(57)【要約】本発明は、標的抗原に対する宿主免疫応答を刺激し持続させるための方法および組成物における、IL-10機能の阻害剤および標的抗原に対する免疫応答のプライミングを刺激する免疫刺激因子の使用について開示する。本発明の方法および組成物は、病原感染および癌を含む様々な状態の処置または予防に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に対してナイーブである対象または以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがある対象における標的抗原に対する免疫応答を刺激するための組成物であって、標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激因子およびIL-10機能の阻害剤を含む組成物。
【請求項２】
免疫刺激因子が、標的抗原の少なくとも一部、標的抗原と免疫相互作用する抗原結合分子、および標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激細胞に対応する抗原より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
標的抗原が関心対象の疾患または病気と関連する、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
標的抗原が病原生物または癌によって産生される、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原が可溶型である、請求項2記載の組成物。
【請求項６】
標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原が粒子または細胞である、請求項2記載の組成物。
【請求項７】
標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原が抗原提示細胞によって提示される、請求項2記載の組成物。
【請求項８】
免疫調節剤が、そのレベルまたは機能的活性を低下させるよう標的抗原と結合しまたはさもなければ相互作用する抗原結合分子である、請求項2記載の組成物。
【請求項９】
免疫刺激細胞が免疫エフェクター細胞である、請求項2記載の組成物。
【請求項１０】
免疫エフェクター細胞が抗原特異的Tリンパ球より選択される、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
標的抗原に対するまたは複数の標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する、少なくとも1つのその他の免疫刺激因子をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
対象が以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがあり、および免疫刺激因子が標的抗原に対応する抗原を含み、対応する抗原のアミノ酸配列が少なくとも該部分のアミノ酸配列と同じである、請求項1記載の組成物。
【請求項１３】
対象が以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがあり、および免疫刺激因子が標的抗原に対応する抗原を含み、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって、対応する抗原のアミノ酸配列が少なくとも該部分のアミノ酸配列と区別される、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
対応する抗原が、対象が既に免疫応答を引き起こしたことがある天然の抗原である、請求項12または請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
IL-10機能の阻害剤が、可溶性もしくは欠損IL-10受容体もしくはその断片、IL-10受容体もしくはその断片を発現する細胞、IL-10もしくはIL-10受容体と免疫相互作用する抗原結合分子、IL-10遺伝子の発現もしくはIL-10発現産物の機能的活性を阻害する核酸、またはIL-10の小分子阻害剤より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
免疫刺激の有効性を増強するアジュバントをさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１８】
アジュバントが抗原をクラスI主要組織適合経路に送達する、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
アジュバントが、標的細胞の細胞質への抗原の送達を媒介するサポニン含有化合物および細胞溶解素より選択される、請求項17記載の組成物。
【請求項２０】
細胞溶解素が抗原と連結しまたはさもなければ会合している、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
細胞溶解素が、抗原提示細胞の空胞から細胞質への抗原の移動を媒介する、請求項19記載の組成物。
【請求項２２】
細胞溶解素がリステリオリシンである、請求項19記載の組成物。
【請求項２３】
標的抗原に対してナイーブである対象または以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがある対象における免疫応答を刺激するための方法であって、標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激因子およびIL-10機能の阻害剤の有効量を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２４】
免疫応答がT細胞を介する免疫応答である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
免疫応答が、対象における標的抗原の存在または異常発現と関連する疾患または病気の処置または予防に必要である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
疾患はまたは病気が、病原感染、免疫不全を特徴とする疾患、または癌より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
それによって標的抗原に対する免疫応答を維持または増強するために、少なくとも1つのその他の有効量の免疫刺激因子および任意で少なくとも1つのその他の有効量のIL-10機能の阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
標的抗原に対する免疫応答を刺激または増強するための医用製剤の製造における、IL-10機能の阻害剤および標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激薬剤の使用。
【請求項２９】
標的抗原の存在または異常発現と関連する疾患または病気を処置または予防するための医用製剤の製造における、IL-10機能の阻害剤および標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に免疫応答を調節するための方法および薬剤に関する。より具体的には、本発明は、標的抗原に対する宿主免疫応答を刺激しまたは持続させるための方法および組成物におけるIL-10機能の阻害剤および標的抗原に対する免疫応答のプライミングを刺激する免疫刺激因子の使用に関する。本発明の方法および組成物は、病原感染および癌を含む様々な病気の処置または予防に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
「抗原原罪」は、宿主が2つの交差反応性抗原によって連続的に刺激された場合、誘導される免疫応答は最初の抗原に対してのみ向けられるということを認識するために造り出された用語であり、およびインフルエンザ感染期間の抗体応答について最初に記載された(Webster, 1966, J. Immunol. 97：177-183(非特許文献1))。新興ウイルスとのあるレベルの交差反応性は精子抗体の持続性を説明し得るが、感染宿主の免疫系が新興ウイルス変異体に対する高親和性の中和抗体を産生するのを妨げる機構は明らかではない。
【０００３】
HIV感染の場合、抗原原罪はB細胞クローンの優勢として現れ、その場合、初めの応答B細胞が「欺瞞的インプリンティング」または「レパートリー凍結」と呼ばれる過程によって「固定」される(Kohler et al., 1994, Immunol. Today 15：475-478(非特許文献2))。このクローンの優勢は、HIVに対して産生される抗体の組の多様性の制限を必然的に伴い、および明らかに新興突然変異体に対する免疫応答の適応を弱め、かつウイルス持続性に有利に働くことができる。
【０００４】
LCMVのある系統でプライミングを受けたマウスは、新しい変異体エピトープに対してよりもむしろ最初のエピトープに対して向けられたCTL応答を伴ってCTLエピトープ変異体系統によるその後の感染に応答するので、抗原原罪はCTL応答にも観察されている(Klenerman and Zinkernagel, 1998, Nature 394(6692)：482-485(非特許文献3))。
【０００５】
変異体抗原、または新規の抗原エピトープを提示する抗原提示細胞と交差反応し、およびしたがって変異体抗原、または新規の抗原エピトープを提示する抗原提示細胞を除去することができる、以前から存在するT細胞または抗体は各々、変異体抗原の新規のエピトープに対する応答の発達の阻害に寄与する因子と考えられている(Da Silva, 2001, Virology 290(2)：350-60(非特許文献4)；McMichael, 1998, Nature 394(6692)：421-422(非特許文献5))。最近、Liuら(2003, J. Immunol. 171：4765-4772(非特許文献6))は、パピローマウイルス(PV)カプシドタンパク質に対する事前免疫が、クラスI制限エピトープを発現するカプシドによる免疫付与の後に、ナイーブCD8+ T細胞からのカプシドタンパク質と連結したMHCクラスI制限エピトープに対するIFN-γ応答の誘導を阻害することを見出した。さらに、Liuらは、この低下した応答がIL-10産生を必要とし、PVカプシド送達の部位に局部的であり、およびカプシドに対する抗体に非依存的であるということを観察した。これらの観察は抗原原罪の記載に適合するとの結論を下している一方で、これらの研究者は、ウイルスまたは腫瘍抗原に対するワクチン接種によって新規の免疫応答を誘導することが望ましい場合に、IL-10の局部的阻害がキャリア抗原に対する事前免疫を克服する重要な決定因子であり得るということを提案した。
【０００６】
本発明に至るまでの仕事において、PVカプシドタンパク質L1 VLP免疫付与により、VLPでプライミングを受けた宿主中のCD8+ T細胞によるその後の抗原特異的IFN-γ分泌の阻害に必要である、抗原特異的IL-10分泌CD4+ T細胞が発生するということが発見された。本発明者らはまた、VLP特異的CD4+細胞が樹状細胞との接触によってIL-10を分泌するということ、およびCD4+ T細胞に教育された樹状細胞が、IL-5は分泌するがIFN-γは分泌しないCD8+ T細胞の誘導に有利に働くということを発見した。さらに、インビトロまたはインビトロのいずれかにおけるIL-10の一時的な中和によって、適当な免疫付与後のVLPに対するCD8+ IFN-γ応答を開始する能力の回復が可能になることが見出された。
【０００７】
上記の知見は、様々な病原性作用物質、とりわけ持続し、および慢性疾患をもたらすことができる病原性作用物質に対するより有効な免疫応答を刺激するための新規の方法および組成物の実施に至っている。
【０００８】
【非特許文献１】Webster, 1966, J. Immunol. 97：177-183
【非特許文献２】Kohler et al., 1994, Immunol. Today 15：475-478
【非特許文献３】Klenerman and Zinkernagel, 1998, Nature 394(6692)：482-485
【非特許文献４】Da Silva, 2001, Virology 290(2)：350-60
【非特許文献５】McMichael, 1998, Nature 394(6692)：421-422
【非特許文献６】Liuら、2003, J. Immunol. 171：4765-4772
【発明の開示】
【０００９】
したがって、ある局面において、本発明は、標的抗原に対してナイーブである対象または以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがある対象における標的抗原に対する免疫応答を刺激するための組成物を提供する。これらの組成物は通常、標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激因子およびIL-10機能の阻害剤を含む。幾つかの態様において、免疫刺激因子は、標的抗原の少なくとも一部、標的抗原と免疫相互作用する抗原結合分子、および標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激細胞に対応する抗原より選択される。標的抗原は典型的には関心対象の疾患または病気と関連する。幾つかの態様において、標的抗原は病原生物または癌によって産生される。標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原は、可溶型(例えば、ペプチドもしくはポリペプチドまたはこれらのうちの任意の1つが発現可能であるコンストラクト)であってもよい。あるいは、抗原は粒子もしくは細胞(例えば、ウイルス、細菌、もしくは細胞全体)であってもよく、または抗原提示細胞(例えば、プロフェッショナルなもしくは条件的な抗原提示細胞)によって提示されてもよい。免疫調節剤が抗原結合分子である態様において、そのような分子は典型的には、そのレベルまたは機能的活性を低下させる(例えば、中和抗体)ように標的抗原と結合しまたはさもなければ相互作用すると考えられる。IL-10機能の阻害剤と合わせて使用し得る例示的な免疫刺激細胞は、細胞溶解性Tリンパ球およびTヘルパーリンパ球などの、しかしこれらに限定されない、抗原特異的Tリンパ球、調節性T細胞ならびにBリンパ球を含む免疫エフェクター細胞である。幾つかの態様において、組成物は、標的抗原に対するまたは複数の標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する、1つより多くの免疫刺激因子、例えば、2、3、4、5、またはそれより多くの免疫刺激因子を含む。
【００１０】
好適には、対象が以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがあり、かつ免疫刺激因子が標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を含む態様において、対応する抗原のアミノ酸配列は少なくとも該部分のアミノ酸配列と同じである。対象が以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがあり、かつ免疫刺激因子が標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を含むその他の態様において、対応する抗原のアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって、少なくとも該部分のアミノ酸配列と区別される。これらの態様の実例となる例において、対応する抗原は、対象が既にそれに対する免疫応答を引き起こした天然の抗原である。
【００１１】
幾つかの態様において、IL-10機能の阻害剤は、可溶性もしくは欠損IL-10受容体もしくはその断片、IL-10受容体もしくはその断片を発現する細胞、IL-10もしくはIL-10受容体と免疫相互作用する抗原結合分子、IL-10遺伝子の発現もしくはIL-10発現産物の機能的活性を阻害する核酸(例えば、IL-10遺伝子またはその転写産物に対する特異性を有するアンチセンス分子、リボザイム、またはRNAi分子)、またはIL-10の小分子阻害剤より選択される。
【００１２】
幾つかの態様において、組成物は薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。ある種の態様において、組成物は免疫刺激の有効性を増強するアジュバントをさらに含む。好適には、アジュバントは、抗原をクラスI主要組織適合(MHC)経路に送達する。例えば、そのようなアジュバントは、標的細胞の細胞質への抗原の送達を媒介する、サポニン含有化合物(例えば、ISCOM)および細胞溶解素を含むが、これらに限定されない。細胞溶解素は抗原と連結し、またはさもなければ会合していてもよい。幾つかの態様において、細胞溶解素は、抗原提示細胞の空胞(例えば、ファゴソームまたはエンドソーム)から細胞質への抗原の移動を媒介し、およびこの種の実例となる例において、細胞溶解素はリステリオリシンである。
【００１３】
本発明の別の局面は、標的抗原に対してナイーブである対象または以前に標的抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがある対象における免疫応答を刺激するための方法を提供する。これらの方法は通常、上で広範囲に記載されたような、有効量の免疫刺激因子およびIL-10機能の阻害剤を対象に投与する工程を含む。組成物の活性成分を連続的に、個別的に、または同時的に投与してもよい。ある種の態様において、免疫応答はT細胞介在性免疫である。好都合なことに、これらの方法は、対象における標的抗原の存在または異常発現と関連する疾患または病気の処置または予防に有用である、ある種の態様において、疾患はまたは病気は、病原感染、免疫不全を特徴とする疾患、または癌より選択される。本発明に従って、IL-10機能の阻害剤は、さもなければ阻害剤の非存在下で産生されると考えられるIL-10の産生を阻害すると考えられ、それによってその後の免疫刺激因子および任意でIL-10機能の阻害剤の送達の後の標的抗原に対するCD8+ IFN-γ応答を開始する対象の能力を維持すると考えられる。したがって、幾つかの態様において、本発明の方法は、それによって標的抗原に対する免疫応答を維持または増強するために、少なくとも1つのその他の有効量の免疫刺激因子および任意で少なくとも1つのその他の有効量のIL-10機能の阻害剤を投与する工程をさらに含む。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、標的抗原に対する免疫応答を刺激または増強するための医用製剤の製造における上で広範囲に記載されたようなIL-10機能の阻害剤および免疫刺激薬剤の使用を企図している。
【００１５】
また別の局面において、本発明は、標的抗原の存在または異常発現と関連する疾患または病気を処置または防止するための医用製剤の製造における上で広範囲に記載されたようなIL-10機能の阻害剤および免疫刺激薬剤の使用にある。
【００１６】
発明の詳細な説明
1、定義
他に特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載された方法および材料と同様または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００１７】
「a(1つの)」および「an(1つの)」という冠詞は、1つまたは1つより多くの(すなわち、少なくとも1つの)冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書において使用される。例として、「1つの要素(an element)」は、1つの要素または1つより多くの要素を意味する。
【００１８】
「約」という用語は、特定の状態に対して30％と同じ程度だけ、好ましくは20％と同じ程度だけ、およびより好ましくは10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％と同じ程度だけ変わる状態(例えば、量、濃度、時間など)を指すために本明細書において使用される。
【００１９】
「抗原」とは、脊椎動物、とりわけ哺乳動物における免疫応答を引き出すことができるタンパク質、ペプチド、または分子もしくは巨大分子の全てまたは部分を意味する。そのような抗原はまた、そのタンパク質、ペプチド、または分子もしくは巨大分子で免疫付与を施された動物由来の抗体との反応性がある。
【００２０】
「抗原結合分子」とは、標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語が、免疫グログリン、免疫グログリン断片、抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来のタンパク質フレームワークにまで及ぶということが理解されると考えられる。
【００２１】
「自己」とは、同じ生物に由来するもの(例えば、細胞、組織など)を意味する。
【００２２】
本明細書において使用される場合の「同種異系」という用語は、異なる遺伝子構成の細胞、組織、生物などを指す。
【００２３】
「生物学的活性断片」とは、断片が親ポリペプチドの活性を保持する全長の親ポリペプチドの断片を意味する。本明細書において使用される場合、「生物学的活性断片」という用語は、親ポリペプチドの活性を含む、例えば、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の連続したアミノ酸の、欠失突然変異体および小ペプチドを含む。この種のペプチドを標準的な組換え核酸技術の適用によって得てもよく、または従来の液相もしくは固相合成技術を用いて合成してもよい。例として、例えば、Nicholsonによって編集され、およびBlackwell Scientific Publicationsによって刊行された「Synthetic Vaccines」と題された刊行物に含まれるAtherton and Shephardによって「Peptide Synthesis」と題された第9章に記載されたような溶液合成または固相合成に対する参照がなされてもよい。あるいは、エンドLys-C、エンドArg-C、エンドGlu-C、およびブドウ球菌V8プロテアーゼなどのプロテイナーゼによる本発明のポリペプチドの消化によってペプチドを産生することができる。例えば、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)技術によって消化された断片を精製することができる。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「細胞組成物」、「細胞ワクチン」、または「細胞免疫原」は、活性成分として少なくとも1つの細胞集団を含む組成物を指す。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「シス作用配列」もしくは「シス調節領域」という用語または類似の用語は、発現可能な遺伝子配列に由来する任意のヌクレオチドの配列を意味すると解されるものとし、遺伝子配列の発現は、少なくとも一部は、ヌクレオチドの配列によって調節される。当業者は、シス調節領域が、任意の構造遺伝子配列の発現のレベルおよび/または細胞型特性および/または発生特異性を活性化し、サイレンシングし、増強し、抑制し、またはさもなければ変更することができ得るということを知っていると考えられる。
【００２６】
本明細書を通じて、文脈上別様に解されるが必要がない限り、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含む(comprising)」という語は、述べられた工程もしくは要素または工程もしくは要素の集合の含有という意味を含むが、任意のその他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の集合の排除という意味を含まないと理解されると考えられる。
【００２７】
「に対応する(corresponds to)」または「に対応する(corresponding to)」とは、標的抗原中のアミノ酸配列に対する実質的な類似性を示すアミノ酸配列をコードする抗原を意味する。一般に、抗原は、標的抗原の少なくとも一部に対する少なくとも約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％の類似性を示すと考えられる。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「培養(culturing)」、「培養(culture)」、およびそれらと同様の語は、インビトロにおいて細胞の増殖または維持を支持することが示されている条件下で細胞の集団(または単一の細胞)を培養するインビトロで用いられる一連の手順を指す。当業者は、培養系で規定される必要がある広範な数の形式、培地、温度範囲、ガス濃度などを認識している。選択される形式および本明細書において開示された方法を実施する個体の特定の要求に基づいて、パラメータは変わると考えられる。しかしながら、培養パラメータの決定は、事実上機械的である。
【００２９】
免疫応答を調節し、または疾患もしくは病気を処置もしくは防止する文脈における、「有効量」とは、処置または防止を必要とする個体に対する、単一用量でのまたは一連の部分としてのいずれかの、調節、処置、または予防を達成するために有効である量の組成物の投与を意味する。有効量は、処置されるべき個体の健康および身体状態、処置されるべき個体の分類群、組成物の剤形、医学的状況の評価、およびその他の関連する要因によって変わると考えられる。量は日常的な試行によって決定することができる比較的幅広い範囲に収まることが期待される。
【００３０】
「発現ベクター」によって、ベクターによってコードされたタンパク質の合成を導くことができる任意の自律的遺伝子エレメントが意味される。そのような発現ベクターは当業者に公知である。
【００３１】
「遺伝子」という用語は、遺伝子に対応するゲノムDNA領域だけでなく、エキソンに対応するcDNA配列または産物の機能型をコードするように人工的に改変された組換え分子も含むよう、その最も幅広い文脈において使用される。
【００３２】
