(57)【要約】本明細書中に記載の発明は、抗原Ｔｅｎ−Ｍ２に指向する抗体およびこのような抗体の使用に関する。特に、抗原Ｔｅｎ−Ｍ２に指向する完全なヒトモノクローナル抗体を提供する。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードする単離ポリヌクレオチド配列およびこれらの免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に、フレームワーク領域（ＦＲ）および／または相補決定領域（ＣＤＲ）にわたる連続する重鎖および軽鎖配列に対応する配列（具体的には、ＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を提供する。このような免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株も提供する。
2008535823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｅｎ−Ｍ２に結合してＴｅｎ−Ｍ２活性を中和する、完全なヒトモノクローナル抗体またはその結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体が全長抗体である、請求項１に記載の完全なヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体またはそのフラグメントが１８ｎＭ未満のＫＤでＴｅｎ−Ｍ２に結合する、請求項１に記載の完全なヒトモノクローナル抗体またはその結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体またはそのフラグメントが１５ｎＭ未満のＫＤでＴｅｎ−Ｍ２に結合する、請求項１に記載の完全なヒトモノクローナル抗体またはその結合フラグメント。
【請求項５】
Ｔｅｎ−Ｍ２に結合し、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、および配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含むヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、および配列番号５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖をさらに含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
不溶性マトリックスに固定された抗体であって、該抗体が請求項１に記載の抗体である、抗体。
【請求項８】
患者サンプルにおけるＴｅｎ−Ｍ２レベルをアッセイする方法であって、以下の工程：
（ａ）前記患者サンプルを請求項１に記載の抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体と接触させる工程と、
（ｂ）Ｔｅｎ−Ｍ２に結合した抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の存在または量を決定する工程、
を含み、それにより、前記患者サンプル中のＴｅｎ−Ｍ２レベルを検出する、方法。
【請求項９】
前記患者サンプルが血液である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗体またはその結合フラグメント、および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１１】
Ｔｅｎ−Ｍ２またはその結合フラグメントに特異的に結合する治療有効用量の抗体を、悪性腫瘍の治療を必要とする動物に投与する工程を含む、悪性腫瘍を治療する方法。
【請求項１２】
前記動物がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が完全なヒトモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記悪性腫瘍が、肺、腎臓、脳、および卵巣からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が請求項１に記載の抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｔｅｎ−Ｍ２に結合する抗体またはその結合フラグメントであって、前記抗体またはその結合フラグメントがＴｅｎ−Ｍ２誘導活性を中和し、前記抗体またはその結合フラグメントがＭａｂ１２０、Ｍａｂ１４０、およびＭａｂ１７１、Ｍａｂ１７９、Ｍａｂ１９９、Ｍａｂ２１３からなる群から選択される完全なヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体、または完全なヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体であるＭａｂ１２０、Ｍａｂ１４０、およびＭａｂ１７１、Ｍａｂ１７９、Ｍａｂ１９９、もしくはＭａｂ２１３と抗原結合ビンが同一の抗体と交差反応する、抗体またはその結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合する抗体およびこのような抗体の使用に関する。特に、抗原Ｔｅｎ−Ｍ２に指向する完全なヒトモノクローナル抗体を提供する。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列およびこれらの免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に、フレームワーク領域および／または相補決定領域（ＣＤＲ）にわたる連続する重鎖および軽鎖配列に対応する配列（具体的には、ＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を提供する。このような免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株も提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連分野の説明
テネウリン（ｔｅｎｅｕｒｉｎ）またはｈＯｄｚとしても公知のヒトＴｅｎ−Ｍ２遺伝子ファミリーは、短い細胞内Ｎ末端を含み、その後に膜貫通領域、８つのＥＧＦ様反復、細胞外側に巨大な球状ドメインが続くＩＩ型膜貫通タンパク質クラスである。Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質のＥＧＦ様反復は、二量体形成を媒介すると考えられている。マウスおよびニワトリのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質のホモログの発現パターンならびに神経突起伸長などの細胞移動のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにより、神経発達における役割が示唆されている。これは、細胞接着分子としての役割を示すヘパリンなどの細胞外基質タンパク質への結合も含み得る。
【０００３】
Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質の構造および機能は以前に調査されている（例えば、非特許文献１）。タンパク質の種々の形態（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４）は、一般に、２７００〜２８００アミノ酸長である。
【０００４】
Ｔｅｎ−Ｍ２は、ＥＧＦドメインを介して二量体形成する。Ｔｅｎ−Ｍ２ファミリーは、ＰＳ２インテグリンと会合することが示されており、細胞外ドメインはヘパリンと相互作用することが公知である。
【非特許文献１】Ｏｏｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４５：５６３−５７７（１９９９）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
１つの実施形態では、細胞上のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に選択的に結合し、Ｔｅｎ−Ｍ２機能に影響を及ぼす完全なヒト抗体を提供する。いくつかの実施形態では、完全なヒト抗体を患者に投与した場合、患者の癌転移を軽減する。１つの態様では、細胞に結合していないＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に選択的に結合する完全なヒト抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体は、他のＴｅｎ−Ｍホモログ（Ｔｅｎ−Ｍ３またはＴｅｎ−Ｍ４など）に結合しない。
【０００６】
１つの態様では、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合する結合体化した完全なヒト抗体を提供する。抗体に薬剤が結合されている場合、細胞への抗体の結合によって細胞に薬剤が送達される。１つの実施形態では、上記の結合体化した完全なヒト抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質の細胞外区域（ｓｅｃｔｉｏｎ）に結合する。別の実施形態では、抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質のＥＧＦ様反復に結合する。別の実施形態では、抗体および結合体化した毒素を、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質を発現する細胞によって内在化する。別の実施形態では、薬剤は細胞傷害薬である。別の実施形態では、薬剤はサポリンである。
【０００７】
好ましい実施形態では、本明細書中に記載の抗体は、高親和性（Ｋｄ）でＴｅｎ−Ｍ２に結合する。例えば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４Ｍ未満または任意の範囲もしくはその間の値未満のＫｄ（これらに限定されない）でＴｅｎ−Ｍ２に結合することができるヒト抗体、ウサギ抗体、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体。親和性および／またはアビディティを、本明細書中に記載のＫｉｎＥｘＡ（登録商標）および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定することができる。
【０００８】
別の実施形態は、本明細書中に開示の完全なヒト抗体とＴｅｎ−Ｍ２への結合を交差競合する（ｃｒｏｓｓ  ｃｏｍｐｅｔｅ）抗体を含む。例えば、Ｔｅｎ−Ｍ２と中和することができる同一生殖細胞系のＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子由来の抗体は、標的上の同一の関連エピトープに結合することができ、互いに交差競合することができる。本発明の抗体を、競合ＥＬＩＳＡおよび／または競合ＢＩＡｃｏｒｅ研究で試験して、交差反応性を決定することができる。
【０００９】
別の態様では、本明細書中に記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００１０】
別の態様では、Ｔｅｎ−Ｍ２抗体およびＴｅｎ−Ｍ２抗体を被験体に投与するための説明書を含むＴｅｎ−Ｍ２関連障害を治療するためのキットを提供する。
【００１１】
別の態様では、患者の癌転移を軽減する方法を提供する。本方法は、完全なヒト抗体を患者に投与する工程を含む。抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２に結合し、それにより、そのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質が第２のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合して二重鎖を形成するのを回避する。それにより、抗体は患者の癌転移を軽減する。
【００１２】
別の態様では、患者の癌転移リスクを軽減する方法を提供する。本方法は、完全なヒト抗体を患者に投与する工程を含む。抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質が第２のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質と活性なＴｅｎ−Ｍ２／Ｔｅｎ−Ｍ２二重鎖を形成するのを回避する様式で第１のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合する。抗体は、第１のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質が依然として第２のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合するように結合する。それにより、抗体は、患者の癌転移リスクを軽減する。
【００１３】
別の態様では、患者の癌細胞を選択的に死滅させる方法を提供する。本方法は、完全なヒト抗体結合体を患者に投与する工程を含む。完全なヒト抗体結合体は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質および薬剤に結合することができる抗体を含む。薬剤は、癌細胞を死滅させる毒素または別の物質である。それにより、抗体結合体は癌細胞を選択的に死滅させる。薬剤はサポリンであり得る。
【００１４】
別の態様では、患者の癌転移リスクを診断する方法を提供する。本方法は、細胞上のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質を選択的に結合する完全なヒト抗体結合体を患者に投与する工程を含む。抗体結合体は、Ｔｅｎ−Ｍ２に選択的に結合する抗体および標識を含む。本方法は、患者中の標識の存在を観察する工程をさらに含む。比較的多い量の標識は、比較的高い癌転移リスクを示し、比較的少ない量の標識は比較的低い癌転移リスクを示す。１つの実施形態では、標識は、緑色蛍光タンパク質である。
【００１５】
異なる態様では、本発明は、細胞を抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体と接触させる工程と、Ｔｅｎ−Ｍ２の存在を検出する工程とを含む細胞中のＴｅｎ−Ｍ２発現に関連する状態を診断する方法を含む。好ましい状態には、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、および脳腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
さらなる実施形態は、重鎖アミノ酸配列を含む単離抗体またはそのフラグメントを含む。他の実施形態は、重鎖核酸配列を含む単離抗体またはそのフラグメントを含む。
【００１７】
１つの態様では、本発明は、Ｔｅｎ−Ｍ２に結合し、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、および５０からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列を有する単離抗体を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、Ｔｅｎ−Ｍ２に結合し、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、および５２からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列を有する単離抗体を提供する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、Ｔｅｎ−Ｍ２に結合し、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、および５０からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列を含み、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、および５２からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む単離抗体を提供する。
【００２０】
１つの実施形態では、単離抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、単離抗体はキメラ抗体である。さらに別の実施形態では、単離抗体はヒト抗体である。
【００２１】
別の態様では、本発明は、Ｔｅｎ−Ｍ２に結合し、以下のＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ  ［１９９１］，ｖｏｌｓ．１−３によって定義）を含む重鎖アミノ酸配列を含む単離抗体を提供する：（ａ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、および５０のアミノ酸２６〜３５の配列からなるＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、および５０のアミノ酸５０〜６６の配列からなるＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号１０、１８、もしくは４２のアミノ酸９９〜１１１、配列番号２のアミノ酸９９〜１０５、配列番号１４もしくは２２のアミノ酸９９〜１１４、配列番号６の９９〜１１７、配列番号２６もしくは３０のアミノ酸９９〜１１０、配列番号３４もしくは３８のアミノ酸９９〜１０９、または配列番号４６〜５０のアミノ酸９９〜１１２の配列からなるＣＤＲ３。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、Ｔｅｎ−Ｍ２に結合し、以下のＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ  ［１９９１］，ｖｏｌｓ．１−３によって定義）を含む軽鎖アミノ酸配列を含む単離抗体を提供する：（ａ）配列番号４、１６、３６、もしくは４０のいずれかのアミノ酸２４〜３９、配列番号８、２４、２８、もしくは３２のいずれかのアミノ酸２４〜３５、配列番号１２、４４、４８、５２のアミノ酸２４〜３４、または配列番号２０のアミノ酸２４〜４０の配列からなるＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４、１６、３６、もしくは４０のいずれかのアミノ酸５５〜６１、配列番号８、２４、２８、もしくは３２のいずれかのアミノ酸５１〜５７、配列番号１２、４４、４８、もしくは５２のアミノ酸５０〜５６、または配列番号２０のアミノ酸５６〜６２の配列からなるＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号４のアミノ酸９４〜１０１、配列番号８、２４、２８、または３２のいずれかのアミノ酸９０〜９８、配列番号１２のアミノ酸８９〜９６、配列番号１６、３６、または４０のアミノ酸９４〜１０２、配列番号２０のアミノ酸９５〜１０３、または配列番号４４、４８、または５２のアミノ酸８９〜９７の配列からなるＣＤＲ３。
【００２３】
これらの実施形態では、単離抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、および／またはヒト化抗体であり得ることが認識される。好ましくは、抗体はヒト抗体である。
【００２４】
本発明の実施形態が抗体の任意の特定の形態に制限されないことも認識される。例えば、提供された抗体は、全長抗体（例えば、インタクトなヒトＦｃ領域を有する）または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２）であり得る。さらに、抗体を、抗体を分泌するハイブリドーマまたは形質転換されたか抗体をコードする遺伝子でトランスフェクトされた組換え産生された細胞から製造することができる。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、本明細書中に記載の抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体のいずれかをコードする単離核酸分子、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体をコードする単離核酸分子を有するベクター、および核酸分子で形質転換された宿主細胞を含む。さらに、本発明の１つの実施形態は、核酸分子が発現して抗体を産生する条件下で宿主細胞を培養し、その後に宿主細胞から抗体を回収することによって抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を産生する方法である。
【００２６】
なおさらなる実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、他のＴｅｎ−ｍファミリーメンバー（Ｔｅｎ−Ｍ３、Ｔｅｎ−Ｍ４が含まれる）に結合する完全なヒト抗体である。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、Ｔｅｎ−Ｍ２を発現する細胞を有効量の抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体で処置する工程を含む、Ｔｅｎ−Ｍ２の発現に関連する細胞増殖を阻害する方法を含む。別の態様では、本発明は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を含む組成物および組成物を使用してＴｅｎ−Ｍ２の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療することができることを示す添付文書またはラベルを含む容器を含む製品を提供する。好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトに抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を投与する。好ましい実施形態では、腫瘍または癌（肺癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌、もしくは卵巣癌またはＮＨＬ（非ホジキンリンパ腫）などの癌が含まれるがこれらに限定されない）を治療する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、有効量の抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を患者に投与する工程を含む、患者におけるＴｅｎ−Ｍ２発現に関連する疾患または状態を治療する方法を含む。患者は、哺乳動物患者、好ましくはヒト患者である。
【００３０】
好ましい実施形態では、本方法は、腫瘍（肺、腎臓、脳、および卵巣の腫瘍ならびに一定の神経膠腫および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）が含まれるがこれらに限定されない）の治療に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
好ましい実施形態の詳細な説明
