(57)【要約】  上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（“ＰＩ３Ｋ”）及びＢ−Ｒａｆの変異が記載されている。ＥＧＦｒに対するヒトモノクローナル抗体を用いて、変異されたＥＧＦｒを含有する腫瘍を治療する方法が記載されている。試料中の１つ又はそれ以上の、変異体ＥＧＦｒ、変異体ＰＩ３Ｋ及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆの存在を確認するための方法及びキット並びに変異体ＥＧＦｒ、変異体ＰＩ３Ｋ及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆの存在に関連する疾患又は症状を治療するための方法及びキットも記載されている。変異体ＥＧＦｒ、変異体ＰＩ３Ｋ及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆを含有する腫瘍を治療する方法も記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項３、４、７、８、１１及び１２の何れかの少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項３、４、７、８、１１及び１２の何れかの単離されたポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項１６】
ポリペプチド産生に対して効果的な条件下で、請求項１４の宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドを調製する方法。
【請求項１７】
ポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
ポリペプチド産生に対して効果的な条件下で、請求項１５の細胞を培養することを含む、ポリペプチドを調製する方法。
【請求項１９】
ポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１６の方法によって調製されたポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１８の方法によって調製されたポリペプチド。
【請求項２２】
異種ポリペプチドに融合された請求項１、２、５、６、９及び１０の何れかの単離されたポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１、２、５、６、９及び１０の何れかの単離されたポリペプチドに結合することができる特異的結合因子。
【請求項２４】
抗体、重鎖及び軽鎖がリンカーによって接続されている抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体並びに配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドへのＥＧＦの結合を阻害する抗体から選択される少なくとも１つの分子から選択される、請求項２３の特異的結合剤。
【請求項２５】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを動物に投与すること、並びに
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに結合できる抗体を前記動物から取得すること、
を含む、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを結合できる抗体を取得する方法。
【請求項２６】
請求項３、４、７、８、１１及び１２の何れかのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２７】
固相支持体に付着された、請求項３、４、７、８、１１及び１２の何れかのポリヌクレオチド。
【請求項２８】
固相支持体に付着された、請求項１、２、５、６、９及び１０の何れかのポリペプチド。
【請求項２９】
請求項３、４、７、８、１１及び１２の何れかの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのアレイ。
【請求項３０】
請求項１、２、５、６、９及び１０の何れかの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのアレイ。
【請求項３１】
Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む、変異体ＲＧＦｒポリヌクレオチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するか、又は前記ポリヌクレオチドの相補物にハイブリッド形成する核酸プローブ。
【請求項３２】
（ａ）対象から得られた試料中での、請求項１及び２の何れかのポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに
（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む、
対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法。
【請求項３３】
（ａ）試料中での、請求項１及び２の何れかのポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに
（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状に対する感受性を診断することを含む、
対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対する感受性を診断する方法。
【請求項３４】
（ａ）変異体ＥＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。）並びに、
（ｂ）前記試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含む、
試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法。
【請求項３５】
（ａ）変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異をコードする。）並びに、
（ｂ）前記試料中の変異体ＥＧＦｒ変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含む、
試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定する方法。
【請求項３６】
対象中のＥＧＦｒ関連癌を診断する方法であり、前記対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含み、前記少なくとも変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在が前記対象中のＥＧＦ関連癌を診断する、前記方法。
【請求項３７】
対象中のＥＧＦｒ関連癌を診断する方法であり、前記対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含み、前記少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在が前記対象中のＥＧＦ関連癌を診断する、前記方法。
【請求項３８】
対象中のＥＧＦｒ関連癌の発生の可能性を決定する方法であり、前記対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含み、前記少なくとも変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在が前記対象中のＥＧＦｒ関連癌の発生の可能性を示す、前記方法。
【請求項３９】
対象中のＥＧＦｒ関連癌の発生の可能性を決定する方法であり、前記対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含み、前記少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在が前記対象中のＥＧＦ関連癌の発生の可能性を示す、前記方法。
【請求項４０】
ＥＧＦｒ関連癌が非小細胞肺癌である、請求項３６、３７、３８及び３９の何れかの方法。
【請求項４１】
（ａ）請求項１４又は１５の何れかの細胞を検査化合物と接触させること、及び
（ｂ）前記検査化合物が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出すること、
を含む、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性の調節物質に対するスクリーニングの方法。
【請求項４２】
請求項４１の方法によって同定された化合物。
【請求項４３】
少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対する治療を必要とする対象に、請求項４２の化合物を投与することを含む、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を治療する方法。
【請求項４４】
（ａ）対象から得られたポリヌクレオチド中の少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を検出すること（少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の検出は、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を発症することに対して、患者が増加した感受性を有することを示す。）、
（ｂ）変異体ＥＧＦｒポリペプチドを特異的に結合する抗体を前記対象に投与することを含む、
少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法。
【請求項４５】
（ａ）対象から得られたポリヌクレオチド中の少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を検出すること（少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の検出は、患者が少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を有することを示す。）、及び
（ｂ）変異体ＥＧＦｒポリペプチドを特異的に結合する抗体を前記対象に投与することを含む、
少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法。
【請求項４６】
抗体がヒト抗体である、請求項４４の方法。
【請求項４７】
抗体がパニツムマブ又はその抗原結合領域である、請求項４６の方法。
【請求項４８】
ＥＧＦｒ変異の少なくとも１つが、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される、請求項４４の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状が非小細胞肺癌である、請求項４４の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を治療する方法であり、このような治療を必要とする対象に、請求項３及び４の何れかのポリヌクレオチドに対してアンチセンスのポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
（ａ）集団中の個体の遺伝的プロファイル中に少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の存在を測定すること、並びに
（ｂ）変異体ＥＧＦｒ遺伝的プロファイルと前記個体の特異的特徴との間の関係を確定することを含む、
個体の特異的集団において、変異体ＥＧＦｒ集団プロファイルを確定する方法。
【請求項５２】
個体の特異的特徴が、ＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を発症する感受性を含む、請求項５１の方法。
【請求項５３】
個体の特異的特徴が、ＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を呈することを含む、請求項５１の方法。
【請求項５４】
対象の変異体ＥＧＦｒポリペプチド中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在又は不存在を測定することを含み、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチド中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在がゲフィチニブを用いた治療に対する耐性を示す、対象中の疾病又は症状に対するゲフィチニブ治療の効力を予測する方法。
【請求項５５】
対象中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在又は不存在を測定することを含む、癌に罹患する対象中の抗ＥＧＦｒ抗体を用いた治療に対する応答性を測定する方法。
【請求項５６】
抗体がパニツムマブ又はセツキシマブである、請求項５５の方法。
【請求項５７】
変異体ＥＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブを含む（前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。）、対象中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するためのキット。
【請求項５８】
２つ又はそれ以上の増幅プライマーをさらに含む、請求項５７のキット。
【請求項５９】
検出部分をさらに含む、請求項５７のキット。
【請求項６０】
核酸試料採取要素をさらに含む、請求項５７のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本願は、上皮成長因子受容体（「ＥＧＦｒ」）変異、変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのポリヌクレオチドを発現する細胞及びこれらのポリペプチドに結合する抗体に関する。本願は、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（「ＰＩ３Ｋ」）変異、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのポリヌクレオチドを発現する細胞及びこれらのポリペプチドに結合する抗体にも関する。本願は、Ｂ−Ｒａｆ変異、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのポリヌクレオチドを発現する細胞及びこれらのポリペプチドに結合する抗体にも関する。本願は、癌を診断する方法、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドと反応する化合物を用いて癌を治療する方法、並びに腫瘍の治療における、抗ＥＧＦｒ特異的結合因子、抗ＰＩ３Ｋ特異的結合因子又は抗Ｂ−Ｒａｆ特異的結合因子の有用性を予測するための方法及びキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療におけるモノクローナル抗体の特定の適用は、抗体が免疫増強イソタイプ、トキシン又は薬物などの細胞毒性エフェクター機能を癌性組織へ特異的に送達する能力に依存している。別のアプローチは、成長因子の細胞受容体を通じ、成長因子によって媒介されるものなどの不可欠な細胞外増殖シグナルを腫瘍細胞から奪うことによって、腫瘍細胞の生存に直接影響を与えるためにモノクローナル抗体を使用することである。本アプローチにおける魅力的な標的の１つは、ＥＧＦ及び形質転換成長因子α（ＴＧＦα）を結合する上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）である（例えば、Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１  ：２０３−２１２，１９９０；Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ６０７−６２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９５；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １０：６７−７３，１９９８参照）。ＥＧＦ又はＴＧＦαのＥＧＦｒ（１７０ｋＤａの膜貫通細胞表面糖タンパク質）への結合は、細胞増殖に至る細胞性生化学的現象（ＥＧＦｒの自己リン酸化及び内部移行など）のカスケードの引き金を引く（例えば、Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：２０３−２１２，１９９０参照）。
【０００３】
幾つかの観察は、ＥＧＦｒがヒト固形腫瘍の発達及び進行を支えていることを示唆している。ＥＧＦ−ｒは、ヒト固形腫瘍の多くの種類上で過剰発現されることが示されている（例えば、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ７：３５９（１９８９），Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：３３９−３４４（１９９０），Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６（１９９４）を参照。）。例えば、ＥＧＦ−ｒ過剰発現は、特定の肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌、脳腫瘍、膀胱癌、頭部及び頸部癌、卵巣癌及び前立腺癌中に観察されている（例えば、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６（１９９４）参照。）。受容体レベルの増加は、不良な臨床的予後を伴うことが報告されている（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ｐｐ．６０７−６２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６，１９９４；Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｂｒ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４７：８７−９８，１９９１；Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  １９：１８３−２３２，１９９５参照）。上皮成長因子（ＥＧＦ）及び形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）は何れも、ＥＧＦ−ｒに結合し、細胞の増殖及び腫瘍の成長をもたらすことが示されている。多くの事例で、増加された表面ＥＧＦｒ発現は、腫瘍細胞による、ＴＧＦα又はＥＧＦの産生を伴い、これらの腫瘍の進行に、自己分泌型成長調節が関与していることを示す（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ｐｐ．６０７−６２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６，１９９４；Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  １９：１８３−２３２，１９９５参照）。
【０００４】
従って、幾つかのグループは、ＥＧＦ−ｒを発現又は過剰発現する腫瘍の治療において、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦ−ｒに対する抗体が有用であり得ることを提案した（例えば、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ７：３５９（１９８９），Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：３３９−３４４（１９９０），Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６（１９９４），Ｔｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６２：６４３−６５０（１９９５）を参照。）。実際に、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αの、受容体への結合を遮断する抗ＥＧＦ−ｒ抗体が腫瘍細胞増殖を阻害するように見受けられることが示されている。しかしながら、同時に、抗ＥＧＦ−ｒ抗体は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−α非依存性細胞増殖を阻害しないようである（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６（１９９４））。
【０００５】
ＥＧＦ及びＴＧＦαの腫瘍細胞への結合を中和することができ、並びにインビトロでリガンド媒介性細胞増殖を阻害することができる、ヒトＥＧＦｒに対して特異的なモノクローナル抗体が、マウス及びラットから作製されている（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ６０７−６２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９５；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １０：６７−７３，１９９８；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６，１９９４参照）。マウス１０８、２２５（例えば、Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０：１６０５−１６１１，１９８８を参照。）及び５２８（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ６０７−６２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９５）又はラットＩＣＲ１６、ＩＣＲ６２及びＩＣＲ６４（例えば、Ｍｏｄｊｔａｊｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６，１９９４；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２４７−２５３，１９９３；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２５４−２６１  ，１９９３）モノクローナル抗体などの抗体の幾つかが、異種移植マウスモデルでの腫瘍増殖に影響を与えるそれらの能力について広く評価された。抗ＥＧＦｒモノクローナル抗体の多くは、ヒト腫瘍細胞とともに投与されると、胸腺除去マウスでの腫瘍形成を予防する上で有効であった（Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２５４−２６１  ，１９９３）。確立されたヒト腫瘍異種移植を有するマウス中に注射されると、マウスモノクローナル抗体２２５及び５２８は、部分的な腫瘍の退行を引き起こし、腫瘍の根絶のためには、ドキソルビシン又はシスプラチンなどの化学療法剤の同時投与を必要とした（Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ６０７−６２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９５；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４６３７−４６４２，１９９３；Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８５：１３２７−１３３３，１９９３）。マウス抗体可変領域がヒト定常領域に連結されている２２５モノクローナル抗体のキメラバージョン（Ｃ２２５）は、高用量でのみ、インビボで改善され���抗腫瘍活性を示した（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１  ：１３１１−１３１８，１９９５；Ｐｒｅｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９：４１９−４２７，１９９６参照）。ラットＩＣＲ１６、ＩＣＲ６２及びＩＣＲ６４抗体は、確立された腫瘍の退行を引き起こしたが、それらの完全な根絶は引き起こさなかった（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２５４−２６１  ，１９９３）。これらの結果は、ＥＧＦｒ発現固形腫瘍に対する抗体治療の有望な標的としてＥＧＦｒを確立し、複数のヒト固形癌におけるＣ２２５モノクローナル抗体を用いたヒト臨床試験へと結実した（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ６４：１２７−１５４，１９９４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ｐｐ．６０７−６２３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，１９９５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：２７７−２９６，１９９４参照）。
【０００６】
生物の分野における特定の進歩は、完全なヒト抗ＥＧＦｒ抗体を産生することを可能とした。ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入されたマウス（ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭ技術、Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｉｎｃ．）を用いて、ヒトＥＧＦｒに対して特異的なヒト抗体が開発された（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６，１９９７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，３１（１−２）：３３−４２，１９９８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ，７（４）：６０７−６１４，１９９８；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３８（１）：１７−２３，２００１  ；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ  ９８／５０４３３参照）。このような抗体の１つであり、ヒトＥＧＦｒに対して５×１０−１１Ｍの親和性を有するヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であるパニツムマブは、ＥＧＦのＥＧＦｒへの結合を遮断すること、受容体シグナル伝達を遮断すること、並びにインビトロで腫瘍細胞の活性化及び増殖を阻害することが示されている（例えば、ＷＯ９８／５０４３３；米国特許第６，２３５，８８３号参照）。胸腺除去マウスでの研究は、パニツムマブはインビボ活性も有することを示し、胸腺除去マウスでのヒト扁平上皮癌Ａ４３１異種移植の形成を予防するのみならず、既に確立された巨大なＡ４３１腫瘍異種移植を根絶した（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３８（１）：１７−２３，２００１  ；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（６）：１２３６−４３，１９９９参照）。パニツムマブは、癌の中でも特に、腎臓癌、結腸直腸腺癌、前立腺癌及び非小細胞扁平上皮肺癌の治療について検討されており（例えば、米国特許公開２００４／００３３５４３号参照）、この抗体を用いた臨床試験が進行中である。
【０００７】
特定の細胞の種類では、ＥＧＦｒなどの成長因子の結合が、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（「ＰＩ３Ｋ」）及びＢ−Ｒａｆの刺激によってアポトーシスを予防する。ＰＩ３Ｋの活性化は、分子カスケードの引き金を引き、プログラム化された細胞死を調節する中央経路の下方制御をもたらす（Ｙａｏ，Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２００３−２００６，１９９５）。Ｒａｆファミリーのメンバーも、哺乳動物でのプログラム化された細胞死の制御物質として同定されている（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｃｅｌｌ８０：２２５−２３６，１９９５）。Ｒａｆノックアウトでは、Ｂ−Ｒａｆを欠如するマウスは細胞の生存の擾乱を示したのに対して、Ｒａｆ−１又はＡ−Ｒａｆを欠如するマウスは、このような擾乱を示さず（例えば、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ６：６１４−６１７，１９９６；Ｗｏｊｎｏｗｓｋｉ，Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １６：２９３−２９７，１９９７を参照）、Ｂ−Ｒａｆが細胞死制御において特異的な機能を有し得ることを示唆している。ＰＩ３Ｋ及びＢ−Ｒａｆは何れも、細胞増殖疾患、特に癌において興味深い。
【発明の開示】
【０００８】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドが提供される。
【０００９】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１０】
特定の実施形態において、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドが提供される。
【００１１】
特定の実施形態において、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
特定の実施形態において、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドが提供される。
【００１３】
特定の実施形態において、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１４】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。特定の実施形態において、前記ベクターを含む宿主細胞が提供される。特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドで形質転換された細胞が提供される。
【００１５】
特定の実施形態において、ポリペプチドを調製する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、ポリペプチド産生に対して効果的な条件下で、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、本方法は、ポリペプチド産生に対して効果的な条件下で、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドを含む細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、本方法は、ポリペプチドを単離することをさらに含む。特定の実施形態において、本方法によって調製されたポリペプチが提供される。
【００１６】
特定の実施形態において、異種ポリペプチドに融合された、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。
