(57)【要約】細菌サンプルを入れる捕集培地；及び複数のバクテリオファージを含む細菌の検出捕集装置。前記バクテリオファージは、前記捕集培地上又はその中にある。各バクテリオファージは、出力波長で光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む。【選択図】図４
2008535480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌サンプルを受け入れる捕集媒体；及び
前記捕集媒体上又はその中に位置する複数のバクテリオファージを含み、各バクテリオファージは、１つの出力波長で光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む細菌の検出捕集装置。
【請求項２】
前記核酸は、蛍光を発する蛋白質をコードし、前記蛍光を発する蛋白質は、前記出力波長の光を発することによって１つの入力波長の光に応答する請求項１の細菌の検出捕集装置。
【請求項３】
前記蛍光を発する蛋白質は、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を含み；前記入力波長は３９５ｎｍであり、前記出力波長は５１０ｎｍであることを特徴とする請求項２の細菌の検出捕集装置。
【請求項４】
前記核酸は、発光基質の存在下において前記出力波長で光を発することができる化学発光する蛋白質をコードする請求項１の細菌の検出捕集装置。
【請求項５】
前記化学発光する蛋白質は、ルシフェラーゼであり、前記発光基質は、ルシフェリンである請求項４の細菌の検出捕集装置。
【請求項６】
前記バクテリオファージは、細菌の１つの菌株に感染すること及び／又はこれを溶解することに特異的である請求項１〜５の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項７】
前記細菌の菌株は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の菌株である請求項６の細菌の検出捕集装置。
【請求項８】
前記菌株は、ＭＲＳＡ株３、１５又は１６である請求項７の細菌の検出捕集装置。
【請求項９】
前記バクテリオファージは、ＮＣＩＭＢ９５６３として寄託された株であり、更に光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む請求項１〜８の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項１０】
前記細菌の菌株は、炭疽菌株である請求項１〜６の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項１１】
前記バクテリオファージは、炭疽菌ファージガンマであり、更に光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む請求項１０の細菌の検出捕集装置。
【請求項１２】
前記捕集媒体は、固体基質である請求項１〜１１の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項１３】
前記バクテリオファージは、前記基質に固定されている請求項１２の細菌の検出捕集装置。
【請求項１４】
前記バクテリオファージは、前記基質に共有結合により固定されている請求項１３の細菌の検出捕集装置。
【請求項１５】
前記バクテリオファージと前記基質との間の共有結合は、カップリング剤により補われている請求項１４の細菌の検出捕集装置。
【請求項１６】
前記基質は、ナイロン又はアミノ若しくはカルボキシ表面基を有するその他のポリマーを含み、かつ前記カップリング剤は、カルボジイミド又はグルタルアルデヒドであり；前記基質は、セルロース又はその他の水酸基含有ポリマーを含み、かつ前記カップリング剤は、ビニルスルホニルエチレンエーテル又はトリアジンを含み；或いは前記基質は、ポリエチレン又は同類のポリマーを含み、かつ前記カップリング剤は、コロナ放電又は過マンガン酸酸化を含む請求項１５の細菌の検出捕集装置。
【請求項１７】
前記バクテリオファージは、その尾部をつながずに、その頭部を介して固定されている請求項１３〜１６の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項１８】
前記基質は、プラスチック材料を含む請求項１２〜１７の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項１９】
更に、水性栄養培地、好ましくはグルコースを含む水性栄養培地を含む請求項１〜１８の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項２０】
更に、前記捕集培地を入れるための容器を含む請求項１〜１９の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項２１】
前記容器は、ＥＬＩＳＡプレートである請求項２０の細菌の検出捕集装置。
【請求項２２】
複数のバクテリオファージ株を含み、各株は異なる細菌の菌株に感染すること及び／又はこれを溶解することに特異的であり、各株のバクテリオファージは、異なる出力波長で光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む請求項１〜５の何れかの細菌の検出捕集装置。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れかの細菌の検出捕集装置を収容するソケット；及び前記ソケットの位置から前記出力波長の光を検出することができる光検出器を含む細菌の検出装置。
【請求項２４】
更に、前記ソケットの位置に前記入力波長の光を放出することができる光源を含む請求項２又は３に従属するような請求項２３の細菌の検出装置。
