(57)【要約】本発明は、野生型CTLA4または非-変異型CTLA4Igと比較して優れた結合力でCD80および/またはCD86抗原に結合する可溶性CTLA4変異分子の、グラフト移植に関連する免疫不全の治療における使用提供する。2008535841.tif 000008
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:8（26位のアラニンまたは27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わる）に示される、CTLA4の細胞外ドメインまたはその一部を含む、CTLA4変異分子の有効投与量を、患者に投与することを特徴とする、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法であり、その細胞外ドメインまたはその一部において、55位のアラニンはチロシンで置換され、さらに130位のロイシンはグルタミン酸で置換されており、またその投与レジメンは初期段階レジメンを含み、該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、また当初は月１回よりもより頻繁に投与することを特徴とする、該治療方法。
【請求項２】
CTLA4変異分子の有効投与量を患者に投与することを含む、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法であり、該CTLA4変異分子は、:
(a)配列番号:4の、27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列、または
(b)配列番号:4の、26位のアラニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列を含み、
該CTLA4変異分子の投与レジメンは初期段階レジメンを含み、該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、また当初は月１回よりもより頻繁に投与することを特徴とする、該治療方法。
【請求項３】
該初期段階投与レジメンは、1日目、2週巡回、4週巡回、8週巡回および12週巡回のCTLA4変異分子の投与を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
該初期段階投与レジメンは、5日目のCTLA4変異分子の投与を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
該初期段階投与レジメンは、6週巡回、10週巡回、4箇月巡回、5箇月巡回および6箇月巡回のCTLA4変異分子の投与を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
該投与レジメンは更に維持段階レジメンを含み、該維持段階レジメンは、初期段階レジメンが終了した後に始まり、および該CTLA4変異分子の投与は、月1回よりもより頻繁には行わない、請求項3、4または5に記載の方法。
【請求項７】
該初期段階のCTLA4変異分子の有効投与量は、約10mg/kg（患者の体重）である、請求項3、4または5に記載の方法。
【請求項８】
維持段階の該CTLA4変異分子の有効投与量は、約5mg/kg（体重）である、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
該CTLA4変異分子の有効投与量は約10mg/kg（患者の体重）であり、投与レジメンは1、15、29、57、85日目であり、その後月1回の5gm/kgの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１０】
該CTLA4変異分子の有効投与量は約10mg/kg（患者の体重）であり、投与レジメンは、1、5、15、29、57、85日目であり、その後月1回の5mg/kgの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１１】
該CTLA4変異分子の有効投与量は約10mg/kg（患者の体重）であり、投与レジメンは、1、5、15、29、43、57、71、85、113、141、169日目およびその後月1回の5mg/kgの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１２】
該グラフト移植に関連する免疫不全は、実質臓器、組織および/または細胞 移植片拒絶反応を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１３】
該グラフト移植に関連する免疫不全は、腎移植片拒絶反応を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
該CTLA4変異分子はさらに、該可溶性CTLA4変異分子の可溶性、親和性および/または結合価を変えるアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１５】
可溶性、親和性および/または結合価を変える該アミノ酸配列は、免疫グロブリン部位を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
該免疫グロブリン部位は、免疫グロブリン定常領域またはその一部である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
該免疫グロブリン定常領域またはその一部は、エフェクター機能を減らすために、変異している、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
該免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒトまたはサル免疫グロブリンの、ヒンジ、CH2およびCH3領域を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
該免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒトまたはサル免疫グロブリン分子のヒンジ、CH2およびCH3領域を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
該免疫グロブリンは、配列番号:4に示される、＋152位のグルタミン酸で始まり、＋383位のリジンで終わるアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２１】
更に接合アミノ酸残基および免疫グロブリンを含み、該接合アミノ酸残基は、該＋150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列と該免疫グロブリンとの間に位置する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２２】
前記CTLA4変異分子は、バシリキシマブ、ダクリズマブ、抗-胸腺細胞グロブリン、カルシニューリン阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル 、ミコフェノール酸、ラパマイシン、アザチオプリン、ムロモナブ、リツキシマブ、シロリムス、エベロリムス、FTY720、FK778、Jak-3、センチカン、副腎皮質ステロイド、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾール、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロンからなる群から選ばれる薬剤の少なくとも1つと併用する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２３】
CAN、脂質異常症、高血圧、糖尿病、多毛症、脱毛症、歯肉増殖症、振戦、神経毒性および骨減少症からなる群から選ばれる転帰の発生および/または進行を減らす、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２４】
さらに約3μg/mlおよび約30μg/mlの間の該CTLA4変異分子の標的トラフ血清濃度を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２５】
CTLA4変異分子の有効投与量を患者に投与することを含むグラフト移植に関連する免疫不全の治療方法であり、該CTLA4変異分子は、:
(a)図7の27位のメチオニンで始まり、＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンで終わるアミノ酸配列、または
(b)図7の26位のアラニンで始まり、＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンで終わるアミノ酸配列を含み、および
該CTLA4変異分子の投与レジメンは、初期段階レジメンを含み、該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、および当初は月１回より頻繁に投与することを含む、該治療方法。
【請求項２６】
該CTLA4変異分子は、バシリキシマブおよびMMFを含む薬剤と、同時にもしくは連続的に併用される、請求項1、2または25に記載の方法。
【請求項２７】
該CTLA4変異分子は、ダクリズマブおよびシロリムスを含む薬剤と、同時にもしくは連続的に併用される、請求項1、2または25に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願第60/668,774号（2005年4月6日出願）の題35§119(e)に基づいて優先権を主張し、該内容を本明細書に引用する。
【０００２】
本出願を通して、あらゆる刊行物を引用する。これらの刊行物の全体の開示を、本発明の技術分野の状況をより十分に言及するために、参照して本出願に引用する。
【０００３】
本発明は、グラフト移植に関連する免疫不全の治療における、野生型CTLA4と比較してCD80(B7−1)およびCD86(B7-2)への結合力が増大した可溶性CTLA4変異分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
移植片拒絶反応においてT-細胞は中心的な役割を果たすため、現在の免疫抑制療法における一般的な目的は、T-細胞の活性化および機能の阻害である(Sayegh MH, Turka LA. The role of T-cell costimulatory activation pathways in transplant rejection. N Engl J Med 1998;338(25):1813-21)。T-細胞は、完全に活性化するには、抗原特異的シグナル(シグナル1)および補助刺激シグナル(シグナル2)の両方を必要とする(Lenschow DJ, Walunas TL, Bluestone JA. CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu Rev Immunol 1996;14:233-58)。最もよく特徴がわかっている補助刺激経路の一つは、CD28-CD80/86(B7−1/2)相互作用である(Linsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annu Rev Immunol 1993;11:191-212)。細胞傷害性T-リンパ球抗原4(CTLA4)は、CD28よりも高い結合力でCD80/86に、結合し、およびそれらの活性化により一時的にT-細胞上に発現し、CD28およびCD80/86間の相互作用を遮断する(Oosterwegel MA, Greenwald RJ, Mandelbrot DA, Lorsbach RB, Sharpe AH. CTLA-4 and T cell activation. Curr Opin Immunol 1999;11(3):294-300.)。これにより、T-細胞活性化のネガティブフィードバックシグナルが生じる。
【０００５】
この経路の治療は、これまでCTLA4Igを対象として行われてきた。CTLA4Igは、関節リウマチ(Kremer JM, Westhovens R, Leon M, et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4Ig. N Engl J Med 2003;349(20):1907-15)および乾癬(Abrams JR, Lebwohl MG, Guzzo CA, et al. CTLA4Ig-mediated blockade of T-cell costimulation in patients with psoriasis vulgaris. J Clin Invest 1999;103(9):1243-52)のようなT-細胞-媒介自己免疫疾患の治療のための方法として、うまく用いられてきた。
【０００６】
LEA29Yは、非ヒトの霊長類移植モデルにおいて、単独でおよび他の免疫抑制物質と組みあわせて研究されてきた。Christian Larsenら(C. Larsen, T. Pearson, A. Adams, P. Tso, N. Shirasugi, E. Strobert, D. Anderson, S. Cowan, K. Price, J. Naemura, J. Emswiler, J. Greene, L.A. Turk, J. Bajorath, R. Townsend, D. Hagerty, P. Linsley and R. Peach; Rational Development of LEA29Y (belatacept), a High-Affinity Variant of CTLA4-Ig with Potent Immunosuppressive Properties; American Journal of Transplantation; Vol. 5, Issue 3, March 2005, p.443)は、腎同種移植片拒絶の研究に用いた非ヒト霊長類モデルにおいて、CTLA4-Igと比較して、LEA29Yの免疫抑制活性は増大することを示した。LEA29Yを、手術中(10mg/kg、静脈内)、4日目(15mg/kg)、および手術後の14、28、42、56および70日目(20mg/kg、静脈内)に投与した。CTLA4Ig(16mg/kg)を、手術中および手術後の4、8、11および16日目に投与した。該治療レジメンはまた、MMF(15mg/kg bid 皮下注射 0−14日目、qd 15−180日目)、メチルプレドニゾロン(皮下注射、以下のスケジュールに従う、0日目: 20mg、1日目: 16mg、3日目: 8mg、4日目:4mg、5−14日目: 3mg、15−180日目: 1mg)およびバシリキシマブ(0.3mg/kg、静脈内、0および4日目)を含んだ。LEA29Yで治療した腎臓同種移植レシピエントの生存は、同等の血清濃度にも関わらず、CTLA4-Igで治療した群より明らかに優れていた。アルブミンで治療したコントロールレシピエントは、CTLA4-Igで治療した群と同様の生存期間中央値を示した。しかしながら、LEA29Yの治療を行ったにも関わらず、全レシピエントは、有意な腎機能の低下(血清中クレアチニンの上昇)を示した。
【０００７】
Andrew Adamsら(A. Adams, N. Shirasugi, T. Jones, M. Durham, E. Strobert, S. Cowan, P. Rees, R. Hendrix, K. Price, N. Kenyon, D, Hagerty, R. Townsend, D. Hollenbaugh, T. Pearson and C. Larsen; Development of a Chimeric Anti-CD40 Monoclonal Antibody That Synergizes with LEA29Y to Prolong Islet Allograft Survival; The Journal of Immunology; Jan 2005; 174; p. 542)は、LEA29YおよびChi220(キメラ抗-ヒトCD40mab)の組み合わせは、膵臓ランゲルハンス島移植の非ヒト霊長類モデルにおいて、相乗的に作用し、同種移植片の残存期間を延ばすことを示した。LEA29Yを、手術中 (20mg/kg); 手術後4、7および14日目; その後2週間毎に100日まで静脈投与した。さらに投与量(20mg/kg)を、月1回、6箇月まで投与した。4つのプロトコルを試験した: 1)LEA29Y単独、2)Chi220(抗-CD40)、3)LEA29YとChi220の組み合わせ、および4)LEA29Yと抗-CD20の組み合わせ。
【０００８】
Andrew Adamsら(A. Adams, N. Shirasugi, M. Durham, E. Strobert, D. Anderson, P. Rees, S. Cowan, H. Xu, Y. Blinder, M. Cheung, D. Hollenbaugh, N. Kenyon, T. Pearson and C. Larsen; Calcineurin Inhibitor-Free CD28 Blockade-Based Protocol Protects Allogeneic Islets in Nonhuman Primates; Diabetes, Vol. 51(2), February 2002, p. 265)は、LEA29Y、ラパマイシン、および抗-IL-2RmAbの組み合わせは、膵臓ランゲルハンス島移植の非ヒト霊長類モデルにおいて、ランゲルハンス島の同種移植片の残存期間を有意に延ばすことを示した。LEA29Yを、手術中(10mg/kg)および術後の4日目(15mg/kg)に静脈投与した。更に投与量20mg/kgを、術後14日目および2週間毎に術後154日目まで投与した。
【０００９】
2003年には、25,000より多い臓器がUSで移植された。実質臓器移植の約60％が腎臓移植であり、つづいて、肝臓移植21％、心臓8％、肺4％であり、および残りの7％は、膵臓および腸のような他の臓器移植である(OPTN/SRTR Annual Report 2004 at www.optn.org)。
【００１０】
腎移植は、末期腎疾患の最も有効な治療である。それにより、生存率および生活の質(QoL)が改善される。移植腎の機能を維持するには、移植片の免疫破壊を防ぐための生涯にわたる免疫抑制療法が必要となる。現在の免疫抑制レジメンにおける1-年の残存率は、死体ドナー移植片では89％および生体ドナー移植片では94％である。しかし、時間が経緯すると、患者および移植片の喪失は共に進行する。死体ドナーおよび生存する血縁ドナーの移植腎の5-年の残存率は、それぞれ66％および79％である(United Network for Organ Sharing Renal Transplant Registry 2003 at www.unos.org)。
【００１１】
長期的な患者および移植片の喪失の最も一般的な原因は、それぞれ循環器疾患および慢性移植腎症(CAN)である(L.C. Paul, Chronic allograft nephropathy  A model of impaired repair rom injury? Nephrol Dial Transplant 2000;15:149-151)。逆説的には、腎移植の主治療であるカルシニューリン阻害剤(CNI)、CsAおよびタクロリムスは、それらは本質的には腎毒性、およびさらに高血圧、高コレステロール血症、および真性糖尿病を含む心血管リスクを引き起こしまたは悪化させるため、長期的な同種移植片の喪失および患者の死亡の直接の原因である。それにもかかわらず、これらの薬剤は、従来の腎移植のあらゆる免疫抑制レジメンの基礎となっている。
【００１２】
現在、広い範囲の患者の維持免疫抑制剤治療の基礎として、CNIの代替となりうる認可された薬剤はない。薬剤、シロリムス(ラパマイシン、Rapamune登録商標Wyeth/Ayerst製)は、CNI-節約レジメンに使用するため認可された。しかしなお少なくとも移植後3箇月間は、CNIをシロリムスとともに使用しなければならない。さらに重要なことは、シロリムスは、移植片喪失のリスクを抑える必要が低い患者に対してのみ、この設定の中でCNI-節約薬剤としての使用に認可されたことである。従って、移植片喪失のリスクの高い患者にとって、CNIの腎毒性作用を回避することは最大の利点であるが、認可されたCNIの代替は無い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、長期的な患者の死亡および移植片喪失の一因となる毒性がなく、治療方法に標準に匹敵する、同種免疫反応の許容しうる管理を提供しうる免疫抑制物質に対して、いまだ満たされていない医学的ニーズはある。理想としては、該薬剤は、移植片喪失のリスクの低い患者だけでなく、高い患者においても有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、野生型CTLA4または非-変異CTLA4Igより高い結合力でCD80および/またはCD86抗原に結合するCTLA4変異分子と投与することによる、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法を提供する。該CTLA4分子は、CTLA4の細胞外ドメインを含む第１のアミノ酸配列を有し、S25-R33領域およびM97-G107領域内の特定のアミノ酸残基は変異する。本発明の変異分子はまた、該変異分子の可溶性を増す第２のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
CTLA4変異分子の1つの例は、本明細書に記載するL104EA29YIg(図7、配列番号:3および4)である。CTLA4変異分子のもう1つの例は、本明細書に記載するL104EIg(図8、配列番号:5および6)である。L104EA29YIgおよびL104EIgは、CD80およびCD86にCTLA4Igと比較してより強い結合力で結合する。
【００１６】
本発明のCTLA4変異分子の投与は、様々な時期に行われうる。概して、投与レジメンには、初期段階（その投与量は多く、および免疫学的なリスクが最も高い期間の投与の頻度は増やされる）、続いて維持段階が含まれる。該初期段階は、移植後の最初の3から6箇月に及びうる。初期段階の投与レジメンは、レシピエント/移植片の状態に依存して異なりうる。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、配列番号:8に示される26位のアラニンもしくは27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の細胞外ドメインまたはその一部を有する、CTLA4変異分子の有効投与量を患者に投与することによる、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法を提供する。さらに、該細胞外ドメインまたはその一部において、55位のアラニンがチロシンで置換され、130位のロイシンが、グルタミン酸で置換される。その上、該投与レジメンは、初期段階レジメンを含み、該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、および当初は月１回よりより頻繁に投与されることを含む。
【００１８】
別の態様において本発明は、配列番号:4の27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列、または配列番号:4の26位のアラニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列を有する有効投与量のCTLA4変異分子を患者に投与することによる、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法を提供する。さらに該CTLA4変異分子の投与レジメンは、初期段階レジメンを含み、該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、当初は月１回よりもより頻繁に投与することを含む。
【００１９】
本発明の詳細な説明
定義
本出願に使用する科学的および技術的用語の全ては、特別の定めのない限り当該技術分野で通常使用する意味を有する。本出願で使用される、以下の単語または語句は、所定の意味を有する。
【００２０】
本明細書において、“リガンド”とは、他の分子を特異的に認識しおよび結合する分子を言い、例えば、CTLA4のリガンドは、B7分子である。
【００２１】
本明細書において“野生型CTLA4”または“非-変異型CTLA4”は、図13(配列番号:9および10; さらにU.S.特許第5,434,131号、第5,844,095号、第5,851,795号に記載)に示される、CTLA4の全長の天然のアミノ酸配列またはその一部もしくは誘導体を有し、B7を認識して結合し、またはB7を阻害し、CD28および/またはCTLA4(例、内因性CD28および/またはCTLA4)との結合をブロックする。特定の態様において、野生型CTLA4の細胞外ドメインは、＋1位のメチオニンで始まり、＋124位のアスパラギン酸で終わり、または野生型CTLA4の細胞外ドメインは、−1位のアラニンで始まり、＋124位のアスパラギン酸で終わる。野生型CTLA4は、細胞表面タンパク質であり、N-末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびC-末端細胞質ドメインを有する。該細胞外ドメインは、B7分子のような標的分子に結合する。細胞内において、天然の野生型CTLA4タンパク質は、未成熟ポリペプチドとして翻訳され、N-末端のシグナルペプチドを含む。該未成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断および除去を含む翻訳後プロセシングを受け、未成熟型のN-末端とは異なる新しくできたN-末端を有するCTLA4切断産物となる。当該技術分野の当業者は、CTLA4切断産物の新しくできたN-末端から1以上のアミノ酸を除去する更なる翻訳後プロセシングが起こりうることを理解する。また、該シグナルペプチドは、完全に除去されないこともあり、通常の開始アミノ酸メチオニンの前で始まる分子が生じる。従って、該成熟CTLA4タンパク質は、＋1位のメチオニンまたは−1位のアラニンで始まりうる。CTLA4分子の該成熟型は、細胞外ドメインまたはその一部を含み、B7に結合する。
【００２２】
“CTLA4Ig”は、Ig尾部につながった野生型CTLA4の細胞外ドメインまたはその一部を含む、可溶性融合タンパク質であり、B7に結合する。特定の態様は、＋1位のメチオニンで始まり、＋124位のアスパラギン酸で終わる; または−1位のアラニンから始まり＋124位のアスパラギン酸までの野生型CTLA4の細胞外ドメイン(図9、配列番号:7および8に示される); ＋125位のグルタミン接合（junction）アミノ酸残基; および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンまでを含む免疫グロブリン部(CTLA4IgをコードするDNAは、ブダペスト条約の規定のもと、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC) 10801 University Blvd.、Manassas、VA 20110-2209に、1991年5月31日に寄託された、およびATCC寄託番号、ATCC 68629を受けた。; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793-80. CTLA4Igを発現するCTLA4Ig-24、Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞株は、1991年5月31日にATCCに寄託された（識別番号CRL−10762）。)を含む。該可溶性CTLA4Ig分子は、シグナル(リーダー)ペプチド配列を含み、または含まない。
【００２３】
本明細書において、“融合タンパク質”は、当該技術分野において既知の方法を用いおよびU.S.特許第5,434,131号または第5,637,481号に記載のように結合した、1以上のアミノ酸配列と定義される。従って、該結合アミノ酸配列は、1つの融合タンパク質を形成する。
【００２４】
本明細書において、“可溶性”とは、細胞に結合または付着していない、すなわち、循環している、分子または断片およびその誘導体をいう。例えば、CTLA4、B7またはCD28は、免疫グロブリン(Ig)部をCTLA4、B7またはCD28の細胞外ドメインにそれぞれ結合することで、可溶性となる。また、CTLA4のような分子は、その膜貫通ドメインを除去することで可溶性とすることが出来る。
【００２５】
