(57)【要約】【課題】中枢神経系由来の神経細胞株及びその樹立方法を提供する。【解決手段】Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子からなる群より選択される遺伝子のうち、少なくとも一つの遺伝子はその上流及び下流にlox配列が挿入されており、上流及び下流にlox配列が挿入されていない遺伝子は欠失している遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞に、NeuroD1遺伝子プロモーター領域とその下流に存在するCre遺伝子とを含むベクターを導入する工程；  前記ベクターの導入された細胞を培養する工程；及び  前記培養された細胞のうち、Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子がそれぞれ欠失している遺伝子型を有する細胞を回収する工程  を含む中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法及びこの方法により樹立された中枢神経系神経細胞に由来する細胞株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子からなる群より選択される遺伝子のうち、少なくとも一つの遺伝子はその上流及び下流にlox配列が挿入されており、上流及び下流にlox配列が挿入されていない遺伝子は欠失している遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞に、NeuroD1遺伝子プロモーター領域とその下流に存在するCre遺伝子とを含むベクターを導入する工程；
前記ベクターの導入された細胞を培養する工程；及び
前記培養された細胞のうち、Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子がそれぞれ欠失している遺伝子型を有する細胞を回収する工程
を含む、中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法。
【請求項２】
前記中枢神経前駆細胞が、大脳皮質組織に含まれた大脳皮質神経前駆細胞であり、Rb遺伝子及びp130遺伝子のそれぞれの上流及び下流にlox配列が挿入され、且つp107遺伝子が欠失している遺伝子型を有し、
前記NeuroD1遺伝子プロモーター領域が配列番号３に示される塩基配列を有し、
前記ベクターがプラスミドであり、
前記ベクター導入工程がex vivoエレクトロポレーション法により実施され、
前記細胞培養工程が、大脳皮質組織に含まれた前記ベクターの導入された細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の方法により樹立された、中枢神経系神経細胞に由来する細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系神経細胞に由来する細胞株及びその樹立方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養技術は、生物製剤の製造、ｉＰＳ細胞の発見など、生物学分野のホットトピックスを産み出してきた重要な技術である。しかし、中枢神経系の神経細胞の培養技術は、幹細胞や皮膚細胞などの培養技術に比べて発展が遅れている。
【０００３】
神経細胞研究のツールとしては、ラット副腎髄質由来の褐色細胞腫から得られた細胞株であるＰＣ１２細胞が知られている（非特許文献１）。しかし、ＰＣ１２細胞は末梢神経系細胞由来の細胞株であるため、中枢神経系神経細胞に対する効果を奏する薬剤のスクリーニング等の用途において、必ずしも最適な細胞ではない。
【０００４】
癌抑制遺伝子Rb並びにそのファミリー遺伝子であるp107及びp130（以下、「Rb遺伝子ファミリー」とも称する。）をCre酵素遺伝子挿入プラスミドにて欠損させた大脳皮質前駆細胞（Rb-TKO前駆細胞）は、神経細胞への分化を進めながら増殖することが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73(7) (1976) p. 2424-2428
【非特許文献２】Oshikawa et al., Development 140 (2013) p. 2310-2320
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者の検討により、神経前駆細胞中のRb遺伝子ファミリーを欠損させることにより作製した細胞には、神経細胞だけではなく増殖能力の高いグリア細胞等も含まれるため、神経細胞の特徴を示す細胞株を継代培養により維持することが困難であることが明らかになった。一方、分化が完了した成熟した神経細胞のRb遺伝子ファミリーを不活性化しても、細胞を不死化することはできないことも明らかになった。
このような状況下において、中枢神経系神経細胞に由来する細胞株及びその樹立方法の確立が求められている。
【０００７】
本発明は、継代培養を経ても中枢神経系神経細胞の特徴を示し得る細胞株及びその樹立方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
課題を解決するための手段は以下に示すとおりである。
［１］  Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子からなる群より選択される遺伝子のうち、少なくとも一つの遺伝子はその上流及び下流にlox配列が挿入されており、上流及び下流にlox配列が挿入されていない遺伝子は欠失している遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞に、NeuroD1遺伝子プロモーター領域とその下流に存在するCre遺伝子とを含むベクターを導入する工程；