【請求項２５】
更に、前記出力波長での光の検出を表示するため前記光検出器と連絡したユーザーインターフェースを含む請求項２３又は２４の細菌の検出装置。
【請求項２６】
更に、前記光検出器と前記ユーザーインターフェースとの間に介在したプロセッサを含み、前記プロセッサは、経時で検出した出力波長での光の強度の変化を計算し、前記ユーザーインターフェースを介して強度の変化を表示するためのものである請求項２５の細菌の検出装置。
【請求項２７】
前記光検出器は、複数の異なる出力波長での光を検出することができる請求項２３〜２６の何れかの細菌の検出装置。
【請求項２８】
更に、請求項１〜２２の何れかの細菌の検出捕集装置を含む請求項２３〜２７の何れかの細菌の検出装置。
【請求項２９】
バクテリオファージが、細菌と結合することができ、それにより前記バクテリオファージの前記細菌との結合に応じてシグナルが生ずることを特徴とする細菌の検出のためのバクテリオファージの使用。
【請求項３０】
サンプル中の細菌を検出するための請求項１〜２２の何れかの細菌の検出捕集装置又は請求項２３〜２８の何れかの細菌の検出装置の使用。
【請求項３１】
下記工程を含むサンプル中の細菌を検出する方法：
ａ）前記サンプルを、１つの出力波長の光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含むバクテリオファージに露出し、その結果、前記サンプル中の細菌が前記バクテリオファージに感染し、かつ前記細菌において前記核酸が発現する工程；及び
ｂ）前記サンプルから前記出力波長で発せられた光を検出し、前記光の検出が細菌の存在を示す工程。
【請求項３２】
前記核酸は、蛍光を発する蛋白質をコードし、前記蛍光を発する蛋白質は、前記出力波長の光を発することによって１つの入力波長の光に応答し、前記方法は、更に、前記サンプルに前記入力波長の光を当てる工程を含む請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記核酸は、化学発光する蛋白質をコードし、前記方法は、更に、前記サンプルに化学発光基質を与える工程を含む請求項３１の方法。
【請求項３４】
前記バクテリオファージは、細菌の１つの菌株に特異的であり、前記出力波長での光の検出は、前記菌株の存在を示す請求項３１〜３３の何れかの方法。
【請求項３５】
前記菌株は、ＭＲＳＡ株、好ましくはＭＲＳＡ株３、１５又は１６である請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記菌株は、炭疽菌である請求項３４の方法。
【請求項３７】
前記バクテリオファージは、請求項１〜２２の何れかの細菌の検出捕集装置の一部である請求項３１〜３６の何れかの方法。
【請求項３８】
工程ａ）は、前記サンプルに関し前記基質をこすりつける工程を含む請求項３７の方法。
【請求項３９】
工程ａ）は、好ましくはグルコースを含む水性栄養培地中で、前記バクテリオファージに感染させた後、前記細菌を増殖させる工程をさらに含む請求項３１〜３８の何れかの方法。
【請求項４０】
工程ｂ）は、前記バクテリオファージが前記細菌に感染するときに、前記出力波長の光を検出することを含み、前記出力波長の光の強度が増大していることの検出が細菌の存在を示す請求項３１〜３９の何れかの方法。
【請求項４１】
前記サンプルは、複数のバクテリオファージの株に接触され、各株は異なる細菌の菌株に特異的であり、各株のバクテリオファージは、異なる出力波長で光を発することができる蛋白質をコードし、前記方法は、更に各出力波長で前記サンプルから発せられた光を検出する工程を含み、ある波長での光の検出が細菌の対応する菌株の存在を示す請求項３１〜４０の何れかの方法。
【請求項４２】
更に、前記バクテリオファージで前記サンプル中の細菌を死滅させる工程を含む請求項３１〜４１の何れかの方法。
【請求項４３】
ＮＣＩＭＢ９５６３として寄託された株のゲノムを有し、更に光を発する蛋白質をコードする核酸を含むバクテリオファージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルを採取する技術、及びそのサンプル中の細菌の存在を判定する技術に関する。建物の屋内において清浄かつ衛生的な環境を維持する過程の一環として、表面からサンプルを採取することに本質的に向けられる。本発明は、病院等の施設にとりわけ適用される。本発明はまた、そのような技術において使用することができる製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、最近のほとんどの抗生物質に抵抗性である種々の細菌である。ＭＲＳＡ微生物は一般に、健康な個体によって許容されうるが、すでに具合が悪い人間に移る場合には、この人間においてより重大な感染が引き起こされる場合がある。その結果、そのような微生物は、何ら問題を引き起こすことなく健康な個体によって保有されうるが、より無防備な人々がいるであろう病院又はその他の環境において、感染の重大な危険がある。ＭＲＳＡは、長期間皮膚及びその他の表面上に保持され、とどまりうるが、表面から表面へ容易に移動する。その結果、個体間で、及び感染しそうな個体へ直接的及び間接的に伝染されうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＭＲＳＡを検出するための現在の技術は、研究室培養プロセスを必要とし、典型的に２〜３日間かかるので、骨の折れるものである。そのような期間内に、各環境において、存在していた全てのＭＲＳＡが広範に広がることがある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一つの視点において、本発明は、増殖中又は休止中の何れかの形態にある細菌、限定されないがとりわけＭＲＳＡの存在を検出する時間を劇的に減少させることができる捕集技術に存する。