(57)【要約】【課題】癌、動脈硬化及び糖尿病などの治療に適した医薬組成物を得る。【解決手段】本発明は、添付の配列リスト中の配列番号１に相当する配列：ＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＬＲＫＬＩＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＫＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ又は等価配列のＴＡＬ−１のＨＬＨドメインの少なくとも１０個連続するアミノ酸及び好ましくは少なくとも１５個連続するアミノ酸からなる又はこれらを含む、ＴＡＬ−１のＨＬＨドメインに干渉可能で、ベクターと有利に関連するペプチド分子に関する。本発明は、前記ペプチド分子を含む医薬組成物、並びに血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療のために設計される薬剤の調製を目的としたＴＡＬ−１のＨＬＨドメインと相互作用可能な化合物の使用にも関する。さらに本発明は、前記化合物の存在下で、ＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用の阻害に対する検出の中に存する、血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療において使用可能な生物活性化合物を同定するための方法に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
添付の配列リスト中の配列番号１に相当する配列：
ＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＬＲＫＬＩＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＫＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ
又は等価配列のＴＡＬ−１のＨＬＨドメインからの少なくとも１０個連続するアミノ酸及び、好ましくは少なくとも１５個連続するアミノ酸からなるあるいは含む、ＴＡＬ−１のＨＬＨドメインに干渉可能なペプチド分子。
【請求項２】
配列：
−ＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＬＲＫＬＩＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ（添付の配列リスト中の配列番号１）、
−ＶＲＲＩＦＴＮＳＲＥＲＷＲＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＲＬＲＫＬＩ（添付の配列リスト中の配列番号２）及び
−ＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＫＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ（添付の配列リスト中の配列番号３）
の中から選択される配列又は前記配列に等価な配列からなるあるいは含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド分子。
【請求項３】
ベクターに関連することを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド分子。
【請求項４】
前記ベクターが、
−プロテグリン又はタチプレシン由来の直鎖ペプチドと、
−ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の形質導入ドメイン及びアンテナペディアの第３ヘリックス由来の形質導入ドメインなどの形質導入ドメインを含む直鎖ペプチドと、
−リポソームなどの粒子と、
−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーと、
を含む群の中から選択されることを特徴とする請求項３に記載のペプチド分子。
【請求項５】
前記ベクターが、式（Ｉ）：
ＢＸ（Ｘ又はＢ）ＢＸＸＸＸＢＢＢＸＸＸＸＸＸＢ（Ｉ）
に従うプロテグリン由来の直鎖ペプチド、
あるいは、式（ＩＩ）：
（Ｂ又はＸ）ＸＸＸＢＸＸＸＢＸＸＸＸＢＢＸＢ（ＩＩ）
に従うタチプレシンの直鎖ペプチド誘導体
（式中、
−同一の又は異なるＢ基は、側鎖がアルカリ基を担持するアミノ酸残基を示し、かつ
−同一の又は異なるＸ基は、脂肪族若しくは芳香族アミノ酸残基を示す）、
あるいは式（Ｉ）又は（ＩＩ）の少なくとも５個及び好ましくは少なくとも７個連続するアミノ酸の配列からなるそれらの断片であることを特徴とする請求項３又は４に記載のペプチド分子。
【請求項６】
前記分子と前記ベクターの間の結合が、生理学的培地又は細胞内部で共有結合、疎水結合、イオン結合、開裂可能な結合又は開裂不可能な結合の中から選択されることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載のペプチド分子。
【請求項７】
前記結合はリンカーを介して直接的若しくは間接的であり、かつ天然に存在する官能基を介して行われるか、あるいは前記ベクター又は前記阻害剤若しくはその両方に導入されることを特徴とする請求項６に記載のペプチド分子。
【請求項８】
−化合物４：
【化１】
2008505848.tif 000006
−化合物５：
【化２】
2008505848.tif 000007
の２つの化合物の中から選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド分子。
【請求項９】
前記組成物において許容可能な賦形剤と有利に関連する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の、活性成分として少なくとも１つのペプチド分子を含む医薬組成物。
【請求項１０】
非経口、経口、直腸、経鼻、経皮、肺又は中枢投与に適する形状で存在することを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療を意図した薬剤の浸透におけるＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用を阻害可能な化合物の使用。
【請求項１２】
前記化合物がＴＡＬ−１のＨＬＨドメインの拮抗阻害剤であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記化合物が請求項１〜８のいずれか１項において定義されるペプチド分子であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記化合物がＴＡＬ−１のそのパートナーＥ４７上への固定を阻害可能な化合物であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記化合物がＴＡＬ−１のＨＬＨドメインのレベルでエピトープ、又はＥ４７のＨＬＨドメインでエピトープのいずれかを認識する抗体であることを特徴とする請求項１１又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記化合物の存在下でＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用の阻害を検出するステップからなる、血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療において使用される可能性が高い生物活性化合物を同定するための方法。