一定の癌では、ヒトＴｅｎ−Ｍタンパク質の伝令ＲＮＡレベルを上方制御することができる。したがって、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質は、癌転移中の細胞移動で役割を果たし得る。ヒト癌における細胞移動およびＴｅｎ−Ｍ２タンパク質発現における役割を示唆する発生研究を考慮すると、Ｔｅｎ−Ｍに対してデザインした療法は原発性腫瘍の転移を阻害することが可能である。したがって、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質の二重鎖形成領域への抗体の投与により、癌転移を阻害することができる。
【００３２】
さらに、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質は、ニューロンの成長およびガイダンスに関与するようである。したがって、本発明の組成物および方法を、このような必要性が生じる状況におけるニューロンの成長および発達を促進または阻害するために適用することができる。例えば、Ｔｅｎ−Ｍタンパク質への抗体の結合によってニューロン成長を促進する本明細書中に開示の抗体を、損傷組織における神経再生などの状況で使用することができる。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合する単離された、好ましくは完全なヒトのモノクローナル抗体の生成および同定に関する。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、高親和性、高力価、またはその両方でＴｅｎ−Ｍ２に結合することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、これらの抗体を毒素または類似の化合物に会合し、これを使用して毒素を特定の位置または細胞型に会合し、所望の位置での細胞型または細胞の死滅を促進する。いくつかの実施形態では、抗体を、高効率で内在化する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質の有効な機能（例えば、シグナル伝達）を防止する。例えば、抗体は、タンパク質の二量体形成ドメイン（例えば、ＥＧＦ様反復）への結合によってＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の別のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質との二量体形成を防止することができる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質のＥＧＦ様反復ドメインに結合する単離抗体またはこれらの抗体のフラグメントを提供する。
【００３６】
本発明の実施形態はまた、これらの抗体を産生するための細胞を提供する。さらに、実施形態は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質の過小発現または過剰発現に関連する疾患の診断または治療としてのこれらの抗体の使用を提供する。
【００３７】
本明細書中に記載の核酸ならびにそのフラグメントおよび変異型（ｖａｒｉａｎｔ）を使用して、例として、（ａ）組換えまたは異種遺伝子産物、（ｂ）本明細書中に開示の核酸の検出および定量のためのプローブ、（ｃ）配列テンプレート（これらに限定されない）としての対応するコードされたタンパク質、ポリペプチド、フラグメント、および変異型の生合成を指示することができる。このような用途を、以下により完全に記載する。
【００３８】
定義：
他で定義しない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈中にて他で必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書中に提供した定義は、外部出典（参照として援用される引例に記載の定義が含まれる）由来の定義に優先する。
【００３９】
一般に、本明細書中に記載の細胞培養および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法および技術は、種々の一般的およびより詳細な参考文献（本明細書中に引用され、本明細書を通して考察されているものなど）に記載のように、当該分野で周知であり、一般的に使用されている。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換のための標準的な技術（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）を使用する。酵素反応および精製技術を、製造者の説明書にしたがって行うか、当該分野で一般に行われているように行うか、本明細書中に記載のように行う。化学合成、化学分析、薬学的調製、処方、および送達、ならびに患者の治療のための標準的な技術も使用する。
【００４０】
本開示で使用されるように、他で示さない限り、以下の用語を、以下の意味を有すると理解すべきである。
【００４１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、少量の特定の核酸片、ＲＮＡ片および／またはＤＮＡ片を、１９８７年７月２８日発行の米国特許第４，６８３，１９５号に記載のように増幅する手順または技術をいう。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることができるように目的またはそれを超える領域の末端由来の配列情報が利用可能である必要がある。これらのプライマーは、増幅すべきテンプレートの反対の鎖と配列が同一であるか類似する。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端と一致し得る。ＰＣＲを使用して、全ゲノムＤＮＡから特定のＲＮＡ配列、特定のＤＮＡ配列を増幅することができ、全細胞ＲＮＡ、バクテリオファージ、またはプラスミド配列などから転写されたｃＤＮＡを増幅することができる。一般に、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３（１９８７）；Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓ，ＮＹ，１９８９）を参照のこと。本明細書中で使用される場合、ＰＣＲは、プライマーとしての公知の核酸および特定の核酸片を増幅または生成するための核酸ポリメラーゼの使用を含む核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の一例であると見なされるが、それが唯一というわけではない。
【００４２】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造特性を有する糖タンパク質である。抗体が特定の抗原への結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンには、抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子が含まれる。後者のポリペプチド類は、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、骨髄腫によって高レベルで産生される。
【００４３】
「未変性の抗体および免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖と連結する一方で、ジスルフィド結合数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的な間隔を有する鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）およびその後に多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインが重鎖の第１の定常ドメインと一列に並び、軽鎖可変ドメインが重鎖の可変ドメインと一列に並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＨａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））。
【００４４】
本明細書中の用語「抗体」を、最も広い意味で使用し、所望の生物活性を示す限り、特に、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメント（ＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２が含まれる）を対象とする。任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてκおよびλと呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの１つに割り当てることができる。組換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断によって結合フラグメントを産生する。以下により詳細に記載のように、結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体が含まれる。「二重特異性」または「二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」抗体以外の抗体は、それぞれその結合部位が同一であると理解される。
【００４５】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体を、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には以下の５つの主なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）にさらに分類することができる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元高次構造は周知である。
【００４６】
本明細書中で使用される、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団（すなわち、この集団を含む各抗体が少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である）から得た抗体をいう。モノクローナル抗体は、特異性が高く、１つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定基に指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されることなく合成することができるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法によって抗体を産生する必要があると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製するか、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」を、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４７】
「単離」抗体は、同定され、その自然環境の成分から単離および／または回収された抗体である。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断または治療での使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体を、（１）ローリー法、およびスピニングカップ配列決定装置（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用による末端または内部のアミノ酸配列によって決定したところ、抗体の９５重量％を超えるまでか、（３）還元または非還元条件下でのクーマーシーブルー、好ましくは銀染色を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製する。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離抗体には、ｉｎ  ｓｉｔｕでの組換え細胞内の抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体を、少なくとも１つの精製工程によって調製する。
【００４８】
「中和抗体」は、結合する標的抗原のエフェクター機能を排除するか有意に減少させることができる抗体分子である。したがって、「中和」Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２活性などのエフェクター機能を排除または有意に減少させることができる。１つの実施形態では、中和抗体は、エフェクター機能を、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９５、９５〜９９、９９〜１００％減少させる。１つの実施形態では、Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、いくらかの程度で、２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の二量体形成を阻害することによって機能を阻害する。別の実施形態では、Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、いくらかの程度で二量体形成したＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の別のタンパク質との会合を阻害することによって機能を阻害する。１つの実施形態では、中和抗体は、第２のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合するＴｅｎ−Ｍ２タンパク質上の位置への直接結合によって二量体形成を阻害する。別の実施形態では、中和抗体はＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の一部に結合する一方で、抗体の一部または抗体に会合しているものがＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の二量体形成を遮断する。別の実施形態では、抗体がＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合してタンパク質の高次構造を変化させ、二量体が生じるのを妨害する。
【００４９】
別の実施形態では、Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、実際に、二量体形成の可能性を増加させる。別の実施形態では、抗体は活性化抗体であり、抗体の結合により、別のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質と二量体形成したかのようにＴｅｎ−Ｍ２タンパク質を有効に作用させるように機能する。
【００５０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、ＩｇＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後に標的細胞を溶解する細胞媒介性反応をいう。主なＡＤＣＣ媒介細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号などに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９８８）などに開示の動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【００５１】
用語「可変」は、一定の可変ドメイン部分の配列が抗体間で非常に異なり、これを各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用するという事実をいう。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＩｇ軽鎖および重鎖可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。より高度に保存された可変ドメイン部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれＦＲ領域を含み、これは主にβシート立体配置を使用し、３つのＣＤＲによって連結してループ連結を形成し、場合によっては、βシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって極めて近接して互いに保持され、他の鎖由来のＣＤＲは抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与など）を示す。
【００５２】
酵素、パパインでの抗体の消化により、「Ｆａｂ」フラグメントおよび「Ｆｃ」フラグメントとしても公知の２つの同一の抗原結合フラグメントが得られ、これらは抗原結合活性を持たないが結晶化能力を有する。酵素ペプシンでの抗体の消化により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、抗体分子の２つのアームが連結したままであり、２つの抗原結合部位を含む。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗原を架橋する能力を有する。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、「Ｆｖ」は、抗原認識部位および抗原結合部位の両方が保持された最小の抗体フラグメントをいう。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体のフラグメントをいう。
【００５５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。２鎖Ｆｖ種では、この領域は、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが非共有結合で強固に結合した二量体からなる。単鎖Ｆｖ種では、１つの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを、軽鎖および重鎖が２鎖Ｆｖ種に類似の「二量体」構造で結合することができるように可動性ペプチドリンカーによって共有結合することができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体表面上に抗原結合部位を定義するのはこの立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも抗原を認識して結合する能力を有するが、完全な結合部位よりも親和性が低い。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜６２（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜５５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５３〜５５（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書中に定義の超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、特定のリガンドと接触してその特異性を決定する免疫受容体部分をいう。免疫受容体のＣＤＲは、受容体にその多様性を付与する受容体タンパク質の最も可変性の高い部分であり、受容体の可変ドメインの遠位末端に６つのループを有し、受容体の２つの各可変ドメイン由来の３つのループを有する。
【００５８】
用語「エピトープ」を、タンパク質抗原上の抗体の結合部位をいうために使用する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸および糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団からなり、通常、特異的な三次元特性および特異的荷電特性を有する。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは１０ｎＭ以下の場合に抗原に結合するといわれる。解離定数（「ＫＤ」）の増加またはより高い解離定数は、エピトープと抗体との間の親和性がより低いことを意味する。言い換えると、抗体およびエピトープは結合または結合状態の維持を好む傾向がより低いことを意味する。解離定数の減少または（ｏｆ）より低い解離定数は、エピトープと抗体との間で親和性がより高いことを意味する。言い換えると、抗体およびエピトープが結合するか結合状態を維持する可能性がより高い。一定量「に過ぎない」ＫＤの抗体は、抗体が所与の親和性（すなわち、より強い（または強固な）親和性）でエピトープに結合することを意味する。
【００５９】
ＫＤがエピトープと抗体との結合特性を説明する一方で、「力価」は抗体機能についての抗体自体の有効性を説明する。比較的低いＫＤは自動的に高力価を意味しない。したがって、抗体は比較的低いＫＤおよび高い力価（例えば、十分に結合して機能を強く変化させる）、比較的高いＫＤおよび高い力価（例えば、十分に結合しないが機能に強い影響を及ぼす）、比較的低いＫＤおよび低い力価（例えば、十分であるが、特定の機能を変化させるのに有効でない様式で結合する）、または比較的高いＫＤおよび低い力価（例えば、単に標的に十分に結合しない）を有し得る。１つの実施形態では、高力価は、低濃度の抗体で阻害レベルが高いことを意味する。１つの実施形態では、抗体は、そのＩＣ５０が低い場合（例えば、１３００〜６００、６００〜２００、２００〜１３０、１３０〜１２０、１２〜５０、５０〜１０、１０〜１、または１未満のｐＭ）、強力であるか力価が高い。
【００６０】
「実質的に」は、他で特定しない限り、別の用語と組み合わせて、値が任意の量の範囲内で変化し得ることであって、この任意の量が実施形態の作製または実施中に起こり得る測定時のエラーに寄与し得ることを意味する。「有意に」は、特許請求の範囲に記載の発明がその目的の用途のために機能するのに十分である限り、値が変化し得ることを意味する。
【００６１】
抗体に関する用語「選択的に結合する」は、抗体が１つの物質のみに結合することを意味しない。むしろ、第１の物質に対する抗体のＫＤが第２の物質に対するＫＤよりも低いことを示す。エピトープに排他的に結合する抗体は、１つのエピトープのみに結合する。
【００６２】
本明細書中で使用される、用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、変異型に関して以下にさらに記載の天然に存在するＬアミノ酸またはＤアミノ酸をいう。一般的に使用されるアミノ酸の一文字表記および三文字表記を、本明細書中で使用する（Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（３ｄ  ｅｄ．１９９４））。
【００６３】
用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体をいう。
【００６４】