本明細書において“CTLA4の細胞外ドメイン”は、B7分子のようなCTLA4リガンドを認識して結合する、CTLA4の部分である。例えば、CTLA4の細胞外ドメインは、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸を含む(図13、配列番号:9および10)。また、CTLA4の細胞外ドメインは、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸を含む(図13、配列番号:9および10)。該細胞外ドメインは、B7分子と結合するCTLA4の断片または誘導体を含む。図13(配列番号:9および10)に示されるCTLA4の細胞外ドメインまたは、B7分子へのCTLA4分子の結合力を変化する変異を含みうる。
【００２６】
本明細書において、“CTLA4変異分子”は、1つの変異または多重変異(好ましくは野生型CTLA4の細胞外ドメイン中に)を有する、(配列番号:9および10)に示される野生型CTLA4、またはその一部もしくはその誘導体を意味する。CTLA4変異分子は、該野生型CTLA4分子の配列と同様であるが一致はせず、しかしなおB7と結合する配列を有する。該変異には、1以上の、保守的（conservative）(例、ロイシンをイソロイシンと置換)もしくは非-保守的（non-conservative）(例、グリシンをトリプトファンと置換)な構造的性質もしくは化学的性質を有するアミノ酸でのアミノ酸残基の置換、アミノ酸欠失、付加、フレームシフト、または切断が含まれうる。CTLA4変異分子は、その中にまたはそれに結合する非-CTLA4分子を含みうる。該変異分子は、可溶性(すなわち、循環)または細胞表面に結合しうる。更なるCTLA4変異分子には、U.S.特許出願第09/865,321、第60/214,065号および第60/287,576号; U.S.特許第6,090,914号、第5,844,095号および第5,773,253号;ならびにPeach, R. J., et al., in J Exp Med 180:2049-2058 (1994))の記載のそれらが含まれる。CTLA4変異分子は、合成的にまたは組換え技術により調製されうる。
【００２７】
“L104EA29YIg”は、アミノ酸の変化、A29Y(29位のアミノ酸残基チロシンがアラニンの代わりとなる)およびL104E(＋104位のアミノ酸残基グルタミン酸がロイシンの代わりとなる)を有する野生型CTLA4の細胞外ドメイン、またはB7分子に結合するその一部を含む可溶性CTLA4変異分子であり、Ig尾部に結合した融合タンパク質である(図7、配列番号:3および4に含まれ; L104EA29YIgをコードするDNAは、2000年6月20日にATCC番号PTA-2104で寄託され; 参照して本明細書に引用するU.S.特許出願第09/579,927号、第60/287,576号および第60/214,065号に同時継続する)。本発明の方法および/またはキットで使用する可溶性L104EA29YIg分子は、シグナル(リーダー)ペプチド配列を含み、または含まない。概して、本発明の方法および/またはキットにおいて、該分子はシグナルペプチド配列を含まない。本発明の方法および/またはキットに使用する可溶性L104EA29YIg分子は、シグナル(リーダー)ペプチド配列を含み、または含まない。概して、本発明の方法および/またはキットにおいて、該分子は、シグナルペプチド配列を含まない。
【００２８】
本明細書において、語句“変異”は、野生型分子のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化、例えば、野生型CTLA4細胞外ドメインのDNA配列および/またはアミノ酸配列の変化を意味する。DNAの変異は、コドンを変化し、アミノ酸配列の変化を引き起こしうる。DNAの変化には、置換、欠失、挿入、選択的スプライシング、または切断が含まれる。アミノ酸の変化には、置換、欠失、挿入、付加、切断、またはタンパク質のプロセシングエラーもしくは切断エラーを含まれる。また、ヌクレオチド配列の変異は、当該技術分野においてよく理解されたアミノ酸配列のサイレント変異を生じうる。その点において、特定のヌクレオチドコドンは、同一のアミノ酸をコードする。例としては、ヌクレオチドコドン CGU、CGG、CGC、およびCGAは、アミノ酸、アルギニン(R)をコードし、;またはコドン GAU、およびGACは、アミノ酸、アスパラギン酸(D)をコードする。従って、タンパク質は、それらの個々のヌクレオチド配列は異なるが、なお同一配列のタンパク質分子をコードする1以上の核酸分子でコードされうる。該アミノ酸コード配列は以下のとおりである:
【表１】
2008535841.tif 000003
変異分子は1以上の変異を有しうる。
【００２９】
本明細書において、“非-CTLA4タンパク質配列”または“非-CTLA4分子”は、B7と結合せず、およびCTLA4がその標的と結合するのを妨げないタンパク質分子を意味する。例としては、それらに制限されないが、免疫グロブリン(Ig)定常領域、またはその一部が含まれる。好ましくは、該Ig定常領域は、ヒトまたはサルIg定常領域であり、例えば、ヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC(ガンマ)1である。該Ig定常領域は、そのエフェクター機能を減少させるよう変異されうる(U.S.特許第5,637,481号、第5,844,095号および第5,434,131号)。
【００３０】
本明細書において、“断片”または“一部”は、CTLA4分子のいずれかの部分またはセグメントであり、好ましくは該CTLA4の細胞外ドメインまたはその一部もしくはそのセグメントであり、その標的例えばB7分子を認識して結合する。該CTLA4の細胞外ドメインは、CTLA4分子のB7分子に対する結合力を変化する変異を含みうる。
【００３１】
本明細書において、“B7”は、それらに限定されないが、B7−1(CD80)、B7-2(CD86)およびB7-3を含むB7ファミリー分子をいい、CTLA4および/またはCD28を認識して結合しうる。
【００３２】
本明細書において、“B7-陽性細胞”は、1以上のB7分子の型を細胞表面で発現する細胞である。
【００３３】
本明細書において、“誘導体”はその親分子の配列相同性および活性を共有する分子である。例えば、CTLA4の誘導体は、野生型CTLA4の細胞外ドメインと少なくとも70％の相同性であるアミノ酸配列を有し、およびB7を認識して結合する可溶性CTLA4分子が含まれ、例えば、CTLA4Igまたは可溶性CTLA4変異分子L104EA29YIgである。
【００３４】
本明細書において、免疫反応の“制御”とは、免疫反応を活性化し、刺激し、上方制御、阻害し、ブロックし、下方制御しまたは修正することをいう。本明細書に記載の自己免疫疾患は、免疫反応を制御すること、例えば、機能的CTLA4-および/またはCD28-陽性細胞のB7-陽性細胞との相互作用を制御することにより、治療しうる。例えば、免疫反応の制御方法には、B7-陽性細胞を本発明の可溶性CTLA4分子と接触させて可溶性CTLA4/B7複合体を形成させ、該可溶性CTLA4分子が内因性CTLA4および/またはCD28分子と該B7分子との反応を阻害することが含まれる。
【００３５】
本明細書において、受容体、シグナルまたは分子の“ブロック”または“阻害”とは、当技術分野で広く認められている試験により検出されるように、受容体、シグナルまたは分子の活性化を防ぐことを意味する。ブロックまたは阻害は部分的または全体でありうる。例えば、細胞性免疫反応のブロックは、腎移植後の血清中クレアチニン濃度のような、移植片の機能性を測定することで検出できる。
【００３６】
本明細書において、“B7の相互作用のブロック”とは、B7がCD28および/またはCTLA4のようなそのリガンドと結合することを妨げ、それによりT-細胞とB7-陽性細胞の相互作用を遮断することを意味する。B7の相互作用をブロックする薬剤の例には、それらに限定されないが、CTLA4、CD28またはB7分子(例、B7−1、B7-2)のいずれかを認識して結合する抗体(または、その一部またはその誘導体)のような分子; 可溶性CTLA4のような該分子の可溶性構造(または、その一部またはその誘導体); CTLA4/CD28/B7-媒介相互作用による細胞シグナルを阻害するようデザインされたペプチド断片または他の小分子が含まれる。好ましい態様において、該ブロック薬は、L104EA29YIg(ATCC PTA-2104)のような可溶性CTLA4変異分子である。
【００３７】
本明細書において、障害または疾患を“治療する”または“治療している”とは、薬物療法または他の療法により疾患または障害を管理することを意味する。疾患または障害の治療は、疾患に関する免疫介在性症状を抑え、疾患または障害の症状を改善し、疾患または障害の重症度を減らし、疾患または障害の進行過程を変え、および/または基礎的疾患または障害の症状を改善または治療する。例えば、グラフト移植に関する免疫不全の治療は、免疫反応を制御すること、例えば、機能的CTLA4-および/またはCD28-陽性細胞とB7-陽性細胞との相互作用を制御することにより、達成されうる。別法として、免疫疾患または免疫不全の治療は、本明細書の記載の組成物の使用により、該疾患または不全が発症または進行するのを防ぎまたは阻害することにより行われうる。例えば、腎移植片拒絶反応の治療には、糸球体ろ過量(GFR)で測定される腎移植片拒絶反応の抑制が含まれる。例えば、グラフト移植に関連する免疫不全の治療には、L104EA29YIgの投与による臓器拒絶反応の予防が含まれる。さらに、グラフト移植に関連する免疫不全の治療は、患者の生存期間および移植臓器の残存期間を延ばしうる。
【００３８】
本明細書において、“免疫系疾患”には、それらに限定されないが、自己免疫疾患、免疫増殖性疾患、およびグラフト移植に関連する免疫不全を含む、T-細胞とB7-陽性細胞との相互作用に介在される疾患が含まれる。
【００３９】
本明細書において、“グラフト移植に関連する免疫不全”は、それらに限定されないが、グラフト移植拒絶反応に関連する免疫不全、グラフト関連疾患、移植片対宿主病(GVHD)(例、骨髄移植に起因し、または寛容の誘導を生じるなど)、グラフトまたは移植片の急性拒絶反応およびグラフトまたは移植片の慢性拒絶反応を含むグラフトまたは移植片の拒絶反応を含む、T-細胞とB7-陽性細胞との相互作用に媒介される移植片関連疾患を意味する。該グラフトは、それらに限定されないが、肌、島細胞(またランゲルハンス島として知られる)、筋肉、肝細胞、神経細胞、心臓、肝臓、腎臓、肺、付属肢、肢、鼻、耳または顔を含む、実質臓器の同種移植片もしくは異種移植片、組織もしくは細胞の同種移植片もしくは異種移植片、または外部組織の同種移植片もしくは異種移植片でありうる。
【００４０】
本明細書において、免疫増殖性疾患には、それらに限定されないが、T細胞リンパ腫; T細胞性急性リンパ性白血病; 精巣血管中心性T細胞リンパ腫; および良性リンパ球性血管炎が含まれる。
【００４１】
本明細書において、自己免疫疾患には、それらに限定されないが、狼瘡(例、エリテマトーデス、ループス腎炎)、乾癬; 橋本甲状腺炎、原発粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病(例、インスリン依存真性糖尿病、I型真性糖尿病、II型真性糖尿病)、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性作用肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患(例、関節リウマチ、乾癬性関節炎)、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病のような疾患が含まれる。
【００４２】
本明細書に記載する本発明をより十分に理解するために、以下の記載で説明する。
【００４３】
本発明の組成物および方法
本発明は、移植のための免疫抑制療法の新規なクラスを提供する。それは、抗原提示細胞(APCs)の表面のB7分子に結合してT-細胞の活性化に必須な補助刺激を阻害する、融合タンパク質である。本発明の可溶性CTLA4変異分子は、その分子標的の限定された分布、およびその作用の特異性において、既存の免疫抑制剤とは異なる。本発明は、CD80および/またはCD86を認識して結合する可溶性CTLA4変異分子を提供する。いくつかの態様において、該可溶性CTLA4変異体は、CTLA4Igと比べて、CD80および/またはCD86に対する高い結合力を有する。例えば、L104EA29YIgは、野生型CTLA4Ig(以下CTLA4Igと称する)と比較して、約2-倍の結合力でCD80に、および約4-倍の結合力でCD86に結合する。この強い結合により、L104EA29YIgは、CTLA4Igと比較して、より効果的に免疫反応をブロックする。
【００４４】
本発明の１つの態様は、免疫系疾患の治療方法を提供する。該方法には、本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子を含む治療用組成物を、少なくとも1つの免疫系疾患に関する症状を緩和するための有効量で、患者に投与することが含まれる。さらに、本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子は、T-細胞/B7-陽性細胞の相互作用をブロックし、それによりCD28に結合するB7のような補助刺激シグナルによるT-細胞の活性化/刺激をブロックし、T-細胞アネルギーまたは寛容の誘導を引き起こすことによって、長期的な免疫系疾患の治療方法を提供しうる。免疫系疾患には、それらに限定されないが、上述の自己免疫疾患、免疫増殖性疾患、およびグラフト移植に関連する免疫不全が含まれる。
【００４５】
別の態様は、本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子を含む治療用組成物を投与することによる、グラフト移植に関連する免疫不全を有する患者において寛容を誘導する方法を提供する。
【００４６】
本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子は、インビボで阻害作用を示す。T細胞およびB7-陽性細胞間の接触の結果としてT-細胞/B7-陽性細胞の相互作用（例えばT細胞/B細胞の相互作用）が生じている状況において、反応させるために導入されたCTLA4変異分子がB7-陽性細胞（例えばB細胞）に結合し、T細胞/B7-陽性細胞の相互作用を妨害、すなわち阻害し、免疫反応を制御する。
【００４７】
別の態様は免疫反応の制御方法を提供する。本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子により下方制御される（減少される）免疫反応は、既に進行中の免疫反応を阻害またはブロックする方法を経て、または免疫反応の誘導を防ぐことを伴いうる。本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子は、Tリンパ球の増殖、サイトカイン分泌および/またはサイトカイン産生のような、活性化T細胞の機能を、T細胞の応答を抑制することにより、T細胞の特異的寛容を誘導することにより、またはその両方により阻害しうる。さらに、本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子は、CTLA4/CD28/B7経路を妨げてT-細胞増殖および/またはサイトカイン分泌を阻害し、およびその結果、細胞破壊の減少およびT-細胞不応答またはアネルギーの誘導が生じうる。
【００４８】
CTLA4変異分子は、少なくとも該CTLA4の細胞外ドメイン、またはCD80および/またはCD86に結合するその一部を含む。該CTLA4変異分子の細胞外部分は、＋1位のメチオニンから始まり＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含む。(図7、配列番号:3および4; または図8、配列番号:5および6)。また、該CTLA4の細胞外部分は、−1位のアラニンから始まり＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含みうる(図7、配列番号:3および4; または図8、配列番号:5および6)。
【００４９】
1つの態様において、該可溶性CTLA4変異分子は、＋25のセリンで始まり、＋33のアルギニンで終わる(S25-R33)アミノ酸配列の領域に1以上の変異を有する該CTLA4の細胞外ドメインを含む、融合タンパク質である。例えば、野生型CTLA4の＋29位のアラニンが、チロシン(コドン: UAU、UAC)で置換されうる。また、アラニンが、ロイシン(コドン: UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG)、フェニルアラニン(コドン: UUU、UUC)、トリプトファン(コドン: UGG)、またはスレオニン(コドン: ACU、ACC、ACA、ACG)で置換される。当該技術分野の当業者に直ちに理解されるように、RNA配列のウラシル(U)ヌクレオチドは、DNA配列のチミン(T)ヌクレオチドに対応する。
【００５０】
別の態様において、該可溶性CTLA4変異分子は、＋97のメチオニンから始まり、＋107のグリシンで終わる(M97-G107)アミノ酸配列の領域中または近くに1以上の変異を有する該CTLA4の細胞外ドメインを含む、融合タンパク質である。例えば、野生型CTLA4の＋104位のロイシンは、グルタミン酸(コドン: GAA、GAG)で置換されうる。この置換を有するCTLA4変異分子を、本明細書においてL104EIg(図8、配列番号:5および6)と記載する。
【００５１】
さらに別の態様において、該可溶性CTLA4変異分子は、S25-R33およびM97-G107領域に1以上の変異を有する該CTLA4の細胞外ドメインを含む、融合タンパク質である。例えば、1つの態様において、CTLA4変異分子は、＋29位にアラニンの代わりにチロシン; および＋104位にロイシンの代わりにグルタミン酸を含む。これらの置換を有するCTLA4変異分子を、本明細書においてL104EA29YIg(図7、配列番号:3および4)と記載する。L104EA29YIgをコードする核酸分子は、pD16 L104EA29YIgに含まれ、および2000年6月19日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209に寄託された(ATCC No. PTA-2104)。該pD16 L104EA29YIgベクターは、pcDNA3ベクター(インビトロゲン)の誘導体である。
【００５２】
本発明はさらに、図7(配列番号:3および4)または図8(配列番号:5および6)に示される、CTLA4変異体の細胞外ドメインまたはその一部、およびCTLA4変異分子の可溶性、親和性および/または結合価を変える部位を含む可溶性CTLA4変異分子を提供する。
【００５３】
本発明の実施に従って、該部位は、免疫グロブリン定常領域またはその一部であり、例えば、1以上のCH1領域、ヒンジ、CH2領域またはCH3領域である。インビボでの使用のために、免疫グロブリン定常領域は、患者に有害な免疫反応を誘発しないことが好ましい。例えば、臨床プロトコルにおいて、変異分子は、ヒトまたはサルの免疫グロブリン定常領域またはその一部含むことが好ましい。適当な免疫グロブリン領域の例には、それらに限定されないが、IgCγ1(IgCガンマ1)、IgCγ2(IgCガンマ2)、IgCγ3(IgCガンマ3)、IgCγ4(IgCガンマ4)、IgCμ(IgCミュー)、IgCα1(IgCアルファ1)、IgCα2(IgCアルファ2)、IgCδ(IgCデルタ)またはIgCε(IgCイプシロン)が含まれる。他のイソタイプは可能である。さらに、他の免疫グロブリン定常領域またはその一部は可能である(好ましくは、他の弱または非-免疫原性免疫グロブリン定常領域またはその一部)。
【００５４】
臨床プロトコルにおいて、該免疫グロブリン部位は、患者に有害な免疫反応を誘発しないことが好ましい。該好ましい部位は、該免疫グロブリン定常領域またはその一部であり、ヒトまたはサル免疫グロブリン定常領域またはその一部を含む。適当な免疫グロブリン領域の1つの例は、ヒトCγ1であり、Fc受容体に結合するようなエフェクター機能を媒介するヒンジ、CH2およびCH3領域を含み、補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介し、または抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介する。該免疫グロブリン部位は1以上の変異を有し(例、CH2領域中、CDCまたはADCCのようなエフェクター機能を下げる)、該変異は、免疫グロブリンのFc受容体への結合能を増加または減少することで、免疫グロブリンのそのリガンドへの結合能を調節する。例えば、免疫グロブリン部位の変異には、ヒンジ領域内のそのいずれかまたはその全てのシステイン残基の変化が含まれ、例えば、＋130位、＋136位、および＋139位のシステインはセリンで置換される(図9、配列番号:8)。該免疫グロブリン部位はまた、図9(配列番号:8)に示されるように＋148位のプロリンのセリンでの置換を含みうる。さらに、免疫グロブリン部位の変異には、＋144位のロイシンのフェニルアラニンでの置換、＋145位のロイシンのグルタミン酸での置換、または＋147位のグリシンのアラニンの置換が含まれうる。免疫グロブリンg部位の例には、U.S.特許公報番号2002/0114814 A1 および2004/0151725 A1、U.S.特許第6,444,792号および第6,750,334号、およびWO 97/28267に記載および開示のものが含まれる。
【００５５】
他の部位にはポリペプチドタグが含まれる。適当なタグの例には、それらに限定されないが、p97分子、env gp120分子、E7分子、およびova分子が含まれる(Dash, B., et al. (1994)  J. Gen. Virol.  75:1389-97; Ikeda, T., et al. (1994)  Gene 138:193-6; Falk, K., et al. (1993) Cell. Immunol. 150:447-52; Fujisaka, K. et al. (1994) Virology  204:789-93)。タグとして他の分子の使用は、可能である(Gerard, C. et al. (1994) Neuroscience  62:721-739; Byrn, R. et al. J. Virol. (1989) 63:4370-4375; Smith, D. et al., (1987)  Science  238:1704-1707; Lasky, L., (1996)  Science  233:209-212)。
【００５６】
本発明はさらに、野生型CTLA4と比較してCD80および/またはCD86抗原と選択的により反応性する、可溶性変異CTLA4Ig融合タンパク質を提供する。1つの例は、図7(配列番号:3および4)に示されるL104EA29YIgである。
【００５７】
別の態様において、該可溶性CTLA4変異分子には接合アミノ酸残基が含まれ、それは該CTLA4部分と該免疫グロブリン部分の間に位置する。該接合アミノ酸は、グルタミンを含むアミノ酸である。該接合アミノ酸は当該技術分野において既知の分子的または化学的合成法により導入されうる。
【００５８】
別の態様において、該可溶性CTLA4変異分子は、該免疫グロブリン部分(例、ヒンジ、CH2およびCH3領域)を含み、該免疫グロブリン部分のヒンジ領域内のシステイン残基のいずれかまたは全てはセリンで置換され、例えば、＋130位、＋136位、または＋139位のシステインである(図7、配列番号:3および4; または図8、配列番号:5および6)。該変異分子はまた、図7(配列番号:3および4)または図8(配列番号:5および6)に示されるように、＋148位のプロリンのセリンでの置換を含みうる。
【００５９】
該可溶性CTLA4変異分子は、該変異分子のCTLA4部分の細胞外ドメインのN-末端に結合したシグナルペプチド配列を含みうる。該シグナルペプチドは、該変異分子の分泌を可能にするいずれかの配列であり、オンコスタチンM(Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853)、もしくはCD5(Jones, N. H. et al., (1986) Nature 323:346-349)からのシグナルペプチド、またはいずれかの細胞外タンパク質のシグナルペプチドを含む。
【００６０】
該変異分子は、該CTLA4の細胞外ドメインのN-末端で結合したオンコスタチンMシグナルペプチド、および該CTLA4の細胞外ドメインのC-末端に結合したヒト免疫グロブリン分子(例、ヒンジ、CH2およびCH3)を含みうる。この分子は、−26位のメチオニンから−1位のアラニンまでのアミノ酸配列を含むオンコスタチンMシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含むCTLA4部分、接合アミノ酸残基である＋125位のグルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンまでのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン部分を含みうる。
【００６１】
本発明の可溶性CTLA4変異分子は、分子的または化学的合成法により得られうる。該分子的方法は、以下の工程を含みうる: 該可溶性CTLA4変異分子を発現およびコードする核酸分子を適当な宿主細胞に導入する; 該宿主細胞が該変異分子を発現できる条件下で、そのように導入された該宿主細胞を培養する; および発現変異分子を単離する。該変異分子の該シグナルペプチド部分が、該タンパク質分子が宿主細胞により該細胞表面に発現し、および分泌されることを可能とする。翻訳された変異分子は、CTLA4部分および免疫グロブリン部分を有する成熟タンパク質を製するために、シグナルペプチドの切断を含む翻訳後修飾を受けうる。該切断は、−1位のアラニンの後でおこり、第1アミノ酸として＋1位のメチオニンを有する成熟変異分子が生じうる(図7、配列番号: 3および4; または図8、配列番号:5および6)。また、該切断は、−2位のメチオニンの後でおこり、第一アミノ酸として−1位のアラニンを有する成熟変異分子を生じうる。
【００６２】
当該技術分野の当業者は、哺乳類細胞でのL104EA29YIgの発現は、生じたタンパク質が残基:(i)＋1から＋357、(ii)−1から＋357;(iii)＋1から＋356、または(iv)−1から356のアミノ酸配列を有しうる(図7、配列番号:3および4; または図8、配列番号:5および6)という、N-およびC-末端の変化を生じうることを認識する。
【００６３】
好ましい態様は、ヒト免疫グロブリン分子(例、ヒンジ、CH2およびCH3)の全てまたは一部に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを有する、可溶性CTLA4変異分子である。この好ましい分子は、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含む該可溶性分子のCTLA4部分、＋125位のグルタミンの接合アミノ酸残基、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。CTLA4の細胞外ドメインを有する該部分は、＋29位のアラニンはチロシンで置換され、および＋104位のロイシンはグルタミン酸で置換されて、変異している。該変異分子の免疫グロブリン部分は、＋130位、＋136位、および＋139位のシステインはセリンで置換され、および＋148位のプロリンはセリンで置換されて、変異しうる。この変異分子は、本明細書において、L104EA29YIg(図7、配列番号:3および4)と記載される。
【００６４】
L104EA29YIgの別の態様は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、＋125位のグルタミンの接合アミノ酸残基、および＋126位のグルタミン酸(例、＋126から＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンまで)を含む免疫グロブリン部分を有する変異分子である。該CTLA4の細胞外ドメインを有する該部分は、＋29位のアラニンはチロシンで置換され; および＋104位のロイシンはグルタミン酸で置換されて、変異している。 該変異分子の該免疫グロブリン部分は、＋130位、＋136位、および＋139位のシステインはセリンで置換され、および＋148位のプロリンはセリンで置換されて、変異している。この変異分子は、本明細書において、L104EA29YIgと記載される(図7、配列番号:3および4)。シグナル配列が切断された後、L104EA29YIgは、＋1位のメチオニンで始まり、または−1位のアラニンで始まりうる。
