(57)【要約】  本発明は、排出ポンプ阻害剤を用いることによりグラム陰性生物のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を増加するための方法および組成物を提供する。
2008505145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の式（Ｉ）
【化１】
2008505145.tif 000026
［式中、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＲ）−、−ＣＨ（ＳＨ）−、−ＣＨ（ＳＲ）−、−ＣＦ２−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＲ）−または−ＣＨ（Ｆ）−〔ここで、Ｒはアルキルである。〕であり；
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはアルキルであるか、または
Ｒ２またはＲ３とＲ４またはＲ５は、一体となってＣ４−７シクロアルキルを形成し；そして、
ｎは、０−３であり、ただしｎが０のとき、Ｘは−ＣＨ２−である。］
で示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグ、および排出ポンプ阻害剤を投与することを含む、哺乳動物においてグラム陰性細菌感染症を処置するための方法。
【請求項２】
前記ヘテロアリールが、式（ＩＩＩ）
【化２】
2008505145.tif 000027
［式中、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、フェニル、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシである。］
で示される残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）の化合物が、
【化３】
2008505145.tif 000028
である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌感染症が、ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌によって引き起こされるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記グラム陰性細菌が、大腸菌（E. coli）、緑膿菌（P. aeruginosa）、インフルエンザ菌（H. influenzae）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グラム陰性細菌がインフルエンザ菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有効量の化合物
【化４】
2008505145.tif 000029
およびグラム陰性細菌においてＲＮＤ排出ポンプを阻害する排出阻害剤を投与することを含む、哺乳動物においてＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌によって引き起こされるグラム陰性細菌感染症を処置するための方法。
【請求項８】
前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、インフルエンザ菌および淋菌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記グラム陰性細菌がインフルエンザ菌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
【化５】
2008505145.tif 000030
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＲ）−、−ＣＨ（ＳＨ）−、−ＣＨ（ＳＲ）−、−ＣＦ２−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＲ）−または−ＣＨ（Ｆ）−〔ここで、Ｒはアルキルである。〕であり；
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはアルキルであるか、または
Ｒ２またはＲ３とＲ４またはＲ５は、一体となってＣ４−７シクロアルキルを形成し；そして
ｎは、０−３であり、ただしｎが０のとき、Ｘは−ＣＨ２−である。］
で示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグに対するグラム陰性細菌の感受性を増加するための方法であって、前記細菌を、式（Ｉ）の化合物およびグラム陰性細菌において排出ポンプを阻害するのに有効な量の排出ポンプ阻害剤と接触させることを含む方法。
【請求項１１】
前記ヘテロアリールが、式（ＩＩＩ）
【化６】
2008505145.tif 000031
［式中、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、フェニル、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシである。］
で示される残基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
式（ＩＩＩ）の化合物が、
【化７】
2008505145.tif 000032
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記グラム陰性細菌における排出ポンプがＲＮＤ排出ポンプである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、インフルエンザ菌および淋菌からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記グラム陰性細菌がインフルエンザ菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化合物
【化８】
2008505145.tif 000033
に対するＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌の感受性を増加するための方法であって、グラム陰性細菌を前記化合物およびグラム陰性細菌においてＲＮＤポンプを阻害するのに有効な量の排出ポンプ阻害剤と接触させることを含む方法。
【請求項１７】
前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、インフルエンザ菌および淋菌からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記グラム陰性細菌がインフルエンザ菌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
式（Ｉ）
【化９】
2008505145.tif 000034
［式中、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＲ）−、−ＣＨ（ＳＨ）−、−ＣＨ（ＳＲ）−、−ＣＦ２−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＲ）−または−ＣＨ（Ｆ）−〔ここで、Ｒは、アルキルである。〕であり；
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはアルキルであるか、または
Ｒ２またはＲ３とＲ４またはＲ５は、一体となってＣ４−７シクロアルキルを形成し；そして、
Ｎが０−３であり、ただし、ｎが０のとき、Ｘは−ＣＨ２−である］
で示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグ、排出ポンプ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
式（Ｉ）の化合物のヘテロアリールが、式（ＩＩＩ）
【化１０】
2008505145.tif 000035
［式中、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、フェニル、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシである。］
で示される残基である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
式（ＩＩＩ）の化合物が、
【化１１】
2008505145.tif 000036
である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記排出阻害剤が、グラム陰性細菌においてＲＮＤ排出ポンプを阻害する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、インフルエンザ菌および淋菌からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記グラム陰性細菌がインフルエンザ菌である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ペプチジルデホルミラーゼ(ＰＤＦ)阻害剤、および特に、排出ポンプ阻害剤を利用することによりグラム陰性細菌に対するＰＤＦ阻害剤の有効性を改善するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現在利用できるすべての抗生物質に対する標的ベースの耐性の継続的出現および拡大は、これらの機序の回避を目的とする化合物修飾の必要性、またはそれ以上に、既存の標的ベースの耐性が交差耐性を与えると予期されない新規の細胞機能に向けられた化合物の発見の必要性を明らかにしている。通常使用される抗生物質についてよく特徴付けられた耐性機序を有するものを含む、ＰＤＦのこれまで利用されていない機能を阻害する新規クラスのヒドロキシルアミン化合物が、この点で、特にグラム陽性細菌に対してかなり有望である。ＷＯ０２／１０２７９０Ａ１を参照のこと。ＰＤＦは、細菌のような原核生物で発見されるメタロペプチダーゼである。原核生物におけるタンパク質合成は、Ｎ−ホルミルメチオニン(ｆＭｅｔ)から始まる。タンパク質合成の開始後、ホルミル基は、ＰＤＦにより除去される。この活性は、タンパク質の成熟に必須である。ＰＤＦが細菌の増殖に必要であることが示されている。真核生物における合成は、その開始をｆＭｅｔに依存しないため、ＰＤＦを阻害し得る薬剤は、新規の抗微生物剤（antimicrobial）および抗菌剤（antibacterial agent）の開発にとって魅力的な候補物質である。
【０００３】
しかしながら、これらの新規薬剤の開発における主な可能性のある障害は、広範囲の構造上無関係の化合物に対する内因性耐性（intrinsic resistance）に寄与する一般的機序である。これらには、グラム陰性細菌の場合、最も急性に現れる膜の不透過性および排出が含まれ、ここで、外膜および排出ポンプは、様々な構造上無関係の化合物の細胞内蓄積を最小にするために共同的に作用することが示されている。Nikaido, J Bacteriol, Vol. 178, No. 20, pp. 5853−5859 (1996)；Nikaido, Curr Opin Microbiol, Vol. 1, No. 5, pp. 516−523 (1998)；および、Nikaido and Zgurskaya, J Mol Microbiol Biotechnol, Vol. 3, No. 2, pp. 215−218 (2001)を参照のこと。耐性−結節形成−分裂（resistance−nodulation−division；ＲＮＤ)ファミリーのグラム陰性細菌の排出ポンプは、最も広い基質範囲を有しており、それ故に、グラム陰性細菌の対薬物耐性に最も一般的に関係している。構造上、それらは、内膜プロトン−薬物交互輸送体、外膜チャネル、ならびにペリプラズムの内膜成分と外膜成分との相互作用を容易にする際に機能すると考えられるいわゆる膜融合タンパク質からなる。基質排出は、プロトン駆動力によってなされ、そして最近のデータは、基質が細胞膜のペリプラズムまたは内側の葉状器官（leaflet）からポンプ排出され得ることを示す。Elkins and Nikaido, J Bacteriol, Vol. 184, No. 23, pp. 6490−6498 (2002)；Li, Ma, Livermore and Nikaido, Antimicrob Agents Chemother, Vol. 38, No. 8, pp. 1742−1752 (1994)；およびYu et al., Science, Vol. 300, No. 5621, pp. 976−980 (2003)を参照のこと。