用語「ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）」は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）（本明細書中で参考として援用される）に記載のヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の２４５ｋｂおよび１９０ｋｂサイズの生殖細胞系の立体配置フラグメントを含むように操作されたマウス株をいう。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から利用可能である。
【００６５】
用語「ＸＥＮＯＭＡＸ（登録商標）」は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）動物を使用した場合、「選択されたリンパ球抗体法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｉ９３：７８４３−７８４８（１９９６））の使用をいう。
【００６６】
用語「ＳＬＡＭ（登録商標）」は、「選択されたリンパ球抗体法」（Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｉ９３：７８４３−７８４８（１９９６）およびＳｃｈｒａｄｅｒ、米国特許第５，６２７，０５２号（共にその全体が本明細書中で参考として援用される）をいう。
【００６７】
用語「疾患」、「病状」、および「障害」は、細胞、身体機能、系、または器官の中断、停止、または障害が起こった細胞または哺乳動物全体の生理学的状態をいう。
【００６８】
用語「症状」は、ある障害に一般的な特徴であるかどうかにかかわらず、該障害の任意の物理的または認められる徴候を意味する。用語「症状」は、全てのこのような徴候またはその任意の一部を意味し得る。
【００６９】
用語「処置する」または「処置」は、望ましくない生理学的変化または障害（癌の発症または拡大など）を防止するか遅延させる（減少させる）ことを目的とする治療上の処置および予防または防止手段をいう。本発明の目的のために、有利または所望の臨床結果には、症状の緩和、疾患範囲の縮小、状態の安定化（すなわち、悪化させないこと）、疾患の進行の遅延または減速、病状の緩和または待期的緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、寛解（部分的または全体）（検出可能かどうかにかかわらず）が含まれるがこれらに限定されない。「処置」はまた、治療を受けなかった場合の予想される寿命と比較した場合の延命を意味し得る。治療を必要とする者は、状態または障害を既に罹患した者および状態または障害を有する傾向のある者または状態または障害を防止すべき者である。疾患または症状と組み合わせて使用する場合、用語「阻害する」は、抗体が疾患または症状を軽減または消失させることができることを意味し得る。
【００７０】
用語「患者」には、ヒトおよび脊椎動物の被験体が含まれる。
【００７１】
処置を目的とした「投与」は、患者への送達を意味する。制限されない例として、このような送達は、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下、経口、局所、経皮、または外科的であり得る。
【００７２】
処置を目的とした「治療有効量」は、患者の状態および／または症状の観察可能な変化がその投与（単独または他の処置と組み合わせた）に起因し得るような量を意味する。
【００７３】
処置を目的とした「薬学的に許容可能なビヒクル」は、患者に投与することができる物理的実施形態である。薬学的に許容可能なビヒクルは、丸薬、カプセル、カプレット、錠剤、経口投与用液体、注射用液体、スプレー、エアロゾル、ロゼンジ、栄養補助食品、クリーム、ローション、オイル、溶液、ペースト、粉末、蒸気、または液体であり得るがこれらに限定されない。薬学的に許容可能なビヒクルの一例は、緩衝化等張液（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））である。
【００７４】
処置を目的とした「中和する」は、化学的および／または生物学的活性を部分的または完全に抑制することを意味する。
【００７５】
処置を目的とした「下方制御」は、特定の標的組成物レベルを低下させることを意味する。
【００７６】
処置を目的とした「哺乳動物」は、哺乳動物（ヒト、家畜、動物園の動物、競技用動物、またはペット（サル、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が含まれる）として分類される任意の動物をいう。
【００７７】
本明細書中で言及される、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか）の重合形態またはいずれかのヌクレオチド型の修飾形態を意味する。この用語には、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態が含まれる。
【００７８】
本明細書中で使用される、用語「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、合成起源、またはいくつかのその組み合わせのポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源によって、「単離ポリヌクレオチド」は、（１）「単離ポリヌクレオチド」が天然で見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合しないか、（２）天然に連結しないポリヌクレオチドと作動可能に連結するか、（３）より大きな配列の一部として天然に存在しない。
【００７９】
本明細書中で言及される、用語「オリゴヌクレオチド」には、天然に存在するオリゴヌクレオチドならびに天然に存在するオリゴヌクレオチド結合および天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって互いに連結した修飾ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般に、２００塩基または２００より少ない塩基を含むポリヌクレオチド小集団である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常、一本鎖（プローブのため）であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築で使用するために二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【００８０】
本明細書中で使用される、用語「天然に存在するヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書中で言及される、用語「修飾ヌクレオチド」には、修飾されているか置換された糖基などを有するヌクレオチドが含まれる。本明細書中で言及される、用語「オリゴヌクレオチド結合」には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、およびホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合が含まれる。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）（その開示が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。オリゴヌクレオチドには、必要に応じて、検出用標識が含まれ得る。
【００８１】
本明細書中で言及される、用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能且つ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそのフラグメントは、かなりの量の非特異的核酸への検出可能な結合を最小にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を使用して、当該分野で公知および本明細書中で考察される選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することができる。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体フラグメントと目的の核酸配列との間の核酸配列の相同性は、少なくとも８０％、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％に相同性が増加することが好ましい。
【００８２】
本明細書中で使用される、用語「調節配列」は、結合するコード配列を発現およびプロセシングするために必要であるポリヌクレオチド配列をいう。調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような調節配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれる。真核生物では、一般に、このような調節配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。用語「調節配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必須である最低限の全ての成分が含まれ、その存在が有利であるさらなる成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）も含まれ得ることが意図される。
【００８３】
本明細書中で使用される、用語「作動可能に連結される」は、成分が意図する様式で機能することが可能になる関係であるように説明される成分の位置をいう。例えば、コード配列に「作動可能に連結された」調節配列を、調節配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような様式で連結する。
【００８４】
本明細書中で言及される、用語「単離タンパク質」は、その起源または誘導源によって、「単離タンパク質」が、（１）天然で見出されたタンパク質に会合しないか、（２）同一供給源由来の他のタンパク質を含まないか（例えば、マウスタンパク質を含まない）、（３）異なる種由来の細胞によって発現するか、（４）天然に存在しないｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、合成起源、またはそのいくつかの組み合わせのタンパク質を意味する。
【００８５】
用語「ポリペプチド」を、未変性のタンパク質、フラグメント、ポリペプチド配列のアナログをいうための一般名として本明細書中で使用する。したがって、未変性のタンパク質、フラグメント、およびアナログは、ポリペプチド属の種である。本発明の好ましいポリペプチドは、例えば、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、および３８によって示されるヒト重鎖免疫グロブリン分子、例えば、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、および４０によって示されるヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、重鎖免疫グロブリン分子と軽鎖免疫グロブリン分子（κ軽鎖免疫グロブリン分子など）との組み合わせおよびその逆によって形成された抗体分子ならびにそのフラグメントおよびアナログを含む。
【００８６】
他で明記しない限り、一本鎖ポリペプチド配列の左側の末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の方向は５’方向をいう。未完成ＲＮＡ転写物の５’→３’方向への付加を転写方向といい、ＲＮＡと同一の配列を有し、且つＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列」といい、ＲＮＡと同一の配列を有し、且つＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」という。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、２０種の従来のアミノ酸およびその略語は、従来の用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸（α−など）、α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）はまた、本発明のポリペプチドに適切な成分であり得る。非従来型のアミノ酸の例には、以下が含まれる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で使用されるポリペプチドの表記では、標準的な用法および慣習に従って、左側方向はアミノ末端方向であり、右側方向はカルボキシ末端方向である。
【００８８】
用語「〜に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部に相同である（すなわち、同一である（厳密には進化的に関連しない））こと、またはポリペプチド配列が基準ポリペプチド配列と同一であることを意味するために本明細書中で使用される。
【００８９】
対照的に、用語「〜と相補的である」は、相補配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味するために本明細書中で使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、基準配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、基準配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００９０】
以下の用語は、２つまたは２つよりも多いポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列の関係を説明するために使用される用語の例である：「基準配列」、「比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一率」、「実質的同一性」、および「相同性」。「基準配列」は、配列比較の基本として使用される定義された配列である。基準配列は、例えば、全長ｃＤＮＡのセグメントまたは配列表に示した遺伝子配列としてのより大きな配列の小集団であり得るか、完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含み得る。一般に、基準配列は、少なくとも１８ヌクレオチド長または６アミノ酸長、頻繁には２４ヌクレオチド長または８アミノ酸長、しばしば少なくとも４８ヌクレオチド長または１６アミノ酸長である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、それぞれ、（１）２分子間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含むことができ、（２）２ポリヌクレオチド配列間または２アミノ酸配列間で異なる配列をさらに含み得るので、２つ（または２つより多い）分子の間の配列比較を、典型的には、配列類似性の局所領域を識別および比較するために「比較ウィンドウ」にわたって２分子の配列を比較することによって行う。
【００９１】
本明細書中で使用される、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を少なくとも１８個の連続するヌクレオチドまたは６個のアミノ酸配列の基準配列と比較する少なくとも約１８個の連続するヌクレオチド部分または６個のアミノ酸の概念セグメントをいい、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分には、２配列の至適なアラインメントのために基準配列（付加や欠失を含まない）と比較して２０％または２０％未満の付加、欠失、および置換など（すなわち、ギャップ）が含まれ得る。配列ウィンドウのアラインメントのための配列の至適なアラインメントを、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ（商標）、またはＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（登録商標）ソフトウェアパッケージ）、または目視（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって行うことができ、種々の方法によって得られた最適なアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたる最も高い相同率が得られる）を選択する。
【００９２】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が比較ウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド毎または残基毎を基本とする）ことを意味する。用語「配列同一率」を、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントした配列を比較し、両配列中に同一のヌクレオチド塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して適合位置数を得て、適合位置数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、この結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって計算する。本明細書中で使用される、用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）の位置の比較ウィンドウ、頻繁に、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）の位置のウィンドウにわたって基準配列と比較した場合、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特徴を示し、この配列同一率を、基準配列と比較ウィンドウにわたって基準配列の合計２０％または２０％未満の欠失または付加を含み得る配列との比較によって計算する。基準配列は、より大きな配列の小集団であり得る。
【００９３】
２つのアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、その配列間で部分的または完全に同一である場合、「相同」である。例えば、８５％相同は、最大に適合するように２つの配列をアラインメントした場合に８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。最大に適合させるためのギャップ（２つの配列のいずれかが適合する）が可能である。５または５未満のギャップ長が好ましく、２または２未満がより好ましい。あるいは、および好ましくは、２つのタンパク質配列（または少なくとも約３０アミノ酸長のポリペプチド由来のポリペプチド配列）は、変異データ行列および６または６を超えるギャップペナルティを用いたプログラムＡＬＩＧＮを使用して５（標準偏差単位）を超えるアラインメントスコアを有する場合、相同（本明細書中でこの用語を使用する場合）である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻の増補（ｐｐ．１−１０）を参照のこと。２つの配列またはその一部は、より好ましくは、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適にアラインメントした場合、そのアミノ酸が５０％以上同一である場合に相同である。
【００９４】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的同一性」は、デフォルトギャップウェイトを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントした場合、２つのペプチド配列が少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換と異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族水酸基の側鎖を有するアミノ酸群はセリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００９５】
本明細書中で考察されるように、アミノ酸配列の変動を少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％に維持する場合、抗体分子または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列の小さな変動が本発明に含まれることが意図される。特に、保存的アミノ酸置換が意図される。保存的置換は、その側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。遺伝子コードされたアミノ酸は、一般に、以下のファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ならびに（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは、以下である。セリンおよびトレオニンは脂肪族ヒドロキシファミリーである。アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーである。アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは脂肪族ファミリーである。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリンへの単独の置換、またはアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸への類似の置換が、特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合に、得られた分子の結合または性質に大きな影響を及ぼさないと予想するのは妥当である。アミノ酸の変化によって機能的ペプチドが得られるかどうかを、ポリペプチド誘導体の特定の活性のアッセイによって容易に決定することができる。アッセイを、本明細書中に詳述する。当業者は、抗体分子または免疫グロブリン分子のフラグメントまたはアナログを容易に調製することができる。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノ末端およびカルボキシル末端は、機能ドメインの境界付近に生じる。構造ドメインおよび機能ドメインを、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列のデータと公的または独自の配列データベースとの比較によって同定することができる。好ましくは、コンピュータ化された比較方法を使用して、公知の構造および／または機能の他のタンパク質中で起こる配列モチーフまたは予想されるタンパク質の高次構造ドメインを同定する。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列の同定方法は公知である。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。上記の例は、当業者が本発明の構造ドメインおよび機能ドメインを定義するために使用することができる配列モチーフおよび構造の高次構造を認識することができることを証明している。
