(57)【要約】【課題】糖尿病における代謝異常を改善するための組成物を提供する。【解決手段】糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物として、ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤を有効成分として用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤を有効成分とする、糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
【請求項２】
前記代謝異常は、糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記糖尿病はインスリン依存性糖尿病である、請求項１又２に記載の組成物。
【請求項４】
前記１種又は２種以上の代謝異常は、脂肪酸、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤は、以下の式（１）で表される、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【化１】
2015030680.tif 000008
【請求項６】
ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
グルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤と、
を有効成分とする、糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
【請求項７】
ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
インスリンと、
を有効成分とする、インスリン依存糖尿病の糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
【請求項８】
ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
ＩＬ―６中和抗体と、
を有効成分とする、インスリン依存糖尿病の糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
【請求項９】
糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するためのＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物のＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害活性を評価する工程、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病による代謝異常を改善するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、膵臓からのインスリン分泌不全により、高血糖、高脂肪酸血症、高ケトン体症を引き起こし、骨格筋、脂肪組織重量が減少して死に至る疾患である。現在、インスリンだけがＴ１ＤＭの治療薬と考えられている。しかしながら、インスリン治療でさえ、Ｔ１ＤＭにおいては、心臓病、腎障害、高血圧などの二次的な合併症をひきこすことが知られている。
【０００３】
実際、長期のインスリン投与は、インスリンの脂質合成及びコレステロール合成促進作用により、脂肪細胞以外の組織での異所性脂質沈着を促進し、その結果、冠動脈疾患を引き起こすことが知られている。さらに、インスリン治療は、低血糖を引き起こすことによってしばしば生命の危険を伴う。このように、インスリン治療は、Ｔ１ＤＭの治療に大変有用であるが、その使用量を減少させる付加的治療法が要請されている。
【０００４】
ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；以下、単に、ＡＭＰＫという。）は、細胞内のエネルギー枯渇によるＡＭＰ（ＡＤＰ）／ＡＴＰ比の上昇を検知して活性化するセリン／スレオニンリン酸化酵素である。ＡＭＰＫの活性化は、ミトコンドリア生合成、脂肪酸酸化、糖利用などのＡＴＰ産生をもたらす異化代謝作用を促進し、タンパク質合成などのＡＴＰを消費する同化作用を抑制する。
【０００５】
インスリン非依存性である２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）では、ＡＭＰＫを活性化するＡＭＰＫ活性化剤を投与して、糖や脂肪の燃焼を増加させることが１つの戦略となっている。こうしたＡＭＰＫ活性化剤としては、メトホルミンなどのビグアナイド系経口血糖降下剤のほか、各種の化合物が知られている（特許文献１、２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−３５８６７号公報
【特許文献２】特表２０１２−５１１５４９号公報
【特許文献３】特開２００８−２０８０８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在までのところ、Ｔ１ＤＭに対するンスリン治療を補充する効果的な薬剤は未だ見出されていない。また、ＡＭＰＫ活性化剤は、Ｔ２ＤＭの治療戦略として有効であることは知られているが、ＡＭＰＫがＴ１ＤＭ等によって生じる、血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体に関する代謝異常において果たす役割は知られていなかった。
【０００８】
本明細書は、糖尿病における代謝異常を改善するための組成物を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、糖尿病によって引き起こされる代謝異常とＡＭＰＫとの関係について種々検討したところ、意外にも、ＡＭＰＫ活性化を阻害する阻害剤が、糖尿病における高血糖、高脂肪酸血症、高ケトン体血症等の代謝状態（代謝異常）を改善できるという知見を得た。さらに、骨格筋と脂肪組織の萎縮を防止できるという知見を得た。本明細書は、こうした新たな知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１０】
（１）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤を有効成分とする、糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（２）前記代謝異常は、糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される、（１）に記載の組成物。
（３）前記糖尿病はインスリン依存性糖尿病である、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）前記１種又は２種以上の代謝異常は、脂肪酸、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）前記ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤は、以下の式（１）で表される、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
【化１】
2015030680.tif 000002
（６）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
グルカゴン阻害剤と、
を有効成分とする、糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（７）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
インスリンと、
を有効成分とする、インスリン依存糖尿病の糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（８）ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤と、
ＩＬ―６中和抗体と、
を有効成分とする、インスリン依存糖尿病の糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物。
（９）糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するためのＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物のＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害活性を評価する工程、
を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】Ａは、ＳＴＺ処理ＷＴマウスのヒラメ筋とＥＤＬ筋におけるリン酸化ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）と総ＡＭＰＫを示す。Ｂは、リン酸化ＡＣＣ（Ｓｅｒ７９）、総ＡＣＣ、α１ＡＭＰＫ、α２ＡＭＰＫを示す。
【図１−２】Ｃは、ＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスの骨格筋（ヒラメ筋、腓腹筋の赤と白の部分と、ＥＤＬ筋）、心臓、鼠径部（Ｉｎｇ）と精巣上体（ＥｐｉＩ）のＷＡＴ、ＢＡＴ、膵臓、脾臓、脳全体におけるα１，α２−ＡＭＰＫに対する抗体を用いたイムノブロットの結果を示す。
【図２】Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける血漿インスリン濃度に対するＳＴＺ投与の影響を示し、インスリンの細胞内シグナル分子であるＡＫＴのリン酸化（Ｔｙｒ４７３）に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｃは、血糖値に対するＳＴＺ投与の影響を示す。
【図３−１】Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の体重に対する影響を示し、Ｂは、ＳＴＺ投与の食物摂取に対する影響を示し、Ｃは、生存率に対する影響を示す。
【図３−２】Ｄは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける組織重量（ヒラメ筋と腓腹筋）に対する影響を示し、写真は、それらのマウスの後肢を示す。Ｅは、同様のマウス群における、組織重量［精巣上体（ＥＰＩ）と鼠径部（Ｉｎｇ）のＷＡＴおよびＢＡＴ］に対する影響を示し、写真はそれらのマウスの腹腔内とＥＰＩＷＡＴを示す（ＤＮ−ＡＭＰＫマウス；右、ＷＴマウス：左）。
【図４】Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける血漿遊離脂肪酸、血漿トリグリセライド、血漿ケトン体濃度に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｂは、同様のマウス群における血漿ノルエピネフリン、血漿エピネフリン、血漿コルチコステロン及び血漿グルカゴン濃度に及ぼすＳＴＺ投与の効果を示す。
