(57)【要約】  本発明は、特に過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質を阻害することによる、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を調節するための組成物及び方法を提供するものである。
2008535821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドのｃ-ｍｅｔシグナル伝達活性を阻害するアンタゴニストであって、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドがエキソン１４の少なくとも一部を欠失しているために野生型のｃ-ｍｅｔに比べてその分解が減少しており、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドがｃ-ｍｅｔシグナル伝達活性を有するものである、アンタゴニスト。
【請求項２】
前記アンタゴニストが、ヒトｃ-ｍｅｔのエキソン１３とエキソン１５のインフレームスプライシングにより形成されるエピトープに結合する抗体である、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドのエキソン１４の少なくとも一部が欠失している、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、エキソン１３がエキソン１５にスプライスされているｃ-ｍｅｔのスプライス変異体をコードする核酸分子からの発現を優位に抑制する抑制性ＲＮＡである、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
前記アンタゴニストによるｃ-ｍｅｔシグナル伝達活性の抑制が過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質の細胞性分解の亢進を含むものである、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
前記アンタゴニストが毒素に結合している、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
前記アンタゴニストが野生型ｃ-ｍｅｔポリペプチドを特異的に結合しない、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
前記アンタゴニストが野生型ｃ-ｍｅｔポリペプチド活性を実質的に阻害しない、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
被検体の腫瘍の治療方法であって、請求項１ないし８の何れか一に記載のアンタゴニストが被検体に投与されることを含み、これによって腫瘍が治療される方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを含むことが決定されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍が、エキソン１４の少なくとも一部を欠失している変異形ｃ-ｍｅｔを含むことが決定されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
レセプタータンパク質分解を誘導する薬剤と組み合わせて前記アンタゴニストが投与されることを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(出願について)
この出願は、米国特許法規則１.５３(ｂ)(１)に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法１１９(ｅ)に基づき、2005年3月25日に出願の仮出願第60/665,482号の優先権を主張し、出典明記によりここにその内容全体を援用するものである。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、一般に、分子生物学及び増殖因子調節の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の修飾因子と該修飾因子の使用に関する。
【０００３】
(発明の背景)
ＨＧＦは、多くの異なる種類の細胞に対して分裂促進活性、細胞運動促進活性及び形態形成活性を有する肝葉由来の多能性因子である。ＨＧＦ作用は特定のチロシンキナーゼであるｃ-ｍｅｔに媒介されており、異常なＨＧＦ及びｃ-ｍｅｔの発現は様々な腫瘍において観察されることが多い。例としてMaulik ら, Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59、 Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7): 863-867を参照。ＨＧＦ／ｃ-Ｍｅｔシグナル伝達経路の調節機能は腫瘍発達及び転移に関係する。例としてTrusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300を参照。
【０００４】
ＨＧＦは、Ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の細胞外ドメインを結合して、多様な生物学的プロセス、例えば細胞分散、増殖及び生存を制御する。ＨＧＦ-Ｍｅｔシグナル伝達は、正常な胚発生、特に筋肉始原細胞の移動と肝臓及び神経系の発達に必須である(Bladt 等, Nature (1995), 376, 768-771；Hamanoue 等, Faseb J (2000), 14, 399-406；Maina 等, Cell (1996), 87, 531-542；Schmidt 等, Nature (1995), 373, 699-702；Uehara 等, Nature (1995), 373, 702-705)。ＭｅｔノックアウトマウスとＨＧＦノックアウトマウスの発生上の表現型は非常に類似しており、ＨＧＦがＭｅｔレセプターの同種リガンドであることが示唆される(Schmidt 等, 1995, 上掲；Uehara 等, 1995, 上掲)。また、ＨＧＦ-Ｍｅｔは、肝再生、血管新生及び創傷治癒の役割も担っている(Bussolino 等, J Cell Biol (1992), 119, 629-641；Matsumoto及びNakamura, Exs (1993), 65, 225-249；Nusrat 等, J Clin Invest (1994) 93, 2056-2065)。Ｍｅｔレセプター前駆体は、タンパク質分解的切断により、ジスルフィド結合により結合する細胞外αサブユニットと膜架橋βサブユニットとなる(Tempest 等, Br J Cancer (1988), 58, 3-7)。βサブユニットは細胞質キナーゼドメインを含有しており、アダプタータンパク質が結合してシグナル伝達を開始する多基質ドッキング部位をＣ末端に有している(Bardelli 等, Oncogene (1997), 15, 3103-3111；Nguyen 等, J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819；Pelicci 等, Oncogene (1995), 10, 1631-1638；Ponzetto 等, Cell (1994), 77, 261-271；Weidner 等, Nature (1996), 384, 173-176)。ＨＧＦが結合すると、Ｇａｂ１及びＧａｂ２/ＳｏｓがＰＩ３キナーゼ及びＲａｓ/ＭＡＰＫそれぞれの活性化を媒介することによって、Ｍｅｔが活性化され、チロシンリン酸化及び下流へのシグナル伝達が起こり、細胞運動及び細胞増殖が促進される(Furge 等, Oncogene (2000), 19, 5582-5589；Hartmann 等, J Biol Chem (1994), 269, 21936-21939；Ponzetto 等, J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123；Royal 及び Park, J Biol Chem (1995), 270, 27780-27787)。
【０００５】
Ｍｅｔは、発癌物質処理した骨肉腫細胞株においてトランスフォーミングすることが示された(Cooper 等, Nature (1984), 311, 29-33；Park 等, Cell (1986), 45, 895-904)。Ｍｅｔの過剰発現又は遺伝子増幅は、様々なヒト癌において観察されている。例えば、Ｍｅｔタンパク質は、結腸直腸癌において少なくとも５倍過剰発現しており、肝転移巣における遺伝子増幅も報告されている(Di Renzo 等, Clin Cancer Res (1995), 1, 147-154；Liu 等, Oncogene (1992), 7, 181-185)。また、Ｍｅｔタンパク質は、経口扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、腎臓細胞上皮癌、胸部上皮癌及び肺上皮癌において過剰発現することが報告されている(Jin 等, Cancer (1997), 79, 749-760；Morello 等, J Cell Physiol (2001), 189, 285-290；Natali 等, Int J Cancer (1996), 69, 212-217；Olivero 等, Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868；Suzuki 等, Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868)。加えて、ｍＲＮＡの過剰発現は、肝細胞癌、胃上皮癌及び結腸直腸上皮癌において観察されている(Boix 等, Hepatology (1994), 19, 88-91；Kuniyasu 等, Int J Cancer (1993), 55, 72-75；Liu 等, Oncogene (1992), 7, 181-185)。
【０００６】
Ｍｅｔのキナーゼドメインの多くの突然変異は、腎臓乳頭上皮癌において観察され、恒常的なレセプター活性化を引き起こしている(Olivero 等, Int J Cancer (1999), 82, 640-643；Schmidt 等, Nat Genet (1997), 16, 68-73；Schmidt 等, Oncogene (1999), 18, 2343-2350)。これらの活性化突然変異により恒常的なＭｅｔチロシンリン酸化が起こり、その結果ＭＡＰＫ活性化、フォーカス形成及び腫瘍形成が生じる(Jeffers 等, Proc Natl Acad Sci U S A (1997), 94, 11445-11450)。加えて、これらの突然変異は細胞運動及び浸潤を亢進する(Giordano 等, Faseb J (2000), 14, 399-406；Lorenzato 等, Cancer Res (2002), 62, 7025-7030)。形質転換細胞のＨＧＦ依存性Ｍｅｔ活性化は、転移、拡散及び移動性の増加を媒介し、最終的に浸潤性腫瘍増殖及び転移を引き起こす(Jeffers 等, Mol Cell Biol (1996), 16, 1115-1125；Meiners 等, Oncogene (1998), 16, 9-20)。
【０００７】
Ｍｅｔは、レセプター活性化、形質転換及び浸潤を作動する他のタンパク質と相互作用することが示されている。新生細胞において、Ｍｅｔは、ラミニンなどの細胞外基質(ＥＣＭ)構成成分のレセプターであるα６β４インテグリンと相互作用して、ＨＧＦ依存性浸潤性増殖を促進することが報告されている(Trusolino 等, Cell (2001), 107, 643-654)。加えて、Ｍｅｔの細胞外ドメインは、セマフォリンファミリーのメンバーであるプレキシンＢ１と相互作用して、浸潤性増殖を増やすことが示されている(Giordano 等, Nat Cell Biol (2002), 4, 720-724)。さらに、腫瘍形成及び転移に関係しているＣＤ４４ｖ６は、Ｍｅｔ及びＨＧＦと複合体を形成して、Ｍｅｔレセプター活性化を引き起こすことも報告された(Orian-Rousseau 等, Genes Dev (2002), 16, 3074-3086)。
【０００８】
Ｍｅｔは、Ron 及び Seaを含むレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)のサブファミリーのメンバーである(Maulik 等, Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13, 41-59)。Ｍｅｔの細胞外ドメイン構造の予測から、セマフォリン及びプレキシンとの相同性の共有が示唆される。ＭｅｔのＮ末端は、すべてのセマフォリン及びプレキシンにおいて保存されるおよそ５００のアミノ酸のセマドメインを含有する。セマフォリン及びプレキシンは、神経発達における役割について最初に記載された、分泌型及び膜結合型のタンパク質の大きなファミリーに属する(Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999),l 9, R201-204)。しかしながら、最近では、セマフォリン過剰発現は腫瘍浸潤及び転移と相関している。プレキシン、セマフォリン及びインテグリンにおいてみられるシステインリッチＰＳＩドメイン(Ｍｅｔ関連配列ドメインとも称される)は、プレキシン及び転写因子にみられるイムノグロブリン様領域である４つのＩＰＴリピートが続くセマドメインに近接して存在する。最近の研究では、Ｍｅｔセマドメインが十分にＨＧＦ及びヘパリンに結合することが示唆される(Gherardi 等, Proc Natl Acad Sci U S A (2003), 100(21):12039-44)。
【０００９】
上記したように、Ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼはその同種リガンドであるＨＧＦによって活性化され、レセプターリン酸化はＭＡＰＫ、ＰＩ-３キナーゼ及びＰＬＣ-ｇ(１、２)の下流の経路を活性化する。下流のシグナル伝達経路の活性化を媒介するために、キナーゼドメイン内のY1234／Y1235のリン酸化はＭｅｔキナーゼ活性化に重要であるのに対して、多基質ドッキング部位のY1349及びY1356はｓｒｃホモロジー-２(ＳＨ２)、ホスホチロシン結合(ＰＴＢ)及びＭｅｔ結合ドメイン(ＭＢＤ)タンパク質(３−５)の結合に重要である。更なる膜近傍リン酸化部位であるY1003は、Ｃｂｌ Ｅ３-リガーゼのチロシンキナーゼ結合(ＴＫＢ)ドメインに対するその結合にとても特徴があるとされている(６、７)。Ｃｂｌ結合は、エンドフィリン媒介性レセプターエンドサイトーシスであるユビキチン化と、その後のレセプター分解を起こすことが報告される(８)。このレセプター下方制御のメカニズムは、類似のＣｂｌ結合部位も有するＥＧＦＲファミリーにおいて既に開示されている(９−１１)。
【００１０】
Ｍｅｔ及びＨＧＦの調節不全は様々な腫瘍において報告されている。リガンド作動性Ｍｅｔ活性化はいくつかの癌において観察されている。血清及び腫瘍内ＨＧＦの上昇は、肺癌、乳癌及び多発性骨髄腫において観察される(１２−１５)。Ｍｅｔ及び／又はＨＧＦの過剰発現、Ｍｅｔ遺伝子増幅又は突然変異は、結腸直腸癌、肺癌、胃癌及び腎臓癌などの様々な癌において報告されており、リガンド非依存性レセプター活性化を起こすと考えられる(２、１６)。加えて、肝臓マウスモデルにおけるＭｅｔの誘導性過剰発現が肝細胞癌を生じさせることから、レセプター過剰発現がリガンド非依存性の腫瘍形成を起こすことが示される(１７)。癌におけるＭｅｔの関連を最も強く表す所見は家族性の散発性腎臓乳頭上皮癌(ＲＰＣ)患者において報告される。レセプターの恒常的活性化を引き起こすＭｅｔのキナーゼドメインの突然変異は、ＲＰＣの生殖細胞系及び体細胞の突然変異として同定された(１８)。トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの突然変異の導入により腫瘍形成及び転移が引き起こされる。(１９)。
【００１１】
Ｍｅｔキナーゼドメインの役割が詳細に調査され、おそらくＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔの発現レベルの増加がいくつかの癌の発達の根底にあることが理論付けられているにもかかわらず、ｃ-ｍｅｔの非キナーゼドメインの生物学的な役割の直接的な証拠は欠けている。実際、様々な腫瘍性症状の病因に関係しているにもかかわらず、ＨＧＦ／-ｃ-ｍｅｔ経路は治療的な標的とすることが難しい経路であった。主に、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔの調節不全により腫瘍形成が生じる作用のメカニズムに関しての理解が欠けているために、この努力はなされていない。したがって、ｃ-ｍｅｔ関連の作用の発癌メカニズムを十分に理解することがとても必要であることは明らかである。本明細書において提供される発明は、この必要性を満たして他の利点を提供するものである。
特許出願及び刊行物を含む、本明細書中で引用したすべての文献は、出典明記によってそれらの全体を援用する。
【００１２】
(発明の開示)
本発明は、特定のヒトの腫瘍が細胞内の下方制御の速度を低減するが細胞シグナル伝達できる変異したｃ-ｍｅｔタンパク質を発現するという新規の発見に少なくとも一部が基づいている。これらの「過剰に安定化した」ｃ-ｍｅｔタンパク質は野生型ｃ-ｍｅｔに比べて発癌活性が増加していることが明らかとなった。本明細書中で示されるように、これらの腫瘍は抗ｃ-ｍｅｔ阻害剤により阻害されうる。過剰に安定化したｃ-ｍｅｔ活性の阻害により多くの治療的有用性が生じる。例えば、これらｃ-ｍｅｔ変異体は特に発癌性があるので、その阻害を標的とすることにより、それら変異体により生じる腫瘍形成を減少することが期待される。さらに、ｃ-ｍｅｔは正常細胞を含め多くの細胞種類にみられるので、腫瘍特異的ｃ-ｍｅｔ変異体を特異的に標的とする能力は、例えばｃ-ｍｅｔ阻害治療の副作用を低減する際に特に有用である。本発明は、本明細書中に記載の発見に基づく方法及び組成物を提供し、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを有する腫瘍のターゲティング及び／又は治療に有用である。
【００１３】
一態様では、本発明は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに特異的に結合できる物質を提供する。一実施態様では、物質は過剰に安定化したｃ-ｍｅｔと関係する生物学的な活性に対して阻害活性を含んでなる。他の実施態様では、物質は過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに特異的に結合できる。一実施態様では、物質は過剰に安定化したｃ-ｍｅｔと結合し、ｃ-ｍｅｔ活性を阻害する。一実施態様では、物質は、ｃ-ｍｅｔ活性を実質的に阻害することなく過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに結合する。これらの物質は、例えば過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを発現する細胞へ治療剤をターゲティングするための分子としてなどの様々な使用を提供するものである。治療剤には、本明細書中に記載の何れかの薬剤、例えば毒素が含まれる。物質は、抗体-薬剤コンジュゲート及び融合ポリペプチドの形態など、任意の好適な形態でありうる。
一態様では、本発明は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質と関係しているＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達を崩壊させるｃ-ｍｅｔアンタゴニストを提供する。一実施態様では、本発明は、ヒトの過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドのｃ-ｍｅｔシグナル伝達活性を阻害するアンタゴニストであって、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドがエキソン１４の少なくとも一部を欠失しているために、野生型のｃ-ｍｅｔに比べて細胞における分解の速度が減少しており、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドがｃ-ｍｅｔシグナル伝達活性を有するものであるアンタゴニストを提供する。
【００１４】
本発明のアンタゴニストは、本明細書中に記載の過剰に安定化したｃ-ｍｅｔ分子の活性を特異的に阻害できる任意の形態であってよい。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは抗体を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、ｃ-ｍｅｔのエキソン１３とエキソン１５のインフレームスプライシングにより形成されるエピトープに特異的に結合する。一実施態様では、エキソン１４の少なくとも一部が、前記のインフレームスプライシングの結果、欠失される。他の態様では、本発明のアンタゴニストはアプタマーを含んでなる。一実施態様では、本発明のアプタマーは、ｃ-ｍｅｔのエキソン１３とエキソン１５のインフレームスプライシングにより形成されるエピトープに特異的に結合する。一実施態様では、エキソン１４の少なくとも一部が、前記のインフレームスプライシングの結果、欠失される。一態様では、本発明のアンタゴニストは、エキソン１３がエキソン１５にスプライスされているｃ-ｍｅｔのスプライス変異体をコードする核酸分子からの発現を優位に／選択的に阻害する抑制性ＲＮＡを含んでなる。一実施態様では、核酸は、変異形スプライシングの結果、エキソン１４の少なくとも一部が欠失している過剰に安定化したｃ-ｍｅｔをコードする。一態様では、本発明は、エキソン１３がエキソン１５にスプライスされているｃ-ｍｅｔのスプライス変異体をコードする核酸分子を優位に／選択的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるアンタゴニストを提供する。一実施態様では、核酸分子は、変異形スプライシングの結果、エキソン１４の少なくとも一部が欠失している過剰に安定化したｃ-ｍｅｔをコードする。
【００１５】
ｃ-ｍｅｔ活性の阻害が、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの生物学的活性が細胞内で低減される限り、当分野で公知の多くの方法の何れかで生じうる。例えば、一実施態様では、本発明のアンタゴニストによるｃ-ｍｅｔ活性の阻害は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質の細胞性分解の促進を含む。他の実施態様では、本発明のアンタゴニストによるｃ-ｍｅｔ活性の阻害は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質のリン酸化の阻害を含む。更なる他の実施態様では、本発明のアンタゴニストによるｃ-ｍｅｔ活性の阻害は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔによるＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路のメンバーのリン酸化の阻害を含む。また、本発明のアンタゴニストによるｃ-ｍｅｔ活性の阻害は、細胞における過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドのレベルの減少によって生じられうる。したがって、例えば、一実施態様では、本発明のアンタゴニストによるｃ-ｍｅｔ活性の阻害は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質の発現、例えば過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからの転写及び／又は翻訳の阻害を含む。他の実施態様では、本発明のアンタゴニストによるｃ-ｍｅｔ活性の阻害は、細胞中の過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに特異的に結合する分子に結合される細胞毒素(例えば抗体-薬剤コンジュゲート)に関連した細胞死を含む。
一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異的抗体又は単鎖抗体である。本発明の方法に用いるアンタゴニストは、場合によっては、増殖阻害剤又は細胞障害性剤、例えば毒素、例としてメイタンシノイドないしカリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素などにコンジュゲートしていてもよい。本発明の方法のいくつかの実施態様では、化学療法剤もまた、被検体に投与される。
【００１６】