【００９６】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させる置換、（２）酸化に対する感受性を減少させる置換、（３）タンパク質複合体形成に対する結合親和性を変化させる置換、（４）結合親和性を変化させる置換、（５）このようなアナログの他の物理化学的または機能的性質を付与するか改変する置換である。アナログには、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインが含まれる。例えば、天然に存在する配列（好ましくは、分子内接触するドメインの外側のポリペプチドの一部）中に１つまたは複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を行うことができる。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造の特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸が親配列で起こるらせんを破壊する、または親配列を特徴づける他の二次構造型を破壊する傾向があるべきではない）。当該分野で認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００９７】
本明細書中で使用される、用語「ポリペプチドフラグメント」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が欠失しているが、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推定された天然に存在する配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは、典型的には、少なくとも５、６、８、または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長である。他の実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも２５アミノ酸長、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸長、さらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００９８】
一般に、製薬工業では、テンプレートペプチドの性質に類似の性質を有する非ペプチド薬としてペプチドアナログを使用する。これらの非ペプチド化合物型を、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓまたはｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」という。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）（本明細書中で参考として援用される）。このような化合物を、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングを活用して開発する。治療に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物を使用して、等価な治療効果または予防効果を得ることができる。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的性質または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、当該分野で周知の方法によって、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群から選択される結合と任意選択的に置換された１つまたは複数のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の同型のＤ−アミノ酸との合成的置換（例えば、Ｌ−リジンのＤ−リジンとの置換）を使用して、より安定なペプチドを生成することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列の異形（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を含む拘束されたペプチドを、当該分野で周知の方法（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）（本明細書中で参考として援用される））、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド結合を形成することができる内部システイン残基の付加によって生成することができる。
【００９９】
本明細書中で使用される、用語「標識」または「標識された」は、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込みによる検出可能なマーカーの組み込みまたは印をつけたアビジン（例えば、光学的方法または比色分析法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチへの結合をいう。一定の状況では、標識またはマーカーは、治療マーカーでもあり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質の種々の標識方法が当該分野で公知であり、これらを使用することができる。ポリペプチド用標識の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次受容体によって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、種々の長さのスペーサーアームによって標識を結合して潜在的な立体障害を減少させる。
【０１００】
本明細書中で使用される、用語「薬学的薬剤（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）または薬物」は、患者に適切に投与した場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物または組成物をいう。本明細書中の他の化学用語を、例えばＴｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））（本明細書中で参考として援用される）に例示されるような、当該分野における従来の用法に従って使用する。
【０１０１】
「薬剤」は、哺乳動物（ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ、または任意の他の温血動物が含まれるが、これらに限定されない）の活動期の疾患の治療、予防的治療、または診断で有用な物質をいう。例えば、薬剤は、放射性同位体、毒素、薬学的薬剤、オリゴヌクレオチド、細胞傷害薬、組換えタンパク質、抗体フラグメント、抗癌薬、抗接着薬、抗血栓症薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝固薬、抗菌薬、抗ウイルス薬、および抗炎症薬からなる群から選択される。このような薬剤の他の例には、抗ウイルス薬（アシクロビル、ガンシクロビル、およびジドブジンが含まれる）；抗血栓症薬／再狭窄薬剤（シロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム、およびアスピリンが含まれる）；抗炎症薬（ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸１７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトレメチン（ａｍｔｏｌｍｅｔｉｎ）、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ、およびニメスリドが含まれる）；抗自己免疫薬（レフルノミド、デニロイキンジフチトクス、スブレウム（ｓｕｂｒｅｕｍ）、ＷｉｎＲｈｏＳＤＦ、デフィブロチド、およびシクロホスファミドが含まれる）；および抗接着薬／抗凝集薬（リマプロスト、クロルクロメン（ｃｌｏｒｃｒｏｍｅｎｅ）、およびヒアルロン酸が含まれるが、これらに限定されない。用語「薬剤」は、所望の方法で標的細胞または標的領域に影響を及ぼし得る当業者に公知であるか本明細書中に開示の任意の化合物を含むことを意味する。薬剤には、標識および種々の治療薬も含まれ得る。
【０１０２】
本明細書中で使用される、用語「実質的に純粋な」は、目的の種（ｏｂｅｊｅｃｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が存在する種のうちで主な種であり（モルに基づいて組成物中の任意の他のそれぞれの種よりも豊富である）、好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種が存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モルベースで）含まれる組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超含まれる。最も好ましくは、目的の種を、本質的に均一になるまで（従来の検出方法によって組成物中に夾雑種を検出することができなくなるまで）精製し、組成物は本質的に１つの高分子種からなる。
【０１０３】
用語「Ｔｅｎ−Ｍタンパク質」は、テネウリン（ｔｅｎｅｕｒｉｎ）またはｈＯｄｚとしても公知のＴｅｎ−Ｍ遺伝子ファミリー由来のタンパク質を示す。Ｔｅｎ−Ｍタンパク質は、短い細胞内Ｎ末端を含み、その後に膜貫通領域、８つのＥＧＦ様反復（上皮成長因子様反復）、細胞外側に巨大な球状ドメインが続くＩＩ型膜貫通タンパク質クラスである。Ｔｅｎ−Ｍ２は、このタンパク質ファミリーの特定のメンバーを示す。Ｔｅｎ−Ｍ２は、ＣＧ５０４２６としても公知である。開示の抗体の調製で使用されるＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の単離区域を、図１Ａの配列番号５３（アミノ酸４００〜１２２６）および図１Ｂの配列番号５４（アミノ酸４００〜２７３３）に示す。当業者に認識され、以下により詳細に記載されるように、Ｔｅｎ−Ｍ２の他の区域を使用して、本明細書中に記載の様式と同一の様式で抗体を生成することができる。
【０１０４】
さらに、当業者によって認識されるように、本明細書および本開示を容易に適用して、種々のＴｅｎ−Ｍファミリーの種々のメンバーに指向する抗体を作製および使用することができるが、簡潔にするために、本発明の例としてＴｅｎ−Ｍ２タンパク質を考察する。ラット（Ｏｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１２，１６５−１８１３（１９９９））；ニワトリ（Ｍｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１２，２０１９−２０３２（１９９９）；Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１６，１９５−２０９（１９９９）；Ｔｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９８，１８７−１９１（２０００）；Ｔｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２０，２７−３９（２００１））、ヒト（Ｂｒａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８，２４０７−２４１３（１９９９）；Ｍｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２５７，８７−９７（２０００））、ゼブラフィッシュ（Ｍｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８７，２２３−２２７（１９９９））、および線虫（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，３２−３８（１９９４））のＴｅｎ−Ｍタンパク質ファミリーのメンバーが記載されている。
【０１０５】
Ｔｅｎ−Ｍ２抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、癌細胞におけるＴｅｎＭ２／Ｔｅｎ−Ｍ２二重鎖の形成を防止し、それにより、癌が別の位置に拡大する可能性を軽減することができる。当業者に認識されているように、抗体は、多数の方法でＴｅｎＭ２／Ｔｅｎ−Ｍ２二重鎖形成を防止または減少させることができる。例えば、抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質のＴｅｎＭ２／Ｔｅｎ−Ｍ２二重鎖形成のための結合に関与する区分（例えば、ＥＧＦ様反復）に直接結合し、それにより、２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の相互の有効な結合を防止することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、二重鎖形成に関与するＥＧＦ様反復に直接結合する。任意の１つまたは複数のＥＧＦ様反復（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および第８の反復が含まれる）に結合するための抗体を作製することができる。したがって、１つの実施形態では、抗体は、第２および第４のＥＧＦ様反復に結合することができる。これらの特定の区域に結合する完全なヒト抗体を、本明細書中に開示の方法および当業者の知識によって生成することができる。あるいは、抗体は別の位置に結合することができ、抗体の非結合区域はタンパク質の２つの半分（ｔｗｏ  ｈａｌｖｅｓ）の結合を立体的に妨害することができる。あるいは、抗体はＴｅｎ−Ｍ２タンパク質上のある位置に結合してタンパク質の高次構造の変化を誘導し、二重鎖形成を防止することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、抗体は２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質を結合させるが、任意の機能的シグナル伝達が起こるのを防止するような方法で結合する。いくつかの実施形態では、これは二重鎖形成に直接関与するＴｅｎ−Ｍ２タンパク質区分の一部のみ（例えば、１つのＥＧＦ様反復）に結合する抗体を含み、そうでなければ抗体は２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の結合に干渉しない。各抗体が２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合することができるので、この特定の抗体は、二重鎖を形成するために利用可能なＴｅｎ−Ｍ２タンパク質数を減少させる利点を有する。同様に、いくつかの実施形態では、２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に一度に結合する抗体もこの利点を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＴｅｎＭ２／Ｔｅｎ−Ｍ２二重鎖の解離を実際に促進する。他の実施形態では、抗体は、ＴｅｎＭ２／Ｔｅｎ−Ｍ２二重鎖の形成を促進する。このような抗体を、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質またはその二重鎖の特定の位置に対して抗体を惹起することによって作製することができ、その結果、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質またはその二重鎖に結合した場合、抗体がＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の他の状態（個別または二重鎖形成状態）の安定化に役立つ。
【０１０８】
当業者は、１）本教示、２）Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質からの論理的な選択（例えば、ＥＧＦ様反復ｌの１つ、いくつか、または全て）、３）標準的な抗体結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）デバイスにおける表面プラズモン共鳴）、および４）機能的二重鎖形成アッセイ（例えば、下記に類似の細胞移動アッセイ）と組み合わせて、上記抗体を容易に生成し、同定し、単離し、使用することができることを認識する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ｔｅｎ−Ｍ２に対する抗体は、種々のＴｅｎ−Ｍ形態および種々のＴｅｎ−Ｍ２形態に選択性を示す。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔｅｎ−Ｍ２に対する抗体は、Ｔｅｎ−Ｍの他の形態（例えば、Ｔｅｎ−Ｍ４、Ｔｅｎ−Ｍ１、およびＴｅｎ−Ｍ３）よりもＴｅｎ−Ｍ２に強固に結合する。例えば、抗体は、他のＴｅｎ−Ｍタンパク質の任意の組み合わせの１つよりもＴｅｎ−Ｍ２に１〜５倍、５〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、または４０〜５０倍強固に結合することができる。他の実施形態では、抗体は、細胞に会合したＴｅｎ−Ｍタンパク質および細胞から解離したＴｅｎ−Ｍタンパク質（特に、Ｔｅｎ−Ｍ２）に選択性を示す。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、細胞表面に付着するＴｅｎ−Ｍ２タンパク質により強固に結合することができる。他の実施形態では、抗体は、細胞から除去されたか分泌または切断されるＴｅｎ−Ｍ２タンパク質により強固に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、等しい強度で両方の形態に結合することができる。他の実施形態では、抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質の１つの形態のみに有効に結合することができる。選択性は、一方の形態について他方の形態と比較して、任意の量（２〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍または５０倍を超える選択性）であり得る。どのようにしてこのような選択的抗体を生成し、このような選択性を決定するのかについての例を、以下の実施例に示す。
【０１１０】
他の実施形態では、Ｔｅｎ−Ｍ２に結合する抗体を、いくつかの薬剤型または化合物型に会合する。薬剤の抗体との会合により、薬剤または化合物がＴｅｎ−Ｍ２を発現する細胞に送達することが可能である。認められるように、Ｔｅｎ−Ｍ２は癌細胞中で発現するので、この組み合わせは細胞傷害薬または治療薬などの薬剤を癌細胞に送達することが可能である。薬剤を、種々の方法で抗体に会合することができる。例えば、薬剤を抗体に直接連結するか、リンカー（切断可能なリンカーであり得る）を介して付着させるか、二次抗体を介して会合することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、他の抗体または薬剤による抗体の結合を可能にするためのエピトープを含む。当業者に認識されるように、薬剤を毒素に会合させる正確な様式はデバイスまたは方法に重要ではない。これらの組成物およびその使用方法に関連するこの問題および他の問題を、特に、以下の「他の治療薬のデザインおよび生成」というタイトルの項でより詳細に考察する。
【０１１１】
抗体の構造
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが公知である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０または１１０を超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分により、主にエフェクター機能を担う定常領域が定義される。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それにより、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソ型が定義される。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域が約１２または１２を超えるアミノ酸の「Ｊ」領域で連結され、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。各軽鎖および／または重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０１１２】
したがって、抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同一である。
【０１１３】
全ての鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲがフレームワーク領域と一列に並び、特異的エピトープと結合することができる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０１１４】
二重特異性抗体または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および異なる結合部位を有する人為的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体を、種々の方法（ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結が含まれる）によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０），Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。二重特異性抗体の産生は、従来の抗体の産生と比較して比較的骨の折れる集中的なプロセスであり得、二重特異性抗体の収率および純度は、一般に、低い。二重特異性抗体は、１つの結合部位を有するフラグメントの形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ）で存在しない。
【０１１５】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変領域および／または定常領域を有する抗体に関連するいくつかの問題が回避される。このようなマウスまたはラット由来のタンパク質の存在により抗体が急速にクリアランスされ得るか、患者によって抗体に対する免疫応答が生成され得る。マウスまたはラット由来の抗体の利用を回避するために、げっ歯類が完全なヒト抗体を産生するようなげっ歯類へのヒト抗体機能の導入によって完全なヒト抗体を生成することができる。