【図５−１】Ａは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後におけるグルコースの腹腔内投与ＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血糖値に対する影響を示し、Ｂは、血漿インスリン濃度に及ぼす影響を示す。Ｃは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後における脂肪負荷試験（トリオレインの強制経口胃内摂取）に係るＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血漿遊離脂肪酸濃度に及ぼす影響を示す。  Ｄは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後における脂肪負荷試験（トリオレインの強制経口胃内摂取）に係るＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血漿インスリン濃度に及ぼす影響を示す。
【図５−２】Ｅは、１回目のＳＴＺ投与から１週間後におけるピルビン酸耐性試験に係るＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるＳＴＺ投与の血糖値に対する影響とＳＴＺ一回目の投与から２週間後の肝臓におけるＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）のｍＲＮＡ量を示す。Ｆは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後におけるＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスの肝臓におけるＰＥＰＣＫのｍＲＮＡ量を示す。
【図６】Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスのヒラメ筋におけるＮＡＭＰＴとＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｂは、同様のマウス群の腓腹筋の赤い部分におけるアセチル化ＰＧＣ−１αのタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｃは、同様のマウス群のヒラメ筋におけるＵＬＫ１のリン酸化（Ｓｅｒ５５５）に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｄは、同様のマウス群のヒラメ筋でＬＣ−３ＩＩのタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｅは、同様のマウス群のヒラメ筋におけるＴＳＣ２のリン酸化（Ｓｅｒ１３８７）に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｆは、同様のマウス群のヒラメ筋におけるＳ６Ｋのリン酸化（Ｓｅｒ３８９）に対するＳＴＺ投与の影響を示す。
【図７】Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスの鼠径部（Ｉｎｇ）のＷＡＴにおけるリン酸化（Ｔｈｒ１７２）ＡＭＰＫと全ＡＭＰＫ（α１及びα２）に対するＳＴＺ投与の影響を示す。Ｂは、同様のマウス群の鼠径部ＷＡＴにおけるＦＡＳ、ＬＰＬ、ＵＣＰ１及びＣｉｄｅａのｍＲＮＡ量に対するＳＴＺ投与の影響を示す。
【図８】Ａは、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスのヒラメ筋におけるアイリシンの前駆体であるＦＮＤＣ５のタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｂは、同様のマウス群の血漿アイリシン濃度に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｃは、ＩＬ−６のタンパク質量に対するＳＴＺ投与の影響を示し、Ｄは、同様のマウス群における血漿ＩＬ−６濃度に及ぼすＳＴＺ投与の影響を示す。
【図９】Ａ及びＢは、それぞれ、１回目のＳＴＺ投与から２週間後のＷＴ及びＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおける血漿レプチン及び高分子量アディポネクチン濃度に及ぼすＳＴＺ投与の影響を示す。
【図１０−１】Ａは、レプチン処理およびＩＬ−６抗体で処理したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＳＴＺ投与後における血漿グルコース濃度の変化を示す。浸透圧ミニポンプは実験１日目に皮下移植し、ＳＴＺをその２日目及び４日目に２回注射した。左のグラフは、ＳＴＺ投与後２週間の血漿グルコース濃度の変化を示し、真ん中と右のグラフは、ＳＴＺ投与後２週間での血糖値及び血漿遊離脂肪酸濃度を示す。Ｂは、ポンプの移植及びＳＴＺ投与から２週間後のレプチン処理及びＩＬ−６抗体処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血漿レプチン、血漿ＩＬ−６、アイリシン及びインスリンに濃度に及ぼすＳＴＺ投与の影響を示す。
【図１０−２】Ｃは、ポンプの移植及びＳＴＺ投与から２週間後のレプチン処理及びＩＬ−６抗体処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのヒラメ筋、ＥＤＬ筋、腓腹筋、Ｅｐｉ及びＩｎｇのＷＡＴ及びＢＡＴの組織重量に対するＳＴＺ投与の影響を示す。
【図１１】ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭは、骨格筋のＡＭＰＫを活性化し、筋肉の萎縮を誘導し、ＩＬ−６およびアイリシンの血漿中濃度を増加させる。ＩＬ−６および／またはアイリシンは、脂肪組織の萎縮及び血漿レプチンレベルの低下を引き起こすと共に、脂肪組織においてＵＣＰ１発現および脂肪分解を促進する。減少した血漿レプチンレベルは、骨格筋においてグルコース及び脂質の利用を抑制し、さらに、筋萎縮を引き起こす。インスリンと同様、減少した血漿レプチンのレベルは、肝臓でのグルコース産生を増加させる。骨格筋におけるＡＭＰＫ活性の阻害は、ＩＤＤＭにおける代謝異常および体重及び組織重量の減少を改善し、ＩＬ−６およびアイリシンの血漿レベルを低減し、レプチン及びアディポネクチンの血漿レベルを増加させる。ＩＬ−６抗体又はレプチンの慢性的な注入は、筋特異的ＤＮ−ＡＭＰＫ発現するマウスと同様に、ＩＤＤＭにおける代謝異常と組織重量の減少を改善する。
【図１２】ＳＴＺの第１回の投与から４日後に浸透圧ポンプを皮下移植し、これによりコンパウンドＣを同１４日目まで連続的に投与したときの第１４日目の血糖値、血漿脂肪酸濃度、組織（筋肉及び脂肪）の重量に対するコンパウンドＣの影響を示す。
【図１３】ＳＴＺの第１回の投与から４日後に浸透圧ポンプを皮下移植し、これによりコンパウンドＣを同１４日目まで連続的に投与したときの第１４日目のヒラメ筋におけるリン酸化合物ＡＣＣ量に対するコンパウンドＣの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書の開示は、ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害による、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病によって生じる、血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常の改善に関する。
【００１３】
本発明者らによれば、Ｔ１ＤＭモデル動物である、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導インスリン欠乏性糖尿病（ＩＤＤＭ）マウスの骨格筋においてＡＭＰＫが活性化していることがわかった。意外にも、骨格筋において内在性のＡＭＰＫと競合するドミナントネガティブＡＭＰＫを発現させてＡＭＰＫの活性化を阻害するマウス（ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウス）においては、血漿インスリンレベルは低いままであるにも関わらず、このマウスにおける代謝異常を改善することがわかった。すなわち、グルコース、脂肪酸、ケトン体、及び糖新生ホルモンの血漿濃度を減少させることがわかった。また、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスでは、脂肪組織、骨格筋、および体重の量を増加し、その後生存率を増加させることがわかった。
【００１４】
さらに、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）は、脂質合成酵素の発現低下と同時に、ＵＣＰ１（脱共役タンパク質１）の発現を増加させたが、それらは、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫ発現するマウスではコントロールレベルに戻った。また、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスは、レプチンの血漿濃度を回復した。レプチンはＩＤＤＭにおける全身グルコース及び脂質代謝の異常を改善することが知られている。
【００１５】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は骨格筋から放出および脂肪組織における脂肪分解を促進し、かつ新規マイオカインであるアイリシンは、ＷＡＴにおいて熱産生タンパク質ＵＣＰ１を誘導する。ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスでは、ＩＬ−６とアイリシンの発現が骨格筋において増加し、それらの血漿中濃度も増加した。しかし、ＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスではＳＴＺを処理してもそれらはコントロールレベルであった。さらに、浸透圧ミニポンプによってＩＬ−６中和抗体を投与すると、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫ発現マウスと同程度に、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスにおける代謝異常が改善した。
【００１６】
さらに、ＡＭＰＫ阻害剤として知られているコンパウンドＣをＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスに投与したところ、このマウスにおける代謝異常を改善することがわかった。すなわち、グルコース、脂肪酸を減少させることがわかった。
【００１７】
以上のように、本明細書は、ＡＭＰＫがＴ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常に重要な役割を果たすことを明らかにする。ＩＤＤＭにおけるＡＭＰＫの活性阻害は、血漿インスリンレベルが低いままであるにも関わらず、全身の代謝の改善と、筋肉および脂肪組織の萎縮の防止と、生存率を増加させた。さらに、本発明者らは、ＩＬ−６およびレプチン脂肪細胞ホルモンが、ＩＤＤＭの代謝異常に関わるおそらくメディエーターであることを明らかにした。本明細書によれば、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常が筋肉や脂肪組織を含む臓器ネットワークの悪循環によって引き起こされることを示している。そして、本明細書は、骨格筋においてＡＭＰＫの活性化を阻害することにより、代謝調節に関わる臓器ネットワークの異常を修正し、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における悪循環を改善できることを示している。
