(57)【要約】【課題】フィーダー細胞を用いずに、無血清培養条件下でｉＰＳ細胞を製造すること、ならびにフィーダー細胞を用いずに、無血清培養条件下でｉＰＳ細胞などの幹細胞の未分化状態および分化多能性を長期間維持できる培養法を提供する。【解決手段】リプログラミング処理を施した体細胞を、好ましくはフィブロネクチンを接着因子として用いて、無血清培地中でフィーダー細胞を用いずに培養することにより人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を誘導することを特徴とするｉＰＳ細胞の製造方法、ならびにフィーダー細胞を用いずに、無血清培地中に腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーに属する蛋白を添加して幹細胞を継代培養することを特徴とする、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リプログラミング処理を施した体細胞を、無血清培地中でフィーダー細胞を用いずに培養することにより人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を誘導することを特徴とするｉＰＳ細胞の製造方法。
【請求項２】
フィブロネクチンを接着因子として用いる、請求項１に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
【請求項３】
体細胞のリプログラミング処理が無血清培地中で行われる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リプログラミング前の体細胞が初代培養から無血清培地中で培養されたものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フィブロネクチンを接着因子として含む、ｉＰＳ細胞を誘導するための無血清培養基材（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
【請求項７】
無血清培地成分およびフィブロネクチンを構成成分として含む、ｉＰＳ細胞を誘導するための無血清培養基材を製造するためのキット（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
【請求項８】
フィーダー細胞を用いずに、無血清培地中に腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーに属する蛋白を添加して幹細胞を継代培養することを特徴とする、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持する方法。
【請求項９】
継代培養が、フィブロネクチンを接着因子として用いて行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞がｉＰＳ細胞である請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により得られたｉＰＳ細胞を、ＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白を添加した無血清培地において、フィーダー細胞を用いずに継代培養することを特徴とする、ｉＰＳ細胞の未分化状態および分化多能性を維持する方法。
【請求項１２】
ＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白を含む、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持するための継代培養用無血清培養基材（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
【請求項１３】
さらにフィブロネクチンを接着因子として含む請求項１０に記載の培養基材。
【請求項１４】
幹細胞がｉＰＳ細胞である請求項１２または１３に記載の培養基材。
【請求項１５】
無血清培地成分およびＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含む、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持するための継代培養用無血清培養基材を製造するためのキット（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
【請求項１６】
さらにフィブロネクチンを接着因子として含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
幹細胞がｉＰＳ細胞である請求項１５または１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の樹立方法ならびに幹細胞の未分化状態および分化多能性の長期維持方法に関する。詳細には、本発明は、フィーダー細胞を用いずに、無血清培養条件下でｉＰＳ細胞を誘導する方法、ならびに培地中に腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を添加して幹細胞を継代培養することを特徴とする、幹細胞の未分化状態および分化多能性の長期維持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、発生生物学や再生医学研究、創薬・疾患研究の分野において、胚性幹細胞（embryonic stem cell : 以下ＥＳ細胞という）や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell :以下 ｉＰＳ細胞という）が注目されている。幹細胞は自己複製能と多分化能を有する細胞であり、様々な細胞系列へと分化する能力を持つ。２００６年に京都大学の山中らがマウスｉＰＳ細胞の樹立を報告して以来、受精卵を用いるという倫理問題の残るＥＳ細胞の代替手段として、大きな注目を浴びている。ｉＰＳ細胞は誘導多能性幹細胞とも訳され、皮膚などの最終分化した細胞に、ウイルスやプラスミドベクター等を用いて初期化遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）を導入し、リプログラムさせることで、胚体外組織を除く、全ての細胞種への分化可能な万能細胞となる。
【０００３】
これら幹細胞は一般的に、血清あるいは動物由来成分を含む代替血清添加培地を用い、不活性化したマウス胎児線維芽細胞（Mouse Embryonic Fibroblast : ＭＥＦ）といったフィーダー細胞をディッシュ上に増やし、それを支持細胞として培養されている。ｉＰＳ細胞の継代前日までに、ＭＥＦ細胞にあらかじめマイトマイシンＣ処理やγ線照射などを行い、増殖を抑えた（不活化した）フィーダー細胞を調整後、ゼラチンコートディッシュ上に播種し、フィーダー細胞がディッシュ上に十分接着伸展したのち、その上に、ｉＰＳ細胞を播種し、共培養を行う。また、継代の際にはできるだけフィーダー細胞とＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞を分離する必要がある。このように、幹細胞を培養するだけでなく、フィーダー細胞の調整も必要なため、大変煩雑な操作が必要である。また、ｉＰＳ細胞に誘導される前の体性分化細胞（体細胞）も牛胎児血清、ヒト血清やヒト自己血清が添加された培地で培養されている。さらに、このような培養条件では、血清あるいは動物由来成分を含む代替血清中の未知の成分の存在や、病原体混入の可能性もあり、ロット差が大きく、常に一定条件での培養は難しい。また、用いるフィーダー細胞も、種類や処理の仕方、ロット差も大きく、幹細胞の状態がかなり左右されるため、安定した条件で幹細胞を培養することは不可能であった。
【０００４】
このように不定要素が多い条件で培養された幹細胞では、培地中に未知の因子が多く含まれるため、組織・臓器発生や再生などの、基礎研究の標準化が困難で、未分化性の維持に必要な増殖因子・分化誘導因子の機能を比較検討する事が難しい。また培地中に含まれる様々な成分の作用により、特定の細胞への分化誘導が難しく、さらには再生医療への臨床応用を考慮すると、未知因子や病原体などの危険因子の混入など安全性が問題となる。そこで、これらの要素を排除するため、組成の明らかな培養条件による培養法の標準化が必要である。特に、組成の明らかな無血清培地を用いるｉＰＳ細胞の製造方法の開発が望まれていた。
【０００５】
さらに、未分化状態および分化多能性を長期間にわたり保持したままｉＰＳ細胞などの幹細胞を継代・維持することも望まれていた。この点において、霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持するための培地組成について検討されている（特許文献１参照）。さらに、ｉＰＳ細胞の未分化性を維持するために腫瘍（トランスフォーミング）増殖因子（ＴＧＦ）を培地に添加することも行われている（非特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１で用いられている無血清培地はＴＧＦを含んでおらず、非特許文献１で用いられているのは血清含有培地であり、本発明とは異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５４２２４７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Guokai Chen et al. Nature Methods, 2011 May; 8(5): 424-429
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血清含有培地のような不定要素が多い条件で培養された幹細胞では、培地中に未知の因子が多く含まれるため、組織・臓器発生や再生などの、基礎研究の標準化が困難で、未分化性の維持に必要な増殖因子・分化誘導因子の機能を比較検討することが難しい。また培地中に含まれる様々な成分の作用により、特定の細胞への分化誘導が難しく、さらには再生医療への臨床応用を考慮すると、安全面から未知因子や病原体などの危険因子を排除する必要がある。そこで、これらの問題を解消するためには、組成が明らかで、危険因子を含まない培地を用いる培養法の確立および標準化が必要である。
【０００９】
