(57)【要約】      （修正有）【課題】既知の好酸球性気道炎症マーカーよりも高い性能の新規マーカーを提供すること、および該マーカーを用いて好酸球性気道炎症に関する情報を取得する方法を提供する。【解決手段】被験者の血液試料中の、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量を測定し、得られた測定値に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液試料中の、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量を測定し、
得られた測定値に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する方法。
【請求項２】
前記測定値と所定の閾値とを比較し、その比較結果に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報が、被験者に好酸球性気道炎症が発生していることを示唆する情報または好酸球性気道炎症が発生していないことを示唆する情報である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被験者の血液試料中の、CCL27およびCXCL9のマーカーの量を測定し、
CCL27の測定値およびCXCL9の測定値に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
CCL27の測定値およびCXCL9の測定値に基づいて、多重ロジスティックモデルにより予測値を取得し、
取得された予測値と所定の閾値とを比較し、その比較結果に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらにIL-25マーカーの量を測定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つである、好酸球性気道炎症に関する情報を取得するためのマーカー。
【請求項８】
被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量に関する情報を取得する測定部と、
前記測定部で取得したマーカーの量に関する情報に基づいて、前記被験者についての好酸球性気道炎症に関する情報を取得する情報処理部と、
前記情報処理部で得られた情報を出力する出力部と
を備える、好酸球性気道炎症に関する情報の取得装置。
【請求項９】
コンピュータに、
被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量に関する情報を受け取る受領ステップと、
前記受領ステップで受け取ったマーカーの量に関する情報に基づいて、前記被験者についての好酸球性気道炎症に関する情報を取得する情報取得ステップと、
前記情報取得ステップで得られた情報を出力する出力ステップと、
を実行させるためのコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好酸球性気道炎症に関する情報の取得方法およびそのような情報を取得するためのマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息（以下、単に「喘息」ともいう）は、気道の慢性炎症と種々の程度の可逆的気道狭窄と気道過敏性の亢進、そして臨床的には繰り返し起こる咳、喘鳴、呼吸困難によって特徴づけられる。喘息の鑑別診断においては、（１）発作性の咳、喘鳴、呼吸困難の反復、（２）可逆性の気流制限、（３）他の心肺疾患などに関連していないこと、が重要視されている。また、喘息の治療は発作の発生頻度をコントロールし、健常人と変わらない日常生活が送れることが目標とされており、現在のガイドラインでは、喘息症状や呼吸機能をモニタリングして治療方針が決定されている。
【０００３】
喘息診断において、気道炎症の存在は、上記（１）〜（３）などの所見と共に観察されることによって、被診断者が喘息に罹患しているという診断結果を支持する情報になり得るとされている。気道炎症は、好酸球や好塩基球などが気道に浸潤し、エフェクター細胞として機能することで生じる。特に、好酸球を主な構成要素とする炎症誘発性細胞集団の浸潤を原因とする気道炎症は、好酸球性気道炎症とも呼ばれ、喘息の重症発作を引き起こす最も重要な病態である。好酸球性気道炎症の状態を判定する（モニターする）指標としては例えば気管支肺胞洗浄液(BALF)中の高好酸球状態と喀痰中好酸球数がある。
【０００４】
気管支肺胞洗浄液(BALF)中の高好酸球状態を判別する方法としては、特許文献１に記載の方法が挙げられる。特許文献１には、気管支肺胞洗浄液(BALF)中の特定のサイトカインレベルのパターンに基づいて、重症の喘息患者とそうでない患者とを区別できることが記載されている。この特許文献１には、MIG（CXCL9, CXC Chemokine Ligand 9）は重症喘息患者においてレベルが低減するサイトカインであると記載されており、MIG、Eotaxin、IL-8(Interleukin-8)およびIL-17(Interleukin-17)レベルの組合せが高好酸球状態の判別に役立つことが記載されている。しかしながら、気管支肺胞洗浄液(BALF)を採取する方法は侵襲度が高い。
【０００５】
また、喀痰中好酸球数が喘息の病型判別や治療方針の決定において有用であるとの報告がなされている（非特許文献１および非特許文献２参照）。
例えば、非特許文献１には、喀痰中好酸球数に基づく治療管理は、従来の標準的な治療管理と比べて、喘息の急性増悪(または重症発作)を顕著に抑制することが記載されている。
また、非特許文献２には、好酸球性炎症の情報を用いることで難治療の喘息患者から好酸球性炎優勢群（症状の程度は低いが好酸球性炎症が高い群）を特定できること、その群に対して喀痰中好酸球に基づく治療管理を行った場合、標準的な治療管理と比べて喘息の悪化を抑制できることが記載されている。
【０００６】
以上のことから、喀痰中好酸球数の検査（喀痰検査）は実際の臨床診断において行われているが、喀痰検査に際しては、すべての喘息患者から自発的に排出された痰を採取できるわけではない。自発的に排出された痰が得られない場合には、患者に高張食塩水を吸入させることによって喀痰排出を誘発する方法が用いられているが、咽頭痛を伴ったり、気道への刺激で喘息発作を誘発したりするおそれがある。
【０００７】
そのため、好酸球性気道炎症の指標となりうるバイオマーカーの探索においては、より確実に、かつ、安全に喘息患者から採取できる検体として、血液が注目されている。
