(57)【要約】  Ｉｎ  ｖｉｖｏ形成され、内因性アルブミン及びあるタンパク質又はある薬剤などのアミン含有化合物を含む結合体を記載する。該結合体は、ポリマー−ジチオベンジル−治療薬結合体のｉｎ  ｖｉｖｏ開裂によって形成され、アルブミン−ジチオベンジル−治療薬結合体を形成する。アルブミン−治療薬結合体のジチオール部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ開裂され、遊離治療薬が本来の形で得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬をアルブミンとの結合体の形で送達するための方法であって、
被験者にポリマー−ジスルフィド−治療薬の形の化合物を投与することを含み、前記治療薬は少なくとも１つのアミン部分を含み、
前記投与は、被験者の内因性アルブミン及び治療薬を含む結合体の形成を実現する方法。
【請求項２】
前記ポリマー−ジスルフィド−治療薬化合物は、構造
【化１】
2008512385.tif 000005
（ここで、ＣＨ２−治療薬の配向はオルト位及びパラ位から選択される。）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミン含有治療薬は、あるタンパク質及びある薬剤から選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療薬は約４５ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーはポリエチレングリコールである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
プロドラッグは、被験者の内因性アルブミン及び少なくとも１つのアミン部分を含む治療薬を含み、前記アルブミン及び前記治療薬は、ジスルフィドによって結合されており、前記プロドラッグは、被験者にポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体を投与することによって得ることができ、前記ポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体の形で投与される治療薬の少なくとも約３５％は前記プロドラッグに変換される、被験者の治療用プロドラッグ。
【請求項７】
前記治療薬は４５ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項６に記載のプロドラッグ。
【請求項８】
前記ポリマーはポリエチレングリコールである、請求項６又は請求項７に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
前記治療薬はある薬剤である、請求項６から請求項８までのいずれか一項に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
前記治療薬はポリペプチドである、請求項６から請求項８までのいずれか一項に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
【化２】
2008512385.tif 000006
［ここで、ＣＨ２−治療薬の配向はオルト位及びパラ位から選択される。］
の形を有する、請求項６から請求項１０までのいずれか一項に記載のプロドラッグ。
【請求項１２】
治療薬の血液循環寿命を延長させるための方法であって、
被験者にポリマー−ＤＴＢ−治療薬結合体の形の化合物を投与することを含み、前記治療薬は少なくとも１つのアミン部分を含み、
前記投与は、内因性アルブミン及び前記治療薬を含むプロドラッグ結合体の形成を実現し、前記プロドラッグ結合体は、遊離形で投与される場合の前記治療薬の血液循環寿命に比べて卓越した血液循環寿命を有する方法。
【請求項１３】
前記ポリマーはポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療薬は４５ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療薬はある薬剤である、請求項１２から請求項１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療薬はポリペプチドである、請求項１２から請求項１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
【化３】
2008512385.tif 000007
（ここで、ＣＨ２−治療薬の配向はオルト位及びパラ位から選択される。）
の形を有する、請求項１２から請求項１６までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載された主題は、ある治療薬及び内因性アルブミンを含む内因的に形成された結合体、並びに治療薬及び内因性アルブミンを含む結合体の形で治療薬を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミンは、血流に見られる多機能タンパク質である。ヒト血清アルブミンは、血漿の膠質浸透圧に対して貢献することによって、血漿量及び組織液のバランスを調節する重要な因子である。アルブミンは、本来、血漿タンパク質の５０〜６０％を構成しており、この分子量が比較的小さい（６６，５００ダルトン）ため、血液の膠質浸透圧の８０〜８５％を生み出す。アルブミンは、経血管的な流量を調節するので、血管内及び血管外の液量を調節し、且つ脂質及び脂溶性物質を運搬する。アルブミン溶液は、熱傷、手術、出血又は循環量不足が存在するような他の外傷若しくは状態に起因するものを含む、ある種のショック又は切迫したショックの治療において、血漿量の増加及び心拍出量の維持に使用されることが多い。
【０００３】
アルブミンは、約２週間の血液循環半減期を有し、本来、脂質及び他の分子を運ぶように設計されている。疎水性結合ポケット及び遊離チオールシステイン残基（Ｃｙｓ３４）が、この機能を可能にする特徴である。Ｃｙｓ３４はｐＫａが低い（約７）ため、ヒト血漿中に見られる、より反応性の高いチオール基の１つである。アルブミンのＣｙｓ３４はまた、血漿中のチオール濃度の主要画分（８０％を超える）となっている（Ｋｒａｔｚ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４５（２５）：５５２３〜３３（２００２））。この反応性の高いチオールを介して担体として作用するアルブミンの能力は、治療目的に利用されている。例えば、薬剤の薬理学的特性を改良するために、薬剤をアルブミンに結合させることが記載されている（Ｋｒｅｍｅｒ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１３：（６）：６１５〜２３（２００２）；Ｋｒａｔｚ他、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．，８（５）：３０５〜１８（２０００）；Ｋｒａｔｚ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４５（２５）：５５２３〜３３（２００２）；Ｔａｎａｋａ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２（４）：２６１〜９（１９９１）；Ｄｏｓｉｏ他、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，７６（１〜２）：１０７〜１７（２００１）；Ｄｉｎｇｓ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１９４（１）：５５〜６６（２００３）；Ｗｕｎｄｅｒ他、Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ．，１７０（９）：４７９３〜８０１（２００３）；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３６（２０）：３３７９〜８５（１９８７））。ペプチド治療薬及びタンパク質治療薬をアルブミンに結合させることも記載されている（Ｈｏｌｍｅｓ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１１（４）：４３９〜４４（２０００）、Ｌｅｇｅｒ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３（２０）：３５７１〜５（２００３）；Ｐａｉｇｅ他、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１２（１２）：１８８３〜８（１９９５））。アルブミンとインターフェロン−アルファ（Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ（商標））との結合体、及びアルブミンとヒト成長ホルモン（Ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ（商標））との結合体、及びアルブミンとインターロイキン−２（Ａｌｂｕｌｅｕｋｉｎ（商標））との結合体については、治療有効性を現在試験中である。該技術分野はまた、標準的な組換え分子生物学手法を使用して、アルブミン−タンパク質の融合を生じさせることについて記載されている（米国特許第６５４８６５３号）。後者を除く全てにおいて、アルブミンとの結合体は、外因性アルブミンとのｅｘ  ｖｉｖｏ結合体形成を伴う。外因性のアルブミン源を使用することに対して障害となり得るのは、汚染又は免疫原性応答である。
【０００４】
治療薬をアルブミンにｉｎ  ｖｉｖｏ結合させることも記載されている。例えば、ここでは選択されたペプチドが投与前に修飾され、アルブミンが該ペプチドに結合できるようになる。この取組みは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ抵抗性グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似体を使用して記載されている（Ｋｉｍ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２（３）：７５１〜９（２００３））。特異的リンカー（［２−［２−［２−マレイミド−プロピオンアミド−（エトキシ）−エトキシ］−アセトアミド）を、該ペプチド上の、付加されたカルボキシル末端リシンに結合させ、アルブミンのシステイン残基が該ペプチドと結合できるようにした。他には、アルブミンへのｉｎ  ｖｉｖｏ結合を増加させるために、特異的タグをペプチド又はタンパク質に結合させることが検討されている（Ｋｏｅｈｌｅｒ他、ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２（２０）：２８８３〜６（２００２）；Ｄｅｎｎｉｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（３８）：３５０３５〜３５０４３（２００２））；Ｓｍｉｔｈ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１２：７５０〜７５６（２００１））。同様の取組みが小分子の薬剤と共に使用されている。該薬剤の誘導体は、アルブミンのシステイン残基と結合する能力を有するように特別に設計された。例えば、このプロドラッグ戦略はドキソルビシン誘導体に使用されている。ドキソルビシン誘導体は、この３４位のシステイン残基において内因性アルブミンに結合される（Ｃｙｓ３４；Ｋｒａｔｚ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，４５（２５）：５５２３〜３３（２００２））。治療薬とアルブミンとのｉｎ  ｖｉｖｏ結合は、内因性アルブミンを使用するという点において、汚染又は外因性アルブミンに対する免疫原性応答に伴う問題を未然に防ぐので、上記のｅｘ  ｖｉｖｏの取組みと比較して利点を有する。しかし、内因性アルブミンとの薬剤結合体をｉｎ  ｖｉｖｏ形成する先行技術の取組みは、薬剤とアルブミンとの間の恒久的な共有結合を伴う。この結合が開裂可能か又は可逆である限り、結合体から放出される薬剤又はペプチドは、元の化合物の修飾された形にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
結合体が（ｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ形成され、（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏにて可逆的であり、治療薬を本来の形で得られるような、治療薬と内因性アルブミンとの結合体を提供することは望ましいであろう。
【０００６】
上述の、従来技術の例及びこれらに関連する限定は、例証となることを目的としており、排他的ではない。従来技術の他の限定は、本明細書を読むこと及び本図面の研究によって、当業者には明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、一態様では、治療薬をアルブミンとの結合体の形で送達するための方法を提供する。該方法は、被験者にポリマー−ジスルフィド−治療薬の形の化合物を投与することを含み、前記治療薬は少なくとも１つのアミン部分を含む。該化合物の投与は、被験者の内因性アルブミン及び治療薬を含む結合体の形成を実現する。
【０００８】
一実施形態では、ポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体は、以下の構造を有するポリマー−ジチオベンジル−治療薬結合体である。
【化１】
2008512385.tif 000002
ここで、ＣＨ２−治療薬の配向はオルト位及びパラ位から選択される。
【０００９】
他の実施形態では、アミン含有治療薬は、あるタンパク質及びある薬剤から選択される。好ましい実施形態では、該治療薬はある薬剤を有するタンパク質であるか、約４５ｋＤａ未満、より好ましくは３０ｋＤａ未満、及びさらに一層好ましくは１５ｋＤａ以下の分子量を有するあるタンパク質である。
