(57)【要約】【課題】フェノキサジノン由来の新規酵素基質、及び、ペプチダーゼ活性を有する微生物の検出における顕色剤としてのその使用。【解決手段】本発明は、下記一般式の新規酵素基質：［化１］2008512106.tif 000014（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ａ及びＸは特許の請求の範囲１に定めるとおりである）：、これを含む反応媒体、並びに、少なくとも１つのペプチダーゼ活性を示す微生物を検出及び／又は識別及び／又は定量するためのその使用に関する。【選択図】なし
2008512106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2008512106.tif 000013
（式中、
−  Ｒ１は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アラルキル基、アリール基、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ’又は−ＮＲ’’Ｒ’’’を表し、
−  Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＯＲ’を表し、
−  Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＲ’又は−ＣＯＲ’を表し、
−  Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ’又はＣ１−Ｃ３アルキル基を表し（Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは水素原子であるとする）、
−  Ｒ’は、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基を表し、
−  Ｒ’’及びＲ’’’はそれぞれ独立してＣ１−Ｃ６アルキル基を表す、又は、Ｒ’’及びＲ’’’は自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−  Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−  Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない）：に相当する
ことを特徴とする発色性酵素基質。
【請求項２】
−  Ｒ１は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アラルキル基、アリール基、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ’又は−ＮＲ’’Ｒ’’’を表し、
−  Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＯＲ’を表し（Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは水素原子又はハロゲン原子であるとする）、
−  Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＲ’又は−ＣＯＲ’を表し、
−  Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１−Ｃ３アルキル基を表し（Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは水素原子であるとする）、
−  Ｒ’は、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基を表し、
−  Ｒ’’及びＲ’’’はそれぞれ独立してＣ１−Ｃ６アルキル基を表す、又は、Ｒ’’及びＲ’’’は自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−  Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−  Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない
ことを特徴とする請求項１に記載の発色性酵素基質。
【請求項３】
Ｒ１がアルキル基、好ましくはＣ１−Ｃ６基を表し、かつ、Ｒ２が水素原子を表す
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の発色性酵素基質。
【請求項４】
Ｒ１が水素原子を表し、かつ、Ｒ２がアルキル基、好ましくはエチル基又はヘキシル基を表す
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の発色性酵素基質。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２がアルキル基又はハロゲン原子を表し、かつ、Ｒ４がアルキル基、−ＣＯＯＲ’ 又は水素原子を表す
ことを特徴とする請求項１に記載の発色性酵素基質。
【請求項６】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子を表す
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の発色性酵素基質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の発色性酵素基質の少なくとも１つの発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、請求項１〜６のいずれか１項に記載の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも１つの他の酵素基質と併用して使用した反応媒体。
【請求項８】
培養基である
ことを特徴とする請求項７に記載の媒体。
【請求項９】
ゲル状である
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の媒体。
【請求項１０】
少なくとも１つのペプチダーゼ活性を示す微生物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて検出及び／又は識別及び／又は定量するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発色性酵素基質又は請求項７〜９のいずれか１項に記載の反応基質の使用。
【請求項１１】
少なくとも１つのペプチダーゼ活性を示す微生物を検出及び／又は識別及び／又は定量するための方法であって、
以下：
・請求項７〜９のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも１つのペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも１つの他の酵素活性と共に顕現させること：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
以下：
・発色性基質の置換基ＡがＬ−アラニンである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物の存在と同義の少なくとも１つの着色の存在を顕現させること：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
緑膿菌の検出方法であって、
以下：  
・発色性基質の置換基Ａがβ−アラニン又はピログルタミンである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を前記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・緑膿菌微生物の存在と同義の少なくとも１つの色変化の存在を顕現化すること：を含む
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチダーゼ活性を検出するための新規の発色性酵素基質に関する。上記基質は、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において、酵素加水分解により物理化学的なシグナルを発する段階を含む用途に使用できる。既存の基質の大部分は蛍光性のみを有するのに対し、本発明の発色性基質は着色を生じ、この着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるので、微生物検出用のゲル化媒体においてこの発色性基質を特に使用できる。
【０００２】
また、本発明は、この基質を含む反応媒体、並びに、グラム陰性菌、グラム陽性菌及びペプチダーゼ活性を示す酵母を検出するための上記基質又は上記媒体の使用、並びに、その使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