一般に、有効なｃ-ｍｅｔアンタゴニストには、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに対するＨＧＦなどのリガンドの結合を阻害するｃ-ｍｅｔインヒビターが含まれる。例えば、ｃ-ｍｅｔインヒビターはｃ-ｍｅｔへのＨＧＦの結合が阻害されるように過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに結合してもよい。一実施態様では、アンタゴニスト抗体は、キメラ抗体、例えば異種性の非ヒト配列、ヒト配列又はヒト化配列(例えばフレームワーク及び／又は定常ドメイン配列)に移植した非ヒトドナーの抗原結合配列を含有する抗体である。一実施態様では、非ヒトドナーはマウスである。一実施態様では、抗原結合配列は、例えば突然変異誘発(例えばファージディスプレイスクリーニングなど)によって得られるような合成のものである。一実施態様では、本発明のキメラ抗体は、マウスのＶ領域及びヒトＣ領域を有する。一実施態様では、マウスの軽鎖Ｖ領域は、ヒトカッパ軽鎖に融合される。一実施態様では、マウスの重鎖Ｖ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｃ領域に融合される。一実施態様では、抗原結合配列は、軽鎖及び／又は重鎖の少なくとも１つか、少なくとも２つか、あるいは３つすべてのＣＤＲを含有する。一実施態様では、抗原結合配列は重鎖ＣＤＲ３を含有する。一実施態様では、抗原結合配列は、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統によって産生されるモノクローナル抗体の可変ドメイン配列及び／又はＣＤＲの一部又はすべてを含有する。一実施態様では、抗原結合配列は、少なくともハイブリドーマ細胞系統１Ａ３.３.１３又は５Ｄ５.１１.６によって産生されるモノクローナル抗体の重鎖のＣＤＲ３を含有する。本発明のヒト化抗体には、ＦＲ内にアミノ酸置換を有するものと移植されたＣＤＲ内に変異を有する親和性成熟変異形が含まれる。ＣＤＲ又はＦＲ内の置換されたアミノ酸は、ドナー又はレシピエントの抗体に存在するものに限定されない。他の実施態様では、本発明の抗体は更に、亢進したＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ機能及びＢ細胞殺傷を含む改良されたエフェクター機能を引き起こすＦｃ領域内のアミノ酸残基の変異を有する。本発明の他の抗体には、安定性を改善する特定の変異を有するものが含まれる。また、本発明の抗体は、生体内でＡＤＣＣ機能を改善したフコース欠陥変異形が含まれる。
【００１７】
一実施態様では、本発明の抗体断片は、SYWLH(配列番号：１)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(配列番号：２)及びYGSYVSPLDY(配列番号：３)からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つないしは３つすべてのＣＤＲ配列を含有する重鎖を具備する抗原結合アームを含有してなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列SYWLHを有する重鎖ＣＤＲ-Ｈ１を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列MIDPSNSDTRFNPNFKDを有する重鎖ＣＤＲ-Ｈ２を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列YGSYVSPLDYを有する重鎖ＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体断片は、KSSQSLLYTSSQKNYLA(配列番号：４)、WASTRES(配列番号：５)及びQQYYAYPWT(配列番号：６)からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＣＤＲ配列を含有する軽鎖を具備する抗原結合アームを含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列KSSQSLLYTSSQKNYLAを有する重鎖ＣＤＲ-Ｌ１を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列WASTRESを有する重鎖ＣＤＲ-Ｌ２を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列QQYYAYPWTを有する重鎖ＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体断片は、SYWLH(配列番号：１)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(配列番号：２)及びYGSYVSPLDY(配列番号：３)からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＣＤＲ配列を含有する重鎖と、KSSQSLLYTSSQKNYLA(配列番号：４)、WASTRES(配列番号：５)及びQQYYAYPWT(配列番号：６)からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＣＤＲ配列を含有する軽鎖を具備する抗原結合アームを含んでなる。
【００１８】
本発明は、ヒトの過剰に安定化したｃ-ｍｅｔ又はその抗原結合断片を結合するヒト化アンタゴニスト抗体を提供するものであり、該抗体は生体内の過剰に安定化したＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性の阻害効果を有し、該抗体は、Ｈ鎖可変領域(ＶＨ)内に、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統によって産生されるモノクローナル抗体の少なくともＣＤＲ３配列と、実質的なヒトのコンセンサス配列(例えば、ヒト重鎖サブグループIII(ＶＨIII)の実質的なヒトコンセンサスフレームワーク(ＦＲ)残基)を含んでなる。一実施態様では、抗体は更に、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統株によって産生されるモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲ1配列及び／又はＣＤＲ２配列を含んでなる。他の実施態様では、前記抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統株によって産生されるモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及び／又はＣＤＲ３配列を、ヒト軽鎖κサブグループＩ(ＶκI)の実質的なヒトコンセンサスフレームワーク(ＦＲ)残基と共に含んでなる。
【００１９】
一実施態様では、本発明の抗体断片は、以下の配列を有する重鎖可変ドメインを含有してなる抗原結合アームを含んでなる：
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS (配列番号：７)
一実施態様では、本発明の抗体断片は、以下の配列を有する軽鎖可変ドメインを含有してなる抗原結合アームを含んでなる：
DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (配列番号：８)
【００２０】
いくつかの例では、ｃ-ｍｅｔへのリガンド(例えばＨＧＦ)の結合に干渉しないｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有することが有利であり得る。したがって、いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔのリガンド(例えばＨＧＦ)結合部位に結合しない。他の実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔへのリガンド(例えばＨＧＦ)結合を実質的に阻害しない。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔへの結合について、リガンド(例えばＨＧＦ)と実質的に競合しない。一例では、本発明のアンタゴニストは、一又は複数の他のアンタゴニストとの結合に使用可能で、ここでアンタゴニストはＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ軸内における種々のプロセス及び／又は機能を標的にする。よって、一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、他のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト、例えばアメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ細胞系統により産生されるモノクローナル抗体のＦａｂ断片が結合するエピトープとは異なる、ｃ-ｍｅｔ上のエピトープに結合する。他の実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ細胞系統により産生されるモノクローナル抗体のＦａｂ断片とは異なる(すなわちそれではない)。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ細胞系統により産生される抗体のｃ-ｍｅｔ結合配列を含まない。一実施態様では、本発明のアンタゴニストはｃ-ｍｅｔ活性を阻害するが、ｃ-ｍｅｔの野生型膜近傍ドメインには結合しない。
【００２１】
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストの一実施態様では、ｃ-ｍｅｔに対するアンタゴニストの結合はＨＧＦによるｃ-ｍｅｔ活性化を阻害する。本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストの一実施態様では、細胞中でのｃ-ｍｅｔに対するアンタゴニストの結合は、細胞の増殖、拡散、形態形成及び／又は運動性を阻害する。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは細胞中の過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに結合して、細胞死を生じさせる。例えば、一実施態様では、アンタゴニストは本明細書中に記載の毒素に結合されている。
いくつかの実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、ペプチド(例えばオリゴペプチド)、抗体、抗体断片、アプタマー、オリゴヌクレオチド(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)、抑制性ＲＮＡ、又はこれらの組合せであるか、又はこれらを含んでなる。
いくつかの実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、本明細書中に記載の本発明のスクリーニング又は同定方法によって得られる。
【００２２】
他の態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストのスクリーニング方法又は同定方法を提供する。ある例では、前記方法は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの少なくとも一部を含んでなる標的分子と候補物質を接触させることを含み、これによって該標的分子を特異的に結合する物質(ｃ-ｍｅｔアンタゴニストなど)が選択される。一実施態様では、この方法は、選択された候補物質が過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの変異した領域に特異的に結合することを決定することをさらに含む。例えば、標的分子がポリペプチドを含んでなる場合、選択された候補物質は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの変異した位置(又は領域)を含有するエピトープに特異的に結合するであろう。他の例では、標的分子が過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの少なくとも一部をコードする核酸を含んでなる場合、選択された候補物質は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔをコードする核酸からの過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質の発現を特異的に阻害するであろう。いくつかの実施態様では、本発明のスクリーニング方法は過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを発現する細胞を選択された物質と接触させることを更に含み、このとき細胞におけるｃ-ｍｅｔ活性の阻害が評価されるものである(例えば、下流のｃ-ｍｅｔシグナル伝達(例えばＭＡＰＫリン酸化)の程度が検出されるか又は数量化される)。ｃ-ｍｅｔシグナル伝達活性の阻害は、当分野で公知の様々な方法で検定されてもよく、当分野で公知の様々な判定基準の何れかに基づくものであり、そのいくつかは本明細書においてより詳細に記述される。例えば、ｃ-ｍｅｔシグナル伝達活性の阻害は、ｃ-ｍｅｔ活性化の量の減少により示されてもよく、代わりに、例えば、細胞内のｃ-ｍｅｔ関連の細胞シグナル伝達の量により示されてもよい。細胞シグナル伝達は様々な方法により評価されてもよく、様々な判定基準に基づくものであり、これらは当分野で公知であり、そのいくつかは本明細書に記述される。例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路における細胞シグナル伝達の発生は、シグナル伝達経路中の標的分子のリン酸化における変化の形態で生物学的に表されうる。ゆえに、例えば、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路における一又は複数の公知のリン酸化標的と関係しているタンパク質リン酸化の量を測定できる。このようなリン酸化標的の例には、ｃ-ｍｅｔ自体と分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)などがある。
【００２３】
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数ののアンタゴニスト及び担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能である。
一態様では、本発明は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか又はポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を含んでなるｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体ないしその断片であるか又は抗体ないしその断片を含んでなるｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする。一実施態様では、本発明の核酸はアプタマーである。一実施態様では、本発明の核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施態様では、本発明の核酸は抑制性ＲＮＡ(例えば小干渉ＲＮＡ)である。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ベクターは、例えば発現ベクターなどの組み換えベクターなど、任意の種類のものでよい。任意の様々な宿主細胞が使われてもよい。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳類の細胞である。
【００２４】
一態様では、本発明は、本発明のアンタゴニストの作製方法を提供する。例えば、本発明は、抗体(ないしその断片)であるか又は抗体(ないしその断片)を含んでなるｃ-ｍｅｔアンタゴニストの作製方法であって、該抗体(ないしその断片)をコードする本発明の組み換えベクターを適切な宿主細胞内で発現させ、該抗体を回収することを含む方法を提供する。他の例では、本発明は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか又はポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を含んでなるｃ-ｍｅｔアンタゴニストの作製方法であって、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)をコードする本発明の組み換えベクターを適切な宿主細胞内で発現させ、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を回収することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、容器と、容器内に具備される組成物を含んでなる製造品であって、該組成物が本発明の一又は複数のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有するものである製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有してなる。一実施態様では、アンタゴニストを含有してなる組成物は担体を更に含み、いくつかの実施態様では、その担体は薬学的に受容可能である。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えばアンタゴニスト)を投与することについての指示書を更に具備する。
【００２５】
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有してなる組成物を具備する第一容器と、バッファを具備する第二容器を有するキットを提供する。一実施態様では、バッファは薬学的に受容可能である。一実施態様では、アンタゴニストを含有してなる組成物は担体を更に含み、いくつかの実施態様では、この担体は薬学的に受容可能である。一実施態様では、キットは、被検体に組成物(例えばアンタゴニスト)を投与することについての指示書を更に含む。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置のための医薬の製造における本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストの使用を提供する。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、抗体、抗体断片、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)、核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性ＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド)、アプタマー、又はこれらの組合せを含む本明細書中に記載の何れかの形態であってもよい。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。
【００２６】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の製造品の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。
【００２７】
本発明は、ｃ-ｍｅｔの遅発性下方制御と関係しているＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達軸の調節不全と関係している疾患状態を調整するために有用な方法及び組成物を提供する。ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路は、例えば細胞増殖及び血管新生を含む複数の生物学的かつ生理学的な機能に関与する。ゆえに、一態様では、本発明は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを標的とするアンタゴニストが被検体に投与されることを含み、それによってＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達が調整される方法を提供する。
一態様では、本発明は被検体の腫瘍の治療方法であって、本発明のアンタゴニストを被検体に投与することを含み、それによって腫瘍が治療される方法を提供する。一実施態様では、腫瘍は過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを含むことが決定される。一実施態様では、腫瘍は、エキソン１４の少なくとも一部を欠失している変異ｃ-ｍｅｔを含むことが決定される。
本発明の方法の一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔインヒビターは、レセプタータンパク質分解を誘導及び／又は促進する薬剤と組み合わせて投与される。
【００２８】
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法であって、有効量の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストと細胞又は組織を接触させることを含み、これによってｃ-ｍｅｔ活性化と関係している細胞増殖が阻害される方法を提供する。
一態様では、本発明は、被検体のｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全に伴う病理的な症状の治療方法であって、有効量の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストが被検体に投与されることを含み、これによって該症状が治療される方法を提供する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方を発現する細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞と本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを接触させることを含み、これによって該細胞の増殖が抑制される方法を提供する。一実施態様では、細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
【００２９】
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方を発現する細胞を含有する癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストが該哺乳動物に投与されることを含み、これによって該哺乳動物が有効に治療される方法を提供する。一実施態様では、細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方の発現ないし活性の増加に関連する細胞増殖性疾患の治療又は予防方法であって、有効量の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストが該哺乳動物に投与されることを含み、これによって該細胞増殖性疾患が有効に治療又は予防される方法を提供する。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
一態様では、本発明は、細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞の増殖がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方の増殖促進作用に少なくとも一部が依存しているものであって、有効量の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストと該細胞を接触させることを含み、これによって該細胞の増殖が抑制される方法を提供する。一実施態様では、細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
【００３０】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療方法であって、該腫瘍の増殖がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方の増殖促進作用に少なくとも一部が依存しているものであって、有効量の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストと該細胞を接触させることを含み、これによって該腫瘍が有効に治療される方法を提供する。一実施態様では、細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
本発明の方法は、任意の適切な病理学的状態、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節不全を伴う細胞及び／又は組織に作用するために用いてもよい。一実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞(例えば、甲状腺のもの)、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、リンパ腫細胞、メラノーマ細胞及び白血病細胞からなる群から選択されるものであってもよい。一実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は、過剰増殖性細胞及び／又は過形成細胞である。一実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は転移性細胞である。
【００３１】
本発明の方法は付加的な処理工程を更に含んでもよい。例えば、一実施態様では、方法は、標的とする細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)が放射線治療及び／又は化学療法剤にさらされる工程を更に含む。
本明細書において記述されるように、ｃ-ｍｅｔ活性化は、その調節不全により多くの病理学的な症状が生じる重大な生物学的過程である。したがって、本発明の方法の一実施態様では、標的とする細胞(例えば癌細胞)は、ｃ-ｍｅｔの活性化が同じ組織起源の正常細胞と比較して亢進されているものである。一実施態様では、本発明の方法によって標的とする細胞の細胞死が生じる。例えば、本発明のアンタゴニストと接触することによってｃ-ｍｅｔ経路によるシグナル伝達が細胞で不可能となり、その結果、細胞死又は細胞増殖の抑制が生じる。他の例では、本発明のアンタゴニストは過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを発現する細胞に結合した毒素を仕向ける。
【００３２】