したがって、本発明が解決すべき具体的課題は、不確定要素および危険因子を含まない条件でｉＰＳ細胞への誘導前の体細胞を培養し、かつ不確定要素および危険因子を含まない条件でｉＰＳ細胞を製造すること、さらにｉＰＳ細胞などの幹細胞を培養維持することであった。具体的には、本発明が解決すべき具体的課題は、体細胞を無血清培養条件下で培養し、フィーダー細胞を用いずに、無血清培養条件下でｉＰＳ細胞を製造すること、ならびにフィーダー細胞を用いずに、無血清培養条件下でｉＰＳ細胞などの幹細胞の未分化性および分化多能性を長期間維持できる培養法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ｉＰＳ細胞への誘導前の体細胞の無血清培養方法、および無血清培地中でフィーダー細胞を用いずに培養することによるｉＰＳ細胞の樹立方法を確立した。特に、フィブロネクチンを接着因子として用いることが好ましいことが判明した。本発明の方法によれば、ヒトｉＰＳ細胞の誘導効率は、従来法（血清添加培養条件）に比べて１０倍以上となった。また本発明者らは、上記培養系において幹細胞の未分化性と多分化能を長期間継代後も維持可能とする細胞増殖因子としてＴＧＦ−βを同定した。これらのことに基づいて本発明が完成された。
【００１１】
したがって、本発明は、下記のものを提供する：
（１）リプログラミング処理を施した体細胞を、無血清培地中でフィーダー細胞を用いずに培養することにより人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を誘導することを特徴とする、ｉＰＳ細胞の製造方法。
（２）フィブロネクチンを接着因子として用いる、（１）に記載の方法。
（３）体細胞のリプログラミング処理が無血清培地中で行われる、（１）または（２）に記載の方法。
（４）リプログラミング前の体細胞が初代培養から無血清培地中で培養されたものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）フィブロネクチンを接着因子として含む、ｉＰＳ細胞を誘導するための無血清培養基材（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
（７）無血清培地成分およびフィブロネクチンを構成成分として含む、ｉＰＳ細胞を誘導するための無血清培養基材を製造するためのキット（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
（８）フィーダー細胞を用いずに、無血清培地中に腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーに属する蛋白を添加して幹細胞を継代培養することを特徴とする、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持する方法。
（９）継代培養が、フィブロネクチンを接着因子として用いて行われる（８）に記載の方法。
（１０）幹細胞がｉＰＳ細胞である（８）または（９）に記載の方法。
（１１）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法により得られたｉＰＳ細胞を、ＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白を添加した無血清培地において、フィーダー細胞を用いずに継代培養することを特徴とする、ｉＰＳ細胞の未分化状態および分化多能性を維持する方法。
（１２）ＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白を含む、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持するための継代培養用無血清培養基材（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
（１３）さらにフィブロネクチンを接着因子として含む、（１２）に記載の培養基材。
（１４）幹細胞がｉＰＳ細胞である（１２）または（１３）に記載の培養基材。
（１５）無血清培地成分およびＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含む、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持するための継代培養用無血清培養基材を製造するためのキット（ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない）。
（１６）さらにフィブロネクチンを接着因子として含む、（１５）に記載のキット。
（１７）幹細胞がｉＰＳ細胞である（１５）または（１６）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、成分の明らかな無血清培地を用いて体細胞を培養し、フィーダー細胞を用いずに、成分の明らかな無血清培地を用いた培養環境下で、体細胞に山中４因子などの遺伝子導入および誘導を行い、ｉＰＳ細胞を製造する方法、ならびにＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞を、未分化状態および分化多能性を保持したまま維持・培養可能な培養基質材および培養液を用いた幹細胞の培養方法が提供される。本発明のｉＰＳ細胞の製造方法によれば、血清含有培地を用いる従来法に比べて１０倍以上の効率でｉＰＳ細胞を誘導できることがわかった。
【００１３】
したがって、本発明において高い効率でｉＰＳ細胞を誘導することができる。そして長期間にわたって幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持することができる。しかも培地中には未知の因子が殆ど存在せず、組織・臓器発生や再生などの、基礎研究の標準化が容易で、未分化性の維持に必要な増殖因子・分化誘導因子の機能を比較検討することも容易である。また本発明においては、培地中に含まれる成分の種類が比較的少なく既知であるから、特定の細胞への分化誘導が容易であり、再生医療への臨床応用を考慮すると安全性が高い細胞が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、無血清培地ｈＥＳＦ９を用いて各種細胞外マトリックス上で誘導したＴＩＧ−３細胞由来ｈｉＰＳ細胞の形態を示す顕微鏡像である。  図１Ａは、無血清培地を用いてヒトｉＰＳ細胞を誘導する際の接着因子の影響を検討した結果を示す。  図１Ｂは、無血清培地ｈＥＳＦ９を用いて、各細胞外マトリックス上に播種２日後のヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳ細胞）形態を示す。  図１Ｃは、各細胞外マトリックス上のｈｉＰＳ細胞のＡＬＰ染色像（感染３６日後）である。図１Ａ〜Ｃのスケールバーは２００μｍである。
【図２】図２は、誘導後の各種細胞外マトリックス上での細胞形態を示す顕微鏡像である。  上段は、各種細胞外マトリックス上にて誘導したＴＩＧ−３細胞由来ヒトｉＰＳ細胞のコロニー回収前の細胞形態像である。  下段は、無血清培地ｈＥＳＦ９を用いて、各細胞外マトリックス上に播種後の細胞形態像である。スケールバーは２００μｍである。
【図３】図３は、ウイルス感染成立時における無血清培養条件の検討結果を示す顕微鏡像およびウイルス感染効率を示すグラフである。ＥＧＦＰを用いたＰＬＡＴ−ＡへのトランスフェクションおよびＴＩＧ−３細胞への感染結果を示す。  上段は、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを加えた血清培養条件（左）あるいはｈＥＳＦ９無血清培養条件（右）の各条件にてｐＭＸｓ−（ＥＧＦＰ）遺伝子導入した２日後の細胞形態を示す。  下段は、ＴＩＧ−３細胞へのウイルス感染効率を示す。スケールバーは２００μｍである。
【図４】図４は、フィーダー細胞を用いない無血清培養条件下での、歯髄由来細胞を用いたｈｉＰＳ細胞の誘導を示すスキームおよび顕微鏡像である。  図４Ａは、ｈｉＰＳ細胞誘導までの概略を示すスキームである。  Ｄａｙ  −７〜０  ：無血清培地ＲＤ６Ｆを用いたタイプＩコラーゲンコートディッシュ上での歯髄細胞の初代培養。  Ｄａｙ  ０〜４：無血清培地ｈＥＳＦ９を使用した、レトロウイルス感染による初期化遺伝子導入（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，ＫＬＦ−４，ｃ−Ｍｙｃ）。  Ｄａｙ  ５：  無血清培地ｈＥＳＦ９培地を用いたフィブロネクチンコートディッシュ上でのヒトｉＰＳ細胞誘導。  Ｄａｙ６〜３０：  隔日での培地交換。  図４Ｂは、初期化遺伝子導入前の無血清培地ＲＤ６Ｆでの歯髄細胞の位相差顕微鏡像である。  図４Ｃは、無血清培地ＲＤ６Ｆを用いてタイプＩコラーゲンコートディッシュ上で４継代した歯髄細胞の位相差顕微鏡像である。図４Ｄは、感染４３日後のＡＬＰ染色像である。スケールバーは２００μｍである。
【図５】図５は、フィーダー細胞を用いないで、無血清培地ｈＥＳＦ９を用いた培養条件下で歯髄由来細胞から誘導したヒトｉＰＳ細胞の特性を解析した結果を示す。  図５Ａは、無血清培地ｈＥＳＦ９あるいはｈＥＳＦ９Ｔ培地(ｈＥＳＦ９にＴＧＦ−β１を加えた無血清培地)で維持したヒトｉＰＳ細胞の位相差像である。  ＤＰ−Ａ−ｉＰＳ−ＣＬ１：無血清培地ｈＥＳＦ９を使用し、フィブロネクチンコートディッシュ上で２代（passage 2）あるいは２１代維持（passage 21）した細胞の位相差像。なお、右側はヒトＥＳ細胞用血清添加培地を使用しフィーダー細胞上で５代維持（passage 5）した細胞の位相差像を示す。  ＤＰ−Ｆ−ｉＰＳ−ＣＬ４、−ＣＬ６、−ＣＬ１６：無血清培地ｈＥＳＦ９Ｔを使用し、フィブロネクチンコートディッシュ上で５８代（passage 58）、５９代（passage 59）あるいは２１代維持（passage 21）した細胞の位相差像。なお、右側はヒトＥＳ細胞用血清添加培地を使用し、フィーダー細胞上で１９代維持（passage 19）した細胞（ＣＬ３１）の位相差像を示す。  スケールバーは２００μｍである。  図５Ｂは、無血清培地ｈＥＳＦ９あるいはｈＥＳＦ９Ｔを用いてフィブロネクチンコートディッシュ上で長期継代・維持した細胞を用いて、未分化マーカーであるＯｃｔ３／４およびＳＳＥＡ−４に対する各抗体を用いてフローサイトメトリーによる解析を行った結果を示す。  図５Ｃは、網羅的遺伝子発現解析結果を示す。マイクロアレイを用いたクラスター解析を行った。ＤＰ  ｃｅｌｌ（歯髄細胞）、無血清培地ｈＥＳＦ９あるいはｈＥＳＦ９Ｔを使用しフィブロネクチンコートディッシュ上で維持したＤＰ−ｉＰＳ細胞（歯髄細胞由来ヒトｉＰＳ細胞）、ヒトＥＳ細胞用血清添加培地を用いてフィーダー細胞上で維持したヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ）について解析を行った。図中のレーン１〜７は以下のとおり。1. DP cell (DP-A) : passage 2  = before infection  2. DP cell (DP-F) : passage 4  = before infection 3. DP-A-iPS-CL1: passage 14  = serum-free condition (hESF9/on FN)4. DP-F-iPS-CL12: passage 36 = KSR-based condition (KSR/on MEF)5. DP-F-iPS-CL6: passage 37  = serum-free condition (hESF9T/on FN)6. DP-F-iPS-CL8: passage 35  = serum-free condition (hESF9T/on FN)7. Tic (hiPSC : JCRB1331): passage 58 = KSR-based condition (KSR/on MEF)
