(57)【要約】  本発明は、脈管完全性を調節するのに有用な方法及び組成物を提供する。
2008535796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞におけるＤＳＣＲ１活性を調節するＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項２】
モジュレーターが、ＶＥＧＦレセプター２(ＶＥＧＦＲ-２)を介してのシグナル伝達により誘導されるＤＳＣＲ１活性を調節する、請求項１に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項３】
モジュレーターが、ＤＳＣＲ１-カルシニューリンＡ(ＣｎＡ)経路を調節する、請求項１又は２に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項４】
ＤＳＣＲ１モジュレーターが、ＮＦＡＴ活性に関連した細胞性イベントを調節する、請求項１から３の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項５】
細胞性イベントが、ＮＦＡＴリン酸化、ＮＦＡＴ核移行、又はＮＦＡＴ転写活性である、請求項４に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項６】
モジュレーターが、ＣｎＡにより誘導される遺伝子発現に拮抗可能なポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１から５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項７】
ポリペプチドが、ＤＳＣＲ１の少なくとも一部を含むペプチドであってＣｎＡと相互作用可能であるペプチドを含む、請求項６に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項８】
ポリペプチドが、ヒトＤＳＣＲ１の約９６から約１２５位、又は約１０８から１２２位のアミノ酸を含む、請求項６又は７に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項９】
モジュレーターが、ＤＳＣＲ１機能と拮抗可能である、請求項１又は２に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１０】
モジュレーターが、内皮細胞に存在すると細胞中においてＤＳＣＲ１の活性を抑制する核酸を含む、請求項９に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１１】
核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１２】
核酸が阻害性／干渉性ＲＮＡを含む、請求項１０に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１３】
阻害性／干渉性ＲＮＡが低分子阻害性／干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、請求項１２に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１４】
内皮細胞が、ＧＣＵＣＡＧＡＣＣＵＵＡＣＡＣＡＵＡＧ、ＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ、ＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＧＧＡＧＡＣＣＵＡ、ＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵＵ、ＡＡＣＧＵＡＵＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣ、ＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ、ＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＧＣＵＣＡＧＡＣＣ及びＡＡＧＡＵＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＵＣＡＵＡＡからなる群から選択される一又は複数の配列を含む、請求項１２又は１３に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１５】
核酸がアプタマーを含む、請求項１０に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１６】
異常な脈管炎症に関連した疾患の治療方法であって、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む方法。
【請求項１７】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
異常な脈管炎症に関連した免疫学的疾患の治療方法であって、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む方法。
【請求項２０】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
脈管完全性の混乱に関連した疾患の治療方法であって、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む方法。
【請求項２３】
脈管完全性の混乱が、脈管／内皮細胞関連炎症に関連している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
抗炎症治療に伴う副作用の改善方法であって、抗炎症治療と併用して、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを患者に投与し、よって、副作用を改善することを含む方法。
【請求項２７】
ＤＳＣＲ１モジュレーターが内皮細胞におけるＤＳＣＲ１活性を阻害する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗炎症治療が炎症を抑制する薬剤を含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
所望しない血管形成に関連した疾患の治療方法であって、抗血管形成剤と、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターとを、疾患を患っている患者に投与することを含む方法。
【請求項３２】
腫瘍の増殖又は癌細胞の増殖の抑制方法であって、有効量の抗癌剤と有効量の請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターとを、腫瘍又は癌細胞に投与することを含み、ここで組合せた有効量で、腫瘍又は癌細胞の増殖が抑制される方法。
【請求項３３】
抗癌剤が抗血管形成剤を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗血管形成剤がＶＥＧＦアンタゴニストを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(関連出願)
この出願は、米国特許法施行規則第1.53(b)(1)条に従って出願された非仮出願であり、その内容を出典明示によりここに援用する2005年3月10日出願の仮出願第60/660172号に対して米国特許法第119条(e)項に基づく優先権を主張する。
【０００２】
(技術分野)
本発明は、一般に、疾患及び他の病的状態の治療の分野に関する。より詳細には、本発明は血管形成に関連した分子的イベント(事象)及び結果を調節するための方法及び組成物に関する。
【０００３】
(背景)
脈管系は、正常な生理学的機能の維持に重要な役割を担っている。例えば、脈管構造の内皮細胞は通常、組織及び器官中への液、電解質及びタンパク質の移動の調節を行う細胞壁を形成する。内皮障壁機能の損失に至らしめるイベント(事象)はかなり複雑で、完全には理解されていないが、脈管構造の完全性の発達及び維持については広範囲に研究されている。例えばKagsbrun & Moses, Chemistry & Biology (1999), 6:R217-R224; Ferrara, Endocrine Reviews (2004), 25(4):581-611を参照。
【０００４】
しかしながら、脈管系の完全性の混乱は、癌から自己免疫疾患等の炎症疾患に及ぶ多くの疾病及び病的状態の原因となっている。例えば、米国特許出願公開第2004/0167198号；Cinesら, Blood (1998), 91(10):3527-3561; Kumarら, Curr. Opin. In Nephrology and Hypertension (2005), 14:33-37; Carmeliet & Collen Am. J. Physiol. (1997), 273:H2091-H2104を参照。他方、ある種の生理学的状況下では、脈管構造の不安定な状態を発生させ及び／又は維持する能力が所望され、不十分であるならば、それ自体が病理学的問題又は次に最適以下の治療結果に至らしめることを記しておくべきである。
【０００５】
脈管構造に関連した炎症は、多くの場合、脈管完全性の混乱に関連した細胞外血管形成刺激の下流のイベントであると特定されている。Kirkpatrickら, Int. J. Microcirc. (1997), 17：231-240。例えば、炎症プロセスが、種々の脈管関連疾患、例えば高血圧の病態生理において重要な役割を担っているという証拠が増えつつある。例えば、Touyz, Cur. Opin. Nephrology and Hypertension (2005), 14:125-131;Kobayashi & Lin, Frontiers in Bioscience (2005), 10:666-674; Bacon, Curr. Opin. Rheumatol. (2004), 17:49-55; Paleolog, J. Clin. Pathol.: mol. Pathol. (1997), 50-225-233; Mullenix et al., Ann. Vasc. Surg. (2005), 19:130-138を参照。Touyzが示しているように、炎症を示すイベント、例えば表面接着分子及びそのリガンドの発現増加、炎症細胞浸潤、サイトカイン産生、ケモカイン放出、酸化ストレス、及び自然免疫の活性化等が、脈管構造中に観察されている。また、内皮細胞の混乱は、内皮細胞により専ら発現されるＥ-セレクチン及びフォンウィルブランド因子の放出にも反映しうる。Kuenenら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2002), 22:1500-1505。持続的及び／又は調節されない炎症は、組織／脈管損傷を生じるおそれがある。典型的には、炎症反応は、脈管透過性、白血球の血管外遊出(付着、移動及び走化性)及び組織修復における変化に関与している。Touyz, 上掲。
【０００６】
残念なことに、今日まで、細胞外血管形成刺激と関連する下流イベント(例えば内皮細胞関連性炎症)との間のシグナル伝達を媒介する細胞内分子に関する情報は不足している。そのため、所望されない炎症に起因する脈管完全性の混乱を最小するか、又は所望される脈管完全性の混乱を誘導するために、血管形成プロセスの微調節を可能にする治療方策を開発する努力が妨げられている。よって、新規の治療的介入の焦点でありうる「中間体」分子標的及び経路を特定する必要性がまさに存在している。ここに開示した発明は、この必要性を満たし、他の利点を提供するものである。
特許出願及び出版物を含むここに引用した全ての文献を、その全てを出典明示により援用する。
【０００７】
(発明の開示)
本発明はダウン症候群必須領域タンパク質ファミリーのメンバーが、血管形成因子による細胞外シグナル伝達と、脈管完全性を調節する下流イベントの細胞内調節との間の重要な中間分子リンクであるという発見に少なくとも部分的に基づく。すなわち、ダウン症候群必須領域１(以下「ＤＳＣＲ１」)は、脈管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)等の血管形成調節因子による刺激の後に活性化した内皮細胞中で誘導される細胞内分子であることがここで示され、よってＤＳＣＲ１の誘導は次に脈管／内皮細胞の炎症に関連した遺伝子の発現を調節する。上述したように、脈管構造に関連した炎症は多数の疾患に関連している。特に、細胞外血管形成シグナルと脈管炎症の細胞内調節との間の媒介にネガティブ調節フィードバックループを介して作用するため、ＤＳＣＲ１は、治療的調節のために特に有利な標的である。理論に縛られるものではないが、細胞／生理学的状況に応じて、ネガティブ調節フィードバックループの成分としてのその能力において、ＤＳＣＲ１は、通常、調節フィードバックループに関連した分子及びシグナル伝達バランスを変えるために、正負双方の調節に対して敏感であることが予期される。このことと一致して、ここに示すように、内皮細胞中でのＤＳＣＲ１活性の増加及び減少の双方が、細胞生存結果の類似した調節に帰することを経験的に示している。例えば、ここに開示されたデータには、重要な分子標的／経路が干渉した場合に、血管形成シグナル伝達に関連した重要な下流イベントの一つ、すなわち脈管構造に関連した炎症の調節をもたらす。ある種の環境下では、このような炎症が検査を受けないで放置されていたとすると、所望されない病理的影響に至るおそれがある。また他の例では、このような炎症の亢進が所望される。本発明は、脈管炎症、よって脈管完全性を調節するようにＤＳＣＲ１の機能／活性に干渉することにより、このような炎症の調節に有用な方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、内皮細胞におけるＤＳＣＲ１活性を調節するＤＳＣＲ１モジュレーターを提供する。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＶＥＧＦレセプター２(ＶＥＧＦＲ-２)を介してのシグナル伝達により誘導されるＤＳＣＲ１活性を調節する。本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＤＳＣＲ１-カルシニューリンＡ(ＣｎＡ)経路の一又は複数の状況を調節しうる。例えば一実施態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＮＦＡＴリン酸化、ＮＦＡＴ核移行、又はＮＦＡＴ転写活性(例えば、ＣｎＡによる遺伝子発現の調節を媒介するＮＦＡＴの能力)等を含む、ＮＦＡＴ活性に関連した一又は複数の細胞性イベントを調節する。
【０００９】
本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、臨床的使用に適した任意の形態で提供することができる。例えば、本発明のモジュレーターは、核酸又はポリペプチドの形態で提供され及び／又は投与することができる。従って、一実施態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＣｎＡにより誘導される遺伝子発現に拮抗可能なポリペプチドをコードする核酸を含む。例えば、ポリペプチドはＤＳＣＲ１の少なくとも一部を含むペプチドであってＣｎＡと共に相互作用可能であるペプチドを含む。一実施態様では、ポリペプチドは一部を含むが、完全な成熟ＤＳＣＲ１タンパク質は含まない。一実施態様では、ポリペプチドは完全長成熟ＤＳＣＲ１タンパク質を含む。一実施態様では、ポリペプチドは、ヒトＤＳＣＲ１の約９６から約１２５位、又は約１０８から約１２２位のアミノ酸を含み、ここでアミノ酸の位置は、配列番号１(図９)に記載の配列を意味する。一実施態様では、ポリペプチドは、ヒトＤＳＣＲ１の約９６から約１２５位、又は約１０８から約１２２位のヒトＤＳＣＲ１の配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有する配列を含み、ここでアミノ酸の位置は、配列番号１(図９)に記載の配列を意味し、但し該ポリペプチドはＣｎＡにより誘導される遺伝子発現に拮抗する能力を保持している。一実施態様では、ポリペプチドは、セリン-プロリン(ＳＰ)配列の少なくとも一部と、ヒトＤＳＣＲ１のＮ及び／又はＣ末端カルシニューリン結合ドメインの少なくとも一部を含み、ここでポリペプチドは、ＣｎＡに結合して、ＣｎＡ調節遺伝子発現を阻害可能である。一実施態様では、ポリペプチドは、(ｉ)ヒトＤＳＣＲ１の約９６から約１２５位、又は約１０８から約１２２位のヒトＤＳＣＲ１の配列で、アミノ酸の位置が配列番号１(図９)に記載の配列を意味するもの；(ｉｉ)セリン-プロリン(ＳＰ)配列の少なくとも一部；及び(ｉｉｉ)ヒトＤＳＣＲ１のＮ及び／又はＣ末端カルシニューリン結合ドメインの少なくとも一部を含み、ここで該ポリペプチドは、ＣｎＡに結合してＣｎＡ調節遺伝子の発現を阻害可能である。
【００１０】
一態様では、本発明は、ＤＳＣＲ１活性に拮抗可能なＤＳＣＲ１モジュレーターを提供する。従って、一実施態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、内皮細胞(例えば、活性化内皮細胞)中に存在すると、細胞中においてＤＳＣＲ１の活性(限定するものではないが、遺伝子発現を含む)を阻害する核酸を含む。一実施態様では、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の実施態様では、核酸は阻害性／干渉性ＲＮＡを含む。一実施態様では、阻害性／干渉性ＲＮＡは低分子阻害性／干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。例えば、ｓｉＲＮＡを含むＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＧＣＵＣＡＧＡＣＣＵＵＡＣＡＣＡＵＡＧ、ＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ、ＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＧＧＡＧＡＣＣＵＡ及びＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵＵからなる群から選択される一又は複数の配列を含みうる。他の例では、ｓｉＲＮＡを含むＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＡＡＣＧＵＡＵＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣ、ＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ、ＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＧＣＵＣＡＧＡＣＣ及びＡＡＧＡＵＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＵＣＡＵＡＡからなる群から選択される一又は複数の配列を含みうる。一実施態様では、ｓｉＲＮＡを含むＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＧＣＵＣＡＧＡＣＣＵＵＡＣＡＣＡＵＡＧ、ＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ、ＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＧＧＡＧＡＣＣＵＡ、ＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵＵ、ＡＡＣＧＵＡＵＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣ、ＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ、ＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＧＣＵＣＡＧＡＣＣ及びＡＡＧＡＵＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＵＣＡＵＡＡからなる群から選択される一又は複数の配列を含む。
【００１１】
一実施態様では、核酸はアプタマーを含む。
一実施態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは抗体を含む。一実施態様では、抗体は、標的内皮細胞に入って細胞内でＤＳＣＲ１を阻害するように、すなわち抗体が内在化されるように、投与される。他の実施態様では、抗体は、標的内皮細胞に導入される(例えば形質移入される)核酸によりコードされる。
【００１２】
一態様では、本発明は、内皮細胞に伴う炎症に関連した様々な疾患の治療方法を提供する。例えば、一態様では、本発明は、異常な脈管炎症に関連した疾患の治療方法を提供するもので、該方法は、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む。一実施態様では、モジュレーターは、脈管構造に関連した炎症を増加させる。一実施態様では、モジュレーターは脈管構造に関連した炎症を抑制する。
【００１３】
一態様では、本発明は、異常な脈管炎症に関連した免疫学的疾患の治療方法を提供するもので、該方法は、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む。一実施態様では、モジュレーターは、脈管構造に関連した炎症を増加させる。一実施態様では、モジュレーターは脈管構造に関連した炎症を抑制する。
【００１４】
さらなる他の態様では、本発明は、脈管完全性の混乱に関連した疾患の治療方法を提供するもので、該方法は、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む。一実施態様では、脈管完全性の混乱は脈管／内皮細胞関連炎症に関連しており、例えばそこでは、所望されない多量の又は少量の脈管／内皮細胞関連炎症が存在している。一実施態様では、モジュレーターは、脈管構造に関連した炎症を増加させる。一実施態様では、モジュレーターは脈管構造に関連した炎症を抑制する。
【００１５】
一態様では、本発明は、抗炎症治療と併用して、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを患者に投与し、よって、該副作用を改善することを含む、抗炎症治療に伴う副作用の改善方法を提供する。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは内皮細胞におけるＤＳＣＲ１活性を抑制する。一実施態様では、抗炎症治療は炎症を抑制する薬剤、例えば免疫細胞活性を抑制可能な薬剤を含む。一実施態様では、薬剤は、シクロスポリンクラスの炎症サプレッサー、例えばシクロスポリンＡ(ＣｓＡ)である。一実施態様では、モジュレーターは、脈管構造に関連した炎症を増加させる。一実施態様では、モジュレーターは脈管構造に関連した炎症を抑制する。
【００１６】
さらなる他の態様では、本発明は、所望しない血管形成に関連した疾患(例えば癌)の治療方法を提供するもので、該方法は、抗血管形成剤と本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターとを、疾患を患っている患者に投与することを含む。
他の態様では、本発明は、腫瘍の増殖又は癌細胞の増殖の抑制方法を提供するもので、該方法は、有効量の抗癌剤と有効量の本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターとを、腫瘍又は癌細胞に投与することを含み、ここで組合せた有効量は、腫瘍又は癌細胞の増殖を抑制する。
【００１７】
一実施態様では、抗癌剤は、抗血管形成剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストを含む。一実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、抗体Ａ４.６.１又はその親和成熟変異体の抗原結合配列を含む。一実施態様では、抗原結合配列は、抗体Ａ４.６.１又はその親和成熟変異体の重鎖の少なくとも１、２又は３の高頻度可変領域を含む。一実施態様では、抗原結合配列は、抗体Ａ４.６.１又はその親和成熟変異体の軽鎖の少なくとも１、２又は３の高頻度可変領域を含む。一実施態様では、抗原結合配列は、抗体Ａ４.６.１又はその親和成熟変異体の重鎖可変ドメインのヒト化形態を含む。一実施態様では、抗原結合配列は、抗体Ａ４.６.１又はその親和成熟変異体の軽鎖可変ドメインのヒト化形態を含む。抗体Ａ４.６.１は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０７０９(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡ)に寄託されているハイブリドーマ株化細胞により産出される抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシツマブである。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシツマブと同じヒトＶＥＧＦのエピトープに結合する抗体である。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒトＶＥＧＦへの結合に対してベバシツマブと競合する抗体である。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、例えばＶＥＧＦＲ２等のＶＥＧＦレセプターに結合する。これらの方法の一実施態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、化学療法剤等の抗癌剤と併用して、患者に投与される。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、脈管完全性の混乱に関連した副作用を抑制する。例えば、脈管完全性の混乱は血栓溶解に関連している場合がある。
【００１８】
一態様では、本発明は、血管形成を亢進することによる疾患の治療方法を提供し、該方法は、有効量の血管形成を誘導させる薬剤と有効量のＤＳＣＲ１モジュレーターとを、疾患を患っている患者に投与することを含み、これにより疾患が治療される。一実施態様では、血管形成を誘導させる薬剤は、血管形成誘導物質、例えばここに開示した一又は複数の血管形成因子を含む。一実施態様では、血管形成因子はＶＥＧＦである。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは脈管完全性の混乱を抑制する。この方法により治療可能な疾患は、例えば創傷、虚血、心疾患、アテローム性動脈硬化症、脈管炎等を含む、ここに開示された任意のものを含む。
【００１９】
一態様では、本発明は、ＤＳＣＲ１モジュレーターに細胞を接触させることを含む、内皮細胞の生存の調節方法を提供する。一実施態様では、内皮細胞は活性化されている。一実施態様では、内皮細胞にはＤＳＣＲ１アンチセンス配列をコードする発現ベクターが形質移入されている。一実施態様では、内皮細胞にはＤＳＣＲ１センス配列をコードする発現ベクターが形質移入されている。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、阻害性／干渉性ＲＮＡを含み、これは一実施態様では低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。
【００２０】
本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターが他の治療剤と併用して投与される本発明の方法において、前記他の治療剤の投与タイミングに対するＤＳＣＲ１モジュレーターの投与タイミングは、経験的及び／又は臨床的に治療的に有用であると考えられるものであれば如何なるものでもよい。例えば一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、前記他の治療剤の投与の前に投与される。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、前記他の治療剤の投与に引き続いて投与される。他の実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、前記他の治療剤の投与と同時に投与される。一実施態様では、前記他の治療剤は抗炎症活性を有している。一実施態様では、２つの薬剤は別々の組成物として投与される。一実施態様では、２つの薬剤は単一組成物として投与される。
【００２１】
一態様では、本発明は、血管形成の修飾を含む疾患の治療に伴う副作用を生じる危険性のある患者を同定する方法を提供し、該方法は、組織又は細胞中におけるＤＳＣＲ１発現又は活性の量を測定し、その量を正常な対応組織又は細胞の量と比較することを含み、ここでの量の差が前記副作用を生じる危険性を示す。一般に、副作用は炎症に伴う脈管完全性の混乱による。該同定方法は、臨床的介入プロセスの間、任意の簡便な及び／又は有益な時点で実施することができる。例えば、対象疾患を治療する治療剤の投与の前、投与の間又は投与の後に、実施しうる。
【００２２】