ｃ-ｍｅｔ活性化(及びそれによるシグナル伝達)の調節不全は、例えば、(遅発性下方制御／分解、発現レベルの増加などによる)ＨＧＦ(ｃ-ｍｅｔの同族リガンド)及び／又はｃ-ｍｅｔ自体の過剰発現を含む、多くの細胞の変化から生じるうる。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方が、同じ組織起源の正常細胞と比較して、細胞(例えば癌細胞)によってより多く発現される細胞を標的とすることを含む。ｃ-ｍｅｔ発現細胞は、様々な供給源からのＨＧＦによって、すなわち自己分泌様式又はパラ分泌様式で制御されうる。例えば、本発明の方法の一実施態様では、標的とした細胞は、異なる細胞内で発現される肝細胞増殖因子／異なる細胞による(例えば、パラ分泌によって)肝細胞増殖因子により接触される／結合される。前記の異なる細胞は、標的とする細胞と比較して同じ組織起源又は異なる組織起源のものであってもよい。一実施態様では、標的とする細胞は、標的とした細胞自体によって(例えば、自己分泌作用／ループを経て)発現されるＨＧＦによって接触／結合される。また、ｃ-ｍｅｔ活性化及び／又はシグナル伝達によりリガンドが独立する。したがって、本発明の方法の一実施態様では、標的とした細胞におけるｃ-ｍｅｔ活性化によりリガンドが独立する。
本発明の方法の一実施態様では、本方法は、(本明細書中に記載のように、ポリヌクレオチド突然変異又はポリペプチド突然変異を検出することによって)腫瘍細胞が過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを含むかどうかを決定する工程を更に含む。
【００３３】
(発明の実施の形態)
本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の抑制因子(特に、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの抑制因子)を同定するための方法、組成物、キット及び製造品と、この抑制因子の使用方法を提供する。
これらの方法、組成物、キット及び製造品の詳細は、本明細書において、提供される。
【００３４】
一般的な技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第２版(Sambrookら, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait, 編, 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney, 編, 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubel等, 編., 1987, 及び定期的に更新されたもの)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullisら, 編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988)。
【００３５】
定義
本明細書中で用いる「過剰に安定化したｃ-ｍｅｔ」なる用語及びその変形語は、野生型のｃ-ｍｅｔのものよりも検出可能な程度のゆっくりとした速度で分解／下方制御される天然に生じる変異形のヒトｃ-ｍｅｔを指す。野生型ｃ-ｍｅｔと過剰に安定化したｃ-ｍｅｔとの間の分解／下方制御速度を比較する方法は、例えば、下記の実施例にて説明したような当分野の技術者に明らかなものが挙げられるがこれに限定されるものではない。一例を挙げると、遅発性分解／下方制御は、細胞のレセプタータンパク質レベルを数量化することに基づいて評価される。他の例では、遅発性分解／下方制御は、ｃ-ｍｅｔへのＣｂｌ結合と関係しているｃ-ｍｅｔ部位の突然変異の検出量に基づいて決定される。一例を挙げると、突然変異は、(例えば、ｃ-ｍｅｔエキソン１４の)ｃ-ｍｅｔユビキチン結合及びレセプタータンパク質分解／下方制御と関係しているｃ-ｍｅｔ部位にある。これらの突然変異は、野生型ｃ-ｍｅｔよりもゆっくりな速度で分解／下方制御される変異したｃ-ｍｅｔタンパク質の発現が生じる任意の形態で生じ、変異したｃ-ｍｅｔタンパク質は野生型ｃ-ｍｅｔ関連の活性(例えば、ＭＡＰＫなどの下流分子のリン酸化、細胞増殖の刺激及び／又は腫瘍形成性の現象の誘導)が可能であるものである。例えば、これらの突然変異には、レセプタータンパク質分解／下方制御を伴うエキソン１４の少なくとも一部を欠失している機能的なインフレームのｃ-ｍｅｔスプライス変異体の発現と関連しているものが含まれる。突然変異の例示的な例には、図１及び図７に示すスプライシング成分に見られるものが含まれる。一実施態様では、細胞における本発明の過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質の存在は、同じくらいの量の細胞内の野生型ｃ-ｍｅｔタンパク質と比較して、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路内の下流分子のリン酸化の延長及び／又は増加と関係している。
【００３６】
本明細書中で用いる「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントがライゲートされうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の種のベクターはファージベクターである。他の種のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内にライゲートされうる。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、あるベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組み換え発現ベクター」(又は単に「組み換えベクター」)と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００３７】
ここで交換可能に用いる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより又は合成反応によりポリマー中に取り込まれうる任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合化(「アセンブリ」とも言う)の前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識との結合によるなどの合成の後に、さらに修飾されてもよい。他の種の修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(一又は複数)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体支持体ないしは半固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００３８】
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長の、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００３９】
本明細書中で用いる「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」なる用語は、特別に又は文脈上別途示されない限り、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達過程を起こす条件下においてこの経路を活性化しうる任意の(天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ)天然の又は変異形のＨＧＦポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦにおいてみられるアミノ酸配列を指す。ｃ-ｍｅｔ(又はＭｅｔ)は、そのレセプターによってＨＧＦ細胞内シグナル伝達が生物学的に達成されるＨＧＦの公知のレセプターである。RefSeq NM_000245に基づく野生型ヒトｃ-ｍｅｔタンパク質配列を図８に示す。
本明細書中で用いる「スプライス部位」、「スプライス接合部位」、「枝分かれ部位」、「ポリピリミジン域」なる用語は、哺乳類、特にヒトのＲＮＡスプライシングとの関係において、当分野で公知の意味を指す。例として、Pagani 及び Baralle, Nature Reviews: Genetics (2004), 5:389-396及びその中の引例を参照のこと。参考として、ｃ-ｍｅｔ ＲＮＡスプライシング成分のための配列の一実施態様を図７に例として記載する。
【００４０】
本明細書中で用いる「宿主細胞」(又は「組み換え宿主細胞」)なる用語は、遺伝的に改変されている細胞、又は組み換えプラスミドないしベクターなどの外因性ポリヌクレオチドの導入によって遺伝的に改変されうる細胞を指す。このような用語が特定の被検体の細胞だけでなくこのような細胞の後代(「プロジェニー」ともいう)も指すことは理解されるであろう。突然変異又は環境の影響の何れかによってある種の修飾が後の世代中に生じるので、このような後代は、実際には親細胞と同一でないが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる用語の範囲内に包含されるものである。
「抗体」(Ａｂ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンには、抗体と一般的に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は完全なモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び(本明細書で詳細に記載される)特定の抗体断片が含まれる。抗体はキメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
【００４１】
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００４２】
本願明細書において、用いられる「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列中の高頻度に可変しているおよび／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語の前にある「ＨＣ」及び「ＬＣ」なる文字はそれぞれ重鎖及び軽鎖のＨＶＲ又はＨＶを指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書に包含される。Kabat相補性決定領域(ＣＤＲ)は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、KabatＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。それぞれの高頻度可変領域の残基を以下に示す。
【００４３】
ループ    Kabat        ＡｂＭ        Chothia         接触
L1        L24-L34      L24-L34      L26-L32        L30-L36
L2        L50-L56      L50-L56      L50-L52        L46-L55
L3        L89-L97      L89-L97      L91-L96        L89-L96
H1        H31-H35B     H26-H35B     H26-H32        H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1        H31-H35      H26-H35      H26-H32        H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2        H50-H65      H50-H58      H53-H55        H47-H58
H3        H95-H102     H95-H102     H96-H101       H93-H101 
【００４４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義されるように、高頻度可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは、通常、抗体の最も可変的な部位であって、抗原結合部位を含有する。
【００４５】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量に存在しうる天然に生じる変異体を除いて同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル調製物と比べて、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
本明細書中のモノクローナル抗体には、具体的に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片が含まれる(米国特許第4,816,567号；及び、Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
【００４６】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものと一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp；Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００４７】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用してつくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数のＣＤＲ／ＨＶＲに一又は複数の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させたものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ／ＨＶＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００４８】
「Ｆｃ領域」という用語は、完全な抗体のパパイン消化で生じ得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域である。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、又は約位置Ｐｒｏ２３０からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。ここで「Ｆｃ領域鎖」とは、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの一つを意味する。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は放射性アイソトープ(例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射性同位元素)、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物性又は動物性起源の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素等の毒素又はその断片を含むことが意図されている。
【００４９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５-ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００５０】
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；エストロゲンレセプターアンタゴニスト、例えばフルベストラント(fulvestrant) (FASLODEX(登録商標))；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(例えばLURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；セレコシブ(celecoxib)などのＣＯＸ-２阻害剤(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾル-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００５１】
「ブロッキング(以下「ブロック」とも言う)抗体」又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか、減弱するものである。このようなブロッキングはレセプターへのリガンド結合などのタンパク質-タンパク質相互作用を阻害することによるなどの任意の方法によって行うことができる。一実施態様では、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にないしは完全に阻害する。
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に制御不能な細胞成長／増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的症状を指す又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、上皮癌、リンパ腫(例えばホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例は、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝上皮癌及び様々なタイプの頭頸部癌を含む。
【００５２】
本明細書中で用いる「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の修飾因子分子及び方法は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。治療剤の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は治療剤の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００５３】
本発明の組成物及び方法
Ａ．ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療剤及び／又は診断剤としての使用が見出されているｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。抗体の産出、同定、特徴付け、修飾及び生成についての態様は、当該分野で十分に確立されており、例えば米国特許出願公開2005/0042216のパラグラフ522〜563、604〜608及び617〜688に記載されている。
【００５４】
ここで開示されているｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、標的細胞／組織への運搬のために任意の好適な形態で処方されうる。例えば抗体は免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【００５５】
Ｂ．ｃ-ｍｅｔアンタゴニストポリペプチド
一態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストはポリペプチドを含んでなる。一実施態様では、アンタゴニストポリペプチドは細胞内の過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質に結合及び／又は拮抗する。一実施態様では、ポリペプチドは過剰に安定化したｃ-ｍｅｔに結合する、好ましくは特異的に結合する。ポリペプチドは、既知のペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組み換え技術を用いて調製及び生成することができる。一実施態様では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストポリペプチドは、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１−７３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなポリペプチドは過剰に安定化したｃ-ｍｅｔ活性を阻害することができる。これらのポリペプチドは、公知の技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する(例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ国際公開公報８４／０３５０６、及び国際公開公報８４／０３５６４；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照)。
【００５６】
バクテリオファージ(ファージ)ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である(Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体(又はランダムクローンｃＤＮＡ)の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド(Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378)又はタンパク質(Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363)ライブラーリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている(Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【００５７】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム(国際公開公報９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号)、Ｔ４ファージディスプレイシステム(Ren等 Gene, 215:439 (1998); Zhu等Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang等, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996); Efimov等, Virus Genes, 10:173 (1995)及びＴ７ファージディスプレイシステム(Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993); 米国特許第５７６６９０５号)も知られている。
【００５８】
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。
ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり(国際公開公報９８／１４２７７)及びファージディスプレイライブラリーは二分子相互作用(国際公開公報９８／２０１６９；国際公開公報９８／２０１５９)及び拘束性へリックスペプチドの特性(国際公開公報９８／２００３６)を分析及び制御するために使用されている。国際公開公報９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。国際公開公報９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌(Staphlylococcus aureus)タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている(Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187)。国際公開公報９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法は国際公開公報９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及び国際公開公報９８／１５８３３に記載されている。
【００５９】
ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
アンタゴニストポリペプチドを作製し、同定し、特徴付け、修飾し及び生成する方法は、当該分野において十分に確立されており、例えば米国特許出願公開2005/0042216のパラグラフ606〜608、614〜688に記載されている。
一実施態様では、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔ活性をアンタゴナイズするためのポリペプチドは、例えば本明細書中に記載のエキソン１４の少なくとも一部を欠失した変異ｃ-ｍｅｔ膜近傍配列を含んでなる標的抗原に基づいたスクリーニングによるなどして、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質構造に基づいて設定することができる。例えば、標的抗原は、ｃ-ｍｅｔのエキソン１３及びエキソン１５のインフレームスプライシングによって生じる配列を含有するポリペプチドを含みうる。
【００６０】
Ｃ．イムノコンジュゲート
他の態様では、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、イムノコンジュゲート、又は抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を提供する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【００６１】
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療のために試験されている。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療のために試験されている。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【００６２】
