(57)【要約】ＴＧＦ−β結合タンパク質の新規クラスまたはファミリーが、開示される。骨鉱化作用を増加させるための分子を選択するためのアッセイおよびこのような分子を利用するための方法もまた、開示される。特に、ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的に結合する抗体に関連する組成物および方法が、提供される。これらの方法および組成物は、ＴＧＦ−β結合タンパク質スクレロスチンとＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー（特に、骨形態形成タンパク質）との間の相互作用を干渉することによって骨ミネラル密度を変化することに関する。骨ミネラル密度を増加させることは、低い骨ミネラル密度がその状態を代表する疾患および状態（例えば、オステオペニア、骨粗鬆症、および骨折）における使用を有する。
2008505843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、該スクレロスチンポリペプチドは、配列番号２、６、８、１４、４６、または６５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位および（ｉｉ）ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つへの該スクレロスチンポリペプチドの結合を競合阻害し、ここで、該ＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号１０２）；Ｄ８９６７５（配列番号１０３）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号１０４）；Ｓ７５３５９（配列番号１０５）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号１０６）；Ｄ３８０８２（配列番号１０７）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号１０８）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号１０９）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号１１０）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、そしてここで、該ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号１１１）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号１１２）；Ｚ４８９２３（配列番号１１４）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号１１５）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号１１３）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸を含むＢＭＰ  ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合し、かつスクレロスチンホモダイマーの形成を障害する抗体、またはその抗体結合フラグメントであって、ここで、該スクレロスチンポリペプチドは、配列番号２、６、８、１４、４６、または６５に示されるアミノ酸配列を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、およびハムスターモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項７】
請求項４に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。
【請求項８】
前記抗体が、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。
【請求項１０】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、およびＦｖからなる群より選択される、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
一本鎖抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント、および生理学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。
【請求項１４】
ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続したアミノ酸および多くて５０個の連続したアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、６、８、１４、４６、または６５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、非ヒト動物において、該ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、かつ（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位および（ｉｉ）ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つへの該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合阻害する抗体を誘発し得、ここで、該ＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号１０２）；Ｄ８９６７５（配列番号１０３）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号１０４）；Ｓ７５３５９（配列番号１０５）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号１０６）；Ｄ３８０８２（配列番号１０７）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号１０８）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号１０９）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号１１０）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、そしてここで、該ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号１１１）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号１１２）；Ｚ４８９２３（配列番号１１４）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号１１５）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号１１３）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸を含むＢＭＰ  ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、免疫原。
【請求項１５】
ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続したアミノ酸および多くて５０個の連続したアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、６、８、１４、４６、または６５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、非ヒト動物において、該ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、かつＳＯＳＴホモダイマーの形成を障害する抗体を誘発し得る、免疫原。
【請求項１６】
前記ペプチドが、キャリア分子と会合する、請求項１４または請求項１５のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項１７】
前記キャリア分子が、キャリアポリペプチドである、請求項１６に記載の免疫原。
【請求項１８】
前記キャリアポリペプチドが、キーホールリンペットヘモシニアンである、請求項１７に記載の免疫原。
【請求項１９】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、該方法は、請求項１４に記載の免疫原を用いて非ヒト動物を免疫する工程を包含し、ここで、（ａ）該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、６、８、１４、４６、または６５に示されるアミノ酸配列を含み；（ｂ）該抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位および（ｉｉ）ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つへの該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合阻害し；（ｃ）該ＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号１０２）；Ｄ８９６７５（配列番号１０３）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号１０４）；Ｓ７５３５９（配列番号１０５）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号１０６）；Ｄ３８０８２（配列番号１０７）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号１０８）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号１０９）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号１１０）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得；そして（ｄ）該ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号１１１）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号１１２）；Ｚ４８９２３（配列番号１１４）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号１１５）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号１１３）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸を含むＢＭＰ  ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、方法。
【請求項２０】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、６、８、１４、４６、または６５に示されるアミノ酸配列を含み、該方法は、請求項１５に記載の免疫原を用いて非ヒト動物を免疫する工程を包含し、ここで、該抗体は、ＳＯＳＴホモダイマーの形成を障害する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、薬学的生成物および方法に関し、より具体的には、骨のミネラル含有量を増加させるために適した方法および組成物に関する。このような組成物および方法は、多種多様な状態（例えば、オステオペニア、骨粗鬆症、骨折、および低い骨ミネラル密度が疾患の特徴である他の障害を含む）を処置するために利用され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
骨質量を変える２つまたは３つの異なる段階が、個体の生涯にわたり起こる（Ｒｉｇｇｓ，Ｗｅｓｔ  Ｊ．Ｍｅｄ．１５４：６３−７７，１９９１を参照のこと）。第一段階は、男性および女性の両方に起こり、最高の骨質量の達成へと進む。この第一段階は、軟骨内成長板の線状増殖、および骨膜付加速度に起因する放射状増殖介して達成される。第二段階は、小柱状骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｂｏｎｅ）（椎骨および骨盤のような平らな骨）について約３０歳、皮質骨（例えば、四肢に見られる長い骨）について約４０歳で始まり、老年まで続く。この段階は、緩慢な骨の減少によって特徴付けられ、男性および女性の両方で起こる。女性ではまた、骨の減少の第三段階が起こり、これは、閉経後のエストロゲン欠乏に最も起因するようである。この段階の間だけで、女性は、皮質骨からさらなる１０％の骨質量を、および小柱状区画から２５％の骨質量を喪失し得る（Ｒｉｇｇｓ，前出参照のこと）。
【０００３】
骨ミネラル含有量の喪失は、多種多様な状態によって引き起こされ得、そして重大な医学的問題を生じ得る。例えば、骨粗鬆症は、骨格の骨質量およびミネラル密度の顕著な減少、骨の微小構造（ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）の分解を含む骨の構造的劣化、ならびにそれに対応する、悪化した個体における骨の脆弱性および骨折への対する感受性の増加によって特徴づけられる、ヒトにおける衰弱性の病気である。ヒトにおける骨粗鬆症は、米国で約２千５百万人の人々に見られる状態である臨床オステオペニア（若年成人の骨についての平均値を、１標準偏差よりも下回るが、２．５標準偏差以上である骨ミネラル密度）によって先行される。米国でさらに７百万〜８百万人の患者が、臨床骨粗鬆症（成熟若年成人の骨ミネラル含有量を２．５標準偏差よりも大きく下回る骨ミネラル含有量として定義される）と診断されている。骨粗鬆症は、健康医療制度について最も費用のかかる疾患の１つであり、米国においては、毎年数百億ドルの費用がかかる。保健医療関連費用に加えて、長期の在宅治療および労働日の喪失が、この疾患の財政的費用および社会的費用に加わる。世界中で約７千５百万人の人々が、骨粗鬆症の危険性がある。
【０００４】
人口母集団における骨粗鬆症の頻度は、年齢とともに増加し、そして白色人種の間では、主に女性である（女性は、米国における骨粗鬆症患者プールの８０％を占める）。老齢者の骨格骨の脆弱性および骨折に対する感受性の増加は、この母集団において偶発的な落下のより大きな危険性によって悪化する。１５０万人より多くの骨粗鬆症関連骨折が、米国で毎年報告されている。臀部、手根、および椎骨の骨折は、骨粗鬆症と関連する最も一般的な損傷の１つである。特に、臀部の骨折は、患者にとって非常に厄介でかつ費用がかかり、女性については、高い割合の死亡率および罹患率と相関がある。
【０００５】
骨粗鬆症は、骨質量の減少に起因する骨折の危険性の増加として定義されているが、骨格障害について、成人の骨密度を実質的に増加させ得る現在利用可能な処置はない。全ての医師の間で、成人において、特に、オステオペニアおよび骨粗鬆症で危険性がある、手根、脊柱および臀部の骨において骨密度を増加させ得る薬物が必要とされるという強い認識が存在する。
【０００６】
骨粗鬆症の予防のための現在の戦略は、個体にいくつかの利点を提供し得るが、疾患の解決を保証することができない。これらの戦略としては、高齢の開始とともに身体活動（特に、体重を支持する活動）を調節することを包含する（食餌に十分なカルシウムを含むこと、アルコール含む製品またはタバコの消費を避けることが挙げられる）。臨床的オステオペニアまたは骨粗鬆症を発症している患者に対して、全ての現在の治療薬および戦略は、構成的に起こる骨再生プロセスの天然成分の骨吸収のプロセスを阻害することによって、骨質量のさらなる低下を減少させることに関する。
【０００７】
例えば、エストロゲンは、現在、骨の減少を遅延させるために処方されている。しかしながら、患者に何らかの長期的利点があるか否か、および７５歳を超える患者に対して少しでも効果があるか否かについて、いくつかの論議が存在する。さらに、エストロゲンの使用は、乳癌および子宮内膜癌の危険性を増加させると考えられる。
【０００８】
ビタミンＤを含むか、または含まない、高用量の食餌性カルシウムはまた、閉経後の女性に対して示唆されている。しかしながら、高用量のカルシウムは、しばしば、不快な胃腸の副作用を有し得、そして血清カルシウムレベルおよび尿中カルシウムレベルは、連続的にモニタリングされなければならない（ＫｈｏｓｌａおよびＲｉｇｓｓ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７０：９７８−９８２，１９９５を参照のこと）。
【０００９】
示唆されている他の治療としては、カルシトニン、ビスホスホネート、タンパク同化ステロイドおよびフッ化ナトリウムが挙げられる。しかしながら、このような治療は、これらの使用を妨げ得る望ましくない副作用を有する（例えば、カルシトニンおよびステロイドは、悪心を引き起こし得、そして免疫応答を引き起こし得、ビスホスホネートおよびフッ化ナトリウムは、骨密度がそこそこ増加したとしても骨折の修復を阻害し得る）（ＫｈｏｓｌａおよびＲｉｇｓｓ，前述を参照のこと）。
【００１０】
新しい骨質量の増加を刺激または増強させる薬物を含む、現在実施されている治療戦略はない。本発明は、骨鉱化作用を増大させるために利用され得る組成物および方法を提供し、従って、骨質量を増加させることが所望される、多種多様な状態を処置するために利用され得る。さらに本発明は、他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
上記のとおり、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の新規クラスまたはファミリー、そして骨ミネラル含有量および骨ミネラル密度を増加させる化合物を選択するためのアッセイ、骨ミネラル含有量および骨ミネラル密度を増加させる化合物、ならびに多種多様な状態の処置または予防においてこのような化合物を利用するための方法を提供する。
【００１２】
本発明の一局面の範囲内で、単離された核酸分子が提供され、ここで、この核酸分子は、以下からなる群より選択される：（ａ）配列番号１、５、７、９、１１、１３、もしくは１５、またはこれらの相補配列を含む単離された核酸分子；（ｂ）高ストリンジェンシーの条件下で（ａ）の核酸分子に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）に従うＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする単離された核酸。本発明の関連局面の範囲内で、単離された核酸分子は、上記で同定された配列のうちの一つの部分のみへのハイブリダイゼーションに基づき提供される（例えば、（ａ）について、ハイブリダイゼーションは、配列番号１のヌクレオチド１５６〜５３９またはヌクレオチド５５５〜６８７から選択される少なくとも２０、２５、５０、または１００ヌクレオチドのプローブであり得る）。容易に明らかなように、ハイブリダイゼーションに利用されるべき必要なストリンジェンシーは、プローブのサイズに基づいて変化し得る。例えば、２５マーのプローブについては、高ストリンジェンシー条件は、以下を包含し得る：６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５×デンハート、６×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０（ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）、４５℃で一晩、その後４５〜５０℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで２回洗浄。低ストリンジェンシー条件下の１００マーのプローブについては、適切な条件は、以下を包含し得る：５×ＳＳＰＥ、５×デンハート、および０．５％  ＳＤＳで、４２〜５０℃で一晩、その後２×ＳＳＰＥ（または２×ＳＳＣ）／０．１％  ＳＤＳで、４２〜５０℃で２回洗浄。
【００１３】
本発明の関連局面内で、配列番号１、５、７、９、１１、１３、または１５と、Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムを利用して５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９８％の相同性レベルで相同性を有する単離された核酸分子が提供される。例えば、このような単離された分子の代表的な例としては、配列番号２、６、１０、１２、１４、または１６を含むタンパク質をコードし、かつＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを利用して５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９８％レベルの相同性レベルでこれらの配列と相同性を有する核酸分子が挙げられる。
【００１４】
単離された核酸分子は、代表的には、１００ｋｂ未満のサイズ、特定の実施形態の範囲内で、５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、またはさらに５ｋｂ未満のサイズである。さらに、他の実施形態の範囲内で、単離された核酸分子は、他の無関係の核酸分子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００３０９８およびＥＭＢ番号ＡＱ１７１５４６に記載されるようなサブクローンＢＡＣ）の「ライブラリー」中に存在しない。しかしながら、単離された核酸分子は、関連分子のライブラリー中で見出され得る（例えば、米国特許第５，８３７，４５８号；同第５，８３０，７２１号；および同第５，８１１，２３８号に記載されるようにシャッフリングのため）。最後に、本明細書中に記載されるような単離された核酸分子は、Ｄａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、またはＳＣＧＦ（米国特許第５，７８０，２６３号）をコードする核酸分子を含まない。
【００１５】
上記の核酸分子を含むクローニングベクター、および上記の核酸分子に操作可能に連結されたプロモーター（例えば、調節性配列）を含む発現ベクターもまた、本発明によって提供される。適切なプロモーターの代表的な例としては、組織特異的プロモーター、ウイルスベースのプロモーター（例えば、ＣＭＶベースのプロモーター（例えば、ＣＭＶ  Ｉ−Ｅ、ＳＶ４０初期プロモーター、およびＭｕＬＶ  ＬＴＲ）が挙げられる。発現ベクターはまた、ウイルスに基づき得るか、またはウイルスに由来し得る（例えば、「ウイルスベクター」）。ウイルスベクターの代表的な例としては、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。上記のベクターのいずれかを含む（ｃｏｎｔａｉｎ）か、または包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）宿主細胞（例えば、ヒト起源、サル起源、イヌ起源、ラット起源、またはマウス起源の宿主細胞を含む）もまた、提供される。
【００１６】
本発明の他の局面の範囲内で、ＴＧＦ−β結合タンパク質を産生する方法が、提供され、この方法は、上記の条件下でＴＧＦ−β結合タンパク質の産生するために十分な条件下および時間、上述のベクターを含む宿主細胞を培養する工程を包含する。さらなる実施形態において、本方法によって産生されるタンパク質は、（例えば、カラムクロマトグラフィー、アフィニティー精製などによって）さらに精製され得る。従って、上記の核酸分子（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６）によってコードされる単離されたタンパク質は、本出願の開示を考慮して容易に産生され得る。
【００１７】
上述のタンパク質またはこのフラグメントが、融合タンパク質として産生され得ることに、また注意するべきである。例えば、一局面の範囲内で、上記のような核酸分子によってコードされるＴＧＦ−β結合タンパク質、または少なくとも１０アミノ酸長、２０アミノ酸長、３０アミノ酸長、５０アミノ酸長、または１００アミノ酸長の、その一部分を含む第一のポリペプチドセグメント、および非ＴＧＦ−β結合タンパク質を含む第二のポリペプチドセグメントを含む融合タンパク質が、提供される。特定の実施形態の範囲内で、第二のポリペプチドは、精製または認識に適切なタグ（例えば、複数のアニオン性アミノ酸残基を含むポリペプチド−米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと）、マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、もしくはアルカリホスファターゼ）、または有毒分子（例えば、リシン）であり得る。
【００１８】
本発明の別の局面の範囲内で、ＴＧＦ−β結合タンパク質の上記のクラスに特異的に結合し得る抗体（例えば、ヒトＢＥＥＲ）が提供される。種々の実施形態の範囲内で、上記抗体は、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体（ヒト起源またはマウス起源の抗体）であり得る。さらなる実施形態の範囲内で、上記抗体は、全抗体の結合特徴を保持する抗体のフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、もしくはＦｖフラグメント、またはさらにはＣＤＲ）である。上述の抗体を産生し得るか、または発現し得るハイブリドーマおよび他の細胞がまた、提供される。
【００１９】
本発明の関連局面の範囲内で、ＴＧＦ−β結合タンパク質を検出する方法が提供され、この方法は、上記のとおり抗体をＴＧＦ−β結合タンパク質に結合させるために十分な条件下および時間、この抗体をインキュベートする工程、およびこの結合を検出する工程を包含する。種々の実施形態の範囲内で、この抗体は、固体支持体に結合されて、（例えば、酵素、蛍光タンパク質、および放射性同位体からなる群より選択されるマーカーを用いて）洗浄もしくは分離、および／または標識を容易にし得る。
【００２０】
本発明の他の局面の範囲内で、高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１８に従う核酸分子、またはそれに対する相補体とハイブリダイズする単離されたオリゴヌクレオチドが、提供される。さらなる実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６をコードする配列中に見出され得る。特定の実施形態の範囲内で、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、または１００ヌクレオチド長である。さらなる実施形態の範囲内で、上記オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、酵素、蛍光分子、または放射性同位体）で標識される。ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする上記の核酸分子の全てまたは一部分を特異的に増幅し得るプライマーが、また提供される。本明細書中で利用される場合、用語「特異的に増幅すること」とは、上述のＴＧＦ−β結合タンパク質を増幅し、他のＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、Ｄａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、またはＳＣＧＦ（米国特許第５，７８０，２６３号））を増幅しないプライマーをいうことと理解されるべきである。
【００２１】
本発明の関連局面の範囲内で、ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸分子を検出するための方法が提供され、この方法は、高ストリンジェンシーの条件下で、上記のとおりオリゴヌクレオチドをインキュベートする工程、およびこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する。特定の実施形態の範囲内で、このオリゴヌクレオチドは、標識され得るか、そして／または固体支持体に結合され得る。
【００２２】
本発明の他の局面の範囲内で、上記のＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、配列番号２、６、８、１０、１２、１４、または１６）のうちの１つをコードするＲＮＡを切断し得るリボザイムが、提供される。このようなリボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ（２’−Ｏ−メチルリボ核酸を含む）、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート結合を有する核酸）またはその混合物で構成され得る。これらのリボザイムをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、および上記リボザイムを発現し得るか、または産生し得るベクターはまた、提供される。ベクターの代表的な例としては、プラスミド、レトロトランスポゾン、コスミド、およびウイルスベースのベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスから少なくとも部分的に作製されたウイルスベクター）が挙げられる。これらのベクターを含む宿主細胞（例えば、ヒト細胞、イヌ細胞、ラット細胞、またはマウス細胞）もまた、提供される。特定の実施形態において、この宿主細胞は、上記ベクターで安定的に形質転換され得る。
【００２３】
本発明のさらなる局面の範囲内で、合成的に、またはインビトロ転写もしくはインビボ転写のいずれかでリボザイムを産生するための方法が提供される。さらなる実施形態の範囲内で、このように産生されたリボザイムは、さらに精製され得、そして／または薬学的組成物中に処方され得る（例えば、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と一緒の、リボザイム、またはリボザイムをコードする核酸分子）。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体または本明細書中に記載される他の選択された分子が、薬学的組成物中に処方され得る。
【００２４】
本発明の他の局面の範囲内で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５に従う核酸分子またはそれに対する相補体とハイブリダイズする核酸分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが、提供され、ここで、このオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるようなＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、ヒトＢＥＥＲ）の発現を阻害する。種々の実施形態の範囲内で、上記オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、または５０ヌクレオチド長である。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチド長未満、７５ヌクレオチド長未満、または６０ヌクレオチド長未満である。容易に明らかであるように、上記オリゴヌクレオチドは、１種以上の核酸アナログ、リボ核酸、またはデオキシリボ核酸で構成され得る。さらに、上記オリゴヌクレオチドは、１つ以上の結合（例えば、共有結合（例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、ホスホン酸メチル結合、メチレン（メチルイミノ）結合、モルホリノ結合、アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）結合、シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合および複素環式糖間結合）を含む））によって改変され得る。キメラオリゴヌクレオチドの１つの代表的な例は、米国特許第５，９８９，９１２号に提供される。
【００２５】
本発明のさらに別の局面において、骨鉱化作用を増加するための方法が提供される。この方法は、上に記載されるリボザイムの有効量を、温血動物に導入する工程を包含する。関連する局面において、このような方法は、上記リボザイムを生成するための核酸分子の転写を助ける条件下にて、本明細書中に記載される所望のリボザイムを生成することが可能な核酸分子またはベクターの有効量を、患者に導入する工程を包含する。
【００２６】
本発明の他の局面において、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。一実施形態において、その胚細胞および体細胞が上に記載されるＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸分子を含むトランスジェニック動物が、提供される。この核酸分子は、遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結され、上記遺伝子は、胚形成期において動物に導入されるか、またはその動物の祖先遺伝子（ａｎｃｅｓｔｏｒ）である。ただし、上記動物はヒトではない。他の実施形態において、トランスジェニックノックアウト動物が提供される。このトランスジェニックノックアウト動物は、その胚細胞および体細胞が、本明細書中に記載のＴＧＦ結合タンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイズする、内因性核酸分子の少なくとも１つの対立遺伝子の破壊を含む動物を包含する。ここで、この破壊は、破壊を伴わない動物と比較して、上記対立遺伝子由来のメッセンジャーＲＮＡの転写を阻害する。ただし、上記動物はヒトではない。種々の実施形態において、この破壊は、核酸の欠失、置換または挿入である。他の実施形態において、上記トランスジェニック動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタまたはイヌである。
【００２７】
本発明のさらなる局面において、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子発現を検出するためのキットが提供される。このキットは、核酸分子を含む容器を備え、ここでこの核酸分子は、以下からなる群より選択される：（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００、または配列番号１０１のヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む核酸分子；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の少なくとも１５、２０、３０、５０、７５，または１００のヌクレオチド長のフラグメントである核酸分子。本明細書中に記載されるＴＧＦ−β結合タンパク質抗体のうちの１つを含む容器を備える、ＴＧＦ−β結合タンパク質を検出するためのキットもまた提供される。
【００２８】
例えば、本発明の一局面において、選択された分子が、骨ミネラル含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１以上の候補分子を、請求項１に記載の核酸分子によってコードされるＴＧＦ−β結合タンパク質およびＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の選択されたメンバー（例えば、ＢＰＭ５またはＢＰＭ６）と混合する工程、（ｂ）上記候補分子が、ＴＧＦ−βファミリーメンバーのシグナル伝達を変化させるか否か、またはＴＧＦ−βファミリーメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を変化させるか否かを決定する工程。特定の実施形態において、上記分子は、間葉細胞分化の正の調節因子としての機能に対するＴＧＦ−βの能力を変化させる。本発明のこの局面において、上記候補分子は、例えば、シグナル伝達もしくは結合を、減少させる（例えば、阻害する）か、または増加させる（例えば、増強する）かのいずれかによって、シグナル伝達または結合を変化させ得る。
【００２９】
さらに別の局面において、選択された分子が、骨ミネラル含有量を増加させ得るか否かを決定するための方法が提供される。この方法は、選択された分子が、骨またはそのアナログに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害するかどうかを決定する工程を包含する。骨またはそのアナログの代表的な例としては、生検を介して得られたヒドロキシアパタイトおよび主要なヒト骨サンプルが挙げられる。
【００３０】
上に列挙された方法の特定の実施形態において、上記選択された分子は、分子の混合物内に含まれ、これらの方法は、アッセイにおいて機能的である１以上の分子を単離する工程をさらに包含し得る。さらに他の実施形態において、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質が固体支持体に結合され、ＴＧＦ−β結合タンパク質の結合が測定されるか、または、ＴＧＦ−β結合タンパク質が固体支持体に結合され、ＴＧＦ−βタンパク質の結合が測定される。
【００３１】
上に記載されるような方法を利用して、多種多様な分子が、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質に対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害することによって、骨ミネラル含有量を増加させる能力についてアッセイされ得る。このような分子の代表的な例としては、タンパク質またはペプチド、有機分子、および核酸分子が挙げられる。
【００３２】
本発明の他の関連する局面において、温血動物中の骨ミネラル含有量を増加させるための方法が、提供される。この方法は、本明細書中に列挙されるアッセイから同定された分子の治療的有効量を、温血動物に投与する工程を包含する。別の局面において、温血動物中の骨ミネラル含有量を増加させるための方法が提供される。この方法は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）に対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子の治療的有効量を、温血動物に投与する工程を包含する。適切な分子の代表的な例としては、アンチセンス分子、リボザイム、リボザイム遺伝子、およびＴＧＦ−β結合タンパク質を特異的に認識し、ＴＧＦ−β結合タンパク質の活性を変化させる抗体（例えば、ヒト化抗体）が挙げられる。
【００３３】
本発明の別の局面において、温血動物中の骨ミネラル含有量を増加させるための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）に対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子の発現に関するベクターを、骨に戻る細胞に導入する工程、および（ｂ）温血動物にベクター含有細胞を投与する工程。本明細書中で利用される場合、末梢投与の後に細胞が骨マトリックス中に局在する場合、細胞が、「骨に戻る」ことが理解されるべきである。一実施形態において、このような方法は、上記導入する工程の前に、骨に戻る骨の骨髄から細胞を単離する工程をさらに包含する。さらなる実施形態において、上記骨に戻る細胞は、ＣＤ３４＋細胞および骨芽細胞からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の他の局面において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質に対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子が提供される（好ましくは、単離される）。
【００３５】
さらなる実施形態において、上記分子は組成物として提供され得、そして骨吸収のインヒビターをさらに含み得る。このようなインヒビターの代表的な例としては、カルシトニン、エストロゲン、ビスホスホネート、抗吸収活性を有する増殖因子およびタモキシフェンが挙げられる。
【００３６】
前述の治療的文脈において利用され得る分子の代表的な例としては、例えば、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンス分子、および／または抗体（例えば、ヒト化抗体）が挙げられる。このような分子は、それらの選択に依存して、本明細書中に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーメンバーのシグナル伝達または結合を変化させるため、拮抗するため、または作動させるために使用され得る。
【００３７】
本発明の種々の実施形態において、上に記載された分子および処置または阻害の方法は、骨粗しょう症、骨軟化症（ｏｓｔｅｏｍａｌａｓｉａ）、歯周病、壊血病、クッシング病、骨折ならびに四肢の不動化（ｌｉｍｂ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）およびステロイド使用が原因の状態のような状態に関して利用され得る。
【００３８】
本発明はまた、ＴＧＦ−β結合タンパク質であるスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）（ＳＯＳＴ）に特異的に結合する抗体を提供し、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（例えば、骨形態形成タンパク質）と相互作用するスクレロスチンの領域に由来するスクレロスチンペプチドを含む免疫原を提供する。一実施形態において、本発明は、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。上記スクレロスチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号４６、または配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで上記抗体は、少なくとも１つの（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位に対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する。ここで、ＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号１０２）；Ｄ８９６７５（配列番号１０３）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号１０４）；Ｓ７５３５９（配列番号１０５）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号１０６）；Ｄ３８０８２（配列番号１０７）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号１０８）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号１０９）；またはＡＡＢ３３８６５（配列番号１１０）に示されるアミノ酸配列を含む、ＢＭＰ  Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、そしてＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号１１１）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号１１２）；Ｚ４８９２３（配列番号１１４）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号１１５）；またはＮＭ＿００１２０４（配列番号１１３）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る。別の実施形態において、本発明は、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合し、スクレロスチンホモダイマーの形成を障害する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、上記スクレロスチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号４６、または配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
本発明の特定の特別な実施形態において、上記抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体であり、その抗体は、マウス、ヒト、ラット、またはハムスターのモノクローナル抗体である。本発明はまた、モノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞または宿主細胞を提供する。本発明の他の実施形態において、上記抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。本発明は、さらに、ヒト化抗体またはキメラ抗体を産生する宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｄまたはＦｖのフラグメントである。本発明はまた、一本鎖抗体である抗体を提供し、一本鎖抗体を発現し得る宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、このような抗体および生理学的に受容可能なキャリアを含有する組成物を提供する。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続するアミノ酸であって、かつ５０個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を提供する。上記ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号４６、または配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、上記ペプチドは、非ヒト動物において、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、少なくとも１つの（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位に対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を誘発し得る。ここで、上記ＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号１０２）；Ｄ８９６７５（配列番号１０３）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号１０４）；Ｓ７５３５９（配列番号１０５）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号１０６）；Ｄ３８０８２（配列番号１０７）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号１０８）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号１０９）；またはＡＡＢ３３８６５（配列番号１１０）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号１１１）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号１１２）；Ｚ４８９２３（配列番号１１４）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号１１５）；またはＮＭ＿００１２０４（配列番号１１３）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る。本発明はまた、ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続するアミノ酸であって、かつ５０個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を提供する。上記ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号４６、または配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、上記ペプチドは、非ヒト動物において、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、ＳＯＳＴホモダイマーの形成を障害する抗体を誘発し得る。
【００４１】
特定の特別な実施形態において、本発明の免疫原は、キャリア分子と関連する。特定の実施形態において、上記キャリア分子はキャリアポリペプチドであり、特別な実施形態において、上記キャリアポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）である。
【００４２】
