(57)【要約】  本明細書は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び増大したクロストリジウム毒素の結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素、かかる修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子及びかかる修飾クロストリジウム毒素の生産方法を開示している。
2008535486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  クロストリジウム毒素の中毒過程の酵素標的修飾段階を行うことができるクロストリジウム毒素の酵素ドメイン、
ｂ）  クロストリジウム毒素の中毒過程の転座段階を実行する能力をもつクロストリジウム毒素の転座ドメイン、
ｃ）  グルカゴン様ホルモン、神経ホルモン、神経調節サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合タンパク質、ニューレキシンに選択的に結合するリガンド、ニューレキシン−２αのためのリガンド、ニューレキシン−２βのためのリガンド、ニューレキシン−３αのためのリガンド、ニューレキシン−３βのためのリガンド、ＷＮＴ、Ｎｇ−ＣＡＭ（Ｌ１）、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、アグリン−ＭＵＳＫ、基底膜ポリペプチド、及び上述のポリペプチドのいずれかの変異体からなる群から選択されたポリペプチドを含み、クロストリジウム毒素の中毒過程の細胞結合段階を行うことができる、標的ドメイン、
ｄ）  プロテアーゼ切断部位、
を含む修飾クロストリジウム毒素であって、
プロテアーゼ切断部位が修飾クロストリジウム毒素の単鎖形態を二重鎖形態へと転換させている、修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び標的ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項４】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、標的ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、標的ドメイン、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項６】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン及び標的ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項７】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位、標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項８】
クロストリジウム毒素の酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン及びＴｅＮＴ酵素ドメインからなる群から選択されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項９】
クロストリジウム毒素の転座ドメインがＢｏＮＴ／Ａ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転座ドメイン、及びＴｅＮＴ転座ドメインからなる群から選択されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１０】
プロテアーゼ切断部位が内因性クロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位又は外因性切断部位である、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１１】
内因性クロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位が、ＢｏＮＴ／Ａ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位及びＴｅＮＴ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位からなる群から選択されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１２】
外因性プロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼ切断部位、トロンビン切断部位、Ｘａ因子切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ジペプチジルアミノペプチダーゼ切断部位、低分子量のユビキチン類似因子（ＳＵＭＯ）／ユビキチン様タンパク質−１（ＵＬＰ−１）プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素基質切断部位からなる群から選択されている、請求項１０に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１３】
クロストリジウム毒素基質切断部位が、ＢｏＮＴ／Ａ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ基質切断部位及びＴｅＮＴ基質切断部位からなる群から選択されている、請求項１２に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１４】
標的ドメインが、セクレチン、グルカゴン様ペプチド、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド、オキシントモジュリン、血管活性腸管ペプチド、胃抑制ポリペプチド、カルシトニン関連ペプチド内臓消化管ペプチド、及び上述のグルカゴン様ホルモンのいずれかの変異体からなる群から選択されたグルカゴン様ホルモンを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１５】
標的ドメインが、コルチコトロピン−放出ホルモン（ＣＣＲＨ）及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）及び上述の神経ホルモンのいずれかの変異体からなる群から選択された神経ホルモンを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１６】
標的ドメインが、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリコホリン−Ａ（ＧＰＡ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、オノスタチンＭ、カルディオトロフィン-１（ＣＴ−１）、カルディオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ニューロロイキン、ＶＥＧＦ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び上述の神経調節サイトカインのいずれかの変異体からなる群から選択された神経調節サイトカインを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１７】
標的ドメインが、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４／５（ＮＴ４／５）及び上述のニューロトロフィンのいずれかの変異体からなる群から選択されたニューロトロフィンを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１８】
標的ドメインが、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、パーセフリン、アルテミン、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）ポリペプチド、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長及び分化因子（ＧＤＦ）、アクチビン、及び上述の成長因子のいずれかの変異体からなる群から選択された成長因子を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１９】
標的ドメインが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ４及び上述のＴＧＦβのいずれかの変異体からなる群から選択されたＴＧＦβポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２０】
標的ドメインが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ１０及び上述のＢＭＰのいずれかの変異体からなる群から選択されたＢＭＰを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２１】
標的ドメインが、ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５及び上述のＧＤＦのいずれかの変異体からなる群から選択されたＧＤＦを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２２】
標的ドメインが、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、インヒビンＡ、及び上述のポリペプチドのいずれかの変異体からなる群から選択されたポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２３】
標的ドメインが、血清アミロイドＰ、β−グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、クライア（ｃｒｙｉａ）、殺虫性デルタ内毒素、アグルチニン、アブリン、リシン、及び上述の糖結合タンパク質のいずれかの変異体からなる群から選択された糖結合タンパク質を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２４】
標的ドメインが、ニューレキシン−１α、ニューレキシン−１β、ニューレキシン−２α、ニューレキシン−２β、ニューレキシン−３α、ニューレキシン−３β及び上述のニューレキシンのいずれかの変異体からなる群から選択されたポリペプチドを結合するリガンドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２５】
標的ドメインが、ラミニンβ−２及びその変異体からなる群から選択されたポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリヌクレオチドを１つの細胞内で発現させる段階を含む修飾クロストリジウム毒素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【従来技術】
【０００１】
本特許出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、その内容全体が全て参照として本明細書に組み込まれる、２００５年３月１５日に出願された米国仮出願第６０／６６２，１５１号及び２００５年３月１５日に出願された米国仮出願第６０／６６１，９５３号に対して優先権を主張する。
【０００２】
本出願に言及された全ての特許及び刊行物は、その内容全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
例えば、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ、及び破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）のようなクロストリジウム毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｔｏｘｉｎ）の神経シグナル伝達を阻害する能力が、広範囲な治療的及び美容的応用において開発されている。例えば、非特許文献１を参照する。一例として、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、現在１つ以上の国家で下記の適用について承認されている；弛緩不能症、成人での痙直、裂肛、腰痛、眼瞼けいれん、歯ぎしり、頸部ジストニア、本態性振戦、眉間のしわ、または運動過多性顔のしわ、頭痛、片側顔面けいれん、膀胱の活動亢進、多汗症、小児脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス障害、鼻と唇のしわ、けいれん性発声障害、斜視及びＶＩＩ神経障害。また、クロストリジウム毒素療法が下記の治療のために提案されているが、神経筋障害については、例えば、ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ」、特許文献１（２００５年３月２９日）；レット  Ｍ．シフマン（Ｒｈｅｔｔ  Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｕｔｅｒｉｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献２（２００４年９月９日）；リチャード  Ｌ．バロン（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｕｌｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇａｓｔｒｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｒｅｆｌｕｘ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、特許文献３（２００４年５月７日）；及びケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら  、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄｙｓｔｏｎｉａ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃ  ｔｏ  Ｇ」、特許文献４（２００１年１１月２０日）を参照し、目の疾患については、例えば、エリク  Ｒ．ファースト（Ｅｒｉｃ  Ｒ．Ｆｉｒｓｔ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献５（２００４年１１月２５日）；ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ」、特許文献６（２００４年８月５日）；及びケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ」、特許文献７（２００４年７月１日）を参照し、痛みについては、例えば、ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｐａｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ」、特許文献８（２００５年３月２２日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｐａｉｎ」、特許文献９（２００３年１１月４���）；ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ  ｂｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ」、特許文献１０（２００２年１０月１５日）；ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）及びミングレイ  チュー（Ｍｉｎｇｌｅｉ  Ｃｕｉ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ」、特許文献１１（２０００年９月５日）；マーティン  Ａ．ボエット（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ｖｏｅｔ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ」、特許文献１２（２００３年９月２３日）；マーティン  Ａ．ボエット（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ｖｏｅｔ）、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ」、特許文献１３（２００４年４月１日）；及びケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｗｅｒ  Ｂａｃｋ  Ｐａｉｎ」、特許文献１４（２００４年２月２６日）を参照し、筋肉損傷については、例えば、グレゴリ  Ｆ．ブルクス（Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｆ．Ｂｒｏｏｋｓ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｉｎｊｕｒｉｅｓ」、特許文献１５（２００２年７月２３日）を参照し、頭痛については、例えば、マーティン  ボエット（Ｍａｒｔｉｎ  Ｖｏｅｔ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｓｉｎｕｓ  Ｈｅａｄａｃｈｅ」、特許文献１６（２００５年１月４日）；ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｔｅｎｓｉｏｎ  Ｈｅａｄａｃｈｅ」、特許文献１７（２００４年８月１７日）；ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｈｅａｄａｃｈｅ」、特許文献１８（２００２年１０月１日）；及びウィリアム  Ｊ．ビンダー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｂｉｎｄｅｒ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｇｒａｉｎｅ  Ｈｅａｄａｃｈｅ  Ｐａｉｎ」、特許文献１９（１９９８年２月３日）を参照し、心臓血管疾患については、例えば、グレゴリ  Ｆ．ブルクス（Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｆ．Ｂｒｏｏｋｓ）及びステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ」、特許文献２０（２００４年７月２７日）を参照し、神経障害については、例えば、ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、特許文献２１（２００３年９月１６日）；及びステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ」、特許文献２２（２００１年１０月２３日）を参照し、精神神経疾患については、例えば、ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉ��  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献２３（２００４年９月１６日）；及びスティーヴン  ドノバン（Ｓｔｅｖｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献２４（２００３年１１月１３日）を参照し、内分泌障害については、例えば、ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献２５（２００４年１２月７日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ」、特許文献２６（２００４年５月２５日）；ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａ  Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  Ｓｗｅａｔ  Ｇｌａｎｄ」、特許文献２７（２００４年１月２７日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ」、特許文献２８（２００２年７月９日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ」、特許文献２９（２００２年１月８日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ」、特許文献３０（２００１年７月１７日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、  特許文献３１（２０００年１１月７日）を参照し、癌については、例えば、ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｂｏｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ」、特許文献３２（２００３年５月２０日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、特許文献３３（２００２年４月９日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ」、特許文献３４（２０００年１０月３１日）；及びミッチェル  Ｆ．ブリン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｆ．Ｂｒｉｎ）及びステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃａｎｃｅｒｓ」、特許文献３５（２００５年２月１０日）を参照し、耳の疾患については、例えば、ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｎｅｒ  Ｅａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献３６（２００２年３月１９日）；及びステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｏｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献３７（２００１年７月２４日）を参照し、自律神経障害については、例えば、パンカイ  Ｊ．パスリチャ（Ｐａｎｋａｉ  Ｊ．Ｐａｓｒｉｃｈａ）及びアンソニー  Ｎ．ケル（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｎ．Ｋａｌｌｏｏ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ」、特許文献３８（１９９５年８月１日）を参照し、また、その他の障害については、例えば、ウィリアム  Ｊ．ビンダー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｂｉｎｄｅｒ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｋｉｎ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｅｌｌ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献３９（１９９７年９月２３日）；エリク  Ｒ．ファースト（Ｅｒｉｃ  Ｒ．Ｆｉｒｓｔ）、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、特許文献４０（２０００年５月１６日）；マービン  シュワルツ（Ｍａｒｖｉｎ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ）及びブライアン  Ｊ．フロイント（Ｂｒｉａｎ  Ｊ．Ｆｒｅｕｎｄ）、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｈａｉｒ  Ｌｏｓｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｈａｉｒ  Ｇｒｏｗｔｈ」、特許文献４１（２００１年１０月９日）；ジーン  Ｄ．Ａ．カラザーズ(Ｊｅａｎ  Ｄ．Ａ．Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ)及びアラステア  カラザーズ（Ａｌａｓｔａｉｒ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）、「Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｏｗｎｔｕｒｎｅｄ  Ｍｏｕｔｈ」、特許文献４２（２００２年３月１９日）；ステファン  ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  ｔｏ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ａｐ
ｐｅｔｉｔｅ」、特許文献４３（２００４年１２月１６日）；及びハワード  Ｉ．カッツ（Ｈｏｗａｒｄ  Ｉ．Ｋａｔｚ）及びアンドリュー  Ｍ．ブルーメンフェルド（Ａｎｄｒｅｗ  Ｍ．Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ）、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、特許文献４４（２００４年６月１７日）；ケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ」、特許文献４５（２００２年１月２４日）；及びケイ  ロジャー  アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐａｉｎ」、特許文献４６（２００４年１月２２日）を参照する。また、ヒト及びその他の哺乳動物の治療的及び美容的処理における、例えば、ＢｏＮＴ及びＴｅＮＴのようなクロストリジウム毒素の予測される用途は、これらの毒素の特性から利益が得られる、さらに増加している範囲の疾患及び病症に拡大されるものと予想される。
【発明の開示】
【０００４】
クロストリジウム毒素療法は、多数の適用において、成功的に用いられている。一般に、クロストリジウム毒素治療剤の投与は、耐薬性が良好である。しかしながら、一部の応用分野では、毒素投与が問題を引き起こすことがあるが、これは、有益な効果を得るためにより多くの投与量が必要だからである。投与量が多くなると、前記毒素が、体内の間質液、及び例えば、心臓血管系及びリンパ系のような循環系を移動し、毒素が、毒素治療の標的ではない区域に望ましくない分散を引き起こす可能性が高くなり得る。このような分散は、例えば、治療の標的ではない神経細胞での神経伝達物質の放出の阻害、または、治療の目的ではない筋肉の麻痺のような望ましくない副作用を引き起こすこともある。例えば、斜頸について、首の筋肉に治療的に有効量のＢｏＮＴ／Ａ治療剤が投与された患者は、毒素が中咽頭に分散され、嚥下困難を引き起こすこともあり得る。したがって、治療部位では効果的であるが、毒素治療の標的ではない区域では殆ど影響を及ぼさない、改善されたクロストリジウム毒素が依然として望まれている。
【０００５】
大きな投与量を必要とする療法でのクロストリジウム毒素の臨床的、治療的及び美容的用途の増加は、製薬産業において、適用標的部位では効果的であるが、所望でない位置または位置等への毒素の分散に関連した望ましくない副作用は減少させまたは防止する修飾クロストリジウム毒素の開発を必要とする。本発明は、非標的化区域への毒素の分散に関連した所望でない副作用を減少させまたは防止する新規なクロストリジウム毒素を提供する。これらの長所及び関連した長所は、例えば、神経筋障害、神経病症障害、目の疾患、痛み、筋肉損傷、頭痛、心臓血管疾患、精神神経疾患、内分泌障害、癌、耳の障害、及び運動過多性顔のしわなど、哺乳動物に対するクロストリジウム毒素の投与が有益な効果を生じ得るその他の障害の治療のような多様な臨床的、治療的及び美容的応用分野に有用である。
【０００６】
図面の簡単な説明
図１は、中枢及び末梢神経細胞での神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現在パラダイムの概略図を示す。図１Ａは、中枢及び末梢神経細胞での神経伝達物質放出メカニズムに対する概略図を示す。放出過程は、１）小胞体ドッキング段階であり、神経伝達物質分子を含有する小胞体の小胞体結合ＳＮＡＲＥタンパク質が、原形質膜に位置した膜結合ＳＮＡＲＥタンパク質と結合する段階、及び２）神経伝達物質放出段階であり、前記小胞体が原形質膜と融合し、神経伝達物質分子が細胞外流出される段階の、２段階を含むものと説明され得る。図１Ｂは、中枢及び末梢神経細胞での破傷風及びボツリヌス毒素活性に対する中毒メカニズムの概略図を示す。この中毒過程は、１）受容体結合段階であり、クロストリジウム毒素がクロストリジウム受容体系と結合し、中毒過程を開始する段階、２）複合体内在化段階であり、毒素結合後、毒素／受容体系複合体を含有する小胞体が細胞内に細胞内移入される段階、３）軽鎖転座段階であり、例えば、小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャンネル細孔の形成、前記重鎖からクロストリジウム毒素軽鎖の分離、及び活性軽鎖の放出を含む多様なイベントが起こると推定される段階、及び４）酵素標的修飾段階であり、クロストリジウム毒素タンパク質の活性軽鎖が、例えば、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンのようなその標的ＳＮＡＲＥ基質を、タンパク質分解的に切断することにより、小胞体ドッキング及び神経伝達物質放出を防止する段階の、４段階を含むものと説明され得る。
【０００７】
図２は、天然由来のクロストリジウム毒素のドメイン編成を示す。単一鎖型は、酵素ドメイン、転座ドメイン、結合ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を示す。転座ドメインと酵素ドメインとの間に位置した二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示される。この領域は、例えば、内因性クロストリジウム毒性プロテアーゼまたは環境で生成した天然由来のプロテアーゼのような天然由来のプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、毒素の単一鎖型を二重鎖型に変換させる内因性二重鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。前記単一鎖型上には、クロストリジウム毒素結合ドメインのＨＣＣ領域が示されている。この領域は、アミノからカルボキシルまでの線形編成のうち、α−折り畳み、β４／β５ヘアピンカーブ、β−折り畳み、β８／β９ヘアピンカーブ、及びγ−折り畳みを含むβ−三葉形ドメインを含む。
【０００８】
図３は、修飾毒素のアミノ末端に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。図３Ａは、増大された標的ドメイン、酵素ドメイン及び転座ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、転座ドメインと酵素ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、標的ドメインと転座ドメイン、転座ドメインと酵素ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。図３Ｂは、増大された標的ドメイン、酵素ドメイン及び転座ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、酵素ドメインと転座ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、標的ドメインと酵素ドメイン、酵素ドメインと転座ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【０００９】
図４は、他の２つのドメイン間に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。図４Ａは、酵素ドメイン、増大された標的ドメイン及び転座ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、酵素ドメインと標的ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、酵素ドメインと標的ドメイン、標的ドメインと転座ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。図４Ｂは、転座ドメイン、増大された標的ドメイン、及び酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、転座ドメインと標的ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、転座ドメインと標的ドメイン、標的ドメインと酵素ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【００１０】
図５は、修飾毒素のカルボキシル末端に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。図５Ａは、酵素ドメイン、転座ドメイン及び増大された標的ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、酵素ドメインと転座ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、酵素ドメインと転座ドメイン、転座ドメインと標的ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。図５Ｂは、転座ドメイン、酵素ドメイン及び増大された標的ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、転座ドメインと酵素ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、転座ドメインと酵素ドメイン、酵素ドメインと標的ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、天然由来のクロストリジウム毒素により標的とされた細胞に対する増大した結合活性を示す修飾クロストリジウム毒素を開示する。増大された結合活性は、クロストリジウム毒素の天然由来の結合ドメインを、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対する結合ドメインと置換することにより得られる。この標的細胞に対する増大された結合活性は、より低い有効投与量の修飾クロストリジウム毒素を個人に投与可能にしなければならないが、これは、より多くの毒素が標的細胞に伝達されるからである。増大した結合活性を有する、そのように修飾されたクロストリジウム毒素は、毒素の、治療に対する標的ではない区域への望ましくない分散を減少させ、クロストリジウム毒素の望まない位置への拡散と関連する望ましくない副作用を減少させまたは防止することができる。
【００１２】
本発明の態様は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転座ドメイン、及び増大された標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素であって、天然由来のクロストリジウム毒素と比べて、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して結合活性を示す修飾クロストリジウム毒素を提供する。本明細書の修飾クロストリジウム毒素内の増大された標的ドメインの位置は、毒素のアミノ末端、酵素ドメインと転座ドメインとの間、または、毒素のカルボキシル末端から見出されるものと想定される。したがって、本明細書に開示された修飾クロストリジウム毒素は、例えば、増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素転座ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメイン；増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメインと、クロストリジウム毒素転座ドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメインと、増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素転座ドメイン；クロストリジウム毒素転座ドメインと、増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメインと、クロストリジウム毒素転座ドメインと、増大された標的ドメイン；及びクロストリジウム毒素転座ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメインと、増大された標的ドメインの、アミノからカルボキシルまでのドメイン配列を含んでもよい。
【００１３】
本発明の他の態様は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転座ドメイン、及び増大された標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記修飾クロストリジウム毒素が天然由来のクロストリジウム毒素と比べて、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して増大された結合活性を示すものであるポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書のポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾クロストリジウム毒素の増大された標的ドメインの位置は、毒素のアミノ末端、酵素ドメインと転座ドメインとの間、または、毒素のカルボキシル末端から見出されるものと予想される。したがって、本明細書に開示されたポリヌクレオチド分子は、例えば、増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素転座ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメイン；増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転座ドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメインと、増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素転座ドメイン；クロストリジウム毒素転座ドメインと、増大された標的ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメインと、クロストリジウム毒素転座ドメインと、増大された標的ドメイン；及びクロストリジウム毒素転座ドメインと、クロストリジウム毒素酵素ドメインと、増大された標的ドメインの、アミノからカルボキシルまでのドメイン配列を含む修飾クロストリジウム毒素をコードしてもよい。
【００１４】
本発明の他の態様は、本明細書に開示された修飾クロストリジウム毒素を製造する方法であって、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転座ドメイン、及び増大された標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内で発現させるが、前記修飾クロストリジウム毒素が天然由来のクロストリジウム毒素と比べて、クロストリジウム毒素標的細胞に対して増大された標的化活性を示すものである段階を含む方法を提供する。本発明の他の態様は、本明細書に開示された修飾クロストリジウム毒素を製造する方法であって、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転座ドメイン、及び増大された標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構造体を細胞内に導入する段階を含み、前記修飾クロストリジウム毒素が天然由来のクロストリジウム毒素と比べて、クロストリジウム毒素標的細胞に対して増大された標的化活性を示すものである段階、及び細胞内で前記発現構造体を発現する段階を含む方法を提供する。
【００１５】
クロストリジウム・ボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・バラティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒａｔｉｉ）、及びクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）により産生される毒素が、ヒト及び他の哺乳動物の治療的及び美容的処理に最も幅広く使用される。Ｃ．ボツリヌス（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）菌株は、７つの抗原的に異なる類型のボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）を産生するが、この毒素は、ヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｂ、／Ｅ及び／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１及び／Ｄ）、または土壌から分離されたもの（ＢｏＮＴ／Ｇ）におけるボツリヌス中毒症発生を調査することにより識別された。７つのボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）血清型の全てが類似した構造及び薬理学的特性を有するのに対して、それぞれはまた、異種の細菌学的特徴を示す。その一方、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）は、Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）の均一菌により産生される。クロストリジウムの他の２つの種であるＣ．バラティ（Ｃ．ｂａｒａｔｉｉ）及びＣ．ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）もまた、それぞれＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｅと類似した毒素を産生する。
【００１６】
クロストリジウム毒素は、互いに約３５％のアミノ酸同一性を保有し、同一の機能的ドメイン組織及び全体の構造的構成を共有する。クロストリジウム毒素は、それぞれ約１５０ｋＤａの単一鎖ポリペプチドと翻訳され、続いて、例えば、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼまたは環境で産生された天然由来のプロテアーゼのような天然由来のプロテアーゼにより、二硫化物ループ内でタンパク質分解的分裂により切断される（図２）。この翻訳後加工は、約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）及び約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）が、単一二硫化物結合及び非共有相互作用により一緒に維持される二重鎖分子を産生する。それぞれの熟成した二重鎖分子は、１）神経伝達物質放出装置の核心成分を特異的に標的化した亜鉛依存性のエンドペプチダーゼ活性を含有するメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣに位置した酵素ドメイン（表１）、２）細胞内小胞体から標的細胞の細胞質内へのＬＣの放出を容易にするＨＣのアミノ末端側半分（ＨＮ）内に含有された転座ドメイン（表１）、３）標的細胞の表面に位置した受容体複合体に対する毒素の結合活性及び結合特異性を決定するＨＣのカルボキシル末端側半分（ＨＣ）の中で見出される結合ドメイン（表１）の、３つの機能的に異なったドメインを含む。
【００１７】
【表１】
2008535486.tif 000003
【００１８】
これらの３つの機能的ドメインの結合、転座及び酵素活性は、全て毒性のために必要である。この過程の全ての細部事項が未だ明らかに知られていないが、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する全体的な細胞中毒メカニズムは、血清型はたは亜型にかかわらず類似している。本出願人は、下記記載により限定する意図は全くないが、前記中毒メカニズムは、１）受容体結合、２）複合体の内在化、３）軽鎖転座、及び４）酵素標的修飾の少なくとも４つの段階を含むものと説明され得る（図１参照）。前記過程は、クロストリジウム毒素のＨＣドメインが標的細胞の原形質膜の表面上に位置した毒素特異的受容体系に結合する際に開始される。受容体複合体の結合特異性は、部分的には、それぞれのクロストリジウム毒素受容体複合体を区別して含むものと見えるガングリオシドとタンパク質受容体の特異的組合せにより得られるものと推定される。一旦結合されると、毒素／受容体複合体は、エンドサイトーシスにより内在化し、内在化した小胞体は、特定の細胞内経路に分類される。転座段階は、小胞体区画の酸性化により始まるようである。この過程は、疎水性を増加させ、毒素の二重鎖型の形成を促進する２つの重要なｐＨ依存性の構造再配列を開始するようである。一旦活性化すると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが細胞内小胞体からサイトゾル内に放出され、そこでは、神経伝達物質放出装置の３つの公知された核心成分の１つを特異的に標的とするようである。これらのコアタンパク質である小胞体−関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム関連のタンパク質（ＳＮＡＰ−２５）及びシンタキシンは、神経末端でのシナプス小胞体ドッキング及び融合に必要であり、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子接合タンパク質受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＳＮＡＲＥ））族の構成員を構成する。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、ＳＮＡＰ−２５をカルボキシル末端領域で切断し、それぞれ９個または２６個のアミノ酸断片を放出し、ＢｏＮＴ／Ｃ１もまた、ＳＮＡＰ−２５をカルボキシル末端の近くで切断する。ボツリヌス血清型であるＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ、及び破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存した中央部分上に作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分をサイトゾル内に放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、シンタキシンをサイトゾル膜表面の近くで単一部位で切断する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的なタンパク質分解は、インビボクロストリジウム毒素により引き起こされる神経伝達物質放出の遮断の原因となる。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は、様々な非神経細胞類型でのエキソサイトーシスに対して普遍的である。これらの細胞では、神経細胞と同様に、軽鎖ペプチダーゼ活性が細胞外流出を阻害する。例えば、ヤン  フメーウ（Ｙａｎｎ  Ｈｕｍｅａｕ）ら「Ｈｏｗ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ」、第８２巻、第５号、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．４２７−４４６頁（２０００年）；キャスリン  タートン（Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔｕｒｔｏｎ）ら、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ」、第２７巻、第１１号、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．５５２−５５８頁（２００２年）；ジョバンナ  ラリ（Ｇｉｏｖａｎｎａ  Ｌａｌｌｉ）ら、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎｅｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ」、第１１巻、第９号、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３１−４３７頁、（２００３年）を参照する。
【００１９】
本発明の態様は、部分的には、修飾クロストリジウム毒素を提供する。本明細書で用いられる用語の「修飾クロストリジウム毒素」は、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する全体的な細胞メカニズムを行うことができる任意のポリペプチドを意味し、クロストリジウム毒素の低親和性または高親和性受容体複合体への結合、毒素の内在化、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質内への転座、及びクロストリジウム毒素基質の酵素的修飾を含む。本明細書で開示された前記修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素で見出される天然由来の結合ドメインの細胞結合活性が欠けているということにより、天然由来のクロストリジウム毒素と区別される。その代わりに、本明細書に開示された修飾クロストリジウム毒素は、標的細胞の表面に位置した内因性クロストリジウム毒素受容体系に対する修飾クロストリジウム毒素の結合活性を決定する増大された標的ドメインを含む。定義によれば、天然由来のクロストリジウム毒素は、増大された標的ドメインが欠けている。
【００２０】
本発明の態様は、部分的には、クロストリジウム毒素酵素ドメインを提供する。本明細書で用いられる用語の「クロストリジウム毒素酵素ドメイン」は、中毒過程の酵素標的修飾段階を行うことができる任意のクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。したがって、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、クロストリジウム毒素基質を特異的に標的とし、例えば、ＳＮＡＰ−２５基質、ＶＡＭＰ基質、及びシンタキシン基質等のＳＮＡＲＥタンパク質のようなクロストリジウム毒素基質のタンパク質分解的切断を含む。クロストリジウム毒素酵素ドメインの非限定的な例には、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖領域、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖領域、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖領域、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖領域、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖領域、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖領域、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖領域、及びＴｅＮＴ軽鎖領域のようなクロストリジウム毒素軽鎖領域が含まれる。
【００２１】
クロストリジウム毒素酵素ドメインは制限なく、例えば、クロストリジウム毒素軽鎖イソ型及びクロストリジウム毒素軽鎖亜型のような天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体；例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素軽鎖キメラ、これらの活性クロストリジウム毒素軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体を含む。
【００２２】
本明細書で用いられる用語の「クロストリジウム毒素軽鎖変異体」は、天然由来であれ非天然由来であれ、開示された標準配列（表１参照）の相応する領域から少なくとも１つのアミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素軽鎖を意味し、前記標準配列の相応する領域に対してパーセント同一性と記載されてもよい。特に表示されない限り、本明細書に開示された全てのクロストリジウム毒素軽鎖変異体は、中毒過程の酵素標的修飾段階を行うことができる。制限されない例として、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番を含むＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体は、配列番号１のアミノ酸領域１番〜４４８番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番を含むＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体は、配列番号２のアミノ酸領域１番〜４４１番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番を含むＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体は、配列番号３のアミノ酸領域１番〜４４９番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番を含むＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体は、配列番号４のアミノ酸領域１番〜４４５番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番を含むＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体は、配列番号５のアミノ酸領域１番〜４２２番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番を含むＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体は、配列番号６のアミノ酸領域１番〜４３９番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番を含むＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体は、配列番号７のアミノ酸領域１番〜４４６番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；また配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番を含むＴｅＮＴ軽鎖変異体は、配列番号８のアミノ酸領域１番〜４５７番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有する。
【００２３】
当業者であれば、クロストリジウム毒素のそれぞれの血清型中に、アミノ酸配列が少し異なり、かつ、これらのタンパク質をコードする核酸が異なる天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体があり得ることが認知可能である。例えば、現在、４個のＢｏＮＴ／Ａ亜型であるＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３及びＢｏＮＴ／Ａ４があり、特定の軽鎖亜型は、他のＢｏＮＴ／Ａ軽鎖亜型と比べて、約９５％のアミノ酸同一性を示す。本明細書で用いられる用語の「天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体」は、制限なく、選択的スプライスによる転写物から生成したクロストリジウム毒素軽鎖イソ型、偶発突然変異により生成したクロストリジウム毒素軽鎖イソ型、及びクロストリジウム毒素軽鎖亜型を含む、天然由来の過程により生成した任意のクロストリジウム毒素軽鎖を意味する。天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素軽鎖を置換することができる。天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、または１００個以上のアミノ酸を置換してもよい。天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体はまた、その天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から、少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個の隣接アミノ酸、少なくとも２０個の隣接アミノ酸、または少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することができるが、前記隣接アミノ酸は、前記天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖に対して、少なくとも５０％のアミノ酸同一性、６５％のアミノ酸同一性、７５％のアミノ酸同一性、８５％のアミノ酸同一性、または９５％のアミノ酸同一性を保有する。
【００２４】