前記ベクターの導入された細胞を培養する工程；及び
前記培養された細胞のうち、Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子がそれぞれ欠失している遺伝子型を有する細胞を回収する工程
を含む、中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法。
［２］前記中枢神経前駆細胞が、大脳皮質組織に含まれた大脳皮質神経前駆細胞であり、Rb遺伝子及びp130遺伝子のそれぞれの上流及び下流にlox配列が挿入され、且つp107遺伝子が欠損している遺伝子型を有し、
前記NeuroD1遺伝子プロモーター領域が配列番号３に示される塩基配列を有し、
前記ベクターがプラスミドであり、
前記ベクター導入工程がex vivoエレクトロポレーション法により実施され、
前記細胞培養工程が、大脳皮質組織に含まれた前記ベクターの導入された細胞を培養することを含む、［１］の方法。
［３］［１］又は［２］の方法により樹立された細胞株。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、継代培養を経ても中枢神経系神経細胞の特徴を示し得る細胞株及びその樹立方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態である細胞株樹立方法において使用されるベクターの一例であるプラスミドpNeuroD1-Creの構成を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施形態である中枢神経系細胞由来細胞株CE1Nの位相差顕微鏡写真である。
【図３】本発明の一実施形態である中枢神経系細胞由来細胞株CE1Nの位相差顕微鏡写真である。
【図４】本発明の一実施形態である中枢神経系細胞由来細胞株CE1NをDAPIにより染色した様子を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】本発明の一実施形態である中枢神経系細胞由来細胞株CE1Nを抗DCX一次抗体-二次抗体により染色した様子を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図６】本発明の一実施形態である中枢神経系細胞由来細胞株CE1NをDAPI及び抗DCX一次抗体-二次抗体により染色した様子を示す蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の中枢神経系神経細胞に由来する細胞株及びその樹立方法について詳細に説明する。
なお、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１２】
＜中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法＞
本発明の中枢神経系神経細胞に由来する細胞株（以下、「特定細胞株」とも称する。）の樹立方法は、Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子からなる群より選択される遺伝子のうち、少なくとも一つの遺伝子はその上流及び下流にlox配列が挿入されており、上流及び下流にlox配列が挿入されていない遺伝子は欠失している遺伝子型（以下、「特定遺伝子型」とも称する。）を有する動物の中枢神経前駆細胞に、NeuroD1遺伝子プロモーター領域とその下流に存在するCre遺伝子とを含むベクター（以下、「特定ベクター」とも称する。）を導入する工程（以下、「ベクター導入工程」とも称する。）、前記ベクターの導入された細胞を培養する工程（以下、「培養工程」とも称する。）、及び、前記培養された細胞のうち、Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子がそれぞれ欠失している遺伝子型（以下、「特定遺伝子欠失遺伝子型」とも称する。）を有する細胞を回収する工程（以下、「回収工程」とも称する。）を含む。
また、本発明の中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法は、必要に応じて他の工程を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明の中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法は、ベクター導入工程と、培養工程と、回収工程と、を含む。すなわち、ベクター導入工程において、転写因子タンパク質であるNeuroD1の遺伝子のプロモーター領域とその下流に存在するCre遺伝子とを含むベクターを、特定遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞に導入する。この中枢神経前駆細胞中においてCre-lox系が作動するとRb遺伝子ファミリー（Rb、 p107 、及びp130の3つ全て）が全て欠失する仕組みが、このベクター導入工程において構築される。ベクター導入工程により得られた細胞が、培養工程においてニューロンへの分化が決定された段階へと至ると、Cre-lox系の作動により、lox配列で挟まれた遺伝子が欠失する。これにより、Rb遺伝子ファミリーに属する遺伝子全てが欠失した細胞を得ることが可能となる。このようにして得られたRb遺伝子ファミリーに属する遺伝子全てが欠失した細胞を、回収工程において回収する。ここで回収された細胞は、継代培養を経ても中枢神経系神経細胞の特徴としてニューロンのマーカーであるダブルコルチン（DCX）を発現する細胞株を生ずる。