「誘導体」とは、例えばその他の化学的部分とのコンジュゲーションもしくは複合体化による修飾によって、または当技術分野において理解されると考えられるような翻訳後修飾によって、基本配列から派生するポリペプチドを意味する。「誘導体」という用語はまた、機能的に同等の分子を提供する付加、または欠失を含む親配列に対してなされた変更をその範囲内に含む。
【００３３】
当技術分野において周知であるような、免疫応答を増強すること(「免疫増強」)とは、異質または疾患特異的抗原(例えば、癌抗原)に応答する動物の能力を増大させること、すなわち、それらの抗原を検出および破壊するために、そのような抗原を攻撃するようプライミングを受けたそれらの細胞の数、活性、および能力が増大することを意味する。免疫応答の強度は、以下を含む標準的なテストによって測定される：当業者に公知の手段による末梢血リンパ球の直接的測定；ナチュラルキラー細胞の細胞毒性アッセイ法(例えば、Provinciali M. et al(1992, J. Immunol. Meth. 155：19-24)参照)、細胞増殖アッセイ法(例えば、Vollenweider, I. And Groseurth, P. J.(1992, J. Immunol.Meth. 149：133-135)参照)、免疫細胞およびサブセットの免疫アッセイ法(例えば、Loeffler, D. A., et al.(1992, Cytom. 13：169-174)；Rivoltini, L., et al.(1992, Can. Immunol. Immunother. 34：241-251)参照)；または細胞介在性免疫についての皮膚テスト(例えば、Chang, A. E. et al(1993, Cancer Res. 53：1043-1050)参照)。前述のテストによって測定されるような任意の統計的に有意な免疫応答の強度の増大は、本明細書において使用される場合の「増強された免疫応答」、「免疫増強」、または「免疫強化」と考えられる。増強された免疫応答はまた、全身および局所感染の治癒、ならびに疾患における症状の低下、すなわち、腫瘍サイズの減少、ハンセン病、結核、マラリア、ナフサウス潰瘍(naphthous ulcers)、疱疹性疣贅および乳頭腫状疣贅、歯肉炎、関節硬化症、カポジ肉腫などのAIDSに付随するもの、気管支感染、ならびにそれらと同様のものを含むがこれらに制限されない、疾患または病気の症状の緩和だけでなく、発熱および炎症などの身体的徴候によっても示される。そのような身体的徴候はまた、本明細書において使用されるような「増強された免疫応答」、「免疫増強」、または「免疫強化」を規定する。
【００３４】
本明細書における「免疫不全」に対する言及は、液性免疫および/または細胞介在性免疫の産生に不全がある任意の病気に対する言及を含む。
【００３５】
本明細書における「免疫相互作用」に対する言及は、分子間の、および特に分子の1つが免疫系の構成要素であり、または免疫系の構成要素を模倣する場合の任意の相互作用、反応、またはその他の形態の関連に対する言及を含む。
【００３６】
細胞の「不活性化」は、細胞が子孫を形成するための細胞分裂ができなくなったということを示すために本明細書において使用される。細胞はそれでもなお刺激に対する応答ができ、またはサイトカインなどの細胞産物の生合成および/もしくは分泌ができてもよい。不活性化の方法は当技術分野において公知である。好ましい不活性化の方法は、マイトマイシンCなどの毒素、または放射線照射による処置である。固定または透過処理され、かつ分裂できない細胞もまた、不活性化細胞の例である。
【００３７】
「単離された」とは、そのネイティブな状態ではそれに通常付随する構成要素が実質的にまたは本質的にない材料を意味する。
【００３８】
それに以下のいずれかの能力がある場合、組成物は「免疫原性」である：a)ナイーブの個体において抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する免疫応答を発生させ；またはb)化合物または組成物が投与されていない場合に起こると考えられる以上に、個体における免疫応答を再構成し、ブーストし、もしくは維持する。単一用量または複数用量で投与された時に、それがこれらの基準のいずれかに達することができる場合、組成物は免疫原性である。
【００３９】
「調節する」とは、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、標的分子のレベルおよび/または機能的活性を増大または減少させることを意味する。例えば、薬剤は、標的分子以外の分子と相互作用することによって、該レベル/活性を間接的に調節してもよい。この点において、標的ポリペプチドをコードする遺伝子の間接的な調節は、第1の核酸分子の発現産物が標的ポリペプチドをコードする核酸分子を調節する、第1の核酸分子の発現の調節をその範囲内に含む。ある種の態様において、「調節(modulation)」または「調節(modulating)」は、所望の/選択された応答が、抗原が単独で用いられた場合よりも、効果的で(例えば、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくはそれを上回る)、速やかで(例えば、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくはそれを上回る)、規模が大きく(例えば、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくはそれを上回る)、および/または容易に誘導される(例えば、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくはそれを上回る)ということを意味する。
【００４０】
「5'非コード領域」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列以外の、発現可能な遺伝子の上流領域に由来する全てのヌクレオチド配列を含むよう、その最も幅広い文脈で本明細書において使用され、5'非コード領域は、少なくとも部分的には、遺伝子の発現を付与もしくは活性化し、またはさもなければ容易にする。
【００４１】
「から得られる」とは、例えば、核酸抽出物またはポリペプチド抽出物などの試料が、宿主の特定の源から単離され、または宿主の特定の源に由来するということを意味する。例えば、抽出物は、宿主から直接単離された組織または生体液から得られてもよい。
【００４２】
本明細書において使用される場合の「オリゴヌクレオチド」という用語は、リン酸ジエステル結合を介して連結された多様な核酸単位(デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその関連する構造変異体もしくは合成類似体)から構成されるポリマー(またはその関連する構造変異体もしくは合成類似体)を指す。したがって、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的にはヌクレオチドおよびそれらの間の連結が天然であるヌクレオチドポリマーを指すが、本用語はまた、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、2-O-メチルリボ核酸、およびそれらと同様のものを含むがこれらに制限されない、様々な類似体をその範囲内に含むということが理解されると考えられる。分子の正確なサイズは特定の用途によって変わってもよい。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さが少し短く、通常約10〜30オリゴヌクレオチドであるが、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語が典型的には大きいオリゴヌクレオチドに対して使用されるのに対し、本用語は任意の長さの分子を指すことができる。
【００４３】
本明細書において使用される場合の「機能的に接続された」または「機能的に連結された」という用語は、その後に遺伝子の転写および任意で翻訳を制御する、プロモーターの調節的制御下に構造遺伝子を置くということを意味する。異種プロモーター/構造遺伝子組み合わせの構築において、その遺伝子配列またはプロモーターとその自然な環境においてそれが制御する遺伝子、すなわち遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子の間の距離とほぼ同じだけ遺伝子転写開始部位から離れた所に遺伝子配列またはプロモーターを位置させることが好ましい。当技術分野において公知であるように、機能の喪失を伴わずに、この距離の幾分の変動が受け入れられることができる。同様に、その自然な環境におけるエレメント；すなわち、それが由来する遺伝子の位置付けによって、その制御下に置かれるべき異種遺伝子に対する調節配列エレメントの好ましい位置付けが規定される。
【００４４】
本明細書において互換的に使用される「患者」、「対象」、「宿主」、または「個体」という用語は、治療または予防が望ましい任意の対象、特に脊椎動物対象、およびさらにより特に哺乳動物対象を指す。本発明の範囲内に収まる好適な脊椎動物は、霊長類、齧歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウサギ目の動物(例えば、ウサギ、野ウサギ)、ウシ科の動物(例えば、ウシ)、ヒツジ科の動物(例えば、ヒツジ)、ヤギ科の動物(例えば、ヤギ)、ブタ科の動物(例えば、ブタ)、ウマ科の動物(例えば、ウマ)、イヌ科の動物(例えば、イヌ)、ネコ科の動物(例えば、ネコ)、鳥類(ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、カナリア、セキセイインコなどのようなコンパニオンバード)、海洋哺乳動物(例えば、イルカ、クジラ)、両生類(ヘビ、カエル、トカゲなど)、および魚類を含む脊椎動物亜門の任意のメンバーを含むが、これらに制限されない。好ましい対象は、関心対象の抗原の存在または異常発現と関連する、病気または疾患に対する処置または予防を必要とするヒトである。しかしながら、前述の用語は、症状が存在することを意味するものではないということが理解されると考えられる。
【００４５】
「薬学的に許容される担体」とは、局所または全身投与において安全に使用され得る固体または液体の充填剤、希釈剤、封入物質を意味する。
【００４６】
本明細書において使用される場合の「薬学的に適合性のある塩」という用語は、ヒトおよび動物の投与にとって毒物学的に安全である塩を指す。この塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、リン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、ナプシル酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、テレフタル酸塩、パモ酸塩、およびペクチン酸塩を含む群より選択されてもよい。
【００４７】
本明細書において使用される場合の「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、mRNA、RNA、cRNA、cDNA、またはDNAを指定する。本用語は典型的には、長さ30ヌクレオチドを上回るオリゴヌクレオチドを指す。
【００４８】
「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列との実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、1つまたは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失され、または異なるヌクレオチドと取り替えられたポリヌクレオチドを包含する。この点において、それによって変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持する、突然変異、付加、欠失、および置換を含めたある種の変更がポリヌクレオチドに対してなされることができるということが当技術分野において十分に理解されている。「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語はまた、天然のアレル変異体を含む。
【００４９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、ならびに同一物の変異体および合成類似体を指すよう本明細書において互換的に使用される。したがって、これらの用語は、天然のアミノ酸ポリマーだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、天然のアミノ酸に対応する化学的類似体などの、合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００５０】
「ポリペプチド変異体」という用語は、少なくとも1つのアミノ酸の付加、欠失、または置換によって参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。アミノ酸の中には、ポリペプチドの活性の性質を変化させずに、幅広く類似の特性を有するその他のアミノ酸に変化させ得るものがあるということが当技術分野において十分に理解されている。したがって、本明細書において使用される場合のポリペプチド変異体は、IFNα、IFNβ、IFNγ、B7-1分子、およびB7-2分子より選択される親ポリペプチドに類似した活性を有するポリペプチドを包含する。好ましい変異体ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含む。ポリペプチド中の実例となる保存的置換が、以下の表に従ってなされてもよい：
【表Ａ】
2008535868.tif 000002
【００５１】
表Aで示された置換よりも保存性の低い置換を選択することによって、機能の実質的な変化がなされる。その他の取り替えは非保存的置換であると考えられ、およびこれらのうちの比較的少数のものが許容され得る。通常、ポリペプチドの特性における最大の変化を産生する可能性が高い置換は、(a)親水性残基(例えば、SerもしくはAsn)が疎水性残基(例えば、Ala、Leu、Ile、Phe、もしくはVal)の代わりに、もしくは疎水性残基(例えば、Ala、Leu、Ile、Phe、もしくはVal)によって置換され；(b)システインもしくはプロリンが任意のその他の残基の代わりに、もしくは任意のその他の残基によって置換され；(c)電気的に陽性の側鎖を有する残基(例えば、Arg、His、もしくはLys)が電気的に陰性の側鎖を有する残基(例えば、GluもしくはAsp)の代わりに、もしくは電気的に陰性の側鎖を有する残基によって置換され、または(d)より小さい側鎖を有する残基(例えば、AlaもしくはSer)もしくは側鎖を有さない残基(例えば、Gly)がかさばった側鎖を有する残基(例えば、PheもしくはTrp)の代わりに、もしくはかさばった側鎖を有する残基(例えば、PheもしくはTrp)によって置換されている置換である。
【００５２】
本明細書における「プロモーター」に対する言及は、その最も幅広い文脈において解されるべきであり、ならびにCCAATボックス配列ならびに発生および/もしくは環境刺激に応答して、または組織特異的もしくは細胞型特異的様式で遺伝子発現を変更するさらなる調節エレメント(すなわち、上流活性化配列、エンハンサー、およびサイレンサー)を伴うまたは伴わない、正確な転写開始に必要とされるTATAボックスを含む、古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。プロモーターは通例、それが発現を調節する、構造遺伝子の上流または5'に位置するが、必ずしもそうである必要はない。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは通例、遺伝子の転写の開始部位の2kb以内に位置する。本発明による好ましいプロモーターは、細胞における発現をさらに増強するための、および/またはそれが機能的に接続されている構造遺伝子の発現のタイミングを変更するための1つまたは複数の特定の調節エレメントのさらなるコピーを含んでもよい。
【００５３】
本明細書において使用される場合の「組換えポリヌクレオチド」という用語は、核酸の操作によって自然では通常見出されない形態にインビトロで形成されるポリヌクレオチドを指す。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形態であってもよい。通常、そのような発現ベクターは、ヌクレオチド配列に機能的に連結された転写および翻訳調節核酸を含む。
【００５４】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技術を用いて、すなわち組換えポリヌクレオチドの発現によって作られたポリペプチドを意味する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、免疫または免疫学的応答を「刺激すること」とは、宿主の免疫系が、さもなければ組成物の非存在下で起こると考えられるよりも高いレベルで、異質分子、同種異系細胞、または腫瘍細胞などの、標的抗原に反応する能力を開始し、ブーストし、または維持する組成物の投与を指す。「1次」免疫応答を刺激することとは、本明細書において、例えば、標的抗原への曝露の欠如、標的に対する不応性、または免疫抑制によって；以前の反応性が検出されなかった対象における特定の免疫応答を引き出すことを指す。「2次」応答を刺激することとは、例えば、自然免疫、自発的免疫付与、または1つもしくは幾つかの組成物もしくは手順を用いた処置によって；以前の反応性が検出された対象における反応性の再開、ブースト、維持を指す。
【００５６】
「処置」、「処置する」、「処置された」、およびそれらと同様の語によって、治療的処置および予防的処置の両方を含むよう意味される。
【００５７】
「ベクター」とは、核酸分子、好ましくは、例えば、核酸配列が挿入またはクローン化され得る、プラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスに由来するDNA分子を意味する。ベクターは、好ましくは1つまたは複数の固有の制限部位を含み、および標的細胞もしくは組織もしくはその前駆細胞もしくは組織を含む規定の宿主細胞において自律的複製ができてもよく、またはクローン化された配列が再生可能であるように規定の宿主のゲノムに組み込み可能であってもよい。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体複製に依存しない、染色体外の実在として存在するベクター、例えば、線状もしくは閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含んでもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された時に、ゲノムに組み込まれ、かつそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであってもよい。ベクター系は、1つのベクターもしくはプラスミド、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全DNAを一緒に含む、2つもしくはそれより多くのベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含んでもよい。ベクターの選別は典型的には、ベクターとベクターが導入されるべき宿主細胞との適合性に依存すると考えられる。ベクターはまた、好適な形質転換体の選択に用いることができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。そのような耐性遺伝子の例は、当業者に周知である。
【００５８】
2、組成物
本発明は、対象の標的抗原に対する二次免疫応答が、標的抗原に対する一次応答の期間に産生され、ならびにナイーブ抗原特異的CD8+細胞が細胞毒性機能およびIFN-γを分泌する能力を獲得するのを妨げる、抗原特異的IL-10分泌CD4+ T細胞の発生によって損なわれる可能性があるという決定から少なくとも一部は生じている。本発明者らはまた、インビトロまたはインビトロのいずれかにおけるIL-10の一時的な中和が、適当な免疫付与後の標的抗原に対するCD8+ IFN-γ応答を開始する対象の能力を回復したということを明らかにした。これらの観察に基づき、本発明者らは、IL-10機能の阻害剤および標的抗原に対する免疫応答を刺激しまたはさもなければ増強する免疫刺激因子を含む組成物を用いて、一次であれ二次であれ、標的抗原に対する免疫応答を引き起こしまたは維持する対象の能力を維持する、より有効な免疫応答を達成することができるということを提案する。
【００５９】
2.1 IL-10機能の阻害剤
IL-10機能の阻害剤には、IL-10もしくはその受容体に直接的もしくは間接的に結合しまたはIL-10もしくはその受容体と物理的に会合し、およびその機能または活性(例えば、白血球、とりわけリンパ球およびよりとりわけTリンパ球の上に存在する1つもしくは複数の表面分子(例えば、受容体)への結合または白血球、とりわけリンパ球およびよりとりわけTリンパ球の上に存在する1つもしくは複数の表面分子(例えば、受容体)との相互作用)の少なくとも1つを好適に遮断し、阻害し、またはさもなければ相殺する任意の分子または化合物が含まれる。結合または会合は、誘導された磁場もしくは常磁場の形成、共有結合形成、例えば、イオン格子に生じるようなイオン相互作用、水素結合、またはあるいは例えば、双極子-双極子相互作用、双極子誘導性双極子相互作用、誘導性双極子誘導性相互作用、もしくは反発相互作用などのファンデルワールス相互作用、または上記の引力の任意の組み合わせを伴ってもよい。ある種の態様において、IL-10機能の阻害剤は、IL-10の少なくとも一部と免疫相互作用する抗原結合分子である。これらの態様において、抗原結合分子は活性型または不活性型のIL-10と免疫相互作用することができ、その違いは、活性のあるサイトカインに対する抗原結合分子は、活性のある立体構造中にのみ存在するエピトープを認識する可能性がより高いということである。実例となる抗原結合分子およびそれらの産生のための方法は、米国特許第5,837,232号；第5,837,293号；および第6,239,260号に記載されている。
【００６０】
その他の態様において、IL-10機能の阻害剤は、IL-10の細胞受容体の活性化を特異的に妨げることができる任意の分子である。例えば、そのような阻害剤は、IL-10受容体と免疫相互作用する抗原結合分子であることができ、その代表例は米国特許第5,863,796号に記載されている。あるいは、この種の阻害剤を、可溶性もしくは欠損IL-10受容体または可溶性IL-10受容体サブユニットより選択することができる。この種の代表的な受容体は、例えば、米国特許第5,843,697号および第6,423,500号、米国特許出願刊行物第20040204351号および第20050064464号、Tan et al.(1995, J. Biol. Chem. 270：12906)、ならびにGenBankアクセッション番号U00672またはNM_001558に記載されている。その他の態様において、IL-10機能の阻害剤は、例えば、米国特許出願刊行物第20020019043号に記載されたような細胞(例えば、細菌細胞)の表面に発現されたIL-10受容体である。
【００６１】
幾つかの態様において、IL-10機能の阻害剤は、IL-10遺伝子の発現またはその発現産物の機能的活性を阻害する核酸である。この種の実例となる例において、阻害剤はIL-10遺伝子発現を低下させまたは無効にし、およびIL-10シグナリング経路を刺激するメッセンジャーRNAの翻訳を阻害するよう機能する、アンチセンスRNAおよびDNA分子ならびにリボザイムを含む、オリゴリボヌクレオチド配列を含むが、これらに制限されない。アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAに結合し、およびタンパク質翻訳を妨げることによって、mRNAの翻訳を直接遮断するよう作用する。アンチセンスDNAに関しては、例えば、−10と＋10領域の間の、翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。IL-10遺伝子およびその転写産物に対する特異性を有する実例となるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国特許第6,184,372号に記載されている。あるいは、標的遺伝子または遺伝子産物のRNA干渉(RNAi)を媒介するRNA分子を用いて遺伝子発現を低下させまたは無効にすることができる。RNAiは、標的遺伝子の転写産物に相同である1本鎖、および典型的には2本鎖のRNA(dsRNA)を導入することによる標的遺伝子の産物への干渉または標的遺伝子の産物の破壊を指す。したがって、幾つかの態様において、IL-10遺伝子の少なくとも一部に対応するdsRNAそれ自体およびとりわけdsRNA産生コンストラクトを用いて、その発現を低下させまたは無効にしてもよい。当技術分野において報告された技術のいずれかを用いて、例えば、ステムループもしくはヘアピンRNA構造をコードする核酸コンストラクトを標的細胞のゲノムにトランスフェクトすることによって、または一点に集中するプロモーターの間から、もしくは1つのプロモーターの後ろからの頭部から頭部へのもしくは尾部から尾部への複製として、標的遺伝子に対する相同性を有するトランスフェクトした核酸コンストラクトを発現させることによって、RNAiを介する遺伝子発現の阻害を完遂してもよい。それがそれ自身に対して折り畳み、かつdsRNAを産生する能力を有する1本のRNAを産生する限り、またはそれがその後アニールして標的遺伝子に対する相同性を有するdsRNAを形成する2つの別々のRNA転写産物を産生する限り、任意の類似のコンストラクトを用いてもよい。あるいは、例えば米国特許出願第20020086356号にTuschlらによって記載されたような、それらが対応する特異的mRNAの切断を導く、約21〜約23ヌクレオチドのRNA分子を、RNAiを媒介するために利用することができる。そのような21〜23nt RNA分子は、3'水酸基を含むことができ、1本鎖または(2つの21〜23nt RNAのように)2本鎖であることができ、dsRNA分子はブラント末端であることができ、または突出末端(例えば、5'、3')を含むことができる。