【０１１６】
完全なヒト抗体の１つの生成方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の２４５ｋｂおよび１９０ｋｂサイズの生殖細胞系立体配置フラグメントを含むように操作されたマウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）の使用による。Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販されている。
【０１１７】
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）の産生は以下でさらに考察し、示されている：１９９０年１月１２日出願の米国特許出願番号０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日出願の０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日出願の０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日出願の０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日出願の０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日出願の０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日出願の０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日出願の０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日出願の０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日出願の０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日出願の０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日出願の０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日出願の０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日出願の０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日出願の０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日出願の０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日出願の０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日出願の０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日出願の０８／７５９，６２０号、米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、および同第５，９３９，５９８号、日本特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２号、同第３  ０６８  ５０６  Ｂ２号、および同第３  ０６８  ５０７  Ｂ２号。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）も参照のこと。１９９６年６月１２日付与された欧州特許第０  ４６３  １５１  Ｂｌ号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願番号ＷＯ９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願番号ＷＯ９６／３４０９６号、１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願番号ＷＯ９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０号も参照のこと。上記引用の各特許、出願、および引例の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１１８】
別のアプローチでは、その他（ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．が含まれる）は、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを使用した。ミニ遺伝子座アプローチでは、外因性Ｉｇ遺伝子座を、Ｉｇ遺伝子座由来の小片（ｐｉｅｃｅｓ）（各遺伝子）の封入によって模倣する。したがって、１つまたは複数のＶＨ遺伝子、１つまたは複数のＤＨ遺伝子、１つまたは複数のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）を、動物への挿入のための構築物に形成する。このアプローチは、以下に記載されている：Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，５４５，８０７号、それぞれがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに付与された米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、および同第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓに付与された米国特許第５，５９１，６６９号および同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、および同第５，７８９，２１５号、ＣｈｏｉおよびＤｕｎｎに付与された米国特許第５，６４３，７６３号、１９９０年８月２９日出願のＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願番号０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日出願の０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日出願の０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日出願の０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日出願の０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日出願の０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日出願の０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日出願の０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日出願の０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日出願の０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日出願の０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日出願の０８／２０９，７４１号（その開示が本明細書中で参考として援用される）。欧州特許第０  ５４６  ０７３  Ｂｌ号、国際特許出願番号ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９２／２２６４５号、ＷＯ９２／２２６４７号、ＷＯ９２／２２６７０号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／００５６９号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９６／１４４３６号、ＷＯ９７／１３８５２、およびＷＯ９８／２４８８４号、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），ａｎｄ  Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）をさらに参照のこ���。
【０１１９】
Ｋｉｒｉｎは、微小細胞融合によって大きな染色体片または全染色体を導入したマウス由来のヒト抗体の生成も証明した。欧州特許出願番号７７３２８８号および８４３９６１号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１２０】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答により、キメラ抗体、そうでなければヒト化抗体が産業的に調製されている。キメラ抗体がヒト定常領域およびマウス可変領域を有するが、特に、慢性用量または複数回用量の抗体の利用において一定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が認められると予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸念および／または効果を無効にするために多量体酵素に対する完全なヒト抗体を得ることが望ましいであろう。
【０１２１】
抗体の調製
本明細書中で使用される場合、抗体を、下記のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）テクノロジーを使用して調製した。このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生能を欠く。これを達成するために使用されるテクノロジーは、本明細書中で言及した特許、出願、および引例に開示されている。しかし、特に、マウスのトランスジェニック産生およびトランスジェニック由来の抗体の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日出願の米国特許出願番号０８／７５９，６２０号および１９９８年６月１１日出願の国際特許出願番号ＷＯ９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日出願のＷＯ００／７６３１０号（その開示が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）（その開示が本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。
【０１２２】
以下に詳述するように、このようなテクノロジーの使用により、Ｔｅｎ−Ｍ２に対する完全なヒトモノクローナル抗体を産生した。本質的に、マウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株を、目的の抗原（例えば、ヒトＴｅｎ−Ｍ２）で免疫化し、リンパ細胞（Ｂ細胞など）を、抗体を発現したマウスから回収し、回収した細胞株を骨髄型細胞株と融合して不死化ハイブリドーマ細胞株を調製する。これらのハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、目的の抗原に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞株を同定する。所望の多量体酵素サブユニットオリゴマー形成ドメインに特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株の産生方法を本明細書中に提供する。さらに、このような細胞株によって産生された抗体の特徴付け（このような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列分析が含まれる）を本明細書中に提供する。
【０１２３】
あるいは、ハイブリドーマを生成するために骨髄腫細胞に融合する代わりに、マウスの免疫化ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株から単離した回収細胞を、最初の抗原、好ましくはヒトＴｅｎ−Ｍ２に対する反応性についてさらにスクリーニングする。このようなスクリーニングには、所望のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質を用いたＥＬＩＳＡおよびＴｅｎ−Ｍ２媒介性抗体内在化などの機能アッセイが含まれる。次いで、目的の１つのＢ細胞分泌抗体を、所望のＴｅｎ−Ｍ２特異的溶血性プラークアッセイを使用して単離する（Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｉ９３：７８４３−７８４８（１９９６））。溶解についてターゲティングした細胞は、好ましくは、所望のＴｅｎ−Ｍ２抗原でコーティングされたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌するＢ細胞培養物の存在下で、プラークの形成は、標的細胞の特異的Ｔｅｎ−Ｍ２媒介性溶解を示す。
【０１２４】
プラーク中心の１つの抗原特異的形質細胞を単離することができ、抗体特異性をコードする遺伝情報を１つの形質細胞から単離する。逆転写酵素ＰＣＲを使用して、分泌された抗体の可変領域をコードするＤＮＡをクローン化することができる。次いで、このようなクローン化ＤＮＡを、適切な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含むｐｃＤＮＡベクターにさらに挿入することができる。次いで、生成されたベクターを、宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように改変された従来の栄養培地中で培養することができる。Ｔｅｎ−Ｍ２に特異的な抗体を産生する複数の単一の形質細胞の単離をここに記載する。さらに、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の特異性をコードする遺伝物質を単離し、適切な発現ベクターに導入し、次いで、宿主細胞にトランスフェクトする。
【０１２５】
一般に、上記細胞株によって産生された抗体は、ヒトκ軽鎖と共に完全なヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２重鎖を有していた。抗体は、固相および液相によって測定した場合、高親和性を有していた（典型的には、約１０−９Ｍ〜約１０−１３ＭのＫｄを保有する）。
【０１２６】
上記のように、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現することができる。特定の抗体をコードする配列を、ＣＨＯ細胞などの適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用することができる。形質転換は、宿主細胞へのポリヌクレオチドの任意の公知の導入方法（例えば、ウイルス中への（またはウイルスベクターへの）ポリヌクレオチドのパッケージングおよびウイルス（またはベクター）での宿主細胞の形質導入が含まれる）または米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許が本明細書中で参考として援用される）に例示される当該分野で公知のトランスフェクション手順により行われる。使用される形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存する。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法が当該分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接微量注入が含まれる。
【０１２７】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から利用可能な多数の不死化細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、および多数の他の細胞株が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。特定の好ましい細胞株を、どの細胞株が高い発現レベルを有し、且つＴｅｎ−Ｍ２結合特性を有する抗体を産生するかを決定することによって選択する。
【０１２８】
当業者によって認識されるように、抗原選択は、単純に、抗原から生成された抗体がその自然環境で完全なタンパク質に結合することを自動的に意味しない。したがって、いくつかの実施形態では、元のタンパク質または抗原の変異型よりもむしろ、未変性タンパク質への結合について、抗体を試験し選択する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質を特に意図する。
【０１２９】
抗体配列
代表的なヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、配列表に示し、その内容を以下の表１および図５〜１７にまとめる。
【０１３０】
【表１−１】
2008535823.tif 000003
【０１３１】
【表１−２】
2008535823.tif 000004
【０１３２】
【表１−３】
2008535823.tif 000005
抗体治療薬
抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２活性に関連する症状および状態に治療効果を有することができる。例えば、抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２／Ｔｅｎ−Ｍ２二重鎖の形成を阻害し、それにより、癌転移を阻害することができるか、抗体を薬剤と会合させ、ターゲティングされた細胞に致死毒素を送達させることができる。さらに、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、病状、特に、癌および癌転移の診断薬として有用である。
【０１３３】
必要に応じて、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体のアイソタイプをスイッチして、例えば、異なるアイソタイプの生物学的性質を活用することができる。例えば、いくつかの環境では、Ｔｅｎ−Ｍ２に対する治療抗体として抗体生成と組み合わせて、抗体が補体を固定し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与することができることが望ましいかもしれない。上記が可能な抗体の多数のアイソタイプが存在し、以下が含まれるが、これらに限定されない：マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。生成された抗体がこのようなアイソタイプを最初に保有する必要がなく、むしろ、生成された抗体は任意のアイソタイプを保有することができ、抗体は当該分野で周知の従来技術を使用してその後にスイッチされたアイソタイプであり得ると認識される。このような技術には、特に、直接組換え技術（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと）、細胞−細胞融合技術（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号および同第６，２０７，４１８号を参照のこと）の使用が含まれる。
【０１３４】
例として、本明細書中で考察された抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、ヒト抗体である。抗体がＴｅｎ−Ｍ２に望ましく結合した場合、抗体のアイソタイプを容易にスイッチして、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ３アイソタイプを生成する一方で、依然として同一の可変領域（抗体の特異性およびいくつかのその親和性を定義する）を保有することができる。次いで、このような分子は、補体を固定し、ＣＤＣに関与することができるであろう。
【０１３５】
細胞−細胞融合技術では、任意の所望のアイソタイプを有する重鎖を保有する骨髄腫細胞株または他の細胞株を調製し、軽鎖を保有する別の骨髄腫細胞株または他の細胞株を調製する。その後、このような細胞を融合し、インタクトな抗体を発現する細胞株を単離することができる。
【０１３６】
したがって、上記で考察される所望の「構造」特性を満たす抗体候補を生成する場合、一般に、アイソタイプスイッチングによる少なくとも一定の所望の「機能」特性を有する抗体候補を得ることができる。
【０１３７】
Ｔｅｎ−Ｍ２に結合する生物学的に活性な抗体を、好ましくは、Ｔｅｎ−Ｍ２活性を減少させるための滅菌薬学的調製物または処方物中で使用する。抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は、好ましくは、標的治療範囲内にＴｅｎ−Ｍ２活性を強く抑制するのに適切な親和性を保有する。抑制は、抗体が別のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質へのＴｅｎ−Ｍ２への結合を妨害する能力に起因し得る。さらに、抗体は、Ｔｅｎ−Ｍ２シグナル伝達事象が一般に起こらないように、高次構造またはＴｅｎ−Ｍ２タンパク質を変化させることができる。
【０１３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用する場合、抗体処方物は、無菌であることが好ましい。これは、当該分野で公知の任意の方法（例えば、滅菌濾過膜による濾過）によって容易に達成される。抗体は、通常、滅菌形態または液体で保存される。凍結乾燥および再構成の前後で滅菌濾過を行う。
【０１３９】
治療抗体組成物を、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈注射液バッグ）または処方を補助するアダプター（皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーなど）を有するバイアルに入れる。
【０１４０】
抗体の投与経路は、公知の方法に従う（例えば、以下に記載の静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、鞘内の注射もしくは注入、吸入もしくは病変内経路、または徐放系）。いくつかの状況では、抗体を、好ましくは、注入またはボーラス注射によって投与する。他の状況では、抗体を含む治療組成物を、好ましくは液体または粉末のエアロゾル（凍結乾燥）として、鼻または肺を介して投与することができる。必要に応じて、組成物を、静脈内、非経口、または皮下に投与することができる。全身に投与する場合、治療組成物は、滅菌され、発熱物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性に関して十分に考慮した非経口で許容可能な溶液であるべきである。これらの条件は、当業者に公知である。
