合性、急性又は慢性移植片対宿主拒絶反応、感染及び他の種々雑多な臓器特異障害を含む。また、骨髄移植移植者には、固形腫瘍を発達させるという長期的な危険性が増加する。
【０００７】
実に、骨髄は血液生成(造血と呼ばれる)と免疫機能に関わる細胞の多くを含んでいる。造血は種類豊富な系統の異なった細胞種類と絡み合っている。複数細胞系統の復元は血液システムの有効な機能に役立つ。 その結果、これらの細胞に対する抑制又は障害は血液、そして/または、免疫機能に影響する。骨髄抑制は骨髄細胞の活性が低下して、赤血球、白血球、そして/または、血小板がより減少する現象をもたらす状態である。白血球の著しい不足は白血球減少症、そして白血球に属する好中球の不足は好中球減少症と呼ばれる。骨髄抑制は、恐らく化学療法を受ける癌患者にとって最も一般的な副作用であり、白血球減少症、好中球減少症、そして/または、血小板の減少を引き起こすこともある。または、様々な病状は、一時的又は慢性の骨髄抑制を引き起こすことがあるが、骨髄抑制が病態生理学的状態によって誘発されることもある。
【０００８】
血小板減少症は血液における血小板の数が異常に低い状態であり、異常出血を誘発することがある。 血小板減少性紫斑病は一種の血小板減少症である。貧血と出血は血小板の減少に関連する可能性がある。重症と慢性の血小板減少症は、癌治療の合併症であり、治療するのは難しい。
【０００９】
ある成長因子は通常、それぞれの標準投与量での化学療法で引き起こされる発熱性好中球減少症や貧血や出血などの合併症又は骨髄抑制を治療する試みに使用された。例えば、G-CSFや赤血球生成促進因子やインターロイキン-11などの因子が使用されたことがある（ジェームス・O.アーミテージ。組換え型のヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の新規応用。血液, 92: 4491-4508, 1998; デヴィッドJ.KuterとC.グレン・ベグリー。 組換え型のヒトトロンボポイエチン: 臨床実験の基本的な生物学と評価。 血液、100: 3457 - 3469, 2002；Xunxiang Duとデヴィッド・A.ウィリアムズ。 インターロイキン-11: 分子、細胞生物学と臨床用途のレビュー。 血液89: 3897 - 3908, 1997。) 。 しかしながら、より多くの薬剤投与量増加の化学療法という投薬計画の投与がより良い治療効果を得るために追求されたので、より大きい度合いの急性そして長期間にわたる骨髄抑制はますます観測されるようになった。しばしば成長因子の治療に抵抗性を示す重症で長期化した骨髄抑制は、主に輸血と化学療法の投与量の増減によって治療される。そのうえ、重症で長期化した骨髄抑制と関連する血小板減少症は、IL-11(化学療法を通じて血小板減少症を治療するために、FDAによって承認された唯一のドラッグ)が血小板産生に適度の効果を持つので治療は特に難しい。トロンボポエチンは癌患者の巨核球前駆細胞と血小板放出の熟成と生存を促進できる有望な成長因子として特定されたが、しかしながら初期の臨床試験では、ある患者にはトロンボポエチンに対する抗原性があり、その抗原性が病気の悪化をもたらすことが示された (David J. Kuter と C. Glenn Begley。組換え型のヒトトロンボポイエチン: 臨床実験の基本的な生物学と評価。血液、100: 3457 - 3469, 2002；Junzhi Li, Chun Yang, Yuping Xia, Amy Bertino, John Glaspy, Michael Roberts,及びDavid J. Kuter。トロンボポエチンに対する抗体の開発によって引き起こされた血小板減少症。血液98, 3241-3248, 2001)。重症血小板減少症を予防そして治療するこの因子の有用性は確立されていない。
【００１０】
したがって、化学療法と放射線療法は癌治療や骨髄と幹細胞幹細胞移植の一部の手段として広く使用されるが、これらの療法の効力はしばしば副作用と密接に関連する。最も一般的な副作用は骨髄抑制である。化学療法と放射線療法で引き起こされた軽度から中程度の骨髄抑制は、通常、療法中止の後又は増殖因子による治療の後に自然に回復する。しかし、重症骨髄抑制は、めったに回復しない上に、しばしば感染、出血そして死亡さえもたらす。残念ながら、通常、血液産生の回復を加速するのに使用されるFDAによって承認された4つの増殖因子(G-CSF、GM-CSF、インターロイキン-11及び赤血球生成促進因子)は、重症そして/又は慢性の骨髄抑制及び多分化造血の回復には、有効でないことが多い。
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願番号No. 10/939,302
【非特許文献１】ジェームス・オー.アーミテージ；血液, 92: 4491-4508, 1998
【非特許文献２】デヴィッド．ジェイ．クッターとシー.グレン・ベグリー； 血液、100: 3457 - 3469, 2002
【非特許文献３】ファンシャン．ドーとデヴィッド・A.ウィリアムズ； 血液89: 3897 - 3908, 1997。
【非特許文献４】デヴィッド．ジェイ．クッター とシー．グレン  ベグリー： 血液、100: 3457 - 3469, 2002
【非特許文献５】ジュンジー  リー；チャン  ヤング；ユーピン  フェイア；エイミー  ベルチノ；ジョーン  グラスピー；ミケル  ロバート；デヴィッド．ジェイ．クッター；血液98, 3241-3248, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は骨髄抑制患者及び貧血、再生不良性貧血そして/又は血小板減少症などのような血液欠乏患者を治療するための培養(活性化)血球を使用する材料と方法を提供する。そのような扱い方は重症そして/又は慢性の骨髄抑制に対する治療法及び多分化造血の回復を含んでいる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の1つの実施例は骨髄抑制と関連する血液欠乏を発病する骨髄抑制患者を治療する方法であり、その方法が血液成分の濃度を高めるために体外培養血球を患者に投与することを含む。別の実施例は癌治療と関連する血液欠乏を発病するヒト患者を治療する方法であり、その方法が血液成分の濃度を高めるために治療効果のある量の体外培養血球を患者に投与することを含む。
【００１４】
別の実施例では、若干の血球を患者に注入するのは血液欠乏に対する有効な治療法である。 その若干の血球はサイトカインとイオノフォアの存在下で培養されることがある。サイトカインとイオノフォアは有効な濃度で存在している。サイトカインにはインターロイキン-2とマクロファージコロニー刺激因子がある。イオノフォアにはA23187がある。
【００１５】
別の実施例では、本開示は患者の血液欠乏を治療する方法を提供する。その方法が体外培養血球を患者に注入することを含む。治療効果のある量の血球を患者に投与しても良い。その血球は患者の自家組織や同種異系又は免疫学的条件に合った所有者からの物に分けている。その血球はさらにサイトカインとイオノフォアの存在下で培養される場合もある。サイトカインとイオノフォアは有効な量で存在している。
【００１６】
さらに別の実施例では、本開示はサイトカインとイオノフォアの存在下で血球を培養するのを含む血球培養方法を提供する。血球は、サイトカインとイオノフォアの有効な量の存在下で培養され、哺乳類の血清を含む又は含まない媒体に培養され、およそ2〜200時間又はそれ以上の時間で培養され、およそ30〜42℃の温度で培養されることがある。サイトカインにはインターロイキン-2、そして/又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子がある。 イオノフォアにはA23187がある。
【００１７】
ここで説明するのは、培養血球（活性化血球）によって骨髄抑制患者及び貧血、再生不良性貧血そして/又は血小板減少症などのような血液欠乏患者を治療する材料と方法である。そのような方法は重症そして/又は慢性の骨髄抑制に対する治療法及び多分化造血の回復を含んでいる。さらに、発明者は上述の相互参照付きの特許出願及びJiayu Chen, Weiwei Liu, Xiaohuai Wang, Huaiyu Chen, Jinming Wu, Yi Yang, Lubo Wu, Demao Yangの「ベンゼン誘発性再生不良性貧血の患者に対する体外免疫療法」、血液病治療と幹細胞研究の雑誌12: 505 - 514, 2003、Demao Yangの「反応、幹細胞と発展」13:162 - 163, 2004で体外活性化免疫細胞のいくつかの用途を明らかにする。培養という用語はこれらの技術で習慣的に使用される細胞の培養方法について言及する。培養は細胞が所期の効果を発揮するように細胞機械を動かすための生成条件に関係する。したがって、細胞を活性化するためにある因子と共に細胞を培養するのは、それらの数を増加するように体外で細胞を拡大培養する方法である。その一方、細胞を保存するまたは処理する方法は、例えば、独特のタイプの冷凍や分離などの方法によって、細胞の貯蔵又は選別される。
【００１８】
「治療効果のある量」という用語、当活性化血球を骨髄によって産生される赤血球、白血球、血小板や他の因子及び骨髄から生成される細胞などの自然な血液成分の濃度が著しく低いような血液欠乏症患者に投与する時、血球計数の統計的に顕著な増加をもたらす活性化血球の十分な数量に言及する。培養血球は患者又は免疫学的に許容できるドナーからの物である。
【００１９】
体外培養による活性化血球の1つのプロトコルは、患者又は免疫学的に許容できるドナーから血液サンプル(例えば、10-100ml)の取得を含む。取得した血液サンプルから血球を分離して、分離された血球を培養する。「免疫学的に許容できるドナー」は医学的に容認できないレベルの移植者反応(例えば、溶血性貧血、心不全、腎不全)を持っていない血球を含む組織を持つ人である。血球は遠心分離などのプロトコルによって血液血清から分離される。分離された血球は一種若しくはそれ以上のサイトカイン(細胞刺激因子を含む)とイオノフォアを含む培地中で無菌条件のもとで培養される。また、他の活性化因子はここで説明されるように使用することができる。分離された血球は上で指定される培地で培養される。例えば、およそ1時間以上の期間、別の実施例ではおよそ30〜42℃の間で、別の実施例でおよそ32〜40℃の間で、またはおよそ37〜38℃の間で、そこに含むいかなる温度範囲ある温度ではおよそ10〜200時間の間やおよそ20〜80時間の間又はおよそ30〜60時間の間で培養される。その技術分野における通常の知識を有する人は、これらの明白な範囲内の期間と温度範囲が熟考されるものであり、本発明の中にある。
【００２０】