【００１８】
以上のことから、本明細書は、ＡＭＰＫ阻害剤の投与は、糖尿病によって生じる、血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善することを開示する。すなわち、ＡＭＰＫ阻害剤は、こうした糖尿病における糖や脂肪の代謝異常を改善し、その結果、高血糖、高脂肪酸血症、高ケトン体症を改善し、糖尿病の終末期に生じる、骨格筋、脂肪組織重量が減少することを予防し、治療することができる。
【００１９】
また、本明細書は、ＡＭＰＫ活性阻害とともにＩＬ−６中和抗体の投与が、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常と代謝異常に伴う疾患を改善し、予防し、治療することができることを開示する。
【００２０】
さらに、本明細書は、ＡＭＰＫ阻害剤を投与しても、血糖値をさらに低下する余地があることを示す知見も提供する。このため血糖値を低下させるための、ＡＭＰＫ阻害剤とグルカゴン阻害剤との組合せによる、糖尿病における代謝異常の改善を提供する。また、インスリンとの併用による糖尿病における代謝異常の改善も提供する。以下、本明細書の開示に関する各種の実施形態を詳細に説明する。
【００２１】
（ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ；ＡＭＰＫ）
ＡＭＰＫは、触媒αサブユニットおよび規制β−およびγ−サブユニットからなるヘテロ複合体である。ＡＭＰＫは生体内において多様な役割を担っている。
【００２２】
（１）ＡＭＰＫの活性化は、例えば、ミトコンドリア生合成、脂肪酸酸化及びグルコース利用とＡＴＰを産生する異化プロセスを促進し、ＡＴＰを消費するタンパク質合成（９）のような同化経路を阻害する。ＡＭＰＫは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の直接リン酸化（Ｓｅｒ７９）とその活性の抑制を介して脂肪酸酸化を促進することが示されている。ＡＣＣ活性の抑制は、サイトゾルからミトコンドリアに遊離脂肪酸を輸送するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ１）のアロステリック阻害剤であるマロニルＣｏＡの産生を減少させ、結果として脂肪酸酸化に至る。
【００２３】
（２）ＡＭＰＫは、また、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）とＳＩＲＴ１（サーチュイン−１：ＮＡＤ＋依存性脱アセチル化酵素）依存経路を介して、ミトコンドリア関連遺伝子発現のための転写補助因子、ＰＧＣ−１αを活性化する。
【００２４】
（３）ＡＭＰＫは、ＴＳＣ２（結節性硬化症のタンパク質２）の直接リン酸化及びそれによるｍＴＯＲ（ｒａｐａｍａｉｃｉｎの哺乳類標的）とＳ６Ｋ（Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ）シグナル伝達経路の抑制を介して、タンパク質合成を阻害する。
【００２５】
（４）ＡＭＰＫは、直接ＵＬＫ１（ＵＮＣ−５１様キナーゼ１）をリン酸化し、オートファジーを誘導、ＬＣ３−ＩＩ（オートファジーの調節因子）の発現を増加させる（１７−１９）。
【００２６】
本明細書において、ＡＭＰＫの活性を阻害するとは、ＡＭＰＫの活性を低下させる、あるいはＡＭＰＫの活性化を低下させるいかなる態様を含む。ＡＭＰＫの活性を阻害する態様としては、例えば、ＡＭＰＫと基質を競合するタンパク質の供給（発現）、ＡＭＰＫのアロステリックな阻害、ＡＭＰＫが活性化する経路の阻害等が挙げられる。
【００２７】
（糖尿病による１種又は２種以上の代謝異常を改善するための組成物）
本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤を有効成分とする。ＡＭＰＫ阻害剤としては、上記の通り、ＡＭＰＫ活性を選択的に低下させるものであれば特に限定されない。ＡＭＰＫ阻害剤としては、例えば、以下の式（１）に示すコンパウンドＣ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ）と称される化合物が挙げられる(J Clin Invest.108, 1167-1174. 2001)。本化合物は、ＡＭＰＫの阻害剤として広く用いられている化合物であり、ＡＭＰＫのキナーゼ活性に必要なα1、α2サブユニットのATP結合部位を選択的に阻害する。
【００２８】
【化２】
2015030680.tif 000003
【００２９】
他のＡＭＰＫ阻害剤としては、以下に示すイソマルトースやイソマルトース構造（グルコースがα１−６結合で結合した）を有するグルコースオリゴマーであるオリゴサッカライドが挙げられる(Cell Metab. 9, 23-34. 2009)。これらは、ＡＭＰＫのβサブユニットのグリコーゲン結合ドメインに結合し、活性を阻害する。
【００３０】
【化３】
2015030680.tif 000004
【００３１】
ＡＭＰＫ阻害剤は、このほか、後述するスクリーニング方法によっても得ることができる。
【００３２】
本組成物は、糖尿病による代謝異常を改善することができる。糖尿病による代謝異常は、各種知られているが、なかでも、糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常が挙げられる。
【００３３】
糖の代謝異常は、いわゆる血中のグルコース量である血糖値の異常を意味している。血糖値に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血糖値の異常は、糖尿病においては概して高血糖である。血糖値の測定方法は周知である。
【００３４】
脂肪酸の代謝異常は、血中の遊離脂肪酸値の異常を意味している。血中遊離脂肪酸に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中遊離脂肪酸の代謝異常は、糖尿病においては概して高値である。血中遊離脂肪酸の測定方法は周知である。
【００３５】
インスリンの代謝異常は、いわゆる血中のインスリン値の異常を意味している。血中インスリン値に関わる代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中インスリン値の異常は、糖尿病においては概して低値である。血中インスリン値の測定方法は周知である。
【００３６】
中性脂肪の代謝異常は、血中の脂肪酸のグリセリンエステル値の異常を意味している。血中中性脂肪に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中中性脂肪の異常は、糖尿病においては概して基準値よりも高値である。血中中性脂肪値の測定方法は周知である。
【００３７】
ケトン体の代謝異常は、血中のアセト酢酸、3-ヒドロキシ酪酸、アセトンの３種の合計のケトン体値の異常を意味している。血中ケトン体に関する代謝異常は、一般的に採用されている基準値等で判定されるものであってもよく、人種、性別、年齢等により、あるいは個人的な基準値で判定されたものであってもよい。血中ケトン体の異常は、糖尿病においては概して基準値よりも高値である。血中ケトン体値の測定方法は周知である。
【００３８】
これらの代謝異常のなかでも、脂肪酸、中性脂肪及びケトン体の代謝異常に対して本組成物を用いることが有利である。ＡＭＰＫ阻害剤はこれらの代謝異常に対して効果的に作用し、低減させることができる。
【００３９】
本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤と、グルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤と、を有効成分とすることができる。ＡＭＰＫ阻害剤の投与による血糖値の低下は、未だ改善の余地が認められる。血糖値の不完全な低下は、グルカゴンによるものと考えられる。そこで、ＡＭＰＫ阻害剤に対してグルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤を組み合わせることで、血糖値の低下をより効果的に実現できる。
【００４０】
グルカゴン阻害剤としては、Glu-001（ノボノルディスク、Soensen H, et al Diabetes 55: 2843-2848, 2006）、グルカゴン受容体アンタゴニスト（イーライリリー、特開2011-518125号公報）等のほか、Yan H, et al J Pharmacol Exp Ther. 329:102-111, 2009に開示されている。また、公知のグルカゴン受容体阻害剤が挙げられる。
【００４１】
本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤と、インスリンと、を有効成分としてもよい。既に説明したように、ＡＭＰＫ阻害剤は、低血糖を引き起こさないため、インスリンと併用することが可能である。この結果、インスリンの投与量を低減でき、注射回数を低減でき、患者の使用性を改善することができる。
【００４２】
本組成物は、ＡＭＰＫ阻害剤と、ＩＬ−６中和抗体と、を有効成分としてもよい。既に説明したように、ＩＬ−６中和抗体の投与が、Ｔ１ＤＭなどの糖尿病における代謝異常を改善する。ＩＬ−６中和抗体としては、公知の方法で取得ないし入手が可能である。
【００４３】
本明細書に開示される組成物は、医薬組成物、飲食品、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。
【００４４】
本組成物は、糖尿病の予防や治療のために投与される医薬組成物として好適に用いることができる。また、糖尿病の予防や改善を図るために日常的に摂取される飲食品としても好適に用いることができる。
【００４５】
本組成物における有効成分は、製剤形態等、必要に応じて、適切な塩の形態をとっていてもよい。塩を有効成分とする場合において、許容される塩の形態は、当業者において周知であり、当業者であれば適切な塩の形態を選択できる。
【００４６】
本組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの各種形態として、経口的に摂取したり、静脈注射などの方法によって非経口的に生体内に取り入れることができる。
【００４７】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤と適宜組み合わせることができる。その他、栄養補助剤を添加して用いることもできる。
【００４８】
本組成物を医薬組成物として用いる場合には、Ｔ１ＤＭなど、糖尿病における代謝異常の改善に有効な１種もしくは２種以上の他の成分を配合することができる。また、糖尿病の予防や治療に有効な他の医薬組成物と併用してもよい。
【００４９】
