(57)【要約】  単一の単離された抗体又はその抗体フラグメントは、ＨＩＶ−１の複数の株及びサブタイプ中に発現されるＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質のエピトープ内の複数の変異配列と結合する。この「汎エピトープ」抗体は、株に関わらず、ＨＩＶ−１感染の治療的及び予防的な組成物並びに治療において、有用である。この汎エピトープ抗体は、生物試料中のＴａｔタンパク質量の測定に基づく、ＨＩＶ−１レベルを検出するためのアッセイにおいて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質のエピトープ内の複数の変異配列に結合する、単一の単離された抗体又はその抗体フラグメントであって、前記エピトープは式：Ｒ1−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｒ2（配列番号５）
（式中、Ｘ7はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎであり；
Ｙ9はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｒ1は欠失、Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり；
Ｒ2は欠失、又はＴｒｐ−Ｚ12−Ｒ3である
（式中、Ｚ12は欠失、Ｌｙｓ、又はＡｓｎであり；
Ｒ3は欠失、又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の全部若しくは一部である））で表され、且つ、
前記単一の抗体又はフラグメントは、複数の株及びサブタイプ由来のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質と結合する、前記単一の単離された抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２】
５種類の前記変異配列と結合する、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項３】
各変異配列について、Ｒ1がＶａｌであり、且つＲ2が欠失である、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項４】
Ｙ9がＧｌｕである前記変異配列の少なくとも１種類、及びＹ9がＡｓｐである前記変異配列の少なくとも１種類と結合する、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項５】
少なくとも２種類の異なる前記変異配列と結合する、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項６】
少なくとも３種類の異なる前記変異配列と結合する、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項７】
少なくとも４種類の異なる前記変異配列と結合する、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項８】
６〜８種類の異なる前記変異配列と結合する、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項９】
９種類以上の異なる前記変異配列と結合する、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項１０】
前記変異配列が以下の（ａ）〜（ｈ）より成る群から選択される、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント：
（ａ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｒｇであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｂ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＬｙｓであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｃ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＳｅｒであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｄ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｓｎであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｅ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｒｇであり、そしてＹ9はＡｓｐである；
（ｆ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＬｙｓであり、そしてＹ9はＡｓｐである；
（ｇ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＳｅｒであり、そしてＹ9はＡｓｐである；及び
（ｈ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｓｎであり、そしてＹ9はＡｓｐである。
【請求項１１】
（ａ）〜（ｄ）より成る群から選択される前記変異配列の少なくとも１種類、及び（ｅ）〜（ｈ）より成る群から選択される前記変異配列の少なくとも１種類と結合する、請求項１０に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項１２】
５種類の異なる前記変異配列と結合する、請求項１０に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項１３】
２〜７種類の異なる前記変異配列と結合する、請求項１０に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項１４】
（ａ）〜（ｈ）の全ての前記変異配列と結合する、請求項１０に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項１５】
モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単離された１本の抗体鎖、又は前記抗体若しくは抗体鎖のフラグメントより成る群から選択される、請求項１に記載の単一の単離された抗体又はフラグメント。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント、及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の複数の異なる抗体又は抗体フラグメントを含有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の前記抗体又は抗体フラグメントが、Ｙ9がＧｌｕである前記変異配列の少なくとも１種類、及びＹ9がＡｓｐである前記変異配列の少なくとも１種類と結合する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
ＨＩＶ−１に対する追加の抗体又は追加の抗体フラグメントを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記の追加の抗体又は追加の抗体フラグメントがＨＩＶ−１  Ｔａｔに結合する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＨＩＶ−１  Ｔａｔに対する前記の追加の抗体又は追加の抗体フラグメントが、式Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（配列番号２）（式中、ＸはＧｌｙ又はＡｌａである）のエピトープ内に位置する配列と結合する抗体又は抗体フラグメントである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載の単一の単離された抗体又は抗体フラグメント、及び検出可能な標識を含む、診断アッセイ試薬。
【請求項２３】
請求項１に記載の前記抗体又は抗体フラグメントが、Ｙ9 がＧｌｕである前記変異配列の少なくとも１種類、及びＹ9がＡｓｐである前記変異配列の少なくとも１種類と結合する、請求項２２に記載の試薬。
【請求項２４】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含む、生物試料のアッセイの実施に使用するためのキット：
（ａ）１以上の請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント；
（ｂ）前記抗体（ａ）が結合するエピトープとは異なるＨＩＶ−１  Ｔａｔ上のエピトープと特異的に結合する、任意の１以上の追加の抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体；
（ｃ）前記試料中に存在するあらゆるＨＩＶ−１  Ｔａｔに対する前記抗体の結合を同定するための、１以上の検出可能な標識又は標識系。
【請求項２５】
前記の抗体又は抗体フラグメント（ａ）が、少なくとも５種類の前記変異体と結合する、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記の抗体又は抗体フラグメント（ａ）が、少なくとも２〜少なくとも８種類の前記変異体と結合する、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
ＨＩＶ−１に曝されたヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害する方法であって、前記対象に対し、感染細胞から放出されるＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質に結合する有効量の請求項１６に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記投与工程を感染後に行う、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与工程を定期的間隔で繰り返す、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質のエピトープ内の少なくとも５種類の変異配列と結合する、単一の単離された抗体又はその抗体フラグメントであって、前記エピトープは式：Ｒ1−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｒ2（配列番号５）
（式中、Ｘ7はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎであり；
Ｙ9はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｒ1は欠失、Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり；
Ｒ2は欠失、又はＴｒｐ−Ｚ12−Ｒ3である
（式中、Ｚ12は欠失、Ｌｙｓ、又はＡｓｎであり；
Ｒ3は欠失、又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の全部若しくは一部である））で表され、且つ、
前記の単一の抗体又はフラグメントは、複数の株及びサブタイプ由来のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質と結合する、前記単一の単離された抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３１】
以下の配列と結合する、請求項３０に記載の単一の単離された抗体又はそのフラグメント：
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号６）；Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号７）；Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号８）；
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号９）；及び
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号１０）
（式中、Ｚ12は欠失、Ｌｙｓ、又はＡｓｎであり；Ｒ3は欠失、又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号２７）の全部若しくは一部である）。
【請求項３２】
ＨＩＶ−１に曝されたヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害する方法であって、前記対象に対し、以下を投与することを含む方法：
