(57)【要約】【課題】一般的な注入バルブを使用しても、微量の試料を簡便に導入できる注入装置を提供する。【解決手段】（１）試料注入部、（２）試料を搬入する手段、（３）試料吸引／洗浄手段、（４）注入条件入力部、及び（５）試料注入制御部を含む試料注入装置であり、（１）の試料注入部は、６ポートを備え、第一の状態と第二の状態とをとることができるバルブであり、（５）の試料注入制御部により、第一の状態で試料保持ループ内に試料を満たした後、バルブを第二の状態に切り替え、この切り替え時間を基準として、（４）の注入条件入力部で指定された時間にバルブを第一の状態に切り替えることにより、試料ループ内の試料の一部を流体流に乗せて流体の出口ポートに移送する、試料注入装置。【選択図】図９
2015042940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、
（１）試料を注入するための試料注入部、
（２）前記試料注入部に試料を搬入する手段、
（３）前記試料注入部に前記試料を吸引または洗浄を行うための試料吸引／洗浄手段、
（４）注入条件を設定する注入条件入力部、及び
（５）前記（４）の条件に従い前記（１）、（２）、（３）を制御する試料注入制御部
を含む試料注入装置であり、
前記（１）の試料注入部は、
試料を保持するための試料保持ループの両端と接続する２つのポート、試料導入ポート、試料排出ポート、流体の入口ポート、流体の出口ポートの６ポートを備え、
少なくとも、前記流体の入口ポートと出口ポートが試料保持ループを介さずに直接導通し、かつ前記試料導入ポートから入った前記試料が前記試料保持ループを介して前記試料排出ポートに出る第一の状態と、前記流体の入口ポートから入った流体が前記試料保持ループを介して前記流体の出口ポートに流れ、かつ前記試料導入ポートと前記試料排出ポートが試料保持ループを介さずに直接導通する第二の状態とをとることができる
バルブであって、
前記（５）の試料注入制御部により、
第一の状態で試料保持ループ内の全てまたは一部に試料を満たした後、バルブを第二の状態に切り替え、前記切り替えた時間を基準として、前記（４）の注入条件入力部で指定された時間にバルブを第一の状態に切り替えることにより、試料保持ループ内の試料の一部を前記流体流に乗せて流体の出口ポートに移送し、注入することを特徴とする、試料注入装置。
【請求項２】
流体の流量と、第二の状態に切り替えた時間から第一の状態に切り替える時間との積が試料注入量となる、請求項１に記載の試料注入装置。
【請求項３】
試料注入量が０．３〜１０マイクロリッタである、請求項１又は２に記載の試料注入装置。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の試料注入装置を備えたことを特徴とする液体クロマトグラフィ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体クロマトグラフィ等において、微量の試料を簡便にカラムに導入することができる試料注入装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィやフローインジェクションといった液体流に何らかの方法により試料を導入して分析を行う「流れ分析機器」においては、試料注入量を一定に保つことで分析精度の向上に寄与することが一般的である。このような流れ分析計では紫外可視検出器や蛍光検出器に代表される光検出、導電性を元にした電気伝導度検出器、酸化還元電位を元にした電気化学検出器など多様な検出器が目的に応じて使用される。これらの検出器はいずれも濃度に比例して信号強度が変化するため、「流れ分析計」に導入される試料の容量は精度良く一定に保つことが求められる。
【０００３】
「流れ分析計」の代表である液体クロマトグラフィでは、溶離液流に試料を導入し、分析カラムで各成分に分離し、検出器で信号強度の変化を連続的にモニタし、その結果から各成分の溶出時間とピーク高さや面積を算出し、同定計算、定量計算が実施される。
【０００４】
液体クロマトグラフィは分析圧が数１００ｋＰａ程度の低圧クロマトグラフィ、分析圧が１０ＭＰａ程度の高圧クロマトグラフィ、分析圧が３０ＭＰａ以上の超高圧クロマトグラフィなど、分析圧により分類されることがあるが、試料注入バルブに関しては基本構造や注入方式ほぼ同じものが用いられることが多い。
【０００５】
