(57)【要約】本発明は、変形性関節症（ＯＡ）に臨床的関連性をもつタンパク質発現プロフィールの同定および使用に関する。特に、本発明は、その発現がＯＡおよびＯＡ進行と相関するマーカータンパク質の本体を提供する。ＯＡの研究および／または診断において、ＯＡの進行の程度の決定において、ならびに処置養生法の選択および／またはモニタニリングにおいてこれらのタンパク質発現プロフィールを用いるための方法およびキットが記載される。本発明はまた、これらタンパク質またはこれらタンパク質をコードする核酸分子の発現を調節する薬物のスクリーニング、特に疾患改変ＯＡ薬剤の開発に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における変形性関節症を診断するための方法であって：
該被験体から得られた生物学的サンプルを提供する工程；
該生物学的サンプルにおいて、図１〜図７に列挙されたタンパク質からなる群から選択される複数のポリペプチド、そのアナログおよびフラグメントの発現のレベルを決定する工程であって、試験タンパク質発現プロフィールを得る工程；
該試験タンパク質発現プロフィールを、コントロールタンパク質発現プロフィールと比較する工程であって、ここで、該試験タンパク質発現プロフィールと、該コントロールタンパク質発現プロフィールとの差異が、該被験体における変形性関節症の存在、不在またはステージの指標である工程；および
該比較に基き、該被験体に対する診断を提供する工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルが、血液のサンプル、尿のサンプル、関節流体のサンプル、唾液のサンプルまたは滑液のサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが、滑液のサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、変形性関節症を有すると疑われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記決定する工程が、図７（Ａ）中に列挙されるタンパク質から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルを決定することを含み、そしてここで、前記試験タンパク質発現プロフィールと前記コントロールタンパク質発現プロフィールとの差異が、変形性関節症の存在の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記決定する工程が、図７（Ｂ）中に列挙されるタンパク質から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルを決定することを含み、そしてここで、前記試験タンパク質発現プロフィールと前記コントロールタンパク質発現プロフィールとの差異が、変形性関節症の存在の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記変形性関節症のステージが、初期変形性関節症または末期変形性関節症である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コントロールタンパク質発現プロフィールが、正常タンパク質発現プロフィールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記差異が、図１および図２に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加であり、そして該差異が、前記被験体における変形性関節症の存在の指標である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記差異が、図４および図５に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少であり、そして該差異が、前記被験体における変形性関節症の存在の指標である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記差異が、図１に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加であり、そして該差異が、前記被験体における初期変形性関節症の存在の指標である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記差異が、図２に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加であり、そして該差異が、前記被験体における末期変形性関節症の存在の指標である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記差異が、図４に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少であり、そして該差異が、前記被験体における初期変形性関節症の存在の指標である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記差異が、図５に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少であり、そして該差異が、前記被験体における後期変形性関節症の存在の指標である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記コントロールタンパク質発現プロフィールが、初期ＯＡタンパク質発現プロフィールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記差異が、図３に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加であり、そして該差異が、前記被験体における後期変形性関節症の存在の指標である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記差異が、図６に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少であり、そして該差異が、後期変形性関節症の存在の指標である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のポリペプチドの発現のレベルを決定する工程が、前記生物学的サンプルを、前記ポリペプチドの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの抗体に曝すことを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
図１〜図７に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチド配列の全部または一部とハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項２２】
被験体における変形性関節症を診断するための、請求項２０または請求項２１に記載の１つ以上の核酸分子の使用。
【請求項２３】
被験体における変形性関節症をステージ分けするための、請求項２０または請求項２１に記載の１つ以上の核酸分子の使用。
【請求項２４】
図１〜図７に提示されるタンパク質、そのアナログ、およびそのフラグメントからなる群から選択される複数のポリペプチドの発現レベル情報を含む、ＯＡ発現プロフィールマップ。
【請求項２５】
前記ＯＡ発現プロフィールマップが、正常個体、変形性関節症をもつ個体、初期変形性関節症をもつ個体、または後期変形性関節症をもつ個体から得られる生物学的サンプルの発現レベル情報を含む、請求項２４に記載のＯＡ発現プロフィールマップ。
【請求項２６】
前記生物学的サンプルが、血液のサンプル、尿のサンプル、関節流体のサンプル、唾液のサンプル、および滑液のサンプルからなる群から選択される、請求項２５に記載のＯＡ発現プロフィールマップ。
【請求項２７】
前記生物学的サンプルが、滑液のサンプルである、請求項２５に記載のＯＡ発現プロフィールマップ。
【請求項２８】
被験体における変形性関節症を診断および／またはステージ分けするためのキットであって、以下：
図１〜図７に提示されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチド、および
図１〜図７に提示されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子；からなる群から選択される少なくとも１つの生物マーカーの発現レベルを特異的に検出する少なくとも１つの試薬；ならびに
被験体において変形性関節症を診断およびステージ分けするために該キットを用いるための指示書、を備える、キット。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの試薬が、少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの試薬が、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクオチド配列に相補的な核酸プローブを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記核酸プローブが、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記核酸プローブが、基質表面上に固定化される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記指示書が、インビトロ診断製品における使用のための米国食品医薬品局によって要求される指示書を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３４】
抽出緩衝液／試薬およびプロトコール、増幅緩衝液／試薬およびプロトコール、ハイブリダイゼーション緩衝液／試薬およびプロトコール、免疫検出緩衝液／試薬およびプロトコール、および標識緩衝液／試薬およびプロトコールの１つ以上をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３５】
少なくとも１つの請求項２５に記載のＯＡ発現プロフィールマップをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３６】
システム中のＯＡ生物マーカーの発現を調節する化合物を同定するための方法であって：
図１〜図７に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチド、および
図１〜図７に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子：からなる群から選択される生物マーカーの発現のレベルを、該システムを該候補化合物に曝す前後に決定する工程；
該複数のレベルを比較する工程；および
該複数のレベルが異なる場合に、該ＯＡ生物マーカーの発現を調節する化合物として該候補化合物を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項３７】
前記システムが、細胞、生物学的流体、生物学的組織、または動物である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記候補化合物が：変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を増大する、変形性関節症における増加した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を減少する、初期変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を増大する、初期変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を減少する、後期変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を増大する、および後期変形性関節症における増加した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を減少することの１以上を実施する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法によって同定される、ＯＡ治療薬。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法によって識別されるＯＡ治療薬の少なくとも１つの有効量、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
被験体における変形性関節症を処置する方法であって、該被験体に、請求項３８に記載のＯＡ治療薬の少なくとも１つの有効量を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、２００５年６月１７日に出願され、そして「変形性関節症のタンパク質プロフィール」と題する仮出願番号第６０／６９２，０４０号の優先権を主張している。この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
筋骨格疾患は、世界中で数百万人の人々に影響し、そしてこの形態は、２０２０年までには５０を超える母集団の予測される倍化に起因して迅速に増加することが予期されている（非特許文献１）。筋骨格疾患は、莫大な健康管理支出および経済的生産性の損失を生じ、そしてそれ故、社会に対して巨大な影響力を有する。米国単独で、筋骨格疾患は、１９９５年には、２１４０億ドルの費用を有すると推定された（非特許文献２）。この千年紀の初期には、米国は、２０００〜２０１０年は、平均余命が増加するとき、世界の健康に対して有し得る、増加する影響力の整形外科疾患を強調し、そしてこれら疾患の理解を進め、そして改良され、費用効果的な処置を開発する目的とともに研究努力を促進することを試みる「骨および関節の１０年間」を宣言した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｏｎｅａｎｄｊｏｉｎｔｄｅｃａｄｅ．ｏｒｇ）。多くのタイプの筋骨格疾患が存在するが、変形性関節症は、世界中で医師によって遭遇される最も共通した慢性の筋骨格疾患障害の１つである。
【０００３】
変形性関節症（ＯＡ）は、関節軟骨の崩壊によって特徴付けられる非炎症性の関節疾患である。それは、指、首、肩、尻、膝、下部脊椎領域、および脚を含む、身体中の１つ以上の関節に影響し得る。ＯＡは、痛みを引き起こし得、そして可動性および下肢を重篤に損傷し得（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）、これらは、独立を維持する無能力および困難性に至り得る（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。ＯＡは加齢にともない：Ｘ線撮影法による変形性関節症の離間率は、３０歳以下の人々では１％より少ないが、年齢とともに増加し、罹患率は急激に上昇し、そして６５を超える個体では約８０％であることが見出された（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。停年後の集団に最も問題を引き起こす症状であるにもかかわらず、ＯＡはまた、米国およびヨーロッパにおける失業の最も高い原因であると見積もられている。年齢に加え、ＯＡと関連することが知られるリスク因子は、肥満、外傷損傷およびスポーツまたは職業ストレスに起因する酷使を含む。しかし、変形性関節症の正確な病因はなお未知である。
【０００４】
目下のところ、ＯＡの診断は、代表的には、放射線学検査、および局所的柔軟性、使用関連の痛み、骨または軟組織膨潤、関節不安定性、制限された関節機能、筋肉痙攣、および関節摩擦音（すなわち、裂け目または削合感覚）を含む臨床観察を基く。ＯＡの診断は、しばしば、医師の検査で示唆されるが、放射線学評価が、この疾患の診断を確認するか、またはこの疾患の重篤度を評価するために用いられる。ＯＡの放射線学的な顕著な特徴は、不均質な関節スペース損失、骨棘形成、嚢形成、および肋軟骨下硬化症を含む。これらの特徴的な特徴は、「重篤」または「後期」ＯＡのＸ線像に一般に存在するが、「初期」ＯＡをもつ患者は、骨変化、関節スペース狭窄および／または骨棘の放射線学的証拠を示さないかも知れず、この診断を不明瞭また確立することを困難にする。信頼性のある診断の不在下で、医師は、この疾患の経過の初期、すなわち、関節破壊の徴候が生じる前に介入することができない。磁気共鳴（ＭＲＩ）は、特に、膝のような大関節で、関節軟骨形態および組成の輪郭を描くために有用であり、そして放射線学では見えない軟骨欠損および関節の薄くなった領域を示し得る（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。しかし、この画像形成技法は、半月板裂け、または靱帯損傷のようなその他の損傷が診断目的のために除かれる必要がないのであれば、患者に対しては慣用的に実施されない。
【０００５】
目下のところ、ＯＡに対する治癒はなく、そして変形性関節症治療は、痛みの軽減、ならびに関節機能の改善および維持を取り扱う。さらに、最近のＣＯＸ−２インヒビターの使用中止の意味で、医師は、ＯＡの治療の彼らの選択がなお制限されている。ＯＡに対する疾患改善薬物の需要が、この流行し、かつ衰弱させる障害の根深い社会的および経済的影響の認識が広く広がったので、相当に増加した。しかし、このような薬物の臨床試験は、単純なＸ線を用いて観察された関節スペースにおける変化の評価に依存している（非特許文献１６）。関節軟骨損失によって引き起こされる変化は小さいので（１〜２ｍｍ／年）、検出可能な十分な変化が起こる前、そしてそれ故、薬物の効き目が評価され得る前に、最小限１年が必要である。
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｒｔａｒｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｉｎｊｕｒｉｅｓ、ａｎｄ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  １９９０  ａｎｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ２０２０、Ｃ．Ｊ．Ｌ．ＭｕｒｒａｙおよびＡ．Ｄ．Ｌｏｐｅｚ（編）、１９９６、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ
【非特許文献２】Ａ．Ｐｒａｅｍｅｒら、Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｔａｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ、第２版、１９９９、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ：Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ
【非特許文献３】Ｅ．Ｂａｇｇａら、Ａｇｅ  Ａｇｅｉｎｇ、１９９２、２１
【非特許文献４】Ｄ．Ｈａｍｅｒｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ、Ｄｉｓ．、１９９５、５４
【非特許文献５】Ｊ．Ｊｏｒｄａｎら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９７、２４
【非特許文献６】Ｓ．Ｍ．ＬｉｎｇおよびＪ．Ｍ．Ｂａｔｈｏｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．１９９８、４６：２１６〜２２５．
【非特許文献７】Ａ．Ａ．Ｇｕｃｃｉｏｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９４、８４：３５１〜３５８
【非特許文献８】Ｍ．Ａ．Ｇｉｇｎａｃら、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ｂ：Ｐｓｙｃｈｏｌ．Ｓｃｉ．Ｓｏｃ．Ｓｃｉ．２０００、５５：３６２〜３７２
