(57)【要約】  喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法が、提供される。本方法は、喘息に関連する症状および病理学的合併症を引き起こす働きをする、本明細書中で開示されるＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生または活性を低下させる薬物をスクリーニングすることを含む。喘息を処置する方法、並びに、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の阻害物質をスクリーニングする方法、および該阻害物質を用いた処置方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＲｅｇＩＩＩ蛋白質を被検物質と接触させる工程；および
（ｂ）被検物質が、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を阻害するかどうかを決定する工程（ここで、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を不活性化する被検物質は喘息の処置に有用である）を含む、方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトであるところの、請求項１記載の方法。
【請求項３】
喘息が、アトピー性喘息、非アトピー性喘息、アレルギー性喘息、運動誘発喘息、薬物誘発喘息、職業性喘息および後期喘息よりなる群から選択されるところの、請求項１記載の方法。
【請求項４】
被検物質が、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を阻害するかどうかの決定が、細胞増殖アッセイを行うことを含むところの、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞増殖アッセイが、標識化チミジン取り込みアッセイ、５−臭素−２′−デオキシウリジン取り込みアッセイ、３−［４，５−ジメチルチアゾールジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル四ナトリウム臭化物アッセイ、アデノシン三リン酸塩生成アッセイおよびその組み合わせよりなる群から選択されるところの、請求項４記載の方法。
【請求項６】
細胞が、初代上皮細胞および上皮細胞株よりなる群から選択されるところの、請求項４記載の方法。
【請求項７】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質が哺乳動物ＲｅｇＩＩＩ蛋白質であるところの、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質が、配列番号：２および配列番号：４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するところの、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質が、配列番号：２および配列番号：４よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するところの、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物における喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）哺乳動物のＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、被検物質と接触させる工程；および
（ｂ）被検物質がレポーター遺伝子産物の産生を阻害するかどうかを決定する工程（ここで、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を不活性化する被検物質は、喘息を処置するのに有用である）を含む、方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒトであるところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
喘息が、アトピー性喘息、非アトピー性喘息、アレルギー性喘息、運動誘発喘息、薬物誘発喘息、職業性喘息および後期喘息よりなる群から選択されるところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
被検物質が、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を阻害するかどうかの決定が、レポーター遺伝子産物の量または活性を定量化することを含むところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターが、配列番号：５記載のヌクレオチド配列を有するところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質プロモーターが、配列番号：５記載のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターが、配列番号：６記載のヌクレオチド配列を有するところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターが、配列番号：６記載のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
レポーター遺伝子産物が、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光蛋白質よりなる群から選択されるところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
それを必要とする哺乳動物に、哺乳動物のＲｅｇＩＩＩγ蛋白質の活性を低下させる薬物の治療量を投与することを含む、喘息の処置方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトであるところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
喘息の処置が、ＡＨＲを低下させること、粘液過剰生産を低下させること、血清ＩｇＥレベルを低下させること、および気道の好酸球増加を低下させること、よりなる群から選択される方法によって実施されるところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物のＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を低下させる薬物が、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃであるところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物のＲｅｇＩＩＩ蛋白質が、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質が、配列番号：１および配列番号：３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
それを必要とする哺乳動物に、哺乳動物のＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を低下させる薬物の治療量を投与することを含む、喘息を処置する方法。
【請求項２６】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を低下させる薬物が、核酸であるところの、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
核酸がリボ核酸であるところの、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
リボ核酸が、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードする配列番号：１または配列番号：３に記載されるヌクレオチド配列の一部と相補的なヌクレオチド配列を有するところの、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
リボ核酸がＲＮＡ干渉であるところの、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物がヒトであるところの、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
阻害物質が、医薬上許容される担体にて投与されるところの、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法を提供することである。更なる本発明の目的は、喘息を処置する方法を提供することである。本発明のこれらの目的および他の目的および利点は、本明細書の記載により明らかとなろう。
【０００２】
本発明は、一般に、喘息治療に関する。具体的には、本発明は、喘息を処置する薬物のスクリーニング方法および喘息を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
喘息は、可逆的な気道閉塞および気道過敏症（ＡＨＲ）の再発エピソードにより特徴付けられる気道の慢性炎症性疾患である。典型的な臨床症状は、生命を脅かし得る又は致死的であり得る息切れ、喘鳴、咳および胸苦しさを含む。既存の治療は、症候の気管支痙攣および肺炎症を軽減することに集中しているが、喘息患者の進行性の肺劣化における長期気道リモデリングの役割に対する認識が高まりつつある。気道リモデリングは、上皮平滑筋および筋繊維芽細胞の過形成および／または異形成、上皮下繊維症およびマトリクス沈着を含む、多くの病的徴候を意味する。この過程は、致命的な喘息の場合、全体として約３００％まで気道を肥厚することとなる。喘息の病態生理学を解明するにあたってなされた飛躍的な発展にもかかわらず、この疾患の有病率、罹患率および死亡率は、過去２０年の間に増加した。２０００年、アメリカ合衆国だけで、およそ１８００万人の救急外来受診、４６５，０００人の入院および４，４８７人の死亡が、喘息を直接の原因とするものであった。喘息に関連する健康管理費は、１年間で１４０億ドルと見積もられている。
【０００４】
アレルギー性喘息は、空中のアレルゲンに対する不適当な炎症反応によって引き起こされると、一般的に受け入れられている。喘息患者の肺は、リンパ球、マスト細胞および特に好酸球の強い浸潤を示す。多岐に及ぶ一連の証拠は、この免疫応答がＴＨ２サイトカインプロフィールを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞により誘発されることを実証した。ある喘息ネズミモデルは、動物のオボアルブミン（ＯＶＡ）への感作に、続いてＯＶＡチャレンジ（免疫反応惹起）の気管内誘導を必要とする。この手順は、マウス肺にＴＨ２免疫反応を引き起こし、ヒトの喘息で見られる４つの主要な異常生理学応答、上方調節された血清ＩｇＥ（アトピー）、好酸球増加、過剰な粘液分泌およびＡＨＲを含む応答を模倣する。好塩基球、マスト細胞、活性型Ｔ細胞およびＮＫ細胞により発現されるサイトカインＩＬ−１３は、マウス肺においてＯＶＡに対する炎症反応の中心的な役割を果たす。ネズミＩＬ−１３の直接の肺点滴注入は、４つの喘息関連症状の全てを引き起こし、逆に言うと、可溶性ＩＬ−１３アンタゴニスト（ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）の存在は、ＯＶＡ−チャレンジ誘導性杯状細胞の粘液合成およびアセチルコリンに対するＡＨＲの両方を完全に阻害する。Wills-Karp, Mら、“Interleukin-13: central mediator of allergic asthma,”Science 282(5397): 2258-2261 (1998)；Grunig, Gら、“Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma,”Science 282(5397): 2261-2263 (1998)。従って、ＩＬ−１３媒介性シグナル伝達は、４つの喘息関連異常生理学的表現型の全てを引き起こす十分条件であり、マウスモデルにおける粘液過分泌および誘導性ＡＨＲの必要条件である。
【０００５】