アミノ酸のアシル基と第一級アミンの間のアミド基を加水分解して切断できる酵素は一般的に「アミノペプチダーゼ」と呼ばれ、ペプチドのアシル基と第一級アミンの間のアミド基を加水分解して切断できる酵素は一般的に「ペプチダーゼ」と呼ばれる。本出願においては、「ペプチダーゼ」という用語は、必要に応じて、上記に定義したペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼの両方を指す可能性がある。
【０００４】
ペプチダーゼ活性検出用の拡散しない発色性酵素基質が文献中に記載されていて、従来技術から既に公知である。例えば、この基質は、本出願人による特許文献１及び特許文献２の範囲内に含まれる。しかし、この基質には、合成が困難であり、純度が低く、かつ、収率が低いといった様々な問題がある。また、培養基中で使用する際には、培養基の組成を非常に正確に定義しなければ着色を観察できない。
【０００５】
固形培地中での混合培養において微生物の検出に使用できる数少ない既存の基質としてはアクリジン由来の基質があり、これは本出願人による特許文献３中に記載されている。
【０００６】
フェノキサジノンに由来する物質は蛍光を発することができることが知られている。上記物質は、
−例えば非特許文献１中に記載されるように、酸−塩基指示薬として、又は、  
−非特許文献２中に記載されるように、例えばタンパク質のコンホメーション変化を追従するための、又は、例えば特許文献４中に記載されるように、微生物を検出するための蛍光標識として使用可能である。後者の場合、記載されている化合物は、液体培地中でしか使用できず、かつ、細菌増殖の実証による微生物の検出は酸化還元電位の変化によって実施されるという欠点がある。従って、酵素活性及び細菌の属種に対しての特異性はない。
【０００７】
現在報告されているアミノフェノキサジノン（ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｏｎｅ）誘導体、及び、特にレゾルファミン（ｒｅｓｏｒｕｆａｍｉｎｅ）誘導体は、ゲル媒体中で使用できる発色性酵素基質として使用されたことはない。
【特許文献１】ＰＣＴ特許ＷＯ９８／０４７３５号
【特許文献２】ＰＣＴ特許ＷＯ９９／３８９９５号
【特許文献３】ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００４／０６９８０４号
【特許文献４】米国特許第５３３６６００号
【非特許文献１】Ｓｔｕｚｋａ，  Ｖ．ら，  １９６３，  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｚｅｃｈ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２８，  １３９９−１４０７
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｊ．ら，  ２００１，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７３（１３），  ２９２０−２９２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明によれば、ペプチダーゼ活性を示す微生物を検出するための新規の発色性酵素基質が提案される。また、本発明は、この基質を含む反応媒体、及び、ペプチダーゼ活性を検出するための上記基質又は上記媒体の使用、及び、その使用方法にも関する。
【０００９】
本出願人は予想外にも、新規の発色性フェノキサジノン誘導体の発する着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるため、培養基中のコロニーの着色の変化によりペプチダーゼ活性を実証できることから、これを使用することによりペプチダーゼ活性を示す微生物を検出可能であることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の基質を含む反応媒体に試験する微生物を播種すると、この微生物が基質を加水分解できない場合にはコロニーの色は無色から白色であることが観察される。一方、この微生物が本発明の基質を加水分解できる場合には、コロニーが着色される。
【００１１】
本発明のフェノキサジノン誘導体は、発色性かつ蛍光性であり、検出感度が良好であるという利点を有する。また、蛍光の励起及び発光は可視スペクトル中で生じ、この蛍光は標準的な照明の下で肉眼で検出できる。
【００１２】
従って、本発明の主題は、式（Ｉ）の発色性酵素基質である。
【００１３】
【化１】
2008512106.tif 000003
【００１４】
（式中、
−  Ｒ１は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アラルキル基、アリール基、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ’又は−ＮＲ’’Ｒ’’’を表し、
−  Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＯＲ’を表し、
−  Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＲ’又は−ＣＯＲ’を表し、
−  Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ’又はＣ１−Ｃ３アルキル基を表し（Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは水素原子であるとする）、
−  Ｒ’は、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基を表し、
−  Ｒ’’及びＲ’’’はそれぞれ独立してＣ１−Ｃ６アルキル基を表す、又は、Ｒ’’及びＲ’’’は自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−  Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−  Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない）
【００１５】
本発明によれば、「アリール」という用語は特に、Ｃ６−Ｃ１２芳香環、特にフェニル環、ベンジル環、１−ナフチル環又は２−ナフチル環を意味するものとする。アラルキル基のアリール部についても同様である。従って、Ｃ６−Ｃ１４アラルキル基のアルキル基はＣ２−Ｃ８である。
【００１６】
「Ｃｘ−Ｃｙアルキル基」という用語は、炭素原子をｘ〜ｙ個、本発明においては炭素原子を１〜１２個、炭素原子を１〜６個、炭素原子を１〜３個又は炭素原子を２〜８個有する直鎖又は分岐のアルキル基を意味するものとする。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基及びドデシル基を挙げることができる。
【００１７】
「ハロゲン原子」という用語は、塩素、臭素、ヨウ素又はフッ素を意味するものとする。
【００１８】
「ヘテロ原子」という用語は、例えばＯ、Ｎ又はＳ等の炭素原子以外の原子を意味するものとする。
【００１９】
Ｒ’’及びＲ’’’により形成可能な複素環の大きさは任意であってよいが、５〜７員環であることが好ましい。
【００２０】
複素環の例としては、モルホリン環、ピペラジン環、ピペリジン環、ピロリジン環及びイミダゾリジン環が含まれる。
【００２１】
本発明によるブロック基には、アミンを保護可能な当業者に公知の任意のブロック基が含まれる。例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｎ−ｔＢＯＣ）、９−フルオレニルオキシカルボニル基、スクシニル基等の可溶性基、又は、ピペコリン酸等の代謝不可能なアミノ酸、すなわち非天然アミノ酸が挙げられる。
【００２２】
ブロック基は、本発明の化合物中に系統的には存在していない。本発明において、すなわち本発明の化合物がブロック基を有していない（Ｘがない）場合、本発明の化合物は塩化物、臭化物又はトリフルオロ酢酸塩等の塩の形態である。
【００２３】
式（Ｉ）中においてＡで表すアミノ酸は、当業者に公知の任意のアミノ酸である。
【００２４】
特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式（Ｉ）の発色性酵素基質でもある。
【００２５】
【化２】
2008512106.tif 000004
【００２６】
（式中、
−  Ｒ１は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アラルキル基、アリール基、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ’又は−ＮＲ’’Ｒ’’’を表し、
−  Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＯＲ’を表し（Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは水素原子又はハロゲン原子であるとする）、
