(57)【要約】  本発明は、処置中の患者における自殺または自己破壊的行動を予測する方法を提供する。該方法は、ドーパミントランスポーター遺伝子(ＳＬＣ６Ａ３)の３’ＵＴＲにおけるＶＮＴＲ多型の検出を用いる。９個またはそれ以下の反復を有する患者を、クロザピンに対する低応答者であると見なす。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子における９個またはそれ以下の反復を、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の弱い発現と相関させる。また提供されるのは、この多型または代用マーカーの存在または非存在に基づく処置法である。また本発明の方法に使用するためのキットも提供する。
2008505060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者サンプルで、クロザピンに感受性を示すバイオマーカー存在に基づいて選択される、選択された患者集団の統合失調症の処置のための医薬の製造におけるクロザピンの使用。
【請求項２】
該バイオマーカーが、ドーパミントランスポーター１(ＳＬＣ６Ａ３；ＤＡＴ１)遺伝子の３’非翻訳領域(ＵＴＲ)に位置する数の異なる縦列反復(ＶＮＴＲ)多型である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該バイオマーカーがさらに、GenBank配列受託番号AF119117.1の４１３７０位のＳＬＣ６Ａ３  Ｅｘｏｎ９  Ａ５９Ｇにおいて多型部位を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
(ａ)患者から体液または他の組織のサンプルを得ること、そして
(ｂ)患者の体液または組織に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の２個のコピーについて、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子(ｈＤＡＴ１遺伝子)の３’ＵＴＲ領域に存在する数の異なる縦列反復(ＶＮＴＲ)多型の同一性を決定する段階を含み、ここで：
(ｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の両コピーが、ＶＮＴＲ多型において９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有するとき、該患者は、自殺行動に関して、クロザピン処置に対する低応答者であると予測され；
(ｉｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の一方のコピーが、ＶＮＴＲ多型において９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有し、そして他方のコピーがＶＮＴＲ多型において１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子を有するとき、該患者は、自殺行動に関して、クロザピン処置に対する高応答者であると予測され；そして
(ｉｉｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の両コピーが、ＶＮＴＲ多型において１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子を有するとき、該患者は、自殺行動に関して、クロザピン処置に対する高応答者であると予測される、
クロザピン処置に対する患者応答性を予測する方法。
【請求項５】
さらに：
(c)患者の体液または組織に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の２個のコピーについて、GenBank配列受託番号AF119117.1の４１３７０位のＳＬＣ６Ａ３  Ｅｘｏｎ９  Ａ５９Ｇにおける多型部位でのヌクレオチド対の同一性を決定する段階を含み、ここで：
(ｉ)両ヌクレオチド対がＡＴであるとき、該患者をＡＡと分類し、該患者はリスクカテゴリーＩであると見なし；
(ｉｉ)一方のヌクレオチド対がＡＴであり、他方がＧＣであるとき、該患者をＧＡと分離し、該患者はリスクカテゴリーIIであると見なし；そして
(ｉｉｉ)両ヌクレオチド対がＧＣであるとき、該患者をＧＧと分類し、該患者はリスクカテゴリーIIIであると見なす、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに：
(ｄ)該患者がリスクカテゴリーIIまたはIIIであるとき、処置中、特別に自殺／自己破壊的な行動の予防措置をとる
段階を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該体液が血液である、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
クロザピン処置に対する応答性を予測する方法であって、
該患者のＳＬＣ６Ａ３遺伝子の３’ＵＴＲ領域における、数の異なる縦列反復配列数(ＶＮＴＲ)多型の同定のための代用マーカーが存在するか否かを同定する段階を含み、ここで：
(ｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の両コピーのための代用マーカーがＶＮＴＲ多型において９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有するとき、該患者は、自殺行動に関して、クロザピン処置に対する低応答者であると予測され；
(ｉｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の一方のコピーのための代用マーカーがＶＮＴＲ多型において９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有し、そして他方のコピーがＶＮＴＲ多型において１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子を有するとき、該患者は、自殺行動に関して、クロザピン処置に対する高応答者であると予測され；そして
(ｉｉｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の両コピーのための代用マーカーがＶＮＴＲ多型において１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子を有すると示すとき、該患者は、自殺行動に関して、クロザピン処置に対する高応答者であると予測される、
方法。
【請求項９】
クロザピン処置感受性を予測するためのキットであって、
(ａ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の３’ＵＴＲ領域に存在する、数の異なる縦列反復(ＶＮＴＲ)多型を同定する手段；および
(ｂ)Ｅｘｏｎ９  Ａ５９Ｇ多型部位でのＳＬＣ６Ａ３多型部位の遺伝子多型パターンを同定する手段
を含むキット。
【請求項１０】
さらにＤＮＡサンプル回収手段を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ＳＬＣ６Ａ３多型部位での遺伝子多型パターンの同定手段がＳＬＣ６Ａ３遺伝子型オリゴヌクレオチドを含む、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型プライマー組成物が、対立遺伝子特異的プライマー対の少なくとも２セットを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型オリゴヌクレオチドが、別の容器に包装されている、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
さらに体液サンプル回収手段を含む、請求項９から１３のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に生物学的サンプルのインビトロ分析に、そして特に、患者サンプルをクロザピンの投与に対する応答のためのバイオマーカーについて分析することに関する。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症は、脳の多数の領域にわたる精神機能障害により特徴づけられる、もっとも深刻な精神疾患の一つである(Freedman R, N. Engl. J. Med. 349(18): 1738-49 (2003))。自殺または自殺企図は、これらの患者における死の約１０％を占め、一般人より統合失調症患者で有意に高い割合で起こる。統合失調症における自殺のリスクファクターは、遺伝因子および環境因子を含み、複雑である。遺伝因子および環境因子間の相互作用がまた報告されている(Caspi A et al., Science 301(5631): 386-9 (2003))。多くの研究で、遺伝要素がこのリスクファクターの約７０％を占め得ると報告されている(Freedman R, N. Engl. J. Med. 349(18): 1738-49 (2003))。しかし、統合失調症は、単一遺伝子ではないようであり、そして該病気に対する連鎖が複製されている多くの染色体座が存在する。セロトニン受容体およびドーパミントランスポーターのような遺伝子における一部の一塩基変異多型は、統合失調症の感受性の増加と関連している。興味深いことに、これらの多型はまた、薬剤応答に対する影響力を有するようである。
【０００３】
最近の臨床試験では、非定型抗精神病性クロザピン(ＣＬＯＺＡＲＩＬ(登録商標)またはＬＥＰＯＮＥＸ(登録商標)、Novartis Pharmaceutical Corporation, East Hanover, NJ, USA)が、統合失調症およびそれに関連する精神障害または統合失調性感情障害を有する患者において自殺率を劇的に低下できることが見いだされた。Meltzer et al., Arch. Gen. Psychiatry, 60: 82-91 (2003); 公開ＰＣＴ特許出願WO 2004/074513を参照。多施設、ランダム化、国際的、２年試験によって、自殺に関して高いリスクと見なされる患者にクロザピンとオランザピンで処置し、患者における自殺行動に関するリスクを比較した。Meltzer HY, J. Clin. Psychiatry 60 Suppl 12: 47-50 (1999)); Meltzer HY et al., Arch. Gen. Psychiatry 60(1): 82 91 (2003); Potkin SG et al., Biol. Psychiatry 54(4):444 52 (2003); Vandenbergh DJ et al., Genomics 14(4):1104 (1992); Grunhage F et al., Mol. Psychiatry 5(3): 275 (2000)。この試験は、自殺企図を含む自殺行動、自殺願望による入院、救済介入の必要性、抗鬱薬、抗不安薬または睡眠薬での必要な同時処置が、クロザピンで処置した患者すべてにおいて有意に減少すると結論づけた。
【０００４】
自殺傾向の減少に至る、もっとも可能性のあるメカニズムは、クロザピンの優れた抗精神病効果および内因性抗鬱活性である。２００２年１２月、米食品医薬品局(ＦＤＡ)が、慢性的に危険である統合失調症または統合失調性感情障害患者における再発性自殺行動の処置のためにクロザピン(ＣＬＯＺＡＲＩＬ(登録商標))を認可した。ＣＬＯＺＡＲＩＬ(登録商標)は、この使用に関してこれまでに認可を受けた最初の薬物である。さらに、ＣＬＯＺＡＲＩＬ(登録商標)／ＬＥＰＯＮＥＸ(登録商標)は、認知機能を改善できることが見いだされた。
【０００５】
しかし、ある患者においてどの程度自殺行動を起こす可能性があるかを正確に予測するのは、難しく、しばしば誤りやすい仕事である。クロザピン処置応答に関する個体内変異は、著しい。すべての患者がクロザピンから利益を得られるわけではない。ある者は治療に対して有害に応答し、他の者は適切に応答しない。広範囲の薬物クラスが利用可能であるにも係わらず、標準な精神薬の第一選択に関係なく、患者の約３０−５０％は急性処置に十分な応答がない。Freedman R, N. Engl. J. Med. 349(18): 1738-49 (2003)); Meltzer HY, Ann. N.Y. Acad. Sci. 932: 44-58; discussion 58 60; (2001)。加えて、従来このような行動の予測を手助けできる客観的テストはなかった。現在、これらの極度に病気の患者における自殺のリスクの減少により有効であることが証明された薬物を手に入れると共に、自殺または自己破壊的行動の可能性の予測のための客観的および確実な手段を得ることは医師にとって重要となっている。薬物応答における基礎となる遺伝因子の同定は、分子医学におけるとりわけ有望な研究分野である。したがって、医師がこの困難かつ重要な決定を成すことを助ける客観的テストは必要である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、統合失調症を含む精神障害を有し得るか、それに感受性であり得る個体における、自殺行動のリスクを予測するためのバイオマーカーおよび方法を提供することにより、この要求に応える。本発明は、患者集団において(１)有用な疾患マーカーである；(２)疾患病因の有効な理解を得るために使用できる；および(３)クロザピン応答者とクロザピン非応答者を区別できる、バイオマーカーを提供する。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、個体のドーパミントランスポーター１遺伝子(ＤＡＴ１遺伝子；ＳＬＣ６Ａ３遺伝子)の３’非翻訳領域(ＵＴＲ)に存在する、数の異なる反復配列(ＶＮＴＲ)多型の決定を含む。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子は、染色体５ｐ１５.３に位置する。他の態様において、本発明は、個体に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子(ＤＡＴ１遺伝子)の２個のコピーについて、Ｅｘｏｎ  ９上の多型部位５９  Ａ→Ｇでのヌクレオチド対の同一性を決定することを含む。多型５９  Ａ→Ｇは、GenBank配列番号AF119117.1の４１３７０位(配列番号２)である(配列番号１は、GenBank配列番号AF119117.1の４１３４１−４１４０１位の配列を提供する。)。
【０００８】
これらのヌクレオチド変異は、ドーパミントランスポーターの異常型の発現を起こし得て、その結果、その機能に影響する。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子における９個またはそれ以下の反復は、本遺伝子の低い発現と相関する。該５９  Ａ→Ｇ多型(配列番号２)は、Ｅｘｏｎ  ９の異常スプライシングを、そしてその結果異常な、検出可能ＲＮＡをもたらす。該遺伝子のポリペプチド生成物は多型を有する患者で変化し得、これが、この多型に関する血液試験の基礎を構成し、それ故患者の自殺可能性の推定値を提供する。
【０００９】
それゆえ、ある態様において、本発明は、患者において、ＳＬＣ６Ａ３座で患者の遺伝子型を決定する方法、および、この情報を自殺または自己破壊的行動のリスクがあるまたはあるかもしれない患者の自殺または自己破壊的行動のリスクの予測方法に使用するための方法を提供する。他の態様において、本発明は、タイプ１事象の発生のリスクのあるまたはあるかもしれない患者の処置中に起こる、タイプ１事象の可能性の予測方法を提供する。１つの態様において、本発明は(ａ)患者からの体液または他の組織サンプルを得ること、そして(ｂ)患者の血液または組織に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の２個のコピーについて、ＶＮＴＲ多型の数を決定することを含む、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の３’−ＵＴＲで患者の遺伝子型を同定する方法を提供する。他の態様において、本発明は：(ｃ)患者の血液または組織に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の２個のコピーについて、GenBank配列受託番号 AF119117.1の４１３７０位のＳＬＣ６Ａ３  Ｅｘｏｎ  ９  Ａ５９Ｇ  (ｒｓ６３４７)における多型部位でのヌクレオチド対の同一性を決定することを含み、ここで、(ｉ)両ヌクレオチド対がＡＴであるとき、該患者をＡＡと分類し；(ｉｉ)一方のヌクレオチド対がＡＴであり、他方がＧＣであるとき、該患者をＧＡと分類し；そして(ｉｉｉ)両ヌクレオチド対がＧＣであるとき、該患者をＧＧクラスと分類する、ＳＬＣ６Ａ３  Ｅｘｏｎ９座で患者の遺伝子型を同定する方法を提供する。他の態様において、該遺伝子型同定を上記の通りに行い、ここで、(ａ)該患者がＡＡに分類されるとき、該患者はリスクカテゴリーＩであると見なし、そして(ｂ)該患者がＧＡに分類されるとき、該患者はリスクカテゴリーIIであると見なし、そして(ｃ)該患者がＧＧに分類されるとき、該患者はリスクカテゴリーIIIであると見なす。
【００１０】
さらに他の態様において、本発明は、ＳＬＣ６Ａ３多型における代用マーカーを利用し上記同定方法を提供する。この方法は、タイプ１事象の発生のリスクがあるまたはあるかもしれない患者の処置中に起こる、タイプ１事象の可能性の予測を含む。１つの態様において、該バイオマーカーは、存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の３’ＵＴＲのＶＮＴＲ多型の数(９個またはそれ以下の反復か１０個またはそれ以上の反復のいずれか)の代用である。他の態様において、本発明は、該患者においてＳＬＣ６Ａ３  Ｅｘｏｎ  ９  Ａ５９Ｇ多型の代用マーカーが存在するか否かの決定を成すことを含み、ここで、(ａ)該代用マーカーが、該患者がＡＡに分類されると示すとき、該患者はリスクカテゴリーＩであると見なし、そして(ｂ)該代用マーカーが、該患者がＧＡに分類されると示すとき、該患者はリスクカテゴリーIIであると見なし、そして(ｃ)該代用マーカーが、該患者がＧＧに分類されると示すとき、該患者はリスクカテゴリーIIIであると見なす。
【００１１】
したがって、さらなる態様において、本発明はまた、処置される患者のＳＬＣＡ３遺伝子の多型の知識に基づく処置の決定方法を提供する。この情報に基づいて、個体は選択した医薬および患者の安全を保証するために必要な観察の程度に関して両方とも、もっとも適当な方法において処置できる。例えば、中程度および高いリスクカテゴリーの個体は、入院および外来患者の両方において、高レベルで観察される。Modestin J et al., J. Clin. Psychiatry 66(4):534-8 (April 2005)参照。
【００１２】
他の態様において、本発明は、(ａ)患者の体液または組織中のＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現生成物の存在に関してアッセイことを含む、自殺または自己破壊的行動のリスクがあるまたはあるかもしれない個体の処置法を提供し、ここで、(ｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現生成物が、高いまたは少なくとも中程度のリスクのある遺伝子型を示す濃度であることが判明したとき、該患者は、他の同類の医薬よりもむしろクロザピンで処理し、そして、処置中個体を入院させることをより真剣に考慮するか、他の自殺予防法を提供する；そして(ｉｉ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現生成物の濃度が、個体を低いリスクであると見なすことを示すとき、患者管理は、患者にとってそれほど煩わしいものである必要はない。
【００１３】
好ましい態様において、上記決定は、ドーパミントランスポーター結合能(ＤＡＴＢＰ)の測定を通したＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子発現生成物(ドーパミントランスポーター１［ＤＡＴ１］)の利用能および親和性または濃度に関する試験により行われる。これは、［１１Ｃ］ＲＴＩ−３２(ドーパミントランスポーターに高い選択性であるポジトロン放出断層撮影(ＰＥＴ)造影放射性リガンド)の使用を必要とする。Wilson, DaSilva & Houle, J. Label. Comp. Radiopharm., 34: 759-765 (1994);および Wilson, DaSilva & Houle, Nucl. Med. Biol., 23(2): 141-146 (1996)参照。
【００１４】
他の態様において、上記同定は、ＤＡＴＢＰを同定する他の方法として、[123I] -β-CIT シングルフォトン核医学断層撮影法(SPECT)技術の使用に頼る。Neumeister et al., Psychol. Med. 31(8): 1467-1473 (2001)参照。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、(ａ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出すること；(ｂ)低リスク患者からのＳＬＣ６Ａ３遺伝子変異に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出すること；そして(ｃ)上記の(ａ)および(ｂ)で検出されたｍＲＮＡレベルを比較することを含み、ここで、(ｉ)(ａ)が存在するとき、患者は中程度のまたは高いリスクであると認識し、適当な予防措置をとる、自殺または自己破壊的行動のリスクがあるかまたはあるかもしれない個体の処置法を提供する。この予防措置は、限定しないが、入院を含む観察レベルの強化、同類のタイプの他の医薬よりも優先したクロザピンの使用を含む；そして(ｉｉ)(ａ)が検出され、そして(ｂ)が検出されないとき、該患者は高リスクカテゴリーにあると見なし、上記タイプのより厳しい予防措置を処置中にとる。
【００１６】
