(57)【要約】  新しいerbBベースのリガンド結合分子を、その調製及び使用の方法とともに開示する。前記結合分子は、組換えDNA分子から発現されるタンパク質である。前記タンパク質は、活性リガンドに結合するerbB細胞外ドメインを含む。これらの結合構成分子は、循環リガンドを結合し且つ隔離するトラップとして作用し、それらを細胞性erbB受容体に結合できなくする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ErbBリガンドに対する結合親和性を有する結合分子であって、当該結合分子全体がErbB受容体の細胞外領域またはその一部である結合分子。
【請求項２】
前記結合分子が、水溶液中で実質的に可溶性である、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記結合分子が、ErbB受容体の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項４】
ErbB1由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項５】
ErbB3由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項６】
ErbB4由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項７】
ErbB受容体タンパク質の一部をコードする核酸配列を含む組換えDNA分子を含む、真核細胞。
【請求項８】
前記細胞が、ErbBリガンドに対する結合親和性を有する結合分子を産生する、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項９】
前記細胞が、ErbBリガンドに対する結合親和性を有する結合分子を産生し、前記結合分子が水溶液中で可溶性である、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項１０】
前記結合分子が、当該細胞の外部且つ当該周辺培地中に運搬される、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項１１】
前記結合分子が、ErbB受容体の細胞外ドメインをさらに含む、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項１２】
ErbB1由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項１３】
ErbB3由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項１４】
ErbB4由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項１５】
前記組換えDNA分子が、Factor Xa切断部位、及びヒト免疫グロブリンG1のFc部分を含む、請求項７に記載の真核細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、ErbBリガンドに対する結合親和性を有する結合分子を産生する、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、ErbBリガンドに対する結合親和性を有する結合分子を産生し、前記結合分子が水溶液中で可溶性である、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項１８】
前記結合分子が、当該細胞の外部且つ当該周辺培地中に運搬される、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項１９】
前記結合分子が、ErbB受容体の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項２０】
ErbB1由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項２１】
ErbB3由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項２２】