イムノコンジュゲート(「免疫複合体」ともいう)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開94/11026参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【００６３】
メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【００６４】
メイタンシノイド薬剤分子の例示的な実施態様にはＤＭ１；ＤＭ３及びＤＭ４が含まれる。メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235 B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【００６５】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製されうる。例えば、米国特許第5,208,020号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
【００６６】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])及びＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)が含まれ、ジスルフィド結合が生じる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【００６７】
アウリスタチン類及びドロスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(US 5663149)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥ及びＭＭＡＦである。更なる例示的な実施態様では、ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦと様々なリンカー成分であるAb-MC-vc-PAB-MMAF、Ab-MC-vc-PAB-MMAE、Ab-MC-MMAE及びAb-MC-MMAF(本明細書中にさらに記載される)を含んでなる。
【００６８】
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、US 5635483; US 5780588；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願のUS Ser. No. 10/983,340も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
【００６９】
カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００７０】
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開93/21232を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
【００７１】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【００７２】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第5208020号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
【００７３】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ            Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
【００７４】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【００７５】
例示的なリンカー構成成分の構造を以下に示す(ここで、波形の線はＡＤＣの他の構成成分への共有結合の部位を示す)：
2008535821.tif 000003
【００７６】
更なる例示的なリンカー構成成分及び略号は以下のものを含む(ここで、抗体(Ａｂ)及びリンカーが示されており、ｐは１〜約８である)：
2008535821.tif 000004
【００７７】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、および(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；(ii) アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又は、その断片)に導入されてもよい。
【００７８】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒドおよびケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
【００７９】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物)；(ii) アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００８０】
抗体(Ab)-MC-MMAEは、本明細書中に提供される何れかの抗体と以下のMC-MMAEとのコンジュゲートにより調製されうる。抗体は、ｐＨ８．０の５００ｍＭ ホウ酸ナトリウムと５００ｍＭ 塩化ナトリウムに溶解して、過剰量の１００ｍＭ ジチオトレイトール(ＤＴＴ)で処理した。３７℃で３０分インキュベートした後、Sephadex G25樹脂で溶出することによって、バッファを交換して、１ｍＭ ＤＴＰＡを含むＰＢＳにて溶出した。溶液の２８０ｎｍの吸光度とＤＴＮＢ (Aldrich, Milwaukee, WI)と反応させて４１２ｎｍの吸光度の測定によるチオール濃度から減少した抗体濃度を決定することによって、チオール／Ａｂ値を調べる。ＰＢＳに溶解した減少した抗体を氷上で冷やす。薬剤リンカー試薬であるマレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)、すなわちMC-MMAEをＤＭＳＯに溶解して、濃度がわかっているアセトニトリルと水にて希釈して、冷やした減少した抗体２Ｈ９を含むＰＢＳに添加する。およそ１時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を止め、反応していない抗体チオール基を覆った。反応混合物を遠心限外濾過によって、濃縮し、2H9-MC-MMAEを精製して、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂による溶出によって脱塩して、無菌条件下で０．２μｍのフィルターに濾過して、保存のために凍結した。
【００８１】
抗体-MC-MMAFは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-MMAFと本明細書において提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAEは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAEと本明細書において提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAFは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAFと本明細書において提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-SMCC-DM1は、以下のSMCC-DM1と本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製されうる。精製された抗体は、(スクシンイミジル４(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ、Pierce Biotechnology, Inc) で誘導体化して、ＳＭＣＣリンカーを導入する。具体的には、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中で、７．５モル等量のＳＭＣＣ(ＤＭＳＯ中に２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍＬ)にて２０ｍｇ／ｍＬの抗体を処理した。室温のアルゴン下で２時間撹拌した後に、反応混合物を、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５にて平衡化したSephadex G25カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。
【００８２】
このようにして調製される抗体-ＳＭＣＣは、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で希釈して、最終濃度およそ１０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｍＭのＤＭ１の溶液を含むジメチルアセトアミドにて反応させる。反応は、１６．５時間、室温、アルゴン下にて撹拌して行う撹拌して行う。コンジュゲート反応混合物は、ｐＨ６．５の１×ＰＢＳによるSephadex G25ゲル濾過カラム(１．５×４．９ｃｍ)にろ過する。２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度で測定されるように、抗体に対するＤＭ１薬剤の比率(ｐ)はおよそ２〜５でありうる。
Ab-SPP-DM1は、本明細書中で提供される何れかの抗体と以下のSPP-DM1とのコンジュゲートにより調製される。精製された抗体は、ジチオピリジル基を導入するために、Ｎ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノエートによって、誘導体化される。ＮａＣｌ(５０ｍＭ)及びＥＤＴＡ(１ｍＭ)を含有する４４．７ｍＬの５０ｍＭ リン酸カリウムバッファ(ｐＨ６．５)中の抗体(３７６．０ｍｇ、８ｍｇ／ｍＬ)を、ＳＰＰ(２．３ｍＬ エタノール中に５．３のモル等量)にて処理した。室温、アルゴン下にて９０分間インキュベートした後、抗応混合物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡにて平衡化したSephadex G25カラムにゲル濾過する。抗体含有分画をプールして、アッセイした。抗体の修飾の程度は、上記の通りに決定される。
【００８３】
抗体-ＳＰＰ-Ｐｙ(およそ１０ｍｍｏｌの解放可能な２-チオピリジン基)を上記の３５ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．５にて希釈して、およそ２．５ｍｇ／ｍＬの終濃度にした。次いで、ＤＭ１(１．７等量、１７μｍｏｌｅ)を含む３．０ｍＭのジメチルアセトアミド(ＤＭＡ、最終反応混合物中３％v/v)を抗体溶液に添加する。およそ２０時間、室温、アルゴン下にて反応を行う。反応物を、３５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて平衡化したセファクリルＳ３００ゲル濾過カラム(５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ)に流す。流速はおよそ５．０ｍＬ／分でよく、６５の分画(各々２０．０ｍＬ)を回収する。抗体分子当たりの結合されるＤＭ１薬剤分子の数(ｐ')は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度を測定して決定し、２Ｈ９抗体当たりのＤＭ１薬剤成分をおよそ２〜４としてもよい。
抗体-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１は、本明細書中に示される何れかの抗体と以下のＢＭＰＥＯ-ＤＭ１とのコンジュゲートにより調製される。抗体を、ビスマレイミド試薬ＢＭ(ＰＥＯ)４(Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、ＢＭ(ＰＥＯ)４を５０％のエタノール／水混合液に１０ｍＭの濃度になるまで溶解して、およそ１．６ｍｇ／ｍｌ(１０マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に１０倍のモル過剰量を加え、１時間反応させて、抗体-リンカー中間生成物である２Ｈ９-ＢＭＰＥＯを形成させることにより達成される。１５０ｍＭのＮａＣｌバッファと０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６のゲル濾過(HiTrap column, Pharmacia)によって、過剰なＢＭ(ＰＥＯ)４を取り除く。およそ１０倍のモル過剰ＤＭ１を、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)に溶解して、２Ｈ９-ＢＭＰＥＯ中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)を用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、ＰＢＳでゲル濾過ないし透析を行って反応していないＤＭ１を取り除く。ＰＢＳ中のＳ２００カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された２Ｈ９-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１に供給する。
【００８４】
Ｄ．核酸を含むｃ-ｍｅｔアンタゴニスト
一態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは核酸分子を含む。例えば、核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性／干渉性ＲＮＡ(例えば低分子抑制性／干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ))、又はアプタマーを含んでいてもよい。これらの核酸修飾因子をスクリーニングし、同定し、作製するための方法は当該分野で知られている。
【００８５】
例えば、ｓｉＲＮＡは、伝統的なアンタゴニスト、例えば小分子又は抗体が機能していない箇所で遺伝子発現を調節可能であることが証明されている。(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003))。インビトロ合成された二重鎖で、３０より少ないヌクレオチド長(例えば、約１５〜２５、１７〜２０、１８〜２０、１９〜２０、又は２１〜２３ヌクレオチド)のＲＮＡは、干渉性ＲＮＡ(ｉＲＮＡ)として作用可能で、また遺伝子発現を特異的に阻害可能である(例えば、Fire A., Trends in Genetics  (1999), 391; 806-810；米国特許出願第09/821832号、同09/215257号；米国特許第6,506,559号；PCT/US01/10188; 欧州特許出願第00126325号を参照)。これらのｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの分解を調節することにより、少なくとも部分的に作用すると考えられる。しかしながら、それらは３０ヌクレオチド長以下であるため、細胞の抗ウイルス防御機構を惹起しない。このような機構には、インターフェロンの生成、宿主細胞タンパク質合成の一般的活動停止が含まれる。実際に、ｓｉＲＮＡは合成され、ついでＤＮＡベクター内でクローン化可能である。このようなベクターを形質移入し、高レベルでｓｉＲＮＡを発現させることができる。高レベルのｓｉＲＮＡ発現は、細胞内に生成されるタンパク質の量を有意に低減させるか、又は「ノックダウン」するのに使用され、よって、タンパク質の過剰発現が病的疾患に関連していると考えられる細胞状況において有用である。
【００８６】
アプタマーは、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質等、標的分子に結合可能な核酸分子である。アプタマーの産生及び治療的用途は、当該分野で十分に確立されている。例えば、加齢黄斑変性の治療に対しては、Macugen(登録商標)(Eyetech, New York)の治療効果、及び米国特許第5,475,096号を参照。
アンチセンス技術は、当該分野で十分に確立されている。この技術に関するさらなる詳細は、以下に提供する。
【００８７】
Ｅ．製薬用製剤
本発明に従って使用されるｃ-ｍｅｔアンタゴニストの治療用製剤は、所望の純度を有するｃ-ｍｅｔアンタゴニストを、任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、保存用に調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、アセテート、トリス、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウム等の等張化剤(tonicifiers)；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ポリソルバート等の界面活性剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、プルロニクス(PLURONICS)(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８８】
また、ここでの製剤は、治療される特定の兆候に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を持つものを含みうる。例えば、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストに加えて、付加的な修飾因子、例えば過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質上の異なるエピトープに結合する第２の抗体、又はいくつかの他の標的に対する抗体を、一つの製剤に含めることが望ましい場合がある。あるいは又は付加的に、組成物は、化学療法剤、細胞障害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤をさらに含有してもよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組合せて、適切に存在している。
【００８９】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに封入されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
【００９０】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド類(米国特許第3,773,919号)、Ｌグルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に用いる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【００９１】
Ｆ．本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを用いた治療
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、様々な非治療的用途を有している。該アンタゴニストは、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔ発現疾病の病期分類又は検出(例えば放射性イメージング)に有用でありうる。抗体、オリゴヌクレオチド及びアプタマーもまた、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、細胞集団における細胞性イベントを調節する過剰に安定化したｃ-ｍｅｔのインビトロでの検出及び定量のために、細胞からの過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの精製及び免疫沈降に有用である。
【００９２】
現在、癌の段階に応じて、癌治療は、次の治療の一又は併用を含む：癌組織を取り除くための外科手術、放射線治療、及び化学療法。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含む治療は、化学療法の副作用及び毒性に対する十分な耐性のない高齢の患者及び放射線治療が限定された実用性しか有さない転移性疾患において、特に所望される。治療的用途では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは単独で、又はホルモン、血管新生抑制、又は放射標識化合物、又は外科手術、凍結療法、及び／又は放射線治療との併用治療に使用することができる。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、他の形態の従来からの治療法と同時に、従来からの治療法の前又は後に投与することができる。化学療法剤、例えばTAXOTERE(登録商標)(ドセタキセル)、TAXOL(登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン、及びミトキサントロンは、癌治療、特にグッドリスク患者に使用される。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、一般的に治療的有効量の化学療法剤と共に投与される。他の実施態様では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、パクリタキセル等の化学療法剤に起因する副作用が減じるように、化学療法と併用して投与される。医師療用卓上参考書(ＰＤＲ)には、様々な癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述したこれら化学療法剤の投与計画及び用量は、治療されている特定の癌、疾病の程度、当業者の医師が精通している他の要因に依存し、医師により決定することができる。
【００９３】
ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、既知の方法に従い、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間にわたる連続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入経路によりヒト患者に投与される。抗体、オリゴペプチド又は有機小分子の静脈内又は皮下投与が、本発明の一実施態様において好ましい。
他の治療計画を、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストの投与と併用してもよい。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬用製剤を使用する同時投与、及び何れかの順序での連続投与を含み、好ましくは、両方の(又は全ての)活性剤が同時に生物学的活性を示す期間があるものである。好ましくは、そのような併用治療により、相乗的治療効果及び／又は所望しない副作用の低減に至る。
特定の病的状態に関連する他の抗原に対する治療剤の投与と、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストの投与を組合せることもまた望ましい。
【００９４】
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なった化学療法剤のカクテルの同時投与を含む、ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト分子と一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤の併用投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシウレア、及びヒドロキシウレアタキサン類(例えば、パクリタキセル及びドキセタキセル(doxetaxel))及び／又はアントラサイクリン系抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは、製造者の使用説明書に従うか、又は当業者が経験的に決定して使用されうる。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編, M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)に記載されている。
【００９５】
ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、抗ホルモン化合物；例えば抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(例えば欧州特許出願公開第616812号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドと、このような分子に対して知られた用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は、抗アンドロゲン治療を予め受けていてもよく、癌がアンドロゲン非依存性になった後に、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを患者に投与してもよい。
【００９６】