【図６】図６は、網羅的遺伝子発現解析（scatter plot解析）の結果を示す。
【図７】図７は、無血清培養条件におけるＴＧＦ−β１の影響を調べた結果を示す。  図７Ａは、各種濃度のＴＧＦ−β１（０，０．１，１，２，５，１０ｎｇ／ｍｌ）添加時の細胞形態を示す。  図７Ｂは、Droplet Digital-PCRを用いたＴＧＦ−β１添加時におけるヒトｉＰＳ細胞の遺伝子発現解析の結果を示す。各発現強度はＧＡＰＤＨにて補正した。  図７Ｃは、無血清培養条件下にて誘導・維持したヒトｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子発現解析の結果を示す。#1 : DP cell (DP-A) : passage 2  = before infection  #2 : DP cell (DP-F) : passage 4  = before infection #3 : DP-A-iPS-CL1: passage 14  = serum-free condition (hESF9/on FN)#4 : DP-F-iPS-CL4: passage 37  = serum-free condition (hESF9T/on FN)#5 : DP-F-iPS-CL6: passage 35  = serum-free condition (hESF9T/on FN)#6 : DP-F-iPS-CL8: passage 35  = serum-free condition (hESF9T/on FN)#7 : DP-A-iPS-CL1: passage 8 = KSR-based condition (KSR/on MEF)#8 : DP-F-iPS-CL12: passage 36 = KSR-based condition (KSR/on MEF) #9 : Tic (hiPSC : JCRB1331): passage 103 = KSR-based condition (KSR/on MEF)  図７Ｄは、無血清培養条件下にて誘導し、ｈＥＳＦ９Ｔ培地にて継代・維持したヒトｉＰＳ細胞の未分化マーカー蛋白の発現解析の結果を示す。  スケールバーは１００μｍである。
【図８】図８は、無血清培養条件下にて誘導・維持したヒトｉＰＳ細胞の分化多能性解析の結果を示す。  図８Ａは各種分化マーカー発現の検討結果を示す。  図８Ｂはテラトーマ形成能の検討結果を示す。  スケールバーは１００μｍである。
【図９】図９は、細胞増殖能および核型解析の結果を示す。  図９Ａは、無血清培養条件にて誘導し、ｈＥＳＦ９Ｔにて２１代継代・維持したヒトｉＰＳ細胞の細胞倍加時間（population doubling time）を調べた結果を示す。  図９Ｂは、無血清培養条件にて誘導し、無血清培地ｈＥＳＦ９Ｔにて２０代継代維持したヒトｉＰＳ細胞の核型簡易解析を行った結果を示す。
【図１０】図１０は、無血清培養条件を用いたヒトｉＰＳ細胞の継代・維持における普遍性の検討結果を示す。スケールバーは２００μｍである。図１０上段はｈＥＳＦ９Ｔ培地を用いてフィブロネクチン上で維持したヒトｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡像を示す。また下段はＤＦ８Ｔ培地を用いてフィブロネクチン上で維持したヒトｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡像を示す。両無血清培地においてもヒトＥＳ細胞様の形態を維持していることが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、第１の態様において、リプログラミング処理を施した体細胞を、無血清培地中でフィーダー細胞を用いずに培養することにより人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を誘導することを特徴とする、ｉＰＳ細胞の製造方法を提供する。なお、ｉＰＳ細胞とは、以下に説明するように、体細胞に複数の遺伝子を導入してリプログラミングを行い、分化多能性と自己複製能を持たせた細胞をいう。本発明において、ｉＰＳ細胞はあらゆる動物の体細胞に由来するものであってよく、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等の体細胞に由来するｉＰＳ細胞が例示されるが、これらのものに限定されない。
【００１６】
リプログラミングとは、分化した体細胞を脱分化させて未分化な細胞に変化させることであり、初期化ともいわれる。リプログラミング処理によって分化細胞がｉＰＳ細胞になる。一般的には、４種の遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ（またはＬ−Ｍｙｃ））、あるいはこれらにいくつかの遺伝子（例えばＮａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）を加えたものを分化細胞に導入することによってリプログラミング処理が行われる。遺伝子の導入にはベクターを使用することが一般的であり、例えばレトロウイルスベクターなどが用いられる。リプログラミング処理は上記の方法に限定されず、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。リプログラミング処理を行う培地は特に限定されないが、本発明においては無血清培地中でリプログラミング処理を行うことが好ましい。
【００１７】
本発明の特徴は、リプログラミング処理を施した体細胞を、無血清培地中で培養することによりｉＰＳ細胞を誘導することである。無血清培地を用いることで、培地中に不確定要素や未知因子あるいは危険因子が存在する懸念が払拭され、様々な解析を再現性よく、容易に行うことができる。また、無血清培地を用いることで、血清含有培地に由来する有害因子を排除できるので、得られるｉＰＳ細胞の安全性が確保される。
【００１８】
また、継代の際にｉＰＳ細胞とフィーダー細胞を分離することが必要であり操作が煩雑になること、フィーダー細胞に由来する様々な因子が培養に影響すること、フィーダー細胞自体のばらつきが大きくｉＰＳ細胞誘導の再現性が良くないことなどの問題も、フィーダー細胞を用いない本発明によって解決される。
【００１９】
無血清培地とは血清を含まない培地をいう。具体的には、無血清培地とは、アミノ酸、無機塩類、ビタミン、微量元素、糖、などを含む基礎培養液に、インスリンや鉄結合蛋白などの既知のホルモンや蛋白因子などの成分の明らかな因子のみ含まれた培地で、細胞の増殖や分化やホルモン分泌能等の機能を生体内と同様に維持することが可能な培地をいう。このような血清を含まない動物細胞培養用の基礎培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ培地、ならびにそれらの混合培地などが知られている。
【００２０】
本発明のｉＰＳ細胞の誘導方法に用いる好ましい無血清培地としては、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ９Ｔ培地、ＲＤ８Ｆ培地、ＤＭＥ／Ｆ１２−８Ｆ培地、ＲＤＦ８Ｆ培地などの培地、ならびにそれらの改変培地が例示される。本発明に用いる無血清培地はこれらの培地に限定されず、当業者は公知の無血清培地から適宜選択して用いることができ、あるいは公知の無血清培地を適宜改変して用いることもできる。
【００２１】
好ましくは、フィーダー細胞不含の無血清培地中でのｉＰＳ細胞の誘導において、フィブロネクチンを接着因子として用いる。フィブロネクチンを接着因子として用いることにより、ｉＰＳ細胞の誘導効率を飛躍的に高めることができ、従来法（血清含有培地中、フィーダー細胞使用）によりｉＰＳ細胞を誘導する場合に比べて、ｉＰＳ細胞誘導効率は約１０倍に上昇する。
【００２２】
フィブロネクチンは当業者に公知の蛋白である。各種生物起源のフィブロネクチンが公知であり、本発明に使用可能である。本発明にて使用されるフィブロネクチンは、細胞から単離されたものであってもよく、組み換え法などの遺伝子工学的方法により製造されたものであってもよい。また、本発明にて使用されるフィブロネクチンは全長のものであってもよく、その断片であってもよい。
【００２３】
リプログラミング処理を施した体細胞を、フィブロネクチンをコートした培養容器に播種し、ｉＰＳ細胞を誘導するために培養を行う。無血清培地以外の培地中でリプログラミング処理を行った場合は、体細胞を当該培地とともにフィブロネクチンをコートした培養容器に播種し、その後、無血清培地に培地交換しながら培養を続け、ｉＰＳ細胞を誘導することができる。無血清培地中でリプログラミング処理を行った場合は、体細胞を当該無血清培地とともにフィブロネクチンをコートした培養容器に播種し、その後、同一または異なる無血清培地に培地交換しながら培養を続け、ｉＰＳ細胞を誘導することができる。播種や培地交換の手法、ｉＰＳ細胞の誘導のための培養条件は当業者に公知である。例えば、培養温度としては３０〜４０℃、好ましくは約３７℃とすることができ、例えば５〜１０％の二酸化炭素を含む空気を満たしたインキュベーター内で培養することができる。
【００２４】
フィブロネクチンを培養容器にコートする方法は当業者に公知である。例えば、ポリ−Ｌ−オルニチンやポリ−Ｌ−リジンで培養容器の表面を処理した後、洗浄し、次いで、フィブロネクチンを含む緩衝液で培養容器の表面を処理することにより、フィブロネクチンを培養容器にコートすることができる。使用するフィブロネクチン量も当業者が容易に定めうる。また、本発明の上記方法において、フィブロネクチン以外の接着因子をフィブロネクチンと併用してもよい。
