(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物等を用いてアルコールオキシダーゼ遺伝子及び糖転移酵素を欠失、変異又は発現抑制した形質転換体を用いた脂肪族ジオール製造方法の提供。【解決手段】（１）アルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質、特定アミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子と特定のアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質、特定アミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、アルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下した形質転換体を、アルコール又は脂肪族炭化水素を含有する培地で培養する工程、（２）得られた培養物から脂肪族ジオールを採取する工程と、を含む脂肪族ジオールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の工程を含む、脂肪族ジオールの製造方法。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、これらの遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下した形質転換体を、アルコール又は脂肪族炭化水素を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から脂肪族ジオールを採取する工程
【請求項２】
前記宿主が微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が酵母である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記酵母がカンジダ（Candida）属に属する菌類である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicola、Candida apicola、Candida  batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、及びCandida stellataからなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記アルコール又は脂肪族炭化水素の炭素原子数が１０以上１８以下である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記脂肪族ジオールの炭素原子数が１０以上１８以下である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記脂肪族ジオールが、α，ω−脂肪族ジオール、β，ω−脂肪族ジオール、又はβ，ω−１−脂肪族ジオールである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、これらの遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下した形質転換体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂肪族ジオールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪族ジオールは、ポリエステル樹脂やポリウレタン樹脂を製造するのに重要な原料モノマーである。原料モノマーとして用いる脂肪族ジオールは、主に化学合成により製造されている。例えば、炭素数１０のデカンジオールは、ひまし油のアルカリ溶融によるセバシン酸の製造を経て合成されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、化学合成法による脂肪族ジオールの製造は、厳密な反応条件が要求され、取扱いが難しい等の問題がある。特に、炭素数の多いジオールは多段階の工程を経て合成されるものが多く、製造工程が複雑になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】１９９９年版ファインケミカル年鑑、シーエムシー出版、３６１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、微生物等を用いて、中鎖や長鎖の脂肪族ジオールを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、微生物を用いた脂肪族ジオールの生産について鋭意検討した。その結果、宿主中の特定のアルコールオキシダーゼ及び糖転移酵素の機能を低下させた形質転換体において、脂肪族ジオールの産生が有意に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記（１）及び（２）の工程を含む、脂肪族ジオールの製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）に関する。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、これらの遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下した形質転換体を、アルコール又は脂肪族炭化水素を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から脂肪族ジオールを採取する工程
【０００７】
また、本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、これらの遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下した形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう）に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、脂肪族ジオール、特に中鎖の脂肪族ジオールを高収率で製造する方法を提供することができる。また、本発明によれば、当該方法に用いる形質転換体を提供することができる。当該方法及び形質転換体は、脂肪族ジオールの工業的生産に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例で作製したKSMΔura-ura株及びKSMΔAOX株の、菌体内アルコールオキシダーゼ活性を示した図である。
【図２】実施例で作製したａ）KSMΔura-ura株、ｂ）KSMΔAOX株、ｃ）KSMΔUGTA株、及びｄ）KSMΔAOXΔUGTA株を、2-テトラデカノールを基質として培養した培養液のGC分析結果を示す図である。
【図３】実施例で作製したKSMΔura-ura株、KSMΔUGTA株、KSMΔAOX株、及びKSMΔAOXΔUGTA株を、２−テトラデカノールを基質として培養した培養液のアルキルポリグリコシド及び脂肪族ジオール生産量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．形質転換体
本発明の形質転換体は、２種類の酵素をコードする遺伝子を有する宿主において、それら両方の酵素遺伝子を欠失、変異又は発現抑制させ、該宿主と比べてこれらの酵素の活性が低下した形質転換体である。形質転換体において欠失等させる２種の酵素は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質、及び下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質である。下記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質はアルコールオキシダーゼ活性を、下記（ｄ）〜（ｆ）のタンパク質はアルコールへの糖転移活性をそれぞれ有する。
これらの酵素について順に説明する。
【００１１】
（１）アルコールオキシダーゼ