例えば、非特許文献３には、吸入コルチコステロイド治療を受けてもなお症状を呈していた重度の喘息患者において、血中Periostinレベルを好酸球性気道炎症の全身性バイオマーカーとして用い得ることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第8,053,199号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】The Lancet, Volume 360, Pages 1715-1721, 2002
【非特許文献２】Am J Respir Crit Care Med, Volume 178, Pages 218-224, 2008
【非特許文献３】J Allergy Clin Immunol, Volume 130, Pages 647-654, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、好酸球性気道炎症の血中マーカーは研究段階であり、マーカーのさらなる開発が求められている。そこで、本発明は、そのような新規マーカーを同定し、それらを用いて被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、血中の好酸球性気道炎症マーカーの新規マーカーとしてCCL27 (CC Chemokine Ligand 27)およびCXCL9 (CXC Chemokine Ligand 9)を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明によれば、
被験者の血液試料中の、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量を測定し、
得られた測定値に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する方法が提供される。
【００１３】
また、本発明によれば、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つである、好酸球性気道炎症に関する情報を取得するためのマーカーが提供される。
【発明の効果】
【００１４】
被験者の血液試料中の本発明のマーカーの量に基づいて、当該被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）の血清を用いて得られた本発明のマーカーCCL27の有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図１Ｂ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）の血清を用いて得られた本発明のマーカーCXCL9の有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図１Ｃ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）の血清を用いて得られたPeriostinの有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図１Ｄ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）の血清を用いて得られたEotaxinの有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図１Ｅ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）の血清を用いて得られたTARCの有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図２Ａ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）および非喘息健常成人12名の血清を用いて得られた本発明のマーカーCCL27の有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図２Ｂ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）および非喘息健常成人12名の血清を用いて得られた本発明のマーカーCXCL9の有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図２Ｃ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）および非喘息健常成人12名の血清を用いて得られたPeriostinの有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図２Ｄ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）および非喘息健常成人12名の血清を用いて得られたEotaxinの有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図２Ｅ】喘息患者39名（喀痰好酸球陽性患者33名および陰性患者６名）および非喘息健常成人12名の血清を用いて得られたTARCの有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図３Ａ】実施例１で得られたCCL27およびCXCL9の測定値を組み合わせて得られた有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図３Ｂ】実施例１で得られたCCL27およびCXCL9の測定値に加え、IL-25の測定値を組み合わせて得られた有意差検定ならびに感度および特異度を示す解析結果である。
【図４】好酸球性気道炎症に関する情報の取得装置の一実施態様である。
【図５】好酸球性気道炎症に関する情報の取得の一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の好酸球性気道炎症に関する情報の取得方法（以下、単に「方法」ともいう）の第１工程は、被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量を測定する工程（測定工程）である。
【００１７】
本発明の方法において、被験者は特に限定されず、例えば医師により喘息に罹患していると診断された患者をはじめ、喘息に罹患している可能性がある成人または小児、および喘息に罹患していない（非喘息）健常な成人または小児などである。
