(57)【要約】  本発明は、新規ピリドジヒドロピラジノン、その製造方法及びその薬物としての使用に関する。前記化合物は、下記一般式(I)に相当する。【化１】2008505157.tif 000046（式中、基L、R1、R2、R3、R4及びR5は、特許請求の範囲及び明細書で与えられる意味を有する。）【選択図】なし
2008505157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(I)に相当する化合物（任意にその互変異性体、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー及び混合物の形態でよく、かつ任意にその薬理学的に許容しうる酸付加塩、溶媒和物又は水和物でよい）。
【化１】
2008505157.tif 000039
（式中、
同一又は異なってよいR1、R2は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、C2-C6-アルケニル及びC2-C6-アルキニルの中から選択される基を表し、或いは
R1とR2が一緒に2-員〜5-員アルキルブリッジを表し、
R3は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C12-アルキル、C2-C12-アルケニル、C2-C12-アルキニル及びC6-C14-アリールの中から選択される基、或いは
任意に置換及び／又は架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキル、C3-C12-シクロアルケニル、C7-C12-ポリシクロアルキル、C7-C12-ポリシクロアルケニル及びC5-C12-スピロシクロアルキルの中から選択される基を表し、
R4は、水素、ヒドロキシ及びハロゲンの中から選択される基、又は
任意に置換されていてもよいC1-C3-アルキル、C2-C6-アルケニル、C2-C6-アルキニル、C1-C5-アルキルオキシ、C2-C5-アルケニルオキシ及びC2-C5-アルキニルオキシの中から選択される基を表し、
Lは、任意に置換されていてもよいC2-C10-アルキル、C2-C10-アルケニル、C6-C14-アリール、-C1-C4-アルキル-C6-C14-アリール、C6-C14-ヘテロアリール、及び任意に架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキルの中から選択されるリンカーを表し、
nは、0又は1を表し、
R5は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、C1-C6-アルケニル、C1-C6-アルキニル、C3-C12-シクロアルキルの中から選択される基、又は
任意に置換されていてもよいピリジル、モルフォリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピペラジニルカルボニル、ピロリジニル、トロペニル、スルホキソモルフォリニル、スルホニルモルフォリニル、チオモルフォリニル及びアザシクロヘプチルの中から選択される基を表す。）
【請求項２】
式中、
R3〜R5、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
同一又は異なってよいR1、R2が、水素、又は
メチル、エチル、プロピル、プロパルギル及びアリルの中から選択される基を表し、
或いは
R1とR2が一緒にシクロプロピルを表す、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式中、
R1〜R4、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
R5が、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、C3-C12-シクロアルキルの中から選択される基、
或いは任意に置換されていてもよいピリジル、モルフォリニル、ピペリジニル、ピペラジニル及びピペラジニルカルボニルの中から選択される基を表す、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
式中、
R1、R2、R4、R5、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
R3が、水素、任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル或いは任意に置換及び／又は架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキルを表す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
式中、
R1、R2、R3、R5、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
R4が、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、メチル、エチル、プロピニルオキシ及びメトキシの中から選択される基を表す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
医薬組成物として使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項７】
抗増殖活性を有する医薬組成物として使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項８】
癌、感染症、炎症性疾患及び自己免疫性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物を調製するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項９】
有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を患者に投与することを特徴とする、癌、感染症、炎症性疾患及び自己免疫性疾患の治療及び／又は予防方法。
【請求項１０】
活性物質として１種以上の請求項１〜５のいずれか１項に記載の一般式(I)の化合物又はその生理学的に許容しうる塩を含有し、任意に通常の賦形剤及び／又は担体と混ぜ合わせてよい、医薬組成物。
【請求項１１】
下記一般式(I)：
【化２】
2008505157.tif 000040
（式中、R1〜R5、n及びLは、請求項１〜５で与えた意味を有する）
の化合物の調製方法であって、
下記一般式(II)：
【化３】
2008505157.tif 000041
（式中、R1〜R3は、請求項１〜４で与えた意味を有し、かつAは脱離基である）
の化合物を、下記一般式(III)：
【化４】
2008505157.tif 000042
（式中、
R4は、請求項１〜５で与えた意味を有し、かつ
R6は、OH、-O-メチル、-O-エチルを表す）
の任意に置換されていてもよい化合物と反応させて、下記一般式(IV)：
【化５】
2008505157.tif 000043
（式中、
R1〜R4は、請求項１〜５で与えた意味を有し、かつ
R6は、OH、NH2-Ln-R5、-O-メチル又は-O-エチルを表す）
の生成物を得、
それから、得られた一般式(IV)の生成物を（任意に、該エステル基-COR6を予め加水分解した後でもよい）、下記一般式(V)：
【化６】
2008505157.tif 000044
（式中、R5は、請求項１〜５で与えた意味を有する）
のアミンと任意に反応させることを特徴とする、前記方法。
【請求項１２】
下記一般式(II)の化合物。
【化７】
2008505157.tif 000045
（式中、R1〜R3は、請求項１〜５で与えた意味を有し、かつAは脱離基である。）
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規ピリドジヒドロピラジノン、その製造方法及びその医薬組成物としての使用に関する。本発明の化合物は、下記一般式(I)に相当する。
【０００２】
【化１】
2008505157.tif 000003
【０００３】
ここで、基L、R1、R2、R3、R4及びR5は、特許請求の範囲及び明細書で与えられる意味を有しうる。
〔発明の背景〕
抗増殖活性を有する活性物質として、先行技術ではジヒドロプテリジノン誘導体(WO 03/020722)及びピリド[3,4-b]ピラジノン(WO 2002/076954)が知られている。
腫瘍細胞は、体による調節及び制御を全体的又は部分的に逃れ、制御されない増殖によって特徴づけられる。これは、一方では、例えばRb、p16、p21及びp53のような制御タンパク質の損失に基づき、また細胞周期のいわゆる促進因子であるサイクリン依存性キナーゼ(CDK's)の活性化にも基づいている。
さらに、タンパク質キナーゼオーロラ(Aurora)Bは、有糸分裂に突入する際の必須機能を有すると記載されている。オーロラBはヒストンH3をSer10でリン酸化し、ひいては染色体凝縮を惹起する(Hsu et al. 2000, Cell 102:279-91)。しかし、例えばCdc25Cのような特有のホスファターゼの阻害によってもG2/M期における特有の細胞周期停止が誘発されうる(Russell and Nurse 1986, Cell 45:145-53)。Cdc25遺伝子に欠陥のある酵母菌はG2期で停止するが、Cdc25の過剰発現は有糸分裂期への早過ぎる突入をもたらす(Russell and Nurse 1987, Cell 49:559-67)。さらに、G2/M期における停止は、特定の運動性タンパク質、例えばEg5のようないわゆるキナーゼの阻害によっても誘発されることがあり(Mayer et al. 1999, Science 286:971-4)、或いは微小管を安定化又は不安定化する薬剤(例えば、コルヒチン、タキソール、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン)によっても誘発されうる(Schiff and Horwitz 1980, Proc Natl Acad Sci U S A 77:1561-5)。
【０００４】
サイクリン依存性のオーロラキナーゼ、いわゆるポロ(polo)様キナーゼに加え、セリン/スレオニンキナーゼの小ファミリーが真核生物細胞周期の調節で重要な役割を果たす。今までに、ポロ様キナーゼPLK-1、PLK-2、PLK-3及びPLK-4が文献に記載されている。特にPLK-1は、有糸分裂期の調節で中心的な役割を果たすことが示されている。PLK-1は、中心体の成熟、ホスファターゼCdc25Cの活性化、及び後期促進複合体(Anaphase Promoting Complex)の活性化の原因である(Glover et al. 1998, Genes Dev. 12:3777-87; Qian et al. 2001, Mol Biol Cell. 12:1791-9)。PLK-1抗体の注射は、非形質転換細胞ではG2停止をもたらし、有糸分裂期では腫瘍細胞静止をもたらす(Lane and Nigg 1996, J Cell Biol. 135:1701-13)。PLK-1の過剰発現が種々のタイプの腫瘍、例えば非小細胞肺癌、板状上皮癌、乳癌及び結腸直腸癌で実証されている(Wolf et al. 1997, Oncogene 14 :543 -549; Knecht et al. 1999, Cancer Res. 59:2794 -2797; Wolf et al. 2000, Pathol. Res. Pract. 196:753 -759; Takahashi et al. 2003, Cancer Sci. 94:148-52)。従って、このカテゴリーのタンパク質も増殖性疾患における治療処置への興味深いアプローチを構成する(Liu and Erikson 2003, Proc Natl Acad Sci U S A 100:5789-5794)。
