(57)【要約】本発明は、疾病を診断する方法または患者の治療経過をモニターする方法を提供する、生理的状態の変化を検出する際に有用な免疫細胞に関する。生理状態の変化を検出するための抗原提示細胞特異的マーカーのアレイ、およびこのような変化を検出する方法もまた提供される。2008505649.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞を有する体液試料を哺乳動物から得る段階；
体液から対象抗原提示細胞を精製する段階；
対象抗原提示細胞の対象プロテオミクスシグニチャーを得る段階；および
対象抗原提示細胞からのプロテオミクスシグニチャーを、病原体または毒素に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；対象シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、病原体または毒素への対象の曝露を示唆する、哺乳動物対象の病原体または毒素への曝露を同定する方法。
【請求項２】
病原体または毒素が細菌性である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細菌性の病原体が、バチルス(Bacillus)；ボルデテラ(Bordetella)；ボレリア(Borrelia)；カンピロバクター(Campylobacter)；クロストリジウム(Clostridium)；コリネバクテリウム(Coryncbacterium)；エンテロコッカス(Enterococcus)；エシェリキア(Escherichia)；フランシセラ(Francisella)；ヘモフィルス(Haemophilus)；ヘリコバクター(Helicobacter)；レジオネラ(Legionella)；リステリア(Listeria)；マイコバクテリウム(Mycobacterium)；ナイセリア(Neisseria)；シュードモナス(Pseudomonas)；サルモネラ(Salmonella)；赤痢菌(Shigella)；ブドウ球菌(Staphylococcus)；連鎖球菌(Streptococcus)；トレポネーマ(Treponema)；ビブリオ(Vibrio)；エルシニア(Yersinia)；ペニシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、およびフルオロキノロンに耐性のナイセリア；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus Aureus)(MRSA)；薬剤耐性肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)；フルオロキノロンおよび他の薬剤耐性サルモネラ血清型チフィ；バンコマイシン中間/耐性黄色ブドウ球菌；およびバンコマイシン耐性エンテロコッカスからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
病原体または毒素が、炭疽(Anthrax)毒素；アレナウイルス(Arenavirus)；炭疽菌(Bacillus anthracis)(炭疽)；ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)毒素)；ブルセラ種(Brucella species)；鼻疽菌(Burkholderia mallei)；偽鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei)(類鼻疽)；オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)；コレラ(Cholera)毒素；ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)毒素(ボツリヌス中毒)；ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)；エボラウイルス(Ebola virus)出血熱；ニパウイルス(Nipah virus)；ハンタウイルス(hantavirus)；ウェルシュ菌のイプシロン毒素；O157:H7株を含む大腸菌(Escherichia coli)；赤痢菌；野兎病菌(Francisella tularensis)；鼻疽(鼻疽菌)；ラッサ熱；マールブルグウイルス(Marburg virus)出血熱；類鼻疽(偽鼻疽菌)；オウム病(オウム病クラミジア)；Q熱(Q熱リケッチア(Coxiella burnetti))；トウゴマ(Ricinus communis)(ヒマの実)由来リシン毒素；発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)；チフス菌(Salmonella Typhi)および他のサルモネラ種；赤痢菌；天然痘；ブドウ球菌エンテロトキシンB；発疹チフス；大痘瘡；コレラ菌(Vibrio cholerae)(コレラ)；ウイルス性脳炎；ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、および西部ウマ脳炎などのアルファウイルス(alphavirus)；フィロウイルス(Filovirus)；ラッサ(Lassa)およびマクポ(Machupo)などのアレナウイルス；コレラ菌；クリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)；ならびにペスト菌(Yersinia pestis)からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
病原体または毒素がプリオンである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
試料を得る段階；
試料を、ナイーブ抗原提示細胞の集団と共に一定時間インキュベートして、抗原提示細胞を試料と接触させる段階；
試料接触抗原提示細胞を単離および精製する段階；
試料接触抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを得る段階；および
試料接触抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを、病原体または毒素に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；試料接触シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、病原体または毒素への対象の曝露を示唆する、試料中の病原体または毒素の汚染を検出する方法。
【請求項７】
病原体または毒素が、炭疽毒素；アレナウイルス；炭疽菌(炭疽)；ボツリヌス菌毒素)；ブルセラ種；鼻疽菌；偽鼻疽菌(類鼻疽)；オウム病クラミジア；コレラ毒素；ボツリヌス菌毒素(ボツリヌス中毒)；ウェルシュ菌；エボラウイルス出血熱；ニパウイルス；ハンタウイルス；ウェルシュ菌のイプシロン毒素；O157:H7株を含む大腸菌；赤痢菌；野兎病菌；鼻疽(鼻疽菌)；ラッサ熱；マールブルグウイルス出血熱；類鼻疽(偽鼻疽菌)；オウム病(オウム病クラミジア)；Q熱(Q熱リケッチア)；トウゴマ(ヒマの実)由来リシン毒素；発疹チフスリケッチア；チフス菌および他のサルモネラ種；赤痢菌；天然痘；ブドウ球菌エンテロトキシンB；発疹チフス；大痘瘡；コレラ菌(コレラ)；ウイルス性脳炎；ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、および西部ウマ脳炎などのアルファウイルス；フィロウイルス；ラッサおよびマクポなどのアレナウイルス；コレラ菌；クリプトスポリジウム・パルバム；ならびにペスト菌からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
試料が食品である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
抗原提示細胞を有する体液試料を哺乳動物から得る段階；
体液から対象抗原提示細胞を精製する段階；
対象抗原提示細胞の対象プロテオミクスシグニチャーを得る段階；および
対象抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを、細菌性の病原体に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；対象シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、病原体による対象の活動性細菌感染を示唆する、哺乳動物対象において細菌性の病原体による感染を診断する方法。
【請求項１０】
細菌性の病原体が、バチルス；ボルデテラ；ボレリア；カンピロバクター；クロストリジウム；コリネバクテリウム；エンテロコッカス；エシェリキア；フランシセラ；ヘモフィルス；ヘリコバクター；レジオネラ；リステリア；マイコバクテリウム；ナイセリア；シュードモナス；サルモネラ；赤痢菌；ブドウ球菌；連鎖球菌；トレポネーマ；ビブリオ；エルシニア；ペニシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、およびフルオロキノロンに耐性のナイセリア；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)；薬剤耐性肺炎連鎖球菌；フルオロキノロンおよび他の薬剤耐性サルモネラ血清型チフィ；バンコマイシン中間/耐性黄色ブドウ球菌；およびバンコマイシン耐性エンテロコッカスからなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物対象の血液を敗血症のバイオマーカーの存在に関してアッセイする段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
敗血症のバイオマーカーが、D-ダイマー；アポリポタンパク質A1；β2ミクログロブリン；C反応性タンパク質；上皮増殖因子；エンドセリン-1；エオタキシン；第VII因子；線維芽細胞増殖因子-9；塩基性線維芽細胞増殖因子；フィブリノーゲン；顆粒球走化性タンパク質-2；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；成長ホルモン；グルタチオンS-トランスフェラーゼ；γインターフェロン；IgA；IL-10；IL-11；IL-12p70；IL-17；IL-18；IL-1β；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；インスリン；γインターフェロン誘導タンパク質10；KC；レプチン；白血病抑制因子；リンホタクチン；単球走化性タンパク質-1/JE；単球走化性タンパク質-3；単球走化性タンパク質-5；マクロファージコロニー刺激因子；マクロファージ由来ケモカイン；マクロファージ炎症性タンパク質-1α；マクロファージ炎症性タンパク質-1β；マクロファージ炎症性タンパク質-1γ；マクロファージ炎症性タンパク質-2；マクロファージ炎症性タンパク質-3β；ミオグロビン；オンコスタチンM；RANTES；幹細胞因子；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；組織性メタロプロテイナーゼ阻害因子-1；腫瘍壊死因子-α；組織因子；トロンボポエチン；血管細胞接着分子-1；血管内皮増殖因子；およびフォンウィルブランド因子からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
敗血症のバイオマーカーが急性期タンパク質である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
抗原提示細胞を有する体液試料を哺乳動物から得る段階；
体液から対象抗原提示細胞を精製する段階；                     えｗｒ
対象抗原提示細胞の対象プロテオミクスシグニチャーを得る段階；および
対象抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを、癌に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；対象シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、対象が癌を有することを示唆する、哺乳動物対象において癌を診断する方法。
【請求項１５】
体液が、血液、血漿、骨髄液、心嚢液、胸膜液、腹水、および滑液、脳脊髄液、痰、尿、ならびにリンパ液からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
癌が、急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児；急性骨髄性白血病、成人；急性骨髄性白血病、小児；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；星状細胞腫、小児小脳；星状細胞腫、小児大脳；胆管癌、肝外；膀胱癌；膀胱癌、小児；骨癌、骨肉腫/悪性線維性組織球腫；脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児；脳腫瘍、大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；脳腫瘍、上衣細胞腫、小児；脳腫瘍、髄芽腫、小児；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；脳腫瘍、視経路および視床下部グリオーマ、小児；脳腫瘍、小児(他)；乳癌；乳癌および妊娠；乳癌、小児；乳癌、男性；気管支腺腫/カルチノイド、小児；カルチノイド腫瘍、小児；カルチノイド腫瘍、胃腸；癌、副腎皮質；癌、膵島細胞；原発部位不明の癌；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星状細胞腫、小児；大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；結腸癌；結腸直腸癌、小児；皮膚T細胞性リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫、小児；上皮癌、卵巣；食道癌；食道癌、小児；ユーイング腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃(Gastric)(胃(Stomach))癌；胃(Gastric)(胃(Stomach))癌、小児；胃腸カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、頭蓋外、小児；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；グリオーマ、小児脳幹；グリオーマ、小児視経路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞(肝臓)癌、成人(原発性)；肝細胞(肝臓)癌、小児(原発性)；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児；ホジキンリンパ腫、妊娠中；下咽頭癌；視床下部および視経路グリオーマ、小児；眼内黒色腫；膵島細胞癌(内分泌膵臓)；カポジ肉腫；腎臓癌；喉頭癌；喉頭癌、小児；白血病、急性リンパ芽球性、成人；白血病、急性リンパ芽球性、小児；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児；白血病、慢性リンパ性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔癌；肝臓癌、成人(原発性)；肝臓癌、小児(原発性)；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児急性；リンパ性白血病、慢性；リンパ腫、AIDS関連；リンパ腫、中枢神経系(原発性)；リンパ腫、皮膚T細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン、小児；リンパ腫、ホジキン、妊娠中；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児；非ホジキン、妊娠中；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児；髄芽腫、小児；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞癌；中皮腫、悪性；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；多発性内分泌腫瘍症候群、小児；多発性骨髄腫/形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成/骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖症候群、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；鼻咽頭癌；鼻咽頭癌、小児；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児；非ホジキンリンパ腫、妊娠中；非小細胞肺癌；口腔癌、小児；口腔および口唇癌；口腔咽頭癌；骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌、小児；卵巣上皮癌；卵巣性胚細胞腫瘍；低悪性度卵巣腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、小児；膵臓癌、膵島細胞；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；下垂体腫瘍；形質細胞新生物/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝臓癌、成人；原発性肝臓癌、小児；前立腺癌；直腸癌；腎細胞(腎臓)癌；腎細胞癌、小児；腎盂および尿管、移行上皮癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺癌；唾液腺癌、小児；肉腫、ユーイング腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫(骨肉腫)/骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児；肉腫、軟部組織、成人；肉腫、軟部組織、小児；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌、小児；皮膚癌(黒色腫)；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫、成人；軟部組織肉腫、小児；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌、小児；テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；T細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；胸腺腫、小児；胸腺腫および胸腺癌甲状腺癌；甲状腺癌、小児；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍、妊娠中；原発部位不明、成人の癌；原発部位不明、小児の癌；小児のまれな癌；尿管および腎盂、移行上皮癌；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；視経路および視床下部グリオーマ、小児；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
プロセッサと、
メモリーと、
ユーザー入力装置と、
出力装置と、
それぞれの参照データ記録が個々の毒素、病原体、または癌と接触した抗原提示細胞の実質的に均一な集団のプロテオミクスシグニチャーとをさらに含む、
複数の参照データ記録を含む参照データセットを有するコンピュータ可読媒体と；
参照データ記録を解析し、ユーザー入力定義基準に基づいて個々のデータ記録を排除および包含するためのコンピュータ可読命令セットと、
記録中のプロテオミクスシグニチャーの類似性に基づき、参照データ記録のプロテオミクスシグニチャーをユーザー入力データ記録のシグニチャーと比較し得る、参照データ記録をユーザー入力データ記録と一致させるためのパターン認識ルーチンを有するエキスパートシステムとを含む、システム。
【請求項１８】
抗原提示細胞が、T細胞、B細胞、リンパ関連樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞などのリンパ系の細胞、ならびに骨髄関連樹状細胞、マクロファージ、単球、巨核球、血小板、顆粒球、および好中球などの骨髄系の細胞からなる群より選択される、請求項17記載のシステム。
【請求項１９】
病原体または毒素が、炭疽毒素；アレナウイルス；炭疽菌(炭疽)；ボツリヌス菌毒素)；ブルセラ種；鼻疽菌；偽鼻疽菌(類鼻疽)；オウム病クラミジア；コレラ毒素；ボツリヌス菌毒素(ボツリヌス中毒)；ウェルシュ菌；エボラウイルス出血熱；ニパウイルス；ハンタウイルス；ウェルシュ菌のイプシロン毒素；O157:H7株を含む大腸菌；赤痢菌；野兎病菌；鼻疽(鼻疽菌)；ラッサ熱；マールブルグウイルス出血熱；類鼻疽(偽鼻疽菌)；オウム病(オウム病クラミジア)；Q熱(Q熱リケッチア)；トウゴマ(ヒマの実)由来リシン毒素；発疹チフスリケッチア；チフス菌および他のサルモネラ種；赤痢菌；天然痘；ブドウ球菌エンテロトキシンB；発疹チフス；大痘瘡；コレラ菌(コレラ)；ウイルス性脳炎；ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、および西部ウマ脳炎などのアルファウイルス；フィロウイルス；ラッサおよびマクポなどのアレナウイルス；コレラ菌；クリプトスポリジウム・パルバム；ならびにペスト菌からなる群より選択される、請求項17記載のシステム。
【請求項２０】
病原体がプリオンである、請求項17記載のシステム。
【請求項２１】
癌が、急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児；急性骨髄性白血病、成人；急性骨髄性白血病、小児；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；星状細胞腫、小児小脳；星状細胞腫、小児大脳；胆管癌、肝外；膀胱癌；膀胱癌、小児；骨癌、骨肉腫/悪性線維性組織球腫；脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児；脳腫瘍、大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；脳腫瘍、上衣細胞腫、小児；脳腫瘍、髄芽腫、小児；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；脳腫瘍、視経路および視床下部グリオーマ、小児；脳腫瘍、小児(他)；乳癌；乳癌および妊娠；乳癌、小児；乳癌、男性；気管支腺腫/カルチノイド、小児；カルチノイド腫瘍、小児；カルチノイド腫瘍、胃腸；癌、副腎皮質；癌、膵島細胞；原発部位不明の癌；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星状細胞腫、小児；大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；結腸癌；結腸直腸癌、小児；皮膚T細胞性リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫、小児；上皮癌、卵巣；食道癌；食道癌、小児；ユーイング腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃(Gastric)(胃(Stomach))癌；胃(Gastric)(胃(Stomach))癌、小児；胃腸カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、頭蓋外、小児；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；グリオーマ、小児脳幹；グリオーマ、小児視経路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞(肝臓)癌、成人(原発性)；肝細胞(肝臓)癌、小児(原発性)；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児；ホジキンリンパ腫、妊娠中；下咽頭癌；視床下部および視経路グリオーマ、小児；眼内黒色腫；膵島細胞癌(内分泌膵臓)；カポジ肉腫；腎臓癌；喉頭癌；喉頭癌、小児；白血病、急性リンパ芽球性、成人；白血病、急性リンパ芽球性、小児；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児；白血病、慢性リンパ性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔癌；肝臓癌、成人(原発性)；肝臓癌、小児(原発性)；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児急性；リンパ性白血病、慢性；リンパ腫、AIDS関連；リンパ腫、中枢神経系(原発性)；リンパ腫、皮膚T細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン、小児；リンパ腫、ホジキン、妊娠中；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児；非ホジキン、妊娠中；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児；髄芽腫、小児；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞癌；中皮腫、悪性；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；多発性内分泌腫瘍症候群、小児；多発性骨髄腫/形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成/骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖症候群、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；鼻咽頭癌；鼻咽頭癌、小児；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児；非ホジキンリンパ腫、妊娠中；非小細胞肺癌；口腔癌、小児；口腔および口唇癌；口腔咽頭癌；骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌、小児；卵巣上皮癌；卵巣性胚細胞腫瘍；低悪性度卵巣腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、小児；膵臓癌、膵島細胞；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；下垂体腫瘍；形質細胞新生物/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝臓癌、成人；原発性肝臓癌、小児；前立腺癌；直腸癌；腎細胞(腎臓)癌；腎細胞癌、小児；腎盂および尿管、移行上皮癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺癌；唾液腺癌、小児；肉腫、ユーイング腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫(骨肉腫)/骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児；肉腫、軟部組織、成人；肉腫、軟部組織、小児；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌、小児；皮膚癌(黒色腫)；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫、成人；軟部組織肉腫、小児；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌、小児；テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；T細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；胸腺腫、小児；胸腺腫および胸腺癌甲状腺癌；甲状腺癌、小児；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍、妊娠中；原発部位不明、成人の癌；原発部位不明、小児の癌；小児のまれな癌；尿管および腎盂、移行上皮癌；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；視経路および視床下部グリオーマ、小児；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項17記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、疾病を診断する方法または患者の治療経過をモニターする方法を提供する、生理状態の変化を検出する際に有用な免疫細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
癌、自己免疫性疾患または循環器系疾患などの多数の疾病において、健常者の細胞表面には見つけることができない正常または異常なタンパク質のペプチドが細胞表面に提示される。ヒトにおいて抗原提示が不十分であると、ヒト免疫系は多数の病原体感染および悪性細胞増殖を制御し、除去することができない。慢性感染の治療ワクチンおよび免疫療法の成功は、防御抗原を制御し、除去することができる種々の免疫応答を誘導するのに効率的な抗原提示の新規方法の開発を頼りにしている。
【０００３】
T細胞が抗原を認識する能力は、抗原とMHCクラスI(MHC-I)またはクラスII(MHC-II)タンパク質の関連に依存している。例えば、細胞障害性T細胞はMHC-Iタンパク質と関連して抗原に応答する。従って、細胞が適当なMHC-Iタンパク質を発現しない場合も、ウイルス感染細胞を死滅させるT細胞はこのウイルスに感染した細胞を死滅させない。ヘルパーT細胞はMHC-IIタンパク質を認識する。ヘルパーT細胞活性は、一般に、抗原提示細胞における抗原の認識およびこれらの細胞における「自己」MHC-IIタンパク質の存在の両方に依存する。自己MHCタンパク質に関連して抗原を認識するこの要件はMHC拘束と呼ぶ。MHC-Iタンパク質は、実質的に全ての有核細胞の表面に見られる。MHC-IIタンパク質は、脾臓のマクロファージ、B細胞および樹状細胞(DC)ならびに皮膚のランゲルハンス細胞を含む細胞に見られる。
【０００４】
哺乳動物において免疫応答を開始する際に重大な段階は、主要組織適合性抗原複合体(MHC)-II拘束性外来抗原を認識するCD4+ヘルパーT細胞の活性化である。これらの抗原は、樹状細胞などの抗原提示細胞の細胞エンドソーム経路に捕獲されて処理される。エンドソームおよびリソソームにおいて、抗原は小さい抗原ペプチドに処理されて、ゴルジ画分のMHC-II上で提示されて、抗原-MHC-II複合体を形成する。この複合体は細胞表面において発現され、発現はCD4+T細胞の活性化を誘導する。
【０００５】
動物における効果的な免疫応答の誘導における他の重大な事象は、CD8+T細胞およびB細胞の活性化に関係する。CD8+細胞は、望ましいタンパク質が処理済みタンパク質として細胞表面に提示されるような方法で細胞を通過して、MHC-I抗原と複合体を形成する場合に活性化される。B細胞は、MHCタンパク質の必要性なく、表面の免疫グロブリン(IgMおよびIgD)によって抗原と相互作用することができる。しかし、CD4+T細胞の活性化は免疫系の全てのアームを刺激する。活性化の結果、CD4+T細胞(ヘルパーT細胞)はインターロイキンを産生する。これらのインターロイキンは、免疫系の他のアームを活性化する助けをする。例えば、ヘルパーT細胞は、B細胞が抗体を産生する助けをするインターロイキン-4(IL-4)およびインターロイキン-5(IL-5)；CD4+およびCD8+T細胞を活性化するインターロイキン-2(IL-2)；ならびにマクロファージを活性化するγインターフェロンを産生する。MHC-II拘束性抗原を認識するヘルパーT細胞は、細胞障害性T細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびB細胞の活性化およびクローン性増殖において中心的な役割を果たすので、抗原に応答してヘルパーT細胞を活性化する初期事象は、その抗原に対する効果的な免疫応答の誘導に重大である。
【０００６】
罹患細胞において発現されるペプチドおよびタンパク質は、このような異常な細胞の同定のためのマーカーとして使用することができる。さらに、これらのペプチドに対する抗体の血清または他の生体液における検出もリスクの指標としてまたは予後指標として使用することができる。しかし、これらの疾患関連ペプチドの濃度は極めて低く、それらの単離および同定は、通常、疾病が個人において優勢となったときしか有効ではなく、その時までには通常効果的な治療は不可能になる。哺乳動物の病的状態を検出するための迅速且つ感度の高いアッセイの必要性が当技術分野において残っている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、抗原提示細胞の柔軟性およびAPC、特にDCが抗原と遭遇後に受ける特異的の高い代謝変化に基づいている。これらの変化は定量することができ、APCの参照の正(抗原曝露)および負(ナイーブ)対照と比較するとき、それらを得た哺乳動物の免疫状態および微小環境に関する情報を提供する。
【０００８】
一局面において、本発明は、抗原提示細胞の亜集団を有する血液試料を哺乳動物被験体から得る段階、血液試料から抗原提示細胞を実質的に単離する段階、単離された抗原提示細胞のゲノムまたはプロテオミクス哺乳動物被験体シグニチャーを誘導する段階であって、哺乳動物被験体シグニチャーが被験体の抗原提示細胞の代謝状態を示す段階、疾病状態を有する参照被験体から抗原提示細胞の1つまたは複数のゲノムまたはプロテオミクス参照シグニチャーを誘導する段階、および哺乳動物被験体のシグニチャーと参照シグニチャーを比較する段階であって、哺乳動物被験体のシグニチャーと参照シグニチャーとの一致性が哺乳動物における疾病状態の存在を示す段階を含む診断方法を提供する。哺乳動物被験体は、好ましくは、ヒトであるが、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたは他の動物などの動物被験体であってもよい。一態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。別の態様において、疾病状態は癌または細胞増殖性疾患である。さらに別の態様において、疾病状態は病原体感染である。さらに別の態様において、病原体感染はウイルス感染である。よりさらに別の態様において、病原体感染は細菌感染である。さらに別の態様において、疾病状態は、ブドウ球菌B型エンテロトキシンまたはボツリヌス毒素によるなど、細菌毒素に起因する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、複数のアドレスを含むアレイであって、各アドレスに抗原提示細胞によって発現される遺伝子に対応する核酸試料が付加されているアレイを提供する。一態様において、アレイは、複数の二次アドレスをさらに含み、各二次アドレスに、抗原に遭遇した経験のある抗原提示細胞によって発現される遺伝子に対応する核酸試料が付加されている。別の態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。さらに別の態様において、抗原は癌抗原である。さらに別の態様において、抗原はウイルス抗原である。さらに別の態様において、抗原は細菌抗原である。さらに別の態様において、抗原は真菌抗原である。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、単離された抗原提示細胞集団を得る段階、食品媒介性病原体の存在下で抗原提示細胞を培養し、それによって食品媒介性病原体に特異的なプロテオミクスまたはゲノム参照シグニチャーを有する参照細胞を作製し、参照シグニチャーを得る段階、食品試料を得る段階、ナイーブ（naive）抗原提示細胞を試料の食品と共に培養する段階、培養した抗原提示細胞から試料シグニチャーを得る段階、および試料シグニチャーと参照シグニチャーを比較する段階であって、試料シグニチャーと参照シグニチャーとの一致性が食品中の食品媒介性病原体の存在を示す段階を含む診断方法を提供する。一態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。別の態様において、食品媒介性病原体は細菌病原体である。さらに別の態様において、食品媒介性病原体はウイルス病原体である。さらに別の態様において、食品媒介性病原体はプリオン病原体である。関連する局面において、本発明は、家畜哺乳動物から抗原提示細胞を得る段階、ならびに家畜哺乳動物における食品媒介性病原体へのAPC曝露、および抗原接触によって生ずるAPCにおける遺伝子およびタンパク質発現の変化をアッセイする段階を提供する。一態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。別の態様において、食品媒介性病原体は細菌病原体である。さらに別の態様において、食品媒介性病原体はウイルス病原体である。さらに別の態様において、食品媒介性病原体は、プリオン病原体、例えばウシ海綿状脳症(BSE)を生ずるプリオンである。
