(57)【要約】【課題】より効率良くクローニングを行い、そのためのプライマー設計を効率良く行い、最終的には、その開発製造販売を効率良く進める。【解決手段】広域サイズの核酸、好ましくは非常に長い核酸を、高効率の切出しと、バックグラウンドおよび汚染（コンタミネーション）が低減された状態で、クローニングすることが可能な新しいファミリーのベクターならびに特異的に目的領域を増幅してクローニング可能なプライマー設計を提供する。また、それらのベクターならびにプライマー設計を用いた、クローニング方法およびバルクライブラリーの調製方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成工程と、予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択工程と、前記選択されたプライマー候補配列に基づき、目的核酸配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含む目的核酸配列を設計する工程と、前記目的核酸配列の各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価して目的核酸領域を選択する工程と、前記選択されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定工程とを、コンピュータを用いて実施してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法ならびに、それを用いたクローニング方法。
【請求項２】
前記プライマー候補配列選択工程の前記基準が、プライマーの二次構造形成能に関する基準であることを特徴とする請求項１記載のプライマー設計方法ならびに、それを用いたクローニング方法。
【請求項３】
前記目的核酸選択工程の前記基準が、前記目的核酸配列が取り得る二次構造の多様性に関する基準であることを特徴とする請求項１または２記載のプライマー設計方法ならびに、それを用いたクローニング方法。
【請求項４】
プライマー設計工程と、前記設計工程で設計されたプライマーの配列に基づきプライマーを合成する合成工程とを有し、前記プライマー設計工程が、請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマー設計方法により実施されることを特徴とするプライマーセットの製造方法ならびに、それを用いたクローニング方法。
【請求項５】
請求項４記載の製造方法により製造されたプライマーを用いたクローニング方法、クローニング産物を製造することを特徴とするｃＤＮＡライブラリーの製造販売方法。
【請求項６】
データ処理装置、記憶装置、入力装置および出力装置を備え、前記データ処理装置が、プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成工程と、予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択工程と、前記選択されたプライマー候補配列に基づき、目的核酸配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含む目的核酸配列を設計する工程と、前記目的核酸配列の各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価して目的核酸領域を選択する工程と、前記選択されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定工程とを、コンピュータを用いて実施してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計装置ならびに、それを用いたクローニング方法。
【請求項７】
さらに、通信装置を備え、前記通信装置により、装置外の通信回線網を介してサーバーに接続可能であり、前記サーバー内のプログラムにより、前記プライマー候補配列生成手段、前記プライマー候補配列選択手段、前記目的核酸配列生成手段、前記目的核酸配列選択手段および前記プライマー配列決定手段からなる群の少なくとも一つの手段を実行可能であることを特徴とする請求項５から６のいずれか一項に記載のプライマー設計装置ならびに、それを用いたクローニング方法。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマー又はプローブ設計方法をコンピュータ上で実行可能なことを特徴とするＥプライマー又はＥプローブ設計用コンピュータプログラムならびにコンピュータプログラムが格納されたことを特徴とする記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。特に、新規クローニングベクターファミリーおよび興味ある核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのクローニング方法が開示される。特にそのクローニングのためのプライマー設計に関して開示されている。
【背景技術】
【０００２】
効率的なゲノムおよびｃＤＮＡクローニングは、高品質で、代表的なライブラリーが多くの遺伝子の分析の豊富な源泉になるので、分子遺伝学研究では重要な手段である。
【０００３】
完全長ｃＤＮＡは、完全長ライブラリーの構築のための出発材料である（例えば、ＲＩＫＥＮ  ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、ＲＩＫＥＮＮ  ａｎｄ  Ｆａｎｔｏｍ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ"，  Ｎａｔｕｒｅ，２００１年２月８日号，４０９巻：６８５−６９０）。標準クローニング技術に比べて、完全長ｃＤＮＡクローニングは、当該ライブラリーからの長いクローンの表現不足または欠落の危険性を本来もっており、また、非常に長いｍＲＮＡ類に由来するｃＤＮＡは、ベクターの容量が十分でなければ、クローン化されない。
【０００４】
現在利用できるプラスミドクローニングベクター類は、短いｃＤＮＡ類用に片寄って(バイアスして)いる：すなわち、連結（ライゲーション）反応およびライブラリー増幅の工程で競合すれば、短い断片の方が長い断片よりずっと効率よくクローニングされる。プラスミド電気穿孔は、ライゲーション工程でのプラスミド分子の環状化の際、関連するサイズバイアスを示さないが、混合ライゲーション反応では、短いｃＤＮＡのほうが長いｃＤＮＡよりずっと効率的に連結される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）。
【０００５】
バクテリオファージ由来のクローニングベクターは、ＤＮＡ類のクローニングや増殖およびライブラリー構築に特に有用なことが明らかにされている。挿入体およびバクテリオファージベクターＤＮＡ類の連結混合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率的にパッケージされ、感染により細菌へ導入が可能である。バクテリオファージベクターはｃＤＮＡ配列のクローニングを可能するが、大規模配列決定のための最終産物は、大規模なコロニー収集、増殖、ＤＮＡ調製および配列決定反応のためのプラスミドであるべきである（Ｓｈｉｂａｔａら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，１０：１７５７−１７７１）。
【０００６】
自動プラスミド切出しのためのクローニングベクターは、広範なｃＤＮＡクローニング用の容量をもつべきで、０．５Ｋｂ程度に短いｃＤＮＡおよび１５Ｋｂ程度に長いｃＤＮＡを含み、それらは、第１鎖ｃＤＮＡ合成の際トレハロースを使えば、アガロースゲル上で可視化できる（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：５２０−５２４）。
【０００７】
全ライブラリーバルク切出しを可能にするバクテリオファージベクターは多数あるが、それらは、クローニングサイズまたはバルク切出しプロトコールの点からは最適ではない。
【０００８】
クローン化挿入体をもつバクテリオファージベクターからのプラスミド切出しの例は、λ−ＺａｐIIで得られた（Ｓｈｏｒｔら，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：７８５３−７６００）。しかし、λ−ＺａｐIIからのバルク切出しは、長短両クローンを含むｃＤＮＡライブラリーのような混合試料を用いた場合、短いインサートの方へサイズバイアスを示す。λ−ＺａｐIIを用いた場合、長い希少なｃＤＮＡを得るのは難しい。
【０００９】
λ−Ｌｏｘ誘導体（Ｐａｌａｚｚｏｌｏ  Ｍ．ら，１９９０，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６），λ−ＹＥＳ（Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：１７３１−５）およびλ−ＴｒｉｐｌｅｘＴＭ（ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ，１９９６年１月）のようなｃＤＮＡクローニングおよびプラスミド切出しのためにデザインされた他のベクターは、９〜１０Ｋｂを超えないＤＮＡを受け入れる。一方、ゲノムライブラリー構築用のベクターおよびＣｒｅ−ｌｏｘ仲介プラスミド切出しは、７Ｋｂｐより長い挿入体を受け入れる：例えばλＰＳ（Ｎｅｈｌｓら，１９９４ａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：７７０−７７５），λｐＡｎ（Ｈｏｌｔら，１９９３，Ｇｅｎｅ，１３３：９５−９７），λＧＥＴ（Ｎｅｈｌｓら，１９９４ｂ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９：２１６９−２１７５），λＭＧＵ２（Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９９２，Ｇｅｎｅ，１２０：１３５−１４１）およびＴｎ１７２１切出しシステムに基づくベクター、λＲＥＳ（Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｅｒ，Ｊ，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２３：６３−６８）。しかしこれらのベクターは、広域サイズｃＤＮＡライブラリーの調製物を許容しない。
