(57)【要約】本発明は、鎖伸長反応から色素アーティファクトを低減させる製品および方法を提供する。例えば、本発明によって、鎖伸長反応から色素アーティファクトを低減させる方法であって、ａ）タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と、少なくとも１つのタンパク質結合材料とを接触させて、該タンパク質結合材料と該タンパク質との複合体を形成する工程；およびｂ）該鎖伸長反応溶液から該複合体を分離する工程を包含する方法が提供される。鎖伸長反応溶液中でタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む第一領域を含む、ミクロ流体デバイスもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖伸長反応からの色素アーティファクトを低減させる方法であって、該方法は：
ａ）タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と、少なくとも１つのタンパク質結合材料とを接触させて、該タンパク質結合材料と該タンパク質との複合体を形成する工程；および
ｂ）該鎖伸長反応溶液から該複合体を分離する工程
を包含する方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｆ６６７Ｙ変異を有する変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、色素標識されたジデオキシヌクレオチドと会合している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記鎖伸長反応が、ＤＮＡ配列決定反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質結合材料が、膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜が、多孔膜である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多孔膜が、約０．０１μｍ〜約２００μｍの範囲のサイズの孔を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多孔膜が、約０．０５μｍ〜約１００μｍの範囲のサイズの孔を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多孔膜が、約０．１μｍ〜約５０μｍの範囲のサイズの孔を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多孔膜が、約０．１μｍ〜約２０００μｍの範囲の厚さを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記多孔膜が、約０．５μｍ〜約１５００μｍの範囲の厚さを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記多孔膜が、約０．５μｍ〜約１０００μｍの範囲の厚さを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質結合材料が、固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記固体支持体が、ミクロスフィアである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ミクロスフィアが、ポリスチレンミクロスフィアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ミクロスフィアが、約１００ｎｍ〜約２０００μｍの直径を有するポリマーミクロスフィアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ミクロスフィアが、約５００ｎｍ〜約１０００μｍの直径を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ミクロスフィアが、約１μｍ〜約２００μｍの直径を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ミクロスフィアが、ノンポーラスミクロスフィアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ミクロスフィアが、ミクロポーラスミクロスフィアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ミクロスフィアが、マクロポーラスミクロスフィアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記ミクロスフィアが、メガポーラスミクロスフィアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質結合材料が、固体支持体の表面上に層を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記固体支持体が、多孔膜である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質結合材料が、共有結合をとおして前記固体支持体と結合している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質結合材料が、サイズを基にした精製の媒質と混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質結合材料が、サイズ排除スピンカラム上に重ねられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ａ）の前に、サイクル配列決定を実施する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記鎖伸長反応溶液を精製する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記鎖伸長反応溶液が、サイズを基にした精製によって精製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記鎖伸長反応溶液が、サイズ排除スピンカラムを使用する、サイズを基にした精製によって精製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記鎖伸長反応溶液が、サイズ排除イオン交換を使用する、サイズを基にした精製によって精製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記鎖伸長反応溶液を、蛍光ＤＮＡシークエンサーで分析する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記精製工程中に、前記鎖伸長反応溶液が、タンパク質結合材料と接触される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記精製工程の前に、前記鎖伸長反応溶液が、タンパク質結合材料と接触される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
鎖伸長反応の前に、前記タンパク質結合材料が、前記鎖伸長反応溶液と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
鎖伸長中、前記タンパク質結合材料が、前記鎖伸長反応溶液と接触されたままである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
鎖伸長反応溶液中のタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む第一領域を含む、ミクロ流体デバイス。
【請求項４４】
鎖伸長反応溶液中のタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む、スピンカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年４月１日に出願された米国特許出願第１１／０９６，７３１号の利益を主張し、この内容は本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