天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体の制限されない例は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖イソ型、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖イソ型、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖イソ型、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖イソ型、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖イソ型、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖イソ型、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖イソ型、及びＴｅＮＴ軽鎖イソ型のようなクロストリジウム毒素軽鎖イソ型である。クロストリジウム毒素軽鎖イソ型は、そのクロストリジウム毒素軽鎖イソ型が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素軽鎖を置換することができる。
【００２５】
天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体のまた他の制限されない例は、例えば、亜型ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３及びＢｏＮＴ／Ａ４由来の軽鎖；亜型ＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ二価型及びＢｏＮＴ／Ｂタンパク非分解性由来の軽鎖；亜型ＢｏＮＴ／Ｃ１−１及びＢｏＮＴ／Ｃ１−２由来の軽鎖；亜型ＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２及びＢｏＮＴ／Ｅ３由来の軽鎖；及びＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３及びＢｏＮＴ／Ｆ４由来の軽鎖のようなクロストリジウム毒素軽鎖亜型である。クロストリジウム毒素軽鎖亜型は、そのクロストリジウム毒素軽鎖亜型が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素軽鎖を置換することができる。
【００２６】
本明細書で用いられる用語の「非天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体」は、制限なく、ランダム変異誘発または合理的設計を用いて、遺伝工学により生成したクロストリジウム毒素軽鎖、及び化学合成により生成したクロストリジウム毒素軽鎖を含む、ヒトの操作補助の下で生成した任意のクロストリジウム毒素軽鎖を意味する。非天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体の制限されない例には、例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素軽鎖キメラ変異体、及び活性クロストリジウム毒素軽鎖断片が含まれる。
【００２７】
本明細書で用いられる用語の「保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体」は、標準クロストリジウム毒素軽鎖配列（表１）から、少なくとも１つのアミノ酸が、本来のアミノ酸のものと類似した特性を少なくとも１つ有する他のアミノ酸またはアミノ酸類似体で置換されているクロストリジウム毒素軽鎖を意味する。特性の例には、制限なく、類似したサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはこれらの任意の組合せが含まれる。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素軽鎖を置換することができる。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００個以上のアミノ酸、または５００個以上のアミノ酸を置換してもよい。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体はまた、その保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から、少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個の隣接アミノ酸、少なくとも２０個の隣接アミノ酸、または少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することができるが、前記隣接アミノ酸は、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖に対して、少なくとも５０％のアミノ酸同一性、６５％のアミノ酸同一性、７５％のアミノ酸同一性、８５％のアミノ酸同一性、または９５％のアミノ酸同一性を保有する。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体の制限されない例には、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体、及び保存的ＴｅＮＴ軽鎖変異体が含まれる。
【００２８】
本明細書で用いられる用語の「非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体」は、１）その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から少なくとも１つのアミノ酸が欠失される；２）その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖に少なくとも１つのアミノ酸が添加される；または３）標準クロストリジウム毒素軽鎖配列（表１）から、少なくとも１つのアミノ酸が、本来のアミノ酸のものと類似した任意の特性を共有しない他のアミノ酸またはアミノ酸類似体で置換されるクロストリジウム毒素軽鎖を意味する。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素軽鎖を置換することができる。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、及び１０個以上のアミノ酸が欠失されてもよい。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖に、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、及び１０個以上のアミノ酸を添加してもよい。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００個以上のアミノ酸、または５００個以上のアミノ酸を置換してもよい。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体はまた、その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖から、少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個の隣接アミノ酸、少なくとも２０個の隣接アミノ酸、または少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することができるが、前記隣接アミノ酸は、その非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素軽鎖に対して、少なくとも５０％のアミノ酸同一性、６５％のアミノ酸同一性、７５％のアミノ酸同一性、８５％のアミノ酸同一性、または９５％のアミノ酸同一性を保有する。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体の制限されない例には、例えば、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体、及び非保存的ＴｅＮＴ軽鎖変異体が含まれる。
【００２９】
本明細書で用いられる用語の「クロストリジウム毒素軽鎖キメラ」は、クロストリジウム毒素軽鎖の少なくとも一部及び少なくとも１つの他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表１の標準クロストリジウム毒素軽鎖から少なくとも１つの特性が異なった毒素軽鎖を形成するポリペプチドを意味するが、但し、このクロストリジウム毒素軽鎖キメラは、依然として神経伝達物質放出装置の核心成分を特異的に標的化し、したがって、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解的に切断する全体的な細胞メカニズムを行うことができなければならない。このようなクロストリジウム毒素軽鎖キメラは、例えば、ランス  Ｅ．スチュアード（Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ）ら、「Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ」、米国特許出願公開第２００３／００２７７５２号（２００３年２月６日）；ランス  Ｅ．スチュアード（Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ）ら、「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ」、米国特許出願公開第２００３／０２１９４６２号（２００３年１１月２７日）；及びランス  Ｅ．スチュアード（Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ）ら、「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ」、米国特許出願公開第２００４／０２２０３８６号（２００４年１１月４日）に記述されている。
【００３０】
本明細書で用いられる用語の「活性クロストリジウム毒素軽鎖断片」は、本発明の態様において有用可能な軽鎖を含む様々なクロストリジウム毒素断片の任意であるが、但し、これらの軽鎖断片は、神経伝達物質放出装置の核心成分を特異的に標的化し、したがって、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解的に切断する全体的な細胞メカニズムを行うことができなければならない。クロストリジウム毒素の軽鎖は、長さがアミノ酸約４２０〜４６０個であり、酵素ドメインを含む（表１）。研究結果によれば、クロストリジウム毒素軽鎖の全長が、前記酵素ドメインの酵素活性に必ずしも必要ではない。制限されない一例としては、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最初の８個のアミノ酸（配列番号１の残基１番〜８番）は、酵素活性に必要ではない。他の制限されない例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最初の８個のアミノ酸（配列番号８の残基１番〜８番）は、酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は、活性に必須ではない。制限されない例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最後の３２個のアミノ酸（配列番号１の残基４１７番〜４４８番）は、酵素活性に必要ではない。他の制限されない例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最後の３１個のアミノ酸（配列番号８の残基４２７番〜４５７番）は、酵素活性に必要ではない。したがって、本実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、少なくとも４２５個のアミノ酸、及び少なくとも４５０個のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含んでもよい。本実施形態の他の態様は、例えば、多くても３５０個のアミノ酸、多くても３７５個のアミノ酸、多くても４００個のアミノ酸、多くても４２５個のアミノ酸、及び多くても４５０個のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含んでもよい。
【００３１】
制限なく、包括的方法、局所的方法、及び例えば断片アプローチ法のようなハイブリッド法を含む様々な配列アラインメント法のいずれかを使用して、天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体及び非天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体のパーセント同一性を求めることができる。パーセント同一性を求めるプロトコールは、当業者の範囲内で、また、本明細書の教示から日常的な手続きである。
【００３２】
包括的方法は、配列を分子の最初から最後までアラインメントし、個別の残基対のスコアを合算し、ギャップペナルティーを与えることで最善のアラインメントを決定する。制限されない方法には、例えば、クラスタル・ダブル(ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ)法、例えば、ジューリー  Ｄ．トンプスン（Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｈｏｉｃｅ」、第２２巻、第２２号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４６７３−４６８０頁（１９９４年）参照；及び反復改良法、例えば、オサム  ゴトウ（Ｏｓａｍｕ  Ｇｏｔｏｈ）、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」、第２６４巻、第４号、J．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２３−８３８頁（１９９６年）参照が含まれる。
【００３３】
局所的方法は、入力配列の全てが共有する１つ以上の保存モチーフを同定することで配列をアラインメントする。制限されない方法例には、例えば、Ｍａｔｃｈ−ｂｏｘ法、例えば、エリック  デピエール（Ｅｒｉｃ  Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ）及びアーネスト  フェイトマンズ（Ｅｒｎｅｓｔ  Ｆｅｙｔｍａｎｓ）、「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ：Ａ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、第８巻、第５号、ＣＡＢＩＯＳ、５０１−５０９頁（１９９２年）参照；ギブスサンプリング法、例えば、Ｃ．Ｅ．ローレンス（Ｃ．Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ）ら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｔｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ：Ａ  Ｇｉｂｂｓ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」、第２６２巻、第５１３１号、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０８−２１４頁（１９９３年）参照；アライン−Ｍ法、例えば、イボ  ヴァン  ワル（Ｉｖｏ  Ｖａｎ  Ｗａｌｌｅ）ら、「Ａｌｉｇｎ−Ｍ  Ａ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、第２０巻、第９号、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１４２８−１４３５頁（２００４年）参照が含まれる。
【００３４】
ハイブリッド法は、包括的及び局所的アラインメント法の両方の機能的態様を組み合わせる。制限されない方法には、例えば、断片対断片比較法、例えば、ブルクハルド  モーガンスターン（Ｂｕｒｋｈａｒｄ  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ）ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｔｏ−Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、第９３巻、第２２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１２０９８−１２１０３頁（１９９６年）参照；Ｔ−コーヒー法、例えば、ケドリック・ノートルダム（Ｃｅｄｒｉｃ  Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ）ら、「Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」、第３０２巻、第１号、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０５−２１７頁（２０００年）参照；マッスル法、例えば、ロバート  Ｃ．エドガー（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｅｄｇａｒ）、「ＭＵＳＣＬＥ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｃｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ」、第３２巻、第５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７９２−１７９７頁（２００４）参照；及びＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ法、例えば、アマレンドラン  Ｒ  スブラマニアン（Ａｍａｒｅｎｄｒａｎ  Ｒ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）ら、「ＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ：Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」、第６巻、第１号、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６６頁（２００５年）参照が含まれる。
【００３５】
したがって、一実施形態では、本明細書に開示された修飾クロストリジウム毒素がクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。本実施形態の一態様では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、例えばクロストリジウム毒素軽鎖イソ型またはクロストリジウム毒素軽鎖亜型のような天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体を含む。本実施形態の他の態様では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、例えば、保存的クロストジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素キメラ軽鎖、活性クロストリジウム毒素軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のクロストリジウム毒素軽鎖変異体を含む。
【００３６】
他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、ＢｏＮＴ／Ａイソ型由来の軽鎖またはＢｏＮＴ／Ａ亜型由来の軽鎖のような天然由来のＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、配列番号１のＢｏＮＴ／Ａイソ型のアミノ酸１番〜４４８番または配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ亜型のアミノ酸１番〜４４８番のような配列番号１の天然由来のＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４８番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体、ＢｏＮＴ／Ａキメラ軽鎖、活性ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１の保存的ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４８番、配列番号１の非保存的ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４８番、配列番号１の活性ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖断片のアミノ酸１番〜４４８番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号１の非天然由来のＢｏＮＴ／Ａ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４８番を含む。
【００３７】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００３８】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００３９】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖が、例えば、配列番号１のアミノ酸１番〜４４８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００４０】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂイソ型由来の軽鎖またはＢｏＮＴ／Ｂ亜型由来の軽鎖のような天然由来のＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂイソ型のアミノ酸１番〜４４１番または配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂ亜型のアミノ酸１番〜４４１番のような配列番号２の天然由来のＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４１番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体、ＢｏＮＴ／Ｂキメラ軽鎖、活性ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２の保存的ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４１番、配列番号２の非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４１番、配列番号２の活性ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖断片のアミノ酸１番〜４４１番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号２の非天然由来のＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４１番を含む。
【００４１】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４２】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００４３】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖が、例えば、配列番号２のアミノ酸１番〜４４１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００４４】
他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型由来の軽鎖またはＢｏＮＴ／Ｃ１亜型由来の軽鎖のような天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型のアミノ酸１番〜４４９番または配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１亜型のアミノ酸１番〜４４９番のような配列番号３の天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４９番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体、ＢｏＮＴ／Ｃ１キメラ軽鎖、活性ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３の保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４９番、配列番号３の非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４９番、配列番号３の活性ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖断片のアミノ酸１番〜４４９番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号３の非天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４９番を含む。
【００４５】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４６】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００４７】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１軽鎖が、例えば、配列番号３のアミノ酸１番〜４４９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００４８】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄイソ型由来の軽鎖またはＢｏＮＴ／Ｄ亜型由来の軽鎖のような天然由来のＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄイソ型のアミノ酸１番〜４４５番または配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄ亜型のアミノ酸１番〜４４５番のような配列番号４の天然由来のＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４５番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体、ＢｏＮＴ／Ｄキメラ軽鎖、活性ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４の保存的ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４５番、配列番号４の非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４５番、配列番号４の活性ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖断片のアミノ酸１番〜４４５番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号４の非天然由来のＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４５番を含む。
【００４９】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５０】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００５１】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｄ軽鎖が、例えば、配列番号４のアミノ酸１番〜４４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００５２】
他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅイソ型由来の軽鎖またはＢｏＮＴ／Ｅ亜型由来の軽鎖のような天然由来のＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅイソ型のアミノ酸１番〜４２２番または配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅ亜型のアミノ酸１番〜４２２番のような配列番号５の天然由来のＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４２２番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体、ＢｏＮＴ／Ｅキメラ軽鎖、活性ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５の保存的ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４２２番、配列番号５の非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４２２番、配列番号５の活性ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖断片のアミノ酸１番〜４２２番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号５の非天然由来のＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４２２番を含む。
【００５３】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５４】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００５５】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖が、例えば、配列番号５のアミノ酸１番〜４２２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００５６】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆイソ型由来の軽鎖またはＢｏＮＴ／Ｆ亜型由来の軽鎖のような天然由来のＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆイソ型のアミノ酸１番〜４３９番または配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆ亜型のアミノ酸１番〜４３９番のような配列番号６の天然由来のＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４３９番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体、ＢｏＮＴ／Ｆキメラ軽鎖、活性ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６の保存的ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４３９番、配列番号６の非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４３９番、配列番号６の活性ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖断片のアミノ酸１番〜４３９番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号６の非天然由来のＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４３９番を含む。
【００５７】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５８】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００５９】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｆ軽鎖が、例えば、配列番号６のアミノ酸１番〜４３９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００６０】
他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇイソ型由来の軽鎖またはＢｏＮＴ／Ｇ亜型由来の軽鎖のような天然由来のＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇイソ型のアミノ酸１番〜４４６番または配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇ亜型のアミノ酸１番〜４４６番のような配列番号７の天然由来のＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４６番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体、ＢｏＮＴ／Ｇキメラ軽鎖、活性ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７の保存的ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４６番、配列番号７の非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４６番、配列番号７の活性ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖断片のアミノ酸１番〜４４６番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号７の非天然由来のＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４４６番を含む。
【００６１】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６２】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００６３】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｇ軽鎖が、例えば、配列番号７のアミノ酸１番〜４４６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００６４】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＴｅＮＴ軽鎖を含む。本実施形態の一態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、ＴｅＮＴイソ型由来の軽鎖またはＴｅＮＴ亜型由来の軽鎖のような天然由来のＴｅＮＴ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のＴｅＮＴイソ型のアミノ酸１番〜４５７番または配列番号８のＴｅＮＴ亜型のアミノ酸１番〜４５７番のような配列番号８の天然由来のＴｅＮＴ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４５７番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、保存的ＴｅＮＴ軽鎖変異体、非保存的ＴｅＮＴ軽鎖変異体、ＴｅＮＴキメラ軽鎖、活性ＴｅＮＴ軽鎖断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＴｅＮＴ軽鎖変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８の保存的ＴｅＮＴ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４５７番、配列番号８の非保存的ＴｅＮＴ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４５７番、配列番号８の活性ＴｅＮＴ軽鎖断片のアミノ酸１番〜４５７番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号８の非天然由来のＴｅＮＴ軽鎖変異体のアミノ酸１番〜４５７番を含む。
【００６５】
本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６６】
本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００６７】
本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴ軽鎖が、例えば、配列番号８のアミノ酸１番〜４５７番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００６８】
本発明の態様は、部分的には、クロストリジウム毒素転座ドメインを提供する。本明細書で用いられる用語の「クロストリジウム毒素転座ドメイン」は、クロストリジウム毒素軽鎖転座を媒介する中毒過程の転座段階を行うことができる任意のクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。したがって、クロストリジウム毒素転座ドメインは、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の移動を容易にし、細胞内小胞体の膜を通じて細胞の細胞質内へのクロストリジウム毒素軽鎖の移動を含む。クロストリジウム毒素転座ドメインの制限されない例には、例えば、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域、及びＴｅＮＴＨＮ領域のようなクロストリジウム毒素ＨＮ領域が含まれる。
【００６９】
クロストリジウム毒素転座ドメインには、制限なく、例えば、クロストリジウム毒素ＨＮ領域イソ型及びクロストリジウム毒素ＨＮ領域亜型のような天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体；例えば、保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体、クロストリジウム毒素ＨＮ領域キメラ、これらの活性クロストリジウム毒素ＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が含まれる。
【００７０】
本明細書で用いられる用語の「クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体」は、天然由来であれ非天然由来であれ、開示された標準配列（表１参照）の相応する領域から少なくとも１つのアミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素ＨＮ領域を意味し、前記標準配列の相応する領域に対してパーセント同一性と記載されてもよい。特に表示されない限り、本明細書に開示された全てのクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖転座を媒介する中毒過程の転座段階を行うことができる。制限されない例として、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番を含むＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体は、配列番号１のアミノ酸領域４４９番〜８７１番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番を含むＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体は、配列番号２のアミノ酸領域４４２番〜８５８番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番を含むＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体は、配列番号３のアミノ酸領域４５０番〜８６６番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番を含むＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体は、配列番号４のアミノ酸領域４４６番〜８６２番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番を含むＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体は、配列番号５のアミノ酸領域４２３番〜８４５番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番を含むＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体は、配列番号６のアミノ酸領域４４０番〜８６４番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番を含むＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体は、配列番号７のアミノ酸領域４４７番〜８６３番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有し；また配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番を含むＴｅＮＴＨＮ領域変異体は、配列番号８のアミノ酸領域４５８番〜８７９番に比べて、例えば、アミノ酸の置換、欠失または添加のような少なくとも１つのアミノ酸相違を有する。
【００７１】
当業者であれば、クロストリジウム毒素のそれぞれの血清型中に、アミノ酸配列が少し異なり、かつ、これらのタンパク質をコードする核酸が異なる天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体があり得ることが認知可能である。例えば、現在、４個のＢｏＮＴ／Ａ亜型であるＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３及びＢｏＮＴ／Ａ４があり、特定のＨＮ領域亜型は、他のＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域亜型と比べて、約８７％のアミノ酸同一性を示す。本明細書で用いられる用語の「天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体」は、制限なく、選択的スプライスによる転写物から生成したクロストリジウム毒素ＨＮ領域イソ型、偶発突然変異により生成したクロストリジウム毒素ＨＮ領域イソ型、及びクロストリジウム毒素ＨＮ領域亜型を含む、天然由来の過程により生成した任意のクロストリジウム毒素ＨＮ領域を意味する。天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域を置換することができる。天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸または１００個以上のアミノ酸を置換してもよい。天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体はまた、その天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個の隣接アミノ酸、少なくとも２０個の隣接アミノ酸、または少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することができるが、前記隣接アミノ酸は、前記天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体に対して、少なくとも５０％のアミノ酸同一性、６５％のアミノ酸同一性、７５％のアミノ酸同一性、８５％のアミノ酸同一性、または９５％のアミノ酸同一性を保有するものである。
【００７２】
天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体の制限されない例は、例えば、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域イソ型、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域イソ型、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域イソ型、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域イソ型、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域イソ型、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域イソ型、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域イソ型、及びＴｅＮＴＨＮ領域イソ型のようなクロストリジウム毒素ＨＮ領域イソ型である。クロストリジウム毒素ＨＮ領域イソ型は、そのクロストリジウム毒素ＨＮ領域イソ型が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域を置換することができる。
【００７３】
天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体の他の制限されない例は、例えば亜型ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３及びＢｏＮＴ／Ａ４由来のＨＮ領域；亜型ＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ二価型及びＢｏＮＴ／Ｂタンパク非分解性由来のＨＮ領域；亜型ＢｏＮＴ／Ｃ１−１及びＢｏＮＴ／Ｃ１−２由来のＨＮ領域；亜型ＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２及びＢｏＮＴ／Ｅ３由来のＨＮ領域；及び亜型ＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３及びＢｏＮＴ／Ｆ４由来のＨＮ領域のようなクロストリジウム毒素ＨＮ領域亜型である。クロストリジウム毒素ＨＮ領域亜型は、そのクロストリジウム毒素ＨＮ領域亜型が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域を置換することができる。
【００７４】
本明細書で用いられる用語の「非天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体」は、制限なく、ランダム変異誘発または合理的設計を用いて、遺伝工学により生成したクロストリジウム毒素ＨＮ領域、及び化学的合成により生成したクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含む、ヒトの操作補助の下で生成した任意のクロストリジウム毒素ＨＮ領域を意味する。非天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体の制限されない例には、例えば、保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体、クロストリジウム毒素ＨＮ領域キメラ性変異体、及び活性クロストリジウム毒素ＨＮ領域断片が含まれる。
【００７５】
本明細書で用いられる用語の「保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体」は、標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域配列（表１）から、少なくとも１つのアミノ酸が、本来のアミノ酸のものと類似した特性を少なくとも１つ有する他のアミノ酸またはアミノ酸類似体で置換されているクロストリジウム毒素ＨＮ領域を意味する。特性の例としては、制限なく、類似したサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはこれらの任意の組合せが含まれる。保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域を置換することができる。保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００個以上のアミノ酸、または５００個以上のアミノ酸を置換してもよい。保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体はまた、その保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から、少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個の隣接アミノ酸、少なくとも２０個の隣接アミノ酸、または少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することができるが、前記隣接アミノ酸は、保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体に対して、少なくとも５０％のアミノ酸同一性、６５％のアミノ酸同一性、７５％のアミノ酸同一性、８５％のアミノ酸同一性、または９５％のアミノ酸同一性を保有するものである。保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体の制限されない例には、例えば、保存的ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体、保存的ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体、保存的ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体、保存的ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体、保存的ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体、保存的ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体、及び保存的ＴｅＮＴＨＮ領域変異体が含まれる。
【００７６】
本明細書で用いられる用語の「非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体」は、１）その非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から少なくとも１つのアミノ酸が欠失されるか；２）その非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域に少なくとも１つのアミノ酸が添加されるか；または３）標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域配列（表１）から、少なくとも１つのアミノ酸が、本来のアミノ酸のものと類似した任意の特性を共有しない他のアミノ酸またはアミノ酸類似体で置換されたクロストリジウム毒素ＨＮ領域を意味する。非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域と実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のいずれの態様においても標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域を置換することができる。非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、及び１０個以上のアミノ酸が欠失されたものであってもよい。非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域に、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、及び１０個以上のアミノ酸を添加したものであってもよい。非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００個以上のアミノ酸、または５００個以上のアミノ酸を置換してもよい。非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体はまた、その非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から、少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個の隣接アミノ酸、少なくとも２０個の隣接アミノ酸、または少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することができるが、前記隣接アミノ酸は、前記非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体が基礎とする標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体に対して、少なくとも５０％のアミノ酸同一性、６５％のアミノ酸同一性、７５％のアミノ酸同一性、８５％のアミノ酸同一性、または９５％のアミノ酸同一性を保有するものである。非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体の制限されない例には、例えば、非保存的ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体、及び非保存的ＴｅＮＴＨＮ領域変異体が含まれる。
【００７７】
本明細書で用いられる用語の「クロストリジウム毒素ＨＮ領域キメラ」は、クロストリジウム毒素ＨＮ領域の少なくとも一部及び少なくとも１つの他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表１の標準クロストリジウム毒素ＨＮ領域から少なくとも１つの特性が異なった毒素ＨＮ領域を形成するポリペプチドを意味するが、但し、このクロストリジウム毒素ＨＮ領域キメラは、依然として神経伝達物質放出装置の核心成分を特異的に標的化し、したがって、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解的に切断する全体的な細胞メカニズムを行うことができなければならない。
【００７８】
本明細書で用いられる用語の「活性クロストリジウム毒素ＨＮ領域断片」は、本発明の態様で有用可能なＨＮ領域を含む様々なクロストリジウム毒素断片のうち、任意のものを意味するが、但し、このような活性断片は、細胞内小胞体から標的細胞の細胞質へのＬＣの放出を容易にし、したがって、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解的に切断する全体的な細胞メカニズムを行うことができなければならない。クロストリジウム毒素の重鎖由来のＨＮ領域は、長さがアミノ酸約４１０〜４３０個であり、転座ドメインを含む（表１）。研究結果によれば、クロストリジウム毒素重鎖由来のＨＮ領域の全長が、前記転座ドメインの転座活性に必ずしも必要なものではない。したがって、本実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、及び少なくとも４２５個のアミノ酸の長さを有する転座ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含むことができる。本実施形態の他の態様は、例えば、多くても３５０個のアミノ酸、多くても３７５個のアミノ酸、多くても４００個のアミノ酸、及び多くても４２５個のアミノ酸の長さを有する転座ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含むことができる。
【００７９】
制限なく、包括的方法、局所的方法、及び例えば断片アプローチ法のようなハイブリッド法を含む様々な配列アラインメント法のいずれによっても、天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体及び非天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体のパーセント同一性を求めることができる。パーセント同一性を求めるプロトコールは、当業者の範囲内で、また、本明細書の教示から日常的な手続きである。
【００８０】
したがって、一実施形態では、本明細書に開示された修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素転座ドメインを含む。本実施形態の一態様では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、例えばクロストリジウム毒素ＨＮ領域イソ型またはクロストリジウム毒素ＨＮ領域亜型のような天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、例えば、保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体、クロストリジウム毒素キメラＨＮ領域、活性クロストリジウム毒素ＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のクロストリジウム毒素ＨＮ領域変異体を含む。
【００８１】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、ＢｏＮＴ／Ａイソ型由来のＨＮ領域またはＢｏＮＴ／Ａ亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のＢｏＮＴ／Ａイソ型のアミノ酸４４９番〜８７１番または配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ亜型のアミノ酸４４９番〜８７１番のような配列番号１の天然由来のＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体のアミノ酸４４９番〜８７１番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体、ＢｏＮＴ／ＡキメラＨＮ領域、活性ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１の保存的ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体のアミノ酸４４９番〜８７１番、配列番号１の非保存的ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体のアミノ酸４４９番〜８７１番、配列番号１の活性ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域断片のアミノ酸４４９番〜８７１番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号１の非天然由来のＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域変異体のアミノ酸４４９番〜８７１番を含む。
