(57)【要約】  精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法が記載される。細胞溶解後のｐＨ低下を利用した結果として、タンパク質の規格を一貫して満たす精製された多糖と、精製プロセスの間のより高い多糖回収率とが生じた。
2008535490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法であって、
（ａ）（ｉ）ダイズベースの培地を含有する第１容器に、選択された血清型の種培養原液を接種し、成長必要量を満たすまでその第１容器をインキュベートし、および
（ｉｉ）ダイズベースの培地を含有する第２容器に、工程（ｉ）からの培養物を、第２容器中で安定なｐＨおよび温度を維持しながら接種すること
を含む、ダイズベースの培地にて選択されたエス．ニューモニエ血清型を成長させる工程と；
（ｂ）界面活性剤を用いて、工程（ａ）で生産された細菌細胞を溶解させ、それによって、可溶性タンパク質、細胞の残骸、核酸、および多糖を含有する溶解物を生産する工程と；
（ｃ）完全な溶解および多糖の放出を確実にするのに十分な時間、細胞溶解物を撹拌する工程と；
（ｄ）細胞溶解物のｐＨを５．５未満に低下させて界面活性剤および大部分の可溶性タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で形成した溶液および沈殿物を、沈殿物を沈降させるのに十分な時間撹拌せずに維持する工程と；
（ｆ）遠心分離および／または濾過により、溶液および沈殿物を処理する工程と
を含み、それにより、溶液中の莢膜多糖が維持され、可溶性タンパク質を効果的に減少させる、方法。
【請求項２】
選択されるストレプトコッカス・ニューモニエの血清型が１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆまたは１９Ａであるところの、請求項１記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムであるところの、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）のｐＨを４．５と５．５未満の間に低下させるところの、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）のｐＨが水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたはその組合せの塩基の供給により維持されるところの、請求項１記載の方法。
【請求項６】
精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法であって、
（ａ）ダイズベースの培地中で、出発容器から生産規模の容器まで漸増する容量で、選択されたエス．ニューモニエ血清型を増大させ、細胞の成長の間に安定なｐＨおよび温度を維持する工程と；
（ｂ）界面活性剤を用いて、工程（ａ）で生産された細菌細胞を溶解させ、それにより可溶性タンパク質、細胞の残骸、核酸、および多糖を含有する溶解物を生産する工程と；
（ｃ）完全な溶解および多糖の放出を確実にするのに十分な時間、細胞溶解物を撹拌する工程と；
（ｄ）細胞溶解物のｐＨを５．５未満に低下させて界面活性剤および大部分の可溶性タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で形成した溶液および沈殿物を、沈殿物を沈降させるのに十分な時間撹拌せずに維持する工程と；
（ｆ）遠心分離および／または濾過により溶液および沈殿物を処理する工程と
を含み、それにより、溶液中の莢膜多糖が維持され、可溶性タンパク質を効果的に低減させる、方法。
【請求項７】
選択されるストレプトコッカス・ニューモニエの血清型が１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆまたは１９Ａであるところの、請求項６記載の方法。
【請求項８】
界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムであるところの、請求項６記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）のｐＨを４．５と５．５未満の間に低下させるところの、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）のｐＨが水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたはその組合せの塩基の供給により維持されるところの、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法であって、