生物学的に活性なＩＬ−１３は、低い親和性で結合するＩＬ−１３Ｒα１鎖と、および高い親和性でＩＬ−１３Ｒα１とＩＬ−４シグナル伝達複合体の共通成分であるＩＬ−１４Ｒとからなる多量体と、特異的に結合する。Wills-Karp, M.,“IL-12/IL-13 axis in allergic asthma,”J Allergy Clin Immunol 107(1): 9-18 (2001)。ＩＬ−１３経路カスケードの活性化は、転写活性化因子Ｓｔａｔ６の補充、リン酸化および最終的な核転座を引き起こす。多くの生理学的研究で、Ｓｔａｔ６−／−ヌル対立遺伝子のマウス同型において、好酸球浸潤、粘液過分泌および気道過敏を含む主な喘息関連症状を引き起こすのに気道ＯＶＡ−チャレンジでは不十分であることが実証された。Kuperman, Dら、“Signal transducer and activator of transcription factor 6 (Stat6)- deficient mice are protected from antigen-induced airway hyperresponsiveness and mucus production,”J Exp Med 187(6): 939-48 (1998)。最近の遺伝学的研究は、喘息およびアトピーで、特異的なヒト対立遺伝子ＩＬ−１３とそのシグナル伝達成分との関連を示し、ヒト疾患におけるこの経路の中心的役割を実証した。Shirakawaら、“Atopy and asthma: genetic variants of IL-4 and IL-13 signaling,”Immunol. Today 21(2):60-64 (2000)。
【０００６】
ＩＬ−１３は、まだその生物学的機能は決定されていないが、ヒトおよびマウスの双方で発現される別の受容体鎖、ＩＬ−１３Ｒα２とも結合する。ネズミＩＬ−１３Ｒα２は、ＩＬ−１３Ｒα１と比べ、およそ１００倍強い親和性（Ｋｄは０．５〜１．２ｎＭ）でＩＬ−１３と結合し、強力な可溶性ＩＬ−１３アンタゴニスト、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃを構成し得る。ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃは、住血吸虫症誘発性の肝線維化および肉芽腫形成、腫瘍免疫学的監視におけるＩＬ−１３の役割を実証するため、種々の疾患モデルにおいて並びにＯＶＡ−チャレンジ喘息モデルにおいて、アンタゴニストとして用いられている。Wills-Karp, Mら、“Interleukin-13: central mediator of allergic asthma,”Science 282(5397): 2258-2261 (1998)；Grunig, Gら、“Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma,”Science 282(5397): 2261-2263 (1998)。
【０００７】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、β−細胞の成長因子であるＲｅｇＩ、およびＲｅｇＩＩも含む多重遺伝子（multi-gene）ファミリーであるＲｅｇ遺伝子ファミリーの副分類である。Okamoto, H., J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6:254-262 (1999)。ヒトでは、ＲｅｇＩＩＩファミリーは、ＨＩＰ、肝細胞癌腫、腸および膵臓で発現される遺伝子、および膵臓関連蛋白質（ＰＡＰ）を含む（上掲）。ヒトで見出された。他のＲＥＧファミリーの遺伝子は、ＲＥＧＩα、ＲＥＧＩβおよびＲＥＧ関連配列がある（上掲）。マウスＲＥＧ遺伝子は、ＲｅｇＩ、ＲｅｇＩＩ、ＲｅｇＩＩＩα、ＲｅｇＩＩＩβ、ＲｅｇＩＩＩγおよびＲｅｇＩＩＩδを含む（上掲）。ＲＥＧ遺伝子は、ラット、ウシおよびハムスターでも認められる（上掲）他のＲｅｇファミリーメンバーの細胞有糸分裂促進活性およびファミリーメンバー間の相同性により、Ｒｅｇ蛋白質は成長因子であると考えられる（上掲）。ＲｅｇＩＩＩ副分類のメンバー間の配列相同性の程度により、本願発明者らは、これらの遺伝子および蛋白質は、生物学的構造および機能に関連があると考える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
気管支痙攣および気道炎症を処置するための、最近の喘息治療は、気管支拡張薬、コルチコステロイドおよびロイコトリエン阻害物質の使用を含む。そのような処置の多くは、望ましくない副作用を伴い、そして、ある期間使用されると、その有効性が低下する。加えて、喘息患者に生じる気道リモデリング過程を軽減する治療介入のために利用できる薬物は、限られている。従って、喘息における高い分子的理解に関する必要性と、関連して、この複雑な疾患を阻止するための新たな治療戦略の検証の必要性がある。本発明は、これらの必要性に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、対照の喘息でない動物と比較して、喘息動物モデルにおいて統計学上有意に増加したことが見出された。特に、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードするｍＲＮＡが、気管内オボアルブミンチャレンジまたはＩＬ−１３の直接の肺点滴注入のいずれかにより向上することが見出され、本明細書中では、喘息治療のための標的として開示される。従って、本発明の１つの態様において、喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法が提供される。喘息を処置するための方法もまた提供される。
【００１０】
本発明の１つの態様において、喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法は、（ａ）ＲｅｇＩＩＩ蛋白質を被検物質と接触させる工程；および（ｂ）その被検物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を阻害するかどうかを決定する工程（ここで、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を不活性化する被検物質は、喘息を処置するのに有用である）、を含む。幾つかの態様において、本発明は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を阻害した場合に、喘息を処置するための物質として被検物質を分類する工程を、さらに含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、（ａ）ＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、被検物質と接触させる工程；および（ｂ）被検物質が、レポーター遺伝子産物の産生を阻害するかどうかを決定する工程（ここに、レポーター遺伝子産物の産生を阻害する被検物質は、喘息の処置に有用である）によって、喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法を提供する。幾つかの態様において、本発明は、レポーター遺伝子産物の産生を阻害した場合、喘息を処置するための物質として被検物質を分類する工程を、さらに含む。
【００１２】
本発明のさらに別の態様において、喘息を処置するための方法が提供される。１つの実施形態において、本方法は、それを必要とする哺乳動物に、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を低下させる物質の治療量を投与することを含む。本発明のさらなる実施形態において、本方法は、それを必要とする哺乳動物に、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を低下させる物質の治療量を投与することを含む。
【００１３】
（図面の詳細な説明）
図１は、Dusetti, N.Jら、Genomics 19(1):108-114 (1994)において報告された、ＲｅｇＩＩＩファミリーのメンバーである、ヒト膵臓関連蛋白質（ＰＡＰ）のｍＲＮＡ配列（配列番号：１）の表示である。残基３３−５５７は、コード配列を表す（ジーンバンク受け入れ番号ＮＰ＿００２５７１）。
【００１４】
図２は、Dusettiら（前掲）において報告された、翻訳されたヒトＰＡＰのアミノ酸配列（配列番号：２）の表示である（ジーンバンク受け入れ番号ＮＭ＿００２５８０）。
【００１５】
図３は、Narushima Yら、Gene 185(2):159-68 (Feb. 7, 1997)において報告された、ネズミ（ハツカネズミ（Mus musculus））ＲｅｇＩＩγ蛋白質のｍＲＮＡ配列（配列番号：３）の表示であり、残基３３〜５５７はコード配列を表す（ジーンバンク受け入れ番号Ｄ６３３６１）。
【００１６】
図４は、Narushimaら（前掲）において報告された、翻訳されたネズミ（ハツカネズミ）ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：４）の表示である。
【００１７】
図５は、ヒトＰＡＰについてのプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号：５）の表示である。
【００１８】
図６は、マウスＲｅｇＩＩＩ蛋白質についてのプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号：６）の表示である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書中で参照される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を構成する。本明細書にて引用される、発行された米国特許、認められた出願、公開された出願（米国および外国）およびジーンバンク・データベース配列を含む参考文献は、それぞれが出典明示により明確に且つ個別に示され本明細書の一部とされるように、同一範囲で出典明示により本明細書の一部とされる。
【００２０】
本発明は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質が、対照の喘息でない動物と比較して、喘息の動物モデルにおいて有意に増大するという、思いがけない発見に基づく。具体的には、ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質をコードするｍＲＮＡが、気管内オボアルブミンチャレンジまたはＩＬ−１３の直接の肺点滴注入のいずれかにより増大される。さらに、ＩＬ−１３受容体に結合するＩＬ−１３の能力を阻害すると、ＲｅｇＩＩＩγの発現を抑えることとなる。ネズミの喘息モデルにおけるＲｅｇＩＩＩγ蛋白質の上方制御は、Ｒｅｇ蛋白質がアレルギー反応に関与すること、またＲｅｇＩＩＩ蛋白質がＩＬ−１３経路を通じて制御されることを示唆する。
【００２１】
Ｒｅｇ蛋白質は、配列の相同性に基づいて３つの副分類に分類される、多重遺伝子ファミリーを含む。最も特徴付けられているものは、ＲｅｇＩであり、もともと膵臓のβ−細胞再生における成長因子として同定され、その発現は、膵臓再生および胃粘膜修復の両方の創傷治癒モデルで上方制御される。ＲｅｇＩは、胃上皮細胞に対する有糸分裂促進物質であり、膵臓摘出ラットにおける膵臓β細胞の生体内（in vivo）増殖を誘導する。マウス第６染色体のＲｅｇ多重遺伝子複合体の一部であるＲｅｇＩＩＩは、ほぼ腸管および結腸で専ら発現されている。直接の点滴注入またはＩＬ−１３の形質転換肺特異的発現のいずれかによる、肺ＩＬ−１３投与は、気道上皮細胞肥大を生じさせることが示された。密接に関連したＲｅｇ蛋白質の有糸分裂促進性の特徴は、ＲｅｇＩＩＩファミリーを、種々の動物疾患モデルおよびヒト喘息において観察される肺上皮の肥大についての更なる調査に関する候補遺伝子にする。本発明者らは、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質が、例えば肺における上皮増殖および／または肥大を刺激すると考える。喘息において観察される上皮細胞増殖および／または肥大による上皮細胞肥厚は、肺のリモデリング過程の一部分である。ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、本明細書中では、Ｒｅｇ蛋白質の有糸分裂促進性の特徴および本明細中で議論されるマウスのアレルギー性喘息モデルにおけるＲｅｇＩＩＩファミリー蛋白質のｍＲＮＡの上方調節のため、ヒト喘息において見られる肺上皮肥大および気道のリモデリング過程を阻止するための標的遺伝子とされる。ＲｅｇＩＩＩファミリー蛋白質は、限定するものではないが、ヒトＨＩＰ、ヒトＰＡＰ、マウスＲｅｇＩＩＩα、マウスＩＩＩβ、マウスＩＩＩγ、マウスＩＩＩδ、ラットＰＡＰ、ラットＰＡＰ  ＩＩＩ、ウシＰＴＰおよびハムスター膵島再生関連蛋白質（islet neogenesis-associated protein）（ＩＮＧＡＰ）を含む。このように、本発明者らは、ＲｅｇＩＩＩファミリー蛋白質は、喘息におけるアレルギー応答に関与しており、その結果として、Ｒｅｇ蛋白質の阻害物質は喘息を処置するのに有効であろうと考える。本明細書中で用いられる「喘息」は、限定されるものではないが、アトピー性喘息、非アトピー性喘息、アレルギー性喘息、運動誘発喘息、薬物誘発喘息、職業性喘息および後期喘息（late stage asthma）を含む。