一態様では、本発明はＤＳＣＲ１モジュレーター(例えば、脈管完全性の混乱／脈管炎症を調節するのに有用な分子)の同定方法を提供するもので、該方法は、ＤＳＣＲ１(又は以下に定義するその機能的変異体)と候補物質を接触させ、候補物質の存在下又は不在下でのＤＳＣＲ１(又はその機能的変異体)の量を測定することを含み、ここで候補物質の存在下又は不在下でのＤＳＣＲ１(又はその機能的変異体)の量の差で、候補物質がＤＳＣＲ１モジュレーターであることが示される。ＤＳＣＲ１量は、当該分野で知られている任意の適切な定性的又は定量的測定法により測定することができる。例えば、ＤＳＣＲ１量は、ＲＮＡ又はタンパク質のレベルにより示すことができる。他の例では、ＤＳＣＲ１量は、ＤＳＣＲ１活性(例えばＣｎＡの阻害)により示される。本発明の方法は、ＤＳＣＲ１アンタゴニスト又はアゴニストを同定するために使用することができる。例えば一実施態様では、ＤＳＣＲ１量は候補物質の存在下で低下する。他の実施態様では、ＤＳＣＲ１量は候補物質の存在下で増加する。本発明の方法により同定されるモジュレーターは、本発明の方法における使用に必要な特徴の任意のものを有しうる。例えば、内皮細胞に関連した脈管完全性及び／又は炎症を調節可能な候補が選択される。あるいは、候補物質は、ある種の所望されない特徴を欠く物質を選択するためにさらに評価することができる。例えば、内皮細胞の増殖を実質的に調節しない候補物質を選択することもできる。
【００２３】
上述したように、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーター及び方法は、脈管完全性の不適切な調節に関連していることが疑われるか又は知られている様々な疾患の治療に有用である。例えば、これらの疾患には、限定されるものではないが、脈管(例えば心血管)、内皮、血管形成(例えば腫瘍／癌)又は免疫学的(例えば自己免疫)疾患カテゴリーが含まれる。しかしながら、いくつかの実施態様では、これらの疾患は心血管又は免疫学的なものではない。いくつかの実施態様では、これらの疾患は内皮又は血管形成のものではない。さらなる他の実施態様では、疾患は組織の炎症(急性又は慢性)に関連しており、例えば自己免疫疾患である。いくつかの病気は、２又は３の疾患カテゴリーに重複する特徴を有している場合がある。
【００２４】
一般に、本発明は、免疫媒介性疾患の治療に有用なモジュレーター分子及び方法を提供する。一実施態様では、本発明は、ここに示したもののような、自己免疫疾患の治療に関する。一実施態様では、疾患は、移植片拒絶又は移植片対宿主病に関する。
【００２５】
治療方法が疾患治療のために血管形成／血管新生を促進することを含む本発明の方法のいくつかの実施態様では、疾患は、限定されるものではないが、例えば脈管外傷、創傷、裂傷、切開、火傷、潰瘍(例えば、糖尿病性潰瘍、褥瘡、血友病性潰瘍、静脈瘤性潰瘍)、組織増殖、体重増加、末梢動脈障害、陣痛誘発、毛髪成長、表皮水疱症、網膜萎縮、骨折、脊髄固定、半月板裂傷等々でありうる。
臨床的に適切であるか所望される場合、本発明の方法は、付加的な処置工程をさらに含むことができる。例えば一実施態様では、本方法は、標的細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)を放射線治療又は化学療法剤に暴露する工程をさらに含む。
【００２６】
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数のＤＳＣＲ１モジュレーターと担体を含有する組成物を提供する。一実施態様では、担体は製薬的に許容可能である。
一態様では、本発明は、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターをコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか又はこれを含むＤＳＣＲ１モジュレーターをコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体又はその断片であるか又はこれを含むＤＳＣＲ１モジュレーターをコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、ＤＳＣＲ１の発現／活性(例えばＤＳＣＲ１遺伝子の転写又はＤＳＣＲ１タンパク質の翻訳)を抑制する核酸配列をコードする。
【００２７】
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは任意のタイプ、例えば組換えベクター、特に発現ベクターであってよい。多様な宿主細胞の任意のものを使用することができる。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞等の哺乳動物細胞である。一実施態様では、本発明の核酸又はベクターは内皮細胞中で発現している。
【００２８】
一態様では、本発明は、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターの製造方法を提供する。例えば、本発明は、抗体(又はその断片)であるか又はこれを含むＤＳＣＲ１モジュレーターの製造方法を提供するものであり、該方法は、前記抗体(又はその断片)をコードする本発明の組換えベクターを適切な宿主細胞中で発現させ、前記抗体(又はその断片)を回収することを含む。他の例では、本発明は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか又はこれを含むＤＳＣＲ１モジュレーターの製造方法を提供するものであり、該方法は、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)をコードする本発明の組換えベクターを適切な宿主細胞中で発現させ、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を回収することを含む。
【００２９】
一態様では、本発明は、容器とその容器に収容された組成物を含む製造品を提供するもので、その組成物は一又は複数の本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを含む。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含む。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターを含む組成物は、いくつかの実施態様では製薬的に許容可能である担体をさらに含有する。一実施態様では、本発明の製造品は、ここに記載の疾患を治療するために組成物(例えばＤＳＣＲ１モジュレーター)を投与するための使用説明書をさらに含む。
【００３０】
一態様では、本発明は、一又は複数の本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを含む組成物を収容する第１の容器と、バッファーを収容する第２の容器とを具備するキットを提供する。一実施態様では、バッファーは製薬的に許容可能である。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターを含む組成物は、いくつかの実施態様では製薬的に許容可能である担体をさらに含有する。一実施態様では、キットは、ここに記載の疾患を治療するために組成物(例えばＤＳＣＲ１モジュレーター)を投与するための使用説明書をさらに含む。
【００３１】
(発明の実施形態)
本発明は、内皮細胞におけるＤＳＣＲ１を調節することにより、様々な疾患を治療するための方法、組成物、キット及び製造品を提供する。これらの方法、組成物、キット及び製造品の詳細をここに提供する。
【００３２】
一般的技術
特に示さない限り、本発明の実施には、当業者の技量内にある分子生物学(組換え技術を含む)、細菌学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の一般的な技術を用いる。このような技術は、文献、例えば「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」第2版(Sambrookら, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編, 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney編, 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編, 1987, 及び定期更新物)；「PCR：The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988)に十分に説明されている。
【００３３】
定義
ここで使用される「脈管」又は「脈管構造」という用語及びその変形語は、哺乳動物の体の至るところに血液(リンパ液を含む)を運ぶ血管系を意味する。
「血管」とは、動脈、細動脈、毛細管、細静脈、静脈、洞及び栄養血管を含む、哺乳動物血管系の任意の管を意味する。本発明の一態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、心筋に血液を供給する脈導管に直接導入される。このような脈導管には、冠動脈並びに伏在静脈又は内乳動脈移植片等の血管が含まれる。一実施態様では、血管は活性化内皮細胞を含む。
【００３４】
「動脈」は、血液を心臓から離れた方向に通過させる血管を意味する。冠動脈は心臓それ自体の組織(特に心筋)に供給し、他の動脈は体の残りの器官に供給する。動脈の一般構造は、多層動脈壁により囲まれた管腔からなる。
【００３５】
ここで使用される「血管形成」なる用語は、血管新生を生じる細胞性イベントを意味し、ここで脈管内皮細胞は増殖し、取り除かれ、再編成されて、先在している脈管網から新規の血管が形成される。血管形成は、(１)プロテアーゼの放出後の局所位置の細胞外マトリックスの分解；(２)毛細管内皮細胞の増殖、及び(３)血管形成刺激の方への毛細管の移動を含む過程のカスケードである。例えば、Ferraraら, Endocrine Rev. (1992), 13:18-32; Ferrara, Nature Reviews (2002), 2:795-803を参照。
【００３６】
ここで使用される場合、「脈管完全性」という用語及びその変形は、脈管構造の機能が損なわれていない状態を意味し、ここで機能が損なわれていない状態には、障壁の２つの区画／側面の間の分子の自由な移動に対して障壁として作用する脈管構造の正常な生理学的能力を有することを含む。より詳細には、２つの区画／側面は、一般的に脈管構造の管腔及びエクストラルーメン空間(extralumenal space)(一般的に脈管構造に隣接する組織及び／又は細胞を含む)に関する。
【００３７】
ここで使用される場合、「脈管完全性の混乱」という用語及びその変形は、障壁の２つの区画の間の移動に対する障壁として作用する脈管構造の無能性を生じる脈管完全性の異常及び／又は所望されない変化を意味する。例えば、脈管構造の炎症は、脈管完全性の混乱に関連するよくある原因である。脈管完全性の混乱は、限定されるものではないが、内皮細胞壊死、内皮細胞アポトーシス、内皮に対する外傷、損傷、脈管漏出、高血圧、及び脈管損傷を含む、一又は複数の組織及び細胞性状態の形態に表れうる。さらなる例には、動物(一般的には哺乳動物)又はヒトが被る、脈管内皮に影響を及ぼす外傷、例えば器官の脈管網を含む血管の外傷(例えば損傷)が含まれ；このような損傷には、創傷、切開、及び潰瘍(例えば糖尿病性潰瘍)、及び血管／内皮細胞の創傷又は裂傷が含まれる。外傷には、内部イベント並びに病原体等の外因性剤により課されるものに起因する状態も含まれる。
【００３８】
ここで使用される場合、「脈管完全性の混乱に関連した疾患」、「異常な脈管炎症に関連した疾患」及びその変形は、一般的に脈管完全性の混乱及び／又は異常な脈管炎症に関連していると考えられているか又は関連していることが知られている病理状態を意味する。これらの疾患には、限定されるものではないが、脈管(例えば心血管)疾患、内皮細胞疾患、血管形成疾患(例えば癌)、及び免疫学的疾患(例えば自己免疫疾患を含む炎症性疾患)が含まれる。例えば、これらの疾患には、血管形成の調節不全に関連する病的状態が含まれる。本発明のモジュレーター分子及び方法により治療することができる疾患には、限定されるものではないが、所望されないか又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬性プラーク(psoriatic plaques)、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化プラーク、心筋梗塞からの浮腫、糖尿病、及び未熟児網膜症を含む他の増殖網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、角の血管新生(ルベオーシス)、眼の血管新生病、血管再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜種、血管種、血管線維腫、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺障害／ＡＲＤＳ、敗血症、高血圧(例えば原発性肺高血圧)、悪性の肺出血、脳浮腫(例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部損傷／外傷に関連するもの)、滑膜炎症、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、難治性腹水症、多嚢胞性卵巣症、子宮内膜症、第三腔体液病(3rd spacing of fluid diseases)(膵炎、コンパートメント症候群、火傷、腸疾患)、子宮筋腫、早期分娩、慢性炎症、例えばＩＢＤ(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、腎同種移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、所望しない又は異常な組織量の増加(非癌性)、肥満、脂肪組織量の増加、血友病性関節、肥厚性瘢痕、毛髪成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、脈管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水症、心膜液貯留(例えば心膜炎に関連するもの)、胸水、胃腸潰瘍、慢性的な気道炎症、及び血管炎が含まれる。
【００３９】
血管形成の調節不全は、本発明の組成物及び方法により治療可能な多くの疾患に至る可能性がある。これらの疾患には、非新生物及び新生物状態の双方が含まれる。新生物疾患には、限定されるものではないが、上述したものが含まれる。非新生物疾患には、限定されるものではないが、所望しない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化プラーク、糖尿病、及び未熟児網膜症を含む他の増殖網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、角の血管新生(ルベオーシス)、眼の血管新生病、血管再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜種、血管種、血管線維腫、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺障害／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧、悪性の肺出血、脳浮腫(例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部損傷／外傷に関連するもの)、滑膜炎症、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、難治性腹水症、多嚢胞性卵巣症、子宮内膜症、流体病の第３スペーシング(膵炎、コンパートメント症候群、火傷、腸疾患)、子宮筋腫、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、腎同種移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、所望しない又は異常な組織量の増加(非癌性)、血友病性関節、肥厚性瘢痕、毛髪成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、脈管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水症、心膜液貯留(例えば心膜炎に関連するもの)、及び胸水が含まれる。
【００４０】
「疾患」とは、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーター及び／又は方法を用いた治療が有益である任意の状態である。これには、慢性及び急性の疾患、又は対象疾患に哺乳動物がかかりやすい病的状態を含む疾病が含まれる。ここで治療される疾患の非限定的例には、悪性及び良性の腫瘍；非白血病及びリンパ系腫瘍；神経細胞、グリア、アストロサイト、視床下部及び他の腺性、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の疾患；及び炎症(例えば自己免疫)、血管形成及び免疫性の疾患が含まれる。
【００４１】
ここで「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織から生じ、個体自身の組織に対する非悪性の疾病又は疾患のことである。ここでの自己免疫疾患は、悪性又は癌性の疾病又は状態、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除く。自己免疫疾病又は疾患の例には、限定されるものではないが、炎症反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)に関連した反応；呼吸困難症候群(成人性呼吸困難症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー病状、例えば湿疹及び喘息及びＴ細胞の浸潤に関連した他の病状及び慢性炎症反応；アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；真性糖尿病(例えば、Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性真性糖尿病)；多発性硬化症；レノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；ショルゲン(Sjorgen)症候群；若年発症糖尿病；及び結核に典型的に見出されるサイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅延型高血圧に関連した免疫反応、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症及び血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出に関連した疾病；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症性疾患；多臓器損傷症候群；溶血性貧血(限定されるものではないが、クリオグロブリン血症又はクームズ陽性貧血を含む)；重症筋無力症；抗原抗体複合体媒介性疾病；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；クレーブス病；ランベルト-イートン筋無力症症候群；類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；スティフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫血小板減少病等が含まれる。
【００４２】
ここで使用される場合、「血管形成因子」又は「血管形成剤」とは、例えば血管形成、内皮細胞の増殖、血管の安定性、及び／又は脈管形成等を促進させる、血管の発育を刺激する分子のことである。一実施態様では、請求項記載の発明において言及されている血管形成因子はＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリーのメンバー(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ)である。一実施態様では、請求項記載の発明において言及されている血管形成因子は、ＰＩＧＦ及び／又はＰＤＧＦファミリーのメンバーである。一実施態様では、請求項記載の発明において言及されている血管形成因子は、ＴＩＥリガンド(アンジオポエチン)である。一実施態様では、請求項記載の発明において言及されている血管形成因子はエフリンである。一実施態様では、請求項記載の発明において言及されている血管形成因子は、限定されるものではないが、一又は複数の成長ホルモン、インシュリン様成長因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー、及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βを含む、創傷治癒を加速させる因子である。例えば、Klagsbrun及びD'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit 及びDetmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Toniniら, Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (例えば、既知の血管形成因子を列挙する表１); 及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
【００４３】
ここで使用される場合、「副作用」という用語又はその変形は、疾患の治療を受ける患者に観察される及び／又は測定される、臨床的、医学的、物理的、生理学的、及び／又は生化学的影響で、意図される治療結果の一部ではない影響を意味する。一般的に、前記影響は、治療される患者の健康状態及び／又は快適さ、治療される患者にとっての健康的危険性、及び／又は治療される患者に対する治療許容性に関して所望されるものではない。
【００４４】
上述したように、ここで記載される炎症性疾患(例えば自己免疫疾患又は自己免疫関連症状)の治療において、患者は、例えば多剤投薬計画におけるように、第２の治療剤、例えば免疫抑制剤(すなわち抗炎症剤)と併用して、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターで治療することができる。ＤＳＣＲ１モジュレーターは、免疫抑制剤と同時に、連続して又は交互に投与することができる。免疫抑制剤は、当該分野で記載されているものと同じか又はそれより少ない投薬量で投与することができる。好ましい補助免疫抑制剤は、治療される疾患の種類並びに患者の病歴を含む多くの要因に依存する。
【００４５】
ここで使用される場合、「免疫抑制剤」とは、患者の炎症反応及び／又は免疫系を抑制又はマスクするように働く物質を意味する。このような薬剤は、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原の発現をダウンレギュレーションし又は抑制し、又はＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。そのような薬剤の例として、ステロイド類、例えばグルココルチコステロイド類、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾン；２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン類(米国特許第4,665,077号参照)；アザチオプリン(又はアザチオプリンに対する逆反応が存在する場合はシクロホスファミド)；ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド(米国特許第4,120,649号に記載のように、ＭＨＣ抗原をマスクする)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト；抗腫瘍壊死因子α抗体；抗腫瘍壊死因子β抗体；抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；及び抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(1990年7月26日公開の国際公開第90/08187号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (米国特許第5,114,721号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offnerら, Science 251:430-432 (1991)；国際公開第90/11294号；及び国際公開第91/01133号)；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞レセプター抗体(欧州特許出願公開第340,109号)を含む。
【００４６】
ここで使用される「ＤＳＣＲ１」なる用語には、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体、及び天然配列ポリペプチドの断片及びポリペプチド変異体(ここでさらに定義する)で、野生型ＤＳＣＲ１に類似した形でカルシニューリン(及び例えば組織因子、Ｅ-セレクチン及びＣｏｘ-２等の炎症マーカー遺伝子の発現)を調節可能なものが含まれる。ここに記載されたＤＳＣＲ１ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源などの種々の供給源から単離されるか、組換え及び／又は合成方法によって調製されるものであってもよい。「ＤＳＣＲ１」、「ＤＳＣＲ１ポリペプチド」、「ＤＳＣＲ１タンパク質」及び「ＤＳＣＲ１分子」なる用語は、ここに開示されたＤＳＣＲ１ポリペプチドの変異体もまた含む。本発明の「ＤＳＣＲ１モジュレーター」は、「ＤＳＣＲ１ポリペプチド」又は「ＤＳＣＲ１タンパク質」の正常な生物学的機能／活性を調節する分子である。
【００４７】
「天然配列ＤＳＣＲ１ポリペプチド」は、天然由来の対応するＤＳＣＲ１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施態様では、天然配列ＤＳＣＲ１ポリペプチドは、配列番号１(図９を参照)のタンパク質コード化アミノ酸配列を含み、ここで、第１のメチオニンはアミノ酸位置１である。このような天然配列ＤＳＣＲ１ポリペプチドは、天然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により産生させることもできる。ここで使用される「ＤＳＣＲ１ポリペプチド」及び「ＤＳＣＲ１タンパク質」なる用語は、特定のＤＳＣＲ１ポリペプチドの天然に生じる切断型又は翻訳後の他の修飾型、天然に生じる変異型(例えば選択的スプライス型)、及び該ポリペプチドの天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
【００４８】
「ＤＳＣＲ１ポリペプチド変異体」又はその変形は、ここに開示された天然配列ＤＳＣＲ１ポリペプチド配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するとここに定義されたＤＳＣＲ１ポリペプチド、一般には活性ＤＳＣＲ１ポリペプチドを意味する。このようなＤＳＣＲ１ポリペプチド変異体には、例えば、天然アミノ酸配列のＮ又はＣ端で、一又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失されたＤＳＣＲ１ポリペプチドが含まれる。通常、ＤＳＣＲ１ポリペプチド変異体は、ここに開示された天然配列ＤＳＣＲ１ポリペプチド配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。通常、ＤＳＣＲ１変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０のアミノ酸長、あるいは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００のアミノ酸長又はそれ以上である。場合によっては、ＤＳＣＲ１変異体ポリペプチドは、天然ＤＳＣＲ１ポリペプチド配列と比較して１以下の保存アミノ酸置換、あるいは天然ＤＳＣＲ１ポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以下の保存アミノ酸置換を有するであろう。
【００４９】
ペプチド又はポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、米国特許第6,828,146号に記載されているように、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。
【００５０】
ここで使用される場合、「ペプチド」及び「ポリペプチド」なる用語は、「ペプチド」なる用語が、一般に２００未満の近接アミノ酸を含むポリペプチドを意味することを除き、互いに交換可能に使用される。
【００５１】
ここで使用される「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送可能な核酸分子を指すことを意図している。ベクターの一タイプは、そこに付加的なＤＮＡセグメントが結合していてもよい環状の二重鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。他のタイプのベクターはファージベクターである。他のタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合していてもよいウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律増殖可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞へ導入されると、宿主細胞のゲノムに結合可能で、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現に対するものであり得る。そのようなベクターをここで「組換え発現ベクター」(又は単に「組換えベクター」)と言う。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的な形態であるので、交換可能に使用することができる。