【００１１】
よりさらに別の局面において、本発明は、疾患の治療を受けている患者から、抗原提示細胞の亜集団を有する血液試料を得る段階、血液試料から抗原提示細胞を実質的に単離する段階、単離された抗原提示細胞についてゲノムまたはプロテオミクス患者シグニチャーを誘導する段階であって、患者シグニチャーが被験体の抗原提示細胞の代謝状態を示す段階、患者と同じ疾患を有する参照被験体から抗原提示細胞の1つまたは複数のゲノムまたはプロテオミクス参照シグニチャーを誘導する段階、および患者シグニチャーを参照シグニチャーと比較する段階であって、患者シグニチャーと参照シグニチャーとの一致性が治療中に低下し、それによって疾患の治療における治療の有効性を示す段階を含む、診断方法を提供する。一態様において、疾患は細胞増殖性疾患または癌であり、治療は抗悪性腫瘍薬の投与である。別の態様において、疾患は細胞増殖性疾患または癌であり、治療は細胞増殖性疾患に対する免疫応答を誘発する。さらに別の態様において、疾患は自己免疫性疾患であり、治療は自己免疫応答を低下する。さらに別の態様において、疾患は細菌感染であり、治療は抗菌剤の投与である。さらに別の態様において、疾患はウイルス感染であり、治療は抗ウイルス剤の投与である。よりさらに別の態様において、疾患は真菌感染であり、治療は抗真菌剤の投与である。また別の態様において、疾患は遺伝性疾患であり、治療は遺伝子置換治療である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、抗原の存在下において培養された抗原提示細胞であって、抗原は、抗原負荷に応答して特異的に上方制御される複数の遺伝子を発現する、抗原提示細胞を提供する。一態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。さらに別の態様において、抗原は癌抗原である。さらに別の態様において、抗原はウイルス抗原である。さらに別の態様において、抗原は細菌抗原である。さらに別の態様において、抗原は真菌抗原である。さらに別の態様において、抗原はプリオン抗原である。一局面において、抗原接触に応答して産生される特異的なポリペプチド(マーカータンパク質)を単離する。これらを使用して抗体を形成し、抗体を、患者から単離したAPCに関係するその後のアッセイに使用し、それによってAPCを単離した患者において発現されるポリペプチドを、免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、FAC、RIAおよび同様の技法によって定性的および定量的に同定する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、抗原に曝露した抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを決定する段階を提供する。一態様において、プロテオミクスシグニチャーは、抗原提示細胞をSELDI質量分析法に供することによって得られる。別の局面において、プロテオミクスシグニチャーは、抗原提示細胞をMALDI-O-TOFおよび他の形態の質量分析法に供することによって得られる。さらに別の局面において、本発明は、抗原に曝露した抗原提示細胞から得られるプロテオミクスシグニチャーを提供する。一態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。さらに別の態様において、抗原は癌抗原である。さらに別の態様において、抗原はウイルス抗原である。さらに別の態様において、抗原は細菌抗原である。さらに別の態様において、抗原は真菌抗原である。さらに別の態様において、抗原はプリオン抗原である。
【００１４】
一局面において、本発明は、疾患を有する哺乳動物から、抗原提示細胞の亜集団を有する血液試料を得る段階；血液試料から抗原提示細胞を実質的に単離する段階、抗原提示細胞から1つまたは複数のマーカーポリペプチドを誘導する段階であって、マーカーポリペプチドが抗原接触に応答して抗原提示細胞において発現され、接触した抗原が疾患に関連するかまたは疾患の原因因子である、段階；マーカーポリペプチドに対する抗体を得る段階；および被験体の抗原提示細胞において、抗体に結合するポリペプチドの有無を検出する段階であって、ポリペプチドの存在が被験体における疾患の存在を確認する段階を含む、診断方法を提供する。抗体に結合するポリペプチドの検出は、ELISA、RIA、FRET、FACおよび他の免疫検出方法などのアッセイを使用して実施することができる。一態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。一態様において、疾患は癌または細胞増殖性疾患である。一態様において、疾患は病原体感染である。一態様において、疾患はウイルス感染である。一態様において、疾患は細菌感染である。一態様において、疾患はプリオン感染である。一態様において、疾患は真菌感染である。
【００１５】
別の局面において、本発明は、抗原に曝露していない哺乳動物組織または哺乳動物生体液の試料に存在するタンパク質/遺伝子発現量を検出する段階を含む、抗原との曝露を診断する方法を含む。次いで、抗原に曝露した哺乳動物組織または哺乳動物生体液の試料に存在するタンパク質/遺伝子発現量を検出する。曝露試料と未曝露試料間のタンパク質/遺伝子発現の検出量の差を求める。所定の抗原の予想されるタンパク質/遺伝子発現のライブラリーとの差を比較する。最後に、差が特定抗原への曝露を示すかどうかを評価する。本発明は、任意の症状の猛襲の前に、人が抗原に曝露したかどうかの診断を提供することができるので、特に有用である。本発明はまた、抗原に曝露した可能性のある人の哺乳動物組織または哺乳動物生体液試料に存在する遺伝子発現/タンパク質パターンを検出する段階、曝露した可能性のある個人のそれらの組織において発現されるハウスキーピング遺伝子およびタンパク質に対する遺伝子またはタンパク質パネル発現の相対的な量を求める段階、所定の抗原の予想される遺伝子発現/タンパク質ライブラリーに対する相対的な量の差を比較する段階；および公知の、目録となっている毒性因子、これまでに未知の抗原または増強因子(potentiating agent)と混合されている抗原への曝露が生じたことを差が示すかどうかを評価する段階を含む、抗原への曝露を診断する方法に関する。ハウスキーピング遺伝子は、抗原への曝露の際に変化しない傾向の遺伝子である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞を有する体液試料を哺乳動物から得る段階；体液から対象抗原提示細胞を精製する段階；対象抗原提示細胞の対象プロテオミクスシグニチャーを得る段階；および対象抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを、癌に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；ここで対象シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、対象が癌を有することを示唆する、哺乳動物対象において癌を診断する方法を提供する。検出に適した癌については、以下で考察する。スクリーニングし得る体液試料には、血液、血漿、骨髄液、心嚢液、胸膜液、腹水、および滑液、脳脊髄液、痰、尿、ならびにリンパ液が含まれる。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、抗原提示細胞を有する体液試料を哺乳動物から得る段階；体液から対象抗原提示細胞を精製する段階；対象抗原提示細胞の対象プロテオミクスシグニチャーを得る段階；および対象抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを、病原体または毒素に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；ここで対象シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、病原体または毒素への対象の曝露を示唆する、哺乳動物対象の病原体または毒素への曝露を同定する方法を提供する。病原体または毒素は、以下のものを含む生物体または毒素のような、細菌起源のものであってよい：バチルス(Bacillus)；ボルデテラ(Bordetella)；ボレリア(Borrelia)；カンピロバクター(Campylobacter)；クロストリジウム(Clostridium)；コリネバクテリウム(Coryncbacterium)；エンテロコッカス(Enterococcus)；エシェリキア(Escherichia)；フランシセラ(Francisella)；ヘモフィルス(Haemophilus)；ヘリコバクター(Helicobacter)；レジオネラ(Legionella)；リステリア(Listeria)；マイコバクテリウム(Mycobacterium)；ナイセリア(Neisseria)；シュードモナス(Pseudomonas)；サルモネラ(Salmonella)；赤痢菌(Shigella)；ブドウ球菌(Staphylococcus)；連鎖球菌(Streptococcus)；トレポネーマ(Treponema)；ビブリオ(Vibrio)；エルシニア(Yersinia)；ペニシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、およびフルオロキノロンに耐性のナイセリア；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus Aureus)(MRSA)；薬剤耐性肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)；フルオロキノロンおよび他の薬剤耐性サルモネラ血清型チフィ；バンコマイシン中間/耐性黄色ブドウ球菌；およびバンコマイシン耐性エンテロコッカス。病原体または毒素はまた、炭疽(Anthrax)毒素；アレナウイルス(Arenavirus)；炭疽菌(Bacillus anthracis)(炭疽)；ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)毒素)；ブルセラ種(Brucella species)；鼻疽菌(Burkholderia mallei)；偽鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei)(類鼻疽)；オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)；コレラ(Cholera)毒素；ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)毒素(ボツリヌス中毒)；ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)；エボラウイルス(Ebola virus)出血熱；ニパウイルス(Nipah virus)；ハンタウイルス(hantavirus)；ウェルシュ菌のイプシロン毒素；O157:H7株を含む大腸菌(Escherichia coli)；赤痢菌；野兎病菌(Francisella tularensis)；鼻疽(鼻疽菌)；ラッサ熱；マールブルグウイルス(Marburg virus)出血熱；類鼻疽(偽鼻疽菌)；オウム病(オウム病クラミジア)；Q熱(Q熱リケッチア(Coxiella burnetti))；トウゴマ(Ricinus communis)(ヒマの実)由来リシン毒素；発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)；チフス菌(Salmonella Typhi)および他のサルモネラ種；赤痢菌；天然痘；ブドウ球菌エンテロトキシンB；発疹チフス；大痘瘡；コレラ菌(Vibrio cholerae)(コレラ)；ウイルス性脳炎；ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、および西部ウマ脳炎などのアルファウイルス(alphavirus)；フィロウイルス(Filovirus)；ラッサ(Lassa)およびマクポ(Machupo)などのアレナウイルス；コレラ菌；クリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)；ならびにペスト菌(Yersinia pestis)であってもよい。または、病原体または毒素は、BSEなどのプリオンである。
【００１８】
別の局面において、本発明は、試料を得る段階；試料を、ナイーブ抗原提示細胞の集団と共に一定時間インキュベートして、抗原提示細胞を試料と接触させる段階；試料接触抗原提示細胞を単離および精製する段階；試料接触抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを得る段階；および試料接触抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを、病原体または毒素に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；ここで試料接触シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、病原体または毒素への対象の曝露を示唆する、試料中の病原体または毒素汚染を検出する方法を提供する。試料はまた食品であってよい。
【００１９】
本発明は、抗原提示細胞を有する体液試料を哺乳動物から得る段階；体液から対象抗原提示細胞を精製する段階；対象抗原提示細胞の対象プロテオミクスシグニチャーを得る段階；および対象抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを、細菌性の病原体に曝露した参照抗原提示細胞のプロテオミクスシグニチャーを含む、少なくとも1つの参照シグニチャーと比較する段階を含み；ここで対象シグニチャーと参照シグニチャーの一致が、病原体による対象の活動性細菌感染を示唆する、哺乳動物対象において細菌性の病原体による感染を診断する方法を提供する。検出に適した病原体には、バチルス；ボルデテラ；ボレリア；カンピロバクター；クロストリジウム；コリネバクテリウム；エンテロコッカス；エシェリキア；フランシセラ；ヘモフィルス；ヘリコバクター；レジオネラ；リステリア；マイコバクテリウム；ナイセリア；シュードモナス；サルモネラ；赤痢菌；ブドウ球菌；連鎖球菌；トレポネーマ；ビブリオ；エルシニア；ペニシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、およびフルオロキノロンに耐性のナイセリア；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)；薬剤耐性肺炎連鎖球菌；フルオロキノロンおよび他の薬剤耐性サルモネラ血清型チフィ；バンコマイシン中間/耐性黄色ブドウ球菌；およびバンコマイシン耐性エンテロコッカスが含まれる。別の態様において、本発明は、哺乳動物対象の血液を敗血症のバイオマーカーの存在に関してアッセイする段階を提供する。敗血症のバイオマーカーには、D-ダイマー；アポリポタンパク質A1；β2ミクログロブリン；C反応性タンパク質；上皮増殖因子；エンドセリン-1；エオタキシン；第VII因子；線維芽細胞増殖因子-9；塩基性線維芽細胞増殖因子；フィブリノーゲン；顆粒球走化性タンパク質-2；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；成長ホルモン；グルタチオンS-トランスフェラーゼ；γインターフェロン；IgA；IL-10；IL-11；IL-12p70；IL-17；IL-18；IL-1β；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；インスリン；γインターフェロン誘導タンパク質10；KC；レプチン；白血病抑制因子；リンホタクチン；単球走化性タンパク質-1/JE；単球走化性タンパク質-3；単球走化性タンパク質-5；マクロファージコロニー刺激因子；マクロファージ由来ケモカイン；マクロファージ炎症性タンパク質-1α；マクロファージ炎症性タンパク質-1β；マクロファージ炎症性タンパク質-1γ；マクロファージ炎症性タンパク質-2；マクロファージ炎症性タンパク質-3β；ミオグロビン；オンコスタチンM；RANTES；幹細胞因子；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；組織性メタロプロテイナーゼ阻害因子-1；腫瘍壊死因子-α；組織因子；トロンボポエチン；血管細胞接着分子-1；血管内皮増殖因子；およびフォンウィルブランド因子が含まれる。敗血症の他のバイオマーカーは、急性期タンパク質である。
【００２０】
これらの局面および他の特徴は以下の考察から明らかになる。
【００２１】
詳細な説明
本発明は、抗原提示細胞(APC)の観察される柔軟性ならびに病原体、腫瘍および有害な物質への曝露に応答してヒト樹状細胞および単球において生じる遺伝子およびタンパク質発現の特異的な変化を迅速に検出するためのそれらの用途に基づいている。抗原提示細胞、特に樹状細胞(DC)マクロファージおよび単球(M)、好中球、TH1およびTH2細胞、NK細胞、ならびにB細胞は、哺乳動物の生体において見られる種々の微小環境を絶え間なくサンプリングしている。例えば、DC細胞はほとんどの組織において未成熟状態で見られ(CD1a+、CD83Low)、それらは病原体および他の抗原を認識し、貪食する(Poindexter, et al., (2004) Breast Cancer Res. 6(4): 408-415参照)。血小板はそれ自体細胞ではないが巨核球の細胞断片であり、血小板も感染性微生物および血清タンパク質に結合し、貪食することができ、病原体ならびに腫瘍細胞およびアポトーシス細胞細片などの細胞断片を検出するための貯蔵所と考えることができる(Youssefian, et al., Host defense role of platelets: engulfment of HIV and Staphylococcus aureus occurs in a specific subcellular compartment and is enhanced by platelet activation. Blood. 2002 Jun 1; 99(11): 4021-9参照)。従って、抗原提示細胞は、一般に、抗原を内部移行して、これらの抗原を他の細胞に提示する能力を有するような細胞(および細胞断片)を指す。例示的な抗原提示細胞には、T細胞、B細胞、リンパ関連樹状細胞およびナチュラルキラー細胞などのリンパ系の細胞、ならびに骨髄関連樹状細胞などの骨髄系列細胞、マクロファージ、単球、巨核球、血小板、顆粒球および好中球などの骨髄系の細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。マクロファージ、単球および樹状細胞などの貪食性の強い細胞が好ましい。
【００２２】
抗原または他の病原因子と直接接触することにより、これらの抗原提示細胞は成熟し、抗原提示の増加、同時刺激分子の発現、サイトカインの発現およびその後のリンパ器官における未処理のT細胞ならびに樹状細胞における表面CD83発現などの他の細胞特異的マーカーの刺激によって特徴づけられる。この成熟過程は、定性的および定量的に測定することができる、これらの細胞における遺伝子発現の数多くの対応する変化によって調節される。生ずる一連の遺伝子発現変化は特異性が高く、APCが曝露される特定の抗原に特異的に応答する。APCは、例えば、特定のペプチド、糖ペプチド、糖脂質を識別し、種々の抗原に曝露されたとき、類似しているが、同一ではない応答を開始することができる。抗原付加に応答したAPCの遺伝子およびタンパク質発現の特定の変化は非常に特異的な測定可能な生物的シグニチャーを示し、APCが抗原を経験したということならびに抗原自体の性質、例えば、その化学的組成および起源を同定するために使用することができる。ある態様において、APCの単離により、その後に貪食された抗原または場合によっては病原体全体をAPCから抽出し、単離することが可能となり、MSまたは同様のツールによってさらに特徴づけることができる。例えば、DCは、ウイルス性および細菌性の病原体を死滅させないで内部移行することが公知である(Sundquist et al., 2004, and Jantsch et al., 2003)。従って、本発明の一目的は、病原体または抗原のゲノム/プロテオミクスシグニチャーを得る以外に、病原体または抗原の一部および/または全体を回収する方法を含む。本発明の別の目的は、抗原接触に応答して上方制御されるAPCポリペプチドの単離である。これらのポリペプチドは抗原接触に特異性の高いマーカーであり、それらの発現は、APCが特定の抗原に出会った経験があることを示す。これらのポリペプチドを全体としてまたは部分として単離することによって、抗体を形成することができ、その後のアッセイに使用して抗原接触を判定する。
【００２３】
例えば、Dasらに付与された米国特許第6,316,197号、特定の遺伝子の発現レベルの別個のパターンを測定することによって毒性の病原体への曝露を診断する方法(Method of diagnosing of exposure to toxic agents by measuring distinct pattern in the levels of expression of specific genes)参照。未成熟DCのLPS刺激への曝露はCD70(+)DCへの最終分化に寄与する(Iwamoto S., et al., Lipopolysaccharide stimulation converts vigorously washed dendritic cells (DCs) to nonexhausted DCs expressing CD70 and evoking long-lasting type 1 T cell responses., J Leukoc Biol. 2005 Apr 27; [Epub ahead of print])参照)。Kumar, A., Kurl, R. N. Kryworuchko, M., Diaz-Mitoma, F., & Sharma, S. 1995. EBV形質転換とc-mycおよびポリAポリメラーゼ(PAP)の発現増加の関連を詳細に記載している、ヒトバーキットリンパ腫B細胞系統においてRNA代謝に与えるヒートショックの差別的な影響(Differential effect of heat shock on RNA metabolism in human Burkitt's lymphoma B-cell lines). Leuk. Res, 19(11): 831-840も参照。LPSまたはTNF-α刺激に応答するIDOの上方制御を記載している、Hwang SL., et al., インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)は樹状細胞活性化およびケモカインに対する走化性反応に必須である(Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is essential for dendritic cell activation and chemotactic responsiveness to chemokines)., Cell Res. 2005 Mar; 15(3): 167-75；およびヒト臍帯血単球由来DCは、臍帯血DC細胞質におけるTNF-α関連アポトーシス誘導リカンド(TRAIL)発現の増加に関連する、リポ多糖(LPS)またはγ-インターフェロン(IFN-γ)による活性化により、血液腫瘍細胞を死滅させる能力を獲得することを記載している、Shi J., et al., Cancer Sci. 2005 Feb; 96(2): 127-33も参照。ヒトヘルペスウイルス-6(HHV-6)はDCによるインターロイキン-12(IL-12) p70の分泌を劇的に抑制し、密接に関連するベータヘルペスウイルスHHV-7は抑制しなかったが、DC成熟に影響する他のサイトカインの、すなわち、IL-10および腫瘍壊死因子α産生は有意に改変されなかったことを詳細に記載している、Smith, A. P., et al., J Virol. 2005 Mar; 79(5): 2807-13も参照。Komerらは、炭疽菌致死性毒素(LeTx)に応答して上方制御されるマクロファージの103種の遺伝子の上方制御を記載した。同様に、Tucker et al.,は、種々の異なるAPC細胞種におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MAPKK)のLeTx切断を記載している。MAPKK活性によって調節される遺伝子の発現は有意に変化しなかったが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3-β(GSK-3β)調節下にある一連の遺伝子は、LeTx処理後発現を変化させた。リーシュマニア・メジャー(Leishmania major)、野兎病(野兎病菌(Francisella tularensis))、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)(BCG)およびネズミマラリア原虫(Plasmodium berghei)との接触に応答したAPCによる一酸化窒素(NO)産生の調節を記載している、Green, S. J. 、Scheller, L. F., Marletta, M. A.、Seguin, M. C.、Koltz, F. W.、Slayter, M.、Nelson, B. J., & Nacy, C. A. 1994. 一酸化窒素：細胞内病原体に対する宿主抵抗性における一酸化窒素のサイトカイン調節(Nitric oxide: cytokine-regulation of nitric oxide in host resistance to intracellular pathogens). Immunol. Lett, 43(1-2): 87-94も参照。Hernychova, L., Kovarova, H., Macela, A., Kroca, M., Krocova, Z.&Stulik, J. 1997.  マウスにおける異なる遺伝子バックグラウンドの影響下におけるマクロファージ野兎病菌相互作用の早期結果(Early consequences of macrophage-Francisella tularensis) interaction under the influence of different genetic background in mice). Immunol. Lett, 57(1-3): 75-81およびClemens, D. L., Lee, B. Y. & Horwitz, M. A. 2004. 病原性および非病原性株の野兎病菌はファゴソームの酸性化および成熟ならびにヒトマクロファージの細胞質への逃避を防止する(Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages). Infect. Immun., 72(6): 3204-3217も参照。ペスト菌(Y. pestis)感染に応答して上方制御される合計22種の異なる遺伝子を詳細に記載している、Ng, L. C.、Forslund, O.、Koh, S.、Kuoppa, K.&Sjostedt, A. 2003. DNAマイクロアレイ分析によって明らかにされるペスト菌(Yersinia pestis)感染に対するマウスマクロファージの応答(The response of murine macrophages to infection with Yersinia pestis as revealed by DNA microarray analysis). Adv. Exp. Med Biol, 529: 155-160も参照。これらの遺伝子には、未知のEST、サイトカイン、サイトカインの酵素、受容体、リガンド、転写因子、転写因子の阻害因子、細胞骨格に関与するタンパク質ならびに細胞周期および細胞増殖に関連することが公知の因子をコードする7種の遺伝子が挙げられ、それらのうち3種がアポトーシスに役割を果たす。APCのLPS処理は転写因子、プロトオンコジーン、アポトーシス関連タンパク質(システインプロテアーゼ)、細胞内キナーゼおよび増殖因子の発現をダウンレギュレーションしたことを詳細に記載している、Saban, M. R.、Hellmich, H.、Nguyen, N. B.、Winston, J.、Hammond, T. G.&Saban, R. 2001.尿生殖器炎症のマウスモデルにおけるLPS誘導性遺伝子発現の経過 (Time course of LPS-induced gene expression in a mouse model of genitourinary inflammation). Physiol Genomics, 5(3): 147-160も参照。LPSに応答した遺伝子上方制御は、インターロイキン-6(IL-6)受容体、α-およびβ-神経増殖因子(α-およびβ-NGF)、血管内皮増殖因子受容体-1(VEGF R1)、C-Cケモカイン受容体およびP-セレクチンを含むクラスターにおいて観察された。発現が顕著な別の密接なクラスターは、プロトオンコジーンc-Fos、Fos-B、Fra-2、Jun-B、Jun-DおよびEgr-1を含んだ。ほとんど全てのインターロイキン遺伝子は、LPS刺激の1時間後には上方制御された。核因子κB(NF-κB)経路遺伝子は、LPS刺激の4時間後にピーク発現を有するシングルクラスターで集合した。一方、インターロイキン受容体およびケモカイン受容体のほとんどは、LPS曝露の24時間後に遅い発現ピークを示した。Mendis, C.、Das, R.、Hammamieh, R.、Royaee, A.、Yang, D.、Peel, S.&Jett, M. 2005. ブドウ球菌エンテロトキシンBに対するヒトリンパ球の転写応答シグニチャー(Transcriptional response signature of human lymphoid cells to staphylococcal enterotoxin B). Genes Immun., 6(2): 84-94. も参照。
【００２４】
従って、これらのポリペプチドおよび他のAPCポリペプチドは、抗原接触を示すタンパク質マーカーを提供する。一局面において、これらのポリペプチドマーカーを単離して、抗体を形成するために使用する。抗APCマーカー抗体は、抗原曝露が疑われる患者から得られる細胞におけるAPCマーカーポリペプチドの発現を検出するために使用することができるアッセイに有用である。一態様において、抗APCマーカー抗体は、蛍光標示式細胞分取(FACS)、蛍光共鳴放出断層撮影(FRET)、ラジオイムノアッセイ(RIA)および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの免疫学的検出方法を使用するアッセイに使用される。他の免疫学的検出アッセイは当業者に公知であり、本明細書に記載する検出方法に好適である。
【００２５】
従って、抗原付加に応答したAPCの変化を使用して前駆症状(病気ではない)状態の人についてアッセイすることができ、疾病の進行または疾病を治療する際の治療法の有効性をモニターすることができる。例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による外毒素の分泌に対する抗生物質リネゾリド（linezolid）の影響を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動とマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法およびウェスタンブロット分析を組み合わせたものによって分析したことを記載している、Bernardo, K.、Pakulat, N.、Fleer, S.、Schnaith, A.、Utermohlen, O.、Krut, O.、Muller, S.&Kronke, M. 2004. 阻止濃度以下のリネゾリドは黄色ブドウ球菌の病原性因子発現を低下する(Subinhibitory concentrations of linezolid reduce Staphylococcus aureus virulence factor expression). Antimicrob. Agents Chemother., 48(2): 546-444参照。同様に、抗原投与に応答したAPCの変化は、生物因子に曝露した人をアッセイするために使用することができ、高リスク曝露個体の早期診断の際に；ならびに症状を発症する早期段階にある人をモニターするために使用することができる。例えば、ウイルスまたは細菌病原体からの抗原付加に応答したAPCの変化はこれらの病原体を迅速に同定し、血漿中への最終的な病原体の出現より数時間または数日早期に判定することができる。関連出願において、本発明は、ワクチンの1つまたは複数の成分とDCの相互作用をアッセイすることによって、ワクチン化の有効性をモニターするために使用することができる。同様に、腫瘍からの抗原付加に応答したAPCの変化は、個人が症状を呈する前に腫瘍の検出を可能にし、それによって早期積極的治療が可能になる。同様に、工業用化学薬品または生物戦争兵器への曝露に応答したAPCの変化は、個人が曝露している可能性のある未知の原因因子の同定を提供し得る。
【００２６】
APCは生体の天然免疫バイオセンサーとして働く。これらの細胞種は全生体組織を循環し、微小環境をサンプリングすることによって生体組織の全てではないにしてもほとんどの調査を担当する。調査を実施する際には、それらは、危険信号、すなわち、有糸分裂活性の増加またはウイルス/細菌感染が認められる組織領域を探し出す(Crawford et al., 2003)。この信号が検出されると、APCは早期転写変化を開始し、細胞表面抗原が発現され、炎症性媒介因子が放出される(Crawford et al., 2003)。これらの細胞の変更は関与部位への他の炎症細胞の動員および細胞対細胞接触の改善に必要とされる。DCなどの抗原提示細胞はパターン認識受容体を有し、種々の病原体に結合し、識別することが可能になる(Chaussabel et al., 2003)。他の受容体には、Toll様受容体、ICAM-1などのICAM、DCSIGN、その他が含まれる。
【００２７】
上記のように、APCは、種々の病原体への曝露に応答して独自の遺伝子シグニチャーを作製する。細菌、カンジダ、インフルエンザまたは異なる寄生虫に感染したDCおよびマクロファージにおける不調和な遺伝子発現をオリゴヌクレオチドアレイを使用して検討したところ、約6800種の遺伝子試料のうち、約1300遺伝子が、抗原への曝露後に発現パターンの大きな変更を示すことを示唆している(Huang et al., The plasticity of dendritic cell responses to pathogens and their components, Science, 294: 2001参照)。例えば、DCは病原体認識受容体としてC型レクチン、例えばDC特異的ICAM-3グラビングノンインテグリン(Grabbing nonintegrin)(SIGN)/CD209を発現し、DCのHIV-1受容体としてならびにヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)および他の病原体の表面グリカンについて同定されている(Appelmelk et al. (2003), J. Immunol., 170:(4)1635-9参照)。Hofer et al., (2001) Immunol. Rev., Jun: 181:5-19およびPuldendran et al., (2001), J. Immunol. Nov.:167(9): 5067-76も参照。これらの受容体およびそれらが相互作用する細胞経路は、DC活性化および応答をモニタリングするための独自のマーカーを提供する。さらに特に、DC応答の変化は測定可能であり、特定の疾病原因因子とDCの相互作用を証拠立てる病原体特異的シグニチャーを提供する。数種のMMP遺伝子は、ホルボールエステル、リポ多糖(LPS)およびブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)などの種々の刺激への曝露後に試験した細胞において転写が活発であることを詳細に記載している、Machein, U. & Conca, W. 1997. ヒト単球細胞における数種のメタロプロテイナーゼ遺伝子の発現(Expression of several matrix metalloproteinase genes in human monocytic cells). Adv. Exp. Med. Biol, 421: 247-251.参照。
【００２８】
有害な環境因子はAPC特異的免疫細胞応答そのものを誘発することができるので、または細胞および組織を破壊し、サイトカインおよび種々の細胞因子に応答して炎症の増加、血管外遊走およびAPCの活性化を生じるので、有害な環境因子も本明細書に記載する方法によって検出可能である。ヒトAPCのこれらの特性により、任意の病原性因子、例えば、感染性病原体、腫瘍、毒素もしくは毒性工業用化学薬品(TIC)または大量破壊兵器(WMD)への曝露を迅速に検出するのに好適となる。
【００２９】