【００２２】
上記のように、本発明は、哺乳動物における喘息を処置するための薬物をスクリーニングする方法を提供する。１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。本明細書で用いられる、「物質」は、限定されるものではないが、合成低分子、化学物質、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、阻害物質、例えばｓｉＲＮＡ、リボザイム、核酸リガンド、例えばアプタマー、ペプチドおよび蛋白質、例えばホルモン、サイトカイン、抗体およびその一部を含む。１つの態様において、本方法は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質を被験物質およびこの蛋白質の基質と接触させることを含む。１つの態様において、被験物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性をモジュレート（例えば、阻害または増大）する。別の態様において、被験物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生または発現をモジュレート（例えば、阻害または増大）する。「被験物質」は、そのモジュレート能力がまだ確認されていない、候補「物質」である。被験化合物がスクリーニングされ、蛋白質の活性、または産生もしくは発現を（例えば、転写または翻訳をモジュレートすることによって）モジュレートすることが示された場合、それらは「薬物」と分類される。特定の実施形態において、物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を低下もしくは阻害する。
【００２３】
幾つかの実施形態において、物質はＲｅｇＩＩＩ蛋白質と結合する。他の実施形態において、物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現の阻害物質または活性化物質と（例えば、化学的にモジュレートすることによって）相互作用する。非制限的な例として、物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性化物質と結合して阻害してもよいし、あるいは物質はＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性の阻害物質と結合して活性化してもよい。さらに、別の非制限的な例において、物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の上流で、例えば、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３受容体またはＩＬ−４受容体を拮抗することによって、相互作用してもよい。本方法は、被験物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性をモジュレート（例えば、阻害）するかどうかを決定すること、および被験化合物が該蛋白質の活性または発現をモジュレート（例えば、阻害）する場合、喘息を処置するための物質として、その被験物質を分類することを含む。ＲｅｇＩＩＩ蛋白質ファミリーのメンバーであるヒトＰＡＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図１および図２で提供され、配列番号：１および配列番号：２に記載される。ネズミＲｅｇＩＩＩγ蛋白質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ図３および図４で提供され、配列番号：３および配列番号：４に記載される。ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現を阻害する例示的な薬物は、制限するものではないが、ＩＬ−１３のアンタゴニスト、例えばｓＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ、ＩＬ−１３受容体のアンタゴニスト、ＩＬ−４受容体のアンタゴニスト、抗体、例えば、抗−ＲｅｇＩＩＩ蛋白質抗体（例えば、抗−ＨＩＰ、抗−ＰＡＰ、抗−ＲｅｇＩＩＩγ）、ＩＬ−１３中和抗体、ＩＬ−１３Ｒ抗体、核酸、例えばｓｉＲＮＡ、アプタマー（即ち、核酸リガンド）、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムおよび低分子化学阻害物質を含む。抗体の場合、本方法は、制限するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作抗体、二重特異性抗体、抗体断片（制限されるものではないが、「Ｆｖ」、「Ｆ（ａｂ’）２」、「Ｆ（ａｂ）」およびＤａｂ）および抗体の反応部分を表す一本鎖を含む。そのような抗体は、免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはその副分類のいずれかに属する抗体、またはその混合物を含む。本発明は、これら抗体の誘導体、例えば、医薬物質としてのそれらの使用に関連した１つまたはそれ以上の他の性質、例えば、血清安定性または産生効率が改変されているが、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質に対するその結合活性を保持しているものを、さらに含む。
【００２４】
別の実施形態において、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を抑制する。本方法は、制限するものではないが、被験物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現をモジュレート（例えば、阻害）するかどうかを決定すること、および被験物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現をモジュレート（例えば、阻害）する場合、喘息を処置するための物質として被験物質を分類すること、を含む。ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現を阻害する例示的な薬物は、制限するものではないが、可溶性ＩＬ−１３受容体（例えば、ＩＬ−１３α１およびＩＬ−１３Ｒα２の細胞外ドメイン、単独体または異種部分、例えば、Ｆｃとの融合体、１３Ｒα  ｓＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）；ＩＬ−１３もしくはＩＬ−１３Ｒに対する中和抗体、またはその抗原結合断片；リボザイム；アンチセンス・オリゴヌクレオチド；ＲＮＡ阻害物質（例えば、ｓｉＲＮＡ）；ホルモン；サイトカイン；および化学物質（例えば、低分子）を含む。Ｗｙｎｎら、米国特許第６，６６４，２２７号（出典明示により完全に本明細書の一部とされる）を参照のこと。
【００２５】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質が喘息の症候および／または合併症を誘発することに関連するという知見は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の配列を、本発明の薬物を同定する方法に有用な配列とする。この方法は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性および／または産生または発現を阻害する能力について可能性のある薬物をアッセイすることを含む。これらのアッセイに有用なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書中にて開示される遺伝子およびコードされたポリペプチドだけでなく、実質的に野生型の遺伝子およびポリペプチドと同じ活性を有するその変異体も含む。本明細書中で用いられる「変異体」は、その変異体が実質的に野生型のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同じ活性を維持している限り、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。ポリペプチドに関して、欠失変異体は生物学的活性に必須でないポリペプチド部分を欠く断片を含むと考えられ、挿入変異体は野生型ポリペプチドまたはその断片が別のポリペプチドと融合されている融合ポリペプチドを含むと考えられる。
【００２６】
従って、１つの実施形態において、本発明に利用されるＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、配列番号：１（図１）または配列番号：３（図３）に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされていてよい。同一性パーセントは、例えば、国立衛生研究所（National Institutes of Health）から入手できるアドバンスＢＬＡＳＴコンピュータプログラム、２．０．８版を用いて配列情報を比較することによって決定することができる。
【００２７】
加えて、別の実施形態において、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、配列番号：１（図１）または配列番号：３（図３）に記載されるヌクレオチド配列と実質的な類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされていてよい。本明細書中に用いられる「実質的な類似性」は、そのヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列と実質的に類似し、さらに適度に厳格な条件下でハイブリダイズすることを意味する。類似性を決定するこの方法は、本発明が属する分野では周知である。厳格な条件の例を以下の表１に示す：非常に厳格な条件は、例えば、少なくとも条件Ａ−Ｆほどに厳格な条件であり；厳格な条件は、例えば、少なくとも条件Ｇ−Ｌほどに厳格であり；および低い厳格な条件は、例えば、少なくとも条件Ｍ−Ｒほどに厳格である。
【表１−１】
2008512086.tif 000002
【表１−２】
2008512086.tif 000003
１ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域（群）に関して予想されるハイブリッドの長さである。あるポリヌクレオチドを未知配列の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる場合、そのハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリッド長であると推測される。既知配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、それらのポリヌクレオチド配列をアライメントし、最適な配列相補性を有する領域または領域群を同定することによって、決定することができる。
２ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中のＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に代えて用いることができる；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後に１５分間行われる。
ＴＢ＊−ＴＲ＊：５０塩基対長よりも短いことが予想されるハイブリッドについてのハイブリダイゼーション温度は、以下の方程式に従って計算されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５−１０ＥＣ低くあるべきである。１８塩基対長よりも短いハイブリッドについては、Ｔｍ（ＥＣ）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８から４９塩基対長のハイブリッドについては、Ｔｍ（ＥＣ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｎａ＋）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッドでの塩基数であり、Ｎａ＋はハイブリダイゼーション緩衝液中でのナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣについてのＮａ＋＝０．１６５Ｍ）。