【００５２】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に導入され得る任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築の前後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識と結合させることにより、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ」、類似体による自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性結合(例えばホスホン酸メチル類、ホスホトリエステル類、ホスホアミデート類、カルバメート類等)及び荷電性結合(ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類等)を有するもの、ペンダント部分を含むもの、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)、挿入剤を含むもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホネート基、ホスフェート基により置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる結合を調製するために活性化されてもよく、もしくは固体状又は半固体状担体に結合していてもよい。５'及び３'端のＯＨはリン酸化、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャッピング基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシル類は標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ-又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の結合基により置き換えてもよい。これらの代替の結合基には、限定されるものではないが、ホスフェートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオエート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオエート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミデート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)により置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここで、それぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又は���ラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで言及した全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５３】
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般に約２００未満のヌクレオチド長の合成ポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述の記載はオリゴヌクレオチドに等しく完全に適用可能である。
【００５４】
ここで使用される「宿主細胞」(又は「組換え宿主細胞」)なる用語は、組換えプラスミド又はベクター等の、遺伝的に改変されているか、又は外来性ポリヌクレオチドの導入より遺伝的に改変可能な細胞を指すことを意図している。このような用語は、特定の患者の細胞ばかりでなく、このような細胞の子孫も意味することを意図していることが理解されなければならない。ある種の修飾は、突然変異又は環境の影響により後の世代において生じるため、このような子孫は実際は親細胞と同一ではない可能性があるが、ここで使用される「宿主細胞」なる用語の範囲には尚含まれる。
【００５５】
「抗体」(Ａｂｓ)及び「免疫グロブリン」(Ｉｇｓ)は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、一般に抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系では低レベルで、骨髄腫では高レベルで産出される。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広義で相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
【００５６】
「抗体断片」は無傷抗体の一部のみを含み、該一部は、無傷抗体に存在する場合に、その一部に通常付随している機能の少なくとも一部、好ましくはほとんど又は全ての機能を保持している。一実施態様では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持している。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合等、無傷抗体に存在する場合にＦｃ領域に通常伴っている少なくとも一の生物学的機能を保持している。一実施態様では、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与可能なＦｃ配列に結合する抗原結合アームを含み得る。
【００５７】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含み；ＶＨに３(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲｓ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これら高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
カバットループ    ＡｂＭ       Chothia       接触
L1   L24-L34      L24-L34      L26-L32      L30-L36
L2   L50-L56      L50-L56      L50-L52      L46-L55
L3   L89-L97      L89-L97      L91-L96      L89-L96
H1   H31-H35B     H26-H35B     H26-H32      H30-H35B
(カバット番号付け)
H1   H31-H35     H26-H35     H26-H32      H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2   H50-H65     H50-H58     H53-H55      H47-H58
H3   H95-H102     H95-H102     H96-H101     H93-H101
【００５８】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５９】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。
【００６０】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第4,816,567号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
【００６１】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jonesら, Nature 321:522-525(1986)；Riechmannら, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００６２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。
【００６３】
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＣＤＲ／ＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。好ましい親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産される。Marksら Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＣＤＲ／ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、Barbasら, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schierら, Gene, 169：147-155(1995)；Yeltonら, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jacksonら, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkinsら, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００６４】
「Ｆｃ領域」なる用語は、無傷抗体のパパイン消化により産生されうる免疫グロブリン重鎖のＣ端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかもしれないが、ヒトＩｇ重鎖のＦｃ領域は、通常、ほぼ位置Ｃｙｓ２２６又はほぼ位置Ｐｒｏ２３０のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定められる。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含み、場合のよってはＣＨ４ドメインを含む。ここで「Ｆｃ領域鎖」とは、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の一方を意味する。
【００６５】
ここで使用される「実質的に同様の」又は「実質的に等価な」なる表現は、当業者が、２つの値の差異が、その値により測定される生物学的特徴の範囲内において生物学的有意性がほとんどないか又はないとみなすように、２つの数値の間に十分に高度な類似性があることを示す。前記２つの値の差異は、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【００６６】
ここで使用される「細胞障害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び小分子毒素又は細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素などの毒素で、それらの断片及び／又は変異体を含むものを含むことを意図する。
【００６７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；デルタ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；ベータ-ラパコン(lapachone)；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標)、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトセシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；ポドシロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む)；エリュテロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、及びラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと)；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；エスペラマイシン(esperamicin)；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(DOXIL(登録商標)及びデオキシドキソルビシンを含む)��エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート、ゲンシタビン(gemcitabine)(GEMZAR(登録商標))、テガフール(UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(XELODA(登録商標))、エポシロン、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(ABRAXANEＴＭ)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチ���類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン(oxaliplatin)；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；上述した任意のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びにＣＨＯＰ等、上述したものの２又はそれ以上の組合せ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用療法の略語、及びFOLFOX、５-ＦＵ及びロイコバビンと組合せてオキサリプラチン(ELOXATINＴＭ)を用いた治療法の略語が含まれる。
【００６８】
また、この定義には、癌の増殖を促進可能なホルモン効果を調節、低減、ブロック又は抑制するように働く抗ホルモン剤が含まれ、多くの場合は全身性又は全身体治療の形態である。それらはホルモン自体であってもよい。具体例には、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプターダウン-レギュレーター(ＥＲＤｓ)；エストロゲンレセプターアンタゴニスト、例えばフルベストラント(FASLODEX(登録商標))；卵巣を抑制又は活動停止させるように機能する薬剤、例えば黄体化(leutinizing)ホルモン-放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、例えば酢酸ロイプロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；他の抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)及びビカルタミド；及びアロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))が含まれる。さらに、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホナート、例えばクロドロナート(例えば、BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロナート(DIDROCAL(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロナート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロナート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロナート(AREDIA(登録商標))、チルドロナート(SKELID(登録商標))又はリゼドロナート(ACTONEL(登録商標))；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に付粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ-アルファ、ラルフ及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチン、及び遺伝子治療用ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター(例えば、LURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えば、ABARELIX(登録商標))；ラパチニブジトシラート(ＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビターで、ＧＷ５７２０１６としても公知のもの)；ＣＯＸ-２インヒビター、例えばセレコキシブ(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾール-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上述した任意のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
「ブロッキング」抗体及び「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物機能を抑制又は低減するものである。このようなブロックは、任意の手段、例えばレセプターへのリガンド結合のような、タンパク質-タンパク質相互作用と干渉することにより、生じせしめることができる。一実施態様では、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に抑制する。
【００６９】
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を意味するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫(例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のさらなる特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌(hepatocellular cancer)、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌(liver cancer)、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌(hepatic carcinoma)、及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。
【００７０】
ここで使用される「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明のモジュレーター分子及び方法は、疾病又は疾患の進行を遅延化させるために使用される。
【００７１】
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。治療剤の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び個体に所望する反応を引き出すための抗体の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、治療剤の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００７２】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．ＤＳＣＲ１モジュレーター抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療及び／又は診断剤としての使用が見出されているＤＳＣＲ１モジュレーター抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。抗体の産出、同定、特徴付け、修飾及び生成についての態様は、当該分野で十分に確立されており、例えば米国特許出願公開第2005/0042216号のパラグラフ522〜563、604〜608、及び617〜688に記載されている。
【００７３】
ここに開示されているＤＳＣＲ１モジュレーター抗体は、標的細胞／組織に送達するための任意の適切な形態に製剤化され得る。例えば、抗体は免疫リポソームとして製剤化されうる。「リポソーム」は、様々なタイプの脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞体であり、哺乳動物への薬物の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。抗体を含むリポソームは、当該分野で既知の方法により調製され、例えばEpsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwangら, Proc. Natl  Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号；及び1997年10月23日公開の国際公開第97/38731号に記載されている。循環時間を高めたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【００７４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学療法剤は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)：1484 (1989)参照。
【００７５】
Ｂ．ＤＳＣＲ１モジュレーターポリペプチド
一態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターはポリペプチドを含む。一実施態様では、モジュレーターポリペプチドは、内皮細胞においてＮＦＡＴ活性に拮抗する。一実施態様では、モジュレーターポリペプチドは、内皮細胞においてＣｎＡ活性に拮抗する。一実施態様では、ポリペプチドは、ＤＳＣＲ１又はＣｎＡと相互作用する細胞内分子又はＤＳＣＲ１と、好ましくは特異的に結合する。ポリペプチドは、既知のプラスミド合成法を使用して化学的に合成してもよいし、又は組換え技術を使用して、調製し精製されてもよい。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターポリペプチドは、少なくとも約５のアミノ酸長、あるいは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長又はそれ以上であり、このようなポリペプチドはＤＳＣＲ１活性を調節可能である。これらのポリペプチドはよく知られている技術を使用し、過度の実験をすることなく同定することができる。この点に関し、ポリペプチド標的に特異的に結合可能なオリゴペプチド用のオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野でよく知られていることが留意される(例えば、米国特許第5,556,762号、同5,750,373号、同4,708,871号、同4,833,092号、同5,223,409号、同5,403,484号、同5,571,689号、同5,663,143号; PCT公開国際公開第84/03506号及び国際公開第84/03564号；Geysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysenら, Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysenら, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofsら, J. Immunol., 140:611-616 (1988)、Cwirla, S. E.ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman, H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson, T.ら (1991) Nature, 352: 624；Marks, J. D.ら (1991),  J. Mol. Biol., 222:581；Kang, A.S.ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668を参照)。
【００７６】
この点に関し、バクテリオファージ(ファージ)ディスプレイは、ポリペプチド標的に特異的に結合可能なライブラリーのメンバー(群)を同定するための大規模なオリゴペプチドライブラリーのスクリーニングを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドが、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に対する融合タンパク質としてディスプレイされる技術である(Scott, J.K.及びSmith, G. P. (1990) Science, 249: 386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体(又はランダムにクローニングされたｃＤＮＡ)の大規模なライブラリーが、高親和性を有する標的分子に結合するそれらの配列に対して、急速かつ効率的に選別されるという点にある。ファージ上のペプチド(Cwirla, S. E.ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378)又はタンパク質(Lowman, H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson, T.ら (1991) Nature, 352: 624；Marks, J. D.ら (1991), J. Mol. Biol., 222:581；Kang, A.S.ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363)ライブラリーのディスプレイは、特異的結合性を持つものに対し、何百万ものポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。ランダム突然変異体のファージライブラリー選定には、多数の変異体を作製して増殖させるための方法、標的レセプターを使用する親和精製のための手順、及び結合性向上の結果を評価する手段が必要である。米国特許第5,223,409号、同5,403,484号、同5,571,689号及び同5,663,143号。
【００７７】
ほとんどのファージディスプレイ法では、糸状ファージを使用しているが、ラムダ型ファージディスプレイシステム(国際公開第95/34683号；米国特許第5,627,024号)、Ｔ４ファージディスプレイシステム(Renら, Gene, 215: 439 (1998)；Zhuら, Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998)；Jiangら, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997)；Renら,  Gene, 195(2):303-311 (1997)；Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996)；Efimovら, Virus Genes, 10: 173 (1995))及びＴ７ファージディスプレイシステム(Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993)；米国特許第5,766,905号)もまた知られている。
【００７８】
基本的なファージディスプレイコンセプトの多くの他の改善及び変形が今もなされている。これらの改善により、選択された標的分子に対する結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングし、所望される性質に対してこれらのタンパク質をスクリーニングする可能性を有する機能的タンパク質を表示するディスプレイシステムの能力が高められる。
【００７９】
ファージディスプレイ反応のための組合せ反応装置が開発されており(国際公開第98/14277号)、ファージディスプレイライブラリーは、二分子の相互作用(国際公開第98/20169号；国際公開第98/20159号)及び拘束らせん型ペプチド(国際公開第98/20036号)の特性を分析し制御するために使用されている。国際公開第97/35196号には、親和性リガンドの単離方法が記載されており、そこでは、ファージディスプレイライブラリーは、リガンドが標的分子と結合するであろう第１溶液と、親和性リガンドが標的分子と結合しないであろう第２の溶液と接触させられて、結合リガンドが選択的に単離される。国際公開第97/46251号には、親和精製抗体を用い、ランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングさせ、ついで結合ファージを単離し、その後マイクロプレートウェルを使用するマイクロパニングプロセスにより、高親和結合ファージを単離する方法が記載されている。親和タグとしての黄色ブドウ球菌プロテインＡの使用は報告されている(Liら (1998) Mol Biotech., 9:187)。国際公開第97/47314号には、基質サブトラクションライブラリーを使用して、ファージディスプレイライブラリーであってよい組合せライブラリーを用い酵素特異性を識別することが記載されている。ファージディスプレイを使用し、洗浄剤での使用に適した酵素を選択するためのスクリーニング法は、国際公開第97/09446号に記載されている。特異的結合タンパク質を選択するためのさらなる方法は、米国特許第5,498,538号、同5,432,018号、及び国際公開第98/15833号に記載されている。