１つめの酵素はアルコールオキシダーゼ（以下、「ＡＯＸ」とも略記する）で、具体的には、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質である。本発明の形質転換体は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下したものである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００１２】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、カンジダ・ボンビコーラ（Candida bombicola（別称：Starmerella bombicola又はTorulopsis bombicola））NBRC10243株由来のアルコールオキシダーゼである。アルコールオキシダーゼは、アルコール酸化酵素の１種で、アルコールをアルデヒドに酸化する反応を触媒する。後述の実施例で示すように、当該タンパク質を欠失した形質転換体は、アルコールオキシダーゼ活性が大幅に低下する。
【００１３】
本発明では、前記（ａ）のタンパク質と機能的に均等な前記（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子も用いることができる。
前記（ｂ）において、アミノ酸配列の同一性は、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明においてアミノ酸配列の同一性とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性は通常の方法により解析することができるが、本発明の同一性はリップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより測定する。
【００１４】
また、前記（ｃ）において、「１又は数個のアミノ酸」は、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、１〜１０個のアミノ酸であることが好ましく、１〜５個のアミノ酸であることがより好ましく、１〜３個のアミノ酸であることがさらに好ましい。
なお、これらのタンパク質がアルコールオキシダーゼ活性を有することは、該タンパク質をコードする遺伝子を破壊して菌体内のアルコールオキシダーゼ活性を測定する方法、又は大腸菌等で該タンパク質を生産し、そのアルコールオキシダーゼ活性を測定する方法等により確認することができる。アルコールオキシダーゼ活性の測定には、後述の実施例で用いた方法等を用いることができる。
【００１５】
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ａ１）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列と５５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ１）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号２は、カンジダ・ボンビコーラNBRC10243株由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子の塩基配列である。
【００１６】
前記（ｂ１）において、塩基配列の同一性は、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明において塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性は通常の方法により解析することができるが、本発明の同一性はリップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより測定する。
【００１７】
また、前記（ｃ１）において、「ストリンジェントな条件」としては、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載のサザンハイブリダイゼーション法等が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに４２℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１８】
（２）糖転移酵素
２つめの酵素はアルコールへの糖転移活性を有する糖転移酵素で、具体的には、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質である。本発明の形質転換体は、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールへの糖転移活性が低下したものである。
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
【００１９】
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、カンジダ・ボンビコーラ（Candida bombicola）由来の糖転移酵素で、ω−ヒドロキシ脂肪酸に対して糖転移活性を持つＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（以下、「ＵＧＴＡ」とも略記する）であると報告されている（K.  Saerens.,  et.  al.,  (2011)  FEMS  Yeast  Res.,  11,  123-132参照）。しかしながら、当該タンパク質がアルコールに対する糖転移活性を有するかは、不明であった。当該タンパク質がアルコールに対する糖転移活性を有することは、今回本発明者らにより初めて得られた知見である。後述の実施例で示すように、当該タンパク質を欠失した形質転換体は、アルコールへの糖転移活性が大幅に低下する。
【００２０】
本発明では、前記（ｄ）のタンパク質と機能的に均等な前記（ｅ）及び（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子も用いることができる。
前記（ｅ）において、アミノ酸配列の同一性は、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
【００２１】
また、前記（ｆ）において、「１又は数個のアミノ酸」は、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、１〜１０個のアミノ酸であることが好ましく、１〜５個のアミノ酸であることがより好ましく、１〜３個のアミノ酸であることがさらに好ましい。
なお、これらのタンパク質がアルコールへの糖転移活性を有することは、アルコールを基質とした糖脂質の生産量を測定する方法等により確認することができる。アルコールへの糖転移活性の測定には、後述の実施例で用いた方法等を用いることができる。
【００２２】
前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ｄ１）〜（ｆ１）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ１）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ１）配列番号４で表される塩基配列と５５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ１）配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号４は、カンジダ・ボンビコーラ由来のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列である。
【００２３】
前記（ｅ１）において、塩基配列の同一性は、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
また、前記（ｆ１）において、「ストリンジェントな条件」としては、前記（ｃ１）と同様の条件が挙げられる。
【００２４】
前記タンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、カンジダ・ボンビコーラ等の微生物から単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１や配列番号３に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に合成等することもでき、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、前記アルコールオキシダーゼ遺伝子や糖転移酵素遺伝子を用いることができる。
【００２５】
