(57)【要約】  本発明は、ｍＲＮＡと標的タンパク質、例えばＨｕＲアッセイの相互作用を調節する薬剤を同定するためのアッセイ法、および、式Ｉ【化１】2008535479.tif 000029（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記で定義の通りである。)の有機化合物、および、例えばＡＲＥ含有ｍＲＮＡおよび標的タンパク質の複合体形成の阻害剤としてのそれらの使用に関する。
2008535479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡと標的タンパク質の相互作用を調節する薬剤を同定するためのアッセイ法であって、
ａ)少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有する標識されたｍＲＮＡを、所望により均質溶液として提供し(該標識はｍＲＮＡ周囲の環境の変化に感受性である物質である)、
ｂ)標的タンパク質と上記工程ａ)で提供したｍＲＮＡを、該ｍＲＮＡと該標的タンパク質の相互作用を調節することが期待される候補化合物の非存在下および存在下で、該ｍＲＮＡと該標的タンパク質の間の複合体が形成できる十分な期間接触させ、
ｃ)工程ｂ)で形成された複合体を検出し、
ｄ)工程ｂ)において候補化合物が存在しなかった場合または存在した場合の形成された複合体の量に差異があるか否かを決定し、そして
ｅ)工程ｄ)において差異が決定された候補化合物を薬剤として選択する
ことを含む、アッセイ法。
【請求項２】
標識が蛍光染料、例えばＣｙ３またはＣｙ５である、請求項１記載のアッセイ法。
【請求項３】
複合体を蛍光強度の測定により検出する、請求項１または２記載のアッセイ法。
【請求項４】
標的タンパク質がＨｕＲタンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項５】
ｍＲＮＡがＩＬ−２、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αから成る群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項６】
ｍＲＮＡが１００から５００ヌクレオチドの間、好ましくは３００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１から５のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項７】
ハイスループット・スクリーニングのための、請求項１から６のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項８】
−  標識された、例えば蛍光標識されたｍＲＮＡ、
−  標的タンパク質、
−  キットの使用指示書、および
−  所望により候補化合物
を含む。キット。
【請求項９】
式
【化１】
2008535479.tif 000020
〔式中、
Ｒ１は、非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールまたは５もしくは６環員とＮ、ＯおよびＳから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルで置換された(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノまたは非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールで置換された(Ｃ１−４)アルキル、または非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールであり、そして
Ｒ３は、非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールまたは５もしくは６環員とＮ、ＯおよびＳから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルである。〕
の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１が非置換もしくは置換フェニルまたは５環員とヘテロ原子としてＮを有するヘテロシクリルで置換された(Ｃ１−３)アルキルであり、
Ｒ２がヒドロキシル、カルボキシル、アミノまたは非置換もしくは置換フェニルで置換された(Ｃ１−２)アルキル、または非置換もしくは置換フェニルであり、そして
Ｒ３が非置換もしくは置換フェニルまたは５もしくは６環員とヘテロ原子としてＮを有するヘテロシクリルである、
請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルまたは１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、
Ｒ２がカルボキシルで置換されたメチル、ｐ−メチル−フェニルで置換されたメチル、１Ｈ−インドル−３−イルで置換されたメチル、ヒドロキシルで置換されたエチル、アミノで置換されたエチルまたはｐ−メチル−フェニルであり、そして
Ｒ３が式
【化２】
2008535479.tif 000021
(式中、
Ｒ４は１−ピペリジンまたは１−(ｐ−アミノカルボニル)−ピペリジンであり、
Ｒ５はメトキシエチル、ベンジルまたは(ｐ−メトキシ−フェニル)−エチルである)
の化合物であるか、または式
【化３】
2008535479.tif 000022
(式中、
Ｒ６はｐ−フェニルまたはｍ−ピリジンであり、そして
Ｒ７はｍ−メトキシ−フェニルまたは１−アミノカルボニル−２−ヒドロキシ−プロピルで置換されたメチルである)
の化合物である、請求項９または１０に記載の化合物。
【請求項１２】
式
【化４】
2008535479.tif 000023
〔式中、
ａ)Ｒ１が、１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がアミノで置換されたエチルであり、そしてＲ３が式
【化５】
2008535479.tif 000024
の化合物であるか、
ｂ)Ｒ１がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルであり、Ｒ２がアミノで置換されたエチルであり、そしてＲ３が式
【化６】
2008535479.tif 000025
の化合物であるか、
ｃ)Ｒ１がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルであり、Ｒ２がｐ−アミノメチル−フェニルで置換されたメチルであり、そしてＲ３がｂ)で定義した化合物であるか、
ｄ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がヒドロキシルで置換されたエチルであり、そしてＲ３が式
【化７】
2008535479.tif 000026
の化合物であるか、
ｅ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がカルボキシルで置換されたメチルであり、そしてＲ３が式
【化８】
2008535479.tif 000027
の化合物であるか、
ｆ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がＨ−インドル−３−イルで置換されたメチルであり、そしてＲ３が式
【化９】
2008535479.tif 000028
で置換された化合物であるか、
ｇ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルであり、そしてＲ３がｆ)で定義した化合物である。〕
の化合物。
【請求項１３】
