(57)【要約】【課題】腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチド、該ペプチドをコードする核酸分子、及び該核酸分子を含むベクター、特異的細胞性免疫を誘導することができ、腎細胞癌の予防又は治療に有用な医薬組成物、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができる腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤及びそれを用いた腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法、ＥｐｏＲ由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる抗原提示細胞調製剤及びそれを用いた抗原提示細胞の調製方法の提供。【解決手段】ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識される所定のアミノ酸配列からなるペプチド、該ペプチドをコードする塩基配列からなる核酸分子、及び該核酸分子を含有するベクター、並びに、それらの少なくともいずれかを含む腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤、及び抗原提示細胞調製剤などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト白血球抗原−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４）分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであって、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするペプチドである。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子を含有することを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチド、及び請求項３に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項５】
癌ワクチンである請求項４に記載の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項６】
ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を請求項１に記載のペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項８】
エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の調製方法であって、
ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に請求項１に記載のペプチド、及び請求項３に記載のベクターの少なくともいずれかを導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、
請求項１に記載のペプチド、及び請求項３に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗原提示細胞調製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎細胞癌の予防又は治療に好適なペプチド、核酸分子、及びベクター、並びに、腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物、腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の調製方法、及び抗原提示細胞調製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（Ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、以下、「ＲＣＣ」と称することがある）は、化学療法や放射線療法といった一般的な癌の治療方法では治療効果が得られず、また、インターフェロン類やインターロイキン−２などのサイトカインによる免疫療法でも限定的な治療効果しか得られないという問題がある。
そのような状況の中、これまでに、腎細胞癌に対するペプチドワクチンとして、Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ９（以下、「ＣＡ９」と称することがある）抗原由来ペプチド、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（以下、「ＶＥＧＦＲ１」と称することがある）由来ペプチドが提案されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
前記ペプチドワクチンによるワクチン療法の経験から、個々の患者の免疫状態の多様性と治療ターゲットである癌の多様性によって免疫応答（ＣＴＬ反応など）が多彩であること、一旦有効であった症例も免疫逃避あるいは寛容により無効となることが明らかとなった。このようなエビデンスを鑑みると、１つの決まった抗原をターゲットにするのではなく、腎癌の発生、分化、増殖に立脚した複数の分子をターゲットにし、それぞれ異なった性質の癌を担癌した宿主に合ったテーラーメイドワクチン療法が必要と思われる。
【０００４】
したがって、腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチドの開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈ  Ｕｅｍｕｒａ，  Ｋ  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｍ  Ｔａｎａｋａ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２（６）  Ｍａｒｃｈ  １５、  ２００６、  １７６８−１７７５
【非特許文献２】Ｋ  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ｔ  Ｍｉｎａｍｉ，  Ｍ  Ｎｏｚａｗａ，  Ｈ  Ｕｅｍｕｒａ、  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１３）  １０８、  １２６０−１２６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチド、該ペプチドをコードする核酸分子、及び該核酸分子を含むベクターを提供することを目的とする。
また、本発明は、特異的細胞性免疫を誘導することができ、腎細胞癌の予防又は治療に有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができる腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤及びそれを用いた腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法、エリスロポイエチンレセプター（以下、「ＥｐｏＲ」と称することがある）由来ペプチドと、ヒト白血球抗原−Ａ２４（以下、「ＨＬＡ−Ａ２４」と称することがある）分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる抗原提示細胞調製剤及びそれを用いた抗原提示細胞の調製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ヒト白血球抗原−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４）分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであって、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするペプチドである。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