【００１７】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに結合することが可能な特異的結合因子が提供される。特定の実施形態において、特異的結合因子は、抗体、重鎖及び軽鎖がリンカーによって接続されている抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体並びに配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドへのＥＧＦの結合を阻害する抗体から選択される少なくとも１つの分子から選択される。
【００１８】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを結合することが可能な抗体を取得する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを動物に投与することを含む。特定の実施形態において、本方法は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを結合することが可能な抗体を動物から取得することをさらに含む。
【００１９】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【００２０】
特定の実施形態において、固相支持体に付着された、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、固相支持体に付着された、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００２１】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのアレイが提供される。特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むポリペプチドのアレイが提供される。
【００２２】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成する核酸プローブが提供される。特定の実施形態において、前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。特定の実施形態において、核酸プローブは、ポリヌクレオチドの相補物にハイブリッド形成する。
【００２３】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対する感受性を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、対象から得られた試料中における、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の存在又は量を測定することを含む。特定の実施形態において、前記方法は、ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状を診断することをさらに含む。特定の実施形態において、前記方法は、ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状に対する感受性を診断することをさらに含む。
【００２４】
特定の実施形態において、試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法が提供される。特定の実施形態において、試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、変異体ＲＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露することを含み、前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。特定の実施形態において、前記方法は、試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することをさらに含む。特定の実施形態において、前記方法は、試料中の変異体ＥＧＦｒ変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含む。
【００２５】
特定の実施形態において、対象中のＥＧＦｒ関連癌を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、前記方法は、対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、前記方法は、対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、少なくとも変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在は、対象中のＥＧＦｒ関連癌を診断する。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在は、対象中のＥＧＦｒ関連癌を診断する。
【００２６】
特定の実施形態において、対象におけるＥＧＦｒ関連癌の発症の可能性を決定する方法が提供される。特定の実施形態において、前記方法は、対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、前記方法は、対象から得た試料中における、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、少なくとも変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在は、対象におけるＥＧＦｒ関連癌の発症の可能性を示す。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在は、対象におけるＥＧＦｒ関連癌の発症の可能性を示す。
【００２７】
特定の実施形態において、ＥＧＦｒ関連癌は、非小細胞肺癌である。
【００２８】
特定の実施形態において、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性の調節物質に対するスクリーニングの方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、細胞を検査化合物と接触させること、及び検査化合物が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出することを含む。特定の実施形態において、本方法によって同定された化合物が提供される。特定の実施形態において、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を治療する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対する治療を必要としている対象に前記化合物を投与することを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、対象から得られたポリヌクレオチド中の少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を検出することを含み、ここにおいて、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の検出は、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を発症することに対して、患者が増加した感受性を有することを示す。特定の実施形態において、本方法は、対象から得られたポリヌクレオチド中の少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を検出することを含み、ここにおいて、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の検出は、患者が少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を有することを示す。特定の実施形態において、本方法は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドを特異的に結合する抗体を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、抗体はヒト抗体である。特定の実施形態において、抗体はパニツムマブ又はその抗原結合領域である。
【００３０】
特定の実施形態において、ＥＧＦｒ変異は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される。
【００３１】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状は非小細胞肺癌である。
【００３２】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を治療する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチドを、このような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【００３３】
特定の実施形態において、個体の特異的集団において、変異体ＥＧＦｒ集団プロファイルを確定する方法が提供される。特定の実施形態におい、本方法は、集団中の個体の遺伝的プロファイル中における少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の存在を測定することを含む。特定の実施形態において、本方法は、変異体ＥＧＦｒ遺伝的プロファイルと前記個体の特異的特徴との間の関係を確定することをさらに含む。特定の実施形態において、個体の特異的特徴は、ＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を発症することに対する感受性を含む。特定の実施形態において、個体の特異的特徴は、ＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を呈することを含む。
【００３４】
特定の実施形態において、対象中の疾病又は症状に対するゲフィチニブ治療の有効性を予測する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、対象の変異体ＥＧＦｒポリペプチド中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチド中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在は、ゲフィチニブを用いた治療に対する耐性を示す。
【００３５】
特定の実施形態において、癌に罹患している対象における抗ＥＧＦｒ抗体を用いた治療に対する応答性を測定する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、対象中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在又は不存在を決定することを含む。特定の実施形態において、抗体はパニツムマブ又はセツキシマブである。
【００３６】
特定の実施形態において、対象中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するためのキットが提供される。特定の実施形態において、本キットは、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブを含み、前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。特定の実施形態において、本キットは、２つ又はそれ以上の増幅プライマーをさらに含む。特定の実施形態において、本キットは、検出成分をさらに含む。特定の実施形態において、本キットは、核酸試料作製要素をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本明細書に引用されている全ての参考文献（特許、特許出願、論文、教科書など、及びこれらの中に引用されている参考文献を含む。）は、それらが既に有効でない範囲まで、参照により、その全体が、本明細書に組み込まれる。本明細書に使用されている節の見出しは、整理の目的のためにすぎず、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。
【００３８】
定義
別段の定義がなければ、本発明に関連して使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がなければ、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
【００３９】
一般的に、本明細書に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学並びにタンパク質及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド化学及びハイブリッド形成法に関連して使用される命名法及びこれらの技術は、周知のものであり、本分野において一般的に使用されている。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に対しては、標準的な技術が使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、又は本分野で一般的に遂行されているように、又は本明細書に記載されているように、実施される。一般に、先述の技術及び手順は、本分野で周知の慣用的な方法に従い、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的参考文献及びより具体的な参考文献中に記載されているように、実施される。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．  Ｙ．（１９８９））」（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学及び医薬品化学及び薬化学に関して使用される命名法、並びに本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学及び医薬品化学及び薬化学の実験室操作及び技術は、周知のものであり、本分野で一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、薬学的な調製、調合及び送達及び患者の治療に対しては、標準的な技術が使用される。
【００４０】
本願において、「又は」の使用は、別段の記載がなければ、「及び／又は」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語並びに「含む」及び「含まれた」などのその他の形式の使用は、限定的なものではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、別段の記載がなければ、一つのユニットを含む要素及び成分並びに１より多いサブユニットを含む要素及び成分を包含する。
【００４１】
本開示に従って使用される場合、以下の用語は、別段の記載がなければ、以下の意味を有するものと理解しなければならない。
【００４２】
本明細書において使用される「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離された核酸」という用語は互換的に使用され、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成起源又はこれらの幾つかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味し、その起源に基づいて、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が本来その中に見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部を伴っていないか、（２）本来連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されているか、又は（３）より大きな配列の一部として本来生じない。
【００４３】
「単離されたタンパク質」及び「単離されたポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、本明細書において、その起源又は由来源により、（１）本来見出されるタンパク質を伴わないか、（２）同じ起源由来の他のタンパク質が存在しないか（例えば、マウスタンパク質が存在しない。）、（３）異なる種由来の細胞によって発現されているか、又は（４）本来存在しない、ｃＤＮＡ、組み換えＲＮＡ若しくは合成起源又はこれらの幾つかの組み合わせのタンパク質を意味する。
【００４４】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、原型タンパク質、断片、ペプチド又はポリペプチド配列の類縁体を表すための包括的な用語として本明細書において使用される。従って、原型タンパク質、断片及び類縁体は、ポリペプチド属の種である。
【００４５】
ポリペプチド配列中の変異に関連する「Ｘ＃Ｙ」という用語は本分野で認知されており、ここにおいて、「＃」はポリペプチドのアミノ酸数に関連する変異の位置を表し、「Ｘ」は野生型アミノ酸配列中の位置に見出されるアミノ酸を表し、「Ｙ」はその位置における変異体アミノ酸を表す。例えば、ＥＧＦｒポリペプチドに関する「Ｌ６８８Ｐ」という表記は、野生型ＥＧＦｒ配列のアミノ酸数６８８にロイシンが存在すること、及び変異体ＥＧＦｒ配列中でロイシンがプロリンで置換されていることを示している。
【００４６】
「変異体ＥＧＦｒポリペプチド」及び「変異体ＥＧＦｒタンパク質」という用語は互換的に使用され、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含むＥＧＦｒポリペプチドを表す。特定の典型的な変異体ＥＧＦｒポリペプチドには、対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導体バリアント、置換バリアント、欠失バリアント及び／又は挿入バリアント、融合ポリペプチド、相同分子種及び種間相同体が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドは、リーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基などの（これらに限定されない。）Ｃ末端又はＮ末端に追加の残基を含む。
【００４７】
「変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド」及び「変異体ＰＩ３Ｋタンパク質」という用語は互換的に使用され、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ及びＨ１０４７Ｌから選択される少なくとも１つのＰＩ３Ｋ変異を含むＰＩ３Ｋポリペプチドを表す。特定の典型的な変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドには、対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導体バリアント、置換バリアント、欠失バリアント及び／又は挿入バリアント、融合ポリペプチド、相同分子種及び種間相同体が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドは、リーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基など（これらに限定されない。）、Ｃ末端又はＮ末端に追加の残基を含む。
【００４８】
「変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチド」及び「変異体Ｂ−Ｒａｆタンパク質」という用語は互換的に使用され、Ｖ６００Ｅ及びＫ６０１Ｅから選択される少なくとも１つのＢ−Ｒａｆ変異を含むＢ−Ｒａｆポリペプチドを表す。特定の典型的な変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドには、対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導体バリアント、置換バリアント、欠失バリアント及び／又は挿入バリアント、融合ポリペプチド、相同分子種及び種間相同体が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、リーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基など（これらに限定されない。）、Ｃ末端又はＮ末端に追加の残基を含む。
【００４９】
「変異体ＥＧＦｒ融合タンパク質」という用語は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端における１つ又はそれ以上のアミノ酸（異種ポリペプチドなど）の融合を表す。
【００５０】
「変異体ＰＩ３Ｋ融合タンパク質」という用語は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端における１つ又はそれ以上のアミノ酸（異種ポリペプチドなど）の融合を表す。
【００５１】
「変異体Ｂ−Ｒａｆ融合タンパク質」という用語は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端における１つ又はそれ以上のアミノ酸（異種ポリペプチドなど）の融合を表す。
【００５２】
ある対象に対して適用される、本明細書で使用する「天然に存在する」という用語は、目的物を自然に見出すことができるという事実を表す。例えば、自然の取得源から単離することができる生物（ウイルスを含む。）中に存在し、実験室またはその他においてヒトが意図的に修飾を加えていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００５３】
本明細書において使用される「作用可能に連結された」という用語は、成分を所期の様式で機能させることができる関係に成分があるような成分の位置を表す。コード配列に対して「作用可能に連結された」調節配列は、調節配列と適合的な条件下で、コード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００５４】
本明細書において使用される「調節配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現及びプロセッシングを実施するのに必要であるポリヌクレオチド配列を表す。このような調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような調節配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような調節配列には、プロモーター及び転写終結配列が含まれる。「調節配列」という用語は、最小限、その存在が発現及びプロセッシングに不可欠である全ての成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合対配列も含むことが可能である。
【００５５】
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド（リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドの何れかまたはヌクレオチドの何れかのタイプの修飾された形態）のポリマー形態を意味する。本用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含む。
【００５６】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語には、天然に存在するオリゴヌクレオチド連結及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって互いに連結された天然に存在するヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般的に、２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０から６０塩基の長さであり、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ないし４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、通常、一本鎖であるが（例えば、プローブの場合）、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る（例えば、遺伝子変異体の構築において使用する場合）。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの何れかであり得る。
【００５７】
「変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチド」、「変異体ＥＧＦｒオリゴヌクレオチド」及び「変異体ＥＧＦｒ核酸」という用語は互換的に使用され、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含むＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを表す。
【００５８】
「変異体ＰＩ３Ｋポリヌクレオチド」、「変異体ＰＩ３Ｋオリゴヌクレオチド」及び「変異体ＰＩ３Ｋ核酸」という用語は互換的に使用され、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ及びＨ１０４７Ｌから選択される少なくとも１つのＰＩ３Ｋ変異を含むＰＩ３Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを表す。
【００５９】
「変異体Ｂ−Ｒａｆポリヌクレオチド」、「変異体Ｂ−Ｒａｆオリゴヌクレオチド」及び「変異体Ｂ−Ｒａｆ核酸」という用語は互換的に使用され、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＢ−Ｒａｆ変異を含むＢ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを表す。
【００６０】
本明細書において使用される「天然に存在するヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドが含まれる。本明細書において使用される「修飾されたヌクレオチド」という用語には、修飾又は置換された糖基などを有するヌクレオチドが含まれる。本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド連結」という用語には、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホルアニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミダートなどのオリゴヌクレオチド連結が含まれる。例えば、「ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．  米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）」を参照されたい（これらの開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）。オリゴヌクレオチドは、所望であれば、検出用の標識を含むことができる。
【００６１】
本明細書において使用される「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、検出可能に及び特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びこれらの断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合の相当な量を最小限に抑えるハイブリッド形成及び洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する。本分野において公知の、及び本明細書に論述されている選択的ハイブリッド形成条件を達成するために、高ストリンジェンシー条件を使用することが可能である。一般的に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び断片と対象核酸配列間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％、より典型的には、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の増加する相同性を有する。それらの配列間に部分的な同一性又は完全な同一性が存在すれば、２つのアミノ酸配列は相同である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列が最大の一致を有するように並置されたときに、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。合致を最大化する際には、（合致されている２つの配列の何れか中の）ギャップが許容される。５又はそれ以下のギャップ長が好ましく、２又はそれ以下がさらに好ましい。あるいは及び好ましくは、変異データマトリックス及び６又はそれ以上のギャップペナルティーを用いるプログラムＡＬＩＧＮを用いて、２つのタンパク質配列（又は、それらから誘導される少なくとも３０アミノ酸の長さのポリペプチド配列）が（標準偏差単位で）６以上のアラインメントスコアを有すれば、本用語が本明細書において使用される場合、それらは相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））及びこの巻に対する補遺２、ｐｐ．１−１０を参照されたい。ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に並置された場合に、２つの配列又はその一部のアミノ酸が５０％超又は５０％に等しい同一性であれば、２つの配列又はその一部は、より好ましくは相同である。本明細書において「対応する」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部に対してポリヌクレオチド配列が相同である（すなわち、厳格に進化的に関連せずに同一である。）こと、又はポリペプチド配列は参照ポリヌクレオチド配列と同一であることを意味するために使用される。これに対して、本明細書において、「に相補的」という用語は、相補的な配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対して相同であることを意味するために使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【００６２】
以下の用語：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセント」及び「実質的な同一性」が、２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の配列関連性を記載するために使用される。「参照配列」とは、配列比較のための基礎として使用される所定の配列である。参照配列は、例えば、配列表に掲載されている完全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメントとして、より大きな配列のサブセットであり得、又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列を含み得る。一般的に、参照配列は、少なくとも１８ヌクレオチド又は６アミノ酸長であり、頻繁に、少なくとも２４ヌクレオチド又は８アミノ酸長であり、しばしば、少なくとも４８ヌクレオチド又は１６アミノ酸長である。２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列は、各々、（１）２つの分子間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の一部）を含んでもよく、及び（２）２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列間で相違する配列をさらに含んでもよく、配列類似性の局所領域を同定及び比較するために、２つ（又はそれ以上の）分子間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つの分子の配列を比較することによって行われる。本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、少なくとも１８の連続するヌクレオチド位置又は６つのアミノ酸の概念的セグメントを表し、ここにおいて、ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、少なくとも１８の連続するヌクレオチド又は６つのアミノ酸配列の参照配列と比較することができ、及び比較ウィンドウ中のポリオヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、（付加又は欠失を含まない）参照配列と比べて、２０パーセント又はそれ以下の付加、欠失、置換など（すなわちギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを並置するための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９９８）の類似法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＧｅｎｅｗｏｒｋｓまたはＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅｓにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって又は目視によって実施することができ、様々な方法によって得られた最高のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって相同性の最高のパーセントをもたらす。）が選択される。