塩の形の、請求項９から１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡおよび標的タンパク質の複合体形成の阻害剤としての、請求項９から１３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１５】
標的タンパク質がＨｕＲである、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項９から１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
サイトカイン、増殖因子、癌原遺伝子またはウイルスタンパク質から成る群から、好ましくはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｒ１、Ｃｏｘ−２、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃから成る群から選択される物質の産生と関連する病因を有する障害の処置用医薬の製造のための、請求項９から１３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１８】
請求項９から１３のいずれかに記載の化合物を、少なくとも１種の医薬賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項１９】
さらに別の薬学的活性剤を含む、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
サイトカイン、増殖因子、癌原遺伝子またはウイルスタンパク質から成る群から選択される、好ましくはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｒ１、Ｃｏｘ−２、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃから成る群から選択される物質の産生と関連する病因を有する障害の処置法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の請求項９から１３のいずれかに記載の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
請求項９から１３のいずれかに記載の化合物を、別の薬学的活性剤と、同時にまたは連続的に投与する、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有機化合物、およびｍＲＮＡと標的タンパク質、例えばＥＬＡＶＬ１タンパク質の相互作用を調節する薬剤を同定するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
莫大な数の遺伝子の発現は、メッセンジャーＲＮＡのレベルにより制御される。特に、初期応答遺伝子の急速な応答および、故に、ある種の刺激に関連している疾患の種々の標的は、しばしば、翻訳後転写制御機構により促進される。これらの工程は、主にメッセンジャーＲＮＡ上に作用する制御タンパク質または因子が仲介する。このような制御標的ｍＲＮＡ−タンパク質相互作用の阻害または調節は、治療的介入のための魅力的なアプローチである。
【０００３】
ｍＲＮＡ制御の低分子量阻害剤の検索のために、理想的には均質溶液中の、標的としたｍＲＮＡ−タンパク質相互作用をモニターするためのアッセイが必要である。本アッセイは、さらに、今日ではしばしば蛍光検出に基づくハイスループット・スクリーニング(ＨＴＳ)環境での実行に適していなければならない。
【０００４】
相対的に小さなタンパク質、例えばｍＲＮＡ安定化タンパク質ＨｕＲ(３６kD)の、長いｍＲＮＡまたは−サブフラグメント(２８１乃至１６４３ヌクレオチド、１００−５００kD)への直接結合は、複合体形成により蛍光標識したＲＮＡが減弱するサイズの相対的な増加に基づいて検出できない。この理由のため、回転または翻訳拡散時間検出に基づいた分光法(例えば蛍光相関分光学(ＦＣＳ)、２Ｄ−ＦＩＤＡ−異方性または他の蛍光偏光測定など)は、容易に除外され得る。
【０００５】
本発明のアッセイ法は、真の平衡条件下、均質溶液中でｍＲＮＡ−タンパク質相互作用をモニターするための新規方法を表す。それは、例えば非常に感受性の単一分枝検出に適用され、故に、Evotec MarkII/IIIのようなＨＴＳプラットフォームに容易に適用できる。検出、例えば共焦点検出の高感受性および精度のため、本発明のアッセイは、慣用の電気泳動移動性シフト、フィルター結合またはヌクレアーゼ保護アッセイの魅力的な代替を表す。また、慣用の巨視的蛍光強度検出法(例えば蛍光プレートリーダー)への適用は直接であり、共焦点装置の有用性を必ずしも必要としない。
【発明の開示】
【０００６】
一つの局面において、本発明は、ｍＲＮＡと標的タンパク質の相互作用を調節する薬剤を同定するためのアッセイ法であって、
ａ)少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有する標識されたｍＲＮＡを、所望により均質溶液として提供し(該標識はｍＲＮＡ周囲の環境の変化に感受性である物質である)、
ｂ)標的タンパク質、例えば、ＨｕＲタンパク質と、上記工程ａ)で提供したｍＲＮＡを、該ｍＲＮＡと該標的タンパク質、例えば、ＨｕＲタンパク質の相互作用を調節することが期待される候補化合物の非存在下および存在下で、該ｍＲＮＡと該標的タンパク質、例えば、ＨｕＲタンパク質の間の複合体が形成できる十分な期間接触させ、
ｃ)工程ｂ)で形成された複合体を検出し、
ｄ)工程ｂ)において候補化合物が存在しなかった場合または存在した場合の形成された複合体の量に差異があるか否かを決定し、そして
ｅ)工程ｄ)において差異が決定された候補化合物を薬剤として選択する
ことを含む、アッセイ法を提供する。
【０００７】
本アッセイ原理は、下記の通り説明できる(例えば図１に記載する通り)：ｍＲＮＡを、例えばＣｙ３で、３'末端をヒドラジンアルデヒド架橋化学により標識する。標的タンパク質の本標識ｍＲＮＡへの結合により、標識、例えばＣｙ３の量子収量が変化し、例えば増加し、この変化がｍＲＮＡと標的タンパク質の相互作用の読み出しを提供する。この硬化は、タンパク質と標識の間の直接接触に見かけ上関与しておらず、３'末端標識から遠位の標的タンパク質、例えばＨｕＲ結合部位を有するｍＲＮＡでさえ、再現性が観察される。我々は、現在、これは、長い範囲の効果を介して翻訳される標的タンパク質との複合体形成による三次元ＲＮＡ形態の変化によりもたらされる可能性があり、そして、標識、例えばＣｙ３の環境感受性に関与すると結論付けている(例えばMujumdar R.B. et al., Bioconj Chem. 1993, 4(2) 105-11参照)。可能性のある阻害剤に起因する減少したタンパク質−ｍＲＮＡ複合体形成は、読み出し、例えば総蛍光強度の減少または高い分子輝度を有する主の減少した粒子数として検出される。
【０００８】
好ましい態様において、標的タンパク質はＨｕＲタンパク質である。
【０００９】
本ｍＲＮＡは、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡであってよく、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−８、Ｃｏｘ−２、ＩＬ−４またはＡＴ−Ｒ１だけでなく、他のＡＲＥ制御標的ファミリーからのＡＲＥを含む炎症性標的を含む。例えば、癌原遺伝子はｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓのようなものである。
【００１０】