（ａ）ダイズベースの培地中で、出発容器から生産規模の容器まで漸増する容量で、血清型１、４、６Ａ、６Ｂおよび７Ｆからなる群より選択されたエス．ニューモニエ血清型を増大させ、細胞の成長の間に安定なｐＨおよび温度を維持し、そのｐＨが水酸化ナトリウムで維持される工程と；
（ｂ）界面活性剤を用いて、工程（ａ）で生産された細菌細胞を溶解させ、それにより可溶性タンパク質、細胞の残骸、核酸、および多糖を含有する溶解物を生産する工程と；
（ｃ）完全な溶解および多糖の放出を確実にするのに十分な時間、細胞溶解物を撹拌する工程と；
（ｄ）細胞溶解物のｐＨを５．５未満に低下させて界面活性剤および大部分の可溶性タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で形成した溶液および沈殿物を、沈殿物を沈降させるのに十分な時間撹拌せずに維持する工程と；
（ｆ）遠心分離および／または濾過により溶液および沈殿物を処理する工程と
を含み、それにより、溶液中の莢膜多糖は維持され、可溶性タンパク質を効果的に低減させる、方法。
【請求項１２】
界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムであるところの、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）のｐＨを４．５と５．５未満の間に低下させるところの、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法であって、
（ａ）炭酸水素ナトリウムを補足したダイズベースの培地中で、出発容器から生産規模の容器まで漸増する容量で、エス．ニューモニエ血清型５を増大させ、細胞の成長の間に安定なｐＨおよび温度を維持し、そのｐＨが水酸化ナトリウムで維持される工程と；
（ｂ）界面活性剤を用いて、工程（ａ）で生産された細菌細胞を溶解させ、それにより可溶性タンパク質、細胞の残骸、核酸、および多糖を含有する溶解物を生産する工程と；
（ｃ）完全な溶解および多糖の放出を確実にするのに十分な時間、細胞溶解物を撹拌する工程と；
（ｄ）細胞溶解物のｐＨを５．５未満に低下させて界面活性剤および大部分の可溶性タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で形成した溶液および沈殿物を、沈殿物を沈降させるのに十分な時間撹拌せずに維持する工程と；
（ｆ）遠心分離および／または濾過により溶液および沈殿物を処理する工程と
を含み、それにより、溶液中の莢膜多糖が維持され、可溶性タンパク質を効果的に低減させる、方法。
【請求項１５】
界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムであるところの、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）のｐＨを４．５と５．５未満の間に低下させるところの、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法であって、
（ａ）炭酸水素ナトリウムを補足したダイズベースの培地中で、出発容器から生産規模の容器まで漸増する容量で、エス．ニューモニエ血清型１９Ａを増大させ、細胞の成長の間に安定なｐＨおよび温度を維持し、そのｐＨが水酸化ナトリウムで維持される工程と；
（ｂ）界面活性剤を用いて、工程（ａ）で生産された細菌細胞を溶解させ、それにより可溶性タンパク質、細胞の残骸、核酸、および多糖を含有する溶解物を生産する工程と；
（ｃ）完全な溶解および多糖の放出を確実にするのに十分な時間、細胞溶解物を撹拌する工程と；
（ｄ）細胞溶解物のｐＨを５．５未満に低下させて界面活性剤および大部分の可溶性タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で形成した溶液および沈殿物を、沈殿物を沈降させるのに十分な時間撹拌せずに維持する工程と；
（ｆ）遠心分離および／または濾過により溶液および沈殿物を処理する工程と
を含み、それにより、溶液中の莢膜多糖が維持され、可溶性タンパク質を効果的に低減させる、方法。
【請求項１８】