本発明はまた、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法を提供する。この方法は、ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続するアミノ酸であって、かつ５０個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を用いて、非ヒト動物を免疫する工程を包含する。ここで、（ａ）上記ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号４６、または配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む；（ｂ）上記抗体は、少なくとも１つの（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位に対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する；（ｃ）上記ＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号１０２）；Ｄ８９６７５（配列番号１０３）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号１０４）；Ｓ７５３５９（配列番号１０５）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号１０６）；Ｄ３８０８２（配列番号１０７）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号１０８）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号１０９）；またはＡＡＢ３３８６５（配列番号１１０）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得る；そして（ｄ）上記ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号１１１）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号１１２）；Ｚ４８９２３（配列番号１１４）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号１１５）；またはＮＭ＿００１２０４（配列番号１１３）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ  ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法を提供する。上記ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号４６、または配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む。この方法は、ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続するアミノ酸であって、かつ５０個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を用いて、非ヒト動物を免疫する工程を包含する。上記ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号４６、または配列番号６５に記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、上記抗体は、ＳＯＳＴホモダイマーの形成を障害する。
【００４４】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図への参照によって明らかになる。さらに、本明細書中に示される、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載する種々の参考文献を含む文書が示され、これらは、その全体が参考として援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、特定の用語の定義を記載すること、および以下に使用される略語を列挙し定義することは、その理解のために役立ち得る。
【００４６】
「分子」は、タンパク質またはペプチド（例えば、所望の結合親和性を有する抗体、組換え結合パートナー、ペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸分子、および核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ））；および有機化合物または無機化合物を含むことが理解されるべきである。
【００４７】
「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意の公知のメンバーまたは新規のメンバーを含むことが理解されるべきであり、「ＴＧＦ−β」はまた、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）も含む。
【００４８】
「ＴＧＦ−βレセプター」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの特定のメンバー（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）に特異的なレセプターをいうことが理解されるべきである。
【００４９】
「ＴＧＦ−β結合タンパク質」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの特定のメンバーまたはサブセット（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）に対する、特異的結合親和性を有するタンパク質をいうことが理解されるべきである。ＴＧＦ−β結合タンパク質の特定の例としては、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００、および配列番号１０１によってコードされるタンパク質を含む。
【００５０】
「ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）に対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合」を阻害するとは、ＴＧＦ−βのＴＧＦ結合タンパク質に対する結合を除くか、または阻害することによって、ＴＧＦ−βまたは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の活性化を可能にするか、あるいはそれぞれのレセプターに対するＴＧＦ−βファミリーメンバー（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）の結合を可能にする分子をいうことが理解されるべきである。このような阻害は、例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの特定のメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子によって、達成され得る。
【００５１】
「ベクター」は、所望のタンパク質の発現に関連し得るアセンブリをいう。上記ベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結する転写プロモーターエレメントを含まなければならない。このベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）またはこの２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）から構成され得る。必要に応じて、上記ベクターは、ポリアデニル化配列、１以上の制限酵素認識部位、ならびに１以上の選択可能なマーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依存して、他の遺伝的エレメント（例えば、複製の起点、さらなる核酸の制限酵素認識部位、エンハンサー、転写の誘導能を与える配列、および選択可能なマーカー）もまた、本明細書中に記載のベクターに組み入れられ得る。
【００５２】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。例えば、真核細胞のゲノムＤＮＡから分離されているＴＧＦ結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。単離された核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡであり得るか、または少なくとも部分的に核酸アナログから構成され得る。
【００５３】
「単離されたポリペプチド」は、細胞成分（例えば、現実に上記ポリペプチドに結合する炭水化物、脂質、または他のタンパク様不純物）を本質的に混入しないポリペプチドである。好ましくは、このような単離されたポリペプチドは、少なくとも純度約９０％であり、より好ましくは、少なくとも純度約９５％であり、最も好ましくは、少なくとも純度約９９％である。特定の実施形態において、特定のタンパク質の調製物単離が、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の一本のバンドとしてわずかに現れる場合、特定のタンパク質の調製物は、単離されたポリペプチドを含む。用語「単離された」は、有機分子（例えば、有機低分子）を称する場合、当該分野で周知である方法（例えば、ＮＭＲ、融点）を利用して化合物が純度９０％を超えることを意味する。
【００５４】
「骨硬化症（ｓｃｌｅｒｏｓｔｅｏｓｉｓ）」は、Ｈａｎｓｅｎ（１９６７）（Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｓｋｌｅｒｏｓｔｅｏｓｅ．ｉｎ：Ｏｐｉｔｚ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．，Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ｐｕｂ．）６  １９６７．Ｐｐ．３５１−３５５）によって、ファン・ブッヘム汎発性皮質過骨症（ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｓｉｓ  ｃｏｒｔｉｃａｌｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｉｓａｔａ）と類似する障害に対して使用された用語である。しかし、骨硬化症は、多くの事例において、骨の変化の放射線学的様子ならびに非対称性の皮膚の合指症の指標および中指の存在が異なることもあり得る。顎は、この状態において、異常な四角い形を有する。
【００５５】
「ヒト化抗体」は、マウスまたは他の非ヒト動物のモノクローナル抗体の相補性決定領域が、マウスまたは他の非ヒト動物の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変鎖から、ヒト可変領域に移された組換えタンパク質である。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「抗体フラグメント」は、抗体の一部分（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなど）である。構造に関係なく、抗体フラグメントは、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質のモノクローナル抗体フラグメントは、ＴＧＦ−β結合タンパク質のエピトープに結合する。
【００５７】
用語抗体フラグメントまたは抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する、合成タンパク質または遺伝子改変タンパク質もまた包含する。例えば、抗体フラグメントとしては、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域ならなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結される組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。
【００５８】
「検出可能な標識」は、ポリペプチド部分（例えば、抗体部分または核酸部分）に結合体化し得、診断に有用な分子を生成する分子または原子である。検出可能な標識の例としては、キレート剤、感光剤、放射性同位体、蛍光因子、常磁性イオン、酵素および他のマーカー成分が挙げられる。
【００５９】
本明細書中に使用される「免疫結合体」とは、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体または抗体フラグメント、ならびに検出可能な標識またはエフェクター分子を含む分子である。好ましくは、免疫結合体は、結合体化後のＴＧＦ−β結合タンパク質に結合する能力を、結合体化の前とおおよそ同じか、あるいはわずかに減少させる。
【００６０】
略語：ＴＧＦ−β−「トランスフォーミング成長因子−β」；ＴＧＦ−ｂＢＰ−「トランスフォーミング成長因子−β結合タンパク質」（一つの代表的なＴＧＦ−ｂＢＰは、「Ｈ．Ｂｅｅｒ」として称される）；ＢＭＰ−「骨形態形成タンパク質」；ＰＣＲ−「ポリメラーゼ連鎖反応」；ＲＴ−ＰＣＲ−逆転写酵素（ＲＴ）を用いてＲＮＡがまずＤＮＡに転写されるＰＣＲプロセス；ｃＤＮＡ−ＲＮＡ配列をＤＮＡ形態にコピーすることによって作製される任意のＤＮＡ。
【００６１】
上記のように、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の新規クラスならびに温血動物において骨ミネラル含有量を増加させるための方法および組成物を提供する。簡単には、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーの新規メンバーをコードする遺伝子における変異が、正常な個体より１〜４倍高い骨ミネラル含有量によって特徴付けられるまれな状態（骨硬化症）をもたらすという予期せぬ発見に基づく。したがって、以下でより詳細に議論されるように、この発見は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の、ＴＧＦ−βタンパク質ファミリーおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）への結合を阻害する分子を選択するために利用され得るアッセイ、ならびに温血動物（例えば、ヒトを含む）の骨ミネラル含有量を増加させるために、このような分子を利用する方法の発達をもたらした。
【００６２】
（骨硬化症として知られる疾患の議論）
骨硬化症は、ヒトにおける異常な骨ミネラル密度に関する疾患である。骨硬化症とは、Ｈａｎｓｅｎ（１９６７）（Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｓｋｌｅｒｏｓｔｅｏｓｅ：Ｏｐｉｔｚ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．，Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ｐｕｂ．）６  １９６７．Ｐｐ．３５１−３５５）によって、ファン・ブッヘム汎発性皮質過骨症に類似しているが、骨変化の放射状の現れ方が異なり、そして多くの症例において人差し指および中指の非対称性の皮膚合指症の存在が異なり得る疾患につけられた用語である。
【００６３】
骨硬化症は、現在、常染色体の準優性疾患として公知であり、この疾患は、成人における骨の広範に散在する硬化した病変によって特徴付けられる。この状態は進行性である。骨硬化症はまた、合指症（２つ以上の指が一緒になって癒合する）と関連する、発生の局面を有する。この骨硬化症候群は、高い身長に関し、多くの罹患した個体は６フィート以上の身長に達する。ホモ接合体の骨ミネラル含有量は、正常な個体において観察されるよりも１〜６倍多くあり得、そして骨ミネラル密度は、正常値（例えば、罹患していない兄弟からの値）を１〜４倍上回り得る。
【００６４】
この骨硬化症候群は、南アフリカにおいてオランダ人子孫のアフリカーナーにおいて主に発症する。アフリカーナー人口の約１／１４０個体は、変異遺伝子（異型接合体）のキャリアである。この変異は、１００％の浸透度を示す。病理（合指症または頭蓋の過成長）を伴なわない異型接合体における骨ミネラル密度の増加の事例報告がある。
【００６５】
骨硬化症を有する患者において、下垂体−視床下部軸の異常性は観察されなかった。特に、成長ホルモンおよびコルチゾンの過生成は無いように考えられる。さらに、罹患した個体において、性ホルモンのレベルは正常である。しかしながら、骨ターンオーバーマーカー（骨芽細胞特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、１型プロコラーゲンＣ’プロペプチド（ＰＩＣＰ）および全アルカリホスファターゼ；（Ｃｏｍｉｅｒ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｒｈｅｕ．７：２４３，１９９５を参照のこと））は、この疾患に関連する過骨芽細胞活性（ｈｙｐｅｒｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が存在するが、骨吸収のマーカー（ピリジノリン、デオキシピリジノリン、Ｎ−テロペプチド、尿のヒドロキシプロリン、血漿酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼおよびガラクトシルヒドロキシリジン（Ｃｏｍｉｅｒ（前出）を参照のこと））で測定すると正常〜僅かに減少した破骨細胞活性が存在することを示す。
【００６６】
骨硬化症は、罹患した個体の生涯の間の、骨格全体にわたる連続的な骨の堆積によって特徴付けられる。同型接合体において、この骨ミネラルの連続的な堆積は、機械的受容器（頭蓋（ｓｋｕｌｌ）、顎、頭蓋（ｃｒａｎｉｕｍ））の存在しない骨格の領域において骨の過成長をもたらす。骨硬化症を有する同型接合体において、頭蓋骨の過成長は頭蓋の圧迫を引き起こし、最終的には脳幹上の過剰な静水圧に起因して死に至らせる。骨格の他の全ての部分において、汎発性の、かつ拡散性の硬化が存在する。長骨の皮質領域は、非常に肥厚され、骨強度の実質的な増大を生じる。小柱の連結の厚みが増すことにより、小柱骨の強度は増大する。硬化骨は、Ｘ線に対して著しく不鮮明に現れる。
【００６７】
実施例１においてより詳細に記載されるように、骨硬化症候群の原因であるこのまれな遺伝的変異は、ＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーの新規メンバー（１つの代表的な例は「Ｈ．Ｂｅｅｒ」と称される）をコードする、ヒト第１７染色体の領域に局在する。以下により詳細に記載されるように、この発見に基づき、骨ミネラル化のメカニズムはより完全に理解され、骨ミネラル化を増進する分子についてのアッセイ、ならびに骨ミネラル含有量を増すため、および数多くの疾患の処置または予防におけるこのような分子の使用が開発され得る。
【００６８】
（ＴＧＦ−βスーパーファミリー）
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび（２次構造および３次構造の両方での）構造モチーフを共有する種々の成長因子を含む。このタンパク質ファミリーは、広範な細胞型に影響する幅広い生物学的応答を示すことが知られている。ＴＧＦ−βファミリーメンバーの多くは、胚の発生の間のパターン形成および組織特異化において重要な機能を有し；成体においては、このファミリーメンバーは、例えば創傷治癒および骨修復および骨のリモデリング、ならびに免疫系の調節に関する。ＴＧＦ−βに加えて、このスーパーファミリーとしては、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、成長および分化因子（ＧＤＦ）、ならびにグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が挙げられる。１次分類は、特定のタンパク質を一般的なサブファミリーに分類する、包括的な配列特徴を通じて確立される。サブファミリー内のさらなる層別化は、より小さいグループのメンバー間のより厳密な配列保存により可能である。特定の場合（例えば、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７）において、アミノ酸同一性は、より小さいグループのメンバー間で７５％の高さであり得る。この同一性のレベルは、単一の代表的な配列が、サブグループをより大きなファミリーの他のメンバーから区別する、重要な生物学的エレメントを示すことを可能にする。
【００６９】
ＴＧＦ−β２の結晶構造は決定されてきた。ＴＧＦ−β２モノマーの一般的な折畳みは、３つのジスルフィド架橋によって形成される、安定的で、コンパクトなシステインノット様構造を含む。１つのジスルフィド架橋により安定化された二量体化は逆行性である。
【００７０】
ＴＧＦ−βは、１型レセプターおよび２型レセプターのヘテロオリゴマーの複合体の形成を誘導することにより信号を出す。ＴＧＦ−βシグナルの伝達は、膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼレセプターの、これら２つの異なる１型サブファミリーおよび２型サブファミリーに関する。少なくとも７つの１型レセプターおよび５つの２型レセプターが、同定されている（Ｋａｗａｂａｔａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．９：４９−６１（１９９８）；Ｍｉｙａｚｏｎｏら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：１１５−５７（２０００）を参照のこと）。ＴＧＦ−βファミリーメンバーは、それらの細胞活動を、内因性のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するレセプターに結合することによって開始する。ＴＧＦ−βファミリーの各メンバーは、１型レセプターおよび２型レセプター（その両方がシグナル伝達に必要である）の特徴的な組み合わせに結合する。ＴＧＦ−βレセプター活性化についての現在のモデルにおいて、ＴＧＦ−βリガンドは、２型レセプター（ＴｂＲ−ＩＩ）にまず結合し、そしてこれは活性化キナーゼを有するオリゴマー形態で細胞膜に生じる。その後、ＴｂＲ−ＩＩの非存在下ではリガンドに結合し得ない１型レセプター（ＴｂＲ−Ｉ）が複合体に補充されて、リガンド／ＩＩ型／Ｉ型の三重複合体を形成する。ＴｂＲ−ＩＩは、次いで膜近傍領域におけるグリシン残基およびセリン残基の豊富なドメイン（ＧＳドメイン）において優勢にＴｂＲ−Ｉをホスホリル化し、そしてそれによってＴｂＲ−Ｉを活性化する。この活性化Ｉ型レセプターキナーゼは、次いでＩ型レセプターキナーゼが特定の遺伝子の転写を調節する場合、核を転位させる、Ｓｍａｄタンパク質ファミリーの特定のメンバーをホスホリル化する。
【００７１】
（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ヒトにおける骨ミネラル密度決定において重要な調節タンパク質である）
骨形成の理解における主要な進歩は、インビボでの軟骨および骨の分化を調節する骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（骨形成タンパク質（ＯＰ；ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としても公知である）の同定であった。ＢＭＰ／ＯＰは、軟骨の形成、軟骨の肥厚および石灰化、血管の浸潤、骨芽細胞の分化ならびに骨の形成を誘導する事象のカスケードを通じて軟骨内の骨の分化を誘導する。上記のように、このＢＭＰ／ＯＰ（ＢＭＰ２〜１４および骨形成タンパク質１および骨形成タンパク質２（ＯＰ−１およびＯＰ−２））（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ１２６４３（ＢＭＰ−２）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ１２６４５（ＢＭＰ３）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ５５１０７（ＢＭＰ−３ｂ、成長／分化因子１０）（ＧＤＦ−１０））；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ１２６４４（ＢＭＰ４）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ２２００３（ＢＭＰ５）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ２２００４（ＢＭＰ６）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ１８０７５（ＢＭＰ７）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ３４８２０（ＢＭＰ８）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｑ９ＵＫ０５（ＢＭＰ９）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｏ９５３９３（ＢＭＰ１０）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｏ９５３９０（ＢＭＰ１１、成長／分化因子１１前駆体（ＧＤＦ−１１））；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｏ９５９７２（ＢＭＰ１５）を参照のこと）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。このＢＭＰ／ＯＰサブファミリーメンバー間のこの著しい進化的保存は、それらが動物の正常な発生および正常な機能において重要であることを示唆する。さらに、ＢＭＰ／ＯＰの複数の形態の存在は、この明白な重複の生物学的な関連性についての重要な疑問を提起する。胎児期後（ｐｏｓｔｆｅｔａｌ）の軟骨形成および骨形成に加えて、このＢＭＰ／ＯＰは、骨格形成（ｓｋｅｌｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ、脳顔面頭蓋および歯の組織の発達を含む）において、ならびに胚の発生および腎臓を含む実質器官の器官形成において、複数の役割を果たす。性質は、分化した組織および器官の発生の提供するように合わせられた、共通の（およびいくつかの）分子メカニズムに依存するということが現在理解されている。このＢＭＰ／ＯＰスーパーファミリーは、高度に保存されているカルボキシ末端領域内のアミノ酸モチーフにおいてわずかなバリエーションを有する分子アイソフォームを展開する、複数の分化した機能のプログラミングにおける自然節減（ｎａｔｕｒｅ  ｐａｒｓｉｍｏｎｙ）の適確な例である。
【００７２】
ＢＭＰは、大きな前駆体タンパク質として合成される。二量体化の際に、このＢＭＰは、細胞内でタンパク質分解的に切断され、次いで細胞から分泌されるカルボキシ末端成熟タンパク質が得られる。ＢＭＰは、他のＴＧＦ−βファミリーメンバーのように、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼレセプターの両方に協同的に結合することによってシグナル伝達を開始する。ＢＭＰがリガンドとして作用し得るＩ型レセプターとしては、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３としてもまた公知である）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６としてもまた公知である）、ＡＬＫ−１およびＡＬＫ−２（ＡｃｔＲ−Ｉとしてもまた公知である）が挙げられる。ＩＩ型レセプターのうち、ＢＭＰは、ＢＭＰＩＩ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＩ）、アクチビンＩＩ型（ＡｃｔＲ−ＩＩ）およびアクチビンＩＩＢ型（ＡｃｔＲ−ＩＩＢ）に結合する。（Ｂａｌｅｍａｎｓら（前出）およびその中に引用される参考文献を参照のこと）。ＢＭＰＩ型レセプターポリペプチドの、ポリヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて提供される：例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００４３２９（配列番号１１６によってコードされる配列番号１０２）；Ｄ８９６７５（配列番号１１７によってコードされる配列番号１０３）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号１１８によってコードされる配列番号１０４）；Ｓ７５３５９（配列番号１１９によってコードされる配列番号１０５）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号１２０によってコードされる配列番号１０６）；およびＤ３８０８２（配列番号１２１によってコードされる配列番号１０７）。Ｉ型レセプターの他のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて提供される：例えば、ＮＰ＿００１１９４（配列番号１０８）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号１０９）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号１１０）。ＢＭＰＩＩ型レセプターポリペプチドの、ポリヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて提供され、これらとしては、例えば、Ｕ２５１１０（配列番号１２２によってコードされる配列番号１１１）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号１２３によってコードされる配列番号１１２）；ＮＭ＿００１２０４（配列番号１２４によってコードされる配列番号１１３）；およびＺ４８９２３（配列番号１２５によってコードされる配列番号１１４）が挙げられる。ＩＩ型レセプターのさらなるポリペプチド配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて提供される：例えば、ＣＡＡ８８７５９（配列番号１１５）。
【００７３】
ＢＭＰは、他のシスチンノットタンパク質と同様に、ホモダイマー構造を形成する（Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：１０３−１５（１９９９））。ＢＭＰ／ＴＧＦ−βファミリーに対して実施された進化学的痕跡（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｒａｃｅ）分析によると、ＢＭＰＩ型レセプター結合部位およびＢＭＰＩＩ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ構造の表面にマッピングされた（Ｉｎｎｉｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３：８３９−４７（２０００））。ＢＭＰ上のこのＩ型レセプター結合部位の位置は、ＢＭＰ−２／ＢＭＰレセプターＩＡ複合体のＸ線構造により後に確認された（Ｎｉｃｋｅｌら、Ｊ．Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８３Ａ（補遺１（Ｐｔ１））：Ｓ７−Ｓ１４（２００１））。予測されるＩＩ型レセプター結合部位は、ＴＧＦ−β３／ＴＧＦ−β  ＩＩ型レセプター複合体のＸ線構造と良く一致し（Ｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：２０３−２０８（２００２））、これはＢＭＰ／ＢＭＰレセプターＩＩＡ系に非常に類似している。
【００７４】
（ＢＭＰ拮抗作用）
ＢＭＰサブファミリーおよびアクチビンサブファミリーは、例えば、ＴＧＦ−β結合タンパク質によって、重要な翻訳後の調節に供される。複雑な細胞外制御系が存在し、これにより高い親和性のアンタゴニストが合成および運び出され、引き続いて、選択的にＢＭＰまたはアクチビンと複合体化し、それらの生物学的活性を崩壊させる（Ｗ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ（１９９９）ＴＩＧ  １５（１）３〜６）。多数のこれら天然のアンタゴニストが同定され、そして配列の相違に基づき、このアンタゴニストは、主要な配列保存の欠落に起因して、独立して進化してきたことを示す。これらのアンタゴニストの先行する研究は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４と相互作用することおよび中和することに対する異なる優先を強調した。脊椎動物において、アンタゴニストとしては、ｎｏｇｇｉｎ、コルジン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、コルジン様、ホリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、ＦＳＲＰ、ＤＮＡ／Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質ファミリー、およびスクレロスチン（ＳＯＳＴ）（Ｂａｌｅｍａｎｓら、前出およびその中に引用される参考文献を参照のこと）が挙げられる。拮抗作用または阻害のメカニズムは、別個のアンタゴニストに対しては異なるようである（Ｉｅｍｕｒａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５  ９３３７−９３４２）。
【００７５】
ＢＭＰアンタゴニストｎｏｇｇｉｎ上の、Ｉ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位はまた、マッピングされてきた。Ｎｏｇｇｉｎは、高い親和性でＢＭＰに結合する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９６）。ｎｏｇｇｉｎ／ＢＭＰ−７複合体構造の研究は、この２つのタンパク質の間の結合相互作用を明らかにした（Ｇｒｏｐｐｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：６３６−４２（２００２））。ＢＭＰシグナル伝達複合体のモデル上のｎｏｇｇｉｎ−ＢＭＰ−７構造の重ね合わせは、ｎｏｇｇｉｎ結合が、ＢＭＰ−７上の両方の結合エピトープ対（すなわち、ＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位およびＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位）を効果的にマスクすることを示した。システインリッチなｎｏｇｇｉｎの骨格配列は、「クリップ」といわれる約２０個のアミノ酸残基（残基２８〜４８）のＮ末端セグメントによって先行される。Ｉ型レセプター結合部位は、ＮｏｇｇｉｎのクリップドメインのＮ末端部分によって塞がれ、そしてＩＩ型レセプター結合部位は、このクリップドメインのカルボキシル末端部分によって塞がれる。ｎｏｇｇｉｎのＣ末端に近いコア領域中の、２つのβ鎖もまた、ＩＩ型レセプター結合部位においてＢＭＰ−７に接触している。この結合様式はｎｏｇｇｉｎダイマーが、ＢＭＰダイマー上の全てのレセプター結合部位（２つのＩ型レセプター結合部位および２つのＩＩ型結合部位）を効率的にブロックすることを可能にする。
【００７６】
（新規ＴＧＦ−β結合タンパク質）
上記のように、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の新規のクラスを提供する。このタンパク質は、ヒトＤＡＮ、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ、およびヒトＣｅｒｂｅｒｕｓ、ならびにＳＣＧＦ（米国特許第５，７８０，２６３号）と比較した場合にほとんど同一のシステイン（ジスルフィド）骨格を有するが、ヌクレオチドレベルではほとんど相同性を有さない（背景の情報については、一般に、Ｈｓｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ａ．Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｅｉｍｏｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｈａｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ．，「Ｔｈｅ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｇｒｅｍｌｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  Ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ  ＢＭＰ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １：６７３−６８３，１９９８を参照のこと）。
【００７７】
ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸分子の新規のクラスの代表的な例は、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００および配列番号１０１に開示される。本明細書中に開示されるポリヌクレオチドは、Ｂｅｅｒと呼ばれるポリペプチドをコードし、これはまた、本明細書中でスクレロスチンまたはＳＯＳＴとも呼ばれる。このクラスの結合タンパク質の代表的なメンバーが、上記ＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、配列番号５および配列番号７）の改変体を包含することもまた、理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、「ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子」（例えば、ＴＧＦ−β結合タンパク質の改変体をコードする単離された核酸分子）は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４６、または配列番号６５の変形であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子をいう。そのような改変体としては、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の天然に生じる多型または対立遺伝子改変体、ならびにこれらのアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含有する合成遺伝子が挙げられる。当業者に公知な種々の基準が、ペプチドまたはポリペプチドにおける特定の位置のアミノ酸が類似しているかどうかを示す。例えば、類似のアミノ酸または保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されているものである。そのような類似の側鎖を有するアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）が挙げられる。分類がより困難であると考えられるプロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＡｌａ）と、性質を共有する。特定の状況において、グルタミンのグルタミン酸への置換またはアスパラギンのアスパラギン酸への置換は、類似の置換であると考えられ得る。なぜなら、グルタミンおよびアスパラギンは、それぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるからである。
【００７８】
ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子のさらなる改変体形態は、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、その遺伝子が、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００または配列番号１０１のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズするかどうかを決定することにより、同定され得る。さらに、ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、システイン骨格を有するタンパク質をコードするはずである。
【００７９】
代替として、ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、配列比較によって同定され得る。本明細書中で使用される場合、２つのアミノ酸配列は、最大の対応に対して整列された場合にその２つのアミノ酸のアミノ酸残基が同じであれば、「１００％のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列は、最大の対応に対して整列された場合にその２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が同じであれば、「１００％のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、標準的なソフトウェアプログラム（例えば、ＤＡＮＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により製造された、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューター計算組に含まれるソフトウェアプログラム）を用いて、実施され得る。最適アラインメントを決定することによって２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２３頁〜１５１頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）における、Ｗｕら（編）、「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」およびＢｉｓｈｏｐ（編）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を参照のこと）。
【００８０】
改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４６または配列番号６５に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するべきであり、そして好ましくは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するべきである。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体は、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００または配列番号１０１に対して少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有することによって、同定され得る。さらに、本発明は、配列番号１または配列番号１００に対して、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を超える同一性を有するＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子改変体を企図する。ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子または改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質を同定するために使用される特定の方法にかかわらず、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質または改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドは、例えば、ＴＧＦ−βタンパク質ファミリーの選択されるメンバーに結合するその能力および／もしくはＴＧＦ−βタンパク質ファミリーの選択されるメンバーのシグナル伝達を阻害するその能力によるか、または抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に対して特異的に結合するその能力によって、機能的に特徴付けられ得る。
【００８１】
本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントを含む。本発明の文脈の中で、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の「機能的フラグメント」とは、ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドの一部をコードする核酸分子をいい、このＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドの一部は、（１）上に示された機能活性を保持するか、または（２）抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に対して特異的に結合するかのいずれかである。例えば、本明細書中に記載されるＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントは、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００または配列番号１０１のヌクレオチド配列の一部を含む。
【００８２】
（２．ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の単離）
ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、例えば、配列番号１に基づくポリヌクレオチドプローブを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、獲得され得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーの調製における第一のステップは、当業者に周知の方法を用いてＲＮＡを単離することである。一般的に、ＲＮＡ単離技術は、細胞を破壊するための方法、ＲＮＡのＲＮａｓｅ関連分解を阻害する手段およびＤＮＡ、タンパク質およびポリサッカリド夾雑物からＲＮＡを分離する方法を提供する。例えば、全ＲＮＡは、液体窒素中で組織を凍結し、その凍結組織を乳鉢および乳棒で粉砕してその細胞を溶解し、その粉砕された組織をフェノール／クロロホルム溶液で抽出してタンパク質を除去し、そして塩化リチウムを用いた選択的遠心分離により残りの不純物からＲＮＡを分離することによって、単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｌｏｇｙ、第３版、４−１頁〜４−６頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９５）［「Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）」］；Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３３頁〜４１頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）［「Ｗｕ（１９９７）」］を参照のこと）。あるいは、全ＲＮＡは粉砕された組織をグアニジニウムイソチオシアネートで抽出し、有機溶媒で抽出し、そして種々の遠心分離を用いて夾雑物からＲＮＡを分離することによって、単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）４−１頁〜４−６頁；Ｗｕ（１９９７）３３頁〜４１頁を参照のこと）。
【００８３】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、好ましくは、全ＲＮＡ調製物から単離される。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、標準的な技術であるオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーを用いて、全ＲＮＡ調製物から単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）４−１１頁〜４−１２頁を参照のこと）。二本鎖ｃＤＮＡ分子は、当業者に周知の技術を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成され得る（例えば、Ｗｕ（１９９７）４１頁〜４６ページを参照のこと）。さらに、市販のキットは、二本鎖ｃＤＮ分子を合成するために使用され得る（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））。
【００８４】
ＴＧＦ−β結合タンパク質ｃＤＮＡクローンを得るための基本的なアプローチは、ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的なｃＤＮＡ分子中で濃縮された、差し引かれたｃＤＮＡライブラリーを構築することによって、改変され得る。差し引かれたライブラリーを構築するための技術は、当業者に周知である（例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：４２３、１９８７における、Ｓａｒｇｅｎｔ、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅｓ」；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９頁〜６５頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）における、Ｗｕら（編）、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｃｔｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」を参照のこと）。
【００８５】
種々のクローニングベクターは、ｃＤＮＡライブラリーの構築のために適切である。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、バクテリオファージ（例えば、λｇｔ１０ベクター）由来のベクターにおいて調製され得る（例えば、Ｈｕｙｎｈら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  λｇｔ１０  ａｎｄ  λｇｔ１１」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｌｏｖｅｒ（編）、４９頁（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５）；Ｗｕ（１９９７）４７頁〜５２頁を参照のこと）。あるいは、二本鎖ｃＤＮＡ分子は、プラスミドベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＬａｍｂｄａＧＥＭ−４（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）または他の市販のベクター）中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手され得る。
【００８６】
クローニングされたｃＤＮＡ分子を増幅するために、上記ｃＤＮＡライブラリーは、標準的な技術を用いて、原核生物宿主中に挿入される。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５細胞中に導入され得、この細胞は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手され得る。
【００８７】
ヒトゲノムＤＮＡライブラリーは、当該分野において周知の手段によって調製され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）５−１頁〜５−６頁；Ｗｕ（１９９７）３０７頁〜３２７頁を参照のこと）。ゲノムＤＮＡは、界面活性剤Ｓａｒｋｏｓｙｌを用いて組織を溶解し、プロテイナーゼＫを用いてその溶解物を消化し、遠心分離によってその溶解物から不溶性の残屑を取り除き、イソプロパノールを用いてその溶解物から核酸を沈殿させ、そして塩化セシウム濃度勾配上で再懸濁されたＤＮＡを精製することによって、単離され得る。
【００８８】