前記（ａ）〜（ｃ）及び（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１や配列番号３に示すアミノ酸配列又は配列番号２や配列番号４に示す塩基配列に基づいて、人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、カンジダ・ボンビコーラ等の微生物からクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
配列番号１や配列番号３に示すアミノ酸配列又は配列番号２や配列番号４に示す塩基配列に変異を導入する場合、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。具体的には、ランダムにクローニングしたDNA断片を用いて相同組換えを起こさせる方法や、γ線等を照射することによりランダムな遺伝子の変異が可能である。
【００２６】
本発明の方法に用いる形質転換体は、宿主中の前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、欠失、変異又は発現抑制することで得られる。
形質転換体の宿主としては、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有するものであればよい。脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、宿主として好ましくは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子及び前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。
当該微生物としては、取り扱い性の向上、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、酵母が好ましい。当該酵母としては、カンジダ（Candida）属に属する菌類、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する菌類、ピチア（Pichia）属に属する菌類、ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属に属する菌類、又はスターメレラ（Starmerella）属に属する菌類等が挙げられる。
前記カンジダ（Candida）属に属する菌類としては、Candida bombicola（別名:Starmerella bombicola)、Candida apicola、Candida  batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellata等が挙げられる。
ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する菌類、ピチア（Pichia）属に属する菌類、ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属に属する菌類、又はスターメレラ（Starmerella）属に属する菌類としては、Rhodotorula bogoriensis、Pichia anomala  PY1、又はWickerhamiella domericqiae等が挙げられる。
これらのなかでも、脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、カンジダ（Candida）属に属する菌類が好ましく、Candida bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellataがより好ましく、Candida bombicolaがさらに好ましい。
なお、上記宿主微生物は、ATCC（American  Type  Culture  Collection）、NBRC  (Biological  Resource  Center,  NITE)等の生物遺伝資源ストックセンター等から入手することができる。
【００２７】
宿主ゲノムから前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子及び前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する方法としては、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去する又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。なかでも、本発明においては、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子及び前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を宿主ゲノムから物理的に欠失させた形質転換体であることが好ましい。
【００２８】
上記の欠失・変異・発現抑制方法は、相同組換えを用いて行うことができる。例えば、標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることができる。また、塩基置換や塩基挿入等の変異を導入した標的遺伝子をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子の機能を低下又は消失させることができる。また、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって宿主ゲノム上の標的遺伝子を分断して、その機能を低下又は消失させることができる。
このような相同組換えによる標的遺伝子の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、Besher  et  al.,  Methods  in  molecular  biology  47，p.291-302,  1995等の文献を参考に行うことができる。
【００２９】
宿主に相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドを導入する方法については、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びそれらの改変法等、酵母の形質転換に通常用いられている方法が挙げられる。
例えば電気パルス法により行う場合、対数増殖期まで増殖させた宿主細胞と、相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドとをソルビトール溶液等に懸濁して、電気パルスを加えればよい。相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドと宿主細胞とを接触させる際に、サーモンスパームＤＮＡ等のキャリアＤＮＡや、ポリエチレングリコール等を添加することにより、形質転換頻度を高めることも好ましい。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値（電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が約１０から２０ミリ秒で、パルス後の生菌率が約１０〜４０％となる条件とすることが好ましい。電気パルスを加えた後、菌液をソルビトール溶液を含む培地にまいて形質転換体を選択する。
目的遺伝子が欠失した形質転換体の選択は、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出して、目的遺伝子部位を含む領域を対象としてＰＣＲを行う方法、又は目的遺伝子領域に結合するＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法、等により行うことができる。
【００３０】
得られた形質転換体では、宿主（すなわち形質転換前の状態）に比べて、アルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下している。なお、形質転換体でアルコールオキシダーゼ活性が低下することは、後述の実施例で用いた方法により確認できる。また、形質転換体でアルコールへの糖転移活性が低下することは、後述の実施例で用いた方法により確認できる他、国際公開第２０１１／１５４５２３号に記載の方法等によっても確認できる。
