(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ短時間にアミノ酸の分離を行うことのできる液体クロマトグラフィー用充填剤、この充填剤を充填したアミノ酸分析のための液体クロマトグラフィー用カラム、及びこのカラムを用いた液体クロマトグラフィー装置を提供する。【解決手段】平均粒径が５μｍ以下、架橋度が５０％以上のポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂から成り、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂が−ＣｎＨ２ｎ−ＳＯ３Ｈ（式中、ｎは３〜５を表す。）で表されるスルホ含有基を有し、交換容量が１００μモル／ｍＬ以下、かつ、そのうちのスルホ基による交換容量が５〜１００μモル／ｍＬである液体クロマトグラフィー用充填剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒径が５μｍ以下で架橋度が５０％以上のポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂から成る液体クロマトグラフィー用充填剤であって、該ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂が−ＣｎＨ２ｎ−ＳＯ３Ｈ（式中、ｎは３〜５を表す。）で表されるスルホ含有基を有し、交換容量が１００μモル／ｍＬ以下かつそのうちのスルホ基による交換容量が５〜１００μモル／ｍＬである液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
前記スルホ含有基が、−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ（式中、Ｘは−ＣＯ−又は単結合を表す。）で表される請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
Ｘが−ＣＯ−を表す請求項２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
前記ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂の平均粒径が３±１μｍである請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
前記ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂が、東ソー株式会社製ＧＰＣ用高分解能カラムSuperH2500（同社商標）、同SuperH2000（同）、又は同SuperH1000（同）に充填された樹脂である請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したアミノ酸分析のための液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項７】
請求項６に記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィー装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤に関し、より詳細には、アミノ酸分析に有効な低交換容量の液体クロマトグラフィー用充填剤、この充填剤を充填した液体クロマトグラフィー用カラム、及びこのカラムを用いた液体クロマトグラフィー装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸分析は、タンパク質の一次構造を決定するのに重要な手段であるばかりでなく、臨床医学分野においては、先天性代謝異常症のスクリーニングや疾病患者の血液や尿中の遊離アミノ酸を測定することで病状の診断など応用分野は広がっている。さらには食品・配合飼料・医薬品開発などアミノ酸組成の分析など生物化学に関する広い分野で欠かすことのできない分析である。
アミノ酸はアミノ基とカルボキシ基を持っているため、溶液中ではｐＨに依存して陽イオンであったり、陰イオンであったりする。現在一般的に用いられているアミノ酸分析のイオン交換樹脂は、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂を基材として、そのベンゼン環にスルホ基（強酸性陽イオン交換樹脂）を導入したものが用いられている。基本的なシステムは三種類以上の移動相を用いる勾配（グラジエント）溶離（ｐＨグラジエント）で分離し、ＯＰＡ法又はニンヒドリン法により検出する方法（ポストカラム法）と、分離に先立ってアミノ酸を蛍光性誘導体に変換し、逆相クロマトグラフィーで分離し蛍光検出する方法（プレカラム法）に分けられる。