【００１０】
好ましい実施形態では、該ポリマーはポリエチレングリコール又は修飾されたポリエチレングリコールである。
【００１１】
他の態様では、被験者の治療用プロドラッグを記載する。該プロドラッグは、被験者の内因性アルブミン及び少なくとも１つのアミン部分を含む治療薬を含み、該アルブミン及び該治療薬はジスルフィドによって結合されている。
【００１２】
さらに他の態様では、治療薬の血液循環寿命を延長させるための方法を企図する。該方法は、上記のポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体を投与することを含み、内因性アルブミン及び該治療薬を含むプロドラッグ結合体の形成が実現される。
【００１３】
上記の例証的な態様及び実施形態に加えて、さらなる態様及び実施形態は、図面を参照することによって、及び以下の説明を研究することによって明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
Ｉ．定義及び略語
本明細書において使用される「タンパク質」とは、アミノ酸のポリマーを指し、アミノ酸の特定の長さのポリマーを指すものではない。したがって、例えばペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド及び酵素という用語は、タンパク質の定義の範囲内に含まれる。この用語には、タンパク質の発現後修飾物、例えばグリコシル化物、アセチル化物、リン酸化物なども含まれる。
【００１５】
「アミン含有」とは、アンモニアから誘導される部分、すなわちアンモニアの１個又は２個の水素原子をアルキル基又はアリール基で置換することによって、一般構造ＲＮＨ２（１級アミン）及びＲ２ＮＨ（２級アミン）が得られるような部分を有する任意の化合物を意味する。ここで、Ｒは任意の治療薬部分である。
【００１６】
本明細書において使用される「ポリマー」とは、水溶性部分を有するポリマーを指し、該水溶性部分は該ポリマーに、室温である程度の水溶性を付与する。すなわち、該ポリマーは親水性ポリマーである。例証的な親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド、上記列挙のポリマーのコポリマー、及びポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマーが含まれる。これらのポリマーの多くが有する特性及びこれらのポリマーの多くとの反応については、米国特許第５３９５６１９号及び第５６３１０１８号に記載されている。好ましいポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）などのＰＥＧの修飾型である。ポリマーの分子量は、広範囲にわたって変更可能であり、ｍＰＥＧについての通常の範囲は、１，０００ダルトン〜５０，０００ダルトン、より好ましくは１，５００ダルトン〜３０，０００ダルトンである。他の実施形態では、約３０，０００ダルトン未満のｍＰＥＧ分子量が企図される。
【００１７】
ポリマー、薬剤若しくは「ポリマー−ＤＴＢ−治療薬結合体」の形の治療薬への言及、又は「ポリマー−ＤＴＢ−薬剤結合体」への言及、又は「アルブミン−治療薬結合体」若しくは「アルブミン−薬剤結合体」への言及は、ポリマー、薬剤又は治療薬が結合体形成のためのある方法で修飾され、該修飾は、結合体形成のための反応中に官能基の付加又は１つ若しくは複数の化学単位の損失を含むが、これらに限定されるものではないということを意味する。
【００１８】
略語：ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ｍＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧ；ＤＴＢ、ジチオベンジル；ｍＤＴＢ、メトキシＤＴＢ；ＥｔＤＴＢ、エトキシＤＴＢ；Ｅｐｏ、エリスロポエチン；ＨＳＡ、ヒト血清アルブミン；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；Ｃｙｓ、システイン；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化タイムオブフライト型質量分析法；ｋＤａ、キロダルトン；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＮＢＤ、（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）。
【００１９】
ＩＩ．結合体形成の方法
一態様では、内因性アルブミン及び治療薬を含む化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ形成のための方法を提供する。治療薬は、アミン基を有するいずれの単位であってよく、例証的な単位を以下に示す。２種、すなわち内因性アルブミン及び治療薬間の結合体形成により、内因性アルブミン及び／又は治療薬の修飾が起こることは認識されるであろう。結合体という文脈における「内因性アルブミン」及び「治療薬」という用語の使用は、結合体を含むこれらの種の残基を意味する。付加体がｉｎ  ｖｉｖｏ形成されると、内因性アルブミンと結合することで、治療薬の血液循環寿命の増加が実現される。したがって、この方法は、製薬業界には通例の低分子量薬剤のみならず、高分子の生物学的治療薬、特にポリペプチドによく認められるような、血液循環時間が短いことに伴う問題の解決策を提供する。担体タンパク質として使用される内因性アルブミンを結合させることにより、ポリペプチド又は薬剤の寿命を延長させることが可能であり、結合体の形成において患者自身のアルブミンが使用されるので、たとえ免疫原性応答があったとしてもわずかであるというさらなる利点を有する。
【００２０】
図１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにて且つ内因性アルブミンを使用したアルブミン−治療薬付加体の形成を一般的に概説している。ポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体を調製し、被験者に投与する。通常、該結合体は静脈内投与されるが、いずれの非経口経路も適している。ポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体は、血流内に、グルタチオン、システイン、ホモシステイン、システイニル−システイン及びアルブミンなどの小分子のチオールが存在するために、血流内で還元される。血漿中、アルブミン存在下でポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体が還元されると、その結果、ポリマー−ジスルフィド−アルブミン付加体の形成に加えて、アルブミン−ジスルフィド−治療薬付加体が形成され、且つ治療薬が遊離形で放出される。アルブミンの３４位のシステイン残基（Ｃｙｓ３４）は内部ジスルフィド結合に関与しない遊離チオールを有し、これが、血流内の遊離チオールの大部分を占める。アルブミン分子の約６０％が血漿中で遊離チオールの形にあると考えられている。アルブミン−ジスルフィド−治療薬結合体は血液中で循環し続け、経時的に血液中の小分子のチオールによって還元される。アルブミン−ジスルフィド−治療薬結合体が血液中で還元されると、治療薬が本来の形で血液中に放出される。
【００２１】
上記のように、治療薬は、ほとんどいずれのアミン含有化合物であってよい。該化合物は、治療薬又は診断薬又は治療活性も診断活性も有さない化合物であることが可能であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与が望ましい。好ましい実施形態では、アミン含有治療薬は、ある薬剤又はあるタンパク質である。幅広い種類の治療薬剤は、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン及びシプロフロキサシンなどの反応性の高いアミン部分を有し、並びにこの方法は、これらのいずれの薬剤も限定されないことを意図する。かかる薬剤の分子量は、通常２ｋＤａ未満であり、１ｋＤａ未満であることが多い。たいていのタンパク質は反応性の高いアミノ基を含み、治療目的又は標的目的のタンパク質は当技術分野において知られている。例証的なタンパク質は、天然に存在するか又は組換え技術によって製造されたポリペプチドである可能性がある。小さい、ヒト組換えポリペプチドが好ましく、０．１〜４５ｋＤａ、より好ましくは０．５〜３０ｋＤａ、さらに一層好ましくは１〜１５ｋＤａの範囲にあるポリペプチドが好ましい。ポリペプチドの分子量は文献に報告されているか、又は通常の方法を使用して実験的に測定することができる。
【００２２】
ポリマー−ＤＴＢ−治療薬結合体を調製するための一般的な反応スキームを、例証的なポリマーとしてｍＰＥＧを用いて、図２Ａに示す。一般に、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脱離基化合物は、当技術分野において記載されている方法に従って調製される（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６６０５２９９号の実施例２Ａ〜２Ｂを参照のこと）。脱離基は、図２Ａに示すような炭酸ニトロフェニル、又は他のいずれの適切な脱離基であってよい。ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−炭酸ニトロフェニル化合物は、治療薬におけるアミン部分と、ウレタン結合によって結合される。化合物中のジスルフィドに隣接した炭素上のＲ基は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、（ＣｎＨ２ｎ＋１；一般にｎは１〜６）などであることが可能であり、ジスルフィド開裂の所望の速度に従って選択される。その上、単一又は複数のＰＥＧ鎖が、この化学反応によって治療薬に結合される可能性があり、例えばＲがＰＥＧ残基である場合、所望の放出プロフィールを実現することができる。治療薬としてリゾチームを含むｍＰＥＧ−メチルＤＴＢ−治療薬結合体及びエリスロポエチンを含むｍＰＥＧ−メチルＤＴＢ−治療薬結合体を調製するための反応の詳細を、実施例１に示す。本明細書に記載されている研究では、ｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−治療薬結合体を使用した。すなわち、図２Ａに関して、ジスルフィド結合に隣接した炭素上のＲ基はメチルであった。本明細書において参照を簡略化するために、この結合体を単にｍＰＥＧ−ＤＴＢ−治療薬と称す。
【００２３】
図２Ｂに図解されているように、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−治療薬結合体が血漿に曝露されると、アルブミンＣｙｓ−３４の遊離チオールが結合体のＤＴＢ部分に攻撃し、その結果、結合体の分解が生じる。この過程の生成物は、遊離治療薬、遊離ｍＰＥＧ、ジスルフィド結合されたｍＰＥＧ−アルブミン、及びアルブミン−治療薬である。後者の付加体はまた、血漿中の小分子のチオールの存在下で、遊離治療薬が放出されることによって示されているようにジスルフィド結合されるが、このことは図２Ｃに図解されている通りである。アルブミン−ＤＴＢ−治療薬が、長期にわたってｉｎ  ｖｉｖｏ循環した後に分解されると、本来の治療薬が産生する。
【００２４】
実施例２には、この方法の実施形態を例示するための研究について記載されている。ここでは、モデル治療薬として、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）とリゾチームとを含む結合体を調製した。ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体の合成は実施例１Ａに記載されており、分子量５ｋＤａ及び１２ｋＤａのｍＰＥＧとの結合体（本明細書において、それぞれｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム及びｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームと示されている）を調製した。これらの結合体を、システイン又はウシ血清アルブミンと共に４７時間インキュベートした。ＨＰＬＣによる分析のために、１０分、３０分、２時間、６時間、２３時間及び４７時間の時点でアリコートを抜き取った（実施例２）。結果を図３Ａ〜３Ｄに示す。
【００２５】
図３Ａ〜３Ｂは、システイン中で種々の表示時間にインキュベートされたポリマー−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースである（図３Ｃ、３Ｄの右手側参照のこと）。図３Ａは、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームについてのトレースを示しており、３本のピークが見られる。すなわち、結合体に相当する１．６分及び１９分のピーク、並びに本来のタンパク質リゾチームに相当する２４分のピークである。結合体に相当する２本のピークの出現は、恐らくリゾチーム上のｍＰＥＧの位置を反映している。この理由として、２個以上の異性体が可能であり、種々の異性体はそれぞれ異なってカラムと相互作用するためである。インキュベーション時間が増加するにつれてリゾチームに相当するピークが増加し、これに相応して結合体ピークが減少することが明らかであるが、このことは、インキュベーション時間がより長くなるにつれて結合体の開裂が持続することに一致する。図３Ｂは、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームについてのトレースを示す。インキュベーション時間がより長くなると本来の遊離リゾチームが増加し、これに相応して結合体の量が減少することが認められる。
【００２６】
