(57)【要約】  核酸増幅をブロックする、あるいは低下させることが可能な２つ以上の内部インターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む増幅ブロッカー。核酸増幅をブロックする、あるいは低下させるための増幅ブロッカーの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅をブロックする、又は低下させることが可能な２個以上の内部インターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む増幅ブロッカー。
【請求項２】
前記ＩＮＡが、２〜６個の内部に位置するＩＰＮを有する、長さが約１５〜５０のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項１に記載のブロッカー。
【請求項３】
前記ＩＮＡが、２〜６個の内部に位置するＩＰＮを有する、長さが約１８〜３５のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項２に記載のブロッカー。
【請求項４】
前記ＩＰＮが、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端から２番目以上の塩基に位置する請求項１〜３のいずれか一項に記載のブロッカー。
【請求項５】
前記ＩＮＡが、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端のいずれにもＩＰＮを含有しない請求項１〜４のいずれか一項に記載のブロッカー。
【請求項６】
前記ＩＰＮが、１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載のブロッカー。
【請求項７】
前記ＩＰＮが、（Ｓ）−１−（４，４’―ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトまたは（Ｒ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される請求項６に記載のブロッカー。
【請求項８】
前記ＩＰＮが、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトである請求項７に記載のブロッカー。
【請求項９】
核酸増幅をブロックする、あるいは低下させるための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のブロッカーの使用。
【請求項１０】
核酸分子の標的領域のメチル化状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上のメチル化されていない標的領域に相補的である第１のブロッカーを増幅反応に提供することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第２のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカーを増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖に相補的第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域がメチル化されている場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域がメチル化されていない場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項１１】
核酸分子の標的領域のメチル化状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上のメチル化されていない標的領域に相補的である第１のブロッカーを増幅反応に提供することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第２のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカーを増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域がメチル化されていない場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域がメチル化されている場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第３および第４のブロッカーであって、前記第１および第２のブロッカー領域の内部の領域に相補的である第３および第４のブロッカーを増幅反応に提供することと、
前記第３および第４のブロッカー領域の外部かつ前記第１および第２のプライマー領域の内部の領域に相補的な第３および第４のプライマーを提供することと、をさらに含む請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸分子上の１つまたは複数の領域を指向する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の１つまたは複数のさらなるブロッカーを提供することをさらに含む請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子上の領域が、前記改変された核酸鋳型上の１つまたは複数の領域に相当する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１と第２のプライマー領域の間の領域に相補的な第１鎖または第２鎖を指向する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の３つ以上のブロッカーを提供することをさらに含む請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子の標的領域の転換状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１のブロッカーであって、核酸分子の第１鎖上の転換されていない標的領域に相補的である第１のブロッカーを増幅反応に提供することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第２のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカーを増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が転換されている場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が転換されていない場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項１７】
核酸分子の標的領域の転換状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１のブロッカーであって、核酸分子の第１鎖上の転換されていない標的領域に相補的である第１のブロッカーを増幅反応に提供することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第２のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカーを増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が転換されていない場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が転換されていた場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項１８】
前記標的領域が、３’側にグアニン（Ｇ）が隣接するシトシン（Ｃ）である請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変のための薬剤が、重亜硫酸塩、酢酸塩、またはクエン酸塩から選択される請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤が、重亜硫酸ナトリウムである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸分子がＤＮＡである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増幅アッセイがＰＣＲである請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
核酸分子の標的領域の状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の、所望でない状態である標的領域に相補的である第１のブロッカーを増幅反応に提供することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第２のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカーを増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が、所望の状態である場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が、所望でない状態である場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項２５】
核酸分子の標的領域の状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第１のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の、所望の状態である標的領域に相補的である第１のブロッカーを増幅反応に提供することと、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の第２のブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカーを増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
ポリメラーゼ増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が所望でない状態である場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が所望の状態である場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項２６】
前記状態が、メチル化、突然変異、または一塩基多型である請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
核酸増幅をブロックする、あるいは低下させるための方法であって、
２つ以上の内部のＩＰＮを含有するＩＮＡ分子を含むブロッカーであって、対象核酸配列に相補的であるブロッカーを核酸増幅反応に提供することと、
前記ブロッカーが、対象核酸配列に結合し、対象配列で、又はその近傍で、増幅をブロックする、あるいは低下させるように増幅反応を実施することと、を含む方法。
【請求項２８】
核酸増幅をブロックする、あるいは低下させる方法であって、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のブロッカーであって、対象核酸配列に相補的であるブロッカーを核酸増幅反応に提供することと、
前記ブロッカーが、対象核酸配列に結合し、対象配列で、又はその近傍で、増幅をブロックする、あるいは低下させるように増幅反応を実施することと
を含む方法。
【請求項２９】
プライマーの第１の対の相補的な領域の間に位置する核酸領域に相補的なプライマーの第２の対を提供することをさらに含む請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸分子がＤＮＡである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ブロッカーを提供する前に、潜在的メチル化部位を含有する改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸を処理する請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変のための薬剤が、重亜硫酸塩、酢酸塩、またはクエン酸塩から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬剤が、重亜硫酸ナトリウムである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１つまたは複数のブロッカーが、前記核酸分子上の１つまたは複数の潜在的メチル化部位を指向する請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