なお、ＡＭＰＫ阻害剤を、他の有効成分、例えば、上記したグルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤、インスリン、ＩＬ−６中和抗体などと併用するとき（以下、こうした併用の組合せを本組合せという場合もある。）、単一の組成物の形態に限定せず、異なる製剤形態、異なる用法用量での投与が可能なように、２以上の有効成分を含む製剤の組合せ（キット）とすることも、当然ながら可能であり、適切な場合がある。こうした変形は、当業者であれば適宜設計事項の範囲内で可能である。
【００５０】
本組成物又は本組合せを飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは食品添加物、であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。飲食品においては、糖尿病における代謝異常の改善に寄与できる他の１種又は２種以上の成分を含んでいてもよい。さらに、飲食品は、他の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。例えば、適宜、栄養補助剤等を添加し、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病を幅広く予防または改善するための多機能性の飲食品として用いることもできる。
【００５１】
本組成物又は本組合せの投与量または摂取量は、年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。本発明の組成物の有効成分であるＡＭＰＫ阻害剤は、概して、Ｔ１ＤＭを含む糖尿病における１種又は２種以上の代謝異常を改善できるのに有効量で使用される。具体的には、成人で１日あたり５ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇ程度が投与又は摂取されるように、１日１回乃至数回に分けて用いることが好ましい。通常、数週間乃至数ヶ月間反復摂取（服用）することが好ましい。
【００５２】
本組成物又は本組合せに係る製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、糖尿病の予防、治療、あるいは改善に用いられる旨の表示を付されていてもよい。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。表示においては、本組成物あるいは場合によっては本組合せで投与もしくは摂取することにより糖尿病における代謝異常が改善されることあるいはその機序についての情報を含むことができる。
【００５３】
（糖尿病における代謝異常を改善するための方法）
本明細書は、このように、本組成物又は本組合せを対象個体に投与もしくは摂取させることを特徴とする、対象における糖尿病における代謝異常を改善し、予防し、治療する方法を提供することができる。
【００５４】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、糖尿病による血中の糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝異常を改善するためのＡＭＰＫ阻害剤のスクリーニング方法である。本スクリーニング方法は、被験化合物のＡＭＰＫ阻害活性を評価する工程、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、糖尿病の代謝異常を改善するのに有効なＡＭＰＫ阻害をスクリーニングできる。
【００５５】
ＡＭＰＫ阻害活性の評価は、例えば、既に説明したＡＭＰＫの活性に基づいて、例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の直接リン酸化（Ｓｅｒ７９）などを指標として評価することができる。
【００５６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
まず、実験に用いた動物及び実験方法を記述し、その後結果について既述する。
【００５８】
（動物）
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ、浜松、日本）と骨格筋特異ＤＮ−ＡＭＰＫ発現するマウス（ＤＮ−ＡＭＰＫマウス）（２９）は、生後１０〜１２週で検討に用いた。ＤＮ−ＡＭＰＫマウスは、ヒトα−骨格アクチンプロモーター（２９）の制御下に、骨格筋において優先的に、アラニン（Ａｓｐ１５７Ａｌａ）の１５７位にアスパラギン酸残基を置換したＡＭＰＫのα１の触媒サブユニットの変異体を過剰発現させた。１５７位のアスパラギン酸は、プロテインキナーゼがＭｇ２＋−ＡＴＰの結合（２９）に不可欠なＤＦＧ（プロテインキナーゼ触媒サブユニットにサブドメインＶＩＩ）モチーフ内にある。動物は、０６：００から１８：００時間に点灯し。２４℃±１℃に調節されたプラスチックゲージに個別に収容され、それらは実験室食（オリエンタル酵母、東京、日本）と水をいつでもアクセスできるように維持した。
【００５９】
マウスに対して、１日目と３日目にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Ｓｉｇｍａ社、東京、日本）を２回腹腔内注射（２００ｍｇ／ｋｇ）した（ＳＴＺ処理ＷＴマウスとＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウス）。マウスの別のグループ（ＷＴマウスおよびＤＮ−ＡＭＰＫマウス）は、ＳＴＺ処理したマウスと同様の方法でビヒクルを注射した。２回目の注射から１週間後、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を行い、その後、脂肪負荷試験およびピルビン酸耐性試験を行った。
【００６０】
血液は毎日尾から採取し、グルコースの血漿濃度はキット（グルコース：グルコースCII-テストワコー、大阪、日本）を用いて測定し、血糖値とした。２回目のＳＴＺ注射から２週間後、午後１時にマウスを断頭し、組織および血液サンプルを採取した。
【００６１】
（ＤＮ−ＡＭＰＫ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ ＡＭＰＫ））
ＤＮ−ＡＭＰＫは、ＡＭＰＫα１サブユニットの１５７番目アスパラギン酸を、アラニンに変異させたタンパク質である。このアスパラギン酸は、キナーゼ活性に必要なＡＴＰ結合に必須であり、アラニンに置換したα１サブユニットを持つＡＭＰＫは、キナーゼ活性を消失する。また、これを細胞内に発現させると、正常なＡＭＰＫと基質、および調節サブユニットを取り合い、細胞内のＡＭＰＫ活性を低下させる。さらに、調節サブユニットに結合出来なかった正常なα１、α２サブユニットは分解されるため、結果としてＡＭＰＫ活性が著しく低下する。
【００６２】
本実験では、骨格筋選択的なヒトアクチンプロモータを用いて、ＤＮ−ＡＭＰＫを骨格筋に選択的に過剰発現したマウスを用いた（国立栄養学研究所江崎教授より供与）。学位論文、下記引用論文にあるように、骨格筋においてａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ （ＡＣＣ） （ＡＭＰＫの主要な標的タンパク質：脂肪合成のための重要な律速酵素）のリン酸化が減少しており、ＡＭＰＫ活性が抑制されていることが分かる。また、α２サブユニットのタンパク質量が骨格筋において選択的に低下している（結合できなかったα２サブユニットが分解されたため）(Am J Physiol Endocrinol Metab. 296, E47-E55.)。
【００６３】
（グルコース耐性、ピルビン酸耐性および脂肪負荷試験）
一晩の絶食後、動物にブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）のためにグルコース（２グラム／ｋｇ）を腹腔内に注射した。グルコース投与から０、３０、６０、９０及び１２０分後に動物の尾から血液を採取した。血漿中のグルコース濃度とインスリン濃度をキット（マウスインスリンＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｕ型）、シバヤギインスリングルコースＣＩＩ−テストワコーグルコース）を用いて測定した（表１）。
【００６４】
【表１】
2015030680.tif 000005
【００６５】
脂肪負荷試験は、既述に従い実施した（３０）。すなわち、４時間の絶食後、マウスにトリオレイン（関東化学株式会社、東京、日本）（１７μｌ／ｇ）を強制的に経口的に胃に導入し、血液を０、３０、６０、９０、１０，１８０及び３００分に連続的に尾より採血した。遊離脂肪酸、トリグリセリドおよびインスリンの血漿濃度は、キットを用いて測定した（遊離脂肪酸：ＮＥＦＡＣ−テストワコー、トリグリセリド：トリグリセリドＥ−テストワコー、マウスインスリンＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｕ型）、シバヤギ）（表１）。
【００６６】
（免疫ブロット分析）
組織を４℃で、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１％トリトンＸ、１ｍＭブチルホスファターゼ阻害剤（カルビオケム社、カリフォルニア、ＵＳＡ）及びプロテイナーゼ阻害剤（シグマ）でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し、上清（２０μｇのタンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。免疫ブロット分析は、表２に示した特異的抗体を用いて行った。免疫複合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（サンタクルズ、カリフォルニア州、米国）と強化された化学発光試薬（ＧＥヘルスケア、東京、日本）で可視化した。タンパク質バンドは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を用いて定量した。
【００６７】
【表２】
2015030680.tif 000006
【００６８】
（アセチルＰＧＣ−１αの測定）
腓腹筋の赤色部分を４℃で、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭの塩化カリウム、１％ＮＰ４０、５ｍＭのニコチンアミド、１ｍＭのナトリウム酪酸ホスファターゼ阻害剤（カルビオケム）およびプロテイナーゼ阻害剤（シグマ）を含有する溶解緩衝液中でホモジナイズした。筋肉の溶解液（タンパク質２ｍｇ）を４０μｌのプロテインＧ−共役セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、東京、日本）で予備洗浄を行い、４μｇのＰＧＣ−１（Ｈ３００）抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）とプロテインＡ共役セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア）で免疫沈降させた。得られた免疫沈降物を、１２５ｍＭトリス塩酸液（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルー、２０％２−メルカプトエタノールを含む５０μｌの試料緩衝液で煮沸し、アセチル化リジンに対する抗体（セルシグナリングテクノロジー、Ｄｅｎｖｅｒｓ、ＭＡ）又は全ＰＧＣ−１α（Ｈ３００）を用いてウェスタンブロット分析に供した。
