(57)【要約】【課題】血管新生および周皮細胞組成物を調節するための方法および組成物の提供。【解決手段】特定の局面において、本開示は、アクチビン様キナーゼＩ（ＡＬＫ１）ポリペプチドの細胞外ドメインのリガンド結合部分を含むポリペプチドが、インビボにおいて、特に、血管新生に関連づけられる障害に苦しむ哺乳動物において血管新生を阻害するために使用され得るという識見に関連する。加えて、本開示は、ＡＬＫ１の阻害剤が、腫瘍および網膜を含めて、脈管形成した組織において周皮細胞被覆を増大させるために使用され得ることを明らかにする。本開示はまた、ＡＬＫ１に対するリガンドを特定し、そのようなリガンドが血管新生促進活性を有することを明らかにし、受容体−リガンドの相互作用を阻害する抗体を記載する。【選択図】図７
2015042680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許法第１１９条の下、２００８年５月２日に出願された米国仮特許出願第６０／０５０，１６８号、および２００９年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／１４４，１３１号の出願日の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
血管新生は、新しい血管を形成するというプロセスであり、多くの正常な生理学的状態および異常な生理学的状態において非常に重要である。正常な生理学的条件下において、ヒトおよび動物は血管新生を特異的な状況および限定された状況で受ける。例えば、血管新生が、正常な場合には、創傷治癒、胎児および胚の発達、ならびに、黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観測される。
【０００３】
望ましくない血管新生または適切に調節されない血管新生が多くの障害において生じており、そのような障害では、異常な内皮成長が病理学的プロセスの原因となり得るか、または、病理学的プロセスに関与し得る。例えば、血管新生が多くの腫瘍の成長に関与する。脱調節された血管新生が様々な病理学的プロセスに関わっており、例えば、関節リウマチ、様々な網膜症、血管腫および乾癬などに関わっている。調節されない血管新生が存在する多様な病理学的疾患状態が血管新生関連疾患として分類されている。
【０００４】
制御された血管新生および制御されない血管新生の両方が、類似した様式で進行すると考えられる。毛細血管が主に内皮細胞および周皮細胞から構成され、内皮細胞および周皮細胞が基底膜によって取り囲まれる。血管新生が、内皮細胞および白血球によって放出される酵素による基底膜の浸食とともに始まる。その後、血管の管腔の内側を覆う内皮細胞が基底膜を通って突き出る。様々な血管新生因子により、内皮細胞は、浸食した基底膜を通って遊走することが誘導される。遊走する細胞は、内皮細胞が有糸分裂および増殖を受ける、元の血管から突き出る「芽」を形成する。内皮の芽は互いに合併して、新しい毛細血管をもたらす毛細血管係蹄を形成する。
【０００５】
血管新生を阻害する薬剤は、様々な障害を処置することにおいて効果的であることが判明している。Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合するモノクローナル抗体であり、様々なガンの処置において効果的であることが判明している。Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）は、ＶＥＧＦに結合するアプタマーであり、脈管形成（浸出型）の加齢性黄斑変性の処置において効果的であることが判明している。ＳＤＦ／ＣＸＣＲ４シグナル伝達経路のアンタゴニストはマウスモデルにおいて腫瘍の脈管形成を阻害し、ガンに対して効果的である（非特許文献１）。イソクマリン２−（８−ヒドロキシ−６−メトキシ−１−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾピラン−３−イル）プロピオン酸（ＮＭ−３）が、経口により生物学的利用可能な血管新生阻害剤としての第Ｉ相臨床評価を完了している。ＮＭ−３はインビトロにおいて内皮細胞および腫瘍細胞の両方を直接に殺し、マウスにおける種々のヒト腫瘍異種移植片の処置において効果的である（非特許文献２）。サリドマイドおよび関連した化合物がガンの処置において有益な効果を示しており、また、分子的な作用機構は不明であるが、血管新生の阻害が抗腫瘍効果の重要な成分であると思われる（例えば、非特許文献３を参照のこと）。関節リウマチの処置におけるＴＮＦ−アルファのアンタゴニストの成功は部分的には、炎症を起こした関節組織に対する抗血管新生効果に起因すると考えられる（非特許文献４）。抗血管新生治療は、他の炎症性疾患（特に、乾癬）に対する有益な効果を有することが広く期待される。多くの抗血管新生剤が、影響を受ける組織に関わりなく、血管新生に対する影響を有するが、他の血管新生剤は、組織特異的な効果を有する傾向があるかもしれない。
【０００６】
周皮細胞は、内皮細胞および平滑筋細胞とともに、血管系の成分細胞タイプの１つである。周皮細胞対内皮細胞の比率が中枢神経系において最大であり、周皮細胞が、血液脳関門における重要な役割を果たしていると考えられる。糖尿病性網膜症は、網膜の微小血管系における周皮細胞の喪失によって特徴づけられ、周皮細胞のこの喪失が、疾患の進行に対する重要な病態生理学的影響を有すると考えられる。
【０００７】
血管新生を阻害するためのさらなる組成物および方法、ならびに、周皮細胞被覆を脈管形成した組織において増大させるためのさらなる組成物および方法を有することが望ましい。これらには、血管の望まれない成長を、全身的に、あるいは、特定の組織および／または疾患状態においてそのどちらであっても阻害することができる方法および組成物が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｕｌｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５年７月１日；６５（１３）：５８６４−７１
【非特許文献２】Ａｇａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５年１２月；５６（６）：６１０−４
【非特許文献３】Ｄｒｅｄｇｅら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００５年１月；６９（１−２）：５６−６３
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎｎら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１９：１６３−９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
部分的には、本開示は、アクチビン様キナーゼＩ（ＡＬＫ１）媒介調節系の特徴づけ、ならびに、血管新生、および、脈管形成した組織における周皮細胞被覆の調節におけるこの系のインビボでの役割を示す。特定の局面において、本開示は、ＡＬＫ−１リガンドのアンタゴニスト、および、抗血管新生剤としてのそのようなアンタゴニストの使用、または、周皮細胞被覆を増大させるためのそのようなアンタゴニストの使用を提供する。加えて、本開示は、ＡＬＫ−１自身のアンタゴニスト、および、抗血管新生剤としてのそのようなアンタゴニストの使用を提供する。本明細書中に記載されるように、ＡＬＫ１は、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７を含むＧＤＦ５群のリガンドに対する受容体であり、同様にまた、ＢＭＰ１０を含むＢＭＰ９群のリガンドに対する受容体でもある。本開示は、ＡＬＫ１および上記で記載されるリガンドによって媒介されるシグナル伝達がインビボにおける血管新生に関与すること、また、この調節系の阻害が強力な抗血管新生効果を有することを明らかにする。加えて、本開示は、ＡＬＫ１調節系の阻害が、脈管形成した組織における増大した周皮細胞被覆を引き起こすことを明らかにする。したがって、特定の局面において、本開示は、血管新生を阻害することにおいて使用されるＡＬＫ１調節系のアンタゴニスト（その受容体のアンタゴニスト、あるいは、そのリガンドの１つまたは複数のアンタゴニストを含む）を提供する。特定の局面において、本開示は、ガン、特に、多発性骨髄腫、黒色腫、肺ガン、膵臓ガン（特に、膵臓の内分泌組織の腫瘍）、乳ガン（例えば、原発性乳ガンまたは転移性乳ガン；エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）またはエストロゲン受容体陰性性（ＥＲ−））、関節リウマチ、眼における病理学的血管新生に関連する障害、および、脈管形成した組織における周皮細胞の喪失に関連する障害（例えば、糖尿病性網膜症など）を処置するためのＡＬＫ１リガンドのアンタゴニストを提供する。
【００１０】
特定の局面において、本開示は、血管新生を阻害することにおいて使用される、ＡＬＫ１の細胞外ドメインのリガンド結合部分を含むポリペプチド（「ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド」）を提供する。何らかの特定の作用機構にとらわれることを望まないが、そのようなポリペプチドは、ＡＬＫ１のリガンドに結合し、かつ、これらのリガンドがＡＬＫ１ならびに他の受容体と相互作用し得ることを阻害することによって作用することが予想される。特定の局面において、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のヒトＡＬＫ１配列のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または、１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、特に組織（例えば、眼など）内への局所的投与のために、小さい単量体タンパク質として、または、（例えば、融合タンパク質として発現させられる）二量体化した形態で使用することができる。ＡＬＫ１  ＥＣＤはまた、改善された特性を提供するために、例えば、増大した半減期、あるいは、製造または精製のより大きい容易さなどを提供するために第２のポリペプチド部分に融合することができる。免疫グロブリンのＦｃ部分への融合、または、ポリオキシエチレン成分（例えば、ポリエチレングリコール）への連結は、全身的投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与および腹腔内投与）におけるＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの血清半減期を増大させるために特に有用であり得る。本明細書中において明らかにされるように、全身投与されたＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチドは強力な抗血管新生効果を眼において有し、同様にまた、肯定的な効果を関節リウマチおよび様々な腫瘍のマウスモデルにおいてもたらす。特定の局面において、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または、１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ここで、そのようなポリペプチドは、介在するリンカーを伴うか、または、介在するリンカーを伴うことなく、そのどちらであっても免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、かつ、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＧＤＦ５、ＧＤＦ７およびＢＭＰ９に結合し、また、１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する。Ｆｃ部分は、生物に対して適切であるように選択することができる。必要な場合には、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分である。好ましい実施形態において、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８を含む。必要な場合には、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含む。必要な場合には、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳動物細胞株における配列番号４の核酸の発現によって、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株にお��る配列番号４の核酸の発現によって産生されるタンパク質である。ＡＬＫ１−ＥＣＤポリペプチドは、実質的にパイロジェン非含有である医薬調製物として配合することができる。医薬調製物は全身的送達（例えば、静脈内送達、動脈内送達または皮下送達）または局所的送達（例えば、眼への局所的送達）のために調製することができる。
【００１１】
特定の局面において、本開示では、治療的状況において使用されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の比較的均一な調製物を開発することにおける困難さが特定される。本明細書中に記載されるように、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、より高次の多量体に凝集する傾向がある。本開示は、これらの困難さに対する解決策を提供しており、したがって、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬調製物で、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が二量体のＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質から構成される医薬調製物を提供する。したがって、特定の局面において、本開示は、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬調製物であって、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＧＤＦ５、ＧＤＦ７およびＢＭＰ９に結合し、また、１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合し、かつ、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が二量体形態で存在する医薬調製物を提供する。ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分であり得る。ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳動物細胞株における配列番号４の核酸の発現によって、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株における配列番号４の核酸の発現によって産生され得る。そのような医薬調製物は、眼への投与のために、特に注射による眼への投与のために適切であるように配合することができる。開示される医薬調製物は、血管新生を阻害すること、腫瘍を処置すること、関節リウマチを処置すること、血管新生に関連する眼の障害を処置すること、および、脈管形成した組織における周皮細胞被覆の喪失に関連する障害（例えば、糖尿病性網膜症など）を含めて、本明細書中に記載される様々な治療目的のために使用することができる。ＡＬＫ１−Ｆｃの医薬調製物は、血管新生を阻害する第２の薬剤との併用で使用することができ、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ、ソラフェニブおよびＶＥＧＦ受容体捕捉剤）などとの併用で使用することができる。
【００１２】
本開示は、ＡＬＫ１シグナル伝達経路のアンタゴニストが周皮細胞被覆を脈管形成した組織において増大させることを明らかにする。したがって、本開示は、周皮細胞被覆における増大を哺乳動物の脈管形成した組織において促進させるための方法を提供する。そのようなアンタゴニストは、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質（例えば、ＡＬＫ１−Ｆｃ）、ＤＡＮタンパク質、ならびに、ＡＬＫ１およびそのリガンドのいずれか（これには、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７が含まれる）に向けられる抗体を含めて、本明細書中に記載されるアンタゴニストのいずれかであり得る。特定の局面において、本開示は、周皮細胞被覆における増大をその必要性のある哺乳動物の脈管形成した組織において促進させるための方法であって、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質の効果的な量を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質はＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質であり得る。また、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができ、ここで、該ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、かつ、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する。ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合することができる。ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３４〜アミノ酸９５に対応するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ＡＬＫ１  ＥＣＤは、配列番号２のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２８５に対して、または、同じアミノ酸配列をコードする、配列番号２のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２８５の改変体に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は配列番号３の配列を有することができる。ＡＬＫ１  ＥＣＤ融合タンパク質は眼に静脈内送達または局所送達することができる。特定の局面において、本開示は、周皮細胞被覆における増大をその必要性のある哺乳動物の脈管形成した組織において促進させるための方法であって、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体の効果的な量を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。抗体は、そのようなＡＬＫ１ポリペプチドに、５×１０−８Ｍ未満のＫＤで、または、１×１０−９Ｍ未満のＫＤで、または、１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで結合することができる。抗体はＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害することができ、ここで、この場合、ＡＬＫ１リガンドは、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される。抗体は静脈内送達または眼内送達することができる。国際公開ＷＯ２００７／０４０９１２に記載される抗体がそのような方法において有用であり得る。ＡＬＫ１シグナル伝達アンタゴニストは、血管新生を阻害する第２の薬剤とともに投与することができ、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストなどとともに投与することができる。処置される哺乳動物は、網膜血管系における周皮細胞被覆の喪失によって特徴づけられる糖尿病性網膜症または他の網膜障害を有し得るか、あるいは、黒色腫、肺腫瘍、多発性骨髄腫、膵臓腫瘍（例えば、膵臓の内分泌組織の腫瘍）および乳ガン（例えば、原発性乳ガンまたは転移性乳ガン；エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）またはエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−））からなる群から選択される腫瘍を有し得る。
【００１３】
特定の局面において、本開示は、哺乳動物における血管新生を、本明細書中に一般的または具体的に記載されるＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドのいずれかを投与することによって阻害するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の効果的な量を哺乳動物に投与することを含み、ここで、ＡＬＫ１  Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、かつ、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する。必要な場合には、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する。必要な場合には、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は配列番号３の配列を有する。ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは（例えば、眼に）局所送達することができ、または、全身送達することができる（例えば、静脈内、動脈内または皮下）。特定の実施形態において、本開示は、哺乳動物の眼における血管新生を、ＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を眼から遠い場所において哺乳動物に投与することによって、例えば、全身的投与によって阻害するための方法を提供する。
【００１４】
特定の局面において、本開示は、ＡＬＫ１（具体的には、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８）に位置するエピトープ）に結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害する抗体を提供する。ＡＬＫ１に対するこれらのリガンドの親和性に基づいて、抗体は５×１０−８Ｍ未満のＫＤで結合することができ、必要な場合には、５×１０−８〜１×１０−１０の間のＫＤで結合することができる。親和性をこの範囲内に有する抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７の１つまたは複数によるシグナル伝達を阻害し、一方、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０によるシグナル伝達に対する影響をほとんど有しないことが予想される。そのような抗体は好ましくは、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドにより刺激される血管新生を阻害する。特定の機構にとらわれることを望まないが、そのような抗体は、ＡＬＫ１活性を直接に阻害することによって作用することが予想され、このことは、ＡＬＫ１リガンドの活性を阻害することが予想されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の活性とは対比されるにちがいない。抗ＡＬＫ１抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０が代わりの受容体系（例えば、ＢＭＰＲ１ａ複合体、ＢＭＰＲ１ｂ複合体およびＢＭＰＲＩＩ複合体）を介してシグナル伝達し得ることを妨げないことが予想される。しかしながら、抗ＡＬＫ１抗体は、ＡＬＫ１に対する低親和性リガンド（例えば、ＴＧＦ−β、これは、結合がたとえ比較的弱くても、ＡＬＫ−１を介する有意なシグナル伝達事象を開始させるとして一般に認識されている）が、ＡＬＫ１  ＥＣＤがたとえ、そのような低親和性リガンドと結合しないか、または、そのような低親和性リガンドを阻害しないことがあるとしても、ＡＬＫ１を介してシグナル伝達し得ることを妨げることが予想される。抗体は１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。親和性をこの範囲内に有する抗体は、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０によるシグナル伝達を阻害することが予想される。そのような抗体は好ましくは、ＡＬＫ１へのＢＭＰ９およびＢＭＰ１０の結合を阻害する。注目すべきことに、本明細書中に開示されるデータに基づいて、ＡＬＫ１に対して比較的不良に結合する抗体はＡＬＫ１へのＴＧＦβ結合を阻害することができ、一方、より強固な結合性リガンド（例えば、ＧＤＦ５またはＢＭＰ９など）を阻害することができない。本明細書中に記載される抗体は好ましくは、分子生物学の技術を使用して構築されている核酸から発現される抗体を意味する組換え抗体であり、例えば、単鎖抗体から開発されるヒト化抗体または完全ヒト抗体などである。Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体および単鎖抗体もまた、用語「組換え抗体」の範囲内に含まれる。抗体はまた、（ヒト型またはマウス型、ならびに、トランスジェニックマウスから得られるヒト抗体を含めて）ポリクローナル抗体または非組換えのモノクローナル抗体であり得る。抗体およびＡＬＫ１−ＥＣＤポリペプチドは、実質的にパイロジェン非含有である���薬調製物として配合することができる。医薬調製物は全身的送達（例えば、静脈内送達、動脈内送達または皮下送達）または局所的送達（例えば、眼への局所的送達）のために調製することができる。国際公開ＷＯ２００７／０４０９１２に記載される抗体が、本明細書中に記載される様々な方法において有用であり得る。
【００１５】