＜２＞  前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞  前記＜２＞に記載の核酸分子を含有することを特徴とするベクターである。
＜４＞  前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物である。
＜５＞  ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を前記＜１＞に記載のペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜６＞  前記＜１＞に記載のペプチドを含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜７＞  エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の調製方法であって、
ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを導入する工程を含むことを特徴とする方法である。
＜８＞  エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗原提示細胞調製剤である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、従来における前記問題を解決することができ、腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチド、該ペプチドをコードする核酸分子、及び該核酸分子を含むベクターを提供することができる。
また、本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、特異的細胞性免疫を誘導することができ、腎細胞癌の予防又は治療に有用な医薬組成物を提供することができる。
また、本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができる腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤及びそれを用いた腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法、ＥｐｏＲ由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる抗原提示細胞調製剤及びそれを用いた抗原提示細胞の調製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、試験例１において、ＥｐｏＲのｍＲＮＡの発現を確認した結果を示す図である。
【図２】図２は、試験例２のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】図３は、試験例４−２−１の６時間５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示す図である。
【図４】図４は、試験例４−２−２の６時間５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであって、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかである。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１１】
本発明において、「ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子に結合できる」とは、ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子と複合体を形成し細胞表面に提示され得ることをいう。
一般に、ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、ＨＬＡの型に依存する規則性あるアミノ酸配列を有することが知られており、前記規則性あるアミノ酸配列は、結合モチーフと呼ばれる。
前記ＨＬＡ−Ａ２４分子に対し、ペプチドが結合できるか否かは、例えば、ウェブサイト（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ、  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＩＨ）などのコンピューター解析により予測することができる。
【００１２】
本発明において、「細胞性免疫に認識される」とは、ペプチドが特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「ＣＴＬ」と称することがある）に認識される、即ち、ペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができることをいう。
ペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチドで刺激した末梢血単核細胞（以下、「ＰＢＭＣ」と称することがある）が、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してインターフェロン（以下、「ＩＦＮ」と称することがある）−γなどのサイトカインを産生するか否かを測定することにより確認する方法などが挙げられる。
前記サイトカインを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡなどで測定することができる。
【００１３】
また、誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５１Ｃｒ放出試験により確認する方法などが挙げられる。
【００１４】
前記（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＥｐｏＲ由来ペプチドであり、前記ＥｐｏＲにおける５２番目から６０番目のアミノ酸配列に相当する（以下、「ＥｐｏＲ５２−６０ペプチド」と称することがある）。
【００１５】
前記（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドとしては、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
前記欠失、置換、及び付加の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
前記置換としては、ペプチドの性質を変化させない点で、同族アミノ酸の間で置換することが好ましい。前記同族アミノ酸は、例えば、極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸などの観点で選択することができる。
【００１８】
前記欠失、置換、及び付加は、ＨＬＡ−Ａ２４分子の結合モチーフである点で、ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン又はフェニルアラニンであり、Ｃ末端アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、又はフェニルアラニンとなるように行うことが好ましい。
【００１９】
前記ペプチドを構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよいし、アミノ酸アナログであってもよい。
