(57)【要約】本発明は、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属の菌株から得られる新規なラッカーゼ酵素に関する。本発明はまた、この酵素をコードする核酸配列、この核酸配列が導入された組換え宿主および組換え宿主における酵素の生産方法にも関する。本発明の酵素は、いくつかの用途に、特にデニムの明度を上げるのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切な条件の下での１回の処理によって、糊抜きされたデニムの明度を次亜塩素酸ナトリウムと少なくとも同じかまたはそれを超える単位数上げることができることを特徴とするラッカーゼ酵素。
【請求項２】
前記次亜塩素酸ナトリウムによる処理が、テキスタイル産業における湿式プロセスで通常使用される装置（例えば洗浄機）を用いることによって、２５ｍｌ／ｌの１０％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）溶液の存在の下で、４０℃の温度、１０．５を超えるｐＨ、約１：１５の液比で、１５分間実施される、請求項１に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３】
前記ラッカーゼによる処理が１種または複数のメディエータの存在の下で実施される、請求項１または２に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項４】
微生物源から得られる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項５】
糸状菌から得られる、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項６】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属から得られる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項７】
寄託菌株ＣＢＳ  １１６０７１から得られる、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項８】
配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも７４％の同一性を有する配列を含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項９】
シグナル配列を欠いている、請求項８に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項１０】
テイルを欠いている、請求項８または９に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項１１】
寄託番号ＤＳＭ  １５４８４として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＦ５４７３中で寄託されたｐＡＬＫ１３４２の配列によってコードされる、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項１２】
ｐＨ３．５から８で、好ましくはｐＨ４から７．５で、最も好ましくはｐＨ５から７で働く、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１３】
前記布地が糊抜きされ、セルラーゼ処理されている、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１４】
デニム処理において、３０から８０℃の温度、好ましくは５０から７０℃の温度で効果的である、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１５】
デニム処理において、６０から７０℃の温度で最も効果的である、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１６】
前記ラッカーゼによる布地の処理が布地の本質的な強度を低下させることがない、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項１７】
前記ラッカーゼによる布地の処理が擦れた外観を損なわない、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項１８】
異種生産宿主において生産される、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項１９】
微生物宿主において生産される、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２０】
糸状菌宿主において生産される、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２１】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の宿主において生産される、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２２】
配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも７４％の同一性を示す配列を含むことを特徴とするラッカーゼ酵素。
【請求項２３】
シグナル配列を欠いている、請求項２２に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２４】
テイルを欠いている、請求項２２または２３に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２５】
微生物源から得られる、請求項２２乃至２４のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２６】
糸状菌から得られる、請求項２２乃至２５のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２７】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属から得られる、請求項２２乃至２６のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２８】
寄託菌株ＣＢＳ  １１６０７１から得られる、請求項２２乃至２７のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項２９】
番号ＤＳＭ  １５４８４の下、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＦ５４７３において寄託されたｐＡＬＫ１３４２の配列によってコードされる請求項２２乃至２８のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３０】
ｐＨ３．５から８で、好ましくはｐＨ４から７．５で、最も好ましくはｐＨ５から７で働く、請求項２２乃至２９のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項３１】
至適ｐＨが約ｐＨ５．５である、請求項２２乃至３０のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項３２】
異種生産宿主において生産される、請求項２２乃至３１のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３３】
微生物宿主において生産される、請求項２２乃至３２のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３４】
糸状菌宿主において生産される、請求項２２乃至３３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３５】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の宿主において生産される、請求項２２乃至３４のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３６】
適切な条件の下での１回の処理によって、糊抜きされたデニムの明度を次亜塩素酸ナトリウムにより処理されたデニムと少なくとも同じかまたは超える単位数上げることができる請求項２２乃至３５のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３７】
前記次亜塩素酸ナトリウムによる処理が、テキスタイル産業にける湿式プロセスで通常使用される装置（例えば洗浄機）を用いることによって、２５ｍｌ／ｌの１０％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）溶液の存在の下で、４０℃の温度、１０．５を超えるｐＨ、約１：１５の液比で、１５分間実施されるものである、請求項３６に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３８】
前記酵素による処理が、３０から８０℃の温度、好ましくは５０から７０℃の温度、より好ましくは６０から７０℃の温度で実施される、請求項３６または３７に記載の酵素。
【請求項３９】
前記ラッカーゼによる処理が１種または複数のメディエータの存在の下で実施される、請求項３６乃至３８のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項４０】
前記酵素によるデニムの処理が本質的な強度のいかなる低下も引き起こさない、請求項３６乃至３９のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項４１】
前記酵素によるデニムの処理が、擦れた外観を損なわない、請求項３６乃至４０のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項４２】
しみの除去に効果的である、請求項２２乃至４１のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項４３】
染料を脱色できる、請求項２２乃至４１のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項４４】
請求項１乃至４３のいずれか１項において定められる酵素をコードすることを特徴とする核酸配列。
【請求項４５】
請求項４４に記載の前記核酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４６】
原核または真核宿主細胞において発現できるようにする発現制御配列に操作され得るように前記核酸配列が結合された請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項４４に記載の核酸配列、または請求項４５もしくは４６に記載のベクターが導入されていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４８】
微生物宿主細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する、請求項４７または４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
請求項４７乃至４９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養する工程、およびポリペプチドを回収する工程を含む、ラッカーゼ活性を有するポリペプチドの生産方法。
【請求項５１】
請求項４４に記載の核酸配列によって、または請求項４５もしくは４６に記載のベクターによってコードされ、請求項５０に記載の方法によって得られる、ラッカーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項５２】
請求項４７乃至４９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養する工程、および、前記細胞からポリペプチドを回収するか、または培地から細胞を分離し上澄みを得る工程を含む、請求項５１に記載のポリペプチドを含む酵素製剤を得るための方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法によって得られる酵素製剤。
【請求項５４】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素を含む酵素製剤。
【請求項５５】
安定剤、緩衝液、メディエータおよび保存剤の群から選択される適切な（複数の）添加剤を含む、請求項５３または５４に記載の酵素製剤。
【請求項５６】
生産宿主の培養後の培地である、請求項５３乃至５５のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項５７】
液体、粉末または顆粒の状態である、請求項５３乃至５６のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項５８】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素に、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件下に、水性媒体中で、デニムを接触させることを含む、デニムの処理方法。
【請求項５９】