１つまたは複数のブロッカーが、核酸分子上の潜在的メチル化部位と結合しない請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、核酸検出アッセイ、特に、ＤＮＡ増幅のブロッカーを使用する改良されたアッセイに関する。本発明はまた、ＤＮＡ増幅の新規のブロッカー、および核酸中の５−メチルシトシン塩基の特異的かつ高感度の検出に適した方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
特定の核酸分子の検出のために、現在、いくつかの手順が利用可能である。これらの手順は一般的に、標的核酸と、長さが短いオリゴヌクレオチド（２０塩基以下）〜数キロベース（ｋｂ）の配列までの範囲であり得る核酸プローブとの間の、配列に依存するハイブリダイゼーションに依存する。
【０００３】
核酸配列の集団からの特異的な配列の増幅のために最も広く使用されている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（ディーフェンバッハ  Ｃ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  Ｃ）およびデヴェクスラー  Ｇ（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ  Ｇ）編、「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．」コールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ニューヨーク州）。この増幅方法では、オリゴヌクレオチド、すなわち、増幅される領域のいずれか一端の、一般に長さが１５〜３０のヌクレオチドの相補鎖が、変性させた一本鎖ＤＮＡ上でのＤＮＡ合成を開始するために使用される。変性、プライマーハイブリダイゼーション、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ鎖合成の連続するサイクルによって、プライマー間の配列の指数関数的な増幅が可能になる。ＲＮＡ配列は、逆転写酵素を使用して最初にＲＮＡをＤＮＡにコピーし、ｃＤＮＡコピーを生成することによって増幅することができる。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、ブロッティング、標識されたプローブを用いるハイブリダイゼーション、その後の（例えば酵素関連のアッセイによる）同定を可能にする標識されたプライマーの使用、標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションするとシグナルを生じる蛍光標識されたプライマー（例えばＢｅａｃｏｎおよびＴａｑＭａｎシステム）の使用を含めて、様々な手段によって検出することができる。
【０００４】
ＰＣＲと同様に、特定のヌクレオチド配列の検出および増幅のための様々な他の技術も開発されている。一例は、リガーゼ連鎖反応である（バラニー  Ｆ（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ）、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｌｉｇａｓｅ．」、「プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ」８８：１８９〜１９３（１９９１年））。
【０００５】
直接的な検出については、標的核酸は、最も一般的には、ゲル電気泳動によってサイズに基づいて分離され、固体支持体に移され、その後、標的配列と相補的なプローブとのハイブリダイゼーションが行われる（サザンおよびノーザンブロッティング）。このプローブは、天然の核酸または類似体（ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）など）であり得る。プローブは、直接的に（例えば３２Ｐを用いて）標識してもよいし、間接的な検出手順を使用してもよい。間接的な手順は通常、「タグ」（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）のプローブへの組み込みに依存するものであり、プローブは、酵素関連の基質転換または化学ルミネセンスなどの手段によって、その後検出される。
【０００６】
核酸の直接的な検出のための広く使用される別の方法は、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕捉プローブを、固体支持体に固定し、溶液中の標的核酸を、固定したプローブとハイブリダイゼーションさせる。結合しなかった標的核酸を洗い落とし、結合された核酸を、標的配列にハイブリダイゼーションする第２のプローブを使用して検出する。検出は、上で概説した通りの直接的または間接的な方法を使用することができる。「分岐ＤＮＡ」シグナル検出システムは、サンドイッチハイブリダイゼーション原理を使用する例である（ウルデア  ＭＳ（Ｕｒｄｅａ  ＭＳ）ら、「Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ．」、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．」１９９１年；（２４）：１９７〜２００）。
【０００７】
核酸配列の直接的な検出のために核酸ハイブリダイゼーションを使用する、急速に成長している分野は、ＤＮＡアレイの分野である（ヤングＲＡ（Ｙｏｕｎｇ  ＲＡ）、「Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ．」、「Ｃｅｌｌ」１０２：９〜１５（２０００年）；ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、「Ａ  Ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ．」、「Ａ  ｎｅｗ  ｂｒｅｅｄ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｅｃｈ  ｄｅｔｅｃｔｉｖｅｓ．」、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８９：８５０〜８５４（２０００年））。このプロセスでは、個々の核酸種（オリゴヌクレオチドから、ｃＤＮＡクローンなどのより長い配列までの範囲であり得る）が、固体支持体に格子パターンで固定される。その後、標識された核酸集団が、アレイとハイブリダイゼーションされ、アレイにおける各スポットとのハイブリダイゼーションのレベルが定量化される。最も一般的には、ハイブリダイゼーションのために、放射能または蛍光で標識された核酸（例えばｃＤＮＡ）を使用するが、他の検出システムも使用することができる。
【０００８】
現在では、例えば、前立腺癌中のＧＳＴＰ１遺伝子プロモーターにおいて発見されたような、ＤＮＡのメチル化変化を検出する最適な方法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ）修飾の後の、当該配列のＰＣＲ増幅に依存する。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡにおいては、シトシンがウラシルに転換される（したがって、ＰＣＲでは、チミンとして増幅される）のに対して、メチル化されたシトシンは非反応性であり、シトシンのままである（フロマー  Ｍ（Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｍ）、マクドナルド  ＬＥ（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＬＥ）、ミラー  ＤＳ（Ｍｉｌｌａｒ  ＤＳ）、コリス  ＣＭ（Ｃｏｌｌｉｓ  ＣＭ）、ワット  Ｆ（Ｗａｔｔ  Ｆ）、グリッグ  ＧＷ（Ｇｒｉｇｇ  ＧＷ）、モロイ  ＰＬ（Ｍｏｌｌｏｙ  ＰＬ）、およびポール  ＣＬ（Ｐａｕｌ  ＣＬ）、「Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｗｈｉｃｈ  ｙｉｅｌｄｓ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ５−ｍｅｔｈｙｌ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄｓ．」、「ＰＮＡＳ」８９：１８２７〜１８３１（１９９２年）；クラーク  ＳＪ（Ｃｌａｒｋ  ＳＪ）、ハリソン  Ｊ（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｊ）、ポール  ＣＬ（Ｐａｕｌ  ＣＬ）、およびフロマー  Ｍ（Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｍ）、「Ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅｓ．」「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」２２：２９９０〜２９９７（１９９４年））。このように、亜硫酸水素塩処理の後では、５−メチルシトシン塩基を含有するＤＮＡは、相当するメチル化されていないＤＮＡとは配列が異なる。プライマーは、そのメチル化状態を決定するために対象ゲノムの領域を非選択的に増幅するために選択してもよいか、あるいは特定のシトシンがメチル化された配列を選択的に増幅するために設計してもよい（ハーマン  ＪＧ（Ｈｅｒｍａｎ  ＪＧ）、グラフ  ＪＲ（Ｇｒａｆｆ  ＪＲ）、ミオハネン  Ｓ（Ｍｙｏｈａｎｅｎ  Ｓ）、ネルキン  ＢＤ（Ｎｅｌｋｉｎ  ＢＤ）、およびベイリン  ＳＢ（Ｂａｙｌｉｎ  ＳＢ）、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ．」「ＰＮＡＳ」９３：９８２１〜９８２６（１９９６年））。
【０００９】
シトシンメチル化の検出のための代替法は、制限酵素（その切断は、部位特異的なＤＮＡメチル化によってブロックされる、あるいはブロックされない）を用いる消化、それに続くサザンブロッティング、および対象領域のハイブリダイゼーション探索を含む。この手法は、有意な割合（一般に＞１０％）のＤＮＡが、該部位でメチル化され、かつ、検出可能な十分なＤＮＡ（約１〜５μｇ）が存在するという状況に限られる。制限酵素（その切断が、部位特異的なＤＮＡメチル化によってブロックされる）での消化の後に、制限酵素部位（１つまたは複数）と隣接するプライマーを使用するＰＣＲ増幅が続く。この方法は、より少量のＤＮＡを利用することができるが、ＤＮＡメチル化以外の理由によって完全な酵素消化が行われなくなることによって、偽陽性のシグナルがもたらされる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の発明者は、今回、メチル化特異的なＰＣＲ（ＭＳＰ）反応に伴う問題を大いに低下させることが可能な、メチル化された核酸の高感度かつ特異的な検出に適したインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を利用する方法を開発した。ＩＮＡの予想外の特性が、本発明を実施するために利用される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の開示
第１の態様では、本発明は、核酸の増幅をブロックする、あるいは低下させることが可能な２つ以上の内部インターカレート型擬似ヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｐｓｅｕｄｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＩＮＡ）を含む増幅ブロッカーを提供する。
【００１２】
ＩＮＡは、２〜１０個、好ましくは２〜６個の内部に位置するＩＰＮを有する、約１５〜５０、より好ましくは約１８〜３５の長さのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であることが好ましい。しかし、１０個を超えるＩＰＮを有するようなさらに長いＩＮＡも使用できることが理解されよう。オリゴヌクレオチドの３’または５’末端から２番目以上の塩基に位置するＩＰＮが、ＤＮＡポリメラーゼに対する優れたブロッキング活性を提供することが、本発明の発明者によって判明した。伸張を中断するためにオリゴヌクレオチドに加えられる３’‐ジデオキシ塩基の追加などの他の阻害戦略とは異なり、本発明によるブロッカーは、機能させるための化学基を３’または５’に位置させることを必要としない。
【００１３】
好ましくは、ＩＮＡは、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端にはＩＰＮを含有しない。
【００１４】
ＩＰＮは、好ましくは１−（４，４’―ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される。好ましくは、インターカレート型擬似ヌクレオチドは、（Ｓ）−１−（４，４’―ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトまたは（Ｒ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される。より好ましくは、ＩＰＮは、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトである。