本発明では、複雑な実験機器を使用することがなく、資格のある細菌学者の力添えを必要としない。本発明の技術は、対象となっている細菌を見つけて、これに付着するバクテリオファージを使用する。使用されるバクテリオファージは、蛍光を発する蛋白質をコードする核酸を含むが、当該蛋白質は、第一の波長の光に、第二の波長の光を発することによって、応答する。前記バクテリオファージが対象となっている細菌と接触すると、前記バクテリオファージは増殖する。その結果、増殖したバクテリオファージに第一の波長の光を当てると、第二の波長で発せられる光の量が増大する。これにより、光学的なプロセスによる細菌の存在の迅速な検出が可能となる。実際には、その光学的なプロセスは、対象となっている細菌が存在するかどうか確証を得るために第二の波長での発光（光の放出）を検出することのみが通常必要とされるように、制御されうる。
【０００５】
本発明の実施に際して、前記バクテリオファージに関し好ましい蛋白質は、波長３９５ｎｍの光を当てたときに波長５１０ｎｍの光を発する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である。何れの蛋白質が使用されても、前記バクテリオファージは、細菌の一つの菌株に特異的であるように選択され、ＭＲＳＡの菌株に特異的でありうる。本発明の特定事項であるが限定事項ではないＭＲＳＡのうち特に毒性のある菌株は、菌株３、１５及び１６である。
【０００６】
本発明の方法の実施に際して、選択されるバクテリオファージを、固体基質に配することができるが、好ましくは当該基質に固定する。固定化を、共有結合を生じさせることによって行ってもよく、典型的には、カップリング剤によって補ってもよい。バクテリオファージを含むウイルスの固体基質への固定化及び安定化は、ストラスクライド大学の名称で国際特許公報ＷＯ  ０３／０９３４６２号において考察されている。前記バクテリオファージは、好ましくはその尾部をつながずに、その頭部を介して固定される。
【０００７】
本発明の細菌の検出捕集装置にとって特に好ましい基質は：
１）ナイロン又はアミノ若しくはカルボキシ表面基を有するその他のポリマーであり、かつ前記カップリング剤が、カルボジイミド又はグルタルアルデヒドであるもの；
２）セルロース又はその他の水酸基含有ポリマーであり、かつ前記カップリング剤が、ビニルスルホニルエチレンエーテル又はトリアジンを含むもの；
３）ポリエチレン又は同類のポリマーであり、かつ前記カップリング剤が、コロナ放電又は過マンガン酸酸化を含むもの
である。
【０００８】
本発明の実施に際して、細菌を保有すると思われる典型的なサンプルは、表面であろう。そのような表面に、前記バクテリオファージを保持する基質をこすりつけることができ、その後当該基質（又は当該表面）に、第一の波長の光を当てて細菌の存在を判定することができる。しかしながら、前記細菌を保有すると思われるサンプルが液体の場合には、前記バクテリオファージを、単独で又は基質に付着した状態で液体に浸すことができ、その後前述のように光に露出される。前記細菌が増殖できるように前記バクテリオファージとの接触後にとにかく前記細菌サンプルを液体に浸すことには何らかの利益があるかもしれない。この目的に適した液体培地は、グルコース等の炭素源を含む水性栄養培地であろう。
【０００９】
本発明を実施することに関し、実際の検出工程では比較的簡単明瞭な光学技術が使用されうるということが理解されるであろう。前記バクテリオファージの蛍光又は蛍光の増大を、例えば光ダイオード又は光電子増倍管を用いて、観察することができ、細菌と接触させて増殖させる前の前記バクテリオファージの蛍光レベルと比較する以外に蛍光のレベルを定量する必要がない。この蛍光の初期レベルは比較的に低い可能性があるので、実質的な蛍光の同定は、対象となっている細菌が存在するかどうかを確かめるのに十分であることは明白であろう。
【００１０】
前記捕集装置自体も同様に、かなり簡単明瞭な装置でありうる。典型的には、その装置は、前記バクテリオファージを含ませるために基質が取り付けられるホルダーを備えるであろう。前記基質は、パッド（pad）又はスワブ（swab）の形態にすることができ、その取り付けは、皿（disc）又は環（annulus）等の適当な形状を選択することにより容易に行うことができる。この装置は、目的とする細菌を含むことが疑われるサンプル表面又は環境に基質を提示するための機器へ装着するための付着層（adhesive layer）を有することができる。
【００１１】
本発明の別の視点によれば、前記捕集技術を促進する手段が提供される。その手段は、選択されたバクテリオファージがその上に位置するカード等の試験体（test element）を含む。対象となっている細菌を保有することが疑われるサンプルに、スワブをこすりつけるが、次に当該スワブは、サンプルから採取された全ての細菌を特定のバクテリオファージと照合するため前記試験体にこすりつけられる。その後、前記試験体は、細菌と接触した結果、バクテリオファージにより生ずる蛍光が増大したかどうかを確認するであろうセンサーユニットに導入される。前記ユニットは、対応するシグナルを出し、処理が完了するであろう。前記サンプル中又はサンプル上に対象となっている細菌が存在した場合には、これが即座に明白になるであろう。前記処理は、ほんの数分で完了しうる。使用した試験体は、廃棄されうる。全ての検出された細菌が前記バクテリオファージとの接触により死滅したであろう試験の後に、前記試験体を廃棄することが安全である。
【００１２】
