(57)【要約】  本発明は、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩並びにそれらの溶媒和物から選択される少なくとも１つを含有する、医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いてAβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβ40およびAβ42の産生を阻害する方法。
【請求項２】
生体またはその一部において、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることを特徴とする、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する方法。
【請求項３】
生体またはその一部において、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法。
【請求項４】
生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いてAβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法。
【請求項５】
生体またはその一部において、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法。
【請求項６】
生体またはその一部において、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法。
【請求項７】
生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いてAβ37の産生を亢進させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法。
【請求項８】
生体またはその一部において、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法。
【請求項９】
生体の一部が脳である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、Aβの凝集阻害剤。
【請求項１１】
Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、神経細胞死の抑制剤。
【請求項１２】
Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、医薬組成物。
【請求項１３】
Aβに起因する疾患を治療するための、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、Aβの凝集阻害剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
【請求項１６】
以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、神経細胞死の抑制剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
【請求項１７】
以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、医薬組成物。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
【請求項１８】
Aβに起因する疾患を治療するための、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含有する、Aβの凝集阻害剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
【請求項２１】
以下の(a)並びに(b)のポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、Aβの凝集阻害剤。
(a) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項２２】
以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含有する、神経細胞死の抑制剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
【請求項２３】
以下の(a)並びに(b)のポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、神経細胞死の抑制剤。
(a) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項２４】
以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含有する、医薬組成物。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
【請求項２５】
以下の(a)並びに(b)のポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、医薬組成物。
(a) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項２６】
Aβに起因する疾患を治療するための、請求項２４または２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
Aβに起因する疾患の治療方法であって、疾患の治療が必要な哺乳動物に、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの有効量を投与することを含む、上記方法。
【請求項２９】
Aβに起因する疾患の治療方法であって、疾患の治療が必要な哺乳動物に、請求項１２，１３，１４，１７，１８，１９，２４，２５，２６および２７からなる群から選択される少なくとも１項記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、上記方法。
【請求項３０】
Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物がヒトである、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３２】
Aβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項３３】
Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42およびAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量およびAβ42量を減少させ、かつAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項３４】
Aβ37の産生を亢進することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項３５】
Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量およびAβ42量を減少させ、かつAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項３６】
生物学的組成物がβ−アミロイド前駆体タンパク質発現細胞を含むものである、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
生物学的組成物が哺乳動物細胞を含むものである、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
生物学的組成物が神経細胞である、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つと、コリンエステラーゼ阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有する医薬組成物。
【請求項４０】
コリンエステラーゼ阻害物質がドネペジルまたはその塩である、請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４１】
NMDA受容体アンタゴニストがメマンチンである、請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４２】
AMPA受容体アンタゴニストがタランパネルである、請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４３】
Aβに起因する疾患の治療薬である、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、請求項４３記載の医薬組成物。
【請求項４５】
Aβに起因する疾患の治療方法であって、疾患の治療が必要な哺乳動物に、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの有効量と、コリンエステラーゼ阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つの有効量とを投与することを含む、上記方法。
【請求項４６】
コリンエステラーゼ阻害物質がドネペジルまたはその塩である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
NMDA受容体アンタゴニストがメマンチンである、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
AMPA受容体アンタゴニストがタランパネルである、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物がヒトである、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つと、コリンエステラーゼ阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有するキット。
【請求項５２】
コリンエステラーゼ阻害物質がドネペジルまたはその塩である、請求項５１記載のキット。
【請求項５３】
NMDA受容体アンタゴニストがメマンチンである、請求項５１記載のキット。
【請求項５４】
AMPA受容体アンタゴニストがタランパネルである、請求項５１記載のキット。
【請求項５５】
(a)および(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントが、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項１５記載の阻害剤。
【請求項５６】
(a)および(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントが、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項１６記載の抑制剤。
【請求項５７】
(a)および(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントが、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ポリヌクレオチドが、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項２０または２１記載の阻害剤。
【請求項５９】
ポリヌクレオチドが、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項２２または２３記載の抑制剤。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドが、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項２４または２５記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せの、アルツハイマー病、ダウン症等のAβに起因する疾患の治療のための医薬組成物としての有用性に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（AD）またはアルツハイマー型老年痴呆症（SDAT; Senile Dementia of the Alzheimer's Type）は進行性に痴呆症状を呈する神経変性疾患である。治療薬としてはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に代表される症状改善剤が主に使用されている。それゆえ、症状の進行抑制剤の開発が社会から強く要望されている。ADまたはSDATの発症原因として、老人斑の主要構成成分の一つであるアミロイドβタンパク質（Aβ; Amyloid βprotein）の異常蓄積が重要であると考えるアミロイド仮説、タウの異常リン酸化による神経原線維変化の形成が重要と考えるタウ説などが提唱されている。Aβはアミロイド前駆タンパク質（APP; amyloid precursor protein）のプロセッシング（β-部位とγ-部位の切断、それぞれβ-セクレターゼ、γ-セクレターゼによって切断される）によって生成されるアミノ酸40個ほどからなるペプチドである(1)。Aβは正常人でも生成しているペプチドであり、アミノ酸（C末端側）の長さによりAβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ40、Aβ42などが存在し、このうち、主要なものはAβ40であることが知られている(2)。これまでの研究からAβ42は疎水性が強く、凝集しやすい（β−シート構造をとりやすい）性質を有しており(3)、AD、SDATやダウン症で初期に蓄積し、その後にAβ40が蓄積することが明らかとなっている（4）。また家族性アルツハイマー病(FAD)で変異が認められるAPP、プレセニリン１（PS1）、プレセニリン2（PS2）はAβ42の産生を亢進させることが報告されている（5a, 5b）。このためAβ、特にAβ42とADまたはSDAT発症との間には強い相関があることが示唆されている。またタウトランスジェニックマウスに対するAβの脳内注入（6）、APPとタウとのダブルトランスジェニックマウス（7）において神経原線維変化の形成が促進されることからAβがタウのリン酸化、神経原線維変化の形成を誘発していると考えられている。
【０００３】
アミロイド仮説に基づくADまたはSDAT治療薬として、Aβの産生阻害剤、Aβの凝集阻害剤、Aβの分解・消失促進剤などが提唱されてきている。Aβ産生阻害剤としてこれまでにγ-セクレターゼ阻害作用を有する化合物が見出されてきた(8a, 8b)。しかし、γ-セクレターゼの基質として、APP以外のタンパク質、たとえばNotchが報告され(9)、従来のγ-セクレターゼ阻害剤はいずれもNotchプロセッシング阻害作用を併せ持つことが報告されている。Notchは、細胞の分化に重要な働きを有しているため、そのプロセッシング阻害は様々な副作用を誘発する可能性が懸念されている（10a, 10b）。またγ-部位の切断を抑制することで蓄積するAPP-C100（あるいは99）(β-セクレターゼによる切断によって生成するAPPのC末側断片)はそれ自体が細胞毒性を有することが遺伝子改変動物の結果から示唆されている(11)。さらにγ-セクレターゼによって切断され生成するAPP intracellular domain（AICD）はNotch intracellular domain（NICD）同様、核内に移行して何らかのシグナルを伝達する可能性が示唆されてきており（12）、既存のγ-セクレターゼ阻害剤ではNotchに由来する副作用に加え、APPのC末側断片の蓄積に由来する副作用が発現する危険性も懸念される。
【０００４】
2001年にイブプロフェン等一部の非ステロイド型抗炎症剤（NSAIDs）が選択的にAβ42の産生を抑制することが報告された（13、14）。これらの化合物はAβ42に対し選択的抑制作用を有し、同時にAβ38の産生を亢進する。またこれらの化合物はAPP/Notchプロセッシングに乖離が認められ、Notch阻害作用を回避したγ-セクレターゼ阻害剤を見出す可能性を示唆する。また一部のNSAIDsはAPPトランスジェニックマウスにおいて、アミロイド斑の形成を阻害することが報告されている。しかしながらそのAβ42産生阻害活性は数十μM〜数百μMと弱く、動物モデルでの有効性をAβ42産生阻害作用だけでは説明できていない(15)。
【０００５】
参考文献
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(9) Notch and amyloid precursor protein are cleaved by similar γ-secretase(s). W. T. Kimberly, W. P. Esler, W. Ye and et al., Biochemistry, 42, 137-144, 2003
(10a) γ-secretase inhibitors repress thymocyte development. B. K. Hadland, N. R. Manley, D. Su et al. P. N. A.S., 98, 7487-7491, 2001
(10b) Chronic treatment with the γ-secretase inhibitor LY-411,575 inhibits Aβ production and alters lymphopoiesis and intestinal cell differentiation. G.T. Wong, D. Manfra, F.M. Poulet et al., J. Biol. Chem., 279, 12876-12882, 2004
(11) Age-Dependent Neuronal and Synaptic Degeneration in Mice Transgenic for the C Terminus of the Amyloid Precursor Protein. M. L. Oster-Granite, D. L. McPhie, J. Greenan and R. L. Neve, J. Neurosci., 16(21), 6732-6741, 1996
(12) The γ-secretase-cleaved C-terminal fragment of amyloid precursor protein mediates signaling to the nucleus. Y. Gao and S. W. Pimplikar, P. N. A.S., 98, 14979-14984, 2001
(13) A subset of NSAIDs lower amyloidogenic Abeta42 independently of cyclooxygenase activity. S. Weggen, J.L. Eriksen, P. Das et al., Nature, 414, 212-216, 2001
(14) 国際公開第01/78721号パンフレット
(15) NSAIDS and enantiomers of flurbiprofen target γ-secretase and lower Aβ42 in vivo. J. L. Eriksen, S. A. Sagi, T. E. Smith, et al., J. Clin. Invest., 112, 440-449, 2003
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、新しい概念に基づく、アルツハイマー病、ダウン症等のAβに起因する疾患の治療のための医薬組成物の提供を目的とする。
【０００７】
本発明者は、これまでの知見から、アミロイド斑はAβ42を核としてAβ40が蓄積することで形成すると考えられているため、Aβ42の産生阻害に加え、主要な生成物であるAβ40を同時に産生阻害する化合物を見出すことが望ましいと考えた。また、Aβ37とAβ38はこれまでに存在することはわかっていたものの、その作用については報告されていなかった。今般、本発明者は、意外にも、Aβ37とAβ38はAβ42に比較して極めて細胞毒性が少ないこと、さらにはAβ42凝集阻害作用を有することを初めて見出した。これらの知見は、Aβ37および／またはAβ38の産生亢進がAβ40およびAβ42（以下、「Aβ40/42」と記す場合もある。後述を参照。）に由来する細胞傷害やアミロイド斑の形成を阻害する可能性を示している。以上のことから、本発明者はAβ37の産生を亢進することのできる化合物、またはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物は、従来のAβ42産生抑制剤に比較して安全性に優れることに加え、より効率的にアミロイドの蓄積を阻害し、新しいアルツハイマー病治療薬と成り得るとの仮説を構築し、鋭意検討を行った。
【０００８】
その結果、本発明者はAβ40/42産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有する化合物を見出すことに成功した。これらの結果から、Aβ37の産生を亢進する点に特徴を有する化合物、またはAβ40/42の産生を阻害し、同時に、細胞毒性が少なくAβ42凝集阻害作用を発揮するAβ37の産生を亢進する点に特徴を有する化合物は、化学構造とは関係なく、従来のAβ42産生抑制剤に比較して安全性に優れることに加え、より効率的にアミロイドの蓄積を阻害すると考えられる。また、Aβ37とAβ38は、Aβ40/42よりも細胞毒性が極めて小さく、Aβ42凝集阻害作用を有することから、本発明の別の態様において、Aβ37とAβ38はアミロイドの蓄積を阻害すると考えられる。従って、当該化合物、Aβ37およびAβ38は、新しい概念に基づく、アルツハイマー病、ダウン症等のAβに起因する疾患の治療薬の有効成分として有効に機能し得ることを明らかにし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いてAβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβ40およびAβ42の産生を阻害する方法。
（２）生体またはその一部において、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることを特徴とする、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する方法。
（３）生体またはその一部において、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法。
ここで、Aβ40にAβ37および／またはAβ38を作用させることで、Aβの凝集を阻害してもよい。
（４）生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いてAβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法。
（５）生体またはその一部において、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法。
（６）生体またはその一部において、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法。
ここで、Aβ40にAβ37および／またはAβ38を作用させることで、神経細胞死を抑制してもよい。
（７）生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いてAβ37の産生を亢進させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法。
（８）生体またはその一部において、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法。
（９）生体の一部が脳である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
【００１０】
（１０）Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、Aβの凝集阻害剤。
（１１）Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、神経細胞死の抑制剤。
（１２）Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、医薬組成物。
（１３）Aβに起因する疾患を治療するための、（１２）記載の医薬組成物。
（１４）Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、（１３）記載の医薬組成物。
【００１１】
（１５）以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、Aβの凝集阻害剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
（１６）以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、神経細胞死の抑制剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
（１７）以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、医薬組成物。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
（１８）Aβに起因する疾患を治療するための、（１７）記載の医薬組成物。
（１９）Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、（１８）記載の医薬組成物。
