(57)【要約】【課題】  五炭糖を発酵原料とした、高効率の２，３−ブタンジオールの製造方法を提供する。【解決手段】  五炭糖を含む原料を用いた微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法においてホスホケトラーゼ活性が弱化または消失した微生物を用いることを特徴とする２，３−ブタンジオールの製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖を含む発酵原料を用いた微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法であって、ホスホケトラーゼ活性が消失した微生物を用いることを特徴とする２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項２】
前記微生物のホスホケトラーゼをコードする遺伝子が欠損している、請求項１に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項３】
前記微生物のホスホケトラーゼをコードする遺伝子が染色体から完全に削除されている、請求項２に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項４】
前記発酵原料が六炭糖と五炭糖を含む、請求項１から３のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項５】
前記微生物がバチルス科細菌である、請求項１から４のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項６】
前記微生物がパエニバチルス属細菌である、請求項１から５のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項７】
前記微生物がパエニバチルス・ポリミクサである、請求項１から６のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、五炭糖からの微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２，３−ブタンジオールは、石油に代わるメチルエチルケトンや１，３−ブタジエンの原料として注目されている物質であり、微生物発酵による生産方法が研究されている。
【０００３】
微生物発酵の発酵原料としては、従来の可食バイオマス由来の糖の他、非可食バイオマス由来の糖が注目されている。発酵原料として非可食バイオマス由来の糖を使用する際には、非可食バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロースなどを糖化酵素によって糖に分解するが、この際にグルコースなどの六炭糖だけではなく、キシロースなどの五炭糖も同時に得られる。そのため、五炭糖を発酵原料とした効率的な発酵技術の開発が求められている。
【０００４】
２，３−ブタンジオール発酵についてはいくつかの微生物を用いた例が開示されているが、比較的高収率で発酵可能であり、かつヒトへの病原性を持たない安全な２，３−ブタンジオール発酵微生物としてはパエニバチルス・ポリミクサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）（非特許文献１）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（非特許文献２）などが知られている。  このうち、パエニバチルス・ポリミクサは五炭糖の資化経路としてペントースリン酸経路に加えホスホケトラーゼ経路を有することが知られている（非特許文献１）。パエニバチルス・ポリミクサの五炭糖から２，３−ブタンジオールへの発酵経路は、まず五炭糖であるキシロースやアラビノースなどは細胞内に取り込まれたのち、いくつかの酵素反応を経てキシルロース−５−リン酸へと変換される。キシルロース−５−リン酸が、ペントースリン酸経路とホスホケトラーゼ経路で代謝されることになる。
【０００５】
ペントースリン酸経路ではキシルロース５−リン酸が全てグリセルアルデヒド−３−リン酸へと変換される。グリセルアルデヒド３−リン酸はさらにピルビン酸へと変換される。ホスホケトラーゼ経路では、ホスホケトラーゼによりキシルロース−５−リン酸が開裂しグリセルアルデヒド−３−リン酸とアセチルリン酸が生成する。このうちグリセルアルデヒド−３−リン酸はピルビン酸へと変換されるが、アセチルリン酸は酢酸へと変換される。どちらの経路においても、ピルビン酸はさらに２段階の酵素反応の後、前駆体であるアセトインを経てアセトインレダクターゼによって２，３−ブタンジオールへと変換されるが、ホスホケトラーゼ経路で生じた酢酸からは２，３−ブタンジオールは生成しない。従って２，３−ブタンジオール発酵における理論収率はペントースリン酸経路を経由したほうが高い。
【０００６】
一方、キシロースがピルビン酸まで代謝される際に生産されるＡＴＰは、ペントースリン酸経路ではキシロース１モルあたり５／３モルであるが、ホスホケトラーゼ経路ではキシロース１モルあたり２モルである（非特許文献１）。すなわち、微生物の増殖に必要なエネルギーとなるＡＴＰの獲得量はホスホケトラーゼ経路のほうが多い。このことは、２，３−ブタンジオール発酵や乳酸発酵など、発酵の中間体がピルビン酸であり、かつピルビン酸から最終産物までの反応でＡＴＰを生じない場合は一般的に当てはまる。
【０００７】
非特許文献３には、ペントースリン酸経路とホスホケトラーゼ経路を両方持つラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を用いた乳酸発酵において、ホスホケトラーゼ活性を消失させることで酢酸生成が減少しキシロースからの乳酸収率が向上するものの、発酵に要する時間が長くなることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍａｒｃｈ  ２００４，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６４，  Ｉｓｓｕｅ  １，  ｐｐ  １１２−１１９
【非特許文献２】Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９４７，  ２５ｂ（１）：  ５６−６４
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１，  Ｖｏｌｕｍｅ  ９１，  Ｉｓｓｕｅ  ６，  ｐｐ  １５３７−１５４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
五炭糖からの２，３−ブタンジオール発酵においてホスホケトラーゼ経路を有する微生物を用いた場合には、前述のようなホスホケトラーゼ経路を経た酢酸生成による収率低下に加え、六炭糖からの発酵に比べてアセトインが蓄積しやすく、２，３−ブタンジオール収率がさらに低下するという課題があった。