特定の局面において、本開示は、哺乳動物における血管新生を、一般的または具体的のどちらであっても本明細書中に記載される、ＡＬＫ１ポリペプチドに結合する抗体の効果的な量を哺乳動物に投与することによって阻害するための方法を提供する。この目的のために有用な抗体はＡＬＫ１の細胞外ドメインに結合することができ（例えば、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるポリペプチドに結合することができ）、または、ＡＬＫ１の別の部分に結合することができる。抗体は、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるポリペプチドに結合することができ、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する。抗体は５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができ、必要な場合には、５×１０−８〜１×１０−１０の間のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管新生を阻害することができる。ＧＤＦ５、ＧＤＦ６またはＧＤＦ７によって媒介されるシグナル伝達をＢＭＰ９またはＢＭＰ１０によるシグナル伝達に対して選択的に阻害する抗体を、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６またはＧＤＦ７が局在化する組織（主として、骨または関節）において生じる血管新生の選択的阻害剤として使用することができる。抗体は１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合することができる。抗体は、ＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害することができ、この場合、ＡＬＫ１リガンドが、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される。抗ＡＬＫ１抗体は（例えば、眼に）局所送達することができ、または、全身送達することができる（例えば、静脈内、動脈内または皮下）。特定の実施形態において、本開示は、哺乳動物の眼における血管新生を、抗ＡＬＫ１抗体を投与することによって阻害するための方法を提供する。別の特定の実施形態において、本開示は、多発性骨髄腫の患者を処置するための方法を提供する。特定の実施形態において、本開示は、血管新生を、多数の血管新生促進（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦおよび／またはＦＧＦなど）の結果としての病理学的血管新生に関連する障害において阻害するための方法を提供する。
【００１６】
特定の局面において、本開示は、本明細書中に開示されるＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を提供する。何らかの特定の機構にとらわれることを望まないが、ＡＬＫ１リガンドに結合する抗体は、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドと事実上類似する効果を有することが予想される。これは、両方のタイプの薬剤が受容体そのものよりもリガンドに結合するからである。特定の実施形態において、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択されるリガンドに結合する。抗体は５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。抗体は、ＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管新生の阻害のために選択することができる。ＣＡＭアッセイが、望ましい抗体を選択するための適切なアッセイ系である。そのような抗体は好ましくは組換え抗体であり、実質的にパイロジェン非含有である医薬調製物として配合することができる。医薬調製物は全身的送達（例えば、静脈内送達、動脈内送達または皮下送達）または局所的送達（例えば、眼への局所的送達）のために調製することができる。
【００１７】
特定の局面において、本開示は、ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を提供し、この場合、ＡＬＫ１リガンドが、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される。抗体は１×１０−１０Ｍ未満のＫＤによりＡＬＫ１リガンドに結合することができる。そのような抗体は好ましくは組換え抗体であり、実質的にパイロジェン非含有である医薬調製物として配合することができる。医薬調製物は全身的送達（例えば、静脈内送達、動脈内送達または皮下送達）または局所的送達（例えば、眼への局所的送達）のために調製することができる。
【００１８】
特定の局面において本開示は、血管新生を哺乳動物において阻害するための方法であって、ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体の効果的な量を哺乳動物に投与することを含み、ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される方法を提供する。抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管新生を阻害することができる。
【００１９】
ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７を含めて、ＢＭＰ／ＧＤＦファミリーのメンバーは、機能的なシグナル伝達複合体を形成するためにＩ型受容体およびＩＩ型受容体に結合する。これらの受容体のための結合部位は異なる。したがって、特定の実施形態において、ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのリガンドを阻害する抗体は、このリガンドのＩ型受容体結合部位またはその近くで結合する抗体である。
【００２０】
特定の局面において、本開示は、哺乳動物における血管新生を、本明細書中に開示されるＡＬＫ１シグナル伝達系の他の阻害剤を投与することによって阻害するための方法を提供する。そのような阻害剤には、ＡＬＫ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０の産生を低下させる核酸（例えば、アンチセンス構築物またはＲＮＡｉ構築物）が含まれ得る。様々な親和性結合試薬もまた使用することができ、例えば、アプタマー、ランダムペプチド、選択された標的への結合を可能にするために改変され得るタンパク質骨格物（そのような骨格物の例には、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）およびＦＮＩＩＩドメインが含まれる）などを使用することができる；それぞれの場合において、親和性結合試薬が、ＡＬＫ１−リガンドの相互作用を乱すことによるか、または、結合後に生じるシグナル伝達を阻害することによるかのどちらであっても、本明細書中に開示されるＡＬＫ１調節系を乱す能力について選択される。
【００２１】
さらなる実施形態において、本開示は、ＡＬＫ１調節系の調節因子としてのＤＡＮの役割を記載する。本明細書中に示されるように、ＤＡＮはＧＤＦ５群のリガンドに結合するが、ＢＭＰ９群のリガンドには結合することができない。したがって、ＤＡＮは、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０によって媒介される血管新生ではなく、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６またはＧＤＦ７によって媒介される血管新生を阻害することが予想される。したがって、ＤＡＮを、ＧＤＦ５群のタンパク質が主として発現される骨または関節における血管新生を阻害するための選択的薬剤として使用することができる。したがって、特定の実施形態において、本開示は、関節リウマチ、および、骨または関節を伴うガン（例えば、多発性骨髄腫および骨転移物）を含めて、骨または関節での血管新生の状況における抗血管新生剤として使用されるＤＡＮタンパク質を提供する。ＤＡＮタンパク質は一般には、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０に対する比較的不良な結合を有しながら、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する。ＤＡＮタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸１７〜アミノ酸１８０（成熟型ヒトＤＡＮ）または配列番号１０のアミノ酸２１〜アミノ酸１２５（ＤＡＮの保存されたシステインノットドメイン）に対応するアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または、１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ＤＡＮタンパク質はまた、配列番号１１のヌクレオチド１５３〜ヌクレオチド４６７に対して、または、同じコード配列を有する、配列番号１１のヌクレオチド１５３〜ヌクレオチド４６７の改変体（「サイレント」改変体、例えば、１つまたは複数の変化をトリプレットコード内のゆらぎ位置に含有する改変体など）に対して、あるいは、配列番号１１のヌクレオチド９３〜ヌクレオチド６３５またはそのサイレント改変体に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでその相補体がハイブリダイゼーションする配列を含む核酸によってコードされ得る。特定の局面において、ＤＡＮタンパク質は融合タンパク質であり、例えば、Ｆｃ融合タンパク質などである。ＤＡＮは、（骨または関節に位置する腫瘍、例えば、多発性骨髄腫および骨転移物などを含めて）骨および関節における血管新生を阻害するために特に有用であることが予想される一方で、ＤＡＮはまた、他の状況において、例えば、どこかほかのところに位置する腫瘍、または、眼において有用であり得る。
【００２２】
特定の局面において、本開示は、関節リウマチを哺乳動物において処置するための方法であって、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体（ここで、ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される）；配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される薬剤の効果的な量を、関節リウマチを有する哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
特定の局面において、本開示は、腫瘍を哺乳動物において処置するための方法を提供する。そのような方法は、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質（例えば、ＡＬＫ１−Ｆｃ）；ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体（ここで、ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される）；配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される薬剤の効果的な量を、腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含むことができる。方法はさらに、血管新生を阻害する第２の薬剤を投与することを含むことができる。腫瘍は、骨に関連する腫瘍、例えば、白血病、骨髄腫瘍、多発性骨髄腫または骨転移物（例えば、乳ガンまたは前立腺ガンに一般に関連する骨転移物など）などであり得る。腫瘍は、黒色腫、肺ガン腫瘍、膵臓腫瘍（例えば、膵臓の内分泌組織の腫瘍）または乳ガン（例えば、原発性乳ガンまたは転移性乳ガン）であり得る。乳ガンはエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）またはエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）であり得る。腫瘍はまた、多数の血管新生促進因子を利用する腫瘍、例えば、抗ＶＥＧＦ治療に対して抵抗性である腫瘍などであり得る。
【００２４】
特定の局面において、本開示は眼用配合物を提供する。そのような配合物は、ＡＬＫ１
ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体（ここで、ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される）；配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される薬剤を含むことができる。
【００２５】
特定の局面において、本開示は、血管新生に関係づけられる眼の疾患を処置するための方法を提供する。そのような方法は、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質；ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体（ここで、ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される）；配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；およびＤＡＮポリペプチドからなる群から選択される薬剤の効果的な量を含む医薬配合物を全身投与するか、または、前記眼に投与することを含むことができる。
【００２６】
それぞれの場合において、本明細書中に記載される薬剤は、血管新生を阻害する第２の薬剤との併用で投与することができる。腫瘍の血管新生を阻害することが望ましい場合、薬剤は、抗ガン効果を有する第２の薬剤との併用で投与することができ、例えば、化学療法剤または生物学的抗ガン剤などとの併用で投与することができる。
【００２７】
本開示はまた、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む眼用医薬配合物であって、そのようなポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、かつ、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＧＤＦ５、ＧＤＦ７およびＢＭＰ９に結合し、また、１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する眼用医薬配合物を提供する。１つの実施形態において、融合タンパク質は配列番号３の配列を有する。１つの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１に由来する。１つの実施形態において、融合タンパク質は、哺乳動物細胞株における配列番号４の核酸の発現によって産生される。１つの実施形態において、細胞株はチャイニーズハムスター卵巣細胞株である。配合物はさらに、下記の医薬品の１つまたは複数を含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブまたはグルココルチコイド。１つの実施形態において、配合物は実質的にパイロジェン非含有である。
【００２８】
本出願はまた、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を含む眼用医薬配合物を提供する。１つの実施形態において、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管新生を阻害する。１つの実施形態において、抗体は５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。別の実施形態において、抗体は１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。１つの実施形態において、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０によって刺激される血管新生を阻害する。配合物はさらに、下記の医薬品の１つまたは複数を含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブまたはグルココルチコイド。１つの実施形態において、配合物は実質的にパイロジェン非含有である。
【００２９】
特定の局面において、本開示は、本明細書中に開示されるＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１へのこのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を含む眼用医薬配合物を提供する。１つの実施形態において、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択されるリガンドに結合する。抗体は５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１リガンドに結合することができる。抗体は、ＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管新生の阻害のために選択することができる。ＣＡＭアッセイが、望ましい抗体を選択するための適切なアッセイ系である。そのような抗体は好ましくは組換え抗体である。配合物はさらに、下記の医薬品の１つまたは複数を含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブまたはグルココルチコイド。１つの実施形態において、配合物は実質的にパイロジェン非含有である。
【００３０】
本出願はまた、血管新生に関係づけられる眼の疾患を処置する方法であって、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含み、かつ、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＧＤＦ５、ＧＤＦ７およびＢＭＰ９に結合し、また、１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する眼用医薬配合物を前記眼に投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態において、融合タンパク質は配列番号３の配列を有する。１つの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１に由来する。１つの実施形態において、融合タンパク質は、哺乳動物細胞株における配列番号４の核酸の発現によって産生される。１つの実施形態において、細胞株はチャイニーズハムスター卵巣細胞株である。配合物はさらに、下記の医薬品の１つまたは複数を含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブまたはグルココルチコイド。１つの実施形態において、配合物は実質的にパイロジェン非含有である。
【００３１】
本出願はまた、血管新生に関係づけられる眼の疾患を処置する方法であって、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体を含む眼用医薬配合物を前記眼に投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態において、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドによって刺激される血管新生を阻害する。１つの実施形態において、抗体は５×１０−８Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。別の実施形態において、抗体は１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＡＬＫ１ポリペプチドに結合する。１つの実施形態において、抗体は、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０によって刺激される血管新生を阻害する。配合物はさらに、下記の医薬品の１つまたは複数を含むことができる：ペガプタニブ、ラニビズマブまたはグルココルチコイド。１つの実施形態において、配合物は実質的にパイロジェン非含有である。
【００３２】
開示された方法の１つの実施形態において、血管新生に関係づけられる疾患が、腫瘍、抗ＶＥＧＦ治療に対して抵抗性である腫瘍、多発性骨髄腫腫瘍、骨、関節に転移しているか、または、骨の炎症を有する腫瘍、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、脈管形成性緑内障および水晶体後線維増殖症からなる群から選択される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬調製物であって、該ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＧＤＦ５、ＧＤＦ７およびＢＭＰ９に結合し、１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合し、そして、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の少なくとも９０％が二量体形態で存在する医薬調製物。
（項目２）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の前記Ｆｃ部分がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分である、項目１に記載の医薬調製物。
（項目３）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の医薬調製物。
（項目４）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が哺乳動物細胞株における配列番号４の核酸の発現によって産生される、項目１に記載の医薬調製物。
（項目５）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株における配列番号４の核酸の発現によって産生される、項目４に記載の医薬調製物。
（項目６）
眼への投与のために好適である医薬調製物である、項目１に記載の医薬調製物。
（項目７）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の少なくとも９５％が二量体形態で存在する、項目１〜６のいずれかに記載の医薬調製物。
（項目８）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の少なくとも９９％が二量体形態で存在する、項目１〜６のいずれかに記載の医薬調製物。
（項目９）
血管新生を阻害する必要性のある哺乳動物において血管新生を阻害するための方法であって、項目１に記載される医薬調製物の効果的な量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
（項目１０）
腫瘍を処置する必要性のある哺乳動物において腫瘍を処置するための方法であって、項目１に記載される医薬調製物の効果的な量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
（項目１１）
血管新生に関連する眼の障害を処置する必要性のある哺乳動物において該障害を処置する方法であって、項目１に記載される医薬調製物の効果的な量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
（項目１２）
関節リウマチを処置する必要性のある哺乳動物において関節リウマチを処置するための方法であって、項目１に記載される医薬調製物の効果的な量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
（項目１３）
血管新生を阻害する第２の薬剤を投与することをさらに含む、項目９〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
周皮細胞被覆の増大を促進させる必要性のある哺乳動物の血管新生した組織において、周皮細胞被覆を増大させる方法であって、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質の効果的な量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
（項目１５）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ここで、該ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、そして、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸３４〜アミノ酸９５に対応するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤが、配列番号２のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２８５に対して、または、同じアミノ酸配列をコードする、配列番号２のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２８５の改変体に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の少なくとも９０％が二量体形態である医薬調製物で投与される、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤ融合タンパク質が眼に静脈内送達または局所送達される、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
血管新生を阻害する第２の薬剤を投与することをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目２４）
前記脈管形成した組織が、前記哺乳動物の眼、腫瘍、骨および関節からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目２５）
前記哺乳動物が、網膜血管系における周皮細胞被覆の喪失によって特徴づけられる糖尿病性網膜症または他の網膜障害を有する、項目１４に記載の方法。
（項目２６）
前記哺乳動物が、黒色腫、肺腫瘍、多発性骨髄腫および乳ガンからなる群から選択される腫瘍を有する、項目１４に記載の方法。
（項目２７）
前記哺乳動物が膵臓腫瘍を有する、項目１４に記載の方法。
（項目２８）
前記哺乳動物が膵臓の内分泌組織の腫瘍を有する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
周皮細胞被覆の増大を促進させる必要性のある哺乳動物の脈管形成した組織において、周皮細胞被覆の増大を促進させる方法であって、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体の効果的な量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
（項目３０）