前記アミノ酸アナログとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物などが挙げられる。
【００２０】
また、前記ペプチドは、本発明の効果を損なわない限り、その構成アミノ酸又はカルボキシル基などが修飾されていてもよい。
前記修飾としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を結合するものや、Ｃ末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等を結合するものなどが挙げられる。
【００２１】
前記ペプチドは、細胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高くＣＴＬ誘導能に優れると期待される点で、液性免疫にも認識されることが好ましい。
本発明において、「液性免疫に認識される」とは、ペプチドに特異的なＩｇＧが生体内に存在する、即ち、ペプチド特異的ＩｇＧが血漿から検出されることをいう。
血漿中の特異的ＩｇＧを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡなどで測定することができる。
【００２２】
前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００２３】
本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドが細胞内で断片化されることで生じるものであってもよい。前記ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
前記ペプチドは、癌増殖に関与するとされるＥｐｏＲ由来ペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるので、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者の癌ワクチン療法に好適に用いることができる。
【００２５】
（核酸分子）
本発明の核酸分子としては、前記ペプチドをコードする塩基配列からなるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記核酸分子の具体例としては、下記配列番号：７で表される塩基配列からなる核酸分子などが挙げられる。
ｔｇｃｔｔｃａｃｃｇａｇｃｇｇｔｔｇｇａｇｇａｃｔｔｇ（配列番号：７）
前記配列番号：７で表される塩基配列からなる核酸分子は、前記配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする。
【００２６】
前記核酸分子は、例えば、後述するベクターに好適に利用可能である。
【００２７】
（ベクター）
本発明のベクターは、本発明の核酸分子を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。
【００２８】
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
前記ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる。
【００２９】
前記ベクターの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して調製することができる。
【００３０】
前記ベクターは、抗原提示細胞に導入されると本発明のペプチドを発現する。そして、前記抗原提示細胞は、前記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する。前記抗原提示細胞は、ペプチド特異的に腎細胞癌細胞を傷害するＣＴＬを効率的に増殖させることができる。
【００３１】
前記ベクターは、後述する腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物、抗原提示細胞調製剤に好適に利用可能である。
【００３２】
（腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物）
本発明の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００３３】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物における前記ペプチド、及び前記ベクターの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかからなるものであってもよい。
前記ペプチド、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３４】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬上許容され得る担体などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記担体の具体例としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンなどが挙げられる。
【００３５】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３６】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せた態様で使用されてもよい。
また、前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００３７】
腎細胞癌患者のＣＴＬは、様々な癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合であるため、前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、例えば、ＣＡ９抗原由来ペプチド、ＶＥＧＦＲ１由来ペプチドと組み合わせて使用してもよい。
【００３８】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、公知の剤形を適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
【００３９】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、癌ワクチンとして使用することが好ましい。
【００４０】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物の投与方法、投与量、投与時期、投与間隔、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することが好ましく、投与方法としては、例えば、皮内投与、皮下投与などが挙げられる。
【００４２】
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象の個体の疾患の状態、年齢、体重、体質、他の成分を有効成分とする医薬組成物の投与の有無などを考慮して適宜選択することができる。
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物が前記ペプチドを含む場合の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド量として、０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇなどが挙げられる。
【００４３】
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物が前記ベクター含む場合の投与量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ量として、０．１μｇ〜１００ｍｇなどが挙げられる。投与方法としては、静脈注射、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。