【００１５】
本発明の例に使用されるＩＰＮの例は、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトであった。しかし、他の化学的な形のＩＰＮも使用できることが理解されよう。
【００１６】
本発明によるブロッカーは、ＰＣＲおよび等温増幅方法などのいずれの形の増幅に使用するにも適している。ＰＣＲは、現在、ヘルスサイエンス・インダストリーにおいて使用される好ましい方法であるので、本発明の発明者は、ＰＣＲを使用する本発明の例を提供する。しかし、本発明がＰＣＲまたは他の任意の形の増幅に制限されないことが理解されよう。
【００１７】
第２の態様では、本発明は、核酸増幅をブロックする、あるいは低下させるための、本発明の第１の態様によるブロッカーの使用を提供する。
【００１８】
第３の態様では、本発明は、核酸分子の標的領域のメチル化状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理すること、
本発明の第１の態様による第１のブロッカー（ここで、第１のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖上のメチル化されていない標的領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
本発明の第１の態様による第２のブロッカー（ここで、第２のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供すること、および
増幅反応を実施すること（ここで、標的領域がメチル化されている場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域がメチル化されていない場合、増幅産物が存在しないこととなる）
含む方法を提供する。
【００１９】
第４の態様では、本発明は、核酸分子の標的領域のメチル化状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理すること、
本発明の第１の態様による第１のブロッカー（ここで、第１のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖上のメチル化された標的領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
本発明の第１の態様による第２のブロッカー（ここで、第２のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供すること、および
ポリメラーゼ増幅反応を実施すること（ここで、標的領域がメチル化されていない場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域がメチル化されている場合、増幅産物が存在しないこととなる）含む方法を提供する。
【００２０】
好ましい形態では、この方法は、
本発明の第１の態様による第３および第４のブロッカー（ここで、第３および第４のブロッカーは、第１および第２のブロッカー領域の内部の領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、および
第３および第４のブロッカー領域の外部かつ第１および第２のプライマー領域の内部の領域に相補的な第３および第４のプライマーを提供すること、をさらに含む。
【００２１】
別の好ましい形態では、この方法は、
核酸分子上の１つまたは複数の領域を指向する、本発明の第１の態様による１つまたは複数のさらなるブロッカーを提供することをさらに含む。
【００２２】
核酸分子上のこの領域は、改変された核酸鋳型上の１つまたは複数の領域に相当することが好ましい。
【００２３】
前記の方法は、
第１と第２のプライマー領域の間の領域に相補的な第１鎖または第２鎖を指向する、本発明の第１の態様による３つ以上のブロッカーを提供することをさらに含みうる。
【００２４】
第５の態様では、本発明は、核酸分子の標的領域の転換状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理すること、
本発明の第１の態様による第１のブロッカー（ここで、第１のブロッカーは、核酸分子の第１鎖上の転換されていない標的領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
本発明の第１の態様による第２のブロッカー（ここで、第２のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供すること、および
増幅反応を実施すること（ここで、標的領域が転換されている場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が転換されていない場合、増幅産物が存在しないこととなる）を含む方法を提供する。
【００２５】
第６の態様では、本発明は、核酸分子の標的領域の転換状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理すること、
本発明の第１の態様による第１のブロッカー（ここで、第１のブロッカーは、核酸分子の第１鎖上の転換された標的領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
本発明の第１の態様による第２のブロッカー（ここで、第２のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供すること、および
増幅反応を実施すること（ここで、標的領域が転換されていない場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が転換されていた場合、増幅産物が存在しないこととなる）を含む方法を提供する。
【００２６】
第７の態様では、本発明は、核酸分子の標的領域の状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理すること、
本発明の第１の態様による第１のブロッカー（ここで、第１のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖上の所望でない状態である標的領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
本発明の第１の態様による第２のブロッカー（ここで、第２のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供すること、および
増幅反応を実施すること（ここで、標的領域が、所望の状態である場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が、所望でない状態である場合、増幅産物が存在しないこととなる）を含む方法を提供する。
【００２７】
第８の態様では、本発明は、核酸分子の標的領域の状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理すること、
本発明の第１の態様による第１のブロッカー（ここで、第１のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖上の所望の状態である標的領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
本発明の第１の態様による第２のブロッカー（ここで、第２のブロッカーは、改変された核酸鋳型の第１鎖の下流の相補的第２鎖上の領域に相補的である）を増幅反応に提供すること、
改変された核酸鋳型の第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供すること、および
改変された核酸鋳型の第１鎖の相補的第２鎖上の第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供すること、
増幅反応を実施すること（ここで、標的領域が所望でない状態である場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が所望の状態である場合、増幅産物が存在しないこととなる）を含む方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、当該状態は、メチル化、突然変異、または一塩基多型である。
【００２９】
第９の態様では、本発明は、核酸増幅をブロックする、あるいは低下させるための方法であって、
２つ以上の内部のＩＰＮを含有するＩＮＡ分子を含むブロッカー（ここで、ブロッカーは、対象核酸配列に相補的である）を核酸増幅反応に提供すること、および
そのブロッカーが、対象核酸配列に結合し、対象配列で、あるいはその近くで、増幅をブロックする、あるいは低下させるような増幅反応を実施することを含む方法を提供する。
【００３０】
第１０の態様では、本発明は、核酸増幅をブロックする、あるいは低下させる方法であって、
本発明の第１の態様によるブロッカー（ここで、ブロッカーは、対象核酸配列に相補的である）を核酸増幅反応に提供すること、および
そのブロッカーが、対象核酸配列に結合し、対象配列で、あるいはその近くで、増幅をブロックまたは低下させるような増幅反応を実施することを含む方法を提供する。
【００３１】
好ましい形態では、増幅アッセイは、ＰＣＲの形のポリメラーゼ増幅である。
【００３２】
核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、核酸分子は、ＤＮＡである。
【００３３】
ある好ましい形態では、「メチル化状態」は、メチル化されていることである。
【００３４】
別の好ましい形態では、「メチル化状態」は、メチル化されていないことである。
【００３５】
好ましくは、潜在的メチル化部位は、当分野でＣｐＧダブレットと称される、３’側にグアニン（Ｇ）が隣接するシトシン（Ｃ）である。
【００３６】
改変のための薬剤は、重亜硫酸塩、酢酸塩、またはクエン酸塩から好ましくは選択される。より好ましくは、この薬剤は、重亜硫酸ナトリウム、すなわち、水が存在する場合にシトシンをウラシルに改変する試薬である。
【００３７】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応して、スルホン化されたシトシン反応中間体（これは、脱アミノ化を受けやすい）を形成し、水が存在する場合には、亜硫酸ウラシルをもたらす。必要に応じて、亜硫酸基を、弱アルカリ性条件下で除去し、ウラシルを形成させることができる。したがって、場合によっては、すべてのシトシンが、ウラシルに転換されることとなる。しかし、メチル化されたシトシンは、メチル化による保護に起因して、修飾試薬によって転換することができない。
【００３８】
ある好ましい形態では、１つまたは複数のブロッカーは、核酸分子上の１つまたは複数の潜在的メチル化部位を指向する。
【００３９】
別の好ましい形態では、ブロッカーは、核酸分子上の潜在的メチル化部位と結合しない。
【００４０】
より一般的な形態では、本発明の発明者は、ＤＮＡの領域にプローブ／ブロッカーをハイブリダイゼーションさせることによって、ポリメラーゼがＤＮＡの伸長に沿って移動するのをブロックすることができることを見出した。これによって、以下における、ある種の配列の増幅が抑制される：ＰＣＲ（サイキ（Ｓａｉｋｉ）他、（１９９８年）、「Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．」、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２３９：４８７〜４９１）、あるいは、これに限定されないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、バラニーＦ．（１９９１年）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｌｉｇａｓｅ．」、「プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ」８８：１８９〜１９３）、および鎖置換型（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）増幅（ＳＤＡ、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）他、（１９９２年）、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ」、「プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ」８９：３９２〜３９６）、核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ、キーヴィティス（Ｋｉｅｖｉｔｉｓ）他、（１９９１年）、「ＮＡＳＢＡ  ＴＭ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１．」