一般的には、試料を一定量保持するための試料保持ループを接続する２つのポートと、試料を導入するポート、試料の排出ポート、溶離液の入口のポート、溶離液の出口ポート（分析カラム導入口）の６ポートを備え、試料を前記試料保持ループ内に導入し保持できる第一の状態（Ｌｏａｄ）と、溶離液の流れにより前記試料保持ループ内の試料を押し出してカラムに導入できる第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）とを切り替えられる構造をとるものである(図１参照)。
【０００６】
試料の注入方式としては大別して以下の３つの方式が提案商品化されている。
【０００７】
（１）ループ全量注入方法（図２参照）
基本的な注入機構の構造は前述と同じである。まず第二の状態で、サンプリング流路を洗浄した（ｓｔｅｐ  １）後、次に第一の状態に切り替え、試料吸引機構により試料保持ループ内を試料で完全に満たす（ｓｔｅｐ  ２，３）。次に、第二の状態に切り替え、試料をカラムに導入する（ｓｔｅｐ  ４，５）。試料注入量は前記試料保持ループの容量で決定される。この方法では、試料を試料保持ループに吸引する量などがある程度変動しても、実際にカラムに導入される試料注入量は一定になるため、注入量の再現性は非常に良好になる。しかしながら、注入量は試料保持ループの容量で決定されるため、注入量を変更するには、工具等を使用して注入バルブに取り付けられた試料保持ループを容量に見合ったものに取り替える必要があり、手間が掛かる欠点がある。また、実際にカラムに注入する試料容量より余分量を使用するため、試料の無駄が生じるという欠点も併せ持つ。
【０００８】
（２）ループ可変注入方法（図３参照）
基本的な注入機構の構造は前述と同じである。第二の状態から注入動作を開始する。まず第二の状態で、サンプリング流路を洗浄した（ｓｔｅｐ  １）後、試料吸引機構により試料を注入バルブのポートｆから出てくるまで吸引する（ｓｔｅｐ  ２）。次に第一の状態に切り替え、試料吸引機構により、目的の注入量を正確に吸引する（ｓｔｅｐ  ３）。次に、第二の状態に切り替え、計量された試料をカラムに導入する（ｓｔｅｐ  ４，５）。試料注入量は試料吸引機構により吸引した容量（試料保持ループ容量以下）で決定される。この方法では、前記（１）の方法と比較すると注入再現性は若干低下するものの、試料注入量を一定範囲で可変にすることができる利点がある。また、前記（１）ほどではないが、実際にカラムに注入する試料容量より余分量を使用するため、試料の無駄が生じるという欠点も併せ持つ。
【０００９】
（３）直接注入法（図４参照）
注入機構の構造は前記の（１）、（２）とは若干異なる。試料計量機構により計量された試料を、注入バルブのポートｅから直接導入する方法である。
【００１０】
まず第二の状態で、サンプリング流路を洗浄した（ｓｔｅｐ  １）後、試料計量機構により直接試料を吸引する（ｓｔｅｐ  ２）。次に第一の状態に切り替え、計量された試料を含む試料計量機構を注入バルブのポートｅに接続し、試料を正確に試料保持ループ内に押し出す（ｓｔｅｐ  ３，４）。
【００１１】
次に、第二の状態に切り替え、計量された試料をカラムに導入する（ｓｔｅｐ  ５，６）。試料注入量は試料計量機構により吸引した容量（試料保持ループ容量以下）で決定される。この方法では、前記（１）の方法と比較すると注入再現性は若干低下するものの、試料注入量を一定範囲で可変にすることができる利点がある。また、前記（１）、（２）のような余分量の試料を殆ど必要としないため試料の無駄が生じないという利点がある。しかしながら、機構が複雑になる欠点を有する。
【００１２】
前述の（１）〜（３）に使用される一般的な２位置切り替え６方バルブの外観図を図５に示す。一般的にステータ（１５）と称する硬質の部品に、試料を一定量保持するための試料保持ループと接続する２つのポート（１１ａ、１１ｄ）、試料を導入するポート（１１ｅ）、試料の排出ポート（１１ｆ）、溶離液の入口のポート（１１ｂ）、溶離液の出口ポート（分析カラム導入口）（１１ｃ）の６ポートを備え、各々試料保持ループ（４）又は配管（１３）を接続する構造を有する。バルブ内部には流路を切り替えるための溝（１８）を３つ有するロータシール（１７）があり、このロータシールを回転させることで流路が切り替わる（図７）。図５ａはバルブ本体（１４）、図５ｂは各配管（１３）又は試料保持ループ（４）を施した状態の図である。使用する配管は、外形が１／１６インチ、内径が０．１〜１．０ｍｍ、材質がＳＵＳ、ＰＥＥＫ樹脂、ＰＴＦＥ樹脂などが用いられ、配管等をオシネ（ナット）（１２）、フェラルによりバルブ本体に接続しシールする構造をとる。
【００１３】
図５ｂから分かるように、バルブのステータ面は６つの配管等／オシネ（ナット）（１２）が密集した状態になってしまう。
