(57)【要約】切断特異性が改変されたI-CreIメガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、該方法により得ることができる変異型、及び新規なDNA標的を切断するため、又は非治療目的での遺伝子工学及びゲノム工学のためのそれらの適用。該変異系をコードする核酸、該核酸を含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞若しくは生物、植物又はヒトを除く動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) I-CreI pdbアクセッションコード1g9yに関してQ44、R68及び／又はR70のアミノ酸を、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T及びYからなる群より選択されるアミノ酸で置換し、
(b) 二本鎖DNA標的の位置−5〜−3に関して以下のR3トリプレットの少なくとも1つを切断するプロフィールを有する工程(a)で得られたI-CreIメガヌクレアーゼ変異型を選択し、ここで前記位置−5〜−3は、以下の式I：
5'- R1CAAAR2R3R4R'4R'3R'2TTTGR'1 -3'
（式中：
R1は存在するか又はせず、存在する場合は、ランダム核酸配列又は位置−20〜−12 (5'から3'に)に位置するI-CreIメガヌクレアーゼホーミング部位のフラグメントのいずれかに相当する1〜9ヌクレオチドを含む核酸フラグメントを表し、R1は前記ホーミング部位の少なくとも位置−12に相当し、
R2は、核酸ダブレットac又はctを表し、前記ホーミング部位の位置−7〜−6に相当し、
R3は、前記位置−5〜−3に相当し、g、t、c及びaから選択される核酸トリプレットを表すが、以下のトリプレットではない：gtc、gcc、gtg、gtt及びgct、
R4は、核酸ダブレットgt又はtcを表し、前記ホーミング部位の位置−2〜−1に相当し、
R'1は存在するか又はせず、存在する場合は、ランダム核酸配列又は位置＋12〜＋20 (5'から3'に)に位置するI-CreIメガヌクレアーゼホーミング部位のフラグメントのいずれかに相当する1〜9ヌクレオチドを含む核酸フラグメントを表し、R'1は前記ホーミング部位の少なくとも位置＋12に相当し、
R'2は、核酸ダブレット ag又はgtを表し、前記ホーミング部位の位置＋6〜＋7に相当し、
R'3は、前記位置＋3〜＋5に相当し、g、t、c及びaから選択される核酸トリプレットを表し、R'3は、R3及びR'3が非パリンドロームの場合にgac、ggc、cac、aac及びagcとは異なり、
R'4は、核酸ダブレットga又はacを表し、前記ホーミング部位の位置＋1〜＋2に相当する）
のR3に対応する
ことを含む、切断特異性が改変されたI-CreIメガヌクレアーゼ変異型を作製する方法。
【請求項２】
前記核酸トリプレットR3が、好ましくは以下のトリプレット：ggg、gga、ggt、ggc、gag、gaa、gat、gac、gta、gcg、gca、tgg、tga、tgt、tgc、tag、taa、tat、tac、ttg、tta、ttt、ttc、tcg、tca、tct、tcc、agg、aga、agt、agc、aag、aaa、aat、aac、atg、ata、att、atc、acg、aca、act、acc、cgg、cga、cgt、cgc、cag、caa、cat、cac、ctg、cta、ctt、ctc、ccg、cca、cct及びcccから、より好ましくは以下のトリプレット：ggg、ggt、ggc、gag、gat、gac、gta、gcg、gca、tag、taa、tat、tac、ttg、ttt、ttc、tcg、tct、tcc、agg、aag、aat、aac、att、atc、act、acc、cag、cat、cac、ctt、ctc、ccg、cct及びcccから選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程(b)で得られるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型が、
【化１−１】
2008535484.tif 000013
【化１−２】
2008535484.tif 000014
からなる群より選択されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型を選択する工程(b)が、酵母細胞においてインビボで行われることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも位置＋／−8〜11の配列がパリンドロームであり、位置−5〜−3の核酸トリプレット及び／又は位置＋3〜＋5の核酸トリプレットが、それぞれ、gtc、gcc、gtg、gtt及びgct、並びにgac、ggc、cac、aac及びagcとは異なる、20〜24 bpの部分的パリンドローム配列を少なくとも含む二本鎖核酸標的を切断するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法により得ることができるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型のインビトロ又は非治療目的のためのインビボにおける使用。
【請求項６】
前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型が、
【化２−１】
2008535484.tif 000015
【化２−２】
2008535484.tif 000016
からなる群より選択されることを特徴とする請求項5に記載の使用。
【請求項７】
前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型がホモダイマーであることを特徴とする請求項5又は6に記載の使用。
【請求項８】
前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型がヘテロダイマーであることを特徴とする請求項5又は6に記載の使用。
【請求項９】
前記DNA標的の位置＋／−3〜5の配列がパリンドロームであることを特徴とする請求項5〜8のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１０】
前記DNA標的の位置＋／−3〜5の配列が非パリンドロームであることを特徴とする請求項5〜8のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１１】
位置−11〜−8、及び＋8〜＋11の前記パリンドローム配列が、それぞれcaaa及びtttgであることを特徴とする請求項5〜10のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１２】
前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型が、位置75に変異をさらに含むことを特徴とする請求項5〜11のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１３】
前記変異がD75N又はD75Vであることを特徴とする請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型が、ヌクレオチドaを位置−4に、及び／又はtを位置＋4に含むDNA標的を切断するために、位置44にアラニン(A)又はアスパラギン(N)を有することを特徴とする請求項5〜13のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１５】
前記メガヌクレアーゼ変異型が、ヌクレオチドcを位置−4に、及び／又はgを位置＋4に含む標的を切断するために、位置44にリジン(K)を有する請求項5〜13のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１６】
前記メガヌクレアーゼ変異型が、ヌクレオチドtを位置−4に、及び／又はaを位置＋4に有する標的を切断するために、位置44にグルタミン(Q)を有する請求項6〜13のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１７】
請求項1〜4のいずれか1項に記載の作製方法により得ることができる、
【化３−１】
2008535484.tif 000017
【化３−２】
2008535484.tif 000018
からなる群より選択されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項１８】
位置44にアラニン(A)又はアスパラギン(N)を有し、かつヌクレオチドaを位置−4に、及び／又はtを位置＋4に含む標的を切断する、請求項17に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項１９】
位置44にリジン(K)を有し、かつヌクレオチドcを位置−4に、及び／又はgを位置＋4に含む標的を切断する、請求項17に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項２０】
ヌクレオチドtを位置−4に、及び／又はaを位置＋4に含む標的を切断するために、位置44にグルタミン(Q)を有する請求項17に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項２１】
ホモダイマーである請求項17〜20のいずれか1項に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項２２】
2つのモノマーからなるホモダイマーであり、各モノマーが請求項17〜20のいずれか1項で定義される異なる変異型に由来する請求項17〜20のいずれか1項に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項２３】
請求項17〜22のいずれか1項に記載されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項23に記載のポリヌクレオチドと調節配列とを含む発現カセット。
【請求項２５】
請求項24に記載の発現カセットを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２６】
ターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項25に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
前記ターゲティングDNA構築物が、請求項17〜22のいずれか1項に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の切断部位を取り囲む領域とホモロジーを共有する配列を含むことを特徴とする請求項26に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
前記ターゲティングDNA構築物が：
a) 請求項17〜22のいずれか1項に記載の変異型の切断部位を取り囲む領域とホモロジーを共有する配列と、
b) a)の配列に接して導入される配列と
を含むことを特徴とする請求項27に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターにより改変されたことを特徴とする細胞。
【請求項３０】
請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターを含むことを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項３１】
請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターを含むことを特徴とする非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３２】
分子生物学、インビボ又はインビトロの遺伝子工学及びインビボ又はインビトロのゲノム工学のための、請求項17〜22のいずれか1項に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、請求項23に記載のポリヌクレオチド、請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクター、請求項29に記載の細胞、請求項30に記載のトランスジェニック植物、請求項31に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の使用。
【請求項３３】
DNA標的配列を含む興味のある部位に二本鎖核酸破断を誘発することによりDNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘発するための請求項32に記載の使用。
【請求項３４】
前記二本鎖核酸破断が、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、機能的遺伝子を変異遺伝子の代わりに復帰させるため、興味のある内因性遺伝子を減弱又は活性化するため、興味のある部位に変異を導入するため、外因性遺伝子又はその一部分を導入するため、内因性遺伝子又はその一部分を不活性化又は削除するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを対形成させずにおいて分解させるためであることを特徴とする請求項32又は33に記載の使用。
【請求項３５】
前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、請求項26で定義されるターゲティングDNA構築物を伴うことを特徴とする請求項32〜34のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３６】
請求項17〜22のいずれか1項に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型のDNA標的を含むベクター上に位置する興味のある部位に、該ベクターを前記で定義されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型と接触させることにより二本鎖核酸破断を行い、それにより前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型の切断部位を取り囲む配列とホモロジーを示す別のベクターとの相同的組換えを誘発する工程を含むことを特徴とする遺伝子工学の方法。
【請求項３７】
以下の工程：
1) 請求項17〜22のいずれか1項に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の少なくとも1つの認識及び切断部位を含むゲノム遺伝子座に、前記切断部位を前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型と接触させることにより二本鎖破断を行い；
