(57)【要約】本発明は、細胞の付着・散布を促進するペプチド、その断片及び誘導体を提供する。具体的には、インテグリンα３β１の結合、細胞の付着・散布を媒介する人間ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメインの確認、ＬＧ３ドメイン内のインテグリンα３β１の依存性細胞の付着・散布を促進する活性モチーフとして作用する配列番号：１のペプチド、その断片及び誘導体である。これにより、ラミニンを含む多様な細胞外基質蛋白質により媒介される細胞付着活性の研究、創傷の治療、組織の再生及び癌転移の抑制などに非常に効果的に使用され得る。【選択図】図１
2008505844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の付着・散布を促進する配列番号：１と記載されるアミノ酸配列を有するペプチド、その断片または誘導体。
【請求項２】
前記誘導体が第１２のアルギニンを保存していることを特徴とする請求項１に記載の誘導体。
【請求項３】
前記誘導体が第１のプロリンまたは第２のプロリンを保存していることを特徴とする請求項１に記載の誘導体。
【請求項４】
前記誘導体が配列番号：１の第８のリシンに置換されたアラニンを有することを特徴とする請求項１に記載の誘導体（Ｐ４−Ｓ１）。
【請求項５】
前記断片が、配列番号：１の第１のプロリンまたは第２のプロリンが欠失されたことを特徴とする請求項１に記載の断片（Ｐ４ Ｄ−Ｎ１）。
【請求項６】
インテグリンα３β１によって細胞の付着・散布を媒介することを特徴とする請求項１に記載のペプチド、その断片または誘導体。
【請求項７】
細胞の付着・散布を促進する配列番号：１３のアミノ酸配列を有するペプチド（ｒＬＧ３−Ｈｉｓ６）またはその誘導体。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のうち何れか１項に記載のペプチド、その断片または誘導体を有効性分として含有する創傷の治療、火傷の治療、組織の再生または癌転移の抑制用の組成物。
【請求項９】
請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載のペプチド、その断片または誘導体を含む創傷被覆材。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載のペプチド、その断片または誘導体を含む組織工学用支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメインにおける、細胞付着及び散布を媒介する、インテグリンα３β１依存性ペプチド、その断片及び誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラミニンは、基底膜に主に存在する細胞外基質蛋白質の一種であって、細胞表面の特定のインテグリンまたは他の受容体との相互作用を通じて、付着、移動性、成長、分化、傷の治癒、及び腫瘍の浸透のような多様な細胞性機能を調節する（Timpl, R., Curr. Opin. Cell Biol. 8:618, 1996;  Howe, A.ら, Curr. Opin. Cell Biol., 10:220, 1998;Colognato, H. and Yurchenco, P. D., Dev. Dyn., 218:213, 2000）。ラミニンは、α、β及びγ鎖の３個の異なる小単位で構成されているので、これらは、二硫化結合により互いに連結される交差した構造を形成する（Ekblom, M. ら, Ann. N. Y. Acad. Sci., 857:194, 1998）。これまで、５α、３β及び３γ鎖が発見されたが、これらの小単位の多様な組み合わせによって、少なくとも１５個の同型体（ラミニン１ないし１５）が形成されるということが報告された（Colognato, H. and Yurchenco, P. D., Dev. Dyn., 218:213, 2000;Burgeson, R. E. ら, Matrix Biol., 14:209, 1994;  Miner, J. H. ら, J. Cell Biol., 137:685, 1997）。これらのラミニン同形体のうち、α３、β３及びγ２鎖で構成されたラミニン５は、独特の構造及び生物学的な活性を有する。ラミニン５は、本来、角化細胞由来の基質蛋白質として同定されたが（Carter, W. G. ら, Cell, 65:599, 1991）、他のラミニン同形体とは違って、３個の小単位のＮ末端部位内で発見されるいくつかのドメインが欠失されている（Aumailley, M. and Rousselle, P., Matrix Biol., 18:19, 1999）。ラミニン５前駆体（４６０ｋＤａ）は、角化細胞内でプロセシングされるが、前記前駆体は、分泌されつつα３鎖（２００ｋＤａ）及びγ２鎖（１５５ｋＤａ）が分解されて、それぞれ１６５ｋＤａ及び１０５ｋＤａの蛋白質に転換される（Marinkovich, M. P.ら, J. Biol. Chem., 267:17900, 1992;Rousselle, P.ら, J. Cell Biol., 114:567, 1991）。
【０００３】
ラミニン５は、結合組織に対する上皮細胞の安定した付着を調節し（Marinkovich, M. P. ら, J. Biol. Chem., 267:17900, 1992;Rousselle, P. ら, J. Cell Biol., 114:567, 1991;  Niessen, C. M.ら, Exp. Cell. Res., 211:360, 1994）、インテグリンα３β１及びα６β４のような細胞表面の受容体と相互作用して細胞の行動に影響を及ぼす（Carter, W. G.ら, Cell, 65:599, 1991;  Rousselle, P.ら, J. Cell Biol. , 114:567, 1991;  Niessen, C. M.ら, Exp. Cell. Res. , 211:360, 1994;  Rousselle, P. and Aumailley, M. , J. Cell Biol. , 125:205, 1994）。正常な人間角化細胞から発現されたインテグリンのうちインテグリンα３β１は、アクチン含有のストレス繊維と関連している病巣付着の形成に関与し、角化細胞の移動性を媒介する（DiPersio, C. M.ら, J. Cell Sci. , 108:2321, 1995;  Zhang, K. and Kramer, R. H. , Exp. Cell. Res. , 227:309, 1996）。インテグリンα６β４は、上皮細胞の半接着斑の構造を形成し、癌腫細胞の浸透だけでなく、上皮細胞の付着・移動及び傷の治癒を媒介する（Niessen, C. M.ら, Exp. Cell. Res. , 211:360, 1994;  Mercurio, A. M.ら, Curr. Opin. Cell Biol. , 13:541, 2001）。ラミニン５またはインテグリンα６β４の突然変異は、上皮と真皮との接合の破裂と特定される致死性先天性表皮水疱症(Herlitz-type junctional epidermolysis bullosa : 全身の表皮が剥離する致死性の症状)を発生させる（Aberdam, D.ら, Nat. Genet. , 6:299, 1994;  Korge, B. P. and Krieg, T. , J. Mol. Med. , 74:59, 1996）。
【０００４】
ラミニン５の他に、ラミニンα３鎖が、ラミニン６（α３β１γ１）、ラミニン７（α３β２γ１）及びラミニン１３（α３β２γ３）で発見されるが、ラミニンβ３及びγ２鎖は、ひたすらラミニン５のみで発見される。ラミニンα３鎖は、約２００個のアミノ酸残基からなる５個の球形モジュールＬＧ１ないしＬＧ５から構成されたＣ末端球形ドメインを含む（Talts, J. F.ら, FEBS Lett. , 426:71, 1998;  Timple, R.ら, Matrix Biol. , 19:309, 2000）。多様なラミニン同型体を利用した遺伝子地図の研究を通じて、ラミニンα鎖の球形ドメインに対するインテグリン依存性細胞の付着位置が糾明された（Baker, S. E.ら, J. Cell Sci. , 109:2509, 1996;  Hirosaki, T.ら, J. Biol. Chem. , 275:22495, 2000）。α３鎖内のＣ末端ＬＧ３ドメインは、ラミニン５の独特の活性に必須である。ラットで組み換えＬＧ３（ｒＬＧ３）ドメイン、及び人間でＬＧドメインが連続的に欠失された組み換えラミニン５蛋白質は、インテグリンα３β１との相互作用により細胞の付着及び移動の促進に寄与する（Hirosaki, T.ら, J. Biol. Chem. , 275:22495, 2000;  Shang, M.ら, J. Biol. Chem. , 276:33045, 2000）。人間ラミニンα３鎖の組み換えＬＧ蛋白質についての研究を通じて、ＬＧ２ドメインがインテグリンα３β１の結合部位を含んでおり、ＬＧ４及びＬＧ５ドメインは、ヘパリン硫酸プロテオグリカンと弱く相互作用するということが明らかになった（Mizushima, H.ら, Cell Growth Differ. , 8:979, 1997）。また、ラミニンα３鎖のＬＧ４−ＬＧ５断片は、それ自体では活性を表さず、成熟したラミニン５の存在下では細胞の移動を促進させたが、これは、これらの断片が細胞の移動を調節できるということを暗示する（Tsubota, Y.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 278:614, 2000）。しかし、組み換え球形ドメインの断片を使用して、インテグリン依存性細胞の付着に直接的に関与する人間ラミニンα３鎖ＬＧドメインを糾明した報告はいまだにない。
【０００５】
一方、ラミニンの一次的な付着部位は、ラミニンα鎖のＣ末端ＬＧドメイン領域内に位置すると認識されている。ラミニンα鎖の多様なＬＧドメインは、細胞の付着及び移動を媒介し、ヘパリン、αジストログリカン、シンデカン及びインテグリンに結合すると知られている（Howe, A.ら, Curr. Opin. Cell Biol. , 10:220, 1998）。人間ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメインが、たとえラミニン５による細胞の付着及び移動性の強力な促進のために必須であるものとして提示されたとしても（Hirosaki, T.ら, J. Biol. Chem. , 275:22495, 2000）、ＬＧ３ドメイン内の生物学的な機能及びインテグリン結合のための活性部位の側面での追加的な報告はない。