【非特許文献９】Ｍ．Ｃ．ＣｏｒｔｉおよびＣ．Ｒｉｇｎｏｎ、Ａｇｉｎｇ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｅｓ．、２００３、１５：３５９〜３６３
【非特許文献１０】Ｒ．Ｃ．Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９８９、１６：４２７〜４４１
【非特許文献１１】Ｅ．ＢａｇｇｅおよびＰ．Ｂｒｏｏｋｓ、Ｄｒｕｇ  Ａｇｉｎｇ、１９９５、７：１７６〜１８３
【非特許文献１２】Ｎ．Ｊ．ＭａｎｅｋおよびＮ．Ｅ．Ｌａｎｅ、Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．、２０００、６１：１７９５〜１８０４
【非特許文献１３】Ｋ．ＯｔｔおよびＪ．Ｍｏｎｔｅｓ−Ｌｕｃｅｒｏ、Ｒａｄｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２、７４：２５〜４２
【非特許文献１４】Ｆ．ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＣ．Ｇｌａｓｅｒ、Ｓｅｍｉｎ．Ｍｕｃｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ．Ｒａｄｉｏｌ．、２００４、８：３２９〜３５３
【非特許文献１５】Ｇ．Ａ．Ｔｕｎｇ、Ｍｅｄ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｒ．Ｉ．、２００４、８７：１７２〜１７５
【非特許文献１６】Ｓ．Ａ．Ｍａｚｚｕｃａら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、１９９７、５：２１７〜２２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
明らかに、ＯＡおよびＯＡ進行の生物学的マーカーに対する大きな必要性が存在する。特に、この疾患の初期ステージで信頼性ある診断およびモニタリングを可能にし得、そして痛みおよび長期間の無能力化を潜在的に防ぐための初期の介入を許容する生物マーカー（バイオマーカー）が高度に所望される。また必要なのは、目下、放射線学的な変化の評価のために必要とされる１年より有意に短い時間フレームで、疾患改変ＯＡ薬物の効き目を評価し得る生物マーカーおよび設計アッセイシステムである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、変形性関節症に臨床的関連性をもつタンパク質発現プロフィールの使用に関する。特に、本発明は、タンパク質の本体を提供し、その発現が、ＯＡと、およびこの疾患の進行の異なる相と相関付けられる。これらのタンパク質の発現プロフィールは、ＯＡの診断およびステージ分けに適用され得る。診断の現存する方法と比較して、本明細書中に開示されるタンパク質プロフィールは、ＯＡおよびＯＡ進行のより確固とした特徴を構成し、そして適切な治療養生法の選択のためのより信頼性ある基礎を提供する。本発明はまた、これらの生物マーカーを標的にする薬物、特に、ＯＡの処置のための新たな治療薬の開発のためのスクリーニングに関する。
【０００８】
一般に、本発明は、図１〜７に列挙されるマーカータンパク質の発現プロフィールの使用を含む。
【０００９】
より詳細には、１つの局面では、本発明は、被験体における変形性関節症を診断するための方法を提供し、この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルを提供する工程；この生物学的サンプルにおいて、図１〜図７に列挙されたタンパク質からなる群から選択される複数のポリペプチド、そのアナログおよびフラグメントの発現のレベルを決定する工程であって、試験タンパク質発現プロフィールを得る工程；この試験タンパク質発現プロフィールを、コントロールタンパク質発現プロフィールと比較する工程であって、ここで、上記試験タンパク質発現プロフィールと、上記コントロールタンパク質発現プロフィールとの差異が、上記被験体における変形性関節症の存在、不在またはステージの指標である工程；およびこの比較に基き、上記被験体に対する診断を提供する工程を包含する。
【００１０】
上記生物学的サンプルは、血液または血液産物のサンプル、尿のサンプル、関節流体のサンプル、唾液のサンプルまたは滑液のサンプルであり得る。特定の好ましい実施形態では、上記生物学的サンプルは、滑液のサンプルである。本発明による複数のポリペプチドの発現のレベルの決定は、上記生物学的サンプルを、上記ポリペプチドの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの抗体に曝す工程を包含し得る。
【００１１】
特定の実施形態では、上記被験体は、ヒト、例えば、変形性関節症を有すると疑われる患者である。
【００１２】
特定の実施形態では、図７（Ａ）中に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントから選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルが測定され、そして上記試験タンパク質発現レベルと上記コントロールタンパク質発現プロフィールとの差異が、上記被験体における変形性関節症の存在の指標である。
【００１３】
その他の実施形態では、図７（Ｂ）中に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントから選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルが測定され、そして上記試験タンパク質発現プロフィールと上記コントロールタンパク質発現プロフィールとの差異が、変形性関節症のステージの指標である。このステージは、初期変形性関節症または後期変形性関節症であり得る。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明の診断方法で用いられるコントロールタンパク質発現プロフィールは、正常タンパク質発現プロフィールである。これらの方法では、図１および図２に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加が、被験体における変形性関節症の存在の指標である。図４および図５に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少は、被験体における変形性関節症の存在の指標である。図１に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加は、被験体における初期変形性関節症の指標である。図２に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加は、被験体における末期変形性関節症の指標である。図４に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少は、被験体における初期変形性関節症の指標である。図５に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少は、被験体における後期変形性関節症の指標である。
【００１５】
その他の実施形態では、本発明の診断方法で用いられるコントロールタンパク質発現プロフィールは、初期ＯＡタンパク質発現プロフィールである。これらの方法では、図３に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける増加が、被験体における後期変形性関節症の指標であり；そして図７に列挙されたタンパク質からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドの発現のレベルにおける減少が、後期変形性関節症の指標である。
【００１６】
別の局面では、本発明は、図１〜図７に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、およびこれらのポリヌクレオチド配列の全部または一部とハイブリダイズする核酸分子を提供する。また提供されるのは、被験体における変形性関節症を診断および／またはステージ分けするためのこれら核酸分子の使用である。
【００１７】
別の局面では、本発明は、図１〜図７に提示されるタンパク質、そのアナログ、およびそのフラグメントからなる群から選択される複数のポリペプチドの発現レベル情報を含むＯＡ発現プロフィールマップを提供する。このＯＡ発現プロフィールマップは、正常個体、変形性関節症をもつ個体、初期変形性関節症をもつ個体、または後期変形性関節症をもつ個体から得られる生物学的サンプルの発現レベル情報を含み得る。この生物学的サンプルは、血液または血液のサンプル、尿のサンプル、関節流体のサンプル、唾液のサンプル、および滑液のサンプルであり得る。
【００１８】
なお別の局面では、被験体における変形性関節症を診断およびステージ分けするためのキットを提供する。本発明のキットは、図１〜図７に提示されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチド、および図１〜図７に提示されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子；からなる群から選択される少なくとも１つの生物マーカーの発現レベルを特異的に検出する少なくとも１つの試薬；ならびに本発明の方法に従って、被験体において変形性関節症を診断および／またはステージ分けするためにこのキットを用いるための指示書を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、上記少なくとも１つの試薬は、上記ポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体を含む。その他の実施形態では、上記少なくとも１つの試薬は、上記少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクオチド配列に相補的な核酸プローブを含む。例えば、上記核酸プローブは、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドであり、そして基質表面上に固定化され得る。
【００２０】
上記キットは、インビトロ診断製品における使用のための米国食品医薬品局によって要求される指示書；以下の１つ以上：抽出緩衝液／試薬およびプロトコール、増幅緩衝液／試薬およびプロトコール、ハイブリダイゼーション緩衝液／試薬およびプロトコール、免疫検出緩衝液／試薬およびプロトコール、および標識緩衝液／試薬およびプロトコール、および／または上記に記載のような少なくとも１つのＯＡ発現プロフィールマップをさらに含み得る。
【００２１】
なお別の局面では、本発明は、システム中のＯＡ生物マーカーの発現を調節する化合物を同定するための方法を提供する。本発明の方法は：図１〜図７に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチド、および図１〜図７に列挙されたタンパク質、そのアナログおよびフラグメントからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子：からなる群から選択される生物マーカーの発現のレベルを、該システムを上記候補化合物に曝す前後に決定する工程；およびこれらのレベルが異なる場合に、上記ＯＡ生物マーカーの発現を調節する化合物としてこの候補化合物を同定する工程を包含する。
【００２２】
これらの方法で用いられるシステムは、細胞、生物学的流体、生物学的組織、または動物であり得る。
【００２３】
候補化合物は、変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を増大し得；変形性関節症における増加した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を減少し得；初期変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を増大し得；初期変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を減少し得；後期変形性関節症における減少した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を増大し得；および／または後期変形性関節症における増加した発現によって特徴付けられる生物マーカーの発現を減少し得るＯＡ生物マーカーの発現を調節する化合物として同定される。
【００２４】
本発明は、本発明のスクリーニング方法によって同定されるＯＡ治療薬、これらのＯＡ治療薬を含む薬学的組成物、およびこれらＯＡ治療薬の少なくとも１つの有効量を患者に投与することにより患者中の変形性関節症を処置する方法をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（定義）
明細書全体を通じて、以下の段落で規定されるいくつかの用語が採用される。
【００２６】
用語「被験体」、「個体」および「患者」は、本明細書では交換可能に用いられる。それらは、変形性関節症を罹患し得るヒトまたは別の哺乳動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギなど）をいうが、この疾患を有していても良いし、有さなくてもよい。多くの実施形態では、この被験体はヒトである。
【００２７】
用語「ＯＡを有すると疑われる被験体」は、１つ以上のＯＡの徴候指標（例えば、関節の痛み、局在化した柔軟性、骨または軟組織膨潤、関節不安定性、関節摩擦音）を提示するか、または（例えば、慣用の身体検査の間に）ＯＡについてスクリーニングされるいる被験体をいう。ＯＡを有すると疑われる被験体はまた、１つ以上のリスク因子（例えば、年齢、肥満、外傷損傷、スポーツに起因する酷使または職業的ストレス、家族歴）を有し得る。この用語は、ＯＡについて試験されていない個体、および（例えば、放射線学的検査に基く）初期診断を受けたが、ＯＡのステージが知られていない個体を包含する。
【００２８】
用語「変形性関節症ステージ」および「変形性関節症フェーズ」は、本明細書では交換可能に用いられ、そして疾患の進行または経過の程度をいう。本発明は、この疾患のステージを決定するための手段を提供する。特に、本明細書で提供される方法は、「温和」または「初期」ＯＡの、および「重篤」または「末期」ＯＡの検出を可能にする。当該技術分野で公知のその他のステージ分けシステムは、例えば、Ｍａｒｓｈａｌによって開発されたものを含む（Ｗ．Ｍａｒｃｈａｌｌ、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９６、２３：５８２〜５８４）。
【００２９】
本明細書で用いられるとき、用語「診断」は、個体が疾患または病気に罹患しているか否かを決定することを狙うプロセスをいう。本発明の文脈では、「ＯＡの診断」は、以下の１つ以上を狙うプロセスをいう：個体がＯＡに罹患しているか否かを決定すること、およびこの疾患のステージを決定すること（例えば、初期ＯＡまたは末期ＯＡ）。
【００３０】
用語「生物学的サンプル」は、本明細書では、その最も広い意味で用いられる。生物学的サンプルは、被験体（例えば、ヒト）から、または被験体の構成要素（例えば、組織）から得られ得る。このサンプルは、これとともに本発明の生物マーカーがアッセイされ得る任意の生物学的組織または流体からであり得る。頻繁に、このサンプルは、「臨床サンプル」、すなわち、患者に由来するサンプルである。このようなサンプルは、制限されないで、細胞を含んでも良いし、含まなくても良い体液、例えば、血液、尿、滑液、唾液、および関節流体；骨または軟骨からのような組織または微細ニードル生検サンプル；および既知の診断、処置および／または結果歴をもつ保管サンプルを含み得る。生物学的サンプルはまた、組織学的目的からとられた凍結サンプルのような組織の切片を含み得る。この用語、生物学的サンプルはまた、この生物学的サンプルを処理することにより派生する任意の材料を包含する。派生する材料は、制限されないで、このサンプルが単離される細胞（またはそれらの子孫）、このサンプルから抽出されるタンパク質または核酸分子を含む。この生物学的サンプルの処理は：濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などをの１つ以上を含み得る。
【００３１】
用語「正常」および「健常」は、本明細書では交換可能に用いられる。それらは、関節の痛みを含む任意のＯＡ症状を示さず、そして軟骨損傷またはＯＡと診断されていない個体または個体の群をいう。好ましくは、この正常個体（または個体の群）は、ＯＡに影響する薬物適用はなく、そして任意のその他の疾患と診断されていない。より好ましくは、正常個体は、試験されるべきサンプルが得られた個体と比較して、同様の性、年齢、身体嵩指数を有する。用語「正常」はまた、健常個体から単離されたサンプルを適任とするために用いられる。
【００３２】
本発明の文脈では、用語「コントロールサンプル」は、正常（すなわち、健常）である個体または個体の群から単離された１つ以上の生物学的サンプルをいう。コントロールサンプルはまた、ＯＡの特定ステージ（例えば、初期ＯＡまたは後期ＯＡ）と診断された患者または患者の群から単離された生物学的サンプルをいう。用語「コントロールサンプル」（または「コントロール」）はまた、正常と分類された１つ以上の個体、またはＯＡもしくはＯＡの特定ステージと診断された１つ以上の個体、またはＯＡの処置を受けていた１つ以上の個体のサンプル由来のデータの編集物をいい得る。
【００３３】
用語「ＯＡ生物マーカー」および「生物マーカー」は、本明細書では交換可能に用いられる。それらは、本発明によって提供され、そしてその発現プロフィールが、ＯＡおよび／またはＯＡの特定ステージの指標であることが見出されたタンパク質のセットから選択されるタンパク質をいう。用語「生物マーカー」はまた、本発明のマーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、およびこれらの核酸分子の一部分とハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【００３４】
本明細書で用いられるとき、用語「ＯＡの指標」は、生物マーカーに用いられるとき、ＯＡまたはＯＡのステージの特徴である発現パターンまたはプロフィールをいい、この発現パターンは、この疾患またはこの疾患の別のステージのない患者におけるより、（最小９５％の信頼性レベルを設定する慣用の統計学的方法を用いて決定されるとき）この疾患またはこの疾患の１つのステージにある患者で有意によりしばしば見出される。好ましくは、ＯＡの指標である発現パターンは、この疾患を有する患者の少なくとも６０％で見出され、そしてこの疾患を有さない被験体の１０％未満で見出される。より好ましくは、ＯＡの指標である発現パターンは、この疾患を有する患者の少なくとも７０％、少なくと７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上で見出され、そしてこの疾患を有さない被験体の１０％未満、８％未満、５％未満、２．５％未満、または１％未満で見出される。
【００３５】