界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムであるところの、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）のｐＨを４．５と５．５未満の間に低下させるところの、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎球菌多糖の生産に使用されるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（エス．ニューモニエ）血清型の細胞溶解物から過剰の可溶性タンパク質を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン製品に利用されるエス．ニューモニエの各血清型についての莢膜多糖は、複合液体培地中でこの生物を成長させることにより生産される。この生物の個体数は、多くの場合、種培養バイアルから種培養ボトルにスケールアップされ、生産規模の発酵容量に達するまで、漸増する容量の１つまたは複数の種発酵槽を経て継代される。成長周期の終止は、いくつかの手段の１つにより判定することができ、その時点で、細胞壁の破壊と、細胞が定常期に達すると細胞の溶解を引き起こす自己溶菌酵素の放出とを助ける界面活性剤の添加により、細胞は溶解される。次に、下流の（精製）処理のために溶解物ブロスが採集される。この精製には、細菌細胞を囲む莢膜多糖を回収するためのいくつかのカラムクロマトグラフィー工程およびダイアフィルトレーション工程が含まれる。この多糖は、ＣＲＭ１９７などの高分子量タンパク質と結合され、多血清型の結合体を含有するワクチンに処方されると、例えば乳幼児などの標的個体群に注射された場合に（エス．ニューモニエに対する）免疫を付与することを助ける。
【０００３】
ワクチンによる有害事象のリスクを減らすために、各血清型の精製多糖中のタンパク質含量について規格が定められている。例えば、現在市販されている７価結合型肺炎球菌（７ｖＰｎＣ）ワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標））では、血清型４の精製多糖中のタンパク質含量についての規格は、乾燥重量に基づいて３％を超えず、血清型６Ｂの精製多糖について、規格は２％を超えないというものである。
【０００４】
いくつかの場合では、全精製プロセスの後でまだ存在する残留タンパク質を除去することは困難であることが立証された。細胞溶解物の精製処理の変更によりこの問題に取り組むためになされた努力は、中程度の成功を収めただけであった。
【０００５】
したがって、このプロセスの上流側でこの問題に取り組むことが決意された。主な混入タンパク質は、細胞の成長および完全性に重大であると判定された。したがって、総タンパク質を減少させるために利用できる残りの選択肢は、成長条件および／または採取条件を改変することからなった。
【０００６】
発酵プロセスはかなり簡単である。細胞（種培養）は、ダイズベースの培地のボトル中で増大され、次に１つまたは２つの種培養発酵槽を経て、最終的に生産規模の発酵槽に継代される。各工程で、温度およびｐＨは厳密にモニターされ、ｐＨは塩基物質（２０％炭酸ナトリウム）の添加により制御される。成長がある点に達すると、細胞溶解プロセスを開始するデオキシコール酸（ＤＯＣ）ナトリウムなどの界面活性剤の導入により、運転は終了する。維持期の後で、溶解物ブロスのｐＨを６．６に調整してデオキシコール酸と細胞膜との複合体を沈殿させる。この物質は、遠心分離による処理まで維持され、固体を除去するために濾過が行われることもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、大部分のタンパク質は清澄な溶解物中に溶解したままであり、そのせいで精製多糖中の残留タンパク質含量は規格を超える。したがって、いくつかの肺炎球菌血清型中の可溶性タンパク質レベルを発酵プロセスまたは精製プロセスのいずれかの間に低下させる必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法を提供することにより、この必要性を満たす。この方法は、
（ａ）（ｉ）ダイズベースの培地が入っている第１容器に、選択された血清型の種培養原液を接種し、成長必要量を満たすまでその第１容器をインキュベートすること、および
（ｉｉ）ダイズベースの培地が入っている第２容器に工程（ｉ）からの培養物を、第２容器中で安定なｐＨおよび温度を維持しながら接種すること
を含む、ダイズベースの培地で選択されたエス．ニューモニエ血清型を成長させる工程と；
（ｂ）界面活性剤を用いて、工程（ａ）で生産された細菌細胞を溶解することによって、可溶性タンパク質、細胞の残骸、核酸、および多糖を含有する溶解物を生産する工程と；
（ｃ）完全な溶解および多糖の放出を確実にするのに十分な時間、細胞溶解物を撹拌する工程と；
（ｄ）細胞溶解物のｐＨを５．５未満に低下させて界面活性剤および大部分の可溶性タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で形成した溶液および沈殿を、沈殿を沈降させるのに十分な時間撹拌せずに維持する工程と；
（ｆ）遠心分離および／または濾過により、溶液および沈殿を処理する工程と