【００１０】
λＳＫシリーズの中だけに０．２から１５．４Ｋｂの計算容量をもついくつかのベクター（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｉら，１９９３，Ｇｅｎｅ，１２７：１−１４）があって、それらは広域サイズｃＤＮＡクローニングの目的に適していると考えられた。残念ながら、λＳＫの基本的切出しシステムは、単純な制限酵素消化に基づくので、ｃＤＮＡの内部切断を起し、それが、ｃＤＮＡクローニングにこれらのベクターがあまり使われない理由と思われる。特開２０００−３２５０８０号の日本特許出願は、修飾λＰＳベクターを開示している。名称λＦＬＣ−１で示されるその新ベクターは、λＰＳベクターの左アームに６ｋｂの核酸配列（スタッファーII）を含むので、興味あるｃＤＮＡを考慮に入れない場合のサイズは３８ｋｂであった。この修飾λＰＳベクターは、広範なサイズのｃＤＮＡを挿入できると記載されている。
【００１１】
上記λＦＬＣ−１は、一般的な（または「標準的」）大型ｃＤＮＡライブラリーに有用ではあるとしても、短い、また非完全長のｃＤＮＡに、なおバイアスを示すので、非常に長く希少で重要な完全長ｃＤＮＡ、特に強く均等化および／または差引き化されたｃＤＮＡライブラリーの場合は、得ることが困難である。当該技術分野におけるさらなる問題点は、バルク切出し組換え機構に関するものである。
【００１２】
バルクｃＤＮＡｓ（ｃＤＮＡライブラリー）、すなわち短、中、および長のｃＤＮＡのような広域サイズのｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーは、クローニングベクター中へ挿入される。次いで、この挿入体は、発現ベクターのような所望の特徴を備えた機能的または特殊化された別のベクターに移される。この転移はサブクローニングと呼ばれる。ＤＮＡセグメントのサブクローニングに使われる機能的または特殊化ベクター類は、機能的に多様である。そのようなベクター類は、さまざまな生物において遺伝子を発現するための；遺伝子発現を調節するための；タンパク質精製を助けるために、または、細胞中のタンパク質の追跡を可能にするために標識を備えるための；クローン化ＤＮＡセグメントを修飾する（例えば、欠失を作出する）ための；プローブ類（例えばリボプローブ類）の合成のための；ＤＮＡ配列分析用の鋳型の調製のための；タンパク質コード領域の同定のための；種々のタンパク質コード領域を融合させるための；興味あるＤＮＡを大量に提供するためのベクター類を含むが、これは非限定的例示である。特定の研究は、興味あるＤＮＡセグメントをいくつかの異なる特殊化ベクター中へサブクローニングすることを含むのが普通である。
【００１３】
制限酵素類およびリガーゼを用いる旧来のサブクローニング法は、時間がかかり、比較的信頼性も低い。
特定の組換え酵素認識配列を用いる組換え酵素認識系の利用が提案され、それらはＣｒｅ−ｌｏｘ（Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６）およびＧａｔｅｗａｙＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ；Ｗａｌｈｏｕｔ  Ａ．Ｊ．Ｍ．ら，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ３２８巻：５７５−５９２；および米国特許第５８８８７３２号）として知られる。
【００１４】
Ｃｒｅ−リコンビナーゼによる固相ｉｎ  ｖｉｖｏ切出しは、増幅されたｃＤＮＡライブラリーを、構成的にＣｒｅ−リコンビナーゼを発現する細菌株、例えばＢＮＮ１３２（Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：１７３１−５）へ感染させることが必要である。しかしながら、この方法は、低いプラスミド収量（Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，上記に同じ）およびプラスミドの不安定性（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３６：１０９７−１１０３）のため、推奨できない：実際、Ｃｒｅ−リコンビナーゼは構成的に発現され、プラスミドの２量体／多量体の生成を起し、高比率の無プラスミド細胞を生じて、シークエンシング効率を損なう。
【００１５】
Ｇａｔｅｗａｙ切出しは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ切出しとは別のシステムである。一般的なＧａｔｅｗａｙＴＭシステムによれば、興味あるＤＮＡ（挿入体）および相互に異なる一対の組換えサイトをもつ挿入体供与ベクターは、サブクローニングベクターおよび相互に異なるが組換え可能な一対の組換え体サイトを含む供与ベクターと、組換えをする。最終産物は、興味あるＤＮＡ（挿入体）をもつサブクローン産物および副産物である。当該組換え体サイトは、ａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬおよびａｔｔＲである。
【００１６】
しかし前記ＧａｔｅｗａｙＴＭは短いｃＤＮＡに対するバイアスを示し；長いｃＤＮＡは低い効率で得られる（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｂｒａｓｃｈ，スライド“Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｔｔＢ−ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ"，ＧＩＢＣＯＢＲＬＲ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｍｉｎａｒ，“Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"，Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ，１９９９）。
【００１７】
クローニングシステムのさらに別の問題は、バックグラウンドの存在であり、これは環境ＤＮＡ汚染および、非組換えプラスミド（興味あるＤＮＡのないプラスミド）であるサブクローニングプロセス副産物によるものである。
【００１８】
バックグラウンドを完全に排除するか、ほとんどもたないことを可能にする、バックグラウンド排除クローニングシステムを提供することが特に望ましい。
当該技術分野では、いくつかのバックグラウンド排除の戦略が提案されている。例えば、Ｗａｌｈｏｕｔら（上記参照）は、ＧａｔｅｗａｙＴＭベクター類，ａｔｔＰ１−ａｔｔＰおよびａｔｔＲ１−ａｔｔＲ２は、ａｔｔ部位とａｔｔ部位の間に、タンパク質産物がＤＮＡジャイレース（ｇｙｒａｓｅ）を妨害するｃｃｄＢ遺伝子（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｐ．およびＣｏｕｔｕｒｉｅｒ  Ｍ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：７３５−７４６）も含むと報告している。組換え後は、ｃｃｄＢ遺伝子を失った（つまり組換え体である）プラスミドのみが、ｇｙｒＡに対して変異していない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で増殖可能で、従って、選択的長所を備えている。遺伝子ｃｃｄＢをもつプラスミドは、ｇｙｒＡ遺伝子に突然変異をもちｃｃｄＢに対する耐性を授かった特定の大腸菌株ＤＢ３．１中でのみ増殖可能である（Ｗａｌｈｏｕｔら、上記参照）。それ故、この種の組換えはプラスミドに限られる。何故なら他のベクター、例えばクローニング系で使われるλ置換ベクターは、ｒｅｃＡタンパク質をもたないＤＢ３．１のような細胞中では増殖および複製できないからである（ｒｅｃＡ産物は置換型バクテリオファージλの増殖に必要である：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。
【００１９】
結論として、ａ）サイズバイアスがなく、しかも非常に長く希少な完全長ｃＤＮＡを含む「サイズバランスのとれた」調製物を許容し；ｂ）改良された組換え機構が可能で；ｃ）バックグラウンドが排除できる、という特徴をもつベクターを提供することが、当該技術分野では必要とされている。
【００２０】
当該技術分野で現在利用できるクローニングベクターは、上記の特徴を満足できない。
本発明は、当該技術分野のそれらの問題の解決を目的と、より効率の良いクローニング、の開発製造販売に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、広域サイズの核酸、好ましくは非常に長い核酸を、高効率の切出しと、バックグラウンドおよび汚染（コンタミネーション）が低減された状態で、クローニングすることが可能な新しいファミリーのベクターならびに特異的に目的領域を増幅してクローニング可能なプライマー設計を提供する。また、それらのベクターならびにプライマー設計を用いた、クローニング方法およびバルクライブラリーの調製方法も提供する。
【００２２】
第１の態様によれば、本発明は、構築ベクターセグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳのサイズが３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂ、好ましくはＣＳが３７．５ｋｂである、クローニングベクターを提供する。この構築ベクターセグメントは、好ましくは、バクテリオファージλベクターで作られる、またはそれを含む。この可換ベクターセグメント（ＲＳ）は、クローニングしようとする興味ある核酸挿入体により置換されるセグメントを表す。
【００２３】
