(57)【要約】      （修正有）【課題】原虫の増殖を抑制しかつ潜伏感染への移行を阻止し得る抗原虫薬をスクリーニングするための方法の提供。【解決手段】ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれた組換えトキソプラズマ株を用いる、抗原虫薬のスクリーニング方法。このスクリーニング方法では、プロモータ１の活性値を原虫の数と潜伏感染へ移行の程度を掛け合わせた値に相当する指標、プロモータ２の活性値を原虫全体の増殖の程度の指標として候補物質の抗原虫作用を評価することができる。【選択図】図１
2015223105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれた組換えトキソプラズマ株を用いる、抗原虫薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記プロモータ１の活性値及び前記プロモータ２の活性値を指標として候補物質を選択する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記プロモータ１の活性値と前記プロモータ２の活性値の比（プロモータ１／プロモータ２）を指標として候補物質を選択する、請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞に前記組換えトキソプラズマ株を感染させる手順と、
前記細胞に候補物質を処理する手順と、
前記プロモータ１の活性値及び前記プロモータ２の活性値を測定する手順と、
前記プロモータ１の活性値及び／又は前記プロモータ２の活性値の測定値がより小さい候補物質を抗原虫薬として選択する手順を含む、
請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記プロモータ１の活性値と前記プロモータ２の活性値の比（プロモータ１／プロモータ２）を算出する手順と、
該比の算出値がより小さい候補物質を抗原虫薬として選択する手順を含む、
請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記プロモータ１がＢＡＧ１プロモータであり、前記プロモータ２がＴＵＢＡ１プロモータである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれた組換えトキソプラズマ株。
【請求項８】
ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれたトキソプラズマ形質転換用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原虫薬のスクリーニング方法及び組換えトキソプラズマ株に関する。より詳しくは、原虫の増殖を抑制しかつ潜伏感染への移行を阻止し得る抗原虫薬をスクリーニングするための方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
トキソプラズマは、アピコンプレックス門に属する寄生性の原虫である。幅広い哺乳類や鳥類での感染が報告されており、ヒトにおいても世界的に数割程度の人口が感染している。ヒトにおいて臨床上問題となってきたのは、先天性トキソプラズマ症と眼トキソプラズマ症である。先天性トキソプラズマ症は、妊娠の数ヶ月前あるいは妊娠中に母親が初めてトキソプラズマに感染する結果起こり、流産や胎児の水頭症、頭蓋内石灰化、神経系の発達障害等を引き起こす。眼トキソプラズマ症は、ＨＩＶ感染や臓器移植後の医原性免疫不全などによって免疫力が低下した患者に発症し、視野の異常や視力障害を引き起こす。
【０００３】
トキソプラズマは、食肉生産家畜やげっ歯類を中間宿主とし、猫科動物を終宿主とする。ヒトへの感染は、感染動物由来の食肉の生食や、ネコの糞中のオーシスト（虫卵）の経口摂取によって生じる。食肉中の潜伏感染状態の虫は食肉検査で検出することが非常に難しい。また、日本国で認可されている食肉生産家畜用のワクチンは存在しない。
【０００４】
従来の抗原虫薬は、中間宿主体内でヒトへの感染源となる潜伏感染状態の原虫（ブラディゾイト）を誘導してしまうことから、家畜におけるトキソプラズマ症の薬剤治療は適当ではない。また、現在ヒトに用いられる薬剤（サルファ剤）は、活発に増殖を繰り返す増殖期の原虫（タキゾイト）を標的としており、原虫の潜伏感染状態を排除できず、再発を防止できない。このため、原虫の潜伏感染への移行を止めながら原虫の増殖を止める新しい薬剤が必要とされている。
【０００５】
本発明に関連して、非特許文献１には、タキゾイト期（増殖期）に特異的に活性を示すＳＡＧ１プロモータの制御下に赤色蛍光タンパク遺伝子が組み込まれた組換えトキソプラズマ株が記載されている。また、非特許文献２には、脳内局所環境における原虫再活性化のメカニズム解明を目的として、ＳＡＧ１プロモータ支配下に赤色蛍光蛋白遺伝子をつないだ発現ユニット、ブラディゾイト期（潜伏期）に特異的に活性を示すＢＡＧ１プロモータ支配下に緑色蛍光蛋白遺伝子をつないだ発現ユニットの双方を導入した組換えトキソプラズマ株が報告されている。なお、これらの文献には、タキゾイト期及びブラディゾイト期の両方において活性を示すプロモータを利用することは記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Detection of the initial site of Toxoplasma gondii reactivation in brain tissue." Takashima Y, et al, Int. J. Parasitol., 2008, 38(5):601-7.
