(57)【要約】本発明は、例えば、C. ジェジュニ（C. jejuni）株O:36およびO:19からのα-2,3-シアリルトランスフェラーゼタンパク質を含む、保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質を提供する。本発明は、それらのシアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化産物を作製する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、GenBank AF130466、GenBank AX934425、GenBank AX934434、GenBank AX934427、GenBank AX934431、GenBank AF401529、GenBank AX934436、GenBank AX934429、GenBank AY044156、GenBank AF400047、GenBank AY297047、GenBank AF305571、GenBank AL139077、GenBank X57315、GenBank AE006157、およびCD：pfam06002.2、CST-Iに由来するシアリルトランスフェラーゼタンパク質のコンセンサス配列より選択される群のメンバーではないという条件で、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含む、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAが、
2008512993.tif 000034
である、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項３】
シアリルトランスフェラーゼモチーフBが、
2008512993.tif 000035
である、請求項2記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項４】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAが、
2008512993.tif 000036
である、請求項2記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項５】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAが、
2008512993.tif 000037
である、請求項2記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項６】
シアリルトランスフェラーゼモチーフBが、
2008512993.tif 000038
である、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項７】
α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項８】
α-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項９】
α-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項7記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１０】
アクセプター分子が、オリゴサッカライド、糖脂質、糖ペプチド、または糖タンパク質である、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１１】
切断されている、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１２】
バクテリアタンパク質である、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１３】
ビブリオ（Vibrionaceae）科のメンバーからである、請求項12記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１４】
ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、およびカンピロバクター（Campylobacter）種からなる群より選択されるバクテリア種からである、請求項12記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１５】
カンピロバクター・ジェジュニ（jejuni）からである、請求項14記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１６】
株O:19からである、請求項15記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１７】
株O:36からである、請求項15記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸タグをさらに含む、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項１９】
アクセサリー酵素に融合される、請求項1記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２０】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）に対して少なくとも98％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２１】
α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項20記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２２】
アクセプター分子が、オリゴサッカライド、糖脂質、糖ペプチド、または糖タンパク質である、請求項20記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２３】
アミノ酸タグをさらに含む、請求項20記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２４】
アクセサリー酵素に融合される、請求項20記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２５】
図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）および図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）からなる群より選択される、請求項20記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２６】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）のアミノ酸1〜283を含む、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２７】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）のアミノ酸1〜285を含む、請求項26記載の単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２８】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）のアミノ酸1〜285を含む、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２９】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）のアミノ酸1〜293を含む、請求項28記載の単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項３０】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列が、図2の核酸配列（O:36核酸配列、配列番号：5）に対して少なくとも98％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸。
【請求項３１】
アクセプター分子が、オリゴサッカライド、糖脂質、糖ペプチド、または糖タンパク質である、請求項30記載の単離または組換え核酸。
【請求項３２】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、アミノ酸タグをさらに含む、請求項30記載の単離または組換え核酸。
【請求項３３】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、アクセサリー酵素に融合される、請求項30記載の単離または組換え核酸。
【請求項３４】
シアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列が、図2の核酸配列（O:36核酸配列、配列番号：5）および図3の核酸配列（O:19核酸配列、配列番号：7）からなる群より選択される、請求項30記載の単離または組換え核酸。
【請求項３５】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列が、図2のヌクレオチド1〜849（O:36核酸配列、配列番号：5）を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸。
【請求項３６】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図3のヌクレオチド1〜888（O:19核酸配列、配列番号：7）を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸。
【請求項３７】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）のアミノ酸1〜285を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸。
【請求項３８】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ；かつシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）のアミノ酸1〜285を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸。
【請求項３９】
請求項30、35、36、37、または38記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項４０】
請求項39記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４１】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項40記載の宿主細胞を増殖させることを含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法。
【請求項４２】
a）アクセプター基質を、シアル酸を含むドナー基質および請求項1、20、26、または28記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドに接触させる段階；および
b）アクセプターサッカライドへのシアル酸部分の転移が生じることを可能にし、それによってシアリル化産物サッカライドを産生する段階、
を含む、シアリル化産物サッカライドを産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えば、C. ジェジュニ（C. jejuni）株O:36およびO:19からのα-2,3-シアリルトランスフェラーゼタンパク質を含む、保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質を提供する。本発明は、それらのシアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化産物を作製する方法も提供する。
【０００２】
関連出願の相互参照
この出願は、すべての目的に対して参照により本明細書に組み入れられる、2004年9月17日に出願された米国特許仮出願第60/610807号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
糖質は、多くの細胞-細胞認識事象、特に発病におけるバクテリアおよびウィルスの哺乳類細胞への接着ならびに炎症におけるセレクチンを介する白血球-内皮細胞相互作用において、主として重要なものとして現在認識されている（Varki (1993) Glycobiology 3: 97-130（非特許文献１））。さらに、バクテリアにおいて見出されているシアリル化複合糖質（Preston et al. (1996) Crit. Rev. Microbiol. 22:139-180（非特許文献２）; Reuter et al. (1996) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377:325-342（非特許文献３））は、宿主免疫応答を逃れるための哺乳類糖脂質において見出されたオリゴサッカライドを模倣すると考えられている（Moran et al. (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16:105-115（非特許文献４））。リポポリサッカライド（LPS）のサッカライド部分による宿主構造の分子擬態は、宿主免疫応答を逃れるためにこの戦略を使用する、様々な粘膜病原体の毒性因子であると考えられている（Moran et al. (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16:105-115（非特許文献４）; Moran et al. (1996) J. Endotoxin Res. 3: 521-531（非特許文献５））。
【０００４】
これらのおよびその他のプロセスに関与するオリゴサッカライド構造は、潜在的な治療的薬剤であるが、それらは、伝統的な化学的手段によって作製するには時間がかかりかつ高価である。特定のオリゴサッカライド構造の産生への非常に前途有望な道は、インビボでそれらを作製する酵素、グリコシルトランスフェラーゼの使用を介する。そのような酵素は、オリゴサッカライドのインビトロ合成に対する位置-および立体選択的触媒として使用され得る（Ichikawa et al. (1992) Anal. Biochem. 202: 215-238（非特許文献６））。シアリルトランスフェラーゼは、活性化糖ヌクレオチドから糖タンパク質、糖脂質、またはポリサッカライド上で見出されるアクセプターオリゴサッカライドへシアル酸を転移させるグリコシルトランスフェラーゼの群である。シアリル化オリゴサッカライド構造の多くは、様々な構造の合成に関与する多くの異なるシアリルトランスフェラーゼの特徴付けをもたらした。シアリルトランスフェラーゼは、哺乳類およびその他の真核生物から、ならびにC. ジェジュニ、ナイセリア（Neisseria）、ヘモフィルス（Haemophilus）、および大腸菌（E. coli）を含む微生物から、単離されかつ特徴付けられている（Tsuji et al. (1996) Glycobiology 6:v-vii（非特許文献７）;米国特許第6,503,744号（特許文献１）；米国特許第6,699,705号（特許文献２）；米国特許第6,096,529号（特許文献３）；米国特許第6,210,933号（特許文献４）；およびWeisgerber et al. (1991) Glycobiol. 1:357-365（非特許文献８））。
【０００５】
オリゴサッカライドの大規模な酵素合成は、必要とされるグリコシルトランスフェラーゼの十分な量の使用可能性に依存する。しかしながら、オリゴサッカライド構造を調製することにおける使用に対する十分な量のグリコシルトランスフェラーゼの産生は、問題がある。多くの哺乳類グリコシルトランスフェラーゼの発現は、真核生物宿主における発現に関与して達成されており、高価な組織培地およびタンパク質のごく中程度の産出に関与し得る（Kleene et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 160-167（非特許文献９）; Williams et al. (1995) Glycoconjugate J. 12: 755-761（非特許文献１０））。大腸菌における発現は、哺乳類グリコシルトランスフェラーゼに対して達成されているが、これらの試みは、主に、大量の活性酵素を回収するのが難しい酵素の不溶型を産出した（Aoki et al. (1990) EMBO. J. 9:3171-3178（非特許文献１１）; Nishiu et al. (1995) Biosci. Biotech. Biochem. 59 (9): 1750-1752（非特許文献１２））。さらに、それらの産物の生物学的活性のために、哺乳類シアリルトランスフェラーゼは、概して、精密なシアリログリカン（sialyloglycan）を作製するために、特定の組織、細胞区画、および/または発生ステージにおいて作用する。
【０００６】
哺乳類シアリルトランスフェラーゼは、一般的に、酵素の同定において助けとなる、保存されたシアリルトランスフェラーゼ結合モチーフを共有する。（Datta and Paulson, J. Biol. Chem. 270:1497-1500 (1995)（非特許文献１３））。この哺乳類モチーフは、バクテリア酵素においては保存されていないように思われる。（例えば、Chiu et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 11:163-70 (2004) Epub 2004 Jan 18（非特許文献１４）を参照されたい。）付加的なバクテリアシアリルトランスフェラーゼの同定は、例えば生物学的活性を有する望ましいオリゴサッカライドの合成において助けとなると考えられるので、したがって、新しいバクテリアシアリルトランスフェラーゼの同定および特徴付けは、これらのテクノロジーの開発において有用であると考えられる。本発明は、このおよびその他の必要性を実現させる。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第6,503,744号
【特許文献２】米国特許第6,699,705号
【特許文献３】米国特許第6,096,529号
【特許文献４】米国特許第6,210,933号
【非特許文献１】Varki (1993) Glycobiology 3: 97-130
【非特許文献２】Preston et al. (1996) Crit. Rev. Microbiol. 22:139-180
【非特許文献３】Reuter et al. (1996) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377:325-342
【非特許文献４】Moran et al. (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16:105-115
【非特許文献５】Moran et al. (1996) J. Endotoxin Res. 3: 521-531
【非特許文献６】Ichikawa et al. (1992) Anal. Biochem. 202: 215-238
【非特許文献７】Tsuji et al. (1996) Glycobiology 6:v-vii
【非特許文献８】Weisgerber et al. (1991) Glycobiol. 1:357-365
【非特許文献９】Kleene et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 160-167
【非特許文献１０】Williams et al. (1995) Glycoconjugate J. 12: 755-761
【非特許文献１１】Aoki et al. (1990) EMBO. J. 9:3171-3178
【非特許文献１２】Nishiu et al. (1995) Biosci. Biotech. Biochem. 59 (9): 1750-1752
【非特許文献１３】Datta and Paulson, J. Biol. Chem. 270:1497-1500 (1995)
【非特許文献１４】Chiu et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 11:163-70 (2004) Epub 2004 Jan 18
【発明の開示】
【０００８】
発明の簡単な概要
本開示は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを同定するために使用され得る新しく認識されたアミノ酸モチーフの説明を提供する。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させるタンパク質の属のメンバーであり；本明細書において定義されるように、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含み；以下の公知のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド（アミノ酸またはコードする核酸のアクセッション番号によって同定される）は、主張される属に含まれない：GenBank AF130466、GenBank AX934425、GenBank AX934434、GenBank AX934427、GenBank AX934431、GenBank AF401529、GenBank AX934436、GenBank AX934429、GenBank AY044156、GenBank AF400047、GenBank AY297047、GenBank AF305571、GenBank AL139077、GenBank X57315、およびGenBank AE006157。図4において示されるCD：pfam06002.2、CST-I、保存されたデータベースドメインに由来する人工的に得られたシアリルトランスフェラーゼタンパク質コンセンサス配列も、属から除外される。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAは、
2008512993.tif 000002
、すなわち
2008512993.tif 000003
である。さらなる態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAは、
2008512993.tif 000004
であり、シアリルトランスフェラーゼモチーフBは、
2008512993.tif 000005
である。その他の態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフBは、
2008512993.tif 000006
である。
【０００９】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性、α-2,8-シアリルトランスフェラーゼ活性を有し得る、または二重α-2,3/8-シアリルトランスフェラーゼ活性を有し得る。
【００１０】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、ドナー分子から、例えばオリゴサッカライド、糖脂質、糖ペプチド、または糖タンパク質などのアクセプター分子へ、シアル酸部分を転移させ得る。
【００１１】
いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、切断されかつ活性を保有する。
【００１２】
いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、バクテリアタンパク質である。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、元来、ビブリオ（Vibrionaceae）科のメンバーに由来し得る。その他の態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、元来、ヘモフィルス・インフルエンザ（influenzae）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、またはカンピロバクター（Campylobacter）種に由来し得る。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、元来、例えば株O:19または株O:36などのカンピロバクター・ジェジュニに由来し得る。
【００１３】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、アミノ酸タグを含み得る、またはアクセサリー酵素に融合され得る。
【００１４】
別の局面において、本開示は、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ、かつ図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）に対して少なくとも98％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、いくつかの態様において、α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、アクセプター分子として、オリゴサッカライド、糖脂質、糖ペプチド、または糖タンパク質を使用する。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、アミノ酸タグを含み得る、またはアクセサリー酵素に融合され得る。さらなる態様において、図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）および図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）。
【００１５】
一つの態様において、本開示は、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ、かつ図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）のアミノ酸1〜283を含む、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。さらなる態様において、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）のアミノ酸1〜285を含む。
【００１６】
別の態様において、本開示は、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させ、かつ図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）のアミノ酸1〜285を含む、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。さらなる態様において、単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）のアミノ酸1〜293を含む。
【００１７】
本開示は、例えば図2の核酸配列（O:36核酸配列、配列番号：5）と少なくとも98％同一性を有するヌクレオチド配列を含むシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸などの、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させる単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸も提供する。コードされるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、例えばオリゴサッカライド、糖脂質、糖ペプチド、および糖タンパク質を含むアクセプター分子へシアル酸を転移させる。コードされるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、アミノ酸タグを含んでもよい；かつ、いくつかの態様において、融合タンパク質を形成するために、アクセサリー酵素へ融合される。付加的な態様において、シアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列は、図2の核酸配列（O:36核酸配列、配列番号：5）または図3の核酸配列（O:19核酸配列、配列番号：7）のいずれかを含む。シアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列の付加的な態様は、例えば図2（O:36核酸配列、配列番号：5）のヌクレオチド1〜849、図2（O:36核酸配列、配列番号：5）のヌクレオチド1〜855、図3（O:19核酸配列、配列番号：7）のヌクレオチド1〜855、および図3（O:19核酸配列、配列番号：7）のヌクレオチド1〜888を含んだ。さらなる態様は、例えば、図5および6のアミノ酸配列または図5および6のアミノ酸配列と80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％より大きな同一性を有するアミノ酸配列などの、H.インフルエンザからのLic3AおよびLic3A2シアリルトランスフェラーゼタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１８】
本開示は、例えば図2のアミノ酸配列（O:36アミノ酸配列、配列番号：6）のアミノ酸1〜285を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列、または図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）のアミノ酸1〜285を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列、または図3のアミノ酸配列（O:19アミノ酸配列、配列番号：8）のアミノ酸1〜293を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするシアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列などの、ドナー基質からアクセプター基質へシアル酸を転移させる単離または組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸も提供する。例えば、図5および6のアミノ酸配列または図5および6のアミノ酸配列と80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％より大きな同一性を有するアミノ酸配列などの、H.インフルエンザからのLic3AおよびLic3A2シアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸も含まれる。
【００１９】
さらなる局面において、本開示は、シアリルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター；発現ベクターを含む宿主細胞、およびシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を増殖させることによって本明細書において記載されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法を提供する。
【００２０】
本開示の別の局面は、シアル酸部分を含むドナー基質ならびにシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびモチーフBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドにアクセプター基質を接触させ；かつアクセプターサッカライドへのシアル酸部分の転移が生じることを可能にし、それによってシアリル化産物サッカライドを産生することによって、シアリル化産物サッカライドを産生する方法を提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