ある実施例は血球そして特に末梢血単核細胞(PBMCs)の培養を対象にする。Boyumによって開発された後様々なテクニックを使用する1960年代以来、PBMCsの分離は実践されている（Boyum, A. (1964) 自然, 204, 793-794, 及び Boyum, A. (1967) スキャン, J. Lab. Clin. Invest Supplを参照）。PBMCsを使用するいくつかの実施例は一つの細胞種類だけを分離する必要は全くない。したがって、本質的に一つの細胞種類だけを取るための複雑な手順は避けられる。ある実施例は少なくとも2-20の細胞種類の血液培養を対象とする。普通の技術者は、この明白な範囲におけるすべての値が熟考されて説明される。単細胞タイプを分離するやり方には不要な細胞種類などのいくつかの偶然の不純物があると認められるが、しかし、そのような精製した標品は基本的に一つの細胞種類だけを含む。さらに、ある場合では、単細胞タイプが複数個の亜型を持つと見なすことができる。それにもかかわらず、そのような精製した培養はある共通点を持った一種類の細胞として、単細胞タイプと特徴付けることができる。ここに説明する方法のいくつかは特定の設備、オペレータ又は細胞種類に付番する方法によって変化を被りやすい数の複数個の血球タイプのキャプチャーを含む。それにもかかわらず、その方法と血液中の様々な細胞の種類を考えると、通常の技術者は、そのような方法によるいくつかの実施例が説明されるように必然的に多くの細胞種類、例えば、少なくとも2-20種類を捕らえることが理解できる。
【００２１】
いくつかの実施例が、さまざまな血球の種類を作成する血球培養と関連している。したがって、血球培養の開始に使用される細胞の種類や精密な細胞タイプにかかわらず、培養方法は血球の生産及び複数個の血球タイプの生成を対象としている。血球は、骨髄で見つけられたある多能性細胞から形成される。それが、血球の始祖であるが、血球として識別可能な機能特性を示すように分化するまでにはならない。
【００２２】
培養された後に、活性化血球は洗浄される(例えば、無菌食塩水によって二回)。そして、治療効果のある量の活性化血球は患者に投与される。活性化血球を投与する1つの許容できる方法が静脈注入である。活性化細胞は単一線量で投与されることがあるが、活性化血球の一部がある期間にわたって投与される。例えば、4週間の間にわたって目下の活性化血球の用量を1週間に一度患者に投与する。しかしながら、半週分、10日間、14日間、21日間、他の中期間又は他の有効な期間ごとに、目下の活性化血球の用量を患者に投与する。そのうえ、間隔は治療の間変化することがある。例えば、初期の血球投与量は、毎日、1週間に二度、毎週、そして/または、隔週の間隔で、投与される。用量は、患者の年齢と病状によって、１治療あたりおよそ1 x 105からおよそ5 x 108の細胞である。治療（例えば、現在の活性化血球の投与)に必要な合計時間は利用可能な活性化血球量と患者の反応に依存する。患者の反応は標準血球数そして/又は骨髄組織構造への回復及び健康における総合的な改善などの点から測定できる。明らかに、血液サンプルは、初期治療の間又は初期治療後に患者から繰り返して得ることができる。したがって、さらなる治療の追加活性化血球を得ることができる。その上、免疫学的に許容できるドナーからの活性化血球は治療の初期に投与、又は持続時間全体に投与できる。また、現在のプロトコルによって活性化された患者からの血球は免疫学的に許容できるドナーからの血球の初期投与後に投与される。
【００２３】
ここで説明するアプローチを通じて骨髄抑制から生じる多くの病気(例えば、血液欠乏)を治療することができる。一般に、血液欠乏は骨髄や骨髄からの特定細胞型などのような血液製品による血液成分の濃度低下に関わる。血液欠乏は貧血、再生不良性貧血及び血小板減少性紫斑病のような血小板減少症を含んでいる。貧血は概して血液成分の欠乏又は赤血球の欠乏などの前後関係によるものと考えられることができる。再生不良性貧血は末梢血因子の欠乏である。特発性血小板減少性紫斑病などの血小板減少性紫斑病は血小板数の欠乏にかかわる。
【００２４】
特定の例として、その治療法がより広く応用できる場合があるが以下の討論そして実例1は少し詳しく再生不良性貧血について説明する。例えば、実例3の癌治療による骨髄抑制のように、血小板減少性紫斑病も実例2のようにここで扱われる。そして、骨髄抑制による多分化造血の回復は実例4のように以下で議論される。
【００２５】
重症再生不良性貧血の最新定義は少なくとも以下の2つによって汎血球減少症とマークされる:1) 500/マイクロリットルより少ない顆粒球、2）2万/マイクロリットルより少ない血小板、3）1%未満の訂正済みの網状赤血球数及び造血性細胞激減の低形成骨髄による貧血。一般に、中度再生不良性貧血は重症範囲でない少なくとも二つの細胞株の低分化骨髄と血球減少にかかわる。発病は潜行性である。最初の症状訴えは貧血による進行性疲労であり、いくつかの場合では、その後出血となる。出血は、通常、血小板減少症にって皮膚と粘膜内層からのである。感染はまれに重症好中球減少症にかかわる。身体検査は青ざめや可能な損傷又は点状出血を明らかにする。再生不良性貧血患者はどんなリンパ節腫脹症も脾腫も示さない。発熱することがある。末梢血検定は汎血球減少症を示す。未熟な赤血球と白血球の存在は再生不良性貧血に対して強く論駁する。
【００２６】
増加する赤血球形成性圧力のため、赤血球は少し大赤血球性であり、そして正常赤血球や正常色素を持つ。訂正済みの網状赤血球数は安値又はゼロであり、赤血球生成の不足を示す。出血時間は正常な凝固パラメータがあっても長引くことがある。患者には増大した血清鉄と標準トランスフェリンがあり、高いトランスフェリン飽和率をもたらす。血漿鉄のクリアランスは赤血球生成の低減によって減少する。骨髄穿刺液は乾くことがある。しかし、生検は脂肪交換で重症低分化又は骨髄形成不全を明らかにする。初期骨髄生検が過形成を示した症例があったので、1つ以上の生検が正確な診断に必要である。憂鬱症は、脊髄、赤血球、多分化能細胞株及び骨髄巨核球を含むすべての造血前駆細胞の中で有名である。一般に、診断は、血液と骨髄標本で貧血、好中球減少症及び血小板減少症の古典的三徴の検出事項に基づいている。骨病変又は腫瘍浸潤物を除外するには、エックス線は必要である。磁気共鳴映像法は明らかに低形成骨髄を特徴づけるのに実用的である。診断が排除の一つであるので、通常、再生不良性貧血を診断できる前に、汎血球減少症と他の研究室調査結果の他の全原因が除外される。
【００２７】
再生不良性貧血における基本的な欠陥は骨髄抑制であるので、すべての細胞株の生成には障害がある。再生不良性貧血の病因の可能なメカニズムは以下である：1)造血幹細胞欠陥又は不足、2)異常な骨髄微小環境、3)異常な制御性細胞、4) 免疫細胞による造血抑制。
【００２８】
病気の病態生理学はまだ完全に明らかでないので、(Young et al., 後天的再生不良性貧血の病態生理学, N. Engl. J. Med. 1997; 336(19): 1365-1372 と Young et al., 後天的再生不良性貧血の病態生理の治療法、血液。1995; 85(12): 3367-3377) 再生不良性貧血が免疫介在性の病気であるという理論をサポートする証拠がある。結合した抗リンパ球グロブリンとシクロスポリンを使用する骨髄移植と免疫抑制療法は治療に使用された(Rosenfeld et al., 重症再生不良性貧血の治療法とする抗胸腺細胞グロブリンとシクロスポリンによる強化免疫抑制, 血液 1995; 85(11)：3058-3065 と Halperin et al., 子供の後天的再生不良性貧血：骨髄移植と免疫抑制療法における11年の経験, Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 1989; 11(3)：304-309). しかしながら、免疫抑制の療法には望ましくない重篤な副作用がしばしばある。そのうえ、顆粒球コロニー刺激因子などのような造血増殖因子(Kojima et al.,組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子による子供再生不良性貧血の治療、血液1991；77(5):937-941 と Sonoda et al., 再生不良性貧血患者 に対するフィルグラスチム(組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子)の長期投与の多分化反応, 幹細胞1993; 11:543-554),顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子(Champlin et al., 組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子による難治性再生不良性貧血の治療, 血液 1989; 73(3):694-699 と Guinan et al.,再生不良性貧血を発病する子供のための組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子第I/II相試験, 血液 1990; 76(6):1077-1082), インターロイキン3 (Ganser et al.,正常造血患者と骨髄損傷患者における組換え型ヒトインターロイキン3の効能, 血液 1990; 76(4):666-676 と Nimer et al., 再生不良性貧血と骨髄異形成を発病する患者におけるインターロイキン3に対する第I/II相試験, Exp. Hematol. 1994; 22: 875-880) は制限されて一時的効果だけを供給した。
【００２９】
多くの患者が免疫抑制療法に反応する。そして、様々な免疫分子の異常なレベルが形成不全患者にある。例えば、マクロファージやナチュラルキラー細胞やB リンパ球や内皮細胞によって産生されたインターロイキン-1は、骨髄間質細胞から赤血球と多分化能コロニー刺激因子の放出を誘発する、そして誘発性骨髄抑制の後に初期前駆細胞を調整して幹細胞回復を刺激することによって、免疫反応と造血規制における中心的役割を果たす。再生不良性貧血における免疫異常は低下したナチュラルキラー細胞活性や増加した数の活性T抑制細胞やインターロイキン-2とガンマーインターフェロンの異常産生から成る。
【００３０】
ナチュラルキラー細胞は直接的接触によって腫瘍細胞やウイルス感染細胞標的を溶解する大きい顆粒性リンパ球である。ナチュラルキラー細胞は、また、ガンマーインターフェロン、インターロイキンー2を産生し、コロニー刺激活性を誘発する。これらの細胞は一定の条件の下で骨髄と赤血球コロニー形成を抑制する。例えば、外因性の増殖因子が培養物にないとき、ナチュラルキラー細胞は、通常、サイトカインを産生して造血を支持する。しかしながら、最適条件ではナチュラルキラー細胞の造血に対する抑制を誘発する。再生不良性貧血患者のナチュラルキラー細胞活性は造血の回復後標準に戻る。
【００３１】