意外なことに、このサイズをもつクローニングベクターは、非常に長いサイズのｃＤＮＡを好ましくも挿入可能で、従ってそれは、非常に完全長のｃＤＮＡのクローニングに特に有利なことが見い出された。３８ｋｂの構築ベクターセグメントをもち、短いサイズのｃＤＮＡに強いバイアスを示すという現行のベクターλ−ＦＬＣの当該技術分野における問題を、このベクターは克服する。
【００２４】
完全長ｃＤＮＡライブラリーの調製のためのベクターの特定の有利なサイズの選択は、λ以外のバクテリオファージにも適用可能である。従って、本発明は、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳのサイズがＸ−１．２ｋｂ≦ＣＳ＜Ｘｋｂで、Ｘはパッケージングを受けるバクテリオファージベクターに必要な最小サイズに相当する、クローニングバクテリオファージベクターにも関する。ＣＳのサイズは好ましくはＸ−０．２ｋｂである。
【００２５】
本発明は、少なくとも複製起点（ｏｒｉ）を含む細菌人工染色体（ｐＢＡＣ）またはそのセグメントを含むバクテリオファージベクター、好ましくは、λバクテリオファージベクターに関する。このベクターは、ＤＮＡフラグメントをクローン化することができる部位；およびＤＮＡフラグメントをクローン化することができるこの部位を含む切除可能フラグメントを規定する１対の誘導性切除媒介部位を含むこともできる。この切除媒介部位の対は、好ましくは、ＦＲＴ部位である。
【００２６】
このベクターは、誘導性複製起点、好ましくは、ｏｒｉＶを更に含んでいてよい。
本発明のクローニングベクターは、既知の組換え系、例えばＣｒｅ−ｌｏｘおよび／またはＧａｔｅｗａｙＴＭシステムを用いて、プラスミドまたは核酸挿入体の切出しを行うことが可能である。
【００２７】
本発明のベクター類は、ｃｃｄＢ遺伝子、ｌｏｘ配列またはｌａｃＺ遺伝子などのバックグラウンド低減システム、または制限エンドヌクレアーゼにより認識される非対称サイト配列も含むことが可能である。
【００２８】
本発明は、上記ベクターを使うクローニング方法にも関する。
別の態様によれば、本発明は、本発明のベクターのＲＳセグメント中に、または、ＧａｔｅｗａｙＴＭシステムの場合には、デスティネーションまたは受入れベクターのＲＳセグメント中に含まれる、ｃｃｄＢ遺伝子および／またはｌｏｘ配列のようなバックグラウンド低減配列を含むクローニングベクターを提供することにより、バックグラウンドまたはコンタミネーションを低減するためのプライマー設計に関する。ファージまたはプラスミドベクターのＲＳは、制限エンドヌクレアーゼにより認識される２つの非対称サイト配列により隣接されることも可能である。
【００２９】
本発明は、これらのベクターを用いることによりバックグラウンドまたはコンタミネーションを低減する方法にも関する。
本発明は、本発明のベクター類を用い、改良Ｃｒｅ−リコンビナーゼまたはＧａｔｅｗａｙＴＭシステムを提供し、プラスミドまたは興味ある核酸の効率的な切出しのための方法にも関する。
【００３０】
好ましくは、本発明は、本発明のベクター類を用いて、長いまたは完全長のｃＤＮＡライブラリーのバルクを調製する方法、さらには、そのプライマー設計に関する。
本発明は、本発明の少なくとも１つのクローニングベクターまたは少なくとも１つのベクター類のライブラリーを含むキットにも関する。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の切出し法により得られたプラスミドベクター、または、均等化および／または差引き化ドライバーとして、好ましくは１本鎖に減らされた本発明のデスティネーションベクターを使うことを含む、少なくとも１つの均等化および／または差引き化ライブラリーを調製するための方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
完全長クローニングは、長いｃＤＮＡの調製およびクローニングの両方に関係する問題によって阻まれてきた。当該諸問題の多くの部分は、熱安定化および熱活性化逆転写酵素による長いｃＤＮＡの調製（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：５２０−５２４）およびキャップ構造に基づく完全長ｃＤＮＡ選択技術の開発（Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３７：３２７−３３６；Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９７，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，４：６１−６６；Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３０３：１９−４４；Ｃａｒｎｉｎｃｉら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０：１６１７−１６３０）によって克服された。
【００３３】
しかし、クローニング法およびバルクｃＤＮＡライブラリーを調製する方法は、短いサイズのｃＤＮＡになおバイアスを示す。  本発明は、核酸を広範なサイズで、好ましくは非常に長くかつ完全長のｃＤＮＡとしてクローニングし、切出しの高効率、および低減されたバックグラウンドとコンタミネーションを達成できる新しいファミリーのベクターを提供する。そのようなベクターを用いたクローニング方法、特に、そのためのプライマー設計方法も提供する。
【００３４】
第１の態様によれば、構築ベクターセグメント（ＣＳ）、および、可換セグメント（ＲＳ）（「スタッファーＩ」と言うこともある）を含むクローニングベクターが提供される。ＲＳは、クローニングしようとする興味ある核酸挿入体により置換される予定のセグメントである。
【００３５】
本発明のバクテリオファージまたはプラスミドベクターは直線状または環状のいずれでもよい。直線状ベクターの場合、セグメントＣＳは、ＲＳの左側の１本と右側の１本の２本のアームまたはセグメントに分かれていると、模式的に考えてもよい。しかし、より明確に述べるなら、ＣＳの左アームまたはセグメントおよび右アームまたはセグメントという用語は、環状ベクターの場合にも用いられる。
【００３６】
当該技術分野で利用できるベクターは修飾タイプのλＰＳベクターであり、３２ｋｂの「基本的」サイズに６ｋｂの核酸配列（スタッファーII）をプラスしたもので、したがって、当該ベクターのサイズは、興味あるｃＤＮＡを考慮から除くと、３８ｋｂであった（本出願人の特開２０００−３２５０８０号）。しかしこのベクターは、短いｃＤＮＡおよび非完全長ｃＤＮＡにバイアスする短所をもっており、そのようなｃＤＮＡの存在は、完全長ｃＤＮＡライブラリーまたはエンサイクロペディアの調製には不都合である。
【００３７】
本発明者らは、意外にも、ＣＳのサイズが３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂ、好ましくはＣＳが３７．５ｋｂであるベクター、好ましくはバクテリオファージ、さらに好ましくはλバクテリオファージが、３８ｋｂのλファージの問題を回避し、長いおよび完全長ｃＤＮＡの選択を許容することを見い出した。
【００３８】
本発明のＣＳの３７．５ｋｂという好ましいサイズは、３７．７ｋｂ（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｉら，１９９３，上記に同じ）に相当する、λファージがパッケージングを受けるのに必要な最小サイズより、０．２ｋｂ短い。
【００３９】
従来のベクターのＣＳ３８ｋｂに比べて、本発明によるＣＳ３７．５ｋｂのベクターが有する利点は表１に示した。短いものに対するバイアスを避け、完全長ｃＤＮＡの好ましい調製のためのこのシステムは、λとは異なるバクテリオファージにも適用可能である。
【００４０】
従って、本発明は、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳのサイズが、Ｘ−１．２ｋｂ≦ＣＳ＜Ｘで、Ｘ（ｋｂで表記される）は、パッケージングを受けるためのバクテリオファージベクターに必要な最小サイズに相当する（上記Ｚａｂａｒｏｗｓｋｉらの報告にあるように、名目上は、λについて３７．７ｋｂである）、クローニングバクテリオファージベクターにも関する。ＣＳのサイズは好ましくはＸ−０．２ｋｂである。
【００４１】
Ｘのサイズから短い断片を減少させることは、ＣＳ断片をパッケージングレベル以下にするが、ＲＳ（「スタッファーＩ」とも言う）の存在は、バクテリオファージベクターのパッケージングを可能にする。本発明のベクターが、所望サイズのスタッファーIIを挿入して、構築されている。スタッファーIIは好ましくは５．５ｋｂで、その結果、ＣＳは３７．５ｋｂに相当する。しかしスタッファーIIは４．５≦スタッファーII＜６でよい。スタッファーIIはどのような起源およびどのような核酸であってもよい。それは外来配列、例えばマウスゲノムＤＮＡまたはプラスミドから取ってきてもよい。スタッファーIIは元々既にベクター中に存在することも可能である。本発明のベクターのＣＳは、好ましくはバクテリオファージセグメントであるか、バクテリオファージ断片を含むことも可能である。好ましくは、バクテリオファージはλバクテリオファージである。利用可能なバクテリオファージおよびλバクテリオファージのリストは、本出願の属する技術分野で報告されており（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら２．１６−２．５３に報告されているものを参照されたい）あるいはそれらに由来するものも使用できる。
【００４２】