ErbB4由来の細胞外ドメインをさらに含む、請求項１５に記載の真核細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、受容体チロシンキナーゼ及びそれらの活性リガンドの分野、可溶性erbBリガンド結合分子を作製するための遺伝子操作の使用、細胞によって可溶性型で分泌される受容体の改変型を作製するための組換えDNAベクター内への改変コンストラクトの挿入、並びに疾患の治療におけるそのような分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、多くの国において死をもたらす原因である疾患の群に対する一般的な名称である。要するに、ガンは、損傷を受けた、制御不能な細胞の異常な増殖が原因である疾患である。異常な細胞増殖は、正常な細胞の増殖、発達、及び死を制御する、ある決定的な遺伝子または遺伝子群における突然変異が理由で起こる。これらの異常な細胞が増殖すると、腫瘍が形成する。最悪の場合、前記腫瘍は身体に多くの悪影響を引き起こし、ついには死をもたらすのに十分に大きくなり、あるいは身体中を十分に広がる。
【０００３】
ガンを治療する主要な方法は、腫瘍を除去することを意図した手術によるものであり、それによって健常な組織のその侵入を引き止める。手術は危険の高い試みである可能性があり、あらゆる患者に適切でないかもしれない。また、例えば、手術することのできない脳の領域に腫瘍が見つかった場合、または白血病等の状態等、あらゆる腫瘍と闘うために手術を用いることが可能ではない。
【０００４】
結果として、手術が保証されないまたは可能ではない腫瘍を処置するために、代替的な治療法が考案されている、また考案されつつある。そのような代替法の１つは放射線である。腫瘍を照射することは、標的腫瘍細胞及びガン細胞でないかもしれない付随的に暴露された細胞に死またはダメージをもたらす。衰弱させる副作用がよく知られている。
【０００５】
化学療法は、当該患者に細胞毒性化合物を供給することによって身体中の腫瘍組織を破壊するためのもう一つの試みである。このタイプの治療法は、ガンと闘う単独の方法として独立して、あるいは手術または放射療法の前または後のいずれかに用いられてよい。放射線におけるように、衰弱させる副作用がよく知られており、手術または放射線のいずれかよりも患者の健康状態により危険である程度のものであるかもしれない。
【０００６】
非ガン性組織にもたらされるダメージを回避し、且つこれらの種々のタイプの治療法の副作用を回避することを意図して、ガン性組織を除去するために単独で用いられる治療法が研究されている。そのような治療法の1つは、大腸腫瘍等の腫瘍に特異的に用いられる抗体の使用であり、それによって健常な組織にダメージを与えないことを意図する。そのような治療法の成功率は低い。
【０００７】
遺伝子ベースの治療法も研究されつつある。ある遺伝子突然変異が、野生型（または正常）遺伝子によってコードされているタンパク質の正常型とは異なって薬剤に反応するタンパク質（または標的）を作製することを示している。このタイプの治療の一例は、慢性骨髄性白血病（「CML」）に対する非常に効果的な治療であり、BCR-ABLキナーゼとして知られている、CMLの進行を主に促進するガン遺伝子を阻害する薬剤グリベック（登録商標）（グリベック（登録商標）はimatinibの商標である）を用いることによって実施されるものである。さらに、グリベック（登録商標）は、あるチロシンキナーゼ受容体、特に多くの胃腸管系腫瘍（「GIST」）において見られるc-kit発ガン性受容体の変異型のインヒビターであることが分かっている。
【０００８】
別の類似した治療薬、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標）、AstraZenecaの商標）は、上皮成長因子受容体（「EGFR」）のチロシンキナーゼ活性を標的とする小分子インヒビターである。イレッサ（登録商標）は、プラチナベース及びドセタキセル（docetaxel）化学療法に反応しない腫瘍を有する患者における飛翔細胞肺ガンの治療用に、FDAによって認可された。患者のおよそ10%がイレッサ（登録商標）に反応するのみであるが、この亜集団は当該薬剤に対する良好な臨床反応を示した。
【０００９】