【００８０】
また、ペプチドライブラリーを作製し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法は、米国特許第5,723,286号、同5,432,018号、同5,580,717号、同5,427,908号、同5,498,530号、同5,770,434号、同5,734,018号、同5,698,426号、同5,763,192号、及び同5,723,323号に開示されている。
モジュレーターポリペプチドを作製し、同定し、特徴付け、修飾し及び生成する方法は、当該分野において十分に確立されており、例えば米国特許出願公開第2005/0042216号のパラグラフ606〜608、614〜688に記載されている。
【００８１】
一実施態様では、ＤＳＣＲ１-依存性ＣｎＡ活性に拮抗するポリペプチドは、例えばRothermelら, Trends Cardiovascular Med. (2003), 13(1):15-21; Vegaら, J. Biol. Chem. (2002), 277(33):30401-30407に記載されているように、ＤＳＣＲ１ドメイン構造に基づいて設計可能である。例えばポリペプチドは、ヒトＤＳＣＲ１の約９６から約１２５位、又は約１０８から約１２２位のアミノ酸を含んでいてもよい。他の実施態様では、ポリペプチドはセリン-プロリン(ＳＰ)配列の少なくとも一部と、ヒトＤＳＣＲ１のＮ及び／又はＣ端カルシニューリン結合ドメインの少なくとも一部を含み、ここで該ポリペプチドはＣｎＡに結合してＣｎ-Ａ調節遺伝子発現を阻害することができる。
【００８２】
Ｃ．ＤＳＣＲ１モジュレーター小分子
一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーター小分子は、ＤＳＣＲ１活性を調節するここで定義したオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。ＤＳＣＲ１モジュレーター小分子は既知の方法を使用して同定され、化学的に合成されうる(例えば、PCT公開国際公開第00/00823号及び国際公開第00/39585号)。ＤＳＣＲ１モジュレーター有機小分子は、通常約２０００ダルトン未満の大きさ、又は約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、このような有機小分子は、よく知られている技術を使用し、過度の実験をすることなく同定可能である。この点に関し、ポリペプチド標的に結合可能な分子に対して有機小分子ライブラリをスクリーニングするための技術は、当該分野においてよく知られている(例えば、PCT公開国際公開第00/00823号及び国際公開第00/39585号を参照)。ＤＳＣＲ１モジュレーター有機小分子は、例えばアルデヒド類、ケトン類、オキシム類、ヒドラゾン類、セミカルバゾン類、カルバジド類、第１級アミン類、第２級アミン類、第３級アミン類、Ｎ置換ヒドラジン類、ヒドラジド類、アルコール類、エーテル類、チオール類、チオエーテル類、ジスルフィド類、カルボン酸類、エステル類、アミド類、尿素類、カルバメート類、カルボネート類、ケタール類、チオケタール類、アセタール類、チオアセタール類、アリールハロゲン化物、スルホン酸アリール類、アルキルハロゲン化物、スルホン酸アルキル類、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン類、アルケン類、アルキン類、ジオール類、アミノアルコール類、オキサゾリジン類、オキサゾリン類、チアゾリジン類、チアゾリン類、エナミン類、スルホンアミド類、エポキシド類、アジリジン類、イソシアネート類、塩化スルホニル類、ジアゾ化合物、酸塩化物等であってよい。
【００８３】
Ｄ．核酸を含むＤＳＣＲ１モジュレーター
一態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは核酸分子を含む。例えば、核酸分子は、センス／アンチセンスオリゴヌクレオチド、阻害性／干渉性ＲＮＡ(例えば低分子阻害性／干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ))、又はアプタマーを含んでいてもよい。これらの核酸モジュレーターをスクリーニングし、同定し、作製するための方法は当該分野で知られている。
【００８４】
例えば、ｓｉＲＮＡは、伝統的なアンタゴニスト、例えば小分子又は抗体が機能していない箇所で遺伝子発現を調節可能であることが証明されている。(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003))。インビトロ合成された二重鎖で、３０より少ないヌクレオチド長(例えば、約１５〜２５、１７〜２０、１８〜２０、１９〜２０、又は２１〜２３ヌクレオチド)のＲＮＡは、干渉性ＲＮＡ(ｉＲＮＡ)として作用可能で、また遺伝子発現を特異的に阻害可能である(例えば、Fire A., Trends in Genetics  (1999), 391; 806-810; 米国特許出願第09/821832号、同09/215257号；米国特許第6,506,559号；PCT/US01/10188; 欧州特許出願第00126325号を参照)。これらのｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの分解を調節することにより、少なくとも部分的に作用すると考えられる。しかしながら、それらは３０ヌクレオチド長以下であるため、細胞の抗ウイルス防御機構を惹起しない。このような機構には、インターフェロンの生成、宿主細胞タンパク質合成の一般的活動停止が含まれる。実際に、ｓｉＲＮＡは合成され、ついでＤＮＡベクター内でクローン化可能である。このようなベクターを形質移入し、高レベルでｓｉＲＮＡを発現させることができる。高レベルのｓｉＲＮＡ発現は、細胞内に生成されるタンパク質の量を有意に低減させるか、又は「ノックダウン」するのに使用され、よって、タンパク質の過剰発現が病的疾患に関連していると考えられる細胞状況において有用である。
【００８５】
アプタマーは、ＤＳＣＲ１タンパク質等、標的分子に結合可能な核酸分子である。アプタマーの産生及び治療的用途は、当該分野で十分に確立されている。例えば、加齢黄斑変性の治療に対しては、Macugen(登録商標)(Eyetech, New York)の治療効果、及び米国特許第5,475,096号を参照。
アンチセンス技術は、当該分野で十分に確立されている。この技術に関するさらなる詳細は、以下に提供する。
【００８６】
Ｅ．製薬用製剤
本発明に従って使用されるＤＳＣＲ１モジュレーターの治療用製剤は、所望の純度を有するＤＳＣＲ１モジュレーターを、任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、保存用に調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、アセテート、トリス、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウム等の等張化剤(tonicifiers)；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ポリソルバート等の界面活性剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、プルロニクス(PLURONICS)(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８７】
また、ここでの製剤は、治療される特定の兆候に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を持つものを含みうる。例えば、ＤＳＣＲ１モジュレーターに加えて、付加的なモジュレーター、例えばＤＳＣＲ１タンパク質上の異なるエピトープに結合する第２の抗体、又はいくつかの他の標的に対する抗体を、一つの製剤に含めることが望ましい場合がある。あるいは又は付加的に、組成物は、化学療法剤、細胞障害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤をさらに含有してもよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組合せて、適切に存在している。
【００８８】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに封入されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
【００８９】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド類(米国特許第3,773,919号)、Ｌグルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に用いる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって直ぐに達成される。
【００９０】
Ｆ．本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを用いた治療
本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、様々な非治療的用途を有している。該モジュレーターは、ＤＳＣＲ１発現疾病の病期分類又は検出(例えば放射性イメージング)に有用でありうる。抗体、オリゴヌクレオチド及び有機小分子もまた、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、細胞集団における細胞性イベントを調節するＤＳＣＲ１のインビトロでの検出及び定量のために、細胞からのＤＳＣＲ１の精製及び免疫沈降に有用である。
【００９１】
現在、癌の段階に応じて、癌治療は、次の治療の一又は併用を含む：癌組織を取り除くための外科手術、放射線治療、及び化学療法。ＤＳＣＲ１モジュレーターを含む治療は、化学療法の副作用及び毒性に対する十分な耐性のない高齢の患者及び放射線治療が限定された実用性しか有さない転移性疾患において、特に所望される。治療的用途では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは単独で、又はホルモン、血管新生抑制、又は放射標識化合物、又は外科手術、凍結療法、及び／又は放射線治療との併用治療に使用することができる。ＤＳＣＲ１モジュレーターは、他の形態の従来からの治療法と同時に、従来からの治療法の前又は後に投与することができる。化学療法剤、例えばTAXOTERE(登録商標)(ドセタキセル)、TAXOL(登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン、及びミトキサントロンは、癌治療、特にグッドリスク患者に使用される。ＤＳＣＲ１モジュレーターは、一般的に治療的有効量の化学療法剤と共に投与される。他の実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、パクリタキセル等の化学療法剤に起因する副作用が減じるように、化学療法と併用して投与される。医師療用卓上参考書(ＰＤＲ)には、様々な癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述したこれら化学療法剤の投与計画及び用量は、治療されている特定の癌、疾病の程度、当業者の医師が精通している他の要因に依存し、医師により決定することができる。
【００９２】
ＤＳＣＲ１モジュレーターは、既知の方法に従い、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間にわたる連続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入経路によりヒト患者に投与される。抗体、オリゴペプチド又は有機小分子の静脈内又は皮下投与が、本発明の一実施態様において好ましい。
【００９３】
他の治療計画を、ＤＳＣＲ１モジュレーターの投与と併用してもよい。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬用製剤を使用する同時投与、及び何れかの順序での連続投与を含み、好ましくは、両方の(又は全ての)活性剤が同時に生物学的活性を示す期間があるものである。好ましくは、そのような併用治療により、相乗的治療効果及び／又は所望しない副作用の低減に至る。
特定の病的状態に関連する他の抗原に対する治療剤の投与と、ＤＳＣＲ１モジュレーターの投与を組合せることもまた望ましい。
【００９４】
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なった化学療法剤のカクテルの同時投与を含む、ＤＳＣＲ１モジュレーター分子と一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤の併用投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシウレア、及びヒドロキシウレアタキサン類(例えば、パクリタキセル及びドキセタキセル(doxetaxel))及び／又はアントラサイクリン系抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは、製造者の使用説明書に従うか、又は当業者が経験的に決定して使用されうる。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編, M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)に記載されている。
【００９５】
ＤＳＣＲ１モジュレーターは、抗ホルモン化合物；例えば抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(例えば欧州特許出願公開第616812号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドと、このような分子に対して知られた用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は、抗アンドロゲン治療を予め受けていてもよく、癌がアンドロゲン非依存性になった後に、ＤＳＣＲ１モジュレーターを患者に投与してもよい。
【００９６】
しばしば、患者には、心臓保護剤(治療に伴う心筋機能不全を防止又は低減するため)、又は一又は複数のサイトカインを同時投与することも有益であり得る。上述した治療計画に加えて、患者は、ＤＳＣＲ１モジュレーター治療の前、同時又は後に、癌細胞の外科的除去及び／又は放射線治療を受けてもよい。上述した同時投与される任意の薬剤の適切な用量は、現在使用されている量であり、薬剤とＤＳＣＲ１モジュレーターとの併用作用(相乗効果)のために低減させてもよい。
【００９７】
疾患の予防及び治療に対して、投与される用量及び方式は、既知の基準に従い、医者により選択されるであろう。ＤＳＣＲ１モジュレーターの適切な用量は、上述したように、治療される疾患のタイプ、重篤度及び病歴、ＤＳＣＲ１モジュレーターが治療又は予防目的で投与されるかどうか、過去の治療法、患者の臨床的病歴、及びＤＳＣＲ１モジュレーターに対する反応性、及び主治医の裁量に依存するであろう。ＤＳＣＲ１モジュレーターは、一回又は連続した治療に対して患者に適切に投与される。一実施態様では、ＤＳＣＲ１モジュレーターは、静脈内注入又は皮下注射により投与される。一又は複数回の別々の投与又は連続注入であってもなくても、疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重(約０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を、患者へ投与するための初期候補用量とすることができる。投与計画には、初期負荷用量約４ｍｇ／ｋｇ、続いて約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量のＤＳＣＲ１モジュレーター抗体の投与が含まれる。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。典型的な毎日の用量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲でありうる。数日間又はそれ以上にわたる繰り返し投与については、病状に応じて、疾病の兆候が所望される程度に抑制されるまで、治療は継続される。この治療の進展度合いは、医者又は他の当業者に知られている基準に基づき、従来からの方法及びアッセイにより、容易にモニターすることができる。
【００９８】
患者へのポリペプチドモジュレーター(例えば、ポリペプチド、抗体等)の投与の他に、本発明では、遺伝子治療によるモジュレーター投与が考察されている。ＤＳＣＲ１モジュレーターを含む／コードする核酸のこのような投与は、「治療的有効量のＤＳＣＲ１モジュレーターの投与」なる表現に含まれる。細胞内抗体を生じせしめるための遺伝子治療の使用に関連しては例えば1996年3月14日に公開された国際公開第96/07321号を参照。
【００９９】
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるためにインビボ及びエキソビボという２つの主要なアプローチ法がある。インビボ送達では、核酸が患者に、通常はＤＳＣＲ１モジュレーターが必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ治療では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、改変された細胞を患者に直接又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜内にカプセル化して投与する(米国特許第4,892,538号及び同5,283,187号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。該技術は、核酸が培養細胞にインビトロで移入されるか、又は意図している宿主の細胞にインビボで移入されるかに応じて変わる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０１００】
一実施態様では、インビボ核酸移入技術には、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス)、及び脂質ベースの系(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)の形質移入を含む。現在知られている遺伝子作製及び遺伝子治療プロトコルの概説については、Andersonら, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第93/25673号とそこに引用された参考文献も参照。
【０１０１】
本発明のＤＳＣＲ１モジュレーター抗体は、ここでの「抗体」の定義に包含される異なった形態でありうる。例えば、抗体には、完全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、及びその機能的断片が含まれる。
【０１０２】
本発明は、ＤＳＣＲ１モジュレーターと担体を含有する組成物を提供する。さらなる実施態様では、組成物は、化学療法剤を含む細胞障害剤又は成長阻害剤等の他の治療剤と組合せて、ＤＳＣＲ１モジュレーターを含有可能である。また本発明は、ＤＳＣＲ１モジュレーター及び担体を含有する製剤も提供する。一実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
【０１０３】
Ｇ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、ＤＳＣＲ１モジュレーターを使用する疾患の治療に有用な物質を含む製造品にある。製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器は、病状の治療に有用な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の疾患の治療のために使用されることを示している。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に組成物を投与するための使用説明書をさらに含むであろう。加えて、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備していてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０１０４】
様々な目的に有用なキットもまた提供される。例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット等、インビトロでＤＳＣＲ１を検出し定量するために本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを含むキットを提供することができる。製造品の場合と同様、キットも容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。容器は、少なくとも一の本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターを含有する組成物を収容する。例えば希釈液及びバッファー、コントロール抗体を収容している付加的な容器が具備せしめられてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物の説明、並びに意図したインビトロ又は検出用途のための使用説明書を提供し得る。
【０１０５】
Ｈ．ポリペプチド又は核酸を含むＤＳＣＲ１モジュレーター−特定の形態及び用途
一実施態様では、本発明の核酸は、内因性ＤＳＣＲ１核酸に結合可能な又はＤＳＣＲ１ポリペプチドをコードする一本鎖核酸配列(ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＤＳＣＲ１ＤＮＡのコード化領域の断片を少なくとも含む。そのような断片は、一般には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krolら(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
【０１０６】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の早期停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する二重鎖の形成をもたらす。そのような方法は本発明に含まれる。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、内皮細胞におけるＤＳＣＲ１タンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖-ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、国際公開第91/06629号に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(すなわち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１０７】
アンチセンス結合に好ましい遺伝子内部位には、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)の翻訳開始／出発コドン(５'-ＡＵＧ／５'-ＡＴＧ)又は終結／停止コドン(５'-ＵＡＡ、５'-ＵＡＧ及び５-ＵＧＡ／５'-ＴＡＡ、５'-ＴＡＧ及び５'-ＴＧＡ)が導入された領域が含まれる。これらの領域は、翻訳開始又は終結コドンからいずれかの方向(すなわち５'又は３')に約２５から約５０の近接ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。アンチセンス結合のための他の例示的領域は、イントロン；エクソン；イントロン-エクソン接合；オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)又は「コード化領域」で、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域であるもの；５'-５'トリホスファート結合を介してｍＲＮＡの５'最端残基に結合したＮ７-メチル化グアノシン残基を含み、ｍＲＮＡの５'キャップを含み、また、５'キャップ構造それ自体並びにキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチド；５'非翻訳領域(５'ＵＴＲ)、翻訳開始コドンから５'方向へのｍＲＮＡの一部、よってｍＲＮＡの翻訳開始コドンと５'キャップ部位との間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの；及び３'非翻訳領域(３'ＵＴＲ)、翻訳終結コドンから３'方向へのｍＲＮＡの一部、よってｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３'末端との間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むものを含む。
【０１０８】
ＤＳＣＲ１ポリペプチドの発現抑制に有用なアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド類が含まれる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有していないものが含まれる。この明細書の目的のため、また当該分野でしばしば参照されるように、それらのヌクレオシド骨格内にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシドであると考えることもできる。例示的な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ-エステル、３'-アルキレンホスホネート、５’-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３'-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び正常な３'-５'結合を有するボラノ-ホスフェート、これらの２'-５'結合類似体、及び一又は複数のヌクレオチド間結合が３'-３'、５'-５'又は２'-２'結合である逆の極性を有するものが含まれる。逆の極性を有する例示的なオリゴヌクレオチドは、３'最端ヌクレオチド結合に一つの３'-３'結合を含み、すなわち脱塩基性であってもよい一つの逆位ヌクレオシド残基を有する(核酸塩基が欠失しているか、又はその場所にヒドロキシル基を有する)。また種々の塩、混合塩及び遊離酸の形態も含まれる。リン含有結合の調製について教示している代表的な合衆国特許には、限定されるものではないが、それぞれ出典明示によりここに援用される米国特許第3,687,808号；同 4,469,863号；同4,476,301号；同5,023,243号；同5,177,196号；同5,188,897号；同5,264,423号；同5,276,019号；同5,278,302号；同5,286,717号；同5,321,131号；同5,399,676号；同5,405,939号；同5,453,496号；同5,455,233号；同5,466,677号；同5,476,925号；同5,519,126号；同5,536,821号；同5,541,306号；同5,550,111号；同5,563,253号；同5,571,799号；同5,587,361号；同5,194,599号；同5,565,555号；同5,527,899号；同5,721,218号；同5,672,697号及び同5,625,050号が含まれる。
【０１０９】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格の例は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は一又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有するものである。これらには、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から一部が形成される)；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を有する他のものが含まれる。このようなオリゴヌクレオシドの調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；第5,792,608号；第5,646,269号及び第5,677,439号が含まれる。
【０１１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、すなわち骨格は、新規の基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物でのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基が保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許第5,539,082号；同5,714,331号；及び同5,719,262号が含まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