多くのタイプの腫瘍の抵抗性のため、腫瘍と戦うための新規な医薬組成物の開発が必要となる。
本発明の目的は、抗増殖活性を有する新規化合物を提供することである。
【０００５】
〔発明の詳細な説明〕
驚くべきことに、基L及びR1〜R5が後述する意味を有する一般式(I)の化合物は特有の細胞周期キナーゼのインヒビターとして作用することが分かった。名を挙げた化合物は、細胞周期の有糸分裂期で細胞を停止した後、その停止細胞のプログラム細胞死を惹起するという点で抗増殖活性を有する。従って、本発明の化合物を用いて、例えば、特有の細胞周期キナーゼの活性に関連し、かつ過剰又は異常な細胞増殖を特徴とする疾患を治療することができる。
(A1) 従って、本発明は、下記一般式(I)の化合物（任意にその互変異性体、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー及び混合物の形態でよく、かつ任意にその薬理学的に許容しうる酸付加塩、溶媒和物又は水和物、好ましくは一水和物若しくは二水和物でよい）に関する。
【０００６】
【化２】
2008505157.tif 000004
【０００７】
（式中、
同一又は異なってよいR1、R2は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、C2-C6-アルケニル及びC2-C6-アルキニルの中から選択される基を表し、或いは
R1とR2が一緒に2-員〜5-員アルキルブリッジを表し、
R3は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C12-アルキル、C2-C12-アルケニル、C2-C12-アルキニル及びC6-C14-アリールの中から選択される基、或いは
任意に置換及び／又は架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキル、C3-C12-シクロアルケニル、C7-C12-ポリシクロアルキル、C7-C12-ポリシクロアルケニル及びC5-C12-スピロシクロアルキルの中から選択される基を表し、
R4は、水素、ヒドロキシ及びハロゲンの中から選択される基、又は
任意に置換されていてもよいC1-C3-アルキル、C2-C6-アルケニル、C2-C6-アルキニル、C1-C5-アルキルオキシ、C2-C5-アルケニルオキシ及びC2-C5-アルキニルオキシの中から選択される基を表し、
Lは、任意に置換されていてもよいC2-C10-アルキル、C2-C10-アルケニル、C6-C14-アリール、-C1-C4-アルキル-C6-C14-アリール、C6-C14-ヘテロアリール、及び任意に架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキルの中から選択されるリンカーを表し、
nは、0又は1を表し、
R5は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、C1-C6-アルケニル、C1-C6-アルキニル、C3-C12-シクロアルキルの中から選択される基、又は
任意に置換されていてもよいピリジル、モルフォリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピペラジニルカルボニル、ピロリジニル、トロペニル、スルホキソモルフォリニル、スルホニルモルフォリニル、チオモルフォリニル及びアザシクロヘプチルの中から選択される基を表す。）
【０００８】
式中、
R3〜R5、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
同一又は異なってよいR1、R2が水素、又は
メチル、エチル、プロピル、プロパルギル及びアリルの中から選択される基を表し、
或いは
R1とR2が一緒にシクロプロピルを表す、式(I)の化合物が好ましい。
また、式中、
R1〜R4、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
R5が、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、C3-C12-シクロアルキルの中から選択される基、
或いは任意に置換されていてもよいピリジル、モルフォリニル、ピペリジニル、ピペラジニル及びピペラジニルカルボニルの中から選択される基を表す、式(I)の化合物も好ましい。
特に、式中、
R1、R2、R4、R5、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
R3が、水素、任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル或いは任意に置換及び／又は架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキルを表す、式(I)の化合物が好ましい。
特に、式中、
R1、R2、R3、R5、n及びLが前記定義どおりであり、かつ
R4が、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、メチル、エチル、プロピニルオキシ及びメトキシの中から選択される基を表す、式(I)の化合物が好ましい。
【０００９】
本発明は、さらに医薬組成物として使用するための式Ｉの化合物に関する。
本発明で特に重要な化合物は、抗増殖活性を有する医薬組成物として使用するための式Ｉの化合物である。
本発明は、式Ｉの化合物の、癌、感染症、炎症性疾患及び自己免疫性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物を調製するための使用にも関する。
本発明は、有効量の式Ｉの化合物を患者に投与することを特徴とする、癌、感染症、炎症性疾患及び自己免疫性疾患の治療及び／又は予防方法にも関する。
本発明は、活性物質として１種以上の一般式(I)の化合物又はその生理学的に許容しうる塩を含有し、任意に通常の賦形剤及び／又は担体と混ぜ合わせてよい、医薬組成物にも関する。
本発明は、さらに、下記一般式(I)：
【００１０】
【化３】
2008505157.tif 000005
【００１１】
（式中、R1〜R5、n及びLは、前記定義どおり）
の化合物の調製方法であって、下記一般式(II)：
【００１２】
【化４】
2008505157.tif 000006
【００１３】
（式中、R1〜R3は、1〜4で上述した意味を有し、かつAは脱離基である）
の化合物を、下記一般式(III)：
【００１４】
【化５】
2008505157.tif 000007
【００１５】
（式中、
R4は、1〜5で上述した意味を有し、かつ
R6は、OH、-O-メチル、-O-エチルを表す）
の任意に置換されていてもよい化合物と反応させて、下記一般式(IV)：
【００１６】
【化６】
2008505157.tif 000008
【００１７】
（式中、
R1〜R4は、前記定義どおりであり、かつ
R6は、OH、-NH-Ln-R5、-O-メチル又は-O-エチルを表す）
の生成物を得、
それから任意に、得られた一般式(IV)の生成物を（任意に、該エステル基-COR6を予め加水分解した後でもよい）、下記一般式(V)：
【００１８】
【化７】
2008505157.tif 000009
【００１９】
（式中、R5は前記定義どおり）
のアミンと反応させることを特徴とする、前記方法に関する。
【００２０】
本発明は、さらに下記一般式(II)の化合物に関する。
【００２１】
【化８】
2008505157.tif 000010
【００２２】
（式中、R1〜R3は、前記定義どおりであり、かつAは脱離基である。）
【００２３】
用語アルキル基（他の基の一部であるアルキル基を含む）は、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル及びデシルのような、1〜12個の炭素原子、好ましくは1〜6個、最も好ましくは1〜4個の炭素原子を有する分岐及び不分岐アルキル基を意味する。特に断らない限り、上記用語プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル及びドデシルは、すべての可能な異性形態を包含する。例えば、用語プロピルは、2つの異性基n-プロピルとイソ-プロピルを含み、用語ブチルは、n-ブチル、イソ-ブチル、sec.ブチル及びtert.-ブチルを含み、用語ペンチルは、イソ-ペンチル、ネオペンチル等を含む。
上記アルキル基中、1個以上の水素原子は、任意に他の基と置き換わっていてもよい。例えば、これらアルキル基は、フッ素で置換されていてもよい。任意に、アルキル基のすべての水素原子が置き換わっていてもよい。
用語アルキルブリッジは、特に断らない限り、2〜5個の炭素原子を有する分岐及び不分岐アルキル基、例えばエチレン、プロピレン、イソプロピレン、n-ブチレン、イソ-ブチル、sec.ブチル及びtert.-ブチルブリッジ等を表す。メチレン、エチレン、プロピレン及びブチレンブリッジが特に好ましい。上記アルキルブリッジ中、任意に、1〜2個のC-原子が、酸素、窒素又はイオウの中から選択される1個以上のヘテロ原子と置き換わっていてもよい。
用語アルケニル基(他の基の一部であるアルケニル基を含む)は、2〜12個の炭素原子、好ましくは2〜6個の炭素原子、最も好ましくは2〜3個の炭素原子を有する分岐及び不分岐アルキレン基を表す（それらが少なくとも1個の二重結合を有することを条件とする）。例として、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル等が挙げられる。特に断らない限り、上記用語プロペニル、ブテニル等は、すべての可能な異性形態をも包含する。例えば、用語ブテニルは、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1-メチル-1-プロペニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル及び1-エチル-1-エテニルを含む。
上記アルケニル基では、特に断らない限り、任意に、1個以上の水素原子が他の基と置き換わっていてもよい。例えば、これらアルキル基は、ハロゲン原子フッ素で置換されていてもよい。任意に、アルケニル基のすべての水素原子が置き換わっていてもよい。
用語アルキニル基(他の基の一部であるアルキニル基を含む)は、2〜12個の炭素原子を有する分岐及び不分岐アルキニル基（それらが、少なくとも1個の三重結合を有することを条件とする）、例えば、エチニル、プロパルギル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等、好ましくはエチニル又はプロピニルを意味する。
【００２４】
上記アルキニル基では、特に断らない限り、任意に、1個以上の水素原子が他の基と置き換わっていてもよい。例えば、これらアルキル基は、フッ素で置換されていてもよい。任意に、アルキニル基のすべての水素が置き換わっていてもよい。
用語アリールは、6〜14個の炭素原子、好ましくは6又は10個の炭素原子を有する芳香族環系、好ましくはフェニルを表し、特に断らない限り、1個以上の例えば以下の置換基を有しうる：OH、NO2、CN、OMe、-OCHF2、-OCF3、-NH2、ハロゲン、好ましくはフッ素又は塩素、C1-C10-アルキル、好ましくはC1-C5-アルキル、好ましくはC1-C3-アルキル、特に好ましくはメチル又はエチル、-O-C1-C3-アルキル、好ましくは-O-メチル又は-O-エチル、-COOH、-COO-C1-C4-アルキル、好ましくは-COO-メチル又は-COO-エチル、又は-CONH2。