【００６２】
その他の態様において、IL-10機能の阻害剤はIL-10の小分子調節因子であり、その実例となる例には、ベータアレチン、ベータアラニルタウリン、カルボベンゾキシベータアラニルタウリン、ならびに米国特許第6,451,853号に開示された化合物の範囲内に収まる様々なその他のアミノチオールおよびアミノリン酸だけでなく、例えば、米国特許第6,723,736号に記載されたような置換されたイソキノリン、イソクロマノン、およびイソチオクロマノンも含まれる。
【００６３】
望ましくは、IL-10機能の阻害剤は宿主にとって無毒性であり、最小限のまたはごくわずかな副作用を伴う。
【００６４】
2.2 免疫調節剤
2.2.1 抗原
本発明は、標的抗原に対する免疫応答を刺激するための関心対象の標的抗原の少なくとも一部に対応する任意の抗原の本発明の組成物における使用を企図している。そのような抗原は可溶型(例えば、ペプチド、ポリペプチド、もしくはペプチドもしくはポリペプチドが発現可能である核酸分子)であってもよく、もしくは細胞全体もしくは弱毒化した病原体調製物(例えば、弱毒化したウイルスまたは細菌)の形態であってもよく、またはそれは以下により詳細に記載されたような抗原提示細胞によって提示されていてもよい。
【００６５】
本発明において有用な標的抗原は典型的にはタンパク質性分子であり、その代表例として、ポリペプチドおよびペプチドが含まれる。そのような分子にはまた、例えば、単純中間代謝産物、糖、脂質、およびホルモンだけでなく複合炭水化物、リン脂質、および核酸などの巨大分子などの、しかしこれらに限定されない、非タンパク質性部分が含まれてもよい。標的抗原は、宿主によって産生される内在性抗原または宿主にとって異質である外来抗原より選択されてもよい。好適な内在性抗原には、癌または腫瘍抗原が含まれるが、これらに制限されない。癌または腫瘍抗原の非限定的な例として、ABL1癌原遺伝子、AIDS関連癌、聴神経腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞性癌、副腎皮質癌、原因不明骨髄化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、無形成性貧血、星細胞腫、運動失調症‐毛細血管拡張症、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳およびCNS腫瘍、乳癌、CNS腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児脳腫瘍、小児癌、小児白血病、小児軟組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛膜癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼：メラノーマ、網膜芽腫、卵管癌、ファンコニ貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、泌尿生殖器癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科癌、血液悪性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内メラノーマ、島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、咽頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リーフラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、リンパ水腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、腎臓の悪性横紋筋様腫瘍、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口癌、多発性内分泌腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌、鼻咽腔癌、腎芽腫、神経芽腫、神経線維腫症、ナイメーヘン切断症候群、非メラノーマ性皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、オストミー卵巣癌、膵癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、稀な癌および関連疾患、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、ロスモンド-トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌(皮膚)、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌(膀胱)、移行細胞癌(腎-骨盤-/-尿管)、絨毛癌、尿道癌、泌尿器系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍より選択される癌または腫瘍由来の抗原が含まれる。ある種の態様において、癌または腫瘍はメラノーマに関する。メラノーマ関連抗原の実例となる例として、メラノサイト分化抗原(例えば、gp100、MART、メランA/MART-1、TRP-1、Tyros、TRP2、MC1R、MUC1F、MUC1R、またはその組み合わせ)およびメラノサイト特異的抗原(例えば、BAGE、GAGE-1、gp100In4、MAGE-1(例えば、GenBankアクセッション番号X54156およびAA494311)、MAGE-3、MAGE-4、PRAME、TRP2IN2、NYNSO1a、NYNSO1b、LAGE1、p97メラノーマ抗原(例えば、GenBankアクセッション番号M12154)、p5タンパク質、gp75、癌胎児性抗原、GM2およびGD2ガングリオシド、cdc27、p21ras、gp100Pmel117、またはその組み合わせ)が含まれる。その他の腫瘍特異的抗原には、以下のものが含まれるが、これらに制限されない：etv6、aml1、シクロフィリンb(急性リンパ芽球性白血病)；Ig-イデオタイプ(B細胞リンパ腫)；E-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、γ-カテニン、p120ctn(神経膠腫)；p21ras(膀胱癌)；p21ras(胆道癌)；MUCファミリー、HER2/neu、c-erbB-2(乳癌)；p53、p21ras(頸部癌)；p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUCファミリー、Cripto-1タンパク質、Pim-1タンパク質(結腸癌)；結腸直腸関連抗原(CRC)-CO17-1A/GA733、APC(結腸直腸癌)；腫瘍胎児性抗原(CEA)(結腸直腸癌；絨毛膜癌)；シクロフィリンb(上皮細胞癌)；HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖タンパク質(胃癌)；α-フェトタンパク質(肝細胞癌)；Imp-1、EBNA-1(ホジキンリンパ腫)；CEA、MAGE-3、NY-ESO-1(肺癌)；シクロフィリンb(リンパ球様細胞由来白血病)；MUCファミリー、p21ras(メラノーマ)；HER2/neu、c-erbB-2(非小細胞肺癌)；Imp-1、EBNA-1(鼻咽頭癌)；MUCファミリー、HER2/neu、c-erbB-2、MAGE-A4、NY-ESO-1(卵巣癌)；前立腺特異的抗原(PSA)ならびにその抗原性エピトープPSA-1、PSA-2、およびPSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖タンパク質(前立腺癌)；HER2/neu、c-erbB-2(腎癌)；ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物(頸部および食道の扁平上皮細胞癌)；NY-ESO-1(精巣癌)；ならびにHTLV-1エピトープ(T細胞白血病)。
【００６６】
異種または外来抗原は、病原生物の抗原より好適に選択される。例示的な病原生物には、ウイルス、細菌、真菌寄生虫、藻類、ならびに原虫およびアメーバが含まれるが、これらに限定されない。実例となるウイルスとして、はしか、おたふく風邪、風疹、灰白脊髄炎、A型、B型肝炎(例えば、GenBankアクセッション番号E02707)、およびC型肝炎(例えば、GenBankアクセッション番号E06890)だけでなく、その他の肝炎ウイルス、インフルエンザ、アデノウイルス(例えば、4型および7型)、狂犬病(例えば、GenBankアクセッション番号M34678)、黄熱病、エプスタイン-バーウイルスおよびパピローマウイルスなどのその他のヘルペスウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎(例えば、GenBankアクセッション番号E07883)、デング熱(例えば、GenBankアクセッション番号M24444)、ハンタウイルス、センダイウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、オルトミクソウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ビスナウイルス、サイトメガロウイルス、ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV)(例えば、GenBankアクセッション番号U18552)を含むが、これらに限定されない、疾患の原因となるウイルスが含まれる。そのようなウイルスに由来する任意の好適な抗原は、本発明の実施において有用である。例えば、HIVに由来する実例となるレトロウイルス抗原として、gag、pol、およびenv遺伝子の遺伝子産物、Nefタンパク質、逆転写酵素、ならびにその他のHIV構成要素などの抗原が含まれるが、これらに限定されない。肝炎ウイルス抗原の実例となる例には、B型肝炎ウイルスのS、M、およびLタンパク質、B型肝炎ウイルスのプレS抗原、ならびにC型肝炎ウイルスRNAなどの、その他の肝炎、例えば、A型、B型、およびC型肝炎のウイルス構成要素などの抗原が含まれるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルス抗原の実例となる例として、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、ならびにその他のインフルエンザウイルス構成要素などの抗原が含まれるが；これらに限定されない。はしかウイルス抗原の実例となる例として、はしかウイルス融合タンパク質およびその他のはしかウイルス構成要素などの抗原が含まれるが、これらに限定されない。風疹ウイルス抗原の実例となる例として、タンパク質E1およびE2ならびにその他の風疹ウイルス構成要素などの抗原；VP7scおよびその他のロタウイルス構成要素などのロタウイルス抗原が含まれるが、これらに限定されない。サイトメガロウイルス抗原の実例となる例として、エンベロープ糖タンパク質Bおよびその他のサイトメガロウイルス抗原構成要素などの抗原が含まれるが、これらに限定されない。呼吸器合胞体ウイルス抗原の非限定的な例として、RSV融合タンパク質、M2タンパク質、およびその他の呼吸器合胞体ウイルス抗原構成要素が含まれる。単純ヘルペスウイルス抗原の実例となる例として、前初期タンパク質、タンパク質D、およびその他の単純ヘルペスウイルス抗原構成要素などの抗原が含まれるが、これらに限定されない。水痘帯状疱疹ウイルス抗原の非限定的な例として、9PI、gpII、およびその他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原構成要素などの抗原が含まれる。日本脳炎ウイルス抗原の非限定的な例として、タンパク質E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80％E、およびその他の日本脳炎ウイルス抗原構成要素などの抗原���含まれる。狂犬病ウイルス抗原の代表的な例として、狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質、およびその他の狂犬病ウイルス抗原構成要素が含まれるが、これらに限定されない。パピローマウイルス抗原の実例となる例として、L1およびL2カプシドタンパク質だけでなく、頸部癌と関連するE6/E7抗原も含まれるが、これらに限定されず、ウイルス抗原のさらなる例については、Fundamental Virology, 第2版, Fields, B. N. and Knipe, D. M. 編, 1991, Raven Press, New Yorkを参照されたい。
【００６７】
真菌の実例となる例として、アクレモニウム属(Acremonium spp.)、アスペルギルス属(Aspergillus spp.)、バシディオボルス属(Basidiobolus spp.)、ビポラリス属(Bipolaris spp.)、ブラストミセス デルマティディス(Blastomyces dermatidis)、カンディダ属(Candida spp.)、クラドフィアロフォラ カリオニイ(Cladophialophora carrionii)、コッコイディオデス イミティス(Coccoidiodes immitis)、コニディオボルス属(Conidiobolus spp.)、クリプトコックス属(Cryptcoccus spp.)、クルブラリア属(Curvularia spp.)、エピデルモフィトン属(Epidermophyton spp.)、エキソフィアラ エアンセルメイ(Exophiala jeanselmei)、エキセロヒルム属(Exserohilum spp.)、フォンセカエア コンパクタ(Fonsecaea compacta)、フォンセカエア ペドロソイ(Fonsecaea pedrosoi)、フサリウム オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フサリウム ソラニ(Fusarium solani)、ゲオトリクム カンディドゥム(Geotrichum candidum)、ヒストプラスマ カプスラーツム変種カプスラーツム(Histoplasma capsulatum var. capsulatum)、ヒストプラスマ カプスラーツム変種デュボイシイ(Histoplasma capsulatum var. duboisii)、ホルテアエ ウェルネッキイ(Horteae werneckii)、ラカジア ロボイ(Lacazia loboi)、ラシオディプロディア テオブロマエ(Lasiodiplodia theobromae)、レプトスファエリア セネガレンシス(Leptosphaeria senegalensis)、マデュレラ グリセア(Madurella grisea)、マデュレラ ミセトマティス(Madurella mycetomatis)、マラセジア フルフル(Malassezia furfur)、ミクロスポルム属(Microsporum spp.)、ネオテスツディナ ロサティイ(Neotestudina rosatii)、オニココラ カナデンシス(Onychocola canadensis)、パラコクシディオデス ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、フィアロフォラ ウェルルコサ(Phialophora verrucosa)、ピエドライア ホルタエ(Piedraia hortae)、ピエドラ イアホルタアエ(Piedra iahortae)、ピティリアシス ウェルシコロル(Pityriasis versicolor)、プセウダレセリア ボイディイ(Pseudallesheria boydii)、ピレノカエタ ロメロイ(Pyrenochaeta romeroi)、リゾプス アルリズス(Rhizopus arrhizus)、スコプラリオプシス ブレウィカウリス(Scopulariopsis brevicaulis)、スキタリディウム ディミディアツム(Scytalidium dimidiatum)、スポロトリクス スケンクキイ(Sporothrix schenckii)、トリコフィトン属(Trichophyton spp.)、トリコスポロン属(Trichosporon spp.)、ジゴムセテ フンギ(Zygomcete fungi)、アブシディア コリムビフェラ(Absidia corymbifera)、リゾムコル プシルス(Rhizomucor pusillus)、およびリゾプス アルリズス(Rhizopus arrhizus)が含まれる。したがって、本発明の組成物および方法において使用し得る代表的な真菌抗原として、カンディダ真菌抗原構成要素；熱ショックタンパク質60(HSP60)およびその他のヒストプラスマ真菌抗原構成要素などのヒストプラスマ真菌抗原；莢膜多糖類およびその他のクリプトコックス真菌抗原構成要素などのクリプトコックス真菌抗原；小球抗原およびその他のコクシディオデス真菌抗原構成要素などのコクシディオデス真菌抗原；ならびにトリコフィチンおよびその他のコクシディオデス真菌抗原構成要素などの白癬真菌抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
細菌の実例となる例として、ジフテリア(例えば、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria))、百日咳(例えば、百日咳菌(Bordetella pertussis)、GenBankアクセッション番号M35274)、破傷風(例えば、破傷風菌(Clostridium tetani)、GenBankアクセッション番号M64353)、結核(例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis))、細菌性肺炎(例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae))、コレラ(例えば、ビブリオ菌(Vibrio cholerae))、炭疽菌(例えば、炭疽菌(Bacillus anthracis))、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢(例えば、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae))、ボツリヌス中毒(例えば、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum))、サルモネラ症(例えば、GenBankアクセッション番号L03833)、消化性潰瘍(例えば、ヘリコバクターピロリ菌(Helicobacter pylori))、レギオネラ病、ライム病(例えば、GenBankアクセッション番号U59487)、を含むが、これらに制限されない、疾患の原因となる細菌が含まれ、その他の病原性細菌には、大腸菌(Escherichia coli)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、および化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)が含まれる。したがって、本発明の組成物および方法において使用し得る細菌抗原には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ペルタクチン、F M2、FIM3、アデニル酸シクラーゼ、およびその他の百日咳細菌抗原構成要素などの百日咳細菌抗原；ジフテリア毒素または類毒素およびその他のジフテリア細菌抗原構成要素などのジフテリア細菌抗原；破傷風毒素または類毒素およびその他の破傷風細菌抗原構成要素などの破傷風細菌抗原；Mタンパク質およびその他の連鎖球菌細菌抗原構成要素などの連鎖球菌細菌抗原；リポ多糖類およびその他のグラム陰性細菌抗原構成要素などのグラム陰性桿菌細菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質65(HSP65)、30kDa主要分泌タンパク質、抗原85A、およびその他のマイコバクテリア抗原構成要素などの結核菌細菌抗原；ヘリコバクターピロリ菌細菌抗原構成要素、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多糖類、およびその他の肺炎球菌細菌抗原構成要素などの肺炎球菌細菌抗原；莢膜多糖類およびその他のインフルエンザ菌細菌抗原構成要素などのインフルエンザ菌細菌抗原；炭疽菌防御抗原およびその他の炭疽菌細菌抗原構成要素などの炭疽菌細菌抗原；rompAおよびその他のリケッチア細菌抗原構成要素などのリケッチア細菌抗原。任意のその他の細菌抗原、マイコバクテリア抗原、マイコプラズマ抗原、リケッチャ抗原、またはクラミジア抗原もまた、本明細書において記載された細菌抗原と共に含まれる。
【００６９】
原虫の実例となる例には、マラリア(例えば、GenBankアクセッション番号X53832)、鉤虫、オンコセルカ症(例えば、GenBankアクセッション番号M27807)、住血吸虫病(例えば、GenBankアクセッション番号LOS198)、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、レイシュマニア症、ギアルディア症(例えば、GenBankアクセッション番号M33641)、アメーバ症、フィラリア症(例えば、GenBankアクセッション番号J03266)、ボレリオ症、および旋毛虫症を含むが、これらに限定されない、疾患の原因となる原虫が含まれる。したがって、本発明の組成物および方法において使用し得る原虫抗原には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞/配偶子表面抗原、血液期抗原pf155/RESA、およびその他のマラリア原虫抗原構成要素などの熱帯熱マラリア原虫抗原；SAG-1、p30、およびその他のトキソプラスマ抗原構成要素などのトキソプラスマ抗原；グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、パラミオシン、およびその他の住血吸虫抗原構成要素などの住血吸虫抗原；gp63、リポホスホグリカンおよびその関連タンパク質、ならびにその他のレイシュマニア抗原構成要素などのレイシュマニアおよびその他のレイシュマニア抗原；ならびに75〜77kDa抗原、56kDa抗原、およびその他のトリパノソーマ抗原構成要素などのクルーズトリパノソーマ抗原。
【００７０】
本発明はまた、抗原としての毒素構成要素を企図し、その実例となる例として、マイコプラズマ、マイコバクテリア、およびヘルペスウイルスに由来する毒素だけでなく、ブドウ球菌エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素；レトロウイルス抗原(例えば、HIVに由来する抗原)、連鎖球菌抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン-A(SEA)、ブドウ球菌エンテロトキシン-B(SEB)、ブドウ球菌エンテロトキシン1〜3(SE1〜3)、ブドウ球菌エンテロトキシン-D(SED)、ブドウ球菌エンテロトキシン-E(SEE)も含まれる。
【００７１】
標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を自然源から単離してもよく、または当技術分野において公知のような組換え技術によって調製してもよい。例えば、改変された免疫応答が望ましい細胞集団または組織から得られた抗原提示細胞のMHCおよびその他の分子から、ペプチド抗原を溶出することができる。当技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて、溶出したペプチドを精製することができる(Rawson et al., 2000, Cancer Res 60(16), 4493-4498)。望ましい場合、精製ペプチドを配列決定し、および例えば以下に記載されたような標準的なタンパク質合成技術を用いてペプチドの合成版を産生することができる。あるいは、改変された免疫応答が望ましい細胞集団または組織の試料を単離し、および試料を溶解するか、または試料をアポトーシス細胞の形成をもたらすと考えられる条件(例えば、紫外線によるもしくはγ線による放射線照射、ウイルス感染、サイトカイン、または細胞から細胞培養培地中の栄養物を奪うことによって、過酸化水素との、もしくはデキサメタゾンなどの薬物とのインキュベーション、セラミド化学療法、およびルプロンもしくはタモキシフェンなどの抗ホルモン薬剤)に供するかのいずれかによって、粗抗原調製物を産生することができる。その後、可溶型での使用用にまたは以下により詳細に記載したような抗原提示細胞との接触用に、粗抗原の源として溶解物またはアポトーシス細胞を用いることができる。
【００７２】
抗原が公知である場合、例えばSambrook, et al., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Press, 1989)、特に第16節および第17節；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley & Sons社, 1994-1998)、特に第10章および第16章；ならびにColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE(John Wiley & Sons社, 1995-1997)、特に第1章、第5章、および第6章：に記載されたような標準的なプロトコルを用いて、便宜上それを組換え型で調製してもよい。典型的には、(a)標的抗原またはその類似体もしくは模倣体が発現可能である発現ベクターを提供し；(b)ベクターを好適な宿主細胞に導入し；(c)宿主細胞を培養してベクターから組換えポリペプチドを発現させ；および(d)組換えポリペプチドを単離する工程を含む手順によって、抗原を調製してもよい。
【００７３】