【０００４】
排出ポンプ、特にＲＮＤファミリーのそれによって対応される広い基質範囲は、高い標的活性の新規の抗微生物剤でさえ有効性が減じられる可能性が、広い範囲またはグラム陰性細菌適用範囲を目指す創薬プログラムで予期され、考慮されなければならないということである。さらに、おそらく抗微生物剤または抗菌剤への暴露により選択される排出ポンプ発現を開始または増加する調節変異が、所定のポンプについてのいくつかまたは全ての基質に対するさらなる耐性を供し得る。Chuanchuen et al., Antimicrob Agents Chemother, Vol. 45, No. 2, pp. 428−432 (2001)を参照のこと。排出ポンプ過剰発現因子（overexpressor）が、臨床的に単離されており[Beinlich, Chuanchuen and Schweizer, FEMS Microbiol Lett, Vol. 198, No. 2, pp. 129−134 (2001)；Mazzariol et al., Antimicrob Agents Chemother, Vol. 44, No. 12, pp. 3441−3443 (2000)；および、Ziha−Zarifi et al., Antimicrob Agents Chemother, Vol. 43, No. 2, pp. 287−291 (1999)を参照のこと]、ポンプ過剰発現は、増加した薬物耐性にかなり貢献し得る。故に、新規な薬剤に対する交差耐性は、他の抗生物質により選択される標的ベースの変異の形で先在しないかもしれないが、抗微生物剤暴露により、新規薬剤に対する減少した感受性を有するポンプ変異体を選択することができる。
【０００５】
重複する基質範囲の複数のＲＮＤファミリーポンプおよび流入を制限することによりポンプの効果を顕著に増加することが示されている著しく不透過性の外膜を有する重要な新たな日和見病原菌（opportunistic pathogen）である緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、排出ベースの耐性のスペクトルの一端を意味する。Poole, J Mol Microbiol Biotechnol, Vol. 3, No. 2, pp. 255−264 (2001)を参照のこと。おそらく他端は、たった１つの公知のＲＮＤファミリー(ａｃｒＡＢホモログ)ポンプを有し[Fleischmann et al., Science, Vol. 269, No. 5223, pp. 496−512 (1995)；および、Sanchez, Pan, Vinas and Nikaido, J Bacteriol, Vol. 179, No. 21, pp. 6855−6857 (1997)を参照のこと]、そして比較的透過性の外膜により特徴付けられる重要な呼吸器病原菌であるインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)を意味する[Dagan et al., Pediatr Infect Dis J, Vol. 19, No. 2, pp. 95−104 (2000)；Gotfried, Am J Med, Vol. 111, Suppl. 9A, pp. 25S−29S (2001)；Pfaller, Ehrhardt and Jones, Am J Med, Vol. 111, Suppl. 9A, pp. 4S−12S (2001)；および、Sokol, Am J Med, Vol. 111, Suppl. 9A, pp. 19S−24S (2001)を参照のこと]。外膜の増加した透過性は、エリスロマイシンのような比較的大きな基質にとっても排出ポンプ効率の制限に関与している。上記Sanchez, Pan, Vinas and Nikaido (1997)を参照のこと。故に、インフルエンザ菌は、排出ベースの内因性および後天的耐性が、あまり問題を引き起こさないと予想され得るグラム陰性病原菌の一例を意味し得る。このことにかかわりなく、そしてエリスロマイシンがインフルエンザ菌のａｃｒＡＢホモログの基質であることと一致して[上記Sanchez, Pan, Vinas and Nikaido (1997)を参照のこと]、インフルエンザ菌臨床分離株におけるマクロライドに対する中程度の内因性耐性は、排出に関係している。Peric, Bozdogan, Jacobs and Appelbaum, Antimicrob Agents Chemother, Vol. 47, No. 3, pp. 1017−1022 (2003)を参照のこと。インフルエンザ菌臨床株は、一般的に、様々な新規のＰＤＦ阻害剤に対する減少した感受性を示すことも報告されている。
【０００６】
まとめとして、上記の議論は、細菌、特にグラム陰性細菌に存在する排出ポンプによる抗菌剤の能動排出が、細菌のこれらの薬剤に対する耐性に貢献する重要な因子であり得ることを示す。従って、細菌の排出ポンプ阻害剤と抗菌剤の組合せ剤の開発および使用は、細菌からの前記薬剤の排出により低下した感受性を有する細菌、特にグラム陰性細菌の、様々な抗菌剤に対する感受性を改善し得る。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
１つの局面において、本発明は、有効量の式（Ｉ）
【化１】
2008505145.tif 000003
［式中、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＲ）−、−ＣＨ（ＳＨ）−、−ＣＨ（ＳＲ）−、−ＣＦ２−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＲ）−または−ＣＨ（Ｆ）−〔ここで、Ｒはアルキルである。〕であり；
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはアルキルであるか、または
Ｒ２またはＲ３とＲ４またはＲ５は、一体となってＣ４−７シクロアルキルを形成し；そして、
ｎは、０−３であり、ただしｎが０のとき、Ｘは−ＣＨ２−である。］
で示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグ、および排出ポンプ阻害剤を投与することを含む、哺乳動物に生じるグラム陰性細菌感染症を処置するための方法を提供する。
【０００８】
１つの有用な態様において、本発明は、ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌によって引き起こされる哺乳動物におけるグラム陰性細菌感染症を処置するための方法を提供する。本方法には、有効量の化合物
【化２】
2008505145.tif 000004
およびグラム陰性細菌においてＲＮＤ排出ポンプを阻害する排出阻害剤を投与することが含まれる。
【０００９】
他の局面において、本発明は、式（Ｉ）:
【化３】
2008505145.tif 000005
［式中、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＲ）−、−ＣＨ（ＳＨ）−、−ＣＨ（ＳＲ）−、−ＣＦ２−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＲ）−または−ＣＨ（Ｆ）−〔ここで、Ｒはアルキルである。〕であり；
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはアルキルであるか、または
Ｒ２またはＲ３とＲ４またはＲ５は、一体となってＣ４−７シクロアルキルを形成し；そして、
ｎは、０−３であり、ただしｎが０のとき、Ｘは−ＣＨ２−である。］
で示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグに対するグラム陰性細菌の感受性を増加するための方法を提供する。本方法には、細菌を、式（Ｉ）の化合物およびグラム陰性細菌において排出ポンプを阻害するのに有効な量の排出ポンプ阻害剤と接触させることが含まれる。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、化合物
【化４】
2008505145.tif 000006
に対する、ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌の感受性を増加するための方法を提供する。
本方法には、グラム陰性細を、前記化合物およびグラム陰性細菌においてＲＮＤポンプを阻害するのに有効な量の排出ポンプ阻害剤と接触させることが含まれる。
【００１１】
他の局面において、本発明は、式（Ｉ）
【化５】
2008505145.tif 000007
［式中、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＲ）−、−ＣＨ（ＳＨ）−、−ＣＨ（ＳＲ）−、−ＣＦ２−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＲ）−または−ＣＨ（Ｆ）−〔ここで、Ｒはアルキルである。〕であり；
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはアルキルであるか、または
Ｒ２またはＲ３とＲ４またはＲ５は、一体となってＣ４−７シクロアルキルを形成し；そして、
ｎは、０−３であり、ただしｎが０のとき、Ｘは−ＣＨ２−である。］
で示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグ、排出ポンプ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１、新規のＰＤＦ阻害剤であるＬＢＭ４１５およびＬＢＫ６１１の構造。
【００１３】
図２、挿入による不活性化に用いられるカナマイシン耐性マーカーの位置および方向を示す（矢印）、インフルエンザ菌のａｃｒＡＢ排出ポンプ遺伝子の遺伝子配列。また、ＯＲＦ ＨＩ１４６２(ｔｏｌＣ)に挿入されたカナマイシン耐性マーカーの位置および方向も示す。
【００１４】
図３、臨床的に分離されたＮＢ６５０６２において欠失するａｃｒＡの位置(黒線)。ＰＣＲに用いられるプライマーの位置を示す。プライマー対ａｃｒＡＨＩＦ/ａｃｒＡＨＩＲは、ａｃｒＡＨＩＦ部位がＮＢ６５０６２において欠失するため、産物を生じない。
【００１５】
図４、ＬＢＭ４１５およびＬＢＫ６１１に対して減少した感受性を有する４種の臨床的分離菌であるインフルエンザ菌由来の切断されたａｃｒＲ遺伝子と、野生形ａｃｒＲの比較。その変異は、下記の通りである：ＮＢ６５０１６は、ヌクレオチド４４２の後ろに１塩基（Ｃ）挿入され(フレームシフト)；ＮＢ６５０２７は、ヌクレオチド３６６の後ろに８ｂｐ欠失−ＧＴＴ挿入され(フレームシフト)、さらに下流に１塩基挿入され；ＮＢ６５０５１は、ヌクレオチド３２２の後ろを４ｂｐ欠失し(フレームシフト)；ＮＢ６５０６３は、Ｃ２５２Ｔ置換(停止)される。
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書中に引用される全ての特許出願、特許および文献は、参照によりそれらの全体を本明細書中に包含される。
【００１７】
他にこれと異なる記載がない限り、本明細書中で用いる下記の用語は、下記の意味を有する。
【００１８】
用語“シクロアルカン”または“シクロアルキル”は、３員から７員の炭素原子を含み、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。
【００１９】
用語“アルキル”は、アルケニルもしくはアルキニル、シクロアルキルまたは１−１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖および環状の基を含む置換アルキルのような飽和もしくは不飽和脂肪族基を示す。好ましくは、“アルキル”または“ａｌｋ”は、存在するときはいつでも、飽和脂肪族基またはシクロアルキルであり、より好ましくはＣ１−７アルキル、特にＣ１−４アルキルである。“アルキル”または“ａｌｋ”の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、t−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシルまたはｎ−ヘプチル、シクロプロピルが含まれるが、それらに限定されず、とりわけｎ−ブチルである。
【００２０】
用語“置換アルキル”は、ハロゲン、低級アルコキシ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールなどのような置換基を含むが、それらに限定されない１個以上の置換基、好ましくは１−３個の置換基で置換されるアルキル基を示す。置換アルキル基の例には、−ＣＦ３、−ＣＦ２−ＣＦ３、ヒドロキシメチル、１−または２−ヒドロキシエチル、メトキシメチル、１−または２−エトキシエチル、カルボキシメチル、１−または２−カルボキシエチルなどが含まれるが、それらに限定されない。