【請求項１７】
前記方法が、
ａ）タンパク質ＴＡＬ−１（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）と、転写因子Ｅ４７（又は前記ＨＬＨドメインを含むこの因子の断片）と、試験される前記生物活性化合物とを接触状態にする段階と、
ｂ）ＨＬＨタンパク質ＨＬＨ（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）又は転写因子Ｅ４７（又は前記ＨＬＨドメインを含むこの因子の断片）を免疫沈降させる段階と、
ｃ）段階（ｂ）で、前記ＴＡＬ−１タンパク質（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）が免疫沈降される場合、段階（ｂ）で得られる免疫沈降物において転写因子Ｅ４７（又は前記ＨＬＨドメインを含むこの因子の断片）の存在を検出する段階と、
ｄ）段階（ｂ）で、転写因子Ｅ４７（又は前記ＨＬＨドメインを含むこの因子の断片）が免疫沈降される場合、段階（ｂ）で得られる免疫沈降物においてタンパク質ＴＡＬ−１（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）の存在を検出する段階と、
を含み、転写因子Ｅ４７（又は前記ＨＬＨドメインを含むこの因子の断片）が段階（ｃ）で存在しない場合あるいはタンパク質ＴＡＬ−１（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）が段階（ｄ）で存在しない場合、前記化合物が血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療において使用される可能性が高い作用物質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、
（ａ'）前記ＴＡＬ−１タンパク質（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）と、転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用する前記ドメインを含むこの因子の断片）と、試験される前記生物活性化合物とを接触状態にする段階と、
（ｂ'）変性剤ではないポリアクリルアミドゲル上に段階（ａ'）で得られる混合物を移動させる段階と、
（ｃ'）前記ＴＡＬ−１複合体（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）及びＥ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用する前記ドメインを含むこの因子の断片）の非存在又は存在を可視化する段階と、
を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、動脈硬化及び糖尿病などの血管新生障害に関連する疾患の治療に関する。本発明は、ペプチド、粒子（リポソーム、ナノ粒子など）及びポリマーなど、ベクターと共役されやすいＴＡＬ−１の様々な相互作用に干渉可能な特異的な血管新生阻害剤に関する。本発明は、かかる阻害剤を含有する医薬組成物並びに血管新生に関連する疾患の治療、より詳細には癌、動脈硬化及び糖尿病の治療におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の毛細血管を再構築する過程である血管新生が新たな血管の形成を招く［リソー（Ｒｉｓｅａｕ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６；６７１頁（１９７７年）］。そして生理的条件において、刺激因子（血管形成剤（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｓ））と阻害剤（血管新生抑制剤（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃｓ））の因子の間の局所平衡の制御下で、血管新生がきめ細かく調節される。成人では内皮の大部分の細胞（９９％超）が休止状態にある。内皮細胞（ＥＣ）は、血管新生シグナルに応答して休止から脱却して「活性化」状態になることで血管新生のプログラムを始動させる。これらの複雑な過程には、ＥＣの活動による毛細血管からの遊離及びその血管新生部位への移動、その増殖及び分化による新たな毛細血管の形成が含まれる。
【０００３】
動脈硬化、糖尿病及び腫瘍などの特定の疾患において血管新生障害が観察される［カーメリエ（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６；３８９頁（２０００年）］。腫瘍が低酸素状態を創出する臨界サイズに達する場合、腫瘍細胞は血管新生を開始又は刺激することで知られるＶＥＧＦ又はｂＦＧＥなどのサイトカインを放出する。腫瘍成長に必要とされる血管新生は、生物での悪性細胞の伝播（転移）における主要な因子でもある。
【０００４】
特定の癌との闘いにおいて進展があることは疑いないが、癌が全世界で進行し、死亡の主要因であることを認識する必要がある。新規薬剤の発見は医学研究の優先事項の１つである。腫瘍血管新生に関する科学的知見における最近の進歩によると、抗血管新生に基づく治療によって癌患者における腫瘍の成長を制御するための新たな方法が提供される可能性がある。
【０００５】
いくつかの抗血管新生の方法が開発されることで、特にサイトカイン又はその受容体に特異的な中和抗体を用いて、活性化因子（ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ）の機能が阻害されている。他の抗血管新生分子は、プラスミノゲン（アンギオスタチン）、コラーゲン（エンドスタチン）又はさらにフィブリノーゲン（アルファスタチン（ａｌｐｈａｓｔａｔｉｎ））などの止血系に存在する生理学的阻害剤（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）から由来している。これらの分子は、ＥＣの形態形成に必要なその細胞外マトリックスへの接着を阻害する。
【０００６】