前記処理がメディエータの存在の下で実施される請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記処理が、３０から８０℃の温度で、好ましくは５０から７０℃、より好ましくは６０から７０℃の温度で実施される、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記処理が、ｐＨ３．５から８、好ましくはｐＨ４から７．５、最も好ましくはｐＨ５から７のｐＨ範囲で実施される、請求項５８乃至６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記処理が、１５分から２時間、好ましくは３０分から９０分間、より好ましくは３０分から６０分間実施される、請求項５８乃至６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記処理において用いられる使用量が、２から５００、好ましくは２０から２００ｎｋａｔ、最も好ましくは２０から１００ｎｋａｔ／（布地１ｇ）である、請求項５８乃至６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記処理が１回または複数回繰り返される、請求項５８乃至６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、処理される材料を接触させることを含む、しみの除去方法。
【請求項６６】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、パルプを接触させる工程を含む、パルプの漂白方法。
【請求項６７】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、繊維を接触させることを含む、天然または化学繊維の処理方法。
【請求項６８】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、繊維を接触させることを含む、リグノセルロース繊維の処理方法。
【請求項６９】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、羊毛を接触させることを含む、羊毛の処理方法。
【請求項７０】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、毛髪を接触させることを含む、毛髪の処理方法。
【請求項７１】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、染料工場廃液を接触させることを含む、染料工場廃液を処理する方法。
【請求項７２】
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素、または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤に、酵素の働きにとって適切な条件の下で、染料または染料含有材料を接触させることを含む、染料の脱色方法。
【請求項７３】
デニム処理、しみの除去、パルプの漂白、繊維の処理、羊毛の処理、毛髪の処理、染料工場廃液の処理または染料もしくは染料含有材料の脱色のための、請求項１乃至４３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素または請求項５３乃至５７のいずれか１項に記載の酵素製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多くの用途、特にデニムの処理に有用な新規なラッカーゼ酵素に関する。本発明はまた、この酵素をコードする核酸、ベクター、宿主細胞および酵素の生産方法ならびに酵素を含む酵素製剤にも関する。さらに、本発明は、デニムの処理方法、しみの除去方法、天然もしくは化学繊維またはリグノセルロース繊維の処理方法、羊毛の処理方法、毛髪の処理方法、パルプおよび染物工場廃液の漂白方法、ならびに染料の脱色方法に関する。本発明はまた、前記用途において用いられ得る様々な使用および組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ラッカーゼ（ＥＣ．１．１０．３．２、ｐ−ベンゼンジオール：酸素  酸化還元酵素）は、マルチ銅オキシダーゼ類に属する。ラッカーゼは、高等植物、真菌、いくつかの昆虫および細菌に広く分布している。これらのラッカーゼは基質特異性が低いことが特徴で、ジフェノール、ポリフェノール、様々な置換フェノール、ジアミン、芳香族アミン、およびヨウ素のような無機化合物さえも含めて、様々な基質を酸化する。ラッカーゼは基質を１電子酸化機構によって酸化し、電子受容体として分子酸素を用いる。ラッカーゼの間で、一次配列、誘導機構、物理化学的（例えば、等電点および糖質含量）および生化学的特性は様々である。しかし、ラッカーゼの銅結合部位は厳格に保存されている。
【０００３】
いくつかのラッカーゼタンパク質およびこれらのラッカーゼをコードする遺伝子が、すでに単離されている。ＷＯ  ０１／９２４９８は、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ菌株から単離された真菌ラッカーゼ酵素を記載する。この酵素（５から８の至適ｐＨを有し、３０から８０℃の間の温度で働く）は、高いｐＨおよび温度条件を必要とする工業的用途によく適しているが、知られている真菌ラッカーゼの大部分は、酸性ｐＨ域で働き、さほど熱安定はない。ＥＰ特許０７６５３９４  Ｂ１（米国特許第５９８１２４３号に対応）は、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａからのラッカーゼ遺伝子のクローニングおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにおけるその発現を記載する。このラッカーゼの至適ｐＨは６．５であり、この酵素は６０℃で２０分間、完全な活性を維持した。米国特許第５７５０３８８号は、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからのラッカーゼ遺伝子のクローニングおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにおけるその発現を記載する。Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍラッカーゼの活性のｐＨプロファイルは、シリンガルダジンおよびＡＢＴＳの酸化に対してそれぞれ、７および４の最適ｐＨを有する。このラッカーゼは、酸性ｐＨでよりも、中性からアルカリ性のｐＨで、より熱安定性があった。
【０００４】
ラッカーゼには多くの工業的に可能な用途があり、例えば、木質パルプの脱リグニン、リグニン含有繊維の処理方法、木質繊維を機能化したり繊維を接着するための木質繊維の処理方法、再生可能原材料からの燃料エタノールの生産向上、食品用途（例えば、ベーキングまたはビールやワインの清澄化における用途）、様々なバイオレメディエーション法およびテキスタイル用途（例えば、デニム処理、しみの除去、テキスタイル産業向けの様々な繊維の処理、染料の脱色方法および染物工場廃液の処理方法）、あるいは毛染め組成物、堅い表面のクリーニング配合物もしくは洗剤配合物における使用である。
【０００５】
「ストーン・ウォッシュ加工」の外観や擦れた（ａｂｒａｄｅｄ）外観は、近年、デニム製造業者の関心を集めている。軽石による伝統的なストーン・ウォッシュは、繊維の強度を低下させ、洗浄機に過酷な負担をかける。最近は、酵素によるデニム仕上げ処理に向かう傾向がある。デニムの「漂白された(色あせした)外観は普通、次亜塩素酸ナトリウムによって得られる。ほとんど全ての濃淡が得られるため、これまでこの「塩素漂白」はインジゴで染色されたデニムに対する最も効果的な漂白方法であった。しかし、次亜塩素酸処理は環境に非常に有害であり、それは制御が難しく布地を損傷し易い。それはまた、使用者にとっても非常に不都合で有害でさえある方法であり、それはライクラ（Ｌｙｃｒａ）を含む製品には使用できず、リンス／洗浄工程による脱塩素処理が必要である。次亜塩素酸ナトリウムに代わる、環境にとって害の少ない代替の開発のための集中的な研究が進行中であり、特に、ラッカーゼが研究されている。これまで、市販のラッカーゼ製剤による結果は、効果と外見に関する限り、「塩素漂白」によって得られるものと比べものにならなかった。次亜塩素酸ナトリウムなしにひどく色落ちした外観を実現するのは非常に難しく不可能であった。
【０００６】
ＷＯ  ９７／２５４６８は、染色されたデニムに擦れた外観をもたせる方法におけるラッカーゼの使用を記載する。この方法は、セルラーゼ処理と、同時またはその後のフェノール酸化酵素（例えばラッカーゼ）および増強剤（例えばシリンガ酸メチル）による処理とを含む。Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ＶｉｌｌｏｓａおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのラッカーゼがこの特許公開におけるラッカーゼの例である。
【０００７】
様々な微生物からのラッカーゼを記載する多数の刊行物にも関わらず、先行技術は、化学的漂白剤に代わりデニム処理に使用できると思われるどのようなラッカーゼも記載していない。こうして、より有効な酸化力、特に、より有効なインジゴ酸化力を有する新規なラッカーゼ酵素が求められている。
様々な用途における多様な条件で、より効果的に働き、より適切であると思われる新規なラッカーゼもまた求められている。
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ  ０１／９２４９８
【特許文献２】ＥＰ  ０７６５３９４  Ｂ１（米国特許第５９８１２４３号に対応）
【特許文献３】米国特許第５７５０３８８号
【特許文献４】ＷＯ  ９７／２５４６８
【非特許文献１】Ｎｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）
【非特許文献２】Ｅｄｍａｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｇｇ  Ｇ．（１９６７）
【特許文献５】ＥＰ  ２４４  ２３４
【特許文献６】ＷＯ  ９７０８３２５
【特許文献７】ＷＯ  ９５３３３８６
【特許文献８】米国特許第５８４３７４５号
【特許文献９】米国特許第５７７０４１８号
【非特許文献３】Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９
【特許文献１０】米国特許第６５７３０８６号
【非特許文献４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）
【非特許文献５】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）
【非特許文献６】Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０
【非特許文献７】Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献８】Ｋｉｉｓｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）
【非特許文献９】Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９５１）
【非特許文献１０】Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）
【非特許文献１１】Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献１２】Ｐａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５
【非特許文献１３】Ｌｅｏｎｏｗｉｃｚ＆Ｇｒｚｙｗｎｏｗｉｃｚ，１９８１
【非特許文献１４】Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）
【非特許文献１５】Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄａ（１９８５）
【非特許文献１６】Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献１７】Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｈ，１９９８
【非特許文献１８】Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献１９】Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）
【非特許文献２０】Ｋａｒｈｕｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）
【非特許文献２１】Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）
【非特許文献２２】Ｊｏｕｔｓｊｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３
【非特許文献２３】Ａｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１
【非特許文献２４】Ｐａｌｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献２５】Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）
【非特許文献２６】Ｍｕｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｉ（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
先行技術に伴う問題の少なくともいくつかを解消することが本発明の目的である。特に、デニム処理における化学漂白剤の量を減らすか、または使用を避けることが可能である新規なラッカーゼ酵素を提供することが本発明の目的である。本発明のラッカーゼ酵素を用いることによって、次亜塩素酸ナトリウムのような化学漂白剤の使用を減らすか、または避けることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、次亜塩素酸ナトリウムによって得られるレベルと同じように、またはそれを超えて、本発明のラッカーゼ酵素がデニムの明度を上げることができるという驚くべき発見に基づいている。このラッカーゼによる処理は、特にデニムの表側でデニムの明度を上げ、これはデニム処理の望ましい結果でもある。