【００２５】
フィブロネクチンでの培養容器のコート方法は公知である。好ましいコート方法の一例は以下のようなものである。フィブロネクチンを２μｇ／ｃｍ２の濃度で培養容器をコーティングし、３７℃３時間以上、一晩までの時間で静置する。なお、直ちに使用しない場合にはコーティング液が乾かないようにパラフィルムで密封し、４℃で保存し、１週間以内に使用する。使用時は、フィブロネチン溶液を吸引し、ＰＢＳで一度洗浄後、使用する。
【００２６】
本発明のｉＰＳ細胞の製造方法において、リプログラミングされるべき体細胞の継代培養を初代培養から無血清培地中で行い、かつ、体細胞のリプログラミング処理を無血清培地中で行ってもよい。体細胞の継代培養を初代培養から行うことにより、かかる実施態様は本願明細書の実施例に記載されている。体細胞の初代培養および継代培養は、当業者が体細胞の種類に応じて培地組成や培養条件を適宜選択して行うことができる。
【００２７】
本発明は、第２の態様において、フィブロネクチンを接着因子として含む、ｉＰＳ細胞を誘導するための無血清培養基材を提供する。本発明のこの態様の培養基材は、無血清培地およびフィブロネクチンを含む。したがって、本発明のこの態様の培養基材の一具体例はフィブロネクチンを含む無血清培地である。本発明のこの態様の培養基材さらなる具体例は、フィブロネクチンをコートした培養容器およびそれに入った無血清培地を含むものであってもよい。ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない。培養容器の形状は皿、ボトル、チューブ、フラスコ、バッグ等があり、特に限定されない。
【００２８】
本発明は第３の態様において、無血清培地成分およびフィブロネクチンを必須構成成分として含む、ｉＰＳ細胞を誘導するための無血清培養基材を製造するためのキットを提供する。ただし当該培養基材はフィーダー細胞を含まない。
【００２９】
無血清培地としては上で例示したものや、それらを改変したものが挙げられる。その成分も公知であるか、あるいは当業者が適宜選択することができるものである。キットに含まれる無血清培地成分の形態は特に限定されない。例えばそのまま培養容器に移して使用可能な液体であってもよく、濃縮液の形態であってもよく、あるいは粉末のごとき固体であってもよい。キットに含まれる無血清培地成分は、例えばビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類、糖類などに分けてキットに含まれていてもよい。
【００３０】
本発明のキットに含まれるフィブロネクチンの形態も特に限定されない。例えばフィブロネクチンは粉末のごとき固体であってもよく、適切なバッファーを含有するフィブロネクチン水溶液のごとき液体であってもよい。
【００３１】
所望により本発明のキットに培養容器が含まれていてもよい。培養容器はガラス、プラスチック等いずれの材質であってもよい。その形状も皿、ボトル、チューブ、フラスコ、バッグ等があり、特に限定されない。本発明のキットに含まれる培養容器は、予めフィブロネクチンにてコートされていてもよい。
【００３２】
通常は、キットには取扱説明書が添付される。
【００３３】
本発明は第４の態様において、フィーダー細胞を用いずに、無血清培地中に腫瘍（トランスフォーミング）増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの蛋白を添加して幹細胞を継代培養することを特徴とする、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持する方法を提供する。本発明において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白、とりわけＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白を無血清培地に添加することにより、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持しつつ長期間にわたって継代培養することが可能となる。
【００３４】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白は、ＴＧＦ−βファミリー、アクチビンファミリー、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーの蛋白を包含する。本発明において好ましいのはＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白である。ＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白は当業者に公知であり、ＴＧＦ−βは、アクチビンやＢＭＰとファミリーを形成し、現在ヒトにおいて、３３種類のファミリー分子から構成されており、ＴＧＦ−β１、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ、ＢＭＰ−２等が例示される。本発明の上記方法に用いられる特に好ましいＴＧＦ−βに属する蛋白はＴＧＦ−β１である。
【００３５】
本発明のこの態様の方法において、無血清培地中のＴＧＦ−βファミリーの蛋白の濃度は、通常１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌであるが、適宜変更することができる。使用するＴＧＦ−βファミリーの蛋白は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００３６】
ＴＧＦ−βファミリーの蛋白は当業者に公知である。各種生物起源のＴＧＦ−βファミリーの蛋白が公知であり、本発明に使用可能である。本発明にて使用されるＴＧＦ−βファミリーの蛋白は、細胞から単離されたものであってもよく、組み換え法などの遺伝子工学的方法により製造されたものであってもよい。また、本発明にて使用されるＴＧＦ−βファミリーの蛋白は全長のものであってもよく、その断片であってもよい。
【００３７】
本発明の幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持する方法に用いる好ましい無血清培地としては、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ９Ｔ培地、ＲＤ８Ｆ培地、ＤＭＥ／Ｆ１２−８Ｆ培地、ＲＤＦ８Ｆ培地、ＥＳＦ７培地などの培地、ならびにそれらの改変培地が例示される。
【００３８】
本発明の上記方法において、フィブロネクチンを接着因子として用いることが好ましい。培養容器へのフィブロネクチンのコート方法その他フィブロネクチンに関する説明は上記のとおりである。
【００３９】
本発明の上記方法を適用できる幹細胞は特に制限はなく、以下に例示する幹細胞を含めてあらゆる幹細胞が包含される。
【００４０】
幹細胞は、複数系統の細胞に分化できる能力（分化多能性）と、 細胞分裂を経ても分化多能性を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞である。幹細胞には受精卵から作られる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、生体内組織に存在する体性幹細胞、および特定の遺伝子を導入して作成される誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）がある。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞はあらゆる種類の細胞に分化できる性質（全能性）を有する。体性幹細胞の例としては、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞などがある。本発明において、幹細胞はあらゆる動物に由来するものであってよく、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等に由来する幹細胞が例示されるが、これらのものに限定されない。これらの幹細胞の製造、取得方法は当業者に公知であり、研究機関に保存されているもの、市販されているものもある。ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取り出し、これを線維芽細胞のごときフィーダー細胞上で培養することにより樹立することができる。ｉＰＳ細胞の作成法については上述のとおりである。
【００４１】
継代培養は、培養細胞を新たな培養容器へと移し替えて増殖、維持することをいう。幹細胞の継代培養方法は当業者に公知である。一般的には、細胞がコンフルエントになる前に、その一部をトリプシン等の消化酵素を用いて培養容器から剥離させ、新しい培養容器を用いて培養することにより、継代培養を行うことができる。培地成分その他の培養条件の選択、培地交換のタイミング、剥離条件、１代あたりの培養時間など、継代培養の手技、手法については、継代培養すべき細胞に応じて当業者が適宜決定、選択することができる。
【００４２】
本発明の上記方法において、フィーダー細胞を用いずに、無血清培地中にＴＧＦ−βファミリーの蛋白を添加して幹細胞を継代培養することが特徴である。無血清培地の作成、選択は当業者が容易に為すところである。本発明の方法によれば、培地中にＴＧＦ−βファミリーの蛋白を添加することにより、長期間にわたり多数の継代を繰り返した場合であっても、安定して幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持することができる。
【００４３】
幹細胞の未分化状態の確認は、形態観察のほか、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−４などの未分化マーカーの発現を調べることによって行われ得る。幹細胞の未分化状態の確認方法は上記方法に限定されず、当業者に公知の方法にて行うことができる。
【００４４】
幹細胞の分化多能性の確認は、継代、維持されている幹細胞から胚樣体を形成させ、分化誘導を行って、各種分化マーカーの発現を調べることによって行われ得る。幹細胞の分化多能性の確認方法は上記方法に限定されず、当業者に公知の方法にて行うことができる。
【００４５】
本発明のこの態様の一具体例において、本発明のｉＰＳ細胞の製造方法により得られたｉＰＳ細胞を、ＴＧＦ−βファミリーに属する蛋白を添加した無血清培地において、フィーダー細胞を用いずに継代培養することにより、ｉＰＳ細胞の未分化状態および分化多能性を維持することができる。なお、本発明のｉＰＳ細胞の製造方法において、ＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含有する無血清培地を用いてｉＰＳ細胞を誘導すると、誘導効率が低下する場合があるので、ｉＰＳ細胞誘導時にＴＧＦ−βファミリーの蛋白を用いないことが好ましい。