【０００６】
これにより、本発明者らは、人間ラミニン５ α３ ＬＧドメインの機能を糾明し、生物学的な活性における核心配列を決定するために、モノマーの水溶性融合蛋白質の形態で発現される組み換え人間ラミニン５ α３ ＬＧドメイン、及びこれらのうち、ＬＧ３ドメイン由来の合成ペプチドを製造して、これらの細胞の付着・散布の活性を調べた。その結果、本発明者らは、人間ラミニン５ α３ ＬＧ３ドメインが、インテグリンα３β１に対するリガンドとして作用して細胞の付着・散布の活性を促進させ、前記ＬＧ３ドメイン内の配列番号：１と記載されるＰＰＦＬＭＬＬＫＧＳＴＲモチーフ（１３１２〜１３２３残基）、その断片及び誘導体が、インテグリンα３β１結合の活性部位として細胞の付着・散布の活性に重要であり、ベスキチンＷ不織布を利用した細胞付着活性度が非常に高く表われて、創傷の治療や組織の再生に効果的に使用され得るということを確認することによって本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、細胞の付着・散布及びインテグリンの結合を媒介する人間ラミニン５ α３鎖内の活性ドメインを糾明し、前記ドメインでインテグリンに特異的に結合して、細胞の付着・散布の活性を促進させる必須なモチーフとして作用するペプチド、その断片及び誘導体、並びにその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、細胞の付着・散布を媒介し、細胞の付着・散布に必須なモチーフとして作用する配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチド、その断片または誘導体を提供する。
【０００９】
また、本発明は、細胞の付着・散布を促進する配列番号：１３のアミノ酸配列を有するペプチド（ｒＬＧ−Ｈｉｓ６）またはその誘導体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ラミニン５ α３鎖ドメイン及びこれらの組み換え蛋白質の模式図である。
【図１Ｂ】Ｈｉｓ６標識の融合蛋白質として発現されたラミニン５ α３鎖ドメインの組み換えＬＧ蛋白質（ｒＬＧ１〜ｒＬＧ５）の模式図である。
【図１Ｃ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで人間ラミニン５ α３鎖ドメインの組み換えＬＧ蛋白質を精製した結果である。
【図２Ａ】人間ラミニン５ α３鎖ドメインの組み換えＬＧ蛋白質の細胞付着活性を人間胎盤ラミニン（ＬＮ）と比較したものを示す結果である。
【図２Ｂ】前記組み換えＬＧ蛋白質の濃度が細胞付着活性に及ぼす影響を調べた結果を示す結果である。
【図２Ｃ】ＨＯＫ−１６Ｂ細胞で前記組み換えＬＧ蛋白質の細胞付着活性及び付着された細胞の数を測定した結果を示す結果である。
【図２Ｄ】ＨＯＫ−１６Ｂ細胞で前記組み換えＬＧ蛋白質の細胞散布活性を測定した結果を示す結果である。
【図３】人間、ラット、マウス及び犬のラミニンα３鎖のＬＧ３ドメインの一部のアミノ酸配列を比較して、合成ペプチドのアミノ酸配列を示す図面である。
【図４Ａ】人間ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメイン由来の合成ペプチド（Ｐ１〜Ｐ５）の濃度変化による細胞付着活性を測定した結果である。
【図４Ｂ】ＨＯＫ−１６Ｂ細胞で前記合成ペプチドの細胞付着活性及び付着された細胞の数を測定した結果を示す結果である。
【図４Ｃ】ＨＯＫ−１６Ｂ細胞で前記合成ペプチドの細胞散布活性を測定した結果を示す結果である。
【図４Ｄ】ＨＯＫ−１６Ｂ細胞に、前記合成ペプチドの前処理が人間ラミニン５ α３鎖の組み換えＬＧ３蛋白質に対するＨＯＫ−１６Ｂ細胞付着の抑剤に及ぼす影響を調べた結果を示す。
【図５Ａ】ＨＯＫ−１６Ｂ細胞に対するインテグリン小単位の流式細胞の分析結果を示す図面である。
【図５Ｂ】人間ラミニン５ α３鎖の組み換えＬＧ３蛋白質による細胞付着活性が、インテグリンα３β１に対する抗体により抑制されることを示す結果である。
【図５Ｃ】人間ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメイン由来の合成ペプチドＰ４による細胞付着活性が、インテグリンα３β１に対する抗体により抑制されることを示す結果である。
【図６Ａ】人間ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメイン由来の合成ペプチドＰ４のＣ末端の切断ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｉ〜Ｐ４ Ｄ−Ｖ）及びＮ末端の切断ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｎ１〜Ｐ４ Ｄ−Ｎ６）のアミノ酸配列を示す図面である。
【図６Ｂ】コントロールＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びＣ末端の切断ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｉ，Ｐ４Ｄ-III及びＰ４ Ｄ−Ｖ）の細胞付着活性を示すグラフである。
【図６Ｃ】コントロールＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、Ｃ末端の切断ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｉ，Ｐ４Ｄ-III及びＰ４ Ｄ−Ｖ）及びＮ末端の切断ペプチド（Ｐ４Ｄ−Ｎ２，Ｐ４Ｄ-Ｎ４及びＰ４Ｄ−Ｎ６）に付着された細胞の数を示すグラフである。
【図６Ｄ】コントロールＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、Ｃ末端の切断ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｉ，Ｐ４Ｄ-III及びＰ４ Ｄ−Ｖ）及びＮ末端の切断ペプチド（Ｐ４Ｄ−Ｎ２，Ｐ４Ｄ-Ｎ４及びＰ４Ｄ−Ｎ６）の細胞散布活性を示すグラフである。
【図７Ａ】ペプチドＰ４のＡｌａに置換されたペプチド（Ｐ４−Ｓ１〜Ｐ４Ｓ−３）のアミノ酸配列を示す結果である。
【図７Ｂ】前記Ａｌａに置換されたペプチドの細胞付着活性及び散布活性を示すグラフである。
【図７Ｃ】前記Ａｌａに置換されたペプチドの細胞付着活性及び散布活性を示すグラフである。
【図８Ａ】ラミニンがＦＡＫのチロシン−３９７燐酸化に及ぼす影響を免疫ブロット分析で調べた結果を示す。
【図８Ｂ】人間ラミニン５ α３組み換えＬＧ３蛋白質が、ＦＡＫの多様な位置のチロシン燐酸化に及ぼす影響を免疫ブロット分析で調べた結果を示す図面である。
【図８Ｃ】人間ラミニン５ α３ ＬＧ３ドメイン由来の合成ペプチドが、ＦＡＫの多様な位置のチロシン燐酸化に及ぼす影響を免疫ブロット分析で調べた結果を示す図面である。
【図８Ｄ】ペプチドＰ４のＡｌａに置換されたペプチド（Ｐ４−Ｓ１〜Ｐ４Ｓ−３）が、ＦＡＫの−３９７、−５７７位置のチロシン燐酸化に及ぼす影響を免疫ブロット分析で調べた結果を示す図面である。
【図９Ａ】ポリスチレン（ＰＳ）、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）及び合成ペプチドＰ４を２４ウェルプレートにコーティングし、ＮＨＥＫ（人間常皮膚角化細胞）の細胞増殖による細胞数の増加を示すグラフである。
【図９Ｂ】ＰＳ、ＢＳＡ及び合成ペプチドＰ４を２４ウェルプレートにコーティングし、ＮＨＥＦ（皮膚線維芽細胞）の細胞増殖による細胞数の増加を示すグラフである。
【図１０Ａ】ペプチドＰ４によるＮＨＥＫ及びＮＨＥＦの細胞付着活性度を多様な対照群と比較した結果である。
【図１０Ｂ】ペプチドＰ４によるＮＨＥＫ及びＮＨＥＦの付着された細胞の数を多様な対照群と比較した結果である。
【図１０Ｃ】ペプチドＰ４によるＮＨＥＫ及びＮＨＥＦの散布された細胞の比率を多様な対照群と比較した結果である。ＰＳ：ポリスチレン、Ｂｅｓｃｈｉｔｉｎ Ｗ ｏｎｌｙ：ベスキチンＷ超極細繊維、ＢＳＡ：への牛血清アルブミンで処理されたベスキチンＷ超極細繊維、Ｐ１：コントロールとしてペプチドＰ１で処理されたベスキチンＷ超極細繊維、Ｐ４：機能性ペプチドＰ４で処理されたベスキチンＷ超極細繊維
【図１１Ａ】ペプチドＰ４の細胞付着活性度及び散布活性度を確認するための動物実験の結果であって、ラット皮膚の傷が治療される過程を３日目及び７日目に顕微鏡で確認した写真（Ｈ＆Ｅ、Ｘ１００）である。
【図１１Ｂ】ペプチドＰ４の細胞付着活性度及び散布活性度を確認するための動物実験の結果であって、ラット皮膚の傷が治療される過程を３日目及び７日目に顕微鏡で確認した写真（Ｈ＆Ｅ、Ｘ２００）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、細胞の付着・散布及びインテグリン結合を媒介する人間ラミニン５ α３鎖内の活性ドメインを糾明するために、５個の独立的に発現される組み換えＬＧ蛋白質（ｒＬＧ１〜ｒＬＧ５）を製造した。
【００１２】
本発明によって製造された組み換えＬＧ蛋白質のうちｒＬＧ１は、配列番号：２の人間ラミニンα３鎖のアミノ酸配列で７８２〜９７８残基を含み、ｒＬＧ２は９５９〜１１４８残基を、ｒＬＧ３は１１２８〜１３６４残基を、ｒＬＧ４は１３５２〜１５５５残基を、ｒＬＧ５は１５２２〜１７１３残基をそれぞれ含む。また、前記組み換えＬＧ蛋白質は、精製を容易にするために、選別標識としてＣ末端に６個のヒスチジン標識が結合された融合蛋白質の形態で発現される（図１Ａ及び図１Ｂを参照）。
【００１３】
それぞれのＬＧドメインをコード化する塩基配列及び選別標識をコード化する塩基配列を含むｃＤＮＡ断片を製造した後、該ｃＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターを製造し、この発現ベクターを大腸菌に形質転換させて得た形質転換体で組み換え蛋白質を発現させた後、発現された蛋白質を選別標識を利用してｒＬＧ１ないしｒＬＧ５を精製した（図１Ｃを参照）。
【００１４】
前記大腸菌形質転換体から分離・精製されたｒＬＧ１ないしｒＬＧ５の細胞の付着・散布の活性を調べた結果、５個のｒＬＧ蛋白質のうちｒＬＧ３のみが細胞付着の活性を表したが（図２Ａないし図２Ｃを参照）、ｒＬＧ３によるＨＯＫ−１６Ｂ細胞の付着は、２５μｇ／ｍｌのコーティング濃度で最大の付着活性を表し、これは、濃度依存的な様相を表した。また、ｒＬＧ３−コーティングプレートで、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞のうち４７％が、散布される細胞の形態学的な特徴である糸状仮足（filopodia）及び葉状仮足（lamellipodia）の類似膨脹を有する平らで、多角形の形状をした（図２Ｄを参照）。このような結果は、ｒＬＧ３蛋白質が細胞の付着・散布を促進して、その親分子であるラミニン５と類似した機能的特徴を表すということを提示する。また、ＬＧ３ドメイン媒介性細胞の付着・散布は、インテグリンα３β１により媒介されたが、これは、インテグリンα３β１が人間角化細胞内のラミニンに対する一次的な受容体であり、ラミニンが角化細胞の付着・散布の活性に重要なリガンドであるということを提示する。