【００６９】
（ＲＮＡ抽出及び定量的リアルタイムＰＣＲ）
全ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン、和光、日本）を使用して組織から単離し、ＲＮＡ（４００ｎｇ）をオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓｉｇｍａ社）およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（タカラ、滋賀県、日本）を用いて逆転写に供した。得られたｃＤＮＡは、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを用いて前述のようにＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、日本、東京）（２２）によって定量した。データは、骨格筋については酸性リボソームタンパク質の存在量により、脂肪組織サンプルについては３６Ｂ４の存在量によって正規化した。プライマーの配列は表３に示す。
【００７０】
【表３】
2015030680.tif 000007
【００７１】
（血漿代謝物とホルモンの測定）
血液サンプル中のグルコース、コルチコステロン遊離脂肪酸、トリグリセリド、ケトン体、インスリン、グルカゴン、ＩＬ−６およびアイリシンの血漿濃度を表１に記載のキットにより測定した。
【００７２】
（ＩＬ−６のためのレプチンと中和抗体の慢性注入）
組換えマウスレプチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）（ぺプロテック株式会社、ロッキーヒル、ＮＪ）またはＩＬ−６（１ｍｇ／ｍｌ）中和抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮ）（３１）を、浸透圧ミニポンプ（アルゼット、モデル２００２、室町機械（株）、東京、日本）を用いて皮下に１４日間０．５μＬ／時の速度で送達した。浸透圧ミニポンプは、ケタミン（体重の１００ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）による麻酔下で皮下に移植した。対照群は、同じタイプのポンプでリン酸緩衝生理食塩水を送達した。その後、浸透圧ミニポンプの移植後２日目と４日目に、ＳＴＺ（２００ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルを腹腔内注射した。体重およびグルコースとインスリンの血漿濃度を毎日モニターした。ミニポンプを移植して二週間後にマウスを断頭し、血液および組織のサンプルを採取した。
【００７３】
（統計分析）
データは平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表示した。複数のグループ間の統計学的比較は分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって検定し、続いてＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後検定を行った。２群間の統計分析は、スチューデントのｔ検定によって行った。＜０．０５のＰ値を統計的に有意とみなした。
【実施例１】
【００７４】
（結果１：ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭは骨格筋においてＡＭＰＫを活性化する）
まず、骨格筋におけるＡＭＰＫがＳＴＺ誘発ＩＤＤＭによってマウスで活性化されるかどうかを検討した。結果を図１−１及び図１−２に示す。ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは、ヒラメ筋（骨格筋の赤色部分）と長趾伸筋（extenstor digtorum longus、ＥＤＬ）（赤筋と白筋を含む混合筋）（図１−１のＡ）においてＡＭＰＫのＴｈｒ１７２リン酸化が増加した。ＡＭＰＫによってリン酸化されるＡＣＣのＳｅｒ７９リン酸化も、ＳＴＺ処理ＷＴマウス（図１−１のＢ）のヒラメ筋で増加した。
【００７５】
α１触媒サブユニット変異体の発現により、ＤＮ−ＡＭＰＫマウスのヒラメ筋、腓腹筋の赤色と白色の部分、およびＥＤＬにおいて、変異α１ＡＭＰＫタンパク質が増加した。これに対して、心臓の筋肉、鼠径（Ｉｎｇ）と精巣上体（ＥＰＩ）ＷＡＴ、肩甲骨間褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、膵臓、脾臓、脳などの他の組織においてα１ＡＭＰＫタンパク質の発現は変化しなかった（図１−１のＢと図１−２のＣ）。対照的に、以前に報告されているように、ＡＭＰＫのα２触媒サブユニットは骨格筋で減少していた。これは、ヘテロ複合体として構成されないＡＭＰＫのサブユニットは分解されるためと考えられる。ＡＭＰＫの活性化と並行して、ＳＴＺ処理ＷＴマウスのヒラメ筋ではＡＣＣのＳｅｒ７９リン酸化が増加したが、ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは増加しなかった（図１−１のＢ）。
【００７６】
ＳＴＺ処理は、血漿インスリン濃度（図２のＡ）とＡｋｔのＳｅｒ４７３リン酸化（図２のＢ）をＷＴおよびＤＮ−ＡＭＰＫマウスの両方のヒラメ筋において減少させた。しかし、血漿グルコース濃度（図２のＣ）は、ＳＴＺ処理ＷＴマウスに比べＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて有意に低かった。したがって、骨格筋におけるＡＭＰＫ活性の選択的抑制は、血漿インスリンレベルが低いままであり骨格筋におけるそのシグナル伝達が阻害されているにも関わらず、高血糖を改善した。
【実施例２】
【００７７】
（結果２：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的な発現は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおける体重減少、過食症、生存率を減少させ、組織の減量を向上させることができる）
ＷＴマウスはＳＴＺ処理（図３−１のＡ）によって体重が減少した。しかしながら、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に改善した。ＳＴＺ投与によって引き起こされた過食もＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウス（図３−１のＢ）で抑制された。さらに、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスは、ＳＴＺの第１回注射後２週目においてもすべて生き残ったが、ＳＴＺ処理したＷＴマウスはわずか３５．７％生き残っただけであった（図３−１のＣ）。
【００７８】
ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスは、ＳＴＺ処理ＷＴマウス（図３−２のＤ）と比較して大幅にヒラメ筋と腓腹筋の組織重量を回復した。また、ＳＴＺ処理により減少した組織精巣上体（Ｅｐｉ）と鼠径（Ｉｎｇ）ＷＡＴ、および肩甲骨間ＢＡＴの重量も、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスで回復した（図３−２のＥ）。これらのデータは、骨格筋におけるＡＭＰＫ活性化を阻害することにより、ＳＴＺによって誘発される骨格筋および脂肪組織の萎縮及び体重減少が改善し、その結果、生存率を増加させることを示唆している。
【実施例３】
【００７９】
（結果３：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的発現は、全身のグルコースおよび脂質代謝を改善する）
ＳＴＺ第１回注射から二週間後、ＳＴＺ−処理されたＷＴマウスは、遊離脂肪酸、トリグリセリドおよびケトン体の血漿濃度が増加していた。ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは、完全に正常レベルに戻った（図４のＡ）。血漿中のノルエピネフリンの濃度、エピネフリン及びコルチコステロン濃度は、ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは増加したが、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは増加していなかった（図４のＢ）。対照的に、血漿グルカゴン濃度はＳＴＺ−処理ＷＴマウスと同様、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて高いままであった（図４のＢ）。このように、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて血糖値が部分的な改善に留まったのは、マウスの高グルカゴン血症（図２のＣ）によるものである。
【００８０】
さらに骨格筋にＤＮ−ＡＭＰＫを発現させた時の全身の糖・脂質代謝に及ぼす影響を調べるために、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）とピルビン酸耐性試験、脂肪（トリオレイン）負荷試験を行った。ＳＴＺ処理されたＷＴマウスは、ＧＴＴに応答して、大きく血糖値が増加した（図５−１のＡ）。しかし、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に血糖値（図５−１のＡ）が改善した。またトリオレインの摂取によって、ＳＴＺ処理ＷＴマウスでは血漿遊離脂肪酸とトリグリセリドの濃度が増加したが、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に改善した（図５−１のＣ）。また、実験の間、血漿インスリン濃度は、ＳＴＺ処理ＷＴマウスと同様、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいても低いままであった（図５−１のＢおよびＤ）。また、肝臓の糖新生活性を反映するピルビン酸耐性試験は、ピルビン酸塩注射に応答して増加した血漿グルコース濃度が、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて有意に改善することを示した（図５−２のＥ）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣＫ）のｍＲＮＡは、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウス（図５−２のＦ）の肝臓で減少した。これらのデータは、骨格筋においてＡＭＰＫ活性を阻害することにより、血漿インスリンレベルは低いままであっても全身のグルコースおよび脂質代謝が改善することを示唆する。
【実施例４】
【００８１】
（結果４：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的発現は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭに応答した骨格筋におけるＡＭＰＫ関連信号の活性化を阻害する）