前記抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤで前記ＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで前記ＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記抗体がＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害し、ここで、該ＡＬＫ１リガンドが、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記抗体が静脈内送達される、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
血管新生を阻害する第２の薬剤を投与することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記脈管形成した組織が、前記哺乳動物の眼、腫瘍、骨および関節からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
前記哺乳動物が、網膜血管系における周皮細胞被覆の喪失によって特徴づけられる糖尿病性網膜症または他の網膜障害を有する、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
前記哺乳動物が、黒色腫、肺腫瘍、多発性骨髄腫および乳ガンからなる群から選択される腫瘍を有する、項目２９に記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳動物が膵臓腫瘍を有する、項目２９に記載の方法。
（項目３９）
前記哺乳動物が膵臓の内分泌組織の腫瘍を有する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
腫瘍を哺乳動物において処置するための方法であって、
（ａ）ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質；
（ｂ）ＡＬＫ１リガンドに結合し、かつ、ＡＬＫ１への該ＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体であって、該ＡＬＫ１リガンドが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、抗体；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８からなるＡＬＫ１ポリペプチドに結合し、かつ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドの結合を阻害する抗体；および
（ｄ）ＤＡＮポリペプチド
からなる群から選択される薬剤の効果的な量を、腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含み、
ここで、該腫瘍が、黒色腫、多発性骨髄腫、骨に関連する腫瘍、骨に転移している腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍および乳ガンからなる群から選択される、方法。
（項目４１）
前記ＡＬＫ−１  ＥＣＤタンパク質がＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、そして、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号３の配列を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸３４〜アミノ酸９５に対応するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４６）
前記ＡＬＫ１  ＥＣＤが、配列番号２のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２８５に対して、または、同じコード配列を有する、配列番号２のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２８５の改変体に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションした核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４７）
（ｂ）の抗体が５×１０−８Ｍ未満のＫＤで前記ＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、項目４０に記載の方法。
（項目４８）
（ｂ）の抗体が１×１０−１０Ｍ未満のＫＤで前記ＡＬＫ１ポリペプチドに結合する、項目４０に記載の方法。
（項目４９）
（ｂ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドにより刺激される血管新生を阻害する、項目４０に記載の方法。
（項目５０）
（ｂ）の抗体がＡＬＫ１リガンドへのＡＬＫ１の結合を阻害し、ここで、該ＡＬＫ１リガンドが、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目５１）
（ｃ）の抗体が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドにより刺激される血管新生を阻害する、項目４０に記載の方法。
（項目５２）
（ｃ）の抗体が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０からなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ１リガンドにより刺激される血管新生を阻害する、項目４０に記載の方法。
（項目５３）
前記ＤＡＮタンパク質がＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質である、項目４０に記載の方法。
（項目５４）
前記ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１０のアミノ酸２１〜アミノ酸１２５の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され、そして、該ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が１×１０−６よりも大きいＫＤでＴＧＦβ−１に結合する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ＤＡＮタンパク質が、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７からなる群から選択される１つまたは複数のＡＬＫ１リガンドに結合する、項目４０に記載の方法。
（項目５６）
前記ＤＡＮタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸１７〜アミノ酸１８０に対応するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目４０に記載の方法。
（項目５７）
前記ＤＡＮタンパク質が、配列番号１１のヌクレオチド１５３〜ヌクレオチド４６７に対して、または、同じコード配列を有する、配列番号１１のヌクレオチド１５３〜ヌクレオチド４６７の改変体に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、項目４０に記載の方法。
（項目５８）
前記薬剤が静脈内送達される、項目４０に記載の方法。
（項目５９）
血管新生を阻害する第２の薬剤を投与することをさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目６０）
前記腫瘍が、黒色腫、肺腫瘍、多発性骨髄腫、膵臓腫瘍および乳ガンからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１はヒトアクチビン様キナーゼ１（ＡＬＫ１）に対するアミノ酸配列（配列番号１）を示す。一重下線は、予測される細胞外ドメインを示す。二重下線は細胞内ドメインを示す。シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインには、下線が引かれていない。
【図２】図２はヒトＡＬＫ１のｃＤＮＡの核酸配列（配列番号２）を示す。コード配列には、下線が引かれる。細胞外ドメインをコードする部分には、二重下線が引かれる。
【図３】図３は、ＦｃドメインへのヒトＡＬＫ１の細胞外ドメインの融合の一例（配列番号３）を示す。ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質は、ヒトＡＬＫ１タンパク質のアミノ酸２２〜アミノ酸１２０をリンカー（下線部）およびＩｇＧ１のＦｃ領域に対してＣ末端で融合されて含む。
【図４】図４は、配列番号３のｈＡＬＫ１−Ｆｃポリペプチドを発現させるための核酸配列を示す。コードされるアミノ酸配列もまた示される。リーダー配列が、Ａｓｐ２２が分泌タンパク質のＮ末端アミノ酸であるように切断される。
【図５】図５は、内皮細胞チューブ形成アッセイにおけるマウスＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ」）およびヒトＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＡＣＥ」）の抗血管新生効果を示す。ＲＡＰおよびＡＣＥのすべての濃度が、内皮細胞成長補充物（ＥＣＧＦ）に対する応答におけるチューブ形成のレベルを陽性コントロール（エンドスタチン）よりも大きい程度に低下させた。
【図６】図６は、ヒヨコ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおけるＧＤＦ７の血管新生効果を示す。ＧＤＦ７の効果はＶＥＧＦの効果に匹敵する。
【図７】図７は、ＣＡＭアッセイにおけるヒトＡＬＫ１−Ｆｃ融合物の抗血管新生効果を示す。ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＧＤＦ７によって刺激される血管新生を阻害する。
【図８】図８は、マウスＡＬＫ１−Ｆｃ（ｍＡＬＫ１−Ｆｃ）、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ、市販の抗ＡＬＫ１モノクローナル抗体（抗ＡＬＫ１ｍＡｂ）および市販の中和抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の比較のための抗血管新生効果を示す。ＡＬＫ１−Ｆｃ構築物の抗血管新生効果が抗ＶＥＧＦ抗体の効果に匹敵する。
【図９】図９は、インビボにおけるｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦ抗体の抗血管新生効果を示す。ｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦは、マウス角膜マイクロポケットアッセイによって測定されるとき、眼における血管新生に対する同程度の効果を有した。
【図１０】図１０は、関節リウマチの、マウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるＡＬＫ１−Ｆｃの効果を示す。グラフは、コラーゲン誘導のオスのＤＢＡ／１関節炎マウスにおいて４２日の観察期間の期間中に求められる平均での群の関節炎スコアを示す。ＲＡＰ−０４１はｍＡＬＫ１−Ｆｃである。Ａｖａｓｔｉｎ（商標）は抗ＶＥＧＦ抗体のベバシズマブである。
【図１１】図１１は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２  １０／３００  ＧＬサイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）による、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ（配列番号３）、および、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＹ）から得られるｈＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の分離を示す。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓの物質は、グラフの左側でのピークによって示されるように、およそ１３％の凝集したタンパク質、ならびに、いくつかのより低分子量の化学種を含有する。配列番号３の物質は、９９％を越える割合で、適切な分子サイズの二量体から構成される。
【図１２】図１２は、ルシフェラーゼを発現するＬｅｗｉｓ肺ガン（ＬＬ／２−ｌｕｃ）細胞からの蛍光シグナルをＰＢＳ処理マウス（丸）およびｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理マウス（三角）において示す。腫瘍細胞を尾静脈に注入し、処理（ＰＢＳまたは１０ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−ＦｃのＩＰ、週２回）を細胞投与当日に開始した。ＰＢＳ処理マウスを、瀕死であるとして２２日目に屠殺した。処理群およびコントロール群はそれぞれが７匹の動物からなった（ｎ＝７）。
【図１３】図１３は、ＡＬＫ１およびＢＭＰ９の発現のレベルを膵臓の内分泌腫瘍のＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスモデルにおける腫瘍発達の様々な段階において示す。ＡＬＫ１の発現が最大血管新生活性の期間中にピークに達し、一方、ＢＭＰ９の発現が腫瘍発達の期間中を通して増大する。
【図１４】図１４は、腫瘍成長に対するｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理の効果をＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスにおいて示す。マウスを、１０週齢または１２週齢のどちらかで始まる２週間の期間にわたってｍＡＬＫ１−ＦｃまたはコントロールＦｃのどちらかにより処理した（それぞれの場合において、３００マイクログラム／マウス、週２回）。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理は腫瘍成長を完全に停止させる。
【図１５】図１５は、ｍＡＬＫ１−ＦｃまたはコントロールＦｃにより処理されたＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスから得られる腫瘍の血管密度（ＣＤ３１＋細胞）を示す。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理は腫瘍の血管密度をおよそ５０％低下させた。
【図１６】図１６は、ｍＡＬＫ１−ＦｃまたはコントロールＦｃにより処理されたＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスから得られる腫瘍の血管における周皮細胞被覆（ＮＧ２＋細胞対ＣＤ３１＋細胞の比率）を示す。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理は周皮細胞被覆をおよそ１００％増大させた。
【図１７】図１７は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ＥＲ−の乳ガン細胞株に由来する細胞株）を使用する同所異種移植片モデルに対するｍＡＬＫ１−Ｆｃの効果を示す。３０ｍｇ／ｋｇの用量において、ｍＡＬＫ１−Ｆｃは異種移植片腫瘍に対する有意な成長遅延効果を有する。
【図１８】図１８は、ＭＣＦ７細胞株（ＥＲ＋の乳ガン細胞株に由来する細胞株）を使用する同所異種移植片モデルに対するｈＡＬＫ１−Ｆｃの効果を示す。１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの用量において、ｈＡＬＫ１−Ｆｃは異種移植片腫瘍に対する有意な成長遅延効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
１．概要
ＡＬＫ１は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドに対するＩ型細胞表面受容体であり、ＡＣＶＲＬ１およびＡＣＶＲＬＫ１としてもまた知られている。ＡＬＫ１は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３およびＢＭＰ−９に対する受容体として関わっている（Ｍａｒｃｈｕｋら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００３；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｊｕｌ  １；２８０（２６）：２５１１１−８）。
【００３５】
マウスにおいて、ＡＬＫ１における機能喪失変異は発達途中の血管系における様々な異常を引き起こす（Ｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００、９７、２６２６−２６３１；Ｕｒｎｅｓｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０００、２６、３２８−３３１）。
【００３６】
ヒトでは、ＡＬＫ１における機能喪失変異は遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ、すなわち、オースラー・ランデュ・ウェーバー症候群）に関連しており、その場合、患者は、動脈から静脈への直接の流れ（連絡）（動静脈短絡）を生じさせる動静脈奇形を、介在する毛細血管床を伴うことなく発達させる。ＨＨＴ患者の典型的な症状には、繰り返される鼻血、胃腸出血、皮膚および粘膜皮膚の毛細血管拡張症、ならびに、肺、脳または肝臓の血管系における動静脈奇形（ＡＶＭ）が含まれる。
【００３７】
Ｄａｖｉｄら（Ｂｌｏｏｄ、２００７  Ｍａｒ  １；１０９（５）：１９５３−６１）およびＳｃｈａｒｐｆｅｎｅｃｋｅｒら（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００７  Ｍａｒ  １５；１２０（Ｐｔ  ６）：９６４−７２）からの最近の刊行物では、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０がＡＬＫ１を内皮細胞において活性化すること、ならびに、この活性化の結果が、内皮細胞の増殖および遊走を阻害することであると結論される。これらの影響は、血管新生促進因子（例えば、ＶＥＧＦなど）の影響とは正反対である。したがって、これらの刊行物は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０はそれら自体が抗血管新生因子であると結論し、さらに、ＡＬＫ１の活性化が抗血管新生効果を有すると結論する。それに反して、本開示は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のアゴニストではなく、むしろ、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のアンタゴニストが抗血管新生効果を有することを明らかにする。
【００３８】
本開示は、ＡＬＫ１の細胞外ドメインの一部を含むポリペプチド（「ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド」）が、ＶＥＧＦ非依存的血管新生と、多数の血管新生因子（これらには、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦが含まれる）によって媒介される血管新生とを含めて、血管新生をインビボにおいて阻害するために使用され得るという発見に関連する。部分的には、本開示は、ＡＬＫ１に対する生理学的な高親和性リガンドの正体を提供し、また、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドが血管新生を阻害することを明らかにする。データは、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドがＴＧＦ−β１への意味のある結合を示さない場合でさえ、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドが抗血管新生効果を発揮し得ることを明らかにする。そのうえ、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＧＤＦ７を含めて、多くの異なる血管新生促進因子によって刺激される血管新生を阻害する。したがって、本開示は、ＡＬＫ１が、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７を含むＧＤＦ５群のリガンドに対する受容体であり、同様に、ＢＭＰ１０を含むＢＭＰ９群のリガンドに対する受容体でもあり、これら２つの群のリガンドに対する親和性が異なるＡＬＫ１調節系の記述を提供する。さらに、本開示は、ＡＬＫ１および上記で記載されるリガンドによって媒介されるシグナル伝達がインビボにおいて血管新生促進性であること、ならびに、この調節系の阻害が強力な抗血管新生効果をインビボにおいて有することを明らかにする。したがって、特定の局面において、本開示は、ＶＥＧＦ依存的血管新生およびＶＥＧＦ非依存的血管新生の両方を含めて、血管新生を阻害することにおいて使用されるＡＬＫ１調節系のアンタゴニスト（その受容体のアンタゴニスト、あるいは、そのリガンドの１つまたは複数のアンタゴニストを含む）を提供する。しかしながら、ＡＬＫ１自身に向けられる抗体は、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドとは異なる効果を有することが予想されることには留意しなければならない。ＡＬＫ１に対する汎中和抗体（すべての強いリガンドおよび弱いリガンドの結合を阻害する抗体）では、ＡＬＫ１を介するそのようなリガンドのシグナル伝達が阻害されることが予想され、しかし、そのようなリガンドが他の受容体（例えば、ＧＤＦ５〜ＧＤＦ７の場合にはＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂおよびＢＭＰＲＩＩ、そして、ＴＧＦβの場合にはＢＭＰ９〜ＢＭＰ１０ならびにＴＢＲＩおよびＴＢＲＩＩ）を介してシグナル伝達し得ることは阻害されないことが予想される。他方で、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、実施例において示される構築物などの構築物については、ＧＤＦ５〜ＧＤＦ７およびＢＭＰ９〜ＢＭＰ１０を含めて、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドが強固に結合するリガンドのすべてを阻害することが予想され、しかし、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドが弱く結合するリガンド（例えば、ＴＧＦ−βなど）には影響を及ぼさない。したがって、ＡＬＫ１に対する汎中和抗体は、ＡＬＫ１を介するＢＭＰ９およびＴＧＦ−βのシグナル伝達を阻止するが、ＡＬＫ１に対する汎中和抗体では、別の受容体を介するＢＭＰ９およびＴＧＦ−βのシグナル伝達は阻止されず、また、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、ＢＭＰ９のシグナル伝達を、すべての受容体（ＡＬＫ１以外の受容体でさえ）を介して阻止し得るが、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドでは、ＴＧＦ−βのシグナル伝達が、どのような受容体を介しても、ＡＬＫ１を介してさえ阻害されないことが予想される。
【００３９】
本明細書中に記載されるタンパク質は、別途具体的に示されない限り、ヒト形態である。これらのタンパク質に対するＧｅｎｂａｎｋ参照は下記の通りである：ヒトＧＤＦ５、ＣＡＡ５６８７４；ヒトＧＤＦ６、ＡＡＨ４３２２２；ヒトＧＤＦ７、ＮＰ＿８７８２４８；ヒトＢＭＰ９、Ｑ９ＵＫ０５；ヒトＢＭＰ１０、Ｏ９５３９３；ヒトＤＡＮ、ＢＡＡ９２２６５。ＡＬＫ１の配列が図１〜図５に示される。
【００４０】
ヒトＤＡＮのアミノ酸配列（配列番号１０）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＡＡ９２２６５）：
【００４１】
【化１】
2015042680.tif 000003
成熟型ＤＡＮタンパク質は、アミノ酸１７〜アミノ酸１８０に対応することが予想される。ＤＡＮの保存されたシステインノットドメインがアミノ酸２１〜アミノ酸１２５（下線部）に対応する。
【００４２】
ヒトＤＡＮのｃＤＮＡ配列（配列番号１１）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＣ０１２０３７）：
【００４３】
【化２】
2015042680.tif 000004
ＤＡＮ前駆体に対するコード配列が核酸９３〜核酸６３５に対応する。成熟型ＤＡＮタンパク質に対するコード配列が核酸１４１〜核酸６３２に対応する。ＤＡＮの保存されたシステインノット部分に対するコード配列が核酸１５３〜核酸４６７に対応する。
【００４４】
本明細書において使用される用語は一般に、本開示の枠内、および、それぞれの用語が使用される特定の状況において、この技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。いくつかの用語が、本明細書中に開示される組成物および方法、ならびに、本明細書中に開示される組成物および方法をいかにして作製および使用するかを記載することにおいてさらなる指針を実施者に提供するために本明細書において議論される。用語のどのような使用であっても、その範囲または意味は、その用語が使用される特定の状況から明らかである。
【００４５】
２．可溶性ＡＬＫ１ポリペプチド
天然に存在するＡＬＫ１タンパク質は膜貫通タンパク質であり、タンパク質の一部が細胞の外側に配置され（細胞外部分）、タンパク質の一部が細胞の内側に配置される（細胞内部分）。本開示の様々な局面は、ＡＬＫ１の細胞外ドメインの一部を含むポリペプチドを包含する。
【００４６】