（ａ）ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質のエピトープ内の複数の変異配列と結合する、単一の単離された抗体又はその抗体フラグメントであって、前記エピトープは式：Ｒ1−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｒ2（配列番号５）
（式中、Ｘ7はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎであり；
Ｙ9はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｒ1は欠失、Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり；
Ｒ2は欠失、又はＴｒｐ−Ｚ12−Ｒ3である
（式中、Ｚ12は欠失、Ｌｙｓ、又はＡｓｎであり；
Ｒ3は欠失、又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の全部若しくは一部である））で表される、前記単一の単離された抗体又はその抗体フラグメント；及び
（ｂ）式：Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（配列番号２）（式中、ＸはＧｌｙ又はＡｌａである）のエピトープ内に位置する配列と結合する、単一の単離された抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３３】
前記の抗体又はフラグメント（ａ）及び抗体又はフラグメント（ｂ）が、医薬的に許容し得る担体と共に、単一組成物中に混合されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記の抗体又はフラグメント（ａ）及び抗体又はフラグメント（ｂ）が、あらゆる順番で順次的に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記の抗体又はフラグメント（ａ）及び抗体又はフラグメント（ｂ）が、同時に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害するための医薬の製造における、請求項１に記載の抗体の使用。
【請求項３７】
以下の（ａ）及び（ｂ）の、ヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害するための医薬の製造における使用：
（ａ）ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質のエピトープ内の複数の変異配列に結合する、単一の単離された抗体又はその抗体フラグメントであって、前記エピトープは式：Ｒ1−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｒ2（配列番号５）
（式中、Ｘ7はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎであり；
Ｙ9はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｒ1は欠失、Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり；
Ｒ2は欠失、又はＴｒｐ−Ｚ12−Ｒ3である
（式中、Ｚ12は欠失、Ｌｙｓ、又はＡｓｎであり；
Ｒ3は欠失、又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の全部若しくは一部である））で表される、前記単一の単離された抗体又はその抗体フラグメント；及び
（ｂ）式：Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（配列番号２）（式中、ＸはＧｌｙ又はＡｌａである）のエピトープ内に位置する配列と結合する、単一の単離された抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３８】
単一の単離されたＨＩＶ−１  Ｔａｔ汎エピトープ１抗体又はその抗体フラグメントを作製する方法であって：
式：Ｒ1−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｒ2（配列番号５）で表されるＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質のエピトープ内の、第１の変異アミノ酸配列を有する１本鎖抗体可変配列（ｓｃＦｖ）のライブラリーを選択し
（式中、Ｘ7はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎであり；
Ｙ9はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｒ1は欠失、Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり；且つ
Ｒ2は欠失、又はＴｒｐ−Ｚ12−Ｒ3である；
（式中、Ｚ12は欠失、Ｌｙｓ、又はＡｓｎであり；
Ｒ3は欠失、又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の全部若しくは一部である））；
前記選択から前記第１の変異配列と結合するｓｃＦｖの第１混合物を得；
前記第１の変異体混合物を前記エピトープ内の第２の異なる変異配列を用いて連続的且つ順次的にスクリーニングし、前記第１及び前記第２の変異配列の両方と結合するｓｃＦｖを生じるものの第２混合物を得；そして
逐次的なｓｃＦｖの各混合物について、前記エピトープ内の異なる変異配列を用いて、前記の連続的且つ順次的なスクリーニング工程を所望により繰り返し、前記エピトープ内の複数の異なる変異配列と結合するｓｃＦｖ混合物を得る、
ことを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記エピトープ内の前記変異配列が、以下の（ａ）〜（ｈ）より成る群から選択される、請求項３８に記載の方法：
（ａ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｒｇであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｂ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＬｙｓであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｃ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＳｅｒであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｄ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｓｎであり、そしてＹ9はＧｌｕである；
（ｅ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｒｇであり、そしてＹ9はＡｓｐである；
（ｆ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＬｙｓであり、そしてＹ9はＡｓｐである；
（ｇ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＳｅｒであり、そしてＹ9はＡｓｐである；及び
（ｈ）配列番号５においてＲ1はＶａｌであり、Ｒ2は欠失であり、Ｘ7はＡｓｎであり、そしてＹ9はＡｓｐである。
【請求項４０】
定常領域骨格中に前記の各ｓｃＦｖを挿入する追加の工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記骨格がヒトＩｇＧ１骨格である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記の単一の単離された抗体又は抗体フラグメントがＨＩＶ−１の複数の株及びサブタイプと結合する、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法により作製される、単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項４３】
前記の抗体又は抗体フラグメントが、Ｙ9がＧｌｕである前記変異配列の少なくとも１種類、及びＹ9がＡｓｐである前記変異配列の少なくとも１種類と結合する、請求項３８に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項４４】
前記抗体が２〜８種類の前記変異配列と結合する、請求項３８に記載の抗体又はフラグメント。
【請求項４５】
対象中のＨＩＶ−１  Ｔａｔレベルを測定するための診断アッセイであって：
（ａ）既知量のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質が固定化されている基質を、未知量のＨＩＶ−１  Ｔａｔを含有する対象由来の生物試料、及び請求項１に記載の単一の単離された抗体又は抗体フラグメントと接触させ（このとき、前記抗体又は抗体フラグメントは、結合したＴａｔ量に対して飽和量以下で存在する）；
（ｂ）前記基質に結合した、請求項１に記載の前記抗体又は抗体フラグメントの量を決定し；
（ｃ）前記の量（ｂ）を、前記試料の非存在下で、様々な既知量の前記抗体又はフラグメントの前記既知量の結合Ｔａｔへの結合を測定した標準結合曲線と比較し、それにより、前記試料中のＴａｔ量は、前記基質に結合した前記抗体量との逆相関によって示される、
ことを含む、前記診断アッセイ。
【請求項４６】
前記の単一の単離された抗体又はフラグメントが２〜８種類の前記変異配列と結合する、請求項４５に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般的に、慢性感染した症候性又は無症候性の患者中のヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の増殖を阻害し、それによりエイズ（ＡＩＤＳ）への進行を最小限にするために有用な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に感染した患者を治療するために、様々な治療方法が利用され、又は研究されている。ＨＩＶ−１治療へのアプローチの或るものは、ＨＩＶ−１の転写活性化（ｔａｔ）遺伝子に焦点を合わせており、この遺伝子はウイルスの高レベル転写に必須なタンパク質（Ｔａｔ）を産生する。ｔａｔ遺伝子及びそのタンパク質は配列決定され、そして提唱されたＨＩＶ治療における関与が調べられている（例えば米国特許第６，５２５，１７９号に引用された文献を参照されたい）。Ｔａｔタンパク質は細胞に外放出されて、他の感染細胞によって取り込まれて細胞中のＨＩＶ−１の転写を亢進させ、また非感染細胞によって取り込まれて宿主細胞の遺伝子活性化を変更させ細胞をウイルスに感染し易くすることができる。細胞によるＴａｔの取り込みは非常に強く、このタンパク質の短い塩基性配列によって媒介されると報告されている（Ｓ．Ｆａｗｅｌｌら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：６６４−６６８）。
【０００３】
Ｔａｔタンパク質に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は動物中で容易に産生され、インビトロでＴａｔタンパク質の取り込みを阻止することが示されており、そのようなＴａｔタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を組織培養液に添加するとインビトロでのＨＩＶ−１感染が減弱される（例えば、米国特許第６，５２４，５８２号に引用された文献を参照されたい）。
【０００４】
本発明の共同発明者の一人による先行の科学刊行物及び特許刊行物（例えば、Ｇ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：９６０；Ｇ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，２０００  Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：２７８９；１９９５年１１月３０日公開の国際特許公開ＷＯ９５／３１９９９号；１９９９年１月２１日公開の国際特許公開ＷＯ９９／０２１８５号；２００１年１１月８日公開の国際特許公開ＷＯ０１／８２９４４号；米国特許第５，８９１，９９４号；第６，１９３，９８１号；第６，３９９，０６７号；第６，５２４，５８２号；及び第６，５２５，１７９号；米国公開特許出願ＵＳ２００３／０，１６６，８３２号及びＵＳ２００３／０，１８０，３２６号）は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質上の或るエピトープに対する抗体を、エイズワクチン及び治療薬として言及している。