I. 序文
本発明は、保存されたモチーフを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼプリペプチドを同定するために使用され得る、保存されたバクテリアシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBのアミノ酸配列を提供する。保存されたシアリルトランスフェラーゼモチーフを含む新しいシアリルトランスフェラーゼは、例えばオリゴサッカライド、糖ペプチドもしくは糖タンパク質、または糖脂質をシアリル化するために使用され得る。本発明は、例えばC. ジェジュニ株O:19およびO:36からのCst-Iタンパク質ならびにヘモフィルス・インフルエンザからのlic3Aおよびlic3A2シアリルトランスフェラーゼなどの、新しいシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸および核酸配列も提供する。
【００２２】
II. 定義
本明細書において使用されるように、「シアリルトランスフェラーゼポリペプチド」は、以下に記載される二つの保存されたモチーフ、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフBを含み、かつシアリルトランスフェラーゼ活性を有する、すなわち、タンパク質が、オリゴサッカライド、糖脂質、または糖タンパク質などのアクセプター基質への活性化シアル酸分子などのドナー基質の転移を触媒する、ポリペプチドを指す。保存されたモチーフの同定は、11個の公知のシアリルトランスフェラーゼタンパク質の配列比較、例えば図1を参照されたい、およびシアリルトランスフェラーゼタンパク質の基質結合部位における保存された残基の位置に基づき、例えば保存された残基は、基質結合部位の構成要素として機能するように思われる。（例えば、Chiu et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 11:163-70 (2004) Epub 2004 Jan 18.を参照されたい）シアリルトランスフェラーゼポリペプチドのこの群は、α2,3リンケージにおけるシアル酸残基の付加を触媒するタンパク質、α2,8リンケージにおけるシアル酸残基の付加を触媒するタンパク質、ならびにα2,3リンケージおよびα2,8リンケージにおけるシアル酸残基の付加を触媒する二重機能タンパク質を含む。例えばα2,6リンケージなどのその他のリンケージにおけるシアル酸残基の付加を触媒するシアリルトランスフェラーゼも、その群に含まれる。
【００２３】
いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、微生物からであり、さらなる態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、バクテリアからである。開示されるシアリルトランスフェラーゼを有するバクテリアのいくつかは、カンピロバクター、ヘモフィルス、およびパスツレラを含む。カンピロバクター・ジェジュニは、シアリルトランスフェラーゼの3つのクラス、すなわちCst-I、Cst-II、およびCst-IIIを有することが公知である。シアリルトランスフェラーゼの3つのC. ジェジュニクラスの各々のメンバーは、本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドに含まれる。本明細書において定義されるように、シアリルトランスフェラーゼタンパク質またはポリペプチドは、以下のアクセッション番号において開示されるシアリルトランスフェラーゼタンパク質を含まない：GenBank AAF13495；GenBank AX934425；GenBank AX934434；GenBank AX934427；GenBank AX934431；GenBank AAL06004；GenBank AX934436；GenBank AX934429；GenBank AAK73183；GenBank AAK85419；図1においてCst-II HB93-13として示されるGenBank AY297047によってコードされるシアリルトランスフェラーゼ；GenBank AAL09368；GenBank NP_282288；GenBank CAA40567；またはGenBank AAK03258。シアリルトランスフェラーゼの定義は、図4において示されるCD：pfam06002.2、CST-I、保存されたデータベースドメインに由来する人工的に得られたシアリルトランスフェラーゼタンパク質コンセンサス配列も除外する。属から除外されるその他のシアリルトランスフェラーゼ配列は、2003年1月7日に発行された米国特許第6,503,744号および2004年3月2日に発行された米国特許第6,699,705号において開示されるカンピロバクターシアリルトランスフェラーゼであり、その両方は、参照により本明細書に組み入れられ；ならびに以下のアクセッション番号において開示される配列：CAA40567、CAB73395、AAL09368、AAL36462、ZP_00322176、ZP_00321441、ZP_00155359、ZP_00156191、AAL05990、AAG43979、AAK03258、AAF13495、AAK96001、AAK91725、AAL06004、CAB73395、AAL09368、NP_245125、およびAAL36462。
【００２４】
本明細書において使用されるように、「シアリルトランスフェラーゼモチーフA」は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドにおいて見出されたアミノ酸配列、すなわち
2008512993.tif 000007
、およびその配列の保存的に修飾された変異体を指す。したがって、シアリルトランスフェラーゼモチーフAは、
2008512993.tif 000008
、およびそれらの配列の保存的に修飾された変異体を指す。本明細書において使用されるように、「シアリルトランスフェラーゼモチーフB」は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドにおいて見出されたアミノ酸配列、すなわち
2008512993.tif 000009
、およびその配列の保存的に修飾された変異体を指す。概して、シアリルトランスフェラーゼモチーフAは、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドにおいてシアリルトランスフェラーゼBに対してアミノ末端に見出されている。二つのシアリルトランスフェラーゼモチーフ間の間隔は、重大ではない。いくつかの態様において、約30、35、40、44、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、または110のアミノ酸残基が、二つのモチーフを分離する。典型的には、二つのモチーフ間の間隔は、例えば80残基と100残基との間、または90残基と95残基との間、およびいつくかの態様に対しては、通常は、例えば91アミノ酸残基、92アミノ酸残基、または93アミノ酸残基である。
【００２５】
本明細書において使用されるように、「切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチド」または文法的変異体は、切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが酵素活性を保有する限り、天然で生じる野生型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドに対して少なくとも一つのアミノ酸残基を除去するために操作されているシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを指す。例えば、アミノ酸1〜約285を含むC. ジェジュニCst-Iポリペプチドは、活性があり；アミノ酸1〜約255を含むC. ジェジュニCst-IIポリペプチドは、活性があり；かつアミノ酸1〜約255を含むC. ジェジュニCst-IIIポリペプチドは、活性がある。
【００２６】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮退のため、多くの機能的に同一の核酸は、任意の与えられたタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは、すべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって規定されるすべての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく記載される対応コドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての起こり得るサイレント変異も記載する。当業者は、核酸における各々のコドン（普通はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および普通はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）が、機能的に同一の分子を産出するように修飾され得ることを認識すると思われる。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変異は、発現産物に関して各々の記載される配列において絶対的であるが、実際のプローブ配列に関して絶対的ではない。
【００２７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列における単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加が、その変更が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を引き起こす「保存的に修飾された変異体」であることを認識すると思われる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加わるものであり、かつそれらを除外しない。
【００２８】
当業者は、多くのアミノ酸が、タンパク質の機能に影響を及ぼすことなくタンパク質において互いに置換され得る、すなわち、保存的置換が、開示されるシアリルトランスフェラーゼなどのタンパク質の保存的に修飾された変異体の基礎であり得ることを認識する。保存的アミノ酸置換の不完全リストが後に続く。以下の8つの群は、互いに保存的な置換であるアミノ酸を各々含む：1）アラニン（A）、グリシン（G）；2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4）アルギニン（R）、リジン（K）；5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）、アラニン（A）；6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；7）セリン（S）、トレオニン（T）、システイン（C）；および8）システイン（C）、メチオニン（M）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。
【００２９】
本発明の細胞および方法は、概してドナー基質からアクセプター分子へシアル酸部分を転移させることによって、シアリル化産物を産生することに対して有用である。本発明の細胞および方法は、概してドナー基質からアクセプター分子へ付加的なモノサッカライドまたは硫酸基を転移させることによって、付加的な糖残基を含むシアリル化産物糖を産生することに対しても有用である。付加は、概して、例えば生体分子などの、オリゴサッカライド、ポリサッカライド（例えば、ヘパリン、カラゲニン、および同様のもの）、または糖脂質もしくは糖タンパク質上の糖質部分の非還元端で起こる。本明細書において定義される生体分子は、糖質、オリゴサッカライド、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、および脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびガングリオシド）などの生物学的に有意な分子を含むが、それらに限定されない。
【００３０】
以下の略語が、本明細書において使用される。
Ara =アラビノシル；
Fru =フルクトシル；
Fuc =フコシル；
Gal =ガラクトシル；
GalNAc =N-アセチルガラクトサミニル；
Glc =グルコシル；
GlcNAc =N-アセチルグルコサミニル；
Man =マンノシル；および
NeuAc =シアリル(N-アセチルノイラミニル)。
【００３１】
「シアル酸」または「シアル酸部分」という語は、9炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチル-ノイラミン酸（2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノ（galactononulopyranos）-1-オン酸）（Neu5Ac、NeuAc、またはNANAとしばしば略される）である。ファミリーの第二のメンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸（Neu5GcまたはNeuGc）であり、NeuAcのN-アセチル基が、ヒドロキシル化される。第三のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソニック酸（nonulosonic acid）（KDN）である（Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)）。9-O-ラクチル-Neu5Acまたは9-O-アセチル-Neu5Acなどの9-O-C1-C6アシル-Neu5Ac、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Acおよび9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acなどの9-置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの概論として、例えば、Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabilism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))を参照されたい。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、1992年10月1日に公開された国際出願国際公開公報第92/16640号において開示される。
【００３２】
「シアリル化産物サッカライド」は、シアル酸部分を含む、例えば生体分子などの、オリゴサッカライド、ポリサッカライド（例えば、ヘパリン、カラゲニン、および同様のもの）、または糖脂質もしくは糖タンパク質に非結合もしくは結合された糖質部分を指す。上記のシアル酸部分のいずれかは、PEG化シアル酸誘導体と同様に使用され得る。いくつかの態様において、例えばフコース、ガラクトース、グルコース、GalNAc、またはGluNAcなどのその他の糖部分も、シアリル化産物サッカライドを産生するためにアクセプター基質に付加される。シアリル化産物サッカライドの例は、例えば、シアリルアクトース（sialylactose）を含む。
【００３３】
「PEG」という語は、ポリ(エチレングリコール)を指す。PEGは、ペプチドに結合されている例示的なポリマーである。ペプチド治療薬（therapeutics）を誘導体化するためのPEGの使用は、ペプチドの免疫原性を軽減しかつ循環からのクリアランス時間を延長することが実証されている。例えば、米国特許第4,179,337号（Davis et al.）は、ポリエチレングリコール（PEG）またはポリプロピレングリコールに連結された酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ペプチドを考慮する。10モルと100モルとの間のポリマーが、モルペプチドあたりに使用され、生理学的活性の少なくとも15％が維持される。
【００３４】
例えばシアリルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼに対する「アクセプター基質」または「アクセプターサッカライド」は、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして作用し得るオリゴサッカライド部分である。アクセプター基質が、対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ドナー基質ならびにその他の必要な反応混合物構成要素と接触し、かつ反応混合物が、時間の十分な期間インキュベートされる場合、グリコシルトランスフェラーゼは、糖ドナー基質からアクセプター基質へ糖残基を転移させる。アクセプター基質は、特定のグリコシルトランスフェラーゼの異なる型に対して変化し得る。従って、「アクセプター基質」という語は、本文中で、特定の適用に対して対象となる特定のグリコシルトランスフェラーゼとともに取られる。シアリルトランスフェラーゼおよび付加的なグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質は、本明細書において記載される。
【００３５】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「ドナー基質」は、活性化ヌクレオチド糖である。そのような活性化糖は、概して、糖のウリジン、グアノシン、およびシチジン一リン酸誘導体（それぞれ、UMP、GMP、およびCMP）または糖の二リン酸誘導体（それぞれ、UDP、GDP、およびCDP）からなり、ヌクレオシド一リン酸または二リン酸は、離脱基としての役目をする。例えば、フコシルトランスフェラーゼに対するドナー基質は、GDP-フコースである。シアリルトランスフェラーゼに対するドナー基質は、例えば、望ましいシアル酸を含む活性化糖ヌクレオチドである。例えば、NeuAcの場合、活性化糖はCMP-NeuAcである。バクテリア、植物、および菌システムは、その他の活性化ヌクレオチド糖を時々使用し得る。
【００３６】
オリゴサッカライドは、還元端におけるサッカライドが実際に還元糖であるかないかにかかわらず、還元端および非還元端を有すると考えられる。許容される命名法に従って、オリゴサッカライドは、左に非還元端および右に還元端をともなって本明細書において描かれる。本明細書において記載されるすべてのオリゴサッカライドは、非還元サッカライド（例えば、Gal）に対する名前または略語、その後にグリコシド結合の配置（αまたはβ）、環結合、結合に関与する還元サッカライドの環位置、および次いで還元サッカライドの名前または略語（例えば、GlcNAc）をともなって記載される。二つの糖間のリンケージは、例えば、2,3,2→3、または（2,3）と表現され得る。各々のサッカライドは、ピラノースまたはフラノースである。
【００３７】
「接触する」という語は、本明細書において以下とほとんど同じ意味で使用される：組み合わせられる、添加される、混合される、通される、インキュベートされる、流される、など。
【００３８】
本適用において必要とされる命名法および一般的な研究室手順の多くは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989において見出され得る。マニュアルは、以後、「Sambrook et al.」と呼ばれる。
【００３９】
「C. ジェジュニ株O:36からのCst-I」という語または「C. ジェジュニ株O:36からのCst-I」をコードする核酸は、（1）C. ジェジュニ株O:36からのCst-I核酸（C. ジェジュニ株O:36からのCst-I核酸配列に対して、例えば図2、配列番号：5を参照されたい）によってコードされるアミノ酸配列またはC. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質（C. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質配列に対して、例えば図2、配列番号：6を参照されたい）のアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのアミノ酸の領域にわたって、約60％よりも大きなアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％。92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはより大きなアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し；（2）C. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質およびその保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された、例えばポリクローナル抗体などの抗体に結合し；（3）C. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質およびその保存的に修飾された変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし；（4）C. ジェジュニ株O:36からのCst-I核酸または触媒ドメインをコードする核酸に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのヌクレオチドの領域にわたって、約95％よりも大きな、好ましくは約96％、97％、98％、99％よりも大きな、またはより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸およびポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、ならびに種間ホモログを指す。好ましくは、触媒ドメインは、配列番号:6のC. ジェジュニ株O:36からのCst-I触媒ドメインに対する96％、97％、98％、または99％よりも大きなアミノ酸同一性を有する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、カンピロバクター、ヘモフィルス、およびパスツレラを含むがそれらに限定されないバクテリアからである。本発明の核酸およびタンパク質は、自然発生的または組換え分子の両方を含む。C. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質は、典型的には、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する。シアリルトランスフェラーゼアッセイ法は、本明細書において記載されるように、適当なドナー基質およびアクセプター基質を使用して、当業者にとって公知の方法に従って行なわれ得る。
【００４０】
「C. ジェジュニ株O:19からのCst-I」という語または「C. ジェジュニ株O:19からのCst-I」をコードする核酸は、（1）C. ジェジュニ株O:19からのCst-I核酸（C. ジェジュニ株O:19からのCst-I核酸配列について、例えば図3、配列番号：7を参照されたい）によってコードされるアミノ酸配列またはC. ジェジュニ株O:19からのCst-Iタンパク質（C. ジェジュニ株O:19からのCst-Iタンパク質配列について、例えば図3、配列番号：8を参照されたい）のアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのアミノ酸の領域にわたって、約60％よりも大きなアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％。92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはより大きなアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し（2）C. ジェジュニ株O:19からのCst-Iタンパク質およびその保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された、例えばポリクローナル抗体などの抗体に結合し；（3）C. ジェジュニ株O:19からのCst-Iタンパク質およびその保存的に修飾された変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし；（4）C. ジェジュニ株O:19からのCst-I核酸または触媒ドメインをコードする核酸に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのヌクレオチドの領域にわたって、約95％よりも大きな、好ましくは約96％、97％、98％、99％よりも大きな、またはより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸およびポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、ならびに種間ホモログを指す。好ましくは、触媒ドメインは、配列番号:8のC. ジェジュニ株O:19からのCst-I触媒ドメインに対する96％、97％、98％、または99％よりも大きなアミノ酸同一性を有する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、カンピロバクター、ヘモフィルス、およびパスツレラを含むがそれらに限定されないバクテリアからである。本発明の核酸およびタンパク質は、自然発生的または組換え分子の両方を含む。C. ジェジュニ株O:19からのCst-Iタンパク質は、典型的には、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する。シアリルトランスフェラーゼアッセイ法は、本明細書において記載されるように、適当なドナー基質およびアクセプター基質を使用して、当業者にとって公知の方法に従って行なわれ得る。
【００４１】
「H. インフルエンザからのlic3Aシアリルトランスフェラーゼ」という語または「H. インフルエンザからのlic3Aシアリルトランスフェラーゼ」をコードする核酸は、（1）H. インフルエンザからのlic3Aシアリルトランスフェラーゼ核酸（lic3Aシアリルトランスフェラーゼ核酸配列について、例えば図5を参照されたい）によってコードされるアミノ酸配列またはH. インフルエンザからのlic3Aシアリルトランスフェラーゼポリペプチドのアミノ酸配列（lic3Aシアリルトランスフェラーゼアミノ酸配列について、例えば図5を参照されたい）に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのアミノ酸の領域にわたって、約60％よりも大きなアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％。92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはより大きなアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。（2）lic3Aシアリルトランスフェラーゼタンパク質およびその保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された、例えばポリクローナル抗体などの抗体に結合する。（3）lic3Aシアリルトランスフェラーゼタンパク質およびその保存的に修飾された変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする。（4）lic3Aシアリルトランスフェラーゼ核酸配列またはlic3Aシアリルトランスフェラーゼタンパク質の触媒ドメインをコードする核酸に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのヌクレオチドの領域にわたって、約95％よりも大きな、好ましくは約96％、97％、98％、99％よりも大きな、またはより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸およびポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、ならびに種間ホモログを指す。好ましくは、触媒ドメインは、lic3Aシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインに対する、96％、97％、98％、または99％よりも大きなアミノ酸同一性を有する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、カンピロバクター、ヘモフィルス、およびパスツレラを含むがそれらに限定されないバクテリアからである。本発明の核酸およびタンパク質は、自然発生的または組換え分子の両方を含む。H. インフルエンザからのlic3Aシアリルトランスフェラーゼは、典型的には、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する。シアリルトランスフェラーゼアッセイ法は、本明細書において記載されるように、適当なドナー基質およびアクセプター基質を使用して、当業者にとって公知の方法に従って行なわれ得る。Lic3Aタンパク質は、アクセッション番号CP000057およびMunson et al., J. Bacteriol. 187:4627-4636 (2005)において開示される。
【００４２】
「H. インフルエンザからのlic3A2シアリルトランスフェラーゼ」という語または「H. インフルエンザからのlic3A2シアリルトランスフェラーゼ」をコードする核酸は、（1）H. インフルエンザからのlic3A2シアリルトランスフェラーゼ核酸（lic3A2シアリルトランスフェラーゼ核酸配列について、例えば図6を参照されたい）によってコードされるアミノ酸配列またはH. インフルエンザからのlic3A2シアリルトランスフェラーゼポリペプチドのアミノ酸配列（lic3A2シアリルトランスフェラーゼアミノ酸配列について、例えば図6を参照されたい）に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのアミノ酸の領域にわたって、約60％よりも大きなアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％。92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはより大きなアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し；（2）lic3A2シアリルトランスフェラーゼタンパク質およびその保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された、例えばポリクローナル抗体などの抗体に結合し；（3）lic3A2シアリルトランスフェラーゼタンパク質およびその保存的に修飾された変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし；（4）lic3A2シアリルトランスフェラーゼ核酸配列またはlic3A2シアリルトランスフェラーゼタンパク質の触媒ドメインをコードする核酸に対して、好ましくは少なくとも約25個、50個、100個、200個、500個、1000個、またはより多くのヌクレオチドの領域にわたって、約95％よりも大きな、好ましくは約96％、97％、98％、99％よりも大きな、またはより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸およびポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、ならびに種間ホモログを指す。好ましくは、触媒ドメインは、lic3A2シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインに対する96％、97％、98％、または99％よりも大きなアミノ酸同一性を有する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、カンピロバクター、ヘモフィルス、およびパスツレラを含むがそれらに限定されないバクテリアからである。本発明の核酸およびタンパク質は、自然発生的または組換え分子の両方を含む。H. インフルエンザからのlic3A2シアリルトランスフェラーゼは、典型的には、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する。シアリルトランスフェラーゼアッセイ法は、本明細書において記載されるように、適当なドナー基質およびアクセプター基質を使用して、当業者にとって公知の方法に従って行なわれ得る。Lic3A2タンパク質は、アクセッション番号CP000057.1およびMunson et al., J. Bacteriol. 187:4627-4636 (2005)において開示される。