【０００３】
上記アミノ酸のプレカラム誘導体化／逆相分離法は、分離に先立つ誘導体化において試料マトリックスの影響を受けやすいこと、誘導体化効率が一定でないこと、反応条件の変化に影響されること、前処理における抽出効率がアミノ酸によって異なることなど、タンパク質構成全アミノ酸を対象とするには再現性や信頼性にやや難点がある。一方、陽イオン交換分離／ポストカラム誘導体化検出法は、遊離アミノ酸を分離してから反応に供するため、マトリックスや反応効率の影響を受けない（フローインジェクション分析法と同様）ので、定量精度が高くより信頼できる方法である。イオン交換法によるアミノ酸の分離にはｐＨグラジエントが必要となり、シリカゲル系固定相はこれに適していないことから多くのカラムには有機ポリマー（スチレン−ジビニルベンゼン樹脂）にイオン交換基を導入した樹脂カラムが用いられている。
市販のアミノ酸分析システムにおいては、高交換容量（２meq/mL以上）の陽イオン交換樹脂カラムが使用され、高濃度移動相（例えば０．２mol/Lクエン酸緩衝液系）によりタンパク質構成アミノ酸を６０分程度で分離するのが一般的である。ただし、分離カラムを初期状態に戻すための再平衡化には更に３０〜６０分を要するため、次の分析を可能にするまでの時間（サイクルタイムと呼ぶ）は分離時間の１．５から２倍となる。
一方、本発明者らは、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂にスルホアシル基を少量導入した、低交換容量陽イオン交換樹脂である液体クロマトグラフィー用充填剤を開発した（特許文献１、非特許文献１）。この充填剤を用いた低交換容量陽イオン交換クロマトグラフィーによれば、５μｍサイズの低交換容量陽イオン交換樹脂を用いて、二液グラジエント溶離にて遊離アミノ酸を５０分で分離でき、市販システムより単純な装置構成により、匹敵する分析時間を達成した（特許文献１等）。本発明者らは、その後、さらなる分離の高分解能化と高速化を目的に充填剤の改良を行い、３μｍサイズの低交換容量陽イオン交換樹脂を開発し、タンパク質構成アミノ酸を２５分以内に分離し、サイクルタイム３５分以内を達成した（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−８３９４６
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Talanta 103 (2013) 245-251
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らが開発した低交換容量陽イオン交換樹脂を用いた液体クロマトグラフィー用充填剤（特許文献１、非特許文献１）において、イオン交換基としてスルホ基（−ＳＯ３Ｈ）と炭化水素鎖とから成るスルホ含有基を用いていたが、分析の高速化は達成したものの、チロシン（Ｙ）、イソロイシン（Ｉ）及びロイシン（Ｌ）の間、特にイソロイシン（Ｉ）及びロイシン（Ｌ）の間の分離が悪いという欠点を有していた（図１）。
従って、本発明は、これらアミノ酸の分離が改善され、簡便かつ短時間にアミノ酸の分離を行うことのできる液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、スルホ含有基（特許文献１、非特許文献１）の構造を検討した結果、分離対象のアミノ酸は親水性部分（アミノ基やカルボキシ基）と疎水性部分（脂肪族又は芳香族の炭化水素基）とから成るため、上記分離の良くないアミノ酸の保持には、上記のスルホ含有基のうち、静電相互作用するスルホ基の位置と疎水性相互作用する炭化水素鎖の長さが影響しているのではないかと考え、その炭化水素基の鎖長を変えて（これに伴ってスルホ基のスチレン環との位置関係も変わる）、これらアミノ酸の分離度を調べた（後記の実施例１及び比較例１）。その結果、イオン交換基として、−ＣｎＨ２ｎ−ＳＯ３Ｈ（式中、ｎは３〜５を表す。）で表されるスルホ含有基を用いることにより、Ｙ、Ｉ及びＬの分離が大幅に改善され、更に分析時間も従来より短縮されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、平均粒径が５μｍ以下で架橋度が５０％以上のポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂から成る液体クロマトグラフィー用充填剤であって、該ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂が−ＣｎＨ２ｎ−ＳＯ３Ｈ（式中、ｎは３〜５を表す。）で表されるスルホ含有基を有し、交換容量が１００μモル／ｍＬ以下かつそのうちのスルホ基による交換容量が５〜１００μモル／ｍＬである液体クロマトグラフィー用充填剤である。