【００２１】
用語“アリール”または“Ａｒ”は、フェニルのような基を含むが、それに限定されない単環；または、ナフチルもしくはアントリルのような基を含むが、それらに限定されない多重縮合環を有する６−１４個の炭素原子の芳香族性炭素環式基を示し；とりわけフェニルである。
【００２２】
用語“ヘテロアリール”または“ＨｅｔＡｒ”は、４員から７員の単環式芳香族性ヘテロ環、または４員から７員の単環式芳香族性ヘテロ環および融合したベンゼン環からなる二環式環を示す。ヘテロアリールは、環内にＮ、ＯおよびＳのようなヘテロ原子が含まれるが、それらに限定されない、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１個または２個のヘテロ原子を有する。好ましいヘテロアリール基は、ピリジニル、ピリミジニルまたはベンズジオキソラニルである。
【００２３】
アリールまたはヘテロアリールは、非置換であるか、またはメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、ＳＣＮ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、フェニル、ヘテロアルキルアリール、アルキルスルホニルおよびホルミルのようなＣ１−７アルキル、特にＣ１−４アルキルが含まれるが、それらに限定されない１個以上の置換基により置換されていてよい。
【００２４】
本明細書で用いる用語“カルボニルアミン”は、−ＮＨＣ（Ｏ）−基を示し、ここで前記基のアミノ部分は、アリール／ヘテロアリールに結合しており、前記基のカルボニル部分は、アザシクロ４−７アルカン、チアザシクロ（thiazacyclo）４−７アルカンまたはイミダザシクロ（imidazacyclo）４−７アルカンに結合する。
【００２５】
用語“ヘテロアルキル”は、上記の飽和またはＹＹ不飽和Ｃ１−１０アルキルを示し、とりわけ基の主な分枝鎖または環状鎖の一部として１個以上のヘテロ原子を含むＣ１−４ヘテロアルキルである。ヘテロ原子は、−ＮＲ−（ここで、Ｒは、水素またはアルキル、−Ｓ−、−Ｏ−および−Ｐ−である。）；好ましくは、−ＮＲ−（ここで、Ｒは、水素またはアルキルである。）；および／または−Ｏ−からなる群から独立して選択され得る。ヘテロアルキル基は、ヘテロ原子（原子価が利用可能なとき）または炭素原子のどちらかの分子の残りの部分に結合し得る。ヘテロアルキル基の例には、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−ＣＨ３およびＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−のような基が含まれるが、それらに限定されない。
【００２６】
ヘテロアルキル基は、非置換であるか、またはアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、およびとりわけフェニルが含まれるが、それらに限定されない１個以上の置換基、好ましくは１−３個の置換基で置換されていてよい。基のヘテロ原子（複数可）、ならびに炭素原子は、置換されていてよい。ヘテロ原子（複数可）はまた、酸化型であってもよい。
【００２７】
本明細書で用いる用語“アルコキシ”は、酸素原子に結合したＣ１−１０アルキル、または好ましくはＣ１−７アルコキシ、より好ましくはＣ１−４アルコキシを示す。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシおよびアリルオキシのような基が含まれるが、それらに限定されない。
【００２８】
本明細書で用いる用語“アシル”は、基−（Ｏ）ＣＲ（ここで、Ｒは、メチルのようなアルキル、とりわけＣ１−７アルキルである。）を示す。アシル基の例には、アセチル、プロパノイルおよびブタノイルが含まれるが、それらに限定されない。
【００２９】
本明細書で用いる用語“アシルオキシ”は、基−ＯＣ（Ｏ）Ｒ（ここで、Ｒは、水素またはメチルもしくはエチルのようなアルキル、とりわけＣ１−７アルキル；または、フェニルまたは上記で定義される置換アルキルである。）を示す。
【００３０】
本明細書で用いる用語“アルコキシカルボニル”は、基−ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキル、とりわけメチルもしくはエチルのようなＣ１−７アルキルである。）を示す。
【００３１】
本明細書で用いる用語“ハロゲン”または“ハロ”は、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素を示し、とりわけフッ素である。
【００３２】
本明細書で用いる用語“チオアルコキシ”は、基−ＳＲ（ここで、Ｒは、上記で定義されるアルキル、例えばメチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオなどを意味する。
【００３３】
本明細書で用いる用語“ヘテロアルキルアリール”は、ヘテロアルキル基、例えばアリール基、とりわけフェニルで置換された−Ｏ−ＣＨ２−を意味する。フェニル基自体はまた、ハロゲン、とりわけフルオロおよびクロロ；ならびに、メトキシのようなアルコキシのような１個以上の置換基で置換されていてよい。
【００３４】
本明細書で用いる用語“アルキルスルホニル”は、基−ＳＯ２Ｒ（ここで、Ｒは、アルキル、とりわけメチルスルホニルのようなＣ１−７アルキルである。）を意味する。
【００３５】
用語“感受性”は、本明細書中で開示される、ＰＤＦ阻害剤の存在に対するグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の感受性を示す。ＰＤＦ阻害剤に対する細菌の“感受性の増加”は、細菌が、細菌を取り巻く培地中低濃度のＰＤＦ阻害剤により阻害されるだろうことを意味する。
【００３６】
本明細書で用いる用語“排出ポンプ”は、基質分子、例えば抗生物質を細菌の外へ輸送する細菌の細胞膜に位置する１個以上のタンパク質成分からなるポンプを示す。グラム陰性細菌のいくつかの排出ポンプ、ならびに全てのグラム陽性細菌の多剤排出ポンプは、細胞膜単層を通して基質を排出し、細胞膜に位置する輸送タンパク質１成分からなる。グラム陰性細菌において、大多数の多剤排出ポンプには、３成分：細胞膜（内膜）に位置する輸送タンパク質、外膜チャネルおよび前記２個を接続するペリプラズムリンカータンパク質が含まれる。この配列において、前記排出ポンプは、内膜と外膜を横切り、それにより細胞質または細胞膜から外側の培地に基質を排出する。３成分の排出ポンプの輸送タンパク質は、プロトン駆動力をプロトンと交換に基質を排出するために用い、そしてメジャーファシリテーター（major facilitator；ＭＦ）スーパーファミリーまたは耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）ファミリーに属する。
【００３７】
本明細書で用いる用語“ＲＮＤ排出ポンプ”は、ＲＮＤファミリーに属する輸送タンパク質を有する排出ポンプを示す。ＲＮＤ輸送タンパク質の予測される構造には、１２個の膜貫通ヘリックスが含まれるが、膜貫通ヘリックス１と２の間、および７と８の間に２個の大きなペリプラズムドメインも含まれる。ＲＮＤ排出ポンプは、ほとんど全ての脂溶性および両親媒性抗生物質；化学療法剤；セルレニンのような代謝阻害剤；色素；ＳＤＳ、トライトンＸ−１００および胆汁酸塩のような界面活性剤；および溶媒を含む広範な基質を排出することができる。同種のＲＮＤ排出ポンプが、例えば大腸菌（E. coli）、緑膿菌、インフルエンザ菌および淋菌で発見される。
【００３８】
本明細書で用いる用語“排出ポンプ阻害剤”は、基質、例えば抗生物質を輸送する排出ポンプの能力を特異的に妨げる化合物を示す。
【００３９】
本明細書で用いる用語“処置”には、動物の細菌感染によりもたらされる臨床症状を予防すること、低減すること、および／または除去すること；動物の細菌感染を予防すること、減少すること、および／または除去すること；または、動物への細菌混入を予防すること、低減すること、および／または除去することが含まれるが、それらに限定されない。関与する細菌は、好ましくはグラム陰性細菌であり、動物は、好ましくは哺乳動物である。
【００４０】
本明細書で用いる用語“哺乳動物”には、ヒトおよび他の霊長類、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、ネコ、イヌなどの種が含まれる。
【００４１】
本明細書で用いる用語“有効量”は、併用したとき、動物の細菌感染を処置するためか、またはＰＤＦ阻害剤への細菌の感受性を改善するために、ＰＤＦを阻害するのに十分なＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤の個々の量を意味する。有効量は、用いる特定のＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤、関与する特定の細菌、動物の年齢、体重、性別および病状、感染型および重症度、ならびに投与経路に依存して変わるが、それにも関わらず、当業者により容易に決定され得る。細菌感染の処置に十分有効であるか、または細菌の感受性を増加するのに必要なＰＤＦ阻害剤の有効量は、ＰＤＦ阻害剤を、排出ポンプ阻害剤なしで投与したとき必要とされるであろう量よりも少量である。
【００４２】
本明細書で用いる用語“薬学的に許容される担体”は、一般的に安全な、無毒の、および生物学的にもその他にも好ましくないものでない医薬組成物の製造において有用である賦形剤を意味し、家畜およびヒトへの使用に許容される賦形剤を含む。本明細書および特許請求の範囲で用いる“薬学的に許容される担体”には、１個以上のそのような担体が含まれる。
【００４３】
本発明は、一般的にＰＤＦ阻害剤に関し、細菌、特にインフルエンザ菌、大腸菌、枯草菌、肺炎桿菌、緑膿菌および淋菌のようなグラム陰性細菌における発見によれば、ＲＮＤ排出ポンプの成分をコードする遺伝子の不活性化は、細菌のＰＤＦ阻害剤への感受性を顕著に増加する。インフルエンザ菌のようなグラム陰性細菌のＲＮＤ排出ポンプの発現を阻害する抑制タンパク質をコードする遺伝子の不活性化が、細菌の本明細書に開示のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を減少することも観察されている。これらの発見と他の下記の証拠（実施例を参照のこと）を合わせると、排出ポンプ、特にＲＮＤ排出ポンプが、細菌、特にグラム陰性細菌のＰＤＦ阻害剤に対する内因性耐性を産生するのに重要な役割を果たすことが示される。これらの発見は、さらに細菌における排出ポンプの阻害は、細菌、特にグラム陰性細菌のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を改善し得ることを示す。
【００４４】
本目的のため、本発明は、動物、特にヒトおよび他の哺乳動物における細菌感染を処置するため、および細菌のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を増加するための、下記の通りのＰＤＦ阻害剤と排出ポンプ阻害剤との併用を対象とする。本発明はまた、ＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤の組合せ剤を含む医薬組成物を対象とする。
【００４５】
本明細書で用いる用語“ＰＤＦ阻害剤”は、式（Ｉ）
【化６】
2008505145.tif 000008
［式中、
Ｘが、−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＯＲ）−、−ＣＨ（ＳＨ）−、−ＣＨ（ＳＲ）−、−ＣＦ２−、−Ｃ＝Ｎ（ＯＲ）−または−ＣＨ（Ｆ）−〔ここで、Ｒが、アルキルである。〕であり；
Ｒ１が、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素またはアルキルであるか、または
Ｒ２またはＲ３とＲ４またはＲ５は、一体となってＣ４−７シクロアルキルを形成し；そして、
ｎは、０−３であり、ただしｎが０のとき、Ｘは−ＣＨ２−である。］
で示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグを示す。
【００４６】
１つの態様において、Ｒ１が、式（ＩＩ）
【化７】
2008505145.tif 000009
［式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、ＳＣＮ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、フェニル、ヘテロアルキルアリール、アルキルスルホニルまたはホルミルである。］