一般に、発現ベクターは、調節ポリヌクレオチドと機能的に接続された抗原をコードするポリヌクレオチドを含むと考えられる。抗原をコードするポリヌクレオチドは、関心対象の標的抗原に対応する抗原をコードする任意の好適な親ポリヌクレオチドから構築することができる。親ポリヌクレオチドは、好適には天然の遺伝子またはその部分である。しかしながら、親ポリヌクレオチドが天然ではなく、組換え技術を用いて人工的に作製されていることもあり得る。調節ポリヌクレオチドは好適には、通常抗原をコードするポリヌクレオチドの発現に使用される宿主細胞にとって適切であると考えられる、転写および/または翻訳制御配列を含む。典型的には、転写および翻訳調節制御配列には、プロモーター配列、5'非コード領域、転写調節タンパク質または翻訳調節タンパク質の機能的結合部位などのシス調節領域、上流オープンリーディングフレーム、転写開始部位、翻訳開始部位、および/またはリーダー配列をコードするヌクレオチド配列、終結コドン、翻訳終止部位、ならびに3'非翻訳領域が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野において公知であるような構成的または誘導可能プロモーターが本発明によって企図されている。プロモーターは、天然のプロモーターか、または1つより多くのプロモーターのエレメントを組み合わせているハイブリッドプロモーターかのいずれかであってもよい。本発明によって企図されているプロモーター配列は、導入されるべき宿主細胞にとってネイティブであってもよく、または本領域が宿主細胞において機能的である、代わりの源に由来していてもよい。
【００７４】
発現ベクターはまた、通例ポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる任意のその他の調節シグナルを含むDNA断片を含む遺伝子の部分を指す、3'非翻訳配列を含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは、mRNA前駆体の3'末端へのポリアデニル酸トラクトの付加をもたらすことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは一般に、カノニカル型5'AATAAA-3'に対する相同性の存在によって認識されるが、変化形がめったにない訳ではない。3'非翻訳調節DNA配列は典型的には約50〜1,000ヌクレオチド塩基対を含み、ならびにポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる任意のその他の調節シグナルに加えて、転写および翻訳終結配列を含んでもよい。
【００７５】
ある種の態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能マーカー遺伝子をさらに含む。選択遺伝子は当技術分野において周知であり、および使用される宿主細胞によって変わると考えられる。
【００７６】
発現ベクターはまた、組換えポリペプチドが融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現するように、(典型的には発現ベクターによって提供される)融合パートナーを含んでもよい。融合パートナーの主な利点は、それらが融合ポリペプチドの同定および/または精製を助けるということである。融合パートナーの周知の例として、親和性クロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離に特に有用である、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ヒトIgGのFc部分、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびヘキサヒスチジン(HIS6)が含まれるが、これらに限定されない。親和性クロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製の目的のために、親和性クロマトグラフィー用の関連マトリックスは、それぞれグルタチオン、アミロース、およびニッケルまたはコバルトがコンジュゲートされた樹脂である。多くのそのようなマトリックスが、(HIS6)融合パートナーで有用なQIAexpress(商標)系(Qiagen)およびPharmacia GST精製系などの「キット」形態で利用可能である。好ましくは、融合パートナーはまた、関連プロテアーゼが本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化し、およびそれによって本発明の組換えポリペプチドをそこから遊離させるのを可能にする、第Xa因子またはトロンビンなどの、プロテアーゼ切断部位を有する。その後、それに続くクロマトグラフ分離によって、遊離ポリペプチドを融合パートナーから単離することができる。融合パートナーはまた、それに対する特異的抗体が利用可能である通例短いペプチド配列である、「エピトープタグ」をその範囲内に含む。それに対する特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能であるエピトープタグの周知の例として、c-Myc、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、およびFLAGタグが含まれる。
【００７７】
発現ベクターを宿主細胞に導入する工程を、トランスフェクション、アデノウイルス、改変レンチウイルス、およびその他のレトロウイルスベクターを含む、ウイルスベクターの形質導入、ならびに形質転換を含む任意の好適な方法によって達成してもよく、その選択は、使用される宿主細胞に依存すると考えられる。そのような方法は、当業者に周知である。
【００７８】
発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変わると考えられる、タンパク質発現に適切な条件下で、発現ベクターによって形質転換した宿主細胞を培養することによって、組換えポリペプチドを産生してもよい。これは日常的な実験を通じて当業者により容易に確かめられる。発現に好適な宿主細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。本発明によるポリペプチドの発現のための1つの好適な宿主細胞は細菌である。使用される細菌は大腸菌であってもよい。あるいは、宿主細胞は、例えば、バキュロウイルス発現系と共に利用され得るSF9細胞などの昆虫細胞であってもよい。幾つかの態様において、IL-10の機能の阻害剤と共に投与される、抗原は、そこからそれが発現される、構築物またはベクターの形を取っている。
【００７９】
あるいは、例えば、Atherton and Sheppard(Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, 1989)またはRoberge et al.(1995, Science 269：202)に記載されたような溶液合成または固相合成を用いて、抗原を合成することができる。合成された抗原のアミノ酸配列は、非天然または天然アミノ酸であることができる。非天然アミノ酸またはペプチド合成期間中の誘導体の例として、4-アミノブチル酸、6-アミノヘキサン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、t-ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、2-チエニルアラニン、および/またはアミノ酸のD異性体が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって企図される非天然アミノ酸のリストを表Bに示す。
【００８０】
【表Ｂ】
2008535868.tif 000003
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【００８１】
本発明はまた、タンパク質分解に対するそれらの抵抗性を変更するためにまたは溶解性特性を最適化するためにまたはそれらを免疫原性作用物質としてより好適にするために、普通の分子生物学的技術を用いてペプチド抗原を改変することを企図している。
【００８２】
ペプチド抗原は、関心対象の標的抗原に対する免疫応答を刺激または阻害するために利用することができる任意の好適なサイズであってもよい。多数の因子がペプチドサイズの選択に影響することができる。例えば、それがT細胞エピトープおよび/もしくはB細胞エピトープ、ならびにそれらのプロセシングに必要なものを含み、またはT細胞エピトープおよび/もしくはB細胞エピトープ、ならびにそれらのプロセシングに必要なもののサイズと対応するように、ペプチドのサイズを選択することができる。クラスI制限T細胞エピトープは典型的には長さ8〜10アミノ酸残基であり、ならびに非天然の隣接残基の隣に置かれた場合、そのようなエピトープは、それらが効率的にプロセシングおよび提示されるのを確実にするために、通常2〜3の天然の隣接アミノ酸残基を必要とする可能性があるということを当業者は認識すると考えられる。クラスII制限T細胞エピトープは通例長さ12〜25アミノ酸残基の範囲にまで及び、および天然の隣接残基が役割を果たし得ると考えられているものの、効率的なタンパク質分解のための天然の隣接残基を必要としなくてもよい。クラスII制限エピトープの別の重要な特色は、それらが通常、隣接配列と共にクラスII MHC分子に特異的に結合する9〜10アミノ酸残基の中核を中央に含み、この中核のどちらか一方の側が、クラスII MHC抗原のどちらか一方の側の上の保存された構造と配列非依存的な様式で会合することによって、結合を安定化するということである。したがって、クラスII制限エピトープの機能的領域は、典型的には約15アミノ酸残基長未満である。線状B細胞エピトープのサイズおよびそれらのプロセシングをもたらす因子は、クラスII制限エピトープと同様に、非常に変わりやすいが、そのようなエピトープは、多くの場合15アミノ酸残基よりもサイズが小さい。前述のことから、ペプチドのサイズは、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30アミノ酸残基であることが好都合であるが、必ずしも必要不可欠ではない。好適には、ペプチドのサイズは、わずか約500、200、100、80、60、50、40アミノ酸残基である。ある種の好都合な態様において、ペプチドのサイズは、ペプチド内に含まれるT細胞および/またはB細胞エピトープの抗原提示細胞による提示に十分である。
【００８３】
効果的な抗原ペプチド(例えば、免疫応答を引き出すことができる最低限のペプチド配列)を同定および選択するための基準を当技術分野において見出すことができる。例えば、Apostolopoulosら(2000, Curr. Opin. Mol. Ther. 2：29-36)は、抗原提示分子の3次元構造ならびに抗原性ペプチドおよびT細胞受容体の両方とのその相互作用の理解に基づいて、最低限の抗原性ペプチド配列を同定するための戦略を議論している。Shastri(1996, Curr. Opin. Immunol. 8：271-277)は、T細胞を活性化するのに役立つ稀なペプチドと通常MHC分子に結合する何千ものペプチドとを区別する方法を開示している。
【００８４】
幾つかの態様において、調節ポリヌクレオチドに機能的に連結された、抗原をコードするポリヌクレオチドを含む合成コンストラクト(または発現ベクター)の形態で抗原を送達する。調節ポリヌクレオチドは好適には、関心対象の細胞または組織型における発現に適合すると考えられる、転写および/または翻訳制御配列を含む。典型的には、転写および翻訳調節制御配列には、プロモーター配列、5'非コード領域、転写調節タンパク質または翻訳調節タンパク質の機能的結合部位などのシス調節領域、上流オープンリーディングフレーム、リボソーム結合配列、転写開始部位、翻訳開始部位、および/またはリーダー配列をコードするヌクレオチド配列、終結コドン、翻訳終止部位、ならびに3'非翻訳領域が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野において公知であるような構成的または誘導可能プロモーターが本発明によって企図されている。プロモーターは、天然のプロモーターか、または1つより多くのプロモーターのエレメントを組み合わせているハイブリッドプロモーターかのいずれかであってもよい。本発明によって企図されているプロモーター配列は、関心対象の生物にとってネイティブであってもよく、または本領域が選ばれた生物において機能的である、代わりの源に由来していてもよい。。プロモーターの選択は、意図される宿主によって異なると考えられる。例えば、哺乳動物細胞での発現に使用され得るプロモーターは通常、カドミウムなどの重金属に応答して誘導することができる、メタロチオネインプロモーター、β-アクチンプロモーターだけでなく、SV40ラージT抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期(IE)プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはHPVプロモーターなどのウイルスプロモーターも含み、特にHPV上流調節領域(URR)も使用されてもよい。これらのプロモーターは全て当技術分野において十分に記載されており、かつ容易に利用可能である。あるいは、プロモーターは、系統特異的であってもよく、およびこの点において、ケラチン遺伝子(例えば、K10、K14、K5、K1)のプロモーターだけでなく、以下の遺伝子トランスグルタミナーゼ1型、インボルクリン、ロリクリン、SPR遺伝子、およびフィラグリンのプロモーターなどの、しかしこれらに限定されない、上皮特異的プロモーターが特に望ましい。
【００８５】
合成コンストラクトはまた、3'非翻訳配列を含んでもよい。3'非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる任意のその他の調節シグナルを含むDNA断片を含む遺伝子の部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、mRNA前駆体の3'末端へのポリアデニル酸トラクトの付加をもたらすことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは一般に、カノニカル型5'AATAAA-3'に対する相同性の存在によって認識されるが、変化形がめったにない訳ではない。3'非翻訳調節DNA配列は好ましくは約50〜1,000ヌクレオチド塩基対を含み、ならびにポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる任意のその他の調節シグナルに加えて、転写および翻訳終結配列を含んでもよい。
【００８６】
幾つかの態様において、合成コンストラクトは、合成コンストラクトを含む細胞の同定を可能にするための選別可能なマーカー遺伝子をさらに含む。選別可能な遺伝子(例えば、lacZ、gfpなど)は当技術分野において周知であり、および特定の細胞または組織での発現に適合すると考えられる。
【００８７】
しかしながら、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの異種系での発現は現在周知であり、および本発明は任意の特定のベクター、転写制御配列、もしくはその産生のための技術に向けられたものではなく、または任意の特定のベクター、転写制御配列、もしくはその産生のための技術に依存していないということが理解されると考えられる。それどころか、本明細書において示されたような方法によって調製される合成ポリヌクレオチドは、任意の好適な様式で、任意の好適な合成コンストラクトまたはベクターと併せて、選択された細胞もしくは組織の中に、またはその前駆体もしくは前駆細胞の中に導入されてもよく、および合成ポリヌクレオチドは、任意の従来の様式で公知のプロモーターによって発現されてもよい。
【００８８】
数多くの非ウイルスまたはウイルス遺伝子送達ベクターのいずれかを用いて、発現に好適な宿主細胞に合成コンストラクトを導入することができる。例えば、レトロウイルス(特に、レンチウイルスベクター)は、遺伝子送達系のための便利なプラットフォームを提供する。当技術分野において公知の技術を用いて、関心対象のコード配列(例えば、遺伝子治療適用に有用な配列)を遺伝子送達ベクターに挿入し、およびレトロウイルス粒子に詰めることができる。その後、組換えウイルスを単離し、およびインビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。
【００８９】
ある実例となる態様において、レトロウイルスは遺伝子送達系のための便利でかつ効果的なプラットフォームを提供する。当技術分野において公知の技術を用いて、標的抗原に対応する抗原をコードする選択されたヌクレオチド配列をベクターに挿入し、およびレトロウイルス粒子に詰めることができる。その後、組換えウイルスを単離し、および対象に送達することができる。幾つかの実例となるレトロウイルス系が記載されており、その例として以下が含まれる：米国特許第5,219,740号；Miller and Rosman, 1989, Bio Techniques 7：980-990；Miller, A. D., 1990, Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa et al., 1991, Virology 180：849-852；Burns et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：8033-8037；およびBoris-Lawrie and Temin, 1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3：102-109。
【００９０】
さらに、幾つかの実例となるアデノウイルスを基にした系もまた記載されている。宿主ゲノムに組込まれるレトロウイルスとは違って、アデノウイルスは染色体外に存続し、したがって挿入突然変異と関連する危険性を最小限に抑える(例えば、Haj-Ahmad and Graham, 1986, J. Virol. 57：267-274；Bett et al., 1993, J. Virol. 67：5911-5921；Mittereder et al., 1994, Human Gene Therapy 5：717-729；Seth et al., 1994, J. Virol. 68：933-940；Barr et al., 1994, Gene Therapy 1：51-58；Berkner, K. L., 1988, Bio Techniques 6：616-629；およびRich et al., 1993, Human Gene Therapy 4：461-476参照)。
【００９１】
様々なアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達用に開発されている。当技術分野において周知の技術を用いて、AAVベクターを容易に構築することができる。例えば、米国特許第5,173,414号および第5,139,941号；国際刊行物国際公開公報第92/01070号および国際公開公報第93/03769号；Lebkowski et al., 1988, Molec. Cell. Biol. 8：3988-3996；Vincent et al., 1990, Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Carter, B. J., 1992, Current Opinion in Biotechnology 3：533-539；Muzyczka, N., 1992, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158：97-129；Kotin, R. M., 1994, Human Gene Therapy 5；793-801；Shelling and Smith, 1994, Gene Therapy 1：165-169；ならびにZhou et al., 1994, J. Exp. Med. 179：1867-1875を参照されたい。
【００９２】
遺伝子移入によって抗原をコードするポリヌクレオチドを送達するために有用なさらなるウイルスベクターには、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスなどの、ポックスファミリーのウイルスに由来するウイルスベクターが含まれる。例として、抗原をコードするポリヌクレオチドを発現するワクシニアウイルス組換え体を以下のように構築することができる。それがワクシニアプロモーターおよび、チミジンキナーゼ(TK)をコードする配列などの、隣接するワクシニアDNA配列と隣り合うように、まずポリペプチドをコードするDNAを適当なベクターに挿入する。その後、このベクターを用いて細胞をトランスフェクトし、細胞は同時にワクシニアを感染させる。相同組換えは、ワクシニアプロモーターと関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子をウイルスゲノムに挿入する役割を果たす。5-BrdUの存在下で細胞を培養し、およびそれに対して耐性のあるウイルスプラークを採取することによって、結果として得られるTK(-)組換え体を選択することができる。
【００９３】
あるいは、鶏痘およびカナリア痘ウイルスなどの、アヴィポックスウイルスを用いて、関心対象のコード配列を送達することもできる。アヴィポックス属のメンバーは感受性のある鳥種において生産的に複製できるに過ぎず、およびそれゆえに哺乳動物において感染性ではないので、アヴィポックスベクターの使用が特にヒトおよびその他の哺乳動物種において望ましい。組換えアヴィポックスウイルスを産生するための方法は当技術分野において公知であり、およびにワクシニアウイルスの産生に関して上で記載されたような、遺伝子組換えを利用している。例えば、国際公開公報第91/12882号；、国際公開公報第89/03429号；および国際公開公報第92/03545号を参照されたい。
【００９４】
米国特許第5,843,723号；第6,015,686号；第6,008,035号および第6,015,694号に記載されたアルファウイルスベクターなどの、数多くのアルファウイルスベクターのうちのいずれかを本発明のポリヌクレオチド組成物の送達用に用いてもよい。ベネズエラウマ脳炎(VEE)に基づくある種のウイルスを用いることもでき、その実例となる例を米国特許第5,505,947号および第5,643,576号に見出すことができる。
【００９５】
さらに、Michael et al., J. Biol. Chem. 268：6866-69, 1993；およびWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：6099-6103, 1992に記載されたアデノウイルスキメラベクターなどの、分子コンジュゲートベクターを本発明の下で遺伝子送達用に用いることもできる。
【００９６】
その他の実例となる例において、レンチウイルスベクターを利用して抗原をコードするポリヌクレオチドを選択された細胞または組織に送達する。典型的には、これらのベクターは、5'レンチウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、1つまたは複数の関心対象の遺伝子に機能的に連結されたプロモーター、第2鎖DNA合成の起点、および3'レンチウイルスLTRを含み、レンチウイルスベクターは核移行エレメントを含む。核移行エレメントは、関心対象のコード配列(例えば、本発明の合成GagまたはEnv発現カセット)の上流(5')かまたは下流(3')のいずれかに位置してもよい。例えば、HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、BIV、EIAV、MVV、CAEV、およびSIVからなる群より選択されるレンチウイルスを含む、多種多様のレンチウイルスを本発明の文脈内で利用してもよい。レンチウイルスベクターの実例となる例は、PCT刊行物国際公開公報第00/66759号、国際公開公報第00/00600号、国際公開公報第99/24465号、国際公開公報第98/51810号、国際公開公報第99/51754号、国際公開公報第99/31251号、国際公開公報第99/30742号、および国際公開公報第99/15641号に記載されている。望ましくは、第3世代SINレンチウイルスを用いる。第3世代SIN(自己不活性化)レンチウイルスの商業供給元には、Invitrogen(ViraPowerレンチウイルス発現系)が含まれる。レンチウイルスベクターの構築、トランスフェクション、採取、および使用に関する詳細な方法は、例えば、Invitrogen技術マニュアル「ViraPowerレンチウイルス発現系バージョンB050102 25-0501」で与えられ、http://www.invitrogen.com/Content/Tech-Online/molecular_biology/manuals_p-ps/virapower_lentiviral_system_man.pdfで入手可能である。レンチウイルスベクターは遺伝子移入のための効果的な方法として現れた。生物安全性特徴の改善により、これらのベクターは生物安全性レベル2(BL2)での使用に好適になった。数多くの安全性特色が、第3世代SIN(自己不活性化)ベクターに組み入れられている。ウイルス3'LTR U3領域の欠失により、全長ウイルスRNAを転写することができないプロウイルスが結果的にもたらされる。さらに、数多くの必須遺伝子がトランスで提供され、ほんの1ラウンドの感染および組み込みだけが可能なウイルスストックを生み出している。レンチウイルスベクターは以下を含む、幾つかの利点を有する：1)両種性エンベロープタンパク質を用いたベクターのシュードタイピングによってそれらが事実上全ての細胞型に感染することができ；2)ニューロンを含む、休止した、分裂終了後の、分化細胞への遺伝子送達が示され；3)それらの低い細胞毒性はトランスジーン送達系の中でも独特であり；4)ゲノムへのウイルス組み込みによって長期間のトランスジーン発現が可能になり；5)それらのパッケージング能力(6〜14kb)はその他のレトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターよりもずっと大きい。この系の能力に関する最近の実証において、GFPを発現するレンチウイルスベクターを用いてマウス幹細胞に感染させ、結果的に生きた子孫、生殖系列伝達、ならびにレポーターのプロモーター特異的および組織特異的発現をもたらした(Trono, D.(編), Lentiviral Vectors, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 2002, 31-52頁：におけるAilles, L. E. and Naldini, L., HIV-1-Derived Lentiviral Vectors.)。最新世代ベクターの例は、Loisら(Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., and Baltimore, D., Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors, Science, 295(2002)868-872)による概説の図2に略図が描かれている。