−  Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＯＲ’又は−ＣＯＲ’を表し、
−  Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１−Ｃ３アルキル基を表し（Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは水素原子であるとする）、
−  Ｒ’は、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基を表し、
−  Ｒ’’及びＲ’’’はそれぞれ独立してＣ１−Ｃ６アルキル基を表す、又は、Ｒ’’及びＲ’’’は自身が結合している窒素原子と共にヘテロ原子を１つ以上含む複素環を形成し、
−  Ａは少なくとも１つのアミノ酸を表し、かつ、
−  Ｘは、ブロック基を表す又は何も表さない）
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大１０つのアミノ酸を有するペプチドを表す。基質のコストの点から、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大４つのアミノ酸を有するペプチドを表すことが好ましい。
【００２８】
本発明に好適なアミノ酸のうち、例えばα−アラニン及びβ−アラニン、ロイシン、プロリン及びピログルタミンを挙げることができる。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、本発明の化合物は、Ｒ１がアルキル基を表し、かつ、Ｒ２が水素基を表すことが好ましい。より好ましくはＲ１はＣ１−Ｃ６又はＣ３−Ｃ６のアルキル基を表し、メチル及びペンチルが特に好ましい。
【００３０】
Ｒ１が水素原子を表し、かつ、Ｒ２がＣ１−Ｃ６アルキル基を表す化合物は、本発明の別の実施形態の構成要素である。Ｒ２がエチル基又はヘキシル基を表す化合物が好ましい。
【００３１】
更に別の実施形態によれば、本発明の化合物は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が各々水素原子を表すものである。
【００３２】
別の実施形態によれば、Ｒ１及びＲ２がアルキル基又はハロゲン原子を表し、かつ、Ｒ４が水素原子、アルキル基又は−ＣＯＯＲ’（Ｒ’はアルキル基である）を表す化合物も好ましい。好ましいアルキル基はＣ１−Ｃ３であり、好ましくはＣ１、アルキル基である。
【００３３】
別の実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がアルキル基又は水素原子である化合物も好ましい。好ましいアルキル基はＣ１−Ｃ３であり、好ましくはＣ１、アルキル基である。
【００３４】
本発明の化合物は、スキーム１で表される方法によって調製することができる。
【００３５】
【化３】
2008512106.tif 000005
【００３６】
スキーム１によれば、好適なジクロロイミン（３）は、適切に置換されたｐ−フェニレンジアミン（１）の酸化的塩素化によって、化合物（２）の存在下で、Ｗｉｌｌｓｔａｅｔｔｅｒ及びＭａｙｅｒのプロトコル（１９０４）に従って調製される。こうして得られたジクロロイミン（３）をその後、適切に置換されたレゾルシノール（４）を含むエタノール溶液中で濃縮し、レゾルファミン（５）を得る。その後、レゾルファミン（５）を、１つ以上の任意に保護されたアミノ酸（６）と共に約−１２℃に冷却した浴中で反応させて、式（Ｉ）の化合物を得る。注目すべきは、言うまでもなく、Ａが単一のアミノ酸である場合、化合物（６）中のＡ’は化合物（Ｉ）のＡに相当し、更に水酸基を含むということである。言い換えると、Ａが単一のアミノ酸である場合、Ａ’の末端は−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、Ａは−Ｃ（Ｏ）−を介して−ＮＨ−に結合していて−ＯＨを有していないということである。また、Ａが少なくとも２つのアミノ酸の鎖である場合には、Ａ’の末端アミノ酸は上記の通りである、すなわち、Ａの末端アミノ酸よりも水酸基を更に含む。
【００３７】
この方法を使用すれば、本発明の化合物をすべて調製することができる。しかし、好ましくは、Ｒ１又はＲ２がアルキル基である式（Ｉ）の化合物は、下記スキーム２に記載されるプロトコルに従って調製することができる。
【００３８】
【化４】
2008512106.tif 000006
【００３９】
上記スキーム２において、ニトロソ化合物（８）は、適切に置換された３−アミノフェノール（７）と亜硝酸ナトリウム等のアルカリ金属亜硝酸塩との反応によって、リン酸又は硫酸の存在下において０〜−３℃の温度で調製される。こうして得られたニトロソアセトアミドフェノール化合物（８）をその後、適切に置換されたレゾルシノール（４）と共に、プロパノール又はブタノール等の溶媒中において、酸触媒としての硫酸、及び、環化剤の存在下で反応させる。こうして得られたアセトアミドフェノキサジノンをその後、硫酸の存在下で９０℃において短時間加熱することによって脱アセチルし、続いて冷却して、水相を沈殿させる（ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）。こうして得られたレゾルファミン（５）をその後、スキーム１のプロトコル中に示されるように、１つ以上の任意に保護されたアミノ酸（６）と反応させる。
【００４０】
スキーム３中に表されるように、上記化合物は次のプロトコルによっても調製することができる。
【００４１】
【化５】
2008512106.tif 000007
【００４２】
【化６】
2008512106.tif 000008
【００４３】
上記スキーム３中において、本発明の化合物は４段階で調製される。
【００４４】
第一段階によれば、適切に置換された２，５−ジメトキシフェノール化合物（１２）は、同様に適切に置換されたヒドロキノン化合物（９）から調製される。この化合物（９）をＮａＨを含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に添加し、続いてヨウ化メチルを含むジメチルホルムアミド中に添加して、この反応の後で４０℃において撹拌することによって、適切に置換された２，５−ジメトキシフェニル化合物（１０）を得る。その後、この化合物を、ウロトロピン（商標）を含むトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に還流下でＤｕｆｆ反応（Ｓｍｉｔｈ  ＷＥ，  １９７２，  Ｊ  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ３７  ：  ３９７２）に従って添加して、適切に置換された２，５−ジメトキシベンズアルデヒド（１１）を得る。最後に、化合物（１１）を、モノペルオキシフタル酸マグネシウムを含むメタノール中に０℃で添加し、その後、バイヤー・ビリガー反応（Ｃａｐｅｃｃｈｉ  Ｔ．，ら，  ２０００，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １，  ２６８１）に従ってＮａＯＨを含むＤＭＦ中に添加して、適切に置換された２，５−ジメトキシフェノール（１２）を得る。
【００４５】
第二段階によれば、２，５−ジニトロフルオロベンゼン（１７）は、適切に置換されたフルオロアニリン（１３）から調製される。この化合物（１３）を、塩化アセチルを含むトリエチルアミン及びジクロロメタン（ＤＣＭ）中に０℃で添加し、適切に置換されたＮ−アセチルフルオロアニリン（１４）を得る。その後、この化合物を酢酸中の濃硫酸及び硝酸の混合物に添加して、適切に置換されたニトロアニリン化合物（１５）を得る。この化合物（１５）を塩酸と共に還流に供してニトロアニリン化合物（１６）を得、これを過ホウ酸ナトリウムを含む酢酸中に６５℃で添加することによって、化合物（１７）を得る。
【００４６】
第三段階によれば、以下のように、第一段階中で得られた２，５−ジメトキシベンゼン（１２）と第二段階中で得られた２，５−ジニトロフルオロベンゼン（１７）との反応によって、レゾルファミン（５）を得る。化合物（１２）及び（１７）をＮａＨを含むＤＭＦ中に室温で添加して、適切に置換されたジアリールエーテル（１８）を得る。その後、この化合物（１８）をＢＢｒ３を含むＤＣＭ中に添加してジヒドロキシジアリールエーテル（１９）を得、これをＰｄ／Ｃ触媒の存在下でメタノールに添加することによって、レゾルファミン（５）を得る。
【００４７】
最後に、最終段階によれば、こうして得られたレゾルファミン（５）を、その後、スキーム１のプロトコル中に示されるように、１つ以上の任意に保護されたアミノ酸（６）と混合する。
【００４８】
上記プロトコルにおいて、開始反応物質（化合物（１）、（２）、（４）、（６）、（７）、（９）及び（１３）は、特にシグマ社から市販されており入手可能である。
【００４９】
また、本発明の主題は、少なくとも１つの上記式（Ｉ）の発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも１つの他の酵素基質と併用して使用した反応媒体に関する。