【００４４】
前記投与時期、及び投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、数週から数ヶ月に１回、１年間〜３年間継続して投与するなどが挙げられる。
【００４５】
前記投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトが挙げられる。
【００４６】
（腎細胞癌の予防又は治療方法）
前記ペプチド、及び前記ベクターは、個体に投与することにより、個体における腎細胞癌の発症を予防したり、腎細胞癌を患っている個体を治療したりすることができる。したがって、本発明は、腎細胞癌を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを投与することを特徴とする、腎細胞癌の予防又は治療方法にも関する。
【００４７】
また、前記腎細胞癌の予防又は治療方法は、後述する腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法により誘導した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を個体に戻したり、後述する抗原提示細胞の調製方法により調製した抗原提示細胞を個体に戻したりすることにより行ってもよい。
【００４８】
（腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法）
本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００４９】
＜接触工程＞
前記接触工程は、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を本発明のペプチドと接触させる工程である。
前記接触工程により、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
【００５０】
前記細胞傷害性Ｔ細胞が「腎細胞癌反応性」であるとは、前記細胞傷害性Ｔ細胞が、腎細胞癌細胞上の癌抗原ペプチドと、ＨＬＡ分子との複合体を認識し、その細胞を傷害する能力を有することをいう。
【００５１】
前記ペプチドは、前記ペプチドのみからなるものを使用してもよいし、後述する腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を使用してもよい。
【００５２】
前記接触の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記ペプチドの存在下で培養する方法などが挙げられる。
【００５３】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法で得られた腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻して腎細胞癌細胞を傷害する養子免疫療法に好適に用いることができる。
【００５５】
（腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤）
本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００５６】
前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記腎細胞癌反応性障害性Ｔ細胞誘導剤は、前記ペプチドのみからなるものであってもよい。
【００５７】
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５８】
前記腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤は、上述した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。
【００５９】
（腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キット）
本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、本発明の腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。
【００６０】
前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００６１】
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、上述した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。
【００６２】
（抗原提示細胞の調製方法）
本発明の抗原提示細胞は、導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００６３】
前記導入工程は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを導入する工程である。
前記導入工程により、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる。前記抗原提示細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る。
【００６４】
前記ペプチドは、前記ペプチドのみからなるものを使用してもよいし、後述する抗原提示細胞調製剤を使用してもよい。
前記ベクターは、前記ベクターのみからなるものを使用してもよいし、後述する抗原提示細胞調製剤を使用してもよい。
【００６５】
前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを前記抗原提示能を有する細胞導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６６】
前記抗原提示細胞は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者由来の抗原提示能を有する細胞を前記ペプチドと共に培養することにより得られる。また、例えば、前記ベクターをＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し、前記ペプチドを発現させることにより得られる。
【００６７】
前記抗原提示能を有する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞などが挙げられる。
前記樹状細胞の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、患者より採取した末梢血単核細胞から培養プレートに接着する細胞を分離し、その細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で約１週間培養する方法などが挙げられる。
【００６８】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６９】
前記抗原提示細胞の調製方法で得られた抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻し、体内での腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を促進するために好適に用いることができる。
【００７０】
（抗原提示細胞調製剤）
本発明の抗原提示細胞調製剤は、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００７１】