【０１１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの例には、ホスホロチオエート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｏ-ＣＨ２-［メチレン(メチルイミノ)又はＭＭＩ骨格として知られている］、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-及び-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-ＣＨ２- [天然ホスホジエステル骨格は、-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-と表せる]で、上述の米国特許第5,489,677号に記載のもの、及び上述の米国特許第5,602,240号のアミド骨格が組み込まれる。付加的な例は、上述の米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１１２】
修飾オリゴヌクレオチドは、一又は複数の置換された糖部分をさらに含みうる。例示的なオリゴヌクレオチドは、２'位に次のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ-アルキル、Ｓ-アルキル、又はＮ-アルキル；Ｏ-アルケニル、Ｓ-アルキニル、又はＮ-アルケニル；Ｏ-アルキニル、Ｓ-アルキニル又はＮ-アルキニル；又はＯ-アルキル-Ｏ-アルキルで、アルキル、アルケニル及びアルキニルが置換又は未置換のＣ１からＣ１０アルキル又はＣ２からＣ１０アルケニル及びアルキニルであってよいもの。特に好ましくは、Ｏ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、及びＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３)]２であり、ここでｎ及びｍは１から約１０である。他の例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２'位に次のものの一つを含む：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリル又はＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、及び類似した特性を有する他の置換基。一つの可能な修飾には、２'-メトキシエトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２'-Ｏ-(２-メトキシエチル)又は２'-ＭＯＥとしても知られる)(Martinら, Helv. CHim. Acta, 1995, 78,486-504)、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらなる好ましい修飾には、２'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２'-ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基、及び２'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(２'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチル又は２'-ＤＭＡＥＯＥとしても当該分野で知られている)、すなわち２'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ２)が含まれる。
【０１１３】
さらなる修飾には、２'-ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合し、よって二環式糖部分を形成しているロックド核酸(ＬＮＡ)(Locked Nucleic Acids)が含まれる。結合は、２'酸素原子及び４'炭素原子に結合するメチレン(-ＣＨ２-)ｎ基であり得、ここでｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製物は、国際公開第98/39352号及び国際公開第99/14226号に記載されている。
【０１１４】
他の修飾には、２'-メトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ３)、２'-アミノプロポキシ(２'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、２'-アリル(２'-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)、２'-Ｏ-アリル(２'-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)及び２'-フルオロ(２'-Ｆ)が含まれる。２'-修飾は、アラビノ(上流)位置又はリボ(下流)位置にあってよい。２'-アラビノ修飾の一つは２'-Ｆである。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に２'-５'結合したオリゴヌクレオチド、又は３'末端ヌクレオチドにおける糖の３'位置、及び５'末端ヌクレオチドの５'位置でもなされうる。またオリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖に代えて、例えばシクロブチル部分等の糖模倣体を有していてもよい。このような修飾された糖構造の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第4,981,957号；同5,118,800号；同5,319,080号；同5,359,044号；同5,393,878号；同5,446,137号；同5,466,786号；同5,514,785号；同5,519,134号；同5,567,811号；同5,576,427号；同5,591,722号；同5,597,909号；同5,610,300号；同5,627,053号；同5,639,873号；同5,646,265号；同5,658,873号；同5,670,633号；同5,792,747号；及び同5,700,920号が含まれる。
【０１１５】
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基(多くの場合、当該分野では単に「塩基」と称される)の修飾又は置換を含んでもよい。ここで使用される場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン(Ａ)及びグアニン(Ｇ)、及びピリミジン塩基のチミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)及びウラシル(Ｕ)が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５-メチルシトシン(５-ｍｅ-Ｃ)、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２-プロピル及び他のアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミン、及び２-チオシトシン、５-ハロウラシル及びシトシン、５-プロピニル(-Ｃ≡Ｃ-ＣＨ３又は-ＣＨ２-Ｃ≡ＣＨ)ウラシル及びシトシン、及びピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６-アゾウラシル、シトシン及びチミン、５-ウラシル(シュードウラシル)、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシル、及び他の８-置換アデニン類及びグアニン類、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチル及び他の５-置換ウラシル類及びシトシン類、７-メチルグアニン及び７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニン、及び８-アザアデニン、７-デアザグアニン、及び７-デアザアデニン、及び３-デアザグアニン及び３-デアザアデニンが含まれる。さらなる修飾された核酸塩基には、三環式のピリミジン類、例えばフェノキサジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾオキサジン-２(３Ｈ)-オン)、フェノチアジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾチアジン-２(３Ｈ)-オン)、Ｇ-クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン(例えば、９-(２-アミノエトキシ)-Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾオキサジン-２(３Ｈ)-オン)、カルバゾールシチジン(２Ｈ-ピリミド[４,５-ｂ]インドール-２-オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ-ピリド[３',２':４,５]ピロール[２,３-ｄ]ピリミジン-２-オン)が含まれる。また修飾された核酸塩基には、プリン又はピリミジン塩基が、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジン及び２-ピリドン等、他の複素環で置き換えられたものも含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859、Kroschwitz, J. I.編 John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、及びEnglischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているものが含まれる。ある種のこれらの核酸塩基は、特に本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これらには、５-置換ピリミジン類、６-アザピリミジン類、及びＮ-２、Ｎ-６及びＯ-６置換されたプリン類、特に２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシル、及び５-プロピニルシトシンが含まれる。５-メチルシトシン置換は、０．６−１．２℃で核酸二本鎖の安定性を増加させることが示されており(Sanghviら, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、例えば２'-Ｏ-メトキシエチル糖修飾と組合た場合の、例示的な塩基置換である。修飾された核酸塩基の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許第3,687,808号、並びに米国特許第4,845,205号；同5,130,302号；同5,134,066号；同5,175,273号；同5,367,066号；同5,432,272号；同5,457,187号；同5,459,255号；同5,484,908号；同5,502,177号；同5,525,711号；同5,552,540号；同5,587,469号；同5,594,121号；同5,596,091号；同5,614,617号；同5,645,985号；同5,830,653号；同5,763,588号；同6,005,096号；同5,681,941号及び同5,750,692号が含まれる。
【０１１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取込を高める一又は複数の部分又はコンジュゲートを、オリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。本発明の化合物は、第１級又は第２級ヒドロキシル基等の官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン類、ポリアミド類、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を高める基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール類、脂質、カチオン性脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、及び染料が含まれる。この発明において、薬力学的特性を高める基には、オリゴマーの取込を改善し、分解に対するオリゴマー耐性を高め、及び／又はＲＮＡとの配列特異性ハイブリッド形成を強化する基が含まれる。この発明において、薬物動態学的特性を高める基には、オリゴマーの取込、分布、代謝又は排出を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には、限定されるものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分(Letsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、例えばヘキシル-Ｓ-トリチルチオール(Manoharanら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauserら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基(Saison-Behmoarasら, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanovら, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchukら, Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム１,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロ-３-Ｈ-ホスホナート(Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Sheaら, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Manoharanら, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、又はアダマンタン酢酸(Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishraら, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性薬物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(Ｓ)-(＋)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２,３,５-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツラート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートしていてもよい。オリゴヌクレオチド薬剤コンジュゲート及びそれらの調製物は、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許出願番号09/334,130(1999年6月15日に出願)、及び米国特許第 4,828,979号；同4,948,882号；同5,218,105号；同5,525,465号；同5,541,313号；同5,545,730号；同5,552,538号；同5,578,717号；同5,580,731号；同5,580,731号；同5,591,584号；同5,109,124号；同5,118,802号；同5,138,045号；同5,414,077号；同5,486,603号；同5,512,439号；同5,578,718号；同5,608,046号；同4,587,044号；同4,605,735号；同4,667,025号；同4,762,779号；同4,789,737号；同4,824,941号；同4,835,263号；同4,876,335号；同4,904,582号；同4,958,013号；同5,082,830号；同5,112,963号；同5,214,136号；同5,082,830号；同5,112,963号；同5,214,136号；同5,245,022号；同5,254,469号；同5,258,506号；同5,262,536号；同5,272,250号；同5,292,873号；同5,317,098号；同5,371,241号；同5,391,723号；同5,416,203号；同5,451,463号；同5,510,475号；同5,512,667号；同5,514,785号；同5,565,552号；同5,567,810号；同5,574,142号；同5,585,481号；同5,587,371号；同5,595,726号；同5,597,696号；同5,599,923号；同5,599,928号及び同5,688,941号に記載されている。
【０１１７】
与えられた化合物における全ての位置が一様に修飾されている必要はないが、実際には、一以上の上述した修飾が、単一化合物又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ導入されうる。また本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。この発明において、「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、２又はそれ以上の化学的に異なる領域を含み、それぞれが少なくとも一のモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから構成されるアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の向上、細胞取込の増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加が、オリゴヌクレオチドに付与されるようにオリゴヌクレオチドを修飾した少なくとも一の領域を有する。オリゴヌクレオチドの付加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質となりうる。例えば、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡストランドを切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。よって、ＲＮａｓｅＨの活性化により、結果的にＲＮＡ標的が切断され、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド抑制の効果がかなり向上する。その結果、多くの場合、同じ標的領域にハイブリッド形成されるホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較し、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、匹敵する結果がより短いオリゴヌクレオチドで得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は、２又はそれ以上の上述したオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合体構造として形成されうる。例示的なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドには、３'端に少なくとも一の２'修飾糖(好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３)が導入されてヌクレアーゼ耐性が付与され、少なくとも４の近接する２'-Ｈ糖類を有する領域が導入されてＲＮａｓｅＨ活性が付与される。このような化合物は、当該分野ではハイブリッド又はギャップマー(gapmer)とも称される。例示的なギャップマーは、少なくとも４の近接した２'-Ｈ糖類を有する少なくとも一の領域により分離した５'端及び３'端に２'修飾糖類(好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３)の領域を有し、ホスホロチオエート骨格結合が導入されうる。このようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第5,013,830号；同5,149,797号；同5,220,007号；同5,256,775号；同5,366,878号；同5,403,711号；同5,491,133号；同5,565,350号；同5,623,065号；同5,652,355号；同5,652,356号；及び同5,700,922号が含まれる。
【０１１８】
この発明で使用されるアンチセンス化合物は、固相合成でよく知られている技術により、簡便にかつ常套的に作製されうる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems(Foster City, Calif.)を含むいくつかの供給元から販売されている。当該分野で知られているこのような合成のための任意の他の手段が、付加的に又は代替的に使用され得る。ホスホロチオエート類及びアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチド類を調製するため、同様の技術を使用することがよく知られている。また本発明の化合物は、取込、分布及び／又は吸収性を補助するため、他の分子、分子構造又は化合物の混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口用、直腸用、局所用又は他の製剤と混合、カプセル化、コンジュゲート等されてもよい。取込、分布及び／又は吸収性が補助された調製物の調製法を教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第5,108,921号；同5,354,844号；同5,416,016号；同5,459,127号；同5,521,291号；同5,543,158号；同5,547,932号；同5,583,020号；同5,591,721号；同4,426,330号；同4,534,899号；同5,013,556号；同5,108,921号；同5,213,804号；同5,227,170号；同5,264,221号；同5,356,633号；同5,395,619号；同5,416,016号；同5,417,978号；同5,462,854号；同5,469,854号；同5,512,295号；同5,527,528号；同5,534,259号；同5,543,152号；同5,556,948号；同5,580,575号；及び同5,595,756号が含まれ、これらのそれぞれを出典明示によりここに援用する。
【０１１９】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、国際公開第90/10048号に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１２０】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えばＣａＰＯ４媒介性ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子移入方法により、又はエプスタイン・バーウイルス等の遺伝子移入ウイルスを使用し、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。例示的な手順において、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボのいずれかで、組換えレトロウイルスベクターと接触される。適切なレトロウイルスベクターには、限定されるものではないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶ、Ｎ２(Ｍ-ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス)、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名された二重コピーベクターが含まれる(国際公開第90/13641号を参照)。
【０１２１】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第91/04753号に記載されるように、リガンド結合分子とのコンジュゲートの形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入されうる。適切なリガンド結合分子には、これらに限定されないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれる。一般に、リガンド結合分子のコンジュゲートは、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合するか、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲート体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第90/10448号に記載されるように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入されうる。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０１２２】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般的に少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０又は１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」なる用語は、基準長さのプラスマイナス１０％の基準ヌクレオチド配列長を意味する。
【０１２３】
ＤＳＣＲ１モジュレーターポリペプチドコードする核酸は遺伝子治療にもまた使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために、細胞に遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、単回の治療により継続的効果が達成される一般的な遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したホスホジエステル基を非荷電基で置換することによって、取り込みを促進するように修飾することができる。
【０１２４】
生存細胞に核酸を導入するために利用される様々な技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入を含む(Dzauら, Trends, in Biotechnology 11, 205-210[1993])。いくつかの状況では、核酸供給源に、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的にする薬剤を提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取込の促進のために用いられ得る。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-2232 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコルの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１２５】
本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターポリペプチド及び核酸分子は、組織タイピングに診断目的で使用でき、ここでＤＳＣＲ１ポリペプチドは、他のものと比較して一の組織、好ましくは同じ組織型の正常な組織と比較して病気の組織で、差次的に発現し得る。
【０１２６】
この発明は、ＤＳＣＲ１を調節するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト薬候補のスクリーニングアッセイは、ＤＳＣＲ１ポリペプチドと結合又は複合体形成するか、又は例えば細胞からのＤＳＣＲ１ポリペプチドの発現の阻害を含む、ＤＳＣＲ１ポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用に干渉する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野でよく特徴付けられたものを含む様々な方式で実施することができる。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をＤＳＣＲ１ポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１２７】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出することができる。特定の実施態様では、ＤＳＣＲ１ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般に固体表面をＤＳＣＲ１ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＤＳＣＲ１ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することによって検出できる。
【０１２８】