で示されるヘテロアリールである。
【００４７】
他の態様において、Ｒ１が、好ましくは式（ＩＩ．１）
【化８】
2008505145.tif 000010
［式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、上記の式（ＩＩ）に定義の通りであり、例えば、
ａ）Ｒ６が、ニトロ、アルキル、置換アルキル、フェニル、ヒドロキシ、ホルミル、ヘテロアルキルアリール、アルコキシ、アシルまたはアシルオキシであり、好ましくはアルキル、とりわけＣ１−７アルキル、ヒドロキシルまたはアルコキシ、とりわけＣ１−７アルコキシであり；そして
Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、水素であるか、または
ｂ）Ｒ６、Ｒ８およびＲ９が、水素であり；そして
Ｒ７が、アルキル、置換アルキル、フェニル、ハロゲン、アルコキシまたはシアノ（好ましくはアルキル、とりわけＣ１−７アルキル）、置換アルキル（とりわけＣＦ３またはアルコキシのような置換Ｃ１−７アルキル（とりわけＣ１−７アルコキシ））であるか、または
ｃ）Ｒ６、Ｒ７およびＲ９が、水素であり；そして
Ｒ８が、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、チオアルコキシ、アシルオキシ、フェニル、アルキルスルホニルまたはカルボキシアルキル（好ましくはアルキル、とりわけＣ１−７アルキル）、置換アルキル（とりわけ−ＣＦ３）、ハロゲンまたはカルボキシアルキルであるか、または
ｄ）Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、水素であり；そして
Ｒ９が、アルキル、ハロゲンまたはヒドロキシであるか、または
ｅ）Ｒ７およびＲ９が、水素であり；そして
Ｒ６およびＲ８が、それぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、フェニルまたはシアノであるか、または
ｆ）Ｒ７およびＲ９が、それぞれ、アルキルまたは置換アルキルであり；そして
Ｒ６およびＲ８が、水素であるか、または
ｇ）Ｒ６およびＲ９が、水素であり；
Ｒ７が、アルキルまたは置換アルキルであり；そして
Ｒ８が、ニトロであるか、または
ｈ）Ｒ８およびＲ９が、水素であり；
Ｒ６が、シアノであり；そして
Ｒ７が、アルコキシであるか、または
ｉ）Ｒ７およびＲ８が、水素であり；
Ｒ６が、アルキル、置換アルキル、アルコキシまたはＳＣＮであり；そして
Ｒ９が、アルキルまたは置換アルキルであるか、または
ｊ）Ｒ６およびＲ７が、水素であり；
Ｒ８が、ニトロまたはハロゲンであり；そして
Ｒ９が、アルキルまたは置換アルキルであるか、または
ｋ）Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、水素であるか、または
ｌ）Ｒ６およびＲ７が、それらが結合する炭素原子と共に、好ましくはヒドロキシで置換されていてよいフェニル基を形成し；そして
Ｒ８およびＲ９が、水素であるか、または
ｍ）Ｒ６およびＲ７が、水素であり；そして
Ｒ８およびＲ９が、それらが結合する炭素原子と共に、フェニル基を形成するか、または
ｎ）ｎが、０であるか、または
ｏ）ｎが、０であり；そして
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、それぞれ独立して、水素、アルキルまたはハロゲンであり、より特にはＲ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は水素であるか、または
ｐ）ｎが０であり；
Ｒ６、Ｒ８およびＲ９が水素であり；そして
Ｒ７がアルキルであるか、または
ｑ）ｎが０であり；
Ｒ６、Ｒ７およびＲ９が、水素であり；そして
Ｒ８が、アルキルまたはハロゲンである。］
で示されるヘテロアリールである。
【００４８】
他の態様において、Ｒ１は、式（ＩＩ．２）の基
【化９】
2008505145.tif 000011
［式中、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、上記の式（ＩＩ）の通りであり、特にＲ７およびＲ８が、それらの結合する炭素原子と共に、フェニル基を形成し；そして
Ｒ６およびＲ９が、水素である。］
である。
【００４９】
さらに他の態様において、Ｒ１が、式（ＩＩＩ）の基
【化１０】
2008505145.tif 000012
［式中、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、フェニル、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシであり、例えば、
ａ）Ｒ６およびＲ８が、水素であり；
Ｒ９が、水素またはアルキルであり；そして
Ｒ７が、アルキル、置換アルキルまたはフェニルであるか、または
ｂ）Ｒ６、Ｒ７およびＲ９が、水素であり；そして
Ｒ８が、ハロゲン、アルキルまたは置換アルキルであるか、または
ｃ）Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、水素であり；そして
Ｒ６がヒドロキシである。］
である。
【００５０】
特に有用な態様において、ヘテロアリールは、式（ＩＩＩ．１）
【化１１】
2008505145.tif 000013
［式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、上記の式（ＩＩＩ）に定義の通りである。］
で示される。
【００５１】
他の態様において、Ｒ１が、非置換フェニルであるか、またはフェニルが、アルコキシ、例えばメトキシ；または、アリールオキシ、例えばフェノキシで置換される。
【００５２】
特に有用な態様において、式（ＩＩＩ．１）の化合物が、
【化１２】
2008505145.tif 000014
である。
【００５３】
他の態様において、Ｒ１が、式（ＩＶ）
【化１３】
2008505145.tif 000015
［式中、Ｒ１０およびＲ１１が、それぞれ独立して、水素またはハロゲンであり、特にＲ１０およびＲ１１が、両方とも水素であるかまたは両方ともハロゲンである。］
で示される。
【００５４】
式（Ｉ）の化合物が、光学異性体、ラセミ体またはジアステレオマーの形態で存在し得ることは明らかである。例えば、式（Ｉ）の化合物〔式中、Ｒ２およびＲ３が、異なる残基であるか、またはＲ４およびＲ５が、異なる残基である。〕は、非対称であり、かつＲ−またはＳ−配置を有し得る。式（Ｉ）の化合物には、全てのエナンチオマーおよびそれらの混合物が包含されることが理解されるべきである。同様の考察を、上記の不斉炭素原子を示す出発物質に関して適用する。
【００５５】
式（Ｉ）の化合物は、遊離型または塩形態、例えば薬学的に許容される塩形態で存在してよい。化合物の“薬学的に許容される塩”は、親化合物の所望の薬理学的活性を有し、かつ望まれない毒性効果を与えない、生理学的および薬学的に許容される塩を意味する。そのような塩には、下記：
（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸；または、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸（hydroxynapthoic acid）、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などのような有機酸と形成される酸付加塩；または
（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンまたはアルミニウムイオンにより置換されるか；または、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどのような有機塩基と配位するとき形成される塩が含まれる。
【００５６】
式（Ｉ）の化合物は、プロドラッグとして作用し得る。“プロドラッグ”は、かかるプロドラッグが哺乳動物対象に投与されるとき、式（Ｉ）の活性な親薬物をインビボで放出する全ての化合物を意味する。式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、修飾がインビボで切断され親化合物が放出され得るように、式（Ｉ）の化合物に存在する官能基を修飾することにより製造される。プロドラッグには、ヒドロキシ基、アミノ基またはスルフヒドリル基が、インビボで切断され遊離ヒドロキシル基、アミノ基またはスルフヒドリル基をそれぞれ再構成し得る任意の基に結合される式（Ｉ）の化合物が含まれる。プロドラッグの例には、エステル、例えば酢酸エステル、ギ酸エステルおよび安息香酸エステル誘導体；カルバメート、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアミノ−カルボニル；式（Ｉ）の化合物のヒドロキシ官能基のエステルなどが含まれるが、それらに限定されない。
【００５７】
式（Ｉ）の化合物を、当業者に公知の化学的合成方法であって、例えばＷＯ０２／１０２７９０Ａ１に記載の方法により得ることができる。
【００５８】
１つの局面において、本発明は、動物、好ましくは哺乳動物における、細菌感染、特にグラム陰性細菌感染を処置するための方法を提供する。本方法には、有効量のＰＤＦ阻害剤、すなわち、式（Ｉ）により示される化合物、またはその塩もしくはそのプロドラッグ、ならびに排出ポンプ阻害剤を投与することが含まれる。
【００５９】
ＰＤＦ阻害剤および排出阻害剤の組合せ剤は、グラム陰性細菌のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を増加する。従って、ＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤の組合せ剤の使用において、排出ポンプ阻害剤の不存在下で特定のＰＤＦ阻害剤に対して耐性の、すなわち、減少した感受性を有する細菌によりもたらされるグラム陰性感染を、その特定のＰＤＦ阻害剤を用いて処置することができる。さらに、排出阻害剤の不存在下でＰＤＦ阻害剤に感受性の細菌によるグラム陰性感染を、より低投与量のＰＤＦ阻害剤を用いて処置し、それにより高投与量のＰＤＦ阻害剤を用いて引き起こされ得る副作用の危険性を軽減することができる。
【００６０】
上記の通り、大多数のグラム陰性細菌は、細胞膜（内膜）にある輸送タンパク質、外膜チャネルおよび前記２個を結合するペリプラズムリンカータンパク質からなる３成分の排出ポンプを有する。Nikaido (1996), supra;Nikaido, Clin Infect Dis, Vol. 27 (Supp. 1), pp. S32−S41 (1998)；および、Zgurskaya and Nikaido, Mol Microbiol, Vol. 37, No. 2, pp. 219−225 (2000）を参照のこと。この配列において、前記排出ポンプは、内膜と外膜を横切り、それにより細胞質または細胞膜から外側の培地へ基質を排出する。上記のZgurskaya and Nikaido (2000)を参照のこと。３成分の排出ポンプの輸送タンパク質は、プロトン駆動力をプロトンと交換に基質を排出するために用い、そしてＭＦスーパーファミリーまたはＲＮＤファミリーに属する。上記のNikaido (1998)を参照のこと。
【００６１】
１つの態様において、処置すべきグラム陰性細菌感染は、ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌によって引き起こされる。上記の通り、用語“ＲＮＤ排出ポンプ”は、結節菌（Rhizobium）において結節形成シグナル分子の推定トランスポーターをさらに含む、ＲＮＤファミリーに属する輸送タンパク質を有する排出ポンプを示す。Saier et al., FASEB J, Vol. 12, pp. 265−274 (1998)；および、Saier et al., Mol Microbiol, Vol. 11, pp. 841−847 (1994)を参照のこと。ＲＮＤ排出ポンプファミリーの全てのメンバーは、同様の構造を有する。それらの提案される構造には、１２個の膜貫通ヘリックスが含まれ、そして膜貫通ヘリックス１と２の間、および７と８の間に２個の大きなペリプラズムドメインも含まれる。上記のNikaido (1998);および、上記のZgurskaya and Nikaido (2000)を参照のこと。ＲＮＤ排出ポンプは、ほとんど全ての脂溶性および両親媒性抗生物質；化学療法剤；セルレニンのような代謝阻害剤；色素；ＳＤＳ、トライトンＸ−１００および胆汁酸塩のような界面活性剤；および溶媒を含む広範な基質を排出することができる。上記のNikaido, Curr Opin Microbiol (1998)；および上記のNikaido (1996)を参照のこと。臨床的に関係のある抗生物質に対する耐性を仲介する排出トランスポーターのほとんどは、ＲＮＤファミリーのメンバーである。上記のSaier et al., FASEB J (1998)を参照のこと。ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌には、セラチア・マルセッセンス、大腸菌、モラクセラ・カタラーリス、バチルス・サブチルス、肺炎桿菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、淋菌、セパシア菌（Burholderia cepacia）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア菌、日和見細菌（Acinetobacter baumannii；A. baumannii）およびシュードモナスプチダ菌（Pseudomonas putida）が含まれるが、それらに限定されない。同種の排出ＲＮＤポンプを、大腸菌、緑膿菌、インフルエンザ菌および淋菌のようなグラム陰性細菌において発見することができる。上記のNikaido, Curr Opin Microbiol (1998)を参照のこと。特に有用な態様において、ＲＮＤポンプを有するグラム陰性細菌は、インフルエンザ菌である。