前記ペプチド、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞調製剤における前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗原提示細胞調製剤は、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかのみからなるものであってもよい。
【００７２】
前記抗原提示細胞調製剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞調製剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７３】
前記抗原提示細胞調製剤は、上述した抗原提示細胞の調製方法に好適に用いることができる。
【００７４】
（抗原提示細胞調製用キット）
本発明の抗原提示細胞調製用キットは、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製用キットであって、本発明の腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。
【００７５】
前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７６】
前記抗原提示細胞調製用キットは、上述した抗原提示細胞の調製方法に好適に用いることができる。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明の試験例を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００７８】
（試験例１：腎細胞癌細胞株におけるＥｐｏＲのｍＲＮＡの発現）
以下の５種類の腎細胞癌細胞株におけるエリスロポイエチンレセプターのｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
＜腎細胞癌株＞
（１）ＳＫＲＣ−１細胞（愛知医科大学の吉川先生より供与）
（２）ＳＫＲＣ−４４細胞（愛知医科大学の吉川先生より供与）
（３）ＳＫＲＣ−５２細胞（愛知医科大学の吉川先生より供与）
（４）ＫＰＫ−１３細胞（大分大学医学部の三股先生より供与）
（５）ＫＫ−ＲＣＣ６細胞（香川大学医学系研究科の筧先生より供与）
【００７９】
＜半定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞
前記各細胞から、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。前記抽出したトータルＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。
前記ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＰＣＲの３０サイクル（（１）変性：９４℃、３０秒間、（２）アニール：５５℃、３０秒間、（３）伸長：７２℃、１分間／ｋｂ）を行った。
【００８０】
前記ＰＣＲは、以下の３種のプライマーセットをそれぞれ用いて行った。
（１）ＥｐｏＲ−１
フォワード：５’−ｃｃｔｇｇｔｃｇｇａｇｃｃｔｇｔｇｔ−３’（配列番号：１１）
リバース：５’−ｃａｃｇａｃｇａｃｔｇｇｃａｃｇａｇ−３’（配列番号：１２）
１０４ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＥｐｏＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインに対応する。
（２）ＥｐｏＲ−２
フォワード：５’−ｔｃｇｔｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇａ−３’（配列番号：１３）
リバース：５’−ａｃｃｔｔｃａｇｇａｇａｇｔｃｔｃｇｃｇａｃｇａ−３’（配列番号：１４）
２４０ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＥｐｏＲの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに対応する。
（３）ＥｐｏＲ−３
フォワード：５’−ｃｃｃｇａｇｃｃｃａｇａｇａｇｃｇａｇｔｔ−３’（配列番号：１５）
リバース：５’−ｔａｇｇａｇｇａｃｇａｇｔａｇａｃｇａａａ−３’（配列番号：１６）
３７２ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＥｐｏＲの細胞質ドメインに対応する。
【００８１】
前記ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色し、撮影した。結果を図１に示す。なお、図１中、ＧＡＰＤＨは内在性コントロールである。
図１の結果から、各腎細胞癌細胞株において、ＥｐｏＲのｍＲＮＡが発現していることが確認された。
【００８２】
（試験例２：ＨＬＡ−クラスＩの発現）
前記ＫＰＫ−１３細胞、及び前記ＫＫ−ＲＣＣ６細胞におけるＨＬＡ−クラスＩの発現を以下のようにして、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により調べた。
前記各細胞を抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（ハイブリドーマ：Ｗ６／３２）、又は抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ社製）で細胞を染色し、次いで、ＦＩＴＣ−コンジュゲート  ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ社製）で染色した。前記染色した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて分析した。結果を図２に示す。
【００８３】
図２中、上段はＫＰＫ−１３細胞、下段はＫＫ−ＲＣＣ６細胞の結果を示し、それぞれ、左側が抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体で染色した場合（ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ）、右側が抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体で染色した場合（ａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２４）の結果を示す。
図２の結果から、ＫＰＫ−１３細胞はＨＬＡ−Ａ２４分子陽性であり、ＫＫ−ＲＣＣ６細胞はＨＬＡ−Ａ２４分子陰性であることが確認された。
【００８４】
（試験例３：ペプチドの検討）
ＥｐｏＲ由来ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４アレル分子に対する結合モチーフに基づいて設計し、ＨＬＡ−クラスＩ分子からの解離予測半減期に基づき計算された結合スコアから下記の５種類のＥｐｏＲ由来ペプチドを候補とした。その結合スコアを表１に示す。
なお、前記ＨＬＡ−クラスＩ分子からの解離予測半減期に基づき計算された結合スコアは、ウェブサイト（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ、  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＩＨ）から算出した。
【００８５】
＜ＥｐｏＲ由来ペプチド＞
（１）ＥｐｏＲ３４−４２  ：  ＫＦＥＳＫＡＡＬＬ（配列番号：１）
配列番号：１で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの３４番目から４２番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：１で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：６で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の２３５番目から２６１番目に対応する。