しばしば、患者には、心臓保護剤(治療に伴う心筋機能不全を防止又は低減するため)、又は一又は複数のサイトカインを同時投与することも有益であり得る。上述した治療計画に加えて、患者は、ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト治療の前、同時又は後に、癌細胞の外科的除去及び／又は放射線治療を受けてもよい。上述した同時投与される任意の薬剤の適切な用量は、現在使用されている量であり、薬剤とｃ-ｍｅｔアンタゴニストとの併用作用(相乗効果)によって減らしてもよい。
【００９７】
疾患の予防又は治療に対して、投与される用量及び方式は、既知の基準に従い、医者により選択されるであろう。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストの適切な用量は、上述したように、治療される疾患のタイプ、重篤度及び病歴、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストが治療又は予防目的で投与されるかどうか、過去の治療法、患者の臨床的病歴、及びｃ-ｍｅｔアンタゴニストに対する反応性、及び主治医の裁量に依存するであろう。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、一回又は連続した治療に対して患者に適切に投与される。一実施態様では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、静脈内注入又は皮下注射により投与される。一又は複数回の別々の投与又は連続注入であってもなくても、疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重(約０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を、患者へ投与するための初期候補用量とすることができる。投与計画には、初期負荷用量約４ｍｇ／ｋｇ、続いて約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体の投与が含まれる。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。典型的な毎日の用量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲でありうる。数日間又はそれ以上にわたる繰り返し投与については、病状に応じて、疾病の兆候が所望される程度に抑制されるまで、治療は継続される。この治療の進展度合いは、医者又は他の当業者に知られている基準に基づき、従来からの方法及びアッセイにより、容易にモニターすることができる。
【００９８】
患者へのポリペプチド修飾因子(例えば、ポリペプチド、抗体等)の投与の他に、本発明では、遺伝子治療による修飾因子投与が考察されている。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含む／コードする核酸のこのような投与は、「治療的有効量のｃ-ｍｅｔアンタゴニストの投与」なる表現に含まれる。細胞内抗体を生じせしめるための遺伝子治療の使用に関連しては例えば1996年3月14日に公開された国際公開第96/07321号を参照。
【００９９】
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるためにインビボ及びエキソビボという２つの主要なアプローチ法がある。インビボ送達では、核酸が患者に、通常はｃ-ｍｅｔアンタゴニストが必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ治療では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、改変された細胞を患者に直接又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜内にカプセル化して投与する(米国特許第4,892,538号及び同5,283,187号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。該技術は、核酸が培養細胞にインビトロで移入されるか、又は意図している宿主の細胞にインビボで移入されるかに応じて変わる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０１００】
一実施態様では、インビボ核酸移入技術には、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス)、及び脂質ベースの系(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)の形質移入を含む。現在知られている遺伝子作製及び遺伝子治療プロトコルの概説については、Andersonら, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第93/25673号とそこに引用された参考文献も参照。
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、ここでの「抗体」の定義に包含される異なった形態でありうる。例えば、抗体には、完全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、及びその機能的断片が含まれる。
本発明は、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストと担体を含有する組成物を提供する。さらなる実施態様では、組成物は、化学療法剤を含む細胞障害剤又は成長阻害剤等の他の治療剤と組合せて、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有可能である。また本発明は、ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト及び担体を含有する製剤も提供する。一実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
【０１０１】
Ｇ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを使用する疾患の治療に有用な物質を含む製造品にある。製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器は、病状の治療に有用な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の疾患の治療のために使用されることを示している。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に組成物を投与するための使用説明書をさらに含むであろう。加えて、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備していてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０１０２】
様々な目的に有用なキットもまた提供される。例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット等、インビトロで過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを検出し定量するために本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含むキットを提供することができる。製造品の場合と同様、キットも容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。容器は、少なくとも一の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有する組成物を収容する。例えば希釈液及びバッファー、コントロール抗体を収容している付加的な容器が具備せしめられてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物の説明、並びに意図したインビトロ又は検出用途のための使用説明書を提供し得る。
【０１０３】
Ｈ．ポリペプチド、核酸及び抗体を含むｃ-ｍｅｔアンタゴニスト−特定の形態及び用途
一実施態様では、本発明の核酸は、内因性の過剰に安定化したｃ-ｍｅｔコード核酸に結合可能な一本鎖核酸配列(ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔＤＮＡのコード化領域の断片を少なくとも含む。そのような断片は、一般には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の早期停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する二重鎖の形成をもたらす。そのような方法は本発明に含まれる。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞における過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖-ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、国際公開第91/06629号に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(すなわち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１０５】
アンチセンス結合に好ましい遺伝子内部位には、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)の翻訳開始／出発コドン(５'-ＡＵＧ／５'-ＡＴＧ)又は終結／停止コドン(５'-ＵＡＡ、５'-ＵＡＧ及び５-ＵＧＡ／５'-ＴＡＡ、５'-ＴＡＧ及び５'-ＴＧＡ)が導入された領域が含まれる。これらの領域は、翻訳開始又は終結コドンからいずれかの方向(すなわち５'又は３')に約２５から約５０の近接ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。アンチセンス結合のための他の例示的領域は、イントロン；エクソン；イントロン-エクソン接合；オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)又は「コード化領域」で、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域であるもの；５'-５'トリホスファート結合を介してｍＲＮＡの５'最端残基に結合したＮ７-メチル化グアノシン残基を含み、ｍＲＮＡの５'キャップを含み、また、５'キャップ構造それ自体並びにキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチド；５'非翻訳領域(５'ＵＴＲ)、翻訳開始コドンから５'方向へのｍＲＮＡの一部、よってｍＲＮＡの翻訳開始コドンと５'キャップ部位との間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの；及び３'非翻訳領域(３'ＵＴＲ)、翻訳終結コドンから３'方向へのｍＲＮＡの一部、よってｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３'末端との間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むものを含む。
【０１０６】
過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドの発現抑制に有用なアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド類が含まれる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有していないものが含まれる。この明細書の目的のため、また当該分野でしばしば参照されるように、それらのヌクレオシド骨格内にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシドであると考えることもできる。例示的な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ-エステル、３'-アルキレンホスホネート、５’-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３'-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び正常な３'-５'結合を有するボラノ-ホスフェート、これらの２'-５'結合類似体、及び一又は複数のヌクレオチド間結合が３'-３'、５'-５'又は２'-２'結合である逆の極性を有するものが含まれる。逆の極性を有する例示的なオリゴヌクレオチドは、３'最端ヌクレオチド結合に一つの３'-３'結合を含み、すなわち脱塩基性であってもよい一つの逆位ヌクレオシド残基を有する(核酸塩基が欠失しているか、又はその場所にヒドロキシル基を有する)。また種々の塩、混合塩及び遊離酸の形態も含まれる。リン含有結合の調製について教示している代表的な合衆国特許には、限定されるものではないが、それぞれ出典明示によりここに援用される米国特許第3,687,808号；同 4,469,863号；同4,476,301号；同5,023,243号；同5,177,196号；同5,188,897号；同5,264,423号；同5,276,019号；同5,278,302号；同5,286,717号；同5,321,131号；同5,399,676号；同5,405,939号；同5,453,496号；同5,455,233号；同5,466,677号；同5,476,925号；同5,519,126号；同5,536,821号；同5,541,306号；同5,550,111号；同5,563,253号；同5,571,799号；同5,587,361号；同5,194,599号；同5,565,555号；同5,527,899号；同5,721,218号；同5,672,697号及び同5,625,050号が含まれる。
【０１０７】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格の例は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は一又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有するものである。これらには、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から一部が形成される)；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を有する他のものが含まれる。このようなオリゴヌクレオシドの調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；第5,792,608号；第5,646,269号及び第5,677,439号が含まれる。
【０１０８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、すなわち骨格は、新規の基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物でのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基が保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許第5,539,082号；同5,714,331号；及び同5,719,262号が含まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
【０１０９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの例には、ホスホロチオエート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｏ-ＣＨ２-［メチレン(メチルイミノ)又はＭＭＩ骨格として知られている］、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-及び-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-ＣＨ２- [天然ホスホジエステル骨格は、-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-と表せる]で、上述の米国特許第5,489,677号に記載のもの、及び上述の米国特許第5,602,240号のアミド骨格が組み込まれる。付加的な例は、上述の米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１１０】
修飾オリゴヌクレオチドは、一又は複数の置換された糖部分をさらに含みうる。例示的なオリゴヌクレオチドは、２'位に次のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ-アルキル、Ｓ-アルキル、又はＮ-アルキル；Ｏ-アルケニル、Ｓ-アルキニル、又はＮ-アルケニル；Ｏ-アルキニル、Ｓ-アルキニル又はＮ-アルキニル；又はＯ-アルキル-Ｏ-アルキルで、アルキル、アルケニル及びアルキニルが置換又は未置換のＣ１からＣ１０アルキル又はＣ２からＣ１０アルケニル及びアルキニルであってよいもの。特に好ましくは、Ｏ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、及びＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３)]２であり、ここでｎ及びｍは１から約１０である。他の例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２'位に次のものの一つを含む：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリル又はＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、及び類似した特性を有する他の置換基。一つの可能な修飾には、２'-メトキシエトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２'-Ｏ-(２-メトキシエチル)又は２'-ＭＯＥとしても知られる)(Martinら, Helv. CHim. Acta, 1995, 78,486-504)、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらなる好ましい修飾には、２'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２'-ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基、及び２'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(２'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチル又は２'-ＤＭＡＥＯＥとしても当該分野で知られている)、すなわち２'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ２)が含まれる。
【０１１１】
さらなる修飾には、２'-ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合し、よって二環式糖部分を形成しているロックド核酸(ＬＮＡ)(Locked Nucleic Acids)が含まれる。結合は、２'酸素原子及び４'炭素原子に結合するメチレン(-ＣＨ２-)ｎ基であり得、ここでｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製物は、国際公開第98/39352号及び国際公開第99/14226号に記載されている。
【０１１２】
他の修飾には、２'-メトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ３)、２'-アミノプロポキシ(２'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、２'-アリル(２'-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)、２'-Ｏ-アリル(２'-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)及び２'-フルオロ(２'-Ｆ)が含まれる。２'-修飾は、アラビノ(上流)位置又はリボ(下流)位置にあってよい。２'-アラビノ修飾の一つは２'-Ｆである。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に２'-５'結合したオリゴヌクレオチド、又は３'末端ヌクレオチドにおける糖の３'位置、及び５'末端ヌクレオチドの５'位置でもなされうる。またオリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖に代えて、例えばシクロブチル部分等の糖模倣体を有していてもよい。このような修飾された糖構造の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第4,981,957号；同5,118,800号；同5,319,080号；同5,359,044号；同5,393,878号；同5,446,137号；同5,466,786号；同5,514,785号；同5,519,134号；同5,567,811号；同5,576,427号；同5,591,722号；同5,597,909号；同5,610,300号；同5,627,053号；同5,639,873号；同5,646,265号；同5,658,873号；同5,670,633号；同5,792,747号；及び同5,700,920号が含まれる。
【０１１３】
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基(多くの場合、当該分野では単に「塩基」と称される)の修飾又は置換を含んでもよい。ここで使用される場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン(Ａ)及びグアニン(Ｇ)、及びピリミジン塩基のチミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)及びウラシル(Ｕ)が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５-メチルシトシン(５-ｍｅ-Ｃ)、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２-プロピル及び他のアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミン、及び２-チオシトシン、５-ハロウラシル及びシトシン、５-プロピニル(-Ｃ≡Ｃ-ＣＨ３又は-ＣＨ２-Ｃ≡ＣＨ)ウラシル及びシトシン、及びピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６-アゾウラシル、シトシン及びチミン、５-ウラシル(シュードウラシル)、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシル、及び他の８-置換アデニン類及びグアニン類、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチル及び他の５-置換ウラシル類及びシトシン類、７-メチルグアニン及び７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニン、及び８-アザアデニン、７-デアザグアニン、及び７-デアザアデニン、及び３-デアザグアニン及び３-デアザアデニンが含まれる。さらなる修飾された核酸塩基には、三環式のピリミジン類、例えばフェノキサジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾオキサジン-２(３Ｈ)-オン)、フェノチアジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾチアジン-２(３Ｈ)-オン)、Ｇ-クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン(例えば、９-(２-アミノエトキシ)-Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾオキサジン-２(３Ｈ)-オン)、カルバゾールシチジン(２Ｈ-ピリミド[４,５-ｂ]インドール-２-オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ-ピリド[３',２':４,５]ピロール[２,３-ｄ]ピリミジン-２-オン)が含まれる。また修飾された核酸塩基には、プリン又はピリミジン塩基が、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジン及び２-ピリドン等、他の複素環で置き換えられたものも含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859、Kroschwitz, J. I.編 John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、及びEnglischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているものが含まれる。ある種のこれらの核酸塩基は、特に本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これらには、５-置換ピリミジン類、６-アザピリミジン類、及びＮ-２、Ｎ-６及びＯ-６置換されたプリン類、特に２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシル、及び５-プロピニルシトシンが含まれる。５-メチルシトシン置換は、０．６−１．２℃で核酸二本鎖の安定性を増加させることが示されており(Sanghviら, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、例えば２'-Ｏ-メトキシエチル糖修飾と組合た場合の、例示的な塩基置換である。修飾された核酸塩基の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許第3,687,808号、並びに米国特許第4,845,205号；同5,130,302号；同5,134,066号；同5,175,273号；同5,367,066号；同5,432,272号；同5,457,187号；同5,459,255号；同5,484,908号；同5,502,177号；同5,525,711号；同5,552,540号；同5,587,469号；同5,594,121号；同5,596,091号；同5,614,617号；同5,645,985号；同5,830,653号；同5,763,588号；同6,005,096号；同5,681,941号及び同5,750,692号が含まれる。