【００１１】
こうして、本発明の一目的は、適切な条件の下で、次亜塩素酸ナトリウムによって処理されたデニムと少なくとも同じ単位数、またはそれを超える単位数、デニムの明度を上げることができるラッカーゼ酵素である。本発明のラッカーゼ処理によって得られる結果は、試験条件（通常の次亜塩素酸ナトリウム漂白条件を表す）で次亜塩素酸ナトリウムにより得られる漂白の結果と比較されている。
【００１２】
より詳細には、本発明のラッカーゼ酵素は、請求項１の特徴部分において記載されていることによって特徴付けられる。
【００１３】
こうして、本発明は、試験条件下に、次亜塩素酸ナトリウムと少なくとも同じ単位数、デニムの表側でのデニムの明度を上げることができるラッカーゼを包含する。驚くべきことに、この効果は、糊抜きだけしたデニムが処理される場合でも実現可能である。糊抜きされセルラーゼで処理されたデニムにラッカーゼ処理が行われる場合、本発明のラッカーゼは、試験条件の下で次亜塩素酸ナトリウムより少なくとも２０％多く、好ましくは少なくとも６０％多くデニムの明度を上げることができる。
【００１４】
本発明の一目的は、デニムの表側で明度の値（Ｌ＊）がセルラーゼ処理の後に３２以下のインジゴ染色デニムがラッカーゼ処理に用いられる場合に、適切な条件の下で、１回の処理で、デニムの表側で少なくとも４７、好ましくは少なくとも５０の明度の値（Ｌ＊）を得ることができるラッカーゼ酵素である。
【００１５】
本発明の一目的は、デニムの表側で明度の値（Ｌ＊）がセルラーゼ処理の後で３２以下のインジゴ染色デニムがラッカーゼ処理に用いられる場合に、適切な条件の下で、１回の処理で、デニムの表側の明度の値（Ｌ＊）を少なくとも１７単位、好ましくは２５単位上げることができるラッカーゼ酵素である。
【００１６】
本発明の一目的は、配列番号１２のアミノ酸配列、あるいは、対応する遺伝子によってコードされる完全長配列を比べた場合に、配列番号１２の配列に少なくとも７４％の同一性を示す配列を含むラッカーゼ酵素である。
より詳細には、本発明のラッカーゼ酵素は、請求項２２の特徴部分に記載されていることによって特徴付けられる。
【００１７】
本発明の新規なラッカーゼは様々な基質に対して高い酸化活性を有する。この酵素はまた、様々な用途における多様な条件で働くことができる。
【００１８】
本発明は、様々な基質の高い酸化活性を有し、したがってまた様々な用途に適する酵素を包含する。特に、本発明は、ｐＨ４．５でＡＢＴＳについて少なくとも８００、またはｐＨ５．５でシリンガルダジンについて少なくとも２００ｎｋａｔ／ｍｇの比活性を有するラッカーゼに関する。
【００１９】
本発明の酵素は、好ましくは微生物から、より好ましくは糸状菌から、特にＴｈｉｅｌａｖｉａ属から、より詳細にはＴｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ種から得られる。有利には、本発明の酵素は、２００４年９月２日に、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｕｐｓａｌａｌａａｎ  ８、３５８４  ＣＴ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダ）に寄託された菌株ＣＢＳ  １１６０７１から得られる。
【００２０】
本発明のラッカーゼ酵素は広いｐＨ範囲で働く。この酵素は、適切な条件の下で、ｐＨ３．５から８で、好ましくはｐＨ４から７．５で働く。最も好ましくは、酵素はｐＨ５から７で働く。本発明の酵素はまた広い温度範囲で働く。例えば、デニム処理において、酵素は、３０から８０℃、好ましくは５０から７０℃、最も好ましくは６０から７０℃の温度で効果がある。酵素はまた室温（１８から３０℃）でも働くが、高温よりも反応速度は遅い。
【００２１】
本発明の一目的はまた、本発明の酵素をコードする核酸配列である。核酸配列は、請求項４４の特徴部分に記載されていることによって特徴付けられる。
本発明のさらなる目的は、本発明の核酸配列を含むベクター、およびこの核酸配列またはベクターを含む宿主、ならびにラッカーゼ活性を有するポリペプチドの生産方法である。
【００２２】
本発明のさらなる一目的はポリペプチドまたは酵素を含む酵素製剤を得る方法であり、この方法は、本発明の酵素をコードする核酸配列、または本発明の酵素をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞を培養する工程、およびポリペプチドを回収する工程を含む。さらに、本発明の目的は、本発明のラッカーゼ酵素を含む酵素製剤である。
【００２３】
本発明の一目的はデニムを処理する方法であり、この方法はデニムを水性媒体中で、本発明のラッカーゼ酵素または酵素製剤に、この酵素が機能するのに適する条件の下で、接触させることを含む。
【００２４】
本発明の一目的はしみを除去する方法であり、この方法は、この方法により処理される材料を本発明のラッカーゼ酵素に、この酵素が機能するのに適する条件の下で、接触させることを含む。
【００２５】
本発明はまた、本発明のラッカーゼ酵素を用いることによる、パルプの漂白方法、繊維の処理方法、羊毛の処理方法、毛髪の処理方法、染物工場の廃液の処理方法、および染料の脱色方法も提供する。
本発明のさらなる目的は、様々な用途および組成物における、本発明のラッカーゼ酵素の使用である。
【００２６】
本発明のラッカーゼ酵素をデニムの漂白に使用することによって、多くの利点を得ることが可能である。本発明のラッカーゼ酵素を用いることによって、環境にとって有害な次亜塩素酸ナトリウムの影響を減らすか、または完全に避けることが可能である。次亜塩素酸ナトリウムが使用されない場合、脱塩素処理は全く必要とされない。次亜塩素酸漂白によるような様々な濃淡を得ることも可能である。非常に色落ちしたデニムの外観を得ることさえ可能である。本発明の酵素を用いることによるラッカーゼ処理の利点の１つは、処理が布地を壊さないことである。ラッカーゼはまた、ライクラを含む製品を処理するためにも使用できる。さらに、ラッカーゼ処理はまた使用者にとっても好都合である。さらに、本発明の酵素は広い温度およびｐＨ範囲で働くことができる。他の用途においてもまた、注目すべき利益を得ることができる。
本発明の他の特徴、態様および利点は以下の説明と添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、適切な条件下に、化学的漂白剤、特に次亜塩素酸ナトリウムにより処理されたデニムと少なくとも同じ単位数、またはそれを超える単位数、デニムの明度を上げることができるラッカーゼ酵素を提供する。
【００２８】
本明細書では、「本発明のラッカーゼ」または「本発明の複数のラッカーゼ」とは、特許請求の範囲において定義され、本明細書において説明されるグループのラッカーゼを意味する。
【００２９】
本発明との関連において、「ラッカーゼ酵素」とは、酵素分類によって、ＥＣ  １．１０．３．２として分類される酵素を意味する。ラッカーゼ酵素は、植物を含めてどのような生物由来でもよく、好ましくは、それは微生物に由来するものである。それは、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む群から選択される細菌に由来するものでよい。好ましくは、この酵素は、例えば、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｎ、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｏｌｌｙｂｉａ、Ｆｏｍｅｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｎｅｕｒａｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、ＴｒａｍｅｔｅｓおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａを含む群から選択される属の真菌（糸状菌および酵母が含まれる）に由来する。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のラッカーゼはＴｈｅｌａｖｉａ属、より好ましくはＴｈｉａｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａから得ることができる。本発明の最も好ましい実施形態によれば、本発明の酵素は、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに番号ＣＢＳ  １１６０７１の下に寄託されている菌株から得ることができる。
【００３１】
本発明のラッカーゼの由来は、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、またはＴ．ａｒｅｎａｒｉａ種に限定されない。本明細書に与えられている説明を利用することによって、当業者は、真菌の他の属から、他の微生物から、また植物のような高等生物から、本発明のラッカーゼを見出し単離できる。
【００３２】
本発明のラッカーゼは、ラッカーゼを産生するどのような生物からでも単離できる。好ましくは、本発明のラッカーゼ酵素は、微生物源から単離される。ラッカーゼを産生できる生物をスクリーニングし、様々な基質についての活性を求め、酵素を特徴付けることができる。例えば、酵素が働くｐＨおよび温度範囲、ｐＨおよび温度の最適条件、ならびに、様々な温度での酵素の安定性を求めることができる。代わりに、様々な生物のラッカーゼをコードする遺伝子を単離し、その遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を、本明細書における実施例において単離され特徴付けられているラッカーゼのアミノ酸配列と比較してもよい。これは、環境試料から直接クローニングすることを含む。
【００３３】
「漂白された外観（ｂｌｅａｃｅｄ  ｌｏｏｋ）」は、先行技術において漂白化学薬品（例えば次亜塩素酸ナトリウム）によりデニム地に得られる効果を意味する。これまでは、ほとんど全ての濃淡が得られるので、「塩素漂白」がインジゴで染色されたデニムにとって最も効果的な漂白方法であった。「白色漂白」効果が望まれる場合、異なる処理浴で順次２から３回漂白を行うか、あるいは高濃度の次亜塩素酸を用いて漂白する。グルコース、スルフィン酸誘導体またはラッカーゼによる漂白が、次亜塩素酸ナトリウムに代わるデニム処理として示唆されていた。しかし、先行技術では、これらのどれによっても、次亜塩素酸による効果と同じ効果が得られなかった。
【００３４】
デニム地の「明度を上げる」ために、先行技術によれば、様々な漂白化学薬品または酵素による処理が実施される。漂白は、セルラーゼまたは軽石、あるいはこれらの両方による処理の後に行われることが多い。
【００３５】
「糊抜き」プロセスは普通、ジーンズの最初の湿式処理であり、織り工程の間の損傷を防ぐために経糸に通常付けられるデンプンまたは他の糊剤の除去を意味する。
湿式処理を改善し均一にするために、アルファ・アミラーゼがデンプン系糊を除去するために使用される。糊抜きの後、ジーンズは普通、水でゆすぐ。
【００３６】
本明細書では、「擦れた」という用語は、セルラーゼ酵素またはストーン・ウォッシュ、またはこれらの両方によって処理された時のデニム地の外観を意味する。むらのある染料の除去の結果、染色された部分と染料が除去された部分の間にコントラストがある。同じ意味の表現は、「ストーン・ウォッシュ観」または「着古し観」である。セルラーゼ処理は、中性または酸性セルラーゼあるいはこれらの両方を用いて実施され得る。布地がセルラーゼ処理またはストーン・ウォッシュ処理されていない場合、布地の外観は、ファッショナブルなコントラストを欠いて、「面白くない（ｄｕｌｌ）」と言われる。
【００３７】
本明細書では、デニムの「明度を上げること」とは、デニム地の明度が肉眼でも測定でも増加することを意味する。明度の増加は、（ラッカーゼ処理後の布地の明度単位Ｌ＊）−（ラッカーゼ処理前の明度単位Ｌ＊）として求められる。デニムの「明度を上げること」は、特に、デニムの表側でのデニムの明度を増加させることを意味する。この増加は、例えば、実施例７〜１０に記載されているように、Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間座標を用いて分光光度計により反射値として色を測定することによって求めることができる。
【００３８】
本発明のラッカーゼ酵素は、１回の処理によって、適切な条件下に、デニムの表側の明度を、次亜塩素酸ナトリウムによって処理されたデニムと少なくとも同じ単位数、またはそれを超える単位数、上げることができる。ラッカーゼ処理は酵素の働きにとって適切な条件下に行われる。ラッカーゼ処理の結果は、通常の漂白条件下に次亜塩素酸ナトリウムにより得られる結果と比較される。試験条件として、次の漂白条件が選択され得る：布地が、４０℃の温度、１０．５を超えるｐＨで、２５ｍｌ／ｌの１０％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）溶液の存在下に処理され、処理時間は１５分である。液比は約１：１５である。この処理は、テキスタイル産業における湿式プロセスで通常使用される装置、例えば洗浄機において実施される。正確な試験条件は実施例１０に記載されている。漂白後、残っている次亜塩素酸は、例えば、亜硫酸水素ナトリウムまたはチオ硫酸ナトリウムによる処理によって除去され、その後、数回のリンス／洗浄工程が行われる。
【００３９】