【００１８】
本発明の方法において、血液試料とは、血液（全血）、血清または血漿である。血液試料は、採取が簡便なものがとりわけ好ましく、例えば末梢血およびそれから取得される血清および血漿などが挙げられる。
【００１９】
CCL27は、CTACKとも呼ばれ、表皮ケラチノサイトに特異的に発現し、リンパ球細胞表面において発現するCCR10受容体のリガンド分子として機能するケモカインとして当業者に周知である。
当該技術において、CCL27タンパク質のアミノ酸配列自体は公知である。このタンパク質のアミノ酸配列は、例えばSWISS-PROT（アクセッション番号：Q9Y4X3）などの公知のデータベースから知ることができる。
【００２０】
CXCL9は、MIGとも呼ばれ、好酸球および気道上皮細胞などにおいて、IFN-γおよびTNF-αなどの炎症刺激により誘導されるケモカインとして当業者に周知である。
当該技術において、CXCL9タンパク質のアミノ酸配列自体は公知である。このタンパク質のアミノ酸配列は、例えばNational Center for Biotechnology Information （NCBI；アクセッション番号：NM_002416）などの公知のデータベースから知ることができる。
【００２１】
本発明の実施形態においては、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーに加えて、IL-25マーカーを加えることもできる。
IL-25は、Th2細胞、気道上皮細胞、および肥満細胞などによって産生される、Pro-Th2サイトカインであり、IL-17ファミリーのサイトカインとして公知である。
当該技術において、IL-25タンパク質のアミノ酸配列自体は公知である。このタンパク質のアミノ酸配列は、例えばSWISS-PROT（アクセッション番号：Q9H293）などの公知のデータベースから知ることができる。
【００２２】
本発明の方法において、マーカーの量とは、上記血液試料中の当該マーカータンパク質の量を意味し、マーカーの量の測定は、上記血液試料中に当該マーカータンパク質が有るか無いかを判定するための定性的な測定を含む。
マーカータンパク質の量の測定方法は、当業者に周知の抗原抗体反応に基づくタンパク質測定法であれば特に限定されないが、例えばELISA法、ウェスタンブロット法などが挙げられ、好ましくはELISA法である。これらの測定方法に用いられる抗体は、血液試料中の各マーカータンパク質を特異的に認識して結合することができる抗体であれば特に限定されない。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの全長抗体または抗体フラグメント（Fab、F(ab')2）などであり得る。このような抗体の作製方法は、当業者に公知である。あるいは、抗体は市販製品であってもよい。
マーカータンパク質の量の測定には、当業者に公知の市販のタンパク質定量キット、例えば、R&D systems社製Duoset ELISA測定用キット、Peprotech社製ELISA development kitなどを用いてもよい。
マーカーの量の測定値は、測定値そのもの（生データ）又はその値に基づいて算出された値であってもよく、例えば、濃度、強度、レベル、質量（重量）、比、などのいずれの形式又は単位でも表すことができる。
【００２３】
本発明の方法の第２工程は、上記の測定工程で得られた測定値に基づいて、被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する工程（情報取得工程）である。ここで、好酸球性気道炎症に関する情報とは、好酸球性気道炎症の診断の指標となり得る情報であれば特に限定されないが、好ましくは、好酸球性気道炎症の発生もしくは状態またはその両方を示す情報である。そのような情報としては、例えば、好酸球性気道炎症が被験者に発生している可能性、好酸球性気道炎症がこれから被験者に発生する危険性などが挙げられる。また、被験者に好酸球性気道炎症が発生している場合は、好酸球性気道炎症に関する情報として、被験者の予後、好酸球性気道炎症の重篤度などが挙げられる。
【００２４】
また、本発明の実施形態においては、複数のマーカーの量の測定値を用いて解析を行う場合、各マーカーの量の測定値を所定の式に代入することで、各マーカーの量の測定値から導き出される多重ロジスティックモデルに、各マーカーの量の測定値を代入することで被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。例えば、CCL27の測定値およびCXCL9の測定値を用いて解析を行う場合、CCL27の測定値およびCXCL9の測定値から多重ロジスティックモデルにより算出される予測値に基づいて、被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。IL-25マーカーの量をさらに測定する場合、CCL27の測定値、CXCL9の測定値、およびIL-25の測定値から多重ロジスティックモデルにより算出される予測値に基づいて、被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。
【００２５】
また、本発明の実施形態においては、測定工程で得られた測定値と所定の閾値との比較結果に基づいて、被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。この場合、測定工程で得られた測定値が所定の閾値より高いか、または閾値と同じという結果が得られた場合、好酸球性気道炎症が被験者に発生していることを示唆する情報またはこれから被験者が好酸球性気道炎症になる危険性が高いという情報を取得することができる。また、被験者に好酸球性気道炎症が発生している場合は、好酸球性気道炎症に関する情報として、被験者の予後が不良であるという情報または好酸球性気道炎症の重篤度が高いという情報を取得することができる。また、測定工程で得られた測定値がCCL27の測定値であり、所定の閾値より高いか、または閾値と同じという結果が得られた場合、CCL27陽性（＋）または好酸球性気道炎症陽性という情報を取得することができる。測定工程で得られた測定値がCXCL9の測定値であり、所定の閾値より高いか、または閾値と同じという結果が得られた場合、CXCL9陽性（＋）または好酸球性気道炎症陽性という情報を取得することができる。
【００２６】