本明細書で用いられるとき、用語「鑑別的に発現される生物マーカー」は、その発現レベルが、被験体（または被験体の集団）において、健常もしくは正常被験体（または健常もしくは正常被験体）におけるその発現レベルに対して異なる生物マーカーをいう。この用語はまた、その発現レベルがこの疾患の異なるステージ（例えば、温和もしくは初期ＯＡ、重篤もしはく末期ＯＡ）で異なる生物マーカーを包含する。異なる発現は、この生物マーカーの一時的または細胞発現パターンにおける、定量的、および定性的差異を含む。以下により詳細に記載されるように、鑑別的に発現される生物マーカーは、単独またはその他の鑑別的に発現される生物マーカーとの組み合わせは、診断、ステージ分け、治療、薬物開発および関連領域における種々の異なる適用で有用である。本明細書中に開示されるこれら鑑別的に発現される生物マーカーの発現パターンは、ＯＡおよびＯＡ進行のフィンガープリントまたは特徴として記載され得る。それらは、未知サンプルおよびそれらについてさらなる情報が求められるサンプルを比較し、そして特徴付けるための参照の点として用いられ得る。本明細書で用いられるとき、用語「発現の減少したレベル」は、本明細書中に記載される１つ以上の方法によって測定されるとき、発現における少なくとも１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の、あるいは発現における１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上の減少をいう。本明細書で用いられるとき、用語「発現の増加したレベル」は、本明細書中に記載される１つ以上の方法によって測定されるとき、発現における少なくとも１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の、あるいは発現における１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上の増加をいう。
【００３６】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書では交換可能に用いられ、そしてそれらの自然の（未変化）形態にあるか、または塩のとしてのいずれか、および非改変またはグリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化による改変されたいずれかである種々の長さのアミノ酸配列をいう。特定の実施形態では、このアミノ酸配列は、完全長のネイティブタンパク質である。その他の実施形態では、このアミノ酸配列は、この完全長タンパク質のより小さいフラグメントである。なおその他の実施形態では、このアミノ酸配列は、グリコシル単位、脂質、またはリン酸イオンのような無機イオンのような、アミノ酸側鎖に付着されるさらなる置換基、およびスルフヒドリル基の酸化のような、これら鎖の化学的変換に関する改変によって改変される。従って、用語「タンパク質」またはその相当する用語は、その特異的性質を変化しないような改変を受ける、完全長ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を含むことが意図される。特に、用語「タンパク質」は、タンパク質のイソ形態、すなわち、同じ遺伝子によってコードされるが、それらのｐＩもしくはＭＷ、またはその両方が異なる改変体を包含する。このようなイソ形態は、それらのアミノ酸配列が異なり得るか（例えば、代替スプライシングまたは制限的タンパク質分解の結果として）、または、それに代わって、差別的翻訳後改変から生じ得る（例えば、グリコシル化、アシル化、リン酸化）。
【００３７】
用語「タンパク質アナログ」は、本明細書で用いられるとき、完全長のネイティブタンパク質と類似または同一の機能を所有するが、このタンパク質のアミノ酸配列に類似または同一でるアミノ酸配列を必ずしも含む必要のないか、あるいはこのタンパク質の構造と類似または同一である構造を所有するポリペプチドをいう。好ましくは、本発明の文脈では、タンパク質アナログは、完全長のネイティブタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも３０％（より好ましくは、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３８】
用語「タンパク質フラグメント」は、本明細書で用いられるとき、第２のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５つのアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０のアミノ酸残基、少なくとも１５のアミノ酸残基、少なくとも２０のアミノ酸残基、、少なくとも２５のアミノ酸残基、少なくとも４０のアミノ酸残基、少なくとも５０のアミノ酸残基、少なくとも６０のアミノ酸残基、少なくとも７０のアミノ酸残基、少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも９０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸残基、少なくとも１２５のアミノ酸残基、少なくとも１５０のアミノ酸残基、少なくとも１７５のアミノ酸残基、少なくとも２００のアミノ酸残基、または少なくとも２５０のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。マーカータンパク質のフラグメントは、完全長のネイティブタンパク質の機能的活性を所有していても良いし、していなくても良い。
【００３９】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書では交換可能に用いられる。それらは、一本鎖または二本鎖形態のいずかにあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、そしてその他であることが陳述されていなければ、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で機能し得る天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含する。これらの用語は、合成のバックボーンをもつ核酸様構造、および増幅産物を包含する。
【００４０】
本明細書で用いられるとき、用語「発現レベルを特異的の検出する試薬」は、１つ以上の生物マーカー（例えば、本明細書中で提供されるマーカータンパク質、マーカータンパク質をコードするポリヌレオチド配列を含む核酸分子、またはこの核酸分子の少なくとも一部分とハイブリダイズするポリヌクレオチド）の発現レベルを検出するために用いられる１つ以上の試薬をいう。適切な試薬の例は、制限されずに、目的のマーカータンパク質に特異的に結合し得る抗体、目的のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ、または目的のポリヌクレオチド配列を特異的に増幅し得るＰＣＲプライマーを含む。用語「増幅する」は、本明細書では、広い意味で用いられ、増幅産物を創生／生成ことを意味する。「増幅」は、本明細書で用いられるとき、一般に、所望の配列、特にサンプルの配列の複数のコピーを生成するプロセスをいう。「コピー」は、テンプレート配列に完全に相補的な配列または同一であることを必ずしも意味しない。
【００４１】
用語「ハイブリダイズ」は、相補的塩基対合を経由する２つの一本鎖核酸の結合をいう。用語「特異的なハイブリダイゼーション」は、核酸分子が、特定の核酸配列に、ストリンジェントな条件（例えば、ハイブリダイズする鎖により低い程度の相補性をもつ競合者核酸の存在下）下で優先的に結合、二本鎖になる、またはハイブリダイズするプロセスをいう。本発明の特定の実施形態では、これらの用語は、試験サンプルからの核酸フラグメント（またはセグメント）が、特定のプローブに、例えば、これらプローブがアレイ上に固定化されるとき優先的に結合し、そしてその他のプローブにはより低い程度で結合するか、または全く結合しないプロセスをより詳細にいう。
【００４２】
用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、および「バイオチップ」は、本明細書では交換可能に用いられる。それらは、好ましくは、既知の配列の複数の核酸分子であるハイブリダイズ可能なアレイ要素の、基板表面上の配列をいう。各核酸分子は、基板表面上の別個のスポット（すなわち、規定された場所または割り当てられた位置）に固定化される。用語
「マイクロアレイ」は、視覚評価のために顕微鏡検査を必要とするようにミニチュア化されるアレイをより特定していう。
【００４３】
用語「プローブ」は、本明細書で用いられるとき、既知の配列の核酸分子をいい、これは、短いＤＮＡ配列（すなわち、オリゴヌクレオチド）、ＰＣＲ産物、またはｍＲＮＡ単離物であり得る。プローブは、試験サンプルからの核酸フラグメントがハイブリダイズする特異的ＤＮＡ配列である。プローブは、通常は水素結合形成による、１つ以上のタイプの化学的結合を通じて相補的または実質的に相補的な配列の核酸に特異的に結合する。
【００４４】
用語「標識され」、「検出可能な物質で標識」および「検出可能な成分で標識」は、本明細書では交換可能に用いられる。これらの用語は、例えば、ある実体（例えば、プローブ）が、その他の実体（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）への結合後に可視化され得ることを特定するために用いられる。好ましくは、この検出可能な物質または成分は、それが測定され得、そしてその強度が結合した実体の量に関連する信号を生成するように選択される。アレイを基礎にした方法では、この検出可能な物質または成分はまた、好ましくは、それが局在化した信号を生成し、それによって、アレイ上の各スポットからの信号の空間的解像を可能にするように選択される。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを標識する方法は、当該技術分野で周知である。標識されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、分光光度的に、光化学的に、生化学的に、免疫化学的に、電気的に、光学的に、または化学的手段によって直接的または間接的に検出可能である標識の取り込み、またはそれとの複合体化によって調製され得る。適切な検出可能な物質は、制限されないで、種々のリガンド、放射線核種、蛍光色素、化学発光物質、マイクロパーティクル、酵素、比色標識、磁性標識、およびハプテンを含む。検出可能な成分はまた、分子ビーコンおよびアプタマービーコンのような生物学的分子であり得る。
【００４５】
用語「ＯＡ発現プロフィールマップ」は、ＯＡの特定ステージ（例えば、疾患の不在、ＯＡ、初期ＯＡおよび末期ＯＡ）における生物マーカーのセットの発現レベルの表示をいう。このマップは、グラフ表示（例えば、紙またはコンピュータースクリーン上）、物理的表示（例えば、ゲルまたはアレイ）、またはコンピューター読み出し可能な媒体中に記録されるデジタル表示として提示され得る。各マップは、この疾患の特定の状況に対応し（例えば、疾患の不在、ＯＡ、初期ＯＡおよび末期ＯＡ）、そしてそれ故、患者サンプルに対する比較のためのテンプレートを提供する。特定の好ましい実施形態では、マップは、有意な数の正常個体、またはＯＡの同じステージの個体から得た複数のサンプルから生成される。マップは、一致した年齢、性および身体嵩指数（ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ）をもつ個体について確立され得る。
【００４６】
用語「コンピューター読み出し可能媒体」は、コンピュータープロセッサーに情報（例えば、データおよび指令）を記録または提供するための任意のデバイスまたはシステムをいう。コンピューター読み出し可能媒体の例は、制限されないで、ネットワーク上に媒体をストリーミングするための、ＤＶＤ、ＣＤ、ハードディスクドライバー、磁気テープおよびサーバーを含む。
【００４７】
用語「化合物」および「物質」は、本明細書では交換可能に用いられる。それらは、生物学的高分子（例えば、核酸、ポリペプチドまたはタンパク質）、有機または無機分子、または細菌、植物、真菌、もしくは動物（特に、ヒトを含む哺乳動物）、細胞または組織のような、任意の天然に存在するか、または天然に存在しない（すなわち、合成または組換え）分子をいう。この化合物は、単一の分子、または少なくとも２つの分子の混合物もしくは複合体であり得る。
【００４８】
用語「候補化合物」は、目的の活性について試験されるべき（上記で規定されるような）化合物また物質をいう。本発明のスクリーニング方法では、候補化合物は、本明細書中に提供される生物マーカーの１つ以上の発現レベルを調整（例えば、増加または減少する）それらの能力について評価される。特に興味深いのは、ＯＡをもつ患者の１つ以上の疾患指標生物マーカーの発現プロフィールを、この疾患の初期ステージに罹患した個体のそれ、または正常個体のそれにより類似した発現プロフィールに回復させ得る候補化合物である。このような化合物は、可能な「ＯＡ治療薬」である。
【００４９】
本明細書で用いられるとき、用語「有効量」は、その意図された目的（単数または複数）を満たすに十分である化合物または物質の量をいう。本発明の文脈では、この目的（単数または複数）は、例えば：少なくとも１つの本発明の生物マーカーの発現を調整すること；および／またはＯＡの発症を遅延または防ぐこと；および／またはこの症状の症状の進行、増悪、または悪化を遅延または停止すること；および／またはこの疾患の症状の改善をもたらすこと、および／またはこの疾患を治癒することであり得る。
【００５０】
用語「システム」および「生物学的システム」は、本明細書では交換可能に用いられる。システムは、少なくとも１つの本発明の生物マーカーを発現または含み得る任意の生物学的実体であり得る。本発明の文脈では、インビトロ、インビボ、およびエクスビボシステムが考慮され；そしてこのシステムは、細胞、生物学的流体、生物学的組織、または動物であり得る。例えば、システムは、生存被験体から（例えば、それは、血液を抜くことによるか、またはニードル生検によってであり得る）、または疾患被験体から（例えば、それは、解剖で得られ得る）派生し得る。
【００５１】
「薬学的組成物」は、本明細書では、本発明の少なくとも１つの化合物（すなわち、少なくとも１つの本発明の生物マーカーの発現の調節剤として本発明のスクリーニングによって同定される候補化合物）、および少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリアを含むとして規定される。
【００５２】
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、そしてそれが投与される濃度で宿主に過剰に毒性でないキャリア媒体をいう。この用語は、溶媒、分散媒体、被覆、抗細菌および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと）。
【００５３】
用語「処置」は、本明細書では、（１）ＯＡの発症を遅延または防ぐこと；または（２）この疾患の症状の進行、増悪、または悪化を遅延または停止すること；または（３）この疾患の症状の改善をもたらすこと；または（４）この症状を治癒することを狙う方法を特徴付けるために用いられる。処置は、予防または防止的作用のために、この疾患の発症前に投与され得る。それはまた、治療作用のために、この疾患の開始後に投与され得る。
【００５４】
（特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
上記で述べたように、本発明は、ＯＡの診断およびステージ分けのための改良されたシステムおよび戦略に関する。特に、本発明は、その発現がＯＡおよびＯＡ進行に相関することが見出された生物マーカーの本体を提供する。
【００５５】
Ｉ−生体マーカー
１つの局面では、本発明は、ＯＡの指標であるタンパク質のセットの本体を提供する。実験のセクションで詳述されるように、これらのタンパク質は、高スループットプロテオミクス技法を用いて同定された。
【００５６】
（タンパク質マーカー）本明細書中に提供されるタンパク質マーカーは、図１〜７に提示される表中に列挙される。
【００５７】
より詳細には、健常患者から、および初期ＯＡまたは末期ＯＡをもつ患者から得られた滑液のサンプルを分析することにより、本出願人らは、図７（Ａ）に列挙されるタンパク質が、正常／健常と初期ＯＡとの間、正常／健常と末期ＯＡとの間を区別することを見出した。本出願人らはまた、図７（Ｂ）に列挙されるタンパク質が、初期ＯＡと末期ＯＡとの間を区別することを見出した。
【００５８】
さらに、本出願人らは、初期ＯＡおよび末期ＯＡをもつ患者から得た滑液のサンプルが、正常個体から得た滑液のサンプルと比較して、図１および図２にそれぞれ列挙されるタンパク質の過剰発現（すなわち、増加した発現レベル）を示すことを見出した。
【００５９】
同様に、本出願人らは、初期ＯＡおよび末期ＯＡをもつ患者から得られた滑液のサンプルが、正常個体から得た滑液のサンプルと比較して、図４および図５にそれぞれ列挙されるタンパク質のより低い発現（すなわち、減少した発現のレベル）を示すことを見出した。
【００６０】
さらに、図３に列挙されたタンパク質は、末期ＯＡをもつ患者からの滑液サンプル中で、初期ＯＡをもつ患者から得た滑液サンプルと比較して増加したレベルの発現を示すことが見いだされ；その一方、図７に列挙されたタンパク質は、後期ＯＡをもつ患者からの滑液サンプル中で、初期ＯＡをもつ患者からの滑液サンプルと比較して減少したレベルの発現を示すことが見出された。
【００６１】
従って、図１〜図７に提示されるタンパク質の発現プロフィールは、ＯＡを診断するため、およびこの疾患の進行の程度を決定する（すなわち、この疾患のステージを決定する）ために用いられ得る。
【００６２】
（核酸マーカー）本発明によって提供されるその他のＯＡ生物マーカーは、上記に記載の本発明のタンパク質マーカー（またはそのアナログもしくはフラグメント）をコードするポリヌクレオチド配列、およびこれらの核酸分子の一部分とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。
【００６３】
（ＯＡ発現プロフィールマップ）この疾患の特定ステージ（例えば、健常被験体、ＯＡをもつ患者、初期ＯＡをもつ患者、および末期ＯＡをもつ患者）に罹患した個体からの生物学的サンプルを用いて得た所定のセットの生物マーカーの発現レベルに関する情報は、ＯＡ発現プロフィールマップを形成するためにグループ分けされ得る。好ましくは、ＯＡ発現プロフィールマップは、同じ疾患ステージをもつ多数の個体の研究から得る。特定の実施形態では、ＯＡ発現プロフィールマップは、一致した年齢、性、および身体指数をもつ個体からのサンプルを用いて確立される。各発現プロフィールマップは、未知の生物学的サンプルから生成された生物マーカー発現パターンに対する比較のためのテンプレートを提供する。ＯＡ発現プロフィールマップは、グラフ表示（例えば、紙またはコンピュータースクリーン）、物理的表示（例えば、ゲルまたはアレイ）あるいはコンピューター読み出し可能媒体中に記録されたデジタル表示として提示され得る。
【００６４】
ＩＩ−診断方法
当業者によって認識され得るように、その発現がＯＡと相関し、そしてこの疾患の異なるステージ間を区別し得る生物マーカーのセットは、未知の生物学的サンプルを同定／研究するために用いられ得る。従って、本発明は、ＯＡを有すると疑われる被験体から得られる生物学的サンプルを特徴付けるため、被験体中のＯＡを診断するため、および被験体中のＯＡの進行を評価するための方法を提供する。このような方法では、被験体から得られた生物学的サンプルについて決定された生物マーカーの発現レベルが、１つ以上のコントロールサンプル中のレベルに比較される。これらコントロールサンプルは、健常個体（または健常個体の群）から、ＯＡを罹患した個体（または個体の群）から、および／またはこの疾患の特定ステージ（例えば、初期ＯＡまたは末期ＯＡ）に罹患した個体（または個体の群）から得られ得る。上記で述べたように、目的の生物マーカーのコントロール発現レベルは、好ましくは、有意な数の個体から決定され、そして平均値または中間値が得られる。特定の好ましい実施形態では、調査される生物学的サンプルについて決定された発現レベルは、上記に記載のように、ＯＡについての少なくとも１つの発現プロフィールマップと比較される。
【００６５】
（生物学的サンプル）
本発明の方法は、任意のタイプの生物学的サンプルの研究に適用され得、１つ以上の本発明の生物マーカーがアッセイされることを可能にする。適切な生物学的サンプルの例は、制限されないで、尿、血液、関節流体、唾液、および滑液を含む。診断の本発明の方法の実施において用いられる生物学的サンプルは、被験体から収集された新鮮または凍結サンプル、既知の診断、処置および／または結果歴をもつ保管サンプルであり得る。生物学的サンプルは、例えば、被験体から血液を抜くこと、または微細ニードル吸引またはニードル生検を用いることによるような、任意の非侵襲的手段によって収集され得る。あるいは、生物学的サンプルは、例えば、外科的生検を含む侵襲的方法によって収集され得る。