特定の実施形態において、本開示は「ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド」を提供する。用語「ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸３４〜アミノ酸９５のシステインノット領域、または、システインノット、それに加えて、細胞外ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のさらなるアミノ酸（例えば、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８など）によって例示されるように、何らかのシグナル配列およびシグナル配列のＮ端側の何らかの配列を含むか、または、含まないかのどちらかであっても、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列、あるいは、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインに対して少なくとも３３パーセント同一であり、また、必要な場合には、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインの配列に対して少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または、１００％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、そのようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを示すことが意図される。同様に、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２８５によって、または、そのサイレント改変体によって、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（一般に、そのような条件はこの技術分野において知られており、しかし、例えば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％（ｗ／ｖ）のブロッキング剤、０．１％のＮ−ラウロイルサルコシン、０．３％のＳＤＳにおける６５℃での一晩のハイブリダイゼーション、および、例えば、５×ＳＳＣにおける約６５℃での洗浄を伴う場合がある）のもとでその相補体にハイブリダイゼーションする核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。加えて、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド６４〜ヌクレオチド３８４によって、または、そのサイレント改変体によって、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（一般に、そのような条件はこの技術分野において知られており、しかし、例えば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％（ｗ／ｖ）のブロッキング剤、０．１％のＮ−ラウロイルサルコシン、０．３％のＳＤＳにおける６５℃での一晩のハイブリダイゼーション、および、例えば、５×ＳＳＣにおける約６５℃での洗浄を伴う場合がある）のもとでその相補体にハイブリダイゼーションする核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。したがって、用語「ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド」は、ＡＬＫ１ポリペプチドの単離された細胞外部分、その改変体（これには、例えば、最大でも２つ、３つ、４つ、５つまたは１０のアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８に対応する配列において含む改変体が含まれ、また、最大でも２つ、３つ、４つ、５つまたは１０のアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失を配列番号１のアミノ酸３４〜アミノ酸９５に対応する配列において含む改変体が含まれる）、そのフラグメント、および、前記のいずれかを含む融合タンパク質を包含し、しかし、それぞれの場合において、好ましくは、前記ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドのどれもが、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０の１つまたは複数に対する実質的な親和性を保持する。用語「ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド」は、全長の、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドはどれも含まれないことが明確に意図される。一般に、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、生物学的に妥当な温度、ｐＨレベルおよび浸透圧モル濃度での水溶液において可溶性であるように設計される。
【００４７】
上記で記載されるように、本開示は、天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドに対する指定された程度の配列同一性または配列類似性を共有するＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドを提供する。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を求めるために、配列が、最適な比較目的のためにアラインメントされる（例えば、ギャップを最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入することができ、かつ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）。その後、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸残基が比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められるとき、これらの分子はその位置において同一である（本明細書中で使用されるように、アミノ酸「同一性」はアミノ酸「ホモロジー」と同等である）。２つの配列の間におけるパーセント同一性は、ギャップの数を考慮に入れての配列によって共有される同一位置の数、および、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されなければならないそれぞれのギャップの長さの関数である。
【００４８】
配列の比較、ならびに、２つの配列の間におけるパーセント同一性およびパーセント類似性の決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；ならびに、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【００４９】
１つの実施形態において、２つのアミノ酸配列の間におけるパーセント同一性が、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能である）ＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して求められる。特定の実施形態において、下記のパラメーターがＧＡＰプログラムにおいて使用される：Ｂｌｏｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列、ならびに、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重み、および、１、２、３、４、５または６の長さ重み。さらに別の実施形態において、２つのヌクレオチド配列の間におけるパーセント同一性が、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能である）ＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を使用して求められる。例示的なパラメーターには、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに、４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重み、および、１、２、３、４、５または６の長さ重みの使用が含まれる。別途具体的に示されない限り、２つのアミノ酸配列の間におけるパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列、１０のギャップ重みおよび３の長さ重みを使用するＧＡＰプログラムを使用して決定されることになり、また、そのようなアルゴリズムにより、所望されるパーセント同一性がコンピューター計算できないならば、本明細書中に開示される好適な代替法が選択されるにちがいない。
【００５０】
別の実施形態において、２つのアミノ酸配列の間におけるパーセント同一性が、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長さペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して求められる。
【００５１】
２つのアミノ酸配列の間における最も良い全体的アラインメントを決定するための別の実施形態を、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．、６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、問合わせ配列および対象配列がともにアミノ酸配列である。前記の全域的配列アラインメントの結果がパーセント同一性に関して示される。１つの実施形態において、アミノ酸配列同一性が、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．、６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して行われる。特定の実施形態において、アミノ酸アラインメントのパーセント同一性およびパーセント類似性を計算するために用いられるパラメーターは、行列＝ＰＡＭ１５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティー＝１、結合ペナルティー＝２０、ランダム化群長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー＝５およびギャップサイズペナルティー＝０．０５を含む。
【００５２】
特定の実施形態において、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、天然に存在するＡＬＫ１タンパク質（例えば、配列番号１の配列など）の細胞外部分を含み、好ましくは、ＡＬＫ１細胞外ドメインのリガンド結合部分を含む。特定の実施形態において、可溶性のＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２２〜アミノ酸１１８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、短縮化された細胞外ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１の細胞外部分のアミノ酸配列の少なくとも３０個、４０個または５０個の連続するアミノ酸を含む。
【００５３】
好ましい実施形態において、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０の１つまたは複数に結合する。必要な場合には、ＡＬＫ１ポリペプチドは、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３への実質的な結合を示さない。結合を、精製タンパク質を溶液中または表面プラズモン共鳴システム（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなど）において使用して評価することができる。好ましい可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドは抗血管新生活性を示す。血管新生阻害活性のためのバイオアッセイには、ヒヨコ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、マウス角膜マイクロポケットアッセイ、埋め込まれた腫瘍に対する、単離タンパク質または合成タンパク質を投与することの影響を測定するためのアッセイが含まれる。ＣＡＭアッセイが、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらによって“Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ”、Ｃｅｌｌ、ｖｏｌ．７９（２）、Ｏｃｔ．１、１９９４、ｐｐ．３１５−３２８に記載される。簡単に記載すると、卵黄が損なわれていない３日齢のニワトリ胚が卵から分離され、ペトリ皿に入れられる。３日間のインキュベーションの後、試験されるタンパク質を含有するメチルセルロースディスクが個々の胚のＣＡＭに加えられる。４８時間のインキュベーションの後、胚およびＣＡＭが、内皮成長が阻害されているかどうかを明らかにするために観察される。マウス角膜マイクロポケットアッセイは、増殖因子含有ペレットを、疑われる内皮増殖阻害剤を含有する別のペレットと一緒にマウスの角膜に埋め込むこと、および、角膜に作られる毛細血管のパターンを観察することを伴う。他のアッセイが実施例に記載される。
【００５４】
ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、ＡＬＫ１ポリペプチドの細胞質テールおよび膜貫通領域を除くことによって作製することができる。代替では、膜貫通ドメインを、欠失によって、または、膜貫通ドメインを構成する通常的には疎水性のアミノ酸残基を親水性のアミノ酸残基により置換することによって不活性化することができる。いずれの場合においても、脂質親和性を低下させ、かつ、水溶性を改善する実質的に親水性のヒドロパシープロフィルが創案される。膜貫通ドメインの欠失では、潜在的に免疫原性のエピトープを導入することが避けられるので、膜貫通ドメインの欠失は、親水性アミノ酸残基による置換よりも好ましい。
【００５５】
ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドはさらに、様々なリーダー配列のいずれかをＮ末端に含むことができる。そのような配列は、ペプチドが真核生物システムにおいて発現され、分泌経路に標的化されることを可能にする。例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２年）を参照のこと。代替では、生来型のＡＬＫ１シグナル配列を、細胞からの排出を行わせるために使用することができる。可能なリーダー配列には、生来型、ｔＰａおよびミツバチのメリチンリーダー（それぞれ、配列番号７〜配列番号９）が含まれる。シグナルペプチドのプロセシングは、変数の中でもとりわけ、選ばれたリーダー配列、使用された細胞タイプ、および、培養条件に依存して変化し得る。したがって、配列番号５のＮ末端開始部位を含めて、成熟型ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドについての実際のＮ末端開始部位が、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のどちらかで１アミノ酸〜５アミノ酸ずれることがある。
【００５６】
特定の実施形態において、本開示では、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるようなＡＬＫ１ポリペプチドの特異的な変異が意図される。そのような変異を、１つまたは複数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ結合型またはＮ結合型のグリコシル化部位など）を導入または排除するように選択することができる。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は一般に、細胞の適切なグリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列、すなわち、アスパラギン−Ｘ−トレオニン（またはアスパラギン−Ｘ−セリン）（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変化はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位については）野生型ＡＬＫ１ポリペプチドの配列に対する１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基を付加することによって、あるいは、野生型ＡＬＫ１ポリペプチドの配列に対する１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基による置換によって行うことができる。グリコシル化認識部位の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方における様々なアミノ酸置換またはアミノ酸欠失（ならびに／あるいは、２番目の位置におけるアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ＡＬＫ１ポリペプチド表面における炭水化物成分の数を増大させる別の手段が、グリコシドをＡＬＫ１ポリペプチドに化学的または酵素的にカップリングすることによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジンに、（ｂ）フリーのカルボキシル基に、（ｃ）フリーのスルフヒドリル基（例えば、システインのフリーのスルフヒドリル基など）に、（ｄ）フリーのヒドロキシル基（例えば、セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンのフリーのヒドロキシル基など）に、（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの芳香族残基など）に、または、（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法が、国際公開ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）に、また、ＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１）、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３９６に記載される（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）。ＡＬＫ１ポリペプチド表面に存在する１つまたは複数の炭水化物成分の除去を化学的および／または酵素的に達成することができる。化学的な脱グリコシル化は、例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドを、トリフルオロメタンスルホン酸である化合物、または、同等な化合物にさらすことを伴い得る。この処理では、アミノ酸配列を無傷のままにしながら、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどの糖またはすべての糖の除去がもたらされる。化学的な脱グリコシル化がさらに、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２によって、また、Ｅｄｇｅら（１９８１）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載される。ＡＬＫ１ポリペプチド表面の炭水化物成分の酵素的切断を、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によっ���記載されるような様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。ＡＬＫ１ポリペプチドの配列を、使用される発現システムのタイプに依存して、適するように調節することができる。これは、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞はすべて、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るからである。一般に、ヒトにおいて使用されるＡＬＫ１タンパク質は、適正なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞において発現され、例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株において発現される。だが、他の哺乳動物発現細胞株、操作されたグリコシル化酵素を有する酵母細胞株、および、昆虫細胞が、同様に有用であることが予想される。
【００５７】
本開示ではさらに、変異体、特に、ＡＬＫ１ポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセット、ならびに、短縮変異体を作製する方法が意図される；コンビナトリアル変異体のプールは、機能的な改変体配列を特定するためにとりわけ有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするという目的は、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのどちらかとして作用し得るＡＬＫ１ポリペプチド改変体、あるいは、代替では、これまでにない活性を一緒に有するＡＬＫ１ポリペプチド改変体を作製することであり得る。様々なスクリーニングアッセイが下記で提供され、そのようなアッセイを、改変体を評価するために使用することができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチド改変体を、ＡＬＫ１リガンドに結合する能力、ＡＬＫ１ポリペプチドへのＡＬＫ１リガンドの結合を妨げる能力、または、ＡＬＫ１リガンドによって引き起こされるシグナル伝達を妨害する能力についてスクリーニングすることができる。ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその改変体の活性はまた、細胞に基づくアッセイまたはインビボでのアッセイにおいて試験することができ、特に、実施例において開示されるアッセイのいずれかにおいて試験することができる。
【００５８】
天然に存在するＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外ドメインを含むＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドと比較して選択的な効力または一般に増大した効力を有するコンビナトリアル由来の改変体を作製することができる。同様に、変異誘発により、対応する野生型ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドとは劇的に異なる血清中の半減期を有する改変体を生じさせることができる。例えば、変化させたタンパク質を、タンパク質分解的分解に対して、あるいは、生来的なＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの分解、または、そうでなければ、生来的なＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの排出もしくは不活性化をもたらす他のプロセスに対してより安定またはより不安定のどちらかにすることができる。そのような改変体、および、それらをコードする遺伝子を利用して、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドのレベルを、ＡＬＫ１ポリペプチドの半減期を調節することによって変化させることができる。例えば、短い半減期はより一時的な生物学的効果を生じさせることができ、また、患者体内における組換えＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドのレベルのより厳格な制御を可能にすることができる。Ｆｃ融合タンパク質において、変異を、タンパク質の半減期を変化させるためにリンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において行うことができる。
【００５９】
コンビナトリアルライブラリーを、可能性のあるＡＬＫ１ポリペプチド配列の少なくとも一部をそれぞれが含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重したライブラリーによって作製することができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結し、その結果、縮重した一組の可能性のあるＡＬＫ１ポリペプチドのヌクレオチド配列が個々のポリペプチドとして発現可能であるように、または、代替では、（例えば、ファージディスプレーについては）一組のより大きい融合タンパク質として発現可能であるようにすることができる。
【００６０】
可能性のあるＡＬＫ１  ＥＣＤ改変体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機において行うことができ、その後、合成遺伝子を発現のための適切なベクターに連結することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成はこの技術分野において広く知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。そのような技術が他のタンパク質の導かれた進化において用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７：６３７８−６３８２；ならびに、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【００６１】
代替では、他の形態の変異誘発を利用して、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチド改変体を、例えば、アラニン走査変異誘発などを使用するスクリーニング（Ｒｕｆら（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３）、Ｇｅｎｅ、１３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２−１０８３８；および、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５）によって、リンカー走査変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら（１９９２）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３１６）によって、飽和変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：６１３）によって、ＰＣＲ変異誘発（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１：１１−１９）によって、または、化学的変異誘発などを含めて、ランダム変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；および、Ｇｒｅｅｎｅｒら（１９９４）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、７：３２−３４）によって作製し、ライブラリーから単離することができる。リンカー走査変異誘発が、特に、コンビナトリアル状況では、ＡＬＫ１ポリペプチドの短縮化された（生物活性な）形態を特定するための注目される方法である。