ゲノムライブラリーの生成のために適切なＤＮＡフラグメントは、ゲノムＤＮＡのランダムな切断によるかまたは制限エンドヌクレアーゼを用いたゲノムＤＮＡの部分的な消化によって得られ得る。ゲノムＤＮＡフラグメントは、従来技術（例えば、適切な終末を生じるための制限酵素消化の使用、ＤＮＡ分子の所望されない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理の使用および適切なリガーゼを用いたライゲーション）に従って、ベクター（例えば、バクテリオファージベクターまたはコスミドベクター）中に挿入され得る。このような操作のための技術は、当該分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）５−１頁〜５−６頁；Ｗｕ（１９９７）３０７頁〜３２７頁を参照のこと）。
【００８９】
ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸分子はまた、本明細書中に記載されるように、ヒトＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、以降同じに得られ得る。ＰＣＲを用いてライブラリーをスクリーニングするための一般的な方法は、例えば、Ｙｕら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｈｉｔｅ（編）、２１１頁〜２１５頁（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）によって提供される。さらに、ＰＣＲを使用して関連遺伝子を単離するための技術は、例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎ、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅ  Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｈｉｔｅ（編）、３１７頁〜３３７頁（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）によって記載される。
【００９０】
あるいは、ヒトゲノムライブラリーは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）およびｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような商業的な供給源から入手され得る。ｃＤＮＡクローンまたはゲノムクローンを含むライブラリーは、本明細書中で記載されるような標準的な方法および当該分野で公知の標準的な方法を用いて、配列番号１に基づく１つ以上のポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）６−１頁〜６−１１頁を参照のこと）。
【００９１】
本明細書に記載されるように産生された抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体はまた、ｃＤＮＡライブラリーからＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離するために使用され得る。例えば、上記抗体は、λｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得るか、または上記抗体は、ハイブリッドの選択および翻訳に続く免疫スクリーニングのために使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）６−１２頁〜６−１６頁；Ｍａｒｇｏｌｉｓら、「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  λ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｂｅｓ」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、１頁〜１４頁（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照のこと）。
【００９２】
ＴＧＦ−β結合タンパク質ｃＤＮＡまたはＴＧＦ−β結合タンパク質ゲノムフラグメントの配列は、標準的な方法を用いて決定され得る。さらに、ＴＧＦ−β結合タンパク質プロモーターまたは調節エレメントを含むゲノムフラグメントの同定は、よく確立された技術（例えば、欠失分析）を用いて達成され得る（例えば、一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、前出を参照のこと）。
【００９３】
代替として、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子は、双方からプライミングする長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書中に記載されるヌクレオチド配列を用いて、ＤＮＡ分子を合成することによって得られ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）８−８頁〜８−９頁を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技術は、少なくとも長さ２キロベースのＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１１３１、１９９３；Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２６６、１９９３；Ｄｉｌｌｏｎら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｈｉｔｅ（編）、２６３頁〜２６８頁（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）；Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：２９９、１９９５）。
【００９４】
（３．ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の生成）
改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子をコードする核酸分子は、本明細書中に記載される手順を用いて、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００または配列番号１０１に基づくヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブで種々のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、得られ得る。ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子改変体はまた、合成的に構築され得る。例えば、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４６または配列番号６５のアミノ酸配列と比較して１つの保存的なアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子が、考案され得る。すなわち、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４６または配列番号６５の１つ以上のアミノ酸置換を含む改変体が、得られ得、ここで、アルキルアミノ酸は、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列中のアルキルアミノ酸に置換され、芳香族アミノ酸は、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列中の芳香族アミノ酸に置換され、硫黄含有アミノ酸は、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸に置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸は、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列中のヒドロキシ含有アミノ酸に置換され、酸性アミノ酸は、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列中の酸性アミノ酸に置換され、塩基性アミノ酸は、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列中の塩基性アミノ酸に置換され、あるいは、二塩基性一カルボン酸アミノ酸は、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列中の二塩基性一カルボン酸アミノ酸に置換される。一般的なアミノ酸のなかでも、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の群：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジンの各々の中のアミノ酸の間の置換によって示される。このような置換の作製において、可能な場合、図１に概説されるシステイン骨格を維持することが重要である。
【００９５】
ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子中の保存的なアミノ酸変化は、ヌクレオチドを、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００または配列番号１０１に列挙されるヌクレオチドに置換することによって導入され得る。このような「保存的なアミノ酸」改変体は、例えば、オリゴヌクレオチド誘発性変異誘発、リンカースキャニング（ｌｉｎｋｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いた変異誘発などによって得られ得る（Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）８−１０頁〜８−２２頁；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編）、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）を参照のこと）。このような改変体の機能的な能力は、標準的な方法（例えば、本明細書中に記載されるようなアッセイ）を用いて決定され得る。あるいは、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドは、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に特異的に結合する能力によって同定され得る。
【００９６】
核酸分子の慣習的な欠失分析は、ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸分子の「機能的なフラグメント」を得るために実施され得る。図示されるように、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子は、一連の入れ子式の欠失を得るために、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで消化され得る。次いで、そのフラグメントは、適切なリーディングフレームの発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドは、単離され、そして活性または抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化の１つの代替は、オリゴヌクレオチド誘発性変異誘発を使用して、欠失または終止コドンを導入し、所望のフラグメントの生成を指定することである。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。
【００９７】
タンパク質の機能分析のための標準的な技術は、例えば、Ｔｒｅｕｔｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：１１３、１９９３；Ｃｏｎｔｅｎｔら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４２ｋＤａ  ２−５Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ＩＳＩＲ−ＴＮＯ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｎｔｅｌｌ（編）、６５頁〜７２頁（Ｎｉｊｈｏｆｆ  １９８７）；Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ、「Ｔｈｅ  ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．１、Ｂｏｙｎｔｏｎら、（編）、１６９頁〜１９９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）；Ｃｏｕｍａｉｌｌｅａｕら、Ｊ．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９２７０、１９９５；Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５２９１、１９９５；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１２９５、１９９５；Ｍｅｉｓｅｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３０：１、１９９６に記載される。
【００９８】
本発明はまた、保存的アミノ酸変化を有する、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の機能的なフラグメントを企図する。
【００９９】
ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、上で議論されるような配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００または配列番号１０１のヌクレオチド配列および配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４６または配列番号６５のアミノ酸配列との同一性レベルを決定することによって、構造に基づいて同定され得る。構造に基づいて改変体遺伝子を同定することの代替的なアプローチは、改変体の可能性があるＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子をコードする核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１００または配列番号１０１のヌクレオチド配列または長さが少なくとも１５ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドのその一部を有する核酸分子にハイブリダイズし得るか否かを決定することである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例示として、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質配列を有する核酸分子は、例えば、５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝１８０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７））、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ＝２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン）および０．５％ＳＤＳを含む緩衝液中で、５５℃〜６０℃で一晩インキュベーションされて、配列番号１由来の配列を有する核酸分子のフラグメントに結合し得る。高ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションの後の洗浄は、代表的に、０．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）または０．５×ＳＳＰＥ中で、５５℃〜６０℃で実施される。
【０１００】
改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の特定のヌクレオチド配列に関わらず、上記遺伝子は、その機能的な活性によってかまたは抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に特異的に結合する能力によって特徴付けられ得る、ポリペプチドをコードする。さらに具体的には、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子は、本明細書中に記載されるヒトＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドの活性の少なくとも５０％、そして好ましくは、６０％超、７０％超、８０％超または９０％超を示すポリペプチドをコードする。
【０１０１】
（４．培養細胞中でのＴＧＦ−β結合タンパク質の生成）
ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子を発現するために、上記ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクター中での転写発現を制御する調節配列に作動可能に連結され、次いで、宿主細胞中に導入されなければならない。転写調節配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列および上記発現ベクターを保有する細胞の選択に適切なマーカー遺伝子を含み得る。真核細胞における外来タンパク質の生成のために適切な発現ベクターは、代表的に、以下を含む（１）細菌性複製起点および抗生物質耐性マーカーをコードして、細菌宿主中での発現ベクターの増殖および選択を提供する、原核生物ＤＮＡエレメント；（２）転写開始を制御する、真核生物ＤＮＡエレメント（例えば、プロモーター）；ならびに（３）転写物のプロセシングを制御する、ＤＮＡエレメント（例えば、転写終結／ポエリアデニル化配列）。
【０１０２】
本発明のＴＧＦ−β結合タンパク質は、好ましくは、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物細胞の例としては、アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）、ヒト胚性腎臓細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、乳仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝細胞癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）およびマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。
【０１０３】
哺乳動物宿主について、上記転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス源（例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど）に由来し得、ここで、その調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関連する。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、哺乳動物遺伝子（例えば、アクチン遺伝子、コラーゲン遺伝子、ミオシン遺伝子およびメタロチオネイン遺伝子）から得られ得る。
【０１０４】
転写調節配列は、ＲＮＡ合成を開始させるために充分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子［Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３、１９８２］、疱疹ウイルスのＴＫプロモーター［ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ  ３１：３５５、１９８２］、ＳＶ４０初期プロモーター［Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４、１９８１］、ラウス肉腫ウイルスプロモーター［Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７、１９８２］、サイトメガロウイルスプロモーター［Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１、１９８０］およびマウス乳腺癌ウイルスプロモーターが挙げられる（一般的に、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１６３頁〜１８１頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）を参照のこと）。
【０１０５】
あるいは、原核生物プロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）は、その原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合に、哺乳動物細胞において、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子発現を制御するために使用され得る（Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９、１９９０；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５、１９９１）。
【０１０６】
ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子はまた、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞中で発現され得る。原核生物宿主においてＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドを発現するために使用され得る適切なプロモーターは、当業者に周知であり、そしてこれらのプロモーターとしては、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｓｐ６ポリメラーゼおよびＴ７ポリメラーゼを識別可能なプロモーター、バクテリオファージλのＰＲプロモーターおよびＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｌａｃＺプロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーターおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７、１９８７、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  、第４版（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｓ  １９８７）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）によって概説される。
【０１０７】
好ましい原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉの適切な株としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ５ＩＦ’、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１０Ｂ／ｐ３、ＤＨ１１Ｓ、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８、ＲＲ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１およびＥＲ１６４７が挙げられる（例えば、Ｂｒｏｗｎ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）を参照のこと）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓの適切な株としては、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０およびＢ１７０が挙げられる（例えば、Ｈａｒｄｙ、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇｌｏｖｅｒ（編）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照のこと）。
【０１０８】
原核生物宿主中でタンパク質を発現するための方法は、当業者に周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、１５頁（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｗａｒｄら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１３７頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；およびＧｅｏｒｇｉｏｕ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１０１頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）を参照のこと）。
【０１０９】
バキュロウイルス系は、クローニングされたＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子を昆虫細胞中に導入するための有効な手段を提供する。適切な発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に基づいており、そして周知のプロモーター（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）７０プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルスの前初期遺伝子プロモーター（ｉｅ−Ｉ）および後初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１０プロモーターならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａメタロチオネインプロモーター）を含む。適切な昆虫宿主細胞としては、ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１由来の細胞株、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａさなぎ卵巣細胞株（例えば、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥおよびＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞が挙げられる。バキュロウイルス系において組み換えタンパク質を生成するための確立された技術は、Ｂａｉｌｅｙら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｕｒｒａｙ（編）、１４７頁〜１６８頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１）によって、Ｐａｔｅｌら、「Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、２０５頁〜２４４頁（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１６−３７頁〜１６−５７頁によって、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）によって、そしてＬｕｃｋｎｏｗ、「Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１８３頁〜２１８頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって、提供される。
【０１１０】
酵母における発現のためのプロモーターとしては、ＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセラーゼキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）などが挙げられる。多くの酵母クローニングベクターが設計され、そして容易に入手可能である。これらのベクターとしては、ＹＩｐベースのベクター（例えば、ＹＩｐ５ベクター）、ＹＲｐベクター（例えば、ＹＲｐ１７）、ＹＥｐベクター（例えば、ＹＥｐ１３）およびＹＣｐベクター（例えば、ＹＣｐ１９）が挙げられる。当業者は、酵母細胞における発現のために適切な、広範な種々のベクターが存在することを理解する。
【０１１１】
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、インタクトな植物組織または単離された植物細胞中に導入され得る。植物組織を培養するための一般的な方法は、例えば、Ｍｉｋｉら、「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌｉｃｋら（編）、６７頁〜８８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）によって提供される。
【０１１２】
発現ベクターは、種々の標準的な技術（リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、微小発射物媒介性送達（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、エレクトロポレーションなど）を用いて宿主細胞中に導入され得る。好ましくは、上記トランスフェクトされた細胞は、選択され、そして増殖させられて、その宿主細胞ゲノム中に安定に統合された発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。ベクターを真核細胞中に導入するための技術および優性選択可能マーカーを用いてこのような安定な形質転換体を選択するための技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）およびＭｕｒｒｙ（編）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）に記載される。細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞中に発現ベクターを導入するための方法はまた、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）によって提供される。
【０１１３】
哺乳動物細胞系によって生成される外来タンパク質を発現し、そして回収するための一般的な方法は、例えば、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１６３頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって提供される。細菌系によって生成されたタンパク質を回収するための標準的な技術は、例えば、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、５９頁〜９２頁（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって提供される。バキュロウイルス系から組み換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）に記載される。
【０１１４】
より一般的には、ＴＧＦ−β結合タンパク質は、標準的な技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど）によって単離され得る。ＴＧＦ−β結合タンパク質の単離および精製におけるさらなる改変が、当業者によって考案され得る。例えば、以下に記載されるように得られる抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、免疫アフィニティー精製によって大量のタンパク質を単離するために使用され得る。
【０１１５】
（５．ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗体の産生）
本発明は、本明細書中で詳細に記載されるように、スクレロスチンに特異的に結合する抗体を提供する。ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗体は、例えば、抗原として発現ベクターの産物を用いることによって得られ得る。スクレロスチンに特異的に結合する抗体はまた、本明細書中で提供されるスクレロスチンポリペプチド配列（配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４６および配列番号６５）のうちの任意の１つに由来するペプチドを用いることによって、調製され得る。特に有用な抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４６および配列番号６５のＴＧＦ−β結合タンパク質と、「特異的に結合する」が、他のＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、Ｄａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＳＣＧＦまたはＧｒｅｍｌｉｎ）に対しては特異的に結合しない。本発明の抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）は、ポリクローナル抗体であってものあるいは特に、モノクローナル抗体であってもよい。上記抗体は、任意の免疫グロブリンクラスに属し得、そして例えば、ＩｇＧ抗体（ＩｇＧのアイソタイプを含み、このアイソタイプは、ヒト抗体については、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４として当該分野で公知である）；ＩｇＥ抗体；ＩｇＭ抗体；またはＩｇＡ抗体であり得る。抗体は、家禽または哺乳動物から得られ得、好ましくは、例えば、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体または他の霊長類抗体に由来し得る。所望される場合、上記抗体は、内在化抗体（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であ得る。
【０１１６】
組み換えＴＧＦ−β結合タンパク質に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ」Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ、編）、１頁〜５頁（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、１５頁（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照のこと）。ポリクローナル抗体は、代表的に、動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒツジ）において生じるが、本発明の抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体はまた、ヒトより下等な霊長類抗体に由来し得る。ヒヒにおいて診断的および治療的に有用な抗体を生じるための一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開番号ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０、１９９０において見られ得る。
【０１１７】
上記抗体は、少なくとも１つの可変領域ドメインを含むべきである。上記可変領域ドメインは、任意の大きさまたは任意のアミノ酸組成からなり得、そして一般的に、少なくとも１つのフレームワーク配列にはめ込まれた超可変アミノ酸配列を含み、この超可変アミノ酸配列は、抗原結合を担う。一般的な用語において、上記可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）可変ドメインおよび／または軽鎖（ＶＬ）可変ドメインの任意の適切な配置であり得る。従って、例えば、上記Ｖ領域ドメインは、モノマーであり得、そしてＶＨドメインであってもＶＬドメインであってもよく、ここで、これらのＶＨドメインまたはＶＬドメインは、独立して、受容可能な親和性で抗原に結合し得る。あるいは、上記Ｖ領域ドメインは、ダイマーであり得、そしてＶＨ−ＶＨダイマー、ＶＨ−ＶＬダイマーまたはＶＬ−ＶＬダイマーを含み得、ここで、そのＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、非共有結合する（本明細書中の以下で、ＦＶと省略される）。しかし、所望される場合、上記鎖は、直接的にか（例えば、上記２つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介して）、またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介してかのいずれかで、共有結合的に結合されて、単鎖ドメイン（本明細書中の以下で、ｓｃＦＶと省略される）を形成し得る。
【０１１８】
上記可変領域ドメインは、天然に存在する任意の可変ドメインまたはその操作されたバージョンであり得る。操作されたバージョンは、組換えＤＮＡ操作技術を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。このような操作されたバージョンとしては、例えば、天然の抗体可変領域から、その天然の抗体のアミノ酸配列中またはその配列への挿入、欠失、もしくは変更により作製されたものが挙げられる。この型の特定の例としては、操作された可変領域ドメインが挙げられ、この可変領域は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、そして必要に応じて、１つの抗体由来の１以上のフレームワークアミノ酸および第２の抗体由来の可変領域ドメインの残部を含む。
【０１１９】
この可変領域ドメインは、少なくとも１つの、他の抗体ドメインもしくはそのフラグメントに対してＣ末端アミノ酸で共有結合され得る。従って、例えば、ＶＨドメインが可変領域ドメインに存在する場合、これは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインもしくはそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメインもしくはそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、上記抗体はＦａｂフラグメントであり得、上記抗体結合ドメインが、ＣＨ１およびＣＫドメインのＣ末端にそれぞれ共有結合的に連結された、関連するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。例えば、Ｆａｂ’フラグメントにおいて見られるようなヒンジ領域ドメインを提供する目的で、またはさらなるドメイン（例えば、抗体ＣＨ２ドメインおよび抗体ＣＨ３ドメイン）を提供する目的で、このＣＨ１ドメインは、さらなるアミノ酸を用いて延長され得る。
【０１２０】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ鎖連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製され得る（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６，１９９１；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら（編）、１６６頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）における、Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；およびＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｂｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら（編）、１３７頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）における、Ｗａｒｄら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」を参照のこと）。
【０１２１】
本発明において使用するための抗体は、一般的に、（従来の免疫手順および細胞融合手順により調製される）モノクローナルであり得るか、または、モノクローナル抗体に由来するフラグメントの場合には、任意の適切な標準的な化学的技術（例えば、還元）または酵素的切断および／もしくは消化技術（例えば、ペプシンを用いる処理））を用いて得られ得る。より具体的には、モノクローナル抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、種々の技術を用いて生成され得る。特定の抗原に対する齧歯類のモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得られ得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５；およびＣｏｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１〜２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）［「Ｃｏｌｉｇａｎ」］；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第２版，Ｇｌｏｖｅｒら（編）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、９３頁におけるＰｉｃｋｓｌｅｙら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ」を参照のこと）。
【０１２２】
簡単に述べると、モノクローナル抗体は、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子産物を含有する組成物をマウスに注射する工程、血清サンプルを取り出すことにより抗体産物の存在を確認する工程、脾臓を取り出してＢリンパ球を得る工程、このＢリンパ球を骨髄性細胞と融合させ、ハイブリドーマを生成する工程、このハイブリドーマをクローニングする工程、上記抗原に対する抗体を産生するポジティブクローンを選択する工程、上記抗原に対する抗体を産生するクローンを培養する工程、およびこのハイブリドーマ培養物から抗体を単離する工程により得られ得る。
【０１２３】
さらに、本発明の抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、ヒトモノクローナル抗体由来であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原チャレンジに応答して特定のヒト抗体を生み出すように操作されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術では、ヒト重鎖の座およびヒト軽鎖の座のエレメントは、内因性の重鎖および軽鎖の座の標的化破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウスの株に導入される。このトランスジェニックマウスは、ヒトの抗原に対して特異的なヒトの抗体を合成し得、そしてこのマウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生み出すために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６，１９９４；およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４に記載されている。
【０１２４】
モノクローナル抗体は、十分に確立された種々の技術によりハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ−排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１頁〜２．７．１２頁および２．９．１頁〜２．９．３頁；Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＩｇＧ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１０巻、７９頁〜１０４頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照のこと）。
【０１２５】
特定の用途のために、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体のフラグメントを調製することが望ましくあり得る。このような抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質加水分解により得られ得る。抗体フラグメントは、従来の方法により、抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化により得られ得る。例示として、抗体フラグメントは、ペプシンを用いる抗体の酵素的切断により生み出され、Ｆ（ａｂ’）２と表記される５Ｓのフラグメントを提供し得る。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されて、３．５ＳのＦａｂ’の１価フラグメントを生成し得る。必要に応じて、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断に由来するスルヒドリル基に対する保護基を用いて実行され得る。代替として、ペプシンを用いる酵素的切断は、２個の１価のＦａｂフラグメントおよび１個のＦｃフラグメントを直接的に生み出す。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３．１１９，１９５９、Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）により、ならびにＣｏｌｉｇａｎらにより、２．８．１頁〜２．８．１０頁および２．１０頁〜２．１０．４頁に記載されている。
【０１２６】
このフラグメントがインタクトな抗体により認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法（例えば、１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断）、または他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝的技術もまた使用され得る。
【０１２７】
あるいは、この抗体は、組換えＤＮＡ技術の使用により得られる組換え抗体または操作された抗体であり得、この組換えＤＮＡ技術は、抗体の可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡの操作および再発現を含む。このようなＤＮＡは、公知であり、そして／またはＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリー（Ｃｈｉｓｗｅｌｌら、Ｄ  ＪおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．Ｔｉｂｔｅｃｈ．１０  ８０〜８４（１９９２）を参照のこと）が挙げられる）もしくは所望のものが合成され得るところから容易に入手可能である。標準的な分子生物学的手順および／または化学的手順が、（例えば、コドンを導入してシステイン残基をつくり、所望の通りに他のアミノ酸もしくはドメインを改変するか、付加するか、または欠失させるように）ＤＮＡを配列決定し、そしてＤＮＡを操作するために使用され得る。
【０１２８】
可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡを含む１種以上の複製可能な発現ベクターが調製され得、そして適切な細胞系（例えば、非産生性骨髄種細胞系（例えば、マウスＮＳＯ系もしくは細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換するために使用され得、これらにおいて、上記抗体が生じる。効率的な転写および翻訳を達成するために、各ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な調節配列（特に、可変ドメイン配列に作動可能に連結されたプロモーター配列およびリーダー配列）を含むべきである。このようにして抗体を産生するための特定の方法は、一般的に周知であり、そして日常的に使用される。例えば、基本的な分子生物学的手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）により記載され；ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３，（１９７７））およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ配列決定ハンドブックに記載の通りに実行され；特定部位の突然変異誘発は、Ｋｒａｍｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１，（１９８４））の方法；ｔｈｅ  Ａｎｇｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ  ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｋｕｎｋｅｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２；４８８〜９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜８２（１９８７）に従って実行される。さらに、多くの刊行物が、（例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｔｏｍｂｓ，Ｍ  Ｐ編，１０、第１章、１９９２、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）において、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ＡおよびＡｄａｉｒ，Ｊ  Ｒにより概説されるように、そして国際特許明細書番号ＷＯ  ９１／０９９６７において概説されるように、ＤＮＡの操作、発現ベクターの作製、および適切な細胞の形質転換による抗体の調製に適切な技術を詳述している。