別の手段は、腫瘍における新しい血管の形成、すなわち血管新生を制御する受容体を攻撃し、且つそれを阻害することである。増殖する腫瘍に栄養を与えるための血管の供給が、その増殖に決定的であると考えられている。血管内皮増殖因子（「VEGF」）は、この過程に決定的であることが分かっている。VEGFが内皮細胞上でその受容体に結合すると、VEGF経路が開始する。これらの受容体VEGFR1及びVEGFR2は、それらの細胞外ドメインでVEGFに結合する膜貫通型チロシンキナーゼであり、内在性チロシンキナーゼ活性を活性化し、細胞内シグナル伝達を誘導する。抗VEGF抗体または抗VEGFR抗体、VEGFがその受容体に結合するのをトラップとして作用することによって阻害する可溶性受容体、及びVEGFRのチロシンキナーゼの小分子インヒビターを用いることによって、この経路を阻害することが報告されている。Holashらは、ヒト免疫グロブリンG1のFc部分に融合させたVEGFR1及びVEGFR2の細胞外ドメインからなる可溶性受容体の使用について報告しており、VEGFに対してトラップとして作用することによる競合的インヒビターであり、それによって、VEGFカスケードを中断させ、腫瘍における新しい血管の形成を阻害すると考えられる（Holashら, 2002, PNAS, vol. 98, no. 17, pp. 11393-11398）。
【００１０】
炎症性疾患、特に関節リウマチにおける可溶性受容体の別の使用において、腫瘍壊死因子α（「TNF-α」）活性化が炎症を引き起こすのに必要とされる。TNF-α介在現象の誘導は、TNF-αホモ三量体の、細胞表面受容体の細胞外ドメインへの結合を必要とする。次いで、これらの細胞表面受容体は多量体を形成し、続いて当該受容体細胞内ドメインを介したシグナル伝達が生じる。TNF-α受容体の天然の、可溶性型は、天然に存在し、且つTNF-αの細胞表面受容体への結合に対する競合的インヒビターとして作用し得るが、それらはほとんどの炎症性疾患に見られる活性のレベルを阻害するのに十分ではない。エンブレル（登録商標）（Amgen社の商標、Thousand Oaks、California、USA）として知られる抗関節炎剤エタネルセプトは、ヒトIgG1のFc部分に連結したヒトTNF-α受容体の細胞外リガンド結合ドメインからなる完全なヒト三量体融合タンパク質である。それは、TNF-αの細胞表面TNF受容体への結合の競合的インヒビターとして作用し、それによって関節リウマチ患者の関節におけるTFN-α誘導炎症活性を阻害する。エタネルセプトはサイトカインキャリア及びTFN-αアンタゴニストとして作用し、TNF-αを生物学的に不活性にする（Goffeら, 2003, J. Am. Acad. Dermatol., vol. 49, no. 2, pp. S105-S111；Goldedburg M., 1999, Clinical Therapeutics, vol. 21, no. 1, pp. 75-87）。
【００１１】
また、TNF-α受容体を標的とする別の薬剤はインフリキシマブ（infliximab）である。これは、TNF-αに対するモノクローナルキメラ抗体であり、起こらなければならない結合を阻害するが、それは膜結合型及び可溶性TNF-αの両方に結合し、ある非所望の副作用を引き起こす可能性がある。
【００１２】
受容体チロシンキナーゼは、いくつかの乳ガンの増殖に重要である。一般に、受容体チロシンキナーゼは、（１）特異的リガンドと結合し得る細胞外ドメイン、（２）膜貫通領域、（３）例えば、タンパク質リン酸化によって当該受容体が制御され得る部位であるjuxtamembraneドメイン、（４）当該受容体の酵素性成分であるチロシンキナーゼドメイン、及び（５）C末端、からなる糖タンパク質である（Davisら, US-6,441,137, Aus. 27, 2002）。乳ガンに対して、タイプI受容体チロシンキナーゼのerbBファミリーは、現在までのところ、最も重要なものである。これらは、erbB1（HER1としても知られる）、erbB２（HER2/neu）、erbB3（HER3）、及びerbB4（HER4）を含む。これらの受容体チロシンキナーゼは、上皮、間葉、及び神経組織において広く発現している。erbB2またはerbB1の過剰発現は、いくつかの乳ガン及び種々の他の悪性疾患における、より好ましくない臨床結果に相関している。
【００１３】