【００２８】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに関する厳格な条件の更なる例は、Sambrookら、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Chs. 9 ＆ 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)、およびAusubelら著、Current Protocols in Molecular Biology, §§ 2.10, 6.3-6.4, John Wiley ＆ Sons, Inc. (1995)にて提供される（出典明示により本明細書の一部とされる）。
【００２９】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、当業者に既知の方法により産生されることができる。例えば、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質遺伝子をコードするヌクレオチド配列を、所望の宿主細胞中に導入することができる。そのようなヌクレオチド配列は、まず、適当な組換え発現ベクター中に挿入され得る。
【００３０】
組換え発現ベクターは、当業者に周知の方法に従って、ベクター内に上述のヌクレオチド配列を組み込むことによって構成することができる。本発明に有用である多種多様なベクターが、知られている。適切なベクターは、プラスミドベクター、並びにレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターを含むウイルスベクターを含む。ベクターは、調節因子を含み、特定の宿主細胞において核酸の有効な発現に必要な若しくは望ましい他の既知遺伝因子を含んでいてよい。例えば、ベクターはプロモーター、および遺伝子の転写を達成するためにプロモーターと協調するいずれかの必要なエンハンサー配列を含んでいてよい。ヌクレオチド配列は、そのような調節因子と作動可能に連結されていてよい。
【００３１】
そのようなヌクレオチド配列は、「遺伝的構築物」と称される。ある遺伝的構築物は、それ自身の遺伝因子、または１つまたはそれ以上の付加的な遺伝因子、限定されるものではないが遺伝子、プロモーターもしくはエンハンサーと組み合わされる遺伝因子を含んでいてよい。幾つかの実施形態において、これらの遺伝因子は、作動可能に連結される。幾つかの実施形態において、問題の特定の遺伝子（例えば、ｈＨＩＰ、ｈＰＡＰ、ＲｅｇＩＩＩγ）が遺伝的構築物に存在していなくてもよく、限定されるものではないが、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質のプロモーターがレポーター遺伝子と作動可能に連結されている場合を含む。
【００３２】
本明細書中で用いられるように、あるヌクレオチド配列が他のヌクレオチド配列と機能的な関係に配置された場合、そのヌクレオチド配列は他のヌクレオチド配列と「作動可能に連結」されている。例えば、コード配列がプロモーター配列と作動可能に連結されている場合、通常、そのプロモーターがコード配列の転写を促進することができることを意味する。「作動可能に連結された」は、典型的には、連結されたＤＮＡ配列が、２つの蛋白質のコード領域を繋ぐために必要で、隣接し且つ読み取り枠内となるように、隣接していることを意味する。しかしながら、プロモーターから数キロ塩基離れて、エンハンサーは機能することができるため、種々の長さのイントロン配列が存在していてよく、幾つかのヌクレオチド配列は、隣接せずに作動可能に連結されていることがある。
【００３３】
組換え発現ベクター中に含まれていてよい、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞中に導入するため、多種多様な方法を利用することができる。そのような方法は、当分野で既知であり、機械的方法、化学的方法、親油的方法および電気穿孔法が挙げられる。顕微注入および例えば、導入されるべきＤＮＡの金粒子基質を用いる遺伝子銃の使用は、制限するものではなく、例示的な機械的方法の代表例である。リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランの使用は、制限するものではなく、例示的な化学的方法の代表例である。例示的な親油的方法は、脂質媒介性トランスフェクションのためのリポソームおよび他の陽イオン試薬の使用を含む。そのような方法は、当分野で周知である。
【００３４】
所望の量のＲｅｇＩＩＩ蛋白質を産生するため、多種多様な宿主細胞を本発明に利用することができる。そのような細胞は、制限されるものではないが、当分野で既知の哺乳動物細胞および細菌細胞を含む、真核および原核細胞を含む。
【００３５】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、制限されるものではないが、クロマトグラフィー技術、電気泳動技術および遠心分離技術を含む、当業者に周知の技術により単離精製することができる。そのような方法は、当分野で既知である。
【００３６】
試料（例えば、組織、細胞培養物またはＲｅｇＩＩＩ蛋白質の量）は、典型的には、蛋白質の活性または産生／発現を阻害するのに十分な時間で、被験物質と接触させる。その時間は、被験物質の性質、具体的なＲｅｇＩＩＩ蛋白質、その活性または発現、選択される検出方法および選択される試料組織に応じて変更し得る。当業者であれば、過度の実験を要することなく、容易に、その時間を決定することができる。例示的な被験物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質と結合することができるものであるか、あるいは、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質と結合し、情報伝達経路の他の成分との機能的に相互作用するその能力を阻害することによって、その蛋白質の活性を低下させるものである。類似のアッセイは、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現を阻害する被験物質、限定するものではなく、ＩＬ−１３アンタゴニスト（例えば、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ融合蛋白質）またはＩＬ−４アンタゴニストを含む被験物質をスクリーニングする。
【００３７】
被験物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を阻害するかどうかを決定するために、多種多様なアッセイを利用することができる。ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は有糸分裂促進活性を有するため、そのようなアッセイは、限定するものではないが、細胞増殖アッセイおよび粘液産生アッセイを含む。１つの実施形態において、所望の細胞を、有効量のＲｅｇＩＩＩ蛋白質と被験物質と接触させるか、あるいは、一緒にインキュベートする。その量は、上皮細胞増殖および／または肥大を刺激するのに有効な量であり、当業者であれば決定することができる。次いで、細胞増殖を測定し、被験物質を含まずＲｅｇＩＩＩ蛋白質を用いて処置した対照細胞と比較することができる。
【００３８】
被験物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を阻害するかどうかを決定するために、多種多様な細胞増殖アッセイを利用することができる。そのような細胞増殖アッセイは、当分野で広く知られており、例えば、標識化チミジン取り込みアッセイ、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン取り込みアッセイ、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル四ナトリウム臭化物アッセイおよびアデノシン三リン酸塩生成アッセイまたはその組み合わせを含む。
【００３９】
当分野で知られているように、標識化チミジンの組み込み、例えば、放射標識化チミジンの組み込みは、細胞増殖を観察あるいは定量化するのに用いることができる。標識化ヌクレオチド、典型的にはトリチウム化チミジンは、細胞が新たに合成するＤＮＡ中に組み込まれる。細胞増殖の相対量は、ＤＮＡ中に組み込まれた放射標識化ヌクレオチドの量を定量化することによって決定される。Cunningham, B.A., The Scientist, 15(13):26 (2001)。ＤＮＡ中に組み込まれた放射標識化ヌクレオチドの量は、液体シンチレーション計数法により測定することができ、細胞増殖の測定法である。
【００４０】
他のヌクレオチドは、新たに合成されたＤＮＡ中に同様に組み込まれ、定量化することができ、細胞増殖の相対的測定法として機能する。例えば、５−ブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、ＤＮＡ中に組み込まれ、商業的に入手可能なＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体を、酵素免疫測定法、例えば酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に用いることによって定量化することができる。
【００４１】
３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル四ナトリウム臭化物（ＭＴＴ）アッセイは、ＭＴＴをホルマザンと称される青色に化合物にする細胞還元能の低下に関する。細胞還元能は、老細胞または死細胞に比べ、活発に増殖する細胞で増大される。従って、青色の強度を（例えば、分光学的に）観察することによるホルマザンの定量化は、細胞増殖の相対的測定法を提供する。Cunningham, B.A., The Scientist, 15(13):26 (2001)；Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63 (1983)。ＭＴＴに代えて若しくは加えて、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８、ＸＴＴおよびＭＴＳを含む他のテトラゾリウム塩を用いることができる。そのようなアッセイを行うためのキットは、商業的に、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナッサス、バージニア州）から入手できる。
【００４２】
アデノシン三リン酸塩生成アッセイは、試験される細胞中に存在するＡＴＰ量を測定する。ＡＴＰは、典型的には、ＡＴＰを加水分解する種々の成分と反応し、光を発する。その光の強度は、細胞内ＡＴＰ量と比例する。１つのアッセイにおいて、ＡＴＰは、酸素の存在下でルシフェラーゼおよびルシフェリンと反応する。そのようなアッセイは、例えば、The Scientist, 15(13):26 (2001)；Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63 (1983)およびCrouchら、J. Immunol. Methods 160:81-88 (1993)に記載されている。
【００４３】
例えば、Ausubelら著., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sonsに記載されるような血球計数およびトリパンブルー染色の使用を含む、当分野で既知の細胞を定量する他の方法を、用いることができる。
【００４４】
多種多様な細胞を、細胞増殖アッセイに用いることができる。非制限的な細胞の例は、哺乳動物の細胞であり、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の有糸分裂促進活性に応答する。そのような細胞は、例えば、初代上皮細胞および／または細胞株、例えばＬＩＭ１８６３（Whiteheadら、Cancer Res. 47(10):2683-9 (１９８７年５月１５日)が挙げられる。そのような細胞は、典型的には細胞培養物として存在する。他の非制限的な細胞の例は、気道上皮細胞がある。細胞培養方法は、当業者には既知であり、例えば、Ausubelら、著., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons; A.J. Shaw著., Epithelial Cell Culture：A Practice Approach (Practical Approach Series), IRL Press,1996; R.I. FreshneyおよびM.G. Freshney著., Culture of Epithelial Cells、第２版、John Wiley ＆ Sons, 2002；およびC. Wise著、Epithelial Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology, v. 188), Humana Press, 2002に記載されている。
【００４５】