図１−１のＢは、ＩＤＤＭではＡＭＰＫの活性化に並行して、骨格筋においてＡＣＣリン酸化が増加することを示す。そこで、ヒラメ筋においてＡＭＰＫに関連するその他の下流シグナル分子の反応を調べた。ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは、ヒラメ筋においてＮＡＭＰＴとＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ量が増加したが、これらの変化は、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは抑制された（図６のＡ）。さらに、ＳＴＺ処理したＷＴマウスでは、腓腹筋の赤色部分においてアセチル化ＰＧＣ−１αの量が減少した。これに対してＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは減少しなかった（図６のＢ）。
【００８２】
オートファジーは、長期的な飢餓のようなエネルギー危機における骨格筋の適応応答において重要な役割を果たす（３２−３４）。ＡＭＰＫは、直接ＵＬＫ１をリン酸化（Ｓｅｒ５５５）し、その結果、ＬＣ３−ＩＩのタンパク質量の増加させることによりオートファジーを調節する（１７−１９）。  ＳＴＺ処理ＷＴマウスは、ヒラメ筋においてＵＬＫ１のリン酸化およびＬＣ３−ＩＩのタンパク質発現を増加したが、これらの変化はＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは抑制された（図６のＣおよびＤ）。
【００８３】
ＡＭＰＫは、ＴＳＣ２（結節性硬化症複合体）のリン酸化（Ｓｅｒ１３８７）の増加とｍＴＯＲシグナルを減少させることによって、タンパク質合成を阻害する（１５，１６）。ＳＴＺ処理されたＷＴマウスではＴＳＣ２（Ｓｅｒ１３８７）のリン酸化が増加し、その結果、ヒラメ筋においてＳ６Ｋのリン酸化（Ｔｈｒ３８９）が減少した。ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは、それらは正常レベルに戻った（図６のＥおよびＦ）。
【実施例５】
【００８４】
（結果５：骨格筋におけるＤＮ−ＡＭＰＫの選択的発現は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭのＷＡＴにおけるＡＭＰＫ活性化と変更された遺伝子発現を正常化する）
ＩＤＤＭマウスにおいてＷＡＴが萎縮するメカニズムを探るために、ＳＴＺ処理ＷＴとＤＮ−ＡＭＰＫマウスのＷＡＴにおいてＡＭＰＫの活性化と遺伝子発現を調べた。骨格筋と同様に、ＡＭＰＫはＳＴＺ処理ＷＴマウスのＩｎｇＷＡＴにおいて活性化したが、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは活性化していなかった（図７のＡ）。ＡＭＰＫは、脂肪細胞において脂質合成を抑制し、脂質合成関連遺伝子の発現を阻害することが示されている（３５）。脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）とリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）のｍＲＮＡ存在量は、ＳＴＺ処理ＷＴマウスの鼠径部（Ｉｎｇ）ＷＡＴにおいて減少したが、それらの発現はＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは有意に回復した（図７のＢ）。また、予期せぬことに、ＳＴＺ処理ＷＴマウスはＩｎｇＷＡＴにおいてＵＣＰ１とＣｉｄｅａ（ｃｅｌｌ-ｄｅａｔｈ-ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＦＦ４５-ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ａ）の遺伝子発現が増加したが、ＳＴＺ処理したＤＮ−ＡＭＰＫでは抑制された（図の７Ｂ）。これらの結果は、ＷＡＴの萎縮が脂質生成の抑制によって誘導され、おそらくＷＡＴにおける熱産生タンパク質ＵＣＰ１の発現増大によって促進されたことを示唆する。
【実施例６】
【００８５】
（結果６：ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭはＡＭＰＫ依存的に骨格筋においてｍｙｏｋｉｎｅｓ（マイオカイン）の発現を増加させる）
骨格筋におけるＡＭＰＫ活性化を抑制することにより、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭでの”脂肪組織萎縮症”が改善するメカニズムを探るために、脂肪細胞の代謝に影響を及ぼすマイオカインの発現を調べた。最近の研究において、新規マイオカイン、アイリシンは、ＰＧＣ−１α依存的に骨格筋においてＦＮＤＣ５（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５）から生成され、皮下ＷＡＴにおけるＵＣＰ１および関連遺伝子発現を誘導することが明らかとなっている（２７）。骨格筋におけるＰＧＣ−１α活性化と一致して、ＳＴＺ処理したＷＴマウスではヒラメ筋中のＦＮＤＣ５タンパク質および血漿アイリシン濃度が増加していた（図８のＡ、Ｂ）。これらは、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおいて完全に正常レベルに戻った。
【００８６】
ＩＬ−６は、骨格筋から放出された別のマイオカインであり、ＷＡＴの脂肪分解を促進する（２５，２６）。ＩＬ−６は、ＡＭＰＫ（２６）を活性化することが報告されている（２６）。ＳＴＺ処理したＷＴマウスではヒラメ筋中のＩＬ−６タンパク質（図８のＣ）および血漿ＩＬ−６（図８のＤ）の濃度が増加したが、それらは、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスで減少した。次に、骨格筋（３６）から放出されることが報告されているＩＬ−１５の血漿濃度を調べた。しかし、ＳＴＺ−処理ＷＴマウスにおいてＩＬ−１５は血漿中で増加しなかった（データは示さず）。
【実施例７】
【００８７】
（結果７：ＳＴＺ処理ＷＴとＤＮ−ＡＭＰＫマウスにおけるレプチンとアディポネクチンの血漿濃度）
レプチンは脂肪細胞から分泌され、その分泌はＷＡＴ量に良く相関する。レプチンは、交感神経および組織におけるβ−アドレナリン受容体を介して、骨格筋におけるグルコース利用を促進する（２０−２２）。さらに、長期的なレプチン治療は、中枢神経系を介して、ＳＴＺ誘発糖尿病を含むＩＤＤＭにおける代謝変化を改善する（２３、２４、３７、３８）。別の脂肪細胞分泌ホルモンであるアディポネクチンも、骨格筋におけるグルコースと脂質の利用を促進し、肝臓でのグルコース産生を抑制する（３９）。レプチン血漿濃度はＳＴＺ処理ＷＴマウスにおいて顕著に減少したが、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウスでは回復した（図９のＡ）。高分子量アディポネクチンの血漿濃度は、ＳＴＺ処理ＷＴマウス（図９のＢ）では変化しなかったが、ＳＴＺ処理ＤＮ−ＡＭＰＫマウス（図９のＢ）では増加した。
【実施例８】
【００８８】
（結果８：レプチンまたはＩＬ−６の中和抗体の慢性的な注入は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおける代謝異常を改善する）
ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおける代謝変化に対して、レプチンおよびＩＬ−６がどのような調節作用を及ぼすかを探るために、浸透圧ミニポンプを用いて２週間、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭ Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにレプチンまたはＩＬ−６の中和抗体を注入した。レプチンの注入により、ＳＴＺ処理を行っていないコントロールレベルまでに血漿グルコース濃度が減少した（図１０−１のＡ）。ＩＬ−６中和抗体の注入も、また、グルコースの血漿濃度を減少した（図１０−１のＡ）。さらに、血漿遊離脂肪酸の濃度はレプチン及びＩＬ−６抗体の注入によってコントロールレベルに戻った（図１０−１のＡ）。
【００８９】
レプチンの注入はミニポンプの植え込み後３日目に約３０ｎｇ／ｍｌまでレプチン血漿濃度を増加させ、実験の終了（２週間）までその濃度を保った（図１０−１のＢ）。脂肪組織量の増加に対応して、ＩＬ−６抗体の注入は、ＳＴＺ処理単独に対して有意に血漿レプチン濃度を増加させた（ＳＴＺ＋ビヒクル：０．１２±０．０１ｎｇ／ｍｌ；ＳＴＺ＋ＩＬ−６抗体：４．１８±０．５７ｎｇ／ｍｌ）（図１０−１のＢ）。
【００９０】
血漿ＩＬ−６およびアイリシンの濃度は、ＩＬ−６抗体とレプチンの注入によって減少した（図１０−１のＢ）。対照的に、血漿インスリン濃度はＳＴＺ処理単独と同様、ＩＬ−６抗体およびレプチンの注入後においても低かった（図１０−１のＢ）。
【００９１】
次に、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭにおいて、レプチンあるいはＩＬ−６に対する抗体を注入した後の骨格筋量、ＷＡＴおよびＢＡＴ組織重量を調べた。全ての注入において、ヒラメ筋、ＥＤＬと腓腹筋の量が増加した（図１０−２のＣ）。さらに、ＩＬ−６抗体の注入により、ＥｐｉＷＡＴとＩｎｇＷＡＴおよびＢＡＴの量が増加した（図１０−２のＣ）。レプチンの注入もそれら脂肪組織の量を少し回復した（図１０−２のＣ）。ＩＬ−６抗体の注入に比べて、レプチン注入後に脂肪組織量の増加が少ない理由は、レプチンが脂肪組織の脂質代謝において異化効果を有するためと考えられる（図１０−２のＣ）。
【００９２】
まとめると、これらの結果は、ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭは、骨格筋においてＡＭＰＫを活性化し、筋萎縮を誘導し、それによってＩＬ−６およびアイリシンの生産を増加することを示唆する（図１１）。ＩＬ−６の血漿レベルの増加は、次いで、脂肪組織において異化プロセスを促進し、レプチン産生を減少させる。アイリシンは、また、ＵＣＰ１の発現を誘導し、ＷＡＴの量を減少させる。血漿レプチン濃度の低下は、骨格筋におけるグルコース及び脂質代謝を損ない、臓器ネットワークにおける悪循環を誘導する。
【実施例９】
【００９３】
（結果９：ＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスに対するＡＭＰＫ阻害剤の投与は、血糖値及び血中遊離脂肪酸濃度を改善する）
ＳＴＺを１日目と３日目に各２００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与して作成したＳＴＺ誘発ＩＤＤＭマウスに対して、糖尿病が顕在化するＳＴＺ投与後４日目に浸透圧ポンプを皮下に埋め込み、ＡＭＰＫ阻害剤であるコンパウンドＣ（２４０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ）を、０．５μｌ／ｈｒ／週でＳＴＺを投与してから１４日目まで持続的に皮下投与した。対照として、ビヒクルのみを皮下投与した。さらに、コントロールとして、ＳＴＺ未処理でビヒクル及びコンパウンドＣを皮下投与した。結果を図１２及び図１３に示す。
【００９４】