、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」３５：２７３〜２８６）、転写ベースの増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＡＳ）、クウォ（Ｋｗｏｈ）他（１９８９年）、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔ．」、「プロナス（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）  ＵＳＡ．」４：１１７３〜７、ヘリカーゼ連鎖反応（ＨＣＲ）、ヴィンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）およびコン（Ｋｏｎｇ）、（２００４年）「Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．」、「ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ」５（８）：１〜６、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ、ファイヤＡ．（Ｆｉｒｅ  Ａ．）およびシューＳ．Ｑ．（Ｘｕ  Ｓ．Ｑ．）（１９９５年）「Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｃｉｒｃｌｅｓ．」、「プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）  ＵＳＡ」９２：４６４１〜４６４５）、自律配列複製（Ｓｅｌｆ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ、グアテッリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）他、（１９９０年）「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎ  ｖｉｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｌｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．」、「プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ」８７：１８７４〜１８７８）を含めた等温方法などの他の増幅プロセス。３’ジデオキシヌクレオチドの追加など、改変された３’オリゴヌクレオチド配列を使用することによって、ポリメラーゼ伸張が停止することが示されている。予想外にも、ＩＰＮ分子は、オリゴヌクレオチドの末端の３’端に配置される必要はなく、実際ＩＮＡの内部に配置することができ、それでもポリメラーゼの伸張をブロックすることができることが判明している。
【００４１】
ＤＮＡポリメラーゼは、そのＩＮＡプライマーが、その内部に位置する複数のＩＰＮを有する場合、所与のゲノム領域にハイブリダイゼーションさせたＩＮＡプライマーの置換／分解に大きな困難を抱えていることが明らかになっている。ＩＮＡ内のＩＰＮは、ポリメラーゼの進行に対するブロッカーとして効率的に作用する。ＩＮＡのこの予想外の特性は、領域内のメチル化されていない配列を増幅からブロックし、メチル化された配列のみを増幅することが可能であることを意味する。さらに、ジデオキシヌクレオチドの３’末端付加などのポリメラーゼ伸張を防止する他の方法と異なり、本発明の発明者は、ブロッキング効果をもたらすために、ＩＰＮ分子は、内部に配置することができ、３’である必要はないことを発見した。このように、メチル化された配列とメチル化されていない配列の混合集団において、すべてのバックグラウンドを排除することが可能である。
【００４２】
本発明はまた、「リアルタイム」検出アッセイにも適用することができる。
【００４３】
その最も単純な形態では、本発明は、ヒトまたは動物または植物または微生物の、最低でも２つの状態で存在するゲノムの任意の所望の領域を差別的に増幅するためのＩＮＡブロッカーの使用に関する。こうした２つの状態は、同じゲノム座位での変化形であるが、ヒトまたは動物または植物または微生物のサンプルのレベルでは、通常、細胞の混合集団（ある集団に特定のゲノム状態が存在し、別の集団に異なるゲノム状態が存在する）に埋没している。「乾草の山の中の針」に例えると、本発明は、針の増幅を可能にし、且つ乾草の山を構成するすべての干し草の増幅の妨害を可能にする。
【００４４】
実際の分子用語では、これは、以下を意味する：針が、癌細胞に存在する特定のメチル化されたゲノム配列であるのに対して、通常の細胞が、同じ座位でメチル化されていない配列を有する場合、本発明は、メチル化されていない配列の求められていない増幅をブロックすることによって、メチル化された配列の増幅および視覚化を可能にする。逆もまた適用可能である。通常の細胞がメチル化されたゲノム配列を有し、癌細胞が、メチル化されていない配列を有する場合、本発明はまた、メチル化された配列をブロックすることによって、メチル化されていない配列の増幅および視覚化を可能にする。
【００４５】
本発明の魅力は、所望されていない実体の巨大な海における、低レベルの実体の検出を可能にすることである。疾患において、ノイズ比に対するシグナルという言い方においては、何千もの通常の細胞（ノイズ）の中に、数個の癌細胞（シグナル）があることは、よくあることである。本発明によるブロッカー技術は、２つのことを行う；それは、ノイズを抑制することと、さらに、こうした２つのタイプの細胞のゲノムからシグナルを増幅することである。
【００４６】
本発明の発明者は、下の例中に示される５つの遺伝子についてのデータを提示するが、本発明は、ゲノムのその部分が２つの状態のうちの１つで存在する場合、ヒトまたは動物または植物または微生物のゲノムのいずれの部分に対しても（それが翻訳領域であっても非翻訳領域であっても）普遍的であり、これらに適用可能である。本発明は、ＳＮＰおよび遺伝子突然変異の検出などの任意の状況のために使用することができるが、これは、ゲノム標的のメチル化状態について見る際に、非常に有用な用途をもつ。
【００４７】
この明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、あるいは（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、所定の要素、整数、またはステップ、あるいは要素、整数、またはステップの群を包含するが、他のどんな要素、整数、またはステップ、あるいは要素、整数、またはステップの群も排除しないことを意味することが理解されよう。
【００４８】
本願明細書に含まれている、文書、行為、材料、装置、論文などに関するいずれの議論も、単に本発明のための状況を提供するためのものに過ぎない。こうした事項のいずれかまたはすべては、従来の技術の基礎の部分を形成する、あるいは、この明細書の各請求項の優先権主張日より前に、それがオーストラリアに存在したというように、本発明に関連する分野における共通の一般知識であったと認めるべきではない。
【００４９】
本発明をより明確に理解できるように、以下の図面および例を参照して、好ましい実施形態を述べることとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
材料および方法
ＩＮＡ／ＩＰＮ定義
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、独特のクラスのＤＮＡ結合分子である。ＩＮＡは、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体と、インターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）モノマーからなる。ＩＮＡは、相補的なＤＮＡに対して非常に高い親和性を有し、内部に配置されたＩＰＮについて最高１０度（ｄｅｇｒｅｅ）、端部に位置するＩＰＮについて最高１１度という安定度である。ＩＮＡ自体は、相補的なＲＮＡよりもＤＮＡとハイブリダイゼーションするのを好む選択的な分子である。ＩＮＡは、オリゴヌクレオチドプライマーよりも約２５倍効率的にＲＮＡに結合することが示されている。一方、従来のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、およびＰＮＡは、ＲＮＡともＤＮＡともと等しい親和性を有する。したがって、ＩＮＡは、まさに真の選択的なＤＮＡ結合剤である。さらにＩＮＡは、他の天然のＤＮＡ分子よりも、相補的なＤＮＡに対して、より高い特異性および親和性を有する。
【００５１】
さらに、ＩＰＮは、ＡＴ−リッチ環境で、最もよくＤＮＡを安定させ、これによって、エピゲノミクスリサーチの分野で得に有用なものとなる。ＩＰＮは一般に、ＩＮＡ分子内へのバルジまたは末端挿入物として配置される。ＩＰＮは、核酸二重鎖中で核酸塩基と相互スタッキング（ｃｏ−ｓｔａｃｋｉｎｇ）が可能である、本質的に平面状の（ヘテロ）ポリ芳香族化合物である。
【００５２】
ＩＮＡ分子はまた、エキソヌクレアーゼ攻撃に対して耐性であることも示されている。これにより、こうした分子は、ｐｈｉ２９などの酵素を使用する増幅のためのプライマーとして特に有用となる。ｐｈｉ２９は、特有のエキソヌクレアーゼ活性を有するので、酵素分解を妨げるために、増幅のための鋳型として使用されるプライマーは、その３’末端で特に改変されなければならない。しかし、ＩＮＡ分子は、さらに改変することなく加えることができる。
【００５３】
ＩＮＡは、従来のＰＣＲ増幅反応に使用することができ、従来のプライマーとして機能することができる。しかし、ＩＮＡは、ＤＮＡ鋳型に対する、より高い特異性を有し、これによって、鋳型が限定され、反応の感受性が限界であるような状況で使用するのに理想的となる。ＩＮＡは、ＡＴ−リッチ環境で、最もよくＤＮＡを安定させ、これによって、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ配列の増幅に特に有用となる。これは、亜硫酸水素塩転換の後、すべてのシトシン残基がウラシルに、その後、ＰＣＲまたは他の増幅の後に、チミンに転換されるという事実に起因する。したがって、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡは、非常にＴリッチである。ＩＮＡ中のＩＰＮ分子の数を増大させることによって、ＩＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の安定度が増す。ＩＮＡ中のＩＰＮが多いほど、ＤＮＡ／ＩＮＡ二重鎖の融解温度は高くなる。予想外にも、ヌクレオチド分子中に複数のＩＰＮが配置された場合、ＩＮＡは、その相補的なＤＮＡに対する非常に高い特異性を有するが、ＩＰＮの包含により、増幅反応中のＰＣＲポリメラーゼ伸張の阻害がもたらされる。したがって、ＩＮＡが、複数のＩＰＮを伴って設計されている場合、これは、ＰＣＲ増幅反応中にブロッキング試薬として作用する（これは、従来のオリゴヌクレオチドを使用すると起こらない）。
【００５４】
本出願人は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの類似体に組み込まれた場合にインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を形成し、オリゴヌクレオチドに対する補足体、あるいはオリゴヌクレオチドの置換体としての新規の有用な特性を有する、あるクラスのインターカレータ擬似ヌクレオチドを以前に開発している（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレット、および国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット）。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの類似体を改変して１つまたは複数のインターカレータ擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含ませ、核酸増幅のブロッカーを形成することができることが判明している。
【００５５】
インターカレータ擬似ヌクレオチドは、好ましくは１−（４，４’―ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される。好ましくは、インターカレータ擬似ヌクレオチドは、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイト、または（Ｒ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される。