ＣＳは、ｏｒｉを少なくとも含むプラスミドセグメントを含ませることによっても修飾可能である。ｏｒｉを含むプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋），ｐＵＣ，ｐＢＲ３２２，およびｐＢＡＣの群から選ばれるのが好ましい。例えば、ｏｒｉを含む修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）の断片が、ＣＳの左アームに挿入されている。しかしながら、ｐＢＡＣまたはその誘導体は、本発明のいずれのベクター構築物の調製についても効率よく使用できる。本発明のベクター類の構築に用いられるベクターおよびリンカー、アダプター、プライマー配列などの例は、ＮＣＢＩ  ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ，ＵＮＩＶＥＣ  Ｂｕｉｌｄ  ＃３．２  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳ）に報告されている。これらのベクター類に関する具体的な情報は、ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＵＳ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＵＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳ；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳにも見られる。
【００４３】
本発明のクローニングベクターは、選択マーカーも含むことが可能である。従って、有毒な化合物に対する耐性を付与する産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、抗生物質耐性遺伝子）；遺伝子産物の活性を抑圧する産物をコードするＤＮＡセグメント；識別可能な産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ベータ・ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー類）；細胞機能を阻害する産物をコードするＤＮＡセグメント；所望の分子の単離を可能にするＤＮＡセグメント（例えば、特定タンパク質への結合サイト）；および酵素により認識される特定のヌクレオチド認識配列をコードするＤＮＡセグメント、より成る群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを、ＣＳが含む。
【００４４】
前記選択マーカーは、より具体的には、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、酵素切断サイト、タンパク質結合サイト、より成る群から選択される少なくとも１つのマーカーおよびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列である。
【００４５】
本発明のベクター類のＲＳは、2つの組換えサイトにより隣接されることが可能であるが、それら2つの組換えサイトは相互に組換えをしない。より具体的には、それらの組換えサイトは、ＧaｔｅｗａｙＴＭ方法論に従う組換え切出しを行うためのａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬ，およびａｔｔＲまたはそれらの誘導体より成る群から選択される（Ｗａｌｈｏｕｔら，２０００，上記に同じ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅ；Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＵＳ５８８８７３２）。Ｇａｔｅｗａｙ組換えサイトおよび誘導体の完全リストは、上記Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ参考文献に開示されている。
【００４６】
ＧａｔｅｗａｙＴＭシステムは、プラスミド間の成分の交換のために、また、興味ある核酸挿入体を特定の機能性プラスミド中へ移すために、当該技術分野で提案された。しかしＧａｔｅｗａｙシステムは短いｃＤＮＡにバイアスを示し、長いｃＤＮＡは低い効率で得られた（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．  Ｂｒａｓｃｈ，スライド“Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｔｔＢ−ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ"，ＧＩＢＣＯＢＲＬＲ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｍｉｎａｒ，“Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"，  Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ，１９９９）。
【００４７】
ところが、本発明者らは、本発明に従ってＧａｔｅｗａｙ組換えサイトを、バクテリオファージベクター中へ移し、ＲＳに隣接配置したところ、当該クローン化ｃＤＮＡライブラリーは短いｃＤＮＡへバイアスを示さないことが、意外にも見い出された。それ故、本発明は、好ましくはＣＳサイズが３２ｋｂ≦ＣＳ＜４５ｋｂ，特に３６．５ｋｂ≦ＣＳ＜３８ｋｂ，より好ましくはＣＳが３７．５ｋｂであり、相互に組換えをしない2つの組換えサイトを含み、ＲＳに隣接する、バクテリオファージベクターを提供する。バクテリオファージは好ましくはλバクテリオファージである。
【００４８】
しかし本発明のバクテリオファージベクターは、λバクテリオファージに限らず、当該技術分野で知られる他のバクテリオファージも使用可能である（例えば、上記のようにＺａｂａｒｏｖｓｋｉら、１９９３，に記載されているもの）。
【００４９】
本発明のベクターで、Ｇａｔｅｗａｙ  ａｔｔＢ，Ｐ，ＬまたはＲまたはそれらの誘導体とは別に、ＲＳに隣接する２つのｌｏｘ組換えサイトを使ってもよい。これらのｌｏｘ組換えサイトは、どのような変異型または誘導型ｌｏｘサイト、例えば変異型または誘導型ｌｏｘＰサイト、Ｈｏｅｓｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８６，１４（５）：２２８７に記載されている（例えばｌｏｘＰ５１１）でもよい。
【００５０】
本発明のベクターは、２つのｌｏｘ組換え体サイトで、それらの各々がＣＳの各アーム、すなわち、一方のｌｏｘサイトは、ＲＳの（または興味ある核酸挿入体の）左側のＣＳ中にあり、もう一方のｌｏｘサイトは、ＲＳの（または興味ある核酸挿入体の）右側のＣＳ中にあり、それらのｌｏｘ組換えサイトは相互に組換え可能である、ように配置された前記組換え体サイトを、含んでもよい。
【００５１】
これらのサイトは、２つのｌｏｘ組換えサイトで、修飾、変異、または誘導されたｌｏｘサイト（Ｈｏｅｓｓら，１９８６，上記に同じ）、好ましくはｌｏｘＰまたはそれの修飾または誘導体であってもよい。例えば、ｌｏｘはｌｏｘＰ５１１（Ｈｏｅｓｓら，１９８６、上記に同じ）であってもよい。ｌｏｘＰ５１１はもう１つのｌｏｘＰ５１１サイトと組換えをするが、ｌｏｘPサイトとは組換えしない。ｌｏｘサイトの上記すべての変化体、変異体、修飾体または誘導体は、本発明の目的については、「ｌｏｘサイトおよびその誘導体」と通常表示する。
【００５２】
この場合、ＲＳが興味ある核酸挿入体により置換された後は、組換えはＣｒｅ−ｌｏｘ組換え酵素により行われる。
Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系は、いくつかの先行技術文献中に記載されている、例えば、Ｐａｌａｚｚｕｏｌｏら，１９９０（上記に同じ）；Ｅｌｌｅｄｇｅら，１９９１（上記に同じ）；およびＳｕｍｍｅｒｓら，１９８４（上記に同じ）を参照されたい。
【００５３】
前記Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え酵素系とは別に、他の組換え系を本発明の目的のために使ってもよい。それらには、Ｋｗ組換え酵素（Ｒｉｎｇｒｏｓｅ  Ｌ．ら，１９９７，ＦＥＢＳ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４８：９０３−９１２），Ｔｎ３レス／レソルバーゼ（解離酵素）からのエレメントとのハイブリッド部位特異的組換え系（Ｋｉｌｂｒｉｄｅ  Ｅ．ら，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９：１２１９−１２３０）、β組換え酵素系（Ｃａｎｏｓａ  Ｉ．ら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３巻，２２号，５月２９日：１３８８６−１３８９１）；ＦＬＰ組換え酵素系（Ｈｕｆｆｍａｎ  Ｋ．Ｅ．およびＬｅｖｅｎｅ  Ｓ．Ｄ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，：２８６：１−１３；およびＷａｉｔｅ  Ｌ．Ｌ．およびＣｏｘ  Ｍ．Ｍ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０巻，４０号：２３４０９−２３４１４）が含まれる。これらの組換え部位の修飾、変異または誘導体も使用可能で、それらは通常「それらの誘導体」と表示される。
【００５４】
Ｃｒｅリコンビナーゼまたは他の組換え酵素に仲介されるこの組換え工程の結果は、興味ある核酸を含むプラスミドの切出しである。
本発明の一つの態様によれば、組換えＧａｔｅｗａｙ様システムに対するＲＳに隣接する組換えサイト、およびＣｒｅ−ｌｏｘ，Ｋｗ，Ｔｎ３レス／レソルバーゼ、β組換え酵素およびＦＬＰ組換えに対するＣＳの２本のアーム中の組換えサイトの両方をベクター中に存在させて、当該ベクターをクローニング、興味ある核酸材料の転移、およびライブラリーの調製に特に適するようにする。事実、特定の場合には、最も便利な切出し系は、当該ベクターを変えたり修飾したりせずに選択可能である。
【００５５】
さらなる側面によれば、本発明のクローニングベクターは、バックグラウンドが低いか無いライブラリーのクローニングまたは調製にも使用できる。従って、本発明は、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、当該ＣＳがバクテリオファージベクターセグメントで、当該ＲＳがバックグラウンド低減系として少なくともｃｃｄＢ遺伝子を含む、クローニングベクターを提供する。
【００５６】