【００９７】
ある種の態様において、ポリヌクレオチドは標的細胞のゲノムに組み込まれてもよい。この組み込みは、相同組換えを介した特定の場所および配向におけるものであってもよく(遺伝子取替え)、またはそれは、ランダムで、不特定の場所において組み込まれてもよい(遺伝子増加)。またさらなる態様において、ポリヌクレオチドは、別々の、DNAのエピソーム性断片として、細胞内で安定的に維持されてもよい。そのようなポリヌクレオチド断片または「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係なまたは宿主細胞周期と同調した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現コンストラクトが細胞に送達され、および細胞内でポリヌクレオチドが留まる様式は、利用される発現コンストラクトの種類による。
【００９８】
その他の態様において、例えば、Ulmer et al., Science 259：1745-49, 1993に記載され、およびCohen, Science 259：1691-92, 1993によって概説されたような「裸の」DNAとしてポリヌクレオチドを投与/送達する。効率的に細胞内に輸送される、生物分解性のビーズ上にDNAをコーティングすることによって、裸のDNAの摂取を増大させてもよい。
【００９９】
さらにその他の態様において、その多くが記載されている、粒子衝突アプローチによって本発明の組成物を送達することができる。1つの実例となる例において、Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford, UK)およびPowderjet Vaccines社(Madison, Wis.)によって製造された装置などの装置によって、ガス駆動式の粒子加速を達成することができ、その幾つかの例が、米国特許第5,846,796号；第6,010,478号；第5,865,796号；第5,584,807号；および欧州特許第0500 799号に記載されている。このアプローチは、手持ち式の装置によって発生したヘリウムガス噴流中で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド粒子などの、顕微粒子の乾燥粉末製剤を高速まで加速し、粒子を関心対象の標的組織中に推進させる無針送達アプローチを提供する。
【０１００】
関連する態様において、本発明の組成物のガス駆動式無針注射に有用であり得るその他の装置および方法は、Biojet社(Portland, Oreg.)によって提供されているものを含み、その幾つかの例が、米国特許第4,790,824号；第5,064,413号；第5,312,335号；第5,383,851号；第5,399,163号；第5,520,639号；および第5,993,412号に記載されている。
【０１０１】
2.2.2 免疫調節細胞態様
抗原提示細胞
本発明はまた、本発明の組成物中の、標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を提示する、抗原提示細胞の使用を企図している。そのような抗原提示細胞には、プロフェッショナルなまたは条件的な抗原提示細胞が含まれる。プロフェッショナルな抗原提示細胞は、Tリンパ球またはBリンパ球を介する免疫応答を刺激またはアネルギー化するために特異的T細胞受容体によって認識される形態で抗原を提示するよう生理的に機能する。プロフェッショナルな抗原提示細胞は、主要組織適合複合体(MHC)の文脈において抗原をプロセシングおよび提示するだけでなく、T細胞活性化と競合し、または寛容原性応答を誘導するのに必要とされるさらなる免疫調節分子も保持する。プロフェッショナルな抗原提示細胞には、マクロファージ、単球、Bリンパ球、単球-顆粒球-DC前駆体を含む、骨髄球系統の細胞、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、T細胞、ランゲルハンス細胞、ならびに指状嵌入樹状細胞および濾胞樹状細胞を含む樹状細胞が含まれるが、これらに限定されない。プロフェッショナルでないまたは条件的な抗原提示細胞は典型的には、Tリンパ球活性化またはアネルギーと競合するのに必要とされる1つまたは複数の免疫調節分子を欠いている。プロフェッショナルでないまたは条件的な抗原提示細胞の例として、活性化Ｔ細胞、好酸球、ケラチノサイト、アストロサイト、濾胞細胞、ミクログリア細胞、胸腺皮質細胞、内皮細胞、シュワン細胞、網膜色素上皮細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、軟骨細胞、腸細胞、胸腺細胞、腎尿管細胞、および線維細胞芽が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、抗原提示細胞は、単球、マクロファージ、Bリンパ球、骨髄球系統の細胞、樹状細胞、またはランゲルハンス細胞より選択される。ある種の好都合な態様において、抗原提示細胞は、CD11cを発現し、および樹状細胞を含む。
【０１０２】
当業者に公知の任意の好適な方法によって、抗原または抗原の群に対する免疫応答を刺激するための抗原提示細胞を調製してもよい。抗原特異的免疫応答を刺激するための抗原提示細胞を調製するための実例となる方法は、Albert et al.(国際刊行物国際公開公報第99/42564号)、Takamizawa et al.(1997, J Immunol, 158(5)：2134-2142)、Thomas and Lipsky(1994, J Immnunol, 153(9)：4016-4028)、O'Doherty et al.(1994, Immunology, 82(3)：487-93)、Fearnley et al.(1997, Blood, 89(10)：3708-3716)、Weissman et al.(1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92(3)：826-830)、Freudenthal and Steinman(1990, Proc Natl Acad Sci USA, 87(19)：7698-7702)、Romani et al.(1996, J Immunol Methods, 196(2)：137-151)、Reddy et al.(1997, Blood, 90(9)：3640-3646)、Thurnher et al.(1997, Exp Hematol, 25(3)：232-237)、Caux et al.(1996, J Exp Med, 184(2)：695-706；1996, Blood, 87(6)：2376-85)、Luft et al.(1998, Exp Hematol, 26(6)：489-500；1998, J Immunol, 161(4)：1947-1953)、Cella et al.(1999, J Exp Med, 189(5)：821-829；1997, Nature, 388(644)：782-787；1996, J Exp Med, 184(2)：747-572)、Ahonen et al.(1999, Cell Immunol, 197(1)：62-72)、およびPiemonti et al.(1999, J Immunol, 162(11)：6473-6481)によって記載されている。
【０１０３】
幾つかの態様において、宿主から抗原提示細胞を単離し、処置し、その後宿主に再導入または再注入する。便宜的に、外科的切除、生検、採血、またはその他の好適な技術のいずれかによって処置されるべき宿主から抗原提示細胞を得ることができる。そのような細胞を本明細書において「自己」細胞と称する。その他の態様において、抗原提示細胞または細胞株を宿主以外の異なる源から調製および/または培養する。そのような細胞を本明細書において「同種異系」細胞と称する。望ましくは、同種異系抗原提示細胞または細胞株は、(本明細書において「一般」抗原提示細胞または細胞株とも称される)潜在的レシピエントに対する主要組織適合抗原および/または副組織適合抗原を共有すると考えられる。この種のある種の好都合な態様において、一般抗原提示細胞または細胞株は、特定の条件に感受性がありまたは特定の条件に傾き易い高率の集団(すなわち、少なくとも、10、20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、または98％)と適合する主要抗原適合(MHC)クラスI抗原を含む。好適には、一般抗原提示細胞または細胞株は、意図された宿主における、免疫応答、望ましくはTリンパ球免疫応答(例えば、細胞毒性Tリンパ球免疫応答)を誘発するのに十分なレベルで、本明細書に記載されたような免疫刺激分子、とりわけ免疫刺激膜分子を天然に発現する。ある種の態様において、抗原提示細胞または細胞株は、国際刊行物国際公開公報第01/88097号に記載されたような少なくとも1つのIFNによる処置に極めて感受性である(すなわち、クラスI HLAの高レベル発現を意味する)。
【０１０４】
幾つかの態様において、抗原が抗原提示細胞によって内在化されるのを可能にするのに十分な時間および条件下で、抗原提示細胞を標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原と接触させまたは標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原により「パルスする」工程；ならびに抗原が抗原提示細胞によって提示のためにプロセシングされるのに十分な時間および条件下で、そのように接触させた抗原提示細胞を培養する工程を含む過程によって、抗原提示細胞を抗原特異的にする。その後、パルスした細胞を用いてインビトロまたはインビボで自己または同種異系T細胞を刺激することができる。抗原提示細胞と接触して置かれるべき抗原の量は、当業者によって実験的に決定されることができる。典型的には、抗原提示細胞を、37℃で約1〜6時間、抗原とインキュベートする。通例、精製抗原およびペプチドについて、0.1〜10μg/mLが、抗原特異的な抗原提示細胞を産生するのに好適である。それらの細胞が抗原を内在化するのに十分な時間の間、抗原を抗原提示細胞に曝露するべきである。パルスチェイスプロトコルを用いて、細胞が内在化しかつプロセシングした抗原を提示するのに必要な時間および抗原の用量を決定してもよく、パルスチェイスプロトコルでは、抗原に対する曝露の後、洗い出し期間および例えば、抗原反応性T細胞などの、読み出し系に対する曝露が行われる。ひとたび、細胞がそれらの表面上にプロセシングした抗原を発現するのに必要な最適の時間および用量を決定すれば、プロトコルを用いて、寛容原性応答を誘導するための細胞および抗原を調製してもよい。当業者は、この点において、抗原提示細胞が抗原を提示するのに必要な時間の長さは、利用される抗原または抗原の形態、その用量、および利用される抗原提示細胞だけでなく、抗体の積み込みを図る条件によっても変わり得るということを認識すると考えられる。これらのパラメータは、日常の手順を用いて当業者によって決定されることができる。
【０１０５】
当業者に公知の方法によって抗原提示細胞への外来抗原の送達を増強することができる。例えば、抗原提示細胞、とりわけ樹状細胞の内在性プロセシング経路への外来抗原の送達のために、幾つかの異なる戦略が開発されている。これらの方法は、pH感受性リポソーム中への抗原の挿入(Zhou and Huang, 1994, Immunomethods, 4：229-235)、可溶性抗原の飲作用による取り込み後のピノソームの浸透圧溶解(Moore et al., 1988, Cell, 54：777-785)、抗原の潜在的アジュバントへの結合(Aichele et al., 1990, J. Exp. Med., 171：1815-1820；Gao et al., 1991, J. Immunol., 147：3268-3273；Schulz et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：991-993；Kuzu et al., 1993, Euro. J. Immunol., 23：1397-1400；およびJondal et al., 1996, Immunity 5：295-302)、ならびに抗原のアポトーシス細胞送達(Albert et al. 1998, Nature 392：86-89；Albert et al. 1998, Nature Med. 4：1321-1324；ならびに国際刊行物国際公開公報第99/42564号および国際公開公報第01/85207号)を含む。組換え細菌(例えば、大腸菌)またはトランスフェクトした宿主哺乳動物細胞を、抗原送達のために(それぞれ微粒子抗原、またはアポトーシス小体として)樹状細胞上でパルスしてもよい。組換えキメラウイルス様粒子(VLP)もまた、樹状細胞株のMHCクラスIプロセシング経路への外来異種抗原の送達のためのビークルとして用いられている(Bachmann et al., 1996, Eur. J. Immunol., 26(11)：2595-2600)。
【０１０６】
あるいは、またはさらに、MHCクラスI経路への送達のための本発明の抗原提示細胞の細胞質中への抗原の移入を増強するために、抗原を細胞溶解素と連結、またはさもなければ会合させてもよい。例示的な細胞溶解素には、サポニン含有免疫刺激複合体(ISCOM)などのサポニン化合物(例えば、Cox and Coulter, 1997, Vaccine 15(3)：248-256および米国特許第6,352,697号参照)、ホスホリパーゼ(例えば、Camilli et al., 1991, J. Exp. Med. 173：751-754参照)、孔形成毒素(例えば、α毒素)、リステリオリシンO(LLO、例えば、Mengaud et al., 1988, Infect. Immun. 56：766-772、およびPortnoy et al., 1992, Infect. Immun. 60：2710-2717)、ストレプトリシンO(SLO、例えば、Palmer et al., 1998, Biochemistry 37(8)：2378-2383)、ならびにパーフリンゴリシンO(PFO、例えば、Rossjohn et al., Cell 89(5)：685-692)などの、グラム陽性細菌の天然細胞溶解素が含まれる。抗原提示細胞がファゴサイトである場合、酸で活性化された細胞溶解素を好都合に用いてもよい。例えば、リステリオリシンは、弱酸性pH(ファゴソーム内のpH条件)においてより大きい孔形成能を示し、それによって(ファゴソームおよびエンドソームを含む)空胞内容物の細胞質への送達を容易にしている(例えば、Portnoy et al., Infect. Immun. 1992, 60：2710-2717参照)。
【０１０７】
抗原提示細胞と接触させるために、細胞溶解素を予め選択された抗原と一緒に単一組成物の形態で提供してもよく、または別個の組成物として提供してもよい。ある態様において、細胞溶解素を抗原と融合しまたはさもなければ連結し、融合または連結によって標的細胞の細胞質への抗原の送達が可能になる。別の態様において、細胞溶解素および抗原を、リポソームまたはウイルス、細菌、もしくは酵母より選択される微生物送達ビークルなどの、しかしこれらに限定されない、送達ビークルの形態で提供する。好適には、送達ビークルが微生物送達ビークルである場合、送達ビークルは無毒性である。この種の好ましい態様において、送達ビークルは、細菌で細胞溶解素を発現させる調節ポリヌクレオチドと機能的に連結された非分泌性の機能性細胞溶解素をコードする第1のポリヌクレオチド、および1つまたは複数の予め選択された抗原をコードする第2のポリヌクレオチドを含む、例えば、米国特許第6,287,556号でPortnoyらによって記載されたような、無毒性の細菌である。様々な機構、例えば、機能的シグナル配列の不在、遺伝子損傷(例えば、機能性シグナル配列突然変異)を有する微生物などの、分泌能のない微生物、または毒を与えられた微生物などによって、非分泌性の細胞溶解素を提供してもよい。多種多様の無毒性で、非病原性の細菌を用いてもよく；好ましい微生物は、比較的よく特徴付けされた株、特にMC4100、MC1061、DH5αなどのような、大腸菌の実験室株である。本発明のために人工的に改変することができるその他の細菌には、リステリア モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、シゲラ フレキシネリ(Shigella flexneri)、マイコバクテリウム、サルモネラ(Salmonella)、枯草菌(Bacillus subtilis)などの、十分に特徴付けされた、無毒性で、非病原性の株が含まれる。特定の態様において、複製性がなく、宿主細胞ゲノム内に組み込まれず、および/または細胞間もしくは細胞内で運動性がないように、細菌を弱毒化する。
【０１０８】
上で記載された送達ビークルを用いて、1つまたは複数の抗原を、ファゴサイト性または非ファゴサイト性の抗原提示細胞を含む、対象ビークルのエンドサイトーシスが可能な事実上全ての抗原提示細胞に送達することができる。送達ビークルが微生物である態様において、対象方法は通常、標的細胞による微生物の取り込みおよびそれに続く(ファゴソームおよびエンドソームを含む)抗原提示細胞空胞内での溶解を必要とする。
【０１０９】
その他の態様において、例えば上で記載されたような好適な発現ベクターの導入によって、抗原提示細胞の内部で抗原を産生する。発現ベクターの抗原をコードする部分は、天然の配列または組換え技術を用いて人工的に作製された、その変異体を含んでもよい。変異体の一例において、抗原をコードするポリヌクレオチドのコドン組成を改変し、国際刊行物国際公開公報第99/02694号および国際公開公報第00/42215号で詳細に示された方法を用いて、選り抜きの標的細胞または組織における抗原の発現の増強を可能にする。簡潔に述べると、これらの方法は、異なるコドンの翻訳効率が異なる細胞または組織間で変わるという観察、および遺伝子のコドン組成と共に、これらの相違を活用して特定の細胞または組織型におけるタンパク質の発現を調節することができるという観察に基づいている。したがって、コドンが最適化されたポリヌクレオチドの構築のために、少なくとも1つの親ポリヌクレオチドの現存コドンを、それが取り替える現存コドンよりも高い標的細胞または組織での翻訳効率を有する同義コドンと取り替える。親核酸分子の現存コドンの全てをより高い翻訳効率を有する同義コドンと取り替えることが好ましいが、部分的な取り替えでさえも発現の増大を完遂することができるので、これは必ずしも必要ではない。好適には、取り替え工程は、5、10、15、20、25、30％、より好適には、35、40、50、60、70％、またはそれを上回る親ポリヌクレオチドの現存コドンに影響する。
【０１１０】
抗原提示細胞への導入のための発現ベクターは、抗原をコードするポリヌクレオチドが細胞によって発現可能であるように、それと適合すると考えられる。例えば、この種の発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ならびにB、C、およびDレトロウイルスなどのレトロウイルスだけでなく、スプマウイルスおよび改変レンチウイルスも含むが、これらに限定されない、ウイルスDNA配列に由来することができる。動物細胞のトランスフェクションのための好適な発現ベクターは、例えば、WuおよびAtaai(2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11(2): 205-208)、VignaおよびNaldini(2000, J.Gene Med.2(5): 308-316)、Kayら(2001, Nat.Med.7(1): 33-40)、Athanasopoulosら(2000, Int.J.Mol.Med.6(4): 363-375)ならびにWaltherおよびStein(2000, Drugs 60(2): 249-271)によって記載されている。利用される発現ベクターおよび抗原提示細胞の特定の選択に依存すると考えられる任意の好適な手段によって、発現ベクターを抗原提示細胞に導入する。そのような導入の手段は当業者に周知である。例えば、接触(例えば、ウイルスベクターの場合)、エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、接合または3親交配(triparental mating)、トランスフェクション、感染、カチオン性脂質による膜融合、DNAをコーティングした微小発射体による高速衝突、リン酸カルシウム-DNA沈殿とのインキュベーション、単一細胞への直接的マイクロインジェクション、およびそれらと同様のものの使用によって、導入をもたらすことができる。その他の方法もまた利用可能であり、および当業者に公知である。あるいは、カチオン性脂質、例えば、リポソームによって、ベクターを導入する。そのようなリポソームは市販されている(例えば、Life Technologies, Gibco BRL, Gaitherburg, Md.によって供給されている、Lipofectin(登録商標)、Lipofectamine(商標)、およびそれらと同様のもの)。例えば、オリゴヌクレオチドの合成、核酸増幅技術、細胞を形質転換すること、ベクターを構築すること、発現系およびそれらと同様のもの、ならびに形質導入しまたはさもなければ細胞の中に核酸を導入することなどの、本明細書において記載されたような抗原をコードする核酸分子、免疫調節分子、および/またはサイトカインを組み立てまたは発現させるための技術は当技術分野において十分に確立され、かつほとんどの専門家は特定の条件および手順のための標準的な資源材料に精通しているということが当業者によって理解されると考えられる。
【０１１１】
幾つかの態様において、免疫応答の改変が望ましい細胞集団または組織由来の抗原提示細胞またはそれらの前駆体を単離することによって、抗原特異的な抗原提示細胞を得る。典型的には、単離された抗原提示細胞または前駆体の中に、構成的に抗原を提示し、または免疫応答の刺激もしくは阻害が望ましい免疫応答の標的もしくは潜在的標的であるようなインビボ抗原を取り込んでいると考えられるものがある。この場合には、外来抗原の送達は必須ではない。あるいは、細胞を健常組織または疾患組織の生検から得、溶解しまたはアポトーシス状態にし、および抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)上でパルスしてもよい。この種のある種の態様において、抗原提示細胞は、抗原特異的な免疫応答が必要とされる癌または腫瘍細胞の代わりを務める。癌または腫瘍細胞の実例となる例には、肉腫および癌の細胞、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血球血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫；骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病；慢性白血病(慢性骨髄性(顆粒球)白血病および慢性リンパ球性白血病)；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫(ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病が含まれる。ある種の態様において、癌または腫瘍は、メラノーマ細胞および乳癌腫細胞の群より選択される。
【０１１２】
上の態様の幾つかにおいて、癌または腫瘍は、条件的なまたはプロフェッショナルでない抗原提示細胞を構成すると考えられ、および場合によっては、それらの抗原提示機能を増強するためにさらなる改変を必要とする可能性がある。これらの場合、TAP1/TAP2トランスポータータンパク質などの抗原プロセシングおよび提示に関与するタンパク質、LMP2およびLMP7などのプロテオソーム分子、gp96、HSP70、およびHSP90などの熱ショックタンパク質、ならびに主要組織適合複合体(MHC)またはヒト白血球抗原(HLA)分子；B7およびCD40などのT細胞活性化のための共刺激シグナルを提供する因子；OX-2、プログラムされた死-1リガンド(PD-1L)などのT細胞の直接的殺傷またはTリンパ球もしくはBリンパ球アネルギーの誘導または調節性T細胞(Treg)発生の刺激のための共阻害シグナルを提供する因子；CD83などのアクセサリー分子；ケモカイン；IFN α、β、およびγ、インターロイキン(例えば、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-22など)のようなリンホカインならびにサイトカイン、細胞増殖を刺激する因子(例えば、GM-SCF)、ならびにその他の因子(例えば、腫瘍壊死因子(TNF)、DC-SIGN、MIP1α、MIP1β、および形質転換増殖因子-β(TGF-β))：を含む免疫応答を調節しまたは免疫応答に直接影響し得る動物において天然に生じる任意の分子を含む、1つまたは複数の免疫調節分子を発現するように、抗原提示細胞をさらに改変する。ある種の好都合な態様において、免疫調節分子をB7分子(例えば、B7-1、B7-2、またはB7-3)ならびにICAM分子(例えば、ICAM-1およびICAM-2)より選択する。
【０１１３】