図３Ｃ〜３Ｄは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で１０分から４８時間までの種々の時間インキュベートされたポリマー−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースである。図３Ｃは、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（１：１）結合体についてのトレースを示す。インキュベーション期間中の早い時期には、結合体に相当する１６．５分及び１８．６分のピークが見られる。ＢＳＡ中でさらにインキュベートすると、２３．８分のピークの出現が認められ、これが本来の遊離リゾチームに相当する。ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのトレースから、同様のことが観察される（図３Ｄ）。以下で論じるが、図５に示すように、これらの実験において過剰のアルブミン及びアルブミン含有付加体は、Ｑスピンカラムによって除去された。ＢＳＡ処理によって、ＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチームの画分のみが遊離リゾチームに変換されたことは明らかである。
【００２７】
図４Ａ〜４ＢはＨＰＬＣトレースから作成されたプロットであり、システイン中（図４Ａ）又はＢＳＡ中（図４Ｂ）でインキュベーション中に、残存する結合体の百分率を時間の関数として示している。図４Ａは、システインと共にインキュベートされた結合体の減少を時間の関数として示す。ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（三角）及びｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（ひし形）については、半減期をそれぞれ６０分及び４５分と算出した。
【００２８】
図４Ｂは、ＢＳＡ中でインキュベーション中に、残存する結合体の減少を時間の関数として示す。システイン中でのインキュベーションに比べて結合体の分解がより遅いことが明らかであり、このことはまた、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（三角）については６時間、及びｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（ひし形）については５時間という半減期が算出されたことにも反映されている。
【００２９】
図４Ｃ〜４ＤはＨＰＬＣトレースから作成されたプロットであり、システイン中（図４Ｃ）又はＢＳＡ中（図４Ｄ）でインキュベーション中に、再生されたリゾチームの百分率を時間の関数として示している。図４Ｃは、本来の遊離リゾチームが、５〜６時間にわたって、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（三角）及びｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（ひし形）から再生されたことを示す。
【００３０】
図４Ｄは、本来の遊離リゾチームが、ＢＳＡと共にインキュベーション中に該結合体から再生されたことを示す。遊離タンパク質の再生は、システインを用いた結合体の再生に比べて遅く、タンパク質の１０％未満が２種のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体のうちのいずれかから遊離形で再生される。
【００３１】
図３〜４のデータは、両結合体がシステインによって及びアルブミンによって開裂されたことを説明している。アルブミンによる開裂は、リゾチームとアルブミンとの反応の結果として、遊離リゾチームを完全には再生しなかった。したがって、アルブミン−リゾチーム結合体の存在及び量を確認するために、さらなる研究を行った。上記ＨＰＬＣ分析において、サンプルをＱ−スピンカラムに通し、クロマトグラフィーカラム上のサンプルが分離する前にＢＳＡを捕捉した。アルブミン−リゾチーム結合体がＱ−スピンカラムで取り除かれるかどうかを判断するために、Ｑ−スピンカラムに通さなかったサンプルをＨＰＬＣ（ＣＭ−カラム）によって分析した。このトレースを図５Ａ〜５Ｄに示す。図５Ａ〜５Ｂは、Ｑ−スピンカラムにサンプルを通す前（図５Ａ）及び通した後（図５Ｂ）に、４％ＢＳＡ中、室温で２４時間インキュベートされたｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのトレースに相当する。トレースを比較することにより、１１．６分の大きいピーク及び１５．３分のより小さいピークが存在することが明らかであり（図５Ａ）、これらのピークはＱ−スピンカラムにサンプルを通した後（図５Ｂ）には見られないものである。ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についても同じことが観察される（図５Ｃ〜５Ｄ）。３種のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体が、ＢＳＡで開裂した後、最初の数分の溶出液において、ＢＳＡのピークの他に約１１分及び１５．２分に２つの新しいピークが現れる。１１分及び１５．２分のピークは、Ｑ−スピンカラムにサンプルを通した後に、これまでは排除していた。
【００３２】
新しく形成されたピークを識別することを目的とした研究については、実施例３に記載されており、この研究において、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームの１：１結合体を調製した。該結合体をＢＳＡと共に２日間インキュベートし、このインキュベーション混合物を、次いでＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析した。ＨＰＬＣトレースを図６に示す。溶出プロフィールの初期にＢＳＡに相当するピークが見える。別のピークが約２４分に存在し、画分Ｅ２、Ｅ３と識別され、アルブミン−リゾチームに相当すると考えられる。約３０分のピークは溶出画分Ｆ１と識別され、約３７分及び３９分のピークは溶出画分Ｇ２及びＧ４と識別される。これらの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。このことは、図７〜８について議論することにする。
【００３３】
イオン交換クロマトグラフィーによって得られた画分（ＨＰＬＣを図６に示す）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを図７に示す。ここで、レーン１は、図６のＨＰＬＣトレース上でＥ２と識別された画分に相当する。レーン２は、図６のＨＰＬＣトレース上でＥ３と識別された画分に相当する。レーン３は、ＨＰＬＣトレース上でＦ１と識別された画分に相当し、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（レーン６）の主成分と同一であるように思われる。レーン４は、図６のＨＰＬＣトレース上でＧ２と識別された画分に相当する。レーン５は、図６のＨＰＬＣトレース上でＧ４と識別された画分に相当する。レーン６は、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（大体１：１）結合体に相当する。レーン７は、リゾチームに相当する。レーン８は、ＢＳＡに相当する。及びレーン９は分子量マーカーである。
【００３４】
ＢＳＡのＳＤＳゲル上での移動は、約５５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量に相当する（レーン８）。ただし、アルブミンの理論上の分子量は、６６．５ｋＤａである。画分Ｅ２及びＥ３（レーン１、２）には、約６０ｋＤａの分子量を有する主要バンドが含まれていた。アルブミン−リゾチーム（理論上の分子量；８１ｋＤａ）生成物の予測された移動は、６９ｋＤａ、すなわちＢＳＡ（５５ｋＤａ）とリゾチーム（１４ｋＤａ）との和である。レーン１及び２上に載せた６５ｋＤａの分子量を有する画分は、アルブミン−リゾチーム結合体の分子量と十分一致している。画分Ｆ１（レーン３）には、ｍＰＥＧ−リゾチーム結合体及び多少のＢＳＡ混入物が含まれる。画分Ｇ２（レーン４）にはリゾチームのみが含まれる。画分Ｇ４（レーン５）にはリゾチーム及び約２４ｋＤａの分子量であるように思われる他のバンドが含まれる。
【００３５】
ＨＰＬＣからＥ２、Ｇ２及びＧ４と識別された画分を還元（β−メルカプトエタノールで）ＳＤＳ−ＰＡＧＥと非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方によって分析すると、以下の像が現れた。ゲルを図８に示す。レーン１は、１４ｋＤａの分子量を有するリゾチームに相当する。レーン２及び３は、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（レーン２）及びβ−メルカプトエタノールで処理された結合体（レーン３）に相当する。β−メルカプトエタノールが結合体を還元し、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ付加体からリゾチームが放出された。レーン４及び５は、ＢＳＡ（レーン４）及びβ−メルカプトエタノールで処理されたＢＳＡ（レーン５）に相当する。β−メルカプトエタノールで還元されたＢＳＡは、予定通り５５ｋＤａ〜６６ｋＤａ（レーン４、５）の分子量に移動したが、これはアルブミンの真の分子量に一致していた。画分Ｅ２（レーン６）は、β−メルカプトエタノールでの処理後、リゾチームのバンドとＢＳＡのバンド（レーン７）とに分解された。このチオール還元は、Ｅ２が、ジスルフィド型結合によって結合されたリゾチーム−アルブミン付加体を含むという指標であった。画分Ｇ２（レーン８）は、β−メルカプトエタノールによって影響を受けないように思われた。画分Ｇ４（レーン１０）は、β−メルカプトエタノールによって単一のバンドに還元された（レーン１１）。このことから、約２４ｋＤａ（レーン１０）のバンドは、ジスルフィド結合によって形成されたリゾチームダイマー（理論上の分子量；約２８ｋＤａ）であることが示唆された。レーン１２は分子量マーカーを示す。
【００３６】
図９は図６に関して議論された精製画分Ｅ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。１４，５８２のシグナルは、１４，３８８ダルトンの理論上の分子量を有する、本来の遊離リゾチームに相当する。６６，７３１のピークは、６６，５００ダルトンの分子量を有する、ＢＳＡに相当する。８１，４３８のピークは、８１ｋＤａの理論上の分子量を有する、アルブミン−リゾチーム付加体結合体に相当する。ＭＡＬＤＩの条件下では、ジスルフィド結合は部分的に切断されることが多いということに留意されたい。４０５８５及び９５９８４のさらなるシグナルは、それぞれ、二重荷電アルブミン−リゾチーム種及びアルブミン−（リゾチーム）２に相当する。
【００３７】
また、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を蛍光標識し、ラット血漿又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃にてタイムコース間で検討した。実施例４に詳述されているように、リゾチームの遊離リシン残基を標識するＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８で、結合体を標識し、次いでラット血漿又はウシ血清アルブミンと共にインキュベートした。サンプルを時間の関数として採取し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。蛍光像を、蛍光イメージャーを使用して定量した。ＳＤＳゲルはまた、ＳＹＰＲＯレッドで染色し、全タンパク質を視覚化した。結果を図１０〜１３に示す。
【００３８】
図１０〜１３におけるデータは、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム及びｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームの両方が、ウシ血清アルブミンの存在下（図１１、１３）と比較して、血漿の存在下（図１０、１２）でより速くアルブミン−リゾチーム及び遊離リゾチームに変換されたことを示す。このことは、ある程度、血漿中の小分子のチオールの存在による可能性がある。これらの研究はまた、開裂剤としてＢＳＡ単独では、ラット血漿の場合と同じ程度の遊離リゾチームを得ることはできなかったことも示している。ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（図１０、１１）については、リゾチームダイマー中間体の形成物が、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（図１２、１３）ほど分離可能ではなかったので、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームの定量に含まれた。高分子量（ＨＭＷ）の蛍光種が認められ、血漿中でインキュベートされたｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームで最もよく見られた。ＨＭＷ種は、明らかに蛍光結合体と血漿タンパク質又はアルブミンとの相互作用に起因し、蛍光体の非特異的転写ではないようである。また、これらのＨＭＷ種は、還元剤の存在下で蛍光リゾチームから開裂される。
【００３９】
図１０Ｃ、１１Ｂ、１２Ｃ及び１３Ｃに関しては、データは、各ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１０Ａ、１１Ａ、１２Ａ及び１３Ａ）の各レーンにおいて、全蛍光標識物質に対する各種の百分率として表される。ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（黒丸）の消失及びアルブミン−リゾチーム（三角）の出現の両方が見られた。その上、遊離リゾチーム（白丸）の出現も見られた。高分子量（ＨＭＷ）の蛍光種（×印）もラット血漿又はウシ血清アルブミンでのインキュベーション中に形成された。図１２Ｃ及び１３Ｃに見られるように、リゾチームダイマー形の中間体も定量された（十字印）。