【０００５】
例えば、これらの刊行物は、Ｔａｔアミノ酸残基４〜１２、即ち：Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｚ12−（配列番号１）（式中、Ｘ7はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎであり、Ｙ9はＧｌｕ又はＡｓｐであり、そしてＺ12はＬｙｓ又はＡｓｎである）にまたがる「ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１」配列内に位置するエピトープに特異的に結合する抗体、及びこの抗体と他のＨＩＶ−１  Ｔａｔに対する抗体を組み合わせた組成物に言及している。これらの刊行物は、Ｔａｔアミノ酸残基４１〜５０、式：−Ｌｙｓ−Ｘ42−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（配列番号２）（式中、Ｘ42はＧｌｙ又はＡｌａである）にまたがる「ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ２」配列内に位置するエピトープに特異的に結合する単離された抗体を含有する別の抗体組成物にも言及している。さらに、これらの刊行物はＴａｔアミノ酸残基５６〜６２、式：−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ58−Ｚ59−Ａ60−Ｙ61−Ｓｅｒ−（配列番号３）（式中、Ｘ58はＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＧｌｎであり、Ｚ59はＰｒｏ又はＨｉｓであり、Ａ60はＧｌｎ又はＰｒｏであり、Ｙ61はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒである）にまたがる「ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ３」配列内に位置するエピトープ、又は、Ｔａｔアミノ酸残基６２〜７３、式：−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘ64−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｙ67−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−（配列番号４）（式中、Ｘ64はＡｓｎ又はＴｈｒであり、Ｙ67はＡｌａ又はＶａｌである）にまたがる「ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ４」配列内に位置するエピトープに特異的に結合する単離された抗体にも言及している。
【０００６】
これらの抗体の組み合わせから形成される組成物、特にエピトープ１変異体の１つに対する抗体と各々が異なるエピトープ１変異体に結合する１以上の抗体との組み合わせ、さらに、そのようなエピトープ１抗体とエピトープ２抗体との組み合わせは、他の組み合わせの中でもとりわけ多数のＴａｔ変異配列、つまりＨＩＶ−１の複数の株並びにサブタイプ、Ｂ及び非Ｂクレード両方に特徴的な配列に結合することができる。これらの抗体組成物は、初期感染におけるＨＩＶ−１の感染性を阻害し、及び／又は抗体陽転後のウイルス量を低下させ、それによりエイズへの進行を遅らせるためにデザインされる。さらに、結果として得られたこれらの抗Ｔａｔ抗体の組成物又は混合物は、ウイルスの多くの株及びサブタイプに対する治療として有利であり、したがって、異なる、そして株特異的な治療薬の必要性を不要にする。
【０００７】
ＨＩＶ−１疾患の進行についての知識が増えているにもかかわらず、当業界では、一般的に、致命的な末期エイズへの感染の進行を遅らせ又は予防するためにＨＩＶ−１による慢性感染を治療するための組成物及び方法の開発の必要性がある。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
１つの側面において、本発明は、複数のＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１変異配列に結合し、それにより複数の株及びサブタイプ由来のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質に結合する、単一の単離された抗体又はそのフラグメント（今後「汎エピトープ１（pan-Epitope 1）」抗体と呼ぶ）を提供する。１つの実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体は、５種類又は少なくとも５種類のＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１変異配列に結合し、それは本発明の以下の詳細な説明において明確に定義される。
【０００９】
別の実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体は、少なくとも２種類のＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１変異配列に結合する。さらに別の実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントは、以下に定義される（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１種類の変異Ｔａｔエピトープ１配列、及び以下に定義される（ｅ）〜（ｈ）のうち少なくとも１種類の変異配列に結合する。別の実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体は、少なくとも３種類、又は少なくとも４種類の変異ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１配列に結合する。
【００１０】
別の実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体は、少なくとも６種類のこれらの配列に結合する。別の実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体は、少なくとも７種類、又は少なくとも８種類の変異体ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１配列に結合する。別の実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体は、９種類以上の変異体ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１配列に結合する。別の実施態様において、単一の汎エピトープ１抗体は、既知のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質（Ｂ及び非Ｂクレード）変異体の９５％以上と反応する。
【００１１】
別の側面において、本発明は、以上に定義される単一の汎エピトープ１抗体の１つを包含する医薬組成物を提供する。別の実施態様において、この組成物は以上に定義される複数の異なる汎エピトープ１抗体を含有する。さらなる実施態様において、この組成物はＨＩＶ−１に対する追加の抗体を含有する。そのような組成物は、エイズを導く慢性ウイルス血症を最小限にすることを意図している。そのような組成物は、慢性感染した症候性又は無症候性の患者にとって、又は他の抗レトロウイルス治療を受けている患者にとって有用である。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は以上に定義される単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメント、及び検出可能な標識又は標識系を包含する診断アッセイ試薬を提供する。
別の側面において、本発明は、サンドイッチアッセイの実施に使用するためのキットであって、１以上の汎エピトープ１抗体又はフラグメント、エピトープ１以外のＨＩＶ−１  Ｔａｔ上のエピトープに結合する１以上の追加の抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体、及び所望により抗体の結合を同定するための１以上の検出可能な標識又は標識系を包含するキットを提供する。
【００１３】
別の側面において、本発明は、アッセイの実施に使用するためのキットであって、１以上の汎エピトープ１抗体又はフラグメント、及び汎エピトープ１抗体のＴａｔへの結合を同定するための１以上の検出可能な標識又は標識系を包含するキットを提供する。本発明のいずれのキットも、コーティングされた固体支持体、種々の基質、及び標識により与えられるシグナルを誘起又は検出するための装置、並びに、血液試料を扱うための従来の装置、適当なバイアル及び他の診断アッセイの構成要素を含む。
【００１４】
さらなる側面において、本発明は、感染したヒト対象中のＨＩＶ−１の複製を阻害する方法又はＨＩＶ−１のウイルスレベルを低減させる方法であって、前記対象に対して、本明細書中に定義される医薬組成物を投与することによる方法を提供する。１つの実施態様において、この方法は、慢性感染した対象中のＨＩＶ−１ウイルスレベルを低く維持するために、本発明の組成物を投与することを含む。
【００１５】
別の側面において、本発明は、ヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害するための医薬の製造における汎エピトープ１抗体の使用を提供する。１つの実施態様において、この使用は５種類以上の異なるエピトープ１変異配列に結合する汎エピトープ１抗体を利用する。別の側面において、本発明は、ヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害するための医薬の製造における、汎エピトープ１抗体又は抗体フラグメント及び抗エピトープ２抗体又は抗体フラグメントの使用を提供する。
【００１６】
さらなる側面において、本発明は、単一の単離された汎エピトープ１抗体又はそのフラグメントの作製方法を提供する。
さらに別の側面において、本発明は、対象中のＨＩＶ−１  Ｔａｔレベルを測定する診断アッセイを提供する。１つの実施態様において、このアッセイは本発明の汎エピトープ１抗体を利用する競合アッセイである。さらなる実施態様において、この汎エピトープ１抗体は少なくとも５種類のＴａｔエピトープ１変異配列に結合する抗体、即ち汎エピトープ１抗体＃５である。
【００１７】
本発明の他の側面及び利点は、本発明の好ましい実施態様についての以下の詳細な説明中にさらに記述される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、複数の株及びサブタイプのＨＩＶ−１感染の治療及び診断に使用するための、治療及び診断のための試薬及び組成物の、当業界における必要性に取り組む。本発明の汎エピトープ１組成物の１つのユニークな利点は、あまり複雑ではなく、使用する試薬が少数ですみ、それでもＨＩＶ−１の株及びサブタイプの全範囲に対して効果的な製剤及び治療応用を含む。同様に、本発明は複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプを、単独のアッセイ且つ最小数の試薬で検出可能にし、それにより、対象が感染しているかもしれないＨＩＶ−１株又はサブタイプ各々のための、複数の別個の試験及び試薬を不要にする。
【００１９】
ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１及び汎エピトープ１抗体
本明細書において、用語「変異体ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１配列」は、以下の式：Ｒ1−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｒ2（配列番号５）［式中、Ｘ7はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ又はＡｓｎであり；Ｙ9はＧｌｕ又はＡｓｐであり；Ｒ1は欠失、Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり；そしてＲ2は欠失又はＴｒｐ−Ｚ12−Ｒ3であって、式中、Ｚ12は欠失、Ｌｙｓ、又はＡｓｎであり、Ｒ3は欠失又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号２７）の全部若しくは一部である］で表される配列を指す。１つの好ましい実施態様によれば、エピトープ１配列は、Ｘ7及びＹ9部位に可変アミノ酸、且つＲ1としてＶａｌを含有し、且つＲ2は欠失であり、即ちＶａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ（配列番号２８）である。別の実施態様によれば、エピトープ１配列は３つの可変部位、即ちＸ7、Ｙ9及びＺ12部位、欠失のＲ1、且つＴｒｐ−Ｚ12−Ｒ3であるＲ2（式中、Ｒ3は欠失）を含有し、例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｚ12（配列番号２９）である。上記の式によれば、変異体エピトープ１配列の全体範囲は、以上に同定された配列番号５のフラグメント、又は配列番号５のフラグメント若しくは全体を包含するより長い配列のいずれかを含有する、長さ７〜約１４個のアミノ酸配列であり得る。したがって、以下の例により明記される８種類よりも多くのエピトープ１変異配列が存在する。