【００５６】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの類似体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）、ならびにこれらの混合物およびそれらのハイブリッド、ならびにそれらのリン原子改変体（ホスホロチオネート、メチルホスホレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｔｅ）、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉａｔｅ）、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、リン酸トリエステル、およびホスホボラノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒａｎｏａｔｅ）など）から選択することができる。天然に存在しないヌクレオチドには、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リクソピラノシル（Ｌｙｘｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドが含まれる。さらに、これらに限定されないが、メチルイミノメチル、フォルムアセテート（ｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、チオフォルムアセテート（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、およびアミドを含む連結基などのヌクレオチドへの結合のために、リンを含有しない化合物を使用することができる。特に、核酸および核酸類似体は、１つまたは複数のインターカレータ擬似ヌクレオチドを含むことができる。
【００５７】
好ましくは、ブロッカーは、ブロッキングＩＮＡを形成する２つ以上の内部のＩＰＮを含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００５８】
ＩＰＮが、メチル化された部位の特定の検出のためにＩＮＡ分子中に配置される場合、本発明者は、潜在的ＣｐＧ部位の間にＩＰＮを配置することを回避することが有用であることを発見した。これは、ＣｐＧ部位がＩＰＮを使用して分割される場合に、得られるＩＮＡの特異性が低下させられるという事実に起因する。
【００５９】
ゲノム核酸
ゲノム核酸は、植物、動物、微生物（細菌、真菌、酵母、およびウイルスなど）から得られるＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、核酸は、ＤＮＡであり、より好ましくは、動物または人間由来のゲノムＤＮＡ、あるいは動物またはヒト細胞の感染性の因子の核酸である。
【００６０】
ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理
核酸の有効な亜硫酸水素塩処理のための例示的なプロトコルを以下で説明する。このプロトコルは、処理される実質的にすべてのＤＮＡを維持することをもたらす。この方法はまた、本明細書ではヒトゲノムシグネチャー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）（ＨＧＳ）法とも称する。サンプルまたは試薬の体積または量は、変わり得ることを理解されたい。
【００６１】
亜硫酸水素塩処理のための好ましい方法は、米国特許出願第１０／４２８３１０号明細書またはＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９（参照により本明細書に組み込む）に出ている。
【００６２】
２μｇのＤＮＡ（望ましければ、適切な制限酵素であらかじめ消化しておいてもよい）に、２μｌ（１／１０体積）の３Ｍ  ＮａＯＨ（５０ｍｌの水に６ｇ、新たに作製）を加えて、最終体積を２０μｌにした。亜硫酸水素塩試薬が、一本鎖分子と好都合に反応するので、このステップで、二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖の形に変性させる。この混合物を、３７℃で１５分間保温した。室温より上の温度での保温を使用して、変性の効率を向上させることができる。
【００６３】
保温の後、２０８μｌ  ２Ｍ  メタ重亜硫酸ナトリウム（４１６ｍｌ  １０Ｎ  ＮａＯＨを加えた２０ｍｌの水中に７．６ｇ；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ  ＃１０３５６．４Ｄ；新たに作製）と、１２μｌの１０ｍＭキノール（５０ｍｌの水中に０．０５５ｇ、ＢＤＨ  ＡｎａｌＲ  ＃１０３１２２Ｅ；新たに作製）を、連続して加えた。キノールは還元剤であり、試薬の酸化の低下を助ける。他の還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）または他の適切な還元剤など）も、使用することができる。このサンプルを、２００μｌの鉱油で覆った。鉱油で覆うことは、試薬の蒸発および酸化を妨げるが、不可欠ではない。その後、サンプルを、５５℃で終夜保温した。あるいは、サンプルを、以下の通りにサーマルサイクラー中に循環させることもできる：以下の通りに約４時間または終夜保温する：ステップ１、ＰＣＲ機械中で５５℃／２時間循環させる；ステップ２、９５℃／２分。ステップ１は、約３７℃〜約９０℃までの任意の温度で実施することができ、長さは、５分〜８時間まで変動し得る。ステップ２は、約７０℃〜約９９℃までの任意の温度で実施することができ、長さは、１秒〜６０分、あるいはさらに長く変動し得る。
【００６４】
メタ重亜硫酸ナトリウムでの処理の後、オイルを除去し、ＤＮＡ濃度が低い場合には、１μｌ  ｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）または２μｌグリコーゲンを加えた。こうした添加物は、任意選択であり、特にＤＮＡが低い濃度で存在する場合に、標的ＤＮＡと共沈殿することによって得られるＤＮＡの収量を向上させるために使用することができる。核酸の量が＜０．５μｇである場合、より効果的な核酸の沈殿のための担体としての添加物の使用が、一般に所望される。
【００６５】
イソプロパノール精製処理は、以下の通りに実施した：サンプルに８００μｌの水を加えて混合し、次いで１ｍｌイソプロパノールを加えた。水または緩衝液は、反応容器中の亜硫酸水素塩の濃度を、この塩が対象標的核酸と共に沈殿しないようなレベルに低下させる。希釈は一般に、塩濃度が、本明細書で開示する通りの所望の範囲内で希釈される限り、約１／４〜１／１０００である。
【００６６】
サンプルを再び混合し、４℃で最低でも５分間放置した。サンプルを、微量遠心管内で１０〜１５分間回転させ、ペレットを７０％  ＥＴＯＨで２回洗浄し、その都度ボルテックス処理した。この洗浄処理によって、核酸と共に沈殿したいずれの残存する塩も除去される。
【００６７】
ペレットを乾燥させ、次いで、適切な体積（例えば５０μｌ）のＴ／Ｅ（１０ｍＭトリス／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ  ７．０〜１２．５中に再懸濁させた。ｐＨ  １０．５の緩衝液が、特に有効であることが判明している。サンプルを、核酸を懸濁するために必要とされる通り、３７℃〜９５℃で１分〜９６時間保温した。
【００６８】
ブロッカー生成
ＩＮＡブロッカーの生成のための適切な方法は、クリステンセンＵＢ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＵＢ）、ペダーセン  ＥＢ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＥＢ）「Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｏｆ  １−Ｏ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ：  ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｓＤＮＡ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｖｅｒ  ＲＮＡ．」、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」２００２年１１月１５日；３０（２２）：４９１８〜２５（参照により本明細書に組み込む）に出ている。
【００６９】
ブロッカー
本明細書では、「ブロッカー」は、核酸増幅をブロックする、あるいは低下させることが可能な２つ以上の内部インターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）である。
【００７０】
本明細書では、「メチルブロッカー」は、その未処理のゲノム状態で元々メチル化されていた、転換された核酸の領域を標的にするように設計されたブロッカーである。
【００７１】
本明細書では、「非メチルブロッカー」は、その未処理のゲノム状態でメチル化されていなかった、転換された核酸の領域を標的にするように設計されたブロッカーである。
【００７２】
本明細書では、「転換ブロッカー」は、転換された核酸の領域を標的にするように設計されたブロッカーである。
【００７３】
本明細書では、「非転換ブロッカー」は、ゲノム核酸の領域（すなわち、重亜硫酸塩または他の処理によって転換されていない領域）を標的にするように設計されたブロッカーである。
【００７４】
ＧＳＴＰ１遺伝子のための実例において使用されるＩＮＡブロッカーの例は、以下の通りである：
【００７５】
【表１】
2008512101.tif 000002
【００７６】
ここで、Ｙは、ＩＰＮを示す。好ましくは、ＩＰＮは、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトの形である。
ＭＢは、メチル化ブロッカーである
ＵＢは、非メチル化ブロッカーである
ＮＣＢは、非転換ブロッカーである
【００７７】
記述子「Ｙ」は、配列中のＩＰＮの配置を表し、これは、配列の塩基数に含まれる。
【００７８】
ＰＣＲプライマー
例のために使用されるプライマーは、以下の通りであった：
【００７９】
【表２】
2008512101.tif 000003
【００８０】
第１ラウンドＩＮＡブロッキングＰＣＲ
ＧＳＴＰ１−１／２＋適切なブロッカー１／２
第２ラウンドＩＮＡブロッキングＰＣＲ
ＧＳＴＰ１−３／４＋適切なブロッカー３／４。
【００８１】
ＤＮＡの従来の亜硫酸水素塩修飾および所与のゲノム領域に対する産物の視覚化
これは、亜硫酸水素塩を用いるＤＮＡサンプルの処理、それに続くＰＣＲ増幅ステップを含む。研究者は、ＰＣＲステップの産物（すなわちゲル上のバンドの視覚化）からは、ＤＮＡがこのステージでメチル化されたかどうか知ることはできず、サンプル中に存在するその特定の遺伝子領域について、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡが存在するかどうか知るに過ぎない。ＰＣＲおよび視覚化の後、産物は、特定の部位が酵素によって切断されるかどうか（したがって、それがメチル化されているか否か）見るために、制限酵素によって消化させることをさらに必要とする、あるいは、その特定の組織サンプルにおいて、遺伝子領域がメチル化されたかどうか決定するために、ＤＮＡバンドまたはフラグメントが配列決定される必要がある。ＰＣＲバンドを配列決定することによって、例えばその領域中のＣｐＧダブレット中の各Ｃが、メチル化されたか否かが示されることとなる。この方法は、１０％超のサンプルがメチル化されている場合、メチル化が、配列決定装置上で大胆かつ型通りに検出されるだけなので、感受性が不足している。特定の組織サンプルでは、例えば、そのサンプル中の細胞の９０％が、研究中の領域にメチル化されていないＤＮＡを有し、１０％が、メチル化されたＤＮＡを有する場合、上述した従来方法は、メチル化プロファイリングの正確な決定に対する感受性が不足しているであろう。さらに、この従来技術の方法は、非常に労働集約的であり、実施するのに時間がかかる。
【００８２】
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）
ＭＳＰは、メチル化を調査する団体によって広く採用されているが、ＭＳＰは、文献中で実証されている、いくつかの非常に重大な限界または欠点を有する。こうした限界または欠点としては、以下が挙げられる：
Ｉ．この方法は、特に、腫瘍の不均一性に起因して、大抵の癌組織でそうであるように、正常細胞と癌細胞の混合集団中に、メチル化されたＤＮＡ領域をもつ少数の癌細胞が存在する場合に、偽陽性シグナルが非常に生じやすい。説明を簡単にするために、通常の細胞は、メチル化されていない状態の、その同等の領域を有するとする。亜硫酸水素塩で処理される場合、偽陽性シグナルは、ＤＮＡが局所的に転換されなかった結果として生じる。したがって、ＰＣＲプライマーは、ＤＮＡの転換されなかった領域（図３、４、および５のＤ部分を参照のこと）を増幅するので、メチル化された反応であると考えられるものが得られるが、実際には、これは、単に亜硫酸水素塩処理によって転換され損なった遺伝子領域を有する。ＩＮＡブロッカーは、転換されなかったＤＮＡ領域の増幅をブロックすることとなる非転換ＩＮＡブロッカーを含むことが可能であるので、この問題をこうむらない。ＩＮＡブロッカー技術を使用して、正のシグナルが得られる場合、このシグナルは、十分に転換されたＤＮＡの結果である。したがって、偽陽性ＰＣＲシグナルは、本発明によるブロッカーを使用することによって排除される。