【非特許文献２】「免疫不全に伴う脳内潜伏トキソプラズマ原虫再活性化の事前予想と再活性化原発局所における宿主遺伝子発現レベルの網羅的解析」（２００７年度報告書）、高島  康弘、厚生労働科学研究費補助金  疾病・障害対策研究分野  エイズ対策研究。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、原虫の増殖を抑制しかつ潜伏感染への移行を阻止し得る抗原虫薬をスクリーニングするための方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供する。
［１］ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれた組換えトキソプラズマ株を用いる、抗原虫薬のスクリーニング方法。
［２］前記プロモータ１の活性値及び前記プロモータ２の活性値を指標として候補物質を選択する、［１］記載のスクリーニング方法。
［３］前記プロモータ１の活性値と前記プロモータ２の活性値の比（プロモータ１／プロモータ２）指標として候補物質を選択する、［２］記載のスクリーニング方法。
［４］細胞に前記組換えトキソプラズマ株を感染させる手順と、前記細胞に候補物質を処理する手順と、前記プロモータ１の活性値及び前記プロモータ２の活性値を測定する手順と、前記プロモータ１の活性値及び／又は前記プロモータ２の活性値の測定値がより小さい候補物質を抗原虫薬として選択する手順を含む、［２］記載のスクリーニング方法。
［５］前記プロモータ１の活性値と前記プロモータ２の活性値の比（プロモータ１／プロモータ２）を算出する手順と、該比の算出値がより小さい候補物質を抗原虫薬として選択する手順を含む、［４］記載のスクリーニング方法。
［６］前記プロモータ１がＢＡＧ１プロモータであり、前記プロモータ２がＴＵＢＡ１プロモータである、［１］〜［５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［７］前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、［１］〜［６］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［８］前記プロモータ１の制御下に組み込まれたレポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼであり、前記プロモータ２の制御下に組み込まれたレポーター遺伝子及びウミシイタケルシフェラーゼである、［７］記載のスクリーニング方法。
【０００９】
［９］ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれた組換えトキソプラズマ株。
［１０］ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれたトキソプラズマ形質転換用ベクター。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、原虫の増殖を抑制しかつ潜伏感染への移行を阻止し得る抗原虫薬をスクリーニングするための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】形質転換用プラスミド（ｐＤＵＡＬＵＣＩ）の構成を説明する図である。
【図２】ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで被験物質の抗原虫作用を評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１３】
１．組換えトキソプラズマ株
本発明に係る組換えトキソプラズマ株は、ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の制御下、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の制御下、にレポーター遺伝子が発現可能に組み込まれていることを特徴する。以下、プロモータ１の制御下に組み込まれたレポーター遺伝子を「レポーター遺伝子１」と、プロモータ２の制御下に組み込まれたレポーター遺伝子を「レポーター遺伝子２」と称する。
【００１４】
この組換えトキソプラズマ株において、ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するプロモータ１の活性値は、ブラディゾイトの数（すなわち原虫の潜伏感染へ移行の程度）の指標とすることができる。そして、プロモータ１の活性値は、その制御下で発現するレポーター遺伝子１の活性値として取得することが可能である。