配列決定反応中に生成されるＤＮＡフラグメントは、電気泳動デバイス中に導入される色素標識されたターミネーターの量を低減させるためにサイズ排除クロマトグラフィーに供され得る。これは、配列決定反応の生成物の分析を妨げる色素アーティファクトを低減し得る。しかしながら、多くの配列決定反応の生成物の分析は、サイズを基にした分離技術によって精製されたとしても、色素アーティファクトをなおも被る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、鎖伸長反応における（例えば、核酸の配列決定反応における）色素アーティファクトを低減させるための製品および方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の特定の実施形態の要旨）
本明細書中に開示されるのは、鎖伸長反応溶液とタンパク質を結合する（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを結合する）材料との接触により、反応生成物を精製して分析する際の色素アーティファクトが低減されるという知見である。
【０００５】
したがって、本発明の一つの実施形態が提供するのは、鎖伸長反応からの色素アーティファクトを低減する方法であり、この方法は、（ａ）タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と少なくとも１つのタンパク質結合材料とを接触させて、タンパク質とタンパク質結合材料との複合体を形成する工程；および（ｂ）鎖伸長反応溶液からこの複合体を分離する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本特許もしくは出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許もしくは特許出願公報のコピーは、申し込みをし、必要な手数料を払えば、当局（Ｏｆｆｉｃｅ）によって提供される。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に開示されるのは、タンパク質結合材料とタンパク質との複合体を形成するために、鎖伸長反応溶液とタンパク質を結合する材料とを接触させることにより、複合体を取り除くためにサンプルを精製して分析する際の色素アーティファクトを低減するという知見である。したがって、一つの実施形態において、本発明は、鎖伸長反応からの色素アーティファクトを低減させる方法を提供し、この方法は、（ａ）タンパク質を含む鎖伸長反応溶液と少なくとも１つのタンパク質結合材料とを接触させて、タンパク質とタンパク質結合材料の複合体を形成する工程；そして（ｂ）鎖伸長反応溶液からこの複合体を分離する工程を包含する。
【０００８】
本発明の特定の実施形態において、この方法はさらに、工程（ａ）の前にサイクル配列決定（ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施する工程を包含する。本発明の特定の実施形態において、この方法はさらに、鎖伸長反応溶液を精製する工程を包含する。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズを基にした精製によって精製される。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除スピンカラムを使用する、サイズを基にした精製によって精製される。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除イオン交換を使用して、サイズを基にした精製によって精製される。
【０００９】
本発明の特定の実施形態において、請求項１に記載の方法はさらに、蛍光ＤＮＡシークエンサーで鎖伸長反応溶液を分析する工程を包含する。
【００１０】
本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、精製工程中に、タンパク質結合材料と接触される。本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応溶液は、精製工程の前に、タンパク質結合材料と接触される。
【００１１】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質は酵素である。本発明の特定の実施形態において、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｆ６６７Ｙ変異を有する変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。本発明の特定の実施形態において、タンパク質は、色素標識されたジデオキシヌクレオチドと会合している。
【００１２】
本発明の特定の実施形態において、鎖伸長反応は、ＤＮＡ配列決定反応である。本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、膜である。本発明の特定の実施形態において、この膜は、多孔膜である。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約０．０１μｍ〜約２００μｍの範囲のサイズの孔を含む。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約０．０５μｍ〜約１００μｍの範囲のサイズの孔を含む。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約０．１μｍ〜約５０μｍの範囲のサイズの孔を含む。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約０．１μｍ〜約２０００μｍの範囲の厚さを有する。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約０．５μｍ〜約１５００μｍの範囲の厚さを有する。本発明の特定の実施形態において、この多孔膜は、約０．５μｍ〜約１０００μｍの範囲の厚さを有する。
【００１３】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、固体支持体である。本発明の特定の実施形態において、この固体支持体は、ミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、このミクロスフィアは、ポリスチレンミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、約１００ｎｍ〜約２０００μｍの直径を有するポリマーミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、約５００ｎｍ〜約１０００μｍの直径を有する。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、約１μｍ〜約２００μｍの直径を有する。本発明の実施形態において、ミクロスフィアは、ノンポーラスミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、ミクロポーラス（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）ミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、マクロポーラス（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）ミクロスフィアである。本発明の特定の実施形態において、ミクロスフィアは、メガポーラス（ｍａｇａｐｏｒｏｕｓ）ミクロスフィアである。
【００１４】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、固体支持体の表面上に層を形成する。本発明の特定の実施形態において、固体支持体は、多孔膜である。本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、共有結合をとおして固体支持体と結合している。
【００１５】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズを基にした精製の媒質と混合される。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズ排除スピンカラム上に重ねられる。
【００１７】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、鎖伸長反応の前に、鎖伸長反応溶液と接触される。本発明の特定の実施形態において、タンパク質結合材料は、鎖伸長反応中、鎖伸長反応溶液と接触したままである。
【００１８】
本発明の特定の実施形態はまた、鎖伸長反応溶液中でタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含む第一領域を含むミクロ流体デバイスも提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態はまた、鎖伸長反応溶液中でタンパク質と結合可能なタンパク質結合材料を含むスピンカラムも提供する。