【００６２】
幅広い様々な技術が、点変異および短縮化によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするために、それについて言えば、特定の性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにこの技術分野において知られている。そのような技術は一般に、ＡＬＫ１ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって作製される遺伝子ラブラリーの迅速なスクリーニングのために適合化することができる。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く使用される技術は典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、適切な細胞をベクターの得られたライブラリーにより形質転換すること、および、所望される活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離が容易になる条件のもとで、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。好ましいアッセイには、ＡＬＫ１リガンド結合アッセイおよびリガンド媒介細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。
【００６３】
特定の実施形態において、本開示のＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドはさらに、ＡＬＫ１ポリペプチドにおいて天然に存在する何らかの修飾に加えて、様々な翻訳後修飾を含むことができる。そのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。結果として、修飾されたＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは非アミノ酸エレメントを含有することができ、例えば、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖およびホスファートなどを含有することができる。ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの機能性に対するそのような非アミノ酸エレメントの影響を、他のＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド改変体について本明細書中に記載されるように試験することができる。ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドが、ＡＬＫ１ポリペプチドの発生期形態を切断することによって細胞において産生されるとき、翻訳後プロセシングはまた、タンパク質の正しい折り畳みおよび／または機能のために重要であり得る。種々の細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３など）が、そのような翻訳後活性のための特異的な細胞装置および特徴的な機構を有しており、種々の細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３など）を、ＡＬＫ１ポリペプチドの正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選ぶことができる。
【００６４】
特定の局面において、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの機能的な改変体または修飾された形態には、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの少なくとも一部分と、１つまたは複数の融合ドメインとを有する融合タンパク質が含まれる。そのような融合ドメインの広く知られている例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。融合ドメインは、所望される性質を与えるように選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離のために特に有用である。アフィニティー精製の目的のために、アフィニティークロマトグラフィーのための関連するマトリックス、例えば、グルタチオンコンジュゲート樹脂、アミラーゼコンジュゲート樹脂、および、ニッケルコンジュゲート樹脂またはコバルトコンジュゲート樹脂などが使用される。そのようなマトリックスの多くが「キット」形態で入手可能である：例えば、（ＨＩＳ６）融合パートナーに関して有用なＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）など。別の一例として、融合ドメインを、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの検出を容易にするように選択することができる。そのような検出ドメインの例には、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、特異的な抗体が入手可能である通常の場合には短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。特異的なモノクローナル抗体が容易に入手可能である広く知られているエピトープタグには、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグおよびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。いくつかの場合において、融合ドメインは、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化して、それにより、組換えタンパク質を融合タンパク質から放出することを可能にするプロテアーゼ切断部位（例えば、Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位）を有する。放出されたタンパク質は、その後、続くクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。特定の好ましい実施形態において、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、ＡＬＫ１ポリペプチドをインビボにおいて安定化するドメイン（「スタビライザー」ドメイン）と融合される。「安定化する」とは、血清中の半減期を、低下した分解、腎臓による低下したクリアランス、または、他の薬物動態学効果のためであるかどうかにかかわらず、増大させるどのようなものでも意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、望ましい薬物動態学的性質を幅広い様々なタンパク質に与えることが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンに対する融合は、望ましい性質を与えることができる。選択され得る他のタイプの融合ドメインには、多量体化ドメイン（例えば、二量体化ドメイン、四量体化ドメイン）および機能的ドメインが含まれる。
【００６５】
具体的な一例として、本開示は、Ｆｃドメイン（例えば、配列番号６）に融合されるＡＬＫ１の可溶性の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【００６６】
【化３】
2015042680.tif 000005
必要な場合には、Ｆｃドメインは、１つまたは複数の変異を、例えば、Ａｓｐ−２６５、リシン３２２およびＡｓｎ−４３４などの残基において有する。特定の場合において、これらの変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃγ受容体に結合する低下した能力を有する。他の場合には、これらの変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、ＭＨＣクラスＩに関連づけられるＦｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する増大した能力を有する。
【００６７】
融合タンパク質の異なるエレメントは、所望される機能性と一致する任意の様式で配置され得ることが理解される。例えば、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドを異種ドメインのＣ末端側に置くことができ、または、代替では、異種ドメインをＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドのＣ末端側に置くことができる。ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドドメインおよび異種ドメインは融合タンパク質において隣接する必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列をどちらかのドメインのＣ末端側またはＮ末端側に含むことができ、あるいは、それらのドメインの間に含むことができる。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリンＦｃ領域」または単に「Ｆｃ」の用語は、免疫グロブリン鎖定常領域（好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域）のカルボキシル末端部分またはその一部分を意味することが理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または、５）２つ以上のドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域の組合せを含むことができる。好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを少なくとも含み、好ましくはＣＨ１ドメインを有しない。
【００６９】
１つの実施形態において、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスはＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、γサブクラス２、γサブクラス３またはγサブクラス４）である。免疫グロブリンの他のクラス、すなわち、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択が米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号において詳しく議論される。特定の免疫グロブリンクラスおよび免疫グロブリンサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を、特定の結果を達成するために選ぶことは、この技術分野における技術のレベルの範囲内であると見なされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部分は好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部分と、好ましくは、ＦｃγのＣＨ３ドメイン、または、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれかにおける相同的なドメインの少なくとも一部分とを含む。
【００７０】
さらには、免疫グロブリン重鎖定常領域内におけるアミノ酸の置換または欠失が、本明細書中に開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが意図される。一例が、Ｆｃ受容体に対する低下した親和性を有するＦｃ改変体を作出するために、アミノ酸置換を上流のＣＨ２領域に導入することである（Ｃｏｌｅら（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３）。
【００７１】
特定の実施形態において、本開示は、他のタンパク質および／または他のＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド化学種から単離されるか、あるいは、そうでない場合には、他のタンパク質および／または他のＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド化学種を実質的に含まない（例えば、他のタンパク質および／または他のＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド化学種を少なくとも８０％含まない、少なくとも９０％含まない、少なくとも９５％含まない、少なくとも９６％含まない、少なくとも９７％含まない、少なくとも９８％含まない、または、少なくとも９９％含まない）ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドの単離および／または精製された形態を利用可能にする。ＡＬＫ１ポリペプチドは一般に、組換え核酸からの発現によって産生される。
【００７２】
特定の実施形態において、本開示は、ＡＬＫ１タンパク質の細胞外部分に対するコード配列を含む、可溶性ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態において、本開示はまた、そのような核酸を含む宿主細胞に関連する。宿主細胞は任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本開示のポリペプチドを、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなど）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現システムを使用して）、酵母または哺乳動物細胞において発現させることができる。他の好適な宿主細胞が当業者には知られている。したがって、本開示のいくつかの実施形態はさらに、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドを産生させる方法に関連する。配列番号３に示され、ＣＨＯ細胞において発現されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は強力な抗血管新生活性を有することが立証されている。
【００７３】
ＤＡＮポリペプチド（野生型ＤＡＮの改変体を含む）、および、ＤＡＮタンパク質を含有する融合タンパク質を、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質に関して上記で記載されるように作製することができ、また、特徴づけることができる。
【００７４】
３．ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸
特定の局面において、本開示は、本明細書中に開示されるフラグメント、機能的な改変体および融合タンパク質を含めて、ＡＬＫ１ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド）のいずれかをコードする単離された核酸および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号２は、天然に存在するヒトＡＬＫ１前駆体ポリペプチドをコードし、一方、配列番号４は、ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合されるＡＬＫ１細胞外ドメインの前駆体をコードする。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。そのような核酸はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドを作製するための方法において使用することができ、または、（例えば、アンチセンス治療法、ＲＮＡｉ治療法または遺伝子治療法において）直接の治療剤として使用することができる。
【００７５】
特定の局面において、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする本発明の核酸はさらに、配列番号２または配列番号４の改変体である核酸を含むことが理解される。改変体ヌクレオチド配列には、１つまたは複数のヌクレオチド置換、ヌクレオチド付加またはヌクレオチド欠失によって異なる配列（例えば、対立遺伝子改変体など）が含まれる。
【００７６】
特定の実施形態において、本開示は、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または、１００％同一である単離された核酸配列または組換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号２または配列番号４に対して相補的な核酸配列、および、配列番号２または配列番号４の改変体もまた、本開示の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態において、本開示の核酸配列は単離することができ、および／または、組換えることができ、および／または、異種の核酸配列と融合させることができ、すなわち、ＤＮＡライブラリーにおいて融合させることができる。
【００７７】
他の実施形態において、本開示の核酸にはまた、配列番号２または配列番号４において指定されるヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号４の相補的配列、あるいは、それらのフラグメントに対して非常にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列が含まれる。上記で議論されるように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させる適切なストリンジェンシー条件が様々であり得ることを容易に理解する。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させる適切なストリンジェンシー条件が様々であり得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、その後の、５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度を、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄工程における温度を、室温（約２２℃）における低いストリンジェンシー条件から、約６５℃における高いストリンジェンシー条件にまで増大させることができる。温度および塩の両方を変えることができ、あるいは、温度または塩濃度を、他方の変数を変化させながら、一定に保つことができる。１つの実施形態において、本開示は、室温における２×ＳＳＣでの洗浄が次に続く、室温における６×ＳＳＣの低いストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイゼーションする核酸を提供する。
【００７８】
配列番号２または配列番号４に示されるような核酸配列から遺伝暗号における縮重のために異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が２つ以上のトリプレットによって指定される。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわち、シノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンについてシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じさせることがある。しかしながら、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における変化を引き起こすＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞の間に存在することが予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の（ヌクレオチドの約３％〜５％までの）１つまたは複数のヌクレオチドにおけるこれらの変化が、天然の対立遺伝子変化のために、所与の種の個体の間に存在し得ることを理解する。ありとあらゆるそのようなヌクレオチド変化および生じるアミノ酸多型が本開示の範囲内である。
【００７９】
特定の実施形態において、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に機能的に連結することができる。調節ヌクレオチド配列は一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切である。数多くのタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が様々な宿主細胞についてこの技術分野において知られている。典型的には、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列またはアクチベーター配列が含まれるが、これらに限定されない。この技術分野において知られているような構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターが本開示によって意図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのどちらであってもよい。発現構築物は細胞においてエピソーム（例えば、プラスミドなど）上に存在し得るか、または、発現構築物は染色体に挿入され得る。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選抜を可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子はこの技術分野において広く知られており、使用される宿主細胞とともに変化する。
【００８０】
本明細書中に開示される特定の局面において、本発明の核酸は、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードし、かつ、少なくとも１つの調節配列に機能的に連結されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節配列は、この技術分野において認識されているものであり、ＡＬＫ１ポリペプチドの発現を行わせるために選択される。したがって、調節配列の用語には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントが含まれる。例示的な調節配列が、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載される。例えば、ＤＮＡ配列に機能的に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する幅広い様々な発現制御配列のいずれもが、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの即時初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステムまたはＴＲＣシステム、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が導かれるＴ７プロモーター、ファージλの主要オペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母のα接合因子のプロモーター、バキュロウイルスシステムのポリヘドロンプロモーター、ならびに、原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびに、これらの様々な組合せが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、および／または、発現させられることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることを理解しなければならない。そのうえ、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および、ベクターによってコードされる何らかの他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカーなど）の発現もまた考慮しなければならない。
【００８１】
本開示に含まれる組換え核酸は、クローン化された遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、トリ細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞）または両者のどれかにおける発現のために好適なベクターに連結することによって作製することができる。組換えＡＬＫ１ポリペプチドを産生させるための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、好適なベクターには、下記のタイプのプラスミドが含まれる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなど）における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
【００８２】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの増殖を容易にするための原核生物用の配列と、真核生物細胞において発現される１つまたは複数の真核生物用の転写ユニットとの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇに由来するベクターが、真核生物細胞のトランスフェクションのために好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選抜を容易にするために細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２など）由来の配列により改変される。代替では、ウイルスの誘導体、例えば、ウシパピローマウイルスの誘導体（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バールウイルスの誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来型およびｐ２０５）などを、真核生物細胞におけるタンパク質の一過性発現のために使用することができる。他のウイルス発現システム（レトロウイルス発現システムを含む）の例を遺伝子治療送達システムの記載において下記で見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる様々な方法がこの技術分野において広く知られている。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の好適な発現システム、ならびに、一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）を参照のこと。いくつかの場合において、組換えポリペプチドをバキュロウイルス発現システムの使用によって発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現システムの例には、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１など）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が含まれる。