【００４３】
「商業規模」は、単一の反応におけるシアリル化産物のグラム規模産生を指す。好ましい態様において、商業規模は、約50グラム、75グラム、80グラム、90グラム、100グラム、125グラム、150グラム、175グラム、または200グラムよりも多くのシアリル化産物の産生を指す。
【００４４】
本発明の組換えタンパク質は、タンパク質の精製または同定を容易にする分子「精製タグ」を一端にともなう融合タンパク質として構築かつ発現され得る。そのようなタグは、グリコシル化反応の間に対象となるタンパク質の固定化に対して使用されてもよい。適したタグは、抗体によって特異的に認識されるタンパク質配列である「エピトープタグ」を含む。エピトープタグは、概して、融合タンパク質を明確に（unambiguously）検出または単離するために容易に使用できる抗体の使用を可能にするために融合タンパク質に組み込まれる。「FLAGタグ」は、配列AspTyrLysAspAspAspAspLysまたはその実質的に同一の変異体からなるモノクローナル抗FLAG抗体によって特異的に認識される、一般的に使用されるエピトープタグである。その他の適したタグは、当業者にとって公知であり、例えば、ニッケルもしくはコバルトイオンなどの金属イオンまたはmycタグに結合すると思われる、ヘキサヒスチジンペプチドなどの親和性タグを含む。精製タグを含むタンパク質は、精製タグに結合する結合パートナー、例えば精製タグに対する抗体、ニッケルもしくはコバルトイオン、または樹脂、およびアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンなどを使用して精製され得る。精製タグは、マルトース結合ドメインおよびスターチ結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者にとって公知である。スターチ結合ドメインは、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/15636号において記載される。ベータシクロデキストリン（BCD）-誘導体化樹脂を使用するスターチ結合ドメインを含む融合タンパク質の親和性精製は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2003年5月5日に出願された米国特許出願第60/468,374号において記載される。
【００４５】
「核酸」という語は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、他に特に限定されない限り、自然発生的なヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含する。他に特に示されない限り、特定の核酸配列は、その相補的な配列を含む。核酸、「核酸配列」、および「ポリヌクレオチド」という語は、本明細書においてほとんど同じ意味で使用される。
【００４６】
「操作可能なように連結される」という語は、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイなど）と第二の核酸配列との間の機能的なリンケージを指し、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写および/または翻訳に影響を及ぼす。
【００４７】
細胞に関して使用される場合「組換え」という語は、細胞が、異種核酸を複製する、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型内に見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞は、細胞の天然型において見出される遺伝子も含むことができ、その遺伝子は、人工的な手段によって修飾されかつ細胞に再導入される。その語は、細胞から核酸を除去することなく修飾されている細胞に対して内因性である核酸を含む細胞も包含し；そのような修飾は、遺伝子置換、部位特異的突然変異、および関連技術によって獲得されるものを含む。
【００４８】
「組換え核酸」は、人工的に構築された核酸を指す（例えば、二つの自然発生的または合成核酸フラグメントを連結させることによって形成される）。この語は、人工的に構築された核酸の複製または転写によって産生される核酸にも適用する。「組換えポリペプチド」は、組換え核酸（すなわち、細胞に対して天然ではないまたはその自然発生型から修飾されている核酸）の転写によって発現され、結果として生じる転写産物の翻訳が後に続く。
【００４９】
本明細書において使用されるように、「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」は、特定の宿主細胞とは異なる供給源を起源とするものである、または同じ供給源からの場合、その原型から修飾されるものである。したがって、原核宿主細胞における異種グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが修飾されているグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。異種配列の修飾は、例えば、プロモーターに操作可能なように連結されることが可能なDNAフラグメントを生成するために制限酵素でDNAを処置することによって生じ得る。部位特異的突然変異誘発などの技術も、異種配列を修飾することに対して有用である。
【００５０】
「サブ配列」は、それぞれ核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）のより長い配列の一部を含む、核酸またはアミノ酸の配列を指す。
【００５１】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、そのような配列と適合する宿主における構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能な核酸要素で、組換え的にまたは合成的に生成される核酸構築である。発現カセットは、少なくともプロモーターを含み、任意で転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは、転写される核酸（例えば、望ましいポリペプチドをコードする核酸）およびプロモーターを含む。発現をもたらすことにおいて必要なまたは助けとなる付加的な因子も、本明細書において記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットは、宿主細胞から発現されたタンパク質の分泌を方向付けるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響するその他の核酸配列も、発現カセットに含まれ得る。
【００５２】
本発明の「融合シアリルトランスフェラーゼポリペプチド」または「融合グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」は、グリコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインおよびアクセサリー酵素（例えば、CMP-Neu5Ac合成酵素）からの第二の触媒ドメインを含むポリペプチドである。融合ポリペプチドは、糖ヌクレオチド（例えば、CMP-NeuAc）の合成ならびに糖ヌクレオチドからアクセプター分子への糖残基の転移を触媒することが可能である。典型的には、融合ポリペプチドの触媒ドメインは、グリコシルトランスフェラーゼおよび触媒ドメインが由来する融合タンパク質のものと少なくとも実質的に同一であると思われる。いくつかの態様において、CMP-シアル酸シンターゼポリペプチドおよびシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、単一のポリペプチドを形成するために融合される。多くのシアリルトランスフェラーゼ酵素は、当業者にとって公知であり、本発明の方法において使用され得る。例えば、ナイセリアCMP-シアル酸シンターゼポリペプチドとナイセリアシアリルトランスフェラーゼタンパク質との間の融合は、例えば、国際公開公報第99/31224号およびGilbert et al., Nat Biotechnol. 16:769-72 (1998)において記載される。例えばナイセリアCMP-シアル酸シンターゼポリペプチドとカンピロバクターシアリルトランスフェラーゼとの間などのその他の融合は、本発明において使用され得る。
【００５３】
本明細書において述べられるように「アクセサリー酵素」は、例えばグリコシルトランスフェラーゼ反応に対する基質またはその他の反応物質を形成する、反応を触媒することに関与する酵素である。アクセサリー酵素は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼによって糖ドナー部分として使用されるヌクレオチド糖の形成を触媒し得る。アクセサリー酵素は、ヌクレオチド糖の形成に対して必要とされるヌクレオチド三リン酸の生成において、またはヌクレオチド糖に組み込まれる糖の生成において使用されるものであってもよい。
【００５４】
「触媒ドメイン」は、標準的には酵素によって実施される酵素反応を触媒するのに十分な酵素の部分を指す。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、糖ドナーからアクセプターサッカライドへシアル酸を転移させるためのシアリルトランスフェラーゼの十分な部分を含むと思われる。触媒ドメインは、酵素全体、そのサブ配列を含み得る、または天然において見出されるような酵素もしくはサブ配列に付着されない付加的なアミノ酸配列を含み得る。
【００５５】
「単離される」という語は、酵素の活性を干渉する構成要素から実質的にまたは本質的に遊離した物質を指す。本発明の細胞、サッカライド、核酸、およびポリヌクレオチドに対して、「単離される」という語は、標準的にはその天然状態において見出されるような物質を伴う構成要素から実質的にまたは本質的に遊離した物質を指す。典型的には、本発明の単離されたサッカライド、タンパク質、または核酸は、銀染色ゲル上のバンド強度または純度を決定するためのその他の方法によって測定されるように、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、または85％の純度であり、通常は、少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の純度である。純度または均質性は、タンパク質または核酸試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後の染色による可視化、などの当技術分野において周知の多くの手段によって示され得る。特定の目的に対して、高解像度が必要であると思われ、精製に対するHPLCまたは同様の手段が使用される。オリゴヌクレオチドまたはその他のシアリル化産物に対して、純度は、例えば薄層クロマトグラフィー、HPLC、または質量分析を使用して決定され得る。
【００５６】
二つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で、「同一の」またはパーセント「同一性」という語は、以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用してまたは目視検査によって測定されるように、最大対応に対して比較および整列される場合に、同じである、または規定されるパーセンテージ同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、二つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００５７】
二つの核酸またはポリペプチドとの関連で、「実質的に同一の」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用してまたは目視検査によって測定されるように、最大対応に対して比較および整列される場合に、少なくとも60％、好ましくは80％または85％、最も好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する二つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約50残基である配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約100残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約150残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい態様において、配列は、実質的にはコード領域の全長にわたって同一である。
【００５８】
配列比較に対して、典型的には、一つの配列は、テスト配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テストおよび参照配列は、コンピューターに入力され、必要であればサブ配列コーディネートが指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列に対するパーセント配列同一性を計算する。
【００５９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局部相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1998)の類似性方法に対する検索によって、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピューター化インプリメンテーションによって、または目視検査（概してCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement)(Ausubel)を参照されたい）によって実施され得る。
【００６０】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402において記載される。BLAST解析を行なうためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に使用できる。このアルゴリズムは、最初に、照会配列における長さWの短いワードを同定することによって高スコアリング配列ペア（HSP）を同定することに関与し、データベース配列における同じ長さのワードと整列される場合に、ある正値閾値スコアTに合致する、またはそれを満たす。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al、前記）。これらの初めの隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すために検索を開始するための種として作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各々の配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対して、パラメータM（合致する残基のペアに対する報酬スコア；常に>0）およびN（合致しない残基に対するペナルティスコア；常に<0）を使用して計算される。アミノ酸配列に対して、スコアリングマトリクスが、累積スコアを計算するために使用される。各々の方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に中止される。累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量X減少する。累積スコアが、一つまたは複数の負-スコアリング残基アラインメントの蓄積により、0またはそれ以下になる。または、いずれかの配列の端が到達される。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列に対する）は、デフォルトとして、11のワード長（W）、10の期待値（E）、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長（W）、10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリクスを使用する（HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）。
【００６１】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、BLASTアルゴリズムは、二つの配列間の類似性の統計解析も行なう（例えば、KarlinおよびAltschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の一つの基準は、最小和確率（P(N)）であり、二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の合致が偶然によって生じる確率の目安を提供する。例えば、核酸は、テスト核酸の参照核酸への比較における最小和確率が約0.1よりも低い、より好ましくは約0.01よりも低い、最も好ましくは約0.001よりも低い場合、参照配列に類似していると考えられる。
【００６２】
二つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる目安は、以下に記載されるように、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが、第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性があることである。したがって、ポリペプチドは、例えば二つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、典型的には、第二のポリペプチドと実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一である別の目安は、以下に記載されるように、二つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００６３】
「特異的にハイブリダイズする」という語句は、配列が複合混合物（例えば、全細胞）DNAまたはRNAに存在する場合に、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリダイゼーションを指す。
【００６４】
「ストリンジェントな条件」という語は、プローブが、その標的サブ配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしないと思われる条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なると思われる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。概して、ストリンジェントな条件は、定義されるイオン強度およびpHにおいて特異的配列に対する温度融点（Tm）よりも約5℃低いように選択される。Tmは、標的配列に相補的なプローブの50％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（定義されるイオン強度、pH、および核酸濃度下で）。（標的配列は概して過剰に存在するので、Tmにおいて、プローブの50％は平衡状態で占有される）。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH 7.0〜8.3において、約1.0 M Na+イオンより少ない、典型的には約0.01〜1.0 M Na+イオン濃度（またはその他の塩）であり、かつ温度が、短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）に対して少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば50ヌクレオチドよりも長い）に対して約60℃であるものである。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加で達成されてもよい。高ストリンジェンシーPCR増幅に対して、約62℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマー長および特異性に応じて約50℃〜約65℃の範囲であり得る。高および低ストリンジェンシー増幅の両方に対する典型的なサイクル条件は、30〜120秒間90〜95℃の変性フェーズ、30〜120秒続くアニーリングフェーズ、および1〜2分間約72℃の伸長フェーズを含む。低および高ストリンジェンシー増幅反応に対するプロトコールおよびガイドラインは、例えば、Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, N.Y.において使用できる。
【００６５】
抗体に関する場合「特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性がある」という語句は、タンパク質、サッカライド、およびその他の生物製剤の異質集団の存在下でタンパク質またはその他の抗原の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定される免疫アッセイ条件下で、規定される抗体は、特定の抗原に選択的に結合し、試料に存在するその他の分子に有意な量において結合しない。そのような条件下での抗原への特異的な結合は、特定の抗原に対するその特異性に対して選択される抗体を必要とする。様々な免疫アッセイ形式は、特定の抗原と特異的に免疫反応性がある抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ELISA免疫アッセイ法は、抗原と特異的に免疫反応性があるモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイ形式および条件の説明に対して、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Soring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
【００６６】
「抗体」は、抗原に特異的に結合しかつ認識する、免疫グロブリン遺伝子からのフレームワーク領域を含むポリペプチドまたはそのフラグメントを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される、重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それぞれ順にIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEの免疫グロブリンクラスを定義する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重大であると思われる。
【００６７】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは、四量体を含む。各々の四量体は、ポリペプチド鎖の二つの同一ペアから成り、各々のペアは、一つの「軽」（約25 kD）および一つの「重」鎖（約50〜70 kD）を有する。各々の鎖のN末端は、主として抗原認識に関与する約100〜110個またはより多くのアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という語は、それぞれこれらの軽および重鎖を指す。
【００６８】
抗体は、例えば、様々なペプチダーゼでの分解によって産生される無傷免疫グロブリンまたは多くのよく特徴付けされたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、それ自身がジスルフィド結合によってVH-CH1に結合される軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'2を産生するために、ヒンジ領域におけるジスルフィドリンケージの下で抗体を分解する。F(ab)'2は、ヒンジ領域におけるジスルフィドリンケージを壊すために軽度の条件下で還元されることができ、それによってF(ab)'2二量体をFab'単量体へと変換する。Fab'単量体は、本質的にヒンジ領域の一部をともなうFabである（Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)を参照されたい）。様々な抗体フラグメントが、無傷の抗体の分解に関して定義されているが、当業者は、そのようなフラグメントが、化学的にまたは組換えDNA方法論を使用することによって新規に合成され得ることを高く評価すると思われる。したがって、本明細書において使用されるように、抗体という語は、抗体全体の修飾によって産生される抗体フラグメント、または組換えDNA方法論を使用して新規に合成されるもの（例えば、単鎖Fv）、またはファージディスプレイライブラリを使用して同定されるもの（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照されたい）も含む。
【００６９】
例えば組換え、モノクローナル、またはポリクローナル抗体などの抗体の調製に対して、当技術分野において公知の多くの技術が使用され得る（例えば、KohlerおよびMilstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); HarlowおよびLane, Antibodies, A Laboratory Mannual (1988);およびGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)を参照されたい）。対象となる抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングでき、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローニングでき、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用できる。モノクローナル抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリは、ハイブリドーマまたはプラズマ細胞から作製されてもよい。重および軽鎖遺伝子産物のランダム組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)を参照されたい）。単鎖抗体または組換え抗体の産生に対する技術（米国特許第4,946,778号、米国特許第4,816,567号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するのに適応させられ得る。また、トランスジェニックマウスまたはその他の哺乳類などのその他の生物は、ヒト化またはヒト抗体を発現するために使用され得る（例えば、米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996);ならびにLonbergおよびHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照されたい）。または、ファージディスプレイテクノロジーが、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマー（heteromeric）Fabフラグメントを同定するために使用され得る（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照されたい）。抗体は、二重特異性、すなわち、二つの異なる抗原を認識できるように作製されてもよい（例えば、国際公開公報第93/08829号、Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991);およびSuresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照されたい）。抗体は、例えば二つの共有結合抗体などのヘテロ複合体、または抗毒素であってもよい（例えば、米国特許第4,676,980号、国際公開公報第91/00360号;国際公開公報第92/200373号；および欧州特許第03089号を参照されたい）。
【００７０】
一つの態様において、抗体は、「エフェクター」部分に結合される。エフェクター部分は、診断的アッセイ法における使用に対する放射性ラベルまたは蛍光ラベルなどのラベリング部分を含む任意の数の分子であり得る。
【００７１】
タンパク質またはペプチドに関する場合、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性がある」という語句は、しばしばタンパク質またはその他の生物製剤の異質集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定される免疫アッセイ条件下で、規定される抗体は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10〜100倍、特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に対して選択される抗体を必要とする。例えば、IgEタンパク質、多型変異体、対立遺伝子、オーソログ、および保存的に修飾された変異体、またはスプライス変異体、またはその部分に対して産生されたポリクローナル抗体は、IgEタンパク質と特異的に免疫反応性があり、かつその他のタンパク質と免疫反応性がないポリクローナル抗体のみを獲得するために選択され得る。この選択は、その他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成され得る。様々な免疫アッセイ形式は、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性がある抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ELISA免疫アッセイ法は、タンパク質と特異的に免疫反応性がある抗体を選択するために日常的に使用される（特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイ形式および条件の説明に対して、例えば、HarlowおよびLane, Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。
【００７２】
「抗原」は、例えばペプチド、糖質、有機分子、または糖脂質および糖タンパク質などのより複雑な分子などの、抗体によって認識されかつ結合される分子である。抗体結合の標的である抗原の部分は、抗原決定基であり、単一の抗原決定基に相当する小さな官能基は、ハプテンと呼ばれる。
【００７３】
「ラベル」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用なラベルは、32P、125I、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるように）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が使用できるハプテンおよびタンパク質を含む（配列番号：3のポリペプチドは、例えば、ペプチドに放射性ラベルを組み込まれることによって検出可能に作製されることができ、ペプチドと特異的に反応性がある抗体を検出するために使用されることができる）。
【００７４】
「免疫アッセイ法」という語は、抗原に特異的に結合するために抗体を使用するアッセイ法である。免疫アッセイ法は、抗原を単離する、標的にする、および/または定量するための特定の抗体の特異的な結合特性の使用によって特徴付けられる。