【００１２】
（２０）以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含有する、Aβの凝集阻害剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
（２１）以下の(a)並びに(b)のポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、Aβの凝集阻害剤。
(a) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２２）以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含有する、神経細胞死の抑制剤。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
（２３）以下の(a)並びに(b)のポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、神経細胞死の抑制剤。
(a) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２４）以下の(a)並びに(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含有する、医薬組成物。
(a) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、またはそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチド
（２５）以下の(a)並びに(b)のポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、医薬組成物。
(a) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b) 配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２６）Aβに起因する疾患を治療するための、（２４）または（２５）記載の医薬組成物。
（２７）Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、（２６）記載の医薬組成物。
【００１３】
（２８）Aβに起因する疾患の治療方法であって、疾患の治療が必要な哺乳動物に、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの有効量を投与することを含む、上記方法。
（２９）Aβに起因する疾患の治療方法であって、疾患の治療が必要な哺乳動物に、（１２），（１３），（１４），（１７），（１８），（１９），（２４），（２５），（２６）および（２７）からなる群から選択される少なくとも１項記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、上記方法。
（３０）Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、（２８）または（２９）記載の方法。
（３１）哺乳動物がヒトである、（２８）または（２９）記載の方法。
【００１４】
（３２）Aβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
（３３）Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42およびAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量およびAβ42量を減少させ、かつAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
（３４）Aβ37の産生を亢進することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
（３５）Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40量、Aβ42量およびAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40量およびAβ42量を減少させ、かつAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
（３６）生物学的組成物がβ−アミロイド前駆体タンパク質発現細胞を含むものである、（３２）〜（３５）のいずれか１項に記載の方法。
（３７）生物学的組成物が哺乳動物細胞を含むものである、（３２）〜（３５）のいずれか１項に記載の方法。
（３８）生物学的組成物が神経細胞である、（３２）〜（３５）のいずれか１項に記載の方法。
【００１５】
（３９）Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つと、コリンエステラーゼ阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有する医薬組成物。
（４０）コリンエステラーゼ阻害物質がドネペジルまたはその塩である、（３９）記載の医薬組成物。
（４１）NMDA受容体アンタゴニストがメマンチンである、（３９）記載の医薬組成物。
（４２）AMPA受容体アンタゴニストがタランパネルである、（３９）記載の医薬組成物。
（４３）Aβに起因する疾患の治療薬である、（３９）〜（４２）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（４４）Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、（４３）記載の医薬組成物。
【００１６】
（４５）Aβに起因する疾患の治療方法であって、疾患の治療が必要な哺乳動物に、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの有効量と、コリンエステラーゼ阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つの有効量とを投与することを含む、上記方法。
（４６）コリンエステラーゼ阻害物質がドネペジルまたはその塩である、（４５）記載の方法。
（４７）NMDA受容体アンタゴニストがメマンチンである、（４５）記載の方法。
（４８）AMPA受容体アンタゴニストがタランパネルである、（４５）記載の方法。
（４９）Aβに起因する疾患が、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症およびアミロイドーシス症からなる群から選択されるいずれかのものである、（４５）〜（４８）のいずれか１項に記載の方法。
（５０）哺乳動物がヒトである、（４５）〜（４９）のいずれか１項に記載の方法。
【００１７】
（５１）Aβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40およびAβ42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つと、コリンエステラーゼ阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有するキット。
（５２）コリンエステラーゼ阻害物質がドネペジルまたはその塩である、（５１）記載のキット。
（５３）NMDA受容体アンタゴニストがメマンチンである、（５１）記載のキット。
（５４）AMPA受容体アンタゴニストがタランパネルである、（５１）記載のキット。
【００１８】
（５５）(a)および(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントが、その塩またはそれらの溶媒和物である、（１５）記載の阻害剤。
（５６）(a)および(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントが、その塩またはそれらの溶媒和物である、（１６）記載の抑制剤。
（５７）(a)および(b)のペプチド、並びにそれらのフラグメントが、その塩またはそれらの溶媒和物である、（１７）記載の医薬組成物。
（５８）ポリヌクレオチドが、その塩またはそれらの溶媒和物である、（２０）または（２１）記載の阻害剤。
（５９）ポリヌクレオチドが、その塩またはそれらの溶媒和物である、（２２）または（２３）記載の抑制剤。
（６０）ポリヌクレオチドが、その塩またはそれらの溶媒和物である、（２４）または（２５）記載の医薬組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。また、本願優先権主張の基礎となる米国特許出願番号第11/111,504号の明細書、図面および要約書の開示内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００２０】
１．本発明の概要
Aβに起因する疾患において、Aβ40/42が蓄積することでアミロイド斑が形成し、さまざまな疾患の症状を引き起こすことが明らかにされている。本発明は、Aβ37の産生を亢進すると、γ-セクレターゼによるAPPからのAβ40/42の産生が抑制されること、また、Aβ37とAβ38はAβ42凝集阻害作用を有するという本発明者による知見に基づいたものである。すなわち、本発明は、生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進することのできる化合物、もしくはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する化合物、またはAβ37、もしくはAβ38の、アルツハイマー病、ダウン症などのAβに起因する疾患の治療上の有用性に関するものである。
【００２１】
（１）Aβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβ40/42の産生を阻害する方法
本発明者は、Aβ37の産生を亢進させると、Aβ40/42の産生が抑制されることを明らかにした。従って、本発明は、生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβ40/42の産生を阻害する方法を提供する。本発明の上記方法には、(i) Aβ37の産生を亢進することができる化合物および(ii) その塩並びに(iii) それらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることができ、これらは本発明に含まれる。
また、本発明は、上記のAβ37の産生を亢進することができる化合物を、同定またはスクリーニングする方法を提供する。本発明の上記方法は、候補化合物の存在または非存在下における、産生したAβ37の量を比較することにより行うことができる。
【００２２】
（２）Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する方法
本発明は、生体またはその一部におけるAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する方法を提供する。本発明の上記方法には、(i) Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物および(ii) その塩並びに(iii) それらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることができ、これらは本発明に含まれる。
また、本発明は、上記のAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物を、同定またはスクリーニングする方法を提供する。本発明の上記方法は、候補化合物の存在または非存在下における、産生した各Aβの量を比較することにより行うことができる。
【００２３】
（３）Aβの凝集を阻害する方法
本発明者は、Aβ37とAβ38はAβ40/42よりも極めて細胞毒性が少なく、さらに、Aβ37とAβ38がAβ42凝集阻害作用を有することを明らかにした。従って、本発明は、生体またはその一部において、Aβ40/42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法を提供する。また、(i) Aβ37、(ii) Aβ38、(iii) Aβ37もしくはAβ38をコードするポリヌクレオチド、(iv) それらの塩または(v) それらの溶媒和物を含むAβの凝集阻害剤は、本発明に含まれる。
また、本発明は、生体またはその一部において、Aβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法を提供する。さらに、本発明は、生体またはその一部において、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつ、Aβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法を提供する。本発明の上記方法には、(vi) Aβ37の産生を亢進することができる化合物、(vii) Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、および(viii) それらの塩、並びに(ix) それらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることができ、これらを含有するAβの凝集阻害剤も本発明に含まれる。
【００２４】
（４）神経細胞死の抑制方法
これまでに、Aβが凝集すると神経細胞にAβが沈着し、神経細胞死が引き起こされることが明らかにされている。本発明者は、Aβ37の産生が亢進すると、上記の凝集毒性を有するAβ40/42の産生を阻害すること、Aβ37とAβ38はAβ42凝集阻害作用を有することを明らかにした。これらの効果によって、Aβの凝集に起因する神経細胞死が抑制される。従って、本発明は、生体またはその一部において、Aβ40/42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法を提供する。また、(i) Aβ37、(ii) Aβ38、(iii) Aβ37もしくはAβ38をコードするポリヌクレオチド、(iv) それらの塩または(v) それらの溶媒和物を含む神経細胞死の抑制剤は、本発明に含まれる。
また、本発明は、生体またはその一部において、Aβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法を提供する。さらに、本発明は、生体またはその一部において、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつ、Aβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法を提供する。本発明の上記方法には、(vi) Aβ37の産生を亢進することができる化合物、(vii) Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、(viii)およびそれらの塩、並びに(ix) それらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることができ、これらを含有する神経細胞死の抑制剤も本発明に含まれる。
【００２５】
（５）Aβに起因する疾患の治療方法
本発明は、Aβに起因する疾患の治療方法を提供する。本発明において、Aβに起因する疾患の治療とは、当該疾患の進行を予防、遅延、または逆転させることを含む。本発明の治療方法は、当該疾患の治療が必要な哺乳動物に、(i) Aβ37の産生を亢進することのできる化合物、(ii) Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、および(iii) それらの塩並びに(iv) それらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する医薬組成物の有効量を投与することにより行うことができる。Aβに起因する疾患に用いられる当該医薬組成物も、本発明に含まれる。当該医薬組成物は、含有する化合物が、Aβ37の産生を亢進する作用を有し、またはAβ37の産生を亢進し、かつ、Aβ40/42の産生を阻害する作用を有し、さらに、Aβ37がAβ42の凝集阻害作用を有するために、Aβに起因する疾患の治療において非常に有効である。
あるいは、Aβに起因する疾患の治療方法は、当該疾患の治療が必要な哺乳動物に、(v) Aβ37、(vi) Aβ38、(vii) Aβ37またはAβ38をコードするポリヌクレオチド、(viii) それらの塩、並びに(ix)それらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有する医薬組成物の有効量を投与することにより行われるものである。Aβに起因する疾患に用いられる当該医薬組成物も、本発明に含まれる。当該医薬組成物は、含有するAβ37、Aβ38、Aβ37またはAβ38をコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物がAβの凝集阻害作用を有するために、Aβに起因する疾患の治療において非常に有効である。
【００２６】
（６）併用療法
本発明は、併用療法によるAβに起因する疾患の治療方法を含むものである。本発明は、(i) Aβ37の産生を亢進することができる化合物、(ii) Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、および(iii) それらの塩、並びに(iv) それらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの有効量と、(a) コリンエステラーゼ（ChE）阻害物質、(b) NMDA（N-methyl-D-aspartate）受容体アンタゴニストおよび(c) AMPA（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid）受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つの有効量とを別々に投与し、またはそれらを含む医薬組成物（配合剤）として投与することにより行われるものである。また、Aβに起因する疾患に用いられるそれらの医薬組成物またはキットも、本発明に含まれる。当該医薬組成物またはキットは、Aβに起因する疾患の治療薬として有効である。さらに当該キットは、併用療法に用いる医薬組成物の有効性を検出または予測するために、または、併用療法に用いる医薬組成物に適した化合物を同定またはスクリーニングするための方法にも用いることができる。
【００２７】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本明細書において「生体」とは哺乳動物であり、「生体の一部」とは、哺乳動物の中枢神経系、特に脳、脊髄などの各臓器の他、生体由来の組織、体液（血液、脳脊髄液、リンパ液、唾液などを含む）、あるいは細胞が含まれる。生体由来の細胞には、初代培養細胞、培養細胞株などの培養細胞も含まれる。
【００２８】
本明細書において「哺乳動物」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ、サルなど）を含む、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。
【００２９】
本明細書において「APP」とは、β−アミロイド前駆体タンパク質（βAPP）という用語を意味し、ヒトにおいては第21番染色体のロングアームに位置する同名の遺伝子によってコードされ、そしてそのC末端領域にAβ領域を含むペプチドをさす。
APPには、アイソタイプが存在することが知られている。表１に、GenBankあるいはSwiss Protに登録されているヒト、マウス、ラットのAPPアイソタイプのAccession numberあるいはSwiss prot Isoform IDを示す。種毎に代表的なアイソタイプが異なっており、例えば、ヒトではAPP770アミノ酸アイソタイプが、マウスではAPP695アミノ酸アイソタイプが、また、ラットではAPP770アミノ酸アイソタイプが代表的なものである。
【００３０】
【表１】
2008535776.tif 000002
【００３１】
本明細書において「Aβ」とは、β−アミロイドタンパク質、アミロイドβタンパク質、β−アミロイドペプチド、アミロイドβペプチドまたはアミロイドベータという用語を意味する。例えば、AβはヒトAPP695アミノ酸アイソタイプの約33個〜約44個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、そして好ましくはAPPの597位〜640位のアミノ酸残基の一部または全部を含むあらゆるペプチドを含むものであって、APPのN末端タンパク質分解、続いてC末端のタンパク質分解によって産生される全てのペプチドを意味する。
【００３２】
本明細書において「γ-セクレターゼ」とは、APPをその膜貫通領域内で切断（分解）することによって、Aβの産生を司る酵素または複数分子の複合体を意味する。
【００３３】
本明細書において「Aβ37」、「Aβ38」、「Aβ40」、「Aβ42」と表記する場合は、それぞれAβX-37、AβX-38、AβX-40、AβX-42（Xは1〜17の整数）を意味する。Xは1または11が好ましいため、特に定めがない限り、Xは1または11を表す。
詳しくは、本明細書において「Aβ37」は37アミノ酸残基からなるAβ37のN末側がX−１残基欠損したものであって、X番目から37番目のアミノ酸までからなるペプチドを意味する。「Aβ40/42」とは、Aβ40およびAβ42を意味する。Aβ40は40アミノ酸残基からなるAβ40のN末側がX−１残基欠損したものであって、X番目から40番目のアミノ酸までからなるペプチドを意味する。Aβ42は42アミノ酸残基からなるAβ42のN末側がX−１残基欠損したものであって、X番目から42番目のアミノ酸までからなるペプチドを意味する。Xは1〜17の整数を意味し、特に定めがない限り、Xは1または11である。
【００３４】
本明細書において「Aβ37の産生を亢進させる」または「Aβ37の産生を亢進する」とは、Aβ37の産生量を増加させる作用を意味する。
【００３５】
本明細書において「Aβ40/42の産生を阻害する」とは、Aβ40/42の産生量を減少（低下）またはAβ40/42の産生を消失させる作用を意味する。
【００３６】
本明細書において「Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する」作用とは、Aβ40/42の産生量を減少（低下）またはAβ40/42の産生を消失させるとともに、Aβ37の産生量を増加させる作用を意味する。
【００３７】
本明細書において「Aβ37の産生を亢進することができる化合物」とは、Aβ37の産生を亢進させる作用を有する限りどのような化合物であってもよい。
【００３８】
本明細書において「Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物」とは、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有する限りどのような化合物であってもよい。
【００３９】
本明細書において「産生を阻害する」および「産生阻害」、または「産生を亢進する」および「産生亢進」とは、再現可能な産生量の変化を意味する。産生量の変化は、例えば1%、5%、10%、20%、40%または40%以上の増加または減少などである限り、どのような量でもよい。また、Aβ40/42の産生阻害においては、Aβ40およびAβ42それぞれの産生量が減少（低下）または産生が消失する限り、Aβ40産生の阻害とAβ42産生の阻害の程度には特に限定されない。
【００４０】
本明細書において「化合物」とは、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、天然または合成低分子化合物ライブラリー、核酸（例えば、オリゴDNA、オリゴRNAなど）、天然または合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質（細菌の代謝により放出される物質を含む）、細胞（例えば、微生物、植物細胞、動物細胞など）抽出液、細胞（例えば、微生物、植物細胞、動物細胞など）培養上清、精製または部分精製ペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに含まれる１つまたは複数の化合物である。前記化合物は新規な化合物であってもよく、公知の化合物であってもよい。さらに、前記化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および／または生化学的手段により改変したものであってもよく、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの直接的化学修飾またはランダムな化学修飾に付して構造的類似体に改変したものであってもよい。前記化合物は、前記化合物のファーマコフォア検索、コンピューターを用いた構造比較プログラムなどにより同定される化合物であってもよい。
【００４１】
本明細書において「誘導体」とは、基となる化合物の一部を変化させた化合物を意味する。誘導体の中には、付加反応による生成物も含まれる。
【００４２】
本明細書において「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、Aβに起因する疾患の治療薬となる本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩等）等が挙げられる。
【００４３】
また、本発明において、化合物、ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、溶媒和物が存在する場合には、それらの溶媒和物が含まれる。溶媒和物としては、水和物、非水和物のいずれであってもよいが、なかでも水和物が好ましい。非水和物としては、例えば、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、n-プロパノール）、及びジメチルホルムアミドなどが使用され得る。