【００１４】
（ベクター導入工程）
本発明の特定細胞株の樹立方法において、ベクター導入工程とは、特定遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞に、特定ベクターを導入する工程である。
ベクター導入工程において、特定遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞に特定ベクターを導入する方法は、特に制限されるものではない。例えば、リポフェクション法やウイルスを用いた遺伝子導入が挙げられる。中でも、動物の中枢神経前駆細胞にベクターを導入する方法としては、低コストで操作が簡便なエレクトロポレーション法が好ましく、遺伝子導入効率の高いｅｘ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション法が更に好ましい。
ベクター導入工程において、温度条件等は特に制限されるものではなく、適宜設定することができる。
【００１５】
本発明において使用される、特定遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞の調製方法としては、特定遺伝子型を有する動物の中枢神経前駆細胞を調製することができればよく、特に制限されるものではない。例えば、人工ヌクレアーゼやCRISPR/Casシステムによるゲノム編集方法等が挙げられる。
中でも、特定遺伝子型を持つマウスが既に作製されており、容易に入手できるため、特定遺伝子型を有するマウスの中枢神経前駆細胞の調製方法としては、floxマウスを使用することが好ましい。
【００１６】
本発明において、特定ベクターの調製方法としては、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域とその下流にＣｒｅ遺伝子とを含むベクターを調製することができればよく、特に制限されるものではなく、特に制限されるものではない。例えば、制限酵素による組換え等が挙げられる。
中でも、短期間で作製可能であるため、特定ベクターの調製方法としては、PCRで遺伝子を増幅する方法等が好ましい。
【００１７】
ベクター導入工程において用いる動物の中枢神経前駆細胞としては、特定遺伝子型を有するものであれば特に制限されるものではない。
特定遺伝子型としては、例えば、Rb遺伝子及びp130遺伝子のそれぞれに上流及び下流にlox配列が挿入され且つp107遺伝子が欠失している遺伝子型（Rb Lox/Lox; p107 -/-; p130 Lox/Lox）等が挙げられる。Ｃｒｅの発現によりRb遺伝子ファミリーが全て欠失した特定遺伝子欠失遺伝子型を有する細胞を判別容易とする観点からは、lox配列間にstopコドンが挿入され、その下流にＧＦＰ遺伝子が挿入されていることが好ましい。また、別の特定遺伝子型としては、例えば、Rb遺伝子の上流及び下流にlox配列が挿入され且つp130遺伝子及びp107遺伝子が欠失している遺伝子型（Rb Lox/Lox; p107 -/-; p130  -/-）も挙げられる。
なお、Ｒｂ遺伝子、ｐ１０７遺伝子及びｐ１３０遺伝子の塩基配列は、すでに公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．NM_009029.2（Ｒｂ遺伝子の塩基配列、配列番号４）、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．NM_011250.4（Ｐ１０７遺伝子の塩基配列、配列番号５）及びＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．NM_011249.2（ｐ１３０遺伝の塩基配列、配列番号６）により入手することができる。
【００１８】
ベクター導入工程において用いる中枢神経前駆細胞としては、大脳皮質神経前駆細胞、小脳神経前駆細胞等が挙げられる。ここで中枢神経前駆細胞は、組織から単離された細胞であってもよいし、組織に含まれた細胞であってもよい。中でも、遺伝子導入法が確立されているため、中枢神経前駆細胞としては、大脳皮質組織に含まれた大脳皮質神経前駆細胞が好ましい。ここで組織に含まれた細胞とは、組織から単離されずに組織を形成している細胞である。
【００１９】
ベクター導入工程において用いる動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウサギ、カエル等、任意の動物が挙げられ、ヒト又はマウスが好ましい。
【００２０】
ベクター導入工程において用いるベクターとしては、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域とその下流にＣｒｅ遺伝子とを含むベクターであれば、特に制限されるものではない。
【００２１】
ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域とその下流にＣｒｅ遺伝子を挿入するベクターの種類は特に制限されるものではない。例えば、プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。中でも、作製が簡便であるため、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域とその下流にＣｒｅ遺伝子を挿入するベクターとしては、プラスミドが好ましい。
【００２２】
ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域及びＣｒｅ遺伝子の塩基配列は、すでに公知であり、その塩基配列はGenbankのアクセッションＮｏ．NC_000068.7より入手することができる。
ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域を含む塩基配列は、その塩基配列情報に基づきデザイン可能なプライマーを用いて、全ゲノム等を鋳型として入手することができる。
具体的には、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．NC_000068.7の79456565〜79456589の塩基配列に相補的な塩基配列を含むフォワードプライマーと、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．NC_000068.7の79458452〜79458476の塩基配列に相補的な塩基配列を含むリバースプライマーとを用いて、野生型マウスtail全ゲノムを鋳型にして調製することができる。
【００２３】
その他、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域とその下流にＣｒｅ遺伝子とを含む塩基配列は、制限酵素による組換え等により調製することもできる。
ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域とその下流にＣｒｅ遺伝子とを含む塩基配列としては、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子プロモーター領域とその下流にＣｒｅ遺伝子とを含んでいればよい。
【００２４】
（細胞培養工程）
本発明の特定細胞株の樹立方法において、細胞培養工程とは、特定ベクターの導入された細胞を培養する工程である。
培養方法は特に制限されるものではなく、動物細胞培養に使用される条件を適宜適用可能であるが、37℃、5%CO2が好ましい。
培養工程において使用される培地の種類は、特に制限されるものではなく、動物細胞培養に使用される培地を適宜使用可能であるが、例えば、Neurobasal培地（Invitrogen）にN2（Invitrogen）、B29（Invitrogen）、0.1%BSA、20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF, Penicillin-Streptomycin（Invitrogen）を加えたものが好ましい。ある実施形態においては、培地にEGF及びbFGFを添加すること、並びにマトリゲル添加培地でコートしたプレートを使用することが、細胞増殖のために必要となることがある。
【００２５】
特定ベクターの導入された細胞とは、ベクター導入工程により得られた細胞であればよく、特に制限されるものではない。例えば、大脳皮質組織に含まれた特定ベクターの導入された細胞、小脳組織に含まれた特定ベクターの導入された細胞等であればよい。中でも、NeuroDプロモーターの活性化時期が好適であるという観点より、大脳皮質組織に含まれた特定ベクターの導入された細胞が好ましい。
【００２６】
（回収工程）
本発明の特定細胞株の樹立方法において、回収工程とは、前記培養された細胞のうち、Rb遺伝子、p107遺伝子、及びp130遺伝子がそれぞれ欠失している遺伝子型を有する細胞を回収する工程である。
回収方法は特に制限されるものではない。例えば、lox配列の下流にＧＦＰ遺伝子が挿入された遺伝子型を有する細胞を用いた場合は、ＧＦＰ遺伝子を発現している細胞を、ＧＦＰの蛍光を利用したフローサイトメトリーを使用すること等で特定遺伝子欠失遺伝子型を有する細胞を高純度で回収することができる。
【００２７】
本発明における回収工程は、上述のフローサイトメトリー等を使用して、細胞培養工程により得られる培養された細胞から本発明の特定細胞株を直接選別して回収する工程であってもよいが、細胞培養工程により得られる培養された細胞から特定遺伝子欠失遺伝子型を有する細胞を選別する工程、特定遺伝子欠失遺伝子型を有する細胞を単離する工程等をさらに含んでいてもよい。ここで、特定遺伝子欠失遺伝子型を有する細胞を選別する方法や、特定遺伝子欠失遺伝子型を有する細胞を単離する方法は、特に制限されるものではない。例えば、蛍光顕微鏡下でコロニーを選別する方法等を準用することができる。
【００２８】
特定遺伝子欠失遺伝子型を有する細胞とは、Ｒｂ遺伝子、ｐ１０７遺伝子、及びｐ１３０遺伝子のいずれもが細胞内において機能を発現しない細胞であれば特に制限されるものではない。例えば、これらの遺伝子がそれぞれ、その一部もしくは全体が欠失、転座、逆位、ドミナントネガティブ等の変異を有するものであってもよく、これらの遺伝子以外における改変が施された結果としてこれらの遺伝子が不活性化したものであってもよい。
【００２９】
（その他の工程）
本発明の特定細胞株の樹立方法は、ベクター導入工程、細胞培養工程及び回収工程の他に必要に応じて他の工程を含むことができる。
他の工程としては、例えば、回収工程により得られた細胞をさらに培養する工程等が挙げられる。
【００３０】
＜中枢神経系神経細胞に由来する細胞株＞
本発明の中枢神経系神経細胞に由来する細胞株（以下、「特定細胞株」とも称する。）は、上述のベクター導入工程、細胞培養工程、及び回収工程を含む、中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法により樹立される。
特定細胞株を樹立するための、ベクター導入工程、細胞培養工程及び細胞回収工程は、中枢神経系神経細胞に由来する細胞株の樹立方法の項において前述した事項をそのまま適用する。
【００３１】