免疫調節分子を組換えによって発現させる代わりに、所望の免疫調節分子を発現する抗原提示細胞を異種の細胞の集団から単離または選択してもよい。単離/選択の任意の方法が本発明によって企図され、その例は当業者に公知である。例えば、細胞の1つまたは複数の特定の特徴を利用して、異種集団からその細胞を特異的に単離することができる。そのような特徴には、細胞の解剖学的場所、細胞密度、細胞サイズ、細胞形態、細胞の代謝活性、Ca2+、K+、およびH+イオンなどのイオンの細胞摂取、染料などの化合物の細胞摂取、細胞表面上に発現したマーカー、タンパク質蛍光、ならびに膜電位が含まれるが、これらに限定されない。この点において用いることができる好適な方法には、組織の外科的除去、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)などのフローサイトメトリー技術、免疫親和性分離(例えば、Dynabead(商標)分離などの磁気ビーズ分離)、密度分離(例えば、メトリザミド、Percoll(商標)、またはFicoll(商標)勾配遠心分離)、および細胞型特異的密度分離が含まれる。望ましくは、免疫調節分子と免疫相互作用する抗原結合分子を用いて、フローサイトメトリーによってまたは免疫親和性分離によって細胞を単離する。
【０１１４】
あるいは、免疫調節分子を可溶型で抗原提示細胞に提供することができる。この種の幾つかの態様において、免疫調節分子は、(例えば、B7細胞外ドメインを含む)機能的な膜貫通ドメインを欠くB7分子であり、その非限定的な例は、McHugh et al.(1998, Clin. Immunol. Immunopathol. 87(1)：50-59)、Faas et al.(2000, J. Immunol. 164(12)：6340-6348)、およびJeannin et al.(2000, Immunity 13(3)：303-312)によって記載されている。この種のその他の態様において、免疫調節タンパク質は、B7分子を含むキメラもしくは融合タンパク質、またはその生物学的活性断片、または免疫グロブリン分子もしくはその生物学的活性断片などの抗原結合分子と共に連結された、これらの変異体もしくは誘導体を含むが、これらに限定されない、B7誘導体である。例えば、約位置1から約位置215までのアミノ酸を含む、B7-1分子の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、PCRを用いて、ヒトIg Cγ1のヒンジ、CH2、およびCH3領域に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにつなぎ、B7Ig融合タンパク質として発現されるコンストラクトを形成させる。B7Ig融合タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするDNAは、1991年3月31日にブタペスト条約の下で、Rockville, Md.のアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託され、およびアクセッション番号68627を受けた。そのようなB7誘導体を作製しおよび組み立てるための技術は、例えば、Linsley et al.(米国特許第5,580,756号)によって開示されている。IgG2aのFc部分にインフレームで融合されたB7-1またはB7-2の細胞外領域を含む融合タンパク質を開示しているSturmhoefel et al.(1999, Cancer Res. 59：4964-4972)に対する言及もなされてもよい。
【０１１５】
必要に応じて、任意の好適な手順によって、可溶性免疫調節分子の半減期を長くしてもよい。好ましくは、例えば、Chapmanら(1999, Nature Biotechnology 17：780-783)によって開示されたような、モノメトシキ-ポリエチレングリコールを含む、ポリエチレングリコール(PEG)によって、そのような分子を化学的に改変する。
【０１１６】
あるいは、またはさらに、細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間および条件下で、少なくとも1つのIFNの存在下で抗原提示細胞を培養し、かつ細胞を洗浄してIFNを除去する。この種のある種の好都合な態様において、培養する工程は、少なくとも1つのI型IFNおよび/またはII型IFNと接触させる工程を含んでもよい。少なくとも1つのI型IFNは、IFN-α、IFN-β、IFN-αの生物学的活性断片、IFN-βの生物学的活性断片、IFN-αの変異体、IFN-βの変異体、該生物学的活性断片の変異体、IFN-αの誘導体、IFN-βの誘導体、該生物学的活性断片の誘導体、該変異体の誘導体、IFN-αの類似体、およびIFN-βの類似体からなる群より好適に選択される。典型的には、II型IFNは、IFN-γ、IFN-γの生物学的活性断片、IFN-γの変異体、該生物学的活性断片の変異体、IFN-γの誘導体、該生物学的活性断片の誘導体、該変異体の誘導体、およびIFN-γの類似体からなる群より選択される。IFN処置を用いて抗原提示細胞の抗原提示機能を増強するための例示的な方法および条件は、国際刊行物国際公開公報第01/88097号に記載されている。
【０１１７】
幾つかの態様において、ひとたび対象に投与すれば、さらなる増殖を妨げるように、抗原提示細胞(例えば、癌細胞)または細胞株を好適に不活性化する。放射線照射(通常は少なくとも約5,000cGy、普通は少なくとも約10,000cGy、典型的には少なくとも約20,000cGyで)；またはマイトマイシン-Cによる処置(普通は少なくとも10μg/mL；より普通には少なくとも約50μg/mL)を含むが、これらに限定されない、任意の物理的、化学的、または生物学的な不活性化の手段を用いてもよい。
【０１１８】
抗原またはそのプロセシングされた形態が、Tリンパ球およびBリンパ球を含む、その他の免疫細胞の潜在的調節のための、ならびに特に特定の抗原または抗原の群に応答するようプライミングを受けたTリンパ球およびBリンパ球を産生するための細胞によって提示されるように、任意の数の手段によって、1つまたは複数の抗原を含みおよび/または発現するよう抗原提示細胞を入手および調製してもよい。
【０１１９】
免疫エフェクター細胞
幾つかの態様において、上で記載された抗原提示細胞は、抗原または抗原の群に対するプライミングを受けたTリンパ球を産生するのに有用である。例えば抗原特異的な抗原提示細胞を抗原特異的な細胞溶解性Tリンパ球(CTL)の標的として用いてTリンパ球のインビトロでの細胞溶解活性をアッセイすること；抗原特異的Tリンパ球増殖をアッセイすること(例えば、Vollenweider and Groseurth, 1992, J. Immunol. Meth. 149：133-135参照)、例えば、ELISPOTアッセイ法、およびELISAアッセイ法を用いて抗原に対するB細胞応答を測定すること；サイトカインプロファイルを調べること；または特定の抗原に対する皮膚反応の試験によって遅延型超過敏(DTH)反応を測定すること(例えば、Chang et al.(1993, Cancer Res. 53：1043-1050)参照)を含むが、これらに限定されない、任意の好適な方法によって、リンパ球、とりわけTリンパ球が特定の抗原に対する免疫応答を示すように誘導する効率を決定することができる。抗原に対する曝露の後に抗原提示細胞の表面上の抗原の存在を検出することができる、当業者に公知のその他の方法もまた本発明によって企図されている。
【０１２０】
したがって、本発明はまた、抗原を代表するものに対して抗原特異的な様式で応答する、抗原特異的BまたはTリンパ球、とりわけTリンパ球を提供する。幾つかの態様において、上で規定されたような抗原提示細胞を、脾臓または扁桃腺/リンパ節などの任意の好適な源から入手し得るが、好ましくは末梢血から入手する、Tリンパ球の集団と接触させることによって、抗原特異的Tリンパ球を産生する。例えば、「Immunochemical Techniques, Part G：Separation and Characterization of Lymphoid Cells」(Meth. in Enzymol. 108, Di Sabato et al編, 1984, Academic Press)で記載されたような標準的な技術を用いて好適に入手される、粗調製物としてまたは部分的に精製された調製物としてまたは実質的に精製された調製物として、Tリンパ球を使用することができる。これには、ヒツジ赤血球によってロゼッティングすること、ナイロンウールのカラムを通過させること、または接着細胞を枯渇させるためのプラスチックによる接着が含まれ、適当なモノクローナル抗体を用いた免疫磁気選択またはフローサイトメトリー選択が当技術分野において公知である。
【０１２１】
それらの抗原提示細胞によって提示された1つの抗原または複数の抗原に対してTリンパ球をプライムするのに十分な期間、Tリンパ球の調製物を本明細書において記載されたような抗原特異的な抗原提示細胞と接触させる。この期間は、通例少なくとも約1日、および約5日までであると考えら得る。
【０１２２】
2.2.3 抗原結合分子
本発明はまた、選択された標的抗原と特異的に免疫相互作用する抗原結合分子の免疫調節剤としての使用を企図している。幾つかの態様において、標的抗原は、疾患もしくは病気においてまたは免疫応答の増強が必要とされる特定の病原体によって発現される。その他の態様において、標的抗原は典型的には、正常状態または疾患もしくは病気がない状態と比べて疾患または病気においてより高いレベルで、異常に発現される。抗原結合分子は、例えば第2.2.1節で記載されたような標的抗原と好適に相互作用性がある。本発明において有用な多数の抗原結合分子が当技術分野において公知である。結腸癌が処置の対象である実例となる例において、抗原結合分子は、Cripto-1タンパク質、Pim-1タンパク質、または例えば、米国特許出願刊行物第20040176576号で開示されたような、結腸癌細胞溶解物中に存在する抗原より選択される抗原と免疫相互作用する。
【０１２３】
幾つかの態様において、抗原結合分子は、ポリクローナル抗体全体である。例えば、ポリクローナル抗血清を入手するために、マウスまたはウサギを含み得る、産生種に標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を注射することによって、そのような抗体を調製してもよい。ポリクローナル抗体を産生する方法は当業者に周知である。使用し得る例示的なプロトコルは、例えばColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley & Sons社, 1991)、およびAusubel et al.,(1994-1998, 前記)、特に第11章の第III節に記載されている。
【０１２４】
産生種で得られるポリクローナル抗体の代わりに、例えば、Kohler and Milstein(1975, Nature 256, 495-497)に記載されたような標準的な方法を用いて、または上で記載されたような1つもしくは複数の抗原を接種した産生種に由来する脾臓もしくはその他の抗原産生細胞を不死化することによる、例えば、Coligan et al.,(1991, 前記)によって記載されたようなそのより最近の改変によって、モノクローナル抗体を産生してもよい。
【０１２５】
本発明はまた、抗原結合分子としてFv、Fab、Fab'、およびF(ab')2免疫グロブリン断片を企図している。あるいは、抗原結合分子は合成安定化Fv断片を含んでもよい。この種の例示的な断片には、ペプチドリンカーを用いてVHドメインのN末端またはC末端をそれぞれVLドメインのC末端またはN末端と架橋している、単鎖Fv断片(sFv、多くの場合scFvと呼ばれる)が含まれる。scFvは抗体全体の全ての定常部分を欠き、および補体を活性化することができない。例えば、Kreberら(Kreber et al. 1997, J. Immunol. Methods；201(1)：35-55)において概略が説明された方法に従って、scFvを調製してもよい。あるいは、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号、またはWinter and Milstein(1991, Nature 349：293)ならびにPluckthun et al(1996, Antibody engineering中の：A practical approach. 203-252)による論文に記載された方法によって、それらを調製してもよい。別の態様において、合成安定化Fv断片は、完全に折り畳まれたFv分子中で2つの残基がそれらの間のジスルフィド結合を形成するように、システイン残基がVHおよびVLドメインに導入されているジスルフィド安定化Fv(dsFv)を含んでもよい。dsFvを産生する好適な方法は例えば(Glockscuther et al. Biochem. 29：1363-1367；Reiter et al. 1994, J. Biol. Chem. 269：18327-18331；Reiter et al. 1994, Biochem. 33：5451-5459；Reiter et al. 1994. Cancer Res. 54：2714-2718；Webber et al. 1995, Mol. Immunol. 32：249-258)に記載されている。
【０１２６】
2.3 付随する構成要素
幾つかの態様において、組成物は、flt3、SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、TNF-α、IL-4、TNF-β、LT-β、IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-13、IL-5、IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-17、IL-16、IL-18、HGF、IL-11、MSP、FasL、TRAIL、TRANCE、LIGHT、TWEAK、CD27L、CD30L、CD40L、APRIL、TALL-1、4-1BBL、OX40L、GITRL、IGF-I、IGF-II、HGF、MSP、FGF-a、FGF-b、FGF-3〜19、NGF、BDNF、NT、Tpo、Epo、Ang1〜4、PDGF-AA、PDGF-BB、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、TGF-α、AR、BTC、HRG、HB-EGF、SMDF、OB、CT-1、CNTF、OSM、SCF、Flt-3L、M-CSF、MK、およびPTN、またはそれらの機能的、組換えもしくは化学的同等物、またはその相同体より好適に選択される、1つまたは複数のサイトカインをさらに含む。好ましくは、サイトカインは、IL-12、IL-3、IL-5、TNF、GMCSF、およびIFN-γからなる群より選択される。
【０１２７】
3. 細胞に基づく治療または予防
本発明に従って、免疫応答をプライミングまたはブーストするための第2.2.2節で記載されたような抗原提示細胞および/または免疫エフェクター細胞と一緒に、例えば第2.1節で記載されたような、IL-10機能の阻害剤を患者に投与することができる。これらの細胞に基づく組成物は、それゆえ、標的抗原の存在または異常発現と関連する疾患または病気を処置または防止するために有用である。抗原または抗原の群に対する所望の免疫応答を産生する、任意の手段(例えば、注射)によって、本発明の細胞を患者に導入することができる。細胞は患者(すなわち、自己細胞)に由来してもよいし、または患者とMHCが一致したもしくは一致しない(すなわち、同種異系の)1人の個体または複数の個体に由来してもよい。典型的には、自己細胞を注射して源細胞を得た患者に戻す。注射部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、または静脈内であってもよい。疾患または病気の症状を処置または防止または緩和するために十分な数で、既に疾患もしくは病気を患っている患者または疾患もしくは病気の傾向がある患者に細胞を投与してもよい。処置または予防を必要とする患者に注射する細胞の数は、とりわけ1つの抗原または複数の抗原、および個体のサイズによって変わってもよい。この数は、例えば約103〜1011、および普通は105〜107細胞(例えば、樹状細胞またはTリンパ球)の範囲であってもよい。処置している医師によって選択されている細胞数および様式で、単回または複数回の細胞の投与を実行することができる。細胞および個体にとって無毒である、薬学的に許容される担体の中で、細胞を投与すべきである。そのような担体は、細胞を増殖させた増殖培地、またはリン酸緩衝化生理食塩水などの任意の好適な緩衝培地であってもよい。単独でまたは例えば、グルココルチコイド、メトトレキサート、D-ペニシルアミン、ヒドロキシクロロキン、金塩、スルファサラジン、TNFαもしくはインターロイキン-1阻害剤、および/または特定の免疫療法のその他の形態などの、しかしこれらに限定されない、望まない免疫応答の処置もしくは防止のための当技術分野において公知のその他の治療と併用した補助療法として、細胞を投与してもよい。
【０１２８】
4. 薬学的製剤
本発明はまた、標的抗原の存在または異常発現と関連する様々な疾患または病気の処置または予防のための活性成分として、例えば第2.1節で記載されたような、IL-10機能の阻害剤を含む、ワクチン、および免疫刺激薬剤、例えば、第2.2.1節で記載されたような抗原、第2.2.2節で記載されたような免疫エフェクター細胞、もしくは第2.2.3節で記載されたような抗原結合分子、またはその組み合わせ(治療的/予防的薬剤)を含む、免疫調節製剤を企図している。これらの治療的/予防的薬剤を、それらだけで、またはそれらが好適な薬学的に許容される担体および/もしくは希釈剤、またはアジュバントと混合されている製剤中でのいずれかで、患者に投与することができる。
【０１２９】
そのような製剤の調製は、当業者に公知の日常的な方法を用いている。典型的には、そのような製剤およびワクチンを、液体溶液としてまたは液体懸濁としてのいずれかで、注射可能なものとして調製し；注射前の液体の溶液、または懸濁に好適な固体形態もまた調製してもよい。また、調製物を乳化してもよい。多くの場合、薬学的に許容され、かつ活性成分と適合する賦形剤と免疫原性活性成分を混合する。好適な賦形剤は、例えば、水、リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、またはそれらと同様のもの、およびその組み合わせである。さらに、望ましい場合、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝薬剤、および/またはワクチンの効果を増強するアジュバントなどの、少量の補助物質を含んでもよい。効果的であり得るアジュバントの例として：ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、N,N-ジコクタデシル-N',N'ビス(2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン)、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオールなどの表面活性物質；ピラン、デキストラン硫酸、ポリICカルボポールなどのポリアミン；リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、もしくはミョウバンなどのミネラルゲル；ムラミルジペプチドなどのペプチドおよびN-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thur-MDP)、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(ノル-MDPと称される、CGP 11637)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリロキシ)-エチルアミン(MTP-PEと称される、CGP 1983A)、および細菌から抽出された3つの構成要素、モノホスホリル脂質A、ジメチルグリシン、タフツシンを含む、RIBIなどの誘導体；オイルエマルジョン；2％スクアレン/Tween80エマルジョン中のトレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格(MPL＋TDM＋CWS)；リンホカイン；QuilAおよび免疫刺激複合体(ISCOM)が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ワクチンの投与から結果的に得られる抗体の量を測定することによってアジュバントの効果を決定してもよく、それらの抗体は、ワクチンの処置細胞によって提示された1つまたは複数の抗原を指向する。
【０１３０】
細胞および処置されるべき個体にとって無毒である、薬学的に許容される担体の中で、活性成分を投与すべきである。そのような担体は、細胞を増殖させた増殖培地であってもよい。適合性のある賦形剤には、リン酸もしくはHepesのような生理学的適合性のある緩衝剤およびデキストロース、生理学的適合性のあるイオン、またはアミノ酸などの栄養物を含むもしくは含まない、等張生理食塩水、ならびに細胞集団、特にその他の免疫原性構成要素を欠いている細胞集団と共に使用するのに好適な様々な培養培地が含まれる。アルブミンおよび血漿分画などの、キャリア試薬および不活性増粘剤もまた用いてもよい。それらがワクチン中に存在する程度まで、不活性な生物学的構成要素は、好ましくは同系の動物または処置されるべきそのようなヒトに由来し、およびさらにより好ましくはそれまでに対象から得られている。注射部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、または静脈内であってもよい。
【０１３１】
可溶性の活性が利用される場合、可溶性活性成分を中性形態または塩形態としてワクチンに製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、(ペプチドの遊離のアミノ基によって形成される)酸添加塩が含まれ、かつそれは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、およびそれらと同様のものなどの有機酸によって形成される。遊離のカルボキシル基によって形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、およびそれらと同様のものなどの有機塩基に由来してもよい。
【０１３２】
必要に応じて、装置またはワクチンを含みかつ持続的もしくは断続的放出に好適な薬学的組成物もしくは組成物を、事実上体内に埋め込み、または比較的緩徐なそのような材料の体内への放出のためにそこに局所的に適用することができると考えられる。
【０１３３】
製剤化および投与のための技術を「Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing社, Easton, Pa., 最新版に見出してもよい。好適な経路には、例えば、経口投与、経直腸投与、経粘膜投与、または経腸投与；筋肉内注射、皮下注射、髄内注射だけでなく、髄膜注射、直接的脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、または眼内注射をも含む非経口送達が含まれてもよい。
【０１３４】
投与されるべき投薬量は、その年齢、性別、体重、および全体的健康状態を含めて、処置されるべき対象によってもよい。投薬量はまた、その標的分子に対するIL-10機能の阻害剤の結合親和性、免疫刺激因子の免疫原性、それらのバイオアベイラビリティー、ならびにそれらのインビボおよび薬物動態プロファイルを考慮に入れると考えられる。この点において、投与のための薬剤の正確な量もまた、専門家の判断によることができる。疾患または病気の処置において投与されるべき薬剤の有効量を決定する際、医師または獣医は、経時的な疾患または病気の進行を評価してもよい。任意の事象において、当業者は、過度の実験をせずに、本発明の薬剤の好適な投薬量を容易に決定してもよい。約104〜1010処置細胞/投与の範囲で、より好ましくは約106〜108処置細胞/投与の範囲で、細胞含有組成物およびワクチンを患者に好適に投与する。患者に投与されるべき活性の投薬量は、癌または腫瘍に関連する症状の低下などの患者における有益な応答を経時的にもたらすのに十分であるべきである。例えば、IL-10機能の阻害剤またはポリペプチド抗原の全身投与用の通例の患者投薬量は、約0.1〜200g、典型的には約1〜160g、およびより典型的には約10〜70gの範囲にまで及ぶ。患者の体重の点から述べると、通例の投薬量は約1.5〜3000mg/kg、典型的には約15〜2500mg/kg、より典型的には約150〜1000mg/kg、およびさらにより典型的には約20〜50mg/kgの範囲にまで及ぶ。IL-10阻害を維持するために、または標的抗原に対する免疫応答を維持もしくはブーストするために、好適な間隔で投薬を投与してもよい。そのような間隔は、当業者に公知の日常的な手順を用いて確認することができ、かつ利用される活性薬剤およびその剤形の種類によって変わることができる。例えば、間隔は、毎日、1日おき、毎週、2週間毎、毎月、2か月毎、3か月毎、半年毎、または毎年であってもよい。
【０１３５】
したがって、標的抗原に対する免疫応答を刺激または増強するための有効量でIL-10機能の阻害剤および免疫刺激因子を提供してもよい。この過程は、免疫刺激因子と共にIL-10機能の阻害剤を個別的に、同時的に、または連続的に投与する工程を伴ってもよい。幾つかの態様において、両方の薬剤を含む単一組成物もしくは薬理学的製剤を投与することに依って、または一方の組成物がIL-10機能の阻害剤を含み、および他方が免疫刺激因子を含む、2つの別個の組成物もしくは製剤を同時に投与することによって、これを達成してもよい。その他の態様において、IL-10機能の阻害剤による処置は、数分から数日の範囲にまで及ぶ間隔で、免疫刺激因子による処置の前または後にきてもよい。IL-10機能の阻害剤が免疫刺激因子に個別的に適用される態様において、IL-10機能の阻害剤が、免疫刺激因子と共に免疫系に対して好都合に組み合わされた効果を依然として発揮することができ、特に、それに続く免疫刺激因子によるチャレンジによって抗原特異的なCD8+ IFN-γ産生免疫応答を開始する対象の能力を維持または増強するように、各々の送達の時間の間に相当な期間が終了しないということが通常は保証されると考えられる。そのような場合において、互いに約1〜12時間以内に、およびより好適には、互いに2〜6時間以内に、細胞を両方のモダリティー(modalities)と接触させるということが企図されている。しかしながら、それぞれの投与の間に数時間(2、3、4、5、6、または7)から数日(1、2、3、4、5、6、7、8または)が経過する、幾つかの状況においては、処置のための期間を顕著に延長することが望ましい場合がある。