を含み、それにより、溶液中の莢膜多糖は維持され、可溶性タンパク質は効果的に減少する。
【０００９】
本発明のこの実施形態のために選択される非限定的なエス．ニューモニエ血清型の例は、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、および１９Ａである。本発明の特定の実施形態では、そして工程（ａ）で成長する血清型に応じて、工程（ａ）における発酵ｐＨは、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、またはその組合せの塩基の供給により維持される。別の実施形態では、工程（ｄ）におけるｐＨは４．５から５．５未満に低下される。なお別の実施形態では、界面活性剤はデオキシコール酸ナトリウムである。
【００１０】
この発明は、精製前にストレプトコッカス・ニューモニエの複合細胞溶解物ブロス中のタンパク質含量を減少させ、莢膜多糖含量を維持するための方法にも関する。この方法は、
（ａ）ダイズベースの培地中で、出発容器から生産規模の容器まで漸増する容量で、選択されたエス．ニューモニエ血清型を増大させ、細胞の成長の間に安定なｐＨおよび温度を維持する工程と；
（ｂ）界面活性剤を用いて、工程（ａ）で生産された細菌細胞を溶解させることにより、可溶性タンパク質、細胞の残骸、核酸、および多糖を含有する溶解物を生産する工程と；
（ｃ）完全な溶解および多糖の放出を確実にするのに十分な時間、細胞溶解物を撹拌する工程と；
（ｄ）細胞溶解物のｐＨを５．５未満に低下させて界面活性剤および大部分の可溶性タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で形成した溶液および沈殿を、沈殿を沈降させるのに十分な時間撹拌せずに維持する工程と；
（ｆ）遠心分離および／または濾過により溶液および沈殿を処理する工程と
を含み、それにより、溶液中の莢膜多糖は維持され、可溶性タンパク質は効果的に低減する。
【００１１】
本発明のこの実施形態のために選択される非限定的なエス．ニューモニエ血清型の例は、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、および１９Ａである。本発明の特定の実施形態では、そして工程（ａ）で成長される血清型に応じて、工程（ａ）における発酵ｐＨは、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、またはその組合せの塩基の供給により維持される。別の実施形態では、工程（ｄ）におけるｐＨは４．５から５．５未満に低下される。なお別の実施形態では、界面活性剤はデオキシコール酸ナトリウムである。
【００１２】
血清型が血清型５または１９Ａであるなお別の実施形態では、ダイズベースの培地に重炭酸ナトリウムが補充されている。
【００１３】
本発明は、細胞溶解物から大量の過剰のタンパク質混入物の除去を可能にすることにより、より清浄な精製用産物（無細胞ブロスすなわちＣＦＢ）を残すので、それにより、一般に以前の発酵および回収法を使用して可能であったよりも高い多糖の回収および総多糖の収率が得られるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、グラム陽性の槍形球菌であり、通常は対（双球菌）の形で見られるが、短い連鎖または単細胞の形でも見られる。これらの細菌は血液寒天平板上で輝くコロニーとなって容易に成長し、嫌気的に成長しない限りα溶血を示し、嫌気的な場合はβ溶血を示す。これらの細菌は、細胞自体の酵素である自己溶菌酵素の存在下で細胞壁を破壊することができる胆汁塩に感受性である。この生物は通性嫌気性菌であり、栄養物の複合要求性を有する点で選好性である。
【００１５】
大部分の肺炎球菌血清型の細胞は、各細胞を囲む多糖被覆である莢膜を有する。この莢膜は、抗体が細菌細胞に接着することを防止することによって食作用を妨害することから、ヒトにおける病原性の決定因子である。現在同定されている莢膜血清型は９０個あり、２３個の血清型が侵入性疾患の約９０％の原因である。ワクチンとしての多糖外被は、発達した、または未障害の免疫系を有する個体に（エス．ニューモニエに対する）妥当な程度の免疫を付与することができるが、多糖との複合タンパク質は、乳児および高齢者（高齢者もまた肺炎球菌感染のリスクに最もさらされている）における免疫反応を可能にする。溶解（死滅）した細菌からこの莢膜多糖を分離し、可能な限り多くの細胞の残骸を除去できることが重要である。本明細書に記載するように、この除去は、一連の発酵プロセスの変更で実現された。
【００１６】