【００６２】
グラム陰性細菌感染を処置するための方法の特に有用な態様において、式（Ｉ）の化合物は、
【化１４】
2008505145.tif 000016
である。
【００６３】
グラム陰性細菌において、排出ポンプ、特にＲＮＤ排出ポンプに特異的な排出ポンプ阻害剤は、当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許番号第６，１１４，３１０号は、様々なグラム陰性細菌に対して幅広く抗生物質の活性を増加する排出ポンプジペプチド阻害剤の遺伝子クラスを記載する。本遺伝子クラス内のジペプチド排出ポンプ阻害剤の例は、下記の構造式
【化１５】
2008505145.tif 000017
を有するＭＣ−０４，１２４であり、それは、ＲＮＤ排出ポンプを阻害し、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、インフルエンザ菌および日和見細菌のような様々なグラム陰性細菌に対していくつかの抗生物質の活性を増加することが示されている。Cho et al., 40th ICAAC (2000)；および、Watkins et al., Bioorgan Med Chem Lett, Vol. 13, pp. 4241−4244 (2003)を参照のこと。グラム陰性細菌に対する抗生物質の活性を増加するＲＮＤ排出ポンプ阻害剤の他の例には、下記の構造式
【化１６】
2008505145.tif 000018
を有するジペプチド阻害剤であるＭＣ−２０７，１１０（Renau et al., J Med Chem, Vol. 42, pp. 4928−4931 (1999)；および、Lomovskaya et al., Antimicrob Agents Chem, Vol. 45, No. 1, pp. 105−116 (1991)に記載される。）、および下記の構造式
【化１７】
2008505145.tif 000019
を有するジペプチド阻害剤であるＭＣ−００２，５９５（上記のLomovskaya et al., Antimicrob Agents Chem (1991)に記載される。）が含まれる。
【００６４】
グラム陰性細菌に対するオキサゾリジノン抗菌剤の活性を増加するＲＮＤ排出ポンプ阻害剤の他の例は、米国特許番号第６，２５１，８６９号に記載のアルギニン誘導体である。
【００６５】
緑膿菌のようなグラム陰性細菌におけるＲＮＤ排出ポンプに特異的な排出ポンプ阻害剤のさらに他の例は、アクチノミセタ（actinomycete）により産生されるベナスタチン（benastatins）ＡおよびＢの硫酸塩、例えば、下記の構造
【化１８】
2008505145.tif 000020
を有するＭＦ−ＥＡ−３７１α、および下記の構造
【化１９】
2008505145.tif 000021
を有するＭＦ−ＥＡ−３７１δ（Lee et al. (2000), 40th ICAAC (2000)に記載される。）である。
【００６６】
グラム陰性細菌感染を有すると診断されたヒトおよび他の動物、特にヒトおよび他の哺乳動物のグラム陰性細菌感染の処置に関して、ＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤またはその医薬組成物を、何らかの常套的経路、例えば局所的または全身的に、例えば経口的、局所的、非経腸的、皮膚下または吸入により投与することができる。選択される経路は、感染のタイプ、重症度および部位ならびに感染を引き起こす細菌の種類に依存して変わる。
【００６７】
“有効量”を達成するために必要なＰＤＦ阻害剤の投与量は、もちろん、上記の様々な因子、例えば投与方法、処置すべき感染のタイプおよび重症度ならびに所望の効果に依存して変わるだろう。一般的に、例えばヒト処置のための有効投与量は、例えば投与の経路および頻度に依存して１日当たり約１−３０００ｍｇの範囲、例えば１日当たり１５００ｍｇである。そのような投与量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１５−５０ｍｇに相当する。適する投与量は、例えば、１日当たり体重１ｋｇ当たり約５−２０ｍｇである。
【００６８】
用いるべき特定の排出ポンプ阻害剤の量は、様々な因子、例えばグラム陰性細菌の種類、特定のＰＤＦ阻害剤に対するグラム陰性細菌の感受性、および処置される動物による吸収に依存して変わる。十分量の排出ポンプ阻害剤が、処置動物において、グラム陰性細菌を薬学的に許容されるレベルのＰＤＦ阻害剤に対して感受性にするために用いられるべきである。特定の排出阻害剤の十分量を、ＰＤＦ阻害剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）について試験し、そしてＰＤＦ阻害剤単独のＭＩＣを、ＰＤＦ阻害剤を排出ポンプ阻害剤と併用するときのＭＩＣと比較することにより容易に決定することができる。一般的に、排出ポンプ阻害剤と投与されるＰＤＦ阻害剤のモル比は、約０．０１から１０である。適するモル比は、約０．１から１．０である。従って、動物においてグラム陰性細菌感染を処置するための排出ポンプ阻害剤の１日投与量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．００１５−５ｍｇの範囲である。適当には、１日投与量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．５−２ｍｇの範囲である。前記排出ポンプ阻害剤を、ＰＤＦ阻害剤を投与する前に投与することができるか、またはＰＤＦ阻害剤と同時に投与することができる。
【００６９】
他の局面において、本発明は、グラム陰性細菌を、細菌において排出ポンプを阻害するのに有効な量のＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤と接触させることを含む、グラム陰性細菌のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を増加するための方法を提供する。本方法は、ＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤の組合せ剤を用いて処理するとき、排出ポンプを発現するグラム陰性細菌細胞に対するＰＤＦ阻害剤の効果を改善する。
【００７０】
グラム陰性細菌のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を増加するための方法の１つの態様において、グラム陰性細菌感染は、ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌、例えば、セラチア・マルセッセンス、大腸菌、モラクセラ・カタラーリス、バチルス・サブチルス、肺炎桿菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、淋菌、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・シュードマレイ、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、アシネトバクター・バーマニーおよびシュードモナスプチダにより引き起こされる。さらなる態様において、ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌には、大腸菌、緑膿菌、インフルエンザ菌および淋菌が含まれる。特定の有用な態様において、ＲＮＤ排出ポンプを有するグラム陰性細菌は、インフルエンザ菌である。本方法に用い得る特に有用なＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤は、上記の通りである。
【００７１】
グラム陰性細菌の特定のＰＤＦ阻害剤に対する感受性を増加する特定の排出ポンプ阻害剤の効果を、例えば、Lorian, ed., Antibiotics in Laboratory Medicine, 3rd Ed., p.432, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MDに記載の交差法（checkerboard method）を用いてインビトロで評価することができる。
【００７２】
さらなる局面において、本発明は、動物、例えば哺乳動物において、細菌感染、特にグラム陰性細菌感染を処置するために有効な医薬組成物を提供する。前記組成物には、上記のＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤ならびに薬学的に許容される担体が含まれる。
【００７３】
前記組成物は、錠剤、カプセル、ウエハー、ファストメルト（fast melt）(ウエハー不含有)、粉末、顆粒、ロゼンジ、クリームまたは、経口用または滅菌非経腸用溶液もしくは懸濁液のような液体調製物を含む、当技術分野で公知の何らかの形態であり得るが、それらに限定されない。ＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤はまた、リポソーム、ミセルまたはマイクロエマルジョン製剤で投与され得る。組成物中に存在するＰＤＦ阻害剤は、プロドラッグとしても投与され得、ここで、投与されたプロドラッグは、被処置哺乳動物中で生体内変換され、生物学的に活性な形態となる。
【００７４】
本発明の局所製剤は、すなわち、軟膏（ointment）；クリームまたはローション；溶液；軟膏（salve）；エマルジョン；プラスター；眼軟膏（eye ointment）ならびに点眼および点耳薬；含浸包帯（impregnated dressing）；経皮パッチ；スプレーおよびエアロゾルとして存在して良く、そして軟膏およびクリーム中、保存剤；薬物浸透を補助するための溶媒；ならびに、エモリエントのような適当な常套的添加剤を含んでいてよい。
【００７５】
前記製剤はまた、クリームまたは軟膏基剤およびエタノール；または、ローションに関してオレイル・アルコールのような互換性の常套的担体を含んでいてよい。そのような担体は、例えば、製剤の約１％から約９９％まで存在し得る。例えば、それらは、製剤の約８０％までを形成し得る。
【００７６】
経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位用量表示形態であり得、結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えばラクトース、糖類、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；分解剤、例えばジャガイモデンプン；または、ラウリル硫酸ナトリウムのような許容される湿潤剤のような常套的賦形剤を含んでいてよい。錠剤を、標準的薬務においてよく知られている方法に従いコーティングすることができる。
【００７７】
経口液体調製物は、例えば水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってよいか、または使用前に水または他の適するビヒクルを用いて再構成される乾燥産物として存在していてよい。かかる液体調製物は、懸濁化剤、例えば、ソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは水素化食用油；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアカシア；非水性ビヒクル(食用油を含んでいてよい)、例えばアーモンド油；グリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコールのような油性エステル；保存剤、例えばメチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸のような常套的添加剤、および要すれば常套的な風味剤または着色剤を含んでいてよい。