2個までのC原子が1又は2個の窒素原子と置き換わっているヘテロアリール基として、例えば、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリミジンが挙げられ、このとき上記各ヘテロアリール環は、任意にベンゼン環に環付加していてもよく（好ましくはベンズイミダゾール）、かつこれらヘテロ環は、特に逆に述べていない限り、例えば1個以上の以下の置換基を有しうる：F、Cl、Br、OH、OMe、メチル、エチル、CN、CONH2、NH2、任意に置換されていてもよいフェニル、任意に置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくは任意に置換されていてもよいピリジル。
シクロアルキル基の例は、3〜12個の炭素原子を有するシクロアルキル基、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はシクロオクチル、好ましくはシクロプロピル、シクロペンチル又はシクロヘキシルであり、このとき上記各シクロアルキル基は、任意に1個以上の例えば以下の置換基を有しうる：OH、NO2、CN、OMe、-OCHF2、-OCF3、-NH2又はハロゲン、好ましくはフッ素又は塩素、C1-C10-アルキル、好ましくはC1-C5-アルキル、好ましくはC1-C3-アルキル、特に好ましくはメチル又はエチル、-O-C1-C3-アルキル、好ましくは-O-メチル又は-O-エチル、-COOH、-COO-C1-C4-アルキル、好ましくは-COO-メチル又は-COO-エチル又は-CONH2。シクロアルキル基の特に好ましい置換基は、=O、OH、NH2、メチル又はFである。
シクロアルケニル基の例は、少なくとも1個の二重結合を有する、3〜12個の炭素原子のシクロアルキル基、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル又はシクロヘプテニル、好ましくはシクロプロペニル、シクロペンテニル又はシクロヘキセニルであり、このとき上記各シクロアルケニル基は、任意に1個以上の置換基を有してもよい。
“=O”は、二重結合で結合している酸素原子を表す。
【００２５】
ポリシクロアルキル基の例は、任意に置換されていてもよい二環式、三環式、四環式又は五環式シクロアルキル基、例えばピナン、2.2.2-オクタン、2.2.1-ヘプタン又はアダマンタンである。ポリシクロアルケニル基の例は、任意に架橋及び／又は置換されていてもよい8-員の二環式、三環式、四環式又は五環式シクロアルケニル基、好ましくはビシクロアルケニル又はトリシクロアルケニル基であり、それらが少なくとも1個の二重結合を含む場合、例えばノルボルネンである。
スピロアルキル基の例は、任意に置換されていてもよいスピロ環式C5-C12アルキル基である。
用語ハロゲンは、一般的にフッ素、塩素、臭素又はヨウ素、好ましくはフッ素、塩素又は臭素、特に好ましくは塩素を表す。
【００２６】
脱離基Aは、例えば-O-メチル、-SCN、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、メタンスルホニル、トリフルオロメタンスルホニル又はp-トルエンスルホニルのような同一又は異なってよい脱離基、好ましくは塩素を意味する。
本発明の化合物は、個々の光学異性体の形態、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー又はラセミ体の混合物の形態、互変異性体の形態及び遊離塩基又は薬理学的に許容しうる酸との対応する酸付加塩（例えば塩酸又は臭化水素酸のようなハロゲン化水素酸、又は例えばシュウ酸、フマル酸、ジグリコール酸又はメタンスルホン酸のような有機酸との酸付加塩のような）の形態、並びにその溶媒和物又は水和物、好ましくは一水和物又は二水和物の形態で存在しうる。
【００２７】
置換基R1又はR2は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、好ましくはメチル、エチル又はプロピル、特に好ましくはメチル又はエチル、C2-C6-アルケニル、好ましくはアリル、1-ブテニル又は2-ブテニル、特に好ましくはアリル及びC2-C6-アルキニル、好ましくはプロピニル又はブチニル、特に好ましくはプロピニルの中から選択される基を意味しうる。
R1とR2が一緒に2-員〜5-員アルキルブリッジ、好ましくはエチレン、プロピレン又はブチレンブリッジ（1〜2個のヘテロ原子、好ましくは酸素又は窒素を含んでよい）を表すことがある。特に好ましくはエチレン、プロピレンである。
置換基R3は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C12-アルキル、好ましくはプロピル、ブチル、ペンチル、又はヘキシル、特に好ましくはプロピル、ペンチル又はヘキシル、C2-C12-アルケニル、好ましくはブテニル、ペンテニル又はヘキセニル、特に好ましくはペンテニル又はヘキセニル、C2-C12-アルキニル、好ましくはプロピニル、ブチニル又はペンチニル、特に好ましくはブチニル又はペンチニル及びC6-C14-アリール、好ましくはフェニル又はナフタレニルの中から選択される基、或いは
任意に置換及び／又は架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキル、好ましくはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル、特に好ましくはシクロペンチル又はシクロヘキシル、C3-C12-シクロアルケニル、好ましくはシクロペンテニル又はシクロヘキセニル、C7-C12-ポリシクロアルキル、好ましくは2.2.1-ヘプタニル又はアダマンチル、C7-C12-ポリシクロアルケニル、好ましくはノルボルネニル又はC5-C12-スピロシクロアルキル、好ましくはスピロ[4.4]ノニル又はスピロ[2.4]ヘプチルの中から選択される基を意味しうる。
最も好ましくは、置換基R3は、イソペンチル、イソプロピル シクロヘキシル又はシクロペンチルを表す。
【００２８】
置換基R4は、水素、ヒドロキシ及びハロゲン、好ましくはフッ素、塩素又は臭素、特に好ましくはフッ素又は塩素の中から選択される基、或いは
任意に置換されていてもよいC1-C3-アルキル、好ましくはメチル、エチル、又はプロピル、特に好ましくはメチル又はエチル、C2-C6-アルケニル、好ましくはアリル、2-ブテニル又は2-ペンテニル、特に好ましくはアリル又は2-ブテニル、C2-C6-アルキニル、好ましくはプロピニル、2-ブチニル又は2-ペンチニル、特に好ましくはプロピニル又は2-ブチニル、C1-C5-アルキルオキシ、好ましくはメトキシ、エトキシ又はプロピルオキシ、特に好ましくはメトキシ又はエトキシ、C2-C5-アルケニルオキシ、好ましくはアリルオキシ、2-ブテニルオキシ又は2-ペンテニルオキシ、特に好ましくはアリルオキシ又は2-ブテニルオキシ及びC2-C5-アルキニルオキシ、好ましくは2-プロピニルオキシ、2-ブチニルオキシ又は2-ペンチニルオキシ、特に好ましくは2-プロピニルオキシ又は2-ブチニルオキシの中から選択される基を意味しうる。
特に好ましくは、置換基R4はメトキシ又はエチルを表す。
【００２９】
Lは、任意に置換されていてもよいC2-C10-アルキル、好ましくはエチル、プロピル、ブチル又はペンチル、C2-C10-アルケニル、C6-C14-アリール、好ましくはフェニル、-C2-C4-アルキル-C6-C14-アリール、-C6-C14-アリール-C1-C4-アルキル、好ましくは-フェニル-メチル、任意に架橋されていてもよいC3-C12-シクロアルキル、好ましくはシクロヘキシル、及び1又は2個の窒素原子を含むヘテロアリールの中から選択されるリンカーを意味しうる。
nは、0又は1、好ましくは1を表す。
R5は、水素又は任意に置換されていてもよいC1-C6-アルキル、好ましくはメチル、エチル又はベンジル、特に好ましくはメチル又はエチルの中から選択される基、或いは
任意に置換されていてもよいピリジル、モルフォリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピペラジニルカルボニル、ピロリジニル、トロペニル、スルホキソモルフォリニル、スルホニルモルフォリニル、チオモルフォリニル及びアザシクロヘプチル、好ましくはピペラジニル、ピペリジニル、モルフォリニル又はピロリジニル、特に好ましくはピペラジニル又はピペリジニルの中から選択される基を意味しうる。
置換基R6は、OH、-O-メチル、-O-エチル、好ましくは-O-メチル又は-O-エチルを意味しうる。
R1〜R6の定義で言及したすべての基は、任意に分岐していてよく、及び／又は置換されていてもよい。
【００３０】
後述する合成法に従って本発明の化合物を調製することができる。このとき一般式(X1)〜(X12)の置換基は上記意味を有する。これら方法は、本発明を説明するものと解釈すべきであり、本発明の内容を限定するものではない。
以下の合成プラン(I)に従って一般式(I)の化合物を調製することができる：
化合物X1、X2及びX7(R4=H；R=Et(X7a)及びR4=OMe；R=Me(X7b))は市販されている；化合物X7c(R4=OMeかつR=Et)は、以下の文献公知の方法で調製される：(a) Taran, F.; Renard, P. Y.; Bernard, H.; Mioskowski, C.; Frobert, Y.; et al.; J.Amer.Chem.Soc. 1998, 120, 3332-3339. (b) Ismail, Ibrahim A.; Sharp, Dale E.; Chedekel, Miles R.; J.Org.Chem. 1980, 45, 2243-2246。
【００３１】
【化９】
2008505157.tif 000011
【００３２】
これとは別に、鏡像異性的に純粋な化合物の調製に特に好適な以下の合成方法を使用することができる(ダイアグラム(II))：
タイプX10の化合物は、以下の文献公知の方法で調製される：Lundquist, Joseph T.; Pelletier, IV and Jeffrey C, Org.Lett. 2001, 3, 781. Freudenberg; Kuhn; Bumann, Chem.Ber. 1930, 63, 2385。
【００３３】
【化１０】
2008505157.tif 000012
【００３４】
一般式(I)の新規化合物は、以下の合成例と同様に調製される。これら実施例は、本発明を説明するための方法例としてのみ意図しており、本発明の内容を限定するものではない。
実施例を合成するために用いるいくつかの中間化合物の調製について以下に述べる。
中間化合物１：
【００３５】
【化１１】
2008505157.tif 000013
【００３６】
11.8gの4,6-ジクロロ-ピリジン-3-イル-アミン二塩酸塩を200mLのジクロロメタンと200mLの水に入れて30.0g(215mmol)の炭酸カリウムと混ぜ合わせた。反応混合物を0℃に冷却し、11.3g(100mmol)のクロロアセチルクロリドを滴加した。30分後、有機相を分別してエバポレートした。残留物をエーテルで結晶させた。
収量：8.6gの化合物X3a(無色固体)