【００６３】
「配列同一性」という用語は、比較ウィンドウにわたって、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列が同一であること（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチド又は残基対残基ベースで）を意味する。「配列同一性のパーセント」という用語は、比較ウィンドウにわたって最適に並置された２つの配列を比較し、合致した位置の数を得るために、両配列中で、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ又はＩ）又は残基が生じる位置の数を測定し、合致した位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって割り、及び配列同一性のパーセントを得るために、結果に１００を乗じることにより計算される。本明細書において使用される「実質的な同一性」という用語は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたって、しばしば、少なくとも２４−４８ヌクレオチド（８−１６アミノ酸）位置のウィンドウにわたって基準配列に対して比較した場合に、ポリヌクレオチド又はアミノ酸が、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より一般的には、少なくとも９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特徴を表し、配列同一性のパーセントは、比較ウィンドウにわたって、参照配列の計２０％又はそれ以下の欠失又は付加を含み得る配列と参照配列を比較することによって算出される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。
【００６４】
本明細書において使用される、２０の慣用アミノ酸及びそれらの略号は、慣用的な用法に従う。「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））」（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本明細書において使用される「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するＬアミノ酸又はＤアミノ酸を表す。アミノ酸に対して一般的に使用される一文字及び三文字の略号が、本明細書において使用される（Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（４ｔｈ  ｅｄ．  ２００２））。２０の慣用アミノ酸、α−、α−二置換されたアミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及びその他の非慣用アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドに対する適切な成分であり得る。非慣用アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書において使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な用法と慣習に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００６５】
同様に、別段の記載がなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端である。二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の、５’から３’への付加の方向は、転写方向と称される。ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’である、ＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’である、ＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００６６】
ポリペプチドに対して適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、初期設定ギャップウェイトを用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによるなど、最適に並置された場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７又は９８％配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。本明細書において論述される場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列中の微小な変動が、本発明によって包含されるものとして想定されるが、但し、アミノ酸配列中の変動は、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、及び最も好ましくは９９％を維持する。保存的なアミノ酸置換とは、それらの側鎖中において、関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般的に、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非帯電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンというファミリーに分けられる。より好ましいファミリー：セリン及びスレオニンは、脂肪族−ヒドロキシファミリーであり；アスパラギン及びグルタミンはアミド含有ファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは芳香族ファミリーであり、並びにシステイン及びメチオニンは含硫側鎖ファミリーである。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンとの単離された置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単離された置換、スレオニンのセリンとの単離された置換、又はあるアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸との類似の置換は、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まなければ、生じた分子の結合又は特性に対して多大な影響を有しない。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、システイン−メチオニン及びアスパラギン−グルタミンである。
【００６７】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる置換、（２）酸化に対する感受性を低下させる置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる置換、（４）結合親和性を変化させる置換及び（５）このような類縁体の他の物理化学的又は機能的特性を付与又は修飾する置換である。類縁体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質を含み得る。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列中に（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分中に）作製し得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じるヘリックスを破壊する傾向を示すべきではなく、又は親配列を特徴付ける二次構造の他の種類を崩壊させるべきでない。）。本分野で認められたポリペプチド二次構造及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、これらは各々、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００６８】
本明細書において使用される「類縁体」という用語は、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントから構成され、及び天然に存在するポリペプチドの活性の少なくとも１つを有するポリペプチドを表す。典型的には、ポリペプチド類縁体は、天然に存在する配列に関して保存的なアミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類縁体は、典型的には、少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長又はそれ以上であり、しばしば、完全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さとすることが可能である。
【００６９】
ペプチド類縁体は、一般に、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として、製薬産業で使用される。非ペプチド化合物のこの種類は、「ペプチド模倣体」と名づけられている。「Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  １５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９（１９８７）」、これらは参照により、本明細書に組み込まれる。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体は、等価な治療効果又は予防効果を生じさせるために使用し得る。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などの模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、本分野で周知の方法によって、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−及び−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群から選択される結合によって必要に応じて置換された１つ又はそれ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸を同種のＤアミノ酸で体系的に置換すること（例えば、Ｌ−リジンに代えてＤ−リジン）は、より安定なペプチドを作製するために使用し得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一なコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドは、本分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製され得る（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１：３８７（１９９２）、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【００７０】
断片又は類縁体の好ましいアミノ及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを、公共の配列データベース又は独自の配列データベースと比較することによって同定することが可能である。好ましくは、コンピュータ化された比較法は、公知の構造及び／又は機能の他のタンパク質中に生じる配列モチーフ又は予測されるタンパク質立体構造ドメインを同定するために使用される。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定するための方法は公知である（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）を参照。）。当業者であれば、本発明に従って構造的及び機能的ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフ及び構造的立体構造を認めることができる。
【００７１】
「特異的結合因子」という用語は、標的に特異的に結合する天然分子又は非天然分子を表す。特異的結合因子の例には、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質及び小分子化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、特異的結合因子は抗体である。特定の実施形態において、特異的結合因子は抗原結合領域である。
【００７２】
「変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する特異的結合因子」という用語は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの任意の部分を特異的に結合する特異的結合因子を表す。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する特異的結合因子は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する抗体である。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する特異的結合因子は抗原結合領域である。
【００７３】
「変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対する特異的結合因子」という用語は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの任意の部分を特異的に結合する特異的結合因子を表す。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対する特異的結合因子は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対する抗体である。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対する特異的結合因子は抗原結合領域である。
【００７４】
「変異体−Ｒａｆポリペプチドに対する特異的結合因子」という用語は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの任意の部分を特異的に結合する特異的結合因子を表す。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに対する特異的結合因子は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに対する抗体である。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに対する特異的結合因子は抗原結合領域である。
【００７５】
「特異的に結合する」という用語は、特異的結合因子が、非標的への結合に比べて大きな親和性で、標的に結合する能力を表す。特定の実施形態において、特異的結合とは、非標的に対する親和性より少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００又は１０００倍大きな親和性での、標的への結合を表す。ある実施形態において、親和性は、アフィニティＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。ある実施形態において、親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定される。特定の実施形態において、親和性は、速度論的な方法によって測定される。特定の実施形態において、親和性は、平衡／溶液法によって測定される。特定の実施形態において、抗体とその認識されるエピトープの１つ又はそれ以上との間の解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下及び最も好ましくは１０ｎＭ以下である場合に、抗体は、抗原を特異的に結合すると言われる。
【００７６】
「原型の抗体及び免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖間で、ジスルフィド結合の数は異なる。各重及び軽鎖は、等間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一つの末端に、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に、多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、及びその他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインとともに並置され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間にインターフェースを形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８６：６５１（１９８５；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２：４５９２（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））。
【００７７】
「抗体」という用語は、原型状態の抗体及び特異的結合について、原型状態の抗体と競合するその抗原結合断片の両方を表す。「その抗原結合断片」とは、断片が抗原結合機能を保持している、原型状態の抗体分子の一部又は断片を表す。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又はパパインを用いた切断によるなど、原型状態の抗体の構想的若しくは化学的切断によって産生される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」）、Ｆｄ’及びＦｄ断片が含まれる。モノクローナル抗体から様々な断片を産生する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １３０：１５１−１８８を参照されたい。）。「二重特異的」又は「二機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一であると理解される。抗体の過剰が、カウンター受容体に結合された受容体の量を、（インビトロ競合結合アッセイで測定された場合に）少なくとも約２０％、４０％、６０％又は８０％低下させ、より一般的には、約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％超低下させる場合に、抗体は、カウンター受容体への受容体の接着を実質的に阻害する。
【００７８】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から同定され、及び分離され、及び／又は回収されている抗体である。その天然環境の夾雑成分は、抗体に対する診断又は治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及びその他のタンパク質又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法及びスピニングカップシークエネータの使用による末端又は内部アミン配列決定によって測定された場合に、抗体の重量を９５％超まで、又は（２）クマシーブルー、若しくは好ましくは、銀染色を用いた、還元若しくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一状態まで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体には、組換え細胞内のインシチュでの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００７９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分の配列が抗体間で大幅に異なり、並びに各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を表す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。可変性は、何れも軽鎖及び重鎖可変ドメイン中に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメント中に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。原型の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、４つのＦＲ領域（大部分はβシート立体構造を採り、３つのＣＤＲによって接続されており、３つのＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成し、幾つかの事例では、βシート構造の一部を形成する。）を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって、互いに近接した状態に保たれ、他の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体を抗原に結合する上で直接に関与していないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００８０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最低の抗体断片である。二本鎖Ｆｖ種では、この領域は、緊密に非共有会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種の構造と同様の「二量体」構造に会合できるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するために相互作用するのは、この立体配置中である。一括して、６つのＣＤＲが抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位より低い親和性であるが、抗原を認識及び結合する能力を有する。
【００８１】
「超可変領域」という用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合に必要とされる抗体のアミノ酸残基を表す。超過片領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−６２（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の３１−５５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／又は「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、特異的なリガンドと接触し、その特異性を決定する免疫学的受容体の一部を表す。免疫学的受容体のＣＤＲは、受容体タンパク質の最も可変的な部分であり、受容体に多様性を付与し、受容体の可変ドメインの遠位末端に位置する６つのループ上に担持され、３つのループは、受容体の２つの可変ドメインの各々に由来する。
【００８３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞によって媒介される反応を表す。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃ発現は、「Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）」の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されているものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイを行い得る。このようなアッセイに対する有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。これに代えて又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、「Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ９５：６５２−６５６（１９８８）」に開示されているものなどの動物モデル中にて、インビボで評価し得る。
【００８４】
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリン及び／又はＴ細胞受容体に特異的な結合をすることができる、あらゆるポリペプチド決定基が含まれる。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造的特徴及び特異的な電荷特徴を有する。
【００８５】
本明細書において、「因子」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子又は生物物質から作製された抽出物を表記するために使用される。
【００８６】
本明細書において使用される、「標識」又は「標識された」という用語は、例えば、放射性標識されたアミノ酸を取り込ませることによって、又は印を付けたアビジン（例えば、光学的方法又は比色分析法によって検出することができる、蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分をポリペプチドに付着させることによって、検出可能なマーカーを取り込むことを表す。ある状況において、前記標識又はマーカーは、治療用とすることもできる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が本分野において公知であり、使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、以下の放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、リン光体）、酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、及び二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、発生し得る立体的障害を減らすために、標識には、様々な長さのスペーサーアームが付着される。
【００８７】
本明細書において使用される「医薬因子又は医薬」という用語は、患者に適切に投与されたときに、所望の治療効果を誘導することができる化学的化合物又は組成物を表す。本明細書中の他の化学用語は、「ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））、参照により、本明細書に組み込まれる。）」に例示されているように、本分野における慣用の用法に従って使用される。
【００８８】
本明細書において、「抗悪性腫瘍薬」という用語は、ヒトの新生物、特に、癌腫、肉腫、リンパ腫又は白血病などの悪性（癌性）病変の発症又は進行を阻害するという機能的特性を有する因子を表すために使用される。転移の阻害は、しばしば、抗悪性腫瘍薬の特性である。
【００８９】
本明細書において使用される「実質的に純粋な」とは、対象種が、存在する主要な種であることを意味し（すなわち、モルベースでは、対象種が、組成物中の他の何れの個々の種よりも豊富である。）、好ましくは、実質的に精製された画分は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を占める組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％超、より好ましくは、約８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超を含む。最も好ましくは、対象種は、組成物が実質的に単一の高分子種からなる、実質的な均一状態（慣用的な検出法によって、莢雑種が組成物中に検出できない。）に精製される。
【００９０】
患者という用語には、ヒト及び動物対象が含まれる。
【００９１】
治療における「哺乳動物」及び「動物」という用語は、ヒト、家畜及び農場動物、並びに動物園、スポーツ又はペット動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）などの哺乳動物として分類される全ての動物を表す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９２】
「疾病状態」という用語は、細胞若しくは身体機能、系または臓器の中断、停止又は異常が起こった細胞又は哺乳動物個体の生理的状態を表す。
【００９３】
「治療する」又は「治療」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の両方を表し、ここにおいて、目的は、癌の発達又は広がりなど、望ましくない生理的変化又は疾患を予防し、又は遅くする（弱める）ことである。本発明において、有益な又は所望の臨床的結果には、検出可能であると、又は検出不能であるとを問わない、症候の緩和、疾病の程度の減弱、疾病の安定化された（すなわち悪化しない）状態、疾病の進行の遅延又は減速、疾病状態の軽減又は緩和及び寛解（部分的又は完全であるかどうかを問わない。）が含まれるが、これらに限定されるものではない。「治療」は、治療を受けていない場合に予測される生存に比べて、延長された生存も意味することが可能である。治療を必要とする者には、症状若しくは疾患を既に有する者及び症状若しくは疾患を有する傾向がある者又は症状若しくは疾患が予防されるべき者が含まれる。
【００９４】
「疾患」とは、１つ又はそれ以上の治療が有益である何らかの症状である。これには、哺乳動物が問題の疾患に罹患し易い病理的症状を含む慢性及び急性の疾患又は疾病が含まれる。本明細書において治療されるべき疾患の非限定的な例には、良性及び悪性腫瘍、白血病及びリンパ系悪性腫瘍、特に、乳癌、直腸癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌又は膀胱癌が含まれる。本発明に従って治療されるべき好ましい疾患は、子宮頸癌及び頸部上皮内扁平上皮及び腺新生物、腎細胞癌（ＲＣＣ）、食道腫瘍及び癌腫由来の細胞株などの悪性腫瘍である。
【００９５】