【００４０】
モデル治療薬としてリゾチームを使用した上記の研究によって、ポリマー−ＤＴＢ−リゾチーム結合体の投与後に、アルブミン−リゾチームのプロドラッグ結合体が形成されることが説明される。好ましい実施形態では、投与されるポリマー−ＤＴＢ−治療薬結合体の少なくとも約３５％が、内因性アルブミン及び治療薬を含むプロドラッグ結合体に変換される。言い換えれば、ポリマー−ＤＴＢ−治療薬結合体の形で投与される治療薬の総量のうち、少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに一層好ましくは少なくとも約７０％が、投与２時間後の血液中にアルブミン−治療薬結合体の形で見出される。
【００４１】
モデル治療薬としてエリスロポエチン（Ｅｐｏ）を使用して、さらなる研究を行った。実施例５に記載されているように、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏを含む結合体を調製した。比較用に、開裂不可能なｍＰＥＧ−Ｅｐｏ結合体も調製した。これらの結合体をヒト血清アルブミンの存在下でインキュベートした。全ての反応を確実に行うために、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化し、ＨＳＡの濃度を生理学的条件に比べて極めて低くし、且つ小分子のチオールを反応に含めなかった。これは、新しく形成されたアルブミン−Ｅｐｏ結合体のその後の開裂を防ぐためである。アルブミン−Ｅｐｏ生成物は、反応物をシステインで処理した場合に見られる（データを図示せず）ような、チオール開裂が可能な結合によって生成される。
【００４２】
図１４Ａは、結合体生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１は、ＨＳＡの存在下でのｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体を示し、レーン２は、ＨＳＡの存在下での開裂不可能なｍＰＥＧ１２Ｋ−Ｅｐｏ結合体を示す。レーン３は、過剰なｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−グリシン結合体と共にインキュベートされたＨＳＡに相当する。レーン４はＨＳＡ単独を示し、レーン５は、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体単独を示す。レーン６は、２ｍＭシステインと共にインキュベートされたｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体に相当する。レーン７はＥｐｏ単独である。これらの実験は、アルブミンのエリスロポエチンへの結合は、開裂可能なｍＰＥＧ−ＤＴＢリンカーの存在に依存することを実証している。Ｅｐｏ単独でも、開裂不可能なｍＰＥＧ−Ｅｐｏでも、どちらもアルブミン−Ｅｐｏ結合体を形成しなかった。さらに、アルブミン−Ｅｐｏ結合自体は、アルブミン−Ｅｐｏ形成の過程において、ＰＥＧ化されなかった。このことは、アルブミン−Ｅｐｏへの変換には、ＰＥＧ−ＤＴＢ部分を取り除くことが必要であることを示している。この証拠は、ｍＰＥＧ−ＤＴＢのチオベンジルリンカー部分によるアルブミンの結合前又はこの結合と同時に起こる、ＰＥＧの開裂に一致する（図２Ｂ）。
【００４３】
ゲルにおける前染色分子量マーカーに照らし合わせて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、関心対象の分子の見かけ分子量は以下の通りである。
【表１】
2008512385.tif 000003
【００４４】
図１４Ｂは、抗−ＨＳＡを用いてプローブした免疫ブロットであり、レーン１〜７は図１４ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける同一サンプルに相当する。図中、「ＨＳＡ−Ｅｐｏ」という表示のある矢印で示されているように、アルブミン−Ｅｐｏ結合体は、約１１１ｋダルトンに見ることができる。ｍＰＥＧ−アルブミン結合体も見ることができ、図中、「ＰＥＧ−ＨＳＡ」という表示のある矢印で示されている。９６ｋＤａのｍＰＥＧ−アルブミン結合体、並びに１０５ｋＤａ及び７５ｋＤａのＰＥＧ−Ｅｐｏの同一性を確認するために、ヨードＰＥＧ染色及びＥｐｏに対する抗体を使用した（データを図示せず）。ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−アルブミンの位置は、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−グリシンを用いたアルブミンの対照反応（レーン３のサンプル）によって確認された。
【００４５】
蛍光標識ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体を、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体に関する上記議論の研究（実施例４）と同様に、ラット血漿又はウシ血清アルブミンの存在下で３７℃にて、タイムコース間で観察した。ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータ（１２ｋＤａ及び３０ｋＤａのｍＰＥＧ分子量）を図１５〜１７に示す。アルブミン含有バンドの同一性を、図１４Ｂと同様に免疫ブロット法によって確認した。ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ（図１５Ａ〜１５Ｃ）については、２：１  ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏがアルブミン−Ｅｐｏと重なり合っているので、これらの種の定量が分かりにくくなった。したがって、このことを明確にするために、ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏを利用した。図１５Ｃと図１６Ｃとを比較することによって、長鎖（高分子量）のｍＰＥＧは、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体におけるジスルフィド結合の開裂速度が緩やかであることが明らかとなる。図１５Ｂ、１６Ｂ及び１７Ｂは、ＳＹＰＲＯレッドで染色することによって視覚化された全タンパク質の含量を示す。１：１を超えた置換比率でのｍＰＥＧ−ジスルフィド−タンパク質結合体のトレース量もまた観察した（２：１  ポリマー：タンパク質）。
【００４６】
図１５Ｃ、１６Ｃ及び１７Ｃにおけるデータは、各ゲル（図１５Ａ、１６Ａ及び１７Ａ）の各レーンにおいて、全蛍光標識物質に対する各種の百分率として表される。ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏタンパク質結合体（黒丸）の消失及びアルブミン−Ｅｐｏ（三角）の出現が見られた。その上、遊離Ｅｐｏ（白丸）の出現も見られた。結合体の開裂は、ウシ血清アルブミン中に比べて血漿中で開裂速度が速くなった。
【００４７】
特に、リゾチーム含有結合体における上記のデータと比較して、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体の形にあるＥｐｏの約２５％のみしかアルブミン−Ｅｐｏ結合体に変換されず、リゾチーム結合体に関して見られたよりもかなり少なかった。ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体を血漿中で２時間以上インキュベートしても、血漿中に見られるＥｐｏの２５〜３０％しかＥｐｏ−アルブミン結合体の形にならなかった。
【００４８】
表２は、図１０〜１３及び図１５〜１７に示されたデータから測定された開裂速度（Ｔ１／２値）の一覧である。これらの速度は、ラット血漿又はウシ血清アルブミンでの処理後、時間ゼロにおいて存在するＰＥＧ−ＤＴＢ−タンパク質の初期量の半分が分解する時間を（分で）表す。
【表２】
2008512385.tif 000004
【００４９】
ＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体の血液循環半減期は、ＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体の血液循環半減期に比べて約１／５に満たなかった。このことは、ジスルフィド結合の開裂速度及びアルブミンとの結合体形成がより速いことを示している。
【００５０】
モデルタンパク質であるＥｐｏ及びリゾチームを用いて調製した結合体について、上記結果が示しているのは、ポリマー−ＤＴＢ−タンパク質結合体がアルブミンと相互作用する場合に、アルブミン−タンパク質結合体が形成され、より小さい分子量のタンパク質と相互作用する場合には、多量のアルブミン−タンパク質結合体が得られるということである。治療タンパク質の電荷又はＤＴＢとの結合位置近くの構造によって引き起こされる障害が、形成されるアルブミン−タンパク質結合体の収率の一因となる可能性がある。この研究はまた、アルブミン−タンパク質結合体がチオール還元剤の存在下で開裂されることを示しており、このことは、リンカーがジスルフィドであり、恐らくチオベンジルリンカーであることを示唆している。
【００５１】
実施例６に記載されているように、ジスルフィド−リンカーの開裂速度を検討する、さらなる研究を行った。実施例４及び５におけるようなタンパク質よりもむしろ、小分子の蛍光アミノ酸誘導体、すなわち３４４．７９ダルトンの分子量を有するリシン−ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）を使用した。簡潔にいうと、ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−ＮＰＣは蛍光リシン−ＮＢＤに結合された。対照として、ｍＰＥＧとリシン−ＮＢＤとの開裂不可能な結合体を、ｍＰＥＧ−炭酸スクシンイミジルを使用して調製した。これらの結合体を、ウシ血清アルブミン中でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のために、指定時間にアリコートを抜き取った。ゲルを図１８Ａ〜１８Ｃに示す。図１８Ａ〜１８Ｃの全てにおいて、レーン２〜６は、開裂不可能なｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ結合体を、等モル濃度のＢＳＡと共に０分、５分、３０分及び１時間インキュベートしたものに相当する。レーン６〜１０は、開裂不可能なｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ結合体を、ＢＳＡと共にインキュベートしたものであるが、結合体は１０倍高い濃度で存在し、インキュベーション時間は０分、５分、３０分、１時間及び１８時間に相当する。ゲルは、基本的に、ＢＳＡと開裂不可能なｍＰＥＧ３０Ｋ−リシン−ＮＢＤとの間の相互作用が、等モル濃度又は１０倍ＰＥＧ濃度で、３７℃、表示タイムコース間では全く起こらないことを示す。ＰＥＧ誘導体単独を図１８Ａ、レーンＮに示す。図１８Ｂ及び１８Ｃは、同一ゲルを示すが、このゲルは、ＰＥＧ（図１８Ｂ）を検出するためにヨードで染色されているか、又はタンパク質を視覚化するためにクマシーブルー染色されている。
【００５２】
図１９Ａ〜１９Ｄは、等モル量のＢＳＡと共にインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤを用いて行った研究についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図１９Ａ〜１９Ｃは、非還元ゲルであるＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ上で移動させたサンプルに相当する。図１９Ｄ〜１９Ｆは、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動させたサンプルに相当する。各ゲルにおけるレーンは、各ゲルの上部に沿って記載されているように、結合体のＢＳＡ中でのインキュベーション時間に相当する。分子量マーカーはＭＷと表示されたレーンであり、レーンＮ（図１９Ａ〜１９Ｃ）はｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ単独に相当する。見られるように、新規の付加体が形成され、インキュベーション５分以内にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって見ることができる。ＢＳＡは、インキュベーション期間のタイムコース間で、恐らくリシン−ＮＢＤで蛍光標識されるようになる（図１９Ａ、１９Ｄ）。また、ＰＥＧに対するヨード染色によって、やがてｍＰＥＧ３０Ｋ−ＢＳＡに相当するバンドが約１２６ｋＤａ（図１９Ｂ、１９Ｅ）に現れる。比較用に、ＢＳＡ単独を図１９Ｄ、レーンＢＳＡに、及びｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ単独を図１９Ａ、レーンＮに示す。β−メルカプトエタノールの存在下で、ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤのＤＴＢリンカーは開裂し、ｍＰＥＧ３０Ｋ及びリシン−ＮＢＤが得られる（図１９Ｄ〜１９Ｆ）。ＢＳＡ反応において形成された付加体はまた、前の実施例に見られるように、恐らくジスルフィド結合されている。ＢＳＡ反応のゼロ時点のサンプルを、ゲルサンプル調製中にβ−メルカプトエタノールで処理した（図１９Ｄ、レーン「０＋βＭＥ」）。ＤＴＢ−リンカーの完全に近い開裂が、これらの条件下で見られた。１８時間の時点のサンプルを同様の方法で処理した（図１９Ｄ、レーン「１８＋βＭＥ」）。１８時間の時点に還元剤を追加したが、ＢＳＡ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ付加体の開裂には十分に適切ではなかった可能性があり、又は付加体形成に関して別の機構も起こる可能性がある。還元されたＢＳＡ及びＰＥＧ３０Ｋは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ同じ距離を移動することに留意されたい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、１１５ｋＤａを超えた位置に移動する高分子量の蛍光ＮＢＤ付加体が何であるかを決定することができない（図１９Ａ、１９Ｄ）。これが、１個又は両方のＢＳＡ分子が同様にリシン−ＮＢＤで標識されるようになるダイマー化ＢＳＡであるか、又は他の（特定、又は非特定の）高分子量付加体であるかどうかは見分けがつかないが、高分子量のＮＢＤ蛍光からのシグナルは全蛍光の５％未満である。