2) 前記破断されたゲノム遺伝子座を、標的遺伝子座とホモロジーを共有する配列で挟まれた該遺伝子座に導入される配列を含むターゲティングDNA構築物との相同的組換えに適切な条件下に維持する
を含むことを特徴とするゲノム工学の方法。
【請求項３８】
以下の工程：
1) 請求項17〜22のいずれか1項に記載のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の少なくとも1つの認識及び切断部位を含むゲノム遺伝子座に、前記切断部位を前記I-CreIメガヌクレアーゼ変異型と接触させることにより二本鎖破断を行い；
2) 前記破断されたゲノム遺伝子座を、切断部位を取り囲む領域とホモロジーを共有する染色体DNAとの相同的組換えに適切な条件下に維持する
を含むことを特徴とするゲノム工学の方法。
【請求項３９】
請求項17〜22のいずれか1項に記載の少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターを含むことを特徴とする組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、標的される遺伝子座とホモロジーを共有する配列で挟まれた興味のある部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項39に記載の組成物。
【請求項４１】
個体にいずれの手段により投与される、必要とする個体において遺伝病を予防、改善又は治癒するための医薬を製造するための、請求項17〜22のいずれか1項に記載の少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターの使用。
【請求項４２】
個体にいずれの手段により投与される、必要とする個体においてDNA中間体を示す感染性因子を原因とする疾患を予防、改善又は治癒するための医薬を製造するための、請求項17〜22のいずれか1項に記載の少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターの使用。
【請求項４３】
生物由来製品、又は生物学的使用若しくは物体の消毒を意図する製品において、インビトロで、DNA中間体を示す感染性因子の伝播を阻害するか、該感染性因子を不活性化するか又は削除するための、請求項17〜22のいずれか1項に記載の少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項25〜28のいずれか1項に記載のベクターの使用。
【請求項４４】
前記感染性因子がウイルスである請求項41〜43のいずれか1項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、切断特異性（cleavage specificity）が改変されたI-CreIメガヌクレアーゼ変異型を作製する方法に関する。本発明は、該方法により得ることができるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、及び新しいDNA標的を切断するため又は非治療目的での遺伝子工学及びゲノム工学のためのその使用にも関する。
本発明は、上記の変異型をコードする核酸、該核酸を含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、該ベクターにより形質転換された細胞又は生物、植物又はヒト以外の動物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
メガヌクレアーゼは、大きい(＞12bp；通常、14〜40 bp)DNA切断部位を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Thierry及びDujon, 1992)。野生では（In the wild）、メガヌクレアーゼは、可動の遺伝的要素、例えばインテイン及びクラスIイントロンにより一般的にコードされるホーミングエンドヌクレアーゼにより本質的に代表される(Belfort及びRoberts, 1997; Chevalier及びStoddard, 2001)。ホーミングとは、メガヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性により開始される、DNA二本鎖破断（double-strand break）(DSB)修復に依拠するこれらの要素の可動化のことである。HO (Haber, 1998; Klarら, 1984; Kostrikenら, 1983)、I-SceI (Colleauxら, 1988; Jacquier及びDujon, 1985; Perrinら, 1993; Plessisら, 1992)、及びI-TevI (Bell-Pedersenら, 1990; Bell-Pedersenら, 1989; Bell-Pedersenら, 1991; Muellerら, 1996)のタンパク質についての初期の研究により、ホーミングプロセスの生物学が説明されている。一方、これらの研究は、生細胞におけるDSB修復の研究についての典型も提供している。
【０００３】
ホーミングエンドヌクレアーゼ標的配列の通常の非対称は、ほとんどの制限酵素認識部位に特徴的な2回回転対称とは対照的である。イントロンORF又はインテインによりコードされるいくつかのホーミングエンドヌクレアーゼは、それらのそれぞれの遺伝的要素の、対立遺伝子のイントロンレス又はインテインレスの部位へのホーミングを促進することが示されている。イントロンレス又はインテインレスの対立遺伝子の中に部位特異的二本鎖破断をつくることにより、これらのヌクレアーゼは組換え生成末端(recombinogenic end)を創り、これがコーディング配列を重複させ、DNAレベルでイントロン又は介在配列の挿入に導く遺伝子変換プロセスに携わる。
【０００４】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、非常によく保存されたアミノ酸モチーフを基に、4つの別々のファミリーに分類される[概説として、Chevalier及びStoddard (Nucleic Acids Research, 2001, 29, 3757〜3774)を参照]。それらの1つはドデカペプチドファミリー(ドデカマー、DOD、D1-D2、LAGLI-DADG、P1-P2)である。これは、それらの最も一般的に保存された配列モチーフ：12残基の配列の1又は2のコピー(非常に大多数)：ドデカペプチドにより集められたタンパク質の最大のファミリーである。1つのドデカペプチドをもつホーミングエンドヌクレアーゼ(D)は分子質量が約20 kDaであり、ホモダイマーとして作用する。2つのコピーを有するもの(DD)は、25 kDa (230アミノ酸)〜50 kDa (HO、545アミノ酸)の範囲で、各モチーフの間に70〜150残基を有し、モノマーとして作用する。切断は認識部位の内部であり、3'OHの突出をもつ4 ntのジグザグの(staggered)カットを残す。LAGLIDADGモチーフの単一コピーを含む酵素、例えばI-CeuI及びI-CreIはホモダイマーとして作用し、ほぼパリンドロームのホーミング部位を認識する。
【０００５】
ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI(pdbアクセッションコード1g9y)の配列及び構造が決定され(Rochaix JDら, NAR, 1985, 13, 975-984; Heath PJら, Nat. Struct. Biol., 1997, 4, 468-476; Wangら, NAR, 1997, 25, 3767-3776; Juricaら Mol. Cell, 1998, 2, 469-476)、X線結晶学を用いた構造モデルが作り出されている(Heathら, 1997)。
【０００６】
I-CreIは、163アミノ酸を含み(pdbアクセッションコード1g9y)、該エンドヌクレアーゼはダイマーとして切断する。LAGLIDADGモチーフは、残基13〜21に相当する。LAGLIDADGα-ヘリックスのいずれかの端では、4つのβシート(位置21〜29; 37〜48; 66-70及び73-78)が、タンパク質と標的DNA配列のハーフサイト（half site）との相互作用を駆動するDNA結合界面を提供する。二量体化界面は、2つのLAGLIDADGヘリックスとその他の残基とを含む。
【０００７】
I-CreIにより認識され切断されるホーミング部位は、長さ22〜24 bpであり、縮重パリンドローム（degenerate palindrome）である(Jurica MSら, 1998の図2及び配列番号65を参照)。より正確には、上記のI-CreIのホーミング部位は、セミパリンドロームの22 bpの配列であり、各ハーフサイトにおいて11 bpのうち7が同一である(Seligman LMら, NAR, 2002, 30, 3870-3879)。
【０００８】
エンドヌクレアーゼ-DNA界面についても記載されており(Jurica MSら, 1998の図4を参照)、特異的タンパク質-DNA接触に関するいくつかの予測を導いている(Seligman LMら, Genetics, 1997, 147, 1653-1664; Jurica MSら, 1998; Chevalier B.ら, Biochemistry, 2004, 43, 14015-14026)。
【０００９】
上記の文献から、次のことが明らかになる：
- 残基G19、D20、Q47、R51、K98及びD137は、I-CreIのエンドヌクレオ分解部位（endonucleolytic site）の一部分である；
- ホーミング部位の配列は、0.2 nMの最大結合親和性を得るために少なくとも20 bpなければならない；
- 配列特異的接触は、ホーミング部位の長さ全体にわたって分布している；
- 塩基対置換は、ホーミング部位での結合又は切断を深刻に破壊することなく、多くの異なるホーミング部位の位置で許容され得る；
- R51及びK98は、酵素活性部位に位置し、切断反応においてルイス酸として作用するか、又はプロトンドナーを活性化する候補であり；これらの残基のそれぞれにおける変異は、I-CreIエンドヌクレオ分解活性を明確に低減させることが観察されている(R51G、K98Q)；
- 変異されたときにI-CreIエンドヌクレアーゼ活性をなくす5つのさらなる残基が、酵素活性部位の中又はその近くに位置する(R70A、L39R、L91R、D75G、Q47H)。
【００１０】
これらの研究は、ゲノム工学のためのメガヌクレアーゼの一般的な使用に道を開く。相同遺伝子ターゲティングは、生細胞での染色体遺伝子座を安定的に改変するための最も正確な方法であるが、その低い効率が主な問題点として残っている。メガヌクレアーゼ誘発DSBが、10000倍まで相同的組換えを刺激するので、メガヌクレアーゼは、今日、哺乳動物細胞における遺伝子ターゲティングの効率を改善し(Choulikaら, 1995; Cohen-Tannoudjiら, 1998; Donohoら, 1998; Elliottら, 1998; Rouetら, 1994)、かつ植物(Puchtaら, 1993; Puchtaら, 1996)及び昆虫(Rong及びGolic, 2000; Rong及びGolic, 2001; Rongら, 2002)のような生物において実行可能な効率にするための最良の手段である。
【００１１】
メガヌクレアーゼは、種々の相同的組換え事象、例えば哺乳動物細胞(Liangら, 1998)、植物(Siebert及びPuchta, 2002)、昆虫(Rongら, 2002)及び細菌(Posfaiら, 1999)における直列反復組換え、又は染色体間組換え(Moynahan及びJasin, 1997; Puchta, 1999; Richardsonら, 1998)を誘導するのに用いられている。
しかし、この技術は、メガヌクレアーゼの可能性のある天然の標的部位の数が少ないことにより、いまだに制限される：数百の天然のホーミングエンドヌクレアーゼが同定されているが(Belfort及びRoberts, 1997; Chevalier and Stoddard, 2001)、興味のある遺伝子を切断する天然のメガヌクレアーゼを得る可能性は、非常に低い。特定の目的のための特異性を有する人工のメガヌクレアーゼをつくることが、この制限を回避するであろう。
【００１２】
新規な特異性を有する人工のエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼドメインをジンクフィンガーDNA結合ドメインに融合させることに基づいてつくられている(Bibikovaら, 2003; Bibikovaら, 2001; Bibikovaら, 2002; Porteus及びBaltimore, 2003)。
【００１３】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、異なるタンパク質ドメインの融合(Chevalierら, 2002; Epinatら, 2003)、又は単独の特定のアミノ酸残基の変異(Seligmanら, 1997, 2002; Sussmanら, 2004; 国際PCT出願WO 2004／067736)のいずれかにより新規なエンドヌクレアーゼを作るための骨格としても用いられている。
【００１４】
国際PCT出願WO 2004／067736は、最初のメガヌクレアーゼ由来のカスタムメイドメガヌクレアーゼを作製する一般的な方法について記載し、該メガヌクレアーゼ変異型は、最初のメガヌクレアーゼの認識及び切断部位（recognition and cleavage site）とは異なるDNA標的配列を切断できる。この一般的な方法は、DNA標的配列に接触するか又は該DNA標的に直接若しくは間接的に相互作用する位置で変異を有するメガヌクレアーゼ変異型のライブラリーを調製し、DNA標的配列を切断できる変異型を選択する工程を含む。最初のメガヌクレアーゼがI-CreI N75タンパク質である場合、残基44、68及び70が変異されたライブラリーを構築し、I-CreIの天然の標的部位に近い6つの一連の標的に対してスクリーニングする。スクリーニングされた変異体は、I-CreI N75骨格タンパク質に比べて結合プロフィールが変化している。しかし、これらはI-CreIの天然の標的部位を切断する。
【００１５】