【００６６】
特定の実施形態では、本発明の方法は、サンプルを処理することなく、または限られた処理とともにこの生物学的サンプル自体に対して実施される。
【００６７】
その他の実施形態では、本発明の方法は、単一細胞レベル（例えば、生物学的サンプルからの細胞の単離）で実施される。しかし、このような実施形態では、本発明の方法は、好ましくは、多くの細胞を含むサンプルを用いて実施され、ここで、アッセイは、サンプル中に存在する細胞の全体のコレクションに亘る発現を「平均する」。好ましくは、目的の生物マーカーのセットの発現を正確かつ信頼性よく決定するために十分な生物学的サンプルがある。複数の生物学的サンプルは、組織の代表的サンプリングを得るために、同じ組織／身体部分からとられ得る。
【００６８】
なおその他の実施形態では、本発明の方法は、生物学的サンブルから調製されたタンパク質抽出物に対して実施される。好ましくは、このタンパク質抽出物は、総タンパク質含量を含む。しかし、この方法はまた：膜タンパク質、核タンパク質、および細胞質ゾルタンパク質の１つ以上を含む抽出物に対して実施され得る。タンパク質抽出の方法は、当該技術分野で周知である（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｄ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｇら、第２版、１９９６、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｅ．Ｌ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ（編）、１９８９；「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｓ．Ｒｏｅ、第２版、２００１、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈ．Ａｈｍｅｌ、２００５、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）。多くの異なる、かつ多様なキットが、体液および組織からタンパク質を抽出するために用いられ得、そして、例えば、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販され入手可能である。従われるべきプロトコールを詳細に記載するＵｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅが、通常、これらのキットのすべてに含まれる。感度、処理時間およびコストは、キット毎に異なり得る。当業者は、特定の状況に最も適切なキット（単数または複数）を容易に選択し得る。タンパク質抽出物が得られた後、この抽出物中のタンパク質濃度は、好ましくは、定量化され得るタンパク質の信号を可能にするためにコントロールサンプルのそれと同じである値に標準化される。このような標準化は、測光法または分光測定法またはゲル電気泳動を用いてなされ得る。
【００６９】
なおその他の実施形態では、本発明の方法は、生物学的サンプルから抽出された核酸分子に対して実施される。例えば、ＲＮＡは、分析前にサンプルから抽出され得る。ＲＮＡ抽出の方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ」、１９８９、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）。体液または組織からのＲＮＡ単離の大部分の方法は、ＲＮａｓｅを迅速かつ効率的に不活性化するためにタンパク質変性剤の存在下での組織の破壊に基く。単離された総ＲＮＡは、次いで、タンパク質夾雑物からさらに精製され得、そして選択的エタノール沈殿、フェノール／クロロホルム抽出、次いで、イソプロパノール沈殿または塩化セシウム、塩化リチウムまたは三フッ化酢酸セシウムグラジエント遠心分離によって濃縮される。体液または組織からＲＮＡ（すなわち、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を抽出するためにキットもまた利用可能であり、そして例えば、Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、およびＱｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から市販され入手可能である。
【００７０】
特定の実施形態では、抽出後、ｍＲＮＡは増幅され、そしてｃＤＮＡに転写され、これは、次いで、適切なＲＮＡポリメラーゼによる複数ラウンドの転写のためのテンプレートとして供され得る。増幅方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ａ．Ｒ．ＫｉｍｍｅｌおよびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７、１５２：３０７〜３１６；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ」、１９８９、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、２００２、第５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号を参照のこと）。逆転写反応は、係留オリゴ−ｄＴプライマー、またはランダム配列プライマーのような非特異的プライマーを用いて、またはモニターされている各プローブに対するＲＮＡに相補的な標的特異的プライマーを用いて、または熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素またはＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病逆転写酵素）を用いて実施され得る。
【００７１】
（タンパク質発現レベルの決定）
本発明の診断方法は、一般に、被験体から得た生物学的サンプル中の複数のポリペプチドの発現レベルの決定を含む。本発明の方法の実施におけるタンパク質発現レベルの決定は、任意の適切な方法によって実施され得る（例えば、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＡ．Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｒｔｉｅｓ  Ｍａｎｎｕａｌ」、１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）。
【００７２】
（結合試薬）一般に、上記発現レベルは、被験体から単離された生物学的システムを、１つ以上のタンパク質マーカーのための結合試薬と接触すること；このサンプル中の、上記結合試薬に結合するポリペプチドのレベルを検出すること；およびこのサンプル中のポリペプチドのレベルを、コントロールサンプル中のポリペプチドのレベルと比較することにより決定される。本明細書中で用いられるとき、用語「結合試薬」は、本発明のタンパク質マーカーに特異的に結合するポリペプチドまたは抗体のような実体をいう。ポリペプチドに「特異的に結合する」実体は、このポリペプチドと検出可能なレベルで反応／相互作用するが、非関連配列または異なるポリペプチドの配列を含むペプチドと検出可能に反応／相互作用しない。
【００７３】
特定の実施形態では、上記結合試薬は、ペプチド成分を有するかまたは有さないリボソーム、ＲＮＡ分子、またはポリペプチドであり得る（例えば、タンパク質マーカーのポリペプチド配列を含むポリペプチド、そのペプチド改変体、またはこのような配列の非ペプチド模倣物）。
【００７４】
その他の実施形態では、上記結合試薬は、本発明のタンパク質マーカーに特異的な抗体である。本発明の方法における使用のための適切な抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、免疫学的に活性なフラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２フラグメント）、抗体重鎖、ヒト化抗体、抗体軽鎖、およびキメラ抗体を含む。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、フラグメントおよびキメラを含む抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて調製され得る（例えば、Ｒ．Ｇ．ＭａｇｅおよびＥ．Ｌａｍｏｙｉ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９８７、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７９〜９７頁；Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６：４９５〜４９７；Ｄ．Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８５、８１：３１〜４２；およびＲ．Ｊ．Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８３、８０：２０２６から２０３；Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８２、２９９：５９３〜５９６；Ａ．Ｃ．Ｎａｉｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８２、２９９；７３４〜７３６；Ａ．Ｊ．Ｃｚｅｒｎｉｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９１、２０１：２６４〜２８３；Ａ．Ｊ．Ｃｚｅｒｎｉｋら、Ｎｅｕｍｅｔｈｏｄｓ；Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＆Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１９９７、３０：２１９〜２５０；Ａ．Ｊ．Ｃｚｅｒｎｉｋら、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１９９５、６：５６〜６１；Ｈ．Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７：３９３７９〜３９３８７；Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８４、８１：６８５１〜６８５５；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８４、３１２；６０４〜６０８；Ｓ．Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５、３１４：４５２〜４５４を参照のこと）。本発明の方法で用いられるべき抗体は、当該技術分野で周知の方法によって精製され得る（例えば、Ｓ．Ａ．Ｍｉｎｄｅｎ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、１９９６、ＩＢＣ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ：Ｓｏｕｔｈｂｒｉｄｇｅ、ＭＡを参照のこと）。例えば、抗体は、タンパク質マーカーまたはそのフラグメントが結合されるカラム上の通過によりアフィニティー精製され得る。結合した抗体は、次いで、高塩濃度をもつ緩衝液を用いてこのカラムから溶出され得る。
【００７５】
調製されることの代わりに、本発明の方法で用いられるべき抗体は、科学的供給源または商業的供給源から得られ得る。
【００７６】
（標識された結合試薬）好ましくは、上記結合試薬は、検出可能成分で直接的または間接的に標識される。検出可能な試薬の役割は、タンパク質マーカー（またはそのアナログもしくはフラグメント）への結合試薬の結合により形成される複合体の可視化を可能にすることによって、上記診断方法の検出ステップを促進することである。好ましくは、この検出可能な試薬は、それが、測定され得、そしてその強度が、分析されるサンプル中に存在するタンパク質マーカーの量に関連する（好ましくは比例する）信号を生成するように選択される。ポリペプチドおよび抗体のような生物学的分子を標識するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ  Ｂ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９７４、Ｖｏｌ．３４、Ｗ．Ｂ．ＪａｋｏｂｙおよびＭ．Ｗｉｌｎｅｃｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；およびＭ．ＷｉｌｃｈｅｋおよびＥ．Ａ．Ｂａｙｅｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８、１７１：１〜３２を参照のこと）。
【００７７】
任意の広範な種類の検出可能な試薬が、本発明の実施において用いられ得る。適切な検出可能な試薬は、制限されないで：種々のリガンド、放射線核種、蛍光色素、化学発光試薬、マイクロパーティクル（例えば、量子ドット、ナノクリスタル、リン光体など）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで用いられるものなど、すなわち西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色定量標識、磁性ビーズ、およびビオチン、ジオシシゲニンまたは抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なその他のハプテンおよびタンパク質）を含む。
【００７８】
特定の実施形態では、この結合試薬（例えば、抗体）は、キャリアまたは支持体（例えば、ビーズ、磁性粒子、ラテックス粒子、マイクロタイタープレートウェル、キュベット、またはその他の反応ベッセル）上に固定化され得る。適切なキャリアまたは支持体材料は、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、リポソーム、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、斑糲岩（ｇａｂｂｒｏｓ）、フィルターペーパー、磁石、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラス、ポリアミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エレチン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルクなどを含む。結合試薬は、第１の結合試薬に特異的な第２の結合試薬を用いて間接的に固定化され得る（例えば、タンパク質マーカーに特異的なマウス抗体は、キャリアまたは支持体上に被覆されたヒツジ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃフラグメント特異的抗体を用いて固定化され得る）。
【００７９】
本発明の診断方法におけるタンパク質発現レベルは、免疫アッセイを用いて決定され得る。このようなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光免疫沈降、ラテックス凝集、血球凝集、および組織化学的試験であり、これらは、当該技術分野で周知の従来方法である。当業者によって認識され得るように、上記免疫アッセイは、競争的または非競争的であり得る。結合試薬のタンパク質マーカーとの結合によつて形成される複合体によって生成される信号の検出および定量の方法は、アッセイの、および検出可能な成分（例えば、蛍光成分）の性質に依存する。
【００８０】
あるいは、上記タンパク質発現レベルは、質量分析法に基く方法、またはタンパク質の検出のために当該技術分野で公知の方法に基く（標識されたリガンドの使用を含む）イメージを用いて決定され得る。その他の適切な方法は、プロテオミクスを基礎にした方法を含む。サンプル中のタンパク質の発現の全体的変化を研究するプロテオミクスは、代表的には以下のステップを含む：（１）電気泳動（１−Ｄ  ＰＡＧＥ）によるサンプル中の個々のタンパク質の分離、（２）ゲルから回収される個々のタンパク質の同定（例えば、質量分析法またはＮ−末端配列決定による）、および（３）生物情報（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いるデータの分析。
【００８１】
（ポリヌクレオチド発現レベルの決定）
上記で既に述べたように、本発明の診断方法は、本発明のタンパク質マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子のセットの発現レベルの決定を含み得る。本発明の方法の実施における核酸分子の発現レベルの決定は、制限されないで、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号、および同第６，０４０，１６６号；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｉｎｎｉｓら（編）、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＴ）、係留ＰＣＲ、競争ＰＣＲ（例えば、米国特許第５，７４７，２５１号を参照のこと）、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）（例えば、「Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、１９９７、９９〜１１５頁を参照のこと」）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＥＰ  ０１  ３２０  ３０８を参照のこと）、一側方ＰＣＲ（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８９、８６：５６７３〜５６７７）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、Ｔａｑｍａｎを基礎にしたアッセイ（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９１、８８：７２７６〜７２８０）、鑑別ディスプレイ（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１９９３、２１：３２６９〜３２７５を参照のこと）およびその他のＲＮＡフィンガープリンティング技法、核酸配列を基礎にした増幅（ＮＡＳＢＡ）およびその他の転写を基礎にした増幅システム（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号および同第５，５５４，５２７号を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼストランド置換増幅（ＳＤＡ）、修復鎖反応（ＰＣＲ）、ヌクレアーゼ保護アッセイ、サブトラクションを基礎にした方法、Ｒａｐｉｄ−ＳｃａｎＴＭなどを含む任意の適切な方法によって実施され得る。
【００８２】
生物学的サンプル中のポリヌクレオチド配列の検出における使用のための核酸プローブは、当該技術分野で公知の従来方法を用いて構築され得る。適切なプローブは、タンパク質マーカーをコードする核酸の領域からの少なくとも５つの連続アミノ酸をコードし、そして好ましくは１５〜４０のヌクレオチドを含む核酸配列に基き得る。核酸プローブは、結合試薬の場合に上記で述べたように、検出可能な成分で標識され得る。この核酸プローブと検出可能な成分との間の会合は、共有結合または非共有結合であり得る。検出可能な成分は、核酸プローブに直接的、またはリンカーを経由して間接的に付着され得る（Ｅ．Ｓ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、１９９５、９：１４５〜１５６）。核酸分子を標識するための方法は、当該技術分野で周知である（標識するプロトコール、標識検出技法およびこの分野における最近の発展の総説には、例えば、Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２、３９：１１４〜１２９；Ｒ．Ｐ．ｖａｎ  Ｇｉｊｓｗｉｊｉｋら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２００１、１：８１〜９１；およびＳ．Ｊｏｏｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４、３５：１３５〜１５３を参照のこと）。