【００２０】
本発明の特定の実施形態において、溶液を分析する際の色素アーティファクトの生成を低減させるために、タンパク質（例えば、色素標識されたヌクレオチドと複合体を形成したタンパク質）は、溶液から取り除かれる。色素標識されたヌクレオチドは、鎖伸長反応中にポリヌクレオチド鎖中に取り込まれなかった色素標識されたヌクレオチド（すなわち、取り込まれていない色素標識ヌクレオチド）である。
【００２１】
本発明の特定の実施形態は、取り込まれていないターミネーターを取り除くために処理された鎖伸長反応生成物を含むスピンカラムを提供する。
【００２２】
本発明の特定の実施形態は、タンパク質を取り除くために処理された鎖伸長反応生成物を含むスピンカラムを提供する。
【００２３】
鎖伸長反応としては、ポリヌクレオチド鎖（例えば、ＤＮＡ鎖）の合成を含む反応が挙げられる。これらの反応は、少なくとも１つのポリメラーゼを使用したテンプレート指向性のポリヌクレオチド伸長プロセスを含み得る。色素標識されたヌクレオチドおよび／もしくはポリヌクレオチドは、鎖伸長反応において利用され得る。鎖伸長反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応、配列決定反応、一塩基伸長（ＳＢＥ）反応、ミニ配列決定反応（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）などが挙げられるが、これらに限定されない。鎖伸長反応溶液は、鎖伸長反応が行なわれる溶液である。
【００２４】
タンパク質結合材料は、タンパク質が結合し得る材料である。特定のタンパク質結合材料が本明細書中に例示されているが、本発明はまた、溶液から（例えば、鎖伸長反応溶液から）タンパク質を除去させるのを可能にするためにタンパク質と結合する他の材料を包含していることも意図する。
【００２５】
鎖伸長反応中に存在するタンパク質は、任意のタンパク質（例えば、不純物として存在するタンパク質を含めた、当業者が鎖伸長反応に加え得る任意のタンパク質）であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は酵素である。本発明のいくつかの実施形態において、酵素は、ＲＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）である。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｆ６６７Ｙ変異を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）であり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであってもよいし、そうでなくてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するアミノ酸配列を有し得るか、もしくは天然に存在するアミノ酸配列より一部誘導された変異体であり得る。
【００２６】
ポリメラーゼとしては、米国特許第６，５３４，２６９号；同第６，３９９，３０４号；同第６，３６５，３５０号；同第６，２６５，１９３号；同第６，１９７，５５５号；同第５，８７６，９３４号；同第５，８７１，９２９号；同第５，４６６，５９１号；および同第６，２２８，６２８号、ならびにＡｂｒａｍｓｏｎ、「Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ：Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ」、Ｉｎ  ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．ＧｅｌｆａｎｄおよびＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、３３−４７（１９９９）；Ｉｇｎａｔｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４４８、１４５−１４８（１９９９）；Ｉｇｎａｔｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４２５、２４９−２５０（１９９８）；Ｋａｌｍａｎら、「Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ａ−１４、Ｐ−４２（１９９５）；ならびにＴａｂｏｒら、ＰＮＡＳ、９２、６３３９−６３４３（１９９５）内に開示されているポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は、色素標識されたジデオキシヌクレオチドと会合している。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応は、ＤＮＡ配列決定反応である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、固体支持体、フィルターもしくは膜である。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズを基にした精製の媒質と混合される。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズを基にした精製の媒質の表面上にコーティングされる。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、サイズ排除スピンカラム上に重ねられる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、鎖伸長反応溶液とタンパク質結合材料とを接触させる前に、サイクル配列決定を実施する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、鎖伸長反応溶液を（例えば、サイズを基にした精製によって）精製する工程を含む。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除スピンカラムを使用する、サイズを基にした精製によって精製される。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズ排除イオン交換を使用する、サイズを基にした精製によって精製される。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズを基にした精製工程中にタンパク質結合材料と接触される。本発明のいくつかの実施形態において、鎖伸長反応溶液は、サイズを基にした精製工程の前に、タンパク質結合材料と接触される。本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、蛍光ＤＮＡシークエンサーで鎖伸長反応溶液を分析する工程を包含する。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、配列決定反応生成物の精製のためのキットである。本発明のキットは、タンパク質結合材料およびサイズ排除クロマトグラフィー材料を含み得る。本発明のキットはさらに、核酸配列決定反応を実施するための１つ以上の試薬を含み得る。このような試薬としては、色素標識されたターミネーター、プライマー、および／もしくはＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。このキットはまた、配列決定反応生成物を精製するためのこれらの使用についての説明書も含み得る。
【００３０】
色素標識されたターミネーターは、核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を配列決定する際に、配列決定反応生成物より取り除かれ得る。例えば、配列決定反応生成物の分析を妨げ得る反応成分を取り除くことを試みて、サイクル配列決定（例えば、サンガー配列決定）の後に、精製工程が実施され得る。色素標識されたジデオキシヌクレオチド（すなわち、色素ターミネーター）を用いたサイクル配列決定の場合、ＤＮＡ配列決定のラダー（ｌａｄｄｅｒ）中に取り込まれなかった色素標識されたジデオキシヌクレオチドを取り除くことは、有用である。これらの取り込まれていない色素標識されたジデオキシヌクレオチドを取り除くことに失敗すると、サンプルが蛍光ＤＮＡシークエンサーで分析される際に、電気泳動図中にアーティファクトを生じる。これらのアーティファクト（本明細書中では、「色素アーティファクト」もしくは単に「アーティファクト」と呼ぶ）は、核酸配列の正確な同定を妨げ得る。