今日までほとんど検討されていない別手法とは、血管新生刺激に応答する内皮細胞の細胞内事象を直接標的にすることである。それ故、出願人は、基本−ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）ファミリー由来の転写因子ＴＡＬ−１が内皮細胞の血管新生応答を特異的に調節することを実証している。ＴＡＬ−１は内皮細胞の移動特性を制御し、かつその毛細血管への分化を刺激する［ラズラック（Ｌａｚｒａｋ）ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００４年）］。マウスにおける相同組換え実験によると、造血及び血管発達における特定の諸段階にとってＴＡＬ−１遺伝子が必要であることが実証されている。Ｔａｌ−１−／−胚（ＴＡＬ−１を発現しない）は、内皮細胞における固有の欠陥を反映するとみられる卵黄嚢において欠陥のある血管新生を呈する［ビスベイダー（Ｖｉｓｖａｄｅｒ）ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２；４７３頁（１９９８年）］。成人では、特定の骨髄の造血前駆体を除き、休止した成熟内皮内ではなく形成される小血管内にＴＡＬ−１タンパク質が発現される［カリアンプール（Ｋａｌｌｉａｎｐｕｒ）ら、Ｂｌｏｏｄ  ８３；１２００頁（１９９４年）］。注目すべきことに、ヒト腫瘍の脈管構造においてＴＡＬ−１の高度な発現が観察される［チェッティ（Ｃｈｅｔｔｙ）ら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １８１；３１１頁（１９９７年）］。したがって、ＴＡＬ−１は血管新生ＥＣのマーカーである。それ故に、発明者らは血管新生を阻害するＴＡＬ−１を標的とした。
【０００７】
出願人は、内皮細胞内でＴＡＬ−１の活性を特異的に遮断することが可能な新たな分子を作製した。現在に至るまで既知のＴＡＬ−１因子のあらゆる活性、すなわちＤＮＡ上への固定又は他の核因子、特にＥ４７若しくはＬＭＯ２との相互作用には、ＴＡＬ−１のＨＬＨモチーフが必要である［スー（Ｈｓｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９１；３１８１頁（１９９４年）；ヴィッテリ（Ｖｉｔｅｌｌｉ）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０；５３３０頁（２０００年）］（図１）。出願人は、ＴＡＬ−１のＨＬＨドメインとの競合に介入可能なペプチド阻害剤を開発した。次いでこれらのペプチド阻害剤は、ペプチドベクターとカップリングすることで、細胞内へのそれらの内在化が可能になり、かつ／又は改善された。
【０００８】
１９９７年１２月８日に出願された仏国特許出願第９７／１０２９７号明細書では、これらのペプチドベクター及び活性分子を運搬するベクターとしてのその使用に関する研究及び結果が記載されている。
【０００９】
下記に示されるペプチド配列では、アミノ酸が１文字を用いたコードによって示されるが、以下の命名法に従い、３文字を用いたコードによっても示される場合がある。
Ａ  Ａｌａ  アラニン
Ｃ  Ｃｙｓ  システイン
Ｄ  Ａｓｐ  アスパラギン酸
Ｅ  Ｇｌｕ  グルタミン酸
Ｆ  Ｐｈｅ  フェニルアラニン
Ｇ  Ｇｌｙ  グリシン
Ｈ  Ｈｉｓ  ヒスチジン
Ｉ  Ｉｌｅ  イソロイシン
Ｋ  Ｌｙｓ  リシン
Ｌ  Ｌｅｕ  ロイシン
Ｍ  Ｍｅｔ  メチオニン
Ｎ  Ａｓｎ  アスパラギン
Ｐ  Ｐｒｏ  プロリン
Ｑ  Ｇｌｎ  グルタミン
Ｒ  Ａｒｇ  アルギニン
Ｓ  Ｓｅｒ  セリン
Ｔ  Ｔｈｒ  トレオニン
Ｖ  Ｖａｌ  バリン
Ｗ  Ｔｒｐ  トリプトファン
Ｙ  Ｔｙｒ  チロシン
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主題は、添付の配列リスト中の配列番号１に相当する配列
ＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＬＲＫＬＩＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＫＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ
又は等価配列のＴＡＬ−１のＨＬＨドメインからの少なくとも１０個連続するアミノ酸及び、好ましくは少なくとも１５個連続するアミノ酸からなるあるいはこれらを含む、ＴＡＬ−１のＨＬＨドメインに干渉可能なペプチド阻害剤（ペプチド分子とも称される）である。
【００１１】
「等価配列」とは、ＴＡＬ−１のＨＬＨドメインの既知の変異体の配列並びに配列番号１の配列に関してアミノ酸の１つ若しくはいくつかの置換、欠失及び／又は付加を示す配列を示す。ここでアミノ酸の前記置換、欠失及び／又は付加により、ＤＮＡ上への固定又は他の核因子、特にＥ４７若しくはＬＭＯ２との相互作用として得られるＴＡＬ−１因子の活性が修飾されることはない。当業者は、これによって得られるＴＡＬ−１転写因子の活性を検証するための様々な技術を認識している。さらに本発明の枠内では、「等価配列」とは、翻訳後修飾及び／又は化学修飾、特に糖鎖付加、アミド化、アシル化、アセチル化、メチル化を示すペプチド、並びに保護基を有するペプチドを示す。本発明におけるペプチドの誘導体は、１種類若しくは数種類のアミノ酸が光学異性体、ジアステレオ異性体、立体配座Ｄの天然アミノ酸、特にヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、６−Ｎ−メチリシン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸といった希アミノ酸、並びに特にオルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、シクロヘキシル−アラニン及びオメガアミノ酸といった合成アミノ酸である場合もある。同誘導体は、レトロペプチド及びレトロインバーソペプチド（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｏｐｅｐｔｉｄｅ）、並びに１つ若しくはいくつかのアミノ酸側鎖が本発明におけるペプチドの抗菌活性を修飾しない基によって置換されるペプチドも網羅する。
【００１２】
本発明の枠内での「ペプチド分子」とは、少なくとも１つのペプチド配列からなる又はそれらを含む分子を示す。ここで前記分子は、アミノ酸以外の付加的化学物質を含む場合もある。
【００１３】
好ましくは、本発明の主題である阻害剤又はペプチド分子は、配列：ＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＬＲＫＬＩＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ（添付の配列リスト中の配列番号１）の化合物１、配列：ＶＲＲＩＦＴＮＳＲＥＲＷＲＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＲＬＲＫＬＩ（添付の配列リスト中の配列番号２）の化合物２及び配列：ＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＫＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ（添付の配列リスト中の配列番号３）の化合物３の中から選択されるか又は前記配列に等価な配列である。したがって、本発明における阻害剤は、
−ＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＬＲＫＬＩＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ（添付の配列リストにおける配列番号１）、
−ＶＲＲＩＦＴＮＳＲＥＲＷＲＱＱＮＶＮＧＡＦＡＥＲＬＲＫＬＩ（添付の配列リスト中の配列番号２）及び
−ＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＫＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ（添付の配列リスト中の配列番号３）
の配列の中から選択される配列又は前記配列に等価な配列からなるかあるいはこれらを含む。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明の主題である阻害剤又はペプチド分子はベクターに関連する。有利な様式では、このベクターは細胞及び標的器官における前記阻害剤の輸送を増大させることが可能である。
【００１５】
当業者は、本発明の枠内で使用可能な様々な種類のペプチドベクターを認識している。したがって、例としてかつ非限定的に、同ベクターは、
−プロテグリン又はタチプレシンを由来とする直鎖ペプチド［仏国特許第９７／１０２９７号明細書］と、
−ＨＴＶ−１のＴａｔタンパク質の形質導入ドメイン［ファウェル（Ｆａｗｅｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９１；６６４頁（１９９４年）；シュワルツェ（Ｓｃｈｗａｔｚｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５；１５６９頁（１９９９年）］及びアンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａ）の第３ヘリックス由来の形質導入ドメイン［デロッシ（Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６９、１０４４４頁（１９９４年）；米国特許第５８８８７６２号明細書］などの形質導入ドメインを含む直鎖ペプチドと、
−リポソーム［ダス（Ｄａｓｓ）及びス（Ｓｕ）  （２００１年）  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．８：１９１−２１３頁］又はナノ粒子［パニャム（Ｐａｎｙａｍ）及びラブハセットワー（Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ）  （２００３年）  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．５５；３２９−４７頁；ダグラス（Ｄｏｕｇｌａｓ）ら（１９８７年）  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．３：２３３−６１頁］などの粒子と、
−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）［グリーンウォルド（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ）ら  （２００３年）  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．５５：２１７−５０頁］などのポリマーと、
を含む群の中から選択される。
【００１６】
本発明は、特に、式（Ｉ）：
ＢＸ（Ｘ又はＢ）ＢＸＸＸＸＢＢＢＸＸＸＸＸＸＢ（Ｉ）
に従うプロテグリン由来の直鎖ペプチド、及び式（ＩＩ）：
（Ｂ又はＸ）ＸＸＸＢＸＸＸＢＸＸＸＸＢＢＸＢ（ＩＩ）
に従うタチプレシン由来の直鎖ペプチド
（式中、
−同一の又は異なるＢ基は、側鎖がアルカリ基を担持するアミノ酸残基を示し、かつ
−同一の又は異なるＸ基は、脂肪族若しくは芳香族アミノ酸残基を示す）、
あるいは式（Ｉ）又は式（ＩＩ）からのペプチドの少なくとも５個及び好ましくは少なくとも７個連続するアミノ酸の配列からなるそれらの断片として想起される。
【００１７】
本発明は、細胞、組織及び／又は器官においてベクター化する、上で定義したベクターや上で定義したペプチド阻害剤の使用にも関する。
【００１８】
上で定義したＴＡＬ−１の様々な相互作用に干渉することが可能なＴａｌ−１の阻害剤又はペプチド分子とベクターとの間の結合は、生理学的培地又は細胞内部で共有結合、疎水結合、イオン結合、開裂可能な結合又は開裂不可能な結合の中から選択される。
【００１９】
この結合はリンカーを介して直接的若しくは間接的であり、かつ天然に存在する官能基を介して行われるか、あるいは前記ベクター又は阻害剤若しくはその両方に導入される。このリンカーは、存在する場合、ベクターと阻害剤の両方の化学的性質及びサイズを考慮して許容される必要がある。例としてかつ非限定的に、発明者らは、アルキル、アリール、アラルキル又はペプチド基、エステル、アルデヒド又はアルキル、アリール又はアラルキル酸、無水物、スルフヒドリル基又はカルボキシル基、例えば、安息香酸マレイミル（ｍａｌｅｙｍｉｌ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）、マレイミルプロピオン酸（ｍａｌｅｙｍｉｌ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体及びスクシンイミジル（ｓｕｃｃｙｎｉｍｉｄｙｌ）誘導体、臭化又は塩化シアン誘導基、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミドエステル又はスルホン酸ハロゲン化物を含むリンカーを挙げることができる。
【００２０】
官能基として、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、又は−ＮＨ２に言及することは可能である。したがって、阻害剤はＮ−末端又はＣ−末端のレベルであるいはペプチドベクターの側鎖のレベルで共有結合によって結合されうる。
【００２１】
血管新生阻害剤とベクターの間の好ましい結合の１種は、少なくとも１つのジスルフィド架橋に関与する。
【００２２】
特に有利な様式では、本発明における阻害剤は、
−化合物４：
【化３】
2008505848.tif 000002
−化合物５：
【化４】
2008505848.tif 000003
の２種類の化合物の中から選択される。
【００２３】
本発明は、活性成分として、上で定義した少なくとも１種類のペプチド阻害剤（又は分子）を含む医薬組成物にも関し、前記組成物において許容可能な賦形剤と有利に関連している。
【００２４】