【００４６】
本発明は第５の態様において、ＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含む、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持するための継代培養用無血清培養基材を提供する。本発明のこの態様の培養基材は、ＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含有する無血清培地を含む。したがって、本発明のこの態様の一具体例はＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含有する無血清培地である。ＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含有する無血清培地は、そのまま培養容器に添加して使用可能な液体として提供されてもよく、使用時に調製可能な濃縮液あるいは粉末のごとき固体として提供されてもよい。本発明のこの態様の培養基材のさらなる具体例は、培養容器およびそれに入ったＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含有する無血清培地を含むものであってもよい。ＴＧＦ−βファミリーの蛋白の種類および無血清培地中の濃度は上で説明したとおりである。培養容器の形状は皿、ボトル、チューブ、フラスコ、バッグ等があり、特に限定されない。好ましくは、上記培養基材において、培養容器はフィブロネクチンにてコートされている。ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない。
【００４７】
本発明は第６の態様において、無血清培地成分およびＴＧＦ−βファミリーの蛋白を含む、幹細胞の未分化状態および分化多能性を維持するための継代培養用無血清培養基材を製造するためのキットを提供する。該培養基材中の培地に含まれるＴＧＦ−βファミリーの蛋白の濃度は上で説明したとおりである。ただし該培養基材はフィーダー細胞を含まない。
【００４８】
無血清培地としては上で例示したものや、それらを改変したものが挙げられる。その成分も公知であるか、あるいは当業者が適宜選択することができるものである。キットに含まれる無血清培地成分の形態は特に限定されない。例えばそのまま培養容器に移して使用可能な液体であってもよく、濃縮液の形態であってもよく、あるいは粉末のごとき固体であってもよい。キットに含まれる無血清培地成分は、例えばビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類、糖類などに分けてキットに含まれていてもよい。
【００４９】
本発明の上記キットにて作成される培養基材において、フィブロネクチンが接着因子として含まれていることが好ましい。本発明のキットに含まれるフィブロネクチンの形態も特に限定されない。例えばフィブロネクチンは粉末のごとき固体であってもよく、適切なバッファーを含有するフィブロネクチン水溶液のごとき液体であってもよい。
【００５０】
所望により本発明の上記キットに培養容器が含まれていてもよい。培養容器はガラス、プラスチック等いずれの材質であってもよい。その形状も皿、ボトル、チューブ、フラスコ、バッグ等があり、特に限定されない。本発明のキットに含まれる培養容器は、予めフィブロネクチンにてコートされていてもよい。
【００５１】
通常は、キットには取扱説明書が添付される。
【００５２】
特に説明した用語を除き、本明細書にて使用される用語は、当業者が刊行物や教科書、辞書などを通じて通常理解している意味に解される。
【００５３】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５４】
全組成が明らかな無血清培地ｈＥＳＦ９（Furue MK, Na J, Okamoto T, et al. (2008) Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci USA 105: 13409-13414）を用いて、ｉＰＳ細胞の誘導までの各過程を無血清培養条件で検討を行った。さらに、ヒト歯髄由来細胞を用いて、初代培養からウイルス感染さらにｉＰＳ細胞の樹立までの全過程を完全無血清培養系にて行うことでｈｉＰＳ樹立および維持を試みた。
【００５５】
１．  細胞培養法
１−１  細胞培養液
１）無血清培地
使用した無血清培地はヒトＥＳ細胞用に開発されたｈＥＳＦ−ＧＲＯ培地（Nipro）（Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェート（１００μｇ／ｍｌ）含有）（表１）に添加因子としてヒト組み換え型インスリン（１０μｇ／ｍｌ）（CSTI 0105, Japan）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）（Sigma T-1147）、２−エタノールアミン（１０  μＭ）（Sigma E-0135）、２−メルカプトエタノール（１０μＭ）（Sigma M-7522）、セレン酸ナトリウム（２０ｎＭ）（Sigma S-9133）、およびヒト組み換え型アルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）（Cell Prime Albumin : Millipore 9301）に包含されたオレイン酸（４．７μｇ／ｍｌ）（Sigma O-1383）を加えたｈＥＳＦ６培地に、ヘパラン硫酸ナトリウム塩（１００ｎｇ／ｍｌ）（Sigma H-7640）およびヒト組み換え型線維芽細胞増殖因子−２（１０ｎｇ／ｍｌ）（FGF-2:R&D, 3718FB）を添加したｈＥＳＦ９培地（表２）を使用し、ウシ血漿由来フィブロネクチン（２μｇ／ｃｍ２）（Sigma F-1141）でコートしたディッシュ上にて培養を行った。
また、歯髄細胞の培養に使用した無血清培地RD6Fは、RPMI1640培地（Sigma）とDMEM培地（Sigma）を１：１で混合し、ビクシリン(９０ｍｇ／ｍｌ)（Meiji, Japan）、カナマイシン(９０ｍｇ／ｍｌ)（GIBCO）、ピルビン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／ｍｌ)（Sigma）、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Dojindo）、重炭酸ナトリウム(２ｇ／Ｌ)（Sigma）を添加したRD培地を基礎培地として、6種類の添加因子(６F)つまり、ヒト組み換え型インスリン（１０μｇ／ｍｌ）（CSTI 0105, Japan）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）（Sigma T-1147）、２−エタノールアミン（１０μＭ）（Sigma E-0135）、２−メルカプトエタノール（１０μＭ）（Sigma M-7522）、セレン酸ナトリウム（２０ｎＭ）（Sigma S-9133）、およびヒト組み換え型アルブミン（５００μｇ／ｍｌ）（Cell Prime Albumin : Millipore 9301）に包含されたオレイン酸（４．７μｇ／ｍｌ）（Sigma O-1383）を加えた培地であり、本培地を用いてタイプＩコラーゲンコートディッシュ上で歯髄細胞の培養を行った。
【００５６】
【表１】
2015123079.tif 000002
【００５７】
【表２】
2015123079.tif 000003
【００５８】
２）ヒトＥＳ細胞用血清添加培地
ＤＭＥＭ−Ｆ１２（GIBCO 12660-012）培地に２０％  Knock Out Serum Replacement : KSR （Invitrogen 12828-028）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（GIBCO 21985-023）、MEM non-essential amino acids （GIBCO 11140-050）、組み換え型ヒトＦＧＦ−２（４ｎｇ／ｍｌ）（R&D 3718FB）を添加した培地を用い、マイトマイシンＣ（１０ｕｇ／ｍｌ）処理にて不活化したＣ５７／ＢＬ６マウス胎仔線維芽細胞上（Millipore: EmbryoMax(R) PMEF-H）に播種し、培養を行った。
【００５９】
１−２  培養細胞株ならびに樹立ヒトｉＰＳ細胞株とその培養方法
１）ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞（ＴＩＧ−３細胞）
地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター研究所にて樹立された日本人胎児肺由来線維芽細胞であるＴＩＧ−３細胞に、レトロウイルスを用いて４遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ）を遺伝子導入し、ヒトｉＰＳ細胞の誘導を試みた。ＴＩＧ−３細胞はＤＭＥＭ培地（Sigma）に１０％  ウシ胎児血清（Hyclone(R) Thermo Scientific, US）および１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）を添加した培地を用い、２〜３日毎に１：４のスプリット比（split ratio）にて１０ｃｍディッシュ（Falcon）上に細胞を播種し、５％ＣＯ２／９５％気相下、３７℃インキュベーター内で培養を行った。
【００６０】
２）ＰＬＡＴ−Ａウイルスパッケージング細胞株
哺乳類への感染指向性を持ち、長期間安定してレトロウイルスの構造タンパク質（gag, pol, env）を産生可能なウイルスパッケージング細胞株Platinum-A Retroviral Packaging Cell, amphotropic （PLAT-A : Cell Biolabs Inc. CA, USA）を使用し、レトロウイルスの産生を行った。ＤＭＥＭ培地（Sigma）に１０％  ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Sigma）および１０μｇ／ｍｌ  ブラスチシジン（Funakoshi, Tokyo, Japan）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）を添加した培地を用いて、２日毎に１：４のスプリット比（split ratio）にて１０ｃｍディッシュ（Falcon）上に細胞を播種し、５％ＣＯ２／９５％気相下、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。
