(57)【要約】  プロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）受容体のアゴニストとして、ＰＫＲ１活性によって媒介される肺および胃腸の疾病または障害のために有用であるＰＫ２βペプチドが記述される。
2008505852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＶＩＴＧＡＣＤＫＤＳＱＣＧＧＧＭＣＣＡＶＳＩＷＶＫＳＩＲＩＣＴＰＭＧＫＬＧＤＳＣＨＰＬＴＲＫＮＮＦＧＮＧＲＱＥ（配列番号：１）および
ＡＶＩＴＧＡＣＤＫＤＳＱＣＧＧＧＭＣＣＡＶＳＩＷＶＫＳＩＲＩＣＴＰＭＧＱＶＧＤＳＣＨＰＬＴＲＫＳＨＶＡＮＧＲＱＥ（配列番号：２）
からなる群から選ばれるアミノ酸配列から本質的になる単離されそして精製されたペプチド、またはその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項２】
配列番号：１に対応するアミノ酸配列を有する単離されそして精製されたＰＫ２βペプチド。
【請求項３】
配列番号：２に対応するアミノ酸配列を有する単離されそして精製されたＰＫ２βペプチド。
【請求項４】
ＡＶＩＴＧＡＣＤＫＤＳＱＣＧＧＧＭＣＣＡＶＳＩＷＶＫＳＩＲＩＣＴＰＭＧＫＬＧＤＳＣＨＰＬＴＲＫＮＮＦＧＮＧＲＱＥ（配列番号：１）および
ＡＶＩＴＧＡＣＤＫＤＳＱＣＧＧＧＭＣＣＡＶＳＩＷＶＫＳＩＲＩＣＴＰＭＧＱＶＧＤＳＣＨＰＬＴＲＫＳＨＶＡＮＧＲＱＥ（配列番号：２）
からなる群から選ばれるアミノ酸配列から本質的になるＰＫ２βペプチド、または該ペプチドの塩、アミドもしくはエステルの製薬学的に活性な量を投与することを含んでなる、ＰＫ１活性によって媒介される疾病または障害をもつと診断された患者を処置する方法。
【請求項５】
ペプチドが配列番号：１に対応するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが配列番号：２に対応するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
疾病または障害が肺の疾病または障害である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
肺の疾病または障害が、喘息、類肉腫症、間質性肺疾患、間質性肺炎、シェーグレン（Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群、閉塞性細気管支炎症候群、線維症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患および急性呼吸困難症候群からなる群から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疾病または障害が胃腸の疾病または障害である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
胃腸の疾病または障害が、感応性腸症候群、糖尿病性軽症胃アトニー、手術後腸閉塞症、慢性便秘、胃食道逆流疾患、慢性消化不良および軽症胃アトニーからなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２００４年３月２９日提出の米国暫定特許出願第６０／５５７，７３３号に対する優先権を利益を請求する。
【０００２】
本発明はＰＫ２βと命名されるペプチドに関し、これはＰＫ２βプロペプチドからプロセスされた生産物である。ＰＫ２β、ＰＫＲ１に対する選択的リガンドは、胃腸障害（例えば、便秘）、肺障害（例えば、肺および気道における不十分な繊毛運動）、およびＰＫＲ１が発現されるある種のがん（例えば、卵巣がんおよび睾丸がん）の処置において有用である。
【背景技術】
【０００３】
２種のシステインに富むペプチド、プロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）１（ＰＫ１）およびプロキネチシン２（ＰＫ２）が同定されている。プロキネチシン（ＰＫ）は多機能性ペプチドであり、これは胃腸（ＧＩ）の平滑筋収縮を刺激することが分かっている（非特許文献１）。ＰＫ１は、また内分泌腺血管内皮成長因子（ＥＧ−ＶＥＧＦ）としても知られており、内分泌腺由来の細胞の増殖および移動を刺激し、そしてマウス卵巣において血管形成を促進する（非特許文献２）。ＰＫ２、もしくは哺乳類Ｂｖ８は、視交叉上核（ＳＣＮ）における行動サーカディアンリズムに影響を与え、そして睾丸における血管形成を促進すると信じられている（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００４】
ＰＫ１およびＰＫ２は密接に関連していて、そしてマンバ（ｍａｍｂａ）の腸のタンパク質（ＭＩＴ）（非特許文献５；非特許文献６）およびカエル皮膚の分泌タンパク質、Ｂｖ８に対して有意な配列相同性を共有する。Ｂｖ８はＧＩ平滑筋の収縮の強力なスチミュレーターであり（非特許文献７）、そして末梢侵害受容器の感作を刺激する（非特許文献８）。
【０００５】
ＰＫは２種の密接に関連するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、プロキネチシン受容体１（ＰＫＲ１）および２（ＰＫＲ２）に結合し、そして活性化するが、これらは配列では８７％同一である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，後出；非特許文献９；非特許文献１０）。ＰＫは、ＰＫ受容体（ＰＫＲ）を発現している細胞において、多分、受容体Ｇｑタンパク質相互作用を介して、Ｃａ２＋可動化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を刺激する（非特許文献１１）。百日咳毒素（ＰＴＸ）は、ＰＫ１誘導の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達を阻害する（非特許文献１２）が、このことはＰＫＲがまたＧｉタンパク質に共役できることを示唆している。
【０００６】
配列の整列は、ＰＫが際立ったＮ−およびＣ末端ドメインを有することを示唆した（非特許文献１３）。Ｎ末端ドメインは、哺乳類および非哺乳類種からのＰＫ中に保存された６個のアミノ酸（ＡＶＩＴＧＡ）を含有する（同上）。Ｃ末端領域は５対のジスルフィド架橋を形成する１０個の保存されたシステインを含有する（同上）。エクソン２および３の間に挿入された２１個の余分なアミノ酸を含有するＰＫ２スプライス変異体の薬理学的活性もまた研究された（同上）。
【非特許文献１】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ  ｃＤＮＡｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ｃｏｎｔｒａｃｔ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅｓ，”Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５９：６９２−６９８（２００１）．
【非特許文献２】ＬｅＣｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｇｌａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４１２：８７７−８８４（２００１）．
【非特許文献３】Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ２  ｔｒａｎｓｍｉｔｓ  ｔｈｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：４０５−４１０（２００１）．
【非特許文献４】Ｌｅｃｒｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−ｇｌａｎｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＶＥＧＦ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  Ｂｖ８  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｉｓ：Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｖ８  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：２６８５−２６９０（２００３）．
【非特許文献５】Ｓｃｈｗｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｌａｃｋ  ｍａｍｂａ（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ  ｐｏｌｙｌｅｐｉｓ）ｖｅｎｏｍ，”Ｔｏｘｉｃｏｎ  ２８：８４７−８５６（１９９０）．
【非特許文献６】Ｓｃｈｗｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，“ＭＩＴ（１），ａ  ｂｌａｃｋ  ｍａｍｂａ  ｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ，”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４６１：１８３−１８８（１９９９）．