【００２０】
別の実施態様として、他の変異体ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１配列は、式：Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｐｒｏ（配列番号３０）、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｔｒｐ−Ｚ12−（配列番号３１）、及びＶａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｘ7−Ｌｅｕ−Ｙ9−Ｔｒｐ−Ｚ12−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号３２）により表される配列、並びに上記の式の範囲に入る他の配列を含む。１つの実施態様において、以下に例示されるように、或る選択された変異体ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１配列は、以下の８種類の配列により表される：
（ａ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（配列番号３３）
（ｂ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（配列番号３４）
（ｃ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（配列番号３５）
（ｄ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（配列番号３６）
（ｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−（配列番号３７）
（ｆ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−（配列番号３８）
（ｇ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−（配列番号３９）
（ｈ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−（配列番号４０）
したがって、１つの実施態様において、例えば、１つの汎エピトープ１抗体は変異体（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｈ）と結合する。別の実施態様においては、汎エピトープ１抗体は（ａ）〜（ｈ）の複数の変異体の異なる組み合わせと結合する。
【００２１】
エピトープ１のこの定義は相同又は類似の改変されたエピトープ配列も包含し、このとき配列番号５の式中の非可変アミノ酸（即ち、１文字と下付き文字によって表されていない物）は、同様の特徴を有するアミノ酸残基により個々に保存的に置換されていてもよい。例えば、配列番号５の非可変アミノ酸残基は、同じ電荷及び／又は同様の側鎖長を持つ他のアミノ酸残基によって置換されていてもよい。同様に、配列番号５の非可変天然アミノ酸は、不自然なアミノ酸残基、即ち化学構造が改変されたアミノ酸、例えばＤ−アミノ酸、非天然の側鎖を持つアミノ酸、Ｎ−メチル化アミノ酸等によって置換されていてもよい。特に、Ｎ−メチル化アミノ酸に関する引用文献を参照されたい。例えば、Ｌ．Ａｕｒｅｌｉｏら、２００２  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４（２１）：３７６７−３７６９及びそこに引用される文献を参照されたい。
【００２２】
したがって本発明は「汎エピトープ１抗体」を提供し、この用語は、複数のＨＩＶ−１エピトープ１アミノ酸配列に結合することができる、単一の単離された抗体又はそのフラグメントを指す。望ましくは、以下の実施例に明示されるように、汎エピトープ１抗体は、結合する全ての変異配列に対して１．０×１０-9以下のＫDを有する。解離定数ＫDは、結合（ｋa）及び解離（ｋd）の測定から求められることは、当業者には容易に理解されるであろう。本発明の全ての汎エピトープ１抗体は、望ましくは同様のＫD値を有する。
【００２３】
本明細書中に例示されるように、汎エピトープ１抗体の１つの実施態様は、少なくとも５種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列に結合することができる、単一の単離された抗体又はフラグメントである。さらなる実施態様において、汎エピトープ１抗体は、５種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列に結合することができる、単一の単離された抗体又はフラグメントである。さらなる実施態様において、汎エピトープ１抗体は、以下の５種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１アミノ酸配列に結合することができる、単一の単離された抗体又はフラグメントである：ＶＤＰＲＬＥＰＷ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号６）；ＶＤＰＫＬＥＰＷ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号７）；ＶＤＰＳＬＥＰＷ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号８）；ＶＤＰＮＬＥＰＷ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号９）；及びＶＤＰＮＬＤＰＷ−Ｚ12−Ｒ3（配列番号１０）、［式中、Ｚ12はＬｙｓ又はＡｓｎであり、Ｒ3は欠失又は配列−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号２７）の全部若しくは一部である］。５種類の変異体に結合するここに例示されたＩｇＧ１汎エピトープ１抗体は、以下のアッセイにおいて５種類の変異配列の全てに対して１．０×１０-9以下のＫDを有することが示される。
【００２４】
汎エピトープ１抗体の別の実施態様は、以上にリストされた変異体エピトープ１配列（ａ）〜（ｈ）のうちの２種類のような、少なくとも２種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列に結合することができる、単一の単離された抗体又はそのフラグメントである。汎エピトープ１抗体のさらに別の実施態様は、少なくとも３種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列に結合することができる、単一の単離された抗体又はそのフラグメントである。汎エピトープ１抗体の別の実施態様は、少なくとも４種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列に結合することができる、単一の単離された抗体又はそのフラグメントである。別の実施態様において、２〜４種類の異なるエピトープ１変異体に結合する本発明の汎エピトープ１抗体は、Ｙ9部位にＧｌｕを有する少なくとも１種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列、及びＹ9部位にＡｓｐを有する少なくとも１種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列に結合する抗体又はフラグメントである。
【００２５】
別の実施態様において、汎エピトープ１抗体である、単一の単離された抗体又はフラグメントは、少なくとも６種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列と結合する。さらなる実施態様は、少なくとも７種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列と結合することができる、単一の単離された抗体又はそのフラグメントを含む。この用語はまた、少なくとも８種類の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列と結合することができる、単一の単離された抗体又はそのフラグメントを指す。この用語はまた、追加の可変部位Ｚ12又はあらゆる側方のアミノ酸を考慮すれば、少なくとも９種類以上の変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列と結合することができる、単一の単離された抗体又はそのフラグメントを指す。尚さらなる実施態様において、以下の実施例に明示されるように、汎エピトープ１抗体は、各々の変異配列に対して１．０×１０-9以下のＫDを有する。
【００２６】
１つの実施態様において、以下の実施例中に詳細に示されるように、単一の選択された汎エピトープ１抗体は、前述の（ａ）〜（ｈ）の８種類の配列により表される、２〜８種類までの変異体ＨＩＶ−１エピトープ１配列と結合する。
【００２７】
したがって、或る単一の単離された汎エピトープ１抗体又はフラグメントは、変異配列（ａ）〜（ｈ）のうちの少なくとも２種類と結合する。本発明の別の単一の単離された抗体又はフラグメントは、前記の異なる変異配列の２〜４種類と結合する。そのような単一の単離された汎エピトープ１抗体又はフラグメントの或る特定の実施態様は、前記の変異配列（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１種類、及び前記の変異配列（ｅ）〜（ｈ）のうちの少なくとも１種類と結合する。さらに他の単一の単離された汎エピトープ１抗体又はフラグメントは、変異配列（ａ）〜（ｈ）のうちのあらゆる５種類〜全８種類と結合する。以下に例示されるように、或る特定のクローンから産生される汎エピトープ１抗体は、エピトープ１（ａ）〜（ｄ）及び（ｈ）の５種類の変異体に結合する。この特定の抗体を、本明細書を通じて汎エピトープ抗体＃５と呼ぶ。
【００２８】
しかしながら、上述のように、汎エピトープ１抗体の他の例は、Ｚ12アミノ酸を含有するか、又は、上記の（ａ）〜（ｈ）によって表される配列と相同で、その中の少なくとも１つの非可変アミノ酸が不自然なアミノ酸である配列を含有する、他のエピトープ１配列と結合するかもしれない。
【００２９】
したがって、本発明の単一の汎エピトープ抗体又はフラグメントは、複数の株及びサブタイプ由来のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質に結合する。１つの実施態様において、単一の汎エピトープ抗体又はフラグメントは、Ｂ及び非Ｂクレードに由来する株及びサブタイプを含む既知のＨＩＶ−１株及びサブタイプの９５％以上と結合する。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、２本の軽鎖及び２本の重鎖を有する無傷の免疫グロブリンを指す。したがって、単一の単離された抗体又はフラグメントは、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であり得る。用語「抗体フラグメント」は、無傷な抗体未満の構造を指し、単離された１本の抗体鎖、Ｆｖ構築体、Ｆａｂ構築体、Ｆｃ構築体、軽鎖の可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）配列等を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
そのような汎エピトープ１抗体又はフラグメントは、以下の実施例中に記述されるような順次的な選択及びスクリーニング技術を用いて、又は他の合成若しくは組換え技術を用いて産生される。上述のように、本発明の単一の単離された汎エピトープ１抗体又はフラグメントは、抗体又は抗体フラグメントのライブラリーからの連続的で順次的な選択及びスクリーニングを含む方法によって作製することができる。例えば、選択には、各々の１本鎖ヒトＦｖライブラリーを、合成エピトープ１ペプチド及び／又は組換えＴａｔタンパク質と接触させること、そして変異体Ｔａｔエピトープ１配列をライブラリーに提示することが含まれる。例えば、変異配列を含有するビオチン化ペプチドのような、第１のエピトープ１変異体アミノ酸配列と結合する配列として、１本鎖抗体可変配列（ｓｃＦｖ）のライブラリーが選択される。この第１配列と結合するｓｃＦｖの混合物が得られ、そして結合しないｓｃＦｖはライブラリーから廃棄される。結果として得られた選択されたｓｃＦｖ混合物を、次に再び連続的且つ順次的に、望む限り多くの異なるエピトープ１配列と接触させ、そして非結合ｓｃＦｖを逐次的に廃棄して、複数のエピトープ１変異体、例えば２から、３、４、５、６、７若しくは８以上の異なるエピトープ１配列と結合するｓｃＦｖの混合物が結果として得られる。望ましい数のエピトープ１変異体に結合する、結果として得られたｓｃＦｖは、次に、選択されたｓｃＦｖの供給源を提供するため操作されクローン化される。例えば、ｓｃＦｖは望ましい抗体又はフラグメントの形で提示するために操作される。