【００６５】
本発明の別の変異分子は、ヒト免疫グロブリン分子(例、ヒンジ、CH2およびCH3)に結合するヒトCTLA4の細胞外ドメインを有する、可溶性CTLA4変異分子である。この分子は、＋1位のメチオニンから始まり＋124位のアスパラギン酸までのCTLA4をコードするアミノ酸配列の部分、＋125位のグルタミンの接合アミノ酸残基、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンまでのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン部分を含む。該CTLA4の細胞外ドメインを有する該部分は、＋104位のロイシンはグルタミン酸で置換されて、変異している。該変異分子の該ヒンジ部分は、＋130位、＋136位、および＋139位のシステインがセリンで置換されて、および＋148位のプロリンはセリンで置換されて、変異している。この変異分子は、本明細書において、L104EIgと記載される(図8、配列番号:5および6)。
【００６６】
別法として、L104EIgの態様は、ヒト免疫グロブリン分子(例、ヒンジ、CH2およびCH3)に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを有する可溶性CTLA4変異分子である。この好ましい分子は、−1位のアラニンから始まり＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含むCTLA4部分、＋125位のグルタミンの接合アミノ酸残基、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまたは＋356位のグリシンを含む免疫グロブリン部分を含む。該CTLA4の細胞外ドメインを有する該部分は、＋104位のロイシンはグルタミン酸で置換されて、変異している。該変異分子の該ヒンジ部分は、130位、＋136位、および＋139位のシステインはセリンで置換され、および＋148位のプロリンはセリンで置換されて、変異している。この変異分子は、本明細書において、L104EIgと記載される(図8、配列番号:5および6)。
【００６７】
さらに、本発明は、:(a)T細胞増殖をブロックし、第2アミノ酸配列と融合する膜糖タンパク質（例えば、CD28、CD86、CD80、CD40、およびgp39）の第1アミノ酸配列; (b) T細胞増殖をブロックする変異CTLA4の細胞外ドメインの断片である第2アミノ酸配列（例えば＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸を含むアミノ酸分子）(図7、配列番号:3および4;または図8、配列番号:5および6); および(c)標識タグとして働きまたは該分子の可溶性を高める第３アミノ酸配列、を有する可溶性CTLA4変異分子を提供する。例えば、第３アミノ酸配列は、本質的に非免疫原性免疫グロブリン分子のヒンジ、CH2およびCH3領域のアミノ酸残基を含みうる。適当な免疫グロブリン分子の例には、それらに限定されないが、ヒトまたはサル免疫グロブリン、例えばIgCγ1が含まれる。他のイソタイプもまた可能である。
【００６８】
本発明はまた、26位のアラニンまたは27位のメチオニンで始まり150位のアスパラギン酸で終わる配列番号:8に示されるCTLA4の細胞外ドメイン、またはその一部を有する、CTLA4変異分子の有効投与量を患者に投与することによる、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法を提供する。さらに、該細胞外ドメインまたはその一部において、55位のアラニンはチロシンで置換され、および130位のロイシンは、グルタミン酸で置換される。さらに、該投与レジメンは、初期段階レジメンを含み、該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、および当初は月１回よりより頻繁に投与することを含む。
【００６９】
さらに、本発明は、配列番号:4の27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列を有する、または配列番号:4の26位のアラニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列を有する、CTLA4変異分子の有効投与量を患者に投与することによる、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法を提供する。またさらに、該CTLA4変異分子の投与レジメンは、初期段階レジメンを含み、該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、および当初は月１回より頻繁に投与することを含む。
【００７０】
本発明はさらに、本発明の可溶性CTLA4変異分子に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。1つの態様において、該核酸分子は、DNA(例、cDNA)またはそのハイブリッドである。別法として、該核酸分子は、RNAまたはそのハイブリッドである。
【００７１】
さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。また、宿主ベクター系を提供する。該宿主ベクター系には、適当な宿主細胞中の本発明のベクターが含まれる。適当な宿主細胞の例には、それらに限定されないが、原核および真核細胞が含まれる。
【００７２】
本発明には、医薬的に有効な投与量の可溶性CTLA4変異分子を含む、グラフト移植に関連する免疫不全の治療の使用のための、医薬組成物が含まれる。ある態様において、グラフト移植に関連する免疫不全は、CD28-および/またはCTLA4-陽性細胞のCD80および/またはCD86陽性細胞との相互作用により媒介される。該可溶性CTLA4変異分子は好ましくは、CTLA4の細胞外ドメインに1以上の変異を有するCTLA4分子である。該医薬組成物は、可溶性CTLA4変異タンパク質分子および/または核酸分子、および/または該分子をコードするベクターを含みうる。
好ましい態様において、該可溶性CTLA4変異分子は、図7(配列番号:3および4)または8(配列番号:5および6)に示される（それぞれL104EA29YまたはL104Eである）該CTLA4の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、該可溶性CTLA4変異分子は、本明細書に開示するL104EA29YIgである。該組成物はさらに、それらに限定されないが、薬物毒素、酵素、抗体、またはコンジュゲートを含む他の治療薬を含みうる。
【００７３】
該医薬組成物はまた、好ましくは、本発明の分子(例、可溶性CTLA4変異分子、例えばL104EA29YまたはL104E)を組み合わせたとき、該分子の活性が残っており、および患者の免疫系に非反応性である物質を含む、適当な担体およびアジュバンドを含む。適当な担体およびアジュバンドの例には、それらに限定されないが、ヒト血清アルブミン; イオン交換体; アルミナ; レシチン; リン酸塩のような緩衝物質; グリシン; ソルビン酸; ソルビン酸カリウム; および硫酸プロタミンのような塩または電解質が含まれる。他の例には、リン酸緩衝生理食塩溶液; 水; オイル/水乳剤のような乳剤; および様々なタイプの湿潤剤のような、標準的医薬担体が含まれる。他の担体にはまた、滅菌溶液; コート錠およびカプセルを含む錠剤が含まれうる。概して該担体は、スターチ、ミルク、糖、特定のタイプのクレイ、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性油脂、ガム、グリセロール、または他の既知の賦形剤のような賦形剤を含む。該担体はまた、香料および着色添加物または他の成分を含みうる。 該担体を含む組成物は、従来既知の方法により処方される。該組成物はまた、様々な液体組成物内、例えばリポソームおよび高分子微小球のような様々な重合体組成物に処方される。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、それらに限定されないが、患者への、静脈内(i.v.)投与、腹腔内(i.p.)投与、筋肉内(i.m.)投与、皮下投与、経口投与、坐薬または局所接触としての投与、またはミニ浸透圧ポンプのような持続放出装置の埋め込み、を含む従来の投与様式を用いて投与されうる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、様々な剤型であり、それらに限定されないが、溶液、懸濁液、タブレット、丸薬、粉末、坐薬、重合体マイクロカプセルまたは微小胞、リポソーム、および注射剤または不溶解性溶液を含む。好ましい剤型は、投与様式および治療用途に依存する。
【００７６】
本発明の代表的な静脈内(i.v.)投与の医薬組成物を以下に示す。
凍結乾燥L104EA29YIg 100mg/バイアル製剤の組成物
【表２】
2008535841.tif 000004
a 溶液再生の際の、バイアル、針およびシリンジへの付着ロスのために、各バイアルは10％の過剰充てんをする。
【００７７】
該凍結乾燥医薬製剤は、水性担体で構成されうる。本明細書において該水性担体の利点は、医薬的に許容されるものであり(ヒトへの投与に安全および無毒)、および凍結乾燥後の液体組成物の調製に有用である。概して、該凍結乾燥医薬製剤を、10mlのUSP滅菌水注射（Sterile Water for Injection）(SWFI)またはUSP0.9％塩化ナトリウム注射（Sodium Chloride Injection）で、約25mg/mlとする。該調製した溶液を、さらに1および10mg/mlの間の濃度の医薬製剤に、USP0.9％塩化ナトリウム注射で希釈する。該注射用の希釈医薬製剤は、等張で、および静脈内注射による投与に適する。
【００７８】
界面活性剤は、調製した医薬製剤とシリコン処理をしたシリンジとの相互作用を減らしまたは防ぐのに十分な量を、該組成物に加えうる。
【００７９】
本発明の該組成物の、最も効果的な投与様式および用法用量は、該疾患の重症度および経過、治療する患者の健康および応答、ならびに治療する医師の判断に依存する。従って、該組成物の用量(また、投与量として知られる)は、個々の患者に対して用量設定すべきである。
【００８０】
該可溶性CTLA4変異分子は、内因性B7(例、CD80および/またはCD86)分子が患者内でそれらのそれぞれのリガンドに結合するのをブロックするのに十分な量および時間をかけた頻度(例、時間の長さおよび/または複数回)で患者に投与されうる。内因性B7/リガンド結合のブロックはそれにより、B7-陽性細胞(例、CD80-および/またはCD86-陽性細胞)とCD28-および/またはCTLA4-陽性細胞との間の相互作用を阻害する。治療薬の用量は、それらに限定されないが、罹患組織のタイプ、治療されるグラフト移植に関連する免疫不全のタイプ、該疾患の重症度、患者の健康、および該薬剤での治療に対する患者の応答を含む、多くのファクターに依存する。
【００８１】
本発明の該分子または該医薬組成物の投与量は体重に基づき、および投与レジメンは標的血清トラフ値により決められうる。概して、移植後の最初の3から6箇月の間の本発明のCTLA4変異分子の標的トラフ血清濃度が、約3μg/mLおよび約30μg/mLの間であれば、同種移植片の機能を維持するのに十分であり、好ましくは約5μg/mLおよび約20μg/mLの間である。概して、維持段階の本発明のCTLA4変異分子の標的トラフ血清濃度は、約0.2μg/mLおよび約3μg/mLの間、好ましくは約0.25μg/mLおよび約2.5μg/mLの間である。
【００８２】
本発明のCTLA4変異分子は、約0.1から約20.0mg/kg（患者の体重）の間、概して約1.0から約15.0mg/kgの間の量を投与されうる。例えば、L104EA29Yは、移植後のハイリスク期間である初期段階の間に10mg/kg（患者の体重）を投与され、および維持量として5mg/kg（患者の体重）に減らされうる。
【００８３】
本発明の分子または医薬組成物の投与は、様々な時期に行われうる。 概して、投与レジメンには初期段階が含まれ、その間の投与量は多く、および投与の頻度は該免疫学的なリスクが最も高い期間は増やされ、その後、維持段階が続く。該初期段階レジメンは、移植後の最初の3から6箇月に及び、当初は月１回よりもより頻繁に、好ましくは免疫学的なリスクおよび/または標的トラフ血清濃度に依存して毎日、1週間毎、または2週間毎の頻度で投与する。該維持段階は、初期段階が終了したとき始まり、月1回より頻繁でなく、および必要な限り継続し、概して患者が移植片を保持する限り継続する投与を含む。本明細書において、1日目は、移植日または本発明の分子または医薬組成物での治療の初日と定義される。
【００８４】
初期段階における本発明のCTLA4変異分子の投与量は、約8から約12mg/kg（患者の体重）、好ましくは約10mg/kgである。維持段階における本発明のCTLA4変異分子の投与量は、約3から約7mg/kg（患者の体重）、好ましくは約5mg/kgである。
【００８５】
該初期段階は、移植後の最初の3から6箇月に及びうる。初期段階の投与レジメンは、レシピエントおよび/または移植片の状態に依存して異なりうる。例えば、より強い初期段階レジメンは、本発明の分子または医薬組成物の高投与量を、最初の3箇月間は、1日目、5日目、2週(例、13−17日)巡回に、その後2週間毎(例、4週巡回、6週巡回、8週巡回、10週巡回、および12週巡回)に投与し、その後、6箇月巡回までは月1回の投与をする(例、4箇月巡回、5箇月巡回、および6箇月巡回に)。より強い初期段階レジメンの代表的な例は、10mg/kg（患者の体重）のL104EA29YIgを、1、5、15、29、43、57、71、85、113、141および169日目に投与する。強くはないレジメンは、例えば、1日目、2週巡回、4週巡回に、その後3箇月巡回までは月1回、本発明の分子または医薬組成物を投与する。強くはない初期段階レジメンの代表的な例は、1、15、29、57および85日目に10mg/kg（患者の体重）のL104EA29YIgを投与する。
【００８６】
概して、初期段階の後維持段階が続き、本発明の分子または医薬組成物のより少ない投与量を、1から2箇月の間隔で、必要な限り、概して患者が移植片を保持する限り、投与する。上記の維持段階でのより強いレジメンの例は、5mg/kg（患者の体重）のL104EA29YIgの月1回の投与を含み、7月巡回から始まりうる。一方、上記の維持段階での強くないレジメンの例は、5mg/kg（患者の体重）のL104EA29YIgの月1回の投与を含み、4月巡回から始まりうる。
【００８７】
また、当該技術分野における当業者は、患者のリスク状態および/または移植後の該治療に対する応答に応じて該投与レジメンを修正しうる。例えば、上述の初期段階での強くはないレジメンは、該レジメンに5日目の投与を加えて、最も免疫学的なリスクの高い期間に投与の頻度を増やすことで、修正される。
【００８８】
本明細書において、“4週”“箇月”、“箇月”または“月1回”とは、28±5日の期間を言う。本明細書において、“2週”とは、14±3日の期間を言う。
【００８９】
該投与レジメンにおいて柔軟性は、本発明のCTLA4変異分子の該標的トラフ値を維持しながら投与スケジュールを移植レシピエントの生活に促進するために必要である。
投与の許容される時間枠は、以下の通りである:
【表３】
2008535841.tif 000005
【００９０】
該目標期日は、先の実際の巡回日に所望の期間を足した結果である。2週巡回における所望の期間は10日である。所望の期間は、先の巡回から2週間を計画した巡回においては14日であり、例えば、4週巡回の後は6週巡回が続く。所望の期間は、先の巡回から1箇月間または4週間を計画した巡回においては28日であり、例えば、3箇月巡回の後に4箇月巡回が続く。所望の期間は、先の巡回から2箇月間を計画した巡回においては56日であり、例えば、6箇月巡回後は8箇月巡回が続く。例えば、実際の巡回日である15日目に14日を足した結果、4週の目標期日である29日目となる。上記の巡回時間枠に基づき、該投与は、29日±3日に行いうる。該投与を26日に行えば、その日が次の目標期日の計算に使用される実際の巡回日となる。
【００９１】
急性拒絶反応のリスクの低いレシピエントには概して、生存する血縁ドナーおよび十分にレシピエントにマッチするドナーから移植を受けた者が含まれる。急性拒絶反応のリスクの高いレシピエントには概して、近縁のドナーからの移植または再移植を受ける者、パネル反応性抗体が高い者、またはアフリカ系アメリカ人である者が含まれる。
【００９２】
急性移植片拒絶反応の差し迫ったリスクに加え、カルシニューリン阻害剤およびステロイドのような維持薬剤の長期間の使用は、長期転帰および患者の生活の質に悪影響を及ぼす毒性となる。例えば、維持薬剤の副作用には、腎機能の低下および/または移植片喪失を引き起こす腎毒性(CAN)、循環器疾患、ならびに高血圧、脂質異常症および糖尿病のような循環器疾患および死亡を引き起こす代謝性疾患が含まれる。更なる副作用には、服薬不履行および生活の質の低下となる、多毛症、脱毛症、歯肉増殖症、振戦、神経毒性および骨減少症が含まれる。本発明の分子または医薬組成物は、グラフト移植に関連する免疫不全を治療する場合これらの転帰を避け、これらの転帰の発生、発達および/または進行を減らすのに、またはこれらの転帰のリスクのある患者におけるグラフト移植に関連する免疫不全の治療のために、使用されうる。本発明の分子または医薬組成物は、GFRにより測定されるような腎機能の改善に使用されうる。
【００９３】
本発明の分子または医薬組成物の投与は、30分から1時間以上の静脈内注射により行うことが出来る。別法として、単一または複数の皮下注射で必要用量を送達することができる。概して、30分間の静脈内注射は、該患者が入院中および/またはモニタリングのために医療関係者への訪問が予定されている間の、治療の初期段階に使用される投与方法である。該皮下注射は、維持段階で使用される代表的な投与様式であり、それにより静脈内注射のための医療関係者への訪問を減らされ、患者は彼らの通常のスケジュールに戻ることが出来る。
【００９４】
本発明の別の態様は、移植後の代替の免疫抑制療法を受けた患者における、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法を提供する。代替の医薬的免疫抑制療法をうけた患者は、本発明の分子または医薬組成物を含む治療に変更、切り替え、または転換し、それにより該代替薬を排除しうる。概して、排除される該医薬を、その特定の薬剤の処方指示に基づいて適当な期間をかけて減らし、一方、同時に本発明の分子または医薬組成物を月1回よりさらに頻繁に投与する。該患者が完全に代替薬をやめれば、該患者は、本発明の分子または医薬組成物を使用する標準的維持レジメンに戻りうる。例えば、CsA/MMF±副腎皮質ステロイドレジメンを受けている患者は、CsAをL104EA29YIgと切り替えて、L104EA29YIg/MMF±副腎皮質ステロイドレジメンとしうる。該変換投与スケジュールのは、CsAの投与量を2箇月かけて減らすこと、およびその2箇月の間に2週間毎に5mg/kgのL104EA29YIgを投与することを含みうる。CsAを排除した時点で、その後該患者は維持段階に入り、およびCsAの無い該治療の期間、4または8週間毎に5mg/kgの投与を継続する。
【００９５】
1つの態様は、B7とそのリガンドとの相互作用のブロックおよび/または免疫系疾患の治療に有効な本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子の適当な投与量を提供する。例えば、該投与量は体重に基づき、および投与レジメンは、標的血清トラフ値により、指示されうる。例えば、免疫系疾患の治療のために、本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子の有効標的トラフ血清濃度は、約0.2μg/mLおよび約30μg/mLの間である。別法として、本明細書に開示される可溶性CTLA4変異分子は、約0.1から約20.0mg/kg（患者の体重）の間の量を、免疫系疾患の治療のために投与されうる。
【００９６】
本発明はさらに、グラフト移植に関連する免疫不全の治療方法を提供する。特定の態様において、該グラフト移植に関連する免疫不全は、CD28-および/またはCTLA4-陽性細胞とCD80/CD86-陽性細胞との相互作用より媒介される。更なる態様において、T細胞相互作用は阻害される。これらの方法には、T細胞とCD80-および/またはCD86-陽性細胞との相互作用を制御するために、本発明の可溶性CTLA4変異分子を患者に投与することが含まれる。グラフト移植に関連する免疫不全の例は、上述される。
【００９７】
本発明はさらに、患者による実質臓器、組織、細胞および/または
外部組織（外部組織（external anatomy）)移植片拒絶反応の予防、抑制または防ぐ方法を提供する。該患者は、実質臓器、組織、細胞および/または外部組織（external anatomy）移植のレシピエントである。 概して、移植において、移植片の拒絶反応は、T細胞により異物と認識されて生じ、該移植片を破壊する免疫反応が続く。本発明の可溶性CTLA4変異分子は、Tリンパ球増殖および/またはサイトカイン分泌を阻害することにより組織の破壊を減らし、および抗原特異的T細胞不応答の誘導を引き起こし、長期的な移植片の受容をもたらしうる。
【００９８】
実施例3に記載の試験は、腎移植レシピエントにおいて、バシリキシマブ(シムレクト登録商標; ノバルティス)誘導、ミコフェノール酸モフェチル(MMF; CellCept登録商標; Roche)、および副腎皮質ステロイドからなるCNI-フリー併用レジメンの一部として使用する場合の、維持免疫抑制剤としてのL104EA29YIgの有効性および安全性を、12箇月にわたってシクロスポリンA(CsA)と比較した。目的は、6箇月および1-年での急性拒絶反応の発生率(生検-確認または推定された)の評価; 1、6、および12箇月でのイオヘキソールクリアランスによる測定糸球体ろ過量(GFR); 血清コレステロールおよびトリグリセリド類を含む高血圧のパラメーター; および全体的な安全性が含まれた。他の予め指定された解析には、1-年での患者の死亡または移植片喪失;急性拒絶反応の重症度; 移植後の真性糖尿病の発生率[前もって糖尿病とは知られていなかった患者において、≧4週間の高血糖の治療が必要、またはヘモグロビン A1C(HbA1c)>7％である場合と定義される]; Modification of Diet in Renal Disease (MDRD, Levey AS, Bosch JP, Lewis JP, Greene T, Rogers N, Roth D.  A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 1999;130:461-470)、Jelliffe (RW. Creatinine clearance: Bedside estimate. Ann Inter Med. 1973;79:604-605)、Cockcroft-Gault(Cockcroft  DW, Gault MH. Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephron 1976;16:31-41)、およびNankivell(Nankivell BJ, Gruenewald SM, Allen RD, Chapman JR.  Predicting glomerular filtration rate after kidney transplantation. Transplantation. 1995; 59(12):1683-1689)式を用いた算出GFR; 薬物動態および免疫原性が含まれた。急性拒絶反応(AR)の診断および治療は、バンフ97判断基準および分類(Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999;55(2):713-23.)に基づいた。事後解析は、慢性移植腎症(CAN)の発生率について行った。
【００９９】
この12-箇月の試験により、L104EA29YIg-に基づく維持療法は、CsAと比較して、ARの予防において同等な有効性、および同様の患者の生存率および移植片残存率を与えることが示された。加えて、L104EA29YIgは、CsA-に基づく維持免疫抑制と比較して有意な腎機能改善およびCANの減少を示した。L104EA29YIgは安全でおよび寛容性が良く、および代表的なCNI-関連毒性はなかった。
【０１００】
長期的なCNIの使用は、それらの腎毒性に制限されるため( Danovitch GM. Immunosuppressive medications for renal transplantation: a multiple choice question. Kidney Int 2001;59(1):388-402)、移植後の最初の年の腎機能の改善は、より良い長期転帰と相関して示され(Hariharan S, McBride MA, Cherikh WS, Tolleris CB, Bresnahan BA, Johnson CP. Post-transplant renal function in the first year predicts long-term kidney transplant survival. Kidney Int 2002;62(1):311-8)、その付随する全ての問題による移植片機能不全および腎不全が減少するという結果に至った。従って、おそらく、L104EA29YIg治療で見られる最も注目すべき知見は、CsAと比較してCANの発生および/または進行の減少を示す、12-箇月の腎組織像を加味した優れたGFRである。これは驚くべき転帰であり、および初めてこの種の知見が免疫抑制療法の無作為第二相試験おいて示された。免疫学的、循環器系および/または代謝性障害の予防によってネフロン量は保存されて、患者の生存率および移植片残存率の両方に有益な効果が及ぼされるため、L104EA29YIgは、より良い長期転帰に関与することが可能である。
【０１０１】
これらの問題は、増加する拡大基準ドナーまたはレシピエントの臓器の使用により、とくに重要である。これらは特にCNI-関連毒性の影響を受けやすいためである。腎移植を受けた患者のCVおよび代謝性の問題の発生率の減少はまた、長期転帰の改善の中核をなす。
【０１０２】
本発明の分子または医薬組成物は、拡大基準レシピエントであって、および/または拡大基準ドナーからの移植片を受けた患者における、グラフト移植に関連する免疫不全の治療に使用されうる。これらの基準は、全米移植臓器分配ネットワーク(UNOS)により出された基準の一部に基づくもので、以下の1以上を含みうる: ドナー年齢は、10歳より下または60歳以上; 心臓死のドナー; 予想されるドナー臓器の冷虚血時間が24時間以上; 現状のPRA≧50％で移植を初め受ける、またはPRA≧30％で再移植を受ける患者; 以前に移植後の最初の6箇月の間に急性拒絶反応のために移植片喪失した患者; ドナーリンパ球およびレシピエント血清を用いたT-細胞リンパ球毒性クロスマッチが陽性である患者; HIV感染患者;過去3年内に活動性結核の治療を必要とした患者; または全米移植臓器分配ネットワーク(UNOS)より出された他の基準。ドナーおよび/またはドナー腎の可能な拡大基準の例は、以下の臓器提供の拡大基準の少なくとも1つを含む： a)ドナー年齢が≧60歳、またはb)ドナー年齢が50-59歳であって、および以下の1に該当する:(i)脳血管障害(CVA)＋高血圧＋SCr>1.5mg/dL、もしくは(ii)CVA＋高血圧、もしくは(iii)CVA＋SCr>1.5mg/dL、もしくは(iv)高血圧＋SCr>1.5mg/dL、またはc)CIT≧24時間、ドナー年齢>10歳、またはd)心臓死のドナー(心停止ドナー)。
【０１０３】
本発明はまた、患者における移植片対宿主病の抑制のための方法を提供する。この方法は、該患者に本発明の可溶性CTLA4変異分子を、単独で、またはさらに追加のIL-2、IL-2R、IL-4、またはγ-インターフェロンに反応性のリガンドと同時にもしくは連続的に、投与することを含む。例えば、本発明の可溶性CTLA変異分子は、ドナーのT細胞の同種反応性を抑制するために骨髄移植レシピエントに投与されうる。別法として、骨髄移植片内のドナーT細胞は、移植前に生体外でレシピエントの同種抗原に対して寛容化されうる。
【０１０４】