記載されているAPC、好ましくは単球、および最も好ましくはDCは、感染性疾患および癌などの疾病に特に応答して被験体の生理の変化を検出するのに有用である。本明細書において使用する抗原という用語は、健康な哺乳動物には一般に外来性である、または哺乳動物にとって天然であるが、病的状態の哺乳動物において突然変異されている、異常であるもしくは濃度が増加しているのが見られる任意の組成物をいうために広義的に使用される。従って、抗原は、細菌、ウイルス、真菌、原虫などの病原体全体ならびに病原体の1つまたは複数の成分を含み、例えば、細菌抗原はリポ多糖(LPS)、タイコ酸、およびペプチドグリカンを含み、ウイルス抗原はHIVのgp120またはインフルエンザのヘマグルチニンもしくはノイラミニダーゼなどのウイルスコートタンパク質を含み、真菌抗原は細胞壁由来タンパク質マンニン(mannin)を含む。プリオンも抗原性であり、疾病状態に関連する特異的なペプチド配列を示す(正常な細胞性タンパク質PrPC、および異常な疾病起因性タンパク質PrPSc)。抗原はまた、癌胎児性抗原(CEA)および異常にグリコシル化されたムチン(MUC)ならびにbcl-2、サバイビン、ヘプシン等数多くの他の腫瘍特異的抗原およびタンパク質などの腫瘍に関連するタンパク質およびペプチドも含む。従って、抗原または抗原性因子の共通の特徴は、抗原提示タンパク質および共同受容体の上方制御などのAPCの特異的な生化学的変化を生ずる、ならびにAPCの成熟および増殖、組織遊走、ならびに抗原への曝露を示す他の特性を生ずるという点においてAPCに与える影響である。APCの検出可能な増加は、未曝露すなわち健康な哺乳動物におけるAPCのレベルと比較して、APCの数の2倍以上の増加が抗原に曝露した哺乳動物において形成されるまたは活性化されるまたは成熟されるように誘導される増加である。DCおよび他の血液細胞を測定するアッセイ技法は当技術分野において周知であるが、例えば、成熟DC細胞マーカーCD2+およびCD83+または未成熟マーカーCD1a+を使用するFACSに限定されない。
【００３０】
一局面において、本発明は、疾病状態に対する患者の応答をモニタリングするための免疫細胞に基づいた方法を提供する。病原体または腫瘍特異的ゲノムおよびプロテオミクス発現パターンまたはシグニチャーの測定は、疾病状態に対する患者の免疫応答を継続的にモニタリングする改善された方法を提供する。この情報を、癌患者の腫瘤もしくは全身腫瘍組織量の低下、またはHIV感染患者のウイルス量の低下、または結核患者における放線菌の除去などの他の関連する医学的情報と併用して使用して、例えば、化学療法、抗ウイルス療法または抗生物質の投与に対して応答する治療効果のモニタリングを可能にする。
【００３１】
従って、APCは、細胞代謝の変化に基づいて、抗原を同定し、個人の健康状態をモニタリングするための有用な診断ツールを提供する。測定可能な変化は数多くの遺伝子、タンパク質およびサイトカインなどの分泌因子の発現において生じ、抗原はまた(血小板の細胞質内などの)APCの細胞質においても検出することができる。従って、一局面において、本発明はAPC遺伝子シグニチャーのアレイ、好ましくは、単球またはDCシグニチャーのアレイを提供する。アレイは、オリゴヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドまたは複数のAPCマーカー遺伝子およびタンパク質のポリペプチド、すなわち、抗原提示細胞において識別的に発現される遺伝子またはタンパク質産物を含む。さらに好ましくは、アレイは、マトリックスの個別のアドレスに約500〜1000種の特異的マーカーを含む。よりさらに好ましくは、アレイは、アレイ上に示される約5,000、約10,000、約20,000種以上の遺伝子または遺伝子産物を含む。最も好ましくは、アレイはゲノムワイドアレイ、例えば、成熟DC cDNAアレイである。AffymetrixおよびIllumina(両システムは相補的である)アレイは例示的である。個々の遺伝子または遺伝子産物は、例えば、対照としてまたは遺伝子発現の定量分析のためにアレイ上で2つ組にしてもよい。このようなアレイの製造および用途は米国特許第6,741,344号、同第6,733,977号および同第6,733,964号に記載されている。基板の選択された領域またはアドレスに、例えばオリゴヌクレオチドのアレイの合成のために材料を選択的に基板に適用するための方法および装置は、さらに米国特許第6,667,394号に記載されている。作製される遺伝子アレイは病原体に対する宿主反応を非常に詳細に代表しており(典型的には52,000遺伝子以上)、例えば、Q-PCRによる同定の場合のように、1つまたは数個の遺伝子の同定(本質的に偏りが生じる)に依存しない。プロテオミクスデータは種々の技法によって形成することができるが、例えば、表面プラスモン共鳴または質量分析法(MALDIまたはSELDI等)の使用に限定されない。DC遺伝子アレイなどのハイスループットスクリーン様式においてゲノムおよびプロテオミクス方法を使用して得られる情報の組み合わせは例外的に特異的な診断データを提供し、従って抗原同定または患者モニタリングの強力なツールを提供する。
【００３２】
種々の目的のためにAPCに基づいた診断アレイを形成するためであるが、一般にAPC、特にDCが異なる抗原への曝露の結果どのように反応するかについてのデータセットを得るために、数多くの種類のアレイが作製される。特定のアレイの使用は化学的組成に依存し、アレイが核酸、ペプチド、その両方、またはレクチン等などの他の化学的部分を有するかどうかに依存して変わる。一般的な例示として、Affymetrix社製のGeneChip(登録商標)などのアレイは、細胞抽出物から作製されるビオチン標識cRNAを使用する。約5マイクログラムの総RNAが適当な出発材料である。RNA試料から作製されるcRNAをアレイに曝露して、適当な標的にハイブリダイゼーションさせる。次いで、アレイを洗浄し、例えば、ストレプトアビジンフィコエリスリンで染色し、次いでAffymetrix社製のGeneChip(登録商標)スキャナー3000またはAgilent GeneArray(登録商標)スキャナーを使用して可視化する。この技法、ならびに公知の免疫学的方法ならびにプロテオミクスおよびゲノムアレイを使用する他の一般的な方法は、一般に当業者に理解されている。
【００３３】
アレイは、病原体および病原性因子の検出および同定ならびに被験体由来の試料を使用する形質転換細胞および組織の検出および同定を提供する。患者の疾病状態についての情報、すなわち、患者データセットは、最初に被験体から血液試料を入手し、次いでその血液試料からDCを単離することによって、記載されているAPCアレイの1つまたは複数を使用して得られる。例えば、記載されているハイブリダイゼーションアレイを使用して、患者のDCシグニチャーを1つまたは複数の対照DCシグニチャーと比較する。アレイ上の対照シグニチャーは、1つまたは複数の疾病状態について正常または健康DCシグニチャーおよび異常または病的DCシグニチャーの両方を最低限示す。種々の他の態様は、種々の疾病状態の病期、例えば、癌の病期の参照シグニチャーを提供する追加の対照DCシグニチャーを含む。そこで得られるアレイおよびデータセットは、例えば、遺伝子病もしくは染色体異常の存在を発見もしくは診断するのに、または疾病もしくは状態に対する素因を診断するアイデンティティー、遺伝もしくは適合性に関する情報を提供するために、病原性微生物による感染を診断するのに、細胞もしくは組織の腫瘍性形質転換を発見もしくは診断するのに、生物兵器もしくは化学兵器試料または毒性の工業用化学薬品への曝露および同定を判定するのに有用である。
【００３４】
一局面において、特定の病原体の有無ならびにそれらが関係する疾病状態の進行中の免疫学的結果を同定するために設計されたAPCアレイが開発されている。例えば、HIVなどのウイルス感染を検出し、モニタリングするアレイが作製される。アレイは、未成熟またはナイーブAPC由来、HIVに曝露したが無症候性の人から得られるAPC由来、HIV曝露があり早期症状の人から得られるAPCおよび後期症状の人のAPC由来のコンセンサスAPCシグニチャーを含む。同様のウイルスアレイ、例えば、肝炎、腫瘍性ウイルスまたは他の慢性もしくは病原性ウイルス感染を診断し、モニタリングするのに有用なものが開発される。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターをモニターするために使用することができる診断用アレイ、例えば、ワクシニアまたはポックスウイルスに対するもの、さらに特には、野生型ベクターとは異なるDCシグニチャーを産生するはずである、形質転換ベクターに特異的なものも好ましい。さらに別の局面において、アレイはヒトAPC、特にCDC優先リストの病原体に曝露させたDCおよびマクロファージ細胞を含む。そのような種類のアレイは、曝露した個体または曝露の可能性のある個体の迅速な緊急診断、病因研究、応答および治療を促進にする。1つの態様において、アレイは、ヒトAPC、特に細菌性の病原体に曝露したTH1およびTH2細胞、B細胞、好中球、DC、ならびにマクロファージ細胞を含む。生物兵器病原体に特異的なDCアレイはテロリストまたは敵の生物兵器攻撃の迅速な検出および応答を提供するので、本土防衛または軍事利用に特異的なアレイも本明細書に提供される。このようなアレイは、天然痘アレイ、炭疽菌アレイ、ボツリヌス菌アレイ、および他のWMD病原体を含む。例えば、毒性病原因子に曝露したヒトAPC、特にDCおよびマクロファージ細胞は、曝露した個体または曝露した可能性のある個体の緊急診断、応答および治療を促進にする。別の態様において、そこから得られるアレイおよび患者データセットは曝露した個体の法医学または毒性学的研究を促進する。
【００３５】
別の局面において、アレイは、ヒトAPC、特に異なる病期の腫瘍増殖を含む異なる腫瘍を有する患者のDCおよびマクロファージから得られる。APCアレイは、特定の腫瘍抗原マーカーの有無および患者の癌の進行中に患者の腫瘍の免疫学的な結果を同定するように設計される。この種のアレイは、罹患個人の迅速な診断、腫瘍同定および適当な治療を促進する。以下の癌種は各々特異的なAPC応答を生じ、記載されている技法を使用する検出の可能性がある：急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児；急性骨髄性白血病、成人；急性骨髄性白血病、小児；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；星状細胞腫、小児小脳；星状細胞腫、小児大脳；胆管癌、肝外；膀胱癌；膀胱癌、小児；骨癌、骨肉腫/悪性線維性組織球腫；脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児；脳腫瘍、大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；脳腫瘍、上衣細胞腫、小児；脳腫瘍、髄芽腫、小児；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；脳腫瘍、視経路および視床下部グリオーマ、小児；脳腫瘍、小児(他)；乳癌；乳癌および妊娠；乳癌、小児；乳癌、男性；気管支腺腫/カルチノイド、小児；カルチノイド腫瘍、小児；カルチノイド腫瘍、胃腸；癌、副腎皮質；癌、膵島細胞；原発部位不明の癌；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星状細胞腫、小児；大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病細胞；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；結腸癌；結腸直腸癌、小児；皮膚T 細胞性リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫、小児；上皮癌、卵巣；食道癌；食道癌、小児；ユーイング腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃(Gastric)（胃(Stomach)）癌；胃(Gastric)（胃(Stomach)）癌、小児；胃腸カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、頭蓋外、小児；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；グリオーマ、小児脳幹；グリオーマ、小児視経路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞(肝臓)癌、成人(原発性)；肝細胞(肝臓)癌、小児(原発性)；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児；ホジキンリンパ腫、妊娠中；下咽頭癌；視床下部および視経路グリオーマ、小児；眼内黒色腫；膵島細胞癌(内分泌膵臓)；カポジ肉腫；腎臓癌；喉頭癌；喉頭癌、小児；白血病、急性リンパ芽球性、成人；白血病、急性リンパ芽球性、小児；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児；白血病、慢性リンパ性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔癌；肝臓癌、成人(原発性)；肝臓癌、小児(原発性)；肺癌、非小細胞、肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児急性；リンパ性白血病、慢性；リンパ腫、AIDS関連；リンパ腫、中枢神経系(原発性)；リンパ腫、皮膚T細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン、小児；リンパ腫、ホジキン妊娠中；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児；非ホジキン妊娠中；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児；髄芽腫、小児；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞癌；中皮腫、悪性；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；多発性内分泌腫瘍症候群、小児；多発性骨髄腫/形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成/骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；黒色腫、多発性；骨髄増殖症候群、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；鼻咽頭癌；鼻咽頭癌、小児；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児；非ホジキンリンパ腫、妊娠中；非小細胞肺癌；口腔癌、小児；口腔および口唇癌；口腔咽頭癌；骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌、小児；卵巣上皮癌；卵巣性胚細胞腫瘍；低悪性度卵巣腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、小児；膵臓癌、島細胞；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；下垂体腫瘍；形質細胞新生物/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝臓癌、成人；原発性肝臓癌、小児；前立腺癌；直腸癌；腎細胞(腎臓)癌；腎細胞癌、小児；腎盂および尿管、移行上皮癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺癌；唾液腺癌、小児；肉腫、ユーイング腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫(骨肉腫)/骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児；肉腫、軟部組織、成人；肉腫、軟部組織、小児；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌、小児；皮膚癌(黒色腫)；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫、成人；軟部組織肉腫、小児；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌、小児；テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；T細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；胸腺腫、小児；胸腺腫および胸腺癌甲状腺癌；甲状腺癌、小児；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍、妊娠中；原発部位不明、成人の癌；原発部位不明、小児の癌；小児のまれな癌；尿道および腎盂、移行上皮癌；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；視経路および視床下部グリオーマ、小児；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；およびウィルムス腫瘍。
【００３６】
乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、グリオーマ、黒色腫、小細胞および大細胞癌、白血病ならびに他の腫瘍性および前癌疾病状態などの種々の癌の検出およびモニタリングを提供するアレイが作製される。異常にグリコシル化されたMUC-1またはCEAもしくはヘプシンなどのマーカーは、上記の腫瘍のほとんどに関連することが公知の共通の腫瘍マーカーの例である。腫瘍特異的マーカーを含む総合的なリストは医学文献において公知である。例示的なアレイには、未成熟またはナイーブAPC由来および病期0、1、2、3または4に段階分けされた腫瘍が認められる患者から得られるAPC由来のコンセンサスAPCシグニチャーが含まれる。組織学的プロファイルおよび他の医学的データをAPCアレイと関連して使用して、疾病状態についての追加の情報を提供することができる。癌に対するAPC応答の柔軟性および特異性により癌種を特異性高く同定し、疾病の病期を判定することが可能になる。従って、それらにより、医療従事者は、例えば、化学療法中にAPCシグニチャーの変化をモニタリングすることによって治療法の経過をモニタリングすることも可能になる。例えば、膵臓癌患者にゲムシタビンを提供し、ゲムシタビン治療コースの前または最中にDCを患者から抽出して、膵臓癌DCアレイと共に使用する。アレイは治療開始時には膵臓癌は段階3であることを示し、1ヶ月のゲムシタビン治療により癌は段階2の病期に戻ったことを示し、それによって患者のゲムシタビン治療の継続を示す。
【００３７】
さらに別の態様において、遺伝子疾患が認められる個人からAPCアレイを作製する。代表的な遺伝子疾患には、例えば、遺伝子の存在、疾病状態を生じるもしくは疾病状態に寄与する生理活性分子である遺伝子の発現産物、または健康な個人における遺伝子の発現産物が疾病状態を改善もしくは予防する生理活性分子である遺伝子の欠損によって生じる疾病状態が含まれる。前者の例は嚢胞性線維症であり、疾病状態はCFTRタンパク質の突然変異によって生じる。後者の例はPKUであり、疾病状態は、フェニルアラニンの代謝を可能にする酵素の欠損によって生じる。本発明のアッセイおよび方法を用いるスクリーニングに適当な遺伝子疾患の例には、例えば、多発性硬化症、内分泌疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、狼瘡、アンジェルマン症候群、シャルコー・マリー・ツース病、てんかん、本態性振せん、脆弱性X症候群、フリードライヒ失調症、ハンチントン病、ニーマン-ピック病、パーキンソン病、プラダー-ウィリ症候群、レット症候群、脊髄小脳萎縮、ウィリアム症候群、エリス-ファン-クレフェルト症候群、マルファン症候群、筋強直性ジストロフィー、大脳白質萎縮症、アテローム性動脈硬化症、ベスト病、ゴーシェ病、グルコースガラクトース吸収不良、脳回転状萎縮、若年型糖尿病、肥満、発作性夜間血色素尿症、フェニルケトン尿症、レフサム病およびタンジアー病が含まれる。このようなアレイは患者の遺伝子疾患を検出し、治療中に遺伝子疾患患者をモニタリングする際に有用である。同様に、本発明のアッセイは、特に健康な遺伝子産物の出現についてまたは遺伝子治療ベクターに対する有害反応について、このように治療されている患者の免疫状態をモニタリングすることによって、遺伝子治療の経過をモニタリングする。
【００３８】
上記の考察は試料中の生物学的変化を測定するための診断にAPCを使用することに焦点を絞っているが、別の態様において、血液、痰、尿、唾液、粘液、脳脊髄液、リンパ液等などの被験体の体液の直接分析をアッセイに供することができる。これらの試料は種々の医学的技法、例えば、脳脊髄液中の感染を探すための腰椎穿刺またはプロテオミクスツールなどの実験技法、例えば、質量分析法を使用して分析され、一般に公知で、以下にも記載されている。従って、本発明のアッセイは、よりさらに高機能の検出およびモニタリング方法を提供する被験体の生体液の直接分析と併せて、変化についてAPCをモニタリングすることに関係し得る。
【００３９】
従って、APCは、特定の状態においてDCによって代表される特異的なゲノムおよびプロテオミクスシグニチャーに基づいて、生物の生物学的変化をモニタリングする特異性が高く、迅速な手段を提供する。上記の考察は、ハイブリダイゼーションまたは免疫学的反応性としてこのような一般的な技法を使用するアッセイにAPCを使用することに中心を置いている。他のプロテオミクスツールは、APC状態の変化を測定する際に適当である。DCプロテオミクスシグニチャーを得る特に好ましい方法は、APC試料の質量スペクトルを得ることに関係する。
【００４０】
ここ10年で、質量分析法(MS)は、生物高分子の分析における重要な分析ツールとなっている。質量分析法は、真空下において分子をイオン化し、蒸発によってそれらを「飛行させる」ことによって個々の分子の「重量を測る」手段を提供する。電場と磁場の組み合わせの影響下において、イオンは、個々の質量(m)および荷電(z)に応じて軌道を描く。MSを実施するためには、検討中の試料を、エネルギー注入によって表面からエネルギー脱離/イオン化(EDI)に供する。典型的には、EDIは熱脱離/イオン化(TDI)、プラズマ脱離/イオン化(PDI)および高速原子衝撃(FAB)、電子衝撃等などの種々の種類の照射脱離/イオン化(IDI)である。試料をイオン化するためにレーザーを使用する場合には、方法は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)などのレーザー脱離/イオン化(LDI)と呼ばれる。脱離は、好ましくは、表面増強レーザー脱離/イオン化(SELDI)などのイオン化表面において種々のヘルパー物質または官能基と共にMS分析物を提示することによって支援することができる。
【００４１】
低分子量分子については、質量分析法は、長い間、親分子イオンの質量を求めることによって有機分子を分析し、特徴づけるための通常の物理-有機レパートリーの一部であった。いわゆる「ソフトイオン化」方法、すなわちMALDIおよびエレクトロスプレーイオン化(ESI)の導入により、高分子、すなわち、ペプチドおよびタンパク質などの質量が300 kDaを超える高分子の無傷(intact)イオン化、検出および正確な質量測定が可能になった(Fenn, J. B., et al., (1989) Science 246, 64-71; Karas M. & Hillenkamp F. (1988) Anal. Chem. 60, 2299-3001参照)。また、イオン化した親分子と他の粒子(例えば、アルゴン原子)との衝突をアレンジすることによって、イオン化した親分子をフラグメント化し、衝突誘起解離(CID)によって二次イオンを形成する。フラグメント化パターン/経路により、より詳細な情報、例えば、分子の構造情報が誘導されうることが非常に多い。
【００４２】
MALDI-MSおよびESI-MSは、核酸およびタンパク質を分析するために使用されている(Nordhoff E., et al., (1997) Mass Spectrom. Rev. 15: 67-138参照)。しかし、核酸は極性が強い生体分子であり、揮発が困難であるので、明瞭で正確な分解能には質量の上限があった。ESIは、MDa質量範囲の大型核酸の無傷の脱離がMALDIより優れていると思われる(Fuerstenau S. D. & Benner W. H. (1995). Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 1528-38; Chen R., Cheng X., Mitchell et al., (1995). Anal. Chem. 67, 1159-1163)。
【００４３】
紫外線(UV)のレーザーを用いる大型DNA分子のMALDI-MSの報告が数報報告されている(Ross P. L. & P. Belgrader (1997) Anal. Chem. 69: 3966-3972; Tang K., et al., (1994) Rapid Commun. Mass Spectrum. 8: 727-730; Bai J., et al., (1995) Rapid Commun. Mass Spectrum. 9: 1172-1176; Liu Y-H-, et al., (1995) Anal. Chem. 67: 3482-3490 and Siegert C. W., et al., (1997) Anal. Biochem. 243, 55-65。しかし、これらの報告に基づいて考えると、質量が30 kDaを超える核酸のUV-MALDI-MSによる分析は、現在の約90 kDaの質量の上限では困難さが増すことが明らかである(Ross P. L. & P. Belgrader (1997) Anal. Chem. 69: 3966-3972)。DNA UV-MALDIスペクトルの質の低下は、リン酸骨格のイオンフラグメント化および多数の塩形成の組み合わせに原因があった。RNAは、UV-MALDI条件下ではDNAより安定性がかなり高いので、RNAの利用可能な質量範囲は最高約150 kDaである(Kirpekar F., et al., (1994). Nucleic Acids Res. 22, 3866-3870)。
【００４４】
固体マトリックス(ほとんどコハク酸で、わずかな程度で、尿素およびニコチン酸)を用いるIR-MALDIによる核酸の分析が記載されている(Nordhoff, E. et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771-776; Nordhoff, E. et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21 : 3347-3357; and Nordhoff, E. et al., (1995) J. Mass Spec. 30: 99-112)。1992年のNordhoffらの論文は、20merのDNAおよび80merのRNAが分解能のほぼ上限であることを報告している。しかし、1993年のNordhoffらの論文は、26merのDNAおよび104merのtRNAの別個のスペクトルを提供している。1995年のNordhoffらの論文は、コハク酸を用いるIR-MALDIより、3-ヒドロキシピコリン酸固体マトリックスを用いるUV-MALDIによって40merの分析の実質的な良好なスペクトルが得られることを示す(図1(d)および1(e)参照)。実際、1995年の報告は、IR-MALDIにより実質的な程度の迅速なフラグメント化が得られたことを報告している。
【００４５】
時間飛行型(TOF)質量分析計では、イオンの質量対荷電比m/zは飛行時間から求めることができる。質量分析法では測定されるものは常に質量対荷電比m/zであり、mは質量であり、zはイオンが保有する基本的な荷電の数であるが、以下では、簡単にするために、質量mおよびその測定だけに言及する。MALDIなどの多数の種類のイオン化は主に単一荷電イオン(z=1)だけを供給するので、これらの種類のイオン化の差は実際には消滅する。イオンセレクターおよび速度集束リフレクターを備えている時間飛行型質量分析計(TOF-MOS)では、飛行時間に基づいてイオンセレクターによって選択される親イオンの娘イオンまたはフラグメントイオンスペクトルを測定することが可能である。親イオンの娘またはフラグメントイオンへの分解は、イオン化中に過剰エネルギーを導入することによって(いわゆる、PSD「ポストソース分解（post source decay）」スペクトル)または衝突誘起フラグメント化などの他の方法を適用することによって誘導することができる。分解によって生じた親イオンおよび娘イオンは、異なるエネルギーによってリフレクター内に質量に応じて分散するように、同じ平均速度であるが、異なる質量比例比で同時にリフレクターに入る。
【００４６】
従って、質量分析ならびに例えば、赤外および紫外線吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルの検出を可能にする他のツールならびに生体分子相互作用分析(例えば、ELISAまたは表面プラスモン共鳴(SPR)プロファイル、Nedlekov et al., (2003) Appl. Env. Microbiol.参照)および試料の物理特性を測定するための他の技法も試料を分析するための方法を提供する。従来の実験方法に関連して上記のAPCを使用する方法から得られる情報は、検討中の各試料の異なる特性を解像することができる統合的アプローチを提供する。例えば、2つの試料のMSプロファイルが類似性の高いパターンを示す場合には、IRスペクトル、NMRスペクトルまたはSPRなどの第2の分析を使用して追加の比較シグニチャーおよび情報を提供する。結果は、試料(単独または混合状態)の独立した同定を提供する、ならびにある態様において、濃度などの試料の定量的情報および試料混合物中の他の薬剤または物質の同定などの定性的情報も提供することができる各試料または分析中の試料に特異的な分析シグニチャープロファイルである。
【００４７】
好ましい方法は、健康状態および抗原付加に応答したAPCのプロテオミクスシグニチャーを得るために質量分析を使用する。質量分析はまた、抗原または他の汚染物質を含有することが疑われる混合物に直接使用することができる。これらのシグニチャーを得るための最も好ましい分析方法には、Ciphergen社製の ProteinChip(登録商標) System Series 4000などのSELDIまたはPerkin Elmer社製のprOTOF(商標)2000 MALDI O-TOF質量分析計などのMALDIをMSに接続する直交プラットホームに基づいたMALDI O-TOFが含まれる。
【００４８】
一局面において、APC、好ましくは、DCのプロテオミクスシグニチャーは、アメリカ国立アレルギー感染病研究所生物兵器防衛優先病原体リスト(National Institute for Allergy and Infectious Diseases Biodefense Priority Pathogens List)の毒素および生物の負荷後に得られる。以下に記載するように、DCを抗原またはそのフラグメントと培養する。プロテオミクスシグニチャーを得る。これらの関連抗原には、炭疽菌(Bacillus anthracis)(炭疽菌)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、エルシニア・ぺスティス(Yersinia pestis)、 バリオラ・メジャー(Variola major) (天然痘)および他のポックスウイルス、 野兎病菌(Francisella tularensis)(野兎病)、およびウイルス性出血熱を生じるもの、 LCM、フニンウイルス(Junin virus)、マクポウイルス(Machupo virus)、 グアナリトウイルス(Guanarito virus)およびラッサ熱を生じるものなどのアレナウイルス(Arenavirus)、リフトバレー熱を生じるものなどのブンヤウイルス(Bunyavirus)およびハンタウイルス(Hantavirus)、カリシウイルス(Calicivirus)、 A型、B型およびC型肝炎、 西ナイルウイルス(West Nile Virus)、ラクロス(LaCrosse)、カリフォルニア脳炎(California encephalitis)、 VEE、 EEE、 WEE、 日本脳炎ウイルス(Japanese Encephalitis Virus)などのウイルス性脳炎、キャサヌール森林病ウイルス(Kyasanur Forest Virus)、 ダニ媒介性出血熱ウイルス(Tickborne hemorrhagic fever virus)、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス(Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(Tickborne encephalitis viruses)、黄熱病(Yellow fever)、多剤耐性TB、インフルエンザ、他のリケッチアおよび狂犬病、フラウイルス(Flavirus)、デング熱(Dengue)、フィロウイルス(Filovirus)、エボラ(Ebola)、マーブルグ類鼻疽菌(Marburg Burkholderia pseudomallei)、コクシエラ・ブルネッティ(Coxiella burnetii)(Q熱)、ブルセラ種(Brucella species)(ブルセラ症)、鼻疽菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、リシン毒素(トウゴマ(Ricinus communis)由来)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)のε毒素、スタヒロコッカス・エンテロトキシンB(Staphylococcus enterotoxin B)、発疹チフス(Typhus fever)(発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii))、 食品および水媒介性病原体、下痢原性大腸菌(Diarrheagenic E.coli)、病原性ビブリオ(Pathogenic Vibrios)、赤痢菌種(Shigella species)、サルモネラ(Salmonella)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)などの細菌およびクリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)、シクロスポラ・カヤタネンシス(Cyclospora cayatanensis)、ジアルジア・ランブリア(Giardia lamblia)、エンタモエバ・ヒストリチカ(Entamoeba histolytica)、トキソプラズマ(Toxoplasma)、微胞子虫(Microsporidia)などの原虫が含まれる。これらの生体試料は、リポ多糖含量、糖タンパク質含量、膜組成、ウイルスエンベロープの有無、病原性因子などの特定のタンパク質の発現および他の生化学プロファイルなどの基準に基づいて、検出および同定を可能にする。例えば、Dell A, Morris HR, 質量分析法による糖タンパク質構造決定(Glycoprotein structure determination by mass spectrometry). Science. 2001; 291(5512):2351-6参照。また、Rudd P.M.ら、正常および病的プリオンタンパク質アイソフォームのグリコシル化の差(Glycosylation differences between the normal and pathogenic prion protein isoforms). Proc Natl Acad Sci U S A. 1999, 96(23): 13044-9も参照。また、Beermanら、B.ブルドルフェリ(B. burdorferi)のリポタンパク質の脂質成分：構造分析、抗原性およびヒト樹状細胞による提示(The lipid component of lipoproteins from B. burdorferi: structural analysis, antigenicity, and presentation by human dendritic cells), Biochem. Biophys. Res. Comm., 267: 897-905 (2000)も参照。分析シグニチャーは、アメリカ国立アレルギー感染病研究所生物兵器防衛優先病原体リスト(National Institute for Allergy and Infectious Diseases Biodefense Priority Pathogens List)の1つまたは複数の毒素および生物に曝露した(または曝露が疑われる)被験体の細胞、体液および組織の試料から得られる。DCおよび体液または組織のシグニチャーを参照シグニチャーと比較して、曝露を確認し、治療のモニタリングの助けとする。例えば、天然痘に曝露したことが疑われる被験体から血液試料を得る。試料を2つに分割する；一方からDCを回収し、他方から血漿を精製する。両方の試料を質量分析に供する。曝露したおよびナイーブDCの陽性および陰性対照を提供する参照シグニチャーとDCシグニチャーを比較し、痘瘡ウイルスの存在について血漿をアッセイする。患者がウイルス血症または有症になる前にシグニチャーは感染を確認することができ、検疫を促進することができる。