「変異体ＥＧＦｒポリペプチドに関連する疾病又は症状」には、以下のうちの１つ又はそれ以上、すなわち、変異体ＥＧＦｒポリペプチドによって引き起こされる疾病又は症状、変異体ＥＧＦｒポリペプチドが寄与する疾病又は症状、変異体ＥＧＦｒポリペプチドを引き起こす疾病又は症状及び変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在と関連する疾病又は症状が含まれる。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに関連する疾病又は症状は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの不存在下で存在し得る。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに関連する疾病又は症状は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在によって悪化され得る。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに関連する疾病又は症状は癌である。典型的な癌には、非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌、脳腫瘍、膀胱癌、頭部及び頸部癌、卵巣癌並びに前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
「変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに関連する疾病又は症状」には、以下のうちの１つ又はそれ以上、すなわち、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドによって引き起こされる疾病又は症状、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドが寄与する疾病又は症状、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドを引き起こす疾病又は症状及び変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの存在と関連する疾病又は症状が含まれる。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに関連する疾病又は症状は、変異の不存在下で存在し得る。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに関連する疾病又は症状は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの存在によって悪化され得る。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに関連する疾病又は症状は癌である。典型的な癌には、非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌、脳腫瘍、膀胱癌、頭部及び頸部癌、卵巣癌並びに前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
「変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに関連する疾病又は症状」には、以下のうちの１つ又はそれ以上、すなわち、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドによって引き起こされる疾病又は症状、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドが寄与する疾病又は症状、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを引き起こす疾病又は症状及び変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの存在と関連する疾病又は症状が含まれる。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに関連する疾病又は症状は、変異の不存在下で存在し得る。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに関連する疾病又は症状は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの存在によって悪化され得る。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに関連する疾病又は症状は癌である。典型的な癌には、非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌、脳腫瘍、膀胱癌、頭部及び頸部癌、卵巣癌並びに前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
「併用療法」において、患者は、化学療法剤又は抗悪性腫瘍剤及び／又は放射線療法と組み合わせて、標的抗原に対する特異的結合因子を用いて治療される。癌は、標準的な一次及び二次療法のために、変異体ＥＧＦｒポリペプチドへの特異的結合因子の付加、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドへの特異的結合因子の付加及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドへの特異的結合因子の付加によるプロトコール下で治療される。プロトコールの設計は、腫瘍塊の減少によって評価される有効性及び標準的な化学療法の通常の用量を減少させる能力に注目する。これらの投薬量の減少は、化学療法剤の用量関連毒性を減少させることによって、追加の治療及び／又は延長された治療を可能とする。
【００９９】
「単独療法」は、化学療法又は抗悪性腫瘍剤を伴わずに、免疫療法を患者に施すことによる疾患の治療を表す。
【０１００】
（特定の実施形態）
ポリペプチド、断片及び融合タンパク質
特定の実施形態において、欠失バリアントは完全長の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの断片である。特定の実施形態において、このような断片は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドのエピトープに対応する。特定の実施形態において、このような断片は、（例えば、インビボプロテアーゼ活性によって）天然に存在する。特定の実施形態において、このような断片は化学的に合成される。特定の実施形態において、このような断片は、変異体ＥＧＦｒ融合タンパク質を形成するために、ポリペプチドに連結され得る。特定の実施形態において、このような断片は、少なくとも５、６、８又は１０アミノ酸長である。特定の実施形態において、このような断片は、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０又は少なくとも７０アミノ酸長である。
【０１０１】
特定の実施形態において、欠失バリアントは、完全長の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの断片が提供される。特定の実施形態において、このような断片は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドのエピトープに対応する。特定の実施形態において、このような断片は、（例えば、インビボプロテアーゼ活性によって）天然に存在する。特定の実施形態において、このような断片は化学的に合成される。特定の実施形態において、このような断片は、変異体ＰＩ３Ｋ融合タンパク質を形成するために、ポリペプチドに連結され得る。特定の実施形態において、このような断片は、少なくとも５、６、８又は１０アミノ酸長である。特定の実施形態において、このような断片は、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０又は少なくとも７０アミノ酸長である。
【０１０２】
特定の実施形態において、欠失バリアントは、完全長の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの断片が提供される。特定の実施形態において、このような断片は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドのエピトープに対応する。特定の実施形態において、このような断片は、（例えば、インビボプロテアーゼ活性によって）天然に存在する。特定の実施形態において、このような断片は化学的に合成される。特定の実施形態において、このような断片は、変異体Ｂ−Ｒａｆ融合タンパク質を形成するために、ポリペプチドに連結され得る。特定の実施形態において、このような断片は、少なくとも５、６、８又は１０アミノ酸長である。特定の実施形態において、このような断片は、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０又は少なくとも７０アミノ酸長である。
【０１０３】
特定の実施形態において、変異体ポリペプチドは、少なくとも１つの非タンパク質に連結され得る。このような基には、Ｎ結合型又はＯ結合型炭水化物鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマー及びこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号参照）。本用語の意味の範疇に属する他の化学的修飾には、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール及び関連する分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドは、分子内のランダムな位置において、又は分子内の所定の位置において修飾されることができ、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の付着された化学的部分を含み得る。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドは、アミノ末端又はポリペプチド内の選択されたリジン若しくはアルギニン残基など、ポリペプチド中の所定の位置においても修飾され得る。他の化学的修飾には、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの検出及び単離を可能とするために、酵素標識、蛍光標識、同位体標識又はアフィニティー標識などの検出可能な標識が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドは、分子内のランダムな位置において、又は分子内の所定の位置において修飾されることができ、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の付着された化学的部分を含み得る。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドは、アミノ末端又はポリペプチド内の選択されたリジン若しくはアルギニン残基など、ポリペプチド中の所定の位置においても修飾され得る。他の化学的修飾には、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの検出及び単離を可能とするために、酵素標識、蛍光標識、同位体標識又はアフィニティー標識などの検出可能な標識が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、分子内のランダムな位置において、又は分子内の所定の位置において修飾されることができ、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の付着された化学的部分を含み得る。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、アミノ末端又はポリペプチド内の選択されたリジン若しくはアルギニン残基など、ポリペプチド中の所定の位置においても修飾され得る。他の化学的修飾には、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの検出及び単離を可能とするために、酵素標識、蛍光標識、同位体標識又はアフィニティー標識などの検出可能な標識が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒ融合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドは、ホモ二量体を形成するために相同なポリペプチドに融合することができ、又はヘテロ二量体を形成するために異種のポリペプチドに融合することができる。典型的な異種のポリペプチド及びペプチドには、融合タンパク質の検出及び／又は単離を可能とするためのエピトープ、膜貫通受容体タンパク質又はその一部（細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインなど）、膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンド又はその一部；触媒的に活性である酵素又はその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチド（ロイシンジッパードメインを含むが、これに限定されない。）、融合タンパク質の安定性を増加させるポリペプチド（免疫グロブリン定常領域を含むが、これに限定されない。）、並びに変異体ＥＧＦｒポリペプチドと異なる治療的活性を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド又は変異体ＥＧＦｒ融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニンへ連結することができ、これは、Ｅ．コリなどの原核細胞中での発現を可能とするために有用であり得る。
【０１０８】
特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋ融合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドは、ホモ二量体を形成するために相同なポリペプチドに融合することができ、又はヘテロ二量体を形成するために異種のポリペプチドに融合することができる。典型的な異種のポリペプチド及びペプチドには、融合タンパク質の検出及び／又は単離を可能とするためのエピトープ、膜貫通受容体タンパク質又はその一部（細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインなど）、膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンド又はその一部；触媒的に活性である酵素又はその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチド（ロイシンジッパードメインを含むが、これに限定されない。）、融合タンパク質の安定性を増加させるポリペプチド（免疫グロブリン定常領域を含むが、これに限定されない。）、並びに変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドと異なる治療的活性を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド又は変異体ＰＩ３Ｋ融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニンへ連結することができ、これは、Ｅ．コリなどの原核細胞中での発現を可能とするために有用であり得る。
【０１０９】
特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆ融合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、ホモ二量体を形成するために相同なポリペプチドに融合することができ、又はヘテロ二量体を形成するために異種のポリペプチドに融合することができる。典型的な異種のポリペプチド及びペプチドには、変異体Ｂ−Ｒａｆ融合タンパク質の検出及び／又は単離を可能とするためのエピトープ、膜貫通受容体タンパク質又はその一部（細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインなど）、膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンド又はその一部；触媒的に活性である酵素又はその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチド（ロイシンジッパードメインを含むが、これに限定されない。）、融合タンパク質の安定性を増加させるポリペプチド（免疫グロブリン定常領域を含むが、これに限定されない。）、並びに変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドと異なる治療的活性を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチド又は変異体Ｂ−Ｒａｆ融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニンへ連結することができ、これは、Ｅ．コリなどの原核細胞中での発現を可能とするために有用であり得る。
【０１１０】
特定の実施形態において、異種又は相同ポリペプチドは、変異体ＥＧＦｒポリペプチドのアミノ末端に融合される。特定の実施形態において、異種又は相同ポリペプチドは、変異体ＥＧＦｒポリペプチドのカルボキシ末端に融合される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の異種又は相同ポリペプチド又はペプチドが、変異体ＥＧＦｒポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に融合される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに直接融合される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本分野において公知であるように、リンカー又はアダプター分子を介して、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに融合される。特定のこのような実施形態において、リンカー又はアダプター分子は、プロテアーゼが融合されるポリペプチドの分離を可能とするために、切断部位を含有するように設計される。
【０１１１】
特定の実施形態において、異種又は相同ポリペプチドは、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドのアミノ末端に融合される。特定の実施形態において、異種又は相同ポリペプチドは、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドのカルボキシ末端に融合される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の異種又は相同ポリペプチド又はペプチドが、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に融合される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに直接融合される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本分野において公知であるように、リンカー又はアダプター分子を介して、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに融合される。特定のこのような実施形態において、リンカー又はアダプター分子は、プロテアーゼが融合されるポリペプチドの分離を可能とするために、切断部位を含有するように設計される。
【０１１２】
特定の実施形態において、異種又は相同ポリペプチドは、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドのアミノ末端に融合される。特定の実施形態において、異種又は相同ポリペプチドは、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドのカルボキシ末端に融合される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の異種又は相同ポリペプチドが、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に融合される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに直接融合される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本分野において公知であるように、リンカー又はアダプター分子を介して、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに融合される。特定のこのような実施形態において、リンカー又はアダプター分子は、プロテアーゼが融合されるポリペプチドの分離を可能とするために、切断部位を含有するように設計される。
【０１１３】
ベクター、宿主細胞、トランスジェニック動物並びにタンパク質産生及び精製
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。特定のこのような実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドは、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターである。
【０１１４】
特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。特定のこのような実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドは、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドは、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ及びＨ１０４７Ｌから選択される少なくとも１つのＰＩ３Ｋ変異を含む。特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターである。
【０１１５】
特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。特定のこのような実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、配列番号１９及び配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、Ｖ６００Ｅ及びＫ６０１Ｅから選択される少なくとも１つのＢ−Ｒａｆ変異を含む。特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターである。
【０１１６】
特定の実施形態において、発現ベクターは、宿主生物によって認識され、及び変異体ＥＧＦｒをコードする核酸分子に作用可能に連結されたプロモーターを含有し得る。特定の実施形態において、発現のために使用される宿主細胞及び所望されるタンパク質の収率に応じて、原型のプロモーター又は異種のプロモーターを使用し得る。
【０１１７】
原核細胞宿主とともに使用するための典型的なプロモーターには、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系並びにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、他の公知の細菌プロモーターを使用し得る。公知の細菌プロモーターの配列は公表されており、これにより、当業者は、何れかの所望される制限部位を供給するために必要とされるリンカー又はアダプターを用いて、所望の核酸配列にそれらを連結することが可能となる。
【０１１８】
酵母宿主とともに使用するための適切なプロモーターも、本分野において周知である。特定の実施形態において、酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に使用される。哺乳動物の宿主細胞とともに使用するための適切なプロモーターは、周知である。哺乳動物の宿主細胞とともに使用するための典型的なプロモーターには、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれるが、これらに限定されない。典型的な哺乳動物プロモーターには、異種の哺乳動物プロモーターが含まれるが、これに限定されない。典型的な異種の哺乳動物プロモーターには、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドを発現するために使用され得る典型的なプロモーターには、ＳＶ４０早期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ｃｅｌｌ，２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：１４４４−５）；メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；及びｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
特定の実施形態において、真核宿主細胞中での転写を増加させるために、ベクター中にエンハンサー配列を含め得る。哺乳動物遺伝子から得られる典型的なエンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質及びインシュリンが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ウイルスから得られるエンハンサーが使用される。真核生物プロモーターの活性化のための典型的なエンハンサー配列には、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、エンハンサーは、ポリペプチドコード領域に対して５’及び３’の位置において、ベクター中にスプライスされ得る。特定の実施形態において、エンハンサーは、プロモーターから５’部位に位置する。特定の実施形態において、エンハンサーは、ポリペプチドコード領域の末端から３’部位に位置する。
【０１２１】
特定の実施形態において、ベクターは、細菌、昆虫及び哺乳動物の宿主細胞の少なくとも１つと適合性があるベクターである。典型的なベクターには、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１４３６３）並びにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
典型的なベクターには、選択された宿主細胞と適合性を有するコスミド、プラスミド及び修飾されたウイルスが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ベクターは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏＩＥＩベースのファジミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  ＪｏＩＩａ  ＣＡ）、Ｔａｑ増幅されたＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｒ）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（Ｒ）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ａ）などの哺乳動物、酵母又はウイルスベクターなどの（これらに限定されない。）プラスミドを含み得る。特定の実施形態において、組換え分子は、形質転換、形質移入、注入、電気穿孔又はその他の公知の技術を介して、宿主細胞中に導入され得る。
【０１２３】
「形質移入」という用語は、何らかのコード配列が実際に発現されているか否かに関わらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを表す。ＣａＰＯ４沈殿及び電気穿孔を含む（これらに限定されない。）形質移入の多数の方法が当業者に公知である。特定の実施形態において、形質移入されたベクターの操作の何れかの指標が宿主細胞内に生じたときに、形質移入が成功したと認められる。
【０１２４】
特定の実施形態において、宿主細胞は、原核生物宿主細胞（Ｅ．コリなど）又は真核生物宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞又は脊椎動物細胞など）であり得る。特定の実施形態において、Ｅ．コリなどの原核生物宿主細胞は、グリコシル化されていないタンパク質、例えば、グリコシル化された真核生物分子に比べて利点を有し得るグリコシル化されていないｓｈＢＣＭＡ及びグリコシル化されていないｓｈＴＡＣＩを産生する。特定の実施形態において、宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合に、その後培地から収集することが可能であるか（宿主細胞が媒地中に本発明のポリペプチドを分泌する場合）、又は本発明のポリペプチドを産生する宿主細胞から直接収集することが可能な（分泌されない場合）本発明のポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、適切な宿主細胞の選択は、所望される発現レベル、活性に対して所望されるか又は必要とされるポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化など）及び／又は生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さなどの様々な要素を考慮に入れる。
【０１２５】
多数の適切な宿主細胞が本分野において公知であり、多くは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能である。典型的な宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７，４２１６−２０）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）及び３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）などの哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な哺乳動物宿主細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び産物の産生及び精製の方法は、本分野において公知である。典型的な宿主細胞には、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）及びＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）が含まれるが、これらに限定されない。典型的な哺乳動物宿主細胞には、霊長類細胞株及びげっ歯類細胞株（形質転換された細胞株を含む。）が含まれるが、これらに限定されない。典型的な宿主細胞には、正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から得られる細胞株、幹細胞株及び一次外植が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、候補細胞は、選択遺伝子が欠失した遺伝子型であり得、又は優性的に作用する選択遺伝子を含有し得る。典型的な宿主細胞には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手できる、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウスから得られる３Ｔ３株、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞が含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞株の各々は、タンパク質発現の分野の当業者によって公知であり、入手可能である。
【０１２６】