ａａｇｔｔｃｇａｇａｇｃａａａｇｃｇｇｃｃｔｔｇｃｔｇ（配列番号：６）
（２）ＥｐｏＲ５２−６０  ：  ＣＦＴＥＲＬＥＤＬ（配列番号：２）
配列番号：２で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの５２番目から６０番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：２で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：７で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の２８９番目から３１５番目に対応する。
ｔｇｃｔｔｃａｃｃｇａｇｃｇｇｔｔｇｇａｇｇａｃｔｔｇ（配列番号：７）
（３）ＥｐｏＲ２１５−２２４  ：  ＲＹＴＦＡＶＲＡＲＭ（配列番号：３）
配列番号：３で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの２１５番目から２２４番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：３で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：８で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の７７８番目から８０７番目に対応する。
ｃｇｃｔａｃａｃｃｔｔｃｇｃｃｇｔｃｃｇｃｇｃｇｃｇｔａｔｇ（配列番号：８）
（４）ＥｐｏＲ３６７−３７５  ：  ＴＹＬＶＬＤＫＷＬ（配列番号：４）
配列番号：４で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの３６７番目から３７５番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：４で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：９で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の１，２３４番目から１，２６０番目に対応する。
ａｃｃｔａｔｃｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｃａａａｔｇｇｔｔｇ（配列番号：９）
（５）ＥｐｏＲ４５５−４６４  ：  ＬＹＬＶＶＳＤＳＧＩ（配列番号：５）
配列番号：４で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの４５５番目から４６４番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：５で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：１０で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の１，４９８番目から１，５２７番目に対応する。
ｃｔｇｔａｃｃｔｔｇｔｇｇｔａｔｃｔｇａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃ（配列番号：１０）
【００８６】
【表１】
2015136293.tif 000002
【００８７】
（試験例４）
−末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）−
以下の試験で用いたＰＢＭＣは、以下のようにして調製した。
インフォームドコンセントのうえ、文書にて同意を得られた腎細胞癌（ＲＣＣ）患者、及び健康なドナーからＰＢＭＣを得た。前記提供者の中には、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者が含まれていた。なお、前記提供者の中には、ヒト免疫不全ウイルス（以下、「ＨＩＶ」と称することがある）に感染している者はいなかった。
前記ＰＢＭＣは、前記提供者から末梢血を３０ｍＬ採取し、フィコール・コンレイ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ）比重遠心法によって調製した。全ての試料は、使用するまで凍結保存した。
本試験は、近畿大学倫理委員会の承認を受けて行った。
【００８８】
−細胞株−
以下の試験で用いた細胞株は、以下のとおりである。全ての細胞株は、ＦＣＳを１０％含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で維持した。
・  Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＊：０２遺伝子を安定的に発現するＣ１Ｒリンパ腫の亜細胞株、久留米大学医学部の伊東先生より供与より供与）
・  ＫＰＫ−１３細胞（ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株、大分大学医学部の三股先生より供与）
・  ＫＫ−ＲＣＣ６細胞（ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性腎細胞癌細胞株、香川大学医学系研究科の筧先生より供与）
・  ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ（ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性幼弱化Ｔ細胞、近畿大学医学部  泌尿器科学教室にて調製）
【００８９】
−ペプチド−
以下の試験で用いたペプチドは、以下のとおりである。全てのペプチドは、ＯＰＥＲＯＮ社から購入した。前記ペプチドは、１０ｍｇ／ｍＬの用量でＤＭＳＯ中に溶解させた。
−ＥｐｏＲ由来ペプチド−
・  ＥｐｏＲ３４−４２  ：  ＫＦＥＳＫＡＡＬＬ（配列番号：１）
・  ＥｐｏＲ５２−６０  ：  ＣＦＴＥＲＬＥＤＬ（配列番号：２）
・  ＥｐｏＲ２１５−２２４  ：  ＲＹＴＦＡＶＲＡＲＭ（配列番号：３）
・  ＥｐｏＲ３６７−３７５  ：  ＴＹＬＶＬＤＫＷＬ（配列番号：４）
・  ＥｐｏＲ４５５−４６４  ：  ＬＹＬＶＶＳＤＳＧＩ（配列番号：５）
−コントロール（ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するコントロール）−
・  エプスタイン・バーウイルス（以下、「ＥＢＶ」と称することがある）由来ペプチド  ：  ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ（配列番号：１７）
・  ＨＩＶ由来ペプチド  ：  ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ（配列番号：１８）
【００９０】
−統計−
以下の試験のデータの統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定し、Ｐ値が０．０５未満である場合を統計学的に有意であるとした。
【００９１】
＜試験例４−１：ＰＢＭＣからのペプチド特異的ＣＴＬの誘導＞
前記ＥｐｏＲ由来ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導できるかについて、従来報告されている方法にいくつかの変更を加えて調べた。具体的な方法は、以下のとおりである。なお、ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者（１０名）から調製したものをそれぞれ用いた。
【００９２】