下流の処理を顕著に改善した３つの大きな変更は、次の通りである：（１）可能ならば発酵の供給塩基を炭酸ナトリウムから水酸化ナトリウムに換えること、（２）デオキシコール酸塩の維持時間に発酵槽内の撹拌を維持すること、および（３）デオキシコール酸塩を用いた溶解物の維持後にｐＨを５．５未満に下げること。
【００１７】
最初の発見は、ｐＨを５．５未満に下げることにより、下流の処理（精製）前に細胞溶解物から望ましくない可溶性タンパク質の５０〜９０％を除去できたことであった。これは非常に重要なプロセス向上となったが、発酵運転の間に設定値のｐＨを維持するために多量の炭酸ナトリウムを使用することにより、酢酸を用いてｐＨを５．０に調整した場合に深刻な発泡の問題が起こった。溶液中に存在する多数の形の炭酸塩が原因で、調整後に安定なｐＨを維持することは困難であることも見出された。これにより、発酵ブロス中に炭酸塩の蓄積を生じないであろう代替の供給塩基を調べることになった。接種前の培地および種培養ボトルのｐＨ調整にすでに使用されていたことから、水酸化ナトリウムが選択された。最大１００Ｌの発酵の実験から、水酸化ナトリウムは吸光度（ＯＤ）に基づく成長にわずかな減少を伴う実行可能な代替物であることが示された。この塩基は発泡の問題もまた解決した。水酸化ナトリウム以外の塩基も使用することができ、例えば血清型５および１９Ａなどで、この生物が成長を維持するためにある形の炭酸塩を必要とすると判定された場合に、重炭酸ナトリウムを補充物として使用することができる。血清型１９Ａについてのように、炭酸ナトリウムが主な供給塩基として使用されるならば、溶解後の（５．５未満のｐＨへの）ｐＨ調整には、発泡を回避するために低速多時間制御型の酸添加が必要である。
【００１８】
最終的に、研究室での観察に基づき、デオキシコール酸塩の維持が（以前のプロトコールにおけるように）撹拌なしに進行したならば、発酵槽の壁およびｐＨプローブにゲル様の沈殿が付着するであろうと判定された。これにより、ｐＨを調整した場合に信頼できないｉｎ−ｓｉｔｕのｐＨ読み取り値が生じた。撹拌工程はこの沈殿が形成することを防止し、ｐＨプローブの完全性を維持させた。
【００１９】
したがって、ここに請求される発明において、選択されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型が、例えば酵素消化されたダイズ性製品、塩化ナトリウム、一塩基性リン酸カリウム、塩化カルシウム、および選択されたアミノ酸からなる滅菌培地中で、出発種培養バイアルから漸増する容量で増大される。硫酸マグネシウムを含むデキストロースは、液体培地中での成長を維持するための炭素源として使用される。その培地に、特定の血清型またはプロセスによって必要とされる他の添加物もまた補充してもよい。培養は種培養ボトルなどの第１容器で開始する。対流性インキュベーター中での成長時間後に、その第１容器を使用して種培養発酵槽などの第２容器に接種し、今度はその第２容器を使用して、生産規模に達するまで、所望であれば生産発酵槽などの少なくとも１つの段階的に大きな容器に接種することができる。一実施形態では、選択されたエス．ニューモニエ血清型を、出発種培養バイアルから種培養ボトルに、２０Ｌ発酵槽に、２００Ｌ発酵槽に、２０００Ｌ生産発酵槽にと漸増する容量で増大させる。次の発酵規模に培養物をいつ移すべきか、そして回分運転をいつ終了すべきかを判定するために、成長パラメーターの吸光度、温度、およびｐＨを厳密にモニターする。
【００２０】
細菌が定常期に入ると、生産発酵槽中の細胞は、陰イオン性界面活性剤または陽イオン性界面活性剤などの界面活性剤の添加により強制的に溶解される。当該界面活性剤の代表的な例には、デオキシコール酸ナトリウム、Ｎ−ラウリルサルコシン、ケノデオキシコール酸ナトリウム、およびサポニンがある。プロセスの第２期は、完全に細胞が死滅したことを確実にするのに十分な時間、例えば８から２４時間、そして７℃から１３℃の温度で細胞溶解物を撹拌後に、５０％酢酸などの酸溶液を用いて細胞溶解物のｐＨをｐＨ５．５未満に低下させることである。強い生産プロセスに必要な一貫した基準で最終精製タンパク質の規格内にすることができるという目的で、実際のｐＨ低下は血清型により変動する。本発明の特定の実施形態では、ｐＨは４．５から５．５未満に低下される。
【００２１】
ｐＨ低下工程は、以前に可溶性であったタンパク質の「塩析」（沈殿）を引き起こす。これは、等電点に達するときのタンパク質に関する周知の化学作用である。本発明においてこの工程を独特にしているのは、塩析が高度複合細胞溶解物ブロス中の精製工程として使用されていることである。このブロスは、培地成分、ＤＮＡ、タンパク質、多糖、ＲＮＡ、および他の細胞の残骸を含有することから「複合」と定義される。
【００２２】