特定の実施形態において、宿主細胞は細菌細胞であり得る。典型的な細菌宿主細胞には、Ｅ．コリの様々な株が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ番号３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））。典型的な宿主細胞には、シュードモナス属種、Ｂ．ズブチリス、その他のバチルス属種及びストレプトミセス属種の様々な株も含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
当業者に公知の酵母細胞の多くの株は、ポリペプチドの発現用の宿主細胞として利用することもできる。特定のこのような実施形態は、製造業者の指示書に従って、市販の発現系、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用する。特定の実施形態において、このような系は、分泌を誘導するためにプレプロα配列に依拠する。ある実施形態において、挿入断片の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。特定の実施形態において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）であり得る。
【０１２８】
特定の実施形態において、植物細胞系は宿主細胞として使用され得る。特定のこのような実施形態において、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ又はタバコモザイクウイルス）で形質移入された植物細胞系が使用される。
【０１２９】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのバキュロウイルス発現ベクター中にクローニングされる。特定の実施形態において、このようなベクターは、無ｓＦ９タンパク質培地中でスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を感染させるために、及び組換えポリペプチドを産生するために、製造業者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用することが可能である。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、このような培地から精製及び濃縮される。
【０１３０】
特定の実施形態において、昆虫細胞系は宿主細胞として使用され得る。特定のこのような系は、例えば、「Ｋｉｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−７，Ｌｕｃｋｌｏｗ（１９９３）」、「Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−７２」及び「Ｌｕｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９」に記載されている。典型的な昆虫細胞には、Ｓｆ−９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれるが、これに限定されない。
【０１３１】
特定の実施形態において、選択された宿主細胞中への、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形質転換又は形質移入は、塩化カルシウム、電気穿孔、微小注入、リポフェクション又はＤＥＡＥ−デキストラン法などの方法を含む周知の方法によって達成され得る。特定の実施形態において、選択された方法は、部分的に、使用されるべき宿主細胞の種類の関数である。これらの方法及びその他の適切な方法は当業者に周知であり、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））」に記載されている。
【０１３２】
変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードする発現ベクターを（形質転換又は形質移入によって）含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を用いて培養され得る。特定の実施形態において、培地は、細胞の増殖及び生存に必要な全ての栄養素を含有し得る。特定の実施形態において、Ｅ．コリ細胞は、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）及び／又はＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中で培養され得る。真核細胞を培養するための典型的な培地には、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭが含まれるが、これらに限定されるものではなく、これらの全てには、培養されている具体的な細胞株に応じて、血清及び／又は成長因子を補充し得る。特定の実施形態において、昆虫細胞は、酵母抽出粉末（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解物及び／又はウシ胎児血清が補充されたＧｒａｃｅの媒地中で培養され得る。
【０１３３】
特定の実施形態において、形質移入された細胞又は形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質又はその他の化合物が、培地への補充物として添加される。特定の実施形態において、使用されるべき化合物は、宿主細胞を形質転換するプラスミド上に存在する選択可能なマーカー要素の見地から選択される。選択可能なマーカー要素がカナマイシン耐性である、特定の実施形態において、培地に添加される化合物はカナマイシンである。選択的な増殖のための典型的な化合物には、アンピシリン、テトラサイクリン及びネオマイシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
特定の実施形態において、宿主細胞によって産生される、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの量は、本分野で公知の標準的な方法を用いて評価することが可能である。典型的な方法には、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降及び活性アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
特定の実施形態において、原核宿主細胞中で発現される変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、細胞質周辺腔若しくは細胞質中の可溶性形態で、又は細胞内封入体の一部として、不溶性形態で存在し得る。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、当業者に公知の何れかの標準的な技術を用いて、宿主細胞から抽出することが可能である。特定の実施形態において、その後に遠心が行われる、フレンチプレス、ホモゲナイズ及び／又は音波処理によって周辺質／細胞質の内容物を放出させるために、宿主細胞を溶解することが可能である。
【０１３６】
特定の実施形態において、細胞質中に存在するか、又は細胞質周辺腔から放出される、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの可溶性形態は、本分野で公知の方法を用いて、さらに精製され得る。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、浸透圧ショック技術によって、細菌の細胞質周辺腔から放出される。
【０１３７】
変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドが形成された封入体を有する場合、これらは、しばしば、細胞内膜及び／又は細胞外膜に結合し得るので、遠心後、主に、ペレット材料中に見出される。特定の実施形態において、ペレット材料は、次いで、封入体を放出し、分解し、及び可溶化するために、極端なｐＨで処理され、又はアルカリｐＨのジチオスレイトール若しくは酸性ｐＨのトリスカルボキシエチルホスフィン、などの還元対の存在下で、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素又は尿素誘導体などのカオトロピック対で処理され得る。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降などを用いて分析し得る。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、以下に記載されている、及び「Ｍａｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５」に記載されているものなどの標準的な方法を用いて単離され得る。
【０１３８】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、単離時に、生物学的に活性でない場合があり得る。特定の実施形態において、生物活性を回復するために、ポリペプチドを「再折り畳み」する、すなわちポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド結合を生成する方法を使用し得る。特定の実施形態において、生物活性は、カオトロープの特定の濃度の存在下で、通常は７を上回るｐＨに、可溶化されたポリペプチドを曝露することによって回復され得る。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用される選択と極めて類似しているが、特定の実施形態において、カオトロープは、より低い濃度で使用され、可溶化のために使用されるカオトロープと必ずしも同一でない。特定の実施形態において、再折り畳み／酸化溶液は、タンパク質のシステイン架橋の形成時にジスルフィドシャッフリングが起こるようにする特定の酸化還元電位を生成するために、還元対又は特定の比率でその酸化形態を加えた還元対も含有する。適切な酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、再折り畳みの効率を増加させるために、共溶媒を使用し得るか、又は必要とし得、この目的のために使用される典型的なリパートナー（ｒｅｐａｒｔｎｅｒ）には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニン及び関連分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、化学合成法によって調製され得る。特定の実施形態において、化学的合成法は、固相ペプチド合成を取り込み得る。特定の実施形態において、化学的合成法は、「Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６３），Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，８５：２１４９」；「Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８２：５１３２」；及び「Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９８４），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ」に記載されているものなど、本分野において公知の技術を使用し得る。特定の実施形態において、ポリペプチドは、アミノ末端上のメチオニンあり又はなしに合成され得る。特定の実施形態において、化学的に合成された、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、ジスルフィド架橋を形成するために、これらの参考文献中に記載されている方法を用いて酸化され得る。特定の実施形態において、このようにして調製された変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドは、原型の又は組換え的に産生された、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに付随する少なくとも１つの生物活性を保持する。
【０１４０】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物を使用し得る。特定の実施形態において、トランスジェニックミルク産生動物（例えば、ウシ又はヤギ）を使用し、動物のミルク中に、グリコシル化された変異体ＥＧＦｒポリペプチド、グリコシル化された変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又はグリコシル化された変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを取得し得る。特定の実施形態において、本分野において公知であるように、グリコシル化された変異体ＥＧＦｒポリペプチド、グリコシル化された変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又はグリコシル化された変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを産生するために、植物が使用される。
【０１４１】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドを実質的に精製する。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドを実質的に精製する。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを実質的に精製する。特定のタンパク質精製技術は、当業者に公知である。特定の実施形態において、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からのポリペプチド分画の粗分画を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術を用いて精製される。典型的な精製法には、硫酸アンモニウムを用いた沈殿、ＰＥＧを用いた沈殿、免疫沈降、熱変性後の遠心、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを含む（これらに限定されない。）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びにこのような技術及びその他の技術の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ポリペプチドは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。特定の実施形態において、精製工程は変化され得、又は特定の工程は省略され得、実質的に精製されたポリペプチドの調製のための適切な方法をなおもたらす。
【０１４２】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又はＢ−Ｒａｆポリペプチドは、カルボキシ末端又はアミノ末端の何れかに位置する、ヘキサヒスチジンなどの１つ若しくはそれ以上のアフィニティータグ又はＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）若しくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの他の小ペプチドとともに調製され得、及び一工程アフィニティーカラムによって精製され得る。特定の実施形態において、ポリヒスチジンは、ニッケルに、大きな親和性と特異性で結合するので、ニッケルのアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ（Ｒ）ニッケルカラムなど）は、ポリヒスチジンタグ化特異的結合対の精製のために使用することが可能である。例えば、「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ（１９９３），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １０．１１．８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ」を参照。特定の実施形態において、２以上の精製工程を使用し得る。
【０１４３】
特定の実施形態において、ポリペプチド調製の精製の程度を定量化する。精製の程度を定量するための特定の方法が、当業者に公知である。特定の典型的な方法には、調製物の特異的結合活性を測定すること及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって調製物内のポリペプチドの量を評価することが含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を評価するための特定の典型的な方法は、調製物の結合活性を計算すること、及びこれを初期抽出物の結合活性と比較することを含む。ある実施形態において、このような計算の結果は、「精製倍数」として表される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実施されているアッセイに依存する。
【０１４４】
特定の実施形態において、ポリペプチドは部分的に精製される。特定の実施形態において、部分精製は、より少ない精製工程を使用することによって、又は同じ一般的な精製スキームの異なる形態を用いることによって達成し得る。例えば、ある実施形態において、ＨＰＬＣ装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的には、低圧クロマトグラフィーシステムを用いた同じ技術より大きな「精製倍数」をもたらす。特定の実施形態において、より低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの総回収率の上で、又はポリペプチドの結合活性を維持する上で利点を有し得る。
【０１４５】
ある例において、ポリペプチドの電気泳動的遊走は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件によって、時折著しく変動し得る。例えば、「Ｃａｐａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ／Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，７６：４２５（１９７７）」を参照されたい。当然のことながら、異なる電気泳動条件下では、精製又は部分精製されたポリペプチドの見かけの分子量は異なり得る。
【０１４６】
トランスジェニック動物
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチド、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。特定の実施形態において、ヒト以外のトランスジェニック動物には、マウス又はラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びその他の農場動物が含まれるが、これらに限定されない。特定のトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号及びＷＯ９４／２８１２２号に記載されているものなどの（これらに限定されない。）周知の方法を用いて調製され得る。
【０１４７】
特定の実施形態において、トランスジェニック動物を構築するために、組織特異性を示す動物転写調節領域を使用し得る。トランスジェニック動物中での組織特異的発現とともに使用するための典型的な転写調節領域には、膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｃｅｌｌ，３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ（１９８７），Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：：４２５−５１５）；膵臓β細胞中で活性であるインシュリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｃｅｌｌ，３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３−８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ系及び肥満細胞中で活性であるマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｃｅｌｌ，４５：４８５−９５）；肝臓中で活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，１  ：２６８−７６）；肝臓中で活性であるαフェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８）；肝臓中で活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，１：１６１−１７１）；骨髄系細胞中で活性であるβグロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４）；脳内の乏突起膠細胞中で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｃｅｌｌ，４８：７０３−７１２）；骨格筋中で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−２８６）；及び視床下部中で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−８）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
特定の実施形態において、野生型ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが中断されており（すなわち、「ノックアウトされた」）、並びに野生型ＥＧＦｒポリペプチドの発現のレベルが、動物中で有意に減少し、又は完全に喪失し、及び変異体ＥＧＦｒポリペプチドが動物中で発現されるように、変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドで置換されているヒト以外の動物が提供される。特定のこのような実施形態において、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されている技術及び方法又は本分野において周知の他の技術などの技術及び方法を用いて、動物が調製され得る。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現のレベルを変化させるために、（例えば、本分野で公知の相同的組み換え法を用いることによって）１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対するプロモーターの活性が調節されたヒト以外の動物が提供される。特定のこのような実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現のレベルは増加される。特定のこのような実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現のレベルは減少される。
【０１４９】
特定の実施形態において、野生型ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが中断されており（すなわち、「ノックアウトされた」）、並びに野生型ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現のレベルが、動物中で有意に減少し、又は完全に喪失し、及び変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドが動物中で発現されるように、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドで置換されているヒト以外の動物が提供される。特定のこのような実施形態において、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されている技術及び方法又は本分野において周知の他の技術などの技術及び方法を用いて、動物が調製され得る。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現のレベルを変化させるために、（例えば、本分野で公知の相同的組み換え法を用いることによって）１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対するプロモーターの活性が調節されたヒト以外の動物が提供される。特定のこのような実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現のレベルは増加される。特定のこのような実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現のレベルは減少される。
【０１５０】
特定の実施形態において、野生型Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが中断されており（すなわち、「ノックアウトされた」）、並びに野生型Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現のレベルが、動物中で有意に減少し、又は完全に喪失し、及び変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドが動物中で発現されるように、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドで置換されているヒト以外の動物が提供される。特定のこのような実施形態において、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されている技術及び方法又は本分野において周知の他の技術などの技術及び方法を用いて、動物が調製され得る。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現のレベルを変化させるために、（例えば、本分野で公知の相同的組み換え法を用いることによって）１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに対するプロモーターの活性が調節されたヒト以外の動物が提供される。特定のこのような実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現のレベルは増加される。特定のこのような実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現のレベルは減少される。
【０１５１】
特定の実施形態において、薬物候補のスクリーニングのために、ヒト以外のトランスジェニック動物を使用することが可能である。特定の実施形態において、ヒト以外のトランスジェニック動物に対する薬物候補の影響が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性化を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性化を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの自己リン酸化を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの自己リン酸化を増加させる能力が測定される。
【０１５２】
特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＥＧＦｒポリペプチドへの、１つ又はそれ以上の特異的結合因子の結合を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＥＧＦｒポリペプチドへの、１つ又はそれ以上の特異的結合因子の結合を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに関連する疾病又は症状を軽減する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＥＧＦｒポリペプチド関連癌を軽減させる能力が測定される。
【０１５３】
特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性化を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性化を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの自己リン酸化を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの自己リン酸化を増加させる能力が測定される。
【０１５４】
特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドへの、１つ又はそれ以上の特異的結合因子の結合を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドへの、１つ又はそれ以上の特異的結合因子の結合を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに関連する疾病又は症状を軽減する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド関連癌を軽減させる能力が測定される。
【０１５５】
特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性化を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性化を増加させる能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの自己リン酸化を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの自己リン酸化を増加させる能力が測定される。
【０１５６】
特定の実施形態において、薬物候補が、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドへの、１つ又はそれ以上の特異的結合因子の結合を減少又は抑制する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドへの、１つ又はそれ以上の特異的結合因子の結合を増加させる能力が測定される。特定のこのような実施形態において、薬物候補が、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに関連する疾病又は症状を軽減する能力が測定される。特定の実施形態において、薬物候補が、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチド関連癌を軽減させる能力が測定される。
【０１５７】
特異的結合因子及び抗体
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する特異的結合因子が提供される。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対する特異的結合因子が提供される。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに対する特異的結合因子が提供される。特定のこのような実施形態において、特異的結合因子は抗体又はその抗原結合断片である。
【０１５８】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、「Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）」によって初めて記載されたハイブリドーマ法を用いて作製し得る。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法によって作製し得る（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０１５９】