【００７８】
非経腸投与について、液体単位投与量形態は、前記化合物および滅菌ビヒクル、好ましくは水を用いて製造される。用いるビヒクルおよび濃度によるが、ＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤を、ビヒクルまたは他の適する溶媒中に懸濁または溶解することができる。溶液の製造において、ＰＤＦ阻害剤および排出阻害剤を、注射水に溶解し、そして適するバイアルまたはアンプルに充填し、密封する前にろ過滅菌し得る。有利には、局所麻酔用保存剤および緩衝剤のような薬剤を、ビヒクル中に溶解することができる。安定性を高めるため、組成物をバイアルに充填し、水を真空下で除去後、凍結することができる。その後、乾燥凍結乾燥粉末をバイアル中に密封し、そして注射水の別のバイアルを、使用前に液体を再構築するために供給することができる。非経腸懸濁液を、ＰＤＦ阻害剤および排出ポンプ阻害剤を溶解する代わりにビヒクル中に懸濁し、滅菌をろ過により達成することができないこと以外は、実質的に同様に製造する。ＰＤＦ阻害剤および排出阻害剤を、滅菌ビヒクル中に懸濁する前に、エチレンオキシドに暴露することにより滅菌することができる。有利には、界面活性剤または湿潤剤が、化合物の均一な分布を容易にするために組成物中に含まれる。
【００７９】
ＰＤＦ阻害剤は、遊離型または薬学的に許容される塩形態で、例えば上記の通りに投与され得る。かかる塩は、常套法で製造され得、遊離化合物と同程度の活性を示す。
【００８０】
下記の実施例は、本発明を説明するためのものであり、いかなる場合も本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８１】
実施例
方法および材料
細菌株、プラスミドおよび増殖培地
本試験に用いる細菌株およびプラスミドを、下記の表１に列記する。ＬブロスおよびＬアガー（Difco）を、エシェリキア・コリ（大腸菌）の通常の増殖のために用いる。チョコレート寒天プレート（Chocolate agar plate）（Remel）を、インフルエンザ菌の通常の増殖のために用いる。１０μｇ／ｍＬのβ−ＮＡＤ（Fluka）および１０μｇ／ｍＬのヘミン／ビタミンＫ溶液（ｓＢＨＩ）（Remel）を添加したブレインハートインフュージョンブロス（Brain heart infusion broth）（Remel）を、インフルエンザ菌の液体ブロス培養に用いる。インフルエンザ菌の自然応答能（natural competence）を誘導するため、栄養的下方移行（nutritional downshift）を、Ｍ−ＩＶ培地を用いて既述の通りに誘導する。Poje and Redfield, Methods Mol Med, Vol. 71, No. , pp. 57−70 (2003)を参照のこと。必要ならば、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ（大腸菌）または５μｇ／ｍＬ（インフルエンザ菌）増殖培地に添加する。
【表１】
2008505145.tif 000022
【表２】
2008505145.tif 000023
【００８２】
抗生物質および基質のＭＩＣを、National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）により確立された方法に従い、ＨＴＭ中２倍希釈物を用いるブロス微量希釈により決定する。NCCLS, Approved standard M7−A5, Wayne, PA (2003)を参照のこと。ＰＤＦ阻害剤は、Novartis Institutes for BioMedical Research, Cambridge, MAで合成される。残りの全ての抗生物質を、Sigma（St. Louis, MO）から購入する。
【００８３】
ＤＮＡ操作
インフルエンザ菌ゲノムＤＮＡを、指示書に従いGentra Systems Inc.（Minneapolis, MN）のＰｕｒｅｇｅｎｅ組織キットを用いて単離する。ＰＣＲおよび配列決定用のオリゴヌクレオチドを、Genelink（Hawthorne, NY）から購入し、ＰＣＲ反応を、供された指示書に従いMolecular Bio−Products Inc. (San Diego, CA）のＥａｓｙｓｔａｒｔ ｍｉｘ−ｉｎ−ａ−ｔｕｂｅシステムを用いて行う。調製したゲノムＤＮＡまたは単離したコロニーからの細胞を、ＰＣＲ反応においてテンプレートとして用いる。制限エンドヌクレアーゼおよび修飾酵素を、その酵素と共に供される指示書に従い用いる。ＤＮＡフラグメントを、Qiagen Inc.（Valencia, CA）のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐまたはゲル抽出キットを指示書に記載の通りに用いて、精製するか、またはアガロースゲル電気泳動後に単離する。ヌクレオチド配列決定は、Agencourt Inc.（Waltham, MA）により行われる。
【００８４】
インビトロ突然変異および遺伝子置換
インフルエンザ菌のａｃｒＢホモログの挿入ノックアウトを構築するため、プライマーａｃｒＢＨＩＦ（５’−ＣＣＡＣＴＴＴＡＡＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧ−３’）（配列番号１）およびａｃｒＢＨＩＲ３（５’−ＣＧＡＡＴＴＡＣＧＴＡＡＧＡＴＡＡＣＣＴＡＡＧＴＧＣＧ−３’）（配列番号２）を用い、インフルエンザ菌ＮＢ６５００１ゲノムテンプレートＤＮＡを用いてａｃｒＢ遺伝子を含む３．１ｋｂのＰＣＲ断片を作製する。ａｃｒＢ ＰＣＲ産物を、キットと共に供される指示書に従いInvitrogen（Carlsbad, CA）のＰＣＲ ２．１−Ｔｏｐｏ中にライゲーションし、次いでａｃｒＢ断片を、ＥｃｏＲＩを用いて切り出し、ｐＥＸ１８Ｔｃ中にライゲーションする。次いで、このコンストラクトを、ａｃｒＢ断片内のＭｆｅＩユニーク部位で線形にし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化して、プライマーＴＮ９０３ＫａｎＦ（５’−ＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴＧ−３’）（配列番号３）およびＴＮ９０３ＫａｎＲ（５’−ＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＡＡ−３’）（配列番号４）を用いてｐＡＣＹＣ１７７から作製されるＴＮ９０３カナマイシン耐性決定部位を含む１．２ｋｂの平滑化ＰＣＲ断片にライゲーションし、プラスミドｐＣＤＢＫｍを得る。インフルエンザ菌ＤＮＡ取り込み（uptake）配列を含む１７７ｂｐのＤＮＡ断片は、既述のプライマーを用いてＮＢ６５０４４ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物である。Akerley et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 99, No. 2, pp. 966−971 (2002)を参照のこと。前記産物を、指示書に従いInvitrogenのＰＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ中にクローニングし、次いでＫｐｎＩで切り出し、ｐＣＤＢＫｍのマルチクローニング部位内のＫｐｎＩ部位にライゲーションし、ｐＣＤＢＫｍＵＳを得る。取り込み配列の包含により、より効率の良い形質転換が促進されることが示され、そのことは、自然形質転換により線形ＤＮＡを効率よく取り込むことのできない様々な分離株中にＤＮＡを導入するのに有用である。上記のAkerley et al. (2002)を参照のこと。
【００８５】
オープンリーデンングフレーム（ＯＲＦ）ＨＩ１４６２（ｔｏｌＣ）の挿入ノックアウトを構築するために［Trepod and Mott, Antimicrob Agents Chemother, Vol. 48, No. 4, pp. 1416−1418 (2004)を参照のこと］、プライマーＨＩ１４６２ＩＦ（５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣ−３’）（配列番号５）およびＨＩ１４６２ＩＲ（５’−ＴＣＣＣＧＣＣＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＡＣＣＧＣＡ−３’）（配列番号６）を用いて、ＮＢ６５００１ゲノムＤＮＡテンプレート由来のＨＩ１４６２の大部分を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を作製し、指示書に従いInvitrogenのＰＣＲ ２．１−Ｔｏｐｏ中に直接ライゲーションする。次いで、挿入物をＥｃｏＲＩ断片として回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫのＥｃｏＲＩ部位中にライゲーションする。次いで、１．８ｋｂのＨａｅＩＩ断片としてｐＢＡＤ１８Ｔｃから単離され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化されたＴＮ９０３カナマイシン耐性決定部位を、平滑化されたＨＩ１４６２内のＭｌｕＩユニーク部位中にライゲーションし、ｐＣＤ１４Ｋｍを作製する。このコンストラクトは、ＨＩ１４６２と同方向のカナマイシン耐性決定部位を有する。図２を参照のこと。
【００８６】
ＯＲＦ ＨＩ０８９３、ａｃｒＲホモログおよびａｃｒＡＢ発現の推定リプレッサーの挿入ノックアウトを構築するため、プライマーａｃｒＲＨＩＦ２（５’−ＴＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＴＡＡＴＴ−３’）（配列番号７）およびａｃｒＲＨＩＲ（５’−ＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＣＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＴ）（配列番号８）を用いて、ＮＢ６５００１ゲノムＤＮＡ由来のＯＲＦ ＨＩ０８９３を含む７５２ｂｐのＰＣＲ断片を作製する。このＰＣＲ断片を、キットと共に供される指示書に従いInvitrogenのＰＣＲ ２．１ Ｔｏｐｏ中にライゲーションし、次いでＥｃｏＲＩ断片として切り出し、ＥｃｏＲＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中にクローニングする。次いで、そのコンストラクトを、ＳｆｕＩを用いて線形にし、上記のプライマーを用いてｐＡＣＹＣ１７７から作製されたＴＮ９０３カナマイシン耐性決定部位を含む１．２ｋｂの平滑化ＰＣＲ断片にライゲーションし、プラスミドｐＣＤＲＫｍを作製する。
【００８７】
ａｃｒＢ：：ＫｍおよびａｃｒＲ：：Ｋｍ挿入をゲノム中に導入するために、インフルエンザ菌株を、ｓＢＨＩ中、初期対数期（ＯＤ６００は、約０．２である。）で増殖させ、自然応答能を、上記のPoje and Redfield (2003)に記載の通りＭ−ＩＶ培地に栄養的下方移行することにより誘導する。コンピテント細胞を、既述の通り［上記のPoje and Redfield (2003)を参照のこと］ｐＣＤＢＫｍＵＳ（ＸｂａＩを用いて線形化）またはｐＣＤＲＫｍ（ＳｃａＩを用いて線形化）を用いて形質転換し、５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むチョコレート寒天上に播き、それらのゲノム上にカナマイシン耐性マーカーを含む細胞を選択する。ＨＩ１４６２：：Ｋｍ挿入をＮＢ６５０４４株のゲノム中に導入するために、コンピテント細胞をｐＣＤ１４Ｋｍ（ＳｃａＩを用いて線形化）を用いて形質転換し、上記の通りチョコレート寒天プレート上で選択する。この挿入をＮＢ６５０２７株およびＮＢ６５０５１株に導入するために、受容細胞を上記の通りにコンピテントにし、ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ０００１株から単離されたゲノムＤＮＡを用いて形質転換し、カナマイシン５μｇ／ｍＬを含むチョコレート寒天プレート上で選択する。挿入を、挿入部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲし、作製された断片を配列決定することにより確認する。
【００８８】
高感受性株ＮＢ６５０６２のＰＣＲ分析およびａｃｒＡ欠失の相補