【００８３】
核酸プローブは、上記タンパク質マーカーをコードするポリヌクレオチドを検出するためのハイブリダイゼーション技法で用いられ得る。この技法は、一般に、被験体から得た生物学的サンプルから単離された核酸分子を、核酸プローブと、この核酸プローブと上記核酸分子中の相補的配列との間で特異的ハイブリダイゼーションが生じ得る条件下で接触すること、およびインキュベートすることを含む。インキュベーションの後、ハイブリダイズしない核酸は除去され、そして上記プローブにハイブリダイズした核酸の存在および量が検出され、そして定量される。
【００８４】
タンパク質マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子の検出は、ＰＣＲのような増幅方法を用いる特異的ポリヌクレオチド配列の増幅、次いで、当該技術分野で公知の技法を用いる増幅された分子の分析を含む。適切なプライマーは、当業者によって慣用的に設計され得る。アッセイ条件下におけるハイブリダイゼーションを最大にするために、本発明の方法で採用されるプライマーおよびプローブは、タンパク質マーカーをコードする核酸の一部と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％そしてより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
【００８５】
本明細書に記載されるハイブリダイゼーションおよび増幅技法は、本発明のタンパク質マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子の発現の質的および量的局面をアッセイするために用いられ得る。
【００８６】
あるいは、各タンパク質マーカーをコードする核酸由来のオリゴヌクレオチドまたはより長いフラグメントが、マイクロアレイにおける標的として用いられ得る。それらの産生の多くの異なるアレイ形態および方法が当業者に公知である（例えば、米国特許番号第５，４４５，９３４号；同第５，５３２，１２８号；同第５，５５６，７５２号；同第５，２４２，９７４号；同第５，３８４，２６１号；同第５，４０５，７８３号；同第５，４１２，０８７号；同第５，４２４，１８６号；同第５，４２９，８０７号；同第５，４３６，３２７号；同第５，４７２，６７２号；同第５，５２７，６８１号；同第５，５２９，７５６号；同第５，５４５，５３１号；同第５，５５４，５０１号；同第５，５６１，０７１号；同第５，５７１，６３９号；同第５，５９３，８３９号；同第５，５９９，６９５号；同第５，６２４，７１１号；同第５，６５８，７３４号；および同第５，７００，６３７号を参照のこと）。マイクロアレイ技法は、大多数のポリヌクレオチド配列の定常状態の同時の測定を可能にする。現在広く用いられるマイクロアレイは、ｃＤＮＡアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイを含む。マイクロアレイを用いる分析は、一般に、このマイクロアレイ上の既知の位置に固定化された核酸プローブにハイブリダイズするサンプルからのｃＤＮＡ配列を検出するために用いられる標識されたプローブから受ける信号の強度の測定を基礎にする（例えば、米国特許第６，００４，７５５号；同第６，２１８，１１４号；同第６，２１８，１２２号；および同第６，２７１，００２号を参照のこと）。アレイを基礎にした遺伝子発現方法は当該技術分野で公知であり、そして多くの科学的刊行物および特許に記載されている（例えば、Ｍ．Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２７０：４６７〜４７０；Ｍ．Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６、９３：１０６１４〜１０６１９；Ｊ．Ｊ．Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９８、５１：３１３〜３２４；米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，４４５，９３４号；同第５，８０７，５２２号；同第５，８３７，８３２号；同第６，０４０，１３８号；同第６，０４５，９９６号；同第６，２８４，４６０号；および同第６，６０７，８８５号を参照のこと）。
【００８７】
（ＯＡ診断およびＯＡステージ分け）
一旦、（上記のように）分析されている生物学的サンプルの目的の生物マーカーの発現レベルが決定されると、それらは、１つ以上のコントロールサンプル中の発現レベルまたはＯＡについての少なくとも１つの発現プロフィールマップと比較される。
【００８８】
本発明の方法による発現レベルの比較は、好ましくは、得られた発現レベルが、アッセイされるサンプルの量における差異、および用いられるサンプルの質における変動（例えば、抽出されたタンパク質の量、または試験されたｍＲＮＡの量および質）の両方について矯正された後に実施される。矯正は、当該技術分野で周知の異なる方法を用いて実施され得る。サンプルのタンパク質濃度は、サンプルが分析される前に、例えば、（すでに上記で述べたように）測光法もしくは分光光度法またはゲル電気泳動を用いて標準化され得る。核酸分子を含むサンプルの場合、矯正は、同じサンプル中の参照遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）に対してレベルを正規化することによって実施され得る。あるいは、またはそれに加えて、正規化は、すべてのアッセイされた遺伝子またはその大きなサブセットの平均または中間信号（例えば、ＲＴ−ＰＣＲの場合にはＣｔ）に基き得る（グローバル正規化アプローチ）。
【００８９】
所定のセットの生物マーカーに対し、生物学的サンプルについて得られた発現パターンの、ＯＡの特定ステージについて確立された発現プロフィールマップに対する比較は、生物マーカー毎の正規化された発現レベルの比較、および／または複数の生物マーカーのセット内の発現レベルの比の比較を含み得る。さらに、分析されている生物学的サンプルについて得られた発現パターンは、発現プロフィールマップの各々（例えば、非ＯＡの発現プロフィールマップ、ＯＡの発現プロフィールマップ、初期ＯＡの発現プロフィールマップ、および末期ＯＡの発現プロフィールマップ）に対して、またはすべてのＯＡ発現プロフィールマップに基き作製された描写を規定する発現プロフィールマップに対して比較され得る。
【００９０】
（適切な処置の選択）
本明細書中に記載された方法を用いて、熟練医師は、本発明の生物マーカーの発現レベルの決定を通じて患者に提供された診断および疾患ステージ分けを基に、各々の個々の患者に適合された処置を選択および処方し得る。特に、本発明は、医師に、初期ＯＡを診断するための主観的でない手段を提供し、これは、介入がその最大の効果を有する可能性があるとき、痛みおよび長期間の無能力を潜在的に防ぎ、そして患者の生活の質を改善する初期の処置を可能にする。所定の患者のための適切な治療養生法の選択は、本発明の方法によって提供される診断／ステージ分けのみを基になされ得る。あいるは、医師はまた、ＯＡを診断し、そしてその進行を評価するために現存する方法で用いられるその他の臨床的または病理学的パラメーターを考慮し得る。
【００９１】
さらに、本発明によって提供されるＯＡ診断およびＯＡステージ分けは、軟骨破壊の徴候が見えないであろうとき、または関節スペース中の変化がＸ線画像上では検出可能ではないであろうときでさえ、この疾患の進行がモニターされることを可能にする。
【００９２】
ＩＩＩ−キット
別の局面では、本発明は、本発明の診断方法を実施するために有用な材料を含むキットを提供する。本明細書に記載される診断／ステージ分け手順は、診断試験所、実験試験所、または開業医によって実施され得る。本発明は、これらの異なるセッティングで用いられ得るキットを提供する。
【００９３】
本発明の方法に従って、生物学的サンプルを特徴付け、被験体中のＯＡを診断し、そして／または被験体中のＯＡをステージ分けするための材料および試薬は、キット中に一緒にアセンブルされ得る。特定の実施形態では、本発明のキットは、１つ以上の本発明の生物マーカーの発現レベルを特異的に検出する少なくとも１つの試薬、および本発明の方法に従ってキットを用いるための指示書を含む。各キットは、好ましくは、上記手順を詳細にする試薬を含み得る。従って、タンパク質マーカー（またはそのアナログまたはフラグメント）を検出／定量化するために、上記タンパク質の発現レベルを特異的に検出する試薬は、上記タンパク質マーカー（またはそのアナログまたはフラグメント）を特異的に結合する抗体であり得る。タンパク質マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出／定量化するために、発現レベルを特異的に検出する試薬は、このポリヌクレオチド配列に相補的な核酸プローブであり得る（例えば、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）。この核酸プローブは、基質表面（例えば、マイクロアレイ）上に固定化されて良いし、されなくても良い。
【００９４】
手順に依存して、上記キットは：抽出緩衝液および／または試薬、増幅緩衝液および／または試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または試薬、免疫検出緩衝液および／または試薬、標識付け緩衝液および／または試薬、および検出手段の１つ以上をさらに備え得る。この手順の異なるステップを実施するためのこれら緩衝液および試薬を用いるためのプロトコールが、このキット中に含められ得る。
【００９５】
これら試薬は、（例えば凍結乾燥された）固体または液体形態で供給され得る。本発明のキットは、必要に応じて、各個々の緩衝液および／または試薬について異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコまたは瓶）を備え得る。各成分は、一般に、その個々の容器中でアリコートされるとして適合されているか、または濃縮形態で提供される。開示される方法の特定ステップを実施するために適切なその他の容器もまた提供され得る。このキットの個々の容器は、好ましくは、商業的販売のための閉じた区画に維持される。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明のキットは、コントロールサンプルをさらに備える。その他の実施形態では、本発明のキットは、比較テンプレートとしての使用のために本明細書中に記載されたようなＯＡおよび／またはＯＡ進行の少なくとも１つの発現プロフィールマップを備える。好ましくは、この発現プロフィールマップは、コンピューター読み出し可能な媒体中に記録されたデジタル情報である。
【００９７】
本発明の１つ以上の方法に従うキットを用いるための指示書は、被験体から得た生物学的サンプルを処理するため、および／または試験を実施するための指示書、結果を解釈するための指示書ならびに製造、薬剤の使用もしくは販売または生物学的製品を規制する政府機関（例えば、ＦＤＡ）によって指示された形態の注意書を備え得る。
【００９８】
ＩＶ−候補化合物のスクリーニング
上記で注記したように、その発現プロフィールが、変形性関節症および変形性関節症進行と相関する本発明の生物マーカーは、（例えば、これらの生物マーカーの発現を阻害するか、または増大する化合物または物質を検出するためのスクリーニングを用いる）新たな治療薬の同定のための魅力的な標的である。従って、本発明は、変形性関節症を処置するため、または変形性関節症進行を調節するために潜在的に有用な化合物の同定のための方法を提供する。
【００９９】
本発明の方法は、少なくとも１つの本発明の生物マーカーを発現する生物学的システムを、候補化合物と、この候補化合物が上記生物マーカーの発現を調整し、それによって試験システムを得るに十分な条件下および時間の間インキュベートする工程；この生物学的システムを、この候補化合物の不在下で同じ条件下で、かつ同じ時間インキュベートする工程であって、それによってコントロールシステムを得る工程；上記試験システム中の生物マーカーの発現レベルを測定する工程；上記コントロールシステム中の生物マーカーの発現レベルを測定する工程；および上記試験システム中で測定された発現レベルが上記コントロールシステム中で測定された発現レベルより少ないか、またはより多い場合に、上記候補化合物が上記生物マーカーの発現を調整すると決定する工程を包含する。
【０１００】
（生物学的システム）本発明のアッセイおよびスクリーニング方法は、任意のタイプの生物学的システム、例えば、細胞、生物学的流体、生物学的組織、または動物を用いて実施され得る。特定の実施形態では、この方法は、ＯＡに起因して軟骨退化を示し得るシステム（例えば、動物モデル、または身体部分の全部または一部分、例えば膝）を用いて実施される。その他の実施形態では、上記方法は、少なくとも１つの本発明の生物マーカーを発現または含む生物学的実体（例えば、細胞、または血液、尿、唾液、もしくは滑液のサンプル）を用いて実施される。
【０１０１】
特定の好ましい実施形態では、本発明のアッセイおよびスクリーニング方法は、標準的な組織培養プラスチックウェア中で増殖され得る細胞を用いて実施される。このような細胞は、任意の承認された供給源由来のすべての適切な通常細胞および形質転換細胞を含む。好ましくは、細胞は、哺乳動物（ヒト、またはげっ歯類もしくはサルのような動物）起源である。より好ましくは、細胞はヒト起源である。哺乳動物細胞は、任意の器官または組織起源であり得（例えば、骨、軟骨、または滑液）、そして細胞が少なくとも１つの本発明の生物マーカーを発現する限り任意の細胞タイプであり得る。
【０１０２】
本発明の方法の実施で用いられる細胞は、原発細胞、二的細胞、または不死化細胞（例えば、確立された細胞株）であり得る。それらは、当該技術分野で周知の技法によって調製され得るか（例えば、細胞は、骨、軟骨または滑液から単離され得る）、または免疫学および微生物学の市販供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入され得る。あるいは、またはさらに、細胞は、遺伝子操作されて、例えば、目的の遺伝子を含み得る。
【０１０３】
本発明によるアッセイを実施するための特定の細胞タイプおよび／または細胞株の選択は、その発現が調整されるべき生物マーカーの性質、およびアッセイの意図される目的のようないくつかの因子によって支配される。例えば、一次薬物スクリーニング（すなわち、スクリーニングの最初のラウンド（単数または複数））のために開発されたアッセイは、好ましくは、確立された細胞株を用いて実施され、これらは、市販され入手可能であり、そして通常比較的増殖が容易であり、その一方、薬物開発プロセスの後期で用いられるアッセイは、好ましくは、原発細胞および二次細胞を用いて実施され、これらは、一般に、不死化細胞より、得ること、維持すること、および／または増殖することがより困難であるが、これらは、インビボ状況のためのより良好な実験モデルを代表する。
【０１０４】
本発明のアッセイおよびスクリーニング方法の実施で用いられ得る確立された細胞株の例は、線維芽細胞および／または骨由来の細胞株を含む。本発明のスクリーニング方法で用いられ得る原発細胞および二次細胞は、制限されないで、軟骨細胞および骨細胞を含む。
【０１０５】
本発明のアッセイで用いられる細胞は、標準的な細胞培養技法に従って培養され得る。例えば、細胞は、しばしば、滅菌環境中の適切な容器中、３７℃で湿潤化された９５％空気−５％ＣＯ２雰囲気を含むインキュベーター中で増殖される。容器は、攪拌された培養または静置培養を含み得る。種々の細胞培養培地は、子ウシ血清のような規定されない生物学的流体を含む培地を含んで用いられ得る。細胞培養技法は当該技術分野で周知であり、そして確立されたプロトコールは、多様な細胞タイプの培養について入手可能である（例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第２版、１９８７、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【０１０６】
特定の実施形態では、上記スクリーニング方法は、マルチウェルアッセイプレートの複数のウェル中に含まれる細胞を用いて実施される。このようなアッセイプレートは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）から市販され入手可能であり、そして、例えば、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルおよび１５３６ウェルのプレートを含む。
【０１０７】
（候補化合物）当業者によって認識されるように、任意の種類の化合物または作用剤が、本発明の方法を用いて試験され得る。候補化合物は、合成または天然化合物であり得；それは、単一分子または異なる分子の混合物または複合体であり得る。特定の実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の化合物を試験するために用いられる。その他の実施形態では、本発明の方法は、化合物のコレクションまたはライブラリーをスクリーニングするために用いられる。本明細書で用いられるとき、用語「コレクション」は、任意のセットの化合物、分子または作用剤をいい、その一方、用語「ライブラリー」は、構造的アナログである化合物、分子または作用剤の任意のセットをいう。
【０１０８】
細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態中にある天然化合物のコレクションは、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）から入手可能である。本発明の方法を用いてスクリーニングされ得る候補化合物のライブラリーは、調製されるか、または多くの会社から購入されるかのいずれかであり得る。合成化合物のライブラリーは、例えば、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＮＨ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）、およびＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から市販され入手可能である。候補化合物のライブラリーはまた、例えば、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｃｏｍｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｍｏｎｓａｎｔｏ／Ｓｅａｒｌｅ、およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＵｐＪｏｈｎを含む大きな化学会社によって開発され、そしてそれらから市販され入手可能である。さらに、天然のコレクション、合成により産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段により容易に改変される。化学的ライブラリーは、伝統的な自動化合成、ＰＣＲ、クローニングまたは所有の合成方法（例えば、Ｓ．Ｈ．ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ｓ．１９９３、９０：６９０９〜６９１３；Ｒ．Ｎ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３３：２０５９〜２０６０；Ｐ．Ｌ．Ｍｙｅｒｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７、８：７０１〜７０７）によって調製することが比較的容易である。