【００１０】
そこで本発明は、ホスホケトラーゼ経路を有する微生物を用いて五炭糖を含む発酵原料から２，３−ブタンジオール発酵を行う場合の、アセトイン蓄積の抑制および２，３−ブタンジオール収率の向上を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意検討した結果、ホスホケトラーゼ活性を消失させることで上記課題を解決することを見出し、本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）の通りである。
（１）五炭糖を含む発酵原料を用いた微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法であって、ホスホケトラーゼ活性が消失した微生物を用いることを特徴とする２，３−ブタンジオールの製造方法。
（２）前記微生物のホスホケトラーゼをコードする遺伝子が欠損している、（１）に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（３）前記微生物のホスホケトラーゼをコードする遺伝子が染色体から完全に削除されている、（２）に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（４）前記発酵原料が六炭糖と五炭糖を含む、（１）から（３）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（５）前記微生物がバチルス科細菌である、（１）から（４）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（６）前記微生物がパエニバチルス属細菌である、（１）から（５）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（７）前記微生物がパエニバチルス・ポリミクサである、請求項１から６のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
２，３−ブタンジオールの収率向上を目的として２，３−ブタンジオール発酵微生物のホスホケトラーゼ活性を弱化または消失させた場合、五炭糖の資化速度が低下することが考えられたが、本発明によれば、五炭糖の資化速度が低下することなく、また、五炭糖からの２，３−ブタンジオール収率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ミニジャーファーメンターを用いた五炭糖からの２，３−ブタンジオール発酵結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、五炭糖を含む発酵原料で微生物を培養して２，３−ブタンジオールを発酵生産する２，３−ブタンジオールの製造方法において、ホスホケトラーゼ活性が弱化または消失した微生物を用いることを特徴とする。
【００１６】
本発明で使用される発酵原料は少なくとも五炭糖を含むことを特徴とするが、五炭糖の他に六炭糖を含むことが好ましい。
【００１７】
五炭糖とは、糖を構成する炭素の数が５つのものであり、ペントース（Ｐｅｎｔｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドペントースと２位にケトン基をもつケトペントースがある。アルドペントースとしては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソースが挙げられ、ケトペントースとしては、リブロース、キシルロースが挙げられる。本発明で用いる五炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはキシロース、アラビノースであり、より好ましくはキシロースである。
【００１８】
六炭糖とは、糖を構成する炭素の数が６つのものであり、ヘキソース（Ｈｅｘｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドースと２位にケトン基をもつケトースがある。アルドースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、グロース、タロースなどが挙げられ、ケトースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボースなどが挙げられる。本発明で用いる六炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。
【００１９】
五炭糖と六炭糖を含む発酵原料に関しては特に限定されないが、六炭糖と五炭糖を両方含むことが知られているセルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。セルロース含有バイオマスには、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法は、どのような方法であってもよく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１−５０６９３４号公報、特開２００５−２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“ＬｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃＢｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０〜５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３−２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１−９５５９７号公報）、バイオマスを２４０〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液を精製してもよい。その方法は、例えばＷＯ２０１０／０６７７８５に開示されている。
【００２０】
発酵原料には、前記糖の他、２，３−ブタンジオール発酵微生物の発酵に好ましく作用するような炭素源、窒素源、無機塩類、並びに必要に応じてアミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有させてもよい。また、発酵を効率よく行うことを目的に適宜消泡剤を含有させてもよい。
【００２１】