【００３２】
その後、各クローンは、異なるＨＩＶ−１株及びサブタイプ由来の異なるＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１変異体との反応性を決定するために、スクリーニングされる。スクリーニングは、選択された複数の変異配列（例えば２、３、４、５、６、７若しくは８以上の配列番号５のエピトープ１変異配列）に対して必要な結合を示す抗体又は抗体フラグメント若しくは構築体が得られるまで、拡大される。
【００３３】
汎エピトープ１抗体は、複数のエピトープ１変異体への結合を媒介することができるｓｃＦｖ由来の可変領域を含有していなければならない。しかしながら、定常領域は従来の方法によって変更できる。例えば、各汎エピトープ１  ｓｃＦｖの可変領域は、ヒトＩｇＧ１骨格のような定常領域骨格中に挿入することができる。そのような抗体は、以下の実施例１に記述されている。したがって、結果として得られた汎エピトープ１抗体は、ヒト又は非ヒト供給源（例えばサル等）由来の重鎖と連結されたヒト軽鎖可変領域を含有するキメラ抗体、又はヒトＩｇＧ抗体骨格を用いたヒト化抗体、又は抗体フラグメントであり得る。適切な抗体骨格の選択及び汎エピトープ１  ｓｃＦｖの挿入は、当業界の技術の範囲内であり、本明細書及び免疫学の従来の教示により提供される。
【００３４】
本明細書の教示によれば、当業者は本明細書中に記述されるあらゆる異なる汎エピトープ１抗体を産生することができるであろう。
本発明の医薬組成物及び方法
したがって、本発明の別の側面は、汎エピトープ１抗体又はフラグメント及び医薬的に許容し得る担体を含有する、ＨＩＶ−１の治療に有用な医薬組成物である。そのような医薬組成物は、好ましくは、エピトープ１式の８種類のＸ7／Ｙ9変異体と結合する、単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有し得る。別の医薬組成物は、エピトープ１の５種類以上のＸ7／Ｙ9変異体と結合する、単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有し得る。さらに別の医薬組成物は、エピトープ１の２〜７種類のＸ7／Ｙ9変異体と結合する、単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有し得る。さらに別の組成物は、エピトープ１の９種類以上のＸ7／Ｙ9／Ｚ12変異体と結合する、単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有することができる。
【００３５】
医薬組成物のさらなる実施態様は、２種類以上の異なる本発明の汎エピトープ１抗体（例えば、各々が複数の異なる変異体に結合する２又は３種類の抗体）を含有し得る。例えば、或る組成物中の１つの汎エピトープ１抗体はＹ9がＧｌｕであるエピトープ１変異体のみに結合し、そしてこの組成物中の第２のエピトープ１抗体はＹ9がＡｓｐである変異体のみに結合し得る。様々なそのような組み合わせは、本開示により当業者には容易に作製できるであろう。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、他のＨＩＶ−１エピトープ、例えば既に同定されたＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ２に対する抗体も含有し得る。本明細書中で使用される用語「ＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ２」は、配列−Ｌｙｓ−Ｘ42−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（配列番号２）（式中、Ｘ42はＧｌｙ又はＡｌａである）を指す。したがって、１つの医薬組成物は、本発明の汎エピトープ１抗体を、エピトープ２内に位置するエピトープ配列に特異的に結合する抗体との組み合わせで含有し得る。
【００３７】
さらに、他のタンパク質及びＨＩＶ−１ウイルス上の免疫原性部位に対する他の抗体を容易に産生し、そして本発明の適切な医薬組成物中に組み合わせることができる。あるいは、本発明の組成物は、他のＨＩＶ−１抗ウイルス療法若しくは医薬投与計画と組み合わせて、又は順次に、使用し得る。
【００３８】
本明細書中に定義されるように、本発明の免疫原性タンパク質性組成物に使用するのに適切な医薬的に許容し得る担体は、当業者には周知である。そのような担体には、水、食塩水、緩衝食塩水、リン酸緩衝液、アルコール性／水性溶液、乳濁液又は懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。他に従来利用されている希釈剤、補助剤及び賦形剤も従来技術に従って添加し得る。そのような担体には、エタノール、ポリオール及びそれらの適切な混合物、植物油、並びに注射可能な有機エステルが含まれ得る。緩衝液及びｐＨ調節剤も利用し得る。緩衝液には、有機酸又は塩基から製造された塩が含まれるが、これに限定されない。代表的な緩衝液には、有機酸塩、例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、若しくはフタル酸の塩（例えばクエン酸塩）、トリス、トリメタンミン（trimethanmine）塩酸塩、又はリン酸緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。非経口担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は固定油が含まれ得る。静脈内担体には、液体及び栄養素補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルブドウ糖に基づく物等が含まれ得る。保存剤及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等も医薬担体中に提供され得る。本発明は担体の選択によって限定されない。上述の構成要素から、適当なｐＨ等張性、安定性及び他の従来の特徴を有するこれらの医薬的に許容し得る組成物を製造することは、当業界の技術の範囲内である。例えば、以下の文献を参照されたい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：薬学の科学と実践、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版社、２０００；及び医薬品添加物便覧、第４版、Ｒｏｗｅら編、ＡＰｈＡ出版社、２００３。
【００３９】
したがって、本発明は、ヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害する医薬の製造における汎エピトープ１抗体の使用を提供する。
本発明のそのような医薬組成物は、ＨＩＶ−１に曝されたヒト対象中のＨＩＶ−１複製を阻害する方法において有用である。本発明による組成物の適切な用量を、感染細胞から放出されるＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質と結合する有効量でヒト対象に投与する。１つの実施態様において、この医薬組成物は、ＨＩＶ−１感染したヒトに対し、ウイルス感染を治療又は制御するために、治療的に投与され得る。そのような感染者は、症候性又は無症候性であり得る。汎エピトープ１抗体は、感染した対象中での慢性ウイルス増殖を低減させ、そしてエイズへの進行を最小限にする。例えば、図１中に具体化されている阻害アッセイのインビトロの結果を参照されたい。
【００４０】
この方法は、感染細胞から他の感染又は非感染細胞へのＴａｔの移動を、汎エピトープ１抗体に阻止させることによって機能する。この作用は感染効率を低減させ、そしてＨＩＶ−１ウイルス増殖の突発を阻止し、それによりウイルスレベルを低下させる。既に感染した患者において、このウイルスレベルの低減方法は、慢性ウイルス血症及びエイズへの進行を低減させる。この方法は、組成物の慢性投与を含むことができる。この方法による治療が適する患者は、ＨＩＶ−１感染した患者で、疾病により免疫無防備状態になり、強い免疫応答を開始することができない患者である。ＨＩＶ感染の後期においては、疾病による免疫傷害のために、抗体の有効力価が発生する可能性はより低くなる。またこの方法による治療が適する患者は、ＨＩＶ−１感染した妊婦、感染した母の新生児、及びウイルスに曝されたと推定される未免疫患者（例えば、ＨＩＶ−１感染者が使用した針を不注意に「刺して」しまったヒト）である。
【００４１】
これらの汎エピトープ１抗体組成物は、ウイルス増殖を阻害し、ウイルス量を低下させるために受動的な免疫療法として投与される。ＨＩＶ−１由来の既知のＴａｔタンパク質の９５％以上又は９９％以上と反応する外来抗体は、患者中での、ウイルス感染細胞から他の感染又は非感染細胞へのＴａｔ移動を即時停止する。この方法によれば、患者は抗体組成物を用いて、長期の治療計画により慢性治療され得る。
【００４２】
本発明の別のユニークな側面は、汎エピトープ１抗体及びエピトープ２抗体の両方を感染患者に投与することを含む、ＨＩＶ−１複製を阻害するもう１つの方法により与えられる。そのような方法は、汎エピトープ１抗体及びエピトープ２抗体の組み合わせを単一の組成物として投与することを利用すると予想される。あるいは、各抗体を別個の組成物として、組み合わせて、又は順次に患者に投与してもよい。驚くべきことに、２つの抗体又は抗体フラグメントの組み合わせは相乗的な結果を生じる。この結果は、一緒に投与され使用されると、各抗体を別個に投与する時に使用される投与量よりも低い投与量の抗体が、望ましい治療結果（即ち、ウイルス血症の軽減）を達成するのに有用なことを示している。
【００４３】
これらの２つの試薬間の相乗効果は、阻害アッセイに例示されている。ＨＩＶ−１感染細胞培養におけるＨＩＶ−１  Ｔａｔレベルの阻害を見るためのインビトロの阻害アッセイ形式において、汎エピトープ１抗体及びエピトープ２抗体は、医薬組成物として単独で使用されると、類似したウイルス阻害結果を生じる。例えば図２を参照されたい。しかしながら、２つの抗体を一緒に投与すると、いずれかの抗Ｔａｔ抗体を単独で使用した時に与えられた相対的に同等の阻害よりも、予想外に、より強力なウイルスレベルの阻害が与えられる。図２に記述されるアッセイの結果を参照されたい。そのような汎エピトープ１抗体とエピトープ２抗体の相乗的活性は予期されていなかった。
【００４４】
上述の方法の各々において、本発明のこれらの組成物は適当な経路、例えば皮下、経口、粘膜、静脈、腹腔内、筋肉内、鼻、又は吸入経路によって投与される。現在好ましい投与経路は、皮下、静脈又は筋肉内である。
【００４５】
本発明の汎エピトープ１抗体の量は、各用量中の他の抗ＨＩＶ−１抗体の有無に関わらず、患者の年齢、体重、性別、全般的な身体条件等を考慮して選択される。重大な副作用を伴わず患者中で外因性効果を生じさせるのに必要とされる抗体の量は、利用される医薬組成物に依存して変化する。一般的に、感染患者においては、各用量は約５〜４００ｍｇ／ｍＬの汎エピトープ１抗体の無菌溶液である注入薬を包含するであろう。別の投与量は約２００ｍｇの抗体である。さらに別の投与量は約１００ｍｇの抗体である。さらに別の実施態様は抗体約５０ｍｇの投与量である。さらなる実施態様は、抗体約１０ｍｇの投与量である。１つの実施態様において、一緒に用いられるとき、汎エピトープ１抗体及びエピトープ２抗体の投与量は上記と同じである。別の実施態様においては、２つの抗体間の相乗効果のため、各抗体単独の１回投与量の合計よりも、組み合わせ投与量は低い。
【００４６】
慢性投与の頻度は、毎日投与〜週に１回又は２回〜月に１回までの範囲に及ぶことがあり、抗体の半減期（例えば、約７〜２１日）に依存し得る。しかしながら、そのような感染患者の慢性治療の持続期間は不確定だが長期であると予想される。他の投与量範囲も当業者により熟慮されるであろうし、特に、抗体組成物の投与が他の抗ウイルス治療と組み合わせて又は順次に行われる場合は、熟慮されるであろう。
【００４７】
本発明の組成物は、針刺し又は母子感染のため急性感染の危険性をもつ対象の慢性治療に利用することができる。本発明の抗体組成物は、感染患者、又は進行したＨＩＶの患者の慢性治療にも利用することができる。
【００４８】
本発明の診断試薬、キット及びアッセイ
本発明のさらなる実施態様として、本発明の汎エピトープ１抗体又はフラグメントは、診断アッセイ試薬として有用であり、検出可能な標識若しくは標識系と共に用いてもよく、又は基質上に固定化されてもよく、又は固定化を媒介する別の薬剤と連結されていてもよい。