【００７５】
「キャリア分子」という語は、T細胞によって認識される抗原決定基を含む免疫原性分子を意味する。キャリア分子は、タンパク質であり得る、または脂質であり得る。キャリアタンパク質は、ポリペプチドを免疫原性にするためにポリペプチドに結合される。キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン、およびウシ血清アルブミンを含む。
【００７６】
「アジュバント」という語は、抗原に対する免疫応答を非特異的に強化する物質を意味する。アジュバントは、完全または不完全のいずれかのフロインドアジュバント；Titermax金アジュバント；ミョウバン；およびバクテリアLPSを含む。
【００７７】
III. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチド
本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、二つのモチーフを含む：シアリルトランスフェラーゼモチーフA、
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、およびその配列の保存的に修飾された変異体、ならびにシアリルトランスフェラーゼモチーフB
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、およびその配列の保存的に修飾された変異体。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフA
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、およびシアリルトランスフェラーゼモチーフB
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のいずれかを含む。本発明のシアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質からアクセプター基質へのシアル酸部分の転移を触媒する。
【００７８】
保存されたシアリルトランスフェラーゼモチーフは、以前に同定されたおよび新しく発見されたバクテリアシアリルトランスフェラーゼの解析によって同定された。18個のシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は整列され、保存されたシアリルトランスフェラーゼ配列モチーフAおよびBは、目視検査によって同定された（例えば、図1を参照されたい）。図1は、18のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドのコンセンサス配列も提供する。当業者は、コンセンサス配列におけるアミノ酸の位置が、たとえアミノ酸残基の正確なナンバリングが異なっても、特定のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドにおけるアミノ酸を同定するために使用され得ることを認識すると思われる。
【００７９】
いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、酵素活性に対して重要であるように思われるその他のアミノ酸残基も含む。例えば、カンピロバクター・ジェジュニ株OH4384からのCst-IIの構造は、解析された。（例えば、Chiu et al., Nat. Struc. Mol. Biol. 11:163-170 (2004)を参照されたい）。Cst-II酵素の突然変異解析は、例えばシアリルトランスフェラーゼモチーフBのアルギニン残基が活性に対して必要とされることを実証した。シアリルトランスフェラーゼモチーフBのアルギニン残基は、Cst-IIにおいてR129と呼ばれ、図1のシアリルトランスフェラーゼコンセンサス配列のR165と相関する。触媒活性に対して重要であるように思われるその他のアミノ酸残基は、Cst-II Y156（コンセンサスY192に対応する）、Cst-II Y 162（コンセンサスY199に対応する）、およびCst-II H188（コンセンサスH226に対応する）を含む。したがって、いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフA、シアリルトランスフェラーゼモチーフB、およびコンセンサスY192に対応するアミノ酸残基；またはシアリルトランスフェラーゼモチーフA、シアリルトランスフェラーゼモチーフB、ならびにコンセンサスY192に対応するアミノ酸残基およびコンセンサスY199またはH226に対応するアミノ酸残基；またはシアリルトランスフェラーゼモチーフA、シアリルトランスフェラーゼモチーフB、およびコンセンサスY199に対応するアミノ酸残基；またはシアリルトランスフェラーゼモチーフA、シアリルトランスフェラーゼモチーフB、ならびにコンセンサスY199に対応するアミノ酸残基およびコンセンサスH226に対応するアミノ酸残基；またはシアリルトランスフェラーゼモチーフA、シアリルトランスフェラーゼモチーフB、およびコンセンサスH226に対応するアミノ酸残基；シアリルトランスフェラーゼモチーフA、シアリルトランスフェラーゼモチーフB、ならびにコンセンサスY192に対応するアミノ酸残基、コンセンサスY199に対応するアミノ酸残基、およびコンセンサスH226に対応するアミノ酸残基を含む。
【００８０】
例えば、コンセンサス残基N44、N86、Q93、D190、F191、S198、F215、またはY222に対応するアミノ酸残基などのその他のアミノ酸残基は、構造データに基づく酵素活性に対して重要である場合があり、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBをともなうシアリルトランスフェラーゼポリペプチドに含まれることができる。当業者は、図1を再検討することに際して、コンセンサス残基S198、Y222、およびF215において、その他のアミノ酸が容認され得ることに留意すると思われる。N86およびQ93も、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドから、例えばいくつかのH. インフルエンザ シアリルトランスフェラーゼポリペプチドから、欠失される。上記のアミノ酸残基は、単独でまたは任意の組み合わせにおいてシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、すなわちシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むポリペプチドに含まれることができ、コンセンサスY192、Y199、またはH226に対応するアミノ酸残基との組み合わせを含む。
【００８１】
シアリルトランスフェラーゼモチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの例は、例えば、C. ジェジュニ株O:19からのCst-Iタンパク質、C. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質、H. インフルエンザからのLic3Aシアリルトランスフェラーゼタンパク質、およびH. インフルエンザからのLic3A2シアリルトランスフェラーゼタンパク質を含む。
【００８２】
IV. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの修飾
保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、それらがシアリルトランスフェラーゼ活性を維持する限り、修飾されてもよい。修飾は、前記に記載される切断、およびいくつかの態様において、タンパク質の部位特異的突然変異誘発を含む。
【００８３】
部位特異的突然変異誘発は、保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドのアクセプター特異性を変更するために使用され得る。いくつかのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α2,3および/またはα2,8リンケージを形成することによってアクセプター分子をシアリル化することができる。例えば、C. ジェジュニ株OH4382、OH4384、O:10、およびO:41からのCstII酵素は、すべてα2,3および/またはα2,8リンケージを形成することができる。トレオニン残基へのAsn51（コンセンサス配列のN86に対応する）の突然変異は、α2,8リンケージにシアル酸を付加するOH4282、OH4384からのCstIIの能力を取り除いた。しかしながら、一官能性O:19株におけるアスパラギンへのThr51の突然変異は、α2,3ならびにα2,8リンケージの両方にシアル酸を付加することができる酵素をもたらした。（例えば、Gilbert et al., J. Biol. Chem. 277:327-337 (2002)を参照されたい）。したがって、コンセンサス配列の位置86に対応する残基の突然変異は、保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの基質特異性を変更するために使用され得る。加えて、C. ジェジュニ株OH4382、OH4384からのCstII酵素におけるグリシンへの残基Ile53（コンセンサス配列の残基88に対応する）の突然変異は、酵素活性における大きな増加を引き起こした。したがって、コンセンサス配列の位置88に対応する残基の突然変異は、保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの活性を変更するために使用され得る。
【００８４】
V. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の単離
保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸は、上に記載されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、すなわち、シアリルトランスフェラーゼモチーフA、
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、およびその配列の保存的に修飾された変異体、ならびにシアリルトランスフェラーゼモチーフB、
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、およびその配列の保存的に修飾された変異体を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフA
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、およびシアリルトランスフェラーゼモチーフB
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のいずれかを含む。本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、ドナー基質からアクセプター基質へのシアル酸部分の転移を触媒する。コードされるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、コンセンサスアミノ酸残基Y192、Y199、H226、N44、N86、Q93、D190、F191、S198、F215、またはY222に対応する、構造解析によって同定されるアミノ酸残基を含んでもよい。
【００８５】
保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の例は、C. ジェジュニ株O:19からのCst-Iタンパク質およびC. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質をコードする核酸を含む。
【００８６】
例えばカンピロバクター、ヘモフィルス、およびシュードモナス（Pseudomonous）種からのシアリルトランスフェラーゼを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼなどのシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸を獲得する方法は、当業者にとって公知である。適した核酸（例えば、cDNA、ゲノム、またはサブ配列（プローブ））は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写に基づく増幅システム（transcription-based amplification system）（TAS）、または自己配列複製システム（self-sustained sequence replication system）（SSR）などのインビトロの方法によってクローニングまたは増幅され得る。多種多様なクローニングおよびインビトロの増幅方法論は、当業者にとって周知である。多くのクローニング訓練を介して当業者を方向付けるのに十分なこれらの技術および説明書の例は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement)(Ausubel); Cashion et al.,米国特許第5,017,478号；およびCarr,欧州特許第0,246,864号において見出される。
【００８７】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするDNAまたはそのサブ配列は、例えば制限酵素での適当な配列のクローニングおよび制限を含む、上に記載されるいずれかの適した方法によって調製され得る。一つの好ましい態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸は、日常的なクローニング方法によって単離される。例えば図1において提供されるようなシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドのヌクレオチド配列またはその他の配列データベース（上を参照されたい）は、ゲノムDNA試料におけるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする遺伝子；または全RNA試料におけるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブを提供するために使用され得る（例えば、サザンまたはノーザンブロットにおいて）。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする標的核酸が同定されると、それは、当業者にとって公知の標準的な方法に従って単離され得る（例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; Berger and Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.;またはAusubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New Yorkを参照されたい）。さらに、単離核酸は、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む完全長シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸、または例えば少なくともシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの触媒ドメインのサブ配列をコードするサブ配列を含む、そのサブ配列を作製するために、制限酵素で開裂され得る。次いで、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはそのサブ配列をコードするこれらの制限酵素フラグメントは、例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を産生するためにライゲーションされ得る。
【００８８】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸またはそのサブ配列は、発現産物に対してアッセイすることによって特徴付けられ得る。発現タンパク質の物理的、化学的、または免疫学的特性の検出に基づくアッセイ法が使用され得る。例えば、ドナー基質からアクセプター基質へのシアル酸部分の転移を触媒する核酸によってコードされるタンパク質の能力によって、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むクローニングされたシアリルトランスフェラーゼを同定し得る。一つの方法において、キャピラリー電気泳動は、反応産物を検出するために採用される。この高感度アッセイ法は、Wakarchuk et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 (45): 28271-276において記載されるように、蛍光でラベルされるサッカライドまたはジサッカライドアミノフェニル誘導体のいずれかを使用することに関与する。α2,3-シアリルトランスフェラーゼに対してアッセイするために、Lac-FCHASEが基質として使用される。α2,8-シアリルトランスフェラーゼに対してアッセイするために、GM3-FCHASEが基質として使用される。（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,503,744号を参照されたい。）その他のグリコシルトランスフェラーゼの反応産物は、キャピラリー電気泳動を使用して検出されることができ、例えばナイセリアlgtC酵素に対してアッセイするために、FCHASE-AP-LacまたはFCHASE-AP-Galのいずれかが使用されることができ、ナイセリアlgtB酵素に対しては、適当な試薬は、FCHASE-AP-GlcNAcである（Wakarchuk、前記）。オリゴサッカライド反応産物の検出に対するその他の方法は、薄層クロマトグラフィーおよびGC/MSを含み、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,503,744号において開示される。
【００８９】
また、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸またはそのサブ配列は、化学的に合成され得る。適した方法は、Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99のホスホトリエステル法；Brown et al (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151のホスホジエステル法；Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862のジエチルホスホロアミダイト法；および米国特許第4,458,066号の固体支持体法を含む。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として使用するDNAポリメラーゼでの重合によって二本鎖DNAへ変換され得る。当業者は、DNAの化学合成が、しばしば約100塩基の配列に限定されるが、より長い配列が、より短い配列のライゲーションによって獲得され得ることを認識する。
【００９０】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸またはそのサブ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などのDNA増幅方法を使用してクローニングされ得る。したがって、例えば、核酸配列またはサブ配列は、一つの制限酵素部位（例えば、NdeI）を含むセンスプライマーおよび別の制限酵素部位（例えば、HindIII）を含むアンチセンスプライマーを使用してPCR増幅される。これは、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む望ましいシアリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはそのサブ配列をコードし、かつ末端制限酵素部位を有する核酸を産生すると思われる。次いで、この核酸は、第二の分子をコードする核酸を含みかつ適当な対応制限酵素部位を有するベクターに簡単にライゲーションされ得る。適したPCRプライマーは、GenBankまたはその他のソースにおいて提供される配列情報を使用して、当業者によって決定され得る。適当な制限酵素部位は、部位特異的突然変異誘発によって、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびB含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質またはそのタンパク質サブ配列をコードする核酸に付加されてもよい。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびB-コードヌクレオチド配列またはサブ配列を含むシアリルトランスフェラーゼをふくむプラスミドは、適当な制限エンドヌクレアーゼで開裂され、次いで、標準的な方法に従って増幅および/または発現のために適当なベクターにライゲーションされる。インビトロの増幅方法を介して当業者を方向付けるのに十分な技術の例は、Berger, Sambrook, および Ausubel, ならびに Mullis et al., (1987)米国特許第4,683,202号; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); ArnheimおよびLevinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35; 1826; Landegren et al., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560;およびBarringer et al. (1990) Gene 89: 117において見出される。
【００９１】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードするいくつかの核酸は、例えばCst-I（例えば、米国特許第6,689,604号を参照されたい）；Cst-II（例えば、米国特許第6,503,744号を参照されたい）；およびCst-IIIなどの、以前に同定されたシアリルトランスフェラーゼタンパク質の配列に基づくPCRプライマーを使用して増幅され得る。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を増幅するために使用され得るPCRプライマーの例は、以下のプライマーペアを含む。
Cst-I核酸に対して：
2008512993.tif 000018
【００９２】
いくつかのバクテリアにおいて、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸は、例えばC. ジェジュニのLOS座などの特定の染色体座を増殖し、次いで典型的にはその座で見出されるシアリルトランスフェラーゼを同定することによって、単離され得る（例えば、米国特許第6,503,744号を参照されたい）。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を含むLOS座を増幅するために使用され得るPCRプライマーの例は、以下のプライマーペアを含む。
CJ42: ヘプトシルターゼ（heptosylTase）-IIにおけるプライマー
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CJ43: ヘプトシルターゼ-Iにおけるプライマー
2008512993.tif 000020
【００９３】
特定の核酸から発現されるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドのその他の物理的特性は、アクセプター基質特異性および/または触媒活性の決定基であるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの適した配列またはドメインを同定する別の方法を提供するために、公知のシアリルトランスフェラーゼの特性と比較され得る。または、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびB遺伝子を含む推定上のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびB遺伝子を含む組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、突然変異導入されることができ、そのシアリルトランスフェラーゼとしての役割、または特定の配列もしくはドメインの役割は、標準的には非突然変異の、自然発生的な、または対照シアリルトランスフェラーゼポリペプチドによって産生される糖質の構造における変異を検出することによって確立されることができる。当業者は、本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの突然変異または修飾が、例えばPCRなどのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸を操作するための分子生物学技術によって容易にされ得ることを認識すると思われる。
【００９４】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む新しく同定されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの機能的ドメインは、本明細書において記載されるように、ポリペプチドを突然変異導入されるまたは修飾する、かつアクセプター基質活性および/または触媒活性などの活性に対してそれらをテストするための標準的な方法によって同定され得る。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む様々なシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの機能的ドメインは、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼならびに一つまたは複数のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの機能的ドメインをコードする核酸を構築するために使用され得る。次いで、これらの複数シアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質は、望ましいアクセプター基質または触媒活性に対してテストされ得る。
【００９５】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸をクローニングすることへの例示的なアプローチにおいて、クローニングされたシアリルトランスフェラーゼの公知の核酸またはアミノ酸配列は、整列され、かつ様々なシアリルトランスフェラーゼ間の配列同一性の量を決定するために比較される。この情報は、対象となるシアリルトランスフェラーゼ間の配列同一性の量に基づいて、例えばアクセプター基質活性および/または触媒活性などのシアリルトランスフェラーゼ活性を与えるまたは調節するタンパク質ドメインを同定かつ選択するために使用され得る。例えば、対象となるシアリルトランスフェラーゼ間の配列同一性を有し、かつ公知の活性と関連するドメインは、そのドメインおよびシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含み、かつそのドメインと関連する活性（例えば、アクセプター基質特異性および/または触媒活性）を有するシアリルトランスフェラーゼタンパク質を構築するために使用され得る。
【００９６】
V. 宿主細胞における保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの発現
本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質は、大腸菌、その他のバクテリア宿主、および酵母を含む様々な宿主細胞において発現され得る。宿主細胞は、好ましくは、例えば酵母細胞、バクテリア細胞、または糸状菌細胞などの微生物である。適した宿主細胞の例は、とりわけ、例えば、アゾトバクター（Azotobacter）種（例えば、A. ビネランジイ（vinelandii））、シュードモナス種、リゾビウム（Rhizobium）種、エルウィニア（Erwinia）種、エシェリチア（Escherichia）種（例えば、大腸菌）、バシルス（Bacillus）、シュードモナス、プロテウス（Proteus）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、シゲラ（Shigella）、リゾビウム（Rhizobia）、ビトレオシラ（Vitreoscilla）、パラコッカス（Paracoccus）、およびクレブシエラ（Klebsiella）種を含む。細胞は、サッカロミセス属（例えば、S. セレビシエ（cerevisiae））、カンジダ属（例えば、C. ウティリス（utilis）、C. パラプシローシス（parapsilosis）、C. クルセイ（krusei）、C. バーサチリス（versatilis）、C. リポリティカ（lipolytica）、C. ゼイラノイデス（zeylanoides）、C. ギリエルモンジイ（guilliermondii）、C. アルビカンス（albicans）、およびC. フミコラ（humicola））、ピチア属（例えば、P. ファリノサ（farinosa）およびP. オーメリ（ohmeri））、トルロプシス属（例えば、T. カンジダ（candida）、T. スファエリカ（sphaerica）、T. キシリヌス（xylinus）、T. ファマタ（famata）、およびT. バーサチリス）、デバリオミセス属（例えば、D. サブグロボサス（subglobosus）、D. カンタレリイ（cantarellii）、D. グロボサス（globosus）、D. ハンセニイ（hansenii）、およびD. ジャポニカス（japonicus））、チゴサッカロミセス属（例えば、Z. ロウキシイ（rouxii）およびZ. バイリイ（bailii））、クルイベロミセス属（例えば、K. マルキシアヌス（marxianus））、ハンセヌラ属（例えば、H. アノマラ（anomala）およびH. ジャジニイ（jadinii））、およびブレタノミセス属（例えば、B. ランビカス（lambicus）およびB. アノマルス（anomalus））を含む、いくつかの属のいずれかであり得る。有用なバクテリアの例は、エシェリチア、エンテロバクター（Enterobacter）、アゾトバクター、エルウィニア、クレブシエラ、バシルス、シュードモナス、プロテウス、およびサルモネラを含むが、それらに限定されない。
【００９７】
宿主細胞において発現されると、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリル化産物を産生するために使用され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を使用して単離されることができ、シアリル化産物を作製するために本明細書において記載されるインビトロ反応において使用されることができる。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む部分的に精製されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、透過性宿主細胞のように、シアリル化産物を作製するためにインビトロ反応において使用されてもよい。宿主細胞は、シアリル化産物を産生するために、インビボシステム（例えば、発酵生産）において使用されてもよい。
【００９８】