【００１４】
試料保持ループ（４）は液体クロマトグラフィで使用される配管と同形状を有する。外形が１／１６インチ、内径が０．２５〜１．０ｍｍ、材質がＳＵＳ、ＰＥＥＫ樹脂、ＰＴＦＥ樹脂などが用いられ、オシネ（ナット）（１２）、フェラルによりバルブ本体に接続しシールする構造をとる。
【００１５】
前述（１）のループ全量注入方法の場合、カラムに導入される試料量は、試料保持ループ容量と前記ステータの流路の容量と前記ロータシールの溝容量との合計になる。
【００１６】
ステータの流路の容量とロータシールの溝容量は通常、数マイクロリッタと小さいことから、注入量が多い場合は前記容量は殆ど無視することが可能となる。しかしながら、注入量が数１０マイクロリッタと少ない場合は、前記の容量も考慮に入れる必要がある。
Ｖ＝Ｓ＋Ｒ＋Ｌ＊３．１４＊（Ｄ／２）２
注入量：Ｖ
配管内径：Ｄ
配管長：Ｌ
ロータシール溝容量：Ｒ
ステータ流路容量：Ｓ
試料保持ループ（４）は、両端にオシネ（１２）／フェラル（１６）を有すること、物理的配置の関係、取り付け／取り外しの作業性を考慮すると、配管長はおおよそ１０ｃｍ以上必要としてしまう（図６参照）。表１は１、２、５、１０、２０マイクロリッタの試料保持ループを作製する場合の配管の内径、長さを計算した値である。表内の（  ）部は配管の長さが１０ｃｍ以下になるものを示しており、作製不可あるいは困難であることを示す。
【００１７】
【表１】
2015042940.tif 000003
このように、２０マイクロリッタの試料保持ループを作製する場合は、内径０．４ｍｍ、長さ１６ｃｍ、または、内径０．２５ｍｍ、長さ４１ｃｍ程度の配管を使用すればよく、作製は可能である。ところが、５マイクロリッタの試料保持ループを作製する場合は、内径０．４ｍｍを使用すると長さは４ｃｍとなり作製できない。内径０．２５ｍｍを使用すると長さは１０ｃｍとなる。これは作製可能な長さの下限に近い。ループ容量は計算上５マイクロリッタであるが、実際には前述のとおり、ロータシールの溝容量、ステータの流路容量が加算されるため、注入量は５マイクロリッタ＋α（数マイクロリッタ）となってしまう。注入量を正確に５マイクロリッタにする場合は、αの容量を考慮する必要があり、ループの配管長は１０ｃｍ以下となり、作製は困難となる。
【００１８】
前述（２）のループ可変注入方法、（３）の直接注入法でも、試料保持ループ内に計量された試料を入れカラムに導入する機構であることから、ロータシールの溝容量とステータの流路容量の合算以下の容量は注入することはできず、低容量を精度良く注入することは困難である。
【００１９】
以上のことから、５マイクロリッタ以下の容量を正確に注入する場合、一般的な６方切り替えバルブを使用することはかなり難しい。これを補うため、ロータシールの溝容量、ステータの流路容量を極度に低減したバルブや、試料保持ループに使用される配管を極細管にしたものも商品化されているが、溶離液や試料に含まれる僅かな不溶物により詰まりが発生しやすく、使い勝手に難がある（非特許文献１）。
【００２０】
また、低容量の試料を注入するために、試料保持ループをロータシールに直接接続しバルブの内部に配したバルブや、ロータシールの溝または穴を試料計量用の保持部として使用するものも提案／商品化されている（図８参照）。いずれも、微小容量の注入は可能であるが、構造が複雑であったり高価である難点がある（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】ＩＤＥＸ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  社  Ｍａｎｕａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒｓ  Ｒｈｅｏｄｙｎｅ  ７５２０、［平成２５年７月１８日検索］、インターネット＜URL : http://www.idex-hs.com/products/4139/Manual-Sample-Injectors.aspx?ProductTypeID=153&ProductFamilyID=2＞