それらの不活性状態において、erbB受容体は単量体として存在している。可溶性リガンドと結合すると、当該受容体内でコンフォメーションの変化が起こり、受容体のホモ及びヘテロ二量体、すなわち活性化受容体型の形成が生じる。リガンド結合及びその後のホモまたはヘテロ二量体化は、自己リン酸化を介して当該受容体の触媒活性を刺激する、すなわち、個々の単量体はチロシン残基で互いにリン酸化する。これにより、受容体の触媒活性のさらなる刺激が生じる。さらに、リン酸化されたチロシン残基のいくつかは、下流のシグナル分子に対して結合部位を提供する。
【００１４】
erbB受容体の活性化は、増殖及び細胞生存等の種々の下流現象を引き起こす。これらの種々の結果は、特定の受容体に結合する特定のリガンドに依存した、異なるシグナル伝達経路を介して起こる。次いで、リガンド結合は、結果として形成するホモまたはヘテロ二量体の組成を指令する。現在、多くの研究は、結合したリガンドのタイプ、及び次いで形成されたホモまたはヘテロ二量体のタイプが、活性化されたerbB受容体上のチロシン残基の差異的リン酸化をもたらすことを示している。例として、ニューレグリン（「NRG」、ヒレグリンとしても知られる）は、erbB受容体に結合するリガンドのファミリーであり、増殖、分化、生存、及び移動を含む種々の応答を誘導する。NRG1β及びNRG2βはerbB3と結合し、且つerbB2/erbB3へテロ二量体を誘導し得るが、NRG1βのみは培養状態の乳ガン細胞の分化を刺激する。この理由は、NRG2βが結合した場合と比較してNRG1βが結合した場合の、活性化されたerbB2/erbB3へテロ二量体への異なる下流シグナル伝達分子の誘導である。例えば、NRG1βとNRG2βは同程度の総レベルのerbB2チロシンリン酸化をもたらすが、NRG1βのみはPI3K（p85）、SHP2、Grb2、及びShcの、当該受容体との結合をもたらす。
【００１５】
可溶性ペプチドリガンドの別のファミリーは、erbB受容体シグナル伝達を制御し、上皮成長因子（「EGF」）とトランスフォーミング成長因子α（「TGF-α」）を含み、そのそれぞれは受容体erbB1に結合する。リガンドEGFまたはTGF-αの発現の増加は、一部のガン患者における好ましくない予後指標として報告されており、腫瘍ミクロ環境におけるEGFまたは他のリガンドの濃度の局所的な増加は、受容体の過剰発現の非存在下でさえ、活性化状態のヘテロ二量体を維持し得ると考えられる。
【００１６】
乳ガンにおいて、erbB1とerbB2はヘテロ二量体化し、生存及び増殖経路を活性化する。erbB1、erbB2、及びerbB4はすべて、機能的触媒ドメインを有し、これはこれらの経路を活性化するのに重要な特性である。erbB1及びerbB2の作用を阻害することを意図したいくつかの治療戦略が知られている。これらの1つは、これらの受容体の細胞外ドメインに結合し、受容体の分解を引き起こす抗体の使用であり、もう1つは、これらの受容体の細胞内ドメイン上の活性キナーゼドメインに結合する小分子インヒビターの使用である。不運なことに、これらの治療法のいずれも、乳ガンの増殖を完全に根絶し得えない。
【００１７】
この理由の1つは、erbB受容体のすべてが小分子によって阻害され得る機能的触媒ドメインを有するとは限らないことであるかもしれない。erbB3受容体チロシンキナーゼは、その触媒ドメインが欠損しているという点において受容体キナーゼの中でも例外的である。他の既知のキナーゼ欠損受容体、すなわち、CCK-4m VIK/RYK、Klg、及びRor1があるが、これらは既知のリガンドがないオーファン受容体である。erbB3はヒレグリン（HRGまたはニューレグリン（NDF）として知られる）等のリガンドに結合し得るため、これらの他の受容体とは異なる。たとえそれが触媒活性を欠いているとしても、erbB3がerbB2及びerbB4とヘテロ二量体化し、erbB2/erbB3及びerbB3/erbB4へテロ二量体を形成し、それによって乳ガンにおけるシグナル伝達活性を刺激するという点において、erbB3は重要である（Leeら, 2001, Cancer Research 61, pp. 4467-4473）。
【００１８】