【０１１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取込を高める一又は複数の部分又はコンジュゲートを、オリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。本発明の化合物は、第１級又は第２級ヒドロキシル基等の官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン類、ポリアミド類、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を高める基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール類、脂質、カチオン性脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、及び染料が含まれる。この発明において、薬力学的特性を高める基には、オリゴマーの取込を改善し、分解に対するオリゴマー耐性を高め、及び／又はＲＮＡとの配列特異性ハイブリッド形成を強化する基が含まれる。この発明において、薬物動態学的特性を高める基には、オリゴマーの取込、分布、代謝又は排出を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には、限定されるものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分(Letsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、例えばヘキシル-Ｓ-トリチルチオール(Manoharanら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauserら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基(Saison-Behmoarasら, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanovら, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchukら, Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム１,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロ-３-Ｈ-ホスホナート(Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Sheaら, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Manoharanら, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、又はアダマンタン酢酸(Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishraら, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性薬物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(Ｓ)-(＋)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２,３,５-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツラート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートしていてもよい。オリゴヌクレオチド薬剤コンジュゲート及びそれらの調製物は、それぞれが出典明示によりここに援用される米国特許出願番号09/334,130(1999年6月15日に出願)、及び米国特許第 4,828,979号；同4,948,882号；同5,218,105号；同5,525,465号；同5,541,313号；同5,545,730号；同5,552,538号；同5,578,717号；同5,580,731号；同5,580,731号；同5,591,584号；同5,109,124号；同5,118,802号；同5,138,045号；同5,414,077号；同5,486,603号；同5,512,439号；同5,578,718号；同5,608,046号；同4,587,044号；同4,605,735号；同4,667,025号；同4,762,779号；同4,789,737号；同4,824,941号；同4,835,263号；同4,876,335号；同4,904,582号；同4,958,013号；同5,082,830号；同5,112,963号；同5,214,136号；同5,082,830号；同5,112,963号；同5,214,136号；同5,245,022号；同5,254,469号；同5,258,506号；同5,262,536号；同5,272,250号；同5,292,873号；同5,317,098号；同5,371,241号；同5,391,723号；同5,416,203号；同5,451,463号；同5,510,475号；同5,512,667号；同5,514,785号；同5,565,552号；同5,567,810号；同5,574,142号；同5,585,481号；同5,587,371号；同5,595,726号；同5,597,696号；同5,599,923号；同5,599,928号及び同5,688,941号に記載されている。
【０１１５】
与えられた化合物における全ての位置が一様に修飾されている必要はないが、実際には、一以上の上述した修飾が、単一化合物又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ導入されうる。また本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。この発明において、「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、２又はそれ以上の化学的に異なる領域を含み、それぞれが少なくとも一のモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから構成されるアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の向上、細胞取込の増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加が、オリゴヌクレオチドに付与されるようにオリゴヌクレオチドを修飾した少なくとも一の領域を有する。オリゴヌクレオチドの付加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質となりうる。例えば、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡストランドを切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。よって、ＲＮａｓｅＨの活性化により、結果的にＲＮＡ標的が切断され、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド抑制の効果がかなり向上する。その結果、多くの場合、同じ標的領域にハイブリッド形成されるホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較し、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、匹敵する結果がより短いオリゴヌクレオチドで得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は、２又はそれ以上の上述したオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合体構造として形成されうる。例示的なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドには、３'端に少なくとも一の２'修飾糖(好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３)が導入されてヌクレアーゼ耐性が付与され、少なくとも４の近接する２'-Ｈ糖類を有する領域が導入されてＲＮａｓｅＨ活性が付与される。このような化合物は、当該分野ではハイブリッド又はギャップマー(gapmer)とも称される。例示的なギャップマーは、少なくとも４の近接した２'-Ｈ糖類を有する少なくとも一の領域により分離した５'端及び３'端に２'修飾糖類(好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３)の領域を有し、ホスホロチオエート骨格結合が導入されうる。このようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれその全体が出典明示によりここに援用される米国特許第5,013,830号；同5,149,797号；同5,220,007号；同5,256,775号；同5,366,878号；同5,403,711号；同5,491,133号；同5,565,350号；同5,623,065号；同5,652,355号；同5,652,356号；及び同5,700,922号が含まれる。
【０１１６】
この発明で使用されるアンチセンス化合物は、固相合成でよく知られている技術により、簡便にかつ常套的に作製されうる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems(Foster City, Calif.)を含むいくつかの供給元から販売されている。当該分野で知られているこのような合成のための任意の他の手段が、付加的に又は代替的に使用され得る。ホスホロチオエート類及びアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチド類を調製するため、同様の技術を使用することがよく知られている。また本発明の化合物は、取込、分布及び／又は吸収性を補助するため、他の分子、分子構造又は化合物の混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口用、直腸用、局所用又は他の製剤と混合、カプセル化、コンジュゲート等されてもよい。取込、分布及び／又は吸収性が補助された調製物の調製法を教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第5,108,921号；同5,354,844号；同5,416,016号；同5,459,127号；同5,521,291号；同5,543,158号；同5,547,932号；同5,583,020号；同5,591,721号；同4,426,330号；同4,534,899号；同5,013,556号；同5,108,921号；同5,213,804号；同5,227,170号；同5,264,221号；同5,356,633号；同5,395,619号；同5,416,016号；同5,417,978号；同5,462,854号；同5,469,854号；同5,512,295号；同5,527,528号；同5,534,259号；同5,543,152号；同5,556,948号；同5,580,575号；及び同5,595,756号が含まれ、これらのそれぞれを出典明示によりここに援用する。
【０１１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、国際公開第90/10048号に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばＣａＰＯ４媒介性ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子移入方法により、又はエプスタイン・バーウイルス等の遺伝子移入ウイルスを使用し、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。例示的な手順において、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボのいずれかで、組換えレトロウイルスベクターと接触される。適切なレトロウイルスベクターには、限定されるものではないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶ、Ｎ２(Ｍ-ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス)、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名された二重コピーベクターが含まれる(国際公開第90/13641号を参照)。
【０１１９】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第91/04753号に記載されるように、リガンド結合分子とのコンジュゲートの形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入されうる。適切なリガンド結合分子には、これらに限定されないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれる。一般に、リガンド結合分子のコンジュゲートは、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合するか、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲート体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第90/10448号に記載されるように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入されうる。アンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０１２０】
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般的に少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０又は１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」なる用語は、基準長さのプラスマイナス１０％の基準ヌクレオチド配列長を意味する。
【０１２１】
アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したホスホジエステル基を非荷電基で置換することによって、取り込みを促進するように修飾することができる。
【０１２２】
生存細胞に核酸を導入するために利用される様々な技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入を含む(Dzauら, Trends, in Biotechnology 11, 205-210[1993])。いくつかの状況では、核酸供給源に、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的にする薬剤を提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取込の促進のために用いられ得る。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-2232 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコルの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１２３】
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストポリペプチド及び核酸分子は、組織タイピングに診断目的で使用でき、ここで過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドは、他のものと比較して一の組織、好ましくは同じ組織型の正常な組織と比較して病気の組織で、差次的に発現し得る。
この発明は、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを調節するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト薬候補のスクリーニングアッセイは、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドと結合又は複合体形成するか、又は例えば細胞からの過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドの発現の阻害を含む、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用に干渉する化合物を同定するために設定される。
【０１２４】
該アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野でよく特徴付けられたものを含む様々な方式で実施することができる。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬を過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な時間及び条件下で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１２５】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出することができる。特定の実施態様では、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般に固体表面を過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化される過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することによって検出できる。
【０１２６】
候補化合物が相互作用するが、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチに結合しない場合、その過剰に安定化したｃ-ｍｅｔとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通しての同時精製などの常套的なアプローチ法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者ら(Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989)；Chienら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにしてモニターすることができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の刊行物に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性を利用して、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合しているものと、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合しているものの２つのハイブリッドタンパク質を用いる。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する発色基質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERＴＭ)は、Clontechから商業的に入手可能である。このシステムは、特定のタンパク質相互作用に関連するタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれらの相互作用とって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１２７】
過剰に安定化したｃ-ｍｅｔと細胞内又は細胞外成分との相互作用に干渉する化合物は、次のようにして試験できる：通常、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔと細胞内又は細胞外成分を含む反応混合物を、その２つの生成物の相互作用と結合を可能にする条件と時間をかけて調製する。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不在下と存在下で実施される。また、プラシーボを第３の反応混合物に添加して、ポジティブコントロールとしてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のようにしてモニターされる。試験化合物を含む反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の生成は、試験化合物が該試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示している。
【０１２８】
アンタゴニストをアッセイするために、特定の活性についてスクリーニングされる化合物を過剰に安定化したｃ-ｍｅｔを発現する細胞に加えてよく、対象の活性を阻害する化合物の能力は、化合物が過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドは、放射性等で標識でき、細胞上に存在する過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するために使用できる。
【０１２９】
潜在的な過剰に安定化したｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されるアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、ここで、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的のｍＲＮＡにハイブリッド形成しタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法は共にポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、成熟した過剰に安定化したｃ-ｍｅｔタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０の塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設定に使用できる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設定され(トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979)；Cooneyら, Science, 241: 456 (1988)；Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)を参照)、それにより過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドの転写及び産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズしてｍＲＮＡ分子の過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボで発現されて、過剰に安定化したｃ-ｍｅｔポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０から＋１０位の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１３０】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成と、続くエンドヌクレアーゼ的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定することができる。さらなる詳細は、例えばRossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、国際公開第97/33551号(1997年9月18日公開)を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなるものでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介してトリプルヘリックス形成を促進するように設定され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上にプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のPCT公報、国際公開第97/33551号を参照。