好ましくは、前記医薬組成物は、非経口、経口、直腸、経鼻、経皮、肺又は中枢投与に適する形状で与えられる。本発明によると、「賦形剤」とは、本発明の阻害剤への添加によってその輸送が促進され、前記組成物における実質的分解が回避され、かつその阻害特性が維持される、任意の物質を示す。賦形剤は、組成物で上に挙げられる適用タイプの一機能として選択される。
【００２５】
本発明は、主題として、このような疾患を患う被験体に対する上で定義した阻害剤又は組成物の有効量の投与からなる、癌、動脈硬化及び糖尿病などの血管新生障害に関連する疾患の治療のための方法も有する。
【００２６】
本発明は、血管新生に関連する疾患、及びより詳細には血管新生障害に関連する疾患の治療、好ましくは癌、動脈硬化及び糖尿病の治療を意図した薬剤の調製における先に定義した阻害剤又は組成物の使用にも関する。
【００２７】
本発明は、血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療を意図した薬剤の調製におけるＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用を阻害可能な化合物の使用にも関する。
【００２８】
本発明の第１の実施形態では、ＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用を阻害可能な化合物が、ＴＡＬ−１のＨＬＨドメインの拮抗阻害剤である。好ましくは、このような化合物は上で定義したペプチド分子である。
【００２９】
本発明の第２の実施形態では、ＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用を阻害可能な化合物が、ＴＡＬ−１のそのパートナーＥ４７上への固定を阻害することが可能な化合物である。好ましい様式では、このような化合物は、ＴＡＬ−１のＨＬＨドメインのレベルでのエピトープ、又はＥ４７のＨＬＨドメインのレベルでのエピトープを認識する抗体である。
【００３０】
先に定義された阻害剤（阻害剤又はペプチド分子）に対して考えられる適用及び使用とは、ＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用を阻害することが可能な化合物に対して準用することである（治療方法、医薬組成物など）。
【００３１】
最後に、本発明は、前記化合物の存在下でＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用の阻害を検出するステップからなる、血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療に使用される可能性が高い生物活性化合物を同定する方法に関する。
【００３２】
「生物活性化合物」により、本発明は、より詳細には、例としてであっても不完全な様式で、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アプタマー、リポタンパク質、多糖類、小分子、非ペプチド分子などの任意の天然又は合成化合物を示す。前記生物活性化合物が同定されると、当業者によく知られた方法を用い、血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療におけるその活性を試験することが容易になる。
【００３３】
当業者は、試験される生物活性化合物がＴＡＬ−１とそのパートナーＥ４７のＨＬＨドメイン間の相互作用を阻害することが可能か否かを検証するのに利用可能な様々な技術を有している。
【００３４】
第１の実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）タンパク質ＴＡＬ−１（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）と、転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）と、試験される生物活性化合物とを接触状態にする段階と、
（ｂ）ＴＡＬ−１タンパク質（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）又は転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）を免疫沈降させる段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で、ＴＡＬ−１タンパク質（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）が免疫沈降される場合、段階（ｂ）で得られる免疫沈降物における、転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）の存在を検出する段階と、
（ｄ）段階（ｂ）で、転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）が免疫沈降される場合、段階（ｂ）で得られる免疫沈降物においてＴＡＬ−１タンパク質（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）の存在を検出する段階と、
を含み、段階（ｃ）で転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）が存在しない場合あるいは段階（ｄ）でタンパク質ＴＡＬ−１（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）が存在しない場合、前記化合物は、血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療において使用される可能性が高い作用物質である。
【００３５】
当業者は、本発明の方法の枠内で使用される可能性が高い、使用可能な様々なタンパク質を有している。例として、使用可能なタンパク質Ｅ４７は、番号ＣＡＥ３０４５４下のＧｅｎｂａｎｋ中に存在するＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓから得られるタンパク質又は番号ＡＡＫ１８６１８下のＧｅｎｂａｎｋ中に存在するＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓから得られるタンパク質でありうる。同様にして、使用可能なＴＡＬ−１タンパク質は、番号Ｐ１７５４２下のＧｅｎｂａｎｋ中に存在するＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓから得られるタンパク質又は番号Ｐ２２０９１下のＧｅｎｂａｎｋ中に存在するＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓから得られるタンパク質である。これらの配列において、当業者は本発明の枠内にある極めて興味深いドメインについて知っている。
【００３６】