【００８２】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８３】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００８４】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＡＨＮ領域が、例えば、配列番号１のアミノ酸４４９番〜８７１番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００８５】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂイソ型由来のＨＮ領域またはＢｏＮＴ／Ｂ亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂイソ型のアミノ酸４４２番〜８５８番または配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂ亜型のアミノ酸４４２番〜８５８番のような配列番号２の天然由来のＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体のアミノ酸４４２番〜８５８番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体、ＢｏＮＴ／ＢキメラＨＮ領域、活性ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２の保存的ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体のアミノ酸４４２番〜８５８番、配列番号２の非保存的ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体のアミノ酸４４２番〜８５８番、配列番号２の活性ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域断片のアミノ酸４４２番〜８５８番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号２の非天然由来のＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域変異体のアミノ酸４４２番〜８５８番を含む。
【００８６】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８７】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００８８】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＢＨＮ領域が、例えば、配列番号２のアミノ酸４４２番〜８５８番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００８９】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型由来のＨＮ領域またはＢｏＮＴ／Ｃ１亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型のアミノ酸４５０番〜８６６番または配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１亜型のアミノ酸４５０番〜８６６番のような配列番号３の天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体のアミノ酸４５０番〜８６６番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体、ＢｏＮＴ／Ｃ１キメラＨＮ領域、活性ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３の保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体のアミノ酸４５０番〜８６６番、配列番号３の非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体のアミノ酸４５０番〜８６６番、配列番号３の活性ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域断片のアミノ酸４５０番〜８６６番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号３の非天然由来のＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域変異体のアミノ酸４５０番〜８６６番を含む。
【００９０】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９１】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００９２】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／Ｃ１ＨＮ領域が、例えば、配列番号３のアミノ酸４５０番〜８６６番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００９３】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄイソ型由来のＨＮ領域またはＢｏＮＴ／Ｄ亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄイソ型のアミノ酸４４６番〜８６２番または配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄ亜型のアミノ酸４４６番〜８６２番のような配列番号４の天然由来のＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体のアミノ酸４４６番〜８６２番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体、ＢｏＮＴ／ＤキメラＨＮ領域、活性ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４の保存的ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体のアミノ酸４４６番〜８６２番、配列番号４の非保存的ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体のアミノ酸４４６番〜８６２番、配列番号４の活性ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域断片のアミノ酸４４６番〜８６２番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号４の非天然由来のＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域変異体のアミノ酸４４６番〜８６２番を含む。
【００９４】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９５】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００９６】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＤＨＮ領域が、例えば、配列番号４のアミノ酸４４６番〜８６２番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【００９７】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅイソ型由来のＨＮ領域またはＢｏＮＴ／Ｅ亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅイソ型のアミノ酸４２３番〜８４５番または配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅ亜型のアミノ酸４２３番〜８４５番のような配列番号５の天然由来のＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体のアミノ酸４２３番〜８４５番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体、ＢｏＮＴ／ＥキメラＨＮ領域、活性ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５の保存的ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体のアミノ酸４２３番〜８４５番、配列番号５の非保存的ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体のアミノ酸４２３番〜８４５番、配列番号５の活性ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域断片のアミノ酸４２３番〜８４５番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号５の非天然由来のＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域変異体のアミノ酸４２３番〜８４５番を含む。
【００９８】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９９】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１００】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＥＨＮ領域が、例えば、配列番号５のアミノ酸４２３番〜８４５番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１０１】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆイソ型由来のＨＮ領域またはＢｏＮＴ／Ｆ亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆイソ型のアミノ酸４４０番〜８６４番または配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆ亜型のアミノ酸４４０番〜８６４番のような配列番号６の天然由来のＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体のアミノ酸４４０番〜８６４番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体、ＢｏＮＴ／ＦキメラＨＮ領域、活性ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６の保存的ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体のアミノ酸４４０番〜８６４番、配列番号６の非保存的ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体のアミノ酸４４０番〜８６４番、配列番号６の活性ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域断片のアミノ酸４４０番〜８６４番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号６の非天然由来のＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域変異体のアミノ酸４４０番〜８６４番を含む。
【０１０２】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０３】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１０４】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＦＨＮ領域が、例えば、配列番号６のアミノ酸４４０番〜８６４番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１０５】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇイソ型由来のＨＮ領域またはＢｏＮＴ／Ｇ亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇイソ型のアミノ酸４４７番〜８６３番または配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇ亜型のアミノ酸４４７番〜８６３番のような配列番号７の天然由来のＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体のアミノ酸４４７番〜８６３番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、保存的ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体、非保存的ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体、ＢｏＮＴ／ＧキメラＨＮ領域、活性ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体を含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域、例えば、配列番号７の保存的ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体のアミノ酸４４７番〜８６３番、配列番号７の非保存的ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体のアミノ酸４４７番〜８６３番、配列番号７の活性ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域断片のアミノ酸４４７番〜８６３番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号７の非天然由来のＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域変異体のアミノ酸４４７番〜８６３番を含む。
【０１０６】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０７】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１０８】
本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＢｏＮＴ／ＧＨＮ領域が、例えば、配列番号７のアミノ酸４４７番〜８６３番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１０９】
また他の実施形態では、クロストリジウム毒素転座ドメインが、ＴｅＮＴＨＮ領域を含む。本実施形態の一態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、ＴｅＮＴイソ型由来のＨＮ領域またはＴｅＮＴ亜型由来のＨＮ領域のような天然由来のＴｅＮＴＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のＴｅＮＴイソ型のアミノ酸４５８番〜８７９番または配列番号８のＴｅＮＴ亜型のアミノ酸４５８番〜８７９番のような配列番号８の天然由来のＴｅＮＴＨＮ領域変異体のアミノ酸４５８番〜８７９番を含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、保存的ＴｅＮＴＨＮ領域変異体、非保存的ＴｅＮＴＨＮ領域変異体、ＴｅＮＴキメラＨＮ領域、活性ＴｅＮＴＨＮ領域断片、またはこれらの任意の組合せのような非天然由来のＴｅＮＴＨＮ領域変異体を含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８の保存的ＴｅＮＴＨＮ領域変異体のアミノ酸４５８番〜８７９番、配列番号８の非保存的ＴｅＮＴＨＮ領域変異体のアミノ酸４５８番〜８７９番、配列番号８の活性ＴｅＮＴＨＮ領域断片のアミノ酸４５８番〜８７９番、またはこれらの任意の組合せのような配列番号８の非天然由来のＴｅＮＴＨＮ領域変異体のアミノ酸４５８番〜８７９番を含む。
【０１１０】
本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、または配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と多くても７０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と多くても７５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と多くても８０％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と多くても８５％のアミノ酸同一性、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と多くても９０％のアミノ酸同一性、または配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番と多くても９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１１１】
本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１１２】
本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のまた他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。本実施形態の他の態様では、ＴｅＮＴＨＮ領域が、例えば、配列番号８のアミノ酸４５８番〜８７９番に比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００または２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１１３】
本発明の態様は、部分的には、増大された標的ドメインを提供する。本明細書で用いられる用語の「増大された標的ドメイン」は、クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に選択的に結合し、クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒させる全体的な内在化メカニズムを開始することができる任意のポリペプチドを意味する。本明細書で用いられる用語の「選択的に」は、極めて好ましい活性または效果を有することを意味する。本明細書で用いられる用語の「選択的に結合」は、ある分子が生理学的条件下で、または生理学的条件と実質的に類似したインビトロ条件下で、その標的受容体系に、他の非標的受容体系と比べて統計的に相当程度高く結合することができることを意味する。したがって、本明細書の増大された標的ドメインに対しては、前記増大された標的ドメインの非クロストリジウム毒素受容体系に対する差別的な結合が存在する。
【０１１４】
本明細書に開示された増大された標的ドメインは、クロストリジウム毒素標的細胞の表面に位置した非クロストリジウム毒素受容体系に対する本明細書に開示された修飾クロストリジウム毒素の結合活性を容易にする。本明細書で用いられる用語の「結合活性」は、制限なく、一分子が共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用等、またはこれらの任意の組合せを含む少なくとも１つの分子間または分子内力を通じて他の分子と直接的または間接的に接触することを意味する。「結合される」及び「結合する」は、結合を意味する用語と見なされる。
【０１１５】
本明細書で用いられる用語の「結合親和性」は、特定の受容体系に対するある分子の結合活性がどれくらい強いかを意味する。一般に、高結合親和性は、結合ドメインとその受容体系との間のより大きい分子間力に起因するのに対して、低結合親和性は、リガンドとその受容体との間の分子間力がより少ない。高結合親和性は、結合ドメインのその受容体結合部位での滞留時間が、低結合親和性の場合と比べてより長い。このように、高結合親和性を有する分子は、受容体系の結合部位を最大限占有し、生理学的反応を引き起こすのに前記分子がより低い濃度で必要であることを意味する。反対に、低結合親和性は、受容体系の受容体結合部位が最大限占有され、最大の生理学的反応が得られるためには、比較的高濃度の分子が必要であることを意味する。したがって、高結合親和性により増加された結合活性を有する修飾クロストリジウム毒素は、減少した投与量の毒素が投与されることにより、毒素の非標的化区域への分散と関連した好ましくない副作用を減少させまたは防止することである。
【０１１６】
本明細書で用いられる用語の「結合特異性」は、ある特定の受容体系においてある分子の結合活性がどれくらい特異的であるかを意味する。一般に、高結合特異性は、ある特定の受容体系または受容体系のサブグループとのより排他的な相互作用をもたらすのに対して、低結合特異性は、より大きい群の受容体系とのより排他的な相互作用をもたらす。このように、高結合特異性を有する分子は、前記分子が１つの特定の受容体系の結合部位を占有し、生理学的反応を引き起こすことを意味する。反対に、低結合特異性は、ある分子が多くの受容体系の結合部位を占有し、複数の生理学的反応を引き起こすことを意味する。したがって、高結合特異性により増加された結合活性を有する修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素標的細胞のサブグループに存在する非クロストリジウム毒素受容体のみを標的とし、全てのクロストリジウム毒素標的細胞の標的化と関連した副作用を減少させる。
【０１１７】
本書で使用される「クロストリジウム毒素標的細胞」という用語は、制限なく、運動ニューロン；感覚ニューロン；自律神経ニューロン、例えば交感神経ニューロン及び副交感神経ニューロン；非ペプチド作動性ニューロン、例えばコリン作動性ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、セロトニン性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン；及びペプチド作動性ニューロン、例えばＰ物質ニューロン、カルシトニン遺伝子関連ペプチドニューロン、血管活性腸管ペプチドニューロン、神経ペプチドＹニューロン、コレシストキニンニューロンを含めた、天然に発生するクロストリジウム毒素が中毒させる能力をもつ天然に発生する細胞である細胞を意味する。
【０１１８】
制限なく、シナプス前膜上に存在する受容体系に対し選択的に結合するポリペプチド及びシナプス後膜上に存在する受容体系に対し選択的に結合するポリペプチドを含めて天然に発生するクロストリジウム毒素上に存在し非クロストリジウム毒素受容体系に対する結合活性を示す任意の及び全ての増大した標的ドメインが、本発明の態様を実践するために使用可能であると想定されている。シナプス前膜上に存在する受容体系に結合すると思われるポリペプチドとしては、制限なく、グルカゴン様ホルモン、例えばセクレチン、グルカゴン様ペプチド、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド（ＧＲＰＰ）、オキシントモジュリン（ＯＸＹ）、血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）及びカルシトニン関連ペプチド内臓消化管ペプチド；神経ホルモン例えば、コルチコトロピン−放出ホルモン（ＣＣＲＨ）及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）；神経調節サイトカイン例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリコホリン−Ａ（ＧＰＡ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、オノスタチンＭ、カルディオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルディオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ニューロロイキン、ＶＥＧＦ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）；ニューロトロフィン例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４／５（ＮＴ４／５）；成長因子例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフリン、アルテミン、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長及び分化因子（ＧＤＦ）、アクチビン；軸索ガイダンスシグナル伝達分子例えばネトリン、セマフロリング及びエフリン；糖結合タンパク質例えば、血清アミロイドＰ、β−グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、クライア、殺虫性デルタ内毒素、アグルチニン、アブリン、リシン、ニューレキシンを選択的に結合するリガンド、例えばニューレキシン−１α及びニューレキシン−１βのためのリガンド；ニューレキシン−２α及びニューレキシン−２βのためのリガンド；及びニューレキシン−３α及びニューレキシン−３βのためのリガンド；及びＷＮＴが含まれる。シナプス後膜上に存在する受容体系に結合するように思われるリガンドとしては、制限なく、Ｎｇ−ＣＡＭ（Ｌ１）、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、アグリン−ＭＵＳＫ、基底膜ポリペプチド例えばラミニンβ−２が含まれる。
【０１１９】
増大した標的ドメインには、制限なく、天然由来の増大した標的ドメイン変異体例えば増大した標的ドメインのイソ型；非天然由来の増大した標的ドメイン変異体、例えば保存的増大した標的ドメイン変異体、非保存的増大した標的ドメイン変異体、増大した標的ドメインキメラ体、その活性増大した標的ドメイン断片又はその任意の組合せ、が含まれる。
【０１２０】
本書で使用される「変異体」という用語は、天然由来のものであれ非天然由来のものであれ、増大した標的ドメイン変異体を記述するために用いられる場合、開示された基準配列の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変更を有する増大した標的ドメインを意味し、この基準配列の対応する領域に対する同一性百分率で記述され得る。明示的に指示されている場合を除き、本明細書で開示されている全ての増大した標的ドメインは、クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対し選択的に結合する能力をもち、クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒させるようにする全体的内在化機序を開始する。非制限の例には、配列番号９のアミノ酸２１〜５０から誘導されたグリコーゲン様ペプチド変異体は、配列番号９のアミノ酸領域２１〜５０に比べて、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８から誘導されたＰＡＣＡＰ変異体は、配列番号１０のアミノ酸領域１３２〜１５８と比べて例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３から誘導されたＣＣＲＨ変異体は、配列番号１９のアミノ酸領域１５９〜１９３と比べて例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号２０のアミノ酸３５〜７０から誘導されたＰＴＨ変異体は、配列番号２０のアミノ酸領域３５〜７０と比べて例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０から誘導されたＩＬ−６変異体は、配列番号２８のアミノ酸領域５７〜２１０領域と比べて例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号３１のアミノ酸５４〜５４６から誘導されたニューロロイキン変異体は、配列番号３１のアミノ酸領域５４〜５４６に比べて例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９から誘導されたＩＧＦ−１変異体は、配列番号３３のアミノ酸領域５２〜１０９に比べて例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９から誘導されたＮＴ−３変異体は、配列番号３８のアミノ酸領域１４４〜２４９に比べて例えばアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになる。
【０１２１】
そのアミノ酸配列と同様これらのタンパク質をコードする核酸においても幾分か異なっている天然由来の増大した標的ドメイン変異体が存在し得るということは、当業者によって認められている。本書で使用する「天然由来の増大した標的ドメイン変異体」という用語は、制限なく、選択的スプライシングを受けた写しから生産される増大した標的ドメインイソ型、自然突然変異により生産される増大した標的ドメインイソ型及び増大した標的ドメイン亜型を含めた、天然由来のプロセスにより生産されるあらゆる増大した標的ドメインを意味する。天然由来の増大した標的ドメイン変異体は、天然由来の増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインと実質的に同じ要領で機能することができ、本発明のあらゆる態様において基準増大標的ドメインと置換され得る。天然由来の増大した標的ドメイン変異体は、天然由来の増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインからの１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸又は１００個以上のアミノ酸に置換することができる。天然由来の増大した標的ドメイン変異体は同様に、天然由来の増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインに対し少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％又は９５％のアミノ酸同一性を有する、天然由来の増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインからの少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個又は、少なくとも２５個の隣接アミノ酸に置換することもできる。
【０１２２】
天然由来の増大した標的ドメイン変異体の制限的意味のない一例は、グルコーゲン様ペプチドイソ型、ＰＡＣＡＰイソ型、ＣＣＲＨイソ型、ＰＴＨイソ型、ＩＬ−６イソ型、ニューロロイキンイソ型、ＩＧＦ−１イソ型及びＮＴ−３イソ型などの増大した標的ドメインイソ型である。増大した標的ドメインイソ型は、増大した標的ドメインイソ型の基礎である基準増大標的ドメインと実質的に同じ要領で機能でき、本発明のあらゆる態様において基準増大標的ドメインに置換可能である。
【０１２３】
本書で使用される「非天然由来の標的ドメイン変異体」という用語は、制限なく、ランダム突然変異誘発又は合理的設計を用いて遺伝子工学により生産される増大した標的ドメイン及び化学合成により生産される増大した標的ドメインを含めた、人間による操作を一助として生産されるあらゆる増大した標的ドメインを意味する。非天然由来の増大した標的ドメイン変異体の非制限の例には、例えば保存的増大した標的ドメイン変異体、非保存的増大した標的ドメイン変異体、増大した標的ドメインキメラ変異体及び活性増大した標的ドメイン断片が含まれる。
【０１２４】
本書で使用されている「保存的増大した標的ドメイン変異体」という用語は、基準増大標的ドメイン配列に由来するもとのアミノ酸のものと類似した少なくとも１つの特性をもつもう１つのアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換された少なくとも１つのアミノ酸を有する増大した標的ドメインを意味する。特性の例としては、制限なく、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能力、水素結合能力、物理化学特性など又はその任意の組合せが含まれる。保存的増大した標的ドメイン変異体は、保存的増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインと実質的に同じ要領で機能することができ、本発明のあらゆる態様において基準増大標的ドメインに置換させられ得る。保存的増大した標的ドメイン変異体は、その基礎である基準増大標的ドメインからの１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００個以上のアミノ酸又は５００個以上のアミノ酸に置換し得る。保存的増大した標的ドメイン変異体は同様に、その基礎である基準増大標的ドメインに対する少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％、又は９５％のアミノ酸同一性を有する、該保存的増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインからの少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、又は少なくとも２５個の隣接アミノ酸に置換することもできる。保存的増大した標的ドメイン変異体の非制限の例には、例えば保存的グルコーゲン様ペプチド変異体、保存的ＰＡＣＡＰ領域変異体、保存的ＣＣＲＨ領域変異体、保存的ＰＴＨ変異体、保存的ＩＬ−６変異体、保存的ニューロロイキン変異体、保存的ＩＧＦ−１変異体及び保存的ＮＴ−３領域変異体が含まれる。
【０１２５】
本書で用いられている「非保存的増大した標的ドメイン変異体」という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインから欠失されている；２）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的増大した標的ドメインの基礎である基準増大標的ドメインに対し付加されている；又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、基準増大標的ドメイン配列からのもとのアミノ酸のものと類似した任意の特性を共有しないもう１つのアミノ酸又はアミノ酸類似体によって、置換されている、増大した標的ドメインを意味する。非保存的増大した標的ドメイン変異体は、非保存的増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインと実質的に同じ要領で機能することができ、本発明のあらゆる態様において基準増大標的ドメインに置換させられ得る。非保存的増大した標的ドメイン変異体は、その基礎である基準増大標的ドメインからの１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、及び１０個以上のアミノ酸を欠失させることができる。非保存的増大した標的ドメイン変異体は、その基礎である基準増大標的ドメインに対して、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸及び１０個以上のアミノ酸を付加することができる。非保存的増大した標的ドメイン変異体は、その基礎である基準増大標的ドメインが、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸又は５００個以上のアミノ酸に置換し得る。非保存的増大した標的ドメイン変異体は同様に、その基礎である基準増大標的ドメインに対する少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％、又は９５％のアミノ酸同一性を有する、該非保存的増大した標的ドメイン変異体の基礎である基準増大標的ドメインからの少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、又は少なくとも２５個の隣接アミノ酸に置換することもできる。非保存的増大した標的ドメイン変異体の非制限の例には、例えば非保存的グルコーゲン様ペプチド変異体、非保存的ＰＡＣＡＰ領域変異体、非保存的ＣＣＲＨ領域変異体、非保存的ＰＴＨ変異体、非保存的ＩＬ−６変異体、非保存的ニューロロイキン変異体、非保存的ＩＧＦ−１変異体及び非保存的ＮＴ−３領域変異体が含まれる。
【０１２６】
本書で使用される「増大した標的ドメインキメラ体」という用語は、この「増大した標的ドメインキメラ体」がなおクロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対し選択的に結合し、クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒させるようにする全体的内在化機序を開始させる能力を有することを条件として、基準増大標的ドメインとは異なる少なくとも１つの特性をもつ増大した標的ドメインを形成するべく、少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部分及び増大した標的ドメインの少なくとも一部分を含むポリペプチドを意味している。
【０１２７】
本書で使用する「活性増大標的ドメイン断片」という用語は、これらの活性断片がなお、クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対し選択的に結合しかつ、クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒させるようにする全体的内在化機序を開始させる能力を有することを条件として、本発明の態様においてさまざまな増大した標的ドメイン断片のうちの任意のものが有用であり得るということを意味している。かくして、本実施形態の態様には、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、及び少なくとも４５０個のアミノ酸という長さを含む増大した標的ドメインを内含し得る。この実施形態のその他の態様は、例えば多くとも５０個のアミノ酸、多くとも１００個のアミノ酸、多くとも１５０個のアミノ酸、多くとも２００個のアミノ酸、多くとも２５０個のアミノ酸、多くとも３００個のアミノ酸、多くとも３５０個のアミノ酸、多くとも４００個のアミノ酸、そして多くとも４５０個のアミノ酸という長さをもつ転座ドメインを含む増大した標的ドメインを含み得る。
【０１２８】
制限なく、包括的方法、局所的方法及びハイブリッド法例えばセグメントアプローチ方法を含め、さまざまな配列アラインメント方法のうちの任意のものを用いて、天然由来の増大した標的ドメイン変異体及び非天然由来の増大した標的ドメイン変異体の同一性百分率を判定することができる。同一性百分率を判定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本書の教示からの常法である。
【０１２９】
かくして、１つの実施形態においては、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素には、増大した標的ドメインが含まれる。この実施形態の一態様においては、増大した標的ドメインは、例えば増大した標的ドメインイソ型又は増大した標的ドメイン亜型といったような天然由来の増大した標的ドメイン変異体を含む。この実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素の転座ドメインは、例えば保存的増大した標的ドメイン変異体、非保存的増大した標的ドメイン変異体、増大した標的ドメインキメラ体、活性増大した標的ドメイン断片又はそれらの任意の組合せといったような非天然由来の増大した標的ドメイン変異体を含む。
【０１３０】
本明細書内で開示されている増大した標的ドメインの一例は、例えば、グルカゴン様ホルモン例えばセクレチン、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２などのグルカゴン様ペプチド、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド（ＧＲＰＰ）、オキシントモジュリン（ＯＸＹ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）及びカルシトニン関連ペプチド内臓消化管ペプチド例えばガストリン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ、ボンベシン）又はコレシストキニン（ＣＣＫ）である。
【０１３１】
かくして、一実施形態においては、増大した結合ドメインがグリコーゲン様ペプチドから誘導される。もう１つの実施形態では、配列番号９のグリコーゲン様ペプチドから増大した結合ドメインが誘導される。この実施形態の態様においては、グリコーゲン様ペプチドから誘導された増大した結合ドメインには、ＧＲＰＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グルカゴン又はオキシントモジュリンが含まれる。この実施形態の態様においては、グリコーゲン様ペプチドから誘導された増大した結合ドメインには、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸９８〜１２４、又はアミノ酸１４６〜１７８が含まれる。
【０１３２】
この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、又は配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、又は配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、又は配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、又は配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３３】
この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸決失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４、又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１３４】
この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸決失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、グリコーゲン様ペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜５０、アミノ酸５３〜８１、アミノ酸５３〜８９、アミノ酸９８〜１２４又はアミノ酸１４６〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１３５】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＰＡＣＡＰから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１０のＰＡＣＡＰから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＰＡＣＡＰから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８を含む。
【０１３６】
この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３７】
この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１３８】
この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＡＣＡＰは、例えば、配列番号１０のアミノ酸１３２〜１５８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１３９】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＨＲＨから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１１のＧＨＲＨから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＨＲＨから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５を含む。
【０１４０】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４１】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１４２】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＨＲＨは、例えば、配列番号１１のアミノ酸３２〜５８又はアミノ酸３２〜７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１４３】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＶＩＰ１から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１２のＶＩＰ１から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＶＩＰ１から誘導された増大した結合ドメインは配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１を含む。
【０１４４】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４５】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１４６】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ１は、例えば、配列番号１２のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２５〜１５１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１４７】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＶＩＰ２から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１３のＶＩＰ２から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＶＩＰ２から誘導された増大した結合ドメインは配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０を含む。
【０１４８】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４９】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１５０】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＩＰ２は、例えば、配列番号１３のアミノ酸８１〜１０７又はアミノ酸１２４〜１５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１５１】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＩＰから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１４のＧＩＰから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＩＰから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３を含む。
【０１５２】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５３】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１５４】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＩＰは、例えば、配列番号１４のアミノ酸５２〜７８又はアミノ酸５２〜９３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１５５】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはセクレチンから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１５のセクレチンから誘導される。この実施形態の一態様においては、セクレチンから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸２８〜５４を含む。
【０１５６】
この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１５のアミノ酸２８〜５４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５７】
この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１５８】
この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、セクレチンは、例えば配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、セクレチンは、例えば、配列番号１５のアミノ酸２８〜５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１５９】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはガストリンから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１６のガストリンから誘導される。この実施形態の一態様においては、ガストリンから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２を含む。
【０１６０】
この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６１】
この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１６２】
この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ガストリンは、例えば配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ガストリンは、例えば、配列番号１６のアミノ酸７６〜９２又はアミノ酸５９〜９２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１６３】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＲＰから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１７のＧＲＰから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＲＰから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０を含む。
【０１６４】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６５】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１６６】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＲＰは、例えば、配列番号１７のアミノ酸４１〜５０又はアミノ酸２４〜５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１６７】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＣＣＫから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１８のＣＣＫから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＣＣＫから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２を含む。
【０１６８】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６９】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１７０】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＫは、例えば、配列番号１８のアミノ酸９９〜１１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１７１】
本明細書中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えばコルチトロピン放出ホルモン（ＣＣＲＨ）又は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）といった神経ホルモンである。
【０１７２】
かくして、１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＣＣＲＨから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号１９のＣＣＲＨから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＣＣＲＨから誘導された増大した結合ドメインは配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４を含む。
【０１７３】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１７４】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１７５】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば、配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＣＲＨは、例えば配列番号１９のアミノ酸１５９〜１９３又はアミノ酸１５４〜１９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１７６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＰＴＨから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２０のＰＴＨから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＰＴＨから誘導された増大した結合ドメインは配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７を含む。
【０１７７】
この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１７８】
この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１７９】
この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＰＴＨは、例えば、配列番号２０のアミノ酸３５〜７０又はアミノ酸１４５〜１７７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１８０】
本明細書の中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリコホリン−Ａ（ＧＰＡ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）としても知られている白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０などのインターロイキン（ＩＬ）、オノスタチンＭ、カルディオトロフィン-１（ＣＴ−１）、カルディオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）又はリン酸グルコースイソメラーゼ（ＧＰＩ）としても知られるニューロロイキン、自己分泌運動性因子（ＡＭＦ）、成熟及び分化因子（ＭＦ）といった神経調節サイトカインである。
【０１８１】