他の態様において、本発明は、個体に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の決定を含む、自殺、抗鬱薬または抗精神病薬の試験を含むがこれらに限定されない臨床試験に包含させる対象の選択方法を提供する(ここで該個体は、示されるリスクカテゴリーに基づいて試験に包含させるか除外する。)。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、自殺または自己破壊的行動のリスクがあるかまたはあるかもしれない個体の処置ストラテジーの決定に使用するためのキットである。このキットは、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現生成物レベルを測定するための必要な材料を含む。好ましい態様において、このキットは、ＤＡＴＢＰの測定を通したＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子発現生成物(ＤＡＴ１)の利用性および親和性または濃度試験のための必要な物質を含み得る。これは、［１１Ｃ］ＲＴＩ−３２(ドーパミントランスポーターに高い選択性であるＰＥＴ造影放射性リガンド)の使用を必要とする。Wilson, DaSilva & Houle (1994), 上記;および Wilson, DaSilva & Houle (1996), 上記参照。
【００１８】
加えて、該キットは、ＤＡＴＢＰレベルを測定できる必要な材料および該個体からの体液サンプルを入れるための好ましい容器を含み得、またキットの使用のための指示書を含み得る。この指示書は、キットの適当な使用および該結果の解釈の適当な方法、ならびにキットで試験した個体の特異性に依存する患者の管理についての示唆を含み得る。
【００１９】
他の態様において、上記キットは、ＤＡＴＢＰ測定のための他の手段として［１２３Ｉ］−β−ＣＩＴ  ＳＰＥＣＴ技術の使用に頼り得る。Neumeister et al. (2001), 上記参照。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、(ａ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子のｍＲＮＡ発現生成物を認識し、それと結合できるポリヌクレオチド；(ｂ)該ポリヌクレオチドと該個体からの体液サンプルを入れるのに適当な容器(ここで、該ポリヌクレオチドは、存在するとき、該ＳＬＣ６Ａ３ｍＲＮＡと接触できる)；(ｃ)該ポリヌクレオチドとＳＬＣ６Ａ３ｍＲＮＡの結合物を検出する手段；(ｄ)該ｍＲＮＡが低リスク、中程度のリスクまたは高リスク個体のゲノム由来であるかを決定するための手段；そして(ｅ)キットの使用のための指示書を含む、自殺または自己破壊的行動のリスクがあるかまたはあるかもしれない個体に対する処置ストラテジーの決定において使用するためのキットである。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は：(ａ)個体に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の２個のコピーについて、上記の通り個体が低リスク、中程度のリスクまたは高リスク個体であるかの指標であるＳＬＣ６Ａ３遺伝子の多型と連鎖不均衡(ＬＤ)である、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の多型を決定し；そして(ｂ)指標の多型とＬＤであるＳＬＣ６Ａ３遺伝子領域に基づいて個体をリスクグループに割り当てることを含む、限定しないが、ＣＬＯＺＡＲＩＬ(登録商標)を含む、限定しないが、クロザピンを含む様々な医薬での処置に対する、自殺または自己破壊的行動のリスクがあるかまたはあるかもしれない個体の応答を決定する方法を提供する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子のＶＮＴＲ座多型部位での患者の多型パターンの同定のためのキットを提供し、該キットはＳＬＣ６Ａ３遺伝子のＶＮＴＲ座多型部位での遺伝子の多型パターンの決定のための手段を含む。
【００２３】
他の態様において、本発明は、Ｅｘｏｎ  ９  Ａ５９ＧのＳＬＣ６Ａ３多型部位での患者の多型パターンの同定のためのキットを提供し、該キットはＥｘｏｎ  ９  Ａ５９ＧのＳＬＣ６Ａ３多型部位での遺伝子の多型パターンの決定のための手段を含む。
【００２４】
他の態様において、本発明は、さらにＤＮＡサンプル回収手段を含むキットを提供する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子のｍＲＮＡ発現の同定のためのキットであり、該キットはＳＬＣ６Ａ３遺伝子のｍＲＮＡ生成物を決定するための手段を含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子のｍＲＮＡ生成物を同定する手段がＳＬＣ６Ａ３遺伝子のｍＲＮＡ発現生成物と結合できるポリヌクレオチドを含む、キットである。
【００２７】
他の態様において、本発明は、Ｇ変異体およびＡ起源遺伝子型の間を区別するような形態で、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子のポリペプチド発現産物の濃度を検出するための手段を含む、患者のＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物濃度またはレベルを同定するためのキットを提供する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、さらに体液サンプルを回収する手段を含む、キットを提供する。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、エキソビボで行う、処置を必要とする、自殺または自己破壊的行動のリスクがあるかまたはあるかもしれない個体の処置法、薬物療法の臨床試験への包含に関して対象を選択するための方法、または、処置中の患者における自殺または自己破壊的行動の可能性を決定する方法を提供する。
【００３０】
本発明のさらに別の局面において、例えば上記のいずれかであるが、ＳＬＣ６Ａ３多型の代用マーカーを検出するキットを提供する。このような代用マーカーは、上記の任意の方法で、例えば、代用マーカーゲノムのｍＲＮＡの検出のような手段により、または代用マーカーのポリペプチド遺伝子発現産物の検出のような手段により、検出できる。代用マーカーの存在または非存在を、次いで、それと目的のＳＬＣ６Ａ３多型の間の既知の関係に基づき、上記決定を行うために使用し得る。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１は、実施例１におけるクロザピン処置群の白人(Ｃａｕｃａｓｉａｎ)のログランク検定解析の結果を示すグラフである。
【００３２】
図２は、実施例１におけるクロザピン処置群の全集団のログランク検定解析の結果のグラフである。
【００３３】
図３は、オランザピン処置群の白人のログランク検定解析の結果を示すグラフである。
【００３４】
図４は、オランザピン処置群の全集団のログランク検定解析の結果を示すグラフである。
【００３５】
図５は、クロザピン処置群の９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する白人と、１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する白人との比較を示すグラフである。
【００３６】
図６は、クロザピン処置群の９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する全対象と、１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する全対象との比較を示すグラフである。
【００３７】
図７は、オランザピン処置群の９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する白人と、１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する白人との比較を示すグラフである。
【００３８】
図８は、オランザピン処置群の９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する全対象と、１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する全対象との比較を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本明細書で使用されるいくつかの用語の定義を以下に提供する。他の語の定義は、U.S. Department of Energy, Office of Science, Human Genome Project により提供される用語集(http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/glossary/)で見いだせる。本発明の実施において、分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡにおける多くの慣用技術を使用する。これらの技術は既知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I III, Ausubel, ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover D, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymol. (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller and Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); and Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu and Grossman, and Wu, Eds., により各々説明されている。ここに記載のすべての特許出願、特許および文献は、その全体を出典明示により本明細書に包含させる。
【００４０】
故に、第一の局面において、本発明は、自殺または自己破壊的行動のリスクがあるまたはあるかもしれない個体が、処置中に自殺行動を起こす可能性を決定する方法を提供する。これらの方法は、患者におけるドーパミン輸送遺伝子ＤＡＴ１(ＳＬＣ６Ａ３)の遺伝子型またはハプロタイプの決定、特にＳＬＣ６Ａ３Ｅｘｏｎ９  Ａ５９Ｇ多型の存在または非存在の決定を含む。
【００４１】
多型が存在せず、両方の対立遺伝子がＡを含むとき、患者は、このような患者は処置中に自殺するリスクが総体的に低いことを特徴とする、カテゴリーＩに分類される。このカテゴリーは、当業者が、その時点の患者の精神状態の試験、過去の病歴、家族歴、患者の病気の性質および病歴、物質濫用の存在のような自殺の既知のリスクファクターなどに基づいて、概算する、その患者に対する自殺的もしくは自己破壊的行動のリスクの程度を意味する。
【００４２】
多型が一方の対立遺伝子上に存在するが他方には存在しないとき、その患者はＡＧの遺伝子型を有し、患者は、患者が処置により自殺するリスクが相対的に高いことを特徴とする、カテゴリーIIに分類される。患者が、遺伝子型ＧＧで多型に関して同型接合体であるとき、患者を、患者が処置中に自殺するリスクが相対的に最も高いことを特徴とする、カテゴリーIIIに分類する。
【００４３】
本明細書で使用する“カテゴリーＩ”、“カテゴリーII”および“カテゴリーIII”なる用語は、個体が処置中に自殺するまたは自己破壊的方法で行動する、すなわち、タイプ１事象が起こるリスクの相対的レベルを意味する。これらのカテゴリーは、リスクがカテゴリーＩからカテゴリーIIで増加し、さらになおカテゴリーIIIで増加することを特徴とする。
【００４４】
当業者には容易に認識されるように、個体が自殺または自己破壊的行動をとるであろうリスクの予測または評価は、かなり不確定である。本明細書で使用するリスクのカテゴリーは、基底のリスクと比較して相対的に増加したリスクのレベルを反映することを意図する。この基底リスクは、当業者が、その患者に関して、その時点の患者の精神状態の試験、過去の病歴、家族歴、患者の病気の性質および病歴、併存する物質濫用の存在のような自殺の既知のリスクファクターなどに基づいて、概算する、リスクである。この基底リスクは、“カテゴリーＩ”リスク評価を構成する。カテゴリーIIリスクグループの患者は、ある一定期間中にタイプ１事象の相対的に高いリスクにあると予測される。増加したリスクはカテゴリーＩの患者の１.５、２.０、３.０または４.０倍である。カテゴリーIIIの患者は、タイプＩ事象のリスクが最高であり、カテゴリーＩの患者と比較して、３.０、４.０、５.０またはそれ以上のリスクにある。この増加したリスクは、ある一定期間中に患者が自殺もしくは自己破壊的行動をとる、またはタイプ１事象を経験するより大きな可能性を反映する。
【００４５】
本明細書で使用する“自殺企図”なる用語は、故意にまたは心的(internal)強迫観念もしくは病的思考(disordered thinking)に対する応答のいずれかにより拘束された個体による、彼または彼女自身の死のリスクを高める、行動を意味する。
【００４６】
本明細書で使用する“タイプ１事象”は、明白な自殺企図の発生、または自殺の切迫したリスクのための監視の増加したレベルを含む入院として定義され、自殺監視委員会(Suicide Monitoring Board)により確認されている。
【００４７】
本明細書で使用する“特別の自殺／自己破壊的行動予防策”は、個体が彼／彼女自身を傷つけるまたは殺すかもしれない可能性を減少する意図を有する、介護者などが取るすべての行動を意味する。これは、その後の病院内または病院外での、観察の増加した頻度、すなわち、来院の頻度の増加または、家族または友人が個体を見るための警戒の増加のいずれかまたはすべてを含むが、これに限定されず、すなわち、これは病院内では、観察の増加した頻度であってよく、すなわち、１５分毎のチェックの代わりに５分毎のチェック、または、患者を絶えず観察(アイコンタクト)するか、もしくは絶えず観察することに近づけるか(アームスレングス・アイコンタクト)または患者を彼らの部屋または観察室(完全室)に制限するか、患者の届く範囲の鋭利なまたは危険な物を除くか、極端な例では、患者を拘束手段内に入れる。
【００４８】
本明細書で使用する“クロザピン”は、薬物クロザピン(８−クロロ−１１−(４−メチル−１−ピペラジニル)−５Ｈ−ジベンゾ［ｂｅ］［１,４］ジアゼピン)およびその塩またはエステルを意味し、商品名薬物ＣＬＯＺＡＲＩＬ(登録商標)またはＬＥＰＯＮＥＸ(登録商標)、Novartis Pharmaceutical Corporation, East Hanover, NJを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
この多型の検出は、ある患者が処置中に自殺する可能性を決定または予測するために使用できる。この多型は、直接、または、多型変異体遺伝子の特徴的ｍＲＮＡの検出により、または体液もしくは組織中の遺伝子のポリペプチド(タンパク質)発現産物の検出および該存在の検出により検出できる。ポリペプチド発現産物の相対的レベルは、患者が同多型に関して異種接合体であるか同種接合体であるか、多型を有しないことが既知の個体である正常のコントロールグループとの比較により決定するのに使用できる。
【００５０】
ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物のレベルは、個体の既存の生理学的状態、環境、薬物療法、上流因子を含む多くの因子、およびまたプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、スプライス部位およびＥｘｏｎスプライシングエンハンサー部位の機能に影響する多型のような内在する遺伝的因子に依存する。
【００５１】
しかしながら、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物のレベルを測定することが可能である。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子発現産物(ＤＡＴ１)の利用能および親和性または濃度を試験するための一つの公開された方法は、ＤＡＴＢＰの測定を介する。低いＤＡＴＢＰは、鬱病および自殺の高い可能性と関連し得る。[１１Ｃ]ＲＴＩ−３２は、該ドーパミントランスポーターに非常に選択的なＰＥＴ造影放射リガンドである。Wilson, DaSilva & Houle (1994), supra; and Wilson, DaSilva & Houle (1996), supra; Seeman, Receptor Tables, Vol. 2, "Drug Dissociation Constants For Neuro receptor and Transporters", Schizophrenia Research (Toronto, 1993); Guttman et al., Neurology, 48(6): 1578-1583 (1997); and Carroll et al., J. Med. Chem., 38(2): 379-388 (1995)参照。
【００５２】
このＰＥＴ造影放射リガンド、すなわち、[１１Ｃ]ＲＴＩ−３２  ＰＥＴはＤＡＴＢＰの検出に使用できる。Meyer et al., Neuroreport, Vol. 12, No. 18, pp. 4121-4125(2001)参照。
【００５３】
別の態様において、ＤＡＴＢＰはまた[１２３Ｉ]−β−ＣＩＴ  ＳＰＥＣＴ法を介して決定できる。Neumeister et al. (2001), 前掲参照。
【００５４】
平均および中間の“正常”レベルが、各遺伝子型グループに関して決定されたら、各遺伝子型グループのＳＬＣ６Ａ３遺伝子産物の平均および標準偏差を決定すべきである。
【００５５】
これらのレベルは標準コントロールとして働く。ドーパミントランスポーターのレベルを、ある患者において、ＰＥＴ法またはＳＰＥＣＴ法のいずれかを使用して測定すべきである。
【００５６】
ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物の標準コントロールレベルを、故に、異なるコントロールグループで決定し、次いでそれをある患者のＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物の測定したレベルと比較する。この遺伝子発現産物は、その特定の遺伝子型グループまたはその遺伝子型グループのポリペプチド遺伝子発現産物と関連する特徴的ｍＲＮＡである。次いで、患者を、あるグループに関するコントロールレベルと比較して、測定したレベルがどの程度似ているかに基づいて、特定の遺伝子型グループに分類するか割り当てる。
【００５７】
当業者には理解されるように、この決定を行う際には一定の不確実さが伴う。したがって、コントロールグループレベルの標準偏差を、蓋然論的決定を行うために使用でき、本発明の方法は、遺伝子型グループ決定に基づいた広範囲の確率で適用できる。故に、例として、限定する目的ではなく、一つの態様において、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物の測定レベルが、コントロールグループの平均の２.５標準偏差内にあるとき、その個体はその遺伝子型グループに割り当ててよい。他の態様においてＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物の測定レベルが、コントロールグループの平均の２.０標準偏差内にあるとき、その個体は、その遺伝子型グループに割り当ててよい。さらに別の態様において、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物の測定レベルが、コントロールグループの平均の１.５標準偏差内にあるとき、その個体はその遺伝子型グループに割り当ててよい。また別の態様において、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子発現産物の測定レベルがコントロールグループのレベルの平均の１.０標準偏差またはそれ以下にあるとき、その個体はその遺伝子型グループに割り当ててよい。
【００５８】
故に、この方法は、種々の程度の確率で、特異的患者をどのグループに入れ、遺伝子型グループへのこのような割り当てが、次いで、個体が入れられるべきリスクカテゴリーを決定するものである、決定を可能にする。
【００５９】
故に、第一の局面において、本発明は、個体が処置中に自殺する可能性を決定する方法を提供する。これらの方法は：
(ａ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子型またはハプロタイプを決定し；そして
(ｂ)ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の１個またはそれ以上の多型変異体の存在または非存在に基づいて、リスクカテゴリーの決定を行う
ことを含む。
【００６０】
ＳＬＣ６Ａ３遺伝子は染色体５ｐ１５.３に位置する。
【００６１】
この多型の検出は、該個体が、処置中に自殺または自己破壊的行動を経験する可能性を決定または予測するために使用できる。加えて、該多型は直接、または、またはより一般的なＳＬＣ６Ａ３遺伝子型と対照的な多型変異体遺伝子の特異的ｍＲＮＡの検出により、または個体の体組織または体液におけるＳＬＣ６Ａ３遺伝子のポリペプチド発現産物の濃度の検出により、検出できる。
【００６２】
ｍＲＮＡレベルおよびポリペプチド遺伝子発現産物の検出および測定法は当分野で既知であり、ヌクレオチドマイクロアレイおよび、質量分析計および／または抗体検出を含むポリペプチド検出法および定量法を含む。Human Molecular Genetics, 2nd Edition. Tom Strachan and Andrew, Read. John Wiley and Sons, Inc. Publication, NY(1999)も参照。
【００６３】
さらに、体液または組織中のＳＬＣ６Ａ３遺伝子のポリペプチド(タンパク質)発現産物の濃度の検出は、多型の存在または非存在の決定に使用でき、ポリペプチド発現産物の相対的レベルは、多型が異種接合体または同種接合体状態で存在するかの決定、したがって、個体のリスクカテゴリーの決定に使用できる。