Seligmanら, 2002は、I-CreIの切断特異性を変える変異について記載している。より具体的には、彼らは、DNA標的に直接接触すると予測されるI-CreIの9つのアミノ酸の役割について研究している(Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68及びR70)。これらの9つのアミノ酸のうちの7つが、対称の位置でヌクレオチドと相互作用すると考えられている(S32、Y33、N30、Q38、R68、Q44及びR70)。上記の9つのアミノ酸と水媒介相互作用に参加すると予測される10番目のアミノ酸(T140)のそれぞれをアラニンに変換した変異体を構築し、大腸菌（E. coli）ベースのアッセイで試験した。
【００１６】
得られたI-CreI変異体は、野生型ホーミング部位に関して4つの明確な表現型のクラスに分かれる：
- S32A及びT140A接触は、ホーミング部位認識について最も重要でないとみられる、
- N30A、Q38A及びQ44Aは、各アッセイにおいて中間レベルの活性を示した、
- Q26A、R68A及びY33Aは不活性である、
- K28A及びR70Aは不活性であり、非毒性である。
【００１７】
この結果から、位置30、38、44、26、68、33、28及び70でのI-CreI変異体は、野生型I-CreIホーミング部位に関する挙動が改変されていることが明らかになる。
【００１８】
I-CreIホーミング部位における7つの対称位置を変化させる変異体について、得られた結果から、各ハーフサイトにおける7つの対称位置のうち5つ：2／21、3／20、7／16、8／15及び9／14 (配列番号65における位置−10／＋10、−9／＋9、−5／＋5、−4／＋4及び−3／＋3に相当)が、インビボにおける野生型I-CreIによる効率的な部位認識に必須であるとみられることが明らかになった。これらの位置で変化された全ての変異体は、インビボで野生型I-CreIによる切断に耐性であった。しかし、大腸菌を用いるインビトロアッセイは、インビボ試験よりもより感受性が高いようであり、インビボ試験よりもより効率的に野生型I-CreIのホーミング部位の検出を可能にする。よって、インビトロ試験は、野生型I-CreIのDNA標的が次のものであり得ることを示す：配列番号65に関する位置−5〜−3でgtc (全ての引用した文献において認識されるホーミング部位)、gcc又はgttトリプレット。
【００１９】
Seligmanらは、I-CreIの位置33とホーミング部位の塩基2及び21 (±10)との間、又はI-CreIの位置32と、ホーミング部位の塩基1及び22 (±11)との間の相互作用についても研究した。Y33C、Y33H、Y33R、Y33L、Y33S及びY33T変異体は、I-CreIにより切断されない、位置±10で改変されたホーミング部位を切断することが見出された(表3)。一方、S32K及びS32Rは、I-CreIにより切断される、位置±11で改変されたホーミング部位を切断することが見出された(表3)。
【００２０】
Sussmanら, 2004は、ホモダイマーのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼI-CreIを、それぞれ位置±6及び±10のホーミング部位の塩基と接触する位置26及び結局は66、又は位置33で変えた研究を報告している。得られた酵素構築物(Q26A、Q26C、Y66R、Q26C／Y66R、Y33C、Y33H)は、選択されたDNA標的のインビボでの特異的な消滅を駆動し、インビトロでのDNA結合及び切断の特異性のシフトを示している。
個別の標的部位変異型に対する酵素点突然変異の選択及び特徴づけの全体的な結果は、結合特異性及び基質切断の動態におけるシフト及び広がりの両方である。
【００２１】
各変異体は、野生型酵素が示すものに比べて、本来の野生型標的部位に対するより高い解離定数(より低い親和性)を示し、各変異体は、野生型酵素が示すものに比べて、新しい標的に対するより低い解離定数(より高い親和性)を示す。
酵素変異体は、結合親和性について記載されたものと同様に基質選択性におけるシフト及び広がりをもつ基質切断の類似の動態を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
より多数のDNA標的配列に到達するために、新規な特異性を有する、すなわちI-CreI又は現在までに単離されているいくつかの変異型により切断されないDNA標的を切断できる新規な特異性を有するI-CreI変異型を作製することは、非常に有用であろう。
このような変異型は、遺伝子及びゲノム工学のために特に興味深いであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
今回、本発明者らは、位置±3〜5で改変された少なくとも1つのホーミング部位を切断可能な変異型をもたらす、I-CreIの位置44、68及び70における変異を見出した。
よって、本発明の主題は、切断特異性が改変されたI-CreIメガヌクレアーゼ変異型を作製する方法であり、該方法は：
(a) I-CreI pdbアクセッションコード1g9yに関してQ44、R68及び／又はR70のアミノ酸を、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T及びYからなる群より選択されるアミノ酸で置換し、
(b) 二本鎖DNA標的の位置−5〜−3に関して以下のR3トリプレットの少なくとも1つを切断するプロフィールを有する工程(a)で得られたI-CreIメガヌクレアーゼ変異型を選択し、ここで前記位置−5〜−3は、以下の式I：
5'- R1CAAAR2R3R4R'4R'3R'2TTTGR'1 -3'
【００２４】
（式中：
R1は存在するか又はせず、存在する場合は、ランダム核酸配列又は位置−20〜−12 (5'から3'に)に位置するI-CreIメガヌクレアーゼホーミング部位のフラグメントのいずれかに相当する1〜9ヌクレオチドを含む核酸フラグメントを表し、R1は前記ホーミング部位の少なくとも位置−12に相当し、
R2は、核酸ダブレットac又はctを表し、前記ホーミング部位の位置−7〜−6に相当し、
R3は、前記位置−5〜−3に相当し、g、t、c及びaから選択される核酸トリプレットを表すが、以下のトリプレットではなく：gtc、gcc、gtg、gtt及びgct、よって、該核酸トリプレットは、好ましくは以下のトリプレットから選択され：ggg、gga、ggt、ggc、gag、gaa、gat、gac、gta、gcg、gca、tgg、tga、tgt、tgc、tag、taa、tat、tac、ttg、tta、ttt、ttc、tcg、tca、tct、tcc、agg、aga、agt、agc、aag、aaa、aat、aac、atg、ata、att、atc、acg、aca、act、acc、cgg、cga、cgt、cgc、cag、caa、cat、cac、ctg、cta、ctt、ctc、ccg、cca、cct及びccc、そしてより好ましくは以下のトリプレットから選択される：ggg、ggt、ggc、gag、gat、gac、gta、gcg、gca、tag、taa、tat、tac、ttg、ttt、ttc、tcg、tct、tcc、agg、aag、aat、aac、att、atc、act、acc、cag、cat、cac、ctt、ctc、ccg、cct及びccc、
【００２５】
R4は、核酸ダブレットgt又はtcを表し、前記ホーミング部位の位置−2〜−1に相当し、
R'1は存在するか又はせず、存在する場合は、ランダム核酸配列又は位置＋12〜＋20 (5'から3'に)に位置するI-CreIメガヌクレアーゼホーミング部位のフラグメントのいずれかに相当する1〜9ヌクレオチドを含む核酸フラグメントを表し、R1は前記ホーミング部位の少なくとも位置＋12に相当し、
R'2は、核酸ダブレット ag又はgtを表し、前記ホーミング部位の位置＋6〜＋7に相当し、
R'3は、前記位置＋3〜＋5に相当し、g、t、c及びaから選択される核酸トリプレットを表し、R'3は、R3及びR'3が非パリンドロームの場合にgac、ggc、cac、aac及びagcとは異なり、
R'4は、核酸ダブレットga又はacを表し、前記ホーミング部位の位置＋1〜＋2に相当する）
のR3に対応する
ことを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
定義
ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、一文字コードに従って示し、ここで、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
本発明において、特に明記しない限りは、残基の番号は、I-CreI配列SWISSPROT P05725、又はpdbアクセッションコード1g9yのアミノ酸番号付けを参照する。この定義によると、「ADR」と名付けられた変異型は、アミノ酸残基Q44及びR68がそれぞれアラニン及びアスパラギン酸で置換されているが、R70は置換されていないI-CreIメガヌクレアーゼである。変異型の切断活性を変化させないその他の変異は示さず、本明細書で採用される命名は、3つの位置44、68及び70のみの変異に限定されない。
【００２７】
ヌクレオチドは、以下のように示す：一文字コードは、ヌクレオチドの塩基を表すために用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについては、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
【００２８】
本出願において、認識又はホーミング部位を表すために配列が与えられる場合、これは5'から3'に、二本鎖ポリヌクレオチドの一本の鎖のみを表すと理解される。
用語「部分的パリンドローム配列」「部分的に対称な配列」「縮重パリンドローム」「擬似パリンドローム配列」は、破壊された対称を有するパリンドローム配列を表すために無差別に用いられる。例えば、22 bpの配列：c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1g+1a+2g+3a+4c+5a+6g+7t+8t+9t+10g+11 (配列番号 71)は、対称が塩基対＋／−1、2、6及び7で破壊されている部分的パリンドローム配列である。別の式によると、位置＋／−8〜11及び＋／−3〜5のヌクレオチド配列は、パリンドローム配列である。対称軸は、位置−1と＋1の塩基対の間に位置する。別の番号付けを用いると、5'末端から3'末端に、パリンドローム配列は、位置1〜4と19〜22、及び7〜9と14〜16であり、対称は塩基対5、6、10、11、12、13、17及び18で破壊されており、対称軸は位置11と12の塩基対の間に位置する。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「野生型I-CreI」とは、SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yの配列を有するI-CreIメガヌクレアーゼを示す。
【００３０】
用語「認識部位」「認識配列」「標的」「標的配列」「DNA標的」「ホーミング認識部位」「ホーミング部位」「切断部位」とは、メガヌクレアーゼにより認識されかつ切断される14〜40 bpの二本鎖でパリンドローム、非パリンドローム又は部分的パリンドロームのポリヌクレオチド配列を表すために、区別されずに用いられる。これらの用語は、メガヌクレアーゼにより二本鎖破断(切断)が導入されるDNAの明確な位置、好ましくは染色体の位置のことをいう。
【００３１】
例えば、野生型I-CreIの既知のホーミング認識部位は、22 bpの配列5'-caaaacgtcgtgagacagtttg-3' (配列番号 71)又は図2Aに示す24 bpの配列5'-tcaaaacgtcgtgagacagtttgg-3' (ここではC1234とよぶ、配列番号 65；位置−5〜−3にgtc、及び位置＋3〜＋5にgac)により表される。この特定の部位は、以下、「I-CreI天然標的部位」ともいう。天然標的からは、位置＋1、＋2、＋6及び＋7、又は−1、−2、−6及び−7のヌクレオチドの変異により、図2Aに示す2つのパリンドローム配列：C1221 (配列番号 12)及びC4334 (配列番号66)を誘導できる。これらはともに位置−5〜−3にgtc、及び位置＋3〜＋5にgacを有し、インビトロ及び酵母においてI-CreIにより切断される。
【００３２】
用語「特異性が改変された」とは、それが由来する最初の(initial)メガヌクレアーゼ(骨格タンパク質)によって同じ条件下では切断されないホーミング部位を切断できるメガヌクレアーゼ変異型に関する。上記の最初の又は骨格タンパク質は、野生型メガヌクレアーゼ又はその変異体であり得る。
実際に、酵母株におけるインビボアッセイを用いたときに、本発明者らは、野生型I-CreIが、位置−5〜−3のパリンドローム配列がgtcであるホーミング部位(C1234、C1221又はC4334のような)だけでなく、gcc、gac、ggc、atc、ctc及びttcのものも切断することを見出した(図9a)。
新規な特異性を有する変異型を作製するために骨格タンパク質としても用いられ得るI-CreI D75N変異体(I-CreI N75)は、位置−5〜−3のパリンドローム配列がgtcであるホーミング部位だけでなく、gcc、gtt、gtg又はgctのものも切断する(図8及び9a)。
【００３３】
ヘテロダイマー形は、例えば、2つのモノマーの融合を進めることにより得ることができる。得られるヘテロダイマーメガヌクレアーゼは、ホモダイマー形によっては切断されない少なくとも1つの標的部位を切断できる。よって、メガヌクレアーゼ変異型は、ヘテロマー形で用いる場合も本発明の一部分である。ヘテロダイマーメガヌクレアーゼの形成のために選択される他方のモノマーは、別の変異型モノマーであり得るが、野生型モノマー、例えばI-CreIモノマー又はI-DmoIモノマーでもあり得る。
【００３４】
よって、本発明者らは、I-CreI変異型ライブラリーを、I-CreI骨格タンパク質(I-CreI D75N)から作製し、これらのそれぞれは位置44、68及び／又は70 (pdbコード1g9y)のアミノ酸残基において少なくとも1つの変異を示し、これらのそれぞれはI-CreI骨格タンパク質によっては切断されない少なくとも1つの標的部位を切断できる。
【００３５】
この特定のアプローチにおいて、変異は、位置44、68及び／又は70の少なくとも1つのアミノ酸残基の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T及びYを含む群で選択される別の残基による置換からなる。各変異されたアミノ酸残基は、別の残基から独立して変更され、選択されるアミノ酸残基は、位置44、68及び／又は70の別のアミノ酸残基と同じであってもよいし、異なっていてもよい。このアプローチにおいて、本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型により切断されるが、I-CreI骨格タンパク質によっては切断されないホーミング部位は、位置−5〜−3のトリプレット配列(式IのR3に相当)及び／又は位置＋3〜＋5のトリプレット配列(式IのR3'に相当)が、I-CreI骨格タンパク質により切断されるホーミング部位の同じ位置におけるトリプレット配列とは異なること以外は、上記及び図2に示すとおりである。
