(57)【要約】      （修正有）【課題】付着性培養細胞を足場となる増殖用の担体等の培養培地から簡易な構成で容易に細胞の剥離が可能な細胞剥離装置及び細胞剥離方法及び細胞培養システムの提供。【解決手段】剥離槽２と、該剥離槽に細胞が付着した担体を含む培地１４を供給する培地供給ライン３と、前記剥離槽に剥離液を供給する剥離液供給ライン５と、前記剥離槽の下部に設けられ、細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルタ９と、該フィルタの下方で前記剥離槽に接続された廃液ライン６と、前記剥離槽を揺動させる振盪機構８とを具備し、前記廃液ラインを介して前記培地を排出した前記剥離槽内に前記剥離液供給ラインから前記剥離液１２を供給し、前記振盪機構が前記剥離槽を揺動させ、前記担体を流動させて細胞を剥離させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
剥離槽と、該剥離槽に細胞が付着した担体を含む培地を供給する培地供給ラインと、前記剥離槽に剥離液を供給する剥離液供給ラインと、前記剥離槽の下部に設けられ、細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルタと、該フィルタの下方で前記剥離槽に接続された廃液ラインと、前記剥離槽を揺動させる振盪機構とを具備し、前記廃液ラインを介して前記培地を排出した前記剥離槽内に前記剥離液供給ラインから前記剥離液を供給し、前記振盪機構が前記剥離槽を揺動させ、前記担体を流動させて細胞を剥離させることを特徴とする細胞剥離装置。
【請求項２】
前記剥離槽内に供給した前記剥離液により、前記フィルタ上にスラリー状の前記担体の流動層が形成される請求項１の細胞剥離装置。
【請求項３】
前記振盪機構は、前記剥離槽を水平方向に往復動させる請求項１又は請求項２の細胞剥離装置。
【請求項４】
細胞が付着した担体を含む培地を剥離槽に供給する工程と、該剥離槽下部の細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルタにより前記培地を濾過する工程と、該培地を前記剥離槽から排出する工程と、前記フィルタ上に残った前記担体に剥離液を供給してスラリー状の流動層を形成する工程と、振盪機構による前記剥離槽の揺動により前記流動層を流動させ細胞を剥離させる工程とを有することを特徴とする細胞剥離方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞剥離装置を用いた細胞培養システムであって、細胞導入装置と、細胞培養装置と、細胞剥離装置と、細胞回収装置とを具備し、前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に細胞が付着した担体を導入し、前記細胞培養装置が前記担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記培地に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、剥離させた細胞を前記細胞回収装置に回収させることを特徴とする細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養した細胞を担体から剥離させる細胞剥離装置及び細胞剥離方法及び細胞培養システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞、植物細胞等の細胞には、それぞれ培養の際に増殖用の足場を必要とする付着性の細胞と、増殖用の足場を必要としない浮遊性の細胞とがあり、培養された細胞は有用物質の生産等に広く使用されている。
【０００３】
動物細胞の培養方法として、静置培養法や浮遊培養法等がある。例えば静置培養法により付着性の細胞を培養する場合には、シャーレやＴフラスコ内、或は６〜２４穴のプレートの穴に培養液を導入し、底面に細胞を付着させるか、或は寒天等により培養液を固化させ、固化させた培養液上に細胞を付着させることで、細胞の培養を行う。
【０００４】
底面或は固化させた培養液上に細胞を付着させる静置培養法の場合、平面上での培養となるので、１ｃｍ2 当り１０4 個の細胞しか培養できず、１０8 個の細胞を培養する場合には約２０００ｃｍ2 もの広さが必要となる。
【０００５】
又、浮遊培養法により付着性の細胞を培養する場合には、直径が１８０μｍ程度のマイクロキャリア（担体）に細胞を付着させ、ボトル等の容器に導入された培養液中に前記担体を浮遊させ、該担体に付着した細胞に許容剪断応力（細胞が破損しない強さの剪断応力）以下の剪断応力を与えることで、細胞の培養を行う。
【０００６】