図１２に示すように、コンパウンドＣの投与により、血糖値及び血中遊離脂肪酸濃度は有意に減少した。また、図１３に示すように、コンパウンドＣの投与により、ヒラメ筋、長趾伸筋及び腓腹筋の重量が増大し、鼠径部及び精巣上体並びにＢＡＴの脂肪組織重量も増大した。この結果から、ＡＭＰＫ阻害剤の投与によっても、ＤＮ−ＡＭＰＫを骨格筋に発現させた時と同様の改善効果が得られることがわかった。
【００９５】
以下に、本明細書で参照しうる参考文献を示す。これらの番号は、適宜明細書において参照される。これらの文献の全内容は、引用により本願に取り込まれるものとする。
1.     Daneman D. (2006) Type 1 diabetes. Lancet 367:847-858.
2.     Cryer PE. (2004) Diverse causes of hypoglycemia-associated autonomic failure in diabetes. N Engl J Med. 350:2272-2279.
3.     Maahs DM, Rewers M. (2006) Mortality and renal disease in type 1 diabetes mellitus-Progress made, more to be done. J Clin Endocrinol Metab. 91:3757-3759.
4.     Steffes MW, Sibley S, Jackson M, Thomas W. (2003) Beta-cell function and the development of diabetes-related complications in the diabetes control and complications trial. Diabetes Care. 26:832-836.
5.     Bluestone JA, Herold K, Eisenbarth G. (2010) Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464:1293-1300.
6.     Liu HY, Cao SY, Hong T, Han J, Liu Z, Cao W. (2009) Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284:27090-27100.
7.     Larsen J, Brekke M, Sandvik L, Arnesen H, Hanssen KF, Dahl-Jorgensen K. (2002) Silent coronary atheromatosis in type 1 diabetic patients and its relation to long-term glycemic control. Diabetes. 51:2637-2641.
8.     Orchard TJ, Olson JC, Erbey JR, Williams K, Forrest KY, Smithline Kinder L, Ellis D, Becker DJ. (2003) Insulin resistance-related factors, but not glycemia, predict coronary artery disease in type 1 diabetes: 10-year follow-up data from the Pittsburgh Epidemiology of Diabetes Complications Study. Diabetes Care. 26:1374-1379.
9.     Hardie DG, Ross FA, Hawley SA. (2012) AMPK: a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13:251-262.
10.    Xiao B, Sanders MJ, Underwood E, Heath R, Mayer FV, Carmena D, Jing C, Walker PA, Eccleston JF, Haire LF, Saiu P, Howell SA, Aasland R, Martin SR, Carling D, Gamblin SJ. (2011) Structure of mammalian AMPK and its regulation by ADP. Nature. 472:230-233.
11.    Merrill GF, Kurth EJ, Hardie DG, Winder WW. (1997) AICAR decreases malonyl-CoA and increases fatty acid oxidation in skeletal muscle of the rat. Am. J. Physiol. Endocrine. Metab. 273:E1107-E1112.
12.    Fulco M, Cen Y, Zhao P, Hoffman EP, McBurney MW, Sauve AA, Sartorelli V. (2008) Glucose restriction inhibits skeletal myoblast differentiation by activating SIRT1 through AMPK-mediated regulation of Nampt. Dev Cell. 14:661-673.
13.    Canto C, Gerhart-Hines Z, Feige JN, Lagouge M, Noriega L, Milne JC, Elliott PJ, Puigserver P, Auwerx J. (2009) AMPK regulates energy expenditure by modulating NAD+ metabolism and SIRT1 activity. Nature. 458:1056-1060.
14.    Canto C, Jiang LQ, Deshmukh AS, Mataki C, Coste A, Lagouge M, Zierath JR, Auwerx J. (2010) Interdependence of AMPK and SIRT1 for metabolic adaptation to fasting and exercise in skeletal muscle. Cell Metab. 11:213-219.
15.    Inoki K, Zhu T, Guan KL. (2003) TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115:577-590.
16.    Gwinn DM, Shackelford DB, Egan DF, Mihaylova MM, Mery A, Vasquez DS, Turk BE, Shaw RJ. (2008) AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30:214-226.
17.    Egan DF, Shackelford DB, Mihaylova MM, Gelino S, Kohnz RA, Mair W, Vasquez DS, Joshi A, Gwinn DM, Taylor R, Asara JM, Fitzpatrick J, Dillin A, Viollet B, Kundu M, Hansen M, Shaw RJ. (2011) Phosphorylation of ULK1 (hATG1) by AMP-activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy. Science. 331:456-461.
18.    Kim J, Kundu M, Viollet B, Guan KL. (2011) AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1. Nat Cell Biol. 13:132-141.
19.    Sanchez AM, Csibi A, Raibon A, Cornille K, Gay S, Bernardi H, Candau R. (2012) AMPK promotes skeletal muscle autophagy through activation of forkhead FoxO3a and interaction with Ulk1. J Cell Biochem. 113:695-710.
20.    Minokoshi Y, Haque MS, Shimazu T. (1999) Microinjection of leptin into the ventromedial hypothalamus increases glucose uptake in peripheral tissues in rats. Diabetes. 48:287-291.
21.    Haque MS, Minokoshi Y, Hamai M, Iwai M, Horiuchi M, Shimazu T. (1999) Role of the sympathetic nervous system and insulin in enhancing glucose uptake in peripheral tissues after intrahypothalamic injection of leptin in rats. Diabetes. 48:1706-1712.
22.    Toda C, Shiuchi T, Lee S, Yamato-Esaki M, Fujino Y, Suzuki A, Okamoto S, Minokoshi Y. (2009) Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58:2757-2765.
23.    Denroche HC, Levi J, Wideman RD, Sequeira RM, Huynh FK, Covey SD, Kieffer TJ. (2011) Leptin therapy reverses hyperglycemia in mice with streptozotocin-induced diabetes, independent of hepatic leptin signaling. Diabetes. 60:1414-1423.
24.    Wang MY, Chen L, Clark GO, Lee Y, Stevens RD, Ilkayeva OR, Wenner BR, Bain JR, Charron MJ, Newgard CB, Unger RH. (2010) Leptin therapy in insulin-deficient type I diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107:4813-4819.  
25.    Pedersen BK, Febbraio MA. (2008) Muscle as an endocrine organ: focus on muscle-derived interleukin-6. Physiol Rev. 88:1379-1406.