本発明では、ホスホケトラーゼ経路およびペントースリン酸経路を有する２，３−ブタンジオール発酵微生物のホスホケトラーゼ活性を消失させ、得られた微生物を用いて２，３−ブタンジオール発酵を行うことを特徴とする。ホスホケトラーゼ経路は、ホスホケトラーゼによるキシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への反応として定義される。ホスホケトラーゼは、キシルロース−５−リン酸からアセチルリン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸への解裂反応を触媒する酵素として定義される。またペントースリン酸経路は、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）およびトランスアルドラーゼ（ＥＣ２．２．１．２）によるキシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびフルクトース−６−リン酸への反応として定義される。
【００２２】
ホスホケトラーゼ活性を消失させる微生物は、ホスホケトラーゼ経路およびペントースリン酸経路を有し、五炭糖を資化する能力を持つ微生物であれば特に制限はなく、自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものでもよい。
【００２３】
ホスホケトラーゼ経路およびペントースリン酸経路を用いて五炭糖を代謝する経路を有する２，３−ブタンジオール発酵微生物としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を用いることができ、具体的にはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、パエニバチルス・ポリミクサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）を用いることができる。これらがホスホケトラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを有することは、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）やＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。また、データベースに情報がない微生物であっても、トランスケトラーゼ活性はＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１００，１２８９−１２９５，１９６９に記載の酵素活性測定方法、トランスアルドラーゼ活性はＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．９，４９９−５０５，１９６６，に記載の酵素活性測定方法にて知ることができる。またホスホケトラーゼ活性は以下に示す酵素活性測定によって知ることができる。
【００２４】
ホスホケトラーゼ活性の消失は、微生物の有するホスホケトラーゼ活性を測定することで評価する。ホスホケトラーゼ活性は、キシルロース−５−リン酸あるいはキシルロース存在下で酵素反応を行い、生成した酢酸をＨＰＬＣで測定することができ、具体的には、実施例の参考例１に開示される方法に準じて測定される。なお、本発明においてホスホケトラーゼ活性が消失するとは、上記測定法において検出される酢酸が検出限界値未満となることである。
【００２５】
ホスホケトラーゼ活性の消失は、例えば、ホスホケトラーゼ遺伝子の発現を抑えることによって行われる。また、これらの遺伝子によりコードされるホスホケトラーゼ酵素の構造を改変することによってもホスホケトラーゼ活性を消失させることができる。ホスホケトラーゼ遺伝子の発現を抑えるための手段としては、例えば、これらの遺伝子のプロモーター配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ、プロモーター活性を消失させることによって転写レベルで遺伝子の発現を抑える方法がある。また、ホスホケトラーゼ遺伝子の発現は、ＳＤ配列と開始コドンとの間の領域中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによって、翻訳レベルで抑えることができる。また、ホスホケトラーゼ酵素の構造を改変させるには、ホスホケトラーゼ遺伝子のコーディング領域の中の塩基配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによってコーディング領域を改変する方法がある。
【００２６】
ホスホケトラーゼ活性を消失させるには、ホスホケトラーゼ遺伝子のコーディング領域を欠損させることが好ましい。ホスホケトラーゼ遺伝子の欠損は、該遺伝子がコードする酵素が正常に機能されないのであれば、遺伝子のコーディング領域の少なくとも一部が欠損していればよい。
【００２７】
ホスホケトラーゼ遺伝子の欠損は、相同性組換えを利用した方法が好ましく用いられる。相同性組換えとは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等を菌体内に導入し、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こさせ、目的の塩基配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせる遺伝子破壊方法である。バチルス科細菌の相同組換えには、例えばＣｒｅレコンビナーゼを用いた方法（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｊｕｎｅ；  ７６（１２）：  ４０８５-４０８８）やｍａｚＦ遺伝子を用いた方法（Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ  Ｓｙｓｔ．  ２００９  Ａｕｇ；８４（４）：３１５−８）を用いることができる。なお、ホスホケトラーゼ活性の消失方法としてより好ましくは、上記相同組換えによってコードする遺伝子を染色体上から完全に削除することである。
【００２８】
微生物の培養は、用いる微生物に適したｐＨ、温度を設定すればよく、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、通常、ｐＨが４〜８で温度が２０〜７５℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。微生物の培養における酸素供給は、通気条件と攪拌条件とを組み合わせることで適宜設定できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
（参考例１）グルコース、キシロース、２，３−ブタンジオールおよび酢酸の分析方法
発酵液中のグルコース、キシロース、２，３−ブタンジオールおよび酢酸の濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：５ｍＭ  硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