被検物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性を阻害するかどうかを決定するために利用することができる別のアッセイは、当業者には既知の技術である、Ｈ＆Ｅ染色した細胞から産生される粘性の定量化である。1つの実施形態において、上皮細胞を、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質および被検物質の有効量と接触させるか、または一緒にインキュベートする。この量は、上皮細胞（群）から杯状細胞への分化を刺激するのに有効な量であり、当業者により決定され得る。次いで、粘液産生を測定し、被検化合物を存在させずＲｅｇＩＩＩ蛋白質を用いて処理した対照細胞と比較することができる。粘性産生に関するＨ＆Ｅ染色に加え、粘液低下をコードするｍＲＮＡの発現は、古典的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて測定することができ、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドアレイを用いて発現されたｍＲＮＡの全体的な特徴づけ、あるいは粘液中のムコ多糖の量を定量化することによって測定することができる。
【００４６】
粘性成分を染色する染色法および比色定量アッセイによる定量法の使用を含む、多種多様なアッセイを、粘性を定量化するために利用することができる。１つの実施形態において、過ヨウ素酸シッフ技術を、粘液中に存在するムチン、糖タンパク質またはムコ多糖を染色するために用いることができる。別には、Svitacheva, Nおよび Davies, J.R., 「Mucin biosynthesis and secretion in tracheal epithelial cells in primary culture」、Biochem. J. 353:23-32 (2001) に記載されるように、ムチンを放射標識化し、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分析することができる。ムチンは、例えば、Svitacheva, NおよびDavies, J.R.（前掲）に記載されるように、当分野で既知の標準方法によって単離することができる。簡単には、培養物中の細胞を集め、試料を透析した後に、ムチンを等密度勾配遠心分離により単離することができる。
【００４７】
多種多様な起源からの哺乳動物の上皮細胞を、ムチンの定量化を含む上述のスクリーニングアッセイ並びに上記の細胞増殖アッセイに利用することができる。非制限的な上皮細胞の例としては、クロンテック社（www.cambrex.com）から入手することができる、末梢気道上皮細胞または気管支上皮細胞がある。そのような細胞は、典型的には、細胞培養物として存在する。細胞培養方法は、当業者には既知であり、例えば、Ausubelら著、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons；A.J. Shaw著、Epithelial Cell Culture：A Practice Approach (Practical Approach Series), IRLPress,1996；R.I. FreshneyおよびM.G. Freshney著., Culture of Epithelial Cells、第２版、John Wiley ＆ Sons, 2002；およびC. Wise著、Epithelial Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology, v. 188), Humana Press, 2002に記載されている。加えて、上皮細胞株を、ムチンの定量化を含むスクリーニングアッセイに用いることができる。
【００４８】
多種多様な被検物質を、本発明のスクリーニング方法において試験することができる。例えば、当分野で既知の低分子化合物、合成低分子化合物、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ阻害物質、例えばｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアプタマー、ペプチドおよび蛋白質、例えばホルモン、抗体およびその一部を、被検物質として実施することができる。１つの非制限的な実施例において、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性部位の３次元構造は、酵素と既知の阻害物質とにより形成される複合体を結晶化することにより決定される。次いで、合理的薬物設計を用い、既知の阻害物質の構造に変更を加えることによって、あるいは、酵素の活性部位と結合する低分子化合物を設計することによって、新たな被検物質を究明する。同様に、当業者であれば、合理的な薬物設計を用いて、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生をモジュレートするのにも有用であろうＩＬ−１３Ｒおよび／またはＩＬ−４Ｒのアンタゴニストを設計することもできる。本明細書中において記述されるように、試験物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性の阻害物質、並びにＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現または産生の阻害物質を含む。ＲｅｇＩＩＩ活性の阻害物質の非制限的な例は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質に対する抗体、低分子阻害物質、並びに蛋白質およびペプチド、例えばホルモンおよびサイトカインを含む。ＲｅｇＩＩＩ産生の阻害物質は、限定するものではないが、ＲｅｇＩＩＩｍＲＮＡまたは蛋白質の産生を阻害する被検物質を含む。そのような被検物質の非制限的な例は、ＩＬ−１３のアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−４Ｒに対する中和抗体を含む。ＩＬ−１３のアンタゴニストは、限定するものではないが、ＩＬ−１３受容体またはＩＬ−４受容体のいずれかと結合するＩＬ−１３の能力を阻害する被検物質を含む。そのようなアンタゴニストは、限定するものではないが、ＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ、およびＩＬ−１３、ＩＬ−１３ＲまたはＩＬ−４Ｒに対する中和抗体を含む。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または産生または発現をモジュレート（例えば、阻害または活性化）する薬物をスクリーニングすることによって、哺乳動物における喘息を処置する薬物をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、限定するものではないが、ｈＨＩＰ、ｈＰＡＰもしくはＲｅｇＩＩＩγを含むＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードする哺乳動物遺伝子のプロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を阻害するのに有用であると考えられる被検物質と接触させる工程；その被検物質がレポーター遺伝子産物の産生を阻害するかどうかを決定する工程；およびその被検物がレポーター遺伝子産物の産生を阻害する場合に、喘息を処置するための薬物としてその被検物質を分類する工程、を含む。１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００５０】
１つの実施形態において、限定するものではないが、ｈＨＩＰ、ｈＰＡＰまたはＲｅｇＩＩＩγを含むＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターは、図５および６のそれぞれに示されるように、配列番号：５または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列を含む。当該配列と少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％および少なくとも約９０％の同一性を有し、かつプロモーターとして機能する、例えば、本明細書に記載のＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードする遺伝子の発現を方向付けるヌクレオチド配列は、また、本発明に含まれる。
【００５１】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質のプロモーターのヌクレオチド配列は、当分野で慣用される方法によって決定される。そのような方法の非制限的な例の１つに、プローブとして配列番号：１（図１）又は配列番号：３（図３）を用いて興味あるプロモーター配列についてゲノムライブラリー（例えば、ＹＡＣ、ヒトゲノムライブラリー）をスクリーニングする方法がある。適当なプロモーター配列を決定するための別の非制限的な方法の例として、電気泳動分離されたヒトゲノムＤＮＡをプローブ（例えば、配列番号：１またはその一部を含むプローブ）で探索し、次いでそのｃＤＮＡプローブ（例えば、配列番号：１）がハイブリダイズするかどうかを決定することによる、ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロットを実施する方法がある。プローブ（例えば、配列番号：１）がハイブリダイズしたバンドを決定し、そのバンドを分離し（例えば、ゲルからの切り出し）、配列分析にかける。これにより、配列番号：１のヌクレオチド１０４−１０６（即ち、ＡＴＧ部位）の５´ヌクレオチド断片の検出が可能となる。ヌクレオチド断片は、およそ５００〜１０００単位長であろう。配列番号：３（図３）に記載のネズミＲｅｇＩＩＩγ蛋白質のプロモーター配列は、これらと同様の方法によって決定することができる。当該配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％および少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、および、例えば、本明細書中に記載のＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードする遺伝子の発現を方向付けるプロモーターとして機能する配列もまた、本発明に含まれる。
【００５２】
種々のレポーター遺伝子を、上記のＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターと作動可能に連結することができる。そのような遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光蛋白質、または当分野で既知の別のレポーター遺伝子産物をコードしていてよい。
【００５３】
本発明の実施形態において、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞中に導入される。そのようなヌクレオチド配列は、まず、本明細書中で上述した適当な組換え発現ベクター中に挿入されよう。
【００５４】
本発明のこの態様におけるベクターは、例えば調節因子を含み、特定の宿主細胞においてＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターによりそのヌクレオチド配列の効果的な発現に必要もしくは望ましい他の既知の遺伝因子を含んでいてよい。例えば、ベクターは、生体内でのレポーター遺伝子の転写を達成するために、生体内でプロモーターと同調するいずれかの必要なエンハンサー配列を含んでいてよい。ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入する方法は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質を産生するために上記した方法と同じである。
【００５５】
多種多様な宿主細胞を、本発明のスクリーニング方法に利用することができる。例示的な宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣、大腸菌、ＣＯＳおよびバチルスを含む。
【００５６】
別には、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質を完全にもしくはその一部をコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載のスクリーニング方法のためのベクターに利用することができる。そのような場合、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、本明細書中上記したクロマトグラフ、電気泳動および遠心分離技術を含む、当業者に周知の技術により単離し、精製することができる。加えて、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質は、当分野で既知の方法により定量することができる。