【００１５】
細胞の付着・散布を媒介するラミニン５ α３ ＬＧ３ドメインで、細胞の付着を活性させるのに必須なアミノ酸残基を糾明するために、ＬＧ３ドメイン由来のアミノ酸残基１２９３〜１３３２部位内で５個の重なった１２−ｍｅｒペプチド（Ｐ１〜Ｐ５）を合成した（図３を参照）。前記のように合成されたペプチドのうちＰ１は、配列番号：２のアミノ酸配列で１２９３〜１３０４残基を、Ｐ２は、１２９７〜１３０８残基を、Ｐ３は、１３０５〜１３１６残基を、Ｐ４は、１３１２〜１３２３残基を、Ｐ５は、１３２１〜１３３２残基に該当するアミノ酸配列を有する。前記のように合成されたペプチドの細胞の付着・散布の活性を調べた結果、配列番号：１と記載されるＰＰＦＬＭＬＬＫＧＳＴＲ配列を有するペプチドＰ４が、ｒＬＧ３と同様に、濃度依存的な様相で強い細胞の付着・散布の活性を表した（図４Ａないし図４Ｃを参照）。
【００１６】
前記でペプチドＰ４の細胞散布活性がｒＬＧ３とほぼ類似していることを確認した本発明者らは、ＬＧ３ドメインの細胞付着の活性にペプチドＰ４が競争的に作用するかを調べた。その結果、ペプチドＰ４は、５１％程度ｒＬＧ３に対する細胞付着を抑制したが、他のペプチドは、いずれも３０分間１００μｇ／ｍｌのペプチドで前培養されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞で細胞付着の活性が低下しなかった（図４Ｄを参照）。これは、ペプチドＰ４の配列が、天然ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメインの細胞結合の部位として作用するということを表す。
【００１７】
また、細胞の付着・散布の活性を表す本発明のｒＬＧ３蛋白質及びペプチドＰ４は、インテグリンα３及びβ１の小単位に対する抗体により特異的に抑制されたが（図５Ｂ及び図５Ｃを参照）、これは、インテグリンα３β１が、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞でｒＬＧ３及びペプチドＰ４の全ての特異的な機能的受容体として作用するということ表す。
【００１８】
強力な細胞の付着・散布の活性を促進させ、インテグリンα３β１に結合するということが確認された配列番号：１のペプチドＰ４の生物学的活性の核心配列を決定するために、ペプチドＰ４からＣ末端が切断された５個の合成ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｉ〜Ｐ４ Ｄ−Ｖ）、及びＮ末端が切断された６個の合成ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｎ１〜Ｐ４ Ｄ−Ｎ６）を製造した（図６Ａを参照）。前記Ｃ末端が切断されたペプチド及びＮ末端が切断されたペプチドの細胞の付着・散布の活性を調べた結果、ペプチドＰ４でＣ末端アルギニン（Ａｒｇ）が欠失されたペプチドＰ４ Ｄ−Ｉが、ペプチドＰ４の対照群に比べて著しく低い細胞の付着・散布の活性を示し（図６Ｂないし図６Ｄを参照）、ペプチドＰ４で二つのＮ末端プロリン（Ｐｒｏ）が何れも欠失されたペプチドＰ４ Ｄ−Ｎ２が、ペプチドＰ４対照群に比べて著しく低い細胞の付着・散布の活性を示した（図６Ｃないし図６Ｄを参照）。
【００１９】
したがって、ペプチドＰ４内のＣ末端Ａｒｇの欠失及び二つのＮ末端Ｐｒｏの欠失が細胞の付着・散布の活性を著しく低下させるということが確認された。しかし、ペプチドＰ４で二つのＮ末端Ｐｒｏのうち一つのみが欠失されたＰ４ Ｄ−Ｎ１は、細胞の付着・散布の活性に大きな変化がなく、これを通じてペプチドＰ４で二つのＮ末端のＰｒｏのうち一つが欠失されたＰ４ペプチド断片も、細胞の付着・散布を促進するペプチドとして効果的であるということが分かった。
【００２０】
これにより、本発明者らは、配列番号：１のペプチドＰ４配列で、塩基性アミノ酸であるＡｒｇ及びリシン（Ｌｙｓ）の役割を糾明するために、第１３１９のＬｙｓ及び第１３２３のＡｒｇのそれぞれ、またはいずれもアラニン（Ａｌａ）に置換された合成ペプチド（Ｐ４−Ｓ１〜Ｐ４−Ｓ３）を製造し（図７Ａを参照）、これら細胞の付着・散布の活性を調べた。その結果、ペプチドＰ４対照群に比べて、ＡｒｇがＡｌａに置換されたＰ４−Ｓ２と、Ｌｙｓ及びＡｒｇが全てＡｌａに置換されたＰ４−Ｓ３との場合、細胞の付着・散布の活性が著しく低下した。しかし、ＬｙｓのみがＡｌａに置換されたＰ４−Ｓ１の細胞の付着・散布の活性に特別な影響を及ぼさなかった（図７Ｂ及び図７Ｃを参照）。したがって、ペプチドＰ４で塩基性残基であるＡｒｇが細胞付着活性に非常に重要であるということが分かる。前記結果は、ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメイン内のＰＰＦＬＭＬＬＫＧＳＴＲ配列（１３１２〜１３２３残基）が、細胞の散布・付着及びインテグリンα３β１の結合を担当する活性モチーフであるということを表す。
【００２１】
一方、ｒＬＧ３またはペプチドＰ４により媒介される信号機構を調べるために、ｒＬＧ３またはペプチドＰ４上に塗布されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞でＦＡＫの燐酸化程度を調べた結果、ラミニンコーティングされたプレートでのＦＡＫ燐酸化の程度が、ラミニンでコーティングされていないプレートに塗布されるか、または浮遊液の状態で保管されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞でのＦＡＫ燐酸化より著しく高かった（図８Ａを参照）。また、ラミニン、ｒＬＧ３またはペプチドＰ１ないしＰ５でコーティングされたプレートで、Ｔｙｒ−３９７、−４０７、−５７６、−５７７、及び−８６１位置のＦＡＫ燐酸化の程度を調べた結果、ラミニンまたはｒＬＧ３でコーティングされたプレートで培養された細胞のＴｙｒ−３９７ ＦＡＫ燐酸化の程度が、未処理対照群に比べてそれぞれ１６. ２及び８. ２倍向上した（図８Ｂを参照）。
【００２２】
また、ペプチドＰ４による人間の正常皮膚角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocytes:NHEK）及び皮膚線維芽細胞（ＮＨＥＦ）の細胞増殖による細胞数の増加は、特に、ＮＨＥＫで優秀であり（図９Ａ及び図９Ｂを参照）、細胞付着活性度及び散布活性度を調べた結果、Ｐ４ペプチドでコーティングされたベスキチンＷ超極細繊維での付着される細胞数及び散布される細胞数が他のコントロール群に比べて高かった（図１０Ａないし図１０Ｃを参照）。
【００２３】
前記結果より、人間ラミニン５ α３鎖の多様なドメインのうちＬＧ３ドメインが、インテグリンα３β１との結合により細胞の付着・散布の促進に必須であり、特に、前記ＬＧ３ドメイン内の配列番号：１のＰＰＦＬＭＬＬＫＧＳＴＲペプチド（配列番号：２の１３１２〜１３２３残基）が、インテグリンα３β１の依存性細胞の付着・散布を促進する活性モチーフであるということを確認した。
【００２４】
また、ｒＬＧ３及び配列番号：１のペプチドによる細胞の付着は、Ｔｙｒ−３９７及び−５７７位置のＦＡＫ燐酸化を上昇させたが、これは、組み換え蛋白質として発現された人間ラミニン５ ＬＧ３ドメインが、インテグリンに特異的に結合して決定的なラミニン機能を支持し、配列番号：１のペプチドが、インテグリンα３β１の結合のための活性モチーフであるということを立証する最初の報告である。
【００２５】
したがって、本発明の人間ラミニン５ α３組み換えＬＧ３ドメイン及び配列番号：１のペプチド、その断片または誘導体は、細胞付着活性の研究、創傷の治療、組織の再生、癌転移の抑制、組織工学及び他の治療学的な応用のために、ラミニン５の代替物として使用され得る。
【００２６】
これにより、本発明は、人間ラミニン５ α３組み換えＬＧ３ドメイン、配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド、その断片または誘導体を有効性分とする創傷の治療、火傷の治療、組織の再生及び癌転移の抑制のための薬学組成物を提供する。
【００２７】
本発明において、前記誘導体は、第１２のＡｒｇが保存されているか、または第１のＰｒｏまたは第２のＰｒｏが保存されていることを特徴とすることができる。
【００２８】
本発明において、該誘導体は、配列番号：１の第８のＬｙｓがＡｌａに置換された誘導体（Ｐ４−Ｓ１）であることを特徴とし、該断片は、配列番号：１の第１のＰｒｏ及び第２のＰｒｏのうちいずれか一つが欠失された断片（Ｐ４ Ｄ−Ｎ１）であることを特徴とすることができる。
【００２９】
本発明において、‘断片’とは、有効活性を有するペプチドで一つ以上のアミノ酸が欠失されたものを言い、該ペプチドと実質的に同一であるか、または類似した活性を有するものを言う。
【００３０】
本発明において、‘誘導体’とは、有効活性を有するペプチドで一つ以上のアミノ酸が置換されたものを言い、前記ペプチドと実質的に同一であるか、または類似した活性を有するものを言う。
【００３１】
本発明の薬学組成物の有効性分は、臨床投与時に非経口投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用され得る。すなわち、本発明のペプチド、その断片または誘導体は、実際に非経口の多様な剤形として投与され得るが、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートなどが使用され得る。
【００３２】
また、前記ペプチド、その断片または誘導体は、生理食塩水または有機溶媒のように、薬剤として許容される担体と混合して使用可能であり、ペプチドの安定性や吸水性を向上させるために、グルコース、蔗糖またはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子蛋白質または他の安定化剤が薬剤として使用され得る。
【００３３】
本発明の薬学組成物でペプチドの総有効量は、大きい丸薬の形態または相対的に短期間の拡散などにより単一投与量で患者に投与でき、多重投与量が長期間投与される分割治療方法により投与されても良い。前記ペプチドの濃度は、薬の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢及び健康状態などの多様な要因を考慮して患者の有効投与量が決定されるため、このような点を考慮するとき、当業者ならば、前記ペプチドの薬学的な組成物としての特定の用途による適切な有効投与量を決定できる。
【００３４】