【００４９】
そのような診断試薬は、エピトープ１式の８種類のＸ7／Ｙ9変異体と結合する単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有し得る。別の診断試薬は、エピトープ１の５種類以上のＸ7／Ｙ9変異体と結合する単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有し得る。さらに別の診断試薬は、エピトープ１の２〜８種類のＸ7／Ｙ9変異体と結合する単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有し得る。さらに別の診断試薬は、エピトープ１の９種類以上のＸ7／Ｙ9／Ｚ12変異体と結合する単一の汎エピトープ１抗体又はフラグメントを含有することができる。
【００５０】
本発明のさらに別の実施態様は、本発明の診断キットを含み、このキットは本発明の単一の汎エピトープ１抗体、又は本発明のいくつかの異なる汎エピトープ１抗体を含有し得る。例えば、試薬中の１つの汎エピトープ１抗体はＹ9がＧｌｕであるエピトープ１変異体のみに結合し、そして試薬中の第２のエピトープ１抗体はＹ9がＡｓｐである変異体のみに結合する。様々なそのような組み合わせは、本開示により当業者に容易に作製されるであろう。そのような診断又はアッセイキットは、他のＨＩＶ−１エピトープ又は非Ｔａｔタンパク質に対する抗体も含有し得る。
【００５１】
そのようなキット及び試薬は、ＨＩＶ−１感染した又はＨＩＶ−１感染した可能性のある対象中の、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−１  Ｔａｔの力価の測定並びに検出に有用である。抗体は、適切な基質、例えばアビジンコーティングされた固体支持体（例えばプレート、スティック又はビーズ）上に固定化され得る。もちろん、診断アッセイ分野で既知の他の結合剤も、同じ目的のために利用し得る。
【００５２】
キット中には、抗体のＨＩＶ−１  Ｔａｔへの結合を検出する試薬、例えば非ヒト抗体（例えばヤギ抗ヒト免疫グロブリン等）も提供される。他の試薬は従来の診断標識又は標識系を含む。例えば、抗体は、直接的又は間接的に以下のものにより標識され得る：例えば、放射性化合物、放射性同位体（例えば32Ｐ、125Ｉ、テクニシウム）；蛍光又は化学発光化合物（例えばＦＩＴＣ、ローダミン又はルシフェリン）；及びタンパク質、例えばビオチン、又は酵素及び酵素補助因子（例えばアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ）；及び／又は分子標識（例えばＦＬＡＧ等）。例えば、Ｃｈｕｂｅｔ  ＲＧ，Ｂｒｉｚｚａｒｄ  ＢＬ．１９９６  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（１）：１３６−１４１；及びＫｎａｐｐｉｋ  Ａ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．１９９４  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９４；１７（４）：７５４−７６１を参照されたい。標識系の他の要素には、標識系（例えば、ストレプトアビジン及び西洋わさびペルオキシダーゼ系）の他の構成要素との相互作用によってシグナルを発生させるために有用な基質が含まれる。抗体を別個に検出部分と抱合させる、当業界で既知のあらゆる方法を利用することができ、それには、Ｈｕｎｔｅｒら，１９６２  Ｎａｔｕｒｅ  １３３：９４５；Ｐａｉｎら  １９８１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍｅｔｈ．４０：２１９及び他の従来の文献に記述される方法が含まれる。
【００５３】
あるいは、標識は抗体から離れて使用されてもよい。その場合キットは、種々の試薬及び標識を読み取る装置（例えば、酵素標識と相互作用して色のシグナルを発生する或る種の基質等）、血液試料を扱うための装置、並びに適当なバイアル及び他の診断アッセイ構成要素も含有する。
【００５４】
本発明の抗体は、あらゆる既知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイ中で利用し得る。例えば、Ｚｏｌａ，モノクローナル抗体：技術マニュアル、ｐｐ１４７−１５８（ＣＲＣ出版社、１９８７）、及び様々なアッセイプロトコルのための他の従来のアッセイ文献を参照されたい。１つの実施態様として、患者中のＨＩＶ−１  Ｔａｔレベルの検出に使用されるキットは、以下のものを含有し得る：１以上の汎エピトープ１抗体又はフラグメント；１以上の所望による追加の抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体であって、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ上の、エピトープ１配列とは異なるエピトープに結合する抗体；及びこれらの抗体の結合を同定するための、１以上の検出可能な標識若しくは標識系。このキットのための、他の従来の診断構成成分は、当業者により容易に選択されるであろう。
【００５５】
別の実施態様において、患者中のＨＩＶ−１  Ｔａｔレベルの検出に使用されるキットは、単一の汎エピトープ１抗体若しくはフラグメント、又は代わりに複数の汎エピトープ１抗体及びフラグメント、並びにこれらの抗体の結合を同定するための１以上の検出可能な標識若しくは標識系を含有する。そのようなキットは競合アッセイの実用に用いるのに適する。
【００５６】
そのようなキット及び試薬は、患者中のＨＩＶ−１力価を評価するための様々なアッセイ形式中で利用し得る。そのような患者は、非感染か、感染しているか、又は本発明の医薬組成物を用いた治療若しくは他の抗ＨＩＶ−１薬物療法を受けていてもよい。
【００５７】
本発明の１つの実施態様において、汎エピトープ１抗体はさらに、競合アッセイの使用を可能にする。この実施態様において、対象中のＨＩＶ−１  Ｔａｔレベルを測定する診断アッセイは、既知量のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質が固定化されている基質を、未知量のＨＩＶ−１  Ｔａｔを含有する対象由来の生物試料、及び検出可能な標識と連結された本発明の単一の単離された汎エピトープ１抗体又はフラグメントと接触させることを含む。汎エピトープ１抗体又はフラグメントは、基質上に結合した既知量のＴａｔに対して飽和量以下で存在する。基質を洗い流し、そして前記基質に結合した汎エピトープ抗体又はフラグメントの量を測定する。
【００５８】
結合した汎エピトープ１抗体の量は、前記試料の非存在下で、様々な既知量の同じ汎エピトープ１抗体又はフラグメントの、前記既知量の結合Ｔａｔに対する結合を測定した標準結合曲線と比較される。したがって、前記試料中のＴａｔ量は、前記基質に対する前記抗体の結合量との逆相関によって示される。
【００５９】
汎エピトープ１抗体又はフラグメントを利用するこの競合アッセイは、２〜８、即ち、２、３、４、５、６、７、又は８種類、又はさらに多数のエピトープ１変異配列に結合し、そしてシンプルでより効率的なアッセイを可能にする。本発明の単独試薬アッセイは、複数の試薬及び複数のアッセイを必要とせずに、複数の株及びサブタイプのＨＩＶ−１感染の検出を可能にする。
【００６０】
例えば、ＨＩＶ−１  Ｔａｔレベルを測定する診断アッセイの別の実施態様は、対象由来の生物材料（例えば、体液、好ましくは血液、血清又は血漿、しかし尿、唾液及び他の液体又は組織でも可）を、試料中のＨＩＶ−１  Ｔａｔと結合する固定化された「捕獲」抗体と接触させることを含む。固定化される捕獲抗体は、汎エピトープ１抗体、又はエピトープ１とは異なるＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープと結合する抗体のいずれでもよい。
【００６１】
固定化は、捕獲抗体を、プレート、ストリップ又はビーズのような固体支持体に結合させることにより与えられる。生物試料を固定化抗体に充分な時間曝してから、支持体を洗浄して、生物試料由来の、ペプチドに結合しないあらゆる成分を除去する。そのような洗浄工程は診断アッセイでは慣例であり、従来の緩衝液を用いて実施される。
【００６２】
もし試料中にＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質が存在すると、そのＴａｔは結合した捕獲抗体に結合することにより固定化されるであろう。その後、結合した成分は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔに対する第２の「検出」抗体と接触させられる。検出抗体は、捕獲抗体と異なる抗体であれば、汎エピトープ１抗体若しくはエピトープ１とは異なるＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープと結合する抗体、又は異種の非ヒト抗体でもよい。検出抗体は、結合したＨＩＶ−１  Ｔａｔ上の、捕獲抗体とは異なるエピトープに結合し、そしてそのため固体支持体上の捕獲抗体と生物試料中のＨＩＶ−１  Ｔａｔの間の結合の検出を可能にする。
【００６３】
第２の検出抗体は、検出可能な標識、又は検出可能なシグナルを発生できる構成要素によって標識することができ、例えば、ビオチン化されるか、又は抗体がＦＬＡＧのような分子タグを含有してもよい。あるいは、標識は抗体の一部でなくともよい。適切な標識は、以上で検討されたように、従来利用されている診断標識の幅広い系列から選択される。１つの実施態様において、標識は酵素でもよく、この酵素は基質と接触すると検出可能な色又は化学発光シグナルを発生する。この色の存在及び／若しくは強度、又は化学発光が、試料中のＴａｔ量の証拠を与える。
【００６４】
本発明の抗体を利用するあらゆる従来のアッセイは、疾病の初期診断はもちろん、治療処置の有効性を決定するために利用され得る。
以下の実施例は、本発明の組成物及び方法の或る種の実施態様を説明する。これらの実施例は請求項及び明細書の開示を限定するものではない。
【実施例１】
【００６５】
汎エピトープ１抗体ＩｇＧを産生するための選択及びスクリーニング工程
Ａ．  ペプチド
以下の実施例全体にわたって、アミノ酸は周知の１文字コードで表される。以下の実施例で使用されるペプチドは、下記の表１に同定される。これらのペプチドは、ビオチン−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号１１）をＮ末端に付加して合成された。このＮ末端配列は、問題のペプチド配列が、アビジンのビオチン結合ポケットの外に確実に出るようにするためのスペーサーとして働く。見本のペプチド配列の一部における典型的なＺ12部位でのＳｅｒの存在も、スペーサーとして提供されており、Ｚ12部位の置換である。
【００６６】
エピトープ１のＸ7及びＹ9可変部位におけるアミノ酸残基を、表中太字で示す。
【００６７】
【表１】
2008535783.tif 000002
【００６８】
*本明細書で使用される、短いビオチン化ペプチド及び長い（「ａｌｔ」）ビオチン化ペプチドは、両方とも同じ結果を与える。したがって、長いペプチド上の追加のアミノ酸は些細な相異であり、それらのエピトープ配列の抗体結合機能に影響を及ぼさなかった。
【００６９】
Ｂ．  ｓｃＦｖの選択
クローンは、ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）Ｌｉｂ−２０００１本鎖フラグメント（ＳｃＦｖ）ライブラリー（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、スウェーデン）から選択された。選択されたｓｃＦｖは、以下のように、変異体エピトープ１配列を提示するペプチドに対して、及びＴａｔタンパク質全体に対して、スクリーニングされた。
【００７０】
工程１において、ビオチン化ペプチドＥ１−ＲＥ（ａｌｔ）が、ストレプトアビジンコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄ基質（Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．、オスロ、ノルウェー）を用いて捕獲された。本質的にはＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ａ．Ｄ．ら  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９４，１３，３２４５−３２６０及びＨａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２２６，８８９−８９６に記述される通りである。これらの公表されている手順を、Ｅｎｇｂｅｒｇ  Ｊ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，１９９６，６，２８７−３１０に記述されるように、結合ファージをトリプシンで溶出することにより改変した。