【０１２９】
特定の実施形態において、本発明に従う抗体は、この抗体に結合する１種以上のエフェクター−分子またはレポーター分子を有し得、そして本発明は、このような改変型タンパク質にまで及ぶ。レポーター分子は、検出可能な部分あるいは検出可能な標識（例えば、酵素、細胞傷害性因子または他のレポーター分子（色素、放射性核種、発光基（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）、蛍光基（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）、もしくはビオチンなど））であり得る。このＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、診断用の適用および治療上の適用のために放射標識され得る。抗体の放射標識のための技術は、当該分野において公知である。例えば、Ａｄａｍｓ  １９９８  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  １２：１１〜２１；Ｈｉｌｔｕｎｅｎ  １９９３  Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．３２：８３１〜９を参照のこと。治療上の適用は、以下により詳細に記載され、そしてＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な抗体（もしくはそのフラグメント）の、他の治療用因子と組み合わせての使用を含む。エフェクター分子またはレポーター分子は、利用可能なアミノ酸側鎖、末端アミノ酸、もしくは、存在する場合には、この抗体に位置するカルボキシレート官能基のいずれかを通して、結合され得る（ただし、結合もしくは結合プロセスは、この分子の結合の特異性および有用性に悪影響を及ぼさないものとする）。特定の官能基としては、例えば、遊離アミノ基、遊離イミノ基、遊離チオール基、遊離ヒドロキシル基、遊離カルボキシル基、もしくは遊離アルデヒド基のいずれかが挙げられる。抗体と、エフェクター分子および／またはレポーター分子との結合は、このような基と、エフェクター分子またはレポーター分子における適切な官能基とを介して達成され得る。この結合は、直接的であっても、間隔基（ｓｐａｃｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）または架橋基を通して、間接的であってもよい。
【０１３０】
エフェクター分子としては、例えば、抗腫瘍性因子、毒素（例えば、酵素的に活性な細菌の毒素（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ体外毒素Ａ）または植物起源の毒素およびそれらのフラグメント（例えば、リシンおよびそのフラグメント；植物ゲロニン、Ｂｒｙｏｎｉａ  ｄｉｏｉｃａ由来のブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）など）が挙げられる。例えば、Ｔｈｒｕｓｈら、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：４９〜７１；Ｆｒａｎｋｅｌら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９２６〜３２）を参照のこと；生物学的に活性なタンパク質（例えば、酵素）；核酸およびそのフラグメント（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそのフラグメント）；天然に存在するポリマーおよび合成ポリマー（例えば、ポリサッカライドおよびポリアルキレンポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール））およびその誘導体）；放射性核種（特に、放射性ヨウ素）；およびキレート化金属。適切なレポーター基としては、キレート化金属、蛍光化合物、またはＮＭＲ分光法もしくはＥＳＲ分光法により検出され得る化合物が挙げられる。特に有用なエフェクター基は、カリカエミシン（ｃａｌｉｃｈａｅｍｉｃｉｎ）およびその誘導体である（例えば、南アフリカ特許明細書番号  ８５／８７９４、８８／８１２７および９０／２８３９を参照のこと）。
【０１３１】
多くの他の毒素（化学療法剤、抗有糸分裂因子、抗生物質、アポトーシス誘導剤（すなわち「アポトーゲン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）」、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９〜１３１２を参照のこと）などは、当業者に公知であり、そして本明細書中で提供される例は、例示的であることが意図されており、本発明の範囲および精神を限定するものではない。特定の抗腫瘍性因子としては、細胞傷害性因子および細胞増殖抑制性因子（例えば、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロホスファミド、もしくはウラシルマスタード）およびこれらの誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、またはシスプラチン；代謝拮抗物質（例えば、葉酸、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸、もしくはフルオロクエン酸）、抗生物質（例えば、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンスルフェート）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、カリカエミシン（ｃａｌｉｃｈａｅｍｉｃｉｎ）およびその誘導体、またはエスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）およびその誘導体）；有糸分裂阻害剤（例えば、エトポシド、ビンクリスチンもしくはビンブラスチンおよびこれらの誘導体）；アルカロイド（例えば、エリプチシン）；ポリオール（例えば、タキシシン（ｔａｘｉｃｉｎ）−Ｉおよびタキシシン−ＩＩ）；ホルモン（例えば、アンドロゲン（例えば、ドロモスタノロンもしくはテストラクトン）、プロゲスチン（例えば、酢酸メゲストロールもしくは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジメチルスチルベストロールジホスフェート、ポリエストラジオールホスフェートもしくはエストラムスチンホスフェート）または抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；アントラキノン（例えば、ミトキザントロン）、尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）；ヒドラジン（例えば、プロカルバジン）、あるいはイミダゾール（例えば、ダカルバジン）が挙げられる。
【０１３２】
キレート化金属としては、２〜８の配位数を有するプラス２価またはプラス３価の金属のキレートが挙げられる。このような金属の特定の例としては、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）およびスカンジウム（Ｓｃ）が挙げられる。一般的に、この金属は、望ましくは、放射性核種である。特定の放射性核種としては、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄおよび４７Ｓｃが挙げられる。
【０１３３】
キレート化金属は、例えば、任意の適切な多座キレート化剤（例えば、非環式もしくは環式の、ポリアミン、ポリエーテル（例えば、クラウンエーテルおよびその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；ならびにカルボン酸誘導体）を用いてキレート化された、上記の金属の型のうちのいずれか１つであり得る。一般的に、キレート化剤の型は、使用する金属に依存する。しかし、本発明に従って結合されるキレート化剤の特に有用な基の１つは、非環式および環式の、ポリアミン、特に、ポリアミノカルボン酸（例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸およびこの誘導体）ならびに大環状アミン（例えば、環式トリ−アザ誘導体および環式テトラ−アザ誘導体（例えば、国際特許明細書番号ＷＯ  ９２／２２５８３に記載の通り）、ならびにポリアミド、特にデスフェリオキサミンおよびこの誘導体を含む。
【０１３４】
抗体におけるチオール基が結合点として使用される場合、これは、エフェクター分子またはレポーター分子に存在するチオール反応基を用いる反応を通して達成され得る。このような基の例としては、α−ハロカルボン酸またはα−ハロエステル（例えば、ヨードアセトアミド）、イミド（例えば、マレイミド）、ビニルスルホンもしくはジスルフィドが挙げられる。これらおよび他の適切な連結手順は、国際特許明細書番号ＷＯ  ９３／０６２３１、ＷＯ  ９２／２２５８３、ＷＯ  ９０／０９１１９５およびＷＯ  ８９／０１４７６に一般的にかつより詳細に、記載されている。
【０１３５】
（骨密度を増加させる分子を選択するためのアッセイ）
上に議論されるように、本発明は、骨密度を増加し得る化合物を選択および／または単離するための方法を提供する。例えば、本発明の１つの局面内では、選択された分子（例えば、候補因子）が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）選択された分子と、ＴＧＦ−β結合タンパク質およびＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の選択されたメンバーとを混合する工程、（ｂ）この選択された分子が、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質によりシグナル伝達を刺激する工程、またはＴＧＦ−β結合タンパク質の少なくとも１つのメンバーへの結合を阻害する工程、を包含する。特定の実施形態内では、この分子は、間充織細胞の分化のポジティブレギュレーターとして機能するＴＧＦ−βの能力を増強する。
【０１３６】
本発明の他の局面内では、選択された分子（候補因子）が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）選択された分子を、ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞に曝す工程（接触させる工程、混合する工程、あわせる工程）、および（ｂ）上記曝された細胞において、ＴＧＦ−β結合タンパク質の発現（または活性）が減少するか否か、あるいはＴＧＦ−β結合タンパク質の活性が減少するか否か、ならびにそれから、この化合物が、骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定する工程、を包含する。１つの実施形態では、上記細胞は、骨生検材料由来の自発的に形質転換されたかまたは形質転換されていない正常なヒトの骨およびラットの頭蓋骨骨芽細胞からなる群より選択される。ＴＧＦ−β結合タンパク質の発現のレベルを検出するための方法が、当該分野で公知であり、本明細書に記載される広範な種々のアッセイフォーマットで実行され得る。イムノアッセイは、ＴＧＦ−β結合タンパク質の発現を検出し、そして定量化するために使用され得、これとしては、例えば、逆流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロットアッセイ（例えば、ドットブロットアッセイおよびウエスタンブロット）、阻害アッセイもしくは競合アッセイ、ならびにサンドウィッチアッセイ（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号、および同４，４８６，５３０号を参照のこと；また、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（前出）も参照のこと）が挙げられ得る。このようなイムノアッセイは、ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な抗体（例えば、本明細書中に記載される抗スクレロスチン抗体）を使用しても、または上記ＴＧＦ−β結合タンパク質に結合されるレポーター分子に特異的な抗体を使用してもよい。ポリペプチド発現のレベルもまた、ＴＧＦ−β結合タンパク質リガンドに結合し得るＴＧＦ−β結合タンパク質の量を定量化することにより決定され得る。例として、サンプル中でスクレロスチンをＢＭＰに結合することは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により検出され得る。あるいは、特定のＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現のレベルが、定量され得る。
【０１３７】
このようなアッセイの代表的な実施形態が、以下の実施例５および実施例６に提供される。簡潔に述べると、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのファミリーメンバーまたはＴＧＦ−β結合タンパク質が、まず固相に結合され、続いて、候補分子が加えられる。次いで、標識された、上記ＴＧＦ−βスーパーファミリーのファミリーメンバーまたはＴＧＦ−β結合タンパク質がこのアッセイに加えられ（すなわち、この標識されたポリペプチドは、その固相に結合されたいずれかのポリペプチドに対しても、リガンドである。上記固相が洗浄され、固体支持体上の、結合されたＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの量もしくは標識されたＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの量または結合されたＴＧＦ−β結合タンパク質もしくは標識されたＴＧＦ−β結合タンパク質が、決定される。本明細書中で記載されるように、骨鉱物含有量を増加させることにおける使用に適切な分子は、ＴＧＦ−β結合タンパク質とＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーとの結合を、統計的に有意な様式で減少させる分子である。明らかに、本発明内の、使用に適切なアッセイは、実施例２および実施例３に記載される実施形態に限定されるべきではない。特に、多くのパラメーターが、（例えば、ＴＧＦ−βの固相への結合により、または固相の剥離により）全体的に変更され得る。
【０１３８】
本発明の他の局面内では、選択された分子が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）選択された分子（候補薬剤）を、ＴＧＦ−βを発現する細胞に曝す（接触させる、混合させる、合わせる）工程、および（ｂ）上記曝された細胞由来のＴＧＦ−βの活性が、変化するかどうかを決定し、そしてそれから上記化合物が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定する工程、を包含する。本明細書に記載される方法と同様に、選択された試験化合物に起因するＴＧＦ−β結合タンパク質の発現の変化を評価するために種々の方法が利用され得る。本発明の１つの実施形態では、候補薬剤は、本明細書に開示されるＴＧＦ−β結合タンパク質スクレロスチンに結合する抗体である。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体を同定するための方法が提供され、この方法は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を、ＳＯＳＴペプチド（本明細書中に開示されるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）と、抗体プラス（＋）ＳＯＳＴ（抗体／ＳＯＳＴ）複合体の形成を可能にする条件下で、これを可能にするのに十分な時間接触させ、次いで、ＳＯＳＴ／抗体複合体のレベルを検出（例えば、その量を定量）し、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体の存在を決定する工程を包含する。この方法は、ＳＰＲを用いて実行されても、または当該分野で公知であり、本明細書中で開示される任意の数の異なるイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、イムノブロットなどが挙げられる）を用いて実行されてもよい。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路としては、ＢＭＰが、細胞上のＩ型レセプターおよびＩＩ型レセプターに結合し、骨鉱物含有量を調節する経路を刺激または誘導するシグナル伝達経路が挙げられる。本発明の特定の好ましい実施形態では、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体は、骨鉱物含有量を増加するための経路を刺激するか、または高める。このような抗体は、本明細書中に開示される方法を用いて同定され得、抗体とＳＯＳＴ特異的ペプチドとの結合を検出し得る。
【０１４０】
本発明の方法はまた、抗体がＢＭＰに結合するＳＯＳＴの領域または部分領域に位置するＳＯＳＴペプチド（例えば、ＳＯＳＴのアミノ末端のペプチドならびにアミノ末端アミノ酸残基およびＳＯＳＴのコア領域（ドッキングコア）（例えば、配列番号４７〜配列番号６４、配列番号６６〜配列番号７３、および配列番号９２〜配列番号９５）の一部を含むペプチド）に結合するか否かを検出することにより、ＢＭＰとＳＯＳＴポリペプチドとの結合を弱化するか、阻害するか（競合的に阻害することを含む）、または妨害する抗体を同定するために使用され得る。本発明の方法はまた、ＳＯＳＴホモダイマーの形成を、弱化するか、妨害するか、または阻害する抗体を同定するために使用され得る。ＳＯＳＴに特異的に結合するこのような抗体は、この抗体と、ＳＯＳＴのコア領域またはカルボキシ末端領域（例えば、配列番号７４〜９１および９６〜９９）に由来するペプチドとの結合を検出することにより同定され得る。
【０１４１】
本発明の別の実施形態では、選択された分子が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）選択された分子（候補薬剤）と、ＴＧＦ−β結合タンパク質およびＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の選択されたメンバーとを、混合するかまたは接触させる工程、（ｂ）この選択された分子がＴＧＦ−βファミリーのタンパク質のシグナル伝達をアップレギュレートするか、またはＴＧＦ−β結合タンパク質と上記ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質との結合を阻害するかを決定する工程を包含する。特定の実施形態の中では、この分子は、ＴＧＦ−βが、間葉細胞の分化のポジティブレギュレーターとして機能する能力を増強する。
【０１４２】
上に記載される方法と同様に、選択された試験化合物に起因するＴＧＦ−βの刺激を評価するために、種々の方法が用いられ得る。１つのこのような代表的な１つの方法が、実施例６において以下に提供される（Ｄｕｒｈａｍら、Ｅｎｄｏ．１３６：１３７４〜１３８０もまた参照のこと）。
【０１４３】
本発明のなお他の局面の中では、選択された分子（候補薬剤）が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され得、この方法は、選択された分子が、ＴＧＦ−β結合タンパク質と骨またはそのアナログとの結合を阻害するか否かを決定する工程を包含する。本明細書中で用いられる場合、骨またはそのアナログとは、ヒドロキシアパタイト、または粉末形態の骨、骨粉、またはインタクトな骨からなる表面をいうことが理解されるべきである。上記の方法と同様に、多種多様な方法が、ＴＧＦ−β結合タンパク質の骨マトリックスへの局在化を阻害するために使用され得る。１つのこのような代表的な方法が、実施例７に以下に提供される（Ｎｉｃｏｌａｓら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．４７：２０６〜１２（１９９５）もまた参照のこと）。
【０１４４】
本発明の１つの実施形態では、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＧＦ−βファミリーメンバーと上記スクレロスチンポリペプチドとの結合を競合的に阻害し得る。上記抗体または抗体フラグメントの、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー（例えば、ＢＭＰ）とスクレロスチンとの結合を弱化またはブロックする能力は、本明細書に記載される任意の方法に従って決定され得る。スクレロスチンに特異的に結合する、抗体およびそのフラグメントは、スクレロスチンホモダイマーの形成を弱化させることにより、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーとスクレロスチンとの結合を、弱化、ブロックまたは妨害し得る。スクレロスチンに特異的に結合する抗体はまた、スクレロスチンがＢＭＰに結合するのを阻害するか、または弱化することにより、スクレロスチンの活性を同定するために使用され得る。あるいは、上記抗体またはそのフラグメントは、細胞ベースのアッセイ中に組み込まれ得るか、または、スクレロスチンが既定の活性を有する動物モデル中に組み込まれ、抗体がその活性を変化（統計的に有意な様式で、増加または減少）させるか否かを決定し得る。スクレロスチンに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメントは、シグナル伝達経路において、このような抗体の効果を試験するために使用され得、これにより上記シグナル伝達経路を調節（刺激または阻害）し得る。好ましくは、抗体とＳＯＳＴとの結合は、シグナル伝達経路の刺激または誘導をもたらす。
【０１４５】
本明細書において引用される方法は、個々の試験分子の分析を参照し得るが、本発明は、それに限定されるべきではない。特に、選択された分子は、化合物の混合物中に含有され得る。したがって、引用される方法は、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合を阻害する分子を単離する工程をさらに包含し得る。
【０１４６】
（候補分子）
多種多様な分子が、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合を阻害する、その能力についてアッセイされ得る。以下でより詳細に考察される代表例としては、有機分子（例えば、有機低分子）、タンパク質もしくはペプチド、および核酸分子が挙げられる。本明細書において記載される候補分子が本明細書において記載されるアッセイに利用され得ることが、以下の考察から証明されるはずである。このような分子が種々の診断設定および治療設定に利用され得ることもまた、容易に明らかになるはずである。
【０１４７】
（１．有機分子）
多くの有機低分子が、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合を阻害する、その能力についてアッセイされ得る。例えば、本発明の一実施形態の範囲内で、適切な有機分子が、化学物質ライブラリー（このライブラリーにおいては、化学物質は、個別にアッセイされる）、またはコンビナトリアルケミストリーのライブラリー（このライブラリーにおいては、複数の化合物が一度にアッセイされて、次いで逆重畳積分され（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）、最も活性な化合物を決定および単離する）のいずれかから選択され得る。
【０１４８】
このようなコンビナトリアルケミストリーのライブラリーの代表的な例としては、以下によって記載されたものが挙げられる：Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓら「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｓｉｒｅｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、米国特許第５，４６３，５６４号；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｒｒａｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ」、ＷＯ  ９５／０２５６６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら「Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ」、ＷＯ  ９５／２４１８６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ  ｌｉｂｒａｒｙ」、ＷＯ  ９５／３０６４２；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．「Ｎｅｗ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ  ９５／１６９１８；Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ．ら「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、ＷＯ  ９５／１６７１２；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．「Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ」、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ら「Ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ  ９５／１６２０９；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ら「Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ  ９３／２０２４２；Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒ．ら「Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｕｓｅｆｕｌ  ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ」、ＷＯ  ９５／０４２７７；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．およびＤ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，５０６，３３７号；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓ，Ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ，ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、ＷＯ  ９６／００１４８；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｂ．およびＧ．Ｐ．Ｗｅｉ「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ」、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７：４８８７−９０，１９９６；Ｒｕｈｌａｎｄ，Ｂ．ら「Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｄｉ���ｅｒｓｅ  β−Ｌａｃｔａｍｓ」、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３−４，１９９６；Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ら「Ｔｈｅ  Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ４−Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ  ａｎｄ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６：７０７−１２，１９９６。
【０１４９】
（２．タンパク質およびペプチド）
広範なタンパク質およびペプチドが、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合のインヒビターに関する候補分子として、同様に利用され得る。
【０１５０】
（ａ．コンビナトリアルペプチドライブラリー）
ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合の推定上のインヒビターであるペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて得られ得る。このようなライブラリーは、当業者によって調製されるか（例えば、米国特許第４，５２８，２６６号および同第４，３５９，５３５号、ならびに特許協力条約公開番号ＷＯ  ９２／１５６７９、ＷＯ  ９２／１５６７７、ＷＯ  ９０／０７８６２、ＷＯ  ９０／０２８０９を参照のこと）、販売元から購入するか（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｈ．Ｄ．ＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ）のいずれかであり得る。
【０１５１】
（ｂ．抗体）
本発明は、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する抗体、このような抗体を用いるための方法を提供する。本発明はまた、これらの抗体の作製および分析のために使用され得るスクレロスチンポリペプチド免疫原を提供する。この抗体は、ＴＧＦ−β結合タンパク質であるスクレロスチンポリペプチドの、リガンド（特に、骨形態形成タンパク質）への結合をブロックまたは障害するのに有用であり得、そしてまた、１種以上の他のリガンドに対するスクレロスチンポリペプチドの結合をブロックまたは障害し得る。
【０１５２】
タンパク質のＴＧＦ−βファミリーの１以上のメンバー（１種以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が挙げられる）に対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する抗体のような分子が、例えば、ＴＧＦ−βメンバーのＴＧＦ結合タンパク質との結合を除去または防止することによってＴＧＦ−βファミリーメンバーもしくはＢＭＰの活性化を可能にするか、またはＴＧＦ−βファミリーメンバー（１種以上のＢＭＰが挙げられる）のその各々のレセプターに対する結合を可能にする分子を指すことが、理解されるべきである。
【０１５３】
本発明はまた、ＴＧＦ−β結合タンパク質スクレロスチンの１種以上のＢＭＰに対する結合を阻害、防止、または障害し得る抗体またはそのフラグメントを作製および／または同定するのに使用され得る、ペプチド免疫原およびポリペプチド免疫原を提供する。本発明はまた、スクレロスチンホモダイマーの形成を阻害、防止、または障害し得る（例えば、統計学的に有意な様式で減少し得る）抗体またはそのフラグメントを作製および／または同定するのに使用され得る、ペプチド免疫原およびポリペプチド免疫原を提供する。本発明の抗体は、骨のミネラル含有量およびミネラル密度を増加し、それによって骨ミネラル含有量の低下をもたらす多くの状態を回復させるために有用である。骨ミネラル含有量の低下をもたらす状態としては、例えば、疾患、遺伝的素因、骨の使用不足をもたらす事故（例えば、骨折）、骨再吸収に影響する治療もしくは骨形成細胞を殺傷する治療、および通常の加齢が挙げられる。
【０１５４】
宿主動物において抗原性応答を生じる可能性の高いアミノ酸配列を決定するために、スクレロスチン特異的抗体の免疫化および／または分析のために有用なポリペプチドまたはペプチドがまた、当業者に公知の方法および本明細書に記載される方法に従ってＴＧＦ−β結合タンパク質の一次、二次、および三次構造を分析することによって選択され得る。例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７（１９９１）；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９３２−４０（１９８５）を参照のこと。モデリングデータおよびＸ線結晶学的データもまた、ＴＧＦ−β結合タンパク質のいずれの部分もしくは領域がＴＧＦ−β結合タンパク質リガンド（例えば、ＢＭＰ）のいずれの部分と相互作用するかを予測および／または同定するために使用され得る。ＴＧＦ−β結合タンパク質ペプチド免疫原が設計および調製され得、これは、上記相互作用部分もしくは相互作用領域内またはその周りのアミノ酸配列を含む。これらの抗体は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の同じリガンドへの結合をブロックもしくは障害するのに有用であり得、そしてＴＧＦ−β結合タンパク質の１種以上の他のリガンドへの結合もまたブロックもしくは障害し得る。
【０１５５】
本発明によって企図される抗体またはその抗原結合フラグメントとしては、スクレロスチンに特異的に結合し得、そしてＴＧＦ−βポリペプチド（例えば、ＢＭＰ）のスクレロスチンへの結合を競合的に阻害し得る抗体が挙げられる。例えば、本発明によって企図される抗体は、ＢＭＰ上のＢＭＰ  Ｉ型レセプター部位への結合もしくはＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位へのスクレロスチンポリペプチドの結合を競合的に阻害するか、またはＢＭＰ上のＩ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位の両方へのスクレロスチンの結合を競合的に阻害し得る。理論に束縛されることを望むことなく、抗スクレロスチン抗体がＢＭＰポリペプチドのＩ型結合部位および／またはＩＩ型結合部位のスクレロスチンへの結合を競合的に阻害し、スクレロスチンの拮抗活性をブロックする場合、ＢＭＰ上のレセプター結合部位は、Ｉ型レセプターおよびＩＩ型レセプターに結合し、それによって骨鉱化作用を増加させるために利用可能である。ＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、スクレロスチン）とＴＧＦ−βポリペプチド（例えば、ＢＭＰ）との間の結合相互作用は、一般的に、各リガンド対がホモダイマーを形成する場合に生じる。したがって、スクレロスチンに対して特異的な抗体を、スクレロスチンのＢＭＰへの結合を競合的に阻害することによってスクレロスチンのＢＭＰへの結合をブロック、障害または防止するために使用する代わりにか、またはそれに加えて、スクレロスチン特異的抗体は、スクレロスチンホモダイマー形成をブロックまたは障害するために使用され得る。
【０１５６】
例示目的で、ヒトＮｏｇｇｉｎの１つのダイマー（ＢＭＰに高親和性で結合する能力を有するＢＭＰアンタゴニスト；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、上述）は、ヒトＢＭＰ−７の１つのダイマーとの複合体において単離され、そして多波長異常回折（ＭＡＤ）（Ｇｒｏｐｐｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：６３６−４２（２００２））によって分析された。本明細書において考察されるように、この研究は、Ｎｏｇｇｉｎダイマーが、ＢＭＰダイマー上の全レセプター結合部位（２つのＩ型レセプター結合部位および２つのＩＩ型レセプター結合部位）を効率的にブロックし得ることを明らかにした。ＢＭＰ−７に接触するＮｏｇｇｉｎのアミノ酸位置は、他のＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、スクレロスチン（ＳＯＳＴ））とＢＭＰとの間の相互作用をモデリングし、免疫源として使用されてそのような相互作用をブロックまたは障害する抗体を生成するペプチドの設計を補助することに有用であり得る。
【０１５７】
本発明の一実施形態において、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗体結合フラグメントは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）上に位置するＢＭＰ  Ｉ型レセプター結合部位およびＢＭＰ  ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも一方もしくは両方に対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する。これらの抗体が結合するＳＯＳＴ上のエピトープは、ＳＯＳＴポリペプチド（配列番号４６のおよそ１〜５６位のアミノ酸）のＮ末端に位置する連続するアミノ酸配列内を含み得るか、またはそれに含まれ得る。上記ポリペプチドはまた、上記Ｎ末端領域をコア領域に連結する短いリンカーペプチド配列（例えば、配列番号９２（ヒト）および配列番号９３（ラット）において提供されるようなポリペプチド）を含み得る。ヒトＳＯＳＴ（例えば、配列番号４６）のより短い代表的なＮ末端ペプチド配列としては、配列番号４７〜５１が挙げられ、そして代表的ラットＳＯＳＴ（例えば、配列番号６５）ペプチド配列としては、配列番号５７〜６０が挙げられる。
【０１５８】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、例えば、Ｉ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位の１つ以上に対応するＢＭＰアミノ酸に対する結合をブロックまたは阻害することによって、ＳＯＳＴポリペプチドのＢＭＰへの結合をブロックするかまたは競合的に阻害する抗体はまた、ＳＯＳＴのコア領域（配列番号４６のおよそ５７〜１４６位におけるアミノ酸）に対応するアミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合し得る。このコア領域を含むポリペプチドはまた、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかもしくは両方において、例えば、このポリペプチドをキャリア分子に結合するのに有用であり得るシステイン残基を含むように伸長するさらなるアミノ酸を含み得る。ヒトＳＯＳＴおよびラットＳＯＳＴの代表的なコアポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号９４および配列番号９５で示されるアミノ酸配列を含む。このような抗体はまた、より短いポリペプチド配列に結合し得る。代表的ヒトＳＯＳＴコアペプチド配列は、配列番号６６〜６９に提供されており、そして代表的ラットＳＯＳＴコア配列は、配列番号７０〜７３に提供されている。
【０１５９】
別の実施形態において、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ＳＯＳＴホモダイマーの形成を障害する（阻害、防止またはブロックする、例えば、統計学的に有意な様式で減少させる）。ＳＯＳＴとＢＭＰとの間の相互作用は、ＳＯＳＴのホモダイマーおよびＢＭＰのホモダイマーに関与し得るので、ＳＯＳＴのホモダイマー形成を防止または障害する抗体は、それによって骨ミネラル密度を変化させ得る。好ましくは、骨ミネラル密度を増加する。一実施形態において、ＳＯＳＴのコア領域に結合する抗体は、ホモダイマー形成を妨害する。このような抗体はまた、コア領域（例えば、配列番号７４、７５および９８（ヒトＳＯＳＴ）および配列番号７６および９９（ラットＳＯＳＴ））に対応する連続するアミノ酸配列を含むペプチドに結合し得る。ＳＯＳＴポリペプチドのＣ末端領域に（配列番号４６または６５のいずれかのおよそ１４７〜１９０位アミノ酸に）位置するエピトープに結合する抗体もまた、ホモダイマー形成を障害し得る。ヒトＳＯＳＴおよびラットＳＯＳＴの代表的Ｃ末端ポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号９６および配列番号９７で示されるアミノ酸配列を含む。このような抗体はまた、より短いポリペプチド配列に結合し得る。代表的ヒトＳＯＳＴ  Ｃ末端ペプチド配列は、配列番号７８〜８１に提供され、そして代表的ラットＳＯＳＴ  Ｃ末端配列は、配列番号８６〜８８に提供される。
【０１６０】
本明細書に記載される、抗体が特異的に結合し得るＳＯＳＴポリペプチドおよびペプチドは、免疫原として有用である。本発明のこれらの免疫原は、動物を免疫化して、ＢＭＰ上に位置するＳＯＳＴのＮ末端領域に由来するペプチドを含むＩ型レセプター結合部位もしくはＩＩ型レセプター結合部位または両方に特異的に結合する抗体の産生をもたらすか、あるいはＳＯＳＴホモダイマー形成を防止し得る、液性免疫応答を惹起するのに使用され得る。
【０１６１】
免疫原として有用なこのようなＳＯＳＴポリペプチドおよびペプチドはまた、抗体を含有するサンプル（例えば、精製された抗体、抗血清もしくは細胞培養物上清、またはＳＯＳＴに対して特異的な１種以上の抗体を含有し得る他の任意の生物学的サンプル）をスクリーニングするための方法に使用され得る。これらのペプチドはまた、生物学的サンプルからＳＯＳＴに特異的に結合する抗体を産生する１種以上のＢ細胞を同定および選択するための方法（例えば、プラーク形成アッセイなど）に使用され得る。次いで、このＢ細胞は、当該分野で公知であり本明細書に記載される組み換え分子生物学技術によってクローン化され得、および／または改変され得るＳＯＳＴ特異的抗体をコードするポリヌクレオチドの供給源として、使用され得る。
【０１６２】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」とは、特定の実施形態において、ＳＯＳＴポリペプチドに対して特異的な、少なくとも１種の抗体を含有するサンプルを指し、生物学的サンプルは、被験体または生物学的供給源から、血液サンプル、生検標本、組織外植体、器官培養物、または他の任意の組織調製物もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。サンプルはさらに、形態学的一体性または物理的状態が、例えば、解剖、分離、可溶化、分取、ホモジェナイズ、生化学的抽出もしくは化学的抽出、粉砕、凍結乾燥、超音波処理、被験体もしくは生物学的供給源に由来するサンプルを処理するための他の任意の手段によって破壊された、組織調製物もしくは細胞調製物を指し得る。被験体もしくは生物学的供給源は、ヒトもしくは非ヒト動物、初代細胞培養物（例えば、インビトロで免疫化されたＢ細胞）、または培養に適合された細胞株であり得る。この細胞株としては、染色体に組み込まれている組み換え核酸配列もしくはエピソーム状の組み換え核酸配列を含み得る遺伝的に操作された細胞株、不死化されているか、もしくは不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化しているかもしくは分化可能な細胞株、形質転換細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
ＳＯＳＴペプチド免疫原はまた、一連のペプチドを合成することによって調製され得る。この一連のペプチドは、全体としてＳＯＳＴポリペプチドのポリペプチド配列全体を表現し、各々は、この一連の中の別のペプチドと共通してＳＯＳＴアミノ酸配列の一部分を有する。この重複部分は、好ましくは、少なくとも４つのアミノ酸配列、そしてより好ましくは、５、６、７、８、９または１０アミノ酸である。各ペプチドは、動物、動物から集められて、いずれの動物がＳＯＳＴのＴＧＦ−βタンパク質への結合を障害もしくはブロックする抗体を産生しているのかを同定するためのアッセイにおいて試験される血清を免疫化するのに、使用され得る。次いで、抗体は、当該分野で公知の方法および本明細書中で記載された方法に従って、このような同定された免疫化された動物から調製される。
【０１６４】
ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合を阻害する抗体は、本明細書において提供される開示を考慮して、容易に調製され得る。特に有用であるのは、配列番号２、６、８、１０、１２、１４、１６、４６もしくは６５のＴＧＦ−β結合タンパク質に「特異的に結合する」が、他のＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、Ｄａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＳＣＧＦもしくはＧｒｅｍｌｉｎ）には特異的に結合しない、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体である。本発明の文脈の中で、抗体とは、以下を包含すると理解される：モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植免疫グロブリン抗体、抗イディオタイプ抗体、およびそれらの抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ可変領域または相補性決定領域）。上記で考察されるように、抗体は、それらが１０７Ｍ−１より大きいかもしくはそれと同等、好ましくは１０８Ｍ−１より大きいかもしくはそれと同等のＫａで結合するが他のＴＧＦ−β結合タンパク質に結合しない場合か、または１０６Ｍ−１未満かもしくはそれと同等のＫａで結合する場合、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対して、または特定のＴＧＦ−βファミリーメンバーに対して特異的であると理解される。その同族抗原に対する抗体の親和性はまた、一般に解離定数ＫＤとして表現され、そして抗ＳＯＳＴ抗体は、約１０−５Ｍ未満もしくはそれと同等のＫＤで結合する場合、より好ましくは約１０−６Ｍ未満もしくはそれと同等のＫＤで結合する場合、なおより好ましく約１０−７Ｍ未満もしくはそれと同等のＫＤで結合する場合、さらにより好ましくは１０−８Ｍ未満もしくはそれと同等のＫＤで結合する場合、ＴＧＦ−βファミリーメンバーに特異的に結合する。さらに、本発明の抗体は、好ましくは、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合をブロック、障害または阻害する（例えば、統計学的に有意に減少する）。モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性、ならびに結合の阻害は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）。親和性はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって決定され得る。表面プラズモン共鳴のため、標的分子は、固相上に固定化されて、フローセルに沿って流れる移動相中のリガンドに曝露される。固定された標的にリガンド結合が生じる場合、局所屈折率が変化し、これはＳＰＲ角度の変化をもたらす。この変化は、反射光の強度の変化を検出することによって、リアルタイムでモニタリングされ得る。ＳＰＲシグナルの変化率は、分析されて、結合反応の結合および解離相についての見かけ上の速度定数を得ることができる。これらの値の比は、見かけ上の平衡定数（親和性）を与える（例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−６５（１９９３）を参照のこと）。
【０１６５】
本発明による抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤもしくはＩｇＡ）に属し得、そしてあるクラスを包含し得る種々のアイソタイプのいずれか（例えば、ヒトＩｇＧクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）であり得る。これは、動物（例えば、家禽（例えば、ニワトリ）および哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、もしくは他のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、もしくは他の霊長類が挙げられるが、これらに限定されない））から得ることができるか、またはそれに由来し得る。抗体は、内在抗体であり得る。
【０１６６】
当該分野で周知の方法は、ＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、ＳＯＳＴ）に対して特異的な抗体、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を作製するために使用され得る。抗体はまた、所望の特性を有するように設計された遺伝的に操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇフラグメントとして産生され得る。例えば、説明目的であって限定ではなく、抗体は、第１の哺乳動物種の少なくとも１つの可変（Ｖ）領域ドメインおよび第２の別個の哺乳動物種の少なくとも１つの定常領域ドメインを有するキメラ融合タンパク質である組み換えＩｇＧを含み得る。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス可変領域配列およびヒト定常領域配列を有する。このようなマウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、マウス抗体に由来する、抗原に対する結合特異性を与える相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト由来領域フレームワーク領域およびヒト由来定常領域に移植することによって「ヒト化」され得る。これらの分子のフラグメントは、タンパク質分解性消化によってか、または必要に応じてタンパク質分解性消化に続くジスルフィド結合の軽度の還元およびアルキル化によって作製され得る。あるいは、このようなフラグメントはまた、組み換え遺伝学的操作技術によって作製され得る。
【０１６７】
特定の好ましい抗体は、本明細書において記載されるように、インビトロアッセイにおいてＴＧＦ−β結合タンパク質活性を阻害またはブロックする抗体である。ＴＧＦ−β結合タンパク質への抗体の結合特性は、一般的に、免疫検出法（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫ブロッティング、向流免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害アッセイもしくは競合アッセイなどが挙げられる）を用いて評価され得る。これらの方法は、当業者によって容易に実施され得る（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号；Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと）。