本発明の可溶性CTLA4変異分子、例えばL104EA29Yは、単独の有効成分として、または同時にもしくは連続的に免疫調節レジメンにおける1以上の他の薬物（例えば免疫抑制物質および/または他の抗-炎症性薬剤）と共に、同種移植片または異種移植片の急性または慢性拒絶反応の治療、防止または抑制または予防のために、または寛容の誘導のために投与されうる。例えば、それは、カルシニューリン阻害剤(例、シクロスポリンAまたはFK506); マクロライド系免疫抑制剤(例、タクロリムス、ラパマイシン、シロリムス)またはその誘導体(例、40-O-(2-ヒドロキシ)エチル-ラパマイシン、シロリムス、センチカン（centican）); リンパ球ホーミング薬(例、FTY720)またはその類似体(FK778、Jak-3)、副腎皮質ステロイド ; シクロホスファミド; アザチオプリン; メトトレキサート; レフルノミドまたはその類似体; ミゾリビン; ミコフェノール酸; ミコフェノール酸モフェチル ; 15-デオキシスペルグアリン（15-deoxyspergualine）またはその類似体; 白血球受容体(例、MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4−1BBまたはそれらのリガンド)に対するモノクローナル抗体免疫抑制剤(例、バシリキシマブ、ダクリズマブ)、リガンド、モノクローナル抗体またはその抗体断片 ; または他の免疫調節化合物(例、CTLA4/CD28-Ig)、またはLFA−1拮抗剤、セレクチン拮抗剤およびVLA-4拮抗剤を含む他の接着分子阻害剤(例、mAbs)もしくは低分子量阻害剤、との併用で使用されうる。該化合物は、CD40を干渉する化合物およびそのリガンド(例、CD40に対する抗体およびCD40-Lに対する抗体)（例えばChi220(US特許第6,051,228号)のような）との併用で、例えば上述の効能、例えば寛容の誘導において、特に有用である。
【０１０５】
本発明の可溶性CTLA4変異分子が、例えば本明細書に記載するような他の免疫抑制療法 / 免疫調節療法と同時にまたは連続的に併用して投与される場合、併用される免疫抑制剤化合物または免疫調節化合物の投与量は、当然ながら用いる併用薬のタイプ（例えばステロイドまたはシクロスポリンかどうか）、用いる特定薬剤、治療される症状などに依存して異なる。
【０１０６】
上記に従って、本発明はさらに、例えば、上述のいずれかの方法の使用のための、L104EA29YIgを含み、遊離構造でまたは医薬的に許容される塩構造であり、免疫抑制剤、免疫調節剤または抗-炎症剤を含む少なくとも1つの医薬組成物と同時にまたは順に使用される、治療上の組み合わせ（例えば、キット）を提供する。該キットには、その投与のための説明書が含まれうる。
【０１０７】
上記に従って、更なる態様において、本発明は、例えば、治療有効量の本発明の可溶性CTLA4変異分子と免疫抑制物質を同時にまたは順に同時投与することを含む、上記の方法を提供する。免疫抑制物質には、可溶性gp39(また、CD40リガンド(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAPとして知られる)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80(例、ATCC 68627)、可溶性CD86、可溶性CD28(例、68628)、可溶性CD56、可溶性Thy−1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM−1、可溶性LECAM−1、可溶性ELAM−1、可溶性CD44、gp39に反応性のリガンド、抗体または抗体断片(例、ATCC HB−10916、ATCC HB−12055およびATCC HB−12056)、CD40に反応性のリガンド、抗体または抗体断片(例、ATCC HB-9110)、B7に反応性のリガンド、抗体または抗体断片(例、ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB−11341、など)、CD28に反応性のリガンド、抗体または抗体断片(例、ATCC HB−11944またはMartinら(J. Clin. Immun. 4(1):18-22、1980)に記載のmAb 9.3）、LFA−1に反応性のリガンド、抗体または抗体断片(例、ATCC HB-9579およびATCC TIB-213)、LFA-2に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、IL-2またはIL-2Rに反応性のリガンド、抗体または抗体断片、IL−12に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、IFN-ガンマに反応性のリガンド、抗体または抗体断片、CD2に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、CD48に反応性の抗体リガンド、抗体または抗体断片、いずれかのICAM(例、ICAM−1(ATCC CRL-2252)、ICAM-2およびICAM-3)に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、CTLA4に反応性のリガンド、抗体または抗体断片(例、ATCC HB-304)、Thy−1に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、CD56に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、CD3に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、CD29に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、TCRに反応性のリガンド、抗体または抗体断片、VLA-4に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、VCAM−1に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、LECAM−1に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、ELAM−1に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、またはCD44に反応性のリガンド、抗体または抗体断片、が含まれる。特定の態様において、モノクローナル抗体が好ましい。別の態様において、抗体断片が好ましい。抗体断片にはそれらに限定されないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFvおよびドメイン抗体(dAbs)(それらに限定されないがWO2006/030220に記載のものを含む）が 含まれる。当該技術分野の当業者に直ちに理解されるように、該組み合わせには、本発明の可溶性CTLA4変異分子および他の1つの免疫抑制物質、該可溶性CTLA4変異分子と他の2つの免疫抑制物質、該可溶性CTLA4分子と他の3つの免疫抑制物質、などが含まれる。最適な組み合わせおよび投与量の判断は、当該技術分野において既知の方法を用いて、決定されおよび最適化されうる。
【０１０８】
特に有用な組み合わせは、L104EA29YIgまたはその医薬組成物と、IL-2およびそのリガンドを妨害する化合物、特に活性化T-リンパ球の表面に選択的に発現するIL-2R(アルファ)に対する標的とされた拮抗剤である。IL-2R(アルファ)に結合する化合物は、同種移植片拒絶に関与する細胞性免疫応答における重要な経路であるIL-2媒介リンパ球活性化を競合的に阻害する。
【０１０９】
具体的な組み合わせには、以下のものが含まれる: L104EA29YIgおよびCD80モノクローナル抗体(mAbs); L104EA29YIgおよびCD86mAbs; L104EA29YIg、CD80mAbs、およびCD86mAbs; L104EA29YIgおよびgp39mAbs; L104EA29YIgおよびCD40mAbs; L104EA29YIgおよびCD28mAbs; L104EA29YIg、CD80およびCD86mAbs、およびgp39mAbs; L104EA29YIg、CD80およびCD86mAbsおよびCD40mAbs; およびL104EA29YIg、抗-LFA1mAb、および抗-gp39mAb。gp39mAbの具体例は、MR1である。他の組み合わせは、当該技術分野の当業者に容易に認識され理解される。
【０１１０】
上記に従って、更なる態様において、本発明は、例えば、治療有効量の本発明の可溶性CTLA4変異分子を補助薬および/または副腎皮質ステロイドと同時にまたは順に同時投与することを含む上記の方法を提供する。毒性のあるカルシニューリン阻害剤を本発明のCTLA4変異分子と置き換えることが目的である。しかし、本発明のCTLA4変異分子はまた、シクロスポリン(ネオーラル登録商標、サンディミュン登録商標ノバルティス製)およびタクロリムス(FK506、プログラフ登録商標（藤沢製）)のようなCNIと同時にもしくは連続的に同時投与されうる。
【０１１１】
補助薬の例には、それらに限定されないが、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH)の阻害剤、例えば、ミコフェノール酸モフェチル(MMF、セルセプト登録商標（Cellcept登録商標)ロシュ・ラボラトリーズ製)およびミコフェノール酸(マイフォーティック登録商標（Myfortic登録商標)ノバルティス製); ラパマイシン(シロリムス、ラパミューン登録商標（Rapamune登録商標）Wyeth/Ayerst製); アザチオプリン(アザルサン登録商標（Azarsan登録商標）Salix製）、イムラン登録商標（Imuran登録商標）、ジェネリック);リンパ球ホーミング剤、例えば、FTY720(ノバルティス製); FK778(藤沢製); Jak-3(ファイザー製); およびサーティカン登録商標(エベロリムス（everolimus）ノバルティス製)が含まれる。  
【０１１２】
副腎皮質ステロイドの例には、それらに限定されないが、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾール、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロンが含まれる。
【０１１３】
代表的な同時投与の組み合わせには、それらに限定されないが、L104EA29YIgおよび上記の群から選ばれる少なくとも1つの補助薬 ; L104EA29YIgおよび上記の群から選ばれる少なくとも1つの副腎皮質ステロイド; L104EA29YIg、MMF(セルセプト ロシュ製)および上記の群から選ばれる副腎皮質ステロイド  ; L104EA29YIg、ラパマイシン(シロリムス、ラパミューン登録商標Wyeth/Ayerst製)、上記の群から選ばれる副腎皮質ステロイドと共にまたは無しに、が含まれる。
【０１１４】
上記の同時投与の組み合わせは、免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば、バシリキシマブ(シムレクト登録商標 ノバルティス製)、ムロモナブ(オルソクローン OKT3登録商標 Ortho Biotech製)、リツキシマブ(リツキサン登録商標(Rituxan登録商標)ジェネテック製)およびダクリズマブ(ゼナパックス登録商標(Zenapax登録商標)ロシュLabs製);または抗-胸腺細胞グロブリン(サイモグロブリン（Thymoglobulin登録商標)SangStat製)のような誘導薬と使用されうる。例えば、適当な組み合わせには、それらに限定されないが、バシリキシマブ(シムレクト登録商標 ノバルティス製)、L104EA29YIg、MMF(セルセプト ロシュ製)および プレドニゾロン; またはダクリズマブ(Zenapax登録商標 ロシュ製)、L104EA29YIgおよびラパマイシン(シロリムス、ラパミューン登録商標Wyeth/Ayerst製)が含まれる。
【０１１５】
概して、上記の該同時投与薬剤の標準的な投与量および投与レジメンは、該治療レジメンへの本発明のCTLA4変異分子の追加に影響されない。しかし、当該技術分野の当業者は、同時投与薬剤、例えば、毒性の少ない本発明のCTLA4変異分子が該治療レジメンに取り込まれるために、補助薬および/または副腎皮質ステロイドのより低い投与量を処方しうる。
【０１１６】
処方情報は、各同時投与薬剤の添付文書に基づきうる。副腎皮質ステロイドは本発明の分子または医薬組成物と同時投与されうる。例えば、患者は副腎皮質ステロイドで毎日治療されうる。1つのステロイドの維持および漸減方法は、手術室(OR)に着いた時点でメチルプレドニゾロンを500mg静脈内、2日目にメチルプレドニゾロンを250mg静脈内、続いて3日にプレドニゾン(またはプレドニゾロン)を 100mg経口、続いて2週の終わりまでにプレドニゾン(またはプレドニゾロン)を20-30mg/日に漸減し、続いて6箇月間まではプレドニゾン(またはプレドニゾロン)2.5mg/日以上に漸減することを含みうる。患者は、それらの治療の過程の間、少なくとも2.5mg/日を維持しうる。
【０１１７】
更なる同時投与薬剤には、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)が含まれうる。概してMMFは食事の時刻に関して一貫したスケジュールで、2分割量で投与される。MMFの投与レジメンの例には、1日2 gが含まれる。最初の投与量は、手術前に投与されうる。その後の投与は、患者が経口投薬に耐えられるようになり次第、経口投与しうる。該投与量およびスケジュールは、検査値(例、WBCの低下)および患者の寛容性に基づいて調整されうる。該添付文書は、十分な処方情報を提供する。
【０１１８】
別の同時投与薬剤には、バシリキシマブが含まれうる。再調製したバシリキシマブ(5mL中20mg)を容量50mLの生理食塩水または5％ブドウ糖に希釈し、静脈内注射として20-30 分をかけて投与しうる。最初の20mg投与量を1日目(移植日)に投与しうる。2番目の20mg投与量を5日目にしうる。該添付文書は、十分な処方情報を提供する。
【０１１９】
更に、例えば上記のいずれかの方法での使用のための、L104EA29YIgを含み、遊離構造または医薬的に許容される塩構造であり、補助薬および副腎皮質ステロイドを含む少なくとも1つの医薬組成物と同時にまたは順に使用される、治療上の組み合わせ、例えばキットが提供される。該キットは、その投与の説明書を含みうる。
【０１２０】
該ラベルおよび/または該説明書は、該医薬組成物は単独で、または選択される症状、例えば上記の免疫系疾患、自己免疫疾患、免疫増殖性疾患、グラフト移植に関連する免疫不全を治療する第2の薬剤と組みあわせて、同時にまたは連続的に使用できることを表示しうる。
【０１２１】
該ラベルは、本明細書に開示される該分子の適当な投与量を表示しうる。例えば、該ラベルは、B7をそのリガンドとの相互作用のブロックし、および/または免疫系疾患を治療するのに有効な該分子の投与量は、体重に基づき、および投与レジメンは標的血清トラフ値に従いうることを表示しうる。例えば、該ラベルは、免疫系疾患を治療するための本明細書に開示されるCTLA4変異分子の有効標的トラフ血清濃度は、約0.2μg/mLおよび約30μg/mLの間であることを表示しうる。また、該ラベルは、本明細書に開示される該CTLA4変異分子は、免疫系疾患の治療のために約0.1から約20.0mg/kg（患者の体重）の間の量を投与されうることを表示しうる。
【０１２２】
本発明の該分子の調製方法
CTLA4変異分子の発現は原核細胞でありうる。原核生物は、様々な細菌の菌株によって、最も頻繁に表される。該細菌はグラム陽性またはグラム陰性でありうる。概して、E. coliのようなグラム陰性菌が好ましい。他の微生物菌株もまた使用しうる。
【０１２３】
CTLA4変異分子をコードする配列は、E. coliのような原核細胞中で外来配列を発現するようにデザインされたベクターに挿入されうる。これらのベクターは、一般に使用される原核調節配列（本明細書において転写開始のプロモーターを含み、任意にオペレーターを含み、リボソーム結合部位配列を伴うと定義される）が含まれ、例えばベータ-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プロモーターシステム(Chang, et al., (1977) Nature 198:1056)、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057)、ならびにラムダ由来PLプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位(Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128)のような一般に使用されるプロモーターが含まれる。
【０１２４】
該発現ベクターはまた、該ベクターが細菌内で複製でき、およびアンピシリンまたはカナマイシンのような抗生物質の存在下で増殖したとき該プラスミドを有する細胞を選択することが出来るように、複製起点および選択マーカー（例えば抗生物質耐性を与えるベータ-ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を含む。
【０１２５】
該発現プラスミドは、それらに限定されないがCaCl2-ショック法(Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  69:2110, and Sambrook et al. (eds.), “Molecular Cloning:  A Laboratory Manual”, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989))および電気穿孔法を含む、様々な標準的な方法により原核細胞に導入することが出来る。
【０１２６】
本発明の実施に従って、真核細胞もまた、適当な宿主細胞である。真核細胞の例には、プライマリーかまたは不死化した動物細胞、酵母(例、サッカロマイセス・セレヴィシエ、シゾサッカロミセス ポンベ、およびピキア パストリス)、および植物細胞が含まれる。骨髄腫、COSおよびCHO細胞は宿主として使用されうる動物細胞の例である。特定のCHO細胞には、それらに限定されないが、DG44(Chasin, et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909)、CHO-K1(ATCC No. CCL-61)、CHO-K1 Tet-On 細胞株(クロンテック)、CHO指定ECACC 85050302(CAMR、Salisbury、Wiltshire、UK)、CHOクローン13(GEIMG、Genova、IT)、CHOクローンB(GEIMG、Genova、IT)、CHO-K1/SF指定ECACC 93061607(CAMR、Salisbury、Wiltshire、UK)、およびRR-CHOK1指定ECACC 92052129(CAMR、Salisbury、Wiltshire、UK)が含まれる。典型的な植物細胞には、タバコ細胞(全植物体、細胞培養、またはカルス)、トウモロコシ細胞、大豆細胞、およびイネ細胞が含まれる。トウモロコシ、大豆、およびイネの種子もまた許容される。
【０１２７】
該CTLA4変異分子をコードする核酸配列もまた、真核生物宿主内で外来配列を発現するよう設計されたベクターに導入されうる。該ベクターの調節要素は、特定の真核生物宿主によって異なりうる。
【０１２８】
発現ベクター中での使用のために一般に使用される真核生物の調節配列には、例えば、CMVプロモーター(CDM8ベクター)およびトリ肉腫ウイルス(ASV)(πLNベクター)のような、哺乳類細胞と適合するプロモーターおよび調節配列が含まれる。他の一般に使用されるプロモーターには、シミアン・ウイルス40(SV40)の初期プロモーターおよび後期プロモーター(Fiers, et al., (1973) Nature 273:113)、または例えばポリオーマ、アデノウイルス 2、およびウシパピローマウイルス由来のような、他のウイルス性プロモーターが含まれる。hMTII(Karin, et al., (1982) Nature 299:797-802)のような誘導性プロモーターもまた使用されうる。
【０１２９】
真核生物でのCTLA4変異分子発現のためのベクターはまた、エンハンサー領域と呼ばれる配列を有しうる。これらは、遺伝子発現の最適化に重要であり、および該プロモーター領域の上流または下流に見られる。
【０１３０】
真核生物宿主細胞のための発現ベクターの例には、それらに限定されないが哺乳類宿主細胞のためのベクター(例、BPV−1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2（マニアティス(Maniatis)）; pIRES(クロンテック); pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1(ライフテクノロジーズ（Life Technologies）); pVPakcベクター、pCMVベクター、pSG5ベクター(ストラタジーン))、レトロウイルスベクター(例、pFBベクター(ストラタジーン))、pCDNA-3(インビトロゲン)またはその修飾型,アデノウイルスベクター; アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター(例、pESCベクター(ストラタジーン))が含まれる。
【０１３１】
CTLA4変異分子をコードする核酸配列は、真核生物宿主細胞に組み込まれ、および宿主ゲノム複製として複製されうる。別法として、CTLA4変異分子を運搬する該ベクターは、染色体外での複製を可能とする複製起点を含みうる。
【０１３２】
サッカロマイセス・セレヴィシエでの核酸配列の発現のために、内在性酵母プラスミド複製源を2μサークルで使用しうる(Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307)。別法として、自己複製を促進出来る酵母ゲノムの配列を使用しうる(例えば、Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39); Tschemper et al., (1980) Gene 10:157; およびClarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300参照)。
【０１３３】
酵母ベクターのための転写調節配列は、糖分解酵素合成のためのプロモーターを含む(Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978)  Biochemistry 17:4900)。 当該技術分野において知られる更なるプロモーターには、CDM8ベクターにあるCMVプロモーター(Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); 3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター(Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073)、および他の糖分解酵素のそれらが含まれる。
【０１３４】
他のプロモーターは、環境刺激または細胞の成長培地により調節されうるので、誘導出来る。これらの誘導性プロモーターには、熱ショックタンパク質、アルコール脱水素酵素 2、イソシトクロム C、酸性ホスファターゼ、窒素異化に関連する酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素の遺伝子由来のそれらが含まれる。
【０１３５】
調節配列はまた、該コード配列の3’末端に位置しうる。これらの配列は、メッセンジャーRNAの安定に作用しうる。該終止は、いくつかの酵母-由来および哺乳類遺伝子において、コード配列に続く3’非翻訳領域に認められる。
【０１３６】
植物および植物細胞のための典型的なベクターには、それらに限定されないが、アグロバクテリウムTiプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、およびトマトゴールデンモザイクウイルス(TGMV)が含まれる。
【０１３７】
哺乳類細胞宿主系の形質転換の一般的態様は、Axel(U.S.特許第4,399,216号 issued Aug. 16、1983年8月16日発行)により記載される。哺乳類細胞は、それらに限定されないが、リン酸カルシウム存在下のトランスフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔法、またはウイルスベクターによる形質導入を含む方法により、形質転換することが出来る。
【０１３８】
外来DNA配列の植物および酵母ゲノムへの導入方法には、(1)単一の細胞または原形質体へのDNAのマイクロインジェクション、DNAの存在下での細胞のガラスビーズとのボルテックス、またはDNA-被覆タングステンまたは金球体の細胞または原形質体への発射のような機械的方法;(2)ポリエチレングリコール処理による細胞膜を高分子透過性とする、または高電圧電気パルス(電気穿孔法)による、DNAの導入;または(3)細胞膜と融合させるリポソーム(cDNAを含む)の使用、が含まれる。
【０１３９】
CTLA4変異分子の発現は、当該技術分野において既知の方法により検出できうる。例えば、該変異分子は、クマシー染色SDS-PAGEゲル法およびCTLA4に結合する抗体を使用する免疫ブロット法により検出しうる。標準的なタンパク質精製方法、例えば、アフィニティ−クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用したタンパク質の回収により、実質的に純粋な生成物を得ることが出来る(R. Scopes in: “Protein Purification, Principles and Practice”, Third Edition, Springer-Verlag (1994))。
【０１４０】
US特許出願US公開番号第2005/0019859号、第2005/0084933号およびWO04/058944は、動物または哺乳類細胞培養による本発明のタンパク質、特に組み換え糖タンパク質生産物の生産のための方法を教示し、およびこれらは参照することで本明細書に引用される。
【０１４１】
本発明はさらに、上記で生産された可溶性CTLA4変異分子を提供する。
【０１４２】
CTLA4IGのコドンに基づく突然変異
1つの態様において、部位特異的変異誘発および新規なスクリーニング方法を、CD86への結合力を高める該CTLA4の細胞外ドメインにおけるいくつかの変異を特定するのに使用した。この態様において、変異は、セリン25からアルギニン33まで、C’ストランド(アラニン49およびスレオニン51)、Fストランド(リジン93、グルタミン酸95およびロイシン96)、およびのメチオニン97からチロシン102まで、チロシン103からグリシン107までの領域、およびグルタミン111、チロシン113およびイソロイシン115の位置のGストランド内の該CTLA4の細胞外ドメインの領域内の残基で行われた。これらの部位を、キメラCD28/CTLA4融合タンパク質の研究(Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058)に基づき、溶媒露出しているアミノ酸残基側鎖、およびCD28およびCTLA4の間の特定の位置でのアミノ酸残基の同一性または相同性の欠如を予測するモデルにて、選択した。また、該特定の残基に空間的に近い(5から20オングストローム単位)いずれかの残基は、本発明の一部と考えられる。
【０１４３】
CD80および/またはCD86に対する親和性の変わった可溶性CTLA4変異分子を合成し、およびスクリーニングするために、2段階の方法がとられた。該実験は、最初にCTLA4の細胞外部分の特定のコドンにおける変異のライブラリーの作成、およびその後にCD80またはCD86への反応性が変化した変異体を同定するためのビアコア分析によるこれらのスクリーニングを伴った。ビアコアアッセイシステム(Pharmacia、Piscataway、N.J.)は、本質的にCD80IgまたはCD86Igの検出器内にあるデキストラン-被覆センサーチップへの共有結合を伴う表面プラズモン共鳴検出器を使用する。該テスト分子をその後、該センサーチップを含むチャンバーに注入し、および結合する相補的なタンパク質の量は、該センサーチップのデキストラン-被覆側に物理的に結合した分子量の変化に基づいて評価され; 分子量の変化を該検出器により測定する。
【０１４４】
本発明の利点
CD80およびCD86に結合するCTLA4は、迅速な“オン”速度および迅速な解離(“オフ”)速度を特徴とし、ならびにCTLA4Ig-CD86複合体は、CTLA4Ig-CD80複合体と比較して、約5-から8-倍の速度で解離するため、CD80および/またはCD86からのCTLA4Igの解離速度を減速することは、より強い免疫抑制作用を有する分子をもたらすと推論された。従って、野生型CTLA4または非-変異型CTLA4Igと比較して、CD80-またはCD86-陽性細胞に対するより高い結合力を有する可溶性CTLA4変異分子は、野生型CTLA4または非-変異型CTLA4Igと比較して、より高い効率で抗原特異的活性化細胞のプライミングをブロックすることが期待される。