かくして１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＣＮＴＦから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２１のＣＮＴＦから誘導される。この実施形態の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２１のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２１のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８２】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１８３】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば配列番号２１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＮＴＦは、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１８４】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＰＡから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２２のＧＰＡから誘導される。この実施形態の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２２のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２２のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８５】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば、配列番号２２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば、配列番号２２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば、配列番号２２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１８６】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば、配列番号２２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば、配列番号２２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば配列番号２２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＰＡは、例えば、配列番号２２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１８７】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＬＩＦから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２３のＬＩＦから誘導される。この実施形態の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２３のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２３のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８８】
この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１８９】
この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば配列番号２３のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＬＩＦは、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１９０】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＣＴ−１から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２４のＣＴ−１から誘導される。この実施形態の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２４のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２４のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９１】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１９２】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば配列番号２４のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＴ−１は、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１９３】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＣＬＣから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２５のＣＬＣから誘導される。この実施形態の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２５のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２５のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９４】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１９５】
この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば配列番号２５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＣＬＣは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１９６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＩＬ−１から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２６のＩＬ−１から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＩＬ−１から誘導された増大した結合ドメインは配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５を含む。
【０１９７】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９８】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０１９９】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１は、例えば、配列番号２６のアミノ酸１２３〜２６５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２００】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＩＬ−２から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２７のＩＬ−２から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＩＬ−２から誘導された増大した結合ドメインは配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３を含む。
【０２０１】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２０２】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２０３】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−２は、例えば、配列番号２７のアミノ酸２１〜１５３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２０４】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＩＬ−６から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２８のＩＬ−６から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＩＬ−６から誘導された増大した結合ドメインは配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０を含む。
【０２０５】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２０６】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２０７】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−６は、例えば、配列番号２８のアミノ酸５７〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２０８】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＩＬ−８から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号２９のＩＬ−８から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＩＬ−８から誘導された増大した結合ドメインは配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４を含む。
【０２０９】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１０】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２１１】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−８は、例えば、配列番号２９のアミノ酸２１〜９９又はアミノ酸３１〜９４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２１２】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＩＬ−１０から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３０のＩＬ−１０から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＩＬ−１０から誘導された増大した結合ドメインは配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８を含む。
【０２１３】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１４】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２１５】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＬ−１０は、例えば、配列番号３０のアミノ酸３７〜１７３又はアミノ酸１９〜１７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２１６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはニューロロイキンから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３１のニューロロイキンから誘導される。この実施形態の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３１のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３１のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１７】
この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば、配列番号３１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば、配列番号３１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば、配列番号３１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２１８】
この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば、配列番号３１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば、配列番号３１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば配列番号３１のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニューロロイキンは、例えば、配列番号３１のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２１９】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＶＥＧＦから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３２のＶＥＧＦから誘導される。この実施形態の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３２のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３２のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２２０】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば、配列番号３２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば、配列番号３２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば、配列番号３２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２２１】
この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば、配列番号３２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば、配列番号３２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば配列番号３２のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＶＥＧＦは、例えば、配列番号３２のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２２２】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＩＧＦ−１から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３３のＩＧＦ−１から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＩＧＦ−１から誘導された増大した結合ドメインは配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８を含む。
【０２２３】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２２４】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２２５】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−１は、例えば、配列番号３３のアミノ酸５２〜１０９又はアミノ酸４９〜１１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む
【０２２６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＩＧＦ−２から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３４のＩＧＦ−２から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＩＧＦ−２から誘導された増大した結合ドメインは配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０を含む。
【０２２７】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２２８】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２２９】
この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＩＧＦ−２は、例えば、配列番号３４のアミノ酸３１〜８４又はアミノ酸２５〜１８０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２３０】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＥＧＦから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３５のＥＧＦから誘導される。この実施形態の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３５のアミノ酸配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３５のアミノ酸配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２３１】
この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２３２】
この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば配列番号３５のアミノ酸配列との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＥＧＦは、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２３３】
本明細書中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えばニュートロフィン、例えばＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３又はＮＴ−５である。
【０２３４】
かくして、１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＮＧＦから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３６のＮＧＦから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＮＧＦから誘導された増大した結合ドメインは配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７を含む。
【０２３５】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２３６】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２３７】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＧＦは、例えば、配列番号３６のアミノ酸１３９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２３８】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＤＧＦから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３７のＢＤＧＦから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＤＧＦから誘導された増大した結合ドメインは配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７を含む。
【０２３９】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２４０】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２４１】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＤＧＦは、例えば、配列番号３７のアミノ酸１３３〜２４０又はアミノ酸１２９〜２４７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２４２】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＮＴ−３から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３８のＮＴ−３から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＮＴ−３から誘導された増大した結合ドメインは配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７を含む。
【０２４３】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２４４】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又は１９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２４５】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−３は、例えば、配列番号３８のアミノ酸１４４〜２４９又はアミノ酸１９〜２５７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２４６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＮＴ−４／５から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号３９のＮＴ−４／５から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＮＴ−４／５から誘導された増大した結合ドメインは配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０を含む。
【０２４７】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２４８】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２４９】
この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＮＴ−４／５は、例えば、配列番号３９のアミノ酸８９〜２０２又はアミノ酸８１〜２１０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２５０】
本明細書中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えばＧＤＮＦ、例えばニュールツリン、パーセフリン又はアルテミンである。
【０２５１】
かくして１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＮＦから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４０のＧＤＮＦから誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＮＦから誘導された増大した結合ドメインは配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１を含む。
【０２５２】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２５３】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２５４】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＮＦは、例えば、配列番号４０のアミノ酸１１８〜２１１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２５５】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはニュールツリンから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４１のニュールツリンから誘導される。この実施形態の一態様においては、ニュールツリンから誘導された増大した結合ドメインは配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７を含む。
【０２５６】
この実施形態のその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２５７】
この実施形態のその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２５８】
この実施形態のその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ニュールツリンは、例えば、配列番号４１のアミノ酸１０７〜１９６又はアミノ酸９６〜１９７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２５９】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはパーセフリンから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４２のパーセフリンから誘導される。この実施形態の一態様においては、パーセフリンから誘導された増大した結合ドメインは配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５を含む。
【０２６０】
この実施形態のその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２６１】
この実施形態のその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、パーセフリンは、例えば、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２６２】
この実施形態のその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、パーセフリンは、例えば、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、パーセフリンは、例えば、配列番号４２のアミノ酸６６〜１５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２６３】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはアルテミンから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４３のアルテミンから誘導される。この実施形態の一態様においては、アルテミンから誘導された増大した結合ドメインは配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８を含む。
【０２６４】
この実施形態のその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２６５】
この実施形態のその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アルテミンは、例えば、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２６６】
この実施形態のその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アルテミンは、例えば、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アルテミンは、例えば、配列番号４３のアミノ酸１２３〜２１８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２６７】
本明細書中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えばＴＧＦβ、例えばＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３又はＴＧＦβ４である。
【０２６８】
かくして１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＴＧＦβ１から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４４のＴＧＦβ１から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＴＧＦβ１から誘導された増大した結合ドメインは配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０を含む。
【０２６９】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２７０】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２７１】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ１は、例えば、配列番号４４のアミノ酸２９３〜３９０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２７２】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＴＧＦβ２から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４４のＴＧＦβ２から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＴＧＦβ２から誘導された増大した結合ドメインは配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４を含む。
【０２７３】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２７４】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２７５】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ２は、例えば、配列番号４５のアミノ酸３１７〜４１４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２７６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＴＧＦβ３から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４４のＴＧＦβ３から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＴＧＦβ３から誘導された増大した結合ドメインは配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２を含む。
【０２７７】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２７８】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２７９】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ３は、例えば、配列番号４６のアミノ酸３１５〜４１２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２８０】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＴＧＦβ４から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４４のＴＧＦβ４から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＴＧＦβ４から誘導された増大した結合ドメインは配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３を含む。
【０２８１】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２８２】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２８３】
この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＴＧＦβ４は、例えば、配列番号４７のアミノ酸２７６〜３７３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２８４】
本明細書中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えばＢＭＰ、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８又はＢＭＰ１０である。
【０２８５】
かくして、１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ２から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４８のＢＭＰ２から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ２から誘導された増大した結合ドメインは配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６を含む。
【０２８６】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２８７】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２８８】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ２は、例えば、配列番号４８のアミノ酸２９６〜３９６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２８９】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ３から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号４９のＢＭＰ３から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ３から誘導された増大した結合ドメインは配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２を含む。
【０２９０】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、ｖと多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２９１】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２９２】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ３は、例えば、配列番号４９のアミノ酸３７０〜４７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２９３】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ４から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５０のＢＭＰ４から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ４から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９を含む。
【０２９４】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２９５】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２９６】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ４は、例えば、配列番号５０のアミノ酸３０９〜４０９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０２９７】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ５から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５１のＢＭＰ５から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ５から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４を含む。
【０２９８】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えばＢＭＰ５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、ＢＭＰ５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、ＢＭＰ５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、ＢＭＰ５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、ＢＭＰ５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又はＢＭＰ５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２９９】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３００】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ５は、例えば、配列番号５１のアミノ酸３５３〜４５４又はアミノ酸３２３〜４５４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３０１】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ６から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５２のＢＭＰ６から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ６から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３を含む。
【０３０２】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３０３】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３０４】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ６は、例えば、配列番号５２のアミノ酸４１２〜５１３又はアミノ酸３７４〜５１３との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３０５】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ７から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５３のＢＭＰ７から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ７から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１を含む。
【０３０６】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３０７】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３０８】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ７は、例えば、配列番号５３のアミノ酸３３０〜４３１又はアミノ酸２９３〜４３１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３０９】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ８から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５４のＢＭＰ８から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ８から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２を含む。
【０３１０】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３１１】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３１２】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ８は、例えば、配列番号５４のアミノ酸３０１〜４０２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３１３】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＢＭＰ１０から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５５のＢＭＰ１０から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＢＭＰ１０から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４を含む。
【０３１４】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３１５】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３１６】
この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＢＭＰ１０は、例えば、配列番号５５のアミノ酸３２３〜４２４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３１７】
本明細書中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えばＧＦＰ、例えばＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ４、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１又はＧＤＦ１５である。
【０３１８】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ１から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５６のＧＤＦ１から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ１から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２を含む。
【０３１９】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３２０】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３２１】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１は、例えば、配列番号５６のアミノ酸２６７〜３７２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３２２】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ２から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５７のＧＤＦ２から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ２から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９を含む。
【０３２３】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３２４】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９と８の関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３２５】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ２は、例えば、配列番号５７のアミノ酸３２７〜４２９との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３２６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ３から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５８のＧＤＦ３から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ３から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４を含む。
【０３２７】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３２８】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３２９】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ３は、例えば、配列番号５８のアミノ酸２６４〜３６４との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３３０】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ５から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号５９のＧＤＦ５から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ５から誘導された増大した結合ドメインは配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１を含む。
【０３３１】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３３２】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３３３】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ５は、例えば、配列番号５９のアミノ酸４００〜５０１との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３３４】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ６から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６０のＧＤＦ６から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ６から誘導された増大した結合ドメインは配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５を含む。
【０３３５】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３３６】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５の関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３３７】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５の関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ６は、例えば、配列番号６０のアミノ酸３５４〜４５５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３３８】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ７から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６１のＧＤＦ７から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ７から誘導された増大した結合ドメインは配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０を含む。
【０３３９】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３４０】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３４１】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ７は、例えば、配列番号６１のアミノ酸３５２〜４５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３４２】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ８から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６２のＧＤＦ８から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ８から誘導された増大した結合ドメインは配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５を含む。
【０３４３】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３４４】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３４５】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ８は、例えば、配列番号６２のアミノ酸２８１〜３７５との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３４６】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ１０から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６３のＧＤＦ１０から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ１０から誘導された増大した結合ドメインは配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８を含む。
【０３４７】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３４８】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３４９】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１０は、例えば、配列番号６３のアミノ酸３７６〜４７８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３５０】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ１１から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６４のＧＤＦ１１から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ１１から誘導された増大した結合ドメインは配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７を含む。
【０３５１】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３５２】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３５３】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１１は、例えば、配列番号６４のアミノ酸３１３〜４０７との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３５４】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはＧＤＦ１５から誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６５のＧＤＦ１５から誘導される。この実施形態の一態様においては、ＧＤＦ１５から誘導された増大した結合ドメインは配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８を含む。
【０３５５】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３５６】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３５７】
この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＧＤＦ１５は、例えば、配列番号６５のアミノ酸２１１〜３０８との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３５８】
本明細書中で開示されている増大した標的ドメインのもう１つの例は、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ又はインヒビンＡである。
【０３５９】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはアクチビンＡから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６６のアクチビンＡから誘導される。この実施形態の一態様においては、アクチビンＡから誘導された増大した結合ドメインは配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６を含む。
【０３６０】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と多くとも７５％のアミノ酸同一性、アクチビンＡと多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３６１】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３６２】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＡは、例えば、配列番号６６のアミノ酸３２１〜４２６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３６３】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはアクチビンＢから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６７のアクチビンＢから誘導される。この実施形態の一態様においては、アクチビンＢから誘導された増大した結合ドメインは配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６を含む。
【０３６４】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３６５】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３６６】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＢは、例えば、配列番号６７のアミノ酸３０３〜４０６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３６７】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはアクチビンＣから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６８のアクチビンＣから誘導される。この実施形態の一態様においては、アクチビンＣから誘導された増大した結合ドメインは配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２を含む。