【００８３】
ＩＩ．この領域が、従来の亜硫酸水素塩処理（高感度手法でない）の後に、あらかじめ配列決定されない限り、研究者は、標的にされているＣｐＧ部位が、そもそもメチル化されたかどうかわからない。したがって、ある特定のＣｐＧ部位は、メチル化されていない、あるいはメチル化中である可能性があり、その領域が配列決定されない限り、その特定のＣｐＧに対して設計されたＭＳＰプライマーは、その特定の遺伝子のメチル化の程度の推定の下で偽陰性反応を生じるであろう。さらに、本発明によるＩＮＡブロッカー技術は、ＰＣＲプライマーを、ＣｐＧジヌクレオチドを含有しない領域に対して設計することができるので、この限界を解決する。したがって、ＰＣＲプライマーは、遺伝子がメチル化されているかどうかに関係なく結合する。
【００８４】
ＩＩＩ．配列が、例えば、配列の第１の部分中に、小さい領域のみのメチル化を含有し、配列の全長に延長しない場合、これは、ＭＳＰを用いると誤った否定的結果を生ずるだろう。これは、第１のＭＳＰプライマーが、相補的なＣｐＧ部位に結合することとなるが、第２の領域はメチル化されていないので、第２のＭＳＰプライマーは結合しないこととなるという事実に起因する。上で既に述べた通り、ＰＣＲプライマーを、領域（メチル化されたかに関係なく増幅することとなる）に対して設計することができるので、該ブロッカーは、この問題を有さない。
【００８５】
ＩＶ．ＭＳＰは、その反応が、ＰＣＲ酵素が、メチル化されたＣまたはメチル化されていないＴ塩基である３’末端塩基からプライミングする能力に依存するので、最適化するのが非常に困難である。したがって、異なる遺伝子領域に対する異なるＭＳＰ反応は、ＭＳＰプライマーと転換された標的領域（Ｔｍ最適条件）との間のハイブリダイゼーション温度が非常に異なる可能性がある。ある遺伝子領域が、非常に高密度のＣｐＧアイランドを含有し、他の遺伝子領域が、かなり少ないＣｐＧアイランドを有する場合、ＣｐＧアイランドからの遺伝子領域は、Ｔｍが７０℃である可能性があるのに対し、他の遺伝子領域は、Ｔｍが５０℃である可能性がある。したがって、ＭＳＰ反応が高い厳密性で実施される場合、Ｔｍが７０℃である遺伝子が、ＰＣＲ産物を産生するのに対して、Ｔｍが５０℃であるＭＳＰ反応は、増幅産物を産生しないこととなる。したがって、各ウェルが、異なるＴｍ最適条件を有することとなり、また、増幅するかしないかが予測不可能な方式で変化することとなるので、（それぞれ、９６ウェルの同じプレートの、または３８４ウェルのＰＣＲプレートの別々のウェルで）複数のＭＳＰ反応を実施することは不可能に近く、他端から感知しうる結果を得るであろう。さらに、本発明によるブロッカー技術におけるＰＣＲプライマーは、ＣｐＧを欠く遺伝子の領域に対して設計することができるので、複数の異なる遺伝子のＴｍ最適条件は、比較的高密度のＣｐＧアイランドよりも制御がかなり容易である。ＰＣＲプライマーのためのプライミング部位として働くＣｐＧジヌクレオチドを欠く、そのアイランド内の小さい領域を発見することは、通常可能である。
【００８６】
Ｖ．ＭＳＰは、プライマーごとにある特定のＣｐＧ部位でのメチル化の存在を検出するだけであるので、ＭＳＰ反応は、遺伝子領域ごとに２つの部位について報告するだけである。これは常に、文書で十分に裏付けられた批判であった。研究者は、ＰＣＲプライマー間の領域のメチル化状態については何もわからない。ブロッカーＩＮＡは、平均して３〜４のＣｐＧ部位を含有することができるので、遺伝子あたり４つのブロッカーを使用すれば、本発明を使用して、メチル化状態について１２〜１６のＣｐＧ部位からの平均を調べることができる。
【００８７】
結果
ブロッカー戦略
本発明をまず、以下の増幅アッセイによって説明する。
【００８８】
図１では、ＰＣＲプライマー＃１およびブロッカー＃１は、対象ゲノム領域由来の亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡとハイブリダイゼーションする。その後、Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲプライマー＃１から、酵素が停止する位置のトップ（ｔｏｐ）ＤＮＡ鎖に結合したブロッカー＃１に到達するまで延長する。何らかの理由で、酵素がブロッカー＃１を迂回する場合、酵素は、ＤＮＡのトップ鎖を複製し、相補的な鎖を産生し、ＰＣＲプライマー＃２に対する結合部位がもたらされる。したがって、ＰＣＲプライマー＃２の内部の配列に相補的な第２のブロッカーが加えられる。これによって、ゲノム領域がその後確実に増幅しないようになる。
【００８９】
ＤＮＡは、ここでは本質的に、３つの塩基ゲノムからなるので、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡの性質に起因して、（特にＰＣＲによる）増幅効率は低下させられる。したがって、最大の感受性を得るために、２ラウンドのＰＣＲを実施することができる。２回のＰＣＲによって、反応の感受性が少なくとも５桁向上し、それによって、この方法は、細胞の小さい亜集団（例えば臨床サンプルにおける癌細胞と正常細胞の混合集団中の非常に少ない数の癌細胞）において起こるＤＮＡメチル化変化の検出に理想的な方法となる。これに関しては、ＰＣＲプライマー＃１およびプライマー＃２の内部の第３および第４のＰＣＲプライマー（ＰＣＲプライマー＃３およびＰＣＲプライマー＃４）が、２つのさらなるブロッカー（ブロッカー＃３およびブロッカー＃４）と共に加えられる。このように、各ＰＣＲプライマーは、そのＰＣＲプライマーの内部の配列に相補的であるブロッカー配列を有する。
【００９０】
したがって、対象各ゲノム領域のために、合計４つのＰＣＲプライマーが合成される。メチル化されたＤＮＡ配列の存在の検出が必要とされる場合、メチル化されていないＤＮＡの増幅をブロックするために、４つの非メチル化ブロッキング配列が使用されるであろう。さらに、配列が亜硫酸水素塩処理によって十分に転換されるのを確実にする（ある種の亜硫酸水素塩処理反応に伴う潜在的問題）ために、さらなる４つの非転換配列を使用して、部分的にのみ転換を受けたＤＮＡの領域の増幅をブロックすることができる。これに関しては、各ＰＣＲ（または他の増幅）反応において、２つのＰＣＲプライマー、２つの非メチル化ブロッカー、および２つの非転換ブロッカーが存在することとなるであろう。
【００９１】
逆に、メチル化されていないＤＮＡ配列の存在の検出が必要とされる場合、メチル化されたＤＮＡの増幅をブロックするために、４つのメチル化ブロッキング配列を使用することができるであろう。さらに、亜硫酸水素塩処理によって配列が十分に転換されることを確実にするために、さらなる４つの非転換配列を使用して、部分的にのみ転換を受けたＤＮＡの領域の増幅をブロックすることができるであろう。さらに、各ＰＣＲ反応においては、２つのＰＣＲプライマー、２つのメチル化ブロッカー、および２つの非メチル化ブロッカーが存在することとなるであろう。
【００９２】
周知のことだが、ブロッカーは、核酸の任意の増幅をブロックするために使用することができる。
【００９３】
ブロッカー特異的な増幅
図２は、説明のために、通常の、また、亜硫酸水素塩処理された人工のＤＮＡ配列、ＣｐＧを含有しない領域を標的にするＰＣＲプライマー＃１およびプライマー＃２、ならびにその適切な標的領域にハイブリダイゼーションする４つのブロッカー配列（２つはメチル化、２つは非メチル化）の配列を示す。
【００９４】
転換されていないＤＮＡ（野生型）に対するＰＣＲプライマーおよびＩＮＡブロッカーのハイブリダイゼーション
図３では、ＰＣＲプライマー＃１は、Ｂ、Ｃ、およびＤにのみハイブリダイゼーションし、配列類似性が不十分であるので、転換されていない配列Ａにはハイブリダイゼーションしない。メチルブロッカーは、亜硫酸水素塩処理されたメチル化された配列Ｂのみと結合することとなり、配列類似性が不十分であるので、転換されていない、メチル化されていない、あるいは局所的に転換されていないＤＮＡ配列には結合しない。その後、Ｔａｑポリメラーゼは、Ｂ、Ｃ、およびＤで示される配列の延長を開始する。しかし、Ｂの場合、酵素は、メチルブロッカーまではたどり着くこととなるが、メチルブロッカーを通過することができないので、産物は形成されない。Ｃの場合、ＴｐＧ部位のミスマッチ塩基に起因して、ブロッカーは結合されないので、Ｔａｑは、所望のＰＣＲフラグメントを産生することとなる。Ｄの場合も、配列類似性が不十分であるので、ブロッカーは結合されず、したがって、ＰＣＲ産物は得られるが、この産物は、転換されていない配列を含有する。
【００９５】
転換されたメチル化されたＤＮＡ配列に対するＰＣＲプライマーおよびブロッカーのハイブリダイゼーション
図４では、ＰＣＲプライマー＃１は、Ｂ、ＣおよびＤにのみハイブリダイゼーションし、配列類似性が不十分であるので、転換されていない配列Ａにはハイブリダイゼーションしない。非メチルブロッカーは、亜硫酸水素塩処理されたメチル化されていない配列Ｃのみと結合し、やはり配列類似性が不十分であるので、転換されていない、メチル化された、あるいは局所的に転換されていないＤＮＡ配列には結合しない。その後、Ｔａｑポリメラーゼは、Ｂ、Ｃ、およびＤに示される配列の延長を開始する。Ｃの場合、酵素は、非メチルブロッカーまではたどり着くこととなるが、非メチルブロッカーを通過することができないので、産物は形成されない。Ｂの場合、ＣｐＧのミスマッチ塩基に起因して、ブロッカーは結合されないので、Ｔａｑは、所望のＰＣＲフラグメントを産生することとなる。Ｄの場合も、配列類似性が不十分であるので、ブロッカーは結合されず、したがって、ＰＣＲ産物は得られるが、この産物は、転換されていない配列を含有する。
【００９６】
局所的に転換されていないＤＮＡ配列に対するＰＣＲプライマーおよびブロッカーのハイブリダイゼーション
図５では、ＰＣＲプライマー＃１は、Ｂ、Ｃ、およびＤにのみハイブリダイゼーションし、配列類似性が不十分であるので、転換されていない配列Ａにはハイブリダイゼーションしない。非転換ブロッカーは、転換されていない配列Ａおよび局所的に転換されていない配列Ｄと結合し、やはり配列類似性が不十分であるので、メチル化されたあるいはメチル化されていないＤＮＡ配列には結合しない。その後、Ｔａｑポリメラーゼは、Ｂ、Ｃ、およびＤで示される配列の延長を開始する。Ｄの場合、酵素は、非転換ブロッカーまではたどり着くこととなるが、非転換ブロッカーを通過することができないので、産物は形成されない。ＢおよびＣの場合、ＣｐＧおよびＴｐＧ部位の配列ミスマッチ塩基に起因して、ブロッカーは結合されないので、Ｔａｑは、所望のＰＣＲフラグメントを産生することとなる。
【００９７】
したがって、非転換ブロッカーは、局所的に転換されていない配列の増幅（従来のＭＳＰに関する主要な問題）を妨げるために、適切なブロッカーおよびプライマーと共に、図３および図４で説明した条件に加えることができる。
【００９８】
方法論の比較
図６は、従来の亜硫酸水素塩ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、およびＩＮＡブロッカー技術を使用するアガロースゲル上で観察されるバンド形成パターンの概略図を示す。
【００９９】
従来の亜硫酸水素塩ＰＣＲを用いると、サンプルがメチル化配列を含有するにせよしないにせよ（正常の組織対癌組織）、バンドが見えるであろう（両方のパネルのレーン１）。この特定の方法は、サンプル中の亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡの存在を検出するだけであり、（通常ジデオキシ配列決定によって）メチル化状態を決定するために、さらに処理しなければならない。
【０１００】
メチル化されたＤＮＡ配列の検出ためにＭＳＰを使用すると、正常の組織は、非メチル化であるであろうから、正常の組織サンプルからのレーン２では、バンドは見られないであろう。しかし、癌組織サンプルのレーン２には、バンドが見られるであろう。メチル化されていない配列を対象とするＭＳＰプライマーを使用すると、正常の組織サンプル（レーン３）ではバンドが観察されるが、癌組織サンプル（レーン３を参照のこと）では観察されないであろう。
【０１０１】
メチル化ブロッカーを使用するＩＮＡブロッカー技術を用いると、正常の組織（レーン４）ではバンドが観察されるが、癌組織（レーン４を参照）では観察されないであろう。非メチル化ブロッカーを使用すると、癌組織（レーン５）ではバンドが観察されるが、正常の組織（レーン５を参照）では観察されないであろう。
【０１０２】
亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡサンプルに適用されるブロッカー技術
図７は、非メチル化ブロッカーがＰＣＲ反応混合物に加えられた場合、亜硫酸水素塩修飾されたＤＮＡ  ＨｅＬａ細胞株、臨床サンプル由来のＴ細胞、および乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ２を用いると、正のＰＣＲシグナルが生じることを示す。
【０１０３】
【表３】
2008512101.tif 000004
【０１０４】
全血からのＴ細胞、Ｂ細胞、およびＣＤ３４＋細胞の精製