【０１４５】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明し、および当業者が同一物を生産し使用するのを助けるために示される。該実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１４６】
本実施例は、本発明の可溶性CTLA4変異分子をコードするヌクレオチド配列を調製するのに使用した方法の説明を提供する。1部位変異L104EIgを調製し、およびCD80および/またはCD86の結合反応速度を試験した。該L104EIgヌクレオチド配列を鋳型として使用して2部位変異CTLA4配列L104EA29YIgを調製し、CD80および/またはCD86の結合反応速度を試験した。
【０１４７】
CTLA4Igコドンに基づく変異誘発
CD80および/またはCD86分子からの解離速度(“オフ”速度)が減速した変異CTLA4Ig分子を同定するための、変異誘発方法およびスクリーニング方法を開発した。1部位変異体ヌクレオチド配列を、CTLA4Ig(U.S. 特許: 第5,844,095号; 第5,851,795号; および第5,885,796号; ATCC受託番号68629)を鋳型として使用して、調製した。特定のcDNAコドンの無作為な変異誘発のために、該コドンの1位および2位はいずれかの塩基であり、3位がグアニンまたはチミンのみである(XXG/T; またはNNG/Tとして知られる)とすることによって、変異原性のオリゴヌクレオチドPCRプライマーを設計した。この様式において、アミノ酸をコードする特定のコドンは、20アミノ酸のそれぞれをコードするよう無作為に変異された。その点に関し、XXG/T変異誘発により、20個のアミノ酸のそれぞれをコードする32の潜在的なコドンが得られる。CTLA4Igの-M97-G107に密接に近接した変異をコードするPCR生成物(参照図7、配列番号:3および4;または図8、配列番号:5および6)を、SacI/XbaIで切断し、および同様に切断したCTLA4IgπLN(またpiLNとして知られる)発現ベクターへサブクローンした。1部位CTLA4変異分子L104EIgを調製するために、この方法を使用した(図8、配列番号:5および6)。
【０１４８】
CTLA4IgのS25-R33に近接する変異誘発のために、最初に、サイレントNheI制限部位を、このループの5’に、PCRプライマー-指向変異誘発により、挿入した。PCR産物をNheI/XbaIで切断し、および同様に切断したCTLA4IgまたはL104EIg発現ベクターへサブクローンした。2部位変異CTLA4分子L104EA29YIg(図7、配列番号:3および4)を調製するために、本方法を使用した。特に、1部位CTLA4変異分子をコードする核酸分子、L104EIgを2部位変異CTLA4分子L104EA29YIgを調製するための鋳型として使用した。L104EA29YIgを有するpiLNベクターは図12に示される。
【実施例２】
【０１４９】
以下に、実施例1に記載のコンストラクトから発現した1-および2-部位変異CTLA4ポリペプチドの非-変異型CTLA4Ig分子と比較してCD80およびCD86抗原に対する結合力の高いものを同定するために使用した、スクリーニング方法の説明を提供する。
【０１５０】
現在のインビトロおよびインビボ研究は、CTLA4Igが単独で、抗原特異的活性化T細胞のプライミングを完全にブロックすることは出来ないことを示す。CTLA4Ig、およびCD80またはCD86に対して特異的なモノクローナル抗体に関し、T細胞増殖阻害を測定するインビトロ試験は、抗-CD80モノクローナル抗体は、CTLA4Ig阻害を増大しなかったことを示す。
一方、抗-CD86モノクローナル抗体は、該阻害を増大し、CTLA4Igは、CD86相互作用をブロックするのに効果的でないことを示す。これらのデータは、CD80-媒介細胞応答の阻害は、CD86-媒介応答に対すると比較して、約100倍低いCTLA4Ig濃度を必要とすることを示す、Linsley ら(Immunity, (1994), 1:793-801)による先の所見を支持する。これらの所見に基づいて、CD86に対して野生型CTLA4より高い結合力を有する可溶性CTLA4変異分子は、CTLA4Igと比較してより効果的に抗原特異的活性化細胞のプライミングをブロックすことが出来ることが推察された。
【０１５１】
この目的を達成するために、上記の実施例1に記載の該可溶性CTLA4変異分子を、CD80およびCD86に対する結合力を改良する該CTLA4の細胞外ドメインのいくつかの変異を同定する新規なスクリーニング方法を用いて、スクリーニングした。本スクリーニング方法は、見かけ上は“オフ”速度が減速した変異体を、“オフ”速度の測定は濃度非依存性であるためタンパク質の精製または定量の必要なしに直接に同定する、効果的な方法を提供する(O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468)。
【０１５２】
COS細胞を、ミニプレップで精製した個々のプラスミドDNAで形質導入し、および数日間増殖させた。3日の条件培地を、可溶性CD80IgまたはCD86Igを被覆したビアコア バイオセンサーチップ(Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden)に供した。変異タンパク質の特異的な結合および解離を表面プラズモン共鳴により測定した(O'Shannessy, D. J., et al., (1993) Anal. Biochem. 212:457-468)。全実験を、ビアコア登録商標またはビアコア登録商標 2000 バイオセンサー（25℃）で行った。リガンドを、標準的な N-エチル-N’-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド N-ヒドロキシスクシンイミド結合を用いて、研究グレードのNCM5 センサーチップ(Pharmacia)に固定化した(Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko, S.N., et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:5425-15434)。
【０１５３】
スクリーニング方法
24ウェル組織培養プレートで増殖したCOS細胞を、変異CTLA4IgをコードするDNAで一過性に形質導入した。3日後に分泌型可溶性変異CTLA4Igを含む培地を収集した。
【０１５４】
条件化COS細胞培地をCD86IgまたはCD80Igで誘導体化されたビアコアバイオセンサーチップ上に流し(Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771に記載されるように)、および変異分子は野生型CTLA4Igで観測されたより“オフ”速度が遅いことが、確認された。選択された培地サンプルに対応するcDNAを配列決定し、およびDNAをより大きなスケールでのCOS細胞一過性トランスフェクションを行うために調製し、変異CTLA4Igタンパク質を培地のプロテインA精製により調製した。
【０１５５】
J. Greene et al. 1996 J. Biol. Chem.  271:26762-26771に記載されるように、および本明細書に記載されるように、ビアコア分析条件および結合平衡デ−タ解析を行った。
【０１５６】
ビアコアデ−タ解析
分析の前に、センサーグラム（Senosorgram）のベースラインをゼロ反応単位(RU)に正常化した。サンプルを偽-誘導化フロー細胞（mock-derivatized flow cell)上に流し、溶液間のバルク屈折率の違いによるバックグラウンド反応単位(RU)値を測定した。平衡解離定数(Kd)をReq 対 Cのプロットから計算した。Reqは定常状態反応マイナス偽-誘導化チップ上での反応であり、およびCは、検体のモル濃度である。結合曲線を、市販の非直線曲線適合ソフトウェア(nonlinear curve-fitting software ）(Prism、GraphPAD Software)を用いて解析した。
【０１５７】
実験データをまず、単一受容体に結合する単一リガンドのモデル(1-部位モデル、すなわち単純なラングミュア系、A＋B⇔AB)に適合させ、および平衡結合定数(Kd=[A]・[B]/[AB])を式 R=Rmax・C/(Kd＋C)から計算した。続いて、データを最も単純なリガンド結合の2-部位モデル(すなわち、式 R=Rmax1・C＼(Kd1＋C)＋Rmax2・C＼(Kd2＋C)と記載されるように、2つの非相互作用の独立した結合部位を有する受容体に) 適合させた。
【０１５８】
これらの2つのモデルの適合度を、実験データとの比較により視覚的に、および該二乗和のF検定により統計的に分析した。2-部位モデルが著しく良好に適合しないかぎり(p<0.1)、より単純な1-部位モデルを最良適合として選択した。
【０１５９】
結合および解離分析をBIA evaluation 2.1 ソフトウェア(Pharmacia)を用いて行った。結合速度定数konを、均一な単一部位相互作用および平行な2-部位相互作用の両方を仮定して、2方法で計算した。単一部位相互作用について、kon値を式 Rt=Req(1-exp-ks(t-t0)(Rtは所定の時間tでの反応; Reqは、定常状態反応; t0は注入開始の時間; およびks=dR/dt=kon・Ckoff（Cは検体の濃度、単量体結合部位に関して計算した））に従って計算した。2-部位相互作用について、kon値を式 Rt=Req1(1-exp-ks1(t-t0)＋Req2(1-expks2(t-t0)に従って計算した。各モデルについて、kon値を、ks対Cのプロットの計算した勾配から測定した(最大結合約70％まで)。
【０１６０】
解離データを1部位(AB=A＋B)または2部位(AiBj=Ai＋Bj)モデルに従って解析し、速度定数(koff)を、最も適合する曲線から計算した。2-結合部位モデルを用いた場合に、該残差が装置のバックグラウンド(2−10 RU、装置による)より大きい場合を除いて、該結合部位モデルを使用した。受容体占有の半減期を関係 t1/2=0.693/koffを用いて計算した。
【０１６１】
フローサイトメトリー
マウスmAb L307.4(抗-CD80)をBecton Dickinson(サンノゼ、カリフォルニア州)より、およびIT2.2(抗-B7-0[またCD86として知られる］)をPharmingen(サンディエゴ、カリフォルニア州)より購入した。免疫染色のために、10mM EDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でインキュベーションすることにより、CD80-陽性および/またはCD86-陽性CHO細胞を培養容器から取り出した。CHO細胞(1−10 x 105)をまず、10％ウシ胎仔血清(FBS)を含むDMEM中でmAbsまたは免疫グロブリン融合タンパク質とともにインキュベートし、その後洗浄し、およびフルオレセインイソチオシアネート-結合ヤギ抗-マウスまたは抗-ヒト免疫グロブリン第2工程試薬(Tago、Burlingame、カリフォルニア州)とともにインキュベートした。細胞を最終洗浄し、およびFACScan(Becton Dickinson)で分析した。
【０１６２】
SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィー
SDS-PAGEをトリス/グリシン4-20％アクリルアミドゲル(Novex、サンディエゴ、CA)で行った。分析ゲルをクマシーブルーで染色し、およびデジタル走査により、湿潤ゲルの画像を得た。CTLA4Ig(25μg)およびL104EA29YIg(25μg)を、0.02％ NAN3 を含むリン酸緩衝生理食塩水で平衡としたTSK-GEL G300 SWXLカラム(7.8 x 300mm、Tosohaas、Montgomeryville、PA)を用い、流量1.0mL/分のサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。
【０１６３】
CTLA4XC120SおよびL104EA29YXC120S
一本鎖CTLA4XC120Sを、先の記載(Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424)のように、調製した。つまり、オンコスタチンM CTLA4(OMCTLA4)発現プラスミドを鋳型として使用し、順方向プライマー、
GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG
を、該ベクターの配列に適合するように選択し、; および該逆方向プライマー、
GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC
は、該CTLA4の細胞外ドメインの最後の7アミノ酸(すなわちアミノ酸118−124)に相当し、ならびに制限酵素部位、および終止コドン(TGA)を含む。該逆方向プライマーは、C120S(120位のシステインからセリン)変異を指定した。特に、上記の逆方向プライマーのヌクレオチド配列GCA(ヌクレオチド34-36)は、以下のヌクレオチド配列の一つに代わる: AGA、GGA、TGA、CGA、ACT、またはGCT。当該技術分野の当業者が理解するように、ヌクレオチド配列GCAは、システインのコドンTGCの逆相補配列である。同様に、ヌクレオチド配列、AGA、GGA、TGA、CGA、ACT、またはGCTは、セリンのコドン逆相補配列である。ポリメラーゼ連鎖反応産物をHindIII/XbaIで切断し、および一方向に発現ベクターπLN(Bristol-Myers Squibb Company、Princeton、NJ)へサブクローンした。L104EA29YXC120Sを同一の方法で調製した。各コンストラクトをDNA配列決定により検証した。
【０１６４】
高結合力変異体の同定および生化学的特性
24アミノ酸が変異誘発に選ばれ、および生じた〜2300の変異タンパク質を、表面プラズモン共鳴(SPR; 上記を参照)によりCD86Ig結合を測定した。各部位での変異誘発の主要な影響は、表IIに示される。S25-R33のいくつかのアミノ酸のランダムな変異誘発は、リガンド結合を明らかには変化しなかった。E31およびR33および残基M97-Y102の変異誘発は、明らかにリガンド結合を低下した。残基S25、A29、およびT30、K93、L96、Y103、L104、およびG105の変異誘発は、減速した“オン”および/または減速した“オフ”速度のタンパク質を生じた。これらの結果は、S25-R33領域の残基、およびM97-Y102中または近くの残基は、リガンド結合に影響するという先の所見を指示する(Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058。
【０１６５】
S25、T30、K93、L96、Y103、およびG105部位の変異誘発は、CD86Igからの“オフ”速度が減速したいくつかの変異タンパク質の同定に至った。一方、これらの場合、減速した“オフ”速度は、減速した“オン”速度により損なわれ、野生型CTLA4Igに見られるそれと一見同様のCD86Igの全体的な結合力を有する変異タンパク質となった。加えて、K93の変異誘発は、観測された動態変化に関与しうる有意な凝集を生じた。
【０１６６】
L104のランダムな変異誘発の後、COS細胞形質導入し、および固定化CD86Ig上の培地サンプルのSPRによるスクリーニングして、野生型CTLA4Igと比較して、約2-倍減速した“オフ”速度を有する変異タンパク質を含む6つの培地サンプルを得た。これらの変異の対応するcDNAを配列決定したとき、それぞれ、ロイシンからグルタミン酸への変異(L104E)をコードすることが分かった。見かけ上、ロイシン104のアスパラギン酸への置換(L104D)は、CD86Ig結合に影響しなかった。
【０１６７】
その後、変異誘発は、表IIに示される各部位で繰り返され、上記のように今回はPCRの鋳型として野生型CTLA4Igの代わりにL104Eを使用した。固定化CD86Igを再び使用してSPR分析し、野生型CTLA4Igと比較して約4-倍の減速した“オフ”速度を有するタンパク質であるアラニン29の変異誘発から6つの培地サンプルを確認した。最も減速した2つはチロシン置換(L104EA29Y)、2つはロイシン(L104EA29L)、1つはトリプトファン(L104EA29W)、および1つはスレオニン(L104EA29T)であった。見かけ上“オフ”速度の減速のない変異体は、アラニン29が野生型CTLA4Igにおいてランダムに単独で変異されたときを確認された。
【０１６８】
精製したL104EおよびL104EA29YIgの相対分子量および凝集の状態を、SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。L104EA29YIg(〜1μg; レーン3)およびL104EIg(〜1μg; レーン2)は、還元下(〜50kDa; ＋βME; プラス2-メルカプトエタノール)および非-還元(〜100kDa; -βME)条件で、見かけ上、CTLA4Ig(〜1μg; レーン1)と同一の電気泳動移動度を有した(FIG. 10A)。サイズ排除クロマトグラフィーは、L104EA29YIg(FIG. 10C)は、見かけ上、二量体CTLA4Igと同一の移動性を有することを示した(FIG. 10B)。該主ピークは、タンパク質二量体、一方、FIG. 10Bの先に溶出した微小ピークは、高分子量集合体を示す。CTLA4Igの約5.0％は、高分子量集合体として存在したが、L104EA29YIgまたはL104EIgの凝集の証拠はなかった。従って、L104EIgおよびL104EA29YIgで見られたCD86Igに対するより強い結合は、変異誘発より誘導された凝集によるものではない。
【０１６９】
平衡および結合速度分析 
プロテインA精製したCTLA4Ig、L104EIg、およびL104EA29YIgについて、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて平衡および結合速度分析を行った。該結果は、表Iに示される。
【表４】
2008535841.tif 000006
(値は、異なる３つの実験からの平均値±標準偏差)
【０１７０】
測定平衡解離定数(Kd;表I)を、濃度範囲(5.0-200nM)から得られた結合曲線から、計算した。L104EA29YIgは、L104EIgまたはCTLA4Igと比較して、より強くCD86Igに結合する。L104EIg(6.06nM)またはCTLA4Ig(13.9nM)と比較して、L104EA29YIg(3.21nM)の低いKdは、CD86IgへのL104EA29YIgのより高い結合力を示す。L104EIg(4.47nM)またはCTLA4Ig(6.51nM)と比較して、L104EA29YIg(3.66nM)の低いKdは、CD80IgへのL104EA29YIgの高い結合力を示す。
【０１７１】
結合速度分析により、CD86Igに対する“オン”速度のように、CD80に結合するCTLA4Ig、L104EIg、およびL104EA29YIgの相対的な“オン”速度は同様であることが明らかになった(表I)。一方、これらの分子の“オフ”速度は、等しくなかった(表I)。CTLA4Igと比較して、L104EA29YIgは、CD80Igからは約2-倍の減速した“オフ”速度、およびCD86Igからの約4-倍の減速した“オフ”速度を有した。L104Eは、L104EA29YIgおよびCTLA4Igの中間の“オフ”速度を有した。これらの変異誘導は、“オン”速度に有意に作用しなかったため、L104EA29YIgで観察されたCD80IgおよびCD86Igに対する結合力の増加は、主に“オフ”速度の減少のためと思われる。
【０１７２】
CD86IgおよびCD80Igに対するL104EA29YIgの結合力の増加が、各単量体の二量体として結合するように影響する変異のためか、または各単量体に導入される構造変化を高める結合活性があるかを決定するために、CTLA4およびL104EA29Y細胞外ドメインの一本鎖コンストラクトを、上記およびLinsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424により120のシステインからセリンへの変異誘発して、調製した。精製タンパク質CTLA4XC120SおよびL104EA29YXC120S は、ゲル浸透クロマトグラフィー(Linsley et al., (1995)、上記)により、単量体であることが示され、その後それらのリガンド結合特性をSPRで分析した。結果は、CD86Igに対する両単量体タンパク質の結合親和性は、それらのそれぞれの二量体(表I)に認められるものより、約35-80-倍、小さいことを示した。これは、CTLA4の二量化は高い結合力リガンド結合に必要であるを立証し、先に公開されたデータ(Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771)を支持する。
【０１７３】
L104EA29YXC120Sは、CTLA4XC120Sと比較して約2-倍の高い親和性でCD80IgおよびCD86Igの両者に結合した。親和性の増加は、両リガンドからの約3-倍の減速した解離速度のためであった。従って、L104EA29Yによるより強いリガンド結合は、分子が二量化する変化よりむしろ、各単量体鎖に導入された結合力増強構造変化が最も可能性がある原因であった。
【０１７４】
結合力増強変異の位置および構造分析
CTLA4の細胞外IgV-様領域の溶液構造は、近年にNMR分光法より決定された(Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531。これにより、三次元の折り畳み構造中のロイシン104およびアラニン29に正確な位置が得られた(FIG. 11A-B)。ロイシン104は、高度に保存されたMYPPPYアミノ酸配列の近くに位置する。アラニン29は、S25-R33領域のC-末端近くに位置し、空間的にMYPPPY領域に近接する。一方、これらの2つの領域の塩基において残基間の有意な相互作用があり、それら両者はタンパク質中の近接する疎水性コアの一部を成すが、L104およびA29の間の直接の相互作用は無いようである。2つの結合力増強変異の構造的影響を、モデル化により評価した。A29Y変異は、S25-R33領域およびMYPPPY領域間の間の隙に、容易に位置することが出来、およびMYPPPY領域の立体構造の安定化に寄与しうる。野生型CTLA4において、L104は、MYPPPY領域近くのL96およびV94との広範囲の疎水性相互作用を形成する。グルタミン酸変異によって、2つの理由のためのL104のそれと同様の立体構造となることは全くあり得そうにない。第1に、該構造中に、S25-R33領域に有意な摂動（perturbation）無しに、より長いグルタミン酸側鎖を収容する十分な余地はない。第2に、疎水性領域でグルタミン酸側鎖の負電荷を埋めるエネルギー性コストは、大きい。それよりむしろ、モデル化研究により、グルタミン酸側鎖は表面にフリップアウトして、溶媒和により、その電荷を安定化させることが出来ることが予想される。このような立体構造的変化は、G105により、該領域の他の残基への最小の歪みとともに、容易に受け入れられる。
【０１７５】
高結合力変異体のCD80またはCD86発現CHO細胞への結合
安定に形質転換されたCD80＋およびCD86＋CHO細胞に結合するCTLA4Igおよび変異分子のFACS分析(Fig. 2)を、本明細書に記載するように行った。CD80-陽性およびCD86-陽性CHO細胞をCTLA4Ig、L104EA29YIg、またはL104EIgの濃度を上げてインキュベートし、およびその後洗浄した。結合した免疫グロブリン融合タンパク質をフルオレセインイソチオシアネート-結合ヤギ抗-ヒト免疫グロブリンを使用して検出した。
【０１７６】
図2に示されるように、CD80-陽性またはCD86-陽性CHO細胞(1.5x105)を、指示された濃度のCTLA4Ig(クローズド四角)L104EA29YIg(丸)、またはL104EIg(三角)とともに、23℃で2時間インキュベートし、洗浄し、およびフルオレセインイソチオシアネート-結合ヤギ 抗-ヒト免疫グロブリン抗体とともにインキュベートした。全5,000の生存細胞の結合をFACScanで分析し(単一測定)、PC-LYSYSを使用してデータヒストグラムから平均蛍光強度(MFI)を測定した。データを、第2工程試薬のみでインキュベートした細胞を測定した蛍光のバックグラウンド(MFI=7)に対して補正した。コントロールL6mAb(80μg/ml)は MFI<30であった。これらの結果は、4つの独立した実験の代表である。
【０１７７】
L104EA29YIg、L104EIg、およびCTLA4IgのヒトCD80-トランスフェクトCHO細胞への結合は、ほぼ等しい(FIG. 2A)。L104EA29YIgおよびL104EIgは、CTLA4Igと比較して、ヒトCD86で安定に形質転換されたCHO細胞により強く結合する(FIG. 2B)。
【０１７８】
機能分析
ヒトCD4-陽性T細胞を、免疫磁性ネガティブ選択(Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604)により、単離した。単離したCD4-陽性T細胞を、滴定濃度の阻害剤の存在下、ホルボールミリスチン酸アセテート(PMA)プラスCD80-陽性またはCD86-陽性CHO細胞で刺激した。CD4-陽性T細胞(8−10 x 104/ウェル)を、1nMのPMAの存在下、照射したCHO細胞刺激因子とともにまたは無しに、培養した。72時間培養の最後7時間内に、1μCi/ウェルの[3H]チミジンを添加して、増殖反応を測定した。PMAプラスCD80-陽性CHOまたはCD86-陽性CHOで刺激したT細胞の、L104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を行った。該結果は、FIG. 3に示される。L104EA29YIgは、CTLA4Igと比較して、CD80-陽性PMA処理CHO細胞での増殖を、より阻害する(FIG. 3A)。L104EA29YIgはまた、CTLA4Igと比較して、CD86-陽性PMA処理CHO細胞での増殖の阻害に、より効果がある(FIG. 3B)。従って、L104EA29YIgは、T細胞のCD80-およびCD86-媒介補助刺激の両方のより強力な阻害剤である。
【０１７９】
図4は、上記で調製したアロ刺激T細胞、および更にCD80およびCD86を発現するPMと呼ばれるヒトBリンパ芽球様細胞株(LCL)でアロ刺激したときのL104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を示す(T細胞(3.0x104/ウェル）およびPM(8.0x103/ウェル）)。一次アロ刺激は6日間行い、その後、該細胞を3H-チミジンで7時間パルスして、その後、放射性標識の取り込みを測定した。
【０１８０】
二次アロ刺激を以下のように行った。7日目一次刺激T細胞をリンパ球分離培地(LSM)(ICN、Aurora、OH)上に集め、および24時間放置した。T細胞をその後、滴定量のCTLA4IgまたはL104EA29YIgの存在下、上記と同一比のPMを加えることによって再刺激した(二次)。刺激は3日間行い、その後該細胞を放射性標識でパルスし、および上記のように集めた。一次アロ刺激T細胞へのL104EA29YIgの影響は、FIG. 4Aに示される。二次アロ刺激T細胞へのL104EA29YIgの影響は、FIG. 4Bに示される。L104EA29YIgは、CTLA4Igと比較して、一次および二次T細胞増殖反応をより阻害する。
【０１８１】
サイトカイン産生(図5)の測定のために、2つの二次アロ刺激プレートを用意した。3日後、培地をELISAキット(Biosource、Camarillo、CA)を用い、該製造者の推奨する条件を用いて、分析した。L104EA29YIgは、CTLA4Igと比較して、二次同種異系刺激後のT細胞IL-2、IL-4、およびγ-IFNサイトカイン産生のブロックにおいて、より強力であることが認められた(FIGS. 5A-C)。
【０１８２】
L104EA29YIgおよびCTLA4Igのサル混合リンパ球反応(MLR)への影響は、図6に示される。2匹のサルからの末梢血単核球細胞(PBMC’S; 各サルから3.5x104細胞/ウェル)をリンパ球分離培地(LSM)上で精製し、および2μg/mlのフィトヘマグルチニン(フィトヘマグルチニン)(PHA)と混合した。該細胞を3日刺激し、採取前に放射性標識で16時間パルスした。L104EA29YIgは、CTLA4Igと比較してより良くサルT細胞増殖を阻害した。
【表５】
2008535841.tif 000007
（主な影響は、“＋”サインで示される）
