(57)【要約】【課題】異常細胞増殖が関わる適応症の治療において、また、ＤＮＡ損傷、又はＤＮＡ複製での障害に関する適応症の治療での化学増感剤及び放射線増感剤として有用な、チェックポイントキナーゼＣｈｋ１の阻害剤を提供すること。【解決手段】特定の構造式を有する置換尿素化合物。当該式において、Ｘ１は、ゼロ、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；Ｘ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；Ｙは、Ｏ若しくはＳであるか、又は＝Ｙは、共通の炭素原子に結合した２つの水素原子を表し；Ｗは、ヘテロアリール、アリール、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキル、又は、ヘテロアリール若しくはアリール基で置換されたＣ１−６アルキルであり、Ｒ６は、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ７、又はヘテロアリールである。【選択図】なし
2008505112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物：
【化１】
2008505112.tif 000028
式中、Ｘ１は、ゼロ、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｘ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｙは、Ｏ若しくはＳであるか、又は＝Ｙは、共通の炭素原子に結合した２つの水素原子を表し；
Ｗは、ヘテロアリール、アリール、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキル、及び、ヘテロアリール又はアリール基で置換されたＣ１−６アルキルからなる群より選択され、前記アリール基ＷはＲ２で表される置換基１〜４個で任意に置換され、前記ヘテロアリール基ＷはＲ５で表される置換基１〜４個で任意に置換され、前記ヘテロシクロアルキル及びシクロアルキル基ＷはＣ１−６アルキル置換基１又は２個で任意に置換され；
Ｒ１は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、及びアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、ハロ、任意に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ＣＯ２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）ＣＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＳＯ２ＮＲ３、Ｃ１−６アルキレンＯＲ３、及びＳＲ３からなる群より選択され；
Ｒ３は、ヒドロ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ＳＯ２Ｒ４、１以上のハロ、ヒドロキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、Ｎ（Ｒ４）２、及びＳＯ２Ｒ４で置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキレンアリール、Ｃ１−６アルキレンヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンＣ３−８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−６アルキレンＳＯ２アリール、任意に置換されたＣ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）２、ＯＣＦ３、Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）３＋、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル、及びＣＨ（Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）２）２からなる群より選択されるか、又は２つのＲ３基が一緒になって任意に置換された３〜８員環の脂肪族環を形成し；
Ｒ４は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンアリール、及びＳＯ２Ｃ１−６アルキルからなる群より選択されるか、又は２つのＲ４基が一緒になって任意に置換された３〜８員環を形成し；
Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ハロ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ１−６アルキレンアリール、Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、及び
【化２】
2008505112.tif 000029
からなる群より選択され；
Ｒ６は、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ７、又はヘテロアリールであり；
Ｒ７は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキレンアリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンヘテロアリール、及びアルコキシからなる群より選択され；
Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立して、ハロ、任意に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ＣＯ２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）ＣＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ８）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＳＯ２ＮＲ３、Ｃ１−３アルキレンＯＲ３、及びＳＲ３からなる群より選択され；
又は、その医薬上許容される塩、若しくはそのプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項２】
Ｘ１及びＸ２が−Ｎ（Ｈ）−であり；
ＹがＯ又はＳであり；
Ｗが、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子を少なくとも２つ有するヘテロアリールであり、当該環は、Ｃ１−６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、ＣＯ２Ｒ３、ＣＮ、及びハロからなる群より選択される１〜４個の置換基で任意に置換される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｗが、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、及びトリアジニルからなる群より選択され、任意に置換されたＣ１−６アルキル、アリール、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、及びハロからなる群より選択される１〜４個の置換基で任意に置換される、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｗが以下からなる群より選択される、請求項２記載の化合物。
【化３】
2008505112.tif 000030
【請求項５】
Ｗが以下からなる群より選択される、請求項２記載の化合物。
【化４】
2008505112.tif 000031
【請求項６】
Ｗがピラジニルである、請求項２記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ７がヘテロアリールである、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
ヘテロアリールがピリジルである、請求項７記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ６が以下からなる群より選択されるヘテロアリールである、請求項１記載の化合物。
【化５】
2008505112.tif 000032
【請求項１０】
ヘテロアリールがＣ１−３アルキレンＮ（Ｒ４）２で置換される、請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１記載の化合物、及び医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項１２】
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−３−イルエチニル−フェニル）−尿素、１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−３−イル−フェニル）−尿素、１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−４−イル−フェニル）−尿素、１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（２−オキサゾール−５−イル−フェニル）−尿素、１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−チアゾール−２−イル−フェニル）尿素、１−［２−（４−ジメチルアミノメチル−チアゾール−２−イル）−５−メチル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素、及びその混合物からなる群より選択される化合物。
【請求項１３】
細胞においてチェックポイントキナーゼ１を阻害する方法であって、
前記細胞を、請求項１記載の化合物の有効量と接触させる過程を含む方法。
【請求項１４】
ある病状について化学療法的又は放射線療法的処置を受ける個体において細胞を感作する方法であって、
前記個体に、化学療法剤、放射線療法剤、又はその混合と組み合わせて請求項１記載の化合物の治療上有効量を投与することを含む方法。
【請求項１５】
１以上のサイトカイン、リンフォカイン、成長因子、又は他の造血因子を投与することをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン又はそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、及びその混合物からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記放射線療法剤が、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光、赤外線、及びマイクロ波からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記症状が、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、外陰癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、腎細胞癌、卵巣癌、脳腫瘍、骨肉腫、及び肺癌からなる群より選択される癌である、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記症状が、粘液性及び円形細胞癌、局所的に進行した癌、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ行性転移、扁平上皮細胞癌、食道扁平上皮細胞癌、口腔癌、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、滲出液リンパ腫（体腔ベースのリンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質の癌、ＡＣＴＨ産生腫瘍、非小細胞癌、乳癌、小細胞癌、腺管癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸新生物に関連したポリープ、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、一次表在性膀胱腫瘍、膀胱の浸潤性移行細胞癌、筋肉浸潤性の膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、一次腹膜上皮性新生物、子宮頸癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部の癌、子宮癌、及び卵胞での固形癌、精巣癌、陰茎癌、腎細胞癌、内因性の脳腫瘍、神経芽腫、星状脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系での転移性腫瘍細胞浸潤、骨腫及び骨肉腫、悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌、甲状腺癌、網膜芽細胞腫、神経芽腫、腹水、悪性胸水、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆嚢癌、栄養膜腫瘍、血管周囲細胞腫、並びにカポジ肉腫からなる群より選択される癌である、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記処置が、関節リウマチ、乾癬、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、及び全身性紅斑性狼瘡からなる群より選択される炎症性症状のために投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
前記化学療法剤が、ゲムシタビン、ペメトレキセド、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、又はその混合物を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
異常細胞増殖を阻害する方法であって、
異常増殖細胞を含む細胞集団を、Ｃｈｋ１活性剤と接触させて前記異常増殖細胞中で細胞周期停止を実質的に同時に起こさせ、次いで、前記細胞集団を、請求項１記載の化合物と接触させて前記細胞周期停止を実質的に無効化することを含む方法。
【請求項２３】
前記Ｃｈｋ１活性剤が少なくとも１つの化学療法剤を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃｈｋ１活性剤が電離放射線又は紫外線を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記電離放射線が、放射線増感剤、光線感作物質、又はその混合と併用して投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記異常増殖細胞が非ガン性のものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
チェックポイントキナーゼ１を阻害する薬剤を製造するための、請求項１記載の化合物の使用。
【請求項２８】
ある病状について化学療法的又は放射線療法的処置を受ける個体において細胞を感作する薬剤を製造するための、請求項１記載の化合物の使用。
【請求項２９】
異常増殖細胞を含む細胞集団で異常細胞増殖を阻害する薬剤を製造するための、請求項１記載の化合物の使用。
【請求項３０】
チェックポイントキナーゼ１の阻害に治療上の利益がある症状の治療的又は予防的処置のための細胞での薬剤を製造するための、請求項１記載の化合物の使用。
【請求項３１】
以下を含むヒトの医薬用製品：
（ａ）請求項１記載の化合物を含む医薬組成物；
（ｂ）当該組成物が異常細胞増殖に関与する適応症の治療に有用である旨を通知する添付文書；及び、
（ｃ）任意の容器。
【請求項３２】
以下を含むヒトの医薬用製品：
（ａ）請求項１記載の化合物を含む医薬組成物；
（ｂ）当該組成物がＤＮＡ損傷又はＤＮＡ複製に関連する適応症の治療で化学増感剤又は放射線増感剤として有用である旨を通知する添付文書；及び、
（ｃ）任意の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件出願は、２００４年７月２日に出願された米国仮出願番号６０／５８５，２９２の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、遺伝物質の完全性を維持し修復する酵素の阻害に有用な化合物に関する。より具体的には、本発明は、一連のアリール−及びヘテロアリール−置換尿素化合物、当該化合物の製造方法、並びに、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）修復、染色体分離、又は細胞分裂での異常を特徴とするガン及び他の病状を治療する治療剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
広範な種類の病状、症状、及び障害（以下「適応症」という）は、異常な増殖細胞を伴っていることを特徴とする。ここで使用する「異常な増殖細胞」（又は「異常細胞増殖」）は、正常、適切、又は予想される経路から逸脱している細胞増殖を意味する。例えば、異常細胞増殖には、ＤＮＡ又は他の細胞成分が損傷し、又は欠陥が生じた場合の細胞の不適切な増殖が含まれる。また異常細胞増殖は、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルの細胞死（例えばアポトーシス）、若しくは双方に原因があるか、又はこれらに介在されるか、又はこれらをもたらす適応症を含む。そのような適応症は、例えば細胞、細胞群、又は組織の、単独又は複数の局所的異常増殖を特徴とすることができ、ガン性（良性又は悪性）及び非ガン性の適応症が含まれる。
【０００４】
本質的に、すべてのガン（良性又は悪性）はある種の異常細胞増殖を伴う。いくつかの非ガン性適応症も異常細胞増殖を伴う。異常細胞増殖を伴う非ガン性適応症の例としては、関節リウマチ、乾癬、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、及び全身性狼瘡が挙げられる。
【０００５】
異常細胞増殖を伴う適応症の治療に対する１つのアプローチとしては、ＤＮＡ損傷剤の使用が挙げられる。この剤はＤＮＡ代謝、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ転写、及び微小管紡錘糸の形成等の重要な細胞過程を阻害することで異常増殖をしている細胞を殺すように設計される。これはまた、例えば染色体の構造的完全性を混乱させるＤＮＡに障害を導入することによっても機能し得る。ＤＮＡ損傷剤は、正常で健康な細胞に対する最小限の損傷とともに、異常増殖細胞においては最大限の損傷、及びそれによる細胞死を誘導しようとするように設計され、投与される。
【０００６】
化学療法剤及び放射線を含む幅広い種類のＤＮＡ損傷剤がこれまで開発されてきており、開発中のものもある。残念ながら、異常細胞増殖を伴う病状の治療におけるＤＮＡ損傷剤の有効性は、特にガン治療において、期待されたほどのものではない。そのような剤の、正常細胞に対する異常増殖細胞の選択性（時に治療指数という）は不十分であることが多い。
【０００７】
さらに、すべての細胞は、ＤＮＡ損傷剤と相反する目的で作用し得る検出及び修復機構を有している。細胞周期チェックポイントと呼ばれるこのような検出機構は、多種の細胞複製過程の順序を維持し、各過程が確実に高度の正確さをもって実行されるようにする（Ｈａｒｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：６２９−３４（１９８９）；Ｗｅｉｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，８：６５２（１９９４））。ＤＮＡ損傷剤により意図的に誘導された損傷も含めてＤＮＡ損傷を細胞が検出すると、ある種のシグナル伝達経路が細胞周期チェックポイントを活性化し、細胞複製周期は一時的に中断する（停止する）。この停止は、時にその病的細胞が生存し続け増殖するのに十分な程度まで、それらのＤＮＡを修復する時間を細胞に与える。この修復は、異常増殖細胞の場合、そのような細胞を殺すのに十分な損傷をＤＮＡに誘導しようとする努力を台無しにする可能性があるので望ましくない。
【０００８】
例えば、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）又は２′，２′−ジフルオロ−２′−デオキシシチジン）と呼ばれる化学療法剤は、自身を合成中のＤＮＡに組み入れることでＤＮＡに損傷を与える。修復されずに残った損傷ＤＮＡは通常、生命の維持を不可能にする。しかしながら、多くの標的細胞では、細胞周期チェックポイントは不適切に作られた（又は損傷のある）ＤＮＡを検出する。活性化された細胞周期チェックポイントは、損傷のあるＤＮＡが修復されるのに十分な時間、細胞周期停止を引き起こす。これは、異常増殖細胞が、化学療法剤、放射線、及び他の療法等のＤＮＡ損傷剤の殺細胞効果に耐える理由を理論化したひとつである。
【０００９】