erbB3受容体の細胞外ドメインのみからなる、天然に生じる切断されたerbB3受容体が同定されている。これらの天然の可溶性受容体はリガンドに結合し、それによって、細胞性erbB3受容体の競合的インヒビターとして機能することが示されている。これらの天然に生じる可溶性受容体は、乳ガンを有する患者に治療的効果を提供するのに十分なほど大量には存在しない。特に、Leeらは、erbB3リガンドの競合的インヒビターとしての、p85可溶性erbB受容体及びその活性の発見について議論している。HRGが細胞表面受容体と結合するのを阻害することによって、この受容体がin vitroにおいて天然に生じるerbB3インヒビターであることが分かった。それは、多くの負の細胞外制御因子の1つとして見なされるかもしれない（Leeら, 2001, Cancer Research, 61: 4467-4473）。
【特許文献１】US-6,441,137
【非特許文献１】Holashら, 2002, PNAS, vol. 98, no. 17, pp. 11393-11398
【非特許文献２】Goffeら, 2003, J. Am. Acad. Dermatol., vol. 49, no. 2, pp. S105-S111
【非特許文献３】Goldedburg M., 1999, Clinical Therapeutics, vol. 21, no. 1, pp. 75-87
【非特許文献４】Leeら, 2001, Cancer Research 61, pp. 4467-4473
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、erbB3リガンドに競合的に結合するerbB3リガンドアンタゴニストを提供し、それによって、細胞性erbB3受容体との結合に対する、そのようなリガンドの可能性を低減または排除することである。
【００２０】
このましくは、本発明の目的は、単一薬剤としてまたは他のガン治療法と組み合わせた、erbB3リガンドアンタゴニストの投与によって、ガンを治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
新しいerbBベースのリガンド結合分子を、その調製及び使用の方法とともに開示する。前記結合分子は、組換えDNA分子から発現されるタンパク質であってよい。前記タンパク質は、活性リガンドに結合し得るerbB細胞外ドメインを含んでよい。これらの結合構成分子は、循環リガンドを結合し且つ隔離し得るトラップとして作用し得、それらを細胞性erbB受容体に結合できなくする。
【００２２】
好ましくは、前記タンパク質はerbB受容体の一部を含んでよく、erbBリガンドに結合する。
【００２３】
さらなる特徴及び利点が本明細書に記載され、以下の詳細な説明及び図面から明らかになる。
【００２４】
図１：ErbBシングルトラップ作用メカニズムの説明図
【００２５】
図２：ErbB3シングルトラップ及びErbBダブルトラップポリペプチドのウエスタンブロット
【００２６】
本明細書は、erbB受容体等の受容体に対するリガンドに結合し得る結合分子を記載する。前記結合分子を、この開示の目的のために、「シングルトラップ」と称する。一実施態様において、当該分子は、すべてのerbBリガンドの部分集団に対する実質的な親和性を有する。当該分子を、単独治療または組合せ治療、例えば、erbB受容体及びリガンドの両方を過剰発現している、またはそれらが変化している腫瘍を有するものにおいて、EGFR及びerbB2インヒビターとともに用いることができる。
【００２７】
一実施態様において、本発明は、一価の結合分子に関するものであって、それらは、特定のerbB受容体に結合するそれらのリガンドに対して実質的な結合親和性を有する。一般に、当該リガンドは、互いに異なる受容体に結合する異なるリガンドである。当該結合分子は水溶液中で可溶性であることが好ましい。あるいは、当該結合分子は、リポソーム製剤等の、それを機能的に可溶性または親水性にする製剤中にあってよい。
【００２８】
一実施態様において、当該結合分子は、受容体の細胞外ドメインの可溶性部分であってよい。任意の適切な受容体を、当該結合分子に利用してよい。適切な受容体は、一般に、リガンド結合に必要且つ十分な決定因子のすべてを含む細胞外ドメインを含む。これらの決定因子は、その天然宿主細胞由来のゲノムまたはcDNAのいずれかから直接単離され得る、相当するmRNAまたは遺伝子構造上に位置してよい。ある実施態様において、erbB受容体のファミリーは、結合分子を作製するために用いられてよい。この最後に、当該結合分子は、erbB受容体，例えば、erbB1、erbB3、またはerbB4の細胞外リガンド結合ドメインを含んでよい。当該結合ドメインは、当該受容体リガンドに対する適切な結合活性が維持される限り、他の構成要素とともにポリペプチド鎖上に存在してよい。