【０１０９】
変形性関節症の処置のための有用な作用剤は、複素環式化合物、ペプチド、糖類、ステロイドなどを含む、広範な種類のクラスの化学品内に見出され得る。特定の実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、小分子（すなわち、分子量＜６００〜７００Ｄａの化合物または作用剤）である化合物または作用剤を同定するために用いられる。
【０１１０】
本発明の方法によるライブラリーのスクリーニングは、「ヒット」または「リード」、すなわち、所望の、しかし最適化されていない生物学的活性を所有する化合物を提供する。有用な薬物候補の開発おける次のステップは、通常、ヒット化合物の化学的構造と、その生物学的または薬学的活性との間の関係の分析である。分子構造と生物学的活性とは、規定された生物学的終点に対する系統的構造改変の結果を観察することにより関係付けられる。第１ラウンドのスクリーニングから入手可能な構造−活性相関関係情報は、次に、小さな第２のライブラリーを生成するために用いられ得、これは、次により高い親和性をもつ化合物についてスクリーニングされる。臨床有用性のために要求されるすべての立体電子的、物理化学的、薬物動態学的、および毒物学的因子を充足するための生物学的に活性な化合物の合成改変を実施するプロセスは、リード最適化と呼ばれる。
【０１１１】
本発明のスクリーニング方法によって可能なＯＡ治療薬として同定される候補化合物は、同様に、構造−活性関係分析を受け得、そして化学的に改変されて改良された薬物候補を提供する。本発明はまた、これらの改良された薬物候補を包含する。
【０１１２】
（ＯＡ治療薬の同定および特徴付け）
本発明のスクリーニング方法において、候補化合物は、試験サンプル中の生物マーカーの発現レベルが、コントロールサンプル中の同じ生物マーカーの発現レベルより低いか、またはより大きい場合、少なくとも１つの本発明の生物マーカーの発現のモジュレーターとして同定される。
【０１１３】
本発明の方法を用いて得られる結果の再現性は、同じ濃度の同じ候補化合物を用いた１回以上の分析を実施することによって（例えば、細胞をアッセイプレートの１つ以上のウェルでインキュベートすることによって）試験され得る。さらに、候補化合物は、この化合物の性質およびその機構（単数または複数）の性質に依存して変動する濃度で有効であり得、変動する濃度の候補化合物が試験され得る（例えば、アッセイプレート中の細胞を含む異なるウェルで候補化合物の異なる濃度の添加による）。一般に、約１ｆＭ〜約１０ｍＭの候補化合物濃度が、スクリーニングのために用いられる。好ましいスクリーニング濃度は、約１０ｐＭと約１００μＭとの間である。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、１つ以上のネガティブまたはポジティブ制御化合物の使用をさらに含む。ポジティブ制御化合物は、スクリーニングアッセイで研究される少なくとも１つの生物マーカーの発現を調整することが知られる任意の分子または作用剤であり得る。ネガティブ制御化合物は、スクリーニングアッセイで研究される少なくとも１つの生物マーカーの発現に対し検出可能でない影響を有することが知られる任意の分子または作用剤であり得る。これらの実施形態では、本発明の方法は、上記候補化合物のポジティブまたはネガティブ制御化合物の調整効果（またはその不在）に対する調整効果を比較する工程をさらに包含する。
【０１１５】
当業者によって認識されるように、一般に、本発明のスクリーニング方法によって同定される化合物をさらに特徴付けることが所望される。例えば、候補化合物が、所定の細胞培養システム（例えば、確立された細胞株）中の特定の生物マーカーの発現のモジュレーターとして同定された場合、この能力を異なる細胞培養システム（例えば、原発細胞または二次細胞）中で試験することが所望され得る。あるいは、またはさらに、この候補化合物の、１つ以上のその他の本発明の生物マーカーの発現に対する影響を評価することが所望され得る。薬物動態学研究および毒物学研究を実施することもまた所望され得る。
【０１１６】
本発明のスクリーニング方法によって同定された候補化合物はまた、インビボの化合物の性質の決定を可能にするアッセイでさらに試験され得る。変形性関節症の適切な動物モデルは、当該技術分野で公知である。一般に、これらのモデルは、自然および誘導（手術による不安定または遺伝子操作）の２つのカテゴリーに入る。天然に存在するＯＡの動物モデルは、モルモット、マウスおよびＳｙｒｉａｎハムスターの膝関節で起こる。共通して用いられる手術による不安定性モデルは、モルモットおよびラットにおける中央半月板裂傷、ウサギにおける中央または側方部分的半月板切除術、イヌにおける中央部分的または総半月板切除術または前部十字形離断を含む。トランスジェニックモデルがマウスで開発されている。可能なＯＡ治療剤として同定された候補化合物を試験するために適切な変形性関節症の動物モデルの例は、制限されないで、Ｍ．Ｊ．ＰｏｎｄおよびＧ．Ｎｕｋｉ、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．、１９７３、３２：３８７〜３８８；Ｔ．Ｖｉｄｅｍａｎ、Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．、１９８２、５３：３３９〜３４７；Ｓ．Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９８３、１２：３４３〜３４９；Ａ．．Ｍ．Ｂｅｎｄｅｌｅら、Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９８７、２４：４３６〜４４３；Ｋ．Ｄ．Ｂｒａｎｄｔら、Ｊ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９１、１８：４３６〜４４６；Ｋ．Ｄ．Ｂｒａｎｄｔ、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、７３２：１９９〜２０５；Ｃ．Ｓ．Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、１９９４、１２：３３１〜３３９；Ａ．Ｇ．Ｆａｍら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、１９９５、３８：２０１〜２１０；Ｋ．Ｗ．ＭａｒｓｈａｌｌおよびＡ．Ｄ．Ｃｈａｎ、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９６、２３：３４４〜３５０；Ｈ．Ｊ．Ｈｅｌｍｉｎｅｎら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００２、４１：８４８〜８５６およびそれらの中に引用される参考文献；ならびにＪ．Ｌ．Ｈｅｎｒｙ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．、２００４、２６０：１３９〜１４５に記載される動物モデルを含む。
【０１１７】
Ｖ−同定されたＯＡ治療薬の薬学的組成物
本発明はまた薬学的組成物を提供し、これは、活性成分として、本明細書に開示される生物マーカーの少なくとも１つ、または生物マーカーの１つのセットの発現のモジュレーターとして本発明のスクリーニングアッセイによって同定された少なくとも１つの化合物の有効量を含む。この薬学的組成物は、当該技術分野で周知の方法を用いて処方され得る。このような組成物は、この活性成分（単数または複数）に加え、薬学的ビヒクルとして作用し、そして本明細書で「薬学的に受容可能なキャリア」と称される、少なくとも１つの薬学的に受容可能な液体、半流動体、または固体希釈剤、賦形剤または媒体を含む。
【０１１８】
本発明によれば、本発明の薬学的組成物は、本発明の１つ以上のＯＡ治療薬を活性成分として含み得る。あるいは、１つのＯＡ治療薬の有効量を含む薬学的組成物は、異なる本発明のＯＡ治療薬を含む薬学的組成物と同時にまたは逐次的に患者に投与され得る。
【０１１９】
本発明の別の実施形態では、本発明のＯＡ治療薬またはその薬学的組成物は、ＯＡの処置に用いられる従来の治療薬と連続的または組み合わせて投与され得る。このような治療薬は、アセトアミノフェノンのような痛み軽減剤；アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、およびケトプロフェンのような非ステロイド抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）；ＣＯＸ−２インヒビター；コルチコステロイド；サプリメントのグルコサミンおよびコンドロイチン硫酸の組み合わせ；およびカプサイシンを含む過カウンター局所処方物を含む。
【０１２０】
あるいは、または加えて、本発明のＯＡ治療薬、またはその薬学的組成物は、連続的に、または、粘性補填、手術、関節形成術（または関節補充手術）、関節固定術（または関節融合）、骨切り術、関節鏡検査および軟骨移植を含む変形性関節症の処置のための従来の治療養生法と組み合わせて投与され得る。
【０１２１】
ＶＩ−処置の方法
別の局面では、本発明は、変形性関節症の処置および／または予防のための方法を提供する。これらの方法は、ＯＡを罹患している被験体に、少なくとも１つの本発明の生物マーカーの発現を調整する化合物の有効量を投与する工程を包含する。この化合物は、当該技術分野で公知であり得、上記少なくとも１つの生物マーカーの発現のモジュレーターととして作用する。あるいは、この化合物は、本発明によって提供されるスクリーニング方法によってＯＡ治療薬として同定され得る。
【０１２２】
（被験体選択）本発明に従う処置を受けるために適切な被験体は、従来方法（例えば、放射線学的検査、臨床観察）を用いてＯＡと診断された個体、および本明細書中に提供される診断方法を用いてＯＡをもつと診断された個体を含む。適切な被験体は、この疾患のために先に伝統的な処置を受けていても良いし、または受けていなくても良い。
【０１２３】
（投与）本発明の方法に従う処置は、所定の時間の期間に亘り、単一の用量または複数の用量からなり得る。本発明のＯＡ治療薬、またはその薬学的組成物はまた、治療あたりデポー（ｄｅｐｏｔ）形態から放出され得る。投与は、注入（皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内など）、経口投与、局所投与、直腸投与、または舌下投与によるような任意の従来様式で実施され得る。
【０１２４】
有効な投薬量および投与養生法は、良好な医療実践および個々の患者の臨床状態によって容易に決定され得る。投与の頻度は、活性成分（単数または複数）の薬物動態学的パラメーターおよび投与の経路に依存する。最適な薬学的処方物は、投与の経路および所望の投薬量に依存して決定され得る。このような処方物は、投与される化合物の生理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボのクリアランスの速度に影響し得る。
【０１２５】
投与の経路に依存して、適切な用量は、体重、身体表面積、また器官サイズに従って算出され得る。適切な投薬量の最適化は、ヒト臨床試験で観察された薬物動態学データを考慮して、当業者によって容易になされ得る。最終投薬量養生法は、薬物の作用、例えば、薬物の比活性、患者の損傷の重篤度および応答性、患者の年齢、状態、体重、性および食事、任意の存在する感染の重篤度、投与の時間およびその他の臨床的因子を改変する種々の因子を考慮して、担当医によって決定される。研究が行われるにつれて、ＯＡの進行の種々のステージに対する適切な投薬量レベルおよび処置の持続時間に関するさらなる情報が出現する。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、本発明をなし、そして実施する好ましい様式のいくつかを記載する。しかし、これらの実施例は、例示目的のみのためであり、そして本発明の範囲を制限することは意味しないことが理解されるべきである。さらに、実施例中の説明が、過去形で提示されているのでなければ、テキストは、明細書の残りと同様に、実験が実際に実施されたか、またはデータが実際に得られたことを示唆することは意図されない。
【０１２７】
以下に提示される結果の大部分は、本出願人らにより、科学的刊行物、Ｒ．Ｇｏｂｅｚｉｅら、「Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｕｒｇ．、２００６、１４：３２５〜３３２、およびＲ．Ｇｏｂｅｚｉｅら、「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  Ｌａｔｅ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ  Ｓｙｎｏｖｉａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」に報告されており、これは、このＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに提示された。各々の科学的刊行物は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１２８】
（実施例１：プロテオミクスによるマーカータンパク質の同定）
（概説）
最近の研究は、血清、組織および滑液を含む複合体タンパク質流体のプロテオームを特徴付けるために質量分析法のパワーをまさに開発し始めた。しかし、この技術のＯＡおよびＲＡの研究への適用は、非常に限られている。本出願人によって提案されたプロジェクトは、少なくとも４つの患者集団：初期ＯＡをもつ患者、末期ステージＯＡ（または末期ＯＡ）をもつ患者、初期ＲＡをもつ患者、および末期ステージＲＡ（または末期ＲＡ）をもつ患者における肩および膝からの滑液のプロテオームを特徴付けるためにこの技法を採用する。これらの特徴付けは、ＯＡおよびＲＡについて別個のタンパク質プロフィールを決定するため、およびこれら疾患の妥当な病因論的候補タンパク質を同定するための努力において、これら疾患状態の各々の間にこれら疾患に特異的な定量的タンパク質プロフィールを決定することを可能にする。
【０１２９】
（提案された研究の場所）
この研究のためのサンプルは、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓおよびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの両方で収集された。これら２つの病院における整形外科手術中の集約的実践は、これら疾患の経過の全体でＲＡおよびＯＡ両方をもつ被験体を研究を研究するための多くの、そして広範な表出を可能にする。Ｐａｒｔｎｅｒｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ＯｆｆｉｃｅからのＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの認可を両方の病院でこの研究を行うために得た。
【０１３０】
さらに、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡにある、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＨＰＣＧＧ）との共同研究が、ＨＰＣＧＧのＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのディレクターであるＤａｖｉｄ  Ｓａｒｒａｃｉｎｏ、Ｐｈ．Ｄ．の指示の基、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いるタンパク質分離およびサンプルの処理にともなう彼らの専門知識を採用するために確立された。このＨＰＣＧＧは、最先端技術施設であり、そしてＨａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｐａｒｔｎｅｒｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、および多くの製薬会社間の３００百万ドルの援助の結果であり、その使命は、臨床医および科学者にゲノミクスおよびプロテオミクスへのアクセスおよび専門技術を提供することである。
【０１３１】
（研究される個体）
このパイロット研究は、４つの疾患群、すなわち：初期ＯＡ、初期ＲＡ、末期ＯＡおよび末期ＲＡの各々からの１５人の研究被験体、および以下の基準の包含および排除に合致する健常ボランティアである２０人の被験体に焦点をあてた。
【０１３２】
（統計学的分析）
患者（初期ＯＡ、初期ＲＡ、末期ＯＡ、末期ＲＡ；群あたり１５）の６０のサンプルサイズの膝および２０の非関節炎コントロールは、９０％の統計学的集合数（α＝０．００１、β＝０．１０）を提供し、複数比較および２−テイルのα−レベルのためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ手順（バージョン５．０、ｎＱｕｅｒｙ  Ａｄｖｉｓｏｒ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で変動の分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて質量分析法から同定されたタンパク質に関する有意な群の差異を検出する。
【０１３３】
（予備研究）
この予備研究の第１の目的は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて非関節炎の膝コントロールと比較したとき、初期および末期の原発性特発性のＯＡをもつ膝関節からのタンパク質プロィールを決定することであった。
【０１３４】
仮説：末期ＯＡをもつ膝関節の滑液からのタンパク質プロフィールは、初期ＯＡおよび非関節炎コントロールのそれらの両方とは異なる。
【０１３５】
原理的説明：先の研究は、ＯＡの発症中の種々のステージからのタンパク質の特徴付けは、疾患の経過の間で異なることを示した。タンパク質は、ゲノム発現の機能的単位であるので、疾患に影響する病因論的実体および細胞応答のメディエーターは、疾患の重篤度が進行するにつれて量、本体またはその両方が異なる可能性がある。さらに、非関節炎滑液は、多分ＯＡを起こすタンパク質を含まないので、この疾患における可能な病因論的作用剤と疑われる候補タンパク質は、非関節炎の関節液には存在しないであろう。
【０１３６】
アプローチ：コントロール群ならびに初期ＯＡおよび末期ＯＡ研究群中の患者の選択は、ＯＡの診断のためのＫｅｌｌｇｒｅｎおよびＬａｗｒｅｎｃｅ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍに基づき実施された。糖尿病、その他の炎症性疾患、関節内骨折または先の３ヶ月のステロイド注射、感染、血液疾患、または癌を含む複雑な医療歴をもつ患者は、このプロジェクトの研究群のいずれにも含めなかった。さらに、この研究のアーム（ａｒｍ）に含められた患者は、滑液の収集前４週間ＮＳＡＩＤ治療にはなかった。慢性関節リウマチの病歴をもつ患者は、この研究アームから排除され、このプロジェクトの最初の目的に適切である。
【０１３７】
詳細な包含または排除基準に合致する正常ボランティアは、ＩＲＢ認可プロトコールを用いるネガティブコントロールとしてこの研究に参加のための出願人の研究所内から勧誘された。これらの患者（受診者）は、年齢が３５歳未満で、そして重篤な膝の外傷、炎症性障害、コルチコステロイド使用、血液疾患、癌または血小板減少症の病歴を有さない。この年齢のカットオフは、軟骨軟化症の見える証拠を有し得る分子レベルに関してＯＡに向かって進行するものを含む亜臨床ＯＡをもつ患者を含む可能性を最小にするために任意に決定された。このコントロール群の各メンバーは、記録された臨床歴、含まれる膝のＸ線評価（ＡＰ／側方／日の出視野（ｓｕｎｒｉｓｅ  ｖｉｅｗｓ））、および出願人の研究所中の外来患者臨床領域中で実施された関節穿刺を有した。関節穿刺の間に収集された滑液は、液体窒素中に即座に急速凍結し、そして−１３５℃で貯蔵された。
【０１３８】