他のＤＮＡ損傷剤は腫瘍細胞をＳ期で停止させる。腫瘍細胞は、ある種の化学療法剤が投与されている間、単にＳ期で停止することによってその化学療法剤に耐えることが観察されている。その後、当該剤が除去されると直ちに、ＤＮＡ損傷は修復され、細胞周期停止は終了して、その細胞は残りの細胞周期を経過する（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：１０６５−１２，２００１）。他の療法はＧ１及びＧ２等の他のチェックポイントで細胞周期停止を引き起こす。したがって、種々のＤＮＡ損傷チェックポイントの阻害は、治療上で誘導されたＤＮＡ損傷の、細胞による修復を阻害するのに役立ち、標的細胞をＤＮＡ損傷剤に対して感作することが期待される。すなわちこのような感作は、これらの治療剤の治療指数を改善することが期待される。
【００１０】
細胞周期はすべての真核種で、その基本過程及び制御様式において構造的及び機能的に同一である。有糸分裂（体細胞）の細胞周期は４つの相：Ｇ１（ギャップ）相、Ｓ（合成）相、Ｇ２（ギャップ）相、及びＭ（有糸分裂）相からなる。Ｇ１、Ｓ及びＧ２相はあわせて、細胞周期の間期といわれている。Ｇ１相のあいだには、細胞の生合成活性は高速度で進行する。ＤＮＡ合成が始まるとＳ相が開始し、細胞の核中のＤＮＡが複製され、２つの同一セットの染色体が形成されると終了する。
【００１１】
細胞はその後、Ｇ２相に移行し、これは有糸分裂が始まるまで継続する。有糸分裂では、染色体は一組になり、２つの新しい核の形状に分離すると、細胞質分裂が起こって、その細胞は、各々が２組の染色体のひとつを含むひとつの核を受け取った２つの娘細胞に分裂する。細胞質分裂がＭ相を終結させ、次の細胞周期の間期が開始する印となる。細胞周期の事象が進行する順序は厳密に制御されており、ひとつの細胞周期事象の開始は、前の細胞周期事象の完了に依存している。これによって、一世代の体細胞から次世代への遺伝物質の複製及び分離における厳密性が確保されている。
【００１２】
細胞周期チェックポイントは、少なくとも３種類の異なるクラスのポリペプチドからなり、これらが染色体代謝における細胞周期シグナル又は欠陥に反応して連続的に作用することが報告されている（Ｃａｒｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：３１４−１５，１９９６）。第一のクラスは、ＤＮＡ損傷、又は細胞周期での異常を検出又は感知する一群のタンパク質である。これらセンサーは毛細血管拡張性運動失調症変異タンパク質（Ａｔｍ）、及び毛細血管拡張性運動失調症Ｒａｄ関連タンパク質（Ａｔｒ）を含む。第二のクラスのポリペプチドは、そのディテクターにより検出されたシグナルを増幅し伝達するもので、Ｒａｄ５３（Ａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：２４１６−８８，１９９４）、及びＣｈｋｌが例示される。第三のクラスのポリペプチドはｐ５３等の細胞周期エフェクターを含み、これらは細胞応答、例えば有糸分裂の停止及びアポトーシスを介在する。
【００１３】
細胞応答チェックポイントの機能に関する現在の理解の多くは、腫瘍由来細胞系の研究から生じたものである。多くの場合、腫瘍細胞は主要な細胞周期チェックポイントを喪失している（Ｈａｒｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１８２１−２８，１９９４）。細胞の新生状態への展開における主要な過程は、ｐ５３を含むものなどの細胞周期チェックポイント経路を不活性化する変異株の獲得であることが報告されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ  ８１：３２３−３０，１９９５；Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：３２３４−３１，１９９７）。これら細胞周期チェックポイントの喪失は、ＤＮＡ損傷にもかかわらず腫瘍細胞が複製されるのにつながる。
【００１４】
無傷の細胞周期チェックポイントを有する非ガン性の組織は通常、単一のチェックポイント経路の一時的な崩壊とは無関係である。しかしながら腫瘍細胞は、細胞周期の進行を制御する経路に欠陥を持つので、別のチェックポイントの摂動によってそれらが特にＤＮＡ損傷剤に敏感になる。例えば変異ｐ５３を含む腫瘍細胞は、Ｇ１ＤＮＡ損傷チェックポイントと、Ｇ２ＤＮＡ損傷チェックポイントを維持する能力との双方において欠陥がある（Ｂｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１４９７−５０１，１９９８）。Ｇ２チェックポイント又はＳ相チェックポイントの開始を標的とするチェックポイント阻害剤はさらに、これらの腫瘍細胞がＤＮＡ損傷を修復する能力を不能にすることが期待され、これによって放射線及び全身性化学療法双方の治療指数を改善する候補である（Ｇｅｓｎｅｒ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ａｔ  ＳＲＩ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｕｍｍｉｔ，Ｍａｒｃｈ  ２００３）。
【００１５】
ＤＮＡ損傷、又はＤＮＡ複製に対する何らかの妨害が存在すると、チェックポイントタンパク質Ａｔｍ及びＡｔｒは、細胞周期停止につながる単一の変換経路を開始する。Ａｔｍは、電離放射線に反応するＤＮＡ損傷チェックポイントにおいて役割を果たすことが示されている。Ａｔｒは、二重鎖ＤＮＡ切断、一本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす薬剤、及びＤＮＡ放射を阻害する剤によって促進される。
【００１６】
Ｃｈｋｌは、ＤＮＡ損傷チェックポイント信号変換経路でＡｔｍ及び／又はＡｔｒの下流に位置するタンパク質キナーゼである（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１４９７−５０１，１９９７；米国特許第６，２１８，１０９号）。哺乳類細胞では、Ｃｈｋｌは、電離放射線、紫外線（ＵＶ）光、及びヒドロキシ尿素等のＤＮＡ損傷を引き起こす剤に反応してリン酸化される（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２４：１４４８−５９，２０００）。このリン酸化は哺乳類細胞でＣｈｋｌを活性化するものであり、Ａｔｍ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８：２４９−５６，１９９９）、及びＡｔｒ（Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記）に依存している。さらにＣｈｋｌは、細胞周期制御で重要なものとして知られている遺伝子産物であるｗｅｅｌ（Ｏ′Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２６：５４５−５４，１９９７）、及びＰｄｓｌ（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：１１６６−１１，１９９９）の双方をリン酸化することが示されている。
【００１７】
これらの研究は、哺乳類Ｃｈｋｌが、Ｓ相での停止につながるＡｔｍ依存性ＤＮＡ損傷チェックポイントにおいて役割を果たしていることを証明する。Ｓ相の哺乳類細胞におけるＣｈｋｌの役割は最近になって解明され（Ｆｅｉｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５４：９１３−２３，２００１；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４７９５−８００，２００２；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８（２４）：２１７６７−７７３，２００３；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，３（３）：２４７−５８，２００３）、ＤＮＡ合成の完全性を観測する際のＣｈｋｌの役割が明らかにされた。ＣｈｋｌはサイクリンＡ／ｃｄｋ２活性を制御するＣｄｃ２５Ａをリン酸化することでＳ相停止を誘発する（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ，上記、及びＳｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。Ｃｈｋｌはまた、細胞がＧ２から有糸分裂に進展する際にサイクリン−Ｂ／ｃｄｃ２（Ｃｄｋｌとしても知られる）を正常に脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであるＣｄｃ２５Ｃをリン酸化して不活性化することでＧ２をも誘発する（Ｆｅｒｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１４９５−７，１９９７；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１８９３−９１，１９９８；及び、Ｂｌａｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，９：１−１０，１９９９）。双方の場合で、Ｃｄｋ活性の制御が細胞周期停止を誘導して、ＤＮＡ損傷又は複製しないＤＮＡの存在下で細胞が有糸分裂に移行するのを防止する。
【００１８】
別のクラスの細胞周期チェックポイント阻害剤はＧ１又はＧ２／Ｍ相のいずれかで動作する。ＵＣＮ−０１、又は７−ヒドロキシスタウロスポリンは元々、タンパク質キナーゼＣに対して初頭効果を持つ非特異性のキナーゼ阻害剤として単離されたが、最近、Ｃｈｋｌの活性を阻害してＧ２細胞周期チェックポイントを無効にすることが見出された（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。すなわちＵＣＮ−０１は非選択的なＣｈｋｌ阻害剤であるから、高用量では細胞に有毒である。低用量では、多くの細胞キナーゼを非特異的に阻害し、また、Ｇ１チェックポイントを阻害する（Ｔｅｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ，３：３５−４６，２００３）。
【００１９】
ＵＣＮ−０１は、放射線、抗ガン剤カンプトセシン（Ｔｅｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．上記）、及びゲムシタビン（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．上記）等のガン療法と併用して使用されているが、あまり成功していない。さらに、ＵＣＮ−０１は、膠芽腫細胞でのテモゾロマイド（ＴＭＺ）誘発ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）の効果を増強するのに使用されている（Ｈｉｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：５８４３−４９，２００１）。臨床では、ＵＣＮ−０１は、おそらくは治療スケジュールの欠陥や、特に主要な分子標的の同定の欠如のために、期待されるほど有効な化学療法剤ではない（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｕｐｄａｔｅｓ，６：１５−２６，２００３）。すなわちＭａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．は、培養非小細胞の肺ガン細胞株でのＵＣＮ−０１によるシスプラチンの細胞周期依存性増強を報告しているが、ＵＣＮ−０１に標的にされた主要な細胞周期チェックポイントを、特異性をもって特定はしていない（Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１（４）：３３７−４８，２００３）。
【００２０】
腫瘍細胞を、細胞周期に影響する化学療法剤を用いた治療に感作するための方策は他にもいくつか存在する。例えば２−アミノプリンの投与は、ミモシン誘導Ｇ１停止、又はヒドロキシ尿素誘導Ｓ相停止等の多細胞周期チェックポイント機構を無効にして、細胞が有糸分裂に移行してこれを通過するのを可能にする（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：２２１２−１６，１９９２）。カフェイン、メチルキサンチンはまた、Ｇ２チェックポイントを通じた発達に介在し、それによって細胞死を誘導することで、シスプラチン、電離放射線等のＤＮＡ損傷剤の細胞毒性を向上させるのにも使用されている（Ｂｒａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３：１３７１−８１，１９９７）。しかしながら、細胞周期停止を達成するのに使用されるカフェインの用量は臨床上許容されるレベルを超過し、実行可能な治療の選択肢ではない。加えて、Ｃｈｋｌキナーゼに対するアンチセンスのヌクレオチドがトポイソメラーゼ阻害剤ＢＮＰ１３５０への感度を向上させるのに使用されている（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９５：４３５−４４，２００２）が、アンチセンス処理及び遺伝子治療に関連する典型的な問題を明らかにしている。
【００２１】
Ｃｈｋｌ阻害剤に関しては、アリール及びヘテロアリール置換尿素化合物が米国特許出願第１０／０８７，７１５号、及び米国仮特許出願第６０／５８３，０８０及び６０／６０２，９６８号に開示され、ジアリール尿素化合物が米国特許公開第２００４／００１４７６５号、米国特許公開第２００３／１９９５１１号、米国特許公開第２００４／００１４７６５号、及びＷＯ０３／１０１４４４に記載され、メチルキサンチン及び関連化合物がＦａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１６４９−５４，１９９５に記載され、ウレイドチフェンがＷＯ０３／０２９２４１及びＷＯ０３／０２８７３１に記載され、Ｎ−ピロロピリジニルカルボキサミドがＷＯ０３／０２８７２４に記載され、アンチセンスＣｈｋｌオリゴヌクレオチドがＷＯ０１／５７２０６及び米国特許第６，２１１，１６４号に記載され、ＣｈｋｌレセプターアンタゴニストがＷＯ００／１６７８１に記載され、ヘテロ芳香族カルボキサミド誘導体がＷＯ０３／０３７８８６に記載され、アミノチオフェンがＷＯ０３／０２９２４２に記載され、（インダゾリル）ベンズイミダゾールがＷＯ０３／００４４８８に記載され、ベンズイミダゾールキノリノンが米国特許公開第２００４／００９２５３５号及びＷＯ０４／０１８４１９に記載され、複素環ヒドロキシイミノ−フルオレンがＷＯ０２／１６３２６に記載され、ｓｃｙｔｏｎｅｍｉｎ等のｓｃｙｔｏｎｅｍａｎ誘導体が米国特許第６，４９５，５８６号に記載され、ヘテロアリールベンズアミドがＷＯ０１／５３２７４に記載され、インダゾールがＷＯ０１／５３２６８に記載され、インドールカルボゾールが上記Ｔｅｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌに記載され、クロマン誘導体がＷＯ０２／０７０５１５に記載され、パウロン（ｐａｕｌｌｏｎｅ）がＳｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ：２９０９−１９，１９９９に記載され、インデノピラゾール（ｉｎｄｅｎｏｐｙｒａｚｏｌｅ）がＷＯ９９／１７７６９に記載され、フラボンがＳｅｄｌａｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，９：１１４３−６８，１９９６に記載され、セリン・トレオニンキナーゼのペプチドループのペプチド誘導体がＷＯ９８／５３０５０に記載され、オキシインドールがＷＯ０３／０５１８３８に記載され、ジアゼピノインドロン（ｄｉａｚｅｐｉｎｏｉｎｄｏｌｏｎｅ）がＷＯ０４／０６３１９８に記載され、ピリミジンがＷＯ０４／０４８３４３に記載され、尿素化合物がＷＯ０４／０１４８７６に記載され、ピロロカルバゾール、ベンゾフロイソインドール、及びアザシクロペンタフルオレンがＷＯ０３／０９１２５５に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
しかしながら当業界には、Ｃｈｋ１の有効かつ選択的な阻害剤に対する要望がいまだ存在する。本発明はこの要望及び他の要望を扱うものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、チェックポイントキナーゼＣｈｋ１の阻害剤に関する。本発明のＣｈｋ１阻害剤は、異常細胞増殖が関わる適応症の治療において、また、ＤＮＡ損傷、又はＤＮＡ複製での障害に関する適応症の治療での化学増感剤及び放射線増感剤として有用である。
【００２４】
したがって、本発明の一態様は、構造式（Ｉ）の化合物を提供することである。この化合物は、構造式（Ｉ）の化合物の有効量を、これを必要とする個体に投与する過程を含む、Ｃｈｋ１を阻害する方法において有用である。
【００２５】
式（Ｉ）の化合物は以下の構造式を有する：
【００２６】
【化６】
2008505112.tif 000003
式中、Ｘ１は、ゼロ、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｘ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｙは、Ｏ若しくはＳであるか、又は＝Ｙは、共通の炭素原子に結合した２つの水素原子を表し；
Ｗは、ヘテロアリール、アリール、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキル、及び、ヘテロアリール又はアリール基で置換されたＣ１−６アルキルからなる群より選択され、前記アリール基ＷはＲ２で表される置換基１〜４個で任意に置換され、前記ヘテロアリール基ＷはＲ５で表される置換基１〜４個で任意に置換され、前記ヘテロシクロアルキル及びシクロアルキル基ＷはＣ１−６アルキル置換基１又は２個で任意に置換され；
Ｒ１は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、及びアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、ハロ、任意に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ＣＯ２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）ＣＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＳＯ２ＮＲ３、Ｃ１−６アルキレンＯＲ３、及びＳＲ３からなる群より選択され；
Ｒ３は、ヒドロ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ＳＯ２Ｒ４、１以上のハロ、ヒドロキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、Ｎ（Ｒ４）２、及びＳＯ２Ｒ４で置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキレンアリール、Ｃ１−６アルキレンヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンＣ３−８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−６アルキレンＳＯ２アリール、任意に置換されたＣ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）２、ＯＣＦ３、Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）３＋、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル、及びＣＨ（Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）２）２からなる群より選択されるか、又は２つのＲ３基が一緒になって任意に置換された３〜８員環の脂肪族環を形成し；
Ｒ４は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンアリール、及びＳＯ２Ｃ１−６アルキルからなる群より選択されるか、又は２つのＲ４基が一緒になって任意に置換された３〜８員環を形成し；
Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ハロ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ１−６アルキレンアリール、Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、及び
【００２７】
【化７】
2008505112.tif 000004
からなる群より選択され；
Ｒ６は、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ７、又はヘテロアリールであり；
Ｒ７は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキレンアリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンヘテロアリール、アルコキシからなる群より選択され；
Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立して、ハロ、任意に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ＣＯ２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）ＣＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ８）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＳＯ２ＮＲ３、Ｃ１−３アルキレンＯＲ３、及びＳＲ３からなる群より選択され；
又は、その医薬上許容される塩、若しくはそのプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【００２８】
本発明の別の態様は、構造式（Ｉ）の化合物を１以上含む医薬用組成物、及び、イン・ビボ若しくはエクス・ビボでＣｈｋ１の阻害が治療上の利益を提供するか、又は研究上若しくは診断上の利点がある適応症の治療的処置における当該組成物の使用を提供することである。
【００２９】
本発明の更に別の態様は、ある適応症について化学療法的又は放射線療法的処置を受ける対象において細胞を感作する方法であって、当該個体に、化学療法剤、放射線療法剤、又は双方と組み合わせて構造式（Ｉ）の化合物を投与することからなる方法を提供することである。限定はしないがこの方法により処置される適応症はガンである。
【００３０】
本発明の別の態様は、異常細胞増殖を阻害又は予防する方法を提供することである。１つの実施形態における方法は、異常増殖細胞を含む細胞集団を、少なくとも１つのＣｈｋ１活性剤と、異常増殖細胞中で細胞周期停止を実質的に同時に起こさせるのに十分な量及び時間接触させることを含む。細胞集団中の細胞周期停止の実質的な同時化を達成する際には、細胞集団を、少なくとも１つのＣｈｋ１阻害剤と、細胞周期停止を実質的に無効化するのに十分な量及び時間接触させる。
【００３１】
本発明の別の態様は、以下を含むヒトの医薬用製品を提供することである：
（ａ）構造式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物；
（ｂ）当該組成物が異常細胞増殖に関与する適応症の治療に有用である旨を通知する添付文書；及び、任意に
（ｃ）容器。
【００３２】
本発明の別の態様は、以下を提供することである：
（ａ）構造式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物；
（ｂ）当該組成物がＤＮＡ損傷又はＤＮＡ複製に関連する適応症の治療で化学増感剤又は放射線増感剤として有用である旨を通知する添付文書；及び、任意に
（ｃ）容器。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のこれら態様及び他の態様は以下の詳細な説明より明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の化合物は構造式（Ｉ）を有する：
【００３５】
【化８】
2008505112.tif 000005
式中、Ｘ１は、ゼロ、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｘ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｙは、Ｏ若しくはＳであるか、又は＝Ｙは、共通の炭素原子に結合した２つの水素原子を表し；
Ｗは、ヘテロアリール、アリール、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキル、及び、ヘテロアリール又はアリール基で置換されたＣ１−６アルキルからなる群より選択され、前記アリール基ＷはＲ２で表される置換基１〜４個で任意に置換され、前記ヘテロアリール基ＷはＲ５で表される置換基１〜４個で任意に置換され、前記ヘテロシクロアルキル及びシクロアルキル基ＷはＣ１−６アルキル置換基１又は２個で任意に置換され；
Ｒ１は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、及びアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、ハロ、任意に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ＣＯ２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）ＣＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレンＳＯ２ＮＲ３、Ｃ１−６アルキレンＯＲ３、及びＳＲ３からなる群より選択され；
Ｒ３は、ヒドロ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ＳＯ２Ｒ４、１以上のハロ、ヒドロキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、Ｎ（Ｒ４）２、及びＳＯ２Ｒ４で置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキレンアリール、Ｃ１−６アルキレンヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンＣ３−８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−６アルキレンＳＯ２アリール、任意に置換されたＣ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）２、ＯＣＦ３、Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）３＋、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル、及びＣＨ（Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ４）２）２からなる群より選択されるか、又は２つのＲ３基が一緒になって任意に置換された３〜８員環の脂肪族環を形成し；
Ｒ４は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンアリール、及びＳＯ２Ｃ１−６アルキルからなる群より選択されるか、又は２つのＲ４基が一緒になって任意に置換された３〜８員環を形成し；
Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルキニル、アリール、ヘテロシクロアルキル、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ハロ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ１−６アルキレンアリール、Ｃ１−６アルキレンＮ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、及び
【００３６】
【化９】
2008505112.tif 000006
からなる群より選択され；
Ｒ６は、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ７、又はヘテロアリールであり；
Ｒ７は、ヒドロ、Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキレンアリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキレンヘテロアリール、アルコキシからなる群より選択され；
Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、独立して、ハロ、任意に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ＣＯ２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）ＣＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ８）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＳＯ２ＮＲ３、Ｃ１−３アルキレンＯＲ３、及びＳＲ３からなる群より選択され；
又は、その医薬上許容される塩、若しくはそのプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【００３７】
本発明の好ましい化合物は、Ｘ１及びＸ２が−Ｎ（Ｈ）−であり、
ＹがＯ又はＳであり、
Ｗが任意に置換されたヘテロアリールである場合の化合物である。ひとつの形態では、Ｗは、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子を少なくとも２つ有するヘテロアリールであり、当該ヘテロアリール環は、任意に置換されたＣ１−６アルキル、アリール、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、ＣＯ２Ｒ３、ＣＮ、及びハロからなる群より選択される１〜４個の置換基で任意に置換され、Ｒ３は上で定義したものである。
【００３８】
構造式（Ｉ）の他の好ましい化合物は、Ｗが、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、及びトリアジニルからなる群より選択され、Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、ＣＯ２Ｒ３、ＯＲ３、及びハロからなる群より選択される１〜４個の置換基で任意に置換される化合物である。
【００３９】
ある好ましい形態では、Ｗが以下からなる群より選択され：
【００４０】
【化１０】
2008505112.tif 000007
Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ３、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、及びハロからなる群より選択される１〜４個の置換基で任意に置換される。
【００４１】
より好ましい形態では、Ｗは以下のものである。
【００４２】
【化１１】
2008505112.tif 000008
最も好ましい形態では、Ｗはピラジニルであり、Ｘ１及びＸ２は各々Ｎ（Ｈ）である。
【００４３】
更に別の好ましい形態では、Ｒ６は、以下からなる群より選択されるヘテロアリールであり：
【００４４】
【化１２】
2008505112.tif 000009
【００４５】
【化１３】
2008505112.tif 000010
任意にＣ１−３アルキレンＮ（Ｒ４）２で置換される。
【００４６】
ここで使用されるように、用語「アルキル」は、示した数の炭素原子を含有する直鎖状及び分枝状炭化水素基、典型的にはメチル、エチル、並びに直鎖状及び分枝状のプロピル及びブチル基を意味する。特記のない限り、炭化水素基は２０個までの炭素原子を含有し得る。
【００４７】
用語「アルキル」は、「橋かけアルキル」、すなわちＣ６−Ｃ１６二環式又は多環式炭化水素基、例えばノルボニル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．２］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、又はデカヒドロナフチルを含む。アルキル基は、例えばヒドロキシ（ＯＨ）、ハロ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ（Ｎ（Ｒ３）２）、及びスルホニル（ＳＯ２Ｒ３）（ここでＲ３は上で定義したものである）で任意に置換されてもよい。
【００４８】
用語「シクロアルキル」は、環状Ｃ３−８炭化水素基、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロヘプチル、又はシクロペンチルを意味する。「ヘテロシクロアルキル」は、その環が、酸素、窒素、及び硫黄からなる群より独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含むこと以外はシクロアルキルと同様に定義される。シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基は、例えばＣ１−４アルキル、Ｃ１−３アルキレンＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨ２、オキソ（＝０）、アリール、トリフルオロエタノイル、及びＯＨからなる群より独立して選択される１〜３個の基で任意に置換された飽和又は部分的に不飽和の環系であってよい。ヘテロシクロアルキル基は、任意に、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−３アルキレンアリール、又はＣ１−３アルキレンヘテロアリールでさらにＮ−置換されてもよい。
【００４９】
用語「アルケニル」は、当該基が炭素−炭素二重結合を含有すること以外は「アルキル」と等しく定義される。
【００５０】
用語「アルキニル」は、当該基が炭素−炭素三重結合を含有すること以外は「アルキル」と等しく定義される。
【００５１】
用語「アルキレン」は、置換基を有するアルキル基を意味する。例えば、用語「Ｃ１−６アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＯＲ」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基で置換された１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を意味する。このアルキレン基は、任意のアルキル置換基として先に掲示した置換基の１個以上で任意に置換される。
【００５２】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、及びヨウ素を意味する。
【００５３】
用語「アリール」は、単独又は組合わせで、単環又は多環式の芳香族基、好ましくは単環又は二環式の芳香族基、例えばフェニル又はナフチルを意味する。特記のない限り、アリール基は非置換でもよいし、あるいは、例えばハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、ＣＯ２Ｒ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）ＣＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ３、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキレンＳＯ２ＮＲ３、Ｃ１−３アルキレンＯＲ１、及びＳＲ３（ここでＲ１とＲ３は上で定義したものである）からなる群より独立して選択される基１個以上、特に１〜４個で置換されてもよい。アリール基の例としては、限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、クロロフェニル、メチルフェニル、メトキシフェニル、トリフルオロメチルフェニル、ニトロフェニル、２，４−メトキシクロロフェニル等が挙げられる。用語「アリールＣ１−３アルキル」及び「ヘテロアリールＣ１−３アルキル」は、Ｃ１−３アルキル置換基を有するアリール又はヘテロアリール基を意味する。
【００５４】
用語「ヘテロアリール」は、１又は２個の芳香族環を含み、かつ芳香族環に少なくとも１つの窒素、酸素、又は硫黄原子を含む単環式又は二環式の環システムを意味する。特記のない限り、ヘテロアリール基は非置換でもよいし、あるいは、例えばＣ１−６アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＦ３、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、ＣＯ２Ｒ２、Ｎ（Ｒ３）２、ＯＲ３、及びハロ（ここでＲ３は上で定義したものである）から選択される置換基１個以上、特に１〜４個で置換されてもよい。ヘテロアリール基の例としては、限定されないが、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノリル、インドリル、トリアジニル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、イミジゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、及びチアジアゾリルが挙げられる。
【００５５】
用語「ヒドロ」は−Ｈである。
【００５６】
用語「ヒドロキシ」は−ＯＨである。
【００５７】
用語「ニトロ」は−ＮＯ２である。
【００５８】
用語「シアノ」は−ＣＮである。
【００５９】
用語「イソシアノ」は−ＮＣである。
【００６０】
用語「トリフルオロメトキシ」は−ＯＣＦ３である。
【００６１】
用語「アジド」は−Ｎ３である。
【００６２】
用語「３〜８員環」は、限定されないが、アリール基について上で例示した基１以上、特に１〜３個で任意に置換された、モルホリニル、ピペリジニル、フェニル、チオフェニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピリミジニル、及びピリジニル等の、炭素環式及びヘテロ環式の脂肪族又は芳香族基を意味する。炭化水素含有部分の炭素原子量は、当該部分中の炭素原子の最小及び最大数を指定した下付き文字によって示され、例えば「Ｃ１−６アルキル」は１から６個以下の炭素原子を有するアルキル基を意味する。
【００６３】
ここでその構造において、置換基を欠いた結合に関して、その置換基はメチルであり、例えば
【００６４】
【化１４】
2008505112.tif 000011
環上の炭素原子に結合した置換基が示されていない場合には、その炭素原子は水素原子を適切な個数含むものと解される。さらに、例えばカルボニル基又は窒素原子に結合した置換基が示されていない場合には、その置換基は水素原子であると解され、例えば
【００６５】
【化１５】
2008505112.tif 000012
略号「Ｍｅ」はメチルである。略号ＣＯ及びＣ（Ｏ）はカルボニル（Ｃ＝Ｏ）である。
【００６６】
表記Ｎ（Ｒｘ）（ここでＸはアルファベット文字又は数字を表し、例えばＲａ、Ｒｂ、Ｒ３、Ｒ４等）は２つのＲｘ基が共通の窒素原子に結合しているのを表示するのに使用される。このような表記で使用される際、Ｒｘ基は同一でも異なってもよく、Ｒｘ基によって定義される基から選択される。
【００６７】
一般に細胞周期チェックポイントを活性化するＤＮＡ損傷剤は、ここで「チェックポイント活性剤」として言及する。「Ｃｈｋ１」と呼ばれるチェックポイントを活性化するＤＮＡ損傷剤は、ここで「Ｃｈｋ１活性剤」として言及する。同様に、そのようなチェックポイントの阻害剤はここで、それぞれ「チェックポイント阻害剤」及び「Ｃｈｋ１阻害剤」として言及する。
【００６８】
ここで使用されるように、Ｃｈｋ１阻害剤は、Ｃｈｋ１タンパク質の細胞周期チェックポイント活性を少なくとも部分的に無効にすることが可能な化合物である。細胞が停止時の細胞周期相から、細胞周期の次の相に通過するのが可能になるか、又は細胞が直接細胞死に移るのが可能になるよう十分に、細胞チェックポイント機構が克服されると、細胞周期チェックポイントの無効が達成される。細胞周期チェックポイントが無効になると、細胞が損傷又は欠陥を次の細胞周期相に持ち込むようになり、これによって細胞死が誘導又は促進される。細胞死はアポトーシスや有糸分裂崩壊など、いかなる関連機構によっても起こり得る。本発明の化合物はＣｈｋ１阻害剤である。
【００６９】
Ｃｈｋ１活性剤はＣｈｋ１キナーゼ活性を賦活する能力を有する公知の、又は後に発見されるあらゆる剤を含み、少なくとも部分的な細胞周期停止を誘導するものである。Ｃｈｋ１活性剤は細胞周期のあらゆる相で細胞周期を停止する能力がある剤を含み、ここでは、その相を、当該活性剤についての「標的相」として言及することがある。標的相は有糸分裂以外のあらゆる細胞周期相、すなわちＧ１相、Ｓ相、及びＧ２相を含む。本発明で有用なＣｈｋ１活性剤は、化学療法剤及び／又は放射線等のＤＮＡ損傷剤を含む。放射線Ｃｈｋ１活性剤は限定されないが、電離放射線を含む。電離放射線は、物質と相互作用することでイオン対を生み出すことができる電磁放射線又は微粒子放射線を含む。電離放射線は、Ｘ及びガンマ線、アルファ及びベータ粒子、中性子、及び荷電核を含む。放射線は、紫外光、可視光、赤外線、マイクロ波放射、及びこれらの混合を含む。実施例９で記載したような分析は、ある剤がＣｈｋ１活性剤であるか否かを決定するのに使用できる。
【００７０】
「異常細胞増殖の阻害」は、異常増殖細胞の増殖速度を遅らせること、又はそのような増殖を完全に除去することを意味する。この阻害は複製速度の減少、細胞死の速度向上、又は双方の結果として起こり得る。細胞死はアポトーシスや有糸分裂崩壊など、いかなる機構でも起こり得る。
【００７１】
「異常細胞増殖の抑制」は、異常細胞増殖を生起する前に阻害すること、又はその再発を阻害することを意味する。
【００７２】
「イン・ビボ」は動物またはヒト内のように、生きた対象内を意味する。この意味で、剤はイン・ビボで治療上用いて、異常に複製する細胞の増殖を遅らせ、又は排除することができる。その剤はイン・ビボで予防剤として用いて、異常な細胞増殖、又はそれに伴う兆候の発現を予防することもできる。
【００７３】
「エクス・ビボ」は生きた対象外を意味する。エクス・ビボ細胞集団の例は、ヒト又は動物由来の流体又は組織試料等の、細胞株及び生物学的試料を含む。そのような試料は当該分野で周知の方法によって得ることができる。生物学的流体試料の例としては血液、脳脊髄液、尿、及び唾液が挙げられる。組織試料の例としては腫瘍及びそのバイオプシーが挙げられる。この意味で、本発明の化合物は治療及び実験双方で多数の用途が見出され得る。