本発明の他の局面において、本ｍＲＮＡはＩＬ−２、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αをコードする配列、またはこのような配列のＡＲＥ含有フラグメントから成る群から選択される。
【００１１】
本発明の他の局面において、本ｍＲＮＡは１００乃至５００ヌクレオチド、好ましくは３００ヌクレオチドの長さを有する。
【００１２】
本標識は、慣用のもの、例えばビオチンまたは、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)もしくはペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)のような酵素、または蛍光分子、例えば蛍光染料であり得る。好ましくは本標識は、例えばＣｙ３またはＣｙ５、例えばＣｙ３のような蛍光染料である。
【００１３】
本発明の好ましい局面において、本標識は蛍光標識、例えばＣｙ３またはＣｙ５である。
【００１４】
本標的タンパク質は、ｍＲＮＡに結合することが既知あって、ここで、このような結合が３次元ＲＮＡ形態をもたらす全てのタンパク質であり得る。本発明の他の局面において、本標的タンパク質は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡに結合するＥＬＡＶＬ１(＝ＨｕＲ)である。
【００１５】
検出された複合体を検出するために、検出手段を使用できる。このような検出手段は、例えば蛍光検出測定のような、アッセイ分野で慣用のものを含む。本発明において使用する検出手段は、標識ｍＲＮＡを認識する分子を含む。
【００１６】
例えば１次元強度依存的共焦蛍光検出法ＦＩＤＡ(蛍光強度分布分析)を使用して、標的タンパク質、例えばＨｕＲの、その標的ｍＲＮＡへの結合を直接的に、そして均質溶液中、サイズに無関係の方法で追跡できる。
【００１７】
本発明の他の局面において、本複合体を蛍光強度の測定により検出する。
【００１８】
所望により形成された複合体を、複合体化されていないフラクションから分離できる。本分離は、例えば慣用の方法に従って、例えば準じて、例えばクロマトグラフィーにより、例えばサイズ排除クロマトグラフィーで行うことができる。
【００１９】
候補化合物は、ｍＲＮＡと標的タンパク質の相互作用に対する調節効果を決定できる化合物(ライブラリー)を含む。化合物(ライブラリー)は、例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、摸倣物、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ'ｓ)を含む。
【００２０】
薬剤は、本発明により提供されるアッセイ法中、工程ｄ)において、例えば検出される、ｍＲＮＡと標的タンパク質の相互作用に影響する(阻害する)化合物である。
【００２１】
薬剤は、選択した候補化合物の一つであり、そしてオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、摸倣物、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ'ｓ)を含み得る。薬剤は１種以上の薬剤、例えば薬剤の組み合わせを含む。
【００２２】
他の局面において、本発明はハイスループット・スクリーニングのための本発明のアッセイ法を提供する。
【００２３】
他の局面において、本発明は、
−  標識ｍＲＮＡ、例えば蛍光標識、
−  標的タンパク質、
−  キットの使用指示書、および
−  所望により候補化合物
を含む、キットを提供する。
【００２４】
本発明により提供されるこのようなキットは、さらに、試験すべきサンプルの適当な環境、および、例えば、候補化合物の試験すべきサンプルに対する効果を決定するための適当な手段を含む、実質的な要素をさらに含み得る。
【００２５】
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイ法により同定された有機化合物に関する。
【００２６】
他の局面において、本発明は、式
【化１】
2008535479.tif 000003
〔式中、
Ｒ１は、非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールまたは５もしくは６環員とＮ、ＯおよびＳから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルで置換された(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２はヒドロキシル、カルボキシル、アミノまたは非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールで置換された(Ｃ１−４)アルキル、または非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールであり、そして
Ｒ３は、非置換もしくは置換(Ｃ６−１８)アリールまたは５もしくは６環員とＮ、ＯおよびＳから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルである。〕
の化合物を提供する。
【００２７】
式Ｉの化合物の好ましい局面において、Ｒ１が非置換もしくは置換フェニルまたは５環員とヘテロ原子としてＮを有するヘテロシクリルで置換された(Ｃ１−３)アルキルであり、
Ｒ２がヒドロキシル、カルボキシル、アミノまたは非置換もしくは置換フェニルで置換された(Ｃ１−２)アルキル、または非置換もしくは置換フェニルであり、そして
Ｒ３が非置換もしくは置換フェニルまたは５もしくは６環員とヘテロ原子としてＮを有するヘテロシクリルである。
【００２８】
式Ｉの化合物の他の好ましい局面において、Ｒ１がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルまたは１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がカルボキシルで置換されたメチル、ｐ−メチル−フェニルで置換されたメチル、Ｈ−インドル−３−イルで置換されたメチル、ヒドロキシルで置換されたエチル、アミノで置換されたエチルまたはｐ−メチル−フェニルであり、そして
Ｒ３が式
【化２】
2008535479.tif 000004
(式中、
Ｒ４は１−ピペリジンまたは１−(ｐ−アミノカルボニル)−ピペリジンであり、
Ｒ５はメトキシエチル、ベンジルまたは(ｐ−メトキシ−フェニル)−エチルである)
の化合物であるか、または式
【化３】
2008535479.tif 000005
(式中、
Ｒ６はｐ−フェニルまたはｍ−ピリジンであり、そして
Ｒ７はｍ−メトキシ−フェニルまたは１−アミノカルボニル−２−ヒドロキシ−プロピルで置換されたメチルである)
の化合物である。
【００２９】
本明細書で他に定義されない限り、アルキルは(Ｃ１−８)アルキル、例えば(Ｃ１−４)アルキルを含む。アリールは(Ｃ６−１８)アリール、例えばフェニルを含む。ヘテロシクリルは、所望により別の環と縮環(系)している、例えばフェニル環と縮環している；例えば、またはヘテロシクリル環と縮環している、例えばピペリジン、ピリジンおよびピロリジンのような、Ｓ、ＯおよびＮから選択される１個から４個のヘテロ原子；例えばＮを有する５または６員環である。アルキル、アリールおよびヘテロシクリルは、非置換のもしくは置換された、例えば有機化学において慣用の基により置換された、アルキル、アリールまたはヘテロシクリルを含む。アミノは非置換および置換アミン、例えばアルキル−およびジアルキルアミンを含む。
【００３０】
式Ｉの化合物において、各個々の定義した置換基は、例えば定義した他の置換基と互いに無関係に好ましい置換基であり得る。
【００３１】
さらに別の局面において、本発明は、式Ｉ
【化４】
2008535479.tif 000006