【００４４】
２．Aβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβ40/42の産生を阻害する方法
本発明は、生体またはその一部において、Aβ37の産生を亢進させることを特徴とする、Aβ40/42の産生を阻害する方法を提供する。上記方法は、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いて行うことができる。例えば、これらの化合物を生体またはその一部（例えば、脳）に投与または接触させることで、Aβ40/42の産生を阻害することができる。本発明の方法は、Aβ37の産生が亢進した結果、Aβ40/42の産生が阻害されるという機序に基づくものである。Aβ37の産生を亢進することができる化合物は、Aβ37の産生亢進の結果として、Aβ40/42の産生を阻害することができるものである。
【００４５】
本明細書において「本発明に使用する化合物類」は、Aβ37の産生を亢進することができる上記の化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含むものである。
すなわち、本発明に使用する化合物類には、
(i)Aβ37の産生を亢進することができる化合物
(ii)上記(i)の塩
(iii)上記(i)の溶媒和物
(iv)上記(ii)の溶媒和物、および
(v)上記(i)〜(iv)の組合せ
から選ばれる少なくとも１つが含まれる。
【００４６】
本発明に使用する化合物類の好適な例としては、例えば後述した実施例に記載された化合物およびその誘導体、並びにそれらの塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つなどが挙げられる。具体的な化合物の例示をすると、
（Ｅ）−Ｎ−ビフェニル−３−イルメチル−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリルアミド（以下、「化合物A」という）、
CAS#501907-79-5で示される化合物（以下、「化合物B」という）、
CAS#670250-40-5で示される化合物（以下、「化合物C」という）
などが挙げられる。
【００４７】
本発明に使用する化合物類は、Aβ37の産生を亢進させる作用を有し、結果としてAβ40/42の産生を阻害する点に特徴があり、そのAβ37の産生を亢進する効果またはAβ40/42の産生を阻害する効果の強弱は、本発明の有用性に影響を与えるものではない。
また、本発明に使用する化合物類は、Aβ38またはAβ39の産生を亢進させる作用をさらに持っていてもよい。
【００４８】
本発明に使用する化合物類、すなわちAβ37の産生を亢進することのできる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つである限り、既知化合物は公知の製造方法によって製造するか、天然化合物であれば公知の抽出方法もしくは公知の精製方法によって取得するか、または市販されている場合は購入することにより得ることができる。また既知化合物の誘導体等は、化学的手段、物理的手段および／または生化学的手段により改変することができる。
【００４９】
上記の化合物A、BおよびCは、例えば実施例に記載の方法で製造することができるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
また、本発明は、上記のAβ37の産生を亢進することができる化合物を、同定またはスクリーニングする方法を提供する。本発明の上記方法は、候補化合物の存在または非存在下における、Aβ37の量を比較することにより行うことができる。同定またはスクリーニング方法に関しては、「６．本発明に使用する化合物類の同定方法またはスクリーニング方法」にて後述する。
【００５１】
３．Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する方法
本発明は、生体またはその一部において、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する方法を提供する。上記方法は、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いて行うことができる。例えば、これらの化合物を生体またはその一部（例えば、脳）に投与または接触させることで、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる。
【００５２】
本明細書において「本発明に使用する化合物類」は、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる上記の化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含むものである。
すなわち、本発明に使用する化合物類には、上記のAβ37の産生を亢進することができる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つ（上記「２．Aβ37の産生を亢進することを特徴とする、Aβ40/42の産生を阻害する方法」中の(i)〜(v)）の他、
(vi)Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物
(vii)上記(vi)の塩
(viii)上記(vi)の溶媒和物
(ix)上記(vii)の溶媒和物、および
(x)上記(vi)〜(ix)の組合せ
から選ばれる少なくとも１つ、も含まれる。
【００５３】
本発明に使用する化合物類の好適な例としては、例えば後述した実施例に記載された化合物およびその誘導体、並びにそれらの塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つなどが挙げられる。具体的な化合物の例示をすると、
（Ｅ）−Ｎ−ビフェニル−３−イルメチル−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリルアミド（以下、「化合物A」という）、
CAS#501907-79-5で示される化合物（以下、「化合物B」という）、
CAS#670250-40-5で示される化合物（以下、「化合物C」という）
などが挙げられる。
【００５４】
本発明に使用する化合物類は、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有する点に特徴があり、また、Aβ40/42の産生を阻害する効果の強弱、Aβ37の産生を亢進する効果の強弱は、本発明の有用性に影響を与えるものではない。
また、本発明に使用する化合物類は、Aβ38またはAβ39の産生を亢進させる作用をさらに持っていてもよい。
【００５５】
本発明に使用する化合物類、すなわちAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することのできる化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つである限り、既知化合物は公知の製造方法によって製造するか、天然化合物であれば公知の抽出方法または公知の精製方法によって取得するか、または市販されている場合は購入することにより得ることができる。また既知化合物の誘導体等は、化学的手段、物理的手段および／または生化学的手段により改変することができる。
【００５６】
上記の化合物A、BおよびCは、例えば実施例に記載の方法で製造することができるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
また、本発明は、上記のAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物を、同定またはスクリーニングする方法を提供する。本発明の上記方法は、候補化合物の存在または非存在下における、各Aβの量を比較することにより行うことができる。同定またはスクリーニングする方法に関しては、「６．本発明に使用する化合物類の同定方法またはスクリーニング方法」にて後述する。
【００５８】
４．Aβの凝集を阻害する方法
上述のように、本発明者は、Aβ37とAβ38はAβ40/42よりも極めて細胞毒性が少なく、さらに、Aβ37とAβ38はAβ42凝集阻害作用を有することを明らかにした。従って、本発明は、生体またはその一部において、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法を提供する。また、上記方法において、Aβ42に作用させるAβ37またはAβ38は、本発明に使用する化合物類により産生された内因性のものであってもよく、外因性のものであってもよい。ここで、本発明に使用する化合物類は、Aβ38またはAβ39の産生を亢進させる作用をさらに持っていてもよい。また、Aβ42には、Aβ37だけでなくAβ38を同時に作用させることもできる。さらにまた、Aβ40もAβ凝集能を有することから、Aβの凝集を阻害するにはAβ40にAβ37および／またはAβ38を作用させてもよい。ここでは、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を作用させる場合について記載するが、Aβ40に作用させる場合もAβ42と同様に実施することができる。
【００５９】
前記の「作用させる」とは、Aβ42をAβ37および／またはAβ38で処理することを意味する。当該処理の方法は限定されるものではなく、任意の方法を選択することができる。例えば、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を接触させること、Aβ42とAβ37および／またはAβ38とを同一の系（例えば同一の試験管内）に共存させることなどが挙げられる。
【００６０】
本明細書において「内因性の」Aβ37またはAβ38とは、当該生体またはその一部に由来するAβ37またはAβ38、あるいは生体またはその一部で産生されたAβ37、Aβ38、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、またはそれらの組合せを意味する。
【００６１】
上述のとおり、Aβ37の産生を亢進することのできる本発明に使用する化合物類によって生体またはその一部において産生したAβ37またはAβ38も、内因性のAβ37またはAβ38に含まれる。従って、上記方法には、本発明に使用する化合物類を用いることができ、当該化合物類は、Aβの凝集阻害剤として用いることができる。上述のとおり、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつAβ37の産生を亢進することのできる本発明に使用する化合物類によって生体またはその一部において産生したAβ37またはAβ38も、内因性のAβ37またはAβ38に含まれる。従って、上記方法には、本発明に使用する化合物類を用いることができ、当該化合物類は、Aβの凝集阻害剤として用いることができる。
【００６２】
本明細書において「外因性の」Aβ37またはAβ38は、当該生体以外に由来するAβ37、Aβ38、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、またはそれらの組合せを、あるいは当該生体以外で産生されたAβ37、Aβ38、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、またはそれらの組合せを意味し、Aβ37もしくはAβ38が、これらをコードするポリヌクレオチド、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、またはそれらの組合せから調製される態様をも含む。外因性のAβ37またはAβ38に関しては、「７．Aβ37またはAβ38」にて後述する。
【００６３】
また、産生の亢進したAβ37またはAβ38によってAβの凝集が阻害されることから、生体またはその一部において、Aβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法も本発明に含まれる。また、産生の亢進したAβ37またはAβ38によってAβの凝集が阻害されることから、生体またはその一部において、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつAβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、Aβの凝集を阻害する方法も本発明に含まれる。本発明の上記方法には、本発明に使用する化合物類、すなわちAβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。本発明に使用する化合物類は、Aβ38またはAβ39の産生を亢進させる作用をさらに持っていてもよい。例えば、本発明に使用する化合物類を、生体またはその一部（例えば、脳）に投与または接触させ、Aβ37および／またはAβ38の産生を亢進させることで、あるいは、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつ、Aβ37および／またはAβ38の産生を亢進させることで、Aβの凝集を阻害することができる。
【００６４】
本発明は、Aβの凝集を阻害する方法において用いられる、本発明に使用する化合物類を含有するAβの凝集阻害剤、および前記外因性のAβ37またはAβ38を含有するAβの凝集阻害剤を含むものである。
【００６５】
５．神経細胞死の抑制方法
Aβが凝集すると、神経細胞にAβが沈着し、神経細胞死が引き起こされることが明らかにされている。本発明者は、Aβ37の産生が亢進すると、上記の凝集毒性を有するAβ40/42の産生を阻害すること、Aβ37とAβ38はAβ42凝集阻害作用を有することを明らかにした。これらの効果によって、Aβの凝集に起因する神経細胞死が抑制される。従って、本発明は、生体またはその一部において、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を作用させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法を提供する。また、上記方法において、Aβ42に作用させるAβ37またはAβ38は、本発明に使用する化合物類により産生された内因性のものであってもよく、外因性のものであってもよい。ここで、本発明に使用する化合物類は、Aβ38またはAβ39の産生を亢進させる作用をさらに持っていてもよい。また、Aβ42には、Aβ37だけでなくAβ38を同時に作用させることもできる。さらにまた、神経細胞死を抑制するためには、Aβ40にAβ37および／またはAβ38を作用させてもよい。ここでは、Aβ42に作用させる場合について記載するが、Aβ40に作用させる場合もAβ42と同様に実施することができる。
【００６６】
前記の「作用させる」とは、Aβ42をAβ37および／またはAβ38で処理することを意味する。当該処理の方法は限定されるものではなく、任意の方法を選択することができる。例えば、Aβ42にAβ37および／またはAβ38を接触させること、Aβ42とAβ37および／またはAβ38とを同一の系（例えば同一の試験管内）に共存させることなどが挙げられる。
【００６７】
上述のとおり、Aβ37の産生を亢進することのできる本発明に使用する化合物類によって生体またはその一部において産生したAβ37またはAβ38も、内因性のAβ37またはAβ38に含まれる。従って、上記方法には、本発明に使用する化合物類を用いることができ、当該化合物類は、神経細胞死の抑制剤として用いることができる。上述のとおり、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつAβ37の産生を亢進することのできる本発明に使用する化合物類によって生体またはその一部において産生したAβ37またはAβ38も、内因性のAβ37またはAβ38に含まれる。従って、上記方法には、本発明に使用する化合物類を用いることができ、当該化合物類は、神経細胞死の抑制剤として用いることができる。
外因性のAβ37またはAβ38に関しては、「７．Aβ37またはAβ38」にて後述する。
【００６８】
また、産生の亢進したAβ37またはAβ38によってAβの凝集が阻害されることから、生体またはその一部において、Aβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法も本発明に含まれる。また、産生の亢進したAβ37またはAβ38によってAβの凝集が阻害されることから、生体またはその一部において、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつAβ37またはAβ38（好ましくはAβ37）の産生を亢進させることを特徴とする、神経細胞死の抑制方法も本発明に含まれる。本発明の上記方法には、本発明に使用する化合物類、すなわちAβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。本発明に使用する化合物類は、Aβ38またはAβ39の産生を亢進させる作用をさらに持っていてもよい。例えば、本発明に使用する化合物類を、生体またはその一部（例えば、脳）に投与または接触させ、Aβ37および／またはAβ38の産生を亢進させることで、あるいは、Aβ40/42の産生を阻害させ、かつ、Aβ37および／またはAβ38の産生を亢進させることで、神経細胞死を抑制することができる。
【００６９】
本発明は、神経細胞死の抑制方法において用いられる、本発明に使用する化合物類を含有する神経細胞死の抑制剤、および前記外因性のAβ37またはAβ38を含有する神経細胞死の抑制剤を含むものである。
【００７０】
前記の神経細胞とは、中枢神経系の細胞、例えば脳由来の神経細胞、好ましくは大脳皮質由来の神経細胞が挙げられ、より好ましくは哺乳動物由来の細胞が好ましい。また、大脳皮質由来の初代培養神経細胞などの神経細胞も含まれる。
【００７１】
６．本発明に使用する化合物類の同定方法またはスクリーニング方法
本発明に使用する化合物類中、Aβ37の産生を亢進することができる化合物は、Aβ37の産生を亢進させる作用を、以下に示すような当該技術分野における標準的な同定方法またはスクリーニング方法によって明らかにすることで得ることもできる。また、本発明に使用する化合物類中、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物は、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を、以下に示す標準的な同定方法またはスクリーニング方法によって明らかにすることで得ることもできる。当該方法は、少数の候補化合物を処理することができる小規模な方法から、多数の候補化合物を処理することができる大規模な方法に至る様々な同定技術またはスクリーニング技術を適宜利用することが可能である。
【００７２】
候補化合物が、Aβ37の産生を亢進させる作用、またはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有するか否かは、候補化合物を生物学的組成物に作用させ、候補化合物の存在または非存在下で、APP分解タンパク質である各Aβの存在、非存在または変化した量を測定し、比較することによって、確認することができる。例えば、各Aβの存在、非存在または変化した量は、免疫沈降、ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 法、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法などの、標準的な抗体アッセイ法を用いて測定することができる。また、免疫沈降とMALDI-TOF、MALDI-TOF/MSを組み合わせてもよい。このとき、抗体を、直接検出のために標識化することができ（例えば放射性同位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤等を用いて）、または結合を検出する２次抗体または試薬と組み合わせて使用し得る（例えばビオチンと西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジン、蛍光化合物、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド等と結合した２次抗体）。また、各Aβは公知の方法を用いて定量化することができる。例えば、内部標準物質を用いて作成される検量線を用いて、MALDI-TOF/MS（後述）により定量化することが可能である。
【００７３】
すなわち、本発明は以下の（１）、（２）に記載の方法を提供するものであり、以下、これらを「本発明の同定方法」または「本発明のスクリーニング方法」ともいう。
【００７４】
（１）本発明により、以下のAβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法またはスクリーニングする方法が提供される。
Aβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法またはスクリーニングする方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
本発明の上記方法は、候補化合物の存在または非存在下における、産生したAβ37の量を比較することにより行うことができる。
【００７５】
（２）本発明により、以下のAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法またはスクリーニングする方法が提供される。
Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物を同定する方法またはスクリーニングする方法であって、
(a) 候補化合物を生物学的組成物と接触させ、
(b) 当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40/42量およびAβ37量と、候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40/42量およびAβ37量とを測定し、
(c) 候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ40/42量およびAβ37量と比較して、当該候補化合物と接触させた生物学的組成物中のAβ40/42量を減少させ、かつAβ37量を増加させた当該候補化合物を選択し、
(d) 上記(c)で得られた候補化合物を、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物として同定する、
ことを含む、上記方法。
本発明の上記方法は、候補化合物の存在または非存在下における、産生した各Aβの量、例えばAβ37、Aβ40、Aβ42の量を比較することにより行うことができる。
【００７６】
また、上記方法で同定された化合物は、Aβ38またはAβ39の産生を亢進させる作用をさらに有していてもよい。
【００７７】
ここで「接触」とは、候補化合物によって生物学的組成物中にAβ37を産生させるために、両者を反応させることを意味する。
【００７８】
「候補化合物と接触させなかった生物学的組成物中のAβ37量（Aβ40/42量およびAβ37量）」とは、対照としての役割を有する。
【００７９】
「増加させた」とは、生物学的組成物中のAβ37量が、候補化合物との接触によって、対照よりも多いことを意味する。
「減少させた」とは、生物学的組成物中のAβ40/42量が、候補化合物との接触によって、対照よりも少ないことを意味する。
【００８０】
「生物学的組成物」とは、γ-セクレターゼおよびAPPを含む組成物であれば特に限られず、無細胞の再構成系、細胞、APPを過剰発現するように操作したトランスジェニック非ヒト動物（以下、「APPトランスジェニック非ヒト動物」という）、非トランスジェニック非ヒト動物などを意味する。前記細胞は、中枢神経系の細胞、例えば脳由来の神経細胞、好ましくは大脳皮質由来の神経細胞、より好ましくは大脳皮質由来の初代培養神経細胞などの神経細胞であり、哺乳動物由来の細胞が好ましい。当該初代培養神経細胞、前記APPトランスジェニック非ヒト動物の調製方法については、後述する。APP発現細胞とは、APPを内因性に発現している細胞、またはAPPの強制発現細胞を意味する。
【００８１】
当該γ-セクレターゼおよび当該APPは、内因性のものであっても、外因性のものであってもよい。内因性の場合は、生体またはその一部に由来するγ-セクレターゼまたはAPPを意味し、生体またはその一部に含有されたままの状態であってもよいし、細胞溶解物のγ-セクレターゼ画分およびAPP画分であってもよい。当該細胞溶解物は、例えばγ-セクレターゼおよびAPPを含有する細胞を低張液もしくは界面活性剤による溶解、または超音波破砕もしくは物理的な破砕により調製されたものであってもよく、場合によっては、カラムなどの精製手段を処置したものであってもよい。外因性の場合は、γ-セクレターゼを構成する各分子をコードするポリヌクレオチドまたはAPPをコードするポリヌクレオチドを含む各ベクターを用いて、細胞に発現させた場合の、γ-セクレターゼ発現細胞またはAPP発現細胞であってもよいし、あるいは、γ-セクレターゼ発現細胞またはAPP発現細胞に由来する細胞溶解物のγ-セクレターゼ画分およびAPP画分であってもよい。当該細胞溶解物は、例えばγ-セクレターゼおよびAPPを含有する細胞を低張液もしくは界面活性剤による溶解、または超音波破砕もしくは物理的な破砕により調製されたものであってもよく、場合によっては、カラムなどの精製手段を処置したものであってもよい。当該ベクターは、細胞にトランスフェクトされ、一過性に遺伝子を発現するもの、または細胞のゲノムに組み込まれ、安定に遺伝子を発現するものであってもよい。当該ベクターをトランスフェクトする宿主細胞は、遺伝子を発現することができる細胞であればよく、哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、繊維芽細胞、ヒト神経膠腫細胞などである。