【００７４】
「放射線増感剤」は、電磁放射線に対する細胞の感度を向上させるか、又は電磁放射線で治療可能な病気の治療を促進するために、ヒト又は他の動物に治療上有効量で投与される化合物を意味する。
【００７５】
「放射線」は限定されないが、波長が１０−２０〜１００メートルの放射線を含む。
【００７６】
用語「容器」は、医薬製品の貯蔵、出荷、分注、及び／又は取り扱いに適したそのためのあらゆる容器を意味する。
【００７７】
用語「添付文書」は、医師、薬剤師、又は患者がその製品の使用に関して情報を得た上で意志決定をできるように必要な安全性及び効力のデータと共に、その製品の投与方法の説明がなされている、その製品に添付された情報を意味する。当該添付文書は一般に、その製品についての「ラベル」とみなされる。
【００７８】
本発明の化合物は、構造式（Ｉ）の化合物の全ての可能な立体異性体及び幾何異性体を含む。本発明はラセミ化合物のみならず、同様に光学活性な異性体も含む。構造式（Ｉ）の化合物が単一のエナンチオマーとして望まれる場合、最終生成物の分割によって、又は異性体的に純粋な出発物質、若しくはキラル補助試薬の使用からの立体特異的合成法によって得ることができる。例えば、Ma et al.,Tetrahedron:Asymmetry,8(6),pages 883-88,1997を参照。最終生成物、中間体、又は出発物質の分割は、当該分野で公知のいずれかの適当な方法によって達成することができる。さらに、構造式（Ｉ）の化合物の互変異性体があり得る状況では、本発明は当該化合物の全ての互変異性型を含むことを意図する。後で証明するが、特定の立体異性体は、化学療法又は放射線療法による処置との組み合わせでＣｈｋ１を阻害するきわめてすぐれた能力を発揮する。
【００７９】
構造式（Ｉ）の化合物のプロドラッグも、本発明の方法における化合物として使用することができる。ある化合物を製剤及び／又は投与に適した形態に誘導体化し、イン・ビボで薬剤として放出されるというプロドラッグ法は十分に確立しており、その化合物の物理化学的性質を一時的に（例えば生体可逆的に）変更するのに首尾よく使用されている（H.Bundgaard,Ed.,"Design of Prodrugs,"Elsevier,Amsterdam,1985;Silverman,"The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action,"Academic Press,San Diego,chapter8,1992;Hillgren et al.,Med.Res.Rev.,15,83,1995を参照）。
【００８０】
本発明の化合物は１以上の官能基を有してもよい。当該官能基は、所望又は必要により、プロドラッグを提供するのに改変されてもよい。適切なプロドラッグは例えば、アミド及びエステル等の酸誘導体を含む。当業者には、Ｎ−オキシドがプロドラッグとして使用できることも理解される。
【００８１】
本発明の化合物は塩として存在してもよい。本発明の化合物の医薬上許容される塩は一般に、本発明の方法において好まれる。ここで使用する用語「医薬上許容される塩」は、構造式（Ｉ）の化合物の塩又は両性イオン型を意味する。構造式（Ｉ）の化合物の塩は、その化合物の最終的な単離及び精製で、又は、適切なカチオンを持つ酸と当該化合物を別途反応させることで製造することができる。適当な医薬上許容されるカチオンは、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）、及びアルカリ土類金属（例えば、カルシウム又はマグネシウム）カチオンを含む。加えて、塩基性中心を含有する構造式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される塩は、医薬上許容される酸と形成した酸付加塩である。医薬上許容される塩を形成するのに使用可能な酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸等の無機酸、並びにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、マロン酸及びクエン酸等の有機酸を含む。本発明の化合物の塩の例は限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、リン酸塩、水素リン酸塩、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、二グルコン酸塩、グリセロールリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、メシレンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルタミン酸塩、二炭酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、及びｐ−トルエンスルホン酸塩を含む。加えて、本発明の化合物に存在する利用可能なアミノ基は、メチル、エチル、プロピル、及びブチルクロライド、ブロマイド、及びイオダイド；ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミルスルフェート；デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステリルクルライド、ブロマイド、及びイオダイド；並びにベンジル及びフェネチルブロマイドで四級化されてもよい。以上に照らして、本明細書中に現れる本発明の化合物へのいずれの言及も、構造式（Ｉ）の化合物のほか、その医薬上許容される塩、溶媒和物、又はプロドラッグを含むことを意図する。
【００８２】
本発明の化合物は治療において純粋な化学物質として投与することができるが、該化合物は、医薬組成物又は製剤として投与するのが有用であろう。従って、本発明は、構造式（Ｉ）の化合物とともに、医薬上許容される希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。また、構造式（Ｉ）の化合物を、医薬上許容される希釈剤又は担体と混合することからなる、医薬組成物の製造方法も提供される。
【００８３】
したがって、本発明はさらに、構造式（Ｉ）の化合物、又はその医薬上許容される塩、プロドラッグ、又は溶媒和物と、１以上の医薬上許容される担体、及び、任意に他の治療及び／又は予防成分とを含む医薬製剤も提供する。前記担体は、製剤の他の成分と適合しており、かつその受容者に有害でないという意味で「許容される」。そのような担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,11th Ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA(1985)で見出すことができる。
【００８４】
本発明の化合物はＣｈｋ１に対して良好な効力を発揮する。効力は、典型的には、ある結果を達成するのに必要な化合物の濃度として表される。効力が大きくなると、その目的の作用を果たすのに必要な化合物は少なくなる。イン・ビトロ効力は、典型的には、ＩＣ５０値換算で表され、用量−応答アッセイを用いて測定される。ＩＣ５０値は、効果が全く観察されない、又は最小の効果が観察される濃度から、部分的効果が観察されるより高い濃度を経て、最大効果が観察される飽和濃度に至るまでの濃度範囲にわたって、対象化合物を感受性アッセイ系と接触させることによって測定することができる。理論的には、阻害剤化合物の用量−応答効果のそのようなアッセイは、ｌｏｇスケールにプロットした場合に濃度の関数として阻害の程度を表すシグモイド曲線として記載することができる。また、該曲線は、理論的には、チェックポイント酵素の活性を、アッセイで観察された最小と最大の酵素活性の差異の５０％のレベルまで低下させるのに十分な濃度のポイントを通過する。この濃度は、５０％阻害での阻害濃度、又はＩＣ５０値と定義される。
【００８５】
ＩＣ５０値は、当業者に周知の慣用的生化学（無細胞）アッセイ技術または細胞ベースのアッセイ技術を用いて決定することができる。そのようなアッセイの例は後に実施例１で提供する。
【００８６】
好ましくは、ＩＣ５０値は関連アッセイを少なくとも２回行うことによって得られ、そのＩＣ５０値は、得られた個々の値の平均（相加平均、又は「平均」）として表される。より好ましくは、アッセイは３ないし１０（又はそれ以上）回反復され、ＩＣ５０値は得られた値の平均として表される。最も好ましくは、アッセイは、当業者に知られた統計学的方法を用い統計学的に信頼性がある平均ＩＣ５０値を生じるのに十分な回数行われる。
【００８７】
本発明の化合物は以下の実施例１で記載するように評価すると、約５μＭ未満で、約０．１ｎＭまでのＩＣ５０値を示す。いくつかの形態では化合物は約５５０ｎＭ以下のＩＣ５０値を示し、別の形態では約２５０ｎＭ未満を示し、約２００ｎＭ未満の場合もあるし、約１５０ｎＭ未満の場合もあるし、約１００ｎＭ未満の場合もあるし、約ｎＭ未満の場合もあるし、約７５ｎＭ未満の場合もあるし、約５０ｎＭ未満の場合もあるし、約２５ｎＭ未満の場合もある。好ましい形態では、他のタンパク質キナーゼを超えてＣｈｋ１を阻害する選択性を発揮する。選択性は有害な副作用を低減し、及び／又は治療指数を改善するのに好適であり得る。
【００８８】
ここでは「選択性」は「倍の選択性」として表現される。一般に、ここで使用する「倍の選択性」は、コンパレータ酵素のＩＣ５０値で除した、比較酵素についての試験化合物のＩＣ５０値である。特に、ここで使用するＣｈｋ１阻害剤についての倍の選択性は、コンパレータ酵素についてのＩＣ５０値で除した、Ｃｈｋ１（比較酵素）についてのＣｈｋ１阻害剤（試験化合物）のＩＣ５０値である。本発明の化合物の測定対象となり得るコンパレータ酵素は、少なくとも以下のタンパク質キナーゼを含む：Ｃｄｃ２、Ｃｈｋ２、ＣＴＡＫ、ＥｐｈＡｌ、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｋｌ、ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ４、ＩＲ、ＪＮＫｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８アルファ、ｐ３８ベータ、ｐ３８デルタ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｒｓｋ２、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ−１、ｐ３８ＭａｐＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、カルシウムカルモデュリン依存性キナーゼＩＩ、及びａｂ１チロシンキナーゼ。コンパレータ酵素に対する試験化合物についてのＩＣ５０値を測定するアッセイは実施例２で記載されており、当業者に周知のものである。好ましい本発明の化合物は、上述した試験タンパク質キナーゼに対して少なくとも約２０倍の選択性を発揮する。
【００８９】
本発明での使用に適切な化合物及び医薬組成物は、その所期の目的を達成するのに有効な量で有効成分を投与する場合を含む。より具体的には、「治療上有効な量」は、ある適応症を患う個体を治療し、又はその適応症の現症状を軽減するのに十分な量を意味する。治療上有効な量の決定は、特にここで提供した詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内のものである。
【００９０】
Ｃｈｋ１阻害剤に加えて、本発明の医薬組成物は、その医薬組成物の単独投与によって生起する、又はこれに関連する可能性がある有害な副作用を軽減するために、サイトカイン、リンフォカイン、成長因子、他の造血因子、又はこれらの混合物を含むよう処方されてもよい。あるいは、このように生物学的活性剤は、所望の治療効果を促進するために本発明の医薬組成物に含まれてもよい。本発明の医薬組成物で有用なアジュバント生物学的活性医薬組成物には、限定されないが、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−Ｉｌ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、エリスロポエチン、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、及び／又はヒトアンジオポイエチン様ポリペプチド等のアンジオポイエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオジェニン、骨形態形成タンパク質−１（ＢＭＰ−Ｉ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−Ｉｌ、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰレセプターＩＡ、ＢＭＰレセプターＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子レセプターサイトカイン誘導好中球走化因子１、サイトカイン誘導好中球走化因子２、内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮細胞増殖因子、上皮由来好中球誘因剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｃ、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、グリア細胞株由来神経栄養因子レセプター１、グリア細胞株由来神経栄養因子レセプター２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子レセプター、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子レセプター、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合性タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子レセプター、神経成長因子神経成長因子レセプター、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター、前Ｂ細胞成長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子レセプター、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ、ＴＧＦ１、ＴＧＦ１．２、ＴＧＦ２、ＴＧＦ３、ＴＧＦ５、潜在的ＴＧＦ１、ＴＧＦ、結合タンパク質Ｉ、ＴＧＦ結合タンパク質ＩＩ、ＴＧＦ結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子レセプターＩ型、腫瘍壊死因子レセプターＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター、血管内皮増殖因子、並びにそれらのキメラタンパク質及び生物学的又は免疫学的に活性な断片が含まれる。
【００９１】
構造式（Ｉ）の化合物はまた、治療用途の方法において当該化合物の有益な性質を促進する補助部位に複合体化又は連結してもよい。そのような複合体化は、特定の解剖学的位置又は対象領域（例えば腫瘍）への当該化合物の輸送を増強し、標的細胞での当該化合物の治療濃度の持続を可能にし、当該化合物の薬物速度論的及び薬理学的特性を変更し、及び／又は当該化合物の治療指数又は安全性プロフィールを改善することができる。適切な補助部位には、例えばアミノ酸、オリゴペプチド、又はポリペプチド、例えばモノクローナル抗体及び他の改変抗体；及び、標的細胞又は組織でのレセプターに対する天然又は合成リガンドが含まれる。他の適切な補助剤には、生体内分布及び／又は標的細胞による当該化合物の吸収を促進する脂肪酸又は脂質部位が含まれる（例えばＢｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７：３２２９，２００１を参照）。
【００９２】
本発明の製剤は、経口、非経口、経粘膜（例えば舌下又は口腔投与による）、局所性、経皮、直腸、又は吸入（例えば鼻腔又は深い肺吸入）投与など、示された病気の治療において標準的な方法で投与することができる。非経口投与には、限定されないが、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、クモ膜下、及び関節内投与形式が含まれる。また、非経口投与は、ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（登録商標）（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＰＬＣ、オックスフォード、イギリス）等の高圧技術を用いて遂行されてもよい。
【００９３】
経口投与及び口腔投与に関しては、当該組成物は、通常の方法で製剤化された錠剤又はトローチ剤の形状にあってよい。例えば、経口投与用の錠剤及びカプセルは、結合剤（例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプン粘液、又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えばラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、又はソルビトール）、滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、又はシリカ）、崩壊剤（例えばジャガイモ澱粉、又は澱粉グリコール酸ナトリウム）、又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等の通常の賦形剤を含んでもよい。当該錠剤は当業界で周知の方法に従って被覆されてもよい。
【００９４】
あるいは、本発明の化合物は、例えば水性又は油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、又はエリキシル等の経口用液体製剤に配合することもできる。さらに、これら化合物を含む製剤は、使用前に水又は他の適切な媒体を用いて構成するために乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、例えば懸濁化剤（ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び水素化食用脂等）；乳化剤（レシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシア等）；（食用油を含み得る）非水性の媒体（アーモンド油、分画ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール、及びエチルアルコール）；防腐剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピル、及びソルビン酸等）といった通常の添加剤を含んでよい。
【００９５】
また、このような製剤は、例えばカカオ脂や他のグリセリド等の通常の座薬基材を含んでいるような座剤として製剤化されてもよい。吸入用の組成物は、通常、乾燥粉末として投与し得る溶液、懸濁液、又はエマルジョンの形態、又は、ジクロロジフルオロメタン又はトリクロロフルオロメタン等の通常の高圧ガスを用いたエアロゾルの形態で提供されてよい。局所性及び経皮製剤は、点眼剤、クリーム、軟膏、ローション、ペースト等の、通常の水性又は非水性の媒体を含むものであるか、又は、薬用膏薬、パッチ、又は膜の形態のものである。
【００９６】
加えて、本発明の組成物は注射による非経口投与又は持続注入用に製剤化されてもよい。注射用製剤は、油性又は水性の媒体中で懸濁液、溶液、又はエマルジョンの形態にあってよく、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤等の処方剤を含んでよい。あるいは、使用前に適切な媒体（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）を用いて構成するために、有効成分が粉末状のものであってよい。
【００９７】
また本発明の組成物は持続性製剤として製剤化されてもよい。このような長期にわたって作用する製剤は埋め込みにより（例えば皮下又は筋肉内に）、又は筋肉注射により投与することができる。したがって、本発明の化合物は、適切な疎水性ポリマー材料（例えば、許容される油中のエマルジョン）、イオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体（例えば難溶性塩）として製剤化することができる。
【００９８】
獣医用途では、式（Ｉ）の化合物又はその医薬上許容される塩、プロドラッグ、若しくは溶媒和物は、標準的な獣医学診療に従って適切に許容される製剤として投与される。獣医は、ある特定の動物のために最も適切な投与処方及び投与経路を容易に決定することができる。本発明の化合物及び方法によって治療可能な動物には、限定されないが、ペット、家畜、展示動物、及び動物園にいる動物が含まれる。
合成方法
本発明の化合物は、以下の合成スキームによって調製することができる。出発物質は市販品から入手可能であるか、又は当業者に知られ十分に確立した文献記載の方法によって調製できる。基Ｘ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、以下で特記のない限り、すでに定義したものである。
スキーム１
【００９９】
【化１６】
2008505112.tif 000013