ガンマーインターフェロンは、活性リンパ球によって生成されて、造血を抑制する。形成不全患者はガンマーインターフェロンの生産過剰を示すが、ガンマーインターフェロンのレベルは免疫抑制作用に応えて減少する。インターフェロンは、前駆細胞に対する直接行動とアクセサリー免疫細胞を通じる間接的な効果による造血コロニー形成の強力阻害剤である。
【００３２】
腫瘍壊死因子アルファは再生不良性貧血で過剰に存在する別のサイトカインである。それは普通血液学先祖のコロニー増殖を抑制するように機能する。高い腫瘍壊死因子アルファ値は減少した血小板、血色素及び白血球数と関連する。腫瘍壊死因子アルファとガンマーインターフェロンは相乗的に造血抑制として作用する。
【００３３】
再生不良性貧血患者は、ガンマーインターフェロンと腫瘍壊死因子アルファを過剰に生成し、逆転したヘルパー: 抑制T細胞比を示す、主に骨髄にT抑制細胞がある。これらの細胞はサイトカイン産生によって造血に対する抑制を介在する。また、骨髄には末梢血より高い割合の細胞傷害性T細胞がある。免疫機能障害の臨床的関連は成功な免疫抑制療法による活性化リンパ球の減少で表明される。
【００３４】
後天的再生不良性貧血の一般的なメカニズム及びベンゼン誘発の再生不良性貧血の特別なメカニズムはよく理解されていない。それにもかかわらず、再生不良性貧血の二つのタイプは病態生理学と臨床症状に関する相当な類似性を共有する。現在、再生不良性貧血、直接障害と免疫介在のメカニズムについて説明する二つの仮説がある。二つの仮説は実証研究と臨床研究からのデータによってサポートされる。骨髄細胞に対する直接障害は細胞傷害性の化学療法と放射線療法による一時的で可逆的骨髄機能不全に関与すると考えられる。免疫介在の骨髄機能不全に対する治療がより難しい。ベンゼン誘発の再生不良性貧血の場合では、病気は二つのメカニズムと関連していると考えられる。骨髄細胞に対する直接障害の証拠はベンゼンが骨髄細胞に対する多くの生化学方法を抑制するのにかかわることを示す研究によって支持される。具体的に、ベンゼンは骨髄にある間質マクロファージを破損し、その結果、不十分なインターロイキン1産生を引き起こす(Niculescu et al., ベンゼンの代謝産物であるパラ-ベンゾキノンの生化学相互作用によってサイトカインを円熟させるプレ-インターロイキン1[アルファ] と 1[ベット]の転換に対する抑制, 1995; 98:211-222 と Kalf et al., パラ-ベンゾキノン, ベンゼンの反応性代謝物, プロセシング酵素、カルパインとインターロイキン1 [ベータ] 変換酵素に対する抑制によって、プレ-インターロイキン1[アルファ] と 1[ベータ]に対する処理を抑制してサイトカインを活性化する、環境衛生展望; 1996; 104 (suppl. 6):1251-1256). インターロイキン1は幹細胞の増殖と分化にとって重要である(Bagby, G.C.,造血間質細胞による多分化増殖因子の生成:単核食細胞とインターロイキン1を含む細胞間調節ネットワーク, 血球1987; 13:147-159 そしてFibbe et al., ヒト線維芽細胞はインターロイキン1とポリ(rl). ポリ(rC)による刺激の後、顆粒球-CSF, マクロファージ-CSFと顆粒球マクロファージ-CSFを生成する, 血液 1988; 72(3):860-866). しかしながら、インターロイキン-1を含む造血増殖因子の治療に対する長期に渡る反応のレポートが全くない。
【００３５】
重症慢性血小板減少症は、癌治療の合併症であり、扱うのは難しい。しかし、実施例３で示されるように、そのような病状は細胞活性化療法で首尾よく治療されることがある。実施例３では、既に従来の強化化学療法そして/または放射線療法に失敗した12人の患者がいた。これらの患者には皆、血小板数が20,000/mLほどなかった。これらの患者では、前のG-CSFによる従来の強化療法にもかかわらず、６人の患者には、また、低白血球数がある。これらの患者を治療するために、健康なドナーからの末梢血単核細胞(PBMCs)が2日間生体外において増殖因子とカルシウム動員因子の組み合わせで培養され、そして、その活性化細胞を1週間に3回静脈注入する。治療の1〜4週間後に、すべての低白血球数患者がより高いレベルの白血球を得た。同時に、血小板減少症の10人の患者は血小板数が40,000/mLに増加した。この療法は、安全で副作用が最小なので、耐容性良好である。培養細胞はさまざまなサイトカインを産生した。これらの研究と関連するデータは、ここに公表される療法が重症慢性でさえ血小板減少症の改善に役立つことを表明する。
【００３６】
そして、骨髄抑制は人体の造血能力に対する損害をもたらすことができる。ここで詳しく説明するのは、実施例４でマウス・モデルの方式で示された骨髄抑制を扱う細胞ベースの免疫療法である。実施例４では、同系脾臓細胞と異種ヒト末梢単核細胞は、2日間生体外においてサイトカインとカルシウム動員因子の組み合わせで培養され、そして、その活性化免疫細胞が多量化学療法と照射を受けた後にマウスに静脈注入される。注入されたマウスは高められた生存と造血回復を見せた。この療法は高効率なので、ただ一つの注入が多分化造血の回復と生存促進を刺激できる。そのメカニズムを研究する際、体外培養免疫細胞は複数のサイトカインを生成し、生存促進においてその付着細胞が非付着細胞より有効である。また、G-CSFと比べて、この療法は正常マウスに既存の幹細胞を動員する能力が低下することが認められた。
【００３７】
培地
体外活性化に使用される適当な培地は血球に必須栄養素を供給する。一般に、これらの培地には血球が直接利用できるすべての形の無機塩類、アミノ酸、ビタミン及び他の化合物がある。実施例と制限なしの方法で、1つの適当な培地がRPMI1640である。しかしながら、無血清の培地AIM-Vなどの他の培地は、適当可能の培養における血球を支える。培地は哺乳類の血清、培地重量の0.1〜50%や1〜40%や5%〜15%のレベルの牛胎児血清によって補足される。改質したRPMI1640として指定されて、米国タイプ菌株保存機関からのカタログNo.30-2001の下で利用可能なRPMIの1つの適当な剤形には、以下の成分がある:
2008512454.tif 000003
2008512454.tif 000004
【００３８】
1.  サイトカイン．サイトカインが血球を活性化するのに使用される時、1つ以上のサイトカインが使用される。サイトカインは、細胞によって放出される低分子タンパク質(通常5-20kDの範囲)であり、細胞間相互作用、コミュニケーション及び他の細胞の反応に特定の影響を与える。通常、サイトカインには、インターロイキン、リンフォカインと腫瘍壊死因子(TNF)やインターフェロンなどシグナリング分子が含まれる。天然サイトカインが使用できる間、組換え型サイトカインが産生され、例えば、確立した核酸発現系が考慮される。また、天然のサイトカインに機能を維持する変更や修飾したサイトカインが使用される。本発明のいくつかの実施例に適する典型的なサイトカインが以下に含まれる:
【００３９】
A インターロイキン. 特定タイプの細胞の機能に影響する種類が豊富な天然ポリペプチドで、少量づつ見出されている。それらは、リンパ球、単核細胞及び他の様々な細胞によって抗原性と非抗原性刺激に応えて分泌される調節タンパク質である。今日まで特定されている１６種類のインターロイキンは、リンパ細胞と他の細胞の増殖、可動度及び分化に対する規制によって、炎症と免疫を調節する。インターロイキンはおよそ10-5万IU/ml、100-5,000IU/ml又は100-1,000IU/mlの濃度に存在している。また、インターロイキンの相対的に有効な濃度が存在する。インターロイキンの有効な濃度は血球が現在のプロトコルによって活性化されるあらゆる濃度である。
【００４０】
i.  インターロイキン1 (IL-1). IL-lは、Tリンパ球とBリンパ球の活性化にかかわる単核白血球、マクロファージ、アクセサリー細胞によって分泌された可溶性タンパク(17kD: 152アミノ酸)であり、抗原や有糸分裂促進因子に対する反応を可能にする。IL-lの生物学的効果は幅広い他の細胞種類に影響する、そしてT-細胞活性化のためのマクロファージ要求性を取り替える能力を含んでいる。少なくとも2つのIL-1遺伝子が知られている。そして、IL-1のアルファとベータフォームは知られている。IL-lは早期に単核白血球とマクロファージ対応の免疫システムによって放出される。それはT-細胞の増殖と蛋白質の合成を刺激する。IL-1の別の作用は熱を誘発することである。
【００４１】
ii. インターロイキン2 (IL-2). IL-2は刺激を受けたTリンパ球によって放出されたホルモン様の物質である。IL-2は抗原と関係なく他のTリンパ球の活性化と分化を誘発する。IL-2は、免疫システムにおけるある病気治療血球の増殖を促進して、Thl CD4細胞によって分泌されてCD8細胞傷害性Tリンパ球を刺激する。また、IL-2はCD4細胞自体の増殖と成熟化を増加させる。
【００４２】
iii.  インターロイキン3 (IL-3). L-3は有糸分裂促進因子活性化T-細胞の生成物である。IL-3は骨髄幹細胞と肥満細胞に対するコロニー刺激因子である。IL-3は造血コロニー刺激因子の1つであると考えられる。
【００４３】
iv. インターロイキン4 (IL-4). IL-4はB-細胞の増殖と分化の誘発によって抗体産生を促進する活性化Tリンパ球によって生成された可溶性サイトカイン因子である。IL-4はクラスII主要組織適合複合体とfc受容体のB-細胞における表現を誘発する。また、IL-4はTリンパ球や肥満細胞株及び顆粒球、骨髄巨核球、赤血球前駆細胞、マクロファージを含む他のいくつかの造血系細胞に影響を与える
【００４４】
v.  インターロイキン5 (IL-5). IL-5は造血における好酸球分化と活性化を促進する因子である。また、それはIg-分泌細胞に最終分化のように活性化B細胞を誘発する。
【００４５】
vi. インターロイキン6 (IL-6). IL-6は、ヒトB細胞の増殖と分化を刺激し、また、ハイブリドーマ細胞と形質細胞腫の増殖因子でもある。それはT-細胞、単核白血球及び線維芽細胞を含む多くの異種細胞によって生成される。IL-6は増殖するように刺激されたT-細胞を含む他の多くの細胞に影響を与えると現在のところ知られている、前B細胞増殖因子として記述された単一チェーン25kDサイトカインである。
【００４６】
vii.  インターロイキン7 (IL-7). IL-7も、B先駆細胞の増殖を促進する造血増殖因子であり、熟成したT-細胞活性化のためにインターロイキン2と共分裂促進誘発のものである。IL-7は骨髄間質性細胞によって産生される。
【００４７】
viii. インターロイキン8 (IL-8). IL-8は好中球を活性化する、そして好中球とTリンパ球を引き付けるサイトカインである。IL-8は炎症性刺激で単核白血球、マクロファージ、Tリンパ球、線維芽細胞、内皮細胞及びケラチノサイトを含むいくつかの細胞種類によって放出される。IL-8はベータ-トロンボグロブリンのメンバーであり、構造上において、血小板因子4に関係する。