【００３６】
予期せぬことに、上記の方法により得ることができる、すなわち「特異性が改変された」I-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、位置−5〜−3及び／又は位置＋3〜＋5においてI-CreI骨格タンパク質標的とは異なる少なくとも1つの標的を切断できる。上記のDNA標的は、位置＋／−3〜5においてパリンドロームである必要はないことに注意しなければならない。I-CreIは、ホモダイマー形で活性であるが、ヘテロダイマー形で活性であり得る。よって、本発明によるI-CreI変異型は、ホモダイマー形だけでなく、ヘテロダイマー形でも活性であり得、両方の場合において、これらは位置＋／−3〜5においてパリンドローム又は非パリンドロームのいずれかの配列である標的を認識できるが、但しI-CreI N75タンパク質が骨格として用いられる場合に、位置−5〜−3及び／又は＋3〜＋5におけるトリプレットは、それぞれ、gtc、gcc、gtg、gtt及びgct、並びにgac、ggc、cac、aac及びagcとは異なる。I-CreI変異型の各モノマーは、ホーミング部位の半分に結合するので、複数の標的を切断できる変異型は、位置＋／−3〜5の配列がパリンドロームでない標的も切断できる。さらに、変異型は、ホモダイマー形及びヘテロダイマー形の両方で作用できる。I-CreI変異型は、他方の変異型が野生型I-CreIモノマー、別の野生型メガヌクレアーゼモノマー、例えばI-DmoI、別のI-CreI変異型モノマー、又はI-CreI以外の別のメガヌクレアーゼからの変異型のモノマーであるヘテロダイマーメガヌクレアーゼを形成できる。
【００３７】
上記の方法の有利な実施形態によると、工程(b)で得られるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、
【化１−１】
2008535484.tif 000002
【００３８】
【化１−２】
2008535484.tif 000003
【００３９】
からなる群より選択される。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型を選択する工程(b)は、酵母細胞においてインビボで行われる。
【００４０】
本発明の主題は、上記で定義される、すなわち上記の方法により得ることができるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の、インビトロ又は非治療目的でのインビボにおける、20〜24 bpの部分的パリンドローム配列を少なくとも含む二本鎖核酸標的を切断するための使用でもあり、ここで、少なくとも位置＋／−8〜11の配列はパリンドロームであり、位置−5〜−3のヌクレオチドトリプレット及び／又は位置＋3〜＋5のヌクレオチドトリプレットは、それぞれ、gtc、gcc、gtg、gtt及びgct、並びにgac、ggc、cac、aac及びagcとは異なる。式Iは、そのようなDNA標的を表す。
【００４１】
上記の使用の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、
【化２−１】
2008535484.tif 000004
【００４２】
【化２−２】
2008535484.tif 000005
【００４３】
からなる群より選択される。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、I-CreIメガヌクレアーゼ変異型はホモダイマーである。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型はヘテロダイマーである。
【００４４】
上記のヘテロダイマーは、本発明で定義する2つの異なるI-CreI変異型の融合又はI-CreI骨格タンパク質と本発明で定義されるI-CreI変異型との融合からなる単鎖キメラ分子のいずれかであり得る。あるいは、上記のヘテロダイマーは、本発明で定義される2つの異なるI-CreI変異型から選択される2つの別個のモノマーからなるか、又はI-CreI骨格タンパク質と本発明で定義されるI-CreI変異型からなり得る。
【００４５】
上記の使用によると：
- I-CreIメガヌクレアーゼ変異型が、位置＋／−3〜5の配列がパリンドロームであるDNA標的を切断できるか、
- 又は上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型が、位置＋／−3〜5の配列が非パリンドロームであるDNA標的を切断できるかのいずれかである。
【００４６】
上記の使用の別の有利な実施形態によると、切断される核酸標的は、位置−11〜−8及び＋8〜＋11のパリンドローム配列がそれぞれcaaa及びtttgであるDNA標的である。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、位置75での変異、好ましくは非荷電のアミノ酸、より好ましくはアスパラギン又はバリン(D75N又はD75V)への変異をさらに含む。
【００４７】
上記の使用のさらに別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、位置−4にヌクレオチドa及び／又は位置＋4にtを含むDNA標的を切断するために、位置44にアラニン(A)又はアスパラギン(N)を有する。
上記の使用のさらに別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、位置−4にヌクレオチドt及び／又は位置＋4にaを含むDNA標的を切断するために、位置44にグルタミン(Q)を有する。
上記の使用のさらに別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、位置−4にヌクレオチドc及び／又は位置＋4にgを含む標的を切断するために、位置44にリジン(K) を有する。
【００４８】
本発明の主題は、
- 上記で定義される作製方法により得ることができ；
- I-CreIの位置44、68及び70の少なくとも1つのアミノ酸残基の1つの変異を有し；該変異は、DNA標的に直接接触するアミノ酸内のもののみであり得；そして
- 位置±3〜5でにおける切断特性が改変された
I-CreIメガヌクレアーゼ変異型でもある。
【００４９】
このような新規のI-CreIメガヌクレアーゼは、制限又はマッピング使用のためのインビトロ消化において、インビボ若しくはエクスビボでゲノム工学のためのツールとして非常に特異的なエンドヌクレアーゼとして用いることができる。さらに、新規な第二世代のホーミングエンドヌクレアーゼを作製する目的のために、それぞれのメガヌクレアーゼは、第二回目の突然変異誘発及び選択／スクリーニングのための新規な骨格として用いることができる。
【００５０】
本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、DNA結合ドメインの位置44、68及び／又は70でのみ変異される。しかし、本発明は、ヘテロダイマーを形成し得る異なるタンパク質も含む。上記のリストからの2つの異なるタンパク質のヘテロダイマー化も、親のタンパク質のみにより切断される部位からの2つの半分で作られた非パリンドローム配列の切断をもたらす。これは、反応バッファー中に2つの異なるI-CreI変異型を加えることによりインビトロで、そして同時発現によりインビボ又はエクスビボで得ることができる。別の可能性は、Epinatら(Epinatら, 2003)により記載されるように、単鎖分子を構築することである。この単鎖分子は、2つの異なるI-CreI変異型の融合であり得、キメラの非パリンドローム配列の切断をもたらすはずである。
【００５１】
上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の有利な実施形態によると、位置44、68及び／又は70のアミノ酸の置換のために選択されるアミノ酸残基は、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T及びYを含む群から選択される。
別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、
【化３−１】
2008535484.tif 000006
【００５２】
【化３−２】
2008535484.tif 000007
【００５３】
からなる群より選択される。上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、I-CreI N75骨格タンパク質により切断されない、上記で定義される少なくとも1つの標的を切断できる。
【００５４】
別の有利な実施形態によると、I-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、位置44にアラニン(A)又はアスパラギン(N)を有し、位置−4にヌクレオチドa及び／又は位置＋4にtを含む標的を切断するが、国際PCT出願WO 2004／067736の表4及び5に示す変異型は除く。好ましくは、上記の変異型は、アラニン又はアスパラギンを有する。
【００５５】
別の有利な実施形態によると、I-CreIメガヌクレアーゼ変異型はグルタミン(Q)を有し、位置44の位置−4にヌクレオチドt及び／又は位置＋4にaを含む標的を切断するが、国際PCT出願WO 2004／067736の表3、4及び5に示す変異型は除く。
さらに別の有利な実施形態によると、本発明のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型は位置44にリジン(K)を有し、位置−4にc及び／又は位置＋4にgを含む標的を切断するが、国際PCT出願WO 2004／067736の表5に示す変異型は除く。
【００５６】
上記のように、使用の用途におけるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の定義の範囲内で、該I-CreIメガヌクレアーゼ変異型は、ホモダイマー又はヘテロダイマーであり得る。これは、パリンドローム又は非パリンドロームのDNA標的を切断し得る。これは、さらに、上記のように位置75に変異を含み得る。
【００５７】
本発明の主題は、本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型をコードすることを特徴とするポリヌクレオチドでもある。
さらに、本発明の主題は、上記のポリヌクレオチドとプロモーターのような調節配列とを含む発現カセット、及び該発現カセットを含む発現ベクターである。上記の変異型が2つの異なるモノマーからなるヘテロダイマーである場合、各モノマーは単独のベクター(デュアル発現ベクター)又は2つの異なるベクターから発現されることができる。
本発明の主題は、ターゲティングDNA構築物をさらに含む、上記のような発現ベクターでもある。
【００５８】
用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子のことである。好ましいベクターの1種は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、自律複製及び／又は連結されている核酸の発現が可能なものである。機能するように連結されている遺伝子の発現を駆動できるベクターは、本明細書において「発現ベクター」という。本発明によるベクターは、限定されないが、YAC (酵母人工染色体)、BAC (細菌人工)、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成又は合成DNAで構成され得る直鎖状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。一般的に、組換えDNA技術で有用性がある発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形であり、「プラスミド」とは、一般的に、そのベクターの形では染色体に結合しない環状二本鎖DNAループのことである。以下の細菌ベクターのように、適切な多数のベクターが当業者に公知であり、市販で入手可能である：pQE7O, pQE6O, pQE-9 (Qiagen)；pbs, pDIO, phagescript, psiXl74. pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene)；ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRlT5 (Pharmacia)；pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene)；pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia)；pQE-30 (QIAexpress)；pET (Novagen)。
【００５９】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1型及び2型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。
【００６０】
ベクターは、選択マーカーを含むことができ、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてTRP1；大腸菌においてテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性である。
【００６１】
好ましくは、上記のベクターは、本発明のポリペプチドをコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下にあって、該ポリペプチドの産生又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセット中に含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、該コードしているポリヌクレオチドに機能するように連結されているプロモーター、リボソーム結合部位、RNA-スプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。
【００６２】
上記の発現ベクターの有利な実施形態によると、上記のターゲティングDNA構築物は、本発明のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の切断部位を取り囲む(surrounding)領域とホモロジーを共有する(sharing)配列を含む。
【００６３】
上記の発現ベクターの別の有利な実施形態によると、上記のターゲティングDNA構築物は：