ハイブリドーマ法の特定の実施形態において、マウス又は他の適切な宿主動物（ハムスター又はマカクザルを含むが、これらに限定されない。）は、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生し、又は産生することができるリンパ球を惹起するために免疫される。特定の実施形態において、リンパ球はインビトロで免疫され得る。特定の実施形態において、リンパ球又はＢ細胞が濃縮されたリンパ球は、電気細胞融合法によって、又はポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いることによって骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，［Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６］）。
【０１６０】
特定の実施形態において、非融合親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又はそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な媒地中に、ハイブリドーマ細胞が播種され、増殖される。特定の実施形態において、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠如している場合には、ハイブリドーマ用培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑制する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【０１６１】
特定の実施形態において、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、及びＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である骨髄腫細胞が選択される。典型的な骨髄腫細胞株には、「Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ」から入手可能なＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫瘍並びに「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡ」から入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導されるものなどのマウス骨髄腫株が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヒト骨髄腫及び／又はマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、ヒトモノクローナル抗体の産生のために使用される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，［１９８７］）。
【０１６２】
特定の実施形態において、ハイブリドーマ細胞がその中で増殖している培地は、抗原に対して誘導されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。特定の実施形態において、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、又はインビトロでの結合アッセイによって測定される。典型的な結合アッセイには、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び「Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０７：２２０（１９８０）」のスキャッチャード分析が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
特定の実施形態において、所望される特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、細胞は、限界希釈操作によってサブクローニングし、及び標準的な方法によって増殖し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。この目的のための典型的な培地には、ＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ハイブリドーマ細胞は、動物中の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１６４】
特定の実施形態において、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製操作によって、培地、腹水液又は血清から適切に分離される。
【０１６５】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、慣用の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離及び配列決定される。特定のこのような実施形態において、ハイブリドーマ細胞は、このようなポリヌクレオチドの好ましい採取源としての役割を果たす。特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは発現ベクター中に配置され得る。特定のこのような実施形態において、発現ベクターは、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を取得するために宿主細胞中に形質移入される。典型的な宿主細胞には、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない、Ｅ．コリ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることにより、修飾することができ、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体を作製する。
【０１６６】
特定の実施形態において、非免疫グロブリンポリペプチドが、抗体の定常ドメインを置換する。特定の実施形態において、標的抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製するために、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを非免疫グロブリンポリペプチドと置換する。
【０１６７】
特定の実施形態において、キメラ又はハイブリッド抗体は、架橋剤を含むものなど（これに限定されない。）の合成タンパク質化学中の公知の方法を用いてインビトロで調製することが可能である。特定のこのような実施形態において、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって構築することが可能である。この目的のための典型的な試薬には、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミダートが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
特定の実施形態において、標的抗原に対するヒト抗体が提供される。特定の実施形態において、融合対としてヘテロ骨髄腫（マウス×ヒトハイブリッド骨髄腫）を用いてヒト抗体を作製するために、ハイブリドーマ技術が拡張される（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７を参照。）。特定の実施形態において、ヒト抗体分泌細胞は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）での感染によって不死化することが可能である（Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １００：５−４０［１９８７］）。特定の実施形態において、ヒトＢ細胞の不死化は、形質転換遺伝子の所定の組み合わせを導入することによって達成することが可能である（Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４００：４６４−４６８［１９９９］）。
【０１６９】
特定の実施形態において、免疫化すると、内在性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体のレパートリーを作製することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）が、ヒト抗体を作製するために使用される（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８［１９９３］；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：６５−９３［１９９５］；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：８４５−８５１［１９９６］；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｆ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−１５６［１９９７］；Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１  ：１１−２３［１９９９］；Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７［２０００］；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０［２０００］参照）。キメラ及び生殖系列変異体マウス中の抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５［１９９３］）。このような生殖系列変異体マウス中にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入することにより、抗原誘発時にヒト抗体の産生をもたらす（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８［１９９３］）。
【０１７０】
Ｍｅｎｄｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６［１９９７］）は、抗原で誘発されたときに、高親和性の完全なヒト抗体を生成する、「Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ｒ）ＩＩ」と称されるトランス上ニックマウスの系列を作製した。これは、内在性ＪＨセグメント中に欠失を有するマウス中への、メガベースヒト重鎖及び軽鎖座位の生殖系列組み込みによって達成された。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）ＩＩは、約６６のＶＨ遺伝子、完全なＤＨ及びＪＨ領域及び３つの異なる定常領域（μ、δ及びλ）を含有するヒト重鎖座位の１，０２０ｋｂを保有し、３２Ｖκ遺伝子遺伝子、Ｊκセグメント及びＣκ遺伝子を含有するヒトκ座位の８００ｋｂも保有する。特定の実施形態において、これらのマウス中で産生される抗体は、遺伝子再編成、集合及びレパートリーを含む全ての点でヒトに見られる抗体と酷似する。特定の実施形態において、ヒト抗体は、マウス座位中の遺伝子再編成を抑制する内在性ＪＨセグメント中の欠失のために、内在性抗体に比べて優先的に発現される。
【０１７１】
特定の実施形態において、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物（例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ｒ）ＩＩ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．））は、変異体ＥＧＦｒポリペプチド、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチド及び／又は変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドなど、特に興味のある抗原で免疫化され得る。特定の実施形態において、これらの免疫化された動物から得られる血清は、初期抗原に対する抗体反応性についてスクリーニングされる。特定の実施形態において、リンパ球はリンパ節又は脾細胞から単離され、ＣＤ１３８陰性及びＣＤ１９＋細胞について選択することにより、Ｂ細胞に関してさらに濃縮され得る。特定の実施形態において、これらのＢ細胞培養（ＢＣＣ）は、上に詳述されているようにハイブリドーマを作製するために、骨髄腫細胞に融合される。特定の実施形態において、これらのＢ細胞培養物は、初期抗原に対する反応性についてさらにスクリーニングされる。このようなスクリーニングには、ＥＬＩＳＡ、目的の抗原を結合する公知の抗体を用いた競合アッセイ及び抗原を発現する一過性に形質移入されたＣＨＯ細胞へのインビトロ結合が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、目的の抗体を分泌する単一のＢ細胞が、特異的な溶血斑アッセイによって同定される。特定のこのような実施形態において、溶解の標的とされる細胞は、前記抗原で被覆されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。特定のこのような実施形態において、斑の形成は、標的細胞の特異的抗原媒介性溶解を示し、従って、目的の免疫グロブリン及び補体を分泌するＢ細胞培養の存在を示す。特定のこのような実施形態において、斑の中心にある単一の抗原特異的形質細胞を単離し、ｍＲＮＡの単離のために使用することが可能である。
【０１７２】
特定の実施形態において、分泌された抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲを用いてクローニングすることが可能である。特定の実施形態において、クローニングされたポリヌクレオチドは、ｐｃＤＮＡ、又は免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常ドメインを含有するｐｃＤＮＡベクターなどのベクターカセットなどの適切な発現ベクター中にさらに挿入される。特定の実施形態において、作製されるベクターは宿主細胞（すなわち、ＣＨＯ細胞）中に形質移入され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された慣用の栄養素培地中で培養される。
【０１７３】
特定の実施形態において、ファージディスプレイ技術は、免疫化されていないドナーから得られる免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体断片をインビトロで作製するために使用される（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３［１９９０］；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：１７３−２０１［１９９９］；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１  ：３７１−３７８［２０００］参照）。特定のこのような実施形態において、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄなどの糸状バクテリオファージのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子の何れか中に、インフレームにクローニングされ、ファージ粒子の表面上に、機能的な抗体断片として提示される。特定の実施形態において、糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有し、抗体の機能的特性に基づく選択も、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。ファージディスプレイは、以下の文書：Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１［１９９３）］；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：４３３−４５５［１９９４］；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ８：４４３−４５０［１９９８］；ａｎｄ  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１  ：３７１−３７８［２０００］中に特定されているものを含む（但し、これらに限定されない。）様々な形式で実施することが可能である。ファージディスプレイ用のＶ遺伝子セグメントの源には、免疫化されたマウスの脾臓から誘導されたＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８［１９９１］）及び免疫されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリー（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９１）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：７２５−７３４（１９９３））が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１７４】
特定の実施形態において、天然免疫反応において、抗体遺伝子は高い速度で変異を蓄積する（体細胞超変異）。特定の実施形態において、導入された変化の幾つかは、より高い親和性を付与する。特定の実施形態において、高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、その後の抗原誘発の間に、優先的に複製及び分化される。特定の実施形態において、この天然の過程は、「チェーンシャフリング」として知られる技術（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３［１９９２］）を用いることによって模倣することが可能である。特定のこのような実施形態において、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫化されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアントのレパートリー（レパートリー）と順次置換することによって改善することが可能であり、ｎＭ域の親和性を有する抗体及び抗体断片の産生を可能とする。特定の実施形態において、「Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１  ：２２６５−２２６６（１９９３）」によって記載されているように、極めて巨大なファージ抗体レパートリーが構築される（「マザー・オブ・オール・ライブラリー」としても知られる。）。特定の実施形態において、高親和性ヒト抗体は、巨大なファージライブラリーから直接単離される（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３２４５−３２６０（１９９４）参照）。特定の実施形態において、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導するために遺伝子シャッフリングを使用することが可能であり、ヒト抗体は、出発するげっ歯類抗体と類似の親和性及び特異性を有する。特定のこのような実施形態において、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖又は軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置換され、げっ歯類−ヒトキメラ（「エピトープインプリンティング」とも称される。）を作出する。特定の実施形態において、抗原による可変領域の選択は、機能的な抗原結合部位を回復することが可能なヒト可変領域の単離をもたらす。すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配（インプリント）する。特定の実施形態において、残存するげっ歯類Ｖドメインを置換するために本過程が反復される場合には、フレームワークを有しないか、又はげっ歯類起源のＣＤＲ残基を有するヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９３／０６２１３号を参照。）。
【０１７５】
アレイ
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドと相補的な１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドと相補的な１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドと相補的な１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。
【０１７６】
特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの存在又は不存在がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの量がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織は評価前に処理され、この処理が１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの量に影響を与える能力も評価される。
【０１７７】
特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリヌクレオチドの存在又は不存在がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリヌクレオチドの量がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織は評価前に処理され、この処理が１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリヌクレオチドの量に影響を与える能力も評価される。
【０１７８】
特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリヌクレオチドの存在又は不存在がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリヌクレオチドの量がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織は評価前に処理され、この処理が１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリヌクレオチドの量に影響を与える能力も評価される。
【０１７９】
特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定のこのような実施形態において、ｍＲＮＡは、まず、細胞又は組織試料から抽出され、続いて、ｃＤＮＡへと変換され、これがマイクロアレイにハイブリッド形成される。特定のこのような実施形態において、マイクロアレイに特異的に結合されたｃＤＮＡの存在又は不存在は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在の指標である。特定のこのような実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現レベルは、マイクロアレイに特異的に結合されたｃＤＮＡの量を定量することによって評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織は評価前に処理され、この処理が１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現に影響を与える能力も評価される。
【０１８０】
特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの存在又は不存在がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定のこのような実施形態において、ｍＲＮＡは、まず、細胞又は組織試料から抽出され、続いて、ｃＤＮＡへと変換され、これがマイクロアレイにハイブリッド形成される。特定のこのような実施形態において、マイクロアレイに特異的に結合されたｃＤＮＡの存在又は不存在は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの存在又は不存在の指標である。特定のこのような実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現レベルは、マイクロアレイに特異的に結合されたｃＤＮＡの量を定量することによって評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織は評価前に処理され、この処理が１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現に影響を与える能力も評価される。
【０１８１】
特定の実施形態において、２つ又はそれ以上の細胞又は組織試料中の１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの存在又は不存在がマイクロアレイ技術を用いて評価される。特定のこのような実施形態において、ｍＲＮＡは、まず、細胞又は組織試料から抽出され、続いて、ｃＤＮＡへと変換され、これがマイクロアレイにハイブリッド形成される。特定のこのような実施形態において、マイクロアレイに特異的に結合されたｃＤＮＡの存在又は不存在は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの存在又は不存在の指標である。特定のこのような実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現レベルは、マイクロアレイに特異的に結合されたｃＤＮＡの量を定量することによって評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織は評価前に処理され、この処理が１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現に影響を与える能力も評価される。
【０１８２】
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドを含むマイクロアレイが提供される（例えば、ＭｃＢｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１７６０−１７６３，２０００参照）。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する候補特異的結合因子は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドマイクロアレイを用いてスクリーニングされる。特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性を調節するための候補化合物は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドマイクロアレイを用いてスクリーニングされる。特定のこのような実施形態において、候補化合物が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの自己リン酸化を減少又は抑制する能力が評価される。特定のこのような実施形態において、候補化合物が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの自己リン酸化を増加する能力が評価される。
【０１８３】
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドを含むマイクロアレイが提供される（例えば、ＭｃＢｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１７６０−１７６３，２０００参照）。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対する候補特異的結合因子は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドマイクロアレイを用いてスクリーニングされる。特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を調節するための候補化合物は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドマイクロアレイを用いてスクリーニングされる。特定のこのような実施形態において、候補化合物が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの自己リン酸化を減少又は抑制する能力が評価される。特定のこのような実施形態において、候補化合物が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの自己リン酸化を増加する能力が評価される。
【０１８４】
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを含むマイクロアレイが提供される（例えば、ＭｃＢｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１７６０−１７６３，２０００参照）。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに対する候補特異的結合因子は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドマイクロアレイを用いてスクリーニングされる。特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性を調節するための候補化合物は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドマイクロアレイを用いてスクリーニングされる。特定のこのような実施形態において、候補化合物が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの自己リン酸化を減少又は抑制する能力が評価される。特定のこのような実施形態において、候補化合物が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの自己リン酸化を増加する能力が評価される。
【０１８５】
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する１つ又はそれ以上の特異的結合因子を含むマイクロアレイが提供される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織中の１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在が評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織中の１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの量が評価される。
【０１８６】
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに対する１つ又はそれ以上の特異的結合因子を含むマイクロアレイが提供される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織中の１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの存在又は不存在が評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織中の１つ又はそれ以上の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの量が評価される。
【０１８７】