これらの小分子は、上で検討したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた任意の他のスクリーニング技術により同定することができる。
【０１３１】
一実施態様では、内部移行抗体が好ましい。抗体は、細胞内への抗体の送達性を高めるある種の特徴を有し、又はそのような特徴を有するように修飾され得る。これを達成するための技術は当該技術で知られている。さらなる他の実施態様では、標的細胞内に抗体を発現させ得る核酸を導入することにより、標的細胞内で抗体を発現させることができる。例えば、米国特許第6,703,019号；同6,329,173号；及びPCT公報第2003/077945号を参照。また、リポフェクション又はリポソームを、細胞内に抗体を送達せしめるために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害断片が一般的に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設定可能である。このようなペプチドは、化学的に合成可能であり、及び／又は組換えＤＮＡ技術により産生させることができる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照。
【０１３２】
標的細胞内への修飾因子ポリペプチドの挿入性は、当該分野で知られている方法により高めることができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質に由来するもの等のある種の配列は、細胞膜を通過する異種タンパク質の効率的な取込みを可能にする。例えば、Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329を参照。
【０１３３】
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体はｃ-ｍｅｔ活性を阻害することができる任意の抗体でありうる。いくつかの具体的な例として、
(ａ) 以下の配列からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列
(i)   KSSQSLLYTSSQKNYLA (配列番号１)である配列Ａ１-Ａ１７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ１
(ii)  WASTRES (配列番号２)である配列Ｂ１-Ｂ７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ２
(iii) QQYYAYPWT (配列番号３)である配列Ｃ１-Ｃ９を含有してなるＨＶＲ-Ｌ３
(iv)  GYTFTSYWLH (配列番号４)である配列Ｄ１-Ｄ１０を含有してなるＨＶＲ-Ｈ１
(v)   GMIDPSNSDTRFNPNFKD (配列番号５)である配列Ｅ１-Ｅ１８を含有してなるＨＶＲ-Ｈ２
(vi)  XYGSYVSPLDY (配列番号６) であり、ＸがＲでない配列Ｆ１-Ｆ１１を含有してなるＨＶＲ-Ｈ３；
(ｂ) 変異体ＨＶＲが配列番号１、２、３、４、５又は６に示す配列の少なくとも一の残基の修飾を含有する、少なくとも一の変異体ＨＶＲ
を含んでなる抗ｃ-ｍｅｔ抗体などがある。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ１は、配列番号１の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ２は、配列番号２の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ３は、配列番号３の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ１は、配列番号４の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ２は、配列番号５の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ３は、配列番号６の配列を含んでなる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は、ＴＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ(配列番号７)を含んでなる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は、ＳＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ(配列番号８)を含んでなる。一実施態様では、これらの配列を含有する本発明の抗体は、ヒト化又はヒトである(共に本願明細書において記述される)。
【０１３４】
一態様では、本発明は、１、２、３、４、５又は６つのＨＶＲを含有してなる抗体を提供するものであり、各々のＨＶＲは配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される配列を含むか、それらからなるか、それらから基本的になるものであり、配列番号１はＨＶＲ-Ｌ１に相当し、配列番号２はＨＶＲ-Ｌ２に相当し、配列番号３はＨＶＲ-Ｌ３に相当し、配列番号４はＨＶＲ-Ｈ１に相当し、配列番号５はＨＶＲ-Ｈ２に相当し、そして、配列番号６、７又は８はＨＶＲ-Ｈ３に相当するものである。一実施態様では、本発明の抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含有してなるものであり、各々、順に、配列番号１、２、３、４、５及び７を含有する。一実施態様では、本発明の抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含有してなるものであり、各々、順に、配列番号１、２、３、４、５及び８を含有する。
【０１３５】
本発明の抗体の変異体ＨＶＲは、ＨＶＲ内に一又は複数の残基の修飾を含有しうる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ２変異体が、以下の位置：Ｂ１(Ｍ又はＬ)、Ｂ２(Ｐ、Ｔ、Ｇ又はＳ)、Ｂ３(Ｎ、Ｇ、Ｒ又はＴ)、Ｂ４(Ｉ、Ｎ又はＦ)、Ｂ５(Ｐ、Ｉ、Ｌ又はＧ)、Ｂ６(Ａ、Ｄ、Ｔ又はＶ)及びＢ７(Ｒ、Ｉ、Ｍ又はＧ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１変異体が、以下の位置：Ｄ３(Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｉ)、Ｄ５(Ｉ、Ｓ又はＹ)、Ｄ６(Ｇ、Ｄ、Ｔ、Ｋ、Ｒ)、Ｄ７(Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＶ)及びＤ９(Ｍ又はＶ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ２変異体が、以下の位置：Ｅ７(Ｙ)、Ｅ９(Ｉ)、Ｅ１０(Ｉ)、Ｅ１４(Ｔ又はＱ)、Ｅ１５(Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｔ又はＶ)、Ｅ１６( Ｌ)、Ｅ１７(Ｅ、Ｈ、Ｎ又はＤ)およびＥ１８(Ｙ、Ｅ又はＨ)の何れかの組合せにおいて１ないし４(１、２、３又は４)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３変異体が、以下の位置：Ｆ１(Ｔ、Ｓ)、Ｆ３(Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｋ)、Ｆ４(Ｇ)、Ｆ６(Ｒ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｗ)、Ｆ７(Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｖ)、Ｆ８(Ｓ、Ａ)、Ｆ１０(Ｙ、Ｎ)及びＦ１１(Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｆ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。それぞれの位置の後の括弧内の文字は例示的置換(すなわち置き換え)のアミノ酸を示すものであり、当分野の技術者に明らかなように、本明細書中の置換アミノ酸としての他のアミノ酸の適合性は、当分野で公知の技術及び／又は本明細書中に記載の技術を用いて慣例的に評価することができる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号１の配列を含有する。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＴである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＲである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ７はＴである。一実施態様では、本発明の抗体は変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含有してなり、Ｆ１がＴ又はＳであり、Ｆ３がＲ又はＳであり、そしてＦ７はＴである。
【０１３６】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＡである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体が、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ２をさらに含んでなり、各々は順に配列番号：１、２、３、４及び５を含有する。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、及び／又は７８はＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
【０１３７】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｂ６がＶである変異体ＨＶＲ-Ｌ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、３、４、５及び６に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、３、４、５及び７に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、３、４、５及び８に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
【０１３８】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１４がＴであり、Ｅ１５がＫであり、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、２、３、４及び６に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、２、３、４及び７に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、２、３、４及び８に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
【０１３９】
また、本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候の必要に応じて一以上の活性な化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない補完的な活性を有するものを含有してもよい。あるいは、又は加えて、組成物は、その機能を亢進する薬剤、例えば細胞障害性剤、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤を含有しうる。このような分子は、意図する目的に有効な量で混合して好適に存在する。
【０１４０】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に示す一般的な説明を考慮して、様々な他の実施態様が実施されうることを理解するであろう。実施例は例示的な目的のためのみであって、多少なりとも本発明の範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１４１】
材料及び方法
細胞培養
細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ＡＴＣＣ)、癌治療及び診断のＮＣＩ部(NCI Division of Cancer Treatment and Diagnosis)腫瘍保存機関又はヒューマンサイエンス振興財団から入手した。２９３細胞及びラット１Ａ細胞を除くすべての細胞株は、１０％ＦＢＳ(Sigma)、ペニシリン／ストレプトマイシン(GIBCO)及び２ｍＭ Ｌ-グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０で維持した。２９３細胞及びラット１Ａ細胞は、上記のように補充した高グルコースＤＭＥＭ中で維持した。
【０１４２】
プラスミド及び安定発現株
完全長Ｍｅｔ ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓは既に記載されている(Kong-Beltran 等, 2004)。Ｍｅｔ ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓを鋳型として用いて、製造業者の指示書に従って、QuikChange部位特異的突然変異誘発(Stratagene)により、既に記載(Peschard 等, 2001)のあるプライマーを用いてＹ１００３Ｆ点突然変異を生成した。QuikChange部位特異的突然変異誘発(Stratagene)により、Ｍｅｔエキソン１４に隣接して新たにＮｈｅＩ制限酵素部位(ａａ９６３−１０１１)を生成する２つのプライマー対を用いてエキソン１４を欠失し、次いでＮｈｅＩで消化した後にプラスミドを再びライゲーションした。ＤＮＡ塩基配列決定によって突然変異を確認した。ラット１Ａ細胞にＭｅｔ安定発現株を生成するために、ｐＲＫ５ＴＫｎｅｏ、Ｍｅｔ ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓ、Ｍｅｔ Ｙ１００３Ｆ-Ｖ５／Ｈｉｓ、又はＭｅｔ ΔＥｘ１４−Ｖ５／Ｈｉｓ ＤＮＡそれぞれ１０μｇをＫｐｎＩで消化して、精製した(Qiagen)。製造者の指示書に従って、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)により６ウェルプレート中で各々４μｇのＤＮＡをラット１Ａ細胞に形質移入した。翌日、細胞をトリプシン処理して、１０ｃｍのプレート中に播いた。２４時間後、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８(Sigma)を加えた。選別はおよそ２週間続け、３Ｄ６抗体を用いたＦＡＣＳ(米国特許第6,099,841号を参照)とＰＥ染色によって、Ｍｅｔポジティブクローンを選別した。１ウェル当たり１細胞とした。広がったクローンを溶解して、Ｖ５抗体(Invitrogen)を用いたイムノブロットによってＭｅｔについて試験した。
【０１４３】
免疫沈降及びウエスタンブロット分析
凍結組織試料においてタンパク質発現を分析するために、組織(〜１００ｍｇ)を、プロテアーゼインヒビター反応混液(Sigma)、ホスファターゼ阻害剤反応混液I及びII(Sigma)、５０ｍＭ フッ化ナトリウム及び２ｍＭ バナジン酸ナトリウムを含有する２００μｌの細胞溶解バッファ(Cell Signaling)中で、Polytron(登録商標)ホモジナイザー(Kinematica)を用いてホモジナイズした。４℃で１時間ゆっくり振とうすることによって試料を更に溶解して、プロテインＡセファロースFast Flow(Amersham)とプロテインＧセファロース４Fast Flow(Amersham)の混合物にて前清掃した。タンパク質濃度はブラッドフォード試薬(BioRad)を用いて測定した。その後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、タンパク質(２０μｇ)を分離して、ニトロセルロースメンブレンへ移し、Ｍｅｔ(DL-21, Upstate)又はβ-アクチン(I-19, Santa Cruz)抗体にてイムノブロットした。タンパク質は、増強させた化学発光(ECL Plus, Amersham)によって視覚化した。Ｍｅｔ及びＣｂｌの形質移入を伴う免疫共沈降研究のために、３μｇの各々のＭｅｔコンストラクトと３μｇのＣｂｌ-ｆｌａｇをＦｕＧＥＮＥ６(Roche)を用いて２９３細胞内に形質移入した。翌日、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦにて３０分間刺激して、完全なプロテアーゼ阻害剤反応混液錠剤(Roche)及びホスファターゼ阻害剤反応混液IIを含有する１％ＮＰ４０溶解バッファ[５０ｍＭ トリス(ｐＨ７．４５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１％ノニデット４０]を用いて回収した。細胞片を遠心分離して、１ｍｇの溶解物を、１．５μｌのＶ５抗体(Invitrogen)又は２μｇのＣｂｌ抗体(C-15, Santa Cruz)によって４℃で回転させながら終夜免疫沈降し、プロテインＧ又はＡビーズとともに２時間インキュベートした。２０ｍＭ ＤＴＴ(Sigma)を含有する２×試料バッファ(Invitrogen)を添加し、試料を５分間沸騰させた。試料を４−１２％のトリス-グリシンゲル(Invitrogen)に流し、０．４５μｍのニトロセルロースメンブレン(Invitrogen)へ移した。メンブレンは５％の脱脂乳にて１時間ブロックした後、Ｖ５抗体、ｆｌａｇポリクローナル抗体(Sigma)又はＰ-Ｔｙｒ抗体(4G10, Upstate)にてイムノブロットした。内在性Ｃｂｌを含む結合研究のために、２９３細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて１０ｃｍのプレートにつき６μｇの各々のＤＮＡコンストラクトを形質移入した。翌日、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦにて３０分間刺激して、回収した。試料を２μｇのＣｂｌ抗体又は１．５μｇのＶ５抗体にて免疫沈降して、Ｖ５抗体又はＣｂｌ抗体にてイムノブロットを行った。Ｖ５免疫沈降したブロットを、リストアウェスタンブロットストリッピングバッファ(Pierce)を用いて除去し、Ｐ-Ｍｅｔ Ｙ１００３(Biosource)、Ｐ-Ｍｅｔ Ｙ１２３４／Ｙ１２３４５ (Cell Signaling)、Ｐ-Ｍｅｔ Ｙ１３４９  (Cell Signaling)又はＰ-Ｍｅｔ１３６５(Biosource)にて再プローブした。分解を調べるために、６ウェルプレート中でＦｕＧＥＮＥ６を用いて、２９３細胞に、０．２５μｇのｐＲＫ５ＴＫｎｅｏ、Ｍｅｔ ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓ、Ｍｅｔ Ｙ１００３Ｆ-Ｖ５／Ｈｉｓ又はＭｅｔ ΔＥｘ１４-Ｖ５／Ｈｉｓ変異体を形質移入した。翌日、示された時間の間、細胞を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド(Sigma)で処理した。溶解物をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析し、メンブレンをＶ５抗体又はアクチン抗体にてイムノブロ��トした。
【０１４４】
ユビキチン結合アッセイ
ＦｕＧＥＮＥ６を用いて、試料当たり全ＤＮＡ量が６μｇとなるように、２９３細胞に３μｇのＭｅｔコンストラクト、２μｇのＣｂｌ-ｆｌａｇ、１μｇのＨＡ-ユビキチンと、ｐＲＫ５ＴＫｎｅｏ又はｐＦｌａｇ５ａの空ベクターを形質移入した。翌日、細胞を、２５μＭのＭＧ-１３２(Calbiochem)で４時間処理した後に回収した。阻害剤、２５μＭ ＭＧ-１３２及び１０ｍＭ Ｎ‐エチルマレイミドを含有する１％ＮＰ-４０溶解バッファ中で細胞を溶解した。溶解物(１ｍｇ)を、１．５μｇのＶ５抗体にて免疫沈降して、ユビキチン(P4D1, Santa Cruz)抗体にてイムノブロットして、次いではがして、Ｖ５抗体にて再プローブした。
【０１４５】
細胞シグナル伝達及び阻害研究
Ｈ２２６、Ｈ５９６、Ｈ３５８又はラット１Ａ-Ｍｅｔ安定発現クローンにおけるシグナル伝達の延長を調べるために、細胞をＰＢＳですすぎ、次いで０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ培地中で１時間、血清枯渇状態にした。ｒｈｕＨＧＦ又はアゴニスト抗Ｍｅｔモノクローナル抗体である３Ｄ６(Genentech)を無血清培地に加えて１０分置いた。次いで、単層の細胞をＰＢＳですすぎ、示された時間の抽出まで無血清培地中でインキュベートした。次いで、細胞を一度ＰＢＳですすぎ、１×ＤＴＴ(Invitrogen)を含有する１×ＳＤＳ試料バッファにて溶解して、短時間超音波処理し、５分間沸騰させた。Ｍｅｔレセプター阻害を分析するために、血清枯渇状態の細胞を含む無血清培地に、示された濃度の抗Ｍｅｔ５Ｄ５抗体を３０分間添加した。次いで、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦにて１５分間(Ｍｅｔ活性化分析のため)又は３０分間(Ａｋｔ及びＭＡＰＫ分析のため)刺激し、ＤＴＴを含有する１×ＳＤＳ試料バッファにて溶解した。沸騰させた試料は、Ｐ-Ｍｅｔ(Ｙ１２３０／Ｙ１２３４／Ｙ１２３５、BioSource)、Ｐ-Ｍｅｔ(Ｙ１２３４／Ｙ１２３５)、Ｍｅｔ(DL-21)、Ｐ-ＭＡＰＫ(E10、Cell Signaling)、Ｐ-ＭＡＰＫ(Cell Signaling)、Ｐ-Ａｋｔ(５８７Ｆ１１、Cell Signaling)、又はＡｋｔ(Cell Signaling)によるＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びイムノブロットにて分析した。二次抗体には、抗ウサギ-AlexaFluor680コンジュゲート(Molecular Probes)又は抗マウス-IRDye800コンジュゲート(Rockland Immunochemicals)を用いた。ニトロセルロースメンブレン上に転写したタンパク質は、製造業者の指示したウェスタンブロット使用法に従ってOdyssey (LiCor)を用いた赤外線スキャンの後に定量化して検出した。細胞生存率測定のために、０．５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ(アッセイ培地)中に９６ウェルプレートの１ウェル当たり１×１０４個以下の細胞を３通り播いて終夜置き、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦを含有するアッセイ培地にて刺激した。ｒｈｕＨＧＦを含まないアッセイ培地を刺激しなかったウェルに添加した。７２時間後、細胞生存度を、Celltiter-Glo発光細胞生存アッセイ(Promega)を用いて測定した。刺激インデックスは、ＨＧＦ刺激培養物の平均細胞生存単位を未刺激培養物の平均細胞生存単位で割って決定した。平均刺激インデックスは最低３回の異なる実験により決定した。増殖阻害アッセイは、ＨＧＦ刺激時にＯＡ-５Ｄ５又はコントロールＩｇを添加して、同様の方法で行った。
【０１４６】
インビボ異種移植片モデル
雌胸腺欠損ヌードマウス(Charles River, Hollister)の皮下に、Ｍｅｔ ＷＴ、Ｍｅｔ Ｙ１００３Ｆ、Ｍｅｔ ΔＥｘ１４又はベクターコントロールを発現しているラット１Ａ安定発現株のプールを接種した(５００００００細胞／マウス、ｎ＝５)。Ｍｅｔレセプター刺激のために、ヒトのＭｅｔのみを認識する抗Ｍｅｔ３Ｄ６アゴニスト抗体の１０ｍｇ／ｋｇを週に１度、腹膜内投与した。腫瘍はデジタル測径器を用いて週２回測定し、腫瘍体積は以下の方程式を用いて算出した：腫瘍容積(ｍｍ３)＝(π／６)(Ａ)(Ｂ)(Ｂ)。Ａ＝最長の幅、Ｂ＝最短の幅。
【０１４７】
結果及び考察
本発明者等は、原発性腫瘍、腫瘍細胞株及び原発性腫瘍異種移植片モデルを示す肺癌と大腸癌の試料のパネルから、Ｍｅｔのエクソンをコードする全ての配列を決定した。配列決定したところ、本発明者等は、イントロン領域フランキングエキソン１４において原発性肺腫瘍試料での体細胞性ヘテロ接合の突然変異を同定した(図１)。これらの突然変異は腫瘍特異性であり、同じ個体の非腫瘍性肺組織にはみられなかった(データは示さない)。非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株であるＨ５９６では、３ｐスプライスドナー部位にホモ接合性の点突然変異を同定した。ジヌクレオチドスプライス部位コンセンサス及びエキソン１４の上流のポリピリミジン域内の突然変異の存在と、エキソン１３とエキソン１５が同相のままであったという所見から、エキソン１４を欠失していると思われるＭｅｔ転写産物が依然として機能的なＭｅｔタンパク質を産生することが示唆される。このことを調べるために、本発明者等は、まず、変異体腫瘍及び細胞株からＭｅｔ ＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲ増幅を行った。３つすべてのイントロンの突然変異により、野生型と比べて短い長さの転写物が生じ、これはエキソン１４の欠失と一致していた(データは示さない)。また、本発明者等は、ＲＴ-ＰＣＲ産物を配列決定することによってエキソン１４の欠如を確認したところ、Ｍｅｔのアミノ酸Ｌ９６４からＤ１０１０を除去するインフレーム欠失が示された。興味深いことに、腫瘍試料がエキソン１４の欠失についてヘテロ接合体であるにもかかわらず、レセプターの変異した形態が主に発現されていたことから(データは示さない)、変異体の転写産物が優先的に発現されていることが示唆される。これは、ウェスタンブロッティングによって、切断型Ｍｅｔタンパク質の優先的な発現を示すことが更に確認された。これらのイントロンの突然変異を有する試料は、配列決定した関連するエキソンにおいて、Ｋ-ｒａｓ、Ｂ-ｒａｆ、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２については野生型であった(データは示さない)。まとめると、これらの結果は、これらのＭｅｔイントロンの突然変異が優性形質であることを示す。興味深いことに、腫瘍形成に関して機能的な因果関係は不明であるけれども、エキソン１４を欠失しているＭｅｔのスプライス変異体は正常なマウス組織において、既に報告されている(２０、２１)。しかしながら、本発明者等は、調べた任意の正常なヒトの肺試料において、このスプライス変異体の発現が検出されなかった(データは示さない)。以前に述べられているように(２１)、正常なヒト組織におけるこのスプライス変異体の欠失はさらに立証されている。エキソン１４を欠失しているスプライス変異体を含むｃＤＮＡは、原発性のヒトのＮＳＣＬＣ試料において報告されている、しかしながら、スプライシング欠損を媒介する際の体細胞性突然変異の役割は評価されなかったし、ある場合でも、発現されうる任意の変異体ｃ-ｍｅｔの機能上の結果でもなかった(２２)。スプライス変異体を含む核酸は癌細胞において、まれでないので、報告されたスプライス変異体の機能的な関連は知られていなかった。