浮遊培養法により細胞を培養する場合、１ｍＬ当り１０6 個の細胞が培養可能であり、１０8 個の細胞を培養する場合でも、１００ｍＬ程度の培養液があればよい。
【０００７】
従来では、静置培養法、浮遊培養法の何れも、培養した細胞を付着対象から剥離させる場合、細胞にＥＤＴＡ液（エチレンジアミン四酢酸）等の剥離液を加え、細胞を剥がれ易くした状態で、作業者がピペットにより吸引、排出を繰返すことで担体と細胞との間に剪断応力を作用させ、細胞を剥離させていた。この為、細胞を剥離させるのに時間と労力が必要であった。
【０００８】
又、ピペットによる細胞の剥離を自動化したものもあるが、この場合、細胞を培養する容器の蓋の開閉や、ピペットを動作させるロボットが必要となる為、装置が複雑且つ高価なものとなる。
【０００９】
尚、特許文献１には、分注容器の蓋を開け、収容容器からチップに細胞懸濁液を吸引し、前記分注容器のウェル内に細胞懸濁液を吐出する工程を自動で行う様になっており、細胞懸濁液を吸引する際に前記チップの先端に空気層を形成することで、前記チップからの液だれを防止する送液方法、送液ユニット、及び自動培養システムが開示されている。
【００１０】
又、特許文献２には、作業空間の内部に、細胞培養のための各種操作が行われる作業テーブルと、パスボックスを通じて持込まれた容器に所定の細胞を植付ける等の所定の作業を自動で行うロボットアームとが設けられ、前記作業空間の確実な滅菌処理が行えると共に、クローズドされた空間において滅菌ガスを無害化することができる細胞自動培養装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−１０２７２３号公報
【特許文献２】特開２０１１−１６７４０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は斯かる実情に鑑み、簡易な構成で容易に細胞の剥離が可能な細胞剥離装置及び細胞剥離方法及び細胞培養システムを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、剥離槽と、該剥離槽に細胞が付着した担体を含む培地を供給する培地供給ラインと、前記剥離槽に剥離液を供給する剥離液供給ラインと、前記剥離槽の下部に設けられ、細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルタと、該フィルタの下方で前記剥離槽に接続された廃液ラインと、前記剥離槽を揺動させる振盪機構とを具備し、前記廃液ラインを介して前記培地を排出した前記剥離槽内に前記剥離液供給ラインから前記剥離液を供給し、前記振盪機構が前記剥離槽を揺動させ、前記担体を流動させて細胞を剥離させる細胞剥離装置に係るものである。
【００１４】
又本発明は、前記剥離槽内に供給した前記剥離液により、前記フィルタ上にスラリー状の前記担体の流動層が形成される細胞剥離装置に係るものである。
【００１５】
又本発明は、前記振盪機構は、前記剥離槽を水平方向に往復動させる細胞剥離装置に係るものである。
【００１６】
又本発明は、細胞が付着した担体を含む培地を剥離槽に供給する工程と、該剥離槽下部の細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルタにより前記培地を濾過する工程と、該培地を前記剥離槽から排出する工程と、前記フィルタ上に残った前記担体に剥離液を供給してスラリー状の流動層を形成する工程と、振盪機構による前記剥離槽の揺動により前記流動層を流動させ細胞を剥離させる工程とを有する細胞剥離方法に係るものである。
【００１７】
更に又本発明は、細胞導入装置と、細胞培養装置と、細胞剥離装置と、細胞回収装置とを具備し、前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に細胞が付着した担体を導入し、前記細胞培養装置が前記担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記培地に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、剥離させた細胞を前記細胞回収装置に回収させる細胞培養システムに係るものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、剥離槽と、該剥離槽に細胞が付着した担体を含む培地を供給する培地供給ラインと、前記剥離槽に剥離液を供給する剥離液供給ラインと、前記剥離槽の下部に設けられ、細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルタと、該フィルタの下方で前記剥離槽に接続された廃液ラインと、前記剥離槽を揺動させる振盪機構とを具備し、前記廃液ラインを介して前記培地を排出した前記剥離槽内に前記剥離液供給ラインから前記剥離液を供給し、前記振盪機構が前記剥離槽を揺動させ、前記担体を流動させて細胞を剥離させるので、容易且つ一度に大量の細胞を回収でき、作業時間を短縮することができると共に、前記担体から細胞を剥離させ、回収する為のロボット等を必要とせず、装置構成の簡易化及び小型化が図れ、製作コストの低減を図ることができる。