【００８２】
（初代培養神経細胞の調製方法）
上述のように、本発明において、生物学的組成物には、中枢神経系の細胞、例えば脳由来の神経細胞、好ましくは大脳皮質由来の神経細胞、より好ましくは大脳皮質由来の初代培養神経細胞などの神経細胞を用いることができる。以下に、大脳皮質由来の初代培養神経細胞の調製方法の例を示すが、以下に限定されるものではない。
【００８３】
エーテル等で妊娠動物（例えばラット、マウスなど）を麻酔処理した後、妊娠動物より無菌的に胎仔（胎生16日齢〜21日齢）を摘出する。前記胎仔より脳を摘出し、氷冷L-15培地に浸す。実体顕微鏡下で大脳皮質を採取する。各脳部位断片を、トリプシン（trypsin）およびDNaseを含有した酵素溶液中で酵素処理を行い、細胞を分散させる。ウマ血清などの添加により酵素反応を停止させ、遠心分離後、上清を除き、細胞塊に培地を加える。培地は、例えば海馬神経細胞、中枢神経系の神経細胞（例えば成体）の培養を長期間維持するために開発された無血清培地を用いることができ、さらに神経細胞が長期生存できるよう補助試薬を含有するものを用いるとよい（Brewer, G. J., J. Neurosci. Methods, 71, 45, 1997、Brewer, G. J., et al., J. Neurosci. Res., 35, 567, 1993）。例えば１〜５％、好ましくは2 %の補助試薬を含有するNeurobasal（商標）培地（インビトロジェン社）が好ましく、より好ましくは補助試薬として２％のB-27サプリメント（インビトロジェン社）、0.5 mM L-glutamine、AntibioticsおよびAntimycoticsを含有するNeurobasal（商標）培地（以下、「Neurobasal/ B27」と記す場合もある。）が好ましい。特に好ましくは、2 % B-27サプリメント、25μMの2-メルカプトエタノール（2-ME）、0.5 mM L-glutamine、AntibioticsおよびAntimycoticsを含有するNeurobasal（商標）培地（以下、「Neurobasal/ B27/ 2ME」と記す場合もある。）である。ピペッティング操作により細胞を再分散させ、ろ過し、細胞塊を除き、神経細胞懸濁液を得る。神経細胞懸濁液を培地にて希釈し、培養用のプレートに細胞を均一密度で播種する。細胞を所定条件下（例えば、5％CO2、95％空気、37℃インキュベーター中の雰囲気下）で一日培養した後、培地全量を新鮮な前記Neurobasal/ B27/ 2MEと交換する。
【００８４】
（トランスジェニック非ヒト動物モデル）
上述のように、本発明において、生物学的組成物として、APPトランスジェニック非ヒト動物を使用することもできる。すなわち、候補化合物または本発明に使用する化合物類がAβ37の産生を亢進させる作用を有するかどうか、またはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有するかどうかは、APPトランスジェニック非ヒト動物モデルを用いた試験により確認することができる。APPトランスジェニック非ヒト動物モデルは当該分野で周知であり、例えばJ. Neurosci. 21(2), 372-381, 2001、J. Clin. Invest., 112, 440-449, 2003に記載されているTg2576マウスが知られている。すなわちTg2576マウスを用いた試験法の一例を挙げれば以下のように行うことができる。
Tg2576マウスにγ-セクレターゼ阻害剤であるN-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester、あるいは候補化合物、本発明に使用する化合物類などを投与したときの脳内、脳脊髄液または血清中の各Aβ量を測定すること（J. Pharmacol. Exp. Ther. 305, 864-871, 2003）によって、上記化合物がAβ37の産生を亢進させる作用を有するか否か、あるいはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有するか否かを評価することが可能である。
【００８５】
本発明において、APPトランスジェニック非ヒト動物の由来する種は、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマを用いることができる。
【００８６】
（非トランスジェニック非ヒト動物モデル）
上述のように、本発明において、生物学的組成物として、非トランスジェニック非ヒト動物モデルを使用することができる。すなわち候補化合物または本発明に使用する化合物類がAβ37の産生を亢進させる作用を有するかどうか、またはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有するかどうかは、非トランスジェニック非ヒト動物を用いた試験により確認することができる。例えば、シンバスタチン（Simvastatin）をモルモットに投与後、脳脊髄液中のAβ量を測定する方法（PNAS, 98, 5856-5861, 2001）、またはγ−セクレターゼ阻害剤LY411575をラットに投与後、脳脊髄液中のAβ40量を測定する方法（JPET, 313, 902-908, 2005）が報告されている。従って、これらの方法に準じて、候補化合物または本発明に使用する化合物類を非トランスジェニック非ヒト動物モデル（例えば、モルモット、マウス、ラットなど）に投与したときの、脳中、脳脊髄液中または血液中の各Aβの量を測定することにより、候補化合物がAβ37の産生を亢進する作用を有するか否か、またはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進する作用を有するか否かを評価することができる。
【００８７】
以下に、本発明の同定方法または本発明のスクリーニング方法に、MALDI-TOF/MSを用いた場合を例に挙げて説明する。
（MALDI-TOF/MS［Matrix-Associated Laser Desorption Ionization ― Time of Flight/ Mass Spectrometry  （マトリクス支援イオン化―飛行時間型質量分析）］によるAβの解析）
本明細書においてMALDI-TOF/MSは、例えばRong Wang, David Sweeney, Sammuel E. Gangy, Sangram S. Sisodia, J. of Biological Chemistry, 271, (50), 31894-31902, 1996、Takeshi Ikeuchi, Georgia Dolios, Seong-Hun Kim, Rong Wang, Sangram S. Sisodia, J. of Biological Chemistry, 278, (9), 7010-7018, 2003、Sascha Weggen, Jason L. Erikson, Pritam Das, Sarah Sagi, Rong Wang, Claus U. Pietrzik, Kirk A. Findlay, Tawnya E. Smith, Michael P. Murphy、Thomas Bulter, David E. Kang, Numa Marquez-sterling, Todd E. Golde, Edward H. Koo, Nature, 414, 212-216, 2001、大河内正康ら著、遺伝子医学  Vol.7 (1), 12-16, 2003に記載されている方法に従って行うことができる。具体的には以下のように行うことができる。
【００８８】
MALDI-TOF/MSによる解析には、中枢神経系の細胞、好ましくは脳由来の細胞、好ましくは大脳皮質由来の神経細胞、より好ましくは大脳皮質由来の初代培養神経細胞を用いることができる。非ヒト動物から脳を摘出し、その摘出脳から常法に従い神経細胞を調製することができる。培地は、例えば海馬神経細胞、中枢神経系の神経細胞（例えば成体）の培養を長期間維持するために開発された無血清培地を用いることができ、さらに神経細胞が長期生存できるよう補助試薬を含有するものを用いるとよい（Brewer, G. J., J. Neurosci. Methods, 71, 45, 1997、Brewer, G. J., et al., J. Neurosci. Res., 35, 567, 1993）。例えば１〜５％、好ましくは2 %の補助試薬と例えば10〜30μM、好ましくは25μMの2-mercaptoethanol（2-ME）などを含有するNeurobasal（商標）培地（インビトロジェン社）が挙げられ、好ましくはNeurobasal（商標）培地（インビトロジェン社）に、２％ B-27 supplement（インビトロジェン社）、25μＭ 2-mercaptoethanol(2-ME)、0.5 mM L-glutamine、AntibioticsおよびAntimycoticsを添加したもの(Neurobasal/ B27/ 2ME)である。アッセイの際は、2-MEのみを添加しない前記培地（Neurobasal/ B27）が好ましい。細胞の培養数日後に、培地を抜き取り、Neurobasal/ B27を加える。次いで、Neurobasal/ B-27にて希釈した候補化合物の溶媒（例えば非プロトン性極性溶媒、好ましくはDMSO (dimethyl sulfoxide)）を添加し、混和する。最終溶媒（例えば非プロトン性極性溶媒、好ましくはDMSO）濃度は、1%以下とするのが好ましい。また、対照群には溶媒（例えば非プロトン性極性溶媒、好ましくはDMSO）のみを添加するとよい。候補化合物または溶媒（例えば非プロトン性極性溶媒、好ましくはDMSO）を添加して数日間培養した培地全量をMALDI-TOF/MSサンプルとして使用することができる。細胞生存の評価は、公知の方法、例えば後述のMTTアッセイで行うことができる。
【００８９】
次に、Aβフラグメントを回収する方法は、例えば免疫沈降法にて行うことができる。サンプリングした培養上清を回収し、遠心分離して細胞片を沈降させる。上清に内部標準物質として、当業者が入手可能な合成Aβ（例えば、合成Aβ12-28（Bachem））を加えることもできる。さらに当業者が入手可能な所望の抗Aβ抗体（好ましくは、抗Aβモノクローナル抗体であり、例えばクローン名4G8、Signet Laboratories, Inc）を加える。続いて常法に従い、例えばBSAなどでブロッキングしたProtein Gおよび／またはProtein Aが結合したセファロースやアガロースなどの水不溶性樹脂（例えば、Protein G plus Protein A Agarose）を加えて混合する。抗Aβ抗体は、抗ヒトAβモノクローナル抗体であってもよい。抗ヒトAβモノクローナル抗体は、市販のものを用いても良いが、当業者であれば容易に作製することもできる。例えば、まず、Aβに共通な部分の配列を抗原に用いて、マウスなどの動物に１〜３回程度免疫し、当該動物から免疫担当細胞を採取し、細胞融合法などにより当該細胞を不死化することで、モノクローナル抗体産生細胞を得ることができる。得られたモノクローナル抗体産生細胞を、ヌードマウスなどの腹腔に投与し、回収した腹水から目的のモノクローナル抗体を得ることができるが、抗体作製方法は上記方法に限定されるわけではない。ここで、抗原に用いるAβの配列は、当業者であれば適宜選択することができる。また、抗原に用いるペプチド部分は、天然由来のもの、自動合成機により合成したもの、APPから生化学的方法により作製したもの、あるいは市販のものを用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
免疫沈降をしたAβフラグメントは、Protein G plus Protein A AgaroseなどのProtein Gおよび／またはProtein Aの結合した水不溶性樹脂を用いて回収し、常法に従い洗浄し、Aβを溶出することにより得ることができる。溶出は、イオン交換水での洗浄後に可能な限り液体を除き、例えば、0.2%NOG、2.4%トリフルオロ酢酸 (TFA; PIERCE)、48.7%アセトニトリル（HPLCグレード、和光純薬）からなる溶液を用いて行うことができるが、これに限定されず、当業者であれば公知技術に基づいて溶出することができる。
【００９１】
Aβの各溶出液とマトリクス溶液を質量分析用サンプルプレートの同一地点に滴下し、室温下自然乾燥させ、これを質量分析器で解析する。ここで、マトリクス溶液は、MALDI-TOS/MSに通常用いられる溶液を使用することができ、例えば0.2% NOG 、0.1％TFA、33%アセトニトリルにα-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (CHCA; BRUKER DALTONICS)を飽和濃度で溶解し、これに質量標準物質としてインシュリン、およびアンジオテンシンIIIを加えて調製したものを用いることができる。質量標準物質としては、上記の他、解析対象である各Aβの分子量（約3,000〜4514）の範囲外の分子量を有するいずれのペプチドおよび化合物を使用することもできる。例えば、インシュリンの代わりにω-Agatoxin TK（分子量5273.0）、human Adrenomedullin2（分子量5100.7）などを、アンジオテンシンIIIの代わりにAngiotensinII（分子量1046.2）、human Endokinin D（分子量1574.8）などを使用することもできる。
【００９２】
MALDI-TOF/MSによるAβの測定は、当業者であれば測定機器の操作手順に従って、容易に行うことができる。用いる機器は、例えば、Voyager-DE (Applied Biosystems)、AXIMA(SHIMADZU BIOTECH)、ultraflex TOF/TOF（Bruker Daltonics）、Ettan MALDI-ToF Pro（amershambiosciences）、prOTOF2000（PerkinElmer）を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００９３】
MALDI-TOF/MSで検出された質量は、質量標準物質の質量理論値を用いて補正することができる。MALDI-TOF/MSの結果、それぞれのピークは、ソフトウェアによってデーターベースから該当するペプチドを同定することができる。そして、検出された各ピークの強さ（Intensity）は数値として出力され、この値を内部標準物質で標準化することもできる。これらの数値を各ピークに該当するペプチド量の測定値とすることができる。
【００９４】
そして、溶媒（例えば非プロトン性極性溶媒、好ましくはDMSO）のみを添加したときのAβ37量と比較して、候補化合物を添加したときのAβ37量が多い場合、当該候補化合物を、Aβ37の産生を亢進することのできる化合物として同定することができる。
あるいは、溶媒（例えば非プロトン性極性溶媒、好ましくはDMSO）のみを添加したときの各Aβ量と比較して、候補化合物を添加したときのAβ40/42の量が少なく、かつAβ37量が多い場合、当該候補化合物を、Aβ40/42の産生を阻害し、かつAβ37の産生を亢進することのできる化合物として同定することができる。
【００９５】
（Aβの解析およびAβの凝集能の解析方法）
本発明に使用する化合物類は、前述のとおり、Aβの凝集を阻害することができる。従って、本明細書において、候補化合物、あるいは本発明に使用する化合物類によるAβの凝集能は、以下のAβの解析方法によって、検出、判定または解析することができる。
【００９６】
Aβの凝集は、Aβのβ−シート構造形成に起因する215〜260nmにおける円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）スペクトルの変化を指標に用いて検討することができる。215〜260nmにおけるCDスペクトルは、Aβがα−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成すると減少する。特に、β−シート構造の形成は、220 nm周辺のCDスペクトルを減少させることが知られている。
【００９７】
また、別の態様として、溶液中でのAβの凝集を簡便に検討するため、チオフラビンT（ThT）を用いてAβの蛍光を測定することができる。Aβを含む溶液に1〜100μmol/L、好ましくは1〜20μmol/L、より好ましくは10μmol/LのThTを添加し、直後にexcitation波長450 nm、emission波長490 nmで蛍光測定する（Wall J., Schell M., Murphy C., Hrncic R., Stevens F.J., Solomon A. (1999) Thermodynamic instability of human lambda 6 light chains: correlation with fibrillogenicity. Biochemistry. 38(42), 14101-14108.）。候補化合物または本発明に使用する化合物類の存在下において、候補化合物または本発明に使用する化合物類の非存在下よりも220 nm周辺のCDスペクトルの減少を抑制する化合物、あるいはThT添加時にThTの蛍光強度の増加を抑制する化合物が、Aβの凝集を阻害させる化合物である。本発明の同定方法または本発明のスクリーニング方法においては、当該Aβ凝集能の低下を指標とすることができる。
【００９８】
（Aβの細胞毒性の検出方法）
Aβはβ−シート構造をとるとAβ繊維の固まりを形成しやすくなり、毒性を示すことが知られている。本発明に使用する化合物類は、前述のとおり、Aβの凝集を阻害することができる。すなわち、候補化合物または本発明に使用する化合物類はβ−シート構造の形成を阻害するため、Aβの細胞毒性を低下させることができる。従って、本発明において、候補化合物または本発明に使用する化合物類により生ずるAβ毒性の低減は、中枢神経系の細胞、好ましくは脳由来の細胞、好ましくは大脳皮質由来の神経細胞、より好ましくは大脳皮質由来の初代培養神経細胞、またはアストロサイトなどのグリア細胞、PC12などの株化細胞にAβを添加した後に、細胞傷害を測定する公知の方法（MTTアッセイ、またはLDH量、アラマーブルー（alamar blue）もしくはトリパンブルーを指標とした細胞傷害測定方法など）を用いて検出することができる。細胞に添加するAβは、全長のAβを用いてもよいし、各Aβ（Aβ37、Aβ38、Aβ40またはAβ42）を用いてもよく、β−シート構造をとる配列である限り、いずれの長さのAβを用いてもよい。また、Aβは天然由来のもの、全合成したもの、または天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものを用いても良い。天然由来のAβは当該技術分野で公知の方法により得ることができる。細胞に添加する各Aβは、例えば、10mM NaOH溶液に100 μg/mlで溶解し、5分後にリン酸緩衝液（Phosphate buffered saline (PBS)）で希釈して500 μMに調製するとよい。
【００９９】
MTTアッセイは、各Aβを添加した前記初代培養神経細胞の細胞毒性をMTTによって測定し、対照群（Aβ処理しなかった群）に対する比率を算出することで、細胞生存活性を比較、評価することができる。例えば、Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT; SIGMA)溶液を、1〜3日間培養した初代培養神経細胞の培地中に終濃度が0.4〜0.8 mg/mlになるように加える。37℃で20分〜1時間培養した後、培地を取り除き、細胞を溶媒（例えば非プロトン性極性溶媒、好ましくはDMSO）で可溶化し、その吸光度(550nm)を測定する。ここで用いる培地は、例えばNeurobasal/ B27/ 2MEが好ましい。
【０１００】
本発明の同定方法またはスクリーニング方法によって得られる本発明に使用する化合物類は、Aβ37の産生を亢進させる作用、またはAβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進させる作用を有するものであり、アルツハイマー病、ダウン症等のAβに起因する疾患の治療に有用である。
【０１０１】
７．外因性のAβ37またはAβ38
（１）Aβ37およびAβ38
本発明はAβ37、Aβ38、およびそれらの塩、並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを含有してなるAβの凝集阻害剤、神経細胞死の抑制剤を提供する。すなわち、本発明は、Aβ37、Aβ38、もしくはそれらの変異体、もしくはそれらのフラグメント、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せ（以下、「本発明に使用するペプチド類」ともいう）を含有してなるAβの凝集阻害剤、神経細胞死の抑制剤を提供するものである。本発明に使用するペプチド類において、Aβ37は、好ましくは配列番号１２、１４または１６で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであり、より好ましくは配列番号１２、１４または１６で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。また本発明に使用するペプチド類において、Aβ38は、好ましくは配列番号１８、２０または２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであり、より好ましくは配列番号１８、２０または２２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。Aβ37およびAβ38は、塩を形成していてもよいし、それらの溶媒和物であってもよく、これらは本発明に使用するペプチド類に含まれる。
【０１０２】
ヒト型Aβ37
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG（配列番号１２）
マウス型Aβ37
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG（配列番号１４）
ラット型Aβ37
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG（配列番号１６）
ヒト型Aβ38
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG（配列番号１８）
マウス型Aβ38
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG（配列番号２０）
ラット型Aβ38
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG（配列番号２２）
【０１０３】
本明細書において前記の「変異体」とは、Aβ37またはAβ38、好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドを意味する。前記変異体は、本発明に使用するペプチド類に含有される。前記変異体は、塩を形成していてもよいし、それらの溶媒和物であってもよく、これらも前記変異体に含まれる。
【０１０４】
本明細書において前記の「実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド」とは、Aβ37またはAβ38（好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド）において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加され、またはこれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドを意味する。ここで、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【０１０５】
ここで「置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【０１０６】
また、本明細書において前記の「フラグメント」とは、Aβ37またはAβ38の部分アミノ酸配列からなるペプチドであって、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドを意味する。詳しくは、前記「フラグメント」は、Aβ37、Aβ38（好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号１８、２０もしくは配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、より好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド）、またはそれらの変異体の部分アミノ酸配列からなるペプチドであって、かつAβの凝集阻害活性を有するペプチドを意味する。この場合、部分アミノ酸配列からなるペプチドを構成するアミノ酸数は、例えば１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個である。フラグメントは、塩を形成していてもよく、それらの溶媒和物であってもよく、それらペプチドも前記フラグメントに含有される。前記フラグメントは、本発明で使用するペプチド類に含有される。
【０１０７】
本発明に使用するペプチド類には、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、本発明に使用するペプチド類の起源は、ヒト、マウス、ラットに限定されず、非ヒト、非マウス、非ラット哺乳動物由来のものも含まれる。
【０１０８】