【非特許文献２】ＶＩＣＩ  Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  社  ＣＨＥＭＩＮＥＲＴ  ＩＮＪＥＣＴＯＲＳ  ／  Ｍｏｄｅｌ  Ｃ７４Ｈ、[平成２５年７月１８日検索]、インターネット＜URL : http://www.vici.com/cval/c74_16-250-10k.php＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、ロータシールやステータのボイド容量を低減していない一般的な注入バルブを使用しても、搭載する試料保持ループの容量以下の微量試料を簡便に導入できる注入装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は前記課題を解決する目的でなされたものであり、具体的には以下のとおりである。
少なくとも、
（１）試料を注入するための試料注入部、
（２）前記試料注入部に試料を搬入する手段、
（３）前記試料注入部に前記試料を吸引または洗浄を行うための試料吸引／洗浄手段、
（４）注入条件を設定する注入条件入力部、及び
（５）前記（４）の条件に従い前記（１）、（２）、（３）を制御する試料注入制御部
を含む試料注入装置であり、
前記（１）の試料注入部は、
試料を保持するための試料保持ループの両端と接続する２つのポート、試料導入ポート、試料排出ポート、流体の入口ポート、流体の出口ポートの６ポートを備え、
少なくとも、前記流体の入口ポートと出口ポートが試料保持ループを介さずに直接導通し、かつ前記試料導入ポートから入った前記試料が前記試料保持ループを介して前記試料排出ポートに出る第一の状態と、前記流体の入口ポートから入った流体が前記試料保持ループを介して前記流体の出口ポートに流れ、かつ前記試料導入ポートと前記試料排出ポートが試料保持ループを介さずに直接導通する第二の状態とをとることができる
バルブであって、
前記（５）の試料注入制御部により、
第一の状態で試料保持ループ内の全てまたは一部に試料を満たした後、バルブを第二の状態に切り替え、前記切り替えた時間を基準として、前記（４）の注入条件入力部で指定された時間にバルブを第一の状態に切り替えることにより、試料保持ループ内の試料の一部を前記流体流に乗せて流体の出口ポートに移送し、注入することを特徴とする、試料注入装置である。
【００２４】
また、流体の流量と、第二の状態に切り替えた時間から第一の状態に切り替える時間との積が試料注入量となる、上述の試料注入装置である。
【００２５】
さらに、試料注入量が０．３〜１０マイクロリッタである、上述のいずれかの試料注入装置である。
【００２６】
また、上述のいずれかの試料注入装置を備えたことを特徴とする、液体クロマトグラフィである。
【００２７】
これにより、前記試料保持ループ内の試料の一部を定量的に前記流体流に乗せて流体の出口ポートに移送することとなり、物理的に作製可能な試料保持ループの容量以下の試料であっても負荷することができる。
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。液体クロマトグラフィに代表される「流れ分析」では、流体の流速は一定値で行うため、第二の状態から第一の状態にバルブを切り替える時間を制御することで、試料の注入量を変更することが可能となる。図９は本発明の時間制御による注入装置の動作を示した模式図、図１０はシステム構成の一例を示した図である。
【００２９】
（ステップ１）
試料注入バルブが第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）から開始する。この状態にて、試料吸引／洗浄手段−注入バルブポートｆ−ポートｅを含む洗浄ラインを洗浄する。なお、このステップ１は、省略することも可能である。
（ステップ２）
試料注入バルブを第一の状態（Ｌｏａｄ）に切り替える。
（ステップ３）
試料注入バルブは第一の状態（Ｌｏａｄ）のまま、試料吸引／洗浄手段により、試料を試料保持ループ内に全量または一部吸引する。
（ステップ４）
試料注入バルブを第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に切り替える。
（ステップ５）
試料保持ループに吸引された試料が、ポンプにより押し出され、カラムに導入される。
（ステップ６）
ステップ３で試料保持ループに吸引された試料が全てカラムに導入される前に、試料注入バルブを第一の状態（Ｌｏａｄ）に切り替える。即ち、試料注入バルブを第一の状態（Ｌｏａｄ）に切り替える時間は、カラムに導入される試料が、試料保持ループに吸引された試料よりも少なくなるよう、設定される。
【００３０】