本発明のバクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクターは、また、構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）も含み、当該ＣＳはバクテリオファージまたはプラスミドベクターセグメントであり、ａ）当該ＲＳはバックグラウンド低減系として少なくとも１つの組換えサイト（ＣＳの左右のアームに存在する２つの組換えサイトとの組換えが可能）を含むか、またはｂ）当該ＲＳは、制限エンドヌクレアーゼ類により認識される、相互に連結しない２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列により隣接されていてもよい。
【００５７】
ＲＳ中に含まれる前記組換えサイトは、ＣＳの左右のアーム中に存在する組換えサイトと組換え可能でなければならない。それ故、このＲＳ組換えサイトを「第三の」組換えサイトと呼んでもよい。その「第三の」組換えサイトは、ｌｏｘ組換えサイトまたはその誘導体、好ましくはｌｏｘＰサイトまたはその誘導体でもよい。
【００５８】
前記２つのエンドヌクレアーゼ非対称サイト配列バックグラウンド低減系は、例えば、ａ）ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列、またはｂ）クラスIIＳ制限酵素類が認識可能な非対称制限エンドヌクレアーゼ切断サイト配列であってもよい。
【００５９】
前記バックグラウンド低減バクテリオファージベクターは、ＣＳのサイズが好ましくは３２ｋｂ≦ＣＳ≦４５ｋｂで、有利にはＣＳが３６．５≦ＣＳ＜３８ｋｂ，さらに好ましくはＣＳが３７．５ｋｂである。前記バクテリオファージは好ましくはλバクテリオファージである。前記バクテリオファージＣＳまたは当該ベクターは、少なくとも一つのｏｒｉを含むプラスミドセグメントを含んでもよい。ｏｒｉを含む前記プラスミドセグメントは、好ましくは、しかし非限定的に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋），ｐＵＣ，ｐＢＲ３２２およびｐＢＡＣより成る群から選択されるか、または上記のように、ＮＣＢＩデータベースに含まれるいずれかのプラスミドである。
【００６０】
バックグラウンド低減プラスミドの場合、当該技術分野で既知の如何なる種類のプラスミド、例えば、上述のプラスミドまたはＮＣＢＩデータベースに開示されたどのプラスミドでもよい。
このベクターは、上記に示した群から選択された少なくとも１つの選択マーカーを含む。特に、当該少なくとも選択されるマーカーは、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、酵素切断サイト、タンパク質結合サイトより成る群およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列から選択可能である。
【００６１】
前記バックグラウンド低減クローニングバクテリオファージまたはプラスミドベクターはまた、上記のような組換え系の少なくとも１つ、すなわち、ａ）ＲＳに隣接し、相互に組換えをしない２つの組換えサイト（Ｇａｔｅｗａｙサイトまたはｌｏｘ修飾サイト）、および／またはｂ）組換え酵素により認識され、ＣＳの２アーム中に配置された、相互に組換えをする少なくとも２つの組換えサイト、を含むことも可能である。相互に組換えできるそれらの組換えサイトは、上記のように、ｌｏｘサイト，Ｋｗ，Ｔｎ３レス／レソルバーゼ，β組換え酵素サイト，およびＦＬＰサイトより成る群より、好ましくは選択される。
【００６２】
バックグラウンド低減ｃｃｄＢ系に関しては、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｐ．およびＣｏｕｔｕｒｉｅｒ  Ｍ．（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：７３５−７４６）によりプラスミド中へ、およびＷａｌｈｏｕｔら（上記に同じ）によってもＧａｔｅｗａｙＴＭベクター用に、開示されている。
【００６３】
前記ｃｃｄＢ遺伝子の産物はＤＮＡジャイレースを妨害する。組換え後、ｃｃｄＢ遺伝子を消失したプラスミド（それらは組換え体である）だけが、ｇｙｒＡに対して変異していない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で増殖できるので、選択的利点がある（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｏｌｉｅｓ文献を参照されたい）。
【００６４】
遺伝子ｃｃｄＢをもつプラスミドは特定の大腸菌株でのみ増殖可能である。例えばＤＢ３．１で、この株はｇｙｒＡ遺伝子に変異があり、ｃｃｄＢに対して耐性を付与する（Ｗａｌｈｏｕｔら，上記に同じ）。それ故、この種の組換えはプラスミドに限られる。何故なら、クローニング系で使われるバクテリオファージベクター、例えばλ置換ベクターは、ｒｅｃＡタンパク質を欠くＤＢ３．１のような細胞中では増殖、複製することはできないからである（ｒｅｃＡ産物は置換型バクテリオファージλの増殖に必要である：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。
【００６５】
これに対して、本発明者らは、本発明によりＲＳ中にｃｃｄＢ遺伝子を含ませたバクテリオファージ、好ましくはλバクテリオファージが、Ｃ６００細胞の培養物中で増殖し、複製可能なことを、意外にも見い出した。なお、ｃｃｄＢ遺伝子を含むプラスミドはＣ６００細胞中で増殖できない。
【００６６】
本発明のベクターにおけるバックグラウンド低減ｃｃｄＢ系の機構を図１，ｇに示す。
興味ある核酸挿入体とＲＳとの置換の際に、置換が起らないか、不完全な連結または置換が生じる可能性がある。この場合、完全な興味ある核酸挿入体をもたないバクテリオファージまたはプラスミドのベクターが培養液中に存在することになって、バックグラウンドを与える。ｃｃｄＢ「自殺遺伝子」を存在下させると、バックグラウンドまたは副産物をゼロ近くまで低減できると考えられる。
【００６７】
バックグラウンドコンタミネーションの問題は、スタッファーＩ（ＲＳ）の除去がゲル（例えばアガロースゲル）上で行われ、スタッファーＩ核酸の断片がＣＳと共に集められ、従ってベクターに再度挿入されうる場合には、精製中にも起りうる。
【００６８】
もう１つのバックグラウンド低減系は「第三の」組換えサイトで、これはＲＳ中に置かれ、本発明のバクテリオファージまたはプラスミドベクターのＣＳの左右のアームの中にある組換えサイトと組換えが可能である。この「第三の」組換えサイトは、ｃｃｄＢ遺伝子の存在下または非存在下でも機能しうる。
【００６９】
好ましくは、このバックグラウンド低減「第三」組換えサイトは、上述のように、ｌｏｘサイトまたはその誘導体、より好ましくは、ｌｏｘＰサイトまたはその誘導体、修飾体または変異体である。しかし、ＲＳ中に存在するバックグラウンド組換えサイトは、ＣＳの両腕中に存在する２つの組換えサイトと、組換えができなければならない。従って、Ｃｒｅリコンビナーゼにより仲介される組換えの場合、３つのサイトはいずれも、相互に組換え可能なｌｏｘ組換えまたはそれらの誘導体でなければならない。
【００７０】
例えば、ＣＳの左右のアームにある２つの組換えサイトおよびＲＳ（スタッファーＩ）中のバックグラウンド低減「第三」組換えサイトは、いずれもすべてｌｏｘＰサイトである。
【００７１】
興味ある核酸挿入体が不完全連結した場合、ＣＳのアームのｌｏｘＰサイトの１つは、切出し工程の間に、「第三」ｌｏｘＰと好ましく組換えし、切出しプラスミドを形成するが、そのプラスミドは、ある場合にはｏｒｉを欠くので複製できず、また別の場合には選択マーカーを欠くので成長できない。
【００７２】
従って、本発明は、記述のように、少なくとも一つの「第三の」組換えサイトを含むバクテリオファージまたはプラスミドベクターを用いて、バックグラウンドの低いまたは無いバルクライブラリーをクローニングするか、または調製する方法にも関する。
【００７３】
このバックグラウンド低減「第三」組換えサイトは、ｌｏｘ以外のどの組換えサイトでも、例えば、上記のような組換えに使われる組換えサイトでもよい。
本発明のバックグラウンド低減バクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクターは、ｃｃｄＢ遺伝子または「第三」組換えサイトなどの存在下であっても、ＲＳ中にｌａｃＺ遺伝子を加え、または存在させてもよい。
【００７４】
本発明のバクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクターは、上記のようなバックグラウンド低減配列の代わりに、またはその存在下で、制限エンドヌクレアーゼ類により認識される２つの非対称サイトも含んでもよい。これら２つの非対称サイト配列は、当該ベクターのＲＳに隣接する。
【００７５】
本発明の目的に有用な非対称サイト配列は、ａ）２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列またはｂ）クラスIIＳ制限酵素類により認識可能な制限エンドヌクレアーゼ非対称切断サイトである。
【００７６】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ａにより販売および記載されている；前記非対称サイト配列の記述もＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔａｌｏｇから入手できる。これらのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列は、１８から３９ｂｐである。しかしながら、本発明においては認識サイト配列はこれらの配列やこれらのサイズには限定されない。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔａｌｏｇは、Ｉ−Ｃｅｕ−Ｉによる５回の繰返し消化の後、ＤＮＡ断片の９５％以上が、本酵素により連結および再切断可能と、報告している。
【００７７】