【００４９】
SELDIまたはMALDI O-TOF質量分析計シグニチャーは、微生物試料の核酸、タンパク質、炭水化物および脂質をプロファイリングすることができるが、好ましくは、病原体全体のシグニチャーをプロファイリングし、得ることができる。シグニチャーは、微生物種および種の変種、例えば、大腸菌O157、微生物増殖期、例えば、胞子形成、栄養または活発増殖期および相対年代ならびに病原性、例えば、A群連鎖球菌の化膿性外毒素A産生、コレラ菌(Vibrio choleae)のコレラ毒素、志賀毒素産生性大腸菌(STEC)または腸管出血性株(EHEC)の大腸菌におけるエンテロトキシン産生などの他の特徴を識別する。例えば、Laiらは、67株のカルノバクテリウム属(Carnobacterium)、非定型ラクトバチルス(Lactobacillus)、エンテロコッカス・デュランス(Enterococcus durans)、ラクトバチルス・マルタロミカス(Lactobacillus maltaromicus)およびバガコッカス・サルモニナルム(Vagacoccus salmoninarum)をフーリエ変換赤外(FT-IR)分光法によって調査したことを考察している。6ヶ月の期間にわたる培養齢および再現性の影響も検討した。結果を多変量解析によって分析し、以前に実施された数量表現検討、熱分解質量分析(PyMS)検討の結果およびDNA-DNAおよび16S rRNA配列相同性を使用した検討と比較した。FT-IRデータとこれらの検討の分類学的関連が観察された。培養齢は、得られるスペクトルにほとんど影響しないことが観察された。再現性検討は、6ヶ月の期間に2回作製されたスペクトル間に関連があることを示した。FTIRはカルノバクテリウム属(Carnobacterial)の分類を検討するための信頼できる方法であり、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)の同定に使用するための迅速な方法としてさらなる可能性を有するとLaiらは結論づけた。Lai, S., R. Goodacre, et al. (2004). 「フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)を使用するカルノバクテリウム属(Carnobacterium) の生物全体フィンガープリント法(Whole-organism fingerprinting of the genus Carnobacterium using Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR).)」 Syst Appl Microbiol 27(2): 186-91参照。同様に、Leeらは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法による検出を用いるフローフィールドフローフラクショネーション(フロー(flow) FFF)分離技法を併せた細菌分析方法を考察している。フローFFFに使用する担体液体の組成は、細菌細胞の保持およびMALDI方法との適合性に基づいて選択される。フローFFFとMALDI-TOF MSとの組み合わせはP. プチダ(P. putida)および大腸菌(E. coli)について実証されている。FFFによる分離により全細胞分画を回収し、さらにMALDI-MSによって分析した。異なる時間間隔において回収された各分画は、細菌の異なるサイズおよび異なる増殖期に対応した。Lee, H., S. K. Williams, et al. (2003). 「フローフィールドフローフラクショネーションおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法による全細菌細胞の分析(Analysis of whole bacterial cells by flow field-flow fractionation and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.)」 Anal Chem 75(11): 2746-52参照。同様に、Lefmannらは、放線菌の同定に使用されるPCR増幅し、インビトロ転写した16S rRNA遺伝子(rDNA)の塩基特異的切断後のMALDI-TOF MSを考察している。臨床検体から頻繁に単離されること12種の標準株のマイコバクテリウム種(Mycobacterium spp.)の全長の16S rDNA参照配列をPCR、クローニングおよび配列決定によって決定した。MALDI-TOF MSに基づいた比較配列分析については、12種の標準株および24種の臨床単離株の放線菌16S rDNAシグニチャー配列(約500 bp)を、RNAプロモータータグ付き順方向プライマーを使用してPCR増幅した。5-メチルリボ-CTPの存在下における順方向鎖のT7 RNAポリメラーゼ媒介性転写は、塩基特異的切断によって作製されるフラグメントの質量差を最大にした。その後、インビトロ転写物をRNase T1で処理して、G特異的切断を生じた。MALDI-TOF MSによる試料分析は、12種の標準株の各々の特異的な質量信号パターンを示し、疑う余地のない同定を可能にした。検出された質量信号パターンをその標準株の参照配列由来コンピュータパターンおよび報告されている16S rDNA配列のコンピュータ質量パターンと比較することによって、24種全ての臨床単離株を明白に同定した。マイコバクテリウム・キセノピ(Mycobacterium xenopi)標準株(DSM 43995)の16S rDNA微小不均一性をMALDI-TOF MSによって検出し、その後サンガージデオキシ配列決定によって確認した。RNA転写物の塩基特異的切断後のMSによる16S rDNAアンプリコンの分析は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)群および遍在性(ubiquitous)放線菌(ツベルクロシス(tuberculosis)以外の放線菌)の迅速で、信頼性の高い同定を可能にすることをLefmannらは結論づけた。Lefmann, M.ら、放線菌の遺伝子型同定のための新規質量分析に基づいたツール(Novel mass spectrometry-based tool for genotypic identification of mycobacteria). J Clin Microbiol 42(1): 339-46 (2004)参照。従って、本発明の一目的は、細菌病原体のプロテオミクス、ゲノム、脂質、炭水化物および全生物シグニチャーを得る段階を含む。好ましくは、これらは、SELDIまたはMALDI O-TOF質量分析法を単独または他のアッセイと併用して使用して得られる。微生物の同定は細菌に限定されず、従って、他の病原性生物の分析シグニチャーには、真菌、ウイルス、プリオンならびに他の感染性菌および病原体のものが含まれる。
【００５０】
APCから誘導されるプロテオミクスシグニチャーおよび患者の体液の病原体の直接評価によって得られるものは記載の疾病の診断に使用されるが、例えば、テルビナフィン、フルコニゾール(fluconizole)、ラミブジン、シプロフロキサシン、バンコマイシン、ペニシリン、メチシリンおよび他の抗生物質などの抗菌化合物に応答する治療経過のモニタリングに特に有用である。抗菌化合物で治療的に治療された被験体の組織、体液および細胞のシグニチャーはまたこのような治療中の毒性についても分析することができる。ウイルス試料の検出は、例えば、ラミブジンの長期治療中に生じるラミブジン耐性を可能にするB型肝炎ウイルス(HBV)の突然変異をアッセイしたHongらに記載されている。ラミブジンによる治療は、HBV DNAポリメラーゼのYMDDモチーフにアミノ酸置換を有するHBVビリオンの選択を生じることが多い。MALDI-TOF MS遺伝子型分けは、感度よくかつ特異的にHBV変種を検出する。Hongらのアッセイは、YMDDモチーフの突然変異部位を含有するオリゴヌクレオチドのPCR増幅および質量測定に基づいている。そこに記載されているMALDI-TOF MSに基づいた遺伝子型分けは、血清1ミリリットルあたり100コピー程度の少ないHBVゲノムを検出するのに十分に感度が高く、野生型および変種ウイルスの混合物を測定するのにすぐれた特異性を有する。40人の患者の血清を分析したとき、MALDI-TOF MSに基づいたアッセイは、公知のウイルス変種および以前の方法で検出されなかった追加のウイルス疑似種ならびにそれらの相対存在量を正確に同定した。感度、精度およびハイスループット分析の可能性により、MALDI-TOF MSに基づいたアッセイは、ラミブジンを投与されているHBV感染患者の集団検診に好適になり、疾病の進行および治療への応答をさらに理解する助けとなりうるとHongらは結論づけた。Hongら、オリゴヌクレオチドフラグメントの質量分光分析を使用したB型肝炎ウイルスYMDD変種の検出(Detection of hepatitis B virus YMDD variants using mass spectrometric analysis of oligonucleotide fragments), J Hepatol. (2004)参照。従って、本発明の一目的は、ウイルス病原体のプロテオミクス、ゲノム、脂質、炭水化物および全生物シグニチャーならびにウイルス感染が認められる被験体のDCおよび他の組織、体液および細胞の分析シグニチャーを含む。好ましくは、これらは、SELDIまたはMALDI O-TOF質量分析法を単独または他のアッセイと併用して使用して得られる。
【００５１】
Bonettoらは、細胞(PrP(C))の疾病特異的アイソフォームへの構造遷移の機序およびプリオン疾患の病原性を罹患する基礎としてプリオンタンパク質スクレイピー(PrP(Sc))の構造および生物学的特性の評価を考察している。マウスPrPから誘導される106アミノ酸の構築物(PrP106またはミニプリオンと呼ばれる)は初代ニューロン培養物に毒性が高く、膜微小粘度の顕著な増加を誘導することをBonettoらは観察した。Bonetto V.ら、合成ミニプリオンPrP106(Synthetic miniprion PrP106), J Biol Chem. 277(35):31327-34 (2002)参照。従って、さらに別の局面において、本発明は、プリオン試料のシグニチャーならびにプリオン感染が認められる被験体のAPCおよび組織、体液および細胞のシグニチャーを含む。好ましくは、これらは、SELDIまたはMALDI O-TOF質量分析法を単独または他のアッセイと併用して使用して得られる。
【００５２】
本発明のさらに別の目的は、健康被験体および例えば、心筋、腎臓もしくは神経組織などの種々の病期の身体的退化、ウイルスもしくは細菌などの種々の病期の感染、または種々の病期の形質転換、悪性度もしくは腫瘍形成能(tumorogenicity)によって特徴付けられる罹患被験体、すなわち、APC、体液および組織からシグニチャー、例えばSELDIまたはMALDI O-TOF MSおよび他の分析シグニチャーを得ることである。特に、癌および前悪性組織は全て、非罹患細胞および組織と比較して大きな生化学的変化を受け、スペクトルおよび他の種類の分析方法によって容易に検出することができる。この一例は、多数の異なる癌種の腫瘍関連抗原MUC-1に見られるグリコシル化パターンの変化または癌胎児性(chorioembrionic)抗原(CEA)もしくは網膜芽細胞腫(RB)、p53およびサイクリン依存的キナーゼcdkなどの腫瘍抑制遺伝子の識別的な発現である。細胞形質転換および癌の数多くのマーカーが医学文献において公知であり、これらは全て本発明の目的のための疾病シグニチャーとなりうる。同様に、これらの組織は、化学療法試料および放射線による治療に応答して代謝状態の変化を示す。これらの変化は治療に対する応答の分子的シグニチャーであり、従って、本明細書に記載する目的に有用である。従って、本発明の方法を使用して、例えば、特定の腫瘍種を同定し、病期を判定し、化学療法または放射線などの治療経過の腫瘍の変化をモニタリングすることができる。記載されている方法を使用して、このような化学療法または放射線療法中に生じる健康な器官および組織の変化をモニタリングして、例えば治療クールを調節するために治療の全身毒性を評価することもできる。一態様において、化学療法の毒性プロファイルが提供される。このプロファイルは、未処置状態、すなわち、化学療法剤に曝露していないおよび複数回投与された薬剤に応答した複数の哺乳動物器官および組織の組織特異的分子分析シグニチャーを含む。プロファイルは、時間領域、すなわち、一定の期間にわたる組織の用量応答シグニチャーを含んでもよい。従って、本発明は、疾病の検出および治療に有用な分析シグニチャーを含む。器官の薄い組織切片の分析により、組織試料の特定の領域内のタンパク質組成に直接相関する2〜70 kDaの質量範囲の500種以上の個別のタンパク質信号を生じることをChaurandらは決定した。画像形成MSを含むこのようなプロファイリングは、ヒトグリオーマおよび非小細胞肺癌を含む多数の罹患組織に適用されている。得られた複雑なMSデータセットの調査により、疾病状態および患者予後特異的タンパク質パターンが同定されている。Chaurand Pら、画像化質量分析法を使用する疾病のタンパク質パターンの評価(Assessing protein patterns in disease using imaging mass spectrometry). J Proteome Res. 2004 Mar-Apr;3(2):245-52参照。同様に、Ahmedらは、卵巣癌のバイオマーカーとして有用となりうる、卵巣癌患者の血清中に識別的に発現されるタンパク質を考察している。Ahmedの論文では、合計24種の血清タンパク質がグレード1の卵巣癌患者において識別的に発現され、31種がグレード2において、25種がグレード3において識別的に発現された。全ての群の卵巣癌患者において有意に上方制御されていたタンパク質スポットの6つを、ヒト血清に存在する肝臓糖タンパク質であるハプトグロビン-1前駆体(HAP1)のアイソフォームとしてナノエレクトロスプレー四重極時間飛行型質量分析法(n-ESIQ(q)TOFMS)およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法によって同定した。異なる病理学的グレードのスポットのさらなる同定は、HAP1に含有されるハプトグロビンエピトープに対するモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロット法および免疫組織化学的局在化によって確認した。Ahmed Nら、卵巣癌の新規循環バイオマーカーとしてのハプトグロビン前駆体のプロテオミクスに基づいた同定(Proteomic-based identification of haptoglobin-1 precursor as a novel circulating biomarker of ovarian cancer). Br. J. Cancer 2004参照。同様に、Bhartiらは、癌患者の全体の生存率を改善するために早期病期における血清腫瘍バイオマーカーの検出を考察している。MALDI-TOF質量分析法(MS)に基づいたタンパク質同定技法を使用すると、SCLC特異的過剰発現タンパク質は、ハプトグロビンα-サブユニットであることが同定され、その血清レベルは疾病の病期に相関している。α-ハプトグロビンの平均レベルは、正常の対照と比較してSCLC血清において増加していた。血清HGFも腫瘍バイオマーカーの可能性のあるものとして検討され、疾病状態に関連することが見出された。Anticancer Res. 2004 Mar-Apr;24(2C): 1031-8。いくつかの他の腫瘍種は、本発明の方法を使用する検出に従う。Iwadateらは、グリオーマの検出および化学療法治療に対する応答を考察している。同じ組織学的カテゴリーにおいて異種性の高い生物学的攻撃性によって特徴付けられるグリオーマの生物学的特徴は、タンパク質レベルにおいて全体的な遺伝子発現によって正確に記載されている。2次元ゲル電気泳動およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法に基づいたプロテオーム分析は、高グレードと低グレードグリオーマ組織間のタンパク質発現の差を同定することができることをIwadateらは検討した。プロテオームプロファイリングパターンを85種の組織試料、すなわち：52試料の多形神経膠芽腫、13試料の未分化星状細胞腫、10試料の星状腫および10試料の正常な脳組織において比較した。Iwadateらは、プロテオームプロファイリングパターンに基づいたクラスター分析によって正常な脳組織をグリオーマ組織から完全に識別することができた。プロテオームに基づいたクラスタリングは患者生存率に有意に相関しており、Iwadateらは攻撃性を有する生物学的に別個のサブセットの星状腫を同定することができた。Iwadateらは、判別分析は、組織学的グレード分けに基づいて識別的に発現される37種のタンパク質セットを抽出することを見出した。それらのうち、高グレードグリオーマにおいて増加していたタンパク質の多くは、小型のGタンパク質を含むシグナル伝達タンパク質と分類された。免疫組織学的分析は、グリオーマ組織において同定されたタンパク質の発現を確認した。Iwadate Y, ら、 タンパク質分析に基づいたヒトグリオーマにおける分子的分類および生存率の予測(Molecular classification and survival prediction in human gliomas based on proteome analysis). Cancer Res. 2004 Apr 1;64(7):2496-501参照。Friedmanらは、ヒト直腸結腸癌および隣接する正常な粘膜のプロテオームの腫瘍特異的な変化を検討するために使用される2次元ディファレンスゲル電気泳動解析に質量分析(MS)を組み合わせたものを��察している。Friedmanらは、一対の正常/腫瘍比較の各々において、試料内部標準混合物を用いるDIGE技術を使用して、1500種以上のタンパク質スポット特徴を検討し、多数の試料間の各タンパク質量変化の統計学的に有意な定量的比較を同時に行った。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型およびタンデム(TOF/TOF)MSは、データベースインタロゲーション(interrogation)のための感度が高く、正確な質量スペクトルデータを提供し、コホート間で量が変化していた(タンパク質分解および翻訳後修飾アイソフォームによる重複性を含む)52種の独自のタンパク質を同定した。Friedman DBら、2次元ディファレンスゲル電気泳動および質量分析によるヒト大腸癌のプロテオーム分析(Proteome analysis of human colon cancer by two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry). Proteomics. 2004 Mar;4(3):793-811参照。Hamlerらは、正常および悪性乳癌上皮細胞系統の細胞溶解物のプロテオミクス分析のための、2次元液相分離スキームに質量分析(MS)を組み合わせたものを考察している。液相分離は、第1次元としての等電点電気泳動および第2次元としての非多孔性シリカ逆相高速液体クロマトグラフィー(NPS-RP-HPLC)からなる。タンパク質定量および質量測定は、エレクトロスプレーイオン化時間飛行型MS(ESI-TOF MS)を使用して実施される。タンパク質は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型MSおよびMALDI四重極時間飛行型(QTOF)タンデム質量分析法(MS/MS)を使用するペプチド質量フィンガープリント法によって同定される。Hamlerらは、正常と悪性乳上皮細胞のタンパク質定量差の可視化を可能にする質量マップを作製した。制限されたpH範囲において質量マッピング実験から得られた約110種の独自のタンパク質のうち、40種(36%)はペプチド質量フィンガープリント法によって陽性として同定され、質量マップのバンドに割り付けられた。これらの40種のうち、22種は、悪性細胞系統の1つまたは複数においてより強く発現されていた。これらのタンパク質は、診断、治療または薬物開発の助けになる可能性のある乳癌バイオマーカーとなる。Hamler RLら、乳癌のプロテオミクス研究およびバイオマーカー同定のための、質量分析を組み合わせた2次元液相分離方法 (A two-dimensional liquid-phase separation method coupled with mass spectrometry for proteomic studies of breast cancer and biomarker identification). Proteomics. 2004 Mar;4(3):562-77参照。Veestraらは血清タンパク質フィンガープリント法を考察している。多数のプロテオミクス研究は、血清および組織などの複雑な生物システムを占める数千のタンパク質の同定およびその後の比較分析に焦点を絞っている。Veenstra T.Dら、血清タンパク質フィンガープリント法(Serum protein fingerprinting). Curr Opin MoI Ther. 2003 Dec;5(6):584-93参照。従って、これらのプロテオミクス、炭水化物、核酸および脂質の分光学的プロファイルまたはパターンは、健康な状態および疾病状態の両方において数多くの組織のシグニチャーを提供し、診断的観点から、疾病の存在を示し、疾病を有する生物の変化をモニタリングするために使用することができる。一態様において、血清またはリンパ試料はこのようなシグニチャーを得るために使用される。別の態様において、DCが使用される。他の態様において、APCは分析学的シグニチャーを提供する。さらに他の態様において、血液細胞、筋���組織、神経組織、上皮組織および結合組織を評価する。
【００５３】
本発明の別の目的は、毒性の工業用化学薬品の化学的シグニチャーならびに毒性の工業用化学薬品(TIC)に曝露したまたは曝露したことが疑われる被験体のAPC、組織、体液および細胞の結果として生じるプロテオミクス、ゲノム、脂質および炭水化物シグニチャーの判定を含む。好ましくは、これらはSELDIまたはMALDI O-TOF質量分析法を単独または他の分析方法と併用して使用して得られる。得られたシグニチャーはデータベースに記憶されて、診断および治療適用に利用可能になる。毒性の工業用化学薬品は、一般に、100,000 Mg/分/M3未満の毒性(吸入によるLC50)および20℃において感知できるほどの(規定されていない)蒸気圧を有する材料と理解される。本明細書において使用するTICという用語は、一般に、所定の量の吸入、摂取または吸収によって曝露した個人において毒性の作用を生ずる任意の物質と考えられる毒性の工業用化学材料(TIM)を含む。TICおよびTIMの例には、燃料、オイル、殺虫剤および除草剤、酸および塩基、放射線源、肥料、ヒ素、塩素、臭素、二硫化炭素、シアン化物、金属(例えば、コバルト、鉛、水銀、カドミウムおよびタリウム)、ホスゲンならびに他の有機および重金属毒素が含まれる。多数のTICおよびTIMが工業上公知であり、上記に言及されている物質は包括的または限定するものであると意図されてはいない。
【００５４】
別の局面において、本発明は、生物兵器および化学兵器(WMDとしても公知)などの国防に重要な物質のシグニチャー、例えば化学的、プロテオミクス、ゲノム、脂質、炭水化物および全生物シグニチャー、ならびにこのような物質に曝露したまたは曝露したことが疑われる被験体のAPC、組織、体液および細胞のプロテオミクス、ゲノム、脂質および炭水化物シグニチャーを提供する。好ましくは、これらのシグニチャーはSELDI、MALDI O-TOF MSおよび他の分析方法を用いて得られる。特に、スペクトル分析は迅速で正確な検出手段を提供するので、試料中の生物および化学兵器を野外同定するための迅速または初期反応プログラムの一部として本発明を使用することが可能である。
【００５５】
分析方法の第1の段階は、研究中の、因子である(TIC、WMD)細菌、ウイルス、プリオン、細胞、APC、流体または組織の試料を得る段階を含む。試料は調査前に処理することができる、すなわち、水もしくは溶媒に溶解するまたは無傷の状態で使用することができる。試料分析方法を使用して、試料についての初歩的な情報を得ることができる。質量スペクトルの収集およびその分析は以下の通りである。試料をMSのインレットポート(inlet port)に適用し、混合物または全細胞(または生物)が、脂質、炭水化物、核酸および/またはペプチド構造または任意の他の無機もしくは有機構造を含んでもよい1つまたは複数の分析物をさらに含有する場合には。試料はMSの前に処理を受けてもよく、試料は、MS分析物が出発分析物の誘導体であるものに変換されてもよく、非分析物種の量は出発試料と比較して変更されており、試料中の異なるMS分析物の相対的な存在は出発試料と比較して変更されており、MS分析物の濃度は出発試料中の対応する出発分析物と比較して変更されており、または溶媒などの試料構成成分は変更され、および/または分析物は溶解された形態から固体の形態、例えば共結晶化型に変更されている。このような処理には、例えば種々のサイズのフラグメントへの消化および/または分析物の化学的誘導体化が含まれる。消化は純粋に化学的または酵素的であってもよい。誘導体化は出発分析物もしくはフラグメントのいわゆる質量タグ法または試料処理プロトコール中に形成される他の誘導体を含む。他の処理は、分析前に試料を精製および/または濃縮することを含む。このような処理は、例えば、炭水化物、脂質、核酸および/またはペプチド構造を含むバイオポリマーである分析物に適用する。または、試料は、変更しないで、マイクロチャネル構造を通過してもよい。
【００５６】
敗血症および感染
敗血症は、毒素産生細菌による血流の激しい感染に起因する重症疾患である。特に免疫系が弱った人または他の内科的疾患を有する人では、敗血症は生命にかかわる場合が多い。敗血症は、体内のどこかで生じ得る細菌感染によって起こる。入院患者では、感染の好発部位には、静脈ライン、手術創、外科用ドレーン、および褥瘡または床ずれとして知られる皮膚損傷の部位、ならびに腎臓(上部尿路感染)、肝臓または胆嚢、腸(通常、腹膜炎と共に見られる)、皮膚(蜂窩織炎)、および肺(細菌性肺炎)、ならびに他の部位の感染が含まれる。多くのその他の病理学的疾患状態はその要素として敗血症を含み得、例えば、細菌性髄膜炎はまた敗血症を伴い得る。小児では、敗血症は骨の感染(骨髄炎)に付随して起こり得る。敗血症の合併症には、敗血症ショック、重要器官(脳、心臓、腎臓)への血流障害、および播種性血管内凝固症候群が含まれる。
【００５７】
精神状態の変化および過換気は、敗血症が起こる初発徴候であると考えられる。血液の細菌感染は血液培養陽性によって確認される場合が多いが、抗生物質を投与されている個体では陰性となる場合がある。敗血症では、血圧が低下しショックをもたらす。腎臓、肝臓、肺、および中枢神経系を含む主要な器官ならびに系は、正常に機能しなくなる。敗血症の別名は全身性炎症反応症候群(SIRS)であり、これは全身性感染症の免疫効果を示すものである。以下で考察する多くの様々なサイトカインが敗血症の病態で役割を担い、細菌感染および敗血所のバイオマーカーとなる。他の症状には、発熱および低体温(低い体温)、過換気、悪寒、身震い、皮膚温上昇、発疹、頻脈、混乱状態またはせん妄、および尿排出量の減少が含まれる。
【００５８】
患者の白血球数が低いかまたは高い、血小板数が低い、血液培養物が細菌に関して陽性である、血液ガスプロファイルがアシドーシスを示す、および腎臓機能試験が異常である(疾患経過の早期)場合に、敗血症の臨床診断が示唆される。本疾患はまた、以下の試験の結果にも変化をきたし得る：末梢血液塗沫により血小板数の低下および赤血球の破壊が示され得る、フィブリン分解生成物が多くの場合に上昇する、出血傾向と関連し得る状態、CBCおよび血液検査が細胞数の正常基準との差を示し、一般的には、未熟な白血球が認められる。
【００５９】
敗血症患者は通常、集中治療室(ICU)でのモニタリングを必要とする。敗血症が疑われたならば、できるだけ早く広域性静脈内抗生物質治療を開始すべきである。血液培養物の結果が得られ、原因生物が同定される場合には、投与する抗生物質の種類数を減らすことができる。よって、不適切な抗生物質の投与は感染を悪化させ得ることから、原因となる正確な病原因子を明らかにし得、より正確な抗生物質治療計画を可能にする迅速かつ正確な診断アッセイが重要である。感染源を明らかにすべきであり、これには患者の細胞、器官、および組織でのさらなる診断試験が必要であり得る。予防措置として、感染した静脈内ラインまたは外科的ドレーンなどの原因を除去すべきであり、膿瘍などの原因を外科的に排出させるべきである。酸素、静脈内輸液、および血圧を上昇させる薬物療法による支持療法が、良好な転帰に必要であると考えられる。腎不全の事象では透析が必要となり得、呼吸不全を起こした際には、多くの場合人工呼吸が必要である。敗血症患者の予後は多くの要因に依存し、早期診断および抗生物質処置が重要である。死亡率は、医学的問題を潜在的に有する人では60%という高さであり得る。その他の医学的問題がない個体では、死亡率はそれよりも低い(しかし、なお顕著である)。
【００６０】
敗血症は免疫系の顕著な変化をもたらす。抗原攻撃、すなわち細菌または他の病原体からの抗原攻撃に応答して、抗原提示細胞は多くのサイトカイン、最も顕著にはインターロイキンIL-1、IL-6、およびIL-11、ならびにTNF-αを血流中に分泌する。インターロイキン-1(IL-1)は炎症反応の重要な部分であり、とりわけマクロファージ、単球、および樹状細胞によって分泌される。インターロイキン-6(IL-6)は、組織損傷に応答して免疫応答を刺激するために抗原提示細胞によって分泌される炎症促進性サイトカインであり、炎症をもたらす。DCは顕著なレベルのIL-6を産生し、これは、免疫系をTh1(細胞媒介性)免疫応答に偏向させるIL-12産生を負に制御する。腫瘍壊死因子α(TNFα)は、白血球(とりわけ、DC、単球、およびマクロファージ)によって産生される炎症促進性サイトカインである。B細胞およびT細胞は、それぞれB細胞受容体(BCR)およびT細胞受容体(TCR)を介して抗原に対する特異性を示す。BCRは、可溶性抗原(ジフテリア毒素のような)と結合する。結合した抗原分子は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってB細胞に貪食される。抗原は断片にまで消化され、次いでクラスII組織適合性分子によって細胞表面に提示される。この構造に特異的なヘルパーT細胞(すなわち、相補的なTCRを有する)はB細胞と結合してリンホカインを分泌し、このリンホカインはB細胞が、細胞周期に入り、有糸分裂を繰り返すことで同一のBCRを有する細胞のクローンに発達すること；内在性膜タンパク質としてのBCRから可溶型を合成することに切り替えること；およびこれらの可溶性BCR(抗体と称する)を分泌する形質細胞に分化することを促進する。CD4+ T細胞は、クラスII組織適合性分子の一部である抗原エピトープと結合する。B細胞、ならびにマクロファージおよび樹状細胞のような食細胞を含む抗原提示細胞はすべて、クラスII分子を発現し、このような状況において抗原エピトープを他の免疫細胞に対して提示する。次いで、T細胞は、他の細胞をこの領域に誘引するリンホカインを放出する。結果として、抗原物質を取り囲んで破壊しようとする細胞および分子の蓄積、炎症が起こる。γ/δT細胞は、α/βT細胞と同様に胸腺内で発生する。しかし、これらはそこから体組織、特に上皮(例えば、腸、皮膚、腟内膜)に遊走し、血液とリンパ節の間を再循環しない(それらは、血液中のT細胞の5%以下存在し、リンパ節ではさらに稀である)。それらは、リンパ節中に見出されるAPCに依存するよりも、むしろそれらを取り囲む上皮細胞の表面上で抗原と遭遇する。それらは外界と内界の間の界面に位置するため、侵入病原体に対して防御の第一線に相当し得る。それらの応答は、αβT細胞の応答よりも早いようである。興味深いことに、γδT細胞が応答する抗原の多くは、特定種類の進入物(例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、結核の病原因子)上のみならず、病原体に攻撃を受ける宿主細胞中も見出される。
【００６１】
感染のバイオマーカー
したがって、APCは微生物と遭遇して様々な抗原を処理するが、上記したようにその抗原はAPCから直接同定または単離され得る。細菌抗原との接触によりAPC内で一連の生化学的応答が開始し、APCはそれぞれ、特定のAPC細胞種(B細胞、TH1細胞、TH2細胞、DC、マクロファージ、単球など)および特定の細菌抗原(例えば、一般にLPSおよび以下で考察するものをさらに含む)などの可変要素に依存した特定の応答を有する。これらの生化学的変化によって、細菌感染の種類および重症度を同定する方法が提供される。さらに、抗原接触したAPCが他の免疫細胞および器官に及ぼす効果を検出することも可能であり、対象中の感染を検出およびモニターするさらなる方法が提供される。
【００６２】
急性期タンパク質(APP)は、急性期反応物質(APR)としても知られ、生化学的および機能的に非関連である約30の異なるタンパク質の群に付与された総称である。血清中の急性期タンパク質のレベルは、炎症反応、特に細菌感染に応答した炎症反応の開始から約90分後に、増加(陽性急性期反応物質)または減少(陰性急性期反応物質)する。より重要な急性期タンパク質は、一般に糖タンパク質である。例外は、C反応性タンパク質(CRP)および血清アミロイドAタンパク質(SAA)である。
【００６３】
APPは、免疫細胞刺激によって産生される種々のサイトカインに応答して産生される。急性期タンパク質の主要な誘導因子は、IL1、IL6、およびTNF-αである。2つのメディエーターIL1およびIL6を用いて、急性期タンパク質は2つの亜群に分類されている。1型急性期タンパク質は、最大合成にIL6およびIL1の相乗作用を必要とするものである。1型タンパク質の例は、C反応性タンパク質、血清アミロイドA、およびα1酸性糖タンパク質である。2型急性期タンパク質は、最大誘導にIL6のみを必要とするものである。2型タンパク質の例は、フィブリノーゲン鎖、ハプトグロビン、およびα2マクログロブリンである。2型急性期タンパク質をコードする遺伝子の発現は、IL1によって頻繁に増強されるのではなく、むしろ抑制される。急性期タンパク質の発現に影響するサイトカインおよび他のメディエーター物質間には、相加的、相乗的、協同的、および拮抗的な効果が起こり、これはほとんどすべての組み合わせで認められている。多くのサイトカインはまた異なる効果を示し、1つまたは2つの急性期タンパク質の合成を誘導するが、他のものの合成は誘導しない。例えば、アクチビンAは、HepG2細胞において急性期タンパク質のサブセットを誘導する。細菌リポ多糖およびいくつかのサイトカイン(主に、IL1、IL6、およびTNF-αであるが、LIF、CNTF、オンコスタチンM、IL11、およびカルディオトロピン-1もまた)はSAA合成の誘導に関与し、これらのサイトカインのいくつかは相乗的に作用する。IL1および同様にIFN-γは、IL6の効果のいくつかを低減させる。IL2およびIL6の効果のいくつかは、TGF-βによって拮抗される。2つまたはさらにそれ以上のサイトカインの組み合わせ作用は、因子がそれ自体では達成できない効果をもたらし得る。培養HepG2肝細胞癌細胞において、IL1、IL6、TNF-α、およびTGF-βは抗キモトリプシンの合成を誘導し、それと同時にアルブミンおよびAFP(α-フェトプロテイン)の合成を抑制する。フィブリノーゲンの合成はIL6によって誘導されるが、この効果はIL-1α、TNF-α、またはTGF-β1により抑制される。IL6によって媒介されるハプトグロビンの合成の増加は、TNF-αにより抑制される。インスリンは、HepG2肝細胞癌細胞において、いくつかの陰性急性期タンパク質(プレアルブミン、トランスフェリン、およびフィブリノーゲン)の合成を阻害する。
【００６４】
サイトカインの異なるパターンが、感染に応答した全身性および局所性組織損傷に関与するという事実は、IL1およびIL6のノックアウトマウスを用いた知見により支持される。組織損傷または感染後の炎症性急性期反応は、IL6ノックアウトマウスにおいて激しく損なわれるが、細菌リポ多糖による攻撃後では中程度に影響を受けるにすぎなかった。IL6の不在下では、テレピン油による化学的攻撃に応答して急性期タンパク質の誘導は劇的に減少するが、そのパラメータは、細菌リポ多糖を注射した後の野生型マウスおよびIL6欠損マウスにおいて同程度に変化した。しかし、これらのマウスは、野生型対照よりも3倍多くのTNF-αを産生する。TNF-βノックアウトマウスでは、テレピン油および細菌リポ多糖攻撃のいずれに対しても正常な急性期反応が認められる。一方、IL1βノックアウトマウスは、細菌リポ多糖に対して正常な応答を示し、IL1βが細菌リポ多糖に対するインビボ全身性反応に必須ではないこと、またはその役割が重複する活性を有する他のサイトカインによって遂行され得ることが示唆される。
【００６５】