なお、トランスフェクションを行う際には、前日にＤＭＥＭ培地に１０％  ＦＢＳを添加した培地を使用し、コラーゲンコートした２５ｃｍ２フラスコ（BioCoat Collagen I Cellware, Falcon）に２ｘ１０６個の細胞を播種し、１６〜２４時間後に細胞が７０％〜８０％コンフルエントになったところで遺伝子導入（トランスフェクション）に使用し、トランスフェクション開始４８〜７２時間後のウイルス上清を回収し、標的細胞に感染させた。
【００６１】
３）樹立ヒトｉＰＳ細胞株（Ｔｉｃ）とその培養方法
コントロールのｉＰＳ細胞として、国立成育医療研究センターの梅澤らが樹立し、医薬基盤研究所より供与されたＴｉｃ（ＪＣＲＢ１３３１）を用いた。Ｔｉｃをあらかじめ０．１％ゼラチンにてコートしたフラスコに、フィーダー細胞として播種した不活化マウス胎仔線維芽細胞（Millipore: PMEF-H）上に播種し、血清添加ＥＳ細胞用培地を用いて培養を行った。なお、細胞分散はデスパーゼII（１ｍｇ／ｍｌ）（Roche 4942078, Basel, Switzerland）を用いて継代を行った。
【００６２】
２．ＴＩＧ−３細胞からのヒトｉＰＳ誘導における無血清培養条件の検討
ヒト胎児肺線維芽細胞ＴＩＧ−３細胞を用いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４遺伝子を、レトロウイルス（ＰＬＡＴ−Ａパッケージング細胞）を用いて感染させ、ヒトｉＰＳ細胞を誘導した。
【００６３】
１）レトロウイルスの作製
１−２  ２）の方法に準じて継代維持したＰＬＡＴ−Ａ細胞に初期化４遺伝子を導入し、レトロウイルスを作成した。使用したプラスミドは京都大学  山中研究室にて作成されたｐＭＸｓ−（ｈＯｃｔ３／４）、ｐＭＸｓ−（ｈＳｏｘ２）、ｐＭＸｓ−（ｈＫｌｆ４）、ｐＭＸｓ−（ｈｃ−Ｍｙｃ）（Cell Biolabs Inc. CA,USA）を用いた。
トランスフェクション前日に、ＰＬＡＴ−Ａ細胞をタイプＩコラーゲン処理した２５ｃｍ２フラスコ（BioCoat Collagen I Cellware, Falcon）に２ｘ１０６個の密度で細胞を播種し、１６〜２４時間経過後に７０％〜８０％コンフルエントになったところで、４μｇのプラスミド溶液とトランスフェクション試薬をＤＭＥＭ培地にて希釈した混合液を加えて、この複合体溶液をＰＬＡＴ−Ａ細胞を播種したフラスコに添加し、トランスフェクションした。さらに、４時間後に血清添加培地を加えて、翌日に１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、トランスフェクション開始２４〜４８時間後のウイルス上清を回収後、標的細胞に感染させた。なお、プラスミド毎にトランスフェクションするため計４枚の２５ｃｍ２フラスコを用意した。
【００６４】
２）リプログラミング過程における無血清培養条件の検討
（１）ウイルス感染および細胞外マトリックス上への播種
１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養したＰＤＬ（集団細胞倍加数）２４〜４０のＴＩＧ−３細胞に、レトロウイルスを感染させ４遺伝子を導入した。その後、無血清培地ｈＥＳＦ９に培地交換し、各種細胞外マトリックス上に播種し、リプログラミング過程における無血清培養条件の検討を行った。
ウイルス感染の前日（Ｄａｙ−１）に１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養したＴＩＧ−３細胞を、３ｘ１０５個の細胞数で６ｃｍディッシュ上に播種した。翌日（Ｄａｙ０）、各ウイルス上清を等量混合したｐＭＸｓ−（４Ｆ）を最終濃度８μｇ／ｍｌとなるようにポリブレンを加えて、０．４５μｍフィルターで濾過した後、血清添加培地にて維持したＴＩＧ−３細胞へ感染させた。感染４時間後にポリブレンの毒性を弱めるため、ウイルス上清と等量の培地を加えた。感染２４時間後（Ｄａｙ１）に培地交換し、４日間（Ｄａｙ４まで）培養を行った。なお、培地交換は２日毎に行った。感染４日後（Ｄａｙ４）にＴＩＧ−３細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理により単一細胞に分散した。続いて、あらかじめ０．１％ゼラチン（Millipore ES-006B）あるいはタイプＩコラーゲン（０．３ｍｇ／ｍｌ）（Nitta gelatin）あるいはフィブロネクチン（２μｇ／ｃｍ２）（Sigma）の各種細胞外マトリックスにてコートした１０ｃｍディッシュ上に１ｘ１０５／ディッシュの細胞数となるよう播種した。再播種翌日（Ｄａｙ５）に無血清培地ｈＥＳＦ９に培地交換し、フィーダー細胞を用いず、各種細胞外マトリックス上に播種することでヒトｉＰＳ細胞の誘導を試み、リプログラミング過程における無血清培養条件の及ぼす影響について検討を行った（図１）。再播種後の培地交換は２日毎に行った。
ゼラチン、タイプＩコラーゲン、フィブロネクチンのいずれの細胞外マトリックス上においても、感染１３日前後より、細胞質と比較して大きな核を持つ、小型で細胞境界が不明瞭なヒトＥＳ細胞様のコロニー形成を認めた（図１）。感染２０日後より、顕微鏡下でピペットを用いてコロニーを回収し、あらかじめ各細胞外マトリックスでコートした４ウェルマルチディッシュ上に播種し、継代した。ゼラチン上に播種したディッシュでは細胞接着が弱く、接着したとしてもコロニーが著しい分化傾向にあった。さらにタイプＩコラーゲン上に播種したディッシュではコロニーは接着するものの、辺縁より著しい分化傾向を示した。一方でフィブロネクチン上に播種したディッシュでは細胞接着後、ヒトｉＰＳ細胞の形態を保持し維持することが可能であった（図２）。また、感染３６日後に未分化性の指標であるＡＬＰ染色を行い、いずれのディッシュ上のコロニーも陽性反応を示した。フィブロネクチンおよびコラーゲン上に播種した細胞が、最も形態的にヒトｉＰＳ細胞に類似していた。
コントロールとして、ウイルス感染４日後（Ｄａｙ４）のＴＩＧ−３細胞を、あらかじめマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）にて不活性化したフィーダー細胞を播種した１０ｃｍディッシュ上で培養し、翌日（Ｄａｙ５）からヒトＥＳ細胞用血清培地に交換し、以後２日毎に培地交換を行った。本培養条件でもコロニーは出現したが、初期化が不完全なコロニーが多く、またフィーダー細胞を用いない無血清培養条件に比べてコロニー出現時期は遅延した（図１）。
【００６５】
（２）感染効率の評価（ＦＡＣＳ解析）
４遺伝子の感染と同時に、使用したレトロウイルスパッケージング細胞ＰＬＡＴ−Ａの感染効率の評価のため、ＥＧＦＰを用いＦＡＣＳ解析にて評価した。
【００６６】
（ｉ）１因子感染効率
前述  ２−１  １）および２）の方法に準じて、ＰＬＡＴ−Ａ細胞にｐＭＸｓ−（ＥＧＦＰ）あるいはｐＭＸｓ−（−）をトランスフェクションし、各ウイルス上清を回収した後、各々ＴＩＧ−３細胞に感染させ、４日後にＴＩＧ−３細胞をセルストレーナー付ＦＡＣＳ用チューブ（BD Falcon）に回収し、フローサイトメーター（FACS CaliburTM, Beckton Dickinson）にて解析を行った。
【００６７】
（ｉｉ）４因子感染効率
前述  ２−１  １）および２）の方法に準じて、ＰＬＡＴ−Ａ細胞にｐＭＸｓ−（ｈＯｃｔ３／４）、ｐＭＸｓ−（ｈＳｏｘ２）、ｐＭＸｓ−（ｈＫｌｆ４）、ｐＭＸｓ−（ｈｃ−Ｍｙｃ）を各々トランスフェクションしたウイルス上清の等量混合液（以後ｐＭＸｓ−（４Ｆ）と表記）、あるいはｐＭＸｓ−（４Ｆ）とｐＭＸｓ−（ＥＧＦＰ）のウイルス上清を３：１の割合で混合したウイルス混合液を、各々ＴＩＧ−３細胞に感染させ、４日後にＴＩＧ−３細胞をセルストレーナー付ＦＡＣＳ用チューブ（BD Falcon）に回収し、フローサイトメーターにて解析を行い、便宜的に４因子感染効率とした。
１因子感染効率をＦＡＣＳにて評価したところ、平均４３．４％であった。次に４因子感染効率として評価したところ、２６．６％とやや感染効率は低下したが、平均的な効率が得られたため、本システムを用いてヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳ細胞）の誘導を試みた。
【００６８】
３）ウイルス感染成立時における無血清培養条件の検討
レトロウイルス上清を無血清培地ｈＥＳＦ９にて回収し、ウイルス感染が成立する２４時間を無血清培地ｈＥＳＦ９として、ウイルス感染成立時における無血清培地の影響について検討を行った（図３）。
ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを加えた血清添加培養条件下にてＰＬＡＴ−Ａ細胞にｐＭＸｓ−（ＥＧＦＰ）あるいはｐＭＸｓ−（−）をトランスフェクションし、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを加えた血清培地条件（以後条件Ａと表記）あるいはｈＥＳＦ９無血清培地条件（以後条件Ｂと表記）の各条件にてトランスフェクションの２４〜４８時間後のウイルス上清を回収し、標的細胞であるＴＩＧ−３細胞に感染させた。ウイルス感染の成立する２４時間を上記ＡあるいはＢ条件にて行い、以後は両条件とも血清添加培地Ａ条件にて培養を行い、３日後にＴＩＧ−３細胞をセルストレーナー付ＦＡＣＳ用チューブに回収し、フローサイトメーター（FACS CaliburTM, Beckton Dickinson）にて解析を行った。
血清添加培養条件Ａでは感染効率は６２．６％、無血清培養条件Ｂでは感染効率は４６．４％であった。条件Ａに比べて、無血清培養条件Ｂは効率がやや低値を示したものの、一般的にｈｉＰＳ誘導に必要なタイター（力価）は維持されていると考えられた。
【００６９】
３．  フィーダー細胞を用いない無血清培養条件での歯髄由来細胞からのヒトｉＰＳ細胞誘導
これまでのＴＩＧ−３細胞を用いた実験結果をもとに、無血清培養条件下にてレトロウイルス上清を用いて、初代培養からウイルス感染を経てヒトｉＰＳ細胞誘導までの全過程を完全無血清培養系にて行い、ヒトｉＰＳ細胞が誘導可能であるか検討を行った（図４）。
【００７０】
１）歯髄由来細胞の初代培養
広島大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会にて承認を得た研究計画に基づき、広島大学病院顎・口腔外科を受診し、同意の得られた患者の抜歯後の歯髄組織から歯髄由来細胞を分離し、ｅｘｐｌａｎｔ培養法にて無血清培地を用いて初代培養を行った。