候補化合物が相互作用するが、ＤＳＣＲ１ポリペプチに結合しない場合、そのＤＳＣＲ１との相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通しての同時精製などの常套的なアプローチ法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者ら(Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにしてモニターすることができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の刊行物に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性を利用して、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合しているものと、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合しているものの２つのハイブリッドタンパク質を用いる。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する発色基質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERＴＭ)は、Clontechから商業的に入手可能である。このシステムは、特定のタンパク質相互作用に関連するタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれらの相互作用とって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１２９】
ＤＳＣＲ１と細胞内又は細胞外成分との相互作用に干渉する化合物は、次のようにして試験できる：通常、ＤＳＣＲ１と細胞内又は細胞外成分を含む反応混合物を、その２つの生成物の相互作用と結合を可能にする条件と時間をかけて調製する。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不在下と存在下で実施される。また、プラシーボを第３の反応混合物に添加して、ポジティブコントロールとしてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のようにしてモニターされる。試験化合物を含む反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の生成は、試験化合物が該試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示している。
【０１３０】
アンタゴニストをアッセイするために、ＤＳＣＲ１ポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングされる化合物と共に細胞に添加してよく、ＤＳＣＲ１ポリペプチドの存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＤＳＣＲ１ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。ＤＳＣＲ１ポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセプター分子に結合したＤＳＣＲ１ポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。
【０１３１】
潜在的なＤＳＣＲ１アンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されるアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、ここで、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的のｍＲＮＡにハイブリッド形成しタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法は共にポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、成熟ＤＳＣＲ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０の塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用できる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)を参照)、それによりＤＳＣＲ１ポリペプチドの転写及び産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＤＳＣＲ１ポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボで発現されて、ＤＳＣＲ１ポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０から＋１０位の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１３２】
潜在的アンタゴニストは、ＤＳＣＲ１ポリペプチドの活性部位、タンパク質相互作用部位、又は他の関連結合部位に結合し、それによりＤＳＣＲ１ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限定されないが、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物を含む。
【０１３３】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成と、続くエンドヌクレアーゼ的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定することができる。さらなる詳細は、例えばRossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、国際公開第97/33551号(1997年9月18日公開)を参照。
【０１３４】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなるものでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介してトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上にプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のPCT公報、国際公開第97/33551号を参照。
これらの小分子は、上で検討したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた任意の他のスクリーニング技術により同定することができる。
【０１３５】
一実施態様では、内部移行抗体が好ましい。抗体は、細胞内への抗体の送達性を高めるある種の特徴を有し、又はそのような特徴を有するように修飾され得る。これを達成するための技術は当該技術で知られている。さらなる他の実施態様では、標的細胞内に抗体を発現させ得る核酸を導入することにより、標的細胞内で抗体を発現させることができる。例えば、米国特許第6,703,019号；同6,329,173号；及びPCT公報第2003/077945号を参照。また、リポフェクション又はリポソームを、細胞内に抗体を送達せしめるために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害断片が一般的に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計可能である。このようなペプチドは、化学的に合成可能であり、及び／又は組換えＤＮＡ技術により産生させることができる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照。
【０１３６】
標的細胞内へのモジュレーターポリペプチドの挿入性は、当該分野で知られている方法により高めることができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質に由来するもの等のある種の配列は、細胞膜を通過する異種タンパク質の効率的な取込みを可能にする。例えば、Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329を参照。
【０１３７】
ここでの製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼすことのない相補的活性を有するものをまた含んでいてもよい。あるいは、又は付加的に、該組成物はその機能を高める薬剤、例えば細胞障害剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤をさらに含有していてもよい。このような分子は、意図される目的に有効な量で組合せて、適切に存在している。
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述した一般的記載が与えられると、様々な他の実施例を実施することができると理解される。実施例は例証の目的のためだけに提供するもので、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１３８】
我々は、内皮細胞中において血管形成因子により調節される遺伝子のゲノム全域の分析を実施し、ＤＳＣＲ１が最も有意に誘導される遺伝子の一つであることを同定した。カルシニューリン(ＣｎＡ)シグナル伝達に対する拮抗機能と一致して、内皮細胞中のＤＳＣＲ１の発現は、脱リン酸化、核移行、及びＣｎＡシグナル伝達の媒介に関与する転写因子、活性化Ｔ細胞核因子(ＮＦＡＴ)の活性をブロックした。ＤＳＣＲ１はＶＥＧＦにより誘導されるだけでなく、ＣｎＡシグナル伝達を活性化させる他の化合物によっても誘導され、活性化された内皮細胞中でのＤＳＣＲ１のさらに一般的な役割が示唆された。ここに示すように、ＤＳＣＲ１の一過性発現は、様々な炎症マーカー遺伝子を弱化させ、活性化された内皮細胞中におけるＤＳＣＲ１のまだ知られていない調節的役割を特定する。内因性ＤＳＣＲ１のノックダウンはＮＦＡＴ活性を増大させ、活性化された内皮細胞上での炎症遺伝子の発現を刺激した。よって、同定された内皮細胞中でのＤＳＣＲ１とＣｎＡシグナル伝達との間のネガティブ調節フィードバックループは、内皮細胞の活性化、例えばＶＥＧＦＲ２を介したＶＥＧＦによる活性化後の炎症遺伝子の発現の基礎をなす潜在的分子メカニズムを表す。
【０１３９】
脈管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)は、ＶＥＧＦＲ-１及び-２と称される２つの膜貫通チロシンキナーゼレセプターに結合し、それがホスホリパーゼＣ-γ、ホスファチジルイノシトール３(ＰＩ-３)キナーゼ／ＡＫＴ、Ｒａｓグアノシントリホスファターゼ活性化タンパク質、及びＳｒｃファミリーを含む多様なシグナル伝達経路を調節し、よって多様な脈管機能を制御する(概説は、Ferrara及びGerber１を参照)。ＶＥＧＦは、腫瘍増殖、慢性炎症、及び糖尿病性網膜症を含む多様な疾病に関連した生理学的及び病理学的血管形成の重要なレギュレーターを表す。一般に、病的な血管形成を伴う悪性腫瘍においてＶＥＧＦ活性に干渉すると、しばしば疾病の進行を鈍化させ、耐性が良好となり、健康で成熟した脈管構造に有意には影響しなかった(概説は、Ferraraら２を参照)。ＶＥＧＦは、脈管完全性を混乱させ、脈管漏出３６、３７を誘導する能力に基づき、ＶＰＦ-血管透過性因子-としてもまた知られている。ＶＥＧＦＲ-２に選択的に結合するＶＥＧＦ変異体は、内皮細胞分裂促進因子及び透過性促進剤として作用するが、ＶＥＧＦＲ-１選択的ＶＥＧＦ変異体はこれらの活性を有さないと思われる。ＶＥＧＦＲ-２を介したＶＥＧＦシグナル伝達及び脈管混乱は、治療的血管形成設定下でのＶＥＧＦのいくつかの用途に関連していると考えられる脈管漏出の増大に対する主要な経路であると思われる。内皮細胞中でＶＥＧＦにより特異的に調節される新規遺伝子を同定して、病的な脈管構造と正常な脈管構造において差次的に発現される遺伝子を同定した。
【０１４０】
我々は、ＶＥＧＦの添加が血清飢餓により誘導される内皮細胞アポトーシスを強力に抑制した十分に確立されたインビボ内皮細胞生存アッセイを使用した。このアッセイは、内皮細胞中におけるシグナル伝達経路の分子成分を同定するのに特に有用であった。例えば、このアッセイ系は、ＰＩ-３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達経路の重要な役割と、内皮細胞生存３,４に対するＢｃｌ２の重要性の検証に有用であった。インビボでの前臨床研究において観察されたように、それらが、血管新生中のＶＥＧＦに対する内皮細胞の顕著な依存性を模倣しているため、同様の条件を現在の研究で選択した。ジーンコーリング(GeneCalling)法(CuraGen, Branford, CT)を使用し、全ヒト内皮トランスクリプトーム５におけるＶＥＧＦ標的遺伝子の検出を探究した。
【０１４１】
ここで我々は、新規のＶＥＧＦ標的遺伝子してのＤＳＣＲ１の同定、及び内皮細胞における抗炎症性シグナル伝達分子としてのＤＳＣＲ１の機能的特徴付けについて記載する。ヒト遺伝子(ＤＳＣＲ１)は、ヒト染色体２１(ＨＣ２１)上の最小領域内に存在する５０〜１００遺伝子の一つであり、これは、２以上のコピーが存在する場合、ダウン症候群(ＤＳ)６として集合的に知られている精神遅滞を引き起こす。ＤＳＣＲ１は、カルシニューリンに結合する能力を共通に共有する、ヒトにおいて３つのメンバーＤＳＣＲ１／ＭＣＩＰ１、ＺＡＫＩ-４／ＤＳＣＲ１Ｌ１／ＭＣＩＰ２、及びＤＳＣＲ１Ｌ２／ＭＣＩＰ３を含む、カルシプレッシン(calcipressins)３８、３９、４０又は調節性カルシニューリン相互作用タンパク質(ＭＣＩＰ)とも称される保存タンパク質のファミリーに属する。ＤＳＣＲ１は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ｂ(ＰＰ２Ｂ)又はカルシニューリンＡ(ＣｎＡ)により調節される細胞質シグナル伝達低分子として機能する。ネガティブ調節フィードバックループと一致して、ＣｎＡ活性はＤＳＣＲ１との結合により抑制される。ＤＳＣＲ１は、発育中の中枢神経系及び心臓に高度に発現しているが、成人では、横紋筋細胞及び心筋細胞６を含む多数の組織及び細胞型において中程度の発現が検出されている。これらの中でも、ＤＳＣＲ１は、横紋筋細胞７におけるＣｎＡシグナル伝達に干渉し、インビボ８での動物モデルにおける心肥大を抑制することが示された。また、Minamiら(J. Biol. Chem. (2004), 279(48):50537-50554)は、ＤＳＣＲ１がトロンビンにより誘導され得ることを報告している。さらにＤＳＣＲ１の慢性的過剰発現は、アルツハイマー病等の疾病に関連しており、脈管炎症及び脈管混乱は、アルツハイマー病、血管性認知症、混合認知症等に関係している。 Ermakら, J. Biol. Chem. (2001), 276(42):38787-38794４１、４３. Townsendら, Ann. N.Y. Acad. Sci. (2002)977:65-76; 及びIadecolaら, Stroke, (2003)34;335-337。
【０１４２】
ＣｎＡは、様々な細胞外シグナル伝達及び環境ストレスに対する細胞性応答の間において重要な役割を担っており、アポトーシス、記憶プロセス、及び骨格及び心筋成長及び分化の調節において重要である(概説は、Rothermelら９及びCrabtree及びOlson１０を参照)。ＣｎＡにより活性化されたＴ細胞転写因子の核因子(ＮＦＡＴｃｌ)の脱リン酸化は、核へのその移行を促進させ、そこで、ＡＰ１、ｃＭＡＦ、ＧＡＴＡ又はＭＥＦ２ファミリー１１のメンバーを含む他の転写因子と協同的に作用する。この遺伝子ファミリーの４つのメンバー(ＮＦＡＴｃｌ-ｃ４)は多くの組織で発現し、神経誘導、骨格及び心筋肥大、心臓弁発育の間において重要な役割を示す(概説は、Hill-Eubanks１２を参照)。炎症細胞におけるそれらの調節的役割に加え、マウスにおける近年の遺伝子破壊実験では、ＮＦＡＴ転写因子ファミリーのいくつかのメンバーに対する独立した脈管機能が示唆されている。これらの発見により、ＮＦＡＴ転写因子は内皮細胞の生存に必要ではないが、血管成熟中１３−１５に血管アセンブリの矯正に重要な役割を担っていることが示唆された。
【０１４３】
過去の研究では、ホルボール１２-ミリステート１３-アセテート(ＰＭＡ)及びイオノマイシン(ＩＯ)１６、１７等のＣｎＡシグナル伝達刺激剤に暴露した内皮細胞中のＮＦＡＴのリン酸化及び核移行が示されていた。シクロスポリンＡ(ＣｓＡ)は、ＣｎＡの強力な阻害剤で、遺伝子発現に対するＣｓＡの抑制効果に基づき、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)１６、Ｃｏｘ-２１８、インターロイキン８(ＩＬ-８)１９、及び組織因子(ＴＦ)２０を含む、いくつかの潜在的ＣｎＡ標的遺伝子が、活性化された内皮細胞において記載されている。よって、いくつかの潜在的ＣｎＡ標的遺伝子は内皮細胞で同定され、ＣｎＡシグナル伝達に対するＤＳＣＲ１の拮抗活性がリンパ球及び心筋細胞で記載されているが、内皮細胞中でのＣｎＡシグナル伝達におけるＤＳＣＲ１の役割は知られていなかった。
【０１４４】
本研究は、活性化された内皮細胞中におけるＣｎＡの新規な内在性インヒビターとしてＤＳＣＲ１を同定するもので、内皮細胞中における炎症マーカー遺伝子発現に対するＤＳＣＲ１レベルの調節の生物学的結果を記載する。例えば、ここで示されるように、内在性ＤＳＣＲ１との干渉で、ＮＦＡＴ活性が増大し、炎症のいくつかのマーカーの発現が刺激され、ＤＳＣＲ１の内在レベルの調節が脈管炎症に十分影響を及ぼすことが示された。
【０１４５】
材料及び方法
ヒトＤＳＣＲ１のクローニング
５'端にＣｌａＩ部位(ＤＳＣＲ１-５'ＣｌａＩ)、３'端にＥｃｏＲ１部位(ＤＳＣＲ１-３'ＥｃｏＲ１)を導入するように設計したプライマーを使用して市販の発現配列タグ(ＥＳＴ)クローン(Incyte, Palo Alto, CA)を用い、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によってＤＳＣＲ１をクローニングした。ＰＣＲ断片をサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)駆動発現ベクターＰＲＫＮ(Genentech, South San Francisco, CA)中にクローニングし、ＣａｌＩ及びＥｃｏＲ１で切断し、挿入断片をさらなる実験に供する前に、配列決定により確認した。Ｃ端にＦＬＡＧエピトープを付加的に導入した(ＤＳＣＲ１-Ｆｌａｇ)。
【０１４６】
試薬。  特に示さない限り、全ての一次抗体はBD Pharmingen(San Diego, CA)から得、組換えヒトＶＥＧＦ(ｒｈＶＥＧＦ)はGenentechから得、塩基性線維芽細胞増殖因子(ｂ-ＦＧＦ)及び腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ-α)はR&D Systems(Minneapolis, MN)から購入した。
【０１４７】
細胞及び細胞アッセイ。  一次ヒト内皮細胞をClonetics (Santa Rosa, CA)から購入し、製造者の使用説明書に従い培養した。ジーンコーリング実験のため、ヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)をClonetics(BioWhittaker, Walkersville, MD)から購入し、製造者の使用説明書に従い、５％のウシ胎児血清(ＦＣＳ)が補填された内皮増殖培地に保持した。細胞(１×１０７)を１９０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で分け、各条件に対して３回の実験を並行して行った。細胞の播種の２４時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)及び０．１％のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)又は０．１％のＢＳＡ＋ＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)又は５％のＦＣＳのいずれかを含む培地(Clonetics)で洗浄した。ＲＮＡ単離及び逆転写-ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)分析を記載されたようにして実施した２１。細胞培養実験については、次の条件を使用した：ヒト(ｈ)ＶＥＧＦ、３０ｎｇ／ｍＬ；ｈＴＮＦ-α、１０ｎｇ／ｍＬ；ＰＭＡ、２００ｎｇ／ｍＬ(Calbiochem, LaJolla, CA)；ＣｓＡ、１μＭ(Calbiochem)；ＩＯ、５μＭ(Sigma, St Louis, MO)；タプシガルジン、５０ｎＭ(Sigma)。一例では、阻害性(ｓｉ)ＲＮＡを、それぞれの遺伝子の完全長ｃＤＮＡに基づき、「スマート-プール」サービス(Dharmacon, Lafayette, CO)を使用し、Dharmacon(Lafayette, CO)により産生した。アデノウイルス形質導入生存実験については、ヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を、製造者の使用説明書に従い、５％ＦＣＳが補填された内皮増殖培地(ＥＢＭ-２)に保持した。３×１０５細胞を６ウェルプレートのウェル毎に分け(Primaria, BD Biosciences, Bedford, MA)、各条件に対して２回の実験を並行して行った。細胞を、室温でバーティカルシェーカーで１０ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｎＭのＭｇＣｌ２を含む無血清培地で２時間、反転したコード配列を有するアンチセンスコンストラクト(Ａｄ-ＤＳＣＲ１-ＡＳ)、ＤＳＣＲ１(Ａｄ-ＤＳＣＲ１)、ｇＤペプチド(Ａｄ-コントロール)をコードするアデノウイルスに感染させた(ＭＯＩ=１００)。その後、５％ＦＣＳを含む標準的な増殖培地を５倍容量添加し、ＣＯ２インキュベータ中に細胞を１日保持した。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含む基本培地(Clonetics, Santa Rosa, CA)を添加し、示すようにＰＭＡ／ＩＯ、Ｈ２Ｏ２及びＺＶＡＤを添加した。血清飢餓及び投薬の２４時間後、Coulter 製スタイル細胞カウンターで細胞を計数した。細胞培養の実験では、次の条件を使用した：ＰＭＡ：２００ｎｇ／ｍｌ(Calbiochem, LaJolla, CA)、イオノマイシン：５μＭ(Sigma, St. Louis, MO)、３％のＨ２Ｏ２溶液を基本培地に１：３００で希釈し、０．１％ＢＳＡを加え、０．０１％のＨ２Ｏ２溶液にした、ＺＶＡＤ５μＭ。
【０１４８】
アデノウイルスベクターの産生及び内皮細胞の形質導入
Ａｄ-ＤＳＣＲ１-Ｆｌａｇ及びＡｄ-ＬａｃＺを、本質的に製造者により記載されたようにして、Stratagene (La Jolla, CA)のＡｄ-イージーベクター作成キットのポリリンカー部位にＮｏｔＩ-ＮｏｔＩｃＤＮＡ挿入断片をクローニングすることにより構築した。
【０１４９】
ジーンコーリング
差次的に発現する新規遺伝子を同定するために、「オープン」技術、例えば遺伝子発現連続分析(ＳＡＧＥ)及びジーンコーリングを使用した。ジーンコーリングは他の箇所で記載されている５、２２。
各処理グループからのサンプルを逆転写し、定量的発現分析(ＱＥＡ)５にかけた。分析は、少なくとも２倍に調節された遺伝子の同定に焦点を合わせた。条件依存性遺伝子発現プロファイルを探求する最初の分析は、先に記載されたようにして５、ＱＥＡ又はジーンコーリングにより実施した。
【０１５０】
ウエスタンブロット及び免疫沈降
１０ｃｍ皿の培養細胞を、トリス（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）緩衝生理食塩水及び０．６ｍＬのＲＩＰＡバッファー(１０ｍＭのＰＢＳ、１％のノニデットＰ-４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム[ＳＤＳ]、１００ｍｇ／ｍＬのフッ化フェニルメチルスルホニル、３０μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム)で２回洗浄し、プロテアーゼインヒビター(Roche Pharmaceuticals, Gaithersburg, MD)を添加した。ヒトＮＦＡＴｃ１、ｃ２及びｃ３に対して産生されたマウスモノクローナル抗体(ｍＡｂ)をSanta Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)から購入した。Ｃｏｘ-２、細胞間接着分子-１(ＩＣＡＭ-１)、血管細胞接着分子-１(ＶＣＡＭ-１)、ヒトＥ-セレクチンに対する親和精製ヤギポリクローナル抗体はBD Pharmingenからのものである。全内皮細胞抽出、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)、ブロット、及び免疫検出を Santa Cruz Biotechnologyのプロトコルに従い実施した。全体で６０ｍｇの全細胞抽出物を、４％から１６％のポリアクリルアミドゲルの各レーンに充填した。高感度化学ルミネッセンス(ＥＣＬ)反応キットをAmersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)から購入し、Vector Laboratories(Burlingame, CA)からの西洋わさびペルオキシダーゼストレプタビジンを使用した。ＮＦＡＴｃ１実験では、同量の細胞抽出物を充填し、ＮＦＡＴｃ１(ｍＡｂ ７Ａ６；１：５００；Santa Cruz Biotechnology)及び充填コントロールα-チューブリン(ＩＣＮからのｍＡｂ；Santa Ana, CA；１：５０００)を可視化した。Ｃｏｘ-２及びＴＦ免疫ブロット分析では、同量の細胞溶菌液を６％から１２％の勾配ＳＤＳ-ＰＡＧＥに充填した。Ｃｏｘ-２を抗Ｃｏｘ-２ｍＡｂ(ＲＤＩ、１：５００)を用いて分析し、抗ｈＴＦｍＡｂ(クローン７Ｇ１１)を用いてＴＦをGenentechで生成させ、１：５００の希釈度で使用した。ゲルにサンプルを充填する前に、タンパク質量を定量しておき、適宜調節した。充填コントロールとして、抗γアダプチンｍＡｂを、４％から２０％のポリアクリルアミドゲルで使用した(１：１０００)。
【０１５１】
内皮細胞アポトーシスの分析
蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)分析では、本質的にGerberら J Biol Chem. 1998;273: 30336-30343に記載されているようにして、細胞をフルオレセインイソチオシアネート-コンジュゲートアネキシンＶ、及び蛍光染料ヨウ化プロピジウムにより染色した。
【０１５２】
一次ヒト内皮細胞の一過性形質移入及びルシフェラーゼアッセイ
ＨＵＶＥＣ及びヒト微小血管内皮細胞(ＨＭＶＥＣ)の一過性形質移入では、３ｍＬの培養培地(Primaria; BD Biosciences, Bedford, MA)中において、６ウェル皿のウェル毎に細胞(７．５×１０４)を播種した。リポフェクション混合物に使用されるプラスミドＤＮＡの量を、全体で３ウェルの形質移入に対して算出した。ついで、１．２５μｇの発現ベクター、３．７５μｇのルシフェラーゼレポーター、及び２．０μｇのＳＶ-ウミシイタケリファレンスレポーターを混合し、１４μｌのＦ１リポフェクション試薬(Targeting Systems, Santee, CA)を添加した。ついで、４．５ｍＬの高グルコースダルベッコ変性イーグル培地(ＤＭＥＭ)を混合物に添加した。一過性形質移入を製造者に推奨されているようにして実施した。レポーター遺伝子発現実験では、製造者の推奨に従い、３００μＬの１×受動溶菌バッファー中でデュアルルシフェラーゼレポーターキット(Dual Luciferase Reporter Kit)(Promega, San Luis Obispo, CA)を使用して細胞を溶解させた。
【０１５３】
ｓｉＲＮＡを含む一過性形質移入実験では、ＨＵＶＥＣを一過性形質移入実験に対して記載されているように６ウェルプレートに播種した。６つの複製については、６００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ(Dharmacon, Lafayette, CO)、７．５μｇのルシフェラーゼ、及び４μｇのウミシイタケレポーターコンストラクトを、６ｍＬの高グルコースＤＭＥＭにおいて混合した。ＦＡＣＳ及び免疫組織化学的(ＩＨＣ)実験では、１１．５μｇの高感度緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)プラスミドを、ルシフェラーゼプラスミドの代わりに添加した。３７℃で２５〜３０分インキュベートする前に、３０μＬのTargefect液Ａと６０μｌのTargefect液Ｂ(Targeting Systems)を混合物に添加し；１ｍＬのこの液を記載されているようにしてリポフェクションに使用した。無血清培地の添加前に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、表示した時間、投与した。
【０１５４】
ＤＳＣＲ１及びＮＦＡＴＣ１のｓｉＲＮＡアンタゴニスト
遺伝子名    ベースの受託番号    センス鎖５'-＞３'の配列
血管形成因子(例えばＶＥＧＦ)活性化研究においてプールとして使用：
DSCR1       NM_004414    GCUCAGACCUACACAUAG
DSCR1       NM_004414    GGACAUCACCUUUCAGUAU
DSCR1       NM_004414    GAAAGAAUGAGGAGACCUA
DSCR1       NM_004414    GACAUCACCUUUCAGUAUU
ＰＭＡ／ＩＯ活性化研究において使用