反対に、測定工程で得られた測定値が所定の閾値よりも低いという結果が得られた場合、好酸球性気道炎症が被験者に発生していないことを示唆する情報またはこれから被験者が好酸球性気道炎症になる危険性が低いという情報を取得することができる。また、被験者に好酸球性気道炎症が発生している場合は、好酸球性気道炎症に関する情報として、被験者の予後が良好であるという情報または好酸球性気道炎症の重篤度が低いという情報を取得することができる。また、測定工程で得られた測定値がCCL27の測定値であり、所定の閾値よりも低いという結果が得られた場合、CCL27陰性（−）または好酸球性気道炎症陰性という情報を取得することができる。測定工程で得られた測定値がCXCL9の測定値であり、所定の閾値よりも低いという結果が得られた場合、CXCL9陰性（−）または好酸球性気道炎症陰性という情報を取得することができる。
【００２７】
また、複数のマーカーの量の測定値を用いて解析を行う場合、各マーカーの量の測定値から導き出される多重ロジスティックモデルに、各マーカーの量の測定値を代入することで算出された値と所定の閾値との比較結果に基づいて、被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。例えば、CCL27の測定値およびCXCL9の測定値を用いて解析を行う場合、CCL27の測定値およびCXCL9の測定値から多重ロジスティックモデルにより算出される予測値が所定の閾値より高いか、または閾値と同じという結果が得られた場合、好酸球性気道炎症陽性という情報を取得することができる。反対に、CCL27の測定値およびCXCL9の測定値から多重ロジスティックモデルにより算出される予測値が所定の閾値よりも低いという結果が得られた場合、好酸球性気道炎症陰性という情報を取得することができる。
【００２８】
なお、所定の閾値は特に限定されず、種々の血液試料についてのデータの蓄積により経験的に設定することができる。あるいは、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、好酸球性気道炎症に罹患していない被験者の血液試料、および、好酸球性気道炎症に罹患する患者の血液試料について、マーカーの量を測定する。次いで、得られた測定結果に基づいて、好酸球性気道炎症に罹患していない被験者の血液試料における測定値よりも高く、且つ、好酸球性気道炎症に罹患する患者の血液試料における測定値よりも低い範囲から閾値を設定する。好ましくは、好酸球性気道炎症に罹患していない被験者の血液試料と好酸球性気道炎症に罹患する患者の血液試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。あるいは、当該技術において公知の統計解析法により判別式を作成し、この式を用いてこれらの蓄積された測定値から閾値を算出してもよい。
【００２９】
本発明の範囲には、好酸球性気道炎症に関する情報を取得するためのマーカー（以下、単に「マーカー」ともいう）も含まれる。本発明のマーカーは、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つである。
本実施形態では、被験者から採取した血液試料中のマーカーの量の測定値に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。なお、マーカーの量の測定および好酸球性気道炎症に関する情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
【００３０】
また、本発明によれば、
被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量に関する情報を取得する測定部と、
前記測定部で取得したマーカーの量に関する情報に基づいて、前記被験者についての好酸球性気道炎症に関する情報を取得する情報処理部と、
前記情報処理部で得られた情報を出力する出力部と
を備える、好酸球性気道炎症に関する情報の取得装置(以下、単に「情報取得装置」ともいう)が提供される。
【００３１】
更に、本発明によれば、
コンピュータに、
被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも１つのマーカーの量に関する情報を受け取る受領ステップと、
前記受領ステップで受け取ったマーカーの量に関する情報に基づいて、前記被験者についての好酸球性気道炎症に関する情報を取得する情報取得ステップと、
前記情報取得ステップで得られた情報を出力する出力ステップと、
を実行させるためのコンピュータプログラムが提供される。
【００３２】
なお、上記の情報取得装置およびコンピュータプログラムの実施形態では、マーカーの量に関する情報には、IL-25マーカーの量に関する情報が含まれていてもよい。
【００３３】
本発明の実施形態に係る情報取得装置およびコンピュータプログラムについては、以下図面を参照して説明する。
本実施形態に係る情報取得装置は、本発明の実施形態に係る情報取得方法を実施するのに好適な装置の一例である。なお、本実施形態に係る情報取得装置は、上記マーカーの量に関する情報として、タンパク質測定で得られた発光強度に基づいて算出した量の測定値を採用し、該測定値と測定値についての閾値とを比較して情報取得を行なう装置である。
【００３４】
図４は、本発明の一実施の形態に係る情報取得装置１の全体構成を示すブロック図である。
本実施の形態に係る情報取得装置１は、タンパク質測定装置１００(以下、「測定部１００」ともいう)と、これと接続された情報処理装置２００(以下、「コンピュータ２００」ともいう)とから構成されている。
測定部１００は、全自動ＥＬＩＳＡ装置などのタンパク質測定法を実行可能なタンパク質測定装置からなる。測定部１００は、血液試料中のマーカーの量の測定時に観測されたマーカーの量に関する情報、例えば発光強度などを測定する装置である。
測定部１００には、コンピュータ２００が接続されている。コンピュータ２００は、測定部１００の動作を制御するとともに、測定部１００で測定された上記の発光強度などのデータに基づいて、好酸球性気道炎症に関する情報を取得する。
【００３５】
コンピュータ２００は、情報処理装置本体２１０(以下、「情報処理部２１０」ともいう)と、必要なデータを情報処理部２１０に入力する入力デバイス２３０と、入出力データなどを表示する表示部(出力部)２２０とを備えている。コンピュータ２００には、必要に応じて、外部記録媒体２４０が含まれる。
【００３６】
コンピュータ２００は、情報処理部２１０と、表示部２２０と、入力デバイス２３０とから主として構成されている。情報処理部２１０は、ＣＰＵ２１０ａと、ＲＯＭ２１０ｂと、ＲＡＭ２１０ｃと、ハードディスク２１０ｄと、読出装置２１０ｅと、入出力インタフェース２１０ｆおよび画像出力インタフェース２１０ｈは、バス２１０ｉによって互いにデータ通信可能に接続されている。