脂肪族ジオールの生産性向上の観点から、形質転換体のアルコールオキシダーゼ活性を宿主のアルコールオキシダーゼ活性に対し７０％以下に低下させることが好ましく、５０％以下に低下させることがより好ましく、３０％以下に低下させることがさらに好ましく、２０％以下に低下させることがよりさらに好ましく、１０％以下に低下させることが特に好ましい。また、同様の観点から、形質転換体の糖転移活性を宿主の糖転移活性に対して、７０％以下に低下させることが好ましく、５０％以下に低下させることがより好ましく、３０％以下に低下させることがさらに好ましく、２０％以下に低下させることがよりさらに好ましく、１０％以下に低下させることが特に好ましい。
【００３１】
微生物の代謝において、脂肪族ジオールはアルコールや脂肪族炭化水素の水酸化によって生成されるものの、生成したジオールは通常、更に酸化されて脂肪酸へ変換されたり、糖付加されて糖脂質へと変換される。前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子の欠失等によりアルコールオキシダーゼ活性が低下すると、形質転換体内でのアルコールの酸化による脂肪酸合成経路が阻害される。また、前記（ｄ）〜（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子の欠失等によりアルコールへの糖転移活性が低下すると、形質転換体内でのアルコールへの糖付加反応が阻害される。その結果、本発明の形質転換体では、ジオールが酸化や糖付加反応により消費されることがなくなるため、ジオールの生産性が向上すると推測される。
【００３２】
２．製造方法
本発明の製造方法は、前記形質転換体を用いて下記（１）及び（２）の工程により行われる。
（１）前記形質転換体を、アルコール又は脂肪族炭化水素を含有する培地で培養する工程、及び
（２）得られた培養物から脂肪族ジオールを採取する工程
なお、本発明において形質転換体を培地で培養するとは、微生物や動植物あるいはその細胞・組織の培養が含まれる。また、培養物には、培養した培地及び形質転換体が含まれる。
【００３３】
形質転換体を培養する培地は、脂肪族ジオール合成の原料として、アルコール又は脂肪族炭化水素を含有する。
前記アルコールは、脂肪族ジオールの利用性の点から、炭素原子数１０以上が好ましく、１２以上がより好ましい。また、炭素原子数１８以下が好ましく、１６以下がより好ましい。さらに、炭素原子数１０以上１８以下が好ましく、１０以上１６以下がより好ましく、１２以上１６以下がさらに好ましい。また、飽和アルコールでも不飽和アルコールでもよい。
好ましいアルコールの具体例としては、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、１−トリデカノール、１−テトラデカノール、１−ペンタデカノール、１−ヘキサデカノール、１−ヘプタデカノール、１−オクタデカノール、１−オレイルアルコール、１−イコサノール、１−ドコサノール等の１級直鎖飽和又は不飽和アルコール、２−デカノール、２−ウンデカノール、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノール、２−ヘキサデカノール、２−ヘプタデカノール、２−オクタデカノール、３−デカノール、３−ウンデカノール、３−ドデカノール、３−トリデカノール、３−テトラデカノール、３−ペンタデカノール、３−ヘキサデカノール、３−ヘプタデカノール、３−オクタデカノール、４−デカノール、４−ウンデカノール、４−ドデカノール、４−トリデカノール、４−テトラデカノール、４−ペンタデカノール、４−ヘキサデカノール、４−ヘプタデカノール、４−オクタデカノール等の２級飽和又は不飽和アルコール等が挙げられる。
なかでも、炭素原子数１０以上１８以下の１級又は２級直鎖飽和アルコールが好ましい。
培地に加えるアルコールは１種であっても２種以上であってもよい。
【００３４】
前記脂肪族炭化水素としては、水酸基の付加により前記アルコールを形成するものが挙げられる。脂肪族ジオールの利用性の点から、炭素原子数１０以上が好ましく、１２以上がより好ましい。また、炭素原子数１８以下が好ましく、１６以下がより好ましい。さらに、炭素原子数１０以上１８以下が好ましく、１０以上１６以下がより好ましく、１２以上１６以下がさらに好ましい。また、飽和炭化水素でも不飽和炭化水素でもよく、アルカンが好ましい。また、直鎖であっても分岐であってもよく、直鎖が好ましい。
好ましい脂肪族炭化水素の具体例としては、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカンなどの飽和または不飽和炭化水素が挙げられる。
なかでも、炭素原子数１０以上１８以下の直鎖アルカンが好ましい。
培地に加える脂肪族炭化水素は１種であっても２種以上であってもよい。
【００３５】
上記アルコール及び炭化水素の中でも、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、１−トリデカノール、１−テトラデカノール、１−ペンタデカノール、１−ヘキサデカノール、２−デカノール、２−ウンデカノール、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノール、２−ヘキサデカノール、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカンが好ましく、１−ドデカノール、１−トリデカノール、１−テトラデカノール、１−ペンタデカノール、１−ヘキサデカノール、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノール、２−ヘキサデカノール、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカンがより好ましく、１−テトラデカノール、２−テトラデカノール、ヘキサデカンがさらに好ましい。
培地はアルコールと脂肪族炭化水素の両方を含有してもよい。
【００３６】
アルコールと脂肪族炭化水素以外の培地成分は、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
例えば、宿主が微生物の場合、炭素源としてグルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、デンプン加水分解物（水あめ）、セルロース加水分解物、又は廃糖蜜（モラセス）などの糖類、ソルビトールやグリセリン等の糖アルコール類、クエン酸などの有機酸類等、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア水、尿素、大豆タンパク質、麦芽エキス、アミノ酸、ペプトン、コーンスティーブリカー等、無機塩類としてマンガン塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、鉄イオン、銅イオン、硫酸塩、リン酸塩等、ビタミン類としてビオチン、イノシトール等を用いることができる。
特に、宿主が酵母の場合には、糖源としてグルコース、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、尿素等、無機塩類として硫酸マグネシウム・７水和物、塩化ナトリウム、塩化カルシウム・２水和物、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等を用いることが好ましい。場合によっては消泡剤などを添加してもよい。
【００３７】
形質転換体の培養条件も、宿主の種類に応じて適宜好ましい培養条件を選択することができる。
例えば、宿主が微生物の場合には、培地のｐＨは２．５〜９．０程度に調節することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養温度は１５〜３５℃程度が好ましく、２５〜３２℃程度がより好ましい。培養時間は６〜２００時間程度が好ましく、２４〜１４８時間程度がより好ましい。必要により通気や攪拌を加えてもよい。
特に、宿主が酵母の場合には、培地のｐＨは用いる酵母が生育し得る範囲、例えば、ｐＨ３．０〜８．０程度に調節することが好ましい。培養温度は１５〜３５℃程度が好ましく、２８〜３２℃程度がより好ましい。培養時間は４８〜１４８時間程度が好ましく、振盪又は通気撹拌培養することが好ましい。
【００３８】
形質転換体を培養し脂肪族ジオールを産生させた後、培養物（培養体や培養液等）から脂肪族ジオールを単離、精製等して回収する。