このように、ステップ４で試料注入バルブを第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に切り替えた時間とステップ６で第一の状態（Ｌｏａｄ）に切り替えた時間との差と、ポンプの流速との積が、カラムに導入される試料量になる。分析を行う場合、ポンプの流速は一定で使用することから、前記の時間差を変更することにより、例えばステップ６で第一の状態（Ｌｏａｄ）に切り替える時間を変更することにより、注入量を変更することができる。なお、前記の時間差は、注入時間に相当するものである。
【００３１】
次に、現在分析で使用される汎用カラム（内径４．６ｍｍ）、セミマイクロカラム（内径２．０ｍｍ）、マイクロカラム（内径１．０ｍｍ）、およびキャピラリィカラム（内径０．５ｍｍ）を例に注入量について説明する。
【００３２】
注入量は試料の特性、濃度、使用するカラムの種類により大きく異なるが、汎用カラムでは１００〜１０マイクロリッタ、セミマイクロカラムでは２０〜２マイクロリッタ、マイクロカラム５〜０．５マイクロリッタ、キャピラリィカラム１〜０．１マイクロリッタの範囲で使用されることが多い。汎用カラムの領域では、注入量が１０マイクロリッタ以上であり、一般的な注入方法／装置で十分に対応できる領域である。セミマイクロカラム〜キャピラリィカラムの領域では注入量が１０マイクロリッタ以下になることが多く、一般的な注入方法／装置では精度良く使用することが難しい領域となる。
【００３３】
本発明の時間制御による注入法を、セミマイクロカラム〜キャピラリィカラムの領域に適用する例を次に示す（何れも、目的の注入量より大きな試料保持ループを備えていることを前提）。セミマイクロカラムで、毎分２００マイクロリッタで送液を行い、注入時間を３秒とした場合、セミマイクロカラムには１０．０マイクロリッタ注入されることになる。マイクロカラムで、毎分５０マイクロリッタで送液を行い、注入時間を３秒とした場合、マイクロカラムには２．５マイクロリッタ注入されることになる。また、キャピラリィカラムで、毎分１２マイクロリッタで送液を行い、注入時間を３秒とした場合、キャピラリィカラムには０．６マイクロリッタ注入されることになる。このように、注入時間を調整することで１０マイクロリッタ以下、特に０．３〜１０マイクロリッタといった量であってもカラムに負荷することが可能となる。
【００３４】
図１１ａは従来の注入方法、図１１ｂは本発明の時間制御による注入装置の注入動作を模式的に示した図である。網掛け部は、試料保持ループの容量とボイド体積の合計量を示すものであり、従来法（図１１ａ）では、その合計量すべてがカラムに導入されるのに対し、本発明による注入法（図１１ｂ）では、その合計量よりも少ない量がカラムに注入される。
【発明の効果】
【００３５】
このように、試料保持ループ内の試料が全て押し出される前に、注入バルブを第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）から第一の状態（Ｌｏａｄ）に切り替えることで、試料保持ループの容量より少ない量の試料を定量的に注入することができる。特に物理的に作製可能な最短の試料保持ループを使用した場合であっても、その容量より少ない極微量の試料を注入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】一般的な液体クロマトグラフ装置の流路系を示した図である。
【図２】一般的なループ全量注入方法の注入原理を示した図である。
【図３】一般的なループ可変注入方法の注入原理を示した図である。
【図４】一般的な直接注入方法の注入原理を示した図である。
【図５】一般的な試料注入バルブの外観を示した図である。ａは配管を施す前、ｂは配管を施した状態を示している。
【図６】試料注入バルブに使用される試料保持ループの外観を示した図である。ａは外観、ｂは拡大図である。
【図７】一般的な試料注入バルブのロータシールの外観を示した図である。
【図８】微量注入に使用されるスライド式バルブの構造を一例を示した図である。
【図９】本発明の時間制御による注入装置の注入原理を示した図である。
【図１０】本発明の時間制御による注入装置のシステム構成の一例を示した図である。
【図１１】注入動作を模式的に示した図である。ａは従来の注入方法、ｂは本発明の時間制御による注入方法を示している。
【図１２】実施例１で使用したシステムの流路図である。ａは第一の状態（Ｌｏａｄ）、ｂは第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示している。
【図１３】実施例１での、試料保持ループの長さを変えた場合の検出器信号の変化を示したクロマトグラムである。
【図１４】実施例１での、試料保持ループの容量とピーク面積の関係を示した図である。