【００１９】
又本発明によれば、細胞が付着した担体を含む培地を剥離槽に供給する工程と、該剥離槽下部の細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルタにより前記培地を濾過する工程と、該培地を前記剥離槽から排出する工程と、前記フィルタ上に残った前記担体に剥離液を供給してスラリー状の流動層を形成する工程と、振盪機構による前記剥離槽の揺動により前記流動層を流動させ細胞を剥離させる工程とを有するので、容易且つ一度に大量の細胞を回収でき、作業時間を短縮することができると共に、前記担体から細胞を剥離させ、回収する為のロボット等を必要とせず、装置構成の簡易化及び小型化が図れ、製作コストの低減を図ることができる。
【００２０】
更に又本発明によれば、細胞導入装置と、細胞培養装置と、細胞剥離装置と、細胞回収装置とを具備し、前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に細胞が付着した担体を導入し、前記細胞培養装置が前記担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記培地に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、剥離させた細胞を前記細胞回収装置に回収させるので、前記細胞剥離装置を簡易な構成とすることができ、システム全体の小型化が図れ、製作コストの低減、省スペース化が図れると共に、大量の細胞を効率よく回収することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施例に係る細胞剥離装置を示す構成図である。
【図２】本発明の実施例に係る細胞剥離装置を用いた細胞剥離処理を説明するフローチャートである。
【図３】本発明の実施例に係る細胞培養システムを説明するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、図面を参照しつつ本発明の実施例を説明する。
【００２３】
先ず、本実施例に係る細胞培養システム２６について説明する。該細胞培養システム２６は、主に、細胞導入装置２７、細胞培養装置１２、細胞剥離装置１、細胞回収装置２８によって構成され、細胞の導入から培養、剥離、回収迄の一連の処理を行う。尚、図３中、実線の矢印は各構成同士が常時接続されている状態を示し、破線の矢印は各構成同士が必要に応じてその都度接続される状態を示している。
【００２４】
前記細胞導入装置２７は、主に薬液タンク３３、担体供給容器３４、細胞供給部３５、冷蔵庫３６等により冷蔵保存された培地タンク３７から構成されている。前記担体供給容器３４、前記細胞供給部３５、前記培地タンク３７には、それぞれ担体３８、細胞（図示せず）、培地１４が貯溜されており、前記細胞導入装置２７は、前記細胞培養装置１２の培養槽３９に前記培地１４と共に前記担体３８を供給する様になっている。
【００２５】
前記細胞培養装置１２は、主に恒温槽４１等により恒温状態が維持される前記培養槽３９、培地循環ポンプ４２、廃液タンク４３から構成されている。前記細胞培養装置１２は、前記細胞導入装置２７から供給された前記担体３８を前記培地１４中に浮遊させ、前記培地循環ポンプ４２により前記培地１４を循環させることで、細胞に許容剪断応力以下の剪断応力を与え、細胞を培養する。
【００２６】
又、前記細胞剥離装置１は、主に剥離槽２、各種薬液が貯溜された薬液タンク４４（後述する緩衝液供給源１５、剥離液供給源１６）から構成され、前記薬液タンク４４から供給された薬液と剪断応力付与手段により与えられる剪断応力により、前記剥離槽２内で前記担体３８から細胞を剥離させる。更に、前記細胞回収装置２８は、前記細胞剥離装置１により剥離された細胞のみを回収する様になっている。
【００２７】
以下、図１を参照して前記担体３８から細胞を剥離させる剥離行程を行う前記細胞剥離装置１の詳細について説明する。前記剥離槽２は略円筒状の容器であり、下端部は下方に向って縮径する円錐形状となっている。又、該剥離槽２の上端には培地供給ライン３と緩衝液供給ライン４と剥離液供給ライン５とがそれぞれ連通され、前記剥離槽２の下端には廃液ライン６と細胞回収ライン７とがそれぞれ連通されている。