【００５０】
事実上、本発明の化合物を含む反応媒体中に又はその上にペプチダーゼ活性を示す微生物を播種すると、着色が生じ、この着色は反応媒体中に又はその上に拡散せずに、コロニーの中に集まる。
【００５１】
本発明によれば、「反応媒体」という用語は、少なくとも１つの微生物の少なくとも１つの酵素活性を顕現させることができる媒体を意味するものとする。
【００５２】
この反応媒体は、顕色媒体としてのみ使用してもよいし、培養基及び顕色媒体の両方として使用してもよい。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応媒体が培養基でもあり、これは本発明の特定の実施形態の構成要素である。
【００５３】
反応媒体は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形培地」という用語は、例えばゲル化媒体を意味するものとする。
【００５４】
微生物を培養するために微生物学において従来から使用される固形培地は寒天であるが、ゼラチン、アガロース又は他のゲル化剤も使用可能である。例えば、コロンビア寒天（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ａｇａｒ）、トリプカーゼ大豆寒天（ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ  ａｇａｒ）、マッコンキー寒天（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ  ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用することができる。
【００５５】
反応媒体が培養基でもある場合、この反応媒体はゲル状であることが好ましい。
【００５６】
反応媒体中の寒天の量は２〜４０ｇ／ｌである。固形培地については、寒天の量は好ましくは９〜２５ｇ／ｌ、より好ましくは１２〜１４ｇ／ｌであり、半固形培地については、寒天の量は２〜６ｇ／ｌが好ましい。
【００５７】
本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用可能である。
【００５８】
反応媒体中における本発明の酵素基質の濃度は０．０１〜１ｇ／ｌ、好ましくは０．０２５〜０．４０ｇ／ｌ、そして有利には０．０５ｇ／ｌである。というのは、この基質濃度である場合には着色のコントラストが良好だからである。
【００５９】
反応媒体は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも１つの他の基質を含んでいてよい。この他の基質の酵素加水分解により、本発明の基質によって検出されるシグナルとは異なる（例えば、色の異なる又は蛍光の異なる）検出可能なシグナルが生じるため、１つ以上の微生物について検出及び／又は識別及び／又は定量等の実証が可能である。
【００６０】
他の特異的な基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコシド（ＢＩＯＳＹＮＴＨ社）若しくは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＢＩＯＳＹＮＴＨ社）等のインドキシル型の基質、又は、微生物の検出に使用される他の任意の基質を挙げることができる。
【００６１】
他の特異的な酵素基質の濃度は、一般的に０．０１〜２ｇ／ｌである。当業者であれば、使用する基質に応じて上記濃度を容易に決定できるであろう。
【００６２】
また、反応媒体は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、無機物、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩又は金属塩等の一種以上の成分を組み合わせて含んでいてよい。媒体の例が、本出願人によるヨーロッパ特許出願ＥＰ６５６４２１号及びＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／０９２０７号中に記載されている。
【００６３】
従って、本発明の酵素基質及び反応媒体は、ペプチダーゼ活性を有する微生物の分析において使用することができる。
【００６４】
従って、本発明の主題はまた、少なくとも１つのペプチダーゼ活性を示す微生物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて検出及び／又は識別及び／又は定量するための、式（Ｉ）の発色性酵素基質又は上記反応基質の使用である。
【００６５】
また、本発明は、少なくとも１つのペプチダーゼ活性を示す微生物を検出及び／又は識別及び／又は定量するための方法であって、
以下：
・上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも１つのペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、このペプチダーゼ活性以外の少なくとも１つの他の酵素活性と共に顕現させること：を含む
ことを特徴とする方法にも関する。
【００６６】
上記播種段階及びインキュベート段階は、当業者に広く知られている。
【００６７】
例えば、インキュベート温度は一般的に２０〜５５℃であり、最も一般的には２５〜４５℃であって、最も一般に使用されるインキュベート温度は３０℃、３５℃及び３７℃である。また、インキュベート時の雰囲気は、嫌気的であっても好気的であっても同様である。
【００６８】
上記顕現は、反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まる着色の変化を視覚化することにより、肉眼で実施される。
【００６９】
本発明の酵素基質によって分析可能な微生物としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び酵母を挙げることができる。
【００７０】
グラム陰性菌としては、次の属の細菌を挙げることができる：シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プローテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ菌、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属及びレジオネラ属。
【００７１】
グラム陽性菌としては、次の属の細菌を挙げることができる：エンテロコッカス菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス、リステリア菌、クロストリジウム属、マイコバクテリウム属及びコリネバクテリウム属。
【００７２】
酵母の例としては、次の属の酵母が含まれる：カンジダ属、クリプトコッカス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【００７３】
本発明の基質は、微生物が増殖でき、かつ、コロニーの着色が明瞭であるため、グラム陰性菌の検出に特に好適である。
【００７４】
特に、ＡがＬ−アラニンである本発明の発色性基質は、グラム陰性菌とグラム陽性菌とをはっきりと識別可能であるという利点を有する。
【００７５】
従って、本発明の別の主題は、細菌のうちグラム陽性微生物に属する細菌とグラム陰性微生物に属する細菌とを識別する方法であって、
以下：
・発色性基質の置換基ＡがＬ−アラニンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性微生物の存在と同義の少なくとも１つの着色の存在を顕現させること：を含む
ことを特徴とする方法からなる。
【００７６】
Ａがβ−アラニン又はピログルタミンである本発明の発色性基質は、緑膿菌と他の属との識別、更には緑膿菌と他のシュードモナス菌株との識別を可能にするという利点を有する。
【００７７】
したがって、本発明の別の主題は、緑膿菌の検出方法であって、
以下：  
・発色性基質の置換基Ａがβ−アラニン又はピログルタミンである上記反応媒体を準備すること、
・試験する生体試料を上記媒体に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・緑膿菌微生物の存在と同義の少なくとも１つの色変化の存在を顕現化すること：を含む
ことを特徴とする方法からなる。
【００７８】
分析する生体試料は、唾液、血液、尿若しくは糞便試料といった任意の臨床試料、又は、その分析が臨床医による診断を援助可能な他の任意の試料である。また、上記試料は、病原微生物が存在しないことを確認する必要のある又は汚染叢数を計数する必要のある又は特定の微生物を検出する必要のある、食品産業及び／又は医薬産業に由来する製品又はこれらの産業における原料の試料であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