脂肪族ジオールを単離、回収する方法としては特に限定されず、通常微生物の培養上清から脂肪族ジオール成分を単離する際に用いられる方法により行うことができる。例えば、溶剤抽出、疎水やイオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理等の方法を用いることができる。
【００３９】
本発明の製造方法は、形質転換体の宿主、培地に含有させるアルコール又は脂肪族炭化水素の種類を適宜選択することにより、種々の脂肪族ジオールを製造することができる。  ポリエステル樹脂およびポリウレタン樹脂の原料モノマーや添加剤としての利用性から、炭素原子数１０以上の脂肪族ジオールが好ましく、１２以上がより好ましい。また、炭素原子数１８以下が好ましく、１６以下がより好ましい。さらに、炭素原子数１０以上１８以下が好ましく、１０以上１６以下がより好ましく、１２以上１６以下がさらに好ましい。また、同様の観点から、直鎖の飽和脂肪族基を有するジオールが好ましい。
また、脂肪族ジオールの水酸基の位置も特に限定されない。脂肪族ジオールとして好ましくは、α位又はβ位のいずれか１方、及びω位又はω−１位のいずれか１方に水酸基を有するジオールであり、α，ω−脂肪族ジオール、β，ω−脂肪族ジオール、又はβ，ω−１−脂肪族ジオールが好ましい。
【００４０】
本発明の製造方法により得られた脂肪族ジオールは、ポリエステル樹脂の原料モノマー、ポリウレタン樹脂の添加剤、医農薬原料の中間体等として利用できる。
【００４１】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体を開示する。
【００４２】
＜１＞  下記（１）及び（２）の工程を含む、脂肪族ジオールの製造方法。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、これらの遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下した形質転換体を、アルコール又は脂肪族炭化水素を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から脂肪族ジオールを採取する工程
【００４３】
＜２＞  前記宿主が微生物である、＜１＞項記載の方法。
＜３＞  前記微生物が酵母である、＜２＞項記載の方法。
＜４＞  前記酵母がカンジダ（Candida）属に属する菌類である、＜３＞項記載の方法。
＜５＞  前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicola、Candida apicola、Candida  batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、及びCandida stellataからなる群より選ばれる、＜４＞項記載の方法。
＜６＞  前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicolaである、＜５＞項記載の方法。
＜７＞  前記アルコール又は脂肪族炭化水素の炭素原子数が１０以上１８以下、好ましくは１０以上１６以下、より好ましくは１２以上１６以下である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞  前記脂肪族ジオールの炭素原子数が１０以上１８以下、好ましくは１０以上１６以下、より好ましくは１２以上１６以下である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞  前記脂肪族ジオールが、α，ω−脂肪族ジオール、β，ω−脂肪族ジオール、又はβ，ω−１−脂肪族ジオールである、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が、下記（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ１）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列と５５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ１）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜１１＞  前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が、下記（ｄ１）〜（ｆ１）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
（ｄ１）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ１）配列番号４で表される塩基配列と５５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ１）配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールへの糖転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００４４】
＜１２＞  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、これらの遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性及びアルコールへの糖転移活性が低下した形質転換体。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
［培地、培養条件］
カンジダ（Candida）属酵母の培養には、以下の培地を使用した。各培地は、121℃、20分のオートクレーブ後に混ぜ合わせて使用した。
また、前培養はφ24mm×200mm大型試験管（YPD培地5mL仕込み）にて30℃、250rpmで48時間振盪培養した種培養液を、φ24mm×200mm大型試験管（ジオール生産培地5mL仕込み）に2％（v/v）植菌し、30℃、250rpmで振盪培養した。
YPD培地：  1%  (D)-グルコース、1%  BactoTM  Yeast  Extract（日本BD社製）、1%  BactoTM  Tryptone（日本BD社製）
ジオール生産培地：  15%  (D)-グルコース、0.41%  クエン酸3ナトリウム（無水）、0.4%  BactoTM  Yeast  Extract、0.154%  塩化アンモニウム、0.07%  硫酸マグネシウム・７水和物、0.05%  塩化ナトリウム、0.027%  塩化カルシウム・2水和物、0.1%  リン酸2水素カリウム、0.012%  リン酸水素2カリウム  （1M  HClにてpH  5.8に調整）
最小培地：  0.68%  Yeast  nitrogen  base  without  amino  acids（日本BD社製）、2％(D)-グルコース
アルコール資化培地：  0.68%  Yeast  nitrogen  base  without  amino  acids（日本BD社製）、0.05%  BactoTM  Yeast  Extract、2％炭素源
【００４７】
［ゲノムＤＮＡ抽出］
カンジダ・ボンビコーラのゲノムＤＮＡは、φ24mm×200mm大型試験管（YPD培地、5mL仕込み）にて30℃、250rpmにて48時間振盪培養した培養液を、4℃、15000rpmにて1分遠心分離し集めた菌体から、Genとるくん(酵母用)High  Recovery（タカラバイオ社製）によって抽出した。
［ＰＣＲ］
ＰＣＲ反応にはPrimeStar  Max  DNA  Polymelase（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従い操作した。
【００４８】
実施例１
１．ＡＯＸ１遺伝子欠損株の構築
（１）AOX1遺伝子欠失用プラスミドの構築
配列番号２に示すカンジダ・ボンビコーラのアルコールオキシダーゼ遺伝子（以下、AOX1遺伝子）欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを、下記の手法で構築した。
pUC-ΔAOXは、AOX1遺伝子（配列番号２）の上流約1000bp、及び下流約1000bpの領域と相補する配列を有し、当該領域間にura3遺伝子が挿入されるよう設計した。