【００６４】
したがって、本発明の一つの態様は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子のタンパク質発現産物の存在および濃度の同定による、患者における該多型の存在または非存在を決定するための方法である。
【００６５】
他の態様において、本発明は、処置中の自殺または自己破壊的行動に関する個体のリスクカテゴリーの決定のための、および、適当な治療戦略を開始するための方法を提供する。これらの方法は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子のより一般的な変異体、すなわち、５９位のＡと、Ａの代わりにＧがある一般的ではない変異体に対応するｍＲＮＡの量および比率の測定を含む。この態様において、２種のｍＲＮＡの比率を、患者の体液または体組織サンプルにおいて決定する。すべてのｍＲＮＡがＡ変異体由来であるならば、該患者は処置中に自殺行動を取る可能性が低い(リスクカテゴリーＩ)。すべてのｍＲＮＡがＧ変異体由来であるならば、該患者は処置中に自殺行動を取る可能性がより高い(リスクカテゴリーIII)。しかしながら、両方のタイプのｍＲＮＡが見られたとき、患者は該多型に関して異種接合体であり、自殺行動の可能性は中程度であると期待される(リスクカテゴリーII)。
【００６６】
当業者は、本明細書に記載の具体的多型に加えて、該多型と連鎖不均衡(ＬＤ)であるすべての多型が、ＬＤである一塩基変異多型(ＳＮＰ)と同じように、同薬剤および治療に関する応答性を示唆する代用マーカーとして働き得ることを容易に認識するであろう。したがって、本明細書に記載のＳＮＰとＬＤであるすべてのＳＮＰが使用でき、本発明の方法に包含されることが意図される。
【００６７】
クロザピンが、比較物抗精神病剤よりも自殺傾向の減少に有効であることを決定するために、前向き、ランダム、並行−グループ試験を行い、自殺の高いリスクがあることが既知の統合失調症および統合失調性感情障害患者におけるクロザピン処置中の自殺傾向のリスクを、オランザピン(ＺＹＰＲＥＸＩＡ(登録商標))での処置と比較して評価する。
【００６８】
遺伝子の変異と、自殺傾向または薬剤応答の可能性のある関連を発見するために、第IV相臨床試験における薬理遺伝学的試験を行った。同試験は、薬剤標的、関連酵素またはトランスポーターをコードする遺伝子ならびに脳機能または統合失調症に関連すると考えられている遺伝子におけるどの多型が、該臨床試験中に試験される効果の臨床的パラメーターのいずれかと関連するか否かを見た。タイプ１事象の発生およびタイプ１事象までの時間を特に試験した。
【００６９】
薬剤標的に関連する、または、統合失調症と関連すると考えられている遺伝子の多型を、処置応答または臨床試験結果と関連し得る遺伝的因子を同定する目的で試験した。
上記の通り、ドーパミントランスポーター１遺伝子(ＳＬＣ６Ａ３またはＤＡＴ１)のＥｘｏｎ９における多型とタイプ１事象の間の非常に有意な関係(ｐ＝０.０００１)が観察された。
【００７０】
この第IV相試験の主要評価項目は、クロザピン(ＣＬＯＺＡＲＩＬ(登録商標)／ＬＥＰＯＮＥＸ(登録商標))処置したおよびオランザピン(ＺＹＰＲＥＸＡ(登録商標))処置した精神分裂病患者の間の自殺のリスクの比較であり、下記のいずれかで測定した：
１)基底から、最初の明白な自殺企図または自殺の切迫したリスクのための監視レベルの増加を含む入院までの時間；または
２)自殺傾向の重症度の臨床的包括評価(Clinical Global Impression of Severity of Suicidality)における基底値からの変化。
【００７１】
副次評価項目は下記に関連する自殺であった：
１)ＺＹＰＲＥＸＩＡ(登録商標)処置患者と比較した、クロザピン処置患者における自殺観念化の強度の減少の証明；および
２)ＺＹＰＲＥＸＩＡ(登録商標)処置患者と比較してクロザピン処置患者における自殺予防のための救済介入の数の減少を証明するため。
【００７２】
この臨床試験からの、四百二(４０２)名が、地元の倫理委員会により承認されたプロトコールにしたがった薬理医学的試験に同意した。十五(１５)ｍＬの血液を、臨床試験場所で患者から採った。ＤＮＡを、製造者の推奨にしたがいPUREGENETM DNA Isolation Kit(D50K)を使用して、Covance(Indianapolis, USA)により抽出した。http://www.gentra.com/purification_chemistries/puregene_protocols.asp?pid=1参照。
【００７３】
遺伝子型判定
一塩基変異多型(ＳＮＰ)を２つの別々の方法により同定した。Third Wave Technologies, Inc. (Madison, WI, USA)はＳＮＰの一つのコレクションを作成し、一方、他のセットは公的データベースから作成した。ＰｕｂＭｅｄのような、ＯＭＩＭ、ＳＮＰ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｌｏｃｕｓ  Ｌｉｎｋ、ｄｂＳＮＰおよびＪａｐａｎｅｓｅ  ＳＮＰデータベースのような公的データベースが利用可能であった。ＳＮＰ上の情報を作成した。候補遺伝子は、薬剤標的に関連するか、この疾患の病因に関連すると考えられている遺伝子であった。
【００７４】
遺伝子型判定のためのプローブセットをThird Wave Technologies, Inc.により設計し、合成した。遺伝子型判定を研究室内で、６０ngのゲノムＤＮＡ上で、インベーダー(登録商標)アッセイ(Third Wave Technologies, Inc)を使用して、製造者の推奨にしたがい行った。Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., 17(3):292-296(1999); およびRyan et al., Mol. Diagn., 4(2):135-144(1999)参照。
【００７５】
統計分析
ハーディ・ワインベルグ平衡(ＨＷＥ)からの偏差
合計４００名の患者からのデータを本試験に使用した。データを、確率検定を使用して、ＨＷＥからの可能性のある偏差に関して評価した。ハーディ・ワインベルグの法則は、対立遺伝子頻度は、ランダム交配した大集団において、世代毎に変化しないと述べている。ＨＷＥからの偏差は下記の２つの可能性の一方を示唆する：
１)遺伝子型判定の誤り；または
２)該多型と試験している該集団の間の関連性。
【００７６】
２番目の場合、特定の多型が、それが病因に何らかの関係があるとき、予測よりも多い頻度で観察され得る。
【００７７】
遺伝子型と臨床表現型の間の相関
分析した各ＳＮＰに関して、説明変数の遺伝子型クラスとのログランク検定を使用し、異なる遺伝子型クラスの間で、臨床結果における有意な差異が存在するか否かを決定した。＞５％のわずかな対立遺伝子頻度のＳＮＰのみを本分析に使用した。あるＳＮＰに関して、試験集団で同種接合体遺伝子型が＜１０％の頻度で見られたら、稀な同種接合体個体を異種接合体と共に分析のために集めた。
【００７８】
有意な結果の存在下で、コックスの比例ハザードモデルを使用し、遺伝子型クラスの危険率を概算した。ボンフェローニの補正を使用して、複数の試験を調節した。統計的分析を統計プログラムＳＡＳ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８.２(SAS, Cary, NC)を使用して行った。ＬＤ分析をＧＯＬＤ(登録商標)パッケージを使用して行った。Abecasis & Cookson, Bioinformatics, 16(2):182-183(2000)参照。フィッシャーの確率検定コントロール試験の場合に使用した。
【００７９】
遺伝子型判定した集団の代表的性質
該遺伝子型判定した集団が全臨床試験集団をどの程度代表するかを決定するために、遺伝子型判定したおよび非遺伝子型判定した集団の間のタイプ１事象の人数および発生を比較した。
【００８０】
遺伝子の変異およびタイプ１事象の間の関連試験
処置グループをまたぐ個人の分布を表１に示す。各遺伝子型に関して使用したサンプルの実数は、薬理遺伝学的試験への制限された参加または遺伝子型結果の欠失のために少ないことがある。
【表１】
2008505060.tif 000003
【００８１】
２２個の候補遺伝子から分かれた四十三(４３)多型を最初に遺伝子型判定した。これらの中で、２３多型が、本試験集団で稀な対立遺伝子頻度＞５％を示し、分析に使用した。試験した各多型に関して、生存分析を行った。説明変数の遺伝子型クラスとのログランク検定を使用し、異なる遺伝子型クラス間でのタイプ１事象までの時間の差異を試験した。上記の通り、タイプ１事象までの時間と、ドーパミントランスポーターＳＬＣ６Ａ３遺伝子(ＤＡＴ１としても既知)におけるＥｘｏｎ９の同義の多型(Ｅｘｏｎ９  Ａ５９Ｇ)の間の有意な関連が発見された(ｐ＝０.０００１)。複数の試験のためのボンフェローニの補正後、調節されたｐ値は０.００４１であった。Ｅｘｏｎ９で同定されたコード配列変異体は、Ａ→Ｇ置換に対応する。本試験において、ＧＡおよびＧＧ遺伝子型の個体は、ＡＡ遺伝子型の個体と比較して、タイプ１事象の高い発生率を有する。ＧＧ遺伝子型の個体は、特にタイプ１事象をより起こしやすいように見える。表２は、異なる遺伝子型グループに関するタイプ１事象を経験する個体数を列記する。
【表２】
2008505060.tif 000004
【００８２】
３つの遺伝子型グループの間の差異を定量化するために、コックスの比例ハザード検定をＥｘｏｎ９  Ａ５９Ｇ多型と行い、説明変数として処理し、後者を層別変数として処理した(表３参照)。有意な処置−遺伝子型相互作用は観察されなかった(ｐ＝０.６０４４)。
【表３】
2008505060.tif 000005
【００８３】
本発明の方法により処置できる状態
自殺行動または自己破壊的行動のリスクを、本発明の方法または本発明の化合物を使用して評価し得る病理学的心理学的(精神医学的)の例は、下記のものを含むが、これらに限定されず、これらの障害の完全な臨床的記述および診断基準に関してDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th Ed. (American Psychiatric Association (APA), Washington, DC, 1994) (DSM IVTM)を参照のこと。
統合失調症性障害
・統合失調症、緊張性、亜慢性、(２９５.２１)
・統合失調症、緊張性、慢性(２９５.２２)
・統合失調症、緊張性、急性増悪を伴う亜慢性(２９５.２３)
・統合失調症、緊張性、急性増悪を伴う慢性(２９５.２４)
・統合失調症、緊張性、寛解期(２９５.５５)
・統合失調症、緊張性、詳細不明(２９５.２０)
・統合失調症、分裂性、亜慢性(２９５.１１)
・統合失調症、分裂性、慢性(２９５.１２)
・統合失調症、分裂性、急性増悪を伴う亜慢性(２９５.１３)
・統合失調症、分裂性、急性増悪を伴う慢性(２９５.１４)
・統合失調症、分裂性、寛解期(２９５.１５)
・統合失調症、分裂性、詳細不明(２９５.１０)
・統合失調症、パラノイア、亜慢性(２９５.３１)
・統合失調症、パラノイア、慢性(２９５.３２)
・統合失調症、パラノイア、急性増悪を伴う亜慢性(２９５.３３)
・統合失調症、パラノイア、急性増悪を伴う慢性(２９５.３４)
・統合失調症、パラノイア、寛解期(２９５.３５)
・統合失調症、パラノイア、詳細不明(２９５.３０)
・統合失調症、未分化型、亜慢性(２９５.９１)
・統合失調症、未分化型、慢性(２９５.９２)
・統合失調症、未分化型、急性増悪を伴う亜慢性(２９５.９３)
・統合失調症、未分化型、急性増悪を伴う慢性(２９５.９４)
・統合失調症、未分化型、寛解期(２９５.９５)
・統合失調症、未分化型、詳細不明(２９５.９０)
・統合失調症、分類不能、亜慢性(２９５.６１)
・統合失調症、分類不能、慢性(２９５.６２)
・統合失調症、分類不能、急性増悪を伴う亜慢性(２９５.６３)
・統合失調症、分類不能、急性増悪を伴う慢性(２９５.９４)
・統合失調症、分類不能、寛解期(２９５.６５)
・統合失調症、分類不能、詳細不明(２９５.６０)
・妄想性(パラノイア)障害(２９７.１０)
・短期反応精神病(２９８.８０)
・統合失調症様障害(２９５.４０)
・統合失調性感情障害(２９５.７０)
・物質誘発性精神病性障害(２９７.３０)
・精神病性障害ＮＯＳ(非定型精神病)(２９８.９０)
【００８４】
情動障害
・大鬱性障害、精神病性特性を伴い重度(２９６.３３)
・気分変調性障害(３００.４)
・鬱性障害ＮＯＳ(３１１)
・双極性Ｉ障害、単一躁病的症状、精神病性特性を伴い重度(２９６.２３)
・双極性Ｉ障害、最近の症状軽躁(２９６.４３)
・双極性Ｉ障害、最近の症状躁、精神病性特性を伴い重度(２９６.４３)
・双極性Ｉ障害、最近の症状混合、精神病性特性を伴い重度(２９６.６３)
・双極性Ｉ障害、最近の症状鬱、精神病性特性を伴い重度(２９６.５３)
・双極性Ｉ障害、最近の症状詳細不明(２９６.８９)
・双極性II障害(２９６.８９)
・気分循環性障害(３０１.１３)
・双極性障害ＮＯＳ(３６６)
・一般的な医学的状態のための気分障害(２９３.８３)
・気分障害ＮＯＳ(２９６.９０)
・行為障害、単独攻撃型(３１２.００)
・行為障害、未分化型(３１２.９０)
・トゥーレット障害(３０７.２３)
・慢性運動および音声チック障害(３０７.２２)
・一過性チック障害(３０７.２１)
・チック障害ＮＯＳ(３０７.２０)
【００８５】
精神活性物質使用障害
・アルコール離脱譫妄(２９１.００)
・アルコール幻覚症(２９１.３０)
・アルコール中毒に関連するアルコール痴呆(２９１.２０)
・アンフェタミンまたは類似に作用する交感神経興奮剤中毒(３０５.７０)
・アンフェタミンまたは類似に作用する交感神経興奮剤譫妄(２９２.８１)
・アンフェタミンまたは類似に作用する交感神経興奮剤妄想障害(２９２.１１)
・カンナビス妄想障害(２９２.１１)
・コカイン中毒(３０５.６０)
・コカイン譫妄(２９２.８１)
・コカイン妄想障害(２９２.１１)
・幻覚剤幻覚(３０５.３０)
・幻覚剤妄想障害(２９２.１１)
・幻覚剤気分障害(２９２.８４)
・幻覚剤幻覚剤後知覚障害(２９２.８９)
・フェンシクリジン(ＰＣＰ)または類似に作用するアリールシクロヘキシルアミン中毒(３０５.９０)
・フェンシクリジン(ＰＣＰ)または類似に作用するアリールシクロヘキシルアミン譫妄(２９２.８１)
・フェンシクリジン(ＰＣＰ)または類似に作用するアリールシクロヘキシルアミン妄想障害(２９２.１１)
・フェンシクリジン(ＰＣＰ)または類似に作用するアリールシクロヘキシルアミン気分障害(２９２.８４)
・フェンシクリジン(ＰＣＰ)または類似に作用するアリールシクロヘキシルアミン有機金属障害ＮＯＳ(２９２.９０)
・他のまたは詳細不明精神活性物質中毒(３０５.９０)
・他のまたは詳細不明精神活性物質譫妄(２９２.８１)
・他のまたは詳細不明精神活性物質痴呆(２９２.８２)
・他のまたは詳細不明精神活性物質妄想障害(２９２.１１)
・他のまたは詳細不明精神活性物質幻覚(２９２.１２)
・他のまたは詳細不明精神活性物質気分障害(２９２.８４)
・他のまたは詳細不明精神活性物質不安障害(２９２.８９)
・他のまたは詳細不明精神活性物質人格障害(２９２.８９)
・他のまたは詳細不明精神活性物質有機金属障害ＮＯＳ(２９２.９０)
・器質性障害
・譫妄(２９３.００)
・痴呆(２９４.１０)
・器質性妄想障害(２９３.８１)
・器質性幻覚(２９３.８２)
・器質性気分障害(２９３.８３)
・器質性不安障害(２９４.８０)
・器質性人格障害(３１０.１０)
・有機金属障害(２９４.８０)
・強迫神経症障害(３００.３０)
・外傷後ストレス障害(３０９.８９)
・全般性不安障害(３００.０２)
・不安障害ＮＯＳ(３００.００)
・身体醜形障害(３００.７０)
・心気症または心気症性心気症(３００.７０)
・身体化障害(３００.８１)
・未分化型身体型障害(３００.７０)
・身体型障害ＮＯＳ(３００.７０)
・間欠性爆発性障害(３１２.３４)
・盗癖(３１２.３２)
・病的賭博(３１２.３１)
・放火癖(３１２.３３)
・抜毛癖(３１２.３９)
・衝動調節障害ＮＯＳ(３１２.３９)
【００８６】
人格障害
・パラノイア(３０１.００)
・統合失調症(３０１.２０)
・統合失調症性(３０１.２２)
・反社会的(３０１.７０)
・ボーダーライン(３０１.８３)
【００８７】
本明細書における“精神病”なる用語は、器質性精神病、薬物誘発精神病、アルツハイマー関連精神病のような精神病のすべての形、およびパラノイア人格障害のような精神病または他の精神障害に関連する状態などを含むことを意味する。
【００８８】
“統合失調症”および“統合失調症様”障害は、このような障害のすべてのタイプ、例えば、緊張性、分裂性、パラノイア、詳細不明および分類不能統合失調症および、それらのポジティブなおよびネガティブな症状を含むこのような疾患に関連するすべての状態を含む。
【００８９】
ＳＮＰの同定および特徴付け
一本鎖高次構造多型分析、変性性高速液体クロマトグラフィー(ＤＨＰＬＣ)によるヘテロ二本鎖分析、直接ＤＮＡ配列決定およびコンピュータ使用法を含む多くの方法を、ＳＮＰの同定および特徴付けに使用できる。Shi, Clin. Chem., 47:164-172(2001)参照。公的データベースにおける豊富な配列情報のおかげで、コンピュータを使用したツールを使用して、ある遺伝子(ｃＤＮＡまたはゲノム配列のいずれか)に対して独立して提出された配列を配置することにより、コンピュータ内でＳＮＰを同定できる。実験的におよびコンピュータ内での方法により得られたＳＮＰの比較は、ＳＮＰＦｉｎｄｅｒ(http://Ipgws.nci.nih.gov:82/perl/snp/snp_cgi.pl)により発見された５５％の候補ＳＮＰがまた実験的に発見されることを示す。Cox, Boillot and Canzian, Hum. Mutal., 17(2):141-150(2001)参照。しかしながら、これらのコンピュータ内での方法は、真のＳＮＰの２７％しか発見しない。
【００９０】
最も一般的なＳＮＰ分類法は、現在、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法および開裂法を含む。これらの方法の各々は、適当な検出システムと接続しなければならない。検出法は、蛍光極性化(Chen, Levine and Kwok, Genome Res., 9(5)：492-499(1999)参照)、ピロホスフェート放出の発光検出(pyrosequencing)((Ahmadiian et al., Anal. Biochem., 280(1):103-110(2000)参照)、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)−に基づく開裂アッセイ、ＤＨＰＬＣおよび質量分析(Shi(2001), 前掲；および米国特許６,３００,０７６Ｂ１参照)を含む。ＳＮＰを検出し、特徴付けする他の方法は、米国特許６,２９７,０１８Ｂ１および６,３００,０６３Ｂ１に記載されている。上記引用文献の記載は、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【００９１】
特定の好ましい態様において、多型の検出は、いわゆるインベーダー(商標登録)法(Third Wave Technologies Inc. Madison, WIから入手可能)の手段により達成できる。このアッセイにおいて、特異的上流“インベーダー”オリゴヌクレオチドおよび部分的に重複する下流プローブが、ＤＮＡ鋳型に結合したとき、一緒に特異的構造を形成する。この構造を開裂酵素により認識し、特異的部位で切断し、これがプローブオリゴヌクレオチドの５'フラップの放出をもたらす。次いで、このフラグメントが、反応混合物に含まれる合成二次標的および二次蛍光標識シグナルプローブに対する“インベーダー”オリゴヌクレオチドとして働く。これが、開裂酵素による二次シグナルプローブの特異的開裂をもたらす。蛍光シグナルが、蛍光共鳴エネルギー移動が可能な色素分子で標識されたこの二次プローブが開裂したときに発生する。開裂は、重複ＤＮＡ配列またはフラップにより形成される構造に対して厳密な要件を有し、したがって、ＤＮＡ鎖の下流の開裂部位の直ぐ上流の一塩基対ミスマッチの特異的検出に使用できる。Ryan et al. (1999), 前掲; およびLyamichev et al. (1999), 前掲参照、また米国特許５,８４６,７１７および６,００１,５６７も参照、これらの記載は、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【００９２】
ある態様において、組成物は、ヌクレオチドの２個またはそれ以上の多型部位の同一性の同時の探索のために、２個またはそれ以上の別々に標識した遺伝子型判定オリゴヌクレオチドを含む。また、プライマー組成物が、多型部位を含む２個またはそれ以上の領域の同時のターゲティングおよび増幅を可能にするために、対立遺伝子特異的プライマー対の２個またはそれ以上のセットを含み得ることも意図する。
【００９３】
本発明のＳＬＣ６Ａ３遺伝子型判定オリゴヌクレオチドはまたマイクロチップ、ビーズまたはガラススライドのような固体表面上に固定化し、またはそこで合成してよい。例えば、ＷＯ９８／２００２０およびＷＯ９８／２００１９参照。このような固定化遺伝子型判定オリゴヌクレオチドはまたプローブハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ伸長アッセイを含むが、これらに限定されない種々の多型検出アッセイに使用し得る。本発明の固定化ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型判定オリゴヌクレオチドは、同時に複数の遺伝子における多型に関するＤＮＡサンプルの急速スクリーニングのために設計されたオリゴヌクレオチドの秩序配列を含み得る。
【００９４】
本発明の対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)プライマーは、３'末端ヌクレオチド、または好ましくは３'末端から２番目のヌクレオチドを含み、それは、特定のＳＮＰのヌクレオチドにのみ相補的であり、それによりそのヌクレオチドを含む対立遺伝子が存在するときにのみ、ポリメラーゼ−介在伸長のプライマーとして働く。コード鎖または非コード鎖のいずれかとハイブリダイズするＡＳＯプライマーは、本発明により意図される。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子多型を検出するためのＡＳＯプライマーは、当業者に既知の技術を使用して開発できる。