8.5gの化合物X3aを85mLのジメチルホルムアミドに入れて13.9g(100mmol)の炭酸カリウムと8.2mL(71mmol)の3-メチルブチルアミンと混ぜ合わせた。反応混合物を50℃で2時間撹拌してから水で希釈した。水相を酢酸エチルで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートし、残留物をメタノールに取り、エーテル性塩酸溶液で結晶させた。
収量：8.5gの化合物X4a(無色固体)
8.4gの化合物X4aを80mLのジメチルホルムアミドに溶かし、17.1mL(100mmol)のN-エチルジイソプロピルアミンと混ぜ合わせて100℃に2時間加熱した。反応混合物を水で希釈し、水相をジクロロメタンで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をエーテルから結晶させた。
収量：6.2gの化合物X5a(無色固体)
6.2gの化合物X5aを30mLのジメチルアセトアミドに入れて2.4mL(37mmol)のヨウ化メチルと混ぜ合わせた。-10℃で1.3g(30mmol)の水素化ナトリウムをバッチ形式で鉱油中60%の分散系として添加した。30分後、反応混合物を氷水上に注いだ。沈殿した沈殿物を吸引ろ過し、エーテルに溶かし、Na2SO4上で乾燥させてエバポレートした。残留物をジイソプロピルエーテル/石油エーテルから結晶させた。
収量：5.9gの化合物X6a(無色固体)
20mLのトルエン中の2.7gの化合物X6aと2.5g(15mmol)の4-アミノ安息香酸メチルX7aの懸濁液を0.6g(1mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.46g(0.5mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び6.5g(20mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて100℃で30時間撹拌した。反応混合物を50mLの酢酸エチルと50mLの水で希釈して沈殿した固体を吸引ろ過した。ろ液の有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残存している残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 9:1)。
収量：2.8gの化合物X8a(黄色固体)
3gの化合物X8aを100mLのメタノールに溶かし、15mLの2N塩酸水溶液と混ぜ合わせて60℃に2時間加熱した。反応混合物を塩酸水溶液で酸性にし、真空中メタノールを除去した。生じた沈殿物を吸引ろ過し、水とアセトンで洗浄した。
収量：2.4gの化合物X9a(無色固体)
【００３７】
中間化合物２：
【００３８】
【化１２】
2008505157.tif 000014
【００３９】
50g(0.36mol)の炭酸カリウムを400mLの水と400mLのエーテルに溶かして20gの4,6-ジクロロ-ピリジン-3-イル-アミン二塩酸塩と混ぜ合わせた。反応混合物を0℃に冷却し、18.9mL(0.15mol)の2-ブロモ-イソ酪酸ブロミドの溶液を2.5時間以内で滴加した。2.5時間後、150mLのエーテルに溶かしたさらなる18.9mLの2-ブロモ-イソ酪酸ブロミドと20gの炭酸カリウムを加えて混合物を1時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水洗した。有機相を分別し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：シクロヘキサン/酢酸エチル 100:0→90:10)。
収量：20.6gの化合物X3b(無色固体)
20gの化合物X3bを80mLのジメチルホルムアミドに入れて16g(120mmol)の炭酸カリウム及び31.6mL(270mmol)の3-メチルブチルアミンと混ぜ合わせた。反応混合物を60℃で1.5時間撹拌してから水とジクロロメタンで希釈した。有機相をエバポレートし、残留物をエーテルに取り、エーテル性塩酸溶液で生成物を結晶させた。得られた固体を炭酸水素カリウム溶液に取り、エバポレートし、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：シクロヘキサン/酢酸エチル 100:0→25:75)。
収量：11.5gの化合物X4b(黄色油)
11gの化合物X4bを165mLのジメチルホルムアミドに溶かし、22mL(130mmol)のN-エチルジイソプロピルアミンと混ぜ合わせて155℃に72時間加熱した。反応混合物をエバポレートし、水を添加して残存している残留物を結晶させた。この固体を水と少量のエーテルで洗浄した。
収量：6.2gの化合物X5b(明灰色固体)
6.3gの化合物X5bを30mLのジメチルアセトアミドに溶かして2.1mL(33mmol)のヨウ化メチルと混ぜ合わせた。-10℃で1.2g(27mmol)の水素化ナトリウムをバッチ形式で鉱油中60%の分散系として添加した。反応混合物をゆっくり周囲温度に戻してから氷水上に注いだ。生じた沈殿物を吸引ろ過し、水と石油エーテルで洗浄した。
収量：6.0gの化合物X6b(無色固体) 
15mLのトルエン中の2gの化合物X6bと1.7g(10mmol)の4-アミノ安息香酸エチルX7aの懸濁液を0.4g(0.6mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.31g(0.3mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び4.4g(14mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて100℃で35時間撹拌した。反応混合物を100mLの酢酸エチルと50mLの水で希釈し、生じた固体をろ別した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をtert-ブチルメチルエーテルと混ぜ合わせ、得られた固体を吸引ろ過した。
収量：1.2gの化合物X8b(褐色固体)
1.7gの化合物X8bを50mLのメタノールに溶かし、10mLの水中の1.6g(40mmol)の水素化ナトリウムと混ぜ合わせて60℃に1.5時間加熱した。反応混合物をエバポレートしてから水と混ぜ合わせた。生じた沈殿物を吸引ろ過し、エーテルと石油エーテルで洗浄した。
収量：1.5gの化合物X9b(無色固体)
【００４０】
中間化合３：
【００４１】
【化１３】
2008505157.tif 000015
【００４２】
15mLのトルエン中の2gの化合物X6bと1.8g(10mmol)の4-アミノ-3-メトキシ安息香酸メチルX7bの懸濁液を0.4g(0.7mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.3g(0.3mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び4.4g(14mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて100℃で30時間撹拌した。反応混合物を100mLの酢酸エチルと50mLの水で希釈し、沈殿した固体を吸引ろ過した。ろ液の有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残存している残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 9:1)。エーテルを添加して生成物を結晶させた。
収量：1.8gの化合物X8c(褐色固体)
1.8gの化合物X8cを50mLのメタノールに溶かし、10mLの水中の1.6g(40mmol)の水素化ナトリウムの溶液と混ぜ合わせて60℃に1.5時間加熱した。反応混合物をエバポレートしてから水と混ぜ合わせた。生じた沈殿を吸引ろ過し、エーテルと石油エーテルで洗浄した。
収量：1.7gの化合物X9c(無色固体)
【００４３】
中間化合物４：
【００４４】
【化１４】
2008505157.tif 000016
【００４５】
30.5gの4,6-ジクロロ-ピリジン-3-イル-アミン二塩酸塩を400mLのエーテルと300mLの酢酸エチルに入れ、0℃にて250mLの水中の75.9g(0.55 mol)の炭酸カリウムの溶液と混ぜ合わせた。次に、27.6mL(0.26mol)の2-ブロモプロピオン酸ブロミドを30分以内で滴加し、反応混合物を2時間以内で周囲温度に戻した。生じたいずれの固体もろ別し、ろ液を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートし、得られた生成物をエーテルから結晶させた。
収量：32.5gの化合物X3d(無色固体)
5.8gの化合物X3dを50mLのジメチルホルムアミドに入れて5.2g(38mmol)の炭酸カリウム及び6g(69mmol)の3-メチルブチルアミンと混ぜ合わせた。反応混合物を80℃で2時間撹拌してから水で希釈した。水相を酢酸エチルで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相を水洗し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：シクロヘキサン/酢酸エチル 75:25)。
収量：5.3gの化合物X4d(無色固体)
5.3gの化合物X4dを10mLのジメチルホルムアミドに溶かし、4.3g(20mmol)のリン酸三カリウムと混ぜ合わせて125℃に3時間加熱した。反応混合物を水で希釈し、水相を酢酸エチルで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相を水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物を石油エーテルから結晶させた。
収量：2.2gの化合物X5d(無色固体)
2.4gの化合物X5dを15mLのジメチルアセトアミドに入れて1mL(16mmol)のヨウ化メチルと混ぜ合わせた。-10℃にて0.5g(13mmol)の水素化ナトリウムをバッチ形式で鉱油中60%の分散系として添加した。15分後、反応混合物を氷水上に注ぎ、エーテルで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をアセトンに取り、エーテル性塩酸溶液で結晶させた。
収量：2.4gの化合物X6d(無色固体)
15mLのトルエン中の1.2gの化合物X6dと1.7g(10mmol)の4-アミノ安息香酸エチルX7aの懸濁液を0.3g(0.5mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.2g(0.2mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び5g(15mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて18時間還流させた。反応混合物をキーゼルグールに通して吸引ろ過し、エバポレートした。残存している残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 9:1)。生成物をアセトンに取り、エーテル性塩酸溶液を用いて塩酸塩として沈殿させた。
収量：0.9gの化合物X8d(黄色固体)
0.9gの化合物X8dを15mLの水に懸濁させ、15mLの半濃塩酸と混ぜ合わせて2時間還流させた。冷却後、生じた沈殿物を吸引ろ過し、水、アセトン及びエーテルで洗浄した。
収量：0.8gの化合物X9d(無色固体)
【００４６】
中間化合物５：
【００４７】
【化１５】
2008505157.tif 000017