【００８３】
好ましい実施形態において、ベクターが、本発明のＡＬＫ１ポリペプチドをＣＨＯ細胞において産生させるために設計される；例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）など。明らかであるように、本発明の遺伝子構築物は、本発明のＡＬＫ１ポリペプチドの発現を培養で増殖させられる細胞において生じさせて、例えば、融合タンパク質または改変体タンパク質を含めて、タンパク質を精製のために産生させるために使用することができる。
【００８４】
本開示はまた、本発明のＡＬＫ１ポリペプチドの１つまたは複数に対するコード配列（例えば、配列番号２または配列番号４）を含む組換え遺伝子によりトランスフェクションされた宿主細胞に関連する。宿主細胞は任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本明細書中に開示されるＡＬＫ１ポリペプチドを、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなど）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現システムを使用して）、酵母または哺乳動物細胞において発現させることができる。他の好適な宿主細胞が当業者には知られている。
【００８５】
したがって、本開示はさらに、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドを含めて、本発明のＡＬＫ１ポリペプチドを産生させる方法に関連する。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする発現ベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞を、ＡＬＫ１ポリペプチドの発現が生じることを可能にするための適切な条件のもとで培養することができる。ＡＬＫ１ポリペプチドを分泌させることができ、または、ＡＬＫ１ポリペプチドを含有する細胞および培地の混合物から単離することができる。代替では、ＡＬＫ１ポリペプチドは細胞質または膜画分に保持される場合があり、細胞を回収し、溶解し、その後、タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養のための好適な培地がこの技術分野において知られている。本発明のＡＬＫ１ポリペプチドは、タンパク質を精製することのためにこの技術分野において知られている技術を使用して、細胞培養培地から、宿主細胞から、または、両方から単離することができ、そのような技術には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、ＡＬＫ１ポリペプチドの特定のエピトープに対して特異的な抗体による免疫親和性精製、および、ＡＬＫ１ポリペプチドに融合されたドメインに結合する薬剤によるアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムを、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合物を精製するために使用することができる）が含まれる。好ましい実施形態において、ＡＬＫ１ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。好ましい実施形態において、精製が、例えば、下記の３つ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成される：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製をウイルスろ過および緩衝液交換により完了することができる。
【００８６】
別の実施形態において、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子、例えば、組換えＡＬＫ１ポリペプチドの所望される部分のＮ末端におけるポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などをコードする融合遺伝子は、発現された融合タンパク質を、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することを可能にし得る。その後、精製リーダー配列は続いて、精製されたＡＬＫ１ポリペプチドを提供するためにエンテロキナーゼによる処理によって除くことができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１：１７７、および、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８８：８９７２を参照のこと）。
【００８７】
融合遺伝子を作製するための様々な技術が広く知られている。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡフラグメントを結合することが、連結のための平滑末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着末端を埋めること、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および、酵素による連結を用いて、従来の技術に従って行われる。別の実施形態において、融合遺伝子を、自動化されたＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。代替では、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を作製するために続いてアニーリングされ得る２つの連続する遺伝子フラグメントの間における相補的な突出部を生じさせるアンカープライマーを使用して行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
【００８８】
ＡＬＫ１、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６またはＧＤＦ７のアンタゴニストである核酸化合物のカテゴリーの例には、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物および触媒的核酸構築物が含まれる。核酸化合物は一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖の化合物はまた、鎖の１つまたは反対側が一本鎖である突出した領域または非相補性の領域を含むことができる。一本鎖の化合物は自己相補性の領域を含むことができ、このことは、この化合物が、二重らせん構造の領域を伴ういわゆる「ヘアピン」構造または「ステム−ループ」構造を形成することを意味する。核酸化合物は、全長のＡＬＫ１核酸配列またはリガンド核酸配列の最大でも１０００ヌクレオチド、最大でも５００ヌクレオチド、最大でも２５０ヌクレオチド、最大でも１００ヌクレオチドまたは最大でも５０ヌクレオチド、最大でも３５ヌクレオチド、最大でも３０ヌクレオチド、最大でも２５ヌクレオチド、最大でも２２ヌクレオチド、最大でも２０ヌクレオチド、または、最大でも１８ヌクレオチドからなる領域に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。相補性の領域は好ましくは少なくとも８ヌクレオチドであり、必要な場合には少なくとも１０ヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌクレオチドであり、必要な場合には１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの間である。相補性の領域は、標的転写物のイントロン、コード配列または非コード配列の内部に含まれ得る（例えば、コード配列部分など）。一般に、核酸化合物は長さにおいて約８ヌクレオチドまたは８塩基対〜約５００ヌクレオチドまたは５００塩基対の長さを有し、必要な場合には、長さが約１４ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドである。核酸は、ＤＮＡ（特に、アンチセンスとして使用される場合）、ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。いずれか一方の鎖が、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合、ならびに、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかとして容易に分類することができない修飾された形態を含むことができる。同様に、二本鎖の化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、または、ＲＮＡ：ＲＮＡであり得るし、また、いずれか一方の鎖が、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合、ならびに、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかとして容易に分類することができない修飾された形態を含むことができる。核酸化合物は、骨格（ヌクレオチド間の連結を含めて、天然の核酸における糖−リン酸部分）または塩基部分（天然の核酸のプリン部分またはピリミジン部分）に対する１つまたは複数の修飾を含めて、様々な修飾のいずれかを含むことができる。アンチセンス核酸化合物は好ましくは、長さが約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドであり、また、多くの場合、特性を改善するために、例えば、血清中での安定性、細胞内での安定性、または、化合物が送達されると考えられる場所（例えば、経口送達された化合物の場合には胃、および、吸入された化合物については肺など）における安定性などを改善するために１つまたは複数の修飾を含有する。ＲＮＡｉ構築物の場合には、標的転写物に対して相補的な鎖が一般に、ＲＮＡまたはその修飾物である。反対側の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは任意の他の変形体であり得る。二本鎖または一本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の二重鎖部分は、ダイサーの基質として働く限り、好ましくは、長さにおいて１８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さを有し、必要な場合には、長さにおいて約２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する。触媒的または酵素的な核酸はリボザイムまたはＤＮＡ酵素であり得るし、修飾された形態を同様に含有することができる。核酸化合物は、生理学的条件下で、かつ、ナンセンス制御またはセンス制御がほとんど影響を有しないか、または、全く影響を有しない濃度で細胞と接触したとき、標的の発現を、約５０％、７５％、９０％またはそれ以上阻害することができる。核酸化合物の影響を試験するための好ましい濃度が、１マイクロモル濃度、５マイクロモル濃度および１０マイクロモル濃度である。核酸構築物はまた、例えば、血管新生に対する影響について試験することができる。
【００８９】
野生型ＤＡＮの改変体を含めて、ＤＡＮポリペプチドをコードする核酸、および、ＤＡＮタンパク質を含有する融合タンパク質をコードする核酸を、ＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質をコードする核酸に関して上記で記載されるように作製することができ、また、特徴づけることができる。
【００９０】
４．抗体
本開示の別の局面が、ＡＬＫ１ポリペプチドの細胞外部分と反応し得る抗体、好ましくは、ＡＬＫ１ポリペプチドと特異的に反応し得る抗体に関連する。好ましい実施形態において、そのような抗体は、リガンド（例えば、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ−９またはＢＭＰ−１０など）に対するＡＬＫ１結合を妨害することができる。すなわち、ＡＬＫ１のリガンドに対する抗体は、関連したタンパク質のプロセシングされた成熟型形態に結合するにちがいないことが理解される。本開示はまた、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０に結合し、かつ、そのようなリガンドに対するＡＬＫ１結合を阻害する抗体を提供する。好ましい抗体は、抗血管新生活性を、バイオアッセイにおいて、例えば、ＣＡＭアッセイまたは角膜マイクロポケットアッセイ（上記参照）などにおいて示す。
【００９１】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、完全な抗体、例えば、いずれかのイソ型の完全な抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）を含むことが意図され、また、選択された抗原と反応し得る免疫グロブリンのフラグメントまたはドメインを含む。抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化することができ、フラグメントを、有用性について、および／または、目的とする特異的なエピトープとの相互作用についてスクリーニングすることができる。したがって、この用語には、特定のタンパク質と選択的に反応することができる、抗体分子のタンパク質分解的に切断された部分または組換え調製された部分のセグメントが含まれる。そのようなタンパク質分解的フラグメントおよび／または組換えフラグメントの限定されない例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ならびに、ペプチドリンカーによって結合されるＶ［Ｌ］ドメインおよび／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成するために共有結合または非共有結合により連結することができる。抗体の用語にはまた、抗体および組換え抗体のポリクローナル調製物、モノクローナル調製物または他の精製された調製物が含まれる。用語「組換え抗体」は、分子生物学の技術を使用して構築されている核酸から発現される抗体、または、分子生物学の技術を使用して構築されている核酸から発現される免疫グロブリンの抗原結合ドメインを意味する（例えば、単鎖抗体から開発されるヒト化抗体または完全ヒト抗体など）。単一ドメイン抗体および単鎖抗体もまた、用語「組換え抗体」の範囲に含まれる。
【００９２】
抗体を、この技術分野において知られている様々な方法のいずれかによって作製することができ、そのような方法には、動物への抗原の投与、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する動物への抗原の投与、または、抗体（多くの場合、単鎖抗体または抗体ドメイン）のライブラリーに対する抗原によるスクリーニングが含まれる。抗原結合活性が検出されると、当該タンパク質の関連する部分を、全長のＩｇＧフレームワークを含めて、他の抗体フレームワークにグラフト化することができる。例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはＡＬＫ１リガンドに由来する免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清またはモノクローナル抗体を標準的プロトコルによって作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。哺乳動物、例えば、マウス、ハムスターまたはウサギなどを、ペプチドの免疫原性形態（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチド、または、抗体応答を誘発することができる抗原性フラグメント、または、融合タンパク質）により免疫化することができる。免疫原性をタンパク質またはペプチドに与えるための技術には、キャリアへのコンジュゲート化、または、この技術分野において広く知られている他の技術が含まれる。ＡＬＫ１ポリペプチドの免疫原性部分（好ましくは、細胞外部分）をアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行を血漿または血清における抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを、抗体のレベルを評価するために、免疫原を抗原として用いて使用することができる。
【００９３】
動物をＡＬＫ１ポリペプチドの抗原性調節物により免疫化した後で、抗ＡＬＫ１抗血清を得ることができ、また、所望されるならば、ポリクローナル抗ＡＬＫ１抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から集め、ハイブリドーマ細胞を得るための不死化細胞（例えば、ミエローマ細胞など）と標準的な体細胞融合手順によって融合することができる。そのような技術はこの技術分野において広く知られており、例えば、ハイブリドーマ技術（これは最初、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）によって開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら（１９８３）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、および、ヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、本開示の哺乳動物ＡＬＫ１ポリペプチドと特異的に反応し得る抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。
【００９４】
抗体の用語は、本明細書中で使用される場合、本発明のＡＬＫ１ポリペプチドの１つと特異的に同様に反応し得るそのフラグメントを含むことが意図される。抗体を、従来の技術を使用してフラグメント化することができ、フラグメントを、完全な抗体について上記で記載されるのと同じ様式で有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントを、抗体をペプシンで処理することによって作製することができる。得られるＦ（ａｂ）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するために処理して、Ｆａｂフラグメントを作製することができる。本開示の抗体はさらに、ＡＬＫ１ポリペプチドに対する親和性が抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって与えられる、二重特異性で、単鎖のキメラなヒト化分子を含むことが意図される。好ましい実施形態において、抗体は、抗体に結合される標識をさらに含み、検出することができる（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子が可能である）。
【００９５】
特定の好ましい実施形態において、本開示の抗体は組換え抗体であり、特に、ヒト化モノクローナル抗体または完全ヒト組換え抗体である。
【００９６】
形容詞の「と特異的に反応し得る」は、抗体に関連して使用される場合、この技術分野において一般に理解されるように、この抗体が、目的とする抗原（例えば、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはＡＬＫ１リガンド）と、目的としない他の抗原との間において十分に選択的であり、その結果、この抗体が、最低でも、特定のタイプの生物学的サンプルにおける目的とする抗原の存在を検出するために有用であることを意味することが意図される。抗体を用いる特定の方法では、結合におけるより大きな程度の特異性が望ましい場合がある。例えば、存在量が少ない目的とするタンパク質を、目的でない１つまたは複数の、存在量が非常に大きいタンパク質の存在下で検出することにおいて使用される抗体は、この抗体が、より大きな程度の選択性を、目的とする抗原と、他の交差反応物との間において有するならば、より良好に機能し得る。モノクローナル抗体は一般に、（ポリクローナル抗体と比較した場合）、所望される抗原と、交差反応ポリペプチドとを効果的に識別する、より大きい傾向を有する。加えて、目的とする抗原を１つのタイプの生物学的サンプル（例えば、便サンプル）において選択的に特定することで効果的である抗体は、同じ抗原を異なるタイプの生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）において選択的に特定するためには同じように効果的でないことがある。同様に、目的とする抗原を、他の生物学的混入物がない精製されたタンパク質調製物において特定することで効果的である抗体は、目的とする抗原を、精製されていない生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは尿サンプルなど）において特定することでは同じように効果的でないことがある。したがって、好ましい実施形態において、本出願は、抗体の使用のために一般に好まれるサンプルタイプであると考えられるサンプルタイプにおける目的とする抗原に対する立証された親和性を有する抗体を提供する。
【００９７】
抗体：抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす１つの特性が、抗原に対する抗体の親和性である。所望される特異性が種々の親和性の範囲とともに達成され得るが、一般に好ましい抗体は、親和性（解離定数）が、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９またはそれ以下である。ＡＬＫ１に対するＴＧＦβの見かけ上低い結合親和性を考えると、多くの抗ＡＬＫ１抗体がＴＧＦβ結合を阻害することが予想される。しかしながら、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７のリガンド群はおよそ５×１０−８ＭのＫＤで結合し、ＢＭＰ９リガンド、ＢＭＰ１０リガンドはおよそ１×１０−１０ＭのＫＤで結合する。したがって、適切な親和性の抗体を、これらのリガンドのシグナル伝達活性を妨害するために選択することができる。
【００９８】
加えて、望ましい抗体を特定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られる抗体の性質に影響を及ぼすことがある。例えば、特定の治療目的のために使用されるための抗体は好ましくは、特定の細胞タイプを標的とすることができる。したがって、このタイプの抗体を得るためには、目的とする抗原を発現する細胞に結合する抗体について（例えば、蛍光活性化細胞分取によって）スクリーニングすることが望ましい場合がある。同様に、抗体が、溶液中の抗原と結合するために使用されることになるならば、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。様々な異なる技術が、特に望ましい抗体を特定するために抗体：抗原相互作用を試験することのために利用可能である。そのような技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａ−ｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）の常磁性ビーズシステム）、ウエスタンブロット、免疫沈殿アッセイおよび免疫組織化学が含まれる。
【００９９】
５．抗体およびＦｃ融合タンパク質における変化
本出願はさらに、操作されたＦｃ領域または変化型Ｆｃ領域を有する抗体、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。そのような抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、エフェクター機能を調節することにおいて、例えば、抗原依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）などを調節することにおいて有用であり得る。加えて、修飾は、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改善することができる。抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列改変体が、適切なヌクレオチド変化をＤＮＡに導入することによって、または、ペプチド合成によって調製される。そのような改変体は、例えば、本明細書中に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列の内部からの残基の欠失、ならびに／または、本明細書中に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列の内部への残基の挿入、ならびに／または、本明細書中に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列の内部における残基の置換を含む。最終的な構築物が所望の特性を有するという条件で、欠失、挿入および置換の任意の組合せが、最終的な構築物に到達するために行われる。アミノ酸変化はまた、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセスを変化させることがある（例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させることなど）。
【０１００】