【０１６８】
免疫原は、ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞、精製もしくは部分的に精製されたＴＧＦ−β結合ポリペプチド、またはその改変体もしくはフラグメント（すなわち、ペプチド）、またはＴＧＦ−β結合タンパク質に由来するペプチドから構成され得る。このようなペプチドは、より大きなポリペプチドのタンパク質分解切断によって作製され得るか、組み換え分子法によって作製され得るか、または化学的に合成され得る。例えば、ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸配列が本明細書において提供されて、当業者は、免疫原として使用するためのＴＧＦ−β結合タンパク質を慣習的に調製し得る。ペプチドは、本明細書に記載されるような方法および当該分野で公知の方法によって、化学的に合成され得る。あるいは、ペプチドは、ＴＧＦ−β結合タンパク質のタンパク質分解切断、および当該分野で公知の方法（例えば、ポリアクリルアミド電気泳動またはかなり多くの液体クロマトグラフィーまたは他の分離方法）によって単離された個々のペプチドによって作製され得る。免疫原として有用なペプチドは、代表的に、本明細書に記載されるようなＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列に由来する少なくとも４もしくは５個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を有し得る。そして好ましくは、ＴＧＦ−β結合タンパク質の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、１９もしくは２０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を有し得る。特定の他の好ましいペプチド免疫原は、ＴＧＦ−β結合タンパク質配列の少なくとも６個の（しかし１２個以上を超えない）連続するアミノ酸を含み、そして他の好ましいペプチド免疫原は、少なくとも２１個（しかし５０個を超えない）ＳＯＳＴポリペプチドの連続するアミノ酸を含む。他の好ましいペプチド免疫原は、ＴＧＦ−β結合タンパク質配列の、２１〜２５個、２６〜３０個、３１〜３５個、３６〜４０個、４１〜５０個、または任意の自然整数のアミノ酸（２１個〜１００個の間（２１個および１００個を含む）の連続するアミノ酸、および１００個〜１９０個の間の連続するアミノ酸）を含む。
【０１６９】
本明細書に開示されるように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウス、ヒツジ、ヤギ、ヒヒもしくはラット）から当業者によって容易に作製され得る。代表的に、ＴＧＦ−β結合タンパク質または１３〜２０アミノ酸のその固有のペプチドもしくは本明細書において記載されたようなその固有のペプチド（好ましくは、グルタルアルデヒドを用いた架橋結合によってキーホールリンペットヘモシニアンに結合したもの）は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、またはＲｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）とともに、腹腔内注射、筋肉内注射、眼内注入、皮内注射、または皮下注射することを通じて動物を免疫化するために使用される。例えば、やはりＨａｒｌｏｗら，上述を参照のこと。一般的に、第１の注入後、動物は、好ましいスケジュールに従って、特に、抗原、アジュバント（あれば）、および／または特定の動物種に従って変動し得る１回以上の追加免疫化（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を受ける。この免疫応答は、動物を定期的に採血し、血清を調製して免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡもしくはオークターロニー拡散アッセイなど）で分析し、特定の抗体力価を決定することによってモニタリングされ得る。特に好ましいポリクローナル抗血清は、これらのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）の１つにおいて、好ましくはバックグラウンドよりも少なくとも３倍大きい検出可能なシグナルを生じる。一旦動物の力価がタンパク質に対する反応性に関してプラトーに達すると、その動物の毎週の採血によってか、または全採血によってかのいずれかで、より大量の血清を容易に得ることができる。
【０１７０】
次いで、ＴＧＦ−β結合タンパク質またはペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体が、例えば、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってこのような抗血清から精製され得る。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質もしくはペプチド、または特定の免疫化された動物種のＩｇ定常領域に対して特異的な抗体が適切な固体支持体上に固定されたアフィニティークロマトグラフィーが、実施され得る。
【０１７１】
本発明で使用するための抗体としては、従来の免疫化、および当該分野で公知である、本明細書に記載されるような細胞融合手順によって調製されるモノクローナル抗体が挙げられる。モノクローナル抗体は、従来技術を用いて容易に作製され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５；Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）［「Ｃｏｌｉｇａｎ」］；米国再発行特許発明第３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号を参照のこと（これらは、本明細書において参考として援用される）；また、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｍ，ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（編），１９８０、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照のこと（これらもまた、本明細書において参考として援用される）；Ｐｉｃｋｓｌｅｙら「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ」、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第２版，Ｇｌｏｖｅｒら（編），９３頁（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５））。抗体フラグメントは、任意の適切な標準的技術（例えば、タンパク質分解性消化、または必要に応じてタンパク質分解性消化（例えば、パパインもしくはペプシンを用いる）に続くジスルフィド結合の弱い還元およびアルキル化）を用いて抗体から得ることができる。あるいは、このようなフラグメントはまた、組み換え遺伝学的操作技術によって作製され得る。
【０１７２】
手短には、一実施形態において、被験体動物（例えば、ラットまたはマウスまたはハムスター）は、本明細書中で記載されるＴＧＦ−β結合タンパク質またはその領域の一部（領域内のペプチドを含む）で免疫化される。そのタンパク質は、生じる免疫応答を増大させるために、アジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント）と混合され得る。初期免疫化の一週間後と三週間後との間に、その動物は、別の追加免疫で再免疫化され得、本明細書中に記載されるアッセイを使用してそのタンパク質に対する応答性について試験され得る。一旦その動物が、注射したタンパク質に対する応答性がプラトーに達すると、その動物は屠殺され、多数のＢ細胞を含む器官（例えば、脾臓およびリンパ節）は回収される。回収した脾臓および／またはリンパ節細胞懸濁液は、モノクローナル抗体を分泌する「ハイブリドーマ」を作製するために、薬物感作される適切な骨髄腫細胞と融合される。適切な骨髄腫株としては、例えば、ＮＳ−０、ＳＰ２０、ＮＳ−１（ＡＴＣＣ番号  ＴＩＢ  １８）およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ  ８．６５３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １５８０）が挙げられる。
【０１７３】
リンパ系（例えば、脾臓）細胞および骨髄腫細胞は、数分間、膜融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤）と合わされ、次いで、ハイブリドーマ細胞の増殖を支持するが、非融合骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上に低密度でプレートされ得る。融合の後、その細胞は、適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０またはＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）およびさらなる成分（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、すなわち、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ由来またはＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来）を含有する培養プレートに配置され得る。さらに、その培地は、融合脾臓細胞および骨髄腫細胞の増殖を選択的に可能にする試薬（例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ））を含有すべきである。約７日後、生じた融合細胞またはハイブリドーマは、ＴＧＦ−β結合タンパク質（使用した抗原に依存して）と反応性である抗体の存在を決定するためにスクリーニングされ得、そして、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合をブロックするか、損なうか、または阻害する。スクレロスチンまたはその改変体に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。
【０１７４】
本発明のタンパク質に対して応答性である抗体の存在を決定するために広範な種々のアッセイが利用され得、それらとしては、例えば、対向免疫電気泳動法、放射性免疫アッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降法、阻害アッセイまたは競合アッセイおよびサンドイッチアッセイ（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；また、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８を参照のこと）が挙げられる。ハイブリドーマは、例えば、限界希釈クローニングによって、または軟質寒天プラーク単離によりクローニングされ、再アッセイされる。従って、所望のタンパク質に対して応答性である抗体を産生するハイブリドーマが単離され得る。
【０１７５】
ハイブリドーマ培養物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウスモノクローナル抗体を産生するための代替的な方法は、ハイブリドーマ細胞を、同系マウス（例えば、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進するために処置された（例えば、プリスタンで刺激された）マウス）の腹膜腔に注射する工程である。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技術によって単離され、精製され得る。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、２．７．１〜２．７．１２ページおよび２．９．１〜２．９．３ページ；Ｂａｉｎｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）、１０巻、７９〜１０４ページの「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）」を参照のこと）。モノクローナル抗体は、その抗体の特定の性質（例えば、重鎖アイソタイプまたは軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択される適切なリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体支持体上に固定された適切なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体およびＴＧＦ−β結合タンパク質またはこれらのフラグメントもしくは改変体が挙げられる。
【０１７６】
さらに、本発明の抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通する任意の数の技術によって作製され得る。このような方法としては、ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫化、挿入したヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化したトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、または当該分野で公知の他の手順および本明細書中の開示に基づいた他の手順が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、抗原性誘発に応答した特定のヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから入手され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３、１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６、１９９４；Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９、１９９４；．Ｓ．特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５〜５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９５  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５〜３５に記載される。この技術において、ヒト重鎖座およびヒト軽鎖座の要素は、内因生の重鎖座および軽鎖座の標的化破壊を含む胚幹細胞株に由来するマウスの株に導入される（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５〜５８（１９９７）も参照のこと）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、酵母人工染色体上のミニ遺伝子構築物または導入遺伝子座（ｔｒａｎｓｌｏｃｉ）であり得、この酵母人工染色体は、マウスリンパ球様組織のＢ細胞特異的ＤＮＡ再構成および超変異を受ける。ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスを免疫化することによって獲得され得、次いで、そのトランスジェニックマウスは、抗原に特異的なヒト抗体を産生し得る。免疫化トランスジェニックマウスのリンパ球細胞は、本明細書中に記載される方法に従って、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために使用され得る。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫化動物の血液から入手され得る。
【０１７７】
ヒトＴＧＦ−β結合タンパク質特異的モノクローナル抗体を作製するための別の方法としては、ＥＢＶ形質転換によってヒト末梢血細胞を不死化する工程が挙げられる。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照のこと。ＴＧＦ−β結合タンパク質（またはその改変体もしくはそのフラグメント）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、このような不死化Ｂ細胞株（またはリンパ芽球腫細胞株）は、本明細書中に提供される免疫検出方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって同定され得、次いで、標準的クローニング技術によって単離され得る。抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体を産生するリンパ芽球腫細胞株の安定性は、当該分野で公知の方法に従ってマウス−ヒトハイブリッド細胞株を産生するために、その形質転換細胞株を、マウス骨髄腫と融合することによって改善され得る（例えば、Ｇｌａｓｋｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ８：３７７〜８９（１９８９）を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのなお別の方法は、インビトロ免疫化であり、これは、ヒト脾臓Ｂ細胞を抗原で刺激し、その後、刺激したＢ細胞をヘテロハイブリッド融合パートナーと融合する工程を包含する。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５を参照のこと。
【０１７８】
特定の実施形態において、抗ＳＯＳＴ抗体を産生するＢ細胞が選択され、軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、当該分野で公知の分子生物学的技術（ＷＯ  ９２／０２５５１；米国特許第５，６２７，０５２号；Ｂａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３〜４８（１９９６））および本明細書中に記載される分子生物学的技術に従ってＢ細胞からクローニングされる。好ましくは、免疫化した動物由来のＢ細胞は、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択することにより、脾臓、リンパ節または末梢血サンプルから単離される。Ｂ細胞はまた、ヒト、例えば、末梢血サンプルから単離され得る。所望の特異性を有する抗体を産生する単一のＢ細胞を検出するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光標示式細胞分取、インビトロ刺激に続く特異的抗体の検出などによる。Ｂ細胞を産生する特異的抗体の選択のための方法としては、例えば、ＳＯＳＴまたはそのペプチドフラグメントを含む軟質寒天中のＢ細胞の単一細胞懸濁液を調製する工程が挙げられる。Ｂ細胞によって産生される特異的抗体の抗原への結合は、複合体の形成を生じ、その複合体は、免疫沈降物として可視的であり得る。特異的抗体を産生するＢ細胞が選択された後、特異的な抗体遺伝子は、当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法に従ってＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離および増殖する工程によりクローニングされ得る。
【０１７９】
特定の使用に関して、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体のフラグメントが所望され得る。抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄは、抗体全体の抗原結合部位を保持し、従って、同一のエピトープに結合する。抗体に由来するこれらの抗原結合フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解性加水分解（例えば、従来の方法に従った抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化）により獲得され得る。例証として、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と示される５Ｓフラグメントを提供するペプシンを用いた抗体の酵素による切断によって産生され得る。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断されて、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを作製し得る。必要に応じて、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対するブロッキング基を使用して行われ得る。代替物として、パパインを使用する酵素による切断は、二つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを直接作製する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０、１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９、１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）；およびＣｏｌｉｇａｎら、２．８．１〜２．８．１０頁および２．１０〜２．１０．４頁に記載される。そのフラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、抗体を切断するための他の方法（例えば、重鎖を分離して一価軽重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成する工程、さらにフラグメントを切断する工程または他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝的技術）が使用され得る。
【０１８０】
抗体フラグメントはまた、複合体を形成するために特異的抗原に結合する抗体のように作用する合成タンパク質または遺伝的に操作されたタンパク質のいずれかであり得る。例えば、抗体フラグメントとしては、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、ペプチドリンカーによって結合された組換え単鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖ  タンパク質）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。本発明の抗体は、好ましくは少なくとも一つの可変領域ドメインを含む。この可変領域ドメインは、任意の大きさであり得るかまたはアミノ酸組成物であり得、概して抗原結合を担い、一つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはそのフレーム内である、少なくとも一つの超可変アミノ酸配列を含む。一般論として、可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）可変ドメインの任意の適切な配置であり得る。従って、例えば、Ｖ領域ドメインは、単量体であり得、ＶＨドメインまたはＶＬドメインであり得、それらは、受容可能な親和性で独立に抗原と結合し得る。あるいは、Ｖ領域ドメインは、二量体であり得、ＶＨ−ＶＨ二量体、ＶＨ−ＶＬ二量体またはＶＬ−ＶＬ二量体を含み得る。好ましくは、Ｖ領域二量体は、非共有結合的に結合した少なくとも一つのＶＨ鎖および少なくとも一つのＶＬ鎖（以下、Ｆｖと呼ぶ）を含む。所望の場合、この鎖は、例えば、二つの可変ドメイン間のジスルフィド結合によって、またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介してのいずれかで、直接共有結合されて、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成し得る。
【０１８１】
可変領域ドメインは、任意の天然に存在する可変ドメインであり得るか、またはその操作されたバージョンであり得る。操作されたバージョンとは、組換えＤＮＡ操作技術を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。このような操作されたバージョンとしては、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列中またはそれらのアミノ酸配列に対する挿入、欠失または変化によって、特定の抗体可変領域から作製されたバージョンが挙げられる。特定の例としては、少なくとも一つのＣＤＲを含み、必要に応じて第一の抗体由来の一つ以上のフレームワークアミノ酸および第二の抗体の可変領域ドメインの残りを含む、操作された可変領域ドメインが挙げられる。
【０１８２】
この可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸で、少なくとも一つの他の抗体ドメインまたはそのフラグメントに共有結合され得る。従って、例えば、可変領域ドメイン中に存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。このような方法で、例えば、抗体は、Ｆａｂフラグメントであり得、ここで、抗原結合ドメインは、それぞれそのＣ末端でＣＨ１ドメインおよびＣＫドメインに共有結合した、関連するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、例えば、Ｆａｂ’フラグメントに見出されるヒンジ領域もしくはヒンジ領域ドメインの一部を提供するために、またはさらなるドメイン（例えば、抗体ＣＨ２ドメインおよび抗体ＣＨ３ドメイン）を提供するために、さらなるアミノ酸で伸長され得る。
【０１８３】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最少認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードするポリペプチドを構築することによって獲得され得る。このようなポリヌクレオチドは、例えば、テンプレートとして抗体産生細胞のｍＲＮＡを使用する、可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６、１９９１；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、１６６ページ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）中のＣｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」：およびＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｃｈら（編）、１３７ページ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）中のＷａｒｄら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」を参照のこと）。
【０１８４】
あるいは、この抗体は、抗体可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡの操作および再発現を含む組換えＤＮＡ技術の使用により獲得される、組換え抗体または操作された抗体であり得る。このようなＤＮＡは公知であり、そして／またはＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリー（ＣｈｉｓｗｅｌｌおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｔｉｂｔｅｃｈ．１０：８０〜８４（１９９２）を参照のこと）が挙げられる）から容易に利用可能であるか、あるいは所望の場合合成され得る。標準的な分子生物学的手順および／または化学的手順は、例えば、システイン残基を作製するためにコドンを導入するため、または所望される場合、他のアミノ酸もしくはドメインを改変、付加もしくは欠失させるために、ＤＮＡを配列決定およびＤＮＡを操作するのに使用され得る。
【０１８５】
ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的であり、ヒト化抗体を含むキメラ抗体はまた、本発明に従って作製され得る。キメラ抗体は、第一の哺乳動物種由来の少なくとも一つの定常領域ドメイン、および第二の別個の哺乳動物種由来の少なくとも一つの可変領域ドメインを有する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜５５（１９８４）を参照のこと）。好ましい実施形態において、キメラ抗体は、非ヒトモノクローナル抗体に由来する少なくとも一つの可変領域ドメイン（例えば、マウス、ラットまたはハムスターのモノクローナル抗体に由来する可変領域）をコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも一つのヒト定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターにクローニングすることによって構築され得る（例えば、Ｓｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４５９〜７６（１９８９）；Ｗａｌｌｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２９２１〜２９（１９９３）を参照のこと）。例として、マウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターに挿入され得る。別のベクターでは、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列が、ヒトＩｇＧ定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする配列を有するフレーム内にクローニングされ得る。選択された特定のヒト定常領域は、特定の抗体に望ましいエフェクター機能（例えば、特定のＦｃレセプターに対する相補的な固定、結合など）に依存し得る。好ましくは、構築されたベクターは、キメラ抗体の安定な発現のために真核細胞にトランスフェクトされる。キメラ抗体を作製するための当該分野で公知の別の方法は、相同組換え（例えば、米国特許第５，４８２，８５６号）である。
【０１８６】
非ヒト／ヒトキメラ抗体は、「ヒト化」抗体を作製するためにさらに遺伝的に操作され得る。このようなヒト化抗体としては、非ヒト哺乳動物種の免疫グロブリン、少なくとも一つのヒト可変フレームワーク領域および少なくとも一つのヒト免疫グロブリン定常領域
に由来する複数のＣＤＲが挙げられ得る。ヒト化抗体を設計するための有用な方法としては、例えば、例証として、限定されずに、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域に最も相同であるヒト可変フレームワーク領域の同定が挙げられ得る。理論に束縛されることは望まないが、このような方法は、ヒト化抗体がＴＧＦ−β結合タンパク質に対する特定の結合親和性を保持する可能性を増加し得、この結合親和性は、いくつかの好ましい実施形態においてＴＧＦ−β結合タンパク質またはその改変体もしくはそのフラグメントに対して実質的に同じ親和性であり得、特定の他の好ましい実施形態において、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対してより大きい親和性であり得る。例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜２７を参照のこと。従って、このようなヒト化抗体の設計は、例えば、コンピュータモデリングによってＣＤＲループ構造および非ヒト可変領域の構造上の決定因子を決定し、次いで、ＣＤＲループおよび決定因子と公知のヒトＣＤＲループ構造および決定因子とを比較する工程を包含し得る。例えば、Ｐａｄｌａｎら、１９９５  ＦＡＳＥＢ  ９：１３３〜９；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：３７７〜３８３を参照のこと。コンピュータモデリングはまた、配列相同性によって選択されたヒト構造テンプレートと非ヒト可変領域とを比較するために使用され得る。例えば、Ｂａｊｏｒａｔｈら、１９９５  Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５〜１０３；ＥＰ−０５７８５１５−Ａ３を参照のこと。非ヒトＣＤＲのヒト化が、結合親和性の減少を生じる場合、コンピュータモデリングは、部分的に完全にまたは最適を上回って大きく（すなわち、非ヒト化抗体のレベルより高いレベルまで増加する）親和性を回復するための部位特異的変異誘発技術または他の変異誘発技術によって変化され得る特定のアミノ酸残基の同定を補助し得る。当業者は、これらの技術に精通していて、このような設計方法に対する多数の変化および改変を容易に理解する。
【０１８７】
ヒト化抗体を調製するためのこのような一つの方法は、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）と称される。本明細書中で使用される場合、用語「ベニヤされたＦＲ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ＦＲ）」および「組換え的にベニヤされたＦＲ」は、全ての天然のＦＲポリペプチドフォールディング構造を実質的に保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するための、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域由来のＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニヤリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が、抗原結合表面内の重鎖および軽鎖ＣＤＲセットの構造および相対的な配置により主に決定されるという理解に基づいている。Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜７３、１９９０。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、その互いとの相互作用、およびそのＶ領域ドメインの残りとの相互作用が慎重に維持される場合のみヒト化抗体に保存され得る。弱い免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性のベニヤされた表面のいずれかを有するハイブリッド分子を提供するために、ベニヤリング技術を使用することによって、免疫系が容易に遭遇する外部（例えば、溶媒到達可能な）ＦＲ残基は、ヒト残基で選択的に置換される。
【０１８８】
ベニヤリングのプロセスは、Ｋａｂａｔのデータベースおよび他のアクセス可能な米国のデータベースおよび外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）に対して最新のものにされたＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）におけるＫａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインに対する利用可能な配列データの使用を用いる。Ｖ領域アミノ酸の溶媒到達性は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメントについての公知の三次元構造から推測され得る。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲは、上で同定された供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同なヒトＶ領域は、対応するマウスアミノ酸と残基毎に比較される。ヒトのＦＲとは異なるマウスのＦＲ中の残基は、当該分野で周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基の交換は、少なくとも部分的に露出される（溶媒到達可能である）部分でのみ行なわれ、Ｖ領域ドメインの三次構造に顕著な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換に注意が払われる。
【０１８９】
従って、この様式において、生じた「ベニヤされた」抗原結合部位は、げっ歯類ＣＤＲ残基、実質的にＣＤＲに隣接する残基、隠されたかまたはほとんど隠された（溶媒到達不可能である）ものとして同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電気的および疎水的）な接触に関与すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「標準的な」三次構造に影響すると考えられるＦＲの保存された構造上の領域由来の残基を保持するように設計される。これらの設計基準は次いで、抗原結合部位の重鎖と軽鎖の両方のＣＤＲを、げっ歯類抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る、ヒトに現れるＦＲ内に合わせる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用される。
【０１９０】
ＴＧＦ−β結合タンパク質またはその改変体もしくはそのフラグメントに特異的に結合する抗体を選択するためのさらなる方法は、ファージディスプレイによるものである。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜５５；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４  Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１〜２８０を参照のこと。ヒトまたはマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーは、ＴＧＦ−β結合タンパク質またはその改変体もしくはそのフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖまたはそれらの多量体）を選択するためにスクリーニングされ得るファージベクターにおいて作製され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｄ．Ｈｕｓｅら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１、１９８９年１２月を参照のこと；また、Ｌ．Ｓａｓｔｒｙら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５７２８〜５７３２、１９８９年８月を参照のこと；また、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１〜９、１９９０年１月；Ｋａｎｇら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４３６３〜６６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１〜３８８；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：４７〜５２およびこれらに引用される参考文献を参照のこと。組換え技術を介した抗体の産生を可能にする市販の系が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能である。手短には、ｍＲＮＡはＢ細胞集団から単離され、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）ベクターおよびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクター内に重鎖および軽鎖の免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製するために使用される。その後、陽性のプラークは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のモノクローナル抗体フラグメントの高レベルの発現を可能にする非溶解性のプラスミドに変換され得る。あるいは、Ｉｇ可変領域フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーは、糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはその改変体）のゲノム内に、ファージ被覆タンパク質をコードする配列とインフレームで挿入され得る。融合タンパク質は、被覆タンパク質と軽鎖可変領域ドメインおよび／または重鎖可変領域ドメインとの融合物であり得る。特定の実施形態に従って、免疫グロブリンＦａｂフラグメントはまた、ファージ粒子上に提示され得る（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照のこと）。これらのベクターは、個々にスクリーニングされ得るか、またはＦａｂフラグメントまたは抗体を形成するように同時発現され得る（Ｈｕｓｅら、前出を参考のこと；またＳａｓｔｒｙら、前出を参考のこと）。
【０１９１】
同様に、抗体の部分またはフラグメント（ＦａｂフラグメントおよびＦｖフラグメント）はまた、従来の酵素消化技術または組換えＤＮＡ技術を使用して、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むことによって、構築され得る。一実施形態において、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ由来の可変領域をコードする遺伝子が、その可変領域についてのヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得るか、または販売源から購入され得る。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、マウス可変領域についてのプライマーおよびヒト可変領域についてのプライマー（とりわけ、ＶＨａ領域についてのプライマー、ＶＨｂ領域についてのプライマー、ＶＨｃ領域についてのプライマー、ＶＨｄ領域についてのプライマー、ＣＨ１領域についてのプライマー、ＶＬ領域についてのプライマー、およびＣＬ領域についてのプライマー）を販売している。これらのプライマーは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を増幅するために使用され得る。これらの領域は、その後、ベクター（それぞれ、例えば、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰＴＭ  ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰＴＭ  Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に挿入され得る。その後、これらのベクターは、発現用のＥ．ｃｏｌｉベースの系、酵母ベースの系、または哺乳動物ベースの系中に導入され得る。これらの技術を利用して、ＶＨドメインとＶＬドメインとの融合物を含む大量の単鎖タンパク質が、産生され得る（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６，１９８８参照）。さらに、そのような技術は、抗体の結合特性を改変することなく、「マウス」抗体を「ヒト」抗体へと変化させるために利用され得る。
【０１９２】
本発明の特定の実施形態において、コンビナトリアルファージライブラリーもまた、非ヒト可変領域のヒト化のために利用され得る。例えば、Ｒｏｓｏｋら，１９９６  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１〜１８；Ｒａｄｅｒら，１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０〜１５を参照のこと。ファージライブラリーは、当該分野で公知の免疫検出方法および本明細書中に記載される免疫検出方法によって目的のＩｇ可変領域を選択するために、スクリーニングされ得る。そのように選択されたファージ中にある挿入された免疫グロブリン遺伝子のＤＮＡ配列は、標準的技術によって決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。その後、選択されたＩｇコード配列が、Ｉｇフラグメントの発現のために別の適切なベクター中にクローニングされ得るか、または、必要に応じて、免疫グロブリン鎖全体の発現のために、Ｉｇ定常領域を含むベクター中にクローニングされ得る。
【０１９３】
他の特定の実施形態において、本発明は、多量体抗体フラグメントであるＳＯＳＴ特異的抗体を企図する。有用な方法論が、一般的には、例えば、Ｈａｙｄｅｎら，１９９７，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２０１〜１２；Ｃｏｌｏｍａら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９〜６３において記載される。例えば、多量体抗体フラグメントは、ミニ抗体（米国特許第５，９１０，５７３号）または二重特異的抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１２８〜１３０）を形成するためにファージ技術によって作製され得る。
【０１９４】
本発明の特定の実施形態において、ＳＯＳＴに特異的な抗体は、細胞内タンパク質として発現される抗体であり得る。このような細胞内抗体はまた、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）とも呼ばれる。このよういな細胞内抗体は、Ｆａｂフラグメントを含み得るか、または好ましくは、ｓｃＦｖフラグメントを含み得る（例えば、Ｌｅｃｅｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：４７６４〜４９（２００１）を参照のこと）。ＣＤＲ領域に隣接するフレームワーク領域は、細胞内還元環境における細胞内発現抗体の発現レベルおよび可溶性を改善するように改変され得る（例えば、Ｗｏｒｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２７９５〜８０３（２０００）を参照のこと）。細胞内発現抗体は、例えば、細胞内発現抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを構築することによって、特定の細胞位置または細胞小器官に指向され得る。このポリヌクレオチド配列は、細胞内において特定の標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に融合され得る（例えば、Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：１１８２〜９１（１９９５）；Ｌｅｎｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１１９６〜２０５（２０００）を参照のこと）。細胞内発現抗体は、当業者にとって利用可能な種々の技術（遺伝子治療ベクターを介すること、もしくは脂質混合物（例えば、Ｉｍｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡにより製造されるＰｒｏｖｅｃｔｉｎＴＭ）を介すること、または光化学的内部移行（ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）法に従うことを包含する）によって、細胞中に導入され得る。
【０１９５】
ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な免疫グロブリン分子中にアミノ酸変異を導入することは、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する特異性もしくは親和性を増加するため、またはエフェクター機能を改変するために、有用であり得る。ＴＧＦ−β結合タンパク質に対してより高い親和性を有する免疫グロブリンが、特定の残基の部位特異的変異誘発によって作製され得る。コンピューター支援型３次元分子モデリング（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）が、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する親和性を改善するために、変化されるべきアミノ酸残基を同定するために使用され得る。例えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．１０：１〜１４２を参照のこと。あるいは、ＣＤＲのコンビナトリアルライブラリーが、Ｍ１３ファージにおいて作製され得、そして改善された親和性を有する免疫グロブリンフラグメントについてスクリーニングされ得る。例えば、Ｇｌａｓｅｒら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３〜３９１３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９〜１３；米国特許第５，７９２，４５６号を参照のこと。
【０１９６】
エフェクター機能もまた、部位特異的変異誘発によって変化され得る。例えば、Ｄｕｎｃａｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３〜６４；Ｍｏｒｇａｎら、１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜２４；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚｅｄｅｈ−Ｋｏｎｄｒｉら、１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：８３０〜３４を参照のこと。例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分にあるグリコシル化部位の変異は、その免疫グロブリンが補体を結合する能力を変化させ得る。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６〜３２を参照のこと。その定常領域ドメインにおける他の変異は、その免疫グロブリンが補体を結合する能力を変化させ得るか、または抗体依存性細胞傷害をもたらし得る。例えば、Ｄｕｎｃａｎら、１９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３〜６４；Ｍｏｒｇａｎら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜２４；Ｓｅｎｓｅｌら、１９９７  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１０１９〜２９を参照のこと。