初期ＯＡ群は、出願人の部門に、半月板裂傷壊死組織切除のための選択的電気関節鏡膝手術を提示する患者の大きなプールの中から選択された。これらの関節からの滑液は、それらの手術のときにＩＲＢ認可プロトコールで「廃棄組織」として収集され、そして即座に液体窒素中に凍結され、そして−１３５℃で貯蔵された。末期ＯＡ群では、原発性特発性変形性関節症と診断され、そして出願人の施設で最初の総膝（ＴＫＲ）置換を提示している研究被験体の同様に大きな集団から連続的系列で選択された患者の中から類似の様式で滑液が回収され、そして処理された。
【０１３９】
非関節炎コントロールは、初期および末期ＯＡサンプルと同時に分析され、ランダムエラーを最小にした。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の後、候補タンパク質の定量のためのＩＣＡＴ手順が以下の方法に記載されるように実施された。
【０１４０】
方法：サンプル調製：各被験体からの滑液の１ｍＬを、マイクロＢＣＡ試験で総タンパク質濃度に正規化し、そして６Ｍ尿素、１００ｍＭ中炭酸アンモニウム、１％ＳＤＳ、中で希釈し、ジスルフィド結合をＤＴＴで還元し、そして得られる遊離のチオールを、ヨードアセタミドでアルキル化した。このサンプルを８倍希釈し、そしてトリプシンを基質に１００：１の酵素比で添加した。消化物をギ酸でクエンチし、そしてヒアルロン酸、尿素、およびＳＤＳをＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ＳＰカラム上で除去した。このカラムからの溶出液を凍結乾燥し、そしてＡｍｅｒａｓｈａｍ  ＡＫＴＡエクスプローラーＨＰＬＣワークステーション上の強カチオン交換を経由して分画した。ペプチドは、Ｍｏｎｏ  Ｓ  ５／５上で、ギ酸アンモニウムのグラジエントで、３０のペプチド含有フラクションに分離された。これらのフラクションを凍結乾燥し、そして１００μＬの５％アセトニトリル、０．１％ギ酸／水中に再懸濁し、そして内部ペプチド標準の混合物を添加した。
【０１４１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：最初の稼動のために、この調製物の７５μＬを、注文パックされた２５０ｃｍ×３０ｃｍ  Ｃ１８シリカパックキャピラリーＨＰＬＣカラム上に注入し、そしてマイクロスプレーインターフェースを経由して、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰプラスイオントラップＭＳ中に２．５時間のグラディエントに亘って溶出した。第２のＭＳ稼動は、第１のマイクロスプレー稼動から豊富度が低いペプチドの存在を示したサンプルについて実施された。これらの低レベルペプチドフラクションについて、１０μＬの同じフラクションが、第１のマイクロスプレー稼動から既に同定された質量のセグメント化された排除リストをもつ７５ｃｍ×１５ｃｍのＣ１８シリカパックカラム上に注入され、そして４時間に亘って分離された。
【０１４２】
分析：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：生データは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｅｇａｎ）を用いてペプチドに対して処理され、そしてＳｅｑｕｅｓｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて非重複タンパク質データベース（ＮＣＢＩ）に対してサーチした。不一致ペプチドフラグメントを、共通ペプチド改変のための質量シフトを用いて同じデータベースの連続的サーチに返送した。高ＭＳ／ＭＳイオンカウントを有し、そしてこのデータベース中の任意のタンパク質に「ヒット」しない任意の残りのペプチドを選択し、そしてＤｅ  ＮｏｖｏＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）に提示した。９９％以上の信頼性で６アミノ酸より大きい配列タグを生成するフラグメントパターンを、ｂｌａｓｔデータベースサーチングのために提示した。この反復アプローチは処理時間を節約し、そして先のヒットの有意さの希釈を防いだ。
【０１４３】
結果は、１のＲＳＰとともに、＋１に対して１．８より大きいＸＣｏｒｒ値を、＋２に対して２．５の、そして＋３に対して３．０の荷電ペプチドをスコアした。得られたペプチドは、Ｂｉｏｗｏｒｋ中で分析し、そして相対ピーク面積は、組み込みの面積計算機を用いて算出した。ＩＣＡＴ標識ペプチドは、Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて分析された。２５％を超える算出された平均ペプチド面積をもつペプチドを単離し、そしてさらなる分析のために次に回した。
【０１４４】
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）およびＷｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｔｅｓｔを、このデータを分析するために用い、そしてｐ＜０．００１をもつ信頼できる生物マーカーを同定した。
【０１４５】
（実施例２：初期および末期変形性関節症のための高度に感受性かつ特異的な候補タンパク質の同定：滑液プロテオーム分析）
方法
この研究のための実験デザインは、各々が初期および末期ＯＡとそれぞれ診断された２１人の患者の２つのコホートに対し、２０人の健常被験体［ＯＡなし］から、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、膝滑液を鑑別タンパク質プロフィール付けすることを含む。この研究のためのすべてのサンプルは、我々の第三ケア委託センター内の患者から収集した。我々の施設のＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄは、この研究のすべての局面を認可した。この研究に含めたすべての滑液サンプルは、膝関節からの獲得の後直ちに液体窒素中に急速凍結された。
【０１４６】
健常被験体。先行する８週間に、膝外傷、慢性の膝の痛み、先の膝手術、血液疾患、癌、軟骨石灰沈着症、コルチコステロイド注入、またはＮＳＡＩＤ使用の任意の病歴のない２０人の被験体を、それらの右／左膝の平面前部−後部、側方および日の出視野ｘ線のために集めた。全部で７８人の被験体を、これらの基準を基に我々の研究への参加を適任とした。関節穿刺を、我々の研究デザインのために必要な２０のサンプルを得るためにこれらの患者の各々に対して試みた。血液汚染がなく、そして最少５００μＬからなるサンプルをこの研究に含めた。
【０１４７】
初期ＯＡ被験体。４５歳が最年少である中央半月板の内側−第３裂傷の選択的関節鏡壊死組織切除を提示する２１人の患者からサンプルを獲得した。この内側−第３裂傷は、比較的無血管性であり、そしてそれ故、プロテオミック分析の間にＯＡに明白に関連するタンパク質発現を混乱させ得る炎症応答を生じる可能性は最も少ない。我々の研究には、臨床的に有意な膝外傷または感染、手術、血液疾患、癌、コルチコステロイド注入または軟骨石灰沈着症の先の病歴をもつ被験体は含めなかった。彼らの半月板裂傷の結果として、先のＮＳＡＩＤ使用は、妥当と思われる排除規準ではなかった。初期ＯＡの診断は、関節鏡により見える軟骨腐食の存在により関節鏡検査のときになされた。滑液は、サンプルの血液汚染を避けるように、関節鏡トロカール配置のときに獲得した。
【０１４８】
末期ＯＡ被験体。１つの滑液サンプルは、原発性特発性変形性関節症の診断のために選択的全体膝置換を提示された２１人の患者の各々から獲得された。排除規準は上記のものと同じであった。各患者は、平面放射線写真上で膝の３つすべての区画の記録された腐食を有していた。滑液は、血液汚染をさけるために関節切開の前に膝関節から獲得した。
【０１４９】
集合（ｐｏｗｅｒ）分析。管理された対をなす比較を３つの疾患クラス（ｎＮｏｒ＝２０、ｎＥＯＡ＝２１、ｎＬＯＡ＝１８）間で実施した。ここで、サイズがそれぞれ１８および２０の２つの疾患クラスは、これらクラス間の試験されたタンパク質生物マーカーの存在における５０％の相対的差異を検出するために０．０５レベルの有意差（α）で８０％の最小の統計学的集合（ｐｏｗｅｒ）を所有している。ゼロ仮説は、２つのクラスに試験された生物マーカーの存在に差異はないことである。
【０１５０】
滑液サンプルの還元／アルキル化および電気泳動。各サンプルを、電気泳動にかける前に溶解緩衝液中で還元し、そしてアルキル化した。各サンプルを、９の分子量領域に分画した。ゲル内トリプシン消化を各サンプルからの９のスライス上で実施した。トリプシン消化の２４時間後、ペプチドを抽出し、そして乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥物を質量分析法のためのローディング緩衝液中に溶解した。
【０１５１】
質量分析法。サンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ−ＦｉｎｎｉｇａｎからのＬＣＱ  ＤＥＣＡ  ＸＰプラスＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｘワークステーション上で分析（ｒｕｎ）する。各分析（２．５時間）には、各サンプルの半分が、Ｃ１８媒体でパックされた７５μｍ  ｉ．ｄ．×１８ｃｍカラム上で分離された。各サンプルの間で、５  Ａｎｇｉｏ  ｍｉｘ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）の標準で、カラム性能を確実にし、そして生じ得る可能の持ち越しを観察した。このＬＣＱは、１つのＭＳ走査および５つのＭＳ／ＭＳ走査とともに、トップ５つの形態で稼動される。
【０１５２】
質量分析法データの処理。６２人のヒト被験体（２０人の健常被験体（Ｎ）、２１人の初期変形性関節症（ＥＯＡ）、および２１人の末期変形性関節症（ＬＯＡ））が存在する。各ヒト被験体の臨床パラメーターは、上記に詳述される。
【０１５３】
スペクトルは、ヒトＲｅｆＳｅｑＨｕｍａｎ（ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に対し、ＳＥＱＵＥＳＴを用いてコンタミナントを付加しサーチした。酸化メチオニンおよびカルボキシアミドメチル化システインについては可変改変を許可した。データは、以下の規準（１）荷電状態１、２および３に対してそれぞれ１．５、２．５および３．０より大きいかまたは等しいＸｃｏｒｒ、（２）０．１より大きいΔＣｎおよび（３）１に等しいＲＳｐを用いてフィルター処理した。これらの規準をパスしたすべてのペプチドは、次いで、正確な一致についてストリングサーチでＲｅｆＳｅｑ中のすべてのヒトタンパク質配列に戻ってマップされた。各遺伝子について、各スライスについて、ペプチドの最小（重複を除く）セットを決定した。このリストは、降順にペプチドの総数によってソートされた。このリスト中の最初のペプチドアレイはクラスターとして規定され、そしてＮ−１比較が、等しかったか、または適正なサブセットであったか否かを決定することによりリスト中のその他のアレイ毎に対で比較された。ペプチドアレイが、等しかったか、または適正なサブセットであった場合、それは、クラスターに付加され、そしてリストから除去された。このプロセスは、すべての比較が終わるまで繰り返された。各クラスターについて、最大数のペプチド要素をもつ遺伝子が、クラスターを指定するために割り当てられた。このクラスター内の複数の遺伝子が、同じ数のペプチドを有する場合、このクラスターの代表として任意の要素が指定された。クラスター間で共有されるペプチドが同定され、そしてさらなる分析から除かれた。
【０１５４】
ペプチド面積は、６０の走査ウインドウでＢｉｏＷｏｒｋｓ  ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中の面積関数を用いて算出した。遺伝子面積は、クラスター内すべての特有のペプチドについて、各独立の分析物の面積の合計として算出された。最大面積が選択され、そして面積算出において用いられた。独立の分析物は、フィルタリング基準を通過するＳＥＱＵＥＳＴサーチ中で同定された荷電に対する特有の質量として規定される。
【０１５５】
特有のＧｅｎＩｎｆｏ受託番号（ＧＩ＃）をもつ１３５のタンパク質が、各サンプルを９のタンパク質ゲルスライスに分割して、６２のすべてのヒトサンプルについてＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって同定された。同じＧＩ＃をもつ１とカウントされた２つのタンパク質が、別個のゲルスライス中で検出された場合、そのときは、３４２のそのようなゲルで集中する要素があることに注目すべきである。このゲルで集中するカウントスキームを考慮することは、１つのタンパク質（その特有のＧＩ＃をもつ）は、別個のゲルスライス中でＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって検出される別個のペプチド配列に生物学的プロセスの間に分解され得るので合理的である。豊富度の２つの測定が、各ゲルスライス中で各検出されたペプチド／タンパク質について考慮された：面積および被写域（Ｃｏｖｅｒａｇｅ）である。この研究における豊富度の第１の測定である面積は、クラスター内のすべての特有のペプチドに対する各独立の分析物についての面積の合計をいう負でない実在数である。分析物面積は、６０の走査ウインドウでＢｉｏＷｏｒｋｓ  ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中の面積関数を用いて算出した。複数の面積が、所定の分析物について同定されたとき、最大の面積が選択され、そしてこの面積算出で用いられた。独立の分析物は、フィルタリング基準を通過するＳＥＱＵＥＳＴサーチ中で同定された荷電に対する特有の質量として規定される。豊富さの第２の測定である被写域は、遺伝子の長さによって分割される所定の遺伝子にマップされ得る非重複ペプチド残基の数をいう負でない領域数であり−同じペプチドが、しばしば複数回配列決定され、そして我々は、我々のサーチが、内部トリプシン切断部位をもつペプチドを同定することを可能にする。このデータセットは、それらのエントリーが面積または被写域のいずれかである、３４２らのゲルで集中されるタンパク質要素×６２のヒトサンプルの代数的マトリックスとして表現され得る。
【０１５６】
主成分分析。主成分分析（ＰＣＡ）を、６２のすべてのサンプルと、３４２のタンパク質プロフィールとの間の優勢な全体のサンプル変動を評価するために用い、そしてこのデータセットを、この全体のサンプル変動に最も影響する優勢な特徴の減少した数の点から要約した（Ｏ．Ａｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０００、９７：１０１０１〜１０１０６；Ａ．Ｔ．Ｋｈｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２００４、１８：６２９〜６４０；Ｊ．Ｍｉｓｒａら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００２、１２：１１１２〜１１２０）。ゲルで集中するタンパク質の豊富さの尺度としての面積で、最初の３つのＰＣのみで、全体のサンプル変動の９８．３３％を捕捉した。
【０１５７】
Ｗｉｌｃｏｎｘｏｎのランクサム試験。各タンパク質について、非パラメーターＷｉｌｃｏｘｏｎランクサム試験を用いて、任意の２つの別個のヒト疾患状態−Ｎ、ＥＯＡ、またはＬＯＡ−からのその豊富さ測定（面積および被写域）が共通の分布に由来するというゼロ仮説を試験した。このゼロ仮説は、ｐ＜０．０００００１について、すなわち、ｐ＜０．０００００１のとき拒絶され、特定のタンパク質は、上記２つの疾患状態間で区区別されて豊富であった。
【０１５８】
結果
サンプル間のプロテオミックプロフィール関係。６２のすべての滑液サンプル間のプロティオミックプロフィール関係を調査した。各サンプルを、３４２のゲルで集中するタンパク質プロフィールとして表した。全体のデータセットは、３４２−タンパク質×６２のヒトサンプルのマトリックスであり、エントリーとして面積ベースの測定をもつ。
【０１５９】
６２のすべてのヒトサンプルに対するＰＣＡを用い、３つのＬＯＡサンプルプロフィールが、残りの５９から統計学的に外にあることが観察された。これら３つの分離物は、引き続くデータ分析から除去され、このデータセットを、３４２−タンパク質×５９ヒトサンプルとして考慮するようにした。サンプル分散の９０．３５％を占めるサンプル分散の２つの最大かつ重要方向−主要成分１（ＰＣ１）および２（ＰＣ２）−にあるこのデータのＰＣＡは、図３に示される。健常被験体プロフィール（ｎ＝２０）は、ＥＯＡ（ｎ＝２１）プロフィールおよびＬＯＡ（ｎ＝１９）プロフィールよりプロティオミックではより均一であることが観察された。最大分散ＰＣ１の方向は、疾患状態と相関しているようである。顕著なことに、この非管理分析は、３４２−タンパク質プロフィールレベルでＥＯＡとＬＯＡとの間の明瞭な区別を示さなかった。
【０１６０】
健常  対  ＯＡプロティオミックプロフィールで区別される豊富さのタンパク質。
【０１６１】
健常群とＯＡ群との間で区別される豊富さ（面積測定による）であったタンパク質を、次いで、ここで調査した。ＯＡは、組み合わせたＥＯＡおよびＬＯＡサンプルから３つのＬＯＡ分離物を引いたものをいう。このＥＯＡ−ＬＯＡ統合は、全体のＥＯＡおよびＬＯＡプロティオミックプロフィール間では、区別の欠如を示す先行する非管理ＰＣＡによって正当化される。
【０１６２】
管理Ｗｉｌｃｏｘｏｎランクサム試験は、健常群とＯＡ群との間で有意に区別される豊富さをもつ（ｐ＜０．００００１）１５の特有のタンパク質を返した（図４を参照のこと）。この数学的アルゴリズムで用いられた小ｐ値は、より便利な技法を用いる選択的な将来の研究のために適切な管理可能な数に、候補タンパク質生物マーカーの数を減らすために任意に選択された。これら１５のタンパク質は、先行するＰＣＡにおけるＰＣ１およびＰＣ２中のトップ１００のサンプル分散−寄与遺伝子の中にある。３つのタンパク質の例外を除き、すべては、健常群よりＯＡにおいて有意により豊富である（図４を参照のこと）。
【０１６３】
生物マーカーの感度および特異性。上記の３つの比較−健常対ＥＯＡ、健常対ＬＯＡ、またはＥＯＡ対ＬＯＡ−の任意の１つの間で区別されて表現される１５のタンパク質について、各タンパク質の特異性および感度（それらの鑑別的発現）を算出した（図１３）我々は、健常  対  ＥＯＡ比較における例示のタンパク質Ｑについて特異性および感度を示す。２０人の健常サンプルおよび２０人のＥＯＡサンプル中のタンパク質Ｑの中間発言値をνＱと仮定し、しかも、Ｑレベルは、健常クラスと正に相関しているとする。２×２の密接関連テーブルを、各疾患クラス（健常またはＥＯＡ）中のサンプルの数およびνＱに対する各サンプル中のタンパク質Ｑの発現レベルをカウントすることにより形成する：
【０１６４】
【表１】
2008547006.tif 000002
感度は、（＃ＴＮ）／（＃ＴＮ＋＃ＦＰ）として規定し、その一方、特異性は（＃ＴＰ）／（＃ＴＰ＋＃ＦＰ）として規定した。これら１５の鑑別的に発現されるタンパク質の合わせた平均感度および特異性は、それぞれ、８４．５８％および８４．５８％である。しかし、候補タンパク質生物マーカーのこのパネルを用い、初期および末期ＯＡをそれぞれ同定するために９９％より大きい感度および特異性が達成され得る（図１３を参照のこと）。
【０１６５】
考察
現在、変形性関節症の初期検出のための臨床使用における生物マーカーはない。健常被験体および変形性関節症をもつ患者の膝からの滑液の現在の比較プロティオミック分析は、１５の鑑別的に発現されたタンパク質生物マーカーの同定を得た。高感度および特異性の両方を所有する単一の生物マーカーはないが、群としての生物マーカーのパネルは、それぞれ、ほぼ１００％の合わせた感度および特異性を示した。本発明者の知識では、この研究は、プロティオミクス分析を用いて同定された変形性関節症のための高感度および特異的候補生物マーカーの最初の成功した同定を示す。
【０１６６】