急性期タンパク質は免疫応答を制御する、炎症のメディエーターおよび阻害物質として機能する、炎症過程で生じる生成物(ヘム結合タンパク質ヘモペキシン、およびハプトグロビン)の輸送タンパク質として作用する、ならびに/または組織修復およびリモデリングにおいて積極的な役割を果たす。少なくともいくつかの急性期タンパク質は、アポトーシスによる細胞死を防御する因子の誘導系を構成すると考えられる。例えば、α1酸性糖タンパク質およびα1アンチトリプシンは、アポトーシスの主要な実行者、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7を活性化する。急性期タンパク質のいくつかは、サイトカインのように挙動する。C反応性タンパク質は、例えばマクロファージを活性化するが、CD14+ DCの成熟および分化を阻害するようである。他の急性期タンパク質は、細胞の走化性挙動に影響する。いくつかの急性期タンパク質は抗タンパク質分解活性を有し、おそらく血管管腔への細胞遊走を阻止して、全身性炎症の確立を妨げるのを助ける。無制御な急性期反応の調節欠損からは、最終的に、全身性炎症反応症候群(SIRS)などの重症の病理学的結果がもたらされる。いくつかのサイトカインの活性の直接的な結果として多くの急性期タンパク質が協調的に発現されることは、少なくとも一部に、これらの急性期タンパク質をコードする遺伝子の制御配列がいわゆるサイトカイン応答エレメント(例えば、IL6特異的エレメントとしてのIL6RE)を含むという事実によって説明され得る。これらのエレメントは、細胞および/または組織特異的様式で、これらの遺伝子の活性を媒介する転写因子によって特異的に認識される。
【００６６】
急性期タンパク質は主に肝臓で合成され、各肝細胞はこれらのタンパク質の全範囲を産生する能力を有している。これらの急性期タンパク質には、α1酸性糖タンパク質；α1抗キモトリプシノーゲン；α1アンチトリプシン；α2アンチプラスミン；α2マクログロブリン；抗トロンビン-3；補体タンパク質(C1、C2、C4、C4結合タンパク質、C5、C9、およびB因子を含む)；C反応性タンパク質；セルロプラスミン；第VIII因子；フェリチン；フィブリノーゲン；フィブロネクチン；ハプトグロビン；ヘムオキシゲナーゼ；ヘモペキシン；ヘパリン補因子-2；カリクレイン；LPS結合タンパク質；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ；マンノース結合タンパク質；プラスミノーゲン；プラスミノーゲン活性化因子阻害因子；プロトロンビン；血清アミロイドA；血清アミロイドP；フォンウィルブランド因子；およびIL1ra(IL1受容体アンタゴニスト)が含まれる。個々の小葉内で単一の肝細胞が刺激された後には、さらなる肝細胞の刺激が観察され、この過程はほとんどすべての肝細胞がこれらの急性期タンパク質を産生し、それらを循環中に放出するまで継続する。
【００６７】
種々の急性期タンパク質は、それらの血漿レベルの上昇または低下、およびそれらの最終濃度についても大きく異なる。特定の急性期タンパク質の血清濃度の上昇は、診断上適切であり、また予後診断の上でも価値がある。急性期反応によって特徴的な血清タンパク質プロファイルが作製され、これを用いて感染の段階およびこの反応をもたらしている病原体の種類をモニターすることができる。それらの測定によって、炎症過程が、類似のまたは同様の臨床像を有する機能障害と識別され得る。正常な状況下では、炎症過程の結果ではない機能障害に付随して急性期反応は認められず、よって機能障害と器質性疾患との識別が可能になる。いくつかの急性期反応はまた、関節リウマチおよび慢性感染症などの慢性疾患においても認められ、悪性疾患はほとんど常に急性期反応を伴う。急性期タンパク質の合成の上昇が、特に細菌感染を有する患者の炎症過程の程度および進行と平行する多くの疾患が存在する。
【００６８】
敗血症に関する画期的な試験の1つはPROWESSプロジェクト(重症敗血症における組換えヒト活性化プロテインCの世界的評価)であり、これは重症敗血症患者で行われた第III相無作為化二重盲検プラセボ対照多施設治験である(Kinasewitz et al., Critical Care, 8:2, 2004を参照されたい)。この試験では、凝固活性化、抗凝血、線維素溶解、内皮傷害、および炎症に特異的な敗血症の19のバイオマーカーを解析して、敗血症の異なる病原因子を考慮して、基準値および経時的な変化が決定された。敗血症の19のバイオマーカーには、D-ダイマー；IL-6；プロテインC；抗トロンビン；プロテインS；プロトロンビン時間；活性化部分プロトロンボプラスチン時間；血小板；プロトロンビン断片1.2；トロンビン-抗トロンビン複合体：トロンビン活性化線維素溶解阻害剤；α2抗プラスミン；プラスミノーゲン；プラスミノーゲン活性化因子阻害因子；可溶性トロンボモジュリン；IL-1β；L-10；IL-8；および腫瘍壊死因子αが含まれる。試験では、グラム陰性もしくはグラム陽性または混合細菌感染、または真菌感染を含む異なる感染モデルを適用した。試験の結果から、敗血症に対する対象応答は宿主の炎症反応および凝固障害応答を含み、これらはグラム陽性、グラム陰性、および真菌敗血症で顕著に類似していることが示された。個々の免疫細胞および過程をより微細に見ることで、生物の相違が明らかになる。
【００６９】
樹状細胞(DC)は重症疾患において重要な役割を果たし、敗血症患者およびマウスの脾臓では枯渇している。Efron PA, et al.(J Immunol. 2004 Sep 1;173(5):3035-43)は、多微生物性敗血症において、マウスリンパ節中の樹状細胞が全身的に消失していることを特徴づけた。彼らは、多微生物性敗血症を誘導した(盲腸結紮および穿刺法)のマウスの局所(腸管膜)および遠位(鼠径部および膝窩)リンパ節中に存在する、DCおよびTh細胞の表現型を解析した。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学染色により、敗血症マウスのリンパ節からDCが顕著に局所(腸管膜リンパ節)および部分的全身性(鼠径部リンパ節、しかし膝窩リンパ節は異なる)消失すること、およびこの過程がアポトーシスの増加と関連することが実証された。この敗血症誘導性のDC消失は、CD3(+)CD4(+) T細胞活性化およびリンパ節中での消失後に起こり、DC消失はその成熟状態の持続的増加に先行されなかった。さらに、敗血症の過程では、成熟/活性化(MHCII(高)/CD86(高))または未熟(MHCII(低)/CD86(低))DCの優先的な消失は認められなかった。しかし、局所および遠位リンパ節において、CD8(+) DCの優先的な消失が認められた。彼らは、リンパ組織中でのDC、特にCD8(+)リンパ系由来DCの消失が、頻繁に敗血症に伴って起こる後天性免疫状態の変化に寄与し得ると結論づけた。
【００７０】
別のグループは、敗血症の動物モデル(盲腸結紮および穿刺)において、死亡率の予測因子として、敗血症応答と関連するさらなる因子について研究した。Heuer et al.,(Crit Care Med. 32:7, 2004)は、敗血症に応答した凝固および炎症のバイオマーカーについて試験した。敗血症のバイオマーカーには、血中グルコース；プロテインC；血液コロニー形成単位；、D-ダイマー；アポリポタンパク質A1；β2ミクログロブリン；C反応性タンパク質；上皮増殖因子；エンドセリン-1；エオタキシン；第VII因子；線維芽細胞増殖因子-9；塩基性線維芽細胞増殖因子；フィブリノーゲン；顆粒球走化性タンパク質-2；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；成長ホルモン；グルタチオンS-トランスフェラーゼ；γインターフェロン；IgA；IL-10；IL-11；IL-12p70；IL-17；IL-18；IL-1β；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；インスリン；γインターフェロン誘導タンパク質10；KC；レプチン；白血病抑制因子；リンホタクチン；単球走化性タンパク質-1/JE；単球走化性タンパク質-3；単球走化性タンパク質-5；マクロファージコロニー刺激因子；マクロファージ由来ケモカイン；マクロファージ炎症性タンパク質-1α；マクロファージ炎症性タンパク質-1β；マクロファージ炎症性タンパク質-1γ；マクロファージ炎症性タンパク質-2；マクロファージ炎症性タンパク質-3β；ミオグロビン；オンコスタチンM；RANTES；幹細胞因子；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；組織性メタロプロテイナーゼ阻害因子-1；腫瘍壊死因子-α；組織因子；トロンボポエチン；血管細胞接着分子-1；血管内皮増殖因子；およびフォンウィルブランド因子が含まれる。筆者らは、ラット敗血症モデルではプロテインC濃度の早期減少により不良転帰が予測される、およびCXCケモカインマクロファージ炎症性タンパク質-2、およびKCの増加もまた不良転帰に先行すると結論づけた。
【００７１】
可溶性バイオマーカー検出および定量的細胞測定を介した感染および敗血症の診断検出の進歩により、診断技法の改善の基礎が提供される。Davis BH.(Expert Rev Mol Diagn. 2005 Mar;5(2):193-207)は、感染/敗血症検出への様々なアプローチについて研究した。プロカルシトニンにより、細菌病因およびウイルス病因の間の分別診断の強化が提供された。好中球CD64測定によって、敗血症の従来の実験的評価よりも優れた感度および特異性が提供された。好中球CD64発現は、健常状態では無視できる。しかし、これは、重篤な感染または敗血症に対する全身性反応の一部として増加する。好中球CD64定量化で見られるような細胞プロテオミクスと、プロカルシトニンまたは骨髄細胞で発現される誘発性受容体(TREM)-1などの、炎症反応の選択された可溶性バイオマーカーとの併用により、感染および敗血症の診断および治療的モニタリングにおける改良法が提供される。さらに、Nupponen et al.,(Pediatrics, 108:1 July 2001)は、ヒト新生児における早発性感染のマーカーとして、循環IL-8および好中球CD11b発現を評価した。筆者らは、初期の全身性感染症の検出において、CD11bおよびIL-8レベルがCRPレベルよりも優れていることを見出した。この知見はTurunen et el.(Pediatric. Res. 57(2):270-275 (2005)によって確認され、彼らは、新生児の遅発性敗血症の初期徴候として、循環貪食細胞上のCD-11b密度の増加について記載している。さらに、Schieven, G. L., H. de Fex, et al.(Antioxid Redox Signal 4(3): 501-7 (2002)は、好中球において、ジ亜塩素酸がチロシンリン酸化シグナル経路を活性化し、カルシウムシグナル伝達およびTNFα産生をもたらすことを発見した。ジ亜塩素酸は好中球によって産生される重要な酸化剤であり、病原体に対する防御に役立つ。ジ亜塩素酸はその細胞毒性に起因して組織損傷を起こすことが知られているが、この酸化剤が免疫系の細胞によるシグナル伝達に及ぼす効果およびそれらの細胞の応答に及ぼすその効果は十分に理解されていない。ジ亜塩素酸はTリンパ球およびBリンパ球において細胞のチロシンリン酸化を誘導し、ZAP-70チロシンキナーゼを活性化し、チロシンキナーゼ依存的様式で細胞のカルシウム伝達を誘導することが見出された。これらのシグナル伝達事象はまた、T細胞受容体を発現しないT細胞株においても起こり、ジ亜塩素酸が正常な受容体調節を迂回することが示唆される。ジ亜塩素酸は、チロシンキナーゼ依存的様式で、末梢血単核細胞において腫瘍壊死因子-α産生を誘導した。これらの結果から、ジ亜塩素酸は、免疫系の細胞においてシグナル経路を活性化することによって、炎症反応に寄与し得ることが示唆される。したがって、ジ亜塩素酸産生および下流のシグナル伝達経路における種々のタンパク質は、炎症および敗血症のAPCバイオマーカーを提供する。
【００７２】
Lainee P, Crit Care Med. 2005 Apr;33(4):797-805は、インターフェロン-γの遅延中和が、霊長類グラム陰性菌血症性ショックの致死性を妨げることを見出した。この試験では、新規抗ヒトインターフェロン-γモノクローナル抗体の遅延投与が、ショックの発症後に投与した場合に、大腸菌菌血症の致死モデルにおいて転帰を改善し、臓器損傷を低減するかどうかを試験した。大腸菌菌血症の霊長類モデルでは、ショック発症後のインターフェロン-γの遅延中和により、生存率が改善し、臓器不全の発生に関連する病理変化が減弱した。これらの知見から、インターフェロン-γ遮断が、致死的敗血症ショックにおける後期介入の潜在的に有効な様式を表すことが示唆される。さらに、インターフェロン-γのモニタリングにより、疾患進行の診断が提供される。
【００７３】
Gibot S, et al.,(Crit Care Med. 2005 Apr;33(4):792-6)は、敗血症の過程において、sTREM(骨髄細胞で発現される可溶性誘発性受容体)-1、プロカルシトニン、およびC反応性タンパク質の血漿濃度を測定した。可溶性TREM-1濃度は、生存者よりも非生存者において入院時に有意に低く(94[30-258]対154[52-435]pg/mL、p = .02)、PCTレベルは非生存者で高かった(19.2[0.3-179]対2.4(0-254)pg/mL、p = .001)。CRPレベルは、2つの患者群の間で違いがなかった。血漿PCTおよびCRPは、生存者および非生存者のいずれにおいても、14日間の試験期間中に減少した。逆に、sTREM-1血漿濃度は、非生存患者では安定なままであるかまたは増加し、生存者では減少した。基準sTREM-1レベルの上昇は、0.1(95%信頼区間、0.1〜0.8)という死亡確率を有する独立した保護因子であることが判明した。血漿sTREM-1の漸進的な減少は、敗血症の回復期における有利な臨床的展開を示す。さらに、基準sTREM-1レベルおよびその変化は、敗血症患者の転帰を予測する方法を提供する。
【００７４】
Ahmed Z, et al.(J Coll Physicians Surg Pak. 2005 Mar;15(3):152-6)は、新生児敗血症において、C反応性タンパク質および血液学的パラメータについて試験した。敗血症の臨床的特徴を有する新生児100名および正常な無症候性新生児100名を、一連の試験で評価した。C反応性タンパク質(CRP)、赤血球沈降速度、全白血球数、絶対好中球数(ANC)、未熟好中球数と全好中球数の比(I/T比)、血小板減少、好中球の変性変化、および多形に関する胃吸引物細胞診(GAC)を用いて、新生児敗血症を診断した。CRPはA群(敗血症確認済)の24/28(85.7%)およびB群(推定敗血症)の58/72(80.5%)において陽性であり、95%の特異性を有した。ANCは感度が2番目に高い試験であり、A群で71.4%およびB群で63.9%の感度を有し、88%の特異性を有した。A群では、多形に関するGACおよび血小板数の感度は、それぞれ71.4%および64.3%であった。A群およびB群について、個々の試験および異なる試験の組み合わせにおける感度、特異性、および予測値(PV)もまた計算した。CRP、TLC、ANC、血小板減少、好中球における細胞質空胞形成、および多形に関するGACを含む一連の試験は、新生児敗血症の培養物陰性症例の検出において感度が高かった。
【００７５】
Sierra R, et al.(Intensive Care Med. 2004 Nov;30(11):2038-45)は、C反応性タンパク質を、敗血症のマーカーとして、および全身性炎症反応症候群を有する患者における感染の早期指標として調べた。血清C反応性タンパク質濃度を、SIRS発症の最初の24時間以内に測定した。健常対象、AMI患者、および非感染性SIRS患者は、敗血症患者(18.9[95% CI、17.1〜21.8])よりも低いC反応性タンパク質中央値(それぞれ、[(0.21[95%信頼区間(95% CI)、0.21〜0.4]mg/dl、2.2[95% CI、2.1〜4.9]mg/dl、および1.7[95% CI、2.4〜5.5]mg/dl)を示した、p<0.001。重症敗血症の存在(r(s)=0.27；p=0.03)、SOFAスコア(r(s)=0.25；p=0.03)、および動脈乳酸(r(s)=0.24；p=0.04)は、敗血症症例におけるC反応性タンパク質濃度と有意に相関した。敗血症を予測するためのC反応性タンパク質の最良閾値は、8 mg/dl(感度94.3%、特異性87.3%)であった。Ng, et al.(Pediatr Res. 2004 Nov;56(5):796-803)は、満期産児における早発性臨床感染、肺炎、および敗血症の同定のための、C反応性タンパク質および好中球CD64発現の診断有用性を評価した。彼らは、好中球CD64が、正期産児における早発性臨床感染および肺炎を同定するための感度の高い診断マーカーであることを見出した。
【００７６】
Mattner J, et al.,(Nature. 2005 Mar 24;434(7032):525-9)は、微生物感染過程における、外因性および内因性糖脂質抗原によるNKT細胞の活性化について研究した。CD1d拘束性ナチュラルキラーT(NKT)細胞は、保存されたT細胞受容体を発現し、種々の微生物病原体に対する宿主防御に寄与する先天性様リンパ球である。しかし、その標的脂質抗原は依然としてわかりにくいままである。エーリキア・ムリス(Ehrlichia muris)およびスフィンゴモナス・カプスラタ(Sphigomonas capsulata)のようなグラム陰性、リポ多糖(LPS)陰性αプロテオバクテリアに対するNKT細胞の微生物、抗原特異的活性化の強力な証拠が存在する。スフィンゴモナスの細胞壁から単離されたグリコシルセラミドは、マウスおよびヒトNKT細胞の直接標的となり、感染マウスにおいて敗血症ショック反応および細菌排除を調節する。一方、グラム陰性、LPS陽性ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)は、LPS活性化樹状細胞によって提示される内因性リソソームグリコスフィンゴ脂質、iGb3の認識を介して、NKT細胞を活性化する。グリコシルセラミドは、グラム陰性、LPS陰性細菌細胞壁の生得的認識のための、LPSの代わりとなるマーカーである。グリコシルセラミドに対するAPC応答により、これらの病原体のバイオマーカーが提供される。
【００７７】
重症敗血症患者および敗血症ショック患者における高移動度ボックス-1タンパク質(HMGB1)の持続的上昇
入院後の最初の週の5時点でサイトカインレベルを測定し、急性生理・慢性度による重症度評価(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation)IIスコアおよび敗血症関連臓器不全評価(Sepsis-related Organ Failure Assessment)スコアと関連づけた。2つのHMGB1アッセイを使用した。いずれからも、高レベルで含有し、試験期間を通して高いままであるHMGB1の遅延性動力学が実証された。最終サンプリング時点である144時間の時点での血清濃度は、他のサイトカインのいずれよりも300倍高く、34,000 +/- 76,000 pg/mL(平均値 +/- sd)であった。しかし、この研究では、HMGB1の血清レベルと感染重症度との予測可能な相関関係は認められなかった。インターロイキン-6、インターロイキン-8、インターロイキン-10、および腫瘍壊死因子-αのレベルは疾患重症度と有意に相関し、いずれも重症敗血症患者と比較して敗血症ショック患者において有意に高かった。HMGB1のレベルは、入院後1週間まで患者の大部分において高いままであり、HMGB1は炎症の下流および後期メディエーターであることが示唆される。したがって、HMGB1は敗血症のバイオマーカーを提供する。
【００７８】
el-Sameea ER, et al.(Egypt J Immunol. 2004;11(1):91-102)は、C反応性タンパク質およびインターロイキン-8と比較して、早発性新生児敗血症の診断マーカーとしてのナチュラルキラー細胞を評価した。この研究は、新生児敗血症においてNK細胞が果たす役割を明らかにすること、および早期新生児敗血症の疑いがある乳児において、循環IL-8サイトカインおよびCRPレベルと比較して、診断マーカーとしてのNK細胞数およびNK細胞毒性の感度を評価することを目的とした。末梢血リンパ球の試料をすべて、フローサイトメトリーを用いたCD16およびCD56陽性細胞の決定、および標準的な4時間51Cr遊離アッセイを用いたNK細胞毒性の決定に供した。血清を分離し、ELISA法を用いてIL-8を測定した。CRP中央値は、入院からほんの12〜60時間後でも、非敗血症群(15.4 mg/L；範囲：7.6〜23.2 mg/L、p < 0.001)と比較して敗血症群(88 mg/L；範囲：17〜159 mg/L)おいて有意に高かった。一方、敗血症群の新生児は、試験開始時に、非敗血症群(中央値63 pg/mL；範囲：32〜94 pg/ml、P < 0.001)よりも有意に高いIL-8の血清レベル(中央値310 pg/mL；範囲：37〜583 pg/ml)を有した。入院時には、CD16およびCD56陽性細胞数よりもNK活性がより影響を受け、NK細胞毒性は、非敗血症群(18.3 +/- 6.7%：範囲10.7〜25.3%、p < 0.01)および健常新生児(23.8 +/- 4.7%：範囲12.2〜32.3%、p < 0.001)よりも敗血症群(3.4 +/- 2.1%、範囲0.9〜7%)において有意に低かった。NK細胞数よりもむしろNK細胞活性の欠損の方が、早発性新生児敗血症に対する感受性において重要な役割を果たす。新生児敗血症の早期診断におけるマーカーとしてのNK細胞毒性の評価から、低減したNK細胞毒性(10%死滅)の感度、特異性、および予測値が、個々または組み合わせたCRPおよびIL-8よりも高いことが明らかにされる。さらに、低減したNK細胞毒性は、新生児敗血症の重症度および転帰と高い相関関係を示し、APC応答を敗血症の予後指標として用いることを可能にしている。
【００７９】
Marsik C, et al.(Clin Immunol. 2005 Mar;114(3):293-8)は、内毒血症患者において、タンパク質および分子レベルでシグナル伝達受容体(GP130)の発現を試験した。インターロイキン6(IL-6)は、敗血症期に顕著な役割を行う。内毒血症期のIL-6、IL-6受容体、およびシグナル伝達受容体gp130の分子制御を調べるため、二重盲検無作為化プラセボ対照治験において、健常若年ボランティア9名に1日目にリポ多糖(LPS)および2日目に生理食塩水をボーラス注入投与した。LPSは、IL-6放出を300倍増強した。IL-6 mRNA発現は、インビボではLPS注入後のいずれの時点の血液試料中においても有意に変化しなかったが、全血を50 pg/ml LPSと共にインキュベートした場合には、インビトロでIL-6 mRNAレベルは8000〜50,000倍上方制御された。LPS注入は、4時間の時点で基準と比較してgp130 mRNAの合成を5.5倍増加させたが(P < 0.05)、プラセボ期では有意な変化は認められなかった(群間でP = 0.001)。LPSは、8時間の時点で、gp130陽性好中球gp130の割合を基準の700%増加させた(P < 0.01対基準およびプラセボ)。IL-6受容体レベルは、軽度の内毒血症によって有意に変化しなかった。内毒血症は、インビボおよびインビトロにおいてgp130発現を上方制御する。したがって、gp130のAPC発現は内毒血症および敗血症のバイオマーカーである。
【００８０】
Morgenthaler NG, et al.(Crit Care. 2005 Feb;9(1):R37-45)は、プロ心房性ナトリウム利尿ペプチドが敗血症における予後マーカーであることを調べた。中央領域プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)レベルの予後値を、急性生理・慢性度による重症度評価(APACHE)IIスコアの予後値、およびサンドイッチ免疫測定法により患者のEDTA血漿で検出した種々のバイオマーカー(すなわち、C反応性タンパク質、IL-6、およびプロカルシトニン)の予後値と比較した。生存者のプロ-ANP中央値は194 pmol/l(範囲20〜2000 pmol/l)であり、これは非生存者(中央値853.0 pmol、範囲100〜2000 pmol/l；P < 0.001)よりも有意に低かった。入院日では、プロ-ANPレベルは非生存敗血症患者よりも生存敗血症患者において有意に高かったが(P = 0.001)、他のバイオマーカーのレベルでそのようなことはなかった。敗血症患者の生存に関する受信者動作特性曲線解析において、プロ-ANPの曲線下面積(AUC)は0.88であり、これはプロカルシトニンおよびC反応性タンパク質のAUCよりも有意に大きく、APACHE IIスコアのAUCと類似していた。
【００８１】
Lowry SF et al.(Surg Infect (Larchmt). 2004 Fall;5(3):261-8)は、重症敗血症を有する外科患者において、バイオマーカーの静的および動的評価を研究した。急性臓器不全を伴う感染に対する全身性炎症反応として定義される重症敗血症は、外科患者によく見られ、罹患率および死亡率の主な原因である。重症敗血症は、炎症性および止血性バイオマーカーと関連づけられている。外科的処置を受けている患者では、サイトカイン放出のさらなる刺激および凝固系の活性化が存在し得る。この研究では、外科患者と非外科患者のバイオマーカーの基準の差を特徴づけた。さらに彼らは、重症敗血症を有する外科患者において、バイオマーカーおよび凝固パラメータの動的変化を評価した。解析に利用したバイオマーカーおよび凝固パラメータは、D-ダイマー；インターロイキン-6(IL-6)；プロテインC活性；プロテインS活性；抗トロンビンIII(ATIII)；活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)およびプロトロンビン時間(PT)、ならびに血小板数であった。重症敗血症を有する外科患者は、非外科患者と比較して、バイオマーカーおよび凝固マーカーの撹乱によって示されるように、基準においてより高い疾患重症度を有するようであった。ドロトレコギンα(活性化)で処置した外科患者は、注入期間中に、D-ダイマー濃度の低減およびプロテインC濃度のより迅速な増加を示した。
【００８２】
O'Connor E, et al.,(Anaesth Intensive Care. 2004 Aug;32(4):465-70)は、血清プロカルシトニンおよびC反応性タンパク質を、神経外傷を有する患者およびくも膜下出血を有する患者において敗血症および転帰のマーカーとして研究した。患者62名を7日間追跡した。血清PCTおよびCRPを、0、1、4、5、6、および7日目に測定した。外傷性脳傷害を有する患者の77%およびくも膜下出血を有する患者の83%が、SIRSまたは敗血症を発症した(P=0.75)。基準のPCTおよびCRPは、それぞれ患者の35%および55%で上昇した(P=0.03)。非SIRS(0.4+/-0.6 ng/ml)からSIRS(3.05+/-9.3 ng/ml)へ、敗血症(5.5+/-12.5 ng/ml)へと、血清PCTレベルの統計的に有意でない段階的増加が認められた。同様の傾向は、軽度(0.06+/0.9 ng/ml)、中等度(0.8+/-0.7 ng/ml)、および重度の頭部傷害(1.2+/-1.9 ng/ml)を有する患者における基準のPCTでも示された。そのような漸次的変化は、血清CRPでは認められなかった。基準のPCTが、基準のCRPと比較して院内死亡率のより良好なマーカーであるという有意でない傾向が存在した(ROC-AUCそれぞれ0.56対0.31)。
【００８３】
Arredouani MS, et al.,(Immunology. 2005 Feb;114(2):263-71)は、ハプトグロビンがエンドトキシン誘導性炎症効果を緩和する能力について研究した。インターロイキン-6(IL-6)に応答して肝細胞により産生される急性期タンパク質であるハプトグロビンは、エンドトキシンによって誘導される炎症反応を調節し得る。ハプトグロビンは、腫瘍壊死因子-α、IL-10、およびIL-12の単球産生を抑制することによって、インビトロでリポ多糖(LPS)効果に選択的に拮抗する能力を有するが、IL-6、IL-8、およびIL-1受容体アンタゴニストの産生を阻害することはできない。LPS誘導性気管支肺過敏性およびエンドトキシンショックの2つの動物モデルにおいて、ハプトグロビンノックアウトマウスは、それらの野生型対応物と比較してLPS効果に対する感受性がより高かった。したがって、ハプトグロビンは、LPS刺激後の単球活性化を制御すると考えられる。急性期反応過程でのハプトグロビンレベルの上昇は、サイトカイン放出の重症度を軽減し、エンドトキシン誘導性効果から保護するフィードバック効果を生じ得る。したがって、ハプトグロビンは敗血症のマーカーであり、疾患重症度と相関する。
【００８４】
Tsujimoto H, et al.(Shock. 2005 Jan;23(1):39-44)は、ヒト敗血症および実験的敗血症におけるマーカーとして、好中球エラスターゼ、MIP-2、およびTLR-4発現を検討した。高度に活性化された好中球は、好中球エラスターゼ(NE)を放出することにより、敗血症において臓器損傷を媒介する上で重要な役割を果たす。Toll様受容体(TLR)は、侵入微生物に対する宿主防御において重要な役割を果たし、そのシグナル伝達経路は、炎症促進性反応の活性化に重要である。この研究では、ヒト敗血症およびマウス腹膜炎(CLP)におけるケモカイン(MIP-2)、TLR-4、およびNE発現間の関係を調べた。単球/マクロファージ上のTLR-4発現を、敗血症患者およびマウス腹膜炎で調べたが、その発現は両集団において顕著に増加していた。腹膜炎を有するマウスにおける、気管支肺胞細胞および肝臓単核細胞によるLPS誘導性MIP-2産生もまた、偽手術マウスと比較して有意に増加していた。マクロファージ細胞株、RAW 264.7細胞をLPSに曝露する前にNE阻害剤で前処理すると、MIP-2産生は顕著に用量依存的に減少し、これはTLR-4抗体で前処理した後に見られるものと匹敵した。さらに、NEおよびLPSはいずれも、ヒト末梢血単球上のTLR-4発現を上方制御した。したがって、敗血症における好中球のケモカイン誘導性動員は、ケモカイン産生のさらなる増加およびTLR-4の発現増加をもたらし得る。好中球由来NEは、単球/マクロファージTLR-4の発現増加と関連し得、それにより炎症反応の正のフィードバックループとして働き、異なる細胞集団の中でこれのバイオマーカーとして働く。
【００８５】
van Rossum AM, et al.(Lancet Infect Dis. 2004 Oct;4(10):620-30)は、新生児および小児の感染の早期マーカーとしてプロカルシトニンを調べた。この研究から、プロカルシトニンが小児の重篤な侵襲性細菌感染の優れたマーカーであることが見出された。しかし、新生児細菌感染の診断におけるプロカルシトニンの使用は複雑であるものの、C反応性タンパク質よりも高い特異性をもたらし得る。さらに、プロカルシトニンは疾患の重症度(尿路感染症および敗血症)と相関することが示され、よって感染および敗血症の予後バイオマーカーとして有用となる。
【００８６】
Turunen R, et al.(Pediatr Res. 2005 Feb;57(2):270-5)は、低出生体重児における遅発性敗血症の初期徴候として、循環貪食細胞上のCD-11b密度の増加を検討した。遅発性院内感染敗血症は、低出生体重(<1000 g)(ELBW)児によく見られる。診断は困難であるが、それは敗血症の早期では、日常的な臨床検査が特異的でなく、また感度もよくないためである。敗血症を有する満期産児では、CD11b/CD18、β2-インテグリンの好中球表面発現が有意に増加する。血液好中球および単球上のCD11b/CD18密度の増加は、ELBW児における早期敗血症マーカーであることが見出された。好中球および単球CD11b/CD18発現は、フローサイトメトリーで決定された。CD11b発現は、血液培養用にサンプリングする前3日間の間で徐々に増加した。サンプリング日には、好中球および単球におけるCD11bの発現中央値は、対照群よりも感染群において高かった。好中球に関しては、感度および特異性はそれぞれ1.00および0.56であり、単球に関してはそれぞれ0.86および0.94であった。
【００８７】
Ashare A, et al.(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005 Apr;288(4):L633-40)は、抗炎症反応、ならびにその、敗血症における死亡率および感染重症度との関連性を調べた。彼らは、マウス敗血症モデルを用いて、組織の炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカインのバランスが、感染重症度および死亡率と直接相関することを見出した。敗血症は、盲腸結紮および穿刺(CLP)によりC57BL/6マウスで誘導した。肝臓組織を、ELISA法によってIL-1β、IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、および可溶性TNF受容体1について解析した。定量リアルタイムPCRにより、細菌DNAを測定した。CLP後、初期には炎症促進性サイトカインが優勢であったものが(6h)、24時間の時点では抗炎症性が優勢となるよう移行した。抗炎症性サイトカインの上昇は、組織細菌レベルの増加によって反映された。炎症促進反応と比較した抗炎症反応の程度は、細菌濃度と相関した。抗炎症反応のタイミングを調節するため、マウスをCLPの前にIL-1raで処置した。これにより、炎症促進性サイトカインが減少し、細菌負荷が早まり、死亡率が上昇した。この研究から、敗血症に対する初期の組織炎症促進反応の後に、抗炎症反応が続くことが示された。抗炎症期は細菌量および死亡率の増加と関連し、抗炎症反応のタイミングおよび大きさによって感染重症度が予測される。
【００８８】
Bozza FA, et al.(Shock. 2004 Oct;22(4):309-13)は、敗血症において、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)レベルと致死的転帰との相関関係について調べた。敗血症および敗血症ショックを有する重病患者において、MIFレベルをインターロイキン-6(IL-6)レベルと比較した。彼らは、MIFおよびIL-6の血漿濃度中央値が、健常対照よりも敗血症ショック患者および敗血症患者で有意に高いこと、ならびにMIFレベルがIL-6レベルと同様に生存者と非生存者の間で有意に異なることを見出した。顕著なことには、MIFの血漿レベルが高いことは(> 1100 pg/mL)、最終的に致死的転帰に至る患者を同定する上で100%の感度および64%の特異性を有した。
【００８９】
したがって、考察したAPPならびに種々のサイトカインおよびリンホカインは、感染および敗血症のタンパク質に基づくマーカーを提供し、感染に応答した対象の免疫状態の変化を決定する方法を提供する。感染に対する記載した種々の免疫応答および器官応答はタンパク質バイオマーカーに焦点をおいたが、これらのタンパク質は必ず遺伝子発現変化から生じる。したがって、タンパク質バイオマーカーをコードする種々の遺伝子自体が検出可能であり、感染および敗血症の核酸に基づくバイオマーカーを提供する。さらに、白血球の分化または増加は感染を示し得る。したがって、これらの細胞変化、ならびに遺伝子およびタンパク質に基づくバイオマーカーの変化の検出により、感染の段階および重症度(例えば、初期段階、中間段階、進行段階、SIRS、および敗血症)の同定ならびに死後解析が可能になる。対象、好ましくはヒト対象に由来する体液試料を、種々の核酸またはプロテオミクスアッセイによって、好ましくは上記のようにリアルタイムでスクリーニングまたはモニターし、これらの感染バイオマーカーの存在またはレベルの変化についてアッセイする。使用に適した体液には、血液、血漿、骨髄液、心嚢液、胸膜液、腹水、および滑液、脳脊髄液、痰、尿、リンパ液、ならびに医学の分野で周知のその他のものが含まれる。
【００９０】
APC病原体バイオセンサー
対象の体液中のAPP、サイトカイン、および他のバイオマーカーの検出(定性的および定量的)に関連して、APC自体を特定の細菌抗原との接触に関してアッセイして、一般的な種類の病原体(グラム陰性、グラム陽性、スピロヘータ、球菌、または桿菌)、特定の病原体(バチルス；ボルデテラ；クロストリジウム；エシェリキア；ヘモフィルス；ヘリコバクター；レジオネラ；リステリア；マイコバクテリウム；ナイセリア；シュードモナス；サルモネラ；赤痢菌；ブドウ球菌；連鎖球菌；ビブリオ；エルシニア、および他の株)、および特定の病原性因子を有する特定の株、サブタイプ、または病原体、WMD株、ならびに院内感染をもたらす株の確定診断を提供することができる。APCを対象から単離し、疾患状態バイオマーカーのレベルの変化についてアッセイする。抗原接触に応答した種々のAPCにおける遺伝子およびタンパク質変化の特異性は、APCが接触した抗原の種類を決定する方法を提供する。
【００９１】
特定の抗原との接触後に(または敗血症などの生物学的状態に応答して)上方制御されるAPC内の遺伝子およびタンパク質は、より伝統的な診断アッセイに使用し得るマーカーセットを提供する。例えば、抗原接触したAPCの質量分析シグニチャーは、病原体への曝露を検出するための迅速でかつ感度の高い手段を提供する。しかし、タンパク質はまた抗体を作製するためにも使用でき、抗体は次いで他の個体において抗原接触を検出するための免疫学的アッセイにおいて、または治療経過をモニターするために使用することができる。