【００４８】
ix. インターロイキン9 (IL-9). IL-9は特に有糸分裂促進因子の刺激されるとき、T-細胞によって産生されたサイトカインである。IL-9は、赤血球前駆細胞(BFUE)の増殖を刺激して、造血の調節因子であると考えられる。IL-9は赤血球生成促進因子と相乗効果的に作用する。IL-9受容体は造血受容体スーパーファミリーに属する。IL-9は、ヒト肥満細胞と巨核芽球白血病細胞及びマウスヘルパーT-細胞クローンの増殖を高める。Il-9はT-細胞とヒト染色体位置5から生じる糖蛋白質である。
【００４９】
x.  インターロイキン10 (IL-10). IL-10はTh2ヘルパーT-細胞、いくつかのB細胞及びLPS活性化単核白血球によって産生された因子である。それは肥満細胞増殖の共調節因子である。
【００５０】
xi. インターロイキン11 (IL-11). IL-11は元々霊長類骨髄間質細胞株から分離された多面性サイトカインである。抗原特異的抗体応答、相乗骨髄巨核球を調整して、骨髄脂質生成を調節する能力を持っている。IL-11はT-細胞に依存するB細胞の成熟化、巨核球生成及び骨髄分化の様々なステージを刺激する。
【００５１】
xii.  インターロイキン12 (IL-12). IL-12は元々インターロイキン2の最適濃度以下にて相乗効果で細胞傷害性エフェクター細胞を誘発す性能によって特定されたジスルフィド結合した40kDと35kDのサブユニットで構成された75kDヘテロ二量体性サイトカインである。IL-12は、マクロファージによって感染に応えて放出され、細胞性免疫の活性化を促進する。具体的に言うと、IL-12はThl CD4細胞の成熟化、特定細胞傷害性Tリンパ球の反応及びNK細胞の活性化増加は誘発する。その結果、IL-12は細胞性免疫の創始者である。それは、NK細胞の溶解作用を促進して、インターフェロン産生を誘発して、活性化T-細胞とNK細胞の増殖を刺激する。ヒトBリンパ芽球様細胞(NC37)によって分泌される。
【００５２】
xiii. インターロイキン13 (IL-13). IL-13は未熟B-リンパ球によって増殖、免疫グロブリンアイソタイプの切り換え及び免疫グロブリン産生を引き起こすTリンパ球由来サイトカインである。IL-13は、活性化T-細胞によって産生され、単核白血球によってIL-6産生を抑制し、また、TNF、IL-1やIL-8などの他の炎症反応を促進するサイトカインの産生を抑制する。IL-13はB-細胞を刺激する。IL-13の遺伝子はIL-4遺伝子を持つ遺伝子群のヒト染色体5qに位置している。
【００５３】
xiv.  インターロイキン14 (IL-14). IL-14はB細胞増殖を誘発し、免疫グロブリン分泌を抑制し、選択的にあるB細胞部分母集団を拡大するサイトカインである。
【００５４】
xv. インターロイキン15 (IL-15). IL-15はTリンパ球の増殖を刺激し、IL-2と生物活性化を共有するサイトカインである。IL-15はBリンパ球の増殖と分化を誘発することもできる。
【００５５】
xvi.  インターロイキン16 (IL-16). IL-16はCD4陽性リンパ球と単核白血球の移動を刺激する活性化Tリンパ球によって産生されたサイトカインである。
【００５６】
B.  リンフォカイン。リンフォカインは別の細胞に作用する白血球によって産生された物質である。インターロイキン、インターフェロン  アルファ、リンホトキシン(腫瘍壊死因子アルファ)、顆粒球単核白血球コロニー刺激因子(GM-CSF)などが例である。
【００５７】
i.  インターフェロン(IFN)は通常、細胞におけるウイルス増殖の防止によってウイルス感染に対して抵抗する役割を持つ糖蛋白質ヒト細胞群である。インターフェロンはインターロイキンと同じ濃度で存在している。また、インターフェロンの有効な濃度は存在している。インターフェロンの有効な濃縮は、血球が現在のプロトコルによって活性化されるいかなる濃度も含むように熟考される。IFNアルファは白血球によって分泌され、そして、IFNガンマはウイルス感染の後に線維芽細胞によって分泌される。
【００５８】
1.  インターフェロン  ガンマは、特異性抗原や分裂刺激に応えてTリンパ球によって生産されたインターフェロンである。
2.  インターフェロン  アルファは、ウイルス感染や二本鎖 RNAによる刺激に応えて白血球によって生産された多くの異なった亜型を含む。そして、IFNアルファ2Aと2Bは遺伝子組み換え技術で作られたタンパク質製品であり、抗腫瘍薬として使用される。インターフェロン  アルファは、生きた又は不活化ウイルス、二本鎖 RNA又はバクテリア標品にさらされる時、末梢血白血球やリンパ芽球様細胞で産生されるタイプIインターフェロン(インターフェロンタイプI)の一つである。それは、ウイルス誘発の白血球培養によって産生され、その著しい抗ウィルス性の活性化に加えてナチュラルキラー細胞の活性化を誘発する主要なインターフェロンである。
3.  インターフェロン  アルファ-2aは位置23にリジンのある、165アミノ酸残基から成るタイプIインターフェロンである。 このタンパク質は、組み換えDNA技術で作り出され、白血球によって分泌されたインターフェロンに類似する。それは抗ウィルス性、または、抗腫瘍性因子として広く使用される。
4.  インターフェロン  アルファ-2bは、位置23にアルギニンのある、165アミノ酸残基から成るタイプIインターフェロンである。 このタンパク質は、組み換えDNA技術で作り出され、白血球によって分泌されたインターフェロンに類似する。それは抗ウィルス性、または、抗腫瘍性因子として広く使用される。
5.  インターフェロン  ベータは、インターフェロン  アルファと同じ刺激に応えて線維芽細胞によって産生されたインターフェロンである。インターフェロン  ベータは生きたウイルスや不活化ウイルス又は二本鎖 RNAによる刺激に応えて線維芽細胞によって作成されたタイプIインターフェロンの一つである。それは、抗ウィルス性、抗増殖性、免疫修飾活性のあるサイトカインである。
6.  インターフェロン-b2 (インターフェロン-6)は、ヒトB細胞の増殖と分化を刺激するサイトカインであり、また、ハイブリドーマ細胞と形質細胞腫の増殖因子でもある。それはT-細胞、単核白血球及び線維芽細胞を含む多くの異種細胞によって生成される。INF-b2は増殖するように刺激されたT-細胞を含む他の多くの細胞に影響を与えると現在のところ知られている、前B細胞増殖因子として記述された単一チェーン25kDサイトカインである。INF-b2は急性期タンパク質の誘発因子とマウス骨髄に影響するコロニー刺激因子である。
7.  インターフェロン  ガンマは、特異性抗原や分裂刺激に応えてTリンパ球によって生産される。
【００５９】
ii. 腫瘍壊死因子(TNF)は、細菌性リポ多糖類にさらされた動物血液中に姿を現す腫瘍抑制因子である。TNFは選択的に生体内そして生体外で腫瘍細胞を殺し、マウスにおけるある種の移植腫瘍細胞の壊死を誘発し、実験的転移を抑制する。ヒトTNFアルファは、157アミノ酸のタンパク質であり、さまざまな炎症反応を促進する作用を持つ。TNFはインターロイキンと同じ濃度で存在している。また、TNFは有効な濃度に存在している。TNFの有効な濃度は血球が現在のプロトコルによって活性化される濃度である。
【００６０】
C.  細胞刺激因子。1つ以上の細胞刺激因子のある時、活性化血球は本発明の前後関係における再生不良性貧血を軽減する際に効果を生じる。細胞刺激因子は、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子などのものを含むように熟考される。細胞刺激因子はおよそ10-50,000IU/ml、10-10,000IU/ml又は10-1000IU/mlの濃度に存在している。また、細胞刺激因子の有効な濃度は存在している。細胞刺激因子の有効な濃度は血球が現在のプロトコルによって活性化される濃度である。
1.  顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF):G-CSFは、種類豊富な細胞によって合成された糖タンパク質であり、造血幹細胞の増殖と分化にかかわる。さらに、これらの因子は幹細胞の終末細胞機能的活性化を刺激する。
2.  顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF):GM-CSFは、内部ジスルフィド結合のある23kD酸性糖タンパクである。GM-CSFは、造血環境と炎症末梢部位にある間葉細胞によって、多くの炎症性メディエータに応えて産生される。GM-CSFは骨髄細胞からの好中球、マクロファージ及び混合顆粒球マクロファージコロニーの産生を刺激して、胎児肝臓前駆細胞による好酸性コロニーの形成を刺激できる。
3.  マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF):M-CSFは、間葉細胞によって合成されたサイトカインである。単核白血球(単核の食細胞)の産生のために、骨髄の多能性幹細胞を分化するように刺激するこの化合物は単核白血球マクロファージシリーズの造血性細胞の生存、増殖及び分化を刺激する。それは、70kDの分子量をもつジスルフィド結合の糖タンパク質二量体であり、c-fmsガン原遺伝子の生成物と同じ単一種類の高親和性受容体に結合する。
【００６１】
2.  イオノフォア。イオノフォアは、脂質二重層と脂溶性を妨害できるカルシウムや他の陽イオン特異試薬(polypeptratesなど)である。2種類のイオノフォアがある:キャリヤーとチャンネル型。バリノマイシンのように、キャリヤーは、特定イオンの周りで檻のような構造を形成して、二重層の疎水性部分を通って自由に拡散する。グラミシジンのように、チャンネル型は、二重層を通して連続的水性微細孔を形成して、イオンの抑えを許容する。上記に加えて、当プロトコルに向かう適当なイオノフォアはA23187(カルシマイシン)、イオノマイシン、ゲルダナマイシン、モネンジン(Na塩)、ニスタチン、ポリミキシン-B硫酸塩及びラパマイシンを含む。A23187のようなキャリヤーはpH勾配に応えてカルシウム陽イオンを蓄積する。A23187は、解離カルボン酸グループを持って、細胞膜を横切って他の陽イオンのために陽子の電気的に中立の交換を触媒する(Hyono et al., BBA 389, 34-46 (1985):Kolber と Haynes, 生物物理学雑誌, 36, 369-391 (1981); Hunt と Jones, 生物科学.Rep., 2, 921-928 (1982)).A23187の二分子がカルボン酸陰イオンとして存在し、その結果、運積の二価陽イオンを放出後の細胞膜を横切って、陽子、または同等物まで運ぶために利用可能である。存在するなら、イオノフォアはおよそ1〜10,000 ng/ml、1〜1000 ng/ml又は10〜500 ng/mlの間の濃度に存在している。また、イオノフォアは有効な濃度に存在している。イオノフォアの有効な濃度は血球が現在のプロトコルによって過剰活性化でないように活性化される濃度である。因子の活性化過密はここで説明する治療アプローチにおて有効ではない。