【００２９】
当該結合分子は、組換えDNA分子から発現されるアミノ酸配列を含んでよい。当該組換えDNA分子は、受容体タンパク質の一部をコードする第一のヌクレオチド配列を含んでよい。他の構成要素、例えばIgG1のFc部分は、当該結合分子中に含まれてよい。ヒトIgG1のFc部分の使用は、薬物療法学の当業者に公知の設計であり、2つの目的にかなうことが知られている。第一は、単量体の可溶性受容体が、より上位構造、例えば、二量体及び三量体へオリゴマー形成するのを可能にすることである。第二の目的は、前記IgG1分子のFc部分なしの分子よりも、in vivoにおいてより長い半減期をもたらす、より安定な分子を作製することである。他の構成要素は、前記リガンド結合要素と前記IgG1-Fc要素を機能的に連結させるリンカーであってよい。一実施例として、グリシン−セリン（Gly4Ser）3リンカーであってよい。他の構成要素は、前記IgG1-Fx要素が所望の場合に当該分子から除去されるのを可能にする、プロテアーゼ認識配列であってよい。例示的な配列は、Factor XaまたはTEVプロテアーゼ認識配列を含む。
【００３０】
ある実施態様において、当該組換えDNA分子は、erbB1に対する配列を含む。ある実施態様において、当該組換えDNA分子は、erbB3由来の配列を含む。他の実施態様において、当該組換えDNA分子は、erbB4由来の配列を含んでよい。これらの場合のいずれかにおいて、選択された配列は、それらの相当するerbBリガンドに結合する実質的な能力を有する。
【００３１】
ある実施態様において、当該受容体配列を、当該結合分子が適切な宿主中で発現され得るように、転写及び翻訳配列と整列して、組換えDNAコンストラクト中にクローニングする。適切な宿主中に用いられ得る転写及び翻訳配列を選択することは、当該技術分野の範囲内である。多くの状況において、受容体はグリコシル化され、グリコシル化はリガンド結合に影響を及ぼし得る。従って、宿主の選択は、当該宿主細胞によって生成されるグリコシル化パターンに依存してもよい。例えば、erbB含有結合分子の場合、哺乳類宿主細胞を用いることができる。
【００３２】
結合分子の例示的実施態様を、図１に略図で示す。erbBリガンド結合ドメインの検出は、erbB受容体に対する細胞外ドメイン特異的抗体を用いた認識によって、ウエスタンブロットにより示される（図２）。
【００３３】
本発明化合物の製薬組成物を用いる方法も提供する。そのような製薬組成物は、注射用、または経口、肺動脈、経鼻、経皮用投与薬、あるいは他の投与薬の形態であってよい。一般に、本発明は、製薬上許容し得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／またはキャリアとともに、有効な量の本発明の結合分子を含有する製薬組成物を含む。そのような組成物は、種々のバッファー含有率（例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pH及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、TWEED（登録商標）80、ポリソルベート80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Thimersol、ベンジルアルコール）等の添加剤；並びに増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の高分子化合物の粒子状製剤またはリポソームへの取込みを含む。ヒアルロン酸も用いてよく、これは循環における存続時間の持続を促進する効果を有する可能性がある。そのような組成物は、物理的状態、安定性、本発明のタンパク質及び誘導体のin vivo放出の割合及びin vivoクリアランスの割合に影響を及ぼす可能性がある。例えば、参考文献によって本明細書に取り込まれている、RemingtonのPharmaceutical Sciences, 18th Ed.（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）1435-1712頁を参照。当該組成物は、形態の形態で調製されてよく、または凍結乾燥した状態等の乾燥粉末の状態であってもよい。経皮的製剤のような、埋め込み可能な持続した放出製剤も考慮される。