【００１５】
また、このブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータ２の活性値は、虫体の総数（すなわち増殖期の虫体及び潜伏感染に移行した虫体の両方を含む原虫全体の増殖の程度）の指標とすることができる。そして、プロモータ２の活性値は、その制御下で発現するレポーター遺伝子２の活性値として取得することが可能である。
【００１６】
従って、本発明に係るトキソプラズマ株では、プロモータ１の活性値を指標として原虫の潜伏感染へ移行の程度を、プロモータ２の活性値を指標として原虫全体の増殖の程度を評価することができる。
【００１７】
プロモータ１としては、ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するものであれば特に限定されないが、例えば、ＢＡＧ１（Bradizoite specific antigen 1）プロモータが好適に用いられる。
【００１８】
また、プロモータ２としては、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータであれば特に限定されないが、ＴＵＢＡ１（alpha tubulin 1）プロモータが好適に用いられる。なお、ＧＲＡ１（dense granule protein 1）プロモータは、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化することが知られているが、プロモータ活性の高さ及びこれによるレポーター遺伝子の活性の検出の容易さの観点から、ＴＵＢＡ１がより好ましい（比較例１参照）。プロモータ２としては、この他、ＡＣＴ１（actin 1）、ＲＰＬ３２ （ribosomal protein L32）なども利用できる可能性がある。
【００１９】
プロモータ１の制御下に組み込まれるレポーター遺伝子１及びプロモータ２の制御下に組み込まれるレポーター遺伝子２としては、ルシフェラーゼが好ましい。この他、蛍光タンパク質や、色調を変化させるルシフェラーゼの派生物なども利用できる。高感度な検出が可能であることから、ルシフェラーゼが好ましい。
【００２０】
レポーター遺伝子１及びレポーター遺伝子２には、異なる活性を示すものを用いる。例えば、ルシフェラーゼの場合、異なる基質特異性を有し、当該基質との反応により異なる条件下でそれぞれ異なる励起波長の光を生じさせる酵素を用いることが望ましい。具体的には、例えば、レポーター遺伝子１としてホタルルシフェラーゼを、レポーター遺伝子２としてウミシイタケルシフェラーゼを用いることが好ましい。この他、レポーター遺伝子１及びレポーター遺伝子２として、蛍光タンパク質を用いる場合には、レポーターとして異なる励起波長に応じて、異なる蛍光波長を生じさせる酵素を用いることが好ましい。具体的には、例えば、レポーター遺伝子１としてＧＦＰ、レポーター遺伝子２としてＲＦＰを用いることが好ましい。
【００２１】
組換えトキソプラズマ株は、従来公知の遺伝子工学的手法を用いて作成できる。まず、プロモータ１の制御下及びプロモータ２の制御下にレポーター遺伝子１及びレポーター遺伝子２がそれぞれ発現可能に組み込まれたトキソプラズマ形質転換用ベクターを作成する。ベクターには、汎用の遺伝子導入用プラスミドを用いることができる。プロモータ１、プロモータ２、レポーター遺伝子１及びレポーター遺伝子２の塩基配列をコードする核酸断片を、必要に応じて制限酵素切断配列を付加したプライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。増幅後の核酸断片とプラスミドを制限酵素処理し、必要に応じて精製を行った後、ライゲーション反応を行って形質転換用ベクターを得る。そして、形質転換用ベクターを用いて、宿主のトキソプラズマ株を形質転換することによって、組換えトキソプラズマ株を得る。形質転換は、例えばエレクトロポレーション法などの公知の手法によりベクターを原虫細胞内に導入することにより行えばよい。
【００２２】
２．抗原虫薬のスクリーニング方法
上述の通り、本発明に係る組換えトキソプラズマ株では、プロモータ１の活性値を指標として原虫の潜伏感染へ移行の程度を、プロモータ２の活性値を指標として原虫全体の増殖の程度を評価することができる。従って、この組換えトキソプラズマ株は、所望の抗原虫作用を示す抗原虫薬をスクリーニングするために利用できる。