〔式中、
ａ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がアミノで置換されたエチルであり、そしてＲ３が式
【化５】
2008535479.tif 000007
の化合物であるか、
【００３２】
ｂ)Ｒ１がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルであり、Ｒ２がアミノで置換されたエチルであり、そしてＲ３が式
【化６】
2008535479.tif 000008
の化合物であるか、
【００３３】
ｃ)Ｒ１がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルであり、Ｒ２がｐ−アミノメチル−フェニルで置換されたメチルであり、そしてＲ３がｂ)で定義した化合物であるか、
【００３４】
ｄ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がヒドロキシルで置換されたエチルであり、そしてＲ３が式
【化７】
2008535479.tif 000009
の化合物であるか、
【００３５】
ｅ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がカルボキシルで置換されたメチルであり、そしてＲ３が式
【化８】
2008535479.tif 000010
の化合物であるか、
【００３６】
ｆ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がＨ−インドル−３−イルで置換されたメチルであり、そしてＲ３が式
【化９】
2008535479.tif 000011
の化合物であるか、
【００３７】
ｇ)Ｒ１が１−ピロリジン−２−オンで置換されたｎ−プロピルであり、Ｒ２がｐ−メチル−フェニルで置換されたメチルであり、そしてＲ３がｆ)で定義した化合物である。〕
の化合物を提供する。
【００３８】
本発明により提供される化合物は、以後“本発明の(に従う)化合物”と命名する。本発明の化合物は、すべての形の、例えば遊離形の、塩の形の、溶媒和物の形の、および塩の溶媒和物の形の化合物を含む。
【００３９】
他の局面において、本発明は、塩の形の本発明の化合物を提供する。
【００４０】
このような塩は好ましくは薬学的に許容される塩を含むが、薬学的に許容されない塩は、例えば製造／単離／精製目的のために含まれる。本発明の化合物の塩は、金属塩または酸付加塩を含む。金属塩は、例えばアルカリまたはアルカリ土類塩を含み；酸付加塩は式Ｉの化合物と酸、例えばフマル酸水素、フマル酸、ナフタリン−１,５−スルホン酸、塩酸、重水素化塩酸；好ましくは塩酸との塩を含む。
【００４１】
遊離形の本発明の化合物は対応する塩形の化合物に変換でき；そして逆もそうである。遊離形または塩形かつ溶媒和物形の本発明の化合物は、対応する遊離形にまたは溶媒和されていない塩の形態の化合物に変換でき；そして逆もそうである。
【００４２】
本発明の化合物は純粋な異性体またはそれらの混合物；例えば光学異性体、ジアステレオ異性体、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体の形で存在できる。本発明の化合物は、例えば不斉炭素原子を含み得て、故に、エナンチオマーまたはジアステレオ異性体およびそれらの混合物、例えばラセミ体の形で存在できる。全ての不斉炭素原子は(Ｒ)−、(Ｓ)−または(Ｒ,Ｓ)−配置、好ましくは(Ｒ)−または(Ｓ)−配置で存在できる。
【００４３】
異性体混合物は、純粋異性体を得るために、適当に、例えば慣用法に、例えば従い、例えば準じて分離できる。本発明は、全ての異性体形態のおよび全ての異性体混合物の本発明の化合物を含む。
【００４４】
本発明はまた、互変異性体が存在できるとき、式Ｉの化合物の互変異性体も含む。
【００４５】
他の局面において、本発明は式Ｉの化合物の製造法であって、
−  Ｒ３が式IIIの化合物であるとき、式Ｉの化合物を得るために
【化１０】
2008535479.tif 000012
(式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６およびＲ７は上記で定義の通りである)
の工程、および得られた式Ｉの化合物の反応混合物からの単離を含む、または
【００４６】
−  Ｒ３が式IIの化合物であるとき、式Ｉの化合物を得るために
【化１１】
2008535479.tif 000013
(式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は上記で定義の通りである)
の工程、および得られた式Ｉの化合物の反応混合物からの単離を含む
方法を提供する。
【００４７】
式IIIａ、IIIｂ、IIａ、IIｂまたはIIｃの中間体(出発物質)において、官能基は、存在するならば、所望により保護された形、または、塩形成基が存在するならば、塩の形であってよい。所望により存在する保護基は、適当な段階で、慣用法に、例えば従い、例えば準じて、除去し得る。
【００４８】
このようにして得た式Ｉの化合物を他のＩの化合物に変換でき、例えば、または遊離形で得た式Ｉの化合物を式Ｉの化合物の塩に変換でき、逆もそうである。
【００４９】
式IIIａ、IIIｂ、IIａ、IIｂまたはIIｃの中間体(出発物質)は既知であるか、または慣用法に従い、例えば準じて、またはここに記載の通り製造できる。
【００５０】
ここに記載の全ての化合物、例えば本発明の化合物および式IIIａ、IIIｂ、IIａ、IIｂまたはIIｃの中間体は、適当に、慣用法に、例えば従い、例えば準じて、または例えばここに明記の通り製造できる。
【００５１】
他の局面において、本発明は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡと標的タンパク質、例えば、ＨｕＲタンパク質の複合体形成の阻害剤としての本発明の化合物の使用を提供する。
【００５２】
好ましい局面において、本ＡＲＥ含有ｍＲＮＡはＩＬ−２、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αから成る群から選択される。
【００５３】
例えば、式Ｉの化合物を含む本発明の化合物は、薬理学的活性を示し、故に、医薬として有用である。
【００５４】
他の局面において、本発明は、医薬として使用するための、本発明の化合物を提供する。
【００５５】
医薬使用のために、本発明の化合物は、１個以上、好ましくは１個の、本発明の化合物、例えば２個以上の本発明の化合物の組み合わせを含む。
【００５６】
他の局面において、本発明は、本発明の化合物を少なくとも１種の医薬賦形剤、例えば増量剤、結合剤、崩壊剤、流動調節剤、滑剤、糖および甘味剤、香料、防腐剤、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用塩および／または緩衝剤を含む、例えば適当な担体および／または希釈剤と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００５７】
他の局面において、本発明は、別の薬学的活性剤をさらに含む、本発明の医薬組成物を提供する。
【００５８】
このような組成物は、慣用法に従い、例えば準じて、例えば混合、造粒、コーティング、溶解または凍結乾燥工程により、製造できる。単位投与形態は、例えば、約０.５mg乃至約１０００mg、例えば１mg乃至約５００mgを含み得る。
【００５９】