【０３６８】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３６９】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３７０】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＣは、例えば、配列番号６８のアミノ酸２４７〜３５２又はアミノ酸２３７〜３５２との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３７１】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはアクチビンＥから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号６９のアクチビンＥから誘導される。この実施形態の一態様においては、アクチビンＥから誘導された増大した結合ドメインは配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０を含む。
【０３７２】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３７３】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３７４】
この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、アクチビンＥは、例えば、配列番号６９のアミノ酸２４７〜３５０との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３７５】
もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインはインヒビンＡから誘導される。もう１つの実施形態においては、増大した結合ドメインは配列番号７０のインヒビンＡから誘導される。この実施形態の一態様においては、インヒビンＡから誘導された増大した結合ドメインは配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６を含む。
【０３７６】
この実施形態のその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又は配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３７７】
この実施形態のその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３７８】
この実施形態のその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、インヒビンＡは、例えば、配列番号７０のアミノ酸２６２〜３６６又はアミノ酸２３３〜３６６との関係において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３７９】
本明細書で開示されている増大した標的ドメインが、天然由来のクロストリジウム毒素中に見出されるクロストリジウム毒素の結合ドメインの結合活性に置き換わる。本書で使用される「クロストリジウム毒素の結合ドメイン」という用語は、「クロストリジウム毒素ＨＣ領域」と同義であり、例えば標的細胞の血漿膜表面上にあるクロストリジウム毒素特異的受容体系に対するクロストリジウム毒素の結合などを含めた、中毒過程の細胞結合段階を行うことができるあらゆる天然由来のクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。結合活性の置き換えは、例えば、全クロストリジウム毒素の結合ドメインを増大した標的ドメインで置き換えることによって；残りのクロストリジウム毒素の結合ドメインの部分が選択的にクロストリジウム毒素受容体系に結合できないことを条件として増大した標的ドメインでクロストリジウム毒素の結合ドメインの一部分を置き換えることによって；そして、クロストリジウム毒素の結合ドメインが、そのクロストリジウム毒素受容体系に選択的に結合できないような形で改変されていることを条件として、クロストリジウム毒素の結合ドメインを含むクロストリジウム毒素に対して増大した標的ドメインを操作可能な形で連結することによって達成可能であると想定されている。
【０３８０】
ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＴｅＮＴのＨＣドメインの三次元結晶構造は、クロストリジウム神経毒素の３つの機能性ドメインが、構造的に区別されることを示す。軽鎖のＨＥＸＸＨコンセンサスモチーフは、チャンネルを通じて接近可能な、タンパク質表面上の深い裂け目に位置した触媒部位の４面体的亜鉛結合ポケットを形成する。ＨＮ及びＨＣドメインの構造は、一次的に単一α−螺旋により連結されたβ−シートトポロジーからなる。円筒状のＨＮドメインは、一部のウイルスタンパク質から見出されるコイルドコイルモチーフと類似した２つの長い両親媒性α−螺旋を含む。ＨＮドメインはまた、「転座ベルト」と呼ばれる非組織化された長いループを形成するが、この転座ベルトは、活性部位の触媒結合ポケットに対する亜鉛原子の接近を遮断する、軽鎖の負に帯電した大きな裂け目の周囲を包み込む。前記ＨＣドメインは、機能を示す約等しい大きさの２つの異なった構造的特徴を含む。ＨＣＮサブドメインと命名された第１は、ＨＣドメインのアミノ側半分内に位置する。ＨＣＮサブドメインは、β−バレル、ゼリーロール折り畳みを形成する。ＨＣＣサブドメインは、ＨＣドメインを含む第２のサブドメインである。このカルボキシ末端サブドメインは、血清アミロイドＰ、シアリダーゼ、ｃｒｙｉａ、殺虫性∂−エンドトキシン及びレクチンのような多数の糖結合タンパク質から見出される炭水化物結合部分と類似した３つの異なった炭水化物結合領域を形成する修飾β−三葉形ドメインを含む。生化学研究によれば、ＨＣＣサブドメインのβ−三葉形ドメイン構造は、細胞表面上のクロストリジウム毒素受容体系の特定の炭水化物含有成分への結合を媒介するものと見える。例えば、クシシトフ  ジナルスキ（Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ  Ｇｉｎａｌｓｋｉ）ら「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｅｔａ−Ｔｒｅｆｏｉｌ  Ｓｕｂｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｆａｍｉｌy  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｌｅｖｅｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ」、第４８２巻、第１−２号、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１１９−１２４頁（２０００年）参照。ＨＣドメインは、ＨＮドメインから遠ざかるように傾き、表面ループを露出させ、これらが結合のために接近可能になるようにする。軽鎖とＨＣドメインとの間には、何らの接触も行われていない。
【０３８１】
構造的β−三葉形ドメインを含むタンパク質は、様々な群のタンパク質を代表する。例えば、Ｃ．Ａ．オレンゴ（Ｃ．Ａ．Ｏｒｅｎｇｏ）ら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｉｅｓ  ａｎｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｓ」、第３７２巻、Ｎａｔｕｒｅ、６３１−６３４頁（１９９４年）参照。前記β−三葉形ドメインは、特徴的疑似−３回転軸対称を示す、３つのβ−ヘアピン構造により一端が閉鎖された６重鎖β−バレルを含む。この３回転軸対称の単量体的構造単位を、一対の逆平行β−シートとして編成された４つのβ−シートを含有するβ−三葉形折り畳みという。これらのβ−三葉形折り畳みをそれぞれに分割したものが、β−ヘアピンカーブである。したがって、線形方式では、β−三葉形ドメインが、第１のβ−三葉形折り畳みの４つのβ−シート、１つのβ−ヘアピンカーブ、第２のβ−三葉形折り畳みの４つのβ−シート、１つの第２のβ−ヘアピンカーブ、第３のβ−三葉形折り畳みの４つのβ−シート（図２）を含む。前記第１のヘアピンカーブが、β−三葉形ドメインの第４及び第５のβ−シート間に位置するので、β４／β５  β−ヘアピンカーブと命名する。同様に、前記第２のヘアピンカーブが、β−三葉形ドメインの第８及び第９のβ−シート間に位置するので、β８／β９  β−ヘアピンカーブと命名する。
【０３８２】
β−三葉形折畳みを含むタンパク質について標準的であるように、クロストリジウム毒素間のＨＣＣサブドメインの全体的アミノ酸配列同一性は低い。しかしながら、結合活性にとって不可欠である重要な残基が構造分析及び突然変異誘発実験により同定されてきた。例えばクリジズトフ・ギナルスキー（Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ  Ｇｉｎａｌｓｋｉ）ら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｅｔａ−Ｔｒｅｆｏｉｌ  Ｓｕｂｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｌｅｖｅｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ」、第４８２号（１−２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １１９〜１２４頁（２０００年）；及びアンドレアス「Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒｕｍｍｅｌ」ら、「Ｔｈｅ  ＨＣＣ−Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  Ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａ  Ｓｉｎｇｕｌａｒ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ」、第５１（３）号、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６３１〜６４３頁（２００４年）を参照のこと。さらに、研究により、β−三葉形ドメイン内に見られる固有の３回転軸対称を付与する上でβ４／β５及びβ８／β９  β−ヘアピンカーブが重要であること、そしてこれらのカーブがβ−三葉形ドメインの安定性にとって重要であることが明らかになった。例えばステフェン・Ｒ．ブリッチ（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｒ．  Ｂｒｙｃｈ）ら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａ  β−ｔｒｅｆｏｉｌ」、第１０号、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２５８７〜２５９９頁（２００１年）；  ジーウォン・キム（Ｊａｅｗｏｎ  Ｋｉｍ）ら、「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  Ｉ’  Ｔｕｒｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  β８／β９  β−ｈａｉｒｐｉｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」、第１１号、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ４５９〜４６６頁（２００２年）；  ジーウォン・キムら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｗａｐｐｉｎｇ  Ｄｏｅｓ  Ｎｏｔ  Ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｗａｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  β４／β５  ａｎｄ  β８／β９  β−ｈａｉｒｐｉｎ  Ｔｕｒｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ」、第１４号、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３５１〜３５９頁（２００５年）を参照のこと。さまざまなクロストリジウム毒素中に見出されるβ−三葉形ドメインを含むアミノ酸配列が表２に示されている。
【０３８３】
【表２】
2008535486.tif 000004
【０３８４】
かくして、１つの実施形態においては、ＨＣ領域を含むクロストリジウム毒素の結合ドメインを、本明細書中で開示されている増大した結合ドメインで置き換えることができる。この実施形態の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｃ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｄ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｅ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｆ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＴｅＮＴ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができる。この実施形態のその他の態様においては、配列番号１のアミノ酸８７２〜１２９６を含むＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号２のアミノ酸８５９〜１２９１を含むＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号３のアミノ酸８６７〜１２９１を含むＢｏＮＴ／Ｃ１  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号４のアミノ酸８６３〜１２７６を含むＢｏＮＴ／Ｄ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号５のアミノ酸８４６〜１２５２を含むＢｏＮＴ／Ｅ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号６のアミノ酸８６５〜１２７４を含むＢｏＮＴ／Ｆ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号７のアミノ酸８６４〜１２９７を含むＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号８のアミノ酸８８０〜１３１５を含むＴｅＮＴ  ＨＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができる。
【０３８５】
もう１つの実施形態においては、ＨＣＣ領域を含むクロストリジウム毒素の結合ドメインを、本明細書中で開示されている増大した結合ドメインで置き換えることができる。この実施形態の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｃ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｄ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｅ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｆ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、ＴｅＮＴ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができる。この実施形態のその他の態様においては、配列番号１のアミノ酸１０９２〜１２９６を含むＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号２のアミノ酸１０７９〜１２９１を含むＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号３のアミノ酸１０９３〜１２９１を含むＢｏＮＴ／Ｃ１  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号４のアミノ酸１０８０〜１２７６を含むＢｏＮＴ／Ｄ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号５のアミノ酸１０６７〜１２５２を含むＢｏＮＴ／Ｅ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号６のアミノ酸１０８７〜１２７４を含むＢｏＮＴ／Ｆ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号７のアミノ酸１０８７〜１２９７を含むＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができ、配列番号８のアミノ酸１１０９〜１３１５を含むＴｅＮＴ  ＨＣＣ領域を増大した標的ドメインで置き換えることができる。
【０３８６】
もう１つの実施形態においては、本明細書で開示されている増大した結合ドメインが、そのクロストリジウム毒素受容体系に選択的に結合できないような形で改変されたクロストリジウム毒素の結合ドメインを含むクロストリジウム毒素に操作可能な形で連結されている。本書で使用されている「改変された」という用語は、クロストリジウム毒素の結合ドメインに関して言及する場合、該ドメインがもはやクロストリジウム毒素受容体系に選択的に結合できないような形でクロストリジウム毒素の結合ドメインの結合活性を無くする又は減少させるように修飾された天然由来のクロストリジウム毒素の結合ドメインを意味する。定義上、改変されたクロストリジウム毒素の結合ドメインは、開示された基準配列（表１参照）の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、その基準配列の対応する領域に対する同一性百分率で描写され得る。非制限の例として、配列番号１のアミノ酸８７２〜１２９６を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ領域は、例えば配列番号１のアミノ酸領域８７２〜１２９６に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号２のアミノ酸８５９〜１２９１を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣ領域は、例えば配列番号２のアミノ酸領域８５９〜１２９１に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号３のアミノ酸８６７〜１２９１を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ｃ１  ＨＣ領域は、例えば配列番号３のアミノ酸領域８６７〜１２９１に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号４のアミノ酸８６３〜１２７６を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ｄ  ＨＣ領域は、例えば配列番号４のアミノ酸領域８６３〜１２７６に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号５のアミノ酸８４６〜１２５２を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ｅ  ＨＣ領域は、例えば配列番号５のアミノ酸領域８４６〜１２５２に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号６のアミノ酸８６５〜１２７４を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ｆ  ＨＣ領域は、例えば配列番号６のアミノ酸領域８６５〜１２７４に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号７のアミノ酸８６４〜１２９７を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＣ領域は、例えば配列番号７のアミノ酸領域８６４〜１２９７に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになり；配列番号８のアミノ酸８８０〜１３１５を含む修飾されたＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＣ領域は、例えば配列番号８のアミノ酸領域８８０〜１３１５に比べたアミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸差異を有することになる。
【０３８７】
この実施形態に態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、例えばその基準配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、その基準配列と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、その基準配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、その基準配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、その基準配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又はその基準配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、例えばその基準配列と多くとも７０％のアミノ酸同一性、その基準配列と多くとも７５％のアミノ酸同一性、その基準配列と多くとも８０％のアミノ酸同一性、その基準配列と多くとも８５％のアミノ酸同一性、その基準配列と多くとも９０％のアミノ酸同一性、又はその基準配列と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３８８】
この実施形態のその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の非隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３８９】
この実施形態のその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、改変されたクロストリジウム毒素ＨＣ領域は、その基準配列との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００又は２００個の隣接アミノ酸添加を有するポリペプチドを含む。
【０３９０】
該発明のもう１つの態様においては、増大した結合活性をもつ修飾されたクロストリジウム毒素は、二重鎖ループ領域内に位置づけされている。本書で使用する「二重鎖ループ領域」という用語は、クロストリジウム毒素の単鎖形態を二重鎖形態に転換させるのに使用されるプロテアーゼ切断部位を含有するクロストリジウム毒素のアミノ酸配列を意味する。クロストリジウム毒素二重鎖ループ領域の非制限の例としては、配列番号１のアミノ酸４３０〜４５４を含むＢｏＮＴ／Ａの二重鎖ループ領域；配列番号２のアミノ酸４３７〜４４６を含むＢｏＮＴ／Ｂの二重鎖ループ領域；配列番号３のアミノ酸４３７〜４５３を含むＢｏＮＴ／Ｃ１の二重鎖ループ領域；配列番号４のアミノ酸４３７〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｄの二重鎖ループ領域；配列番号５のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｏＮＴ／Ｅの二重鎖ループ領域；配列番号６のアミノ酸４２９〜４４５を含むＢｏＮＴ／Ｆの二重鎖ループ領域；配列番号７のアミノ酸４３６〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｇの二重鎖ループ領域；及び配列番号８のアミノ酸４３９〜４６７を含むＴｅＮＴの二重鎖ループ領域が含まれる（表８）。
【０３９１】
【表３】
2008535486.tif 000005
【０３９２】
制限なく内因性二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位及び外因性プロテアーゼ切断部位を含め、クロストリジウム毒素の単鎖ポリペプチド形態を二重鎖形態に転換させるために任意のかつ全てのプロテアーゼ切断部位を使用することができると想定されている。
【０３９３】
本書で使用されている「内因性二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位」という用語は「天然由来の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位」と同義語であり、天然由来のクロストリジウム毒素の二重鎖ループ領域内に見られる天然由来のプロテアーゼ切断部位を意味し、制限なく、例えばクロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位イソ型及びクロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位亜型といったような天然由来のクロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位変異体を含む。内因性プロテアーゼ切断部位の非制限の例としては例えば、ＢｏＮＴ／Ａ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位及びＴｅＮＴ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位が含まれる。
【０３９４】
上述のように、クロストリジウム毒素は、その後天然由来のプロテアーゼによりジスルフィドループ内部でタンパク質切断によって切断される約１５０ｋＤａの単鎖ポリペプチドとして翻訳される。この翻訳後プロセッシングは、単一のジスルフィド結合及び非共有的相互作用により合わせて保持された約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）と約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）を含む二重鎖分子を生成する。プロテアーゼの同一性は、現在未知であるが、数多くのクロストリジウム毒素のための二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位は決定されてきた。ＢｏＮＴにおいては、Ｋ４４８−Ａ４４９での切断がＢｏＮＴ／Ａの単一ポリペプチド形態を二重鎖形態に転換させ；Ｋ４４１−Ａ４４２での切断がＢｏＮＴ／Ｂの単一ポリペプチド形態を二重鎖形態へと転換させ；Ｋ４４９−Ｔ４５０での切断が、ＢｏＮＴ／Ｃ１の単一ポリペプチド形態を二重鎖形態へと転換させ；Ｒ４４５−Ｄ４４６での切断はＢｏＮＴ／Ｄの単一ポリペプチド形態を二重鎖形態へと転換させ；Ｒ４４２−Ｋ４２３での切断は、ＢｏＮＴ／Ｅの単一ポリペプチド形態を二重鎖形態へと転換させ；Ｋ４３９−Ａ４４０での切断は、ＢｏＮＴ／Ｆの単一ポリペプチド形態を二重鎖形態へと転換させ；Ｋ４４６−Ｓ４４７での切断は、ＢｏＮＴ／Ｇの単一ポリペプチド形態を二重鎖形態へと転換させる。Ａ４５７−Ｓ４５８におけるＴｅＮＴの単一ポリペプチド形態のタンパク質分解切断は、結果として二本鎖形態をもたらす。かかる二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で操作可能な形で連結されている。しかしながら、二重鎖ループ内部の付加的な切断部位も同様に切断されて小さいペプチド断片の生成が失われる結果となると思われるという点にも留意すべきである。非制限の例として、ＢｏＮＴ／Ａ単鎖ポリペプチドの切断は、二重鎖ループ内部の１０アミノ酸断片の喪失を結果としてもたらす。
【０３９５】
かくして、一実施形態においては、単鎖毒素を二重鎖形態に転換させるために、内因性クロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位を含むプロテアーゼ切断部位が使用される。この実施形態の態様においては、タンパク質分解切断による二重鎖形態への転換は、ＢｏＮＴ／Ａ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位又はＴｅＮＴ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位を含む部位から起こる。
【０３９６】
この実施形態のその他の態様においては、タンパク質分解切断による二重鎖形態への転換は、例えば、配列番号１のアミノ酸４３０〜４５４を含むＢｏＮＴ／Ａの二重鎖ループ領域；配列番号２のアミノ酸４３７〜４４６を含むＢｏＮＴ／Ｂの二重鎖ループ領域；配列番号３のアミノ酸４３７〜４５３を含むＢｏＮＴ／Ｃ１の二重鎖ループ領域；配列番号４のアミノ酸４３７〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｄの二重鎖ループ領域；配列番号５のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｏＮＴ／Ｅの二重鎖ループ領域；配列番号６のアミノ酸４２９〜４４５を含むＢｏＮＴ／Ｆの二重鎖ループ領域；配列番号７のアミノ酸４３６〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｇの二重鎖ループ領域；又は配列番号８のアミノ酸４３９〜４６７を含むＴｅＮＴの二重鎖ループ領域を含む部位から発生する。
【０３９７】
同様に、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素の単鎖ポリペプチドを二重鎖形態へと転換するために外因性プロテアーゼ切断部位を使用することができるということも想定されている。本書で使用されているように、「外因性プロテアーゼ切断部位」は、「非天然由来のプロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然由来のクロストリジウム毒素からの二重鎖ループ領域内に通常存在しないプロテアーゼ切断部位を意味する。外因性プロテアーゼ切断部位の非制限の例には、例えばエンテロキナーゼ切断部位（表５）；トロンビン切断部位（表９）；Ｘａ因子切断部位（表９）；ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位（表９）；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（表９）；ジペプチジルアミノペプチダーゼ切断部位；低分子量のユビキチン類似因子（ＳＵＭＯ）／ユビキチン様タンパク質−１（ＵＬＰ−１）プロテアーゼ切断部位、例えばＭＡＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧ（配列番号５７）；及びクロストリジウム毒素基質切断部位が含まれる。
【０３９８】
【表４】
2008535486.tif 000006
【０３９９】
上述のように、クロストリジウム毒素は単一ポリペプチド形態からタンパク質分解切断により二重鎖分子へと転換される。天然由来のプロテアーゼは現在知られていないが、切断はジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基の間で二重鎖ループ領域内で発生する（表８を参照のこと）。外因性プロテアーゼ切断部位で内因性プロテアーゼ切断部位を置き換えることにより、１つの毒素の二重鎖ループ領域を切断するために用いられる天然由来のプロテアーゼを産生しない生体内で発現された場合に本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素の切断が可能となる。同様にして、二重鎖ループ領域内に外因性プロテアーゼ切断部位を付加することによって、１つの毒素の二重鎖ループ領域を切断するために用いられる天然由来のプロテアーゼを産生しない生体内で発現された場合に、本明細書で開示される修飾クロストリジウム毒素の切断も可能となる。
【０４００】
外因性プロテアーゼ切断部位がそのそれぞれのプロテアーゼによって切断される能力をもつということを条件として、任意のあらゆる長さの外因性プロテアーゼ切断部位が本発明の態様において有用であるということが想定されている。かくして、この実施形態の態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は、長さが少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸又は少なくとも６０アミノ酸であり得る。この実施形態のその他の態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は例えば、長さが多くとも６アミノ酸、多くとも７アミノ酸、多くとも８アミノ酸、多くとも９アミノ酸、多くとも１０アミノ酸、多くとも１５アミノ酸、多くとも２０アミノ酸、多くとも２５アミノ酸、多くとも３０アミノ酸、多くとも４０アミノ酸、多くとも５０アミノ酸又は多くとも６０アミノ酸であり得る。
【０４０１】
この実施形態の態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位のための天然由来のプロテアーゼ切断部位が置換するように二重鎖ループ領域を修飾することができる。このタイプの修飾においては、天然由来のプロテアーゼ切断部位は操作不能にされ、かくしてそのプロテアーゼによって切断され得ない。外因性プロテアーゼ切断部位のみがその対応する外因性プロテアーゼにより切断され得る。このタイプの修飾においては、外因性プロテアーゼ部位は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に枠内で操作可能な形で連結されており、該部位はそのそれぞれの外因性プロテアーゼにより切断され得る。非制限の例としては、二重鎖ループ領域内に外因性プロテアーゼ切断部位を含む単鎖修飾ＢｏＮＴ／Ａは、そのそれぞれの外因性プロテアーゼにより切断されて毒素の二重鎖形態を生産することができる。
【０４０２】
この実施形態のその他の態様では、天然由来のプロテアーゼ切断部位に加えて外因性プロテアーゼ切断部位を含み入れるように二重鎖ループ領域を修飾することができる。このタイプの修飾においては、両方の切断部位共、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で操作可能な形で連結されており、両部位共そのそれぞれのプロテアーゼにより切断可能である。非制限の例としては、天然由来のＢｏＮＴ／Ａ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位及び外因性プロテアーゼ切断部位の両方を含有する二重鎖ループを含む単鎖修飾ＢｏＮＴ／Ａが、天然由来の二重鎖ループのプロテアーゼ又は適切な外因性プロテアーゼのいずれかにより切断されて、毒素の二重鎖形態を生産することができる。
【０４０３】
天然由来のプロテアーゼ切断部位は、天然由来の二重鎖ループのプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある少なくとも２つのアミノ酸を改変させることによって操作不能にされ得る。二重鎖ループ領域の２つのシステイン残基が無傷の状態にとどまりなおもジスルフィド架橋を形成できることを条件として、より広範な改変を行なうことができる。アミノ酸改変の非制限の例には、アミノ酸の欠失又は異なるアミノ酸での当初のアミノ酸の置き換えが含まれる。かくして、１つの実施形態においては、天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を改変させることにより、天然由来のプロテアーゼ切断部位が操作不能にされる。この実施形態のその他の態様においては、例えば天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも３つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも４つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも５つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも６つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも７つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも８つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも９つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも１０のアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも１５のアミノ酸；又は天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する少なくとも２０のアミノ酸；などを改変させることにより天然由来のプロテアーゼ切断部位が操作不能にされる。
【０４０４】
この実施形態のさらにその他の態様においては、例えば天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも３つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも４つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも５つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも６つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも７つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも８つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも９つのアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも１０のアミノ酸；天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも１５のアミノ酸；又は天然由来のプロテアーゼにより切断されたペプチド結合の両側にある２つのアミノ酸を内含する多くとも２０のアミノ酸；などを改変させることにより天然由来の二重鎖プロテアーゼ切断部位が操作不能にされる。
【０４０５】
一実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループの中に外因性プロテアーゼ切断部位が位置設定されている。この実施形態の態様では、修飾クロストリジウム毒素は例えば、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含む外因性プロテアーゼ切断部位を含んでいる。この実施形態のその他の態様では、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴの二重鎖ループの内部に外因性プロテアーゼ切断部位が位置設定されている。
【０４０６】
この実施形態の一態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は例えば、修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループ内部に位置設定されたウシエンテロキナーゼ切断部位であり得る。該実施形態のその他の態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は例えば、配列番号７１を含む修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループ内部に位置設定されたウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位であり得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位は、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴの二重鎖ループの内部に位置設定されている。
【０４０７】
この実施形態のもう１つの態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループ内部に位置設定されたタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位であり得る。該実施形態のその他の態様では、外因性プロテアーゼ切断部位は、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０又は配列番号８１を含む修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループの内部に位置設定されたタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位であり得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位は、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴの二重鎖ループの内部に位置設定されている。
【０４０８】
この実施形態のさらにもう１つの態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループ内部に位置設定されたヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位であり得る。該実施形態のその他の態様では、外因性プロテアーゼ切断部位は、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７を含む修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループの内部に位置設定されたヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位であり得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位は、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴの二重鎖ループの内部に位置設定されている。
【０４０９】
この実施形態のさらにもう１つの態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループ内部に位置設定されたＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位であり得る。該実施形態のその他の態様では、外因性プロテアーゼ切断部位は、配列番号８８を含む修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループの内部に位置設定されたＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位であり得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位は、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴの二重鎖ループの内部に位置設定されている。
【０４１０】
この実施形態のさらなる態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループ内部に位置設定されたトロンビンプロテアーゼ切断部位であり得る。該実施形態のその他の態様では、外因性プロテアーゼ切断部位は、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２又は配列番号１０３を含む修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループの内部に位置設定されたトロンビンプロテアーゼ切断部位であり得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、トロンビンプロテアーゼ切断部位は、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴの二重鎖ループの内部に位置設定されている。
【０４１１】
この実施形態のもう１つの態様においては、外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループ内部に位置設定された凝固因子Ｘａプロテアーゼ切断部位であり得る。該実施形態のその他の態様では、外因性プロテアーゼ切断部位は、配列番号１０４又は配列番号１０５を含む修飾クロストリジウム毒素の二重鎖ループの内部に位置設定された凝固因子Ｘａプロテアーゼ切断部位であり得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、凝固因子Ｘａプロテアーゼ切断部位は、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴの二重鎖ループの内部に位置設定されている。
【０４１２】
もう１つの実施形態においては、外因性プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む。本書で使用される「クロストリジウム毒素基質切断部位」というのは、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下でのクロストリジウム毒素による切断結合における検出可能なタンパク質分解のために充分な隣接又は非隣接認識要素又はその両方を合わせた切断結合を意味する。定義上、クロストリジウム毒素基質切断部位は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下で少なくとも１つのクロストリジウム毒素による切断を受ける可能性がある。クロストリジウム毒素基質切断部位の非制限の例は、例えばスチュワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）、Ｌ．Ｅ．ら、「自己活性化クロストリジウム毒素」、米国仮特許出願第６０／７１８，６１６号（２００５年９月１９日）の中で開示されている。
【０４１３】
本明細書に開示されている修飾クロストリジウム毒素は任意には１つ以上の付加的構成要素を含むものとされている。任意の構成要素の非制限の例として、修飾クロストリジウム毒素は、フレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域をさらに含み得る。フレキシブルスペーサの非制限の例には、例えばＧ−スペーサＧＧＧＧＳ（配列番号１０６）又はＡスペーサＥＡＡＡＫ（配列番号１０７）が含まれる。フレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域を用いて、ポリペプチドの特徴、属性又は特性を最適化するべくポリペプチド領域の長さを調整することができる。かかるフレキシブル領域は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対して枠内で操作可能な形で連結される。非制限の例として、縦一列に１つ以上のフレキシブルスペーサを含むポリペプチド領域を用いて、プロテアーゼ切断部位をより良く曝露しかくしてプロテアーゼによるその部位の切断を容易にすることができる。もう１つの非制限の例として、縦一列に１つ以上のフレキシブルスペーサを含むポリペプチド領域を用いて、増大した標的ドメインをより良く提示し、かくして、その受容体系に対するその増大した標的ドメインの結合を容易にすることができる。
【０４１４】
かくして、一実施形態においては、本明細書内で開示されている修飾クロストリジウム毒素が、フレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域をさらに含む可能性がある。もう１つの実施形態においては、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素はさらに、縦一列に複数のフレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域をさらに含み得る。この実施形態の態様においては、フレキシブル領域は、縦一列に例えば少なくとも１つのＧ−スペーサ、少なくとも２つのＧ−スペーサ、少なくとも３つのＧ−スペーサ、少なくとも４つのＧ−スペーサ又は少なくとも５つのＧ−スペーサを含み得る。この実施形態のその他の態様においては、フレキシブル領域が縦一列に例えば多くとも１つのＧ−スペーサ、多くとも２つのＧ−スペーサ、多くとも３つのＧ−スペーサ、多くとも４つのＧ−スペーサ又は多くとも５つのＧ−スペーサを含み得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、フレキシブル領域は縦一列に例えば少なくとも１つのＡ−スペーサ、少なくとも２つのＡ−スペーサ、少なくとも３つのＡ−スペーサ、少なくとも４つのＡ−スペーサ又は少なくとも５つのＡ−スペーサを含み得る。この実施形態のさらにその他の態様においては、フレキシブル領域が縦一列に例えば多くとも１つのＡ−スペーサ、多くとも２つのＡ−スペーサ、多くとも３つのＡ−スペーサ、多くとも４つのＡ−スペーサ又は多くとも５つのＡ−スペーサを含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、同じフレキシブルスペーサの１つ以上のコピー、異なるフレキシブルスペーサ領域の１つ以上のコピー又はそれらの任意の組合せを含み得る。
【０４１５】
この実施形態の態様においては、フレキシブルスペーサを含む修飾クロストリジウム毒素は、例えば修飾ＢｏＮＴ／Ａ、修飾ＢｏＮＴ／Ｂ、修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１、修飾ＢｏＮＴ／Ｄ、修飾ＢｏＮＴ／Ｅ、修飾ＢｏＮＴ／Ｆ、修飾ＢｏＮＴ／Ｇ又は修飾ＴｅＮＴであり得る。
【０４１６】
修飾クロストリジウム毒素が中毒過程を実施する能力を有することを条件として、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素が、任意の及び全ての場所においてフレキシブルスペーサを含み得るということが想定されている。この実施形態の態様においては、フレキシブルスペーサが、例えばフレキシブルドメインと転座ドメイン、酵素ドメインと増大した標的ドメイン、酵素ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。この実施形態のその他の態様においては、Ｇ−スペーサが、例えば酵素ドメインと転座ドメイン、酵素ドメインと増大した標的ドメイン、酵素ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。この実施形態のその他の態様では、Ａ−スペーサが、例えば酵素ドメインと転座ドメイン、酵素ドメインと増大した標的ドメイン、酵素ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。
【０４１７】
この実施形態のその他の態様においては、フレキシブルスペーサが、例えば増大した標的ドメインと転座ドメイン、増大した標的ドメインと酵素ドメイン、増大した標的ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。この実施形態のその他の態様においては、Ｇ−スペーサが例えば増大した標的ドメインと転座ドメイン、増大した標的ドメインと酵素ドメイン、増大した標的ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。この実施形態のその他の態様においては、Ａ−スペーサが例えば増大した標的ドメインと転座ドメイン、増大した標的ドメインと酵素ドメイン、増大した標的ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。
【０４１８】
この実施形態のさらにその他の態様においては、フレキシブルスペーサが、例えば転座ドメインと酵素ドメイン、転座ドメインと増大した標的ドメイン、転座ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。この実施形態のその他の態様においては、Ｇ−スペーサが転座ドメインと酵素ドメイン、転座ドメインと増大した標的ドメイン、転座ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。この実施形態のその他の態様については、Ａスペーサが、例えば転座ドメインと酵素ドメイン、転座ドメインと増大した標的ドメイン、転座ドメインとプロテアーゼ切断部位の間に位置づけされている。
【０４１９】
最適な構成要素のもう１つの非制限の例には、修飾クロストリジウム毒素はさらにエピトープ−結合領域を含むことができる。エピトープ−結合領域は、例えばタンパク質の精製及びタンパク質の視覚化が関与する多様な手順において使用可能である。このようなエピトープ−結合領域は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で操作可能な形で連結される。エピトープ−結合領域の非制限の例には、例えばＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）（配列番号１０８）、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）（配列番号１０９）、ヒトｐ６２ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）（配列番号１１０）、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号１１１）、物質Ｐ（配列番号１１２）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質−Ｄ前駆物質（配列番号１１３）、Ｖ５（配列番号１１４）、ＡＵ１（配列番号１１５）及びＡＵ５（配列番号１１６）；親和結合、例えばポリヒスチジン（ＨＩＳ）（配列番号１１７）、ストレプトアビジン結合ペプチド（ｓｔｒｅｐ）及びビオチン又はビオチニル化配列；ペプチド結合領域、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン、及びマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインが含まれる。適切な結合ペプチドを選択し、作製しかつ使用するための特定のプロトコールの非制限の例は、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ」、１７．９０〜１７．９３頁（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３巻、第３版、２００１年）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（エドワード・ハーロウ（Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ）及びダヴィッド・レーン（Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９９８年）；及び「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．１」（エドワード・ハーロウ及びダヴィッド・レーン、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）の中で記述されている。さらに、結合ペプチドならびに充分に特徴づけされた試薬、条件及びプロトコールの非制限の例は、制限なく、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  ＡｌｔｏのＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミンジェン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ）；カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．）；及びカリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含めた商業的供給メーカーから容易に入手可能である。これらのプロトコールは、当該技術分野の中に充分入り、かつ本書で教示されている日常的手順である��
【０４２０】
かくして、一実施形態においては、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素はさらにエピトープ−結合領域を含む。もう１つの実施形態においては、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素は、さらに複数のエピトープ−結合領域を含む。この実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は例えば少なくとも１つのエピトープ−結合領域、少なくとも２つのエピトープ−結合領域、少なくとも３つのエピトープ−結合領域、少なくとも４つのエピトープ−結合領域又は少なくとも５つのエピトープ−結合領域を含み得る。この実施形態のその他の態様では、修飾クロストリジウム毒素は例えば多くとも１つのエピトープ−結合領域、多くとも２つのエピトープ−結合領域、多くとも３つのエピトープ−結合領域、多くとも４つのエピトープ−結合領域又は多くとも５つのエピトープ−結合領域を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は同じエピトープ−結合領域の１つ以上のコピー、異なるエピトープ−結合領域の１つ以上のコピー又はその任意の組合せを含み得る。
【０４２１】