【００９５】
本発明の他の遺伝子型判定オリゴヌクレオチドは、本発明で同定された新規多型部位の一つの一から数ヌクレオチド下流に位置する標的領域とハイブリダイズする。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の新規多型の一つを検出するためのポリメラーゼ−介在プライマー伸長法において有用であり、したがってこのような遺伝子型判定オリゴヌクレオチドは、本明細書で“プライマー−伸長オリゴヌクレオチド”と呼ぶ。好ましい態様において、プライマー−伸長オリゴヌクレオチドの３'−末端は、多型部位に直ぐに隣接して位置するヌクレオチドと相補的なデオキシヌクレオチドである。
【００９６】
他の態様において、本発明は、別々の容器に包装された少なくとも２個の遺伝子型判定オリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。同キットは、別々の容器に包装されたハイブリダイゼーション緩衝液(オリゴヌクレオチドをプローブとして使用するとき)のような他の成分も含んでよい。あるいはオリゴヌクレオチドを標的領域の増幅に使用するとき、同キットは、別々の容器に包装された、ポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)のようなポリメラーゼが介在するプライマー伸長法のために最適化した反応緩衝液を含んでよい。
【００９７】
上記のオリゴヌクレオチド組成物およびキットは、個体のＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子型判定および／またはハプロタイプ判定(haplotyping)のための方法に有用である。本明細書で使用する“ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型”および“ＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプ”なる用語は、本明細書に記載の新規多型部位の１個またはそれ以上に存在するヌクレオチド対またはヌクレオチドを各々含み、所望により、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子における１個またはそれ以上の付加的多型部位に存在するヌクレオチド対またはヌクレオチドを含んでよい、遺伝子型またはハプロタイプを意味する。付加的多型部位は現在知られている多型部位または今後発見される部位であってよい。
【００９８】
遺伝子型判定法の一つの態様は、個体に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の２コピーを含む核酸混合物、またはそのフラグメントを個体から単離し、この２コピーにおける１個またはそれ以上の多型部位でヌクレオチド対の同一性を決定し、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型を同個体に割り当てることを含む、方法である。当業者には容易に理解されるように、個体における遺伝子の２“コピー”は、同じ対立遺伝子または異なる対立遺伝子であってよい。特に好ましい態様において、該遺伝子型判定法は、各多型部位でヌクレオチド対の同一性を決定することを含む。
【００９９】
典型的に、核酸混合物またはタンパク質を、血液サンプルまたは組織サンプルのような、個体から摂取した生物学的サンプルから単離する。適当な組織サンプルは、全血、精液、唾液、涙液、尿、糞便、汗、頬塗抹標本、皮膚ならびに、筋肉または神経組織および毛髪のような特異的臓器組織の生検サンプルを含む。核酸混合物は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡから成り、後者２例においては、生物学的サンプルはＳＬＣ６Ａ３遺伝子が発現される臓器から単離すべきである。さらに当業者には、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物が、イントロンにまたは５'および３'非転写領域に位置する多型の検出に使用すべきでないことは認識されよう。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子フラグメントを単離したら、それは遺伝子型判定すべき多型部位(複数もある)を含むべきである。
【０１００】
ハプロタイプ判定法の一つの態様は、個体に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の２コピーの一つのみを含む核酸分子、またはそのフラグメントを個体から単離し、そのコピーにおいて、そのコピー中の１個またはそれ以上の多型部位のヌクレオチドの同一性を決定し、個体にＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプを割り当てることを含む。核酸は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子またはフラグメントの２コピーを分離できる任意の方法を使用して単離でき、ＳＬＣ６Ａ３イソ遺伝子の調整に関して上記の方法を含むが、これらに限定されず、標的化インビボクローニングが好ましい方法である。
【０１０１】
当業者には容易に認識されるように、すべての個々のクローンは、個体に存在する２個のＳＬＣ６Ａ３遺伝子コピーの一方のハプロタイプ情報しか提供しない。ハプロタイプ情報が個体の他のコピーに関して記載されているとき、付加的ＳＬＣ６Ａ３クローンを試験する必要がある。典型的に、個体のＳＬＣ６Ａ３遺伝子の両方のハプロタイプ判定の９０％以上の確率を得るために、少なくとも５クローンを試験すべきである。特に好ましい態様において、多型部位の各々のヌクレオチドを同定する。
【０１０２】
好ましい態様において、ＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプ対を、個体に存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の各コピーにおける多型部位での各コピーの１個またはそれ以上のヌクレオチドの位相配列(phased sequence)の同定により決定する。特に好ましい態様において、ハプロタイプ判定法は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の各コピーにおける多型部位でのヌクレオチドの位相配列の同定を含む。遺伝子の両コピーをハプロタイプ判定するとき、同定工程は好ましくは別々の容器に入れられた遺伝子の各コピーで行う。しかしながら、２コピーを異なる標識で標識するか、他の方法で別々に識別可能または同定可能であるとき、同方法を同じ容器中で行うことが可能であることも想定する。例えば、該遺伝子の第一および第２コピーを異なる第一および第二蛍光色素で各々標識し、そしてさらに第三蛍光色素で標識したＡＳＯを多型部位(複数もある)のアッセイに使用するとき、第一および第三色素の組合せの検出は第一遺伝子コピーにおける多型を同定し、一方、第二および第三色素の組合せの検出は、第二遺伝子コピーにおける多型を同定する。
【０１０３】
遺伝子型判定およびハプロタイプ判定法の両方において、ヌクレオチド(またはヌクレオチド対)の多型部位(複数もある)での同一性は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の一方または両方に直接由来する多型部位(複数もある)を含む標的領域(複数もある)またはフラグメントを増幅し、増幅した領域(複数もある)の配列を慣用法により決定することにより決定し得る。当業者には、一方のヌクレオチドのみがその部位で同種接合体である個体の多型部位で検出され、個体がその部位について異種接合体であるとき、２個の異なるヌクレオチドが検出されることは、容易に認められよう。該多型は、ポジティブタイプ同定として既知のように直接、または、ネガティブタイプ同定と見なされる推論により同定できる。例えば、ＳＮＰが基準集団においてグアニンおよびシトシンであることが知られているとき、その部位は、その部位で同種接合体である病気の個体でグアニンまたはシトシンであるか、その部位で異種接合体である個体のとき、グアニンおよびシトシンの両方であるか、ポジティブに決定できる。あるいは、その部位はグアニンではない(すなわちシトシン／シトシン)またはシトシンではない(すなわちグアニン／グアニン)であるとネガティブに決定できる。
【０１０４】
加えて、本明細書に記載の新規多型部位のすべてに存在する対立遺伝子(複数もある)の同一性を、目的の多型部位とＬＤである、本明細書に記載していない多型部位の遺伝子型判定により間接的に決定できる。一つの部位の特定の変異体の存在が、第二の部位の他の変異体の予測を増強するとき、２つの部位はＬＤであると言う。Stevens, Mol. Diag., Vol. 4, pp. 309-317(1999)参照。本明細書に記載の多型部位と連鎖不均衡にある多型部位は、同遺伝子の領域内に、または、本明細書には記載していない他のゲノム領域に位置し得る。本明細書に記載の新規多型部位とＬＤにある多型部位の遺伝子型判定は、多型部位の対立遺伝子の同一性を検出するための上記の方法のいずれかを含むが、これに限定されない方法により行うことができる。
【０１０５】
標的領域(複数もある)を、ＰＣＲ(米国特許４,９６５,１８８参照)、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)(Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, No. 1, pp. 189 193(1991); およびＷＯ９０／０１０６９参照)およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(ＯＬＡ)(Landegren et al., Science, Vol. 241, pp. 1077-1080(1988)参照)を含むが、これらに限定されない任意のオリゴヌクレオチド−定方向増幅法を使用して増幅し得る。このような方法においてプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドは、多型部位を含むか、それに隣接する核酸領域と特異的にハイブリダイズしなければならない。典型的に、オリゴヌクレオチドは１０−３５ヌクレオチド長および好ましくは、１５−３０ヌクレオチド長である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは２０−２５ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドの正確な長さは当業者が通常考慮し、実施している多くの因子に依存する。
【０１０６】
他の既知の核酸増幅法は、標的領域の増幅に使用し得、転写−ベースの増幅システム(米国特許５,１３０,２３８；ＥＰ３２９,８２２；米国特許５,１６９,７６６およびＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６７００参照)および等温法を含む。Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(1):392-396(1992)参照。
【０１０７】
標的領域における多型はまた当分野で既知のいくつかのハイブリダイゼーション−ベースの方法の一つを使用して、増幅の前または後にアッセイできる。典型的に、ＡＳＯはこのような方法の実施に利用する。ＡＳＯを別々に標識したプローブ対として使用し、対の一方のメンバーは標的配列の一つの変異体に完全な適合を示し、他方のメンバーは異なる変異体に完全な適合を示す。ある態様において、１個以上の多型部位を、ＡＳＯまたはオリゴヌクレオチド対のセットの使用により一度に検出できる。好ましくは、同セットのメンバーは、検出すべき多型部位の各々にハイブリダイズしたとき、互いに、５℃以内およびより好ましくは２℃以内の融点を有する。
【０１０８】
標的ポリヌクレオチドへのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、溶液中の両方の物質で行い得、または、このようなハイブリダイゼーションは、いずれかのオリゴヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドが、固体支持体に共有結合的にまたは非共有結合的に結合しているとき、行い得る。結合は、例えば、抗体−抗原相互作用、ポリ−Ｌ−Ｌｙｓ、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン、塩架橋、疎水性相互作用、化学結合、熱固化ＵＶ架橋などが仲介し得る。ＡＳＯは固体支持体上に直接合成するか、または、合成後に固体支持体に結合してよい。本発明の検出法における使用に適当な固体支持体は、シリコン、ガラス、プラスチック、紙などから成る支持体を含み、それらは、例えば、ウェル(９６ウェルプレートのような)、スライド、シート、膜、繊維、チップ、皿およびビーズに形作られていてよい。該固体支持体を、ＡＳＯまたは標的核酸の固定を容易にするために、処理し、被覆し、または誘導体化してよい。
【０１０９】
個体のＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子型またはハプロタイプを、また、ＷＯ９５／１１９９５に記載のように、遺伝子の１個または両方のコピーを含む核酸サンプルの、核酸アレイおよびサブアレイとハイブリダイゼーションすることにより決定できる。アレイは、遺伝子型またはハプロタイプに包含されるべき多型部位の各々を代表するＡＳＯの一式を含む。
【０１１０】
多型の同一性は、また、リボプローブを使用したＲＮａｓｅ保護法(Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7575(1985);およびMeyers et al., Science, 230:1242(1985)参照)および、ヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質、例えば大腸菌ｍｕｔＳタンパク質を含むが、これらに限定されないミスマッチ検出法を使用して決定できる。Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)参照。あるいは、変異体対立遺伝子は、一本鎖高次構造多型(ＳＳＣＰ)分析(Orita et al., Genomics, 5:874-879(1989); Humphries et al., “Molecular Diagnosis of Genetic Diseases”, Elles, Ed., pp. 321-340(1996))または変性濃度分配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)により同定できる。Wartell, Hosseini & Moran Jr., Nucl. Acids Res., 18(9):2699-2706(1990);およびSheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236(1989)参照。
【０１１１】
ポリメラーゼ−介在プライマー伸長法も多型(複数もある)の同定に使用できる。いくつかのこのような方法が特許および科学文献に記載され、“Genetic Bit Analysis”法(ＷＯ９２／１５７１２参照)およびリガーゼ−／ポリメラーゼ−介在遺伝子ビット分析(米国特許５,６７９,５２４参照)を含む。関連法は、ＷＯ９１／０２０８７、ＷＯ９０／０９４５５、ＷＯ９５／１７６７６、米国特許５,３０２,５０９および５,９４５,２８３に記載されている。多型を含む伸長したプライマーは、米国特許５,６０５,７９８に記載のように質量分析により検出できる。他のプライマー伸長法は、対立遺伝子−特異的ＰＣＲである。Ruano and Kidd, Nucl. Acids Res., 17:8392(1989); Ruano et al., Nucl. Acids Res., 19(24):6877-6882(1991); ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２２４５６;およびTurki et al., J. Clin. Invest., 95:1635-1641(1995)参照。加えて、複数の多型部位を、Wallace et al. (ＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／１０４１４)に記載のように、対立遺伝子−特異的プライマーのセットを使用した核酸の複数領域の同時の増幅により試験できる。
【０１１２】
好ましい態様において、各民族地理学的(ethnogeographic)グループのハプロタイプ頻度データを試験し、それがＨＷＥと一致するか否かを決定する。ＨＷＥ(Hartl et al., “Principles of Population Genomics”, 3rd Edition (Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1997)参照)は、ハプロタイプ対Ｈ１／Ｈ２の発見の頻度が、Ｈ１≠Ｈ２のときＰＨ−Ｗ(Ｈ１／Ｈ２)＝２ｐ(Ｈ１)ｐ(Ｈ２)と等しく、Ｈ１＝Ｈ２のときＰＨ−Ｗ(Ｈ１／Ｈ２)＝ｐ(Ｈ１)ｐ(Ｈ２)と等しいことを仮定する。観察されたハプロタイプ対頻度と予期した値の統計的に有意な差は、集団グループにおける著しい近親交配、遺伝子上の強い選択圧、サンプリングのバイアスおよび／または遺伝子型判定法における誤りを含む、１個またはそれ以上の因子のためである。ＨＷＥからの大きな偏差が民族地理学的グループで観察されたとき、そのグループの個体数を増やし、その偏差がサンプリングのバイアスによるものであるか否か見ることができる。より大きなサンプルサイズが、観察されたハプロタイプ対頻度と予期した値の間の差を減少しないとき、個体を、例えば、CLASPER System(登録商標) technology(米国特許５,８６６,４０４参照)または対立遺伝子−特異的長距離ＰＣＲのような直接ハプロタイプ判定法を使用して、ハプロタイプ判定することを考えてよい。Michalotos-Beloin et al., Nucl. Acids Res., 24(23):4841-4843(1996)参照。
【０１１３】
ＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプ対を予測するためのこの方法の一つの態様において、割り当て工程は、下記の分析を行うことを含む。第一に、可能性のあるハプロタイプ対の各々を、基準集団におけるハプロタイプ対に包含させる。一般に、基準集団におけるハプロタイプ対の１個のみが可能性のあるハプロタイプ対とマッチし、その対を該個体に割り当てる。時折、基準ハプロタイプ対の代表的な１個のハプロタイプのみ、個体の可能性のあるハプロタイプ対と一致し、このような場合、該個体をこの既知のハプロタイプおよび可能性のあるハプロタイプ対由来の新規ハプロタイプを含むハプロタイプ対に割り当てる。稀な例で、基準集団におけるハプロタイプのいずれも可能性のあるハプロタイプ対と一致しないか、または別の場合、複数の基準ハプロタイプ対が可能性のあるハプロタイプ対と一致する。このような場合、個体を好ましくは、例えば、CLASPER SystemTM technology(米国特許５,８６６,４０４参照)、ＳＭＤまたは対立遺伝子−特異的長距離ＰＣＲのような直接分子ハプロタイプ判定法でハプロタイプ判定する。Michalotos-Beloin et al. (1996), 前掲参照。
【０１１４】
本発明はまた集団中のＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプの頻度の決定法を提供する。該方法は、遺伝子型またはハプロタイプがＦＳ６３  ＴＥＲ多型を含むがこれに限定されない、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子における１個またはそれ以上の多型部位で検出されるヌクレオチド対またはヌクレオチドから成る、集団の各メンバーに存在するＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子型またはハプロタイプ対の決定；および特定の遺伝子型またはハプロタイプが集団で発見される頻度を計算することを含む。該集団は基準集団、家族集団、同性集団、集団グループ、特性集団、例えば、医学的状態または治療的処置に対する応答のような目的の特性を示す個体のグループであってよい。
【０１１５】
本発明の他の局面において、基準集団において見られるＳＬＣ６Ａ３遺伝子型および／またはハプロタイプの頻度データを、特性とＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプの間の関係を同定する方法に使用する。該特性は、疾患への感受性または処置への応答を含むが、これらに限定されないすべての検出可能な表現型であってよい。該方法は、基準集団および該特性を示す集団における遺伝子型(複数もある)またはハプロタイプ(複数もある)の頻度のデータの獲得を含む。基準および特性集団の一方または両方の頻度データは、上記の方法の一つを使用した、集団における各個体の遺伝子型判定またはハプロタイプ判定により得ることができる。特性集団のハプロタイプを直接決定するか、または、上記のような予測的遺伝子型対ハプロタイプ法により決定できる。
【０１１６】
他の態様において、基準および／または特性集団の頻度データを、予め決定した頻度データ(電子形で書かれていてよい)の評価により得る。例えば、該頻度データは、コンピュータでアクセス可能なデータベースに存在し得る。該頻度データを得たら、基準および特性集団における遺伝子型(複数もある)またはハプロタイプ(複数もある)の頻度を比較する。好ましい態様において、集団で観察される全での遺伝子型および／またはハプロタイプの頻度を比較する。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の特定の遺伝子型またはハプロタイプが、特性集団において統計的有意な量で基準集団より頻繁であるとき、該特性をＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプと関連すると予測する。