【０１９７】
特定の実施形態に従って、本明細書中に記載されるＩｇ分子のいずれかの、非ヒト重鎖可変領域、非ヒト軽鎖可変領域、ヒト重鎖可変領域、ヒト軽鎖可変領域、ヒト化重鎖可変領域、またはヒト化軽鎖可変領域が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドフラグメント（単鎖抗体）として構築され得る。例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照のこと。多官能性ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、種々の公知のエフェクタータンパク質のいずれかをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とインフレームの状態で連結することによって、作製され得る。これらの方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、および米国特許第５，４７６，７８６号に開示されている。例として、エフェクタータンパク質は、免疫グロブリン定常領域配列を含み得る。例えば、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８８：１〜７を参照のこと。エフェクタータンパク質の他の例は、酵素である。非限定的な例として、このような酵素は、治療目的での生物学的活性を提供し得るか（例えば、Ｓｉｅｍｅｒｓら、１９９７  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：５１０−１９を参照のこと）、または診断的使用のための検出可能な活性（例えば、任意の多数の周知の基質の、検出可能な産物への、西洋ワサビペルオキシダーゼにより触媒される転換）を提供し得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質のなお他の例としては、Ｉｇ−毒素融合物、または免疫毒素が挙げられ、これらにおいて、ｓｃＦｖポリペプチドが毒素に連結されている。
【０１９８】
本明細書中に記載されるｓｃＦｖまたは任意の抗体フラグメントは、特定の実施形態において、融合タンパク質と抗原（例えば、ＴＧＦ−β結合タンパク質）との間の特異的結合の検出を可能にするペプチドドメインまたはポリペプチドドメインに、融合され得る。例えば、その融合ポリペプチドドメインは、ｓｃＦｖ融合タンパク質とＴＧＦ−β結合タンパク質との結合を、当業者が精通している種々の技術のうちのいずれかによって検出するための、アフィニティタグポリペプチドであり得る。ペプチドタグの例としては、アビジン、ストレプトアビジン、またはＨｉｓ（例えば、ポリヒスチジン）が挙げられる。検出技術としてはまた、例えば、ビオチン配列もしくはビオチン模倣物配列（例えば、Ｌｕｏら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５およびその中で引用される参考文献を参照のこと）に対するアビジン融合タンパク質もしくはストレプトアビジン融合タンパク質の結合、検出可能な部分（例えば、標識化部分）による融合タンパク質の共有結合改変、融合タンパク質と特定の標識化レポーター分子との非共有結合、酵素活性を有する部分を含む融合タンパク質による検出可能な基質の酵素改変、または固相支持体上における融合タンパク質の固定（共有結合固定もしくは非共有結合固定）が挙げられ得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質の構築のための他の有用な親和性ポリペプチドとしては、例えば、ＷＯ  ８９／０３４２２、米国特許第５，４８９，５２８号、同第５，６７２，６９１号、ＷＯ  ９３／２４６３１、米国特許第５，１６８，０４９号、同第５，２７２，２５４号に開示されるような、ストレプトアビジン融合タンパク質；アビジン融合タンパク質（例えば、ＥＰ５１１，７４７参照）；酵素（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）；およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチドが挙げられ得る。
【０１９９】
本明細書中に記載されるような、ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知の発現ベクターを使用して、核酸切除、連結、形質転換、およびトランスフェクションのための種々の周知の手順のうちのいずれかに従って、伸長され得そして発現され得る。従って、特定の実施形態において、抗体フラグメントの発現は、原核生物宿主（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において好ましいものであり得る（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７〜５１５を参照のこと）。他の特定の実施形態において、抗体もしくはそのフラグメントの発現は、真核生物宿主細胞（酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）、または植物細胞を含む）において好ましいものであり得る。適切な動物細胞の例としては、骨髄腫細胞（例えば、マウスＮＳＯ株）、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、またはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の例としては、タバコ細胞、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、およびイネ細胞が挙げられる。
【０２００】
一旦、適切な抗体が得られたならば、それらの抗体は、当業者にとって周知である多くの技術（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８参照）によって、単離または精製され得る。適切な技術としては、ペプチドアフィニティカラムもしくはタンパク質アフィニティカラム（カラムマトリックスに結合した抗定常領域抗体の使用を含む）、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡカラムもしくはプロテインＧカラムにおける精製、またはこれらの技術の何らかの組合せが、挙げられる。
【０２０１】
（ｃ．変異体ＴＧＦ−β結合タンパク質）
本明細書中に記載される下記実施例（例えば、実施例８および実施例９）に記載されるように、ネイティブＴＧＦ−β結合タンパク質が特定のＴＧＦ−βファミリーメンバーの活性をブロックする能力と競合するＴＧＦ−β結合タンパク質の改変バージョンは、骨密度の増加をもたらす。従って、ＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合するがＴＧＦ−βファミリーメンバーの機能を阻害しない、ＴＧＦ−β結合タンパク質の変異体は、この基準を満たす。上記変異体バージョンは、ＴＧＦ−β結合タンパク質の内因性阻害機能と有効に競合する。
【０２０２】
（ｄ．タンパク質の産生）
本明細書中に記載されるポリペプチドとしては、ＴＧＦ結合タンパク質であるスクレロスチンおよびその改変体、ならびにスクレロスチンに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが、挙げられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上記遺伝子と実質的に類似する遺伝子誘導体、および単離された核酸分子、ならびに適切な場合には上記遺伝子およびその誘導体によってコードされるタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）が、挙げられる。本明細書中において使用される場合、ヌクレオチド配列は、（ａ）そのヌクレオチド配列が、上記遺伝子および核酸分子のコード領域に由来し、かつ例えば、上記の配列の部分もしくは対立遺伝子改変体を含むか、あるいはＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子をコードする場合；（ｂ）そのヌクレオチド配列が、中程度のストリンジェンシー下、高ストリンジェンシー下、もしくは非常に高いストリンジェンシー下（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９参照）にて本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能である場合；および／あるいは（ｃ）上記ＤＮＡ配列が、（ａ）もしくは（ｂ）において規定されるＤＮＡ配列に対して遺伝コードの結果として縮重している場合には、「実質的に類似する」と見なされる。さらに、本明細書中に開示される核酸分子は、相補配列および非相補配列の両方を、これらの配列が他の点では本明細書中に示される基準を満たす限りにおいては、包含する。本発明の文脈において、高ストリンジェンシーとは、標準的なハイブリダイゼーション条件（例えば、５×ＳＳＰＥ、０．５％  ＳＤＳ（６５℃）、または等価物）を意味する。
【０２０３】
本明細書中に記載される核酸分子によってコードされるタンパク質の構造は、例えば、Ｐ／Ｃ  Ｇｅｎｅ  ｏｒ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の疎水性プロット機能を使用して、またはＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２，１９８２）により記載される方法に従って、一次翻訳産物から予測され得る。
【０２０４】
本発明のタンパク質は、酸性塩もしくは塩基性塩の形態でか、または中性形態で、調製され得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって改変され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸配列または核酸配列に対してなされ得る。それらの置換、欠失、または付加の正味の効果は、変異体タンパク質もしくは野生型タンパク質の生物学的活性を保持すること、またはさらに増強もしくは減少することである。さらに、例えば、遺伝コードにおける縮重に起因して、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変動が存在し得る。
【０２０５】
本明細書中に開示されるタンパク質の他の誘導体は、上記タンパク質と、他のタンパク質もしくはポリペプチドとの結合体を包含する。これは、例えば、タンパク質の精製または同定を促進するために付加され得るＮ末端融合タンパク質もしくはＣ末端融合タンパク質の合成によって、達成され得る（米国特許第４，８５１，３４１号参照、また、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８も参照）。あるいは、融合タンパク質（例えば、Ｆｌａｇ（登録商標）／ＴＧＦ−β結合タンパク質）が、上記タンパク質の同定、発現、および分析を補助するために、構築され得る。
【０２０６】
本発明のタンパク質は、本明細書中に記載される広汎な種類の技術を使用して、構築され得る。さらに、ネイティブ配列フラグメントに対する連結を可能にする制限部位が隣接する変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、変異が、特定の遺伝子座において導入され得る。連結の後、生じる再構築された配列は、望ましいアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
【０２０７】
あるいは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発技術が、必要とされる置換、欠失、または挿入に従って変化された特定のコドンを有する改変遺伝子もしくは改変核酸分子を提供するために、使用され得る。上記に示される改変を生成する例示的方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２〜１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）によって開示される。タンパク質の欠失誘導体または短縮誘導体（例えば、可溶性細胞外タンパク質）はまた、望ましい欠失に近接する簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、構築され得る。制限の後、突出が埋められ得、そしてＤＮＡが再連結され得る。上記に示される改変を行う例示的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）によって開示される。
【０２０８】
本発明の核酸分子においてなされる変異は、好ましくは、コード配列のリーディングフレームを保存する。さらに、その変異は、好ましくは、転写された場合にそのｍＲＮＡの翻訳に有害な影響を与える二次ｍＲＮＡ構造（例えば、ループまたはヘアピン）を生成するようにハイブリダイズし得る、相補的領域を生成しない。変異部位は、予め決定され得るが、その変異自体の性質が予め決定される必要はない。例えば、所定部位における変異の最適な特徴について選択するために、ランダムな変異誘発が、標的コドンにおいて行われ得、発現された変異体が、生物学的活性の獲得もしくは喪失もしくは保持についてスクリーニングされ得る。あるいは、変異は、ネイティブ配列フラグメントに対する連結を可能にする制限部位が隣接する変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座にて導入され得る。連結の後、生じる再構築された配列は、望ましいアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
【０２０９】
本発明のタンパク質をコードする核酸分子はまた、ＰＣＲ変異誘発、化学的変異誘発（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，ＰＮＡＳ  ８３：３４０２〜３４０６，１９８６）などの技術を使用して、強制的ヌクレオチド誤組み込み（例えば、ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ，Ｇｅｎｅ  ８８：１０７〜１１１，１９９０）によって、またはランダムに変異誘発されたオリゴヌクレオチドの使用（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ  ３：１１２〜１１７，１９８９）によって、構築され得る。
【０２１０】
本発明はまた、上記遺伝子を発現可能なベクターを含む宿主細胞を培養することによる、上記の遺伝子および核酸分子の操作および発現を提供する。そのようなベクターまたはベクター構築物は、望ましいタンパク質をコードする合成核酸分子またはｃＤＮＡ由来核酸分子のいずれかを含み、これらは、適切な転写調節エレメントもしくは翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている。適切な調節エレメントは、種々の供給源（細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス遺伝子、哺乳動物遺伝子、昆虫遺伝子、または植物遺伝子を含む）に由来し得る。適切な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成され得る。調節エレメントの例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、およびリボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が、挙げられる。
【０２１１】
上記のタンパク質のうちのいずれかをコードする核酸分子は、広汎な種類の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞（細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、ウイルス細胞、昆虫細胞、または植物細胞が、挙げられる）によって容易に発現され得る。外来ＤＮＡを発現するようにそのような細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９〜１９３３，１９７８；Ｍｕｒｒａｙら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら、米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと；植物細胞については、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７〜１０７１，１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７〜３９２，１９９２を参照のこと）。
【０２１２】
本発明を実行するために適切な細菌宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に入る種々の種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に入る種々の種、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に入る種々の種、ならびに当業者にとって周知である他の多くの細菌種および本明細書中に記載される他の多くの細菌種が、挙げられる。細菌宿主細胞の代表的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が、挙げられる。
【０２１３】
細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞において機能するプロモーター、１つ以上の表現型選択マーカー、および細菌複製起点を含む。代表的プロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，１９７８参照のこと）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０〜８９，１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎら、Ｇｅｎｅ  ８７：１２３〜１２６，１９９０）、ｔｒｐプロモーター（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：１５５，１９８３）、ならびにｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｅｎｅ  ２０：２３１，１９８２）が、挙げられる。代表的な選択マーカーとしては、種々の抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子）が、挙げられる。宿主細胞を形質転換するために適切な多くのプラスミドが、当該分野で周知であり、そのプラスミドとしては、とりわけ、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ  ２：９５，１９７７参照）；ｐＵＣプラスミドであるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：２０〜７７，１９８３、ならびにＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ  １９：２５９〜２６８，１９８２参照）；ならびにｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が、挙げられる。
【０２１４】
本発明を実行するために適切な酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種々の種（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）が、挙げられる。酵母および真菌のために適切な発現ベクターとしては、とりわけ、酵母用のＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ番号３７４１９）、ならびにａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１６９，１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５〜１０３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ  ８：１２１〜１３３，１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４〜１０８，１９７８）ならびにそれらの誘導体が、挙げられる。
【０２１５】
酵母において使用するために好ましいプロモーターとしては、酵母グリコール酸遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３〜１２０８０，１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９〜４３４，１９８２）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら編，ｐ３５５，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２〜２０１，１９８３）が、挙げられる。真菌ベクターのために有用なプロモーターの例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓグリコール酸遺伝子由来のプロモーター（例えば、ａｄｈ３プロモーター）（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９，１９８５）が、挙げられる。この発現単位はまた、転写ターミネーターを含み得る。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら（上記）１９８５）である。
【０２１６】
細菌ベクターと同様に、上記酵母ベクターは、一般的には、選択マーカーを含む。この選択マーカーは、形質転換体が選択されるのを可能にする表現型アッセイが存在する優性表現型を示す多数の遺伝子のうちの１つであり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完するマーカー、抗生物質耐性を提供するマーカー、または細胞が特定の炭素源を利用するのを可能にするマーカーであり、それには、ｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈら（同書））、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ  ８：１７，１９７９）またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌら（同書））が挙げられる。別の適切な選択マーカーは、ｃａｔ遺伝子である。このｃａｔ遺伝子は、酵母細胞に対して、クロラムフェニコール耐性を付与する。
【０２１７】
真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９〜１９３３，１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１７４０〜１７４７，１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３０１：１６７〜１６９，１９８３を）によって記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって補完される遺伝子欠損を含み得る。特定の宿主および選択マーカーの選択は、充分に当業者のレベルの範囲内にある。
【０２１８】
酵母の形質転換のためのプロトコールはまた、当業者にとって周知である。例えば、形質転換は、ＤＮＡを用いて酵母のスフェロプラストを調製すること（Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７５：１９２９，１９７８を参照のこと）によって、またはＬｉＣｌなどのアルカリ塩で処理すること（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３，１９８３を参照のこと）によって、容易に達成され得る。真菌の形質転換はまた、Ｃｕｌｌｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：３６９，１９８７）によって記載されるようにポリエチレングリコールを使用して実行され得る。
【０２１９】
ウイルスベクターは、上記のような望ましいタンパク質をコードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むベクターを包含する。広汎な種類のプロモーターが、本発明の状況において利用され得る。そのプロモーターとしては、例えば、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、ＲＳＶ  ＬＴＲ、フレンドＭｕＬＶ  ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８１〜７８４，１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７〜４６３，１９９４）、ヘルペスＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、ならびにサイトメガロウイルス最後期プロモーターが、挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態において、そのプロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ  ９１／０２８０５、ＥＰ  ０，４１５，７３１；およびＷＯ  ９０／０７９３６参照）である。適切な組織特異的プロモーターの代表的な例としては、中性特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来増殖因子βプロモーター、骨形成タンパク質プロモーター、ヒトα１−カイメリン（ｃｈｉｍａｅｒｉｎ）プロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびシナプシンＩＩプロモーターが、挙げられる。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記のプロモーターならびにＨＩＶプロモーターなどのプロモーターが挙げられる）、肝炎特異的プロモーター、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）特異的プロモーター、ならびに細菌特異的プロモーター、真菌特異的プロモーター、または寄生生物（例えば、マラリア）特異的プロモーター）が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染している特定の細胞もしくは組織を標的とするために、使用され得る。
【０２２０】
本発明を実行するために適切な哺乳動物細胞としては、とりわけ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＳａＯＳ細胞、骨肉腫、ＫＳ４８３細胞、ＭＧ−６３細胞、初代骨芽細胞、ならびにヒト骨髄肉腫または哺乳動物骨髄肉腫が、挙げられる。本発明を実行する際に使用するための哺乳動物発現ベクターは、クローン化した遺伝子、核酸分子、またはｃＤＮＡの転写を指向することが可能なプロモーターを、含む。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターが、挙げられる。骨特異的プロモーターとしては、骨シアロタンパク質のプロモーターおよびオステオカルシンのプロモーターが、挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１〜５３０，１９８５）、サイトメガロウイルス最後期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４，１９８１）、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ、ＲＳＶ  ＬＴＲ、メタロチオネイン１、アデノウイルスＥ１ａが挙げられる。細胞プロモーターとしては、マウスメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号）、マウスＶκプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７０４１〜７０４５，１９８３；Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５４９６，１９８７）およびマウスＶＨプロモーター（Ｌｏｈら、Ｃｅｌｌ  ３３：８５〜９３，１９８３）が、挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも部分的には、望ましい発現レベルにか、またはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に、依存する。
【０２２１】
このような発現ベクターはまた、プロモーターから下流に、かつ目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列から上流に位置するＲＮＡスプライス部位を含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。発現ベクターには、目的のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルもまた含まれる。適切なポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来の初期ポリアデニル化シグナルまたは後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス５  Ｅ１Ｂ領域およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーターに由来するポリアデニル化シグナル（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０，１９８１）が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する非コードウイルスリーダー配列（例えば、アデノウイルス２三連リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ））を含む。好ましいベクターはまた、エンハンサー配列（例えば、ＳＶ４０エンハンサー）を含み得る。発現ベクターは、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする配列もまた含み得る。適切な発現ベクターは、市販の供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得られ得る。
【０２２２】
クローニングされたＤＮＡ配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １４：７２５，１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３）、エレクトロポレーションによって（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションによって（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８７）、培養された哺乳動物細胞に導入され得る。ベクターで安定にトランスフェクトされるか、またはクローニングされたＤＮＡが組み込まれた細胞を同定するために、選択マーカーは、一般に、目的の遺伝子またはｃＤＮＡとともに細胞に導入される。培養された哺乳動物細胞において使用するために好ましい選択マーカーとしては、薬物（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。この選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙによって検討されている（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（これは、本明細書中に参考として援用される））。
【０２２３】
適切なベクターを含む哺乳動物細胞は、一定期間（代表的には１〜２日間）にわたって増殖して、目的のＤＮＡ配列を発現し始めることが可能である。薬物選択は、次いで、安定な様式で選択マーカーを発現している細胞の増殖について選択するために適用される。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトされた細胞について、薬物濃度は、段階的様式で増大されて、クローニングされた配列のコピーの数の増大について選択され得、それによって、発現レベルが増大され得る。その導入された配列を発現する細胞が選択され、望ましい形態または望ましいレベルで、目的のタンパク質の生成についてスクリーニングされる。次いで、これらの基準を満たす細胞がクローニングされ得、生成のためにスケールアップされ得る。
【０２２４】
哺乳動物細胞のトランスフェクションについてのプロトコールは、当業者に周知である。代表的な方法としては、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス融合媒介性トランスフェクション、アデノウイルス融合媒介性トランスフェクション、およびプロトプラスト融合媒介性トランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照のこと）が挙げられる。裸のベクター構築物はまた、筋細胞または他の適切な細胞によって取り込まれて、その後、哺乳動物（または他の動物）の筋肉に注射され得る。
【０２２５】
ポリペプチドの生成のために昆虫宿主細胞および植物宿主細胞を使用する方法は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。当該分野で公知の多くの昆虫宿主細胞はまた、本発明において有用であり得る。例えば、昆虫細胞において異種ＤＮＡ配列を発現するためのベクターとしてのバキュロウイルスの使用は、Ａｔｋｉｎｓｏｎらによって検討されている（Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４，１９９０）。当該分野で公知の多くのベクターおよび植物宿主細胞はまた、本発明において有用であり得る（例えば、植物細胞において遺伝子および核酸分子を発現するためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのベクターとしての使用）（Ｓｉｎｋａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．による総説（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ  １１：４７−５８，１９８７）を参照のこと）。
【０２２６】
本発明の関連する局面において、本発明のタンパク質は、生殖細胞および体細胞が、所望のタンパク質をコードし、かつこの遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む、トランスジェニック動物において発現され得る。あるいは、類似の様式において、所望の遺伝子を欠いているトランスジェニック動物が、準備され得る（例えば、「ノックアウト」マウス）。このようなトランスジェニック動物は、種々の非ヒト動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、およびブタが挙げられる）において準備され得る（Ｈａｍｍｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０−６８３，１９８５、Ｐａｌｍｉｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９−８１４，１９８３、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８−４４４２，１９８５、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ  ４１：３４３−３４５，１９８５、ならびに米国特許第５，１７５，３８３号、同第５，０８７，５７１号、同第４，７３６，８６６号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３４７，０７５号、同第５，２２１，７７８号、および同第５，１７５，３８４号を参照のこと）。簡潔には、発現ベクター（適切に配置された発現制御配列とともに、発現されるべき核酸分子を含む）は、受精卵の前核に、例えば、マイクロインジェクションによって導入される。注入されたＤＮＡの組み込みは、組織サンプルからＤＮＡのブロット分析によって検出される。動物の子孫に伝えられるように、その導入されたＤＮＡが、動物の生殖系列に組み込まれることが好ましい。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの使用によって、または導入遺伝子の調節された発現を可能にする誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら，１９８３，前出））の使用によって達成され得る。
【０２２７】
他の方法の中でも、適切な宿主およびベクター系を培養して、本明細書中に記載の組換え翻訳生成物を生成することによって、タンパク質が単離され得る。このような細胞株の上清またはタンパク質封入体、またはそのタンパク質が上清に排出されない全細胞は、次いで、所望のタンパク質を単離するために、種々の精製手順によって処理され得る。例えば、この上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニット）を使用して濃縮され得る。濃縮の後に、その濃縮物は、適切な精製マトリクス（例えば、適切な支持体に結合した抗タンパク質抗体（例えば、単離されるべきポリペプチドに特異的に結合する抗体））に適用され得る。あるいは、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂が、タンパク質を精製するために使用され得る。さらなる代替法として、１種以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、そのタンパク質をさらに精製するために使用され得る。本発明のタンパク質を単離するための他の方法は、当該分野で周知である。
【０２２８】
単離されたポリペプチドの純度は、当該分野で公知の技術および本明細書中に記載の技術（例えば、ゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー法）によって決定され得る。好ましくは、このような単離されたポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。特定の具体的実施形態において、タンパク質は、他の望ましくないタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、続いてクーマシーブルー染色に従って全く検出されない場合に、本発明の文脈において「単離された」と見なされる。他の実施形態において、望ましいタンパク質は、他の望ましくないタンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、続いて銀染色に従って全く検出されないように、単離され得る。
【０２２９】
（３．核酸分子）
本発明の他の局面において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに結合するＴＧＦ−β結合タンパク質を阻害し得る核酸分子が提供される。例えば、一実施形態において、ＴＧＦ−β結合タンパク質核酸配列の発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が提供される（一般には、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ：Ｎｅｗ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｍ．ＩｎｏｕｙｅおよびＢ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ，編，１９８７  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐ．４０１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，編，１９８９  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１００４−１０１２，１９９３；ＷＯ９５／１０６０７；米国特許第５，３５９，０５１号；ＷＯ９２／０６６９３；ならびにＥＰ−Ａ２−６１２８４４を参照のこと）。簡潔には、このような分子は、転写されたＴＧＦ−β結合タンパク質ｍＲＮＡ配列の領域に相補的で、かつこの領域とワトソン−クリック塩基対を形成し得るように、構築される。得られた二本鎖核酸は、ｍＲＮＡのその後のプロセシングを妨害し、それによって、タンパク質合成を防止する（実施例１０を参照のこと）。
【０２３０】
本発明の他の局面において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに結合するＴＧＦ−β結合タンパク質を阻害し得るリボザイムが提供される。本明細書中に記載される場合、「リボザイム」は、特異的認識のためのアンチセンス配列、およびＲＮＡ−切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むことが意図される。この触媒性の鎖は、化学量論的濃度を超える標的ＲＮＡ中の特異的部位を切断する。広く種々のリボザイムが、本発明の文脈において利用され得る（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  ４８：２１１−２２０，１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：５９６−６００，１９８８；Ｗａｌｂｏｔ  ａｎｄ  Ｂｒｕｅｎｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：１９６，１９８８；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５，１９８８によって記載されるもの）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら，米国特許第５，２５４，６７８号（１９９３年１０月１９日発行）、Ｈｅｍｐｅｌら，欧州特許公開番号０  ３６０  ２５７号（１９９０年３月２６日公開）により記載されるもの）；ならびにＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボソームＲＮＡベースのリボザイム（Ｃｅｃｈら，米国特許第４，９８７，０７１号を参照のこと）が挙げられる）。本発明のリボザイムは、代表的には、ＲＮＡからなるが、ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはこれらのキメラアナログ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）から構成されてもよい。
【０２３１】
（４．標識）
遺伝子生成物または上記および下記の候補分子のいずれかは、種々の化合物（例えば、蛍光分子、毒素、および放射性核種が挙げられる）で標識され得る。蛍光分子の代表例としては、フルオレセイン、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉタンパク質（例えば、フィコエリトリン）、ローダミン、テキサスレッドおよびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表例としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａが挙げられる。放射性核種の代表例としては、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１，Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１２が挙げられる。さらに、上記の抗体はまた、標識されてもよいし、リガンド結合対の一方のパートナーに結合体化されてもよい。代表例としては、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。
【０２３２】
本明細書中に記載の分子を、上記の代表的な標識と結合体化または標識するための方法は、当業者によって容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，米国特許第４，７４４，９８１号；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，米国特許第５，１０６，９５１号；Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，米国特許第４，０１８，８８４号；Ｍｅｔａｌ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，米国特許第４，８９７，２５５号；およびＭｅｔａｌ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，米国特許第４，９８８，４９６号を参照のこと；Ｉｎｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３４，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔ  Ｂ，ＪａｋｏｂｙおよびＷｉｌｃｈｅｋ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．３０，１９７４もまた参照のこと；ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ，「Ｔｈｅ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２，１９８８もまた参照のこと）。
【０２３３】
（薬学的組成物）
上記のように、本発明はまた、薬学的にまたは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに結合するＴＧＦ−β結合タンパク質を阻害する上記の分子の１つを含む種々の薬学的組成物を提供する。一般に、このようなキャリアは、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であるべきである。通常は、このような組成物の調製は、治療剤と、緩衝液、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、マルトース、スクロースまたはデキストリンが挙げられる）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、ならびに他の安定化剤および賦形剤とを合わせる工程を包含する。中性緩衝化生理食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。
【０２３４】
本発明の薬学的組成物は、種々の異なる経路による投与のために調製され得る。一般に、キャリアの型は、投与様式に基づいて選択される。薬学的組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、クモ膜下腔投与、直腸投与、膣投与、舌下投与または非経口投与（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ）、外耳道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、または尿道内の注射または注入が挙げられる）が挙げられる）について処方され得る。薬学的組成物（例えば、経口投与または注射による送達のため）は、液体の形態（例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁液）中にあり得る。液体の薬学的組成物は、例えば、以下のうちの１種以上を含み得る：溶媒または懸濁媒体として作用し得る滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液（好ましくは、生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、不揮発性油（ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒））；抗菌剤；抗酸化剤；キレート剤；緩衝物質（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）および等張性の調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量のバイアル中に封入され得る。生理食塩水の使用が好ましく、注射可能な薬学的組成物は、好ましくは無菌である。
【０２３５】
本明細書中に記載の組成物は、徐放のために処方され得る（すなわち、投与後の化合物のゆっくりとした放出をもたらすカプセルまたはスポンジのような処方物）。このような組成物は、一般に、周知の技術を使用して調製され得、例えば、経口用の埋め込み、直腸用の埋め込みもしくは舌下用の埋め込みにより、または所望の標的部位における埋め込みにより投与される。徐放性処方物は、キャリアマトリクス中に分散され、そして／または速度制御膜で取り囲まれたレザバ内に含まれる薬剤を含み得る。このような処方物内で使用するためのキャリアは、生体適合性であり、生分解性でもあり得る；好ましくは、この処方物は、比較的一定のレベルの活性成分の放出を提供する。徐放性処方物内に含まれる活性化合物の量は、埋め込みの部位、放出の速度およびの予測される持続時間、ならびに処理または予防されるべき状態の性質に依存する。この点で有用な例示的なキャリアは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子を含む。他の例示的な遅延放出キャリアは、超分子生体ベクター（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）を含み、これは、非脂質親水性コア（例えば、架橋多糖またはオリゴ糖）、および必要に応じて、両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外部層（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ  ９４／２００７８、ＷＯ  ９４／２３７０１およびＷＯ  ９６／０６６３８を参照のこと）を含む。