典型的には、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、望ましい宿主細胞において機能的であるプロモーターの制御下に置かれる。非常に多種多様なプロモーターが周知であり、特定の適用に応じて本発明の発現ベクターにおいて使用され得る。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性があるようになる細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位、および同様のものなどのその他の発現制御配列も、任意で含まれる。これらの制御配列の一つまたは複数を含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。従って、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸が望ましい宿主細胞における高レベル発現のために組み込まれる、発現カセットを提供する。
【００９９】
特定の宿主細胞における使用に適した発現制御配列は、その細胞において発現される遺伝子をクローニングすることによってしばしば獲得される。本明細書においてリボソーム結合部位配列をともなって、任意でオペレーターをともなって転写開始に対するプロモーターを含むと定義される、一般的に使用される原核生物制御配列は、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモーターシステム（Change et al., Nature (1977) 198: 1056）、トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057）、tacプロモーター（DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25）;ならびにλ-由来PLプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128）などの一般的に使用されるプロモーターを含む。特定のプロモーターシステムは、本発明に対して重大ではなく、原核生物において機能する任意の使用できるプロモーターが用いることができる。
【０１００】
大腸菌以外の原核細胞におけるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質の発現に対して、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要とされる。そのようなプロモーターは、その種からクローニングされている遺伝子から獲得され得る、または異種プロモーターが使用され得る。例えば、ハイブリッドtrp-lacプロモーターは、大腸菌に加えてバシルスにおいて機能する。
【０１０１】
リボソーム結合部位（RBS）は、本発明の発現カセットに都合良く含まれる。例えば、大腸菌におけるRBSは、開始コドンの3〜11ヌクレオチド上流に位置する長さ3〜9ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる（Shine and Dalgarno, Nature (1975) 254: 34; Steitz, Biological regulation and development: Gene expression (ed. R.F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, NY）。
【０１０２】
酵母におけるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質の発現に対して、都合の良いプロモーターは、GAL1-10（Johnson and Davies (1984) Mol. Cell. Biol. 4:1440-1448）、ADH2（Russell et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:2674-2682）、PHO5（EMBO J. (1982) 6:675-680）、およびMFα（Herskowitz and Oshima (1982) The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (eds. Strathern, Jones, and Broach) Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 181-209）を含む。酵母における使用に対する別の適したプロモーターは、Cousens et al., Gene 61:265-275 (1987)において記載されるようなADH2/GAPDHハイブリッドプロモーターである。例えば菌アスペルギルス（Aspergillus）の株（McKnight et al.,米国特許第4,935,349号）などの糸状菌に対して、有用なプロモーターの例は、ADH3プロモーター（McKnight et al., EMBO J. 4: 2093 2099 (1985)）およびtpiAプロモーターなどのアスペルギルス・ニジュランス（nidulans）解糖系遺伝子に由来するものを含む。適したターミネーターの例は、ADH3ターミネーターである（McKnight et al.）。
【０１０３】
構成的または調節プロモーターは、いずれも本発明において使用され得る。調節プロモーターは、融合タンパク質の発現が誘導される前に、宿主細胞が高密度まで増殖させられ得るので、有利であり得る。異種タンパク質の高レベル発現は、いくつかの状況において細胞増殖を遅らせる。誘導プロモーターは、遺伝子の発現を方向付けるプロモーターであり、発現のレベルは、例えば、温度、pH、嫌気性または好気性条件、光、転写因子、および化学物質などの環境または発生因子によって変更可能である。そのようなプロモーターは、本明細書において「誘導」プロモーターと呼ばれ、ヌクレオチド糖合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼまたは酵素の発現のタイミングを制御することを可能にする。大腸菌およびその他のバクテリア宿主細胞に対して、誘導プロモーターは、当業者にとって公知である。これらは、例えば、lacプロモーター、バクテリオファージλPLプロモーター、ハイブリッドtrp-lacプロモーター（Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80: 21）、およびバクテリオファージT7プロモーター（Studier et al. (1986) J. Mol. Biol.; Tabor et al. (1985) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82: 1074-8）を含む。これらのプロモーターおよびそれらの使用は、Sambrook et al.,前記において議論される。原核生物における発現に対して特に好ましい誘導プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする遺伝子または複数の遺伝子から獲得されたプロモーター構成要素に連結されたtacプロモーター構成要素を含む二重プロモーターである（例えば、UDPガラクトース4-エピメラーゼ遺伝子（galE）からのプロモーター）。二重tac-galプロモーターは、PCT特許出願公報国際公開公報第98/20111号において記載される。
【０１０４】
適当な宿主細胞におかれる場合にポリヌクレオチドの発現を駆動する、遺伝子発現制御シグナルに操作可能なように連結される対象となるポリヌクレオチドを含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。本発明の融合タンパク質をコードする発現カセットは、宿主細胞への導入のために発現ベクターにしばしば置かれる。ベクターは、典型的には、発現カセットに加えて、一つまたは複数の選択された宿主細胞においてベクターが独立に複製することを可能にする核酸配列を含む。概して、この配列は、ベクターが宿主染色体DNAとは独立に複製することを可能にするものであり、複製の元または自己複製配列を含む。そのような配列は、様々なバクテリアに対して周知である。例えば、プラスミドpBR322からの複製の元は、ほとんどのグラム陰性バクテリアに適している。または、ベクターは、宿主細胞ゲノム相補体に統合され、かつ細胞がDNA複製を行なう時に複製されることによって、複製され得る。バクテリア細胞における酵素の発現に対する好ましい発現ベクターは、二重tac-galプロモーターを含むpTGKであり、PCT特許出願公報国際公開公報第98/20111号において記載される。
【０１０５】
ポリヌクレオチド構築物の構築は、概して、バクテリアにおいて複製できるベクターの使用を必要とする。多くのキットが、バクテリアからのプラスミドの精製に対して市販されている（例えば、EasyPrepJ、FlexiPrepJ、両方ともPharmacia Biotechから；StrataCleanJ、Stratageneから；およびQIAexpress Expression System、Qiagenを参照されたい）。次いで、単離されかつ精製されたプラスミドは、その他のプラスミドを産生するためにさらに操作されることができ、細胞にトランスフェクトするために使用されることができる。ストレプトミセス（Streptomyces）またはバシルスにおけるクローニングも可能である。
【０１０６】
選択可能なマーカーは、本発明のポリヌクレオチドを発現するために使用される発現ベクターにしばしば組み込まれる。これらの遺伝子は、選択的な培地において増殖させられた形質転換宿主細胞の生存または増殖に対して必要な、タンパク質などの遺伝子産物をコードし得る。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、その培地において生存しないと思われる。典型的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなどの抗生物質またはその他の毒素に対する耐性を与えるタンパク質をコードする。または、選択可能なマーカーは、例えば、バシルスに対してD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子など、栄養要求性欠乏を補足するまたは複合培地から使用できない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードし得る。しばしば、ベクターは、例えばベクターが宿主細胞に導入されることに先行して複製される大腸菌またはその他の細胞において機能的である一つの選択可能なマーカーを有すると思われる。多くの選択可能なマーカーは、当業者にとって公知であり、例えばSambrook et al.,前記において記載される。
【０１０７】
上に列記される構成要素の一つまたは複数を含む適したベクターの構築は、上で引用される参照において記載されるように標準的なライゲーション技術を採用する。単離プラスミドまたはDNAフラグメントは、開裂され、仕立てられ、必要とされるプラスミドを生成するのに望ましい型に再ライゲーションされる。構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認するために、プラスミドは、公知の方法に従って、制限エンドヌクレアーゼ分解および/またはシークエンシングなどの標準的な技術によって解析され得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当技術分野において公知である。組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニングおよびインビトロ増幅方法は、当業者にとって周知である。多くのクローニング訓練を介して当業者を方向付けるのに十分なこれらの技術および説明書の例は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger);およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement)(Ausubel)において見出される。
【０１０８】
本発明の発現ベクターを構築するための開始物質としての使用に適した様々な一般的なベクターは、当技術分野において周知である。バクテリアにおけるクローニングに対して、一般的なベクターは、pBLUESCRIPT（商標）などのpBR322由来ベクターおよびλ-ファージ由来ベクターを含む。酵母において、ベクターは、Yeast Integratingプラスミド（例えば、YIp5）およびYeast Replicatingプラスミド（YRpシリーズプラスミド）、およびpGPD-2を含む。哺乳類細胞における発現は、pSV2、pBC12BI、およびp91023、ならびに溶解ウィルスベクター（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、およびバキュロウィルス）、エピソームウィルスベクター（例えば、ウシパピローマウィルス）、およびレトロウィルスベクター（例えば、マウスレトロウィルス）を含む、様々な一般的に使用できるプラスミドを使用して達成され得る。
【０１０９】
選ばれた宿主細胞に発現ベクターを導入するための方法は、特に重大ではなく、そのような方法は、当業者にとって公知である。例えば、発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換によって大腸菌を含む原核細胞に、およびリン酸カルシウム処置または電気穿孔法によって真核細胞に、導入され得る。
【０１１０】
翻訳カップリングは、発現を強化するために使用され得る。戦略は、プロモーターの下流に置かれる翻訳システムに対して天然の高発現遺伝子に由来する短い上流オープンリーディングフレームを使用し、リボソーム結合部位は、数アミノ酸コドンの後に終止コドンが続く。終止コドンのすぐ前に、第二のリボソーム結合部位があり、終止コドンの後に続くのは、翻訳の開始に対する開始コドンである。システムは、RNAにおける二次構造を解き、翻訳の効率的な開始を可能にする。Squires, et. al. (1988), J. Biol. Chem. 263: 16297-16302を参照されたい。
【０１１１】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、細胞内で発現され得る、または細胞から分泌され得る。細胞内発現は、しばしば高収率となる。必要であれば、可溶性活性融合タンパク質の量は、リフォールディング過程を行うことによって増加させられ得る（例えば、Sambrook et al.,前記；Marston et al., Bio/Technology (1984) 2: 800；Schoner et al., Bio/Technology (1985) 3: 151を参照されたい）。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、細胞からペリプラズムまたは細胞外培地のいずれかへ分泌される態様において、DNA配列は、開裂可能なシグナルペプチド配列に連結される。シグナル配列は、細胞膜を介する融合タンパク質の移動を方向付ける。プロモーター-シグナル配列ユニットを含む大腸菌における使用に適したベクターの例は、大腸菌phoAプロモーターおよびシグナル配列を有するpTA1529である（例えば、Sambrook et al.,前記；Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 7212; Talmadge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77: 3988; Takahara et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 2670を参照されたい）別の態様において、融合タンパク質は、例えば精製、分泌、または安定性に役立つように、タンパク質Aまたはウシ血清アルブミン（BSA）のサブ配列に融合される。
【０１１２】
本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、その他のバクテリアタンパク質にさらに連結されてもよい。このアプローチは、正常な原核生物制御配列が転写および翻訳を方向付けるので、しばしば高収率となる。大腸菌において、lacZ融合は、異種タンパク質を発現させるためにしばしば使用される。適したベクターは、pUR、pEX、およびpMR100シリーズなど、容易に使用できる（例えば、Sambrook et al.,前記を参照されたい）。特定の適用に対して、精製の後に融合タンパク質から非グリコシルトランスフェラーゼおよび/またはアクセサリー酵素アミノ酸を開裂することが望ましい可能性がある。これは、シアノゲンブロマイド、プロテアーゼによるまたは因子Xaによる開裂を含む、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかによって遂行され得る（例えば、Sambrook et al.,前記; Itakura et al., Science (1977) 198: 1056; Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 106; Nagai et al., Nature (1984) 309: 810; Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 561を参照されたい）。開裂部位は、開裂の望ましいポイントにおいて融合タンパク質に対する遺伝子に入れられ（engineered）得る。
【０１１３】
複数の組換えタンパク質は、単一の発現ベクターに複数の転写カセットを置くことによって、またはクローニング戦略において採用される発現ベクターの各々に対して異なる選択可能なマーカーを使用することによって、単一の宿主細胞において発現され得る。
【０１１４】
それらのN-末端の統合性を維持する大腸菌から組換えタンパク質を獲得するのに適したシステムは、Miller et al. Biotechnology 7:698-704 (1989)によって記載されている。このシステムにおいて、対象となる遺伝子は、ペプチダーゼ開裂部位を含む酵母ユビキチン遺伝子の最初の76残基へのC-末端融合として産生される。二つの部分の結合における開裂は、無傷の真正N-末端残基を有するタンパク質の産生を引き起こす。
【０１１５】
VI. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製
本発明のシアリルトランスフェラーゼタンパク質は、細胞内タンパク質としてまたは細胞から分泌されるタンパク質として発現され得る、かつ本発明の方法においてこの型で使用され得る。例えばシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む、発現された細胞内または分泌シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含む粗細胞抽出物は、本発明の方法において使用され得る。
【０１１６】
または、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および同様のものを含む当技術の標準的な手順に従って精製され得る（概して、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)を参照されたい）。少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％均質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、92％、95％、98〜99％またはより高い均質性が最も好ましい。精製タンパク質は、例えば抗体産生に対する免疫原として使用されてもよい。
【０１１７】
本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を容易にするために、タンパク質をコードする核酸は、エピトープまたは親和性結合試薬が使用できる「タグ」、すなわち精製タグに対するコード配列を含んでもよい。適したエピトープの例は、mycおよびV-5レポーター遺伝子を含み；これらのエピトープを有する融合タンパク質の組換え産生に対して有用な発現ベクターは、市販されている（例えば、Invitrogen (Carlsbad CA)ベクター pcDNA3.1/Myc-HisおよびpcDNA3.1/V5-Hisは、哺乳類細胞における発現に適している）。本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBタンパク質を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドにタグを付着させるのに適した付加的な発現ベクター、および対応する検出システムは、当業者にとって公知であり、いくつかが市販されている（例えば、FLAG'' (Kodak, Rochester NY)）。適したタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合することが可能なポリヒスチジン配列である。典型的には、6つの隣接ヒスチジンが使用されるが、6よりも多いまたは少ないものが使用できる。ポリヒスチジンタグに対する結合部分としての役目をし得る適した金属キレート親和性リガンドは、ニトリロ三酢酸（NTA）を含む（Hochuli, E. (1990) 「Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents」 Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; Qiagen (Santa Clarita, CA)から市販されている）。
【０１１８】
精製タグは、マルトース結合ドメインおよびスターチ結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者にとって公知である。スターチ結合ドメインは、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/15636号において記載される。ベータシクロデキストリン（BCD）-誘導体化樹脂を使用するスターチ結合ドメインを含む融合タンパク質の親和性精製は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2003年5月5日に出願された米国特許出願第60/468,374号において記載される。
【０１１９】
タグとしての使用に適しているその他のハプテンは、当業者にとって公知であり、例えば、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR)において記載される。例えば、ジニトロフェノール（DNP）、ジゴキシゲニン、バルビツレート（例えば、米国特許第5,414,085号を参照されたい）、およびフルオロフォアのいくつかの型が、ハプテンとして有用であり、これらの化合物の誘導体も有用である。ハプテンおよびその他の部分をタンパク質およびその他の分子に連結させるためのキットは、市販されている。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、SMCCなどのヘテロ二官能性リンカーは、タグを捕獲試薬上に存在するリジン残基に付着させるために使用され得る。
【０１２０】
当業者は、改変が、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの触媒または機能的ドメインに、それらの生物学的活性を損なうことなくなされ得ることを認識すると考えられる。いくつかの改変は、クローニング、発現、または融合タンパク質への触媒ドメインの組み込みを容易にするためになされ得る。そのような改変は、当業者にとって周知であり、例えば、例えば開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニンまたは都合良く配置される制限酵素部位もしくは終止コドンもしくは精製配列を作製するためにいずれかの末端に置かれる付加的なアミノ酸（例えば、ポリHis）を提供するための、触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端におけるコドンの付加を含む。
【０１２１】
VII. 融合シアリルトランスフェラーゼタンパク質
いくつかの態様において、本発明の組換え細胞は、望ましいシアリル化オリゴサッカライドの合成に関与する複数の酵素活性を有する融合タンパク質を発現する。融合ポリペプチドは、例えば、例えばCMP-シアル酸シンターゼなどのアクセサリー酵素に結合されるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドから成り得る。融合タンパク質は、触媒ドメインまたは酵素のその他の切断を使用して作製されてもよい。例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、CMP-シアル酸シンターゼに関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに、フレーム単位で、結合され得る。次いで、結果として生じる融合タンパク質は、活性化シアル酸分子の合成だけでなく、アクセプター分子へのシアル酸部分の転移も触媒し得る。融合タンパク質は、一つの発現可能なヌクレオチド配列に連結された二つまたはそれ以上のシアル酸サイクル酵素であり得る。本発明の融合シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、当業者にとって周知の様々な組換えDNA技術を用いて、容易にデザインされかつ操作され得る。例示的な融合タンパク質は、1999年6月24日に国際公開公報第99/31224号として公開され、ナイセリアからのα2,3-シアリルトランスフェラーゼと融合されたナイセリアからのCMP-シアル酸シンターゼを開示する、PCT特許出願番号PCT/CA98/01180において記載される。当業者は、多くのその他のCMP-シアル酸シンターゼポリペプチドおよびシアリルトランスフェラーゼが、本発明における使用のために融合され得ることを認識すると思われる。いくつかの態様において、ナイセリアからのCMP-シアル酸シンターゼは、C. ジェジュニからのシアリルトランスフェラーゼに融合される。C. ジェジュニシアリルトランスフェラーゼ（Cst）は、CstI、CstII、またはCstIII酵素であり得る。C. ジェジュニシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの完全長または切断バージョンは、融合シアリルトランスフェラーゼタンパク質において使用され得る。いくつかの態様において、複数の融合シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、細胞において発現される。
【０１２２】
いくつかの態様において、本発明の組換え細胞は、例えば非シアル酸残基などの少なくとも一つの付加的な糖残基の付加に関与する複数の酵素活性を有する融合タンパク質を発現する。これらの融合ポリペプチドは、例えば、例えばアクセサリー酵素の触媒ドメインに結合されるシアリルトランスフェラーゼではなく、グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインから成り得る。例えば、アクセサリー酵素触媒ドメインは、グリコシルトランスフェラーゼに対するドナーであるヌクレオチド糖の形成における段階を触媒し得る、またはグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応を触媒し得る。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに、フレーム単位で、結合され得る。次いで、結果として生じる融合タンパク質は、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、アクセプター分子への糖部分の転移も触媒し得る。融合タンパク質は、一つの発現可能なヌクレオチド配列に連結された二つまたはそれ以上のサイクル酵素であり得る。本発明のポリペプチドは、当業者にとって周知の様々な組換えDNA技術を用いて、容易にデザインされかつ操作され得る。適した融合タンパク質は、1999年6月24日に国際公開公報第99/31224号として公開されたPCT特許出願番号PCT/CA98/01180において記載され、例えばガラクトシルトランスフェラーゼにフレーム単位で融合されるUDPグルコースエピメラーゼを含む。
【０１２３】
VIII. ドナー基質およびアクセプター基質
本発明の方法において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびにその他のグリコシルトランスフェラーゼによって使用される適したドナー基質は、UDP-Glc、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-GalNAc、GDP-Man、GDP-Fuc、UDP-GlcUA、およびCMP-シアル酸、およびその他の活性化シアル酸部分を含むが、それらに限定されない。Guo et al., Applied Biochem. and Biotech. 68: 1-20 (1997)
【０１２４】
典型的には、アクセプター基質は、α2,3リンケージによるシアル酸残基の付加に対する末端ガラクトース残基を含む。α2,8リンケージにおけるシアル酸残基の付加に対して、第二のシアル酸残基は、α2,8リンケージによる第一のシアル酸に連結される。適したアクセプターの例は、β1,4リンケージによってGlcNAcまたはGlcに連結される末端GalおよびGlcNAcまたはGalNAcのいずれかへβ1,3連結される末端Galを含む。例えば、適したアクセプターは、例えば、Galβ1,4GlcNAc、Galβ1,4GalNAc、Galβ1,3GalNAc、ラクト-N-テトラオース、Galβ1,3GlcNAc、Galβ1,3Ara、Galβ1,6GlcNAc、Galβ1,4Glc（ラクトース）などのガラクトシルアクセプター、および当業者にとって公知のその他のアクセプターを含む（例えば、Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)を参照されたい）。シアル酸が付着される末端残基は、それ自身が、例えばH、サッカライド、オリゴサッカライド、または少なくとも一つの糖質原子を有するアグリコン基に付着され得る。いくつかの態様において、アクセプター残基は、例えば、タンパク質、脂質、またはプロテオグリカンに付着されるオリゴサッカライドの部分である。
【０１２５】
本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに方法によって使用される適したアクセプター基質は、ポリサッカライドおよびオリゴサッカライドを含むが、それらに限定されない。例えば、ラクトースは、例えば3'シアリルアクトースなどのシアリルアクトースを形成するためにシアリル化され得る。本明細書において記載されるシアリルトランスフェラーゼは、都合の良い開始物質から望ましい産物を産生するために多酵素システムにおいて使用されてもよい。
【０１２６】
本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに方法によって使用される適したアクセプター基質は、タンパク質、脂質、ガングリオシド、および本発明の方法によって修飾され得るその他の生物学的構造（例えば、全細胞）を含むが、それらに限定されない。これらのアクセプター基質は、典型的には、上に記載されるポリサッカライドまたはオリゴサッカライド分子を含むと思われる。本発明の方法によって修飾され得る例示的な構造は、表1において記述される当業者にとって公知の細胞上の多くの糖脂質、糖タンパク質、および糖質構造のいずれかを含む。
【０１２７】
（表１）
2008512993.tif 000021
【０１２８】
シアリルトランスフェラーゼ-触媒反応において使用される適したアクセプター基質の例、およびシアリルトランスフェラーゼ-触媒反応において使用される適したアクセプター基質の例は、Guo et al., Applied Biochem. and Biotech. 68: 1-20 (1997)において記載されるが、それらに限定されない。
【０１２９】
本発明は、望ましいオリゴサッカライド部分を有するオリゴサッカライド、糖タンパク質、および糖脂質を産生するそれらの能力に対して選択されるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。同様に、存在する場合は、アクセサリー酵素は、望ましい活性化糖基質または産物オリゴサッカライド上で見出される糖に基づいて選ばれる。
【０１３０】