【０１１７】
好ましい態様において、統計的分析を、ボンフェローニの補正を伴う分散分析(ＡＮＯＶＡ)試験および／または遺伝子型表現型相関を複数回模倣し、有意な値を計算するブートストラッピング法の標準分析の使用により行う。多くの多型を分析するとき、因子の補正を行い、偶然発見されるであろう有意な関係を補正してよい。本発明の方法で使用する統計法に関して、“Statistical Methods in Biology”, Third Edition, Bailey, ed., Cambridge Univ. Press(1997); “Introduction to Computational Biology”, Waterman, Ed., CRC Press(2000); および“Bioinformatics”, BaxevanisおよびOuellette, ed., John Wiley & Sons, Inc. (2001)を参照。
【０１１８】
該方法の好ましい態様において、目的の特性は、いくつかの治療的処置に対して患者が示す臨床的応答、例えば、ＳＬＣ６Ａ３を標的とする薬剤に対する応答または医学的状態のための治療的処置に対する応答である。
【０１１９】
本明細書で使用する“連鎖不均衡”(ＬＤ)は、遺伝子のマーカーのある組み合わせが、集団内で、ゲノムで離れている距離に基づいて予期されるまたは偶然のみよりも多いか少ない頻度で一緒に起こる状態を意味する。これは、ゲノムのこの領域における減少した組み換えまたは、マーカーの一方が集団内に挿入されていたため、平衡に達するのに十分な時間がなかった創始者効果に由来するものである可能性がある。
【０１２０】
マーカーがそれらがあるべきであるよりも頻繁に発生するとき、これはまたマーカーがゲノム上で近く、したがって、統合して受け継がれる傾向にあることを意味する。いずれの場合も、一方のマーカーの存在が、他方のマーカーが特定の患者にも存在するという傾向を高める。この状況において、患者ゲノム中のこれらのマーカーの存在が、他方の代用マーカーとして使用できる。一方のマーカーが他方よりも簡単に検出できるとき、目的の特異的なものよりも容易に検出できるものを試験する方が望ましいことがある。連鎖不均衡におけるマーカーは、何らかの任意の機能的関係を有しても有しなくてもよい。マーカーが一緒に受け継がれる傾向は、座間の組み換えの割合により測定し得る。
【０１２１】
本明細書において使用される“代用マーカー”は、目的のＳＬＣ６Ａ３遺伝子のマーカーと一緒に、偶然から予測されるよりも頻繁に一緒に発生する傾向にある、ＳＮＰのような遺伝子のマーカー、または特異的遺伝子型またはハプロタイプを意味する。したがってこの代用マーカーの検出は、本発明の方法において、目的のマーカーが偶然から予測されるよりも高い可能性で存在するという指標として使用できる。この関連が十分に意味があるとき、代用マーカーの検出を目的のマーカーの存在の指標として使用できる。本発明のすべての方法は、目的のＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプと関連して起きることが示されている代表マーカーの使用を成し得る。
【０１２２】
したがって、本発明の一つの態様において、目的のＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプとＬＤである検出可能な遺伝子型またはハプロタイプを代用マーカーとして使用できる。ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型とＬＤである遺伝子型は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子に対する特定の遺伝子型またはハプロタイプが、統計的有意な割合または量で、基準集団におけるよりも、可能性のある代用マーカー遺伝子型をまた証明する集団において頻繁であるか否かを決定することにより発見できる。このような場合、このマーカー遺伝子型を、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプと関係があると予測し、そして、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型の代わりに代用マーカーとして使用できる。本発明の種々の態様において、代用マーカーを、このマーカーが目的のマーカーと一緒に発生する可能性が５０％より多い、好ましくは６０％より多い、より好ましくは７０％より多い、さらにより好ましくは８０％より多い、またはさらに好ましい態様において９０％より多い、またはより好ましい態様において９５％より多いとき、この方法で使用できる。
【０１２３】
本明細書で使用する“医学的状態”は、処置が望まれる１個またはそれ以上の肉体的および／または心理学的徴候として発症するすべての状態または疾患を含むが、これらに限定されず、以前におよび新たに同定された疾患および他の障害を含む。
【０１２４】
本明細書で使用する“多型”なる用語は、集団内で＞１％の頻度で存在する配列変異体を意味する。該配列変異体は、５％または１０％またはそれ以上のような１％より有意に高い頻度で存在してよい。また、本用語は、個体において多型部位で観察される配列変異体を言及するために使用してよい。多型は、ヌクレオチド置換、挿入、欠失およびマイクロサテライトを含み、必ずしもではないが、遺伝子発現またはタンパク質機能に検出可能な差異をもたらしてよい。
【０１２５】
本明細書で使用する“臨床応答”なる用語は、下記のいずれかまたはすべてを意味する：応答、応答なしおよび不利な応答、すなわち副作用の定量的測定。
【０１２６】
本明細書で使用する“対立遺伝子”なる用語は、特異的染色体位置(座)での遺伝子またはＤＮＡ配列の特定の形を意味する。
【０１２７】
本明細書で使用する“遺伝子型”は、個体の相同染色体の対上の座の１個またはそれ以上の多型部位で発見されるヌクレオチド対(複数もある)の非位相５'から３'配列を意味する。本明細書で使用する遺伝子型は、完全−遺伝子型および／またはサブ−遺伝子型を含む。
【０１２８】
本明細書で使用する“ポリヌクレオチド”は、非修飾もしくは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってよいすべてのＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。ポリヌクレオチドは、限定しないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的に二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域を意味する。ポリヌクレオチドなる用語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性または他の理由のために主鎖を修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【０１２９】
本明細書で使用する“一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)”なる用語は、集団内の、ゲノムにおける一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド変異の発生を意味する。ＳＮＰは、遺伝子内またはゲノムの遺伝子間領域内で起こり得る。
【０１３０】
本明細書で使用する“遺伝子”なる用語は、プロモーター、Ｅｘｏｎ、イントロン、および他の発現を制御する非翻訳領域を含む、ＲＮＡ産物の生合成を制御するための全情報を含む、ＤＮＡのセグメントを意味する。
【０１３１】
本明細書で使用する“ポリペプチド”なる用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチド等量式(isostere)により互いに結合した２個またはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。ポリペプチドは一般にペプチド、グリコペプチドまたはオリゴマーと呼んでいる短鎖、および一般にタンパク質と呼んでいるより長い鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、２０遺伝子−コードアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセッシングのような天然の過程で、または、当分野で既知の化学修飾法により修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基礎的テキストに、およびより詳細にモノグラフに、ならびに、多くの研究論文に記載されている。
【０１３２】
本明細書で使用する“多型部位”なる用語は、少なくとも２個の別の配列が集団中で見られる座における位置を意味し、その最も頻繁なものは９９％を超えない頻度を有する。
【０１３３】
本明細書で使用する“ヌクレオチド対”なる用語は、個体由来の染色体の２コピー上の多型部位で見られるヌクレオチドを意味する。
【０１３４】
本明細書で使用する“位相”は、ヌクレオチド対の配列を、座中の２個またはそれ以上の多型部位に当てはめたとき、座の１コピー上のこれらの多型部位に存在するヌクレオチドの組合せが既知であることを意味する。
【０１３５】
臨床的処置への応答とＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプの間の相関を導き出すために、処置を受けている個体の集団(以後“臨床集団”と呼ぶ)により示される臨床応答のデータを得ることが必要である。この臨床データは、すでに行われている臨床試験の結果の分析により得ることができ、および／または臨床データは、１個またはそれ以上の新規臨床試験の計画および実施により得ることができる。
【０１３６】
本明細書で使用する“臨床試験”なる用語は、特定の処置に対する応答の臨床データを得るために設計されたすべての研究試験を意味し、第Ｉ相、第II相および第III相臨床試験を含むが、これらに限定されない。標準法を使用して、患者集団を定義し、対象を登録する。
【０１３７】
本明細書で使用する“座”なる用語は、遺伝子もしくは肉体的または表現型特徴に対応する染色体またはＤＮＡ分子上の位置を意味する。
【０１３８】
臨床集団に包含される個体が、目的の医学的状態の存在に関して段階的であることが好ましい。これは、患者が示す徴候(複数もある)が１個以上の基礎を成す状態によりもたられ得るとき、および、基礎を成す状態の処置が同じでないとき、特に重要である。この例は、患者が、喘息または呼吸器感染のいずれかが原因の呼吸困難を経験するものであろう。両方の発症を喘息薬物で処置したとき、実際に喘息を有しなかった見かけ上の非応答者の疑似グループが存在するであろう。これらの人々は、ハプロタイプおよび処置結果の間の相関を検出する能力に影響し得る。可能性のある患者のこの段階付けは、標準的肉体的試験または１個またはそれ以上の実験室における試験を用いる。あるいは、患者の段階付けは、ハプロタイプ対と疾患感受性または重症度の間に強い相関がある状況のとき、ハプロタイプ判定を使用する。
【０１３９】
目的の治療的処置は、試験集団の各個体への投与であり、該処置に対する各個体の応答を１個またはそれ以上の予定した基準を使用して測定する。多くの場合、試験集団は広範囲の応答を示し、試験者は、種々の応答により作成した応答者グループの数、例えば、低、中程度および高を選択する。加えて、試験集団における各個体のＳＬＣ６Ａ３遺伝子を遺伝子型判定しおよび／またはハプロタイプ判定し、これは処置の適用前または後であってよい。
【０１４０】
臨床および多型データの両方を得た後、個々の応答とＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプの内容の間の相関関係を作成する。相関関係はいくつかの方法で作成できる。一つの方法では、個体をＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプ(またはハプロタイプ対)(多型グループとも呼ぶ)によりグループ分けし、次いで、各多型グループのメンバーが示す臨床応答の平均および標準偏差を計算する。
【０１４１】
これらの結果を次いで分析し、臨床応答と多型グループの間の観察された変化が統計的有意であるか否か決定する。使用し得る統計分析法は、Fisher and vanBelle, “Biostatistics:A Methodology for the Health Sciences”, (Wiley lnterscience, NY, 1993)に記載されている。この分析はまたＳＬＣ６Ａ３遺伝子におけるどの多型部位が、表現型の差異に最も有意に関与するかの回帰計算を含む。
【０１４２】
ＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプの内容と臨床応答の間の相関関係を発見するための第二の方法は、エラー最小化最適アルゴリズム(error-minimizing optimization algorithm)に基づく予測的モデルを使用する。多くの可能性のある最適化アルゴリズムの一つは、遺伝子のアルゴリズムである。Judson, “Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry”, Reviews in Computational Chemistry, Lipkowitz and Boyd, Eds., Vol. 10, pp. 1-73, VCH Publishers, NY(1997)参照。疑似アニーリング(Press et al., “Numerical Recipes in C:The Art of Scientific Computing”, Ch. 10, Cambridge University Press, Cambridge(1992)参照)、神経回路網(Rich and Knight, “Artificial Intelligence”, Second Edition, Ch. 18, McGraw-Hill, New York(1991)参照)、標準傾斜降下法(Press et al. (1992), 前掲参照)または他の全体的または局所最適化法(Judson(1997), 前掲における考察参照)も使用できる。好ましくは、相関関係は、２０００年６月２６日出願の“ハプロタイプデータの入手および使用のための方法”なる標題のＰＣＴ出願に記載の遺伝子のアルゴリズム法を使用して発見する。
【０１４３】
相関関係は、また、臨床データにおけるその変異のどの程度が、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の多型部位の異なるサブセットにより説明できるか、ＡＮＯＶＡ法を使用して分析してよい。２０００年６月２６日出願の“ハプロタイプデータの入手および使用のための方法”なる標題のＰＣＴ出願に記載のように、ＡＮＯＶＡを使用して、応答の変動が、測定できる１個またはそれ以上の特性または変異体に由来するかまたは相関しているかに関する仮説を試験するために使用する。Fisher & vanBelle(1993), 前掲参照。
【０１４４】
上記の分析から、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプの内容の関数として臨床応答を予測する数学的モデルを当業者は容易に構築し得る。好ましくは、該モデルは、モデルを試験するために設計した１個またはそれ以上のフォローアップ臨床試験で確認する。
【０１４５】
臨床応答とＳＬＣ６Ａ３遺伝子の遺伝子型またはハプロタイプ(またはハプロタイプ対)の間の関係の同定は、処置に応答するか応答しない、または、低いレベルで応答し、さらなる処置、すなわち、薬剤のより多い量が必要である可能性がある個体を決定する診断法の設計の基礎であり得る。該診断法はいくつかの形の一つ、例えば、直接ＤＮＡ試験、すなわち、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の多型部位の１個またはそれ以上の遺伝子型判定またはハプロタイプ判定；血清検査；または肉体的試験測定の形を取り得る。唯一の要件は、診断的試験結果と基礎となるＳＬＣ６Ａ３遺伝子型またはハプロタイプの良好な相関、すなわち、臨床応答との相関の存在である。好ましい態様において、この診断法は上記の予測的ハプロタイプ判定法を使用する。
【０１４６】
本発明の方法を実施する際に関係する任意のまたはすべての分析的および数学的操作をコンピュータで行い得る。加えて、コンピュータは、表示装置に表示される映像(または画面)を作成し、それにより使用者が、染色体位置、遺伝子構造および遺伝子ファミリー、遺伝子発現データ、多型データ、遺伝子配列データおよび臨床データ、集団データ、例えば、１個またはそれ以上の集団に関する民族地理学的起源、臨床応答、遺伝子型およびハプロタイプのデータを含む、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子およびそのゲノム変異に関する大量の情報を見て、分析するために交信できる、プログラムを実行できる。本明細書に記載のＳＬＣ６Ａ３多型データは、関係するデータベースの一部として、例えば、ＯｒａｃｌｅデータベースまたはASCIIフラットファイルの例として貯蔵できる。これらの多型データをコンピュータのハードドライブに貯蔵してよく、または、例えば、ＣＤ−ＲＯＭまたはコンピュータが利用できる１個またはそれ以上の他の貯蔵デバイス上に貯蔵してよい。例えば、該データを、ネットワークを介してコンピュータで通信する１個またはそれ以上のデータベースに貯蔵してよい。
【０１４７】
他の態様において、本発明は、個体のＳＬＣ６Ａ３遺伝子のハプロタイプ判定および／または遺伝子型判定のための方法、組成物およびキットを提供する。該組成物は、多型部位を含むか、それに隣接する１個またはそれ以上の標的領域と特異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを含む。本明細書に記載の新規多型部位での個体の遺伝子型またはハプロタイプを確立するための該方法および組成物は、ＳＬＣ６Ａ３タンパク質の発現および機能またはその欠損が影響する疾患の病因における多型の影響の研究、ＳＬＣ６Ａ３を標的とする薬剤の効果の研究、ＳＬＣ６Ａ３タンパク質の発現および機能が影響する疾患に対する個体の感受性の予測、および、ＳＬＣ６Ａ３を標的とする薬剤に対する個体の応答性の予測に有用である。
【０１４８】
また別の態様において、本発明は、遺伝子型またはハプロタイプと特性の間の相関関係を同定する方法を提供する。好ましい態様において、該特性は、疾患への感受性、疾患の重症度、疾患の段階または薬剤への応答である。このような方法は、遺伝子型と、効果測定、薬物動態測定および副作用測定を含む処置結果の間に相関関係の可能性があるとき、すべての薬理遺伝学的適用のための診断的試験および治療的処置の開発に適用できる。
【０１４９】
本発明はまたＳＬＣ６Ａ３遺伝子について決定した多型データの貯蔵および表示のためのコンピュータシステムも提供する。該コンピュータシステムは、コンピュータ処理ユニット；ディスプレイ；および多型データを含むデータベースを含む。該多型データは、基準集団のＳＬＣ６Ａ３遺伝子について同定した多型、遺伝子型およびハプロタイプを含む。好ましい態様において、コンピュータシステムは、その漸進的相関関係にしたがい構成したＳＬＣ６Ａ３ハプロタイプを示す表示を産生できる。
【０１５０】
本明細書で同定されている多型部位を記載する際、簡便のために遺伝子のセンス鎖について言及する。しかしながら、当業者には認められるように、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子を含む核酸分子は、相補的二本鎖分子であって良く、故に、センス鎖上の特定の部位に関する言及は、同様に、相補的アンチセンス鎖上の対応する部位を言及し得る。故に、いずれかの鎖上の多型部位を言及して良く、オリゴヌクレオチドは、多型部位を含む標的領域のいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするように設計し得る。故に、本発明はまた本明細書に記載のＳＬＣ６Ａ３ゲノム変異体のセンス鎖に相補的な、一本鎖ポリヌクレオチドを含む。
【０１５１】
ＳＬＣ６Ａ３の発現における本明細書で同定した多型の影響は、ＳＬＣ６Ａ３遺伝子の多型変異体を含む、組み換え細胞および／または生物、好ましくは組み換え動物の調製により試験し得る。本明細書で使用する“発現”は、下記の１個またはそれ以上を含むが、これらに限定されない：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写；前駆体ｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡを産生するためのスプライシングおよび他の加工；ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのＳＬＣ６Ａ３タンパク質への翻訳(コドン使用頻度およびｔＲＮＡ利用能を含む)；およびグリコシル化および／または適切な発現および機能に必要であるとき、翻訳産物の他の修飾。
【０１５２】
本発明の組み換え細胞を調製するために、所望のＳＬＣ６Ａ３イソ遺伝子を、イソ遺伝子が染色体外に残るように、ベクター中で細胞内に挿入してよい。このような状況下で、該遺伝子は、細胞により染色体外位置から発現する。好ましい態様において、ＳＬＣ６Ａ３イソ遺伝子を、その細胞に存在する内在性ＳＬＣ６Ａ３遺伝子と再結合するような方法で細胞内に挿入する。このような組み換えは、二重組み換えが起こる必要があり、それにより所望のＳＬＣ６Ａ３遺伝子多型を得る。組み換えおよび染色体外維持のために遺伝子を導入するためのベクターは当分野で既知であり、すべての適当なベクターまたはベクター構築物を本発明で使用し得る。ＤＮＡを細胞内に挿入するためのエレクトロポレーション、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈およびウイルス性形質導入のような方法が当分野で既知である；したがって、方法の選択は、通常の技術の実施者の能力および好みに依存するであろう。
【０１５３】