【００２３】
本発明に係る抗原虫薬のスクリーニング方法は、以下の手順（１）〜（４）を含む。
（１）細胞に前記組換えトキソプラズマ株を感染させる手順。
（２）前記細胞に候補物質を処理する手順。
（３）前記プロモータ１の活性値及び前記プロモータ２の活性値を測定する手順。
（４）前記プロモータ１の活性値及び／又は前記プロモータ２の活性値の測定値がより小さい候補物質を抗原虫薬として選択する手順。
また、本発明に係る抗原虫薬のスクリーニング方法は、上記（４）の手順に替えて又はこれに加えて以下の（５）、（６）の手順を含んでいてもよい。
（５）前記プロモータ１の活性値と前記プロモータ２の活性値の比（プロモータ１／プロモータ２）を算出する手順。
（６）該比の算出値がより小さい候補物質を抗原虫薬として選択する手順。
【００２４】
手順（１）
まず、細胞に本発明に係る組換えトキソプラズマ株を感染させる。細胞を用いる場合、プレートやディッシュなどに細胞を培養し、培養液に原虫の懸濁液を添加する。
【００２５】
手順（２）
次に、抗原虫薬作用の評価対象とする候補物質を細胞に処理する。細胞を用いる場合、細胞の培養液に候補物質あるいはその溶液又は懸濁液を添加する。
【００２６】
手順（３）
プロモータ１の活性値及びプロモータ２の活性値を測定する。例えば、上述したホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼをレポーター遺伝子１及びレポーター遺伝子２として用いる場合、細胞のライセートを調製し、市販のルシフェラーゼアッセイキットを用いてライセート中のホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定することにより、プロモータ１の活性値及びプロモータ２の活性値を得ることができる。
【００２７】
手順（４）〜手順（６）
プロモータ１の活性値は、原虫の数と原虫の潜伏感染へ移行の程度を掛け合わせた値の指標となる。また、プロモータ２の活性値は、原虫全体の増殖の程度の指標となる。このため、得られたプロモータ１の活性値及びプロモータ２の活性値に基づけば、候補物質の抗原虫作用を例えば以下の通り評価することができる。
【００２８】
＜プロモータ１の活性値が大きく、プロモータ２の活性値が小さい場合＞
プロモータ２の活性値が小さいため、候補物質は、原虫の増殖を効果的に抑制できていると評価できる。しかし、プロモータ１の活性値が大きいため、潜伏感染への移行を引き起こしてしまっているといえる。
【００２９】
＜プロモータ１の活性値が小さく、プロモータ２の活性値も小さい場合＞
プロモータ２の活性値が小さいため、候補物質は、原虫の増殖を効果的に抑制できていると評価できる。さらに、プロモータ１の活性値も小さいため、潜伏感染への移行も効果的に阻止できていると評価できる。このように、プロモータ１の活性値を上げることなく、プロモータ２の活性値を下げることができる候補物質は、潜伏感染を誘導することなく、原虫の増殖を抑制できるという点で優れた抗原虫薬となり得る。
【００３０】
上記２つの場合は、評価の典型例であるが、本発明に係る抗原虫薬のスクリーニング方法では、プロモータ１の活性値の大小により原虫の潜伏感染へ移行の阻止作用を、プロモータ２の活性値の大小により原虫増殖の抑制作用を評価することができるため、所望の抗原虫作用を示す候補物質を探索するために利用できる。
【００３１】
評価の指標としては、プロモータ１の活性値とプロモータ２の活性値の比（プロモータ１／プロモータ２）を用いることもできる。プロモータ１の活性値は、ブラディゾイトの数（すなわち原虫の潜伏感染へ移行の程度）の指標である。そして、プロモータ２の活性値は、虫体の総数（すなわち増殖期の虫体及び潜伏感染に移行した虫体の両方を含む原虫全体の増殖の程度）の指標である。従って、上記比に基づけば、虫体総数に占めるブラディゾイト数の割合を評価できる。
【００３２】
比（プロモータ１／プロモータ２）を指標とすれば、例えば原虫の増殖抑制作用が同程度の候補物質であっても、当該比がより小さい候補物質を選択することで、潜伏感染への移行を誘導するリスクがより小さい抗原虫薬を得ることができる。
【００３３】
本発明に係る抗原虫薬のスクリーニング方法は、実施例に記載されるように、マルチウェルプレートを用いた多検体処理が可能であり、１０の２乗のオーダーの原虫を用いた小スケール解析が可能である。従って、本発明に係る抗原虫薬のスクリーニング方法は、所望の抗原虫作用を示す抗原虫薬をハイスループットで探索するために有用である。
【００３４】