下顎埋伏智歯の抜去歯牙より分離した歯髄を７０％エタノールに浸漬後、細切し、以下に記載したＲＤ６Ｆ培地を用い、タイプＩコラーゲン（０．１５ｍｇ／ｍｌ）（Ｎｉｔｔａ  ｇｅｌａｔｉｎ）にてコートしたディッシュ上に、５％ＣＯ２／９５％気相下、３７℃下、ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。培地交換は２〜３日毎に行い、サブコンフルエントまで増殖した段階で０．０５％  tｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理により細胞分散後、０．１％tｒｙｐｓｉｎ  iｎｈｉｂｉｔｏｒを加えてｔｒｙｐｓｉｎ作用を中和し、ディッシュ上に細胞を播種し、３〜４日毎に継代を行った。
無血清培地として以下に示すＲＤ６Ｆを用いた。すなわち、ＤＭＥＭ培地（Sigma）とＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma）を１：１で混合し、ビクシリン（９０ｍｇ／ｍｌ）（Meiji, Japan）、カナマイシン（９０ｍｇ／ｍｌ）（ＧＩＢＣＯ）、ピルビン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／ｍｌ）（Sigma）、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Dojindo）、重炭酸ナトリウム（２ｇ／Ｌ）（Sigma）を添加したＲＤ培地を基礎培地として、６種類の添加因子インスリン（１０μｇ／ｍｌ）（CSTI 0105）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）（Sigma T-1147）、２−エタノールアミン（１０μＭ）（Sigma E-0135）、２−メルカプトエタノール（１０μＭ）（Sigma M-7522）、セレン酸ナトリウム（１０ｎＭ）（Sigma S-9133）、および脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（Sigma O-3008）に抱合されたオレイン酸（４．７μｇ／ｍｌ）を加えた培地をＲＤ６Ｆとし、培養を行った。
【００７１】
２）レトロウイルス感染およびヒトｉＰＳ細胞誘導
無血清培地ＲＤ６Ｆにて初代培養を行った歯髄由来細胞に、全過程を通して無血清条件下にてウイルス感染させ、フィブロネクチン上に播種し、誘導を行った。
初代培養開始から２週間程度継代培養を行った細胞を、ウイルス感染の前日（Ｄａｙ−１）に、３ｘ１０５の細胞数で６０ｍｍディッシュ上に播種した。翌日（Ｄａｙ０）、無血清培地ｈＥＳＦ９にて回収したレトロウイルス上清ｐＭＸｓ−（４Ｆ）にポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を添加したのち、歯髄由来細胞に感染させた。感染４時間後に等量の無血清培地ｈＥＳＦ９を追加し、２４時間後に培地交換を行い、感染５日後（Ｄａｙ５）に各細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理により単一細胞に分散し、あらかじめフィブロネクチン（２μｇ／ｃｍ２）にてコートしたディッシュ上に、細胞数１．０ｘ１０５個／１０ｃｍディッシュとなるよう播種した。再播種後は２日毎に無血清培地ｈＥＳＦ９培地を用いて培地交換を行った（図４）。感染１５日後よりｉＰＳ様のコロニーが出現し、感染２０日後のコロニーを回収し、フィブロネクチンコートしたディッシュ上に播種し、無血清培地ｈＥＳＦ９あるいはｈＥＳＦ９にＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地ｈＥＳＦ９Ｔを用いて継代培養を行った。完全無血清培養系ではＡＬＰ活性陽性コロニー数が多く（図４Ｄ）、ｉＰＳ細胞誘導効率が０．３９％と高い誘導効率を示した。また、同一のベクターを使用した文献と比較しても高い誘導効率を示した（表３）。さらに、ウイルス感染５日後に再播種せず、培地のみｈＥＳＦ９に交換した条件についても検討を行ったが、細胞形態の変化が乏しく、コロニーは全く形成されなかった。なお、ＫＳＲ添加培養条件にて誘導されたヒトｉＰＳ細胞様のコロニーは、マイトマイシンＣにて不活性化したフィーダー細胞上に播種し、ヒトＥＳ細胞用血清培地を用いて培養を行い、分化前に顕微鏡下でコロニーを回収し、継代を行った。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
３）歯髄細胞由来ヒトｉＰＳ細胞の未分化性の維持
（１）ヒトｉＰＳ細胞の増殖能および未分化性の維持に及ぼすＴＧＦ−β１の影響
歯髄由来細胞から樹立したｈｉＰＳ細胞を、マイクロピペットを用いて機械的に小さくした後、無血清培地ｈＥＳＦ９あるいはＴＧＦ−β１を加えたｈＥＳＦ９Ｔ培地を用いてフィブロネクチンコートしたディッシュ上に播種した（図５Ａ）。無血清培地ｈＥＳＦ９で維持したｈｉＰＳ細胞はディッシュに接着するものの、長期継代培養とともに未分化性を十分に維持することが困難となり、辺縁から次第に分化した細胞の遊走が観察された。一方、ＴＧＦ−β１を含む無血清培地ｈＥＳＦ９Ｔで維持したヒトｉＰＳ細胞は、未分化性を維持したまま継代培養することが可能であった（図７Ａ）。また、ｈＥＳＦ９培地に各種濃度（０、０．１、１、２、５、１０ｎｇ／ｍｌ）のＴＧＦ−β１を添加し、培養４日後に全ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡ合成後、QX100TM Droplet DigitalTM PCR system （Bio-RAD）を用いて遺伝子発現解析を行った。Droplet DigitalTM PCRはddPCRTM supermix （Bio Rad）を用いて添付のプロトコールに準じ、QX100TMDroplet Generator （Bio Rad）にて液滴を作成しＰＣＲ反応にて増幅後、QX100TM Droplet Reader（Bio Rad）を用いて解析を行った。ＴＧＦ−β１濃度依存的に未分化性を保持した細胞数は増加し、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの未分化マーカー遺伝子発現が増強した（図７Ｂ）。なお、ＴＧＦ−β１濃度は２〜１０ｎｇ／ｍｌでもっとも未分化マーカーが高発現していたが、ＴＧＦ−β１非存在下では著しく未分化マーカー遺伝子の発現が低下するとともに、中胚葉分化マーカーのプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）および心筋などの内胚葉分化マーカーであるＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）といった分化マーカーの発現を認めた。また、無血清培地ｈＥＳＦ９あるいはｈＥＳＦ９Ｔを用いて３０代継代・維持されたヒトｉＰＳ細胞をフローサイトメトリーにて解析したところ、ＳＳＥＡ４陽性細胞率はｈＥＳＦ９Ｔ培地で９１．７％でありｈＥＳＦ９培地での割合（１２％）と比較し有意に高かった。また、Ｏｃｔ３／４陽性細胞率はｈＥＳＦ９Ｔ培地で６７．５％であったが、ｈＥＳＦ９培地では０．６％と低下していた（図５Ｂ）。無血清培地ｈＥＳＦ９を用いることで、ｉＰＳ細胞の樹立および短期間では未分化性を維持したヒトｉＰＳ細胞の継代・維持が可能であるが、ＴＧＦ−β１を添加することで、未分化性を保持した細胞の長期継代・維持が可能となることが示された。
【００７４】
（２）ＴＧＦ−β１添加培地ｈＥＳＦ９Ｔにて継代したヒトｉＰＳ細胞の特性解析
無血清培地ｈＥＳＦ９あるいはｈＥＳＦ９Ｔを用いて、フィブロネクチン上で継代・維持したヒトｉＰＳ細胞からＲＮＡを抽出し、Agilent Sure Print G3 Human GE 8x60K v2 MicroarrayにてGenespring12.0 （Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を使用し遺伝子の網羅的発現解析（genome-wide gene expression profiling analysis）を行ったところ、ヒトＥＳ細胞用血清培地を用いてフィーダー細胞上で維持したヒトｉＰＳ細胞と比較して、概ね同一の遺伝子発現パターンを示した（図５Ｃ、図６）。一方でこれらのパスウェイ解析において、ｈＥＳＦ９培地で継代・維持した細胞はｈＥＳＦ９Ｔ添加培地で培養した細胞と比較し、ＴＧＦ−βシグナリングパスウェイ（ＷＰ５６０）、ＷＮＴシグナリングおよび多能性パスウェイ（ＷＰ３９９）、ＷＮＴシングナリングパスウェイ（ＷＰ４２８）およびアポトーシスモジュレーションおよびシグナリングパスウェイ（ＷＰ１７７２）において有意に異なる発現パターンを示していた。
以上より、無血清培地ｈＥＳＦ９Ｔを用いてフィブロネクチン上で継代・維持したヒトｉＰＳ細胞は、従来の血清添加培地を用いてフィーダー細胞上で維持したヒトｉＰＳ細胞培養と同様の遺伝子発現を示しており、未分化性が保持されていることが確証された。
【００７５】
４）歯髄細胞由来ヒトｉＰＳ細胞の特性解析
（１）未分化性の検討
（ｉ）蛍光免疫染色を用いた未分化マーカー蛋白発現解析
無血清培地ｈＥＳＦ９を使用しフィブロネクチンコートディッシュ上で誘導後、ＴＧＦ−β１添加培地にて継代維持した細胞（DP-F-iPS-CL16 passage19）について、各種未分化マーカー抗体（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１）を使用して蛍光免疫染色を行うことにより未分化マーカーの発現解析を行った。各抗体はAlexa Fluor(R) 488にて可視化し、併せてＤＡＰＩにて核染色を行った。ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の未分化マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１のすべてが発現していることを確認した（図７Ｄ）。
【００７６】
（ｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた未分化マーカー遺伝子発現の検討