ＳＬＣ６Ａ３イソ遺伝子を挿入し得る細胞の例は、連続培養細胞、例えばＣＯＳ、ＮＩＨ／３Ｔ３、および関連組織タイプ(すなわち、ＳＬＣ６Ａ３イソ遺伝子を発現する)の初代または培養細胞を含むが、これらに限定されない。このような組み換え細胞を、異なるタンパク質変異体の生物学的活性の比較に使用できる。
【０１５４】
変異体遺伝子を発現する組み換え生物、すなわち、トランスジェニック動物を、当分野で既知の標準法を使用して調製する。好ましくは、変異体遺伝子を含む構築物を非ヒト動物に、または該動物の先祖に、胚段階で、すなわち、一細胞段階で、または一般に約８細胞段階よりも前に挿入する。本発明の構築物を担持するトランスジェニック動物は、当業者に既知のいくつかの方法により製造できる。一つの方法は、胚に、１個またはそれ以上のインスレーター要素、目的の遺伝子または複数の遺伝子、および、導入遺伝子として遮蔽された遺伝子(複数もある)を有する完全なシャトルベクターを提供するために当業者に既知の他の成分を含むように構築したレトロウイルスを形質移入することを含む。例えば、米国特許５,６１０,０５３参照。他の方法は、胚への導入遺伝子の直接注入を含む。第三の方法は、胚幹細胞の使用を含む。
【０１５５】
ＳＬＣ６Ａ３イソ遺伝子を挿入し得る動物の例は、マウス、ラット、他の齧歯類および非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない。Recombinant DNA, Watson, Gilman, Witkowski & Zoller, eds., W.H. Freeman & Company, NY, pp. 254-272の“The Introduction of Foreign Genes into Mice”およびその中の引用文献参照。ヒトＳＬＣ６Ａ３イソ遺伝子を安定に発現し、ヒトＳＬＣ６Ａ３タンパク質を産生するトランスジェニック動物を、異常なＳＬＣ６Ａ３発現および／または活性が関与する疾患を研究するための、およびこれらの疾患の症状または影響を減少させるための種々の候補薬剤、化合物および処置レジメンのスクリーニングおよびアッセイのための生物学的モデルとして使用できる。
【０１５６】
ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)を利用したｍＲＮＡレベル分析
ＲＴ−ＰＣＲ(リアルタイム定量的ＰＣＲ)アッセイは、ＲＮＡ鎖(ｍＲＮＡ鎖を含む)からのＤＮＡ鎖の合成を触媒するためのＲＮＡ逆転写酵素を利用する。得られたＤＮＡを特異的に検出および定量し得、この方法はｍＲＮＡの特異的種のレベルの決定のために使用し得る。これを行うための一つの方法は、商品名ＴＡＱＭＡＮ(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)として既知であり、ＡＭＰＬＩ  ＴＡＱ  ＧＯＬＤ(登録商標)  ＤＮＡポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性を利用して、ＰＣＲ反応中にプローブの特異的形態を開裂する。これはＴＡＱＭＡＮ(登録商標)プローブと呼ばれる。Luthra et al., “Novel 5' Exonuclease-Based Ral-Time PCR Assay For the Detection of t(14; 18)(q32; q21) in Patients With Follicular Lymphoma”, Am. J. Pathol., 153:63-68(1998)参照。該プローブはオリゴヌクレオチド(通常約２０量体)と、５'−レポーター色素および３'−クエンチャー色素から成る。蛍光レポーター色素、例えばＦＡＭ(６−カルボキシフルオレッセイン)は、該オリゴヌクレオチドの５'末端に共有結合する。該レポーターは、３'末端に位置するリンカー・アームを介して結合しているＴＡＭＲＡ(６−カルボキシ−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルローダミン)により消光する。Kuimelis et al., “Structural Analogues of TaqMan Probes for Real-Time Quantitative PCR”, Nucl. Acids Symp. Ser., 37:255-256(1997); およびMullah et al., “Efficient Synthesis of Double Dye-Labeled Oligodeoxyribonucleodide Probes and Their Application in a Real Time PCR Assay”, Nucl. Acids Res., 26(4):1026-1031(1998)参照。反応中、プローブの開裂がレポーター色素とクエンチャー色素を分離し、レポーターの発光の増強をもたらす。
【０１５７】
ＰＣＲ産物の蓄積を、直接、レポーター色素の蛍光の増加のモニタリングにより検出する。Heid et al., “Real Time Quantitative PCR”, Genome Res., Vol. 6, No. 6, pp. 986-994(1996)参照。反応は、固定回数のサイクルの後に蓄積されているＰＣＲ産物の量よりも、ＰＣＲ産物の増幅が最初に検出されるときの循環中の時点により特徴付けられる。核酸標的の開始時コピー数が多ければ多いほど、より早く蛍光の有意な増加が観察される。Gibson, Heid & Williams et al., “A Novel Method For Real Time Quantitative RT-PCR”, Genome Res., 6:995-1001(1996)参照。
【０１５８】
プローブが無傷であるとき、レポーター色素のクエンチャー色素への接近が、主に、Foersterタイプエネルギー伝達によるレポーター蛍光の抑制をもたらす。Lakowicz et al., “Oxygen Quenching and Fluorescence Depolarization of Tyrosine Residues in Proteins”, J. Biol. Chem., 258:4794-4801(1983)参照。ＰＣＲ中、目的の標的が存在したとき、プローブは特にフォワードおよびリバースプライマー部位の間をアニールする。ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ(登録商標)  ＤＮＡポリメラーゼの５'−３'核酸分解活性は、プローブが標的とハイブリダイズしているときのみ、レポーターとクエンチャーの間のプローブを開裂する。該プローブフラグメントを次いで標的から離し、鎖の重合化を続ける。この工程は全サイクルで起こり、産物の指数関数的蓄積により妨害されない。該プローブの３'末端は、ＰＣＲ中のプローブの伸長を防止するために遮断する。
【０１５９】
受動的基準はＴＡＱＭＡＮ(登録商標)緩衝液に包含され、５'ヌクレアーゼアッセイに関与しない色素である。受動的基準は、レポーター色素シグナルをデータ分析中に標準化するための内部基準を提供する。標準化は、濃度または容量の変化による蛍光の変化を補正するために必要である。
【０１６０】
標準化は、レポーター色素の放出強度を受動的基準の放出強度で割り、ある反応試験管についてＲｎ(標準化レポーター)として定義される比率を得ることにより達成される。
【０１６１】
基準サイクル(threshold cycle)またはＣｔ値は、ΔＲｎにおける統計的有意な増加が最初に検出されるサイクルである。Ｒｎ対サイクル数のグラフにおいて、基準サイクルは、配列検出アプリケーションがＰＣＲ産物の指数関数的増加に伴うシグナルの増加を検出し始めたときに起こる。
【０１６２】
定量的測定を行うため、ｃＲＮＡ(標準)の連続希釈を、正確で速いｍＲＮＡ定量化に必要な標準曲線を構築するために、各実験に包含させる。該方法の再現性を推測するために、同じｃＲＮＡサンプルの増幅を数回行ってよい。
【０１６３】
細胞の転写状態を測定するための他の方法は、電気泳動分析の複雑を制限する制限フラグメントのプールを産生し、例えば、二重制限酵素消化と位相プライマー(例えば、Zabeau et al.の、１９９２年９月２４日出願のＥＰ０５３４８５８Ａ１参照)を組み合わせた方法、またはｍＲＮＡ末端に最も近い部位の制限フラグメントを選択する方法である。例えば、Prashar & Weissman, “Analysis of Differential Gene Expression by Display of 3' End Restriction Fragments of cDNAs”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(2):659-663(1996)参照。
【０１６４】
他の方法は、各ｃＤＮＡを同定するための複数のｃＤＮＡのいずれかにおける十分な塩基対、例えば、２０−５０塩基対を配列決定することにより、または、定義したｍＲＮＡ末端経路パターンに関連する既知の位置に産生された、短い標識、例えば、９−１０塩基対を配列決定することにより、ｃＤＮＡプールを統計的にサンプリングするものである。例えば、Velculescu, Science, 270:484-487(1995)参照。
【０１６５】
他の局面の測定
本発明の種々の態様において、転写状態以外の生物学的状態の局面、例えば、翻訳状態、活性状態、または、混合された局面を、薬剤および経路の応答を得るために測定できる。これらの態様の詳細は本セクションに記載する。
【０１６６】
翻訳状態測定
遺伝子(複数もある)によりコードされるタンパク質の発現を、検出可能に標識されているか、その後に標識できるプローブにより検出できる。一般に、該プローブは、発現されたタンパク質を認識する抗体である。
【０１６７】
本明細書で使用する“抗体”なる用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体および、抗体フラグメントがタンパク質に結合するために十分な生物学的に機能する抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１６８】
記載の遺伝子の一つによりコードされるタンパク質に対する抗体を製造するために、種々の宿主動物を同ポリペプチドまたはその一部の注射により免疫してよい。このような宿主動物は、例をいくつか挙げると、ウサギ、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。種々のアジュバントを使用して免疫学的応答を増強することができ、宿主の種に依存して、フロインド(完全および不完全)、ミネラル・ゲル、例えば、水酸化アルミニウム；界面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノール；および有用である可能性があるヒトアジュバント、例えばカルメットーゲラン菌(ＢＣＧ)およびコリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)を含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物のような抗原、または、その抗原機能性誘導体で免疫した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の製造のために、上記のような宿主動物を、コードされたタンパク質、またはその一部を、同様にまた上記のアジュバントを補って注射することにより免疫できる。
【０１７０】
特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体(ｍＡｂ)は、培養における連続細胞系による抗体分子の産生のために提供された方法のいずれかにより得ることができる。これらは、Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497(1975)；および米国特許４,３７６,１１０のハイブリドーマ法、Kosbor et al., Immunol. Today, Vol. 4, p. 72(1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030(1983)のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., 1985), pp. 77-96を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む免疫グロブリンのいずれかおよびそれらのいずれかのサブクラスであってよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養し得る。製造法で現在好ましいのは、インビボでの最高力価のｍＡｂの産生である。
【０１７１】
加えて、適当な抗原特異性の分子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子を、マウス抗体由来の遺伝子とスプライシングすることにより、“キメラ抗体”を産生するために開発された方法(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608(1984); およびTakeda et al., Nature, 314:452-454(1985)参照)を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスｍＡｂ由来の可変または超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである。
【０１７２】
あるいは、一本鎖抗体の製造について記載された方法、米国特許４,９４６,７７８；Bird, Science, 242:423-426(1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883(1988); およびWard et al., Nature, 334:544-546(1989)を、異なって発現される遺伝子一本鎖抗体の産生に適合できる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重−および軽−鎖フラグメントを、アミノ酸架橋を介して形成し、一本鎖ポリペプチドを得る。
【０１７３】
より好ましくは、“ヒト化抗体”の製造に有用な方法を、タンパク質、フラグメントまたはその誘導体に対する抗体の製造に適合できる。このような方法は米国特許５,９３２,４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９に記載されている。
【０１７４】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法により産生できる。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により製造できるＦ(ａｂ')２フラグメント、および、Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド結合の還元により製造できるＦａｂフラグメントを含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望の特異性のモノクローナルＦａｂフラグメントの急速で容易な同定を可能にするために、構築できる(Huse et al., Science, 246:1275-1281(1989))。
【０１７５】
既知のタンパク質がサンプル中で発現される程度を、次いで、上記の抗体を利用するイムノアッセイ法により決定する。このようなイムノアッセイ法は、ドット・ブロッティング、ウェスタン・ブロッティング、競合的および非競合的タンパク質結合アッセイ、酵素免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組織化学、蛍光活性化細胞選別(ＦＡＣＳ)および他の一般的に使用されており、かつ、科学文献および特許文献に広く記載されている方法を含むがこれらに限定されず、多くは市販品を用いる。
【０１７６】
検出の容易さのために特に好ましいのは、サンドイッチＥＬＩＳＡであり、それには多くの変法が存在し、そのすべてを本発明に包含することを意図する。例えば、典型的前向きアッセイにおいて、非標識抗体を固体支持体上に固定し、試験する物質を該結合分子と接触させ、その後、抗原−抗体バイナリー複合体の形成を可能にするのに十分な時間である適当な期間、インキュベーションする。この時点で、検出可能なシグナルを誘発できるレポーター分子で標識した二次抗体を添加し、インキュベーションし、抗体−抗原−標識抗体の３重複合体の形成を十分に可能にする。すべての未反応物質を洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察により決定するか、または、既知の量の抗原を含むコントロールサンプルと比較することにより定量してよい。前向きアッセイの変法は、サンプルと抗体の両方を結合抗体に同時に添加する同時アッセイ、または、標識抗体と試験するサンプルを最初に合わせ、インキュベートし、非標識表面結合抗体を添加する、リバースアッセイを含む。これらの方法は当分野で既知であり、微細な変化の可能性は容易に明らかである。本明細書で使用する“サンドイッチアッセイ”は、基本的な２部位法のすべての変法を包含することを意図する。本発明のイムノアッセイに関して、唯一の制限因子は、標識抗体が目的の遺伝子により発現されるタンパク質に特異的な抗体でなければならないことである。
【０１７７】
このタイプのアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア−または放射性核種−含有分子のいずれかである。酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)の場合、酵素を、通常、グルタールアルデヒドまたは過ヨウ素酸の手段により二次抗体に結合する。しかしながら、容易に認識されるように、当業者に既知の広範囲の異なるライゲーション法が存在する。一般的に使用される酵素は、とりわけホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼである。特異的酵素と共に使用すべき基質は、一般に、対応する酵素での加水分解による、検出可能な色の変化の産生のために選択する。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリホスファターゼコンジュゲートとの使用に適しており；ペルオキシダーゼコンジュゲートに関して、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンを一般に使用する。上記のような発色性基質よりむしろ蛍光産物を産生する、蛍光発生基質を用いることも可能である。適当な基質を含む溶液を次いで３重複合体に添加する。基質は二次抗体に結合した酵素と反応し、定質的可視シグナルを発生し、それをさらに、通常、分光光度法により定量し、血清サンプル中に存在するタンパク質の量を評価できる。
【０１７８】
あるいは、蛍光化合物、例えば、フルオレッセインおよびローダミンを、その結合能を変えることなく、抗体と化学的に結合させ得る。特定波長の光の照射により活性化したとき、蛍光色素−標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子の興奮状態を誘発し、続いて、特徴的な長い波長の光を放出する。放出は光学顕微鏡で可視的に検出可能な特徴的な色として発現する。免疫蛍光法およびＥＩＡ法の両方とも当分野で十分に確立されており、本方法のために特に好ましい。しかしながら、他のレポーター分子、例えば放射性同位体、化学発光または生物発光分子も用いてよい。当業者には、要求される使用に適合させるためにどのように方法を変更すべきか明白であろう。
【０１７９】
翻訳状態の測定はまたいくつかの付加的方法にしたがい行い得る。例えば、タンパク質の完全ゲノムモニタリング、すなわち、“プロテオーム”、Goffeau et al., 前掲を、結合部位が、細胞ゲノムによりコードされる多くのタンパク質種に対して特異的な、固定化された、好ましくはモノクローナルの、抗体を含む、マイクロアレイの構築により行うことができる。好ましくは、抗体はタンパク質をコードするかなりの部分に対するか、または少なくとも目的の生物学的ネットワークモデルの試験または確認に関連するタンパク質に対して存在する。モノクローナル抗体の製造法は既知である。例えば、その全体をすべての目的のために包含させるHarlow and Lane, “Antibodies:A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, NY(1988)参照。一つの好ましい態様において、モノクローナル抗体は、細胞のゲノム配列に基づいて設計した合成ペプチドフラグメントに対して産生する。このような抗体アレイで、細胞由来のタンパク質を該アレイと接触させ、その結合を当分野で既知のアッセイによりアッセイする。
【０１８０】
あるいは、タンパク質を二次元ゲル電気泳動系により分離することができる。二次元ゲル電気泳動は当分野で既知であり、典型的に第一次元に沿った等電点電気泳動と、それに続く第二次元に沿ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を含む。例えば、Hames et al., “Gel Electrophoresis of Proteins:A Practical Approach”, IRL Press, NY(1990); Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14440-14445(1996); Sagliocco et al., Yeast, 12:1519-1533(1996); およびLander, Science, 274:536-539(1996)参照。得られた電気泳動図を、質量分析法、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用したウェスタン・ブロッティングおよび免疫ブロット分析、ならびに内部およびＮ末端マイクロ・シークエンシングを含む、多くの方法で分析できる。これらの方法を使用して、薬物に暴露された細胞内、例えば、酵母内、または、例えば、特異的遺伝子の欠損または過剰発現により修飾された細胞内を含む、生理学的条件下で、産生された全タンパク質のかなりの部分の同定が可能になる。
【０１８１】