【００４８】
30mLのトルエン中の1.5gの化合物X6dと2.7g(15mmol)の4-アミノ-3-メトキシ安息香酸メチルX7bの懸濁液を1.3g(2mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.9g(1mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び10g(30mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて18時間還流させた。冷却後、生じた固体を吸引ろ過し、ろ液をエバポレートした。残存している残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 9:1)。
収量：0.3gの化合物X8e(褐色固体)
0.3gの化合物X8eを10mLの2N塩酸水溶液に懸濁させ、2時間還流させた。冷却後、生じた沈殿物を吸引ろ過し、水、アセトン及びエーテルで洗浄した。
収量：0.2gの化合物X9e(無色固体)
【００４９】
中間化合物６：
【００５０】
【化１６】
2008505157.tif 000018
【００５１】
10gの4,6-ジクロロ-ピリジン-3-イル-アミンを200mLのエーテルに溶かし、20g(0.14mol)の炭酸カリウムの溶液と混ぜ合わせた。0℃にて15mL(0.11mol)の2-ブロモブチリルブロミドを2時間以内で滴加すると、その間に固体が生じた。反応混合物を200mLの酢酸エチルで希釈し、有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。得られた固体をエーテルで洗浄した。
収量：14.5gの化合物X3f(無色固体)
40mLのジメチルホルムアミド中の14.2gの化合物X3f、20g(0.14mol)の炭酸カリウム及び4.4g(50mmol)の3-メチルブチルアミンの混合物を120℃で4時間撹拌してからエバポレートした。残存している油を水と混ぜ合わせて酢酸エチルで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相を水洗し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物を酢酸エチルに取り、生成物をエーテル性塩酸で結晶させた。得られた固体を酢酸エチルとエーテルで洗浄した。
収量：10.2gの化合物X4f(無色固体)
50mLのジメチルホルムアミド中の11.7gの化合物X4fと10.3g(80mmol)のN-エチルジイソプロピルアミンの混合物を9時間還流させた。反応混合物をエバポレートし、炭酸カリウム水溶液と混ぜ合わせて酢酸エチルで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をエーテルから結晶させた。
収量：8.3gの化合物X5f(無色固体)
8.2gの化合物X5fを100mLのジメチルホルムアミドに入れ、2.8mL(45mmol)のヨウ化メチルと混ぜ合わせ、-10℃にて1.8g(45mmol)の水素化ナトリウムをバッチ形式で鉱油中60%の分散系として加えた。反応混合物を0℃で30分撹拌し、400mLの氷水上に注ぎ、水相を酢酸エチルで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をアセトン/エーテルに取り、生成物をエーテル性塩酸溶液で結晶させた。
収量：9.1gの化合物X6f(無色固体)
15mLのトルエン中の1.3gの化合物X6fと1.7g(10mmol)の4-アミノ安息香酸エチルX7aの懸濁液を0.4g(0.6mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、2.5g(2.7mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び1.5g(5mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて100℃で24時間撹拌した。反応混合物を50mLの酢酸エチルと混ぜ合わせ、生じた沈殿物をろ別した。ろ液をエバポレートし、カラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 9:1)。生成物をアセトン取り、エーテル性塩酸溶液を用いて塩酸塩として沈殿させた。
収量：1.6gの化合物X8f(黄色固体)
1.6gの化合物X8fを60mLの1N塩酸水溶液に懸濁させ、24時間還流させた。冷却後、生じた沈殿物をろ過し、水とアセトンで洗浄した。
収量：1.4gの化合物X9f(無色固体)
【００５２】
中間化合物７：
【００５３】
【化１７】
2008505157.tif 000019
【００５４】
60mLのトルエン中の3.4gの化合物X6fと4.4g(24mmol)の4-アミノ-3-メトキシ安息香酸メチルX7bの懸濁液を0.9g(1.5mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.9g(1mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び10g(30mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて100℃に24時間加熱した。冷却後、生じた固体を吸引ろ過し、ろ液をエバポレートした。残存している残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：シクロヘキサン/酢酸エチル 3:1)。
収量：4.6gの化合物X8g(褐色固体)
4.4gの化合物X8gを60mLの2N塩酸水溶液に懸濁させ、18時間還流させた。冷却後、生じた沈殿物を吸引ろ過し、アセトンとエーテルで洗浄した。
収量：3.9gの化合物X9g(無色固体)
【００５５】
中間化合物８：
【００５６】
【化１８】
2008505157.tif 000020
【００５７】
20.7gの化合物X3を150mLのアセトニトリルに入れて59.6mL(0.7mol)のイソプロピルアミンと混ぜ合わせ、周囲温度で24時間撹拌した。反応混合物をエバポレートし、水に取り、ジクロロメタンで抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。得られた油をエーテルと少量の酢酸エチルに取り、エーテル性塩酸溶液を添加して生成物を結晶させた。
収量：20.5gの化合物X4h(無色固体)
50mLのジメチルホルムアミド中の9.1gの化合物X4hと15g(0.11mol)のN-エチルジイソプロピルアミンの混合物を7日間還流させてからエバポレートした。残留物を炭酸カリウム水溶液に取り、酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートし、残留物をエーテルで結晶させた。
収量：5.5gの化合物X5h(明黄色固体)
18.2gの化合物X5hを250mLのジメチルホルムアミドに入れ、8.2mL(0.13mol)のヨウ化メチルと混ぜ合わせた。混合物を-5℃に冷却して4.0g(0.10mol)の水素化ナトリウムをバッチ形式で鉱油中60%の分散系として添加した。反応混合物を0℃で2時間撹拌してから800mLの氷水上に注いだ。生じた沈殿物をろ別して水と石油エーテルで洗浄した。
収量：15.9gの化合物X6h(明黄色固体)
60mLのトルエン中の1gの化合物X6hと1.4g(10mmol)の4-アミノ安息香酸エチルX7aの懸濁液を0.2g(0.3mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.3g(0.3mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び3.3g(10mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて100℃で65時間撹拌した。反応混合物をセルロースに通してろ過し、エバポレートし、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：酢酸エチル/石油エーテル 2:1)。
収量：1.2gの化合物X8h(黄色泡)
1gの化合物X8hを15mLの水に懸濁させ、15mLの半濃塩酸と混ぜ合わせ、2時間還流させた。冷却後、生じた沈殿物を吸引ろ過し、水、アセトン及びエーテルで洗浄した。
収量：0.9gの化合物X9h(無色固体)
【００５８】
中間化合物９：
【００５９】
【化１９】
2008505157.tif 000021
【００６０】
120mLのトルエン中の2.9gの化合物X6hと4.4g(23mmol)の4-アミノ-3-メトキシ安息香酸エチルX7cの懸濁液を0.8g(1.3mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、1g(1.1mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び10g(30mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせ、100℃に72時間加熱した。冷却後、反応混合物をセルロースに通してろ過し、ろ液をエバポレートした。残存している残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：石油エーテル/酢酸エチル 1:2)。
収量：3.6gの化合物X8i(明褐色固体)
3.6gの化合物X8iを20mLの水に懸濁させ、15mL半濃塩酸と混ぜ合わせ、2時間還流させた。冷却後、生じた沈殿物を吸引ろ過し、水、アセトン及びエーテルで洗浄した。
収量：2.95gの化合物X9i(無色固体)
【００６１】
中間化合物10：
【００６２】
【化２０】
2008505157.tif 000022
【００６３】
10g(154mmol)のナトリウムアジドを45mLの水に溶かして0℃で75mLのジクロロメタン及び9.3mL(55mmol)の無水トリフルオロメタンスルホン酸と混ぜ合わせた。反応混合物を2時間撹拌してから40mLのジクロロメタンで2回抽出した。混ぜ合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄してNa2SO4上で乾燥させた。このようにして得た溶液を90mLの水と180mLのメタノール中の2.5g(28mmol)のD-アラニン、5.9g(42mmol)の炭酸カリウム及び70mg(0.3mmol)の硫酸銅(II)五水和物の混合物に添加した。これを周囲温度で12時間撹拌してから真空中で有機溶媒を除去した。残留物を水で希釈し、pHを6.2に調整した。これを酢酸エチルで抽出した。水相をpH 2に調整し、混合物を再び酢酸エチルで抽出した。これら有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。
収量：4.0gの化合物X13a(明黄色油)
3.3gの化合物X13aを30mLのジクロロメタンに溶かし、5mL(68mmol)の塩化チオニルと混ぜ合わせて50℃で2時間撹拌した。混合物を回転式エバポレーターで濃縮し、残留物を6.6g(28mmol)の4,6-ジクロロ-ピリジン-3-イル-アミン二塩酸塩と10mL(124mmol)のピリジンの10mLのジクロロメタン中の溶液と混ぜ合わせた。12時間後、混合物を水と混ぜ合わせてジクロロメタンで抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートし、カラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 100:5)。