また本発明は、上記の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したアミノ酸分析のための液体クロマトグラフィー用カラムであり、更にこの液体クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィー装置である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによれば、タンパク質構成アミノ酸を２０分以内に分離し、繰り返し分析は３０分以内が可能であり、非タンパク系アミノ酸、クレアチン、クレアチニンなど生体関連アミノ酸類、核酸塩基、ヌクレオシド、などの有機陽イオン類は、同時ないしグループ毎の分離が可能である。
液体クロマトグラフとしては基本的な装置構成に基づくため、設備の初期投資を低くでき、移動相濃度が低いので環境負荷が小さく、高速分離・定量するのでランニングコストが低く、従って、費用対効果がきわめて高い。
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基の導入及び交換容量が制御されているため、安定した低交換容量の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。また、充填カラムの耐久性も高く、1年以上性能を維持することができる。劣化の際は、高塩濃度溶液で洗浄又は再充填することで性能を回復できる。分析コストパフォーマンスに優れ、誰でも手軽にアミノ酸分析を実施できる。溶離液濃度が低いので、多用される蛍光検出法のほかに、汎用の紫外吸収検出器や電気伝導率検出器も使用可能になり、方法の適用範囲が広がる。溶離液濃度は通常の1/10以下なので環境負荷は小さい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】特許文献１（特開２００３−８３９４６）に記載の標準アミノ酸（アミノ酸１７種）のクロマトグラムである（その図５）。このカラムの充填剤は、スルホプロピオニル基を有するポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂である（その実施例３）。そのためチロシン（Ｙ）、イソロイシン（Ｉ）及びロイシン（Ｌ）の分離があまり良くない（その[００１９]）。
【図２】ＰＳ−ＤＶＢ樹脂をスルホン化する反応機構の例を示す図である。
【図３】実施例１と比較例１で用いたカラムのｐＨに対する交換容量を示す図である。イオン交換基であるスルホ含有基が、Ａはスルホブチリル基（実施例１）であり、Ｂはスルホプロピオニル基（比較例１）である。カルボキシ基による交換容量は、それぞれｐＨ１２において５〜７μモル／ｍＬ程度である。
【図４】疎水性アミノ酸５種のクロマトグラムである。イオン交換基であるスルホ含有基が、Ａはスルホブチリル基であり、Ｂはスルホプロピオニル基である。
【図５】実施例２〜５で用いたカラムのｐＨに対する交換容量を示す図である（白丸）。比較のため、基材樹脂（スルホン化前）のデータを載せる（黒丸）。基材樹脂の交換容量は、その合成の過程で生成したと考えられるカルボキシ基によるものである。
【図６】本発明のカラムを用いた標準アミノ酸（Ａ）タンパク質構成アミノ酸18種（ＵＶ検出）及び（Ｂ）非タンパク系６種を含む２２種アミノ酸（蛍光検出）のクロマトグラムである。
【図７】本発明のカラムを用いた（Ａ）日本酒、（Ｂ）白ワイン及び（Ｃ）メロン果汁のクロマトグラム（蛍光検出）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いるポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（以下「Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂」という。）は、単量体としてスチレンを主として用い、更にジビニルベンゼンを用いて架橋した重合体であればよく、更にビニルフェノール、オレフィンその他の単量体を含んでもよい。このようなＳｔ−ＤＶＢ樹脂は、平均粒径、架橋度、排除限界分子量などで規定される。
この平均粒径は５μｍ以下、好ましくは２〜５μｍ、より好ましくは３±１μｍである。５μｍ以上ではアミノ酸の分離能が低下するため適当ではなく、一方２μｍ以下では充填が難しく、流量も低くする必要が生じグラジエント溶離に適しないため好ましくない。