他の局面において、本発明は、サイトカイン、増殖因子、癌原遺伝子またはウイルスタンパク質から成る群から選択される物質(好ましくは該因子はＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｒ１、Ｃｏｘ−２、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃから選択される)の産生と関連する病因を有する障害の処置用の、医薬、例えば医薬組成物の製造のための、本発明の化合物の使用を提供する。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、サイトカイン、増殖因子、癌原遺伝子またはウイルスタンパク質から成る群から選択される物質(好ましくは該因子はＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｒ１、Ｃｏｘ−２、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃから選択される)の産生と関連する病因を有する障害の処置法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の本発明の化合物を；例えば医薬組成物の形で投与することを含む、方法を提供する。
【００６１】
処置は処置および予防を含む。
このような処置のために、適当な投与量は、もちろん、例えば、用いる本発明の化合物の化学的性質および薬物動力学データ、個々の宿主、投与形態ならびに処置する状態の性質および重症度に依存して変化する。しかしながら、一般に、大型哺乳動物、例えばヒトにおいて、満足行く結果のために、指示される１日量は、約０.０１ｇ乃至約１.０ｇの本発明の化合物であり；簡便には、例えば、１日４回までの分割量で投与する。
【００６２】
本発明の化合物は任意の慣用の経路で、例えば経鼻、口腔、直腸、経口投与を含む、例えば経腸投与で；例えば、静脈内、筋肉内、皮下を含む非経腸投与で；または例えば皮膚上、鼻腔内、気管内を含む局所投与で；
例えばコーティングまたは非コーティング錠剤、カプセル、注射可能溶液または懸濁液の形で、例えばアンプル、バイアルの形で、クリーム、ゲル、ペースト、吸入粉末、泡状物、チンキ、リップスティック、液滴、スプレーの形で、または坐薬の形で投与できる。
【００６３】
本発明の化合物は薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または金属塩の形で；または遊離形で；所望により溶媒和物の形で使用できる。塩の形の本発明の化合物は遊離形の；所望により溶媒和物の形の本発明の化合物と同程度の活性を有する。
【００６４】
本発明の化合物は、本発明に従う医薬処置のために単独で、または１種以上の他の薬学的活性剤と組み合わせて使用できる。
【００６５】
組み合わせは、１種以上の薬学的活性剤が同じ製剤中に存在する固定された組み合わせ剤；別々の製剤中の薬学的活性剤が、例えば併用投与の指示書と共に同じ包装内で販売されるキット；および複数の薬学的活性剤が別々に包装されているが、同時のまたは連続的な投与のための指示が与えられる、自由な組み合わせを含む。
【００６６】
図面の説明：
図１：アッセイ原則(概略)
タンパク質の標識した、例えばＣｙ３標識した、ｍＲＮＡ(ここでは：３'末端標識)への結合により、環境感受性標識、例えばＣｙ３の量子収量が増加する。この増加は、例えばＦＩＤＡアルゴリズムによる分子輝度のような適当な読み出しの増加として、または例えばアンサンブル平均した読み出しを使用した総蛍光強度の増加として、検出可能である。この効果は、ｍＲＮＡ配列内の標識、例えばＣｙ３標識の近位(Ａ)または遠位(Ｂ)のタンパク質結合部位について等しく観察される。
【００６７】
図２：例示的Ｃｙ３  ＦＩＤＡアッセイｍＲＮＡ−タンパク質結合曲線
ＨｕＲｆｌと、ＩＬ−２(Ａ)、ＩＬ−１β(Ｂ)およびＴＮＦ−α(Ｃ)の３'末端をＣｙ３標識した３'ＵＴＲ(＝非翻訳領域)の間の相互作用に関する例示的結合曲を示す。解離定数(Ｋｄ)は、下記実施例に記載の等式１に従い決定する。Ｃｙ３との非特異的ＨｕＲ相互作用を除外するために、ネガティブコントロールを遊離染料(Ｄ)で行う。Ｃｙ３分子輝度は、コントロールタンパク質(Ｅ)としてＢＳＡ(＝ウシ血清アルブミン)でＩＬ−２  ３'ＵＴＲを力価測定した後、未変化のままである。３'末端をＣｙ３標識したＲＮＡの濃度は全実験で０.５nMである。ＨｕＲ結合部位を何ら含まない５Ｓ  ＲＮＡが、非特異的コンペティターＲＮＡとして、全サンプルに１００nMで存在する。しかしながら、ほとんど同一の結合曲線が、全てのコンペティターＲＮＡ非存在下で記録される(ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲ、(Ｆ)について示される)。
【００６８】
図３：図２に示す結合実験についてのＲＮＡ転写物
ヒトＩＬ−２、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの３'ＵＴＲのインビトロ転写物(各々GenBank受託番号NM_000589, NM_000576およびNM_000594；７０７−１０３５位、８９７−１４９０位および８７２−１５６８位)を、Ｃｙ３で３'末端標識する。ＨｕＲ結合部位(青色で示す)は３'末端標識に対して異なる(連続的)近接性であるが、タンパク質結合によるＣｙ３量子収量が一貫して見られる。
【００６９】
下記実施例において、全ての温度は摂氏であり、未補正である。
下記略語を使用する：
【表１】
2008535479.tif 000014
【実施例】
【００７０】
Ａ)スクリーニングアッセイ：
インビトロで転写されたｍＲＮＡを、標準プロトコールに従い、ヒドラジド活性化Ｃｙ３(Amersham Biosciences)で３'末端標識する(例えばQin PZ et al., Methods 1999;18(1):60-70)。本標識ＲＮＡをＲＰ−ＨＰＬＣで精製する。１：１化学量論をＵＶ／ＶＩＳ分光学で制御する。本Ｃｙ３標識ｍＲＮＡを、２分、８０°でアッセイ緩衝液(ＰＢＳ、０.１％(ｗ／ｖ)  Pluronic F-127、５mM  ＭｇＣｌ２)中熱変性させ、−０.１３°ｓ−１の勾配でのｒｔまでの冷却により再折り畳みする。各サンプル中の標識ＲＮＡの最終濃度は０.５nMであり、これは、下記の工程における共焦容量中の平均＜１蛍光粒子を確実にする。各サンプルの正確な濃度を、点広がり関数の調節パラメーターとして与えられる、並行ＦＣＳ評価に由来する粒子数および共焦容量のサイズに基づき決定する。蛍光で標識したＲＮＡを組み換えＨｕＲｆｌまたはＨｕＲ１,２の濃度の増加に対して力価測定する。ＨｕＲ−ｍＲＮＡ複合体形成を、１Ｄ−ＦＩＤＡでの分子輝度の決定により真の平衡条件下でモニターする(例えばKask P. et al., Introduction to the theory of fluorescence intensity distribution analysis. FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY: THEORY AND APPLICATIONS 65 PG. 396-409. 2001 [Figures] -409; Kask P. et al., Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96[24], 13756-13761. 23-11-1999)。あるいは、Ｃｙ３蛍光強度を、慣用のアンサンブル平均した検出法、例えば蛍光プレートリーダーを使用して測定できる。
【００７１】
ＦＩＤＡ測定を９６または３８４ウェルのガラス底マイクロタイタープレート(Whatman)で、EvotecOAI PickoScreen 3装置上、環境温度(２３.５°で一定)で行う。Olympus倒立顕微鏡ＩＸ７０ベースの装置に、２個の蛍光検出器である、ダイクロイックミラーを蛍光励起通路に設置する。HeNeレーザー(λ＝５４３nm、レーザーパワー＝４７８μW)を蛍光励起のために使用する。本励起レーザー光は、光学検出経路から、ＯＤ＝５の干渉バリアにより遮断されている。アッセイ緩衝液中のＣｙ３またはＴＭＲ(ｃ＝０.５nM)を共焦ピンホール(７０μm)の調節のために使用する。１Ｄ−ＦＩＤＡシグナルを２０の連続測定(各１０秒)から平均化する。ＦＩＤＡアルゴリズムでの生データの分離が