【００５３】
ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ結合体を等モル濃度のＢＳＡと共にインキュベートした場合について同様の研究を行った。相当するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図２０Ａ〜２０Ｃに、及び蛍光標識リシン−ＮＢＤの定量を図２０Ｄに示す。ゲルに関して、図２０Ａは、ゲルの上端に沿って示されているように、サンプルをインキュベーション時間の関数として示す。図２０Ｂ及び２０Ｃは、それぞれＰＥＧ視覚化用及びタンパク質視覚化用に染色された同一ゲルに相当する。図２０Ａにおけるデータを定量し、図２０Ｄのグラフを得た。ただしβＭＥの存在下で移動させたレーン２２＋βＭＥを除いた。ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ（図２０Ｄ、黒丸）の消失及びＢＳＡ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ（図２０Ｄ、白丸）の出現の両方が見られた。半量のｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤが残存するおおよその時間は２７．５分であり、ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏの分解に対する時間の１／３未満であった（表２）。形成されたＢＳＡ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ種は、分析終了点による全ＮＢＤシグナルの９２．２％であった。
【００５４】
他の試験においては、実施例７に記載されているが、ミクロコッカスルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）混濁試験を使用し、４％ＢＳＡ若しくはシステインで処理した後、又は対照として生理食塩水で処理した後に、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム活性を分析した。図２１は、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体をシステイン（四角）、ＢＳＡ（丸）又は生理食塩水（三角）と共にインキュベートした場合の、活性リゾチームの濃度をμｇ／ｍＬで、時間の関数として分で示している。ＢＳＡでの開裂後、この試験による活性リゾチームの濃度は、２４時間後で約１８μｇ／ｍＬ（丸）であった。この量は、システイン開裂から再生された活性リゾチーム（７４μｇ／ｍＬ、四角）の２４％しかない。したがって、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチームをＢＳＡ処理すると、ＢＳＡ−リゾチーム結合体が形成された。この理由として、ＢＳＡ−リゾチーム結合体が酵素活性を全く有さないのに対して、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体がシステイン開裂されると活性リゾチームが放出されたためである。図２１におけるデータは、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体が酵素活性をほとんど有さない（１〜５％）こと、及び該結合体を生理食塩水中３７℃で２４時間以下でインキュベートしても、ＰＥＧからリゾチームが放出されなかったことを示す。このデータはまた、システインを媒介としたｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチームの開裂に関しては酵素活性が再生されるが、一方ＢＳＡ開裂からは活性リゾチームの画分しか形成されないことを示す。このことは、ＢＳＡ反応の主要生成物として、不活性なアルブミン−リゾチーム結合体が形成されることに一致する。出発結合体であるｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチームは、長期間にわたって、ＰＢＳにおいて最小の活性を示した。
【００５５】
ポリマー−ＤＴＢ−治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ投与について、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームを含む結合体をラットに投与することによって検討した。実施例８に記載されているように、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームを１群３匹のラットに静脈内投与した。さらなるラットに、開裂不可能なｍＰＥＧ−リゾチーム結合体、又は比較対照として遊離リゾチームを投与した。２４時間の期間にわたり、選択された間隔で血液サンプルを採取し、リゾチーム濃度について分析した。結果を図２２に示す。
【００５６】
図２２は、３投与群についてのリゾチーム濃度を、時間の関数として（すなわち、薬物動態プロフィール）示している。遊離リゾチーム（逆三角形）は血流から急速に除去された。開裂不可能なｍＰＥＧ−リゾチーム結合体（ひし形）の形で投与されたリゾチーム、又はｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（丸）が投与されたリゾチームは、似たような延長された循環寿命を示した。開裂不可能なｍＰＥＧ−リゾチーム結合体及び開裂可能なｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体の両方についての半減期及びＡＵＣ値は類似していた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、血漿中で、及びｉｎ  ｖｉｖｏ条件と同様のアルブミン溶液中でのインキュベーション中に、ポリマー−ＤＴＢ−薬剤結合体が比較的急速に開裂されるのは、チオール還元剤が存在するためであるということが実証されている。開裂不可能なｍＰＥＧ−リゾチーム結合体に匹敵するほど長い、開裂可能なｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体の循環寿命は、長循環アルブミン−リゾチーム生成物の形成に一致する。したがって、本ｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、アルブミン−リゾチーム付加体の形成が、モデル薬剤（リゾチーム）の緩やかなクリアランス及び長い循環寿命の根拠であるということを裏付けるものである。
【００５７】
以上のことから、本発明の種々の目的及び特徴をいかにして満たすかということを理解することが可能である。ｅｘ  ｖｉｖｏ調製されたポリマー−ジスルフィド−治療薬結合体を被験者に投与し、長い薬剤循環寿命を有するアルブミン−治療薬結合体の形成を実現することが可能である。上記の研究ではジチオベンジル結合を使用するが、他のジスルフィド結合が同様に適用できることは理解されるであろう。本来の形での治療薬は、アルブミン−治療薬結合体のｉｎ  ｖｉｖｏでのチオール開裂後に再生される。アルブミン−治療薬結合体は、内因性アルブミンを使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成される。アルブミン及びアルブミン−治療薬結合体の長い循環寿命は、腫瘍などの組織又は関節リウマチの治療のための滑膜の標的として、薬剤を送り込む能力を提供する。当業者は、治療薬の血液循環寿命が延長されたことから恩恵を受けるであろう種々の病状を理解することができる。タンパク質分子などの治療薬の循環時間が増加することにより、治療に必要な治療薬の量がより少なくなるため、１回投与あたりの費用を削減することが可能になる。その上、投与回数をより少なくすることができるため、患者のコンプライアンスを改善することが可能になる。本明細書に記載された技術は、アミン基を有する任意の治療薬と共に利用されることが可能である。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本明細書に記載された本発明をさらに説明するためのものであり、本発明の範囲を決して限定するためのものではない。
【００５９】
（実施例１）
ポリマー−ＤＴＢ−治療薬結合体の調製
本反応スキームは、図２Ａに一部説明されている。
【００６０】
Ａ．ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム
参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６６０５２９９号の実施例２Ａに記載されているように、種々の分子量（５〜３０ｋＤａ）のｍＰＥＧ−メチルＤＴＢ−炭酸ニトロフェニルを調製した。ｍＰＥＧ−Ｍｅ−ＮＰＣ結合体の構造を図２Ａに示す。ここで、ＲはＣＨ３（メチル）である。
【００６１】
リゾチーム（最終濃度１０ｍｇ／ｍＬで）を、ホウ酸塩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）中、２５℃で２〜５時間、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＮＰＣ又はｍＰＥＧ−ＮＰＣのどちらか一方と共に、３．５ＰＥＧ／リゾチーム（０．５ＰＥＧ／アミノ基）の仕込みモル比を使用して反応させた。この結合反応物を、１０倍過剰のグリセリンを加えることによってクエンチした。
【００６２】
ＰＥＧ−リゾチーム結合体を、Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、ディアフィールド、イリノイ州から購入したカルボキシメチルＨＥＭＡ−ＩＥＣ  Ｂｉｏ１０００セミ分取ＨＰＬＣカラム（７．５ｘ１５０ｍｍ）上で精製した。まず初めに、結合反応物を、ｐＨ６の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中ＨＰＬＣカラムに注入した。未反応のＰＥＧが全て除去されるまで、この緩衝液での溶出を続けた。次いで、ｐＨ６の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中０．２Ｍ  ＮａＣｌを１５分間適用し、ＰＥＧ化リゾチームを溶出させた。最後に、２０分間かけて０．５Ｍ  ＮａＣｌまで塩濃度を増加させることによって、本来のリゾチームを溶出させた。画分（１ｍＬ）を採取し、タンパク質及びＰＥＧの含量について分析した。このようにして、各画分のアリコート（２５μＬ）を、ＢＣＡタンパク質定量用試薬（２００μＬ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州）と、マイクロタイタープレートのウェル中で３７℃にて３０分間反応させ、吸光度を５６２ｎｍで読み取った。ＰＥＧ測定についても同様に、２５μＬのアリコートを、１Ｎ  ＨＣｌ（２００μＬ）中０．１％ポリメタクリル酸溶液と［Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ＆Ｓ．Ｍｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９７）Ｃｈａｐｔｅｒ２１，ｉｎ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ＆Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編），ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，ｐｐ．３１８〜３４１］マイクロタイタープレートのウェル中で反応させ、次いで吸光度を４００ｎｍで読み取った。タンパク質及びＰＥＧの両方を含む画分を貯留した。１つのＰＥＧ部分のみを含むＰＥＧ−リゾチームの単離については、同一の陽イオン交換クロマトグラフィーのプロトコールを使用し、採取した画分を逆相ＨＰＬＣ定量法によって分析した。ＰＥＧ対リゾチーム結合体種が１：１の単一ピークを含む画分を貯留した。
【００６３】
Ｂ．ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＥＰＯ
参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６６０５２９９号の実施例２Ａに記載されているように、種々の分子量（５〜３０ｋＤａ）のｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−炭酸ニトロフェニルを調製した。
【００６４】
アセトニトリル中１６ｍＭ  ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＮＰＣ（１９９．６ｍｇ／ｍＬ）及びｍＰＥＧ−ＮＰＣ（１９５．３ｍｇ／ｍＬ）のストック溶液を調製した。
【００６５】
組換え型ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ、ＥＰＲＥＸ（登録商標））を、２０ｍＭクエン酸Ｎａ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ６．９中、２．７７ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で予備調製することによって得た。