ＮＢ６５０６２株中のａｃｒＡ遺伝子を含む領域を得るため、プライマーａｃｒＲＨＩＦ１（５’−ＧＴＧＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＴＡ−３’）（配列番号９）およびａｃｒＡＨＩＲ（５’−ＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＧ−３’）（配列番号１０）を用いて、ＮＢ６５０６２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ断片を作製する。図３を参照のこと。その断片を、ゲルにより精製し、ヌクレオチド配列を決定する。
【００８９】
ａｃｒＡ欠失の相補に関して、機能的ａｃｒＡＢポンプを含むＮＢ６５０４４由来のゲノムＤＮＡを用い、上記の栄養的下方移行法を用いてＮＢ６５０６２を形質転換する。形質転換細胞を、両方ともａｃｒＡＢ排出ポンプの基質である、４μｇ／ｍＬのＬＢＭ４１５または２μｇ／ｍＬのエリスロマイシンのどちらかを含むチョコレート寒天上に播く。
【００９０】
実施例１
ＬＢＭ４１５に対する低下した内因性感受性におけるａｃｒＡＢポンプの役割
ＮＢ６５０４４実験室株におけるａｃｒＢの挿入不活性（図２を参照のこと）は、ＬＢＭ４１５に対する感受性を顕著に増加し、ＬＢＭ４１５のＭＩＣの、親株に対する４μｇ／ｍＬからａｃｒＢ欠失誘導株ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ０００１に対する０．２５μｇ／ｍＬへの低下に反映される。下記の表２を参照のこと。挿入はまた、ＬＢＫ６１１および公知のポンプ基質であるエリスロマイシンに対する感受性を増加し［上記のSanchez, Pan, Vinas and Nikaido (1997)を参照のこと］、他のマクロライド（クリンダマイシン）に対する感受性をより大幅に増加するが、ポンプの基質でないテトラサイクリンに対する感受性には影響しない［上記のSanchez, Pan, Vinas and Nikaido (1997)を参照のこと］。表２を参照のこと。他の公知のポンプの基質でないクロラムフェニコールはまた、ａｃｒＢの欠失に影響されない（データ非表示）。このことは、インフルエンザ菌のＡｃｒＡＢポンプが、ＬＢＭ４１５に対する低下した感受性の主な要因であることを裏付ける。
【表３】
2008505145.tif 000024
【００９１】
排出は、従来、感受性株と比べて耐性株における放射標識したエリスロマイシンの比較的少ない集積に基づくインフルエンザ菌臨床分離株における中程度のマクロライド耐性の仲介に関わっているが、一方、マクロライドに対する高レベルの耐性は、標的変異と関係する。上記のPeric, Bozdogan, Jacobs and Appelbaum (2003)を参照のこと。既に試験された臨床株の一部［上記のPeric, Bozdogan, Jacobs and Appelbaum (2003)を参照のこと］は、マクロライドに対して高感受性であり、放射標識したエリスロマイシンを蓄積せず、それらは排出ポンプを欠くことが示唆される。また分離株の一部は、マクロライドおよびＰＤＦ阻害剤の両方に高感受性であることも明らかである。ＰＣＲ診断を用いることにより、ａｃｒＲ−、ａｃｒＡ−またはａｃｒＢ−に由来する断片がこれらの株のいくつかについて入手され（データ非表示）、ポンプ遺伝子が、高感受性株においても広範に分布することを示唆する。しかしながら、高感受性の株ＮＢ６５０６２（表２を参照のこと）に関して、ａｃｒＡ産物は得られず、ゲノム欠失があるかもしれないことが示される。フランキングプライマー（図３を参照のこと）を用いるａｃｒＡ領域を含むＰＣＲ断片の作製により、予測された２ｋｂよりも実質的に短いサイズの断片が得られる。その断片のヌクレオチド配列決定により、ａｃｒＡの大部分の欠失である８７３ｂｐの欠失（図３を参照のこと）が明らかとなる。無傷のａｃｒＡＢ領域を有するＮＢ６５０４４由来のゲノムＤＮＡを用いるＮＢ６５０６２の形質転換、およびＬＢＭ４１５（４μｇ／ｍＬ）またはエリスロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を含むチョコレート寒天上での選択により、両クラスの抗生物質に対して低下した感受性を有し、非基質の排出に対する感受性の変化のない株ＮＢ６５０６２−ＣＤＳ００３８およびＮＢ６５０４４−ＣＤＳ００３９分離株を得る。表２を参照のこと。その形質転換体のパルスフィールドゲル電気泳動分析は、ＮＢ６５０６２の制限パターンと同一であるが、ＰＣＲおよび配列決定は、全長ａｃｒＡの修復を明らかにし、高感受性が実際に株ＮＢ６５０６２のａｃｒＡＢポンプの欠失の結果であることが確認される。このことは、ＰＤＦ阻害剤およびマクロライドに対する内因性耐性を供する際のＡｃｒＡＢポンプの役割と一致しており、既述の示唆［上記のPeric, Bozdogan, Jacobs and Appelbaum (2003)を参照のこと］の通り、排出ポンプを獲得できなかったというよりむしろ、マクロライドおよびＬＢＭ４１５高感受性株は、排出ポンプ成分の変異による欠失の結果であり得ることを示す。これらの株に由来するａｃｒＲ遺伝子の配列決定はまた、ａｃｒＲ変異が、選択プレートでのＬＢＭ４１５またはエリスロマイシンのどちらかへの暴露中にも選択されないことを示す、親株との相違がないことを明らかにする。様々なａｃｒ遺伝子について予測されたＰＣＲ産物を与える残りの高感受性株は、ポンプ機能を欠く他の明らかでない変異を有し得るが、これは、未だ確認されていない。
【００９２】
これまでのインフルエンザ菌での唯一のＲＮＤファミリーポンプの同定を考慮すると、それが、インフルエンザ菌について知られている唯一の自然環境であるヒト宿主中での生存において重要な機能を果たすことが予期されるかもしれない。ある臨床分離株におけるこのポンプの欠失は、そのポンプが一般的にインフルエンザ菌において維持されるが、場合によっては見かけ上欠失し得る点で興味深く、その役割が必ずしも必要でないことを示唆する。
【００９３】
実施例２
ａｃｒＡＢモログ排出ポンプの外膜成分の同定
ａｃｒＡＢポンプが、インフルエンザ菌におけるＰＤＦ阻害剤およびマクロライドの両方に対する内因性耐性の主な要因（contributor）であることを確認したので、ポンプの三部構造（tripartite architecture）を完成するためのポンプの外膜チャネル成分を同定することに興味があった。大腸菌のａｃｒＡＢに相当するＴｏｌＣ外膜チャネルを用いるインフルエンザ菌ゲノムのタンパク質ホモロジー検索は、ＯＲＦ ＨＩ１４６２との顕著な類似性を明らかにする（期待値２．９×１０−６）。興味深いことに、緑膿菌ｍｅｘＡＢ−ｏｐｒＭポンプのｏｐｒＭ成分は、期待値２．８×１０−２２でＨＩ１４６２に対してより一層対応し、ＨＩ１４６２が、外膜チャネルのよい候補であることを示す。このことと一致して、インフルエンザ菌ＮＢ６５０４４におけるＨＩ１４６２の不活性化（図２を参照のこと）（ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ００２２）は、全てａｃｒＡＢポンプの基質であるエリスロマイシン、クリンダマイシンおよびＬＢＭ４１５に対する感受性を増加するが、ポンプの基質でないテトラサイクリンに対する感受性に影響を与えない。表２を参照のこと。近年、他のグループ［上記のTrepod and Mott (2004)を参照のこと］も、このポンプについて外膜チャネルとしてＨＩ１４６２の同定を報告している。故に、本発明に包含されるデータは、この発見を支持し、ＬＢＭ４１５に対する耐性を仲介するこのチャネル成分の役割を説明する。
【００９４】
興味深いことに、ＨＩ１４６２は、そのＣ末端にコードされる半分以上の、他のＯＲＦ ＨＩ１３４０との全体的一致を示す。この類似性にもかかわらず、基質をポンプ排出するための特定の感受性へのＨＩ１４６２欠失の明らかな影響により、ＨＩ１３４０からのおそらくほとんどない臨床的に関連する貢献と共に、そのチャネルとしての役割が確認される。ＨＩ１４６２とＨＩ１３４０のそれらのＮ末端部分の相違は、少なくともＮＢ６５０４４において、異なるポンプとの相互作用を明確にし得る。実際、ＨＩ１３４０と共に機能し得るｅｍｒＡＢポンプホモログＨＩ０８９８およびＨＩ０８９９はそれぞれ、１個の遺伝子であるｆｔｓＮのみがａｃｒＡＢポンプと異なる。インフルエンザ菌におけるｅｍｒＡＢポンプの不活性化は、広範な化合物に対する感受性に影響せず［上記のTrepod and Mott (2004)を参照のこと］、このポンプ、典型的にはそのファミリーのポンプが、抗生物質を効率よく排出しないかもしれないことを示唆する。しかしながら、それは、ｅｍｒＡＢポンプよりも優先的に化合物を排出し得るａｃｒＡＢポンプの存在下で不活性化され、その点で前記ポンプの不存在は、試験する基質のいくつかまたは全てをポンプ排出するその能力を明らかにしないかもしれない。あるいは、ＨＩ１３４０は、ａｃｒＡＢポンプと共に機能し得るが、大量に発現されないかもしれない。排出ポンプ成分としてのＨＩ１３４０の可能性のある役割は、未だ決定されていない。
【００９５】
実施例３
ａｃｒＡＢおよびインフルエンザ菌臨床株におけるＰＤＦ阻害剤に対する低下した感受性
多数の細菌の臨床分離株における抗生物質に対する低下した感受性は、排出ポンプの過剰発現と関係している。歴史的には、臨床分離株におけるリプレッサー変異体および／またはポンプ遺伝子過剰発現の同定が、ほとんどの場合に、低下した耐性が排出に起因するとするのに十分であると考えられているが、リプレッサー遺伝子変異および／またはポンプ発現状態と特定の抗生物質に対する耐性に常に明確な関係があるわけではない。Sobel, McKay and Poole, Antimicrob Agents Chemother, Vol. 47, No. 10, pp. 3202−3207 (2003)を参照のこと。ａｃｒＡＢポンプが、そのＰＤＦ阻害剤に対して最も低い感受性を有する臨床株における低下した感受性の仲介に重要な役割を果たすかどうかを直接検討した結果、ａｃｒＢが、株ＮＢ６５０１６、ＮＢ６５０２７、ＮＢ６５０５１、ＮＢ６５０６３、ＮＢ６５０６９およびＮＢ６５０７６（それらは全て、ＬＢＭ４１５、ＬＢＫ６１１およびクリンダマイシンに対して低下した感受性を示す。）で不活性化される（図２を参照のこと）。ポンプの欠失は、実質的に、全ての場合に抗微生物剤の両クラスに対する感受性を増加するが、ポンプの非基質に影響することなく（下記の表３を参照のこと）、ａｃｒＡＢポンプが、広範に分布し、これらの株により示される低下した感受性の主な要因であるという直接確認を提供する。さらに、株ＮＢ６５０２７およびＮＢ６５０５１におけるＨＩ１４６２の不活性化（図２を参照のこと）は、同様に、ポンプ基質に対する感受性を増加させ（表３を参照のこと）、臨床分離株のａｃｒＡＢポンプ作用におけるこの外膜チャネルの役割をさらに裏付ける。
【表４】
2008505145.tif 000025
【００９６】
実施例４
ａｃｒＲは、ａｃｒＡＢポンプ発現のリプレッサーである。
ａｃｒＡＢ排出ポンプが、ＬＢＭ４１５およびマクロライドに対して低下した感受性を有するインフルエンザ菌臨床分離株におけるこれらの薬剤に対する低下した感受性の主な要因であるという証明は、増加したポンプ発現が、感受性の低下をもたらすことを示唆する。排出ポンプ制御の新たな概念は、ますます複雑化しているが、ポンプの過剰発現が、調節遺伝子における単一変異の結果である多くの場合がある。例えば、緑膿菌ｎａｌＢ株は、ｍｅｘＡＢ−ｏｐｒＭ遺伝子のすぐ上流に位置するリプレッサーをコードするｍｅｘＲ遺伝子中の変異のためにｍｅｘＡＢ−ｏｐｒＭを過剰発現する。Poole et al., Antimicrob Agents Chemother, Vol. 40, No. 9, pp. 2021−2028 (1996)を参照のこと。インフルエンザ菌において、ａｃｒＡＢのすぐ上流に位置するＯＲＦ ＨＩ０９８３（図２を参照のこと）は、ａｃｒＡＢの発現の制御に関与し得るａｃｒＲ／ｔｅｔＲファミリーリプレッサーをコードする。ＮＢ６５０１６、ＮＢ６５０２７、ＮＢ６５０５１およびＮＢ６５０６３由来のＨＩ０８９３のヌクレオチド配列決定は、フレームシフトまたは停止コドンの導入のどちらかをもたらす、挿入／欠失または点変異の存在を明らかにする。図４を参照のこと。ＮＢ６５０６９およびＮＢ６５０７６由来のａｃｒＲ遺伝子の配列決定は、ａｃｒＲ遺伝子について公開された配列に対してアミノ酸変化をもたらす点変異を明らかにする（データ非表示）。ａｃｒＲ変異のこの優位性は、ａｃｒＡＢ排出ポンプが、ａｃｒＲリプレッサー機能の欠失によりこれらの株において過剰に発現されることを強く示唆する。
【００９７】
実施例５
ＬＢＭ４１５およびマクロライドに対する感受性の調節におけるインフルエンザ菌ａｃｒＲの役割