本発明は以下の実施例によってより完全に理解されるであろう。しかし、これらの実施例はいかなる制限を加えるものでもない。
【実施例１】
【００８０】
＜７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン及び７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンの合成＞
ｐ−フェニレンジアミン１．７６ｇ（１０ｍｍｏｌ）を塩素化して１，４−ジクロロベンゾキノンジイミンを調製し、これを、無水メタノール（５０ｍｌ）の存在下で加熱することによって溶解させ、溶液を撹拌している中に尿素９ｇを添加した。続いて５−ペンチルレゾルシノール１．８ｇ（１０ｍｍｏｌ）を４０〜５０℃において溶液中に添加し、完全に溶解した後で、反応混合物を注意深く還流に供して、過剰に発熱しないようにした。加熱を１．５時間続け、その後、冷却した反応混合物をアンモニアを含む氷／水混合物を十分に撹拌している中にゆっくり添加した。沈殿を吸引ろ過によって回収して水で洗浄し、その後風乾させて、表題の化合物の混合物からなる粗生成物２．２ｇを得た（生成物の大部分は塩素化されていなかった）。
【００８１】
二口フラスコから酢酸（３０％、２００ｃｍ３）を、撹拌しながら、水素化ホウ素ナトリウム約５ｇ及び水酸化ナトリウム２００ｍｇを水２００ｃｍ３中に溶解した溶液に滴下した。７−アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン及び７−アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンの混合物（０．５６４ｇ）が無水ジメチルホルムアミド（１５ｃｍ３）中に（加熱後に冷却することにより）溶解している三口フラスコに、水素ガスを通し、この溶液を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１５ｃｍ３）で希釈した。Ｐｄ／Ｃ触媒（５％、２００ｍｇ）をこの溶液に添加した。この溶液を水素ガスと共にゆっくりと噴霧し、還元が明白になった後、長時間（約１時間）継続した。この還元は、溶液が紫色から灰色がかった緑色に変化したことによって実証された。こうしてレゾルファミン溶液を得た。
【００８２】
別のフラスコ中で、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン０．７５６ｇ（４．０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン０．４０８ｇ（４．０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１０ｃｍ３）中に溶解し、この溶液を−２０℃に冷却して、クロロギ酸イソブチル０．５６ｃｍ３（４．０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。この混合物を−２０℃で更に３０分間撹拌し、その後、この混合物を−１０℃でレゾルファミン溶液中に撹拌しながら導入し、同時に水素ガスと共に噴霧した。１５分後、水素の導入を停止し、系を密閉して、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させて、残留固体をジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解して、ＤＣＭ溶液をろ過し、ＮａＨＣＯ３（５％、５０ｃｍ３で２回）及び水（５０ｃｍ３）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４を使用して乾燥させ、ろ過して濃縮し、２つの表題の物質からなる残渣を得た。これをシリカカラムクロマトグラフィーで精製し、石油／酢酸エチル（７：３）混合物を使用して溶出した。第一のスポットは、オレンジ色固体の７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチル−フェノキサジン−３−オンに相当し、第二のスポットは褐色固体の７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンに相当する。
【実施例２】
【００８３】
＜７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン及び７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンの合成＞
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニンの代わりにＮ−ｔ−Ｂｏｃ−β−アラニンを使用する以外は、上記実施例１中に記載されるプロトコルを繰り返した。
【００８４】
シリカカラムクロマトグラフィーを実施して、石油／酢酸エチル（６：４）混合物を使用して溶出することによって、表題の化合物を回収した。第一のスポットは、オレンジ色固体の７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンに相当し、第二のスポットはオレンジ色固体の７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンに相当する。
【実施例３】
【００８５】
＜アミノ化誘導体の脱保護＞
これを実施するために、実施例１及び２で得られた化合物を次の割合でＴＦＡ（トリフルオロ酢酸塩）２ｃｍ３中に溶解した：７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン０．１０ｇ（０．２１ｍｍｏｌ）、並びに、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン及び７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンをそれぞれ８０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）。
【００８６】
この混合物を室温で１５分間保持した。出発原料が現れなくなるまで、反応の進行を薄層クロマトグラフィーによって記録した。ＴＦＡを真空下で除去し、残渣をエーテルで完全に洗浄して乾燥させることによって、トリフルオロ酢酸塩（褐色固体）の形状の様々な化合物を次の収率で得た：７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン０．０９５ｇ（９２％）、並びに、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン及び７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンをそれぞれ８０ｍｇ（９７％）。
【実施例４】
【００８７】
＜７−Ｎ−（Ｌ−ピログルタミル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン及び７−Ｎ−（Ｌ−ピログルタミル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンの合成＞
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニンの代わりにＬ−ピログルタミン酸０．５１６ｇを使用する以外は、上記実施例１中に記載されるプロトコルを繰り返した。
【００８８】
シリカカラムクロマトグラフィーを実施して、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９５：５）混合物を使用して溶出することによって、表題の化合物を回収した。第一のスポットは、褐色固体の７−Ｎ−（Ｌ−ピログルタミル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンに相当し、第二のスポットは褐色固体の７−Ｎ−（Ｌ−ピログルタミル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オンに相当する。
【実施例５】
【００８９】
＜７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−ジメチルフェノキサジン−３−オン及び７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２，４−トリメチルフェノキサジン−３−オンの合成＞
（５．１．  ジメトキシベンゼン類を調製する基本手順）
コンデンサー、マグネティックスターラーバー及び塩化カルシウム保護チューブを備えた丸底二口フラスコを乾燥させた中で、ヒドロキノン（１モル等量）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌ中に溶解し、ＮａＨ  ２．２モル等量を少量ずつ添加した。塩基を添加した後、Ｈ２の放出が停止したら、ヨウ化メチル４モル等量を１５〜２０分間かけて滴下した。添加終了後、反応混合物を４０℃で２時間撹拌した。塩水２００ｍｌをフラスコに添加し、得られた混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌで３回）で抽出した。有機層を合わせて水で洗浄し（５０ｍｌで２回）、生成物をＭｇＳＯ４を使用して乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーに供した。