前記バクテリオファージを含む試験体には、対象となっている細菌との接触の際に前記バクテリオファージの増殖を促進させるべく栄養素の貯蔵槽（reservoir of nutrient）を含めることができる。例えば、前記試験体は、近傍若しくは一端から延長して形成され、かつ栄養素の貯蔵槽と連絡した溝（groove）又は管（channel）を有するカードであってもよい。しかしながら、通常、前記栄養素及びバクテリオファージは共に前記試験体上に固定されるであろう。溝又は管が形成されることは必須ではないが、そのような試験体は、対象となっている異なる細菌に異なるバクテリオファージを添加する複数の溝又は管を備えるよう形成されうる。栄養素の有り無しで、前記バクテリオファージは、例えば印刷技術によって、前記試験体上に固定した固着層（deposits）の形態で存在しうる。前記溝、管、又は固着層は、色分けされてもよい。
【００１３】
前記試験体を、グループ又はセットで作成してもよく、様々な細菌の菌株を検出する際に使用するため様々にチャージされた（charged）溝若しくは管を有する試験体又はカードの選択をすることができる。前記センサーを、各管又は溝からの蛍光をモニターするようにデザインすることができ、それによってどこに細菌が存在するかを検出するばかりでなく本質的に同一の検出プロセスで１以上のいくつかの異なる細菌の菌株を同定することもできる。前記試験体はまた、自身が保有しているバクテリオファージに関する情報ばかりでなく検討されているサンプルを与える個体又は部位の詳細、並びにその他の望ましい同定に関する情報も有しうる。この目的のため前記試験体に磁気ストリップ（magnetic strip）を組み込んでもよい。
【００１４】
本発明の一つの視点によれば、
細菌サンプルを受け入れる捕集媒体；及び
前記捕集媒体上又はその中にある複数のバクテリオファージを含み、各バクテリオファージは、１つの出力波長で光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む細菌の検出捕集装置が提供される。
【００１５】
好都合には、前記核酸は、蛍光を発する蛋白質をコードし、前記蛍光を発する蛋白質は、前記出力波長の光を発することによって１つの入力波長の光に応答する。
【００１６】
好ましくは、前記蛍光を発する蛋白質は、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を含み；前記入力波長は３９５ｎｍであり、前記出力波長は５１０ｎｍである。
【００１７】
これに代えて、前記核酸は、１つの発光基質の存在下において特定の出力波長で光を発することができる化学発光する蛋白質をコードする。
【００１８】
有利には、前記化学発光する蛋白質は、ルシフェラーゼであり、前記発光基質は、ルシフェリン（lucifern）である。
【００１９】
好都合には、前記バクテリオファージは、細菌の一つの菌株に感染すること及び／又はこれを溶解することに特異的である。
【００２０】
好ましくは、前記細菌の菌株は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の菌株である。
【００２１】
有利には、前記菌株は、ＭＲＳＡ株３、１５又は１６である。
【００２２】
これに代えて、前記細菌の菌株は、炭疽菌の菌株である。
【００２３】
有利には、前記捕集媒体は、固体基質である。
【００２４】
好都合には、前記バクテリオファージは、前記基質に固定される。
【００２５】
好ましくは、前記バクテリオファージは、前記基質に共有結合により固定される。
【００２６】
有利には、前記バクテリオファージと前記基質との間の共有結合は、カップリング剤により補われる。
【００２７】
好ましくは、前記基質は、ナイロン又はアミノ若しくはカルボキシ表面基を有するその他のポリマーを含み、かつ前記カップリング剤は、カルボジイミド又はグルタルアルデヒドであり；前記基質は、セルロース又はその他の水酸基含有ポリマーを含み、かつ前記カップリング剤は、ビニルスルホニルエチレンエーテル又はトリアジンを含み；或いは前記基質は、ポリエチレン又は同類のポリマーを含み、かつ前記カップリング剤は、コロナ放電（corona discharge）又は過マンガン酸酸化（permanganate oxidation）を含む。
【００２８】
好都合には、前記バクテリオファージは、その尾部をつながずに、その頭部を介して固定される。
【００２９】
好ましくは、前記基質は、プラスチック材料を含む。
【００３０】
有利には、前記装置は、更に、水性栄養培地、好ましくはグルコースを含む水性栄養培地を含む。
【００３１】
好都合には、前記細菌の検出捕集装置は、更に、前記捕集媒体を入れるための容器を含む。
【００３２】
好ましくは、前記容器は、ＥＬＩＳＡプレートである。
【００３３】
有利には、前記装置は、複数のバクテリオファージ株を含み、各株は、異なる細菌の菌株に感染すること及び／又はこれを溶解することに特異的であり、各株のバクテリオファージは、異なる出力波長で光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む。
【００３４】
好都合には、前記装置は、ヒンジを介して接続された二つの薄板（sheet）を含む。好ましくは、前記薄板の一方は、細菌サンプルを入れるためのスライドカバー付き開口部（slide-covered aperture）を有する。有利には、両方の薄板は、これらの薄板が共にヒンジで折り畳まれるときに整合するように配されたスライドカバー付き開口部を有する。好都合には、前記少なくとも一方の薄板には、二つの薄板を接合するため粘着物（adhesive）が施される。
【００３５】
本発明の別の視点によれば、前記請求項の何れかの細菌の検出捕集装置を収容するソケット；及び前記ソケットの部位から前記出力波長で光を検出することができる光検出器を含む細菌の検出装置が提供される。
【００３６】