低下したエフェクター機能を有する抗体およびＦｃ融合タンパク質を、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅらによって記載されるＡｌａ−Ａｌａ変異（これに限定されない）を含めて、アミノ酸配列における変化を導入することによって作製することができる（国際公開ＷＯ９４／２８０２７および同ＷＯ９８／４７５３１を参照のこと；Ｘｕら、２０００、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００；１６−２６もまた参照のこと）。したがって、特定の実施形態において、Ａｌａ−Ａｌａ変異を含めて、変異を定常領域内に有する本開示の抗体およびＦｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を低下させるために、または、エフェクター機能を無効にするために使用することができる。これらの実施形態によれば、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位におけるアラニンへの変異、または、２３５位におけるアラニンへの変異、または、それらの組合せを含むことができる。１つの実施形態において、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、Ａｌａ−Ａｌａ変異により、２３４位におけるフェニルアラニンからアラニンへの変異（単数または複数）、および／または、２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異が記述されるＩｇＧ４フレームワークを含む。別の実施形態において、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、Ａｌａ−Ａｌａ変異により、２３４位におけるロイシンからアラニンへの変異（単数または複数）、および／または、２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異が記述されるＩｇＧ１フレームワークを含む。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＣＨ２ドメインにおける点変異Ｋ３２２Ａを含めて、他の変異を代替として、または、加えて有することができる（Ｈｅｚａｒｅｈら、２００１、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１６１−８）。
【０１０１】
特定の実施形態において、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を強化するために、または、補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を阻害するために、そのどちらかで改変することができる。調節されたＣＤＣ活性を、１つまたは複数のアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸挿入をＦｃ領域において導入することによって達成することができる（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照のこと）。代替として、または、加えて、システイン残基（１つまたは複数）をＦｃ領域において導入することができ、それにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして作製されるホモ二量体抗体は、改善または低下した内部移行能力、および／あるいは、増大または低下した補体媒介細胞殺傷を有することができる。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）、および、Ｓｈｏｐｅｓ、Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）、国際公開ＷＯ９９／５１６４２、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号、ならびに、国際公開ＷＯ９４／２９３５１を参照のこと。
【０１０２】
６．血管新生、周皮細胞被覆および特定の障害を調節するための方法および組成物
本開示は、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質など）、ＤＡＮタンパク質（例えば、ＤＡＮ−Ｆｃ融合タンパク質など）、または、本明細書中に開示される抗体（例えば、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０またはＡＬＫ１のＥＣＤに対する抗体など）、または、前記のいずれかの核酸アンタゴニスト（例えば、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ）（これらは以降、まとめて、「治療剤」として示される）の効果的な量を対象に投与することによって、血管新生を哺乳動物において阻害し、および／または、周皮細胞被覆を哺乳動物において増大させる方法を提供する。示されるデータは、本明細書中に開示される抗血管新生治療剤が、哺乳動物の眼における血管新生を阻害するために使用され得ることを示している。これらの治療剤はまた、骨および関節における血管新生、ならびに、腫瘍における血管新生、特に、骨および関節に関連する腫瘍における血管新生を阻害することにおいて有用であることが予想される。
【０１０３】
血管新生関連疾患には、血管新生依存的ガン、これには、例えば、固形腫瘍、血行性腫瘍（例えば、白血病など）および腫瘍転移物が含まれる；良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫；関節リウマチ；乾癬；ルベオーシス；オースラー・ウェバー症候群；心筋性血管新生；プラーク脈管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；および血管線維腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
特に、本開示のポリペプチド治療剤は、ガン（腫瘍）を処置または防止するために有用であり、特に、成長を支えるために血管新生プロセスに頼ることが知られているようなガンを処置または防止するために有用である。ほとんどの抗血管新生剤とは異なり、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドは、多数の因子によって刺激される血管新生に影響を及ぼす。このことは、ガンにおいて、すなわち、ガンがしばしば、腫瘍の血管新生を支える多数の因子を獲得する場合において非常に関係がある。したがって、本明細書中に開示される治療剤は、１つだけの血管新生因子を標的とする薬物（例えば、ＶＥＧＦを標的とするベバシズマブ）による処置に対して抵抗性である腫瘍を処置することにおいて特に効果的である。本明細書中で明らかにされるように、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、黒色腫、肺ガン、膵臓ガン（例えば、膵臓の内分泌組織の腫瘍）、多発性骨髄腫および乳ガン（例えば、原発性乳ガンまたは転移性乳ガン；エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）またはエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−））の病理学的影響を軽減させることにおいて効果的である。
【０１０５】
多発性骨髄腫は、重要な血管新生成分を含むガンとして広く認識される。したがって、本明細書中に開示されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および他の治療剤が、多発性骨髄腫、および、骨に関連する他の腫瘍を処置することにおいて有用であることが予想される。本明細書中で明らかにされるように、本明細書中に開示される治療剤は、多発性骨髄腫に関連する骨損傷を緩和するために使用することができ、したがって、他の腫瘍（例えば、乳腫瘍または前立腺腫瘍など）の骨転移に関連する骨損傷を緩和するために使用することができる。本明細書中で記されるように、ＧＤＦ５〜ＧＤＦ７のリガンドが骨において非常に発現しており、また、何らかの特定の機構に限定されることを望まないが、これらのリガンドの妨害は、骨における腫瘍発達のために要求されるプロセスを中断させるかもしれない。
【０１０６】
そのような方法の特定の実施形態において、１つまたは複数のポリペプチド治療剤を一緒に（同時に）、または、異なる時間で（連続的に）投与することができる。加えて、ポリペプチド治療剤は、ガンを処置するための、または、血管新生を阻害するための別のタイプの化合物とともに投与することができる。
【０１０７】
特定の実施形態において、本開示の本発明の方法は単独で使用することができる。代替では、本発明の方法は、増殖性障害（例えば、腫瘍）の処置または防止に向けられる他の従来的な抗ガン治療法との組合せで使用することができる。例えば、そのような方法は、予防的なガン防止、手術後におけるガンの再発および転移の防止において使用することができ、また、他の従来的なガン治療の補助として使用することができる。本開示では、従来的なガン治療（例えば、化学療法、放射線治療、光療法、免疫療法および手術）の有効性が本発明のポリペプチド治療剤の使用により高まり得ることが認識される。
【０１０８】
広範囲の一連の従来的化合物は、抗新生物活性を有することが示されている。これらの化合物は、固形腫瘍を小さくするために、または、転移およびさらなる成長を防止するために、または、白血病もしくは骨髄悪性腫瘍における悪性細胞の数を減らすために化学療法における医薬剤として使用されている。化学療法はこれまで、様々なタイプの悪性腫瘍を処置することにおいて効果的であるが、多くの抗新生物化合物は、望ましくない副作用を誘導する。２つ以上の異なる処置が組合せされるとき、これらの処置は相乗的に働き、これらの処置のそれぞれの適用量の減少を可能にし、それにより、より大きな適用量でのそれぞれの化合物によって及ぼされる有害な副作用を軽減させ得ることが示されている。他の場合には、処置に対して不応性である悪性腫瘍が、２つ以上の異なる処置の混合治療に対して応答し得る。
【０１０９】
本明細書中に開示されるポリペプチド治療剤が、同時または連続的のどちらであっても、別の従来的な抗新生物剤との組合せで投与されるとき、そのような治療剤は抗新生物剤の治療効果を高めることができ、または、そのような抗新生物剤に対する細胞の抵抗性を克服することができる。このことは抗新生物剤の適用量の軽減を可能にし、したがって、望ましくない副作用を軽減させるか、または、抵抗性細胞における抗新生物剤の有効性を回復させる。
【０１１０】
本開示によれば、本明細書中に記載される抗血管新生剤は、疾患を処置するための他の組成物および手順との組合せで使用することができる。例えば、腫瘍を、ＡＬＫ１またはＡＬＫ１リガンドのアンタゴニストと組み合わされる手術、放射線または化学療法により従来的に処置することができ、その後、アンタゴニストを続いて、微小転移物の休眠状態を延長させるために、また、何らかの残存する原発性腫瘍を安定化させるために患者に投与することができる。
【０１１１】
血管新生阻害剤はまた、新しいガンまたは再発ガンを発達させることについての危険性が高いことが知られている個体に対して予防的に与えることができる。したがって、本開示の１つの局面は、ＡＬＫ１もしくはＡＬＫ１リガンドのアンタゴニストおよび／またはその誘導体あるいは本開示の別の血管新生阻害剤の効果的な量を対象に投与することを含む、対象におけるガンの予防的防止のための方法を包含する。
【０１１２】
本明細書中で明らかにされるように、ＡＬＫ１−Ｆｃは、関節リウマチのマウスモデルの表現型を減少させるために効果的である。したがって、本明細書中に開示される治療剤は、関節リウマチおよび他のタイプの骨炎症または関節炎症を処置するために使用することができる。
【０１１３】
特定の正常な生理学的プロセスもまた、血管新生に関連する（例えば、排卵、月経および胎盤形成）。本開示の血管新生阻害タンパク質は、内皮細胞の刺激が過度または異常である疾患の処置において有用である。これらの疾患には、腸管癒着、アテローム性動脈硬化、強皮症および肥厚性瘢痕（すなわち、ケロイド）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の血管新生阻害タンパク質はまた、血管新生を病理学的結果として有する疾患の処置において、例えば、ネコひっかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）などの処置において有用である。
【０１１４】
全身性の血管新生阻害タンパク質を、胚着床のために要求される子宮の脈管形成を減少または防止することによって受胎調節剤として使用することができる。したがって、本開示は、胚着床を防止するために十分な量のそのような阻害タンパク質が女性に投与されるとき、効果的な受胎調節方法を提供する。この受胎調節方法の１つの局面において、胚着床を阻止するために十分な量のそのような阻害タンパク質が、性交および受精が起こる前または起こった後で投与され、したがって、これにより、受胎調節の効果的な方法、おそらくは「事後避妊」法が提供される。この陳述によってとらわれることを望まないが、子宮内膜の脈管形成の阻害が胚盤胞の着床を妨害すると考えられる。卵管の粘膜の脈管形成の類似した阻害が胚盤胞の着床を妨害し、これにより、卵管妊娠の発生が防止される。投与方法には、ピル、注射（静脈内、皮下、筋肉内）、坐薬、膣スポンジ、膣タンポンおよび子宮内デバイスが含まれるが、これらに限定されない。本開示の血管新生阻害剤の投与は胎盤の正常な高まった脈管形成を妨害し、また、無事に着床した胚盤胞、ならびに、発達中の胚および胎児における血管の発達も同様に妨害することもまた考えられる。
【０１１５】
眼において、血管新生が、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、脈管形成性緑内障および水晶体後線維増殖症に関連する。本明細書中に開示される治療剤を眼内に、または、眼への他の局所的投与によって投与することができる。さらに、実施例において示されるように、ＡＬＫ１−Ｆｃは全身投与することができ、それにもかかわらず、眼の血管新生に対する所望の効果を有する。
【０１１６】
眼における血管新生に関連する他の疾患には、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクレンズ過度装用、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病、しゅさ、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂質変性、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状ヘルペス感染症、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁（ｍａｒｉｇｉｎａｌ）角質溶解、関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー類肉腫症、強膜炎、スティーヴンズ・ジョンソン病、類天疱瘡（ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ）、放射状角膜切開および角膜移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、類肉腫、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔｓ）病、網膜炎または脈絡膜炎を引き超す感染症、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、乳頭小窩（ｏｐｔｉｃ  ｐｉｔ）、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性的網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。他の疾患には、ルベオーシス（隅の脈管形成）に関連する疾患、ならびに、すべての形態の増殖性硝子体網膜症を含めて、線維血管性組織または線維性組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
眼の状態を、例えば、治療剤の全身的注射、局所的注射、眼内注射によって、または、治療剤を放出する持続放出デバイスの挿入によって処置または防止することができる。治療剤は、薬学的に許容され得る眼用ビヒクルにおいて送達することができ、その結果、化合物が眼の角膜領域および内部領域（例えば、前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜など）に浸透することを可能にするための十分な期間にわたって、化合物が眼の表面との接触状態で維持されるようにされる。薬学的に許容され得る眼用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油またはカプセル化剤であり得る。代替では、本開示の治療剤は硝子体液および房水に直接に注入することができる。さらなる代替において、化合物を、眼の処置のために、例えば、静脈内注入または静脈内注射などによって全身投与することができる。
【０１１８】
１つまたは複数の治療剤を投与することができる。本開示の方法はまた、眼の状態を処置するために使用される他の医薬品との同時投与を含む。２つ以上の薬剤、または、薬剤および医薬品の組合せを投与するとき、投与を時間的に同時または連続的に行うことができる。これらの治療剤および／または医薬品は、異なる投与経路によって、または、同じ投与経路によって投与することができる。１つの実施形態において、治療剤および医薬品が眼用医薬配合物において一緒に投与される。
【０１１９】
１つの実施形態において、治療剤が、血管新生を薬理学的機構によって阻止するように作用する他の医薬品との同時による投与によって、眼における血管新生に関連する疾患を処置するために使用される。本開示の治療剤とともに同時に投与することができる医薬品には、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））、乳酸スクアラミン（Ｅｖｉｚｏｎ（商標））、へパリナーゼおよびグルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン）が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本明細書中に開示される少なくとも１つの治療剤と、下記の医薬品の１つとを含有する眼用医薬配合物を投与することによって、血管新生に関連する疾患を処置するための方法が提供される：ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））、乳酸スクアラミン（Ｅｖｉｚｏｎ（商標））、へパリナーゼおよびグルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン）。
【０１２０】
７．配合物および効果的用量
本明細書中に記載される治療剤は医薬組成物に配合することができる。本開示に従って使用される医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤を使用して従来の様式で配合することができる。そのような配合物は一般に、ほとんどの規制要件に従って、パイロジェン非含有である。
【０１２１】
特定の実施形態において、本開示の治療方法は、組成物を全身投与するか、あるいは、組成物をインプラントまたはデバイスとして局所投与することを含む。投与されるとき、本開示において使用される治療組成物は、パイロジェン非含有の生理学的に許容され得る形態である。上記で記載されるような組成物に必要な場合には同様に含めることができるＡＬＫ１シグナル伝達アンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤を、本明細書中に開示される方法において本発明の化合物（例えば、ＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド、または、本明細書中に開示される抗体のいずれか）とともに同時または連続的に投与することができる。
【０１２２】
典型的には、本明細書中に開示されるタンパク質治療剤は非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与され、特に、静脈内または皮下に投与される。非経口投与のために好適な医薬組成物は、１つまたは複数のＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチドまたは他の抗体を、１つまたは複数の医薬的に許容され得る無菌の等張性の水性または非水性の溶液、分散物、懸濁物またはエマルション、あるいは、無菌の注射可能な溶液または分散物に使用直前に再構成され得る無菌の粉末との組合せで含むことができ、この場合、それらは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、配合物を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質、あるいは、懸濁化剤または増粘剤を含有することができる。本開示の医薬組成物において用いることができる好適な水性キャリアおよび非水性キャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなど）、および、それらの好適な混合物、植物油（例えば、オリーブ油など）、ならびに、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が含まれる。適正な流動性を、例えば、被覆物質（例えば、レシチンなど）の使用によって、また、分散物の場合には要求される粒子サイズの維持によって、また、界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１２３】
１つの実施形態において、本明細書中に開示される抗体およびＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質は眼用医薬配合物において投与される。いくつかの実施形態において、眼用医薬配合物は、無菌の水溶液、好ましくは、注射のための適切な濃度の無菌の水溶液であるか、あるいは、膏薬または軟膏である。そのような膏薬または軟膏は典型的には、無菌の医薬的に許容され得る膏薬基剤または軟膏基剤（例えば、鉱油−白色ワセリン基剤など）に溶解または懸濁される本明細書中に開示される１つまたは複数の抗体またはＡＬＫ１  ＥＣＤタンパク質を含む。膏薬組成物または軟膏組成物において、無水ラノリンもまた、配合物において含むことができる。チメロサールまたはクロロブタノールもまた、好ましくは、抗菌剤としてそのような軟膏組成物に加えられる。１つの実施形態において、無菌の水溶液は、米国特許第６，０７１，９５８号に記載される通りである。
【０１２４】
本開示は、ｐＨを調節するための酸および塩基、ならびに、ｐＨを狭い範囲の範囲内で保つための緩衝化剤を含むために変更することができる配合物を提供する。さらなる医薬品を配合物に加えることができる。これらには、ペガプタニブ、へパリナーゼ、ラニビズマブまたはグルココルチコイドが含まれるが、これらに限定されない。本開示による眼用医薬配合物は無菌操作によって調製されるか、または、滅菌が調製の好適な段階で行われる。
【０１２５】
組成物および配合物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイスにおいて提供することができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現
出願人らは、最小のリンカーを間に有してヒトＦｃドメインに融合されるヒトＡＬＫ１の細胞外ドメインを有するか、または、最小のリンカーを間に有してマウスＦｃドメインに融合されるマウスＡＬＫ１の細胞外ドメインを有する可溶性のＡＬＫ１融合タンパク質を構築した。これらの構築物はそれぞれ、ｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃとして示される。
【０１２７】
ｈＡＬＫ１−Ｆｃが、ＣＨＯ細胞株から精製されるものとして、図３に示される（配列番号３）。注目すべきことに、ヒトＡＬＫ１タンパク質の細胞外ドメインの従来のＣ末端が配列番号１のアミノ酸１１８であるが、本発明者らは、グルタミン残基で終わるドメインを有することを避けることが望ましいことを明らかにしている。したがって、ヒトＡＬＫ１に由来する配列番号３の部分は、Ｑ１１８のＣ末端側に２つの残基（ロイシンおよびアラニン）を取り込む。したがって、本開示は、Ｑ１１８の上流側の１アミノ酸〜５アミノ酸（配列番号１に対して１１３〜１１７）または下流側の１アミノ酸〜５アミノ酸（１１９〜１２３）のどこかであるＡＬＫ１由来配列のＣ末端を有するＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド（Ｆｃ融合タンパク質を含む）を提供する。
【０１２８】
ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質およびｍＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質をＣＨＯ細胞株において発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチのメリチン（ＨＢＭＬ）：
【０１２９】
【化４】
2015042680.tif 000006
（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）：
【０１３０】
【化５】
2015042680.tif 000007
（ｉｉｉ）生来型：
【０１３１】
【化６】
2015042680.tif 000008
選択された形態はＴＰＡリーダーを用い、図４に示されるプロセシングされないアミノ酸配列を有する（配列番号５）。
【０１３２】
このポリペプチドは、図４に示される核酸配列によってコードされる（配列番号４）。
【０１３３】
精製を、例えば、下記の３つ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製をウイルスろ過および緩衝液交換により完了することができる。ｈＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質が、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定されるように、９８％を越える純度に、また、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定されるように、９５％を越える純度に精製された。
【０１３４】
タンパク質の産生および精製の過程において、本発明者らは、ｈＡＬＫ１−Ｆｃが、二量体と、変性する還元条件（例えば、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のもとでは純粋であるようであるが、患者への投与のためには問題となる高次凝集体との混合物で発現される傾向があることを認めた。これらの凝集物は免疫原性であり得るか、または、生物学的利用能が不良であり得る。また、それらの不均一性のために、これらの凝集物は、医薬調製物を薬物開発のために望ましいレベルで特徴づけることを困難にする。したがって、様々な取り組みを、最終的な調製物における凝集物の量を減らすために試験した。