【０１４１】
本明細書中に記載のように、治療用の抗体を、典型的に、処方物に組み込んで輸送、送達、および耐性などが改良される適切なキャリア、賦形剤、他の薬剤を使用して調製する。簡潔に述べれば、保存または投与のための本明細書中に記載の抗体の投薬処方物を、所望の純度を有する抗体を１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製する。これらの処方物には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、小胞（リポフェクチン（商標）など）を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油滴型乳濁液、油中水滴型乳濁液、カルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、カルボワックスを含む半固体混合物が含まれ得る。処方物には、緩衝液（ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および他の有機酸塩など）、抗酸化剤（アスコルビン酸など）、低分子量（約１０残基未満）のペプチド（ポリアルギニンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなど）、モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストランが含まれる）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、対イオン（ナトリウムなど）、および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、またはポリエチレングリコールなど）が含まれ得る。他の許容可能なキャリア、賦形剤、および安定剤は、当業者に周知である。処方物中の有効成分が処方物によって不活化されず、且つ処方物が投与経路と生理学的に適合可能且つ許容可能なである場合、任意の上記混合物は、本発明の治療および療法で適切であり得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”  Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３２（２）：２１０−８（２０００），Ｗａｎｇ  Ｗ．”Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００），Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ  ”Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ．８９（８）：９６７−７８（２０００），Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）、およびさらなる情報を得るための参考文献も参照のこと。
【０１４２】
注射用滅菌組成物を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３））に記載の従来の薬務にしたがって処方することができる。例えば、水またはゴマ油、ラッカセイ油、もしくは綿実油のような天然に存在する植物油のようなビヒクル中の活性化合物の溶解物または懸濁物、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクルが望ましいかもしれない。許容される薬務にしたがって、緩衝液、防腐剤、および抗酸化剤などを組み込むことができる。
【０１４３】
抗体を徐放性調製物として投与し、長期にわたり放出させることもできる。徐放性処方物の適切な例には、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。マトリックスは、成型品、フィルム、またはマイクロカプセルの形態であり得る。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，（１９８１）１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，（１９８２）１２：９８−１０５に記載のポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，（１９８３）２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−ビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ、前出）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。
【０１４４】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが１００日間にわたって分子を放出することができる一方で、一定のヒドロゲルは、より短い時間間隔でタンパク質を放出する。カプセル化タンパク質が長期間体内に保持される場合、これらは、３７℃で水分に曝露された結果として変性または凝集し、生物活性を喪失し、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機構に応じて、タンパク質安定化のための妥当なストラテジーを考案することができる。例えば、凝集機構がジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、適切な添加物を使用した含水量の調節、および特異的ポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化することができる。
【０１４５】
徐放性組成物には、懸濁液中に結晶を維持することができる適切な処方物中に懸濁された抗体の結晶の調製物も含まれる。皮下または腹腔内に注射された場合、これらの調製物は、徐放効果を発揮することができる。他の組成物には、リポソーム捕捉抗体も含まれる。このような抗体を含むリポソームを、それ自体が公知の方法によって調製する（米国特許第ＤＥ  ３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５）８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０）７７：４０３０−４０３４；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２，６４１号；日本特許出願８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号）。
【０１４６】
所与の患者のための抗体処方物の投薬量を、担当医が決定することができる。適切な投薬量の決定では、医師は治療薬の作用を改変することが公知の種々の要因（例えば、疾患の重症度および型、体重、性別、食事、投与時間および経路、他の投薬ならびに他の関連する臨床要因が含まれる）を考慮することができる。治療有効投薬量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかによって決定することができる。
【０１４７】
本明細書中に記載の治療で使用すべき有効量の抗体は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。したがって、セラピストは、至適な治療効果を得るために必要な投薬量の力価を測定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を修正することが好ましい。典型的な１日投薬量は、上記要因に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇを超えるまでの範囲であり得る。典型的には、臨床家は、投薬量が所望の効果を達成するまで治療抗体を投与する。この治療の進行を、従来のアッセイによって容易にモニタリングする。
【０１４８】
本明細書中に記載の抗体がＴｅｎ−Ｍ２活性に起因するか関連する症状および状態の治療で治療効果を有すると予想される。
【０１４９】
他の治療薬のデザインおよび生成
本発明に従い、且つＴｅｎ−Ｍ２に関して本明細書中で産生されて特徴づけられた抗体の活性に基づくと、他の治療方法のデザインが容易になり、これらのデザインが当業者に開示される。このような方法には、高度な抗体治療薬（二重特異性抗体、免疫毒素、および放射性標識治療薬など）、ペプチド治療薬の生成、遺伝子療法（特に、細胞内発現抗体）、アンチセンス治療薬、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
高度な抗体治療薬の生成と組み合わせて、補体固定が望ましい特性である場合、例えば、二重特異性物質、免疫毒素、または放射性標識の使用によって細胞死滅のための補体への依存を回避することが可能である。
【０１５１】
例えば、（ｉ）２つの抗体（一方のＴｅｎ−Ｍ２に特異性を有する抗体および他方の第２の分子に対する抗体が互いに結合体化している）、（ｉｉ）Ｔｅｎ−Ｍ２に特異的な一方の鎖および第２の分子に特異的な第２の鎖を有する１つの抗体、または（ｉｉｉ）Ｔｅｎ−Ｍ２および他の分子の両方に特異性を有する単鎖抗体を含む二重特異性抗体を生成することができる。このような二重特異性抗体を、周知の技術（例えば、（ｉ）および（ｉｉ）との組み合わせ（例えば、Ｆａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）およびＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ，前出を参照のこと）および（ｉｉｉ）との組み合わせ（例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｎｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２）を参照のこと））を使用して生成することができる。いずれの場合にも、必要に応じて第２の特異性を得ることができる。例えば、重鎖活性化受容体（ＣＤ１６またはＣＤ６４（例えば、Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．１８：１２７（１９９７）を参照のこと）またはＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照のこと）（ただしこれらに限定されない）に対する第２の特異性を得ることができる。いくつかの実施形態では、２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合するように抗体をデザインする。いくつかの実施形態では、２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質に結合し、且つ２つのＴｅｎ−Ｍ２タンパク質がシグナル伝達が起こり得る様式で実際に互いに接触することをさらに回避するように抗体をデザインする。この実施形態では、結果は、Ｔｅｎ−Ｍ２の抗体によるシグナル伝達が防止され、各抗体が２つのＴｅｎ−Ｍ２分子を停止させることができるという点で有利であり得る。
【０１５２】
当該分野で周知の技術を使用して、免疫毒素として作用するように抗体を修飾することもできる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照のこと。米国特許第５，１９４，５９４号も参照のこと。放射性標識抗体の調製と組み合わせて、当該分野で周知の技術を使用して、このような修飾抗体を容易に調製することもできる。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｈａｆｈｅｒおよびＬｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照のこと。米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号、同第５，１０２，９９０号（再発行第３５，５００号）、同第５，６４８，４７１号、および同第５，６９７，９０２号も参照のこと。各免疫毒素および放射性標識分子は、所望の多量体酵素サブユニットドメインを発現する細胞を死滅させる可能性が高いであろう。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて有効量の抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を、薬剤（例えば、放射性同位体、薬学的組成物、または毒素）に連結する。好ましくは、このような抗体を、疾患の治療のために使用することができ、このような疾患は、ｔｅｎ−Ｍタンパク質、および特にＴｅｎ−Ｍ２の過剰発現または過小発現に関し得る。例えば、薬物が抗有糸分裂薬、アルキル化薬、抗代謝産物、抗血管形成薬、アポトーシス薬、アルカロイド、ＣＯＸ−２、および抗菌薬ならびにその組み合わせの群から選択される薬学的性質を保有することが意図される。薬物を、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２インヒビター、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、代謝拮抗薬、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位複合体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ならびにそのアナログおよび組み合わせからなる群から選択することができる。
【０１５４】
毒素の例には、さらに、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、シュードモナス内毒素、ならびにその誘導体、組み合わせおよび修飾物が含まれる。
【０１５５】
放射性同位体の例には、局在化および／または療法のために使用することができるγ線放射体、陽電子放射体、およびＸ線放射体ならびに療法のために使用することができるβ線放射体およびα線放射体が含まれる。診断、予後、および病期分類に有用であることが以前に記載されている放射性同位体も療法に有用である。抗癌薬および抗白血病薬の非限定的な例には、アントラサイクリン（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、イダルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｎｉｎｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、およびモルフォリノなど）、ならびにその誘導体、組み合わせ、および修飾物が含まれる。例示的医薬品には、シスプラチン、タキソール、カリチアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド、およびブレオマイシン、ならびにその誘導体、組み合わせ、および修飾物が含まれる。好ましくは、抗癌薬および抗白血病薬は、ドキソルビシン、モルホリノドキソイルビシン、またはモルホリノダウノルビシンである。
【０１５６】
当業者に認識されるように、上記実施形態では親和性値が重要であり得る一方で、特定の抗体の機能に応じて、他の要因も同様またはそれ以上に重要であり得る。例えば、免疫毒素（抗体に会合した毒素）について、標的への抗体の結合作用が有用であり得るが、いくつかの実施形態では、細胞への毒素の内在化が所望の最終結果である。そのようなものとして、これらの状況では、内在化率の高い抗体が望ましい可能性がある。しかし、抗体がＴｅｎ−Ｍ２タンパク質と別のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質との二重鎖形成を防止しようとするならば、これらの抗体を望む必要はない。したがって、１つの実施形態では、高効率で内在化する抗体が意図される。高効率の内在化を、内在化抗体率として測定することができ、低い値から１００％までであり得る。例えば、種々の実施形態では、０．１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９９、および９９〜１００％が高効率であり得る。当業者によって認識されるように、所望の効率は、実施形態によって異なる（例えば、会合する薬剤、領域に投与することができる抗体の量、抗体−薬剤複合体の副作用、処置すべき問題の型（例えば、癌型）および重症度に応じて異なる）。
【０１５７】
他の実施形態では、本明細書中に開示の抗体により、Ｔｅｎ−Ｍ２レベルの変化に関連する疾患または障害をスクリーニングするための哺乳動物組織又は細胞中のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の検出のためのアッセイキットが得られる。キットは、抗原タンパク質と結合する抗体および抗体と抗原（存在する場合）との反応を示すための手段を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を含む組成物および組成物を使用してＴｅｎ−Ｍ２によって媒介される疾患を治療することができることを示す添付文書またはラベルを含む容器を含む製品を提供する。好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトに抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を投与する。
【実施例】
【０１５９】
実施される実験および達成される結果が含まれる以下の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、これらの実施例は、本明細書中に記載の本発明を制限すると解釈すべきではない。
【０１６０】
実施例１
抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の生成
Ｔｅｎ−Ｍ２に対するモノクローナル抗体を、図１Ａおよび１Ｂに示す配列を有する抗原を使用したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（ＩｇＧ２κＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株），Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の免疫化によって構築した。図１Ａに示した抗原は、Ｖ５−６ｘＨｉｓ（二重下線および斜体で示す）およびヒトＦｃタグ（太字で示す）も付加し、図１Ｂに示した抗原は、６ｘＨｉｓ−Ｖ５タグ（斜体および二重下線で示す）も付加した。シグナルペプチドに下線を引いている。
【０１６１】
上記免疫化マウスから産生したハイブリドーマおよびＢ細胞クローンを、Ｔｅｎ−Ｍ２特異的モノクローナル抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを、可溶性Ｔｅｎ−Ｍ２抗原でコーティングし（図１Ｂを参照のこと）、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。ブロッキング緩衝液（２００μＬ／ウェル、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサールを含む１×ＰＢＳ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ハイブリドーマまたはＢ細胞クローンの上清（５０μＬ／ウェル）、ポジティブコントロール、およびネガティブコントロールを添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。
【０１６２】
インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ヤギ抗ｈｕＩｇＧｆｃ−ＨＲＰ検出抗体（１００μＬ／ウェル）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＴＭＢ基質（１００μＬ／ウェル）を添加し、プレートを１０分間発色させ（ネガティブコントロールウェルが辛うじて発色し始めるまで）、５０μＬ／ウェルの停止溶液を添加し、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーにて４５０ｎｍの波長について読み取った。
【０１６３】
次いで、上記ＥＬＩＳＡで結合について陽性と同定されたハイブリドーマまたはＢ細胞クローン上清を、天然に抗原が発現するＳＮＢ−１９細胞株を使用して内因的に発現したＴｅｎ−Ｍ２に結合する能力についてアッセイした。上記スクリーニングで同定した２４７個のＢ細胞クローンサンプルについてＦＭＡＴベースの蛍光アッセイを行った。簡潔に述べれば、９６ウェルマイクロタイター皿中に、１０，０００細胞／ウェルでＳＮＢ−１９細胞を播種した。細胞が接着した後、培地を除去し、Ｂ細胞クローン上清と置換した。１時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、結合した抗体を、Ｃｙ５結合体化抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的ポリクローナル抗体を介して検出した。陽性ウェルを、ＦＭＡＴリーダーを使用して画像化した。以下の表２は、可溶性Ｔｅｎ−Ｍ２（Ｃｕｒ００７）ＥＣＤに結合したハイブリドーマおよびＢ細胞クローンの数ならびにその後にＳＮＢ−１９細胞株にも結合したＢ細胞数をまとめている。
【０１６４】
表２
可溶性Ｔｅｎ−Ｍ２および細胞表面Ｔｅｎ−Ｍ２への抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体結合
【０１６５】
【表２】
2008535823.tif 000006
全Ｂ細胞クローンを、Ｖ５−Ｈｉｓ可溶性ペプチドへのその結合について試験し、２４７個がこれに交差反応しなかった。６個のハイブリドーマクローンを可溶性Ｔｅｎ−Ｍ２−Ｖ５−Ｈｉｓタンパク質への結合についてのみ試験し、このアッセイ以降に進めなかった。その配列を、図５〜９に示す。
【０１６６】
実施例２
Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の結合特異性
本実施例は、生成された種々の抗体の特異性を証明する。抗体を、安定な細胞株を発現するＴｅｎ−Ｍ３（Ｃｕｒ０２６）および癌細胞株上に内因的に発現したＴｅｎ−Ｍ４（ＣＲ１０５）に結合する能力について試験した。上記スクリーニングで同定された２４７個のＢ細胞クローンサンプルについてＦＭＡＴベースの蛍光アッセイを行った。簡潔に述べれば、９６ウェルのマイクロタイター皿中に、１０，０００細胞／ウェルで細胞を播種した。細胞が接着した後、培地を除去し、Ｂ細胞クローン上清と置換した。１時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、結合した抗体を、Ｃｙ５結合体化抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的ポリクローナル抗体を介して検出した。陽性ウェルを、ＦＭＡＴリーダーを使用して画像化した。以下の表３は、たった１つの抗体１７９がＴｅｎ−Ｍ３に交差反応することを示すデータをまとめている。
【０１６７】