DSCR1       NM_004414    AACGUAUGACAAGGACAUCAC
遺伝子名    ベースの受託番号    センス鎖５'-＞３'の配列
NFATC1      NM_172390,   CGUAUGAGCUUCGGAUUGA
NFATC1      NM_172390,   GCAGAGCACGGACAGCUA
NFATC1      NM_172390,   UCAGAAACUCCGACAUUGA
NFATC1      NM_172390,   GCCGGAAUCCUGAAACUCA
注釈：列挙された全てのｓｉＲＮＡは各鎖に３'-オーバーハング、アンチセンス鎖のみに５'-ホスファートを有する。
【０１５５】
免疫蛍光顕微鏡法
一次ヒト内皮細胞(７×１０３細胞／ｃｍ２)を、染色の２４時間前に８チャンバー顕微鏡用スライド(Nalgene Nunc, Naperville, IL)の各ウェルに播種した。細胞を、室温でバーティカルシェーカーに１０ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｎＭのＭｇＣｌ２を含む無血清培地で２時間、ＬａｃＺ又はＤＳＣＲ１をコードするアデノウイルスに感染させた(感染効率[ＭＯＩ]=１００)。その後、標準的な増殖培地を５倍容量添加し、ＣＯ２インキュベータ中に細胞を２日間保持した。培地を取り替えた後、細胞を、３０ｎｇ／ｍＬ濃度のｈＶＥＧＦで２０分処理した。様々な抗体と共にインキュベートする前に、−２０℃で４分間、細胞をメタノールで固定し、室温でＰＢＳで洗浄した。室温で１時間、一次マウス抗ヒトＮＦＡＴｃ１抗体(sc7294, Santa Cruz Biotechnology)を含むＰＢＳ中でインキュベートした。ついで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Alexa Fluor４８８抗マウスＩｇＧ(Molecular Probes, Eugene, OR)を含むＰＢＳ中でインキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Vectashield培地(Vector Laboratories)中、カバーガラスの下に置いた。ｘ６３オイル対物レンズを使用するAxioCam MRモノクロカメラ(Zeiss, Thornwood, NY)が取付けられたZeiss Axiovert 200蛍光顕微鏡を用い、顕微鏡観察及び写真撮影を実施した。
【０１５６】
ウサギ中でのヒトＤＳＣＲ１に対するポリクローナル抗体の産生及びウエスタンブロット分析
ＤＳＣＲ１を、プライマーＤＳＣＲ１-ＥｃｏＲＩ-Ｐｒｏ５'を用いてＰＣＲ増幅させ、余分にプロリンとＤＳＣＲ１-Ｓｔｏｐ-ＸｈｏＩ３'を添加し、テンプレートとしてＤＳＣＲ１ｃＤＮＡを使用して、ｐＧＥＸ-ＫＧにクローニングした。ＧＳＴ-ＤＳＣＲ１を発現させ、本質的に過去に記載されたようにして２３精製した。ポリクローナルウサギ抗ＧＳＴ-ＤＳＣＲ１を、組換えＧＳＴ-ＤＳＣＲ１を用いた免疫化によって調製した。濾過された粗血清をウエスタンブロット(１：４００)に使用した。オリゴ及びＴａｑＭａｎプローブプライマーセットを表１に示す。
表１．オリゴ及びＴａｑＭａｎプローブプライマーセット
プライマーセット
HSDSCR1.1113FP      5'(FAM)-AGG TTG TGA AAA CAG CAG CAA TGC AAT GT-(TAMRA)P3'
HSDSCR1.1088.F      CCA CAG GAA GCC GCC TAG T
HSDSCR1.1171.R     TGA GGG AAG AAA GGA AAC GCT
HSGMCSF-571T      5'(FAM)-AGG TCC AGG CCA CTC CCA CC GT-(TAMRA)P3'
HSGMCSF-515F      GTC ATC TTG GAG GGA CCA A
HSGMCSF-610R      TTC TGC CAT GCC TGT ATC A
HSTF-1911T          5'(FAM)-TTA ACT GAC TTA AGT GGC ATT AAA CAT TTG AGA GCT AA GT- (TAMRA)P3'
HSTF-1880F          CAG CTT CCT AAT ATG CTT TAC AAT CT
HSTF-2025R          CAA TGT CAA CCA TAG AAG CTT TAA GTA
HSCOX-2-3152T      5'(FAM)-CCT GGC TAC CTG CAT GCT GTT CC GT-(TAMRA)P3'
HSCOX-2-3130F      CAG TAG GTG CAT TGG AAT CAA
HSCOX-2-3207R      TCT TAG CAA AAT GGC TAA AAG AAG
HSCD34-2497T        5'(FAM)-ATC CCT GCT CAA CCC CTC TGG A GT-(TAMRA)P3'
HSCD34-2447F        CCC AGG TCC TTG TTT GCT
HSCD34-2519R        TCC AAC CGT CAT TGA AAC C
HSVCAM-1-2686T      5'(FAM)-CGA AGT TTG TTC ATC AGA CTC CTG TGC GT-(TAMRA)P3'
HSVCAM-1-2665F      GCA TGG TAC GGA GAT GTT TC
HSVCAM-1-2730R      GGC CAC ATT GGG AAA GTT
DSCR1-EcoRI-Pro 5'  CCGAATTCCCATGCATTTTAGAAACTTTAACTACAG
DSCR1-Stop-XhoI 3'  GGGCTCGAGCTAGCTGAGGTGGATCGGCGTGTACTCC
【０１５７】
結果
新規なＶＥＧＦ標的遺伝子の同定
血清の不在下においてＶＥＧＦにより特異的に調節される遺伝子を、それぞれ基本条件(添加なし[ＮＡ])のものと比較して、ＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)又は５％のＦＣＳで刺激されたＨＵＶＥＣ由来の遺伝子発現プロファイルの示差電子的サブトラクションにより同定した。このような分析の視覚ディスプレイを図１Ａに示すが、これは、ＶＥＧＦがそれぞれ刺激の６時間後に４．８倍、２４時間後に２．９倍の、ＨＵＶＥＣ中におけるＤＳＣＲ１ｍＲＮＡ発現を誘導したことを示している。５％のＦＣＳの存在で、ＤＳＣＲ１の発現レベルは有意に変化しなかった。総括して、我々は、それぞれ６時間後及び２４時間後に、ＦＣＳ刺激細胞中における遺伝子発現の改変を表す１．８％及び４．４％の微量の変化を検出した。ＶＥＧＦ刺激細胞では、それぞれ６及び２４時間後に１．７％及び３．４％の遺伝子に変化が観察された。ＦＣＳではなくＶＥＧＦにより特異的に誘導される４６のｃＤＮＡ断片の同一性を、過去に記載されているようにして決定した５。２８のｃＤＮＡは既知遺伝子又はＥＳＴに対応するもので、これらの中でもＤＳＣＲ１が最も強く誘導された。残った１８のｃＤＮＡ断片は、公的データベース内の如何なる既知の配列にも一致しなかった。２８の既知遺伝子のなかの１３(４６％)は、分泌因子のクラスに属し、これはさらに分泌性組織２４としての内皮の重要な役割を強調する。全体で６の遺伝子(２１％)が、ＤＳＣＲ１を含むシグナル伝達に潜在的に関与している細胞質タンパク質のクラスに属している。３つのリボソーム、２つのミトコンドリア、２つの転写因子、１つの細胞周期調節遺伝子、及び翻訳調節に関与している１つの遺伝子を含む残りの９の遺伝子(３７％)は、代謝及び細胞周期調節に関与する遺伝子クラスを表す。
【０１５８】
活性化された内皮細胞に至らしめる条件はＤＳＣＲ１発現を誘導する
ジーンコーリング法から得られた結果を実証するため、我々は、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ分析(ＴａｑＭａｎ)により、ＶＥＧＦ又は他の内皮細胞分裂促進因子で刺激された種々のヒト内皮細胞中のＲＮＡレベルを分析した。我々の先の結果(図１Ａ)を確認し、血清飢餓ＨＵＶＥＣにＦＣＳ又はｂ-ＦＧＦを添加しても、ＤＳＣＲ１レベルを有意には変化させなかったが、ＶＥＧＦを添加すると、ＨＵＶＥＣ中において３６時間を越えてＤＳＣＲ１の延長された発現が誘導された(図１Ｂ)。これらの発見は、ジーンコーリング実験からのデータを確認し、ＤＳＣＲ１が有糸分裂内皮細胞中で発現される一般的マーカーではないことが示唆された。
【０１５９】
２つのＶＥＧＦＲのそれぞれがＤＳＣＲ１の誘導をどの程度媒介しているかを評価するために、我々は、過去に記載２５、２６されたようにして、排他的な形で各ＶＥＧＦＲを活性化させる変異ＶＥＧＦ型を試験した。ＶＥＧＦＲ-２選択的変異体型(ＶＥＧＦＲ２-ｓｅｌ)は、ＤＳＣＲ１発現の誘導においてＶＥＧＦに等しく強力である。これに対し、ＶＥＧＦＲ-１選択的リガンド(ＶＥＧＦＲ１-ｓｅｌ及びＰＩＧＦ)は、ＤＳＣＲ１発現における改変を誘導できず、ＶＥＧＦＲ-２はＤＳＣＲ１発現の誘導に十分であることが示された(図１Ｂ−Ｃ)。
【０１６０】
異なる組織から単離された内皮細胞は、ＶＥＧＦＲ発現のレベル又はそれらのシグナル伝達経路において変わり得、これはＶＥＧＦ標的遺伝子の発現プロファイルに影響を及ぼす可能性がある。そのような潜在的細胞型特異的な差異について試験するために、我々は、ヒト肺大動脈内皮細胞(ＨＰＡＥＣ)、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(ＨＭＶＥＣ)、及びヒト大動脈内皮細胞(ＨＵＡＥＣ)を、ＶＥＧＦ又はレセプター選択的突然変異型を用いて刺激し、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲによりＤＳＣＲ１発現を分析した。ネガティブコントロールとして、我々は、有意なレベルのＶＥＧＦレセプターを発現しない(データを示さず)、ヒト肺大動脈平滑筋細胞(ＨＰＡＳＭＣ)を試験した。試験した全ての内皮細胞では、ＶＥＧＦＲ１-ｓｅｌではなく、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２-ｓｅｌによる刺激に応じて、ＤＳＣＲ１の発現レベルが増加することが示されており、ＶＥＧＦＲ-２が多様な内皮細胞におけるＤＳＣＲ１の誘導に必要かつ十分であることが示された(図１Ｃ及びデータを示さず)。一般に、ほとんどの細胞型では、ＨＵＶＥＣと比較した場合、ＶＥＧＦによる長時間にわたる刺激の後、ＤＳＣＲ１発現において、あまり突出した増加は示されなかった(図１Ｂ)。
【０１６１】
活性化された内皮細胞に一般的に至らしめる条件でＤＳＣＲ１発現が誘導されるかどうか、またＣｎＡがＤＳＣＲ１の調節に関与しているかどうかを評価するために、我々は、ＴＮＦ-α、又はＣｎＡシグナル伝達を活性化させる化合物、例えばカルシウムイオン透過孔Ａ２３１８７[GenBank](ＩＯ)を、単独で又はＰＭＡ及びタプシガルジン、他のＣｎＡシグナル伝達のアクチベーターと併用して、ＨＵＶＥＣを刺激した。５．５時間(図１Ｄ)及び１８時間(データを示さず)後、全ての化合物はＤＳＣＲ１ｍＲＮＡレベルを有意に増加させ、そのような誘導は、ＣｓＡ、ＣｎＡシグナル伝達のインヒビターの存在下で、強力に抑制された。興味深いことに、ＴＮＦ-αは、ＶＥＧＦで観察されたのと同様のレベルまでＤＳＣＲ１を誘導した。ＨＵＶＥＣから調製された全細胞抽出物のウエスタンブロット分析により、ＶＥＧＦ、ＰＭＡ／ＩＯ、及びタプシガルジン(図１Ｅ)による刺激の６時間後、ＤＳＣＲ１の誘導が確認された。ｍＲＮＡレベルでの発見と同様、ＤＳＣＲ１タンパク質レベルにおける有意な増加は、ｂ-ＦＧＦ又は５％のＦＣＳを用いた刺激の後では見出されなかった。ｍＲＮＡレベルでの発見に対して、我々は、ＴＮＦ-αで刺激された細胞におけるＤＳＣＲ１タンパク質レベルの増加は検出できず、ＶＥＧＦ及びＴＮＦ-αによるＤＳＣＲ１発現の調節には異なるメカニズムがあることが示唆された。活性化された内皮細胞におけるＤＳＣＲ１レベルに対するＣｓＡの阻害効果に基づき、我々は、この誘導が大部分はＣｎＡにより媒介されると結論づけた。しかしながら、ＴＮＦ-αでの刺激後のＣｓＡによるｍＲＮＡ発現の不完全な抑制は、内皮細胞にさらなる未知の調節メカニズムが存在していることを示唆している。
【０１６２】
ＤＳＣＲ１はＮＦＡＴの核移行を防止する
ヒト肺静脈内皮細胞(ＨＰＶＥＣ)に添加すると、ＶＥＧＦは、刺激後２７２０分と早い時間でＮＦＡＴｃ１の核移行を誘導した。よって、我々は、ＨＵＶＥＣにおけるＮＦＡＴｃ１の核移行の動態、及びＤＳＣＲ１がどの程度でこのプロセスに干渉するのかを分析した。内皮細胞のＩＨＣ分析により、ＶＥＧＦにより刺激された細胞におけるＮＦＡＴｃ１の顕著な核局在化が明らかとなり、それは、刺激の２０分後(図２Ａ)、及び６０分及び１２０分といった長時間のインキュベート後(データを示さず)ＤＳＣＲ１を発現している細胞には存在しなかった。我々の知っている限りでは、これは、活性化された一次ヒト内皮細胞においてＤＳＣＲ１とＮＦＡＴｃ１の間で機能的干渉があり、ＮＦＡＴｃ１の核移行が防止されることの最初の証明である。また、我々は、ＩＨＣ法によるコントロールベクター(Ａｄ-ＬａｃＺ)又はエピトープ-タグＤＳＣＲ１をコードするベクターを用いたアデノウイルス(Ａｄ-ＤＳＣＲ１-ＦＬＡＧ)形質導入後の内皮細胞におけるＤＳＣＲ１の細胞内局在を研究した。先の報告７、２８、４１と一致して、我々は、Ａｄ-ＤＳＣＲ１-ＦＬＡＧを用いた形質導入後のＤＳＣＲ１の細胞質及び核局在化を検出し、これはＶＥＧＦ又はＩＯ／ＰＭＡの存在下で変わらなかった(データを示さず)。
【０１６３】
セリンスレオニンホスファターゼＣｎＡによるＮＦＡＴｃ１の脱リン酸化により、核に入り転写を刺激することができる２８、この転写因子の活性化型が生じる。よって、我々は、内皮細胞におけるＮＦＡＴｃ１のリン酸化状態に対するＤＳＣＲ１の効果を、ＣｓＡにより誘導される効果と比較することを望んだ。Johnsonら２７による発見と同様、活性化された内皮細胞の細胞抽出物の分析により、ＤＳＣＲ１(図２Ｂにおいては「Ｐ」で標識)に応じて、ＮＦＡＴｃ１の脱リン酸化型からリン酸化型へのシフトが実証された。これらの変化はＣｓＡにより誘導される効果に匹敵し、ＣｎＡのホスファターゼ活性がブロックされたことを示唆する。さらに、全体的なＮＦＡＴｃ１タンパク質レベルはＤＳＣＲ１により増加しており、ＤＳＣＲ１発現がＮＦＡＴｃ１タンパク質の安定性に影響を及ぼすおそれがあることが示された。これに対して、ＣｓＡはＮＦＡＴｃ１タンパク質レベルを有意には変化させず、ＣｎＡ活性とＮＦＡＴｃ１リン酸化を調節するＣｓＡとＤＳＣＲ１との間の潜在的に異なる作用機序を示唆している。
【０１６４】
ＤＳＣＲ１はＮＦＡＴの転写活性を弱化する
形質転換した腫瘍細胞を用いた実験では、ＩＯ及びＰＭＡ２８等のＣｎＡを刺激する化合物に暴露された細胞において、ＤＳＣＲ１及びＮＦＡＴ転写活性の間に機能的干渉があることが実証された。このようなメカニズムが内皮細胞に存在するかどうかを試験するために、我々は、ＤＳＣＲ１に対して発現ベクターを一過性に同時形質移入し、内皮細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を分析して、ＮＦＡＴ活性のレベルを定量した。ＣｓＡにより誘導される効果と同様に、ＤＳＣＲ１の発現により、ＰＭＡ、タプシガルジン、ＴＮＦ-α、又はカルシウムイオン透過孔Ａ２３１８７[GeneBank]で刺激された内皮細胞におけるＮＦＡＴ駆動転写が強く抑圧された(図３Ａ)。ＤＳＣＲ１はＡＰ１活性に有意には干渉せず(図３Ｂ)、効果がＮＦＡＴに対して特異的であることが実証された。
【０１６５】
ＤＳＣＲ１は活性化された内皮細胞での炎症マーカー遺伝子の発現を抑制する
ＣｎＡ標的遺伝子発現に対するＤＳＣＲ１の発現増加の効果を研究するために、我々は、ＤＳＣＲ１をコードするアデノウイルスベクターを内皮細胞に形質導入し、活性後のＣｎＡ標的遺伝子の発現レベルを分析した。試験された条件には、ＶＥＧＦ、ＰＭＡ／ＩＯ又はタプシガルジン及びそれらの組合せと共に、４時間インキュベートすることが含まれる。リアルタイムＲＴ-ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの分析により、活性化された内皮細胞におけるＣＯＸ２、Ｅ-セレクチン、及びＴＦの有意な誘導が明らかとなった(図４Ａ)。先の報告と一致して、ＶＥＧＦによる刺激に応答した２〜３倍の増加は、ＩＯ／ＰＭＡ２０により誘導される遺伝子発現の１０〜２０倍の増加よりも顕著に低かった。これらの違いは、おそらく、細胞内で作用するＰＭＡが、細胞外で発現したＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦと比較して、ＣｎＡシグナル伝達のより強力なインデューサーであることを反映している。初めてここで実証されたように、ＤＳＣＲ１の発現により、ＶＥＧＦ又はＩＯ／ＰＭＡで刺激された内皮細胞において炎症マーカー遺伝子の発現が抑制された。
【０１６６】
ＲＮＡレベルのこれらの変化がタンパク質レベルでの改変と相関しているかどうかを検証するために、我々は、一連のＦＳＣＳ及びウエスタンブロット実験を実施した。図４Ｂ−Ｃに示されたデータには、ＤＳＣＲ１によるＥ-セレクチン、ＶＣＡＭ-１、ＴＦ、及びＣｏｘ-２のダウンレギュレーションが証明されている。ＴＦ及びＣｏｘ-２タンパク質レベルにおける低下は、ＣｓＡ単独により誘導される効果と比較した場合、ＤＳＣＲ１発現に応答してさらに顕著であった(図４Ｃ、レーン４及び７を４及び５と、６及び９を６及び５とそれぞれ比較せよ)。これらの発見は、ＤＳＣＲ１が、活性されたヒト内皮細胞において、ＣｓＡよりもより強力に、いくつかの炎症マーカー遺伝子の発現を低下させることを実証している。
【０１６７】
次に、我々は、ＶＥＧＦ刺激に応答した、ＤＳＣＲ１を含むＶＥＧＦ標的遺伝子の発現動態をモニターした。予期したように、ＧＭ-ＣＳＦ、ＴＦ、ＣＯＸ-２、ＶＣＡＭ-１及びＥ-セレクチンのＲＮＡレベルは、ＶＥＧＦ投与後、０及び２時間の間に増加した(図５Ａ)。しかしながら、このような誘導は一過性であり、コントロールの未処理細胞と比較した場合、刺激後の６から３６時間の間に、抑制に逆戻りした。コントロールとして、我々は、ＶＥＧＦ刺激に応答したＢｃｌ-２の発現を分析したが、これは全実験にわたって一致して発現されていた(図５Ａ及びGerberら３)。結論として、ＶＥＧＦ標的遺伝子の発現の低下は、ＶＥＧＦ刺激に応答したＤＳＣＲ１発現レベルの増加に一致した。データを組合せると、ＤＳＣＲ１が活性化された内皮細胞において、ＣｎＡシグナル伝達と干渉するネガティブフィードバックループで作用し得るという我々のモデルが支持される(図５Ｂ)。
【０１６８】
アデノウイルスＤＳＣＲ１を使用する混乱が内皮細胞生存率を調節する
ストレス状態に暴露された内皮細胞中でのＡｄ-ＤＳＣＲ１によるＤＳＣＲ１の過剰発現は、ＤＳＣＲ１アンチセンスコンストラクトの発現により内因性ＤＳＣＲ１が減少したように、内皮細胞死を誘導した。このことは、血清飢餓、Ｈ２Ｏ２暴露、及びＰＭＡ／ＩＯ処理下、特にＺＶＡＤ等のカスパーゼ阻害剤の存在下で見られた。
【０１６９】
ＤＳＣＲ１のノックダウンがＮＦＡＴ活性と活性化された内皮細胞での炎症マーカー遺伝子の発現を誘導した
ｓｉＲＮＡを用いた内皮細胞の形質移入の効果を試験するために、我々は、抗Ｆｌａｇ抗体を使用してＤＳＣＲ１のエピトープ-タグ型(ＤＳＣＲ１-ＦＬＡＧ)をコードする発現ベクターで同時形質移入された細胞のウエスタンブロット分析を実施した。あるいは、我々は、ウサギポリクローナル抗血清を使用することにより、ＤＳＣＲ１の内因性レベルを評価した。我々は、ＦＬＡＧタグ型(ＰＲＫＮ-ＤＳＣＲ１-ＦＬＡＧ)をコードする発現ベクターが同時形質移入されると、ＤＳＣＲ１タンパク質発現が完全に存在しないことを見出したが(図６Ａ)、これは、ＤＳＣＲ１を標的にするｓｉＲＮＡが、ＤＳＣＲ１発現を強力に低下させたことを示している。予想されるように、我々は、内因性ＤＳＣＲ１のレベルが５０％〜７０％低下することを見出したが、これは、ＧＦＰ発現ベクターを同時形質移入させた細胞の蛍光顕微鏡観察により評価されたものと同様の形質移入効果と一致した。これらのデータにより、ｓｉＤＳＣＲ１を用いた内皮細胞の一過性形質移入が、内皮細胞のタンパク質レベルを効果的に低減させることが示唆された。
【０１７０】
次に、我々はこれらの条件を適用し、ＣｎＡ下流シグナル伝達イベントに対する内因性ＤＳＣＲ１レベルの低下の影響を調べた。我々は、ＮＦＡＴ結合部位を含むルシフェラーゼレポーターコンストラクトでｓｉＲＮＡを一過性に同時形質移入し、ＶＥＧＦ又はＰＭＡ／ＩＯで形質移入内皮細胞を活性化させた。ＩＯ／ＰＭＡ(図６Ｃ)又はＶＥＧＦ(図６Ｄ)の双方が存在するコントロール形質移入細胞(ｓｉコントロール)に対して、細胞にｓｉＤＳＣＲ１を形質移入した場合、ＮＦＡＴ活性が２及び３倍に増加した。ｓｉＤＳＣＲ１形質移入細胞に対し、ｓｉＮＦＡＴｃ１形質移入細胞においてＮＦＡＴ活性が減少しており、一次ヒト内皮細胞に対するｓｉＲＮＡ同時形質移入法の有効性が確認された(図６Ｃ−Ｄ)。
【０１７１】
最後に、我々は、活性化された内皮細胞中でのＣｎＡ標的遺伝子発現に対する内因性ＤＳＣＲ１発現のノックダウンの効果について分析することを望んだ。ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞を選択するために、我々は、形質移入混合物にＧＦＰ発現ベクターを添加した。ＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳ分析により、ｓｉＤＳＣＲ１の存在下、ＴＦ、Ｅ-セレクチン、及びＶＣＡＭ-１を含むいくつかの炎症マーカー遺伝子の発現レベルの増加が明らかになった(図７Ａ)が、ＩＣＡＭ-１発現は有意には影響を受けなかった(データを示さす)。これに対して、ｓｉＮＦＡＴｃ１での細胞の同時形質移入では遺伝子発現がブロックされ、活性化された内皮細胞におけるＥ-セレクチン、ＶＣＡＭ-１、及びＴＦ発現でのこの転写因子の重要な役割が示唆された。興味深いことに、ＶＣＡＭ-１の基本及び活性化レベルは、双方ともｓｉＮＦＡＴｃ１により抑制され、ＶＣＡＭ-１の基本発現におけるＮＦＡＴｃ１の役割が証明された。ＶＥＧＦで刺激された細胞中におけるｓｉＤＳＣＲ１による炎症遺伝子発現の誘導の大きさは、ＰＭＡ／ＩＯで刺激された細胞について観察されたレベル以下であることがはっきりした(図７Ａ−Ｂ)。他の報告２０と同様に、これらの発見により、ＰＭＡ／ＩＯ等の薬理学的化合物に対して、カルシニューリンシグナル伝達を誘導するＶＥＧＦの潜在能力が低下することがさらに証明された。要約すると、我々の発見により、ＤＳＣＲ１の内因性レベルは、ＶＥＧＦ又は他のＣｎＡシグナル伝達のアクチベーターにより刺激される内皮細胞での炎症遺伝子の発現を抑制するのに十分であることが証明された。
【０１７２】
検討
ＣｓＡとＤＳＣＲ１との間の作用機序の差
ＤＳＣＲ１とＣｓは双方ともＣｎＡ活性に干渉するが、それらは、分子標的及び干渉メカニズムにおいて異なる。ＣｓＡ及びＦＫ５０６のような他の免疫抑制剤は、特定の細胞性イムノフィリン(それぞれＦＫＢ１２及びシクロフィリン)と複合体を形成することによりカルシニューリンを阻害し、この複合体はカルシニューリン上の複数の部位に結合する。これに対して、ＤＳＣＲ１は、ＮＦＡＴタンパク質で最初に同定されたカルシニューリン相互作用ドメインに似た構造的モチーフを介して直接ＣｎＡに結合する。これらの領域を欠くＤＳＣＲ１の切断型はＣｎＡに対する結合性に欠陥がある７(Rothermelら９を参照)ため、ＤＳＣＲ１内のこれらの保存モチーフは機能的重要性を有していると思われる。よって、ＤＳＣＲ１は、おそらくＮＦＡＴ及び他のリン酸化タンパク質基質への接近が阻害されることで、カルシニューリンの活性部位に直接接触すると考えられる。
【０１７３】
我々は、作用機序の差が異なる薬理効果に翻訳されるかどうかを分析した。図４に示すように、ＤＳＣＲ１及びＰＭＡ／ＩＯは、ＶＥＧＦ、タプシガルジン、又はＰＭＡ／ＩＯで刺激された内皮細胞において、Ｅ-セレクチン、ＴＦ、及びＣｏｘ-２を含むいくつかのＮＦＡＴ標的遺伝子の発現を有意に低下させた。しかしながら、ＤＳＣＲ１により誘導されるＮＦＡＴｃ１の過剰リン酸化及び遺伝子発現における低下は、ＣｓＡにより誘導される効果と比較した場合、一般により顕著である(図４Ｃ)。結論として、ＣｓＡに対する炎症遺伝子の発現に対するＤＳＣＲ１の阻害効果の増加は、内皮細胞における炎症イベントを調節する他のシグナル伝達経路にＤＳＣＲ１が干渉することに起因すると思われる。あるいは、差次的応答は、細胞中にＤＳＣＲ１を発現するアデノウイルスベクターとは対称的に培養培地に添加されるＣｓＡの薬理的特性の差異に起因している可能性がある。
【０１７４】
ＤＳＣＲ１と活性化された内皮細胞における炎症遺伝子の調節
ＣｎＡと下流転写因子ＮＦＡＴは、発達性血管形成において役割を担っていると思われる。双方のＮＦＡＴｃ１対立遺伝子に欠損のあるマウスは、鬱血性心不全の結果として、約１４．５の胎生期に、大動脈及び肺動脈弁発育欠陥と続く死亡を示す１３、１５。ＮＦＡＴｃ３及びＮＦＡＴｃ４を欠くマウスにおける２重ノックアウト実験は、弁の発育を損なわないが、血管アセンブリにおける全般的な欠陥のため１４、約１１日の胎生期に胚性致死に至る。類似した脈管表現型が、双方のＣｎＡ対立遺伝子に欠損を持つ胎仔で観察された。これらの発見により、ＣｎＡシグナル伝達経路は、内皮細胞の生存を直接は制御しないが、血管成熟にとって重要であることが示唆される。この意見を支持し、我々は、ＤＳＣＲ１レベルの変化に応答する内皮細胞生存における如何なる有意な変化も検出しなかった(データを示さず)。
【０１７５】
内皮細胞中におけるＤＳＣＲ１によるネガティブフィードバックループ
内皮細胞中において、ＣｓＡ１６、１８−２０により抑制される遺伝子の多くは、ＶＥＧＦ１６、１８−２０、３０−３３により調節されることが独立に記載されている。これらの知見は、ＶＥＧＦが、ＣｎＡを介してこのクラスの遺伝子を調節し得ることを意味している。この理論を支持して、ＶＥＧＦで刺激された内皮細胞にＣｓＡを添加すると、ＩＬ-８、ＧＭ-ＣＳＦ、及びＣｏｘ-２１８、３２−３４の発現レベルが弱化した。これら遺伝子の全てが一過性の形で、ＶＥＧＦによりアップレギュレートされ、ＶＥＧＦと共に長時間インキュベートすると、ダウンレギュレーションされる。内皮細胞における我々の仕事は、ＮＦＡＴｃ１、ＣｎＡシグナル伝達を媒介する転写因子と阻害性タンパク質ＤＳＣＲ１の同時のアップレギュレーションに注意を向けており、そこでは、ＤＳＣＲ１が内皮細胞にネガティブなフィードバックループ(図５Ｂ)を生じせしめる。このシグナル伝達経路を支持して、我々は、ＶＥＧＦ刺激の２時間後、Ｅ-セレクチン、ＴＦ、ＣＯＸ-２、及びＶＣＡＭ-１発現が最も高いレベルにあることを見出した。これに対して、処理６時間後、これらの遺伝子の発現レベルは、未処理のコントロール細胞のレベルと同じかそれ以下であった。実験期間中、刺激後、最初の６時間でＤＳＣＲ１レベルは増加し、その後にプラトーに達した(図５Ａ)。ネガティブフィードバックと一致して、ＶＥＧＦ標的遺伝子の発現は、ＤＳＣＲ１発現と逆相関していた。
【０１７６】
ネガティブフィードバックループのモデルは、阻害成分のノックダウンにより、内皮細胞における炎症マーカー遺伝子のレベルが増加する結果になることをさらに予測している(図５Ｂ)。この実験と一致して、内因性ＤＳＣＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ実験では、ＮＦＡＴ転写活性の増加(図６Ｃ)と、活性化された内皮細胞におけるＴＦ、ＶＣＡＭ-１及びＥ-セレクチンを含むＣｎＡ標的遺伝子の発現(図７Ａ)が明らかになった。ＶＥＧＦで処理された内皮細胞を分析すると、ｓｉＲＮＡによる内因性ＤＳＣＲ１のノックダウンにより、ＮＦＡＴ(図６Ｄ)の活性、及びＴＦ、Ｅ-セレクチン、及びＶＥ-カドヘリンの発現レベル(図７Ｂ)の増加が生じた。総括すると、ＶＥＧＦ刺激細胞における誘導の大きさは、ＰＭＡ／ＩＯ処理と比較した場合、あまり顕著ではなく、これは、ＣｎＡ活性を刺激する後の化合物の優れた効能により説明される。
【０１７７】
サイトカイン刺激に応答する刺激性及び阻害性シグナル伝達イベントの同時誘導は、他の生物学的系に対して記載されている。ネガティブフィードバックループは、ＴＮＦ-α又はＩＬ-１によるより長い時間にわたる刺激の効果を制限することがリンパ球において記載されている。双方のサイトカインが、様々な細胞型３５におけるＴＮＦ-αシグナル伝達にネガティブに干渉する細胞内アダプター分子Ａ２０を誘導する３５。よって、ＴＮＦ-αシグナル伝達におけるＡ２０の保護的役割に類似して、我々は、血管形成因子(例えばＶＥＧＦ)又は他の刺激により内皮細胞が長時間にわたって活性化されている間、ＤＳＣＲ１は、脈管損傷を防止することができると考える。
【０１７８】
結論として、我々は、炎症誘導化合物で刺激された内皮細胞での炎症遺伝子の抑制におけるＤＳＣＲ１の役割について第１の直接的証拠をここに提供した。Ｃｏｘ-２及びＴＦを含む、治療標的としてのこれら遺伝子のいくつかの突出した役割が分かると、我々の発見は、脈管構造での炎症イベントの発現を制御し、血管完全性の混乱に影響を及ぼす新規な治療標的としてＤＳＣＲ１に注意を向けている。
【０１７９】
参考文献の一部のリスト
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【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１Ａ】ＧｅｎｅＣａｌｌ法及びＲＴ-ＰＣＲを使用した遺伝子発現分析。(Ａ)一次ＨＵＶＥＣを、無血清培地又はＶＥＧＦ又は５％ＦＣＳが補填された無血清培地のいずれかに、それぞれ０、６又は２４時間、暴露させた。内皮細胞を溶解し、全ＲＮＡを単離し、ジーンコーリングを使用して遺伝子発現を分析した。各カラムは、互いに比較された一連の二元比較の結果を表す。しかしながら、「Ｐ」(Ｐ＝被毒)又は「Ｉ」(Ｉ=単離、クローニング、配列決定、及び被毒)とマークされた遺伝子を確認した。示した選択遺伝子は、６及び２４時間でＶＥＧＦによる誘導が見出されたが、５％ＦＣＳでの刺激では見出されなかった；ＶＥＧＦによる刺激回数を、それぞれのボックス中の数で示した。グレイのボックスは、血清６及び２４時間対無血清の二元比較において、遺伝子に対し、発現に何の変化も観察されなかったことを示している。拡大されたサムネイル中の垂直な黒いバーは、ジーンコーリングの信頼水準を示す。