【００５７】
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子またはＲｅｇＩＩＩ蛋白質遺伝子をコードするヌクレオチド配列を、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を阻害するのに有効であると考えられる被検物質と接触させた後、その被検物質が、レポーター遺伝子産物の産生を阻害するかどうかが決定される。この評価は、レポーター遺伝子産物の量もしくは活性のいずれかを定量することによって決定することができる。定量化方法は、用いられるレポーター遺伝子に依存するであろうが、そのレポーター遺伝子産物に対する抗体を用いた酵素免疫吸着測定法の使用を含み得る。加えて、アッセイは、化学ルミネセンス、蛍光または放射能減衰を測地するもの、または当分野で既知の他の方法であってよい。本明細書中に記載のレポーター遺伝子産物の活性もしくは量を決定するアッセイは、当分野で知られている。被検物質が、レポーター遺伝子産物の産生を阻害する場合、その物質は、喘息を処置するための薬物と分類される。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法は、試験管内（in vitro）（例えば、細胞に基づくアッセイまたは酵素活性アッセイにおけるＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現をモニターすること）あるいは生体内（例えば、被検物質を哺乳動物に投与した後に、組織試料、例えばＢＡＬにおけるＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現をモニターすること）のいずれかで実施される。例示的な哺乳動物は、限定するものではないが、ヒト、マウス、ラットおよびイヌを含む。
【００５９】
本発明はまた、喘息を処置する方法を提供する。本明細書中で用いられる「処置」、「処置する」もしくは「処置される」は、喘息の少なくとも１つの症候もしくは合併症を、予防、低下または除去することを意味する。例示的な喘息の症候および／または合併症は、制限されるものではないが、ＡＨＲ、粘液過剰産生、増進された血清ＩｇＥレベル、増進された気道抗酸球増加および気道リモデリングを含む。これらの方法は、それを必要とする哺乳動物、例えばヒトに、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生または活性を低下させる薬物の有効量を投与することを含む。本発明の薬物で処置されることができる哺乳動物の他の非制限的な例としては、マウス、ラットおよびイヌを含む。「治療量」は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または産生または発現を阻害する又は低下させることができ、臨床上有意な応答を引き起こすことができる薬物の量を表す。臨床上の応答は、処置される状態の改善またはそのような状態の予防を含む。本発明に基づいて投与される薬物の具体的な用量は、勿論、投与される薬物、処置される具体的な喘息および類似の状態を含む症例ごとの具体的な事情により決定されるであろう。ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または産生または発現を低下させる薬物は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより見出される薬物を含む。さらなる薬物、または阻害物質は、当分野でよく知られており、例えば、蛋白質およびペプチド、例えば、ホルモン、サイトカインおよび抗体およびその一部、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアプタマー、並びに低分子を含む。例えば、Houstonら、PNAS 99(14): 9127-9132 (2002)を参照のこと。一例として、本明細書にて用いられるＲｅｇＩＩＩ蛋白質に対する抗体は、制限するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、遺伝的に作り出された抗体、二重特異性抗体、抗体断片（限定されるものではないが、「Ｆｖ」、「Ｆ（ａｂ´）２、「Ｆ（ａｂ）」、および「Ｄａｂ」を含む」、および抗体の反応部分を表す一本鎖抗体であってよい。そのような抗体は、いずれかの免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはそれらの副分類に属する抗体、もしくはその混合物を含む。本発明は、さらにそれらの抗体の誘導体、例えば、医薬物質としてのその使用に関する１つまたはそれ以上の特性、例えば、血清安定性もしくは産生効率が改変されているが、それらのＦｏｘＭ１−結合活性を保持しているものを含む。抗体の非制限的な例としては、抗−ＲｅｇＩＩＩ抗体、抗−ＩＬ−１３中和抗体、抗−ＩＬ−１３Ｒおよび抗−ＩＬ−４Ｒ抗体を含む。上記抗体型のそれぞれについての産生方法は、当分野で周知である。
【００６０】
種々の実施形態において、そのような抗体は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質（例えば、ｈＨＩＰ、ｈＰＡＰ、ＲｅｇＩＩＩγ）、ＩＬ−１３、ＩＬ１３−Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、またはＲｅｇＩＩＩのシグナル経路の別の成分と結合する。さらなる実施形態において、抗体は、ＲｅｇＩＩＩ活性または発現の阻害物質を結合する。上記の抗体型のそれぞれを産生する方法は当分野で周知である。
【００６１】
抗体を合成するのに用いることができる細胞は、形質転換後の動物、菌類、細菌細胞または酵母細胞が挙げられる。非制限的な一例として、ハイブリドーマ細胞は、既知の様式で、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質で免疫された動物から、それらの抗体を産生するＢ細胞を単離し、ＲｅｇＩＩＩもしくはＩＬ−１３結合抗体についてそれらの細胞を選択し、続いて、それらの細胞を、例えばヒトまたは動物の細胞、例えばマウスミエローマ細胞、ヒトリンパ芽球細胞またはヘテロハイブリドーマ細胞と融合させることによって、あるいは、それらの細胞の不死化細胞株を作り出すのに適当なウイルスを感染させることによって、作製することができる。
【００６２】
非制限的な一例として、ヒトＲｅｇＩＩＩ（例えば、ＨＩＰ、ＰＡＰ）またはＩＬ−１３モノクローナル抗体は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質を検出するのに、または喘息様の症候を有する対象を処置するのに用いることができる。用語「モノクローナル」は、得られた抗体の特徴が、実質的に均一な抗体集団に基づくこと（即ち、集団を構成する個々の抗体が、わずかに存在し得る自然発生的な突然変異の可能性を除いて同一であること）、およびいずれかの具体的な方法により抗体の産生を要求するものと解釈されないことである。
【００６３】
このように、試料中のＲｅｇＩＩＩ蛋白質の検出または定量化は、モノクローナル抗体とＲｅｇＩＩＩ蛋白質またはＩＬ−１３との間の特異的な結合反応を利用する免疫アッセイにより実施することができる。種々の免疫アッセイは、当分野で周知であり、そのいずれを用いてもよい。免疫アッセイの例としては、それぞれ第一および第二の抗体として、モノクローナル抗体と別のモノクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法、第一および第二抗体として、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法、金コロイドを用いる染色法、凝集法、ラテックス法および化学ルミネセンスが挙げられる。
【００６４】
抗体断片もまた、喘息処置についてのＲｅｇＩＩＩ蛋白質またはＩＬ−１３検出に用いることができる。抗体断片は、酵素、例えば、パパインもしくはペプシンを用いて抗体のＦｃ部分を切除する酵素法により、化学的な酸化により、または抗体遺伝子の遺伝操作により得ることができる。遺伝的に操作された切断されていない断片を使用することも可能であり、有利でもある。これらの抗体またはその断片は、単独でもしくは混合物で用いることができる。当業者であれば、ＩＬ−１３受容体もしくはＩＬ−４受容体に対する抗体もまた、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または産生または発現を低下させることによって喘息を処置する方法に使用できることは理解される。
【００６５】
本発明は、ＩＬ−１３アンタゴニストの治療量を投与することを含み、その投与がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の産生を低下させる、喘息の処置方法を含む。本明細書中のいずれかで記載されるように、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現は、少なくとも部分的にＩＬ−１３経路を通じて調節される。１つの非制限的な実施形態において、被検物質は、ＩＬ−１３受容体と結合するＩＬ−１３の能力を乱すことにより、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の下方調節を起こさせるＩＬ−１３アンタゴニストである。１つの実施形態において、アンタゴニストは、ＩＬ−１３を結合するＩＬ−１３受容体と競合する。１つの実施形態において、アンタゴニストは、制限するものではないが、ＩＬ−１３受容体の１つまたはそれ以上の結合鎖を含む融合蛋白質を含む。非制限的な可溶性の融合蛋白質の例としては、ＩＬ−１３Ｒα１−ＦｃおよびＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃを含む。例示的な被検物質は、限定するものではないが、合成低分子を含む化合物、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアプタマー、ペプチドおよび蛋白質、例えばホルモン、サイトカインおよび抗体またはその一部、例えば抗−ＩＬ−１３中和抗体および抗−ＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−４Ｒ抗体もまた含む。
【００６６】
本発明は、核酸を投与することにより、喘息を処置する方法を含む。例示的な核酸は、制限されるものではないが、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含む。１つの実施形態において、リボ核酸は、図１および図３に表される、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質をコードする配列番号：１または配列番号：３に記載のヌクレオチド配列の一部の相補的なヌクレオチド配列を有する。
【００６７】