【００９０】
（５．１．１  １，４−ジメトキシ−２，３−ジメチルベンゼン）
２，３−ジメチルヒドロキノン１．９５７ｇ（０．０１４１６ｍｏｌ）を使用して、上記項目５．１中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒／ジエチルエーテル（９５：５）混合物を使用して、物質を白色固体（２．２７ｇ、８０％）として分離した。
【００９１】
（５．１．２．  １，４−ジメトキシ−２，３，５−ジメチルベンゼン）
２，３，５−トリメチルヒドロキノン２．１７５ｇ（０．０１４２９ｍｏｌ）を使用して、上記項目５．１中に記載される方法を実施した。物質を無色の油（２．３６７ｇ、９２％）として分離した。
【００９２】
（５．２．  Ｄｕｆｆ反応によるジメトキシベンゼン類の調合）
ジメトキシベンゼン１等量をＴＦＡ  ２０ｍｌ中に溶解し、得られた溶液にウロトロピン（商標）１．０５等量を添加した。反応混合物を無水条件下で２時間還流に供した。ＴＦＡを減圧下で蒸発させ、残渣をエーテル１００ｍｌ中に溶解し、有機溶液を水（５０ｍｌで３回）で洗浄した後、ＭｇＳＯ４を使用して乾燥させた。溶媒を蒸発させて残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／ジエチルエーテル（８０：２０）混合物  を使用して溶出を実施した。
【００９３】
（５．２．１．  ２，５−ジメトキシ−３，４−ジメチルベンズアルデヒド）
１，４−ジメトキシ−２，３−ジメチルベンゼン２．２７０ｇ（０．０１３６６ｍｏｌ）を使用して、上記項目５．２中に記載される方法を実施した。表題の物質を白色固体（１．１８ｇ、４４％）として分離した。
【００９４】
（５．２．２  ２，５−ジメトキシ−３，４，６−ジメチルベンズアルデヒド）
１，４−ジメトキシ−２，３，５−トリメチルベンゼン２．２７４ｇ（０．０１２６２ｍｏｌ）を使用して、上記項目５．２中に記載される方法を実施した。表題の物質を黄色固体（１．２１ｇ、４６％）として分離した。
【００９５】
（５．３  バイヤー・ビリガー酸化を使用してフェノール類を調製する基本手順）
ジメトキシベンズアルデヒド０．０３３ｍｏｌをメタノール５０ｍｌ中に溶解し、反応混合物を０℃で保持しながら、モノペルオキシフタル酸マグネシウム（ＭＭＰＰ）（０．０１８ｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌ中に懸濁した懸濁液を滴下した。添加終了後、反応混合物を室温で４時間撹拌した。生じたエステルを、１Ｍ  ＮａＯＨ  ５０ｍｌを使用して、塩基的条件下で加水分解した。１時間後、メタノールの３／４を減圧下で除去し、過剰な塩基を１Ｍ  ＨＣｌで中和して、ｐＨ３に調節した。フェノールを酢酸エチル（５０ｍｌで３回）中で抽出し、有機層を合わせてＭｇＳＯ４を使用して乾燥させ、溶媒を蒸発させて、残渣をカラムクロマトグラフィーに供した。
【００９６】
（５．３．１．  ２，５−ジメトキシ−３，４−ジメチルフェノール）
２，５−ジメトキシ−３，４−ジメチルベンズアルデヒド１．１２６ｇ（５．７９７ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．３中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／ジエチルエーテル（６０：４０）混合物を溶離液として使用して、表題の物質を黄色油（０．２３９ｇ、２３％）として分離した。
【００９７】
（５．３．２．  ２，５−ジメトキシ−３，４，６−トリメチルフェノール）
２，５−ジメトキシ−３，４，６−ジメチルベンズアルデヒド１．２０５ｇ（５．７８６  ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．３中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／ジエチルエーテル（７５：２５）混合物を溶離液として使用して、表題の物質を白色固体（０．８５６ｇ、７５％）として分離した。
【００９８】
（５．４．  ジアリールエーテル類を調製する基本手順）
好適なフェノール１モル等量を無水ＤＭＦ  １０ｍｌ中に溶解し、ＮａＨ  １．１モル等量を少量ずつ添加した。ガスの発生が終了した後、生じたナトリウムフェノラート溶液を室温で１５分間撹拌した。無水ＴＨＦ  ５ｍｌ中の２，５−ジニトロフルオロベンゼン１モル等量溶液をフラスコに滴下して、反応混合物を２時間撹拌した。最終的に、フラスコの中身を水５０ｍｌ中に注ぎ、混合物をエーテル（５０ｍｌで３回）で抽出し、有機層を合わせてＭｇＳＯ４を使用して乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーに供した。
【００９９】
（５．４．１  １−（２’，５’−ジニトロフェノキシ）−３，４−ジメチルベンゼン）
２，５−ジニトロフルオロベンゼン０．２９３ｇ（１．５７５ｍｍｏｌ）及び２，５−ジメトキシ−３，４−ジメチルフェノール０．２８７ｇ（１．５７５  ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．４中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／酢酸エチル（８５：１５）混合物を溶離液として使用してカラムクロマトグラフィーを実施し、表題の物質をオレンジ色固体（０．４１５ｇ、７６％）として得た。
【０１００】
（５．４．２  １−（２’，５’−ジニトロフェノキシ）−３，４，６−トリメチルベンゼン）
２，５−ジニトロフルオロベンゼン０．８１２ｇ（４．３６２ｍｍｏｌ）及び２，５−ジメトキシ−３，４，６−トリメチルフェノール０．８５６ｇ（４．３６２ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．４中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／ジエチルエーテル（７５：２５）混合物を溶離液として使用してカラムクロマトグラフィーを実施し、表題の物質を黄色固体（１．４１２ｇ、８９％）として得た。
【０１０１】
（５．５．  ヒドロキノンメチルエーテル類を脱保護する基本手順）
ジメチルアリールエーテル１モル等量を無水ＤＣＭ  ３０ｍｌ中に溶解し、この混合物を−７８℃に冷却した。ヘキサン（１Ｍ）中のＢＢｒ３  ２．５モル等量を冷エーテル溶液に滴下し、反応生成物を−７８℃で３０分間撹拌した。その後、この混合物を室温に加熱し、反応が終了するまで撹拌した（続いて薄層クロマトグラフィーを実施した）。反応混合物を０℃のメタノール１０ｍｌで希釈し、水５０ｍｌ中に注いだ。有機層を分け、水相を酢酸エチル（２５ｍｌで３回）で洗浄した。有機層を合わせて、ＭｇＳＯ４を使用して乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーに供した。
【０１０２】
（５．５．１．  １−（２’，５’−ジニトロフェノキシ）−３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロキシベンゼン）
表題の化合物は、分離はされなかったが、形成及び還元され、同じ容器（下記項目５．６．１参照）における反応に従って直接環化した。
【０１０３】
（５．５．２．  １−（２’，５’−ジニトロフェノキシ）−３，４，６−トリメチル−２，５−ジヒドロキシベンゼン）
１−（２’，５’−ジニトロフェノキシ）−２，５−ジメトキシ−３，４，６−ジメチルベンズアルデヒド０．６２６ｇ（１．７２８ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．５中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／ジエチルエーテル（７０：３０）混合物を溶離液として使用して、表題の物質をオレンジ色固体（０．４３５ｇ、７５％）として分離した。
【０１０４】
（５．６．  ７−アミノフェノキサジン−３−オン類を調製する基本手順）
ジヒドロキシジアリールエーテル１．３ｍｍｏｌをメタノール５ｍｌ中に溶解し、Ｐｄ／Ｃ  ５％触媒（１０％（重量／重量））をこの溶液に添加した。この反応混合物を、室温で水素化装置の中で、水素雰囲気下において４時間撹拌した。シリカをこのフラスコに添加し（カラムクロマトグラフィーに導入する残渣の量を考慮した際の十分量）、この混合物を、空気を自由に供給して更に４時間激しく撹拌した。酸化の終了後、溶媒を除去して残渣を溶離勾配を使用してカラムクロマトグラフィーに供した（軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／酢酸エチル（５０：５０）混合物で開始し、同溶媒の（２５：７５）混合物を経て同溶媒の（０：１００）混合物に至る）。最後に、酢酸エチル／メタノール（９０：１０）混合物を溶離液として使用した。