【００６６】
ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＮＰＣをＥｐｏと、モル比６：１で、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．８中、室温（約２５℃）にて４時間混合した。反応物をさらに４℃で一晩インキュベートし、次いで１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５中で透析することによってクエンチした。
【００６７】
精製前に、結合体を２０ｍＭトリスｐＨ７．５緩衝液中で透析し、０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ低タンパク結合シリンジフィルターを通してろ過した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．（ピスカタウエイ、ニュージャージー州）から入手した１ｍＬ  Ｑ  ＸＬ陰イオン交換カラム上で、２０ｍＭトリスｐＨ７．５緩衝液を含む移動相Ａから２０ｍＭトリスｐＨ７．５緩衝液中５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む移動相Ｂへと段階勾配溶出プロフィールを使用して精製を行った。勾配は、Ａ１００％が８分間、Ｂ１８％が２５分間、次いでＢ７０％が１０分間であった。溶出画分をポリプロピレン管に各画分１ｍＬずつ採取した。移動相Ｂ１８％（９０ｍＭ  ＮａＣｌ）時に溶出する画分を、精製結合体の画分（１０画分）として識別し、１本の管に貯留し、２〜８℃で保存した。
【００６８】
精製ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ６．９中（緩衝液４Ｌを４回交換）、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ分画分子量６０００〜８０００透析チューブを使用して透析した。ＹＭ１０膜を有する１０ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ濃縮装置を使用し、窒素圧４５〜５０ｐｓｉ下で、各サンプル量を１０ｍＬから約４．５ｍＬに減らした。
【００６９】
（実施例２）
システイン及びＢＳＡ溶液中でのＰＥＧ−ＤＴＢ−タンパク質結合体の分解
ＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を、実施例１Ａに記載したように調製した。結合体（１００μｇ／ｍＬ＝０．０６６ｍＭ）を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中で、０．６ｍＭシステイン中又は４％ＢＳＡと共に室温（２２〜２４℃）でインキュベートした。種々の時点でアリコートを採取し、反応を２０ｍＭヨードアセトアミドを用いて停止し、分析まで２〜８℃で保存した。
【００７０】
システインと共にインキュベートした結合体については、アリコートの分析を以下のように行った。サンプルを１０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．４中１／１０に希釈し、カルボキシメチル（ＣＭ）陽イオン交換カラム上で分析した。
【００７１】
ＢＳＡと共にインキュベートした結合体については、サンプルの分析を以下のように行った。サンプルを１０ｍＭ  ＰＯ４  ｐＨ７．４中１／１０に希釈し、Ｑスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）に通してアルブミン及びこのいずれの関連生成物をも捕捉し、次いで同一のＣＭカラム上で分析した。
【００７２】
ＨＰＬＣは、以下の条件で行った。すなわち、カラム：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ  ＣＭ−５ＰＷ  １０ミクロン（７．５ｍｍｘ７．５ｃｍ）；移動相：（Ａ）１０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．４及び（Ｂ）１０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．４中５００ｍＭ  ＮａＣｌ；勾配：Ａ１００％を５分間、Ｂ０％からＢ１００％へ２０分間；流速：１ｍＬ／分；蛍光検出器：λｅｘ２９５ｎｍ、λｅｍ３６０ｎｍ（スリット３０ｎｍ）；並びに注入量、１００μＬである。
【００７３】
結果を図３Ａ〜３Ｄ、図４Ａ〜４Ｄ及び図５Ａ〜５Ｄに示す。
【００７４】
（実施例３）
アルブミンでのｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチームの開裂後のアルブミン−リゾチーム生成物の同定
Ａ．ＨＰＬＣによる分析
実施例１Ａに記載したように調製したｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム１−１結合体（１００μｇ／ｍＬ）を、４％ウシ血清アルブミンと共に、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７．４中、２日間室温（２２〜２４℃）でインキュベートした。次いで、反応物をカルボキシメチル（ＣＭ）陽イオン交換カラム上に注入し、０．５ｍＬの画分を採取して分析した。イオン交換分離条件は以下通りである。すなわち、カラム：ＨＥＭＡ  ＣＭ６．６ｍＬ；移動相：Ａ）１０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．４、Ｂ）１０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．４中５００ｍＭ  ＮａＣｌ；勾配：Ａ１００％を１０分間、Ｂ０％からＢ１００％へ４０分間、次いでＢ１００％で１分間；流速：１ｍＬ／分；ＵＶ検出器：２１５ｎｍ及び２８０ｎｍ；注入量、３．３ｍＬである。ＨＰＬＣトレースを図６に示す。
【００７５】
Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる分析
結合体の特性付けを行うために、変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。プレキャストＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（４〜１５％）、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ泳動緩衝液、分子量タンパク質スタンダ−ド（Ｍａｒｋ１２（商標））及びＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ−２５０染色キットは、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州から入手した。通常の電気泳動において、サンプルを含むタンパク質１〜３μｇをゲルの各ウェルにロードし、次いで２００ｍＶの定電圧で電気泳動させ、メーカーの使用説明書に従って、タンパク質用に染色した。ＰＥＧ検出用に、全く同一のゲルをＫｕｒｆｕｒｓｔ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００（２）：２４４〜２４８（１９９２）に従って、ヨードで染色した。図７に示すように、ＣＭカラム分離から採取した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析した。
【００７６】
ＣＭカラム分離から採取した画分はまた、５０ｍＭβ−メルカプトエタノールと共にインキュベートし、次いで再びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを図８に示す。画分Ｅ２及びＥ３は、アルブミン−リゾチーム付加体であると判明した。画分Ｆ１は、残存するｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム（１：１）結合体であった。画分Ｇ２にはリゾチームが含まれていた。画分Ｇ４は、ジスルフィド（ＤＴＢ）結合されたリゾチームダイマーに相当した。同様に、アルブミン−リゾチームの存在を、他の分子量のＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体の、アルブミンを媒介とした反応から確認した。
【００７７】
精製アルブミン−リゾチーム付加体（図６における画分Ｅ２）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析したところ、図９に示すように、８１ｋＤａの主要なアルブミン−リゾチーム付加体の分子イオンが存在した。
【００７８】
（実施例４）
血漿及びアルブミン溶液中でのポリマー−ＤＴＢ−タンパク質結合体の分解に対する特性付け
分子量５、１２及び３０ｋＤａのｍＰＥＧから誘導される、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体及びｍＰＥＧ−ＤＴＢ−エリスロポエチン結合体を、上記のように調製した。これらの結合体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８で標識し、遊離染料を除去した。標識結合体（０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬ）を７５％ラット血漿と共に、又は３．５５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水の存在下でインキュベートした。分析のために指定時点に抜き取ったサンプルを、５０ｍＭヨードアセトアミドで処理し、ジスルフィドの開裂を終了させ、次いで氷上に置いた。採取したサンプルをＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８蛍光像を、蛍光イメージャーを使用して定量した。結果を図１０〜１３に示す。
【００７９】
（実施例５）
ポリマー−ＤＴＢ−エリスロポエチン結合体の特性付け
Ａ．システイン中及びＨＳＡ中での結合体の開裂
ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ（上記のように調製した）、ｍＰＥＧ−Ｅｐｏ又はＥｐｏ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を、０．０５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と共に、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液中、２１時間３７℃でインキュベートした。反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる視覚化を確実に行うために、ＨＳＡの濃度を生理学的条件に比べて極めて低くし、且つ小分子のチオールを反応に含めなかった。これは、形成されたいずれのアルブミン−Ｅｐｏもその後に開裂しないようにするためである。ＳＹＰＲＯ（商標）レッドタンパク質染色液で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図１４Ａに示し、抗−ＨＳＡを用いてプローブした免疫ブロットを図１４Ｂに示す。
【００８０】
Ｂ．ラット血漿中及びＢＳＡ中での蛍光結合体の開裂
蛍光標識ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−タンパク質結合体もまた同様に、ラット血漿又はウシ血清アルブミンの存在下で３７℃にて、タイムコース間で観察した。ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体を標識し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（ユージーン、オレゴン州）からの標識キットであるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８を使用し、原則的にキットの使用説明書に従って精製した。Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから、抗凝血剤としてＥＤＴＡを用いて血漿を採取し、アリコートの状態で−２０℃にて保存した。Ｐｒｏｌｉａｎｔ（アンケニー、アイオワ州）からのウシ血清アルブミンを、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中に再懸濁させた。反応物には、７５％血漿又は３．５％ＢＳＡ、０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬ標識結合体タンパク質（Ｅｐｏについては１．６〜３．３μＭ；リゾチームについては３．５〜７μＭ）及びｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水が含まれており、Ｏ−リングキャップを有する管中に入れた。サンプルを各反応混合物から採取し、５０ｍＭヨードアセトアミド（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２ｍＭ  ＥＤＴＡ中ストック濃度１５０ｍＭ）で終了させ、氷上に置き、光から保護した。時間ゼロのサンプルについては、蛍光ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−タンパク質を加える前に、血漿又はＢＳＡをヨードアセトアミドでクエンチした。
【００８１】