好都合には、前記細菌の検出装置は、更に、前記ソケットの部位において前記入力波長で光を放出することができる光源を含む。
【００３７】
好ましくは、前記細菌の検出装置は、更に、前記出力波長での光の検出を表示するため前記光検出器と連絡したユーザーインターフェースを含む。
【００３８】
有利には、前記細菌の検出装置は、更に、前記光検出器と前記ユーザーインターフェースとの間に介在したプロセッサを含み、前記プロセッサは、経時で検出した出力波長での光の強度の変化を計算し、前記ユーザーインターフェースを介して強度の変化を表示するためのものである。
【００３９】
好都合には、前記光検出器は、複数の異なる出力波長を検出することができる。
【００４０】
好ましくは、前記細菌の検出装置は、更に、前記細菌の検出捕集装置を含む。
【００４１】
本発明の更なる視点によれば、バクテリオファージが、細菌と結合することができ、それにより前記バクテリオファージの前記細菌との結合に応じてシグナルが生ずる細菌の検出のためのバクテリオファージの使用が提供される。
【００４２】
本発明の別の視点によれば、サンプル中の細菌を検出するための本発明の細菌の検出捕集装置又は本発明の細菌の検出装置の使用が提供される。
【００４３】
本発明の更に別の視点によれば、下記工程を含むサンプル中の細菌を検出する方法が提供される：
ａ）前記サンプルを、１つの出力波長の光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含むバクテリオファージに露出し、その結果、前記サンプル中の細菌が前記バクテリオファージに感染し、かつ前記細菌において前記核酸が発現する工程；及び
ｂ）前記サンプルから前記出力波長で発せられた光を検出し、前記光の検出が細菌の存在を示す工程。
【００４４】
好都合には、前記核酸は、蛍光を発する蛋白質をコードし、前記蛍光を発する蛋白質は、出力波長の光を発することによって入力波長の光に応答し、前記方法は、更に、前記サンプルに前記入力波長の光を当てる工程を含む。
【００４５】
これに代えて、前記核酸は、化学発光する蛋白質をコードし、前記方法は、更に、前記サンプルに化学発光基質を与える工程を含む。
【００４６】
好ましくは、前記バクテリオファージは、細菌の１つの菌株に特異的であり、前記出力波長での光の検出は、前記菌株の存在を示す。
【００４７】
有利には、前記細菌の菌株は、ＭＲＳＡ株、好ましくはＭＲＳＡ株３、１５又は１６である。
【００４８】
好都合には、前記バクテリオファージは、ＮＣＩＭＢ９５６３として寄託された株であり、更に光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む。
【００４９】
好都合には、前記細菌の菌株は、炭疽菌である。
【００５０】
好ましくは、前記バクテリオファージは、炭疽菌ファージガンマ（Bacillus anthracis phage Gamma）であり、更に光を発することができる蛋白質をコードする核酸を含む。
【００５１】
好ましくは、前記バクテリオファージは、本発明の細菌の検出捕集装置の一部である。
【００５２】
有利には、工程ａ）は、前記サンプルに関し前記基質をこすりつける工程を含む。
【００５３】
好都合には、工程ａ）は、更に水性栄養培地、好ましくはグルコースを含む水性栄養培地中で、前記バクテリオファージに感染させた後、前記細菌を増殖させる工程を含む。
【００５４】
好ましくは、工程ｂ）は、前記バクテリオファージが前記細菌に感染するときに、前記出力波長の光を検出することを含み、前記出力波長の光の強度が増大していることの検出が細菌の存在を示す。
【００５５】
有利には、前記サンプルは、複数のバクテリオファージの株に接触され、各株は、異なる細菌の菌株に特異的であり、各株のバクテリオファージは、異なる出力波長で光を発することができる蛋白質をコードし、前記方法は、更に各出力波長で前記サンプルから発せられた光を検出する工程を含み、ある波長での光の検出が細菌の対応する菌株の存在を示す。
【００５６】
好都合には、前記方法は、更に、前記バクテリオファージで前記サンプル中の細菌を死滅させる工程を含む。
【００５７】
本発明の別の視点によれば、ＮＣＩＭＢ９５６３として寄託された株のゲノムを有し、更に光を発する蛋白質をコードする核酸を含むバクテリオファージが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
ここで、実施例として、添付した模式図に基づいて、本発明が記載される。図１の装置は、試験サンプルに接触させるための積み重なったパッド又はスワブ８に連続的に押し込むピストン６に押し付けられるプランジャー４を備える管２から基本的に構成される。各スワブ８は、その露出され又は露出されうる表面１０に固定された、選択されたバクテリオファージを既に保持していてもよい。あるいは、バクテリオファージを、使用直前に前記表面１０に塗布することもできる。その後前記装置は、その試験サンプルの表面又は環境にこすりつけるか、さもなければ接触するように使用されうる。その結果、前記表面１０は、前記サンプル上又はサンプル中に存在するであろう細菌と接触する。前記バクテリオファージは、プロモーターに作動可能に連結した蛍光蛋白質（適当な蛋白質は緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である）をコードする核酸を含む。前記バクテリオファージは、ＭＲＳＡ、又はその１若しくは複数の菌株等の特定の細菌を検出するために選択されるであろう。より具体的には、前記バクテリオファージは、細菌の特定の菌株に感染し、これを溶解するであろう。例えば、受託番号９５６３でナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collection of Industrial and Marine Bacteria）に寄託されたバクテリオファージ（ＮＣＩＭＢ９５６３）は、ＭＲＳＡの菌株２及び１２から１７に対して溶菌性であり、そのようなバクテリオファージのベースとして使用されるのに適している。ＮＣＩＭＢ９５６３は、当然、プロモーター連結ＧＦＰ遺伝子を含むように変更されなければならない。別の例として、炭疽菌ファージガンマ（配列番号１）は、炭疽菌の分類ファージ（typing phage）であり、同様にそのようなバクテリオファージのベース（基礎ないし基本成分）として使用するのに適している。