【非特許文献７】Ｍｏｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｖ８、ａ  ｓｍａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｆｒｏｇ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｆｒｏｍ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｉｎｄｕｃｅ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ｉｎ  ｒａｔｓ，”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３７４：１８９−１９６（１９９９）．
【非特許文献８】Ｎｅｇｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｖ８，”Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３７：１１４７−１１５４（２００２）．
【非特許文献９】Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＧ−ＶＥＧＦ／ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎｓ  ａｓ  ｃｏｇｎａｔｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｏｒｐｈａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９３：３９６−４０２（２００２）．
【非特許文献１０】Ｓｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５７９：１７３−１７９（２００２）．
【非特許文献１１】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ／ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｇｌａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：１９２７６−１９２８０（２００２ａ）．
【非特許文献１２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｇｌａｎｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｒｅｎａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：８７２４−８７２９（２００２ｂ）．
【非特許文献１３】Ｂｕｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６５：５８２−５８８（２００４）．
【発明の開示】
【０００７】
１つの態様では、本発明は、ＡＶＩＴＧＡＣＤＫＤＳＱＣＧＧＧＭＣＣＡＶＳＩＷＶＫＳＩＲＩＣＴＰＭＧＫＬＧＤＳＣＨＰＬＴＲＫＮＮＦＧＮＧＲＱＥ（配列番号：１）およびＡＶＩＴＧＡＣＤＫＤＳＱＣＧＧＧＭＣＣＡＶＳＩＷＶＫＳＩＲＩＣＴＰＭＧＱＶＧＤＳＣＨＰＬＴＲＫＳＨＶＡＮＧＲＱＥ（配列番号：２）から選ばれるアミノ酸配列から本質的になるペプチドに対向される。１つの好適な態様では、本発明は、配列番号：１に対応するアミノ酸配列を有するヒトＰＫ２βペプチドに対向される。その他の好適な態様では、本発明は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を有するマウスまたはラットＰＫ２βペプチドに対向される。
【０００８】
その他の態様では、本発明は、また、実質的に純粋な形態におけるＰＫ２βペプチドの製薬学的に活性な量を投与することを含んでなる、ＰＫ１活性によって媒介される疾病または障害をもつと診断された患者を処置する方法に対向される。１つの好適な態様では、疾病または障害は、消化管／腸の疾病または胃腸障害である。その他の好適な態様では、疾病または障害は肺の疾病または障害である。
【０００９】
本発明の種々の他の態様、特徴および利益は、詳細な記述および添付される図を参照することによってより完全に理解できる。
【００１０】
ＰＫ２Ｌとして本明細書で命名される、択一的にスプライスされたＰＫ２  ｍＲＮＡのためのｃＤＮＡは、ＰＫ２と比較して２１個の余分のアミノ酸をコードしている。ＰＫ２Ｌの発現が、ＰＫ２βとして本明細書で命名される短い形態のペプチドの生産をもたらすことが、ここに発見された。
【００１１】
ＰＫ１およびＰＫ２と比較してＰＫ２βの機能的特徴は、ＰＫ２βが、ＰＫＲ２に対するよりもＰＫＲ１への強い受容体選択性を現すことを示す。さらに、シグナル伝達の研究は、ＰＫがＰＫＲ発現細胞においてアデニルシクラーゼを刺激することを現し、このことはＰＫＲがまたＧｓタンパク質に共役されることを示している。
【００１２】
下記の実施例において記述されるように、ＰＫ２Ｌは、哺乳類細胞において組換え技術により発現され、そしてＰＫ１およびＰＫ２と比較して薬理学的に特徴決定された。生物化学的特徴は、分泌されたＰＫ２Ｌタンパク質が、さらにタンパク質分解的切断、多分２つの推定フリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位における切断によって、ＰＫ２βと呼ばれる、より小さいペプチドにプロセスされることを示している。ＰＫ２Ｌとともにフリンの同時発現は、ＰＫ２βプロセッシング効率を有意に増大した。機能的研究は、ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βペプチドが、類似の効力によりＰＫＲ１発現細胞において細胞内Ｃａ２＋応答を刺激することを示した。しかしながら、ＰＫＲ２発現細胞におけるＣａ２＋応答のＰＫ２β刺激は、ＰＫ１およびＰＫ２よりも約５０倍低い効力である。ＰＫ２およびＰＫ２Ｌの異なる発現パターンと合わせて、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２を発現する細胞におけるＰＫ２に較べられるＰＫ２βによるＣａ２＋応答の相違する刺激は、これらのペプチドがイン・ビボでは異なる機能をもつであろうことを示している。以下に議論される結果は、ＰＫが、ＰＫＲ発現細胞においてＣａ２＋可動化を刺激するのみならず、またｃＡＭＰ蓄積も誘導することを示している。ＰＫ２βの機能的発現および精製は、イン・ビボでのＰＫＲ１の選択的活性化のために有用な作用物を提供する、かくして、ＰＫ２βは、ＰＫＲ１
を選択的活性化するための治療剤として有用であるに違いない。また、ＰＫ２βによるＰＫＲ１の選択的活性化は、ＰＫ２βに結合するか、またはその活性を調節するか、あるいはＰＫ２β結合のコンペティターであって、そのためにＰＫＲ１活性を上方調節または下方調節する化合物の同定およびスクリーニングを容易にし、これらの化合物はＰＫＲ１活性によって媒介される疾病または障害の処置において（例えば、ＰＫ２β活性のインヒビター、アゴニストまたはアンタゴニストとして）使用できるであろう。
【００１３】
本発明のペプチドまたはその活性を調節する化合物により処置されてもよい代表的な医学的症状、疾病または他の適応症は、限定されるものではないが、胃腸（ＧＩ）の機能および運動、肺性および肺機能、免疫機能、胎盤機能、血管機能、出生前および出生後の栄養、サーカディアンリズム、および乳産生を含む。代表的な肺疾患は、喘息、類肉腫症、間質性肺疾患、間質性肺炎、シェーグレン（Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、線維症性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を含む（参照、例えば、Ｅｆｔｈｉｍｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｓｏｕｔｈ  Ｍｅｄ．Ｊ．，９８（２）：１９２−２０４；Ｈａｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，１６（４）：３５０−３５５；およびＭｅｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｔｈｏｒａｘ．，６０（３）：２４４−２４８）。代表的なＧＩ疾患は、感応性腸症候群、糖尿病性軽症胃アトニー、手術後腸閉塞症、慢性便秘、胃食道逆流疾患、慢性消化不良、および軽症胃アトニーを含む（参照、例えば、Ｓａｍｓｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１９９７，１５（４−５）：２６３−２７４；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．，３３（４−５）：２１７−２２６；Ａｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１６（１）：３８−４６；およびＢｒｉｅｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０（１）：１−３）。代表的な妊娠および胎盤機能に関連する障害は、胎盤機能不全、子癇前症、胎児炎症性応答症候群、および抗リン脂質症候群（ＬＰＳ）を含む（参照、例えば、Ｗｅｉｓｓｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｓｐｏｒｔ．ｓ  Ｅｘｅｒｃ．，３６（１２）：２０２４−２０３１；Ａｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｓｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｏｃ．Ｊ．，６（１２）：７６６−７６９；およびＨｉｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．，１４（６）：９３７−５１）。