エピトープ−結合領域の場所は、制限なく、修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端、修飾クロストリジウム毒素内又は修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端を含めた、さまざまな位置であり得る。かくして、一実施形態において、エピトープ−結合領域は修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置設定される。かかる場所では、開始メチオニンが該エピトープ−結合領域の前に置かれるべきである。さらに、当該技術分野においては、開始メチオニンを含むもう１つのポリペプチドのアミノ末端に操作可能な形で連結されたポリペプチドを付加した場合には、もとのメチオニン残基が欠失され得るということがわかっている。これは、付加されたポリペプチドが新しい開始メチオニンを含有し、もとの開始メチオニンが融合タンパク質の最適な発現を低減し得るという事実に起因する。この実施形態の態様においては、本仕様書で開示されている修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置設定されたエピトープ−結合領域は例えば、ＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）エピトープ−結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ−結合領域、ヒトｐ６２ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）エピトープ−結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エピトープ−結合領域、Ｐ物質エピトープ−結合領域、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エピトープ−結合領域の糖タンパク質−Ｄ前駆物質、Ｖ５エピトープ−結合領域、ＡＵ１エピトープ−結合領域、ＡＵ５エピトープ−結合領域、ポリヒスチジンエピトープ−結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチドエピトープ−結合領域、ビオチンエピトープ−結合領域、ビオチニル化エピトープ−結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン又はマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。
【０４２２】
もう１つの実施形態においては、エピトープ−結合領域は、修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置設定される。この実施形態の態様においては、本明細書中に開示された修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置設定されるエピトープ−結合領域は、例えば、ＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）エピトープ−結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ−結合領域、ヒトｐ６２ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）エピトープ−結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エピトープ−結合領域、Ｐ物質エピトープ−結合領域、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エピトープ−結合領域の糖タンパク質−Ｄ前駆物質、Ｖ５エピトープ−結合領域、ＡＵ１エピトープ−結合領域、ＡＵ５エピトープ−結合領域、ポリヒスチジンエピトープ−結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチドエピトープ−結合領域、ビオチンエピトープ−結合領域、ビオチニル化エピトープ−結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン又はマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。
【０４２３】
最適な構成要素のもう１つの非制限の例には、修飾クロストリジウム毒素はさらにエピトープ−結合領域を含むことができる。エピトープ−結合領域は、例えばタンパク質の精製及びタンパク質の視覚化が関与する多様な手順において使用可能である。このようなエピトープ−結合領域は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で操作可能な形で連結される。エピトープ−結合領域の非制限の例には、例えばＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）（配列番号１０８）、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）（配列番号１０９）、ヒトｐ６２ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）（配列番号１１０）、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号１１１）、物質Ｐ（配列番号１１２）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質−Ｄ前駆物質（配列番号１１３）、Ｖ５（配列番号１１４）、ＡＵ１（配列番号１１５）及びＡＵ５（配列番号１１６）；親和結合、例えばポリヒスチジン（ＨＩＳ）（配列番号１１７）、ストレプトアビジン結合ペプチド（ｓｔｒｅｐ）及びビオチン又はビオチニル化配列；ペプチド結合領域、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン、及びマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインが含まれる。適切な結合ペプチドを選択し、作製しかつ使用するための特定のプロトコールの非制限の例は、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ」、１７．９０〜１７．９３頁（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）編、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３巻、第３版、２００１年）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（エドワード・ハーロウ（Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ）及びダヴィッド・レーン（Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９９８年）；及び「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ」（エドワード・ハーロウ及びダヴィッド・レーン、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）の中で記述されている。さらに、結合ペプチドならびに充分に特徴づけされた試薬、条件及びプロトコールの非制限の例は、制限味なく、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  ＡｌｔｏのＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミンジェン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ）；カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．）；及びカリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含めた商業的供給メーカーから容易に入手可能である。これらのプロトコールは、当該技術分野の中に充分入り、かつ本書で教示されている日常的手順���ある。
【０４２４】
かくして、一実施形態においては、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素はさらにエピトープ−結合領域を含む。もう１つの実施形態においては、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素は、さらに複数のエピトープ−結合領域を含む。この実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は例えば少なくとも１つのエピトープ−結合領域、少なくとも２つのエピトープ−結合領域、少なくとも３つのエピトープ−結合領域、少なくとも４つのエピトープ−結合領域又は少なくとも５つのエピトープ−結合領域を含み得る。この実施形態のその他の態様では、修飾クロストリジウム毒素は例えば多くとも１つのエピトープ−結合領域、多くとも２つのエピトープ−結合領域、多くとも３つのエピトープ−結合領域、多くとも４つのエピトープ−結合領域又は多くとも５つのエピトープ−結合領域を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は同じエピトープ−結合領域の１つ以上のコピー、異なるエピトープ−結合領域の１つ以上のコピー又はその任意の組合せを含み得る。
【０４２５】
エピトープ−結合領域の場所は、制限なく、修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端、修飾クロストリジウム毒素内又は修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端を含めた、さまざまな位置であり得る。かくして、一実施形態において、エピトープ−結合領域は修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置設定される。かかる場所では、開始メチオニンが該エピトープ−結合領域の前に置かれるべきである。さらに、当該技術分野においては、開始メチオニンを含むもう１つのポリペプチドのアミノ末端に操作可能な形で連結されたポリペプチドを付加した場合には、もとのメチオニン残基が欠失され得るということがわかっている。これは、付加されたポリペプチドが新しい開始メチオニンを含有し、もとの開始メチオニンが融合タンパク質の最適な発現を低減し得るという事実に起因する。この実施形態の態様においては、本仕様書で開示されている修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置設定されたエピトープ−結合領域は例えば、ＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）エピトープ−結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ−結合領域、ヒトｐ６２ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）エピトープ−結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エピトープ−結合領域、Ｐ物質エピトープ−結合領域、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エピトープ−結合領域の糖タンパク質−Ｄ前駆物質、Ｖ５エピトープ−結合領域、ＡＵ１エピトープ−結合領域、ＡＵ５エピトープ−結合領域、ポリヒスチジンエピトープ−結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチドエピトープ−結合領域、ビオチンエピトープ−結合領域、ビオチニル化エピトープ−結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン又はマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。
【０４２６】
もう１つの実施形態においては、エピトープ−結合領域は、修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置設定される。この実施形態の態様においては、本明細書中に開示された修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置設定されるエピトープ−結合領域は、例えば、ＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）エピトープ−結合領域、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ−結合領域、ヒトｐ６２ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）エピトープ−結合領域、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エピトープ−結合領域、Ｐ物質エピトープ−結合領域、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エピトープ−結合領域の糖タンパク質−Ｄ前駆物質、Ｖ５エピトープ−結合領域、ＡＵ１エピトープ−結合領域、ＡＵ５エピトープ−結合領域、ポリヒスチジンエピトープ−結合領域、ストレプトアビジン結合ペプチドエピトープ−結合領域、ビオチンエピトープ−結合領域、ビオチニル化エピトープ−結合領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン又はマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。
【０４２７】
本明細書の中で開示されている修飾クロストリジウム毒素は、その修飾クロストリジウム毒素が中毒過程を行うことができることを条件として、任意のかつ全ての場所で増大した結合ドメインを含み得る、ということが想定されている。非制限の例には、修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端に増大した結合ドメインを位置設定すること（図３）；修飾クロストリジウム毒素のクロストリジウム毒素の転座ドメインとクロストリジウム毒素の酵素ドメインの間に増大した結合ドメインを位置設定すること（図４）；及び修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に増大した結合ドメインを位置設定すること（図５）が含まれる。
【０４２８】
かくして、一実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態の一態様では、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボニル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボニル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。
【０４２９】
もう１つの実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、増大した標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態の一態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、増大した標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様では、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、増大した標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様では、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、増大した標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むクロストリジウム毒素の結合ドメインを含み得る。
【０４３０】
もう１つの実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態の一態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。
【０４３１】
もう１つの実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態の一態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、増大した標的ドメイン、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。
【０４３２】
もう１つの実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態の一態様では、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン及び増大した標的ドメインを含むアミノ−カルボキシル単一ポリペプチド線形順序を含み得る。
【０４３３】
本発明の態様は、部分的に、修飾クロストリジウム毒素を提供する。本明細書に開示されているクロストリジウム毒素修飾の非制限の例には、例えば増大した標的ドメインの付加、プロテアーゼ切断部位の付加、酵素、転座及び結合ドメインの再配置及びスペーサ領域の付加が含まれる。このような修飾は全て、細胞を中毒させる修飾クロストリジウム毒素の能力に実質的影響を及ぼさないものと理解される。本書に使用されている「実質的影響を及ぼさない」という用語は、低又は高親和力受容体複合体に対するクロストリジウム毒素の結合、毒素／受容体複合体の内在化、細胞質内へのクロストリジウム毒素軽鎖の転座及びクロストリジウム毒素基質の酵素的修飾を包含する、クロストリジウム毒素がニューロン内に入り神経伝達物質の放出を阻害するようにする全体的細胞機序をなおも行うことができるということを意味する。この実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、例えば、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも１０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも２０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも３０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも４０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも５０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも６０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも７０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも８０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも９０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の少なくとも９５％の有毒性を有する。この実施形態の態様においては、該修飾クロストリジウム毒素は、例えば、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも１０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも２０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも３０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも４０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも５０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも６０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも７０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも８０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも９０％の有毒性、天然由来のクロストリジウム毒素の多くとも９５％の有毒性を有する。
【０４３４】
本発明のもう１つの態様は、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレチド分子を提供する。本明細書で開示される任意のかつ全ての修飾クロストリジウム毒素がポリヌクレオチド分子によりコードされ得るということが想定されている。
【０４３５】
本発明の態様は、部分的に、ポリヌクレオチド分子を提供する。本書で使用する「ポリヌクレオチド分子」は、「核酸分子」と同義であり、任意の長さのリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドといったようなヌクレオチドの重合体形態を意味する。制限なく天然由来の及び非天然由来のＤＮＡ分子及び天然由来の及び非天然由来のＲＮＡ分子を含めた、本明細書に開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードできる任意のかつ全てのポリヌクレオチド分子が有用であり得ると想定されている。天然由来の及び非天然由来のＤＮＡ分子の非制限の例には、一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ベクターコンストラクト、例えばプラスミドコンストラクト、ファージミドコンストラクト、バクテリオファージコンストラクト、レトロウイルスコンストラクト及び人工染色体コンストラクトが含まれる。天然由来の及び非天然由来のＲＮＡ分子の非制限の例には、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ及びｍＲＮＡが含まれる。
【０４３６】
かくして、一実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードする。
【０４３７】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子が、本明細書中で開示されているクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素を部分的にコードする。この実施形態の一態様においては、修飾クロストリジウム毒素の酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、例えばクロストリジウム毒素の酵素ドメインイソ型又はクロストリジウム毒素の酵素ドメイン亜型といったような天然由来のクロストリジウム毒素の酵素ドメイン変異体を含んでいる。この実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素の酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、例えば保存的クロストリジウム毒素の酵素ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素の酵素ドメイン変異体又は活性クロストリジウム毒素の酵素ドメイン断片又はそのあらゆる組合せといったような非天然由来のクロストリジウム毒素の酵素ドメイン変異体を含んでいる。この実施形態のその他の態様においては、クロストリジウム毒素の酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン又はその活性断片を含んでいる。
【０４３８】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子が、本明細書中で開示されているクロストリジウム毒素の転座ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素を部分的にコードする。この実施形態の一態様においては、修飾クロストリジウム毒素の転座ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、例えばクロストリジウム毒素の転座ドメインイソ型又はクロストリジウム毒素の転座ドメイン亜型といったような天然由来のクロストリジウム毒素の転座ドメイン変異体を含んでいる。この実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素の転座ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、例えば保存的クロストリジウム毒素の転座ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素の転座ドメイン変異体又は活性クロストリジウム毒素の転座ドメイン断片又はそのあらゆる組合せといったような天然由来のクロストリジウム毒素の転座ドメイン変異体を含んでいる。この実施形態のその他の態様においては、クロストリジウム毒素の転座ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、ＢｏＮＴ／Ａ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転座ドメイン、ＴｅＮＴ転座ドメイン又はその活性断片を含んでいる。
【０４３９】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、本明細書中で開示されている増大した標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素を一部分コードする。この実施形態の一態様においては、増大した標的ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して選択的に結合するポリペプチドを含んでいる。この実施形態の他の一態様においては、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が、例えばイソ型又は亜型といったような天然由来の変異体を含んでいる。この実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が、例えば保存的変異体、非保存的変異体又は活性断片又はその任意の組合せといった非天然由来の変異体を含んでいる。この実施形態のその他の態様においては、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対し選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が、ＴＧＦβスーパーファミリーポリペプチド、例えばＴＧＦβ、ＢＭＰ、ＧＤＦ及びアクチビン；ニューロトロフィン、例えばＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５；軸索ガイダンスシグナル伝達分子、例えばネトリン、セマフロリング及びエフリン；神経調節サイトカイン、例えばＣＮＴＦ、ＧＰＡ、ＬＩＦ、インターロイキン、オノスタチンＭ、ＣＴ−１、及びＣＬＣ；糖結合タンパク質、例えば血清アミロイドｐ、β−グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、クライア、殺虫性デルタ内毒素、アグルチニン、アブリン及びリシン；ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２；ニューレキシン、ニューロロイキン／ＡＭＦ／ＭＦ；ＴｒｋＢ；ＥＧＦ；内臓消化管ペプチド、例えばガストリン、ＶＩＰ、ボンベシン及びＷＮＴ、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄを含んでいる。
【０４４０】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、本明細書中で開示されている増大した標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素を一部分コードする。この実施形態の一態様においては、増大した標的ドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して選択的に結合するポリペプチドを含んでいる。この実施形態の一態様においては、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が、例えばイソ型又は亜型といったような天然由来の変異体を含んでいる。この実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対して選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が、例えば保存的変異体、非保存的変異体又は活性断片又はその任意の組合せといった非天然由来の変異体を含んでいる。この実施形態のその他の態様においては、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜上に存在する非クロストリジウム毒素受容体系に対し選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が、Ｎｇ−ＣＡＭ（Ｌ１）、Ｎ−ＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、アグリン−ＭＵＳＫ及び基底膜ポリペプチド及びラミニンβ−２を含んでいる。
【０４４１】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子が、本明細書中に開示されているプロテアーゼ切断部位を含む修飾クロストリジウム毒素を一部分コードしている。この実施形態の一態様においては、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位を含んでいる。この実施形態の態様においては、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位は、例えばＢｏＮＴ／Ａ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位又はＴｅＮＴ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位であり得る。この実施形態のもう１つの態様においては、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、外因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位を含んでいる。この実施形態の態様においては、外因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位をコードするポリヌクレオチド分子は、例えばウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位、凝固因子Ｘａプロテアーゼ切断部位又はクロストリジウム毒素基質切断部位、例えばＢｏＮＴ／Ａ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ基質切断部位、又はＴｅＮＴ基質切断部位であり得る。
【０４４２】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、本明細書中で開示されているフレキシブルスペーサを含む修飾クロストリジウム毒素を一部分コードする。この実施形態の一態様においては、ポリヌクレオチド分子がフレキシブルスペーサ、Ｇスペーサ、Ａ−スペーサ又はそれらの任意の組合せをコードする。
【０４４３】
これらに制限されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、核酸ライゲーション、細菌形質転換、核酸精製、核酸配列決定及び組換えベースの技術を含めて、本明細書中に開示された修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作製するために必要となり得る充分に立証された分子生物学技術は、当業者の技術範囲内に充分入り、本書の教示に由来する日常的な手順である。修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作製するのに必要な特定のプロトコールの非制限の例は、例えば「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」、上掲、（２００１年）；及び「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、フレデリック  Ｍ．アウスベル（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２００４年）内に記述されている。さらには、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作製するのに有用なさまざまな市販の製品が広く入手可能である。これらのプロトコールは、当業者の技術範囲内に充分入り、本書中の教示に由来する日常的手順である。
【０４４４】
本発明のもう１つの態様は、細胞中の修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を発現する段階を含む、本明細書中に開示されている修飾クロストリジウム毒素の生産方法を提供する。本発明のもう１つの態様は、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトを細胞内に導入し該細胞内で発現コンストラクトを発現する段階を含む、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素の生産方法を提供している。
【０４４５】
本明細書に開示されている方法は、修飾クロストリジウム毒素を一部分含んでいる。本明細書の中で開示されている方法を用いて、本明細書中で開示されている任意のかつ全ての修飾クロストリジウム毒素を生産できるものと想定されている。同様に、本明細書中に開示されている方法を用いて本明細書中に開示される修飾クロストリジウム毒素を生産する上で、本明細書中に開示される修飾クロストリジウム毒素をコードする任意の及び全てのポリヌクレオチド分子が有用であり得るということも想定されている。
【０４４６】
本明細書で開示されている方法は、発現コンストラクトを一部分含んでいる。発現コンストラクトは、細胞又は無細胞抽出物内のポリヌクレオチド分子を発現するために有用な発現ベクターに対し操作可能な形で連結された本明細書に開示されたポリヌクレオチド分子を含んでいる。制限なくウイルス発現ベクター；原核生物発現ベクター；真核生物発現ベクター例えば酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター及び哺乳動物発現ベクター、及び無細胞抽出物発現ベクターを含め多様な発現ベクターを、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を発現する目的で利用することが可能である。さらに、これらの方法の態様を実践するのに有用な発現ベクターには、構成性、組織特異的、細胞特異的又は誘発性プロモータ要素、エンハンサ要素又はその両方の制御下で修飾クロストリジウム毒素を発現するものが含まれ得るということも理解される。かかる発現ベクターから発現コンストラクトを作製し使用するための充分に立証された試薬及び条件と共に発現ベクターの例が、制限なくカリフォルニア州Ｐａｌｏ  ＡｌｔｏのＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック；カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミンジェン；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン  Ｉｎｃ；ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ）；カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａのキアゲン；カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーンを含む商業的供給メーカーから容易に入手可能である。適切な発現ベクターの選択、作製及び使用は、当業者の技術範囲内に充分入り本書中の教示に由来する日常的手順である。
【０４４７】
かくして、この実施形態の態様には、制限なく、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し操作可能な形で連結されたウイルス発現ベクター；修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し操作可能な形で連結された原核生物発現ベクター；修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し操作可能な形で連結された酵母発現ベクター；修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対して操作可能な形で連結された昆虫発現ベクター；及び修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対して操作可能な形で連結された哺乳動物発現ベクターが含まれる。この実施形態のその他の態様には、制限なく、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対して操作可能な形で連結された無細胞発現ベクターを含む無細胞抽出物を用いて、本明細書内に開示されている修飾クロストリジウム毒素を発現するために適した発現コンストラクトが含まれる。
【０４４８】
本明細書中で開示されている方法には、一部には細胞が含まれる。任意かつ全ての細胞が使用可能であると想定されている。かくして、この実施形態の態様には、制限なく、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ウェルス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジア・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、カウロバクタークレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エクストルケンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ナイセリア・メニンギラス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｒｕｌｌｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から誘導されたものといったような好気性、微好気性、好二酸化炭素性、通性、嫌気性、グラム陰性及びグラム陽性菌細胞の菌株を制限なく含む原核細胞、及び例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から誘導されたものといったような酵母菌株を制限なく含む真核細胞；例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）及びタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）から誘導されたものといったような昆虫細胞及び昆虫から誘導された細胞系列、及び例えばマウス、ラット、ハムスタ、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類及びヒトから誘導されたものといったような、哺乳動物細胞及び哺乳動物から誘導された細胞系列が含まれる。細胞系列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、欧州動物細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）及びドイツ微生物細胞培養コレクション（ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から得ることができる。適切な細胞系列を選択、作製及び使用するための特定的プロトコールの非制限の例は、例えば「ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ」（マテウス・Ｆ．Ａ．グーセン（Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｆ．Ａ．Ｇｏｏｓｅｎ）ら編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９３年）；「ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ：  ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＳＰＥＣＴＳ」（Ｊ．Ｍ．フラク（Ｖｌａｋ）ら編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９６年）；モーリーン  Ａ．ハリソン（Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ）及びイアン  Ｆ．ラエ（Ｉａｎ  Ｆ．Ｒａｅ）、「ＧＥＮＥＲＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ」（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）；「ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」（アラン・ドイル（Ａｌａｎ  Ｄｏｙｌｅ）ら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９８年）；Ｒ．イアン・フレシネー（Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、「ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：  Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ」（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、第４版、２０００年）；「ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」（ジョン  Ｒ．Ｗ．マスターズ（Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ）編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２０００年）；「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」、上掲、（２００１年）；「ＢＡＳＩＣ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」（ジョン  Ｍ．デービス（Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｄａｖｉｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、２００２年）；及び「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、上掲、（２００４年）の中で記述されている。これらのプロトコールは、当業者の技術範囲内に入り本書の教示に由来する日常的手順である。
【０４４９】
本明細書で記述されている方法には、一部には、ポリヌクレオチド分子を細胞内に導入することが含まれている。細胞中に導入されるポリヌクレオチド分子は、その細胞により過渡的に又は安定した形で維持され得る。安定した形で維持されるポリヌクレオチド分子は、染色体外にあって自己複製できるか、又は細胞の染色体材料内に組込まれて非自己複製し得る。本明細書中で開示されているポリヌクレオチド分子を細胞内に導入するための任意かつ全ての方法を使用できると想定されている。細胞内に核酸分子を導入するために有用な方法には、制限なく、化学媒介型トランスフェクション例えば、リン酸カルシウム媒介型、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン媒介型、脂質媒介型、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型、ポリリシン媒介型及びポリブレン媒介型トランスフェクション；物理媒介型トランスフェクション例えばバイオリスティック粒子送達、マイクロインジェクション、原形質融合及び電気穿孔；及びウイルス媒介型トランスフェクション、例えばレトロウイルス媒介型トランスフェクションが含まれる。例えば「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」、１６．１〜１６．６２頁（サンブルック及びラッセル編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３巻、第３版、２００１年）を参照のこと。当業者であれば、細胞中に発現コンストラクトを導入するための特定的方法の選択が、一部には、その細胞が発現コンストラクトを過渡的に含有することになるか又は細胞が発現コンストラクトを安定した形で含有することになるかによって左右されるということを理解している。これらのプロトコールは、当業者の技術範囲内に充分入り、本書中の教示に由来する日常的手順である。
【０４５０】
この実施形態の一態様においては、トランスフェクションと呼ばれる化学媒介型方法が、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内に導入する目的で使用される。化学媒介型トランスフェクション方法においては、化学的試薬は、細胞内へのその摂取を容易にする核酸と複合体を形成する。かかる化学的試薬としては、制限なく、リン酸カルシウム媒介型、例えばマーチン・ジョーダン（Ｍａｒｔｉｎ  Ｊｏｒｄａｎ）及びフロリアン・フォーム（Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｗｏｒｍ）、「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」、第３３号（２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３６〜１４３頁、（２００４年）を参照）；ジエチル−アミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン媒介型、脂質媒介型、カチオン重合体媒介型例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型及びポリリシン媒介型及びポリブレン媒介型、（例えばチャン・ツァン（Ｃｈｕｎ  Ｚｈａｎｇ）ら、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ」、第３３号（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４４〜１５０頁、（２００４年）を参照）が含まれる。かかる化学媒介型送達系は標準的方法により調製可能であり、かつ市販されている。例えばセルフェクト（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ）トランスフェクションキット（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙのアマーシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））；哺乳動物トランスフェクションキット、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥ  デキストラン、（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）；リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）トランスフェクション試薬（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）；エクスジェン（ＥｘＧｅｎ）５００トランスフェクションキット（メリーランド州Ｈａｎｏｖｅｒのフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｉｎｃ．））、及びスーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）及びエフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）トランスフェクションキット（カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａのキアゲン）を参照のこと。
【０４５１】
この実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内に導入するために物理媒介型方法が使用される。物理技術としては、制限なく、電気穿孔法、バイオリスティック及びマイクロインジェクションが含まれる。バイオリスティック及びマイクロインジェクション技術は、核酸分子を細胞内に導入するために細胞壁に穴を開ける。例えばジェイク  Ｅ．ビウェンガ（Ｊｅｉｋｅ  Ｅ．  Ｂｉｅｗｅｎｇａ）ら、「Ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第７１号（１）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６７〜７５頁（１９９７年）；及びジョン・オーブリアン（Ｊｏｈｎ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）及びサラ  Ｃ．Ｒ．ルミス（Ｓａｒａｈ  Ｃ．  Ｒ．  Ｌｕｍｍｉｓ）、「Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｔｏ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｙｅｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、第３３号（２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２１〜１２５頁（２００４年）を参照のこと。電気透過化とも呼ばれる電気穿孔法は、核酸分子がそれを通って進入する過渡的な気孔を作製するために短かい高圧電気パルスを用い、全ての細胞型の安定した過渡的トランスフェクションのために有効に使用可能である。例えばＭ．ゴルジオ（Ｍ．Ｇｏｌｚｉｏ）ら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、第３３号（２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２６〜１３５頁（２００４年）；及びオリバー・グレッシュ（Ｏｌｉｖｅｒ  Ｇｒｅｓｃｈ）ら、「Ｎｅｗ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ」、第３３号（２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５１〜１６３頁（２００４年）を参照のこと。
【０４５２】
この実施形態のもう１つの態様においては、細胞内に修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を導入するために形質導入と呼ばれるウイルス媒介型方法が使用される。過渡的形質導入方法においては、宿主細胞内でウイルス粒子が感染し複製するプロセスは、細胞内に核酸分子を導入するためにこの機序を使用する目的で操作されている。ウイルス媒介型方法は、制限なくレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス及びバキュロウイルスを含む多様なウイルスから開発されたものである。例えばアーミン・ブレッシュ（Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ）、「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」、第３３号（２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６４〜１７２頁（２００４年）；及びマウリツィオ・フェデリコ（Ｍａｕｒｉｚｉｏ  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ）、「Ｆｒｏｍ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｏ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２２９号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３〜１５頁（２００３年）；  Ｅ．Ｍ．ポースクラ（Ｅ．  Ｍ．  Ｐｏｅｓｃｈｌａ）、「Ｎｏｎ−ｐｒｉｍａｔｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第５号（５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、５２９−５４０頁（２００３年）；カリム・ベニホード（Ｋａｒｉｍ  Ｂｅｎｉｈｏｕｄ）ら、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、第１０号（５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４４０〜４４７頁（１９９９年）；Ｈ．ビューラー（Ｈ．Ｂｕｅｌｅｒ）、「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」、第３８０号（６）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、６１３〜６２２頁（１９９９年）；チューイ  Ｍ．ライ（Ｃｈｏｏｉ  Ｍ．Ｌａｉ）ら．、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２１号（１２）、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８９５〜９１３頁（２００２年）；エドワード  Ａ．バートン（Ｅｄｗａｒｄ  Ａ．Ｂｕｒｔｏｎ）ら、「Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２１号（１２）、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９１５〜９３６頁（２００２年）；パオラ・グランディ（Ｐａｏｌａ  Ｇｒａｎｄｉ）ら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＳＶ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第３３号（２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７９〜１８６頁（２００４年）；イリア・フラロフ（Ｉｌｙａ  Ｆｒｏｌｏｖ）ら、「Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第９３号（２１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１１３７１〜１１３７７頁（１９９６年）；マルクス  Ｕ．エーレングルバー（Ｍａｒｋｕｓ  Ｕ．Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ）、「Ａｌｐｈａｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第５９号（１）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．、１３〜２２頁（２００２年）；トーマス  Ａ．コスト（Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．Ｋｏｓｔ）及びＪ．パトリック・コンドレー（Ｊ．Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｏｎｄｒｅａｙ）、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２０号（４）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７３〜１８０頁（２００２年）；及びＡ．ヒューザー（Ａ．Ｈｕｓｅｒ）及びＣ．ホフマン（Ｃ．Ｈｏｆｍａｎｎ）、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第３号（１）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、５３〜６３頁（２００３年）を参照のこと。
【０４５３】
