(57)【要約】【課題】ケラチノサイトを介してメラノサイトのメラニン産生を抑制する素材の評価方法、及びそれから得られる美白素材を提供する。【解決手段】メラノサイトとケラチノサイトの共培養にて美白素材を添加し、より実際の皮膚に近い状態でメラニン産生抑制効果を評価する方法を確立する。また、確立した共培養方法を用い、ケラチノサイトを介してメラニン産生抑制効果を発現する美白素材を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチノサイトとメラノサイトの共培養から構成され両細胞間の相互作用の評価を可能とするメラニン産生抑制剤の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により選択された美白剤を含有する美白用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白素材のメラニン産生抑制効果の評価方法と、新規美白素材の選定およびそれを配合した化粧料の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに多くの美白成分が開発されてきたが、その評価方法は主に、マウス由来のＢ１６メラノーマ細胞の単培養系に美白素材を添加し、メラニン産生量の変化を測定するものであった（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
しかしながら、動物種がマウスであることや、メラノサイトのがん細胞であるメラノーマ細胞を用いていることから、ヒト皮膚のメラノサイトの反応とは異なる点が多い。また、メラノサイトのメラニン生成能は、周囲に存在するケラチノサイトが放出する種々の因子によって制御されていることも近年の皮膚科学の発展に伴い明らかとなっている（例えば、非特許文献２を参照）。従って、マウスメラノーマ細胞の単培養系による従来の方法では、実際のヒト皮膚で起こっているメラニン産生の現象を反映しているとは言い難い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｎｄｏ  Ｈ，  Ｆｕｎａｓａｋａ  Ｙ，  Ｏｋａ  Ｍ，  Ｏｈａｓｈｉ  Ａ，  Ｆｕｒｕｍｕｒａ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｎａｇａ  Ｊ，  Ｍａｔｓｕｎａｇａ  Ｎ，  Ｈｅａｒｉｎｇ  ＶＪ，  Ｉｃｈｉｈａｓｈｉ  Ｍ．  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４０：１３１２−１３１６，  １９９９．
【非特許文献２】Ｉｍｏｋａｗａ  Ｇ．  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐｉｇｍｅｎｔａｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １７：９６−１１０，  ２００４．
【非特許文献３】Ｓｗｏｐｅ  ＶＢ，  Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｅｋ  Ｚ，  Ｋａｓｓｅｍ  ＬＭ，  Ｎｏｒｄｌｕｎｄ  ＪＪ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  １  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ６  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ａｒｅ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９６：１８０−１８５，  １９９１．
【非特許文献４】Ｃｈｏｉ  Ｈ，  Ａｈｎ  Ｓ，  Ｌｅｅ  ＢＧ，  Ｃｈａｎｇ  Ｉ，  Ｈｗａｎｇ  ＪＳ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｌｅｐｉｄｉｕｍ  ａｐｅｔａｌｕｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＩＬ−６  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １８：４３９−４４６，  ２００５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の方法であるＢ１６マウス由来メラノーマ細胞による評価方法は、薬剤に対するメラニン産生量の増減が敏感に反応するため美白剤のスクリーニングには適している。しかしながら、ケラチノサイトが評価培養系に存在していないため、実際のヒトの皮膚で起こっているメラノサイトとケラチノサイトの相互作用によるメラニン産生の制御機構を再現することは不可能である。
【０００６】
そこで、本発明ではヒト皮膚由来のメラノサイトとケラチノサイトの共培養からなる新規メラニン産生抑制剤評価法を確立し、ケラチノサイトを介したメラニン産生抑制剤を提供する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
太陽紫外線が皮膚に照射されると、ケラチノサイトは紫外線から皮膚を防御するためエンドセリン１やステムセルファクターなどのメラニン産生促進因子を放出してメラノサイトを刺激する（例えば、非特許文献２を参照）。また、ケラチノサイトはインターロイキン６などのメラニン産生を逆に抑制する因子を同様に放出する（例えば、非特許文献３、非特許文献４を参照）。このように、メラノサイトのメラニン産生はケラチノサイトを介して制御されていることが知られている。本発明ではヒト皮膚由来のメラノサイトとケラチノサイトを同時に使用することで、上記のような実際にヒトへ使用した状態に近い効果の評価が行える事を特徴とする。
【０００８】
メラノサイトとケラチノサイトの共培養系で評価を行う事で、メラノサイトの単培養での評価だけでは得られなかったメラノサイトとケラチノサイトの間で情報交換されるメラニン産生制御因子を介したメラニン産生抑制効果を評価できることを特徴とする。また、それにより得られる美白素材を提供する。
【０００９】
上記のメラノサイトとケラチノサイトの共培養試験方法にて評価を行ったところ、植物エキスにメラノサイト単培養系では得られなかった高いメラニン産生抑制効果が確認された。
上記植物エキスの原料としてはエイジツ（学名：Ｒｏｓａ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ）、メリンジョ（学名：Ｇｎｅｔｕｍ  ｇｎｅｍｏｎ  Ｌｉｎｎ）、ブドウ（学名 ：Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ダイズ（学名：Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、カワラヨモギ(学名：Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ)、ウコン（学名：Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）、カンゾウ（学名：Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ）などがあげられるが本発明はこれにより限定されるものではない。