同培養条件にて継代維持した細胞からＲＮＡを抽出し、各種未分化マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにて解析した。ＲＮＡ抽出は、illustra RNA spin Mini Isolation kit（GE Healthcare UK Ltd, England）を用いて添付のプロトコールに準じ、上記で培養した細胞の全ＲＮＡを抽出した。核酸の定量はNano Drop(R)（Nano Drop Technologies, Inc., USA）を使用した。細胞より抽出した各全ＲＮＡ（１μｇ）をHigh Capacity RNA-to-cDNA Master Mix（Applied Biosystems, CA, USA）を用い、サーマルサイクラー（PTC-0220 DNA Engine Dyad : MJ Japan, Tokyo）を使用し、２５℃下５分間、４２℃下３０分間、８５℃下５分間インキュベーションし逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲはKOD FX Neo（Toyobo, Osaka, Japan）を用いて、変性反応９８℃、１０秒、アニーリング６２℃、３０秒、伸長反応６８℃、３０秒の条件で行い、これを１サイクルとして３５サイクル行い、ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル（Invitrogen）にて電気泳動後、SYBR Safe DNA gel stain（Invitrogen）にて可視化した。ヒトＥＳ細胞の未分化マーカー遺伝子であるＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｇ１、Ｒｅｘ−１（Reduced- expression 1; Zfp42）の発現を検討した。対照として、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現を検討した（図７Ｃ）。無血清培養条件下にて誘導・維持したヒトｉＰＳ細胞は未分化マーカーであるＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｇ１、Ｒｅｘ−１を発現していた。一方で、遺伝子導入前の歯髄由来細胞においては、これらの未分化マーカーは発現していなかった（図７Ｃ）。
【００７７】
（ｉｉｉ）ＡＬＰ染色
ヒトｉＰＳ細胞をＡＬＰ固定液（４．５ｍＭクエン酸、２．２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、３ｍＭ塩化ナトリウム、６５％メタノール、３％ホルムアルデヒド）にて固定後、アルカリフォスファターゼ基質キット（ヒストファイン  ファーストレッドII基質キット  Nichirei, Tokyo, Japan）にて遮光下、室温で１５分間反応させた後、数回洗浄後、位相差顕微鏡（Nikon ECLIPSE TE300）にて観察を行った。
【００７８】
（２）多分化能の検討
（ｉ）胚様体を用いた分化誘導
無血清培養条件にてｈＥＳＦ９培地あるいはｈＥＳＦ９Ｔ培地にて継代・維持したヒトｉＰＳ細胞（ｈＥＳＦ９培地で維持したＤＰ−Ａ−ｉＰＳ細胞あるいはｈＥＳＦ９Ｔ培地で維持したＤＰ−Ｆ−ｉＰＳ細胞）から胚様体と呼ばれる疑似胚を形成させ分化誘導を行った。分化誘導培地としてＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加し、９６穴細胞低吸着プレート（SUMILON Prime Surface(R) U plate, 住友ベークライト）に播種し、４日間浮遊培養を行い、胚様体を形成させた後、ゼラチンコートしたプレートに細胞を播種し、さらに１０日間分化誘導を行った。誘導１４日後の細胞に対して各種分化マーカー抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。各抗体はAlexa Fluor(R) 594にて可視化し、併せてＤＡＰＩにて核染色を行った。その結果、神経幹細胞系のマーカーであるネスチンや神経細胞のマーカーであるβIII−チューブリン、中胚葉マーカーであるα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、内胚葉マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に対して発現を認めた。一方、未分化マーカーのＯｃｔ３／４は発現していなかった（図８Ａ）。
【００７９】
（ｉｉ）免疫不全マウスを用いたテラトーマ（奇形腫）形成能の評価
無血清培地、ｈＥＳＦ９培地あるいはｈＥＳＦ９Ｔ培地にて継代・維持したヒトｉＰＳ細胞を、免疫不全マウス（ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＣｒｌＣｒｌｊ）の背部皮下に移植し、テラトーマの形成能を検討した。コントロールとしてヒトｉＰＳ細胞をＫＳＲ添加ＥＳ細胞培養用標準培地にてフィーダー細胞上にて誘導した細胞を用いた。各条件において、１×１０６個の細胞を５０μｌのＰＢＳに懸濁し、同量のタイプＩコラーゲンと混合し、５０μｌを免疫不全マウスの背部皮下に移植した。移植約１０週間後に両条件とも腫瘤を形成したため、摘出した腫瘤を４％パラホルムアルデヒドにて４℃下一晩固定後、通法に従い脱脂、パラフィン包埋し、６μｍの連続切片を作成し、２つのグループに分け、一方に対しては通法に従いヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。また、一方に対してアルシアンブルー／ＰＡＳ染色を行った。脱パラフィン後、３％酢酸にて３分間処理し、ｐＨ２．５アルシアンブルー溶液（和光純薬、Osaka、Japan）にて３０分間処理を行った。染色後水洗し、０．５％過ヨウ素酸溶液（和光純薬）にて５分間、コールドシッフ液（和光純薬）にて３０分間処理を行い、亜硫酸水（和光純薬）で３分間処理を３回繰り返した後、水洗した。核染色をマイヤー・ヘマトキシリン溶液にて行い、脱水・封入後、顕微鏡にて観察を行った。切片では表皮や神経といった外胚葉の組織、軟骨や筋肉・結合組織といった中胚葉の組織、消化管や肝臓などの内胚葉に分化した組織を認め、摘出した腫瘤がテラトーマであることが示された（図８Ｂ）。なお、ＫＳＲ添加ＥＳ細胞培養用標準培地にてフィーダー細胞上にて継代維持した細胞においても三胚葉へと分化した組織を認めた。
【００８０】
（３）ＳＴＲ（Short Tandem Repeat）解析
患者より採取した歯髄由来細胞および、無血清培養条件下にて初期化遺伝子を導入し作製したヒトｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、Powerplex 16 system （Promega Corporation, Madison, WI）を用いてABI PRISM (R)3100 Genetic analyzer（Applied Biosystems）およびGene Mapper v3.5を使用しＳＴＲ解析を行ったところ１６遺伝子座のアレルパターンがすべて一致した。
【００８１】
（４）細胞増殖能および核型解析
無血清培養条件にて誘導し、ｈＥＳＦ９Ｔにて２１代継代・維持したヒトｉＰＳ細胞の細胞倍加時（population doubling time）は１６．６±０．８時間であった（図９Ａ）。
無血清培地ｈＥＳＦ９Ｔにて２０代継代維持したヒトｉＰＳ細胞の核型解析を行った。培養中の細胞に対して、コルセミド溶液（Karyo Max(R), GIBCO）を最終濃度０．０６μｇ／ｍｌとなるように加え、６時間培養継続後、細胞を回収し、１０μＭ  Ｒｏｃｋインヒビター（Ｙ−２７６３２：和光純薬）を添加したのち、細胞を分散した。続いて、３７℃下１０分間０．０７５Ｍ塩化カリウム溶液にて低張液処理し、カルノア固定液にて固定後、遠心し、再度カルノア固定液にて固定を繰り返したのち、細胞懸濁液をスライドガラス上に滴下し、風乾後、４％ギムザ染色液（武藤化学、Tokyo、Japan）にて染色後、光学顕微鏡にて検鏡し、核型解析を行った。無血清培地ｈＥＳＦ９Ｔにて２０代継代維持したヒトｉＰＳ細胞の核型簡易解析を行った結果、正常染色体数を示した。２ｎ＝４６，ＸＸ（図９Ｂ）。
【００８２】
４．本発明の無血清培養条件を用いたヒトｉＰＳ細胞の継代・維持における普遍性の検討
上記の研究結果をもとに、無血清培地ｈＥＳＦ９Ｔを用いて維持されたヒトｉＰＳ細胞を用いて、ｈＥＳＦ−ＧＲＯのかわりに基礎培地としてDulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham培地(１：１の比率で混合)を使用し、前述の６種類の添加因子にＦＧＦ−２、Ｈｅｐａｒｉｎ、ＴＧＦ−β１を添加した、ＤＦ８ＦＴ培地による、未分化性の維持に関して検討を行った。無血清培地ＤＦ８ＦＴを用いて、フィブロネクチン上にヒトｉＰＳ細胞を播種したところ、形態の変化なく、未分化性を保持したまま継代・維持が可能であった（図１０）。
【００８３】
５．まとめ
一般的に、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞は、不活性化したフィーダー細胞や血清などの動物由来成分を含む条件で培養されている。このような培養系では各種異種抗原の混入の恐れがあり、再生医療への応用は困難であり、さらにこれら幹細胞の増殖・分化制御機構やその制御因子を明らかにすることも非常に困難である。本発明によって、無血清培地培地を用いて、フィーダー細胞を用いず正常ヒト歯髄由来細胞から、ヒトｉＰＳ細胞を誘導することが可能となった。ヒトｉＰＳコロニーは感染後約２週間で出現し、未分化性および多分化能を有していた。また、初代培養からウイルス感染を経てヒトｉＰＳ細胞樹立までの全過程を完全無血清培養系にて行い、初めてヒトｉＰＳ細胞を誘導できることも明らかとなった。また、本発明の未分化性および分化多能性を維持しつつ継代培養する方法は、ヒトｉＰＳ細胞のみならず、あらゆる動物の幹細胞に適用可能である。
【００８４】
従来のヒトｉＰＳ細胞培養系を用いると、フィーダー細胞や動物由来成分の使用により、種々の既知および未知因子が混在し、培養法の標準化は難しく、未分化性の維持や特定組織・臓器への分化制御も困難である。さらに、動物由来蛋白等の混入により、感染症等の恐れもある。これに対し、本発明の無血清培養系では既知の因子のみから成るため、幹細胞の未分性の維持や増殖・分化を制御する各種因子の同定や検討が容易となり、発生・組織・臓器再生メカニズムの解明や、創薬スクリーニングへの応用、さらに安全で確実な再生医療の実現が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、医薬品や医用材料の開発、生化学の研究分野、畜産業などにおいて利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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