【００７１】
工程２は、Ｅ１−ＮＥ（ａｌｔ）、Ｅ１−ＫＥ（ａｌｔ）及びＥ１−ＳＥ（ａｌｔ）と呼ばれるビオチン化ペプチドの混合物を用いて実施した。ペプチド濃度は、工程１及び２において１〜５×１０-8Ｍの範囲であった。工程３においては、４×１０-8Ｍの完全なＴａｔタンパク質（アミノ酸１〜８６、Ｘｅｐｔａｇｅｎ、イタリア）をマイクロタイタープレートに固定化し、そしてトリプシン溶出後の固相選択に使用した。使用されたファージ量は、第１、第２及び第３選択のそれぞれにおいて、９．４×１０12、３．４×１０11及び１．４×１０12ｐｆｕであった。
【００７２】
工程１及び２の後、ファージミドを増幅するため、大腸菌ＨＢ１０１Ｆ’細胞をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中でＯＤ600  ０．５まで生育し、そして＋３７℃で３０分間、溶出されたファージに感染させた。次に、＋３０℃、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する５００ｃｍ2  ＬＢ−寒天プレート上で一晩インキュベーションを続けた。コロニーをＬＢ培地に再懸濁させ、そして＋３７℃でＯＤ600  ０．５に達するまで生育した。コロニーを６×１０9ｐｆｕのＲ４０８／ｍｌヘルパーファージに３０分間感染させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１００μＭになるように添加し、そして＋２５℃で一晩インキュベーションを続けた。工程３の後、ファージミドＤＮＡ作製のため、結果として得られたファージを上記のように感染させ、そして１．５時間生育して培地交換した（ＬＢ＋１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋０．１％グルコース）。生育は＋３０℃で一晩続け、そしてプラスミドミニプレップキット（バイオラッド、７３２−６１００）を用いてミニプレップを実施した。
【００７３】
Ｃ．  ｓｃＦｖのスクリーニング
可溶性ｓｃＦｖを発現させるため、遺伝子ＩＩＩコード領域を制限酵素消化により除去し、そして結果として得られたベクターをＴｏｐ１０細菌中へ形質転換させた。発現したｓｃＦｖクローンを、標的（選択工程１及び２で使用された標的ペプチドと対照抗原Ｅ２−ＢＩＯの混合物、β−ＦＬＡＧ検出使用（ＳＩＧＭＡ，Ａ−９４６９））に対する化学発光ＥＬＩＳＡで試験した。同じエピトープ１変異配列（即ち、同じＸ及びＹ変異体）を含有する短いペプチドと長い（ａｌｔ）ペプチドの各セットのように、短いペプチドと長い（ａｌｔ）ペプチドを用いたスクリーニングが同じ結果を生じたことは、着目するべきである。
【００７４】
４２７１個のうち全体で５９０個のクローンが第１スクリーニングで陽性であり、即ち、それらのクローンは標的Ｅ１−ＮＥ（ａｌｔ）に反応した。陽性のクローンは４種類の個々のペプチド全て、Ｔａｔタンパク質（Ｘｅｐｔａｇｅｎ、イタリア）、及び対照抗原（Ｅ２−ＢＩＯ及びＢＳＡ−オキサゾロン）に対する第２次スクリーニングで再試験された。試験された全てのクローンのうち、３２２個が、４種類の特異的ペプチド：Ｅ１−ＲＥ（ａｌｔ）、Ｅ１−ＫＥ（ａｌｔ）、Ｅ１−ＳＥ（ａｌｔ）、及びＥ１−ＮＥ（ａｌｔ）の全て、並びにＴａｔタンパク質に対して陽性で、且つ対照に対しては陰性であった。これらのうち２８８個のクローンをさらに配列決定により分析した。全体として、２６個のクローンが、明瞭な反応性パターン及び超可変領域配列を持つことが見出され、そしてｓｃＦｖとして大量に発現された。
【００７５】
このスクリーニング工程の結果、１〜４種類の配列変異体並びに完全なＴａｔタンパク質を認識するｓｃＦｖが得られた。全４種類の変異体だけでなくＴａｔタンパク質も認識するクローンだけが、次の工程に進み、そして第５変異体Ｅ１−ＮＤに対して試験された。
【００７６】
親和性分析が、固定化されたビオチン化ペプチド、即ちＥ１−ＲＥ（ａｌｔ）、Ｅ１−ＳＥ（ａｌｔ）、Ｅ１−ＫＥ（ａｌｔ）、Ｅ１−ＮＥ（ａｌｔ）及びＥ１−ＮＤを用いて実施された。試験されたクローンのうちの数個が５種類の変異体全てを認識することができた。１、２、３、４、又は５種類の配列変異体を認識するクローンの例を表２にリストする。
【００７７】
【表２】
2008535783.tif 000003
【００７８】
これらのＥＬＩＳＡの結果に基づき、固定化したエピトープ１含有Ｔａｔタンパク質／ペプチドと遊離Ｔａｔタンパク質に結合する８個のクローンが見つかった。これらのクローンを大量発現させ、そしてＮｉ−ＮＴＡセファロースで精製して、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイでさらに分析した（データ計算にはＢＩＡ評価３．２及びモデル１：１ラングミュア結合を使用した；Ｂｉａｃｏｒｅマニュアルを参照されたい）。
【００７９】
８個のクローンのうち、２個のクローン（汎エピトープ１＃５及び汎エピトープ１＃６と呼ぶ）が、５種類のエピトープ１ペプチドの全てと高い親和性で結合した。表３を参照されたい。
【００８０】
【表３】
2008535783.tif 000004
【００８１】
Ｄ．  完全なＩｇＧ1抗体への変換
汎エピトープ１＃５及び汎エピトープ１＃６のクローンを完全なＩｇＧ1抗体へと変換した。汎エピトープ１＃５及び汎エピトープ１＃６のｓｃＦｖから、ＶＨ及びＶＬ遺伝子をＰＣＲ増幅した。産生したＰＣＲフラグメントを制限酵素消化し、そしてｐｃＤＮＡ３から改変された専有の発現ベクター中へ連結した。この発現ベクターは、ＰＣＲ増幅ＶＨ遺伝子挿入のためのγ１ゲノム定常領域（ＮＣＢＩデータベース受託番号Ｚ１７３７０）、又はＰＣＲ増幅ＶＬ遺伝子挿入のためのλゲノム定常領域（ＮＣＢＩデータベース受託番号Ｘ０６８７５）を含有する。
【００８２】
結果として得られた重鎖及び軽鎖構築体を、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄプラスミドメガキット（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号Ｋ３００４−１）を用いて大量産生させた。プラスミドＤＮＡをＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−４００  ＨＲカラム（アマシャム・バイオサイエンス、カタログ番号２７−５２４０−０１）を利用してスピン精製し、そしてＣＯＳ−７緑色サル細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５１）に一過性に形質移入するために使用した。
【００８３】
ＣＯＳ−７細胞を３７℃、５％ＣＯ2で、Ｄ−ＭＥＭ（インビトロジェン、カタログ番号３１９６６−０２１）中で培養し、そして１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン、カタログ番号２６１４０−０７９）及び１×非必須アミノ酸（インビトロジェン、カタログ番号１１１４０−０３５）を補充した。形質移入は、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン、カタログ番号１１６６８−０１９）を使用し、製造者のプロトコルに従って実施した。形質移入の２０時間後、細胞培養液をＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン、カタログ番号３１９６６−０２１）で置換し、そして１０％Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（インビトロジェン、カタログ番号１６２５０−０７８）及び１×非必須アミノ酸（インビトロジェン、カタログ番号１１１４０−０３５）を補充した。５日間のインキュベーション期間の後、細胞培養液を収集し、そして完全なＩｇＧ分子を回収した。
【００８４】
Ｅ．  ＩｇＧのスクリーニング
ＣＯＳ−７細胞中に一過性発現されている変換ＩｇＧ1分子をプロテインＡカラムで精製した。精製された成分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点電気泳動、用量応答ＥＬＩＳＡ及びＬＡＬ−テストにより、さらに特徴づけした。初期試験においては、許容し得るレベルで発現したのは１つのＩｇＧ1汎エピトープ１抗体のみであった。第２のＩｇＧ1汎エピトープ１抗体＃６はそれ以上分析しなかった。このＩｇＧ1汎エピトープ１抗体の可変領域Ｈ１を配列決定し、そしてＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号４１）と見出された。
【００８５】
ＩｇＧ1汎エピトープ１抗体＃５と、エピトープ１ペプチド又はＴａｔタンパク質全体との親和性決定は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて実施した。８種類の特異的なビオチン化ペプチドと対照ペプチドをストレプトアビジンチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡ−ｃｈｉｐ、ＢＲ−１０００−３２）に固定化した。ペプチドは固定化され、且つＩｇＧは２価であるため、以下の表４Ａ〜４Ｂ及び５に報告される見かけの速度定数は、部分的にアビディティーの結果であり得る。チップマトリクス又は無関係のペプチドに対するバックグラウンド結合は検出されなかった。表４Ａ〜４Ｂ及び５を参照されたい。ＡＴＧ、ＵＳＡ含有アミノ酸１〜８６により発現された組換えＴａｔタンパク質を使用した。その配列は、１箇所の例外、即ち残基４２のアミノ酸アラニンがグリシンで置換されていること以外は、表１にリストされた物と相同である。
【００８６】
【表４】
2008535783.tif 000005
【００８７】
【表５】
2008535783.tif 000006
【実施例２】
【００８８】
機能のインビトロ研究
ＩｇＧ1汎エピトープ１抗体＃５のＨＩＶ−１複製を阻害する能力は、カロリンスカ研究所（ストックホルム、スウェーデン）で実施された一連の実験により試験された。この実験は、ＨＩＶ−１株ＩＩＩＢに感染したジャーカット細胞に基づいており、この細胞中で、ウイルスの複製が、ＨＩＶ−１  ｇａｐタンパク質ｐ２４に対するＥＬＩＳＡによってモニターされた（Ｒｅら，１９９５  Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，１０，４０８−４１６）。
【００８９】
ウイルス感染手順において、指数関数的に生育中のジャーカット細胞に、ウイルス接種液を１時間、＋３７℃で感染させ、それから細胞を洗浄し、そして培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地：Ｇｌｕｔａｍａｘ試薬、１０％ＦＣＳ、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）に再懸濁した。感染細胞と非感染細胞を様々な濃度で混合した。同時に、抗Ｔａｔ  ＩｇＧ1又は対照の抗ＦＩＴＣ（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら，２０００  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８（８）：８５２−８５６）を、増加濃度で培養液に添加した。この培養液を＋３７℃、５％ＣＯ2中でインキュベートした。
【００９０】
３〜４日後、この培養液を分割し、そして新鮮な培地と抗体を再び与えた。ウイルスレベルは、ｐ２４検出ＥＬＩＳＡにより、感染後７日目に決定した。
図１及び２は、このアッセイからの支持データを与える。図１は、１％の初期感染細胞を用いて実施した実験を示す。１％及び３％の初期感染細胞を用いて実施した阻害実験から計算されたＩｇＧ1汎エピトープ１抗体＃５のＩＣ50値は、それぞれ、０．１４μｇ／ｍｌ及び０．４４μｇ／ｍｌであった。したがって、図１は、本発明の汎エピトープ１抗体による、用量相関したＨＩＶ−１複製の阻害を明示する。図２は、汎エピトープ１抗体及びＴａｔエピトープ２に対する抗体を単独で使用すると、同様の用量相関阻害曲線を示すことを明示する。この２つの抗体を組み合わせて使用すると、相乗的な応答が発生する。２つの抗体の組み合わせは、驚くべきことに、いずれかの抗体を単独で使用したときに生じたよりも１０倍も強力なウイルスレベルの阻害を生じた。これは、汎エピトープ１抗体を抗エピトープ２抗体と共に使用することによる、予期しなかった、しかし追加の貴重なＨＩＶ−１ウイルスレベルの阻害のための治療組成物及び方法を示している。
【実施例３】
【００９１】
Ｔａｔレベルを測定するためのアッセイ
競合アッセイ形式に従い、単一の汎エピトープ１抗体、好ましくは、検出可能な標識で標識されている汎エピトープ１抗体を利用する。アッセイを実施する前に、プレートをＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質でコーティングする。最適以下又は飽和以下に希釈した汎エピトープ１抗体、及び既知量のＨＩＶ−１  Ｔａｔを含有する血漿試料をプレートに添加する。プレート上のＴａｔへの汎エピトープ１抗体結合について、標準結合曲線を測定する。血漿試料中のＨＩＶ−１  Ｔａｔが多いほど、汎エピトープ１抗体の結合は少なくなる。