【図１５】実施例１での、試料注入時間を変えた場合の検出器信号の変化を示したクロマトグラムである。
【図１６】実施例１での、試料注入時間と、ピーク高さ又は面積との関係を示した図である。
【図１７】実施例１での、本発明の時間制御による注入装置の精度を示した図である。ａはクロマトグラム、ｂはピーク高さおよび面積の再現性を示した図である。
【図１８】実施例２で使用したシステムの流路図である。ａは溶離液Ａ通液／試料注入バルブが第一の状態（Ｌｏａｄ）、ｂは溶離液Ａ通液／試料注入バルブが第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示している。ｃは溶離液Ｂ通液／試料注入バルブが第一の状態（Ｌｏａｄ）を示している。
【図１９】実施例２での、試料注入時間を変えた場合の検出器信号の変化を示したクロマトグラムである。
【図２０】図１９の内径０．５ｍｍ長さ１０ｃｍの試料保持ループを使用し、注入時間が０．０３分の場合のクロマトグラムを拡大した図である。
【図２１】実施例２での、試料注入時間と総面積の関係を示した図である。凡例の黒丸は内径０．２５ｍｍ、長さ１０ｃｍ、凡例の白三角は内径０．５ｍｍ長さ１０ｃｍの試料保持ループを使用した場合を示している。
【実施例】
【００３７】
以下に本発明を実施例を用いて説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］
本発明の効果を検証するため、以下のように実施した。
【００３９】
図１２に、使用した液体クロマトグラフの流路図を示す。溶離液を送液するポンプ（２）、試料を注入する２位置６ポートの注入バルブ（２０）、抵抗管（３５）、紫外可視の検出器（７）で構成した。
【００４０】
ポンプ（２）は東ソー（株）製ＤＰ−８０２０、検出器（７）は東ソー（株）製ＵＶ−８０２０を４１５ｎｍの波長で用いた。分析カラムの代用とした抵抗管（３５）は内径０．２ｍｍ長さ２ｍのＳＵＳ配管を螺旋状に巻いたものを使用した。注入する２位置６ポートの注入バルブ（２０）として高砂電気工業製ソレノイド駆動式２ポジション６ポートバルブ（ＭＴＶ−６ＳＬ−Ｎ３２ＵＦ−１）を使用した。前記バルブに装着する試料保持ループ（４）は外径１／１６インチ、内径０．２５ｍｍ、０．５ｍｍ、０．７５ｍｍのＰＥＥＫ配管を指定の長さに切断したものを使用した。溶離液（１）は純水を毎分１ミリリッタで送液し、試料として全血を１／４００に希釈して用いた。
【００４１】
まず、検証に使用したバルブのロータシールの溝部およびステータ部の流路容量を算出するため、試料保持ループの長さを１０から５０ｃｍまで変化させ、ピーク面積の変化を確認した（内径０．２５ｍｍ、ＰＥＥＫ配管）。図１３に検出器信号の変化、図１４に試料保持ループ容量に対するピーク面積の関係を示した。なお、各配管長での容量は、計算上表２の通りになる。
【００４２】
【表２】
2015042940.tif 000004
図１４から分かるように、保持ループ容量とピーク面積は良好な直線関係が見られる。しかしながらその近似直線は原点を通らず、一定の切片を有している。つまり、試料保持ループの長さをゼロにしても、計算上はピーク面積が存在することになる。これは、切り替えバルブのロータシール溝やステータ部の流路容量が存在することを意味している。この条件下での近似式は下記の通りとなる。
Ａｒｅａ＝７５．６２７＊Ｖ＋４５６．８９
Ａｒｅａ：ピーク面積
Ｖ：試料保持ループ容量（計算値）
ピーク面積（Ａｒｅａ）  にゼロを代入して得られたＶが切り替えバルブのロータシール溝やステータ部の流路等のボイド容量となる。上記近似式から、今回使用した注入バルブの総ボイド容量は約６．０マイクロリッタと計算される。
０＝７５．６２７＊Ｖ＋４５６．８９
Ｖ＝−４５６．８９／７５．６２６＝−６．０μＬ
このことから、この注入バルブでは理論上６．０マイクロリッタ以下は注入することはできない。実際には物理的配置から１０ｃｍ以下の試料保持ループは作製できないことから、内径０．２５ｍｍの配管を使用した場合は、１０ｃｍのときのループ配管容量（４．９マイクロリッタ）と総ボイド容量（６．０マイクロリッタ）の合計値、１０．９マイクロリッタ以下の注入はできないことになる。
【００４３】
次に、本発明の時間制御による注入装置の効果を検証した。試料保持ループは外径１／１６インチ、内径０．２５ｍｍ、長さ１０ｃｍのＰＥＥＫ配管を使用した（ループ容量４．９μＬ）。溶離液は純水を毎分１００マイクロリッタで送液し、試料として全血を１／４００に希釈して用いた。その他の装置構成および基本条件等は前述と同じである。