【００６２】
使用、パッケージ及び配分
活性化細胞の配送は患者の臨床的指標における統計的に顕著な改善を提供できる。例えば、ここでの説明通りに活性化細胞の投与は、白血球数、赤血球数、血色素レベル及び血小板数の統計的顕著な増加をもたらす。一般に、ここで説明する治療手順の継続は正常な血中濃度へ戻すことができる。いくつかの実施例では、四回の治療後に、患者は白血球数、赤血球数及び血色素がそれぞれ少なくともおよそ20%、別の実施例では少なくともおよそ35%、そして他の実施例では少なくともおよそ50%増加した。同様に、血小板数は、いくつかの実施例では少なくともおよそ25%、他の実施例で少なくともおよそ50%、さらなる実施例ではおよそ100%増加できる。この技術に関する普通の技能をもつ人は、提出範囲内の血液パラメータ改善の追加範囲が熟考されて、本開示内にあると承認する。
【００６３】
1つ以上のサイトカイン、そして/または、1つ以上のイオノフォアなどのような活性化化合物は、配分のために、適切な細胞培地や部分に混ぜられることができる。別の実施例では、一つ以上の活性化化合物は、出荷のために、細胞培土や部分と共にパッケージできる。同様に、1つ以上のサイトカインやイオノホアなどの活性化化合物の必要な組み合わせは、出荷のために、一緒にパッケージ、混ぜられることがある。これらの実施例のいずれでは、培土そして/又は活性化化合物は、残存培土要素そして/又は活性化化合物に結合されて、細胞の培養に必要な培土を形成する。また、これらの実施例のいずれでは、一緒にパッケージされる組み立ては、活性化特性で細胞培土を完成する指示そして/又は細胞培養を実行する指示などを含む。
【００６４】
細胞培養は、患者を治療する施設で、または離れた場所で実行できる。どちらの場合でも、活性化細胞は、細胞が生き抜くことを保証するために、細胞培養から収穫後の短期間の後に投与されることができるようになる。また、存続能力のある状態に細胞を維持する条件のもとで細胞を格納できる。例えば、凍結保護物質は液体窒素温度で細胞を格納できる。患者に投与する適切な時、既知の手順で、細胞を準備できる。細胞は患者に投与する緩衝生理食塩溶液で一時保留できる。他の既知のキャリヤーは細胞の配送に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
【実施例１】
【００６６】
再生不良性貧血の治療
I. 患者
ベンゼンに対する1〜6年間職業被曝の照合経歴をもつ8人の患者に対して、彼らの同意を得た後に、現在の投薬計画を行うようになった。その患者は、1人の男性と7人の女性であり、患者の年令が24から41までの幅がある。これらの患者の中に、四人の患者は急性出血症状によって入院したことがある。これらの入院患者は輸血や血小板輸血を必要とした。他の4人の患者は、慢性症状を経験して、それぞれ4月間、6月間及び15月間標準治療法によって治療された。造血を確認するために、骨髄生検と吸引サンプルは、すべての患者から採取された。ベンゼンの毒性量は患者の血液と骨髄に存在していた。
【００６７】
II． 末梢血単核白血球と細胞培養の精製
末梢血単核白血球(PBMCs)はFicoll-Hypaque遠心分離法によって患者血液サンプル(40-50ml)から分離された。分離されたPBMCsは、10%のウシ胎仔血清と一緒に滅菌状態におけるRPMI1640の適切なボリューム(細胞濃度に基づく)に置かれ、500IU/ml(ケイロン、エマリービル、CA)のインターロイキン-2(IL-2)、200IU/ml(イミュネクス、シアトルワシントン)の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)及び100ng/ml(シグマ、セントルイス、MO)のカルシウムイオノフォアA23187などのある時、2x106セル/ミリリットルで48時間培養された。培養期間の終わりに、付着細胞は、培養容器のプラスチック表面から擦り落とされて、非付着細胞と共に取り入れられた。その細胞を取り入れるために、細胞ペレットを形成するように細胞を遠沈した。異なった数の細胞は異なった患者のために採取された。採取された細胞は塩水で二度洗われ、患者に投与された。洗われた後、その細胞は5〜10mlsの塩水で再懸濁された。塩水量は細胞数によって確定する。これらの懸濁液は、その細胞を患者に投与する前に、50mlの塩水でさらに希釈された。
【００６８】
治療プロトコール
活性化同種異系PBMCsは、最初の3つの治療ではたった一人の患者(HC)に使用された。その患者が少ない血球数、大量出血及び感染を経験したからである。他の患者に関しては、活性化PBMCsは50mlの塩水で患者に静脈注入された。その治療は少なくとも4週間を通じて毎週繰り返された。特定患者に投与された細胞数は患者から採取された細胞数に依存した。
【００６９】
III. 結果
血液学的パラメータ
白血球数、赤血球数、血色素レベル及び血小板数などの血液学的パラメータは、各患者に対する治療の前後にモニターされて、Table1に示される。これらの患者からのデータは、療法が末梢血細胞数を促進するのにおいて効果的であることを示した。リストに記載された1つ以上のサブセットの改善を経験した患者が6人、より良い血小板数を経験した患者が2人であった。二回の治療後、ほとんどの患者の血球数は、向上し始めて、当活性化細胞が投与された後に向上し続けた。8人の患者のうちの7人は、四回の治療後、いくつかの血液学的パラメタが正規水準に又は接近正規水準に達するという範囲に向上した。患者の血球数は一般的に療法によって向上されたが、改善は一様に達成されたことではない。赤血球数の有限な改善を得たが、血小板数の劇的な改善を得た患者がいた。全部患者の血小板数が著しく増加した。
【００７０】
患者HCは他の患者より重症急性症状を経験した。さらに、患者HCには、また、出血問題があった。患者HCの末梢血球の低い産生高のために、同種異系PBMCsは患者HCの造血を刺激するのに使用された。同種異系細胞による三回の治療後に、患者HCの血球数は向上し始めた。そして、同種異系細胞による三回の治療後に、自系PBMCsは療法を続けるのに使用された。患者HCの血液学的パラメタは六回の治療後に正規水準に修正されなかったが、患者HCは向上し続けていた。
【００７１】
不快症状に応じる当免疫療法の投与は軽度から中程度である。5人の患者はどんな感知できる不快も経験しなかった。3人の患者は細胞注入の後、寒気、37℃から39℃までの熱病、頭痛、吐き気、嘔吐及び食欲不振を経験した。しかしながら、これらの症状は一時的で、通常1〜2日間続いた。患者が不快を経験したとき、アスピリンは投与された。
【００７２】
骨髄造血
療法開始前と最終治療の2週間後に、全部患者から骨髄生検と吸引サンプルを採取した。図1で示すように、最も重症サンプルをもった3人の患者からの骨髄サンプルの組織構造は療法開始前に重症損害を示した。療法が投与された後に、骨髄組織構造における顕著な改善は発見された。しかしながら、患者HCに関して、患者HCの骨髄で観測された改善は改善された末梢血数と一体となっていなかった。
【００７３】
輸血
治療開始前に、8人の患者のうちの4人は、出血と一体となる重症病状を経験した。これらの4人の患者は、治療前と治療間、全血か血小板の周期的注入を必要とした。しかしながら、四回の治療後に、出血を経験する患者がいなく、そして、全血と血小板輸血が中止された。
【００７４】
持続時間
当細胞ベース療法の有益な効果は一時的ではない。すべての患者は、療法中止後に、改善された又は安定した血液学的パラメタを持ち続けていた。何人かの女性患者は月経の間不安定な血球数を経験したが、どんな患者も再発を経験しなかった。療法に応じた患者LCは最終治療(図2)以来2カ月以上安定した症状を経験した。
【００７５】
議論
この研究の結果は、活性化PBMCsを再生不良性貧血を発病する患者に投与するのが高効率であることを示す。患者の中には、正常骨髄に近接する組織構造を持ったが、標準に近接しない末梢血液学的パラメタを持っていた人もいた。時間ギャップが骨髄組織構造の回復と末梢血細胞数の回復の間に起こったことが分かった。このギャップを経験する患者は、厳密にモニターされ、そして、患者の血液学的パラメタが継続的な改善を示した。これらの患者は、正規の末梢血細胞数に達するには時々何週間も又は数カ月かかった。
【００７６】
研究で発生するデータを分析する際に、患者が療法から得た利益の中で、血液の異なった区画における血小板の増加が最も明白で、顕著で、急速であることは注意された。血小板にはより速い増殖と分化合間があるということは、血小板数の初期増加の可能な原因である。また、好中球、顆粒球、網状赤血球などの他の血球種類は、リストアップされた4つのパラメタ(データを図示せず)に一致して改善された。血小板数は、他の血球よりベンゼン毒性に最も敏感であるが、より速い増殖間隔のために当療法にもっとも影響されやすい。
【００７７】
後天的再生不良性貧血は治療しにくい病気である。しかしながら、当免疫抑制療法はこの病気を治療するのにおいて非常に効果的であった。これまで、骨髄移植はこの病気を治療する唯一の治療法であるしかしながら、骨髄移植の成功にもかかわらず、この療法には腫瘍などの重篤な合併症(Socie et al.,治療後に起こる悪性腫瘍, N. Eng. J. Med. 1993; 329(16)：1152-1157)と移植片対宿主拒絶反応がある(Ferrara et al., 移植片対宿主拒絶反応, N. Engl. J. Med. 1991(324); 324:667-674). そのうえ、多くの患者は手順の費用そして/又は適合するドナーの不足によって、骨髄移植の治療を受けられない。このために、より少ない副作用を伴う簡単で効果的な療法は、再生不良性貧血を扱うのに必要である。この研究の結果は、最小の副作用で再生不良性貧血を有効に扱うことができることを示す。当細胞ベース免疫療法は、また、他のタイプの貧血と骨髄異状に適切である。これらの疾患は、カクテル化学療法を受けたHIV(ヒト免疫不全ウイルス)感染者、化学療法と放射線療法を受けた骨髄機能不全の癌患者、遺伝性再生不良性貧血と血小板減少性紫斑病の患者によって経験された。
【００７８】