Ｕ底型９６ウェルマイクロ培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）において、ＰＢＭＣ（５×１０４細胞／ウェル）を、ペプチド（前記各ＥｐｏＲ由来ペプチド、又は前記ＥＢＶ由来ペプチド））を１０μｇ／ｍＬで含む培養培地１００μＬ中で培養した。前記培養培地は、４５％  ＲＰＭＩ  １６４０培地、４５％  ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０％  ＦＣＳ、及びＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００倍希釈、Ｇｉｂｃｏ社製）からなる。
培養開始の翌日に、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む前記培養培地を１００μＬ添加した。培養８日目に、１００μＬの前記培養培地を除去し、同じペプチド（１０μｇ／ｍＬ）を含む新しい培養培地を補充した。培養９日目に、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む前記培養培地を１００μＬ添加した。
培養１７日目に、１つのウェルで培養された細胞を４つのウェルに分けた。その後、２つのウェルは、対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養し、残りの２つのウェルは、前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した。１８時間培養した後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮ−γの産生を測定した。
【００９３】
ペプチド特異的ＣＴＬの誘導は、前記対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値と、前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値との差が５０ｐｇ／ｍＬ以上であり、かつ、前記対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値と、前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値との比（前記対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値／前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値）が、１．２以上であるときは陽性と判定した。
【００９４】
前記判定の結果、陽性と判定されたものについての結果を表２に示す。
【表２】
2015136293.tif 000003
【００９５】
表２の結果から、前記ＥｐｏＲ由来ペプチドの中でも、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチド（配列番号：２）が、１０人のＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者のうち６人のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができ、特に好ましいペプチドであることがわかった。また、ＨＬＡ−クラスＩ分子からの解離予測半減期に基づき計算された結合スコアが高いものが、活性が高いというわけではないこともわかった。
【００９６】
＜試験例４−２：ペプチド特異的ＣＴＬの腎細胞癌細胞株に対する細胞傷害活性＞
ペプチド特異的ＣＴＬの腎細胞癌細胞株に対する細胞障害活性を、標準的な６時間５１Ｃｒ放出アッセイにより、以下のようにして試験した。
【００９７】
−ＣＤ８陽性Ｔ細胞−
以下の試験に用いるＣＤ８陽性Ｔ細胞は、以下のようにして、ペプチド刺激されたＰＢＭＣから調製した。
前記試験例４−１と同様の方法により、前記ＥｐｏＲ５２−６０ペプチド（配列番号：２）で刺激されたＰＢＭＣ（ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者  ６名からそれぞれ調製（Ｐｔ  ＃６９、Ｐｔ  ＃４２、Ｐｔ  ＃４６、Ｐｔ  ＃５７、Ｐｔ  ＃５０、及びＰｔ  ＃５２の６サンプル。前記Ｐｔ  ＃４２、及びＰｔ  ＃４６は、それぞれ、前記試験例４−１の患者７、及び９に該当）。）のそれぞれについて、抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（ｍＩｇＧ１：ＤＩＡＣＬＯＮＥ、Ｂｅｓａｎｃｏｖ  Ｃｅｄｅｘ社製）で染色し、次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  抗ＣＤ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及び抗ＣＤ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で処理した。前記Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合した細胞は、磁化し、取り除いた。前記処理により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞が取除かれ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合は、およそ８０％〜８５％であった（データは示さず）。
なお、陰性対照細胞としては、フィトヘマグルチニンで活性化されたＴ細胞を用意した。
【００９８】
＜＜試験例４−２−１＞＞
ターゲット細胞として、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株であるＫＰＫ−１３細胞、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性腎細胞癌細胞株であるＫＫ−ＲＣＣ６細胞、及びＨＬＡ−Ａ２４分子陽性幼弱化Ｔ細胞であるＰＨＡ−ｂｌａｓｔを用い、これらに対する前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞（以下、「エフェクター細胞」と称することがある）の細胞傷害活性を以下のようにして、試験した。
【００９９】
丸底の９６ウェルプレートにおいて、５１Ｃｒ標識したターゲット細胞（２，０００個／ウェル）と、エフェクター細胞とを所定のエフェクター細胞／ターゲット細胞比で培養した。
特異的な５１Ｃｒ放出は、以下の式から計算した。
特異的溶解（％）＝（試験サンプルにおける放出−自然放出）×１００／（最大放出−自然放出）
前記「自然放出」は、エフェクター細胞なしで５１Ｃｒ標識したターゲット細胞をインキュベートした場合の上清から決定し、前記「最大放出」は、エフェクター細胞なしで、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（和光純薬工業株式会社製）と５１Ｃｒ標識したターゲット細胞とをインキュベートした場合の上清から決定した。
結果を図３に示す。図３の縦軸は、「特異的溶解（％）」（％  ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸は、エフェクター細胞と、ターゲット細胞との比（Ｅ／Ｔ：エフェクター細胞／ターゲット細胞）を示す。
【０１００】
図３に示されるように、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｐｏＲ５２−６０ペプチドにて刺激したＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者由来の各ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性腎細胞癌株（ＫＫ−ＲＣＣ６）及びＨＬＡ−Ａ２４分子陽性幼弱化Ｔ細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）に対してよりもＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌株（ＫＰＫ１３）に対して高いレベルの細胞障害活性を示した。この結果は、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドにて刺激されたＰＢＭＣは、腎細胞癌に対してＨＬＡ−Ａ２４分子拘束性に細胞障害活性を発揮することを示す。