a)    請求項によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の切断部位を取り囲む領域とホモロジーを共有する配列と、
b)    a)の配列に接して導入される配列と
を含む。
【００６４】
本発明の主題は、上記で定義されるポリヌクレオチド又は上記で定義されるベクターにより改変されたことを特徴とする細胞でもある。
本発明の主題は、上記で定義されるポリヌクレオチド又は上記で定義されるベクターを含むことを特徴とするトランスジェニック植物でもある。
本発明の主題は、上記で定義されるポリヌクレオチド又は上記で定義されるベクターを含むことを特徴とする非ヒトトランスジェニック哺乳動物でもある。
【００６５】
本発明において定義されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に知られるいずれの方法により作製できる。例えば、これらは、特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりcDNA鋳型から増幅される。好ましくは、該cDNAのコドンは、所望の発現系における該タンパク質の発現に好ましいように選択される。
【００６６】
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学技術により得て、宿主細胞に導入することができる。
【００６７】
本発明のヘテロダイマーメガヌクレアーゼは、上記で定義するように2つのポリペプチドを発現させることにより作製できる。好ましくは、上記のポリペプチドは、各ベクターが上記で定義される異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含む2つの発現ベクター、或いは上記で定義される両方のポリヌクレオチドフラグメントを含むデュアル発現ベクターで改変された宿主細胞において、ポリペプチドの同時発現に適する条件下で同時発現され、ヘテロダイマーメガヌクレアーゼは宿主細胞培養物から回収される。
【００６８】
本発明の主題は、さらに、上記で定義されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、好ましくはともに１つの発現ベクター(デュアル発現ベクター)に含まれるか又はそれぞれが異なる発現ベクターに含まれる1つ又は2つのポリヌクレオチド、細胞、トランスジェニック植物、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の、分子生物学、インビボ又はインビトロの遺伝子工学、及びインビボ又はインビトロのゲノム工学のための非治療目的での使用である。
【００６９】
非治療目的とは、例えば(i) タンパク質生産のための細胞パッケージング系統における特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(ii) 株の改良及び代謝工学のための農作植物における特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(iii) 遺伝子改変農作植物におけるマーカーの除去のための標的された組換え、(iv) (例えば抗生物質生産のための)遺伝子改変微生物株におけるマーカーの除去のための標的された組換えを含む。
【００７０】
上記の使用の有利な実施形態によると、該使用は、DNA標的配列を含む興味のある部位における二本鎖破断を誘導し、それによりDNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘導するためである。
【００７１】
本発明によると、上記の二本鎖破断は：特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異された遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復するため、興味のある内因性遺伝子を減弱若しくは活性化するため、興味のある部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は削除するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを修復されないままにして分解させるためである。
【００７２】
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を伴う。
【００７３】
本発明の主題は、上記で定義されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型のDNA標的を含むベクター上に位置する興味のある部位に、該ベクターを上記で定義されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型と接触させて、それにより上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の切断部位を取り囲む配列とホモロジーを示す別のベクターとの相同的組換えを誘導することにより二本鎖核酸破断を行う工程を含むことを特徴とする、遺伝子工学の方法でもある。
【００７４】
本発明の主題は、以下の工程を含むことを特徴とする、ゲノム工学の方法でもある：1) 上記で定義されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の少なくとも1つの認識及び切断部位を含むゲノム遺伝子座に、該切断部位を上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型と接触させることにより二本鎖破断を行い、2) 該破断されたゲノム遺伝子座を、標的遺伝子座とホモロジーを共有する配列で挟まれた、該遺伝子座に導入される配列を含むターゲティングDNA構築物との相同的組換えに適する条件下に維持する。
【００７５】
本発明の主題は、以下の工程を含むことを特徴とする、ゲノム工学の方法でもある：1) 上記で定義されるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の少なくとも1つの認識及び切断部位を含むゲノム遺伝子座に、該切断部位を上記のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型と接触させることにより二本鎖破断を行い、2) 該破断されたゲノム遺伝子座を、切断部位を取り囲む領域とホモロジーを共有する染色体DNAとの相同的組換えに適する条件下に維持する。
【００７６】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、ポリヌクレオチド又はベクターを含むことを特徴とする組成物でもある。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、標的される遺伝子座とホモロジーを共有する配列で挟まれた興味のある部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む。
【００７７】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、ポリヌクレオチド又はベクターの、必要とする個体における遺伝子病を予防、改善又は治癒するための医薬の製造のための使用でもあり、該医薬は該個体にいずれの手段により投与される。
【００７８】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、ポリヌクレオチド又はベクターの、必要とする個体におけるDNA中間体(intermediate)を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための医薬の製造のための使用でもあり、該医薬は該個体にいずれの手段により投与される。
【００７９】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのI-CreIメガヌクレアーゼ変異型、ポリヌクレオチド又はベクターの、生物由来製品又は生物学的使用若しくは物体の消毒を意図する製品において、インビトロで、DNA中間体を示す感染性因子の伝播を阻害するか、それを不活性化するか又は除去するための使用でもある。
具体的な実施形態において、上記の感染性因子はウイルスである。
【００８０】
上記の特徴の他に、本発明は、本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型及びその使用を説明する実施例並びに添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴をさらに含む。添付の図面において：
- 図1は、実験の基本原理を示す。(a) そのDNA標的に結合したI-CreIの構造。(b) 無作為化のために選択される残基44、68、70と、D75と相互作用する塩基対とを示す構造のズーム。(c) ライブラリー及び標的の設計。I-CreI残基Q44、R68及びR70とDNA標的との相互作用を示す(上図)。直接又は間接的にDNA標的と相互作用するその他のアミノ酸残基は示していない。I-CreIモノマーの位置44のアルギニン(R)残基は、標的配列の位置−5のグアニンと直接相互作用するが、位置44のグルタミン(Q)残基と位置70のアルギニン(R)残基は、相補鎖の位置＋4のアデニン及び位置＋3のグアニンとそれぞれ直接相互作用する。ここで記載する標的(C1221、配列番号12)は、I-CreI天然標的(C1234、配列番号65)に由来し、I-CreIにより切断されるパリンドロームである(Chevalierら, 2003, 既出)。切断位置は、矢印の頭で示す。ライブラリーにおいて、残基44、68及び70は、ADEGHKNPQRSTで置換する。I-CreIはホモダイマーであるので、ライブラリーは、パリンドローム標的を用いてスクリーニングした。位置±3、±4及び±5の置換により得られる64個のパリンドローム標的を作製した。そのような標的のいくつかの例を示す(下図；配列番号1〜7)。
【００８１】
- 図2は、研究で用いた標的を示す。A. 天然I-CreI標的(ここではC1234とよぶ、配列番号65)由来の2つのパリンドローム標的。I-CreI天然標的は、灰色の箱で囲む2つのパリンドロームを含む：一方に−8〜−12及び＋8〜＋12のヌクレオチド、そして別の方に−5〜−3及び＋3〜＋5のヌクレオチド。そこからヌクレオチド塩基の番号付けが行われる垂直の点線は、パリンドローム配列の対称軸を表す。天然標的から、2つのパリンドローム配列、C1221 (配列番号 12)及びC4334 (配列番号66)を導き出すことができる。ともにインビトロ及び酵母においてI-CreIにより切断される。各標的部位の1つの鎖のみを示す。B. 64個の標的。64個の標的(配列番号1〜64)は、I-CreI天然標的(C1234、配列番号65)に由来し、I-CreIにより切断されるパリンドロームであるC1221 (配列番号12)に由来する(Chevalierら, 2003, 既出)。これらは、位置−5、−4、−3、＋3、＋4及び＋5での置換により得られる24 bpのパリンドローム全てに対応する。
【００８２】
- 図3は、変異型のスクリーニングを示す。(a) 酵母を、LEU2遺伝子をマーカーとするメガヌクレアーゼ発現ベクターで形質転換し、TRP1遺伝子をマーカーとするレポータープラスミドで形質転換した酵母と個別に交配させる。レポータープラスミドにおいて、LacZレポーター遺伝子は、2つの直列反復で挟まれた興味のある部位を含む挿入断片で中断されている。二倍体において(LEU2 TRP1)、メガヌクレアーゼによる標的部位の切断(白色の長円形)は、2つのlacZ反復間の相同的組換えを誘導し、機能的なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(灰色の長円形)をもたらし、これはX-Gal染色により監視できる。(b) 実験のスキーム。I-CreI変異型のライブラリーは、PCRを用いて構築され、複製可能な酵母発現ベクターにクローニングされ、S. cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を形質転換する。64個のパリンドローム標的を、LacZベースの酵母レポーターベクターにクローニングし、得られたクローンでFYBL2-7B株(MATa, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換する。フィルタメンブレン上のロボット支援格子付け(gridding)を用いて、メガヌクレアーゼ変異型を発現する個別のクローンと、レポータープラスミドを有する個別のクローンとの交配を行う。一次ハイスループットスクリーニングの後に、陽性クローンのORFをPCRにより増幅し、配列決定する。410個の異なる変異型を、2100個の陽性から同定し、低密度で試験して完全なパターンを確立し、350個のクローンを確認した。また、294個の変異体を酵母ベクターに再クローニングし、二次スクリーニングで試験し、その結果は再クローニングせずに得られたものを確実にした。選択されたクローンは、次いで、同様のCHOベースのアッセイ、及び最終的にはインビトロで切断活性についてアッセイした。
【００８３】
-図4は、I-CreI N75骨格タンパク質をコードするcDNA配列、及びUlib2ライブラリー構築に用いた縮重プライマーを表す。A. 骨格タンパク質のコーディング配列(CDS) (配列番号 69)は、塩基対1〜塩基対501であり、「停止」コドンTGA (示さず)は、塩基対501に続く。D75N変異に加えて、タンパク質は、その活性を変更しない変異をさらに含む。タンパク質配列(配列番号70)において、N-末端の2つの最初の残基は、メチオニンとアラニン(MA)であり、C-末端の3つの残基は、アラニン、アラニン及びアスパラギン酸である(AAD)。B.縮重プライマー(配列番号67、68)。
【００８４】
- 図5は、pCLS0542メガヌクレアーゼ発現ベクターマップを表す。メガヌクレアーゼ発現ベクターは、LEU2をマーカーとする。誘導性Gal10プロモーターにより駆動される変異型の発現を行うために、I-CreIメガヌクレアーゼ変異型をコードするcDNAを、NcoI及びEagIで消化したこのベクターにクローニングする。
【００８５】
- 図6は、pCLS0042レポーターベクターマップを表す。レポーターベクターは、TRP1及びURA3をマーカーとする。LacZタンデム反復同士は、800 bpのホモロジーを共有し、1.3 kbのDNAだけ離れている。これらは、ADHプロモーター及びターミネーター配列に取り囲まれている。標的部位は、SmaI部位にクローニングされる。
【００８６】