この発明の操作の特定理論的基礎によって縛られることを願っていない間、現在、いくつかの現象が当免疫治療に対する患者の良い返事の原因であると分かった。最初の理論は活性化細胞が同時に複数(恐らく部分的に未知)の有効因子を分泌するということである。一斉に働くとき、これらの重複因子には相乗的結合効果がある。当療法の有効性に仮定された2番目の原因は、造血に関するいくつかの現在未知の主要因子が活性化免疫細胞によって産生されるということである。これらの未知の因子は当療法の有効性に少なくとも一部原因となる。関係する3番目の原因は、免疫細胞が骨髄に移動して、そして近距離で造血幹細胞と他の前駆細胞にサイトカインを届けることができるということである。そのうえ、当活性化免疫細胞は、骨髄における微環境改善を影響する間、骨髄に極めて接近するように保持することができる。当療法の有効性原因となる4番目の原因は、造血細胞の増殖と分化にとって、免疫細胞と造血性細胞との細胞接触が不可欠であるということである。5番目の原因は、少量でさえの活性化免疫細胞が免疫システムを造血から不利影響を防止するのに貢献するということである。10-100mlの血液からのPCMBs量は比較的少ない。しかしながら、これらの少量のものは骨髄組織構造と造血に大きい効果を生じた。
【００７９】
当プロトコルによって活性化された血球を投与する結果は、前の研究結果から見て予想外である。1つの研究に対する異論をもって、Young et al.は(ノート2) 好中球番号だけに影響するように投与された増殖因子(顆粒球コロニー刺激因子と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)を発見した。その研究は、顆粒球コロニー刺激因子が投与された時の好中球と血小板数の著しい増加を示した。単独でまたは顆粒球マクロファージ刺激因子と組み合わせて投与されるインターロイキン-3は、骨髄造血に対する効果が単独で投与された増殖因子より少なかった。同様 (Liu et al., 造血における細胞間相互作用, 血球 1987; 13:101-110 と Ettinghausen et al., 癌患者に対するリンフォカイン活性化キラー細胞と組み換えインターロイキン-2による免疫療法の血液学的影響, 血液 1987; 69(6):1654-1660), 活性化末梢血単核白血球とインターロイキン-2を患者に投与すると、「強調」貧血とoesinophiliaがこの療法を受けるということが発見された。
【００８０】
本発明も製造の項目を含むように熟考される。上述でより完全に説明する通り、1つ以上のサイトカインとイオノフォアの独立包装容器を含む。容器中身は、当療法プロトコルにおける使用のために、血球の培養と活性化に使用される。ラベルなどの指示は製造の項目に存在する。血球の培養に適当な培土はさらに含まれる。
【実施例２】
【００８１】
血小板欠乏の治療
この例は特発性血小板減少性紫斑病を発病する1年5ケ月の女性患者に対する治療について説明した。患者はおよそ9ケ月でその病気を発病したと診断された。
【００８２】
患者は、最初に、副腎皮質ステロイドと免疫グロブリンの静脈注入などの伝統的療法で治療された。患者はその伝統的療法に応じたが、副腎皮質ステロイド療法に完全に依存するようになった。十分な血小板レベルを維持するために、患者はますますより高い投与量の副腎皮質ステロイドを受け取らなければならなかった。
【００８３】
そして、患者はここに説明するような活性化細胞ベースの療法で治療された。その治療は、毎度40-50 mlsより20mlsだけの血液を患者からを採取したことを除いて、実例1の説明と同じであった。患者は9週間を通じて1週間に一度治療された。体外活性化細胞は1日目、8日目、15日目、22日目、29日目、35日目、42日目、49日目及び56日目に投与された。それと同時に、活性化細胞による免疫治療が開始され、副腎皮質ステロイドといかなる他の伝統的療法が完全に中止された。患者の血小板レベルは、活性化細胞による治療の間、図2に示されるように徐々に向上した。患者は、49日目に、血小板数の著しい減少と関連する肺感染にあった。患者が感染から回復した後に、患者の血小板数は正規水準に戻った。
【実施例３】
【００８４】
血小板減少症の治療
I. 患者
末期血液と転移性固形癌の成人患者は当研究(表2)に登録された。研究開始前に、患者は放射線療法のある又はない集中的な化学療法を受ける必要性があった、そして絶対好中球数=500/mL、血色素濃度=6.50gm/dL、血小板数=20,000/mLのような重症骨髄抑制を経験していた。研究における患者はG-CSF、赤血球生成促進因子及び最小量のインターロイキン-11による併用療法を少なくとも2週間受けなければならなかった。また、選択された患者は血小板数=20,000/mLと定義された重症血小板減少症から回復したことがなかった。患者は予防的血小板輸血に依存するのが必要であり、固形癌の患者には激痛を伴う癌細胞の骨への転移があって鎮痛のために放射線治療を必要とするなどが条件であった。
【００８５】
【表２】
2008512454.tif 000005
【００８６】
また、患者は、研究にふさわしいように以下の基準を満たす必要があった:東方協同腫瘍学組織(ECOG)の癌の状態を表す指標=2、臨床上重症心臓または新陳代謝の病気がない。適切な肝臓と腎臓の機能(合計ビリルビンレベル52.0mg/dL、血中尿素窒素(BUN)530mg/dL、血清中クレアチニンレベル52.0mg/dL)。標準の左心室駆出率(=放射性核種駆出率[RNEF]の50%)。
【００８７】
または、副腎皮質ステロイド又は抗凝固薬による治療を受ける患者は除外された。また、研究開始前4週間以内にいかなるサイトカインや治験薬を受けた患者は、不適格であった。全患者は、同意書に署名しなければならない。そのプロトコルは病院の施設内治験審査委員会によって承認された。
【００８８】
II.末梢血単核と細胞培養の精製
ABO適合同種異系白血球は、leukopheresisによって健康なドナーから採取され、Ficoll-Hypaque遠心分離法で末梢血単核白血球(PBMCs)に分けられた。PBMCsは、500IU/mLのIL-2(Ruixing生物薬剤有限責任会社、中国北京)、200U/mLのGM-CSF(NCPC、中国石家荘)及び100ng/mLのカルシウムイオノフォアA23187(シグマ、セントルイス、MO)の存在下で、48時間3x106/mlの滅菌状態において10%のウシ胎仔血清(FCS)(Jiangbin 生物試薬、中国杭州)によってRPMI-1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)で培養された。IL-2とGM-CSFの濃度は単核白血球とT-細胞に最大限度の刺激活性を持つように定められ、FCSはヒト免疫細胞の増殖と分化に対する支持においてヒト血清より強いので、細胞培養に加えるように選ばれた。この研究で使用されるFCSは、加熱不活性化されなかった。付着細胞は、プラスチックから擦り落とされて、非付着細胞と共に取り入れられた。そして、その細胞は輸液前に塩水で３回洗浄された。
【００８９】
III.研究デザイン
この非盲検、非無作為化臨床実験に、12人の適任患者が登録された。患者は0日目、1日目及び2日目に5×107活性化免疫細胞の日用量で注入され、その後、3日目から7日目までは静止期間を置いた。3日間の治療と4日の休息というサイクルは最大4週間にわたって1週間に一度繰り返された。本治療法の間、血小板数が40,000/mLを越えた時は治療が中止された。
【００９０】
血小板数は非連続日の間、少なくとも週に3回モニターされた。20,000/mLより血小板数が減少したときは血小板を輸血した。この予防性血小板輸血方針は、この研究における全治験責任医師によって従われた。最新の数が40,000/mLより大きかったなら、血小板算定は3日後に繰り返し測定された。増殖因子の併用は血小板回復に対する混乱させる影響の可能性を最小にするのを許容されなかった。塩酸プロメタジンは、細胞輸液が副作用を減少し始めるすぐ前に定期的に患者に投与された。
【００９１】
IV.サイトカイン分析
細胞培養開始の2日後に、非付着細胞は、集められて塩水で二度洗浄した。また、付着細胞は培養瓶で塩水で徐々に二度洗浄した。洗浄した非付着細胞はサイトカインなしで同じフラスコで新鮮な培地に戻され、カルシウムイオノフォアを追加してさらに3日間培養を続けるた。浮遊物は、サイトカイン分析のためにLuminexR xMAPR システム(Luminex , Austin, TX)によって、上清液が収集されてプールされた。
【００９２】
V.  結果
A．細胞収率
2日間の培養の間、いくつかの細胞がGM-CSF、IL-2及びカルシウムイオノフォアからの刺激によって生き残って大きくなり、一方、無反応細胞は死んた。細胞培養前後の細胞数における違いは小さかった。
【００９３】
B．血小板回復
重症と長期に渡る血小板減少症を発病する10人の患者は、血小板数が= 40,000/mL (図3)に増加して、療法に応じた。他の2人の患者は応じなかった。体外活性化免疫細胞による療法(治療サイクルが最大4週間にわたって週に一度繰り返される。0日目から始まって連続的3日間投与される)を受けた後の血小板数を示す（図３参照）。各線は患者の血小板数の動態変化を示す。断続線は40 x 109 セル/mLの血小板数を示す。血小板改善を示した10人の患者のうち、2人は三回の治療を受け、3人は六回の治療を受け、3人は九回の治療を受け、そして、他の2人は12回の治療を受けた。12人の患者のうちの2人は、12回の治療後に療法の終点に達しなかった。
【００９４】
C．白血球回復
また、6人の患者には白血球数が低かった。G-CSFによる強化治療にもかかわらず、白血球数は依然として標準より低かった。活性化免疫細胞による療法の結果、6人の患者のすべては白血球数が正規の水準(図4)へ上昇して、回復した。体外活性化免疫細胞による療法(治療サイクルが最大4週間にわたって週に一度繰り返される。0日目から始まって連続的3日間投与される)を受けた後白血球数を示す（図4を参照）。白血球の回復は血小板の回復より早かった。主として重症骨髄抑制患者にとって、一週間から数週間早くなった。血小板は上記に説明したように上昇しなかった2人の患者は、白血球数の改善を示した。一般に、血小板数の治療と回復は白血球の治療と回復より長い時間がかかることがわかった。
【００９５】
D．サイトカイン産生
サイトカインのグループは、これらの治癒力のある細胞が複数のサイトカインを産生するかどうか確定するように選択された。表3に示すように、19種のサイトカインが測定された。7(IL-1b、IL-2、IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、MIP-1b)は非常に高いレベルにあり、9(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18、IFN-ガンマ及びMCP-1)は適度のレベルにあり、他の3(IL-7、IL-12及びEotaxin)は非常に低い分泌レベルであった。
【００９６】
【表３】
2008512454.tif 000006
【００９７】
E. 臨床許容範囲