別の実施形態において、低分子干渉ＲＮＡ（即ち、ＲＮＡ干渉の過程による）は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の阻害物質として用いられる。ＲＮＡ干渉は、サイレンシングされる遺伝子標的に相同する二本鎖ＲＮＡによりもたらされる、配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングに関する。低分子干渉ＲＮＡを利用した蛋白質の産生を阻害する方法は、当分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ国際出願番号、国際公開第ＷＯ０１／７５１６４号パンフレット；第００／６３３６４号パンフレット；第０１／９２５１３号パンフレット；第００／４４８９５号パンフレット；および第９９／３２６１９号パンフレットに開示されている。ＲＮＡ干渉構築物またはｓｉＲＮＡ二本鎖ＲＮＡ分子は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質またはＩＬ−１３の発現を干渉するのに用いることができる。典型的には、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質またはＩＬ−１３の少なくとも１９、２１、２２または２３個のヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ分子に十分である。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、２個のヌクレオチド３´突出を有する。ｓｉＲＮＡが、ある構築物から、例えばヘアピン分子から又は所望のＲｅｇＩＩＩもしくはＩＬ−１３配列の逆方向反復から細胞内で発現されると、次に、内因性の細胞内機構装置がその突出部を作り出す。ｓｉＲＮＡ分子は、試験管内での転写による化学的合成によって、または長鎖ｄｓＲＡＮのＲｎａｓｅＩＩＩもしくはダイサー（Dicer）による消化によっても調製することもできる。Brummelkampら、Science, 296:550-53 (2002)；Elbashirら、Nature, 411:494-98 (2001)；Elbashirら、Genes Dev, 15:188-200 (2001)。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または産生についての１つまたはそれ以上の阻害物質と１つまたはそれ以上のＩＬ−１３アンタゴニストとの同時投与を含む、喘息の処置方法を含む。例示的なＲｅｇＩＩＩ阻害物質は、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性をモジュレート（例えば、阻害）する物質、例えば、抗−ＲｅｇＩＩＩ抗体、同様に、ＲｅｇＩＩＩのｍＲＮＡの転写をモジュレート（例えば、阻害）する物質、例えば、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＩＬ−１３の例示的なアンタゴニストは、ＩＬ−１３受容体と結合するＩＬ−１３の能力をブロックする物質を含む。そのような物質は、ＩＬ−１３分子に作用する物質、例えば、ｓＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃおよび抗ＩＬ−１３中和抗体、並びにＩＬ−１３受容体に作用する物質、例えば、抗ＩＬ−１３Ｒ抗体および合成低分子を含む。ＩＬ−１３のアンタゴニストは、さらに、リボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、サイトカインおよびホルモンを含む。ここで、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質を阻害し、ＩＬ−１３と拮抗する物質を含む組み合わせ治療が考えられる。
【００６９】
本発明は、哺乳動物におけるＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現を低下させる方法を含む。本方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストの有効量を投与することを含む。１つの実施形態において、アンタゴニストは、ＩＬ−１３受容体と結合するＩＬ−１３の能力をブロックする。別の実施形態において、アンタゴニストは、ＩＬ−４受容体と結合するＩＬ−１３の能力をブロックする。そのようなアンタゴニストは、喘息を処置する方法に関連して上述されたものを含む。特定の実施形態において、アンタゴニストは、ｓＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ、ｓＩＬ−１３Ｒα２−ＦｃおよびＩＬ−１３に対する中和抗体よりなる群から選択される。
【００７０】
別の態様において、本発明は、喘息の処置効果をモニターする方法を含む。本方法は、被検物質を投与し、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現をモニターすることを含み、ここで、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の発現を低下させる物質は、その被検物質が喘息を処置するのに有用であることを意味する。被検物質は、本明細書中のいずれかに記載されるものを含む。１つの実施形態において、本方法は、ＩＬ−１３のアンタゴニストを投与することを含む。ＩＬ−１３のアンタゴニストは、上述のものを含む。非制限的なＩＬ−１３アンタゴニストの例としては、ｓＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ、ｓＩＬ１３Ｒα２−ｃおよびＩＬ−１３に対する中和抗体を含む。
【００７１】
喘息を処置する方法は、それを必要とする哺乳動物に、ＩＬ−１３アンタゴニストを投与すること、ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現または産生のレベルを検出すること、およびＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現のレベルを、ＩＬ−１３アンタゴニストで処置する前の対照レベルと比較することを含む。ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現又は産生のレベルは、対照レベルと比較して、増加もしくは低下してよい。被検物質がＲｅｇＩＩＩ蛋白質の活性または発現を低下もしくは阻害する場合、次に、その物質は喘息を処置するのに効果的なＩＬ−１３アンタゴニストとして分類されよう。ＲｅｇＩＩＩの活性または発現を阻害する例示的な薬物は、制限するものではないが、ｓＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ、ｓＩＬ１３Ｒα２−ｃ、ＩＬ−１３に対する中和抗体および抗−ＲｅｇＩＩＩ抗体を含む。
【００７２】
薬物は、多種多様な経路で投与することができる。投与経路の例としては、経口、非経口、経皮および肺投与を含む。例えば、薬物は、鼻腔内、筋肉内、皮下、腹膜内、膣内、およびそのいずれかの組み合わせにて投与することができる。肺投与に関して、噴霧器、吸入器またはエアロゾル調剤を用いて、適当な製剤中の治療薬物を輸送することができる（すなわち、エアロゾル化剤を用いて）。加えて、薬物を単独で、もしくは他の薬物または既知の薬品と組み合わせて投与することができる。組み合わせにおいて、薬物は、同時に投与されてもよいし、まあは、それぞれの薬物が異なる時に投与されてもよい。１つまたはそれ以上の既知の喘息薬品と組み合わされる場合、薬物および薬品は同時に投与されてもよいし、または、薬物は薬品（類）の前もしくは後に投与されてもよい。
【００７３】
１つの実施形態において、薬物は、医薬上許容される担体にて投与される。当分野で既知の適切な担体のいずれかを用いることができる。１つの実施形態において、担体は、薬物を可溶化するのに有効である。担体は、限定されるものではないが、固体、液体、固体と液体の混合物を含む。担体は、カプセル剤、錠剤、ピル剤、粉剤、ロゼンジ、懸濁剤、エマルジョンまたはシロップ剤の剤形をとることができる。担体は、香味料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、結合剤、安定化剤、錠剤崩壊剤およびカプセル化物質として作用する物質を含んでいてよい。
【００７４】
全身経口投与のための錠剤は、当分野で知られているように、賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール）、セルロース（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ガム（例えば、アラビアゴム、トラガカントゴム）を、崩壊剤、例えばメイズ、スターチまたはアルギン酸、結合剤、例えばゼラチン、コラーゲンまたはアカシア、および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクを共に含んでいてよい。
【００７５】
粉剤において、担体は、細かく砕かれた薬物の有効量と一緒に混合される、細かく砕かれた固体である。
【００７６】
液剤、懸濁剤またはシロップ剤において、薬物の有効量が、担体、例えば、滅菌水または有機溶媒、例えば水性ポリエチレングリコール中に溶解もしくは懸濁されている。他の成分は、水性スターチまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液または当分野で既知の適切な油中に阻害物質を分散させることによって作製することができる。
【００７７】
薬物は治療量で投与される。その量は、喘息を処置するのに有効な量である。その量は、利用される薬物の活性、喘息の性質および対象の健康に応じて変更されよう。用語「治療上有効な量」は、望まれる治療上の結果を達成するために有効な投薬量で処置することを意味するために用いられる。さらに、当業者であれば、薬物の治療上の有効な量は、細かく調整することによって、および／または１つ以上の薬物を投与することによって、または抗−喘息化合物（例えば、コルチコステロイド）と一緒に薬物を投与することによって、減じたり増やしたりできることは、理解されよう。以下の実施例において例示するように、治療上の有効な量は、例えば、経験的に比較的低量から始め、有益な効果（即ち、抗原に曝された喘息患者の症候の軽減）を同時に評価して徐々に増量することによって、容易に決定することができる。
【００７８】
薬物を担体と組み合わせる場合、薬物は、約１重量パーセント〜約９９重量パーセントの量で存在させることができ、残りは、医薬上許容される担体から構成される。幾つかの実施形態において、薬物は、約２５重量パーセント〜約７５重量パーセントの量で存在する。幾つかの実施形態において、薬物は、約３０重量パーセント〜約６０重量パーセントの量で存在する。幾つかの実施形態において、薬物は、約４０重量パーセント〜約５０重量パーセントの量で存在する。
【００７９】
参考文献は、現在、本発明を例示する特定の実施例においてなされよう。実施例は、本発明の例示的な実施形態を提供するものであり、それにより本発明の範囲が制限されることを意図するものでないことは、理解されるべきである。
【００８０】
実施例１
アレルギー反応に伴うマウス肺における遺伝子発現の変化
気管内ＯＶＡ−チャレンジにより誘導される遺伝子発現の変化を同定するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)）を、０日目にＰＢＳ２００μｌ中の１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（Sigma, St. Louis, MO）を腹腔内（i.p.）注射することにより免疫した。１４日と２５日に、マウスをケタミンとキシラジン（それぞれ４５および８ｍｇ／ｋｇ）の混合物を用いて麻酔にかけ、気管内に、５０μｌの１．５％ＯＶＡ溶液または同量のＰＢＳをチャレンジした。ＩＬ−１３媒介性シグナル伝達に依存するｍＲＮＡ濃度の変化を同定するために、ＯＶＡチャレンジしたマウス２匹は、アレルギーチャレンジの期間の前に及び期間中に、可溶性のＩＬ−１３受容体融合蛋白質、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃの3階の腹腔内注射で処理された。この受容体融合蛋白質のＦｃ−部分の対照として、ＯＶＡ−チャレンジしたマウス２匹を、ｈＩｇＧの腹腔内投与にて同様に処理した。第二の組の６匹の対照マウスは、次のチャレンジを行うことなく、ＯＶＡに同様に感作させ、同時期にＰＢＳ緩衝液の気管内投与を、単独（ｎ＝２）でか、あるいはｈＩｇＧ（ｎ＝２）もしくはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ（ｎ＝２）の腹腔内注射で処理された。ＯＶＡ−チャレンジおよび緩衝液単独の対照マウスの肺組織を、第二の肺へのチャレンジの後、７８時間で採取した（２８日）。
【００８１】
瞬間凍結マウス肺組織を、液体窒素冷却乳鉢と乳棒を用いて砕き、６ｍｌの４Ｍグアニジンイソチアシネート／０．７％の２−メルカプトエタノール（ＧＴＣ／ＭＥ）に懸濁し、さらに２分間超音波処理した。その組織懸濁液を、酸平衡フェノール（Promega Total RNA Kit）を用いて２回抽出し、等量のイソプロパノールを用いて核酸を沈殿させた。そのペレットを、０．８ｍｌのＧＴＣ／ＭＥ中に再懸濁し、等量の酸フェノール、２回およびクロロホルム、１回で再抽出した。ＲＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＥＰＣ中に懸濁し、Ｈ２Ｏ処理し、ＯＤ２８０により定量した。
【００８２】
ｃＤＮＡを１０μｇの全ＲＮＡから、Byrneら、「Preparation of mRNA for expression monitoring,」 Current Protocols in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc. (New York 2000)に記載の変法を用いて、スーパースクリプト・キット（Superscript Kit）（ＢＲＬ）により合成した。第一の合成鎖は、リボソームＲＮＡの書き間違いを防ぐため５０℃で行わせ、次の試験管内アンチセンスＲＮＡ（クランク）増幅およびビオチン標識化のためのポリ−Ｔプライマー（Ｔ７Ｔ２４）を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用した。ｃＤＮＡは、製造元の取扱書に従い、Biome Carboxyterminated beads (Polysciences)を用いて精製し、４８μｌの１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ７．８中に溶出した。