【０１３６】
上で示されたように、IL-10機能の阻害剤または免疫刺激因子のいずれかの1つより多くの投与が望ましいと考えられる。IL-10機能の阻害剤が「A」であり、かつ免疫刺激因子が「B」である場合、以下に例示されたように、様々な組み合わせが利用されてもよい：
2008535868.tif 000006
【０１３７】
その他の組み合わせが企図されている。この場合もまた、それに続く免疫刺激因子によるチャレンジによって抗原特異的なCD8+ IFN-γ産生免疫応答を開始する対象の能力を維持または増強するために有効な組み合わせ量で、両方の薬剤を対象の免疫系に送達する。
【０１３８】
5. 免疫応答を調節するための方法
免疫学的にナイーブであり、または以前にその抗原に対する免疫応答を引き起こしたことがある対象における標的抗原に対する免疫応答を刺激するために、本発明の組成物を用いてもよい。したがって、本発明はまた、対象に本発明の組成物またはワクチンを投与することによって、対象における免疫応答を増強するための方法にまで至る。好都合には、免疫応答は細胞介在性の免疫応答(例えば、望ましくはCD8+ IFN-γ産生T細胞を含む、T細胞介在性の応答)である。例えば、上で議論されたように、連続的に、同時に、または個別的にのいずれかで、組成物の活性成分を投与してもよい。
【０１３９】
疾患または病気の処置および/または予防のための方法であって、そのような処置を必要とする患者に、上で広範囲に記載されたような、有効量の免疫刺激因子と共に、有効量のIL-10機能の阻害剤を投与する工程を含む方法もまた、本発明によって含まれる。ある種の態様において、標的抗原は、癌、感染性疾患、および免疫不全を特徴とする疾患より好適に選択される疾患もしくは病気と関連しまたは該疾患もしくは病気の原因である。癌の例として、ABL1癌原遺伝子、AIDS関連癌、聴神経腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞性癌、副腎皮質癌、原因不明骨髄化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、無形成性貧血、星細胞腫、運動失調症‐毛細血管拡張症、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳およびCNS腫瘍、乳癌、CNS腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児脳腫瘍、小児癌、小児白血病、小児軟組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛膜癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼：メラノーマ、網膜芽腫、卵管癌、ファンコニ貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、泌尿生殖器癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科癌、血液悪性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内メラノーマ、島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、咽頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リーフラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、リンパ水腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、腎臓の悪性横紋筋様腫瘍、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口癌、多発性内分泌腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌、鼻咽腔癌、腎芽腫、神経芽腫、神経線維腫症、ナイメーヘン切断症候群、非メラノーマ性皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、オストミー卵巣癌、膵癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、稀な癌および関連疾患、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、ロスモンド-トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌(皮膚)、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌(膀胱)、移行細胞癌(腎-骨盤-/-尿管)、絨毛癌、尿道癌、泌尿器系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
その他の態様において、本発明の組成物はまた、正常な免疫応答を開始することができない免疫不全個体への養子移入用の、多数のCD8+またはCD4+ CTLを発生させるために用いることができると考えられる。例えば、HIV感染(Koup et al., 1991, J. Exp. Med. 174：1593-1600；Carmichael et al., 1993, J. Exp. Med. 177：249-256；およびJohnson et al., 1992, J. Exp. Med. 175：961-971)、マラリア(Hill et al., 1992, Nature 360：434-439)、ならびにメラノーマなどの悪性腫瘍(Van der Brogen et al., 1991, Science 254：1643-1647；およびYoung and Steinman 1990, J. Exp. Med., 171：1315-1332)で苦しむ個体における治療目的のために、抗原特異的CD8+ CTLを養子的に移入することができる。
【０１４１】
また別の態様において、組成物は、ウイルス、細菌、または寄生虫感染の処置または予防に好適である。本発明によって企図されるウイルス感染には、HIV、肝炎、インフルエンザ、日本脳炎ウイルス、エプスタイン-バーウイルス、および呼吸器合胞体ウイルスによって引き起こされる感染が含まれるが、これらに制限されない。細菌感染には、ネイセリア(Neisseria)種、髄膜炎菌(Meningococcal)種、ハエモフィルス(Haemophilus)種、サルモネラ種、連鎖球菌種、レギオネラ(Legionella)種、およびマイコバクテリウム(Mycobacterium)種によって引き起こされる感染が含まれるが、これらに制限されない。本発明によって包含される寄生虫感染には、プラスモディウム(Plasmodium)種、住血吸虫(Schistosoma)種、レイシュマニア(Leishmania)種、トリパノソーマ(Trypanosoma)種、トキソプラスマ(Toxoplasma)種、およびギアルディア(Giardia)種よって引き起こされる感染が含まれるが、これらに制限されない。
【０１４２】
任意の好適な技術を用いて、免疫付与の効率を評価してもよい。例えば、51CrまたはAlamarBlue(商標)で標識された標的細胞を用いたペプチドコーティング細胞または組換えウイルス感染細胞上の刺激された脾臓細胞または末梢血単核細胞(PBMC)を用いて、CTL溶解アッセイ法を利用してもよい。例えば、霊長類、マウス、またはヒト細胞を用いて、そのようなアッセイ法を行うことができる(Allen et al., 2000, J. Immunol. 164(9)：4968-4978、さらにWoodberry et al., 下記)。あるいは、新鮮なおよび刺激されたPBMC両方のHLAクラスIテトラマー染色(例えばAllen et al., 前記)、増殖アッセイ法(Allen et al., 前記)、ELISPOTアッセイおよび細胞内IFN-γ染色(Allen et al., 前記)、線形のB細胞応答用のELISAアッセイ法；ならびに合成ポリヌクレオチドを発現する細胞試料のウェスタンブロットを含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の技術を用いて、免疫付与の有効性をモニターしてもよい。
【０１４３】
幾つかの態様において、組成物は、標的抗原に対応する抗原を発現することができる核酸コンストラクトを含む。哺乳動物、とりわけヒトへのそのようなコンストラクトの投与には、直接的な経口摂取による送達、全身注射、または選択された組織もしくは細胞への送達が含まれる。例えば、微小発射体衝突、リポソームを介するトランスフェクション(例えば、リポフェクチンもしくはリポフェクトアミン)、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムまたはDEAE-デキストランを介するトランスフェクションによって、哺乳動物の細胞または組織へのコンストラクトの送達を容易にしてもよい。好適な送達方法に関する議論をAusubel et al.,(1994-1998,  前記)の第9章に見出してもよい。
【０１４４】
選択された標的細胞または組織の中に発現ベクターを導入する工程は、意図される使用および種によって異なると考えられ、ならびに非ウイルスまたはウイルスベクター、カチオン性リポソーム、レトロウイルス、および例えば、Mulligan, R. C.,(1993 Science 260 926-932)で記載されているようなアデノウイルスの1つまたは複数を伴うことができる。そのような方法は、例えば以下を含む。
【０１４５】
A. 注射(Wolff et al., 1990, Science 247 1465-1468)、外科的埋め込み、点滴、または任意のその他の手段による発現ベクターの局部適用
この方法はまた、その処置の有効性を増大させるために、発現ベクターによってコードされるタンパク質に応答する細胞の、注射、外科的埋め込み、点滴、または任意のその他の手段による局部適用と組み合わせて、用いることもできる。この方法はまた、タンパク質の活性に必要とされる1つまたは複数の別の因子の、注射、外科的埋め込み、点滴、または任意のその他の手段による局部適用と組み合わせて、用いることもできる。
【０１４６】
B. 単独での、またはリポソーム(Zhu et al., 1993, Science 261 209-212)、ウイルスカプシドもしくはナノ粒子(Bertling et al., 1991, Biotech. Appl. Biochem. 13 390-405)、もしくは任意のその他の送達の媒介物と組み合わせた、DNA(Calabretta et al., 1993, Cancer Treat. Rev. 19 169-179)、またはRNAの注射による一般的な全身送達
ポリヌクレオチド/発現ベクターを標的分子に連結すること(例えば、抗原結合分子を利用する、いわゆる、「魔法の弾丸」アプローチ)によって、または発現ベクターによってコードされるタンパク質の活性に必要とされる1つまたは複数の別の因子の、もしくはタンパク質に応答する細胞の、注射、外科的埋め込み、点滴、もしくは任意のその他の手段による局部適用によって、標的の改善を達成してもよい。例えば、アンチセンスIL-10ポリヌクレオチドを含むリポソームの場合、皮膚癌でより高いレベルで発現される、EGF受容体に特異的である、免疫相互作用性薬剤のリポソームコート内への取り込みによって、リポソームを皮膚癌細胞、例えば、扁平上皮癌細胞に標的してもよい。
【０１４７】
C. それらの細胞でのポリヌクレオチドの発現を増大させるために、トランスフェクション(例えば、リン酸カルシウム：Chen et al., 1987, Mole. Cell Biochem. 7 2745-2752、もしくはカチオン性脂質およびポリアミン：Rose et al., 1991, BioTech. 10 520-525の存在下)、感染、注射、エレクトロポレーション(Shigekawa et al., 1988, BioTech. 6 742-751)、または任意のその他の方法によってエクスビボで改変された細胞の、任意の手段による注射、埋め込み、または送達
プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、(アデノウイルスもしくはレトロウイルス；Mulligan, 1993, Science 260 926-932；Miller, 1992, Nature 357 455-460；Salmons et al., 1993, Hum. Gen. Ther. 4 129-141などの)ウイルス、もしくはその他のベクター、またはリポソーム(Zhu et al., 1993, Science 261 209-212)、ウイルスカプシド、もしくはナノ粒子(Bertling et al., 1991, Biotech. Appl. Biochem. 13 390-405)などのその他の改変の薬剤、または任意のその他の改変の媒介物によって、改変を媒介することができる。遺伝子または遺伝子産物用の送達ビークルとしての細胞の使用は、Barr et al., 1991, Science 254 1507-1521によっておよびDhawan et al., 1991, Science 254 1509-1521によって記載されている。標的細胞は、処置される対象におけるそれらの生存を促進すると考えられる任意の栄養物、増殖因子、マトリックス、またはその他の薬剤と組み合わせて送達することができる。
【０１４８】
本発明が容易に理解され、かつ実際に実施され得るように、これから以下の非限定的な実施例によって、特定の好ましい態様を記載する。
【０１４９】
実施例
実施例1
抗原を経験した宿主における新しいCD8 T細胞IFN-ガンマ応答を発生させるための抗原原罪の克服
材料および方法
マウス
Animal Resource Centre(ARC, Perth, Australia)から特定病原体を含まない状態(SPF)で4〜8週齢の成獣メスC57BL/6(H-2b)マウスを購入し、別の場所で記載されたように、C57BL/6Jバックグラウンド上のヒトパピローマウイルス16 E7(RAHYNNIVTF)MHCクラスI制限T細胞受容体ベータ鎖トランスジェニックマウスを研究室で産生した(Matsumoto, 2004, J Natl Cancer Inst 96：1611-1619)。マウスは始めから終わりまでSPF条件の下で管理され、および実験は全てUniversity of Queensland動物実験倫理委員会の指針によって承認され、かつ該指針に従って行われた。
【０１５０】
細胞株およびペプチドおよび抗体
スポドプテラ フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(Sf-9)細胞(Life Technique)を、Sf-9 IIサプリメント(Life Technique)および10％胎仔ウシ血清(FBS)(CSL, Melbourne)を含むSf-900 II培地中で、27℃で維持した。抗IL-10Rハイブリドーマ(3B1.3a)は、Centenary Institute, University of SydneyのWarwick Britton博士によって快く提供され、および10％ FBSを含むRPMI-1640(Invitrogen, USA)中で維持された。
【０１５１】
抗IL-10R MAbの産生のために、ハイブリドーマ細胞を1％ FBSを含むRPMI中で72時間培養し、上清を回収しおよびプロテインGカラム(Sigma-Aldrich)に通し、ならびにカラムに100mMグリシン(Sigma-Aldrich)を流すことによって溶出した。溶出した抗体をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(0.15M NaCl；0.02M PO4；pH 7.4)に対して徹底的に透析し、および抗体の濃度を以前に記載されたように測定した(Liu et al., 2003, J Immunol 171：4765-4772)。
【０１５２】
抗CD4 MAb(GK1.5)および抗CD8 MAb(2.43)は腹水から産生した。抗CD4-FITC MAb(RM4-4)、FITCラットIgG2a(R35-95)、抗IL-10 MAb(JES5-16E3)、抗Gr-1 MAb(RB6-85C)；抗CD45R/B220 MAb(RA3-6B2)；および抗CD16/CD32 MAb FcγII/III(2.4G2)は、BD PharMingen(San Diego, CA)から購入した。
【０１５３】
MHCクラスI(H-2Db)制限HPV16 E7ペプチドRAHYNIVTFは、Chiron Mimotopes(Melbourne, Australia)によって合成および精製された。水酸化アルミニウムはSuperfos Biosector(Vedbaek, Denmark)から購入し、および不完全フロイントアジュバントはSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。
【０１５４】
マウス単核細胞の単離およびフローサイトメトリー解析
密度勾配遠心分離によって、マウス血液単核細胞の単離を行った。簡潔に述べると、200μLの静脈血を0.2％ EDTA Na2(Sigma-Aldrich)を含むPBSに添加し、および1mLのHistopaque(Sigma-Aldrich)に重層した。400g、15分間、22℃での遠心分離の後、中間層を0.1％ウシ血清アルブミンおよび0.1％ NaN3を含むPBSで徹底的に洗浄し、その後室温で15分間、FITCがコンジュゲートされたMAbに曝露させ、ならびにBecton Dickinson FACSCaliberフローサイトメーターおよびCellquest(Becton Dickinson)ソフトウェアを用いて解析した。
【０１５５】
組換えVLPの産生
ヒトパピローマウイルス6bL1、BPV1L1 VLP(L1VLP)およびBPV1L1/HPV16E7CTL(L1E7VLP)組換えタンパク質をコードするバキュロウイルスの構築が記載されている(Peng et al., 1998, Virology 240：147-157)。以前に記載された(Liu et al., 2003,  前記)ようなCsCl勾配遠心分離によって、L1組換えバキュロウイルスを感染させたSF9細胞の核からVLPを精製した。VLPの同一性および完全性を確認するために、試料を透過電子顕微鏡および免疫ブロッティングに供した。免疫ブロット解析については、タンパク質試料をSDS-PAGE試料緩衝剤中で希釈し、10％ SDS-PAGEゲル中で電気泳動し、およびニトロセルロース膜に転写した。抗L1モノクローナル抗体MC15(Kulski et al., 1998, Virology 243：275-282)で膜をプロービングした。結合した抗体は、膜のセイヨウワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヒツジ抗マウス抗体(Silenus)とのインキュベーションによって検出し、および増強された化学発光(Amersham)を用いて可視化した。電子顕微鏡については、CsCl勾配精製および透析したVLP試料を炭素コーティングした格子の上に載せ、2％モリブデン酸アンモニウム、pH6.2で染色し、およびHitachi H-800電子顕微鏡で調べた。
【０１５６】
マウスの免疫付与
3または5匹のマウスの群に、水酸化アルミニウムゲル(「ミョウバン」)と共にまたはなしで、示されたように30または50μgのVLPで免疫付与を施した。免疫付与の間、イソフルオラン(Abbott)でマウスに軽く麻酔をかけた。VLPは、50μLのPBS中にあり、または等量のミョウバンと混合されていた。インビボ中和実験のために、0.5〜1mgのモノクローナル抗体または正常ラット血清を腹腔内に投与した。
【０１５７】
培養上清由来のIL-10、IL-5、およびIFN-γサイトカインについてのELISA
製造元の推奨する手順に従って、以前に記載されたように、IL-5、IL-10、およびIFN-γ(R&D system, USA)についてのELISAを行った(Liu et al., 2003, 前記)。
【０１５８】
ELISPOT
記載されたようにELISPOTを行った(Khammanivong et al., 2003, Immunol Cell Biol 81：1-7)。簡潔に述べると、IL-2(Life Techniques)の添加ありまたはなしで、1つの脾臓細胞またはリンパ節懸濁を、抗IFNγ(BD PharMingen)でコーティングした膜基盤96ウェルプレート(Millipore)に添加した。様々な濃度でペプチドを添加し、および37℃で18時間、細胞をペプチドと共に保持した。ビオチン化抗IFNガンマ(BD PharMingen)、アビジン・セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Sigma-Aldrich)、およびDAB(Sigma-Aldrich)へのプレートの連続的曝露によって、抗原特異的IFNγ分泌細胞を検出した。
【０１５９】
マウス脾臓CD11c+細胞の陽性選択
C57BL/6Jマウス脾臓を1mg/mlのコラゲナーゼD(Roche)中で保持し、および500ulのコラゲナーゼDを各々の脾臓の中に注射した。その後、脾臓をより小さい破片に切り、37℃で45〜60分間、5mlのコラゲナーゼD中で保持し、およびスチール製のメッシュに通した。細胞をカウントし、2％ FBSを含むRPMI中で洗浄し、および108トータル細胞当たり、2％FBSを含む400mL RPMI中で再懸濁した。100μLのMACS CD11cマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を添加し、および15分間、6〜12℃で保持した。洗浄後、108細胞当たり500μl中で、細胞を再懸濁した。製造元のプロトコルに従って、CD11c陽性細胞をLSカラム(Miltenyi Biotec)で陽性選択した。フローサイトメトリーによって評価した場合、CD11c+細胞の純度はおよそ80％であった。
【０１６０】
CD4細胞の選択
抗原によるプライミングを受けたCD4+ T細胞について濃縮されたリンパ球集団を発生させるために、マウスにL1VLPで2回免疫付与を施し、および2回目の免疫付与の7日後に、排出鼠径リンパ節を除去した。細胞を70μmナイロン膜(BD, PharMingen)に通し、および1ml RPMI＋2％ FBS中で再懸濁した。108細胞毎に：抗Gr-1 MAb 8μL、抗B220 MAb 6μL、抗MHC II(I-Ab)MAb 5μL、抗FcγII/III MAb 4μL、および抗CD8 MAb 6μLを添加した。室温で15分間のインキュベーションの後、細胞を1mlのRPMI＋2％ FBS中で洗浄および再懸濁した。抗ラットMACSビーズ(Miltenyi Biotec)を、100μL/108細胞で、9℃で15分間添加し、RPMI培地で洗浄し、および製造元のプロトコルに従ってLSカラムに通した。CD4+ T細胞の陽性選択のために、細胞を4℃で1時間、抗CD4 MAb(RM4-4)と共に保持し、その後4℃で1時間、ラット抗CD4 Dynabeadビーズと共に回転ミキサーで保持した。その後、製造元の取扱説明書に従って、Magnetic Particle Concentrator(Dynal Biotech)を用いて、CD4+細胞を陽性選択した。
【０１６１】
キメラE7 VLPへのAPCの曝露によるE7 TCRトランスジェニックCD8 T細胞のインビトロ活性化
105 CD11+細胞を37℃で18時間、40μgのBPVL1 VLP、BPV1-HPV16E7キメラVLP、またはHPV6 VLPに曝露した。徹底的な洗浄の後、細胞をU型96ウェル組織培養プレート(Cellstar)に置き、およびC57Bl/6マウス由来、またはE7 T細胞と名付けられた、MHCクラスI制限E7ペプチドRAHYNIVTFに特異的なTCRβ鎖トランスジーンを有するC57Bl/6マウス由来の、37℃で2時間のプラスチックへの曝露によって接着細胞を枯渇させた、異なる数の脾臓細胞を添加した。TCRβ鎖トランスジェニックC57Bl/6動物由来のT細胞のおよそ50％は、E7ペプチドテトラマーに結合し、かつE7ペプチドでパルスした標的に応答してIFN-γを分泌する(Matsumoto et al., J Natl Cancer Inst. 96(21)：1611-1619, 2004)。細胞を37℃で2日間保持し、およびサイトカイン測定用に上清を回収した。3Hチミジンを培養プレートにさらに16時間添加し、およびT細胞増殖を記載されたようにアッセイした(Fernando et al., 1998, J Immunol 161：2421-2427)。幾つかの実験において、L1 VLPまたは無関係な抗原で免疫付与を施されたマウス由来のCD4濃縮リンパ球をVLPに曝露されたCD11c+細胞に18時間添加した。その後、E7 T細胞および15μg/mlのGK1.5ブロッキング抗体を添加し、細胞を培養し、48時間後に記載されたようにサイトカイン分泌および増殖を評価した。
【０１６２】
統計解析
両側スチューデントt検定を用いて統計解析を行った。
【０１６３】
結果および考察
キャリアによるプライミングを受けたCD4+細胞はインビボでのCD8 T細胞によるIFN-γ分泌の阻害を媒介する