【００５９】
各スワブ８は、皿状で示され、典型的には、プラスチック材料で形成され、使用前に滅菌される。選択されるバクテリオファージは、好ましくは共有結合的な固定化、例えば、前出の国際特許明細書ＷＯ  ０３／０９３４６２号において議論されているようなものによりスワブに付着される。前記ファージを固定する利点は、それらの構造がそれに従って安定化され、それによってそれらのファージの寿命が延長されるということである。各スワブを、対象となっている細菌の増殖を補助することができるであろう水性栄養培地と共に包装することもできるであろうし、或いは使用前にそのような溶液で湿らせることもできるであろう。適当な培地は、０．１％グルコースを含むメチルセルロースゲルであるが、他の形態において別のセルロース誘導体、ガラクトマンナン又はその他の炭水化物のゲルが使用される。しかしながら、前記ゲルが、それ自体、蛍光性でないということは重要である。前記培地は検出されうる細菌に合わせて作成されるであろうということにも留意すべきである。例えば、ファージガンマを用いて炭疽菌を検出するため、培地にはペプチド混合物が与えられる。
【００６０】
前記スワブ８が、試験時にサンプルの全体にこすりつけられるか、さもなければこれと接触すると、対象となっている細菌が存在する場合には、前記バクテリオファージは自身の生物学的役割を果たして細菌に感染し、前記バクテリオファージ自身が各細菌を溶解又は破裂させることによって細菌を効果的に破壊する前に増殖する。各細菌におけるバクテリオファージ増殖期の間に、蛍光蛋白質をコードする核酸を含む前記バクテリオファージゲノムが、複製され、発現される。このようにして感染した各細菌は、その内部で蛍光蛋白質を合成する。続いて、細胞の溶解の際、前記蛍光蛋白質が細菌から放出され、いくつかはバクテリオファージ粒子に取り込まれるであろ。前記スワブはその後光学試験に付されるが、その段階を図２に図示する。
【００６１】
図２に示したように、前記スワブ８の表面１０には、ＬＥＤ又は紫外線を供給する他の光源からの光が当たる。前記表面１０に当たる光は適当な波長を有するように適当なフィルターを通って前記スワブ８に伝達される；ＧＦＰのための波長は３９５ｎｍであろう。この露光によって、表面１０上の増殖したバクテリオファージ、より具体的には発現した蛍光蛋白質を刺激し、第二の選択した波長の光が発せられる；ＧＦＰでは波長は５１０ｎｍであり、この蛍光は、対応する５１０ｎｍフィルター１８を通って光ダイオード、光電子増倍管、電荷結合デバイス（charge coupled device）又はその他の検出器１６によって検出される。前記検出器１６が受ける蛍光の量は、増殖しない場合の前記バクテリオファージによって放出される蛍光の量と比較される；有意な如何なる増大も、もちろん対象となっている細菌の存在を示す。必要に応じて、前記検出器を、細菌の存在又は不存在を表示するか、又は汚染レベルの表示をする適当なプロセッサと組み合わせることもできる。
【００６２】
この方法で細菌を検出することの長所は、検出が行われるようにするため前記バクテリオファージが増殖する必要があるということであり、そしてまた、これは細菌が生存していることも必要とする。したがって、本発明では、ともすれば死んだ細菌が存在した場合に生ずるであろう偽陽性の結果が全く得られることがない。
【００６３】
前記スワブ８及びその表面１０については、上記図２の記載の中で言及したが、こすりつけた又は接触したサンプルについては、前記スワブと前記サンプルとの両方向に移動する細菌及びバクテリオファージを考慮して、前記スワブに代えて又は追加して、光学試験を適用することができることは理解されるであろう。前記スワブ又はサンプルの性質に依存するが、前記検出器を、前記光源を基準としてその反対側に配することができる。光学検出器システムの構成部品を、図１の装置が固定されるハウジングに取り付けられるであろう手持ち式の装置に容易に組み込むことができることも理解されるであろう。しかしながら、緑色検出光（Green detected light）からＵＶ源を分離するために必要とされる干渉フィルタの使用に関し注意を払うべきである。同様に光学装置及びシステム形態の緻密なデザインも、前記源から及び蛍光から光を分離するのに役立つであろう。
【００６４】
図３には、前述した方法において使用するのに適した試験体が図示されている。それには、典型的にはクレジットカードの大きさの、プラスチック材料で形成されたカード２０が示されている。一方の面には、当該カードの前端部２４から延長して、栄養素と共に固定されたバクテリオファージの４つのライン２２が配されている。４つのライン２２のそれぞれは、細菌の異なる菌株に特異性をもつバクテリオファージを保持する。後端部２６側には、前記カードの使用中にユーザーがカードを手に持つことができるよう十分な領域２８があり、この領域は、ある程度視覚的に識別することができる。また輪郭で示されているのは、前記カード又はそのカードが保有するバクテリオファージの使用に関する追加の情報を保有している磁気ストリップ３０である。
【００６５】