スキーム１で示したように、式４の化合物は、ＤＩＥＡ等の塩基、及び、ジフェニルホスホリルアジドを用いた処理によって、式６の化合物から調製できる。この反応の典型的な溶媒はＴＨＦであり、反応は１〜１２時間、室温、風防下で行われる。
スキーム２
【０１００】
【化１７】
2008505112.tif 000014
スキーム２は式５の化合物の別の合成法を示す。スキーム４によって調製された式５の化合物を用いて、式３の化合物は処理される。限定はしないが有用な溶媒はＤＭＦであり、反応温度は約１〜１２時間、室温〜６００℃の間に維持される。
スキーム３
【０１０１】
【化１８】
2008505112.tif 000015
スキーム３で示しているように、式７の化合物は、ピリジン等の塩基の存在下、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル等のクロロギ酸アリールを用いた処理により式８の化合物から調製できる。限定はしないがこの反応で使用される溶媒としては、０℃〜室温の温度で、ＣＨ２Ｃｌ２又はピリジンが挙げられる。
スキーム４
【０１０２】
【化１９】
2008505112.tif 000016
スキーム４は式３の化合物へのアプローチを示している。式１の化合物は、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、又はＫ３ＰＯ４等の塩基性水溶液の存在下、ボロン酸アリール、及び、パラジウム（０）源（例えば、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン）を用いた処理により式２の化合物に変換される。限定はしないがこの反応で使用される溶媒の例としては、ＴＨＦ、ジオキサン、又はエチレングリコールジメチルエーテルが挙げられる。この反応は通常、約１〜１２時間、０℃〜９００℃の間の温度で行われる。式２の化合物は、例えばＰｄ／Ｃ、Ｐｔ／Ｃ、又は亜鉛の存在下、式３の化合物に変換される。限定はしないがこの反応で使用される溶媒の例としては、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、又はＨＯＡｃが挙げられる。あるいは、式１の化合物は、ＰｄＣｌ２（ＰＰＨ３）２又は他のパラジウム（０）源等の触媒を用いて末端アルキン１１をアリール化するのに使用することもできる。反応は通常、トリエチルアミン等の塩基の存在下、室温から９０℃までの温度で行われる。
【０１０３】
さらに、Ｘがトリフラート（ｔｒｉｆｌａｔｅ）すなわちｔｆである場合の式１の化合物は式９の化合物から得ることができる。典型的な試薬としてはトリフリック無水物又はＮ−フェニルトリフリイミドが挙げられる。反応は通常、−１０℃〜室温の温度で行われる。溶媒の例としては限定されないが、ジクロロメタンである。塩基の例としては限定されないが、ＴＥＡ又はジイソプロピルエチルアミンである。
スキーム６
【０１０４】
【化２０】
2008505112.tif 000017
スキーム６は式５の化合物の代替的合成法を説明するものである。式３の化合物はスキーム２で記載した方法に従って式１０の化合物に変換することができる。次に式１０の化合物はスキーム４に記載の方法に従って式５の化合物に変換することができる。
【０１０５】
構造式（Ｉ）の化合物の例は以下に提示するが、これらに限定されず、その合成法は以下及び米国特許出願公開番号２００３／００６９２８４８（参照によりここに組み込む）に記載する一般的方法に従って行われた。本発明の更なる化合物は、出発物質の賢明な解決策により、上記の一般的スキーム及び以下の具体的合成法を使用して調製することができる。
【０１０６】
ここに記載した合成法で使用する略号は以下のとおり：時間（ｈ）、分（ｍｉｎ）、気圧（ａｔｍ）、脱イオン化（ＤＩ）、窒素（Ｎ２）、水（Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、塩化水素（ＨＣｌ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）、ジクロロパラジウムビストリフェニルホスフェン（ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、メタノール（ＭｅＯＨ）、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）、酢酸（ＨＯＡｃ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、ｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−ＴｓＯＨ）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、硝酸（ＨＮＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、飽和（ｓａｔ′ｄ）、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、炭素担持パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ヨウ化第一銅（Ｃｕ（Ｉ）Ｉ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，８−ジアザシクロ［５．４．０］ウンデシ−７−エン（ＤＢＵ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）。
中間体１：
【０１０７】
【化２１】
2008505112.tif 000018
５−メチル−ピラジン−２−カルボニルアジド
室温でＮ２下、ＴＨＦ５４０ｍＬ中の５−メチル−ピラジン−２−カルボン酸（２５ｇ，１８１ｍｍｏｌ）攪拌懸濁液に、ＤＩＥＡ（３１．７ｍＬ，１８１ｍｍｏｌ）を添加し、褐色の溶液を得た。次に、ＴＨＦ５０ｍＬ中の溶液としたジフェニルホスホリルアジド（３９．２ｍＬ，１８１ｍｍｏｌ）を、風防下、１時間かけて滴下した。一晩攪拌して反応させた。次に反応物を室温で回転濃縮して少容量とし、Ｅｔ２Ｏ（１Ｌ）とＨ２Ｏ（１Ｌ）との間で分配した。Ｈ２Ｏ層をＥｔ２Ｏ２ｘ２５０ｍＬで逆抽出し、あわせて有機層を２ｘ１Ｌのｓａｔ′ｄ  Ｎａ２ＣＯ２で洗浄した。有機層は乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して固体物とし、これをＥｔ２Ｏで粉砕して、生成物を黄色の固体として得た（１５ｇ，５０％）。より純粋な化合物は、粗製物ｘｇをＥｔ２Ｏの２０ｘｍＬに取り込み、室温で数分間、脱色炭１〜２ｘｇで処理することで単離することができた。濾過及び濃縮後、ＥｔＯＡｃでのＴＬＣで均質及び純白とした。回収率は通常６５％であった。
化合物１：
【０１０８】
【化２２】
2008505112.tif 000019
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−３−イルエチニル−フェニル）−尿素
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−（４−メチル−２−ニトロ−フェニルエチニル）−シラン
１−ブロモ−４−メチル−２−ニトロベンゼン（３．２４ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（１．０５ｇ，１．５ｍｍｏｌ）、及びＣｕ（Ｉ）Ｉ（５．７ｇ，３０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＴＥＡ（４０ｍＬ）を、次いでＴＭＳ−アセチレン（５．３ｍＬ，３７．５ｍｍｏｌ）を添加した。６０℃で１２ｈ攪拌した後、反応物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）及び１０％Ｎａ２ＣＯ３（１５０ｍＬ）で希釈した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で乾燥して無定形の黒色残渣４．０ｇを得た。
工程２．１−エチニル−４−メチル−２−ニトロ−ベンゼン
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−（４−メチル−２−ニトロ−フェニルエチニル）−シラン（３．５ｇ，１５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＮａＯＨ（１．８ｇ，４５ｍｍｏｌ，Ｈ２Ｏ５ｍＬ中）。１時間攪拌後、反応物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）及び１０％Ｎａ２ＣＯ３（１５０ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬで１回）で抽出した。有機層を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で乾燥して褐色固体１．４０ｇ（２度の工程で５８％）を得た。
工程３．３−（４−メチル−２−ニトロ−フェニルエチニル）−ピリジン
３−ブロモピリジン（６０８ｍｇ，３．８５ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（２４６ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）、及びＣｕ（Ｉ）Ｉ（７３３ｍｇ，３．８５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＴＥＡ（１０ｍＬ）を、次いで１−エチニル−４−メチル−２−ニトロ−ベンゼン（５６４ｍｇ，３．５ｍｍｏｌ）を添加した。６０℃で４時間攪拌した後、反応物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）及び１０％Ｎａ２ＣＯ３（１５０ｍＬ）で希釈した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で乾燥した。生成物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（７／３）を溶出液としＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｍカートリッジを用いて精製して淡褐色の油状物を得た。
工程４．５−メチル−２−ピリジン−３−イルエチニル−フェニルアミン
３−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル−エチニル）−ピリジン（１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１ｍＬ）溶液に、ｓａｔ′ｄ  ＮＨ４ＣｌＯの５ｍＬを、次いで亜鉛粉（０．３３ｇ，５．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を１０分間攪拌した後、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）、及びＮａ２ＣＯ３（１０％水溶液で５０ｍＬ）で希釈した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、透明な油状物として所望の物質を得た。
工程５．１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−３−イルエチニル−フェニル）−尿素
あらかじめ９０℃で１５分間加熱した５−メチル−ピラジン−２−カルボニルアジド（化合物７）（１６３ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）のトルエン（４ｍｌ）溶液に、攪拌下、５−メチル−２−ピリジン−３−イルエチニル−フェニルアミン（１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を６５℃に冷却し、１２ｈ攪拌した。次いで反応混合物を室温に冷却した。有機層に酢酸エチルを添加し、ブラインで洗浄してＭｇＳＯ４で乾燥した。濾過、及び減圧下での濃縮後、油状物を単離し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：４を溶出液とするカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製した。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.39 (br s, 1H), .8.79 (s, 1H), 8.61 (d, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.79 (d, 1H), 7.41 (m, 2H), 7.31 (m, 1H), 6.91 (d, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.37 (s, 3H) . LRMS (apci, positive) m/e 344.4 (M+1) .
化合物２
【０１０９】
【化２３】
2008505112.tif 000020
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−３−イル−フェニル）−尿素
工程１．３−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）−ピリジン
４−ブロモ−２−ニトロ−フェノール（６４８ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）、及び３−ピリジルボロン酸（３８７ｍｇ，３．１５ｍｍｏｌ）をジオキサン５ｍＬで希釈し、Ｎ２下に置いた。炭酸カリウムをＨ２Ｏ１ｍＬで希釈し、反応混合物に添加した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１７３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を添加した後、反応物を７０℃に加熱し、一晩攪拌した。反応物を室温まで冷却させた後、ＥｔＯＡｃ３０ｍＬ、及び１０％Ｎａ２ＣＯ３３０ｍＬで希釈した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた物質をヘキサン／ＥｔＯＡｃ、１／１を溶出液とするＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｍカートリッジで精製して、オフホワイトの固体を得た。
工程２．５−メチル−２−ピリジン−３−イル−フェニルアミン
３−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）−ピリジンから、化合物１、工程４に従って調製。
工程３．１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−３−イル−フェニル）−尿素
５−メチル−２−ピリジン−３−イル−フェニルアミン、及び化合物７を用いて化合物１、工程５に従って調製。1H- NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.00 (br s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.70 (d, 1H), 8.40 (s, 2H), 7.75 (d, 1H), 7.40 (m, 2H), 7.15 (d, 1H), 7.05 (d, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.40 (s, 3H) . LRMS (apci, positive) m/e 320.3 (M+1) .
化合物３
【０１１０】
【化２４】
2008505112.tif 000021
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−４−イル−フェニル）−尿素
工程１．４−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）−ピリジン
４−ピリジルボロン酸、及び４−ブロモ−２−ニトロ−フェノールを用いて化合物２、工程１に従って調製。
工程２．５−メチル−２−ピリジン−４−イル−フェニルアミン
４−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）−ピリジンを用いて化合物１、工程４に従って調製。
工程３．１−（５−メチル−ピラジン−２-イル）−３−（５−メチル−２−ピリジン−４−イル−フェニル）−尿素
５−メチル−２−ピリジン−４−イル−フェニルアミン、及び化合物７を用いて化合物１、工程５に従って調製。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.90 (br s, 1H), 8.65 (d, 2H), 8.25 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.10 (br s, 1H), 7.45 (d, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.15 (d, 1H), 7.05 (d, 1H), 2.48 (s, 3H), 2.46 (s, 3H) . LRMS (apci, positive) m/e 320.0 (M+1) .
化合物４：
【０１１１】
【化２５】
2008505112.tif 000022
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（２−オキサゾール−５−イル−フェニル）−尿素
工程１：２−オキサゾール−５−イル−フェニルアミン
２−オキサゾール−５−イル−フェニルニトロ（１９０ｍｇｓ，１ｍｍｏｌ）を室温でＥｔＯＨ３ｍＬにとかした。パールマン触媒を触媒量添加し、水素化を１ａｔｍで行った。セライトで濾過した後、溶液を減圧下で濃縮した。黄色の固体を単離した。
工程２：１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（２−オキサゾール−５−イル−フェニル）−尿素
２−オキサゾール−５−イル−フェニルアミン、及び化合物７を用いて化合物１、工程５に従って調製。LRMS (apci, positive) m/e 296.0 (M+1).
化合物５；
【０１１２】
【化２６】
2008505112.tif 000023
１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−チアゾール−２−イル−フェニル）尿素
工程１：４−メチル−２−ニトロ−ベンズアミド
４−メチル−２−ニトロベンズアミドを、４−メチル−２−ニトロ安息香酸から、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，７５：１３８９（１９５７）に記載の方法によって得た。
工程２：４−メチル−２−ニトロ−チオベンズアミド
４−メチル−２−ニトロベンズアミド（１８０ｍｇｓ，１ｍｍｏｌ）、及びＢｅｌｌｅｕ試薬（５２９ｍｇｓ，１ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下でＴＨＦ３ｍＬに溶かした。この懸濁液を一晩攪拌した。黄色の溶液が形成された。その溶液を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２２０ｍＬに再溶解し、未使用の等級のシリカゲルを添加した。その溶液を減圧下で濃縮して、シリカゲルに吸着した化合物をＢｉｏｔａｇｅ  ＺＩＦユニットに搭載した。その化合物を、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン３：７を用いたＢｉｏｔａｇｅ  １２Ｍカラムでクロマトグラフィーにかけた。所望の画分を集め濃縮して、暗黄色の固体として所望の物質を得た。
工程３：２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル−チアゾール）
４−メチル−２−ニトロ−チオベンズアミド（３７ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を、ｐＴｓＯＨ（９０ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）、及び２−ブロモ−１，１−ジエトキシエタン（４８ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）と共にＨＯＡｃ（５ｍＬ）に溶かした。その混合物を１．５時間、１００℃に加熱した。所望の生成物をＣｈｅｗ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３９（９）：２３２３−２３３２（１９９１）に記載の方法を用いて単離した。
工程４：２−（４−メチル−２−アミノ−フェニル−チアゾール）
２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル−チアゾール）（３０ｍｇｓ，０．１３ｍｍｏｌ）を、触媒量のパールマン触媒と共にＥｔＯＨ（３ｍＬ）に溶かした。化合物４、工程１について記載の方法に従った。所望の物質を良い収率で得た。
工程５：１−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−３−（５−メチル−２−チアゾール−２−イル−フェニル）尿素
２−（４−メチル−２−アミノフェニル−チアゾール）、及び化合物７を用いて化合物１、工程５に従って調製。LRMS (apci, positive) m/e 326.0 (M+1) .