前記の次亜塩素酸ナトリウム試験条件下に得られる結果に比べて、本発明のラッカーゼ酵素は、適切な条件下に、１回の処理によって、糊抜きされたデニムの明度をデニムの表側で、次亜塩素酸ナトリウムと少なくとも同じ単位数、増加させる。本明細書では、「糊抜きされた」とは、セルラーゼ処理なしで「糊抜きだけされた」ことを意味する。糊抜きされセルラーゼ処理されたデニムにラッカーゼ処理が行われた場合明度は、典型的には、試験条件下で次亜塩素酸ナトリウムによって処理されたデニムより２０から７０％、好ましくは４０から１１５％増加する。
【００４０】
インジゴで染色しセルラーゼ処理され、デニムの表側での明度の値（Ｌ＊）が３２より小さいデニムを使用した場合に、本発明のラッカーゼにより、適切な条件下１回の処理で、デニムの表側で、４７から５０またはこれを超える明度の値（Ｌ＊）を得ることが可能である。
【００４１】
インジゴで染色しセルラーゼ処理した、デニムの表側での明度の値（Ｌ＊）が３２より低いデニムを使用した場合に、本発明のラッカーゼにより、適切な条件下１回の処理で、デニムの表側で、１７から２５単位またはそれ以上明度の値（Ｌ＊）を増加させることが可能である。
【００４２】
本発明のラッカーゼによりデニム地を処理することによって、次亜塩素酸ナトリウムにより得られるものと同質の漂白効果を得ることができる。一層の白色化効果が望まれる場合、より多くの量を用いるか、あるいは酵素処理を繰り返す、または酵素処理を他の漂白処理と組み合わせることができる。本発明のラッカーゼ処理はまた、他の任意の漂白処理と、化学漂白処理の１種または複数と、またはデニムの明度を上げることができる他の1つまたはそれ以上の酵素処理と組み合わせることができる。
【００４３】
本明細書では、「メディエータ」は、ラッカーゼの作用を高めるために必要なことが多い添加剤を意味する。先行技術のラッカーゼの多くは、メディエータがなければ、働かない、あるいは効果的に働かない。やはり、本発明でのＴｈｉｅｌａｖｉａ由来のラッカーゼもやはり、メディエータの存在の下でより効果的に働く。適切なメディエータには、例えば、シリンガ酸メチル、アセトシリンゴン、シリンガ酸エチル、シリンガ酸ブチルおよびシリンガ酸ラウリル、プロピオン酸−フェノチアジン（ＰＰＴ）、２，２’−アジノビス−３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホナート）（ＡＢＴＳ）、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（Ｔｅｍｐｏ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）、ビオルル酸、Ｎ−ヒドロキシ−アセトアニリド（ＮＨＡ）が含まれる。メディエータは、用途およびメディエータの種類に応じて、０．１から１００ｍｇ／（処理材料１ｇ）、または０．１から１００ｍｇ／（処理材料１Ｌ）、好ましくは１から１０ｍｇ／（処理材料１ｇ）、または１から１０ｍｇ／（処理材料１Ｌ）の範囲で使用され得る。
【００４４】
本発明のラッカーゼ酵素により、どのような種類のデニム地でも処理できる。有利には、デニムはインジゴで染色されたデニムである。デニムはまた、インジゴ誘導体により処理されていても、あるいは、デニムは何らかの他の染料と一緒にインジゴにより染色されていてもよい（例えば、硫化染料で下染めされ、インジゴで染色されたデニム）。デニム地はセルラーゼ処理されていても、あるいはストーン・ウォッシュされていても、あるいはこれらの両方をされていてもよく、あるいは、デニム地は、前もって糊抜き後に本発明のラッカーゼによって処理されてもよい。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のラッカーゼによるデニム処理は、３０から８０℃の温度で、好ましくは５０から７０℃の温度で、より好ましくは６０から７０℃の温度で実施される。処理の間のｐＨは、ｐＨ３．５から８、好ましくはｐＨ４から７．５、最も好ましくはｐＨ５から７の範囲でよい。処理は、１５分から２時間、好ましくは３０分から９０分間、より好ましくは３０分から６０分間行うことができる。処理に使用される酵素の量は、布地１ｇあたり２から５００ｎｋａｔ、より好ましくは２０から２００、最も好ましくは２０から１００ｎｋａｔでよい。
【００４６】
本発明によるデニム処理は、一般に次の工程を含む：
−糊抜きされたデニム、または必要に応じ糊抜きされセルラーゼ処理されたデニムを、酵素の働きにとって適切な条件の下で、水性媒体中で、有効量のラッカーゼ酵素に接触させる工程；および
−水により１回または複数回のすすぎをおこなう工程。
【００４７】
ラッカーゼ処理は、好ましくは、セルラーゼ処理されたデニムに実施される。ラッカーゼ処理の後、洗剤を含んでもよい高温または低温の水による１回または複数回のゆすぎが行われる。酵素は布地の強度を低下させないので、酵素の不活性化は通常ラッカーゼ処理の後には必要でないが、必要であれば、当業者によく知られている方法によって実施できる。この処理は通常、テキスタイル産業において湿式プロセスで使用される普通の装置（例えば、洗浄、セルラーゼ処理、染色または仕上げに使用される工業用機械）において実施される。
本発明との関連において、「デニム」とは、デニム地、通常はデニムジーンズを意味する。
【００４８】
デニムの漂白における本発明のラッカーゼ製剤の性能は、実施例７に記載するように、様々なｐＨ値で示された。宿主としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａを用いて生産された組換えラッカーゼ製剤を、デニムを漂白する能力について試験し、市販のラッカーゼ製剤である、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓのＤｅｎｉｌｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した。
【００４９】
本発明のラッカーゼは、表１０および図８に見られるように、先行技術のラッカーゼに比べて、５から７の全てのｐＨ値で、デニムのインジゴ染料の脱色において優れており、ｐＨ６が最適条件であった。本発明のラッカーゼ製剤だけが、最高の明度値を有する強く漂白された外観を実現することができた。さらに、セルラーゼ処理により得られた擦れた外観は維持されていた。デニムの裏側での明度の増加および青さの低下もまた、メディエータを用い本発明のラッカーゼ製剤により処理されたデニムで最高であった。
【００５０】
実施例８に記載されているように、様々な温度でデニムを漂白する本発明のラッカーゼの能力が試験され、先行技術のラッカーゼと比較された。
【００５１】
表１２および図９に見られるように、本発明のラッカーゼ製剤は、先行技術のラッカーゼに比べて、３０〜８０℃で、デニムの漂白において優れていた（明度の増加がより大きい）。
６０から７０℃の温度が本発明のラッカーゼにとって最適条件であり、デニム地の外観は強く色落ちしていた。
【００５２】
デニムの漂白における酵素使用量の効果を、実施例９に記載されているように、ラッカーゼ−メディエータ系で調べた。セルラーゼ処理デニムジーンズを、様々なラッカーゼ用量で、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株産生組換えラッカーゼおよび先行技術のラッカーゼで処理した。使用量を２０から１００ｎｋａｔ／（布地１ｇ）に増すことにより、本発明の酵素による漂白が大幅に向上した。３０分から６０分に時間を増やすと、表１４および図１０に見られるように、本発明のラッカーゼの性能はさらに改善された。
【００５３】
ラッカーゼ−メディエータ系によるデニムの漂白を、実施例１０に記載されているように、次亜塩素酸による漂白と比較した。様々なタイプのデニムを、本発明のラッカーゼおよび先行技術のラッカーゼにより処理し、得られた結果を次亜塩素酸漂白と比較した。試験においては、糊抜きの後、様々な擦れレベルまでセルラーゼにより洗浄したデニム試料、または糊抜きだけが行われた試料を用いた。本発明のラッカーゼは、表１８〜２０および図１１Ａ〜Ｄに見られるように、各タイプのセルラーゼ処理デニム試料の全てで、先行技術のラッカーゼおよび塩素漂白に比べて優れていた。糊抜きだけ行った布地では、Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼ製剤により得られた漂白効果（デニムの表側でのＬ＊の増加）は、次亜塩素酸ナトリウムによるものと同等またはより良好であり、先行技術のラッカーゼ（Ｄｅｎｉｌｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅ）によるものより少なくとも１００％より良好であった。本発明のラッカーゼにより、普通は多量の次亜塩素酸ナトリウムを使用してのみ得られる非常に強い漂白効果を実現することが可能であった。
【００５４】
本発明のラッカーゼを産生する微生物は自然から単離できる、あるいは、それらは、当業者によく知られているスクリーニング方法を用いることによって、すでに単離され同定されたカルチャー・コレクションの菌株からスクリーニングできる。スクリーニングは、プレート培養での固形培地で、または液体培地で、酵素活性を測定して酵素の産生を調べることにより実施できる。活性を測定するのに適した基質には、ＡＢＴＳ、ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）、グアイアコール、およびシリンガルダジンが含まれる。真菌は、例えば実施例１に参照されている方法によって、レマゾール・ブリリアント・ブルー（Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）Ｒ−４７８、タンニン酸、およびグアイアコールのような指示薬を用いて、ラッカーゼを産生する能力についてスクリーニングできる。より高等な生物（例えば植物）からも適切なラッカーゼは単離でき、それらのラッカーゼをコードする遺伝子をクローン化できる。
【００５５】
本発明は、様々な基質を酸化する能力が高く様々な用途に適している酵素に関する。特に、本発明は、ｐＨ４．５でＡＢＴＳについて、少なくとも８００ｎｋａｔ／ｍｇ、より好ましくは少なくとも９００ｎｋａｔ／ｍｇの比活性を有する酵素に関する。シリンガルダジンが基質として用いられる場合には、比活性は、ｐＨ５．５で、少なくとも２００、好ましくは少なくとも３００ｎｋａｔ／ｍｇである。グアイアコールが基質として用いられる場合には、酵素の比活性は、ｐＨ５．５で、少なくとも４０ｎｋａｔ／ｍｇ、好ましくは少なくとも６０ｎｋａｔ／ｍｇである。
【００５６】
スクリーニングの結果見出される微生物菌株は、適切な培地で培養でき、培養液またはプレートにおけるラッカーゼの生成が観察できる。関心のあるラッカーゼが十分量産生された後、その酵素を精製し、その性質をより綿密に調べることができる。
【００５７】
産生されたラッカーゼ酵素は、酵素化学の通常の方法（例えば、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）を用いることによって精製できる。精製は、タンパク質定量、酵素活性アッセイおよびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってモニタできる。様々な温度およびｐＨ値での精製酵素の酵素活性を求めることができ、同様に、分子量および等電点を求めることができる。
【００５８】
精製された酵素とは酵素製剤を表し、ラッカーゼタンパク質以外には他のタンパク質を含んでいないか、あるいは微量の他のタンパク質を含んでいる。得られた他のタンパク質を本質的に含まないラッカーゼの純度は、≧９０％である。
【００５９】
本発明の好ましいラッカーゼの精製は実施例１に例示されている。濃縮された培養濾液をＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに載せ、タンパク質を塩勾配を上げて溶離し、ラッカーゼ活性画分をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ゲル濾過樹脂上に載せた。精製後、活性アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。高純度試料を得るために、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ陰イオン交換工程を追加した。もちろんここで記載された方法を、他の知られている精製方法にかえる、あるいは加えて用いることによって、本発明の酵素を分離することが可能である。
【００６０】
ラッカーゼの等電点は等電点電気泳動により求められ、ラッカーゼ活性を含むバンドは、例えば、実施例２に記載されているように、ＡＢＴＳによりゲルを染めることによって視覚化できる。
様々な温度でのラッカーゼ活性の測定は、Ｎｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）によって開発された方法に従って、実施例１に記載されているようにＡＢＴＳ法によって、あるいは文献に記載されている他の方法によって実施できる。
【００６１】
ラッカーゼの至適ｐＨは、ｐＨを変えた適当な緩衝液中、適当な基質を用い活性を追跡することによって求めることができる。
熱安定性は、適切な緩衝液中、特定のｐＨで、温度を変えて酵素試料をインキュベートすることによって求めることができる。各温度での酵素の残存活性は、例えばＡＢＴＳ法によって決定できる。
【００６２】
精製したラッカーゼの比活性は、様々なラッカーゼの基質（例えば、ＡＢＴＳ、ジメトキシ−フェノール（ＤＭＰ）、シリンガルダジン、およびグアイアコール）に対して求めることができる。
【００６３】
ラッカーゼの活性への様々な阻害剤の作用は、阻害剤の存在下、例えば、ＡＢＴＳと酵素との反応の間の酸素消費を密封・充填された容器内で酸素電極により測定することによって、あるいは分光的手段により酵素活性を追跡することによって求めることができる。
【００６４】
タンパク質のＮ−末端ならびに内部ペプチドは、実施例２に記載されているように、エドマン分解化学［Ｅｄｍａｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｇｇ  Ｇ．（１９６７）］により、あるいは文献に記載されている他の方法によって配列決定できる。