【０１３５】
１つの取り組みにおいて、いくつかの異なる細胞培養培地を試験した。ＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ（カタログ番号９１１１９、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）は、ｈＡＬＫ１−Ｆｃの高レベルの産生を維持しながら、凝集生成物の産生における顕著な減少を示した。加えて、８．０のｐＨにおける疎水性相互作用カラム（例えば、フェニルセファロース）からの物質の溶出は凝集生成物のさらなる分離をもたらした。得られた物質は、９９％を越える二量体から構成される。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって販売されるＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質（カタログ番号３７０−ＡＬ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）との比較では、ＮＳＯ細胞において産生されるこのタンパク質は８４％が二量体であり、残りのタンパク質がサイズ排除クロマトグラフィーによって高分子量の化学種として現れることが示される。調製物についてのサイズ分離カラムプロフィルの比較が図１１に示される。凝集物形成がＡＬＫ１−Ｆｃ製造における重要な課題として特定されたことにより、さらなる精製工程を伴う取り組み（だが、そのような取り組みは精製タンパク質の低下した収率をもたらし得る）を含めて、他の取り組みが開発され得ることが予想される。
【０１３６】
実施例２：ＡＬＫ１−Ｆｃリガンドの同定
ＡＬＫ１はＴＧＦβファミリーのメンバーに対するＩ型受容体である。ＴＧＦβファミリーの様々なメンバーを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用して、ヒトＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質に対する結合について試験した。ＴＧＦβ自身、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４はすべてが、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質に対する実質的な結合を示すことができなかった。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４が、限定された結合を示した。ＧＤＦ５、ＧＤＦ７およびＢＭＰ９が、およそ５×１０−８Ｍ、５×１０−８Ｍおよび１×１０−１０ＭのＫＤ値による結合をそれぞれ示した。ＧＤＦ５およびＧＤＦ７のＧＤＦ６に対する類似性に基づいて、ＧＤＦ６は、類似した親和性により結合することが予想される。ＢＭＰ１０はＢＭＰ９に非常に近縁であり、これもまた、類似した親和性により結合することが予想される。
【０１３７】
実施例３：内皮細胞に対するＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＡＬＫ１抗体の影響の特徴づけ
Ｓｍａｄ１／５／８媒介のシグナル伝達に対して応答性である４つの連続するコンセンサスＳＢＥ部位の制御下にあるルシフェラーゼレポーター構築物（ＳＢＥ４−ｌｕｃ）を使用して、本発明者らは、ＢＭＰ−９媒介による活性を、ＨＭＶＥＣ細胞において、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ薬物または中和するＡＬＫ１特異的モノクローナル抗体の存在下および非存在下で測定した。ＨＭＶＥＣ細胞をｒｈＢＭＰ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）により刺激し、これにより、この場合にはＳＢＥ４−ｌｕｃ調節の転写アップレギュレーションにおける増大によって立証されるＳｍａｄ１／５／８媒介の転写活性化を誘導した。添加されたとき、ｈＡＬＫ１−Ｆｃ化合物（１０μｇ／ｍｌ）または抗体（１０μｇ／ｍｌ）は、この転写応答を、それぞれがほぼ６０％減少させた。このことは、ＡＬＫ１−Ｆｃの存在がＢＭＰ９のシグナル伝達を著しく低下させること、および、そのうえ、ＢＭＰ９のシグナル伝達がＡＬＫ１活性に関連づけられることを示している。
【０１３８】
ＳＭＡＤリン酸化の活性化が、上流側アクチビン受容体の活性化をアッセイするために一般に使用される。ＡＬＫ１は、そのリガンドにより活性化されるとき、ＳＭＡＤタンパク質１、同５および同８のリン酸化を調節することが知られている。この点で、本発明者らは、３０分の時間経過にわたって、ＳＭＡＤリン酸化をＨＵＶＥＣ細胞（ＡＬＫ１受容体を生来的に発現するヒト内皮細胞株）において開始させるためにｒｈＢＭＰ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化が、細胞をリガンドで処理した５分後に認められ、リン酸化が３０分の期間の全体にわたって維持された。比較的低い濃度のｈＡＬＫ１−Ｆｃ（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下では、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化が低下した。このことから、この薬剤は内皮細胞におけるＳｍａｄ１／５／８の活性化を阻害することが確認された。
【０１３９】
インビトロ系におけるＡＬＫ１−Ｆｃの抗血管新生効果を評価するために、本発明者らは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ基体表面での内皮細胞の管形成を低下させることにおける化合物の有効性をアッセイした。この技術は、脈管形成を評価するために一般に使用されており、迅速かつ非常に再現的な結果を与える。内皮細胞成長補充物（ＥＣＧＳ）が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上の内皮細胞からの微小血管の形成を誘導するために使用され、その後、抗血管新生化合物の効力が、１８時間の時間経過にわたって、薬物およびＥＣＧＳの両方の存在下におけるコード形成の低下として測定される。予想されるように、ＥＣＧＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）の添加は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ基体上で生じる内皮細胞コード形成の基礎的レベルを示す陰性コントロール（処理が加えられない）と比較されたとき、有意なコード形成を誘導した（図５）。ｈＡＬＫ１−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｍＡＬＫ１−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）のどちらかを加えたとき、コード形成が目視的に低下した。すべてのサンプルにおける血管長さの最終的な定量化により、ｈＡＬＫ１−ｆｃまたはｍＡＬＫ１−Ｆｃのどの濃度も、脈管形成を基礎的レベルに低下させたことが明らかにされた。加えて、強い血管新生促進因子（ＥＧＣＳ）の存在下におけるｈＡＬＫ１−ＦｃおよびｍＡＬＫ１−Ｆｃは、陰性コントロールのエンドスタチン（１００ｎｇ／ｍｌ）よりも一層強力な抗血管新生活性を明らかにする脈管形成の強い阻害を維持した。
【０１４０】
実施例４：ＣＡＭアッセイ
ＶＥＧＦおよびＦＧＦは、血管新生を刺激することが広く知られている。ＣＡＭ（ヒヨコ絨毛尿膜）アッセイシステムを使用して、ＧＤＦ７の抗血管新生効果を評価した。図６に示されるように、ＧＤＦ７は、ＶＥＧＦの効力と類似する効力により血管新生を刺激する。類似する結果がＧＤＦ５およびＧＤＦ６に関して認められた。
【０１４１】
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合物をＣＡＭアッセイにおいて抗血管新生活性について試験した。これらの融合タンパク質は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＧＤＦ７によって刺激される血管新生に対する強力な抗血管新生効果を示した。図７を参照のこと。ＢＭＰ９およびＰＤＧＦは、血管新生を誘導する比較的不良な能力をこのアッセイにおいて示したが、それにもかかわらず、これらの因子のそのような抗血管新生効果はＡＬＫ１によって阻害された。
【０１４２】
ＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質および市販されている抗血管新生性抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体をＣＡＭアッセイにおいて比較した。ＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質は、抗ＶＥＧＦと比較されたとき、類似した効力を有した。この抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ）は現在、ヒトにおけるガンおよび黄斑変性の処置において使用される。図８を参照のこと。
【０１４３】
興味深いことに、抗ＡＬＫ１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）はこのアッセイシステムにおいて血管新生を有意に阻害することができなかった。本発明者らは、これは異なる種におけるＡＬＫ１配列での違いを反映しているかもしれないと予想する。
【０１４４】
実施例５：マウス角膜マイクロポケットアッセイ
マウス角膜マイクロポケットアッセイを使用して、マウスの眼における血管新生に対するＡＬＫ１−Ｆｃの効果を評価した。ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、腹腔内投与されたとき、眼の血管新生を有意に阻害した。図９に示されるように、ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、眼の血管新生を、抗ＶＥＧＦと同じ程度に阻害した。ｈＡＬＫ１−Ｆｃおよび抗ＶＥＧＦは同一の重量／重量の適用量で使用された。類似するデータが、ＶＥＧＦにより含浸されたＭａｔｒｉｇｅｌプラグが眼以外の場所に埋め込まれたときに得られた。
【０１４５】
これらのデータは、ＡＬＫ１に対する高親和性リガンドが血管新生を促進させること、および、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が強力な抗血管新生活性を有することを明らかにする。ＡＬＫ１に対するリガンドは、ＡＬＫ１に対する中間的な親和性を有するＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７のグループ化と、ＡＬＫ１に対する大きい親和性を有するＢＭＰ９、ＢＭＰ１０のグループ化との２つのカテゴリーに分けられる。
【０１４６】
ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７は主として骨および関節に局在化し、一方、ＢＭＰ９は血液中を循環する。したがって、ＡＬＫ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７を含む、骨および関節の血管新生促進系と、ＡＬＫ１およびＢＭＰ９（および、おそらくはＢＭＰ１０）を含む全身性の血管新生系とが存在するようである。
【０１４７】
実施例６：関節リウマチのマウスモデル
マウスのコラーゲン誘導による関節炎モデルは、関節リウマチの広く受け入れられているモデルである。本研究では、１０匹のマウスからなる群を、ビヒクル、抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ−陰性コントロールとして、これは、ベバシズマブがマウスＶＥＧＦを阻害しないからである）、あるいは、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇでの用量のｍＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ−０４１」）により処理した。２１日目でのコラーゲンブーストの後、関節炎スコア（図１０を参照のこと）および足の腫れがすべての群において着実に増大し、３８日目前後でピークに達した。ｍＡＬＫ１−Ｆｃ（「ＲＡＰ−０４１」）により処理されたマウスは、特に最大用量（２５ｍｇ／ｋｇ）において、両方の特徴についての低下したスコアを示した。だが、低下は統計学的有意差を達成しなかった。それにもかかわらず、用量に関連づけられる傾向が明らかである。
【０１４８】
４２日目での研究終了までに、関節炎の発生率が、ビヒクルコントロールにより処理されたマウスでは１０／１０に、ベバシズマブにより処理されたマウスでは９／１０に、１ｍｇ／ｋｇでのｍＡＬＫ１−Ｆｃにより処理された群では８／１０に、また、ｍＡＬＫ１−Ｆｃの１０ｍｇ／ｋｇにより処理された群では９／１０に達していた。ｍＡＬＫ１−Ｆｃの２５ｍｇ／ｋｇにより処理された群は、疾患発生率がより低く、６／１０であった。
【０１４９】
実施例７：ＤＡＮのリガンド結合特性
ＤＡＮは、ＢＭＰ活性を阻害する分泌型シスチンノットタンパク質のファミリーのメンバーである。ＤＡＮは、ＧＤＦ５に結合し、かつ、ＧＤＦ５に拮抗することが知られている。本発明者らは、ＤＡＮはまた、ＢＭＰ９に対してではなく、ＧＤＦ７に対して強固に結合することを明らかにする。したがって、本発明者らは、ＤＡＮは、ＡＬＫ１に対する骨および関節に局在化する一連のリガンドを阻害すると結論し、また、ＤＡＮは、骨および関節に関連づけられる血管新生の強力なアンタゴニストであることが予想されると結論する。したがって、ＤＡＮは、骨のガン、例えば、多発性骨髄腫および骨転移物、ならびに、関節リウマチおよび変形性関節炎を処置することにおいて有用であり得る。
【０１５０】
まとめると、これらの実施例において開示される発見は、本明細書中で記載される数多くの試薬を、血管新生をインビボにおいて阻害するために、特に、眼の血管新生を阻害するために提供する。これらの発見はまた、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７に対して標的化される薬剤が、骨および関節の血管新生を選択的に阻害するために使用され得ることを示している。これらの発見はさらに、そのような薬剤が、ガンおよび関節リウマチを処置するために使用され得ることを示している。
【０１５１】
実施例８：ＡＬＫ１−ＦｃはＣＡＭアッセイにおいて腫瘍の血管新生を低下させる
腫瘍は、どのような組織の場合とも同様に、基本的な栄養要求および酸素要求を有する。小さい腫瘍は十分な量を隣接血管からの拡散によって獲得することができるが、腫瘍が大きさにおいて増大するにつれて、腫瘍は、既存の毛細血管を補充し、かつ、維持することによって栄養分を確保しなければならない。腫瘍成長を血管の阻害によって制限するＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質の能力を試験するために、本発明者らは様々な濃度のｍＡＬＫ１−Ｆｃを黒色腫外植片ＣＡＭアッセイにおいて試験した。上記で記載されるＣＡＭアッセイの場合と同様に、小さい窓をそれぞれの卵の表面に作製し、その窓を介して、５×１０５個のＢ１６黒色腫細胞を植え付けた。その後、卵を、１週間の期間、０．０２ｍｇ／ｍｌのｍＡＬＫ１−Ｆｃ、０．２ｍｇ／ｍｌのｍＡＬＫ１−Ｆｃにより毎日処理したか、または、非処理のままにした。実験が終了したとき、腫瘍を注意深く取り出し、重量測定し、デジタル画像を得た。ｍＡＬＫ１−Ｆｃにより処理されたＣＡＭに由来する腫瘍は、非処理のＣＡＭ腫瘍と比較されたとき、サイズにおける有意な減少を示した。腫瘍重量の定量により、０．０２ｍｇ／ｍｌのｍＡＬＫ１−Ｆｃまたは０．２ｍｇ／ｍｌのｍＡＬＫ１−Ｆｃのどちらかにより毎日処理された腫瘍の重量が、非処理のＣＡＭと比較して、６５％および８５％の減少を示したことが明らかにされた（図６Ｅ）。結論として、脈管形成および腫瘍成長が、ＡＬＫ１−Ｆｃを加えたとき、用量応答的な様式で有意に抑制された。このことは、ＡＬＫ１−Ｆｃが強力な抗血管新生剤であることを示している。
【０１５２】
実施例９：肺ガンの実験モデル
腫瘍の進行に対するＡＬＫ１−Ｆｃの効果をさらに確認するために、肺ガンのマウスモデルを試験した。蛍光標識されたマウスＬｅｗｉｓ肺ガン細胞（ＬＬ／２−ｌｕｃ）を尾静脈からアルビノＢｌａｃｋ６マウスに投与した。同じ日に、マウスは、腹腔内投与されるＰＢＳコントロール（ｎ＝７）または１０ｍｇ／ｋｇのｍＡＬＫ１−Ｆｃ（ｎ＝７）のどちからによる処理を開始した。生存中の蛍光画像化では、肺に局在化する腫瘍の実質的な発達がコントロールマウスにおいて示され、マウスが埋め込み後２２日目までに瀕死になり、屠殺されなければならなかった程度に達した。それに反して、ＡＬＫ１−Ｆｃにより処理されたマウスは肺腫瘍の実質的に遅れた成長を示し、２２日目現在で１００％の生存を示した。図１２を参照のこと。
【０１５３】
これらのデータは、ＡＬＫ１−Ｆｃが肺ガンのマウスモデルにおいて腫瘍成長に対する実質的な効果を有し、延命効果をもたらすことを明らかにする。
【０１５４】
実施例１０．膵臓腫瘍モデルに対するＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質の効果
ＳＶ４０ラージＴ抗原は、マウスにおける自然発生的な同所性腫瘍の形成を刺激するためにマウスにおける様々な異なる組織において発現され得るガン遺伝子である。これらの腫瘍は、天然において生じる腫瘍に対して、一般に使用される異種移植片モデルよりも大きい類似点を有し得る。ＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスにおいて、マウスが、Ｔ抗原をインスリンプロモーターの制御下で発現するように遺伝子改変され、その結果、マウスが膵臓の内分泌組織において特異的に腫瘍を発達させるようにされる。本発明者らは、ＲＩＰ１−Ｔａｇ２腫瘍に対するＡＬＫ１−Ｆｃの効果を試験した。
【０１５５】
本発明者らは、ＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスの膵臓組織が、正常な組織から始まり、その後、この組織が過形成的外観を発達させ、実質的なデノボ血管系を発達させるための血管新生を受け、完全に形成された腫瘍に最終的にはなる一連の段階を経ることを認めた。ＡＬＫ−１およびＢＭＰ９の発現をこれらの様々な段階で組織においてモニターした。結果が図１３に示される。ＡＬＫ１の発現が発達の血管新生段階の期間中にピークに達し、一方、ＢＭＰ９の発現は腫瘍発達の期間中を通して増大した。
【０１５６】
ＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスを、１０週齢（初期腫瘍発達）または１２週齢（成熟腫瘍発達）から開始して、ｍＡＬＫ１−ＦｃまたはコントロールＦｃにより処理した（３００マイクログラム／マウス、すなわち、大雑把には１２ｍｇ／ｋｇ、２週間にわたって週に２回）。いずれの場合においても、ｍＡＬＫ１−Ｆｃによる処理は本質的には腫瘍成長を停止させた。図１４を参照のこと。１０週齢で処理されたマウスの腫瘍体積は１０週から１２週まで増大せず、一方、コントロールのＦｃタンパク質により処理されたマウスは、腫瘍体積が同じ期間中に３倍になったことを示したことに留意されたい。同様に、１２週齢で処理されたマウスの腫瘍体積は１２週から１４週まで増大せず、一方、コントロール群は腫瘍体積におけるさらに３０％の増大を示した。
【０１５７】
処理された腫瘍およびコントロールの腫瘍の蛍光染色は、ＣＤ３１（内皮細胞のマーカー）についての染色によって測定されるように、ｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理によって引き起こされる血管化における低下を示した。図１５。意外なことに、ｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理は、ＮＧ２陽性細胞（周皮細胞）対ＣＤ３１陽性細胞の比率によって測定されるように、腫瘍血管系の周皮細胞被覆における増大を引き起こした。図１６。周皮細胞は、血管の一部を形成し、かつ、血管の安定性および透過性を調節することにおいて役割を果たす細胞である。周皮細胞被覆における類似する増大が、ＣａＬｕ６非小細胞肺ガン細胞株による異種移植片腫瘍モデルのＡＬＫ１−Ｆｃ処理に応答して認められた。
【０１５８】
まとめると、これらのデータは、ＡＬＫ１−Ｆｃが、ＲＩＰ１−Ｔａｇ２マウスにおいて形成される自然発生的な同所性膵臓腫瘍における腫瘍成長の強力な阻害剤であること、ならびに、その腫瘍阻害が、腫瘍の血管化における顕著な低下および腫瘍血管系の周皮細胞被覆における顕著な増大と相関することを示す。腫瘍生物学に関しての後者の意味は未だ明らかにされていない。しかしながら、糖尿病性網膜症の病理学は主として、周皮細胞の喪失および糖尿病性網膜の血管からの流体の漏出に起因することには留意しなければならない。したがって、これらのデータは、ＡＬＫ１−Ｆｃが抗腫瘍剤／抗血管新生剤として使用され得ること、および、さらには、この薬剤が、血管新生した組織における周皮細胞の形成を促進させるために使用され得ることを明らかにする。
【０１５９】
実施例１１．乳ガン腫瘍モデルに対するＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の効果
ｍＡＬＫ１−Ｆｃは、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）腫瘍細胞およびエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）腫瘍細胞の両方に由来する乳ガン腫瘍細胞株の成長を遅らせることにおいて効果的であった。
【０１６０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞株（これはＥＲ−の細胞に由来する）を、腫瘍成長および起こり得る転移のインビボ検出を可能にするためにルシフェラーゼ遺伝子により安定的にトランスフェクションした。本研究では、１×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ細胞を胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の乳房脂肪パッドに同所的に埋め込んだ。腫瘍の進行を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ画像化システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生物発光検出によって追跡した。発光（検出された光子の数）における増大が全身腫瘍組織量における増大に対応する。
【０１６１】
３０匹のメスのヌードマウスに対して、１×１０６個の腫瘍細胞を乳房脂肪パッドに注入した。腫瘍埋め込みの３日後に、マウスを、皮下（ＳＣ）注射によって週に２回、ビヒクルコントロールまたはｍＡＬＫ１−Ｆｃ（３０ｍｇ／ｋｇ）のどちらかにより処理した。処理を続け、腫瘍の進行を１０週間にわたって生物発光画像化によってモニターした。３０ｍｇ／ｋｇでのｍＡＬＫ１−Ｆｃ処理では、ビヒクル処理のコントロールと比較されたとき、生物発光検出によって明らかにされるように、腫瘍の進行が遅くなった（図１７）。ｍＡＬＫ１−Ｆｃによる処理はこのモデルにおいて腫瘍成長を遅らせたが、後退させなかった。このことは、腫瘍が、継続した成長を支えるための新しい血管の形成を要求するまでの特定のサイズにまで生存可能であり得るという点で、抗血管新生化合物に予想され得る。類似する実験において、ｈＡＬＫ１−Ｆｃは、３ｍｇ／ｋｇもの低い用量レベルで、わずかにより小さいが、類似する効果をもたらした。
【０１６２】
エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）のルシフェラーゼ発現細胞株であるＭＣＦ−７もまた、同所性埋め込みモデルにおいて試験した。このモデルでは、メスのヌードマウスに、１７β−エストラジオールの６０日間徐放性ペレットが皮下に埋め込まれる。ペレット埋め込みの２日後に、５×１０６個のＭＣＦ−７腫瘍細胞を乳房脂肪パッドに埋め込んだ。マウスを、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇでのｈＡＬＫ１−Ｆｃにより、または、ビヒクルコントロールにより週に２回、ＩＰ経路によって処理した。腫瘍の進行をＩＶＩＳ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ画像化装置（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）による毎週での生物発光画像化によって追跡した。ビヒクル処理されたマウスでは、腫瘍が研究日２６日まで急速に進行した（図１８）。２６日目以降は、腫瘍の生物発光における変動が、（エストラジオールペレットが枯渇した）６０日目での研究の終了まで認められた。これらの変動は、急速な腫瘍成長が、腫瘍の壊死および発光シグナルにおける同時低下を引き起こす宿主動物の抗血管新生応答を越え得るという点で、このモデルの一般的な特徴のためである。残る細胞が成長し続け、これにより、増大したシグナルがもたらされる。１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのｈＡＬＫ１−Ｆｃにより処理されたマウスは、ビヒクル処理されたコントロールと比較して、腫瘍サイズを研究期間中にわたって一定のレベルで維持することができた。このことは、腫瘍成長に対するこの分子の強力な効果を示している。
【０１６３】
参照による援用
本明細書中において言及されるすべての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が、参照によって組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのように、本明細書によりそれらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書中における何らかの定義を含めて、本出願明細書が優先する。
【０１６４】
均等物
当該発明の具体的な実施形態が本明細書中において明示的に開示されるが、上記の詳細な説明は例示的であり、限定的ではない。発明の多くの変化が、本明細書および下記の請求項を検討したとき、当業者には明らかになる。発明の完全な範囲は、請求項を均等物のそれらの完全な範囲と一緒に参照することによって、また、本明細書をそのような変化と一緒に参照することによって決定されなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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