また植物エキス以外にもプロポリス、ローヤルゼリー、レスベラトロール、イオウ、セレブロシド、セラミド、モンモリロナイト、カオリン、海泥、ミロネクトン、花粉荷エキスなどがあげられるが本発明はこれにより限定されるものではない。
【００１０】
更には、上記メラニン産生抑制効果を持つ美白素材を有効成分として配合する化粧料組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
上記方法を用いることで、従来の方法では美白素材として評価出来なかった素材からメラニン産生抑制効果を見出す事が可能となり新規の美白素材の開発が行える。また、その美白素材を従来の美白化粧料素材と組み合わせることで相乗的な効果が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態に関し詳細に記載するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
【００１３】
正常ヒトメラノサイトを培養用６穴プレートに播種し、そこにハンギング型の微小孔フィルター（直径１μｍ孔、ミリポア製、ＰＩＲＰ３０Ｒ４８）を装着した。さらにその微小孔フィルターの中に正常ヒトケラチノサイトを播種し、両細胞が底面に接着するまで２４時間培養した。その後、培養液（ＧＩＢＣＯ製、添加剤ＨＭＧＳ−２含有Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４）を１０μｇ／ｍＬ濃度のエイジツエキスを含んだ培養液と交換し、６日間培養した。培地交換は中３日で実施した。微小孔フィルターを取り除いたのち培養プレートに生着したメラノサイトをトリプシン処理により回収し、細胞数をカウントした。遠沈して得た細胞ペレットをエタノール：エーテル＝１：１溶液で脱脂した後、細胞ペレットに１０％ＤＭＳＯ含有１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて８０℃１０分間処理で溶解した。細胞溶解液の吸光度（４９０ｎｍ）を測定し、細胞数あたりのメラニン量を算出した。また、ケラチノサイトが共存しないメラノサイトのみの単培養系でも同様にエイジツエキスのメラニン産生に及ぼす影響を評価した。
【実施例１】
【００１４】
図５より１０μｇ／ｍＬのエイジツエキスを含有した培養液で６日間培養したメラノサイトのメラニン産生量は、メラノサイトのみの単培養系ではメラニン産生抑制作用はほとんど認められなかったものの、ケラチノサイトとの共培養系ではエイジツエキスを処理していないコントロールの約６７％まで減少し、顕著なメラニン産生抑制作用が認められた。
【実施例２】
【００１５】
（製造例）各種組成物の製造
上記の評価結果に従い、以下にその処方例を示すが、各処方例は各製品の製造における常法により製造したもので良く、配合量のみを示した。又、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００１６】
（配合例１）化粧水  質量％
グリセリン  ４．００
エタノール  ８．００
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油  ０．２０
エイジツエキス  ０．５０
水溶性プラセンタエキス  １．００
防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル）   適量
クエン酸  ０．０３
クエン酸ナトリウム  ０．１０
精製水  残 余
【００１７】
（配合例２）乳液  質量％                                                          
流動パラフィン  ５．００
ワセリン  １．００
デカメチルシクロペンタシロキサン  ２．００
ステアリルアルコール  １．００
イソステアリン酸  ０．５０
ステアリン酸  ０．５０
モノステアリン酸グリセリル  １．００
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（６０Ｅ．Ｏ．）  ２．００
グリチルレチン酸ステアリル  ０．０５
酢酸トコフェロール  ０．１０
１，３−ブチレングリコール  ７．００
グリセリン  ５．００
エイジツエキス  ０．１０
防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル）  適量
カルボキシビニルポリマー  ０．１５
水酸化カリウム  ０．１０
精製水  残 余  
【００１８】
（配合例３）クリーム  質量％      
α−オレフィンオリゴマー  ８．００
ミツロウ  ２．００
トリエチルヘキサノイン  ３．００
ジメチコン（６ｃｓ）  ３．００
ベヘニルアルコール  ２．００
ステアリルアルコール  １．００
自己乳化型モノステアリン酸グリセリル  ２．００
モノミリスチン酸デカグリセリル  １．００
天然型ビタミンＥ  ０．０５
グリセリン  ５．００
ジプロピレングリコール  ５．００
エイジツエキス  ０．２５
フェノキシエタノール  ０．３５
防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル）  適量
グリチルリチン酸ジカリウム  ０．１０
エデト酸二ナトリウム  ０．０５
水素添加大豆リン脂質  ０．２５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体  ０．２０
Ｌ−アルギニン  ０．２２
香料  ０．０５
精製水  残 余  
【００１９】
（配合例４）パック  質量％    
１，３−ブチレングリコール  ５．００
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油  ０．５０
ポリビニルアルコール  １０．００
カルボキシメチルセルロースナトリウム  ３．００
エイジツエキス  ０．５０
エタノール  １２．００
フェノキシエタノール  ０．３０
精製水  残 余  
【００２０】
（配合例５）パウダー  質量％    
タルク  ７９．９９
カオリン  ５．００
酸化チタン  ３．００
ミリスチン酸亜鉛  ５．００
セリサイト  ７．００
エイジツエキス  ０．０１
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明におけるメラノサイトとケラチノサイトの共培養に用いる細胞培養プレートのシステム構成図。
【００２２】
【図２】本発明におけるメラノサイトとケラチノサイトの共培養の試験方法のスキーム図。
【００２３】
【図３】本発明におけるメラノサイトの単培養に用いる細胞培養プレートのシステム構成図。
【００２４】
【図４】本発明におけるメラノサイトの単培養の試験方法スキーム図。
【００２５】
【図５】実施例１において得られた、エイジツエキスを添加した共培養（Ａ）および単培養（Ｂ）によるメラニン産生抑制効果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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