使用の際、細菌を保有すると思われるサンプルに、スワブをこすりつけ、その後当該スワブを、前記カード２０の表面上のライン２２にこすりつける。前記溝中の栄養素は、対象となっている細菌に接触した全てのバクテリオファージの増殖又は分裂増殖を増強し、その後必要な波長の光を当てると蛍光の増大をともなうであろう。感染した可能性のある溝を有する前記カードは、その後、光学分析が行われるセンサーユニット（図示せず）において適宜形成されたスロットに導入（挿入）される。各ライン２２は、細菌の特定の菌株に対応付けされているので、前記センサーは、選択した細菌の菌株のそれぞれが検出されるかどうかを別々に確認することができる。
【００６６】
一つの形態において、先の形態のような積層構造のスワブを設ける代わりに、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートが設けられ、各ウェルには先の形態のようなバクテリオファージを含む栄養サンプル（例えばゲル状のもの）が配される。使用の際、サンプルは、例えば表面に沿ってスワブをこすりつけることから、採取され、その後前記ＥＬＩＳＡプレートのウェルに配される。スワブを、部屋又はビルの異なる場所にこすりつけることができ、採取された各サンプルを、前記ＥＬＩＳＡプレートの異なるウェルに配することができる。前記バクテリオファージがサンプル中の全ての細菌に感染し増殖するのに十分な時間が経過したら、前記ＥＬＩＳＡプレートはＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて試験される。この形態の利点は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーが病院等に普及し、それによって本発明が既存のハードウェアと連結するということである。
【００６７】
一つの特定の例として細菌の検出捕集装置及び対応する細菌の検出装置が図４及び５に示されている。図４を参照すると、細菌の検出捕集装置３１は、ヒンジ３５に接続された第一及び第二の板３３、３４を備える紙又はカードブック３２を備える。前記第一及び第二の板３３、３４は、それぞれ「クレジットカード」と同一の大きさである。
【００６８】
前記第一の板３３の末端には、前記ヒンジ３５に隣接して、前記第一の板の開口部３６が設けられ、当該開口部に、透明のスライドで蓋をしている。前記スライドの内面には、複数のバクテリオファージが備えられ、それぞれが適当なプロモーターの制御下、ＧＦＰをコードする核酸を保有する。前記バクテリオファージは、前記スライド表面に共有結合的に固定されている。前記スライドの内面を覆うように、取り外し可能なシール（removable sticker）４４が設けられ、これによって使用前にバクテリオファージが保護される。
【００６９】
前記第一及び第二の板３３、３４が押し合わされた（pressed together）ときに二つの開口部３６、３７は整合するので、前記第二の板３４には、前記第一の板３３上の第一の開口部３６の位置に対応する位置に、第二の開口部３７が設けられている。前記第二の開口部３７にも、透明のスライドで蓋をしている。前記第二の板３４の内面の残りの部分には、粘着性の被膜３８が施され、これは、カバー（wrapper）（図示せず）で覆われている。
【００７０】
ここで図５を参照すると、細菌の検出装置３９は、ケーシング（casing）４０を備え、当該ケーシングには、前記カ−ド３２を収容するのに適した大きさのスロット４１が配されている。前記細菌の検出装置３９はまた、入力をし、かつ当該装置からの出力を受けるコントロール画面４２、並びにプリンター用紙排出口（paper printer outlet）４３を備える。前記ケーシング４０の内部には、図２に示した装置と同じ原理で作動する紫外線の光源及び蛍光検出器（図示せず）が設けられている。前記紫外線の光源を、コントロールパネル４２を用いてコントロールしてもよく、前記蛍光検出器の結果を、コントロール画面４２で確認してもよい。
【００７１】
使用の際、サンプルは、例えばスワブを病院の表面にこすりつけることによって、スワブに採集される。前記シール４４が、前記第一の板３３から取り除かれ、前記サンプルが前記第一の開口部３６のスライドの内側に配される。その後粘着性の面３８を覆っている前記カバーも取り除かれて処分され、前記第一及び第二の板３３、３４が、押し合わされ、粘着性の面３８によって所定の位置で固定される。これによって、前記サンプル中の全ての有害物質の漏れが防がれ、前記サンプルに混入する可能性のある全ての物質の移入も防がれる。前記第一及び第二の開口部３６、３７の位置決めのため、前記サンプルは、前記カード３２の何れの側からも見える。
【００７２】
その後、前記サンプルを、前記バクテリオファージを前記サンプル中の全ての細菌に感染させ、それらの内部で増殖させるべく、ある期間放置する。
【００７３】
その後前記カード３２を、前記細菌の検出装置３９のスロット４１に挿入し、前記細菌の検出装置を、コントロールパネル４２を用いて稼動させる。その後紫外線を、前記カード３２に、より具体的には前記第一及び第二の開口部３６、３７を通して、注ぐ。同時に、前記サンプルから放出される全ての蛍光が、蛍光検出器により検出され、何かが検出された場合には、その後その強度が、前記コントロールパネル４２上に報告される。したがって、前記コントロールパネル４２には、前記バクテリオファージが感染することができるという、前記サンプル中の細菌の存在又は不存在に関する表示がなされる。
【００７４】