【００３１】
本発明を限定するものではないが、配列決定反応において使用される色素標識されたジデオキシヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼとの間の相互作用は、サイズを基にした精製手順の後に観察される色素アーティファクトの形成を導くと考えられている。ポリメラーゼは、色素標識されたジデオキシヌクレオチドとともに比較的高い分子量の複合体を形成すると考えられている。この複合体は、スピンカラムをとおして保持されずに通過し、そしてＤＮＡとともに溶出されるに充分に大きくそして充分に安定していると考えられている。しかしながら、この複合体が電気泳動注入条件に供された場合、この複合体は解離し、そして色素標識されたジデオキシヌクレオチドが色素アーティファクトとして観察され得るようである。この知見に基づき、分析の前に複合体を取り除くことによって、色素アーティファクトを配列決定反応から低減させる（例えば、取り除く）ための方法および製品が開発された。
【００３２】
本明細書中に記載されている発明は、反応（例えば、鎖伸長反応）を実施するためのミクロ流体プラットフォーム（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）の使用を可能にする。このようなプラットフォームは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第６，６１３，５２５号；同第６，５８２，９８７号；同第６，３４４，３２６号；同第６，１０３，５３７号；および同第６，０７４，８２７号中に記載されている。このようなプラットフォームは、配列決定反応のための精製方法としてサイズ排除イオン交換（ＳＥＩＥ）を使用し得、それゆえに、サイズを基にした他の精製と同様の問題に苦しみ得る。ＳＥＩＥは、例えば、米国特許出願公開第２００４００５５９５６号；同第２００４００１８５５９号；同第２００４００１８１１６号；同第２００４００１６７０２号；および同第２００３０２２８７０６号中に記載されている。本発明の方法と、ミクロ流体プラットフォームを利用する方法とを合わせることによって、これらの問題は避けられ得る。
【００３３】
ゆえに、本発明の特定の実施形態は、（例えば、タンパク質結合材料をともなうタンパク質を、例えば溶液から取り除くために）本発明の方法を実施するのに使用されることが可能なデバイス（例えば、ミクロ流体デバイス）を提供する。例えば、本発明の特定の実施形態は、タンパク質結合材料を含む領域を有するミクロ流体デバイスを提供する。本発明の特定の実施形態は、タンパク質結合材料を含む第一領域および取り込まれていないヌクレオチド（例えば、色素標識ターミネーター）を取り除くための第二領域を有するミクロ流体デバイスを提供する。第一領域および第二領域は、チャネルによって互いに連結され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明は、鎖伸長反応の前、鎖伸長反応中および／もしくは鎖伸長反応後に加えられるタンパク質結合材料の使用を含む。このような材料は、タンパク質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を結合し得、そしてそうする際、蛍光ＤＮＡ配列決定を行なう前に精製法（例えば、サイズを基にした精製方法）を使用する場合の色素アーティファクトの形成を減少もしくは防止する。
【００３５】
サイズを基にした精製の前もしくはその精製中に配列決定反応生成物がタンパク質結合支持体と反応された場合、色素アーティファクトは減じられることが見出された。本発明のいくつかの実施形態において、配列決定反応生成物は、スピンカラムを使用した精製の前にタンパク質結合膜（例えば、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ））をとおしてろ過され得る。これは、電気泳動図中の色素アーティファクトを低減させる（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）。精製方法としてサイズ排除イオン交換を使用した際に、同様の効果がみられる（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）。精製していない配列決定反応生成物もまた、スピンカラムを使用する精製の前にアフィニティークロマトグラフィー支持体（例えば、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ））で精製され得、そしてこれもまた、色素アーティファクトを電気泳動図から低減させる（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、タンパク質結合材料とサイズを基にした精製の媒質とを混合する工程を包含する方法を含む。例えば、色素アーティファクトの減少を起こすために、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６が、サイズを基にした精製の媒質と混合され得る（例えば、１００ｕＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６が、８００ｕＬのＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム中に混合され得る）（図４）。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、サイズを基にした精製の媒質の表面上をタンパク質結合材料でコーティングすることを含む（例えば、対立電荷をともなう高分子電解質の複数層でコーティングされた多孔性陰イオン交換樹脂）（米国特許出願第１０／７８０，９６３号を参照されたい）。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、サイズ排除スピンカラムの上部にタンパク質結合材料を重ねることを含む。例えば、色素アーティファクトを低減させるために、１００ｕＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６が、８００ｕＬのＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ、ＵＳＡ）の上部にピペットで入れられ得る（図５）。
【００３９】
これらは、タンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）に結合し得る、ゆえに色素アーティファクトを配列決定反応から減じ得る材料（例えば、膜およびクロマトグラフィー支持体）の単なる例である。タンパク質に結合することが可能である任意の材料（例えば、ＤＮＡポリメラーゼに結合することが可能である材料）もまた使用され得る。
【００４０】
これらの材料としては、ＰＯＲＯＳ  ２０  ＨＰ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＨｉＴｒａｐ  Ｏｃｔｙｌ  ＦＦ、ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ−ｈｉｇｈ  ｓｕｂ、Ｏｃｔｙｌ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（全てＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈより）、ポリ（４−ビニルフェノール）、ＭＷ  １５００〜７０００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）もしくはＩｓｏｌｕｔｅ  ＥＮＶ＋（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
（スピンカラム）
スピンカラムおよびスピンカラムを作るための方法は、当業者に公知である。例えば、いくつかの会社がスピンカラムを製造し販売しており、このような会社としては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ、ＵＳＡ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）が挙げられる。スピンカラムはまた、当業者によって容易に調製され得、そして多くの手順のバリエーション（例えば、空のカラムにサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を詰めることを含む）が使用され得る。自己充填（ｓｅｌｆ−ｆｉｌｌｅｄ）カラムに有用な樹脂の例は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０およびＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−３０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）である。いくつかの取り込まれていない色素アーティファクトをＤＮＡ配列決定反応から取り除く際にこれらの製品が使用され得るが、これらは、現代のＤＮＡ配列決定キット（例えば、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ））とともに使用される際に、残留色素アーティファクトを被る。