【００６５】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＲＦ５５９７から単離・精製されたラッカーゼ酵素の分子量は約８０ｋＤａであった。精製ラッカーゼは、等電点電気泳動において、５．５、５．９、６．４、６．８、および６．９のｐＩにバンドを示した。
【００６６】
精製ラッカーゼに対する至適ｐＨは、グアイアコールで求めると、５．５であり、この酵素はｐＨ７でも尚相当に高い活性を示した。この酵素は、３．５から８、好ましくは４から７．５、最も好ましくは５から７のｐＨ範囲で働く。測定の精度は±０．５である。
【００６７】
第１のｐＨ範囲（ｐＨ３．５から８）は、この範囲内では最大活性の２０％以上あることを意味し、第２のｐＨ範囲（ｐＨ４から７）は、この範囲内では最大活性の４０％以上あることを意味し、第３のｐＨ範囲（ｐＨ５から７）は、この範囲内では最大活性の８０％以上あることを意味する。
ラッカーゼの半減期は、アッセイ条件において、５０℃で２６時間、６０℃で５．５時間であった。
【００６８】
デニム漂白用途におけるラッカーゼの温度最適条件は６０℃であった。この酵素は、１８から８０℃の温度で働くが、３０から８０℃の温度で、より好ましくは５０から７０℃の温度で、最も好ましくは６０から７０℃の温度で効果的に働く。
【００６９】
本発明の酵素の比活性は、ＡＢＴＳで最大で、ｐＨ４．５で、１０２０ｎｋａｔ／（タンパク質１ｍｇ）であった。ｐＨ５．５、ＤＭＳでの比活性は２６０、シリンガルダジンでは４９０、またグアイアコールで６３ｎｋａｔ／ｍｇであった。
【００７０】
有益な性質を示すラッカーゼは、元の宿主によって生産されるか、あるいは、該ラッカーゼをコードするＤＮＡ配列と該酵素を発現させるのに必要な配列とを導入した宿主を適切な条件下に培養し、必要ならば酵素を分離することを含む方法によって組換え宿主によって生産され得る。生産宿主はラッカーゼを発現できるどのような生物であってよい。好ましくは、この宿主は微生物細胞、より好ましくは真菌である。最も好ましくは、宿主は糸状菌である。好ましくは、組換え宿主は、主な活動としてまたは主な活動の１つとしてラッカーゼを発現し分泌するように変更される。生産宿主培養後の培地は、そのまま用いても、あるいは宿主細胞を取り除いても、また／あるいは、培地を濃縮、濾過または分画してもよい。培地を乾燥してもよい。
【００７１】
適切な発現および生産宿主系は、例えば、真菌宿主Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（ＥＰ  ２４４  ２３４）で開発された生産系、あるいは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ生産系、例えば、Ａ．ｏｒｙｚａｅもしくはＡ．ｎｉｇｅｒ（ＷＯ  ９７０８３２５およびＷＯ  ９５３３３８６、米国特許第５８４３７４５号、米国特許第５７７０４１８号）、あるいはＦｕｓａｒｉｕｍ、例えばＦ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（米国特許第６５７３０８６号）で開発された生産系である。細菌で開発された適切な生産系は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または放線菌のＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓで開発された生産系である。酵母で開発された適切な生産系は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの他の微生物または哺乳動物細胞での生産系もまた可能である。
【００７２】
本発明のラッカーゼ酵素を生産するための好ましい宿主は、特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌株である。
保護の範囲内であるのは、さらに、選択されたラッカーゼをコードする核酸配列と、ラッカーゼをコードする配列の発現および分泌を容易にする配列（例えば、プロモーターおよびシグナル配列）とを宿主に導入する時に使用できるベクターである。
【００７３】
標準的な分子生物学の方法を、ラッカーゼ酵素のクローニングにおいて、すなわち、ＤＮＡの分離および酵素処理、大腸菌の形質転換などにおいて用いることができる。用いられる基本的な方法は、標準的な分子生物学のハンドブック、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）に記載されている。
【００７４】
選択された宿主生物から調製された遺伝子ライブラリーを、ＰＣＲにより調製されたプローブによりスクリーニングした。ＰＣＲ反応において使用されたオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、天然の宿主により産生された精製ラッカーゼ酵素から得られたペプチドのアミノ酸配列、および真菌ラッカーゼのコンセンサス配列に基づいた。得られたＤＮＡ生成物は、配列決定により、また、いくつかの制限酵素により消化されたＴｈｉｅｌａｖｉａゲノムＤＮＡにサザンブロットハイブリダイゼーションを実施することにより同定した。
【００７５】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼ完全長遺伝子をプラスミドｐＡＬＫ１６０７、ｐＡＬＫ１３４１およびｐＡＬＫ１３４２に導入した。プラスミドｐＡＬＫ１３４２を含む大腸菌株ＲＦ５４７３は、ＤＳＭＺコレクションに寄託された（ＤＳＭ  １５４８４）。ラッカーゼの推定アミノ酸配列がＤＮＡ配列から解析された。
【００７６】
ＴｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼのＴａｌｃｃ１配列（配列番号１１）および推定アミノ酸配列（配列番号１２）が図６に示されている。遺伝子の長さは２２７９ｂｐ（停止コドンを含めて）であった。推定タンパク質配列は６１７個のアミノ酸からなり、２１個のアミノ酸の予想されたシグナル配列および１３個のアミノ酸の「テイル（ｔａｉｌ）」配列（配列ＤＳＧＬの後から始まる）を含んでいた。野生型（ｗｔ）のラッカーゼから精製されたペプチドは推定アミノ酸配列に全て見出され、クローンされた遺伝子は、組換え宿主から精製されたラッカーゼをコードしていることを示した。予想された分子量は、成熟ポリペプチドで６４４５６Ｄａであり、予想されたｐＩは６．３１（アミノ酸２２〜６０４、シグナル配列およびＣ末端テイルは除く）であった。推定アミノ酸配列は９つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含んでいた。公開されているラッカーゼ配列に対する相同性を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）でＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．９）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて検索した。Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（ＥＭＢＬアクセス番号ＣＡＥ００１８０．１、ＬＡＣ２＿ＰＯＤＡＭ、ＸＰ＿３２３８８１．１）のラッカーゼと最大の相同性があった。ＴａＬｃｃ１配列は、ＢＬＡＳＴ検索においてこれらの配列と５０％を超える同一性を示し、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ（ＥＰ  ０７６５３９４  Ｂ１、米国特許第５９８１２４３号に対応）およびＳｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（米国特許第５５７０３８８号）のラッカーゼ配列とも同様であった。最大の同一性は７３．１％で、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓのラッカーゼに見出された。
【００７７】
本明細書では、「同一性」という用語により、対応する遺伝子によりコードされる第１アミノ酸から最後のアミノ酸までを互いに比較した場合の２つのアミノ酸配列の間の同一性を意味する。完全長配列の同一性は、ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ；Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）プログラム・パッケージ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．９．０）で、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル・アラインメント・プログラムを用い、次のパラメータ：ＥＭＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ・ペナルティ１０．０、伸長ペナルティ０．５を用いて求めた。
【００７８】
本発明の範囲内であるのは、ラッカーゼ活性を有し、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも７４％の同一性を示すアミノ酸配列を含む酵素またはポリペプチドである。好ましい酵素は、少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７８％、より一層好ましくは少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含む。尚一層好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号１２のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を示す。
【００７９】
さらに、本発明の範囲内であるのは、上で定義された通りであるけれどもシグナル配列またはテイルあるいはこれらの両方を欠いている酵素および切り詰め型ポリペプチドである。シグナル配列またはテイルあるいはこれらの両方は、例えば、翻訳後の段階の間に、あるいは培養後の培地において、あるいは培地または酵素製剤の保管の間に、切断される可能性がある。さらに、タンパク質からのプロペプチドは宿主によって切断されることがある。切り詰めはまた、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子で産生宿主を形質転換する前に、短くすることによっても実現される。
【００８０】
本発明によるラッカーゼは天然宿主または組換え宿主が培地中に産生することができ、そこから、既知のタンパク質化学の方法を用いて、ラッカーゼを単離および精製できる。培地が十分に多量のラッカーゼを含み他の有害なタンパク質は含んでいない場合、細胞を簡単に分離することによって培養液をそのまま用いることが可能である。望まれる場合には、培養液を濃縮、濾過、分画および／または精製してもよい。それを乾燥してもよい。様々な用途で、ラッカーゼを多く含む酵素製剤を用いることが好ましい。このような酵素製剤は、遺伝子工学により、または培養条件を最適化することにより、生産宿主に培地中にラッカーゼ酵素を増量して産生させることによって調製できる。増量とは、天然宿主により自然に産生されるラッカーゼ酵素の量を超えるラッカーゼ酵素の量を表す。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼは、糸状菌宿主、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主で生産できる。生産は実施例４により詳細に記載されている。精製された組換えラッカーゼは、至適ｐＨ、熱安定性、およびｐＩに関して特性評価され、これらは、組換えラッカーゼが野生型のＴｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼと同様の性質を有することをはっきりと示した。
【００８２】
ラッカーゼの生産はまた、野生または組換え菌株の培養条件および培地を最適化することによって改善できる。炭素／窒素の比は、酵素の生産にとって最善のものであるように最適化できる。発育条件、ｐＨ、温度、混合および空気供給も該酵素の生産にとって可能なかぎり最善のものであるように最適化できる。発酵では、ラッカーゼ産生の誘導物質、例えば、ベラトリルアルコール、キシリジン、またはリグニンも使用できる。誘導物質を添加する方法および時間、濃度も最適化できる。
【００８３】
本明細書では、「酵素製剤」という用語は任意の酵素製品を表し、この製品は少なくとも１種のラッカーゼ酵素を含む。したがって、このような酵素製剤は、1種以上のラッカーゼ、または一種以上のラッカーゼと他の酵素を含む培養後の培地もしくは濾液、単離されたラッカーゼ酵素、またはラッカーゼ酵素の混合物、または一種以上のラッカーゼ酵素および一種以上の他の酵素の混合物であり得る。ラッカーゼ活性以外に、このような製剤は、添加剤、例えばメディエータ、安定剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤および／または培地成分を含んでいてもよい。好ましい添加物は、酵素製剤が用いられる用途を意図した酵素製剤において一般に使用されるようなものである。酵素製剤は、液体、粉末または顆粒の形態であり得る。本明細書では、「培養後の培地」は、産生された酵素を含む、宿主を培養した培地を意味する。好ましくは、宿主細胞は、生産後、前記培地から分離される。
【００８４】
本発明の酵素製剤はラッカーゼ以外に、１種または複数の他の酵素を含んでいてもよく、これらの酵素は、例えば、アミラーゼ、セルラーゼおよび／またはペルオキシダーゼであり得る。代わりに、本発明のラッカーゼ処理の前、その間、またはその後で、別の酵素処理を実施してもよい。この酵素処理には、例えば、１回もしくは複数回のアミラーゼ処理、１回もしくは複数回のセルラーゼ処理および／または１回もしくは複数回のペルオキシダーゼ処理が含まれ得る。他のどの酵素が酵素製剤に含まれるか、または酵素処理に使用されるかは、用途に応じて決まる。