さらに、本発明に係る抗原虫薬のスクリーニング方法は、原虫の潜伏感染へ移行の程度を原虫全体の増殖の程度との比（プロモータ１／プロモータ２）で評価することができる。従来の抗原虫薬は、活発に増殖を繰り返す増殖期の原虫（タキゾイト）を標的としており潜伏感染状態を引き起こしてしまう。本発明に係る抗原虫薬のスクリーニング方法によれば、ブラディゾイトの数を虫体の総数で補正することで、原虫の増殖抑制作用が同程度であっても潜伏感染への移行を誘導するリスクがより小さい候補物質を選択でき、原虫の潜伏感染への移行を阻止しながら増殖を抑制できる新規な薬剤を得ることが可能である。
【００３５】
３．原虫の感染機序の解析
本発明に係る組換えトキソプラズマ株では、プロモータ１の活性値を指標として原虫の潜伏感染へ移行の程度を、プロモータ２の活性値を指標として原虫全体の増殖の程度を評価することができる。従って、この組換えトキソプラズマ株は、トキソプラズマの潜伏感染メカニズムを解析するためにも利用できる。
【実施例】
【００３６】
＜実施例１：ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株の作成＞
ブラディゾイトにおいて特異的に活性化するＢＡＧ１プロモータの下流、及び、ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するＴＵＢＡ１プロモータの下流、にそれぞれホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼが発現可能に組み込まれた組換えトキソプラズマ株（ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株）を以下の手順により作成した。
【００３７】
（１）形質転換用ベクターの作成
ＢＡＧ１プロモータの制御下にホタルルシフェラーゼを、ＴＵＢＡ１プロモータの制御下にウミシイタケルシフェラーゼを挿入した形質転換用プラスミド（ｐＤＵＡＬＵＣＩ、図１参照）を作製した。
【００３８】
図１中、「ＨＸＧＰＲＴ  ｃａｓｓｅｔｔｅ」は、外来ＤＮＡ配列を挿入された原虫を選択するための薬剤耐性を与える遺伝子を発現する塩基配列（配列番号１）を示す。「ＢＡＧ１  ５’ＵＴＲ」は、ＢＡＧ１遺伝子の５’側非翻訳領域の塩基配列（配列番号２）を示し、ＢＡＧ１プロモータの塩基配列を含む。「Ｆｉｒｅｆｌｙ  ＬＵＣ」は、ホタルルシフェラーゼの塩基配列（配列番号３）を示す。「ＧＲＡ２  ３’ＵＴＲ」は、ＧＲＡ２遺伝子の３’側非翻訳領域の塩基配列（配列番号４）を示す。「Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬＵＣ」は、ウミシイタケルシフェラーゼの塩基配列（配列番号５）を示す。「ＴＵＢＡ１  ５’ＵＴＲ」は、ＴＵＢＡ１遺伝子の５’側非翻訳領域の塩基配列（配列番号６）を示し、ＴＵＢＡ１プロモータの塩基配列を含む。
【００３９】
プラスミドの作製は、以下の手順で行った。
（１−１）プラスミド「pMini.HT.TUBA1-RenilaLuc-Gra2」の作製
ＴＵＢＡ１  ５’ＵＴＲを、プライマー１及びプライマー２を用いて、トキソプラズマＲＨ株のゲノムから増幅した。また、ウミシイタケルシフェラーゼの塩基配列を、プライマー３及びプライマー４を用いて、市販のプラスミド（pRL-TK、Promega）から増幅した。２つの増幅産物を制限酵素処理し、プラスミドpMini.3xFlag.ht（Sugi T. et al. Eukaryot Cell. 2010, 9, 667-670）に挿入し、pMini.HT.TUBA1-RenilaLuc-Gra2を得た。
【００４０】
プライマー１：5'-AAGCGGCCGCAACGACACAAGGAG-3' （配列番号７、下線はNotIサイト）
プライマー２：5'-GTTTCCACCTGCACTCCCATTTTGTCGAAAAAGGGAATTC-3' （配列番号８、下線はEcoRIサイト）
プライマー３：5'-GAATTCCCTTTTTCGACAAAATGACTTCGAAAGTTTATG-3' （配列番号９、下線はEcoRIサイト）
プライマー４：5'-AGATCTTATTGTTCATTTTTGAGA-3' （配列番号１０、下線はBglIIサイト）
【００４１】
（１−２）プラスミド「pBAG1-FireflyLuc-Gra2」の作製