収量：4.9gの化合物X11a(明褐色固体)
【００６４】
アルゴン雰囲気内で7.1gの化合物X11aを150mLのTHFに入れ、35mLのトリメチルホスフィンの1M溶液(THF中)を滴加した。混合物を一晩撹拌してから水と混ぜ合わせてエバポレートした。残留物を水に取り、ジクロロメタンで抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。得られた黄色油をアセトン/エーテルに取り、エーテル性塩酸溶液を添加して生成物を結晶させた。
収量：5.4gの化合物X12a(無色固体)
6.3gの化合物X12aを250mLのジクロロメタンに入れて2.2g(26mmol)のシクロペンタノン、14g(66mmol)のナトリウムトリアセトキシボロヒドリド及び3.3g(40mmol)の酢酸ナトリウムと混ぜ合わせた。混合物を12時間撹拌してから炭酸水素ナトリウム水溶液と混ぜ合わせた。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。得られた油をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 100:2)。
収量：5.5の化合物X4j(明黄色油)
5mLのジメチルホルムアミド中の1gの化合物X4jと3.5mL(20mmol)のN-エチルジイソプロピルアミンの混合物を150℃に34時間加熱した。反応混合物を水と混ぜ合わせてジクロロメタンで抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。
収量：0.7gの化合物X5j(ベージュ色固体)
4.1gの化合物X5jを10mLのジメチルホルムアミドに入れて1mL(17mmol)のヨウ化メチルと混ぜ合わせた。-5℃にて1.2g(30mmol)の水素化ナトリウムをバッチ形式で鉱油中60%の分散系として添加した。反応混合物を0℃で2時間撹拌し、水と混ぜ合わせてジクロロメタンで抽出した。混ぜ合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。
収量：4.0gの化合物X6j(橙色油)
70mLのトルエン中の4gの化合物X6jと2.8g(15mmol)の4-アミノ-3-メトキシ安息香酸メチルX7bの懸濁液を0.6g(0.9mmol)の2,2´-ビス-(ジフェニルホスフィノ)-1,1´-ビナフチル、0.9g(0.9mmol)のトリス(ジベンジリデンアセトン)-ジパラジウム(0)及び12g(37mmol)の炭酸セシウムと混ぜ合わせて50時間還流させた。冷却後、反応混合物をセルロースに通してろ過し、ろ液をエバポレートした。残存している残留物を酢酸エチルに取り、水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、活性炭に通してろ過し、エバポレートした。生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 95:5)。
収量：3.1gの化合物X8j(赤色油)
3.1gの化合物X8jを30mLの水に懸濁させ、15mLの濃塩酸と混ぜ合わせて10時間還流させた。冷却後、生じた沈殿物を吸引ろ過し、水、アセトン及びエーテルで洗浄した。
収量：2.2gの化合物X9j(無色固体)
【００６５】
表１から選択した実施例の合成：
実施例2：
0.1gの化合物X9d、0.08gのTBTU及び1mLのDIPEAを2mLのジメチルホルムアミドに溶かして25℃で10分撹拌した。次に0.05gの3-ピコリルアミンを加え、混合物を70℃でさらに15分撹拌した。反応混合物をエバポレートし、10mLの酢酸エチルと混ぜ合わせて水で洗浄した。水相を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機相を水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物を酢酸エチルから結晶させた。
収量：0.067g(無色固体) 融点：167-168℃
【００６６】
実施例5：
0.06gの化合物X9e、0.055gのTBTU及び0.5gのDIPEAを2mLのジメチルホルムアミドに溶かして25℃で10分撹拌した。次に0.05gの4-ピコリルアミンを加え、混合物をさらに30分25℃で撹拌した。反応混合物をエバポレートし、20mLの酢酸エチルと10mLの水と混ぜ合わせた。水相を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機相を水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン/酢酸エチル/メタノール 70:20:10)。
収量：0.043g(無色固体)
【００６７】
実施例6：
0.23gの化合物X9g、0.18gのTBTU及び0.29mLのDIPEAを5mLのジメチルホルムアミドに溶かして25℃で10分撹拌した。次に0.07gの3-ピコリルアミンを加え、混合物を25℃でさらに15分撹拌した。反応混合物をエバポレートし、20mLの酢酸エチルと10mLの水と混ぜ合わせた。水相を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機相を水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し(溶出液：ジクロロメタン/酢酸エチル/メタノール 70:20:10)、酢酸エチルから塩酸塩として沈殿させた。
収量：0.16g(無色固体) 融点：104-112℃
【００６８】
実施例8：
0.23gの化合物X9g、0.18gのTBTU及び0.30mLのDIPEAを5mLのジメチルホルムアミドに溶かして25℃で10分撹拌した。次に0.06gのシクロプロピルアミンを加え、混合物を25℃でさらに15分撹拌した。反応混合物をエバポレートし、20mLの酢酸エチル及び10mLの炭酸カリウム水溶液と混ぜ合わせた。水相を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機相を水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し(溶出液：ジクロロメタン/酢酸エチル/メタノール 70:20:10)、酢酸エチルから結晶させた。得られた固体をエーテルで洗浄した。
収量：0.12g(無色固体) 融点：201-203℃
【００６９】
実施例13：
0.15gの化合物X9f、0.15gのTBTU及び0.29mLのDIPEAを5mLのジクロロメタンに溶かして25℃で30分撹拌した。次に0.10gのシクロブチルアミンを加え、混合物を25℃で一晩撹拌した。反応混合物をエバポレートし、残留物を20mLの水と混ぜ合わせた。生じた沈殿物を吸引ろ過し、ジクロロメタンに取り、この溶液をNa2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。エーテル性塩酸溶液を添加して生成物を結晶させた。
収量：0.13g(無色固体) 融点：238-239℃
【００７０】
実施例18：
30mLのジクロロメタン中の0.3gの化合物X9aと0.3gの塩化チオニルの混合物を24時間還流させた。反応混合物をエバポレートし、10mLのジクロロメタンに取り、0.5gの3-アミノピリジンと混ぜ合わせて25℃で30分撹拌した。エバポレーション後、残留物を水で希釈し、生じた沈殿物を吸引ろ過して水洗した。固体をジクロロメタンに溶かし、Na2SO4上で乾燥させ、エバポレートした。アセトンを添加して生成物を結晶させた。
収量：0.09g(無色固体) 融点：231-232℃
【００７１】
実施例22：
0.1gの化合物X9b、0.09gのTBTU及び0.30mLのDIPEAを5mLのジクロロメタンに溶かして25℃で20分撹拌した。次に0.04gの1-メチル-ピペリジン-4-イルアミンを加え、混合物を25℃でさらに4時間撹拌した。溶液を15mLのジクロロメタンで希釈し、水洗した。有機相をエバポレートし、エーテルと酢酸エチルを添加して残留物を沈殿させた。得られた固体をメタノール/エーテルと撹拌し、吸引ろ過した。
収量：0.024g(無色固体)
【００７２】
実施例25：
0.1gの化合物X9c、0.09gのTBTU及び0.30mLのDIPEAを2mLのジメチルホルムアミドに溶かして25℃で20分撹拌した。次に0.04gの4-アミノピリジンを加え、混合物を100℃でさらに1.5時間撹拌した。溶液を15mLのジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。有機相をエバポレートし、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した(溶出液：ジクロロメタン→ジクロロメタン/メタノール 90:10)。石油エーテル、エーテル及び酢酸エチルを添加して生成物を沈殿させた。
収量：0.01g(無色固体) 融点：117℃
【００７３】
実施例44：
0.15gの化合物X9i、0.15gのTBTU及び0.10mLのDIPEAを1mLのジクロロメタンに溶かして25℃で30分撹拌した。次に0.07gの8-メチル-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタ-3-イルアミンを加え、混合物を25℃で一晩撹拌した。反応混合物を炭酸カリウム水溶液で洗浄し、有機相をエバポレートした。エーテルを添加して残留物を結晶させた。
収量：0.16g(無色固体) 融点>200℃
【００７４】
実施例45：
0.15gの化合物X9i、0.14gのTBTU及び0.11mLのDIPEAを1mLのジクロロメタンに溶かして25℃で30分撹拌した。次に0.15mLのアンモニアをメタノール中の7N溶液として加え、混合物を25℃で一晩撹拌した。反応混合物をろ別し、ろ液を炭酸カリウム水溶液で洗浄した。有機相をエバポレートし、エーテルを添加して残留物を結晶させた。
収量：0.13g(無色固体) 融点>200℃
【００７５】
実施例46：
0.1gの化合物X9h、0.11gのTBTU及び0.07mLのDIPEAを1mLのジクロロメタンに溶かして25℃で30分撹拌した。次に、0.03gの3-アミノピリジンを加え、混合物を25℃で一晩撹拌した。反応混合物を炭酸カリウム水溶液で洗浄し、有機相をエバポレートした。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し(溶出液：ジクロロメタン/メタノール 100:5→100:7)、エーテルを添加して生成物を結晶させた。
収量：0.04g(黄色がかった固体) 融点>200℃
【００７６】
実施例49：
0.1gの化合物X9j、0.09gのTBTU及び0.25mLのDIPEAを1.5mLのジクロロメタンに溶かして25℃で30分撹拌した。次に0.02mLのイソプロピルアミンを加え、混合物を25℃で一晩撹拌した。反応混合物を炭酸カリウム水溶液で洗浄し、有機相をエバポレートした。残留物をアセトン/エーテルに取り、エーテル性塩酸溶液を添加して生成物を沈殿させた。
収量：0.07g(無色固体) 融点：179-181℃
【００７７】
実施例51：
0.1gの化合物X9j、0.09gのTBTU及び0.50mLのDIPEAを1.5mLのジクロロメタンに溶かして25℃で30分撹拌した。次に0.07gのトランス-4-モルフォリノ-シクロヘキシルアミンを加え、混合物を25℃で一晩撹拌した。反応混合物を炭酸カリウム水溶液で洗浄し、有機相をエバポレートした。エーテルを添加して残留物を結晶させた。