【００８５】
本発明の酵素製剤は、本発明のラッカーゼ酵素の１種または複数を、あるいは本発明のラッカーゼ酵素の１種または複数と一緒に他のラッカーゼ酵素を含んでよい。例えば、様々な条件に対して酵素製剤をより有用にするために、異なる性質を有するラッカーゼ酵素を組み合わせてもよい。
本発明のラッカーゼ酵素は、デニムの漂白と同様な条件の下で、しみの除去に使用できる。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態によれば、しみの除去は、３０から８０℃の温度で、好ましくは５０から７０℃の温度で、より好ましくは６０から７０℃の温度で実施される。この処理の間のｐＨは、ｐＨ３．５から８、好ましくはｐＨ４から７．５、最も好ましくはｐＨ５から７であり得る。処理は１５分から２時間、好ましくは３０分から９０分間、より好ましくは３０分から６０分間で実施され得る。この処理に使用される酵素の量は、布地の重量に対して、０．２から２０００ｎｋａｔ／ｇ、好ましくは１から５００ｎｋａｔ／ｇ、より好ましくは２から２００ｎｋａｔ／ｇである。
【００８７】
本発明のラッカーゼおよびＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅラッカーゼ製剤を、実施例１１に記載されているように、しみを除去する能力について試験した。これらの試験では、草のしみと茶のしみで人為的に汚した試験布を、メディエータと共にあるいはメディエータなしで用いた。酵素の使用量は２０および２００ｎｋａｔ／（布地１ｇ）であり、試験は、ｐＨ６で６０分間、４０℃、５０℃または６０℃で行われた。
【００８８】
表２１と図１２ＡおよびＢに見られるように、本発明のラッカーゼ製剤は、メディエータと一緒に用いると、先行技術のラッカーゼに比べて、６０℃で、草のしみの除去においてより効果的であった。表２２と図１４ＡおよびＢに見られるように、本発明のラッカーゼはまた４０℃でもより良好であった。望みの効果を得るためには、メディエータが必要であった。
【００８９】
表２１および２２と図１３ＡおよびＢ、ならびに図１５ＡおよびＢに見られるように、本発明のラッカーゼはまた、メディエータと一緒に用いると、６０℃で、茶のしみの除去においてより効果的であり、使用量が多いと特に、４０℃でも僅かだがより良好であった。望みの効果を得るためには、メディエータが必要であった。
【００９０】
本発明のラッカーゼはまた、メディエータと一緒に用いると、６０℃で、茶のしみの除去においてより効果的であり、表２２と図１４に見られるように、特に使用量が多いと４０℃でも僅かだがより良好であった。望みの効果を得るためには、メディエータが必要であった。
【００９１】
本発明のラッカーゼ酵素はまた染料の脱色にも使用できる。例えば染物工場の廃液は、染料を除去および／または染料を脱色することなしには、自然の水系に放出できない。この脱色はデニムの漂白において用いられるものに似た条件下に実施できる。適切な酵素使用量および処理時間は、脱色される染料の量と処理条件により変わる。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態によれば、染料の脱色は、３０から８０℃の温度で、好ましくは５０から７０℃の温度で、より好ましくは６０から７０℃の温度で実施される。この処理の間のｐＨは、ｐＨ３．５から８、好ましくはｐＨ４から７．５、最も好ましくは５から７であり得る。酵素の使用量および処理時間は、試験して用途に最も適するように選択できる。目安として、処理液１Ｌあたり０．２から２０００ｎｋａｔが用られる。処理時間は、好ましくは１５分から２４時間、より好ましくは３０分から１２時間である。処理が低温（例えば１７から３０℃）で実施される場合、処理時間は長くなることがある。
【００９３】
実施例１２に記載されているように、本発明のラッカーゼを、メディエータの存在下、またはそれなしに、様々な染料を脱色する能力について試験した。振盪フラスコを５０℃で、約３０、９０および１５０分間インキュベートした。本発明のラッカーゼは、表２３に見られるように、インジゴカルミン、レマゾール・ブリリアント・ブルーおよびシバクロンブリリアント・レッド３Ｂ−Ｐを大幅に脱色できた。
【００９４】
本発明のラッカーゼは様々な基質について高い酸化能力を有し、種々の工業的用途に適している。このような用途は、例えば、繊維製品の製造および林業に関する用途、化粧品産業およびパーソナルケア製剤産業における用途、ならびに他の用途である。これらの用途において、温度およびｐＨは、本発明のラッカーゼが働く範囲にある。酵素使用量および処理時間は用途および処理される材料に応じて選択できる。
【００９５】
メディエータは本発明のラッカーゼの効果を向上させるために添加剤として必要なことがある。さらに、十分な酸素が反応に取り込まれることが不可欠である。必要であれば、酸素は、空気または酸素または酸素富化空気のいずれかを導入することによって、反応混合物に加えられてもよい。
【００９６】
本発明のラッカーゼは、化学繊維または天然繊維またはこれらの両方を処理するために、テキスタイル産業において使用するのに適している。本発明の酵素は、セルロース繊維ならびにタンパク質繊維（例えばウール）を処理するのに適している。
【００９７】
本発明のラッカーゼは、林業において使用するのに適している。リグニン含有繊維をラッカーゼと接触させることができる。ラッカーゼ処理により、繊維の強度特性が向上する。このことは、例えば、機械的に粉砕したリグニン含有繊維からなっているファイバー・ボード、木質複合材料、紙または厚紙製品および複合材料の製造に利用できる。本発明のラッカーゼは、木材繊維を機能化する、または繊維を接着するためにも使用できる。
【００９８】
本発明のラッカーゼはまた、様々な化合物の解重合にも、よく適している。本発明のラッカーゼを用いることにより、クラフトパルプのリグニンを解重合できるので、低リグニン含量のパルプを製造できる。このため、ラッカーゼをパルプの漂白に使用すると漂白用化学薬品の使用を減らすことができる。ラッカーゼ処理した後のパルプは漂白性が良好になる結果、後の漂白用化学薬品の消費が減る。これが、塩素含有化学薬品が使用される場合、環境にとって望ましくない有機塩素化合物の生成の減少につながる。
【００９９】
本発明のラッカーゼはまた、リグニンのような化合物を重合させて高分子量化合物をつくるのに使用することもできる。
本発明の酵素は酸化能力が高いので、化粧品産業またはパーソナルケア製品を製造する産業において、染料、染料前駆体、発色性化合物を酸化するために使用できる。染料が酸化されると、その化合物は脱色される。この効果は、例えば、毛染めに、または歯を白くする時に利用できる。毛染めを実施するためには、染料の前駆体または修飾剤が通常、必要とされる。
【０１００】
本発明によるラッカーゼはまた、抄紙機の作業性を向上させるためにも使用できる。本発明のラッカーゼは、リグニンおよび抽出物由来の化合物を重合させることによって、また、抄紙機における微生物の有害な生育を抑えることによって、抄紙機の作業性を向上させるのに使用できる。
【０１０１】
本発明のラッカーゼ酵素が使える可能性のある用途は、ベーキング用途における生地の改善、ビールおよびワインの清澄化、再生可能な原材料からの燃料エタノールの製造の改善、および様々なバイオレメディエーション、ならびに硬い表面の洗浄または洗剤への配合である。
【０１０２】
一般に、前記用途では、処理温度は、好ましくは３０から８０℃、より好ましくは５０から７０℃であるが、反応はより低い温度、例えば１８から３０℃、でも実施することができる。ｐＨは、３．５から８、好ましくは５から７である。処理時間は１５分から２４時間、好ましくは３０分から２時間であり得る。酵素使用量は０．１から２０００、好ましくは１から１０００、より好ましくは２から２００ｎｋａｔ／（処理される材料１ｇまたは１Ｌ）でよい。適切な量の適切なメディエータを添加してもよい。
【０１０３】
前記用途向けの組成物は、有効量の本発明の酵素または酵素製剤と、該用途に適する任意選択の添加剤を含む。テキスタイル産業向けの組成物は、例えば、適量の表面活性剤、緩衝剤、安定剤および保存剤を含み、林業向けの組成物は、例えば、適量の緩衝剤、安定剤および保存剤を含み得る。全ての組成物において、環境にとって、また人（または動物）に使用して有害な物質は避けられるべきである。特に、化粧品産業およびパーソナルケア製品産業向けの組成物は、皮膚へのまたは摂取して有害な作用を含むべきでない。
【０１０４】
本発明は、本発明によるラッカーゼ酵素または酵素製剤を含む、デニム処理用の組成物を提供する。本発明はまた、本発明によるラッカーゼ酵素または酵素製剤を含む、しみを除去するための組成物、パルプの漂白用組成物、テキスタイル産業向けの繊維処理用の組成物、林業向けの繊維処理用の組成物、ウール処理用組成物、毛髪処理用の組成物、染物工場廃液の処理用組成物、および染料の脱色用組成物を提供する。
【０１０５】
以下の実施例は本発明を例示しようとするものであり、如何なる仕方においても本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１０６】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼの生産と精製
Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼの生産
Ｒｏａｌ  Ｏｙのカルチャー・コレクションの様々な菌株を、Ｋｉｉｓｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）に記載されているように、指示薬としてレマゾール・ブリリアント・ブルーＲ−４７８、タンニン酸、およびグアイアコールを用いて、ラッカーゼ産生能力についてスクリーニングした。Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７がグアイアコールおよびレマゾール・ブリリアント・ブルーＲ−４７８に陽性反応を示した。
【０１０７】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ菌をＰＤ寒天（Ｄｉｆｃｏ）上＋４℃で維持した。接種用および生産用培地は以下を含む：２５ｇ／ｌのグルコース（ＡｎａｌａＲ）、２７．５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５ｍｇ／ｍｌのＩｎｄｕｌｉｎ  ＡＴ（Ｓｉｇｍａ）、０．０４ｌ／ｌの無機物溶液（１．０ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）、１．０ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）、０．１ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）、０．１６ｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）、１．０ｇ／ｌのＮａ２ＥＤＴＡ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ））。グルコースは別に滅菌し、無菌的に培地に加えた。
【０１０８】
微生物を、３７℃の温度で、回転振盪機（２００ｒｐｍ）上で５０または２００ｍｌの体積で培養した。５または２０ｍｌのよく生育した菌糸体を培地に接種した。ラッカーゼ活性を８日まで追跡すると、培養の６日後に、最大のラッカーゼ活性（約２０ｎｋａｔ／ｍｌ）に達した。６つの平行培養を行った。細胞を遠心（１００００ｇで１０分間、＋４℃）により発酵液から除去し、培養濾液をさらに精製した。
【０１０９】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼの精製
濃縮した培養濾液を、最初に、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）で前もって平衡化）上に注入した。塩濃度を上げながら（平衡化緩衝液中、０〜５００ｍＭのＮａ２ＳＯ４）でタンパク質を溶離させた。ラッカーゼ活性画分を集め、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ゲル濾過樹脂（２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７、２００ｍＭのＮａＣｌを含む）で平衡化）に注入した。精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いクマシー・ブリリアント・ブルーにより染色した。ラッカーゼ陽性画分を集め、濃縮した。塩を除去し、緩衝液を２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に変えた。高純度試料を得るために、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ陰イオン交換工程を追加した。試料をＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化）上に注入した。タンパク質を、Ｎａ２ＳＯ４の１〜３００ｍＭの直線塩勾配により溶離させた。図１はラッカーゼの精製を示している。
【０１１０】
酵素活性アッセイ
培溶液上澄みによるラッカーゼ活性は、基質としてＡＢＴＳを用いて測定した。活性アッセイは、Ｎｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）により開発された方法に従って実施した。試料を、０．０２５Ｍのコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）により稀釈した。最初に、０．３５０ｍｌのＡＢＴＳ溶液（１１ｇ／ｌ）を１．１５ｍｌの稀釈液に加え、反応を波長４３６ｎｍで２分間追跡した。活性はナノカタールとして表される。
【０１１１】
タンパク質含量の測定