表３
関連相同Ｔｅｎ−Ｍ３（ＣＵＲ０２６）およびＴｅｎ−Ｍ４（ＣＵＲ１０５）への抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の結合プロフィール
【０１６８】
【表３】
2008535823.tif 000007
上記データから認められるように、記載の抗体は、バックグラウンドレベルと比較して結合が増加したことを証明した。これらの結果は、抗体が他の密接に関連する抗原およびタンパク質に比べてＴｅｎ−Ｍ２への結合に比較的選択性を示すか特異的であり得ることを証明した。
【０１６９】
実施例３
種々のＴｅｎ−Ｍ２抗体の内在化アッセイ
本実施例は、種々のＴｅｎ−Ｍ２抗体をＳＮＢ−１９細胞内に内在化することができることを証明した。下に報告するように、いくつかの抗体を、わずかに高レベルの効率（例えば、比較的大量の抗体を細胞に内在化することができる）で内在化した。
【０１７０】
Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を使用して、ＳＮＢ−１９細胞を染色した。最初に４℃でこれを行い（バックグラウンド測定のために内在化されない）、３７℃に３０分間シフトして内在化を誘導した。
【０１７１】
ＳＮＢ−１９細胞を、細胞解離培地（Ｓｉｇｍａ）を使用して培養皿から除去し、計数し、９６ウェルＶＥＥ底プレートに移した（１００，０００細胞）。細胞をスピンして沈殿させ、培地を除去し、細胞を、１００μＬのハイブリドーマ上清で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートした細胞をスピンして沈殿させ、ジスルフィド結合を介してＡｌｅｘ６４７色素に連結した二次抗体（１μｇ／ｍｌの抗ＨｕＩｇＧ  Ｆｃ−ＳＳ−Ａｌｅｘａ６４７または抗ＨｕＩｇＧ  Ｆａｂ−ＳＳ−Ａｌｅｘａ６４７）を使用して、結合抗体を検出した。二次抗体を、氷上で７分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、氷冷１０％ＦＣＳ／ＰＢＳで再懸濁した。次いで、サンプルを３つのサンプルに分け、スピンして沈殿させ、上清を除去した。
【０１７２】
２つの複製物（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）を、氷冷１０％ＦＣＳ／ＰＢＳで再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。他の複製物を、加温１０％ＦＣＳ／ＰＢＳで再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーション後、細胞をスピンして沈殿させ、以下の緩衝液の１つで再懸濁した。１つの緩衝液は、２５０μＬの冷５０ｍＭグルタチオンであり、４℃のサンプルに添加した。これを、ジスルフィド結合の不完全な還元によるバックグラウンド蛍光の基準として使用した。第２の緩衝液は、２５０μＬの冷５０ｍＭグルタチオンを有し、３７℃の複製物に添加した。グルタチオンのみが細胞表面の二次抗体に接近した。抗体が内在化された場合、ジスルフィド結合は、グルタチオンによって還元されず、細胞は依然として蛍光を発する。したがって、残存する蛍光強度は、抗体の内在化量に比例した。第３の緩衝液は２５０μＬの冷１０％ＦＣＳ／ＰＢＳであり、他の４℃のサンプルに添加した。このサンプルは、最大蛍光を示すためのコントロールであった。
【０１７３】
次いで、サンプルを氷上で３０分間インキュベートし、スピンして沈殿させ、３００μＬの氷冷１０％ＦＣＳ／ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。結果を表４に示す。
【０１７４】
表４
内在化：４℃でＳＮＢ−１９細胞株を染色するために使用し（内在化せず）、その後に内在化を誘導するために３７℃に３０分間シフトしたＴｅｎ−Ｍ２（Ｃｕｒ０００７）特異的抗体
【０１７５】
【表４】
2008535823.tif 000008
上記表で認められるように、試験した全抗体がいくらかの範囲で内在化された。最小内在化率は２９％であった。いくつかの抗体は４０％超で内在化され、１つの抗体（１８８）は約５０％の内在化率で内在化された。
【０１７６】
実施例４
抗体毒素結合体
本実施例は、どのようにして毒素に結合体化した抗体を癌細胞の増殖の防止に有効な組成物として使用するのかを証明した。クローン原性アッセイを使用して、抗体をサポリン毒素結合体化二次抗体試薬と結合体化した場合に一次抗体が癌細胞死を誘導することができるかどうかを決定した（例えば、ＫｏｈｌｓおよびＬａｐｐｉ，”Ｍａｂ−ＺＡＰ：Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８（１）：１６２−５（Ｊａｎ．２０００）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載）。
【０１７７】
簡潔に述べれば、細胞を、約３０００細胞／ウェルの密度で平底組織培養プレートにプレートした。２日目または細胞密集度が約２５％に到達した場合、１００ｎｇ／ウェルの二次ｍＡｂ−毒素（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−サポリン；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＨＵＭ−ＺＡＰ；ｃａｔ．ｎｏ．ＩＴ−２２）を添加した。抗ＥＧＦＲ抗体（ポジティブコントロール）、抗Ｔｅｎ−Ｍ２ｍＡｂ、またはアイソタイプコントロールＡｂを、所望の濃度（典型的には、１〜５００ｎｇ／ｍＬ）で各ウェルに添加した。５日目に、細胞をトリプシン処理し、６ウェル組織培養皿に移し、３７℃でインキュベートした。プレートを毎日試験した。１０〜１２日目に、プレートをギムザで染色し、プレート上のコロニーを計数した。最終的に形成されたコロニー数によってプレーティング効率を決定した。
【０１７８】
細胞傷害性化学療法試薬である５フルオロウラシル（５−ＦＵ）をポジティブコントロールとして使用し、これによってほとんど完全な死滅を誘導したのに対して、サポリン結合体化ヤギ抗二次抗体のみではほとんど効果がなかった。両細胞株によって発現されたＥＧＦ様受容体に対して生成されたモノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ  ＭＳ−２６９−ＰＡＢＸ）を使用して、一次抗体および二次抗体−サポリン結合体特異的死滅を証明した。
【０１７９】
種々の濃度（例えば、５ｐＭと１０００ｐＭとの間）の抗体／毒素結合体を、抗体／毒素結合体が内在化可能な条件下でＳＮＢ−１９細胞に投与した。次いで、細胞を、９６時間増殖させ続けた。次いで、コロニーを計数して、ＳＮＢ−１９細胞増殖の阻害量を決定した。結果を図３に示す。
【０１８０】
図に認められるように、いくつかの抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体により、６ｎｇと１００ｎｇとの間の範囲の量でＳＮＢ−１９細胞の濃度が５０％または５０％を超えて減少した。図４は、Ｔｅｎ−Ｍ２を発現しない癌細胞株ＩＧＲＯＶ−１を使用した増殖アッセイの阻害を示す。予想されるように、ＩＧＲＯＶ−１細胞の増殖は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の添加に影響を受けず、図３で認められるＳＮＢ−１９細胞の増殖阻害が抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の特定の性質に起因することを示した。
【０１８１】
実施例５
抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の構造分析
抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の可変重鎖および可変軽鎖を、そのＤＮＡ配列を決定するために配列決定した。全ての抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体についての完全な配列情報を、各γ鎖およびκ鎖の組み合わせのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と共に、図５〜１７に示す。
【０１８２】
可変重鎖ヌクレオチド配列を分析して、ＶＨファミリー、Ｄ領域配列、およびＪ領域配列を決定した。次いで、配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、生殖細胞系のＶＨ領域、Ｄ領域、およびＪ領域の配列を比較して体細胞高頻度変異を評価した。抗Ｔｅｎ−Ｍ２重鎖の一次アミノ酸配列を、図１８に示す。生殖細胞系配列を上記に示し、新規のアミノ酸配列と共に変異を示す。示した生殖細胞系配列と同一の配列中のアミノ酸を、ダッシュ（−）を使用して示す。軽鎖を同様に分析して、Ｖ領域およびＪ領域を決定し、生殖細胞系軽鎖配列由来の任意の体細胞変異を同定した（図１９）。
【０１８３】
実施例６
種々の抗体のＶ遺伝子使用
本実施例は、上記で特徴づけられた特定の抗体と会合する種々のＶ遺伝子を証明した。多数の抗体中のＶ遺伝子を分析して、どの遺伝子が特定の抗体で使用されたかを決定した。抗体の重鎖および軽鎖の両方に関与するＶ遺伝子を、以下の表５に示す。
【０１８４】
【表５】
2008535823.tif 000009
上記表で認められるように、全ての抗体はＪＨ６Ｂ遺伝子またはＪＨ４Ｂ遺伝子に関与していた。
【０１８５】
実施例７
エピトープ結合およびＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）親和性の決定
エピトープ結合
本明細書中に記載の一定の抗体は、米国特許出願公開番号２００３０１５７７３０号に記載のプロトコールにしたがって、「ビン化（ｂｉｎｎｅｄ）」する。一次抗体へのカップリングのためのＭｘｈＩｇＧ結合体化ビーズを調製する。必要な上清体積を、以下の式を使用して計算する：（ｎ＋１０）×５０μＬ（式中、ｎ＝プレート上の総サンプル数）。濃度が既知である場合、０．５μｇ／ｍＬを使用する。ビーズストックを穏やかにボルテックスし、次いで、上清でウェルあたり２５００個のビーズおよび０．５×１０５／ｍＬの濃度に希釈し、震盪機にて暗所の室温で一晩インキュベートしたか、０．５μｇ／ｍＬの既知濃度の場合、２時間インキュベートした。吸引後、５０μＬの各ビーズをフィルタープレートの各ウェルに添加し、１００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液を加えて１回洗浄し、吸引した。５０μＬ／ウェルの抗原およびコントロールをフィルタープレートに添加し、被覆し、震盪機にて暗所で１時間インキュベートした。洗浄工程後、一次抗体で使用した濃度と同一の希釈（または既知である場合、濃度）を使用して、５０μＬ／ウェルの未知の二次抗体を添加する。次いで、プレートを、震盪機にて暗所の室温で２時間インキュベートし、その後に洗浄工程を行った。次に、５０μＬ／ウェルのビオチン化ｍｘｈＩｇＧの５００倍希釈物を添加し、震盪機にて暗所の室温で１時間インキュベートした。洗浄工程後、５０μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＰＥの１０００倍希釈物を添加し、震盪機にて暗所の室温で１５分間インキュベートした。洗浄工程後、各ウェルを、８０μＬのブロッキング緩衝液中に再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘを使用して読み取った。結果は、モノクローナル抗体が異なるビン（ｂｉｎ）に属することを示す。異なるビン由来の抗体による競合結合は、類似のエピトープまたは隣接エピトープに対する抗体特異性を支持する。非競合結合は、固有のエピトープに対する抗体特異性を支持する。
【０１８６】
ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）分析を使用した抗Ｔｅｎ−Ｍ２ｍＡｂ親和性の決定
ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）を使用して、Ｔｅｎ−Ｍ２抗原に対する抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の結合親和性を決定した。研究用ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）２０００バイオセンサを使用して、２５℃で分析を行った。日常的なカップリングを使用して、ＣＭ５  ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）チップ上に高密度ヤギαヒト抗体表面を調製した。抗体上清を、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡおよび１０ｍｇ／ｍＬカルボキシメチルデキストランを含むＨＢＳ−Ｐ泳動緩衝液で約５μｇ／ｍＬに希釈した。次いで、抗体を、２分間接触させて個別の表面上にそれぞれ捕捉し、抗体ベースラインの安定化のために５分間洗浄した。
【０１８７】
２９２ｎＭのＴｅｎ−Ｍ２抗原を、各表面上に７５秒間注入し、その後に３分間解離させた。コントロールフローセル由来のシグナルを引き、Ｔｅｎ−Ｍ２注入直前の緩衝液注入のベースラインのドリフトを引くことによって二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）データを得た。各ｍＡｂのＴｅｎ−Ｍ２結合データを、各表面上に捕捉されたｍＡｂ量について正規化した。正規化されたドリフト修正応答も測定した。２５℃での抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂ結合の速度分析の結果を、以下の表７に列挙する。
【０１８８】
表７  精製したＴｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂのＴｅｎ−Ｍ２低分解能ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）スクリーニング
【０１８９】
【表７】
2008535823.tif 000010
＄Ｋｄは、非線形適合プロセスにおいてこの値にて一定に保持される。
＊極めて複雑な動態。
【０１９０】
実施例８
ウエスタンブロット分析、免疫組織化学的分析、およびＦＡＣＳ分析による抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂによるＴｅｎ−Ｍ２タンパク質の検出
抗Ｔｅｎ−Ｍ２モノクローナル抗体の抗原結合特性および交差反応性を決定するために、１μｇのＴｅｎ−Ｍ２（Ｍ２）、Ｔｅｎ−Ｍ３（Ｍ３）、またはＴｅｎ−Ｍ４（Ｍ４）組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を、還元条件下で、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、電気泳動によって０．４５μｍＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。膜を、３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＴＢＳＴで３時間ブロッキングし、２μｇ／ｍｌの濃度のＴＥＮ−Ｍ２ｍＡｂ抗体で３時間探索した。図２０に示すように、ＴＥＮ−Ｍ２  ｍＡｂは、ｐ１２５  Ｔｅｎ−Ｍ２種を特異的に認識するが、Ｔｅｎ−Ｍ３タンパク質やＴｅｎ−Ｍ４タンパク質を認識しない。
【０１９１】
抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂが癌細胞中の内因性Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質を認識することができることも決定した。ＩＧＲＯＶ−１、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＮＢ−１９、および７８６−０細胞から作製した総タンパク質溶解物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜にブロッティングした。次に、ウエスタンブロットを、Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質（図２１の上のパネル）および抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体（図２１の下のパネル）に対して生成されたウサギポリクローナル抗体のいずれかとインキュベートした。内因性Ｔｅｎ−Ｍ２タンパク質のサイズに対応する約３０ｋＤのバンドを、ＳＮＢ−１９細胞中でＴｅｎ−Ｍ２ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方によって検出した。さらなるコントロールとして、転写陰性細胞株ＩＧＲＯＶ−１細胞およびＳＫ−ＯＶ−３細胞中にＴｅｎ−Ｍ２タンパク質は検出されなかった。
【０１９２】
免疫組織化学
種々のヒト癌組織におけるＴｅｎ−Ｍ２発現を、抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂを使用した免疫組織化学によって分析した。免疫組織化学のために、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した種々のヒト癌組織由来の組織サンプル切片を、Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂで染色した。プロテイナーゼＫ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）による部分的タンパク質分解を使用して抗原賦活を行い、内因性ペルオキシダーゼ活性を３％過酸化水素のメタノール溶液で反応停止させた。
【０１９３】
組織切片を、５％ＢＳＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）および１％ヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）のＰＢＳ溶液で最初に１時間ブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液で希釈したビオチン化ＴＥＮ−Ｍ２またはビオチン化アイソタイプコントロールＩｇＧ２抗体とインキュベートした。１時間後、切片を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（２００倍）と４５分間インキュベートした。洗浄工程を繰り返し、その後、ＤＡＢ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して色素を発色させた。ＤＡＢ反応を停止させ、切片を、ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で対比染色し、脱水し、ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してマウントした。
【０１９４】
以下の表８で認められるように、乳癌、腎臓癌、および前立腺癌中の膜上が強く染色された（＋２）。ほとんどのヒトの乳癌、前立腺癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓明細胞癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、リンパ腫、および黒色腫の検体において、強度スコア＋１または＋１を超えるより弱い陽性染色も同定された。
【０１９５】
表８
抗Ｔｅｎ−Ｍ２免疫組織化学のまとめ
【０１９６】
【表８】
2008535823.tif 000011
乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓明細胞癌、肺癌、卵巣癌、および黒色腫の染色例を、図２２Ａ〜Ｇにそれぞれ示す。抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体染色により、大部分のＴｅｎ−Ｍ２タンパク質が乳癌、卵巣癌、腎臓明細胞癌、結腸癌、肺癌、黒色腫、および前立腺癌の腫瘍細胞の膜上および細胞質領域に見出されることが明らかとなった。興味深いことに、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体は黒色腫サンプルの内皮も染色し、抗血管形成の可能性が示唆されたが、多数の正常組織の内皮を染色しなかった。コントロールＩｇＧに関して癌組織染色は認められなかった。表８に列挙される正常なヒト組織に対しても抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体での免疫組織化学染色を行った。主に、正常な腎臓、前立腺、卵巣、扁桃腺、および甲状腺で陽性染色が認められた。腎臓の尿細管で認められるように、ほとんどの組織染色が細胞質で起こることに注目すべきである。前立腺は、ストロマの膜染色が認められた（図２２Ｈ〜Ｉ）。
【０１９７】
フローサイトメトリー
１５個の異なる細胞株の表面のＣＧ５０４２６（Ｔｅｎ−Ｍ２）発現の定量分析を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定した。約１×１０６細胞を採取し、洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、４％ＦＢＳ、および０．１％ＮａＮ３を含む染色緩衝液中で飽和量（１μｇ／ｍｌ）のＴＥＮ−Ｍ２またはアイソタイプ適合コントロール抗体のいずれかと氷上で３０分間インキュベートし、その後、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）の１００倍希釈物にて氷上で３０分間洗浄および染色した。細胞を、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにて試験した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアバージョン３．３を使用してデータ分析を行い、各細胞型について相乗平均蛍光強度比（ＧＭＲ）を決定した。
【０１９８】
以下の表９で認められるように、ＦＡＣＳ分析により、抗Ｔｅｎ−Ｍ２ｍＡｂで表面染色された７つの癌細胞株（ＳＮＢ−１９細胞、ＲＸＦ６３１細胞、ＲＸＦ３９３細胞、７８６−０細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＮＣｌ−Ｈ８２細胞、およびＨｏｐ６２細胞が含まれる）がアイソタイプコントロールｍＡｂバックグラウンドの少なくとも３倍であることが同定された。
【０１９９】
表９
ＲＴＱ  ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、および抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｍＡｂでのヒト癌細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害のまとめ
【０２００】
【表９】
2008535823.tif 000012