生物学的状態の他の局面に基づいた態様
ｍＲＮＡ発生量以外の細胞性成分のモニタリングは、ｍＲＮＡモニタリングでは遭遇しないある技術的困難さに遭遇しているが、当業者には、細胞機能の特徴と関連するタンパク質の活性を測定できる本発明の方法の使用において、本発明の態様はこのような測定を基礎とし得ることは明白であろう。活性測定は、特徴付けられている特定の活性に適当なすべての機能的、生化学的または物理的手段により行ってよい。活性が化学的変換を含むとき、細胞性タンパク質を天然基質と接触させ、変換の割合を測定できる。活性化が多数の単位の会合を包含するとき、例えば、ＤＮＡと活性化ＤＮＡ結合複合体が会合するとき、会合タンパク質の量、または会合の二次的結果、例えば転写されたｍＲＮＡの量を測定できる。また、例えば、細胞サイクル制御におけるような、機能的活性のみが知られているとき、機能の実行を観察できる。どのように知られ測定されても、タンパク質活性における変化が、本発明の前記の方法により分析された応答データを形成する。
【０１８２】
別のおよび非限定的態様において、応答データは、細胞の生物学的状態の混合された局面の形であってよい。応答データは、例えば、あるｍＲＮＡ発生量の変化、あるタンパク質発生量の変化およびあるタンパク質活性の変化から構築できる。
【０１８３】
マーカーとしての核酸およびタンパク質の検出
特定の態様において、マーカーに対応するｍＲＮＡのレベルを、生物学的サンプルで、インサイチュおよびインビトロ形式両方で、当分野で既知の方法を使用して決定できる。“生物学的サンプル”なる用語は、対象から単離された組織、細胞、生体液およびそれらの単離物、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むことを意図する。多くの発現検出法は単離ＲＮＡを使用する。インビトロ法に関して、ｍＲＮＡの単離に対して選択していないすべてのＲＮＡ単離法を、細胞からのＲＮＡの精製に使用できる。例えば、Ausubel et al., Ed., Curr. Prot. Mol. Biol., John Wiley & Sons, NY(1987-1999)参照。さらに、多数の組織サンプルが当業者に既知の方法、例えば、一本鎖段階ＲＮＡ単離法、Chomczynski, 米国特許４,８４３,１５５(１９８９)を使用して容易に処理できる。
【０１８４】
単離ｍＲＮＡをハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用でき、それは、サザンまたはノーザン分析、ＰＣＲ分析およびプローブアレイを含むが、これらに限定されない。ｍＲＮＡレベルの検出のための一つの好ましい診断法は、単離ｍＲＮＡを、検出する遺伝子によりコードされたｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子(プローブ)と接触させることを含む。該核酸プローブは、例えば、完全長ｃＤＮＡ、またはその一部、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であり、本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドである。本発明の診断アッセイに使用するための他の適当なプローブは本明細書に記載されている。ｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、当該マーカーが発現されていることを示唆する。
【０１８５】
一つの形態において、該ｍＲＮＡを固体表面上に固定し、プローブと、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲル状で流すことにより接触させ、ｍＲＮＡを、ゲルからニトロセルロースのような膜に移す。別の形態において、プローブ(複数もある)を固体表面上に固定し、ｍＲＮＡをプローブ(複数)と、例えば、Affymetrix遺伝子チップアレイにおいて接触させる。当業者は、既知のｍＲＮＡ検出法を、本発明のマーカーによりコードされるｍＲＮＡのレベルの検出に使用するために容易に適合できる。
【０１８６】
サンプル中の本発明のマーカーに対応するｍＲＮＡのレベルを検出するための別法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ(Mullis、米国特許４,６８３,２０２(１９８７)に記載の実施態様；リガーゼ連鎖反応、Barany(1991), 前掲；自己配列複製、Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878(1990)；転写増幅系、Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177(1989)；Ｑ−Ｂｅｔａレプリカーゼ、Lizardi et al., Biol. Technology, 6:1197(1988)；ローリング・サークル複製、Lizardi et al.、米国特許５,８５４,０３３(１９８８)；または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅の工程、続いて、当業者に既知の方法を使用した増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少ない数で存在するとき、核酸分子の検出にとりわけ有用である。本明細書で使用する、増幅プライマーは、遺伝子の５'または３'領域(各々プラスおよびマイナス鎖またはその逆)とアニールでき、その間に短領域を含む核酸分子の対と定義される。一般的に、増幅プライマーは約１０−３０ヌクレオチド長であり、約５０−２００ヌクレオチド長の領域の側面に位置する。適当な条件下および適当な試薬により、このようなプライマーは、プライマーが側面にあるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０１８７】
インサイチュ法に関して、ｍＲＮＡを検出前に細胞から単離する必要がない。このような方法において、細胞または組織サンプルを既知の組織学的方法を使用して調製／加工する。次いで、サンプルを支持体、典型的にはガラススライド上に固定し、次いで、マーカーをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズできるプローブと接触させる。
【０１８８】
マーカーの絶対的発現レベルに基づいて決定を成す代わりに、決定をマーカーの標準化した発現レベルに基づき成してよい。発現レベルは、その発現レベルをマーカーではない遺伝子、例えば、構造的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と比較することにより、マーカーの絶対的発現レベルを補正することにより標準化する。標準化するための適当な遺伝子は、アクチン遺伝子または上皮細胞−特異的遺伝子のようなハウスキーピング遺伝子を含む。この標準化は、一つのサンプル、例えば１名の患者サンプルと、他のサンプルの発現レベルの比較、または、異なる供給源由来のサンプル間の比較を可能にする。
【０１８９】
あるいは、該発現レベルは、相対的発現レベルとして提供してよい。マーカーの相対的発現レベルを決定するために、マーカーの発現レベルを、当該サンプルにおける発現レベルを決定する前に、正常の１０個またはそれ以上のサンプルを、疾患生物学的サンプル、好ましくは５０個またはそれ以上のサンプルに対して決定する。多くの数のサンプルでアッセイした遺伝子の各々の平均発現レベルを決定し、これをマーカーの基底発現レベルとして使用する。試験サンプルに関して決定したマーカーの発現レベル(発現の絶対的レベル)を、次いで、そのマーカーに関して得た平均発現値で割る。これにより相対的発現レベルを決定する。
【０１９０】
好ましくは、基底値決定に使用したサンプルは、多型を有しない患者由来のものである。細胞源の選択は、相対的発現レベルの使用に依存する。正常組織に見られる発現を平均発現スコアとして使用することは、アッセイしたマーカーが特異的(正常細胞に対して)であるか否かの評価を助ける。加えて、データの蓄積が多いほど、平均発現値を再考でき、蓄積データに基づいた相対的発現値の改善を提供する。
【０１９１】
ポリペプチドの検出
本発明の他の態様において、マーカーに対応するポリペプチドを検出する。本発明のポリペプチドを検出するための好ましい試薬は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドと結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う抗体である。抗体はポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであってよい。無傷の抗体、またはそのフラグメント、例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２を使用できる。プローブまたは抗体に関連して“標識”なる用語は、プローブまたは抗体のへの検出可能物質の結合、すなわち、物理的架橋によるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに、直接標識されている他の試薬との反応による、プローブまたは抗体の間接的標識を包含することを意図する。間接的標識の例は、蛍光標識した二次抗体、および蛍光標識したストレプトアビジンにより検出できるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を使用した一次抗体の検出を含む。
【０１９２】
個体由来のタンパク質は、当業者に既知の方法を使用して単離できる。該タンパク質単離法は、例えば、HarlowおよびLane(1988), 前掲に記載のようなものを用いてよい。
【０１９３】
種々の形態を用いて、サンプルが規定の抗体と結合できるタンパク質を包含するか否か、決定できる。このような形態の例は、ＥＩＡ；ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ウェスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡを含むが、これらに限定されない。当業者は、既知のタンパク質／抗体検出法を、細胞が本発明のマーカーを発現するか否か、および、血中または他の体組織における該特異的ポリペプチド発現産物の相対的濃度の決定において使用するために容易に適合できる。
【０１９４】
一つの形態において、抗体または抗体フラグメントを、ウェスタン・ブロットまたは免疫蛍光法のような方法において使用し、タンパク質発現を検出できる。このような使用において、抗体またはタンパク質のいずれかを固体支持体に固定することが一般的に好ましい。適当な固相支持体または担体は、抗原または抗体を結合できるすべての支持体を含む。既知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩および磁鉄鉱を含む。
【０１９５】
当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適当な担体を知っており、本発明における使用のためにこのような支持体を適合できる。例えば、患者細胞から単離したタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に流し、ニトロセルロースのような固相支持体に固定できる。次いで、該支持体を適当な緩衝液で洗浄し、その後、検出可能に標識した抗体で処理する。固相支持体を次いで緩衝液で２度の洗浄を行い、非結合抗体を除去してよい。固体支持体上に結合した標識の量を次いで慣用法により検出し、この測定を血液または他の体組織におけるタンパク質のレベルまたは濃度に翻訳する。
【０１９６】
本発明はまた、例えば、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、大便、脳脊髄液、羊水(acitic fluid)または血液を含むがこれらに限定されないすべての体液および体組織の生検サンプルを含む、生理学的サンプルにおける本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットも包含する。例えば、キットは、生物学的サンプル中の本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出できる標識化合物または試薬、および、サンプル中のポリペプチドまたはｍＲＮＡの量を決定するための手段、例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合するポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドプローブに結合する抗体を含む。キットはまたキットを使用して得た結果の解釈のための指示を含んでよい。
【０１９７】
抗体−ベースのキットに関して、キットは、例えば、
１)本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合している、例えば、固体支持体に結合している、第一抗体；および、所望により、
２)ポリペプチドまたは第一抗体のいずれかに結合し、検出可能標識とコンジュゲートしている、第二の異なる抗体
を含み得る。
【０１９８】
オリゴヌクレオチド−ベースのキットに関して、キットは、例えば、
１)本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド；または
２)本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用なプライマー対
を含み得る。
【０１９９】
キットは、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定化剤も含んでよい。該キットはさらに検出可能に標識した、例えば、酵素または基質を検出するのに必要な成分を含んでよい。さらにキットはまたコントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを含み、これは、アッセイし、試験サンプルと比較できる。キットの各成分は個々の容器中に入れられ、種々の容器のすべてを一つの包装に、同キットを使用して行ったアッセイの結果を解釈するための指示書と一緒に包含できる。
【０２００】
細胞への抗体の導入
細胞内タンパク質およびそれらの濃度の特徴付けは、種々の方法で行ってよい。例えば、抗体を、細胞に、例えば、抗体の細胞へのマイクロインジェクション(Morgan et al., Immunol. Today, Vol. 9, pp. 84-86(1988))または所望の抗体をコードするハイブリドーマｍＲＮＡの細胞内への形質転換を含む、種々の方法で導入し得る。Burke et al., Cell, 36:847-858(1984)参照。さらなる方法において、組み換え抗体を人工的に作成し、標的タンパク質と結合させるため、ならびに、標的タンパク質活性を遮断するために、広範囲の非リンパ細胞型において異所的に発現させる。Biocca et al., Trends Cell Biol., 5:248-252(1995)参照。抗体の発現は好ましくは、飽和摂動(saturating perturbation)を作成するために、Ｔｅｔプロモーターのような制御可能プロモーター、または常時活性なプロモーターの制御下にある。第一工程は、標的タンパク質に適当な特異性を有する特定のモノクローナル抗体の選択である(下記参照)。次いで、選択した抗体の種々の領域をコードする配列を、例えば、全抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント(ペプチドリンカーにより結合したＶＨおよびＶＬ領域)(“ＳｃＦｖ”フラグメント)、二量抗体(diabodies)(異なる特性の２つの結合したＳｃＦｖフラグメント)などを含む、種々の人工的に作成された抗体形態内にクローン化できる。Hayden, Gilliland & Ledbetter, Curr. Opin. Immunol., 9(2):201-212(1997)。種々の形態の細胞内に発現した抗体を、例えば、細胞質、核、ミトコンドリアなどに、それらを種々の既知の細胞内リーダー配列との融合対として発現させることにより、細胞区画内に標的下できる。Bradbury et al., 抗体Engineerinq, Borrebaeck, Ed., IRL Press, 2:295-361(1995)参照。特に、ＳｃＦｖ形態は細胞質ターゲティングに特に適しているように見える。
【０２０１】
有用な抗体タイプの種類
抗体タイプは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに限定されない。当分野で既知の種々の方法を、標的タンパク質に対するポリクローナル抗体の製造に使用できる。抗体の製造のために、種々の宿主動物を、標的タンパク質注入で免疫でき、このような宿主動物は、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限定されない。種々のアジュバントを免疫学的応答を増強するために使用でき、宿主の種類に依存し、フロインド(完全および不完全)、ミネラル・ゲル、例えば水酸化アルミニウム；界面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョンおよびジニトロフェノール；および有用である可能性があるヒトアジュバント、例えばＢＣＧおよびコリネバクテリウム・パルヴムを含むが、これらに限定されない。
【０２０２】
モノクローナル抗体
標的タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造するために、培養中の継代細胞系による抗体分子の産生を提供する、すべての方法を使用し得る。このような方法は、ヒトモノクローナル抗体を製造するための、Kohler and Milstein(1975), 前掲により元々開発されたハイブリドーマ法；トリオーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72(1983)参照)；およびＥＢＶハイブリドーマ法を含むが、これらに限定されない。Cole et al. (1985), 前掲参照。本発明のさらなる態様において、モノクローナル抗体を無菌動物から、最近の方法(ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５)を使用して製造できる。本発明によると、ヒト抗体を使用でき、ヒトハイブリドーマを使用して(Cole et al. (1983), 前掲参照)、またはヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスでインビトロで形質転換して得ることができる。Cole et al. (1985), 前掲参照。実際、本発明によると、適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子を、標的タンパク質に特異的なマウス抗体由来の遺伝子とスプライシングすることによる、“キメラ抗体”の製造のために開発された方法(Morrison et al. (1984), 前掲; Neuberger et al. (1984), 前掲; Takeda et al. (1985), 前掲参照)を使用できる；このような抗体は本発明の範囲内である。
【０２０３】
さらに、モノクローナル抗体が有利であるとき、それらは別法として、ファージディスプレイの方法を使用して大きな抗体ライブラリーから選択できる。Marks et al., J. Biol. Chem., 267(3):16007-16010(1992)参照。この方法を使用して、１０−１２個までの異なる抗体のライブラリーをｆｄ糸状ファージ上に発現させ、モノクローナル抗体の選択に利用可能な抗体の“シングル・ポット”インビトロ免疫系を創成する。Griffiths et al., EMBO J., 13(14):3245-3260(1994)参照。このようなライブラリーからの抗体の選択は当分野で既知であり、固定化した標的タンパク質にファージを接触させ、該標的と結合するファージを選択し、クローニングし、抗体可変領域をコードする配列を所望の抗体形式を発現する適当なベクター内にサブクローニングすることを含む。
【０２０４】
本発明によると、一本鎖抗体の製造のために記載された方法(米国特許４,９４６,７７８参照)を、標的タンパク質の特異的な一本鎖抗体の製造に適合できる。本発明のさらなる態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの合成に関して記載された方法(Huse et al. (1989), 前掲参照)を利用し、標的タンパク質に所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの速くて容易な同定を可能にする。
【０２０５】
標的タンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメントを当分野で既知の方法により製造できる。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により製造できるＦ(ａｂ')２フラグメント；Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド結合の還元により製造できるＦａｂ'フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより製造できるＦａｂフラグメント、およびＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
抗体の製造において、望ましい抗体のスクリーニングを、当分野で既知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにより行い得る。標的タンパク質に特異的な抗体を選択するために、産生されたハイブリドーマまたはファージディスプレイ抗体ライブラリーを、標的タンパク質に結合する抗体に関してアッセイしてよい。
【０２０７】
治療剤の投与