架橋度は５０％以上、好ましくは８０％以上である。この架橋度はＳｔ−ＤＶＢ樹脂中のジビニルベンゼンに相当するものであり、架橋度が低いと、測定時に樹脂の変形を起こし、所望の流量（特に高流量）で測定が出来ず、従って分解能も下がってしまい好ましくない。
排除限界分子量は、例えば、５０，０００以下、好ましくは１，０００〜２０，０００である。この排除限界分子量は実際樹脂の細孔径に相当するが、上記用件を細孔径で表現すると、７０オングストローム以下、好ましくは１０〜３０オングストロームである。
このＳｔ−ＤＶＢ樹脂は、カルボキシ基を有していてもよい。カルボキシ基は、基材樹脂の合成の過程やアシル化段階などで生成する可能性がある。またＳｔ−ＤＶＢ樹脂にカルボキシ基を意図的に導入することも可能である。
このＳｔ−ＤＶＢ樹脂として、東ソー株式会社製ＧＰＣ用高分解能カラムSuperH2500（同社商標）（粒径３μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）２０，０００、架橋度８０％以上）、同SuperH2000（同）（粒径３μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）１０，０００、架橋度８０％以上）、又は同SuperH1000（同）（粒径３μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）１，０００、架橋度８０％以上）に充填された樹脂が好ましい。
【００１１】
本発明のＳｔ−ＤＶＢ樹脂はスルホ含有基を有する。このスルホ含有基はスルホ基（−ＳＯ３Ｈ）とこれに結合した疎水性の炭化水素鎖を有する基であり、例えば、−ＣｎＨ２ｎ−ＳＯ３Ｈで表される。式中、ｎは３〜５、好ましくは３の整数を表す。−ＣｎＨ２ｎ−は好ましくは直鎖（−（ＣＨ２）ｎ）である。
このスルホ含有基は、この炭化水素鎖をＳｔ−ＤＶＢ樹脂に結合するために適当な結合基を有してもよい。この結合基としては、アシル基（−ＣＯ−）、エーテル基（−Ｏ−）などが挙げられる。このスルホ含有基は、例えば、−Ｘ−ＣｎＨ２ｎ−ＳＯ３Ｈ（式中、Ｘはアシル基を表す。）で表されてもよい。
【００１２】
Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂をスルホン化する方法には、樹脂を濃硫酸中に入れてスルホン化する直接スルホン化法があるが、樹脂に修飾させるイオン交換容量の調節が難しく、マクロポーラス型の樹脂では高交換容量（約１ミリモル／ｍＬ程度）になってしまい不適当である。
Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂のスルホン化は、A.SeubertとA.Klingenbergによる方法（Journal of Chromatography A, 782 (1997) 149-157）を用いて行ってもよい。この方法によるＳｔ−ＤＶＢ樹脂のスルホン化は、以下のような２段階で行う。
１段階：Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂をω−ハロゲン化アシルクロライド及びルイス塩基（例えば、塩化アルミニウム）を用いてアシル化する。
２段階：アシル化されたＳｔ−ＤＶＢ樹脂の末端ハロゲンをスルホン化する。このスルホン化はいかなる公知の方法を用いてもよいが、硫化ジメチル（Ｓ（ＣＨ３）２）と亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）を用いる方法を推奨する。
この方法によれば、スルホ含有基としてスルホアシル基（−ＣＯ−ＣｎＨ２ｎ−ＳＯ３Ｈ）が生成する。この方法によるスルホン化の反応機構の例を図２に示す。この方法によれば、交換容量をアシル化剤の量で制御しながら行うことができるため、上述の直接スルホン化法のようにＳｔ−ＤＶＢ樹脂を高交換容量にすることなく低交換容量のスルホン化Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂を製造することが可能である。
Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂にスルホ基に炭化水素鎖を付した基（−ＣｎＨ２ｎＳＯ３Ｈ）を付加する方法としては、予めＳｔ−ＤＶＢ樹脂に水酸基やハロゲン化メチル基を付加しておき、これらを当該スルホ含有基に置換する方法などがある。
【００１３】
本発明のスルホン化Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂の交換容量は１００μモル／ｍＬ以下、好ましくは５〜５０μモル／ｍＬである。この交換容量は弱酸性（例えば、ｐＨが３〜５）において１０〜２０μモル／ｍＬであることが更に好ましい。