計算上、注入バルブを第一の状態（Ｌｏａｄ）から第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に切り替え溶離液によりループ内の試料を完全に押し出すには０．１分を要する。
（ループ容量４．９μＬ＋ボイド容量６．０μＬ）／（１００μＬ／ｍｉｎ）＝０．１分
注入バルブを第一の状態（Ｌｏａｄ）から第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に切り替え、一定時間後に第一の状態に戻し、試料保持ループ容量以下の試料の注入が定量的に行えるか検証を行った。また比較のために、ループ内の試料が全量押し出すのに十分な時間（０．２分）第二の状態を保持させたデータも取得した（ループ全量注入に相当）。注入時間と計算上の注入量を表３に示す。
【００４４】
【表３】
2015042940.tif 000005
図１５はクロマトグラム、図１６は注入時間に対するピークの面積、高さの変化を示した図である。計算上、注入時間が０．２分と０．１分では同量となることから、ピーク高さ、面積とも近い値を示している。注入時間を０．１分から短くするに連れて、ピーク強度が減少して行くことが見てとれる。このことから、注入時間を試料が完全に押し出される時間より短い時間に設定することで、（試料保持ループ＋バルブのボイド容量）以下の微量を定量的に注入できることが分かる。
【００４５】
次に、時間制御による注入装置の再現性について検証を行った。注入時間は０．０２分（注入量２μＬ）で、ｎ＝１０、３セットで実施した。１セット目のクロマトグラムを図１７ａに、面積および高さのＣｖ％を図１７ｂに示す。注入量が２μＬと少ないにもかかわらず、面積、高さとも約４％程度の再現性が得られている。
【００４６】
［実施例２］
本発明の時間制御による微量注入の効果を検証するため、ヘモグロビンＡ１ｃの測定を以下のように実施した。
【００４７】
実施例１で用いたシステムに２液のステップグラジエントが可能な機構を追加し、抵抗管（３５）の代わりにマイクロ分析カラム（３３）を搭載して実施した（図１８参照）。
【００４８】
溶離液Ａ（２９）の送液ポンプＡ（２７）と注入バルブ（２０）との間に、２位置６ポートの流路切り替えバルブ（３１）を配し、溶離液保持ループ（３２）内に溶離液Ｂを充填し、試料の注入から一定時間後に前記バルブを切り替えることでステップグラジエントを実施した。
【００４９】
溶離液保持ループ（３２）は外径１／１６インチ、内径０．７５ｍｍ、長さ３０ｃｍ（容量１３２マイクロリッタ）のＰＥＥＫ配管を使用した。
【００５０】
マイクロ分析カラム（３３）は内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍｍのカラム管にＴＳＫｇｅｌＢｏｒａｔｅ−５ＰＷ（１０μｍ）を充填したものを、４０℃で温調されたカラムオーブン（３４）内に設置し使用した。
【００５１】
溶離液Ａ，Ｂ（２９、３０）は東ソー（株）自動グリコヘモグロビン分析計ＧＨｂＶＩＩＩのアフィニティ用溶離液を使用した。溶離液Ａは毎分２００マイクロリッタで送液し、試料として全血を１／２００に希釈して用いた。ステップグラジエントは、試料注入後、０分から０．６５分まで溶離液Ａ、０．６５分から１．０５分まで溶離液Ｂが流れる条件で実施した。
【００５２】
注入バルブ（２０）が第一の状態（Ｌｏａｄ）で試料保持ループ内に試料を満たし、第二の状態（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に切り替え、試料保持ループと注入バルブのボイド部に保持された試料をマイクロ分析カラムへと押し出し、保持された試料の全量が押し出される前に第一の状態に戻し、微量注入を実施した。図１９は第二の状態から第一に状態に戻す時間（注入時間）を０．２分から０．０１分まで変化させた場合のクロマトグラムであり、図１９ａは試料保持ループ（４）に外径１／１６インチ、内径０．２５ｍｍ、長さ１０ｃｍ（容量：４．９マイクロリッタ）を装着した場合、図１９ｂは試料保持ループ（４）に外径１／１６インチ、内径０．５ｍｍ、長さ１０ｃｍ（容量：１９．６マイクロリッタ）を装着した場合のクロマトグラム、図２０は内径０．５ｍｍ、長さ１０ｃｍの試料保持ループを使って、注入時間が０．０３分のクロマトグラムを拡大したもの、図２１は注入時間に対するヘモグロビンＡ１ｃピークの総面積の変化を示した図である。
【００５３】
試料注入時間は表４のように０．２分から０．０１分まで変化させて行った。
【００５４】
【表４】
2015042940.tif 000006