糖タンパク質の合成のために、対象となるシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの様々な量（例えば、0.01〜100 mU/mgタンパク質）を、対象となるシアリルトランスフェラーゼによるグリコシル化に対する潜在的なアクセプター部分を有するオリゴサッカライドが連結される糖タンパク質（例えば、1〜10 mg/mlで）と反応させることによって、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む適したシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを容易に同定し得る。望ましいアクセプター部位に糖残基を付加する本発明の組換えシアリルトランスフェラーゼタンパク質の能力が比較され、望ましい特性（例えば、アクセプター基質特異性または触媒活性）を有するシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが選択される。
【０１３１】
概して、望ましいシアリル化オリゴサッカライド部分を有するオリゴサッカライド、糖タンパク質、および糖脂質の酵素合成の有効性は、本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む組換え的に産生されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの使用を介して強化され得る。組換え技術は、大規模インビトロ糖タンパク質および糖脂質修飾に必要とされる大量のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの産生を可能にする。
【０１３２】
いくつかの態様において、本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに方法による使用に対する適したオリゴサッカライド、糖タンパク質、および糖脂質は、グリコシル化反応の間に固体支持体上に固定された糖タンパク質および糖脂質であり得る。「固体支持体」という語は、半固体支持体も包含する。好ましくは、標的糖タンパク質または糖脂質は、グリコシル化反応が完了した後に反応性糖タンパク質または糖脂質が放出され得るように、可逆的に固定される。多くの適したマトリクスは、当業者にとって公知である。例えば、イオン交換は、グリコシル化反応が進行する間、糖タンパク質または糖脂質を適当な樹脂上に一時的に固定するために採用され得る。対象となる糖タンパク質または糖脂質に特異的に結合するリガンドは、親和性に基づく固定化に対して使用されてもよい。例えば、糖タンパク質に特異的に結合する抗体が適している。また、対象となる糖タンパク質が、それ自身が抗体である、またはそのフラグメントを含む場合、親和性樹脂としてタンパク質AまたはGを使用し得る。対象となる糖タンパク質または糖脂質に特異的に結合する色素およびその他の分子も適している。
【０１３３】
好ましくは、アクセプターサッカライドが完全長糖タンパク質の切断バージョンである場合、それは、好ましくは、完全長糖タンパク質の生物学的活性サブ配列を含む。例示的な生物学的活性サブ配列は、酵素活性部位、受容体結合部位、リガンド結合部位、抗体の相補性決定領域、および抗原の抗原性領域を含むが、それらに限定されない。
【０１３４】
IX. シアリル化産物の産生
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、インビトロ反応混合において、またはインビボ反応によって、例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む組換え微生物の発酵性増殖によって、シアリル化産物を作製するために使用され得る。
【０１３５】
A. インビトロ反応
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、インビトロの反応混合においてシアリル化産物を作製するために使用され得る。インビトロ反応混合物は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド、部分的に精製されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、または精製されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含む透過性微生物；ならびにドナー基質アクセプター基質、および適当な反応バッファーを含み得る。インビトロ反応に対して、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドなどの組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質、アクセプター基質、ドナー基質、およびその他の反応混合物成分は、水性反応媒質における混和によって組み合わせられる。付加的なグリコシルトランスフェラーゼは、望ましいシアリル化産物に応じて、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドとの組み合わせにおいて使用され得る。媒質は、概して、pH値約5〜約8.5を有する。媒質の選択は、望ましいレベルにおけるpH値を維持する媒質の能力に基づく。したがって、いくつかの態様において、媒質は、pH値約7.5に中和される。バッファーが使用されない場合、媒質のpHは、使用される特定のグリコシルトランスフェラーゼに応じて、約5〜8.5に維持されるべきである。フコシルトランスフェラーゼに対して、pH範囲は、好ましくは、約6.0〜8.0に維持される。シアリルトランスフェラーゼに対して、範囲は、好ましくは、約5.5〜約8.0である。
【０１３６】
酵素量または濃度は、触媒の初速度の測定単位である活性ユニットにおいて表現される。1活性ユニットは、与えられた温度（典型的には37℃）およびpH値（典型的には7.5）における、分あたりの1μモルの産物の形成を触媒する。したがって、10ユニットの酵素は、10μモルの基質が、37℃の温度およびpH値7.5において1分に10μモルの産物に変換される場合の、その酵素の触媒量である。
【０１３７】
反応混合物は、二価金属カチオン（Mg2+、Mn2+）を含み得る。反応媒質は、必要であれば、可溶化界面活性剤（例えば、TritonまたはSDS）およびメタノールまたはエタノールなどの有機溶媒を含んでもよい。酵素は、溶液において遊離して使用され得る、またはポリマーなどの支持体に結合され得る。したがって、反応混合物は、初めは実質的に均質であるが、ある沈殿物が、反応の間に形成し得る。
【０１３８】
上記のプロセスが実施される温度は、凝固のすぐ上からほとんどの感受性酵素が変性する温度までの範囲であり得る。その温度範囲は、好ましくは約0℃〜約45℃であり、より好ましくは約20〜約37℃である。
【０１３９】
そのように形成された反応混合物は、グリコシル化される糖タンパク質に付着されるオリゴサッカライド基上に存在する望ましいオリゴサッカライド決定基の望ましい高収率を獲得するのに十分な時間維持される。大規模調製に対して、反応は、しばしば、約0.5〜240時間の間、より典型的には約1〜18時間の間、進行することを可能にされると思われる。
【０１４０】
グリコシルトランスフェラーゼ反応の一つまたは複数は、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として実施され得る。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件および説明は、記載されている。多くのグリコシルトランスフェラーゼサイクル（例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクル、およびフコシルトランスフェラーゼサイクル）は、米国特許第5,374,541号および国際公開公報第9425615A号において記載される。その他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ichikawa et al. J. Am. Chem. Soc. 114:9283 (1992), Wong et al. J. Org. Chem. 57: 4343 (1992), DeLuca, et al., J. Am. Chem. Soc. 117:5869-5870 (1995)、およびIchikawa et al. Carbohydrates and Carbohydrate Polymers. Yaltami, ed. (ATL Press, 1993)において記載される。
【０１４１】
その他のグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼに対して詳細に記載されているのと同様のトランスフェラーゼサイクルに置換され得る。特に、グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、例えばAlg8（Stagljov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5977 (1994)）またはAlg5（Heesen et al. Eur. J. Biochem. 224:71 (1994)）などのグルコシルトランスフェラーゼ、例えばα(1,3)N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β(1,4)N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Nagata et al. J. Biol. Chem. 267:12082-12089 (1992)およびSmith et al. J. Biol Chem. 269:15162 (1994)）、およびポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Homa et al. J. Biol Chem. 268:12609 (1993)）などのN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであってもよい。適したN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、GnTI（2.4.1.101, Hull et al., BBRC 176:608 (1991)）、GnTII、およびGnTIII（Ihara et al. J. Biochem. 113:692 (1993)）、GnTV（Shoreiban et al. J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)）、O-連結N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Bierhuizen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9326 (1992)）、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸トランスフェラーゼ（Rajput et al. Biochem J. 285:985 (1992)）、およびヒアルロン酸シンターゼを含む。適したマンノシルトランスフェラーゼは、α(1,2)マンノシルトランスフェラーゼ、α(1,3)マンノシルトランスフェラーゼ、β(1,4)マンノシルトランスフェラーゼ、Dol-P-Manシンターゼ、OCh1、およびPmt1を含む。
【０１４２】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに対して、プロセスにおいて使用される様々な反応物質の濃度または量は、温度およびpH値などの反応条件、ならびにグリコシル化されるアクセプターサッカライドの選択および量を含む多くの因子に依存する。グリコシル化プロセスは、酵素の触媒量の存在下での活性化ヌクレオチド、活性化ドナー糖の再生、および産生PPiの捕捉を可能にするので、プロセスは、先に議論された化学量論的基質の濃度または量によって限定される。本発明の方法に従って使用され得る反応物質の濃度に対する上限は、そのような反応物質の可溶性によって決定される。
【０１４３】
好ましくは、活性化ヌクレオチド、リン酸ドナー、ドナー糖、および酵素の濃度は、グリコシル化が、アクセプターが消費されるまで進行するように、選択される。以下に議論される検討材料は、シアリルトランスフェラーゼとの関連であるが、概して、その他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに適用可能である。
【０１４４】
酵素の各々は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに温度、時間、およびpH値などの反応条件に従って変化する。あらかじめ選択された基質濃度および反応条件下での与えられた酵素に対する触媒量を決定するための手段は、当業者にとって周知である。
【０１４５】
B. インビボ反応
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、例えばシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含む組換え微生物の発酵増殖などのインビボ反応によって、シアリル化産物を作製するために使用され得る。組換え微生物の発酵増殖は、アクセプター基質およびドナー基質またはドナー基質への前駆体、例えばシアル酸、を含む媒質の存在下で生じ得る。例えば、Priem et al., Glycobiology 12:235-240 (2002)を参照されたい。微生物は、アクセプター基質およびドナー基質またはドナー基質への前駆体を取り込み、アクセプター基質へのドナー基質の付加が、生細胞において起こる。微生物は、例えば糖輸送タンパク質の発現によって、アクセプター基質の取り込みを容易にするために変更され得る。例えば、ラクトースがアクセプターサッカライドである場合、LacYパーミアーゼを発現する大腸菌細胞が使用され得る。その他の方法は、アクセプターサッカライドの分解を減少させる、またはドナーサッカライドもしくはドナーサッカライドの前駆体の産生を増加させるために使用され得る。いくつかの態様において、シアリル化産物の産生は、宿主微生物の操作によって強化される。例えば、大腸菌において、シアル酸の分解は、CMP-シアレート（sialate）シンターゼ（NanA-）を欠く宿主株の使用によって最小にされ得る。（大腸菌において、CMP-シアレートシンターゼは、異化酵素であるように思われる。）また、大腸菌において、例えばラクトースがシアリル化産物を合成することにおけるアクセプターサッカライドまたは中間体である場合、ラクトース分解は、LacZ-である宿主細胞を使用することによって最小にされ得る。
【０１４６】
C. シアリル化産物の特徴付けおよび単離
シアリル化産物の産生は、例えば、望ましい産物の産生が生じたことを決定することによって、またはアクセプター基質などの基質が使い果たされたことを決定することによって、モニターされ得る。当業者は、オリゴサッカライドなどのシアリル化産物が、例えばペーパーまたはTLCプレートを使用するクロマトグラフィーなどの技術を使用して、または例えばMALDI-TOFスペクトロメトリーなどの質量分析によって、または核磁気共鳴分光法によって、同定され得ることを認識すると思われる。シアリル化産物の同定の方法は、当業者にとって公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,699,705号およびVarki et al., Preparation and Analysis of Glycoconjugates, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 17 (Ausubel et al. eds, 1993)において見出される。
【０１４７】
いくつかの態様において、本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに方法は、実質的に均一なグリコシル化パターンを有する糖タンパク質または糖脂質を酵素的に合成するために使用される。糖タンパク質および糖脂質は、糖型変更が望ましいタンパク質、糖タンパク質、脂質、または糖脂質に付着されるサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む。サッカライドまたはオリゴサッカライドは、グリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質として機能し得る構造を含む。アクセプター基質がグリコシル化される際、望ましいオリゴサッカライド部分が形成される。望ましいオリゴサッカライド部分は、それが付着される糖タンパク質または糖脂質に望ましい生物学的活性を与えるものである。本発明の組成物において、あらかじめ選択されたサッカライド残基は、対象となる潜在的なアクセプター部位の少なくとも約30％に連結される。より好ましくは、あらかじめ選択されたサッカライド残基は、対象となる潜在的なアクセプター基質の少なくとも約50％に連結され、さらにより好ましくは、対象となる潜在的なアクセプター基質の少なくとも70％に連結される。開始糖タンパク質または糖脂質が、対象となるオリゴサッカライド部分において異質性を示す（例えば、開始糖タンパク質または糖脂質上のオリゴサッカライドのいくつかが、対象となるアクセプター基質に付着されたあらかじめ選択されたサッカライド残基をすでに有する）状況において、列挙されたパーセンテージは、そのようなあらかじめ付着されたサッカライド残基を含む。
【０１４８】
「変更された」という語は、本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに方法の適用の後で、元来産生されるような糖タンパク質上で観測されるものとは異なるグリコシル化パターンを有する対象となる糖タンパク質または糖脂質を指す。そのような複合糖質の例は、糖タンパク質の糖型が、糖タンパク質が天然である生物の細胞によって産生される場合の糖タンパク質上で見出されるものと異なる糖タンパク質である。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、ならびに天然複合糖質が産生される細胞と同じまたは異なる種であり得る宿主細胞によって元来産生されるような複合糖質のグリコシル化パターンと比較して、これらの複合糖質のグリコシル化パターンが修飾される糖タンパク質および糖脂質を酵素的に合成するためにそのようなタンパク質を使用する方法も提供される。
【０１４９】
糖タンパク質および糖脂質の構造解析によってだけではなく、複合糖質の一つまたは複数の生物学的活性の比較によっても、グリコシル化パターンにおける差を査定できる。例えば、「変更された糖型」を有する糖タンパク質は、非修飾糖タンパク質と比較して、グリコシル化反応後の糖タンパク質のもう一つの生物学的活性における改善を示すものを含む。例えば、変更された複合糖質は、本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに方法の適用の後に、対象となるリガンドまたは受容体に対するより大きな結合親和性、より大きな治療的半減期、軽減された抗原性、および特定の組織に対する標的性を示すものを含む。観測される改善の量は、好ましくは、統計的に有意であり、より好ましくは、少なくとも約25％改善であり、さらにより好ましくは、少なくとも約30％、40％、50％、60％、70％であり、さらにさらにより好ましくは、少なくとも80％、90％、または95％である。
【０１５０】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを使用して産生された産物は、精製をともなわずに使用され得る。しかしながら、例えば、薄層もしくは厚層（thick）クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過などの標準的な周知の技術は、グリコシル化サッカライドの回収に対して使用され得る。例えば、同一出願人による豪州特許第735695号において記載されるナノ濾過または逆浸透膜を用いる膜濾過も使用され得る。さらなる例として、膜が約1000〜約10,000ダルトンの分子量カットオフを有する膜濾過は、タンパク質を除去するために使用され得る。別の例として、次いで、ナノ濾過または逆浸透は、塩を除去するために使用され得る。ナノ濾過膜は、使用される膜に応じて、一価塩を通すが多価塩および約200〜約1000ダルトンよりも大きな非電荷溶質を保有する、逆浸透膜のクラスである。したがって、例えば、本発明の組成物および方法によって産生されるオリゴサッカライドは、膜において保有されることができ、混入している塩は通り抜けると思われる。
【０１５１】
X. 多酵素オリゴサッカライド合成
上で議論されるように、いくつかの態様において、二つまたはそれ以上の酵素が、糖タンパク質または糖脂質上のオリゴサッカライド決定基を含む望ましいオリゴサッカライドを形成するために使用され得る。例えば、特定のオリゴサッカライド決定基は、望ましい活性を示すために、ガラクトース、シアル酸、およびフコースの付加を必要とし得ると考えられる。従って、本発明は、例えばシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、ならびにフコシルトランスフェラーゼまたはガラクトシルトランスフェラーゼなどの別のグリコシルトランスフェラーゼなどの、二つまたはそれ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、望ましいオリゴサッカライド決定基の高収率合成を獲得するために使用される方法を提供する。
【０１５２】
本明細書において記載されるようなシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、多数のグリコシルトランスフェラーゼとの組み合わせにおいて使用され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む組換えシアリルトランスフェラーゼポリペプチドと、例えばH. ピロリ（pylori）α-1,3/4-フコシルトランスフェラーゼなどの組換えフコシルトランスフェラーゼとの組み合わせを使用できる。例えば、ヘリコバクター（Helicobacter）・ピロリからのフコシルトランスフェラーゼは、米国特許第6,534,298号および同第6,238,894号；2004年1月29日に公開された国際公開公報第2004009838号；2004年1月22日に出願された米国特許出願第10/764,212号において開示される。その各々は、すべての目的に対して、参照により本明細書に組み入れられる。α2,3-シアリルトランスフェラーゼ、二官能性α2,3-2,8-シアリルトランスフェラーゼ、β-1,4-GalNAcトランスフェラーゼ、およびβ-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを含むバクテリアグリコシルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニから単離されており、2004年3月2日に発行された米国特許第6,699,705号において開示され、すべての目的に対して、参照により本明細書に組み入れられる。同様に、組換えグリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼに融合されることができるまたはできない組換えアクセサリー酵素とともに使用されることができ、それによって融合タンパク質を形成する。その他の態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに付加的なグリコシルトランスフェラーゼまたはアクセサリー酵素は、同じ細胞において産生され、望ましい最終産物を合成するために使用される。
【０１５３】
いくつかの場合において、糖タンパク質連結または糖脂質連結オリゴサッカライドは、糖タンパク質または糖脂質のインビボ生合成に際して、対象となる特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質を含むと思われる。そのような糖タンパク質または糖脂質は、それぞれ糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンの先行する修飾をともなわずに、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質および方法を使用して、グリコシル化され得る。しかしながら、その他の場合において、対象となる糖タンパク質または糖脂質は、適したアクセプター基質を欠くと思われる。そのような場合、本発明の方法は、次いで糖タンパク質連結または糖脂質連結オリゴサッカライドが、望ましいオリゴサッカライド部分を形成するために、対象となるあらかじめ選択されたサッカライドユニットのグリコシルトランスフェラーゼ触媒付着に対するアクセプター基質を含むように、糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンを変更するために使用され得る。
【０１５４】
糖タンパク質連結または糖脂質連結オリゴサッカライドは、任意で、シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質または一つもしくは複数の適当な残基が適したアクセプター基質を獲得するために付加され得る部分のいずれかを曝露するために、最初に全体的にまたは部分的に「トリミング（tirimmed）」され得る。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素は、付着およびトリミング反応に対して有用である。例えば、「高マンノース」-型オリゴサッカライドを表示する糖タンパク質は、一つまたは複数のあらかじめ選択されたサッカライドユニットの付着に際して、望ましいオリゴサッカライド決定基を形成するアクセプター基質を獲得するために、マンノシダーゼによるトリミングを受け得る。
【０１５５】
その方法は、その天然型において非グリコシル化されるタンパク質または脂質上の望ましいオリゴサッカライド部分を合成することに対しても有用である。対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する適したアクセプター基質は、本発明の方法を使用するグリコシル化に先行してそのようなタンパク質または脂質に付着され得る。例えば、グリコシル化に対する適したアクセプターを有するポリペプチドを獲得する方法に対して、米国特許第5,272,066号を参照されたい。
【０１５６】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、適したアクセプターを作製するために最初に複合糖質を修飾することに関与する、複合糖質上に存在するサッカライド基のインビトロシアリル化に対する方法を提供する。
【０１５７】
XI. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの使用およびそれらのシアリル化産物
本発明は、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドならびに糖タンパク質、糖脂質、およびオリゴサッカライド部分を酵素的に合成するためにシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを使用する方法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む少なくとも一つのシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、アクセプター基質、ならびにドナー基質、ならびに典型的には可溶性二価金属カチオンを含む反応媒質においてインビトロで起こり得るか；または、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、インビボで起こり得る。いくつかの態様において、アクセサリー酵素が、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドに対するドナー基質を合成し得るように、アクセサリー酵素およびアクセサリー酵素触媒部分に対する基質も存在する。
【０１５８】
本発明の方法および反応混合物を使用して産生されることができ、特に対象となる産物サッカライドは、以下を含むがそれらに限定されない。
【０１５９】
A. オリゴサッカライド
反応混合物および方法は、シアリルラクトース、シアリル-LNnT（LSTd）、シアリル-LNT、STn-抗原、およびそのグリコシドを含む、多種多様なオリゴサッカライドを産生することに対して有用である。グリコシドは、その他の物質へのカップリングに対するリンカーアームまたは同様のものの組み込みを含み得る。
【０１６０】
本発明の組換え細胞、反応混合物、および方法を使用して産生し得る化合物の中には、シアル酸およびシアル酸部分を含む任意の糖が含まれる。これらは、シアリルラクトシドを含むシアリルガラクトシド、ならびに下記式を有する化合物を含む。
2008512993.tif 000022
【０１６１】
これらの式において、R'は、1〜18炭素のアルキルまたはアシル、5,6,7,8-テトラヒドロ-2-ナフタミド；ベンザミド；2-ナフタミド；4-アミノベンザミド；または4-ニトロベンザミドである。Rは、水素、アルキルC1-C6、サッカライド、オリゴサッカライド、または少なくとも一つの炭素原子を有するアグリコン基である。「少なくとも一つの炭素原子を有するアグリコン基」という語は、基-A-Zを指し、Aは、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、酸素、硫黄、アミノ、イミノ、またはアルコキシで置換されてもよい1〜18の炭素原子のアルキレン基を示し；かつZは、水素、-OH、-SH、-NH2、NHR1、-N(R1)2、-CO2H、-CO2R1、-CONH2、-CONHR1、-CON(R1)2、-CONHNH2、または-OR1であり、各々のR1は、独立に、1〜5の炭素原子のアルキルである。加えて、Rは、
2008512993.tif 000023
であることができ、n、m、o=1〜18；(CH2)n-R2（n=0〜18）、R2は、様々に置換された芳香族環であり、好ましくは一つもしくは複数のアルコキシ基、好ましくはメトキシもしくはO(CH2)mCH3（m=0〜18）、またはその組み合わせで置換されているフェニル基である。Rは、3-(3,4,5-トリメトキシフェニル)プロピルであってもよい。
【０１６２】
一般式に含まれる構造の関連セットは、Galがβ1,3に連結され、かつFucがα1,4に連結されるものである。例えば、ここではSLeaと呼ばれるテトラサッカライド、NeuAcα2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAcβ1-は、セレクチン受容体によって認識される。Berg et al., J. Biol. Chem., 266:14869-14872 (1991)を参照されたい。特に、Bergらは、E-セレクチンcDNAで形質転換された細胞が、SLeaを含むネオ糖タンパク質に選択的に結合することを示した。
【０１６３】
本発明の方法は、Galα1,3Galβ1,4Clc(R)β-O-R1を含む一般式Galα1,3Gal-、を有するオリゴサッカライド化合物を合成することに対しても有用であり、R1は、X=OHである-(CH2)n-COX、OR2、-NHNH2、R=OHまたはNAcであり、かつR2は、水素、サッカライド、オリゴサッカライド、または少なくとも一つの炭素原子を有するアグリコン基であり、かつn=2〜18、より好ましくは2〜10の整数である。本発明に従って合成され得る化合物の中には、ラクト-N-ネオテトラオース（LNnT）、GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc（LNT-2）、シアリル(α2,3)-ラクトース、およびシアリル(α2,6)-ラクトースも含まれる。
【０１６４】
オリゴサッカライドは、上に記載されるように、インビトロ反応混合物において、または適当な組換え微生物の発酵増殖において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを使用して作製され得る。
【０１６５】