【００４２】
ゆえに、本発明の特定の実施形態は、（例えば、タンパク質結合材料を伴うタンパク質を、例えば溶液から取り除くために）本発明の方法を実施するために使用されることが可能なデバイス（例えば、スピンカラム）を提供する。
【００４３】
（タンパク質結合材料としての固体支持体）
いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を配列決定反応から取り除くための固体支持体の使用に関連しており、これによって色素アーティファクトを、取り除かないのであれば、低減させる。固体支持体は、約０．０１μｍ〜約２００μｍの範囲（例えば、約０．０５μｍ〜約１００μｍ、例えば、約０．１μｍ〜約５０μｍ）の孔サイズ、および約０．１μｍ〜約２０００μｍの範囲（例えば、約０．５μｍ〜約１５００μｍ、例えば、約０．５μｍ〜約１０００μｍ）の厚さを有する多孔膜であり得る。固体保持体は、約１００ｎｍ〜約２０００μｍの範囲（例えば、約５００ｎｍ〜約１０００μｍ、例えば、約１μｍ〜約２００μｍ）の粒子サイズを有するポリマーミクロスフィアであり得る。ポリマーミクロスフィアは、ミクロポーラス（約３０Å未満の孔サイズ）、マクロポーラス（約３０Å〜約４０００Åの孔サイズ）もしくはメガポーラス（ｍａｇａｐｏｒｏｕｓ）（約４０００Åより大きい孔サイズ）（例えば、Ｐｏｌｙｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｌｏｓ  Ｇａｔｏｓ、ＣＡ）によって、高内部相エマルジョン（ｈｉｇｈ−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｐｈａｓｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）（ＨＩＰＥ）技術（米国特許第４，５２２，９５３号および同第５，５８３，１６２号を参照されたい）を使用して調製されたＭａｇｎａｐｏｒｅＴＭ）であり得る。いくつかの実施形態において、孔のサイズは、約１０Å〜約１０，０００Åの範囲（例えば、約１００Å〜約８，０００Å）であり得る。いくつかの実施形態において、孔のサイズは、約１０，０００Åより大きいサイズであり得る。
【００４４】
多孔膜の場合、分析物は、膜の孔を通して透過（すなわち、ろ過）されて、タンパク質−色素ターミネーター複合体が隔離され得る。ポリマーミクロスフィアの場合、精製は、分析物をポリマーミクロスフィアのバッチにさらすことによってか、もしくは充填されたミクロスフィアのカラムをとおして溶出することによる、それぞれバッチモードもしくはクロマトグラフィーモードであり得、タンパク質−色素ターミネーター複合体が隔離され得る。いくつかの実施形態において、表面は、ノンポーラスミクロスフィア、ノンポーラス膜、もしくはタンパク質結合表面を提示するために調製された（例えば、表面が官能基化された）他のノンポーラス表面であり得る。
【００４５】
（フェノール部分を有する固体支持体）
本発明の一つの実施形態は、スキーム１に例示されるように、表面にフェノール部分を有するポリマー固体支持体２による色素アーティファクトの除去を含む。例えば、固体支持体は、スチレンとジビニルベンゼンとのフリーラジカル重合、そしてその後のヒドロキシル化によって調製されたポリマーミクロスフィア１であり得る。（スキーム１）。当業者は、フェノール基を表面に有する２を調製するために、１におけるニトロ化／アミノ化、そしてその後のジアゾ化／加水分解を行ない得る。乳化重合中にポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）（例えば、ヘキサノール）がモノマー中に加えられ得、多孔質ポリスチレンミクロスフィアを得る。当業者は、ポロゲン濃度および実験条件を調整させることによって、多孔度および孔のサイズを調節し得る。２に類似した化学組成を有する市販されている製品は、Ｉｓｏｌｕｔｅ  ＥＮＶ＋である（Ａｒｇｏｎａｕｔ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。
【００４６】
（スキーム１．フェノール基を表面に有する架橋ポリスチレンミクロスフィアの調製）
【００４７】
【化１】
2008535487.tif 000002
フェノール部分を有するポリマーミクロスフィアはまた、スキーム２に例示されるように、少なくとも１つのコモノマー（これは、水不溶性であってもよいし、もしくはわずかに水溶性であってもよい）および架橋剤とのヒドロキシスチレン前駆体の乳化共重合によっても調製され得る。多孔度を調整するためにポロゲンもまた加えられ得る。スキーム２において、ヒドロキシスチレン前駆体は、例えば、続く工程において加水分解して、フェノール部分を付与するアセトキシスチレン３である。コモノマーは、スチレン；（メタ）アクリルアミド（例えば、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、およびＮ−ブチル（メタ）アクリルアミド）；（メタ）アクリレート（例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート）；Ｎ−ビニルアミド（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド）；ビニルアルキルエーテル（例えば、ビニルメチルエーテルおよびビニルブチルエーテル）；アリルアルキルエーテル（例えば、アリルエチルエーテル、アリルブチルエーテル、およびアリルベンジルエーテル）；もしくはこれらの２つ以上の組み合わせであり得る。架橋剤としては、例えば、ジビニルベンゼン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレンジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレートもしくはテトラエチレングリコールジアクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、所望する物理的特性および化学的特性を有するポリマーミクロスフィアを調製するために使用される適切な量の架橋剤を決定し得る。このフェノールポリマーはまた、多孔膜を作るために使用され得もする。フェノール部分を有するポリスチレンミクロスフィアの調製のための別のプロトコルは、Ｊｅａｎ  Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、２０、６７５−６８０（１９７９）によって報告されている。
【００４８】
（スキーム２．アセトキシスチレンを基にしたフェノールポリマーミクロスフィア）
【００４９】
【化２】
2008535487.tif 000003
ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）を基にした固体支持体
本発明の別の実施形態は、タンパク質−色素ターミネーター複合体を取り除くことによって色素アーティファクトを低減させるための、ＰＶＤＦもしくはその誘導体の使用を含む。粒子もしくは膜の形態のＰＶＤＦは、色素アーティファクトを低減させるために使用され得る。タンパク質結合材料とタンパク質との複合体に結合するために、ＰＶＤＦフィルムのスルホン化から調製されたイオン交換膜もまた使用され得る（スキーム３；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９６４およびＹａｎｇら、２００３）。負に荷電したスルホネート基の存在が、ＤＮＡフラグメントの受動吸着を低減させる。
【００５０】
（スキーム３．ポリビニリデンジフルオリドのスルホン化）
【００５１】
【化３】
2008535487.tif 000004
架橋デキストランおよび架橋アガロースを基にした固体支持体