【０１０５】
（５．６．１．  ７−アミノ−１，２−ジメチルフェノキサジン−３−オン）
１−（２’，５’−ジニトロフェノキシ）−３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロキシベンゼン０．２６６ｇ（０．７６３６ｍｍｏｌ）から開始して、同じ容器における反応に従って、上記項目５．６中に記載される方法を実施した。表題の物質を赤褐色固体（０．１２５ｇ、６８％）として得た。
【０１０６】
（５．６．２．  ７−アミノ−１，２，４−トリメチルフェノキサジン−３−オン）
１−（２’，５’−ジニトロフェノキシ）−３，４，６−トリメチル−２，５−ジヒドロキシベンゼン０．４３５ｇ（１．３０１３ｍｍｏｌ）から開始して、上記項目５．６中に記載される方法を実施した。表題の物質を赤褐色固体（０．２３７ｇ、７２％）として得た。
【０１０７】
（５．７  ペプチドを７−アミノフェノキサジン−３−オン類に結合させる基本手順）
マグネティックスターラーバーを備えた小型丸底フラスコの中で７−アミノフェノキサジン−３−オン０．４ｍｍｏｌを無水ＤＭＦ  ５ｍｌ中に溶解し、Ｐｄ／Ｃ  ５％触媒０．０１０ｇをこの溶液に添加した。フラスコを室温で水素化装置の中に配置し、この反応混合物を１時間撹拌する間、水素雰囲気を維持した。溶液の色が濃紫色から灰色がかった緑色に変化したことから、完全に還元されたことを確認することができた。別のフラスコの中で、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アラニン０．０８９ｇ（０．４７１９ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）０．０７２ｇ（０．４７１９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）０．０７ｍｌ（０．４７１９ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ  ５ｍｌ中に溶解し、この反応混合物を室温で１時間撹拌した。上記の終了後、第二のフラスコの中身を、シリンジを使用して不活性雰囲気下において、（７−アミノフェノキサジン−３−オンの還元体の入った）第一のフラスコの中に導入した。反応物が非常に迅速に酸化するため、空気中の酸素はなくなった。この混合物を室温で更に２０時間撹拌した。この反応混合物をセライト（商標）を使用してろ過し、溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチル２０ｍｌ中で再融解させ、有機層を１Ｍ  ＨＣｌ  ２０ｍｌ、１０％  Ｎａ２ＣＯ３  ２０ｍｌ及び水２０ｍｌで洗浄した。生成物をＭｇＳＯ４を使用して乾燥させてろ過し、減圧下で蒸発させて残渣を得、これを、軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／酢酸エチル（３０：７０）混合物を溶離液として使用して、カラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１０８】
（５．７．１  ７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−ジメチルフェノキサジン−３−オン）
７−アミノ−１，２−ジメチルフェノキサジン−３−オン０．１１０ｇ（０．４５７８ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．７中に記載される方法を実施した。表題の物質を赤褐色固体（０．１０４ｇ、５５％）として得た。
【０１０９】
（５．７．２  ７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２，４−トリメチルフェノキサジン−３−オン）
７−アミノ−１，２，４−トリメチルフェノキサジン−３−オン０．１００ｇ（０．３９３３ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．７中に記載される方法を実施した。表題の物質をオレンジ色固体（０．１１３ｇ、６８％）として得た。
【０１１０】
（５．８．  Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル基の脱保護）
対応するＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基保護化合物０．２ｍｍｏｌを無水ＤＣＭ  ３ｍｌ中に溶解し、ＴＦＡ  １ｍｌをこの溶液に添加した。反応が終了するまでこの反応混合物を室温で撹拌した（続いて薄層クロマトグラフィーを実施した）。溶媒及び過剰なＴＦＡを減圧下で蒸発させ、残渣を溶離勾配を使用してショートカラムクロマトグラフィーで精製した（軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／酢酸エチル（５０：５０）混合物で開始し、同溶媒の（０：１００）混合物に至る）。最後に、酢酸エチル／メタノール（９０：１０）混合物を溶離液として使用した。
【０１１１】
（５．８．１．  ７−Ｎ−（β−アラニル）アミノ−１，２−ジメチルフェノキサジン−３−オン  トリフルオロ酢酸塩）
７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−ジメチルフェノキサジン−３−オン０．０４７ｇ（０．１１３８ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．８中に記載される方法を実施した。表題の物質を赤色固体（０．０４６ｇ、９５％）として得た。
【０１１２】
（５．８．２．  ７−Ｎ−（β−アラニル）アミノ−１，２，４−トリメチルフェノキサジン−３−オン  トリフルオロ酢酸塩）
７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２，４−トリメチルフェノキサジン−３−オン０．０８１ｇ（０．１８９７ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．８中に記載される方法を実施した。表題の物質を赤色固体（０．０８０ｇ、９６％）として得た。
【実施例６】
【０１１３】
＜７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１−メチル−２−クロロフェノキサジン−３−オン−４−カルボン酸メチルの調製＞
１，４−ジクロロベンゾキノンイミン１．７６ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、無水エタノール５０ｍｌ中にゆっくり撹拌しながら溶解させた。この溶液を撹拌している中に、４−メチル−２，６−ジヒドロキシベンゼン酸メチル１．８２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を撹拌しながらゆっくりと還流させると、大量に発熱していることが明らかになったため、フラスコを熱源から遠ざけなければならなかった。発熱がおさまったら、反応混合物を更に３０分間還流し、室温に冷却した。この反応混合物を室温で更に３時間放置した後、固形物を吸引ろ過によって回収し、少量の湯で洗浄した後で吸引し、これを可能な限り乾燥させ、続いてデシケーター中で真空下で乾燥させた。残渣を、移動相として酢酸エチルを使用してシリカゲル薄層クロマトグラフィーに供した。大量の濃色の塩基性物質、及び、蛍光ピンク色の成分が観察された。固形物を酢酸エチル中に溶解してろ過し、円錐状のシリカゲルを通過させた。ろ液には実質的に塩基性物質が含まれていない。溶媒を減圧下で除去し、固形物を分離した。
【０１１４】
上記のようにｔ−ＢＯＣ−β−アラニンを使用して固形物をアミノアシル化し、表題の化合物を得た。
【実施例７】
【０１１５】
＜７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−６−メチルフェノキサジン−３−オンの合成＞
（７．１．  Ｎ−アセチル−２−メチル−３−フルオロアニリンの合成）
塩化アセチル１．９８ｍｌ（２７．７８ｍｍｏｌ）を撹拌しながら、ＤＣＭ  ５０ｍｌ中の２−メチル−３−フルオロアニリンの３．１６１ｇ（２５．２６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン３．８７ｍｌ（２７．７８ｍｍｏｌ）溶液に０℃において添加した。この溶液を室温に温め、１時間撹拌した。この溶液を水（５０ｍｌで３回）で洗浄し、生成物をＭｇＳＯ４を使用して乾燥させて、溶媒を減圧下で除去した。鉱物油／酢酸エチル（ＥｔＯａｃ）の混合物から再結晶させた後、表題の化合物３．８４４ｇ（９１％）を白色結晶として得た。
【０１１６】
（７．２．  Ｎ−アセチル−２−メチル−３−フルオロ−４−ニトロアニリンの合成）