本発明の例えば微生物などの組換え細胞および反応混合物は、複数の酵素段階を必要とする産物サッカライドを合成することにおいて特に有用である。これらの態様において、組換え細胞は、二つまたはそれ以上の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むことができ、それぞれのヌクレオチド糖基質の両方を産生し得る。次いで、組換え細胞は、発酵増殖およびオリゴサッカライドの産生を形成するために使用されることができる、またはグリコシルトランスフェラーゼの精製に対して透過化され得るもしくは使用されることができる。または、反応混合物は、組換え細胞の二つまたはそれ以上の型を含むことができ、その各々は、一つまたは複数の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子および対応するヌクレオチド糖生成システムを含む。例えば、組換え細胞型の組み合わせを使用でき、その一つは、外因性シアリルトランスフェラーゼ遺伝子およびCMP-シアル酸を産生するためのシステムを含み、別の組換え細胞型は、外因性ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、かつUDP-Galを産生する。態様のこの群において、異なる細胞型は、初めの反応混合物において組み合わせられ得る、または好ましくは、第二のグリコシルトランスフェラーゼ反応に対する組換え細胞型は、第一のグリコシルトランスフェラーゼ反応が完了に近づいた際に、反応媒質に添加され得る。単一の容器において順に二つのグリコシルトランスフェラーゼ反応を実施することによって、全体の収率は、中間体種が単離される手順に対して改善される。さらに、余分な溶媒および副産物の浄化および処分は、軽減される。
【０１６６】
例えば、本発明は、下記式を有する化合物の調製に対する組換え細胞および方法を提供する。
2008512993.tif 000024
【０１６７】
この式において、Rは、水素、サッカライド、オリゴサッカライド、または少なくとも一つの炭素原子を有するアグリコン基である。R'は、アセチルまたはアリルオキシカルボニル（Alloc）のいずれかであり得る。
【０１６８】
「少なくとも一つの炭素原子を有するアグリコン基」という語は、基-A-Zを指し、Aは、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、酸素、硫黄、アミノ、イミノ、またはアルコキシで置換されてもよい1〜18の炭素原子のアルキレン基を示し；かつZは、水素、-OH、-SH、-NH2、NHR1、-N(R1)2、-CO2H、-CO2R1、-CONH2、-CONHR1、-CON(R1)2、-CONHNH2、または-OR1であり、各々のR1は、独立に、1〜5の炭素原子のアルキルである。加えて、Rは、
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であることができ、n、m、o=1〜18；(CH2)n-R2（n=0〜18）、R2は、様々に置換された芳香族環であり、好ましくは一つもしくは複数のアルコキシ基、好ましくはメトキシもしくはO(CH2)mCH3（m=0〜18）、またはその組み合わせで置換されているフェニル基である。
【０１６９】
これらの化合物を合成することに関与する段階は以下を含む。
（a）化合物：
2008512993.tif 000026
を形成するのに十分な条件下で、UDP-ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼで式GlcNR'β(1→3)Galβ-ORの化合物をガラクトシル化する段階；
（b）化合物：
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を形成するために、シアル酸が非還元糖に転移させられる条件下で、α(2,3)シアリルトランスフェラーゼを使用して、シアル酸のCMP誘導体の存在下で、シアリルトランスフェラーゼで（a）において形成された化合物をシアリル化する段階；および
（c）
2008512993.tif 000028
を提供するために、（b）において形成された化合物をフコシル化する段階。
【０１７０】
本発明の組換え細胞は、これらの段階の各々を個々にまたは同時に実施するための効率的な方式を提供する。段階の一つまたは複数は、本発明の組換え細胞を使用して実施され得る。例えば、シアリル化およびガラクトシル化反応は、外因性ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子も含みかつUDP-Galを産生する、本明細書において開示される組換え細胞を使用して遂行され得る。フコシル化段階は、適当なグリコシルトランスフェラーゼおよびドナー糖を産生する組換え細胞を使用して実施されてもよい、または従来的な非細胞に基づく方法を使用して実施され得る。
【０１７１】
一つの態様において、Rはエチルであり、フコシル化段階は、化学的に実施され、ガラクトシル化およびシアリル化段階は、本明細書において開示されるような細胞において実施される。
【０１７２】
いくつかの態様において、組換え細胞および反応混合物は、フコシル化もされるシアリル化サッカライド産物の産生に対して構築される。GDP-フコースを産生しかつ適当なフコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細胞の使用を介して、以下の糖質構造が、獲得できるものの中に含まれる：（1）Fucα(1→2) Galβ-；（2）Galβ(1→3)[Fucα(1→4)]GlcNAcβ-；（3）Galβ(1→4)[Fucα(1→3)]GlcNAcβ-；（4）Galβ(1→4)[Fucα(1→3)]Glc；（5）-ClcNAcβ(1→4)[Fucα(1→6)]GlcNAcβ1→Asn；（6）-GlcNAcβ(1→4)[Fucα(1→3)GlcNAcβ1→Asn；（7）Fucα(1→6)Galβ→；（8）Fucα(1→3)]Galβ-；（9）Glcβ(1→3)Fucα1→O-ThrおよびFucα1→O-Thr/Ser；および（10）Fucα1→セラミド。反応物質としてGDP-フコースを使用して形成され得るシアリル化産物の例は、3'-シアリル-3-フコシルラクトース、シアリルルイスX、およびシアリルルイスAを含むが、それらに限定されない。
【０１７３】
ガラクトシル化/シアリル化産物も、本発明の組換え細胞および方法を使用して産生され得る。例えば、UDP-Galを産生しかつ適当なガラクトシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の使用によって、β1,4リンケージ、α1,3リンケージ、α1,4リンケージ、またはβ1,3リンケージにおけるGalを、GlcNAcまたはGlc残基を含むサッカライドに付加し得る。組換え細胞は、透過化され、アクセプターサッカライドと接触して置かれ、UDP-GalからアクセプターへのGalの転移を引き起こす。本発明が合成の効率的な方法を提供するそのようなオリゴサッカライドの一つの例は、ラクト-N-ネオテトラオース、Galβ(1-4)-GlcNAcβ(1-3)-Galβ(1-4)-Glc（式I）である。例えば、Min-Yuan Chou et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 (32): 19166-19173を参照されたい。
2008512993.tif 000029
【０１７４】
GlcNAcまたはGalNAc残基を含むシアリル化産物も産生され得る。本発明は、GalNAcトランスフェラーゼまたはGlcNAcトランスフェラーゼをコードし、かつ活性化UDP-GalNAcまたはUDP-GlcNAcを産生する、本明細書において開示される組換え細胞を提供することによって、GalNAcまたはGlcNAcをβ1,3リンケージまたはβ1,4リンケージにおけるGalに付加するための方法も提供する。
【０１７５】
上記の説明において、語は、概してそれらの標準的な意味に従って使用される。本明細書において使用されるような「アルキル」という語は、メチル、エチル、n-プロピル、ブチル、n-ヘキシル、および同様のものなどの1〜8の炭素の低アルキル、シクロアルキル（3〜7炭素）、シクロアルキルメチル（4〜8炭素）、ならびにアリールアルキルを含む、分岐または非分岐、飽和または不飽和、一価または二価の、1〜20の炭素を有する炭化水素ラジカルを意味する。「アルコキシ」という語は、例えばエトキシ、メトキシ、またはn-プロポキシなどの、酸素によって分子の残部に付着されるアルキルラジカルを指す。「アルキルチオ」という語は、硫黄によって分子の残部に付着されるアルキルラジカルを指す。「アシル」という語は、ヒドロキシル基の除去によって有機酸に由来するラジカルを指す。例は、アセチル、プロピオニル、オレオイル、ミリストイルを含む。
【０１７６】
「アリール」という語は、例えばベンゼンからフェニルなどの、一つの原子の除去によって芳香族炭化水素に由来するラジカルを指す。芳香族炭化水素は、例えばナフチルなどの、複数の不飽和炭素環を有し得る。
【０１７７】
「アルコキシ」という語は、例えばエトキシ、メトキシ、またはn-プロポキシなどの、酸素によって分子の残部に付着されるアルキルラジカルを指す。
【０１７８】
「アルキルチオ」という語は、硫黄によって分子の残部に付着されるアルキルラジカルを指す。
【０１７９】
「アルカノアミド」ラジカルは、一般式-NH-CO-(C1-C6アルキル)を有し、置換してもよいまたはされなくてもよい。置換される場合、置換基は典型的にはヒドロキシルである。その語は、二つの好ましい構造、アセトアミド、-NH-CO-CH3、およびヒドロキシアセトアミド、-NH-CO-CH2-OHを具体的に含む。
【０１８０】
「複素環式化合物」という語は、三つまたはそれ以上の原子を有する環化合物を指し、原子の少なくとも一つが炭素以外（例えば、N、O、S、Se、P、またはAs）である。そのような化合物の例は、フラン（フコースなどのペントースのフラノース型を含む）、ピラン（グルコースおよびガラクトースなどのヘキソースのピラノース型を含む）ピリミジン、プリン、ピラジン、および同様のものを含む。
【０１８１】
シアリル化産物内に含まれる構造のリストは、表2において続く。以下に列記されるオリゴサッカライドの各々は、非結合産物として合成され得る、または例えば糖脂質もしくは糖タンパク質もしくは糖ペプチドに結合されることによって合成され得る。当業者は、リストが不完全であること、およびこれらの構造の変異も合成され得ることを認識すると思われる。
【０１８２】
（表２）オリゴサッカライドの式および必要な酵素活性
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【０１８３】
B. ガングリオシドおよび関連構造を含む糖脂質
本発明の反応混合物および細胞は、多くの異なる糖脂質を産生することに対しても有用である。特に対象となるものは、例えば、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、グローボ（Globo）-H、グローボテトロース（Globotetrose）、リポポリサッカライド、およびこれらの脂質の様々な型を含む。例えば、脂質は、例えばリソ-、デアセチル、リンカーアーム含有、またはO-アセチル型に修飾され得る。
【０１８４】
本発明は、望ましいガングリオシドもしくはその他のスフィンゴ糖脂質、またはその誘導体を獲得するために特定の様式において一つまたは複数のサッカライド部分を付加するための反応混合物、細胞型、および方法を提供する。本発明の方法は、ガングリオシドおよびその他の糖スフィンゴイドを含む糖スフィンゴイドを合成するための、一つまたは複数の組換えグリコシルトランスフェラーゼを発現する細胞の使用に関与する。望ましい糖質を前駆体分子に連結するためのグリコシルトランスフェラーゼの使用を介して、高特異性を有する望ましいリンケージを達成し得る。いくつかの態様において、グリコシルトランスフェラーゼ反応に先行してスフィンゴイド前駆体から脂肪酸部分を除去し、かつ/または反応を促進するために有機溶媒を使用することが望ましい。多くのガングリオシドおよび関連構造を産生することに対する酵素および反応スキームは、公報である国際公開公報第99/28491号として1999年6月10日に公開され、「Enzymatic synthesis of gangliosides」と題されるPCT特許出願番号PCT/US/25470において記載される。
【０１８５】
本発明の方法は、多くのガングリオシドおよび関連構造のいずれかを産生することに対して有用である。対象となる多くのガングリオシドは、Oettgen, H.F., ed., Gangliosides and Cancer, VCH, Germany, 1989, pp. 10-15、およびそこで引用される参照において記載される。特に対象となるガングリオシドは、例えば、脳ならびにその他の供給源において見出されるものを含み、表3において列記される。
【０１８６】
（表３）ガングリオシドの式および略語
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糖脂質の命名法、IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (Recommendations 1997); Pure Appl. Chem. (1997) 69: 2475-2487; Eur. J. Biochem (1998) 257: 293-298 (www.chem.qmw.ac.uk/iupac/misc/glylp.html)。
【０１８７】
C. 糖ペプチドおよび糖タンパク質
いくつかの態様において、産物サッカライドは、ポリペプチドに付着される。したがって、本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、反応混合物、および細胞は、治療的半減期、免疫原性、および同様のものなどの特性における様々な改善を達成するために糖タンパク質を修飾することに対して有用である。特に対象となる糖ペプチドの例は、例えば、STn-ペプチド、Tn-ペプチド、T-ペプチド、ST-ペプチド、およびこれらの構造の連結バージョンを含む。糖タンパク質の修飾に対して有用である酵素および反応は、例えば、1998年6月23日に国際公開公報第98/31826号として公開されたPCT特許出願番号US98/0835において記載される。
【０１８８】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、N-連結糖タンパク質、すなわちN-連結グリカンを修飾するまたは合成するために使用され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、例えば二分岐、三分岐、四分岐、または五分岐オリゴサッカライド構造などの、複合型N-連結グリカンを修飾するまたは合成するために使用され得る。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、O-連結糖タンパク質を修飾するまたは合成するために使用され得る。
【０１８９】
いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、Sia-α2,6-GalNAc-アミノ酸構造を含む糖タンパク質を合成する。タンパク質は、Sia-α2,3-Gal-β1,3-GalNAc-アミノ酸構造、またはSia-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-アミノ酸構造、またはSia-α2,3-Gal-β1,4Glu-アミノ酸構造を含む糖タンパク質を合成するために使用されてもよい。糖タンパク質へのオリゴサッカライドのリンケージに対するアミノ酸の同一性は重大ではなく、Asn、Ser、またはThrに限定されない。
【０１９０】
D. 薬学的およびその他の適用
次いで、上に記載される化合物は、例えば、抗原、診断的試薬、食料品として、または治療薬として、様々な適用において使用され得る。したがって、本発明は、様々な条件を処置することにおいて使用され得る薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、上に記載される方法に従って作製されるオリゴサッカライドから成る。
【０１９１】
本発明の薬学的組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用に適している。本発明における使用に適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)において見出される。薬物送達に対する方法の簡単な概論として、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照されたい。
【０１９２】
薬学的組成物は、予防的および/または治療的処置に対する、エアロゾルによるまたは経皮的になどの、非経口、鼻腔内、局所、経口、または局部投与を目的とする。一般的に、薬学的組成物は、非経口的に、例えば静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは例えば水、緩衝水、生理食塩水、PBS、および同様のものなどの水性担体に、溶解または懸濁された化合物を含む非経口投与に対する組成物を提供する。組成物は、pH調節および緩衝剤、張度調節剤（tonicity adjusting agent）、湿潤剤、界面活性剤、ならびに同様のものなどの、生理学的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質を含み得る。
【０１９３】
これらの組成物は、従来的な滅菌技術によって滅菌され得る、または滅菌濾過され得る。結果として生じる水性溶液は、使用のためにそのまま包装されることができ、または凍結乾燥されることができ、凍結乾燥調製は、投与に先行して滅菌水性担体と組み合わせられる。調製のpHは、典型的には3と11の間、より好ましくは5〜9、最も好ましくは7〜8であると思われる。
【０１９４】
いくつかの態様において、本発明のオリゴサッカライドは、標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソームに組み込まれ得る。例えば、Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)、米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、および同第4,837,028号において記載されるように、様々な方法が、リポソームを調製することに対して使用できる。様々な標的物質（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームの標的化は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第4,957,773号および同第4,603,044号を参照されたい）。
【０１９５】
オリゴサッカライドを含む組成物は、予防的および/または治療的処置に対して投与され得る。治療的適用において、組成物は、上に記載されるように、治癒するまたは少なくとも部分的に疾患およびその合併症の症候を止めるのに十分な量において、疾患をすでに患っている患者に投与される。これを遂行するのに十分な量は、「治療的有効量」として定義される。この使用に対して有効な量は、疾患の重症度ならびに患者の体重および全身状態に依存すると思われるが、概して、70 kgの患者に対して1日あたり約0.5 mg〜約40 gのオリゴサッカライドの範囲であると思われ、1日あたり約5 mg〜約20 gの化合物の投薬量が、より一般的に使用される。
【０１９６】
組成物の単回または複数回投与は、処置する医師によって選択される用量レベルおよびパターンをともなって実施され得る。任意の事象において、薬学的製剤は、患者を有効に処置するのに十分な本発明のオリゴサッカライドの量を提供するべきである。
【０１９７】
オリゴサッカライドは、診断的試薬としての使用を見出してもよい。例えば、ラベル化化合物は、炎症を有することが疑われる患者における炎症または腫瘍転移の領域を特定するために使用され得る。この使用に対して、化合物は、例えば125I、14C、またはトリチウムなどの適当な放射性同位体でラベルされ得る。
【０１９８】
本発明のオリゴサッカライドは、本発明の化合物と特異的に反応性のあるモノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生に対する免疫原として使用され得る。様々な免疫グロブリン分子の産生および操作に対する当業者にとって使用できる多数の技術が、本発明において使用され得る。抗体は、当業者にとって周知の様々な手段によって産生され得る。
【０１９９】
例えばマウス、ウサギ、ウマなどの非ヒトモノクローナル抗体の産生は周知であり、たとえば本発明のオリゴサッカライドを含む調製で動物を免疫することによって遂行され得る。免疫動物から獲得された抗体産生細胞は、不死化されかつスクリーニングされる、または最初に望ましい抗体の産生に対してスクリーニングされ、次いで不死化される。モノクローナル抗体産生の一般的な手順の議論として、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N.Y. (1988)を参照されたい。
【０２００】
XII. ペプチドへの修飾糖の結合
修飾糖は、結合を媒介する適当な酵素を使用して、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドまたはタンパク質に結合される。好ましくは、修飾ドナー糖、酵素、およびアクセプターペプチドまたはタンパク質の濃度は、アクセプターが消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。
【０２０１】
望ましいオリゴサッカライド構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを使用する多くの方法は公知であり、概して本発明に適用可能である。例示的な方法は、例えば国際公開公報第96/32491号、Ito et al.、Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993)、ならびに米国特許第5,352,670号、同第5,374,541号、および同第5,545,553号において記載される。
【０２０２】
いくつかの態様において、エンドグリコシダーゼは、グリコシルトランスフェラーゼとの組み合わせにおいて反応において使用される。酵素は、ペプチドへの修飾糖の付加の前または後のいずれかに、任意のポイントにいてぺプチド上のサッカライド構造を変更するために使用される。
【０２０３】
別の態様において、方法は、一つまたは複数のエキソ-またはエンドグリコシダーゼを使用する。グリコシダーゼは、典型的には突然変異体であり、それらを破断するよりはむしろグリコシル結合を形成するために加工される。突然変異体グリカナーゼは、典型的には、活性部位酸性アミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換を含む。例えば、エンドグリカナーゼがエンド-Hである場合、置換活性部位残基は、典型的には130位におけるAsp、132位におけるGlu、またはその組み合わせであると思われる。アミノ酸は、概して、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置換される。
【０２０４】
突然変異体酵素は、通常はエンドグリカナーゼ加水分解段階の逆反応と類似の合成段階によって、反応を触媒する。これらの態様において、グリコシルドナー分子（例えば、望ましいオリゴ-またはモノ-サッカライド構造）は、離脱基を含み、反応は、タンパク質上のGlcNAc残基へのドナー分子の付加をともなって進行する。例えば、離脱基は、フルオリドなどのハロゲンであり得る。その他の態様において、離脱基は、Asn、またはAsn-ペプチド部分である。さらにさらなる態様において、グリコシルドナー分子上のGlcNAc残基は、修飾される。例えば、GlcNAc残基は、1,2オキサゾリン部分を含み得る。
【０２０５】
好ましい態様において、本発明の複合体を産生するために使用される酵素の各々は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに温度、時間、およびpH値などの反応条件に従って変化する。あらかじめ選択された基質濃度および反応条件下での与えられた酵素に対する触媒量を決定するための手段は、当業者にとって周知である。
【０２０６】
上記のプロセスが実施される温度は、凝固のすぐ上からほとんどの感受性酵素が変性する温度までの範囲であり得る。好ましい温度範囲は、約0℃〜約55℃、より好ましくは約20℃〜約30℃である。別の例示的な態様において、本方法の一つまたは複数の構成要素は、好熱性酵素を使用して高温で実施される。
【０２０７】
反応混合物は、アクセプターがグリコシル化され、それによって望ましい複合体を形成するのに十分な時間維持される。複合体のいくつかは、通常は24時間以内に獲得される回収可能な量をともなって、数時間後にしばしば検出され得る。当業者は、反応の速度が、選択されたシステムに対して最適化される多くの様々な因子（例えば、酵素濃度、ドナー濃度、アクセプター濃度、温度、溶媒体積）に依存することを理解する。
【０２０８】
本発明は、修飾ペプチドの工業規模の産生も提供する。本明細書において使用されるように、工業規模は、概して、少なくとも1グラムの終了精製複合体を産生する。
【０２０９】
以下に続く議論において、本発明は、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを使用するグリコシル化ペプチドへの修飾シアル酸部分の結合によって例示される。例示的な修飾シアル酸は、PEGでラベルされる。PEG修飾シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に関する以下の議論の焦点は、例証の明瞭さのためであり、本発明がこれらの二つのパートナーの結合に限定されることを意味することを意図されない。さらに、その議論は、その他の水溶性ポリマー、治療的部分、および生体分子を含むPEG以外の薬剤でのグリコシルユニットの修飾に、等しく適用可能である。
【０２１０】
酵素的アプローチは、ペプチドまたは糖ペプチド上へのPEG化またはPPG化糖質の選択的導入に対して使用され得る。その方法は、PEG、PPG、またはマスク化反応性官能基を含む修飾糖を使用し、適当なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わせられる。望ましい糖質リンケージを作製すると思われるグリコシルトランスフェラーゼを選択すること、およびドナー基質として修飾糖を使用することによって、PEGまたはPPGは、ペプチド骨格上へ、糖ペプチドの既存の糖残基上へ、またはペプチドへ付加されている糖残基上へ直接的に導入され得る。
【０２１１】
シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプターは、自然発生的な構造または組換え的、酵素的、もしくは化学的にそこに置かれるもののいずれかとして、本発明の方法によって修飾されるペプチド上に存在する。適したアクセプターは、例えば、Galβ1,4GlcNAc、Galβ1,4GalNAc、Galβ1,3GalNAc、ラクト-N-テトラオース、Galβ1,3GlcNAc、Galβ1,3Ara、Galβ1,6GlcNAc、Galβ1,4Glc（ラクトース）、および当業者にとって公知のその他のアクセプターを含む（例えば、Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)を参照されたい）。
【０２１２】
一つの態様において、シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプターは、糖ペプチドのインビボ合成に際して修飾される糖ペプチド上に存在する。そのような糖ペプチドは、糖ペプチドのグリコシル化パターンの先行する修飾をともなわずに、主張される方法を使用してシアリル化され得る。または、本発明の方法は、適したアクセプターを含まないペプチドをシアリル化するために使用され得る。当業者にとって公知の方法によって、最初にアクセプターを含むようにペプチドを修飾する。例示的な態様において、GalNAc残基は、GalNAcトランスフェラーゼの作用によって付加される。
【０２１３】
例示的な態様において、ガラクトシルアクセプターは、ガラクトース残基をペプチドに連結された適当なアクセプター、例えばGlcNAcに付着させることによって組み立てられる。その方法は、修飾されるペプチドを適した量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、galβ1,3またはgalβ1,4）および適したガラクトシルドナー（例えば、UDP-ガラクトース）を含む反応混合物とインキュベートすることを含む。反応は、実質的に完了まで進行することを可能にされる、または、反応は、あらかじめ選択された量のガラクトース残基が付加される際に終了される。選択されたサッカライドアクセプターを組み立てるその他の方法は、当業者にとって明白であると思われる。
【０２１４】
さらに別の態様において、糖ペプチド連結オリゴサッカライドは、シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプターまたは一つもしくは複数の適当な残基が適したアクセプターを獲得するために付加され得る部分のいずれかを曝露するために、最初に全体的にまたは部分的に「トリミング」される。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば、米国特許第5,716,812号を参照されたい）は、付着およびトリミング反応に対して有用である。
【０２１５】
ペプチドまたはタンパク質への修飾糖の結合に対する方法は、例えば、2001年10月10日に出願された米国特許出願第60/328,523号；2002年6月7日に出願された米国特許出願第60/387,292号；2002年6月25日に出願された米国特許出願第60/391,777号；2002年8月16日に出願された米国特許出願第60/404,249号；PCT/US02/32263；2003年4月9日に出願され、2004年7月22日に公開された米国特許出願第20040142856号；2002年、2003年11月5日に出願され、2004年7月15日に公開された米国特許出願第20040137557号；2003年4月9日に出願され、2004年7月8日に公開された米国特許出願第20040132640号；2003年4月9日に出願され、2004年7月1日に公開された米国特許出願第20040126838号；2003年4月9日に出願され、2004年6月17日に公開された米国特許出願第20040115168号；2003年4月9日に出願され、2004年4月29日に公開された米国特許出願第20040082026号；2003年4月9日に出願され、2004年4月22日に公開された米国特許出願第20040077836号；2003年4月9日に出願され、2004年4月1日に公開された米国特許出願第20040063911号；および2003年4月9日に出願され、2004年3月4日に公開された米国特許出願第20040043446号において見出される。その各々は、すべての目的に対して、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１６】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、他に特に文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「核酸」に対する言及は、複数のそのような核酸を含み、「ポリペプチド」への言及は、一つまたは複数のポリペプチドおよび当業者にとって公知のその等価物などへの言及を含む。
【０２１７】
本明細書において議論される刊行物は、本出願の出願日に先行するそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないという承認として解釈されない。さらに、提供される公開の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、独立に確認される必要がある場合がある。引用は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１８】