情報処理部２１０は、ＣＰＵ２１０ａと、ＲＯＭ２１０ｂと、ＲＡＭ２１０ｃと、ハードディスク２１０ｄと、読出装置２１０ｅと、入出力インタフェース２１０ｆと、画像出力インタフェース２１０ｈと、バス２１０ｉとを備えている。
情報処理部２１０内において、ＣＰＵ２１０ａ、ＲＯＭ２１０ｂ、ＲＡＭ２１０ｃ、ハードディスク２１０ｄ、読出装置２１０ｅ、入出力インタフェース２１０ｆおよび画像出力インタフェース２１０ｈは、それぞれバス２１０ｉによって、データの送受信が可能に接続されている。
【００３７】
ＣＰＵ２１０ａは、ＲＯＭ２１０ｂに記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ２１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することができる。ＲＯＭ２１０ｂには、ＣＰＵ２１０ａによって実行されるコンピュータプログラムおよびＣＰＵ２１０ａがコンピュータプログラムを実行するためのデータなどが記録されている。ＲＡＭ２１０ｃは、ＲＯＭ２１０ｂおよびハードディスク２１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ２１０ｃは、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ２１０ａの作業領域として利用される。
ハードディスク２１０ｄには、オペレーティングシステム(OS)、アプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ２１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラムおよびそのコンピュータプログラムの実行に用いられるデータがインストールされている。
ハードディスク２１０ｄにインストールされているプログラムには、好酸球性気道炎症に関する情報の取得方法を実現するためのアプリケーションプログラム２４０ａおよび測定部１００を制御するプログラムが含まれている。また、ハードディスク２１０ｄには、好酸球性気道炎症に関する情報の取得方法を実現するためのプログラムの実行に用いられるデータとして、閾値などが記憶されている。
【００３８】
読出装置２１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、CD-ROMドライブ、DVD-ROMドライブなどによって構成されており、外部記録媒体２４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。なお、アプリケーションプログラム２４０ａは、外部記録媒体２４０に記録されていてもよく、情報処理装置本体２１０内に設けられたＲＯＭ２１０ｂまたはＲＡＭ２１０ｃに保存されていてもよい。
また、ＣＰＵ２１０ａが外部記録媒体２４０から当該アプリケーションプログラム２４０ａを読み出し、アプリケーションプログラム２４０ａをハードディスク２１０ｄにインストールすることも可能である。
【００３９】
また、ハードディスク２１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明においては、上述した判定に係るアプリケーションプログラム２４０ａは、該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
【００４０】
入出力インタフェース２１０ｆは、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェースおよびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成されている。入出力インタフェース２１０ｆには、キーボードやマウスなどの入力デバイス２３０が接続されている。また、入出力インタフェース２１０ｆには測定部１００が接続されている。これにより、情報処理部２１０は、入出力インタフェース２１０ｆを介して測定部１００とデータの送受信が可能である。
【００４１】
画像出力インタフェース２１０ｈは、ＬＣＤまたはＣＲＴなどで構成された表示部２２０に接続されており、ＣＰＵ２１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部２２０に出力する。表示部２２０は、入力された映像信号にしたがって、画像(画面)を表示する。また、表示部２２０は、後述するＣＰＵ２１０ａから与えられた判定結果を出力する。
【００４２】
ここで、上記の情報取得装置１において実行されるアプリケーションプログラム２４０ａの動作フローの一例について、図５を参照して説明する。
【００４３】
まず、測定部１００から入出力インタフェース２１０ｆを介して、タンパク質測定で得られた発光強度などのデータが受領される（ステップＳ１）。
【００４４】
次いで、ステップＳ２において、ＣＰＵ２１０ａは、タンパク質測定で得られた発光強度のデータに基づき、マーカーの量の測定値を算出する。
【００４５】
ステップＳ３において、ＣＰＵ２１０ａは、アプリケーションプログラム２４０ａのデータとしてハードディスク２１０ｄに予め記憶させた発光強度の閾値のデータと、上記の発光強度のデータとを比較する。このステップＳ３では、該発光強度が発光強度の閾値よりも大きいか否かについて比較判断される。
発光強度が閾値以上である場合(Ｙｅｓ)、ステップＳ４−１に処理を進める。反対に、発光強度が閾値未満である場合(Ｎｏ)、ステップＳ４−２に処理を進める。
【００４６】
ステップＳ４−１において、ＣＰＵ２１０ａは、好酸球性気道炎症陽性であるという情報をＲＡＭ２１０ｃに格納するとともに、画像出力インタフェース２１０ｈを介して表示部２２０に出力する。具体的には、マーカーとしてCCL27が用いられた場合、CCL27陽性（＋）または好酸球性気道炎症陽性という情報を出力する。マーカーとしてCXCL9が用いられた場合、CXCL9陽性（＋）または好酸球性気道炎症陽性という情報を出力する。本発明においては、好酸球性気道炎症が被験者に発生しているか、またはこれから被験者が好酸球性気道炎症になる危険性が高いという情報を出力してもよい。また、被験者に好酸球性気道炎症が発生している場合は、被験者の予後が不良であるか、または好酸球性気道炎症の重篤度が高いという情報を出力してもよい。
【００４７】