【実施例３】
【０１８３】
本試験は、腎移植レシピエントにおける、バシリキシマブ(シムレクト登録商標; ノバルティス)導入、ミコフェノール酸モフェチル(MMF; セルセプト登録商標; Roche)、および副腎皮質ステロイドを含むCNI-フリー併用レジメンの一部として使用した場合の、上記L104EA29YIgの維持免疫抑制剤としての有効性および安全性を、12箇月間にわたってCsAと比較した。
【０１８４】
生体または死亡ドナーからのHLA不一致腎臓同種移植の成人レシピエントが適格者とした。これまでに腎移植した患者、パネル反応性抗体>20％の経歴、または調査者により急性拒絶反応のリスクが高いと見なされた者は、該調査対象の≦10％に制限した。除外基準は、巣状糸および分節性糸球体硬化症、I型もしくはII型膜性増殖性糸球体腎炎、または溶血性尿毒症症候群の基礎腎疾患/血栓性血小板減少性紫斑病; 活動性肝炎BもしくはC、またはHIV; およびドナー年齢が>60または<6、心臓死のドナー、または腎冷虚血時間>36時間のドナーを含んだ。
【０１８５】
これは、非盲検、無作為化、アクティブ-コントロール、繰り返し投与の、米国、ヨーロッパおよびカナダで行われた多施設治験であった。≧18歳の腎移植を受ける(死亡または生体ドナー、ドナーおよびレシピエントがHLA-一致であるときを除く)男女の適格患者を、L104EA29YIgより強い(MI)治療レジメン、L104EA29YIgより強くない(LI)治療レジメン、またはシクロスポリン A(CsA)により、1:1:1の比率で; 全て、バシリキシマブ(シムレクト登録商標; ノバルティス)による導入療法、ミコフェノール酸モフェチル(MMF; セルセプト登録商標; Roche)による補助的維持療法、および副腎皮質ステロイドと組みあわせて、治療するために無作為化した。両L104EA29YIgレジメンには、L104EA29YIgを10mg/kg投与する初期段階、およびq4週間またはq8週間の間隔でL104EA29YIgを5mg/kg投与する維持段階が含まれる。各レジメンの投与量は、体重に基づく。これらの投与量を、非ヒトの霊長類研究の中、有効であると見なされた標的トラフ値により決定した。これらの値は、最初、免疫学的なリスクが最も高い期間(0-90日目)は、高い投与量を必要とした。該初期段階は、MIレジメンにおいてより長く(6対3箇月)、およびより頻繁な投与を含んだ。
【０１８６】
L104EA29YIgより強い(MI)治療レジメンは、1、5、15、29、43、57、71、85、113、141および169日目は10mg/kg、続いて4または8週間毎に5mg/kgの投与を含んだ。L104EA29YIgより強くない(LI)治療レジメンは、1、15、29、57および85日目は10mg/kg、続いて4または8週間毎に5mg/kgを含んだ。L104EA29YIgを30-分静脈内注射で投与した。CsAに無作為化された患者は、事前に指定された標的血清濃度範囲、最初の1箇月間は150-400ng/mlおよび2−12箇月間は150-300ng/mlを達成するために、1日2回の投与(7±3mg/kg)を受け、これは現状の医療と一致する。全患者は、MMFを１日2g、およびバシリキシマブを4日毎に20mgを受けた。副腎皮質ステロイド漸減レジメンはまた、メチルプレドニゾロンの静脈内ボーラスを1日目500mgおよび2日目250mg、続いて経口プレドニゾンを3日目100mg、4日目50mg、5−30日目25mg、31−44日目22.5mg、45−58日目20mg、59−72日目17.5mg、73−86日目15mg、87−100日目12.5mg、および101−114日目10mgを含んだ。114日目後は、該プレドニゾン投与量を1箇月おきに2.5mg減らし得たが、1日5mg未満ではなかった。
【０１８７】
第1目的は、L104EA29YIgが、6箇月での急性拒絶反応の予防において、CsAに劣らないことを証明することであった。第2目的は、6箇月および1-年での急性拒絶反応の発生率(生検-確認されたまたは推定された)の評価; 1、6、および12月箇月目でのイオヘキソールクリアランスによる測定糸球体ろ過量(GFR); 高血圧のパラメーター; 血清コレステロールおよびトリグリセリド類; および全体的な安全性を含んだ。他の事前に指定した解析には、1-年での患者の死亡または移植片喪失; 急性拒絶反応の重症度; 移植後の真性糖尿病の発生率[≧4週間の高血糖の治療を必要とする、またはヘモグロビン A1C(HbA1c)>7％であり、事前に糖尿病と知られていない患者と定義する]; the Modification of Diet in Renal Disease(MDRD, Levey AS, Bosch JP, Lewis JP, Greene T, Rogers N, Roth D.  A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 1999;130:461-470)、Jelliffe(RW. Creatinine clearance: Bedside estimate. Ann Inter Med. 1973;79:604-605)、Cockcroft-Gault(Cockcroft  DW, Gault MH. Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephron 1976;16:31-41)、およびNankivell (Nankivell BJ, Gruenewald SM, Allen RD, Chapman JR.  Predicting glomerular filtration rate after kidney transplantation. Transplantation. 1995; 59(12):1683-1689)式を用いた算出GFR; 薬物動態および免疫原性をが含まれた。急性拒絶反応(AR)の診断および治療は、バンフ97判断基準および分類(Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999;55(2):713-23.)に基づいた。慢性移植腎症(CAN)の発生率について事後解析を行った。
【０１８８】
急性拒絶反応(AR)の診断および治療は、バンフ97判断基準および分類( Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999;55(2):713-23.)に基づいた。術中腎臓同種移植生検を、ベースライン組織を評価するために行った。生検した組織を染色し、および腎移植病理のバンフ97実務分類に従って類別した。生検は、臨床的にARが疑われる全てのエピソードの確認するために、ARの治療に先立って、治療について知らされていない独立した病理学者により、生検が行われた。
【０１８９】
更なるエンドポイントには、CsA治療をされた患者と比較したL104EA29YIgで治療をされた患者における、12箇月での臨床的に疑わしくおよび生検で証明された急性拒絶反応(CSBPAR); 1-年での死亡または移植片喪失; ARエピソードの重症度(バンフ97基準を用いて測定した); 治療不成功(調査者の見解;≧グレード IIB 拒絶反応; 再発性またはステロイド-耐性拒絶反応と定義される); 1、6および12箇月での腎機能(イオヘキソールクリアランスにより評価した糸球体ろ過量[GFR])および慢性移植腎症(CAN)のエビデンス(間質性線維症および尿細管萎縮); 高血圧のパラメーター(拡張期血圧[BP]≧90mmHgおよび/または収縮期BP≧140mmHg); 血清脂質; 安全性、認容性および有害事象(AE)が含まれた。
【０１９０】
安全性および認容性の評価のために、定期の臨床巡回の間、AE、検査室測定(血液学、生化学および尿検査)およびバイタルサインを記録した。
【０１９１】
結果
218人の患者全てが腎移植を行い、およびMI群(N=74)、LI群(N=71)、またはCsA(N=73)に無作為化された。ベースライン人口統計および臨床的特徴は、3つの治療群間で同様であった。164人の患者の全てが、1-年の治療を完了した。1年より前に中断した患者(N=16対16対20; MIレジメン対LIレジメン対CsA)の、最も多く見られる原因は、AE(N=5対8対9)および治療不成功(N=7対5対3)であった。
【０１９２】
CSBPARの発生は、全ての治療群で低頻度であり、およびCSBPARまたは生検証明された急性拒絶反応(BPAR)の発生率において、治療群間で統計的に有意な差はなかった。6および12箇月でのCSBPARの発生率は、MI、LIおよびCsA治療に関して、それぞれ6.8％、5.6％および8.2％であった。
【０１９３】
BPARは、他の2つの群と比較してLI群で僅かに高かったものの(MI、LIおよびCsA治療に関してそれぞれ18.9％、29.6％および17.8％)、6および12箇月でのBPARの発生率はまた、群間で同様であった。生検-証明された急性拒絶反応は、CSBPARと比較して全ての治療群において高頻度であり、およびLI群で最もよく見られた。一方、これらのイベントの多くは、所望のトラフ血清濃度より低いL104EA29YIgの患者に生じることが認められた。
【０１９４】
ARの重症度に治療群間の統計的に有意な差は見られなかった; 一方、数は少なく、および移植片喪失を生じなかった。
【０１９５】
本試験は、CsAに関して注意の基準を容認するために試験薬剤に非盲検であり、それはおそらく、CsA群(N=144)と比較してL104EA29YIg群(N=345)での生検数の増加の一因となった。これは、この方法で設計された試験に予期しないことではないが、L104EA29YIg治療群における腎臓の組織学的異常の診断率を増加し得た。
【０１９６】
全治療群において死亡および/または移植片喪失はまれであり、MI群で1人の死亡が報告され、CsA群で4人、およびLI群で無しであった。ほとんどの移植片喪失は、免疫学的イベントにより引き起こされたものでなく、LI群において1に対し、MIおよびCsA群において、3の移植片のみが喪失した。
【０１９７】
CsA-に基づく免疫抑制と比較して、L104EA29YIg-に基づく治療で、腎機能における有意な改善が見られた。イオヘキソールクリアランスは、全ての時点で、L104EA29YIg治療が優れており、CsAと比較して12月での平均改善は11ml/分/1.73m2(〜20％)であった。
【０１９８】
12箇月での慢性移植腎症(CAN)は、CsA-治療患者よりL104EA29YIg-治療患者においては、相対的に30〜50％低かった。12箇月での、新たなまたは悪化したCANの比率は、MI、LIおよびCsA群それぞれ、29％、19％および44％であった。
【０１９９】
MI(130mmHg)およびLI(129mmHg)治療群の患者に対してCsAで治療された患者(133mmHg)は、1-年での平均収縮期血圧が、3−4 mmHg高かった。これは、L104EA29YIg群における降圧薬のより低い使用にも関わらなかった(MI: 87.5％; LI 84.1％: CsA 92.2％)。脂質低下薬の使用はまたL104EA29YIgで低かったが(MI: 36.1％; LI: 31.9％; CsA: 53.1％)、全血清コレステロールは、CsA-(212mg/dL)治療患者に対してL104EA29YIgで僅かに低かった(MI: 198mg/dL; LI: 201mg/dL)。
【０２００】
L104EA29YIg治療群において1人であったのに対して、CsA群において患者4人(5.5％)が死亡した。有害事象(AE)の率は、治療群間で同等であった; しかし、関連AEは、CsA治療と比較してL104EA29YIg治療が有意に低かった。L104EA29YIgの静脈内投与は、注入反応はなく、十分に寛容された。L104EA29YIg-治療患者は、貧血、白血球減少、多毛症、振戦および歯肉増殖症のような代表的なCsA-関連有害事象を示さなかった。L104EA29YIgに基づく治療は、CsAに基づく治療と比較して、感染または悪性腫瘍のリスクの増大に関与しなかった。
【０２０１】
結論
この12箇月の試験は、L104EA29YIgに基づく維持療法は、CsAと比較して、ARの予防において同等な有効性、および同様の患者の生存率および移植片残存率を提供することを示す。加えて、L104EA29Yigは、CsAに基づく維持免疫抑制と比較して、腎機能の有意な改善およびCANの減少を示した。L104EA29Yigは、安全でおよび十分に寛容であり、および代表的な CNI-関連毒性を伴わなかった。
【０２０２】
CsAに基づく治療で見られた低いAR率はまた、L104EA29Yigでも達成されることが示され、CSBPARおよびBPARの比率は、3つの治療群間で同様であった。BPARの大部分は亜症状性と分類され、腎機能は損なわれていないことを示唆した。MI群のAR率はLI群と比較して数値的に低く、L104EA29YIgの容量依存的な反応が可能性を示唆する。L104EA29YIg群のより頻繁な生検は、潜在的にこれらの群における急性および慢性拒絶の両方の過剰-診断を引き起こしうるため、本試験においてL104EA29YIg療法の利点は理解されうることを示唆する。
【０２０３】
BPARの主な事象は移植後の3箇月内に生じ、これは、高い投与量の免疫抑制剤が移植後の早い期間に必要であることが他者により示されているので(Wiecek A, Nowicki M, Kokot F, Ritz E. Acute failure of the transplanted kidney--pathophysiology, diagnosis and prevention. Ann Transplant 1996;1(4):5-9 and  Bennett WM. Posttransplant acute renal failure. Ren Fail 1997;19(2):225-6)、予想されなかったことではない。これらの事象の多くは、所望のトラフ値より下で、生じたため、安定状態に達する前の治療の最初の月における該レジメンを変えることを、考慮すべきである。維持段階の間に見られたBPARの多くは、L104EA29YIgが大変低いまたは検出できないレベルで生じ、それらの期間のARの発生率は、不十分な免疫抑制に関連することを示唆し、それは、該投与レジメンの変更により、避けられうる。
【０２０４】
本試験によって、L104EA29YIgは、CsAと比較して同様の全体的なAE率を伴い、治験薬に関連するAEはより少ないことを実証する。3つの治療群間に、ウィルス関連AE数の大きな差は認められなかった。
【０２０５】
低いAR率の存在において、維持免疫抑制の新しい目的は、高血圧、脂質異常症、薬物毒性、および瘢痕の予防を含む、長期的な合併症の減少である。自己免疫疾患においてみられるように、新しい免疫選択性維持免疫抑制物質の創出が、現れつつある。L104EA29YIgによる免疫選択性補助刺激ブロックによるT-細胞補助刺激の阻害は、腎移植におけるより選択的な維持免疫抑制、毒性の減少および長期転帰の改善の見込みを提示する、新しいパラダイムを示す。
【実施例４】
【０２０６】
CNIに相当する短期的な患者の生存率および移植片残存率を提供し、それらの長期的な腎毒性作用、循環器系影響、および代謝的影響のない、腎移植における新しい治療へのいまだ満たされていない多大な医学的ニーズが存在する。ECD規定腎臓同種移植のレシピエントの、長期的な患者の生存率および移植片の残存率は、標準的な適格判断基準に合うドナーからの同種移植片レシピエントのそれらを明らかに下回り、該ニーズは、それらの間で特に大きい。新規な作用機序を有する免疫抑制物質L104EA29YIgは、有望な非-腎毒性のECD同種移植片の腎移植レシピエントにおける使用のための候補である。L104EA29YIgは遅延方法よりむしろ移植時に投与出来るため、CNIではよく必要であることだが-特に最初の腎機能が低下したそれらの同種移植片-それは、時機を逸せずに、およびポリクローナル抗リンパ球製剤の必要性無しに、免疫抑制を可能とする。これは、好ましい安全性を有する同程度の急性拒絶反応となりうる。L104EA29YIgは腎毒性とは予想されないため、付加的な利点は、同種移植片の構造(つまり、CAN)および機能(つまり、GFR)に関して見るべきである。最後に、CNIとは違って、L104EA29YIgの目的とされた作用機序は、循環器系/代謝系プロフィールに不利に作用すること無く、免疫抑制を提供すべきである。この患者集団におけるL104EA29YIgの使用の全体的な利点-リスク評価を以下に記載する。
【０２０７】
2つの投与レジメン(実施例3に記載される。LIレジメンに微修正を加え、および4-週間毎の維持注入スケジュールを用いる)を試験する。
第1目的
1）CsAと比較した、12箇月での、患者の生存率および移植片残存率の複合への、L104EA29YIgの影響の評価。
2）CsAと比較した、12箇月での測定GFRが<60mL/分/1.73m2、または3箇月から12箇月までの測定GFRの≧10mL/分/1.73m2の低下の複合への、L104EA29YIgの影響の評価。
第2目的
1）CsAと比較した、12箇月での、測定GFRへの、L104EA29YIgの影響の評価。
2）CsAと比較した、12箇月までの、生検-証明されたCANへの、L104EA29YIgの影響の評価。
3）CsAと比較した、3箇月での測定GFR、およびベースライン(3箇月)から12箇月までの変化への、L104EA29YIgの影響の評価。
4）CsAと比較した、12箇月での、測定GFRが<30mL/分/1.73m2である患者の比率への、L104EA29YIgの影響の評価。
5）CsAと比較した、3、12、24、および36箇月での算出GFR、およびベースライン(3箇月)から12、24、および36箇月までの変化への、L104EA29YIgの影響の評価。
6）CsAと比較した、12、24、および36箇月での、PTDMへの、L104EA29YIgの影響の評価。
7）CsAと比較した、12、24、および36箇月での、高血圧の程度（SBPおよびDBP、高血圧および制御高血圧の発生率と有病率、および治療レジメンの強さを含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
8）CsAと比較した、12、24、および36箇月での、脂質代謝異常の程度（血清総コレステロール、血清非HDLコレステロール、血清低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール、血清HDLコレステロール、血清TG、脂質代謝異常および制御脂質代謝異常の発生率と有病率、および治療レジメンの強さを含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
9）CsAと比較した、24および36箇月での、患者の生存率および移植片残存率への、L104EA29YIgの影響の評価。
10）CsAと比較した、6箇月での、急性拒絶反応の程度（急性拒絶反応の発生率および重症度、腎機能の低下および予測されるDGFのためのポリクローナル抗リンパ球製剤の使用、急性拒絶反応の治療のためのリンパ球除去療法の最初の使用、ステロイド-耐性急性拒絶反応の発生率、急性拒絶反応後の完全回復の発生率(SCrのベースラインへの回帰)、無症状性の拒絶反応の発生率、および組織学的所見に関わらず全ての治療された急性拒絶反応エピソードの発生率を含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
11）CsAと比較した、QoLへの、L104EA29YIgの影響の評価。
12）CsAと比較した、L104EA29YIgの全体的な安全性の評価。
第3目的
1）CsAと比較した、ベースライン(3箇月)から12、24、および36箇月までの算出GFRの傾きおよび切片への、L104EA29YIgの影響の評価。
2）CsAと比較した、12箇月での、測定GFRが<45mL/分/1.73m2である患者の比率への、L104EA29YIgの影響の評価。
3）CsAと比較した、12箇月での算出GFRが<75mL/分/1.73m2である患者および3箇月から12箇月までの算出GFRの低下が少なくとも15mL/分/1.73m2である患者の比率への、L104EA29YIgの影響の評価。
4）CsAと比較した、DGFの発生率への、L104EA29YIgの影響の評価。
5）CsAと比較した、12、24、および36箇月での、急性拒絶反応の程度（急性拒絶反応の発生率および重症度、腎機能の低下および予測されるDGFのためのポリクローナル抗リンパ球製剤の使用、急性拒絶反応の治療のためのリンパ球除去療法の最初の使用、ステロイド-耐性急性拒絶反応の発生率、急性拒絶反応後の完全回復の発生率(SCrのベースラインへの回帰)、無症状性の拒絶反応の発生率、および組織学的所見に関わらず全ての治療された急性拒絶反応エピソードの発生率を含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
6）CsAと比較した、12、24、および36箇月での、複合循環器疾患エンドポイント(判定された循環器系死亡、心筋梗塞、虚血性脳卒中、循環器系原因による非選択的入院、および経皮的冠動脈インターベンション)への、L104EA29YIgの影響の評価。
7）CsAと比較した、12、24、および36箇月での、複合心腎臓疾患エンドポイント(死亡、移植片喪失、非致死的心筋梗塞、および発作)への、L104EA29YIgの影響の評価。
8）CsAと比較した、12、24、および36箇月での、フラミンガムリスクスコアへの、L104EA29YIgの影響の評価。
9）CsAと比較した、治験薬投与中止の発生率への、L104EA29YIgの影響の評価。
10）CsAと比較した、抗-ドナーヒト白血球抗原(HLA)抗体への、L104EA29YIgの影響の評価。
11）CsAと比較した、生検標本におけるC4d陽性への、L104EA29YIgの影響の評価。
【０２０８】
試験デザイン
該研究期間は3年であり、安全性評価のため8週間の追跡調査期間が続く。3年の治療期間の後、患者は、長期的な拡張試験に適格となりうる。
【０２０９】
これは、無作為化、部分的盲検、アクティブ-コントロール、平行群試験である。全ての患者は、以下に定義する拡大基準のドナーから腎臓を受ける。これらの判断基準は、全米移植臓器分配ネットワーク(UNOS)発行のそれらの一部に基づき; それらはまた、心臓死(DCD、心停止)または長時間の冷虚血時間(CIT)であるドナーからのそれらなど潜在的に障害のある臓器を特定するために広く用いられる他の特徴を含む。
【０２１０】
約540人の患者を、L104EA29YIg(MIレジメン)、L104EA29YIg(LIレジメン)、またはCsAのいずれかで治療するために、1:1:1の比率に無作為化する。全ての患者はまた、バシリキシマブの導入、ならびにMMFおよび副腎皮質ステロイドのバックグラウンド維持免疫抑制療法を受ける。MIレジメンに無作為化された患者は、1および5日目、その後2週間毎に3箇月まで(2、4、6、8、10、および12週)、およびその後4週間毎に6箇月まで(16、20、および24週)、静脈内L104EA29YIg(10mg/kg)を受ける。6箇月の後、MI治療群の患者は、36箇月の試験完了まで4週間毎に、維持量のL104EA29YIg(5mg/kg)を投与される。LIレジメンに無作為化された患者は、1および5日目、およびその後2週間毎に1箇月まで(2週および4週)、および4週間毎に3箇月まで(8週および12週)、静脈内L104EA29YIg(10mg/kg)を受ける。3箇月の後、LI治療群の患者は、36箇月での試験完了まで4週間毎に、維持量のL104EA29YIg(5mg/kg)を投与される。
【０２１１】
LIおよびMI群間の盲検は、6および10週にLI治療群に偽薬注入を使用して維持する。CsAに無作為化された患者は、現状の医療と一致する特定のトラフ血清濃度範囲を達成するよう設計された1日2回の投与を受ける。
【０２１２】
腎臓同種移植片機能低下および予測されるDGFを経験するCsAに無作為化された患者への、ポリクローナル抗リンパ球製剤(サイモグロブリンまたはATGAM)の使用は、必須でないが、容認される。これらの薬剤は、移植片機能が回復するまでの免疫抑制を得るために、CsAの投与に広く使用される。この臨床設定においてポリクローナル抗リンパ球製剤の使用および投与の決定は、該プロトコル指針内の調査者の判断である。L104EA29YIgの安全性および有効性を、1、2、および3年に評価する。
【０２１３】
主な結果判定法
各L104EA29YIgに基づくレジメンを、以下の主な有効性結果判定法でCsAに基づくレジメンと比較する:
(1)12箇月での患者の生存率および移植片残存率の複合;
(2)12箇月での測定GFRが<60mL/分/1.73m2、または3箇月から12箇月までの測定GFRの≧10mL/分/1.73m2の低下の複合。
該目的は、死亡および移植片喪失の非劣性および腎機能の優位性を証明することである。患者の生存率および移植片残存率のエンドポイントを選択した。これらの基準は、同種移植片レシピエントにとって最も重要な臨床成績であるためである。同種移植片喪失は効果的な免疫抑制療法で予防されうるが、同療法は感染症、PTLD、悪性腫瘍、腎毒性、または循環器疾患による死亡のリスクを増大しうる。従って、同種移植片レシピエントにおける免疫抑制療法の正味の利益の集約尺度として、患者の生存率および移植片残存率の複合エンドポイントを調査することは妥当である。この複合エンドポイントは、データの喪失または患者の誤分類によるバイアスなしに全ての患者を評価できるという更なる利点を有する。
【０２１４】
エンドポイントとして腎機能を選択した。移植後の腎機能および長期的な腎臓の成績との間の関係は、様々な設定で繰り返し実証されているからである。腎機能の測定が、移植後数日、退院時、または移植後6および12箇月であろうと、該関係は存在する。それは、生体および死体ドナーからの腎臓のレシピエント、若年および高齢の死体ドナーからの腎臓のレシピエント、移植2回目のレシピエント、ならびに成人および小児レシピエントに見られる。
【０２１５】
多施設治験からの結果は、長期的な移植片残存の予測のためにSCrの重要性を確信させる。腎機能と長期的な予後の間の関係は、厳密に比例でないが、強くおよび再現性がある。成人腎移植レシピエントの分析において、1-年でのSCrおよび推定メジアン移植片半減期との関係の試験により、SCr>1.5mg/dLで顕著な屈曲点が明らかになった。同様に、6箇月から1-年までのSCrの変化(ΔSCr)および推定メジアン移植片半減期の関係の試験により、ΔSCr≧0.3mg/dLで顕著な屈曲点が明らかになった。従って、1-年での腎機能の絶対値と6箇月(または同様の安定な移植後早期の時点)から1-年までの腎機能の変化の両方が、結果判定法としての使用に適する。長期的な成績に対する腎機能の関係における非直線の存在により、腎機能の絶対的な方法は、寸法的なものと比較してより優れた臨床的妥当性があることが示唆される。1-年での腎機能の閾値>1.5mg/dLおよび6箇月から1-年までのSCr変化≧0.3mg/dLが適切と思われる。
【０２１６】
上記の試験において、予後の腎機能の重要性は、SCrをマーカーとして使用して実証された。これらの試験は概して、糸球体ろ過の直接的な方法として使用するにはあまりに大きすぎた。腎機能のマーカーとしてのSCrの制限は良く知られている。SCrレベルは、クレアチンの腎排せつとクレアチンの内因的生成のバランスを主として反映する。後者は有意に筋肉量の変動、感染症、炎症、およびステロイドの使用により影響され、それは、移植集団でよく見られる。さらに、クレアチンの腎排せつは、2つのルート-糸球体ろ過および尿細管分泌により起こる。糸球体ろ過の減少のSCrへの影響は通常、尿細管分泌の代償的増加により隠され、従って、腎臓機能障害のマーカーとしてのSCrの上昇の使用は、減少している。GFRの減少した患者の40％は、SCrが正常または低いと見積もられている。人口統計学的および生体測定的要因の影響を明らかにすることにより、SCrおよびGFRの相互関係を改良しようとする多数の式が、開発されている。様々な式から見積もったGFRとイヌリンクリアランスにより測定した実際のGFRの一致のレベルを、安定な腎機能を有する294人の移植レシピエントにおいて試験した。イヌリンクリアランス測定と少なくとも10mL/分/1.73m2異なる予測GFR値の割合は、Jelliffe式の34％からNankivell式の53％に及んだ。Leveyらの提案する式を、この試験でGFRの計算に用いる。この式は、移植集団においてGFRをより正確に予測することが示され、Nankivellなどの他の式より良好な予測値と測定値の相互関係を有する。真のGFRと算出GFRの相当の違いを考慮して、真の糸球体ろ過マーカーのクリアランスを、腎機能の主なエンドポイントを評価するために使用する(Appendix 1)。60mL/分/1.73m2のGFR、または少なくとも10mL/分/1.73m2のGFR変化を、大規模な疫学研究で確立されたSCrの閾値1.5mg/dLまたは少なくとも0.3mg/dLのSCr変化におおよそ等しいとして使用する。移植後の腎機能は、概して3箇月までに安定するため、複合エンドポイントの該成分変化を3から12箇月まで評価する。