体外活性化免疫細胞による療法はすべての患者によってよく許容された。どんな皮膚反応、体液貯留、血栓塞栓現象、または臓器毒性も発見されなかった。最も一般的な副作用は、寒気、37°Cから39°Cまでの発熱、頭痛、吐き気、嘔吐及び食欲不振であった。これらの副作用は、たいてい輸液に関連し、一過性であった。細胞注入後の24時間内に多くは解消された。これらの症状を表した患者は、それなりに、一般的な治療法にしたがって治療された。副作用を最小にするために、塩酸プロメタジンがしばしば投与された。その副作用のため、研究から脱落する患者はいなっかた。
【００９８】
F．議論
この研究では、体外活性化血球(厳密に言えば免疫細胞)による治療法は、化学療法と放射線療法によって誘発される血小板減少症の回復をかなり促進した。その結果、骨髄への転移を伴う患者には、鎮痛のために必要な放射線療法を受けることに耐えられる充分な血小板があった。多くのトロンボポエチンサイトカインの臨床開発は、穏やかな活性や顕著な毒性又は中和抗体のために制限された。インターロイキン-11はこれまで米国食品医薬品局によって承認された唯一のトロンボポエチンサイトカインである。IL-11を受けたが反応しなかったという基準を満たすように、この研究における患者が慎重に選択された。
【００９９】
体外免疫治療は、重症血小板減少症にだけではなく、好中球減少症にも有効であることがと分かった。低い白血球数の6人の患者は、G-CSF療法が彼らの白血球数を正規の水準に機能アップできないにもかかわらず、その療法によく反応した。この結果は動物実験で得たものと一致している(Huaiyu Chen, Lubo Wu, Jiayu Chen, Xiaohui Wang, Jing Li, Bo Xie, 及びDemao Yang.体外活性化免疫細胞は、生存を促進し、骨髄抑制のマウスのおける多分化造血の回復を刺激する。提出。).造血の多分化を刺激する当治療法の効果は重症慢性骨髄抑制の患者に特筆すべき利益をもたらす。
【０１００】
G-CSFは軽度から中程度の好中球減少症に対して高効率であるが、しかしながら、重症慢性血液欠乏に対してはそれほど有効ではないと述べられている。高度損傷を受けた骨髄の回復は協働して作用する複数の増殖因子が必要とされる(恐らく部分的に知られていない)。治療法の特定理論に結び付けられないで、いくつかの現在未知の鍵になる要因は、当治療法の有効性の少なくとも一要因である可能性がある。当研究で使用する体外活性化免疫細胞は複数のサイトカインと増殖因子(表3)を分泌した。分泌されたサイトカインには、GM-CSF, G-CSF, IL-1(Hestdal K, Jacobsen SE, Ruscetti FW, Dubois CM, Longo DL, Chizzonite R, Oppenheim JJ, Keller JRなどがある。インターロイキン-1アルファの造血に対する生体内の効果は以下である：コロニー刺激因子受容体調節の役割。血液 15;80(10):2486-94, 1992.), IL-6(Rodriguez Mdel C, Bernad A, Aracil M. インターロイキン-6欠乏の骨髄間質前駆細胞に対する影響が欠陥のある造血を齎す。.血液. 1;103(9):3349-54. 2004.)そして、IL-8 (Fibbe WE, Pruijt JF, Velders GA, Opdenakker G, van Kooyk Y, Figdor CG, Willemze R. IL-8-起因幹細胞動員の生態学.Ann N Y Acad Sci.30;872:71-82, 1999) 造血に関している。また、注入された細胞が骨髄、肝臓及び脾臓に移動して増殖因子を造血幹細胞と他の前駆細胞に最短に送ることも可能である。そのうえ、また、その注入された細胞は、微環境改善に影響できる程の期間を通して、骨髄に極めて接近することができる。当療法の有効性原因となる他の要因は、造血細胞の増殖と分化にとって、免疫体と造血性細胞との細胞接触が不可欠であるということである。増殖因子によってベンゼン誘発の再生不良性貧血を扱う以前の経験は、当方法よりより良くて急速に既存前駆細胞プールを刺激するが、骨髄造血に対する持続的効果を欠いているということである。この実例は、慢性病により有利に効果的であってより長い期間の使用に適する特定の療法をが説明する(Jiayu Chen ; Weiwei Liu ; Xiaohuai Wang ; Huaiyu Chen; Jinming Wu ; Yi Yang ; Lubo Wu ; Demao Yang.ベンゼン誘発の再生不良性貧血の患者に対する体外免疫療法。Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research. 12: 505 - 514, 2003).
【０１０１】
PBMCsの培養におけるGM-CSF、IL-2及びカルシウムイオノフォアの利用は細胞活性化と分化を成し遂げる。カルシウムイオノフォアは強い非特異性細胞刺激因子である。その利用はGM-CSFとIL-2の効果を高めることである。GM-CSF、IL-2、IL-12及びカルシウムイオノフォアは、単核白血球を樹状細胞の表現型に類似する細胞に誘導する(Bedrosian I, JG Roros, S Xu, HQ Nguyen, F Engels, MB Faries, GK Koski, PA Cohen とBJ Czerniecki.顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン-2とインターロイキン-12がカルシウムイオノフォアと共同作用して樹状細胞機能を高める。J Immunother 23:311-320, 2000).しかしながら、成熟した強力な樹状細胞を生産するほとんどのプロトコルには、6日間から8日間までの最適培養時間がある。その治療法は、サイトカイン生産の細胞活性化ピークである培養2日目の細胞を使用する。それに、この治療法は、より実用的で、より扱いやすい。血球(特に血小板)の複数系統を刺激する当治療法の効力は、現在利用可能な治療法よりいくつかの利点、特に、増殖因子である。
【実施例４】
【０１０２】
骨髄抑制の治療
I. 骨髄抑制の誘発
生後10週間目の雌BALB/cマウス(中国広州Sun Ye Xian大学動物センター)が1グループあたり10匹のグループに分割された。骨髄抑制は、1.5mg/マウスのカルボプラチンi.p.注入と注入後すぐに300cGyの全身照射の単回放射によって誘導された。骨髄抑制を誘導するカルボプラチンと照射の量は、マウスに対して80%から100%の間で死亡率を示す様々な投与量を組み合わせをテストする予備試験が行われた。
【０１０３】
II  .細胞と細胞培養
ヒト白血球は、健康人ドナーのleukopheresisによって採取され、Ficoll-Hypaque遠心分離法で末梢血単核白血球(PBMCs)に分けられた。PBMCsは、500IU/mLのIL-2 (Ruixing生物薬剤有限責任会社、中国北京)、200U/mLのGM-CSF(NCPC、中国石家荘)及び100ng/mLのカルシウムイオノフォアA23187(シグマ、セントルイス、MO)の存在下で、48時間3x106/mlの滅菌状態において10%のウシ胎仔血清(FCS)(Jiangbin 生物試薬、中国杭州)によってRPMI-1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)で培養された。FCSはヒト免疫細胞の増殖と分化を支持するヒト血清より強いので、細胞培養に添加するために選択された。この研究で使用されるFCSは、培養細胞の活性化に有益な複数の増殖因子を含むので、加熱不活性化されなかった。付着細胞は、プラスチックから擦り落とされて、非付着細胞と共に取り入れられた。そして、その細胞はマウスに注入される前に塩水によって3回洗浄された。
【０１０４】
付着細胞から非接着性細胞の分離は、プラスチックに付着する付着細胞の性質によって行われた。PBMCsは、増殖因子とカルシウムイオノフォアの存在しない状態で3時間培養され、そして、非付着細胞が培養瓶からそっと取り除かれた。そして、付着細胞と非付着細胞は、カルシウムイオノフォア付加のGM-CSF、及びカルシウムイオノフォア付加のIL-2の存在下で、別々に2日間培養された。
【０１０５】
正常なBALB/cマウスからの脾臓は均質化され、赤血球は蒸留水によって溶解された。残った細胞は、1ng/mlのマウスGM-CSF、2ng/ml のIL-2(eBioscience, San Diego, CAから)そしてカルシウムイオノフォアA23187と共に2日間培養された。
【０１０６】
III.研究グループと治療
骨髄抑制のマウスは、化学療法と放射線治療の前後に、体外活性化同系マウス脾臓細胞とヒトPBMCsによって、それぞれ処置された。骨髄抑制の誘発後の療法において、マウスは0日目、2日目、4日目及び6日目にて4回静脈注入された。1匹マウスあたり1x105, 1x106 と1x107の細胞投与量がテストされた。また、骨髄抑制の誘発後3時間の2x107細胞による一回の注入がテストされた。
【０１０７】
予防療法において、1マウスあたり2x107活性化細胞による一回注入が骨髄抑制誘発の24時間前に実施された。
【０１０８】
IV. サイトカイン分析
細胞培養開始2日後、非付着細胞は、集められて塩水で二度洗浄され、その一方、付着細胞は培養瓶で塩水で緩やかに二度洗浄された。洗浄した非付着細胞はサイトカインなしで同じフラスコと新鮮な培地に戻され、カルシウムイオノフォアは更に3日間培養を続けるために追加された。浮遊物は、サイトカイン分析のためにLuminexR xMAPR システム(Luminex , Austin, TX)によって、採集されてプールされた。
【０１０９】
V. 末梢血分析
化学療法と放射線治療後の回復を確定するために、末梢血は8日目、15日目及び22日目にマウスのテール静脈から集められた。全血球の算定はマウス血液に対してThechnicon H-1E(Technicon Instruments Corp、Tarrytown, NY)によって実施された。
【０１１０】
VI. 活性化ヒト血球による幹細胞動員
表4は、この細胞治療による、あるレベルの幹細胞動員があるということを示す。IL-2、GM-CSF及びカルシウムイオノフォアによって培養された異種ヒト細胞は、連続した3日間で１日に一度、1マウスあたり1x107で、正常なBALB/c雌マウスに投与された。最後注入の2日後に、末梢血はレトロ軌道穿刺によって採取された。赤血球は、すぐに水で溶解され、そして、10x PBSは塩濃度を正規の水準にバランスを取り戻すために加えられた。残った細胞は、抗マウスCD34 PE(BD Biosciences Pharmingen、San Diego) 単クローン抗体によって、氷にて20分間培養された。細胞は、培養の後にPBSで3回洗われて、次に、FACSCALIBUR(Becton Dickinson [BD]; San Jose, CA)で分析された。サンプルは前方サイドスキャターとサイドスキャターによって流量血球計算器に引き込まれ、そして、破片サブトラクション法と通門パラメーターによって細胞の特性を確定した。合計3万の事象は、単核白血球断片を特定するために数えられた。分析はCELLQUESTソフトウェア(BD)によって行われた。コントロールとしての未処置の正常マウスからの細胞。表4で示すように、CD34表示細胞の個体群は正常マウスの0.34%(標準誤差)から活性化細胞によって扱われたマウスの1.63%まで増加し、幹細胞を骨髄から末梢血血行に刺激そして動員する異種ヒト免疫細胞の能力を活性化したことを表明した。