カンジダ・ボンビコーラ  KSM36株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記表１に示すＰＣＲプライマーAOX1  US  in  F1（配列番号５）及びAOX1  US-ura  R（配列番号６）、Pura3  F（配列番号７）及びura3  R（配列番号８）、ura-AOX1  LS  F（配列番号９）、AOX1  LS  in  R1（配列番号１０）を用い、AOX1遺伝子の上流約1000bpの領域、ura3遺伝子、AOX1遺伝子の下流約1000bpの領域のＤＮＡ断片を増幅した。
次に、プラスミドpUC118を鋳型とし、下記表１に示すＰＣＲプライマーpUC  in  F2（配列番号１１）及びpUC  in  R2（配列番号１２）を用いてプラスミド領域を増幅し、これをInfusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて、上記のＤＮＡ断片と結合した。得られたプラスミドを、大腸菌DH5αに導入し、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含むLB寒天培地上にて培養し、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、目的のAOX1遺伝子欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを得た。
【００４９】
（２）カンジダ・ボンビコーラ  AOX1遺伝子欠失株の構築
M.  D.  DE.  Backerら，  Yeast（1999），  15，p.1609-1618.の手法に従い、pUC-ΔAOXを用いてKSMΔura3株を形質転換した。
I.  V.  Bogaertら，  Yeast（2008），25，p.273−278.に記載の手法により、カンジダ・ボンビコーラ  KSM36株より、ウラシル要求性株を選抜した。さらに、ウラシル要求性株の中から、ura3遺伝子領域に変異が挿入された株を選抜し、KSMΔura3株とした。
KSM36株とKSMΔura3株のura3遺伝子領域の配列を解析したところ、KSMΔura3株では、一塩基変異により、54位のシステイン（Cys）がチロシン（Tyr）に変化していた。KSMΔura3株は最小培地では生育できず、5-フルオロオロチン酸添加YPD培地、及びウラシル添加最小培地にて生育可能であった。また、KSMΔura3株に、カンジダ・ボンビコーラ  NBRC10243株由来の野生型ura3遺伝子を、上記IAN  Van  Bogaertらの手法にて導入したところ、最小培地にて生育可能となった。また、本菌株は、培地にウラシルを添加した場合、ソホロリピッド生産能は親株であるKSM36株と同等であった。
KSMΔura3株を300ppmのウラシルを添加したYPD培地5mLに植菌し、30℃、250rpm、48時間前培養した。培養液0.5mLを300ppmのウラシルを添加したYPD培地50mLに接種し、30℃、120rpmで約6時間培養した。生育した菌体を集菌した後、氷冷した滅菌水20mLで菌体を2回洗浄した。菌体を、氷冷した1mLの1M  ソルビトール溶液に懸濁し、5000rpmで5分間遠心し、上清を捨てた後、400μLの1M  ソルビトールを加えて懸濁した。菌体懸濁液を50μLずつ分注し、pUC-ΔAOXを2.5μg加えた。菌体懸濁液を、BIO-RAD  GENE  PULSER  II（バイオラッド社製）を用いてエレクトロポレーションした後、1M  ソルビトールを含む最小培地にまいて、30℃で1週間培養した。
得られた形質転換体から、ＰＣＲ法により、AOX1遺伝子の上流及び下流領域での二重交叉による相同組換えが生じた株を選抜した。得られた形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、表１に示すＰＣＲプライマーAOX1  US  in  F1（配列番号５）及びAOX1  LS  in  R1（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。非相同組換え、及び一重交差による相同組換えでは破壊用ベクター由来の約3000bp、及び野生型ゲノム由来の約3500bpの二つのバンドが確認され、AOX1遺伝子部位での二重交差による相同組換えでは破壊用ベクター由来の約3000bpのバンドのみが観察される。この結果、得られた形質転換体あたり７０％の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔAOX株とした。
【００５０】
（３）カンジダ・ボンビコーラ  ウラシル遺伝子導入株
AOX1遺伝子欠失株の対照菌株として、KSMΔura株に、AOX1遺伝子が欠失しないように、野生型ura3遺伝子をKSMΔura株の変異ura3領域に導入した株KSMΔura-ura株を作製した。
カンジダ・ボンビコーラ  KSM36株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記表１に示すＰＣＲプライマーPura3  F（配列番号７）、及びura3  R2（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲ法にてura3領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Mighty  Cloning  Reagent  Set  Blunt  End（タカラバイオ社製）を用いて、pUC118DNA  HincII/BAP（タカラバイオ社製）へ挿入し、プラスミドpUC-ura3を得た。
プラスミドpUC-ura3を用い、上記（２）と同様の手法にてKSMΔura株に導入した。得られた形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、プラスミド領域に設計したプライマーpUC  seq  1（配列番号１４）及びpUC  seq  2（配列番号１５）を用いて、ＰＣＲによる組換えの確認を行った。この結果、得られた形質転換体あたり１１％の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔura-ura株とした。
【００５１】
【表１】
2015123020.tif 000002
【００５２】
２．アルコールオキシダーゼ活性の測定
カンジダ・ボンビコーラ  KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて30℃、250rpm、48時間、前培養した。前培養液を、炭素源として(Ｄ)-グルコース、及び１-ヘキサデカノールを10g/Lずつ添加したアルコール資化培地に1％植菌し、30℃、250rpmにて48時間培養した。培養後の菌体からミクロソーム膜タンパク質画分を調製し、アルコールオキシダーゼ活性（AOX活性）を測定した。なお、微生物のアルコールオキシダーゼは膜タンパク質画分に局在することが知られている。
【００５３】
ミクロソーム膜タンパク質画分の調製、及びアルコールオキシダーゼ活性の測定は、G.  D.  Kempら，Appl.  Microbiol.  Biotechnol.  (1988)，  29，p．370-374記載の方法に従い行った。
［ミクロソーム膜タンパク質画分の調製］
培養後の菌体20mLを、8000rpm、4℃にて10min遠心して集菌した後、菌体を10mLの生理食塩水で2回洗浄した。菌体を1/15M  リン酸バッファー（pH7.4）  500μLを加え懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械製）、及び媒体に0.5mmグラスビーズを用いて破砕した。500μLの1/15M  リン酸バッファー（pH7.4）を添加、混合し、破砕液を4℃、3000gで5分遠心し、破砕されなかった菌体を除去した。上清を4℃、20000gで60分遠心し、ミトコンドリアとペルオキシソーム画分を除去した。残った上清を回収し、4℃、100000gで90分遠心し、沈殿を回収し200μLの1/15M  リン酸バッファー（pH7.4）を添加し懸濁した。この懸濁液を、ミクロソーム膜タンパク質画分として、以下のアルコールオキシダーゼ活性の測定に用いた。
【００５４】
［アルコールオキシダーゼ活性の測定］