採取したサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）上で、過剰のＮｕＰＡＧＥ（商標）ローディング緩衝液の存在下、ＭＯＰＳ又はＭＥＳ泳動緩衝液を用いて分離した。前染色分子量マーカーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）からのものであった。イメージング及び定量を、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）９４００及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、λｅｘを４８８ｎｍ、λｅｍを５２０ｎｍ、バンドパス４０にて行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８による定量に続いて、ＳＹＰＲＯ（商標）レッド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した後、全タンパク質シグナルをイメージングした（λｅｘは４８８ｎｍ、λｅｍは６１０ｎｍ、バンドパス３０）。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８による全標識物質に対する各種の百分率を、各レーンについて測定した。結果を図１５〜１７に示す。
【００８２】
（実施例６）
アルブミンの存在下でのポリマー−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ結合体の特性付け
ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤを、２ｍＭ  ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−炭酸ニトロフェニル及び５倍モル過剰のＨ−Ｌｙｓ−（ε−ＮＢＤ）−ＮＨ２（Ａｎａｓｐｅｃ、サンノゼ、カリフォルニア州によるカスタム合成）を使用し、６０ｍＭヒドロキシスクシンイミド、６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５の存在下で、上記実施例１と同様に調製した。開裂不可能なｍＰＥＧ３０Ｋ−リシン−ＮＢＤを、ｍＰＥＧ３０Ｋ−炭酸スクシンイミジルを使用して調製した。両調製において、遊離Ｈ−Ｌｙｓ−（ε−ＮＢＤ）−ＮＨ２をｐＨ７．４のＰＢＳ中、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５によって除去した。ＢＳＡでの開裂反応及び分析は、原則的に、実施例５Ｂに記載した通り、３．３％ＢＳＡをＰＥＧ試薬に対して等モル比で使用して行った。ＰＥＧ試薬の比率がより高いと、ＰＥＧ試薬由来のノイズが高くなった。使用するＰＥＧ試薬の比率がより低い場合、該試薬は反応中に、経時的に完全に消費されたが、検出は低かった。等モル比にすることで、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）蛍光体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びλｅｘが４８８ｎｍ、λｅｍが５５５ｎｍ、バンドパス２０での蛍光イメージングによって定量するのに最適な視覚化が可能になった。結果を図１８〜２０に示す。図１８及び１９Ａ〜１９Ｃは、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）に従って使用した、３〜８％Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅゲルを示す。ゲルを、タンパク質視覚化用にＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、及びＰＥＧ視覚化用にヨードで染色した。
【００８３】
（実施例７）
システイン及びＢＳＡ中でのｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（１−１結合体）の開裂
ミクロコッカスルテウス混濁試験による分析
ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を精製し、２．５６ｍｇ／ｍＬのストック溶液として調製した。この溶液には、９６％の純粋な１−１ｍＰＥＧ−タンパク質結合体、１．６％の２−１結合体、及び約２％の結合されていないリゾチームが含まれていた。ミクロコッカスルテウス混濁試験を使用し、結合体の開裂後に再生された活性リゾチームの量を測定した。
【００８４】
ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（タンパク質濃度で５０μｇ／ｍＬ）を、０．６ｍＭシステインと共に、及び４％ＢＳＡ（約０．４５ｍＭ遊離チオールを含み、このアルブミンの７５％が遊離ＳＨ形にある）と共に、３７℃にて、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４緩衝液中でインキュベートした。種々の時点で、インキュベーションバイアルからのアリコートをヨードアセトアミドに加え、最終濃度を２０ｍＭにし、開裂反応を停止させた。サンプルを分析前に２〜８℃で保存した。
【００８５】
ミクロコッカスルテウスのストック溶液を、１００ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７中０．３ｍｇ／ｍＬで調製した。リゾチームの標準溶液をＰＢＳ中１、２、４、６、８及び１０μｇ／ｍＬで調製し、リゾチームの標準曲線を作成した（図示せず）。開裂反応からのサンプルをＰＢＳ中１／１０に希釈した。この試験のために、標準、サンプル又は対照の５０μＬを、９６−ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。各ウェルに、ミクロコッカスルテウス２００μＬを加え、速やかに、１０分間のプレートリーダーで、３０秒の読取り間隔で、４５０ｎｍで２５℃にてプレートを読み取った。
【００８６】
傾き（ΔＡ／分）を、読取りの最初の５分間に算出し、相当するリゾチーム濃度をリゾチームの標準曲線から外挿した。システイン（四角）、ＢＳＡ（丸）又はＰＢＳ（三角）中で開裂した結合体について、結果を図２１にグラフで示す。
【００８７】
（実施例８）
ポリマー−ＤＴＢ−治療薬結合体のｉｎ  ｖｉｖｏ投与
Ａ．１２５ＩＰＥＧ−リゾチームの調製
リゾチーム（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．３中、１００ｍｇ／ｍｌにおいて６６ｍｇ）を６０５μＣｉのＮａ１２５Ｉ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、アーヴィン、カリフォルニア州）と、ｌｏｄｏ−Ｇｅｎ（登録商標）コートされた管（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州）中で混合し、２０分間隔で混合しながら室温で１時間反応させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｆゲルろ過カラム（１７ｍＬ）上で遊離１２５Ｉを除去することによってヨウ素化反応を停止させ、１２５Ｉ−リゾチームを得た。次いで、得られた１２５Ｉ−リゾチームをｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＮＰＣ及びｍＰＥＧ−ＮＰＣのどちらか一方と反応させ、上記のように、陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【００８８】
Ｂ．薬物動態実験
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（各２５０〜３３０ｇ、１実験１製剤につき３匹）に、１２５Ｉ標識リゾチーム又はこのＰＥＧ結合体（０．３５ｍＬ、０．４ｍｇタンパク質／ｍＬ、４．６ｘ１０６ｃｐｍ／ｍＬ）を、静脈内（外側尾静脈経由）又は皮下（右後肢上部背側に）のどちらかで投与した。血液サンプル（０．４ｍＬ）を眼窩後方洞経由で採取した。注射による血液採取は全て、動物が吸入麻酔下（イソフルラン／Ｏ２）にある間に行った。サンプルをポリプロピレン管中のヘパリン上に採取して、氷上で１時間以下で保存し、その後、未使用のポリプロピレン管に３本に分けて（０．１００ｍＬ）ピペットで移した。血液サンプルを、投与後の以下の時間に採取した（以下の全ての時間に採血したラットは一匹もいなかった）：投与後３０秒、１５分、３０分並びに１、２、３、４、６、８、２４、４８、７２、９６、１２０及び１６８時間。最後の４時点は、より長時間の皮下の実験のために追加されたということに留意されたい。次いで、サンプルをＰａｃｋａｒｄ（商標）５０００ガンマカウンターで、１２５Ｉについて計数した。ｃｐｍ数を、サンプルの比放射能によって濃度に変換した。
【００８９】
結果を図２２に示す。
【００９０】
いくつかの例証的な態様及び実施形態が上記に議論されているが、当業者であれば、ある変更例、交換例、追加例及びこれらのサブコンビネーションを認識されよう。したがって、以上に添付した特許請求の範囲及び以前に紹介した特許請求の範囲は、これらの真の意図及び範囲内にある、かかる変更例、交換例、追加例及びサブコンビネーションを全て含むものと解釈されるということを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】内因性アルブミン及び治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ形成についての反応スキームを示す図である。治療薬を、ポリマー−ジチオベンジル−治療薬結合体（ポリマー−ＤＴＢ−治療薬）の形で被験者に投与すると、アルブミン−ＤＴＢ−治療薬結合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏ形成され、最終的に、治療薬は本来の形で放出される。
【図２Ａ】メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）−ＤＴＢ−治療薬結合体の調製についての合成反応スキームを示す図である。
【図２Ｂ】続くアルブミン−ＤＴＢ−治療薬結合体の形成についての合成反応スキームを示す図である。
【図２Ｃ】アルブミン−ＤＴＢ−治療薬結合体が分解し、本来の治療薬が放出される合成反応スキームを示す図である。
【図３Ａ】システイン中で１０分から４７時間までの種々の時間インキュベートされたポリマー−ＤＴＢ−リゾチーム結合体、ここではｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図３Ｂ】システイン中で１０分から４７時間までの種々の時間インキュベートされたポリマー−ＤＴＢ−リゾチーム結合体、ここではｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図３Ｃ】ＢＳＡ中で１０分から４７時間までの種々の時間インキュベートされたポリマー−ＤＴＢ−リゾチーム結合体、ここではｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図３Ｄ】ＢＳＡ中で１０分から４７時間までの種々の時間インキュベートされたポリマー−ＤＴＢ−リゾチーム結合体、ここではｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図４Ａ】システイン中でインキュベーション中に、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（三角）及びｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（ひし形）について、残存する結合体の百分率を時間の関数として時間で示すプロットである。
【図４Ｂ】ＢＳＡ（ＢＳＡ）中でインキュベーション中に、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（三角）及びｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（ひし形）について、残存する結合体の百分率を時間の関数として時間で示すプロットである。
【図４Ｃ】システイン中でインキュベーション中に、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（三角）及びｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（ひし形）について、再生されたリゾチームの百分率を時間の関数として時間で示すプロットである。
【図４Ｄ】ＢＳＡ中でインキュベーション中に、ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（三角）及びｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体（ひし形）について、再生されたリゾチームの百分率を時間の関数として時間で示すプロットである。
【図５Ａ】Ｑ−スピンカラムにサンプルを通す前に、４％ＢＳＡ中、室温で２４時間インキュベートされたｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図５Ｂ】Ｑ−スピンカラムにサンプルを通した後に、４％ＢＳＡ中、室温で２４時間インキュベートされたｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図５Ｃ】Ｑ−スピンカラムにサンプルを通す前に、４％ＢＳＡ中、室温で２４時間インキュベートされたｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図５Ｄ】Ｑ−スピンカラムにサンプルを通した後に、４％ＢＳＡ中、室温で２４時間インキュベートされたｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体についてのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図６】ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（１：１）結合体をＢＳＡと共に２日間インキュベートして得られたサンプルのＨＰＬＣトレースを示すグラフである。