サンプルは、Ｒｏｙａｌ  Ｎｏｒｔｈ  Ｓｈｏｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、シドニー、オーストラリアで、白血球搬出法を受けている患者から得られた。サンプルは、従来の倫理委員会（Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けて得られた。白血球は、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＃１７−１４４０−０３；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を使用して、メーカーの指示書に従って濃縮した。Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＣＤ３４＋細胞は、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ  ＣＤ２  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）＃１１６．０３；Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ、ニューヨーク州）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ１９  （Ｐａｎ  Ｂ）  Ｄｙｎａｌ＃１１１．４３、およびＤｙｎａｌ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）＃１１３．０１）を使用して、それぞれ製造指示書に従って、白血球集団から単離した。
【０１０５】
使用した配列およびプライマーを、表２に示す。
【０１０６】
ＰＣＲプレミックスは、以下の通りに準備した：
【０１０７】
【表４】
2008512101.tif 000005
【０１０８】
【表５】
2008512101.tif 000006
【０１０９】
【表６】
2008512101.tif 000007
【０１１０】
【表７】
2008512101.tif 000008
【０１１１】
図１に記載した原理に従って、２ラウンドのＰＣＲ増幅を、Ｈｙｂａｉｄ  ＰＸ２サーモサイクラー中で実施した。亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡ  １μｌを、第１ラウンドのＰＣＲ反応チューブの各々に加えた。ＰＣＲは、以下の通りに実施した。
【０１１２】
【表８】
2008512101.tif 000009
【０１１３】
第１ラウンドのＰＣＲが完了した後、第１ラウンドのＰＣＲ反応混合物１μｌを、第２ラウンドの増幅チューブに移し、上のＰＣＲプログラムを繰り返した。
【０１１４】
その後、ＰＣＲ反応混合物１０μｌを、２％アガロースゲル上で分析した。
【０１１５】
こうしたサンプルの従来の亜硫酸水素塩ゲノム配列決定によって、ＨｅＬａ細胞株ＤＮＡは、この特定のゲノム領域について完全にメチル化されていたことが示された。Ｔ細胞ＤＮＡは、メチル化されていないことが示されたが、従来の亜硫酸水素塩ゲノム配列決定の解析能は、わずか１０％である。制限酵素Ｔａｑ  １（ＴＣＧＡを切断する）およびＢｓｔＵ１（ＣＧＣＧを切断する）を使用する、増幅された産物の制限消化によって、アンプリコン中のメチル化が示された。これは、本発明のＩＮＡブロッカー技術が、低レベルでメチル化された配列の検出での従来の亜硫酸水素塩ゲノム配列決定よりも明らかに優れていることを示す。さらに、Ｔ４７Ｄ２  ＤＮＡが、従来の亜硫酸水素塩配列決定によって配列決定された場合、配列の前半がメチル化されていたのに対し、後半はメチル化されていなかったことが明らかになった。図７Ａおよび７Ｂで分かるように、非メチル化ブロッカーおよびメチル化ブロッカーを使用して、バンドが検出された。ＭＳＰが使用されるならば、第２のＭＳＰ  ＰＣＲプライマーのためのプライミング部位がメチル化されず、したがって、プライマーは結合しないであろうから、この特定のサンプルは、偽陽性バンドを生じるであろう。
【０１１６】
メチル化ＩＮＡブロッカーを使用すると、すべての結果は、従来の亜硫酸水素塩配列決定によって得られる結果と一致した。
【０１１７】
臨床試験結果
図８および表３は、細胞株または臨床サンプルの１１の異なるサンプル由来の４つのゲノム領域（ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＸＣＬ−２、ＧＳＮ、およびＨＩＣ−１）に関するブロッカー実験の結果を示す。使用したブロッカーおよび実験プロトコルは、以下の通りである：
【０１１８】
対象各遺伝子領域のためのＰＣＲプレミックスは、以下の通りに準備した：
【０１１９】
【表９】
2008512101.tif 000010
【０１２０】
図１に記載する原理に従って、Ｈｙｂａｉｄ  ＰＸ２サーモサイクラー中で、２ラウンドのＰＣＲ増幅を実施した。亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡ１μｌを、各々の第１ラウンドのＰＣＲ反応チューブの各々に加えた。ＰＣＲは、以下の通りに実施した。
【０１２１】
【表１０】
2008512101.tif 000011
【０１２２】
第１ラウンドのＰＣＲが完了した後、第１ラウンドのＰＣＲ反応混合物１μｌを、第２ラウンドの増幅チューブに移し、上のＰＣＲプログラムを繰り返した。
【０１２３】
その後、ＰＣＲ反応混合物１０μｌを、２％アガロースゲル上で分析した。
【０１２４】
【表１１】
2008512101.tif 000012
【０１２５】
ゲノム領域ＣＤＫＮ２ＢおよびＣＸＣＬ−２は、顆粒球において弱いバンドとして示される少量のメチル化を除いて、ほとんどすべてのサンプルにおいてメチル化されていないことが判明した。これらの結果は、選択されたサンプルに対する個別の増幅、それに続くＰＣＲ産物の直接的配列決定によって確認した。直接的なＤＮＡ配列決定では、ＣＤＫＮ２ＢまたはＣＸＣＬ−２  ＰＣＲフラグメントのいずれにおいてもメチル化が示されなかった。直接的な配列決定の感受性は、増幅された材料の１０％超がメチル化されない限り、配列はメチル化されていないものとして読み取られるような程度である。したがって、顆粒球サンプルにおけるＣＸＣＬ−２の弱いバンドの存在は、ブロッカーアッセイによって検出される、このサンプルにおける非常に低レベル（＜１０％）のメチル化の指標となる。
【０１２６】
ＧＳＮゲノム領域について配列決定されたすべてのサンプルにおいて、混合メチル化パターンが観察され、これは、ブロッカーアッセイの結果と一致していた。このゲノム領域のメチル化パターンは、ＰＣＲアンプリコンの長さ全体を通して多様であり、多くの場合、すべてのＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されるというわけではなかった。あるいは、メチル化されていない配列とメチル化された配列の混合物が、個々のＣｐＧ部位で観察された。
【０１２７】
ＢＬ１３、Ｈｅｌａ、およびＬＮＣａＰ細胞株について、Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  （ＨＩＣ−１）遺伝子のメチル化が観察され、ＣｐＧ部位は、１００％メチル化を示していた。興味深いことに、正常のＳＭＣ（サンプル６）細胞株は、ＨＩＣ−１遺伝子のメチル化を示さない唯一の細胞株であった。白血病の緩解中の患者由来の顆粒球およびＴ細胞（サンプル９および１０）は、ブロッカーアッセイによって混合メチル化を示し、圧倒的多数についてＰＣＲアンプリコンがメチル化されていないように見えたが、これは、直接的な配列決定手法の感受性の欠如にも起因する可能性がある。
【０１２８】
これらの結果から、本発明によるブロッカーアッセイは、ヒトゲノムの様々な領域のメチル化パターンを検出するための強力なツールであることがわかる。
【０１２９】
当業者であれば、広く述べた通りの本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態で示す通りの本発明に対する非常に多くの変形および／または改変を行うことができることが理解できるであろう。したがって、本発明の実施形態は、あらゆる点で、例示的であり限定的でないと考えられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】２ラウンドのＤＮＡ増幅で使用されるプライマーおよびブロッカーの位置の概要を提供する、ＩＮＡブロッカー戦略の例示的詳細を示す。
【図２】メチル化された、あるいはメチル化されていないＤＮＡ配列を使用する２ラウンドのＤＮＡ増幅で使用されるプライマーおよびブロッカーの位置の概要を提供する、ＩＮＡブロッカー戦略を機能させる方法の例示的詳細を示す。これは、例として説明目的で使用されており、これらのブロッカーおよびプライマー配列は、現実のアッセイでは一般に使用されないであろう。ゲノムＤＮＡ配列（配列番号１７）；亜硫酸水素塩処理されたメチル化された配列（配列番号１８）；亜硫酸水素塩処理されたメチル化されていない配列（配列番号１９）；ＰＣＲプライマー＃２（配列番号２０）；ＰＣＲプライマー＃１（配列番号２１）；メチルブロッカー＃２（配列番号２２）；メチルブロッカー＃１（配列番号２３）；非メチルブロッカー＃２（配列番号２４）；非メチルブロッカー＃１（配列番号２５）。
【図３】ＰＣＲプライマーおよびメチル化ＩＮＡブロッカーの、様々な亜硫酸水素塩処理ＤＮＡタイプへのハイブリダイゼーションを示す例である。Ａ．転換されていない配列（配列番号２６）；Ｂ．亜硫酸水素塩処理されたメチル化された配列（配列番号２７）；Ｃ．亜硫酸水素塩処理されたメチル化されていない配列（配列番号２８）；Ｄ．局所的に転換されていない配列（配列番号２９）；ＰＣＲプライマー＃１（配列番号３０）；メチルブロッカー＃１（配列番号３１）。
【図４】ＰＣＲプライマーおよび非メチル化ＩＮＡブロッカーの、様々な亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡタイプへのハイブリダイゼーションを示す例である。Ａ．転換されていない配列（配列番号２６）；Ｂ．亜硫酸水素塩処理されたメチル化された配列（配列番号２７）；Ｃ．亜硫酸水素塩処理されたメチル化されていない配列（配列番号２８）；Ｄ．局所的に転換されていない配列（配列番号２９）；ＰＣＲプライマー＃１（配列番号３０）；非メチルブロッカー＃１（配列番号３２）。
【図５】ＰＣＲプライマーおよび非転換ＩＮＡブロッカーの、様々な亜硫酸水素塩処理ＤＮＡタイプへのハイブリダイゼーションを示す例である。Ａ．転換されていない配列（配列番号２６）；Ｂ．亜硫酸水素塩処理されたメチル化された配列（配列番号２７）；Ｃ．亜硫酸水素塩処理されたメチル化されていない配列（配列番号２８）；Ｄ．局所的に転換されていない配列（配列番号２９）；ＰＣＲプライマー＃１（配列番号３０）；非転換ブロッカー＃１（配列番号３３）。
【図６】従来のＰＣＲ、ＭＳＰ技術、あるいは図３、４、および５で概説したＩＮＡブロッカーとプライマーの組み合わせを使用する、アガロースゲル電気泳動で視覚化された、予測される増幅産物を示す。結果は、定義された一組の既知のＤＮＡマーカーに対する様々な増幅／検出方法を使用して、ゲル上で検出される予測される増幅産物の位置およびサイズの例によって示される。
【図７】ＩＮＡブロッカー技術の、亜硫酸水素塩処理されたゲノムＤＮＡサンプルへの適用に関するデータを示す。プロモーター領域のメチル化状態を評価するために、ＧＳＴＰ１プロモーター領域に対するＩＮＡブロッカーおよびＰＣＲプライマーが、（表３に記述される）９つのゲノムＤＮＡサンプルに適用されている。
【図８】表２に記述する１１のゲノムＤＮＡサンプルに適用されるブロッカーおよびＰＣＲプライマーを使用する、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＸＣＬ−２、ＧＳＮ、およびＨＩＣ−１遺伝子の近くの４つのゲノム領域の増幅結果および推定されるメチル化状態を示す。結果は、表３に記述する１１のゲノムＤＮＡサンプルに適用されるブロッカーおよびＰＣＲプライマーを使用するものであり、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＸＣＬ−２、ＧＳＮ、およびＨＩＣ−１座位の近くのヒトゲノム領域からの増幅産物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月15日(2006.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の標的領域のメチル化状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で前記核酸分子を処理することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第１の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上のメチル化されていない標的領域に相補的である第１のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第２の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖の下流に相補的な第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖に相補的な前記第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域がメチル化されている場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域がメチル化されていない場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項２】