【０１０１】
＜＜試験例４−２−２＞＞
ペプチド刺激ＣＴＬの細胞傷害活性に関与する細胞のタイプをコールド阻害試験により調べた。コールド阻害試験は以下のようにして行った。
【０１０２】
丸底９６ウェルプレートにおいて、５１Ｃｒ標識したターゲット細胞（ＫＰＫ−１３細胞；２，０００個／ウェル）と、上述したエフェクター細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）とを、下記のいずれかの５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞（４×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）と共に培養し、前記試験例４−２−１と同様にして、特異的溶解（％）を求めた。なお、コントロールとして、前記５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞を用いなかった場合についても同様にして、特異的溶解（％）を求めた。結果を図４に示す。
−５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞−
（１）  前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞
（２）  前記ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞
なお、本試験では、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者  ３名からそれぞれ調製したＰＢＭＣ（Ｐｔ  ＃６９、Ｐｔ  ＃４２、及びＰｔ  ＃５７の３サンプル。前記Ｐｔ  ＃４２は、前記試験例４−１の患者７に該当）を用いて得られたエフェクター細胞について調べた。
【０１０３】
図４の横軸は、「特異的溶解（％）」（％  ｌｙｓｉｓ）を示し、縦軸は、上から順に、「コントロール」（ｎｏｎｅ）、５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞として「ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞」を用いた場合（Ｃ１Ｒ−Ａ２４／ＨＩＶ）、５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞として「ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞」を用いた場合（Ｃ１Ｒ−Ａ２４／ＥｐｏＲ  ５２）の結果を示す。
図４に示されるように、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドにて刺激したＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者由来のＰＢＭＣのＫＰＫ１３細胞に対する細胞障害活性は、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドをパルスした非標識のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞の添加によって有意に抑制されたが、ＨＩＶ由来ペプチドをパルスした非標識のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞によっては抑制されなかった。このコールド阻害試験の結果は、ペプチド刺激ＰＢＭＣのＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株に対する細胞障害活性が、ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞による可能性が高いことを示す。
【０１０４】
以上の結果は、本発明のＥｐｏＲ由来ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌において腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導でき、特異的免疫療法、特に癌ワクチン療法に有用であることを示す。本発明のＥｐｏＲ由来ペプチドにより、ペプチドワクチン療法の選択肢を増やすことが可能となると考えられる。
【０１０５】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  ヒト白血球抗原−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４）分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであって、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするペプチドである。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
＜２＞  前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞  前記＜２＞に記載の核酸分子を含有することを特徴とするベクターである。
＜４＞  前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物である。
＜５＞  癌ワクチンである前記＜４＞に記載の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物である。
＜６＞  腎細胞癌を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物を投与することを特徴とする方法である。
＜７＞  ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を前記＜１＞に記載のペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜８＞  前記＜１＞に記載のペプチドを含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜９＞  前記＜８＞に記載の腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットである。
＜１０＞  エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の調製方法であって、
ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを導入する工程を含むことを特徴とする方法である。
＜１１＞  エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗原提示細胞調製剤である。
＜１２＞  エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製用キットであって、
前記＜１１＞に記載の抗原提示細胞調製剤を含むことを特徴とする抗原提示細胞調製用キットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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