あるいは、ステップＳ４−２において、ＣＰＵ２１０ａは、好酸球性気道炎症陰性であるという情報をＲＡＭ２１０ｃに格納するとともに、画像出力インタフェース２１０ｈを介して表示部２２０に出力する。具体的には、マーカーとしてCCL27が用いられた場合、CCL27陰性（−）または好酸球性気道炎症陰性という情報を出力する。マーカーとしてCXCL9が用いられた場合、CXCL9陰性（−）または好酸球性気道炎症陰性という情報を出力する。本発明においては、好酸球性気道炎症が被験者に発生していないか、またはこれから被験者が好酸球性気道炎症になる危険性が低いという情報を出力してもよい。また、被験者に好酸球性気道炎症が発生している場合は、被験者の予後が良好であるか、または好酸球性気道炎症の重篤度が低いという情報を出力してもよい。
【００４８】
なお、本実施形態において、ステップＳ３では、該発光強度が発光強度の閾値よりも大きいか否かについて比較判断されるが、これに限定されるものではない。複数のマーカーの量の測定値を用いて解析を行う場合、各マーカーの量の測定値を所定の式に代入することで、各マーカーの量の測定値に対して重要度に応じた重み付けを行って算出された値が所定の閾値よりも大きいか否かについて比較判断されてもよい。この場合、所定の閾値は、ＣＰＵ２１０ａは、アプリケーションプログラム２４０ａのデータとしてハードディスク２１０ｄに予め記憶されている。
なお、本実施形態において、タンパク質測定で得られた発光強度のデータは、測定部１００から入出力インタフェース２１０ｆを介して取得されるが、これに限定されるものではない。ユーザーがタンパク質測定で得られた発光強度のデータを入力デバイス２３０により入力し、ＣＰＵ２１０ａが、これら入力された値を発光強度として取得してもよい。
【００４９】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００５０】
実施例１および比較例１
本発明のマーカーCCL27およびCXCL9を単独で用いた場合の性能を調べるため、下記のような試験を行った。また、比較のために、好酸球性気道炎症の既知マーカーであるPeriostin、好酸球との関連性が示唆されているEotaxinおよびTARC（CCL17, CC Chemokine Ligand 17）についても同様に試験を行った。
【００５１】
(1) 試料の調製
国立病院機構相模原病院より、喘息患者39名の血清試料を入手した。これらの喘息患者について、喀痰を用いてハンセル法による好酸球検査を行った結果、喀痰好酸球が検出された(喀痰好酸球陽性)患者は33名、喀痰好酸球が検出されなかった(喀痰好酸球陰性)患者は6名であった。
【００５２】
(2) ELISA測定
上記で得た血清試料を用いて、各マーカーの量を測定するために下記のようにしてELISA測定を行った。
(2-1) CCL27
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY376)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液(4μg/mL固相抗体,0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファー(0.05%Tween20, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファー(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% Tween20, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA, 0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で４倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.075μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.5% Casein,  0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase [R&D systems AR001 ], 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファー(20mM Tris 10mM  MgCl pH9.8)で1回洗浄し、基質(CDP-Star Ready-to-use Sapphire II Tropix)を100μL添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LabTech)で発光シグナルを検出した。
【００５３】
(2-2) CXCL9
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY392)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液(1μg/mL固相抗体, PBS pH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)にて４倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.2μg/mL標識抗体, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4) を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄する。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、基質を添加し、100μLの化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
【００５４】
(2-3) Periostin
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY3548)を使用した。