【０２１７】
他の結果判定法
主要な第2目的は、CsAと比較した、12箇月での測定GFRおよび12箇月での生検-証明されたCANへの、L104EA29YIgの影響の評価である。これらのエンドポイントは、L104EA29YIgの評価においてそれらの重要性を強調するために、他の第2エンドポイントから分離する。上記のように、ECD腎臓における機能的ネフロン量および腎予備は、標準的な判断基準ドナー臓器で見られるよりはるかに下回る患者生存率および移植片残存率の原因となるドナーの特徴(例、高齢、循環器系併存疾患、調達手段、およびCIT)のために、移植時に低下し易い。腎機能は移植時に低下する可能性があるため、十分な比率の患者が試験エントリー時での補助的予備腎機能エンドポイントの判断基準、または腎臓同種移植機能のベースラインの判定に適合しうることが可能である。従って、該プロトコルの主要な第2目的は、CsAと比較した、12箇月での測定GFRの差における、L104EA29YIgの影響の評価である。この主要な第2エンドポイントは、事前のこのECD集団におけるドナーバリアビリティに関係なく、CsAと比較したL104EA29YIgの効果の識別を可能にした。それはまた、全体で腎機能の評価に寄与し、およびL104EA29YIgは腎移植レシピエントにおいて有意な医学的な利点を提供するという結論をさらに強化する。残る主要な第2目的は、12箇月までの生検-証明されたCANである。機能する移植片の遅発性の腎臓同種移植喪失の主な原因として、CANは死亡についで2番目である。逆説的には、CNIは、直接的(すなわち、直接的な腎毒性作用)および間接的(すなわち、不利な循環器系および代謝系作用)な経路により、CANの原因となると考えられる。その特有の作用機序のために、L104EA29YIgは、直接的に腎毒性でなく、または循環器系および代謝系パラメーターを不利に変えそうにない。
【０２１８】
上記実施例において、L104EA29YIg-治療患者にCANの発生率の減少における好ましい効果が見られた。現試験において、CANの発生率の低下を達成することは、腎機能の改善と合わせて、L104EA29YIgが腎移植レシピエントにおいて有意な医学的な利点を提供するという結論を補強する。急性拒絶反応の予防におけるL104EA29YIgの有効性は、様々な結果判定法により評価される。これらには、その発生率、重症度、治療に対する反応性、および成績が含まれる。これらの方法の解釈は、一方、L104EA29YIgおよびCsAの本質的な違いより複雑である。L104EA29YIgを移植時に投与し、一方、初期腎機能の証拠があった時点でCsAを始める。この試験において、CsAに無作為化された患者のうち、最初の腎機能が低下し、およびDGFが予想される場合は、免疫抑制の適用を与えるためのポリクローナル抗リンパ球製剤を受けることが見込まれる。この治療効果は、CsA-治療患者における急性拒絶反応の進行を予防またはマスクし、および急性拒絶反応の該結果判定法で評価不可能な患者を供する。L104EA29YIgに無作為化された患者（移植時から治療されている）において同様の処置をとることは不必要であるため、急性拒絶反応の該相対評価は、同等でない。急性拒絶反応の予防においてL104EA29YIgの有効性をより正確に評価するために、この能力においてのポリクローナルリンパ球製剤の使用はまた、急性拒絶反応の他の判定方法と併用して報告される。
【０２１９】
調査集団
該調査集団には、ドナーの特性、調達手続き、CIT、または他の因子のために潜在的に準最適である腎臓同種移植のレシピエントが含まれる。該特定の適格者の判断基準は、UNOS発行の臓器提供のための‘拡大された判断基準’に基づく。長期のCITのドナーからまたはDCDからの腎臓のレシピエントはまた、適格である。概して、免疫学的判断基準は、患者の選択に重要な役割を果たさない。免疫学的リスクの様々なレベルの患者が適格である。該試験は、一方、免疫学的リスクの高い患者(クロスマッチ陽性、パネル反応性抗体[PRA]が≧30％、これまでに移植を受けた者)を排除する。これらの患者は、それらの抗体価を減らすため、血漿交換のような治療が必要であり得るが、これは、このプロトコルの範囲を超える。患者は世界的に約90サイトで登録される。
主な有効性結果判定法
1）CsAと比較した、12箇月での患者の生存率および移植片残存率の複合への、L104EA29YIgの影響の評価。
2）CsAと比較した、12箇月での測定GFR<60mL/分/1.73m2、または3箇月から12箇月までの測定GFRの≧10mL/分/1.73m2の低下の複合への、L104EA29YIgの影響の評価。
第2有効性結果判定法
1）CsAと比較した、12箇月での測定GFRへの、L104EA29YIgの影響の評価。
2）CsAと比較した、12箇月までの生検-証明されたCANへの、L104EA29YIgの影響の評価。
3）CsAと比較した、3箇月での測定GFR、およびベースライン(3箇月)から12箇月までの変化への、L104EA29YIgの影響の評価。
4）CsAと比較した、12箇月での測定GFR<30mL/分/1.73m2の患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。
5）CsAと比較した、3、12、24、および36箇月での算出GFR、およびベースライン(3箇月)から12、24、および36箇月までの変化への、L104EA29YIgの影響の評価。
6）CsAと比較した、12、24、および36箇月でのPTDMへの、L104EA29YIgの影響の評価。
7）CsAと比較した、12、24、および36箇月での高血圧の程度（SBPおよびDBP、高血圧および制御高血圧の発生率と有病率、および治療レジメンの強さを含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
8）CsAと比較した、12、24、および36箇月での脂質代謝異常の程度（血清総コレステロール、非HDLコレステロール、LDLおよびHDLコレステロール、およびTG、脂質代謝異常および制御脂質代謝異常の発生率と有病率、および治療レジメンの強さを含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
9）CsAと比較した、24および36箇月での患者の生存率および移植片残存率へのL104EA29YIgの影響の評価。
10）CsAと比較した、6箇月での急性拒絶反応の程度（急性拒絶反応の発生率および重症度、腎機能の低下および予測されるDGFのためのポリクローナル抗リンパ球製剤の使用、急性拒絶反応の治療のためのリンパ球除去療法の最初の使用、ステロイド-耐性急性拒絶反応の発生率、急性拒絶反応後の完全回復の発生率(SCrのベースラインへの回帰)、無症状性の拒絶反応の発生率、および組織学的所見に関わらず全ての治療された急性拒絶反応エピソードの発生率を含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
11）CsAと比較した、QoLへの、L104EA29YIgの影響の評価。
10）CsAと比較した、L104EA29YIgの全体的な安全性の評価。
第3の結果判定法
1）CsAと比較した、ベースライン(3箇月)から12、24、および36箇月までの算出GFRの傾きおよび切片への、L104EA29YIgの影響の評価。
2）CsAと比較した、12箇月での測定GFR<45mL/分/1.73m2の患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。
3）CsAと比較した、12箇月での算出GFR<75mL/分/1.73m2の患者および3箇月から12箇月までの算出GFRの低下が少なくとも15mL/分/1.73m2の患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。
4）CsAと比較した、DGFの発生率への、L104EA29YIgの影響の評価。
5）CsAと比較した、12、24、および36箇月での急性拒絶反応の程度（急性拒絶反応の発生率および重症度、腎機能の低下および予測されるDGFのためのポリクローナル抗リンパ球製剤の使用、急性拒絶反応の治療のためのリンパ球除去療法の最初の使用、およびステロイド-耐性急性拒絶反応の発生率、急性拒絶反応後の完全回復の発生率(SCrのベースラインへの回帰)、無症状性の拒絶反応の発生率、および組織学的所見に関わらず全ての治療された急性拒絶反応エピソードの発生率を含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。
6）CsAと比較した、12、24、および36箇月での複合循環器疾患エンドポイント(判定された循環器系死亡、心筋梗塞、虚血性脳卒中、循環器系原因による非選択的入院、および経皮的冠動脈インターベンション)への、L104EA29YIgの影響の評価。
7）CsAと比較した、12、24、および36箇月での複合心腎臓疾患エンドポイント(死亡、移植片喪失、非致死的心筋梗塞、および発作)への、L104EA29YIgの影響の評価。
8）CsAと比較した、12、24、および36箇月でのフラミンガムリスクスコアへの、L104EA29YIgの影響の評価。
9）CsAと比較した、治験薬投与中止の発生率への、L104EA29YIgの影響の評価。
10）CsAと比較した、抗-ドナーHLA抗体への、L104EA29YIgの影響の評価。
11）CsAと比較した、生検標本におけるC4d陽性への、L104EA29YIgの影響の評価。
【０２２０】
移植片喪失の定義
移植片喪失は、機能喪失または物理的喪失と定義される。機能喪失は、中心的検査室により≧4週間測定されたSCrの持続的レベルが≧6.0mg/dL(530「mol/L)、または連続≧56日の透析、または患者が2度目の移植を受ける程度までの腎機能の低下と定義される。移植片喪失の全ての原因は、独立したEACにより判断される。
【０２２１】
臓器移植後臓器機能障害(DGF)の定義
DGFは、試験8日目(手術後7日目)までの透析による治療と定義される。
【０２２２】
慢性移植腎症(CAN)の定義
生検-証明されたCANは、腎移植病理のバンフ97実務分類を用いて、盲検の中心的組織病理学者により決定される。該CANの発生率は、全ての1日目後の生検を移植時に得られた生検のベースラインと比較して決定される。この比較は、後にCANと解釈されうる既存の病理組織の存在および重症度を証明する。
【０２２３】
移植後の真性糖尿病の定義
PTDMは、最新の国際合意ガイドライン.20に定められた定義に従って定義される。これらの判断基準を要約すると、: 
a）糖尿病の症状、プラス、随時血漿グルコース(PG)濃度≧200mg/dL(11.1mmol/L)、または
b）空腹時血漿グルコース(FPG)≧126mg/dL(7.0mmol/L)、または
c）経口ブドウ糖負荷試験において、2-時間PG≧200mg/dL(11.1mmol/L)、および
d）急性代謝性代償不全を伴う明白な高血糖がない場合、別の日に、静脈PGの測定に基づいた確認的臨床検査が行わなければならない。
該試験は、PTDMの評価にFPGを用いるが、患者がこれらの他の方法を用いて評価され、および上記判断基準に適合すると認められれば、それらはPTDMであると見なされる。
【０２２４】
高血圧の基準の定義
高血圧は、本試験において、慢性腎疾患の患者のためのthe Seventh Report of the Joint National Committee on the Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure21に従って定義される。この定義は、SBP≧130mmHgまたはDBP≧80mmHgに基づく。加えて、高血圧の兆候のために降圧薬を受け、SBP<130mmHgおよびDBP<80mmHgである、または高血圧の病歴を有する、全ての患者は、この定義に含まれる。高血圧の発生率は、無作為化および移植後に高血圧が進行した患者の割合と定義される。高血圧の有病率は、その時々に上記の高血圧の定義に適合する患者の割合と定義される。制御高血圧は、高血圧の兆候のための降圧薬を受け、または別の兆候のために降圧薬を受けた間、SBP<130mmHgおよびDBP<80mmHgであり、高血圧の病歴を有することと定義される。SBP<130mmHgおよびDBP<80mmHgであり、高血圧以外の兆候のため降圧薬を処方され(例、片頭痛予防のためのベータブロッカー)、高血圧の病歴のない患者は、高血圧でも制御高血圧でもないと見なされる。治療レジメンの強さは、高血圧を制御するために使用された総降圧薬数と定義される。降圧作用は、兆候に関わりなくあるため、全ての降圧薬は、高血圧または制御高血圧の患者において高血圧の兆候のためとカウントされる。
【０２２５】
脂質代謝異常測定の定義
脂質代謝異常は、the National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (NKF-K/DOQI).22からの最新のガイドラインに従って、定義される。脂質代謝異常は、高トリグリセリド血症(TGsε500mg/dL[5.65mmol/L])、高コレステロール血症(LDLε100mg/dL[2.59mmol/L])、または高TGs(TGsε200mg/dL[2.26mmol/L の存在下、非HDLの上昇(非HDLε130mg/dL[3.36mmol/L])と定義される。制御脂質代謝異常は本試験において、上記の脂質代謝異常の1つのために薬理学的管理を受けており、うまく治療されており、およびそれらの脂質値は先のパラグラフに記載の閾値を下回る患者と定義される。これらの薬剤の中には、腎不全を伴う投与、CsAと併用する該開始投与量または最大推奨投与量に関して、特定の予防措置および/または警戒を有するものがあり、さもなくば、CsA PKの変化を引き起こしうる。特定の勧告のための適切な添付文書を参照する。抗高脂血症として使用される他の薬剤(すなわち、非-スタチン療法)は、レベルI治療強度と見なされる。スタチンと他のクラスの薬剤(例、エゼチミブ)の併用は、スタチン療法の強度レベルをレベル1ずつ上げうる。; 従って、強度レベル5より大きくすることが可能である。
【０２２６】
急性拒絶反応は、臨床上の証拠および生検確認を必要とする臨床病理学的イベントと定義されうる。同種移植片の生検は、盲検の中央の独立の病理学者により、腎移植病理のバンフ97実務分類を用いて、急性拒絶反応の存在および重症度を判断される。急性拒絶反応の分析において、中央の病理学者による 生検の判断および分類は、現地解釈に優先する。疑わしい急性拒絶反応に対して行った生検が、該判断基準に完全には適合しないが、中央の病理学者により急性拒絶反応と判断され、および急性拒絶反応の治療をもたらす場合は、急性拒絶反応としてカウントされる。無症状性の拒絶反応は、その臨床的相関は欠けているが、中央の病理学者による組織学的所見が急性拒絶反応と一致することと定義される。ステロイド-耐性急性拒絶反応は、副腎皮質ステロイドでの治療後、SCrの改善がなくおよび/またはリンパ球枯渇療法の使用を必要とする組織学的所見と定義される。
フラミンガムリスクスコア
このリスクスコアは、‘ハードな’冠状動脈性心臓病(心筋梗塞および冠動脈血栓による死)の10-年のリスクを評価するために、フラミンガム心臓研究23からのデータを使用する。この計算に含まれる該リスク因子は、年齢、性、総コレステロール、HDLコレステロール、SBP、糖尿病、高血圧の治療、および前月のタバコの使用である。
【０２２７】
症例数の決定
該第1目的は、12箇月でのCsAと比較した、患者生存率、移植片残存率および腎機能へのL104EA29YIgの効果を評価することである。該2つの補助的予備エンドポイントは、: (1)移植後12箇月に残存する移植片を有する患者の割合、および(2)12箇月の測定GFRが<60mL/分/1.73m2、および/または3箇月から12箇月までの測定GFRの減少が≧10mL/分/1.73m2である患者の割合、である。12箇月での真の患者生存率および移植片残存率が、CsAレジメンで80％、および該2つのL104EA29YIgレジメンの各々が83％であるとき、治療群につき180人の患者の症例数は、確率83％を提供し、第1の補助的予備エンドポイント(患者の生存率および移植片残存率)における絶対差(各L104EA29YIgレジメンとCsAレジメン間)についての両側（2-sided）97.3％CIの上限は、10％を超えないことを確認する。腎機能のエンドポイントについて、群につき180人の患者の症例数は、CsAレジメンと比較して、各L104EA29YIgレジメンの測定GFRエンドポイントに適合する患者の割合における25％の減少を検出するのに有効であり、このときCsA投与群の75％が腎機能エンドポイントに適合し、25％が脱落したとみなされる。全体として、治療群につき180人の患者は、少なくとも80％の確率で、有意水準0.05(Dunnett adjustment)でコントロールされた全体的な第1種の過誤を有する、両補助的予備エンドポイントに適合する1つのL104EA29YIgレジメンを検出し得る。
【０２２８】
試験対象患者基準
対象集団:
1）該患者は、死亡腎移植ドナーの初めてのレシピエントである。
2）ドナーおよび/またはドナー腎臓は、以下の臓器提供の拡大基準の少なくとも1つに該当する: 
a)ドナー年齢が≧60歳、または
b)ドナー年齢が50-59歳で、以下の1つに該当する:
(i)脳血管障害(CVA)＋高血圧＋SCr>1.5mg/dL、または
(ii)CVA＋高血圧、または
(iii)CVA＋SCr>1.5mg/dL、または
(iv)高血圧＋SCr>1.5mg/dL、または
c)CIT≧24時間、ドナー年齢>10歳、または
d)心臓死のドナー(心停止ドナー)
3）男性および女性、共に18歳以上、
4）WOCBPは、全試験期間および試験後8週間までの間、妊娠のリスクを最小限にする方法で妊娠をさけるため適当な避妊方法を使用していなければならない。WOCBPには、初経を経験し、および成功した不妊化手術(子宮摘出、両側卵管結紮、または両側卵巣摘出)をしていない、または閉経後(無月経が≧連続12箇月; またはホルモン補充療法を受ける、文書化された血清卵胞刺激ホルモン値が＞35mIU/mLである女性と定義される)でない、女性が含まれる。妊娠を防ぐための経口、インプラント、または注射の避妊ホルモン、または子宮内避妊具、またはバリア法(ペッサリー、コンドーム、殺精子剤)のような機械的製品の使用、または禁欲している、またはパートナーが生殖不能である(例、精管切除)、女性でさえ、妊娠の可能性があると見なすべきである。WOCBPは、試験薬剤の開始前72時間内に、血清妊娠テストが陰性でなければならない(最小感度25IU/Lまたはヒト絨毛性ゴナドトロピン[HCG]の同等なユニット)。
5）男性は、該試験の間、および最後の注入後8週間まで、パートナーの妊娠のリスクを最小限にするため、適当な避妊方法を使用しなければならない。
【０２２９】
除外基準
1）全試験期間および最後の注入後8週間までの間、許容される避妊方法の使用を認めない、または使用できないWOCBP
2）妊娠または授乳中の女性
3）登録時または治験薬投与前に妊娠テスト陽性の女性
4）全試験期間および試験薬剤の最後の注入後8週間まで、適当な避妊方法の使用を認めない、または使用できない男性
5）ドナー年齢が<10歳
6）以下の基礎にある腎疾患を有する患者: 
a)巣状分節性糸球体硬化症(生検証明された)
b)I型またはII型膜性増殖性糸球体腎炎
c)溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病症候群
7）現状のPRAが≧30％である患者
8）T-細胞リンパ球クロスマッチ陽性の患者
9）以前に実質臓器移植(腎臓を含む)をした患者
10）同時に実質臓器(心臓、肝臓、膵臓)または細胞(島、骨髄、幹細胞)移植を受ける患者
11）拡大基準ドナーからペアの腎臓を受ける患者(二重の腎移植)
12）C型肝炎抗体-陽性またはC型肝炎のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)-陽性の患者
13）B型肝炎表面抗原-陽性またはB型肝炎のPCR-陽性の患者
14）ヒト免疫不全ウィルス(HIV)感染の患者
15）先3-年内に活動性結核(TB)の治療が必要であった患者、またはこれまでにTBの3重(または以上)の併用療法が必要で合った患者。精製タンパク質誘導体(PPD)陽性の患者は、それらが潜在性TBの治療を完了し、および登録時のx-線検査で陰性でない限り、該試験の資格はない。最後12箇月内に実施のPPD試験は、結果の文書がある限り許容される。最後12箇月内にPPDのない患者で、これまでの結果が陰性であった者で、それらがまた、登録時に胸部x-線が陰性であり、TBを示す症状はなく、TB接触は知られておらず、TBの流行地域に現在滞在のところ滞在しておらず、最近に赴いておらず、または、すでに移住してきた場合は、登録されうる。PPD反応が≧10mmの硬結、またはヒーフスコア(Heaf score)が、非-カルメット・ゲラン桿菌(非-BCG)免疫化患者において>1、もしくはBCG免疫化患者において>2は、テスト陽性と見なすべきである。より保守的な判断基準は適用しうる。より保守的な判断基準は、該発表されたガイドラインおよび/または医学界に指示される局所的基準に従って、適用されうる。
16）活動性感染または通常移植を除外する他の禁忌を有する患者
17）病状または他の基礎疾患により、寿命が大幅に制限された患者
18）過去5-年内に癌の経歴(局所的切除により治癒した非-メラノーマ皮膚細胞癌以外)のある患者
19）過去5-年内に物質乱用(薬物またはアルコール)の経歴、または適切な追跡試験に適合しない精神疾患を有する患者
20）活動性消化性潰瘍、慢性下痢、または消化管吸収不良を有する患者 
21）共通毒性基準(CTC)グレードII以上の現地検査値を有する患者は、本試験に参加しえない。しかしながら、CTCグレードIIの例外である特定の検査値は許容される。以下に許容を記載する: 血液学: ヘモグロビンはCTCグレードIIより下である(8g/dLより下ではない)。血小板はCTCグレードIIより下であるが、80,000/mm3(80 x 109/L)より下でない。総白血球(WBC)数は、CTCグレードIIより下であるが、3000/mm3(3 x 109/L)より下でない。顆粒球およびリンパ球数はいずれの値でもよい。化学: SCrおよび血中尿素窒素(BUN)値は、いずれの値でもよい。血糖は、いずれの値でもよい。尿検査: 尿検査結果は、いずれの値でもよい。
22）40-歳以上の全ての女性、および乳癌の経歴を有する第一度近親者を有する、または乳癌の他のリスク因子を有する全ての年齢の女性は、スクリーニングマンモグラムを受け、または登録の6箇月内に行ったスクリーニングマンモグラムの結果を提供しなければならない。マンモグラムに悪性腫瘍の疑いがあり、および悪性腫瘍の可能性が、更なる臨床的、実験室、または他の診断的評価をうけて、合理的に解除されえない患者は、除外される。登録の6箇月内にスクリーニングマンモグラムを行っていない場合、患者は現地判断基準により適当な移植候補と見なされるが、マンモグラムのベースラインは、移植後4週間内に得られうる。
23）異なる静脈内投与、またはおそらく測定GFRの補助的予備エンドポイントの評価を妨げる他の理由を有する患者、またはプロトコル指定の12-箇月の同種移植片生検をしない(例、既存の凝固問題のため)、またはしたがらない患者。
24）静脈内ヨードx-線造影剤に対する真性アレルギーの経歴を有する患者
25）該1日目巡回前30日内に試験研究中の薬剤を使用した患者
26）これまでにL104EA29YIgで治療された患者
27）精神的疾患または身体的疾患(例、感染症)の治療のために、強制的に拘留された(不本意に拘禁された)、拘束された者または患者は、この本試験に登録してはならない。
【０２３０】
L104EA29YIgの投与
1日目は、移植日(移植後0日)と定義される。1日目の投与の注入は、医師が最初の術中評価を行い、該患者が依然、移植候補のままであり、移植を続行することを確認した後に、および移植血管吻合前に始めるべきである。注入量は、患者の試験1日目の実際の体重に基づき、および体重変化が±10％でない限り試験経過の間に修正しない。治験薬は、比較的定速で30分間をかけて患者に投与すべきである。1日目および5日目(移植後4日目)の投与量は、約96時間をあけて(±6時間)投与すべきである。続く巡回および注入の時間枠を以下に記載する。透析を行う患者については、L104EA29YIgの注入および患者の体重測定は、透析治療後に行うべきである。
【０２３１】
L104EA29YIgMIレジメン:  MIレジメンに無作為化された患者は、1および5日目、およびその後隔週に2箇月(2、4、6、8、10、および12週)、およびその後4週間毎に6箇月まで(16、20、および24週)、静脈内L104EA29YIg(10mg/kg)を受ける。6箇月の後、MI治療群の患者は、L104EA29YIgの維持量の5mg/kgを4週間毎に36箇月の試験完了まで受ける。
【０２３２】
L104EA29YIgLIレジメン:  LIレジメンに無作為化された患者は、静脈内L104EA29YIg(10mg/kg)を、1および5日目、およびその後隔週に2週間(2および4週)、およびその後4週間毎に2箇月間(8および12週)受ける。3箇月の後、LI治療群の患者は、L104EA29YIgの維持量5mg/kgを4週間毎に36箇月の試験完了まで受ける。LIおよびMI群間の盲検を、LI治療群に2回の偽薬注入を用いて維持する。
従って、LIレジメンに無作為化された患者は、6および10週に偽薬(5％ブドウ糖、水中、注射用[D5W])注入を投与される。
【０２３３】
シクロスポリン(CsA)の投与
CsAの１日量は、食事の時刻に関して一貫したスケジュールで、2分割量で投与すべきである。試験巡回日に、該患者は、トラフCsA血中濃度をとるまで、午前のCsA投与を控えなければならない。試験巡回日に、患者が標準化されたBPモニタリングおよび/または測定GFR評価をする場合、これらの測定は、CsA投与の前に完了する。最初の1日量は、7±3mg/kg(すなわち、4-10mg/kg)とすべきである。その後の投与は、所定のトラフ血清濃度範囲を維持するために調節すべきである。: 最初の1箇月: 目標値150-300ng/mL、最初の1箇月の後: 目標値100-250ng/mL。投与2時間後の血漿濃度(C2)を用いたCsA値のモニタリングは、本試験において用いない。最近のC2モニタリングによるNeoralの管理に関する国際合意声明は、C2モニタリングの使用を支持するが、それはまた、C2モニタリングに関連する腎機能への長期的な影響、CANの発生率、および全般的な安全性プロフィールに関するデータの不足を明確に示した。24 さらに、糖尿病、胃排出が遅い患者、またはCsAクリアランスを変える併用薬を使用する患者を含め、全ての患者がC2モニタリングに適するとは限らない。さらに、低いC2値は、真の低い吸収(この時、CsA投与量を増やすべき)または吸収が遅い(この時、最大血漿濃度が遅延し、および投与量の増加は、毒性を生じうる)に起因しうる。最後に、この方法は、一般的でなく、およびこの方法は、現プロトコルの範囲を超えていることは予め確認されている。更なる処方情報のために、該添付文書を参照する。CsAは、全ての患者において、7日目までに始められるべきである。調査者がCsAを始めることが全く患者にとって得策でないと考え(例、腎機能の低下のため)、および代わりに非-試験薬剤(例、シロリムス)を使用することを選択する患者において、この行為は、薬剤試験の中断と見なす。
【０２３４】
即時に同種移植片機能を有する患者に対して: CsAの治療に無作為化された患者において、CsAの最初の投与量は、適切な同種移植片機能の証拠があるまではないが、あり次第すぐに、投与すべきである。適切な同種移植片機能は、移植後のイニシャル値と比較してSCrの少なくとも1mg/dLの低下、または移植後12時間(以下)の尿排出量が≧250mLと定義される。
【０２３５】
腎臓同種移植片機能低下および予測されるDGFを有する患者に対して:  術後の同種移植片機能低下および予測されるDGFを有する患者は、-必須でないが-、ポリクローナル抗リンパ球製剤を受ける資格がある。患者がポリクローナルリンパ球製剤を受けるか否かに関わらず、CsAは、同種移植片機能の回復の証拠(上記に定義する)があったとき、または7日目までに開始すべきである。
【０２３６】
副腎皮質ステロイド
本試験において全患者は、毎日の副腎皮質ステロイドで治療される。
ステロイド維持-漸減
移植日(1日目): 手術室(OR)に到着次第、メチルプレドニゾロンを(コハク酸ナトリウムとして)500mg静脈内
【０２３７】
2日目: メチルプレドニゾロンを(コハク酸ナトリウムとして)250mg静脈内
【０２３８】
3日目: プレドニゾン(またはプレドニゾロン)を100mg経口(p.o.)