図２１から分かるように、注入時間が０．０１分から０．０５分の場合、内径０．２５ｍｍと、内径０．５ｍｍの試料保持ループのどちらを搭載しても、得られる総面積はほぼ同一の値を示す。注入時間とピークの総面積はほぼ原点を通る１次式で近似でき、注入時間を制御することで注入量を正確に制御できることを表している。
【００５５】
内径０．２５ｍｍの試料保持ループを搭載時は、注入時間が０．２分から０．１分までは、ピークの総面積は殆ど変化していない。計算上の注入時間０．２分での注入量は４０マイクロリッタ（０．２ｍｉｎ×２００μＬ／ｍｉｎ）となり、（ループ容量＋注入バルブのボイド容量）を大幅に超過していることから、図２で例示したループ全量注入法となっている。
【００５６】
０．０５分より注入時間を短くすると、それに伴い総面積も減少していき、注入時間と総面積は原点を通る１次式で近似できる。つまり、試料保持ループとバルブのボイド容量以下の微量の試料がカラムに注入されたことになり、注入時間を制御することで注入量を変化させることができることを示唆している。
【００５７】
内径０．５ｍｍの試料保持ループの搭載時も前記と同様な傾向が見られる。試料保持ループの容量が４倍になっていることから、注入時間とピーク総面積の直線性の範囲が０．１分まで拡大されている。
【００５８】
一般的に、ループ全量注入法、ループ可変注入法、直接注入法など方式によらず、微量の試料を注入する場合、試料保持ループの容量をできるだけ抑えることで注入の精度が向上する。そのため、内径の細い管を使用して試料保持ループを作製することとなるが、試料の吸引抵抗が増大したり、管内での詰まりの頻度が増加するなどリスクが高まる。
【００５９】
本発明の時間制御による注入装置では、注入量は流速と注入時間で決定されるため、低容量域では、試料保持ループの形態、容量により影響を受けにくい。つまり、必要以上に内径の小さい管で試料保持ループを作製する必要はなく、前記リスクを回避することが可能となる。
【００６０】
本発明の時間制御による注入装置での注入量の精度は、バルブの切り替え時間の精度と溶離液の流量の精度に依存する。そのため、一般的なループ全量注入法、ループ可変注入法、直接注入法と比較すると注入精度は若干低いが、簡便に注入量を変更できたり、微量注入が可能であったりと利点が多い。実施例２で例示したように、グリコヘモグロビン測定などのように、各成分の面積比から定量計算を行う測定計などでは非常に有効である。
【符号の説明】
【００６１】
１．溶離液
２．ポンプ
３．試料注入バルブ
４．試料保持ループ
５．試料
６．分析カラム
７．検出器
８．洗浄液
９．試料吸引機構
１０．切替弁
１１．ポート
１２．オシネ（ナット）
１３．配管
１４．バルブ本体
１５．ステータ
１６．フェラル
１７．ロータシール
１８．溝
１９．注射器
２０．注入バルブ
２１．ステータＡ
２２．ステータＢ
２３．吸引ニードル
２４．スラーダ
２５．試料保持孔
２６．流路
２７．送液ポンプＡ
２８．送液ポンプＢ
２９．溶離液Ａ
３０．溶離液Ｂ
３１．流路切り替えバルブ
３２．溶離液保持ループ
３３．マイクロ分析カラム
３４．カラムオーブン
３５．抵抗管
３６．試料搬入手段
３７．試料吸引／洗浄手段
３８．試料注入制御部
３９．注入条件入力部
【図１】
2015042940.tif 000007
【図２】
2015042940.tif 000008
【図３】
2015042940.tif 000009
【図４】
2015042940.tif 000010
【図５】
2015042940.tif 000011
【図６】
2015042940.tif 000012
【図７】
2015042940.tif 000013
【図８】
2015042940.tif 000014
【図９】
2015042940.tif 000015
【図１０】
2015042940.tif 000016
【図１１】
2015042940.tif 000017
【図１２】
2015042940.tif 000018
【図１３】
2015042940.tif 000019
【図１４】
2015042940.tif 000020
【図１５】
2015042940.tif 000021
【図１６】
2015042940.tif 000022
【図１７】
2015042940.tif 000023
【図１８】
2015042940.tif 000024
【図１９】
2015042940.tif 000025
【図２０】
2015042940.tif 000026
【図２１】
2015042940.tif 000027