好ましくは、前記非対称サイト配列を切断できる制限ホーミングエンドヌクレアーゼ類は、Ｉ−ＣｅｕＩ，ＰＩ−ＳｃｅＩ，ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＩ−ＳｃｅＩより成る群から選択される。
【００７８】
ＲＳが除かれ、相互に連結しない２つのホーミングエンドヌクレアーゼ認識サイト配列をＣＳ腕の末端部にもつようになったベクターを示す；ＲＳは、これらのサイトの配列に特異的なホーミングエンドヌクレアーゼを用いて取り除かれた。隣接して配置された一対のホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列（これらの配列はベクターのものと同じである）をもつ興味ある核酸挿入体が、上記のＲＳを除去したベクターへの連結のために提供されている。ベクターの１つのホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列が、当該挿入体の相補性ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列を認識し、ハイブリッド形成する。ベクターの第２ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列が、ある時間経過後、好ましくは一晩後に、興味ある挿入体のもう一方の末端部に配置された相補性ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列を認識し、ハイブリッド形成する。結局、本システムを用いて、ある時間の後、挿入体のすべての相補性部位配列は、ベクターの相補性サイト配列を認識し、ハイブリッド形成する。結果として、挿入体・ベクター連結が行われる。挿入体・挿入体およびベクター・ベクターの連結は、それらの末端部が相補的でないため起らず、副産物が低減する。このシステムの場合、当該ベクターに入る核酸コンタミネーションも低減される。
【００７９】
ホーミングエンドヌクレアーゼ認識サイト配列は、デスティネーションベクター、好ましくはプラスミドヘ配置も可能で、そのサブクローニング工程は、有利に実施できる。
このデスティネーションベクターは、当該ベクターのものと同一の２つのエンドヌクレアーゼ認識サイト配列を隣接して配置した、興味ある核酸挿入体と連結する。
【００８０】
同じ工程は、クラスIIＳエンドヌクレアーゼ酵素類により認識される非対称サイト配列を、ホーミングエンドヌクレアーゼサイト配列の代わりに使う場合にも実施可能である。クラスIIＳ制限酵素類は、ＡｌｗＡ，ＡｌｗＸＩ，Ａｌｗ２６Ｉ，ＢｂｓＩ，ＢｂｖＩ，ＢｂｖII，ＢｃｓｆＩ，ＢｃｃＩ，ＢｃｇＩ，ＢｃｉＶＩ，ＢｉｎＩ，ＢｍｒＩ，ＢｐｍＩ，ＢｓａＩ，ＢｓｅＲＩ，ＢｓｇＩ，ＢｓｍＡＩ，ＢｓｍＢＩ，ＢｓｐＭＩ，ＢｓｒＤＩ，ＢｓｔＦ５Ｉ，ＥａＲＩ，Ｅｃｏ３１Ｉ，Ｅｃｏ５７Ｉ，Ｅｓｐ３Ｉ，ＦａｕＩ，ＦｏｋＩ，ＧｓｕＩ，ＨｇａＩ，ＨｉｎＧＵII，ＨｐｈＩ，Ｋｓｐ６３２Ｉ，ＭｂｏII，ＭｍｅＩ，ＭｎII，ＮｇｏＶIII，ＰｌｅＩ，ＲｌａＡＩ，ＳａｐＩ，ＳｆａＮＩ，ＴａｑII，ＴｔｈｌｌｌII，ＢｓｎＩｓ，ＢｓｍＦＩ，ＢｓｅＭII，および同様なもの（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  Ｗ．ら，１９９１，Ｇｅｎｅ，１００，１３−２６；およびＣａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を含む。
【００８１】
いくつかの制限酵素の認識サイトおよび切断サイトの例（括弧内は、認識サイトおよび切断サイト）は、ＢｂｖＩ（ＧＣＡＧＣ  ８／１２），ＨｇａＩ（ＧＡＣＧＣ  ５／１０），ＢｓｍＦＩ（ＧＧＧＡＣ  １０／１４），ＳｆａＮＩ（ＧＣＡＴＣ  ５／９），およびＢｓｐＩ（ＡＣＣＴＧＣ  ４／８）である。
【００８２】
上述のエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列は、ｃｃｄＢ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、および／またはＲＳ中への「第三」バックグラウンド低減組換えサイト（例えばｌｏｘ）の存在下でも、本発明のバクテリオファージまたはプラスミドクローニングベクター中へ配置することが可能である。
【００８３】
上述のようにエンドヌクレアーゼ非対称系と連結されたベクターは、引き続いて、ＣＳ中に存在する任意の組換え系、例えばｃｒｅ−ｌｏｘ組換え酵素、好ましくはｌｏｘＰ，Ｋｗ，ＦＬＰ，Ｔｎ３レス／レソルバーゼ、β組換え酵素、などにより切出されることが可能である。それ故、エンドヌクレアーゼ非対称性を含む本発明のベクターは、少なくとも一対の組換えサイトもＣＳ中に含む。
【００８４】
本発明のクローニングベクターのＲＳ（またはスタッファーＩ）は当該ベクターにより除去され、連結工程で興味ある核酸挿入体と置換される。
本発明の態様のすべてで使われる興味ある核酸挿入体は、ＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドより成る群から選択される。有利には、長いｃＤＮＡおよび好ましくは完全長ｃＤＮＡである。完全長ｃＤＮＡは好ましくは均等化および／または差引き完全長ｃＤＮＡである。
【００８５】
本発明に従うベクター類はいずれも、興味ある核酸のクローニングに、およびライブラリー、特に完全長ｃＤＮＡライブラリー／ライブラリー類、の調製に非常に有用であることが判明した。
【００８６】
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体をクローニングする、または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、ａ）少なくとも１つの本発明のクローニングベクターを調製する；ｂ）当該クローニングベクター中のＲＳを、興味ある核酸挿入体と置換し、興味ある核酸挿入体を含むベクターを得る；ｃ）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの切出しを行う；ｄ）興味ある核酸挿入体をもつ（組換え体）プラスミド、または興味ある核酸挿入体をもつ（組換え体）プラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法に関する。
【００８７】
所望により、工程ｂ）およびｃ）の間に、クローニングベクターの増幅の工程を行うことが可能である。
本発明の前記方法は、バックグラウンドを減らしたまたは無い状態で、興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製するために使用可能である。
【００８８】
従って、本発明は、バックグラウンドが低いか無い状態で、興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）上述のように、バックグラウンド低減系を含む、本発明の少なくとも１つのクローニングベクターを調製する；（ｂ）工程（ａ）のベクターのＲＳを興味ある核酸挿入体と置換する；（ｃ）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含むプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ切出しを行う；（ｄ）興味ある核酸挿入体をもち、またバックグラウンド低減配列を欠く（組換え体）プラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
【００８９】
所望により、工程ｂ）およびｃ）の間に増幅工程が行われる。
本発明によるバックグラウンド低減系は、遺伝子ｃｃｄＢまたは「第三」組換えサイト配列（ＣＳの左右アームの中にある２つのｌｏｘ組換えサイトと組換え可能な）であってよく、それは、本発明のバクテリオファージまたはプラスミドのＲＳ中に配置される。前記「第三」組換えサイトは、好ましくはｌｏｘサイトまたはその誘導体であり、より好ましくはｌｏｘＰサイトまたはその誘導体である。
【００９０】
Ｇａｔｅｗａｙ様の方法の場合、遺伝子ｃｃｄＢは、デスティネーションベクターのＲＳ中へ配置される。
前記バクテリオファージまたはプラスミドベクターまたはデスティネーションベクターは、ｌａｃＺ遺伝子を含むことも可能である。
【００９１】
別途、本発明による前記バックグラウンド低減法では、バクテリオファージまたはプラスミドベクターは、ＲＳに隣接する２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識部位配列を含むことも可能である。
【００９２】
従って、本発明は、興味ある核酸挿入体をクローニングする、または興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ベクターのＲＳに隣接して配置された２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列を含む、少なくとも１つのバクテリオファージまたはプラスミドベクターを調製する；（ｂ）工程ａ）のベクター中へ配置された２つの配列と連結できる２つのエンドヌクレアーゼ非対称認識サイト配列を両隣に含む興味ある核酸挿入体によってＲＳを置換し、興味ある核酸挿入体を含むベクターを得る；（ｃ）興味ある核酸挿入体、または興味ある核酸挿入体を含む少なくとも１つのプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの切出しを行う；（ｄ）バックグラウンドが低いか無い状態で、興味ある核酸をもつ（組換え体）切出しプラスミドまたはデスティネーションプラスミド、または当該プラスミド（類）のライブラリーを回収する、工程を含む前記方法にも関する。
【００９３】
さらに、本発明は、本発明のベクターを用いる、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系に関する。