ホタルルシフェラーゼの塩基配列を、プライマー５及びプライマー６を用いて、市販のプラスミド（pGL4.10、Promega）から増幅した。増幅産物を制限酵素処理し、市販のキット（InFusion cloning system、Takara-clontech）を用いて、pBAG cassette plasmid（Masatani et al. unpublished data）のＢＡＧ１  ５’ＵＴＲ及びＧＲＡ２  ３’ＵＴＲの間に挿入し、pBAG1-FireflyLuc-Gra2を得た。
【００４２】
プライマー５：5'-GCCACCAAGCTTGATATGGAAGATGCCAAAAAC-3' （配列番号１１）
プライマー６：5'-CTGCAGGAATTCGATTTACACGGCGATCTTGCC-3' （配列番号１２）
【００４３】
（１−３）プラスミド「pDUALUCI」の作製
ＢＡＧ１  ５’ＵＴＲ及びホタルルシフェラーゼの塩基配列を、制限酵素を用いてpBAG1-FireflyLuc-Gra2から切り出した。また、ホタルルシフェラーゼの塩基配列及びＧＲＡ２  ３’ＵＴＲを、プライマー７及びプライマー８を用いて、pBAG1-FireflyLuc-Gra2から増幅し、制限酵素処理した。制限酵素処理により得られた２つの断片をpMini.HT.TUBA1-RenilaLuc-Gra2に挿入し、pDUALUCIを得た。
【００４４】
プライマー７：5'-GCCACCAAGCTTGATATGGAAGATGCCAAAAAC-3' （配列番号１３）
プライマー８：5'-AAGGGCCCTGGCGAAATCAACGCAC-3' （配列番号１４、下線はApaIサイト）
【００４５】
（２）形質転換
文献（Karasov, A.O., et al, Int. J. Parasitol. 2005, 35, 285-291）に記載の方法に従って、ｐＤＵＡＬＵＣＩをＰＬＫ／ｈｘｇｐｒｔ-株にトランスフェクトし、形質転換株を選択した。簡単に説明すると、ＮｏｔＩで直線化したｐＤＵＡＬＵＣＩ  ２０μｇを、バッファーに懸濁した原虫（１．０×１０6個）にエレクトロポレーションにより導入した。トランスフェクト後の原虫をＭＰＡ（５０μｇ／ｍｌ）及びキサンチン（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間後から選択を開始し２週間程度薬剤選択を行った。選択された原虫を限界希釈によってクローン化して、強いルシフェラーゼ活性を発するクローンをＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株として得た。
【００４６】
＜実施例２：ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株を用いた抗原虫薬のスクリーニング＞
ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株を用いて、原虫の増殖を抑制しかつ潜伏感染への移行を阻止する作用を有する低分子化合物をスクリーニングした。
【００４７】
宿主細胞（Ｖｅｒｏ細胞）を９６ウェルプレートで単層培養した。ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株原虫を１０００個／ウェルで播種した。２時間培養後、培養液（1%FCS, DMEM）を、ＤＭＳＯに溶解させた被験物質を含む培養液に交換した。原虫播種２日後に、市販のキット（Dual-Glo Luciferase Assay System、Promega）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。
【００４８】
６種類の化合物について測定を行った結果を図２に示す。図中、横軸はウミシイタケルシフェラーゼの相対蛍光値（ＴＵＢＡ１プロモータの活性値）を示し、原虫の増殖の指標となる。また、縦軸はホタルルシフェラーゼの相対蛍光値（ＢＡＧ１プロモータの活性値）を示し、原虫の潜伏感染移行の指標となる。図中、「ｐＨ８．１」は、既知の潜伏感染誘導条件であるアルカリ条件（ｐＨ８．１）で細胞を処理した結果を示す。また、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、被験物質による処理を行っていない対照群の結果を示す。
【００４９】
化合物１は、２５０ｎＭ及び１２５ｎＭの処理では、感染期虫体の増殖を抑制するものの、潜伏感染への移行を強く誘導した。また、５００ｎＭの処理でも、感染期虫体の増殖抑制効果は高まるものの、やはり潜伏感染への移行を引き起こした。化合物３も同様の性状を示した。
【００５０】