特定細胞株は、クローン化されており、かつ神経細胞の特徴を示し得る中枢神経由来の細胞株であるため好ましい。たとえば、中枢神経系神経細胞に対する効果を奏する薬剤のスクリーニング、中枢神経系神経細胞の処置の研究等において、好適に使用することができると考えられる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００３３】
（実施例１）
＜NeuroD1プロモーターのクローニング及びベクターの構築＞
【００３４】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーを合成し、野生型マウスtailDNAを鋳型としてPCRを行い、配列番号３に示される塩基配列を有するマウスNeuroD1プロモーター領域のcDNA配列を増幅した。増幅された標的配列を、TOPO TA cloning kit（Invitrogen製）を用いてプラスミド（Invitrogen製pCRII TOPOベクター）に組み込み、キットのプロトコルに従って作成したポジティブクローンからプラスミドを抽出した。このプラスミドをEcoRI及びBamHIで切断して前記標的配列を含む断片を得、当該断片をpMCS-Cre (Oshikawa et al., Development 140 (2013) p. 2310-2320)のEcoRIとBamHIサイトに組み込んだ。このようにして、NeuroD1プロモーターの下流にCreが位置する構成を有するプラスミドベクターであるpNeuroD1-Creを作製した。pNeuroD1-Creの構成の概略を図１に示す。
【００３５】
（実施例２）
＜大脳皮質に由来する神経細胞株の樹立＞
Rb遺伝子（配列番号４）及びp130遺伝子（配列番号５）がそれぞれlox配列で挟まれ且つp107遺伝子（配列番号６）が欠失した遺伝子型を有するマウス（Z/EG; Rb Lox/Lox; p107 -/-; p130 Lox/Lox）としてはMichael Dyer博士（セント・ジュード小児研究病院、米国）より提供されたもの（Oshikawa et al., Development 140 (2013) p. 2310-2320）を用いた。胎生14日目の当該マウス胎仔の大脳皮質組織に、本発明者らが報告済みのex vivoエレクトロポレーション法（Oshikawa et al., Development 140 (2013) p. 2310-2320）に従ってpNeuroD1-Creを遺伝子導入した。遺伝子導入後の切片を4日間組織培養した後に、トリプシンを用いて細胞を単離し、FACSソーター（BD社製FACSVantage SE）を用いてGFP陽性細胞（Rb-TKO細胞）を選別し、3×105個の細胞を回収した。回収した細胞を10cmディッシュに播種し、CO2インキュベーターで培養した。ここで細胞培養培地としては、Neurobasal培地（Invitrogen社製）にN2サプリメント（Invitrogen社製）、B29サプリメント（Invitrogen社製）、0.1%BSA、20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF, ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen社製）を加えたものを使用した（以下、この培地をNB培地と呼ぶ）。また10cmディッシュとしては、10%マトリゲル（BD Bioscience社製）を含むNB培地を入れ、氷上で30分間静置させてコートし、PBSで1回洗浄したものを使用した。
【００３６】
培養開始から3週間後に形成し始めた単一の細胞由来のコロニーを、シリコンリングを用いて隔離した。0.05%トリプシン-EDTA（Invitrogen社製）処理によってコロニーを回収し、マトリゲルでコートした48ウェルプレートに播種した。その後同様に、6ウェルプレートへの播種を行い、さらに10 cm ディッシュへの播種を行ってスケールアップした。こうして得られた単一の細胞由来の細胞株（クローン）をCE1N細胞と名付けた。
【００３７】
（実施例３）
＜免疫細胞染色＞
CE1N細胞をマトリゲルでコートしたカバーガラス上で48時間培養し、4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて4℃で1時間固定した。さらに2%正常ヤギ血清を用いて室温で1時間インキュベート（ブロッキング）し、一次抗体として1/1000希釈した抗DCX抗体（Abcam製ab18723、抗神経細胞マーカー抗体）を一晩反応させた。二次抗体としてAlexa Fluor 546 Goat Anti-Rabbit IgG（Invitrogen社製）を用いて一次抗体を可視化した。また、DAPIを用いてCE1N細胞中の核を染色した。
【００３８】
図２及び図３は位相差顕微鏡（Olympus製IX73）によりCE1N細胞を観察した透過光イメージング結果を表す写真である。図２は倍率100倍で撮影された写真でありCE1N細胞が神経突起を伸展させていることを示す。図３は、図２で撮影された領域の一部を倍率400倍で撮影した写真である。図４〜図６は、図３で観察された領域を蛍光顕微鏡（Olympus製IX73）により観察した蛍光イメージング結果を表す写真である。DAPIによる核染色写真（図４）、抗DCX一次抗体-二次抗体によるDCX染色写真（図５）、及びDAPI／抗DCX一次抗体-二次抗体の両方を検出した写真（図６）を解析した結果、CE1N細胞がニューロンのマーカーであるDCXを発現していることがわかり、CE1N細胞は大脳由来の幼若神経細胞であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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