被覆されていない二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、それが約３６ｋｂの比較的大きいポリヌクレオチド分子を処理し、高力価で生産され、かつ多様な分裂細胞及び非分裂細胞の両方に効率良く感染しうることから、哺乳動物細胞形質導入のために選択されることが多い。例えばウィム  Ｔ．Ｊ．Ｍ．Ｃ．ハーメンス（Ｗｉｍ  Ｔ．Ｊ．Ｍ．Ｃ．Ｈｅｒｍｅｎｓ）ら、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｌｉａ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ  ａｎｄ  ＰＮＳ」、第７１号（１）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、８５〜９８頁（１９９７年）；及びヒロユキ・ミズグチ（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ）ら、「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第５２号（３）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１６５〜１７６頁（２００１年）を参照のこと。アデノウイルスベースの系を用いた形質導入は、核酸分子が、宿主細胞染色体内に組込まれるのではなくむしろ細胞核内にエピソームから運び込まれることから、長時間のタンパク質発現に耐えられない。アデノウイルスベクター系及びかかるベクターの使用方法についてのプロトコールが、ヴィラパワー（商標）アデノウイルス発現系（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）及びヴィラパワー（商標）アデノウイルス発現系取扱説明書２５−０５４３、バージョンＡ、インビトロジェン、（２００２年７月１５日）；及びアドイージー（商標）アデノベクター系（ＡｄＥａｓｙ（商標）  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン  Ｉｎｃ．）及びアドイージー（商標）アデノベクター系取扱説明書０６４００４ｆ、ストラタジーン中で開示されている。
【０４５４】
核酸分子送達は、同様に、例えばオンコレトロウイルス及びレンチウイルスといった一本鎖ＲＮＡレトロウイルスを使用することもできる。レトロウイルス媒介型形質導入は、往々にして１００％に近い形質導入効率を生み出し、感染の多重度（ＭＯＩ）を変動させることによりプロウイルスコピー数を容易に制御でき、かつ細胞を過渡的に又は安定した形で形質導入するために使用可能である。例えばティジアナ・トニーニ（Ｔｉｚｉａｎａ  Ｔｏｎｉｎｉ）ら、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ａｎｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、２８５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４１〜１４８頁（２００４年）；アーミン・ブレッシュ（Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ）、「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」、第３３号（２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６４〜１７２頁（２００４年）；  フェリックス・ルシラ・タルガ（Ｆｅｌｉｘ  Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ）、「Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ」、第２６７号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４１７〜４３３頁（２００４年）；及びローランド・ウォルコビッチ（Ｒｏｌａｎｄ  Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ）ら、「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、第２４６号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３９１〜４１１頁（２００４年）を参照のこと。レトロウイルス粒子は、脂質外皮に取り囲まれたタンパク質カプシド内にパッケージングされたＲＮＡゲノムから成る。レトロウイルスは、逆転写酵素と共に細胞質内にそのＲＮＡを注入することによって宿主細胞を感染させる。このときＲＮＡ鋳型は、宿主細胞ゲノム内に組込むことで自ら複製する線形二本鎖ｃＤＮＡ内に逆転写される。ウイルス粒子は、（プロウイルスを介して親細胞から娘細胞への）垂直方向ならびに（ビリオンを介して細胞から細胞への）水平方向の両方向で広がる。この複製戦略は、問題の核酸分子が宿主細胞の染色体内に安定した形で組込まれ、かくしてタンパク質の長期発現を可能にするため、長期持続的発現を可能にする。例えば、動物研究により、さまざまな組織内に注入されたレンチウイルスベクターが、１年超の間持続したタンパク質発現を生み出すことがわかっている。例えばルイージ・ナルディニ（Ｌｕｉｇｉ  Ｎａｌｄｉｎｉ）ら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ」、第２７２号（５２５９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３〜２６７頁（１９９６年）を参照のこと。例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）といったようなオンコレトロウイルス由来のベクター系は広く使用されており、数多くの異なる非分裂細胞に感染する。レンチウイルスも同様に、分裂細胞及び非分裂細胞を含む数多くの異なる細胞型に感染し、高い特異性を示す細胞標的を可能にする複合外膜タンパク質を有し得る。
【０４５５】
レトロウイルスベクター及びかかるベクターをいかに使用するかの特定的プロトコールが米国特許である、マンフレッド・ゴッセン（Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ）及びエルマン・ビュジャール（Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ）、「テトラサイクリン応答性プロモータによる真核細胞内遺伝子発現の厳格な管理」、米国特許第５，４６４，７５８号（１９９５年１１月７日）及びエルマン・ビュジャール及びマンフレッド・ゴッセン、「遺伝子発現の調節方法」、米国特許第５，８１４，６１８号（１９９８年９月２９日）、デビッド  Ｓ．ホグネス（Ｄａｖｉｄ  Ｓ．Ｈｏｇｎｅｓｓ）、「昆虫ステロイドホルモン受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びそれを用いて形質転換された細胞」、米国特許第５，５１４，５７８号（１９９６年５月７日）及びデビッド  Ｓ．ホグネス、「昆虫エコダイソン受容体をコードするポリヌクレオチド」、米国特許第６，２４５，５３１号（２００１年６月１２日）；エリザベッタ・ベゲト（Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ）ら、「Ｃ末端ホルモン結合ドメイントランケーションを有するプロゲステロン受容体」、米国特許第５，３６４，７９１号（１９９４年１１月１５日）、エリザベッタ・ベゲトら、「突然変異ステロイドホルモン受容体、その使用方法と遺伝子療法のため分子スイッチ」、米国特許第５，８７４，５３４号（１９９９年２月２３日）；及びエリザベッタ・ベゲトら、「突然変異ステロイドホルモン受容体、その使用方法と遺伝子療法のため分子スイッチ」、米国特許第５，９３５，９３４号（１９９９年８月１０日）の中で開示されている。さらに、かかるウイルス送達系は、標準的方法によって調製され、市販されている。例えばＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  ＡｌｔｏのＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック）及びＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系使用説明書、ＰＴ３００１−１、ＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック、（２００３年３月１４日）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）及びＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）系、「Ａ  Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｄ」、２５−０３１３、インビトロジェン、（２００２年１１月４日）；ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス発現系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）及びＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス発現系使用説明書、２５−０５０１  バージョンＥ、インビトロジェン、（２００３年１２月８日）；及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）レトロウイルス誘導型哺乳動物発現系（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）レトロウイルス誘導型哺乳動物発現系使用説明書、０６４００５ｅを参照のこと。
【０４５６】
本明細書中で開示されている方法は、一部には、ポリヌクレオチド分子から修飾クロストリジウム毒素を発現することを含んでいる。制限なく細胞ベースの系及び無細胞の発現系を含めて、さまざまな発現系のいずれでも、本明細書中で開示されているポリヌクレオチド分子からの修飾クロストリジウム毒素を発現するために使用することができる。細胞ベースの系には、制限なく、ウイルス発現系、原核細胞、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系及び哺乳動物発現系が含まれる。無細胞系としては、制限なく、小麦胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物及び大腸菌抽出物が含まれ、これらは一般に本書で開示されている方法と等価である。発現系を用いたポリヌクレオチド分子の発現は、制限なく、誘発性発現、非誘発性発現、構成性発現、ウイルス媒介型発現、安定組込み型発現及び過渡的発現を含めたさまざまな特徴のいずれでも含むことができる。充分に特徴づけされたベクター、試薬、条件及び細胞を含む発現系が充分に立証されており、制限なくテキサス州Ａｕｓｔｉｎのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）；カリフォルニア州Ｐａｌｏ  ＡｌｔｏのＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック；カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミンジェン；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン；カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａのキアゲン；インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓのロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；及びカリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーンを含む商業的供給メーカーから容易に入手可能である。適切な異種発現系の選択及び使用についての非制限の例は、例えば、「ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ．Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」（Ｓ．Ｊ．ヒギンズ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）及びＢ．デビッド・ヘイムズ（Ｂ．Ｄａｖｉｄ  Ｈａｍｅｓ）編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；ジョセフ  Ｍ．フェルナンデス（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）及びジェームス  Ｐ．ホフラー（Ｊａｍｅｓ  Ｐ．Ｈｏｅｆｆｌｅｒ）、「ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭＳ．  ＵＳＩＮＧ  ＮＡＴＵＲＥ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＡＲＴ  ＯＦ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；及びミーナ・ライ（Ｍｅｅｎａ  Ｒａｉ）及びハリッシュ・パド（Ｈａｒｉｓｈ  Ｐａｄｈ）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、第８０号（９）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＳＣＩＥＮＣＥ、１１２１〜１１２８頁、（２００１年）に記述されている。これらのプロトコールは、当業者の技術範囲内に充分入り、本書中の教示に由来する日常的手順である。
【０４５７】
本明細書内で開示されているポリヌクレオチド分子によりコードされた修飾クロストリジウム毒素を発現するために、さまざまな細胞ベースの発現手順が有用である。例としては、制限なく、ウイルス発現系、原核細胞発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系及び哺乳動物発現系が含まれていた。ウイルス発現系には、制限なく、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、アデノウイルス発現系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、ＡｄＥａｓｙ（商標）ＸＬアデノウイルスベクター系（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）及びＶｉｒａＰｏｒｔ（登録商標）レトロウイルス遺伝子発現系（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）が含まれる。原核細胞発現系の非制限の例には、Ｃｈａｍｐｉｏｎ（商標）ｐＥＴ発現系（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）、ＴｒｉＥｘ（商標）細菌発現系  （ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）発現系（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．）、及びＡｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）タンパク質発現及び精製系（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）が含まれる。酵母発現系には、制限なく、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（商標）ピチア属発現キット（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、ＹＥＳ−Ｅｃｈｏ（商標）発現ベクターキット（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）及びＳｐＥＣＴＲＡ（商標）分裂酵母発現系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）が含まれる。バキュロウイルス発現系の非制限の例にはＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、及びＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）（カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミジェン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ））が含まれる。昆虫発現系には、制限なく、キイロショウジョウバエ発現系（ＤＥＳ（登録商標））（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ（商標）システム（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）及びＩｎｓｅｃｔＤｉｒｅｃｔ（商標）システム（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン)が含まれる。哺乳動物発現系の非制限の例には、Ｔ−ＲＥｘ（商標）テトラサイクリン調節発現系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、ｐｃＤＮＡ（商標）系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、ｔｈｅ  ｐＳｅｃＴａｇ２系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ（登録商標）系、ＩｎｔｅｒＰｌａｙ（商標）哺乳動物ＴＡＰ系（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジー��）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）誘導性哺乳動物発現系（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）及びＬａｃＳｗｉｔｃｈ（登録商標）ＩＩ誘導性哺乳動物発現系（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）が含まれる。
【０４５８】
本明細書の中で開示されているポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾クロストリジウム毒素を発現するもう１つの手順は、例えば制限なく原核生物抽出物及び真核生物抽出物といったような無細胞発現系を利用する。原核細胞抽出物の非制限の例には、ＲＴＳ１００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹキット（インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓのロシュ・アプライド・サイエンス）、ＡｃｔｉｖｅＰｒｏインビトロ翻訳キット（テキサス州Ａｕｓｔｉｎのアンビオン）、ＥｃｏＰｒｏ（商標）系（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）及びＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）プラス発現系（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）が含まれる。真核細胞抽出には、制限なく、ＲＴＳ１００小麦胚芽ＣＥＣＦキット（インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓのロシュ・アプライド・サイエンス）、ＴｎＴ（登録商標）結合小麦胚芽抽出系（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））、小麦胚芽ＩＶＴ（商標）キット（テキサス州Ａｕｓｔｉｎのアンビオン）、Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ（商標）キット（テキサス州Ａｕｓｔｉｎのアンビオン）、ＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ系（テキサス州Ａｕｓｔｉｎのアンビオン）及びＴｎＴ（登録商標）結合網状赤血球溶血液系（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎのプロメガ）が含まれる。
【実施例】
【０４５９】
以下の非制限の例は、開示された実施形態を容易により完全に理解するべくあくまでも例示のために提供されており、いかなる形であれ、本明細書に開示されている実施形態のいずれかを制限するように意図されていない。
【０４６０】
実施例１
増大した結合活性をもつ修飾クロストリジウム毒素の結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の構築
この例は、部位特異的突然変異誘発を用いた、増大した結合活性を伴う修飾クロストリジウム毒素の結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の作製方法を例示している。
【０４６１】
ＢｏＮＴ／Ａをコードするポリヌクレオチド分子（配列番号１）を、標準的手順ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌのバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて合成する。長さが２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドを、標準的ホスホルアミダイト合成を用いて合成する。全長ポリヌクレオチド分子を組立てるべく共にライゲートされる二本鎖二重鎖へとこれらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成するべくＳｍａｌ部位においてｐＵＣＢＨＢ１ベクター内に標準的分子生物学方法を用いて、このポリペプチド分子をクローニングする。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３．１（カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙのアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）を用いて配列決定することにより、合成ポリヌクレオチド分子を確認する。
【０４６２】
所望の場合、ＢｏＮＴ／Ａをコードする発現最適化されたポリヌクレオチド分子（配列番号１）を合成して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株内での発現を改善することができる。ＢｏＮＴ／Ａをコードするポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌菌株の未変性ポリヌクレオチド分子内に標準的に存在する同義語コドンを含むように；２）大腸菌菌株内に見い出される未変性ポリヌクレオチド分子の平均Ｇ＋Ｃ含有量により接近して一致するＧ＋Ｃ含有量を含むように；３）ポリヌクレオチド分子内部に見い出されるポリモノヌクレオチド領域を削減するように；及び／又は４）ポリヌクレオチド分子内に見い出される内部調節又は構造部位を除去するように修飾することができる。例えばランス  Ｅ．スチュワード（Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ）ら、「タイプＥ活性ボツリヌス毒素発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２０５７８号（２００５年６月９日）；  ランス  Ｅ．スチュワードら、「タイプＡ活性ボツリヌス毒素発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２７９１７号（２００５年８月３日）を参照のこと。配列最適化がひとたび完了した時点で、標準的ホルホラミダイト合成を用いて、長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドを合成する。全長ポリヌクレオチド分子を組立てるべく共にライゲートされる二本鎖二重鎖へとこれらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａを生成するべくＳｍａｌ部位においてｐＵＣＢＨＢ１ベクター内に標準的分子生物学方法を用いて、このポリペプチド分子をクローニングする。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３．１（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））及びＡＢＩ３１００シーケンサー（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）を用いて配列決定することにより、合成ポリヌクレオチド分子を確認する。所望の場合には、酵母菌株、昆虫細胞系列又は哺乳動物細胞系列といったような異なる生体に対する最適化を行なうことができる。例えばスチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２０５７８号（２００５年６月９日）；及びスチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２７９１７号（２００５年８月３日）を参照のこと。
【０４６３】
配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１をコードするポリヌクレオチド分子、配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇをコードするポリヌクレオチド分子、及び配列番号８のＴｅＮＴをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＵＣＢＨＢ１クローニングコンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略が使用される。さらに、当業者は、例えば二重鎖ループ領域内部の外因性プロテアーゼ切断部位又はフレキシブルスペーサ領域を含むようにクロストリジウム毒素を修飾することができる。
【０４６４】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａを構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１の読取り枠を含むインサートを切除し、かつ２）このインサートをｐＥＴ２９ベクターに操作可能な形で連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼで、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａコンストラクトを消化させる（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）。ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａを生成するため、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてインサートをサブクローニングする。ライゲーション混合物を、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へと形質転換させ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含む１．５％のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天平板（ｐＨ７．０）上に固定し、一晩の成長のため３７℃のインキュベータ内に置く。カナマイシン耐性コロニーとして、細菌含有発現コンストラクトを同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補コンストラクトを単離し、インサートの存在及び配向を判定するために制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成によりこれを分析する。このクローニング戦略は、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対して操作可能な形で連結された配列番号１のＢｏＮＴ／Ａをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを生み出した。
【０４６５】
配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１をコードするポリヌクレオチド分子、配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆをコードするポリヌクレオチド分子、配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇをコードするポリヌクレオチド分子、及び配列番号８のＴｅＮＴをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略が使用される。
【０４６６】
増大した結合活性をもつ修飾結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ａを構築するためには、結合活性に影響を及ぼす特異的アミノ酸を変更させることになる。機能のためには、配列番号１のアミノ酸  Ｔｒｐ１１０１、Ｇｌｙ１１０２、Ｌｅｕ１１０５、Ｔｙｒ１１１１、Ｔｙｒ１１１２、Ｇｌｙ１１５８、Ｉｌｅ１１６３、Ａｓｐ１１７９、Ｇｌｕ１２０３、Ｐｈｅ１２５２、Ｓｅｒ１２６４、Ｔｒｐ１２６６、Ｔｙｒ１２６７、Ｇｌｎ１２７０、Ｇｌｙ１２７９及びＴｒｐ１２８２が重要であることはすでに知られている。どのアミノ酸置換がＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインの結合活性を増大したさせ得るかを判定するために、計算機によるタンパク質設計アルゴリズムが、最適化された特性をもつ新規のタンパク質を生成することになる。ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインの結晶構造を、計算機計算用の出発鋳型として使用する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ（登録商標）（ＰＤＡ（登録商標））及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（商標）（ＳＰＡ（商標））計算からの組合せた出力を用いて、潜在的アミノ酸候補が同定されることになる。ＰＤＡ計算のためには、可変的位置でのアミノ酸の立体構造は、回転異性体ライブラリから誘導された一組の主鎖独立型側鎖回転異性体として表わされることになる。選択された可変的位置での考慮対象アミノ酸の考えられる全ての組合せのエネルギーは、ファンデルワールス、静電気及び水素結合相互作用を記述する用語を含む力場を用いて計算されることになる。最適な（基底状態）配列は、デッドエンド除去（ＤＥＥ）アルゴリズムを用いて判定されることになり、予測された基底状態を中心とする類似の配列のエネルギーを評価するためには、モンテカルロ（ＭＣ）アルゴリズムが使用されることになる。ＳＰＡ計算では、サンプリング対象の配列について各「進化」ラウンド中にエネルギーが計算されている状態で、低エネルギー配列をスクリーニングするために遺伝的アルゴリズムが利用される。アミノ酸の立体構造は、フレキシブル回転異性体モデルを用いて主鎖独立型回転異性体ライブラリから誘導された１組の側鎖回転異性体として表わされることになる。ＳＰＡ計算は、その後最近傍単一連結階層的クラスタ分析アルゴリズムを用いて類似の配列のグループに計算によりクラスタ化されることになる配列を生成することになる。臨界接触アミノ酸が配列及び立体構造の両方において固定され、可変アミノ酸における単一の及び組合せの置換を評価するために計算が実施されることになる。これらの残基と接触状態にある全てのアミノ酸は浮動させられる。すなわち、立体構造の調整を可能にするために、アミノ酸同一性ではなくアミノ酸立体構造が変動できるようになる。天然由来のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインに関係するその予測エネルギー及びその占有すなわち１０００ＭＣ又は遺伝的アルゴリズムシーケンスセット内で置換が発生した回数に基づいて、最終的な実験的置換が選択されることになる。ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを安定化させるものと予測された置換を同定するべく、ロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）を用いて、２組の設計計算を実施する。第１ラウンドでは、単一のアミノ酸置換のみがモデリングされる��第２ラウンドでは、界面アミノ酸が未変性アミノ酸型を含めただしシステインは除外して２０の天然由来のアミノ酸全てに同時に変化できるようになる。各ケースにおいて、置換されたアミノ酸側鎖と接触するアミノ酸側鎖は再度パッケージングされ（未変性アミノ酸型の全ての回転異性体を許容する）ことになる。低エネルギーを有する配列及び立体構造を、モンテカルロシミュレーションアニーリング手順を用いて選択する。結果として得られた全てのタンパク質複合体モデルは、予測された結合エネルギーを計算することにより再評定される。最終的配列が、最低の結合エネルギーのために選択された。
【０４６７】
同定された候補アミノ酸は、部位特異的インビトロ突然変異誘発を用いて変化させられることになる。鋳型としてのｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ、以上で同定された所望のアミノ酸変化をコードするセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）の場合に含まれている試薬を用いて、５０μＬの反応が組立てられる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ミックスは、５μＬの１０倍緩衝液、１μＬのデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）１μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位／μＬ）、１２５ｎｇの各プライマ、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び最終体積を５０μＬにするだけのヌクレアーゼを含まない水を含有する。サーモサイクラー条件は、６０秒間９５℃を１サイクル；３０秒間９５℃、６０秒間５５℃及び１０分間７２℃を１６サイクル；５分間７２℃を１サイクルそして４℃を維持、というものである。サーモサイクリングの後、反応に対して１μＬのＤｐｎｌ制限酵素（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａのストラタジーン）を添加し、これを３７℃で１時間インキュベートして鋳型ＤＮＡを消化させる。反応をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｋｉｔ（カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａのキアゲン）により精製し、アガロースゲル電気泳動により分析して、その反応が全長プラスミドを生産したことを判定する。突然変異誘発産物は、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）へと形質転換され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．５％のルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天平板（ｐＨ７．０）上に固定され、一晩成長させるべく３７℃のインキュベータ内に置かれることになる。候補突然変異誘発コンストラクトがアンピシリン耐性コロニーとして単離されることになり、又インサートの存在を判定するべく発現コンストラクト及び制限エンドヌクレアーゼ消化物を単離するためにアルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて分析される。点突然変異誘発の取込みは、候補プラスミドコンストラクトの配列分析により判定されることになる。
【０４６８】
増大した結合活性をもつ修飾ＢｏＮＴ／Ａ候補の結合活性をテストするために、ＦＧＦＲ３の可溶性部分は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合検定、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙバイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．））において使用するため組換え発現させられることになる。ＦＧＦＲ３の可溶性部分は、ストレプトアビジンに対する融合として発現され、受容体はこのとき適切なセンサーチップ上で固定化される。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）器具を用いて、受容体結合の結果としての局所的屈折率の変化がＳＰＲ角度の変化として測定されることになる。ＳＰＲ角度の変化速度を次に分析して会合速度（Ｋｏｎ）、解離速度（Ｋｏｆｆ）及び解離平衡定数（ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を決定する。増大した結合活性を有する修飾ＢｏＮＴ／Ａ候補は、それが由来した天然由来のＢｏＮＴ／Ａから得た測定値に比べて増大した会合速度、又は減少した解離速度、又は増大した会合速度と減少した解離速度の両方、又は減少した解離平衡定数のいずれかを示すことになる。
【０４６９】
実施例２
非毒素関連タンパク質を含む修飾クロストリジウム毒素のコンストラクション
以下の実施例は、非毒素関連タンパク質を含む増大した標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の作製方法を例示している。
【０４７０】
ＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａをコードするポリヌクレオチド分子を、実施例１に記述されている通りに、標準的な手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌのバイオテクノロジー）を用いて合成する。ＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａは、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ａ菌株からのＨＡ−３３β−三葉形ドメインである配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で、ＢｏＮＴ／Ａβ三葉形ドメインである配列番号１のアミノ酸１１１１〜１２９６を置き換えるように修飾されたＢｏＮＴ／Ａである。所望の場合、ＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａをコードする発現最適化されたポリヌクレオチド分子を合成して、例えば大腸菌菌株、酵母菌菌株、昆虫細胞系列又は哺乳動物細胞系列といったような異なる生体内への発現を改善させることができる。例えばスチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２０５７８号（２００５年６月９日)、スチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２７９１７号（２００５年８月３日)を参照のこと。合成されたポリヌクレオチド分子を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ケミストリー３．１（カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙのアプライドバイオシステム）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙのアプライドバイオシステム）を用いた配列決定によって確認する。
【０４７１】
配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で配列番号２のアミノ酸１０９８〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＢであるＢｏＮＴ／Ｂ−３３／Ａ；配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で配列番号３のアミノ酸１１１２〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１であるＢｏＮＴ／Ｃ１−３３／Ａ；配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で配列番号４のアミノ酸１０９９〜１２７６が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＤであるＢｏＮＴ／Ｄ−３３／Ａ；配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で配列番号５のアミノ酸１０８６〜１２５２が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＥであるＢｏＮＴ／Ｅ−３３／Ａ；配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で配列番号６のアミノ酸１１０６〜１２７４が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＦであるＢｏＮＴ／Ｆ−３３／Ａ；配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で配列番号７のアミノ酸１１０６〜１２９７が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＧであるＢｏＮＴ／Ｇ−３３／Ａ；及び配列番号９のアミノ酸１５１〜２９３で配列番号８のアミノ酸１１２８〜１３１５が置き換えられている修飾ＴｅＮＴであるＴｅＮＴ−３３／ＡのためのｐＵＣＢＨＢ１クローニングコンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略が使用される。同様にして、上述のクロストリジウム毒素からのβ−三葉形ドメインを、配列番号９のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１０のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１１のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１２のアミノ酸１０〜１４６；配列番号１３のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１４のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１５のアミノ酸１０〜１４６；配列番号１６のアミノ酸１０〜１４１；配列番号１７のアミノ酸１０〜１４１；配列番号１８のアミノ酸１０〜１４１；配列番号１０の１５１〜２９３；配列番号１１の１５１〜２９３；配列番号１２の１５３〜２９４；配列番号１３の１５１〜２７９；配列番号１４の１５１〜２９２；配列番号１５の１５３〜２９１；配列番号１６の１４８〜２８５；配列番号１７の１４８〜２８６；配列番号１８の１４８〜２８６；配列番号１９の９〜１４６；配列番号２０の９〜１４６；配列番号２１の９〜１４６；配列番号２２の９〜１４６；配列番号２３の１０５０〜１１９４；配列番号２４の１０５０〜１１９９；配列番号２５の１０５０〜１１９４；配列番号２６の１０４９〜１１９８；配列番号２７の１０４９〜１１９７；配列番号２８の１０４９〜１１９７；配列番号２９の１０１４〜１１６３；配列番号３０の１０１６〜１１６０；配列番号３１の１０１７〜１１６６；及び配列番号３２の１０５０〜１１９９を含む非毒素関連タンパク質β−三葉形ドメインで置き換えることもできる。
【０４７２】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａを構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａをコードする配列番号１の読取り枠を含むインサートを切除し、かつ２）このインサートをｐＥＴ２９ベクターに操作可能な形で連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼで、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａコンストラクトを消化させる（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）。ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａを生成するため、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてインサートをサブクローニングする。ライゲーション混合物を、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へと形質転換させ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含む１．５％のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天平板（ｐＨ７．０）上に固定し、一晩の成長のため３７℃のインキュベータ内に置く。カナマイシン耐性コロニーとして、細菌含有発現コンストラクトを同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補コンストラクトを単離し、インサートの存在及び配向を判定するために制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成によりこれを分析する。このクローニング戦略は、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対して操作可能な形で連結された配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ−３３／Ａをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを生み出した。
【０４７３】
ＢｏＮＴ／Ｂ−３３／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−３３／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−３３／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−３３／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−３３／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−３３／Ａ、ＴｅＮＴ−３３／Ａ、ならびに配列番号９のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１０のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１１のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１２のアミノ酸１０〜１４６；配列番号１３のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１４のアミノ酸１０〜１４４；配列番号１５のアミノ酸１０〜１４６；配列番号１６のアミノ酸１０〜１４１；配列番号１７のアミノ酸１０〜１４１；配列番号１８のアミノ酸１０〜１４１；配列番号１０の１５１〜２９３；配列番号１１の１５１〜２９３；配列番号１２の１５３〜２９４；配列番号１３の１５１〜２７９；配列番号１４の１５１〜２９２；配列番号１５の１５３〜２９１；配列番号１６の１４８〜２８５；配列番号１７の１４８〜２８６；配列番号１８の１４８〜２８６；配列番号１９の９〜１４６；配列番号２０の９〜１４６；配列番号２１の９〜１４６；配列番号２２の９〜１４６；配列番号２３の１０５０〜１１９４；配列番号２４の１０５０〜１１９９；配列番号２５の１０５０〜１１９４；配列番号２６の１０４９〜１１９８；配列番号２７の１０４９〜１１９７；配列番号２８の１０４９〜１１９７；配列番号２９の１０１４〜１１６３；配列番号３０の１０１６〜１１６０；配列番号３１の１０１７〜１１６６；及び配列番号３２の１０５０〜１１９９を含む上述の修飾クロストリジウム毒素についてコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略を使用する。
【０４７４】
実施例３
非毒素関連タンパク質の折畳みを含む修飾クロストリジウム毒素の構築
以下の実施例は、非毒素関連タンパク質の折畳みを含む増大した標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の作製方法を例示している。
【０４７５】
ＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａをコードするポリヌクレオチド分子を、実施例１に記述されている通りに、標準的な手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌのバイオテクノロジー）を用いて合成する。ＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａは、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ａ菌株由来のＨＡ−１７β−三葉形ドメインからのγ折畳みである配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で、ＢｏＮＴ／Ａβからのγ−折畳みである配列番号１のアミノ酸１２３７〜１２９６を置き換えるように修飾されたＢｏＮＴ／Ａである。所望の場合、ＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａをコードする発現最適化されたポリヌクレオチド分子を合成して、例えば大腸菌菌株、酵母菌菌株、昆虫細胞系列又は哺乳動物細胞系列といったような異なる生体内への発現を改善させることができる。例えばスチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２０５７８号（２００５年６月９日)、スチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２７９１７号（２００５年８月３日)を参照のこと。合成されたポリヌクレオチド分子を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ケミストリー３．１（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）を用いた配列決定によって確認する。
【０４７６】
配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で配列番号２のアミノ酸１２２３〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＢであるＢｏＮＴ／Ｂ−１７γ／Ａ；配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で配列番号３のアミノ酸１２３０〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１であるＢｏＮＴ／Ｃ１−１８γ；配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で配列番号４のアミノ酸１２１９〜１２７６が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＤであるＢｏＮＴ／Ｄ−１７γ／Ａ；配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で配列番号５のアミノ酸１１９９〜１２５２が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＥであるＢｏＮＴ／Ｅ−１７γ／Ａ；配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で配列番号６のアミノ酸１２２２〜１２７４が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＦであるＢｏＮＴ／Ｆ−１７γ／Ａ；配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で配列番号７のアミノ酸１２３１〜１２９７が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＧであるＢｏＮＴ／Ｇ−１７γ／Ａ；及び配列番号１９のアミノ酸９５〜１４６で配列番号８のアミノ酸１２５５〜１３１５が置き換えられている修飾ＴｅＮＴであるＴｅＮＴ−１７γ／ＡのためのｐＵＣＢＨＢ１クローニングコンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略が使用される。
【０４７７】
同様にして、ＨＡ−１７／Ａβ−三葉形ドメインからのγ折畳みは、ＢｏＮＴ／Ａβ−三葉形ドメインからのα折畳みである配列番号１のアミノ酸１１１１〜１１６２；ＢｏＮＴ／Ｂβ−三葉形ドメインからのα折畳みである配列番号２のアミノ酸１０９８〜１１４７；ＢｏＮＴ／Ｃ１β−三葉形ドメインからのα折畳みである配列番号３のアミノ酸１１１２〜１１５０；ＢｏＮＴ／Ｄβ−三葉形ドメインからのα−折畳みである配列番号４のアミノ酸１０９９〜１１３７；ＢｏＮＴ／Ｅβ−三葉形ドメインからのα折畳みである配列番号５のアミノ酸１０８６〜１１２９；ＢｏＮＴ／Ｆβ−三葉形ドメインからのα折畳みである配列番号６のアミノ酸１１０６〜１１５２；ＢｏＮＴ／Ｇβ−三葉形ドメインからのα折畳みである配列番号７のアミノ酸１１０６〜１１５３；又はＴｅＮＴβ−三葉形ドメインからのα折畳みである配列番号８のアミノ酸１１２８〜１１７７に置き換わることができる。同様にして、ＨＡ−１７／Ａβ−三葉形ドメインからのγ折畳みは、ＢｏＮＴ／Ａβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである配列番号１のアミノ酸１１７９〜１２２３；ＢｏＮＴ／Ｂβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである配列番号２のアミノ酸１１６６〜１２１０；ＢｏＮＴ／Ｃ１β−三葉形ドメインからのβ折畳みである配列番号３のアミノ酸１１６７〜１２１８；ＢｏＮＴ／Ｄβ−三葉形ドメインからのβ−折畳みである配列番号４のアミノ酸１１５４〜１２０７；ＢｏＮＴ／Ｅβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである配列番号５のアミノ酸１１４７〜１１９０；ＢｏＮＴ／Ｆβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである配列番号６のアミノ酸１１７２〜１２１３；ＢｏＮＴ／Ｇβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである配列番号７のアミノ酸１１７３〜１２１８；又はＴｅＮＴβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである配列番号８のアミノ酸１１９５〜１２４０に置き換わることができる。
【０４７８】
同様にして、上述のクロストリジウム毒素由来のβ−三葉形ドメインからのα−折畳み、β−折畳み又はγ−折畳みを、配列番号２０のアミノ酸９５〜１４６、配列番号２１のアミノ酸９５〜１４６、又は配列番号２２のアミノ酸９５〜１４６を含むＨＡ−１７γ−折畳み；配列番号９のアミノ酸１０５〜１４４、配列番号１０のアミノ酸１０５〜１４４、配列番号１１のアミノ酸１０５〜１４４、配列番号１２のアミノ酸１０７〜１４６、配列番号１３のアミノ酸１０５〜１４４、配列番号１４のアミノ酸１０５〜１４４、配列番号１５のアミノ酸１０７〜１４６、配列番号１６のアミノ酸１０３〜１４１、配列番号１７のアミノ酸１０３〜１４１、配列番号１８のアミノ酸１０３〜１４１、配列番号９のアミノ酸２４９〜２９３、配列番号１０のアミノ酸２４９〜２９３、配列番号１１のアミノ酸２４９〜２９３、配列番号１２のアミノ酸２５０〜２９４、配列番号１３のアミノ酸２４９〜２７９、配列番号１４のアミノ酸２４８〜２９２、配列番号１５のアミノ酸２４９〜２９１、配列番号１６のアミノ酸２４１〜２８５、配列番号１７のアミノ酸２４２〜２８６、又は配列番号１８のアミノ酸２４２〜２８６を含むＨＡ−３３γ折畳み；又は配列番号２３のアミノ酸１１４９〜１１９４、配列番号２４のアミノ酸１１４９〜１１９９、配列番号２５のアミノ酸１１４９〜１１９４、配列番号２６のアミノ酸１１４８〜１１９８、配列番号２７のアミノ酸１１４８〜１１９７、配列番号２８のアミノ酸１１４８〜１１９７、配列番号２９のアミノ酸１１１４〜１１６３；配列番号３０のアミノ酸１１１５〜１１６０、配列番号３１のアミノ酸１１１７〜１１６６又は配列番号３２のアミノ酸１１５０〜１１９９を含むＮＴＮＨγ−折畳みで置き換えることができる。
【０４７９】
類似の要領で、上述のクロストリジウム毒素由来のβ−三葉形ドメインからのα−折畳み、β−折畳み又はγ−折畳みを、配列番号１９のアミノ酸９〜５０、配列番号２０のアミノ酸９〜５０、配列番号２１のアミノ酸９〜５０、又は配列番号２２のアミノ酸９〜５０を含むＨＡ−１７α−折畳み；配列番号９のアミノ酸１０〜５４、配列番号１０のアミノ酸１０〜５４、配列番号１１のアミノ酸１０〜５４、配列番号１２のアミノ酸１０〜５６、配列番号１３のアミノ酸１０〜５４、配列番号１４のアミノ酸１０〜５４、配列番号１５のアミノ酸１０〜５６、配列番号１６のアミノ酸１０〜５４、配列番号１７のアミノ酸１０〜５４、配列番号１８のアミノ酸１０〜５４、配列番号９のアミノ酸１５１〜１９５、配列番号１０のアミノ酸１５１〜１９５、配列番号１１のアミノ酸１５１〜１９５、配列番号１２のアミノ酸１５３〜１９７、配列番号１３のアミノ酸１５１〜１９５、配列番号１４のアミノ酸１５１〜１９５、配列番号１５のアミノ酸１５３〜１９７、配列番号１６のアミノ酸１４８〜１９０、配列番号１７のアミノ酸１４８〜１９０、又は配列番号１８のアミノ酸１４８〜１０９を含むＨＡ−３３α折畳み；又は配列番号２３のアミノ酸１０５０〜１０９７、配列番号２４のアミノ酸１０５０〜１０９４、配列番号２５のアミノ酸１０５０〜１０９７、配列番号２６のアミノ酸１０４９〜１０９６、配列番号２７のアミノ酸１０４９〜１０９６、配列番号２８のアミノ酸１０４９〜１０９６、配列番号２９のアミノ酸１０１４〜１０６１；配列番号３０のアミノ酸１０１６〜１０６３、配列番号３１のアミノ酸１０１７〜１０６４又は配列番号３２のアミノ酸１１５０〜１０９７を含むＮＴＮＨα−折畳みで置き換えることができる。
【０４８０】