また、本発明は、人間ラミニン５ α３組み換えＬＧ３ドメイン、配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド、その断片または誘導体を含む創傷被覆材を提供する。
【００３５】
皮膚とは、人体を外部の刺激から保護し、水分の損失を防止する機能を行う重要な装置の一つであって、皮膚に火傷や各種の外傷により欠損が発生すれば、その保護作用が喪失されて機能障害を起こす。また、水分の損失による多様な副作用及び外部からの細菌感染などを起こして、患部の治療を難しくするか、または２次的な機能障害または損傷のような追加的な副作用をもたらす。したがって、創傷の治癒を迅速に行い、２次的な各種の副作用を最小化するためには、適切な被覆材を利用した創傷の治癒が行わなければならない。
【００３６】
創傷被覆材は、皮膚の損傷が発生した患部を保護し、皮膚組織の再生を促進させるものであって、急増している皮膚損傷の患者に必須な重要な医療用品の一つである。一般的に、広範な火傷の部位を治療するとき、損傷した組織を火傷の部位から除去し、除去された部分を最終的な自家移植に先立って、一時的な火傷の被覆材で覆う。一時的な火傷の被覆材は、幾つかの治療の機能を行わなければならない。第一に、外部からの微生物の浸透による感染を防止するだけでなく、内部からの水分、塩、蛋白質の損失を防止する遮断膜として役割を行う。第二に、創傷の閉鎖を促進させて浄化及び創傷部位の再生を容易にする。第三に、痛みを緩和させる。
【００３７】
したがって、このような機能に加えて、該創傷被覆材が、損傷した皮膚細胞の再生および傷の治癒にも寄与できれば理想的である。
【００３８】
本発明による組織工学用支持体は生体組織の代用品を作って移植することにより体の機能を維持，向上または復元することを目的にする組織工学分野で用いられるすべての支持体を含む。このような組織工学用支持体が合成生高分子であるポリアミノ酸、ポリ酸無水物、ポリε−カプロラクトン、ポリオルソエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びこれらの共重合体であるポリ乳酸―グリコール酸（ＰＬＧＡ）などと、天然生高分子であるアルギン酸、キトサン、高アルギニン酸及びコラーゲンなどで製造された多孔性ポリ乳酸遮蔽膜が含まれるし、遮蔽膜としては多孔性ポリ乳酸遮蔽膜キチンまたはキトサンナノ繊維で製造された再生膜またはキチンまたはキトサンのフィルムの形の遮蔽膜が使用できるがこれに限定されない。
【００３９】
本発明のラミニン５ α３組み換えＬＧ３ドメイン、配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド、その断片または誘導体は、細胞の付着・散布の活性が優秀であり、これを含む創傷被覆材の効果が非常に優秀であると期待され、本発明でも既存の市販中の人工皮膚素材であるベスキチンＷ超極細繊維に本発明のペプチドＰ４をコーティングしたとき、細胞の付着活性度が非常に優秀であるということを確認することによってこれを立証した。
実施例
【００４０】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
【００４１】
ただし、下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
＜実験例１：細胞及び培養の条件＞
【００４２】
クローニングされたＨＰＶ−１６ゲノムで形質転換されて不滅化された人間口腔の角化細胞であるＨＯＫ−１６Ｂ細胞株（Park, N. H.ら, Carcinogenesis, 12:1627, 1991）を０. １５ミリモルのカルシウム及び補助的な成長因子ブレットキット（KGM;Clonetics, SanDiego, CA）を含む角化細胞基底培養液（keratinocyte basal medium: KGM）に培養した。正常な人間口腔角化細胞（Normal Human Oral Keratinocytes: NHOKs）は、以前に報告されたところによって準備した（Min, B. M.ら, Exp. Cell. Res. , 249:377, 1999）。具体的に、口腔手術を受けた健康な志願者（１８才〜３０才）の歯ぐきの上皮組織から、トリプシン処理により口腔角化細胞を分離した後、これをＫＧＭに一次培養した。約７０％の融合性を表した一次ＮＨＯＫｓを、６０ｍｍのペトリ皿当たり１×１０５細胞の濃度で塗布した後、８０％の融合性に至るまで培養した。８０％の融合性に至った細胞を継代培養し、これから２次培養されたＮＨＯＫｓを下記実験に使用した。
＜実験例２： 細胞の付着・散布活性の分析＞
【００４３】
細胞の付着活性の分析は、岡崎らにより報告された方法によって行った（Okazaki, I.ら, J. Biol. Chem. , 277:37070, 2002）。具体的に、２４−ウェル培養プレート（Nunc, Roskilde, Denmark）を多様な濃度のｒＬＧ蛋白質で４℃で一晩中コーティングした後に乾燥させた。基質コーティングされたプレートに１％の熱不活性牛血清アルブミン（BSA:Bovine Serum Albumin, Sigma）を含む燐酸化された緩衝食塩水（Phosphate Buffered Saline:PBS）を添加し、３７℃で１時間保管して遮断した後、ＰＢＳで２回洗浄した。前記実験例１で０. ０５％のトリプシン及び０. ５３ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳにより、上皮組織から分離した細胞を培地に再浮遊させ、各プレートに１×１０５細胞／５００μｌの濃度で添加した後、３７℃で１時間培養した。培養後、プレートをＰＢＳで２回洗浄して、付着されていない細胞を除去した。プレートに付着された細胞を１０％のホルマリンを含むＰＢＳで１５分間固定した後、ＰＢＳで２回洗浄し、０. ５％のクリスタルバイオレットで１時間染色した。前記プレートをＤＤＷで軽く３回洗浄した後、２％のＳＤＳで５分間溶血させた。吸光度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ５５０マイクロプレート読取器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用して５７０nmで測定した。
【００４４】
散布された細胞を確認するために、プレートに付着された細胞を１０％のホルマリンを含むＰＢＳで１５分間固定した後、ＰＢＳで２回洗浄し、０. ００５％のクリスタルバイオレットで１時間染色した。前記プレートをＤＤＷで軽く洗浄した。代表数を定めるために、各プレートを４等分した後、各領域当たり２箇所を１００倍の倍率でオリンパス顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を利用して写真を撮った。糸状仮足及び葉状仮足の類似膨脹を有する平らで多角形状の細胞を、散布された細胞と見なした。逆に、洗われずにプレートの表面に付着された状態で存在する細胞を、非散布細胞と見なした。
＜実験例３：流細胞分析＞
【００４５】
細胞表面のインテグリン発現レベルを調べるための流細胞分析は、ロデックなどの方法によって行った（Rodeck, U.ら, J. Cell Sci. , 110:113, 1997）。具体的に、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を０. ０５％のトリプシン及び０. ５３ミリモルのＥＤＴＡを含むＰＢＳで軽く処理して分離した後に洗浄し、抗インテグリンｍＡｂｓ（ａｎｔｉ−α２、α３、α５、α６、αｖ、β１及びβ４）と共に４℃で４５分間培養した。洗浄後、細胞をＦＩＴＣ標識２次抗体と共に４℃で４５分間培養した後、流細胞分析器（FACS, Calibur flow cytometer, Becton-Dickinson, San Jose, CA）で分析した。
＜実験例４：付着活性抑制の分析＞
【００４６】
ｒＬＧ３蛋白質及びペプチドＰ４に対するＨＯＫ−１６Ｂ細胞の受容体を同定するために、相異なる形態のインテグリンに対する５μｇ／ｍｌのｍＡｂｓまたは５ミリモルのＥＤＴＡをそれぞれ０. ５ｍｌの培養溶液内のＨＯＫ−１６Ｂ細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に添加した後、３７℃で３０分間前培養した。前培養された細胞を、２５μｇ／ｍｌ濃度のｒＬＧ３または１０μｇ／ウェル濃度のペプチドＰ４であらかじめコーティングされたプレートに移した後、３７℃でさらに１時間培養した。付着された細胞を前記実験例２で記述した方法によって定量して、細胞付着の活性抑制の程度を測定した。
＜実験例５：ＦＡＫ燐酸化の分析＞
【００４７】
ＦＡＫ燐酸化の分析は、シャングなどの方法によって行った（Shang, M.ら, J. Biol. Chem. , 276:33045, 2001）。具体的に、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞をトリプシン処理した後に洗浄し、０. １％のＢＳＡを含む無血清ＫＧＭに浮遊させて、３７℃で１時間培養した。６０ｍｍのペトリ皿をラミニン（５μｇ／ｍｌ）、ｒＬＧ３（２５μｇ／ｍｌ）またはＰ１ないしＰ５ペプチド（５０μｇ／皿）で４℃で一晩中コーティングした後に乾燥させた。付着性ＦＡＫの分析のために、１×１０６細胞を、コーティングされていないか、またはラミニン、ｒＬＧ３−または多様なペプチドでコーティングされたペトリ皿に添加した後、５％のＣＯ２が３７℃で１５分、３０分または６０分間付着されるように放置した。培養の末期に細胞を冷却ＰＢＳで洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝溶液［５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７. ４）、１５０ミリモルのＮａＣｌ、１％のノニデット Ｐ−４０、０. ５％のＮａ−デオキシコール酸塩、１ミリモルのＥＤＴＡ、０. １％のＳＤＳ、２ミリモルのＮａ３ＶＯ４、１ミリモルのグリセリンリン酸、１ミリモルのＰＭＳＦ及びプロテアーゼ抑制剤カクテル］を利用して溶解させた。溶解物を４℃で１０分間１２, ０００Ｘｇで遠心分離して、細胞質抽出物を分離した。
【００４８】