本発明の方法の段階（ｂ）では、免疫沈降させる機能を有するタンパク質として使用される抗体がどの種類であるかを当業者であれば知っているであろう［転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）の特異抗体又はＴＡＬ−１タンパク質（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質から得られる断片）の特異抗体］。
【００３７】
段階（ｃ）では、段階（ｂ）で得られる免疫沈降物における転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）の存在の検出については、転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）に対する特異抗体を用いたウエスタンブロット法、転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）の活性に関するアッセイ、あるいは標識付けされた転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）を用いる方法などを例とする、当業者が有するいずれかの技術を用いて実施可能である。ここで前記標識付けとは放射性標識付けでありうる。
【００３８】
段階（ｄ）でのＴＡＬ−１タンパク質（又は前記ＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）に対し、必要に応じた変更の実施が可能である。
【００３９】
第２の実施形態では、本方法は、
（ａ'）タンパク質ＴＡＬ−１（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）と、転写因子Ｅ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）と、試験される生物活性化合物とを接触状態にする段階と、
（ｂ'）変性剤ではないポリアクリルアミドゲル上に段階（ａ'）で得られる混合物を移動させる段階と、
（ｃ'）ＴＡＬ−１複合体（又はＨＬＨドメインを含むこのタンパク質の断片）及びＥ４７（又はＴＡＬ−１と相互作用するドメインを含むこの因子の断片）の非存在又は存在を可視化する段階と、
を含む。
【００４０】
段階（ｃ'）でこの複合体が存在しないことによって試験用活性化合物の阻害効果が現れ、それ故、この化合物は、血管新生に関連する疾患の予防及び／又は治療、並びに好ましくは、癌、動脈硬化及び糖尿病の治療において使用される可能性が高い作用物質である。
【００４１】
本発明の方法の段階（ｃ'）では、当業者に既知の様々な技術を利用してもよい。例として、タンパク質のＴＡＬ−１又はＥ４７又はこれらの断片のうちの１つから得られる特異的な抗体を用いてウエスタンブロットを行うことが可能である。
【００４２】
ＴＡＬ−１阻害剤とペプチドベクターとからなる化合物の調製、並びにそれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果に関する以下の実施例を読めば、本発明の他の利点及び特性が明らかになるであろう。以下の添付の図面が参照されることになろう。
【実施例】
【００４３】
Ｉ−化学物質合成
１）遊離しかつベクター化されたＴＡＬ−１阻害剤の合成
ペプチドをＦｏｃ／ｔｕ手法によって固相上に集め、トリフルオロ酢酸によって開裂させてかつ脱保護し、次いで逆相で分取高圧クロマトグラフィーによって精製して凍結乾燥した。その純度（＞９５％）及びその同一性を分析ＨＰＬＣ及び質量分析法によって確認した。ペプチド配列：ＳｙｎＢ３（Ｈ−ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ−ＮＨ２；１３９４．８Ｄａ、添付の配列リスト中の配列番号７）、ＳｙｎＢ４（Ｈ−ＡＱＳＦＲＶＳＹＲＧＩＳＹＲＲＳＲ−ＮＨ２；２１４５．１Ｄａ、添付の配列リスト中の配列番号６）、Ｔａｌ−ＨＬＨ（Ｈ−ＱＱＮＶＮＦＡＦＡＥＬＲＫＬＩＰＴＨＰＰＤＫＫＬＳＫＮＥＩＬＲＬＡＭＫＹＩＮＦＬＡ−ＮＨ２、添付の配列リスト中の配列番号１）。
【００４４】
２）ペプチドベクター上での阻害剤のカップリング
ベクターの活性化：ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）の存在下で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＳＰＤＰ（Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート）によってペプチドベクターのＳｙｎＢ３とＳｙｎＢ４を処理した。生成されるペプチドである（２−ピリジルチオ）プロピオニル−ＳｙｎＢ３（１５９１．８Ｄａ）と（２−ピリジルチオ）プロピオニル−ＳｙｎＢ４（２３４２．１Ｄａ）をＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。
【００４５】
共役物の調製：Ｃ−ＴａｌＨＬＨ（システインの追加によって合成されたＴａｌ−ＨＬＨ化合物）のシステイン側鎖とベクターによって運搬される３−メルカプト−プロピオネートとの間でジスルフィド架橋を形成するのに、ＤＩＥＡの存在下で、活性化された各ペプチドベクターの（２−ピリジルチオ）プロピオニル−ＳｙｎＢｘ（ｌｅｑ）をＤＭＦ中でＣ−ＴａｌＨＬＨ（ｌｅｑ）とともに可溶化させた。エーテルの添加により、生成される共役物（Ｔａｌ−ＨＬＨ−ＳｙｎＢ３；６３０３Ｄａ及びＴａｌ−ＨＬＨ−ＳｙｎＢ４；７０５２．６Ｄａ）を沈殿させ、次いでＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。２２０ｎｍでの分析ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による品質管理によってモル質量を確認し、９６％を超える純度を決定づけた。
【００４６】
ＩＩ−試験化合物
下記表１に試験化合物を示す。
【００４７】
【表１】
2008505848.tif 000004
【００４８】
１）翻訳／免疫沈降試験
供給元（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））より提案された条件に従い、ＴＮＴ−Ｔ７とカップリングされた網状赤血球溶解物系において配列コーディングの転写及び翻訳を可能にするプラスミドを用い、ＴＡＬ−１とＥ４７の２種類のタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同時翻訳させる。尿素の２Ｍ溶液中に溶解されるペプチドの添加の有無にかかわらず、メチオニンＳ３５の存在下で翻訳を行う。ゲルの電気泳動及びオートラジオグラフィーによって各翻訳物のアリコート部分（１μｌ）を制御する。網状赤血球溶解物中への最大０．７μｇのペプチドの添加（最終容量２５μｌ）は、２種類のタンパク質の翻訳の有効性に影響しない。
【００４９】