0.1M  リン酸バッファー（pH7.4）  100μL、2.8g/L  2,2’-azino-di  [3-ethylbenzothiazoline-(6)-sulfonic  acid]（ABTS）溶液  50μL、horseradish  peroxidase  47units/mL溶液  30μL、及びミクロソーム膜タンパク質画分  10μLを混合し、30℃で5分インキュベートした。その後、5mM  1-ドデカノール  DMSO溶液  10μLを添加し、0分、及び5分後の405nmにおける吸光度を測定した。アルコールオキシダーゼは、1μmolのアルコールを酸化し、2μmolのラジカルカチオンを産生する。1mMのラジカルカチオン型ABTSは405nmで18.4の吸光度を示すが、これは0.5mMの酸化された基質と同義である。そこで、1分間に0.0368の吸光度変化を、アルコールオキシダーゼ活性の1Uと定義した。
ミクロソーム膜タンパク質１ｇあたりのアルコールオキシダーゼ活性を図１に示す。
【００５５】
図１から明らかなように、AOX1遺伝子が欠失したKSMΔAOX株は、KSMΔura-ura株と比べて、アルコールオキシダーゼ活性が大幅に低下した。
【００５６】
３．UGTA遺伝子欠損株の構築
（１）UGTA1遺伝子欠失用プラスミドの構築
配列番号４に示すカンジダ・ボンビコーラの糖転移酵素遺伝子（以下、UGTA1遺伝子）欠失用プラスミドpUC-ΔUGTAを、下記の手法で構築した。
なお、用いたUGTA1遺伝子（配列番号４）は、カンジダ・ボンビコーラの糖転移酵素の１つとして報告されているものである（K.  Saerens.,  et.  al.,  (2011)  FEMS  Yeast  Res.,  11,  123-132参照）。前記文献では、当該UGTA1遺伝子をコードするタンパク質が、ω−ヒドロキシ脂肪酸に対して糖転移活性を持つことが報告されている。しかしながら、当該タンパク質がアルコールに対する糖転移活性を有するかは、不明であった。また、本発明者らの調査によれば、これまでにカンジダ・ボンビコーラにおいて、アルコールへの糖転移酵素に関する報告例は認められなかった。
そのため、UGTA1遺伝子欠損株を構築して、当該遺伝子によりコードされる酵素がアルコールに対する糖転移活性を有するものであるかを検証した。
【００５７】
カンジダ・ボンビコーラKSM36から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すＰＣＲプライマーpUC-UGTA  US  in  F1（配列番号１６）及びUGTA  US-ura  R（配列番号１７）、Pura3  F及びura3  R、UGTA  LS  F（配列番号１８）、UGTA  LS-pUC  R1（配列番号１９）のプライマーを用いてUGTA1遺伝子の上流領域、ura3遺伝子、UGTA1遺伝子の下流領域の断片を増幅した。次に、プラスミドpUC118を鋳型とし、表１に示すpUC  in  F2及びpUC  in  R2のプライマーを用いてプラスミド領域を増幅し、上記の断片をInfusion  HD  Cloning  Kitを用いて結合させ、大腸菌DH5αに導入し、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、目的のUGTA1遺伝子欠失用プラスミドpUC-ΔUGTAを得た。
【００５８】
（２）UGTA1遺伝子欠損株の構築
得られたプラスミドpUC-ΔUGTAを用いて、前記１．（２）と同様の手法でKSMΔura3株を形質転換した。
得られた形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すプライマーpUC-UGTA  US  in  F1及びUGTA  LS-pUC  R1を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、PrimeStar  MaxDNA  Polymerase（タカラバイオ）添付のプロトコールに従った。非相同組換え、及び一重交差による相同組換えでは破壊用ベクター由来の約3000bp、及び野生型ゲノム由来の約3500bpの二つのバンドが確認され、UGTA1遺伝子部位での二重交差による相同組換えでは破壊用ベクター由来の約3000bpのバンドのみが観察される。得られた形質転換体あたり３６％の確率で相同組換え株が得られ、これをKSMΔUGTA株とした。
【００５９】
４．UGTA遺伝子及びAOX1遺伝子の二重欠損株の構築
前記１．（１）のプラスミドpUC-ΔAOXにおいて、ura3遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子に置換したAOX1遺伝子欠失用プラスミドを作製した。プロモーター及びターミネーター領域はカンジダ・ボンビコーラ由来ura3遺伝子の配列を用いた。pUC-ΔAOXを鋳型とし、表１に示すura3T  F1（配列番号２０）及びPura3-Hygre  R1（配列番号２１）のプライマーを、及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するpREP4（Invitrogen社製）を鋳型とし、表１に示すPura-Hygre  in  F1（配列番号２２）及びHygre-ura3T  in  R1（配列番号２３）のプライマーを用いて、ura3ターミネーター領域とura3プロモーター領域を含むAOX1遺伝子欠失用ベクター領域、ハイグロマイシン耐性遺伝子の断片を増幅した。上記の断片を、Infusion  HD  Cloning  Kitを用いて結合させ、大腸菌DH5αに導入し、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、目的のAOX1遺伝子欠失用プラスミドpUC-ΔAOX1::Hygを得た。
【００６０】
得られたプラスミドpUC-ΔAOX1::Hygを用いて、前記１．（２）と同様の手法でKSMΔUGTA株を形質転換した。
得られた形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すプライマーAOX1  US  in  F1及びAOX1  LS  in  R1を用いてＰＣＲを行った。非相同組換え、及び一重交差による相同組換えでは破壊用ベクター由来の約4000bp、及び野生型ゲノム由来の約3500bpの二つのバンドが確認され、AOX1遺伝子部位での二重交差による相同組換えでは破壊用ベクター由来の約4000bpのバンドのみが観察される。得られた形質転換体あたり５０％の確率で相同組換え株が得られ、これをKSMΔAOXΔUGTA株とした。
【００６１】
５．各遺伝子欠損株の脂肪族ジオール生産性
上記で得られたKSMΔura-ura株、KSMΔUGTA株、KSMΔAOX株、KSMΔAOXΔUGTA株をそれぞれ、YPD培地にて、30℃、250rpmで48時間前培養した。前培養液を、ジオール生産培地30mL仕込み500mL坂口フラスコに2%植菌し、さらに基質として２-テトラデカノールを20g/Lとなるよう添加し、30℃、120rpmにて培養した。基質添加から48時間後の培養液を、GC分析に供し、各株における脂肪族ジオール生産性、及びアルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）生産性をそれぞれ測定した。
【００６２】
［GC-MS分析］
培養液5mLより内部標準として１-オクタデカノールを0.05%添加した１-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った。次に、遠心エヴァポレーターにて乾固し、１M  NaOH水溶液を添加し、100℃で4時間処理した。続いて、１-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った後、遠心エヴァポレーターにて乾固し、トリメチルシリル（TMS）化試薬を用いて誘導体化した。TMS化したサンプルを以下のGC-FID、及びGC-MS法にて解析し、脂肪族ジオール、アルキルポリグリコシド生産量、及び残存基質量を得た。
GCは、装置として7890A（アジレント・テクノロジー社製）、カラムとしてDB-1  ms  25m×0.20mm×330μm（J&W  scientific社製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量1mL/min、昇温プログラム100℃（1分）→10℃/分→300℃（20分）にて行った。標準物質としてｎ−ドデシルマルトシド（CALBIOCHEM社製）を用い、18分から22分に検出されるアルキルポリグルコシド由来のピークを積算し、アルキルポリグルコシド総生産量として算出した。脂肪族ジオールについては、標準物質として1,14-テトラデカンジオール（ALDRICH社製）を用い、下記のGC-MS解析により確認した９分から１４分に検出されるジオール体由来のピークを積算し、脂肪族ジオール総生産量として算出した。