まず、384ウェルELISAプレートに50μLの抗体希釈液( 1μg/mL固相抗体,PBS pH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、100μLのブロッキングバッファー(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% Tween20, 0.05% NaN3, PBS pH7.4) で、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で100倍希釈した血清を50μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し50μLの標識抗体液(2μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.5% Casein,  0.05% NaN3, PBS pH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。50μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を50μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、100μLのALP活性化バッファーで洗浄し、50μLの基質を添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LABTECH)で発光シグナルを検出した。
【００５５】
(2-4) Eotaxin
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY320)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液( 2μg/mL固相抗体, PBS pH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で４倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.1μg/mL標識抗体, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄する。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
【００５６】
(2-5) TARC
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY364)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液(2μg/mL固相抗体, PBS pH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で４倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.1μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を添加する。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
【００５７】
(3) ELISA測定結果の解析
各マーカーについて、濃度既知のスタンダードの発光シグナル（RLU）から4-Parameter fitにより検量線を作成した。検体から得られた発光シグナル（RLU）を検量線にあてはめ、血清中のマーカー濃度を算出した。解析には解析ソフトMARS(BGM LABTECH)を使用した。
【００５８】
(4) 統計解析
統計解析にはStatFlex Version 6.0 (YUMIT)を使用した。
(4-1) 有意差検定
喀痰好酸球の陽性または陰性に応じて患者群を２群に分け、マンホイットニー検定にて血清中のマーカー濃度差を検定した。検定結果を表１−１にまとめる。
【表１−１】
2015068760.tif 000002
(4-2) 感度および特異度の算定
ROC曲線を求め喀痰好酸球陽性または陰性のカットオフを設定し感度および特異度を算出した。
カットオフの設定は、ROC曲線において、（感度、１−特異度）が（１、０）である点から最も近いポイント（図中に矢印で表記）に設定した。
(4-3) ROC曲線の比較
各項目間でHanleyの方法によりROC曲線の曲線下面積（AUC）を比較した。
【００５９】
CCL27(図１Ａ)およびCXCL9(図１Ｂ)について得られた解析結果を実施例１として、Periostin(図１Ｃ)、Eotaxin(図１Ｄ)およびTARC(図１Ｅ)について得られた解析結果を比較例１として示す。また、解析結果を下記の表１−２にまとめる。
【００６０】
【表１−２】
2015068760.tif 000003
【００６１】
表１−１より、Periostin、Eotaxin、およびTARCについては、喀痰好酸球陽性患者と陰性患者との間のマーカー濃度に有意差が見られない一方、CCL27およびCXCL9については、喀痰好酸球陽性患者と陰性患者との間のマーカー濃度に有意差が見られた。このことから、CCL27およびCXCL9は、喘息患者における喀痰好酸球陽性患者と陰性患者とを判別することが可能なマーカーであることがわかる。
【００６２】
また、表１−２の結果から、CCL27およびCXCL9は、感度と特異度の観点から、Periostin、EotaxinおよびTARCよりも優れた性能を有するマーカーであることが明らかとなった。
【００６３】
実施例２および比較例２
実施例２において、本発明者は、CCL27およびCXCL9について、好酸球性気道炎症の一次スクリーニング用マーカーとしての性能を調べるために、非喘息健常成人の血清中のマーカー濃度を測定し、実施例１で得られたマーカー濃度を比較および解析する実験を行った。具体的には、非喘息健常成人検体として健常ボランティア12名から得られた血清試料を用いて実施例１と同様にELISAによるマーカー濃度測定を行い、実施例１で用いた血清試料39検体から得られたマーカー濃度のデータと組み合わせて実施例１と同様の統計解析を行った。なお、非喘息健常成人は、喀痰好酸球陰性群に含めて扱った。
【００６４】
CCL27(図２Ａ)およびCXCL9(図２Ｂ)について得られた解析結果を実施例２として、Periostin(図２Ｃ)、Eotaxin(図２Ｄ)およびTARC(図２Ｅ)について得られた解析結果を比較例２として示す。また、解析結果を下記の表２−１および表２−２にまとめる。
【００６５】
【表２−１】
2015068760.tif 000004
【表２−２】
2015068760.tif 000005
【００６６】
表２−１より、PeriostinおよびTARCについては、喀痰好酸球陽性患者と陰性患者との間のマーカー濃度に有意差が見られない一方、CCL27、CXCL9およびEotaxinについては、喀痰好酸球陽性群（喀痰好酸球陽性患者）と陰性群（喀痰好酸球陰性患者および非喘息健常成人）との間のマーカー濃度に有意差が見られた。このことから、CCL27、CXCL9、およびEotaxinは、喀痰好酸球陽性群と陰性群とを判別することが可能なマーカーであることがわかる。