本発明に使用するペプチド類は、種々の公知の方法により得ることができる。本発明に使用するペプチド類は、天然由来のものであってもよく、または全合成したものであってもよい。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。天然由来の場合、生体由来の細胞を培養した後、公知の方法で細胞と上清とを遠心分離またはろ過などにより分離し、上清を集めることができる。培養上清に含まれるペプチド類は、公知の分離、精製技術を適宜組み合わせて精製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行うことができる。
【０１０９】
また、本発明に使用するペプチド類は、遺伝子工学的手法および／または生化学的手法を用いて得ることができる。遺伝子工学的手法および／または生化学的手法を用いて、APPのプロセッシング（β-部位とγ-部位の切断、それぞれβ-セクレターゼ、γ-セクレターゼによって切断される）により、本発明に使用するペプチド類を得ることができる。具体的には、常法に従って、生体由来もしくはAPPトランスジェニック非ヒト動物由来のAPP発現細胞または当該細胞膜片を作製し、それらに適当なタンパク質分解酵素、好ましくはβ-セクレターゼ、γ-セクレターゼを作用させ、所望とするAβを産生させることができる。この際、本発明に使用する化合物類を用いて、所望とする前記ペプチド類を効率的に産生させることも可能である。
【０１１０】
（２）Aβ37およびAβ38をコードするポリヌクレオチド
また本発明の別の態様によれば、本発明に使用するペプチド類をコードするポリヌクレオチド、すなわち、Aβ37もしくはAβ38をコードするポリヌクレオチド、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、またはそれらの組合せから、Aβ37またはAβ38を調製することができる。例えば、本発明に使用するペプチド類をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のペプチドを分離および精製することによって、Aβ37またはAβ38を調製することができる（Sambrook and Russell, Molecular Cloning, 3rd edition, CSHL Press）。あるいは、本発明に使用するペプチド類をコードするポリヌクレオチドを、ウサギ網状赤血球ライセートや大腸菌ライセートなどを用いる、いわゆるセルフリー系のin vitro translation法に適用することでAβ37またはAβ38を調製することができる(例えば、「Rapid Translation System」（Roche Applied Science）、「Proteios」（TOYOBO））。
【０１１１】
ここで、Aβ37またはAβ38をコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するペプチド類をコードするポリヌクレオチドであり、
好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、
より好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、
もしくはそれらの変異体、
もしくはそれらのフラグメント、
をコードするポリヌクレオチド、もしくはそれらの塩もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せ（以下、「本発明に使用するポリヌクレオチド類」ともいう）である。上記のように、本発明に使用するポリヌクレオチド類は、塩またはそれらの溶媒和物であってもよく、これらも本発明に使用するポリヌクレオチド類に含まれる。
【０１１２】
ここで、配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１１、１３もしくは１５で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１７、１９もしくは２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド、もしくはその相同体、もしくはそれらの塩またはそれらの溶媒和物が好ましい。
【０１１３】
また、本発明に使用するペプチド類に含まれている変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１１、１３もしくは１５で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドの相同体、配列番号１７、１９もしくは２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドの相同体、もしくはそれらの塩またはそれらの溶媒和物が好ましい。
【０１１４】
また、本発明に使用するペプチド類に含まれているフラグメントをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１１、１３もしくは１５で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドの一部、もしくは配列番号１７、１９もしくは２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドの一部、もしくはそれらの塩またはそれらの溶媒和物が好ましい。
【０１１５】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、DNAまたはRNAが含まれる。
【０１１６】
ヒト型Aβ37
GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGC（配列番号１１）
マウス型Aβ37
GATGCAGAATTCGGACATGATTCAGGATTTGAAGTCCGCCATCAAAAACTGGTGTTCTTTGCTGAAGATGTGGGTTCGAACAAAGGCGCCATCATCGGACTCATGGTGGGC（配列番号１３）
ラット型Aβ37
GATGCGGAGTTCGGACATGATTCAGGCTTCGAAGTCCGCCATCAAAAACTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCCATCATTGGACTCATGGTGGGT（配列番号１５）
ヒト型Aβ38
GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGT（配列番号１７）
マウス型Aβ38
GATGCAGAATTCGGACATGATTCAGGATTTGAAGTCCGCCATCAAAAACTGGTGTTCTTTGCTGAAGATGTGGGTTCGAACAAAGGCGCCATCATCGGACTCATGGTGGGCGGC（配列番号１９）
ラット型Aβ38
GATGCGGAGTTCGGACATGATTCAGGCTTCGAAGTCCGCCATCAAAAACTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCCATCATTGGACTCATGGTGGGTGGC（配列番号２１）
【０１１７】
本明細書において前記の「相同体」とは、Aβ37またはAβ38をコードするポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１１、１３もしくは１５で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１７、１９もしくは２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。相同体は、塩またはその溶媒和物であってもよく、それらも前記相同体に含有される。前記相同体は、本発明で使用するポリヌクレオチド類に含有される。
【０１１８】
本明細書において前記の「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、Aβ37またはAβ38をコードするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列（好ましくは配列番号１１、１３もしくは１５で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１７、１９もしくは２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに相補的な塩基配列）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、Aβ凝集阻害活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。ストリンジェントな条件としては、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-Hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を3回、最後に、1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行うことも考えられる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１１、１３、１５、１７、１９または２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、より一層好ましくは90％（例えば、95％以上）の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１１９】
上記のアミノ酸配列、塩基配列のGenBank accession numberは、ヒトAβ37はNM_000484（塩基配列）、NP_000475（アミノ酸配列）；マウスAβ37はNM_007471（塩基配列）、NP_031497（アミノ酸配列）；ラットAβ37はNM_019288（塩基配列）、NP_062161（アミノ酸配列）；ヒトAβ38はNM_000484（塩基配列）、NP_000475（アミノ酸配列）；マウスAβ38はNM_007471（塩基配列）、NP_031497（アミノ酸配列）；ラットAβ38はNM_019288（塩基配列）、NP_062161（アミノ酸配列）である。
【０１２０】
本発明に使用するポリヌクレオチド類は、例えば天然由来のものでもよく、または全合成したものでもよい。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものを使用することもできる。本発明に使用するポリヌクレオチド類の典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはcDNAライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なDNAプローブを用いてスクリーニングを行う方法などを挙げることができる。
【０１２１】
本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類によってコードされるペプチドは、Aβ凝集阻害作用を示す。当該Aβ凝集阻害作用は、上記「６．本発明に使用する化合物類の同定方法またはスクリーニング方法」に記載のAβ凝集能の解析方法を用いて、確認することができる。Aβの凝集は、Aβが沈着した神経細胞において細胞死を引き起こすことが明らかにされている。従って、本発明に使用するペプチド類または当該ペプチドをコードする本発明に使用するポリヌクレオチド類は、Aβ凝集阻害剤または神経細胞死の抑制剤として用いることもできる。
【０１２２】
Aβ凝集阻害剤または神経細胞死の抑制剤として使用するにあたり、本発明のポリヌクレオチド類を単独または適当なベクターに挿入して、あるいは、シグナル配列、ポリペプチド安定化配列などの配列を付加して用いることができる。
【０１２３】
上記ベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、プラスミド、ファージミド、コスミドなどの公知のものを使用することができる。
【０１２４】
８．医薬組成物
本発明は、Aβに起因する疾患の治療方法を提供する。上記方法は、当該疾患の治療が必要な哺乳動物に、本発明に使用する化合物類、すなわちAβ37の産生を亢進することのできる化合物、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することのできる化合物、およびそれらの塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つの有効量を投与することにより行うことができる。本発明は、本発明に使用する化合物類、すなわちAβ37の産生を亢進することのできる化合物、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することのできる化合物、およびそれらの塩ならびにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含有する、医薬組成物を含むものである。
【０１２５】
また、本発明のAβに起因する疾患の治療方法は、当該疾患の治療が必要な哺乳動物に、本発明に使用するペプチド類、すなわちAβ37またはAβ38、好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドもしくは配列番号１８、２０もしくは配列番号２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、より好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドもしくは配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、もしくはそれらの変異体、もしくはそれらのフラグメント、もしくはそれらの塩もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せ、の有効量を投与することにより行うことができる。
【０１２６】
また、上記方法は、当該疾患の治療が必要な哺乳動物に、本発明に使用するポリヌクレオチド類、すなわちAβ37もしくはAβ38をコードするポリヌクレオチドもしくはそれらの塩もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せの有効量を投与することにより行うことができる。上記のAβ37またはAβ38は、好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドもしくは配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、より好ましくは配列番号１２、１４もしくは１６で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドもしくは配列番号１８、２０もしくは２２で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、もしくはそれらの変異体、もしくはそれらのフラグメントである。
【０１２７】
上記方法において、本発明に使用するポリヌクレオチド類は、さらに好ましくは、配列番号１１、１３もしくは１５で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドもしくは配列番号１７、１９もしくは２１で表されるいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド、より好ましくは配列番号１１、１３もしくは１５で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくは配列番号１７、１９もしくは２１で表されるいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド、もしくはそれらの相同体、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、またはそれらの組合せの有効量を投与することにより行うことができる。
【０１２８】
本発明は、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を有効成分として含有する、医薬組成物を含むものである。
【０１２９】
本明細書において、「本発明の医薬組成物」は、本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類、または本発明に使用するポリヌクレオチド類を有効成分として含有する医薬組成物を意味する。本発明の医薬組成物はAβに起因する疾患の治療薬として有用である。
【０１３０】
上記の有効成分である本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類、本発明に使用するポリヌクレオチド類は、それらのプロドラッグであってもよい。
【０１３１】
本明細書において、「プロドラッグ」とは、バイオアベイラビリティ(bioavailability)の改善や副作用の軽減等を目的として、「薬剤の活性本体」（プロドラッグに対応する「薬剤」を意味する）を不活性な物質に化学修飾したものを意味し、吸収後、体内では活性本体へ代謝され、作用を発現する薬剤のことである。従って、「プロドラッグ」という用語は、対応する「薬剤」よりも固有活性（intrinsic activity）は低いが、生物学的な系に投与されると、自発的な化学反応または酵素触媒反応または代謝反応の結果、その「薬剤」物質を生成する任意の化合物、ペプチド、ポリヌクレオチドを指す。当該プロドラッグとしては、上記例示した前記化合物類、前記ペプチド類もしくは前記ポリヌクレオチド類のアミノ基、水酸基、カルボキシル基などがアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化、炭酸化、エステル化、アミド化またはウレタン化された化合物、ペプチド、ポリヌクレオチドなどの種々のプロドラッグを例示することができる。但し、例示した群は包括的なものではなく、典型的なものに過ぎず、当業者は他の既知の各種プロドラッグを公知の方法によって上記例示した前記化合物類、前記ペプチド類または前記ポリヌクレオチド類から調製することができる。上記例示した前記化合物類、前記ペプチド類または前記ポリヌクレオチド類からなるプロドラッグは、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３２】
本明細書において「Aβに起因する疾患」とは、アルツハイマー病（AD）（例えば、以下の文献１、２、３、４、５、６、７、８参照）；アルツハイマー型老年性痴呆症（SDAT）、老年性痴呆（例えば、文献９参照）；前頭側頭型痴呆（例えば、文献１０参照）；ピック病（例えば、文献１１参照）；ダウン症（例えば、文献１２、１３参照）；脳血管アンギオパチー（例えば、文献１４、１５、１６、１７参照）；遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（例えば、文献１８、１９、２０、２１参照）；認知障害（例えば、文献２２参照）；記憶障害・学習障害（例えば、文献２３，２４，２５参照）；類澱粉症（アミロイド−シス）、脳虚血（例えば、文献２２、２６、２７参照）；脳血管性痴呆（例えば、文献２８参照）；眼筋麻痺（例えば、文献２９参照）；多発性硬化症（例えば、文献３０、３１参照）；頭部外傷（例えば、文献３２参照）；失行症（例えば、文献３３参照）；プリオン病、家族性アミロイドニューロパチー、トリプレットリピート病（例えば、文献３４、３５、３６参照）；パーキンソン病（例えば、文献３７参照）、レビー小体型痴呆（例えば、文献３８、３９、４０、３７参照）；パーキンソニズム・痴呆コンプレックス（例えば、文献４１，４２参照）；第１７番目染色体に連鎖する前側頭型痴呆・パーキンソニズム（例えば、文献４３参照）；嗜銀性グレイン型痴呆（例えば、文献４４参照）；ニーマン・ピック病（例えば、文献４５参照）；筋萎縮性側策硬化症（例えば、文献４６、４７、４８、４９参照）；水頭症（例えば、文献５０、５１、５２、５３、５４参照）；対不全麻痺（例えば、文献２９、３３、５５、５６参照）；進行性核上性麻痺（例えば、文献４０、３７参照）；脳出血（例えば、文献５７、５８参照）；痙攣（例えば、文献５９参照）；軽度認知障害（例えば、文献６０，６１参照）；動脈硬化（例えば、文献６２参照）等多岐に渡る。
【０１３３】
本発明において「Aβに起因する疾患」は、好ましくはアルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症またはアミロイドーシス症である。
【０１３４】
（文献１） Klein WL, et al., Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss, Proceeding of the National Academy of Science of the USA, 2003, Sep 2, 100(18), p.10417-10422.
（文献２） Nitsch RM, et al., Antibodies against β-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease, Neuron, 2003, May 22, 38(4), p.547-554.
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【０１３７】
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a）〜（c）の治療を含む：
（a）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（b）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（c）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
【０１３８】
本発明の医薬組成物、好ましくは本発明のAβに起因する疾患の治療薬は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を含有する医薬組成物は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容され得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することが可能である。
【０１３９】
好ましい剤形としては、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤等による経口剤、吸入剤、坐剤、注射剤（点滴剤を含む）、軟膏剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤、リポソーム剤等による非経口剤が挙げられる。
【０１４０】
これらの製剤の製剤化に用いる担体には、例えば通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖等の糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩；精製水等が挙げられる。
【０１４１】
賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が、ぞれぞれ用いられる。上記の成分は、それらの塩またはその溶媒和物であってもよい。
【０１４２】
例えば経口製剤は、本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類に賦形剤、さらに必要に応じて例えば結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。錠剤・顆粒剤の場合には、例えば糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。シロップ剤や注射用製剤等の場合は、例えばpH調整剤、溶解剤、等張化剤等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤等とを加えて、常法により製剤化する。また、外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能であり、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水等の原料が挙げられ、必要に応じ、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料等を添加することができる。さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量％の間で変動され得る。本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を前記治療に使用する場合は、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【０１４３】
本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類は、Aβに起因する疾患の症状にある患者がいる場合に、常法に従い、前記ポリヌクレオチド類の有効量を該患者に投与し、生体内で前記ペプチドを発現させることによる遺伝子治療を行うことができる。例えば、本発明に使用するポリヌクレオチド類を細胞に導入し、当該細胞で前記ペプチドを発現させた後、当該細胞を患者に移植することによってAβに起因する疾患の治療をすることができる。また、本発明に使用するポリヌクレオチド類を用いて治療を施す場合は、常法に従って、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与するために、当該ポリヌクレオチド類を単独のまま使用してもよいし、あるいは当該ポリヌクレオチド類にシグナル配列、ポリペプチド安定化配列などの配列を付加し、あるいはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入してもよい。本発明に使用するポリヌクレオチド類は、そのまま、または薬学的に許容される担体とともに製剤化し、常法に従って、カテーテルまたは遺伝子銃によって投与することができる。