【００９２】
図３は、そのようなアッセイの結果を説明している。２００ｎｇ／ｍｌ  Ｔａｔでコーティングしたプレートを、増加量のＨＩＶ−１  Ｔａｔ及び最適以下の１０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識汎エピトープ１抗体を含有する患者の緩衝液試料と接触させた。汎エピトープ１抗体への結合の競合が、コーティングされたプレート上に結合したＨＩＶ−１  Ｔａｔ配列と、試料中のＨＩＶ−１  Ｔａｔ配列との間で起こる。
【００９３】
試料中のＴａｔ量が増加すると、汎エピトープ１抗体のプレートへの結合量が減少した。結合は、ストレプトアビジンと結合した抗ヒトＩｇＧの添加により検出した。このＩｇＧは汎エピトープ１抗体と結合した。プレートを洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼをプレートに添加すると、結合した汎エピトープ１抗体量に比例する検出可能なシグナルが発生した。プレートに結合した試料中の汎エピトープ１抗体量を測定し、そして標準結合曲線と比較することにより、試料中のＨＩＶ−１  Ｔａｔ量が計算された。以上に詳述したように、このアッセイにおいて他のシグナル発生標識を利用してもよいこと、そしてシグナル発生系の選択はこのアッセイにおける限界ではないことは、当業者に明らかである。
【００９４】
図４は、組換えＴａｔのヒト血漿中における競合アッセイより得られた用量応答曲線であり、このアッセイは上記と同様にして５０％血漿中で行った。典型的な用量応答曲線が得られ、汎エピトープ１抗体の試料中Ｔａｔへの結合は血漿によって干渉されないことが示された。このアッセイは、患者血漿Ｔａｔレベルの測定を可能にした。
【００９５】
組換えＴａｔ及びエピトープ１変異体ペプチドについて比較の用量応答曲線を得るため、緩衝液中での同様のアッセイを行った。結果は図５のグラフに明示される。試験されたペプチドは、Ｅ１−ＲＥ、Ｅ１−ＮＥ、Ｅ１−ＳＥ、Ｅ１−ＫＥ、Ｅ１−ＮＤ及び全長のＴａｔであった。全ての曲線が同様であり、全ての変異体が同様の結果を与えることを示している。
【００９６】
最終的に、上述のような一連の競合アッセイを３つのＨＩＶ−１感染ヒト対象で実施した。図６Ａ及び６Ｂに表されるように、対象は数字及び記号で識別した：即ち、対象Ａ（●）、対象Ｂ（□）、対象Ｃ（◆）。汎エピトープ抗体Ｅ９を使用する本発明の競合アッセイは、感染血漿中のＲＮＡ検出後数日にわたって、Ｔａｔ  ＲＮＡレベル及びウイルス力価を同定するのに有用であることが示された。これらのデータは、単一の汎エピトープ１抗体を使用する本発明の競合アッセイが臨床試料中のＴａｔレベルを検出できること、つまり感染された対象中のＴａｔにコードされるタンパク質を検出することによりＨＩＶ−１感染を確認できることを明示している。
【００９７】
以上に実施例で明示され、またデータ報告されたように、競合アッセイ形式の１つの利点は、アッセイ中に利用される試薬（抗体）の数を減らせることである。汎エピトープ１抗体を、配列番号５の複数の配列に対するモノクローナル抗体の混合物の代わりに使用し、単独のアッセイでＨＩＶ−１  Ｔａｔの複数の株及びサブタイプの検出を達成する。
【実施例４】
【００９８】
Ｔａｔバイオアッセイ及びＩｇＧ1汎エピトープ１抗体＃５による阻害
正常なヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）はＨＩＶ−１の複製を維持しないが、インビトロでマイトジェン又はＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質により活性化されるとＨＩＶ−１複製に許容的にさせられる（Ｌｉ  ＣＪら  １９９７  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：８１１６−１８２０）。さらに、Ｌｉらは、Ｔａｔに誘導された許容性を、Ｔａｔに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体によって阻害できることを明示した。このアプローチを使用して、ヒトＰＢＭＣ中のＴａｔ誘導によるＨＩＶ−１複製許容性をモノクローナル抗体（Ｍａｂ）で阻害するためのバイオアッセイを開発した。
【００９９】
ＰＢＭＣロット＃０３ＡＰ０４（Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）及び大腸菌で発現され逆相クロマトグラフィー（ＡＴＧ、Ｉｎｃ．）で精製された組換えＴａｔを実験に使用した。
【０１００】
１ウェル当たり１００μｌの細胞（５×１０6／ｍｌ）を使用し、そして１００μｌの、様々な濃度の単独のＴａｔ、又は様々な濃度のモノクローナル抗体と予めインキュベートした１０ｎｇ／ｍｌのＴａｔを細胞に添加し、そして５日間、３７℃、５〜６％ＣＯ2及び湿度８０〜９０％でインキュベートした。平底の９６ウェル組織培養プレートを使用した。
【０１０１】
５日後、ウェル中で培地をピペッティングして細胞をプレート表面から遊離させ、そして細胞をＶ底９６ウェルプレートに移して徹底的に洗浄した。精製ＨＩＶ−１ウイルスライセート（ＢＩＩＩ）（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐ．）の１／１０希釈液を１００μｌずつ各ウェルに添加し、そして４時間インキュベートした。これは、ウェル当たり、ＨＩＶ−１タンパク質ｐ２４の３５ｎｇ単位を表す。
【０１０２】
４時間後、細胞を徹底的に洗浄し、組織培養腋に再懸濁し、そしてさらに４〜５日間インキュベートした。終了時に細胞を４００×ｇで１０分間遠心し、そして上清を収集した。この上清を、Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ  ＲＥＴＲＯｔｅｋ（商標）ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡを使用し、製造者の推奨に従って、ＨＩＶ−１  ｐ２４についてアッセイした。
【０１０３】
Ｔａｔを含有しない（０  Ｔａｔ）対照については複製ウェルを１０個使用し、１０ｎｇ／ｍｌ  Ｔａｔを含有する分は複製ウェルを１０個使用した。他のウェルは全て５個ずつの複製とした。データはＰｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）プログラムに入力し、そして一元配置のＡＮＯＶＡにより統計的に分析し、その後多角的分析のための補正をして列間の差を分析した。
【０１０４】
結果を図７に表す。１０ｎｇ／ｍｌはＰＢＭＣをＨＩＶ−１複製に対して許容的にする（Ｐ＜０．００１）。この許容性は１μｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）及び１０μｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０１）のＩｇＧ１汎エピトープ１＃５抗体により阻害されるが、対照のＩｇＧ１抗体の１、１０又は５０μｇ／ｍｌでは阻害されない。
【０１０５】
したがって、汎エピトープ１抗体、即ち５種類のエピトープ１変異体に結合する単一の抗体の存在は、ヒトＰＢＭＣ中でＴａｔを阻害することによりＨＩＶ−１複製を阻害する能力を明示した。
【０１０６】
本発明の多数の改変及び変形が本明細書に含まれ、そしてそれらは当業者には明白であると予想される。本発明の組成物及び方法へのそのような改変及び変更は、本明細書に添付される特許請求の範囲内に包含されると信じる。以上にリスト又は参照された全ての文献は、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１感染（１％初期感染）ジャーカット細胞におけるＨＩＶ−１株ＩＩＩＢの複製の阻害をプロットしたグラフである。この細胞を、増加濃度（μｇ／ｍｌ）の本発明の汎エピトープ１  ＩｇＧ抗体（汎エピトープ１抗体、◆）に曝し、対照抗体（■）と比較した。汎エピトープ１  ＩｇＧ抗体はＨＩＶ−１  Ｔａｔエピトープ１の５種類の変異体と結合する。これら５種類の変異体は、ウイルスのＨＩＶ−１  Ｂ及び非Ｂ株の９５％以上に存在するであろう。ウイルスレベルは感染後７日目にＨＩＶ−１  ｐ２４タンパク質検出ＥＬＩＳＡによって決定した。データは、対照に対し、抗体濃度の増加に伴う阻害を示す。
【図２】図２は、図１と同じ汎エピトープ１  ＩｇＧ抗体（汎エピトープ１抗体；◆）、エピトープ２に結合するモノクローナル抗体（エピトープ２抗体；■）、両モノクローナル抗体を共に使用した場合（△）、及び対照抗体（Ｘ）について、投与量１０  ＴＣＩＤ５０で、図１のアッセイにおける阻害をプロットしたグラフである。結果として得られた曲線（△）は、汎エピトープ１抗体とエピトープ２抗体を両方使用すると、汎エピトープ１抗体（◆）又はエピトープ２抗体（■）単独で得られた結果と比較して、アッセイ操作における相乗効果を示す。
【図３】図３は、２００ｎｇ／ｍｌのＴａｔをプレート上にコーティングした、競合アッセイの結果を示すグラフである。増加量のＨＩＶ−１  Ｔａｔを緩衝液中に含有する試料と、コーティングされたＴａｔとが、１０ｎｇのビオチン標識された検出用汎エピトープ１抗体への結合を競合する。試料中のＴａｔ量が増加するにつれて、汎エピトープ１抗体のプレートへの結合量は減少する。結合は、ヤギ抗ヒト抗体ＩｇＧ−西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）試薬を使用して検出する（この試薬が、結合した汎エピトープ１抗体上のビオチンに結合する）。この抗体は図１で使用された物と同じである。
【図４】図４は、組換えＴａｔのヒト血漿中での競合アッセイにより得られた用量応答曲線であり、このアッセイは図３の記述と同様にして、５０％血漿中で行った。典型的な用量応答曲線が得られ、汎エピトープ１抗体の試料中Ｔａｔへの結合は、血漿によって干渉されないことが示された。この抗体は図１で使用された物と同じである。
【図５】図５は、組換えＴａｔ（ｒＴａｔ）及びＴａｔエピトープ１変異体に対応するペプチドについて、図３と同様のアッセイにおける、緩衝液中での、比較の用量応答曲線を示す。Ｔａｔ（２００ｎｇ／ｍｌ）をプレート上にコーティングする。ペプチドは、Ｅ１−ＲＥ（「ＲＥ」）、Ｅ１−ＮＥ（「ＮＥ」）、Ｅ１−ＳＥ（「ＳＥ」）、Ｅ１−ＫＥ（「ＫＥ」）、Ｅ１−ＮＤ（「ＮＤ」）及び全長Ｔａｔ（「Ｔａｔ」）と表示する。これらのペプチド、及び「ａｌｔ」と命名される代わりの変異体は、表１に定義される。汎エピトープ１抗体の濃度は１０ｎｇ／ｍｌであった。結果として得られた結合曲線は全て同様であり、全変異体が同様な結果を与えることが示される。本明細書を通じて使用されるように、短いビオチン化ペプチドと長い（「ａｌｔ」）ビオチン化ペプチドの両方が、同じ結果を与えることに着目されたい。
【図６】図６Ａは、３つのＨＩＶ−１感染ヒト対象における、図３と同様の競合アッセイにより得られたグラフである。対象は数字及び記号で識別される：即ち、対象Ａ（●）、対象Ｂ（□）及び対象Ｃ（◆）。図１の汎エピトープ１抗体を使用する本発明の競合アッセイは、感染血漿中のＲＮＡ検出後数日にわたってＴａｔ  ＲＮＡレベル（ｎｇ／ｍｌ）を同定するのに有用であることを示す。図６Ｂは、図６Ａの患者について、初期ＲＮＡ検出後の１日当たりのウイルス力価（ＲＮＡコピー数／ｍｌ）を測定した同様のグラフである。対象Ｂは時間ゼロの急性感染から回復したことに着目されたい。
【図７】図７は、正常ヒト末梢血単核球（ＰＭＢＣ）における、ＨＩＶ−１複製と、Ｔａｔ活性化及びＩｇＧ１汎エピトープ＃５抗体（即ち、５種類のエピトープ１変異体に結合する抗体）による阻害との相関関係を示すグラフである。最初の５列は、様々なレベル、即ち、０、０．１、１．０、１０、及び１００ｎｇ／ｍｌのＴａｔ濃度を反映する。ＨＩＶ−１複製を誘導する最適濃度は図中に示されるように１０ｎｇ／ｍｌと決定された。後の６列は、最適な１０ｎｇ／ｍｌのＴａｔに曝されたＰＢＭＣにおける、様々な濃度のＩｇＧ１汎エピトープ＃５抗体によるＨＩＶ−１複製の阻害を示す。図中に指示されるように、汎エピトープ＃５抗体は任意の参照文字「Ｅ」で表され、そして抗体濃度０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌについての結果は、対照ＩｇＧ１抗体濃度１、１０、及び５０μｇ／ｍｌの結果と並んで示される。全ての対照（任意の参照文字「Ｃ」で表される）において、ＨＩＶ−１複製の阻害は有意ではなく（ＮＳ）、また０．２μｇ／ｍｌ濃度のＩｇＧ１汎エピトープ＃５抗体においても、有意でなかった（即ち、ｐ＞０．０５）ことに着目されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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