化合物２は、２５０ｎＭ及び１２５ｎＭの処理では、感染期虫体の増殖を抑制するものの、潜伏感染への移行を強く誘導した。一方、５００ｎＭの処理では、潜伏感染への移行を阻止しながら、感染期虫体の増殖も顕著に抑制した。
【００５１】
化合物４は、潜伏感染への移行を阻止しながら感染期虫体の増殖を抑制し、用量依存的な増殖抑制効果を示した。化合物６も同様の性状を示した。
【００５２】
化合物５は、感染期虫体の増殖を抑制できたが、潜伏感染への移行も引き起こした。
【００５３】
以上の結果から、原虫の増殖を抑制しかつ潜伏感染への移行を阻止する作用に優れる化合物として化合物４及び化合物６を選択できた。
【００５４】
＜比較例１：プロモータの比較検討＞
ブラディゾイト及びタキゾイトにおいて活性化するプロモータとして、ＴＵＢＡ１プロモータに替えてＧＲＡ１プロモータを用いた以外は実施例１と同様にして組換えトキソプラズマ株を作成した。形質転換用プラスミドの作成に用いた、ＧＲＡ１プロモータの塩基配列を含むＧＲＡ１遺伝子の５’側非翻訳領域の塩基配列を配列番号１５に示す。
【００５５】
作成した組換えトキソプラズマ株を、実施例２と同様にして宿主細胞に感染させ、２日後に市販のキットを用いてルシフェラーゼアッセイを行った。
【００５６】
結果、ＴＵＢＡ１プロモータに比べてＧＲＡ１プロモータではウミシイタケルシフェラーゼの活性値が弱く、ブラディゾイト及びタキゾイトに共通して活性化するプロモータには、ＴＵＢＡ１プロモータを用いることが好ましいことが分かった。
【００５７】
＜参考例１：スクリーニング系の感度評価＞
実施例２のスクリーニング系における虫体数の検出感度限界を決定した。
【００５８】
宿主細胞（Ｖｅｒｏ細胞、１．８×１０6）をディッシュ（６ｃｍ）で単層培養した。ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株原虫を播種し、２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄して未感染の原虫を取り除いた後、培養液（1%FCS, DMEM）を、維持用（急性感染期型虫体用）培養液（1%FCS, DMEM）又は潜伏感染誘導培養液（1%FCS, 25mM HEPES, DMEM, pH8.1）に交換した。
【００５９】
維持用培地を入れたディッシュは３７℃のＣＯ2培養器に入れ５％ＣＯ2で培養を行った。潜伏感染誘導培養液を入れたディッシュは３７℃の湿潤箱に入れ、大気の分圧と同じＣＯ2条件で培養を行った。２日後に培地を交換し、４日目に原虫を細胞から回収した。血球計算盤を用いて原虫数の計測し、希釈列を作成した。希釈後の所定数の虫体をそれぞれ溶解し、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６０】
感染期虫体および潜伏期虫体それぞれの原虫数と得られたルシフェラーゼ活性を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2015223105.tif 000003
【００６２】
原虫の増殖の指標となるウミシイタケルシフェラーゼの活性値（ＴＵＢＡ１プロモータの活性値）は、１０2の原虫数でも十分な感度で検出が可能であった。また、原虫の潜伏感染移行の指標となるホタルルシフェラーゼの活性値（ＢＡＧ１プロモータの活性値）も、１０2の原虫数で十分な感度で検出できた。このことから、本スクリーニング系が高い感度を有し、ハイスループットスクリーニングに適した感度を有することが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１：ＨＸＧＰＲＴ  ｃａｓｓｅｔｔｅの塩基配列
配列番号２：ＢＡＧ１遺伝子の５’側非翻訳領域の塩基配列
配列番号３：ホタルルシフェラーゼの塩基配列
配列番号４：ＧＲＡ２遺伝子の３’側非翻訳領域の塩基配列
配列番号５：ウミシイタケルシフェラーゼの塩基配列
配列番号６：ＴＵＢＡ１遺伝子の５’側非翻訳領域の塩基配列
配列番号７：プライマー１の塩基配列
配列番号８：プライマー２の塩基配列
配列番号９：プライマー３の塩基配列
配列番号１０：プライマー４の塩基配列
配列番号１１：プライマー５の塩基配列
配列番号１２：プライマー６の塩基配列
配列番号１３：プライマー７の塩基配列
配列番号１４：プライマー８の塩基配列
配列番号１５：ＧＲＡ１遺伝子の５’側非翻訳領域の塩基配列
【図１】
2015223105.tif 000004
【図２】
2015223105.tif 000005
【配列表】
2015223105000001.app