このうちスルホ基による交換容量は５〜１００μモル／ｍＬ、好ましくは５〜５０μモル／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜２０μモル／ｍＬである。
本発明のスルホン化Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂（即ち、陽イオン交換樹脂）はイオン交換基としてカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を含有してもよい。カルボキシ基による交換容量は、例えば、スルホ基による交換容量の０．５〜２倍であってもよく、スルホ基による交換容量±その３０％、特に±その１５％であってもよい。ただし、上記のようにスルホ基、カルボキシ基その他のイオン交換基による交換容量の合計は１００μモル／ｍＬ以下である。
交換容量が１００μモル／ｍＬ以下のような低交換容量のカラムを用いると、その検出に目的に応じて電気伝導率、紫外吸収、蛍光検出などの検出方法を用いることが可能であり、検出方法に選択の余地が広がり好ましい。特に紫外吸収による検出方法を用いれば芳香族アミノ酸とクレアチニン（ヒトの筋肉量に比例して排泄される代謝物）の同時分析が容易に行えることとなり好ましい。さらに、このような低交換容量のカラムを全アミノ酸を対象としない特定のアミノ酸分析に用いると、極めて簡便に低コストで特定用途のアミノ酸検出が可能になる。しかしながら、交換容量が１００μモル／ｍＬ以上の高交換容量のカラムではこのような微妙な検出方法を採用することができず、一般に蛍光検出法を用いることになり、その自由度が低下する。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
Ｓｔ−ＤＶＢ樹脂として、三菱化学株式会社製高速液体クロマトグラフィー用高架橋ポリエチルスチレンビニルフェノールジビニルベンゼン共重合体（架橋度６８%以上，粒径４μｍ）試作品を以下の手順に従ってスルホン化した（図２）。
樹脂1.0gを1,2-ジクロロエタン25mLに入れ、超音波で懸濁した。懸濁液を300mL丸底フラスコに入れ、4-クロロブチリルクロリド（Cl-CO-(CH2)3-Cl）0.20mLを入れた後、15分間室温で撹拌した。塩化アルミニウム0.264gを加え、さらに10分撹拌した。その後、THF 100mLを一気に加え、反応を停止した。フィルターサイズ1μmの吸引濾過装置へ移し、THF/H2O 1:1(v/v)、2M HCl、H2O、メタノール(それぞれ100mL)の順で樹脂を洗浄した。洗浄した樹脂をジメチルスルフィド15mL、メタノール20mLで懸濁し、300mL丸底フラスコを用い、6h撹拌した。溶液を再び吸引濾過装置へ移し、メタノール100mLで洗浄した。乾燥した樹脂へ1M亜硫酸ナトリウム 100mLを加え、80℃水浴中で樹脂が完全に懸濁するまで撹拌した。反応させた樹脂を吸引濾過装置へ移し、H2O、メタノール(それぞれ100mL)の順で洗浄した。乾燥した樹脂0.7gを5mM H3PO4へ加え、超音波で懸濁した。その後、4.6mm I.D.×75mmカラムへ12MPaを超えないよう充填した。
【００１５】
カラムの交換容量の測定には、交換容量測定装置（ポンプ：株式会社日立製作所製 L-7110、カラムオーブン：温度40℃ スガイU-620、電気伝導率検出器：TOSOH CM-8010、デジタルマルチメーター：ADCE 7351E ADVANTEST、pH メーター：F-24 堀場）を用いた。測定方法は以下の通りである。なお、検出器の出力範囲が広いのでインテグレーターを検出器のレコーダー端子に繋げた。測定条件は、ポンプ流速1.0ml/min、カラム温度40℃、電気伝導率GAIN0.5、RANGE500×10μSとした。
10mM硝酸ナトリウムをカラムに電気伝導率検出器の出力変化がなくなるまで、流した。これは、イオン交換体をナトリウム型にするためである。また、カラム内の硝酸ナトリウムを追い出すため、水を電気伝導率検出器の出力変化がなくなるまで流した（洗浄）。
ナトリウム型のカラムに10mM硝酸を流し、最終的に電気伝導率検出器の出力変化がなくなるまで流した。
このカラムの平衡pHに対する交換容量を図３Ａに示す。
【００１６】
次に、このカラムを用いて、疎水性アミノ酸5種の分離検討を行った。
アミノ酸試薬として、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I) 以上1mM、メチオニン(M) 0.1mM、チロシン(Y) 0.01mM（以上、和光純薬工業（株）製）を水に溶解し、上記の濃度になるよう調製した。