- 図7は、特異性が改変された292個のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の切断プロフィールを示す。これらの変異型は、I-CreI N75骨格タンパク質に由来する。タンパク質は、位置44、68及び70に存在するアミノ酸で定義する(最初の3つの列)。アミノ酸の番号付けは、pdbアクセッションコード1g9yに従う。標的は、位置−5〜−3のヌクレオチドで定義する。各タンパク質について、切断が観察された(1)か又は切断が観察されない(0)かを、64個の標的の1つずつについて示す。
【００８７】
- 図8は、I-CreI変異型の切断パターンの8つの例を示す。メガヌクレアーゼは、図2Bに示す64個の標的に対して4回試験する。異なる標的の位置は、上の左のパネルに示す。I-CreI N75骨格タンパク質に由来する変異型は、位置44、68及び70のアミノ酸により同定する(例えば：KSSは、K44、S68、S70及びN75、又はK44／S68／S70)。アミノ酸の番号付けは、pdbコード1g9yに従う。QRRは、I-CreI N75に相当する。切断される標的は、パネルに並べて示す。
【００８８】
- 図9は、変異型の切断パターンを示す。変異体は、位置44、68及び70の残基に対応する3文字で同定する。各変異体は、I-CreI天然標的由来の64個の標的、及び一連のコントロール標的に対して試験する。標的マップは、上の右のパネルに示す。(a) 野生型I-CreI (I-CreI)及びI-CreI N75 (QRR)タンパク質、並びにI-CreI N75タンパク質の7つの誘導体について酵母(左)及び哺乳動物細胞(右)における切断パターン。酵母について、最初の未処理データ(フィルタ)を示す。CHO細胞について、定量的未処理データ(ONPG測定)を示し、0.25より優れた値を箱で囲み、0.5より優れた値を中程度の灰色で強調し、1より優れた値を濃い灰色で強調する。LacZ：ポジティブコントロール。0：標的なし。U1、U2及びU3：3つの異なる切断されないコントロール。(b) インビトロでの切断。I-CreI及び4つの変異体を、酵母及びCHOで最も強いシグナルをもたらす標的を含む一連の2又は4つの標的に対して試験する。消化は、方法に記載するようにして、2 nMの直鎖状基質を用いて37℃にて1時間行う。2つの異なる標的を用いた未処理データを、I-CreIについて示す。ggg及びcctの両方を用いた場合に、I-CreIを用いて切断は検出されない。
【００８９】
- 図10は、統計的分析を表す。(a) 切断された標的：I-CreI変異型により切断される標的は、灰色で着色する。各標的を切断するタンパク質の数を下に示し、灰色の着色の程度は、酵母におけるこれらの切断するものを用いて得られる平均シグナル強度に比例する。(b) 7つのクラスタのうちの3つの分析。各変異体クラスタ(クラスタ1、3及び7)について、各標的についての累積強度を計算し、バープロット(左の列)は、標準化した強度が減少する順で示す。各クラスタについて、各位置(44、68及び70)での各タイプのアミノ酸の数を、右の列にコード化したヒストグラムとして示す。アミノ酸の色コードの凡例は、図の一番下に示す。(b) 酵母における変異体及び標的データの階層的クラスタリング。変異体及び標的はともに、ユークリッド距離及びウォード法を用いる階層的クラスタリングを用いてクラスタリングした(Ward, J.H., American statist. Assoc., 1963, 58, 236-244)。クラスタリングは、Rパッケージからのhclustを用いて行った。変異体及び標的のデンドログラムは、クラスタの位置を最適化するために再並べ替えし、変異体デンドログラムを、推定クラスタを用いて8の高さで切断した。QRR変異体及びGTC標的は矢印で示す。灰色の程度は、シグナルの強度を反映する。
【００９０】
- 図11は、ハイブリッド又はキメラ部位の例を示す：gtt (配列番号 79)及びcct (配列番号77)は、I-CreI部位由来の2つのパリンドローム部位である。gtt／cctハイブリッド部位(配列番号80)は、上の鎖(top strand)の−5、−4、−3にgtt配列を示し、下の鎖(bottom strand)の5、4、3にcct配列を示す。
【００９１】
- 図12は、ヘテロダイマー変異型の切断活性を示す。酵母は、KTG変異型及びQAN変異型で同時形質転換した。標的の構成は、上のパネルに示す：単独のgtt、cct又はgccハーフサイトを有する標的は太字で示す；ホモダイマー及び／又はヘテロダイマーで切断されると予測される、このようなハーフサイトを2つ有する標的は、太字で灰色で強調する；0：標的なし。結果は、下の3つのパネルに示す。予期せぬわずかなシグナルが、KTG及びQANでそれぞれ切断されるgtc／cct及びgtt／gtcについてのみ観察される。
【００９２】
- 図13は、ヘテロダイマー変異型の切断活性の定量的分析を表す。(a) 酵母における選択された変異体の同時形質転換。明確化のために、関連するハイブリッド標的の結果のみを示す。aac／acc標的は、常に、関連しない標的の例として示す。KTG×AGRの組について、示していないが、パリンドロームのtac及びtct標的は、それぞれAGR及びKTGにより切断される。cat標的のRRN変異体による切断は非常に低く、酵母においては定量できなかった。(b) CHO細胞における一過的な同時形質転換。(a)及び(b)について、黒のバー：第一の変異体のみについてのシグナル；灰色のバー：第二の変異体のみについてのシグナル：縞のバー：同時発現又は同時形質転換により得られたシグナル。
【００９３】
- 図14は、選択されたマウス染色体17 DNA標的に対する、組み立てられたヘテロダイマーARS-KREの活性を示す。CHO-K1細胞系統は、等モルの標的LagoZプラスミド、ARS及びKRE発現プラスミドで同時トランスフェクションし、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。LagoZプラスミドとI-SceI、I-CreI、ARS又はKRE組換えプラスミド又は空のプラスミドで同時トランスフェクションした細胞を、コントロールとして用いた。
【００９４】
以下の実施例は、本発明を説明するために示され、本発明の範囲を限定するものではない。配列が配列番号69とは異なるcDNA及び適切なプライマーから得られるその他の変異型は、本発明の一部分である。
【００９５】
実施例1：新規な機能的エンドヌクレアーゼのスクリーニング
メガヌクレアーゼ変異型を作製するための方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いられる哺乳動物又は酵母の細胞における切断により誘発される組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004／067736に記載される。これらのアッセイにより、標準的な方法により監視できる機能的LacZレポーター遺伝子が得られる(図3a)。
【００９６】
A) 材料及び方法
a) 変異体ライブラリーの構築
I-CreI wt及びI-CreI D75N (又はI-CreI N75)のオープンリーディングフレーム(配列番号69、図4A)を、以前に記載されたようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003, 31, 2952〜2962)。変異D75Nは、コドン75をaacで置換することにより導入した。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、位置3〜5の塩基と直接相互作用する位置44、68及び70にコドンVVK (18コドン、アミノ酸ADEGHKNPQRST)を有するSigmaからの縮重プライマー、及びDNA鋳型としてI-CreI D75N遺伝子を用いるPCRにより作製した。このようなプライマーは、12の理論的多様性での残基44、68及び70の変異を可能にする。簡単に、フォワードプライマー(5'-gtttaaacatcagctaagcttgacctttvvkgtgacttcaaaagacccag-3'、配列番号67)及びリバースプライマー(5'-gatgtagttggaaacggatccmbbatcmbbtacgtaaccaacgcc-3'、配列番号68)を用いて、PCRフラグメントを、50μl PCR反応中で増幅させた：PCR産物をプールし、EtOH沈殿させ、50μl 10 mM Tris中に再懸濁した。PCR産物を、適切な制限酵素で消化した、I-CreI D75N遺伝子を有するpET発現ベクターにクローニングした。ベクター及び挿入DNAの消化は、2工程(単独酵素消化)で行い、これらの間にDNAサンプルを抽出し(伝統的なフェノール：イソアミルアルコールに基づく方法)、EtOH沈殿させた。10μgの消化ベクターDNAを、5：1で超過の挿入DNAを用いるライゲーションに用いた。大腸菌TG1細胞を、エレクトロポレーションにより、得られたベクターで形質転換した。ライブラリーの理論的多様性を超える数の細胞クローンを作製するために、6×104クローンを作製した。細菌クローンは、プレートからこそげ、対応するプラスミドベクターを抽出して精製した。
【００９７】
ライブラリーは、酵母pCLS0542ベクター(図5)に、全I-CreI D75N ORFを含有するNcoI-EagI DNAフラグメントをサブクローニングすることにより、再クローニングした。LEU2遺伝子をマーカーとするこの2ミクロンベースの複製可能なベクターにおいて、I-CreI変異型は、ガラクトース誘導プロモーターの制御下にある(Epinatら, 既出)。大腸菌でのエレクトロポレーションの後に、7×104クローンを得て、7×104クローンは、DNAレベルでの理論的多様性の12倍を表す(183 = 5832)。DNAを抽出し、S. cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を形質転換した。13824個のコロニーを、コロニーピッカー(QpixII, GENETIX)を用いて採取し、144マイクロタイタープレートで成長させた。
【００９８】
b) 標的クローンの構築
C1221の24 bpパリンドローム(tcaaaacgtcgtacgacgttttga、配列番号12)は、ほぼパリンドロームの天然CreI標的のハーフサイトの反復である(tcaaaacgtcgtgagacagtttgg、配列番号65)。C1221は、酵母及び哺乳動物の細胞の両方においてインビボ及びエクスビボでI-CreI天然標的と同様に効率的に切断される。64個のパリンドローム標的は、次のようにして導き出した：両側に12 pbの非パリンドロームの余分な配列を有する64個のDNA標的の2つの鎖に相当する64対のオリゴヌクレオチド(ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgacaatcgtctgtca (配列番号 72)及びリバース相補配列)をSigmaに注文し、アニールしてpGEM-T Easy (PROMEGA)にクローニングした。次に、400 bpのPvuIIフラグメントを、64 pGEM-T-由来ベクターの1つずつから切り出し、以前に記載され(Epinatら, 既出)、pCLS0042 (図6)ともよばれる酵母ベクターpFL39-ADH-LACURAZにクローニングして、64個の酵母レポーターベクターを得た。切り出し、消化及びライゲーションの工程は、当業者に知られる典型的な方法を用いて行う。標的配列の挿入は、pCLS0042のSmaI部位で行う。64個のパリンドローム標的は、図2Bに記載する(位置−5〜−3及び＋3〜＋5、配列番号1〜配列番号64)。
【００９９】
c) 酵母株及び形質転換
メガヌクレアーゼ発現変異型のライブラリー及びA44／R68／L70変異型を、FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)に形質転換した。
標的プラスミドは、酵母FYBL2-7B:株(MATa, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)に形質転換した。
形質転換のために、伝統的な化学薬品／熱ショック法を用いることができ、日常的に、DNA 1μg当たり106個の独立した形質転換体を得る；形質転換体は、ロイシン非含有合成培地で選択した(Gietz及びWoods, 2002)。
【０１００】
d) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
I-CreI変異型クローン、及び酵母レポーター株を、グリセロール(20%)ストックで貯蔵し、新しいマイクロプレートで複製させた。変異体は、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、高い格子密度(gridding density) (約20スポット／cm2)を用いて格子付けした。第2の格子付け手順を同じフィルタ上で行って、各変異型について64又は75個の異なるレポーター含有酵母株からなる第2の層をスポットした。簡単に、各レポーター株を13824回ナイロンメンブレン上にスポットし、このスポットの1つずつの上に、変異型メガヌクレアーゼを発現する13824個の酵母クローンの1つをスポットした。メンブレンを固形YPDリッチ寒天培地上に置き、30℃で一晩インキュベートして交配させた。次に、フィルタを、ロイシンとトリプトファンを欠き、ガラクトース(1%)を炭素源として含む合成培地(同時発現実験についてはG418も有する) に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロース中に0.02% X-Galを含む固形アガロース培地上に置いて37℃にてインキュベートし、β-ガラクトシダーゼ活性を監視した。陽性クローンを、染色により、インキュベーションの2日後に同定した。結果をスキャンにより分析し、自社開発のソフトウェアを用いて定量を行った。二次スクリーニングについて、292個の選択した陽性について、各変異体を同じメンブレンにおいて4回試験した以外は同じ手順を行った(図8及び9aを参照)。
【０１０１】
d) 一次ヒットの配列及び再クローニング
酵母における一次クローニングの間に同定された陽性クローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、PCRにより増幅して配列決定した。次いで、ORFを、Gateway法(Invitrogen)を用いて再クローニングした。ORFを、PROLIGOからのプライマー： ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc (配列番号 73)及びggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc (配列番号 74)を用いて、酵母コロニー上でのPCRにより増幅させた(Akadaら, Biotechniques, 28, 668〜670, 672〜674)。PCR産物を：(i) ガラクトース誘導プロモーター、選択マーカーとしてLEU2又はKanR、及び2ミクロン複製起点を有する酵母ゲートウェイ発現ベクター、並びに(ii) NOVAGENからのpET 24d(+)ベクターにクローニングした。得られたクローンを、配列決定により(MILLEGEN)確認した。