【０２３６】
別の例示的実施形態において、生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）が、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号、同第５，４０７，６０９号および５，９４２，２５２号に開示される。改変されたＢ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ  ９９／４０９３４、およびこれに引用される参考文献に記載される）もまた、多くの適用のために有用である。別の例示的キャリア／送達系は、粒子−タンパク質複合体（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載されるもの）を含むキャリアを採用し、これは、宿主におけるクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０２３７】
別の例示的実施形態において、リン酸カルシウムコア粒子が、キャリアとして、または本発明の組成物のための制御放出マトリクスとして使用される。例示的なリン酸カルシウム粒子は、例えば、公開特許出願番号ＷＯ／００４６１４７において開示される。
【０２３８】
抗ＳＯＳＴ抗体および／または調節因子をコードするポリヌクレオチドを含む（その結果、このポリペプチドおよび／または調節因子は、インサイチュで生成される）薬学的組成物について、このポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系（核酸、および細菌発現系、ウイルス発現系および哺乳動物発現系が挙げられる）のいずれかに存在し得る。このような発現系にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９，１９９３に記載されるように「裸」であり得、Ｃｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２，１９９３により検討されている。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にＤＮＡをコーティングすることによって増大され得る。
【０２３９】
種々の処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻内、および筋肉内の投与および処方が挙げられる）において本明細書中に記載の特定の組成物を使用するための適切な投薬および処置のレジメンの開発は、当該分野で周知であり、これらのうちのいくつかは、例示の全般的目的のために簡潔に以下に議論される。
【０２４０】
特定の適用において、本明細書中に開示される薬学的組成物は、動物への経口投与を介して送達され得る。よって、これらの組成物は、不活性希釈剤とともに、または同化性可食キャリアとともに処方されてもよいし、あるいは、これらの組成物は、硬質性シェルのゼラチンカプセルまたは軟質性シェルのゼラチンカプセルに閉じこめられてもよいし、あるいは、これらの組成物は、錠剤に圧縮されてもよいし、あるいは、これらの組成物は、食事の食品に直接組み込まれてもよい。
【０２４１】
特定の状況において、本明細書中に開示される薬学的組成物を、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらに腹腔内に送達することが望ましい。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのうちのいくつかは、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中に調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにこれらの混合物および油中に調製され得る。保存および使用の通常の条件の下で、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含み得る。
【０２４２】
注射用途に適した例示的薬学的形態としては、無菌の注射用溶液または分散液の即座の調製のための、無菌の水溶液または分散剤および無菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒、これらの適切な混合物、ならびに／または植物性油であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および／または界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中で使用することによってもたらされ得る。
【０２４３】
一実施形態において、水溶液中での非経口投与のために、この溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤が、まず、十分な塩類またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与のために特に適している。この関係において、本開示に鑑みて、使用され得る滅菌水性媒体は、当業者に公知である。例えば、１投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または推奨される注入部位に注射され得るかのいずれかである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１５版，ｐｐ．１０３５−１０３８および１５７０−１５８０を参照のこと）。投薬量のいくらかの変形例が、処置される被験体の条件に依存して必然的に存在する。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、当然ながら、好ましくは、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓにより必要とされる無菌性、発熱原性、ならびに全般的な安全性および純度標準を満たす。
【０２４４】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成され、無機塩（例えば、塩酸またはリン酸）もしくは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）で形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄）、および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から得られ得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合性の様式で、かつ治療的に有効であるような量で投与される。
【０２４５】
キャリアは、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝化剤、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である範囲を除いて、治療用組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性成分はまた、この組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応も類似の不適切な反応も生じない、分子実体および組成物をいう。
【０２４６】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、ビヒクルなどが、本発明の組成物を適切な宿主細胞／宿主生物に導入するために使用される。特に、本発明の組成物は、送達のために処方され得、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化される。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合または非共有結合のいずれかにより結合され得る。
【０２４７】
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の処方および使用は、一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：３０７−２１，１９９８；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ５６（３）：６９１−９５，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３５（８）：８０１−０９，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１２（２−３）：２３３−６１，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号（各々、その全体が本明細書中に具体的に援用される）を参照のこと）。
【０２４８】
リポソームは、他の手順ではトランスフェクトすることが通常困難である多くの細胞型（Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞）で首尾よく使用されてきた（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２７）：１６３３７−４２，１９９０；Ｍｕｌｌｅｒら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９（３）：２２１−２９，１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系では代表的な、ＤＮＡの長さの拘束がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射治療剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを、種々の培養された細胞株および動物に導入するために有効に使用されてきた。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の自己免疫応答とも、許容されない毒性とも関連しないようである。
【０２４９】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散し、自然に、多層同心二重層の小胞を形成する（これはまた、多重膜小胞（ＭＬＶ）ともいう）リン脂質から形成される。
【０２５０】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現可能な様式で化合物を捕捉し得る（例えば、以下を参照のこと：Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２４（１２）：１１１３−２８，１９９８）。細胞内ポリマー荷重に起因する副作用を避けるために、そのような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計され得る。このような粒子は、例えば、以下に記載されているように作製され得る：Ｃｏｕｖｒｅｕｒら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．５（ｌ）：ｌ−２０，１９８８；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｚｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４５（２）：１４９−５５，１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５０（１−３）：３１−４０，１９９８；および米国特許第５，１４５，６８４号。
【０２５１】
さらに、本発明の薬学的組成物は、そのような薬学的組成物の使用に関する指示を提供する包装材料とともに容器内に配置され得る。一般に、そのような指示は、試薬濃度を記載する分かりやすい表現、および特定の実施形態では、その薬学的組成物を再構成するのに必要であり得る賦形剤成分または希釈物（例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）を相対量で含む。
【０２５２】
（処置の方法）
本発明はまた、骨のミネラル含有量およびミネラル密度を増大させるための方法をも提供する。手短には、多数の状態が、骨ミネラル含有量の喪失を生じる。これら状態としては、例えば、疾患、遺伝的素因、骨の使用の喪失を生じる事故（例えば、骨折）、骨の再吸収を行う治療剤、骨形成細胞を殺傷する治療剤および正常な加齢が挙げられる。ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合を阻害する、本明細書において記載される分子の使用を通じて、そのような状態は、処置または予防され得る。本明細書において利用されるように、骨ミネラル含有量は、選択される部位において、骨ミネラル含有量が統計学的に有意な様式で増加した場合（例えば、標準偏差の１／２より大きい）に増加したと理解されるべきである。
【０２５３】
骨ミネラル含有量の喪失を生じる広範で種々の状態が、本明細書において記載される分子を用いて処置され得る。そのような状態を有する患者は、周知の技術を利用した臨床診断を通じて同定され得る（例えば、以下を参照のこと：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．）。処置され得る疾患の代表例としては、異形成が挙げられ得、この疾患では、骨の異常な成長または発達が存在する。そのような状態の代表例としては、以下が挙げられる：軟骨形成不全症、鎖骨頭蓋骨形成不全、内軟骨腫症、線維性骨形成異常、ゴーシェ病、低リン酸塩血くる病、マーファン症候群、多発性遺伝性外骨腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｅｘｏｔｏｓｅｓ）、神経線維腫症、骨形成不全、大理石骨病、オステオポイキリー、硬化損傷、骨折、歯周疾患、偽関節および化膿骨髄炎。
【０２５４】
処置または予防され得る他の状態としては、広範な種々の骨減少の原因（すなわち、若年時におけるピーク骨格ミネラル含有量を１標準偏差より多く下回る骨ミネラル含有量または密度を生じさせる状態）が挙げられる。そのような状態の代表例としては、貧血状態、ステロイドによって生じる状態、ヘパリンによって生じる状態、骨髄障害、壊血病、栄養失調、カルシウム欠乏症、特発性骨粗鬆症、先天性骨減少、先天性骨粗鬆症、アルコール中毒、慢性肝臓疾患、老化、閉経後状態、希発月経、無月経、妊娠、糖尿病、甲状腺機能亢進、クッシング病、先端巨大症、性腺機能低下症、不動すなわち非活動、反射性交感神経性ジストロフィ症候群、一過性局所性骨粗鬆症および骨軟化症が挙げられる。
【０２５５】
本発明の一つの局面において、骨ミネラル含有量または密度は、温血動物に、治療有効量の、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合を阻害する分子を投与することによって増大され得る。処置され得る温血動物の例としては、脊椎動物および哺乳動物の両方を含み、これらには、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスが挙げられる。治療分子の代表例としては、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体（例えば、ヒト化抗体または本明細書に記載されている他の任意の抗体）が挙げられる。
【０２５６】
本発明の他の局面において、骨密度を増大させる方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：骨にホーミングする（ｈｏｍｅ）細胞に、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーのメンバーへの結合を阻害する分子の発現を指向するベクターを導入する工程；およびそのベクター含有細胞を温血動物に投与する工程。手短には骨にホーミングする細胞は、患者の骨（例えば、骨髄（例えば、ＣＤ３４＋、骨芽細胞、骨細胞など）から得られた細胞）、末梢血から、または培養物から直接得られ得る。
【０２５７】
ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーのメンバーへの結合を阻害する分子の発現を指向するベクターは、細胞に導入され得る。適切なベクターの代表例としては以下が挙げられる：以下のようなウイルスベクター：ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号）、アデノウイルスベクター（例えば、ＷＯ  ９４／２６９１４，ＷＯ  ９３／９１９１；Ｋｏｌｌｓら，ＰＮＡＳ  ９１（１）：２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，ＰＮＡＳ  ９０（２４）：１１４９８−５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８（６）：２８３８−４８，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７，１９９３；Ｚａｂｎｅｒら，Ｃｅｌｌ  ７５（２）：２０７−２１６，１９９３；Ｌｉら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９，１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０：１２８７−１２９１，１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４，１９９３；Ｊａｆｆｅら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８，１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏらＧｅｎｅ  １０１（２）：１９５−２０２、１９９１）、アデノ随伴ウイルスベクター（ＷＯ  ９５／１３３６５；Ｆｌｏｔｔｅら，ＰＮＡＳ  ９０（２２）：１０６１３−１０６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３，１９９４）、天然痘ウイルスベクター（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ａｎｄ  Ｐａｏｌｅｔｔｉ、ＰＮＡＳ  ７９：４９２７−４９３１，１９８２；およびＯｚａｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）６５３：６６０，１９９３）、およびレトロウイルス（例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９１／０２８５；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８）。ウイルスベクターは、異なるウイルス由来のまたは非ウイルス供給源の異なるエレメント（例えば、プロモーター、エンベロープ配列）の混合物を含むように同様に構築され得る。種々の実施形態において、ウイルスベクター自体、またはそのウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかが以下に記載される方法および組成物において利用され得る。
【０２５８】
本発明の他の実施形態において、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーのメンバーへの結合を阻害する分子をコードする核酸分子は、種々の技術により投与され得る：この技術としては、例えば、ポリＬリジンＤＮＡ複合体と結合体化されたアシアロオソムコイド（ＡＳＯＲ）の投与（Ｃｒｉｓｔａｎｏら，ＰＮＡＳ  ９２１２２−９２１２６，１９９３），殺傷されるアデノウイルスに連鎖するＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌら，ＨｕｍＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４，１９９２）、サイトフェクチン媒介性導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ，Ｖｉｃａｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、直接ＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１５−８１８，１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）；リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，１９８９）；リポソーム（ＰｉｃｋｅｒｉｎｇらＣｉｒｃ．８９（１）：１３−２１、１９９４；およびＷａｎｇら，ＰＮＡＳ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｗｉｌｌｉａｍｎｓら，ＰＮＡＳ  ８８：２７２６−２７３０，１９９１）；およびタンパク質自体をコードする核酸の、単独（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３；３８６０−３８６４，１９９３）またはＰＥＧ核酸複合体を利用した直接送達が挙げられる。本発明のベクターによって発現され得る分子の代表的な例としては、リボザイムおよびアンチセンス分子が挙げられ、これらの各々は、以下により詳細に考察される。
【０２５９】
増大した骨ミネラル含有量の決定は、Ｘ線（例えば、Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｏｍｅｔｒｙすなわち「ＤＥＸＡ」）の使用を通じて直接的に、または骨代謝回転マーカー（例えば、骨芽細胞特異的なアルカリホスファターゼ、オステオカルシン、Ｉ型プロコラーゲン、Ｃプロペプチド（ＰＩＣＰ）、および総アルカリホスファターゼ；Ｃｏｍｉｅｒ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｒｈｅｕ．７：２４３，１９９５を参照のこと）もしくは骨吸収のマーカー（ピリジノリン、デオキシピリジノリン、Ｎ−テロペプチド、尿ヒドロキシプロリン、血漿酒石酸耐性酸ホスタファターゼおよびガラクトシルヒドロキシリジン；Ｃｏｍｉｅｒ前出を参照のこと）により決定され得る。骨塊の量もまた、体重からまたは当該分野において公知の他の方法によって計算され得る（Ｇｕｉｎｎｅｓｓ−Ｈｅｙ，Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓ．ａｎｄ  Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．５：１７７−１８１，１９８４を参照のこと）。
【０２６０】
当業者には明らかなように、投与の量および頻度は、処置されるべき適応症の性質および重篤性、所望の応答、患者の状態などに当然に依存する。代表的には、組成物は、種々の上述のような技術によって投与され得る。
【０２６１】
以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【０２６２】
（実施例１：ヒト第１７番染色体のロングアームに対する骨硬化症のマッピング）
ヒトにおける骨硬化症を担う欠損の遺伝子マッピングによって、新規のＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーメンバーをコードするヒト第１７染色体の領域に対してこの障害を担う遺伝子を位置づけした。骨硬化症において、骨格の骨は、罹患していない被験体のものに比べミネラル密度における顕著な増大を提示する。頭部における骨もまた過剰成長を示す。骨硬化症患者は一般的には健常であるが、患者は、誕生時の合指症の程度の変動および頭蓋骨における頭蓋の圧縮および神経圧縮の程度の変動を示し得る。
【０２６３】
骨硬化症に関連する遺伝子欠損の連鎖解析を、この疾患が起こった２４家族の南アフリカのアフリカーナーの家族から収集したＤＮＡサンプルに対してホモ接合性マッピング法を適用することによって実施した（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら，１９９４，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：１３３１−１３３５．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ３  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｍａｐｐｉｎｇ」）。南アフリカのアフリカーナー集団は、遺伝的に同質であり；その集団は、少数の始祖からの子孫であり、その始祖は、数世紀前にその地域を植民地化したのであり、そして地理的および社会的な障害によってその始祖から隔離されてきた。骨硬化症は、アフリカーナーコミュニティの外側の世界では世界中どこでも希であり、このことは、遺伝子における変異がその始祖集団に存在し、そしてそれ以来集団の数の増加と共にその数を増やしてきたのであることを示唆する。ホモ接合性マッピングの使用は、劣勢変異に隣接するＤＮＡマッピングマーカーは、近親婚家族および隔離された集団出身の罹患した個体においてホモ接合性であるようであるという仮定に基づく。
【０２６４】
常染色体からの３７１のマイクロサテライトマーカーのセット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｔ  ６）を選択して、骨硬化症患者サンプルからＤＮＡのプールを分類した。この分析についてのＤＮＡサンプルは、２４家族２９名の骨硬化症の患者、５９名の罹患していない家族のメンバーおよび同一の集団から関連しない対照個体のセットに由来する．このプールは、４〜６の個体からなり、それら個体は罹患した個体、近親婚の家族出身の罹患した個体、両親、および罹患していない兄弟姉妹、あるいは血縁関係のない対照のいずれかである。血縁関係のない個体のプールにおいて、および罹患した個体または家族のメンバーを有するプールのほとんどにおいて，マーカーの分析によって、各々のマーカーについてのいくつかの対立遺伝子サイズが示された。１つのマーカーであるＤ１７Ｓ１２９９は、ホモ接合性の示唆；罹患した個体のプールのいくつかにおいて１つのバンドを示した。
【０２６５】
すべての２４名の骨硬化症家族を、Ｄ１７Ｓ１２９９（１７ｑｌ２−ｑ２１）の領域に合計で１９マーカーを用いて分類した。すべての家族からの罹患した個体は、この領域においてホモ接合性であり、そして２９個体のうちの２５個体は、コアハプロタイプに対してホモ接合性であった。これらは、各々、Ｄ１７Ｓ１７８７とＤ１７Ｓ９３０との間の同じ対立遺伝子を有した。他の４名の個体は、このハプロタイプに適合した１つの染色体と、それに適合しなかった第２のものを有した。合計すれば、このデータは、３メガ塩基領域が必然的に骨硬化症の変異を含むことを示唆した。この３メガ塩基領域におけるエキソンのほとんどの配列分析によって、新規ＴＧＦ−β結合タンパク質コード配列における非センス変異（配列番号１の１１７位のＣ→Ｔ変異は停止コドンを生じる。）を同定した。この変異は、アフリカーナー子孫の骨硬化症患者およびキャリアにとって独特であったことを示した。この遺伝子の正体をさらに、そのイントロンにおける変異（イントロンお＋３位におけるＡ→Ｔ変異）を同定することによって確認した。これは、骨硬化症と診断された単一の血縁関係のない患者において不適切なｍＲＮＡプロセシングを生じる。
【０２６６】
（実施例２：ＴＧＦ−β結合タンパク質の遺伝子発現の組織特異性）
（Ａ．ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＢｅｅｒ遺伝子発現）
第一鎖のｃＤＮＡを、以下の全ＲＮＡサンプルから、市販されるキット（「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて調製した：ヒト脳、ヒト肝臓、ヒト脾臓、ヒト胸腺、ヒト胎盤、ヒト骨格筋、ヒト甲状腺、ヒト下垂体、ヒト骨芽細胞（ＮＨＯｓｔ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから）、ヒト骨肉腫細胞株（Ｓａｏｓ−２，ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８５）、ヒト骨、ヒト骨髄、ヒト軟骨、サバンナサル骨、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびヒトの末梢球単球。すべてのＲＮＡサンプルは、社内で調製した以下のものを除き、市販の供給源（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した：ヒト骨芽細胞、ヒト骨肉腫細胞株、ヒト骨、ヒト軟骨およびサバンナサル骨。これらの社内のＲＮＡサンプルを、市販のキット（「ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）で調製した。
【０２６７】
ＰＣＲをこれらのサンプルに対して行い、そしてさらに、ヒトゲノムサンプルを対照として行った。センスＢｅｅｒオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有する：５’−ＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号１９）。アンチセンスＢｅｅｒオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有した：５’−ＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）。さらに、ＰＣＲを、コントロールとしてヒトβアクチン遺伝子のためのプライマーを用いて実施した。センスβアクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有した：５’−ＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号２１）。アンチセンスβアクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有した：５’−ＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＧＴＡＧＣＡ−３’（配列番号２２）。ＰＣＲを、標準的な条件を用いて、２５μｌ反応物中で行った。ここでは、６１℃のアニール温度を用いた。３２サイクルのＰＣＲを、Ｂｅｅｒプライマーを用いて行い、そして２４サイクルを、βアクチンプライマーを用いて行った。
【０２６８】
増幅後、各反応物からの１２μｌを、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析した。図２Ａを参照のこと。
【０２６９】
（Ｂ．マウス胚切片のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション）
全長マウスＢｅｅｒ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、アンチセンス方向およびセンス方向で、製造業者のプロトコールを用いてクローニングした。３５ＳαＧＴＰ標識したｃＲＮＡセンスおよびアンチセンスの転写物を、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）によって供給されるインビトロ転写試薬を用いて合成した。インサイチュハイブリダイゼーションを、Ｌｙｏｎｓら（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：２４２７−２４３６，１９９０）のプロトコールにしたがって行った。
【０２７０】
マウスＢｅｅｒ  ｃＲＮＡプローブは、発生中のマウス胚の神経管、肢芽、血管および骨化軟骨において発現される特定のメッセンジャーを検出した。図３のパネルＡは、肢（ｌ）芽、血管（ｂｖ）および神経管（ｎｔ）の先端外胚葉性頂堤（ａｅｒ）において発現を示す。パネルＢは、脳（４）の第４脳室における発現を示す。パネルＣは、下顎（ｍａ）、頸椎（ｃｖ）後頭骨（ｏｃ）、口蓋（ｐａ）および血管（ｂｖ）における発現を示す。パネルＤは、肋骨（ｒ）および心臓弁（ｖａ）における発現を示す。パネルＡは、１０．５ｄｐｃ胚の横断切片である。パネルＢは、１２．５ｄｐｃ胚の矢状断面であり、パネルＣおよびパネルＤは、１５．５ｄｐｃ胚の矢状断面である。
【０２７１】
ｂａ＝鰓弓、ｈ＝心臓、ｔｅ＝終脳（前脳）、ｂ＝脳、ｆ＝前頭鼻塊、ｇ＝腸、ｈ＝心臓、ｊ＝顎、ｌｉ＝肝臓、ｌｕ＝肺、ｏｔ＝耳胞、ａｏ＝、ｓｃ＝脊髄、ｓｋｍ＝骨格筋、ｎｓ＝副鼻腔、ｔｈ＝胸腺、ｔｏ＝舌、ｆｌ＝前肢、ｄｉ＝横隔膜。
【０２７２】
（実施例３：組み換えＢＥＥＲタンパク質の発現および精製）
（Ａ．ＣＯＳ−１細胞における発現）
全長ヒトＢｅｅｒタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、以下のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させた：５’オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有し：
【０２７３】
【化１９】
2008505843.tif 000003
そしてＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（ボールド）を持ち、ついで１９ヌクレオチドのＢｅｅｒ遺伝子を含み、これは、推定アミノ末端開始コドン（ＡＴＧ）の前に６塩基対から始まる。３’オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有し：
【０２７４】
【化２０】
2008505843.tif 000004
そして、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（ボールド）に続き、逆で相補的な終止コドン（ＣＴＡ）に続きＦＬＡＧエピトープの逆相補体（下線、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に、Ｂｅｅｒのカルボキシ末端５アミノ酸をコードするヌクレオチドの逆相補体を含む。ＰＣＲ産物は、ＴＡクローニングされ（「Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ」，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、そして個々のクローンを、ＤＮＡ配列決定によってスクリーニングした。ついで、配列を確認したクローンを、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、そして１．５％アガロースゲル上で、市販の試薬（「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」，Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ついで、このフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ホスファターゼ処理したｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）プラスミド中に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、そしてＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピリシンプレート上にプレートした。適切な方向に所望の組み換え体を有するコロニーを、以下を用いるＰＣＲベースのスクリーニングにより同定した：Ｔ７プロモーター／ｐｃＤＮＡ３．１におけるプライミング部位に対応する５’プライマー、および内部ＢＥＥＲ配列の逆相補体に対応する配列５’−ＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２５）を有する３’プライマー。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２７５】
ＣＯＳ-１細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６５０）をトランスフェクションのために用いた。５０μｇの発現プラスミドｐｃＤＮＡ-Ｂｅｅｒ-Ｆｌａｇを、市販のキットを用いて製造業者が供給するプロトコールに従ってトランスフェクションした（「ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。トランスフェクション後の最終の培地は、０．１％の仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であった。培養４日後、その培地を取り出した。組み換えＢＥＥＲの発現を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いたウエスタンブロットにより分析した。組み換えＢＥＥＲタンパク質の精製を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティカラム（「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて実施した。このカラムのプロファイルを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。
【０２７６】
（Ｂ．ＳＦ９昆虫細胞における発現）
ヒトＢｅｅｒ遺伝子配列を、標準的な条件および以下のプライマーを用いたＰＣＲを用いて、増幅した：
センスプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＴ−３’（配列番号２６）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＧＧＣ−３’（配列番号２７）。
【０２７７】
得られたｃＤＮＡは、２回の改変を有するＢｅｅｒのコード領域を含んだ。Ｎ末端分泌シグナルを除去し、そしてＦＬＡＧエピトープタグ（Ｓｉｇｍａ）をインフレームで挿入物のＣ末端に融合した。ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を加え、そして遺伝子を標準的な方法を用いてバキュロウイルス発現ベクター中への移入のためにｐＭｅｌＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。
【０２７８】
Ｂｅｅｒタンパク質を発現する組み換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ-Ｎ-Ｂｌｕｅトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製し、そして製造業者の指示にしたがって精製した。
【０２７９】
ＳＦ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０％仔ウシ血清を含むＴＮＭＦＨ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。タンパク質発現のために、スピナーフラスコ中のＳＦ９培養物を、１０より大きなＭＯＩで感染させた。培地および細胞のサンプルを、５日間にわたり毎日採取し、そして抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）または抗Ｂｅｅｒウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロットによってＢｅｅｒの発現をモニターした。
【０２８０】
５日後、バキュロウイルス感染したＳＦ９細胞を遠心分離により採取し、そして細胞に付随するタンパク質を細胞ペレットから、高塩抽出緩衝剤（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）を用いて抽出した。抽出物（３００ｍｌ培養物中あたり２０ｍｌ）を、遠心分離により明澄化し、４リットルのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）に対して３回透析し、そして遠心分離を再び行って明澄化した。この高塩画分をＨｉｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；５ｍｌベッド容量）にアプライし、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて徹底的に洗浄し、そして結合したタンパク質を１５０ｍＭ  ＮａＣｌから１２００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配で溶出した。Ｂｅｅｒ溶出物を、約８００ｍＭ  ＮａＣｌにおいて観察した。Ｂｅｅｒを含む画分を、１０％グリセロールおよび１ｍＭ  ＤＴＴに補充し、そして８０℃で凍結した。
【０２８１】
（実施例４：ＢＥＥＲ、ＧＲＥＭＬＩＮおよびＤＡＮに対するポリクローナル抗体の調製および試験）
（Ａ．抗原の調製）
ヒトＢｅｅｒ、ヒトＧｒｅｍｌｉｎおよびヒトＤａｎのＤＮＡ配列を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた標準的なＰＣＲ方法を用いて増幅した：
Ｈ．Ｂｅｅｒ
センス：５’−ＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＧＴＴＣ−３’（配列番号２８）
アンチセンス５’−ＡＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号２９）
Ｈ．Ｇｒｅｍｌｉｎ
センス：５’−ＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号３０）
アンチセンス：５’−ＡＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＴＧＧＡ−３’（配列番号３１）
Ｈ．Ｄａｎ
センス：５’−ＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号３２）
アンチセンス：５’−ＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号３３）。
【０２８２】
各場合において、列挙されたプライマーは、コード領域全体−分泌シグナル配列を増幅した。これらは、ＢｅｅｒおよびＧｒｅｍｌｉｎについてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの部位、そしてＤａｎについてＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの部位で、細菌性発現ベクターｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）内にサブクローニングするための制限部位を含む。ｐＱＥ３０は、クローニング領域の５’末端に６×Ｈｉｓタグのコード配列を含む。完成した構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ−１５／ｐＲｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ）に形質転換し、個々のクローンを、配列決定により確認した。Ｍ−１５／ｐＲｅｐ内のタンパク質発現および精製（セファロースに結合したＮｉ−ＮＴＡに結合する、６×Ｈｉｓ親和性タグ）を、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｈｅ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ）により記載されるように実施した。
【０２８３】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢｅｅｒタンパク質を、６Ｍグアニジン中での可溶化を用いて有意な量で回収し、２〜４Ｍまで透析して、保存の間の沈殿を防止した。Ｇｒｅｍｌｉｎタンパク質およびＤａｎタンパク質を、６Ｍグアニジン中での可溶化を用いてより高い量で回収し、精製後のグアニジン濃度は０．５Ｍであった。
【０２８４】
（Ｂ．ポリクローナル抗体の産生および試験）
上記の３つの抗原の各々に対するポリクローナル抗体を、標準的なプロトコールを用いて、ウサギ宿主およびニワトリ宿主において産生した（Ｒ＆Ｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ；ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｒａｂｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｓｅｒａ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２版．１９９２．１１．３７−１１．４１．寄稿：Ｈｅｌｅｎ  Ｍ．ＣｏｏｐｅｒおよびＹｖｏｎｎｅ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ；ニワトリ抗血清は、Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｒａｍｏｎａ，ＣＡで作製した）。
【０２８５】
ウサギ抗血清およびニワトリの卵のＩｇｙ画分を、ウエスタンブロットにより活性についてスクリーニングした。上記の３つの抗原の各々を、ＰＡＧＥにより分離し、０．４５μｍニトロセルロース（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に移した。この膜を、各片がおよそ７５ｎｇの抗原を含むように細片（ｓｔｒｉｐ）に切断した。この細片を、３％  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ  Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中でブロッキングし、１×Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）／０．０２％  ＴＷＥＥＮ緩衝液中で３回洗浄した。一次抗体（ブロッキング緩衝液中、１：１００〜１：１，０００の範囲の希釈物中の予備免疫ビーズ、ウサギ抗血清、またはニワトリの卵ＩｇＹを、穏やかに揺り動かしながら、１時間、細片と共にインキュベートした。１×ＴＢＳ／０．０２％  ＴＷＥＥＮでの３回の洗浄を２シリーズ行なった後、二次抗体（ペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ウサギ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；またはペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ニワトリ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共に１時間インキュベートした。１×ＴＢＳ／０．０２％  ＴＷＥＥＮの３回の洗浄の最終サイクルを行い、この細片をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発色させた。
【０２８６】
（Ｃ．抗体の交差反応性試験）
前節において説明したプロトコールに従って、Ｂｅｅｒ、ＧｒｅｍｌｉｎまたはＤａｎのニトロセルロース細片を、そのそれぞれのウサギ抗血清またはニワトリの卵ＩｇＹの希釈物（１：５０００および１：１０，０００）、ならびに残りの２つの抗原に対して作製された抗血清またはニワトリの卵Ｉｇｙ（希釈物１：１０００および１：５０００）と共にインキュベートした。マッチしない抗体のレベルの増加を実施して、増加した濃度においてのみ見られ得るこれらの抗体による低親和性結合を検出した。発色のプロトコールおよび持続時間は、上記のプロトコールを用いた３つ全ての結合事象について同じものである。試験した抗原のいずれについても、抗原の交差反応性は観察されなかった。
【０２８７】
（実施例５  ＢｅｅｒのＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質との相互作用）
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なる系統学的アームに由来するタンパク質とのＢｅｅｒの相互作用を、免疫沈降法を用いて研究した。精製したＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＧＤＮＦを、市販の供給源（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得た。代表的なプロトコールは以下の通りである。部分的に精製したＢｅｅｒを、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に透析した。免疫沈降を、３００μｌのＩＰ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．５％  トリトンＸ１００、および１０％グリセロール）中で行なった。３０ｎｇの組換えヒトＢＭＰ−５タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、５００ｎｇのＦＬＡＧエピトープタグ化Ｂｅｅｒの存在下および非存在下にて、１５μｌのＦＬＡＧ親和性マトリクス（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）に適用した。このタンパク質を、４℃にて４時間インキュベートし、次いで、この親和性マトリクスに結合したタンパク質を、ＩＰ緩衝液（洗浄ごとに１ｍｌ）中で５回洗浄した。この結合したタンパク質を、６０μｌの１×ＳＤＳ  ＰＡＧＥサンプル緩衝液中の親和性マトリクスから溶出した。このタンパク質を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、Ｂｅｅｒに結合したＢＭＰ−５を、抗ＢＭＰ−５抗血清（Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）を用いるウエスタンブロットにより検出した（図５を参照のこと）。
【０２８８】
（Ｂｅｅｒリガンド結合アッセイ）
ＦＬＡＧ−Ｂｅｅｒタンパク質（２０ｎｇ）を、１００μｌのＰＢＳ／０．２％  ＢＳＡに添加し、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で事前にコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに吸着させ、ＰＢＳ中１０％のＢＳＡでブロッキングした。これを、室温で６０分間実施する。このタンパク質溶液を取り除き、そしてウェルを洗浄して、結合していないタンパク質を取り除く。ＢＭＰ−５を、ＰＢＳ／０．２％  ＢＳＡ中１０ｐＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度で各ウェルに添加し、そして、室温で２時間インキュベートする。結合溶液を取り除き、そしてこのプレートを、２００μｌ容量のＰＢＳ／０．２％  ＢＳＡで３回洗浄する。次いで、ＢＭＰ−５のレベルを、ＥＬＩＳＡによって、ＢＭＰ−５抗血清を用いて検出する（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ  ２  １１．２．１−１１．２．２２）。特異的な結合を、全結合から非特異的な結合を減算することによって算出し、ＬＩＧＡＮＤプログラム（ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｄｂａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，ｐ２２０−２３９，（１９８０））により分析する。