【００２８】
又、前記剥離槽２の下部には、該剥離槽２を揺動可能に保持する剪断応力付与手段である振盪機構８が設けられる。前記剥離槽２内の下部には、メッシュ状のフィルタ９が水平に設けられている。尚、本実施例に於いて、揺動とは、所要の振幅、周波数により前記剥離槽２を水平方向、垂直方向に往復動させる動作、該剥離槽２を所定の速度で往復円運動させる動作、所要の振幅、周波数により所定の支点を中心に前記剥離槽２を往復傾斜させる動作等を含む。本実施例に於いては、前記振盪機構８は、例えば１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍの範囲で前記剥離槽２を揺動させる。
【００２９】
前記フィルタ９は、細胞のみを通し、前記担体３８は通さない大きさの網目を有している。ここで、該担体３８はセファロース、ポリスチレン、セラミック等からなるマイクロキャリアであり、直径は１８０μｍ程度となっている。又、前記フィルタ９上には、前記担体３８の流動層１１（後述）が形成される様になっている。
【００３０】
又、前記培地供給ライン３は、細胞を培養する前記細胞培養装置１２と上流側で接続され、中途部に培地供給ポンプ１３が設けられている。前記細胞培養装置１２は、前記培地供給ポンプ１３を介して、前記培地供給ライン３から細胞の付着した前記担体３８を含む前記培地１４を前記剥離槽２内に供給可能となっている。
【００３１】
前記緩衝液供給ライン４は、上流側で前記緩衝液供給源１５と接続され、前記緩衝液供給ライン４を介して、前記剥離槽２内にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等の緩衝液を供給可能となっている。又、前記剥離液供給ライン５は、上流側で前記剥離液供給源１６と接続され、前記剥離液供給ライン５を介して、前記剥離槽２内にＥＤＴＡ液（エチレンジアミン四酢酸）等の剥離液を供給可能となっている。
【００３２】
前記廃液ライン６は、余剰となった前記培地１４等を排出する前記廃液タンク４３（図３参照）と下流側で接続されている。又、前記廃液ライン６の中途部には廃液ポンプ１７が設けられ、該廃液ポンプ１７を駆動させることで前記剥離槽２内の液体を前記廃液タンク４３に排出可能となっている。
【００３３】
前記細胞回収ライン７は、無菌コネクタ１８を介して下流側で細胞導入ライン１９と接続されている。又、前記細胞回収ライン７の中途部には回収ポンプ２１が設けられ、該回収ポンプ２１を駆動することで前記剥離槽２内の細胞を前記細胞導入ライン１９を介して細胞回収容器２２に回収できる様になっている。尚、該細胞回収容器２２は、前記細胞回収装置２８の一部を構成している。
【００３４】
前記細胞回収容器２２は、例えば遠沈管であり、内部には予め前記培地１４が導入されており、蓋体２３により閉塞されている。該蓋体２３には前記細胞導入ライン１９が貫通し、該細胞導入ライン１９は前記細胞回収容器２２の内部に延伸し、該細胞回収容器２２の底部近傍で開口している。又、前記蓋体２３にはエア給排ライン２４が接続されている。該エア給排ライン２４は、前記培地１４の液面よりも上方で開口し、中途部にエアフィルタ２５が設けられている。
【００３５】
次に、図２のフローチャートを用い、前記細胞剥離装置１を用いた細胞剥離処理について説明する。
【００３６】
ＳＴＥＰ：０１  細胞剥離処理が開始されると、先ず前記培地供給ポンプ１３を駆動させ、前記培地供給ライン３を介して、前記細胞培養装置１２で培養された細胞を含む前記培地１４が前記剥離槽２内に供給される。この時、該剥離槽２内に供給される前記培地１４の流量は、回収する細胞の個数により決定される。
【００３７】
ＳＴＥＰ：０２  前記剥離槽２内に所望の流量の前記培地１４が供給されると、前記培地供給ポンプ１３を停止し、前記廃液ポンプ１７を駆動させて、前記剥離槽２内の前記培地１４を前記廃液ライン６を介して前記廃液タンク４３に排出する。この時、前記フィルタ９の網目の大きさは前記担体３８の直径よりも小さくなっているので、前記培地１４が濾過され、前記フィルタ９上には前記培地１４中に含まれていた前記担体３８が残留する。
【００３８】
ＳＴＥＰ：０３  前記培地１４を排出すると、次に前記緩衝液供給ライン４を介して前記剥離槽２内にＰＢＳを供給し、細胞付きの前記担体３８に付着した前記培地１４を洗浄する。尚、前記剥離槽２内に供給されるＰＢＳの流量は、前記担体３８の洗浄に充分な流量、例えば前記培地１４と同程度の流量とする。
【００３９】
ＳＴＥＰ：０４  ＰＢＳを前記剥離槽２内に所定時間留めた後、前記廃液ポンプ１７を駆動させ、前記剥離槽２内から前記廃液ライン６を介してＰＢＳを排出する。尚、前記担体３８に付着した前記培地１４を充分に洗浄できる様、ＳＴＥＰ：０３とＳＴＥＰ：０４の２工程を複数回繰返すことが望ましい。