液体クロマトグラフィー装置：
デガッサ−：株式会社島津製作所製DGU-20A3、ポンプ：株式会社島津製作所製 LC-20AD 2台、サンプルループインジェクター：Rheodyne 7725I、カラム恒温槽：株式会社島津製作所製CTO-20A、データ処理：クロマトPro、検出器：紫外吸収検出器 株式会社島津製作所製 SPD-20A
溶離条件：
流速：1.0 mL/min、溶離液  A液：6 mM H3PO4  B液：18mM NaH2PO4+2mM H3PO4+15%ACN
A液とB液の割合を変えた三種の溶離条件によるＩ，Ｌ間の分離度(Rs)は平均0.62±0.05であり比較例１と比べると分離度が有意に高い。最も分離度の高かったクロマトグラムを図４Ａに示す。
【００１７】
比較例１
アシル化試薬である4-クロロブチリルクロリドを3-クロロプロピオニルクロリド（Cl-CO-(CH2)2-Cl）に変更し、溶離液をA液：3 mM H3PO4、B液：20 mM NaH2PO4+15 % ACNに変更したほかは、実施例１と同様の操作を行った。
このカラムのpHに対する交換容量を図３Ｂに示す。実施例１と比較例１のカラムの交換容量は同程度といえる。
A液とB液の割合を変えた三種の溶離条件によるＩ，Ｌ間の分離度(Rs)は平均0.39±0.06であった。最も分離度の高かったクロマトグラムを図４Ｂに示す。
【００１８】
実施例２
東ソー株式会社製ＧＰＣ用高分解能カラムSuperH2500（同社商標）（粒径３μｍ、排除限界分子量（ポリスチレン）２０，０００、架橋度８０％以上）カラムより取り出したＳｔ−ＤＶＢ樹脂を、実施例１と同様にスルホン化して、カラムを作製した。実施例１と同様に測定したカラムのｐＨに対する交換容量を図５に示す。
このカラムを用いて、（A）１８種類のタンパク質構成アミノ酸（和光純薬工業（株）製、SIGMA-ALDRICH製、又は東京化成工業（株）製）及び（Ｂ）２２種アミノ酸（６種非タンパク系アミノ酸と１６種タンパク質構成アミノ酸（和光純薬工業（株）製、SIGMA-ALDRICH製、又は東京化成工業（株）製）の分離検討を行った。使用した装置とクロマトグラフィー条件を下記に示す。
(i) 装置：
ポンプ：株式会社島津製作所製LC-20AD  2液高圧グラジエントシステム
デガッサー：株式会社島津製作所製DGU-20A3  
カラムオーブン：株式会社島津製作所製CTO-20A  
紫外吸光検出器：株式会社島津製作所製SPD-20A  
蛍光検出器：Waters474 Waters，
ポンプ（蛍光誘導体化試薬用）：株式会社日立製作所製L7110  
オーブン（反応コイル用）：スガイU620 
(ii) クロマトグラフィー条件：
UV検出波長  210 nm
試料注入量20 μL
蛍光検出（励起波長340nm、蛍光波長430 nm）
Gain：1
Response，STD，
反応コイル：2 m × 0.5 mm ID
蛍光誘導体化試薬流速 0.5 mL / min
結果のクロマトグラムをそれぞれ図６Ａ及びＢに示す。
【００１９】
その結果、18種アミノ酸を19分で分離できた。
図６Ａ、Ｂ（本願実施例２）を図１（特許文献１）と比べると、図１ではチロシン（Ｙ）、イソロイシン（Ｉ）及びロイシン（Ｌ）の分離が良くないのに対して、図６Ａ及びＢではこれらの分離が良好である。図１のスルホ含有基はスルホプロピオニル基（−ＣＯ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ）であるのに対し、図６のスルホ含有基はスルホブチリル基（−ＣＯ（ＣＨ２）３ＳＯ３Ｈ）である。本願実施例２（図６）においては、スルホ含有基の炭化水素鎖が−（ＣＨ２）２−から−（ＣＨ２）３−に長くなり疎水性が増したことが、親水性部分と疎水性部分とから成るアミノ酸の分離に影響し、これらの分離が改善されたといえる。
なお、本願の充填剤を用いたカラムを用いた場合、他のアミノ酸も良好に分離されており、かつ分離速度も早い（図６Ｂ）。
【００２０】
実施例３〜５
日本酒（１０倍希釈）、白ワイン（１０倍希釈）及びメロン果汁（１００倍希釈）について、実施例３と同様の操作により、アミノ酸分離を調べた．液体類については，フィルター濾過しミリＱ水で希釈した．メロン果汁については乳鉢ですり潰したのち，果汁をフィルター濾過し，ミリＱ水で希釈した．結果のクロマトグラムを図７(A)〜(C)に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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