特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに対する１つ又はそれ以上の特異的結合因子を含むマイクロアレイが提供される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織中の１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの存在又は不存在が評価される。特定のこのような実施形態において、細胞又は組織中の１つ又はそれ以上の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの量が評価される。
【０１８８】
特定の方法
特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドを結合することが可能な抗体を取得する方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドを結合することが可能な抗体を取得する方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを結合することが可能な抗体を取得する方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドを動物に投与すること及び少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドを結合することが可能な抗体を前記動物から取得することを含む、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドを結合することが可能な抗体を取得する方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドを動物に投与すること及び少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドを結合することが可能な抗体を前記動物から取得することを含む、少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに結合することが可能な抗体を取得する方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを動物に投与すること及び少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドを結合することが可能な抗体を前記動物から取得することを含む、少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに結合することが可能な抗体を取得する方法が提供される。特定のこのような実施形態において、抗体はヒト抗体である。
【０１８９】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを結合できる抗体を取得する方法であり、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを動物に投与すること、並びに配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを結合できる抗体を前記動物から取得することを含む前記方法が提供される。特定のこのような実施形態において、抗体はヒト抗体である。
【０１９０】
特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを結合できる抗体を取得する方法であり、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの少なくとも１つの断片を動物に投与すること（前記少なくとも１つの断片は少なくとも１つの変異を含む。）、並びに配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに結合できる抗体を前記動物から取得することを含む前記方法が提供される。特定のこのような実施形態において、抗体はヒト抗体である。
【０１９１】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９２】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、及び（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、及び（ｂ）前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９３】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＰＩ３Ｋポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９４】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９５】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体Ｂ−Ｒａｆポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９６】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９７】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対する感受性を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＥＧＦｒポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９８】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中での、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中での、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０１９９】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体ＰＩ３Ｋポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０２００】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中での、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中での、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＰＩ３Ｋ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０２０１】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法が提供される。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）対象から得られた試料中での、変異体Ｂ−Ｒａｆポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０２０２】
特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリペプチドの発現の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、対象中の１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連する疾病又は症状への感受性を診断する方法は、（ａ）前記対象から得られた試料中の、配列番号１９及び配列番号２０から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの転写又は翻訳の存在又は量を測定すること、並びに（ｂ）前記ポリヌペプチドの転写又は翻訳の存在又は量に基づいて、１つ又はそれ以上のＢ−Ｒａｆ変異に関連した疾病又は症状への感受性を診断することを含む。特定の実施形態において、前記疾病又は症状は癌である。
【０２０３】
特定の実施形態において、変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法が提供される。特定の実施形態において、試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法は、（ａ）変異体ＥＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。）、並びに（ｂ）前記試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定する方法は、（ａ）変異体ＥＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。）、並びに（ｂ）前記試料中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含む。
【０２０４】
特定の実施形態において、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法が提供される。特定の実施形態において、試料中の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法は、（ａ）変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ及びＨ１０４７Ｌから選択される少なくとも１つのＰＩ３Ｋ変異を含む。）、並びに（ｂ）前記試料中の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、試料中の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの存在又は不存在を測定する方法は、（ａ）変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ及びＨ１０４７Ｌから選択される少なくとも１つのＰＩ３Ｋ変異を含む。）、並びに（ｂ）前記試料中の変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含む。
【０２０５】
特定の実施形態において、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法が提供される。特定の実施形態において、試料中の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定する方法は、（ａ）変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｖ６００Ｅ及びＫ６０１Ｅから選択される少なくとも１つのＢ−Ｒａｆ変異を含む。）、並びに（ｂ）前記試料中の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定することを含む。特定の実施形態において、試料中の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの存在又は不存在を測定する方法は、（ａ）変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブに試料を曝露すること（前記領域は、Ｖ６００Ｅ及びＫ６０１Ｅから選択される少なくとも１つのＢ−Ｒａｆ変異を含む。）、並びに（ｂ）前記試料中の変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの存在又は不存在を測定することを含む。
【０２０６】
特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性の調節物質をスクリーニングする方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性の調節物質をスクリーニングする方法は、変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現する細胞を検査化合物に接触させること、及び前記検査化合物が変異体ＥＧＦｒポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出することを含む。特定のこのような実施形態において、検査化合物はＥＧＦｒポリペプチドの活性を増加させる。特定のこのような実施形態において、検査化合物はＥＧＦｒポリペプチドの活性を減少させる。特定のこのような実施形態において、ＥＧＦｒポリペプチドの活性を減少させることが同定された検査化合物は、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドに関連する疾病又は症状を治療するために使用することが可能である。特定のこのような実施形態において、ＥＧＦｒポリペプチドの活性を増加させることが同定された検査化合物は、少なくとも１つの変異体ＥＧＦｒポリペプチドに関連する疾病又は症状を治療するために使用することが可能である。
【０２０７】
特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性の調節物質をスクリーニングする方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性の調節物質をスクリーニングする方法は、変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現する細胞を検査化合物に接触させること、及び前記検査化合物が変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出することを含む。特定のこのような実施形態において、検査化合物はＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を増加させる。特定のこのような実施形態において、検査化合物はＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を減少させる。特定のこのような実施形態において、ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を減少させることが同定された検査化合物は、少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに関連する疾病又は症状を治療するために使用することが可能である。特定のこのような実施形態において、ＰＩ３Ｋポリペプチドの活性を増加させることが同定された検査化合物は、少なくとも１つの変異体ＰＩ３Ｋポリペプチドに関連する疾病又は症状を治療するために使用することが可能である。
【０２０８】
特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性の調節物質をスクリーニングする方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性の調節物質をスクリーニングする方法は、変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現する細胞を検査化合物と接触させること、及び前記検査化合物が変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性を調節するかどうかを検出することを含む。特定のこのような実施形態において、検査化合物はＢ−Ｒａｆポリペプチドの活性を増加させる。特定のこのような実施形態において、検査化合物はＢ−Ｒａｆポリペプチドの活性を減少させる。特定のこのような実施形態において、Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性を減少させることが同定された検査化合物は、少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに関連する疾病又は症状を治療するために使用することが可能である。特定のこのような実施形態において、Ｂ−Ｒａｆポリペプチドの活性を増加させることが同定された検査化合物は、少なくとも１つの変異体Ｂ−Ｒａｆポリペプチドに関連する疾病又は症状を治療するために使用することが可能である。
【０２０９】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法が提供され、本方法は、
（ａ）対象から得られたポリヌクレオチド中の少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を検出すること（少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の検出は、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を発症することに対して、患者が増加した感受性を有することを示す。）、及び
（ｂ）変異体ＥＧＦｒポリペプチドを特異的に結合する抗体を前記対象に投与することを含む。
【０２１０】
特定のこのような実施形態において、抗体はヒト抗体である。特定のこのような実施形態において、抗体はパニツムマブ又はその抗原結合領域である。
【０２１１】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法が提供され、本方法は、
（ａ）対象から得られたポリヌクレオチド中の少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を検出すること（少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の検出は、患者が少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を有することを示す。）、及び
（ｂ）変異体ＥＧＦｒポリペプチドを特異的に結合する抗体を前記対象に投与することを含む。
【０２１２】
特定のこのような実施形態において、抗体はヒト抗体である。特定のこのような実施形態において、抗体はパニツムマブ又はその抗原結合領域である。
【０２１３】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法が提供され、前記ＥＧＦｒ変異の少なくとも１つはＬ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される。
【０２１４】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法が提供され、ここにおいて、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状は非小細胞肺癌である。
【０２１５】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状に対して対象を治療する方法が提供され、このような治療を必要とする対象に、変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチドに対してアンチセンスのポリヌクレオチドを投与することを含む。
【０２１６】
特定の実施形態において、個体の特異的集団において、変異体ＥＧＦｒ集団プロファイルを確定する方法が提供され、（ａ）集団中の個体の遺伝的プロファイル中に少なくとも１つのＥＧＦｒ変異の存在を測定すること、並びに（ｂ）変異体ＥＧＦｒ遺伝的プロファイルと前記個体との関係を確定することを含む。特定のこのような実施形態において、個体の特異的特徴は、ＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を発症することに対する感受性を含む。特定のこのような実施形態において、個体の特異的特徴は、ＥＧＦｒ変異に関連する疾病又は症状を呈することを含む。
【０２１７】
特定の実施形態において、対象中の疾病又は症状に対するゲフィチニブ治療の効力を予測する方法が提供され、対象の変異体ＥＧＦｒポリペプチド中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在又は不存在を測定することを含み、ここにおいて、１つ又はそれ以上の変異体ＥＧＦｒポリペプチド中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在は、ゲフィチニブを用いた治療に対する耐性を示す。
【０２１８】
特定の実施形態において、癌に罹患する対象中の抗ＥＧＦｒ抗体を用いた治療に対する応答性を測定する方法が提供され、対象中のＥＧＦｒ変異Ｔ７９０Ｍの存在又は不存在を測定することを含む。特定のこのような実施形態において、抗体はパニツムマブ又はセツキシマブである。
【０２１９】
特定の実施形態において、対象中の変異体ＥＧＦｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するためのキットが提供される。特定のこのような実施形態において、本キットは、変異体ＲＧＦｒポリペプチドの領域をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するプローブを含み、前記領域は、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８停止、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ及びＶ９４８Ａから選択される少なくとも１つのＥＧＦｒ変異を含む。特定の実施形態において、本キットは、２つ又はそれ以上の増幅プライマーをさらに含む。特定の実施形態において、本キットは、検出成分をさらに含む。特定の実施形態において、本キットは、核酸試料作製要素をさらに含む。
【０２２０】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のためのみに提供されており、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【０２２１】
実施例
【実施例１】
【０２２２】
非小細胞肺癌及び結腸直腸腺癌腫瘍試料中でのＥＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ及びＢ−Ｒａｆ変異の同定
非小細胞肺癌腫（「ＮＳＣＬＣ」）に伴うＥＧＦｒ、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（「ＰＩ３Ｋ」）及びＢ−Ｒａｆ中の変異を同定するために、ＥＧＦｒ、ＰＩ３Ｋ及びＢ−Ｒａｆの特異的エキソンは、ＮＳＣＬＣ腫瘍試料から単離及び増幅された。化学療法及び／又はパニツムマブによる患者の治療の前に、化学療法治療単独（カルボプラチン／パクリタキセル）と、ヒト抗ＥＧＦｒ抗体（Ａｍｇｅｎ）パニツムマブと組み合わされた化学療法治療とを比較する第一次ＮＳＣＬＣ試験に参加した２０人の患者から得た二重盲検腫瘍試料を得た。結腸直腸腺癌（「ＣＲＣ」）に伴うＥＧＦｒ及びＰＩ３Ｋ中の変異を同定するために、２０人のＣＲＣ患者の腫瘍からＥＧＦｒ及びＰＩ３Ｋの特異的エキソンを単離及び増幅した。化学療法及び／又はパニツムマブによる患者の治療の前に、化学療法治療単独（カルボプラチン／パクリタキセル）と、ヒト抗ＥＧＦｒ抗体（Ａｍｇｅｎ）であるパニツムマブと組み合わされた化学療法治療とを比較する第一次ＣＲＣ試験に参加した２０人の患者から得た二重盲検腫瘍試料を得た。これらのエキソンに対する野生型配列由来の何れかの変化を同定するために、単離された各エキソンを配列決定した。
【０２２３】
２０人の患者から得られたＮＳＣＬＣ腫瘍試料（表１）及び２０人の患者から得られたＣＲＣ腫瘍試料（表２）を集めた。腫瘍のＥＧＦｒ発現の量を特定するために各腫瘍試料の一部を染色し、３点のスケールで（３が染色の最大の程度である。）染色をランク付けした。各腫瘍試料の少なくとも１０％は、３又はそれ以上の染色レベルを示した。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の巨視的解剖により、隣接する正常な組織、壊死片及び間質から腫瘍組織を分離した。整えられた試料を顕微鏡スライド上に固定し、室温で保存した。
【０２２４】
【表１】
2008535477.tif 000002
【０２２５】
【表２】
2008535477.tif 000003
【０２２６】
製造業者のプロトコールに従い、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いて、試料スライドからゲノムＤＮＡを調製した。最終の単離されたゲノムＤＮＡ産物を、５００μＬの水中に溶解した。各エキソンに対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって、ヒトＥＧＦｒのエキソン１８、１９、２０、２１及び２３、ヒトＰＩ３Ｋのエキソン９及び２０並びにヒトＢ−Ｒａｆのエキソン１５に対応する配列を増幅した。野生型ＥＧＦｒ  ｃＤＮＡ配列中の各エキソンに対するイントロン配列５’及び３’を用いて、各エキソンに対するプライマー配列を設計した（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００６９７７；配列番号５５）。ゲノム野生型ＥＧＦｒヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ０７３３２４で見出される。野生型ＥＧＦｒポリペプチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＳ８３１０９（配列番号１）で見出される。ＥＧＦｒエキソン１８に対するフォワードプライマーは、５’−ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＣＣ−３’（配列番号２２）であり、ＥＧＦｒエキソン１８に対するリバースプライマーは、５’−ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号２３）であった。ＥＧＦｒエキソン１９に対するフォワードプライマーは、５’−ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ−３’（配列番号２４）であり、ＥＧＦｒエキソン１９に対するリバースプライマーは、５’−ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＴＣ−３’（配列番号２５）であった。ＥＧＦｒエキソン２０に対するフォワードプライマーは、５’−ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＡＧＧ  ＴＣ−３’（配列番号２６）であり、ＥＧＦｒエキソン２０に対するリバースプライマーは、５’−ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号２７）であった。ＥＧＦｒエキソン２１に対するフォワードプライマーは、５’−ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＧ−３’（配列番号２８）であり、ＥＧＦｒエキソン２１に対するリバースプライマーは、５’−ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＡＧＣ−３’（配列番号２９）であった。ＥＧＦｒエキソン２３に対するフォワードプライマーは、５’−ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＴＣ−３’（配列番号３０）であり、ＥＧＦｒエキソン２３に対するリバースプライマーは、５’−ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＣ−３’（配列番号３１）であった。
【０２２７】
野生型ＰＩ３Ｋポリペプチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ７９１４３（配列番号１４）で見出される。野生型ＰＩ３ＫｃＤＮＡ配列は、図７（配列番号５８）に示されている。ＰＩ３Ｋエキソン９に対するフォワードプライマーは、５’−ＣＴＧ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  Ｇ−３’（配列番号３２）であり、ＰＩ３Ｋエキソン９に対するリバースプライマーは、５’−ＧＴＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＡＴＧ  Ｇ−３’（配列番号３３）であった。ＰＩ３Ｋエキソン２０に対するフォワードプライマーは、５’−ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＧＣ−３’（配列番号３４）であり、ＰＩ３Ｋエキソン２０に対するリバースプライマーは、５’−ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＴＧＣ−３’（配列番号３５）であった。野生型Ｂ−Ｒａｆポリペプチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００４３３３（配列番号１８）で見出される。野生型Ｂ−Ｒａｆ  ｃＤＮＡ配列は、図８（配列番号６０）に示されている。Ｂ−Ｒａｆエキソン１１に対するフォワードプライマーは、５’−ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＧＣ−３’（配列番号３６）であり、Ｂ−Ｒａｆエキソン１１に対するリバースプライマーは、５’−ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  ＣＣ−３’（配列番号３７）であった。Ｂ−Ｒａｆエキソン１５に対するフォワードプライマーは、５’−ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＡＧＧ−３’（配列番号３８）であり、Ｂ−Ｒａｆエキソン１５に対するリバースプライマーは、５’−ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＡＧ−３１’（配列番号３９）であった。
【０２２８】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）及び以下の条件を用いてＰＣＲを行った。１０×Ｔａｑ緩衝液５μＬ、２４ｍＭのＭｇＣｌ２０．５μＬ、ゲノムＤＮＡ（約０．５ｎｇ）１μＬ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ７μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ）１μＬ及び２９．５μＬのｄｄＨ２Ｏを合わせて、混合した。合わせたプライマー原液（それぞれ１０μＭ）６μＬを各チューブに添加した。サイクルプロトコールは、９３℃で４分を１サイクル、９３℃で１０秒、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル、７２℃で４分を１サイクルであった。反応の終了時に、温度を４℃に維持した。
【０２２９】
各個別のエキソンに対するＰＣＲ産物をプールし、ゲル精製した。製造業者の指示書に従って、ＴＯＰＯ−ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いて、精製され増幅されたエキソン配列をｐＣＲ２．１ベクター中にサブクローニングした。Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｐｉｃｋｅｒによって、ベクター及び目的の挿入エキソンを含有するＥ．コリコロニーを選択した。液体培地中で、これらのコロニーを一晩増殖させた。製造業者の指示書に従って、ＱＩＡＧＥＮ  ９６００、３０００又は８０００Ｂｉｏ−ｒｏｂｏｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各一晩細菌培養から得られたプラスミドＤＮＡを単離した。
【０２３０】
製造業者の指示書に従い、ＢｉｇＤｙｅ  ３．１Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、各エキソンを含有する単離されたプラスミドＤＮＡを配列決定した。３７００、３１００又は３７３０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて配列決定データを集め、ＳｅＱｕｅｎｃｈｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて分析した。患者試料から得られたエキソン配列を野生型エキソン配列と比較した。結果は、図１及び２に模式的に示されている。
【０２３１】