図１に示した形態のバリエーションでは、前記スワブ８にまったく同じバクテリオファージを設ける代わりに、複数の異なるバクテリオファージの菌株が設けられる。各バクテリオファージの菌株は、細菌の異なる菌株に特異的である。例えば、第一のバクテリオファージの菌株を、ＭＲＳＡの所定の菌株に対して溶解性であるＮＣＩＭＢ  ９５６３とし、第二のバクテリオファージの菌株を、炭疽菌の菌株に対して特異的である炭疽菌ファージ  ガンマとする。更に、バクテリオファージの各菌株は異なる波長で蛍光を発する蛋白質をコードする核酸を含む。前記スワブ８は、前記のように使用されるが、検出の間、両方の発光波長が観察され、細菌の何れかの菌株の存在又は不存在が、何れかの又は両方の波長での発光の存在又は不存在を検出することによって、同時に判定されうる。
【００７５】
前記形態では、蛍光を発する蛋白質として緑色蛍光蛋白質が例示されているが、他の多くの異なるタイプの蛍光を発する蛋白質が利用できることは理解されるはずである。これらの例として、商品名リビングカラーズ（Living Colors）で入手できる礁珊瑚蛍光蛋白質（reef coral fluorescent protein）が挙げられる。
【００７６】
本発明の更なる形態において、前記バクテリオファージは、蛍光を発する蛋白質とは異なるタイプの光を発する蛋白質をコードする核酸を含むことも理解されるはずである。特に、前記蛋白質は、化学発光のもの又はリン光のものであってもよい。適当な化学発光蛋白質の特定の例として、ルシフェラーゼが挙げられる。この６１ＫＤａ酵素は、発光基質（例えばルシフェリン）及びＡＴＰの存在下において、通常緑色から黄色のスペクトルで、光を発すべく二段階の酸化反応を触媒する。これらの形態において、前記スワブ８はまた、発光基質及びＡＴＰ資源を含み、その結果、溶解した細胞によってルシフェラーゼが放出される場合には、発光が可能となる。
【００７７】
ここで本発明の構成成分を製造するのに必要とされる分子生物学について記載する。発光蛋白質をコードする核酸を含む適当なバクテリオファージを製造するため、適当な菌株特異性バクテリオファージが先ず選択される（例えばＮＣＩＭＢ９５６３又は炭疽菌）。ＤＮＡが前記バクテリオファージから抽出され、塩化セシウム勾配遠心法によって精製される。ファージＤＮＡは、適当な大きさのフラグメントに消化され、その後大腸菌プラスミドにクローン化される。前記発光蛋白質をコードする核酸に隣接する適当なファージシーケンスを含むプラスミドも同様に構築される。このプラスミドは、シャトルベクターに組み込まれ、二回相同組み換え（double crossover）によって、前記発光蛋白質をコードする遺伝子は、ファージゲノムにおいて対応する位置に導入される。
【００７８】
適当なバクテリオファージを得るための別のアプローチは、前記発光蛋白質遺伝子を含むトランスポソンを使用することであるが、その後そのトランスポソンは、無作為に多数のバクテリオファージに挿入される。前記ファージは、その後大腸菌中で増殖され、前記発光蛋白質を発現するコロニーが選択される。組換えファージＤＮＡは、単離され、適当なホスト細菌（例えば、出発バクテリオファージがＮＣＩＭＢ９５６３である場合には、前記ホスト菌株は、黄色ブドウ球菌である）に組み込まれる。適当なバクテリオファージを含むプラークが、その後選択される。
【００７９】
下記参考文献により、細菌の検出のためのバクテリオファージにおける緑色蛍光蛋白質の使用についてのいくつかの有用な考察がもたらされる：
１．構築したファージベースの微生物吸着剤の効率を評価するための生物発光サルモネラの使用。Ｗ．Ｓｕｎ、Ｌ  Ｂｒｏｖｋｏ、及びＭ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｊ  Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ＆Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０００年  ２５  ２７３−２７５
２．緑色蛍光蛋白質標識ＰＰ０１バクテリオファージを用いることによる大腸菌１５７：Ｈ７の迅速な検出。Ｍａｓａｈｉｔｏ  Ｏｄａ、Ｍａｓａｍｏｔｏ  Ｍｏｒｉｔａ  Ｈａｊｉｍｅ  Ｕｎｎｏ及びＹａｓｕｎｏｒｉ  Ｔａｎｊｉ  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏ  ２００４年１月  ５２７−５３４。
３．Ｎａｃｈｗｅｉｓ  Ｕｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｋａｔｉｏｎ  ｖｏｎ  Ｂａｋｔｅｒｉｅｎｓｔａｍｍｅｎ（細菌の菌株の検出及び同定）０１／０９３７０  Ａ２  Ｍｉｌｌｅｒ、Ｓｔｅｆａｎ。
４．緑色蛍光蛋白質の分子構造（The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein）。Ｙａｎｇ  Ｆら  ネイチャーバイオテクノロジー  １４、１２４６−１２５１（１９９６）。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明を実施した捕集装置の部分断面側面図である。
【図２】目的とする細菌が存在するかどうかを決定するために、複数のバクテリオファージがどのように試験されうるかを示す図である。
【図３】本発明の別の実施形態による細菌の検出捕集装置の平面図である。
【図４】本発明の更なる実施形態による細菌の検出捕集装置の斜視図である。
【図５】図４に示した実施形態と組み合わせて動作可能な細菌の検出装置の斜視図である。
【図１】
2008535480.tif 000003
【図２】
2008535480.tif 000004
【図３】
2008535480.tif 000005
【図４】
2008535480.tif 000006
【図５】
2008535480.tif 000007
【配列表】
2008535480000001.app
【国際調査報告】
2008535480.tif 000008
2008535480.tif 000009
2008535480.tif 000010