血管形成の異常調節に関連する代表的な疾患は、ある種のがん、例えば、卵巣がん、頸部がん、睾丸がん、および副腎がんを含む（参照、例えば、ＬｅＣｏｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ，６７：２１７−２２１；Ｋｉｓｌｉｏｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ，Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８（８）：３７００−３７０７；ＬｅＣｏｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１００（５）：２６８５−２６９０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，９（１）：２６４−２７２；ＬｅＣｏｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８（９）：９１３−９１７；Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６２（６）：１８８１−１８９３；およびＬｅＣｏｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４４（６）：２６０６−２６１６）。そのような疾病、医学的症状または他の適応症を処置するために適当な用量または有効量は、適当な用量を決定するための既知の技術を用いて日常的に決定することができる。
【００１４】
治療剤として、または治療化合物を同定するために使用されてもよいＰＫ２β材料の調製が以下に具体的に説明される。
【００１５】
材料および方法
ＰＫＲ１およびＰＫＲ２のｃＤＮＡクローニング    両ＰＫＲ１およびＰＫＲ２のための全長ｃＤＮＡコーディング領域が、ヒト胎児脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）からＰＣＲ−増幅された。ＰＫＲ１のために使用されたプライマーは、Ｐ１：５’ＡＣＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  Ｇ  ３’（配列番号：３）およびＰ２：５’ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  Ｃ  ３’（配列番号：４）であった。ＰＫＲ２のために使用されたプライマーは、Ｐ３：５’ＡＣＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ３’（配列番号：５）およびＰ４：５’ＡＣＧ  ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ３’（配列番号：６）であった。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）条件は、４０秒間９４℃、４０秒間６５℃および３分間７２℃（４０サイクル）であった。ＰＣＲ生産物はｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクター中にクローン化され、そしてインサート領域が自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列決定された。
【００１６】
プロキネチシンの発現および精製    ヒトＰＫ１成熟ペプチドコーディング領域が、２種のプライマーＰ５：５’  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＧＡ
ＣＧＡ  ＴＡＡ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＴＧＡ
ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＧ  ３’（配列番号：７）およびＰ６：５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  Ｇ  ３’（配列番号：８）を用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅された。シグナルペプチドコーディング領域を有しないヒトＰＫ２およびＰＫ２ＬｃＤＮＡは、２種のプライマーＰ７：５’ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ３’（配列番号：９）およびＰ８：５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ３’（配列番号：１０）を用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ条件は、４０秒間９４℃、４０秒間６５℃および１分間７２℃（４０サイクル）であった。ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２ＬのためのＰＣＲ生産物は、改変ｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクター中にクローン化されたが、これはαペプチドシグナル配列とそれに続くＦＬＡＧタグをコードしている。ＰＫｃＤＮＡは、ＦＬＡＧコーディング配列の後にイン・フレームにクローン化され、そしてインサート領域が同一性を確認するために配列決定された。得られる発現ベクターは、哺乳類の分泌タンパク質シグナルペプチドと、それに続いてＦＬＡＧペプチド、エンテロキナーゼ切断部位、および天然のシグナルペプチド配列を有しないそれぞれＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２Ｌを含有するキメラペプチドをコードしていた。ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２Ｌプラスミドは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション３日後に、細胞培養上澄液が回収され、そしてＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）アフィニティーカラムを通過させた。カラムはリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、そして０．１ｍＭグリシンＨＣｌ，ｐＨ３．０により溶出された。溶出されたタンパク質画分は、直ちに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で中和され、そしてエンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により切断された。次いで、切断されたタンパク質は、さらに、Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅｖｉａ，ＣＡ）を用いて逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製された。
【００１７】
ウエスタン・ブロット    組換えＰＫタンパク質の発現は、ウエスタンブロットによって追跡された。１．５ｍｌチューブにおいて、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズスラリー２０μｌが、ＰＫ１、ＰＫ２、ＰＫ２Ｌを発現するか、ＰＫ２Ｌとフリンを同
時発現するＣＯＳ−７細胞、または対照のＣＯＳ−７細胞からの細胞培養培地１ｍｌに添加された。同時に、対応する細胞サンプルが、溶解バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル，Ｓｉｇｍａ）を用いて溶解され、そしてＡＮＴＩ−ＦＬＡＧビーズと混合された。チューブは振動する台の上で一夜４℃でインキュベートされた。ビーズが遠心分離され、そして氷冷ＴＢＳＴ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）により２回洗浄された。免疫沈降されたタンパク質が、還元条件下で４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に展開され、そしてＰＶＤＦメンブラン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に転写された。メンブランは最初に、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）により、次いでヤギ−マウスＩｇＧ（西洋ワサビペルオキシダーゼ共役、Ｓｉｇｍａ）によりブロットされた。ウエスタンブロットメンブランは、次いでＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬキットを用いて現像された。
【００１８】
Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付されたＰＫ２の発現、精製およびヨウ素化    Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付されたＰＫ２（ＰＫ２−ｆ）が記述のように構築された（Ｓｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。２種のプライマーＰ９：ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＣＣＡ
ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＣＣＣ（配列番号：１１）およびＰ１０：ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＡＡ  ＡＣＡ（配列番号：１２）が、使用されてヒト全脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が増幅された。ＰＣＲ増幅されたＰＫ２−ｆは、発現ベクターｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化された。得られるクローンは配列決定されて同一性が確認され、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション３日後に、細胞培養上澄液が回収され、そしてＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ）アフィニティーカラムを通過させた。カラムはＰＢＳで洗浄され、そして０．１ｍＭグリシンＨＣｌ，ｐＨ３．０により溶出された。溶出されたタンパク質画分は、直ちに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で中和され、そしてさらに、Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ）を用いて逆相ＨＰＬＣによって精製された。精製された組換えＰＫ２−ｆタンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅによる記述のようにＩｏｄｏｇｅｎ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）および１２５Ｉ−ＮａＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いてヨウ素化された。ヨウ素化ＰＫ２−ｆはＧ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）ゲル濾過カラムによって精製された。
【００１９】
放射標識リガンド結合アッセイ    発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるＰＫＲ１およびＰＫＲ２は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション２日後に、細胞が、ＰＢＳ中１０ｍＭＥＤＴＡによって培養皿から脱離され、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）により洗浄され、そして９６穴の不透明なポリリジン被覆プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中に１ウェル当たり５０，０００細胞の密度で接種された。接種２時間後、競合結合アッセイが、１００ｐＭ１２５Ｉ標識ＰＫ２−ｆおよびコンペティターとしての種々の濃度の無標識ＰＫ１、ＰＫ２またはＰＫ２βの存在下で９６穴プレートにおいて実施された。結合アッセイは、１００μｌの最終容量においてＤＭＥＭ＋５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２および１％ウシ血清アルブミン中で実施された。結合アッセイは室温で１時間実施された。プレートが氷冷ＰＢＳで３回洗浄された後、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−４０（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）が添加され、そしてプレートがＴｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）においてカウントされた。
【００２０】
細胞内Ｃａ２＋可動化アッセイ    発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にお
けるＰＫＲ１およびＰＫＲ２は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトされた。トランスフェクション２日後に、細胞が１０ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて脱離され、そしてポリ−Ｄ−リジン被覆された９６穴の黒色の組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに接種された。リガンドに刺激されるＣａ２＋の可動化は、既に記述されているようにＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）においてＦｌｕｏ−３  Ｃａ２＋染料（ＴＥＦ  Ｌａｂｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いてアッセイされた（Ｌｉｕ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ，ｍｏｕｓｅ，ｒａｔ  ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｈ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，”Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９９：１２１−１３０（２００１ａ））。
【００２１】
ＰＫによるＰＫＲ発現細胞におけるｃＡＭＰ蓄積の刺激    ＰＫで刺激されるｃＡＭＰ蓄積のアッセイが、ＣＲＥプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ受容体遺伝子を担持する、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２を安定して発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を用いて実施された。安定な細胞系は、ＰＫＲ１またはＰＫＲ２発現ベクターのトランスフェクションに続いて４００ｍｇ／Ｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ）の選択下で生成された。細胞内ｃＡＭＰ濃度の増大は、より高いβ−ガラクトシダーゼ発現をもたらし、この活性が基質としてクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）を用いて測定される。細胞が９６穴組織培養プレートに接種され、種々の濃度のＰＫ１、ＰＫ２またはＰＫ２βにより刺激された。細胞内ｃＡＭＰ濃度は、記述されたように細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイすることによって直接測定された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｕｒｔｈ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｈ４）ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ，”Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５９：４２０−４２６（２００１ｂ））。
【００２２】
異なる実験では、発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるＰＫＲ１およびＰＫＲ２が、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞中にＧｓ発現プラスミドとともにコ・トランスフェクトされた。トランスフェクション２日後に、細胞が、ＰＢＳ中１０ｍＭＥＤＴＡによって脱離され、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培養中に再懸濁され、次いで、９６穴プレート上に１ウェル当たり５０，０００細胞の密度で塗布された。接種２時間後、細胞培養培地が２ｍＭイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２により置換され、そして３０分間インキュベートされた。種々の濃度のＰＫ１、ＰＫ２またはＰＫ２βが細胞に添加され、２００μｌ／ウェルの最終容量において、さらに３０分間インキュベートされた。各ウェルに０．５ＮＨＣｌ  ２０μｌを添加することによって反応が停止され、ｃＡＭＰが抽出された。細胞培養培地は、製造者による記述のようにｃＡＭＰ［１２５Ｉ］ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ  Ａｓｓａｙキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によってｃＡＭＰ濃度について試験された。
【００２３】
種々のヒト組織におけるＰＫ２Ｌ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ検出    ヒト組織からの１１種のヒトｃＤＮＡプール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が、ＰＣＲ増幅法を用いてＰＫ１、ＰＫ２、ＰＫ２β、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２のｍＲＮＡ発現について解析された。反応において使用されるプライマーは、ＰＫ２およびＰＫ２βについては前述されたＰ７およびＰ８；ＰＫ１についてはＰ１１：５’ＡＣＧ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ
ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＣＧ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＴＣＡ３’（配列番号：１３）およびｐ１２：５’ＡＣＧ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ３’（配列番号：１４）；Ｐ
ＫＲ１についてはＰ１３：５’ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＧＧ３’（配列番号：１５）およびＰ１４：５ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧ３’（配列番号：１６）；ならびにＰＫＲ２についてはＰ１５：５’ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＴＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＴＣ３’（配列番号：１７）およびＰ１６：５’ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＧＡ３’（配列番号：１８）である。すべてのＰＣＲ反応は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４０秒間９４℃、３０秒間６５℃、１分間７２℃で４０サイクルの間実験された。ＰＣＲ生産物はアガロースゲル上で展開され、ニトロセルロースメンブラン上に転写され、そしてそれぞれＰＫ１（５’ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＴＣ３’−配列番号：１９）、ＰＫ２およびＰＫ２β（５’ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＧＴＡ３’−配列番号：２０）、ＰＫＲ１（５’ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  Ｃ３’−配列番号：２１）、およびＰＫＲ２（５’ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  Ｇ３’−配列番号：２２）に対して特異的な３２Ｐ−標識オリゴプローブとハイブリダイズされた。ヒトβ−アクチン遺伝子発現についてのＰＣＲ検出が、ｃＤＮＡの品質のための対照として全組織について使用された。ヒトβ−アクチンｍＲＮＡ発現のＰＣＲ検出のためのプライマーは、５’ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ３’（配列番号：２３）および５’ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  Ａ３’（配列番号：２４）であった。
【００２４】
結果
ＰＫ２ＬｃＤＮＡの同定およびＰＫ２ＬｍＲＮＡ組織発現パターンの分子特徴の決定 
ＲＴ−ＰＣＲを用いてＰＫ２ｍＲＮＡ発現プロフィルを特徴決定する過程において、予想されたＰＫ２のＰＣＲ生産物よりもやや大きいサイズをもつＰＣＲ生産物が同定された。そのＰＣＲ生産物の分子クローニングとＤＮＡ配列決定は、それがＰＫ２のコーディング領域に対して６３塩基対のインサートを有し、これが２１残基さらに長いタンパク質をもたらし（図１Ａ）、そしてＰＫ２Ｌと命名されることを示した。Ｇｅｎｂａｎｋの検索では、本配列が、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおけるタンパク質配列と同一であるタンパク質をコードしていることが示された（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｑ９ＨＣ２３，Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｆｒｏｇ  Ｂｖ８  ａｒｅ  ｍａｉｎｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ，”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４６２：１７７−１８１（１９９９））。類似の方法を用いて、ラットＰＫ２ＬｃＤＮＡがまたラットの肺ｃＤＮＡプールから単離された。ヒトおよびラットのＰＫ２Ｌの完全ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに付託されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ３４９１３１；ＡＹ３４８３２２）。タンパク質配列の比較では、ラットとマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ ０５６５８３）ＰＫ２Ｌタンパク質が、シグナル配列を除いては本質的に同一であり、そして９０％のアミノ酸同一性をもつヒトＰＫ２Ｌに高度に関連していることを示している（図１Ｂ）。
【００２５】
ヒトのＰＫ２、ＰＫ２ＬおよびゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡ配列の比較は、ＰＫ２遺伝子がＰＫ２によって使用されない推定上のエクソン領域を含有する（図１Ｃ）ことを表し、このことは、ＰＫ２ＬｍＲＮＡがＰＫ２遺伝子からの択一的にスプライスされたイソ型であるかもしれないことを示している。ＰＫ２ＬのｍＲＮＡ発現プロフィルが、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて１１種の異なるヒト組織におけるＰＫ１、ＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２のそれと平行して解析された。図２で示されるように、その結果は、それらの各々がその独特な発現パターンを有することを示している。ＰＫ１ｍＲＮＡは胎盤において主に発現されることが分かり、一方、ＰＫ２ｍＲＮＡは全組織において見いだされる。ＰＫ２ＬｍＲＮＡは試験されたほとんどの組織において検出され、そして肺および脾臓において最も高いことが見いだされたが、脳ではわずかに検出され、そして腎臓では検出されず、ここではＰＫ２ｍＲＮＡが検出される。ＰＫＲ１ｍＲＮＡは脳、肺、肝臓、脾臓、脾臓および乳腺において検出された。ＰＫＲ２ｍＲＮＡは、脾臓および乳腺における比較的低レベルの発現とともに、脳では非常に顕著な発現を有する。
【００２６】
ＰＫの発現、精製および生化学的特徴決定    ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２Ｌが、ＣＯＳ−７細胞からＮ末端ＦＬＡＧタグをもつ分泌される融合タンパク質として発現された。細胞培養上澄液中の分泌された融合タンパク質は、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーカラムを用いて精製された。アフィニティー精製されたタンパク質は、エンテロキナーゼにより切断され、さらに逆相ＨＰＬＣによって精製された。ＨＰＬＣ精製されたタンパク質は９８％超の純度である。ＰＫ１（１０ｋＤａ）およびＰＫ２（９ｋＤａ）のサイズは本研究者らの予想と一致する。しかしながら、ＰＫ２Ｌ（６〜７ｋＤａ）を発現するＣＯＳ−７細胞から精製されたタンパク質のサイズは、ＰＫ２ＬｃＤＮＡコーディング領域により推定されたサイズ（１１．５ｋＤａ）よりもはるかに小さい。ＰＫ２Ｌコーディング領域はＰＫ２と比較して２１個のさらなるアミノ酸をコードしているので、本発明者らは、ＰＫ２ＬはＰＫ２より高い分子量を有するに違いないと予測した。しかしながら、ＰＫ２ＬｃＤＮＡをトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞から精製されたタンパク質は、ＰＫ２より小さいＭＷを有し、このことは、ＰＫ２Ｌタンパク質のためのプロ・タンパク質切断プロセスが存在することを示唆している。
【００２７】
ＰＫ２Ｌ発現細胞溶解物および細胞培養培地のウエスタン・ブロット解析では、ＦＬＡＧ−ＰＫ２Ｌが、ＦＬＡＧ−ＰＫ１（１１．７ｋＤａ）およびＦＬＡＧ−ＰＫ２（１０．８ｋＤａ）より大きい予想されたサイズ（１３．５ｋＤａ）として細胞において生成されたことを示した（図３）。痕跡量のＦＬＡＧ−ＰＫ２Ｌが培養培地において検出されたけれども、順化培地に存在する多くのＦＬＡＧ−ＰＫ２Ｌは、より小さい形態物、すなわちＰＫ２β（８〜９ｋＤａ）にプロセスされると考えられる（図３）。ＰＫ２βのサイズに基づいて、プロテアーゼ切断部位が、ＦＬＡＧ−ＰＫ２Ｌに存在する２１個のさらなるアミノ酸の範囲中に予測される。それらの２１個のアミノ酸の多くは塩基性アミノ酸であり、したがって２個のフリン部位を含む、数個の推定プロ・ホルモン変換酵素切断部位をもつ配列を形成している。プロセスされたＦＬＡＧ−ＰＫ２βの二重バンドは、２種の異なるフリン切断部位におけるＦＬＡＧ−ＰＫ２Ｌの別なプロセスを示している。フリンはＣＯＳ−７を含む多くの異なる細胞において発現されるので、フリンがＰＫ２Ｌの切断に関与しているのであろう。ＰＫ２Ｌとともにさらなるフリンの同時発現は、ＰＫ２βへのＰＫ２Ｌの完全なプロセッシングをもたらす（図３）。ＰＫ２βの比較的低いバンドはプロセスされた形態物の主たるものであり、そして逆相ＨＰＬＣによりさらに精製され、薬理学的特徴決定のために使用された。
【００２８】
プロキネチシンは異なる親和力によりＰＫＲ１およびＰＫＲ２に結合する    利用できる精製ＰＫ２βを用いて、ＰＫ１およびＰＫ２と比較して、ＰＫ２βがＰＫＲ１またはＰＫＲ２に結合するか否か調査された。Ｃ末端ＦＬＡＧタグを付したＰＫ２が１２５Ｉで標識され、そして放射性リガンドとして使用されたが、これは高い親和力においてプロキネチシン受容体に結合することが報告されている（Ｓｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞からの膜が競合結合アッセイにおいて使用された。結果（図４Ａ）は、ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βすべてが、能力ＰＫ２＞ＰＫ２β≡ＰＫ１のランク順の高い親和力によりＰＫＲ１に結合することを示し