ＮＳＣＬＣ患者腫瘍試料の変異分析（図１）によって、ＥＧＦｒ中に以下の幾つかの変異が同定された。２人の異なる患者中にＥＧＦｒのエキソン１８中の２つの異なる変異（Ｑ７０１Ｈ（配列番号４０、配列番号３のポリペプチドをコードする。）及びＬ６８８Ｐ（配列番号４１、配列番号２のポリペプチドをコードする。））、２人の異なる患者中にＥＧＦｒのエキソン１９中の１５塩基対の欠失（配列番号４２、配列番号４のポリペプチドをコードする。）及び変異（Ｋ７４５Ｎ（配列番号４３、配列番号５のポリペプチドをコードする。））、３人の異なる患者中にＥＧＦｒのエキソン２０中の３つの異なる変異（Ｃ７８１Ｒ（配列番号４４、配列番号６のポリペプチドをコードする。）、Ｔ７９０Ｍ（配列番号４５、配列番号８のポリペプチドをコードする。）及びアミノ酸７７１と７７２の間のヒスチジン挿入（配列番号４６、配列番号７のポリペプチドをコードする。））、単一の患者中にＥＧＦｒのエキソン２１中の１つの変異（Ｑ８４９Ｒ（配列番号４７、配列番号１０のポリペプチドをコードする。））並びに２つの異なる患者中のＥＧＦｒのエキソン２３中の２つの異なる変異（Ｖ９４８Ａ（配列番号４８、配列番号１３のポリペプチドをコードする。）及びＦ９１０Ｌ（配列番号４９、配列番号１２のポリペプチドをコードする。））。ＮＳＣＬＣ患者試料中のＰＩ３Ｋエキソンの分析によって、７人の異なる患者中に観察されたＰＩ３Ｋのエキソン９中に単一の変異（Ｅ５４５Ａ（配列番号５０、配列番号１６のポリペプチドをコードする。）を同定し、ＰＩ３Ｋのエキソン２０中には変異を同定しなかった。Ｂ−Ｒａｆエキソン１５の分析も、２人の異なる患者中に単一の変異（Ｖ６００Ｅ（配列番号５１、配列番号１９のポリペプチドをコードする。））を同定した。
【０２３２】
これに対して、ＣＲＣ患者の腫瘍試料の変異分析は、２０人のＣＲＣ患者中にはＥＧＦｒの変異を一切同定しなかった（図２）。２０人の患者のうち１３人が、ＮＳＣＬＣ患者試料中に以前に同定されたＰＩ３Ｋのエキソン９中に同一のＥ５４５Ａ変異（配列番号５０、配列番号１６のポリペプチドをコードする。）を有していた。さらに、このエキソン中に、３人の他の患者中に変異Ｅ５４２Ｋ（配列番号５３、配列番号１５のポリペプチドをコードする。））が同定された。単一の患者において、ＰＩ３Ｋのエキソン２０中に１つの変異（Ｈ１０４７Ｌ（配列番号５４、配列番号１７のポリペプチドをコードする。））が同定された。
【０２３３】
このように、１２の異なるＥＧＦｒ変異、１つのＰＩ３Ｋ変異及び１つのＢ−Ｒａｆ変異がＮＳＣＬＣ患者の腫瘍試料中に同定された一方で、ＣＲＣ患者の腫瘍試料中には、３つのＰＩ３Ｋ変異が同定され、ＥＧＦｒ変異は同定されなかった。
【実施例２】
【０２３４】
拡張された非小細胞肺癌腫変異分析
３９人のさらなるＮＳＣＬＣ患者腫瘍試料の拡張された変異研究を行った。化学療法及び／又はパニツムマブによる患者の治療の前に、化学療法治療単独（カルボプラチン／パクリタキセル）と、ヒト抗ＥＧＦｒ抗体（Ａｍｇｅｎ）であるパニツムマブと組み合わされた化学療法治療とを比較する第一次ＮＳＣＬＣ試験に参加した３９人の患者から得た二重盲検腫瘍試料を得た。実施例１に記載されている同一のＤＮＡ単離、増幅、サブクローニング及び分析操作を用いて、変異の存在について、ＥＧＦｒエキソン１８、１９、２０、２１及び２３並びにＢ−Ｒａｆエキソン１１及び１５を分析した。３９個の試料が表３に詳述されており、これらの試料の分析の結果は図３に示されている。
【０２３５】
【表３】
2008535477.tif 000004
2008535477.tif 000005
【０２３６】
分析の結果は、ＥＧＦｒエキソン２０又は２３中に変異を同定しなかった。４つの異なる患者試料中のＥＧＦｒエキソン１８（Ｌ６８８Ｐ（配列番号４１、配列番号２のポリペプチドをコードする。））中に、単一の変異が同定された。単一の患者試料中に、ＥＧＦｒエキソン１９中の単一の１５塩基対欠失（配列番号４２、配列番号４のポリペプチドをコードする。）が同定された。それぞれ２人の異なる患者において、ＥＧＦｒエキソン２１（Ｌ８５８Ｒ（配列番号６１、配列番号１１のポリペプチドをコードする。）及びＬ８２８停止（配列番号５６、配列番号９のポリペプチドをコードする。））中に、２つの変異が同定された。Ｂ−Ｒａｆエキソン１１中には変異が同定されなかった。単一の患者試料中において、Ｂ−Ｒａｆのエキソン１５中に１つの変異Ｋ６０１Ｅ（配列番号５７、配列番号２０のポリペプチドをコードする。））が同定された。観察された変異のうち、２つが、実施例１において既に同定されており（ＥＧＦｒエキソン１８中のＬ６８８Ｐ及びＥＧＦｒエキソン１９中の１５塩基対の欠失）、３つが新たに同定された（ＥＧＦエキソン２１中のＬ８５８Ｒ及びＬ８２８停止並びにＢ−Ｒａｆエキソン１５中のＫ６０１Ｅ）。ＥＧＦｒ遺伝子中の合計９つの確認された変異が８人のＮＳＣＬＣ患者試料中に同定され、Ｂ−Ｒａｆ遺伝子中の１つの確認された変異が１人のＮＳＣＬＣ患者中に同定された。
【実施例３】
【０２３７】
変異体ＥＧＦｒポリペプチドの自己リン酸化能の分析
典型的には、ＥＧＦｒは、ＥＧＦ又はＴＧＦ−αなどのリガンドへの結合時に、内部移行への前駆体として自己リン酸化現象を経験する。従って、インビトロでのＥＧＦ誘導性ＥＧＦｒリン酸化の阻害を測定するために、実施例２で同定された特定のＥＧＦｒ変異体ポリペプチドを研究した。
【０２３８】
野生型（配列番号１）又は変異されたＥＧＦｒポリペプチドを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株が構築された。各株からの細胞を播種し、ＥＧＦでの刺激前に、パニツムマブ又はゲフィチニブ（ＩｒｅｓｓａＴＭ、４−キナゾリンアミン、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−４−（モルホリン）プロポキシ］、小分子キナーゼ阻害剤）の何れか０〜２μＭで処理した。ＥＧＦ誘導性自己リン酸化に対するＩＣ５０は、ゲフィチニブ及びパニツムマブ処理された試料に対して計算された（表４）。野生型ＥＧＦｒ及びＴ７９０Ｍ変異体ＥＧＦｒポリペプチドに対する生の電気泳動データが図４に示されている。
【０２３９】
【表４】
2008535477.tif 000006
【０２４０】
表４に示されているように、野生型ＥＧＦｒ及び１５塩基対の欠失及びＬ８５８Ｒ  ＥＧＦｒ変異体に対して、低濃度のＥＧＦｒ自己リン酸化を抑制する上で、ゲフィチニブ及びパナツムマブの両方が有効であった。しかしながら、ゲフィチニブ（ＩＣ５０＞２０００ｎＭ）によって、Ｔ７９０Ｍ変異体ＥＧＦｒポリペプチドの自己リン酸化は阻害されなかったが、パニツムマブ（０．２３ｎＭのＩＣ５０）によって効果的に阻害された。従って、パニツムマブは、ＥＧＦｒエキソン２０中にＴ７９０Ｍ変異を有するＮＳＣＬＣ患者に対して、ゲフィチニブより有効な処置であり得る。
【実施例４】
【０２４１】
変異分析のパニツムマブ効果との相関
実施例２の変異分析後、変異が観察された患者について研究の結果を非盲検とした（表５）。腫瘍サイズに基づいて、安定な疾病又は進行性の疾病の改善を特定するためのガイドラインを提供する固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）を用いて、６週毎に、調査者によって臨床データを評価した（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０００，“Ｎｅｗ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｔｏ  Ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ，”  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９２（３）：２０５−２１６を参照）。
【０２４２】
【表５】
2008535477.tif 000007
【０２４３】
結果は、化学療法と組み合わせたパニツムマブが、ＥＧＦｒエキソン２０中のＴ７９０Ｍ変異及びＥＧＦｒエキソン２１中のＬ８５８Ｒ変異を有する患者に対して、少なくとも１２週間、安定な疾病をもたらすことを、示している。化学療法／パニツムマブ併用療法を用いると、ＥＧＦｒエキソン１９中の１５塩基対欠失を有する患者中に部分的な応答が観察された。これに対して、ＥＧＦｒエキソン１９中に同じ１５塩基対欠失を有する患者は、化学療法処置のみで、安定な疾病を達成するに過ぎなかった。
【０２４４】
最近の研究は、ＥＧＦｒチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブ（ＩｒｅｓｓａＴＭ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）及びエルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリナミン）に対して感受性を示す、ＮＳＣＬＣ由来の腫瘍中に幾つかのＥＧＦｒ変異を同定した。Ｌｙｎｃｈら（２００４，“Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ，”  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５０（２１）：２１２９−３９）は、以下のＥＧＦｒ変異：アミノ酸７４６−７５３領域中の欠失、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ及びＧ７１９Ｃが、ゲフィチニブによる処理に対する、ＮＳＣＬＣ患者腫瘍の感受性と関連することを見出した。Ｐａｅｚら（２００４，“ＥＧＦＲ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７−１５００）は、Ｌｙｎｃｈらと同様の知見を有し、ＥＧＦｒ変異Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｓ及びアミノ酸７４６と７５９の間の様々な欠失変異を有する腫瘍を、ゲフィチニブによる治療に対して感受性があると同定した。Ｐａｏら２００４（“ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｆｒｏｍ“ｎｅｖｅｒ  ｓｍｏｋｅｒｓ”  ａｎｄ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ａｎｄ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ，”Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３６）：１３３０６−１３３１１）は、類似のＥＧＦｒ変異（Ｅ７４６−Ａ７５０欠失、Ｌ７４７−Ｓ７５２欠失、Ｌ８５８Ｒ及びＲ７７６Ｃ／Ｌ８５８Ｒ）がゲフィチニブ又はエルロチニブによる治療に対するＮＳＣＬＣ腫瘍の感受性と関連することを見出した。
【０２４５】
これらの研究と同様、実施例１及び２に論述されている研究も、ＮＳＣＬＣ腫瘍を伴うＥＧＦｒ変異として、エキソン１９中の１５塩基対欠失変異体及びエキソン２１中のＬ８５８Ｒを同定した。非盲検化された患者の転帰が利用可能なデータのうち、これらの２つの変異又はＴ７９０Ｍの何れかを含有する腫瘍は、化学療法と組み合わせたパニツムマブによって阻害された。しかしながら、Ｔ７９０Ｍ変異は、ゲフィチニブ／エルロチニブ実験において以前に同定されなかった。インビトロ研究は、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦｒ変異体の自己リン酸化はパニツムマブの極めて低濃度で効果的に阻害されるのに対して、ゲフィチニブはこの変異体ＥＧＦｒの自己リン酸化の効果的阻害剤ではないことを示す。従って、パニツムマブ併用療法は、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦｒ変異体に対する効果的な治療であり得るが、ゲフィチニブは効果的な治療ではあり得ない。
【０２４６】
他の実施形態は、明細書の検討及び本明細書に開示されている本発明の実施から当業者に自明である。明細書及び実施例は、典型的なものに過ぎないと考えられ、本発明の真の範囲及び精神は、以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。
【０２４７】
パニツムマブ第２相ＮＳＣＬＣ臨床試験から得られたＥＧＦｒ体細胞遺伝子変異の同定及び前臨床性質決定：パニツムマブ感受性及びゲフィチニブ耐性を有する新規変異の発見
Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｄ，１＊  Ｊｕａｎ  Ｔ，１＊  Ｓａｒｏｓｉ  Ｉ，１  Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｊ，２  Ｓａｎｄｌｅｒ  Ａ，３  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｊ，４  Ｐｒａｇｅｒ  Ｄ，５  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ，３  Ｊｅｒｉａｎ  Ｓ，１  Ｒａｄｉｎｓｋｙ  Ｒ１（＊これらの著者は同等に寄稿した。），
１Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ；２Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ；３  Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ−ｌｎｇｒａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ；４Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；５ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ
背景：ＥＧＦｒチロシンキナーゼ阻害剤とモノクローナル抗体間の異なる機序を理解することは、ＥＧＦｒ経路及び臨床的な有益性をもたらすと思われる治療法に対する洞察を導き得る。完全なヒトモノクローナル抗体であり、ＥＧＦｒ細胞外ドメインに対して誘導されたパニツムマブは、現在、化学療法（カルボプラチン／パクリタキセル）と化学療法＋パニツムマブを比較する第一次ＮＳＣＬＣ試験において研究されている（ｎ＝１７５；主要評価項目＝無増悪期間）。ＥＧＦｒ遺伝子変異について、６０人の患者を評価した。本研究の目的は、パニツムマブが、ゲフィチニブに比べて、新規ＥＧＦｒ変異に対して異なる活性を有するかどうかを決定することであった。
【０２４８】
方法：切開されたＦＦＰＥ腫瘍切片（前処理）からゲノムＤＮＡを単離した。ＥＧＦｒ遺伝子エキソン１８、１９、２０、２１及び２３に対してＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をプールし、サブクローニングし、エキソン当り３０を超えるコロニーの配列を決定し、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分離した。その後のＰＣＲ及びゲノムＤＮＡ配列決定によって、変異の存在が確認された。これらのデータは、臨床結果データ（調査者は、６週ごとに、ＲＥＣＩＳＴによって評価した。）に関連付けられた。インビトロでのＥＧＦ誘導性ＥＧＦｒ自己リン酸化の阻害を測定するために、ＷＴ及び変異体ＥＧＦｒを過剰発現しているＣＨＯ細胞を、ＥＧＦ刺激の前に、パニツムマブ又はゲフィチニブの何れか０−２μＭで処理した。
【０２４９】
結果：６０人のＮＳＣＬＣ患者が、８人の患者中に５つの異なる体細胞ＥＧＦｒ遺伝子変異を示した。
【０２５０】
【表６】
2008535477.tif 000008
＊ＰＲ＝部分的応答、ＳＤ＝安定な疾病、ＰＤ＝進行性の疾病
【０２５１】
ＥＧＦｒ野生型、エキソン１９欠失、エキソン２１点変異及び新規エキソン２０変異のＥＧＦ誘導性自己リン酸化に対するＩＣ５０は、ゲフィチニブで前処理された細胞については、１４．６、１．４、３．２及び＞２０００ｎＭであり、パニツムマブで前処理された細胞については、０．２３、０．１７、０．１８及び０．２３ｎＭであった。
【０２５２】
結論：８人の患者が、ＥＧＦｒ体細胞遺伝子変異を有していた。ＥＧＦｒを過剰発現しているＣＨＯ細胞において、パニツムマブは、変異の状態に関わらず、ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲ自己リン酸化を阻害した。エキソン２０中の新規ＥＧＦｒ変異は、パニツムマブに対するインビトロ感受性、ゲフィチニブに対する耐性及びパニツムマブ＋化学療法での治療に応答して、２サイクルにわたり（約１２週間）、安定な疾病を経験した患者での臨床的有益性を伴う。
【０２５３】
パニツムマブ＋パクリタキセル及びカルボプラチン又は化学療法のみで治療されたＮＳＣＬＣ患者中のＥＧＦｒ遺伝子変異の分析
Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｄ，１＊  Ｊｕａｎ  Ｔ，１＊  Ｓａｒｏｓｉ  Ｉ，１  Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｊ，２  Ｓａｎｄｌｅｒ  Ａ，３  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｊ，４  Ｐｒａｇｅｒ  Ｄ，５  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ，３  Ｍｏｓｓ  Ｓ，１  Ｒａｄｉｎｓｋｙ  Ｒ１（＊これらの著者は同等に寄稿した。）、
１Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ；２Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ；３  Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ−ｌｎｇｒａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ；４Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ；５ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ
背景：パニツムマブは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）に対して誘導された完全なヒトモノクローナル抗体である。最近のデータは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の部分集団において、ＥＧＦｒキナーゼドメイン中の体細胞遺伝子変異が小分子チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を伴うことを示唆している。パニツムマブ処理に対する患者の転帰とのＥＧＦｒ遺伝子変異の関連性が存在すれば、これを決定するために、パクリタキセルとカルボプラチン（化学療法）とパニツムマブ＋化学療法の有効性と安全性を比較する無作為化された第２相研究に登録した６０人のＮＳＣＬＣ患者の腫瘍中に、ＥＧＦｒ遺伝子を配列決定した。適格な患者は、段階ＩＩＩｂ／ＩＶ疾病及び免疫組織化学によって示されたところにより、腫瘍細胞の１０％超に１＋、２＋又は３＋のＥＧＦ発現を有する腫瘍を有していた。腫瘍応答は、ＲＥＣＩＳＴ基準を用いて、６週毎に、調査者によって評価された。本研究は登録を終え（ｎ＝１７５）、治療が進行中である。
【０２５４】
方法：ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片の、光学顕微鏡下での解剖により、隣接する正常な組織、壊死片及び間質から腫瘍組織（前処理）を分離した。ゲノムＤＮＡを単離し、ＥＧＦｒ遺伝子のエキソン１８、１９、２０、２１及び２３に対してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をプールし、サブクローニングし、最低３０個のコロニー／エキソン／患者を分析した。その後のＰＣＲ及び精製されたゲノムＤＮＡの配列決定を使用して、変異の存在を確認した。蛍光色素ターミネーター化学を用いてＥＧＦｒの変異分析を行い、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で分割した。
【０２５５】
結果：６０人のＮＳＣＬＣ患者のＤＮＡ配列決定によって、計８人の患者（４人は化学療法治療群から及び４人の患者は化学療法＋パニツムマブ治療群から）中に体細胞ＥＧＦｒ遺伝子変異が明らかとなった。
【０２５６】
【表７】
2008535477.tif 000009
＊ＰＲ＝部分的応答、ＳＤ＝安定な疾病、ＰＤ＝進行性の疾病
【０２５７】
結論：ＥＧＦｒ体細胞遺伝子変異について、６０人のＮＳＣＬＣ患者を評価した。８人の患者がＥＧＦｒ遺伝子変異を有することが明らかとなり、３人の患者はパニツムマブ＋化学療法により、部分的応答又は安定な疾病を有することが観察され、１人の患者はパニツムマブ＋化学療法に対して応答しなかった。４人の患者は、化学療法単独で、部分的応答又は安定な疾病を有することが観察された。６０人の患者の転帰が提示されている。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】図１は、実施例１に記載されている作業に従って、２０人の患者から得られた非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）腫瘍試料の変異分析を示す表である。各腫瘍のゲノムＤＮＡから得られたＥＧＦｒエキソン１８、１９、２０、２１及び２３、ＰＩ３Ｋエキソン９及び２０並びにＢ−Ｒａｆエキソン１５を増幅し、配列決定し、野生型ＥＧＦｒ、ＰＩ３Ｋ又はＢ−Ｒａｆ配列と比較した。
【図２】図２は、実施例１に記載されている作業に従って、２０人の患者から得られた結腸直腸腺癌（「ＣＲＣ」）腫瘍試料の変異分析を示す表である。各腫瘍のゲノムＤＮＡから得られたＥＧＦｒエキソン１８、１９、２０、２１及び２３、ＰＩ３Ｋエキソン９及び２０並びにＢ−Ｒａｆエキソン１５を増幅し、配列決定し、野生型ＥＧＦｒ、ＰＩ３Ｋ又はＢ−Ｒａｆ配列と比較した。
【図３】図３は、実施例２に記載されている作業に従って、３９人の患者から得られたＮＳＣＬＣ腫瘍試料の変異分析を示す表である。各腫瘍のゲノムＤＮＡから得られたＥＧＦｒエキソン１８、１９、２０、２１及び２３並びにＢ−Ｒａｆエキソン１１及び１５を増幅し、配列決定し、野生型ＥＧＦｒ又はＢ−Ｒａｆ配列と比較した。
【図４】図４は、実施例３に記載されている作業に従った、野生型及びＴ７９０Ｍ  ＥＧＦｒ自己リン酸化に対するゲフィチニブ及びパニツムマブの阻害活性の放射性ゲル電気泳動分析を示す。
【図５Ａ】図５は、対応する野生型配列との、特定の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに特定のＰＩ３Ｋポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のアラインメントを示している。
【図５Ｂ】図５は、対応する野生型配列との、特定の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに特定のＰＩ３Ｋポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のアラインメントを示している。
【図５Ｃ】図５は、対応する野生型配列との、特定の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに特定のＰＩ３Ｋポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のアラインメントを示している。
【図５Ｄ】図５は、対応する野生型配列との、特定の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに特定のＰＩ３Ｋポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のアラインメントを示している。
【図５Ｅ】図５は、対応する野生型配列との、特定の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに特定のＰＩ３Ｋポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のアラインメントを示している。
【図５Ｆ】図５は、対応する野生型配列との、特定の変異体ＥＧＦｒポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに特定のＰＩ３Ｋポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のアラインメントを示している。
【図６Ａ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｂ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｃ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｄ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｅ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｆ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｇ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｈ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｉ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｊ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｋ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｌ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｍ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｎ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｏ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｐ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｑ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｒ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｓ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｔ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｕ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｖ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｗ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｘ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｙ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図６Ｚ】図６は、野生型及び変異体ＥＧＦｒ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ａ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ｂ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ｃ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ｄ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ｅ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ｆ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ｇ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図７Ｈ】図７は、野生型及び変異体ＰＩ３Ｋ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図８Ａ】図８は、野生型及び変異体Ｂ−Ｒａｆ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図８Ｂ】図８は、野生型及び変異体Ｂ−Ｒａｆ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図８Ｃ】図８は、野生型及び変異体Ｂ−Ｒａｆ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図８Ｄ】図８は、野生型及び変異体Ｂ−Ｒａｆ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図８Ｅ】図８は、野生型及び変異体Ｂ−Ｒａｆ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図８Ｆ】図８は、野生型及び変異体Ｂ−Ｒａｆ分子に対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
2008535477.tif 000025
【図６Ｇ】
2008535477.tif 000026
【図６Ｈ】
2008535477.tif 000027
【図６Ｉ】
2008535477.tif 000028
【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
2008535477.tif 000030
【図６Ｌ】
2008535477.tif 000031
【図６Ｍ】
2008535477.tif 000032
【図６Ｎ】
2008535477.tif 000033
【図６Ｏ】
2008535477.tif 000034
【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
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【図６Ｔ】
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【図６Ｕ】
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【図６Ｖ】
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【図６Ｗ】
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【図６Ｘ】
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【図６Ｙ】
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【図６Ｚ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2008535477.tif 000049
【図７Ｅ】
2008535477.tif 000050
【図７Ｆ】
2008535477.tif 000051
【図７Ｇ】
2008535477.tif 000052
【図７Ｈ】
2008535477.tif 000053
【図８Ａ】
2008535477.tif 000054
【図８Ｂ】
2008535477.tif 000055
【図８Ｃ】
2008535477.tif 000056
【図８Ｄ】
2008535477.tif 000057
【図８Ｅ】
2008535477.tif 000058
【図８Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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