タンパク質含量を、Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９５１）により開発された方法に基づくＢｉｏ−ＲａｄのＤＣタンパク質アッセイキットにより求めた。製造元の指示に従ってアッセイを実施し、反応で生じた色の強度を、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＬａｍｂｄａ  ２０分光光度計を用いて波長７５０ｎｍで測定した。０．２５〜１．２５ｇ／ｌ（ＢＳＡ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の濃度のウシ血清アルブミンを用いて標準曲線を定めた。
【実施例２】
【０１１２】
精製したＴｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａラッカーゼ（ｗｔ  ＴａＬｃｃ１）の特性評価
分子量およびｐＩ
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａラッカーゼ（ｗｔＴａＬｃｃ１）の分子量を、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで求めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において用いたゲルは、既製のトリスＨＣｌ１２％ゲル（ＢｉｏＲａｄ）であった。タンパク質バンドを、クマシー・ブリリアント・ブルー（Ｒ  ３５０；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により染色することによって可視化し、分子量マーカー（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  ＃７７０８Ｓ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）と比較した。Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａラッカーゼの分子量は約８０ｋＤａであった。ラッカーゼの等電点を、ＬＫＢ  ２１１７  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ電気泳動装置（ＬＫＢ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｒｏｍｍａ、スウェーデン）で、製造元の指示に従って、３〜９のｐＨ範囲（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ＩＥＦ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の等電点電気泳動により求めた。ラッカーゼ活性をふくむバンドは２５ｍＭのコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）中２ｍＭのＡＢＴＳによりゲルを染色し、タンパク質はクマシー・ブリリアント・ブルー染色により可視化した。精製したＴｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼは、等電点電気泳動で、５．５、５．９、６．４、６．８、および６．９のｐＩで複数のバンドを示した。
【０１１３】
至適ｐＨ
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａラッカーゼの至適ｐＨを、基質としてグアイアコールを用いて、２．０〜８．０のｐＨ範囲で、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ汎用緩衝液中で求めた。精製および粗Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼについて求めた至適ｐＨを図２に示す。図２に示されているように、Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼの至適ｐＨは５．５であり、この酵素はｐＨ７でも尚、相当に高い活性を示し、それを超えると活性は低下し始める。
【０１１４】
熱安定性
ラッカーゼの熱安定性を、６０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の酵素溶液（０．３ｇｌ−１）をインキュベートすることによって求めた。残留酵素活性をＡＢＴＳで求めた。結果から示されるように、ラッカーゼの半減期は、５０℃および６０℃でそれぞれ、２６時間および５．５時間であった（図３）。
【０１１５】
比活性
精製したＴｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼの比活性を、様々なラッカーゼの基質に対して求めた。活性を、ＡＢＴＳ（Ｎｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ジメトキシ−フェノール（ＤＭＰ）（Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、シリンガルダジン（Ｐａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、およびグアイアコール（Ｌｅｏｎｏｗｉｃｚ＆Ｇｒｚｙｗｎｏｗｉｃｚ，１９８１）に対して求めた。ＡＢＴＳとの活性測定は、２５℃、２５ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）中で行い、他の基質については、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中で実施した。結果を表１に示す。
【０１１６】
表１．精製Ｔｈｉｅｌａｖｉａ野生型ラッカーゼ（ｗｔ  ＴａＬｃｃ１）の比活性
【表１】
2008512999.tif 000002
【０１１７】
ラッカーゼの阻害
ラッカーゼ活性への様々な阻害剤の作用を、密封し完全充填したエーレンマイヤーフラスコ中、ＡＢＴＳとの酵素反応の間の酸素消費を、Ｏｒｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ０８１０１０酸素電極（ソフトウェア：ＳｅｎｓｏｒＬｉｎｋ（商標）ＰＣＭ８００；Ｏｒｉｏｎ、Ｅｓｐｏｏ、フィンランド）により測定することによって求めた。酸素消費速度を、３０ｍｌの反応容積に、適量のラッカーゼ、２ｍＭのＡＢＴＳ、および様々な濃度の様々な阻害剤を含む溶液（２５ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）中）で測定した。
【０１１８】
表２．Ｔｈｉｅｌａｖｉａ野生型ラッカーゼ（ｗｔ  ＴａＬｃｃ１）の阻害
【表２】
2008512999.tif 000003
【０１１９】
Ｎ−末端および内部アミノ酸の配列決定
タンパク質のＮ−末端ならびに内部ペプチド配列を、エドマン分解法（Ｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｇｇ，１９６７）に従って、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて決定した。ペプチドの調製のために、凍結乾燥したタンパク質を、ジチオトレイトールにより還元し、ヨードアセトアミドによりカルボキシメチル化し、シークエンス・グレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、酵素／基質の質量比１：１００で、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム中、ｐＨ８．３、３７℃で１２時間切断した（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。生成したペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８カラム）により、アセトニトリルの直線勾配（０．１％トリフルオロ酢酸中、０〜６０％のアセトニトリル）で分離した。内部ペプチド配列を表３に示す。タンパク質のＮ−末端は、それが恐らくブロックされているために、得ることができなかった。
【０１２０】
表３．決定されたＴｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼ（ＡＬＫＯ４１９７）の内部ペプチド配列。ペプチドのＮ−末端は恐らくブロックされていた。
【表３】
2008512999.tif 000004
【実施例３】
【０１２１】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７のＴａＬｃｃ１をコードする遺伝子のクローニング
標準的な分子生物学の方法を、ＤＮＡ（プラスミド、ＤＮＡ断片）の分離および酵素処理、大腸菌の形質転換などにおいて用いた。用いられた基本的な方法は、標準的な分子生物学のハンドブック（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１））に記載されている。
【０１２２】
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７の遺伝子ライブラリーを、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ（商標）ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）に、製造元の指示に従って作製した。Ｒａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄａ（１９８５）の方法により分離した染色体ＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａにより部分的に消化した。消化されたＤＮＡをアガロースゲル内でサイズ分画し、その後、選んだサイズの断片（９〜２３ｋｂ）を分離し、脱リン酸化し、ＢａｍＨＩ消化したラムダベクターアームに連結した。連結混合物を、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて、製造元の指示に従ってパッケージングした。遺伝子ライブラリーの力価は、１．２×１０６ｐｆｕ／ｍｌであり、増幅ライブラリーの力価は、１．１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０１２３】
遺伝子バンクのスクリーニングに使用するプローブを、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ＡＬＫＯ４１９７ゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより増幅した。最初に、いくつかのプライマー（縮重オリゴ）を考案し（表４、配列番号４〜９）、ＰＣＲ反応で試験した。プライマーの配列は、精製ＴａＬｃｃ１から得られたペプチドのアミノ酸配列（図５）に基づいた。ＰＣＲ反応におけるプライマーの組合せを、公開されたラッカーゼ配列のペプチド相同部の位置に従って選択した。ＰＣＲ反応混合物は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％のＤＭＳＯ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、５μＭの各プライマーおよび２単位のＤｙｎａｚｙｍｅ  ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、フィンランド）および約５μｇのゲノムＤＮＡを含んでいた。ＰＣＲ反応の条件は次の通りであった：９５℃で５分間の初期変性、次いで、９５℃で１分間―５０℃で１分間のアニーリング―７２℃で２分間の伸長、を３０サイクル、そして最後に７２℃で１０分間の最終伸長、である。最も特異的な結果と予想したサイズ（公開された真菌ラッカーゼ配列から計算）を有するＤＮＡ生成物が、ＰＯＸ２７／ＰＯＸ３１およびＰＯＸ２８／ＰＯＸ３１のプライマーの組合せを用いて実施したＰＣＲ反応から得られた。これらの２つの反応物からＤＮＡ断片を分離し、これらをｐＣＲ（商標）Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングした。ＤＮＡ生成物を配列決定により、また、いくつかの制限酵素により消化されたＴｈｉｅｌａｖｉａゲノムＤＮＡにサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより特徴を明らかにした。２つの断片は、ストリンジェントな洗浄条件の下で得られたハイブリッド形成パターンが一致した。２つの断片から推定されるアミノ酸配列は、公開されたラッカーゼ配列のいくつかに相同性を有する配列を含んでいた（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴプログラム、ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０１２４】
プライマーＰＯＸ２７およびＰＯＸ３１を用いることによってＰＣＲ反応から得られた１ｋｂの断片を、遺伝子バンクのスクリーニングのためのプローブとして選択した。この断片の配列は、プライマーＰＯＸ２８およびＰＯＸ３１を用いることによって増幅された遺伝子領域を含んでいた。また、推定したアミノ酸配列は、ＴａＬｃｃ１内部ペプチド３（実施例２、図５）の配列を含んでいた。このＰＣＲ断片を含むｐＣＲ（商標）Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（商標）ベクターをｐＡＬＫ１５５０と名づけた。
【０１２５】
表４．遺伝子ライブラリーからＴａｌｃｃ１遺伝子をスクリーニングするためのプローブを増幅するためのＰＣＲプライマーとして合成したオリゴヌクレオチド（配列番号４〜９）。オリゴは、オリゴヌクレオチド；オリゴの箇所は、オリゴヌクレオチド配列の考案に用いたペプチドのアミノ酸の位置。
【表４】