ている。ＰＫＲ２では、ＰＫ１およびＰＫ２のみが結合アッセイにおいて高い親和力を表し、これに対してＰＫ２βは高濃度において限界的な活性があった（図４Ｂ）。ＰＫＲ２の能力のリガンドランク順はＰＫ２＞ＰＫ１＞＞ＰＫ２βである。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２に対するＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βのＩＣ５０値が表１に列挙される。
【００２９】
【表１】
2008505852.tif 000003
【００３０】
ＰＫ２βは選択的にＰＫＲ１を活性化する    ＰＫ１およびＰＫ２は、ＰＫＲ発現細胞においてＣａ２＋の可動化を刺激すると報告されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｓｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。この研究は、ＰＫＲ発現細胞におけるＣａ２＋の可動化の刺激においてＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βを比較するために計画された。結果は、ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βがＰＫＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞においてナノモル濃度においてＣａ２＋の可動化を刺激することを表している（図５Ａ）。両受容体に対して高い能力を有するＰＫ１とＰＫ２とは異なり、ＰＫ２βは、結合の結果と一致して、ＰＫＲ１においてのみ活性がある（図５Ａ、５Ｂ）。全Ｃａ２＋アッセイに関するＥＣ５０が表２において総括される。
【００３１】
【表２】
2008505852.tif 000004
【００３２】
プロキネチシン受容体は多数のシグナル伝達経路に共役している    ＰＴＸはＰＫに刺激されるＭＡＰキナーゼシグナル伝達を阻害することが報告されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）が、このことは、ＰＫＲがＧｉ関連タンパク質の活性化を介してＭＡＰキナーゼを活性化することを示唆している。Ｃａ２＋可動化アッセイの進行において、ＰＫＲ２発現細胞における最大のリガンド刺激されるＣａ２の＋可動化が、ＰＫＲ１発現細胞におけるそれよりも一貫して有意に低いことが観察されたが、これは報告されたこと（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）と一致している。しかしながら、ＰＫＲ２が、受容体／ＧｉカップリングをＣａ２＋可動化のシグナル伝達にシフトするキメラＧタンパク質Ｇｑｉ５（Ｃｏｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｗｉｃｔｈｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｑα  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｏｆ  Ｇｉα，”Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７４−２８０（１９９３））と同時に発現された場合には、ＰＫＲ２発現細胞における最大のリガンド刺激されるＣａ２の＋可動化は、ＰＫＲ１発現細胞からのそれのほぼ同じレベルまで増大した（図６）が、このことは、ＰＫＲ２がまた、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２ｂ）による初期の報告と合致して、Ｇｉ関連のＧタンパク質と共役されることを示唆する。得られた他のデータは、ＰＫＲ１発現細胞におけるＣａ２の＋可動化が、Ｇｑｉ５の同時発現によって有意に影響されないことを表した。
【００３３】
ＰＫＲ１およびＰＫＲ２によって使用されるシグナル伝達経路をさらに探求するために、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２発現細胞においてｃＡＭＰ蓄積の刺激に及ぼすＰＫの影響が試験された。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２細胞系は、ＣＲＥプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保持しているＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において確立された（Ｌｉｕ。ｅｔ  ａｌ．２００１ｂ）。宿主細胞では、ｃＡＭＰ濃度の増加はβ−ガラクトシダーゼ発現の増大をもたらし、細胞におけるｃＡＭＰ濃度を反映するこの酵素活性が、基質としてＣＰＲＧを用いて測定された。この結果は、ＰＫ１およびＰＫ２が用量依存方式でＰＫＲ発現細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激することを示した（図７Ａ、７Ｂ）。得られた他のデータは、ＰＫＲ発現のない場合、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞がＰＫに対する応答を現さないことを例証した。ＰＫＲ発現細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激するＰＫのＥＣ５０値が表３において示される。
【００３４】
【表３】
2008505852.tif 000005
【００３５】
ｃＡＭＰ蓄積アッセイが、ＰＫＲ１またはＰＫＲ２を一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞において実施された。結果は、ＰＫがＰＫＲ発現細胞においてｃＡＭＰ蓄積を刺激することを示した。リガンドに刺激されるｃＡＭＰ蓄積は、Ｇｓタンパク質がＰＫＲと同時発現される場合、有意に増大される（図８Ａ）。ｃＡＭＰ蓄積アッセイでは、ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βの能力のランク順は、Ｃａ＋２アッセイからのそれに類似する。全ＰＫはＰＫＲ１に対して高い能力を示した（図８Ｂ）。ＰＫＲ２発現細胞では、ＰＫ１およびＰＫ２のみが高い能力のリガンドであると考えられ、ＰＫ２βは高い濃度において限界的な活性を示すだけであった（図８Ｃ）。ＰＫＲ発現のないＨＥＫ２９３はＰＫ刺激に応答しなかった。ＰＫＲ１またはＰＫＲ２発現細胞ＨＥＫ２９３におけるｃＡＭＰ蓄積の刺激においてＰＫのＥＣ５０値が表３において示される。
【００３６】
検討
ＰＫ２の遺伝子構造の解析は、推定される択一的スプライシングがＰＫ２遺伝子の第３エクソンにおいて生じることを示している。ＰＫ２に較べて、ＰＫ２ＬｍＲＮＡは、ＰＫ２タンパク質のＬｙｓ４７とＶａｌ４８との間に２１個のアミノ酸インサートをもたらすさらなるエクソン（６３ｂｐ）を有した。また非常に類似するスプライスバリアントがラットにおいて発見され、そしてマウスにおいて報告され（Ｗｅｃｈｅｓｅｌｂｅｒｇｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、したがって、ＰＫ２Ｌの機能は種の中において保存されていると考えられる。ＰＫ２ＬのｍＲＮＡ発現の解析は、ＰＫ２ＬｍＲＮＡ発現パターンがＰＫ２のそれとは異なり、したがってＰＫ２Ｌが異なって機能するであろうことを示している。ＰＫＲ１ｍＲＮＡがまた発現される肺および脾臓における比較的豊富なＰＫ２ＬｍＲＮＡ発現は、ＰＫ２Ｌが、何かの肺機能と免疫機能に関与しているであろうことを示している。ＰＫは平滑筋の収縮を刺激することが知られている。高レベルのＰＫ２ＬｍＲＮＡ発現は、肺から塵粒子と流体を排出するための肺における繊毛運動の活性化に関係しているのであろう。ＰＫの化学誘引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）効果が、ＰＫＲを
発現する副腎皮質毛管内皮（ＡＣＥ）細胞について示されている（ＬｅＣｏｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。脾臓における高レベルのＰＫ２Ｌ発現は、免疫細胞がＰＫＲを発現し、そしてＰＫに対する応答において化学誘引するか否かを知る興味を起こす。
【００３７】