【００９２】
種々の病原性細菌株について以下に考察する。これらの病原体およびそれらが原因となる種々の疾患は、本明細書に記載するAPCに基づいた方法単独で、またはその方法をそのような生物および疾患の公知の医学的診断と併用して、検出および同定することが可能である。特定の病原性細菌株のより詳細な説明については、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Edition), George M. Garrity, Editor-in-Chief, Springer, New York (2001)を参照されたい。
【００９３】
バチルスは、桿菌型で内生胞子を形成する好気性または通性嫌気性グラム陽性菌である。大部分のバチルス種は無害な腐生菌であるが、2種は医学的に重要であると見なされている：炭疽菌およびセレウス菌(B. cereus)。炭疽菌は炭疽の病原因子であり、炭疽菌の重要な病原性遺伝子はプラスミドpXO1およびpXO2上に見出されている。セレウス菌は、下痢または嘔吐症候群を呈する食中毒を起こす日和見病原体である。
【００９４】
ボルデテラは、グラム陰性絶対好気性球桿菌である。7種のボルデテラ種が医学文献中に記載されている。それらは大きく2つの群に分類され得る：1つ目は百日咳菌(B. pertussis)、パラ百日咳菌(B. parapertussis)、および気管支敗血症菌(B. bronchisepitca)を含み、これらはそれぞれ哺乳動物の気道に定着する。第2群は第1群と遠縁であり、B.アビウム(B. avium)、B.ヒンジイ(B. hinzii)、B.ホルメシイ(B. holmesii)、およびB.トレマタム(B. trematum)を含む。百日咳菌、パラ百日咳菌、および気管支敗血症菌は、多くの病原性因子、およびbvgAS遺伝子座によってコードされるほぼ同一の病原性制御系を共有している。厳密なヒト病原体である百日咳菌は、重篤な痙攣性咳の発症を特徴とする高伝染性呼吸器疾患である百日咳の病原因子である。パラ百日咳菌はヒトに軽度の百日咳を起こし、またヒツジに慢性非進行性肺炎を起こす。気管支敗血症菌は、広範な動物に慢性呼吸器感染症をもたらす。
【００９５】
ライム病菌(Borrelia burgdorferi)は、米国で最もよく見られるマダニ媒介疾患、ライム病の病原因子であるスピロヘータである。このスピロヘータの保有宿主は、シロアシネズミおよびオジロジカである。感染した鹿ダニに咬まれることによって、伝染が達成される。マダニとの接触は通常、やぶおよび高草の地域で起こる。この疾患は通常、独特の皮膚病変、遊走性紅斑によって認識され、頭痛、項部硬直、筋肉痛、関節痛、疲労、およびリンパ節腫脹の可能性を伴う。全症例ですべての症状が見られるわけではなく、よって診断は複雑になる。抗生物質で治療でき、未確認および/または未治療の患者は、髄膜脳炎、心筋炎、またはさらには特に膝の関節炎を発症し得る。ライム病は短期もしくは些細な場合もあれば、または慢性、持続性、および身体の自由を奪う場合もある。慢性疾患状態は、抗生物質治療を行うかまたは行わずにやがて回復し得る。症例のわずかな割合では、抗生物質治療の後でも回復が見られない。
【００９６】
ピロリ菌(Campylobacter pylori)は、他のカンピロバクターと共通した多くの特質を有するが、これは新しい属を示し得る。ピロリ菌は大量のウレアーゼを産生し、よってこの特性を使用して迅速な診断試験が開発されている。この生物は主に、胃の表面上皮を裏打ちする胃粘膜層の下に見出される。ピロリ菌による感染は、慢性となり得る急性組織学的胃炎をもたらす。この細菌は、B型胃炎の病原因子である。無症候性の人々におけるこの生物の普及率は、年齢に関連しているようである。ピロリ菌は一般に、常に慢性胃炎に合併する消化性潰瘍疾患を有する患者に見出される。この生物の根絶は、胃炎の治癒および十二指腸潰瘍疾患の再発率の低下と関連している。
【００９７】
ボツリヌス菌は嫌気性グラム陽性胞子形成桿菌であり、その胞子は耐熱性が非常に高い。この菌は、土壌および海洋環境から単離され得る。いくつかの株(タンパク質非分解性)は、3.3℃まで下がった温度でゆっくりと増殖し得る。ボツリヌス菌は通常、4.6未満のpH値および0.94未満の水分活性値で毒素を産生しない。その毒素は既知の最も強力な毒素の1つであり。10-6 gで成人を殺傷するのに十分である。ボツリヌス中毒は、ギランバレー症候群などの他の疾患と混同される場合が多いため、臨床症状のみでの診断は困難である。最も直接的でかつ有効な方法は、患者の血清もしくは便中、または患者が消費した食品中の毒素の存在を示すことである。主張および記載する本アッセイ法よりも前に、この毒素を検出するために最もかつ広く用いられていた方法は、マウスバイオアッセイである。これは通常、毒素の単離後3日間を要する。
【００９８】
クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)またはC.ディフィシル(グラム陽性嫌気性菌)は現在、抗生物質摂取後に起こり得る結腸炎(結腸の炎症)および下痢の主要な病原因子として認められている。C.ディフィシル感染は、世界中で最もよく見られる病院(院内)感染の1つである。米国だけで、この感染は年間約300万の下痢および結腸炎症例をもたらす。この細菌は、多種多様な細菌を網羅する(広域性)抗生物質治療後に、病院および慢性疾患治療施設で主に獲得され、入院患者に下痢が大発生する最多原因である。C.ディフィシル関連結腸炎の主な特徴の1つは、結腸の細胞(結腸細胞)の破壊を伴う結腸組織(粘膜)における重症の炎症である。この疾患は最初に、抗生物質治療による、通常結腸に見られる有益細菌の変化を含む。この変化は、C.ディフィシルまたはその胞子が環境中に存在する場合、その細菌の定着を引き起こす。C.ディフィシルが蔓延しており、患者が頻繁に抗生物質を摂取する病院または介護施設では、C.ディフィシル感染は非常によく見られる。一方、外来患者として抗生物質治療を受けた個体は、C.ディフィシル感染を発症する危険性は非常に低い。実験室での研究から、C.ディフィシルは腸に定着した場合に、2つの強力な毒素、毒素Aおよび毒素Bを放出し、これらが結腸の内層中の特定の受容体に結合して、下痢および大腸または結腸の炎症(結腸炎)を最終的に引き起こすことが示されている。したがって、これらの毒素は、この疾患の発病または発症に関与している。破傷風菌(Clostridium tetani)は、破傷風の病原因子である関連株である。
【００９９】
ウェルシュ菌は、嫌気性グラム陽性胞子形成桿菌である(嫌気性とは、遊離酸素の存在下で増殖できないことを意味する)。この菌は環境中に広く分布し、ヒトならびに多くの家畜および野生動物の腸内に頻繁に存在する。この生物の胞子は、土壌、堆積物、およびヒトまたは動物の糞便汚染にさらされる区域中に存続する。ウェルシュ菌食中毒とは、ウェルシュ菌によって起こる、食物に起因する一般的な疾患を説明するために用いられる用語である。より重篤であるが稀な疾患もまた、C型株で汚染されている食物を摂取することによって起こる。後者の疾患は、壊疽性腸炎またはピッグベル疾患として知られている。ウェルシュ菌中毒の一般的な病型は、食中毒毒素を産生し得る多数のウェルシュ菌を含む食物を消費してから8〜22時間後に起こる強烈な腹部疝痛および下痢を特徴とする。この疾患は通常24時間以内に終了するが、個体によってはそれほど重篤でない症状が1または2週間持続する。脱水症および他の合併症の結果として、数例の死亡が報告されている。ウェルシュ菌によって起こる壊疽性腸炎(ピッグベル)は、致死的である場合が多い。この疾患もまた、汚染された食物中の多数の病原細菌を摂取した結果として発症する。壊疽性腸炎(ピッグベル症候群)による死は、感染および腸の壊死によって起こり、および結果として生じた敗血症に起因する。
【０１００】
ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)は、グラム陽性桿菌で胞子を形成せず非運動性、桿菌の一端が特徴的に膨張しており(こん棒状)、通性嫌気性、異染顆粒、重症型、温和型、中間型の3つの生物型であり；毒素を産生する。ジフテリアは毒素産生性感染症であり、病原生物が咽頭に定着して、真核細胞のタンパク質合成を阻害する毒素を産生する。局所的に、死滅した上皮細胞および白血球は、気管を妨害する可能性を有する偽膜の形成を起こし得る。気道が一掃されるかまたは気管開口術が行われなければ、死亡する場合もある。死亡はまた、毒素(生物ではなく)が全身に広がった場合に起こる心臓、腎臓、または他の器官の損傷に起因し得る。毒素はEF2(タンパク質鎖の伸長に関与する因子である伸長因子2)を改変し、その機能を失わせる。これによって体内の実質的にすべての臓器でタンパク質合成が効率的に停止するが、この毒素は心臓および腎臓に高い親和性を有する。毒素は単一ポリペプチド鎖であるがA-B型毒素であり、毒素の一部(Bドメイン)が毒素を細胞に結合させ、毒素の一部が細胞に入る。Bが結合した後、分子が切断されAが細胞に入る。AドメインはADPリボシル化活性を有し、NADのADPリボースをEF2中の修飾ヒスチジン残基、ジフタミドに付加する酵素である。ADPリボース基の付加が、EF2を本質的に失活させる。この毒素遺伝子は、コリネバクテリウムに感染し得るテンプレート・ファージのゲノムの一部であることが示されている。溶原化した後に、この生物は病原性および潜在的毒素産生菌となる。毒素は低い鉄濃度に応答してインビボで産生される。
【０１０１】
エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)(かつて大便連鎖球菌(Streptococcus faecalis)とされていたもので、また非溶血性連鎖球菌、γ溶血性連鎖球菌、腸球菌(enterococcus)、D群連鎖球菌、およびバンコマイシン耐性腸球菌(VRE)としても知られる)は、グラム陽性球菌で通性嫌気性であり、単一で、対となって、または短い鎖状で存在する。24時間後、血液寒天培地上で溶血は認められない(48時間後にα溶血が認められ得る)。この細菌は腸管および女性生殖菅の常在菌であり、尿路感染症、菌血症、および細菌性心内膜炎に時々関連する。この細菌は新たに院内伝染病原体として認識され、院内感染から回収されたうち3番目に多く見られる生物の1つであり、院内感染の10%、菌血症感染の9%、尿路感染の16%、および細菌性心内膜炎の症例の5〜15%の原因となっている。
【０１０２】
病原性大腸菌は、様々な種類の下痢、尿路感染症、敗血症、および髄膜炎を含む、種々の疾患をヒトに引き起こす。様々な重症度のヒト下痢症を引き起こす大腸菌株は、6つの主要なカテゴリーに分類されている：腸管毒素原性大腸菌(ETEC)、腸管侵入性大腸菌(EIEC)、腸管病原性大腸菌(EPEC)、腸管出血性大腸菌(EHEC)、腸管凝集性大腸菌(EAEC)、および分散接着性大腸菌(DAEC)。尿路感染症(UTI)は最もよく見られる腸管外大腸菌感染症であり、尿路病原性大腸菌(UPEC)に起因する。さらに、大腸菌は、特に新生児期に髄膜炎をもたらす、最も多く見られるグラム陰性菌である。髄膜炎および敗血症に関与する病原型は、髄膜炎関連大腸菌(MNEC)と称される。大腸菌のDAECカテゴリーは、HEp-2細胞単層への接着の特徴的な分散パターンの存在によって定義される。DAEC株には2つのサブクラスが存在する：LEEアイランドを有する分散接着性腸管病原性大腸菌(DA-EPEC)、およびAfa/DRファミリーの接着を示すDAEC。EAECの特徴には、腸管毒素原性大腸菌の易熱性または耐熱性エンテロトキシン分泌の欠如、およびHEp-2細胞またはガラス基質のいずれかの表面上における細菌の特有の「積みレンガ状」自己凝集によって認識される、HEp-2細胞への凝集パターンでの接着(AA)が含まれる。EAEC株は異種性であるが、大部分は接着因子AFFおよびディスパージン(Dispersin)、ならびに毒素EAST1、Pet、Pic、およびShET1をコードする病原性プラスミドの保存されたファミリーのメンバーを有する。EHEC株は以下の特徴を有する：腸細胞消失に関与する遺伝子座(locus for enterocyte effacement)(LEE)、および志賀毒素を産生する能力。
【０１０３】
EHEC株の主要な病原性因子には、接着因子Efa-1/LifA、インチミン、Paa、およびToxBが含まれる。毒素には、溶血素およびStxが含まれる。EIEC株は以下の特徴を有する：大部分の病原性大腸菌株は細胞外に残存するが、EIECは細胞内病原体である。EIECの病原性因子は、赤痢菌種の病原性因子と実質的に同じである。EIECに起因する赤痢は、伝統的な診断法では赤痢菌種のメンバーに起因する赤痢と臨床的に識別不能であるが、本方法を用いれば検出可能である。EIECは、赤痢菌種の遺伝子型または表現型特徴を有しながら、大腸菌の生化学的特性を有する。EIECは、S.フレックスネリ(S. flexneri)において記載されているプラスミドと機能的に互換的であり、そのプラスミドとかなりの程度のDNA相同性を共有する大きなプラスミドを含む。赤痢菌病理発生の重要な局面は、ID50が極めて低いことである。S.フレックスネリ、S.ソンネ(S. sonnei)、および志賀赤痢菌(S. dysenteriae)のID50は、約5000生物体である。一方、疾患を発症するには少なくとも108個のEIECが摂取される必要がある。EPEC株は以下の特徴を有する：接着および消失性(A/E)病変として知られる組織病理を腸管上皮上に生じ、また志賀毒素産生能の欠如を示す。典型的なEPEC株は大きな病原性プラスミド(EPEC接着因子(EAF)プラスミド)を有し、これによって束状線毛の生成、および宿主細胞表面におけるクラスターまたは微小コロニーの存在を意味する、局所的接着(LA)と称する特徴的なパターンでの上皮細胞への接着が可能になる。LAパターンはEPEC株の大腸菌にのみ特有であり、よって診断手段として広く用いられている。EPEC株の主要な病原性因子には、接着因子BFP、インチミン、リンホスタチン(Lymphostatin)/LifA、およびPaa、ならびに毒素CDTおよびEAST1が含まれる。ETEC株は以下の特徴を有する：ETEC株は、エンテロトキシンLT(易熱性エンテロトキシン)およびST(耐熱性エンテロトキシン)の産生により、他の大腸菌病原型と識別される。ETEC株は、LTのみ、STのみ、またはLTとSTの両方を発現し得る。腸管粘膜表面への接着を媒介する1つまたは複数の定着因子(CF)の産生は、ETEC病原性の中心的な段階である。MNEC株は以下の特徴を有する：K1莢膜多糖を有する大腸菌株は、新生児大腸菌髄膜炎に由来する分離株の主たるもの(約80%)であり、これらのK1分離株の大部分は限られた数のO型(例えば、O-18、O-7、O-1)と関連している。これらの株は一般に、自然な感染経路(例えば、経口)、腸定着および移行、より深い組織への浸透、ならびに血液脳関門を通過する前に必要な菌血症のレベルという経過をたどる。大腸菌K1は、ジッパー機構を介して脳微小血管内皮細胞(BMEC)に侵入し、細胞内で増殖することなくBMECを通り抜けて封入空胞中に移行する。MNEC株の主要な病原性因子には、接着因子S線毛および毒素CNF-1が含まれる。UPEC株は以下の特徴を有する：腸外病原性大腸菌(ExPEC)の亜群であり、典型的に、病原性アイランドと称する、糞便分離株中には見出されない大きな遺伝子ブロックを有する。UPECは、尿路上皮細胞に侵入してその中で複製する。UPEC株の主要な病原性因子には、接着因子Drアドヘシンならびに毒素CNF-1および溶血素が含まれる。
【０１０４】
野兎病菌は小さなグラム陰性好気性桿菌であり、2つの主要な血清型：ジェリソン(Jellison)A型およびB型がある。A型はより病原性の高い型である。感染が疑われる場合、野兎病菌は標準的な培地での培養が困難であるため、血清学的アッセイに基づいて診断を行い得る。凝集力価測定は感染の第1週後に行うことができ、4〜8週の間にピークに到達する。感染個体は通常、ストレプトマイシンまたはゲンタマイシンの10〜14日間という投与計画に供される。βラクタマーゼ活性に起因して、βラクタムは一般に効果がない。
【０１０５】
ヘモフィルスはグラム陰性球桿菌である。ヘモフィルス(血液を好むことを意味する)という属名は、好気性条件下で増殖するのに、この生物がヘム関連分子に依存することを指す。上気道で主に見出される偏性ヒト片利共生生物であるインフルエンザ菌(H. influenzae)の特徴は、多くの制御回路を欠く小さなゲノムを有する比較的単純な生活様式の必要条件を満たす。インフルエンザ菌は、腸内細菌科の中では稀であるが、ナイセリアおよびヘリコバクターなどの他のグラム陰性粘膜病原体の中では一般的なマイクロサテライトに起因して、主に表面タンパク質およびLPS成分の発現が異なる相異なった表現型を生じ得る。この株に共通した疾患には、主にb型莢膜を有するインフルエンザ菌(Hib)によって起こる、菌血症などの全身性感染症、髄膜炎、敗血症性関節炎、および低年齢小児の肺炎が含まれる。肺炎、中耳炎、副鼻腔炎、および気管支炎などの呼吸器感染症は、主に莢膜をもたない株によって起こる。ヘモフィルスの主な病原因子には、接着因子HMW1/HMW2、血球凝集性線毛、Hap、Hia/Hsf、OapA、およびP5タンパク質が含まれる。主要なエンドトキシンはLPSである。免疫回避は、P2タンパク質を通して促進される。
【０１０６】
ヘリコバクターは、ウォリネラ・スクシノゲネス(Wolinella succinogenes)、カンピロバクター種、およびアクロバクター(Acrobacter)種に近縁の、小さな曲がりくねったグラム陰性菌である。分離株は、ウレアーゼ、カタラーゼ、およびオキシダーゼ活性の存在によって生化学的に特徴づけられる。多くのヘリコバクター種は、ヒトおよび他の哺乳動物の腸または胆道に定着し得、そこで炎症反応を引き起こす。ピロリ菌(H. pylori)は、本質的に定着しにくい酸性環境であるヒト胃粘膜に定着し、宿主の免疫および炎症反応の発生にもかかわらず、数十年間この生態的地位で存続する能力を有する点で、並外れた細菌である。持続的な定着は、重篤な胃十二指腸疾患の重要な危険因子として認識されている。ピロリ菌は、病原性が顕著に異なる株があり、遺伝的に多様な種である。ヘリコバクターに見出される主な病原性因子には、接着因子BabA、HopZ、およびSabAが含まれる。主なエンドトキシンはLPSおよびVacAである。
【０１０７】
レジオネラは胞子非形成グラム陰性桿菌であって、γ-プロテオバクテリアのメンバーであり、これまでに42種および65の血清型のレジオネラが記載されている。選択された宿主細胞内で細胞内複製することは、環境中で増殖する主要でかつおそらくは唯一の手段である。これらの種の多くはヒトにとって病原性があることが報告されているが、在郷軍人病菌(L. pneumophila)が、疾患に関連した最も頻繁に見られる分離菌種である。この種は細胞内病原体であり、肺胞マクロファージ内の保護的ファゴソームに侵入してその中で複製する。ナトリウム耐性および低毒性を有する鞭毛をもたない細胞によって特徴づけられる複製期、ならびに形態学的に短く、太く、鞭毛をもち、かつ毒性が高い細胞によって特徴づけられる感染期、という2段階の増殖が認められる。マクロファージの死滅および溶解には、初期段階におけるアポトーシスの誘発および感染過程の後期における孔形成の誘導という2つの段階が必要である。在郷軍人病菌の病原性の要は、ファゴソーム-リソソーム融合を妨げる能力にあると考えられる。レジオネラの主要な病原性因子には、Hsp60、IV型線毛が含まれる。エンドトキシンはLPSを含む。
【０１０８】
リステリアはグラム陽性で桿状であり、莢膜をもたず胞子を形成しない細菌である。この属は以下の6種からなる：リステリア菌(L. monocytogenes)、L.シーリゲリ(L. seeligeri)、L.ウェルシメリ(L. welshimeri)、L.イノキュア(L. innocua)、L.イバノビイ(L. ivanovii)、およびL.グレイイ(L. grayi)。リステリア菌およびL.イバノビイは典型的な通性細胞内寄生生物であり、食細胞および非食細胞に侵入し、その中で生存し、増殖し得る。侵入の様式はジッパー機構である。これは、侵入する際に、細菌周囲の宿主細胞膜をジッパー開閉する段階を伴う。細菌リガンドは、宿主細胞上の表面分子と相互作用する。受容体は一般に、細胞接着および/または細胞骨格機構の活性化に関与するタンパク質である。リガンド-受容体相互作用により、アクチン細胞骨格の局所的再構成、および結果として原形質膜により細菌体が堅固に封入にされることになる他のシグナルが誘導される。リステリアは、アクチンに基づく細胞内移動によって細胞から細胞へ直接伝播する。リステリア菌はヒトおよび動物の両方に感染し、髄膜炎、敗血症、および流産を引き起こす。L.イバノビイはヒツジおよびウシに限られ、敗血症、新生児敗血症、および流産をもたらすが、脳感染症は引き起こさない。これらの細菌に起因する感染症は、リステリア症として知られている。他の種は一般に、病原性がないと見なされている。
【０１０９】
マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム科(family of Mycobacteriaceae)の中の細菌の1つの属である。これらはグラム陽性であり、50種を超えるその大部分が、土壌細菌ストレプトミセス(Streptmyces)およびアクチノミセス(Actinomyces)と近縁の非病原性環境由来細菌である。結核菌、ライ菌(M. leprae)、およびM.ウルセランス(M. ulcerans)を含む数種は、高度に繁栄している病原体である。病原性マイコバクテリアは、急性もしくは慢性疾患として発現し得るか、または後に再度表面化する可能性を有しつつ臨床的に無症候性であり得る長期感染を確立するのが非常にうまい。結核菌は結核の病原因子である。ライ菌はライ病の病原因子である。L.ウルセランスは、ブルーリ潰瘍の病原因子である。マイコバクテリウムの主要な病原性因子には、抗原85、LAM、およびMmaA4が含まれる。マイコバクテリウムの主要な毒素は、ホスホリパーゼCである。
【０１１０】
ナイセリアはグラム陰性双球菌であり、その隣接面は扁平である。この属は、2つのヒト病原性種、淋菌(N. gonorrhoeae)および髄膜炎菌(N. meningitidis)、ならびに動物に対して病原性をもつかまたはヒトもしくは動物の常在菌叢である多くの他の種を含む。淋菌および髄膜炎菌は、それらの唯一の宿主、ヒトに適応する能力に関して例示的である。いずれの種も、ヒト粘膜組織に定着する能力を有する。淋菌は主に、密接な性的接触後に尿直腸または肛門直腸粘膜に感染し、髄膜炎菌は、感染した呼吸飛沫の吸入後に上気道に定着する。病原性ナイセリアの1つの驚くべき特徴は、それらが自身の表面構造を変える大きな能力である。宿主細胞への侵入様式は、上記のジッパー機構を介して起こる。淋菌は淋病の病原因子であり、髄膜炎菌は流行性髄膜炎をもたらす病原因子である、主要な病原性因子には、LOS、IV型線毛が含まれる。
【０１１１】
シュードモナスは、γ-プロテオバクテリア科(γ-Probacteria family)に属する遍在性細菌である。シュードモナス属は、臨床的に重要なヒト病原体である緑膿菌(P. aeruginosa)、農業上重要な植物病原体P.シリンゲ(P. syringae)、および非病原性バイオレメディエーション因子(P. putida)を含む。緑膿菌は主要な日和見性ヒト病原体であって、生物膜を形成する能力が顕著であり、グラム陰性菌の中で最も特徴づけられたクオラムセンシング系を有する。緑膿菌は、コンタクトレンズ装着者における眼感染症から、敗血症ショックにつながる熱傷後感染および創傷感染、ならびに嚢胞性線維症患者または他の免疫不全患者における肺感染症に至るまで、種々の日和見感染を起こし得る。
【０１１２】
サルモネラはグラム陰性桿菌であり、以下の2つの種を含む：2,000を超える血清型に細分されるS.エンテリカ(S. enterica)およびS.ボンゴリ(S. bongori)。遺伝学的類似性および宿主範囲に基づき、種は以下の6つの亜種にさらに細分されている：エンテリカ(1群)、サラマエ(salamae)(2群)、アリゾナエ(arizonae)(3a群)、ジアリゾナエ(diarizonae)(3b群)、ホウテナエ(houtenae)(4群)、およびインディカ)(6群)。S.ボンゴリは、最初は亜種5として分類されていた。S.エンテリカは、チフス菌およびネズミチフス菌をはじめとする、ヒトに対して病原性をもつ多くの血清型を含む。サルモネラはM細胞を介して腸管粘膜を横切り、パイエル板に定着し、リンパ管および血流を介して肝臓および脾臓に伝播する。新生の膜結合区画から脱して細胞質内で複製する赤痢菌、リステリア、およびリケッチアとは対照的に、サルモネラはその膜結合空胞中で生存しようとする。ネズミチフス菌はヒト胃腸炎の主な原因であり、ヒト腸チフスのマウスモデルとして使用される。チフス菌は、全身性熱疾患腸チフスをもたらすヒト特異的病原体である。
【０１１３】
赤痢菌は、エシェリキアに近縁のグラム陰性腸内桿菌である。赤痢菌は、以下の4つの種に分類される：志賀赤痢菌、S.フレックスネリ、S.ボイディイ(S. boydii)、S.ソンネ。赤痢菌は、通性細胞内病原体である。ヒトへの最初の侵入経路は、粘膜関連リンパ節を覆っている濾胞関連上皮(FAE)中のM細胞である。極性化した上皮細胞への侵入は、基底外側から最も効率よく起こる(サルモネラおよびEPEC/志賀毒素産生大腸菌は、頂端側から宿主細胞と相互作用し得る)。赤痢菌、リステリア、およびリケッチアは、食胞から脱し得り、細胞質の細胞骨格成分を使用して移動を達成し、細胞間伝播をもたらし得る、これまでに見出されたたった3つの細菌属である。赤痢菌感染に起因する疾患には、志賀毒素(志賀赤痢菌(血清型1のみ))によって起こる細菌性赤痢および赤痢が含まれる。
【０１１４】
ブドウ球菌は、ミクロコッカス科(Micrococcaceae family)に属するグラム陽性球菌である。これらは、2つの主要な群：黄色ブドウ球菌および非黄色ブドウ球菌に分類される。黄色ブドウ球菌は、市中感染および院内感染の主な原因の1つである。非黄色ブドウ球菌種の中では、表皮ブドウ球菌(S. epidermis)が最も臨床的に重要である。ブドウ球菌は、主に細胞外病原体である。接着は、MSCRAMM(接着性基質分子を認識する微生物表面成分)と称する表面タンパク質アドヘシンによって媒介される。表皮ブドウ球菌の病原性に寄与する1つの特徴は、プラスチックに接着し、生物膜を形成する能力である。ブドウ球菌は、表在膿瘍および創傷感染から、骨髄炎、心内膜炎、および敗血症などの重大な全身性感染、毒素性ショック症候群、ブドウ球菌性猩紅熱、ならびにブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群に及ぶ、多種多様な疾患をもたらす。表皮ブドウ球菌は、典型的にプラスチックインプラント上の生物膜に起因するカテーテル関連感染症および心内膜炎の病原因子である。毒素には、α-溶血素、β-溶血素、δ-溶血素、γ-溶血素、表皮剥奪毒素、PVL、SE、およびTSST-1が含まれる。
【０１１５】
連鎖球菌は、顕微鏡観察下で鎖のように見えるグラム陽性好気性菌の混成群である。この属は、血液寒天培地上での溶血の種類によって3群に分類される：β-溶血性(赤血球の透明な完全溶解)、α溶血性(不完全な緑色の溶血)、およびγ溶血性(溶血なし)。ランスフィールド分類は、細胞壁糖質の抗原性の差に基づく(A〜V群)。肺炎連鎖球菌の表面糖質抗原は特定のランスフィールド群に相当せず、これは連鎖球菌の化膿(膿産生)株とみなされ得る。化膿連鎖球菌(S. pyogenes)は、咽頭炎、猩紅熱、膿痂疹、丹毒、蜂窩織炎、敗血症、毒性ショック症候群、壊死性筋膜炎およびその続発症、リウマチ熱、ならびに急性糸球体腎炎を含む、多種多様な疾患の原因である。S.アガラクチアエ(S. agalactiae)は、新生児髄膜炎、細菌性敗血症、および肺炎の原因である。肺炎連鎖球菌は、肺炎の主な病原因子である。
【０１１６】
梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)は、梅毒の病原因子である。これは、外膜および細胞膜、薄いペプチドグリカン層、ならびにペリプラズム鞭毛を有するらせん状から正弦曲線状の細菌、スピロヘータである。梅毒トレポネーマの発病の機構はほとんど理解されていない。既知の病原性因子は同定されておらず、外膜はタンパク質を欠いてほとんど脂質である。したがって、先行技術の梅毒の診断検査は最適以下である。
【０１１７】
ビブリオはグラム陰性であり、さらにアエロモナス(Aeromonas)属およびプレシオモナス(Plesiomonas)属を含むビブリオ科(family Vibrionaceae)の一部である。コレラ菌はいくつかの医学的に重要な種の1つであり、その他には腸炎ビブリオ菌(V. parahaemolyticus)およびV.バルニフィカス(V. vulnificus)がある。コレラ菌は十分に認識されており、ヒト腸疾患コレラの病原因子として広範囲に研究されている。この疾患は、微生物がより深い組織へと侵入することはなく粘膜表面で起こり、疾患症状は主に単一分子、コレラ毒素の作用に起因する。
【０１１８】
エルシニアはグラム陰性球桿菌であり、11種から構成され、そのうち3種は齧歯動物およびヒトに対して病原性がある：ペスト菌、仮性結核菌(Y. pseudotuberculosis)、およびエンテロコリチカ菌(Y. enterocolitica)のいくつかの生物型。病原性は本質的に、エルシニア病原性に関与するプラスミドを意味してpYVと称される、保存された70 kbプラスミドの存在によって付与される。エルシニアは、リンパ組織に対する向性、およびYsc-Yop III型分泌系に起因する、宿主の一次免疫応答に抵抗する顕著な能力を示す。細胞侵入の様式は、ジッパー機構によって起こる。ペスト菌は、腺ペストまたは黒死病の病原因子である。仮性結核菌は、腸管膜リンパ節炎および敗血症の病原体である。最もヒトに蔓延しているエンテロコリチカ菌は、急性腸炎から腸管膜リンパ節炎に及ぶ胃腸症候群を引き起こす。
【０１１９】
病原体参照ライブラリー
本発明は、電子的に検索可能なプロテオミクス病原体参照ライブラリー(PPRL)の作成を提供するが、これは、診断および治療目的でヒトにおいて生物学的病原体および化学的毒素を検出するために、ならびに環境中および家畜中の同様物を検出するために(BSEおよび細菌汚染など)、APCを用いる細胞に基づくアッセイ法と併用して用いられる。プロテオミクス病原体ライブラリーはまた、食物供給の完全性を損なうためにテロリストによって用いられる可能性のある細菌病原体に関して、およびより害は少ないが同様に危険な供給源から生じる病原性汚染を一般的に検出するために、食物をスクリーニングする際の参照としても有用である。
【０１２０】
病原体シグニチャーを得ることができるが、より好ましくはAPCにおける遺伝子およびプロテオミクス変化、好ましくは病原体と接触後のAPCにおける細胞の遺伝子およびプロテオミクス変化の全体をアッセイして、接触した病原体に関する具体的な詳細を提供する。1つの局面において、病原体参照ライブラリーは、病原性細菌と接触した種々のAPCの個々の電子的に検索可能な記録またはデータセットから構築される。これについては、実施例6でさらに詳述する。病原体参照ライブラリーによって診断が容易になり、診断では、病原体参照ライブラリー記録中に、対象試料中のAPCシグニチャープロファイルとのおおよその一致が検出されるまで、1つまたは複数の未知病原体による感染を有する対象から取得した試料を病原体参照ライブラリー中の様々なデータセットと比較する。
【０１２１】
病原体参照ライブラリーを構築するには、最初に、既知病原体に関する個々のシグニチャーを、例えば分光学的方法によって記載した通りに取得する。これらを参照シグニチャーとして使用し、各参照試料に由来する複数のシグニチャーを用いて、個々の病原体または薬剤のコンセンサスシグニチャーを導出する。コンセンサスシグニチャーを用いて知識ベースを作成し得り、これを用いて、病原体データベース中に保存された情報に基づいて、未知の病原性試料を同定することができる。抗原接触に応答したAPCプロテオミクス変化の記録を有する、プロテオミクス病原体参照ライブラリーが好ましい(PPRL)。特定の態様において、ライブラリーは、病原体を特徴づける他のデータと共に、特定の病原体に接触したAPCのコンセンサスシグニチャーを有するデータ記録を含む。他のデータには、例えば取得日、株情報、緩衝液組成、試料供給源、APC細胞種などの、病原体試料に関連するデータフィールドの典型であるASCIIデータ(例えば、単純な英数字データを含む)が含まれる。
【０１２２】
データ記録は任意の市販の標準的なデータベースに保存するか、またはデータ記録にインデックスを設け、様々なコンピュータアプリケーションによって容易にアクセスできるように、専用データベースを作成してデータ記録を保存する。データ記録はまた、データファイルを1つのコンピュータシステムから別のコンピュータシステムに容易に送信できるように、XMLファイルまたは別の適切なタグつきフォーマットとして保存し得る。
【０１２３】
1つの態様において、シグニチャーは、例えばコンピュータ内の電子記録の形態で、データベース中に保存する。そのようなデータベースは、本明細書に上記したように、知識ベースと統合され得るか、またはそれによって提供され得る。データベースは、例えばパケット交換網によりネットワーク化し得る。データベースへのアクセスは、TCP/IP接続または任意の適切なインターネット接続などの多くの接続手順によって達成し得る。データベースはまた、例えばコンパクトディスクなどの光媒体上に含まれる独立型であってよい。コンピュータ実行データベースは典型的に、当業者に周知であるように、表またはその他のユーザー定義可能なフィールドの形態で整理されたデータの収集物である。特定の態様において、本発明は、関係データベース中の指定のデータベース表中にシグニチャーを保存する段階を提供し、このデータベースを検索して、1つまたは複数の検索可能なフィールドに特定された検索語を満たす一連の要素オブジェクトを同定するデータを含む検索結果を返すことができる。検索結果は、問い合わせの検索語を満たす要素オブジェクトのリストとして保存し得る。要素オブジェクト値は、1つまたは複数の表示可能なフィールドに関して表示され得る。特定の態様においては、シグニチャーおよび特徴値データベースを実装するため、ならびに未知病原体のシグニチャーに相当する一致物を見出す目的でデータベースを検索するために必要なデータモデルの要素を保存するためのデータベースとして、実験室データ管理システムを適切に使用し得る。MSピーク、名称、構造、基礎構造、ならびに、技法、分子量、CAS登録番号、および化学的同義語などの特徴フィールドによる検索が可能である。クライアントプロセスとデータベースサーバープロセスの間の通信は、当業者に周知である技法を用いて実行され得る。例えば、そのような通信は、XMLなどの自己記述的拡張可能フォーマットでデータを持続的に表示することにより提供され得る。クライアントプロセスは実験に由来するデータを受け取るかまたは作成し、既知の技術を用いて、データベースサーバープロセスと通信するためのフォーマット(例えば、XMLデータストリーム)でそのデータを実装する。データベースサーバープロセスは、クライアントプロセスからそのような通信を受信した際に、入ってくるデータストリームを解析して、データストリームからオブジェクト記述を抽出する。
【０１２４】
標準的なまたはカスタムのデータベース中にデータ記録を保存することに加え、記録の保存および管理を、適切な知識管理ツールを使用して強化することができる。そのような知識管理ツールは典型的に、ユーザーが追跡したい情報を同定することを可能にし、それを理路整然とした様式で整理し、情報および参照ファイルを追加して記録に関する知識を強化する。例えば、特定の病原性試料に関して、知識管理ツールは、特定のシグニチャーを得るために使用したAPC、生物の特徴、関連試料データ、およびライブラリーユーザーによって加えられた他の情報またはコメントを含む、その病原性試料に関連した情報の理路整然とした保存を可能にし得る。したがって、知識ベースは、検索アプリケーションによって提供される特定の包含または排除基準に最も適したデータ記録のサブセットを同定または生成できるように、検索アプリケーションによって検索され得る個々の参照データ記録の収集物を提供する。
【０１２５】
例示的なインフォマティクス参照システムは、多くのスペクトルデータベースとスムーズに連動するよう設計された、BioRad LaboratoriesのKnow-It All(登録商標)インフォマティクスシステムである。
【０１２６】
以下の実施例では、質量分析技法を使用したプロテオミクス病原体参照ライブラリー(PPRL)の作成について詳述する。最初に、それぞれの記録が特定の病原体および特定のAPCに関するスペクトル情報を有する、複数のデータ記録を含むデータベースを構築する。既知の病原性試料をAPCと接触させ、次いでこれを質量分析計で処理して、これらの抗原接触APCのシグニチャーを作成する。スペクトルシグニチャーを、分子または生物の構造情報、機器パラメータ、病原体試料の物理的および化学的特性、画像および文書、ならびに他の情報と共に保存し、単一のデータ記録として保管されるデータセット中に蓄積する。次いで、知識管理ツールにより参照データ記録を整理し、処理し、注釈をつけてから、データベース中に保存する。遺伝子およびタンパク質(バイオマーカー)発現情報のさらなるデータベースは、特にスペクトルデータベースと共に解析され得る記録を有する場合に望ましい。情報をハイパーリンクすることによって、遠隔サーバー上にデータを保存することができ、1つまたは複数の遠隔地からこれにアクセスすることができるようになる。