酢酸に加えて、請求された方法は、硫酸およびリン酸を用いても機能することが示され、これらの酸が一部をなすホフマイスター系列に従う様々な効率で機能するはずである。ホフマイスター系列は、様々な陰イオンおよび陽イオン、ならびにそれらがタンパク質混合物を沈殿させる能力の順位である。溶液中の（ホフマイスター系列における）これらの化合物の終濃度が、様々なタンパク質の最終的な溶解度を決定する。
【００２３】
沈殿を沈降させるのに十分であり、それにより例えば温度１５℃から２５℃で１２から２４時間などの連続遠心分離プロセスを援助する撹拌しない維持時間の後に、以前に可溶性であったタンパク質（および他の以前に可溶性であった混入成分のおそらく一部）のかなりの部分が固体沈殿として溶液から降下し、溶液中に残留する多糖産物の損失も分解もほとんどない。
【００２４】
次に、連続遠心分離またはその代わりに標準的なボトルの遠心分離により、沈殿を有するこの溶液が処理される。多糖を含有する上清を収集し、粒子濾過または精密濾過に流してから、下流の濃縮および精製に移す。
【００２５】
本発明の方法に使用する結果は図に示す。図１は、エス．ニューモニエ血清型４についての細胞溶解物ブロスに関してｐＨを６．８から５．０に低下させるために酢酸を使用して観察されたタンパク質の減少の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。左端のレーンはタンパク質分子量についての参照として使用した分子量マーカーである。試料レーン１（「Ｃ」）は、ｐＨを調整されなかった対照である。数字は、２つの主タンパク質混入物のバンド（４８ｋＤａおよび３９ｋＤａ）の近似値（溶解物ブロス中のｇ／Ｌ）および全レーンにおける総タンパク質もまた示す。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析のために供された一定分量の試料に含有される総多糖の収率もまた示す。レーン２〜８はｐＨを調整した試料からの同情報を示す。レーン９〜１１は基本的な一次回帰分析によりタンパク質の収率を決定するために使用したＢＳＡ標準である。ｐＨ６．８の試料に関してはＰｓ分析を行わなかった。この特定の血清型では、多糖（Ｐｓ）のおよそ中程度の損失があったが、その損失はｐＨ低下によるタンパク質損失よりもずっと低い割合であった。
【００２６】
図２は、細胞溶解物のｐＨを５．０に低下させた場合のエス．ニューモニエ血清型６Ｂの細胞溶解物中のタンパク質減少を多糖収率の安定性と共にプロットして示すグラフである。この血清型では多糖の損失は見られなかった。対照的に、総タンパク質の半分超が減少した。
【００２７】
図３は、細胞溶解物のｐＨを５．０に低下させた場合のエス．ニューモニエ血清型１の細胞溶解物中のタンパク質減少を多糖収率の安定性と共にプロットして示すグラフである。多糖濃度の変化はほとんど観察されなかった。対照的に、総タンパク質の９０％超が減少した。
【００２８】
図４は、細胞溶解物のｐＨを４．１に低下させた場合のエス．ニューモニエ血清型５の細胞溶解物中のタンパク質減少を多糖収率の安定性と共にプロットして示すグラフである。非常に低いｐＨまで多糖濃度にほとんど変化が観察されなかった。この変化は、添加された酸の量に起因する希釈効果が原因とされた。対照的に、総タンパク質はｐＨ４．５で７５％超が減少した。
【００２９】
図５は、細胞溶解物のｐＨを４．５に低下させた場合のエス．ニューモニエ血清型６Ａの細胞溶解物中のタンパク質減少を多糖収率の安定性と共にプロットして示す、２回の異なる発酵運転のグラフである。多糖濃度にほとんど変化は観察されなかった。このグラフは、Ｎａ２ＣＯ３の代わりにＮａＯＨを使用した場合に多糖濃度は維持されたが、タンパク質濃度が減少したこともまた示す。
【００３０】
図６は、細胞溶解物のｐＨを４．８に低下させた場合のエス．ニューモニエ血清型７Ｆの細胞溶解物中のタンパク質減少を多糖収率の安定性と共にプロットして示すグラフである。多糖濃度にほとんど変化は観察されなかった。対照的に、総タンパク質はｐＨ４．８で８０％超が減少した。
【００３１】
下の表１は、本発明の方法が利用された後の、最終精製された多糖からのタンパク質減少および多糖増加の一部を示すものである。
【００３２】
【表１】
2008535490.tif 000003
【００３３】
上に概略した発酵プロセスの変更は、精製処理前に溶解物ブロスのタンパク質含量を顕著に減少させるように作用する。これにより、多糖の回収についての現行の精製プロセスをあまり変更せずに、精製産物がタンパク質の規格に適合するようになった。これらの変更の予想外の利点は、ＯＤにより決定されたやや低い成長にかかわらず、総精製多糖収率が２５〜１００％改善したことであった。これは、発酵／回収プロセスの強い改善であり、この改善は、肺炎球菌多糖の生産を顕著に高めることができる。
【００３４】