【００８３】
試験管内で、Ｔ７ポリメラーゼによるアンチセンスｃＲＮＡの合成およびビオチン標識化のための転写反応、Qiagen RNeasyスピンカラム精製、そしてｃＲＮＡ断片化を行った。ジーンチップ（登録商標）ハイブリダイゼーション混合物は、製造元の取扱書にあるように、全量２００μｌの１×ＭＥＳ緩衝液中に、１０μｇの断片化ｃＲＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む。反応混合液を、Affymetrix Mu11KsubAとMu11KsubBオリゴヌクレオチドアレイに４５℃で１８時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション混合液を取り除き、そのアレイを洗浄し、製造元の取扱書に従って、ジーンチップ（登録商標）Fluidics Station ４００を用いてストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン（Molecular Probes）で染色し、Hewlett Packard ジーンアレイ・スキャナーにて走査した。蛍光のデータを集め、マイクロアレイ・スイート４．０ソフトウェアーを用いて、遺伝子特異的差分平均（difference average）に変換した。
【００８４】
１１メンバー標準曲線を、クローン化した細菌およびバクテリオファージ配列から得られる遺伝子断片を０．５ｐＭ〜１５０ｐＭの濃度範囲でそれぞれハイブリダイゼーション混合液中にスパイクすることによって調製した。この基準は、２ｋｂの平均転写サイズを想定した場合、１００万につきおよそ３．３〜１０００部分（ｐｐｍ）のＲＮＡ頻度を表した。ビオチン化標準曲線断片は、プラスミドに基づく鋳型によるＴ７ポリメラーゼに誘導されるＩＶＴ反応により合成された。スパイクされたビオチン化ＲＮＡ断片は、チップ感度を評価する内部基準として、そして個々の遺伝子から測定される蛍光差分平均をｐｐｍのＲＮＡ頻度に変換するための標準曲線として役に立つ。遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドを含む完全一致と単一の不対合プローブの組みとの間の平均蛍光の差は、スパイクされた標準曲線に関する頻度値を決定するために用いられる。加えて、個々の陽性又は陰性応答プローブペアの画分に主に基づくアルゴリズムの第二の組みは、遺伝子産物の絶対的な有無を評価するのに用いられる。個々のマクロアレイチップの感度は、２つまたはいずれか３つの隣接する標準曲線のスパイクの鋳型でも存在すると言われる最小濃度の半分に設定される。標準曲線線形回帰は、ゼロを通過するよう重み付けされ、最小と報告される遺伝子頻度は、個々のジーンチップ（登録商標）の感度に対して設定される。
【００８５】
各処置または対照実験条件についての複数の独立した再現を測定し、発現データを、擬陽性を取り除く目的で繰り返しの統計解析にかけた。所定の実験の組みに関する個々の測定から決定された頻度値を最初に比較した。処置および対照動物の平均値を、平均倍変化（average fold change）（ＡＣＦ）を得るために比較した。両側スチューデントｔ−検定は、生の頻度値を用いた不均一性の共分散か、または対数−変換した頻度値を用いた均一性の共分散のいずれかを用いて計算した。
【００８６】
アレルゲンチャレンジ誘導性の遺伝子発現を同定するために用いられた３つの処置群のそれぞれについて測定された全体の遺伝子発現は、種々の対照と処置ファイルとに関してコンピュータ処理されたｍＲＮＡ保全性、存在するとされる遺伝子の数および全ｍＲＮＡ頻度に関して、均衡が保たれていた。
【００８７】
ＰＢＳ処置された対照マウスについて測定された遺伝子発現プロフィールは、ヒトＩｇＧまたはｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃの腹腔内同時投与によっては有意に変化されなかったことから、６匹の対照マウスの頻度値は、未処理の基礎発現値の平均を計算するため、１つの組みとしてまとめられた。同様に、緩衝液またはｈＩｇＧの腹腔内同時投与のいずれかで処置された４匹のＯＶＡチャレンジマウスは、肺のアレルゲンチャレンジｍＲＮＡ頻度に関する平均頻度値を計算するため、１つの組みにまとめられた。そのデータを以下の表２に示す。
【表２】
2008512086.tif 000004
【００８８】
データは、ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質ｍＲＮＡが、ＩＬ−１３またはオボアルブミンの直接の肺気管内投与による誘導アレルギーチャレンジによって、特異的に誘導されることを証明している。加えて、データは、可溶性の受容体アンタゴニスト（ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）を用いて、ＩＬ−１３活性化を阻害すると、オボアルブミンチャレンジによるＲｅｇＩＩＩγ蛋白質の発現が完全に阻害されることを示している。ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃアンタゴニストを利用した生理学的研究により、ＩＬ−１３活性が、上皮粘液産生およびＡＨＲを含む喘息疾患症状に必須であることが、以前に示された。従って、ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質は、オボアルブミンアレルギーチャレンジの下流のＩＬ−１３応答遺伝子と同定され、喘息処置の治療物質であると認められる。
【００８９】
これらのデータは、可溶性ＩＬ−１３アンタゴニストの腹膜内投与が、ＯＶＡアレルギー肺ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質の誘導を完全に阻害することができたことを裏付けている。ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃアンタゴニストを利用した生理学研究により、ＩＬ−１３活性が、上皮粘液産生およびＡＨＲを含む喘息疾患病状に必須であることが、以前に示された。Wills-Karp, Mら、Science 282(5397):2258-61 (1998)。従って、これらのデータは、ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質を阻害することとなる治療介入が、喘息関連症候の軽減と関係することを証明している。
【００９０】
実施例２
ｍＩＬ−１３肺点滴注入により誘導されるマウス肺における遺伝子発現変化
肺の遺伝子発現におけるＩＬ−１３媒介性の変化を同定するために、６匹のＢａｌｂ／Ｃマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）を、組換えｍＩＬ−１３の複数回（０、２４時間および４８時間）の５μｇ用量の肺点滴注入で処理した。第二の組みの対照Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝４）は、緩衝液だけを同じ計画で点滴した。加えて、Ｓｔａｔ６−／−裸マウスの組みを、発現プロファイリングのために７８時間で全ての肺を採取する前に、同じように、複数回用量でｍＩＬ−１３（ｎ＝４）またはＰＢＳ緩衝液（ｎ＝５）を肺点滴注入して処理した。Ｓｔａｔ６−／−は、付加的な対照であり；粘液産生およびＡＨＲについての重大なＩＬ−１３シグナル伝達経路における重要な媒介物であり；このＩＬ−１３シグナル伝達トランスデューサーが存在しない喘息患者の症候を改善する。アレルゲンチャレンジ誘導性遺伝子発現を同定するために用いられた３つの処置群のそれぞれについての遺伝子発現は全体で、種々の対照および処置ファイルに関してコンピュータ処理されたｍＲＮＡ保全性、存在するとされる遺伝子の数および全ｍＲＮＡ頻度に関して、非常に均衡が保たれていた。そのデータを表３に示す。
【表３】
2008512086.tif 000005
【００９１】
これらのデータは、ｍＲＮＡ濃度の増加がｍＩＬ−１３肺点滴注入により媒介されることを裏付ける。
【００９２】
実施例３
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質活性の阻害物質についていのスクリーニングアッセイの予備的実施例
ヒトＲｅｇＩＩＩ蛋白質（例えば、ｈＨＩＰ、ｈＰＡＰ）を、細菌発現ベクター中にクローン化し、大腸菌またはＣＯＳ細胞に形質転換し、標準の分子生物学および生物化学的方法を利用するカラムクロマトグラフにより、細菌または哺乳動物培養物から精製する。ついで、初代上皮細胞または上皮細胞株をＲｅｇＩＩＩ蛋白質で処理する。該蛋白質と接触させた後、その細胞または細胞株は、上皮細胞またはムチンの増加についてアッセイされる。被検物質は、上皮細胞の染色により、または増大された分泌グラノール（granuole）の顕微鏡観察により決定される、粘液産生および／または上皮細胞の増殖をモジュレート（例えば、阻害）する能力によりスクリーニングされる。
【００９３】
実施例４
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質プロモーターに関するＲｅｇＩＩＩ蛋白質産生の阻害物質についてのスクリーニングアッセイの予備的実施例
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の蛋白質プロモーターを、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼと連結する。そのレポーター遺伝子の活性は、転写特異性を示すＩＬ−１３での誘導によって示される。被検物質をスクリーニングし、ＩＬ−１３誘導性受容体遺伝子活性を阻害する物質を同定する。
【００９４】
実施例５
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質阻害物質を用いた喘息の処置
ＲｅｇＩＩＩ蛋白質の既知蛋白質阻害物質の治療上の有効量を、喘息と診断された対象に投与する。喘息患者症候を示す対照群も、プラセボ対照として処置する。投与は、単一の処置または数日にわたる処置によって行われてよい。対象は、喘息関連症候、例えば、ＡＨＲおよび粘液産生について評価される。効果的な処置は、対照群と比較して、喘息関連症候の軽減により決定される。
【００９５】
本発明は、図面および明細書中で詳細に表され、記載されるが、それらは、例示として考えられるべきであり、特徴を制限するものではなく、単に特定の実施形態を示し、記載したものであると理解されるべきであり、本発明の精神の範囲内にある全ての変更および改良は、保護されるべきであることが期待されることは理解されよう。加えて、本明細書中で引用される全ての参考文献は、当業者の水準を示すものであり、出典明示によりそれらは完全に本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】Dusetti, N.Jら、Genomics 19(1):108-114 (1994)において報告された、ＲｅｇＩＩＩファミリーのメンバーである、ヒト膵臓関連蛋白質（ＰＡＰ）のｍＲＮＡ配列（配列番号：１）の表示である。
【図２】Dusettiら（前掲）において報告された、翻訳されたヒトＰＡＰのアミノ酸配列（配列番号：２）の表示である（ジーンバンク受け入れ番号ＮＭ＿００２５８０）。
【図３】Narushima Yら、Gene 185(2):159-68 (Feb. 7, 1997)において報告された、ネズミ（ハツカネズミ（Mus musculus））ＲｅｇＩＩγ蛋白質のｍＲＮＡ配列（配列番号：３）の表示であり、残基３３〜５５７はコード配列を表す（ジーンバンク受け入れ番号Ｄ６３３６１）。
【図４】Narushimaら（前掲）において報告された、翻訳されたネズミ（ハツカネズミ）ＲｅｇＩＩＩγ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：４）の表示である。
【図５】ヒトＰＡＰについてのプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号：５）の表示である。
【図６】マウスＲｅｇＩＩＩ蛋白質についてのプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号：６）の表示である。
【図１】
2008512086.tif 000006
【図２】
2008512086.tif 000007
【図３】
2008512086.tif 000008
【図４】
2008512086.tif 000009
【図５】
2008512086.tif 000010
【図６】
2008512086.tif 000011
【国際調査報告】
2008512086.tif 000012