【００６７】
また、表２−２の結果から、CCL27およびCXCL9は、感度と特異度の観点から、好酸球性気道炎症の一次スクリーニング用マーカーとして、Periostin、EotaxinおよびTARCよりも優れた性能を有するマーカーであることが明らかとなった。特に、CCL27の特異度は、健常成人を加えた場合に、健常成人を加えない場合（実施例１、図１Ａ）よりも著しく向上し、その結果AUCも極めて良好なものとなっている（表２および図２Ａ）。上記の結果から、CCL27は、健常成人および喘息患者の両方を対象とする好酸球性気道炎症の一次スクリーニングなどにおいて特に優れた性能を有するマーカーとして利用できることが示唆された。
【００６８】
上記の実施例１および２の結果を総合すると、CCL27およびCXCL9はいずれも公知の好酸球性気道炎症マーカーおよび好酸球関連タンパク質よりも優れた性能を有する好酸球性気道炎症マーカーとして利用することができると考えられる。また、CCL27は、喘息に罹患していない被験者を含めた母集団のなかから好酸球性気道炎症に罹患している疑いのある患者を選抜するためのマーカーとして特に良好な性能を有すると考えられる一方、CXCL9は、喘息に罹患する患者のなかから、好酸球性気道炎症に罹患する患者と罹患していない患者とを判別するためのマーカーとして特に良好な性能を有すると考えられる。
【００６９】
実施例３
実施例３において、本発明者は、単独で良好な判別性能を示した本発明のマーカーCCL27とCXCL9とを組み合わせて、更に優れた判別性能が得られるかどうかを調べた。また、本発明のマーカーCCL27とCXCL9にさらにIL-25を組み合わせて、更に優れた判別性能が得られるかどうかを調べた。
【００７０】
IL-25濃度のELISA測定は、実施例１においてマーカー濃度のデータを取得したものと同一の血清試料について行い、具体的には下記のようにして行った。
ELISA測定にはPeprotech社製 ELISA development kit (900-K234)を使用した。
まず、ELISAプレートに100μLの抗体希釈液(1μg/mL固相抗体, PBS pH12.0)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で４倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.25μg/mL標識抗体, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
【００７１】
次に、目的変数を喀痰好酸球測定結果（陽性/陰性）、説明変数を血清中のCCL27およびCXCL9濃度として多重ロジスティックモデルを作成し、各マーカーの量の測定値を代入することで喀痰好酸球測定結果の予測値を取得した（変数指定法）。各血清試料から得られたマーカー濃度について予測値を算出した。喀痰好酸球陽性患者について算出された予測値は、大部分が1.0付近に集中している一方、喀痰好酸球陰性患者について算出された予測値は、0付近〜0.8付近に分布していることがわかる（図３Ａ）。次いで、算出された予測値に基づいて、ROC解析を行った。感度と特異度が一致するポイントにカットオフを設定し、AUCを算出した結果、カットオフは約0.847（感度および特異度は0.76）、AUCは約0.879であった。設定したカットオフを図３Ａに示す。このカットオフを用いることで、喀痰好酸球陽性喘息患者と陰性患者とを高精度で判別することが可能であることがわかる。
【００７２】
更に、目的変数を喀痰好酸球測定結果（陽性/陰性）、説明変数を血清中のCCL27、CXCL9およびIL-25濃度として多重ロジスティックモデルを作成し、各マーカーの量の測定値を代入することで喀痰好酸球測定結果の予測値を取得した（変数指定法）。各血清試料から得られたマーカー濃度について予測値を算出した。喀痰好酸球陽性患者について算出された予測値は、大部分が1.0付近に集中している一方、喀痰好酸球陰性患者について算出された予測値は、0.2付近〜0.85付近に分布していることがわかる（図３Ｂ）。次いで、算出された予測値に基づいて、ROC解析を行った。感度と特異度が一致するポイントにカットオフを設定し、AUCを算出した結果、カットオフは約0.767（感度および特異度は0.88）、AUCは約0.960であった。設定したカットオフを図３Ｂに示す。このカットオフを用いることで、喀痰好酸球陽性喘息患者と陰性患者とを高精度で判別することが可能であることがわかる。
【００７３】
図３Ａと図１Ａおよび１Ｂとの比較から、本発明のマーカーCCL27およびCXCL9の組合せ（図３Ａ）は、これらをそれぞれ単独で用いる場合（実施例１）よりも、喀痰好酸球陽性喘息患者と陰性患者とを判別する上で優れた性能を有することが示唆された。
更に、本発明のマーカーに加えて、IL-25を組み合わせた場合（図３Ｂ）には、CCL27およびCXCL9を組み合わせた場合（図３Ａ）よりも優れた判別性能が得られることが示唆された。
【符号の説明】
【００７４】
１００    タンパク質測定装置（測定部）
２００    情報処理装置（コンピュータ）
２１０    情報処理装置本体（情報処理部）
２２０    表示部（出力部）
２３０    入力デバイス
２４０    外部記録媒体
２１０ａ  ＣＰＵ
２１０ｂ  ＲＯＭ
２１０ｃ  ＲＡＭ
２１０ｄ  ハードディスク
２１０ｅ  読出装置
２１０ｆ  入出力インタフェース
２１０ｈ  画像出力インタフェース
２１０ｉ  バス
２４０ａ  アプリケーションプログラム
【図１Ａ】
2015068760.tif 000006
【図１Ｂ】
2015068760.tif 000007
【図１Ｃ】
2015068760.tif 000008
【図１Ｄ】
2015068760.tif 000009
【図１Ｅ】
2015068760.tif 000010
【図２Ａ】
2015068760.tif 000011
【図２Ｂ】
2015068760.tif 000012
【図２Ｃ】
2015068760.tif 000013
【図２Ｄ】
2015068760.tif 000014
【図２Ｅ】
2015068760.tif 000015
【図３Ａ】
2015068760.tif 000016
【図３Ｂ】
2015068760.tif 000017
【図４】
2015068760.tif 000018
【図５】
2015068760.tif 000019