【０１４８】
Ｍｅｔ(Ｌ９６４−Ｄ１０１０)の膜近傍ドメイン内のエキソン１４の４７のアミノ酸欠失によりＣｂｌ結合に必要なＹ１００３リン酸化部位が取り除かれ、活性化されたレセプターが下方制御される。以前の研究では、Ｙ１００３Ｆ突然変異がＣｂｌ結合を破壊し、Ｍｅｔ活性化を維持することが示されている(６)。本発明者等は、まず、免疫共沈降研究によって、腫瘍関連の変異形ＭｅｔのＣｂｌ結合の欠如を確認した。２９３細胞にＣｂｌ-ｆｌａｇを有する以下のＭｅｔコンストラクトを形質移入することによって、野生型Ｍｅｔ(Ｍｅｔ ＷＴ)、変異体Ｍｅｔ Ｙ１００３Ｆ(Ｍｅｔ Ｙ１００３Ｆ)及び、エキソン１４欠失Ｍｅｔ(Ｍｅｔ ΔＥｘ１４)を２９３細胞に形質移入した。本発明者等は、Ｍｅｔ ΔＥｘ１４へのＣｂｌ結合がＷＴ Ｍｅｔと比較して減少していることを発見し(図２Ａ)、Ｍｅｔ Ｙ１００３ＦへのＣｂｌ結合の欠如を確認した(６)。Ｍｅｔ ＷＴ及びＭｅｔ変異体によるＣｂｌチロシンリン酸化は同等であることから、Ｍｅｔ突然変異により全体のＣｂｌリン酸化が変更されなかったことが示された。また、Ｍｅｔ ＷＴがＭｅｔ ΔＥｘ１４ではなく内在性のＣｂｌと免疫共沈降することが示された(図２Ｂ)。これはＭｅｔとＣｂｌの共発現の所見と一致している。さらに、本発明者等は、Ｍｅｔレセプター活性化に必要なチロシンリン酸化部位を調べた。本発明者等のデータでは、Ｙ１２３４／Ｙ１２３５、Ｙ１３４９及びＹ１３６５のリン酸化がＭｅｔ ＷＴ及びＭｅｔ ΔＥｘ１４の両方に残っていることが示唆された(図２Ｂ)。予想されるように、Ｍｅｔ ＷＴと異なり、Ｍｅｔ ΔＥｘ１４のＹ１００３リン酸化が欠如していた(図２Ｂ)。Ｃｂｌ Ｅ３-リガーゼ活性は、レセプターのユビキチン媒介性の分解を促すことが報告されているので(６、８)、Ｍｅｔ ＷＴ、Ｍｅｔ Ｙ１００３Ｆ及びＭｅｔ ΔＥｘ１４を形質移入した細胞において、ユビキチン結合アッセイを行った。Ｍｅｔ ΔＥｘ１４及びＭｅｔ Ｙ１００３Ｆはともに、Ｃｂｌの存在下において、Ｍｅｔ ＷＴと比べてユビキチン結合を減弱した(図２Ｃ)。本発明者等は、Ｙ１２３４／Ｙ１２３５のリン酸化がすべてのＭｅｔコンストラクトに残っていることと、ホスホ-Ｙ１００３が既に述べたように変異体内で欠如していることを確認した(データは示さない)。興味深いことに、変異体と比較してＣｂｌとの共発現又はＭｅｔ ＷＴ単独の発現により、あまりプロセシングされていないＭｅｔ ＷＴが検出された(図２Ｃ)。これらの所見から、Ｃｂｌを結合するＭｅｔ ＷＴが優先してユビキチン結合され、Ｍｅｔ ΔＥｘ１４とは対照的に分解されることが示唆される(６、２４)。Ｍｅｔ ΔＥｘ１４のユビキチン結合の減少によりレセプターの下方制御が生じるかどうかを決定するために、細胞にＭｅｔコンストラクトを形質移入して、シクロヘキシミド処理し、新規のタンパク質合成を阻止した。Ｍｅｔ ΔＥｘ１４は、Ｍｅｔ ＷＴと比較して、時間とともに遅発性のレセプター下方制御を示した(図２Ｄ)。Ｍｅｔ Ｙ１００３Ｆ変異体は同様な結果を示した(データは示さない)。転写産物レベルでＭｅｔを同程度に発現していたにもかかわらず、エキソン１４のスプライス変異体を有する原発性腫瘍は、同一の患者の正常な隣接肺組織とＭｅｔ野生型腺癌の両方に���べて、Ｍｅｔタンパク質のレベルが有意に増加していた(データは示さない)。さらに、これらのエキソン１４欠失の患者腫瘍におけるＭｅｔ発現の免疫組織化学分析により、すべての腫瘍性細胞において、強い膜性の発現が示された。それに対して、Ｍｅｔ ＷＴを有する腫瘍と正常な隣接組織では散発性のＭｅｔ発現が観察された(データは示さない)。
【０１４９】
Ｍｅｔ ΔＥｘ１４の下方制御の減少がＨＧＦ刺激の際の下流のシグナル伝達に作用したかどうかを決定するために、エキソン１４欠失(Ｈ５９６)又はＭｅｔ ＷＴ(Ｈ２２６及びＨ３５８)を有するＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株において、Ｍｅｔ、Ａｋｔ及びＭＡＰＫリン酸化レベルを調べた。Ｈ５９６細胞は、ホスホ-Ｍｅｔ及びホスホ-ＭＡＰＫレベルがＨＧＦ刺激の３時間後まで維持されるのに対して、Ｍｅｔ ＷＴレセプターを発現するＨ２２６細胞株及びＨ３５８細胞株は時間につれて規則的にリン酸化が損失されていたことを示した(図２Ｅ)。興味深いことに、ホスホ-Ａｋｔレベルは、ＨＧＦに応答して初めに活性化されるにもかかわらず時間につれて維持されなかった。また、Ｓｔａｔ３及びＳｔａｔ５のリン酸化を調べたが、活性化の亢進は示されなかった(データは示さない)。これらの腫瘍細胞株は異なる遺伝的背景に由来するので、本発明者等は比較のために空のベクター、Ｍｅｔ ＷＴ及びＭｅｔ ΔＥｘ１４を用いてラット１Ａ細胞の安定発現株を生成した。ラット１Ａ Ｍｅｔ ΔＥｘ１４は、組み換えヒトレセプター単独を活性化するＭｅｔアゴニスト３Ｄ６によって刺激した場合に、Ｍｅｔ ＷＴと比べて、ＭＡＰＫリン酸化の延長を示したが、Ａｋｔ活性化は示さなかった(２５)(図２Ｆ、５)。
【０１５０】
継続したＭｅｔ及びＭＡＰＫのシグナル伝達の結果は、２８の更なるＮＳＣＬＣ細胞株のパネルに照らしてエキソン１４欠失Ｍｅｔを有するＨ５９６細胞のＨＧＦ媒介性の増殖において調べた(図３Ａ)。Ｈ５９６細胞は一貫して、ＮＳＣＬＣ細胞株のパネルのＨＧＦ刺激により最も高い増殖能力を表した。さらに、Ｍｅｔ欠失のインビボ増殖を評価するために、マウスに、ラット１Ａ Ｍｅｔ ΔＥｘ１４安定発現株を接種し、腫瘍形成能についてラット１Ａ Ｍｅｔ ＷＴと比較した。細胞増殖の増加は、Ｍｅｔ ＷＴと比較して、Ｍｅｔ ΔＥｘ１４及びＭｅｔ Ｙ１００３Ｆ ラット１ａ細胞において観察された(データは示さない)。３Ｄ６による刺激によって、ラット１Ａ Ｍｅｔ ΔＥｘ１４細胞は、ラット１Ａ Ｍｅｔ ＷＴに比べて、高い腫瘍形成性があり、腫瘍をより大きくさせた(図３Ｂ)。これらの結果は、エキソン１４欠失Ｍｅｔの発癌の役割の亢進と一致していた。
【０１５１】
ＭｅｔアンタゴニストがＭｅｔを欠失している腫瘍細胞を阻害しうるかどうかを決定するために、Ｈ５９６細胞を、公知の抗ｃ-ｍｅｔ阻害剤(抗Ｍｅｔ ＯＡ-５Ｄ５とも称する(２６))で処理した。抗Ｍｅｔ ＯＡ-５Ｄ５は３つの免疫グロブリンポリペプチドを含んでなる抗体である。つまり、可変ドメイン配列を含有する完全な軽鎖及び重鎖(図９に示す)、並びに完全長の重鎖のＦｃ部と二量体化するＦｃ部位を含有するＮ末端切断型重鎖を含む。また、抗Ｍｅｔ ＯＡ-５Ｄ５の構築及び生成は、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２６１９(２００４年１２月１７日に出願)において記述される。Ｍｅｔ及びＭＡＰＫのリン酸化は、用量に依存して抗Ｍｅｔ ＯＡ-５Ｄ５の添加により減少した(図４Ａ、６)。さらに、ＯＡ-５Ｄ５によるＨ５９６細胞の処理により、細胞の増殖がリガンドに依存して用量依存的に阻害された(図４Ｂ)。これらの結果は、Ｍｅｔアンタゴニストによって過剰に安定化されるｃ-ｍｅｔ(例えば膜近傍の欠失を表す変異体ｃ-ｍｅｔ)を発現している癌のターゲティングを含む治療的手法を支持するものである。
【０１５２】
腫瘍細胞には異常なスプライシングが本来備わっているにもかかわらず、腫瘍関連のスプライス変異体は実際のところ、細胞内でゆっくりと分解され、発癌活性の亢進を表す変異体レセプタータンパク質をコードすることは、むしろ予想外である。本発明者等のデータは、例えば体細胞性突然変異により制御されるスプライシングイベントが発癌性遺伝子産物を活性化するために腫瘍により利用されることを強く示唆する。簡単な研究において、差別的にスプライセオソームの集合化(「アセンブリ」ともいう)に作用し、選択的にエキソン１４を除外する複数の種類のイントロン突然変異の識別によって、Ｍｅｔのこのような変異原性イベントの関連が強く示唆された。興味深いことに、膜近傍ドメイン内の欠失及び挿入は、外見上は、レセプター高次構造及びキナーゼドメインの活性化を変えることによる特定のレセプターチロシンキナーゼの活性化に機能がある(Hubbard, S Nature Rev Mol Cell Bio, 5:464, 2004)。ＫＩＴ(Hirota 等 Science 279:577, 1998)及びＰＤＧＦＲα(Heinrich, MC. 等 Science 299:708, 2003)の膜近傍欠失は消化管間質腫瘍において同定されている。膜近傍内の内部タンデムリピートは、急性骨髄性白血病においてＦＬＴ３を活性化する(Nakao, M 等 Leukemia 10:1911, 1996)。しかしながら、本明細書中の膜近傍欠失の同定により、レセプター下方制御を遅延させるＭｅｔ活性化の完全に異なるメカニズムが示され、したがって癌細胞において有意に安定性が増している変異体ｃ-ｍｅｔタンパク質が生じる。これらのデータから、レセプター下方制御を制御する突然変異が発癌活性を引き起こし、腫瘍発達を促すことが示唆される。
【０１５３】
引用文献の一部
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【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】Ｍｅｔのエキソン１４に隣接するイントロン突然変異を表す。イントロン／エキソン構造に関して、対応する核酸(NM_000245)欠失及び／又は点突然変異(薄い灰色文字)を示すＭｅｔエキソン１４の概略図。(A) Ｈ５９６、肺癌細胞株。(B) pat.14、患者１４の肺腫瘍試料。(C) pat.16、患者１６の患者の肺腫瘍試料。参考として、腫瘍Ｈ５９６には、(A)において＋１とマークした位置でＧからＴへの点突然変異がある。腫瘍患者１４には、(B)において−２７から−６とマークした位置の配列の欠失がある。腫瘍患者１６には、(C)において３１９５から＋７とマークした位置の配列の欠失がある。
【図２Ａ】Ｍｅｔ及びＭＡＰＫの活性化と関係している過剰に安定化したｃ-ｍｅｔの遅発性下方制御。ＭｅｔコンストラクトとＣｂｌ-ｆｌａｇを同時に形質移入した２９３細胞を、Ｖ５又はＣｂｌ抗体によって免疫沈降(ＩＰ)した後に、Ｖ５、ｆｌａｇ又はＰ-Ｔｙｒ抗体によってイムノブロット(ＩＢ)した。溶解物はｆｌａｇ又はＣｂｌ抗体によって探索した。
【図２Ｂ】２９３細胞にＭｅｔコンストラクトを形質移入した後に、内在性ＣｂｌのＩＰを行った。Ｖ５抗体によるイムノブロットでは、内在性ＣｂｌによりＭｅｔＤＥｘ１４ではなくＭｅｔ ＷＴが同時に免疫沈降されたことを示す。メンブレンを取り除き、Ｙ１００３、ＹＹ１２３４／１２３５、Ｙ１３４９又はＹ１３６５リン酸-特異的抗体によって再び探索した。
【図２Ｃ】２９３細胞の一過性形質移入体の溶解物を、Ｖ５抗体によって免疫沈降して、ユビキチン結合したＭｅｔを検出するためにユビキチン抗体によってイムノブロットを行った。メンブレンを取り除き、Ｖ５抗体によって再び探索してＭｅｔの存在を検出した。溶解物はｆｌａｇ又はアクチン抗体によって探索して、等価物発現についてのＣｂｌ-ｆｌａｇ又はアクチンを検出した。
【図２Ｄ】２９３細胞に示したコンストラクトを形質移入して、１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで処理した。溶解物は、Ｖ５抗体又はアクチンによって探索した。
【図２Ｅ】血清枯渇状態の肺癌細胞株を５０ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦにて１０分間刺激し、その後すすいで、無血清培地に戻した。示した時間に溶解物を回収して、Ｐ-Ｍｅｔ(Ｙ１２３０／Ｙ１２３４／Ｙ１２３５)、Ｍｅｔ、Ｐ-ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫ、Ｐ-Ａｋｔ又はＡｋｔについてイムノブロットを行った。
【図２Ｆ】ラット１Ａ安定クローンを血清枯渇状態にして、アゴニストＭｅｔモノクローナル抗体３Ｄ６(５μｇ／ｍｌ)にて１０分間処理して、ＰＢＳですすぎ、無血清培地に戻した。示された時間に溶解物を採取し、Ｐ-ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫ、Ｐ-Ａｋｔ又はＡｋｔについてイムノブロットを行った。
【図３Ａ】Ｍｅｔ膜近傍の欠失を有する細胞株におけるリガンド依存性の増殖能の亢進。ＮＳＣＬＣ細胞株のパネルにおけるＨＧＦ刺激性増殖は、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦの有無の下に７２時間培養した後に測定した。最低３回の別々の実験から測定して、結果を刺激インデックス(ＳＩ)として示した。
【図３Ｂ】ヌードマウスに皮下接種した、ＨＧＦアゴニスト抗体(３Ｄ６)を含む又は含まない、ベクター、Ｍｅｔ ＷＴ、Ｍｅｔ ＤＥｘ１４をそれぞれ発現するラット１Ａ安定細胞株の増殖曲線。
【図４】抗Ｍｅｔ ｍＡｂであるＯＡ-５Ｄ５によるリガンド依存性Ｍｅｔシグナル伝達とＨ５９６細胞における増殖の抑制。(A) 血清枯渇状態のＨ２２６又はＨ５９６細胞を、示された濃度のＯＡ-５Ｄ５とともに３０分間インキュベートして、その後１００ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦによって１５分間刺激した。溶解物を採取して、Ｐ-Ｍｅｔ(Ｙ１２３４／Ｙ１２３５)、Ｍｅｔ、Ｐ-Ａｋｔ、Ａｋｔ、Ｐ-ＭＡＰＫ又はＭＡＰＫについてイムノブロットを行った。(B) ５０ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＨＧＦの有無の下、示された濃度のＯＡ-５Ｄ５又はコントロールＩｇで処理して、７２時間後に細胞生存率を測定した。
【図５】ラット１Ａ安定性Ｍｅｔ細胞株におけるキナーゼに対するホスホキナーゼ比の定量化。Ｐ-ＭＡＰＫ：ＭＡＰＫ(下)及びＰ-Ａｋｔ：Ａｋｔ(上)の比率は、AlexaFluor680及びIR Dye800コンジュゲート二次抗体を検出するOdyssey赤外線スキャナーを用いて定量化した。
【図６】ＯＡ-５Ｄ５で処理したＨ５９６及びＨ２２６細胞におけるキナーゼに対するホスホキナーゼ比の定量化。細胞株ごとのＰ-Ｍｅｔ：Ｍｅｔ、Ｐ-Ａｋｔ：Ａｋｔ、又はＰ-ＭＡＰＫ：ＭＡＰＫの比率は、AlexaFluor680及びIRDye800コンジュゲート二次抗体を検出するOdyssey赤外線スキャナーを用いて定量化した。
【図７】ヒトのｃ-ｍｅｔエキソン１４のスプライシングを制御すると思われるシス作動性スプライシング成分を表す。これらの成分内の一又は複数の位置の突然変異が、エキソン１４の野生型スプライシングに対してネガティブな影響を及ぼすと思われる。
【図８】RefSeq. NM_000245に基づく野生型のヒトｃ-ｍｅｔタンパク質配列を表す。
【図９】実施例に示すＯＡ-５Ｄ５の軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列を表す。
【図１】
2008535821.tif 000005
【図２Ａ】
2008535821.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008535821.tif 000017
【図８】
2008535821.tif 000018
【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月22日(2008.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体はｃ-ｍｅｔ活性を阻害することができる任意の抗体でありうる。いくつかの具体的な例として、
(ａ) 以下の配列からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列
(i)   KSSQSLLYTSSQKNYLA (配列番号４)である配列Ａ１-Ａ１７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ１
(ii)  WASTRES (配列番号５)である配列Ｂ１-Ｂ７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ２
(iii) QQYYAYPWT (配列番号６)である配列Ｃ１-Ｃ９を含有してなるＨＶＲ-Ｌ３
(iv)  GYTFTSYWLH (配列番号２０)である配列Ｄ１-Ｄ１０を含有してなるＨＶＲ-Ｈ１
(v)   GMIDPSNSDTRFNPNFKD (配列番号２１)である配列Ｅ１-Ｅ１８を含有してなるＨＶＲ-Ｈ２
(vi)  XYGSYVSPLDY (配列番号２２) であり、ＸがＲでない配列Ｆ１-Ｆ１１を含有してなるＨＶＲ-Ｈ３；
(ｂ) 変異体ＨＶＲが配列番号４、５、６、２０、２１又は２２に示す配列の少なくとも一の残基の修飾を含有する、少なくとも一の変異体ＨＶＲ
を含んでなる抗ｃ-ｍｅｔ抗体などがある。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ１は、配列番号４の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ２は、配列番号５の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ３は、配列番号６の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ１は、配列番号２０の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ２は、配列番号２１の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ３は、配列番号２２の配列を含んでなる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は、ＴＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ(配列番号２３)を含んでなる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は、ＳＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ(配列番号２４)を含んでなる。一実施態様では、これらの配列を含有する本発明の抗体は、ヒト化又はヒトである(共に本願明細書において記述される)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
一態様では、本発明は、１、２、３、４、５又は６つのＨＶＲを含有してなる抗体を提供するものであり、各々のＨＶＲは配列番号４、５、６、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される配列を含むか、それらからなるか、それらから基本的になるものであり、配列番号４はＨＶＲ-Ｌ１に相当し、配列番号５はＨＶＲ-Ｌ２に相当し、配列番号６はＨＶＲ-Ｌ３に相当し、配列番号２０はＨＶＲ-Ｈ１に相当し、配列番号２１はＨＶＲ-Ｈ２に相当し、そして、配列番号２２、２３又は２４はＨＶＲ-Ｈ３に相当するものである。一実施態様では、本発明の抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含有してなるものであり、各々、順に、配列番号４、５、６、２０、２１及び２３を含有する。一実施態様では、本発明の抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含有してなるものであり、各々、順に、配列番号４、５、６、２０、２１及び２４を含有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
本発明の抗体の変異体ＨＶＲは、ＨＶＲ内に一又は複数の残基の修飾を含有しうる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ２変異体が、以下の位置：Ｂ１(Ｍ又はＬ)、Ｂ２(Ｐ、Ｔ、Ｇ又はＳ)、Ｂ３(Ｎ、Ｇ、Ｒ又はＴ)、Ｂ４(Ｉ、Ｎ又はＦ)、Ｂ５(Ｐ、Ｉ、Ｌ又はＧ)、Ｂ６(Ａ、Ｄ、Ｔ又はＶ)及びＢ７(Ｒ、Ｉ、Ｍ又はＧ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１変異体が、以下の位置：Ｄ３(Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｉ)、Ｄ５(Ｉ、Ｓ又はＹ)、Ｄ６(Ｇ、Ｄ、Ｔ、Ｋ、Ｒ)、Ｄ７(Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＶ)及びＤ９(Ｍ又はＶ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ２変異体が、以下の位置：Ｅ７(Ｙ)、Ｅ９(Ｉ)、Ｅ１０(Ｉ)、Ｅ１４(Ｔ又はＱ)、Ｅ１５(Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｔ又はＶ)、Ｅ１６(Ｌ)、Ｅ１７(Ｅ、Ｈ、Ｎ又はＤ)およびＥ１８(Ｙ、Ｅ又はＨ)の何れかの組合せにおいて１ないし４(１、２、３又は４)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３変異体が、以下の位置：Ｆ１(Ｔ、Ｓ)、Ｆ３(Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｋ)、Ｆ４(Ｇ)、Ｆ６(Ｒ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｗ)、Ｆ７(Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｖ)、Ｆ８(Ｓ、Ａ)、Ｆ１０(Ｙ、Ｎ)及びＦ１１(Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｆ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。それぞれの位置の後の括弧内の文字は例示的置換(すなわち置き換え)のアミノ酸を示すものであり、当分野の技術者に明らかなように、本明細書中の置換アミノ酸としての他のアミノ酸の適合性は、当分野で公知の技術及び／又は本明細書中に記載の技術を用いて慣例的に評価することができる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号４の配列を含有する。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＴである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＲである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ７はＴである。一実施態様では、本発明の抗体は変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含有してなり、Ｆ１がＴ又はＳであり、Ｆ３がＲ又はＳであり、そしてＦ７はＴである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＡである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体が、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ２をさらに含んでなり、各々は順に配列番号４、５、６、２０及び２１を含有する。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、及び／又は７８はＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｂ６がＶである変異体ＨＶＲ-Ｌ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号４、６、２０、２１及び２２に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号４、６、２０、２１及び２３に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号４、６、２０、２１及び２４に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１４がＴであり、Ｅ１５がＫであり、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号４、５、６、２０及び２２に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号４、５、６、２０及び２３に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号４、５、６、２０及び２４に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
【国際調査報告】
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