【０１０２】
B) 結果
I-CreIは、22 bp擬似パリンドローム標的を切断するダイマーのホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然標的に結合しているI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて、8つの残基が7つの塩基と直接相互作用を確立していることを示している(Juricaら, 1998, 既出)。残基Q44、R68、R70は、位置3〜5 (及び−3〜−5、図1)で3つの連続する塩基対と接触する。網羅的なタンパク質ライブラリー対標的ライブラリーのアプローチを行って、DNA結合界面のこの部分を局所的に加工した。まず、I-CreI骨格をD75からNに変異させて、I-CreI構造の埋もれているD75の水素受容体電位を満足する、ライブラリー中のR68及びR70の塩基性残基の置換に起因する、存在する可能性のあるエネルギーのひずみを減少させる。変異体D75Nのホモダイマー(pET発現ベクターを用いてそれを過剰発現させた大腸菌から精製)は、I-CreIホーミング部位を切断することが示された。D75N変異はタンパク質構造に影響しなかったが、過剰発現実験においてI-CreIの毒性を減少させた。次に、位置44、68及び70を無作為化し、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的の位置±3、±4及び±5での置換により得られる64個のパリンドローム標的(Chevalierら, 2003, 既出)を、図1及び2Bに示すようにして作製した。最終的に、タンパク質ライブラリー中の変異体は、3つの残基の位置でvvkコドンによりコードされる12のアミノ酸のいずれかの独立した組み合わせに対応した。結果として、タンパク質ライブラリーの最大の(理論的)多様性は、123又は1728であった。しかし、核酸については、多様性は183又は5832である。
【０１０３】
得られたライブラリーを、LEU2栄養要求性マーカー遺伝子を有する酵母複製発現ベクターにクローニングし、leu2変異一倍体酵母株(FYC2-6A)に形質転換した。64個の標的を、適切な酵母レポーターベクターにクローニングし、一倍体株(FYBL2-7B)に形質転換して、64個のテスター株を得た。
【０１０４】
ロボット支援の交配プロトコルを用いて、我々のライブラリーから多数のメガヌクレアーゼをスクリーニングした。一般的なスクリーニングストラテジは、図3bに示す。13,8247メガヌクレアーゼ発現クローン(理論的多様性の約2.3倍)を、高密度(20スポット／cm2)でナイロンフィルタ上にスポットし、64個の標的株の1つずつに対して個別に試験した(884,608スポット)。少なくとも1つの標的に対して活性を示す2100個のクローンを単離し(図3b)、メガヌクレアーゼをコードするORFをPCRにより増幅して配列決定した。410個の異なる配列を同定し、同様の数の相当するクローンを、さらなる分析のために選択した。スポット密度は4スポット／cm2に減らし、各クローンを64個のレポーター株に対して4重に試験することにより、完全なプロフィールを創った(図8及び9aに示すように)。350個の陽性を確認できた。次に、1つより多いクローンを含有する株の可能性を回避するために、変異体ORFをPCRにより増幅し、酵母ベクターに再クローニングした。得られたプラスミドを、酵母に個別に形質転換しなおした。294個のこのようなクローンを得て、低密度(4スポット／cm2)で試験した。ほとんどが弱いシグナルのものについて一次スクリーニングとは違いが観察され、28個の弱く切断するものが今回は陰性と見られた。1つの陽性クローンのみが、一次プロファイリングで観察されたものとは異なるパターンを示した。
【０１０５】
実施例2：異なる切断プロフィールを持つI-CreIメガヌクレアーゼ変異型
実施例1からの確認されたクローンは、非常に多様なパターンを示した。これらの新規のプロフィールのいくつかは、最初の骨格といくらかの類似性を共有したが、その他のほとんどは全く異なった。野生型I-CreI及びI-CreI N75を含むプロフィールの種々の例を、図8及び9aに示す。全体的な結果(特異性が改変された292個の変異型についてのみ)を、図7にまとめる。
【０１０６】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、その標的配列におけるいくらかの縮重に通常は適応でき、我々の最初の発見の1つは、本来のI-CreIタンパク質自体が酵母において7つの異なる標的を切断することであった。我々の変異体の多くもこの規則に従い、切断される配列の数は1〜21の範囲で、切断される配列の平均は5.0配列(標準偏差＝3.6)であった。興味深いことに、50個の変異体において(14%)、特異性が変更されて1つのみの標的を切断するようになった。37個(11%)は2つの標的を切断し、61個(17%)は3つの標的を切断し、58個(17%)は4つの標的を切断した。5つ以上の標的については、パーセンテージは10%より低かった。まとめると、38個の標的が変異体により切断された(図10a)。位置±3にAを有する標的に対してはわずかに切断が観察され、位置±5、±4、±3にtgn及びcgnを有する標的は全く観察されなかったことに注目する価値がある。
【０１０７】
これらの結果は、本発明の範囲を限定するものではない。なぜなら、図7は、292個の変異型を用いて得られた結果を示しているだけだからである(完全ライブラリー中で得ることができる1728 (又は123)個のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型のうちの291個)。
【０１０８】
実施例3：新規なメガヌクレアーゼは、高活性及び狭い特異性を保持したまま新規な標的を切断できる
A) 材料及び方法
a) 標的クローンの構築
64個のパリンドローム標的を、実施例1に記載するようにしてpGEM-T Easy (PROMEGA)にクローニングした。次に、400 bpのPvuIIフラグメントを切り出し、哺乳類ベクターpcDNA3.1-LACURAZ-ΔURAに、以前に記載されたようにしてクローニングした(Epinatら, 既出)。75個のハイブリッド標的配列を、次のようにしてクローニングした：オリゴヌクレオチドを、各変異パリンドロームの2つの異なるハーフサイトを含むように設計した(PROLIGO)。
【０１０９】
b) 一次ヒットの再クローニング
酵母における一次スクリーニングの間に同定された陽性クローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、(i) 供給業者(INVITROGEN)の指示に従ってCHOゲートウェイ発現ベクターpCDNA6.2に、及びii) NOVAGENからのpET 24d(+)ベクターに再クローニングした。得られたクローンを配列決定により確認した(MILLEGEN)。
【０１１０】
c) 哺乳動物細胞アッセイ
American Type Culture Collection (ATCC)からのCHO-K1細胞系統を、10%胎児ウシ血清を補ったHam'sF12K培地で培養した。一過性の一本鎖アニーリング(Single Strand Annealing；SSA)アッセイのために、細胞を、トランスフェクションの1日前に、ウェル当たり13.103細胞で12ウェルプレートに播種した。同時トランスフェクションを、次の日に、400 ngのDNAとEFFECTENEトランスジェニックキット(QIAGEN)を用いて行った。等モル量の標的LagoZプラスミド及び発現プラスミドを用いた。次の日に、培地を交換し、細胞をさらに72時間インキュベートした。CHO-K1細胞単層を、PBSで1回洗浄した。次いで、細胞を、β-ガラクトシダーゼ液体アッセイのために加えられた150μlの溶解／視覚化バッファー(100 mlの溶解バッファー(Tris-HCl 10 mM pH7.5, NaCl 150 mM, Triton X100 0.1 %, BSA 0.1 mg／ml, プロテアーゼ阻害剤)、900 mlの視覚化バッファー(10 mlのMg 100×バッファー(MgCl2 100 mM, β-メルカプトエタノール35 %)、110 ml ONPG (8 mg／ml)及び780 mlのリン酸ナトリウム0.1 M pH7.5)を用いて、氷上で30分間溶解した。β-ガラクトシダーゼ活性を、415 nmで光学密度を測定することによりアッセイした。全体の手順は、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行った。β-ガラクトシダーゼ活性は、タンパク質濃度、インキュベーション時間及びトランスフェクション効率について標準化した相対的単位として算出する。
【０１１１】
d) タンパク質の発現及び精製
Hisタグ付加タンパク質を、大腸菌BL21 (DE3)pLysS細胞において、pET-24d (+)ベクター(NOVAGEN)を用いて過剰発現させた。IPTG (0.3 mM)を用いる誘導は、25℃にて行った。細胞は、50 mMリン酸ナトリウム(pH 8)、プロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット, Roche)を含む300 mM塩化ナトリウム、及び5 % (v／v)グリセロールの溶液中で超音波破砕した。細胞溶解物を、100000 gにて60分間遠心分離した。次いで、Hisタグ付加タンパク質を、コバルトを装填した5ml Hi-TrapキレーティングHPカラム(Amersham Biosciences)を用いてアフィニティ精製した。イミダゾールの直線勾配(0.25Mまでのイミダゾール、次いで0.5 Mイミダゾール, 0.3 M NaCl及び50mMリン酸ナトリウムpH 8でのプラトー)を用いる溶出中に、いくつかのフラクションを回収した。タンパク質が豊富なフラクション(SDS-PAGEにより決定)を、2番目のカラムに供した。粗精製サンプルをpH 6にし、20 mMリン酸ナトリウムpH 6.0で平衡化した5 ml HiTrap Heparin HPカラム(Amersham Biosciences)に供した。結合したタンパク質を、20 mMリン酸ナトリウム及び1M塩化ナトリウムを用いる塩化ナトリウムの連続勾配を用いて溶出する。精製されたフラクションは、SDS-PAGEに供し、濃縮し(10 kDaカットオフのcentriprep Amicon Ultra system)、液体窒素で凍結させて−80℃にて貯蔵した。精製タンパク質は、PD10カラム(Sephadex G-25M, Amersham Biosciences)を、PBS又は10 mM Tris-HCl (pH 8)バッファー中で用いて脱塩した。
【０１１２】
e) インビトロ切断アッセイ
単独のメガヌクレアーゼ DNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まず、XmnIを用いて直線化した。切断アッセイは、10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT及び50μg／ml BSA中で37℃にて行った。標的基質濃度は、2 nMを用いた。希釈範囲は、25μlの最終反応容量中で各タンパク質について0〜85 nMであった。反応は、1時間後に、5μlの45%グリセロール, 95mM EDTA (pH 8), 1.5 % (w／v) SDS, 1.5 mg／ml プロテイナーゼK及び0.048 % (w／v)ブロモフェノールブルー(6×Buffer Stop)を加えることにより停止し、37℃にて30分間インキュベートした。消化産物をアガロース電気泳動ゲルで泳動し、エチジウムブロミド染色の後にフラグメントを定量して、切断されたパーセンテージを算出した。
【０１１３】
B) 結果
8つの代表的な変異体(6つの異なるクラスタに属する、以下を参照)を、さらなる特徴決定のために選択した(図9)。まず、酵母におけるデータは、以前の報告において記載されたようにしてメガヌクレアーゼ発現ベクターと標的ベクターとの一過性同時トランスフェクションに基づくアッセイを用いて、哺乳動物細胞において確認した。8個の変異ORF及び64個の標的を適切なベクターにクローニングし、ロボット支援マイクロタイターベースの実験計画を用いて、各選択された変異型を64個の異なるレポータープラスミドの1つずつとCHO細胞にて同時トランスフェクションした。メガヌクレアーゼにより誘発される組換えを、機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子の回復を監視する標準的な定量ONPGアッセイにより測定した。プロフィールは、5回の独立した実験において定性的及び定量的に再現可能であることが見出された。図9aに示すように、酵母及びCHO細胞の両方において、強い及び中程度のシグナルがほぼ常に観察され(ADKを除く)、これにより酵母HTSプロセスの妥当性が確認された。しかし、酵母で観察された弱いシグナルは、しばしばCHO細胞で観察されず、これは検出レベルの違いによるもののようである(QRR及び標的gtg、gct及びttcを参照)。4つの変異体も大腸菌で産生し、金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。野生型部位及びそれらの同起源の部位に対するこれらの相対的インビトロ切断効率を決定した。標準化された条件下での切断の程度は、変異体についての広い濃度範囲にわたって評価した(図9b)。同様に、これらの標的に対するI-CreI wtの活性を分析した。多くの場合、基質の100%の切断は達成できず、これは、これらのタンパク質がほとんど又は全くターンオーバーを有さないという事実を反映しているようである(Perrinら, EMBO J., 1993, 12, 2939〜2947; Wangら, Nucleic Acids Res., 1997, 25, 3767〜3776)。一般に、インビトロアッセイは、酵母及びCHO細胞で得られたデータを確かにしたが、驚くべきことに、gtt標的はI-CreIにより効率的に切断された。
【０１１４】