【００３１】
（参考例２）パエニバチルス・ポリミクサ野生株のホスホケトラーゼ活性測定
パエニバチルス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を、１５０ｍＭ  キシロースを含むＢａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９８，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０，  Ｉｓｓｕｅ  １２，  ｐｐ  １１３３−１１３８）にて３０℃で対数中期まで培養した。集菌後１００ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．８）にて３回洗浄し、２０ｍＭＭｇＳＯ４、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ジチオスレイトールを含むリン酸バッファーに懸濁した。懸濁液を超音波破砕したのち、遠心して得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液２５０ｍＬに対して１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）７０ｍＬ、０．０５Ｍ  ＭｇＣｌ２５０ｍＬ、３．６ｍＭ  チアミンピロリン酸５０ｍＬ、３３ｍＭ  キシルロース５０ｍＬ、１００ｍＭＡＴＰ５０ｍＬを添加し、３９℃で１時間インキュベートした。反応を停止させるためＨ２ＳＯ４を終濃度が１０％ｗ／ｖとなるように添加し、遠心後の上清に含まれる酢酸を参考例１のＨＰＬＣ条件で分析した。その結果、ホスホケトラーゼ活性は８４（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）となり、パエニバチルス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株におけるホスホケトラーゼ活性を確認した。
【００３２】
（参考例３）パエニバチラス・ポリミクサ野生型株を用いた六炭糖からの２，３−ブタンジオール発酵試験
パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で５ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した。得られた培養液全量を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの発酵培地（表１）に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍにてバッチ発酵を行った。結果を表２に示す。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
【表２】
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【００３５】
（比較例１）パエニバチラス・ポリミクサ野生型株を用いた五炭糖からの２，３−ブタンジオール発酵試験
パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株を試験管で５ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した。得られた培養液全量を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの発酵培地（表１、ただし糖としてキシロース５０ｇ／Ｌを含む）に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍにてバッチ発酵を行った。結果を表２に示す。
【００３６】
六炭糖を含む原料を用いた場合に２，３−ブタンジオール収率は０．３１であったのに対し、五炭糖を含む原料を用いた場合では著量のアセトインおよび酢酸が蓄積した結果２，３−ブタンジオール収率は０．１２となり、六炭糖に比べ収率が顕著に低下した。
【００３７】
（実施例１）ホスホケトラーゼ活性が消失した株の作製
（ホスホケトラーゼ遺伝子削除用プラスミドの構築）
大腸菌で自律複製可能なプラスミドｐＢＲ３２２を鋳型として、配列番号１および２をプライマーとしてＰＣＲを行い、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子および複製開始点を含む領域を増幅した。バチルス科細菌で自律複製可能なプラスミドｐＣ１９４をＰｖｕＩＩで消化し、増幅した断片とライゲーションしたのちＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに導入した。得られたプラスミドをｐＰＰ０５とした。
【００３８】
バチルス科細菌で自律複製可能なプラスミドｐＥ１９４を鋳型として、配列番号３および４をプライマーとしてＰＣＲを行い、エリスロマイシン（Ｅｒｔ）耐性遺伝子を含む領域を増幅した。ｐＰＰ０５をＢｇｌＩで消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて連結させたのち、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに導入した。得られたプラスミドをｐＰＰ０６とした。
【００３９】
パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株のコロニーを鋳型として、配列番号５および６をプライマーとしてＰＣＲを行い、ホスホケトラーゼ遺伝子の５‘非翻訳領域およびＦＲＴ  ｒｅｇｉｏｎを増幅した。ｐＰＰ０６をＥｃｏＲＶで消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて連結させたのち、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに導入した。得られたプラスミドをｐＰＰ０７とした。
【００４０】
パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株のコロニーを鋳型として、配列番号７および８をプライマーとしてＰＣＲを行い、ホスホケトラーゼ遺伝子の３‘非翻訳領域およびＦＲＴ  ｒｅｇｉｏｎを増幅した。ｐＰＰ０７をＥｃｏＲＶで消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて連結させたのち、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに導入した。得られたプラスミドをｐＰＰ１１とした。
【００４１】
（ＦＬＰレコンビナーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築）