本発明のいくつかの実施形態は、タンパク質−色素ターミネーター複合体を結合するために、架橋、アルキル化もしくはアリール化されたデキストランおよびアガロースの使用を含む。架橋デキストランとしては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）（スキーム４）もしくはＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）（スキーム５）が挙げられるが、これらに限定さず、そして架橋アガロースとしては、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（スキーム６）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
（スキーム４．エピクロロヒドリンを有する架橋デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）））
【００５３】
【化４】
2008535487.tif 000005
（スキーム５．Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを有する架橋デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）））
【００５４】
【化５】
2008535487.tif 000006
（スキーム６．アガロースの架橋したもの（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ））
【００５５】
【化６】
2008535487.tif 000007
堅い高架橋デキストランおよびアガロースのビーズもしくは多孔膜の表面の親水性は、例えば、ヒドロキシル部分を介してアルキル基、アリール基もしくはアルキルアリール基を導入することにより、調整され得る。例えば、ブチル基もしくはフェニル基は、表面のヒドロキシル基とエピクロロヒドリンとを反応させ（スキーム７を参照されたい）、そしてその後、アルコキシドもしくはフェノキシドと反応させることによって、表面上に共有結合され得る。疎水性相互作用の種々の強さのために、タンパク質、ペプチドおよび酵素が表面に結合する。中性の親水性マトリックスは、負に荷電したＤＮＡフラグメントの受動吸着を最小にするが、表面の疎水基（スキーム７でのＲ）は、疎水性相互作用によって、ペプチド、タンパク質、酵素およびタンパク質−色素ターミネーター複合体に結合する。
【００５６】
（スキーム７．架橋デキストランおよび架橋アガロースの表面修飾）
【００５７】
【化７】
2008535487.tif 000008
高架橋ヒドロゲルを基にした固体支持体
本発明の一つの実施形態は、その表面上に疎水性部分を含む高架橋ヒドロゲルを用いたタンパク質−色素ターミネーター複合体の除去を提供する。ヒドロゲルの親水性マトリックスは、ＤＮＡフラグメントの受動吸着を低減させるが、疎水性部分は、タンパク質−色素ターミネーター複合体と結合するための疎水性相互作用に寄与する。ヒドロゲルは、水溶性モノマー、少なくとも１つの水溶性、わずかに水溶性、もしくは水不溶性のコモノマー、および架橋剤を重合することによって調製され得る。架橋剤は、水溶性でもよいし、わずかに水溶性でもよいし、もしくは水不溶性でもよい（例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉ（ｍｅｔｈｙ）ａｃｒｙｌａｔｅ）、もしくはペンタエリスリトールトリ(メタ)アクリレート))。架橋剤の適切な濃度および化学構造を選択することによって、望ましい物理的特性および化学的特性の水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ）が得られ得る。本発明の種々の実施形態において、コモノマーとしては、疎水性部分（例えば、ブチル（メタ）アクリレート（ｂｕｔｈｙｌ（ｍｅｔｈｙ）ａｃｒｙｌａｔｅ）、スチレン、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ブチル−Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ブチル−Ｎ−ビニル−アセトアミド、Ｎ−フェニル−Ｎ−ビニルアセトアミド、ビニルメチルエーテル、ビニルブチルエーテル、アリルエチルエーテル、アリルブチルエーテル、アリルベンジルエーテル、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせ）が挙げられる。本発明の種々の実施形態において、コモノマーとしては、陰イオン部分（例えば、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルスルホン酸もしくはスチレンスルホン酸）が挙げられる。疎水性部分は、疎水性相互作用をとおしてタンパク質−色素ターミネーター複合体に結合し得るが、ヒドロゲルマトリックスの陰イオン部分は、負に荷電されたＤＮＡフラグメントの受動吸着を減じ得る。ヒドロゲル粒子を調製するために、通常の乳化重合、逆乳化重合、膜乳化／重合技術が使用され得る。乳化のための条件を調整すること、および適切な界面活性剤を使用することによって、望ましい粒子サイズが得られ得る。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態において、出来上がった配列決定反応の生成物（例えば、サーマルサイクリング後の配列決定反応からの生成物）は、反応の精製の前に、タンパク質結合材料を含む容器に加えられ得る。本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、反応をサーマルサイクリングする前に、配列決定反応に直接加えられ得る。タンパク質結合材料は、反応がサーマルサイクリングされている間中、配列決定反応と同じ容器内に残り得る。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質結合材料は、ビーズもしくは粒子（例えば、クロマトグラフィー支持体）、あるいは不溶性粒子（例えば、ポリマーミクロスフィア）であり得る。タンパク質結合材料は、室温で、反応緩衝液中で、タンパク質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を結合することが可能であるべきであるが、サーマルサイクリング条件下でこの反応を妨げるべきでない。
【００６０】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によって説明される。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
配列決定反応生成物を、サイズを基にした精製の前もしくは間に、タンパク質を結合する材料と接触させた場合、この生成物が分析された際に色素アーティファクトは観察されないことが見出された。
【００６２】
ＤＮＡ配列決定反応
各２０ｕＬの反応につき８ｕＬのＢｉｇＤｙｅターミネーター（ＢＤＴ）ｖ．３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを使用して、２０ｕＬの配列決定反応を実施した。配列決定プライマーは、１反応につき３．２ｐｍｏｌのＭ１３リバースプライマーであった。（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’；配列番号１）。テンプレートは、ユニバーサルＭ１３プライミング部位を有するＰＣＲ生成物であった。
【００６３】
２０ｕＬの反応につき、約１５０ｎｇのテンプレートを使用した。この反応を、デフォルトの配列決定条件（９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で２４０秒；２５回）を使用して、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＡ）においてサイクリングし、そして貯留した。図１および図２において配列決定されたＰＣＲ生成物は、図３、図４および図５のものとは異なった。配列決定のためのＰＣＲ生成物が変わることは、アーティファクトを低減させるためにサンプルを精製する能力に影響を与えなかった。
【００６４】
図１Ａは、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム精製で精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。図１Ｂは、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム精製の前にＭｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ  Ｅｎｚｙｍｅデバイスで精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。図１Ｃは、図１Ａ（上部のパネル）および図１Ｂ（下部のパネル）からの生データを表している。