上記開示は、一般に本発明を記載するものである。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、単に例示の目的で記載され、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
エス．ニューモニエ血清型１、６Ａ、および７Ｆの細胞溶解物中のタンパク質の減少
マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクの調製
エス．ニューモニエ血清型１をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）６３０１株から得た。エス．ニューモニエ血清型６Ａおよび７Ｆはニューヨーク州立大学のＧｅｒａｌｄ  Ｓｈｉｆｆｍａｎ博士から得た。その株を増大させ、動物起源の成分を除去するために数世代の種培養原液を作った（Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３世代）。種培養原液のさらなる２世代を生産した。このさらなる第１世代はＦ３バイアルから作り、次の世代は追加の第１世代のバイアルから作った。凍結保存剤として合成グリセロールを用いて、種培養バイアルを凍結保存した（＜−７０℃）。凍結したバイアルに加えて、Ｆ４世代について凍結乾燥バイアルを用意した。細胞バンクの調製物について、全ての培養物をダイズベースの培地中で成長させた。凍結前に、遠心分離により細胞を濃縮し、使用済みの培地を除去し、合成グリセロールなどの凍結保存剤を含有する新鮮培地中に細胞のペレットを再懸濁した。
【００３６】
発酵および回収
ワーキングセルバンクからの培養物を使用して、ダイズベースの培地が入っている種培養ボトルに接種した（表２）。成長必要量を満たすまで、撹拌せずにボトルを３６±２℃でインキュベートした。種培養ボトルを使用して、ダイズベースの培地が入っている種培養発酵槽に接種した。３Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを約７に維持した。標的吸光度に達した後で、種培養発酵槽を使用してダイズベースの培地が入っている生産発酵槽に接種した。３Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを維持した。成長の停止後に、または発酵槽の作業容量に達したときに発酵を終了した。ブロス中に０．１２％〜０．１３％濃度となり、細菌細胞を溶解させ細胞関連多糖を放出させるように、適切な量の滅菌１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加した。溶解後に、発酵槽の内容物を７℃から１３℃の温度で８から２４時間の時間間隔で撹拌して、完全な細胞溶解および多糖の放出を確実に起こした。この維持時間中の撹拌は、溶解物の沈渣が発酵槽の壁およびｐＨプローブに付着するのを防止することにより、ｐＨプローブの完全性を維持させた。次に、５０％酢酸を用いて、溶解された培養ブロスのｐＨを約ｐＨ５．０に調整した。温度１５℃から２５℃で１２から２４時間の時間間隔で撹拌しない維持時間後に、以前に可溶性であったタンパク質のかなりの部分が固体沈殿として溶液から沈み、溶液中に残留した多糖の損失も分解もほとんどなかった。次に、連続フロー遠心分離に続くデプスフィルター処理および０．４５μｍの精密濾過により、沈殿を有する溶液を清澄にした。
【００３７】
小規模では、上記プロセスは血清型４および６Ｂについて総タンパク質の顕著な減少もまた招いた（図１および２）。これは、大規模でこれらの２つの血清型についてこのプロセスが機能するであろうことを示している。（エス．ニューモニエ血清型４および６Ｂもまた、ニューヨーク州立大学のＧｅｒａｌｄ  Ｓｈｉｆｆｍａｎ博士から入手した）。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
実施例２
エス．ニューモニエ血清型５の細胞溶解物中のタンパク質の減少
エス．ニューモニエ血清型５は、ニューヨーク州立大学（ブルックリン、ニューヨーク）のＧｅｒａｌｄ  Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ博士から入手した。細胞バンクシステムの調製については、実施例１を参照されたい。
【００４０】
発酵および回収