ＰＫ２Ｌの機能的役割を探求するために、ＰＫ２ＬｃＤＮＡが、ＰＫ１およびＰＫ２と平行して哺乳類細胞において発現され、そして発現されたタンパク質が精製された。組換えペプチドは、ＦＬＡＧタグを付したタンパク質を発現させ、タグを切り離し、そしてＨＰＬＣによって最終生産物を精製することによって作成された。ＰＫ１およびＰＫ２発現についての最終生産物は期待されたとおりであったが、ＰＫ２ＬｃＤＮＡを発現する細胞からの精製ペプチドは期待されたものよりも有意に小さかった。細胞溶解物（未分泌）と培地（分泌）におけるＰＫ２Ｌペプチドの比較は、ＰＫ２Ｌが期待されたように細胞において生成されるが、タンパク質分解的切断によってさらに小さいものにプロセスされることを示した。ＰＫ２Ｌのタンパク質配列解析は、２種のフリン切断部位（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ６０およびＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ６５）が存在し、これがフリン切断部位についてのＡｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇモチーフ（Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ，”Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：２３４３５−２３４３８（１９９２）；Ｎａｋａｙａｍａ，“Ｆｕｒｉｎ：ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｋｅｘ２ｐ−ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｗｉｄｅ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２７：６２５−６３５（１９９７））と一致することを示した。また類似するフリン切断部位がマウスおよびラットのＰＫ２Ｌにも存在するが、ＰＫ１およびＰＫ２ペプチドには不在である。フリンはＣＯＳ−７細胞を含む多数の異なる細胞によって発現される（Ｙａｎａｇｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｐｒｏｉｓｕｌｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａｂａｓｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ  ｔｏ  ｍａｔｕｒｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｒｉｎ  ｉｎ  ｎｏｎｅｎｄｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，”Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：６３９−６４４（１９９３））ので、ＰＫ２Ｌは、多分ＣＯＳ−７細胞から分泌する間に内因性フリンによって切断されるのであろう。事実、フリンの同時発現は切断プロセスを促進する。
【００３８】
ＰＫ２βがＰＫ２Ｌの成熟形態であるので、本明細書に記述された研究はＰＫ２βに焦点を絞った。ＰＫ２βの薬理学的性質がＰＫ１およびＰＫ２のそれと比較された。その結果は、両ＰＫ１およびＰＫ２が両ＰＫＲ１およびＰＫＲ２発現細胞においてＣａ２＋可動化を強く活性化するのに対して、ＰＫ２βはＰＫＲ２よりもＰＫＲ１を一層強く刺激することを示す。またＰＫ２βは、放射性リガンド結合アッセイにおいてＰＫ１およびＰＫ２と比較して試験された。放射性リガンドとしてヒトＰＫ１のＴｙｒ７５において１２５Ｉを用いてＰＫ１を標識する試みにより、得られる放射性リガンドは、ＰＫＲ１またはＰＫＲ２発現細胞のいずれかを用いる結合アッセイにおいて、非常にわずかしか特異的結合を起こさなかった。ＰＫ２はＴｙｒを有しないので、ＦＬＡＧタグにＴｙｒをもつＣ末端ＦＬＡＧタグ付きのＰＫ２が発現され、そして１２５Ｉで標識された。１２５Ｉ−ＰＫ２−ＦＬＡＧは、高い親和力によりＰＫＲ１およびＰＫＲ２に結合し、そして結合アッセイにおいて８：１のノイズ比まで平均的シグナルを生じる。したがって、１２５Ｉ−ＰＫ２−ＦＬＡＧは、無標識のＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βを特徴決定するために、競合アッセイにおけるトレーサーとして使用された。結合結果は、ＰＫ２βがＰＫＲ２よりもＰＫＲ１に優先的に結合することを示しており、このことはＣａ２＋可動化実験と一致する。ＰＫ２は、結合アッセイにおいてＰＫ１またはＰＫ２βよりも、両ＰＫＲ１とＰＫＲ２に対するはるかに大きい親和力を示した。ＰＫ１はＣａ２＋アッセイでは高い能力を示したが、結合アッセイでは非常に低い能力しか示さなかった。結合アッセイにおけるＰＫ１の能
力の減少は、放射性リガンドとして１２５Ｉ−ＰＫ１を用いた場合に観察される低下した結合を説明できる。ＥＣ５０およびＩＣ５０値の相違は、アッセイメカニズムにおける相違の結果であろう。
【００３９】
ＰＫ２β成熟ペプチドは、ＰＫ２のＮ末端の４７個のアミノ酸のみを保持しており、そしてＰＫＲ１に対する強力な完全アゴニストとしてなお作用するが、このことは、ＰＫの機能性ドメインがＮ末端に置かれていることを示す。事実、ＰＫ１、ＰＫ２、ＭＩＴおよびＲｖ８における配列比較は、それらがＣ末端におけるよりもＮ末端においてはるかに高い保存配列を共有していることを示している。
【００４０】
若干のＧタンパク質共役受容体は、Ｇｑ、ＧｉおよびＧｓタンパク質を含む、種々のＧタンパク質と相互作用することが示されており（Ｃｈａｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ２Ａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：５７３０−５７３４（１９９４）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｇｑ／１１  ａｎｄ  Ｇｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｇ  ｈｏｒｍｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ＬβＴ２  ｃｅｌｌｓ，”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３２０９９−３２１０８（２００２）；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ，ｓｕｐｒａ；Ｓａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ｓｕｐｒａ）、したがって、ＰＫＲはＧｑタンパク質と共役されると考えられる。ＭＡＰＫのＰＫに誘導される活性化がＰＴＸ感受性である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ，ｓｕｐｒａ）という事実は、ＰＫＲがまたＧｉタンパク質と共役されるであろうことを示す。事実、本発明者らの結果は、Ｇｑｉ５のＰＫＲ２との同時発現が、ＰＫＲ２発現細胞においてＰＫに刺激されるＣａ２＋応答を増大することを示す。
【００４１】
ＰＫがＰＫＲ発現細胞においてｃＡＭＰを刺激するか否かを探求した結果は、ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２βが、ＰＫＲ発現細胞においてｃＡＭＰの蓄積を用量依存方式で刺激したことを示している。首尾一貫した結果は、安定なＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞またはＰＫＲ１とＰＫＲ２を一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞においてｃＡＭＰ蓄積アッセイを実施する場合に得られた。ＰＫＲとＧｓタンパク質の同時発現は、ＰＫに刺激されるｃＡＭＰ蓄積を増進し、このことはＰＫＲがＧｓタンパク質と共役できることを反映している。
【００４２】
ＰＫ受容体は、異なる種類のＧタンパク質を介して種々のシグナル伝達経路に共役できるので、ＰＫＲを発現するが異なるＧタンパク質発現パターンをもつ天然細胞は、ＰＫに対して異なって応答し、そのために、それらの細胞に異なる生理学的機能を遂行させるであろう。
【００４３】
ＰＫ２βはＰＫＲ１に対するアゴニストとして作用し、したがってＰＫＲ１活性によって媒介される疾病または障害を処置するために有用である。本発明のペプチド化合物は、ペプチドのための慣用調合物、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に記述されているような調合物において投与されてもよい。好ましくは、ペプチドは、この投与経路に適当な調合物を用いて、注射、好ましくは静脈内の注射によって投与される。あるいはまた、ペプチドは、所望の治療利益が得られるまで長時間にわたって定常的な注入によって投与されてもよい。他の投与様式は、例えば、坐剤、鼻内エアゾル剤および適当であれば経口調合物を含む。
【００４４】
本発明の組成物は、好ましくは、ＰＫ２βペプチドの有効量、すなわち、ＰＫＲ１調節を介して所望の治療効果を達成するのに有効な量を含有する。代表的な用量レベルは、熟練技術者の理解範囲内にある適当な用量の選択により、約０．００１〜１０００μｇ／ｋｇ被験者、より好ましくは０．００１〜１００μｇ／ｋｇである。
【００４５】
かくして、本発明はまた、有効量の本発明のペプチドまたはその非毒性の付加塩、アミドもしくはエステルを含んでなる製薬学的組成物を提供する。製薬学的に許容できる、非毒性の塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて、遊離アミノ基と形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩は、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第２鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得られてもよい。
【００４６】
好ましくは、組成物はペプチド化合物に加えて１種以上の生理学的に許容できるか、または製薬学的に許容できる液体、ゲルまたは固体希釈剤、補助剤、賦形剤、媒体および／または担体を含有する。適当な希釈剤および賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそれらの組み合わせ物を含む。さらに、所望であれば、組成物は少量の補助成分、例えば湿潤剤または乳化剤、安定剤またはｐＨ緩衝剤などをさらに含有してもよい。場合によっては、組成物は他の成分を含有してもよく、またはその他の製薬学的組成物と同時に投与されてもよい。