【０１２７】
未同定の病原体を特徴づけるには、未同定の病原体と接触したAPCで分光分析を行い、分光学的シグニチャーファイルおよび関連データを生成する。好ましい分光学的シグニチャーは、質量分析シグニチャーである。次いで、検索アプリケーションまたはエキスパートシステムで、未同定病原体と既知の病原体のデータベースとの比較を行い、記録の類似性およびユーザー定義の規則に基づいたアプローチに基づく所望の同定を行う。MSスペクトル検索については、スペクトルの比較を行う場合に、ピーク位置の不確実性を考慮しなければならない。好ましくは、ピーク位置の不確実性の許容範囲は、システムのユーザーによって設定される。さらに、検索アルゴリズムが未知スペクトルと参照スペクトルのピークを比較してから、ユーザーは、検索するスペクトルがピークを有するべきまたは有さないべき位置を特定すること、比較するピークの最小の大きさおよび数を特定すること、ならびにピーク強度に基づいて検討物を包含または排除することが許容されるべきである。これらの基準に基づき、このシステムによって、未知の問い合わせ記録と類似した潜在的参照記録が同定される。
【０１２８】
同定された記録により特定病原体への曝露が示唆され、次いでその記録が適切な報告フォーマットでユーザーに報告される。未知記録と参照データベース中の記録との間に一致が認められない場合には、上記のように解析され、データベース中に追加され得る新たな記録が見出された可能性がある。未同定病原体の名称が決定され得ないとしても、そのシグニチャーを他の未同定病原体に対する今後の一致のためにデータベース中に加えて、この未同定病原体の出現の繰り返しを確証することができる。特定の態様においては、未同定病原体は既知病原体の局所データベースと比較し得、一致が認められない場合に、未同定病原体を、遠隔地に位置し得るネットワーク化された既知病原体のその他のデータベースと比較し得る。このようにして、局所地域では比較的稀である病原体でも、その病原体がより蔓延しているか、またはより広く研究されている地域の遠隔データベース中の既知病原体と一致する可能性がある。例えば、地方の病院は、患者対象から得られた未同定の病原体の分光学的シグニチャーを、Atlantaの疾病管理センター(Center for Disease Control)のデータベース中に含まれる病原体記録と一致させるよう試みることができる。
【０１２９】
一般に、検索アプリケーションまたはエキスパートシステムは、被験試料の分光学的シグニチャーを、データベース中に保存された既知病原体のシグニチャー記録と比較することによって、入力した被験試料を同定する。好ましくは、シグニチャーは未知感染を有する対象から得られたAPCのものであり、これを参照病原体と接触したAPCのAPCシグニチャーと比較する。エキスパートシステムは典型的に、PPRLのユーザーに情報を提供する、およびPPRLのユーザーから指示を受けるためのユーザーインターフェースを含む。特定の態様においては、ユーザーインターフェースにより、ユーザーがパケット交換網などのネットワーク上でシステムを操作することが可能となるが、独立型システムもまた使用可能である。検索アプリケーションまたはエキスパートシステムは、PPRLデータベース中の特定の記録を同定および選択する、コンピュータ可読の命令セットおよび構成データを提供する。
【０１３０】
エキスパートシステムまたは検索アルゴリズムは典型的に、特定の基準を満たす記録を選択するために、決定木、解析論理、およびパターン認識ルーチンの組み合わせを含む。解析論理ルーチンによって、システムがユーザーインターフェースを介してユーザーと情報のやり取りを行い、同定試料と比較するための知識ベースから既知病原体シグニチャーを回収し、適切な出力フォーマットでアウトプット文書を作成することが可能になる。
【０１３１】
決定木ルーチンは、解析する必要のある知識ベース中の記録の領域を狭める上で用いられ得る。例えば、被験試料が細菌性の病原体を含むことをユーザーが知っており、ユーザーがこの情報をインターフェースを介して入力し得る場合、エキスパートシステムは、検討物から化学物質シグニチャーおよびウイルスシグニチャーを排除することになる。パターン認識ルーチンは、狭められた記録のサブセットを解析し、最適な一致物を同定する。パターン認識ソフトウェアは好ましくはニューラルネット技術に基づき、本明細書内でより詳細に考察するように、分光学的シグニチャーに基づいて未知病原体を同定する上でパターン認識を使用する。
【０１３２】
1つの態様では、既知病原体(またはこれと接触したAPC)のコンセンサスな分光学的シグニチャーそれぞれについて、一連の特徴値を抽出する。次いでこれらの特徴値を、特徴値セットとして、または特徴値セットに由来する複合値として保存し得る。未知病原体を評価する際には、その特徴値セットを抽出し、データベースと比較して、正確なまたはおよその一致物を見出す。例えば、既知病原体の特徴値セットがデータベース中に保存されている場合には、未知病原体の特徴値セットを導出し、データベースと比較して、それがデータベース中に存在する特徴値セットと一致するかどうかを見出す。一致物が認められる場合、未知病原体は、データベース中の特徴値セットが一致した既知病原体として同定される。同様に、特徴値セットに由来する複合値がデータベース中に保存されている場合には、やはり未知病原体の複合値を導出し、次いで複合値を比較してデータベース中の一致物を見出す。一致物が認められたならば、未知病原体は、データベース中の複合値が一致した既知病原体として同定される。当業者によって認識されるとおり、分光学的シグニチャーの特徴値セットは、単に分光学的出力中の相対強度セットを代表するものであってよい。または、分光学的出力中の相対強度セットから複合値を導出することができる。
【０１３３】
パターン認識
特定のその他の態様では、既知病原性試料の分光学的シグニチャーに由来するデータおよび/または像の知識ベースに基づいて、未知病原性試料の分光学的シグニチャーを同定するために、パターン認識で用いられる周知の技法を使用する。そのようなパターン認識問題を解く際のニューラルネットワークの使用は、文献で広範囲に論じられている。例えば、CORNELIUS T. LEONDES ED., IMAGE PROCESSING AND PATTERN RECOGNITION (Academic Press 1998)を参照されたい。
【０１３４】
パターン認識の1つの定義は、パターン中の特徴およびそれらの関係に基づいて、視覚的または論理的パターンがクラスに割り当てられる情報削減過程である。したがって、この定義は目の前の問題に対して良好に振る舞い、分光学的シグニチャー(それらに由来するデータを含む)は、既知病原体の分光学的シグニチャー(それらに由来するデータを含む)に対応する既知クラスの1つに割り当てられ。
【０１３５】
パターン認識解決法の1つの一般的モデルは、Lampinen et al., Pattern Recognition, in IMAGE PROCESSING AND PATTERN RECOGNITION, 1-53 (Cornelius T. Leondes, ed., Academic Press 1998)に記載されており、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。このモデルでは、パターン認識解決法における以下の段階を説明している：(1) データ収集；(2) 登録；(3) 前処理；(4) 分割；(5) 正規化；(6) 特徴抽出；(7) 分類；および(8) 後処理。これらの段階をそれぞれ以下の項で説明する。
【０１３６】
(1) データ収集
データ収集段階は、既知病原体(訓練データ)の分光学的シグニチャーの収集および同定または分類しようとする未知病原体の分光学的シグニチャーの収集を含む。分光学的シグニチャーの収集過程については、本出願の他の部分でより詳細に論じてある。
【０１３７】
(2) 登録
登録段階では典型的に、モデルに対するデータの非常に基礎的な適合化が行われる。例えば、パターン認識に関する音声認識の状況では、登録段階は、分類される必要のある発話が単離され得るように、全くのノイズである音声部分を決定する段階を含む。分光学的シグニチャーの状況では、訓練データ(既知病原体のシグニチャー)および被験データ(未知病原体のシグニチャー)が分光システムの出力に基づいて実に容易に同定されることから、この段階は単純である。
【０１３８】
(3) 前処理
データの前処理は、シグナルに対するノイズの効果を軽減するために行われる。したがって、パターン認識過程を妨げるデータの特徴は除去され得、パターン認識問題を促進するデータの特徴は増強され得る。
【０１３９】
(4) 分割
この段階では、処理されたデータが、分類の意味ある実体である下位区分に分割される。分光学的シグニチャーを同定する状況では、(分光計からの関連出力に基づいて)シグニチャーを同定する課題は、比較的単純である。
【０１４０】
(5) 正規化
すべてのパターン認識問題における問題の1つは、同定しようとする病原体に本来備わっている変動に基づくか、またはデータ収集および処理段階によって導入される変動に基づく、同定しようとするシグニチャーの変動である。したがって、使用し得るアプローチの1つは、分類する対象の変動に対して不変である特徴抽出または分類アルゴリズムを使用することである。この過程は正規化と称され、この過程は自由度の少なくともいくらかの損失という副作用がある。その結果、データの本質的次元の次元が減少する。分光学的シグニチャーの状況では、正規化は、分光学的出力の相対強度のパターンに基づいて容易に実行され得る。したがって、いずれかの種類の絶対値を用いるのではなく、相対強度(またはシグニチャー)を使用することが、パターン認識でさらに使用するためのデータを正規化するのに役立つ。
【０１４１】
(6) 特徴抽出
特徴抽出の目的は、クラス間の変動を最大限にしつつクラス内の変化を最小限に抑えるのに役立つという意味で、分類目的に最も関連のある情報を生データから抽出することにある。特徴抽出はまたデータの次元を低減するのにも役立ち、特徴空間の次元が増加すると訓練データがすぐに希薄となって分類性能の低下を招く「次元の呪い」という問題を回避するのに役立つ。例えば、その全体が本明細書に組み入れられるLampinen et al.の11〜20ページで論じられているように、特徴抽出の過程ではニューラルネットワークが用いられ得る。
【０１４２】
(7) 分類
これは、知識ベース中に保存されている既知病原体シグニチャーに基づいて未知病原体シグニチャーが分類される、最も重要な段階である。分類過程の出力は、既知病原体の1つに相当するクラスの1つが個別に選択されること、またはいずれの既知病原体クラスも一致しないことことが示唆されることである。さらに、分類過程はまた、特定の分類が行われた際の信頼度を示唆する確率度を示す。
【０１４３】
統計的方法およびニューラル分類方法は、Lempinen et al.の20〜37ページで論じられており、その開示は全体として本明細書に組み入れられる。統計的方法は、ノンパラメトリック法が得られた例示的データを直接参照するのに対して、特徴密度ベクトルに対して特定の関数形式が想定されるパラメトリック法を含む。参照シグニチャーとの照合の状況では、パラメトリック法およびノンパラメトリック法のいずれもが有利に使用され得る。
【０１４４】
ニューラル方法は、それらの学習過程に基づいて分類されることが多い：教師あり学習アルゴリズムは、訓練期が始まる前にすべての例示的データが分類されることを必要とし、一方、教師なしアルゴリズムはラベルなしデータも使用し得る。未知病原体シグニチャーの分類には、教師あり学習アルゴリズムが有利であると考えられ、教師なし学習アルゴリズムは例えば特徴抽出過程により適している可能性がある。
【０１４５】
特定の態様においては、木に基づく分類子モデルが使用され得る。例えば分類木が二分木である場合には、例えば特徴値との比較による基準に基づいて、左に分岐するかまたは右に分岐するかの決定が各ノードで行われる。木拡大(tree-growing)アルゴリズムは、最大限に純粋なノードの形成を試みつつ、パターン空間を超長方形に再帰的に分割する。木を適度な大きさに保持するために、停止基準が用いられる。木に基づく市販の分類子は、例えば、W.N. VENABLES AND B. D. RIPLEY, MODERN APPLIED STATISTICS WITH S-PLUS (Springer Verlag, New York, 1994)に記載されている、S-Plus統計的ソフトウェアパッケージによって提供される。
【０１４６】
特定の態様では、原型の分類子もまた有利に使用され得る。これらはメモリー中に訓練試料を保持し(または知識ベースからそれらを読み込み)、記憶された訓練試料と入力データとの間の距離に基づいて分類する。そのような分類子のいくつかの例には、k-最近傍分類子(k-NN)、学習ベクトル量子化器(LVQ)アルゴリズム、および学習k-NN分類子が含まれ、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられるLempinen et al.の30〜32ページに記載されている。
【０１４７】
実施例1
以下の実施例は疾病のバイオセンサーとしてのAPCの使用を詳細に記載している。種々の病原体に曝露したDCの参照標準を作製し、その後の患者アッセイに使用して、曝露を判定し、病原体に対する免疫学的応答を定性する。
【０１４８】
遺伝子発現分析：
種々のドナーのDCおよびマクロファージ/単球を病原体の存在下および非存在下において培養して、病原体に対する応答を開始し、次いで回収する。総RNAを未感染および感染細胞から抽出し、参照アレイを作製するために使用する。または、参照アレイを作製する前に総RNAをcDNAに変換する。患者由来のDC試料を回収して、核酸を抽出し、マイクロアレイにハイブリダイゼーションし、次いでスキャンする。マイクロアレイのデータ処理において、本発明者らは、平均差強度値の一定の変化に基づいてフィルタリング方法を使用する。生データの分析のためには、本発明者らは、極度にロバスト性の発現データ分析プラットホームであるGenNetを使用する。このようなプラットホームの使用はハイスループット要求を満たし、拡張可能である。
【０１４９】
病原体の遺伝子型分け：
DCおよびマクロファージは病原体貯蔵所として働くので、これらの細胞の濃縮および病原体の存在についての遺伝子型分析の使用は新規スクリーニング方法を提供する。ウイルスおよび細菌疾患の従来の診断方法は、例えば、血液培養による病原体自体の検出または例えばPCRによる病原体特異的タンパク質もしくはDNA/RNAの検出およびこれらの所見と臨床症状の相関を必要とする。従来のスクリーニング方法に関連する限界を克服するために、本発明者らはハイスループット遺伝子型アッセイを開発しており、大多数の病原体をスクリーニングするために使用する。また、これらのアッセイは微生物株の分子変異を検出することができる；したがって、例えば、特定の細菌、ウイルス、心筋または寄生虫株等の感染経路、起源および関係の識別を可能にする。
【０１５０】
質量分析法(MS)：
ペプチド同定の成功および再現性(productivity)を改善するために、本発明者らはSELDIおよびMALDI時間飛行型(TOF)質量分析計を使用した。これらは、ペプチド質量フィンガープリントを検出するために最も一般的に使用されている質量分析方法である。このMALDI-O-TOFシステムは、MALDIソースからリフレクションTOF質量分析計に試料イオンを導入するために直交注入を使用している。従来の軸方向MALDI-TOFシステム(直線またはリフレクションモード)のMALDIはTOFMSに直接接続されている。この直接接続は、試料標的に関連する任意の不一致が検出器に運ばれるので、機器の精度、分解能および感度に影響を与える。一方、直交型幾何学を使用すると、MALDIソースはTOFから分離され、従って不一致を排除し、性能を増加し、方法の開発を単純化する。処理後の培養物と比較した未処理の培養物に見られるタンパク質シグニチャーを確立する。
【０１５１】
バイオマーカー検出：
バイオマーカーを検出するために、本発明者らは市販のパターン認識を使用し、Eclipse Diagnostics社製のソフトウェアまたは同様のソフトウェアを発見する。このソフトウェアは、ゲノムおよびプロテオミクスバイオマーカーおよび他の複雑な生物学的関係の迅速な検出を可能にする。これらのバイオマーカーはデータベースの一部であり、病原体特異的参照として使用される。
【０１５２】
利点
第一に、骨髄細胞は細胞内に病原体を濃縮している；従って、検出感度を改善した。第二に、cDNAマイクロアレイ技術は、試料あたり52,000種以上の遺伝子を分析することができる高分解能技術であり、血液から病原体を培養することから独立している。本発明者らのマイクロアレイ構成方法は、遺伝子あたり長い70merプローブデザインおよび30倍内部重複性に関係する。第三に、症状が生じる前に診断する能力である。遺伝子操作した病原体の場合には、新たな病原体を検出するために従来の分子生物学、ELISAまたはPCRに基づいた技術を作製しなければならない。主要な細胞経路(例えば、アポトーシス、炎症、NFκBおよび炎症媒介因子)を評価することによって、本発明者らは曝露の早期事象を検出することができる。本発明者らは、長期培養または分化を推し進めるための高価なサイトカインの使用を必要としない、血液からDCおよびマクロファージを迅速に濃縮する方法(1.5 時間)を開発した。一方、当代の方法はDC前駆体を7日培養することを必要とする。サイトカインに長期に曝露して培養中のDCは細胞経路に特定の変化を誘導することが公知であり、病原体の感染性、遺伝子の活性化およびタンパク質合成を変更することが実証されている。ハイスループット(HT)遺伝子アレイは1日あたり1,000種を越える試料の分析を可能にする。1日あたり処理される試料数は装置依存的であり、プロテオミクス技術の場合と同様である(例えば、10,000試料/1日)。HTシステムとゲノムおよびプロテオミクスデータベースの統合は検出効率を改善し、疾病進行のリアルタイムモニタリングも可能にする。集合的に、組み合わせは、ネットワークでリアルタイムに共有することができる、病院および研究室のための高い複雑性のゲノムおよびプロテオミクスに基づいたアレイおよび情報データベースを提供する。
【０１５３】
本発明は、生体内および環境の病原体を迅速に同定する方法を提供する。以下の病原体はAPCおよび本明細書に記載する技法を使用する検出および特徴づけが可能である：細菌、ウイルス、心筋、プリオンおよび原虫。
【０１５４】
APCに提示されて病原体曝露APCシグニチャーを作製する代表的な細菌には、表皮ブドウ球菌(S. epidermis)およびブドウ球菌(S. aureus)などのブドウ球菌(Staphylococcus)；マイクロコッカス(Micrococcus)；化膿レンサ球菌(S. pyogenes)、 S. エクイ(S. equis)、 S.ズウェピデミカス(S. zooepidemicus)、S. エクイシミリス(S. equisimilis)、 肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae) および S. アガラクティエ(S. agalactiae)などの連鎖球菌(Streptococcus)；C. ピオゲネス(C. pyogenes)およびC. シュードツベルクローシス(C. pseudotuberculosis)などのコリネバクテリウム(Corynebacterium)；E. ルジオパシエ(E. rhusiopathiae)などのエリジペロスリックス(Erysipelothrix)；L. モノサイトゲネス(L. monocytogenes)などのリステリア(Listeria)；B. アントラシス(B. anthracis)などのバチルス(Bacillus)；C. パーフリンジェンス(C. perfringens)などのクロストリジウム(Clostridium)；ならびに結核菌(M. tuberculosis)およびM. レプレ(M. leprae)などのマイコバクテリウム(Mycobacterium)などのグラム陽性およびグラム陰性細菌が含まれる。グラム陰性細菌種は、大腸菌(E. coli) O157などのエシェリキア(Escherichia)；S. チフィ(S. typhi)および S. ガリナルム(S. gallinarum)などのサルモネラ(Salmonella)；S. ディセンテリエ(S. dysenteriae)などの赤痢菌(Shigella)；V. コレレ(V. cholerae)などのビブリオ(Vibrio)；Y. ペスティス(Y. pestis)およびY. エンテロコリチカ(Y. enterocolitica)などのエルシニア(Yersinia)；P.ミラビリス(P. mirabilis)などのプロテウス(Proteus)；B. ブロンキセプチカ(B. bronchiseptica)などのボルデテラ(Bordetella)；緑膿菌(P. aeroginosa)などのシュードモナス(Pseudomonas)；K. ニューモニエ(K. pneumoniae)などのクレブシエラ(Klebsiella)；P. ムルトシダ(P. multocida)などのパスツレラ(Pasteurella)；M. ボビス(M. bovis)などのモラクセラ(Moraxella)；S. マルセッセンス(S. marcescens)などのセラチア(Serratia)；H. インフルエンザ(H. influenza)などのヘモフィルスならびにカンピロバクター(Campylobacter)種を含む属によって例示されるが、これらに限定されない。本発明のアッセイに好適な他の種には、ライム病を生じるものなどのスピロヘータ、エンテロコッカス(Enterococcus)、 ナイセリア(Neisseria)、 マイコプラズマ(Mycoplasma)、 クラミジア(Chlamidia)、 フランシセラ(Francisella)、 パスツレラ(Pasteurella)、 ブルセラ(Brucella)および腸内細菌(Enterobacteriaceae)が含まれる。また、CDC生物学的病原体A、BおよびC生物学的病原体も検出可能である。本発明により検出可能である病原性細菌種のさらに別の例は、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)、第9編、1994年、Williams and Wilkins, Baltimore, Mdなどの標準的な分類学的で説明的な研究を参照することによって得られる。
【０１５５】
病原体曝露APCシグニチャーを作製するためにAPCに提示される代表的なウイルスには、アデノウイルス(小児胃腸炎、急性出血性膀胱炎、非細菌性肺炎およびウイルス性結膜炎において見出されうるものなど)、ヘルペスウイルス(I型およびII型単純ペルペス、水痘帯状疱疹(水疱の原因菌)、サイトメガロウイルスおよび単核球症(原因菌エプスタインバーウイルス(Epstein-Barr virus))、ポックスウイルス(天然痘などの疾患の原因菌(バリオラ  メジャー(Variola major)およびバリオラ  マイナー(Variola minor))、A、BおよびC型肝炎、ワクシニアウイルス、ハンタウイルスおよび伝染性軟属腫など)、ピコルナウイルス(ライノウイルス(コロナウイルスによっても生じる感冒)など)、ポリオウイルス(灰白髄炎)、オルソミクソウイルスまたはパラミクソウイルス(インフルエンザおよび呼吸器合胞体ウイルス(RS)など)、パラインフルエンザウイルス(流行性耳下腺炎などのような疾病を含む)および麻疹(はしか)、ラブドウイルス(狂犬病)、水疱性口内炎(VSV)、ルベラなどのトガウイルス--三日ばしかを生ずる原因菌および脳炎を生ずるトガウイルス科(EEE、WEEおよびVEE)、デング熱、西ナイル熱、黄熱および脳炎を生じる原因菌などのフラビウイルス、ブンヤウイルスおよびアレナウイルス、レオウイルス、SARS、肝炎を生ずる原因菌などのコロナウイルス、などのパピローマウイルスなどのパポバウイルス感染、HIV、HTLV-1およびHTLV-IIなどのレトロウイルス感染が含まれる。
【０１５６】
APCに提示されて病原体曝露APCシグニチャーを作製する代表的な真菌には、例えば、C. albicansなどのカンジダ(Candida)；C. ネオフォルマンス(C. neoformans)などのクリプトコッカス(Cryptococcus)；マラセジア(Malassezia)(ピチロスポルム(Pityrosporum))；H. カプスラーツム(H. capsulatum)などのヒストプラズマ(Histoplasma)；C. イミチス(C. immitis)などのコクシディオイデス(Coccidioides)；H. デストルーエンス(H. destruens)などのヒフォマイセス(Hyphomyces)；B. デルマチチジス(B. dermatiditis)などのブラストマイセス(Blastomyces)；A. フミガーツス(A. fumigatus)などのアスペルギルス(Aspergillus)；P.  マルネフェリ(P. marneffei)などのペニシリウム(Penicillium)；シュードアレシェリア(Pseudallescheria)；フサリウム(Fusarium)；ペシロミセス(Paecilomyces)；ケカビ(Mucor)/クモノスカビ(Rhizopus)；ならびにP. カリニ(P. carinii)などのニューモシスチス(Pneumocystis)；種が含まれる。リノスポリジウム(Rhinosporidium)およびスポロトリックス(Sporothrix)などの皮下真菌、ならびにミクロスポルム(Microsporum)および白癬菌(Trichophyton)種などの皮膚糸状菌は本明細書において本発明の態様による予防および治療が可能である。検出することができる他の疾病を生ずる真菌には、白癬菌(Trichophyton)；ミクロスポルム(Microsporum)； エピデルモフィトン(Epidermophyton)；バシディオボルス(Basidiobolus)；コニディオボルス(Conidiobolus)；リゾプスクニンガメリア(Rhizopus Cunninghamelia)；リゾムコール(Rhizomucor)；パラコクシディオイデス(Paracoccidioides)；シュードアレシェリア(Pseudallescheria)；リノスポリジウム(Rhinosporidium)およびスポロトリックス(Sporothrix)が含まれる。
【０１５７】
APCに提示されて病原体曝露APCシグニチャーを作製する代表的な原虫には、アメーバ、繊毛虫、鞭毛無視および胞子虫、例えば、プラスモジウム(Plasmodium)、トリパノソーマ(Trypanosoma)またはクリプトスポリジウム(Cryptosporidium)などの1つまたは複数の単細胞で、通常顕微鏡サイズの真核生物が含まれる。
【０１５８】
抗原に曝露された免疫監視細胞(APC)に由来する遺伝子、ペプチド、およびタンパク質はまた、それらの分光学的シグニチャーに基づき参照ライブラリーの一部として使用され得るか、または例えばFRET、フローサイトメトリー、およびその他の多重化に基づく検出方法で使用する抗体を作製するために、直接使用され得る。好ましいタンパク質多重化検出系には、Bender SystemsのものおよびBD Biosciencesのもの(CBAシステムなど)が含まれる。曝露の可能性がある対象の初期検出およびスクリーニングは、例えば分光学的解析により行われ得る。(抗原曝露後に上方制御されるペプチドに対する)抗APC抗体は、疾患の経過を追跡するために、伝統的なフローサイトメトリーおよび多重化アッセイにおいて用いられる。
【０１５９】
実施例2
抗原提示細胞(APC)特異的シグニチャーの作製は2段階方法である。第1の段階は免疫細胞集団を入手して、細胞膜を分画化し、膜、細胞質および核からタンパク質を濃縮することに関係する。好ましい細胞は骨髄系統であるが、PBMCが好適である。DCを含む骨髄細胞集団を濃縮する方法は、米国特許第6,589,526号および同第6,194,204号に記載されている。骨髄細胞は、約90%から10%の集団の単球および樹状細胞を含む。単球の抗原マーカーには、CD14+、HLA-DRまたは MHCクラスII、CD80+ CD86+が含まれる。DCの抗原マーカーには、CD2+、CD5+、CD14+ CD83+およびCD90+が含まれる。これらは正または負の選択方法によって得られる。好ましい細胞種は、DCおよび単球細胞に一致した抗原マーカーを発現する骨髄である。現在のところ、培養骨髄細胞ではなく、単離直後、すなわち、血液精製骨髄細胞を使用することが好ましい。
【０１６０】
以下はPBMCから単球を単離するための示唆されている手法である：軟膜を健康なボランティアから単離し(Transfusion Therapy, Children's Hospital, Boston, MA)、PBSで洗浄し、濃縮した。次いで、軟膜濃縮物を、例えば、StemCell Technologiesから市販されているRosetteSepキットなどの改良型単球濃縮手段と共にインキュベーションした。このロゼットカクテルは、T細胞、B細胞、NK細胞および顆粒球に結合する抗CD3、抗CD19、抗CD54および抗CD62モノクローナル抗体を含有する。30分のインキュベーション後、この集団をフィコールグラジエントで層化し、2500 rpmにおいて30分遠心分離(Sorvall RT 6000, DuPont, Wilmington, DE)して、高密度(T、B、顆粒球およびNK細胞)から低密度DCおよびMoを分離した。低密度細胞集団は、フローサイトメトリーによって>95% CD14highであった。これらの細胞を、ヒトCD2に対する100倍希釈したマウスmAB(腹水中)と共に4℃で30分間インキュベーションし(1O1d2-4Cl (抗Tl12); Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) (26)、洗浄し、ヤギ抗マウスIgG磁気ビーズ(Miltenyi Biotech)と共にインキュベーションした。インキュベーション後、製造業者の使用説明書により調製物を磁気カラムに通した。磁気カラムはCD2+細胞を保持し、純度>96%であったが、CD2細胞は、抗CD2および抗CD14を用いたフローサイトメトリーによって純度>95%であった。マグネシウムおよびカルシウムを含有しないHBSS(Cellgro; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)に10% v/v熱不活性化プールヒト血清(PHS) (Nabi, Boca Raton, FL)およびヒトIgG(50 mg/ml; Immuno AG, Vienna, Austria)を含有するブロック緩衝液を使用して、単離またはフローサイトメトリー分析の各段階中の非特異的mAb結合を防止した。単離直後の無サイトカイン(noncytokine)インキュベーションしたCD2+およびCD2- Moの形態学的および機能的検討のために、本発明者らは、10%熱不活性化PHS、20μg/mlゲンタマイシン、100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI 1640 (Cellgro)を含有する培養培地(CM)を使用した(Life Technologies, Gaithersburg, MD)。
【０１６１】
第2の段階は、例えば、QSTAR (ABI)、Ciphergen社製のSELDI TOFまたはPerkin Elmer社製のproTOFを使用してDCから質量スペクトルを得ることに関係する。スペクトルはナイーブAPCおよび病原体、腫瘍または他の抗原に曝露したものについて得た。この実施例において、本発明者らは、病原体-APCまたは病原体-食品試料(すなわち、リステリア(Listeria)-APC、リステリア-ミルク)から個々のデータセット(シグニチャー)を得て、細菌汚染されたミルクおよび汚染されていないミルクのプロファイルを作製するための方法を記載している。個人のAPCのサンプリングから得られるリステリア感染個人のシグニチャーも提供する。
【０１６２】
各プロファイルは、m/zサイズ(kD)、m/z強度(uAmp)および標準偏差値などの特性によって測定される、検討中の病原因子の細胞膜、細胞質タンパク質および核タンパク質特徴、タンパク質荷電(すなわち、正および負)、Cu2+キレート特性、種々のエンドペプチダーゼによる未変性または変性タンパク質の切断パターン等を含む。シグニチャーの特徴を同定する出現頻度は反復試料、好ましくは、3〜4試料のスペクトルを得、それによってコンセンサスシグニチャーを提供することによって裏付けられる。
【０１６３】
試料タンパク質を単離、分画化または濃縮する一般的に使用されるいくつかの方法は以下のようであり、他は当技術分野において公知である。PARISキット-これはAmbion社製のキットであり、試料からRNAおよびタンパク質の迅速な単離を可能にする。このキットは、APCウイルスまたは細菌同時培養物からのAPCタンパク質の単離に関係するような検討に使用することができる。試料のさらに感度の高い検出および特徴づけのためには、一般的な分子生物学的技法によって得られる細胞膜分画を使用することが有利である。膜、細胞質および核タンパク質の組み合わせはAPCに基づいた検出方法の感度を増強する。
【０１６４】
超音波処理による細菌溶解はグラム陰性およびグラム陽性細菌に使用することができ、超音波処理を使用し、任意に細胞膜が厚いまたは頑強なグラム陰性細菌または微生物のプロファイルのために強く進められている、Tween、Triton X-100、ジギトニン、CHAPS、SDS、ノニデット等などの界面活性剤を使用する。このプロトコールを、図11〜13に示すミルク検討に使用した。寒天プレートから5 mlのTEN緩衝液(10 mM Tris-HCl pH 7.4、 1 mM EDTA、 100 mM NaCl)に細菌を回収する。5,000×gにおいて10分間で細菌をペレット化する。ドライアイス/エタノール浴で3ラウンドの凍結/融解に試料を供し、37℃において融解する。細菌ペレットを小容量(0.1〜0.5 ml)の氷冷MTBS緩衝液(16 mM Na2HPO4、 4 mM NaH2P04、 150 mM NaCl、 1% Triton X-100、 1 mM PMSF)に再懸濁させる。15秒のバーストで懸濁液を超音波処理し、次に氷上で30秒インキュベーションする(4ラウンドの超音波処理)。細菌小片を14,000 rpmでペレット化する。上清を新たなチューブに取り出す。Bradfordタンパク質アッセイ、標準曲線、UV吸収または他の方法によってタンパク質濃度を測定する。SELDI分析時まで-70℃において保存する。
【０１６５】
繰り返しの凍結融解は、凍結融解サイクルを反復して細胞を剪断することに関係する。試料をドライアイス-エタノール混合物において凍結し、37℃において融解した。これらの段階を4回反復し、試料を14,000 rpmで5分間微小遠心分離器で遠心分離して透明な上清を形成した。上清を取り、試料の操作時まで-70℃で保存した。フレンチプレス(French Press)による細菌の溶解はグラム陰性細菌に使用することができ、グラム陽性細菌には推奨されない。この技法を実施するためには、20 mM HEPES pH 7.4、 50 mM NaCl、 1% Triton-X 100、 1 mM PMSFに細菌のペレットを再懸濁する。750 psiにおいてフレンチプレスを使用して分離する。4℃において20,000×gで20分遠心分離することによって細胞小片を除去する。Bradfordタンパク質アッセイまたは同様のアッセイによって上清中のタンパク質濃度を測定する。SELDI技法の実施時まで-70℃において分量を保存する。BugBuster抽出キット-これは、Novagenによって販売されている市販のキットであり、大腸菌(E. coli) の細胞壁を穏やかに破壊して、活性なタンパク質を放出することができる。これは、細胞調製物に発現標的タンパク質を放出するためのフレンチプレスまたは超音波処理の簡単で、迅速で、低費用の代替法である。または、10 mM Tris-HCl pH 7.4、 8 M Urea、 2% (w/v) CHAPS、 ImM PMSFなどの緩衝液も溶解緩衝液として使用することができる。SELDI技法の実施時まで-70℃において分量を保存する。
【０１６６】
以下に記載されているSELDI実験プロトコールはIMAC ProteinChip Array (PCA)を使用する。その後の金属親和性結合タンパク質のための遷移金属を捕獲するためのNTA官能基をIMACアレイにコーティングする。これらのプロファイリング検討では、表面に試料を適用する前にアレイに銅をチャージする。結合緩衝液中のイミダゾール濃度によって選択的に求める。結合/洗浄緩衝液中のイミダゾール濃度を増加すると、金属に対する親和性の低いタンパク質の結合が低下されて、バックグラウンド信号が低くなる。IMAC PCAのプロトコールは以下に詳細に記載されており、他のCiphergen PCAプロトコールと同様である。
【０１６７】
8スポットアレイの使用：
バイオプロセッサーにPCAを集合させて、各ウェルに50マイクロリットルのIMAC添加液を加える。室温において5分間ボルテックスする。ウェルから緩衝液を除去する。水ですすぐ。各ウェルに50マイクロリットルのIMAC中和緩衝液を加える。室温において5分間ボルテックスする。ウェルから緩衝液を除去し、すすぐ。各ウェルに150マイクロリットルのIMAC結合緩衝液を加え、室温において5分ボルテックスする。緩衝液を除去する。結合緩衝液による洗浄段階を2回反復する。次に、90マイクロリットルのIMAC結合緩衝液および10マイクロリットルの試料を加え、室温において30分ボルテックスする。試料濃度に対するIMAC結合緩衝液の比は、望ましいタンパク質濃度に依存して変わってもよい。試料を取り出し、IMAC結合緩衝液で3回洗浄し、各洗浄は5分の撹拌段階を必要とする。終了したら、脱イオン水ですすぎ、バイオプロセッサーのウェルを排水し、空気乾燥させる。各スポットに1.0マイクロリットルのEAM(マトリックス)溶液を適用し、空気乾燥させる。Ciphergen ChipリーダーでPCAを分析する。