３７℃で３０分間インキュベーションした後、抗−ＴＡＬ−１モノクローナル抗体（ＢＴＬ７３＋２ＴＬ１３６；［プルフォード（Ｐｕｌｆｏｒｄ）ら、ＢＩｏｏｄ  ８５；６７５頁（１９９５年〉］）の混合物によって翻訳産物を免疫沈降させてから、ゲルの電気泳動及びオートラジオグラフィーによって分析する。オートラジオグラフィーによる走査後に得られるＥ４７／ＴＡＬ−１比を計算することにより、各点におけるＴＡＬ−１−Ｅ４７の相互作用を定量する。すべてのウェルにおいて、標準化のためにここではＴＡＬ−１に対応するバンドの強度を用いる。ペプチドの非存在下での相互作用を恣意的に１００％に規定する。
【００５０】
２）細胞毒性試験
造血細胞Ｋ５６２をＡＴＣＣから市販ルートで入手した。産物を添加する２４時間前に、１ウェル当たり約１０４個の細胞として細胞を播種する。次いで実験日には同細胞は６０〜８０％のコンフルエント状態である。ＯｔｉｍＭｅｍ（登録商標）培地内では、９５％の湿度と５％のＣＯ２の雰囲気で、培養物中で細胞を３７℃で維持する。
【００５１】
化合物の濃度を上昇させた状態で細胞を４８時間インキュベートする。培養時間の終了時に、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）をウェルに添加し、次いで培養皿をオーブン内で４時間インキュベートする。次いで、生成されるホルマザンの結晶性沈殿物を２００μｌのＤＭＦ／ＳＤＳの添加によって溶解させる。マイクロプレートリーダーを用い、５５０ｎｍ（参照６３０ｎｍ）で光学密度（ＯＤ）を測定する。
【００５２】
ＬＤ５０を判定するのに、ウェルのＯＤの百分率を産物濃度の関数として処理したものを図を用いて示す。これは成長の５０％を阻害する産物の濃度に相当する。
【００５３】
３）内皮細胞の生存試験
臍帯静脈由来のヒト内皮細胞ＨＵＶＥＣ（クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ））を、１０％の非補完的な（ｄｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）仔ウシ胎児血清を添加した完全ＥＭＢ−２培地（クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ））内のゼラチンでコーティングされたディッシュ上で培養する。３〜５の経路で細胞を使用する。ＥＣＶ３０４細胞（ＡＴＣＣから入手）を１０％の非補完的な仔ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭで培養する。
【００５４】
トリプシンを用いて細胞を取り出し、血清を含まない培地（ＯｐｔｉＭＥＭ、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に懸濁させる。ペプチドの様々な濃度の存在下で２００μｌ中で約８×１０３個の細胞を２０分間インキュベートし、遠心分離し、次いでコラーゲンＩでコーティングされたウェル（４８−ウェルプレート）内の完全ＥＢＭ２培地に播種する。オーブン内で２４時間後、供給元の（シグマ（Ｓｉｇｍａ））推奨に従って行われるＭＴＴ試験で細胞の生存を評価する。
【００５５】
ＩＩＩ−結果
１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＡＬ−１／Ｅ４７の相互作用に対するペプチドの阻害効果
発明者らは、表１に記載の化合物（化合物１、２及び３）が、２種類のタンパク質のＨＬＨドメインによって仲介されるヘテロ二量体ＴＡＬ−１−Ｅ４７の形成に作用可能か否かを試験することを選択した。化合物１がＴＡＬ−１のＨＬＨドメイン全体又はヘリックス１−ループ−ヘリックス２を含み、化合物２が基本領域及びヘリックス１を含み、化合物３がループ及びヘリックス２を含む（図１参照）。
【００５６】
発明者らは、タンパク質の１つに特異的な抗体による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳されたＴＡＬ−１及びＥ４７に対する共免疫沈降試験を用いた。
【００５７】
発明者らによる実験では、化合物Ｔａｌ−ＨＬＨ（化合物１）全体が用量依存的な様式で（０．２μｇで５０〜６０％の阻害；０．５μｇで９０〜１００％）ＴＡＬ−１とＥ４７との相互作用を有効に阻害することを実証する（図２Ａ及び２Ｂ）。他の２つの阻害ペプチド（化合物２及び３）の有する阻害力はより低く、それは最高濃度で５０％を超えない（図２Ａ）。したがって発明者らは、これ以外の実験用に阻害ペプチドＴａｌ−ＨＬＨ（化合物１）を使用することを選択した。
【００５８】
２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＡＬ−１／Ｅ４７の相互作用に対するペプチドベクターとカップリングした阻害ペプチドの効果
発明者らは、阻害ペプチドＴａｌ−ＨＬＨのベクター化又はカップリングにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＡＬ−１とＥ４７との相互作用に対するその阻害効果が変化しないか否かを判定したかった。阻害剤を、ジスルフィド結合（化合物５及び４の各々）を介して２種類のペプチドベクター（ＳｙｎＢ３及びＳｙｎＢ４）とカップリングさせた。これら２種類のペプチドベクターは、細胞膜を介する分子輸送を増大させる能力を有する。図３にみられる結果によると、阻害ペプチドＴａｌ−ＨＬＨのベクター化がその阻害効果を修飾しないことが確認される。ベクターＳｙｎＢ３とカップリングされる阻害剤（化合物５）の活性が結果としてＴａｌ−ＨＬＨ阻害剤（化合物１）の場合よりも高くなることに注目することは興味深い。
【００５９】
３）造血細胞上でカップリングされる阻害ペプチドの効果
生存にＴＡＬ−１の活性を必要とする造血系（Ｋ５６２）について、まずベクター化された阻害剤の阻害効果について試験した。造血系Ｔ（Ｈ９）の成長がＴＡＬ−１から独立していることからこれを対照として用いた。これらの２つの白血病系（ｌｅｕｃｅｍｉｃ  ｌｉｎｅ）は、成長因子の非存在下で数日間生存可能である。血清を含まない培地内でのペプチドの効果を試験するのにこれを用いてもよい。
【００６０】
予測通り、Ｈ９細胞（ＴＡＬ−ｌ陰性）では、ペプチドＴａｌ−ＨＬＨがベクター化されるか否かについては有意な差異を認めなかった（結果を示さない）。しかしながら、Ｔａｌ−ＨＬＨペプチドは、Ｋ５６２細胞（ＴＡＬ−１の活性を必要とする）においてベクター化される場合に高度な細胞毒性効果を有した（表２）。事実、成長の５０％を阻害する濃度に相当するＬＤ５０は、阻害剤単独（化合物１）の場合と比べてベクター化された阻害剤（化合物４）の場合に２倍低値である。
【００６１】
【表２】
2008505848.tif 000005
【００６２】
４）カップリングした阻害ペプチドの内皮細胞の生存に対する効果
発明者らは、遊離しかつベクター化された阻害剤の内皮細胞の生存に対する効果についても試験した。図４は、化合物１がＨＵＶＥＣ細胞の生存に対する効果を有しなかったことを示す。しかしながら、それが一旦カップリングされると（化合物４及び５）、用量依存的な様式でＨＵＶＥＣ細胞の生存に特異的に作用する。阻害剤とカップリングされないペプチドベクターとを同時に添加しても全く効果がなかったことから、ペプチドベクターによる産物のカップリングは生存に対して効果をもたらすのに重要であった。負の制御として用いられるＥＣＶ３０４細胞では、これら化合物はカップリングの有無にかかわらず非特異的な細胞毒性を誘発した（結果を示さない）。