【０２８９】
この方法のバリエーションにおいて、Ｂｅｅｒを操作して、ヒトＦｃ融合タンパク質として発現させる。同様に、リガンドＢＭＰを操作して、マウスＦｃ融合として発現させる。これらのタンパク質を一緒にインキュベートし、均質な時間分解蛍光検出（Ｇ．Ｗ．Ｍｅｌｌｏｒら，Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，３（２）９１−９９，１９９８）を用いて、Ｍｅｌｌｏｒらに記載されるようにアッセイを実施する。
【０２９０】
（実施例６  ＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合するＴＧＦ−β結合タンパク質の阻害についてのスクリーニングアッセイ）
上記のアッセイを、２つの例外を除いて、繰り返す。第一に、ＢＭＰ濃度を以前に決定したＫｄに固定したままにする。第二に、アンタゴニスト候補のコレクションを固定濃度で添加する（有機低分子のコレクションの場合は２０μＭ、そして抗体の研究においては１μＭ）。これらのＴＧＦ−β結合タンパク質の候補分子（アンタゴニスト）の結合は、種々の化学構造を表す、市販または内部のコレクションに由来する有機化合物を含む。これらの化合物を、ＤＭＳＯ中のストック溶液として調製し、標準的なアッセイ条件下で、１％以下の最終容積でアッセイウェルに添加する。これらを、ＢＭＰおよびＢｅｅｒと共に室温で２時間インキュベートし、この溶液を取り除き、そして、結合したＢＭＰを記載されたように定量する。化合物または抗体の非存在下で観察されたＢＭＰの結合の４０％を阻害する薬剤を、この相互作用のアンタゴニストと考える。これらをさらに、力価研究に基づいて強力なインヒビターとして評価し、これらの阻害定数、およびＴＧＦ−β結合タンパク質の結合親和性に対するその影響を決定する。また、同等の特異性のコントロールアッセイを実施して、ＢＭＰリガンドの作用に依存するアッセイを使用した研究（例えば、ＢＭＰ／ＢＭＰレセプター競合研究）を通じて、同定されたアンタゴニストについての選択性プロフィールを確立し得る。
【０２９１】
（実施例７  骨マトリクスへのＴＧＦ−β結合タンパク質局在化の阻害）
骨マトリクス（ヒドロキシアパタイト）への局在化の阻害の評価を、Ｎｉｃｏｌａｓの方法（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｖ．Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ５７：２０６，１９９５）を改変したものを用いて実施する。簡単に述べると、１２５Ｉで標識したＴＧＦ−β結合タンパク質を、Ｎｉｃｏｌａｓ（前出）により記載されたように調製する。ポリプロピレン濾過膜（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｎｃ，Ｗｅｙｍｏｕｔｈ  ＭＡ）を備え付けた９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにヒドロキシアパタイトを添加する。ＴＧＦ−β結合タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液中０．２％アルブミンに添加する。マトリクスを含むウェルを、この緩衝液で３回洗浄する。吸着したＴＧＦ−β結合タンパク質を、０．３Ｍ  ＮａＯＨを用いて溶出し、定量する。
【０２９２】
ＴＧＦ−β結合タンパク質を試験分子と一緒にインキュベートし、上記のようにこの混合物をマトリクスに適用することによって、インヒビターの同定を行なう。このマトリクスを、ＰＢＳ緩衝液中の０．２％アルブミンで３回洗浄する。吸着したＴＧＦ−β結合タンパク質を、０．３Ｍ  ＮａＯＨを用いて溶出し、定量する。化合物も抗体も存在しない条件下で観察されたＴＧＦ−β結合タンパク質の４０％を阻害する薬剤を、骨局在化のインヒビターと考える。これらのインヒビターを、用量応答研究を通じてさらに特徴づけ、その阻害定数、およびＴＧＦ−β結合タンパク質の結合親和性に対するその影響を決定する。
【０２９３】
（実施例８  ＴＧＦ−β結合タンパク質変異体の構築物）
（Ａ．変異誘発）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ中の全長ＴＧＦ−β結合タンパク質ｃＤＮＡは、変異誘発のための鋳型として機能する。簡単に述べると、適切なプライマー（上に提供される考察を参照のこと）を利用して、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応によってＤＮＡフラグメントを作製する。このポリメラーゼ連鎖反応を、５７℃のアニーリング温度を用いて、製造業者により提供された緩衝液中で、２３サイクル実行する。次いで、この生成物を、２つの制限酵素に曝露して、アガロースゲル電気泳動を用いて単離した後、再び、マッチする配列を酵素的消化により除去したｐＢＲＰ４−５０３に連結する。変異体の完全性を、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【０２９４】
（Ｂ．変異型ＴＧＦ−β結合タンパク質の哺乳動物細胞発現および単離）
変異型ＴＧＦ−β結合タンパク質のｃＤＮＡを、実施例３に記載したｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現ベクターに移す。配列を確認した後、得られた構築物を、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトし、分泌されたタンパク質を、実施例３に記載したように精製する。
【０２９５】
（実施例９  動物モデル−Ｉ）
（Ｂｅｅｒ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスの作製）
ＣＩＴＢマウスゲノムＤＮＡライブラリー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬにより分配される）から単離された、約２００キロベース（ｋｂ）のＢＡＣクローン１５Ｇ５を使用して、マウスＢｅｅｒ遺伝子の完全配列、ならびにその５’および３’の隣接領域を決定した。遺伝子本体全体＋約１７ｋｂの５’隣接配列および約２０ｋｂの３’隣接配列を含む４１ｋｂのＳａｌＩフラグメントを、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩコスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ内で増殖させた。次いで、このコスミド構築物から、マウスＢｅｅｒ遺伝子全体、ならびに５’および３’の隣接配列（それぞれ、１７ｋｂおよび１４ｋｂ）を含む３５ｋｂのＭｌｕＩ−ＡｖｉＩＩ制限フラグメント（配列番号６）を、従来の手段を用いてゲル精製し、マウス接合体のマイクロインジェクション（ＤＮＸ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ；米国特許第４，８７３，１９１号）のために使用した。クローン化したＤＮＡフラグメントがゲノム内にランダムに挿入された創始動物（ｆｏｕｎｄｅｒ  ａｎｉｍａｌ）を、生きて生まれた仔の５〜３０％の頻度で得た。トランスジーンの存在を、少量のマウス組織（例えば、尾の先端）から抽出したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施することにより確認した。ＤＮＡを、以下のプロトコールを用いて抽出した：組織を、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫを含有する溶解緩衝液中、５５℃にて一晩消化した。次の日、このＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（５０：５０）で一度、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で一度抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁して、８〜１０μｇの各ＤＮＡサンプルを、ＥｃｏＲＩのような制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動に供し、そして、荷電したナイロン膜（例えば、ＨｙＢｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））に移した。次いで、得られたフィルターを、マウスＢｅｅｒ遺伝子座に由来し、かつ内因性遺伝子座に由来するフラグメントおよびトランスジーンに由来する異なるサイズのフラグメントの両方を認識し得る放射能標識したＤＮＡフラグメントと共にハイブリダイズした。ファウンダー動物を正常な非トランスジェニックマウスと交配させ、Ｂｅｅｒ遺伝子の過剰発現の効果を決定するために十分な数のトランスジェニック子孫および非トランスジェニック子孫を作製した。これらの研究のために、種々の齢の動物（例えば、１日齢、３週齢、６週齢、４ヶ月齢）を、広範な骨格形成、骨塩密度、骨塩含有量、破骨細胞および骨芽細胞の活性、軟骨内骨化の程度、軟骨形成などを確認するために設計された多数の異なるアッセイに供する。トランスジーンからの転写活性は、種々の組織からＲＮＡを抽出し、そして、トランスジーンが由来するマウス株（１２９Ｓｖ／Ｊ）とＤＮＡマイクロインジェクションのために用いたマウスの株［（Ｃ５７ＢＬ５／Ｊ×ＳＪＫ／Ｊ）Ｆ２］���の間の一塩基多型を利用するＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いることによって、決定され得る。
【０２９６】
（動物モデル−ＩＩ）
（相同組換えによるマウスＢｅｅｒ遺伝子の破壊）
胚性幹（ＥＳ）細胞における相同組換えを用いて、内因性のマウスＢｅｅｒ遺伝子を不活性化し、その後、機能喪失変異を保有する動物を作製し得る。Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を、その発現が、内因性のＢｅｅｒ遺伝子プロモーターおよび翻訳開始シグナルにより制御されるように、ターゲティングベクター内に遺伝子操作する。この方法において、Ｂｅｅｒ遺伝子発現の空間的かつ時間的なパターンが、ターゲティングされた対立遺伝子を保有する動物において決定され得る。
【０２９７】
このターゲティングベクターを、まず、ｐＧＴ−Ｎ２９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する薬物選択可能なホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターにより駆動されるネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）カセットを、クローニングベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングすることによって構築した。ＰＣＲを用いて、Ｐ１  Ｃｒｅリコンビナーゼの認識部位であるバクテリオファージＰ１  ｌｏｘＰ部位（Ｈｏｅｓｓら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，７９：３３９８，１９８２）に、ＰＧＫｎｅｏカセットを隣接させた。このことにより、ターゲティングされたＥＳ細胞、またはＥＳ細胞が由来する動物における、ｎｅｏ耐性マーカーのその後の除去が可能となる（米国特許第４，９５９，３１７号）。このＰＣＲプライマーを、３４ヌクレオチド（ｎｔｄ）のｌｏｘＰ配列、１２〜２５ｎｔｄのＰＧＫｎｅｏカセットの５’末端および３’末端、ならびに、ｐＳＰ７２にクローニングするための制限酵素認識部位（センスプライマーにおいてはＢａｍＨＩ、そしてアンチセンスプライマーにおいてはＥｃｏＲＩ）から構成された。センスプライマーの配列は、５’−ＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＴ−３’（配列番号３４）であり；アンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＡ−３’（配列番号３５）であった。
【０２９８】
次の段階は、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、およびｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に由来するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する３．６ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＳＰ７２−ＰＧＫｎｅｏプラスミドにクローニングすることであった。マウスＢｅｅｒ遺伝子座に相同な「短いアーム（ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ）」を、ＢＡＣクローン１５Ｇ５に由来する２．４ｋｂのフラグメントを増幅することによって作製した。このフラグメントの３’末端は、Ｂｅｅｒ遺伝子の翻訳開始部位と一致し、そして、ＰＣＲにおいて使用したアンチセンスプライマーはまた、そのコード領域がＢｅｅｒ開始部位にインフレームで融合し得るように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の５’末端に対して相補的な３０ｎｔｄを含んだ。「短いアーム」をｐＳＰ７２−βｇａｌ−ＰＧＫｎｅｏプラスミドに導入するために取られたアプローチは、このプラスミドを、β−ｇａｌ遺伝子の上流にある部位で直線状にし、次いで、このフラグメントを「短いアーム」のＰＣＲ産物と同時形質転換し、そして、このＰＣＲ産物が相同組換えによって組み込まれたプラスミドを選択することであった。「短いアーム」の増幅のためのセンスプライマーは、この組換え事象を可能にするために、ｐＳＰ７２ベクターに対して相補的な３０ｎｔｄを含んだ。このセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴ−３’（配列番号３６）であり、そして、アンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡ−３’（配列番号３７）であった。
【０２９９】
Ｂｅｅｒ遺伝子座に由来する「長いアーム（ｌｏｎｇ  ａｒｍ）」を、希少切断制限酵素部位ＳｇｒＡＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを導入するプライマーを用いて、ＢＡＣクローン１５Ｇ５に由来する６．１ｋｂのフラグメントを増幅することによって作製した。具体的には、センスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号３８）であり；アンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＴＣＧＴＴＡＡＴＴ−３’（配列番号３９）であった。得られたＰＣＲ産物を、中間的な工程として、ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。
【０３００】
マウスＢｅｅｒ遺伝子ターゲティング構築物はまた、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復エレメント（ＲＳＶ  ＬＴＲ）の制御下に、第二の選択マーカーである、単純疱疹ウイルスＩのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶＴＫ）を含んだ。この遺伝子の発現は、哺乳動物細胞を、ガンシクロビルに対して感受性（かつ生存不能）にする；それゆえ、この構築物が非相同的な事象により組み込まれたネオマイシン耐性細胞に対して選択するための簡便な方法である（米国特許第５，４６４，７６４号）。このＲＳＶＬＴＲ−ＨＳＶＴＫカセットを、ｐＰＳ１３３７から、後に「長いアーム」−ＴＡベクタープラスミドのＦｓｅＩ部位およびＡｓｃＩ部位へのクローニングを可能にするプライマーを用いて増幅した。このＰＣＲについて、センスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＡ−３’（配列番号４０）であり；アンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号４１）であった。
【０３０１】
ターゲティングベクターの構築の最終段階は、「長いアーム」およびＲＳＶＬＴＲ−ＨＳＶＴＫ遺伝子を含有する８．８ｋｂのＳｇｒＡＩ−ＡｓｃＩフラグメントを、ｐＳＰ７２−「短いアーム」−βｇａｌ−ＰＧＫｎｅｏプラスミドのＳｇｒＡＩ部位およびＡｓｃＩ部位にクローニングする工程を包含する。このターゲティングベクターを、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションする前に、ＡｓｃＩまたはＰａｃＩのいずれかで消化することによって直線状にした。
【０３０２】
（実施例１０  アンチセンス媒介性のＢｅｅｒの不活性化）
最初のオリゴヌクレオチドの５’末端が、Ｂｅｅｒ転写物の転写開始ＡＵＧと重なり、そして次のオリゴヌクレオチドの５’末端が、ＢｅｅｒのＡＵＧに対して５’方向に５ヌクレオチド増分移動を生じる（５０ヌクレオチド離れるまで）ような方法で重なる形式で、１７ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製する。等価な塩基組成を用いるが、コーディングｍＲＮＡに対するあらゆる有意なハイブリダイゼーションを阻害するために、配列は再分配して、対応するコントロールオリゴヌクレオチドを設計および調製する。この試験細胞系への試薬の送達を、カチオン性脂質送達（Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３，１９８７）により行なう。２μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、１００μｌの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ低血清培地；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）に添加し、そしてこれを、１００μｌの低血清培地中のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬（６μｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）と混合する。これらを混合し、室温にて３０分間複合体形成させ、そして、この混合物を、前もって播種しておいたＭＣ３Ｔ３Ｅ２１細胞またはＫＳ４８３細胞に添加する。これらの細胞を培養し、そしてｍＲＮＡを回収する。Ｂｅｅｒ  ｍＲＮＡを、Ｂｅｅｒ特異的なプライマーと組合せたＲＴ−ＰＣＲを用いてモニタリングする。さらに、別々の実験ウェルを回収し、そして、実施例４に記載されたウエスタンブロット法によりタンパク質レベルを特徴付ける。この細胞を収集し、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ）中に再懸濁し、そして、可溶性タンパク質を回収する。この物質を、１０〜２０％勾配の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用する。分離したタンパク質をニトロセルロースに移し、そして、記載された抗体試薬を用いて、上記のようにウエスタンブロットを実施する。並行して、コントロールオリゴヌクレオチドを同一の培養物に添加し、そして、実験操作を繰り返す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理が、コントロールと混ぜたオリゴヌクレオチドと比較したいずれの場合においても５０％の変化を生じた場合、Ｂｅｅｒ  ｍＲＮＡまたはＢｅｅｒタンパク質のレベルの低下を有意であると考える。この方法論は、選択的な遺伝子の不活性化、およびこれらの組織培養モデルにおける、その後の石灰化した小結節の表現型の特徴づけを可能にする。
【０３０３】
（実施例１１  スクレロスチンコア領域のモデル化）
相同性認識技術（例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７））、ＦＵＧＵＥ（Ｓｈｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：２４３−５７（２００１））は、ＳＯＳＴのコア領域（ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ）が、シスチンノットの折り畳みを採用することを示唆した。ＦＵＧＵＥは、配列と構造との間の相同性を検出するための感度のいい方法である。実験的に決定された３Ｄ構造が公知のヒト絨毛性ゴナドトロピン−β（ｈＧＣ−β）は、ＦＵＧＵＥにより、ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅの最も近い相同体として同定された（Ｓｈｉら、前出）。それゆえ、ｈＣＧ−βは、ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅのための３Ｄモデルを構築するための構造的な鋳型として用いられた。
【０３０４】
ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅおよびその近い相同体のアラインメントを図７に示す。アラインメントで示される相同体の中でも、ｈＣＧ−β（ＣＧＨＢ）のみが既知の３Ｄ構造を有した。ＳＯＳＴ＿ＣｏｒｅとｈＣＧ−βとの間の配列同一性は、約２５％であった。８つのＣＹＳ残基が、ファミリー間で保存されており、ＳＯＳＴ＿ＣｏｒｅとｈＣＧ−βとの間の全体的な構造類似性を際立たせている。これらのシスチンの対（１−５、３−７、４−８）は、「ノット」配置でジスルフィド結合（図７において実線で示す）を形成し、これは、シスチンノットの折り畳みに特徴的であった。図７に点線で示される付加的なジスルフィド結合（２−６）は、このファミリーに固有のものであり、他のシスチンノットファミリー（例えば、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ）と、このタンパク質のファミリーを区別した。
【０３０５】
ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅを、構造的な鋳型として、ｈＣＧ−βの３Ｄ構造（Ｗｕら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：５４５−５８（１９９４））であるＰＤＢ（Ｂｅｒｍａｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８（Ｐｔ  ６  Ｐｔ１）：８９９−９０７（２００２））エントリー１ＨＣＮを用いてモデル化した。モデルを、ＭＯＤＥＬＥＲ（ＳａｌｉおよびＢｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９−８１５（１９９３））を用いて計算した。最良なモデルのスナップ写真を図８に示す。
【０３０６】
多くのシスチンノットタンパク質は、モノマーの疎水性コアを欠いているので、ダイマーを形成する（Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒら，前出；ＳｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒおよびＧｒｕｔｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：４４５−５８（１９９３））；Ｗｕら，前出）。ＳＯＳＴは、おそらく同じ規則に従い、そして、その安定性を増すために、ホモダイマーを形成する。ダイマー化したＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ領域についてのモデルを構築することは、以下の理由から、いくつかの課題を提示した：（１）ＳＯＳＴ＿ＣｏｒｅとｈＣＧ−βとの間の配列類似性が低かった（２５％）；（２）ホモダイマーの代わりに、ｈＣＧ−βは、ｈＣＧ−αとヘテロダイマーを形成した；ならびに（３）モノマーの多数の異なる相対的立体配置が、異なるファミリーに由来するダイマー化したシスチンノットタンパク質（例えば、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ニューロトロフィン、ＩＬ−１７Ｆ、ゴナドトロピン）において観察されており、これは、ＳＯＳＴのダイマー立体配置が、ｈＣＧ−α／βヘテロダイマー立体配置から有意に偏向し得ることを示唆した。このモデルを構築する際に、手動の調整と組合せて構造重ね合わせ技術を用いて、ヘテロダイマー構造（１ＨＣＮ）に由来するｈＣＧ−βでｈＣＧ−αを置き換え、次いで、擬ｈＣＧ−βホモダイマー構造に従ってＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅホモダイマーモデルを構築した。最終的なモデルを図９に示す。
【０３０７】
（実施例１２）
（ＳＯＳＴ−ＢＭＰ相互作用のモデリング）
本実施例は、ＢＭＰにおけるＩ型およびＩＩ型レセプター結合部位のタンパク質モデリングを記載し、この結合部位は、ＢＭＰとＳＯＳＴとの間の相互作用に関係する。
【０３０８】
競合研究は、ＳＯＳＴが、ＢＭＰへの結合に関してＩ型レセプターおよびＩＩ型レセプターの両方と競合したことを示した。ＥＬＩＳＡベースの競合アッセイでは、ＢＭＰ−６が、スクレロスチンでコーティングした表面（３００ｎｇ／ウェル）と高い親和性（ＫＤ＝３．４ｎＭ）で選択的に相互作用した。増加量のＢＭＰレセプターＩＡ（ＦＣ融合構築物）は、ＢＭＰ−６（１１ｎＭ）への結合に関してスクレロスチンと競合した（ＩＣ５０＝１１４ｎＭ）。１０倍のモル過剰のＢＭＰレセプターは、ＢＭＰ−６に対するスクレロスチンの結合を約５０％まで減少させるのに十分であった。この競合を、ＢＭＰレセプターＩＩ−ＦＣ融合タンパク質（ＩＣ５０＝３６ｎＭ）およびＤＡＮ（ＩＣ５０＝４３ｎＭ）でも観察した。このアッセイの特異性を、スクレロスチンとｒアクチビンＲ１Ｂ−ＦＣ融合タンパク質（ＢＭＰに結合しなかったＴＧＦ−βファミリーメンバー）との間の、ＢＭＰ−６への結合に関する競合の欠如によって示した。
【０３０９】
ＢＭＰポリペプチドにおけるＩ型およびＩＩ型レセプター結合部位は、マッピングされており、そして空間的に分離していた（Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒら、前出；Ｉｎｎｉｓら、前出；Ｎｉｃｋｅｌら、前出；Ｈａｒｔら、前出）。高い親和性でＢＭＰに結合する別のＢＭＰアンタゴニストであるＮｏｇｇｉｎは、ＮｏｇｇｉｎのＮ末端部分を介して、Ｉ型およびＩＩ型レセプター結合部位の両方においてＢＭＰに接触する（Ｇｒｏｐｐｅら、前出）。Ｃ末端付近のコア領域中の２つのβ鎖はまた、ＩＩ型レセプター結合部位においてＢＭＰに接触する。
【０３１０】
手動調整されたＮｏｇｇｉｎとＳＯＳＴとのアラインメントは、この２つのポリペプチドが、タンパク質のＮ末端部分間とコア領域との間の配列類似性を共有することを示した。アミノ酸配列アラインメントを、図１０に示す。特徴的なｃｙｓ−ｋｎｏｔを形成するシステイン残基が、ＮｏｇｇｉｎとＳＯＳＴとの間で観察された。全体の配列同一性は、２４％であり、Ｎ末端結合領域（アラインメント位置１〜４５）内の配列同一性は、３３％であった。ＮｏｇｇｉｎのＮ末端結合領域における２つの残基（すなわち、アラインメント位置２１のＬｅｕ（Ｌ）および位置２３のＧｌｕ（Ｅ））は、ＢＭＰ結合において重要な役割を果たすと報告された（Ｇｒｏｐｐｅら、前出）。両方の残基は、ＳＯＳＴでも同様に保存された。コア領域（アラインメント位置１３１〜２２８）内の配列同一性は、約２０％であったが、ｃｙｓ−ｋｎｏｔ骨格は維持され、そして十分な数の重要な残基が保存され、ＮｏｇｇｉｎとＳＯＳＴとの間の相同性を支持している。
【０３１１】
Ｎｏｇｇｉｎ構造をＳＯＳＴともまた比較して、どのように２つのＳＯＳＴモノマーが二量化するのかを理解した。図１１に示されるように、Ｎｏｇｇｉｎ構造は、Ｎ末端領域とコア領域との間のリンカーが、２つの領域を接続することにおいて役割を果たすだけでなく、２つのＮｏｇｇｉｎモノマー間で二量体化界面の一部を形成することを示唆した。ＮｏｇｇｉｎとＳＯＳＴとの間の１つの主な違いは、Ｎ末端領域とコア領域との間のリンカーがＳＯＳＴで非常に短かったことであった。
【０３１２】
ＳＯＳＴのＣ末端領域は、ＳＯＳＴ二量体化で役割を果たし得る。Ｎｏｇｇｉｎの配列はコア領域で終わったが、ＳＯＳＴは、余剰なＣ末端領域を有した。Ｎｏｇｇｉｎ構造では、ジスルフィド結合が２つのＮｏｇｇｉｎモノマーのＣ末端を接続した。従って、ＳＯＳＴのＣ末端領域は、２つのモノマーの界面の近くから始まり、二量体化に寄与し得た。さらに、二次構造予測は、ＳＯＳＴのＣ−末端領域のいくらかの部分がヘリックスを形成する傾向を有することを示した。ＳＯＳＴ中のこの領域は、おそらくヘリックス−ヘリックスパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）（これは、Ｎｏｇｇｉｎにおける長いリンカーの昨日の模倣である）を通じて二量体化活性に関与し得る。ＮｏｇｇｉｎとＳＯＳＴとの構造間の別の違いは、アラインメント位置１６９〜１８５におけるＳＯＳＴコア領域におけるアミノ酸挿入であった（図１０を参照のこと）。この挿入は、β−ヘアピンを広げ、これはＮｏｇｇｉｎ構造中の二量体化界面に向いていた（図１１ではモノマーの中央にかつＣ末端Ｃｙｓ残基の上にループ領域として示される）。この広がったβ−ヘアピンもまた、ＳＯＳＴ二量体化に寄与し得た。
【０３１３】
（実施例１３）
（ＳＯＳＴペプチド免疫原の設計および調製）
本実施例は、ＳＯＳＴペプチド免疫原の設計を記載し、この免疫原は、動物を免疫しＢＭＰとＳＯＳＴとの間の相互作用をブロックしかつＳＯＳＴモノマーのダイマー形成を妨げる抗体を生成させるために使用される。
【０３１４】
（ＢＭＰ結合フラグメント）
ＳＯＳＴとＮｏｇｇｉｎとの間の全体的な類似性、および２つのポリペプチドのＮ末端領域間の類似性は、ＳＯＳＴがＮｏｇｇｉｎと類似の様式でＢＭＰと相互作用し得ることを示唆する。つまり、ＳＯＳＴのＮ末端領域は、ＢＭＰにおけるＩ型およびＩＩ型レセプター結合部位の両方と相互作用し得、そしてコア領域（図１０のアミノ酸アラインメント位置１９０〜２２０）の一部は、ＩＩ型レセプター結合部位と相互作用し得、その結果、これらのＳＯＳＴ領域に特異的な抗体は、ＢＭＰのＳＯＳＴへの結合をブッロクするかまたは弱め得る。
【０３１５】
ラットおよびヒトＳＯＳＴに対するこれらのＳＯＳＴポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、以下のように提供される。
【０３１６】
ＳＯＳＴ＿Ｎ＿リンカー：Ｎ末端領域（コア領域に接続する短いリンカーを含む）
【０３１７】
【化１】
2008505843.tif 000005
ＳＯＳＴ＿コア＿結合：ＢＭＰのＩＩ型レセプター結合部位においてＢＭＰと接触する可能性を有するコア領域の部分（両方の末端においてわずかに伸ばされてＣＹＳ残基アンカーを含む）：
【０３１８】
【化２】
2008505843.tif 000006
（ＳＯＳＴ二量体化フラグメント）
ＳＯＳＴのＣ末端領域は、ＳＯＳＴホモダイマーの形成に関与する可能性を有する（実施例１２を参照のこと）。伸長したβ−ヘアピンもまた、ホモダイマー形成で役割を果たし得る。このような領域に特異的に結合する抗体は、ＳＯＳＴモノマーの二量体化を妨げるか弱め得る。このことにより、続いて、ＳＯＳＴとの間の相互作用を妨げ得る。これらの領域に対応するラットおよびヒトのＳＯＳＴにおけるポリペプチドフラグメントは、以下のとおりである。
【０３１９】
ＳＯＳＴ＿Ｃ：Ｃ末端領域
【０３２０】
【化３】
2008505843.tif 000007
ＳＯＳＴ＿コア＿ダイマー：ＳＯＳＴ二量体化に関与する可能性を有するコア領域の部分（両方の末端でわずかに伸ばされてＣｙｓ残基アンカーを含む）：
【０３２１】
【化４】
2008505843.tif 000008
（ＳＯＳＴのＮ末端におけるＢＭＰ結合フラグメント）
ＳＯＳＴの重要なＮ末端結合領域（図１０におけるアラインメント位置１〜３５）を、Ｎｏｇｇｉｎ／ＢＭＰ−７複合体構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ登録番号：１Ｍ４Ｕ）およびアミノ酸配列アラインメント（図１０を参照のこと）を基にモデリングして、ＢＭＰと相互作用する可能性を有するＳＯＳＴのＮ末端のアミノ酸残基を同定した。ＳＯＳＴのモデルは、図１２に示されている。比較モデルでは、ＳＯＳＴ配列におけるアラインメント位置８（矢印および付随の文章を参照のこと）におけるフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）が、ＢＭＰダイマーの表面上の疎水性ポケットに突き出ている。同様の「ノブ−穴（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」の特徴が、ＢＭＰとＩ型レセプターとの複合体構造で観察されており（Ｎｉｃｋｅｌら、前出）、レセプターのＰｈｅ８５が、同様のポケットに適合し、このことがＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー（例えば、ＴＧＦ−βファミリー、ＢＭＰファミリーなどを含む）に対するリガンド−Ｉ型レセプター認識において重要な特徴である。このモデルに従って、プロリン（Ｐｒｏ）によるターン（Ｐｒｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｕｒｎ）もまた保存され、これが、Ｎ末端結合フラグメントがＢＭＰダイマー表面に沿って進み、Ｉ型レセプター結合部位からその複合体の反対側のＩＩ型レセプター結合部位に移動することを可能にする。また、結合フラグメントのカルボキシ末端付近のＰｒｏが指示する別のターンが保存され、次いでこれは、リンカー領域に接続する。ＳＯＳＴとＢＭＰとの間の広範な接触は、図１２において明らかである。
【０３２２】
（ペプチド免疫原）
ペプチドを、ＢＭＰタンパク質と接触することが予想されるＳＯＳＴのＮ末端領域を含むように設計した。そのペプチド配列を以下に示す。動物を免疫するために、ペプチド配列を重複するように設計し、そして追加のシステインをそのＣ末端の終端に付加して、ＫＬＨへの架橋を容易にした。次いで、このペプチドを、免疫するために使用した。その免疫原のペプチド配列は、以下のとおりである。
【０３２３】
ヒトＳＯＳＴ：
【０３２４】
【化５】
2008505843.tif 000009
追加のＣｙｓを含むヒトＳＯＳＴペプチド：
【０３２５】
【化６】
2008505843.tif 000010
ラットＳＯＳＴ：
【０３２６】
【化７】
2008505843.tif 000011
追加のＣｙｓを含むラットＳＯＳＴペプチド：
【０３２７】
【化８】
2008505843.tif 000012
以下のペプチドを、ＢＭＰタンパク質と接触すると予想されるコア領域のアミノ酸部分を含むように設計した。システインを、ＫＬＨへの結合のために、各ペプチドのＣ末端の終端に付加し、その結合ペプチドを免疫に使用した。ドッキングコアＮ末端ペプチドにおいて、ＫＬＨへの二重の結合を回避するために、内部のシステインをセリンに変更した。
【０３２８】
ヒトＳＯＳＴについて：
付加されたＣｙｓ残基を含まないアミノ酸配列：
【０３２９】
【化９】
2008505843.tif 000013
ラットＳＯＳＴについて：
付加または置換されたＣｙｓ残基を含まないアミノ酸配列：
【０３３０】
【化１０】
2008505843.tif 000014
付加または置換されたＣｙｓ残基を含むペプチド免疫原：
【０３３１】
【化１１】
2008505843.tif 000015
ＳＯＳＴホモダイマーを形成するように相互作用する可能性のあるＳＯＳＴ内の２つの領域は、Ｎｏｇｇｉｎに存在しないＳＯＳＴコア領域を有するアミノ酸を含む。この配列を含むように設計したヒトＳＯＳＴペプチドは、ＫＬＨに結合するＣ末端ＣｙｓまたはＮ末端Ｃｙｓを有した。ラットＳＯＳＴペプチドについて、システインを、その配列のカルボキシ末端に付加した（配列番号７６）。ＫＬＨ結合ペプチドを免疫のために使用した。
【０３３２】
ヒトＳＯＳＴについて：
【０３３３】
【化１２】
2008505843.tif 000016
ラットＳＯＳＴについて：
【０３３４】
【化１３】
2008505843.tif 000017
付加されたシステインを含むラットＳＯＳＴペプチド
【０３３５】
【化１４】
2008505843.tif 000018
ＳＯＳＴホモダイマーを形成するように相互作用する可能性のあるＳＯＳＴ内の第２の領域は、Ｃ末端領域を含む。ペプチド免疫原を、この領域内のアミノ酸配列を含むように設計した（以下を参照のこと）。ＫＬＨへの結合のために、システイン残基を、Ｃ末端の終端に付加し、その結合ペプチドを免疫のために使用した。
【０３３６】
ヒトＳＯＳＴについて：
【０３３７】
【化１５】
2008505843.tif 000019
Ｃ末端に付加されたＣｙｓを含むペプチド免疫原：
【０３３８】
【化１６】
2008505843.tif 000020
ラットＳＯＳＴについて：
【０３３９】
【化１７】
2008505843.tif 000021
Ｃ末端に付加されたＣｙｓを含むペプチド免疫原：
【０３４０】
【化１８】
2008505843.tif 000022
（実施例１４）
（ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗体の結合を検出するためのアッセイ）
本実施例は、スクレロスチンに対するリガンド（例えば、抗体またはその抗体フラグメント）の結合を検出するためのアッセイを記載する。
【０３４１】
ＦＬＡＧ（登録商標）−スクレロスチン融合タンパク質を、製造業者（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により提供されるプロトコールおよび米国特許第６，３９５，５１１号に記載のプロトコールに従って調製した。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを、抗ＦＬＡＧ（登録商標）モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングし、次いで、ＰＢＳ中の１０％  ＢＳＡでブロックする。上記融合タンパク質（２０ｎｇ）を１００μｌ  ＰＢＳ／０．２％  ＢＳＡに添加し、９６ウェルプレート上へ室温で６０分間吸着させる。このタンパク質溶液を取り出し、ウェルを洗浄して未結合の融合タンパク質を除去する。ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７）を、ＰＢＳ／０．２％  ＢＳＡに希釈し、各ウェルに１０ｐＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度で添加する。室温で２時間インキュベート後、結合溶液を取り出し、プレートを２００μｌ体積のＰＢＳ／０．２％  ＢＳＡで３回洗浄する。スクレロスチンに対するＢＭＰの結合を、標準的なＥＬＩＳＡ技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ  ２  １１．２．１〜１１．２．２２（１９９８）を参照のこと）に従って、そのＢＭＰに特異的なポリクローナル抗血清抗体またはモノクローナル抗体、および適切な酵素結合二段階試薬を用いて検出する。特異的結合を、全結合から非特異的結合を差し引くことによって計算し、ＬＩＧＡＮＤプログラム（Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｄｂａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０〜３９（１９８０））を用いて分析する。
【０３４２】
ＢＭＰに対するスクレロスチンの結合をまた、均一時間分解蛍光検出（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（Ｍｅｌｌｏｒら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、３：９１−９９（１９９８））によって検出する。スクレロスチンをコードするポリヌクレオチド配列を、組換え核酸構築物におけるヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結し、当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法に従って、ヒトＦｃ−スクレロスチン融合タンパク質として発現させる。同様に、ＢＭＰリガンドを操作し、ＢＭＰ−マウスＦｃ融合タンパク質として発現させる。これらの２つの融合タンパク質を一緒にインキュベートし、Ｍｅｌｌｏｒらによって記載されるようにアッセイを行う。
【０３４３】
（実施例１５）
（ＴＧＦ−β結合タンパク質に対するＴＧＦ−βファミリーメンバーの結合を阻害する抗体のためのスクリーニングアッセイ）
本実施例は、スクレロスチンに対するＴＧＦ−βファミリーメンバーの結合を阻害する抗体を検出するための方法を記載する。ＥＬＩＳＡを、ＢＭＰ濃度をそのＫｄ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって決定される）で固定した状態にすることを除いて、基本的に実施例１４に記載されるように実施する。さらに、抗体または抗体のライブラリーもしくはコレクションを、ウェルに１μＭの濃度まで加える。抗体を室温で２時間、ＢＭＰおよびスクレロスチンと共にインキュベートし、その溶液を取り出し、そして結合したＢＭＰを記載されるように（実施例１４）定量する。抗体の非存在下で観察されるＢＭＰの結合の４０％を阻害する抗体は、この相互作用のアンタゴニストであると考えられる。これらの抗体をさらに、潜在的なインヒビターとして、力価研究を実施してＴＧＦ−β結合タンパク質の結合親和性におけるそれらの阻害定数および阻害効果を決定することによって評価する。同等の特異性コントロールアッセイもまた、ＢＭＰリガンドの作用に依存するアッセイ（例えば、ＢＭＰ／ＢＭＰレセプター競合研究）を用いて、同定されたアンタゴニストについての選択的プロフィールを確証するために行ってもよい。
【０３４４】
（実施例１６）
（骨基質へのＴＧＦ−β結合タンパク質局在化の阻害）
骨基質（ハイドロキシアパタイト）への局在化の阻害の評価を、Ｎｉｃｏｌａｓの方法（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．５７：２０６−１２（１９９５））に対する改変を用いて行う。簡単に述べると、１２５Ｉ標識ＴＧＦ−β結合タンパク質を、Ｎｉｃｏｌａｓ（前出）により記載されるように調製する。ハイドロキシアパタイトを、ポリプロピレン濾過膜（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｎｃ，Ｗｅｙｍｏｕｔｈ  ＭＡ）を備える９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。次いで、ＰＢＳ緩衝液中の０．２％アルブミンに希釈したＴＧＦ−β結合タンパク質を、ウェルに添加する。基質を含むウェルをＰＢＳ緩衝液中の０．２％アルブミンで３回洗浄する。吸着されたＴＧＦ−β結合タンパク質を、０．３Ｍ  ＮａＯＨを用いて溶出し、次いで、定量する。
【０３４５】
ハイドロキシアパタイトに対するスクレロスチンＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害するかまたは弱める抗体を、ＴＧＦ−β結合タンパク質をこの抗体と共にインキュベートし、その混合物を上記のように基質に適用することによって同定する。その基質を、ＰＢＳ緩衝液中の０．２％アルブミンで３回洗浄する。吸着されたスクレロスチンを、０．３Ｍ  ＮａＯＨで溶出し、次いで、定量する。抗体の非存在下で観察される結合レベルと比較して、ハイドロキシアパタイトに対するスクレロスチンの結合レベルを少なくとも４０％阻害する抗体は、骨局在化インヒビターであると考えられる。このような抗体を、用量応答研究でさらに特徴付けして、ＴＧＦ−β結合タンパク質の結合親和性におけるその阻害定数および阻害効果を決定する。
【０３４６】
上記から、本発明の特定の実施形態が、例示目的のために本明細書に記載されてきたが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いては、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０３４７】
【図１】図１は、ヒトＤａｎ；ヒトＧｒｅｍｌｉｎ；ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびヒトＢｅｅｒのアミノ酸配列を比較する図式の説明である。矢印は、システイン骨格を示す。
【図２】図２は、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子（特に、ヒトＢｅｅｒ遺伝子）の発現についての種々のヒト組織の調査から得られた結果を要約する。半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順を使用して、全ＲＮＡから合成された第一の鎖のｃＤＮＡ由来の遺伝子の一部分を増幅した（実施例２Ａにおいて、より詳細に記載した）。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、マウスＢｅｅｒ転写物に相補的であるｃＲＮＡプローブを用いて、マウス胚切片のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションから得られた結果を要約する（実施例２Ｂにおいて、より詳細に記載した）。パネル３Ａは、１０．５ｄｐｃ胚の横断面である。パネル３Ｂは、１２．５ｄｐｃ胚の矢状断面であり、そしてパネル３Ｃおよびパネル３Ｄは、１５．５ｄｐｃ胚の矢状断面である。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、ウエスタンブロット分析によって、３種の異なるポリクローナル抗体のそれぞれの抗原に対する特異性を説明する（実施例４において、より詳細に記載した）。図４Ａは、Ｈ．Ｂｅｅｒ抗原（Ｈ．ＤａｎまたはＨ．Ｇｒｅｍｌｉｎではない）に対する抗Ｈ．Ｂｅｅｒ抗体の特異的な反応性を示す。図４Ｂは、Ｈ．Ｇｒｅｍｌｉｎ抗原（Ｈ．ＢｅｅｒまたはＨ．Ｄａｎの抗原ではない）に対する抗Ｈ．Ｇｒｅｍｌｉｎ抗体の反応性を示す。図４Ｃは、Ｈ．Ｄａｎ（Ｈ．ＢｅｅｒまたはＨ．Ｇｒｅｍｌｉｎではない）に対する抗Ｈ．Ｄａｎ抗体の反応性を示す。
【図５】図５は、ウエスタンブロット分析によって、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（ＢＭＰ−４ではない）に対するＴＧＦ−β結合タンパク質、Ｂｅｅｒの選択性を説明する（実施例５において、より詳細に記載した）。
【図６】図６は、ＴＧＦ−β結合タンパク質、ＢｅｅｒとＢＭＰ−５との間のイオン性相互作用が、１５〜３０ｎＭ範囲の解離定数を有することを示す。
【図７】図７は、ＳＯＳＴ（スクレロスチン）ポリペプチドおよびその最も近いホモログの特徴的なシスチンノットを含む領域の配列を提示する。シスチンノットを形成する３つのジスルフィド結合は、実線として図示される。点線によって示される余分なジスルフィド結合は、このファミリーに独特であり、３Ｄ構造において２つのβヘアピンチップを連結する。示されたポリペプチドは、以下である：ＳＯＳＴ：スクレロスチン（配列番号１２６）；ＣＧＨＢ：ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβ（配列番号１２７）；ＦＳＨＢ：卵胞刺激ホルモンβサブユニット（配列番号１２８）；ＴＳＨＢ：甲状腺刺激ホルモンβ鎖前駆体（配列番号１２９）；ＶＷＦ：Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（配列番号１３０）；ＭＵＣ２：ヒトムチン２前駆体（配列番号１３１）；ＣＥＲ１：Ｃｅｒｂｅｒｕｓ  １（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓホモログ）（配列番号１３２）；ＤＲＭ：ｇｒｅｍｌｉｎ（配列番号１３３）；ＤＡＮ：（配列番号１３４）；ＣＴＧＦ：結合組織増殖因子前駆体（配列番号１３５）；ＮＯＶ：ＮｏｖＨ（腎芽細胞腫過剰発現遺伝子タンパク質ホモログ）（配列番号１３６）；ＣＹＲ６：（配列番号１３７）。
【図８】図８は、ＳＯＳＴのコア領域（ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ）の３Ｄモデルを説明する。
【図９】図９は、ＳＯＳＴホモダイマーのコア領域の３Ｄモデルを提示する。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、５種の異なる動物に由来するＮｏｇｇｉｎのアミノ酸配列の整列を提供する：ヒト（ＮＯＧＧ＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１３８）；ニワトリ（ＮＯＧＧ＿ＣＨＩＣＫ，配列番号１３９）；アフリカツメガエル（ＮＯＧＧ＿ＸＥＮＬＡ，配列番号１４０）；ＮＯＧＧ＿ＦＵＧＲＵ，配列番号１４１）；およびゼブラフィッシュ（ＮＯＧＧ＿ＺＥＢＲＡ，配列番号１４２）；ならびにヒト由来のＳＯＳＴ（ＳＯＳＴ＿ＨＵＭＡＮ，配列番号４６）、ラット（ＳＯＳＴ＿ＲＡＴ，配列番号６５）、およびマウス（ＳＯＳＴ＿Ｍｏｕｓｅ，配列番号１４３）。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、５種の異なる動物に由来するＮｏｇｇｉｎのアミノ酸配列の整列を提供する：ヒト（ＮＯＧＧ＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１３８）；ニワトリ（ＮＯＧＧ＿ＣＨＩＣＫ，配列番号１３９）；アフリカツメガエル（ＮＯＧＧ＿ＸＥＮＬＡ，配列番号１４０）；ＮＯＧＧ＿ＦＵＧＲＵ，配列番号１４１）；およびゼブラフィッシュ（ＮＯＧＧ＿ＺＥＢＲＡ，配列番号１４２）；ならびにヒト由来のＳＯＳＴ（ＳＯＳＴ＿ＨＵＭＡＮ，配列番号４６）、ラット（ＳＯＳＴ＿ＲＡＴ，配列番号６５）、およびマウス（ＳＯＳＴ＿Ｍｏｕｓｅ，配列番号１４３）。
【図１１】図１１は、Ｎｏｇｇｉｎ／ＢＭＰ−７複合体構造を図示する。ＢＭＰホモダイマーは、表面様式において図の下部分に示される。Ｎｏｇｇｉｎホモダイマーは、漫画様式で、ＢＭＰダイマーの上に示される。円は、Ｎ末端結合領域、コア領域、およびＮ末端とコア領域との間のリンカーの輪郭を描く。
【図１２】図１２は、ＳＯＳＴのＮ末端領域に位置される潜在的なＢＭＰ結合フラグメントの３Ｄモデルを示す。ＢＭＰダイマーは、表面様式において示され、潜在的なＢＭＰ結合フラグメントがスティック様式（ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅ）で示される。ＢＭＰ表面上の疎水性ポケットへのフェニルアラニン残基の適合が記述される
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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