GC-MSは、装置として7890A-5975C（アジレント・テクノロジー社製）、カラムとしてDB-1  ms  25m×0.20mm×330μm（J&W  scientific社製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量1mL/min、昇温プログラム100℃（1min）→10℃/min→300℃（20min）にて行った。
【００６３】
KSMΔura-ura株、KSMΔAOX株、KSMΔUGTA株、KSMΔAOXΔUGTA株におけるGC分析の結果を図２ａ）〜ｄ）にそれぞれ示す。図２において、ISは内部標準として用いた1-オクタデカノール、2-C14ol由来APGは２−テトラデカノールにソホロシドが付加した化合物由来のピークをそれぞれ示す。
図２ａ）に示すように、KSMΔura-ura株では、2-C14ol由来APGのメインピーク以外に、高沸点側にピーク３が確認された。ｂ）に示すように、KSMΔAOX株では、KSMΔura-ura株と同様に３のピークが確認された他、KSMΔura-ura株にはないピーク４及び５が高沸点側に確認された。さらに、2-テトラデカノールと内部標準である1-オクタデカノールの間に、ピーク１及び２が確認された。ｃ）に示すように、KSMΔUGTA株では、KSMΔAOX株と同様のピーク１が確認された。一方、KSMΔura-ura株やKSMΔAOX株で認められた2-C14ol由来APGのメインピークやピーク３は確認されなかった。ｄ）に示すように、KSMΔAOXΔUGTA株では、KSMΔAOX株と同様のピーク１及び２が確認された。一方、KSMΔura-ura株やKSMΔAOX株で認められた2-C14ol由来APGのメインピークやピーク３は確認されなかった。
【００６４】
続いて、GC-MS解析により、上記ピーク１〜５の各化合物（以下、ピーク１化合物等という）の構造を決定した。
水酸基を有する脂肪酸類をTMS化した後にGC-MS解析を行った場合、水酸基の位置に寄らず常に水酸基を含むアルキル末端側のフラグメントイオンが得られる。フラグメントイオンの例を表２に示した。
【００６５】
【表２】
2015123020.tif 000003
【００６６】
GC-MS解析の結果、ピーク１化合物ではフラグメントイオンとして73及び117が、ピーク２化合物は73、103及び117が認められた。また、ピーク１及び２化合物は、2-テトラデカノールのTMS化物と内標である1-オクタデカノールのTMS化物の間に検出されるため、沸点もこの両者の中間と推定される。これらのことから、ピーク１化合物は2-テトラデカノールのω-1位が水酸化された2,13-テトラデカンジオールであり、ピーク２化合物は2-テトラデカノールのω末端が水酸化された1,13-テトラデカンジオールであると考えられた。
【００６７】
また、ピーク３化合物では73、117及び271.1、ピーク４化合物では73及び103、ピーク５化合物では73、117及び271.1がフラグメントイオンとして確認された。
ピーク４化合物では103のフラグメントイオンが認められることから、ピーク２化合物である1,13-テトラデカンジオールに糖転移したジオール型アルキルポリグリコシドと考えられた。さらに、117のピークが検出されないため、1,13-テトラデカンジオールの13位の水酸基に糖が転移されていると考えられた。これらの結果から、ピーク４化合物は、ジオール型アルキルポリグリコシド（13-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)）であると考えられた。
一方、ピーク３化合物とピーク５化合物は同じフラグメントイオンパターンを示した。ピーク５化合物はKSMΔAOX株培養時にのみ認められた。また、KSMΔAOX株ではAOX1遺伝子欠損により、１級アルコールを含むジオールが蓄積すると考えられる。これらのことから、KSMΔAOX株のみで認められたピーク５化合物は、ピーク２化合物である1,13-テトラデカンジオールの１位の水酸基に糖付加したジオール型アルキルポリグリコシド（13-hydroxy-1-O-tetradecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)）であり、他方、ピーク３化合物は、ピーク１化合物である2,13-テトラデカンジオールのどちらかの水酸基に糖転移したジオール型アルキルポリグリコシド（12-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)）であると考えられた。
【００６８】
以上まとめると、KSMΔura-ura株は、アルキルポリグリコシドとしてジオール型アルキルポリグリコシド（12-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)、及び第２級アルコール型アルキルポリグリコシド（1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)を生産し、アルキルポリグリコシド総生産量は3.30g/Lであった。一方、KSMΔura-ura株では脂肪族ジオールの生産は確認されなかった。
KSMΔAOX株では、KSMΔura-ura株で確認されたアルキルポリグリコシドに加えて、２種のジオール型アルキルポリグリコシド（13-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)、及び13-hydroxy-1-O-tetradecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)）を生産し、アルキルポリグリコシド総生産量は8.97g/Lであった。また、脂肪族ジオールとして、基質である2-テトラデカノールのω-１位が水酸化された2,13-テトラデカンジオール、及び2-テトラデカノールのω末端が水酸化された1,13-テトラデカンジオールを生産し、脂肪族ジオール総生産量は0.44g/Lであった。
KSMΔUGTA株ではアルキルポリグリコシドの生産は確認されなかった。一方、脂肪族ジオールとして、KSMΔAOX株でも確認された2,13-テトラデカンジオールを生産し、脂肪族ジオール総生産量は0.78g/Lの生産性であった。
KSMΔAOXΔUGTA株では、アルキルポリグリコシドの生産は確認されなかった。一方、脂肪族ジオールとして、KSMΔAOX株と同様、2,13-テトラデカンジオール及び1,13-テトラデカンジオールを生産し、脂肪族ジオール総生産量は2.50g/Lであった。
各株におけるアルキルポリグリコシド総生産量及び脂肪族ジオール総生産量を図３に示す。
【００６９】
図３から明らかなように、KSMΔUGTA株ではアルキルポリグリコシドの生産能が消失した。これにより、UGTA1遺伝子によりコードされる酵素は、ω-ヒドロキシ脂肪酸だけでなく、アルコールの水酸基に対しても糖転移活性を有していることが確認された。
また、AOX1遺伝子とUGTA1遺伝子の二重欠損株であるKSMΔAOXΔUGTA株では、アルキルポリグリコシドの生産性が消失し、脂肪族ジオールの生産性がKSMΔAOX株に比べて約６倍に向上していた。
これらの結果から、KSMΔAOXΔUGTA株は、２級アルコールを原料とし、脂肪族ジオールを高い収率で生産できることがわかった。
【００７０】
実施例２
実施例１の５．において、基質の２-テトラデカノールを表３に示す基質に変更し、基質添加量を10g/L、基質添加後の培養時間を44時間に変更した以外は同様にして、KSMΔAOXΔUGTA株の脂肪族ジオール生産性を検証した。結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
2015123020.tif 000004
【００７２】
表３から明らかなように、各基質に対応するジオールが生成することが確認された。このことから、KSMΔAOXΔUGTA株は、１級アルコール、２級アルコール又はアルカンから、脂肪族ジオールを生産できることがわかった。
【図１】
2015123020.tif 000005
【図３】
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【図２】
2015123020.tif 000007
【配列表】
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