(ａ)慣用のアンサンブル平均した測定と等しい平均分子輝度、または
(ｂ)個々の成分(遊離ｍＲＮＡ対複合体)のそれらの各分子輝度での平衡濃度
の抽出に続く。
【００７２】
本分子輝度データを、非線形最小二乗回帰(GraFit 5.0.3, Erithacus software, London)により適合させ、
(ａ)解離定数Ｋｄ
【数１】
2008535479.tif 000015
(式中、[ｍＲＮＡ０]：ＲＮＡの総濃度、[ＨｕＲ０]：ＨｕＲの総濃度、ｑｍｉｎ：遊離ＲＮＡの分子輝度、ｑｍａｘ：ＲＮＡ−ＨｕＲ複合体の分子輝度、ｑ：与えられたＨｕＲ０およびＲＮＡ０濃度で、定常状態平衡のための平均分子輝度である)
により決定される、(１：１)複合体形成の程度に依存した平均定常状態シグナルｑ
(ｂ)解離定数Ｋｄ
【数２】
2008535479.tif 000016
により決定される、遊離およびタンパク質結合ｍＲＮＡ([ｍＲＮＡｆｒｅｅ]および[ｍＲＮＡ・ＨｕＲ]は各々ＦＩＤＡ分析に直接由来する)の平衡濃度を記載する質量作用の法則に由来する正確な代数解式を使用して、平衡解離定数Ｋｄを抽出する。
【００７３】
ＨｕＲおよび個々にＣｙ３標識した標的ｍＲＮＡの間の相互作用の結合曲線の例は、図２に示す(全ての示すデータは、２０の個々のＦＩＤＡ測定の平均であり、少なくとも３回の独立した実験の代表である)。
【００７４】
話を続けると、本アッセイは、均質溶液中で(制御)ｍＲＮＡタンパク質相互作用をモニタリングするための新規試みを提供する。本アッセイは、真の平衡条件と、高い検出感受性の利益を組み合わせ、ハイスループット・スクリーニングにおける該相互作用の阻害剤または調節剤のスクリーニングに適する。莫大な数の転写後に制御される疾患に関連した標的と共に、記載のアッセイは、ＲＮＡターゲティング・アプローチに基づき、癌、炎症性、ウイルス、またはアレルギー性疾患の治療的介入の基礎として働く。
【００７５】
Ｂ)分析法：
ａ)ＨＰＬＣ：２個のポンプユニット３０６、動力学的混合チャンバー・モジュール８１１Ｃ、検圧(manometric pressure)モジュール８０５、ＵＶ検出器ＵＶ／ＶＩＳ  １５５および自動注入器２３４から成るAbimed(D-Langenfeld)ＨＰＬＣ系を使用する。分離は、Grom(D-Herrenberg)により製造された分析カラムGromSil150 ODS-5 ST(３μm、１２０×２mm)上で行う。Ｈ２Ｏ／０,１％ＴＦＡ(ｖ／ｖ)(溶離剤Ａ)およびアセトニトリル／０,１％ＴＦＡ(ｖ／ｖ)(溶離剤Ｂ)の０.４mL／分の流速での勾配を使用する。ＵＶトレースをλ＝２１４およびλ＝３０５nmで各々測定する。生成物の純度を、λ＝２１４nmで決定したピーク領域に基づき、割り振る。
【００７６】
ｂ)ＥＳ−ＭＳ：ＥＳ−ＭＳ分析をMicromass(Altrinchan/UK)Quattro II三連四重極質量分光計と、Waters(D-Eschborn)５１５メーク・アップ・ポンプ(６０μL／分  アセトニトリル／水  １：１、０,１％ギ酸含有)およびAbimed(D-Langenfeld)Gilson 232Xオートサンプラーで行う。
【００７７】
ｃ)ＬＣ−ＭＳ：ＬＣ−ＭＳ分析をWaters-Micromass(D-Eschborn)ＺＱ質量分光計と、ＨＰＬＣ系2790 Alliance HT分離モジュールおよび９９６ダイオードアレイ検出器で行う。Grom(D-Herrenberg)により製造された分析カラムGromSil120 ODS-5 ST(３μm、６０×２ｍｍ)を使用する。Ｈ２Ｏ／０,１％ＴＦＡ(ｖ／ｖ)(溶離剤Ａ)およびアセトニトリル／０,１％ＴＦＡ(ｖ／ｖ)(溶離剤Ｂ)の０.６mL／分の流速での勾配を使用する。
【００７８】
ｄ)分取ＨＰＬＣ：製造的分離のために、ポンプユニット３２２、ＵＶ検出器ＵＶ／ＶＩＳ  １５１(λ＝３０５ｎｍ)およびGilson 215液体ハンドラーから成るAbimed(D-Langenfeld)ＨＰＬＣ系１０１４を使用する。分離は、Merck(D-Darmstadt)により製造された分取カラムPurospher RP18(５μm、１２５×２５mm)上で行う。Ｈ２Ｏ／０,１％ＴＦＡ(ｖ／ｖ)(溶離剤Ａ)およびアセトニトリル／０,１％ＴＦＡ(ｖ／ｖ)(溶離剤Ｂ)の３０mL／分の流速での勾配を使用する。
【００７９】
実施例１から３：
化合物１から３の合成をスキーム１に従い行う。
【化１２】
2008535479.tif 000017
【００８０】
ａ)固体支持体へのリンカーの充填
４.２ｇのTentaGelＴＭ  Ｓ  ＮＨ２樹脂１(充填能力＝０.２５mmol／ｇ)をＤＭＦで予め洗浄する(４×２０mL)。０.８２ｇの４−ブロモメチル−３−ニトロ安息香酸２および０.４８２ｇのＨＯＢｔ＊Ｈ２Ｏを６０mLの８％ＤＭＦのＤＣＭ(ｖ／ｖ)溶液に溶解する。４８７μLのＤＩＣを添加する。ｒｔで３０分撹拌後、得られた溶液を予め線上したTentaGelＴＭ  Ｓ  ＮＨ２樹脂１に移す。得られた混合物をｒｔで１９時間振盪する。得られた樹脂３を濾取し、ＤＭＦ(６×５０mL)、ＤＣＭ(６×５０mL)およびＭｅＯＨ(６×５０mL)で洗浄し、減圧下乾燥させる。反応の完了を負のカイザー−ニンヒドリン試験により確認する。
【００８１】
ｂ)樹脂３と１級アミン４ａ、４ｂとの反応
３.１８ｇの樹脂３の２０mLのＤＭＳＯ溶液に、２.１３３ｇの１−(３−アミノプロピル)−ピロリジン−２−オン(４ａ)を添加する。１.２７ｇの樹脂３の１０mLのＤＭＳＯ溶液に、０.７３ｇの４−メチルベンジルアミン(４ｂ)を添加する。得られた混合物を３時間、ｒｔで撹拌する。得られた樹脂５ａおよび５ｂを濾取し、ＤＭＳＯ(３×６mL)、ＤＭＦ(６×６mL)、ＤＣＭ(６×６mL)、ＭｅＯＨ(６×６mL)で洗浄し、減圧下乾燥させる。クロラニル試験は陽性である。
【００８２】
ｃ)保護されたアミノ酸６ａ−ｆの樹脂５ａ−ｂへのカップリングおよびＮ(α)保護基(Ｆｍｏｃ)の開裂
０.６５ｇの樹脂５ａを５等分する。０.６５ｇの樹脂５ｂを２等分する。０.４５mmolの各Ｎ保護されたアミノ酸６ａ−ｆ(各々６ａ：Ｎ(α)−Ｆｍｏｃ−Ｎ(γ)−Ｂｏｃ−Ｌ−２,４−ジアミノ酪酸、２回；６ｂ：Ｆｍｏｃ−(ＯＴｒｔ)−Ｌ−ホモセリン；６ｃ：Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；６ｄ：Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；６ｅ：Ｆｍｏｃ−Ｌ−４−ＭｅＰｈｅ−ＯＨ；６ｆ：Ｆｍｏｃ−Ｌ−(４−Ｂｏｃ−アミノメチル)Ｐｈｅ−ＯＨ)を５mLのＤＭＦ、９３μLのＤＩＣおよび９２mgのＨＯＢｔ＊Ｈ２Ｏに溶解する。得られた溶液を３０分、ｒｔで撹拌する。得られた活性化６ａの溶液を、２等分する。各部分を、樹脂５ａおよび樹脂５ｂの各部分に移し、側鎖保護された樹脂７ａおよび８ａを各々得る。得られた活性化６ｂ−ｅの溶液を、樹脂５ａの残りの部分に添加し、保護された樹脂７ｂ−ｅを得る。６ｆ含有溶液を樹脂５ｂの第２の部分に移し、保護された樹脂８ｂを得る。１６.５時間、ｒｔで振盪後、得られた樹脂を濾取し、ＤＭＦ(９×１０mL)、ＤＣＭ(６×１０mL)およびＭｅＯＨ(６×１０mL)で洗浄する。完全に保護された樹脂７ａ−ｅおよび８ａ−ｂを減圧下乾燥させる。全クロラニル試験は陰性である。
【００８３】