【図１Ｂ】(Ｂ)リアルタイムＲＴ-ＰＣＲによるＤＳＣＲ１発現分析２１。ＨＵＶＥＣを無血清条件に保持し、標記した時間の間、５％のＦＣＳ、ｂ-ＦＧＦ(１０ｎｇ／ｍＬ)、ＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)、ＰＩＧＦ(１００ｎｇ／ｍＬ)、ＶＥＧＦＲ１-ｓｅｌ(１００ｎｇ／ｍＬ)、又はＶＥＧＦＲ２-ｓｅｌ(３０ｎｇ／ｍＬ)で刺激した。使用した突然変異タンパク質は、ＶＥＧＦＲ２-ｓｅｌ(ＫＤＲ選択的)：ＶＥＧＦＤ６３Ｓ／Ｇ６５Ｍ／及びＦｌｔ選択的ＶＥＧＦ Ｉ４３Ａ／Ｉ４６Ａ／Ｑ７９Ａ／Ｉ８３であった２５。
【図１Ｃ】(Ｃ)リアルタイムＰＣＲによるＤＳＣＲ１発現分析。ＨＰＡＥＣ、ＨＤＭＥＣ、及びＨＵＡＥＣを、０．５％のＦＣＳ(ＮＡ)の存在下、又は０．５％のＦＣＳ及びＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)又はＶＥＧＦ突然変異型の存在下でインキュベートし、ＶＥＧＦＲ１(ＶＥＧＦＲ１-ｓｅｌ、１００ｎｇ／ｍＬ)かＶＥＧＦＲ２(ＶＥＧＦＲ２-ｓｅｌ、３０ｎｇ／ｍＬ)２６のいずれかに４(■)、８(網目模様ボックス)及び２４(□)時間、結合させた。コントロール細胞として、有意なレベルのＶＥＧＦレセプターは発現しないＨＵＰＡＳＭＣを使用した(データを示さず)。示したデータは、全体で３回の独立した実験のうちの代表的な一つの３組のサンプルの平均±ＳＤを表す。参照遺伝子としてシクロフィリンを使用し、Gerberら３が記載したようにして、相対ＲＮＡ単位(ＲＲＵ)を算出した。
【図１Ｄ】(Ｄ)リアルタイムＰＣＲによるＤＳＣＲ１発現分析。ＨＵＶＥＣを、示したようにＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)、ＶＥＧＦＲ２-ｓｅｌ(３０ｎｇ／ｍＬ)、ＶＥＧＦＲ１-ｓｅｌ(１００ｎｇ／ｍＬ)、ＰＭＡ(２００ｎｇ／ｍＬ)、及びＩＯ(５μＭ)、タプシガルジン(５０ｎＭ)又はＴＮＦ-α(１０ｎｇ／ｍＬ)で５．５時間刺激する前に、ＣｓＡ(１μＭ)の存在下で２時間インキュベートした。示したデータは、全体で２回の独立した実験のうちの代表的な一つの並行して実施された２組のサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図１Ｅ】(Ｅ)示したように０％の血清、０．５％のＢＳＡ、５％のＦＣＳ、ｈＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)、ｂ-ＦＧＦ(１０ｎｇ／ｍＬ)、ＴＮＦ-α(１０ｎｇ／ｍＬ)及びＰＭＡ又はイオノマイシン(ＩＯ)中で５時間増殖させたＨＵＶＥＣの全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。コントロールとして１００ｎｇの組換えＤＳＣＲ１タンパク質を含めた。
【図２】ＤＳＣＲ１の細胞分布及びＮＦＡＴｃ１リン酸化。(Ａ)Ａｄ-ＤＳＣＲ１-ＦＬＡＧ又はコントロールＡｄ-ＬａｃＺ(ＭＯＩ＝１００)を形質導入しＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)に暴露したＨＵＶＥＣのＩＨＣ分析。ＶＥＧＦによる刺激の２０分後、細胞を固定し、ＮＦＡＴｃ１の細胞分布を分析した。(Ｂ)ＮＦＡＴｃ１リン酸化のウエスタンブロット分析。ＨＵＶＥＣを、示されたアデノウイルスベクター(ＭＯＩ＝１００)を形質導入するか、又は形質導入培地のみ(ＮＡ)に暴露した。形質導入の２日後、ＣｓＡ(１μＭ)を細胞に添加し、２時間後、細胞をＰＭＡ(２００ｎｇ／ｍＬ)／ＩＯ(５μＭ)で４時間刺激した。リン酸化状態とは関係なくＮＦＡＴｃ１を認識する抗ＮＦＡＴｃ１抗体を使用したウエスタンブロット分析を全細胞抽出物に施した。示したデータは、全体で３回の実験の代表的な一つからのものである。
【図３】ＤＳＣＲ１は、活性化された内皮細胞中におけるＮＦＡＴの転写活性に干渉する。(Ａ)ＤＳＣＲ１のＣ末端エピトープタグ型をコードするＣＭＶ駆動発現ベクター、又は同量の空ベクターを含む混合物で形質移入されたＨＵＶＥＣのルシフェラーゼレポータ遺伝子分析。ルシフェラーゼレポーターコンストラクトは、３つのＮＦＡＴ結合部位(ＮＦＡＴ-Ｌｕｃ)又はＡＰＩ(Ｂ)結合部位の３コピーのいずれかをそれぞれ含む。形質移入の４８時間後、細胞を、ＰＭＡ(２００ｎｇ／ｍＬ)、タプシガルジン(５０ｎＭ)又はＩＯ(５μＭ)で６時間刺激した。細胞を溶解し、レポーター遺伝子発現について分析した。示したデータには、ＳＶ４０-ＲＬ活性に対するルシフェラーゼ活性が表されている。データは、４回の独立した実験のうちの代表的な一つの３組のサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図４Ａ】活性化された内皮細胞中でのＤＳＣＲ１による炎症マーカー遺伝子の発現抑制。(Ａ)ＤＳＣＲ１をコードするアデノウイルスベクター(ＭＯＩ＝１００)(Ａｄ-ＤＳＣＲ１-ＦＬＡＧ)又はコントロールＬａｃＺ(Ａｄ-ＬａｃＺ)が形質導入されたＨＵＶＥＣのリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ分析。形質導入の２日後、細胞を、培養培地単独、又はＰＭＡ(２００ｎｇ／ｍＬ)及びＩＯ(５μＭ)、ＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)、タプシガルジン(５０ｎＭ)、又は示したようなそれらの組合せが補填された培養培地と共に、５〜６時間インキュベートした。全ＲＮＡを単離し、Ｃｏｘ-２(ｉ)、Ｅ-セレクチン(ｉｉ)及びＴＦ(ｉｉｉ)についてのレベルを、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ分析で分析した。示したデータは、全体で３回の独立した実験のうちの代表的な一つの３組のサンプルの平均±ＳＤを表す。参照遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用し、Gerberら３が記載したようにして、ＲＲＵを算出した。
【図４Ｂ】(Ｂ)様々な化合物により刺激された一過性形質移入内皮細胞のＦＡＣＳ分析。ＰＢＳ(ＮＡ)、ＰＭＡ(２００ｎｇ／ｍＬ)、ＩＯ(５μＭ)、ＴＮＦ-α(１０ｎｇ／ｍＬ)又はそれらの組合せのいずれかで細胞を刺激する２時間前に、ＣｓＡ(１μＭ)を形質導入細胞に添加した。刺激の２４時間後、２５ｍＭのＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)／ＰＢＳ中において１０分間インキュベートすることにより、細胞を培養皿から取り出した。Ｅ-セレクチン、ＶＣＡＭ-１、ＴＦ、及びＩＣＡＭ-１の発現について細胞を分析した。クロマトグラム下の白色領域は、Ａｄ-ＤＳＣＲ１が形質導入された細胞上での発現レベルを表し；グレイの領域はＬａｃＺ形質導入細胞上での発現レベルを表す。示したデータは、全体で３回の独立した実験の代表的な一つからのものである。
【図４Ｃ】(Ｃ)Ｃｏｘ-２及びＴＦそれぞれについてのＨＵＶＥＣの全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。等しい充填を確認するために、２γ-アダプチンを認識する抗体を使用した。示したデータは、３回の独立した実験の一つの代表的実験からのものである。
【図５】内皮細胞上でのＶＥＧＦによる炎症マーカー遺伝子の一過性調節。(Ａ)示された時間の間、無血清条件に保持され、ＶＥＧＦ(３０ｎｇ／ｍＬ)で刺激されたか又は無血清培地のみに保持されたＨＵＶＥＣのリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ分析。発現レベルに対するＴａｑＭａｎ分析を実施した。示された相対発現レベルを、ＶＥＧＦの存在下での遺伝子発現のＲＲＵを非刺激レベルで割ることにより得た。(Ｂ)ＶＥＧＦ又はＣｎＡシグナル伝達を活性化する化合物による刺激後にカルシニューリンとの干渉に至る活性化内皮細胞中でのＤＳＣＲ１によるネガティブフィードバック調節ループの概略図。
【図６】ｓｉＲＮＡによる内因性ＤＳＣＲ１のノックダウンは活性化内皮細胞中におけるＮＦＡＴ活性を亢進する。(Ａ)ｓｉＲＮＡ及びＰＲＫＮ-ＤＳＣＲ１-Ｆｌａｇ発現ベクターが同時形質移入されたＨＵＶＥＣのウエスタンブロット分析。抗ＦＬＡＧ抗体を使用して全細胞抽出物を分析した。(Ｂ)ヒトＤＳＣＲ１を検出するポリクローナル抗血清を使用することにより、ｓｉＤＳＣＲ１が形質移入されたＨＵＶＥＣを、ＤＳＣＲ１の内因性レベルについて分析した。(Ｃ)ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターコンストラクト及びＤＳＣＲ１を標的化するｓｉＲＮＡ、ＮＦＡＴｃ１、又はコントロールでの一過性形質移入後にＩＯ／ＰＭＡ(６時間)又はＶＥＧＦ(１２時間)でそれぞれ刺激したＨＵＶＥＣ由来の細胞抽出物中におけるＮＦＡＴ活性についてのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ。示したデータは、全体で３回の独立した実験のうちの代表的な一つの３組実施されたものからである。エラーバー＝ＳＤ。*Ｐ＜．０１、**Ｐ＜．００１、ｓｉコントロール及びｓｉＤＳＣＲ１群を比較する分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用。
【図７Ａ】内因性ＤＳＣＲ１のノックダウンが活性化内皮細胞上の炎症マーカーの発現を誘導する。(Ａ)ＧＦＰ及びｓｉＤＳＣＲ１、ｓｉＮＦＡＴｃ１、又はｓｉコントロールｓｉＲＮＡをコードする発現ベクターが一過性に同時形質移入されたＨＵＶＥＣのＦＡＣＳ分析。ＰＭＡ／ＩＯ又はコントロール処理(ＮＡ)での刺激の４時間後、ＧＰＦ＋細胞上でのＴＦ、ＶＣＡＭ-１、及びＥ-セレクチンの細胞表面発現について細胞を分析した。
【図７Ｂ】(Ｂ)ＶＥＧＦで刺激し、ＴＦ(４時間)、ＶＣＡＭ-１(２０時間)、及びＥ-セレクチン(２０時間)の発現を分析したＨＵＶＥＣのＦＡＣＳ分析。示したデータは３回の独立した実験の代表的な１セットに対応する。
【図８】ＤＳＣＲ１の修飾は内皮細胞の生存に影響を及ぼす。血清飢餓、Ｈ２Ｏ２暴露、及びＰＭＡ／ＩＯ処理を含むストレス状態に暴露された内皮細胞中でのＡｄ-ＤＳＣＲ１によるＤＳＣＲ１の過剰発現は、ＤＳＣＲ１アンチセンスコンストラクトの発現により内因性ＤＳＣＲ１の減少がそうであったように内皮細胞死を誘導する。(Ａ)センス又はアンチセンスＤＳＣＲ１のいずれかをコードするアデノウイルスコンストラクトを含むＤＳＣＲ１の修飾により、血清飢餓の２４時間後、一次ヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の生存率が低下した。(Ｂ)センス又はアンチセンスＤＳＣＲ１のいずれかをコードするアデノウイルスコンストラクトを含むＤＳＣＲ１の修飾により、血清飢餓の２４時間後、ＺＶＡＤカスパーゼ阻害剤の存在下、一次ヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の生存率が低下した。
【図９】ヒトＤＳＣＲ１のアミノ酸配列(配列番号１)の例示的実施態様。
【図１Ａ】
2008535796.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月15日(2007.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞におけるＤＳＣＲ１活性を調節するＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項２】
モジュレーターが、ＶＥＧＦレセプター２(ＶＥＧＦＲ-２)を介してのシグナル伝達により誘導されるＤＳＣＲ１活性を調節する、請求項１に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項３】
モジュレーターが、ＤＳＣＲ１-カルシニューリンＡ(ＣｎＡ)経路を調節する、請求項１又は２に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項４】
ＤＳＣＲ１モジュレーターが、ＮＦＡＴ活性に関連した細胞性イベントを調節する、請求項１から３の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項５】
細胞性イベントが、ＮＦＡＴリン酸化、ＮＦＡＴ核移行、又はＮＦＡＴ転写活性である、請求項４に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項６】
モジュレーターが、ＣｎＡにより誘導される遺伝子発現に拮抗可能なポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１から５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項７】
ポリペプチドが、ＤＳＣＲ１の少なくとも一部を含むペプチドであってＣｎＡと相互作用可能であるペプチドを含む、請求項６に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項８】
ポリペプチドが、ヒトＤＳＣＲ１の約９６から約１２５位、又は約１０８から１２２位のアミノ酸を含む、請求項６又は７に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項９】
モジュレーターが、ＤＳＣＲ１機能と拮抗可能である、請求項１又は２に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１０】
モジュレーターが、内皮細胞に存在すると細胞中においてＤＳＣＲ１の活性を抑制する核酸を含む、請求項９に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１１】
核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１２】
核酸が阻害性／干渉性ＲＮＡを含む、請求項１０に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１３】
阻害性／干渉性ＲＮＡが低分子阻害性／干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、請求項１２に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１４】
内皮細胞が、ＧＣＵＣＡＧＡＣＣＵＵＡＣＡＣＡＵＡＧ（配列番号２）、ＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＧＧＡＧＡＣＣＵＡ（配列番号４）、ＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵＵ（配列番号５）、ＡＡＣＧＵＡＵＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣ（配列番号６）、ＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ（配列番号７）、ＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＧＣＵＣＡＧＡＣＣ（配列番号８）及びＡＡＧＡＵＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＵＣＡＵＡＡ（配列番号９）からなる群から選択される一又は複数の配列を含む、請求項１２又は１３に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１５】
核酸がアプタマーを含む、請求項１０に記載のＤＳＣＲ１モジュレーター。
【請求項１６】
異常な脈管炎症に関連した疾患の治療方法であって、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む方法。
【請求項１７】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
異常な脈管炎症に関連した免疫学的疾患の治療方法であって、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む方法。
【請求項２０】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
脈管完全性の混乱に関連した疾患の治療方法であって、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを有効量、患者に投与し、よって疾患を治療することを含む方法。
【請求項２３】
脈管完全性の混乱が、脈管／内皮細胞関連炎症に関連している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
抗炎症治療に伴う副作用の改善方法であって、抗炎症治療と併用して、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターを患者に投与し、よって、副作用を改善することを含む方法。
【請求項２７】
ＤＳＣＲ１モジュレーターが内皮細胞におけるＤＳＣＲ１活性を阻害する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗炎症治療が炎症を抑制する薬剤を含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を増加させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
モジュレーターが、脈管構造に関連した炎症を阻害する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
所望しない血管形成に関連した疾患の治療方法であって、抗血管形成剤と、請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターとを、疾患を患っている患者に投与することを含む方法。
【請求項３２】
腫瘍の増殖又は癌細胞の増殖の抑制方法であって、有効量の抗癌剤と有効量の請求項１から１５の何れか一項に記載のＤＳＣＲ１モジュレーターとを、腫瘍又は癌細胞に投与することを含み、ここで組合せた有効量で、腫瘍又は癌細胞の増殖が抑制される方法。
【請求項３３】
抗癌剤が抗血管形成剤を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗血管形成剤がＶＥＧＦアンタゴニストを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
脈管構造に関連した炎症は、多くの場合、脈管完全性の混乱に関連した細胞外血管形成刺激の下流のイベントであると特定されている。Kirkpatrickら, Int. J.Microcirc. (1997), 17：231-240。例えば、炎症プロセスが、種々の脈管関連疾患、例えば高血圧の病態生理において重要な役割を担っているという証拠が増えつつある。例えば、Touyz, Cur. Opin. Nephrology and Hypertension (2005),14:125-131;Kobayashi &Lin, Frontiers in Bioscience (2005), 10:666-674;Bacon, Curr. Opin. Rheumatol.(Jan. 2005), 17:49-55; Paleolog, J. Clin. Pathol.:mol. Pathol. (1997), 50-225-233; Mullenix et al., Ann. Vasc. Surg. (2005),19:130-138を参照。Touyzが示しているように、炎症を示すイベント、例えば表面接着分子及びそのリガンドの発現増加、炎症細胞浸潤、サイトカイン産生、ケモカイン放出、酸化ストレス、及び自然免疫の活性化等が、脈管構造中に観察されている。また、内皮細胞の混乱は、内皮細胞により専ら発現されるＥ-セレクチン及びフォンウィルブランド因子の放出にも反映しうる。Kuenenら, Arterioscler.Thromb. Vasc. Biol. (2002), 22:1500-1505。持続的及び／又は調節されない炎症は、組織／脈管損傷を生じるおそれがある。典型的には、炎症反応は、脈管透過性、白血球の血管外遊出(付着、移動及び走化性)及び組織修復における変化に関与している。Touyz, 上掲。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
一態様では、本発明は、ＤＳＣＲ１活性に拮抗可能なＤＳＣＲ１モジュレーターを提供する。従って、一実施態様では、本発明のＤＳＣＲ１モジュレーターは、内皮細胞(例えば、活性化内皮細胞)中に存在すると、細胞中においてＤＳＣＲ１の活性(限定するものではないが、遺伝子発現を含む)を阻害する核酸を含む。一実施態様では、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の実施態様では、核酸は阻害性／干渉性ＲＮＡを含む。一実施態様では、阻害性／干渉性ＲＮＡは低分子阻害性／干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。例えば、ｓｉＲＮＡを含むＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＧＣＵＣＡＧＡＣＣＵＵＡＣＡＣＡＵＡＧ（配列番号２）、ＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＧＧＡＧＡＣＣＵＡ（配列番号４）及びＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵＵ（配列番号５）からなる群から選択される一又は複数の配列を含みうる。他の例では、ｓｉＲＮＡを含むＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＡＡＣＧＵＡＵＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣ（配列番号６）、ＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ（配列番号７）、ＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＧＣＵＣＡＧＡＣＣ（配列番号８）及びＡＡＧＡＵＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＵＣＡＵＡＡ（配列番号９）からなる群から選択される一又は複数の配列を含みうる。一実施態様では、ｓｉＲＮＡを含むＤＳＣＲ１モジュレーターは、ＧＣＵＣＡＧＡＣＣＵＵＡＣＡＣＡＵＡＧ（配列番号２）、ＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＧＧＡＧＡＣＣＵＡ（配列番号４）、ＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵＵ（配列番号５）、ＡＡＣＧＵＡＵＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣ（配列番号６）、ＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＵＵＣＡＧＵＡＵ（配列番号７）、ＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＵＵＧＣＵＣＡＧＡＣＣ（配列番号８）及びＡＡＧＡＵＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＵＣＡＵＡＡ（配列番号９）からなる群から選択される一又は複数の配列を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
ＤＳＣＲ１及びＮＦＡＴＣ１のｓｉＲＮＡアンタゴニスト
遺伝子名    ベースの受託番号    センス鎖５'-＞３'の配列
血管形成因子(例えばＶＥＧＦ)活性化研究においてプールとして使用：
DSCR1       NM_004414    GCUCAGACCUUACACAUAG(配列番号2)
DSCR1       NM_004414    GGACAUCACCUUUCAGUAU(配列番号3)
DSCR1       NM_004414    GAAAGAAUGAGGAGACCUA(配列番号4)
DSCR1       NM_004414    GACAUCACCUUUCAGUAUU(配列番号5)
ＰＭＡ／ＩＯ活性化研究において使用
DSCR1       NM_004414    AACGUAUGACAAGGACAUCAC(配列番号6) 
NFATC1      NM_172390,   CGUAUGAGCUUCGGAUUGA(配列番号10)
NFATC1      NM_172390,   GCAGAGCACGGACAGCUA(配列番号11)
NFATC1      NM_172390,   UCAGAAACUCCGACAUUGA(配列番号12)
NFATC1      NM_172390,   GCCGGAAUCCUGAAACUCA(配列番号13)
注釈：列挙された全てのｓｉＲＮＡは各鎖に３'-オーバーハング、アンチセンス鎖のみに５'-ホスファートを有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
ウサギ中でのヒトＤＳＣＲ１に対するポリクローナル抗体の産生及びウエスタンブロット分析
ＤＳＣＲ１を、プライマーＤＳＣＲ１-ＥｃｏＲＩ-Ｐｒｏ５'を用いてＰＣＲ増幅させ、余分にプロリンとＤＳＣＲ１-Ｓｔｏｐ-ＸｈｏＩ３'を添加し、テンプレートとしてＤＳＣＲ１ｃＤＮＡを使用して、ｐＧＥＸ-ＫＧにクローニングした。ＧＳＴ-ＤＳＣＲ１を発現させ、本質的に過去に記載されたようにして２３精製した。ポリクローナルウサギ抗ＧＳＴ-ＤＳＣＲ１を、組換えＧＳＴ-ＤＳＣＲ１を用いた免疫化によって調製した。濾過された粗血清をウエスタンブロット(１：４００)に使用した。オリゴ及びＴａｑＭａｎプローブプライマーセットを表１に示す。
表１．オリゴ及びＴａｑＭａｎプローブプライマーセット
プライマーセット
HSDSCR1.1113FP      5'(FAM)-AGG TTG TGA AAA CAG CAG CAA TGC AAT GT (配列番号14)-(TAMRA)P3'
HSDSCR1.1088.F      CCA CAG GAA GCC GCC TAG T (配列番号15)
HSDSCR1.1171.R      TGA GGG AAG AAA GGA AAC GCT (配列番号16)
HSGMCSF-571T        5'(FAM)- AGG TCC AGG CCA CTC CCA CC GT (配列番号17)-(TAMRA)P3'
HSGMCSF-515F        GTC ATC TTG GAG GGA CCA A (配列番号18)
HSGMCSF-610R        TTC TGC CAT GCC TGT ATC A (配列番号19)
HSTF-1911T          5'(FAM)-TTA ACT GAC TTA AGT GGC ATT AAA CAT TTG AGA GCT AA GT (配列番号20)-(TAMRA)P3'
HSTF-1880F          CAG CTT CCT AAT ATG CTT TAC AAT CT (配列番号21)
HSTF-2025R          CAA TGT CAA CCA TAG AAG CTT TAA GTA (配列番号22)
HSCOX-2-3152T       5'(FAM)-CCT GGC TAC CTG CAT GCT GTT CC GT (配列番号23)-(TAMRA)P3'
HSCOX-2-3130F       CAG TAG GTG CAT TGG AAT CAA (配列番号24)
HSCOX-2-3207R       TCT TAG CAA AAT GGC TAA AAG AAG (配列番号25)
HSCD34-2497T        5'(FAM)- ATC CCT GCT CAA CCC CTC TGG A GT (配列番号26)-(TAMRA)P3'
HSCD34-2447F        CCC AGG TCC TTG TTT GCT (配列番号27)
HSCD34-2519R        TCC AAC CGT CAT TGA AAC C (配列番号28)
HSVCAM-1-2686T      5'(FAM)-CGA AGT TTG TTC ATC AGA CTC CTG TGC GT (配列番号29)-(TAMRA)P3'
HSVCAM-1-2665F      GCA TGG TAC GGA GAT GTT TC (配列番号30)
HSVCAM-1-2730R      GGC CAC ATT GGG AAA GTT (配列番号31)
DSCR1-EcoRI-Pro 5'  CCGAATTCCCATGCATTTTAGAAACTTTAACTACAG (配列番号32)
DSCR1-Stop-XhoI 3'  GGGCTCGAGCTAGCTGAGGTGGATCGGCGTGTACTCC (配列番号33)
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2008535796.tif 000019
【国際調査報告】
2008535796.tif 000020
2008535796.tif 000021
2008535796.tif 000022
2008535796.tif 000023