【００６５】
図２Ａは、ＳＥＩＥ精製で精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。図２Ｂは、ＳＥＩＥ精製の前にＭｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ  Ｅｎｚｙｍｅデバイスで精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。図２Ｃは、図２Ａ（上部のパネル）および図２Ｂ（下部のパネル）からの生データを表している。
【００６６】
図３Ａは、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム精製で精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。図３Ｂは、２０μＬの反応と５０μＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂との反応、続いてＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム精製によって精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。
【００６７】
図４は、均質の混合吸着床を形成するためにＣｅｎｔｒｉＳｅｐ中に混合された１００μＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を有するＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを使用して精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。
【００６８】
図５は、積み重ねられた吸着床を形成するためにＣｅｎｔｒｉＳｅｐの上部に重ねられた１００μＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を有するＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを使用して精製されたＢｉｇＤｙｅターミネーターのバージョン３．１の配列決定反応の結果を表している。
【００６９】
酵素除去
貯留された配列決定反応生成物の５０ｕＬのアリコートを、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ  Ｅｎｚｙｍｅデバイスに加え、そしてベンチトップ遠心分離機で１３，０００×ｇで３０秒スピンした。その後、膜をとおった液体をＣｅｎｔｒｉＳｅｐもしくはＳＥＩＥのいずれかで精製した。ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムの前にＨｉＴｒａｐ樹脂を使用した精製の場合（図３Ｂ）、配列決定反応生成物の２５ｕＬのアリコートを５ｕＬのＨｉＴｒａｐ樹脂のスラリーと混合し、そして５分間ボルテックスした。この混合物をスピンダウンし、そして２０ｕＬの上澄みをとり、そしてＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムに入れた。
【００７０】
ＣｅｎｔｒｉＳｅｐ精製
Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを、８００ｕＬの高純度の脱イオン水で２時間水和させた。配列決定反応生成物の２０ｕＬのアリコートを、カラムをとおして溶出させた。精製されたサンプルを、分析のためにＡＢＩ  ３１００に移した。
【００７１】
混合親和性／ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム
ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを、８００ｕＬの水で水和させ、そしてボルテックスした。このカラムを３０分静置した。ＨｉＴｒａｐ樹脂のスラリーの１００ｕＬのアリコートをピペットで加え、そしてボルテックスした。他の親和性樹脂もまた使用され得た。その後、このカラムを、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムに含まれていた説明書によって加工処理した。
【００７２】
層状親和性／ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム
ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを、８００ｕＬの水で水和させ、そしてボルテックスした。このカラムを３０分静置した。３０分の水和の後、スピンカラムの蓋を開け、そして重力によって約１０分間排水させた。ＨｉＴｒａｐ樹脂のスラリーの１００ｕＬのアリコートを、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐ樹脂吸着床の上部にピペットで慎重に加えた。（他の親和性樹脂もまた使用され得た。）その後、このカラムを、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムに含まれていた説明書によって加工処理した。
【００７３】
サイズ排除イオン交換精製
スラリー（この材料の完全な説明については２００４００１８５５９Ａ１；２００４００１６７０２Ａ１；および米国特許出願第１０／７８０，９６３号を参照されたい）の１ｕＬのアリコートを、ＭｉｃｒｏＡｍｐチューブに移した。サンプルの１ｕＬのアリコートを加え、そしてこの混合物をピペットで混合し、その後、１分間ボルテックスした。この混合物に、６ｕＬの脱イオン水を加え、ボルテックスし、樹脂をチューブの下部にスピンダウンし、そして分析のために上澄みをＡＢＩ  ３１００に移した。
【００７４】
電気泳動条件
ＡＢＩ  ３１００で、３６ｃｍのキャピラリーアレイ、ＰＯＰ−６ポリマーおよびデフォルトの「高速配列決定（ｒａｐｉｄ  ｓｅｑ）」法の改変版で電気泳動を実施した。この方法は、注入条件を１０００Ｖで２２秒から５００Ｖで１１秒に下げることによって改変された。注入物は、脱イオン水から作った。
【００７５】
（実施例２）
この実施例は、酵素結合材料が、サーマルサイクリングの前に配列決定反応に直接加えられ得ることを示す実験を説明する。ゆえに、酵素結合材料は、反応がサーマルサイクリングされている間中、配列決定反応と同じ容器中に残り得る。酵素結合材料は、反応緩衝液中で、室温でタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を結合することが可能であるべきであるが、酵素結合材料は、サーマルサイクリング条件下でこの反応を妨げるべきでない。
【００７６】
８０ｕＬのＢｉｇＤｙｅターミネーター  ｖ．３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、３．２ｐｍｏｌ／ｕＬの１０ｕＬのＭ１３ユニバーサルフォワード配列決定プライマー（５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’；配列番号２）、１５ｕＬのｐＧＥＭ（２００ｎｇ／ｕＬ）プラスミドテンプレート、および９５ｕＬの脱イオン水とを合わせることによって、ＢｉｇＤｙｅ  ｖ．３．１ターミネーター反応溶液を調製した。
【００７７】
反応溶液の２０ｕＬのアリコートを、９６ウェルＰＣＲトレーの６つのウェルにピペットで加えた。２つの異なるタイプのタンパク質結合材料を、反応への付加物としてテストした。以下に説明する両方の添加物（それぞれ１００ｕＬ）を、反応溶液に加える前に、脱イオン水の５００ｕＬアリコートで５回洗浄した。洗浄の後、全ての材料をスピンダウンし、そして樹脂の高さよりも高い最小量の水を残した。
【００７８】
溶液を以下のようにして調製した。チューブ１＆２において、何も添加していない２０ｕＬの反応溶液をコントロールとして使用した。チューブ３＆４において、２０ｕＬの反応溶液を、１ｕＬのＰＯＲＯＳ  ２０  ＨＰ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）と合わせた。チューブ５＆６において、２０ｕＬの反応溶液を、１ｕＬのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  ｈｉｇｈ  ｓｕｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）と合わせた。
【００７９】