ＤＭＦ(４００mL、１／１、ｖ／ｖ)中のピペリジンの貯蔵溶液のアリコート(５mL)を、Ｎ(α)−Ｆｍｏｃ保護基を開裂するために０.６６ｇの保護された樹脂７ａ−ｅおよび８ａ−ｂの各々に添加する。得られた混合物を３０分振盪する。得られた脱保護された樹脂７ａ−ｅ、８ａ−ｂを濾取し、ＤＭＦ(９×２５mL)、ＤＣＭ(６×２５mL)およびＭｅＯＨ(６×２５mL)での反復洗浄に付す。得られた樹脂を減圧下乾燥させる。カイザー−ニンヒドリン試験は陽性である。
【００８４】
ｄ)対称性二カルボン酸構造を含む化合物１４ａ−ｃの合成
対称性二カルボン酸９ａおよび９ｂのＦｍｏｃ脱保護樹脂７ａおよび８ａ−ｂ上へのカップリング
対称性二カルボン酸９(９ａ：ピリジン−２,６−ジカルボン酸；９ｂ：テレフタル酸、２回；各１.５mmol)を、１１５mgのＨＯＢｔ＊Ｈ２Ｏ、４８５mgのＤＩＥＡおよび９５mgのＤＩＣの５mLのＤＭＦ溶液に溶解する。得られた９ａの溶液を樹脂７ａに添加し、樹脂１０ａを得る。得られた９ｂの二等分した溶液を樹脂８ａおよび８ｂに添加し、各々樹脂１０ｂおよび１０ｃを得る。２０時間、ｒｔで振盪後、得られた樹脂１０ａ−ｃを濾取し、ＤＭＦ(９×２０mL)、ＤＣＭ(６×１０mL)、ジエチルエーテル(６×１０mL)で洗浄し、減圧下乾燥させる。全樹脂サンプルのカイザー−ニンヒドリン試験は陰性である。
【００８５】
ｅ)樹脂に結合したジカルボン酸モノ−アミド１０ａ−ｃとアミノ酸アミド１１および１級アミン１２のカップリング
３３９mgのペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートおよび２４２μLのピリジンの５mLのＮＭＰ溶液に、各々６５０mgの樹脂１０ａ−ｃを添加する。得られた混合物を２.５時間、ｒｔ振盪する。得られた樹脂を濾取し、ＮＭＰ(１０×５mL)で洗浄する。２９８mgの(Ｏ−Ｔｒｔ)保護Ｌ−スレオニンアミドヒドロクロライド(１１)を、２０.３mgの無水ＨＯＢｔおよび３mmolのＤＩＥＡの３.０mLのＮＭＰ溶液に溶解し、６５０mgの予め活性化した樹脂１０ａに添加して、樹脂１３ａを得る。１８２mgの３−メトキシベンジルアミン(１２)を４０.６mgの無水ＨＯＢｔおよび１.５mmolのＤＩＥＡの６.０mgのＮＭＰ溶液に溶解する。得られた溶液を２等分し、それらを予め活性化した樹脂１０ｂおよび１０ｃに添加し、各々樹脂１３ｂおよび１３ｃを得る。得られた混合物を１４.５時間、ｒｔで振盪する。得られた樹脂を濾取し、ＮＭＰ(６×１０mL)、ＤＭＦ(６×１０mL)、ＤＣＭ(６×１０mL)、およびＭｅＯＨ(６×１０mL)で洗浄し、減圧下乾燥させる。
【００８６】
ｆ)Ｂｏｃ−保護基のアミノ酸６の側鎖からの開裂
５０％ＴＦＡのＤＣＭ(ｖ／ｖ)溶液の５mLを、６５０mgの樹脂１３ａ−ｃの各々に添加する。得られた混合物を２時間、ｒｔで振盪する。得られた樹脂を濾取し、２０％ＴＦＡのＤＣＭ溶液(ｖ／ｖ、３×５mL)、ＤＭＦ(６×１０mL)、ＤＣＭ(６×１０mL)および無水ＥｔＯＨ(６×１０mL)で洗浄し、減圧下乾燥させる。
【００８７】
ｇ)最終化合物１４ａ−ｃの樹脂１３ａ−ｃからの開裂
５mLのＭｅＯＨ＋１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ)を、脱保護した樹脂１３ａ−ｃの各々に添加する。樹脂含有ガラスバイアルを光分解のためにプラスチック担体上に置く。光分解を３６６nmで９０分、Stratageneでの撹拌下、NEC Blacklight T5、FL8Bl、８Ｗランプを備えたUV StratalinerTM 1800で行う。光分解中、チャンバーの温度を圧縮空気の流れにより冷却する。得られた樹脂物質を濾取し、ＤＣＭ(２×５mL)で洗浄する。得られた濾液からの溶媒を蒸発させる。粗物質をさらに分取ＨＰＬＣによる精製に付してよい。
【００８８】
実施例１：
ピリジン−２,６−ジカルボン酸２−({３−アミノ−１−[３−(２−オキソ−ピロリジン−１−イル)−プロピルカルバモイル]−プロピル}−アミド)６−[(１−カルバモイル−２−ヒドロキシ−プロピル)−アミド]を得る。
ＭＷ＝４９１.５５５２  保持時間：３.８分  ＬＣ−ＭＳ  [Ｍ＋Ｈ]＋：４９２
【００８９】
実施例２：
Ｎ−[３−アミノ−１−(４−メチル−ベンジルカルバモイル)−プロピル]−Ｎ'−(３−メトキシ−ベンジル)−テレフタルアミドを得る。
ＭＷ＝４８８.５９２  保持時間：８.２９分  ＬＣ−ＭＳ  [Ｍ＋Ｈ]＋：４８９
【００９０】
実施例３：
Ｎ−[２−(４−アミノメチル−フェニル)−１−(４−メチル−ベンジルカルバモイル)−エチル]−Ｎ'−(３−メトキシ−ベンジル)−テレフタルアミドを得る。
ＭＷ＝５６４.６９  保持時間：８.４６分  ＬＣ−ＭＳ  [Ｍ＋Ｈ]＋：５６５
【００９１】
実施例４から７：
化合物４から７の合成をスキーム２に従い行う。
【化１３】
2008535479.tif 000018
【００９２】
ａ)樹脂７ｂ−ｅのアセトアセチル化
Ｎ(α)脱保護した樹脂７ｂ−ｅを５mLシリンジに入れる。３５９mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルアセトアセテート１５を１７.０mLのＤＣＭに溶解する。３１０mgのＤＩＥＡを添加し、貯蔵溶液の４mLの量を、６５０mgの樹脂７ｂ−ｅ各々の各シリンジに移す。５時間、ｒｔで振盪後、得られたアセトアセチル化した樹脂１６ａ−ｄを濾取し、ＤＣＭ(３×５mL)、ＤＭＦ(６×５mL)、ＤＣＭ(６×５mL)およびＭｅＯＨ(６×５mL)で洗浄し、乾燥させる。カイザー−ニンヒドリン試験は陰性である。
【００９３】
ｂ)樹脂１６ａ−ｄと１級アミン１７ａ−ｃの反応(エナミノン形成)
ＴＨＦおよびＴＭＯＦ(１／１、ｖ／ｖ)の５mLの貯蔵溶液を、６５０mgの樹脂１６ａ−ｄ各々に添加する。１.５mmolの１級アミン１７ａ−ｃ(樹脂１６ａとの反応のために１７ａ：２−メトキシエチルアミン；樹脂１６ｂとの反応のために１７ｂ：２−(３−メトキシフェニル)−エチルアミン；各々樹脂１６ｃおよび１６ｄとの反応のために２回１７ｃ：ベンジルアミン)の各々を添加し、得られた混合物を１８時間、ｒｔで振盪する。得られた樹脂１８ａ−ｄを濾取し、ＴＨＦ／ＴＭＯＦ(１／１、ｖ／ｖ)(３×６mL)、ＤＭＦ(６×６mL)、ＤＣＭ(６×６mL)およびＭｅＯＨ(６×６mL)で洗浄し、乾燥させる。
【００９４】
ｃ)樹脂と結合したエナミノン１８ａ−ｄと１,４−ジブロモ−２,３−ブタンジオン１９からのピロールの合成
２３０mgの２,６−ジ−ｔｅｒｔ.−ブチルピリジンおよび２９２mgの１,４−ジブロモ−２,３−ブタンジオン１９を２４mLのジオキサンに溶解し、貯蔵溶液を得る。得られた貯蔵溶液の一定量(６mL／樹脂)を６５０mgの樹脂１８ａ−ｄの各々に添加する。得られた混合物を１.５時間、ｒｔで振盪する。得られた樹脂２０ａ−ｄを濾取し、ジオキサン(６×６mL)、ＤＭＦ(６×６mL)、ＴＨＦ(６×６mL)およびＤＣＭ(６×６mL)で洗浄する。
【００９５】
ｄ)樹脂と結合したブロモアセチル−ピロール２０ａ−ｄの２級アミン２１ａおよび２１ｂとの置換
１９２mgの２級アミン２１(１２８mgの樹脂２０ａと反応するための２１ａ：ピペリジン−４−カルボキサミド、１２８ｇの樹脂２０ｂ−ｄと反応するための２１ｂ：ピペリジン)の各々およびＤＭＳＯ(４×６mL)を６５０mgの樹脂２０ａ−ｄの各々に添加する。得られた混合物を１５.５時間、ｒｔで振盪する。得られた樹脂２２ａ−ｄを濾取し、ＤＭＳＯ(３×１mL)、ＤＭＦ(６×１mL)、ＤＣＭ(６×１mL)およびＭｅＯＨ(６×１mL)で洗浄し、乾燥させる。
【００９６】
ｅ)保護基のアミノ酸６(樹脂２２ａ−ｃ)の側鎖からの開裂