前記細胞質抽出物にＳＤＳ試料緩衝溶液［５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６. ８）、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、０. １％のブロモフェノール・ブルー、１００ミリモルのβ−メルカプトエタノール］を添加して蛋白質を変性させた後、８％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に展開した。蛋白質が展開されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをニトロセルロース膜へ電気的伝達を行った後、前記膜を総ＦＡＫのレベルを決定するために、多クローン性の抗ＦＡＫ抗体で免疫ブロッティングするか、またはチロシン燐酸化の程度を決定するために、多クローン性の抗ＦＡＫ（ｐＹ３９７）、（ｐＹ４０７）、（ｐＹ５７６）、（ｐＹ５７７）または（ｐＹ８６１）抗体を利用して免疫ブロッティングした。このとき、ＦＡＫ燐酸化の相対的な倍率誘導は、プレート上に塗布されたコントロール細胞の背景レベルに対する試料のＦＡＫ燐酸化の増加と定義され、次の通りに決定された：まず、ウェスタンブロットから燐酸化されたＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）及び総ＦＡＫ（ｔ−ＦＡＫ）信号の濃度計測器の強度をＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（Fuji photo film, Japan）で測定した。各試料のｔ−ＦＡＫに対するｐ−ＦＡＫの比率（ｐ−ＦＡＫ／ｔ−ＦＡＫ）を、蛋白質の展開における差で補正した。前記比率は、ＦＡＫ燐酸化の相対的な倍率誘導を得るために、陰性コントロールのｐ−ＦＡＫ／ｔ−ＦＡＫ比に対して標準化した。
＜実施例１：人間ラミニン５ α３鎖の組み換えＬＧドメインの発現＞
【００４９】
人間ラミニン５とインテグリンとの結合を糾明するために、人間ラミニン５の付着ドメインであるα３鎖の５個のＬＧドメインを、それぞれ大腸菌でモノマーの水溶性組み換え蛋白質の形態で発現させた。
【００５０】
具体的に、人間ラミニン５ α３鎖ＤＮＡは、ＮＨＯＫｓから分離されたｍＲＮＡを使用して、メーカーの指針によってスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（GibcoBRL, Grand Island, NY）を利用する逆転写酵素の連鎖重合反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりクローニングした。このように、クローニングされたラミニン５ α３鎖ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、ラミニン５ α３鎖の５個のＣ末端ＬＧ ｃＤＮＡ断片（ＬＧ１〜ＬＧ５）を増幅させた後、ＬＧ１ないしＬＧ３断片は、それぞれｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Promega, Madison, WI）に、ＬＧ４及びＬＧ５断片は、それぞれｐＥＺ−Ｔベクター（RNA, Seoul, Korea）にクローニングした。ＰＣＲに使用されたプライマーは、次の通りである：ＬＧ１、配列番号：３（センス）及び配列番号：４（アンチセンス）；ＬＧ２、配列番号：５（センス）及び配列番号：６（アンチセンス）；ＬＧ３、配列番号：７（センス）及び配列番号：８（アンチセンス）；ＬＧ４、配列番号：９（センス）及び配列番号：１０（アンチセンス）；ＬＧ５、配列番号：１１（センス）及び配列番号：１２（アンチセンス）。あらゆるプラスミド作成物（コンストラクト）は、塩基配列を分析して、断片が正しく挿入されたか否かを確認した。前記ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター及びｐＥＺ−ＴベクターにクローニングされたＬＧ ＤＮＡ断片のうちＬＧ１断片は、哺乳動物の発現ベクターであるｐＥＴ−３２ａ（＋）（Novagen, Madison, WI）のＥｃｏＲＩの部位に、ＬＧ２断片は、同じベクターのＮｃｏＩ−ＳａｌＩの部位にクローニングし、ＬＧ３ないしＬＧ５断片は、それぞれ哺乳動物の発現ベクターであるｐＲＳＥＴ（Invitrogen, Carlsbad, CA）のＮｃｏＩの部位にクローニングした。
【００５１】
組み換え蛋白質の精製を容易にするために、この過程で組み換え蛋白質のＣ末端に６個のヒスチジン標識（Ｈｉｓ６−ｔａｇ）を連結させた。正しい方向にＤＮＡの断片が挿入されたクローンを選択し、クローニングの過程中に突然変異や欠失が発生したかを配列分析によって確認した。前記発現ベクターでそれぞれ形質転換させた大腸菌Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＬ２１の菌株を、５９５nmでの光学濃度（OＤ）が０. ５ないし０. ６になるまで３７℃のＬＢ培地で培養した後、１ミリモルのＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Promega）を添加し、組み換えＬＧドメイン蛋白質の発現を誘導した。３７℃で５時間蛋白質の発現を誘導した後、細胞を１０分間６, ０００ｒｐｍで遠心分離して回収した。細胞沈殿物は、使用前まで−８０℃で保管した。
【００５２】
蛋白質の精製のために、前記細胞沈殿物を１ミリモルのフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｓｉｇｍａ）を含む冷却溶解緩衝溶液（１００ミリモルのＮａＨ２ＰＯ４, １０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍのウレア, ｐＨ８. ０）に浮遊させた。前記細胞浮遊液を、泡が立たないように留意しながら、１０ｍｌのピペットを通過させて細胞を溶解させた。これから得た細胞溶解物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸アガロース（Qiagen, Valencia, CA）カラムにローディングした。前記カラムを、１０ミリモルのイミダゾールを含む溶解緩衝溶液で洗浄した後、２５ミリモルのイミダゾールを含む溶解緩衝溶液を利用して、カラムに吸着された蛋白質を溶出させた。
【００５３】
溶出した組み換え蛋白質を、１００ミリモルのＮａＨ２ＰＯ４及び１ミリモルのフッ化フェニルメチルスルホニルを含む１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ３. ０）緩衝溶液で高濃度から低濃度（３Ｍ、２Ｍ、１Ｍまたは０. ５Ｍ）までのウレアで連続的に透析した後、最後に、１ミリモルのフッ化フェニルメチルスルホニルを含むＰＢＳ（ｐＨ３. ０）で透析して再生させた。透析されたｒＬＧ蛋白質をセントリコン機器（Centricon YM-10, Millipore, Bedford, MA）を利用して０. ５μｇ／ｍｌの濃度で濃縮させた後、使用するまで−８０℃で保管した。蛋白質の濃度は、バイオ・ラッド蛋白質分析キット（Hercules, CA）を利用して測定した。
【００５４】
全体α３鎖分子内の組み換え蛋白質の対応アミノ酸の部位を図１Ａに示した。図１Ａでラミニン５ α３鎖のドメイン構造（開放されたカラム）は、ＩＩＩａ、Ｉ／ＩＩ及びＬＧ１−ＬＧ５で表示され、陰影部位は、シグナルペプチドを表す。また、閉鎖された棒は、本発明によって製造された組み換えＬＧ蛋白質の位置を示し、括弧の中の数字は、全体α３鎖分子内の組み換えＬＧ蛋白質の相応するアミノ酸の位置を示す。このように製造された組み換えＬＧ蛋白質のうち、ｒＬＧ１は、配列番号：２の人間ラミニンα３鎖のアミノ酸配列で７８２〜９７８残基を含み、ｒＬＧ２は、９５９〜１１４８残基を、ｒＬＧ３は、１１２８〜１３６４残基を、ｒＬＧ４は、１３５２〜１５５５残基を、ｒＬＧ５は、１５２２〜１７１３残基を含む。
【００５５】
本発明で製造された組み換えＬＧ蛋白質は、何れも蛋白質の折り畳みを容易にするために、３個ないし２５個のアミノ酸によって隣接するドメインまで延び、蛋白質の精製及び同定の便宜のために、それぞれのＮ末端に６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）が標識された融合蛋白質の形態で発現された（図１Ｃ）。本発明によって、大腸菌でモノマーの水溶性融合蛋白質の形態で発現されたｒＬＧ１、ｒＬＧ２、ｒＬＧ３、ｒＬＧ４及びｒＬＧ５蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけて電気泳動を行った後にクマシー・ブルーで染色して、各組み換え蛋白質の分子量がそれぞれ４３、３９、３２、３０及び２９ｋＤａであるということを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色によって確認されたｒＬＧ蛋白質を、変性条件下でＮｉ２＋−ニトリロトリ酢酸−アガロースを利用してほぼ均一に分離した（図１Ｃ）。前記５種類のｒＬＧｓ発現レベルは互いに類似しており、平均的には、０. ５ｌの細菌培養から約０. ５ｍｇの精製されたｒＬＧ蛋白質を得た。
＜実施例２：人間ラミニン５ α３鎖ｒＬＧの細胞の付着・散布の活性＞
【００５６】
前記実施例１で製造された人間ラミニン５ α３組み換えＬＧ蛋白質が、それぞれ細胞の付着・散布に如何なる影響を及ぼすかを調べるために、これらの細胞の付着・散布の活性を、実験例２に記載された方法によって測定した。
【００５７】
その結果、５個のｒＬＧ蛋白質のうち、ｒＬＧ３のみが細胞付着の活性を表したが（図２Ａないし図２Ｃ）、ｒＬＧ３に対するＨＯＫ−１６Ｂ細胞の付着は、２５μｇ／ｍｌのコーティング濃度で最大の付着活性を表し、これは、濃度依存的な様相を表した（図２Ｂ）。図２Ｂで、ＢＳＡ及びラミニンは、それぞれ陰性及び陽性のコントロールとして使用された。２５μｇ／ｍｌまたはこれより高いコーティング濃度でｒＬＧ１、ｒＬＧ２、ｒＬＧ４及びｒＬＧ５をＢＳＡコントロールと比較したとき、同じ条件下で細胞付着の活性をほとんど表さなかった（図２Ｂ及び図２Ｃ）。５０μｇ／ｍｌのｒＬＧ３で細胞付着の活性は、５μｇ／ｍｌのラミニンコーティングされたコントロールと比較したとき、約４５％低下した（図２Ａ）。
【００５８】
ラミニン５ α３鎖ｒＬＧ３の付着活性をさらに分析するために、付着された細胞が基底層に拘束されているか、それとも基底層上に散布されているかを調べた。付着分析において、ｒＬＧｓに付着されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞を洗浄及び固定し、かつクリスタルバイオレットで染色した後、染色された細胞を分析した。これから決定されたｒＬＧｓの細胞付着の活性プロファイルは、吸光光度計により決定されたｒＬＧｓのプロファイルと非常に類似していた（図２Ｃ）。
【００５９】
また、実験例２に記述した方法によって、ｒＬＧｓのＨＯＫ−１６Ｂ細胞に対する散布活性を調べた結果、ｒＬＧ３−コーティングプレートで、４７％のＨＯＫ−１６Ｂ細胞が散布される細胞の形態学的な特徴である糸状仮足及び葉状仮足の類似膨脹を有する、平らでかつ多角形状を示した（図２Ｄ）。ｒＬＧ３に対して残存する非散布性細胞は、洗われずにプレートの表面に付着された状態で存在した。それに対し、ｒＬＧ１−、ｒＬＧ２−、ｒＬＧ４−またはｒＬＧ５−コーティングされたプレートでは最小の細胞散布が観察された。前記結果は、組み換えＬＧ３ドメインが細胞の付着・散布を促進して、その親分子であるラミニン５と類似した機能的な特徴を表すということを提示する。