さらに、上述のクロストリジウム毒素由来のβ−三葉形ドメインからのα−折畳み、β−折畳み又はγ−折畳みを、配列番号１９のアミノ酸５５〜９１、配列番号２０のアミノ酸５５〜９１、配列番号２１のアミノ酸５５〜９１、又は配列番号２２のアミノ酸５５〜９１を含むＨＡ−１７β−折畳み；配列番号９のアミノ酸６０〜１００、配列番号１０のアミノ酸６０〜１００、配列番号１１のアミノ酸６０〜１００、配列番号１２のアミノ酸６２〜１０２、配列番号１３のアミノ酸６０〜１００、配列番号１４のアミノ酸６０〜１００、配列番号１５のアミノ酸６２〜１０２、配列番号１６のアミノ酸６０〜９８、配列番号１７のアミノ酸６０〜９８、配列番号１８のアミノ酸６０〜９８、配列番号９のアミノ酸２００〜２４２、配列番号１０のアミノ酸２００〜２４２、配列番号１１のアミノ酸２００〜２４２、配列番号１２のアミノ酸２０２〜２４３、配列番号１３のアミノ酸２００〜２４２、配列番号１４のアミノ酸２００〜２４１、配列番号１５のアミノ酸２００〜２４２、配列番号１６のアミノ酸１９５〜２３４、配列番号１７のアミノ酸１９５〜２３５、又は配列番号１８のアミノ酸１９５〜２３５を含むＨＡ−３３β折畳み；又は配列番号２３のアミノ酸１１１１〜１１３８、配列番号２４のアミノ酸１１１１〜１１３９、配列番号２５のアミノ酸１１１１〜１１３８、配列番号２６のアミノ酸１１１０〜１１３８、配列番号２７のアミノ酸１１１０〜１１３８、配列番号２８のアミノ酸１１１０〜１１３８、配列番号２９のアミノ酸１０７５〜１１０３；配列番号３０のアミノ酸１１７７〜１１０４、配列番号３１のアミノ酸１０７８〜１１０６又は配列番号３２のアミノ酸１１１１〜１１３９を含むＮＴＮＨβ−折畳みで置き換えることができる。
【０４８１】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａを構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａをコードする配列番号１の読取り枠を含むインサートを切除し、かつ２）このインサートをｐＥＴ２９ベクターに操作可能な形で連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼで、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａコンストラクトを消化させる（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）。ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａを生成するため、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてインサートをサブクローニングする。ライゲーション混合物を、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へと形質転換させ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含む１．５％のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天平板（ｐＨ７．０）上に固定し、一晩の成長のため３７℃のインキュベータ内に置く。カナマイシン耐性コロニーとして、細菌含有発現コンストラクトを同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補コンストラクトを単離し、インサートの存在及び配向を判定するために制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成によりこれを分析する。このクローニング戦略は、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対して操作可能な形で連結された配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ−１７γ／Ａをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを生み出した。
【０４８２】
ＢｏＮＴ／Ｂ−１７γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−１７γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−１７γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−１７γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−１７γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−１７γ／Ａ、ＴｅＮＴ−１７γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ−３３−１γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−３３−１γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−３３−１γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−３３−１γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−３３−１γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−３３−１γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−３３−１γ／Ａ、ＴｅＮＴ−３３−１γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ−３３−２γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−３３−２γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−３３−２γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−３３−２γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−３３−２γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−３３−２γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−３３−２γ／Ａ、ＴｅＮＴ−３３−２γ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＴｅＮＴ−ＮＴＮＨγ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ−１７α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−１７α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−１７α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−１７α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−１７α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−１７α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−１７α／Ａ、ＴｅＮＴ−１７α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ−３３−１α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−３３−１α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−３３−１α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−３３−１α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−３３−１α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−３３−１α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−３３−１α／Ａ、ＴｅＮＴ−３３−１α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ−３３−２α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−３３−２α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−３３−２α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−３３−２α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−３３−２α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−３３−２α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−３３−２α／Ａ、ＴｅＮＴ−３３−２α／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＮＴＮＨα／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＮＴＮＨα／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＮＴＮＨα／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−ＮＴＮＨα／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−ＮＴＮＨα／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−ＮＴＮＨα／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−ＮＴＮＨα／Ａ、ＴｅＮＴ−ＮＴＮＨα、ＢｏＮＴ／Ａ−１７β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−１７β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−１７β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−１７β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−１７β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−１７β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−１７β／Ａ、ＴｅＮＴ−１７β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ−３３−１β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−３３−１β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−３３−１β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−３３−１β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−３３−１β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−３３−１β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−３３−１β／Ａ、ＴｅＮＴ−３３−１β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ−３３−２β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−３３−２β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−３３−２β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−３３−２β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−３３−２β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−３３−２β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−３３−２β／Ａ、ＴｅＮＴ−３３−２β／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＮＴＮＨβ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＮＴＮＨβ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＮＴＮＨβ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｄ−ＮＴＮＨβ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ−ＮＴＮＨβ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｆ−ＮＴＮＨβ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｇ−ＮＴＮＨβ／Ａ、ＴｅＮＴ−ＮＴＮＨβをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを��製するために、類似のクローニング戦略が使用される。
【０４８３】
ＨＡ−１７  α折畳み、β折畳み又はγ折畳みを含むアミノ酸；ＨＡ−３３  １α折畳み、１β折畳み、１γ−折畳み、２α−折畳み、２β−折畳み又は２γ−折畳みを含むアミノ酸；又はＮＴＮＨ  α折畳み、β折畳み又はγ折畳みを含むアミノ酸によりそのα折畳み又はβ折畳みが置き換えられている上述の修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを作製するためにも、類似のクローニング戦略が用いられる。
【０４８４】
実施例４
ＦＧＦＲ３に選択的に結合するＦＧＦを含む修飾クロストリジウム毒素の構築
以下の実施例は、ＦＧＦＲ３に対し選択的に結合するＦＧＦを含む増大した標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の作製方法を例示している。
【０４８５】
ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８をコードするポリヌクレオチド分子を、実施例１に記述されている通りに、標準的な手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌのバイオテクノロジー）を用いて合成する。ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８は、ＦＧＦ−１８β−三葉形ドメインである配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で、ＢｏＮＴ／Ａβ三葉形ドメインである配列番号１のアミノ酸１１１１〜１２９６を置き換えるように修飾されたＢｏＮＴ／Ａである。必要に応じて、ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８をコードする発現最適化されたポリヌクレオチド分子を合成して、例えば大腸菌菌株、酵母菌菌株、昆虫細胞系列又は哺乳動物細胞系列といったような異なる生体内への発現を改善させることができる。例えばスチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２０５７８号（２００５年６月９日) 、スチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２７９１７号（２００５年８月３日)を参照のこと。合成されたポリヌクレオチド分子を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ケミストリー３．１（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）を用いた配列決定によって確認する。
【０４８６】
配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で配列番号２のアミノ酸１０９８〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＢであるＢｏＮＴ／Ｂ−Ｆ１８；配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で配列番号３のアミノ酸１１１２〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１であるＢｏＮＴ／Ｃ１−Ｆ１８；配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で配列番号４のアミノ酸１０９９〜１２７６が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＤであるＢｏＮＴ／Ｄ−Ｆ１８；配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で配列番号５のアミノ酸１０８６〜１２５２が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＥであるＢｏＮＴ／Ｅ−Ｆ１８；配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で配列番号６のアミノ酸１１０６〜１２７４が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＦであるＢｏＮＴ／Ｆ−Ｆ１８；配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で配列番号７のアミノ酸１１０６〜１２９７が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＧであるＢｏＮＴ／Ｇ−Ｆ１８；及び配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３で配列番号８のアミノ酸１１２８〜１３１５が置き換えられている修飾ＴｅＮＴであるＴｅＮＴ−Ｆ１８のためのｐＵＣＢＨＢ１クローニングコンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略が使用される。同様にして、上述のクロストリジウム毒素からのβ−三葉形ドメインを、配列番号３３のアミノ酸２６〜１５５；配列番号３４のアミノ酸２９〜１５５；配列番号３５のアミノ酸８３〜２０６；配列番号３６のアミノ酸４３〜１７２；配列番号３７のアミノ酸６３〜１９６；配列番号３８のアミノ酸５５〜１８３；配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３、を含むＦＧＦβ−三葉形ドメインで置き換えることもできる。
【０４８７】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８を構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８をコードする配列番号１の読取り枠を含むインサートを切除し、かつ２）このインサートをｐＥＴ２９ベクターに操作可能な形で連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼで、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８コンストラクトを消化させる（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）。ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８を生成するため、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてインサートをサブクローニングする。ライゲーション混合物を、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へと形質転換させ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含む１．５％のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天平板（ｐＨ７．０）上に固定し、一晩の成長のため３７℃のインキュベータ内に置く。カナマイシン耐性コロニーとして、細菌含有発現コンストラクトを同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補コンストラクトを単離し、インサートの存在及び配向を判定するために制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成によりこれを分析する。このクローニング戦略は、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対して操作可能な形で連結された配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８をコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを生み出した。
【０４８８】
ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｆ１８、ＢｏＮＴ／Ｃ１−Ｆ１８、ＢｏＮＴ／Ｄ−Ｆ１８、ＢｏＮＴ／Ｅ−Ｆ１８、ＢｏＮＴ／Ｆ−Ｆ１８、ＢｏＮＴ／Ｇ−Ｆ１８、ＴｅＮＴ−Ｆ１８、ならびに配列番号３３のアミノ酸２６〜１５５；配列番号３４のアミノ酸２９〜１５５；配列番号３５のアミノ酸８３〜２０６；配列番号３６のアミノ酸４３〜１７２；配列番号３７のアミノ酸６３〜１９６；配列番号３８のアミノ酸５５〜１８３；及び配列番号３９のアミノ酸５４〜１８３を含む上述の修飾クロストリジウム毒素についてコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略を使用する。
【０４８９】
実施例５
ＦＧＦＲ３に選択的に結合するＦＧＦ折畳みを含む修飾クロストリジウム毒素の構築
以下の実施例は、ＦＧＦＲ３に対し選択的に結合するＦＧＦ折畳みを含む増大した標的ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の作製方法を例示している。
【０４９０】
ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８γをコードするポリヌクレオチド分子を、実施例１に記述されている通りに、標準的な手順（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌのバイオテクノロジー）を用いて合成する。ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８γは、Ｆ１８β−三葉形ドメインからのγ−折畳みである配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で、ＢｏＮＴ／Ａβ三葉形ドメインからのγ−折畳みである配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２９６を置き換えるように修飾されたＢｏＮＴ／Ａである。必要に応じて、ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８γをコードする発現最適化されたポリヌクレオチド分子を合成して、例えば大腸菌菌株、酵母菌菌株、昆虫細胞系列又は哺乳動物細胞系列といったような異なる生体内への発現を改善させることができる。例えばスチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２０５７８号（２００５年６月９日)、スチュワード、上掲、ＰＣＴ特許出願第２００５／０２７９１７号（２００５年８月３日)を参照のこと。合成されたポリヌクレオチド分子を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ケミストリー３．１（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒのアプライドバイオシステム）を用いた配列決定によって確認する。
【０４９１】
配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で配列番号２のアミノ酸１２２３〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＢであるＢｏＮＴ／Ｂ−Ｆ１８γ；配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で配列番号３のアミノ酸１２３０〜１２９１が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１であるＢｏＮＴ／Ｃ１−Ｆ１８γ；配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で配列番号４のアミノ酸１２１９〜１２７６が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＤであるＢｏＮＴ／Ｄ−Ｆ１８γ；配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で配列番号５のアミノ酸１１９９〜１２５２が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＥであるＢｏＮＴ／Ｅ−Ｆ１８γ；配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で配列番号６のアミノ酸１２２２〜１２７４が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＦであるＢｏＮＴ／Ｆ−Ｆ１８γ；配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で配列番号７のアミノ酸１２３１〜１２９７が置き換えられている修飾ＢｏＮＴ／ＧであるＢｏＮＴ／Ｇ−Ｆ１８γ；及び配列番号３９のアミノ酸１３８〜１８３で配列番号８のアミノ酸１２５５〜１３１５が置き換えられている修飾ＴｅＮＴであるＴｅＮＴ−Ｆ１８γのためのｐＵＣＢＨＢ１クローニングコンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略が使用される。同様にして、ＦＧＦ１８β−三葉形ドメインからのγ折畳みは、ＢｏＮＴ／Ａβ−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号１のアミノ酸１１１１〜１１６２；ＢｏＮＴ／Ｂβ−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号２のアミノ酸１０９８〜１１４７；ＢｏＮＴ／Ｃ１β−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号３のアミノ酸１１１２〜１１５０；ＢｏＮＴ／Ｄβ−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号４のアミノ酸１０９９〜１１３７；ＢｏＮＴ／Ｅβ−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号５のアミノ酸１０８６〜１１２９；ＢｏＮＴ／Ｆβ−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号６のアミノ酸１１０６〜１１５２；ＢｏＮＴ／Ｇβ−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号７のアミノ酸１１０６〜１１５３；又はＴｅＮＴβ−三葉形ドメインからのα折畳みである、配列番号８のアミノ酸１１２８〜１１７７に置換わることができる。同様にして、ＦＧＦ１８β−三葉形ドメインからのγ折畳みは、ＢｏＮＴ／Ａβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号１のアミノ酸１１７９〜１２２３；ＢｏＮＴ／Ｂβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号２のアミノ酸１１６６〜１２１０；ＢｏＮＴ／Ｃ１β−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号３のアミノ酸１１６７〜１２１３；ＢｏＮＴ／Ｄβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号４のアミノ酸１１５４〜１２０７；ＢｏＮＴ／Ｅβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号５のアミノ酸１１４７〜１１９０；ＢｏＮＴ／Ｆβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号６のアミノ酸１１７２〜１２１３；ＢｏＮＴ／Ｇβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号７のアミノ酸１１７３〜１２１８；又はＴｅＮＴβ−三葉形ドメインからのβ折畳みである、配列番号８のアミノ酸１１９５〜１２４０に置換わることができる。
【０４９２】
同様にして、上述のクロストリジウム毒素由来のβ−三葉形ドメインからのα折畳み、β折畳み又はγ折畳みを、配列番号３３のアミノ酸１０９〜１５５、配列番号３４のアミノ酸１１５〜１５５；配列番号３５のアミノ酸１６６〜２０６；配列番号３６のアミノ酸１２７〜１７２；配列番号３７のアミノ酸１４８〜１９６；又は配列番号３８のアミノ酸１３８〜１８３を含むＦＧＦγ折畳みで置き換えることができる。同様に、上述のクロストリジウム毒素由来のβ−三葉形ドメインからのα折畳み、β折畳み又はγ折畳みを、配列番号３３のアミノ酸２６〜６４；配列番号３４のアミノ酸２９〜６７；配列番号３５のアミノ酸８３〜１２１；配列番号３６のアミノ酸４３〜８０；配列番号３７のアミノ酸６３〜１００；配列番号３８のアミノ酸５５〜９１；又は配列番号３９のアミノ酸５４〜９１を含むＦＧＦα折畳みで置き換えることができる。さらに、上述のクロストリジウム毒素由来のβ−三葉形ドメインからのα折畳み、β折畳み又はγ折畳みを、配列番号３３のアミノ酸６８〜１０５；配列番号３４のアミノ酸７１〜１１１；配列番号３５のアミノ酸１２５〜１６２；配列番号３５のアミノ酸１２５〜１６２；配列番号３６のアミノ酸８４〜１２３；配列番号３７のアミノ酸１０４〜１４４；配列番号３８のアミノ酸９５〜１３４；又は配列番号３９のアミノ酸９５〜１３４を含むＦＧＦβ折畳みで置き換えることができる。
【０４９３】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８を構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ｆ１８γ／Ａをコードする配列番号１の読取り枠を含むインサートを切除し、かつ２）このインサートをｐＥＴ２９ベクターに操作可能な形で連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼでｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８γコンストラクトを消化させる（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）。ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８γを生成するため、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてインサートをサブクローニングする。ライゲーション混合物を、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へと形質転換させ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含む１．５％のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天平板（ｐＨ７．０）上に固定し、一晩の成長のため３７℃のインキュベータ内に置く。カナマイシン耐性コロニーとして、細菌含有発現コンストラクトを同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補コンストラクトを単離し、インサートの存在及び配向を判定するために制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成によりこれを分析する。このクローニング戦略は、カルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対して操作可能な形で連結された配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８γをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを生み出した。
【０４９４】
ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｆ１８γ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−Ｆ１８γ、ＢｏＮＴ／Ｄ−Ｆ１８γ、ＢｏＮＴ／Ｅ−Ｆ１８γ、ＢｏＮＴ／Ｆ−Ｆ１８γ、ＢｏＮＴ／Ｇ−Ｆ１８γ、ＴｅＮＴ−Ｆ１８γ、ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８α、ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｆ１８α、ＢｏＮＴ／Ｃ１−Ｆ１８α、ＢｏＮＴ／Ｄ−Ｆ１８α、ＢｏＮＴ／Ｅ−Ｆ１８α、ＢｏＮＴ／Ｆ−Ｆ１８α、ＢｏＮＴ／Ｇ−Ｆ１８α、ＴｅＮＴ−Ｆ１８α、ＢｏＮＴ／Ａ−Ｆ１８β、ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｆ１８β、ＢｏＮＴ／Ｃ１−Ｆ１８β、ＢｏＮＴ／Ｄ−Ｆ１８β、ＢｏＮＴ／Ｅ−Ｆ１８β、ＢｏＮＴ／Ｆ−Ｆ１８β、ＢｏＮＴ／Ｇ−Ｆ１８β、又はＴｅＮＴ−Ｆ１８β、ならびに配列番号３３のアミノ酸１０９〜１５５；配列番号３４のアミノ酸１１５〜１５５；配列番号３５のアミノ酸１６６〜２０６；配列番号３６のアミノ酸１２７〜１７２；配列番号３７のアミノ酸１４８〜１９６；配列番号３８のアミノ酸１３８〜１８３；配列番号３３のアミノ酸２６〜６４；配列番号３４のアミノ酸２９〜６７；配列番号３５のアミノ酸８３〜１２１；配列番号３６のアミノ酸４３〜８０；配列番号３７のアミノ酸６３〜１００；配列番号３８のアミノ酸５５〜９１；配列番号３９のアミノ酸５４〜９１；配列番号３３のアミノ酸６８〜１０５；配列番号３４のアミノ酸７１〜１１１；配列番号３５のアミノ酸１２５〜１６２；配列番号３６のアミノ酸８４〜１２３；配列番号３７のアミノ酸１０４〜１４４；配列番号３８のアミノ酸９５〜１３４；又は配列番号３９のアミノ酸９５〜１３４を含む上述の修飾クロストリジウム毒素についてコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを作製するために、類似のクローニング戦略が使用される。
【０４９５】
実施例６
細菌細胞内での修飾クロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、細菌細胞内で本明細書にて開示されている修飾クロストリジウム毒素のいずれかを発現させるために有用な手順を例示している。
【０４９６】
例えば、実施例１〜５中の発現コンストラクトのいずれかといったような発現コンストラクトが、熱ショック形質転換プロトコールを用いて、化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）の中に導入される。熱ショック反応を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬの入った１．５％のルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天平板（ｐＨ７．０）上に平板固定し、一晩成長させるため３７℃のインキュベータ内に置く。発現コンストラクトを含む形質転換されたＥ．ｃｏｌｉのカナマイシン耐性コロニーを用いて、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＰＡ−０．５Ｇ培地３．０ｍＬの入ったバッフル付きフラスコに植菌し、これを次に、一晩成長させるため２５０ｒｐｍで振とうする３７℃のインキュベータ内に置く。今度は結果として得た一晩スタータ培養物を用いて、１：１０００の希釈度で５０μｍ／ｍＬのカナマイシンを含有するＺＹＰ−５０５２自己誘発培地の入った３Ｌ入りのバッフル付きフラスコに植菌する。培養体積は、約６００ｍＬ（フラスコ体積の２０％）から約７５０ｍＬ（フラスコ体積の２５％）までの範囲内にあった。これらの培養を、約５．５時間２５０ｒｐｍで振とうする３７℃のインキュベータ内で成長させ、その後、一晩発現させるため２５０ｒｐｍで振とうする１６℃のインキュベータに移す。遠心分離（２０〜３０分間４℃で４０００ｒｐｍ）により細胞を収獲し、直ちに使用するか、又は必要になるまで乾燥状態で保管する。
【０４９７】
実施例７
修飾クロストリジウム毒素の精製及び定量化
以下の実施例は、本明細書中で開示されているあらゆる修飾クロストリジウム毒素の精製及び定量化に有用な方法を例示する。
【０４９８】
固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）タンパク質精製のためには、実施例７で記述されている通りの修飾クロストリジウム毒素を発現するために使用される大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ２）細胞ペレットを、カラム結合緩衝液（２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．８；５００ｍＭの塩化ナトリウム；１０ｍＭのイミダゾール；２倍プロテアーゼ阻害物質カクテルセットＩＩＩ（カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＥＭＤバイオサイエンシーズ・カルビオケム（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））；５単位／ｍＬのベンゾナーゼ（ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバジェン）；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１００、４−オクチルフェニルポリエトキシラート；１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に再懸濁させ、その後低温オークリッジ（Ｏａｋｒｉｄｇｅ）遠心分離管に移す。細胞を溶解させるため氷上で細胞懸濁液を音波処理し（ブランソンデジタル音波処理装置（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）上で６０秒の冷却間隔で４０％の振幅にて１０秒の１０〜１２パルス）、その後遠心分離（２０分間４℃で、１６，０００ｒｐｍ）して、溶解物を清澄化させる。２．５〜５．０ｍＬのＴＡＬＯＮ（商標）Ｓｕｐｅｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏ２＋親和性樹脂（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  ＡｌｔｏのＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック）が詰められた２０ｍＬのＥｃｏｎｏ−Ｐａｃカラム支持体（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いて固定化金属親和性クロマトグラフィカラムを調製し、これを次に５カラム体積の脱イオン精製水及びそれに続く５カラム体積のカラム結合緩衝液で洗い流すことで平衡化する。清浄化した溶解物を、重力流（約０．２５〜０．３ｍＬ／分）により平衡化カラムにゆっくりと適用する。その後カラムを、５カラム体積のカラム洗浄緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．８；５００ｍＭの塩化ナトリウム；１０ｍＭのイミダゾール；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１００、４−オクチルフェノールポリエトキシラート；１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）で洗浄する。修飾クロストリジウム毒素を、２０〜３０ｍＬのカラム溶離緩衝液（２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．８；５００ｍＭの塩化ナトリウム；５００ｍＭのイミダゾール；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１００、４−オクチルフェニルポリエトキシラート；１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）で溶離させ、約１２の１ｍＬ画分で収集する。各々の溶離画分内に含まれる修飾クロストリジウム毒素の量をブラッドフォード材料検定により決定する。この手順においては、各々１．０ｍＬの画分の２０μＬのアリコートを２００μＬのＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質試薬（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）と組合せ、脱イオン蒸留水���１〜４倍希釈し、その後、比色シグナルの強度を分光光度計を用いて測定する。最強のシグナルを伴う５つの画分を溶解ピークとみなし、共に組合わせる。標準としてウシガンマグロブリン（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）を用いて、プールしたピーク溶解画分の総タンパク質濃度を推定することにより、総タンパク質収量を判定する。
【０４９９】
ＦＰＬＣ脱塩カラムを用いた修飾クロストリジウム毒素の精製のためには、４℃のカラム緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）８０ｍＬで、ＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０サイズ排除カラム（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙのアマーシャム・バイオサイエンシーズ）を予め平衡化させる。カラムを平衡化させた後、修飾クロストリジウム毒素試料をＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィシステム（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）を用い１０ｍＬ／分の流速で４℃のカラム緩衝液の定組成移動相を伴うサイズ排除カラムに適用する。およそ７〜１２ｍＬの単一画分として脱塩修飾クロストリジウム毒素試料を収集する。
【０５００】
ＦＰＬＣイオン交換カラム中のＦＰＬＣを用いた修飾クロストリジウム毒素の精製のためには、ＩＭＡＣカラムからの溶離の後脱塩させた修飾クロストリジウム毒素試料をＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィシステム（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）を用いて１ｍＬのＱ１（商標）アニオン交換カラム（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）に適用する。４℃のカラム緩衝液（５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）中でカラムに試料を適用し、以下の要領で４℃の溶離緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５）を用いて線形勾配によりこれを溶離させる：ステップ１、１ｍＬ／分の流速で５．０ｍＬの５％溶離緩衝液；ステップ２、１ｍＬ／分の流速で２０．０ｍＬの５〜３０％溶離緩衝液；ステップ３、１．０ｍＬ／分の流速で２．０ｍＬの５０％溶離緩衝液；ステップ４、１．０ｍＬ／分の流速で４．０ｍＬの１００％溶離緩衝液；及びステップ５、１．０ｍＬ／分の流速で５．０ｍＬの０％溶離緩衝液。カラムからの修飾クロストリジウム毒素の溶離を２８０、２６０及び２１４ｎｍで監視し、２８０ｎｍで最小閾値（０．０１ａｕ）より高い値で吸収するピークを収集する。修飾クロストリジウム毒素の大部分は約１００〜２００ｍＭの塩化ナトリウム溶液で溶離することになる。修飾クロストリジウム毒素の平均合計収量をプラッドフォード検定によって判定する。
【０５０１】
修飾クロストリジウム毒素の発現を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。上述の手順で精製した試料を２倍ＬＤＳ試料緩衝液（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）に添加し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）を用いて変性還元条件下でＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する。ゲルを、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）で染色し、分離したポリペプチドを、修飾クロストリジウム毒素発現レベルの定量化のためＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）を用いて画像化する。ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）タンパク質分子量標準（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）に比較することで、修飾クロストリジウム毒素のサイズ及び量を決定する。
【０５０２】
修飾クロストリジウム毒素の発現は同様にウエスタンブロット分析によっても分析される。上述の手順を用いて精製したタンパク質試料を２倍のＬＤＳ試料緩衝液（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）に添加し、変性還元条件下でＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）を用いてＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりこれを分離させる。分離したポリペプチドを、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＳＤ半乾燥電気泳動転移細胞器具（カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓのバイオ・ラド・ラボラトリーズ）を用いたウエスタンブロット法により、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄのインビトロジェン）上へとゲルから移す。２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝食塩水（２５ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１．３−プロパンジオール塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム）、０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート、２％のウシ血清アルブミン、５％の脱脂粉乳を含む溶液中にて２時間室温でインキュベートすることにより、ＰＶＤＦ膜を遮断する。遮断した膜を、プローブとして適切な一次抗体を含むＴｒｉｓ−緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝食塩水、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）中で一晩４℃でインキュベートする。一次抗体プローブ探査されたブロットを、毎回Ｔｒｉｓ緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）中で１５分間ずつ３回洗浄する。二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼに共役された適切な免疫グロブリンＧ抗体を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水中で２時間室温にて、洗浄済み膜をインキュベートする。二次抗体でプローブ探査されたブロットを、毎回Ｔｒｉｓ緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）中で１５分間ずつ３回洗浄する。ＥＣＬＰｌｕｓ（商標）ウエスタンブロット検出システム（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙのアマーシャム・バイオサイエンシーズ）を用いて標識された修飾クロストリジウム毒素のシグナル検出を視覚化し、修飾クロストリジウム毒素発現レベルの定量化のためにＴｙｐｈｏｏｎ９４１０可変モード画像化装置（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙのアマーシャム・バイオサイエンシーズ）で画像化する。
【０５０３】
本発明の態様について、開示された実施形態を参考にして記述してきたが、当業者であれば、開示されている特定の例がこれらの態様をあくまでも例示するものであり、いかなる形であれ、本発明を制限するものではない、ということを認識するであろう。本発明の精神から逸脱することなくさまざまな修正を加えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０５０４】
【図１Ａ】中枢及び末梢神経細胞での神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現在パラダイムの概略図を示す。本図は、中枢及び末梢神経細胞での神経伝達物質放出メカニズムに対する概略図を示す。放出過程は、１）小胞体ドッキング段階であり、神経伝達物質分子を含有する小胞体の小胞体結合ＳＮＡＲＥタンパク質が、原形質膜に位置した膜結合ＳＮＡＲＥタンパク質と結合する段階、及び２）神経伝達物質放出段階であり、前記小胞体が原形質膜と融合し、神経伝達物質分子が細胞外流出される段階の、２段階を含むものと説明され得る。
【図１Ｂ】中枢及び末梢神経細胞での神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現在パラダイムの概略図を示す。本図は、中枢及び末梢神経細胞での破傷風及びボツリヌス毒素活性に対する中毒メカニズムの概略図を示す。この中毒過程は、１）受容体結合段階であり、クロストリジウム毒素がクロストリジウム受容体系と結合し、中毒過程を開始する段階、２）複合体内在化段階であり、毒素結合後、毒素／受容体系複合体を含有する小胞体が細胞内に細胞内移入される段階、３）軽鎖転座段階であり、例えば、小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャンネル細孔の形成、前記重鎖からクロストリジウム毒素軽鎖の分離、及び活性軽鎖の放出を含む多様なイベントが起こると推定される段階、及び４）酵素標的修飾段階であり、クロストリジウム毒素タンパク質の活性軽鎖が、例えば、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰまたはシンタキシンのようなその標的ＳＮＡＲＥ基質を、タンパク質分解的に切断することにより、小胞体ドッキング及び神経伝達物質放出を防止する段階の、４段階を含むものと説明され得る。
【図２】天然由来のクロストリジウム毒素のドメイン編成を示す。単一鎖型は、酵素ドメイン、転座ドメイン、結合ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を示す。転座ドメインと酵素ドメインとの間に位置した二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示される。この領域は、例えば、内因性クロストリジウム毒性プロテアーゼまたは環境で生成した天然由来のプロテアーゼのような天然由来のプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、毒素の単一鎖型を二重鎖型に変換させる内因性二重鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。前記単一鎖型上には、クロストリジウム毒素結合ドメインのＨＣＣ領域が示されている。この領域は、アミノからカルボキシルまでの線形編成のうち、α−折り畳み、β４／β５ヘアピンカーブ、β−折り畳み、β８／β９ヘアピンカーブ、及びγ−折り畳みを含むβ−三葉形ドメインを含む。
【図３Ａ】修飾毒素のアミノ末端に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。本図は、増大された標的ドメイン、酵素ドメイン及び転座ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、転座ドメインと酵素ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、標的ドメインと転座ドメイン、転座ドメインと酵素ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【図３Ｂ】修飾毒素のアミノ末端に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。本図は、増大された標的ドメイン、酵素ドメイン及び転座ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、酵素ドメインと転座ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、標的ドメインと酵素ドメイン、酵素ドメインと転座ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【図４Ａ】他の２つのドメイン間に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。本図は、酵素ドメイン、増大された標的ドメイン及び転座ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、酵素ドメインと標的ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、酵素ドメインと標的ドメイン、標的ドメインと転座ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【図４Ｂ】他の２つのドメイン間に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。本図は、転座ドメイン、増大された標的ドメイン、及び酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、転座ドメインと標的ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、転座ドメインと標的ドメイン、標的ドメインと酵素ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【図５Ａ】修飾毒素のカルボキシル末端に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。本図は、酵素ドメイン、転座ドメイン及び増大された標的ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、酵素ドメインと転座ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、酵素ドメインと転座ドメイン、転座ドメインと標的ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【図５Ｂ】修飾毒素のカルボキシル末端に位置した増大された標的ドメインを有する修飾クロストリジウム毒素を示す。本図は、転座ドメイン、酵素ドメイン及び増大された標的ドメインを含む、アミノからカルボキシルまでの線形編成を有する修飾クロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を示し、二重鎖ループ領域は、二重ＳＳ括弧で示されている。二重鎖ループ領域内のタンパク質分解的切断部位Ｐは、転座ドメインと酵素ドメインとの間に位置している。Ｐプロテアーゼを用いたタンパク質分解的切断の際に、前記毒素の単一鎖型が二重鎖型に変換する。Ｐプロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外因性プロテアーゼ切断部位であってもよい。スペーサは、転座ドメインと酵素ドメイン、酵素ドメインと標的ドメイン、またはこれらの任意の組合せ間に配置されてもよい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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2008535486.tif 000009
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月29日(2007.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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