【図７】ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（１：１）結合体をＢＳＡと共に２日間インキュベートして得られたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。画分識別名は図６におけるＨＰＬＣトレース上に表示されたピーク識別名に相当する。
【図８】ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム（１：１）結合体をＢＳＡと共に２日間インキュベートし、さらにメルカプトエタノールと共にインキュベートして得られたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。画分識別名は図６におけるＨＰＬＣトレース上に表示されたピーク識別名に相当する。
【図９】ジスルフィド結合された分子量８１ｋＤａのアルブミン−リゾチーム付加体に相当する精製画分Ｅ２（図６において識別された）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す図である。
【図１０Ａ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１０Ｂ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図であり、全タンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１０Ｃ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図であり、各時点での全蛍光標識種に対して表された蛍光標識種の定量を示す図である。
【図１１Ａ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１１Ｂ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図であり、各時点での全蛍光標識種に対して表された蛍光標識種の定量を示す図である。
【図１２Ａ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１２Ｂ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図であり、全タンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１２Ｃ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図であり、各時点での全蛍光標識種に対して表された蛍光標識種の定量を示す図である。
【図１３Ａ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１３Ｂ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図であり、全タンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１３Ｃ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体を示す図であり、各時点での全蛍光標識種に対して表された蛍光標識種の定量を示す図である。
【図１４Ａ】ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ＋ＨＳＡ（レーン１）；ｍＰＥＧ１２Ｋ−Ｅｐｏ＋ＨＳＡ（レーン２）；ＨＳＡ＋過剰のｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−グリシン（レーン３）；ＨＳＡ（レーン４）；ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ（レーン５）；ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ＋２ｍＭシステイン（レーン６）；Ｅｐｏ（レーン７）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図１４Ｂ】抗−ＨＳＡを用いてプローブした免疫ブロットを示す図である。レーン１〜７は図１４ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける同一サンプルに相当する。
【図１５Ａ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１５Ｂ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図であり、全タンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１５Ｃ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図であり、各時点での全蛍光標識種に対して表された蛍光標識種の定量を示す図である。
【図１６Ａ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１６Ｂ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図であり、全タンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１６Ｃ】ラット血漿の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図であり、各時点での全蛍光標識種に対して表された蛍光標識種の定量を示す図である。
【図１７Ａ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１７Ｂ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図であり、全タンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１７Ｃ】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、３７℃でインキュベートされた蛍光標識ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−Ｅｐｏ結合体についてのデータを示す図であり、各時点での全蛍光標識種に対して表された蛍光標識種の定量を示す図である。
【図１８Ａ】等モルのウシ血清アルブミン（レーン１〜５）又は１０倍過剰の蛍光体（レーン６〜１０）の存在下で３７℃にてインキュベートされた、開裂不可能な蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−リシン−ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）分子のデータを示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１８Ｂ】等モルのウシ血清アルブミン（レーン１〜５）又は１０倍過剰の蛍光体（レーン６〜１０）の存在下で３７℃にてインキュベートされた、開裂不可能な蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−リシン−ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）分子のデータを示す図であり、ＰＥＧに対してヨードで染色された同一ゲルを示す図である。
【図１８Ｃ】等モルのウシ血清アルブミン（レーン１〜５）又は１０倍過剰の蛍光体（レーン６〜１０）の存在下で３７℃にてインキュベートされた、開裂不可能な蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−リシン−ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）分子のデータを示す図であり、次いでタンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１９Ａ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１９Ｂ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図であり、ＰＥＧに対してヨードで染色された同一ゲルを示す図である。
【図１９Ｃ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図であり、次いでタンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図１９Ｄ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図１９Ｅ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図であり、ＰＥＧに対してヨードで染色された同一ゲルを示す図である。
【図１９Ｆ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図であり、次いでタンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図２０Ａ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図である。表示タイムコースに従ってサンプルをクエンチし、非還元ゲルであるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。
【図２０Ｂ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図であり、ＰＥＧに対してヨードで染色された同一ゲルを示す図である。
【図２０Ｃ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示す図であり、次いでタンパク質に対して染色された同一ゲルを示す図である。
【図２０Ｄ】等モル相対濃度のウシ血清アルブミンの存在下、３７℃でインキュベートされた、蛍光ｍＰＥＧ３０Ｋ−ＤＴＢ−リシン−ＮＢＤ分子のデータを示すグラフであり、各時点でのＮＢＤ種（図２０Ａゲルから）の定量を示すグラフである。
【図２１】活性リゾチームの濃度をμｇ／ｍＬで、ｍＰＥＧ５Ｋ−ＤＴＢ−リゾチーム結合体の、システイン（四角）、ＢＳＡ（丸）又は生理食塩水（三角）でのインキュベーション時間の関数として分で示すグラフである。
【図２２】Ｉ１２５−リゾチーム、Ｉ１２５−標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−リゾチーム、又はＩ１２５−標識ｍＰＥＧ１２Ｋ−ＤＴＢ−リゾチームを静脈内投与されたラットにおいて得られた薬物動態プロフィールを示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2008512385.tif 000013
【図３Ｃ】
2008512385.tif 000014
【図３Ｄ】
2008512385.tif 000015
【図４Ａ】
2008512385.tif 000016
【図４Ｂ】
2008512385.tif 000017
【図４Ｃ】
2008512385.tif 000018
【図４Ｄ】
2008512385.tif 000019
【図５Ａ】
2008512385.tif 000020
【図５Ｂ】
2008512385.tif 000021
【図５Ｃ】
2008512385.tif 000022
【図５Ｄ】
2008512385.tif 000023
【図６】
2008512385.tif 000024
【図１１Ｂ】
2008512385.tif 000025
【図１４Ａ】
2008512385.tif 000026
【図１４Ｂ】
2008512385.tif 000027
【図２０Ｄ】
2008512385.tif 000028
【図２１】
2008512385.tif 000029
【図２２】
2008512385.tif 000030
【図７】
2008512385.tif 000031
【図８】
2008512385.tif 000032
【図９】
2008512385.tif 000033
【図１０】
2008512385.tif 000034
【図１１Ａ】
2008512385.tif 000035
【図１２】
2008512385.tif 000036
【図１３】
2008512385.tif 000037
【図１５】
2008512385.tif 000038
【図１６】
2008512385.tif 000039
【図１７】
2008512385.tif 000040
【図１８Ａ】
2008512385.tif 000041
【図１８Ｂ】
2008512385.tif 000042
【図１８Ｃ】
2008512385.tif 000043
【図１９Ａ】
2008512385.tif 000044
【図１９Ｂ】
2008512385.tif 000045
【図１９Ｃ】
2008512385.tif 000046
【図１９Ｄ】
2008512385.tif 000047
【図１９Ｅ】
2008512385.tif 000048
【図１９Ｆ】
2008512385.tif 000049
【図２０Ａ】
2008512385.tif 000050
【図２０Ｂ】
2008512385.tif 000051
【図２０Ｃ】
2008512385.tif 000052
【国際調査報告】
2008512385.tif 000053
2008512385.tif 000054
2008512385.tif 000055
2008512385.tif 000056
2008512385.tif 000057
2008512385.tif 000058
2008512385.tif 000059