ウイルスカプシドキャリアと結合したMHCクラスI制限エピトープの投与は、エピトープ特異的なIFN-γ分泌CD8 T細胞を誘導する(Peng et al., 1998, 前記；Liu et al., 2000, Virology 273：374-382)。しかしながら、ウイルスカプシドと関連する新しいエピトープに対するIFN-γ応答の活性化は、抗原原罪と称される観察である、キャリアウイルスカプシドに対する既存の免疫によって阻害される(Liu et al., 2003, 前記；Da Silva, 2001 前記)。本発明者らは、そのような阻害がキャリア抗原プライミングの部位に局在化し、かつIL-10産生を必要とするということを以前に示した(Liu et al., 2003,  前記)。本研究において、本発明者らは、観察された阻害の機構およびそれを克服する手段を定義している。調節機能を有するIL-10分泌T細胞は主にCD4+細胞であるので(Sakaguchi, 2004, Annu Rev Immunol 22：531-562)、免疫CD4細胞が以前に観察されたIFN-γ応答の阻害にインビボで必要かどうかを立証するということが決定された。それゆえ、本発明者らは、ウイルスカプシドと関連する新しいE7エピトープに対するIFN-γ応答を開始することができないBPV1 L1ウイルスカプシドでプライムした動物からCD4+細胞を枯渇させた。その後、本発明者らは、3週間にわたってナイーブCD4集団の回復を観察し(図1C)、およびL1E7 VLPによる免疫付与によってE7エピトープに対するIFN-γ応答を開始する能力の回復について検討した。予想された通り、E7エピトープ特異的IFNγ応答は、ナイーブ動物ではL1E7 VLPによって誘導され、L1 VLPによるプライミングを受けた、枯渇させていないマウスではL1E7 VLPで誘導されなかった。しかしながら、E7特異的IFN-γ分泌T細胞は、抗原経験CD4細胞を枯渇させ、かつL1E7 VLPによる免疫付与の前にナイーブCD4を回復させたL1 VLP免疫付与マウスで容易に検出された(図1D)。これらの結果は、本発明者らのこれまでの知見を確認し、かつウイルスカプシド特異的CD4+ T細胞がエピトープ特異的IFN-γ応答に必要とされるということをインビボで示している。
【０１６４】
L1 VLPによるプライミングを受けたマウスにおけるL1E7 VLPによるE7特異的T細胞IFN-γ応答の誘導の阻害は、IL-10およびさらにL1 VLPによるプライミングを受けたCD4+ T細胞に依存的であるので、IL-10がリンパ節排出中のプライミングを受けたCD4+細胞によってL1 VLP注射部位で産生されるということが提案された。これを検討するために、L1E7 VLPで2回マウスに免疫付与を施し、および排出リンパ節由来の細胞によるサイトカイン分泌を調べた。アジュバントなしで、またはミョウバンアジュバントと共に注射されたL1E7 VLPは、L1E7 VLPによってインビトロで刺激された排出リンパ節細胞による抗原特異的IL-10産生を増強した(図1A)。IL-10産生はリンパ節細胞の抗CD4処置によって顕著に低下したが、抗CD8処置によって低下しなかった(図1B)。L1E7 VLP免疫付与は同様に、免疫付与を施された動物由来の脾臓細胞によるL1E7 VLP抗原に応答したIL-10産生を増強した。したがって、VLPによる免疫付与は、VLP特異的CD4陽性T細胞による排出リンパ節におけるIL-10分泌を誘導し、これらのVLP特異的CD4細胞が、新しいMHCクラスI制限エピトープによる免疫付加に応答した、IFN-γ分泌T細胞の誘導のIL-10依存的な抑制に寄与することを示唆している。
【０１６５】
ウイルスカプシドによるプライミングを受けたCD4+細胞はインビトロでの抗原特異的IFNγ分泌を阻害する
E7ペプチドがVLPに共有結合的に連結されていない場合、E7ペプチド特異的T細胞応答は、E7タンパク質およびL1 VLPで免疫付与を施されたL1 VLPによるプライミングを受けた宿主で観察される(Liu et al., 2003,  前記)。これは、同じDCがCD4 T細胞に対してはL1 VLPペプチドを提示し、かつCD8 T細胞に対してはE7ペプチドを提示する場合、CD4細胞は、IL-10を分泌することによって、E7特異的CD8細胞の運命に局部的に影響を与えるという仮説を示唆する。この仮説を詳しく調べるために、本発明者らは、マウス脾臓から単離したCD11c+細胞(これから先、DCと呼ぶ)をL1 VLP、L1E7 VLP、または無関係なHPV6L1 VLPに18時間曝露させるインビトロ系を組み立てた。その後、抗原をパルスしたDCによるナイーブE7特異的(TCRトランスジェニック)CD8 T細胞のインビトロでの活性化をIFN-γ分泌およびT細胞増殖として評価した。予想された通り、E7特異的CD8+ T細胞のインビトロでの活性化は、L1E7 VLPに曝露されたDCについては観察されたが、L1 VLPまたはHPV6L1 VLPについては観察されなかった(図2A)。パルスされていないDCまたはL1 VLPに曝露されたDCに曝露されたCD8+またはCD4+ T細胞からの顕著なIFN-γ分泌は観察されず(図2B、C)、インビトロ系の特異性が示されている。
【０１６６】
このインビトロ系におけるCD8 T細胞活性化に対するL1 VLPで免疫付与を施された動物由来のCD4細胞の効果を調べるために、本発明者らは、L1 VLPで免疫付与を施されたマウス、または免疫付与を施されていないマウスの排出リンパ節由来のCD4+ T細胞を添加した。E7 TCRトランスジェニックT細胞の添加前に、CD4+ T細胞を以前にVLPに曝露されたDCと18時間共培養した。予想された通り、ナイーブマウス由来のCD4 T細胞はCD8 T細胞によるE7特異的IFN-γ分泌に影響を与えなかったが、驚くべきことに、L1 VLPで免疫付与を施されたマウス由来のCD4 T細胞を添加した時、E7特異的CD8+ T細胞増殖およびIFN-γ分泌は増大した(図2B)。これらのデータにより、L1 VLPで免疫付与を施されたマウス由来のL1 VLP特異的CD4細胞の大部分が、インビトロでの抗原への曝露によって、ヘルパーT細胞として機能しているということ、ならびに局部のインビボ環境およびインタクトのリンパ節構造が、CD4+によって誘導される抗原でパルスされたDCによるCD8+プライミングの抑制にとって重要であり得るということが示唆された。VLPがミョウバンと共に共投与された場合、VLPで免疫付与を施されたマウス由来のCD4+ T細胞はより多くのIL-10を分泌するので、本発明者らは、VLPおよびミョウバンによってプライミングを受けたCD4+ T細胞が、L1E7 VLPに曝露されたDCによるE7特異的T細胞の活性化を阻害することができるかどうかを検討した。VLPのみで免疫付与を施された動物由来のCD4+細胞とは対照的に、ミョウバンおよびVLPで免疫付与を施された動物由来のCD4細胞は、E7特異的T細胞IFN-γ分泌の活性化を顕著に阻害した(図2C)。本発明者らのインビボ観察から予測されるように、この阻害がIL-10によって媒介されるかどうかを詳しく調べるために、本発明者らはまず異なるCD4+細胞およびDC培養由来の上清をIL-10についてアッセイした。予想された通り、IL-10分泌は、対照免疫付与動物由来のCD4+細胞との培養からよりもVLPで免疫付与を施された動物由来のCD4+細胞を含む培養からの方が顕著に高かった(図2D)。さらに、インビトロでのIL-10の中和によって、L1E7 VLPによってプライミングされたDCによるE7ペプチド特異的T細胞によるIFN-γ分泌の活性化が回復された(図3A)。したがって、ウイルスカプシドによってプライミングを受けたCD4+細胞は、L1E7を提示するDCとの相互作用により、IL-10を分泌する。CD4+細胞とDCの間の相互作用は、それに続くDCによるE7特異的CD8制限T細胞からのIFN-γ分泌の活性化を妨げ、およびIFN-γ分泌の阻害はIL-10に依存的である。
【０１６７】
VLP特異的CD4 T細胞に曝露されたDCはIL-5を分泌するようナイーブCD8 T細胞をプライミングする
L1E7を提示するDCと免疫CD4細胞を共培養した場合、E7特異的CD8+ T細胞によるIFNγ分泌は阻害されたが、T細胞増殖は増大し(図2C)、抗原に曝露されたDCによるE7 TCRトランスジェニックT細胞の活性化が、抗原提示が起こるサイトカイン環境によって、異なる機能的結果を結果的にもたらすことが示唆された。IL-10分泌CD4+ T細胞によるCD8+ T細胞によるIFN-γ産生の観察された抑制が、エフェクター表現型の発達の不全を表すのか、あるいはTc1からTc2型へのエフェクター表現型の移行を表すのかを詳細に調べるために、本発明者らは、共培養中での細胞によるIL-5産生を測定した。CD8+ T細胞によるIL-5分泌は、無関係なCD4+ T細胞の添加によるよりも、L1 VLPおよびミョウバンで免疫付与を施された動物由来のCD4 T細胞の添加による方が、高かった(図4A)。E7特異的CD8+ T細胞が増強されたIL-5分泌の源であるかどうかを明確にするために、抗原に曝露されたDCとの共培養の18時間後にCD4細胞を除去し(図4、FACS結果)、その後「教育された」DCをE7TCR CD8 T細胞、または無関係なCD8+ T細胞と培養した。DCがL1特異的CD4細胞によって教育されていても、CD4+ T細胞に曝露されていなくても、E7特異的T細胞増殖は同じようであった(図4Ba、c、e)。しかしながら、特にプライミングを受けたCD4+細胞が大量のIL-10を分泌するようにミョウバンで誘導された場合、抗原によってプライミングを受けたCD4+細胞によって教育されたDCと共に培養したE7特異的T細胞によって、顕著により多いIL-5が産生された(図4B b、d、f)。興味深いことに、高レベルのIL-5分泌は、IL-10分泌CD4+ T細胞によって教育されたDCに曝露された無関係なナイーブT細胞からも観察され(図4B、f)、そのようなDCがIL-5を分泌するようにCD8+ T細胞を非特異的に誘導することができることが示唆された。したがって、DCによって提示されるそれらの同種抗原を認識するCD4+ T細胞によるDCの事前教育によって、インビトロで抗原によってプライミングを受けたDCに曝露されたCD8によって産生されるサイトカインを決定することができる。
【０１６８】
IL-10の中和によるCD8+ CTL応答の回復
本発明者らは、キャリアタンパク質に対する動物の事前プライミングの結果の、キャリアタンパク質と連結されたエピトープに対するTc1型CD8応答の阻害を克服し得る方法を検討した。癌または慢性ウイルス感染を有する患者は、抗体および腫瘍またはウイルス抗原特異的CTLエフェクターの欠如を特徴とする、ウイルスおよび腫瘍特異的抗原に対する効果のない免疫応答を一般に有するので、そのような阻害を克服することは免疫療法にとって重要である可能性がある。刺激としてのCpG DNAと一緒にVLPを自然免疫系に投与することによって、誘導されたCD8+免疫応答の規模を増大させることができ(Storni, 2002, J Immunol 168：2880-2886)、それゆえ本発明者らは、CpGと共にL1E7によって、ウイルスカプシドタンパク質によってプライミングを受けたマウスに免疫付与を施したが、E7特異的CD8 IFN-γ応答の誘導は見られなかった(図5A、B)。したがって、プライミングを受けた宿主における抗原の免疫原性をDCのより良い活性化を通じて増大させることによって、事前プライミングによる新しいCD8+ Tc1応答の観察された阻害を克服することができなかった。その後、本発明者らは、IL-10を中和することが、L1でプライミングを受けたマウスに、L1E7での免疫付与によるE7特異的IFN-γ応答を開始する能力を回復させることができるかどうかをインビトロおよびインビボで検討した。異なる濃度の抗IL-10中和抗体をインビトロDC/CD4/CD8共培養系に添加し、抗IL-10によって、E7特異的CD8+ T細胞IFN-γ分泌が用量依存的な様式で回復したが、T細胞増殖は変更しなかった(図3A)。これらの結果により、IL-10の存在下で活性化されたE7TCRは増殖によって応答することはできるが、IFNγを産生しないという本発明者らの知見が確かめられた。次に、本発明者らは、抗IL-10受容体抗体の投与を通じて、IL-10受容体を遮断することによってインビボでのIL-10の効果を中和することが、L1VLPでプライミングを受けたマウスにおいて、L1E7に対するE7特異的IFN-γ応答を回復させることができるかどうかを詳しく調べた。L1E7 VLPによる免疫付与の時点で、L1 VLPでプライミングを受けたマウスにIL-10受容体に対する遮断抗体、またはラット血清を投与した。IFN-γ分泌E7特異的CD8 T細胞は、抗IL-10Rを受けたマウスでは観察されたが、正常ラット血清を受けたマウスでは観察されず、IL-10の一時的中和が、L1に対する事前プライミングにもかかわらず、L1E7によるE7特異的IFN-γ分泌CD8 T細胞の誘導を可能にすることができることが示された(図3B)。
【０１６９】
実施例2
IL-10の中和による新たな炎症性応答の発生
材料および方法
マウスの免疫付与
50μgのHPV 16E7および10μgのQuilAで、マウスに免疫付与を施した。幾つかのマウスは、腹腔内に、0.3mgの抗IL-10受容体抗体の形態のIL-10阻害剤も受けた。
【０１７０】
皮膚移植
HPV 16E7が上皮細胞でのみ発現している、ドナーK14E7マウス由来の耳全体を外科的に除去し、かつ背側表面および腹側表面を分離した。トランスジェニック移植片をC57BL/6マウスの脇腹に置き、抗生物質を浸透させたVaselineガーゼ(Bactigrass, Smith and Nephew, London)で適切な位置に保持し、微小孔テープおよび包帯(CoFlex；Andover, Salisbury, MA)で7日間覆い、ならびに7日目にそれらが付着しかつ血管が通った場合、技術的にうまく行ったと評価した。研究の期間中は週に3回、皮膚移植片を観察し、および表1のデータは移植後14日目の移植片状況をまとめている。
【０１７１】
結果および考察
本発明者らは、ケラチン14(K14)プロモーターからE7を発現する皮膚移植片はナイーブの同系動物によって拒絶されず、およびE7に対する炎症応答の証拠またはE7に対する測定可能な全身性免疫を誘導する証拠を示さないということを以前に明らかにした。そのような移植片を持つマウスの免疫付与は、抗体、遅延型超過敏(DTH)、およびE7特異的CTLとして測定可能なE7に対する免疫を誘導するが、E7発現移植片に対する効果を有さない(Matsumoto, K., et al., 2004, J Natl Cancer Inst 96：1611；Dunn, L. A., Met al., 1997. Virology 235：94)。しかしながら、106 E7 TCRトランスジェニックT細胞の受動的な移入とE7免疫付与によって拒絶が達成されることができるので、移植片はE7特異的CTLによる拒絶を受け易い。
【０１７２】
本発明者らは、この皮膚移植モデルを利用して、E7ワクチンおよびIL-10阻害の共投与がHPV 16のE7タンパク質抗原に対する免疫応答を増強するかどうかを示した。特に、本発明者らは、任意で抗IL-10受容体抗体と共に、E7(HPV 16L1 E7 VLPとして)で、K14E7移植片を持つ動物に免疫付与を施し、およびそのような免疫付与によって誘導される炎症応答を観察した。表1に示された結果は、IL-10阻害剤の共投与が、E7を持つ移植片における局部炎症応答を著しく増強することを示している。具体的には、処置された8匹のマウスのうち2匹が部分的な移植片拒絶(2動物)および移植片における重度の炎症のいずれかを進行させ、その一方、IL-10阻害剤の投与なしでは、移植片拒絶は観察されず、稀に炎症が観察された場合(10匹中＜1動物)があるのみであった。
【０１７３】
【表１】
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【０１７４】
上の結果は、E7免疫付与とIL-10中和によって、E7単独で免疫付与が施された免疫応答よりも、強いE7特異的免疫応答が発生するということを示している。また、このモデルにおける拒絶はE7特異的CTLに依存的であるので、これらの結果は、E7ワクチンの投与の時点でのIL-10の中和によって、増強されたE7特異的CTL応答が発生するということも示している。
【０１７５】
本明細書において引用されたあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、その完全な形で参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７６】
本明細書における任意の参照の引用は、そのような参照が本出願に対する「先行技術」として利用可能であるという承認であると解されるべきではない。
【０１７７】
本明細書を通じて、本目的は、本発明を任意の1つの態様または特定の特色の収集物に限定することなく、本発明の好ましい態様を記載することである。それゆえ、当業者は、本開示に照らして、様々な修正および変更が、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の態様においてなされ得るということを正しく認識すると考えられる。そのような修正および変更は全て、付随する特許請求の範囲内に含まれるということが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１Ａ】ウイルスカプシドによってプライミングを受けたCD4+ T細胞がIL-10を産生し、かつE7特異的IFN-γ阻害に必要とされるということを示すグラフ表示である。パネル(A)では、3〜5匹のC57BL/6Jマウスの群に、0日目および14日目に、ミョウバンと共にもしくはミョウバンなしで、L1 VLPで免疫付与を施し、または免疫付与を施さないままにした。リンパ節リンパ球を21日目に回収し、および10μg/mL L1 VLPに48時間曝露させた。上清をELISAでIL-10についてアッセイした。
【図１Ｂ】ウイルスカプシドによってプライミングを受けたCD4+ T細胞がIL-10を産生し、かつE7特異的IFN-γ阻害に必要とされるということを示すグラフ表示である。パネル(B)では、動物にミョウバンと共にL1 VLPで2回免疫付与を施し、ならびに(A)と同様に、リンパ節および脾臓リンパ球を、15μg/mLの抗CD4(GK1.5)、抗CD8(2.43)、またはアイソタイプ対照抗体の添加しまたは添加せずに、VLPに曝露させた。上清をELISAでIL-10について解析した。結果は、脾臓については個々のマウスの、およびプールした局部リンパ節細胞については3回のアッセイの平均±SEMである。
【図１Ｃ】ウイルスカプシドによってプライミングを受けたCD4+ T細胞がIL-10を産生し、かつE7特異的IFN-γ阻害に必要とされるということを示すグラフ表示である。パネル(C)では、(A)と同様に、動物にL1 VLPで2回免疫付与を施し、ならびに500μLの1mg/mL抗CD4(GK1.5)または正常ラット血清(NRS)を21日目から連続3日間、腹腔内に与えた。25日目および43日目の血液のFACS解析で、CD4+ T細胞の枯渇および回復をモニターした。
【図１Ｄ】ウイルスカプシドによってプライミングを受けたCD4+ T細胞がIL-10を産生し、かつE7特異的IFN-γ阻害に必要とされるということを示すグラフ表示である。パネル(D)では、(C)と同様にCD4+細胞を枯渇させた動物(αCD4)または模擬枯渇させた動物(NRS)に、44日目および58日目にL1 E7 VLPで免疫付与を施した(L1/L1E7)。これまで未処置の動物に同様にL1E7 VLPで免疫付与を施した(L1E7)。脾臓およびリンパ節におけるE7特異的なIFN-γ分泌CD8+ T細胞の誘導を55日目にELISPOTで評価した。
【図２】VLPおよびミョウバンで免疫付与を施されたマウス由来のCD4+ T細胞が、インビトロでのE7特異的IFN-γ分泌を抑制するということを示すグラフ表示である。パネル(A)では、C57BL/6Jマウス由来の105個のCD11c+樹状細胞を、それぞれ40μg/mLのBPV1 L1E7 VLP、BPV1 L1 VLP、またはHPV6 L1 VLPに18時間曝露させた。徹底的な洗浄の後、5×105 E7 TCRトランスジェニックT細胞を添加し、および48時間培養した。上清をELISAでIFN-γについて測定した。3Hチミジンを添加し、およびT細胞増殖を3H取り込みとして評価した。パネル(B)では、CD11c+細胞(105)をBPV1 L1E7 VLPに18時間曝露させ、または抗原なしで培養した。洗浄後、BPV1 L1 VLPで免疫付与を施されたマウス由来の、または免疫付与を施されていないマウス由来のCD4+ T細胞(105)を示したように添加した。5×105 E7 TCR細胞、および15μg/mLの最終濃度のGK1.5抗CD4抗体を添加し、ならびにT細胞増殖およびIFN-γ分泌を上のようにアッセイした。パネル(C)では、CD11c+細胞(105)をBPV1 L1E7 VLPまたはBPV1 L1 VLPに18時間曝露させた。洗浄後、ミョウバンと共にBPV1 L1 VLPで免疫付与を施されたマウス由来の、またはOVAのMHC II制限ペプチドで免疫付与を施されたマウスである、ミョウバンと共にOVTで免疫付与を施されたマウス由来の、または免疫付与を施されていないマウス由来のCD4+ T細胞(105)を示したように添加した。5×105 E7 TCR細胞を添加し、ならびにT細胞増殖およびIFN-γ分泌を上のようにアッセイした。結果は、3通りの試料からの平均±SEMである。パネル(D)では、CD11c+細胞(105)をBPV1 L1E7 VLPか、またはBPV1 L1 VLPのいずれかに18時間曝露させた。洗浄後、ミョウバンと共にBPV1 L1 VLPで免疫付与を施されたマウス由来の、またはミョウバンと共にOVTで免疫付与を施されたマウス由来のCD4+ T細胞(105)を示したように添加した。上清を回収し、およびELISAでIL-10分泌を測定した。結果は、3通りの試料からの平均±SEMである。
【図３】IL-10の中和によってE7特異的なIFN-γ分泌が回復するということを示すグラフ表示である。パネル(A)はインビトロ中和を示している。C57BL/6Jマウス由来のCD11c+細胞(105)を40μg/mLのE7 VLPに18時間曝露させた。L1 VLPおよびミョウバンで免疫付与を施されたマウス由来のCD4細胞(105)、ならびに示されたような抗IL-10抗体を18時間添加した。その後、E7 TCRトランスジェニックT細胞(5×105)を48時間添加した。上清をサイトカインELISA用に回収し、およびT細胞増殖を3Hチミジン取り込みとして評価した。パネル(B)はインビボ中和を示している。3匹のC57BL/6Jマウスの群に、0日目および14日目に、L1 VLPで免疫付与を施した。20日目および21日目に、マウスに0.5mgの抗IL-10Rまたは正常ラット血清のいずれかを腹腔内に示したように与え、かつ21日目にE7 VLPで免疫付与を施した。34日目および35日目に、IL-10R抗体投与およびVLP免疫付与を繰り返した。41日目に、脾臓および局部排出リンパ節を回収し、ならびにE7ペプチド特異的IFN-γELISPOTを行った。
【図４−１】VLPでプライミングを受けたCD4+ T細胞に曝露された樹状細胞(DC)は、抗原に応答してIL-5を分泌するようCD8+ T細胞を指図するということを示すグラフ表示である。パネル(A)では、C57BL/6Jマウス由来のCD11c+細胞(105)を40μg/mLのL1E7 VLPかまたはL1 VLPのいずれかに18時間曝露させた。その後、それらを未処置のままにしておき、または18時間ミョウバンと共にOVTで免疫付与を施されたもしくはミョウバンと共にL1 VLPで免疫付与を施されたマウス由来のCD4+細胞(105)に示したように曝露させた。E7 TCRトランスジェニックT細胞(5×105)を48時間添加した。培養上清をIL-5 ELISA用に回収した。パネル(B)では、CD11c+細胞を40μg/mLのL1E7 VLPとインキュベートし、その後、未処置のまましておくか(a、b)または18時間L1 VLPで免疫付与を施された(c、d)もしくはL1 VLPおよびミョウバンで免疫付与を施された(e、f)C57BL/6Jマウス由来のCD4+細胞曝露させるかのいずれかにした。その後、CD4+細胞を陽性選択(FACSプロファイル-AFTER)によって枯渇させ、および5×105個のE7特異的または無関係なT細胞を48時間添加し；T細胞増殖(a、c、e)をアッセイし、およびIL-5レベル(b、d、f)をELISAで測定した。
【図４−２】VLPでプライミングを受けたCD4+ T細胞に曝露された樹状細胞(DC)は、抗原に応答してIL-5を分泌するようCD8+ T細胞を指図するということを示すグラフ表示である。パネル(B)では、CD11c+細胞を40μg/mLのL1E7 VLPとインキュベートし、その後、未処置のまましておくか(a、b)または18時間L1 VLPで免疫付与を施された(c、d)もしくはL1 VLPおよびミョウバンで免疫付与を施された(e、f)C57BL/6Jマウス由来のCD4+細胞曝露させるかのいずれかにした。その後、CD4+細胞を陽性選択(FACSプロファイル-AFTER)によって枯渇させ、および5×105個のE7特異的または無関係なT細胞を48時間添加し；T細胞増殖(a、c、e)をアッセイし、およびIL-5レベル(b、d、f)をELISAで測定した。
【図５】CpG刺激はIL-10分泌CD4細胞によるE7特異的なIFN-γ分泌の抑制を克服することができないということを示すグラフ表示である。3匹のC57BL/6Jマウスの群に、0日目および14日目に、L1 VLPで免疫付与を施し(L1/L1E7)、または免疫付与を施さないままにした(L1E7)。21日目および35日目に、全ての群にE7 VLPで免疫付与を施した；1つの群には示したように10μg/mLのCpGを与えた。最後の免疫付与の6日後、脾臓および排出リンパ節を回収し、ならびにE7特異的IFN-γELISPOTアッセイを行った。結果は、各群における3匹のマウスからの平均および1S.E.Mである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【国際調査報告】
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