化合物６：
【０１１３】
【化２７】
2008505112.tif 000024
１−［２−（４−ジメチルアミノメチル−チアゾール−２−イル）−５−メチル−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
工程１：２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル−チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル
化合物５、工程２に記載のように調製した４−メチル−２−ニトロ−チオベンズアミド（６０ｍｇｓ，０．３０ｍｍｏｌを、室温でＮ２下、無水ＥｔＯＨ１ｍＬ中で攪拌した。ブロモピルビン酸エチル（６５ｍｇｓ，０．３３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を３ｈ、７０℃に加熱した。その反応物をＥｔＯＡｃで３０ｍＬに希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過、濃縮して黄色の固体とした。これを次の工程にそのまま用いた。
工程２：２−（４−メチル−２−ニトロフェニル）チアゾール−４−イルメタノール
２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル−チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル（２９２ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を、開口したフラスコ中で、室温で無水ＥｔＯＨ５ｍＬに溶かした。水素化ホウ素ナトリウム（１ｍｍｏｌ，３８ｍｇ）を数時間かけて滴下し、その反応をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン２：３）でモニターした。反応終了後、２ＮのＨＣｌを攪拌下、慎重に滴下した。１５分後、透明な黄色の溶液をロータリーエボポレーターで濃縮し、その粗製混合物をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）、及び水（６０ｍＬ）の間で分配した。有機物を単離し、ｓａｔ  ＮａＨＣＯ３、及びｓａｔ  ＮａＣｌ６０ｍＬで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過、濃縮して所望の物質としてオレンジ色の固体を得た。
工程３  ２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）チアゾール−４−カルバルデヒド
２−（４−メチル−２−ニトロフェニル）チアゾール−４−イルメタノール（２９７ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ）をＮ２下、室温でＣＨ２Ｃｌ２５ｍＬ中に攪拌した。固体のＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬（５００ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、反応が完了した。反応物をＣＨ２Ｃｌ２５０ｍＬに希釈し、１ＮのＮａＯＨ６０ｍＬで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製の物質を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：４を溶出液とするｂｉｏｔａｇｅカラム１２Ｍで精製して所望の物質を得た。
工程４：ジメチル−［２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）−チアゾール−４−イルメチル］アミン
ジメチルアミン（ＭｅＯＨ中２Ｍ溶液を６４０μＬ）、酢酸ナトリウム、及び水素化シアノホウ素ナトリウム（５６ｍｇｓ，０．８９ｍｍｏｌ）を室温でＮ２下、ＭｅＯＨ２．６ｍＬ中で攪拌した。氷ＨＯＡｃを添加してｐＨを７〜８に調整した。次いで２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）チアゾール−４−カルバルデヒド（１５９ｍｇｓ，０．６４ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ３．２ｍＬ溶液として添加した。２ｈ後、生成物の形成が質量分析より明白であった。反応を一晩進行させた。その際、アセトン（５００μＬ）を添加して未反応の水素化ホウ素を消失させて、反応物をｐＨ＜３に酸性化した。反応物を濃縮した。残渣をＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）とＨ２Ｏ（３０ｍＬ）とのあいだに分配した。水相をＥｔ２Ｏで抽出した後、１ＮのＮａＯＨで中性化し、ｐＨを１０とした。水相をＥｔ２Ｏで再抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して所望の物質を得た。
工程５：ジメチル−［２−（４−メチル−２−アミノ−フェニル）−チアゾール−４−イルメチル］アミン
ジメチル−［２−（４−メチル−２−ニトロ−フェニル）−チアゾール−４−イルメチル］アミンから、化合物５、工程４に従って調製。
工程６：１−［２−（４−ジメチルアミノメチル−チアゾール−２−イル）−５−メチル−３−フェニル］−３−（５−メチル−ピラジン−２−イル）−尿素
化合物７、及びジメチル−［２−（４−メチル−２−アミノ−フェニル）−チアゾール−４−イルメチル］アミンから工程１、化合物５に従って調製。LRMS (apci, positive) m/e 383.0 (M+1) . 
治療方法
本発明の化合物は、異常細胞増殖に関与する症状の治療に使用することができる。例えば当該化合物は、ヒトや他の動物等における真核細胞が関与するガンや他の細胞増殖適応症の治療に使用される放射線、及び／又は化学療法剤の治療効果を増強するのに使用することができる。一般に本発明の化合物は、ガン性のものであろうと非ガン性のものであろうと異常に増殖している細胞を阻害する。例えば本発明の化合物は、代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート又は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）による治療が通例になっているガンの治療の改善に使用することができる。
【０１１４】
本発明の化合物の使用は、異常増殖細胞の部分的又は完全な退行、すなわち細胞集団からのそのような細胞の減少又は除去につながる。つまり、例えば、異常増殖細胞の集団がガン細胞であるとき、本発明の化合物は、ガンの成長速度の遅延、ガンの数の減少、及び／又は部分的又は完全なガンの退行に使用することができる。
【０１１５】
本発明の化合物は、異常細胞増殖が確認されていない時、又は異常細胞増殖が進行していない場合に異常細胞増殖が疑われ又は予想される時にイン・ビボ又はエクス・ビボで使用することができる。本発明の化合物はまた、異常細胞増殖が以前に治療されている場合にも、同じものの再発を予防又は阻害するために使用することができる。
【０１１６】
本発明のひとつの方法は、本発明のＣｈｋ１阻害剤化合物を治療上有効な量で、化学療法剤と組み合わせて、これを必要とする個体に投与することを含む。あるいは、本発明の方法は、本発明のＣｈｋ１阻害剤の少なくとも１つを治療上有効な量で、ガン細胞の増殖を阻害する活性を有する抗体、例えばハーセプチンと組み合わせて、これを必要とする個体に投与することを含む。
【０１１７】
そのためガンは、化学療法剤又は抗体と組み合わせた本発明のＣｈｋ１阻害剤の投与による強化治療の影響を受けやすい。本発明によって治療可能なガンとしては、固形ガンを特徴とする上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍、並びに、白血病、リンパ腫や、通常腫瘤はないが血管又はリンパ細網系に分布している他のガン等の骨髄又はリンパ系のガンが挙げられる。これらのガンとしては、例えば、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、外陰癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、腎細胞癌、卵巣癌、脳腫瘍、骨肉腫、及び肺癌が挙げられる。
【０１１８】
従って本発明の化合物は、Ｃｈｋ１活性により介在されるガンに有用である。より具体的には、Ｃｈｋ１活性は、限定はされないが、成人及び小児の腫瘍学、固形ガン／悪性腫瘍の成長、粘液性及び円形細胞癌、局所的に進行した癌、転移性癌、ユーイング肉腫等のヒト軟部肉腫、リンパ行性転移等の癌転移、特に頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道扁平上皮細胞癌、口腔癌、血液細胞悪性腫瘍、例えば多発性骨髄腫、白血病、例えば急性リンパ性白血病、急性抗リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、滲出液リンパ腫（体腔ベースのリンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌（例えば、小細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質の癌、ＡＣＴＨ産生腫瘍、非小細胞癌、乳癌、例えば小細胞癌及び腺管癌）、消化管癌（例えば、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、及び結腸直腸新生物に関連したポリープ）、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器癌（一次表在性膀胱腫瘍、膀胱の浸潤性移行細胞癌、及び筋肉浸潤性の膀胱癌等の膀胱癌を含む）、前立腺癌、女性生殖系の悪性腫瘍（卵巣癌、一次腹膜上皮性新生物、子宮頸癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部の癌、子宮癌及び卵胞での固形癌を含む）、男性生殖系の悪性腫瘍（精巣癌、及び陰茎癌を含む）、腎臓癌（腎細胞癌を含む）、脳腫瘍（内因性の脳腫瘍、神経芽腫、星状脳腫瘍、神経膠腫、及び中枢神経系での転移性腫瘍細胞浸潤を含む）、骨肉腫（骨腫、及び骨肉腫を含む）、皮膚癌（悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、及び扁平上皮細胞癌を含む）、甲状腺癌、網膜芽細胞腫、神経芽腫、腹水、悪性胸水、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆嚢癌、栄養膜腫瘍、血管周囲細胞腫、及びカポジ肉腫等の形態の腫瘍に関連している。
【０１１９】
また本発明の化合物は、細胞を放射線感受性にするのにも使用することができる。放射線で治療可能な病気としては限定されないが、腫瘍性疾患、良性及び悪性の癌、並びに癌性細胞が挙げられる。放射線治療は、ガンマ線（１０−２０〜１０−１３ｍ）、Ｘ線（１０−１２〜１０−９）、紫外線（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）、及びマイクロ波（１ｍｍ〜３０ｃｍ）等の電磁波放射線を用いる。
【０１２０】
現在、いくつかの癌の治療プロトコルは、例えばＸ線等の電磁波放射線により活性化された放射線増感剤を用いる。Ｘ線活性化放射線増感剤の例としては限定されないが、以下のものが挙げられる：メトロニダゾール、ミソニダゾール（ｍｉｓｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、エタニダゾール（ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）、ニモラゾール（ｎｉｍｏｒａｚｏｌｅ）、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、並びにこれらの治療上有効な類似体及び誘導体。
【０１２１】
癌の光線力学療法（ＰＤＴ）は、増感剤の放射線活性剤として可視光を用いる。光線力学的放射線増感剤の例としては限定されないが、以下のものが挙げられる：ヘマトポルフィリン誘導体、ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ（登録商標）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、スズエチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、ｐｈｅｏｂｏｒｂｉｄｅ−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、並びにこれらの治療上有効な類似体及び誘導体。
【０１２２】
放射線増感剤は、Ｃｈｋ１阻害剤に加えて１以上の化合物の治療上有効な量を併せて投与することができ、そのような化合物としては限定されないが、標的細胞への放射線増感剤の取り込みを促進する化合物、標的細胞への治療薬、栄養素、及び／又は酸素の流れを制御する化合物、追加の放射線の有無に関わらず腫瘍に作用する化学療法薬、又は癌若しくは他の病気を治療する治療上有効な他の化合物が挙げられる。放射線増感剤と併せて使用できる追加の治療剤又は方法の例としては限定されないが、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、酸素、カルボゲン（ｃａｒｂｏｇｅｎ）、赤血球の輸血、ペルフルオロカーボン（例えば、ＦＬＵＯＳＯＬＷ（登録商標）−ＤＡ）、２，３−ＤＰＧ、ＢＷ１２Ｃ，カルシウムチャンネル遮断薬、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、抗血管形成化合物、ヒドララジン、及びＬ−ＢＳＯが挙げられる。
【０１２３】
癌を治療するのに本発明の化合物と組み合わせて用いることのできる化学療法剤としては限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、さらには天然物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、本発明の阻害剤化合物は、ドキソルビシンや他のアントラサイクリン類似体等の抗生物質、シクロホスファミド等のナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソール等のピリミジン類似体、並びにその天然及び合成誘導体、等と投与することができる。他の例としては、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性の細胞を含む際の乳腺腺癌等の混合腫瘍である場合、上記化合物は、ロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と併せて投与することができる。他の抗腫瘍プロトコルは、別の治療法、例えば外科手術や放射線（ここでは補助治療法ともいう）と併せた阻害剤化合物の使用を含む。本発明で有用な更なる化学療法剤は、ホルモン及びそのアンタゴニスト、放射性同位体、抗体、天然物、及びその組み合わせを含む。本発明の化合物を使用する方法で有用な化学療法剤の例を次の表に掲載する。
【０１２４】
【表１】
2008505112.tif 000025
【０１２５】
【表２】
2008505112.tif 000026
放射線増感剤との併用で特に有用な化学療法剤の例としては、例えば、カンプトセシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロン（アルファ、ベータ、ガンマ）、イリノテカン、ヒドロキシ尿素、クロラムブシル、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、２−クロロアデノシン、フルダラビン、アザシチジン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、並びにこれらの治療上有効な類似体及び誘導体が挙げられる。
【０１２６】
本発明において、本発明の化合物は、ゲムシタビン単独、又は、これと、さらにパクリタキセルとの組み合わせにおいて有用である。また本発明の化合物は、ペメトレキセド単独との組み合わせ、又はこれと、さらにシスプラチン、カルボプラスチン、又は他のプラスチンとの組み合わせにおいても有用である。また本発明のＣｈｋ１阻害剤は、ゲムシタビン及びペメトレキセドとの組み合わせで投与することもできる。
【０１２７】
ゲムシタビンとの組合せで投与される本発明のＣｈｋ１阻害剤は、例えば膵臓癌、子宮の平滑筋肉腫、骨肉腫、転移性非小細胞肺癌、四肢及び体幹軟部組織肉腫、腎細胞癌、腺癌及びホジキン病の治療において有用であり得る。ペメトレキセドと投与される本発明のＣｈｋ１阻害剤は中皮腫の治療において有用であり得る。
【０１２８】