＜実施例３：細胞の付着・散布に効果的な人間ラミニン５ α３鎖ＬＧ配列の同定＞
【００６０】
前記実施例２で、人間ラミニン５ α３鎖ＬＧ３ドメインが、細胞の付着・散布を媒介するという事実を確認した。また、ＬＧ３ドメイン内のＣ末端の２８個のアミノ酸（１２９７〜１３２４残基）及び８３個のアミノ酸（１２１４〜１２９６残基）部位が、それぞれ細胞の付着及び移動性を促進させると報告された（Kariya, Y.ら, J. Cell Biochem. , 88:506, 2003）。これにより、本発明者らは、ラミニン５ α３鎖ＬＧドメインで細胞付着の活性を付与するのに必須なアミノ酸残基を糾明するために、ＬＧ３ドメイン由来のアミノ酸残基１２９３〜１３３２の部位内で５個の重なった１２−ｍｅｒペプチドを、大韓民国基礎科学研究所でパイオニアペプチド合成器（Applied Biosystems, Forster City, CA）でＣ末端アミドを利用したＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）基礎固形相方法によって合成した（図３）。図３で矢印は、合成ペプチドの位置を示す。推定されたβ筋構造は灰色の箱に入れ、ペプチドＰ４の基本アミノ酸Ｌｙｓ及びＡｒｇは白色の箱に入れた（http://www.bmm.icnet.uk/〜3djigsaw/dom_fish）。合成されたペプチドは、逆相高性能の液体クロマトグラフィによって精製され、高性能の液体クロマトグラフィ及び質量分光分析器を使用して特徴を分析した。このように合成されたペプチドのうちＰ１は、配列番号：２のアミノ酸配列で１２９３〜１３０４残基、Ｐ２は、１２９７〜１３０８残基、Ｐ３は、１３０５〜１３１６残基、Ｐ４は、１３１２〜１３２３残基、Ｐ５は、１３２１〜１３３２残基に該当するアミノ酸配列を有する。
【００６１】
前記のように合成されたペプチドを、実験例２と同じ方法によってペプチドでコーティングされたプレート上で細胞の付着・散布の活性を、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を利用して調べた。２４ウェルプレートをそれぞれ１０、２０、３０、４０及び５０μg／ウェル濃度のペプチドＰ１ないしＰ５でコーティングした。ＨＯＫ−１６Ｂ細胞をペプチドでコーティングされたプレートに添加し、無血清培地で１時間反応させた。未付着細胞を除去した後に付着細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、染色された細胞を分析した。吸光度は、マイクロプレート読取器を利用して５７０nmで測定した。このとき、ＢＳＡ及びｒＬＧ３をそれぞれ陰性及び陽性コントロールとして使用した。
【００６２】
その結果、ペプチドＰ４（ＰＰＦＬＭＬＬＫＧＳＴＲ）は、強い濃度依存的細胞の付着活性を表し、最大の細胞付着の活性は、ペプチドＰ４をプレートに１０μg／ウェル濃度以上にコーティングする場合に得られた。しかし、非常に高いコーティング濃度でさえペプチドＰ１、Ｐ２及びＰ３は付着活性を表さず、ペプチドＰ５は、２５μg／ウェル以上の濃度で濃度依存的様相で、非常に弱い付着活性を表した（図４Ａ）。
【００６３】
また、１０μg／ウェルコーティング濃度でペプチドの付着活性プロファイルは、細胞付着の分析で細胞数の測定により決定されたが、何れもほぼ同じ様相の細胞付着が観察された（図４Ｂ）。ペプチドＰ４の細胞付着の活性は、ｒＬＧ３の付着活性と類似していた。
【００６４】
ペプチドＰ４の付着活性を詳細に分析するために、付着された細胞が基底層に拘束されているか、それとも基底層上に散布されているかを調べた。このとき、ＢＳＡ及びｒＬＧ３をそれぞれ陰性及び陽性のコントロールとして使用し、散布形態を表す細胞の比率は、総付着細胞の数を散布細胞の数で除算して定量的に計算した。その結果、ペプチドＰ４でコーティングされたプレートで、３５％のＨＯＫ−１６Ｂ細胞が散布される細胞の形態学的な特徴を表したが、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３またはＰ５でコーティングされたプレートでは何らの散布細胞も観察されなかった（図４Ｃ）。
【００６５】
前記でペプチドＰ４の細胞の付着・散布の活性が、ｒＬＧ３とほぼ類似しているということが確認された。これにより、本発明者らは、ＬＧ３ドメインの細胞付着の活性にペプチドＰ４が競争的に作用しているかを、実験例４に記載された方法によって調べた（図４Ｄ）。まず、精製されたｒＬＧ３蛋白質（２５μｇ／ｍｌ）を２４ウェルプレートにコーティングした。ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を、ペプチドが添加されていないか、または多様なペプチド（１００μｇ／ｍｌ）が添加された培地で３７℃で３０分間前培養した。前培養された細胞をｒＬＧ３でコーティングされたプレートに添加した後、無血清培地内で１時間反応させた。未付着細胞を除去した後に付着細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。コントロール培養物（ペプチドなしに前培養されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞）の平均付着活性を１００％と見なし、結果は、４回の独立的な実験の平均±Ｓ. Ｄ. で表した。その結果、合成ペプチドＰ４は、約５１％のｒＬＧ３に対する細胞の付着を抑制したが、他のペプチドは、何れも３０分間１００μｇ／ｍｌのペプチドで前培養されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞で、ｒＬＧ３に対する細胞付着の活性を低下させなかった。これは、ペプチドＰ４配列（ＰＰＦＬＭＬＬＫＧＳＴＲ）が、天然ラミニン５ α３鎖ＬＧ３ドメインの細胞結合部位として作用するということを表すものである。
＜実施例４：インテグリンα３β１の依存的なｒＬＧ３及びペプチドＰ４に対する細胞の付着＞
【００６６】
本発明者らは、組み換えＬＧ３ドメイン及びペプチドＰ４の細胞の付着・散布の活性に関与する細胞表面の受容体を糾明するために、ｒＬＧ３またはペプチドＰ４でコーティングされた表面に付着するＨＯＫ−１６Ｂ細胞の表面に発現されるインテグリンの種類を、インテグリン小単位に対する機能遮断の単クローン性抗体（Chemicon Temecula, CA）を使用するＦＡＣＳ分析により決定した。実験例３のように、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞をα２、α３、α５、α６、αｖ、β１またはβ４インテグリン小単位に特異的なｍＡＢｓと共に培養した後流細胞分析のためのＦＩＴＣ−接合２次抗体で染色して流細胞分析を行った。このとき、陰性コントロールは、２次抗体のみで培養した。結果は、蛍光強度の関数（×軸）としてプロッティングされた細胞数（Ｙ軸）で表した。その結果、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞がα３β１、α６β１及びα６β４インテグリンを含む多様なインテグリンを発現するということを確認した（図５Ａ）。
【００６７】
一方、リガンドとインテグリンとの相互作用は、２価陽イオンを要求すると知られている。これにより、本発明者らは、前記相互作用において陽イオンの役割を決定するために、ｒＬＧ３−及びペプチドＰ４でコーティングされたプレートでのＨＯＫ−１６Ｂ細胞の付着に金属キレート剤であるＥＤＴＡが及ぼす影響を調べた。ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を５ミリモルのＥＤＴＡまたはインテグリンα３（Ｐ１Ｂ５）、β１（６Ｓ６）及びα６（ＮＫＩ−ＧｏＨ３）小単位に対する機能遮断ｍＡｂｓ（Chemicon Temecula, CA） ５μｇ／ｍｌと共に、３７℃で３０分間前培養した後、２５μｇ／ｍｌのｒＬＧ３であらかじめコーティングされたプレートに接種して１時間培養した。未付着細胞を除去した後に付着細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、染色された細胞を分析した。コントロール培養物（ＥＤＴＡまたはインテグリン抗体なしに前培養されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞）の平均付着の活性を１００％と見なした。その結果、ｒＬＧ３に対する細胞の付着は、５ミリモルのＥＤＴＡによりほぼ完壁に抑制された（図５Ｂ）。これと同様に、ｒＬＧ３でコーティングされたプレートよりは低かったが、５ミリモルのＥＤＴＡ存在下で１０μg／ウェルの濃度でペプチドＰ４がコーティングされたプレートでも、細胞付着活性の低下が観察された（図５Ｃ）。これは、ｒＬＧ３及びペプチドＰ４に対する細胞表面の受容体がリガンドとの相互作用のために、２価陽イオンを必要とするインテグリンのうち一つであるということを提示する。
【００６８】
また、インテグリン小単位に対する機能遮断ｍＡｂｓが、ｒＬＧ３またはペプチドＰ４でコーティングされた表面に対するＨＯＫ−１６Ｂ細胞の付着活性に及ぼす効果を調べた。その結果、ｒＬＧ３またはペプチドＰ４でコーティングされた表面に対する付着は、α３及びβ１小単位に対する抗体により特異的に抑制されたが（図５Ｂ及び図５Ｃ）、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞の抗インテグリンα３抗体の処理は、ｒＬＧ３及びペプチドＰ４の付着活性をそれぞれ７１％及び４９％ずつ抑制した一方、抗インテグリンβ１抗体の処理は、ｒＬＧ３及びペプチドＰ４の付着活性をそれぞれ７１％及び５４％ずつ抑制した。前記結果から、インテグリンα３β１が、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞でｒＬＧ３及びペプチドＰ４全ての特異的な機能的受容体であり、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞に対するペプチドＰ４の細胞付着活性が、ｒＬＧ３に比べて、インテグリンα３β１との少し弱い相互作用によって媒介されるということが分かる。
＜実施例５：ペプチドＰ４のＣ末端の切断及びＡｌａに置換されたペプチドの細胞付着の活性＞
【００６９】