核酸分子の標的領域のメチル化状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で核酸分子を処理することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第１の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上のメチル化された標的領域に相補的である第１のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第２の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖の下流に相補的な第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖に相補的な前記第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域がメチル化されていない場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域がメチル化されている場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項３】
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第３および第４の増幅ブロッカーであって、前記第１および第２のブロッカー領域の内側の領域に相補的である第３および第４のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
前記第３および第４のブロッカー領域の外側かつ前記第１および第２のプライマー領域の内側の領域に相補的な第３および第４のプライマーを提供することと、をさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子上の１つまたは複数の領域を指向する、２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む１つまたは複数のさらなる増幅ブロッカーを提供することをさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子上の領域が、前記改変された核酸鋳型上の１つまたは複数の領域に相当する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１鎖または第２鎖を指向し、前記第１と第２のプライマー領域の間の領域に相補的であり、２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む、３つ以上のブロッカーを提供することをさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
核酸分子の標的領域の変換状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で前記核酸分子を処理することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第１の増幅ブロッカーであって、前記核酸鋳型の第１鎖上の変換されていない標的領域に相補的である第１のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第２の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖の下流に相補的な第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖に相補的な前記第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が変換されている場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が変換されていない場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項８】
核酸分子の標的領域の変換状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で前記核酸分子を処理することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第１の増幅ブロッカーであって、前記核酸鋳型の第１鎖上の変換された標的領域に相補的である第１のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第２の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖の下流に相補的な第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖に相補的な前記第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が変換されていない場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が変換されている場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項９】
前記標的領域が、３’側にグアニン（Ｇ）が隣接するシトシン（Ｃ）である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変のための薬剤が、重亜硫酸塩、酢酸塩、またはクエン酸塩から選択される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、重亜硫酸ナトリウムである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子がＤＮＡである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＮＡが、２〜６の内部に位置するＩＰＮを有する、長さが約１５〜５０のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＮＡが、２〜６の内部に位置するＩＰＮを有する、長さが約１８〜３５のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＰＮが、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端から２番目以上の塩基に位置する請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＮＡが、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端のいずれにもＩＰＮを含有しない請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＰＮが、１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＩＰＮが、（Ｓ）−１−（４，４’―ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイト、または（Ｒ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩＰＮが、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅アッセイがＰＣＲである請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
核酸分子の標的領域の状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で前記核酸分子を処理することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第１の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の望ましくない状態を有する標的領域に相補的である第１のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第２の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖の下流に相補的な第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖に相補的な前記第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が望ましい状態である場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が望ましくない状態である場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項２３】
核酸分子の標的領域の状態を検出するための方法であって、
改変された核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を改変するが、５−メチルシトシン塩基は改変しない薬剤で前記核酸分子を処理することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第１の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の第１鎖上の望ましい状態を有する標的領域に相補的である第１のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
２つ以上のインターカレート型擬似ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）を含む第２の増幅ブロッカーであって、前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖の下流に相補的な第２鎖上の領域に相補的である第２のブロッカー、を増幅反応に提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖上の標的領域の上流の核酸領域に相補的な第１のプライマーを提供することと、
前記改変された核酸鋳型の前記第１鎖に相補的な前記第２鎖上の前記第２のブロッカー領域の下流の核酸領域に相補的な第２のプライマーを提供することと、
ポリメラーゼ増幅反応を実施することと、を含み、ここで、標的領域が望ましくない状態である場合、増幅産物が存在することとなり、標的領域が望ましい状態である場合、増幅産物が存在しないこととなる、方法。
【請求項２４】
前記状態が、メチル化、突然変異、または一塩基多型である請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩＮＡが、２〜６の内部に位置するＩＰＮを有する、長さが約１５〜５０のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＮＡが、２〜６の内部に位置するＩＰＮを有する、長さが約１８〜３５のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＰＮが、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端から２番目以上の塩基に位置する請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＩＮＡが、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端のいずれにもＩＰＮを含有しない請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＰＮが、１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩＰＮが、（Ｓ）−１−（４，４’―ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイト、または（Ｒ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＰＮが、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトである請求項３０に記載の方法。
【国際調査報告】
2008512101.tif 000021
2008512101.tif 000022
2008512101.tif 000023