収量：0.08g(明黄色固体) 融点：166-168℃
【００７８】
実施例52：
0.1gの化合物X9j、0.09gのTBTU及び0.25mLのDIPEAを1.5mLのジクロロメタンに溶かして25℃で30分撹拌した。次に0.03gの1-メチルピペリジン-4-アミンを加え、混合物を25℃で一晩撹拌した。反応混合物を炭酸カリウム水溶液で洗浄し、有機相をエバポレートした。エーテルを添加して残留物を結晶させた。
収量：0.03g(明黄色固体) 融点：148-151℃
トランス-4-モルフォリノ-シクロヘキシルアミン
【００７９】
【化２１】
2008505157.tif 000023
【００８０】
ジベンジル-4-モルフォリノ-シクロヘキシルアミン
3.9g(30mmol)の4-ジベンジルシクロヘキサノンを100mLのCH2Cl2に溶かし、混合物を3.9g(45mmol)のモルフォリン及び9.5g(45mmol)のNaBH(OAc)3と25℃で12時間撹拌した。次に水と炭酸カリウムを加え、有機相を分別し、乾燥させ、かつエバポレートした。残留物をシリカゲルカラム上で精製した(溶出液：酢酸エチル90/メタノール10＋1%濃アンモニア)。適切なフラクションを真空中でエバポレートした。
収量：6.6g(60%)のシス異性体と2g(18%)のトランス異性体。
或いは、以下の方法でトランス-ジベンジル-4-モルフォリノ-シクロヘキシルアミンを調製しうる：
33g(112mmol)の4-ジベンジルシクロヘキサノンを300mLのメタノールに溶かし、17.4g(250mmol)のヒドロキシルアミン塩酸塩と混ぜ合わせて60℃で4時間撹拌した。真空中で溶媒を蒸発させ、500mLの水及び50gの炭酸カリウムと混ぜ合わせて300mLのジクロロメタンで2回抽出した。有機相を乾燥させ、真空中でエバポレートし、残留物を石油エーテルから結晶させ、1.5Lのエタノールに溶かして70℃に加熱した。166gのナトリウムをバッチ形式で添加し、ナトリウムが溶解するまで還流させた。溶媒を除去し、残留物を100mLの水と混ぜ合わせて400mLのエーテルで2回抽出した。有機相を水で洗浄し、乾燥させ、真空中でエバポレートし、カラムに通してトランス異性体を単離した(溶出液：酢酸エチル80/メタノール20＋2%濃アンモニア)。
収量：12.6g(41%)。
6.8g(23mmol)のトランス-1-アミノ-4-ジベンジルアミノシクロヘキサンを90mLのDMFに溶かし、5mL(42mmol)の2,2´-ジクロロエチルエーテル及び5gの炭酸カリウムと100℃にて8時間撹拌した。冷却後、30mLの水を加え、沈殿した結晶を吸引ろ過し、短カラムに通して精製した(溶出液：酢酸エチル)。残留物をメタノールと濃塩酸から二塩酸塩として結晶させた。
収量：7.3g(72%)。
トランス-4-モルフォリノ-シクロヘキシルアミン
7.2g(16.4mmol)のトランス-ジベンジル-4-モルフォリノ-シクロヘキシルアミンを100mLのメタノールに溶かし、30〜50℃にて1.4gのPd/C(10%)上で水素化した。真空中で溶媒を除去し、残留物をエタノールと濃塩酸から結晶させた。
収量：3.9g(93%)；融点：312℃。
【００８１】
例えば、上述した方法と同様にして表１に列挙した式(I)の化合物を得た。
【００８２】
【表１】
2008505157.tif 000024
【００８３】
【表２】
2008505157.tif 000025
【００８４】
【表３】
2008505157.tif 000026
【００８５】
【表４】
2008505157.tif 000027
【００８６】
【表５】
2008505157.tif 000028
【００８７】
【表６】
2008505157.tif 000029
【００８８】
【表７】
2008505157.tif 000030
【００８９】
【表８】
2008505157.tif 000031
【００９０】
【表９】
2008505157.tif 000032
【００９１】
【表１０】
2008505157.tif 000033
【００９２】
【表１１】
2008505157.tif 000034
【００９３】
【表１２】
2008505157.tif 000035
【００９４】
【表１３】
2008505157.tif 000036
【００９５】
【表１４】
2008505157.tif 000037
【００９６】
【表１５】
2008505157.tif 000038
【００９７】
明かなように、一般式(I)の化合物は、治療分野における広範な用途によって特徴づけられる。特に、特有の細胞周期キナーゼの阻害、特に培養ヒト腫瘍細胞の増殖のみならず、例えば上皮細胞のような他の細胞の増殖に対する阻害効果が役割を果たす当該用途に言及すべきだろう。
DNA染色後のFACS分析によって実証できるように、本発明の化合物によってもたらされる、増殖の阻害は、特に細胞周期のG2/M期における細胞の停止によって媒介される。使用する細胞によって左右される、細胞周期のG2/M期に特有の長さの時間の細胞停止後にプログラム細胞死が開始する。細胞周期のG2/M期における停止は、例えば、特有の細胞周期キナーゼの阻害によって誘発される。本発明の一般式Ｉの化合物の生物学的特性に照らし、該化合物、その異性体及びその生理学的に許容しうる塩は、過剰又は異常な細胞増殖によって特徴づけられる疾患の治療に好適である。
このような疾患として、例えば、以下のものが挙げられる：種々の感染症(例えばHIV及びカポジ肉腫)；炎症性疾患及び自己免疫性疾患(例えば大腸炎、関節炎、アルツハイマー病、糸球体腎炎及び創傷治癒)；細菌、真菌及び／又は寄生虫感染症；白血病、リンパ腫及び固体腫瘍；皮膚疾患(例えば乾癬)；骨疾患；心血管疾患(例えば再狭窄及び肥大)。本発明の化合物、その異性体及びその生理学的に許容しうる塩は、放射線、UV治療及び／又は細胞分裂抑制治療によって引き起こされる増殖性細胞(例えば毛髪、腸管、血液及び前駆細胞)のDNAに対する損傷を防止するためにも好適である(Davis et al., 2001)。
上記疾患の予防、短期又は長期治療のため、本発明の新規化合物を同じ徴候に使用される他の活性物質、例えば、細胞分裂抑制剤、ホルモン又は抗体と併用することもできる。
PLK1阻害アッセイ、培養ヒト腫瘍細胞についての細胞毒性試験及び／又は例えば、HeLaS3細胞についてのFACS分析で本発明の化合物の活性を決定した。両試験方法で、本化合物は、良い乃至非常に良い活性、すなわち、例えばHeLaS3細胞毒性試験で5μmol/L未満、通常1μmol/L未満のEC50値、及びPLK1阻害アッセイで1μmol/L未満のIC50値を示した。
【００９８】
〔PLK1キナーゼアッセイ〕
酵素の調製：
バキュロウィルス感染した昆虫細胞(Sf21)から、そのN-末端でGSTに結合している組換えヒトPLK1酵素を単離する。精製は、グルタチオンセファロースカラム上のアフィニティークロマトグラフィーで行う。
200mlのSf-900 II血清フリー昆虫細胞培地(Life Technologies)中の4×107個のSf21細胞(Spodoptera frugiperda)をスピナフラスコに接種する。27℃及び70rpmでの72時間のインキュベーション後、新しいスピナフラスコ内トータル180mlの培地に1×108個のSf21細胞を接種する。さらに24時間後、20mlの組換えバキュロウィルス貯蔵懸濁液を加え、細胞を27℃にて70rpmで培養する。3時間後に細胞を収集し、オカダ酸を加え(Calbiochem,最終濃度0.1μM)、懸濁液をさらにインキュベートする。細胞数を測定し、遠心分離によって(5分,4℃,800rpm)細胞を除去してPBS(8g NaCl/l,0.2g KCl/l,1.44g Na2HPO4/l,0.24g KH2PO4/l)で1回洗浄する。再遠心分離後、ペレットを液体窒素中でフラッシュ-凍結させる。次に、ペレットを急速に解かして氷冷溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,10mM MgCl2,1mM DTT,5μg/ml ロイペプチン,5μg/ml アプロチニン,100μM NaF,100μM PMSF,10mM β-グリセロールホスフェート,0.1mM Na3VO4,30mM 4-ニトロフェニルホスフェート)に再懸濁させて1×108個の細胞/17.5mlを得る。氷上で30分細胞を溶解させる。細胞デブリを遠心分離(4000rpm,5分)で除去後、清澄な上清をグルタチオンセファロースビーズ(50mlの上清当たり1mlの再懸濁かつ洗浄ビーズ)と混ぜ合わせて回転ボード上で混合物を30分4℃でインキュベートする。ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、1mlの溶出緩衝液/ml再懸濁ビーズで組換えタンパク質をビーズから溶出する(溶出液緩衝液：100mM Tris/HCl pH=8.0,120mM NaCl,20mM 還元型グルタチオン(Sigma G-4251),10mM MgCl2,1mM DTT)。Bradfordアッセイでタンパク質濃度を決定する。
【００９９】
〔アッセイ〕
96-ウェル丸底皿(Greiner bio-one, PS Microtitre plate No.650101)のウェル内で以下の成分を混ぜ合わせる：
−6%のDMSO、0.5mg/mlのカゼイン(Sigma C-5890)、60mMのβ-グリセロリン酸、25mMのMOPS pH=7.0、5mMのEGTA、15mMのMgCl2、1mMのDTT中、種々濃度の10μlの被験化合物(例えば、300μMで開始して1:3に希釈)
−20μlの基質溶液(25mMのMOPS pH=7.0、15mMのMgCl2、1mMのDTT、2.5mMのEGTA、30mMのβ-グリセロリン酸、0.25mg/mlのカゼイン)
−20μlの酵素希釈物(25mMのMOPS pH=7.0、15mMのMgCl2、1mMのDTT中、酵素原料の1:100希釈)
−10μlのATP溶液(45μMのATP、1.11×106のBq/ml γ-P33-ATPと共に)。
【０１００】
ATP溶液を添加して反応を開始し、穏やかに振とうさせながら30℃で45分間続ける(IKA Schuttler MTS2で650rpm)。1ウェル当たり125μlの氷冷5% TCAを添加して反応を停止して少なくとも30分間氷上でインキュベートする。沈殿物を収集してフィルタープレート上に移してから(96-ウェルマイクロタイターフィルタープレート:UniFilter-96,GF/B;Packard;No.6005177)、1%のTCAで4回洗浄して60℃で乾燥させる。1ウェル当たり35μlのシンチレーション溶液(Ready-Safe;Beckmann)を添加後、プレートを封止テープで密閉し、沈殿したP33の量をWallac Betacounterで測定する。
測定データを標準的なGraphpadソフトウェア(Levenburg-Marquard Algorhythmus)で評価する。
【０１０１】
〔培養ヒト腫瘍細胞についての細胞毒性の測定〕