２０％ＴＦＡのＤＣＭ(ｖ／ｖ)溶液の５mLを、樹脂２２ａ−ｃの各々に添加し、Ｒ２上の保護基(Ｔｒｔ、ｔ−Ｂｕ、Ｂｏｃ)を除去する。得られた混合物を１時間、ｒｔで振盪する。得られた脱保護した樹脂２２ａ−ｃを濾取し、２０％ＴＦＡのＤＣＭ溶液(ｖ／ｖ、３×１mL)、ＤＭＦ(６×２mL)、ＤＣＭ(６×２mL)、ＥｔＯＨ(６×２mL)およびエーテル(３×２mL)で洗浄し、乾燥させる。
【００９７】
ｆ)最終化合物２３ａ−ｄの樹脂２２ａ−ｄからの開裂
５mLの酸性メタノールおよび１％ｖ／ｖ  ＴＦＡを脱保護した樹脂２２ａ−ｃおよび非ＴＦＡ処理樹脂２２ｄの各々に添加する。ガラスバイアルをプラスチック担体中に入れる。光分解を撹拌および３６６nmの照射下、９０分、NEC Blacklight T5、FL8Bl、８Ｗランプを備えたStratagene(登録商標) UV StratalinerTM 1800で行う。光分解中、チャンバーの温度を圧縮空気の流れにより冷却する。得られた樹脂物質を濾取し、ＤＣＭ(２×５mL)で洗浄する。得られた合わせた濾液からの溶媒を蒸発させる。化合物の粗物質を、さらに分取ＨＰＬＣによる精製に付してよい。
【００９８】
実施例４：
１−{２−[４−{３−ヒドロキシ−１−[３−(２−オキソ−ピロリジン−１−イル)−プロピルカルバモイル]−プロピルカルバモイル}−１−(２−メトキシ−エチル)−５−メチル−１Ｈ−ピロル−２−イル]−２−オキソ−エチル}−ピペリジン−４−カルボン酸アミドを得る。
ＭＷ＝５７６.６９９  保持時間：２.２４分  ＬＣ−ＭＳ  [Ｍ＋Ｈ]＋：５７７
【００９９】
実施例５：
３−{[１−[２−(３−メトキシ−フェニル)−エチル]−２−メチル−５−(２−ピペリジン−１−イル−アセチル)−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル]−アミノ}−Ｎ−[３−(２−オキソ−ピロリジン−１−イル)−プロピル]−スクシンナミン酸を得る。
ＭＷ＝６２３.７５６  保持時間：７.５９分  ＬＣ−ＭＳ  [Ｍ＋Ｈ]＋：６２４
【０１００】
実施例６：
１−ベンジル−２−メチル−５−(２−ピペリジン−１−イル−アセチル)−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸{２−(１Ｈ−インドル−３−イル)−１−[３−(２−オキソ−ピロリジン−１−イル)−プロピルカルバモイル]−エチル}−アミドを得る。
ＭＷ＝６５０.８２８  保持時間：８.２４８分  ＬＣ−ＭＳ  [Ｍ＋Ｈ]＋：６５１
【０１０１】
実施例７
１−ベンジル−２−メチル−５−(２−ピペリジン−１−イル−アセチル)−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸{１−[３−(２−オキソ−ピロリジン−１−イル)−プロピルカルバモイル]−２−ｐ−トリル−エチル}−アミドを得る。
ＭＷ＝６２５.８１８  保持時間：８.４４分  ＬＣ−ＭＳ  [Ｍ＋Ｈ]＋：６２６
【０１０２】
実施例８：ＨｕＲ関連ｍＲＮＡ安定性制御の小分子阻害剤の同定
ＨｕＲ関連ｍＲＮＡ安定性制御の小分子阻害剤の同定のために、３種の異なる補足的ＨＴスクリーニングを行う：
(１)ＩＬ−２またはＴＮＦ−α  ＡＵリッチ・エレメント制御下の蛍ルシフェラーゼでの細胞性レポーター遺伝子アッセイ。このアッセイは、ＡＲＥ介在ｍＲＮＡ安定化の細胞で活性な非毒性阻害剤の同定のために設計する。確認されたヒットを、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αプロモーターの制御下にルシフェラーゼＣＤＳでアッセイし、転写レベルで作用する化合物を排除する。定義によれば、同定されたヒット化合物は短命ＡＲＥ  ｍＲＮＡの転写後安定化をＡＲＥ経路に沿ったいくつかのレベルで妨害する。
【０１０３】
(２)共焦変動分光学を使用したＨｕＲ−ＡＲＥ阻害剤のインビトロスクリーニング。このアッセイは、溶液中で、ＨｕＲの短縮変異体であるＨｕＲ１２のＴＭＲ標識ＡＲＥ  ＲＮＡへの結合をモニタリングするために２Ｄ−ＦＩＤＡを使用する。このスクリーニングで同定された化合物は、ＨｕＲ−ＡＲＥ認識をＡＲＥまたはＨｕＲ１２への結合のいずれかにより妨害すると仮説立てられる。
【０１０４】
(３)ＣＯＮＡとＨｕＲ。コンビナトリアル・ビーズ上ライブラリーを、ＣＯＮＡとの高親和性ＨｕＲ結合剤についてスクリーニングする。ヒットしたビーズの選択およびビーズ上結合剤の固体支持体からの開裂後、化合物構造をμＨＰＬＣ−ＭＳにより解読する。西郷性したヒット化合物のＨｕＲへの結合を溶液中で試験する。第一の結果として、同定された化合物は高親和性ＨｕＲ結合剤を代表する。機能的に、これらはＡＲＥ認識、核・細胞質間輸送およびｍＲＮＡのＡＲＥ依存性分解からの保護を含む、何らかのＨｕＲ活性の阻害剤であり得る
【０１０５】
ＲＮＡフラクション結合ｙを、ｙ＝(ｒ−ｒｍｉｎ)／((ｒ−ｒｍｉｎ)＋Ｑ(ｒｍａｘ−ｒ))（式中、ｒ≡測定された異方性、ｒｍｉｎ、ｒｍａｘ≡各々遊離およびＨｕＲ結合したＲＮＡの異方性、Ｑ≡クエンチング)に基づいた異方性データから計算する。解離定数Ｋｄを、Mathematica 5.0.0のKMathでの非線形曲線適合により決定し、１：１：１化学量論的、競合的阻害が仮説立てられる。
【０１０６】
【表２】
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化合物の解離定数は、ＨｕＲｆｌへの結合のＡＲＥ  ＲＮＡとの競合的実験に基づき決定
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】アッセイ原則(概略)。タンパク質の標識した、例えばＣｙ３標識した、ｍＲＮＡ(ここでは：３'末端標識)への結合により、環境感受性標識、例えばＣｙ３の量子収量が増加する。この増加は、例えばＦＩＤＡアルゴリズムによる分子輝度のような適当な読み出しの増加として、または例えばアンサンブル平均した読み出しを使用した総蛍光強度の増加として、検出可能である。この効果は、ｍＲＮＡ配列内の標識、例えばＣｙ３標識の近位(Ａ)または遠位(Ｂ)のタンパク質結合部位について等しく観察される。
【図２】例示的Ｃｙ３  ＦＩＤＡアッセイｍＲＮＡ−タンパク質結合曲線。ＨｕＲｆｌと、ＩＬ−２(Ａ)、ＩＬ−１β(Ｂ)およびＴＮＦ−α(Ｃ)の３'末端をＣｙ３標識した３'ＵＴＲ(＝非翻訳領域)の間の相互作用に関する例示的結合曲を示す。解離定数(Ｋｄ)は、下記実施例に記載の等式１に従い決定する。Ｃｙ３との非特異的ＨｕＲ相互作用を除外するために、ネガティブコントロールを遊離染料(Ｄ)で行う。Ｃｙ３分子輝度は、コントロールタンパク質(Ｅ)としてＢＳＡ(＝ウシ血清アルブミン)でＩＬ−２  ３'ＵＴＲを力価測定した後、未変化のままである。３'末端をＣｙ３標識したＲＮＡの濃度は全実験で０.５nMである。ＨｕＲ結合部位を何ら含まない５Ｓ  ＲＮＡが、非特異的コンペティターＲＮＡとして、全サンプルに１００nMで存在する。しかしながら、ほとんど同一の結合曲線が、全てのコンペティターＲＮＡ非存在下で記録される(ＴＮＦ−α  ３'ＵＴＲ、(Ｆ)について示される)。
【図３】図２に示す結合実験についてのＲＮＡ転写物。ヒトＩＬ−２、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの３'ＵＴＲのインビトロ転写物(各々GenBank受託番号NM_000589, NM_000576およびNM_000594；７０７−１０３５位、８９７−１４９０位および８７２−１５６８位)を、Ｃｙ３で３'末端標識する。ＨｕＲ結合部位(青色で示す)は３'末端標識に対して異なる(連続的)近接性であるが、タンパク質結合によるＣｙ３量子収量が一貫して見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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