上記項目７．１で上に得られた化合物を、酢酸１０ｍｌ中の濃硫酸５ｍｌ及び硝酸５ｍｌの混合物と１８℃で１時間反応させた。続いてこの反応溶液を水１００ｍｌ中に希釈し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（５０ｍｌで３回）中で抽出して、ＭｇＳＯ４を使用して乾燥させ、溶媒を真空下で除去した。表題の化合物を白色固体（１．９６ｇ、７１％）として分離した。
【０１１７】
（７．３．  ２−メチル−３−フルオロ−４−ニトロアニリンの合成）
上記項目７．２で上に得られた化合物１．３１１ｇ（６．１８ｍｍｏｌ）を５Ｍ塩酸中で２時間還流させた。この溶液を炭酸ナトリウムで中和した後、ジエチルエーテル（５０ｍｌで３回）で抽出し、ＭｇＳＯ４を使用して乾燥させて、溶媒を真空下で除去した。鉱物有機溶媒／ＥｔＯＡｃ（７０：３０）混合物を溶離液として使用して、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製した。表題の物質を黄色固体（０．５８９ｇ、９４％）として分離した。
【０１１８】
（７．４．  ２−フルオロ−３，６−ジニトロトルエンの合成）
酢酸４ｍｌ中の上記項目７．３で上に得られた化合物０．３５７ｇ（２．１０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＥｔＯＡｃ  １１ｍｌ中の過ホウ酸ナトリウム四水化物１．６１ｇ（１０．４６ｍｍｏｌ）溶液に６５℃で滴下し、この混合物を６時間撹拌した。この反応溶液を水５０ｍｌ中に希釈し、この混合物をジエチルエーテル（２０ｍｌで３回）中で抽出して、ＭｇＳＯ４を使用して乾燥させ、溶媒を真空下で除去した。鉱物有機溶媒／トリクロロメタン（７０：３０）混合物を溶離液として使用して、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、表題の物質を黄色液体（０．２７４ｇ、６５％）として得た。
【０１１９】
（７．５  ２，５−ジメトキシフェノールの合成）
２，５−ジメトキシベンズアルデヒド５．５３ｇ（０．０３３３ｍｏｌ）を使用して、上記項目５．３中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／ジエチルエーテル（８０：２０）混合物を溶離液として使用して、表題の物質を黄色油（４．２７ｇ、８３％）として分離した。
【０１２０】
（７．６  １−（３’，６’−ジニトロ−２’−メチルフェノキシ）−２，５−ジメトキシベンゼンの合成）
上記項目７．４中で調製された２−フルオロ−３，６−ジニトロトルエン０．３６６ｇ（１．８３ｍｍｏｌ）及び上記項目７．５中で調製された２，５−ジメトキシフェノール０．２８２ｇ（１．８３ｍｍｏｌ）を使用して、上記項目５．４中に記載される方法を実施した。軽鉱物有機溶媒（６０〜８０℃）／ジエチルエーテル（７０：３０）混合物を溶離液として使用して、表題の物質を黄色固体（０．４００ｇ、６５．５％）として分離した。
【０１２１】
（７．７．  表題の化合物の合成）
上記項目５．５〜５．７中に記載されるように、表題の化合物を得ることができる。
【実施例８】
【０１２２】
＜グラム陰性菌のＬ−アラニンペプチダーゼ活性の検出＞
実施例１で調製された塩素化された又は塩素化されていない化合物、すなわち、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン（塩素化されたＬ−アラニル化合物）及び７−Ｎ−（Ｎ’’−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン（塩素化されていないＬ−アラニル化合物）を実施例３中に記載されるプロトコルによって脱保護したものを使用した。
【０１２３】
Ｌ−アラニル化合物各々１０ｍｇをジメチルスルホキシド１ｍｌ中に溶解し、この混合物を５０℃で融解したコロンビア寒天２００ｍｌに添加した。こうして構成された培地をペトリ皿に分配した（各基質の最終濃度：５０ｍｇ／ｌ）。
【０１２４】
その後、国際的に保存されている株又は本出願人が保存している株に由来する菌株を、１０μｌの較正ループを用いて角培地上に、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄに較正された懸濁液を使用して播種した。また、すべての菌株を、発色性基質を含まないコロンビア寒天培地上に、増殖コントロールとして播種した。全ての培養物を３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。
【０１２５】
２４〜４８時間インキュベートした後の増殖及び着色の結果を表１に示す（Ｇは増殖、Ｃは色、Ｉは無色、＋＋は非常に良好な増殖、＋は菌株の良好な増殖、＋／−は菌株の平均的な増殖、及び、−は菌株が増殖していないことを示す）。
【０１２６】
【表１】
2008512106.tif 000009
【０１２７】
上記表１中の結果は、本発明の酵素基質によれば、すべての細菌の菌株が増殖するので検出できるが、着色の変化はグラム−菌株（菌株１〜４及び６〜７）でのみ観察され、これにより、グラム−菌株とグラム＋菌株とを識別できることを示す。
【実施例９】
【０１２８】
＜緑膿菌属の細菌のβ−アラニンペプチダーゼ活の検出＞
これを実施するため、実施例２で調製された塩素化された又は塩素化されていないアラニン化合物、すなわち、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン（塩素化されたβ−アラニル化合物）及び７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン（塩素化されていないβ−アラニル化合物を実施例５中に記載されるプロトコルによって脱保護したものを使用した。
【０１２９】
また、ペトリ皿を準備し、菌株を実施例５中に記載されるプロトコルによって播種した。
【０１３０】
２４〜４８時間インキュベートした間の着色の結果を下記表２中に示す。
【０１３１】
【表２】
2008512106.tif 000010
【０１３２】
上記表２中の結果から、本発明の化合物によれば、緑膿菌細菌を優先的に検出できることが実証される（薄紫色から紫色への着色）。
【実施例１０】
【０１３３】
＜ピログルタミルペプチダーゼ活性の検出＞
これを実施するため、実施例４で調製された塩素化された又は塩素化されていないピログルタミル化合物、すなわち、７−Ｎ−（Ｌ−ピログルタミル）アミノ−２−クロロ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン（塩素化されたＬ−ピログルタミル化合物）及び７−Ｎ−（Ｌ−ピログルタミル）アミノ−１−ペンチルフェノキサジン−３−オン（塩素化されていないＬ−ピログルタミル化合物）を実施例５中に記載されるプロトコルによって脱保護したものを使用した。
【０１３４】
また、ペトリ皿を準備し、菌株を実施例５中に記載されるプロトコルによって播種した。
【０１３５】
２４〜４８時間インキュベートした間の着色の結果を下記表３中に示す。
【０１３６】
【表３】
2008512106.tif 000011
【０１３７】
上記表３中の結果から、本発明の化合物によれば、緑膿菌細菌を優先的に検出できることが実証される。
【実施例１１】
【０１３８】
＜緑膿菌属の細菌のβ−アラニンペプチダーゼ活の検出＞
これを実施するため、実施例５及び６で調製されたβ−アラニン化合物、すなわち、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２−ジメチルフェノキサジン−３−オン（ｂ−ａｌａ−ＤＭＰ）、７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１，２，４−トリメチルフェノキサジン−３−オン（ｂ−ａｌａ−ＴＭＰ）及び７−Ｎ−（Ｎ’−ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル）アミノ−１−メチル−２−クロロ−４−（オキソ−１−メチル）フェノキサジン−３−オン（ｂ−ａｌａ−ＭＣＭＰ）を上記実施例中に記載されるプロトコルによって脱保護したものを使用した。
【０１３９】
また、ペトリ皿を準備し、菌株を実施例７中に記載されるプロトコルによって播種した。
２４〜４８時間インキュベートした間の着色の結果を下記表４中に示す。
【０１４０】
【表４】
2008512106.tif 000012
【０１４１】
＊  本出願人の保存する菌株
【０１４２】
上記表４中の結果から、本発明の化合物によれば、緑膿菌細菌を優先的に検出できることが実証される（ピンク色から青紫色への着色）。結果は、使用する置換基とその主環上での位置に応じて緑膿菌種に対する感度及び特異性が変わり得るのと同様に、色及び色の強度の点でも変わり得、これらの様々な基質の使用が意図した目的に応じた異なる特定の用途において考慮されるということにも注目できる。
【国際調査報告】
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