前記実施例４で、ペプチドＰ４が強力な細胞の付着・散布の活性を促進させ、インテグリンα３β１に結合するということが確認された。これにより、本発明者らは、ペプチドＰ４で生物学的な活性の核心配列を決定するために、ペプチドＰ４からＣ末端が切断された５個の合成ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｉ〜Ｐ４ Ｄ−Ｖ）及びＮ末端が切断された６個の合成ペプチド（Ｐ４ Ｄ−Ｎ１〜Ｐ４ Ｄ−Ｎ６）を製造し（図６Ａ）、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を利用したペプチドでコーティングされたプレート上で細胞の付着・散布の活性に及ぼす効果を調べた。２４ウェルプレートを、１０μg／ウェル濃度の前記Ｃ末端の切断されたペプチドまたはＮ末端の切断されたペプチドでコーティングした後、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を前記プレートに添加し、無血清培地で１時間培養した。未付着細胞を除去した後に付着細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、染色された細胞を分析した。吸光度は、マイクロプレート読取器を利用して５７０nmで測定した。ＢＳＡ及びペプチドＰ４をそれぞれ陰性及び陽性コントロールとして使用した。
【００７０】
その結果、ペプチドＰ４でＣ末端Ａｒｇが欠失されたペプチドＰ４ Ｄ−Ｉが、ペプチドＰ４対照群に比べて著しく低い細胞付着の活性を表した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。しかし、ペプチドＰ４でＣ末端アミノ酸の追加的な欠失は、Ｐ４ Ｄ−Ｉと類似しているか、または少し低下した細胞付着の活性を表した。これと同様に、５個のＣ末端の切断ペプチドの細胞散布の活性も、ペプチドＰ４コントロールに比べて著しく低く（図６Ｄ）、細胞散布様相は、細胞付着プロファイルとほぼ同じであった。
【００７１】
前記でペプチドＰ４内のＣ末端Ａｒｇの欠失が、細胞付着活性を著しく低下させるということが確認された。
【００７２】
また、ペプチドＰ４で、二つのＮ末端Ｐｒｏのうち一つのみが欠失されたペプチドＰ４ Ｄ−Ｎ１の場合、Ｐ４コントロールに比べて付着活性及び散布活性が大きく低下しなかったが、二つのＮ末端Ｐｒｏが何れも欠失されたＰ４ Ｄ−Ｎ２の付着活性及び散布活性は著しく低くなった（図６Ｃ及び図６Ｄ）。しかし、ペプチドＰ４でＮ末端アミノ酸の追加的な欠失は、Ｃ末端アミノ酸が欠失されたペプチドＰ４と類似しているか、またはそれより著しく低い細胞の付着活性及び散布活性を表した。
【００７３】
ペプチドＰ４配列で塩基性アミノ酸のＡｒｇ及びＬｙｓが細胞付着の活性に及ぼす影響を糾明するために、Ｌｙｓ１３１９及びＡｒｇ１３２３がそれぞれ、または何れもＡｌａに置換された合成ペプチド（Ｐ４−Ｓ１〜Ｐ４−Ｓ３）を製造し（図７Ａ）、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を利用したペプチドでコーティングされたプレート上で、これらの細胞の付着・散布の活性を調べた（図７Ｂ及び図７Ｃ）。
【００７４】
２４ウェルプレートを１０μg／ウェル濃度のペプチドでコーティングした後、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を前記プレートに添加し、無血清培地で１時間反応させた。未付着細胞を除去した後に付着細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、染色された細胞を分析した。ＢＳＡ及びペプチドＰ４をそれぞれ陰性及び陽性コントロールとして使用し、結果を４回の独立的な実験の平均±Ｓ. Ｄ. で表した。
【００７５】
その結果、ペプチドＰ４対照群に比べて、ＡｒｇがＡｌａに置換されたＰ４−Ｓ２と、Ｌｙｓ及びＡｒｇが何れもＡｌａに置換されたＰ４−Ｓ３との場合、細胞付着活性及び散布活性が著しく低下した。しかし、ＬｙｓのみがＡｌａに置換されたＰ４−Ｓ１の細胞の付着・散布の活性には大きな変化がなかった（図７Ｂ及び図７Ｃ）。これからペプチドＰ４で塩基性であるＡｒｇが、ペプチドＰ４の細胞の付着・散布の活性に必須であるということを確認した。前記結果は、ラミニン５ α３鎖のＬＧ３ドメイン内のＰＰＦＬＭＬＬＫＧＳＴＲ配列（１３１２〜１３２３残基）が細胞の付着・散布及びインテグリンα３β１−結合を担当する活性モチーフであるということを表す。
＜実施例６：ｒＬＧ３−またはペプチドＰ４がＦＡＫのＴｙｒ−３９７及び−５７７位置の燐酸化に及ぼす影響＞
【００７６】
インテグリンは、付着受容体だけでなく、信号伝達体としても作用するということが知られている（Schwartz, M. A.ら, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. , 11:549, 1995;Shoenwaelder, S. M. and Burridge, K. , J. Biol. Chem. , 274:14359, 1999）。細胞外基質蛋白質に対するインテグリンの活性は、細胞外基質蛋白質の構成成分に対する細胞付着を導く主要チロシン燐酸化蛋白質である病巣付着キナーゼ（ＦＡＫ）の燐酸化を向上させる（Clark, E. A. and Brugge, J. S. , Science, 268:233, 1995;Guan, J. L. , Int. J. Biochem. Cell Biol. , 29:1085, 1997;Giancotti, F. G. and Ruoslahti, E. , Science, 285:1028, 1999）。ＦＡＫ Ｔｙｒ−３９７、−４０７、−５７６、−５７７、−８６１及び−９２５が燐酸受容体の部位に同定されたが、これらのうちＴｙｒ−３９７が、ＦＡＫ自動燐酸化の主要部位として報告された（Schlaepfer, D. D.ら, Nature, 372:786, 1994）。
【００７７】
これにより、本発明者らは、ｒＬＧ３またはペプチドＰ４により媒介される信号機構を調べるために、ＦＡＫ燐酸化をｒＬＧ３またはペプチドＰ４上に塗布されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞で調べた。ラミニンは、α３β１インテグリンに対する対照群リガンドの結合によって含まれた（Lampe, P. D.ら, J. Cell Biol. , 143:1735, 1998）。まず、ラミニンでコーティングされたか、またはコーティングされていないプレート上で、Ｔｙｒ−３９７ＦＡＫ燐酸化の程度を１５分、３０分または６０分間、ＨＯＫ−１６Ｂ細胞を利用して実験例５に記載された方法によってＦＡＫ燐酸化の分析を行った。
【００７８】
トリプシン処理により分離したＨＯＫ−１６Ｂ細胞を１時間浮遊させた後、散布液の状態（Ｓｕｓ）で保管するか、またはラミニン（５μｇ／ｍｌ）でコーティングされるか、またはコーティングされていない６０ｍｍの培養皿に再塗布した。細胞がプレートに付着されるように、１５分、３０分または６０分間放置した後、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）を抗ＦＡＫｐ−Ｙ３９７抗体（Biosource, Camarillo, CA）で免疫分析した。その結果、ラミニンでコーティングされたプレートでのＦＡＫ燐酸化の程度が、ラミニンでコーティングされていないプレートに塗布されるか、または浮遊液の状態で保管されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞のＦＡＫ燐酸化より著しく高かった。このような効果は１５分以内に観察され、ラミニンでコーティングされたプレートに露出された後、１５分で最高値を示した（図８Ａ）。
【００７９】
これにより、Ｔｙｒ−３９７、−４０７、−５７６、−５７７、及び−８６１位置でのＦＡＫ燐酸化の程度をラミニン（５μｇ／ｍｌ）、ｒＬＧ３（２５μｇ／ｍｌ）、またはペプチドＰ１ないしＰ５（５０μｇ／６０ｍｍの皿）でコーティングされたプレートで１５分間培養されたＨＯＫ−１６Ｂ細胞で調べた。細胞溶解物を抗ＦＡＫｐ−Ｙ３９７、ｐ−Ｙ４０７、ｐ−Ｙ５７６、ｐ−Ｙ５７７またはｐ−Ｙ８６１抗体（Biosource, Camarillo, CA）で免疫分析し、総ＦＡＫのレベルは、抗ＦＡＫ抗体（Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY）を使用して検出した。各試料で、ｔ−ＦＡＫに対するｐ−ＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ／ｔ−ＦＡＫ）の比率は、蛋白質ローディングでの差を補正して計算した。ＦＡＫ燐酸化の相対的な倍率誘導を得るために、前記比率を、陰性コントロール（すなわち、プレート上に塗布された細胞）のｐ−ＦＡＫ／ｔ−ＦＡＫの割合で標準化させた。その結果、ラミニンまたはｒＬＧ３−コーティングされたプレートで培養された細胞のＴｙｒ−３９７ ＦＡＫ燐酸化の程度が、未処理コントロールに比べてそれぞれ１６. ２及び８. ２倍向上した（図８Ｂ）。これは、ラミニンがＦＡＫのＴｙｒ燐酸化を誘導するという事実と一致する（Clark, E. A. and Brugge, J. S. , Science, 268:233, 1995;Guan, J. L. , Int. J. Biochem. Cell Biol. , 29:1085, 1997;Giancotti,F. G. and Ruoslahti, E. , Science, 285:1028, 1999）。
【００８０】
ペプチドＰ４に付着された細胞でのＴｙｒ−３９７ＦＡＫ燐酸化のレベルが、ラミニンに付着された細胞より低くても、他のペプチドに付着された細胞でのＦＡＫ燐酸化よりはさらに高かった（図８Ｃ）。また、ペプチドＰ４に塗布された細胞でチロシン−５７７ ＦＡＫ燐酸化のレベルが、他のペプチドに塗布された細胞よりやや高かったが、ラミニンに塗布された細胞よりは依然として低かった。しかし、ＦＡＫチロシン−４０７、−５７６、及び−８６１でのこのような変化は、類似した条件で調査されたラミニン、ｒＬＧ３、または他のペプチドでは観察されなかったが（図８Ｂ）、これは、ラミニン、ｒＬＧ３及びペプチドＰ４が個別的なインテグリンα３β１の媒介信号機構を活性化させるということを意味する。
【００８１】
ペプチドＰ４で、ＡｒｇがＡｌａに置換された合成ペプチドＰ４−Ｓ２、及びＬｙｓ及びＡｒｇが何れもＡｌａに置換された合成ペプチドＰ４−Ｓ３が、対照群であるペプチドＰ４に比べて細胞の付着を著しく抑制したため、本発明者らは、ＦＡＫのＴｙｒ燐酸化において、ペプチドＰ４配列内の二つの塩基性アミノ酸の役割を糾明するために、ペプチドＰ４−Ｓ１ないしＰ４−Ｓ３に付着するＨＯＫ−１６Ｂ細胞内のＴｙｒ−３９７及び−５７７位置でのＦＡＫ燐酸化のレベルを調べた。ＬｙｓがＡｌａに置換されたペプチドＰ４−Ｓ１上に塗布された細胞で、Ｔｙｒ−３９７位置のＦＡＫ燐酸化は、ペプチドＰ４の場合と類似していた。しかし、ペプチドＰ４−Ｓ２及びＰ４−Ｓ３上に塗布された細胞でのＦＡＫ燐酸化は、ペプチドＰ４に比べて著しく低下した（図８Ｄの上部パネル）。これと同様に、ＦＡＫＴｙｒ−５７７でのこのような変化が、類似した条件下でペプチドＰ４−Ｓ１ないしＰ４−Ｓ３上で観察された（図８Ｄの下部パネル）。前記結果は、細胞付着活性と密接した関連のあるペプチドＰ４内の塩基性残基であるＡｒｇ１３２３が、ＦＡＫのＴｙｒ燐酸化に要求されるということを表す。