【０１１１】
【表４】
2008512454.tif 000007
【０１１２】
VII.  イオノフォアなしで培養された体外血球による骨髄抑制マウスの救護    図7に示されるように、GM-CSFと抗ヒトCD3抗体が培養に用いられ、PBMCsは骨髄抑制マウスを治療するのにうまく利用された。その細胞は、1mg/ml のGM-CSFとマウス抗ヒトCD3抗体によって2日間培養されたこと以外に、ここで説明するように集められて培養された。骨髄抑制の誘発は先に述べたように培養した。マウスは、化学療法と照射誘発の48時間と96時間後に、すぐに、1匹マウスあたり1x106の細胞投与量で3回静脈内投与された。図7で示すように、この培養方法は骨髄抑制を治療する血球に対する活性化において効果的であった。さらに、異種ヒト細胞は成功的にマウスに使用された。
【０１１３】
サイトカインと細胞活性化因子の様々な組み合わせによる様々の培養条件は、造血に対する同様の影響がある。末梢血単核白血球の混合群を活性化するIL-2、GM-CSF及びカルシウムイオノフォアの組み合わせは、有効であるが、異なった細胞活性化因子のある培養条件も有効である。したがって、ここで説明された実施例を実行するための培養条件は、イオノフォア、GM-CSF及びIL-2の一つ又は組み合わせの使用に限定されない。
【０１１４】
VIII. 結果
A．短期と長期の生存
図５に示すように、体外活性化同系マウス脾臓細胞が生存を促進する。骨髄抑制マウスは、骨髄抑制誘発の2日、4日及び6日後に、すぐ体外活性化マウス脾臓細胞による4つの治療を受けた。骨髄抑制マウスは、化学療法と放射線治療の後の0日目、2日目、4日目及び6日目にて、3倍の投与量で活性化マウス脾臓細胞とヒトPBMCsによる4回の静脈注入を受けた。対照マウスは体外活性化なしの新鮮なマウス脾臓細胞を受けた。図5に示すように、未処置の対照マウス及び新鮮なマウス脾臓細胞を受けたマウスは0〜30%の低生存率であった。対照的に、活性化マウス脾臓細胞は骨髄抑制マウスの生存率を80-100%に増加させた。生存率の著しい違いは治療グループ内には全くみられなかった。1匹マウスあたり1x107の新鮮なマウス脾臓細胞を四回注入されたマウスは、他の対照グループよりわずかに高い生存率を示した。異種ヒト細胞による4回の治療は、骨髄抑制マウスの生存に対して同様の影響を与えた(データを図示せず)
【０１１５】
図6は、体外活性化同系脾臓細胞と異種ヒト免疫細胞のただ一回の注入が生命力を機能アップし、骨髄抑制マウスが骨髄抑制誘発の直後2x107の体外活性化細胞のただ一回の注入を受けたということを示す。体外活性化細胞による四回の治療が骨髄抑制マウスの重要な部分を救った。ただ一回の治療が生存率を改善できるかどうか確認するために、実験が行われた。その結果、化学療法と照射直後、マウスあたり2x107のただ一回の活性化細胞注入は、骨髄抑制マウスの生存率の増加が四回の治療を受けたマウスほど高くないが、生存率と血液学的回復(図6)を機能アップしたということを示した。
【０１１６】
活性化免疫細胞によって救われた骨髄抑制マウスは長期生存のために六ヶ月まで追跡調査された。救われた全マウスは、治療の6ケ月後に生き生きしていた。生存に対する骨髄抑制誘発の後に投与された療法の強い効果にもかかわらず、化学療法と照射の前の予防療法はマウス(データを図示せず)を救えなかった。
【０１１７】
図6によって、骨髄抑制マウスは骨髄抑制誘発の直後2x107の体外活性化細胞によるただ一回の注入を受けた。骨髄抑制マウスの治療における活性化免疫細胞の異なった亜母集団によって果たされた役割をさらに調査するために、ヒト付着と非付着免疫細胞は、別々に培養されて、骨髄抑制マウスに注入された。図8で示すように、二つの個体群は骨髄抑制マウスの生存率を機能アップできた。しかしながら、付着細胞は非付着細胞より強力であった。
【０１１８】
B．血球数の回復
総血球数算定は治療法の前後に実行された。図9によって、骨髄抑制マウスは骨髄抑制誘発の直後の2日目、4日目及び6日目に1x107の体外活性化ヒト細胞による注入を受けた。化学療法と照射を受ける前の血球数は100%として指定された。図9は、四回の1x107細胞を受けたマウスの回復曲線を示す。治療を受けるマウスの血球数は、三週目に向上し始め、五週目に完全に回復した。血小板数の向上が白血球と赤血球の向上より1週間早かった。一般に、本治療法による血球数の回復速度が治療の投与量と数(データを図示せず)とよく関連して、いったん血球数が向上し始め、完全な回復が2〜3週間以内に起こった。
【０１１９】
C．議論
この実例の結果は、体外活性化免疫細胞による細胞治療が化学療法と照射誘発の骨髄抑制の治療に対して効果的であるということを示す。G-CSF, GM-CSF、赤血球生成促進因子とIL-11の現在利用可能なドラッグは、軽度から中程度の骨髄抑制に対して有効であるが、重症慢性骨髄抑制と癌患者の高用量化学療法による血小板減少症に対してしてしばしば効力がない。活性化免疫細胞による細胞治療は、骨髄抑制の治療において、増殖因子よりある利点を持っている。まず最初に、活性化細胞は造血に関する複数の増殖因子を作り出すに違いない。そして、これらの増殖因子が一斉に働けば、相乗効果がある。また、いくつかの現在未知の鍵になる要因は、少なくとも本治療法の有効性の一部の原因である可能性がある。特定の理論に結び付けられないで、細胞注入による体外活性化免疫細胞とそれに続く体内免疫反応は、増殖因子の産生の一因となっている。次に、注入された細胞が骨髄、肝臓及び脾臓に移動して増殖因子を造血幹細胞と他の前駆細胞に近距離で送る。そのうえ、また、その注入された細胞は、微環境改善に影響できる程の期間を通じて、骨髄に極めて接近するままである。3番目に、造血細胞の増殖と分化にとって、注入された細胞と造血性細胞との細胞接触は不可欠である。
【０１２０】
体外活性化免疫細胞によって産生されたサイトカインとケモカインはいくつかの面白い特性を示す。IFN-ガンマ、IL-12、IL-4とIL-10などの4つの主要なサイトカインは、それぞれTヘルパー細胞のTh1とTh2のサブセットを表し、強力な造血活性化を持ったIL-1b, IL-6, IL-8, G-CSF及びGM-CSFと比べて比較的低いレベルにあった。異種ヒト細胞が同系マウス細胞と同じくらい有効であるという検出結果は、療法のメカニズムがMHC依存性や介在性ではないということを意味していた。
【０１２１】
細胞培養におけるIL-2の使用は、T-細胞の生存を助力して刺激された。操作の特定理論に結び付けられないで、IL-2活性化T細胞の生体内には、抗CD3単クローン抗体やPHA又はConAのような他の因子によって活性化されたT細胞より、より長い生存率とサイトカイン産生がある。GM-CSFは同じ理由で骨髄性細胞を刺激するのに使用される。T細胞と骨髄性細胞の完全な活性化を確実にするため、カルシウムイオノフォアは、IL-2とGM-CSFと共に共同刺激するように使用される。
【０１２２】
GM-CSFとカルシウムイオノフォアは、樹状細胞の表現型に類似する細胞に単核白血球を誘発することがある。しかしながら、成熟した強力な樹状細胞を生産するほとんどのプロトコルには、6日間から8日間までの最適培養時間がある。ここで説明する療法は、サイトカイン生産の細胞活性化ピークである培養2日目の細胞を使用する。それに、この療法は、より実用的、より扱いやすい。さらに、幹細胞や高濃縮単核白血球製剤の精製した製剤を準備するための特別なステップを行う必要は全くない。そのうえ、そのようなプロトコルは、細胞表面抗原の分泌などのような免疫学的目的を達成するように、細胞を刺激するある濃度と持続時間における培養要因に細胞を触れさせるように指示された。そのような方法は、そのような表現型の達成又はそのようなマーカーの表現の測定や達成のように指示されないので、当療法を可能にしない。さらに、培養された細胞のタイプと培養の持続時間の違いは、必ずここで説明した血球活性化方法で誘発される活性化の状態に達するというわけではない。そのうえ、当療法は骨髄抑制そして/又は造血に関する治療を含んでる。その治療はこれらの他のプロトコルによって示されていない。
【０１２３】
すべての刊行物、特許、特許出願及びここで引用された他のドキュメントは、全体の参照によって合併される。紛争の場合では、当仕様は優先すべきである。
【０１２４】
それの精神から出発しないで、この発明に関する幾多の変更を行うことがあるので、当発明の範囲は、例証そして説明された実施例に限局されていない。むしろ、発明の範囲は追加されたクレームとそれらの同等物で確定することになっている。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図1は、当療法に敏感な3人の患者に対するH&E染色骨髄生検の低倍率図を示す。 A、C及びEとラベルされた図は治療前の患者からの骨髄である。これらの図では、初期のガラガラして障害のある骨髄は重症再生不良性貧血を暗示する。B、D及びFと示される図では、骨髄は治療後の同じ患者からである。これらの骨髄は多くの改善された分布と細胞充実度を示す。
【図２】図2は血小板欠乏症の子供患者のために活性化細胞治療の開始した何日も後の機能としての立方ミリメートルあたりの血小板における血小板算定のプロットである。
【図３】図3は血小板減少症に苦しむ患者に対して体外活性化免疫細胞によって治療する後の血小板算定のプロットである。
【図４】図4は血小板減少症に苦しむ患者に対して体外活性化免疫細胞によって治療する後の白血球数算定のプロットである。
【図５】図5は骨髄抑制の誘発の後に投与された体外活性化免疫細胞に対応した残存物のプロットである。
【図６】図6は骨髄抑制の誘発の後に投与された体外活性化同系異種免疫細胞に対応した残存物のプロットである。
【図７】図7は骨髄抑制の誘発の後に投与された体外活性化同系異種免疫細胞に対応した残存物を示す代替的細胞培養条件を使用する結果のプロットである。
【図８】図8は付着細胞と非付着細胞の役割を示す骨髄抑制の誘発の後に投与された体外活性化同系異種免疫細胞に対応した残存物のプロットである。
【図９】図9は体外活性化異種免疫細胞に対応する回復率を示すプロットである。
【０１２６】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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