【０１４４】
本発明に使用するポリヌクレオチド類が挿入された前記ベクターも上述と同様に製剤化することができ、例えば非経口的に使用することができる。投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１４５】
本発明に使用する化合物類を含有する本発明の医薬組成物の有効な投与量は、例えば症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて異なるが、通常、成人の場合は体重６０ｋｇ、１日あたり経口投与では約３０μｇ〜１０ｇ、好ましくは１００μｇ〜５ｇ、さらに好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇをそれぞれ１回または数回に分けて投与し、注射投与では約３０μｇ〜１ｇ、好ましくは１００μｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは１００μｇ〜３０ｍｇをそれぞれ１回または数回に分けて投与する。
【０１４６】
本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を含有する本発明の医薬組成物の投与形態および必要な投与量範囲は、前記ペプチド類または前記ポリヌクレオチド類の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約０．１〜５００μｇ、好ましくは約０．１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１４７】
上記の投与量は、本発明のAβ凝集抑制方法または神経細胞死の抑制方法においても、参照することができる。
【０１４８】
９．併用療法
本発明は、併用療法によるAβに起因する疾患の治療方法（以下、「本発明の併用療法」ともいう）およびそれに用いる医薬組成物を含有する。
（１）実施態様
本発明において、「併用」とは、化合物を組み合わせて用いることを意味し、別々の化合物を投与時に併用する形態、および混合物（配合剤）としての形態の両方を含む。
本明細書において「併用」とは、併用の一成分が、本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類、および本発明に使用するポリヌクレオチド類、並びに本発明の医薬組成物からなる群から選択される少なくとも１つであり、他の成分が、ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つを含有する医薬組成物、またはNMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つを含有する医薬組成物である併用を含む。ここで、本発明の医薬組成物、すなわちAβに起因する疾患の治療薬は、「８．医薬組成物」の記載を参照することができる。
【０１４９】
また、本発明の別の実施態様において、当該併用は本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類および本発明に使用するポリヌクレオチド類からなる群から選択される少なくとも１つと、ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つ、またはNMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有する医薬組成物（配合剤）として提供される。
【０１５０】
また、本発明の別の実施態様において、「併用」は、併用の成分が、本発明に使用する化合物類および本発明に使用するペプチド類である併用、または本発明に使用する化合物類および本発明に使用するポリヌクレオチド類である併用を含む。当該併用は、本発明に使用する化合物と本発明に使用するペプチド類とを含有する医薬組成物（配合剤）として、または本発明に使用する化合物と本発明に使用するポリヌクレオチド類とを含有する医薬組成物（配合剤）として提供されてもよい。
【０１５１】
（２）医薬組成物（配合剤）
（i）本発明は、本発明に使用する化合物類、すなわちAβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つと、ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有する医薬組成物（配合剤）を提供する。
【０１５２】
（ii）本発明は、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類、すなわちAβ37もしくはAβ38、もしくはそれらの変異体、もしくはそれらのフラグメント、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、もしくはそれらの組合せ、または、Aβ37もしくはAβ38をコードするポリヌクレオチド、もしくはそれらの相同体、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、もしくはそれらの組合せと、ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有する医薬組成物を提供する。
【０１５３】
（iii）本発明は、本発明に使用する化合物類と本発明に使用するペプチド類とを含有する医薬組成物を提供する。
【０１５４】
（iv）本発明は、本発明に使用する化合物類と本発明に使用するポリヌクレオチド類とを含有する医薬組成物を提供する。
【０１５５】
本明細書において、「本発明の併用療法に用いる医薬組成物」は、上記(i)〜(iv)に記載の医薬組成物を意味する。
【０１５６】
（３）ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニスト
ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストは、いずれもAβに起因する疾患の治療薬として使用され、または開発されているものである。
【０１５７】
（i）ChE阻害物質
本発明におけるChE阻害物質とは、ChE阻害作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物であり、ChE阻害作用、すなわちChEの活性を可逆的にまたは不可逆的に阻害する物質を意味する。本発明において、ChEにはアセチルコリンエステラーゼ(AChE)（EC3.1.1.7）、ブチリルコリンエステラーゼなどが含まれる。本発明のChE阻害物質の好ましい特徴としては、ブチリルコリンエステラーゼに対してよりもAChEに対して高い選択性を有していること、血液脳関門を通過する能力を有していること、治療に際して必要とされる用量においては重篤の副作用を生じさせることはないことなどを挙げることができる。
【０１５８】
本発明の併用に用いる医薬組成物において、本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類、本発明に使用するポリヌクレオチド類、および本発明の医薬組成物からなる群から選択される少なくとも１つと併用しまたは配合して使用するための好ましい化合物には、ChE阻害物質およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つ、特にAChE阻害物質およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。
【０１５９】
本発明においてChE阻害物質としては、ドネペジル（donepezil）（アリセプト（ARICEPT）（登録商標））、ガランタミン（レミニール（Reminyl）（登録商標））、タクリン（Tacrine）（コグネックス（Cognex）（登録商標））、リバスチグミン（エクセロン（Exelon）（登録商標））、ジフロシロン（zifrosilone）（米国特許第5693668号明細書）、フィゾスチグミン（physostigmine）（シナプトン（Synapton））、イピダクリン（ipidacrine）（米国特許第４５５０１１３号明細書）、キロスチグミン（quilostigmine）、メトリフォネート（Metrifonate）（プロメム（Promem））（米国特許第４９５０６５８号明細書）、エプタスチグミン、ベルナクリン、トルセリン（tolserine）、シムセリン（cymserine）（米国特許第６４１０７４７号明細書）、メスチノン、イコペジル（icopezil）（米国特許第５７５０５４２号明細書）、ＴＡＫ−１４７（J.Med. Chem., 37(15), 2292-2299, 1994、日本国特許第２６５０５３７号公報、米国特許第５２７３９７４号明細書）、フペルジンＡ（huperzine A）（Drugs Fut. , 24, 647-663, 1999）、スタコフィリン（stacofylline）（米国特許第４５９９３３８号明細書）、チアトルセリン（thiatolserine）、ネオスチグミン（Neostigmine）、エセロリン（eseroline）またはチアシムセリン（thiacymserine）、８−［３−［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−４−ピペリジニル］−１−オキソプロピル］−１,２,５,６−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３,２,１−ｉｊ］キノリン−４−オン（日本国特許第３５１２７８６号公報）、フェンセリン、ZT−１、あるいは前記化合物の誘導体もしくはその塩またはそれらの溶媒和物または前記化合物もしくは前記誘導体のプロドラッグもしくはその塩もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せなどが挙げられる。
【０１６０】
例えば、ドネペジルまたはその塩（例えば、塩酸塩）は、その代表的な例として、日本国特開平１−７９１５１号公報、日本国特許２５７８４７５号公報、日本国特許２７３３２０３号公報、日本国特許３０７８２４４号公報または米国特許第４８９５８４１号公報などに開示されている方法により容易に製造することができる。ガランタミンおよびその誘導体は、米国特許第４６６３３１８号明細書、国際公開第８８／０８７０８号パンフレット、国際公開第９７／０３９８７号パンフレット、米国特許第６３１６４３９号明細書、米国特許第６３２３１９５号明細書、米国特許第６３２３１９６号明細書などに記載されている。タクリンおよびその誘導体は、米国特許第４６３１２８６号明細書、米国特許第４６９５５７３号明細書、米国特許第４７５４０５０号明細書、国際公開第８８／０２２５６号パンフレット、米国特許第４８３５２７５号明細書、米国特許第４８３９３６４号明細書、米国特許第４９９９４３０号明細書、国際公開第WO９７／２１６８１号パンフレットなどに記載されている。リバスチグミンおよびその誘導体は、欧州特許第１９３９２６号明細書、国際公開第９８／２６７７５号パンフレット、国際公開第９８／２７０５５号パンフレットなどに記載されている。
【０１６１】
さらには、本発明においてChE阻害物質としては、国際公開第００／１８３９１号パンフレットに記載されたChE阻害作用を有する化合物などが挙げられる。
【０１６２】
また、プロドラッグとしては、上記例示した化合物のアミノ基、水酸基、カルボキシル基などがアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化、炭酸化、エステル化、アミド化またはウレタン化された化合物などの種々のプロドラッグを例示することができる。但し、例示した群は包括的なものではなく、典型的なものに過ぎず、当業者は他の既知の各種プロドラッグを公知の方法によって上記例示した化合物から調製することができる。上記例示した化合物からなるプロドラッグは、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６３】
（ii）NMDA受容体アンタゴニスト
本発明におけるNMDA受容体アンタゴニストとは、NMDA受容体に結合して、その機能を阻害する化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを意味する。本発明のNMDA受容体アンタゴニストとしては、メマンチン（memantine; 3,5-Dimethyl-adamantan-1-ylamine; CAS#19982-08-2）、その誘導体、もしくはそれらのプロドラッグ、もしくはそれらの塩（好ましくは塩酸塩）もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せなどが挙げられる。メマンチンおよびその誘導体、ならびにそれらの製造方法は、日本国特許第２８２１２３３号に記載されている。
【０１６４】
（iii）AMPA受容体アンタゴニスト
本発明におけるAMPA受容体アンタゴニストとは、AMPA受容体に結合して、その機能を阻害する化合物およびその塩並びにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つを意味する。本発明のAMPA受容体アンタゴニストとしては、タランパネル（Talampanel）(LY300164 ; (R)-(-)-1-(4-Aminophenyl)-3-acetyl-4-methyl-7,8- methylenedioxy-3,4- dihydro-5H-2,3-benzodiazepine; CAS#161832-65-1)、その誘導体、もしくはそれらのプロドラッグ、もしくはそれらの塩もしくはそれらの溶媒和物またはそれらの組合せなどが挙げられる。タランパネルの製造方法は、J.Chem.Soc.Perkin Trans. I 1995年1423頁に記載されている。
【０１６５】
（４）投与形態
本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類、本発明に使用するポリヌクレオチド類、および本発明の医薬組成物からなる群から選択される少なくとも１つと、ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つ、またはNMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとの併用は、Aβに起因する疾患の治療において有用である。また、本発明に使用する化合物類と本発明に使用するペプチド類との併用、または本発明に使用する化合物類と本発明に使用するポリヌクレオチド類との併用は、Aβに起因する疾患の治療において有用である。すなわち、本発明の併用療法に用いる医薬組成物は、Aβに起因する疾患の治療において有用である。
【０１６６】
本発明において「Aβに起因する疾患」は、好ましくはアルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症またはアミロイドーシス症である。
【０１６７】
本発明の併用療法において、併用の成分それぞれを、疾患の治療が必要な哺乳動物（例えばヒト）に、そのまま同時にその有効量投与するか、または時間差をつけてその有効量投与すればよい。または慣用される方法により製剤化した医薬組成物として、併用の成分それぞれを、同時にその有効量投与するか、または時間差をつけてその有効量投与すればよい。あるいは、本発明の併用療法において、併用の成分それぞれを、そのまま配合して製剤化したものを有効量投与してもよいし、ある程度製剤化してから配合して製剤化したものを有効量投与してもよい。製剤化は、当業者であれば慣用される技術に基づいて行うことができる（前記「８．医薬組成物」参照）。ここで、「同時」とは、一つの投与スケジュールにおいて同一のタイミングで投与されることを意味し、投与の時分が完全に同一である必要はない。
【０１６８】
本発明の併用療法に用いる医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口または非経口的に投与することができる（前記「８．医薬組成物」参照）。併用時または配合時には、併用または配合の成分それぞれの投与形態または投与量とが異なっていても良い。
【０１６９】
本発明に使用する化合物類の投与量は、例えば症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて異なるが、通常、成人の場合は体重６０ｋｇ、１日あたり経口投与では約３０μｇ〜１０ｇ、好ましくは１００μｇ〜５ｇ、さらに好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇを、注射投与では約３０μｇ〜１ｇ、好ましくは１００μｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは１００μｇ〜３０ｍｇを、それぞれ１回または数回に分けて投与する。
【０１７０】
本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類の投与形態および必要な投与量範囲は、前記のペプチド類または前記のポリヌクレオチド類の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量として、患者の体重６０ｋｇあたり例えば約０．００６〜３０ｍｇ、好ましくは約０．００６〜６ｍｇ、より好ましくは０．０６〜３ｍｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【０１７１】
ChE阻害物質の経口投与形態として、塩酸ドネペジルの細粒剤は商品名アリセプト細粒（エーザイ株式会社）、錠剤は商品名アリセプト錠（エーザイ株式会社）として入手することができる。貼布剤として経皮吸収により投与する場合には、ChE阻害物質は、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することが好ましい。
【０１７２】
経口投与における前記ChE阻害物質の投与量は、成人体重６０ｋｇあたり、０．００１〜１０００ｍｇ／日、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／日、より好ましくは０．１〜３００ｍｇ／日である。塩酸ドネペジルを例にあげると、経口投与量は、好ましくは０．１〜３００ｍｇ／日であり、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／日であり、さらに好ましくは１．０〜５０ｍｇ／日である。また、タクリンの場合は０．１〜３００ｍｇ／日、好ましくは４０〜１２０ｍｇ／日の用量で投与することが好ましく、リバスチグミンの場合は０．１〜３００ｍｇ／日、好ましくは３〜１２ｍｇ／日の用量で投与することが好ましく、ガランタミンの場合は０．１〜３００ｍｇ／日、好ましくは１６〜３２ｍｇ／日の用量で投与することが好ましい。
非経口投与において、前記ChE阻害物質の好ましい投与量としては、貼布剤の場合、５〜５０ｍｇ／日であり、さらに好ましくは１０〜２０ｍｇ／日である。また、注射剤の場合には、生理食塩水または市販の注射用蒸留水などの薬学的に許容できる担体中に０．１μｇ／ｍｌ担体〜１０ｍｇ／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤の投与量は、処置を必要とする患者に対し、０．０１〜５．０ｍｇ／日であり、さらに好ましくは０．１〜１．０ｍｇ／日であり、一日あたり１〜３回に分けて投与することができる。
【０１７３】
NMDA受容体アンタゴニスト（例えばメマンチン）、AMPA受容体アンタゴニスト（例えばタランパネル）の投与形態および投与量は、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。例えば、メマンチンを経口投与するのに好ましい治療用量は、成人１人（体重６０ｋｇ）あたり、約５〜３５ｍｇ／日であるが、メマンチンは、１００〜５００ｍｇ／日の用量で治療に用いることが十分許容される。また、タランパネルは、成人１人（体重６０ｋｇ）あたり、約２０〜７０ｍｇ、好ましくは約２０〜５０ｍｇを１日２〜４回、好ましくは１日３回用いることができる。
【０１７４】
前記NMDA受容体アンタゴニストおよび前記AMPA受容体アンタゴニストの投与量は上記に限定されるわけではなく、投与する化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物、投与経路の効率の違いなどによって投与量は変動し得る。例えば、経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
上記併用時または配合時における投与量は、上記投与量の中から適宜選択することができる。
【０１７５】
１０．キット
本発明は、本発明に使用する化合物類、すなわちAβ37の産生を亢進することができる化合物、Aβ40/42の産生を阻害し、かつ、Aβ37の産生を亢進することができる化合物、およびそれらの塩ならびにそれらの溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１つと、前記ChE阻害物質、前記NMDA受容体アンタゴニストおよび前記AMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有するキットを提供する。例えば、前記ChE阻害物質はドネペジルまたはその塩（例えば、塩酸塩）、前記NMDA受容体アンタゴニストはメマンチン、前記AMPA受容体アンタゴニストはタランパネルを挙げることができる。
【０１７６】
本発明のキットは、本発明の併用療法に用いる医薬組成物の有効性を、検出または予測するために用いることができる。例えば、当該医薬組成物に含まれる有効成分と同一の成分を含む本発明のキットを用いて、Aβ凝集阻害活性や神経細胞死の抑制活性を本発明に記載の方法で解析することで、当該医薬組成物の治療有効性を検出または予測することが可能となる。本発明のキットは、さらに、治療有効性の検出または予測に必要な要素、例えば、バッファー、酵素、基質、実験器具、説明書などを含有してもよい。
【０１７７】
また、本発明のキットは、併用療法に用いる医薬組成物に適した化合物をスクリーニングまたは同定するための方法に用いることができる。本発明のキットには、既知の化合物、例えば前述したドネペジルまたはその塩、メマンチン、タランパネルを含有させることができ、これらを標準薬としてスクリーニングまたは同定に用いることも可能である。本発明のキットは、さらに、スクリーニングまたは同定に必要な各試薬、説明書などを含有してもよい。
【０１７８】
また、本発明のキットは、本発明の併用療法、すなわち、併用療法によるAβに起因する疾患の治療に用いることができる。すなわち、本発明の医薬組成物と、ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有するキットは、Aβに起因する疾患の併用療法に用いることができる。また、本発明に使用する化合物類と、ChE阻害物質、NMDA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つとを含有する医薬組成物を含むキットも、Aβに起因する疾患の併用療法に用いることができる。本発明のキットをAβに起因する疾患の治療に用いる際の投与量、投与形態などは、上記９．併用療法の記載を参照できる。当該キットは、さらに、投与に必要な注射器、注射針、溶媒、カテーテル、説明書などを含有していてもよい。
【０１７９】
ここで、「Aβに起因する疾患」は、好ましくはアルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、軽度認知障害、老年性痴呆、ダウン症またはアミロイドーシス症である。
【０１８０】
また、本発明のキットの別の態様では、上記の態様における本発明に使用する化合物類に替えて、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類、すなわちAβ37もしくはAβ38、もしくはそれらの変異体、もしくはそれらのフラグメント、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物、もしくはそれらの組合せ、または、Aβ37もしくはAβ38をコードするポリヌクレオチド、もしくはそれらの相同体、もしくはそれらの塩、もしくはそれらの溶媒和物もしくはそれらの組合せを用いたキットが提供される。
【０１８１】
また、本発明のキットの別の態様では、上記の態様におけるChE阻害物質、前記NMDA受容体アンタゴニストおよび前記AMPA受容体アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つに替えて、本発明に使用するペプチド類または本発明に使用するポリヌクレオチド類を用いたキットが提供される。
【実施例】
【０１８２】
以下、さらに実施例、製造例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではなく、当業者への完全な開示を提供するために示すものである。また、記載されたこれら実験が全てまたは唯一行われた実験であることを意味または暗示するものでもない。ここで使用された数値（例えば、量、温度、濃度等）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮され、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
【０１８３】
[実施例１  円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）によるAβの解析]
（１）Aβのヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）処理