【０２３９】
4日目から14日目(すなわち、2週の終わり):プレドニゾン(またはプレドニゾロン)を20-30mg経口（毎日）に漸減 
【０２４０】
15日目から6箇月: プレドニゾン(またはプレドニゾロン)を2.5mg経口（毎日）より低くはない量まで漸減
【０２４１】
患者は、少なくとも2.5mg経口（毎日）を3-年間維持しなければならない。
【０２４２】
初めの2回の投与(試験1日目（移植日）および試験2日目（術後1日目)）は、静脈内投与である。残りの投与は、経口投与である。しかし、経口投与が不可能なときは、その時々で等価量のメチルプレドニゾロンの静脈内投与が許容される。経口投与よりむしろ静脈内投与とする該理由は、併発疾患、術後のイレウス、または調査者の判断における他の原因である。メチルプレドニゾロンが利用できない場合、メチルプレドニゾロンに相当する量の別の静脈内副腎皮質ステロイド薬の使用が、許容される。
【０２４３】
ミコフェノール酸モフェチル投与
本試験の全患者はMMFで治療される。1日のMMFは、食事の時刻に関して一貫したスケジュールで、2分割量で投与すべきである。該投与量は、1日2gである。; しかし、アフリカ系アメリカ人においては、調査者の判断により、1日3gを投与されうる。25 MMFは経口投与すべきである。併発疾患、術後のイレウス、または調査者の判断による他の原因のために、必要な場合は、静脈内投与が許容される。最初の投与は、手術前に投与すべきである。その後の投与は、患者が経口投薬を寛容でき次第、経口投与すべきである。該投与量およびスケジュールは、検査値(例、WBCの低下)および患者の寛容性に基づいて調整され、決定されうる(下記参照)。十分な処方情報のため、添付文書を参照する。
【０２４４】
悪心、下痢、または他のMMF-関連の胃腸への副作用(例、十分に評価されおよびMMFに対する非認容性以外の病因が考えられない症状)が発症した患者に対しては、MMFの投与量は、最大耐量に減らされうる。好中球減少(絶対好中球数<1.3 x 103/「L)を発症した患者に対しては、該添付文書のとおり、MMFの投与は中断し、または投与量を減らすべきである。
【０２４５】
バシリキシマブの投与
本試験の全患者は、推奨されるバシリキシマブの投与レジメンで治療される。バシリキシマブは、末梢静脈または中心静脈からのみで投与すべきである。再調製したバシリキシマブ(5mL中20mg)を、生理食塩水または5％ブドウ糖で容量50mLに希釈し、および静脈内注射として20-30分をかけて投与すべきである。最初の20mg投与量は、1日目(移植日; 術後0日目)に投与すべきである。L104EA29YIgに無作為化された患者に対して、この最初のバシリキシマブの注入は、L104EA29YIgの注入が完了後、できるだけ早く行うべきである。2回目の投与量20mgを、5日目(術後4日目)に投与すべきである。それらがリンパ球枯渇療法を受けたまたは受けることが見込まれている場合、該2回目のバシリキシマブ投与量は、患者に投与すべきでない。追加情報のために、添付文書を参照する。
【０２４６】
腎臓同種移植片機能低下および予測されるDGFのためのポリクローナル抗リンパ球製剤
移植後に腎臓同種移植片機能低下および予測されるDGFを経験する、CsAに無作為化された患者に対して、ポリクローナル抗リンパ球製剤(サイモグロブリンまたはATGAM)の使用は、-必須でないが-許容される。他のポリクローナル抗リンパ球製剤またはポリクローナル抗胸腺細胞グロブリンの使用は、それらが腎移植における急性拒絶反応の治療に適応されている場合、製造承認が存在する分野において許容される。注目すべきは、OKT3は、この目的には使用されないが、バンフ97グレードIIb以上の急性拒絶反応またはステロイド-耐性急性拒絶反応の治療に使用されうる。Campath 1-H登録商標(アレムツズマブ)の使用は、それが腎臓移植での使用は適応されていないため、本プロトコルにおいて許容されない。
これらの薬剤は、移植片機能がCsA投与を許容するまでの免疫抑制を得るため、この能力において広く使用されている。従って、ポリクローナル抗リンパ球製剤は本臨床設定において、調査者の判断により、移植片の動脈および静脈の開存性が存在し、および超音波画像による水腎の証拠がない場合に見られる、以下の判断基準の≧1に適合する患者において、使用されうる: 
a)尿量<250cc/12時間。b)移植後の最初の24-72時間において、ベースライン値からのSCrの有意な改善がない(<1mg/dL)。c)透析治療。腎臓同種移植片機能低下および予測されるDGFのためのこれらの薬剤の使用は、L104EA29YIg-治療患者には許容されない。
【０２４７】
スルファメトキサゾール/トリメトプリムの投与
本試験に参加する禁忌を有さない全患者は、尿路感染およびニューモシスティスカリニ感染を防ぐために、スルファメトキサゾール/トリメトプリム予防薬を受けるべきである。投薬および投与は、該添付文書に従って、腎機能の値により決定される。禁忌を有するまたはサルファ剤もしくはトリメトプリムに不寛容である患者は、調査者の判断により、吸入ペンタミジンでの予防的治療を受けうる。十分な処方情報のために、添付文書を参照する。
【０２４８】
バルガンシクロビル / ガンシクロビル、アシクロビル / バラシクロビルの投与
バルガンシクロビル、ガンシクロビル、アシクロビル、およびバラシクロビルに対する禁忌を有さない全てのレシピエントは、CMVおよび単純ヘルペスの感染を防ぐために、これらの薬剤で予防的に治療を受けるべきである。予防的治療の投与および期間のガイドラインを以下に示す:
【０２４９】
移植後の最初の10日間またはT-細胞-枯渇療法の間の予防:
全移植患者は、プロトコルにつき、術後10日間バルガンシクロビルまたはガンシクロビルを受ける。急性拒絶反応のための導入療法または治療ためのT-細胞-枯渇療法で治療されている場合、該患者は、T-細胞-枯渇療法の期間、バルガンシクロビルまたはガンシクロビルを受ける。患者が10日目前に退院する場合、経口バルガンシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、またはアシクロビルのいずれかを、CMV免疫状態に基づいて下記のように始める。
【０２５０】
予防のためのバルガンシクロビル: 
クレアチンクリアランス≧60mL/分、投与量900mg毎日; クレアチンクリアランス40-59mL/分、投与量450mg毎日; クレアチンクリアランス<40mL/分、投与量450mg一日おきに。
【０２５１】
予防のためのガンシクロビル: 
該患者が経口薬を寛容できない、またはバルガンシクロビルが使用不可能である場合、ガンシクロビル懸濁液またはカプセルが代替となりうる。クレアチンクリアランス≧70mL/分、投与量1g、3回、毎日; クレアチンクリアランス50-69mL/分、投与量500mg、3回、毎日; クレアチンクリアランス25-49mL/分、投与量500mg、2回、毎日; クレアチンクリアランス10-24mL/分、投与量500mg、毎日; クレアチンクリアランス<10mL/分、投与量500mg、血液透析後、3回/週。静脈内ガンシクロビルが必要な場合、投与のために添付文書を参照する。
【０２５２】
移植後10日目から少なくとも3箇月までの予防: 
CMV抗体血清陽性ドナーからCMV抗体血清陰性レシピエント: 上記のプロトコルのバルガンシクロビルまたはガンシクロビルを≧3箇月、継続する。
【０２５３】
CMV抗体血清陽性または血清陰性ドナーからCMV抗体血清陽性レシピエント: 経口アシクロビル≧移植後3箇月: 血清中クレアチニン≧50mL/分、投与量800mg、経口、4回、毎日; 血清中クレアチニン25-49mL/分、投与量800mg、経口、3回、毎日; 血清中クレアチニン11-24mL/分、投与量800mg、経口、2回、毎日; 血清中クレアチニン<10mL/分、投与量800mg、経口、毎日; 血液透析、投与量800mg、毎日、血液透析後。
【０２５４】
バラシクロビルは、患者の便宜のため、退院時にアシクロビルに変えうる。血清中クレアチニン≧50mL/分、投与量500mg、経口、2回、毎日; 血清中クレアチニン25-49mL/分、投与量500mg、経口、毎日; 血清中クレアチニン11-24mL/分、投与量500mg、経口、毎日; 血清中クレアチニン<10mL/分、投与量250mg、経口、毎日; 血液透析、投与量250mg毎日、血液透析後
【０２５５】
CMV抗体血清陰性ドナーからCMV抗体血清陰性レシピエント: ヘルペスの予防のみに必要とされる経口アシクロビルプロトコル: 移植後≧3箇月継続する。アシクロビル400mg、経口、2回、毎日、または患者の便宜のため、退院時にバラシクロビルはアシクロビルに変えうる。十分な処方情報のため、添付文書を参照する。
注入-のみ巡回方法
a）L104EA29YIg治療に無作為化された患者に対して: L104EA29YIg投与前に妊娠テスト陰性であることが必要である。投与量は、患者の最近の試験巡回時の体重に基づく。患者は、バイタルサインを監視されるべきであり(注入前後)、およびAEを評価されるべきである。PKサンプルを、いくつかの巡回で要求しうる。
b）CsA治療に無作為化された患者に対して: 患者は、AEのみの評価のために連絡される。本巡回は、電話連絡でもよく、および特定の巡回の所定の巡回時間枠内に行うべきである。
巡回時間枠
a）L104EA29YIg治療に無作為化された患者に対して: 
1および5日目投与は、約96時間(±6時間)を空けて、投与すべきである。注入-のみ巡回のスケジューリングを促進するために、以下の時間枠をその後の投与に許容する: 巡回2週、巡回時間枠目標期日±2日; 巡回4週-6箇月、巡回時間枠目標期日±3日、巡回7箇月-36箇月、巡回時間枠目標期日±5日; 巡回フォローアップ8週間、巡回時間枠目標期日±5日。
b）CsA治療に無作為化された患者に対して:
5日目の後、患者は、 2、4、8、および12週の臨床巡回; その後3-箇月間隔巡回に参加することのみ必要である。非-3-箇月間隔巡回(すなわち、6、10、16、20、28、32週間目など)に、AE情報を収集するため、電話連絡を行う。L104EA29YIgに無作為化された患者対して上述したのと同一の巡回時間枠内に、臨床および連絡巡回を行う。3-および12-箇月目のGFR評価の目標期日は、12週±14日および52週±14日である。特定の状況下で、および該医学的監視の事前の許可を有する場合、3箇月および12箇月での測定GFR評価は、それぞれ6箇月および15箇月まで行いうる。測定GFR評価の延長を正当化する該理由には、同時発生的な急性拒絶反応エピソードの存在、または技術的な理由による評価の繰り返の必要が含まれる。
【０２５６】
12-箇月の同種移植片の生検の目標期日は、52週±14日である。同様に、特定の状況下で、および該医学的監視の事前の許可を有する場合、該同種移植片の生検は、15箇月まで取得しうる。同種移植片生検の延長を正当化する該理由には、抗凝固の一時的な必要性が含まれる。
【実施例５】
【０２５７】
当該技術分野の当業者は、異なる調査集団、ドナー判断基準および/または目的を含む試験をデザインするために、上記実施例4の投与スケジュールを用いうる。例えば、本移植試験は、予想冷虚血時間<24時間の生体ドナーまたは死亡ドナーからの腎移植を受ける患者を評価する。免疫学的リスクの様々なレベルの患者が適格である。しかし、該試験は、免疫学的リスクの最も大きい患者を排除する。患者は、実施例4において上述したように、MI、LIまたはCsA治療群に無作為化される。
【０２５８】
第1目的
CsAと比較した、12箇月までの患者生存および移植片残存の複合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12箇月での測定GFR<60mL/分/1.73m2、または3箇月から12箇月までの測定GFR≧10mL/分/1.73m2の低下の複合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12箇月までの急性拒絶反応の発生率への、L104EA29YIgの影響の評価。
【０２５９】
第2目的
CsAと比較した、12箇月での測定GFRへの、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12箇月での生検-証明されたCANへの、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12箇月での測定GFRが<60mL/分/1.73m2、または3箇月から12箇月までの測定GFRの≧10mL/分/1.73m2の低下の第1複合エンドポイントの個々の要素への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12、24、および36箇月までの死亡、移植片喪失、および急性拒絶反応の3重の複合エンドポイントへの、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、24箇月での測定GFRが<60mL/分/1.73m2 である患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、3および24箇月での測定GFR、ならびにベースライン(3箇月)から12箇月までおよび24箇月までの変化への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12および24箇月での測定GFRが<30mL/分/1.73m2である患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、6、12、24、および36箇月での算出GFR、および6箇月から12、24、および36箇月までの変化への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12、24、および36箇月までのPTDMへの、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12、24、および36箇月での高血圧の程度（SBPおよびDBP、高血圧および制御高血圧の発生率と有病率、および治療レジメンの強さを含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12、24、および36箇月での脂質代謝異常の程度（血清総コレステロール、非HDLコレステロール、低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール、およびHDLコレステロール、およびTG、脂質代謝異常および制御脂質代謝異常発生率と有病率、および治療レジメンの強さを含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、24および36箇月までの患者の生存率および移植片残存率への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、24および36箇月での算出GFRが<60mL/分/1.73m2 である患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、6、12、24、および36箇月までの急性拒絶反応の程度（急性拒絶反応の発生率および重症度、腎機能の低下および予測される臓器移植後臓器機能障害(DGF)のためのポリクローナル抗リンパ球製剤の使用、急性拒絶反応の治療のためのリンパ球除去療法の最初の使用、ステロイド-耐性急性拒絶反応の発生率、急性拒絶反応後の完全回復(SCrのベースラインへの回帰)の発生率、無症状性の拒絶反応の発生率、組織学的所見に関わらず、全ての治療された急性拒絶反応エピソードの発生率、および急性拒絶反応の発症時期を含む）への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、QoLへの、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、L104EA29YIgの全体的な安全性の評価。CsAと比較した、3箇月から12、24、および36箇月までの算出GFRの傾きおよび切片への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12箇月での算出GFRが<60mL/分/1.73m2である患者、または3箇月から12箇月までの算出GFRの減少が少なくとも10mL/分/1.73m2である患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、DGFの発生率への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12および24箇月での測定GFRにより評価されたステージ1からステージ5までの慢性腎疾患を有する患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、36箇月での算出GFRにより評価されたステージ1からステージ5までの慢性腎疾患を有する患者の割合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12、24、および36箇月までの複合循環器系疾患エンドポイント(判定された循環器系死亡、心筋梗塞、虚血性脳卒中、および血行再建術[外科的または経皮的])への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12、24、および36箇月までの複合心腎臓疾患エンドポイント(死亡、移植片喪失、非致死的心筋梗塞、および発作)の複合への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、12、24、および36箇月でのフラミンガムリスクスコアへの、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、治験薬の中止の発生率への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、抗-ドナーヒト白血球抗原(HLA)抗体への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、アンジオテンシンII型1(AT1)-受容体抗体への、L104EA29YIgの影響の評価。CsAと比較した、生検標本におけるC4d陽性への、L104EA29YIgの影響の評価。
【０２６０】
試験デザイン
該試験期間は、3-年間であり、および安全性評価のための続く8-週間のフォローアップ期間を含む。これは、無作為化、部分的盲検、アクティブ-コントロール、平行群の試験である。全患者は、予測されるCITが<24時間である生体ドナーまたは死亡ドナーからの腎移植を受ける。
【０２６１】
約660人の患者を、L104EA29YIg(MIレジメン)、L104EA29YIg(LIレジメン)、またはCsAのいずれかの治療に1:1:1の比で無作為化する。全患者はまた、バシリキシマブによる導入およびMMFおよび副腎皮質ステロイドのバックグラウンド維持免疫抑制療法を受ける。MIレジメンに無作為化された患者は、1および5日目、その後2週間毎に3箇月まで(2、4、6、8、10、および12週)、およびその後4週間毎に6箇月まで(16、20、および24週)、静脈内L104EA29YIg(10mg/kg)を受ける。6箇月の後、MI治療群の患者は、維持量のL104EA29YIg 5mg/kgの投与を4週間毎に36箇月の試験完了まで受ける。LIレジメンに無作為化された患者は、1および5日目、およびその後2週間毎に1箇月まで(2および4週)、および4週間毎に3箇月まで(8および12週)、静脈内L104EA29YIg(10mg/kg)を受ける。3箇月の後、LI治療群の患者は、維持量のL104EA29YIg 5mg/kgの投与を4週間毎に36箇月の試験完了まで受ける。LIおよびMI群間の盲検は、6および10週間にLI治療群に偽薬注入を用いて維持する。CsAに無作為化された患者は、現状の医療と一致する特定のトラフ血清濃度範囲を達成するために設計された、1日2回の投与を受ける。L104EA29YIgの安全性および有効性を1、2、および3年に評価する。独立のDSMBが、該試験のデータを継続的に検証し、および必要ならば、試験実施の変更を薦める。
【０２６２】
調査集団
該調査集団には、予測されるCITが<24時間である生体ドナーまたは死亡ドナーからの腎臓同種移植レシピエントが含まれる。概して、免疫学的判断基準は、患者の選択に大きくは関与しない。免疫学的リスクのレベルが異なる患者が、適格である。しかし、該研究は、免疫学的リスクが最大である患者(クロスマッチ陽性、現状のパネル反応性抗体[PRA]が≧50％、またはこれまでにで移植された、現状のPRA≧30％の者)を排除する。これらの患者は、それらの抗体価を減らすため、血漿交換のような治療が必要であり得るが、これは、このプロトコルの範囲を超える。患者は、世界的に約100のサイトで登録される。
【０２６３】
試験対象患者基準
対象集団:
1）該患者は、予測されるCITが<24時間である生体ドナーまたは死亡ドナーの腎移植のレシピエント
2）共に18歳以上の男性および女性、
3）WOCBPは、全試験期間および最後の注入後8週間までの間、妊娠のリスクを最小限にする方法で妊娠をさけるために、適当な避妊方法を使用していなければならない。WOCBPには、初経を経験し、および成功した不妊化手術(子宮摘出、両側卵管結紮、または両側卵巣摘出)をしていない、または閉経後(無月経が≧連続12月;またはホルモン補充療法[HRT]を受ける、文書化された血清卵胞刺激ホルモン値[FSH]が＞35mIU/mLである女性と定義される)でない女性が含まれる。妊娠を防ぐための経口、インプラント、または注射の避妊ホルモン、または子宮内避妊具またはバリア法(ペッサリー、コンドーム、殺精子剤)のような機械的製品を使用している、または禁欲している、またはパートナーが生殖不能である(例、精管切除)女性でさえ、妊娠の可能性があると見なすべきである。WOCBPは、試験薬剤の開始前72時間内に、血清妊娠テストが陰性でなければならない(最小感度25IU/Lまたはヒト絨毛性ゴナドトロピン[HCG]の同等なユニット)
【０２６４】
除外基準
1）全試験期間および最後の注入後8週間までの間、許容される避妊方法の使用を認めない、または使用できないWOCBP。
2）妊娠または授乳中の女性。
3）登録時または治験薬投与前に妊娠テスト陽性の女性。
4）遺伝学的に同一のドナーレシピエントのペア(すなわち、一卵性双生児)。
5）ドナー年齢が<10歳。
6）以下に定義される拡大基準ドナー臓器をうける患者:
a)ドナー年齢≧60歳、または
b)ドナー年齢が50-59歳で、および以下の1つに該当する:
(i)脳血管障害(CVA)＋高血圧＋SCr>1.5mg/dLまたは
(ii)CVA＋高血圧または
(iii)CVA＋SCr>1.5mg/dLまたは
(iv)高血圧＋SCrが>1.5mg/dL、または
c)予測されるCITが≧24時間、または
d)心臓死のドナー(心停止ドナー)。
7）以下の基礎にある腎疾患を有する患者:
a)原発性巣状分節性糸球体硬化症
b)I型またはII型膜性増殖性糸球体腎炎 
c)溶血性尿毒症症候群(HUS)/血栓性血小板減少性紫斑病症候群
患者が、病因不明のESRDを有する、および/または組織学的に確認された診断のない場合、該患者は、調査者により見なされた原発性巣状分節性糸球体硬化症、I型またはII型膜性増殖性糸球体腎炎、またはHUSの臨床的診断に一致する臨床的徴候または症状がない限り、該試験に登録されうる。
8）現状のPRA≧50％での最初の(初めての)移植を受ける患者、またはPRAε30％での再移植を受ける患者。
9）以前に急性拒絶反応のために移植片喪失をした患者。
10）T-細胞リンパ球傷害性クロスマッチ陽性の患者。
11）先に非-腎臓実質臓器移植をした患者(腎臓の再移植を行う患者は、他の試験判断基準に適合する間は適格である)、または多臓器移植(例、腎臓-膵臓)を行う患者、または調査者により、今後3-年内に2回目の実質臓器または細胞移植(例、膵臓または島移植)を受けそうであると見なされた患者。
12）同時に実質臓器(心臓、肝臓、膵臓)または細胞(島、骨髄、幹細胞)移植を受ける患者。
13）ペアの腎臓(二重のまたはひとまとめの腎移植)を受ける患者。
14）C型肝炎抗体-陽性またはC型肝炎ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)-陽性である患者。
15）B型肝炎表面抗原-陽性またはB型肝炎PCR-陽性である患者。
16）ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染である患者。
17）前3-年内に活動性結核(TB)の治療が必要であった患者、またはこれまでに3重(または以上)のTBの併用療法が必要であった患者。精製タンパク質誘導体(PPD)陽性である患者は、それらが潜在性TBの治療を完了し、および登録時の胸部x-線で陰性でない限り、該試験の資格はない。最後12箇月内のPPD試験の実施は、結果の文書がある限り許容される。最後12箇月内にPPDのない患者で、これまでの結果が陰性であった者で、それらがまた、登録時に胸部x-線が陰性であり、TBを示す症状はなく、TB接触は知られておらず、TBの流行地域に現在滞在のところ滞在しておらず、最近に赴いておらず、または、すでに移住してきた場合は、登録されうる。PPD反応が≦10mm硬結、またはヒーフスコア(Heaf score)が、非-カルメット・ゲラン桿菌(非-BCG)免疫化患者において>1、もしくはBCG免疫化患者において>2は、テスト陽性と見なすべきである。より保守的な判断基準は、該発表されたガイドラインおよび/または医学界に指示される局所的基準に従って、適用されうる。
18）活動性感染または通常移植を除外する他の禁忌を有する患者。
19）病状または他の基礎疾患により、寿命が大幅に制限された患者。
20）過去5-年内に癌の経歴(局所的切除により治癒した非-メラノーマ皮膚細胞癌以外)のある患者。
21）過去5-年内に物質乱用(薬物またはアルコール)の経歴、または適切な追跡試験に適合しない精神疾患を有する患者。
22）活動性消化性潰瘍、慢性下痢、または消化管吸収不良を有する患者。
【０２６５】
L104EA29YIgMIおよびLIならびにCsAレジメンの投与および巡回時間枠は、必要に応じてリストを含み、上記および実施例4の記載のとおりである。
【０２６６】
本発明の技術分野における当業者に明らかなように、本発明は、上記に具体的に開示されたそれら以外に本発明の精神と基本的な特徴から逸脱することなく具現化される。従って、上記の本発明の特定の態様は、説明であり限定するものでないと考えられる。本発明の範囲は、前述の説明に含まれる該実施例に制限されるよりむしろ、添付の特許請求の範囲に記載のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】図1は、L104EA29YIg、L104EIg、および野生型CTLA4IgのCD86Igに対する結合平衡分析を示す。
【０２６８】
【図２】図2A＆2Bは、下記の実施例2に記載のL104EA29YIg、L104EIg、およびCTLA4IgのヒトCD80-またはCD86-トランスフェクトCHO細胞への結合を示すFACSアッセイのデータを示す。
【０２６９】
【図３】図3A＆3Bは、下記の実施例2に記載のCD80-陽性およびCD86-陽性CHO細胞の増殖の阻害を示す。
【０２７０】
【図４】図4A＆4Bは、下記の実施例2に記載のように、L104EA29YIgはCTLA4Igと比較して、一次および二次アロ刺激されたT細胞の増殖の阻害において、より効果的であることを示す。
【０２７１】
【図５】図5A-Cは、下記の実施例2のように、L104EA29YIgはCTLA4Igと比較して、アロ刺激されたヒトT細胞のIL-2(FIG. 5A)、IL-4(FIG. 5B)、およびγ-インターフェロン(FIG. 5C)サイトカイン産生の阻害において、より効果的であることを示す。
【０２７２】
【図６】図6は、下記の実施例2の記載のように、L104EA29YIgはCTLA4Igと比較して、フィトヘマグルチニン-(PHA)刺激サルT細胞の増殖の阻害において、より効果的であることを示す。
【０２７３】
【図７】図7(配列番号:3および4)は、下記の実施例1に記載のように、シグナルペプチド; ＋1位のメチオニンで始まり、＋124位のアスパラギン酸で終わる、または−1位のアラニンで始まり、＋124位のアスパラギン酸で終わる、変異したCTLA4の細胞外ドメイン; およびIg領域を含む、CTLA4変異分子(“L104EA29YIg”)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。配列番号:3および4はそれぞれ、シグナルペプチド; ＋27位のメチオニンで始まり、＋150位のアスパラギン酸で終わる、または＋26位のアラニンで始まり、＋150位のアスパラギン酸で終わる変異したCTLA4の細胞外ドメイン; およびIg領域を含む、CTLA4変異分子(“L104EA29YIg”)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【０２７４】
【図８】図8(配列番号:5および6)は、下記の実施例1に記載のように、シグナルペプチド; ＋1位のメチオニンで始まり、＋124位のアスパラギン酸で終わる、または−1位のアラニンで始まり、＋124位のアスパラギン酸で終わる変異したCTLA4の細胞外ドメイン; およびIg領域を含む、CTLA4変異分子(“L104EIg”)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。配列番号:5および6はそれぞれ、シグナルペプチド; ＋27位のメチオニンで始まり、＋150位のアスパラギン酸で終わる、または＋26位のアラニンで始まり、＋150位のアスパラギン酸で終わる変異したCTLA4の細胞外ドメイン; およびIg領域を含む、CTLA4変異分子(“L104EIg”)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【０２７５】
【図９】図9(配列番号:7および8)は、シグナルペプチド; ＋1位のメチオニンで始まり＋124位のアスパラギン酸まで、または−1位のアラニンで始まり＋124位のアスパラギン酸までの該CTLA4の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列; およびIg領域を有する、CTLA4Igのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。配列番号:7および8はそれぞれ、シグナルペプチド; ＋27位のメチオニンで始まり、＋150位のアスパラギン酸で終わる、または＋26位のアラニンで始まり、＋150位のアスパラギン酸で終わる該CTLA4の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列; およびIg領域を含む、CTLA4Igのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【０２７６】
【図１０】図10A-Cは、CTLA4Ig(レーン1)、L104EIg(レーン2)、およびL104EA29YIg(レーン3A)のSDSゲル(FIG. 10A)、; およびCTLA4Ig(FIG. 10B)およびL104EA29YIg(FIG. 10C)のサイズ排除クロマトグラフである。
【０２７７】
【図１１】図11Aおよび11Bは、NMR分光法により決定された溶液構造から作成された該CTLA4細胞外IgV-様折り畳みのリボンダイヤグラムを示す。FIG. 11Bは、結合力増強変異、L104およびA29の位置および側鎖の方向を示すS25-R33領域およびMYPPPY領域の拡大図を示す。
【０２７８】
【図１２】図12は、L104EA29YIg挿入を有する、ベクター、piLN-L104EA29Yの模式図を示す。
【０２７９】
【図１３】図13は、CTLA4受容体(配列番号:9および10)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月10日(2007.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008535841.tif 000041
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