【００３４】
製薬上許容し得るキャリアは、糖質、例えば、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、及びソルビトール等を含む。製剤に用いられる他の成分は、DPPC、DOPE、DSPC、及びDOPCを含んでよい。天然または合成界面活性剤を用いてよい。PEGを用いてよい（当該タンパク質またはアナログの誘導体化における、その使用とは異なったとしても）。サイクロデキストラン等のデキストランを用いてよい。胆汁酸塩及び他の関連賦活剤を用いてよい。セルロース及びセルロース誘導体を用いてよい。アミノ酸を、例えばバッファー製剤における使用等に用いてよい。
【００３５】
また、リポソーム、マイクロカプセル、または微粒子、封入複合体、あるいは他のタイプのキャリアの使用も考慮される。
【００３６】
治療方法に関わる投薬計画は、薬剤の作用を変更する種々の要因、例えば、当該患者の年齢、状態、体重、性別、及び食事、疾患の重篤度、投与期間、並びにたの臨床的要因を考慮して、主治医によって決定される。一般に、毎日の投薬計画は、体重キログラムあたり、本発明化合物の0.1-1000マイクログラムの範囲、好ましくはキログラムあたり0.1-150マイクログラムにするべきである。
【実施例】
【００３７】
＜実施例１＞
本実施例は、単一組換え遺伝子コンストラクト中にerbB受容体細胞外ドメイン、erbB3細胞外ドメインを有する、シングルトラップ分子の1つの代表的組成物の構築を示す。
【００３８】
当該erbBシングルトラップは、erbB1、erbB3、またはerbB4のいずれかの細胞外ドメインを含むことによって、erbBファミリーの異なるリガンドに結合するように設計されてよい。
【００３９】
イスラエルのレホボートにあるWeizmann InstituteのDr. Yosef Yardenの研究室によって、erbB3の切断型がpEF-IRES-Pプラスミドにクローニングされた。このコンストラクトは、LI（ドメインI）、SI（ドメインII）、LII（ドメインIII）、及びSIIの一部（ドメインIV）と称されるerbB3の最初の3つの細胞外ドメインからなる。この断片の3’末端に融合した他のタンパク質ドメインは、PKAリン酸化部位、Factor Xa切断部位、及び当該3’末端に付加したヒトIgG1のFc断片を含む。次いで、この断片全体を、pEF-IRES-PプラスミドのNhe I-Not Iサイトにクローニングし、pEF-ECD3IgG-IRES-Pプラスミドを作り出す。
【００４０】
pEF-ECD3IgG-IRES-Pプラスミドを改変し、pEF-ECD3-IRES-Pプラスミドを作製した。当該ECD3IgGを、erbB3のLI、SI、LII、及びSIIドメインの一部のみが発現するように切断した。これを達成するための都合のよい制限酵素がなかったため、PCRプライマーをerbB3細胞外ドメインの一部を増幅するように設計した。これらのプライマーは正方向プライマーにXho Iサイトを含み、これはSIIドメインの3’末端に最も近い唯一の制限酵素サイトだったためである。逆方向プライマーはNot Iサイトを含み、これは当該コンストラクトの3’末端の元来のクローニングサイトであり、ネストNhe Iサイトと終始コドンが当該Nhe Iサイトと部分的に重なっていたためである。マルチクローニングサイト（「MCS」）の5’末端には、erbB3シングルトラップの構築後にerbB3細胞外ドメイン断片全体が切断されることを可能にするNhe Iサイトがあるため、当該Nhe Iサイトを逆方向プライマーのNot Iサイトの内側に組み込み、pEF-IRES-P空コントロールプラスミドの構築を可能にした。
【００４１】
pEF-ECD3IgG-IRES-Pを以下のようなPCR反応ための鋳型として用いた。pEF-ECD3IgG-IRES-P プラスミド25ng、NEB 10×Ventポリメラーゼバッファー2.5μL、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、及びdTTPそれぞれの10mM溶液）0.5μL、正方向及び逆方向プライマー0.5μL、並びにVentポリメラーゼ（5000ユニット/mL）0.5μL。当該プライマーの配列は、：s-erbB3-Xho I、5’-AGC TCT CGA GCA ACA TTG ATG GAT TTG TGA ACT GC（配列番号１）、及びs-erbB3- Nhe I-Not I、5’-AGC TGC GGC CGC TAG CTC AAC CAG GGC CTG GGC CCC AGC ATC（配列番号２）であった。PCR条件は以下のとおりであった。95℃2分間、次いで95℃45秒間、55℃45秒間、及び72℃2分間を22サイクル、その後72℃5分間で最後の伸長。