ヒト型Aβ1-42（ペプチド研究所、Prod.# 4349-v）、ヒト型Aβ1-40（ペプチド研究所、Prod.# 4307-v）、ヒト型Aβ1-38（SIGMA、A0189）またはヒト型Aβ1-37（ペプチド研究所、カスタム合成）をHFIP（SIGMA、H8508）に1mg/mLとなるように溶解し、その溶液を2時間4℃下震盪した。その後にその溶液を500μLポリプロピレン製マイクロチューブに10〜30μLずつ分注し、使用時までそれらを-80℃にて保存した。
【０１８４】
（２）石英セルの洗浄
光路長1mm（最大容量500μL）および2mm（最大容量1mL）の石英セル（日本分光）に2%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を満たし、それらを20分間超音波洗浄器内で洗浄した。その後石英セルの内部の液を廃棄して、再度セルに2%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を満たし、それらを20分間超音波洗浄器内で洗浄した。その後セル内部の液を廃棄して蒸留水でセル内部を洗浄した。続いてセルに水酸化ナトリウムの飽和溶液を満たし、それらを20分間超音波洗浄器内で洗浄した。その後セル内部の液を廃棄して蒸留水でセル内部を洗浄し、続いてメタノールでセル内部を洗浄した。最後にアセトンでセル内部を洗浄して室温で風乾した。
【０１８５】
（３）Aβの再溶解とインキュベーション
AβのHFIP溶液を濃縮遠心機（トミー精工、CC-180、およびST-10）を用いてHFIPを蒸発させた後、Aβを10ｍM HEPES、0.9% NaCl溶液に溶解した。溶解した各Aβ溶液は37℃にてインキュベートし、経時的にそれらのCD測定を行った。さらにAβ1-42の凝集能に対するAβ1-37、Aβ1-38またはAβ1-40の影響を検討する目的で、Aβ1-42と各Aβとを1:3（5μM：15μM）の比率で混合し、上記と同様に混合物のCD測定を行った。
【０１８６】
（４）標準溶液の測定
光路長10mmの円筒形石英セル（日本分光）に0.06% d-10-カンファースルホン酸アンモニウム（片山化学、Prod.#05-1251）水溶液を満たし、以下の条件下で測定を行った。CD測定機器は日本分光社製J720WIとした。
測定範囲：350〜220nm
データ間隔：1nm
走査速度：50nm/sec
積算回数：1回
レスポンス：2sec
バンド幅：1.0nm
感度：200meg
290nm付近を極大とする正規分布様の測定曲線を示すことを確認すれば、装置は正常に作動していると判断した。
【０１８７】
（５）CD測定
Aβを含む溶液を、洗浄後の光路長1mmまたは2mm石英セルに注入し、それらのCDを測定した。測定していない間は石英セルを37℃、100％湿度下で静置した。なおCDの測定は以下の条件で測定した。
測定範囲：260〜190nm
データ間隔：1nm
走査速度：50nm/sec
積算回数：2回
レスポンス：2sec
バンド幅：1.0nm
感度：100meg
【０１８８】
（６）結果
（６Ａ）各Aβの2次構造
各Aβ溶液を37℃にてインキュベーションしたときの、CD測定を経時的に行った。測定開始から溶解1日後までは全てのAβフラグメントはランダム構造をとっていると考えられるCDであった（図１A〜E）。ところが溶解2日後からAβ1-42のみがβ−シート構造を形成していると考えられるCDとして検出された（図１F）。その後溶解5日後までCDの測定を続けたが、Aβ1-42はβ−シート構造を形成したままと考えられるCDを示した（図１G〜I）。一方、その他のAβフラグメントは溶解5日後までランダム構造をとっていると考えられるCDを示した（図１A〜I）。即ち、Aβ1-37はAβ1-42よりもβ−シート構造をとりにくいことが示唆された。この性質はAβ1-38、Aβ1-40もAβ1-37と同様であった。
【０１８９】
（６Ｂ）Aβ1-42のβ−シート構造の形成に対する他のAβの作用
Aβ1-42の凝集能に対するAβ1-37、Aβ1-38またはAβ1-40の影響を検討した。Aβ1-42と各Aβとを1:3の比率で混合したときのCD測定を行った。
測定開始から8時間までは、全てのAβフラグメントはランダム構造をとっていると考えられるCDであった（図２A〜E）。インキュベーション開始1日後からAβ1-42+バッファーのみが、β−シート構造を形成していると考えられるCDとして検出された（図２F）。その後溶解3日後までCDの測定を続けたが、Aβ1-42+バッファーはβ−シート構造を形成したままと考えられるCDを示した（図２GおよびH）。またAβ1-40混合サンプルは溶解２日後にβ−シート構造を形成していると考えられるCDとして検出された（図２G）。これに対してAβ1-37混合サンプルでは溶解3日後にβ−シート構造を形成していると考えられるCDとして検出され（図２H）、Aβ1-37がAβ1-42のβ−シート構造の形成速度を遅らせる作用を持っていることが示唆された。この作用はAβ1-38でも同様であった（図２H）。この結果から、Aβ1-40の、Aβ1-42のβ−シート構造の形成を阻害する作用は、Aβ1-37やAβ1-38の当該作用よりも弱いことが示唆された。
【０１９０】
[実施例２  チオフラビンT（ThT）によるAβの凝集能の解析]
（１）Aβの凝集能の解析
前記実施例１と同様に調製した各ヒト型Aβ（Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-40またはAβ1-42）を各々10 mM HEPES、0.9% NaCl溶液に終濃度10 mMとなるように再溶解し、それらを37℃のCO2インキュベーター内で経時的にインキュベートした。各サンプルにThT（SIGMA）を終濃度10 μMで添加後、それらのサンプルを96穴黒色プレート（コーニング）に移し、それらを10秒間攪拌後、それぞれのサンプルの蛍光強度を測定した。測定は蛍光分光器（LJL Biosystems）を用い、励起光の波長を450nmとし、波長490nmの蛍光強度を測定した。次に、Aβ1-42の凝集能に対するAβ1-37、Aβ1-38またはAβ1-40の影響を検討するためにAβ1-42と各Aβとを1:3の比率で混合し、上記と同様にそれらのThTの蛍光強度を経時的に測定した。
【０１９１】
（２）結果
（２A）各Aβのβ−シート構造の形成
Aβ1-42は、インキュベーション時間に伴いThTの蛍光強度を増していく（図３A、■）のに対し、Aβ1-37（●）、Aβ1-38（▲）またはAβ1-40（□）では蛍光強度の増加は認められなかった。
（２Ｂ）Aβ1-42のβ−シート構造の形成に対する他のAβの作用
Aβ1-42とAβ1-37（●）、Aβ1-38（▲）またはAβ1-40（□）を1:3で混合した場合にはAβ1-42単独（■）に比較して蛍光強度の増加は抑制された（図３B）。その抑制の程度はAβ1-40の存在下に比較してAβ1-37またはAβ1-38の存在下で強い結果であった（図３C）。これらの結果はCDによるβ−シート構造の解析結果とよく相関していた。
【０１９２】
[実施例３  ラット胎仔海馬由来培養神経細胞におけるAβ（25μM）の細胞毒性]
（１）初代培養神経細胞の調製
胎生18日齢のWistar系ラット（Charles River Japan）より海馬を単離し培養に供した。具体的には、エーテル麻酔下、妊娠ラットより無菌的に胎仔を摘出した。その胎仔より脳を摘出し、それらを氷冷L-15培地（InvitrogenまたはSIGMA）に浸した。その摘出した脳から、実体顕微鏡下で海馬を採取した。採取した海馬断片を、0.25 %トリプシン（trypsin）（Invitrogen）および0.01 % DNase (SIGMA)を含有した酵素溶液中、37 ℃、30分間の酵素処理することにより、細胞を分散させた。この際、酵素反応は非働化済みウマ血清を加えることで停止させた。この酵素処理溶液を1500 回転／分にて5分間遠心分離し、その上清を除いた。得られた細胞塊に培地を5 〜 10 ml加えた。培地にはNeurobasal培地（Invitrogen Corp. Cat #21103-049, Carlsbad, CA USA）に、2% B-27 supplement(Invitrogen Corp. Cat #17504-044, Carlsbad, CA USA)と25 μM 2-mercaptoethanol（2-ME、WAKO. Cat #139-06861、Osaka、Japan)と0.5 mM L-glutamine（Invitrogen Corp. Cat #25030-081, Carlsbad, CA USA）およびAntibiotics―Antimycotics（Invitrogen Corp. Cat #15240-062, Carlsbad, CA USA）を添加したもの（Neurobasal/B27/2ME）を用いた。培地が加えられた細胞塊を、緩やかなピペッティング操作により細胞を再分散させた。この細胞分散液を、40 μmナイロンメッシュ（セルストレーナー、Becton Dickinson Labware）でろ過して細胞塊を除き、神経細胞懸濁液を得た。この神経細胞懸濁液を培地にて希釈し、96ウェルプレート（BIOCOAT（登録商標）、 Poly-D-lysine coated、Becton Dickinson Labware）に初期細胞密度、1.6×105 cells/ 100μl/ウェルにて播種した。播種した細胞は５％CO2、95％空気、37℃インキュベーター中にて１日培養した後、その培地全量を新鮮なNeurobasal/ B27/ 2MEと交換した。
【０１９３】
（２）Aβ添加とMTTアッセイ
各Aβ（Aβ1-37、Aβ1-40またはAβ1-42）を10mM NaOH溶液に100 μg/mlで溶解し、それらを5分後にリン酸緩衝液（Phosphate buffered saline (PBS)）で希釈して500 μＭに調製した。各サンプルを5％CO2、95％空気、37℃インキュベーター中にて3日間インキュベートした。培養5日目に培地交換とともに、各Aβを細胞に添加した。さらに48時間培養し、それらの細胞毒性をMTTアッセイによって測定した。培地を除去した後、それらに新鮮な温めた培地を100μl/ウェル加え、さらにD-PBS（Dulbecco's PBS、SIGMA）に溶解した8mg/ mlのThiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT; SIGMA)溶液を5μl/ウェル添加し、5％CO2、95％空気、37℃ インキュベーター中にて20分間インキュベートした。培地除去後、それらにDimethylsulfoxide (DMSO)を100 μl/ウェル加え、析出したMTTフォルマザン結晶をよく溶解させた後、550 nmの吸光度を測定した。対照群（Aβ処理しなかった群、CTRL）に対する比率（% of CTRL）を算出し、細胞生存活性を比較、評価した。
% of CTRL = ( A550_sample) / (A550_CTRL) x 100
(A550_sampleはサンプルウェルの550 nm吸光度を表し、A550_CTRLは対照群ウェルの550 nm吸光度を表す。)
【０１９４】
（３）結果
各Aβ（Aβ1-37、Aβ1-40またはAβ1-42）添加４８時間後にラット海馬由来神経細胞のMTT活性を測定した結果、Aβ1-37では対照群に比較して、差は認められなかった。Aβ1-40では10%程度の活性低下が認められ、Aβ1-42処理では25%程度のMTT活性の低下が認められた(図４)。各Aβは、C末側に長いほどAβの細胞毒性は強かった。Aβの細胞毒性は凝集状態（β−シート構造の含量）と関連すると考えられているが、このことは本実施例の結果でも確認することができた。すなわち、Aβ1-37はAβ1-42に比較して、β−シート構造を形成し難く、その結果、細胞毒性も弱いことが示された。
【０１９５】
[実施例４  化合物A
（Ｅ）−Ｎ−ビフェニル−３−イルメチル−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリルアミド（下記式）の合成]
【化１】
2008535776.tif 000003
【０１９６】
（３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒドおよび３−メトキシ−４−（５−メチルイミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒドの合成）
４−フルオロ−３−メトキシベンズアルデヒド（３．００ｇ）と４−メチルイミダゾール（３．３０７ｇ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（４．０５ｇ）を加え、反応液を１００℃で一晩攪拌した。得られた反応混合物を減圧下濃縮し、残渣に水および酢酸エチルを加え、有機層を分配した。有機層は飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン−酢酸エチル系）で精製し、３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒド（８５６ｍｇ）と３−メトキシ−４−（５−メチルイミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒド（４４ｍｇ）を得た。
【０１９７】
３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒドの物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：２．３１（ｓ，３Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），７．０２（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ）．
【０１９８】
３−メトキシ−４−（５−メチルイミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒドの物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：２．１０（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），６．９１（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５７−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），１０．０５（ｓ，１Ｈ）．
【０１９９】
（（Ｅ）−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリル酸の合成）
上記の方法で得られた３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒド（４．００ｇ）のテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）溶液に、ジエチルホスホノ酢酸エチルエステル（４．００ｍＬ）および水酸化リチウム一水和物（９３２ｍｇ）を順次加え、反応液を一晩攪拌した。原料の消失を確認後、反応液に２規定水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）とエタノール（５ｍＬ）を加え、その反応液を室温で一晩撹拌した。反応液を０℃に冷却し、反応液に２規定塩酸を（３０ｍＬ）を加え、その結果析出した沈殿物を桐山漏斗で濾取した。得られた沈殿物を水および酢酸エチルで洗浄し、（Ｅ）−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリル酸を４．６１ｇ得た。得られた化合物の物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ）．
【０２００】
（（Ｅ）−Ｎ−ビフェニル−３−イルメチル−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリルアミドの合成）
（Ｅ）−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリル酸（２．２０ｇ）のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）溶液に、３−フェニルベンジルアミン塩酸塩（２．３０ｇ）とジイソプロピルエチルアミン（４．５７ｍＬ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．９６ｇ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．３８ｇ）を順次加え、その反応液を室温で一晩攪拌した。原料の消失を確認した後、反応液に水および酢酸エチルを加え、有機層を分配した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル→酢酸エチル：エタノール＝１０：１）で精製し、（Ｅ）−Ｎ−ビフェニル−３−イルメチル−３−［３−メトキシ−４−（４−メチルイミダゾール−１−イル）フェニル］アクリルアミドを３．３０ｇ得た。得られた化合物の物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：７．７１（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ），７．５２−７．６０（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．３７（ｔｄ，Ｊ＝１．２，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｂｒｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｂｒｓ，Ｊ＝１Ｈ），４．６７（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ）．
【０２０１】
[実施例５  化合物B（CAS#501907-79-5）
Ｎ−｛［（４−クロロフェニル）アミノ］イミノメチル｝−Ｎ’−（４−シアノフェニル）ウレア（下記式）の合成]
【化２】
2008535776.tif 000004
【０２０２】
（Ｎ−（４−クロロフェニル）グアニジン  パラトルエンスルホン酸塩の合成）
４−クロロアニリン（５．０ｇ）とシアナミド（１．９１ｇ）およびパラトルエンスルホン酸１水和物（７．４５ｇ）のトルエン（６０ｍＬ）溶液を１２時間加熱還流した。反応液を室温まで放冷した後、反応液に氷水（３００ｍＬ）を加え、３０分間攪拌した。反応液中に析出した固形物を吸引濾取し、得られた固形物を終夜風乾することにより、Ｎ−（４−クロロフェニル）グアニジン  パラトルエンスルホン酸塩を１１．１ｇ得た。得られた化合物の物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ（ｐｐｍ）：２．２９（ｓ，３Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．３１−７．６２（ｍ，８Ｈ），９．４５−９．８４（ｂｒｓ，１Ｈ）．
【０２０３】
（Ｎ−[［（４−クロロフェニル）アミノ］イミノメチル]−Ｎ’−（４−シアノフェニル）ウレアの合成）
Ｎ−（４−クロロフェニル）グアニジン  パラトルエンスルホン酸塩（１．０ｇ）と４−シアノフェニル  イソシアネート（４２２ｍｇ）のアセトン（３０ｍＬ）溶液に、五規定水酸化ナトリウム水溶液（０．５６ｍＬ）を加え、その反応液を室温で４時間攪拌した。その後、反応液を濃縮し、反応液から析出した固形物を濾取した。得られた固形物を水（５０ｍＬ）およびエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、終夜風乾することにより、Ｎ−[［（４−クロロフェニル）アミノ］イミノメチル]−Ｎ’−（４−シアノフェニル）ウレアを８５０ｍｇ得た。得られた化合物の物性値は報告値（CAS #501907-79-5）と一致した。
【０２０４】
[実施例６  化合物C（CAS#670250-40-5）
５−｛２−｛３−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシメチル−２−オキソ−２−ピペリジン−１−イルエチル］ウレイド｝ピリジン−４−イルオキシ｝−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸  メチルアミド（下記式）の合成]
【化３】
2008535776.tif 000005
【０２０５】
（Ｎ１−メチル−５−（２−アミノ−４−ピリジル）オキシ−１Ｈ−インドールカルボキサミドの合成）
水素化ナトリウム（４０％ミネラルオイル含有、４３０ｍｇ）のＤＭＦ懸濁液に、窒素雰囲気下室温で、国際公開第０２／３２８７２号パンフレット記載の４−（１Ｈ−５−インドリルオキシ）−２−ピリジナミン（２．２５３ｇ、CAS #417722-11-3）を徐々に加えた。その反応液を１０分間室温で攪拌した後、氷水浴冷却し、その反応液にフェニル  Ｎ−メチルカルバメート（１．５８７ｇ）を加え、その反応液を室温まで昇温し、２時間攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、有機層を分配した。得られた有機層を水および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣を酢酸エチルから結晶化させ、析出した結晶を濾取し、通風乾燥することにより、Ｎ１−メチル−５−（２−アミノ−４−ピリジル）オキシ−１Ｈ−インドールカルボキサミド（２．１６３ｇ）を淡褐色結晶として得た。得られた化合物の物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：３．０９（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，３Ｈ），４．３６（ｍ，２Ｈ），５．４９（ｍ，１Ｈ），５．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．３０（ｄｄ，Ｊ＝６．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）．
【０２０６】
（フェニル  Ｎ−｛４−［１−（メチルアミン）カルボニル−１Ｈ−５−インドリロキシ］−２−ピリジル｝−Ｎ−（フェノキシカルボニル）カルバメートの合成）
Ｎ１−メチル−５−（２−アミノ−４−ピリジル）オキシ−１Ｈ−インドールカルボキサミド（２．０ｇ）のＴＨＦ（１４０ｍＬ）とＤＭＦ（１．４ｍＬ）の懸濁液にトリエチルアミン（２．２ｍＬ）を加えた。氷冷下、この反応液にクロロギ酸フェニル（１．８ｍＬ）を加え、その反応液を室温で１．５時間攪拌した。クロロギ酸フェニル（０．５ｍＬ）を追加し、さらにこの反応液を室温で３０分間攪拌した。反応液に酢酸エチルと飽和食塩水を加え、有機層を分配した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣にジエチルエーテルを加え、析出した結晶を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄後、通風乾燥することにより、フェニル  Ｎ−｛４−［１−（メチルアミン）カルボニル−１Ｈ−５−インドリロキシ］−２−ピリジル｝−Ｎ−（フェノキシカルボニル）カルバメート（３．３ｇ）を淡褐色結晶として得た。得られた化合物の物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ（ｐｐｍ）：３．３０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，３Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，Ｊ＝６．０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１５−７．１８（ｍ，４Ｈ），７．２７−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．４５（ｍ，５Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｑ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．４１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）．
【０２０７】
（５−｛２−｛３−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシメチル−２−オキソ−２−ピペリジン−１−イルエチル］ウレイド｝ピリジン−４−イルオキシ｝−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸  メチルアミドの合成）