特異性のシフトは、酵母及びCHOで得られたプロフィールから明らかであった：I-CreIの好ましいgtc標的は切断されないか又はわずかに切断されたが、新しい標的を用いてシグナルが得られた。この特異性の切換えは、図9bに示すようなインビトロ分析により、QAN、DRK、RAT及びKTGについて確認した。さらに、酵母及びCHOにおいて種々のレベルの活性を示す(図9a)これらの4つの変異体は、I-CreIに類似の動態で(13〜25 nMによる最大切断の半分)、インビトロでそれらの好ましい標的の17〜60%を切断することが示された(図9b)。よって、活性は、加工によりほぼ保存された。第三に、切断される標的の数は、変異体間で変動した：QRR、QAN、ARL及びKTGのような強く切断するものは、I-CreIを用いて観察される範囲で切断スペクトルを有する(酵母において5〜8個の検出可能なシグナル、CHOにおいて3〜6)。特異性は、弱く切断する変異体との比較はより困難である。例えば、単独の弱いシグナルがDRKを用いて観察されるが、より複雑なパターンの減弱による唯一の検出可能なシグナルを表すかもしれない。にもかかわらず、強く切断する変異型の挙動は、加工が非常に狭い特異性を保存することを示す。
【０１１５】
実施例4：階層的クラスタリングはI-CreI変異型ファミリーを定義する
A) 材料及び方法
クラスタリングは、Rパッケージからのhclustを用いて行った。低密度の一次スクリーニングからの定量データを用いた。変異型及び標的はともに、ユークリッド距離及びウォード法を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタリングした(Ward, J.H., American Stat. Assoc., 1963, 58, 236〜244)。変異体及び標的のデンドログラムは、クラスタの位置を最適化するために再並べ替えし、変異体デンドログラムを、8の高さで切断して、クラスタを定義した。
【０１１６】
B) 結果
次に、階層的クラスタリングを用いて、変異型の多数の多様な切断パターンのうちでファミリーを同定できるかについて決定した。一次及び二次スクリーニングは一致した結果を示したので、酵母低密度スクリーニングの第1回目からの定量データを分析に用いて、より大きいサンプルサイズが可能になった。変異型及び標的はともに、ユークリッド距離及びウォード法を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタリングし(Ward, J.H., 既出)、7つのクラスタを定義した(図10b)。それらの3つについての詳細な分析を示し(図10c)、結果を表Iにまとめる。
【０１１７】
【表１】
2008535484.tif 000008
【０１１８】
各クラスタについて、一連の好ましい標的を、シグナルの頻度及び強度に基づいて同定できた(図10c)。各クラスタについての3つの好ましい標的を、それらの切断頻度とともに表1に示す。これらの頻度の合計は、クラスタの特異性の測定である。例えば、クラスタ1において、3つの好ましい標的(gtt／c／g)は、観察された切断の78.1%の原因であり、gtt単独では46.2%であり、非常に狭い特異性を明らかにする。実際に、このクラスタは、QANとしてgttをほとんど切断するいくつかのタンパク質を含む(図9a)。対照的に、クラスタ2における3つの好ましい標的は、全ての観察されるシグナルの36.6%のみを表す。このクラスタにおいて観察される比較的広く多様なパターンによると、QRRは5つの標的を切断する(図9a)が、その他のクラスタのメンバーの活性は、これらの5つの標的に限定されない。
【０１１９】
各クラスタで見出された残基の分析は、位置44について強い偏向を示す：Qは、クラスタ1及び2で圧倒的に示されるが、A及びNはクラスタ3及び4で、そしてKはクラスタ6及び7でより頻繁である。一方、これらの偏向は、クラスタ1及び2においてt：a塩基対、クラスタ3、4及び5においてa：t塩基対、及びクラスタ6及び7においてc：g塩基対が大多数であるDNA位置±4についての強い塩基嗜好性に関連する(表Iを参照)。その標的に結合するI-CreIの構造は、残基Q44が位置−4における下の鎖(及び位置＋4における上の鎖、図1b及び1cを参照)と相互作用することを示す。これらの結果は、この相互作用が我々の変異体においてほとんど保存されていることを示し、Q44がアデニンと、A44 (又はより低頻度にN44)がチミンと、そしてK44がグアニンと接触を確立するであろう「コード」を明らかにする。このような相互関係は、位置68及び70について観察されなかった。
【０１２０】
実施例5：変異型は、機能的ヘテロダイマーに組み立てられて、新しいDNA標的配列を切断できる
A) 材料及び方法
75個のハイブリッド標的配列を、次のようにしてクローニングした：オリゴヌクレオチドを、各変異パリンドロームの2つの異なるハーフサイトを含有するように設計した(PROLIGO)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gateway法(INVITROGEN)を用いて酵母及び哺乳動物レポーターベクターにクローニングした。酵母レポーターベクターで、S. cerevisiae FYBL2-7B株(MATα, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
【０１２１】
B) 結果
変異型は、パリンドローム部位を切断可能なホモダイマーである。切断可能な標的のリストを、ハイブリッド切断部位を切断するであろうヘテロダイマーを創ることにより拡張できるかを試験するために(図11に記載のようにして)、明瞭なプロフィールのI-CreI変異型のサブセットを選択し、LEU2又はKAN遺伝子をマーカーとする2つの異なる酵母ベクターにクローニングした。位置44、68及び／又は70、並びに位置75のNに変異を有する変異体の組み合わせを、一連のパリンドローム及び非パリンドロームのキメラDNA標的とともに酵母で同時発現させた。例を図12に示す：K44,T68,G70,N75 (KTG)変異体及びQ44,A68,N70,N75 (QAN)変異体の同時発現は、2つのキメラ標的であるgtt／gcc及びgtt／cctを切断したが、これらはいずれか単独の変異では切断されなかった。パリンドロームgtt、cct及びgcc標的(並びにKTG及びQANのその他の標的)も切断され、ホモダイマー型が形成された結果によるようであったが、無関係の標的は切断されなかった。さらに、gtt、cct又はgccハーフサイトは切断を可能にするには充分ではなかった。なぜなら、このような標的は、完全に耐性であったからである(図12におけるggg／gcc、gat／gcc、gcc／tac及びその他の多くを参照)。予期せぬ切断は、KTG 及びQANホモダイマーを用いてそれぞれgtc／cct及びgtt／gtcでのみ観察されたが、シグナルは非常に弱いままであった。つまり、効率的な切断は、2つの変異モノマーの協力的な結合を必要とする。これらの結果は、ヘテロダイマー型についての特異性の良好なレベルを証明する。
【０１２２】
まとめると、14個の異なるタンパク質の合計で112の組み合わせを酵母において試験し、組み合わせの37.5% (42／112)について、それらの推定キメラ標的に対して陽性シグナルが得られた。定量データは、図13aにおいて6つの例について示し、同じ6つの組み合わせについて、一過性同時トランスフェクション実験において、適切な標的のサブセットを用いてCHO細胞で確認した(図13b)。一般的な規則として、2つの発現タンパク質のうちの1つがホモダイマーと同様の強いシグナルを与える場合は、機能的ヘテロダイマーが常に得られた。例えば、2つの低活性の変異体であるDRN及びRRNは、KTG又はQRRのような強く切断するものと機能的ヘテロダイマーを与える(図13a及び13b)が、同じ弱い変異体の同時発現により、キメラ標的の切断は検出できなかった。
【０１２３】
実施例6：組み立てられたヘテロダイマーによる天然DNA標的の切断
A) 材料及び方法
a) ゲノム調査
I-CreI変異型により切断される可能性がある天然標的は、パターンcaaaacnnnnnnnnnngttttg (ここで、nはa、t、c又はgである) (配列番号78)と一致するゲノム配列について公共のデータベースをスキャンすることにより同定した。天然標的DNA配列caaaactatgtagagggttttg (配列番号75)は、マウス染色体17で同定された。
このDNA配列は、それぞれ配列tcaaaactatgtgaatagttttga (配列番号76)及びtcaaaaccctgtgaagggttttga (配列番号77)を切断する2つのI-CreI変異型の組み合わせにより切断される可能性がある。
【０１２４】
b) メガヌクレアーゼ変異型の単離
変異型は、標的として配列tcaaaactatgtgaatagttttga (配列番号76)又は配列tcaaaaccctgtgaagggttttga (配列番号77)を用いて、実施例1に記載するようにして、酵母における切断誘発組換えアッセイにより選択した。
【０１２５】
c) 標的プラスミドの構築
オリゴヌクレオチドは、各変異パリンドロームの2つの異なるハーフサイトを含むように設計した(PROLIGO)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製された二本鎖標的DNAを、Gateway法(INVITROGEN)を用いて、以前に記載された(Epinatら, 既出)哺乳動物レポーターベクターpcDNA3.1-LACURAZ-ΔURAにクローニングして、標的LagoZプラスミドを作製した。
【０１２６】
d) メガヌクレアーゼ発現ベクターの構築
酵母におけるスクリーニングの間に同定されたクローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、酵母コロニー上でPCRにより増幅し、別個にCHO発現ベクターpCDNA6.2 (INVITROGEN)に、実施例1に記載するようにしてクローニングした。I-CreI変異型は、CMVプロモーターの制御下で発現させた。
【０１２７】
e) 哺乳動物細胞アッセイ
CHO-K1細胞を、等モル量の標的LagoZプラスミドと発現プラスミドとで一過的に同時トランスフェクションし、β-ガラクトシダーゼ活性を、実施例3及び5に記載するようにして測定した。
【０１２８】
B) 結果
I-CreI変異型により切断される可能性がある天然DNA標的は、パターンcaaaacnnnnnnnnnngttttg (配列番号78)に一致する配列のゲノム調査を行うことにより同定した。マウスの染色体17で同定された無作為に選択したDNA配列(配列番号78)を、レポータープラスミドにクローニングした。このDNA標的は、I-CreI変異型であるA44,R68,S70,N75 (ARS)及びK44,R68,E70,N75 (KRE)の組み合わせにより切断される可能性があった。
【０１２９】
CHO細胞におけるこれらの2つの変異系の同時発現は、図14に示すように機能的ヘテロダイマータンパク質の形成を導く。実際に、I-CreI変異型が個別に発現された場合に、KREタンパク質は残存活性を示したが、マウスDNA標的で切断活性は実質的に検出できなかった。これに対して、これらの2つの変異型が、可能性のある標的を有するプラスミドとともに同時発現されたときには、強いβ-ガラクトシダーゼ活性が測定できた。まとめると、これらのデータは、ヘテロダイマー化がCHO細胞内で起こり、ヘテロダイマーが機能的であることを明らかにした。
【０１３０】
これらのデータは、ホモダイマー変異型を組み立てることにより創られたヘテロダイマータンパク質が、天然にあるDNA標的配列のリストを、変異型の全ての可能な組み合わせから得られる全ての可能なハイブリッド切断標的に拡張することを証明する。
さらに、これらのデータは、ホモダイマーのそれらの個別のDNA標的がわかっていれば、変異型の組み合わせにより切断され得るDNA配列を予測することが可能であることを示す。さらに、標的の位置1及び2 (並びに−1及び−2)はgtacとは異なることができ、これらがDNA／タンパク質相互作用においてほとんど役割がないことを示唆する。
【０１３１】
【表２】
2008535484.tif 000009
【０１３２】
【表３】
2008535484.tif 000010
【０１３３】
【表４】
2008535484.tif 000011
【０１３４】
【表５】
2008535484.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】実験の基本原理を示す。
【図２Ａ】天然I-CreI標的(ここではC1234とよぶ、配列番号65)由来の2つのパリンドローム標的。
【図２Ｂ】64個の標的。
【図３ａ】変異型のスクリーニングを示す。
【図３ｂ】変異型のスクリーニングを示す。
【図４Ａ】I-CreI N75骨格タンパク質をコードするcDNA配列、及びUlib2ライブラリー構築に用いた縮重プライマーを表す。
【図４Ｂ】I-CreI N75骨格タンパク質をコードするcDNA配列、及びUlib2ライブラリー構築に用いた縮重プライマーを表す。
【図５】pCLS0542メガヌクレアーゼ発現ベクターマップを表す。
【図６】pCLS0042レポーターベクターマップを表す。
【図７】特異性が改変された292個のI-CreIメガヌクレアーゼ変異型の切断プロフィールを示す。
【図８】I-CreI変異型の切断パターンの8つの例を示す。
【図９ａ】野生型I-CreI (I-CreI)及びI-CreI N75 (QRR)タンパク質、並びにI-CreI N75タンパク質の7つの誘導体について酵母(左)及び哺乳動物細胞(右)における切断パターン。
【図９ｂ】インビトロでの切断。
【図１０】統計的分析を表す。
【図１１】ハイブリッド又はキメラ部位の例を示す。
【図１２】ヘテロダイマー変異型の切断活性を示す。
【図１３】ヘテロダイマー変異型の切断活性の定量的分析を表す。
【図１４】選択されたマウス染色体17 DNA標的に対する、組み立てられたヘテロダイマーARS-KREの活性を示す。
【図２Ｂ】
2008535484.tif 000019
【図２Ｂ】
2008535484.tif 000020
【図７．１】
2008535484.tif 000021
【図７．２】
2008535484.tif 000022
【図７．３】
2008535484.tif 000023
【図７．４】
2008535484.tif 000024
【図７．５】
2008535484.tif 000025
【図８】
2008535484.tif 000026
【図９ａ】
2008535484.tif 000027
【図１２】
2008535484.tif 000028
【図１３】
2008535484.tif 000029
【図１】
2008535484.tif 000030
【図２Ａ】
2008535484.tif 000031
【図３ａ】
2008535484.tif 000032
【図３ｂ】
2008535484.tif 000033
【図４Ａ】
2008535484.tif 000034
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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