実施例
実施例1：カンピロバクター・ジェジュニ株O:19およびO:36におけるCst-I酵素の同定
Cst-I核酸をクローニングすること。ゲノムDNAは、C. ジェジュニ株O:19からおよびC. ジェジュニ株O:36から単離された。PCRは、ストリンジェントな条件下で、プライマーCJ18FおよびCJ40Rを使用して行なわれた。核酸配列およびコードされるアミノ酸配列は、図2および3において示される。
【０２１９】
結果
Cst-I酵素をコードする核酸は、C. ジェジュニ株O:19からおよびC. ジェジュニ株O:36から単離された。両方の酵素は、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含む。
【０２２０】
実施例2：カンピロバクター・ジェジュニからのCst-I酵素の活性のある切断
切断は、タンパク質をコードする核酸の適当な欠失を作製することによって、C. ジェジュニ株OH4384からのCst-I酵素で作製された。切断型タンパク質は、MalEタンパク質との融合として発現された。トロンビン開裂部位は、切断型タンパク質の精製を容易にするために、MalEタンパク質とCst-I酵素との間に含まれた。
【０２２１】
アッセイ法
タンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）を使用して決定された。酵素アッセイ法のすべてに対して、活性の1ユニットは、分あたり1モルの産物を生成する酵素の量として定義された。FCHASE-ラベル化オリゴサッカライドは、Gilbert et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 187-194において記載されるように調製される。p-ニトロフェノール-グリコシド（p-NP-グリコシド）は、Sigma-Aldrichから獲得された。
【０２２２】
-2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性は、10μLの最終体積における1 mM Lac-FCHASE（6-(5-フルオレセイン-カルボキサミド)-ヘキサン酸スクシミジルエステル）、0.2 mM CMP-Neu5Ac、50 mM MOPS pH 7、10 mM MnCl2、および10 mM MgCl2を使用して、37℃でアッセイされた。5分後、蛍光性アクセプターをともなう反応混合物は、10 mM NaOHで希釈され、以前に記載されたような（Gilbert et al. (1997)前記）分離条件を使用して行なわれるキャピラリー電気泳動によって解析された。
【０２２３】
アクセプターの速度論的解析は、1mMにおけるCMP-Neu5Acを用いて、0.1〜10 mMの濃度におけるp-NP-グリコシドを用いて、37℃で行なわれた。ドナーCMP-Neu5Acの速度論的解析は、5 mMにおけるp-NP-ラクトースを用いて、20μM〜1000μMの濃度において行なわれた。アクセプター変換のレベルが、アクセプター速度論的アッセイ法に対して約5〜10％の間であることを確実にするために注意が払われた。
【０２２４】
ドナー速度論に対して、CMP-Neu5Acの変換の量は、反応の後に添加される10μM p-NP-グルコースの内部標準と比較して、形成された産物の量から計算された。このピークは、アクセプターおよび産物ピークから良く分解された。p-NP-グリコシドとの反応は、2％SDS、20 mM EDTAの等体積の添加によって停止され、3分間75℃に加熱され、次いで、水で1:1（または10 mM濃度に対して最大で1:10）に希釈された。次いで、試料は、260 nmと300 nmとの間を走査するダイオードアレイ検出器を使用してCEによって解析され、ピークは290 nmにおいて検出された。エレクトロフェログラムからのピークは、P/ACE Station（商標）ソフトウェアを用いて、手動のピーク積分を使用して解析された。酵素活性の迅速な検出に対して、トランスフェラーゼ反応混合物からの試料は、Gilbert et al. (1996)前記において記載されるように、シリカ-60 TLCプレート（E. Merck）上の薄層クロマトグラフィーによって検査された。
【０２２５】
結果
完全長430アミノ酸タンパク質のアミノ酸1〜285を含む株OH4384からのCst-I切断（Cst-95）は、活性を保有した。株O:19からのCst-Iタンパク質の最初の285アミノ酸は、OH4384タンパク質のアミノ酸残基1〜285と同一である。株O:36からのCst-Iタンパク質は、二つの残基（すなわち、99および283）においてOH4384株と異なる。Cst-95タンパク質は、バクテリア培地のリットルあたり約500ユニットの収率で、大腸菌において発現された。
【０２２６】
実施例3：カンピロバクター・ジェジュニ株O:19およびO:36におけるCst-I酵素の活性
C. ジェジュニ株O:19からおよびC. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質の発現
C. ジェジュニ株O:19からおよびC. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質をコードする核酸は、大腸菌における発現に対する発現ベクターへクローニングされた。大腸菌は、発現ベクターで形質転換され、シアリルトランスフェラーゼタンパク質を発現するのに適した条件下で増殖させられ、採取され、溶解された。Cst-I発現産物を含む溶解物は、上に記載されるようにシアリルトランスフェラーゼ活性に対してアッセイされ、C. ジェジュニ株O:19からおよびC. ジェジュニ株O:36からのCst-Iタンパク質の両方は、CMP-Neu5AcからアクセプターへのNeu5Acの転移を触媒する。O:19およびO:36活性は、Cst-I OH4384からのタンパク質の活性と比較された。以下の値が獲得された：Cst-I OH4384、346.2 mU/ml；Cst-I O:19、324.9 mU/ml；およびCst-I O:36、50.3 mU/ml。
【０２２７】
上記の発明は、理解の明瞭性の目的のために例証および例によって詳しく記載されているが、本発明の開示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および改変がそれになされ得ることが、当業者にとって容易に明白であると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】公知のシアリルトランスフェラーゼおよび二つのこれまで未知のシアリルトランスフェラーゼ（Cst-I O:19およびCst-I O:36）のアラインメントを提供し、アミノ酸モチーフAおよびアミノ酸モチーフBの保存された性質を実証する。18のタンパク質配列のアラインメントは、CLUSTAL-Wを使用して行なわれた。*は、すべての18配列において保存されている残基を示す。モチーフAおよびBにおける残基は、下線を引かれ、かつ太字である。モチーフAの最後の残基が、パスツレラ・ムルトシダからのPM1174以外のすべての配列において保存されていることに注目されたい。残基1〜300は、Cst-I OH4384、Cst-I O:19、およびCst-I O:36に対して含まれ；付加的なC-末端残基は省略された。その他の配列は、完全長である。アラインメントに基づくコンセンサス配列（Prim. cons.）は、下の行において示される。
【図２】カンピロバクター・ジェジュニ株O:36からのCst-Iに対する核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図３】カンピロバクター・ジェジュニ株O:19からのCst-Iに対する核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図４】CD：pfam06002.2、CST-I、保存されたデータベースドメインに由来するシアリルトランスフェラーゼタンパク質のコンセンサス配列を提供する。
【図５】本発明のシアリルトランスフェラーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ86-028NPからのlic3A核酸およびタンパク質に対する核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図６】本発明のシアリルトランスフェラーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ86-028NPからのlic3A2核酸およびタンパク質に対する核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【図１−１】
2008512993.tif 000039
【図１−２】
2008512993.tif 000040
【図２】
2008512993.tif 000041
【図３】
2008512993.tif 000042
【図４】
2008512993.tif 000043
【図５】
2008512993.tif 000044
【図６】
2008512993.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月17日(2006.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本発明の組換えタンパク質は、タンパク質の精製または同定を容易にする分子「精製タグ」を一端にともなう融合タンパク質として構築かつ発現され得る。そのようなタグは、グリコシル化反応の間に対象となるタンパク質の固定化に対して使用されてもよい。適したタグは、抗体によって特異的に認識されるタンパク質配列である「エピトープタグ」を含む。エピトープタグは、概して、融合タンパク質を明確に（unambiguously）検出または単離するために容易に使用できる抗体の使用を可能にするために融合タンパク質に組み込まれる。「FLAGタグ」は、配列AspTyrLysAspAspAspAspLys（配列番号：33）またはその実質的に同一の変異体からなるモノクローナル抗FLAG抗体によって特異的に認識される、一般的に使用されるエピトープタグである。その他の適したタグは、当業者にとって公知であり、例えば、ニッケルもしくはコバルトイオンなどの金属イオンまたはmycタグに結合すると思われる、ヘキサヒスチジンペプチドなどの親和性タグを含む。精製タグを含むタンパク質は、精製タグに結合する結合パートナー、例えば精製タグに対する抗体、ニッケルもしくはコバルトイオン、または樹脂、およびアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンなどを使用して精製され得る。精製タグは、マルトース結合ドメインおよびスターチ結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者にとって公知である。スターチ結合ドメインは、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/15636号において記載される。ベータシクロデキストリン（BCD）-誘導体化樹脂を使用するスターチ結合ドメインを含む融合タンパク質の親和性精製は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2003年5月5日に出願された米国特許出願第60/468,374号において記載される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
III. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチド
本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、二つのモチーフを含む：シアリルトランスフェラーゼモチーフA、
2008512993.tif 000046
、およびその配列の保存的に修飾された変異体、ならびにシアリルトランスフェラーゼモチーフB
2008512993.tif 000047
、およびその配列の保存的に修飾された変異体。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフA DVFRCNQFYFED（配列番号：3）またはDVFRCNQFYFEE（配列番号：4）、およびシアリルトランスフェラーゼモチーフB
2008512993.tif 000048
のいずれかを含む。本発明のシアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質からアクセプター基質へのシアル酸部分の転移を触媒する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
V. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の単離
保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸は、上に記載されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、すなわち、シアリルトランスフェラーゼモチーフA、
2008512993.tif 000049
、およびその配列の保存的に修飾された変異体、ならびにシアリルトランスフェラーゼモチーフB、
2008512993.tif 000050
、およびその配列の保存的に修飾された変異体を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフA DVFRCNQFYFED（配列番号：3）またはDVFRCNQFYFEE（配列番号：4）、およびシアリルトランスフェラーゼモチーフB
2008512993.tif 000051
のいずれかを含む。本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、ドナー基質からアクセプター基質へのシアル酸部分の転移を触媒する。コードされるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、コンセンサスアミノ酸残基Y192、Y199、H226、N44、N86、Q93、D190、F191、S198、F215、またはY222に対応する、構造解析によって同定されるアミノ酸残基を含んでもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードするいくつかの核酸は、例えばCst-I（例えば、米国特許第6,689,604号を参照されたい）；Cst-II（例えば、米国特許第6,503,744号を参照されたい）；およびCst-IIIなどの、以前に同定されたシアリルトランスフェラーゼタンパク質の配列に基づくPCRプライマーを使用して増幅され得る。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を増幅するために使用され得るPCRプライマーの例は、以下のプライマーペアを含む。
Cst-I核酸（配列番号：34および35）に対して：
2008512993.tif 000052
【００９２】
いくつかのバクテリアにおいて、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸は、例えばC. ジェジュニのLOS座などの特定の染色体座を増殖し、次いで典型的にはその座で見出されるシアリルトランスフェラーゼを同定することによって、単離され得る（例えば、米国特許第6,503,744号を参照されたい）。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を含むLOS座を増幅するために使用され得るPCRプライマーの例は、以下のプライマーペア（配列番号：40および41）を含む。
CJ42: ヘプトシルターゼ（heptosylTase）-IIにおけるプライマー
2008512993.tif 000053
CJ43: ヘプトシルターゼ-Iにおけるプライマー
2008512993.tif 000054
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を容易にするために、タンパク質をコードする核酸は、エピトープまたは親和性結合試薬が使用できる「タグ」、すなわち精製タグに対するコード配列を含んでもよい。適したエピトープの例は、mycおよびV-5レポーター遺伝子を含み；これらのエピトープを有する融合タンパク質の組換え産生に対して有用な発現ベクターは、市販されている（例えば、Invitrogen (Carlsbad CA)ベクター pcDNA3.1/Myc-HisおよびpcDNA3.1/V5-Hisは、哺乳類細胞における発現に適している）。本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBタンパク質を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドにタグを付着させるのに適した付加的な発現ベクター、および対応する検出システムは、当業者にとって公知であり、いくつかが市販されている（例えば、FLAG'' (Kodak, Rochester NY)）。適したタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合することが可能なポリヒスチジン配列である。典型的には、6つの隣接ヒスチジン（配列番号：42）が使用されるが、6よりも多いまたは少ないものが使用できる。ポリヒスチジンタグに対する結合部分としての役目をし得る適した金属キレート親和性リガンドは、ニトリロ三酢酸（NTA）を含む（Hochuli, E. (1990) 「Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents」 Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; Qiagen (Santa Clarita, CA)から市販されている）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
【図１】公知のシアリルトランスフェラーゼおよび二つのこれまで未知のシアリルトランスフェラーゼ（Cst-I O:19およびCst-I O:36）のアラインメントを提供し、アミノ酸モチーフAおよびアミノ酸モチーフBの保存された性質を実証する。18のタンパク質配列（配列番号：14〜31）のアラインメントは、CLUSTAL-Wを使用して行なわれた。*は、すべての18配列において保存されている残基を示す。モチーフAおよびBにおける残基は、下線を引かれ、かつ太字である。モチーフAの最後の残基が、パスツレラ・ムルトシダからのPM1174以外のすべての配列において保存されていることに注目されたい。残基1〜300は、Cst-I OH4384、Cst-I O:19、およびCst-I O:36に対して含まれ；付加的なC-末端残基は省略された。その他の配列は、完全長である。アラインメントに基づくコンセンサス配列（Prim. cons.；配列番号：32）は、下の行において示される。
【図２】カンピロバクター・ジェジュニ株O:36からのCst-Iに対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：5および6）を提供する。
【図３】カンピロバクター・ジェジュニ株O:19からのCst-Iに対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：7および8）を提供する。
【図４】CD：pfam06002.2、CST-I（配列番号：13）、保存されたデータベースドメインに由来するシアリルトランスフェラーゼタンパク質のコンセンサス配列を提供する。
【図５】本発明のシアリルトランスフェラーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ86-028NPからのlic3A核酸およびタンパク質に対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：9および10）を提供する。
【図６】本発明のシアリルトランスフェラーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ86-028NPからのlic3A2核酸およびタンパク質に対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：11および12）を提供する。
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月22日(2007.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008512993000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月27日(2007.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本発明の組換えタンパク質は、タンパク質の精製または同定を容易にする分子「精製タグ」を一端にともなう融合タンパク質として構築かつ発現され得る。そのようなタグは、グリコシル化反応の間に対象となるタンパク質の固定化に対して使用されてもよい。適したタグは、抗体によって特異的に認識されるタンパク質配列である「エピトープタグ」を含む。エピトープタグは、概して、融合タンパク質を明確に（unambiguously）検出または単離するために容易に使用できる抗体の使用を可能にするために融合タンパク質に組み込まれる。「FLAGタグ」は、配列AspTyrLysAspAspAspAspLys（配列番号：33）またはその実質的に同一の変異体からなるモノクローナル抗FLAG抗体によって特異的に認識される、一般的に使用されるエピトープタグである。その他の適したタグは、当業者にとって公知であり、例えば、ニッケルもしくはコバルトイオンなどの金属イオンまたはmycタグに結合すると思われる、ヘキサヒスチジンペプチドなどの親和性タグを含む。精製タグを含むタンパク質は、精製タグに結合する結合パートナー、例えば精製タグに対する抗体、ニッケルもしくはコバルトイオン、または樹脂、およびアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンなどを使用して精製され得る。精製タグは、マルトース結合ドメインおよびスターチ結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者にとって公知である。スターチ結合ドメインは、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/15636号において記載される。ベータシクロデキストリン（BCD）-誘導体化樹脂を使用するスターチ結合ドメインを含む融合タンパク質の親和性精製は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2003年5月5日に出願された米国特許出願第60/468,374号において記載される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
III. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチド
本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、二つのモチーフを含む：シアリルトランスフェラーゼモチーフA、
2008512993.tif 000055
、およびその配列の保存的に修飾された変異体、ならびにシアリルトランスフェラーゼモチーフB
2008512993.tif 000056
、およびその配列の保存的に修飾された変異体。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフA
2008512993.tif 000057
、およびシアリルトランスフェラーゼモチーフB
2008512993.tif 000058
のいずれかを含む。本発明のシアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質からアクセプター基質へのシアル酸部分の転移を触媒する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
V. 保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の単離
保存された配列モチーフを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸は、上に記載されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、すなわち、シアリルトランスフェラーゼモチーフA、
2008512993.tif 000059
、およびその配列の保存的に修飾された変異体、ならびにシアリルトランスフェラーゼモチーフB、
2008512993.tif 000060
、およびその配列の保存的に修飾された変異体を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフA
2008512993.tif 000061
、およびシアリルトランスフェラーゼモチーフB
2008512993.tif 000062
のいずれかを含む。本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、ドナー基質からアクセプター基質へのシアル酸部分の転移を触媒する。コードされるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、コンセンサスアミノ酸残基Y192、Y199、H226、N44、N86、Q93、D190、F191、S198、F215、またはY222に対応する、構造解析によって同定されるアミノ酸残基を含んでもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むバクテリアシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードするいくつかの核酸は、例えばCst-I（例えば、米国特許第6,689,604号を参照されたい）；Cst-II（例えば、米国特許第6,503,744号を参照されたい）；およびCst-IIIなどの、以前に同定されたシアリルトランスフェラーゼタンパク質の配列に基づくPCRプライマーを使用して増幅され得る。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を増幅するために使用され得るPCRプライマーの例は、以下のプライマーペアを含む。
Cst-I核酸に対して（配列番号：34および配列番号：35）：
2008512993.tif 000063
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
いくつかのバクテリアにおいて、シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸は、例えばC. ジェジュニのLOS座などの特定の染色体座を増殖し、次いで典型的にはその座で見出されるシアリルトランスフェラーゼを同定することによって、単離され得る（例えば、米国特許第6,503,744号を参照されたい）。シアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を含むLOS座を増幅するために使用され得るPCRプライマーの例は、以下のプライマーペア（配列番号：40および配列番号：41）を含む。
CJ42: ヘプトシルターゼ（heptosylTase）-IIにおけるプライマー
2008512993.tif 000064
CJ43: ヘプトシルターゼ-Iにおけるプライマー
2008512993.tif 000065
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBを含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を容易にするために、タンパク質をコードする核酸は、エピトープまたは親和性結合試薬が使用できる「タグ」、すなわち精製タグに対するコード配列を含んでもよい。適したエピトープの例は、mycおよびV-5レポーター遺伝子を含み；これらのエピトープを有する融合タンパク質の組換え産生に対して有用な発現ベクターは、市販されている（例えば、Invitrogen (Carlsbad CA)ベクター pcDNA3.1/Myc-HisおよびpcDNA3.1/V5-Hisは、哺乳類細胞における発現に適している）。本発明のシアリルトランスフェラーゼモチーフAおよびBタンパク質を含むシアリルトランスフェラーゼポリペプチドにタグを付着させるのに適した付加的な発現ベクター、および対応する検出システムは、当業者にとって公知であり、いくつかが市販されている（例えば、FLAG'' (Kodak, Rochester NY)）。適したタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合することが可能なポリヒスチジン配列である。典型的には、6つの隣接ヒスチジン（配列番号：42）が使用されるが、6よりも多いまたは少ないものが使用できる。ポリヒスチジンタグに対する結合部分としての役目をし得る適した金属キレート親和性リガンドは、ニトリロ三酢酸（NTA）を含む（Hochuli, E. (1990) 「Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents」 Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; Qiagen (Santa Clarita, CA)から市販されている）。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】公知のシアリルトランスフェラーゼおよび二つのこれまで未知のシアリルトランスフェラーゼ（Cst-I O:19およびCst-I O:36）のアラインメントを提供し、アミノ酸モチーフAおよびアミノ酸モチーフBの保存された性質を実証する。18のタンパク質配列（配列番号：14〜31）のアラインメントは、CLUSTAL-Wを使用して行なわれた。*は、すべての18配列において保存されている残基を示す。モチーフAおよびBにおける残基は、下線を引かれ、かつ太字である。モチーフAの最後の残基が、パスツレラ・ムルトシダからのPM1174以外のすべての配列において保存されていることに注目されたい。残基1〜300は、Cst-I OH4384、Cst-I O:19、およびCst-I O:36に対して含まれ；付加的なC-末端残基は省略された。その他の配列は、完全長である。アラインメントに基づくコンセンサス配列（Prim. cons.；配列番号：32）は、下の行において示される。
【図２】カンピロバクター・ジェジュニ株O:36からのCst-Iに対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：5および配列番号：6）を提供する。
【図３】カンピロバクター・ジェジュニ株O:19からのCst-Iに対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：7および配列番号：8）を提供する。
【図４】CD：pfam06002.2、CST-I（配列番号：13）を、保存されたデータベースドメインに由来するシアリルトランスフェラーゼタンパク質のコンセンサス配列提供する。
【図５】本発明のシアリルトランスフェラーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ86-028NPからのlic3A核酸およびタンパク質に対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：9および配列番号：10）を提供する。
【図６】本発明のシアリルトランスフェラーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザ86-028NPからのlic3A2核酸およびタンパク質に対する核酸配列およびアミノ酸配列（配列番号：11および配列番号：12）を提供する。
【国際調査報告】
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