【０１６８】
一方、Perkin-Elmer proTOF実験プロトコールは、MALDI表面に単離されたタンパク質試料を直接適用する。しかし、この方法では、MALDI表面は試料中の全て(すなわち、タンパク質および非タンパク質)に結合する。試料をクリーンアプすること、例えば、ある種のタンパク質を除去し、それによって総タンパク質レベルを低下し、試料混合物の複雑さを低下することができるMillipore ZIP TIPS(登録商標)、フィルター付きイオン交換ピペットチップを使用したミクロスケールタンパク質精製を製造業者は示唆している。しかし、この技法は、チップごとに異なるチップ性能が得られるシグニチャーに影響することがあるほどに敏感である。
【０１６９】
次の段階は、病原体とAPCの相互作用からのマーカータンパク質の誘導体化に関係する。マーカータンパク質が単離されたら、タンパク質は、診断用抗体を作製するための鋳型を提供する。誘導体化されたAPCタンパク質に対するこれらの抗体は、例えば、診断目的のためにマルチプレクサーまたは蛍光リーダーに取り付けられて、免疫学的アッセイに使用することができる。
【０１７０】
実施例3
この実験は、細菌およびウイルス病原体に曝露させたDCのAPC由来シグニチャーの再現性を検討した。リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)を、上記の細菌溶解および超音波処理方法によって処理し、金属結合(図1〜2)または疎水性表面(図3〜4)について評価した。試料は平行処理し、異なるチップアナライザーにおいて異なるPCAチップで分析した。結果はすぐれた実験再現性を実証している。データはスペクトル(図1、図3）またはゲル(図2、図4)像で示す。
【０１７１】
図5は、未処置/未感染骨髄細胞(Mx、上のパネル、樹状細胞の(DC)混合物、中央のパネルおよび(Mo)単球、下のパネル)、DCおよびMoの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する。DCおよびMoの個々のプロファイルに差が観察される。
【０１７２】
図6〜11は、対照アデノウイルスの存在下(図6、8および10)または単一遺伝子置換したアデノウイルスの存在下(図7、9および11)で培養したMx、MoおよびDCの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する。観察されたシグニチャーは、野生型および突然変異型アデノウイルスを感染させたAPCは、本発明を使用して同定し、識別することができることを示している。一遺伝子置換/改変を有するウイルスを識別することができる独自のタンパク質シグニチャーを得ることができる。
【０１７３】
図12〜14は、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)の存在下において同時培養したMx(図12)、DC(図13)およびMo(図14)の核タンパク質抽出物から得られるタンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する。他のグラム陽性およびグラム陰性細菌の存在下で培養したAPCも、APCと同時培養した微生物を同定するために使用することができる独自のシグニチャーを作製する。リステリア単独、すなわちAPCと共に培養しないプロテオミクスシグニチャー(図15の下のパネル)は3つの同時培養シグニチャーとは別個で、リステリアの異常増殖は生じず、それによってAPC同時培養を汚染しないことを示唆している。
【０１７４】
図16〜17は、リステリア汚染した脱脂乳または全乳の分光プロファイル(シグニチャー)を例示する。図15は、結果のスペクトル像を示すが、図16〜17はゲル像を示す。結果は、APC検出方法とは関係なく、本発明が乳汁および他の食料品中の独自の病原体の存在を検出する能力を実証している。
【０１７５】
実施例4 
病原性因子以外に、本発明の診断方法は、種々の癌および遺伝子疾患の検出、診断および病期判定を含む。癌は数多くのマーカーによって検出可能である。悪性細胞は、しばしば、正常な細胞ではみられない抗原を発現する：これらの抗原の一部は細胞表面に見られ、例えば、CEA(癌胎児性抗原)および識別的にグリコシル化された(低グリコシル化)MUC-1は2つの周知の腫瘍関連抗原である。MUC-1/DF-3は、とりわけ、大多数のヒトの癌、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病および濾胞性リンパ腫において過剰発現されている。抗原は、DCによる抗原の提示によりHLA制限されたT細胞応答を開始することができる(Brossart et al., (2001) Cancer Res. Sept.:61(18):6846-50参照)。癌細胞において上方制御されている他のタンパク質には、血管内皮増殖因子(VEGF)、Her-2/neuおよびヘプシンが含まれる。細胞接着分子-1(ICAM-1)、血管接着分子-1(VCAM-1)およびEセレクチン(ELAM-1)は、癌および腫瘍抑制に関連する炎症応答に関連する複雑な系列の事象において重要な役割を果たす。
【０１７６】
病原性因子以外に、本発明の診断方法は種々の腫瘍および悪性新生物の検出、診断および病期判定を含む。本発明は、周囲組織に浸潤し、新たな生体部位に転移する傾向のある未分化細胞の増殖によって特徴づけられる種々の悪性新生物のいずれかを検出することができる。例えば、APCを以下の癌と培養して、癌曝露細胞のAPCシグニチャーを作製する：星状細胞腫、グリオーマ、上衣腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、網膜芽細胞腫、膀胱癌、小および非小細胞肺癌、麦細胞肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膣癌、卵巣癌、肝臓癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、骨髄腫、基底細胞癌、メラノーマ、甲状腺濾胞腺癌、膀胱癌、グリオーマ、骨髄異形成症候群、精巣癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、扁平細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、尿路上皮癌、乳癌または前立腺癌。
【０１７７】
APC、特にCD2+ DCを、生検によって得られる原発性または転移腫瘍細胞、好ましくは、代表的な病期の腫瘍増殖から取られる細胞と共に培養する。または、APCを、精製されたCEA(chorioembryonic antigen)調製物または識別的にグリコシル化された(低グリコシル化)MUC-1または他の腫瘍関連抗原と共に培養する。APC溶解物を使用してcDNAを作製し、次いでこれを使用して、ハイスループットスクリーニングのためのAPC参照標準アレイを作製する。抗原接触に応答して上方制御されるタンパク質は、例えばELISA、フローサイトメトリー、FACS、および多重化アッセイなどの免疫学的検出アッセイにおいて有用な抗体を調製するために用いられる。上記に掲載する各主要種についてアレイを作製し、好ましくは、特定の癌種の各病期を含む。
【０１７８】
実施例5
被験体および環境から試料を単離するためのキットを開発する。
【０１７９】
患者診断用途のためには、キットは、患者から血液試料を入手し、単離するための試薬および材料、ならびにAPC、PBMC、好ましくは、DCなどの細胞を濃縮し、細胞を処理して細胞質、核または膜分画を形成し、任意に大きいタンパク質を処理して小さいペプチドにするための試薬および材料を含む。
【０１８０】
キットは、SELDIのためのCiphergenおよびMALDI-O-TOFのためのPerkin Elmerによって作製されるものなどの、質量分析法に使用するのに適当なチップまたはプレートおよび試薬をさらに含んでもよい。キットはまた使用の好適な取扱説明書も含む。ある態様において、キットは、例えば、癌を診断し、病期判定する際に使用するため、または感染菌および感染の進行を判定するため、または法医学的分析のために上記に記載するAPCアレイの1つまたは複数を含む。他のキット構成要素は、質量分析計を較正するために使用する参照タンパク質などの対照を含む。さらに他の態様において、キットは、アルブミンまたは高分子量タンパク質を含み、シグニチャーにおける低分子量タンパク質の分解能を増強するために使用される(アルブミン衝撃(bump)技法)。患者に使用するキットはヒトおよび獣医学的使用に好適である。
【０１８１】
以下のキットが本明細書において提供される：環境および曝露被験体において生物兵器に関連する病原体を同定するための生物兵器防衛キット；食品の乳製品および家畜の汚染をサンプリングするための農業用キット；被験体の内分泌および代謝機能を評価するための内分泌および代謝キット；変性性変化を評価するための神経額的キット；曝露被験体において病原体を同定するための感染性疾患キット；胎児の健康を評価するための出生前キット；被験体の癌進行を診断し、病期判定し、化学療法および疾患進行をモニタリングするための癌キット；心障害および虚血および血管閉塞の早期徴候を検出するための循環器系キット；すなわち、造影剤および化学療法剤による被験体の傷害を検出するための腎キット。
【０１８２】
実施例6
生物兵器、化学兵器、核兵器、および放射性物質兵器が関与するテロ攻撃がもたらす、国家の安全に対する潜在的な脅威は、重大な国際的懸念である。そのような攻撃に対して公衆衛生局が直面している課題の1つは、これらの物質に曝露され病気を発症していない個体を診断する能力がこれまで限られていることである。医療専門家および政府関係者はみな、病気の大流行--例えば、アジアおよびカナダにおけるSARS、東アジアにおける鳥インフルエンザ、ならびにアフリカにおけるエボラウイルスおよびマールブルグウイルスなど--によって、診断の速度および公衆衛生対策の実施が散発的大流行と世界的流行との相違を意味し得ることを実証すると認識している。農業標的に対するテロ攻撃(農業テロ)の可能性は、国家安全保障の脅威としてますます認識されている。農業生産が地理的に分散し安全でない環境にあるという事実によって、農業には、脅威に対処するに当たって独特な問題を提起する特徴がいくつかある。家畜は限られた区域に集められ、その後輸送され、他の群れと入り混じる場合が多い。ヨーロッパでの口蹄疫(FMD)の大流行、および米国でBSEの2例目が最近検出されたことは、迅速かつ正確な様式で家畜の疾患を検出する重要性を浮き彫りにしている。牛乳などの食品は、意図的に汚染され得る接近可能な区域に保存されている。疫病および病気の大流行は、経済的に重要な輸出品を中断し得る。効率的な検出は、認識の高まり、ならびに家畜および食品を迅速にスクリーニングする能力によって脅威のレベルを迅速に判断する能力に依存する。過去に起こった疾病の大流行による教訓から、検出および診断の速度が散発的事象と広範囲にわたる疾病との相違を決定し得ることが示されている。
【０１８３】
本発明は、バイオテロ物質を検出およびモニタリングするため、ならびに感染因子および対象の免疫系に及ぼすそれらの影響を定性的および定量的に評価するための、包括的なゲノム、バイオインフォマティクス、機能ゲノム、免疫細胞(APCに基づく)プロテオミクスアプローチを提供する。これらのアプローチはまた、次世代の薬物、ワクチン、診断、および免疫療法の新たな標的の発見および同定につながり得る重要な情報資源を科学界に提供する。最も重要なのは、これらのアプローチが迅速かつ正確であることである。
【０１８４】
1つの局面においては、電子的に検索可能なプロテオミクス病原体参照ライブラリー(PPRL)を構築する。PPRLは、CDCバイオテロ物質および疾患リスト上の個々のまたは組み合わせの毒素および病原体と接触させた免疫監視細胞(APC)の記録を含む。この記録は、これらの物質に対するAPCの明確な曝露に関する参照シグニチャーを提供する。PPRLは、ヒト対象において生物学的/化学的病原体の曝露を決定する上で有用であり、また家畜などの他の哺乳動物の曝露を検出するためにも使用できる。PPRLはまた、食糧供給に偶然にまたは意図的に導入された可能性のある細菌性および化学的病原体に関して食品をスクリーニングするための参照を提供する。
【０１８５】
APCのシグニチャーは、CDCバイオテロ物質および疾患リスト上の毒素および病原体と接触させた細胞を用いて得られる。これらには、炭疽毒素(炭疽菌)；アレナウイルス；炭疽菌(炭疽)；ボツリヌス菌毒素)；ブルセラ種；鼻疽菌；偽鼻疽菌(類鼻疽)；オウム病クラミジア；コレラ毒素；ボツリヌス菌毒素(ボツリヌス中毒)；ウェルシュ菌；エボラウイルス出血熱；ニパウイルスおよびハンタウイルスなどの新興感染症；ウェルシュ菌のイプシロン毒素；大腸菌O157:H7(大腸菌)；食品安全性に対する脅威(例えば、サルモネラ種、大腸菌O157:H7、赤痢菌)；野兎病菌(野兎病)；鼻疽(鼻疽菌)；ラッサ熱；マールブルグウイルス出血熱；類鼻疽(偽鼻疽菌)；オウム病(オウム病クラミジア)；Q熱(Q熱リケッチア)；トウゴマ(ヒマの実)由来リシン毒素；発疹チフスリケッチア(発症チフス)；サルモネラ種(サルモネラ症)；チフス菌(腸チフス)；サルモネラ症(サルモネラ種)；赤痢菌(細菌性赤痢)；細菌性赤痢(赤痢)；天然痘(大痘瘡)；ブドウ球菌エンテロトキシンB；腸チフス(チフス菌)；発疹チフス(発症チフスリケッチア)；大痘瘡(天然痘)；コレラ菌(コレラ)；ウイルス性脳炎(アルファウイルス[例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、および西部ウマ脳炎])；ウイルス性出血熱(フィロウイルス[例えば、エボラ、マールブルグ]およびアレナウイルス[例えば、ラッサおよびマクポ])；水の安全性に対する脅威(例えば、コレラ菌、クリプトスポリジウム・パルバム)；ならびにペスト菌(疫病)が含まれる。
【０１８６】
曝露させたAPCのシグニチャーはデジタル化し、個々のデータ記録としてコンピュータ可読媒体上に記録する。1つの局面において、抗原曝露した無傷のAPC(各細胞サブタイプ)のプロテオミクスシグニチャーは、例えばSELDI、MALDI-O-TOF、およびMALDI-TOFを用いて取得する。データ記録と共に、APC細胞種、毒素または病原体、緩衝液組成、および特定のAPCシグニチャーを得るための材料/方法、ドナー情報、ならびにその他の関連する医療および病因情報を含むメタデータを提供する。これが参照データセットである。参照データセットは各APC細胞種および各毒素または病原体について取得し、これらはまとめてプロテオミクス病原体参照ライブラリー中の参照データ記録を構成する。PPRLは、参照データ記録を解析し、ユーザー定義基準に基づいて個々のデータセットを排除および包含するためのエキスパートシステム、およびプロテオミクスシグニチャーの類似性に基づき、データセット、特に曝露させたAPCのシグニチャーを、入力した対象由来試料を有する未知データセットのシグニチャーと一致させるためのパターン認識ルーチンを含む。
【０１８７】
PPRLを使用するには、医療専門家は、CDCバイオテロ物質に曝露された疑いのある対象から血液を採取する。血液試料からAPCを単離し、APC細胞サブタイプについて、例えばFACSでCD2+ DCまたはCD4+ T細胞などの抗原マーカーに関して分離する。各APCサブタイプを用いて、全細胞質量分析プロテオミクスシグニチャーを得る。シグニチャーをデジタル化し、これを、プロテオミクスシグニチャーを蓄積し、医療専門家が試料に関連するメタデータを付加することを可能にするアルゴリズムを有するコンピュータプログラムにアップロードし、それによって未知データセットが作成される。コンピュータプログラムは、医療専門家がユーザー定義情報を有するデータセットを検索問い合わせにさらに蓄積することを可能にし、検索問い合わせを好ましくはネットワーク上でPPRLに伝達する。エキスパートシステムは、記載したように未知データセットにより参照データ記録を解析する。特定の規定の信頼区間で未知データセットと一致する参照データセットとして定義される潜在的一致物が、ネットワーク上で医療専門家に返される。したがって、医療専門家は、種々のCDCバイオテロ物質に対する対象の曝露を確認または排除することができる。
【０１８８】
1つの局面において、PPRLは、以下のCDCプログラムの1つまたは複数とネットワーク化されている：活動的細菌中央監視(Active Bacterial Core Surveillance)(ABC)；淋菌分離株監視プロジェクト(Gonococcal Isolate Surveillance Project)(GISP)；国家抗生物質耐性モニタリングシステム：腸内細菌(National Antimicrobial Resistance Monitoring System: Enteric Bacteria)(NARMS:EB)；国家電子疾病監視システム(National Electronic Disease Surveillance System)(NEDSS)；健康情報および監視システム委員会(Health Information and Surveillance Systems Board)(HISSB)；国家院内感染監視システム(National Nosocomial Infections Surveillance System)(NNIS)；集中治療抗生物質耐性疫学(Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology)(ICARE)；および健康管理と関連した新興抗生物質耐性の監視(Surveillance of Emerging Antimicrobial Resistance Connected to Healthcare)(SEARCH)プログラム。1つの態様において、対象試料中のCDCバイオテロ物質の陽性同定をもたらす問い合わせは、これらのプログラム群の1つまたは複数に陽性同定の警報を発する。別の態様では、警報は米国国土安全保障省に送られる。さらに別の態様では、警報は、例えば検出地域に近接した、特定の地理的地域内の病院に送られる。
【０１８９】
実施例7
PPRLは、一般的な疾患をもたらす病原体、院内病原体、および薬剤耐性病原体を含む細菌性の病原体と接触させた免疫監視細胞(APC)の記録を含む。この記録は、これらの病原体に対するAPCの明確な曝露に関する参照シグニチャーを提供する。PPRLは、ヒト対象において細菌性の病原体の曝露を決定する上で有用であり、また家畜などの他の哺乳動物の曝露を検出するためにも使用できる。
【０１９０】
APCのシグニチャーは、以下の細菌性の病原体と接触させた細胞を用いて得られる。これらには、バチルス；ボルデテラ；ボレリア；カンピロバクター；クロストリジウム；コリネバクテリウム；エンテロコッカス；エシェリキア；フランシセラ；ヘモフィルス；ヘリコバクター；レジオネラ；リステリア；マイコバクテリウム；ナイセリア；シュードモナス；サルモネラ；赤痢菌；ブドウ球菌；連鎖球菌；トレポネーマ；ビブリオ；エルシニア；ペニシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、およびフルオロキノロンに耐性のナイセリア；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)；薬剤耐性肺炎連鎖球菌；フルオロキノロンおよび他の薬剤耐性サルモネラ血清型チフィ；バンコマイシン中間/耐性黄色ブドウ球菌；およびバンコマイシン耐性エンテロコッカス、ならびに他の多剤耐性細菌株が含まれる。
【０１９１】
病原体に曝露させたAPCのシグニチャーはデジタル化し、個々のデータ記録としてコンピュータ可読媒体上に記録する。1つの局面において、抗原曝露した無傷のAPC(各細胞サブタイプ)のプロテオミクスシグニチャーは、例えばSELDI、MALDI-O-TOF、およびMALDI-TOFを用いて取得する。データ記録と共に、APC細胞種、毒素または病原体、緩衝液組成、および特定のAPCシグニチャーを得るための材料/方法、ドナー情報、ならびにその他の関連する医療および病因情報を含むメタデータを提供する。別の局面では、APC系列は、様々な感染段階、すなわち初期局所感染、播種性感染、中等度敗血症、重症敗血症、SIRS、敗血症ショック、および多臓器不全症候群(MODS)にある、細菌感染を有する参照対象から得る。これが参照データセットである。参照データセットは各APC細胞種ならびに各細菌性の病原体および感染段階について取得し、これらはまとめてプロテオミクス病原体参照ライブラリー中の参照データ記録を構成する。PPRLは、参照データ記録を解析し、ユーザー定義基準に基づいて個々のデータセットを排除および包含するためのエキスパートシステム、およびプロテオミクスシグニチャーの類似性に基づき、データセット、特に曝露させたAPCのシグニチャーを、入力した対象由来試料を有する未知データセットのシグニチャーと一致させるためのパターン認識ルーチンを含む。
【０１９２】
PPRLを使用するには、医療専門家は、細菌性の病原体に曝露された疑いのある対象から血液を採取する。血液試料からAPCを単離し、APC細胞サブタイプについて、例えばFACSでCD2+ DCまたはCD4+ T細胞などの抗原マーカーに関して分離する。各APCサブタイプを用いて、全細胞質量分析プロテオミクスシグニチャーを得る。シグニチャーをデジタル化し、これを、プロテオミクスシグニチャーを蓄積し、医療専門家が試料に関連するメタデータを付加することを可能にするアルゴリズムを有するコンピュータプログラムにアップロードし、それによって未知データセットが作成される。コンピュータプログラムは、医療専門家がユーザー定義情報を有するデータセットを検索問い合わせにさらに蓄積することを可能にし、検索問い合わせを好ましくはネットワーク上でPPRLに伝達する。エキスパートシステムは、記載したように未知データセットにより参照データ記録を解析する。特定の規定の信頼区間で未知データセットと一致する参照データセットとして定義される潜在的一致物が、ネットワーク上で医療専門家に返される。したがって、医療専門家は、種々の細菌性の病原体に対する対象の曝露を確認または排除すること、および感染段階を識別することができる。PCRによる抗生物質耐性遺伝子の増幅などのさらなるアッセイにより、特定の薬物に耐性であり得る細菌を確認または排除し、それによって治療経過を支援することができる。
【０１９３】
実施例8
種々の種類の癌を有し、これらの癌の様々な病期にある患者から取得した免疫監視細胞(APC)の記録を含む癌プロテオミクス参照ライブラリーを作成する。この記録は、疾患進行の様々な段階にある種々の癌に対するAPCの明確な曝露に関する参照シグニチャーを提供する。このライブラリーは、被験対象において癌の存在を診断する上で、および癌の種類および段階を同定する上で有用である。
【０１９４】
以下の癌型はそれぞれ特定のAPC応答を生じ、記載の技法を用いた検出に従う癌である：急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児；急性骨髄性白血病、成人；急性骨髄性白血病、小児；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；星状細胞腫、小児小脳；星状細胞腫、小児大脳；胆管癌、肝外；膀胱癌；膀胱癌、小児；骨癌、骨肉腫/悪性線維性組織球腫；脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小児；脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児；脳腫瘍、大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；脳腫瘍、上衣細胞腫、小児；脳腫瘍、髄芽腫、小児；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；脳腫瘍、視経路および視床下部グリオーマ、小児；脳腫瘍、小児(他)；乳癌；乳癌および妊娠；乳癌、小児；乳癌、男性；気管支腺腫/カルチノイド、小児；カルチノイド腫瘍、小児；カルチノイド腫瘍、胃腸；癌、副腎皮質；癌、膵島細胞；原発部位不明の癌；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星状細胞腫、小児；大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；結腸癌；結腸直腸癌、小児；皮膚T細胞性リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫、小児；上皮癌、卵巣；食道癌；食道癌、小児；ユーイング腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃(Gastric)(胃(Stomach))癌；胃(Gastric)(胃(Stomach))癌、小児；胃腸カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、頭蓋外、小児；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；グリオーマ、小児脳幹；グリオーマ、小児視経路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞(肝臓)癌、成人(原発性)；肝細胞(肝臓)癌、小児(原発性)；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児；ホジキンリンパ腫、妊娠中；下咽頭癌；視床下部および視経路グリオーマ、小児；眼内黒色腫；膵島細胞癌(内分泌膵臓)；カポジ肉腫；腎臓癌；喉頭癌；喉頭癌、小児；白血病、急性リンパ芽球性、成人；白血病、急性リンパ芽球性、小児；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児；白血病、慢性リンパ性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔癌；肝臓癌、成人(原発性)；肝臓癌、小児(原発性)；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児急性；リンパ性白血病、慢性；リンパ腫、AIDS関連；リンパ腫、中枢神経系(原発性)；リンパ腫、皮膚T細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン、小児；リンパ腫、ホジキン、妊娠中；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児；非ホジキン、妊娠中；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児；髄芽腫、小児；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞癌；中皮腫、悪性；原発不明の転移性頸部扁平上皮癌；多発性内分泌腫瘍症候群、小児；多発性骨髄腫/形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成/骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖症候群、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；鼻咽頭癌；鼻咽頭癌、小児；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児；非ホジキンリンパ腫、妊娠中；非小細胞肺癌；口腔癌、小児；口腔および口唇癌；口腔咽頭癌；骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌、小児；卵巣上皮癌；卵巣性胚細胞腫瘍；低悪性度卵巣腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、小児；膵臓癌、膵島細胞；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；下垂体腫瘍；形質細胞新生物/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝臓癌、成人；原発性肝臓癌、小児；前立腺癌；直腸癌；腎細胞(腎臓)癌；腎細胞癌、小児；腎盂および尿管、移行上皮癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺癌；唾液腺癌、小児；肉腫、ユーイング腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫(骨肉腫)/骨の悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児；肉腫、軟部組織、成人；肉腫、軟部組織、小児；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌、小児；皮膚癌(黒色腫)；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫、成人；軟部組織肉腫、小児；原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌；胃(Stomach)(胃(Gastric))癌、小児；テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児；T細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；胸腺腫、小児；胸腺腫および胸腺癌甲状腺癌；甲状腺癌、小児；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍、妊娠中；原発部位不明、成人の癌；原発部位不明、小児の癌；小児のまれな癌；尿管および腎盂、移行上皮癌；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；視経路および視床下部グリオーマ、小児；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍。
【０１９５】
曝露させたAPCのシグニチャーはデジタル化し、個々のデータ記録としてコンピュータ可読媒体上に記録する。1つの局面において、癌に曝露した無傷のAPC(各細胞サブタイプ)のプロテオミクスシグニチャーは、例えばSELDI、MALDI-O-TOF、およびMALDI-TOFを用いて取得する。データ記録と共に、APC細胞種、癌に関する組織学的情報、緩衝液組成、および特定のAPCシグニチャーを得るための材料/方法、ドナー情報、ならびにその他の関連する医療および病因情報を含むメタデータを提供する。別の局面では、APC系列は、様々な病期、すなわち1期、2期、3期、または4期などにある、細胞増殖性疾患を有する参照対象から得る。これが参照データセットである。参照データセットは各APC細胞種ならびに各癌型および病期について取得し、これらはまとめてプロテオミクス癌参照ライブラリー中の参照データ記録を構成する。PCRLは、参照データ記録を解析し、ユーザー定義基準に基づいて個々のデータセットを排除および包含するためのエキスパートシステム、およびプロテオミクスシグニチャーの類似性に基づき、データセット、特に曝露させたAPCのシグニチャーを、入力した対象由来試料を有する未知データセットのシグニチャーと一致させるためのパターン認識ルーチンを含む。
【０１９６】
PCRLを使用するには、医療専門家は検討中の対象から血液を採取する。対象は癌を有している可能性がなく、この手順は単に疾患のスクリーニングであるか、または対象は、遺伝的素因もしくは以前の検診により癌を有していることが疑われ得るか、または対象は確認された癌を有し得り、この手順は疾患の変化をモニターするために設計される。血液試料からAPCを単離し、APC細胞サブタイプについて、例えばFACSでCD2+ DCまたはCD4+ T細胞などの抗原マーカーに関して分離する。各APCサブタイプを用いて、全細胞質量分析プロテオミクスシグニチャーを得る。シグニチャーをデジタル化し、これを、プロテオミクスシグニチャーを蓄積し、医療専門家が試料に関連するメタデータを付加することを可能にするアルゴリズムを有するコンピュータプログラムにアップロードし、それによって未知データセットが作成される。コンピュータプログラムは、医療専門家がユーザー定義情報を有するデータセットを検索問い合わせにさらに蓄積することを可能にし、検索問い合わせを好ましくはネットワーク上でPCRLに伝達する。エキスパートシステムは、記載したように未知データセットにより参照データ記録を解析する。特定の規定の信頼区間で未知データセットと一致する参照データセットとして定義される潜在的一致物が、ネットワーク上で医療専門家に返される。したがって、医療専門家は、対象が、種々の癌の存在を示すAPCシグニチャーを有するかどうかを確認すること、および病気を識別することができる。
【０１９７】
等価物
本発明の具体的な態様の上記の詳細な説明から、独自の検出方法が記載されていることが明らかになるはずである。特定の態様が本明細書において詳細に開示されているが、これは例示目的のためだけに例として実施されており、以下の添付の特許請求の範囲に関して限定するものと意図されていない。特に、特許請求の範囲によって規定されている本発明の精神および範囲から逸脱しないで、種々の置換、変更および改良を本発明に加えることができることが考慮されている。例えば、検出方法に使用されるスペクトルの選択またはAPCは、本明細書に記載されている態様の知識を有する当業者にとって日常的なことであると考えられる。
【０１９８】
参考文献
本明細書に引用されるすべての米国特許およびその他の参考文献は、ここにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】リステリア・モノサイトゲネスを、細菌溶解および超音波処理方法によって処理し、金属結合について評価した図である。データはスペクトル像で示す。
【図２】リステリア・モノサイトゲネスを、細菌溶解および超音波処理方法によって処理し、金属結合について評価した図である。データはゲル像で示す。
【図３】リステリア・モノサイトゲネスを、細菌溶解および超音波処理方法によって処理し、疎水性表面について評価した図である。データはスペクトル像で示す。
【図４】リステリア・モノサイトゲネスを、細菌溶解および超音波処理方法によって処理し、疎水性表面について評価した図である。データはゲル像で示す。
【図５】未処置/未感染骨髄細胞(Mx、上のパネル、樹状細胞の(DC)混合物、中央のパネルおよび(Mo)単球、下のパネル)、DCおよびMoの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図６】対照アデノウイルスの存在下で培養したMxの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図７】単一遺伝子置換したアデノウイルスの存在下で培養したMxの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図８】対照アデノウイルスの存在下で培養したMoの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図９】単一遺伝子置換したアデノウイルスの存在下で培養したMoの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図１０】対照アデノウイルスの存在下で培養したDCの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図１１】単一遺伝子置換したアデノウイルスの存在下で培養したDCの細胞質タンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図１２】リステリア・モノサイトゲネスの存在下において同時培養したMxの核タンパク質抽出物から得られるタンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図１３】リステリア・モノサイトゲネスの存在下において同時培養したDCの核タンパク質抽出物から得られるタンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図１４】リステリア・モノサイトゲネスの存在下において同時培養したMoの核タンパク質抽出物から得られるタンパク質プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。
【図１５】リステリアに汚染された脱脂乳または全乳の分光プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。結果のスペクトル像を示す。
【図１６】リステリアに汚染された脱脂乳または全乳の分光プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。ゲル像を示す。
【図１７】リステリアに汚染された脱脂乳または全乳の分光プロファイル(シグニチャー)を例示する図である。ゲル像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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