ＯＡおよび慢性関節リウマチ（ＲＡ）の生物マーカーの発見は、活発な研究および進行中の領域である。いくつかの候補生物マーカーが、変形性関節症について種々の技法をも用いて同定されている。これらの生物マーカーの最も有望な１つは、軟骨分解のためのマーカーＣＴＸ−ＩＩである。研究者は、この生物マーカーが、健常コントロールからＲＡおよびＯＡを区別する能力を有することを示した（Ｓ．Ｃｈｒｉｓｇａｕら、Ｂｏｎｅ、２００１、２９：２０９〜２１５）。その他の研究は、尿で軟骨分解を検出するこの候補生物マーカーの可能性を示した（Ｍ．Ｊｕｎｇら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００４、７１：７０〜７５）。この候補生物マーカーが、いくつかの研究が示したように（Ｓ．Ｃｈｒｉｓｇａｕら、Ｂｏｎｅ、２００１、２９：２０９〜２１５；Ｐ．Ｇａｒｎｅｒｏら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．、２００１、６０：６１９〜６２６）疾患の重篤度を定量的に追う場合、開発中の治療薬の効き目のモニターとして有用であり得る。ＣＴＸ−ＩＩは、１つの研究では、放射線学的疾患進行を予言することが示されている（Ｍ．Ｒｅｉｇｍａｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、２００４、５０：２４７１〜２４７８）。しかし、候補生物マーカーまたは尺度から臨床的に有用な生物マーカーに真に移行するために、感度、特異性および予想値が、大きな検証された患者集団で決定されることが重要である。
【０１６７】
ＯＡおよびＲＡのための可能な生物マーカーとして同定された別の重要なタンパク質は、軟骨オリゴマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）（Ｃ．Ｓ．Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、２００２、２０：９２〜１００；Ａ．Ｄ．Ｒｅｃｋｌｉｅｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｍ．、１９９８、４１：９９７〜１００６；Ｍ．Ｓｈａｒｉｆら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９５、３４：３０６〜３１０；Ｍ．Ｓｋｏｕｍａｌら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００３、３２：１５６〜１６１）。ＣＴＸ−ＩＩでのように、いく人かの研究者は、この候補生物マーカーは、血清中の疾患進行に従うレベルを有し得、そして放射線学的に関節破壊と関連することを報告した（Ｍ．Ｓｈｒｉｆら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｍ．、２００４、５０：２４７９〜２４８８；Ｖ．Ｖｉｌｉｍら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９７、３４１：８〜１６）。ＹＬＫ−４０は、末期ステージＯＡおよび活性ＲＡをもつ患者の血清および滑液中に見出される報告された能力をもつ別の候補生物マーカーである。それは初期ＯＡの間に見出されないことを示す証拠は、ＯＡのための可能な生物マーカーとしての候補性をアピールすることをはるかに低くする（Ｔ．Ｃｏｎｒｏｚｉｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．Ｄｉｓ．、２０００、５９：８２８〜２３１；Ｓ．Ｈａｒｖｅｙら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２０００、２９：３９１〜３９３；Ｊ．Ｓ．Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９６、３５：５５３〜５５９；Ｊ．Ｓ．Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９３、３２：９４９〜９５５）。別のタンパク質５Ｄ４のレベルは、ＯＡおよびＲＡ患者の滑液および血清中で減少することが報告され、示されている（Ａ．Ｒ．Ｐｏｏｌｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４、９４：３５〜３３；Ｍ．Ｓｈａｒｉｆら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９６、３５：９５１〜９５７）が、このデータは、ＯＡ患者における上昇したレベルを報告するその他の研究者と混乱している（Ｇ．Ｖ．Ｃａｍｐｉｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．、１９９１、３４：１２５４〜１２５９；Ｆ．Ｍｅｈｒａｂａｎら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．、１９９１、３４：３８３〜３９２）。ヒアルロナンと凝集する大きな分子であるアグレカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）はまた、可能な生物マーカーとして同定され、そして軟骨形成の指標と考えられている（Ｐ．Ｇａｒｎｅｒｏら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．２０００、４３：９５３〜９６８）。アグレカン８４６は、ＯＡ患者の滑液および軟骨内に高濃度で見出されている（Ｌ．Ｓ．Ｌｏｈｍａｎｄｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．、１９９９、４２：５３４〜５４４；Ａ．Ｒ．Ｐｏｏｌｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４、９４：２５〜３３；Ｇ．Ｒｉｚｋａｌｌａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９２、９０：２２６８〜２２７７）。アグレカン８４６の血清レベルは、ＯＡの最も末期の間に最高のレベルであると報告され（Ａ．Ｒ．Ｐｏｏｌｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４、９４：２５〜３３）、その一方、ＲＡ患者における研究からの関係は、これらの��ベルは、疾患のサブタイプとともに変動する（Ｍａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９５、１０７１〜１０７７）。本発明者らの予備データは、アグレカンを、初期および末期ＯＡの高度に感受性の候補生物マーカーとして、健常な関節炎でない膝の滑液内で最も高いレベルであるレベルで含む（図１３を参照のこと）。いくつかの軟骨分解産物およびＣＯＭＰは、質量分析計上の本発明者らのサンプルから同定されたが、それらは、一旦、本発明者らのデータの統計学的および数学的分析が実施されると、感度および特異性によって表されるように予測値を保持しなかった。
【０１６８】
本発明者らの研究からの変形性関節症サンプル中の細胞外システインプロテアーゼインヒビターであるシスタチンＡの不在は、シスタチンの下方制御を変形性関節症の発症にリンクした先の研究からの結果を確認する（Ｍ．Ａｂｒａｈａｍｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．、２００３、７０：１７９〜１９９；Ｂ．Ｌｅｎａｒｃｉｃら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ、１９８８、３６９  補遣：２５７〜２６１；Ｊ．Ｍａｒｔｅｌ−Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１９９０、８：３３６〜３４４；Ｖ．ＴｕｒｋおよびＷ．Ｂｏｄｅ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９１、２８５：２１３〜２１９）。この知見はまた、初期変形性関節症の発症におけるカテプシンの重要な役割を示唆する研究（Ｒ．Ａ．Ｄｏｄｄｓら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．、１９９９、４２：１５８８〜１５９３；Ｄ．Ｇａｂｒｉｊｅｌｃｉｃら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９０、２８：１４９〜１５３；Ｗ．Ｓ．Ｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．、２００２、４６：６６３〜６７４；Ｇ．Ｍ．Ｋｅｙｓｚｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．、１９９５、３８：９７６〜９８４；Ｙ．Ｔ．Ｋｏｎｔｔｉｎｅｎら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．、２００２、４６：９５３〜９６０；Ｊ．Ｐ．Ｍｏｒｋｏら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．Ｄｉｓ．、２００４、６３：６４９〜６５５）に対する支持を提供する。この仮説は、アグレカン−１を分解するカテプシンの機能的能力によってさらに支持される。ＯＡ滑液中のシスタチンプロテアーゼインヒビターの不在は、アグレカン−１およびその他の軟骨成分の分解を可能にし得、そしてそれによって、ＯＡの病因に寄与し得る。変形性関節症におけるカテプシン、シスタチンおよびアグレカンの間の正確な相互役割は、さらなる研究のための主題のままである。
【０１６９】
ＯＡに対する信頼性のある生物マーカーの開発は、少なくとも３つの様式でこの疾患の機構の処置および理解を改善することで発展に顕著に寄与し得る。第１は、この生物マーカーは、疾患の初期ステージにある変形性関節症を同定するための診断として用いられ得る。任意の疾患についてこの能力の生物マーカーを用いる臨床的衝撃は、一旦、それが同定されると、この疾患を治癒または停止する現存する治療薬の効き目に関連する。現在、ＯＡを処置するために用いられるいくつかの薬物があり、そしてそれらのいずれも、疾患進行を停止するか、臨床試験で関節破壊を逆行することは納得いくように示されていない。初期疾患の診断薬としてのＯＡ生物マーカーの役割は、関節破壊を逆行し、または疾患進行成熟を防ぐ治療薬の開発として増加して価値あるものとして増加する。初期ＯＡを検出する生物マーカーの第２のかつより即座の必要性は、治療介入の効き目のモニターとしての可能な使用のためである。ＯＡに対する薬物開発の最も高価な局面の１つは、特定の候補の薬学的治療が患者で有効かつ安全であるか否かを決定することに付随するコストと時間である。この困難性は、臨床研究で検証され、そしてそのレベルが疾患重得度を追うＯＡのための感受性かつ特異的生物マーカーの不在から生じる。ＯＡ生物マーカーの第３の重要な適用は、この疾患の臨床的サブクラスを規定するためにそれらを利用する可能性に関する。最近の研究および臨床的経験は、非炎症性関節炎について表現型が異なるサブクラスの存在を含む。しかし、これらの表現型について科学的に知られていることはほとんどなく、そしてこの疾患の初期ステージの間にＯＡのより攻撃的なサブタイプをもつ患者を臨床的に同定する方法はない。疾患の初期ステージの間にＯＡないのサブタイプを生化学的に区別する能力は、この障害の病態生理学への価値ある洞察に至り得、そして一旦有効な治療薬が開発されると臨床的決定をなすことを知らせ得る。
【０１７０】
本発明の研究、およびより便利な研究技法を用いるその他からの有望な結果にかかわらず、いくつかの重要な原理が、「疾患生物マーカー」の規定に関し、注意深い考慮が必要である。第１に、タンパク質またはタンパク質のセットが生物マーカーであるために、問題の遺伝子またはタンパク質は、２つ以上の生物学的状態間を鑑別する能力を証明する必要がある。この規準は、所定のタンパク質または遺伝子の単純な測定から生物マーカーを区別する。第２に、候補生物マーカーは、それを超えるか、またはそれ未満で疾患の存在を予見し得る閾値を検証する適切な臨床研究で検証される必要がある（Ｊ．ＬａＢａｅｒ、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００５、４：１０５３〜１０５９）。この方法での候補生物マーカーの検証は、臨床的に有用な試験としてのそれらの適用に向けて生体に重要なステップである。第３に、生物マーカーの疾患状態間を区別する能力は、予見値を示す必要がある（Ｊ．ＬａＢａｅｒ、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００５、４：１０５３〜１０５９）。候補生物マーカーとして特定のタンパク質を評価する最も多い公開された研究は、「ｔ検定」またはＡＮＯＶＡのいずれかを用いる、その統計的有意差を決定するために正常コントロールに対して所定の疾患状態における生物マーカーの平均値を比較する。この方法論は、良好な生物マーカーであるべき任意の所定の遺伝子またはタンパク質標的の定性に関して正道を逸脱した結論に至り得る。任意の候補生物マーカーの価値を評価する優れた方法は、その感度および特異性を決定することである。なぜなら、これらの統計学的ツールは、研究者が、相対的なタンパク質の豊富さが、試験された集団にかかわらず、２つの疾患を分離するために「十分に異なる」か否かを決定することを可能にするからである。これらの原理は、本発明者の研究のデザインに取り込まれ、予見値をもつ生物マーカーのパネルは、初期および末期ＯＡが識別され得るために、統計学的に有意差だけであるのではない。
【０１７１】
本研究からのデータの分析は、さらなる研究を必要とし得るＯＡ病態生理学の本発明者らの理解に関する２つのその他の可能な重要である含意を有している。第１に、ピーク面積を用いる主要な成分分析は、ＯＡコホート内に２つの別個の集団を示した。これらの別個の群は、初期および末期ＯＡの両方に存在した（図１１）。ＯＡコホートのために含める規準は、原発性特発性変形性関節症をもつ患者を識別するために設計されたので、この観察は、「原発性」変形性関節症が、事実、不均質疾患であることを示唆する。本発明者らの研究において各患者の医療歴および薬物療法記録の本発明者らの分析は、薬物療法、疾患または個体群統計学から得られるタンパク質発現について変動における任意の統計学的に有意な関係を同定できなかった。従って、これらの候補生物マーカーは、さらなる研究のために患者間のＯＡの特定のサブクラスを選択することで有用であり得る。第２に、本研究に由来するＯＡのためのこの候補生物マーカープロフィールは、変形性関節症の病理機構は、疾患の経過全体で分子レベルで有意に変化しないことを示唆する。初期および末期変形性関節症が、分子変化の進行によって表されるのであれば、本発明者らは、疾患進行をもつこれら２つの疾患群のタンパク質発現プロフィールにおいて分散を観察することを期待し得る。むしろ、ＯＡの病態生理学は、「ドロップボール」減少に似ているかも知れない。すなわち、関節炎の関節内の病態生理学的変化の連続的かつ不変サイクルが、多数月〜年の期間に亘って継続し、関節軟骨の破壊を生じ、表現型で末期ＯＡを生じる。
【０１７２】
本研究で提示されるＯＡの候補タンパク質生物マーカーは、予見的かつ臨床的に有用なＯＡ生物マーカーを同定することに向けて重要なステップを提示する。しかし、これらの候補生物マーカーのさらなる検証が、それらが臨床的に有用である得る前に必要であり得る。第１に、これらタンパク質の疾患特異的性能が、慢性関節リウマチのような疾患に対して決定される必要がある。第２に、年齢に合致した健常コントロール群が、これら候補生物マーカーの予見値が関節軟骨における年齢関連変化にかかわらず確立され得るように分析される必要がある。第３に、これら候補生物マーカーの臨床的有用性を最大にするために、尿および血液のような、より容易に接近可能な体液におけるそれらの性能が研究される必要がある。最後に、これらの候補生物マーカーの検証規準が首尾良く実施される場合、そのときは、多くの患者が迅速かつ同時に分析され得る、タンパク質マイクロアレイのような、より容易なアッセイプラットホームが開発される必要がある。
【０１７３】
（その他の実施形態）
本発明のその他の実施形態は、本明細書を考慮することから、または本明細書中に開示される本発明の実施から、当業者に明らかである。明細書および実施例は、例示のみとして考慮されることが意図され、本発明の真の範囲は、添付の請求の範囲によって示される。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、正常個体の滑液サンプルと比較して、初期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプル中で上方調節されることが見出された（ｐ＞０．００１）２６のタンパク質のリストを示す。
【図２】図２は、正常個体の滑液サンプルと比較して、末期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプル中で上方調節されることが見出された（ｐ＞０．００１）２６のタンパク質のリストを示す。
【図３】図３は、初期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプルと比較して、末期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプル中で上方調節されることが見出された（ｐ＞０．０５）１３のタンパク質のリストを示す。
【図４】図４は、正常個体の滑液サンプルと比較して、初期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプル中で下方調節されることが見出された（ｐ＞０．００１）１０のタンパク質のリストを示す。
【図５】図４は、正常個体の滑液サンプルと比較して、末期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプル中で下方調節されることが見出された（ｐ＞０．００１）６つのタンパク質のリストを示す。
【図６】図６は、初期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプルと比較して、末期変形性関節症をもつ患者の滑液サンプル中で下方調節されることが見出された６つのタンパク質のリストを示す。
【図７】図７（Ａ）は、初期変形性関節症と正常／健常サンプルとの間、または後期変形性関節症と正常／健常サンプルとの間を識別することが見出されたタンパク質のリストを示す。図７（Ｂ）は、初期変形性関節症と末期変形性関節症との間を識別することが見出されたタンパク質のリストを示す。
【図８Ａ】図８は、初期変形性関節症の候補生物マーカーのリストを示す。
【図８Ｂ】図８は、初期変形性関節症の候補生物マーカーのリストを示す。
【図８Ｃ】図８は、初期変形性関節症の候補生物マーカーのリストを示す。
【図９Ａ】図９は、末期変形性関節症の候補生物マーカーのリストを示す。
【図９Ｂ】図９は、末期変形性関節症の候補生物マーカーのリストを示す。
【図９Ｃ】図９は、末期変形性関節症の候補生物マーカーのリストを示す。
【図１０Ａ】図１０は、図７上に提示される表中に列挙されたタンパク質について得られた結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、図７上に提示される表中に列挙されたタンパク質について得られた結果を示す。
【図１１】図１１は、３４２すべてのタンパク質スポットの主要成分分析を示すグラフである（実施例２を参照のこと）。健常被験体  対  末期および初期変形性関節症についてタンパク質プロフィールの鑑別的発現が、この調べた分析技法を用いて観察される。
【図１２】図１２は、質量分析法からの総イオン電流を用いる生物マーカーの相対的定量の結果を示すグラフである（実施例２を参照のこと）。コントロールと「疾患」コホートとの間のカットオフ値を決定することは、「生物」マーカーとしてのタンパク質または遺伝子標的の確立に向かっての必要な基準の１つである。
【図１３】図１３は、Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎランクサム検定の結果を要約する表を示し、これは、健常群とＯＡ群との間で有意に鑑別できる豊富さをもつ（ｐ＜０．００００１、およびＰＣＡを用いるトップ１００ないのランク順序）特有のタンパク質を返答した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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