従来技術の項に記載したように、当該技術で周知（Ｐｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６）のＣｒｅリコンビナーゼ固相ｉｎ  ｖｉｖｏ切出し（図３も参照されたい）は、低いプラスミド収量（Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，１９９０，上記に同じ）およびプラスミドの不安定性という欠点がある；実際、Ｃｒｅリコンビナーゼは構成的に発現されて、プラスミドの２量体／多量体の生成を起こして、高比率の無プラスミド細胞をもたらし、配列分析の効率を損なう（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３６：１０９７−１１０３）。
【００９４】
一方、Ｃｒｅ液相ｉｎ  ｖｉｖｏ切出しの使用は、これまで成功していない。その理由は、液培養では短いプラスミドを含む細胞は非常に長いプラスミドを含む細胞より速く複製し、短いプラスミド（すなわち興味ある短い核酸挿入体）の方にバイアスを生じ、長いまたは完全長核酸挿入体を得るのが極めて難しいためである。
【００９５】
本発明者らは、増殖（複製）および増幅の極めて低いか無い条件下の液相でプラスミドの切出しを行い、興味ある核酸挿入体を抽出し、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない細胞中で増殖が可能な種々のプラスミドを調製し、および固相中で（プレート上で）さらに増殖（増幅）を行わせることにより、従来技術の前述の欠点を実質的に回避できることを、意外にも見い出した。
【００９６】
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体をクローニングする、または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する方法であって、ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含む少なくとも１つのクローニングベクターであって、当該ＣＳがその左右アームに位置する少なくとも２つのｌｏｘ組換えサイトまたはそれらの誘導体を含むバクテリオファージベクターである、前記クローニングベクターを調製する；ｂ）当該クローニングベクター中のＲＳを興味ある核酸挿入体で置換する；ｃ）当該ベクターをパッケージングする；ｄ）ｃｒｅ組換え酵素を発現する少なくとも１つの細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ液相感染させる；ｅ）切出しプラスミドが短時間しかまたは全く増殖しない条件下で、興味ある核酸挿入体を含むプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏ液相切出しを行わせる；ｆ）細胞溶解を行わせ、前記挿入体をもつプラスミドまたはそれらのプラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
【００９７】
この方法は、所望により、ｇ）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない少なくとも１つの細胞を電気穿孔または形質転換し、工程ｆ）のプラスミドを当該細胞中へ貫入させる；ｈ）工程ｇ）におけるように感染させた細胞をプレーティングし、興味ある核酸挿入体をもつプラスミドまたはそれらのプラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む。
【００９８】
前記電気穿孔は、当該技術分野で周知の方法に従って行われる。前記形質転換は、好ましくは化学的処置、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１．７１−１．８４に従って行われる。
【００９９】
本方法で用いるバクテリオファージベクターは、好ましくはλバクテリオファージである。
相互に組換えするｌｏｘ組換えサイトは、上記のように、変異、修飾または誘導のいずれの型のｌｏｘサイトでもよく、好ましくはｌｏｘＰであり、変異、修飾または誘導化されていてもよい（従って、通常、ｌｏｘＰまたはその誘導体と表示される）。
【０１００】
本方法の工程ｅ）は、好ましくは２０〜４℃の温度で、０〜３時間で行われる。当該温度は好ましくは室温から３７℃である。
本発明者らは、新しいかつ創意に富むｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え法も開発した。
【０１０１】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏ法では、興味ある核酸挿入体を含むバクテリオファージベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、当該技術分野で知られる（細菌用）パッケージング抽出物（エキス）（例えば、ＧｉｇａｐａｃｋＲ
またはＧｉｇａｐａｃｋｇｏｌｄＲ または同等物、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳ）の存在下で、パッケージされる。エキス中にあるヌクレアーゼ類は、パッケージされなかった短い核酸および核酸コンタミネーション全般を切断する。その結果、パッケージされたベクターの核酸が精製される。
【０１０２】
５．５ｋｂのスタッファーIIを含むベクター（または３７．５ｋｂのＣＳのサイズをもつバクテリオファージベクター）が使われる好ましい場合、０．５ｋｂ未満のサイズをもつ短いおよび完全長でないｃＤＮＡは、パッケージされず、エソヌクレアーゼにより除去される。その結果、短いｃＤＮＡに対するバイアスが低いか無いライブラリーが得られる。このライブラリーは、非常に長いおよび完全長ｃＤＮＡの調製に非常に有用である。
【０１０３】
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーをクローニングする方法であって、（ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、当該ＣＳがその左右アームに位置する２つのｌｏｘ組換えサイトまたはそれらの誘導体を含むバクテリオファージベクターである、少なくとも１つのクローニングベクターを調製する；（ｂ）少なくとも１つのクローニングベクター中のＲＳを興味ある核酸挿入体で置換する；（ｃ）パッケージングエキスの存在下で、工程ｂ）のバクテリオファージクローニングベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングを行う；（ｄ）キャプシドからバクテリオファージクローニングベクターを抽出する；（ｅ）Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で、当該ベクターから、興味ある核酸挿入体を含むプラスミドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで切出す；（ｆ）当該プラスミドまたはプラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
【０１０４】
本方法は、（ｇ）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しない少なくとも１つの細胞を電気穿孔または形質転換して前記プラスミドを当該細胞へ導入する；（ｈ）工程ｇ）の細胞をプレーティングして、興味ある核酸挿入体をもつプラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する、工程をさらに含んでもよい。
【０１０５】
所望により、工程ｃ）およびｄ）の間にプレート上でバクテリオファージの増幅工程を行ってもよい。
前記ｌｏｘ組換えサイトは、それらの変異、修飾、または誘導されたｌｏｘサイトでよく、好ましくはｌｏｘＰまたはその誘導体でもよい。
【０１０６】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｒｅ−ｌｏｘ法で使われるバクテリオファージは、好ましくはλバクテリオファージである。
さらに、本発明者らは、本発明のベクターからの興味ある核酸挿入体を、少なくとも１つのデスティネーション機能性ベクターヘ移すことによる、Ｇａｔｅｗａｙ機構に基づく方法を開発した。この機能性ベクターは、さまざまな用途、例えば、配列分析、細菌または真核生物細胞中でのタンパク質の発現、タンパク質融合産物の作出、その他に利用可能である。
【０１０７】
既に述べたように、Ｇａｔｅｗａｙ法は、プラスミドにのみ関係し、短いｃＤＮＡに強いバイアスを示す。Ｇａｔｅｗａｙ法では、ｃＤＮＡがＰＣＲにより増幅され、プラスミドデスティネーションベクターへ挿入される。しかし、ｃＤＮＡのＰＣＲ反応時間は非常に長く、一般に反応は一晩行われるが、それは効率の低くさおよびサイズバイアスを意味している。短い挿入体をもつ断片は、長い挿入体をもつ断片より、速やかに組換えする。従って、混合した場合、常にサイズバイアスがあり、最も短いものがより長いものと競合し、短い方が効率よくクローニングされ、サイズバイアスを起こす。
【０１０８】
本発明者らは、Ｇａｔｅｗａｙ法のこのバイアス問題を解決した。本発明の方法は、（異なるサイズの）興味ある核酸をバクテリオファージベクター中へ連結する工程を含む。
本発明のバクテリオファージベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ法の供与ベクターよりサイズが大きい（例えば、３７．５ｋｂプラス核酸挿入体）。本発明に従うＣＳサイズをもつベクターは、短および長挿入体を識別せず、長短両方の挿入体を含むベクター類は、同じような効率で、増幅および／または切出しされるので、短い核酸挿入体に対するバイアスはない。
【０１０９】