本明細書に記載の障害の処置に使用する薬剤の投与量は、最終の分析において、その症例を担当する医師により、該薬剤の知識、臨床試験で決定した組み合わせる薬剤の特性、および、その医師が患者を処置している以外の疾患を含む患者の特性を使用して決定されるべきである。投与量の一般的概略および好ましい投与量を本明細書に提供でき、また、提供し、例えば、イロペリドンは１日１回１−５０mgおよび最も好ましくは１日１回１２−１６mg；オランザピンは１日１回約０.２５−５０mg；好ましくは１日１回１−３０mg；および最も好ましくは１日１回１−２５mg；クロザピンは毎日約１２.５−９００mg；好ましくは毎日約１５０−４５０mg；リスペリドンは毎日約０.２５−１６mg；好ましくは毎日約２−８mg；セルチインドールは毎日約０.０００１−１.０mg／kg；クエチアピンは１日１回投与でまたは分割投与で約１.０−４０mg／kg；ジプラシドンは毎日約５−５００mg；好ましくは毎日約５０−１００mg；ハルドールは１日１回または２回０.５−４０mgである。
【０２０８】
考慮されるすべての化合物は、経口で利用可能であり、通常経口で投与され、したがって、補助剤を用いた経口投与の組み合わせが好ましい。それらは、一緒に、単一の投与形で、または、別々に投与してよい。しかしながら、経口投与が唯一の経路でもましてや好ましい唯一の経路ではない。例えば、経皮投与は、経口薬を摂取することを忘れがちなまたはそれが嫌な患者にとって非常に望ましいことがある。特定の状況下で、薬剤の一方を一つの経路、例えば、経口で投与してよく、他方を、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、経鼻または直腸内経路で投与してよい。投与経路はいずれにしても非常に多様であり、薬剤の物理的特性および患者と介護者の簡便性により限定される。
【実施例】
【０２０９】
実施例１
ＤＡＴ１遺伝子の３’ＵＴＲ領域におけるＶＮＴＲ多型とクロザピン応答との関係
本実施例の目的は、ドーパミントランスポーター１遺伝子(SLC6A3;DAT1)の３’ＵＴＲ領域におけるＶＮＴＲ多型とクロザピン処置による統合失調症または統合失調性感情障害を有する患者の薬剤応答との潜在的関係を評価することであった。
【０２１０】
後向き薬理遺伝学分析は、ＤＡＴ１遺伝子の３’ＵＴＲ領域における数の異なる反復配列(ＶＮＴＲ)多型とクロザピン処置による統合失調症または統合失調性感情障害を有する患者の薬剤応答との潜在的関係を評価することを試みていた。
【０２１１】
クロザピンとオランザピン処置された患者における自殺行動リスクを比較する多施設、ランダム化、２年試験は、すでに統合失調症または統合失調性感情障害を有する患者で行なわれた(上記参照)。ドーパミントランスポーター遺伝子(ＳＬＣ６Ａ３)のＥｘｏｎ９における同義多型とタイプ１事象までの時間の有意な関係は、クロザピングループにおいて発見された。ＧＧ遺伝子型を有する対象は、この対象が試験の終了時で最もひどい自殺行動を示したため、低応答者であることが判明した。該試験結果は、また自殺企図の予防において、クロザピンはオランザピンより有効であることを示した。ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００４／０７４５１３参照。
【０２１２】
遺伝子型判定
InterSePT試験(上記参照)に登録されている患者からの４０２個のサンプルを回収し、ＶＮＴＲ多型に関する遺伝子型同定をした。InterSePT試験に登録された全４０２人の対象は、公倫理委員会により承認されたプロトコールで薬理遺伝学試験を行う。１５mlの血液を治験実施施設で患者から回収した。該ＤＮＡをＰＵＲＥＧＥＮＥ(登録商標)DNA Isolationキット(Ｄ５０Ｋ)を製造業者の推奨に従って使用しCovance (Indianapolis, USA)により抽出した。ＶＮＴＲ遺伝子型同定は、Kidd(Kidd Laboratory, http://info.med.yale.edu/genetics/kkidd/SLC6A3_3VNTR.html)に記載のＰＣＲ法を使用して行った。センスおよびアンチセンスＰＣＲプライマーはそれぞれ、5'-GGT GTA GGG AAC GGC CTG AGA G-3'(SEQ ID NO:3)および5'-CTT CCT GGA GGT CAC GGC TCA AGG-3'(SEQ ID NO:4)であった。約１００−２００ngのゲノムＤＮＡを各アッセイのために必要であった。ＰＣＲを９４℃(３０”)、６２℃(３０”)および７２℃(３０”)の条件で３０サイクル行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルを使用して分析した。
【０２１３】
臨床的評価
第１の有効変化値として、以下の２個の基準のいずれか１つに合うまでの時間であった(日数、ランダム化後)：(ａ)重大な自殺企図；および(ｂ)切迫した自殺リスクのための入院。タイプ１事象は、上記２項目の組み合わせとして定義される。第２の有効変化値として、以下を決定した：(ａ)重大な自殺企図を有する対象のパーセンテージ；(ｂ)切迫した自殺リスクのための入院を有する対象のパーセンテージ；(ｃ)Positive and Negative Syndrome Scale(PANSS)の合計点における基準値からの変化；(ｄ)Positive subtotal of PANSSにおける基準値からの変化；および(ｅ)Negative subtotal of PANSSにおける基準値からの変化。
【０２１４】
統計分析
WindowsパッケージSAS Version 8.2を統計分析のために使用した。遺伝子型グループ間の人口統計差異の連続的および二分(dischotomous)変化値を、ノンパラメトリックANOVAおよびFisherの直接確率検定、それぞれを使用して比較した。タイプ１事象までの時間に対する遺伝子型の異なる影響を、ログランク検定を使用して評価した。年齢、性別、物質濫用および自殺企図をさらにCox比例危険モデルを使用したさらなる分析において調整した。
【０２１５】
ログランク検定は、ＶＮＴＲ多型と試験中のタイプ１事象のリスクにより測定した自殺行動の間の、有意な関係を同定した。さらに、この関係は、クロザピン処置群にのみ存在した。９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する対象は、有意に高割合のタイプ１事象を示した(Ｐ＝０.００４)。同対象はまた、より高い生涯の自殺企図率を示した(Ｐ＝０.０１)。ＶＮＴＲ多型とタイプ１事象のリスクとの関連における起こり得る混乱を調整するために、Cox比例危険モデルを構築した。多変数モデルは、共変量:年齢、性別、物質濫用および生涯の自殺企図に加えてＶＮＴＲ多型から構成された。ＶＮＴＲ多型とタイプ１事象のリスクとの関係は、有意なままであった(Ｐ＝０.００８５)。これらの結果は、ＶＮＴＲ多型において９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する対象が、自殺行動に関してクロザピン処置に低応答者であることを示した。加えて、positive and negative syndrome scale(PANSS)を含む精神病評価により評価されたクロザピン処置応答における、遺伝子型グループ間で有意な差異はなかった。
【０２１６】
ＤＡＴ１遺伝子のＶＮＴＲ多型とクロザピン応答の関係
本実施例の薬理遺伝学分析において、これら２種の処置群の薬剤応答に対する遺伝学的効果を比較した。表４に示す通り、対象の多くは、白人であった。遺伝子型グループ間で年齢および診断に有意な差はなかった。１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子を有する対象は、相対的に若い傾向があるが、統計学的に有意な差はなかった。
【表４】
2008505060.tif 000006
値は平均(ＳＤ)である。
+Fisherの直接確率検定を使用した。
*ANOVAを使用した。
9≧:9以下の反復;10≦:10以上の反復。
【０２１７】
ログランク検定において、ＶＮＴＲ多型とタイプ１事象までの時間の有意な関係は、クロザピン処置群(白人部分集団：Ｐ＝０.０１６５、全集団：Ｐ＝０.０２５２)において観察されたが、オラザピン処置群(白人部分集団：Ｐ＝０.４０５８、全集団：Ｐ＝０.７４９５)(図１および図２)では観察されなかった。９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する対象は、１０またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する対象と比較して、タイプ１事象の有意に高い割合を示し、９個またはそれ以下の反復対立遺伝子は、劣性形態で低クロザピン応答と相関関係がある可能性が示唆された。しかしながら、図３および図４に示す通り、オラザピン処置群(白人部分集団：Ｐ＝０.４０５８、全集団：Ｐ＝０.７４９５)において、このような関係は、検出できなかった。
【０２１８】
１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する対象は、タイプ１事象のリスクについて同様に行動した。したがって、９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する対象と１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する対象との比較を行った。関係の増加した有意性が観察された(白人部分集団：Ｐ＝０.００４２、全集団：Ｐ＝０.００８２)(図５および図６)。同様の分析をまた、オラザピン処置群で行った。また、図７および図８のように、オラザピン処置群における関係は検出できなかった(白人部分集団：Ｐ＝０.２４８６、全集団：Ｐ＝０.７９５９)。
【０２１９】
ＶＮＴＲ多型とタイプ１事象のリスクとの関係における起こり得る混乱を調整するために、Cox比例危険モデルを構築した。多変数モデルは、共変量：年齢、性別、物質濫用および自殺企図に加えてＶＮＴＲ多型から構成された。表５に示す通り、ＶＮＴＲ多型とタイプ１事象のリスクとの関係は、クロザピン処置群において有意なままであった(白人部分集団：Ｐ＝０.００８５、全集団：Ｐ＝０.０３９６)。同様に、オラザピン処置群における関係は検出できなかった(白人部分集団：Ｐ＝０.２６４７、全集団：Ｐ＝０.６９０２)。
【表５】
2008505060.tif 000007
値は平均(ＳＤ)である。
＊年齢、性別、物質濫用および生涯の自殺企図を調整した。
【０２２０】
試験の最後に、各遺伝子型グループのタイプ１事象を有する対象の割合も計算した。表６に示す通り、９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する白人の４４％が、タイプ１事象を示した。対照的に、１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する白人は、約１６％しかタイプ１事象を示さなかった。全集団において、９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する対象の３９％がタイプ１事象を示し、１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する対象の約１６％がタイプ１事象を示した。これらの結果は、ログランク検定およびCox比例危険モデルにより検出された関係と一致した。
【表６】
2008505060.tif 000008
値は、対象の数(%)である。
【０２２１】
加えて、positive and negative syndrome scale (PANSS)を含む精神病評価により測定してクロザピン処置に対する応答において遺伝子型群間で有意差はなかった。
【０２２２】
ＤＡＴ１遺伝子におけるＶＮＴＲ多型と生涯の自殺企図の関係
疾病重症度の基準値におけるＤＡＴ１遺伝子のＶＮＴＲ多型の影響の可能性を試験した。表７に示す通り、生涯の自殺企図または過去３６ヶ月間の自殺企図における遺伝子型群間で有意な差があった。ＶＮＴＲ多型における９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する対象は、１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する対象と比較して、有意に高い自殺企図を示した。生涯の自殺企図との関係は、疾病重症度の変更におけるこの多型の可能性のある役割を示唆した。
【表７】
2008505060.tif 000009
値は平均(ＳＤ)である。
*遺伝子型群間の差は、ANCOVAを使用して比較した。年齢および性別を調整した。
+Fisherの直接確率検定を使用した。
【０２２３】
考察
ＤＡＴ１座のいくつかの多型は既に記載されており、４０−ｂｐ  ＶＮＴＲ多型は、ヒトの疾患との関連試験において広く研究されている。このＶＮＴＲ多型は、心的外傷後ストレス障害(Segman RH et al., Mol. Psychiatry 7(8): 903-7 (2002))、注意欠陥過活動性障害(ADHD)(Smith KM et al., Am. J Med. Genet. 119B(1):77-85 (2003);Chen CK et al. Mol. Psychiatry 8(4):393-6 (2003))、長期メタンフェタミン精神病(Ujike H et al., Pharmacogenomics J. 3(4):242-7 (2003))、子供の外面化行動問題(Young SE et al., Am. J. Med. Genet. 114(2):144-9 (2002))、および過食行動を伴う摂食障害(Shinohara M et al., J. Psychiatry Neurosci. 29(2):134-7 (2004))と関係がある可能性が明らかとなった。興味深いことに、ＡＤＨＤを有する患者におけるこのＶＮＴＲ多型とメチルフェニデート応答との関係が観察された。Kirley A et al., Am. J. Med. Genet. 121B(1): 50-4 (2003)。
【０２２４】
ドーパミントランスポーターは、放出されたドーパミンをシナプス末端に回収することによるシナプス中のドーパミンの活性制御において重要な役割を果たす。セロトニンおよびドーパミンの該トランスポーターが助ける取り込みは、それらが広く使用されている抗鬱薬および向精神薬の活性部位であるため、ヒトの行動または精神状態における活動に関連している。ＤＡＴ１遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＶＮＴＲ多型は脳の遺伝子発現に影響し、恐らく神経伝達の変更をもたらす。Mill J et al., Am. J. Med. Genet. 114(8): 975-9 (2002); Fuke S et al., Pharmacogenomics J. 1(2):152-6 (2001)。それゆえ、この多型は、薬理遺伝学分析の有効なマーカーを代表する。
【０２２５】
本実施例において、我々は、ＶＮＴＲ多型とクロザピン処置されている統合失調症または統合失調性感情障害を有する患者のタイプ１事象のリスクとの間の有意な関係を見いだした。この関係はクロザピン処置群にのみ存在し、オラザピン処置群には見られず、ＶＮＴＲ多型とクロザピン応答との直接的関係を示唆する。
【０２２６】
生涯の自殺企図の関係は、疾患重症度を変更するこの多型の機能を示す。９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する対象は、タイプ１事象の高いリスクを有し、そしてクロザピン処置にあまり良い反応をしない傾向がある。
【０２２７】
要約
クロザピンは、統合失調症の症状を処置するために利用されるもっとも臨床上強力な薬剤の１種である。クロザピンから最も利益を受けそうな者を処置前に同定されたとき、それは、これらの患者の臨床管理の著しい改善である。
【０２２８】
ドーパミントランスポーター遺伝子(ＳＬＣ６Ａ３)における２種の多型(３’−ＵＴＲにおけるＶＮＴＲおよびＥｘｏｎ９における多型)とタイプ１事象(自殺企図)までの時間との関係は、Ｃｌｏｚａｒｉｌ(登録商標)で処置された患者において見いだされた。これらの結果は、遺伝子型が、自殺に対する処置においてクロザピン応答の予測に使用できることを示す。２種のリスクファクターを組み合わせたとき、この関係の有意性はわずかに向上した。２種のリスクファクターを有する部分集合中の患者の約４０％が試験の最後にタイプ１事象を経験し；２種のリスクファクターを有さない部分集合中の患者の１５％のみがタイプ１事象を有した。遺伝子型に従い、患者の約１０％は、低応答者であると計算できる。したがって、可能性のある呈応答者をＳＬＣ６Ａ３遺伝子型に基づいて処置から除去できたならば、クロザピン応答率は有意に改善され得る。
【０２２９】
実施例２
クロザピン応答に対する遺伝子の影響が統合失調症と統合失調性感情障害との間で差があるかどうかを決定する試みにおいて、疾患に基づく部分集合分析を行った。表８に示した通り、ＤＡＴ１遺伝子のＶＮＴＲ多型とタイプ１事象により評価されるクロザピン応答との関係は、統合失調症を有する対象においてのみ存在し、統合失調性感情障害を有する対象には存在しなかった。加えて、統合失調症または統合失調性感情障害を有する対象でのオラザピン処置の応答において、遺伝子型群間で差はなかった。これらの結果は、自殺行動に対する遺伝子の影響において、統合失調症と統合失調性感情障害で有意な差があることを示す。ＤＡＴ１遺伝子の３’ＵＴＲ  ＶＮＴＲ多型は、統合失調症患者におけるクロザピン応答予測の遺伝マーカーである。
【表８】
2008505060.tif 000010
値は対象の数(%)である。
+終了時 タイプ１事象。
S/S = 9≧/9≧; S/L = 10≦/9≧; L/L = 10≦/10≦。
++ログランク検定を使用して、遺伝子型群間のタイプ１事象までの時間の全体的差異を比較した。
+++ログランク検定を使用して、S/SおよびS/LおよびL/L間でのタイプ１事象までの時間の差異を比較した。
【０２３０】
引用文献
本明細書に記載のすべての引用文献は、各個々の文献または特許もしくは特許出願が具体的にそして個々に、その全体をすべての目的のために包含させると示してあるのと同程度に、その全体を引用し、かつ、すべての目的のために本明細書に包含させる。本明細書に記載の引用文献の記載は、単にその著者らにより成された主張を要約するものであり、すべての引用文献が先行技術を構成すると承認したものではない。出願人は引用文献の精度および妥当性に異議を申し立てる権利を有する。
【０２３１】
加えて、本明細書に記載の全てのGenBank受託番号、Unigene Cluster番号およびタンパク質受託番号は、各個々の番号が具体的にそして個々に、その全体をすべての目的のために包含させると示してあるのと同程度に、本明細書にその全体を引用し、かつ、すべての目的のために、本明細書に包含させる。
【０２３２】
本発明は、本発明の一つの態様の一つの例示であることを意図する、本明細書中に記載の特定の態様について限定すべきではない。本発明の多くの修飾および変法が、当業者には明白なように、その精神および範囲から逸脱することなく成し得る。本明細書に列記のものに加えて、本発明の範囲内の機能的に同等な方法および装置が、前記の記載および添付の図面から当業者に明白である。このような修飾および変法は、特許請求の範囲の範囲内にあると解釈する。本発明は、本発明は添付の特許請求の範囲の観点から、限定されるべきであり、このような特許請求の範囲が権利を与えられているものと等価なものの完全な範囲を含む。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】実施例１におけるクロザピン処置群の白人(Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ)のログランク検定解析の結果を示すグラフである。
【図２】実施例１におけるクロザピン処置群の全集団のログランク検定解析の結果を示すグラフである。
【図３】オランザピン処置群の白人のログランク検定解析の結果を示すグラフである。
【図４】オランザピン処置群の全集団のログランク検定解析の結果のグラフである。
【図５】クロザピン処置群の９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する白人と１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する白人との比較を示すグラフである。
【図６】クロザピン処置群の９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する全対象と１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する全対象との比較を示すグラフである。
【図７】オランザピン処置群の９個またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する白人と１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する白人との比較を示すグラフである。
【図８】オランザピン処置群の９またはそれ以下の反復対立遺伝子を有する全対象と１０個またはそれ以上の反復対立遺伝子の少なくとも１個のコピーを有する全対象との比較を示すグラフである。
【図１】
2008505060.tif 000011
【図２】
2008505060.tif 000012
【図３】
2008505060.tif 000013
【図４】
2008505060.tif 000014
【図５】
2008505060.tif 000015
【図６】
2008505060.tif 000016
【図７】
2008505060.tif 000017
【図８】
2008505060.tif 000018
【配列表】
2008505060000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月24日(2007.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008505060000001.app
【国際調査報告】
2008505060.tif 000021
2008505060.tif 000022
2008505060.tif 000023
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2008505060.tif 000025
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