また本発明の化合物は、異常細胞増殖を特徴とする炎症性の疾患、症状、又は障害の治療で使用される薬剤の効能を増強することもできる。本発明の化合物で治療可能な炎症性疾患の例としては限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、全身性発症若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）、及び全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）が挙げられる。関節炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、及びＳＬＥの治療にはよく、電離放射線、メトトレキサート、及びシクロホスファミド等の免疫抑制療法の使用が伴う。このような治療は通常、直接的又は間接的に、ＤＮＡ損傷を誘発する。原因の免疫細胞内のＣｈｋ１活性を阻害すると、その細胞は、これら標準的な治療による制御に対してより敏感になる。乾癬及び白斑は一般に、ソラレンと組み合わせた紫外線放射（ＵＶ）で治療される。本発明の化合物はＵＶ及びソラレンの殺傷作用を高め、この治療計画の治療指数を改善する。一般に、本発明の化合物は、免疫抑制剤と組み合わせて使用される場合に、炎症性疾患細胞の制御を増強する。
【０１２９】
また本発明の化合物は、異常増殖細胞を特徴とする他の非癌性症状を治療する方法においても使用することができる。このような症状としては限定されないが、アテローム性動脈硬化、再狭窄、脈管炎、腎炎、網膜症、腎疾患、増殖性皮膚疾患、乾癬、ケロイドの瘢痕、光線性角化症、スティーブンス・ジョンソン症候群、骨粗しょう症、上皮の下方増殖を含む眼の過剰増殖性疾患、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、糖尿病性網膜症、Ｈｅｍａｎｇｉｏ増殖性疾患、魚鱗癬、及び乳頭腫が挙げられる。
【０１３０】
本発明のＣｈｋ１阻害剤を投与するひとつの好ましい方法をＷＯ０５／０２７９０７で記載しており、その開示内容を参照してここに組み込む。異常細胞増殖を阻害するそのような方法は、Ｃｈｋ１活性剤（例えば化学療法剤）、及び本発明によるＣｈｋ１阻害剤の計画投与を伴う。この方法では、少なくとも１つのＣｈｋ１活性剤が、増殖細胞で細胞周期停止の実質的な同期化を誘導するのに十分な用量及び時間で投与される。実質的な相同期化を達成すると、少なくとも１つのＣｈｋ１阻害剤が投与されて細胞周期停止を無効にし、治療的細胞死を誘導する。本方法はいかなるＣｈｋ１活性剤でも有用であり、異常細胞増殖を伴う癌性及び非癌性の症状を治療又は予防する用途がある。
【０１３１】
異常増殖細胞集団は、１つの、又は１より多い本発明のＣｈｋ１阻害剤と接触させることができる。１より多いＣｈｋ１阻害剤を使用する際には、その複数のＣｈｋ１阻害剤は、当業者、例えば主治医（ヒト患者の場合）、又は実験者（イン・ビトロ又はエクス・ビボの方法の場合）によって決定される同じ又は異なる方法（例えば、同時に又は連続的に、同じ又は異なる時間で、あるは同じ又は異なる手順によって）を用いて当該細胞と接触させてよい。
【０１３２】
また異常増殖細胞集団は、１以上のＣｈｋ１活性剤と接触させることもできる。１より多いＣｈｋ１活性剤を使用する場合には、その複数のＣｈｋ１活性剤は、上記のＣｈｋ１阻害剤に関して全般的に記載したような同じ又は異なる方法を用いて当該細胞と接触させてもよい。
【０１３３】
本発明の化合物は、エクス・ビボの細胞集団に適用することができる。例えば、本発明の化合物は、所定の適応症、細胞型、患者、及び他の治療パラメータについてＣｈｋ１阻害剤を投与するのに最適なスケジュール及び／又は用量に関する情報を得るためにエクス・ビボで使用することができる。この情報は実験目的で、又はイン・ビボの治療手順を決定するために病院で使用することができる。本発明の化合物の他のエクス・ビボの使用は、当業者に明らかであろう。
【０１３４】
当業者には理解できることであるが、ここで記載する方法においては追加の有効又は補助成分を使用してもよい。同様に当業者には理解できることであるが、ここでの治療への言及は、確定した病気又は症候の治療に加えて、予防にも及ぶ。
【０１３５】
治療に必要な本発明の化合物の量は、治療すべき症状の性質に伴い、また患者の年齢及び状態に伴い変動し、最終的には担当医師又は獣医によって決定される。しかしながら、一般的には、成人ヒト治療で投与される用量は通常、１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量は、一回の服用で投与してもよいし、適切な間隔をあけて投与される複数回の服用として、例えば１日あたり２回、３回、４回、又はそれ以上の回数の副服用で投与してもよい。実際には、医師が個々の患者について適切な投与計画を決定し、その用量は特定の患者の年齢、体重、及び反応に応じて変動する。前記用量は平均的なものを示したものであるが、より多い用量又はより少ない用量が必要となる個々のケースは存在し、そのようなものも本発明の範囲内のものである。
【０１３６】
いかなる用量でも本発明のＣｈｋ１阻害剤と細胞集団との接触は、細胞周期チェックポイントの実質的な無効化を達成するのに十分な時間行われる。通常、必須ではないが、そのような時間は、種々の要素に応じて約７２ｈ〜約９６ｈまでを含む。ある実施形態では、担当医師又は専門家により決定されるのであるが、約数週間以上までの時間をかけてＣｈｋ１阻害剤を投与するのが望ましい、又は必要である。すなわち、本発明のＣｈｋ１阻害剤は通常、約１時間まで、約２ｈまで、約３ｈまで、約４ｈまで、約６ｈまで、約１２ｈまで、約１８ｈまで、約２４ｈまで、約４８ｈまで、又は約７２ｈまでの時間、投与することができる。当業者であれば、ここで示した時間範囲は単に例示にすぎず、この表示範囲内及び外の範囲及び部分的範囲も本発明の範囲内であることを理解しよう。
【０１３７】
本発明のＣｈｋ１阻害剤は複数の回数で投与することができる。例えばＣｈｋ１阻害剤は以下の頻度で与えることができる：４日の間隔をあけて１日に１回として合計４回（ｑ４ｄｘ４）、３日の間隔をあけて１日に１回として合計４回（ｑ３ｄｘ４）、５日の間隔をあけて１日に１回（ｑｄｘ５）、３週間かけて１週に１回（ｑｗｋ３）、１日に５回、２日休憩してさらに１日５回（５／２／５）、又は状況により適切となるよう決定される用法。
【実施例】
【０１３８】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
Ｃｈｋ１阻害剤のＩＣ５０値の測定
ヒトＣｈｋ１ｃＤＮＡを、１９９８年９月４日が出願日のＷＯ９９／１１７９５に以前記載したように同定し、クローニングした。全長Ｃｈｋ１のアミノ末端にＦＬＡＧ（登録商標）タグを挿入した。５′プライマーはＥｃｏＲＩサイト、Ｋｏｚａｋ配列を含み、さらに、Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＩＬ）を用いたアフィニティー精製のためのＦＬＡＧ（登録商標）タグもコードする。３′プライマーはＳａｌＩサイトを含む。ＰＣＲ増幅断片を、ＥｃｏＲＩ−Ｓａｌｌ断片（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）としてｐＣＩ−Ｎｅｏにクローニングした後、ＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔｌ断片としてｐＦａｓｔＢａｃＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）にサブクローニングした。組み換えバキュロウイルスをＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃマニュアルに記載のように調製し、これを使用して、ＣＣＭ３媒体（Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中で成長したＳｆ−９細胞に感染させてＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きＣｈｋ１タンパク質を発現させた。
【０１３９】
ＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きＣｈｋ１を、バキュロウイルスに感染したＳｆ−９細胞の凍結ペレットから精製した。凍結細胞ペレットを、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｂ−グリセロリン酸塩、２５ｍＭ  ＮａＦ、４ｍＭ  ＭｇＧｌ２、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、２ｍＭバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭ  ＤＴＴ、及びプロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ２０００  カタログ＃１８３６１７０）を含む等量の２Ｘ溶菌バッファと混合した。次に細胞を、ドウンス・ホモゲナイザーの乳棒で２０回ドウンスを行い、１時間４８，４００ｘｇで遠心分離した。Ｍ２アフィニティーを１０倍のカラム体積の５０ｍＭグリシンｐＨ３．５、次いで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで交互に三度事前洗浄し、最後にＴｒｉｓ  ＮａＣｌで洗浄した。次にそのカラムを２５倍のカラム体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＴＷＥＥＮ＊−２０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１Ｘ完全ミニプロテアーゼ錠剤で洗浄した。次に除去した溶解物を４℃で４時間かけてバッチでＭ２アフィニティー樹脂に結合した。次に樹脂と溶解物の混合物をカラムに注ぎ込んで、その流出物を集めた。その樹脂を１０倍のカラム体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び３ｍＭ  Ｎ−オクチルグルコシドで洗浄した。次にＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きＣｈｋ１を、６倍のカラム体積の冷２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｎ−オクチルグルコシド、０．５ｍｇ／ｍＬＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド含有（Ｓｉｇｍａ，２０００カタログ＃Ｆ−３２９０）を用いてそのカラムから溶出させた。３つの画分を集めてＦＬＡＧタグ付きＣｈｋ１の存在を分析した。
【０１４０】
Ｃｈｋ１キナーゼ活性の分析は、１００ｎｇ精製ＦＬＡＧ（登録商標）−Ｃｈｋ１（ＡＴＰ１５０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ）、２０μｍ  Ｃｄｃ２５Ｃペプチド（H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg-arg-arg-arg-OH）（配列番号１）、４μｍ  ＡＴＰ、２μＣｉ［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％ＮＰ４０、及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む。反応は、ＡＴＰ含有反応混合物の添加によって開始され、室温で１０分間行われた。反応はリン酸（１５０ｍＭ最終濃度）の添加で停止し、ホスホセルロース・ディスクに移した。このホスホセルロース・ディスクを１５０ｍＭリン酸で５度洗浄し、空気乾燥した。シンチレーション流体を添加し、ディスクをウォーレス・シンチレーション計測器で計測した。このアッセイは広範な濃度範囲のＣｈｋ１阻害剤化合物の存在下でインキュベートされ、その化合物のＩＣ５０値を算出した。上述したように、分析に付した本発明の化合物のすべては本アッセイで約５００ｎＭ未満のＩＣ５０値を示した。
実施例２
選択性
本発明のＣｈｋ１阻害剤を選択性に関して試験したが、Ｃｈｋ１を比較酵素とし、以下のプロテインキナーゼをコンパレータ酵素とした：Ｃｄｃ２，Ｃｈｋ２，ＣＴＡＫ，ＥｐｈＡｌ，ＥｐｈＡ２，Ｅｒｋｌ，ＦＧＦＲｌ，ＦＧＦＲ４，ＩＲ，ＪＮＫｌ，ｃ−Ｋｉｔ，ｐ３８アルファ，ｐ３８ベータ，ｐ３８デルタ，Ｒｏｓ，Ｒｓｅ，Ｒｓｋ２，ＴｒｋＡ，ＴｒｋＢ，プロテインキナーゼＡ，プロテインキナーゼＣ，ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ，プロテインキナーゼＢ／Ａｋｔ−１，ｐ３８ＭａｐＫ，ｐ７０Ｓ６Ｋ，カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼＩＩ、及びａｂｌチロシナーゼキナーゼ。
【０１４１】
ある化合物対Ｃｈｋ１のＩＣ５０値は上述のように測定した。コンパレータ酵素に対する当該化合物のＩＣ５０値は改良ＥＬＩＳＡ法又は蛍光偏光を用いた専有技術基盤ＳｅｌｅｃｔＳｍａｒｔＴＭ（ＭＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｅｒｖｉｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を用いて測定した。全ての試験阻害剤は、試験コンパレータ酵素と比較してＣｈｋ１について少なくとも２０倍の選択性を示した。
【０１４２】
あるいは、これら各キナーゼについてのＩＣ５０を測定する分析は、米国特許公開第２００２／０１６５２１号、及びＷＯ９５／１９９８８を含む文献において以前に記載している。その双方をここに参照して取り込む。
実施例３
本発明のＣｈｋ１阻害剤が細胞内でのＣｈｋ１機能を阻害する
本発明のＣｈｋ１阻害剤が細胞内でのＣｈｋ１機能を阻害することを立証するために、阻害剤を分子細胞ベースのアッセイで試験することができる。哺乳類のＣｈｋ１はイン・ビトロでＣｄｃ２５Ｃをリン酸化することが示されており、ＤＮＡ損傷に反応してサイクリンＢ／ｃｄｃ２を負に調節することを示唆しているので、サイクリンＢ／ｃｄｃ２の活性を高めるＣｈｋ１阻害剤の能力を分析することができる。実験は以下のようにデザインすることができる：ＨｅＬａ細胞に８００ラドで照射し、３７℃で７ｈインキュベートする。これらの細胞は機能的にｐ５３ネガティブであるから、もっぱらＧ２で停止する。次いで、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）を０．５μｇ／ｍＬ濃度で添加し、細胞を３７℃で１５ｈインキュベートする。ノコダゾールの添加は、Ｇ２停止を通過してＭに移行するすべての細胞を捕捉するように設計される。最後に、Ｃｈｋ１阻害剤を８ｈかけて添加し、細胞を採取し、溶解し、製造者が示唆するようにサイクリンＢ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に対する抗体を用いた等量のタンパク質で免疫沈降した。次に免疫沈降物を、ヒストンＨ１キナーゼ活性を分析することによってサイクリンＢ−関連ｃｄｃ２キナーゼ活性について分析した（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，Ｄｅｃ．１１，１９９８；２７３（５０）：３３４５５−６４）。
【０１４３】
加えて、電離放射線誘導Ｇ２ＤＮＡ損傷チェックポイントを無効化する本Ｃｈｋ１阻害剤の能力を、分裂指数アッセイ実験を用いて立証することができる。ＨｅＬａ細胞（約１ｘ１０６）を上述のように処理する。細胞を遠心分離で採取し、ＰＢＳで一度洗浄した後、７５ｍＭ  ＫＣｌ２．５ｍＬ中に再懸濁し、再度遠心分離した。次に細胞を、新たに調製した冷ＨＯＡｃ：ＭｅＯＨ（１：３）３ｍＬ中に固定し、氷上で２０分間インキュベートする。細胞を沈殿させ、固定溶液を吸引してＰＢＳ０．５ｍＬ中に再懸濁する。固定した細胞１００μＬをガラス製顕微鏡用スライドにピペットで載せ、サンプルを固定溶液１ｍＬに浸すことにより有糸分裂展着液を作製する。次にスライドを空気乾燥し、ライト染色液（Ｓｉｇｍａ）で１分間染色した後、Ｈ２Ｏで一度洗浄し、５０％ＭｅＯＨで一度洗浄する。凝縮した染色体の存在、及び核膜の欠失により有糸分裂細胞を確認する。
実施例４
本発明のＣｈｋ１阻害剤は癌治療による細胞の殺傷を増強する
本発明の化合物によるＣｈｋ１の阻害によって標的細胞がＤＮＡ損傷剤の殺傷作用に敏感になることを証明するために、細胞を本発明のＣｈｋ１阻害剤の存在下でインキュベートし、放射又は化学ＤＮＡ損傷剤に露呈させることができる。９６ウェルのマイクロタイタープレートに１ウェルあたり１０００〜２０００個の密度で播種した細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＭＰＩ１６４０中、３７℃で１８時間、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータで増殖させる。試験細胞は、興味のある細胞又は細胞系であればいかなるもの（ＨｅＬａ，ＡＣＨＮ，７８６−０，ＨＣＴ１１６，ＳＷ６２０，ＨＴ２９，Ｃｏｌｏ２０５，ＳＫ−ＭＥＬ−５，ＳＫ−ＭＥＬ−２８，Ａ５４９，Ｈ３２２，ＯＶＣＡＲ−３，ＳＫ−ＯＶ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＣＦ−７，ＰＣ−３，ＨＬ−６０，Ｋ５６２，及びＭＯＬＴ４）も含み得る。全ての細胞系の表示は以下のヒト細胞系を参照する。