ａＴＥＮ−Ｍ２：材料と方法に記載のＲＴＱ  ＰＣＲによってＣＴ値を決定した。フローサイトメトリー分析によって相乗平均比（ＧＭＲ）を決定した。記載のクローン原性アッセイによって抗体−薬物細胞傷害性（ＡＤＣ）または細胞死滅を決定した。
ｂＩＣ５０値は、三連のウェルで行った各実験を使用した２つの独立したクローン原性アッセイの平均およびＳＤである。
ＮＤ：実施せず。
【０２０１】
実施例９
抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｖｃＭＭＡＥおよび抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ＭＭＡＦを使用した脳腫瘍および腎臓細胞癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害
抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｖｃＭＭＡＥおよび抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ＭＭＡＦが抗原陽性細胞を特異的に阻害したかどうかを調査するために、細胞死滅アッセイを行い、抗Ｔｅｎ−Ｍ２薬結合体処置後の細胞生存率を評価した。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、一晩回復させた。種々の濃度の抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｖｃＭＭＡＥまたは抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ＭＭＡＦ抗体結合体を、サブコンフルエントの細胞培養物に添加し、３７℃で４日間インキュベートした。次いで、細胞を、６ウェルプレートに移し、さらに７日間増殖させた。ＲＸＦ６３１細胞、ＲＸＦ３９３細胞、および７８６−０細胞はコロニーを形成せず、細胞計数法を使用した。簡潔に述べれば、各ウェル中の細胞を回収し、５０μｌの増殖培地に再懸濁した。血球計を使用して、顕微鏡下で細胞を計数した。処置サンプルと未処置サンプルとの間の比に基づいて、生存細胞画分を計算した。ＩＣ５０を、未処置のコントロール培養物と比較してコロニー形成または細胞数が５０％減少する濃度と定義した。
【０２０２】
表９で認められるように、Ｔｅｎ−Ｍ２発現細胞は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｖｃＭＭＡＥおよび抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ＭＭＡＦによって誘導された増殖阻害に感受性を示すが、抗原を発現しない細胞は感受性を示さなかった。抗Ｔｅｎ−Ｍ２薬結合体の最高の死滅効果は、ＳＮＢ−１９細胞およびＲＸＦ３９３細胞にて約６０ｐＭのＩＣ５０で認められた（図２３Ａ、Ｂ）。ＲＸＦ６３１細胞は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｖｃＭＭＡＥ（ＩＣ５０＝７．６ｎＭ）よりも抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ＭＭＡＦ（ＩＣ５０＜６０ｐＭ）に対して感受性が高かった（図２３Ｃ）。７８６−０が遊離ＭＭＡＥや遊離ＭＭＡＦのいずれにも感受性を示さなかったという本発明者らの前の観察と一致して、抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂ結合体は、７８６−０細胞にほとんど影響を及ぼさなかった（図２３Ｄ）。抗体ＰＫ１６．３をｖｃＭＭＡＥと結合体化し、同一の実験においてＩｇＧコントロールとして使用した。ＲＸＦ−３９３細胞に対して約３０％の非特異的増殖阻害効果が得られたが、他の３つの細胞株のいずれにも効果がなかった。
【０２０３】
これらのデータは、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦなどの薬物と結合体化した抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂが脳腫瘍および腎臓細胞癌の治療に非常に強力且つ選択的な薬剤であることを示す。
【０２０４】
参照による援用
本明細書中で引用した全ての引例（特許、特許出願、論文、およびテキストブックなどが含まれる）およびこれらが引用した参考文献は、既に引用していない範囲で、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２０５】
等価物
上記明細書は、当業者が本発明を実施することができるために十分であると見なされる。上記説明および実施例は、本発明の一定の好ましい実施形態を詳述し、本発明が意図する最良の形態を記載している。しかし、上でいかに詳述しようとも、本発明を多数の方法で実施することができ、本発明を添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物にしたがって解釈すべきであると認識される。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１Ａ】図１は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の免疫化のために使用されたＴｅｎ−Ｍ２抗原のアミノ酸配列の図である。
【図１Ｂ】図１は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の免疫化のために使用されたＴｅｎ−Ｍ２抗原のアミノ酸配列の図である。
【図２】図２は、ＳＮＢ−１９細胞株（Ｔｅｎ−Ｍ２発現に陽性）およびＩＧＲＯＶ−１（Ｔｅｎ−Ｍ２発現に陰性）へのＴｅｎ−Ｍ２抗体の結合ＦＡＣＳプロフィールである。
【図３】ＳＮＢ−１９細胞上でのＴｅｎ−Ｍ２抗体薬物結合体による増殖阻害を示す棒グラフである。
【図４】図４は、ＩＧＲＯＶ−１細胞上でのＴｅｎ−Ｍ２抗体薬物結合体による増殖阻害を示す棒グラフである。
【図５】図５は、Ｔｅｎ−Ｍ２−７．１．１と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図５Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図５Ｂは、図５Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図５Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図５Ｄは、図５Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図６】図６は、Ｔｅｎ−Ｍ２−７．２．１と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図６Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。図６Ｂは、図６Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図６Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。図６Ｄは、図６Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図７】図７は、Ｔｅｎ−Ｍ２−７．３．１と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図７Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。図７Ｂは、図７Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。図７Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。図７Ｄは、図７Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図８】図８は、Ｔｅｎ−Ｍ２−７．７．１と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図８Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。図８Ｂは、図８Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図８Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。図８Ｄは、図８Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図９】図９は、Ｔｅｎ−Ｍ２−８．１と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図９Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。図９Ｂは、図９Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。図９Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。図９Ｄは、図９Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図１０】図１０は、Ｔｅｎ−Ｍ２−８．６と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１０Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。図１０Ｂは、図１０Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。図１０Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２３）を示す。図１０Ｄは、図１０Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。
【図１１】図１１は、Ｔｅｎ−Ｍ２−１２０と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１１Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。図１１Ｂは、図１１Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。図１１Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す。図１１Ｄは、図１１Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図１２】図１２は、Ｔｅｎ−Ｍ２−１４０と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１２Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す。図１２Ｂは、図１２Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。図１２Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す。図１２Ｄは、図１２Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図１３】図１３は、Ｔｅｎ−Ｍ２−１７１と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１３Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号３３）を示す。図１３Ｂは、図１３Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。図１３Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）を示す。図１３Ｄは、図１３Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。
【図１４】図１４は、Ｔｅｎ−Ｍ２−１７９と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１４Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号３７）を示す。図１４Ｂは、図１４Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。図１４Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す。図１４Ｄは、図１４Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。
【図１５】図１５は、Ｔｅｎ−Ｍ２−１８８と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１５Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号４１）を示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。図１５Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号４３）を示す。図１５Ｄは、図１５Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
【図１６】図１６は、Ｔｅｎ−Ｍ２−１９９と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１６Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す。図１６Ｂは、図１６Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。図１６Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号４７）を示す。図１６Ｄは、図１６Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【図１７】図１７は、Ｔｅｎ−Ｍ２−２１３と示した本発明のヒト抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の描写である。図１７Ａは、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）を示す。図１７Ｂは、図１７Ａに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。図１７Ｃは、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。図１７Ｄは、図１７Ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。
【図１８】図１８は、１２種の抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の重鎖可変ドメイン領域のアミノ酸配列のその各生殖細胞系配列とのアラインメントを示す表である。「−」は、生殖細胞系配列と同一であることを示す。体細胞高頻度変異に起因する生殖細胞系との相違を、各アミノ酸によって示す。免疫グロブリン中のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）およびＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３）を、各カラムの見出しに示す。
【図１９】図１９は、１２種の抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の軽鎖可変ドメイン領域のアミノ酸配列のその各生殖細胞系配列とのアラインメントを示す表である。「−」は、生殖細胞系配列と同一であることを示す。体細胞高頻度変異に起因する生殖細胞系との相違を、各アミノ酸によって示す。免疫グロブリン中のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）およびＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３）を、各カラムの見出しに示す。
【図２０】図２０は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体がｐ１２５  Ｔｅｎ−Ｍ２（レーンＭ２）タンパク質を特異的に認識することを示すウエスタンブロットである。
【図２１】図２１は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２ウサギポリクローナル抗体（上のパネル）または抗Ｔｅｎ−Ｍ２モノクローナル抗体クローン１４０（下のパネル）を使用したＩＧＲＯＶ、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＮＢ−１９、および７８６−０細胞中の内因性Ｔｅｎ−Ｍ２抗体を示すウエスタンブロットである。
【図２２Ａ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ａは、乳癌サンプルおよびアイソタイプコントロールにおける腫瘍細胞の膜および細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。１２サンプルのうち１０サンプルが陽性に染色された。
【図２２Ｂ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｂは、卵巣癌サンプルおよびアイソタイプコントロールにおける腫瘍細胞の細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。１０サンプルのうち１０サンプルが陽性に染色された。
【図２２Ｃ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｃは、腎臓癌サンプルおよびアイソタイプコントロールにおける腫瘍細胞の膜および細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。９サンプルのうち９サンプルが陽性に染色された。
【図２２Ｄ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｄは、結腸癌サンプルおよびアイソタイプコントロールにおける腫瘍細胞の細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。１０サンプルのうち７サンプルが陽性に染色された。
【図２２Ｅ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｅは、肺癌サンプルおよびアイソタイプコントロールにおける腫瘍細胞および炎症細胞の細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。１０サンプルのうち１０サンプルが陽性に染色された。
【図２２Ｆ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｆは、黒色腫およびアイソタイプコントロールにおける腫瘍細胞および内皮の細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。１０サンプルのうち１０サンプルが陽性に染色された。
【図２２Ｇ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｇは、前立腺癌およびアイソタイプコントロールにおける腫瘍細胞およびストロマの細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。１０サンプルのうち１０サンプルが陽性に染色された。
【図２２Ｈ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｈは、腎臓およびアイソタイプコントロールの正常な管状細胞の細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。
【図２２Ｉ】図２２は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２抗体の免疫組織化学分析である。図２２Ｉは、正常な前立腺サンプルおよびアイソタイプコントロールにおける上皮およびストロマの膜および細胞質に対するＴｅｎ−Ｍ２抗体染色を示す。
【図２３−１】図２３は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｖｃＭＭＡＥおよび抗Ｔｅｎ−Ｍ２ＭＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害を示す棒グラフを示す。図２３Ａは、ＳＮＢ−１９脳腫瘍細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂ薬物結合体を示す棒グラフである。図２３Ｂは、ＲＸＦ−３９３腎臓細胞の癌細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡＢ薬物結合体を示す棒グラフである。図２３Ｃは、ＲＸＦ−６３１腎臓細胞の癌細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡＢ薬物結合体を示す棒グラフである。図２３Ｄは、７８６−０腎臓細胞の癌細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡＢ薬物結合体を示す棒グラフである。
【図２３−２】図２３は、抗Ｔｅｎ−Ｍ２−ｖｃＭＭＡＥおよび抗Ｔｅｎ−Ｍ２ＭＭＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害を示す棒グラフを示す。図２３Ａは、ＳＮＢ−１９脳腫瘍細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡｂ薬物結合体を示す棒グラフである。図２３Ｂは、ＲＸＦ−３９３腎臓細胞の癌細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡＢ薬物結合体を示す棒グラフである。図２３Ｃは、ＲＸＦ−６３１腎臓細胞の癌細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡＢ薬物結合体を示す棒グラフである。図２３Ｄは、７８６−０腎臓細胞の癌細胞を死滅させる抗Ｔｅｎ−Ｍ２  ｍＡＢ薬物結合体を示す棒グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月27日(2008.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008535823.tif 000087
2008535823.tif 000088
2008535823.tif 000089
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