培養ヒト腫瘍細胞についての細胞毒性を測定するため、子宮頚癌の腫瘍細胞系HeLa S3(米国菌培養収集所(American Type Culture Collection)(ATCC)から得た)をHam´s F12培地(Life Technologies)と10%の胎児ウシ血清(Life Technologies)内で培養し、対数増殖期に収集する。次に、HeLa S3細胞を96-ウェルプレート(Costar)内に1ウェル当たり1000個の密度で入れ、インキュベーター内で一晩インキュベートし(37℃及び5%のCO2)、各プレートの6ウェルは培地のみで満たす(3ウェルは培地コントロールとして、3ウェルは還元型AlamarBlue試薬とのインキュベーションのため)。種々濃度で活性物質を細胞に加える(DMSOに解かす;DMSOの最終濃度:0.1%)(各場合三通りの測定)。72時間のインキュベーション後、20μlのAlamarBlue試薬(AccuMed International)を各ウェルに加え、細胞をさらに7時間インキュベートする。コントロールとして20μlの還元型AlamarBlue試薬をそれぞれ3ウェルに加える(AlamarBlue reagent,30分間オートクレーブ処理する)。7時間のインキュベーション後、個々のウェルのAlamarBlue試薬の色の変化をPerkin Elmer蛍光分光光度計で測定する(励起530nm,発光590nm,シフト15,積分時間0.1)。反応したAlamarBlue試薬の量は、細胞の代謝活性を表す。コントロール(インヒビター無しのHeLa S3)のパーセンテージとして相対的な細胞活性を計算し、50%まで細胞活性を阻害する該活性物質の濃度(IC50)を導く。3つの個々の測定値の平均から、ダミー値(培地コントロール)の補正をして値を計算する。
【０１０２】
〔FACS分析〕
ヨウ化プロピジウム(PI)は化学量論的に二本鎖DNAに結合するので、細胞のDNA含量に基づく細胞周期のG1、S及びG2/M期における細胞の比率の決定に好適である。G0期及びG1期の細胞は二倍体DNA含量(2N)を有し、G2期又は有糸分裂期の細胞は4N DNA含量を有する。
例えばPI染色のため、40万個のHeLa S3細胞を75cm2の細胞培養フラスコ上に接種し、24時間後、コントロールとして0.1%のDMSOを添加するか又は種々の濃度(0.1%のDMSO中)で基質を添加した。基質又はDMSOと共に24時間細胞をインキュベートした後、細胞をPBSで2回洗浄してからトリプシン/EDTAで分離した。細胞を遠心分離し(1000rpm,5分,4℃)、細胞ペレットをPBSで2回洗浄後、細胞を0.1mlのPBSに再懸濁させた。細胞を80%のエタノールで4℃にて16時間或いは-20℃にて2時間固定した。固定細胞を遠心分離し(1000rpm,5分,4℃)、PBSで洗浄してから再び遠心分離した。細胞ペレットを2mlの0.25% Triton X-100(PBS中)に再懸濁させ、氷上で5分インキュベート後、5mlのPBSを加えて混合物を再び遠心分離する。細胞ペレットを350μlのPI染色溶液(0.1mg/mlのRNase A(Sigma, No. R-4875),10μg/mlのヨウ化プロピジウム(Sigma, No. P-4864)1×PBS中)に再懸濁させた。暗所で染色緩衝液と共に細胞を20分インキュベート後、FACSスキャン用の試料測定容器に移した。DNAの測定はアルゴンレーザー(500mW,発光488nm)、及びDNA Cell Quest Programme(BD)を備えたBecton Dickinson FACSアナライザーで行った。バンド-パスフィルター(BP 585/42)で対数関数的なPI蛍光を決定した。Becton Dickinson製のModFit LT Programmeを用いて個々の細胞周期における細胞集団を数量化した。
【０１０３】
他の腫瘍細胞についても本発明の化合物を試験した。例えば、これら化合物は全種類の組織の癌に有効であり(例えば乳房(MCF7)；結腸(HCT116)、頭頚部癌(FaDu)、肺(NCI-H460)、膵臓(BxPC-3)、前立腺(DU145))、肉腫(例えばSK-UT-1B、Saos-2)、白血病及びリンパ腫(例えばHL-60、Jurkat、THP-1)及び他の腫瘍(例えばメラノーマ(BRO)、グリオーム(U-87MG))、このような適応症に利用できる。このことは、本発明の化合物が全種類の腫瘍型の治療に広く適用しうる証拠である。
一般式(I)の化合物は、単独で又は本発明の他の活性物質と共に使用することができ、任意に、他の薬理学的に活性な物質と共に使用してもよい。適切な製剤として、例えば、錠剤、カプセル剤、座剤、液剤（特に注射用液(s.c., i.v., i.m.)及び注入液）、エリキシル剤、乳剤又は散剤が挙げられる。医薬的に活性な化合物の含量は、全体として該組成物の0.1〜90wt.%、好ましくは0.5〜50wt.%であり、すなわち、以下に指定する薬用量範囲を達成するのに十分な量である。必要な場合、指定用量を1日に数回与えてよい。
【０１０４】
例えば、活性物質を、既知の賦形剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はラクトースのような不活性な希釈剤、コーンスターチ又はアルギニン酸のような崩壊剤、デンプン又はゼラチンのような結合剤、ステアリン酸マグネシウム又はタルクのような潤沢剤及び／又はカルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、又はポリ酢酸ビニルのような放出遅延用薬剤と混合することによって、好適な錠剤が得られる。錠剤が数層で構成されていてもよい。
従って、前記錠剤と同様に製造したコアを一般的に錠剤コーティングに用いる物質、例えばコリドン又はシェラック、アカシアゴム、タルク、二酸化チタン又は糖で被覆することによってコーティング錠を調製することができる。遅延放出を果たすため、又は不適合を防止するため、コアがいくつかの層から成ってもよい。同様に、遅延放出を達成するため、おそらく錠剤について上述した賦形剤を用いて、錠剤コーティングがいくつかの層で構成されていてもよい。
【０１０５】
本発明の活性物質又はその組合せを含むシロップ剤又はエリキシル剤は、サッカリン、シクラメート、グリセロール又は糖のような甘味料及び風味向上剤、例えばバニリン又はオレンジエキスのような香料をさらに含んでよい。懸濁アジュバント又は増粘剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、湿潤剤、例えば脂肪アルコールとエチレンオキシドの縮合生成物、又は保存剤、例えばp-ヒドロキシベンゾエートを含んでもよい。
注射用及び注入用液は常法で、例えば、等張剤、保存剤（例えばp-ヒドロキシベンゾエート）、又は安定剤（例えばエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩）を添加して（任意に乳化剤及び／又は分散剤を使用してもよく、さらに希釈剤として水を使用する場合、任意に、例えば有機溶媒を溶媒和剤又は溶解助剤として用いてもよい）調製され、それを注射バイアル若しくはアンプル又は注入ビンに移す。
【０１０６】
１種以上の活性物質又は活性物質の組合せを含むカプセル剤は、例えば活性物質を不活性な担体（例えば、ラクトース又はソルビトール）と混合し、それをゼラチンカプセルに詰めることによって調製される。
適切な座剤は、例えば、この目的のために提供される担体、例えば中性脂肪又はポリエチレングリコール若しくはその誘導体と混合することで調製される。
使用しうる賦形剤として、例えば、水、医薬的に許容しうる有機溶媒、例えばパラフィン(例えば石油留分)、植物油(例えば落花生油又はゴマ油)、単官能又は多官能アルコール(例えばエタノール又はグリセロール)、担体、例えば天然鉱物粉(例えばカオリン、クレー、タルク、チョーク)、合成鉱物粉(例えば高分散ケイ酸及びシリケート)、糖(例えばショ糖、ラクトース及びグルコース)、乳化剤(例えばリグニン、亜硫酸パルプ廃液、メチルセルロース、デンプン及びポリビニルピロリドン)及び滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸及びラウリル硫酸ナトリウム)が挙げられる。
【０１０７】
製剤は、常法、好ましくは経口又は経皮で、最も好ましくは経口投与される。経口投与では、錠剤は、当然、上記担体と別に、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム及びリン酸二カルシウムのような添加剤を種々の添加剤、例えばデンプン、好ましくはジャガイモデンプン、ゼラチン等と共に含んでよい。さらに、錠剤化プロセスと同時にステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクのような潤沢剤を使用しうる。水性懸濁液の場合、上記賦形剤に加えて種々の風味向上剤又は着色剤と活性物質を混ぜ合わせることができる。
非経口用途では、活性物質と適宜の液状担体の溶液を使用しうる。
静脈内用の薬用量は1時間当たり1〜1000mg、好ましくは1時間当たり5〜500mgである。
しかし、体重、投与経路、該薬物に対する個体の反応、その製剤の性質及び該薬物を投与する時間又は間隔によって、指定量から外れる必要があることもある。従って、上述した最小用量未満の使用で十分な場合もあり、他の場合には、上限を超えなければならないこともある。大量に投与する場合、１日かけて小量を数回に分けることが賢明である。
【０１０８】
以下の製剤例は、本発明の範囲を限定せずに本発明を例証する。
〔医薬製剤の実施例〕
A)          錠剤                      1錠剤当たり
活性物質                    100mg
ラクトース                  140mg
コーンスターチ              240mg
ポリビニルピロリドン         15mg
ステアリン酸マグネシウム      5mg
500mg
微粉砕活性物質、ラクトース及びいくらかのコーンスターチを一緒に混合する。混合物を篩ってからポリビニルピロリドンの水溶液で湿らせ、混練し、湿式顆粒化して乾燥させる。顆粒、残りのコーンスターチ及びステアリン酸マグネシウムを篩って一緒に混合する。混合物を圧縮して適切な形状と大きさの錠剤を作製する。
【０１０９】
B)          錠剤                                1錠剤当たり
活性物質                               80mg
ラクトース                             55mg
コーンスターチ                        190mg
微結晶性セルロース                     35mg
ポリビニルピロリドン                   15mg
ナトリウム-カルボキシメチルスターチ    23mg
ステアリン酸マグネシウム                2mg
400mg
微粉砕活性物質、いくらかのコーンスターチ、ラクトース、微結晶性セルロース及びポリビニルピロリドンを一緒に混合し、混合物を篩い、残りのコーンスターチと水で仕上げて顆粒を形成し、この顆粒を乾燥させて篩う。ナトリウムカルボキシメチルスターチとステアリン酸マグネシウムを加えてよく混ぜ合わせ、混合物を圧縮して適宜の大きさの錠剤を形成する。
【０１１０】
C)          アンプル溶液
活性物質                    50mg
塩化ナトリウム              50mg
注射用水                     5ml
活性物質をそれ自体のpH又は任意に5.5〜6.5のpHで水に溶かし、塩化ナトリウムを加えてそれを等張にする。得られた溶液を熱源なしでろ過し、ろ液を無菌条件下でアンプルに移してから滅菌し、融合により封着する。アンプルは5mg、25mg及び50mgの活性物質を含有する。
【国際調査報告】
2008505157.tif 000047
2008505157.tif 000048
2008505157.tif 000049
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