【０１４４】
【表３】
2008505112.tif 000027
細胞は化学療法剤単独、又は化学療法剤とＣｈｋ１阻害剤を含む媒体で処理する。細胞は約５日間インキュベートした後、３Ｈ−チミジン取り込み量を算定することにより増殖を測定する。化学療法剤は、エトポシド、ドキソルビシン、シスプラチン、クロラムブシル、５−フルオロウラシルを含む。細胞増殖を、未処理のコントロール細胞の９０％に阻害するのに必要な薬剤濃度をＧＩ９０と定義する。
【０１４５】
薬剤の殺傷作用を増強する能力を評価するために、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、２−クロロアデノシン、フルダラビン、アザシチジン、及びゲムシタビン等の追加の代謝拮抗物質と共に本発明の化合物を試験することができる。ゲムシタビンと組み合わせた場合のＨＴ２９結腸直腸癌の殺傷の増強を評価することによって、本発明の化合物を互いに比較することができる。
【０１４６】
さらに、放射線による殺傷を増強する本発明のＣｈｋ１阻害剤の能力を試験することができる。
実施例５
動物モデルでのＣｈｋ１阻害剤活性を測定する高感度アッセイ
齧歯類腫瘍モデルでのＣｈｋ１阻害剤活性を測定するのに以下の高感度アッセイを開発した。とりわけ、腫瘍モデルでのＣｈｋ１機能を阻止するＣｈｋ１阻害剤の能力を測定するため、及び分指標的にＣｈｋ１阻害剤が接近するのを容易にする条件の評価を可能にするために、特に上記アッセイを使用することができる。
【０１４７】
有糸分裂に特異的な事象である、セリン１０でのヒストンＨ３リン酸化（Ｈ３−Ｐ）をモニターすることによって有糸分裂指数を測定する定量的免疫蛍光アッセイを用いて、化学療法誘発チェックポイントを無効にする選択的Ｃｈｋ１阻害剤の能力を測定する（Ａｊｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７１：１３１９７−２０１，１９９６；Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｗ．，２７４：２５５４３−９，１９９９）。このアッセイの手順は以下のとおり。Ｃｈｋ１活性剤（本研究では化学療法剤）及び／又はＣｈｋ１阻害剤で処置した、又は未処理の齧歯類由来腫瘍を摘出し、パラフィン包埋をする。その腫瘍を６ミクロンの厚みにスライスし、スライドガラスに載せる。キシレン、１００％エタノール、９５％ＥｔＯＨ、７０％ＥｔＯＨ、及びＤＩＨ２Ｏを用いた３ｍｉｎの連続的処置によってスライドからパラフィンを除去する。次に１０ｍＭクエン酸ナトリウム中、９５℃で１０分間スライドを加熱した後、２０分間の冷却過程を行う。Ｂｌｏｃｋバッファ（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）中に２０％正常ヒト血清及び２％ウシ血清アルブミン）でスライドを３０分間阻止する。当該Ｂｌｏｃｋバッファで抗ホスホヒストンＨ３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．＃０６−５７０）を１：２００に希釈し、１スライドと共に１ｈインキュベートする。ＰＢＳＴで５ｍｉｎ、３度スライドを洗浄する。３０分かけて二次抗体ロバの抗うさぎローダミン（Ｊａｃｋｓｏｎ，ｃａｔ＃７１１−２９５−１５２）を添加する。次にＰＢＳＴで２度、スライドを洗浄、ＰＢＳ中の０．１μＭ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）７５μＭを添加して、３０分間染色をさせる。次にＰＢＳＴでスライドを２度以上洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ，ｃａｔ＃Ｈ−１４００）に搭載する。蛍光顕微鏡検査法を用いてスライドを観察する。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ４．６）を用いて、総（ＤＡＰＩ染色）細胞に対するＨ３−Ｐ抗体で染色した細胞の割合を定量化する。
実施例６
選択的Ｃｈｋ１阻害剤は、ＤＮＡ損傷誘発Ｇ２及びＳ相チェックポイントを無効にする
以前の複数の研究によって、選択的Ｃｈｋ１阻害剤はＤＮＡ損傷誘発Ｇ２／Ｍ及びＳ相チェックポイントを実質的に無効にすることが証明された。先の研究では、標的相がＧ２相であるところの電離放射線（ＩＲ）によってＤＮＡ損傷が誘発される。後の研究では、標的相がＳ相であるところの化学療法剤によってＤＮＡ損傷が誘発される。公開された米国特許出願公開第２００３／００６９２８４号、及びそこで引用された参考文献を参照。
【０１４８】
簡潔にいうと、有糸分裂指数実験によりＩＲ誘導Ｇ２ＤＮＡ損傷チェックポイントのＣｈｋ１阻害剤無効化を分析する。約１ｘ１０６個のＨｅＬａ細胞に８００ｒａｄで照射し、３７℃で７時間インキュベートをする。これらの細胞は機能的にｐ５３ネガティブであるから、もっぱらＧ２で停止する。次いで、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）を０．５μｇ／ｍＬ濃度で添加し、細胞を３７℃で１５ｈインキュベートする。（ノコダゾールの添加は、Ｇ２停止を通過して有糸分裂に移行する細胞を捕捉するように設計され、これによりさらにＧ１に進行するのを阻害しＭ相細胞の定量化を可能にする。）選択的Ｃｈｋ１阻害剤を８ｈかけて添加し、細胞を遠心分離で採取し、ＰＢＳで洗浄した後、７５ｍＭ  ＫＣｌ２．５ｍＬに再懸濁し、再度遠心分離する。次に細胞を、新たに調製した冷ＨＯＡｃ：ＭｅＯＨ（１：３）３ｍＬ中に固定し、氷上で２０分間インキュベートする。細胞を沈殿させ、固定溶液を吸引し細胞をＰＢＳ０．５ｍＬ中に再懸濁する。固定した細胞１００μＬをガラス製顕微鏡用スライドにピペットで載せ、サンプルを固定溶液１ｍＬに浸すことにより有糸分裂展着液を作製する。次にスライドを空気乾燥し、ライト染色液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）で１分間染色した後、水で一度洗浄し、５０％ＭｅＯＨで一度洗浄する。凝縮した染色体の存在、及び核膜の欠失により有糸分裂細胞を確認した。Ｃｈｋ１阻害剤は放射線の存在下で有糸分裂細胞の個数を増加させることになり、これによりＩＲ誘導Ｇ２体の無効化を証明する。このチェックポイント無効化は、細胞の有糸分裂への移行に必要なサイクリンＢ／−ｃｄｃ２活性の増強につながる。こうして、ＩＲ、次いでＣｈｋ１阻害剤で処置した細胞は損傷ＤＮＡを伴う有糸分裂に移行する。これら実験はＣｈｋ１がＩＲ誘導Ｇ２に関与するという仮定を確認するものである。
実施例７
Ｃｈｋ１阻害剤は異種移植腫瘍モデルでＣｈｋ１活性剤の存在下、腫瘍細胞に取り込まれる
異種移植腫瘍モデルでは、ヌードマウスの側腹にＨＴ２９結腸癌腫瘍を移植し、２００ｍｍ３まで成長させる。次にマウスを、３日あけて１日目と４日目に２度、媒体、３００ｍｇ／ｋｇＣｈｋ１阻害剤、２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビン、又は、３００ｍｇ／ｋｇＣｈｋ１阻害剤及び２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンの同時投与で処置する。Ｃｈｋ１阻害剤とゲムシタビンの同時投与により腫瘍保持マウスを処置すると、ゲムシタビン単独の場合と比較して腫瘍増殖が４日遅延する。
【０１４９】
腫瘍組織へのＣｈｋ１阻害剤の拡散を評価するために、Ｃｈｋ１阻害剤の血清及び組織レベルを測定する。Ａｌｚｅｔポンプを用いて、連続的な輸送システムで２４時間、ＨＴ２９腫瘍保持マウスに５００ｍｇ／ｋｇＣｈｋ１阻害剤を投与する。血清サンプルを採ってから、腫瘍、腎臓、肝臓、脾臓及び肺を採取する。時点は１、２、４、８、２４時間で集める。組織を抽出し、Ｃｈｋ１阻害剤のレブルを定量する。この実験は、Ｃｈｋ１阻害剤が正常及び腫瘍組織に浸透し、腫瘍組織で約１５μＭのレベルに達し、脾臓組織において８ｈで約２０μＭのピークに至る。すなわちＣｈｋ１阻害剤は増殖細胞に容易に取り込まれ、Ｃｈｋ１活性化学療法剤との併用で、増殖性疾患を治療する療法として有用である。
実施例８
Ｃｈｋ１阻害剤及びゲムシタビンで処置した腫瘍の用量反応
ゲムシタビン処置後のＣｈｋ１阻害剤の有効量と、用量依存的チェックポイント無効化が抗腫瘍活性と関連したか否かとを決定するために、用量反応に関する実験を行う。
【０１５０】
ヌードマウスにＨＴ２９腫瘍細胞を移植し、腫瘍を１０日間成長させた。開始時点での腫瘍は約１００ｍｍ３であった。動物をＭＴＤ（１６０ｍｇ／ｋｇ）のゲムシタビンで、その後５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、又は４００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１阻害剤で処置した。この実験でゲムシタビン前処置の時間は３２ｈである、この時間がこの種の腫瘍に最適であることを、細胞に基づいたアッセイが示したので。各治療計画での腫瘍容積の分析は、ＨＴ２９腫瘍保持マウスを上述の療法で処置すると、ゲムシタビン単独の場合よりも腫瘍成長が遅延することを示し、２００ｍｇ／ｋｇ又は４００ｍｇ／ｋｇのＣｈｋ１阻害剤及びゲムシタビンはＣｈｋ１阻害剤の用量依存性効果を示した。
実施例９
ある薬剤がＣｈｋ１活性剤であるか否かを決定するためのアッセイ
ある薬剤がＣｈｋ１活性剤であるか否かを決定するために、Ｃｈｋ１における特異的なリン酸化部位に対するホスホ特異的抗体を用いてＣｈｋ１のリン酸化状態を測定することができる。セリン３１７及び３４５は、電離放射線、紫外線、ヒドロキシ尿素、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、及びゲムシタビンで細胞を処置した後にリン酸化されることが示されている。Liu et al. , Genes Dev. 14:1448-59, 2000; Zhao et al. , MoI. Cell Biol. 21:4129-39, 2001; Lopez-Gironaet al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:11289-94, 2001; Guo et al . , Genes Dev. 14:2745-56, 2000; Gatei et al. , J. Biol. Chem. 278:14806-11, 2003; Ng et al., J Biol Chem. 279 (10) -.8808-19, 2004; Wang et al. , Natl Acad Sci U S A. 100 (26) :15387-92, 2003; Stojicet al . , Genes Dev. 18 (11) :1331-44, 2004. These serine sites are phosphorylated by upstream checkpoint kinases, Atm and Atr. Liu et al. , Genes Dev. 14:1448-59, 2000; Zhao et al. MoI. Cell Biol., 21:4129-39, 2001.
候補Ｃｈｋ１活性剤に応えたこれら部位のリン酸化は、腫瘍細胞のウェスタンブロット又は免疫組織化学によるモニターすることができる。例えば、ゲムシタビンがセリン３４５及び３１７でのＣｈｋ１活性につながることを証明するのに以下の手法を使用することができる。ＨＴ２９細胞を２０μＭゲムシタビンで２ｈ処置する。ゲムシタビンを細胞成長媒体から洗い出し、さらに２２ｈ、細胞をインキュベートする。タンパク質溶解物を調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転移し、リン酸化したセリン３１７又は３４５のいずれか（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）に特異的な抗血清（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）でプローブする。ウェスタンブロットは、ＨＴ２９結腸癌細胞のゲムシタビン処置がセリン３１７及び３４５双方のリン酸化につながることを示す。
実施例１０
Ｃｈｋ１阻害剤に応えたＣｈｋ１阻害剤をモニターするためのアッセイ
セリン２９６でのＣｈｋ１のリン酸化がゲムシタビンによる腫瘍細胞の処置で促進され、この部位でのリン酸化がＣｈｋ１阻害剤で阻害されることが見出された。この部位でのリン酸化は、Ａｔｍ及びＡｔｒを阻害するウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）では阻害されない。従って、セリン２９６のリン酸化はセリン３１７及び３４５でのリン酸化とは相違するものである。加えて、精製したＣｈｋ１調製物中ではこの部位がリン酸化されることが見出され、精製酵素が自身を、又は他のＣｈｋ１分子をセリン２９６においてリン酸化する能力があることを示唆している。総合すれば、これらのデータはセリン２９６でのリン酸化がＣｈｋ１自身によって行われることを示している。従って、Ｃｈｋ１活性剤に応えて腫瘍中でのＣｈｋ１活性をモニターするのにこのアプローチを使用することができる。さらに、このアプローチは、Ｃｈｋ１阻害剤によるＣｈｋ１活性の阻害を測定するのにも使用することができる。
【０１５１】
すなわち、２０μＭのゲムシタビンで２ｈ、ＨＴ２９細胞を処置する。ゲムシタビンを細胞成長媒体から洗い出し、さらに２２ｈ、細胞をインキュベートする。タンパク質溶解物を調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転移し、リン酸化したセリン２９６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）に特異的な抗血清（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）でプローブする。ウェスタンブロットは、ＨＴ２９結腸癌細胞のゲムシタビン処置がセリン２９６のリン酸化につながることを示す。さらに、選択的Ｃｈｋ１阻害剤で１５ｍｉｎ処置したＨＴ２９細胞はセリン２９６リン酸化を示さない。これらのデータはセリン２９６リン酸化がＣｈｋ１キナーゼによって行われることを示唆している。
実施例１１
動物腫瘍モデル
マウスにおいてＤＮＡ損傷剤による腫瘍の殺傷を増強する本発明のＣｈｋ１阻害剤の能力を試験するため、結腸腫瘍細胞系を用いた異種移植腫瘍モデルを確立する。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はゲムシタビンをＤＮＡ損傷剤として使用することができる。６〜８週齢の胸腺Ｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスで異種移植腫瘍を増殖させるのに、ＨＴ２９及びＣｏｌｏ２０５（ヒト結腸癌）及びＨ４６０及びＣａｌｕ−６（非小細胞癌）細胞を使用することができる。マウスを、薄板状の空気キャビネット中、無菌条件下に飼育し、殺菌した食料と水を無制限に給餌した。細胞系を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミンを加えたＲＭＰＩ１６４０媒体中、５％ＣＯ２加湿雰囲気で準密集状態に成長させる。ひとつの細胞懸濁液をＣＭＦ−ＰＢＳ中に調製し、細胞濃度を１ｘ１０８細胞／ｍＬに調製する。マウスの右脇腹又は右脚の皮下（ｓ．ｃ．）に総数１×１０７個の細胞（１００μＬ）を接種する。
【０１５２】
マウスを４つの処置グループに無作為に分け（５−１５匹マウス／グループ）、腫瘍が７５〜１００ｃｍ３の体積に達したとき（通常、接種の７〜１１日後）に使用する。腫瘍をノギスで計測し、腫瘍体積を以下の経験式を用いて予測する：腫瘍体積（ｃｍ３）＝腫瘍長さ（ｃｍ）×腫瘍幅（ｃｍ）×腫瘍深さ（ｃｍ）／３．３。処置はｉ）１６０ｍｇ／ｋｇでのゲムシタビンの１００μＬ腹腔内（ｉ．ｐ）投与からなる。ゲムシタビンで処置したマウスでは腫瘍成長の遅れが観察される。１６０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンとＣｈｋ１阻害剤の経口投与との組合せでマウスを処置すると、腫瘍体積が減少し、延命することが期待される。腫瘍の大きさは実験期間中、１日おきにモニターする。
【０１５３】
上述した本発明の多数の修正及び変更を、その真意及び範囲から逸脱することなくなすことができるのは自明であるから、添付の請求項で示されている限定のみが課されるべきである。
【配列表】
2008505112000001.app
【国際調査報告】
2008505112.tif 000033
2008505112.tif 000034
2008505112.tif 000035
2008505112.tif 000036
2008505112.tif 000037