【００４７】
また本発明のペプチドは、標識された試薬、例えば抗体を用いる免疫アッセイにおいて使用する抗血清を調製するために使用されてもよい。ペプチド化合物は、ジアルデヒド、カルボジミドによるか、または市販のリンカーを用いて、適当であるように抗原性付与担体に複合されてもよい。化合物および免疫学的試薬は、種々の標識、例えば、発色団、、蛍光団（例えばフルオレセインもしくはローダミン）、ラジオアイソトープ（例えば１２５Ｉ、５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈ）または磁化粒子により当該技術分野において既知の手段を用いて標識されてもよい。これらの標識された化合物および試薬、またはそれを認識し、特異的に結合できる標識された試薬は、診断試薬としての用途を見い出すことができる。生物標本由来のサンプルは、本発明の化合物を用いて共通の抗原決定基をもつ物質の存在もしくは量についてアッセイすることができる。さらに、モノクローナル抗体が既知の技術を用いて調製されてもよく、この抗体は、例えば、イン・ビボで免疫学的に関連する化合物の過剰生産を中和するために治療上の用途を有するであろう。
【００４８】
本発明は詳細な説明およびその好適な態様を参照して記述されたが、本発明の範囲は先の記述によってではなく、特許法の原則の下で適当に解釈されるような付随する請求項によって限定されることが理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】図１Ａは、シグナルペプチドを含まない、ヒトＰＫ２とＰＫ２Ｌとの間のアミノ酸配列比較を提供する（ＰＫ２Ｌにおける２１個の余分のアミノ酸は太字で強調される；フリン（ｆｕｒｉｎ）認識配列は下線を施されている；潜在的なフリン切断部位は矢印によって示される）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトとラット／マウスのＰＫ２Ｌペプチド間のアミノ酸配列比較を示す（ラットおよびマウスＰＫ２Ｌペプチドは同一である；推定フリン認識配列は下線を施されている）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＰＫ２の遺伝子構造およびＰＫ２とＰＫ２ＬのｍＲＮＡによる相違するエクソン使用を具体的に説明する（数字は、それぞれＰＫ２およびＰＫ２Ｌコーディング領域におけるヌクレオチド位置を示す；ＡＴＧおよびＳＴＰは翻訳開始と停止コドンをそれぞれ表す）。
【図２】図２は、ＰＫおよびＰＫＲのｍＲＮＡ発現プロフィルを描写している。ＰＫＲ１、ＰＫＲ２、ＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２ＬについてのそれぞれＲＴ−ＰＣＲ生産物がアガロースゲルにおいて展開されてニトロセルロースメンブランに転写され、そして特異的プローブとハイブリダイズされた。ヒトのβ−アクチンｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ検出が内部対照として使用された。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＯＳ−７細胞において発現された組換えＰＫのウエスタンブロット解析の結果を示す（いずれか細胞順化培地（列１〜５）または細胞溶解物（列６〜１０）からのＦＬＡＧを付されたＰＫ１、ＰＫ２およびＰＫ２Ｌが、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用いるウエスタンブロットによって解析された；列１および６は対照細胞を示し、列２および７はＰＫ１を発現する細胞の結果を示し、列３および８はＰＫ２を発現する細胞を示し、列４および９はＰＫ２Ｌを発現する細胞を示し、列５および１０はＰＫ２Ｌとフリンを同時発現する細胞を示す）。
【図３Ｂ】図３ＢはＰＫ２、ＰＫ２ＬおよびＰＫ２βについての図である。  図４Ａおよび４Ｂは、ＰＫが種々の親和力によりＰＫＲ１およびＰＫＲ２に結合することを図によって説明している。ＰＫＲ１またはＰＫＲ２を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞が９６穴プレートに接種された。１２５Ｉ標識されたＰＫ２−ｆが、１００ｐＭの最終濃度において各ウエルに添加された。種々の濃度のＰＫ１、ＰＫ２またはＰＫ２βが、コンペティターとしてアッセイに添加された。すべてのアッセイは三並列で実施された。結果は、三並列の平均値（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）である。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、ＰＫが種々の親和力によりＰＫＲ１およびＰＫＲ２に結合することを図によって説明している。ＰＫＲ１またはＰＫＲ２を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞が９６穴プレートに接種された。１２５Ｉ標識されたＰＫ２−ｆが、１００ｐＭの最終濃度において各ウエルに添加された。種々の濃度のＰＫ１、ＰＫ２またはＰＫ２βが、コンペティターとしてアッセイに添加された。すべてのアッセイは三並列で実施された。結果は、三並列の平均値（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）である。図４ＡはＰＫＲ１発現細胞を用いる結合アッセイの結果を提供する。図４ＢはＰＫＲ２発現細胞における結合アッセイの結果を示す（凡例：■，ＰＫ１；▲，ＰＫ２；▼，ＰＫ２β）。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ＰＫが種々の力価においてＰＫＲ１およびＰＫＲ２を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＣａ２＋の可動化を刺激することを図によって説明している。ＰＫＲ１またはＰＫＲ２を一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞が９６穴プレートに接種され、Ｃａ２＋染料Ｆｌｕｏ−３を負荷され、次いで種々の濃度のＰＫ１、ＰＫ２またはＰＫ２βにより刺激された。Ｃａ２＋の遊離が蛍光画像プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用いて測定された。結果は三並列の実験の平均値（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）である。図５ＡはＰＫＲ１発現細胞におけるＣａ２＋の移動の結果を示す。図５ＢはＰＫＲ２発現細胞におけるＣａ２＋の可動化の結果を提供する（凡例：■，ＰＫ１；▲，ＰＫ２；▼，ＰＫ２β）。
【図６】図６は、Ｇｑｉ５がＰＫＲ２を発現する２９３細胞においてＰＫ誘導のＣａ２＋可動化を増進することを示している。２９３細胞はＧｑｉ５またはＰＫＲ２のいずれかをトランスフェクトされるか、あるいはＰＫＲ２とＧｑｉ５を同時にトランスフェクトされた。トランスフェクション２日後、細胞は、ＰＫ２刺激に対する応答におけるＣａ２＋可動化アッセイにおいて試験された。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、プロキネチシンが、ＰＫＲ１（図７Ａ）およびＰＫＲ２（図７Ｂ）を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞においてｃＡＭＰ蓄積を刺激することを示す実験結果を表す。細胞はアッセイ前夜９６穴プレートに接種された。種々の濃度のＰＫ１またはＰＫ２が培地に添加され、３７℃で６時間インキュベートされた。ｃＡＭＰ濃度は、基質としてＣＰＲＧを用いて細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイすることによって測定された。アッセイ結果は、５７０ｎｍにおいてミクロプレートリーダーで読まれた（凡例：■，ＰＫ１；▲，ＰＫ２；▼，ＰＫ２β）。
【図８Ａ】図８Ａは、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２発現細胞におけるｃＡＭＰ蓄積の刺激を例証する結果を示す（ＨＥＫ２９３細胞は、ｍｏｃｋトランスフェクトされたか、あるいはＰＫＲ１、ＰＫＲ２、Ｇｓによってトランスフェクトされたか、あるいはＰＫＲ１またはＰＫＲ２とともにＧｓによって同時トランスフェクトされたかいずれかであった；トランスフェクトされた細胞は、ＰＫ２の１μＭによって刺激された；蓄積されたｃＡＭＰはｃＡＭＰ［１２５Ｉ］ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ  Ａｓｓａｙキットを用いて測定された）。
【図８Ｂ−８Ｃ】図８Ｂおよび８Ｃは、種々の濃度における種々のＰＫを用いて刺激されたＰＫＲ１／Ｇｓ（図８Ｂ）またはＰＫＲ２／Ｇｓ（図８Ｃ）を同時発現するＨＥＫ２９３細胞からの結果を具体的に説明している（蓄積されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ［１２５Ｉ］ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ  Ａｓｓａｙキットを用いて測定された；結果は三並列の実験の平均値（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）である（凡例：■，ＰＫ１；▲，ＰＫ２；▼，ＰＫ２β）。
【図１】
2008505852.tif 000006
【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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