【００４２】
増幅したPCR断片を１％アガロースゲル上で電気泳動し、Qiagen Gel Extractionキットを用いて精製した。当該PCR産物及びpEF-ECD3IgG-IRES-PプラスミドをXho I及びNot Iを用いてオーバーナイトで消化し、１％アガロース上で分離し、Qiagen Gel Extractionキットを用いて精製した。当該Xho I-Not I PCR断片を、当該Xho I-Not I消化pEF-ECD3IgG-IRES-Pプラスミド中にライゲーションし、DH5αコンピテント細胞中に形質転換した。Xho I及びNot Iを用いた消化によって、クローンを組換えに関してスクリーニングした。次いで、この新しいコンストラクト、pEF-ECD3-IRES-PプラスミドをNhe Iで消化した。当該断片を1％アガロースで分離し、Qiagen Gel Extractionキットを用いて精製し、pIRESバックボーンプラスミドをそれ自身に再ライゲーションさせた。これにより、いずれのerbB3またはIgG1-Fc配列も有さないpEF-IRES-Pコントロールプラスミドが作製された。
【００４３】
＜実施例２＞
この実施例は、哺乳類宿主細胞における、組換えDNA分子からのダブルトラップ分子の発現、及び活性型でのその精製を示す。当該pEF-ECD3IgG-IRES-Pプラスミド、pEF-ECD3-IRES-Pプラスミド、及びpEF-IRES-Pコントロールプラスミドを別々に293T細胞にトランスフェクションし、次いでそれらをピューロマイシンで選択し、当該プラスミドを安定に取込んだ細胞の集団を形成した。これらの形質導入された細胞は、培養培地中にECD3IgG及びECD3シングルトラップポリペプチドを分泌する。
【００４４】
トランスフェクションされた293T細胞からのウエスタンブロットの結果（図２）は、当該erbB3シングルトラップはerbB3特異的抗体によって認識されないが（レーン１）、同じポリペプチドからの可溶性erbB3及び可溶性erbB1を発現するポリペプチドは、前記抗体によって検出される（レーン３及び４）ことを示している。これらのポリペプチドは、それらが2つの異なるerbB細胞外リガンド結合ドメインの細胞外リガンド結合部分を含むため、erbBダブルトラップと称される。シングルトラップとダブルトラップに用いられるerbB3細胞外リガンド結合部分の間の唯一の違いは、ダブルトラップ中のerbB3細胞外リガンド結合部分のC末端における3アミノ酸の付加である。従って、ダブルトラップポリペプチドを構成するが、erbBシングルトラップの現在の形態には存在しない、これらの3つの付加的アミノ酸、TEVプロテアーゼ認識配列、及びヒスチジンタグを含むように、当erbB3シングルトラップを改変する。これらの構成要素を、PCR等の既知の方法によって、当該erbB3シングルトラップポリペプチドに付加することができる。
【００４５】
＜実施例３＞
当該erbB3シングルトラップの機能性を調べるために、当該293T細胞からの培養上清を回収し、ろ過し、BT474乳ガン細胞を培養するために用いた。pEF-IRES-Pコントロールベクターを発現する293T細胞由来の培養上清で培養された細胞と比較して、pEF-ECD3-IRES-Pプラスミドを発現する293T細胞由来の培地で培養されたBT474細胞では、48時間後に、細胞数の有意な減少が観察された。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１：ErbBシングルトラップ作用メカニズムの説明図
【図２】図２：ErbB3シングルトラップ及びErbBダブルトラップポリペプチドのウエスタンブロット
【００４７】
（配列表）
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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