ｐＣＰ２０（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００８  Ｏｃｔ；７５（２）：３５９−６１）を鋳型として、配列番号９および１０をプライマーとしてＰＣＲを行い、ＦＬＰレコンビナーゼ遺伝子を含む領域を増幅した。また、パエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１をのコロニーを鋳型として配列番号１１および１２をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｇａｐＡ遺伝子の５‘非翻訳領域を増幅した。ｐＰＰ０５をＢｇｌＩＩで消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて連結させたのち、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに導入した。得られたプラスミドをｐＰＰ０９とした。
【００４２】
（ホスホケトラーゼ削除株の作製）
パエニバチラス・ポリミクサのホスホケトラーゼ遺伝子の削除を、Ｆｌｐ−ＦＲＴ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを利用した二重交叉相同組換えにより行った。パエニバチラス・ポリミクサへのプラスミド導入はＲｏｓａｄｏらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １９，  Ｉｓｓｕｅ  １，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９４，  Ｐａｇｅｓ  １−１１）に従い行った。まずｐＰＰ１１をパエニバチラス・ポリミクサＡＴＣＣ１２３２１株に導入し、クロラムフェニコール（Ｃａｍ）耐性株を取得した。シングルコロニーを５ｍＬのＧＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。その後培養液５０μＬを別の５ｍＬＧＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。この操作を再度繰返したのち、培養液１０μＬをＥｒｔ含有ＧＢプレートおよびＣａｍを含有するＧＢプレートに塗布し、Ｅｒｔ耐性かつＣａｍ感受性を持つ株を選抜した。
【００４３】
得られた組換え株にｐＰＰ０９を導入し、Ｃａｍ耐性株を取得した。シングルコロニーを５ｍＬのＧＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液１０μＬを抗生物質を含まないＧＢプレートおよびＥｒｔを含有するＧＢプレートに塗布し、Ｅｒｔ感受性株を選抜した。得られた株をΔｘｆｐ株とした。参考例２と同様の方法にてΔｘｆｐ株のホスホケトラーゼ活性測定を行い、ホスホケトラーゼ活性の消失を確認した。
【００４４】
（実施例２）ホスホケトラーゼ遺伝子削除株を用いた五炭糖からの２，３−ブタンジオール発酵
Δｘｆｐ株およびコントロールとして野生型株を試験管で５ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した。得られた培養液全量を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの発酵培地（表１、ただし糖としてキシロース２０ｇ／Ｌを含む）に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍにてバッチ発酵を行った。結果を表３に示す。野生型株では１７ｇ／Ｌのキシロースを消費するのに２０時間を要したのに対し、Δｘｆｐ株では１８ｇ／Ｌのキシロースを１８時間で消費することができ、発酵時間が短縮された。また野生型株ではキシロースを１７ｇ／Ｌ消費した時点でアセトインが１．１ｇ／Ｌ蓄積したのに対し、Δｘｆｐ株では１８ｇ／Ｌのキシロースを消費した時点でのアセトイン蓄積量は０．４ｇ／Ｌであり、アセトイン蓄積を抑制することができた。２，３−ブタンジオール収率はホスホケトラーゼ遺伝子削除により０．１６から０．２０に向上した。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
（実施例３）ホスホケトラーゼ遺伝子削除株を用いた混合糖からの２，３−ブタンジオール発酵
Δｘｆｐ株およびコントロールとして野生型株を試験管で５ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養した。得られた培養液全量を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの発酵培地（表１、ただし糖としてグルコース２０ｇ／Ｌおよびキシロース２０ｇ／Ｌを含む）に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍにてバッチ発酵を行った。結果を表４に示す。その結果、六炭糖と五炭糖の混合糖を用いた発酵においても発酵時間の短縮および２，３−ブタンジオール収率向上効果を確認した。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
（実施例４）ホスホケトラーゼ遺伝子削除株を用いた五炭糖からの２，３−ブタンジオール発酵２
Δｘｆｐ株およびコントロールとして野生型株を試験管で５ｍＬの前培養培地（グルコース５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）にて３０℃で一晩培養し、前々培養とした。得られた前々培養液全量を５００ｍＬ容量のひだ付三角フラスコに入った５０ｍＬの前培養培地に植菌し、１日培養し、前培養とした。前培養液をミニジャーファーメンター（エイブル）に入れた発酵培地（表１、ただし糖としてキシロース２０ｇ／Ｌを含む）１Ｌに植菌し、３０℃、ｐＨ６．５にてバッチ発酵を行った。培養中のｐＨは５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２にて一定に調整した。また圧縮空気を０．１Ｌ／ｍｉｎにて吹き込み、５００ｒｐｍで攪拌をしながら培養を行った。結果を図１に示す（白抜き：Δｘｆｐ株、塗潰し：野生型株）。図１より、通気攪拌を行いながらｐＨ一定の条件下でも発酵時間の短縮および２，３−ブタンジオール収率向上効果を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によって、五炭糖を含む発酵原料を用いた２，３−ブタンジオールの発酵生産の効率を大幅に向上させることができる。
【図１】
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【配列表】
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