従って、本発明は、少なくとも１つの興味ある核酸挿入体をクローニングする、または少なくとも１つの興味あるバルク核酸ライブラリーを調製する、「Ｇａｔｅｗａｙ様」方法であって、（ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、当該ＣＳがバクテリオファージベクターセグメントであり、ＲＳは２つの組換えサイトにより隣接され、これらの組換え体サイトが相互に組み換えをしない、少なくとも１つのクローニングベクターを調製する；（ｂ）本発明に従い核酸挿入体で前記ＲＳを置換する；（ｃ）工程ｂ）の少なくとも１つのバクテリオファージクローニングベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングする；（ｄ）工程（ａ）のクローニングベクターの組換えサイトと組換え可能な２つの組換えサイトに隣接されるデスティネーション可換セグメント（ＲＳ）を含む少なくとも１つのデスティネーションベクターを工程ｃ）のクローニングベクターに提供することにより、興味ある核酸挿入体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切出しを行う；（ｅ）興味ある前記核酸挿入体をもつ組換えプラスミドまたは当該プラスミドのライブラリーを回収する、工程を含む前記方法を提供する。
【０１１０】
好ましくは、前記バクテリオファージはλバクテリオファージである。
前記バクテリオファージクローニングベクターまたはデスティネーションベクターのＲＳに隣接する、相互に組換えない２つの組換え部位は、ａ）ａｔｔＢ，ａｔｔＰ，ａｔｔＬ，およびａｔｔＲまたはそれらの誘導体より成る群から選択される組換え部位、またはｂ）ｌｏｘ組換え部位またはその誘導体、好ましくはｌｏｘＰまたはその誘導体（例えば、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ５１１）であってもよい。
【０１１１】
興味ある核酸が、Ｇａｔｅｗａｙ技術を使って、デスティネーションベクターに移された後、ａ）ＧＷ直接；ｂ）ＧＷ間接；ｃ）ＧＷ増幅法という手続きに従って、さらなるデスティネーションまたは受入れベクターへ移してもよい。
【０１１２】
本発明に従い興味ある核酸挿入体を運ぶ前記切出しプラスミドまたはデスティネーションプラスミドは、均等化および／または差引き化法でドライバーとして使用可能である。  ｃＤＮＡライブラリー、好ましくは完全長ｃＤＮＡライブラリーの均等化および／または差引き化の方法は、Ｃａｒｎｉｎｃｉら，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０：１６１７−１６３０によって開示されている。
【０１１３】
従って、本発明は、少なくとも１つの均等化および／または差引き化ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）本発明の前記方法に従って、切出される少なくとも１つのプラスミドまたは調製されるデスティネーションプラスミドを、提供する；（ｂ）工程ｂ）のプラスミドを核酸標的のプールへ提供する；（ｃ）前記プラスミド／標的ハイブリッドを除去する；（ｄ）本発明の前記プラスミドにハイブリッド形成しなかった均等化および／または差引き化核酸標的を集める、工程を含む前記方法に関する。
【０１１４】
一つの態様によれば、工程ａ）のプラスミドは１本鎖とされる。例えば、それは、２本鎖プラスミドの１本鎖に少なくとも１つのニックをつくることにより処理される。次いで、ニックされた鎖は除去され、最終的に工程（ｃ）から（ｄ）が適用される。
【０１１５】
好ましくは、ニックは、タンパク質ＧｅｎｅII（Ｇｅｎｅ−ｔｒａｐｐｅｒ  Ｋｉｔ，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳ）を使って導入し、ニックされた鎖は、エクソヌクレアーゼにより除去される。そのエクソヌクレアーゼは好ましくはＥｘｏIIIである。
【０１１６】
さらなる態様によれば、本発明は、少なくとも１つの均等化および／または差引き化ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）構築セグメント（ＣＳ）および可換セグメント（ＲＳ）を含み、ＣＳがＦ１のｏｒｉを含む、本発明の少なくとも１つのベクターを提供する；（ｂ）本発明に従い興味ある核酸挿入体でＲＳを置換する；（ｃ）ヘルパーファージを添加し、細胞から分泌される多数の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ベクターコピーをつくる；（ｄ）工程ｃ）からのコピーを核酸標的のプールへ提供する；（ｅ）当該プラスミド／標的ハイブリッドを除去する；（ｆ）当該標的とハイブリッド形成しなかった均等化および／または差引き化核酸標的を集める、工程を含む前記方法に関する。
【０１１７】
ヘルパーファージは好ましくはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる。ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ）で細菌細胞を感染し、当該細胞から分泌される１本鎖プラスミドを回収し、そのＤＮＡを抽出し、最後に１本鎖プラスミドから当該ＤＮＡを回収することから成る、ｓｓＤＮＡベクターを調製する方法のより詳細な記述は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｔｒａｔａｇｅｎｅユーザーマヌアルで見ることができる。ベクターを１本鎖にするためにヘルパーファージを使う方法も、（Ｂｏｎａｌｄｏら，１９９６．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：７９１−８０６）に記載されている。
【０１１８】
ｆ１（＋）複製起点を使う場合、Ｒ４０８のようなヘルパーファージを使ってもよい（Ｓｈｏｒｔら，１９８８，上記に同じ）。
本発明によるバクテリオファージベクターは、当該技術分野において知られているいずれかの種類のプラスミドまたはプラスミドフラグメント、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、細菌人工染色体プラスミド（ｐＢＡＣ）、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Kim et al., 1996, Genomics, 34:213-218）、ＵＳ５，８７４，２５９号（本明細書中に援用される）による修飾または誘導体ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、または公共デーベースに挙げられるようなまたは上に示される Company's Catalogues より入手可能ないずれか他のプラスミドを用いて製造することができる。
【０１１９】
一つの態様によれば、本発明は、少なくとも複製起点（ｏｒｉ）を含む細菌人工染色体（ｐＢＡＣ）またはｐＢＡＣ誘導体またはそのセグメントを含むバクテリオファージベクターを提供する。このバクテリオファージは、好ましくは、λバクテリオファージである。このｏｒｉは、好ましくは、プラスミドを単コピーで維持することができるｏｒｉでありうる。
【０１２０】
このバクテリオファージ中に含まれるｐＢＡＣまたはそのセグメントは、
−ＤＮＡフラグメントをクローン化することができる部位；
−ＤＮＡフラグメントをクローン化することができるこの部位に隣接した少なくとも１対の誘導性切除媒介部位であって、互いに相対して平行した配向で与えられていて且つＤＮＡフラグメントをクローン化することができる部位を含む切除可能フラグメントを規定する切除媒介部位を更に含んでいてよい。この誘導性切除媒介部位の対は、例えば、互いに相対して平行した配向で与えられる部位でありうる（ＵＳ５，８７４，２５９号を参照されたい）。切除媒介部位の対は、好ましくは、ＦＲＴ部位である。このバクテリオファージは、切除媒介部位の対中に、配列番号４５に示される配列を更に含んでいてよい（ＵＳ５，８７４，２５９号による）。
【０１２１】
このバクテリオファージ中に含まれるｐＢＡＣまたはそのセグメントは、誘導性複製起点、好ましくは、ｏｒｉＶを更に含んでいてよい。したがって、ｏｒｉＶは、ＢＡＣプラスミドの多重コピーを生じるように誘導されてよい（ｐＢＡＣは、通常は、単コピーで存在する）。
【０１２２】
このバクテリオファージは、本出願中に記載される１個またはそれを超える組換え部位を含むことができる。例えば、このバクテリオファージは、次の、（ａ）二つの組換え部位であって、どちらの部位も他方と組換えしない部位；（ｂ）二つのｌｏｘ組換え部位であって、どちらの部位も互いに組換えすることができる部位；（ｃ）二つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識部位配列；（ｄ）クラスIIＳ制限酵素によって認識可能な二つの制限非対称エンドヌクレアーゼ切断部位配列であって、どちらの部位配列も他方と連結する部位配列；より選択される少なくとも二つの組換え部位を含んでいてよい。
【０１２３】
これら二つの組換え部位（ａ）は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲおよびそれらの誘導体からなる群より選択されてよい。
これら二つの組換え部位（ａ）は、互いに組換えしないｌｏｘ組換え部位誘導体であってもよい。
【０１２４】
これら二つの組換え部位（ｂ）は、好ましくは、ｌｏｘＰ部位である。
二つのホーミングエンドヌクレアーゼ部位配列（ｃ）は、好ましくは、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＩ−ＳｃｅＩからなる群より選択される。
【０１２５】
このバクテリオファージは、少なくとも一つのバックグラウンド減少性配列、例えば、（ａ）ｃｃｄＢ遺伝子；（ｂ）ｌａｃＺ遺伝子；（ｃ）ｌｏｘ配列を更に含んでいてよい。
【０１２６】
興味ある核酸をクローニングするまたは興味ある大量核酸ライブラリーを製造する方法であって、
（ａ）ｐＢＡＣ（またはｐＢＡＣ誘導体）またはそのフラグメントを含むバクテリオファージクローニングベクターを製造し；
（ｂ）このバクテリオファージクローニングベクター中に興味ある核酸を挿入し；
（ｃ）興味ある核酸インサートを含むプラスミド（ｐＢＡＣまたはその誘導体）の in vivo または in vitro 切除を可能にし；そして
（ｄ）興味ある核酸インサートを有するＢＡＣプラスミドまたはこれらＢＡＣプラスミドのライブラリーを回収する；
工程を含む方法も提供する。
【０１２７】
本発明は、本発明に従う少なくとも１つのクローニングベクターまたは少なくとも１つのベクター類のライブラリーを、含むキットにも関与し、また、そのためのプライマー設計にも関与する。