＜実施例７：Ｐ４ペプチドによるＮＨＥＫ及びＮＨＥＦの細胞付着活性度の測定＞
＜７−１：ＮＨＥＫの準備＞
【００８２】
ＮＨＥＫは、組織標本を１才〜３才の健康な人の表皮組織から採取して準備した。前記組織標本を、３Ｘの抗生剤が含まれたカルシウム及びマグネシウムが含まれていないハンクス平衡塩類溶液（ＣＭＦ−ＨＢＳＳ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で３回洗浄し、表皮組織から上皮層を分離するために、コラゲナーゼ（１. ０ｍｇ／ｍｌ；sigma Chemical Co. ）及びディスパーゼ（２. ４ｍｇ／ｍｌ；Boeringer-Mannheim）を含有したＣＭＦ−ＨＢＳＳを添加して、９５％の空気及び５％の二酸化炭素の条件下で３７℃で９０分間培養した。ＮＨＥＫは、前記のように分離された表皮組織から準備し、０. １５ｍＭのカルシウム及び成長因子であるブレットキットを含んだＫＧＭで細胞培養を施行した。細胞の密度が約７０％となったとき、ＮＨＥＫを６０ｍｍのペトリ皿当たり１×１０５個の細胞数で分注し、細胞の密度が約７０％となるまで培養した。このように、継代培養を実施し、２回継代培養したＮＨＥＫを使用した。
＜７−２：ＮＨＥＦの準備＞
【００８３】
ＮＨＥＦは、人間の表皮組織を１才〜３才の健康な人から採取して、３Ｘの抗生剤が含まれたカルシウム及びマグネシウムが含まれていないハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄した後、体外培養を施行して準備した。細胞の密度が約８０％となったとき、ＮＨＥＦを１：３の割合で分注して、細胞の密度が約８０％となるまで培養を施行した。このように継代培養を実施し、４回継代培養したＮＨＥＦを使用した。
＜７−３：上皮細胞の増殖促進の確認＞
【００８４】
ポリスチレン（ＰＳ）、ＢＳＡ及び合成ペプチドＰ４を２４ウェルプレートにコーティングした。ＮＨＥＫ（ＰＤ １３. ０；２×１０４ｃｅｌｌｓ／１２ウェルプレート）及びＮＨＥＦｓ（passage number 5）の培養物を、前記ＰＳ、ＢＳＡ（１％）及びペプチドＰ４（２０μｇ／１２ウェルプレート）でコーティングされたプレートにそれぞれ添加し、これらを１日、２日、３日または４日間培養した。生存細胞は、トリパンブル排除法によりヘモサイトメータでカウントした。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）と表した。
【００８５】
前記測定結果に対し、ＮＨＥＫ及びＮＨＥＦに対する細胞の増殖による細胞数が増加する傾向を、図９Ａ及び図９Ｂにそれぞれ示した。図示されているように、ＢＳＡでコーティングされたプレートのＮＨＥＫ及びＮＨＥＦの数が最も少なく、ＰＳ及びペプチドＰ４でコーティングされたプレートで、細胞の増殖による細胞数の増加が類似していたが、ＮＨＥＫの場合、ＰＳプレートに比べてペプチドＰ４プレートでＮＨＥＫの細胞数が急増して、ペプチドＰ４が、特にＮＨＥＫの増殖に効果的であるということが確認できた。
＜７−４：細胞付着活性度の測定＞
【００８６】
直径が１４ｍｍであるベスキチンＷ超極細繊維（UNITIKA Co. , Japan）を２４ウェル培養皿に入れ、０. ４ｍｌの牛血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）、非機能性ペプチド（Ｐ１、１０μｇ／ウェル）または機能性ペプチド（Ｐ４、１０μｇ／ウェル）を添加して、室温で１２時間乾燥コーティングさせた。ベスキチンＷ超極細繊維のみを試験する場合には、０. ４ｍｌのＰＢＳを添加して同じく処理した。ペプチドでコーティングされていない部位を遮断させるために、各ウェル当たり０. ４ｍｌの牛血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で３０分間培養した。牛血清アルブミンを除去し、ＰＢＳで注意深く洗浄した。各ウェル当たり１×１０５セル（０. ５ｍｌ）を分注し、９５％の空気及び５％の二酸化炭素の条件下で３７℃で６０分間培養した。この時に使用した培養液は、０. １５ｍＭのカルシウム及び成長因子ブレットキットを含んだＫＧＭであった。培養液を除去し、ＰＢＳで１回注意深く洗浄した後、０. ４ｍｌの１０％のホルマリン溶液を加えて、室温で１５分間放置させて細胞を固定させた。固定液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ベスキチンＷ超極細繊維に付着された細胞をヘマトキシリンエオシン溶液で染色した。染色液を除去して、蒸溜水で３回注意深く洗浄した後、ベスキチンＷ超極細繊維に付着された細胞の写真を撮影した。代表値を得るために、ベスキチンＷ超極細繊維を４等分して、各領域当たり２箇所ずつ、総８箇所をオリンパスＢＸ５１顕微鏡で１００倍の倍率で写真撮影を行った。平均百分率及び標準偏差は、４回の独立的な実験から計算した。前記写真と、細胞の付着活性度及び散布活性度の計算結果とは、それぞれ図１０Ａないし図１０Ｃに表した。
【００８７】
図１０Ａないし図１０Ｃに示すように、市販中の人工皮膚素材であるベスキチンＷ超極細繊維に本発明のペプチドＰ４をコーティングしたとき、細胞付着活性度及び細胞散布活性度が最も高くと表れた。本発明に係るペプチドＰ４は、創傷の治療や組織の再生に効果的であるということをこの結果から確認できた。
＜実施例８：動物実験によるペプチドＰ４の細胞の付着活性度及び散布活性度の確認＞
＜８−１：動物実験の条件＞
【００８８】
本実施例のために、体重が２４０±１０ｇであるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを利用した。麻酔後に、各ラットの背中に二つの１ｃｍ×１ｃｍの四角形の傷を脊椎カラムに平行に付けた。その後、ペプチドＰ４でコーティングされたベスキチンＷ超極細繊維を各ラットの傷に適用した。同じ傷は、ベスキチンＷ超極細繊維のみに処理してコントロールとした。処理後３日または７日目に、表皮化及び肉芽の組織学的な検査のために各傷を除去した。
＜８−２：傷の治癒及び組織学的な検査＞
【００８９】
組織学的な検査のために、３日目及び７日目の対照群と、ペプチドＰ４でコーティングされたベスキチンＷ超極細繊維実験群との結果を、顕微鏡を利用して確認した。図１１Ａ及び図１１Ｂには、それぞれ１００倍及び２００倍の顕微鏡の写真を示した。
【００９０】
３日目及び７日目の対照群で、繊維性組織の破片が傷の表面を覆い、その層の下側で多形核の白血球が厚く浸潤し、線維芽細胞が増殖することが観察された。しかし、３日目及び７日目のペプチドＰ４でコーティングされたベスキチンＷ超極細繊維の実験群では、表面組織の破片が消え、若い毛細血管及び線維芽細胞が著しく増殖することが確認された。
【００９１】
両側の群で傷の表皮化は、４週後に完結した。また、炎症細胞が消え、結合組織が厚く形成された。しかし、７日目のペプチドＰ４でコーティングされたベスキチンＷ超極細繊維群で、表面組織の破片が消え、若い毛細管及び線維芽細胞が著しく増殖した。
【００９２】
このような動物実験の結果によって、ペプチドＰ４でコーティングされたベスキチンＷ超極細繊維群の初期段階の治癒が、ベスキチンＷ超極細繊維のみを適用したコントロール群よりさらに速いということが確認された。
【００９３】
以上、本発明の特定の内容部分を詳細に記述したところ、当業者にとって、このような具体的な技術は単に望ましい実施例であり、これによって本発明の範囲が制限されないという点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
前述したように、本発明の配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド、その断片及び誘導体は、インテグリンα３β１と特異的に結合して細胞の付着・散布を促進させることによって、ラミニンを含む多様な細胞外基質蛋白質により媒介される細胞付着活性の研究、創傷の治療、組織の再生及び癌転移の抑制などに効果的に使用され得る。
【図１Ａ】
2008505844.tif 000003
【図１Ｂ】
2008505844.tif 000004
【図１Ｃ】
2008505844.tif 000005
【図２Ａ】
2008505844.tif 000006
【図２Ｂ】
2008505844.tif 000007
【図２Ｃ】
2008505844.tif 000008
【図２Ｄ】
2008505844.tif 000009
【図３】
2008505844.tif 000010
【図４Ａ】
2008505844.tif 000011
【図４Ｂ】
2008505844.tif 000012
【図４Ｃ】
2008505844.tif 000013
【図４Ｄ】
2008505844.tif 000014
【図５Ａ】
2008505844.tif 000015
【図５Ｂ】
2008505844.tif 000016
【図５Ｃ】
2008505844.tif 000017
【図６Ａ】
2008505844.tif 000018
【図６Ｂ】
2008505844.tif 000019
【図６Ｃ】
2008505844.tif 000020
【図６Ｄ】
2008505844.tif 000021
【図７Ａ】
2008505844.tif 000022
【図７Ｂ】
2008505844.tif 000023
【図７Ｃ】
2008505844.tif 000024
【図８Ａ】
2008505844.tif 000025
【図８Ｂ】
2008505844.tif 000026
【図８Ｃ】
2008505844.tif 000027
【図８Ｄ】
2008505844.tif 000028
【図９Ａ】
2008505844.tif 000029
【図９Ｂ】
2008505844.tif 000030
【図１０Ａ】
2008505844.tif 000031
【図１０Ｂ】
2008505844.tif 000032
【図１０Ｃ】
2008505844.tif 000033
【図１１Ａ】
2008505844.tif 000034
【図１１Ｂ】
2008505844.tif 000035
【配列表】
2008505844000001.xml
【国際調査報告】
2008505844.tif 000050
2008505844.tif 000051
2008505844.tif 000052