その後、ＰＣＲトレーを、デフォルトのＢｉｇＤｙｅサイクリング条件を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ９７００サーマルサイクラーでサーマルサイクリングした。サーマルサイクリングの後、９６ウェルのトレーをサーマルサイクラーから取り出し、そして１分間ボルテックスした。その後、このプレートを遠心分離機でスピンダウンした。
【００８０】
製造業者の説明書のとおりに、６つのＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを、８００ｕＬの脱イオン水で水和させ、ボルテックスし、そして２時間静置した。ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムに入れる前に、再び水和したカラムを、ベンチトップ遠心分離機で３０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。それぞれの配列決定反応溶液の２０ｕＬのアリコートを、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム上にピペットで入れた。サンプルとともに酵素結合樹脂をピペットで入れることを避けるために、特別な注意をはらわなかったが、実際はいくつかの樹脂がＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムに移された。サンプルを含むカラムを、ベンチトップ遠心分離機で３０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。約２０ｕＬのサンプルを、それぞれのカラムから回収した。ＤＮＡシークエンサーでの分析のために、２０ｕＬの精製されたサンプルのアリコートを、９６ウェルプレートに移した。サンプルを、ＡＢＩ  ３１００  ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、３６ｃｍのキャピラリーアレイを使用し、ＰＯＰ−６ポリマーおよびデフォルトのＲａｐｉｄＳｅｑ３６法を使用して分析した。
【００８１】
結果を、図６〜図８として示す。それぞれのサンプルを２連で実施したが、それぞれのうちの一つの例のみを図に示す。
【００８２】
図６は、配列決定反応において何の添加物も使用されず、そして生じた配列決定反応が、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを使用して精製された際の結果を表している。２つの色素アーティファクトが見え、これは、塩基２５と塩基３５との間でデータの誤読（ｍｉｓｃａｌｌ）を生じた。
【００８３】
図７は、サーマルサイクリングの前に、１ｕＬのＰＯＲＯＳ  ２０  ＨＰ２を配列決定反応に加えた際の結果を表している。反応をサーマルサイクリングする間中、酵素結合材料（ＰＯＲＯＳ  ２０  ＨＰ２）が、配列決定反応と同じ容器中に残ったことに注意されたい。生じた配列決定反応を上記で説明したとおりに精製し、そして分析した際に、色素アーティファクトは観察されなかった。
【００８４】
図８は、サーマルサイクリングの前に、１ｕＬのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  ｈｉｇｈ  ｓｕｂを配列決定反応に加えた際の結果を表す。反応をサーマルサイクリングする間中、酵素結合材料（ＰＯＲＯＳ  ２０  ＨＰ２）が、配列決定反応と同じ容器中に残ったことに注意されたい。生じた配列決定反応を上記で説明したとおりに精製し、そして分析した際に、色素アーティファクトは観察されなかった。
【００８５】
前述の明細書中で、本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して説明され、そして多くの詳細が説明の目的のために述べられたが、本発明は、さらなる実施形態が可能であり、そして本明細書中に述べられる詳細のいくつかは、本発明の基本原理から逸脱せずに大きく変えられ得ることは、当業者に明らかである。
【００８６】
本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【００８７】
【化８】
2008535487.tif 000009
【００８８】
【化９】
2008535487.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｌｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ、ＵＳＡ）で精製された配列決定反応の結果を表している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラム精製の前にＭｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ  Ｅｎｚｙｍｅデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）で精製された配列決定反応の結果を表している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａ（上部のパネル）および図１Ｂ（下部のパネル）からの生データを表している。
【図２Ａ】図２Ａは、サイズ排除イオン交換（ＳＥＩＥ）精製で精製された配列決定反応の結果を表している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＳＥＩＥ精製の前にＭｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ  Ｅｎｚｙｍｅデバイスで精製された配列決定反応の結果を表している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ａ（上部のパネル）および図２Ｂ（下部のパネル）からの生データを表している。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラムを使用して精製された配列決定反応の結果を表している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラムを使用した精製の前にタンパク質結合粒子と接触された配列決定反応の結果を表している。
【図４】図４は、均質の混合吸着床を形成するためにカラム中に混合された樹脂を有するカラムを使用して精製された配列決定反応の結果を表している。
【図５】図５は、積み重ねられた吸着床を形成するためにカラムの上部に重ねられたタンパク質結合粒子を有するＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラムを使用して精製された配列決定反応の結果を表している。
【図６】図６は、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラムで精製された配列決定反応の結果を表している。この図において、サーマルサイクリング中もしくはサーマルサイクリングの後に、配列決定反応にタンパク質結合粒子は加えられなかった。
【図７】図７は、サーマルサイクリングの前に１ｕＬのＰＯＲＯＳ  ２０  ＨＰ２を配列決定反応に加えたことの結果を表している。
【図８】図８は、サーマルサイクリングの前に１ｕＬのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  ｈｉｇｈ  ｓｕｂを配列決定反応に加えたことの結果を表している。
【図１Ａ】
2008535487.tif 000011
【図１Ｂ】
2008535487.tif 000012
【図１Ｃ】
2008535487.tif 000013
【図２Ｂ】
2008535487.tif 000014
2008535487.tif 000015
【図２Ｃ】
2008535487.tif 000016
【図３Ａ】
2008535487.tif 000017
【図３Ｂ】
2008535487.tif 000018
【図４】
2008535487.tif 000019
【図５】
2008535487.tif 000020
【図６】
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【図７】
2008535487.tif 000022
【図８】
2008535487.tif 000023
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月21日(2008.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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