（２Ｒ）−ベンジルオキシカルボニルアミノ−3−ヒドロキシプロピオン酸（１．９１ｇ）とＮ−メチルモルホリン（８０９ｍｇ）のＴＨＦ溶液に、−１５℃以下でクロロギ酸イソブチル（１．０９ｇ）を滴下し、その反応溶液を30分間攪拌した。その後、その反応液に−15℃以下でピロリジン（１．１３ｇ）を加え、その反応溶液を０℃で３０分間攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、有機層を分配した。得られた有機層を１規定塩酸および１規定水酸化ナトリウム水溶液および飽和重曹水さらに飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をメタノール（１５ｍＬ）とＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、その溶液に１０％パラジウム−カーボン（含水品、３００ｍｇ）を加え、その反応溶液を水素気流下、室温で９０分間攪拌した。反応完結後、反応液をセライト濾過し、濾液を減圧濃縮することにより、（２Ｒ）−アミノ−3−ヒドロキシ−１−（ピペリジン−1−イル）プロパン−1−オン（６８４ｍｇ）を無色油状物として得た。フェニル  Ｎ−｛４−［１−（メチルアミン）カルボニル−１Ｈ−５−インドリロキシ］−２−ピリジル｝−Ｎ−（フェノキシカルボニル）カルバメート（１５７ｍｇ）とトリエチルアミン（１．５ｍＬ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、（２Ｒ）−アミノ−3−ヒドロキシ−１−（ピペリジン−1−イル）プロパン−1−オン（２２８ｍｇ）を加えた。その反応溶液を室温で18時間攪拌した後、反応液に酢酸エチルと飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、有機層を分配した。得られた有機層を水および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル：メタノール＝５０：１）により精製し、酢酸エチル−ヘキサンの混合溶媒から結晶を析出させた。得られた結晶を濾取し、通風乾燥することにより、５−｛２−｛３−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシメチル−２−オキソ−２−ピペリジン−１−イルエチル］ウレイド｝ピリジン−４−イルオキシ｝−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸  メチルアミド（１０７ｍｇ）を白色結晶として得た。得られた化合物の物性値は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ（ｐｐｍ）：１．３６−１．６１（ｍ，６Ｈ），２．８５（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，３Ｈ），３．４０−３．５３（ｍ，６Ｈ），４．７６（ｍ，１Ｈ），４．９２（ｂｒｓ，１Ｈ），６．５４（ｄｄ，Ｊ＝６．０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１０−８．２６（ｍ，２Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），９．２１（ｓ，１Ｈ）．
【０２０８】
[実施例７  MALDI-TOF/MSによるラット初代培養神経細胞培養上清中のAβの解析]
（１）ラット初代神経細胞培養
前記実施例３と同様な方法により、胎生18日齢のWistar系ラットより大脳皮質由来の神経細胞を調製した。大脳皮質由来の神経細胞懸濁液は培地にて希釈し、予めpoly-D-lysineにてコーティングされた10cm径ポリスチレン製培養ディッシュ（BIOCOAT（登録商標） cell environments Poly-D-lysine cell culture dish、Becton Dickinson Labware）に初期細胞密度が3.5×105 cells/ cm2になるように15ml/ディッシュで播種した。播種した細胞は５％CO2、95％空気、37 ℃ インキュベーター中にて１日培養した後、それらの培地全量を新鮮なNeurobasal/ B27/ 2MEと交換し、引き続き3日間培養した。
【０２０９】
（２）化合物添加
培養4日目に、前述の実施例にて合成した試験化合物、すなわち化合物A、化合物B（CAS#501907-79-5）または化合物C（CAS#670250-40-5）の添加を以下のとおりに行った。培地全量を抜き取り、2-MEのみを添加しないNeurobasal/ B27/ 2ME（Neurobasal/ B27）を11ml/ dish加えた。Neurobasal/ B27にて最終濃度の100倍に希釈した試験化合物（化合物A、B、C）のDMSO溶液を110 μl/ dish添加し、よく混和した。最終DMSO濃度は1%以下とした。また対照群にはDMSOのみを添加した。
【０２１０】
（３）サンプリング
試験化合物添加後3日間培養し、培地全量を回収した。得られた培地はMALDI-TOF/MSサンプルとした。
【０２１１】
（４）細胞生存の評価
細胞生存は以下の方法でMTTアッセイにより評価した。培地回収後のディッシュに温めた培地を10ml/ dish加え、D-PBSに溶解した8mg/ mlのMTT溶液を500μl/ dish添加し、それらを5％CO2、95%空気、37℃ インキュベーター中にて20分間インキュベートした。培地除去後、それらにDMSOを10ml/ dish加え、MTTフォルマザン結晶をよく溶解させた後、それらの550 nmの吸光度を測定した。対照群（薬物処理しなかった群、CTRL）に対する比率（% of CTRL）を算出し、細胞生存活性を比較、評価した。
【０２１２】
（５）免疫沈降
サンプリングした培養上清を15mL遠心管に回収し、それらにプロテアーゼ阻害剤カクテルComplete（Roche Diagnostics GmbH）の25倍濃度液を400μL添加してそれらを4℃下、3,000回転／分、5分間遠心分離して細胞片を沈降させた。上清を別の15mL遠心管に移し、それらに内部標準物質として合成Aβ12-28（Bachem）を終濃度2nMとなるように加え、更にそれらに抗Aβモノクローナル抗体（クローン名4G8、Signet Laboratories, Inc）を5μg加えた。続いて4℃下で2%BSAを用いてブロッキングした5μLのProtein G plus Protein A Agarose（Oncogene Research Products）をTBS bufferで洗浄したものを加えた。さらにそれらに3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1- propanesulfonate (CHAPS; SIGMA )を終濃度1%となるように加え、それらを４℃下4〜8時間混合した。
【０２１３】
（６）MALDI-TOF/MS［Matrix-Associated Laser Desorption Ionization−Time of Flight/ Mass Spectrometry（マトリクス支援イオン化―飛行時間型質量分析）］
免疫沈降をしたAβフラグメントを吸着したProtein G plus Protein A Agaroseを、4℃下、3,000回転／分で5分間遠心分離して回収し、それらを1.5mLマイクロチューブに移した。Protein G plus Protein A Agaroseを500μLの140 mM NaCl, 0.1%N-Octyl Glucoside (NOG; Loche Diagnostics GmbH), 10 mM Tris-HCl, pH 8で2回、500μLのTris-HCl, 10 mM, pH 8で1回、続いて500μLのイオン交換水で1回洗浄した。イオン交換水での洗浄後にそれらから可能な限り液体を除き、5μLの0.2%NOG、2.4%トリフルオロ酢酸 (TFA; PIERCE)、48.7%アセトニトリル（HPLCグレード、和光純薬）でAβを溶出させた。これとは別に0.2% NOG 、0.1％TFA、33%アセトニトリルにα-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (CHCA; BRUKER DALTONICS)を飽和濃度で溶解し、これに質量標準物質としてヒトインシュリン（ペプチド研究所）、およびアンジオテンシンIII（ペプチド研究所）をそれぞれ終濃度167nM、および56nMとなるように加えてマトリクス溶液とした。Aβの各溶出液0.5μLとマトリクス溶液0.5μLを質量分析用サンプルプレートの同一地点に滴下し、それらを室温下自然乾燥させた。これを質量分析器Voyager DE（Applied Biosystems）で解析した。なお検出された質量全てについて、ヒトインシュリン、およびアンジオテンシンIIIの質量をそれぞれ5807.6、および931.1として補正した。また各サンプル間でのAβ検出強度の標準化は各サンプルで検出された内部標準Aβ12-28の強度を全て同じと仮定して行った。
【０２１４】
ラット型Aβ（配列番号１６および配列番号２２）はアミノ酸配列のうち、5番目（R→G）、10番目（Y→F）、13番目（H→R）のアミノ酸がヒト型Aβ（配列番号１２および配列番号１８）と異なり、Aβ1-Yに加えAβ11-Yが主要産生物であることが知られている（Yは32〜42の整数）（J. Neurochem. 71, 1920-1925, 1998 ）。
一方、ヒト型APPからの生成物としてAβ1-40が最もメジャーなピークとして観察され、マイナーなピークとしてAβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-42が検出されている（J. Biol. Chem. 271(50), 31894-31902, 1996）。このパターンは、本実施例においてラット初代培養神経細胞で観察されたパターン（Aβ1-YとAβ11-Yを同一のフラグメントとみなした場合）と酷似しており、さらにラット型のアミノ酸14番目以降の配列はヒト型と一致する。すなわち、γ-部位の切断に関して、ラット型Aβで得られた知見はヒト型Aβにも適応でき、このことは当業者であれば容易に判断できる。従って、本実施例におけるデータ解析は、Aβ1-Y、Aβ11-Yについて行った（Yは32〜42の整数）。
【０２１５】
（７）結果
マトリクス支援イオン化―飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MS）による化合物無添加の神経細胞培養上清中におけるAβ各フラグメントの結果は図５Aのように示され、分子量2421から4565までの部分を拡大表示したのが図５Bである。この結果についてそれぞれのピークの強さ（Intensity）が高さと面積で数値化される。試験化合物を添加した神経細胞培養上清中におけるMALDI-TOF/MSの結果も同様のフォーマットで出されるため、面積をそのピークの強さの値として扱い、内部標準であるAβ12-28の強さで標準化した後に比較した。試験化合物の各濃度における各Aβフラグメントの強度の変化を検討したものが図６A〜Cである。
【０２１６】
化合物A（図６A）
Aβ1-42またはAβ11-42の変化は検出できていないが、化合物Aの濃度依存的にAβ1-40またはAβ11-40の産生が阻害されていることが示された。一方で、Aβ1-37またはAβ11-37、およびAβ1-38またはAβ11-38の産生が化合物Aの濃度依存的に亢進していることが示された。
化合物B（CAS#501907-79-5）（図６B）
Aβ1-42またはAβ11-42の変化は検出できていないが、化合物Bの濃度依存的にAβ1-40またはAβ11-40の産生が阻害されていることが示された。一方で、Aβ1-37またはAβ11-37、およびAβ1-38またはAβ11-38の産生が化合物Bの濃度依存的に亢進していることが示された。
化合物C（CAS#670250-40-5）（図６C）
Aβ1-42またはAβ11-42の変化は検出できていないが、Aβ1-40またはAβ11-40の産生が阻害される傾向にあることが示された。一方で、Aβ1-37またはAβ11-37、およびAβ1-39またはAβ11-39の産生が化合物Cの濃度依存的に亢進していることが示された。
【０２１７】
[実施例８  ELISAによるラット初代培養神経細胞培養上清中のAβの定量]
（１）ELISA測定用サンプル
前記実施例７（３）で回収した培地の一部をELISA用サンプルとして使用した。前記サンプルは、Aβ42測定には希釈せずに、Aβ40測定にはELISAキット付属の希釈液にて5倍希釈して各ELISAに供した。
【０２１８】
（２）Aβ ELISA
AβのELISAは、免疫生物研究所（IBL Co., Ltd.）のHuman Amyloid beta （1-42） Assay Kit（#17711）、およびHuman Amyloid beta （1-40） Assay Kit（#17713）を用いた。方法は前記キット推奨のプロトコール（添付文書に記載の方法）にて行った。但し、Aβ検量線は、beta-amyloid peptide 1-42, ratおよびbeta-amyloid peptide 1-40, rat（Calbiochem. #171596[Aβ42]、171593[Aβ40]）を用いて作製した。結果は、対照群（薬物処理しなかった群、Control）の培地中Aβ濃度に対する百分率（% of Control）にて表示した。
【０２１９】
（３）結果
化合物A、BおよびCのいずれにおいても、濃度依存的にAβ40（□）およびAβ42（■）の産生が阻害されていることが示された（図７A〜C）。
【０２２０】
本明細書中で使用される専門用語は、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。
他に特に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用されうるが、好ましい方法および材料について以上の記載を参照できる。
本明細書中で言及された全ての出版物は、例えば、ここで記載された発明と関連して用いられた出版物中に記載される、細胞系、構築物および方法を記載および開示する目的で、その全体が本明細書中に参照として組み入れられ、あるいは、本発明の化合物同定方法、スクリーニング方法およびそれらの技術のための方法および組成物の開示に関して、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１Ａ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解直後（図１A）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。
【図１Ｂ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解１時間後（図１B）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。
【図１Ｃ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解３時間後（図１C）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。
【図１Ｄ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解４時間後（図１D）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。
【図１Ｅ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解１日後（図１E）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。溶解１日後ではいずれのAβもβ−シート構造を示さなかった（図１E）。
【図１Ｆ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解２日後（図１F）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。溶解２日後にAβ１-４２だけがβ−シート構造に特徴的な波形を示し（図１F）、溶解５日後まで安定であった（図１I）。
【図１Ｇ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解３日後（図１G）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。
【図１Ｈ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解４日後（図１H）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。
【図１Ｉ】Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０、Aβ１-４２（各１０μM）の円偏光二色性（Circular Dichroism : CD）測定結果。  縦軸は円偏光度、横軸は測定波長を示す。各Aβを１０ｍM HEPES、０.９％ NaCl溶液に溶解５日後（図１I）に得られたCDスペクトルである。波長220nm付近を極小とする波形がβ−シート構造を示す。溶解２日後にAβ１-４２だけがβ−シート構造に特徴的な波形を示し（図１F）、溶解５日後まで安定であった（図１I）。Aβ１-３７、Aβ１-３８およびAβ１-４０では５日後までβ−シート構造の形成は認められなかった（図１I）。
【図２Ａ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した直後（図２A）に得られたCDスペクトルである。
【図２Ｂ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した２時間後（図２B）に得られたCDスペクトルである。
【図２Ｃ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した４時間後（図２C）に得られたCDスペクトルである。
【図２Ｄ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した６時間後（図２D）に得られたCDスペクトルである。
【図２Ｅ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した８時間後（図２E）に得られたCDスペクトルである。８時間後まではすべてのAβはランダム構造をとっていると考えられた（図２E）。
【図２Ｆ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した１日後（図２F）に得られたCDスペクトルである。溶解１日後からAβ１-４２＋バッファーのみがβ−シート構造を示した（図２F）。
【図２Ｇ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した２日後（図２G）に得られたCDスペクトルである。Aβ１-４０混合サンプルでは２日後にβ−シート構造を示すCDスペクトルが検出された（図２G）。
【図２Ｈ】Aβ１-４２にAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合のCD測定結果。  ５μMのAβ１-４２と１５μMのAβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを混合した３日後（図２H）に得られたCDスペクトルである。Aβ１-３７またはAβ１-３８混合サンプルでは３日後にβ−シート構造を示すCDスペクトルが検出された（図２H）。特に、Aβ１-３７およびAβ１-３８は、Aβ１-４０に比較してAβ１-４２のβ−シート構造の形成を遅らせる作用が強いことが示唆された。
【図３Ａ】チオフラビンTの蛍光強度。  縦軸はチオフラビンT蛍光強度を示し、β−シート構造の含量を示す。横軸はインキュベーション時間を示す。（■）はAβ１-４２、（□）はAβ１-４０、（▲）はAβ１-３８、（●）はAβ１-３７を示す。Aβ１-４２はインキュベーション時間に伴いチオフラビンTの蛍光強度を増していくのに対し、Aβ１-３７、Aβ１-３８、Aβ１-４０では蛍光強度の増加は認められなかった。
【図３Ｂ】チオフラビンTの蛍光強度。  Aβ１-４２と、Aβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０とを１：３で混合した場合のチオフラビンTの蛍光強度を示す。縦軸は蛍光強度を示し、β−シート構造の含量を示す。横軸はインキュベーション時間を示す。（■）はAβ１-４２＋バッファー、（□）はAβ１-４２＋Aβ１-４０、（▲）はAβ１-４２＋Aβ１-３８、（●）はAβ１-４２＋Aβ１-３７を示す。
【図３Ｃ】チオフラビンTの蛍光強度。  図３Bのうち、蛍光強度0から6000000の部分を拡大したものである。Aβ１-４２単独に比較して、Aβ１-３７、Aβ１-３８またはAβ１-４０を混合した場合にはβ−シート構造の形成は抑制された。その抑制の程度はAβ１-４０に比較してAβ１-３７、Aβ１-３８で強い結果であった。これらの結果はCDによるβ−シート構造の解析結果とよく相関していた。
【図４】ラット胎仔海馬由来培養神経細胞におけるAβ（25μM）の細胞毒性。  縦軸はMTT活性を示し、対照群（Aβ非添加群）に対する百分率を示す。値が小さいほどMTT活性が低く、細胞毒性が強いことを示す。Aβ１-４２はMTT活性の低下を示したが、Aβ１-３７は示さなかった。
【図５Ａ】MALDI-TOF/MSによるラット初代培養神経細胞培養上清中のAβの解析結果。  MALDI-TOF/MSによる化合物無添加の神経細胞培養上清中におけるAβ各フラグメントの結果を示す。縦軸は強度、横軸は分子量を示す。なお検出された質量全てについて、標準物質として加えたヒトインシュリン、およびアンジオテンシンIIIの質量を、それぞれ5807.6、および931.1として補正した。また各サンプル間でのAβ検出強度の標準化は、各サンプルで検出された内部標準Aβ12-28の強度を全て同じと仮定して行った。
【図５Ｂ】MALDI-TOF/MSによるラット初代培養神経細胞培養上清中のAβの解析結果。  図５Aのうち、分子量2421から4565までの部分を拡大表示した。
【図６Ａ】各化合物のAβフラグメントに対する作用。図６A：化合物A  それぞれのピークのIntensity（強さ）を面積で数値化し、内部標準であるAβ12-28の強さで標準化した後に比較した。縦軸は各Aβフラグメントの強度を示し、それぞれのカラムは添加した試験化合物の濃度を示す。試験化合物の濃度依存的に、Aβ37の産生が亢進していることが示された。
【図６Ｂ】各化合物のAβフラグメントに対する作用。図６B：化合物B（CAS#501907-79-5）  それぞれのピークのIntensity（強さ）を面積で数値化し、内部標準であるAβ12-28の強さで標準化した後に比較した。縦軸は各Aβフラグメントの強度を示し、それぞれのカラムは添加した試験化合物の濃度を示す。試験化合物の濃度依存的に、Aβ37の産生が亢進していることが示された。
【図６Ｃ】各化合物のAβフラグメントに対する作用。図６C：化合物C（CAS#670250-40-5）  それぞれのピークのIntensity（強さ）を面積で数値化し、内部標準であるAβ12-28の強さで標準化した後に比較した。縦軸は各Aβフラグメントの強度を示し、それぞれのカラムは添加した試験化合物の濃度を示す。試験化合物の濃度依存的に、Aβ37の産生が亢進していることが示された。
【図７Ａ】ELISAによるラット初代培養神経細胞培養上清中のAβの定量結果。図７A：化合物A  縦軸は培地中のAβ濃度を対照群（薬物処理しなかった群）に対する百分率で示し、横軸は添加した試験化合物の濃度を示す。（□）はAβ40、（■）はAβ42を示す。試験化合物の濃度依存的に、Aβ40およびAβ42の産生が阻害されていることが示された。
【図７Ｂ】ELISAによるラット初代培養神経細胞培養上清中のAβの定量結果。図７B：化合物B（CAS#501907-79-5）  縦軸は培地中のAβ濃度を対照群（薬物処理しなかった群）に対する百分率で示し、横軸は添加した試験化合物の濃度を示す。（□）はAβ40、（■）はAβ42を示す。試験化合物の濃度依存的に、Aβ40およびAβ42の産生が阻害されていることが示された。
【図７Ｃ】ELISAによるラット初代培養神経細胞培養上清中のAβの定量結果。図７C：化合物C（CAS#670250-40-5）  縦軸は培地中のAβ濃度を対照群（薬物処理しなかった群）に対する百分率で示し、横軸は添加した試験化合物の濃度を示す。（□）はAβ40、（■）はAβ42を示す。試験化合物の濃度依存的に、Aβ40およびAβ42の産生が阻害されていることが示された。
【図１Ａ】
2008535776.tif 000006
【図１Ｂ】
2008535776.tif 000007
【図１Ｃ】
2008535776.tif 000008
【図１Ｄ】
2008535776.tif 000009
【図１Ｅ】
2008535776.tif 000010
【図１Ｆ】
2008535776.tif 000011
【図１Ｇ】
2008535776.tif 000012
【図１Ｈ】
2008535776.tif 000013
【図１Ｉ】
2008535776.tif 000014
【図２Ａ】
2008535776.tif 000015
【図２Ｂ】
2008535776.tif 000016
【図２Ｃ】
2008535776.tif 000017
【図２Ｄ】
2008535776.tif 000018
【図２Ｅ】
2008535776.tif 000019
【図２Ｆ】
2008535776.tif 000020
【図２Ｇ】
2008535776.tif 000021
【図２Ｈ】
2008535776.tif 000022
【図３Ａ】
2008535776.tif 000023
【図３Ｂ】
2008535776.tif 000024
【図３Ｃ】
2008535776.tif 000025
【図４】
2008535776.tif 000026
【図５Ａ】
2008535776.tif 000027
【図５Ｂ】
2008535776.tif 000028
【図６Ａ】
2008535776.tif 000029
【図６Ｂ】
2008535776.tif 000030
【図６Ｃ】
2008535776.tif 000031
【図７Ａ】
2008535776.tif 000032
【図７Ｂ】
2008535776.tif 000033
【図７Ｃ】
2008535776.tif 000034
【配列表】
2008535776000001.app
【国際調査報告】
2008535776.tif 000035
2008535776.tif 000036
2008535776.tif 000037
2008535776.tif 000038
2008535776.tif 000039
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2008535776.tif 000042