26.    Wan Z, Ritchie I, Beaudoin MS, Castellani L, Chan CB, Wright DC. (2012) IL-6 Indirectly Modulates the Induction of Glyceroneogenic Enzymes in Adipose Tissue during Exercise. PLoS One. 7:e41719
27.    Bostrom P, Wu J, Jedrychowski MP, Korde A, Ye L, Lo JC, Rasbach KA, Bostrom EA, Choi JH, Long JZ, Kajimura S, Zingaretti MC, Vind BF, Tu H, Cinti S, Hojlund K, Gygi SP, Spiegelman BM. (2012) A PGC1-α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481:463-468.
28.    Wu J, Bostrom P, Sparks LM, Ye L, Choi JH, Giang AH, Khandekar M, Virtanen KA, Nuutila P, Schaart G, Huang K, Tu H, van Marken Lichtenbelt WD, Hoeks J, Enerback S, Schrauwen P, Spiegelman BM. (2012) Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150:366-376.
29.    Miura S, Kai Y, Kamei Y, Bruce CR, Kubota N, Febbraio MA, Kadowaki T, Ezaki O. (2009) Alpha2-AMPK activity is not essential for an increase in fatty acid oxidation during low-intensity exercise. Am J Physiol Endocrinol Metab. 296, E47-E55.
30.    Kotani K, Peroni OD, Minokoshi Y, Boss O, Kahn BB. (2004) GLUT4 glucose transporter deficiency increases hepatic lipid production and peripheral lipid utilization.  J Clin Invest. 114:1666-1675.
31.    Inoue H, Ogawa W, Asakawa A, Okamoto Y, Nishizawa A, Matsumoto M, Teshigawara K, Matsuki Y, Watanabe E, Hiramatsu R, Notohara K, Katayose K, Okamura H, Kahn CR, Noda T, Takeda K, Akira S, Inui A, Kasuga M. (2006) Role of hepatic STAT3 in brain-insulin action on hepatic glucose production. Cell Metab. 3:267-275.
32.    Komatsu M, Waguri S, Ueno T, Iwata J, Murata S, Tanida I, Ezaki J, Mizushima N, Ohsumi Y, Uchiyama Y, Kominami E, Tanaka K, Chiba T. (2005) Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169: 425-434.
33.    Mammucari C, Milan G, Romanello V, Masiero E, Rudolf R, Del Piccolo P, Burden SJ, Di Lisi R, Sandri C, Zhao J, Goldberg AL, Schiaffino S, Sandri M. (2007) FoxO3 controls autophagy in skeletal muscle in vivo. Cell Metab. 6:458-471.
34.    Lokireddy S, Wijesoma IW, Teng S, Bonala S, Gluckman PD, McFarlane C, Sharma M, Kambadur R. (2012) The ubiquitin ligase Mul1 induces mitophagy in skeletal muscle in response to muscle-wasting stimuli. Cell Metab. 16:613-624.
35.    Sullivan JE, Brocklehurst KJ, Marley AE, Carey F, Carling D, Beri RK. (1994) Inhibition of lipolysis and lipogenesis in isolated rat adipocytes with AICAR: a cell-permeable activator of AMP-activated protein kinase. FEBS Lett. 353:33-36 
36.    Quinn LS. (2008) Interleukin-15: a muscle-derived cytokine regulating fat-to-lean body composition. J Anim Sci. 86:E75-83
37.    Yu X, Park BH, Wang MY, Wang ZV, Unger RH. (2008) Making insulin-deficient type 1 diabetic rodents thrive without insulin. Proc Natl Acad Sci U S A. 105:14070-14075.
38.    Fujikawa T, Chuang JC, Sakata I, Ramadori G, Coppari R. (2010) Leptin therapy improves insulin-deficient type 1 diabetes by CNS-dependent mechanisms in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 107:17391-17396.
39.    Yamauchi T, Nio Y, Maki T, Kobayashi M, Takazawa T, Iwabu M, Okada-Iwabu M, Kawamoto S, Kubota N, Kubota T, Ito Y, Kamon J, Tsuchida A, Kumagai K, Kozono H, Hada Y, Ogata H, Tokuyama K, Tsunoda M, Ide T, Murakami K, Awazawa M, Takamoto I, Froguel P, Hara K, Tobe K, Nagai R, Ueki K, Kadowaki T. (2007) Targeted disruption of AdipoR1 and AdipoR2 causes abrogation of adiponectin binding and metabolic actions. Nat Med. 13:332-339
40.    Shimomura I, Hammer RE, Ikemoto S, Brown MS, Goldstein JL. (1999) Leptin reverses insulin resistance and diabetes mellitus in mice with congenital lipodystrophy. Nature. 401:73-76
41.    Oral EA, Simha V, Ruiz E, Andewelt A, Premkumar A, Snell P, Wagner AJ, DePaoli AM, Reitman ML, Taylor SI, Gorden P, Garg A. (2002) Leptin-replacement therapy for lipodystrophy. N Engl J Med. 346:570-578
42.    Li X, Wu X, Camacho R, Schwartz G, LeRoith D. (2011) Intracerebroventricular leptin infusion improves glucose homeostasis in lean type 2 diabetic MKR mice via hepatic vagal and non-vagal mechanisms. PLoS ONE. 6:e17058
43.    Stanford KI, Middelbeek RJ, Townsend KL, An D, Nygaard EB, Hitchcox KM, Markan KR, Nakano K, Hirshman MF, Tseng YH, Goodyear LJ. (2013) Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin Invest. 123:215-223.
44.    Minokoshi Y, Kim YB, Peroni OD, Fryer LG, Muller C, Carling D, Kahn BB. (2002) Leptin stimulates fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase.  Nature. 415:339-343.
45.    Suzuki A, Okamoto S, Lee S, Saito K, Shiuchi T, Minokoshi Y. (2007) Leptin stimulates fatty acid oxidation and peroxisome proliferator-activated receptor alpha gene expression in mouse C2C12 myoblasts by changing the subcellular localization of the alpha2 form of AMP-activated protein kinase. Mol Cell Biol. 27:4317-4327.
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号１〜１８：プライマー
【図１−１】
2015030680.tif 000009
【図１−２】
2015030680.tif 000010
【図２】
2015030680.tif 000011
【図３−１】
2015030680.tif 000012
【図３−２】
2015030680.tif 000013
【図４】
2015030680.tif 000014
【図５−１】
2015030680.tif 000015
【図５−２】
2015030680.tif 000016
【図６】
2015030680.tif 000017
【図７】
2015030680.tif 000018
【図８】
2015030680.tif 000019
【図９】
2015030680.tif 000020
【図１０−１】
2015030680.tif 000021
【図１０−２】
2015030680.tif 000022
【図１１】
2015030680.tif 000023
【図１２】
2015030680.tif 000024
【図１３】
2015030680.tif 000025
【配列表】
2015030680000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月27日(2014.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される化合物を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療剤。
【化１】
2015030680.tif 000026
【請求項２】
糖、脂肪酸、インスリン、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される代謝異常を改善する、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
脂肪酸、中性脂肪及びケトン体からなる群から選択される代謝異常を改善する、請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
以下の式（１）で表される化合物と、
【化２】
2015030680.tif 000027
グルカゴン阻害剤及び／又はグルカゴン受容体阻害剤と、
を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療用組成物。
【請求項５】
以下の式（１）で表される化合物と、
【化３】
2015030680.tif 000028
インスリンと、
を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療用組成物。
【請求項６】
以下の式（１）で表される化合物と、
【化４】
2015030680.tif 000029
ＩＬ―６中和抗体と、
を有効成分として含有する、１型糖尿病の治療用組成物。
【請求項７】
Ｉ型糖尿病の治療のためのＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
被験化合物のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのリン酸化活性を指標として、被験化合物のＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害活性を測定する工程と、
【請求項８】
さらに、以下の式(1)で表される化合物のＡＭＰ−活性化プロティンキナーゼの阻害活性と対比して前記被験化合物の被験化合物のＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害活性を評価する工程と、
【化５】
2015030680.tif 000030
を備える、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼの阻害活性が肯定された前記被験化合物をＩ型モデル動物に投与して、当該モデル動物における血糖値、血中遊離脂肪酸、筋重量及び脂肪組織重量からなる群から選択される１種又は２種以上を評価する工程と、
を備える、請求項７又は８に記載の方法。