【００６３】
これらの実験では、ＴＡＬ−１阻害剤がペプチドベクターによって内皮細胞内に浸透する際のその特異的な効果が実証される。
【００６４】
５）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト内皮細胞の細管形成に対するペプチドの効果（３次元コラーゲンゲル）
濃縮された（１ｍｇ／ｍｌ）コラーゲンゲルＩ内に播種されたＨＵＶＥＣ内皮細胞は、増殖を停止させ、活性化培地（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＤＣＢ１３１、１％の仔ウシ胎児血清、ＶＥＧＦ２ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ２０ｎｇ／ｍ１及びＰＭＡ８０ｎＭ）の存在下で、細胞索（ｃｅｌｌ  ｃｏｒｄ）内ですぐに組織化して初期の網状組織（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ）を形成する。２４〜４８時間内に、整列した細胞（ａｌｉｇｎｅｄ  ｃｅｌｌ）は、より長く成長し、互いに融合し、次第に擬似細管（ｐｓｅｕｄｏ  ｔｕｂｕｌｅ）を形成する。発明者らは、臍帯由来のヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細管形成に関するこのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、ベクター化されたペプチドＨＬＨ（化合物１）の効果について試験した。濃度が上昇したベクター化されたペプチド（化合物５）又はカーゴ単独（化合物１）を、同細胞を含むコラーゲン溶解物と活性化培地の両方に添加した。
【００６５】
図５はこれらの実験の１つを図示する。ベクター化されたペプチドＨＬＨ（化合物５）が７〜１０μＭで細管形成に極めて強力に作用する一方、カーゴ単独（化合物１）は対照培養物（５％ＤＭＳＯ）についてこの濃度範囲における効果を有しない。
【００６６】
６）マウスにおけるペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対する効果（マトリゲルプラグ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ））
マトリゲルプラグ試験は、インプラント内での血管新生を誘発可能なマウス腫瘍由来の細胞外マトリックスであるマトリゲルのマウスにおける皮下注射からなる。事実、宿主の内皮細胞は、マトリゲル内に含まれる前血管新生因子の影響下でこの「偽腫瘍（ｐｓｅｕｄｏ−ｔｕｍｏｕｒ）」に向けて移動し、マトリゲル内に浸潤することで５〜７日で毛細血管網を組織化する。
【００６７】
上記実験では、腹部の正中線の両端上にマトリゲルの皮下注射（５００μｌ）を２回行った。注射直前にイソフルレンの吸入によってマウスに麻酔をかけた（Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標））。
【００６８】
マトリゲル（ビーディーバイオサイエンシーズ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；バッチ１０４０３、１３ｍｇ／ｍＬ）をｂＦＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）によって補完し、ヘパリン（６０Ｕ／ｍｌ）と、ＳｙｎＢ３（化合物７）、ＳｙｎＢ３−ＨＬＨ（化合物５）、ＳｙｎＢ４（化合物６）、ＳｙｎＢ４−ＨＬＨ（化合物４）といった種々のペプチドとを添加し、５％ＤＭＳＯ中で最終濃度を２０μＭとした。
【００６９】
マウスを動物（雄Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢）６匹からなる３つの同一群に分けた。
−対照群（マウス１〜６）における各マウスが左側に５％ＤＭＳＯを含むマトリゲル及び右側に対照の抗血管新生ペプチドの注射を２回受けた。
−「ＳｙｎＢ３」群（マウス７〜１２）における各マウスが左側にＳｙｎＢ３を含むマトリゲル及び右側にＳｙｎＢ３−ＨＬＨの注射を２回受けた。
−「ＳｙｎＢ４」群（マウス１３〜１８）における各マウスが左側にＳｙｎＢ４を含むマトリゲル及び右側にＳｙｎＢ４−ＨＬＨの注射を２回受けた。
【００７０】
注射の６日後、ＣＯ２の吸入によってマウスを屠殺し、インプラントを回収することで血管新生を評価した（光及びヘモグロビンアッセイ）。供給元の推奨（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））に従い、Ｄｒａｂｋｉｎの溶液を用いた、マトリゲルのインプラント内に含まれるヘモグロビンのアッセイによって血管新生を定量した。
【００７１】
図６（肉眼的分析）及び図７（ヘモグロビンアッセイ）に示される結果より、ペプチドベクター単独の添加が血管新生に対して有意な効果を示さなかったことは明らかである。しかしながら、ベクターの１つと共役されたＨＬＨペプチドがインプラントにおいて血管新生を有効に阻害する（１２のうちの１１）。この阻害は、血管新生を阻害することで知られる阻害剤（Ｔｕｍ）によって得られる阻害と比べてより高度であった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】２量体ＨＬＨを示す。
【図２】様々な阻害剤によるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＡＬ−１とＥ４７の相互作用の阻害を図示する。
【図３】ペプチドベクターとカップリングされた阻害剤によるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＡＬ−１とＥ４７の相互作用の阻害という阻害について図示する。
【図４】ＨＵＶＥＣ内皮細胞の生存に関する化合物の効果を図示する。
【図５】培養の２２時間後での本発明における一化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト内皮細胞の細管発生に対する効果を図示する。
【図６】マトリゲルのインプラントの肉眼的分析により、本発明における化合物で補完されるか否か、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対する本発明における化合物の効果を示す。
【図７】前記マトリゲルのインプラント中に含まれるヘモグロビンのアッセイにより、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対する本発明における化合物の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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