【００４０】
ＳＴＥＰ：０５  前記担体３８の洗浄が完了すると、次に前記剥離液供給ライン５を介して前記剥離槽２内にＥＤＴＡ液を供給する。前記担体３８にＥＤＴＡ液が供給されることで、細胞が前記担体３８から剥がれやすい状態となる。尚、前記剥離槽２内に供給するＥＤＴＡ液の流量は、前記フィルタ９上に堆積した前記担体３８が、流動性を有するスラリー状の前記流動層１１となる様な流量とする。例えば、ＥＤＴＡ液の液位が前記フィルタ９の上方５ｍｍ程度であり、ＥＤＴＡ液中の前記担体３８の濃度を５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ程度とすることで、前記流動層１１が流動性を有するスラリー状となる。
【００４１】
ＳＴＥＰ：０６  ＥＤＴＡ液の供給後、前記振盪機構８を駆動させ、前記剥離槽２を揺動させる。例えば、回転数を１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍとして該剥離槽２を水平方向に往復動させる。該剥離槽２の往復動により前記流動層１１が流動し、前記担体３８と細胞との間に流動による剪断応力、及び前記担体３８同士の衝突による衝撃を作用させることで、該担体３８から細胞を剥離させる。尚、前記剥離槽２を往復動させる時間は、ＥＤＴＡ液が細胞に悪影響を与えない様短時間、例えば５分程度とするのが望ましい。
【００４２】
ＳＴＥＰ：０７  前記担体３８から細胞を剥離させた後、前記回収ポンプ２１を駆動させ、前記細胞回収ライン７、前記細胞導入ライン１９を介して、細胞をＥＤＴＡ液と共に前記細胞回収容器２２内の前記培地１４中に導入し、細胞剥離処理を終了する。細胞剥離処理終了後は、前記細胞回収ライン７を前記無菌コネクタ１８から取外し、前記細胞回収容器２２を種々の用途に用いることができる。
【００４３】
この時、前記フィルタ９の網目の大きさは、細胞よりも大きく、前記担体３８よりも小さいので、該担体３８のみが前記フィルタ９上に残留し、細胞のみが前記細胞回収容器２２内に回収される。又、該細胞回収容器２２内には、予めＥＤＴＡ液の１０倍程度の前記培地１４が導入されており、ＥＤＴＡ液は細胞に悪影響を及さない濃度迄希釈される。
【００４４】
尚、前記エア給排ライン２４にシリンジを接続し、該シリンジにより細胞の回収を行ってもよい。該シリンジにより細胞の回収を行う場合には、前記回収ポンプ２１を省略することができる。
【００４５】
上述の様に、本実施例では、前記剥離槽２内の前記フィルタ９上に前記担体３８を堆積させ、剥離液であるＥＤＴＡ液を供給してスラリー状の前記流動層１１とし、該流動層１１を流動させて細胞を前記担体３８から剥離させ、細胞を回収している。
【００４６】
従って、ピペットを用いることなく容易且つ一度に大量の細胞を回収することができ、作業時間を短縮することができる。
【００４７】
又、前記担体３８から細胞を剥離させ、回収する為のロボット等を必要としないので、装置構成の簡易化及び小型化を図ることができ、製作コストの低減を図ることができる。
【００４８】
又、細胞を剥離させる際に、供給するＥＤＴＡ液の流量を、前記担体３８がスラリー状となる程度の最小限の流量としているので、ＥＤＴＡ液を前記細胞回収容器２２内の前記培地１４により希釈でき、ＥＤＴＡ液による細胞への悪影響を抑止することができる。
【００４９】
更に、前記細胞剥離装置１の小型化が図れることで、前記細胞導入装置２７、前記細胞培養装置１２、前記細胞回収装置２８を含む前記細胞培養システム２６全体の小型化を図ることができる。
【００５０】
尚、本実施例では、前記振盪機構８により前記剥離槽２を水平方向に往復動させ、前記流動層１１を流動させているが、該流動層１１を流動させ、前記担体３８に剪断応力を与えられればよい。従って、前記剥離槽２を上下方向に往復動させる、該剥離槽２を円運動させる、或は該剥離槽２を傾動させる等、前記流動層１１を流動させる種々の形態が適用可能であるのは言う迄もない。
【符号の説明】
【００５１】
１    細胞剥離装置          ２    剥離槽
３    培地供給ライン        ４    緩衝液供給ライン
５    剥離液供給ライン      ６    廃液ライン
７    細胞回収ライン        ８    振盪機構
９    フィルタ              １１  流動層
１４  培地                  ３８  担体
【図１】
2015123060.tif 000003
【図２】
2015123060.tif 000004
【図３】
2015123060.tif 000005