ａｃｒＲが、ａｃｒＡＢポンプ発現の負の調節因子であるかどうか、その結果ａｃｒＲ機能の欠失が、ＬＢＭ４１５およびマクロライドに対する低下した感受性をもたらすかどうかをさらに検討するために、ａｃｒＲ遺伝子を、実験室株ＮＢ６５０４４において挿入により不活性化する。図２を参照のこと。これは、ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ０００８の、ポンプの基質でないテトラサイクリンに対する感受性を変化しないが、ＬＢＭ４１５に対する感受性の２倍の減少ならびにＬＢＫ６１１およびクリンダマイシンに対する感受性の４倍の減少の結果となる。表３を参照のこと。このことは、ａｃｒＲが、ａｃｒＡＢ遺伝子発現の負のリプレッサーとして作用することを示唆する。しかしながら、カナマイシンカートリッジは、ａｃｒＲ中、下流のａｃｒＡＢ部位と同方向に存在し（図２を参照のこと）、極性効果（polar effect）によるａｃｒＡＢの増加した発現を除外できない。故に、ＬＢＭ４１５およびマクロライドに対する低下した感受性におけるａｃｒＲ変異の役割をさらに明確にするために、ＮＢ６５０４４を８μｇ／ｍＬにてＬＢＭ４１５に暴露することより、変化したａｃｒＲ遺伝子を有する変異体を選択することができるかどうかを試験する。株ＮＢ６５０４４の変異を、８μｇ／ｍＬのＬＢＭ４１５を含むチョコレート寒天上で選択し（頻度；１０−８−１０−９）、１０個の分離した変異体由来のａｃｒＲ遺伝子の試験により、１０個全ての分離株におけるａｃｒＲ変異が明らかとなる（データ非表示）。
【００９８】
これらの変異体のうち２個の、導入された停止コドンおよびアミノ酸変化をそれぞれ有するＮＢ６５０４４−ＣＤＳ００１１およびＮＢ６５０４４−ＣＤＳ００１４の感受性試験により（表３の説明文を参照のこと）、ＬＢＭ４１５およびＬＢＫ６１１に対する感受性の８倍の減少、ならびにクリンダマイシンに対する感受性の４倍の減少、またテトラサイクリンに対する変化のない感受性が明らかとなる。表３を参照のこと。さらに、発現プロファイリングにより、両変異体、ならびにａｃｒＲを不活性にされた株ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ０００８における増加したａｃｒＡＢ転写物の存在（約２．５倍）が明らかにされ、ポンプの増加した発現を支持する（データ非表示）。ａｃｒＲ転写物の存在の同様の増加はまた、緑膿菌におけるｍｅｘＺおよびｍｅｘＲのような多くの排出ポンプ調節遺伝子について観察される現象であるａｃｒＲの自己制御を示唆することが観察される。選択されたａｃｒＲ変異体ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ００１１およびＮＢ６５０４４−ＣＤＳ００１４と、株ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ０００８（ここで、ａｃｒＲは、下流のａｃｒＡＢ領域と同方向のＴＮ９０３カナマイシン耐性決定基の挿入により不活性化される。）との薬物耐性プロフィールの類似性は、株ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ０００８におけるポンプの過剰発現が、ＴＮ９０３カートリッジプロモーターからの極性効果により生じないことを示唆する。まとめると、これらのデータは、ＬＢＭ４１５に対する低下した感受性が、ａｃｒＲ変異によりもたらされるａｃｒＡＢ排出ポンプの過剰発現形態において突然変異的に獲得され得ることを示すだろう。これは、ａｃｒＲノックアウト株における様々な化合物に対する感受性の変化が全く観察されない、インフルエンザ菌のａｃｒＲの不活性化についてのこれまでの報告とは対称的である。上記のTrepod and Mott (2004)を参照のこと。増加したポンプ発現が、常に、全てのポンプ基質に等しく影響するわけではなく、特にｍｅｘＡＢ−ｏｐｒＭまたはａｃｒＡＢのようなポンプの発現のわずかな増加の場合は、それらは、優位なレベルで既に発現されている。ポンプ効率が、個々の基質特性に特異的に関係する可能性が高いため、ポンプのわずかな過剰発現によりもたらされる感受性の大きな変化は、この場合にはＬＢＭ４１５、ＬＢＫ６１１およびクリンダマイシンを含むポンプ発現の典型的なレベルで効率よく排出されるある一部のポンプ基質について観察されるだけかもしれない。
【００９９】
実施例６
インフルエンザ菌および大腸菌におけるＰＡＢＮおよびレセルピンによるＬＢＭ４１５の増加
インフルエンザ菌ＮＢ６５０４４−ＣＤＳ００１１を、インフルエンザ菌試験に用いる。この株は、ポンプ阻害のより高感度の検出結果となると考えられる増加したポンプ発現を有する。
【０１００】
大腸菌試験に関して、株ＮＢ２７００６を用いる。この株は、その天然のＡｃｒＡＢポンプを欠失し（H Okusu et al. J. Bacteriol. 1996 178: 306−308に記載される）、インフルエンザ菌ａｃｒＡＢポンプ遺伝子をクローニングするための適する宿主である。
【０１０１】
インフルエンザ菌：ＭＩＣ決定を、一方の軸に一連のＬＢＭ４１５を、もう一方の軸に一連の排出阻害剤を有する９６ウェル滅菌プレート中で行う。用いる培地は、ＨＴＭ（Remel）である。接種を、ＢＢＬ ｐｒｏｍｐｔシステムを用いてウェル当たり約１０−５個の細菌に設定する。
【０１０２】
大腸菌：ＭＩＣ決定を、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ検定培地を用いる以外、上記に記載の通りに行う。
【０１０３】
インフルエンザ菌のＡｃｒＡＢポンプ成分をコードする遺伝子を、プライマーａｃｒＡ ｐｒｏｍ Ｆ１（５’−ＡＡＴＴＡＣＧＴＡＡＧＡＴＡＡＣＣＴＡＡＧＴＧＣＧ−３’）（配列番号１１）ならびにインフルエンザ菌および大腸菌においてＭＣ−２０７，１１０およびレセルピンによるＬＢＭ４１５のａｃｒＢＲ３増強（５’−ＴＡＴＴＡＧＣＧＧＡＡＴＴＡＴＣＴＧＡＡＧ−３’）（配列番号１２）を用いてＮＢ６５０４４ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅する。産物を含むａｃｒＡＢを、Ｔｏｐｏ ＰＣＲ２．１（Invitrogen）中にクローニングし、Ｔｏｐ１０コンピテントセル（Invitrogen）に形質転換する。プラスミドを有する挿入部分を単離し、変異がＰＣＲおよびクローニング中に導入されていないことを確認するために配列決定する。その後、このプラスミドを用いて、天然のＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣポンプ機能を欠く、大腸菌株ＮＢ２７００６を形質転換する。
ＬＢＭ４１５が、ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣによりポンプ排出されることが公知であるため、ＭＣ−２０７，１１０による活性の増強は、ＲＮＤファミリーポンプ機能を妨げるこの化合物の報告された能力に一致する。ＭＣ−２０７，１１０はまた、インフルエンザ菌においてＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣにより比較的効率よく排出される他の基質であるクリンダマイシンを増強することが観察されている。ＭＣ−２０７，１１０によるＬＢＭ４１５の増強において観察されるポンプ基質でないテトラサイクリンの増強はない。まとめると、データ（非表示）は、ＬＢＭ４１５の効果が実際に、ＭＣ−２０７，１１０のＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣ排出ポンプによる排出を妨げる一般的能力の結果であることを示唆する。しかしながら、レセルピンは、ＬＢＭ４１５またはクリンダマイシンのどちらも増強しない（データ非表示）。レセルピンは、例えばＡＢＣトランスポーターベースの排出の阻害剤としてよく特徴付けられているが、ＲＮＤファミリーポンプに対する活性をほとんど示さない。
【０１０４】
実施例７
大腸菌におけるインフルエンザ菌ＡｃｒＡＢ排出成分に対するＭＣ−２０７，１１０活性
ＡｃｒＡＢポンプ成分を過剰発現するインフルエンザ菌において、２個のポンプ基質であるクリンダマイシンおよびＬＢＭ４１５を増強するが、ポンプの基質でないテトラサイクリンに影響を与えないＭＣ−２０７，１１０の活性は、ＭＣ−２０７，１１０が、インフルエンザ菌においてＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣポンプ阻害剤として弱く機能することを示唆する。これをさらに試験するため、インフルエンザ菌ａｃｒＡＢ遺伝子をクローニングし、大腸菌株ＮＢ２７００６のＡｃｒＡＢポンプ欠失をトランスに相補するために用いる。大腸菌の天然ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣポンプは、ＬＢＭ４１５に対する顕著な内因性耐性を与えることが示されている（ＭＩＣ；一般的に１２８μｇ／ｍｌ以上）。これに対して、ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣポンプ機能を欠く株は、感受性である（ＭＩＣ；一般的に約１μｇ／ｍｌ）。インフルエンザ菌ａｃｒＡＢ遺伝子を用いる大腸菌株ＮＢ２７００６におけるポンプ欠失の相補は、ＬＢＭ４１５に対する顕著に増加した耐性をもたらす（ＭＩＣ；３２μｇ／ｍｌ）。このことは、ａｃｒＡＢ遺伝子が、大腸菌において機能的であること、およびそれらが、大腸菌ＴｏｌＣ外膜チャネルを有する機能単位を形成し得ることを示す。
【０１０５】
排出ポンプが、外膜透過性のような因子により影響を受け、大腸菌が、インフルエンザ菌ほど透過性ではない外膜を有すると考えられるため（薬物耐性に対する排出の増加した影響を説明すると考えられる）、それは、インフルエンザ菌ＡｃｒＡＢポンプ阻害の検出が、大腸菌バックグラウンドでより高感度かもしれないという理由である。これと一致して、インフルエンザ菌ａｃｒＡＢ遺伝子を用いてトランスに相補された大腸菌ＮＢ２００７におけるＬＢＭ４１５およびクリンダマイシンの両方に対するＭＣ−２０７，１１０の増強活性が観察される。さらに、テトラサイクリンの増強は検出されない。これは、天然の大腸菌ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣポンプが、テトラサイクリンを排出するという点で興味深い。このことは、インフルエンザ菌ポンプの抗生物質基質プロフィールが、大腸菌株で維持されていることを示唆する。このデータはさらに、ＭＣ−２０７，１１０が、インフルエンザ菌ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣポンプによるＬＢＭ４１５の排出を妨げ得るという考えを支持する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１、新規のＰＤＦ阻害剤であるＬＢＭ４１５およびＬＢＫ６１１の構造。
【図２】図２、挿入による不活性化に用いられるカナマイシン耐性マーカーの位置および方向を示す（矢印）、インフルエンザ菌のａｃｒＡＢ排出ポンプ遺伝子の遺伝子配列。また、ＯＲＦ ＨＩ１４６２(ｔｏｌＣ)に挿入されたカナマイシン耐性マーカーの位置および方向も示す。
【図３】図３、臨床的に分離されたＮＢ６５０６２において欠失するａｃｒＡの位置(黒線)。ＰＣＲに用いられるプライマーの位置を示す。プライマー対ａｃｒＡＨＩＦ/ａｃｒＡＨＩＲは、ａｃｒＡＨＩＦ部位がＮＢ６５０６２において欠失するため、産物を生じない。
【図４】図４、ＬＢＭ４１５およびＬＢＫ６１１に対して減少した感受性を有する４種の臨床的分離菌であるインフルエンザ菌由来の切断されたａｃｒＲ遺伝子と、野生形ａｃｒＲの比較。その変異は、下記の通りである：ＮＢ６５０１６は、ヌクレオチド４４２の後ろに１塩基（Ｃ）挿入され(フレームシフト)；ＮＢ６５０２７は、ヌクレオチド３６６の後ろに８ｂｐ欠失−ＧＴＴ挿入され(フレームシフト)、さらに下流に１塩基挿入され；ＮＢ６５０５１は、ヌクレオチド３２２の後ろを４ｂｐ欠失し(フレームシフト)；ＮＢ６５０６３は、Ｃ２５２Ｔ置換(停止)される。
【図１】
2008505145.tif 000037
【図２】
2008505145.tif 000038
【図３】
2008505145.tif 000039
【図４】
2008505145.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月2日(2007.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008505145000001.app
【国際調査報告】
2008505145.tif 000041
2008505145.tif 000042
2008505145.tif 000043
2008505145.tif 000044