ワーキングセルバンクからの培養物を使用して、上（表２）に記載したダイズベースの培地が入っている種培養ボトルに接種した。この培地には滅菌ＮａＨＣＯ３溶液を１０ｍＭ濃度で補充してあった。成長必要量を満たすまで、撹拌せずにボトルを３６±２℃でインキュベートした。種培養ボトルを使用して、１０ｍＭ濃度のＮａＣＯ３を有するダイズベースの培地が入っている種培養発酵槽に接種した。３Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを約７．０に維持した。標的吸光度に達した後で、種培養発酵槽を使用して１０ｍＭ濃度のＮａＣＯ３を有するダイズベースの培地が入っている生産発酵槽に接種した。３Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを維持した。成長の停止後に、または発酵槽の作業容量に達したときに発酵を終了した。ブロス中に０．１２％〜０．１３％濃度となり、細菌細胞を溶解させ細胞関連多糖を放出させるように、適切な量の滅菌１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加した。溶解後に、発酵槽の内容物を７℃から１３℃の温度で８から２４時間の時間間隔で撹拌して、完全な細胞溶解および多糖の放出を確実に起こした。この維持時間中の撹拌は、溶解物の沈渣が発酵槽の壁およびｐＨプローブに付着するのを防止することにより、ｐＨプローブの完全性を維持させた。次に、５０％酢酸を用いて、溶解された培養ブロスのｐＨを約ｐＨ４．８に調整した。温度１５℃から２５℃で１２から２４時間の時間間隔で撹拌しない維持時間後に、以前に可溶性であったタンパク質のかなりの部分が固体沈殿として溶液から沈み、溶液中に残留した多糖の損失も分解もほとんどなかった。次に、連続フロー遠心分離に続くデプスフィルター処理および０．４５μｍの精密濾過により、沈殿を有する溶液を清澄にした。
【００４１】
前述の論考および実施例は、単にある種の実施形態の詳細な説明を提示しているだけであることを了解されたい。したがって、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な修飾を加え、様々な等価物を作製することができることは当業者に明らかなはずである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】エス．ニューモニエ４型について酢酸を用いてｐＨを減少させるときの可溶性タンパク質の有意な減少をグラム／リットル溶解物単位で示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。３９ｋＤａおよび４８ｋＤａの成分は細胞壁表面タンパク質である。多糖の収率もまた示す。
【図２】ｐＨ調整をｐＨ５に下げた、エス．ニューモニエ６Ｂ型についての結果のチャートであり、このチャートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるタンパク質の減少および屈折率（ＲＩ）検出器を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより決定される多糖（Ｐｓ）の収率を示す。
【図３】ｐＨ調整をｐＨ５に下げた、エス．ニューモニエ１型についての結果のチャートであり、このチャートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるタンパク質の減少およびＲＩ検出器を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより決定される多糖の収率を示す。
【図４】ｐＨ調整をｐＨ４．１に下げた、エス．ニューモニエ５型についての結果のチャートであり、このチャートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるタンパク質の減少およびＲＩ検出器を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより決定される多糖の収率を示す。
【図５】ｐＨ調整をｐＨ４．５に下げた、２つの異なる発酵運転のエス．ニューモニエ６Ａ型についての結果のチャートであり、このチャートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるタンパク質の減少およびＲＩ検出器を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより決定される多糖の収率を示す。
【図６】エス．ニューモニエ７Ｆ型についてのｐＨ４．８に下げたｐＨ調整の結果のチャートであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるタンパク質の低減およびＲＩ検出器を用いたＨＰＬＣ−ＳＥＣにより決定される多糖の収率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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