2008512999.tif 000005
（ａ  縮重を減らすために、いくつかのコドンを真菌での優先度に従って選択した。
（ｂ  Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｘ＝Ｉ（イノシトール）またはＣ、Ｙ＝ＴまたはＣ；括弧内の「ｓ」＝センス鎖、括弧内の「ａｓ」＝アンチセンス鎖。
（ｃ  これらのペプチド配列は図５に含まれている。
（ｄ  Ｃ．サーモフィラムＡＬＫＯ４２６５（ＥＭＢＬ  ＡＪ５０８９３１−５０８９３３）から単離されたキシラナーゼ遺伝子であるｘｙｎ１１Ａ、ｘｙｎ１１Ｂおよびｘｙｎ１１Ｃにおける優先性に従って選んだコドンを使用した。
【０１２６】
プラスミドｐＡＬＫ１５５０からの挿入断片を、ジゴキシゲニンを用いて、製造元（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）の指示に従って標識した。増幅した遺伝子ライブラリーから約１．８×１０５のプラークをスクリーニングした。フィルターでのハイブリッド形成温度は６８℃であり、フィルターを、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて室温で２回、５分間ずつ洗浄し、その後、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で２回、１５分間ずつ洗浄した。いくつかの陽性プラークが得られ、あるものは強くハイブリッド形成していたが、ハイブリッド形成がそれほど強くないプラークもかなりあった。強くハイブリッド形成したプラークの５つを精製し（Ｆ１〜Ｆ５）、ファージＤＮＡを分離した。ファージＤＮＡのサザンブロット分析により、クローンＦ１、Ｆ２およびＦ３は全て、プローブとハイブリッド形成する約３ｋｂのＸｈｏＩ断片と約７ｋｂのＢａｍＨＩ断片を含んでいることが明らかになった。これらの断片と、さらに、６．１ｋｂのＳａｃＩＩ断片および３．８ｋｂのＳｐｅＩ断片をクローンＦ１から分離した。これらの断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクターまたはＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  米国）に連結し、得られたプラスミドをｐＡＬＫ１６０６（ＸｈｏＩ断片）、ｐＡＬＫ１６０７（ＢａｍＨＩ断片）、ｐＡＬＫ１３４１（ＳａｃＩＩ断片）およびｐＡＬＫ１３４２（ＳｐｅＩ断片）と名づけた。ＴａＬｃｃ１をコードする遺伝子の配列をこれらのクローン、およびｐＡＬＫ１６０７から分離されたより短いサブクローンから決定した。完全長Ｔａｌｃｃ１遺伝子は、プラスミドｐＡＬＫ１６０７、ｐＡＬＫ１３４１およびｐＡＬＫ１３４２に含まれていた。プラスミドｐＡＬＫ１３４２を含む大腸菌株ＲＦ５４７３をＤＳＭコレクションに寄託した（ＤＳＭ  １５４８４）。
【０１２７】
Ｔａｌｃｃ１配列（配列番号１１）および推定アミノ酸配列（配列番号１２）が図６に示されている。遺伝子の長さは２２７９ｂｐ（停止コドンを含めて）である。５１、６２，９１、８３、７９および５９ｂｐの長さを有する６つのイントロンが見出された。推定タンパク質配列は６１７個のアミノ酸からなり、２１アミノ酸からなる予想されたシグナル配列（ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ２．０；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、および、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｈ，１９９８）と、１３アミノ酸からなる「テイル」配列（配列ＤＳＧＬの後に始まる）を含んでいる。ｗｔ  ＴａＬｃｃ１から精製されたペプチドは全て、推定アミノ酸配列に見出され、クローンされた遺伝子がＡＬＫＯ４１９７から精製されたラッカーゼをコードしていることを示した。予想された分子量は成熟ペプチドで６４４５６Ｄａであり、予想されたｐＩは６．３１（アミノ酸２２〜６０４、シグナル配列およびＣ−末端テイルは除く）であった。これらの予想は、ＥｘＰＡＳｙサーバでＣｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツール（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を用いてなされた。推定アミノ酸配列は、９つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含んでいた。公開されているラッカーゼ配列に対する相同性を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）でＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．９）を用いて検索した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。最も高い相同性は、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（ＥＭＢＬアクセス番号ＣＡＥ００１８０．１、ＬＡＣ２＿ＰＯＤＡＮ、ＸＰ＿３２３８８１．１）からのラッカーゼに見出された。ＴａＬｃｃ１配列について、これらの３つのラッカーゼ配列、ＢＬＡＳＴ検索においてＴＡＬｃｃ１と５０％を超える同一性を有するＮＣＢＩデータベースからの他の配列、および、特許データベースから見出されたＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａおよびＳｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（それぞれ、ＥＰ０７６５３９４  Ｂ１／米国特許第５９８１２４３号および米国特許第５７５０３８８号）からのラッカーゼ配列とのアラインメントを行った。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのグローバル・アラインメント（ＥＭＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ・ペナルティ１０．０、伸長ペナルティ０．５；ＥＭＢＯＳＳプログラム・パッケージ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．９．０）を用いて得られた同一性の値が表５に示されている。
【０１２８】
表５．推定ラッカーゼアミノ酸配列のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル・アラインメントにより得られた同一性の値（％）。シグナル・ペプチドを含めて、全長アミノ酸配列のアラインメントを行った。マトリックス：ＥＭＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ・ペナルティ  １０・０、伸長ペナルティ  ０．５。ＭａｌはＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ（ＣＡＥ００１８１０）、ＭｔｈはＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａのラッカーゼ（ＥＰ  ０７６５３９４  Ｂ１から）、ＰａｎはＰｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ（ＬＡＣ２＿ＰＯＤＡＮ）、ＳｔｈはＳｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのラッカーゼ（米国特許第５７５０３８８号から）、Ｎｃｒ  ＬＡＣ１はＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（ＬＡＣ１＿ＮＥＵＣＲ）、Ｎｃｒ  ＸＰはＮ．ｃｒａｓｓａ（ＸＰ  ３２８８８１）、Ｎｃｒ  ＫＳＮＣＬＯはＮ．ｃｒａｓｓａ（ＫＳＮＣＬＯ）、Ｎｃｒ  ＬＡＣ２はＮ．ｃｒａｓｓａ（ＬＡＣ２＿ＮＥＵＣＲ）、ＣｐａはＣｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ（ＬＡＣ１＿ＣＲＹＰＡ）、ＧＰｒはＧａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ  ｔｒｉｔｉｃｉ（Ｌａｃ３  ＣＡＤ１００７４９）。
【表５】
2008512999.tif 000006
【実施例４】
【０１２９】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉでの組換えＴａＬｃｃ１の生産
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉでの組換えＴａＬｃｃ１の生産のために、発現プラスミドｐＡＬＫ１６６７を構築した。それ自身のシグナル配列を有するＴａｌｃｃ１遺伝子を、ＰＣＲにより、正確に、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  ｃｂｈ１（ｃｅｌ７Ａ）プロモーターに融合した。含まれるｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ１ターミネーター、ａｍｄＳマーカーおよびｃｂｈ１の３’フランキング領域は、Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）に記載されている通りであった。Ｔａｌｃｃ１遺伝子断片をその３’末端からＮｃｏＩにより切断した。この開裂により、ｃｂｈ１ターミネーターの前に、Ｔａｌｃｃ１ターミネーターの８０ｋｂが構築物に残された。ＥｃｏＲＩによる消化の後、１０．１ｋｂの線状発現カセット（図７）をベクター骨格から分離し、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  Ａ４７プロトプラストに形質転換を起こさせた。形質転換を、Ｋａｒｈｕｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）に記載されている修正をして、Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）の通りに実施した。形質転換体を選択プレートで、一代の分生子により、ＰＤ培地で分生子に胞子形成させる前に純化した。
【０１３０】
形質転換体のラッカーゼ産生を、振盪フラスコ培養（５０ｍｌ）の培養上澄み液により分析した。複合ラクトースベースセルロース誘導性培地（Ｊｏｕｔｓｊｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）（５％のＫＨ２ＰＯ４による緩衝、０．１ｍＭのＣｕＳＯ４添加、ＰＨ６．０）で、形質転換体を７日間生育させた。ラッカーゼ活性のアッセイを、実施例１に記載されているように、基質としてＡＢＴＳを用いて行った。ｃｂｈ１遺伝子座へ発現カセットが狙い通りに入った可能性は、ＣＢＨ１陰性表現型として、ドットブロットにより、またはウェスタンブロットによりスクリーニングした（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ−ＳＲＣ  ９６；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）。ＣＢＨ１タンパク質の検出を、モノクローナル抗体ＣＩ−２５８またはＣＩ−２６１（Ａｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）およびＰｒｏｔｏＢｌｏｔウェスタンブロットＡＰシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。選択された形質転換体の遺伝子型を、サザンブロット（いくつかの遺伝子消化産物が含まれ、それぞれの発現カセットをプローブとして用いた）を用いることによって確認した。
【０１３１】
選択されたＣＢＨ１陰性形質転換体ＲＦ５５９７およびＲＦ５５９８に発酵を行わせ、組換えＴａＬｃｃ１の精製（実施例５）および応用試験（実施例７〜１２）のための材料を得た。
【実施例５】
【０１３２】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉで発現したＴｈｉｅｌａｖｉａ（ＡＬＫＯ４１９７）ＴａＬｃｃ１の精製
ＴａＬｃｃ１は複数ｐＩのアイソフォーム・ラッカーゼである、すなわち、この酵素は、等電点電気泳動と、その後の活性染色で、５．５〜６．９のｐＨ範囲内に６〜７つの別個のバンドを示す。最初に、培養上澄み液の緩衝液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂により５ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に変えた。試料を、予め平衡化したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＦＦカラムに注入した。タンパク質を、Ｎａ２ＳＯ４塩の直線勾配（０〜３５０ｍＭ）により溶離させた。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅからのラッカーゼ陽性画分を集め、緩衝液を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＰＤ  １０カラムにより、５ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に変えた。試料を、予め平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムに注入した。タンパク質を、直線的に増加するＮａ２ＳＯ４（０〜２００ｍＭ）により溶離させた。ラッカーゼ陽性画分は５〜４０ｍＭのＮａ２ＳＯ４塩の濃度で溶出してきた。最終精製段階はゲル濾過により実施した。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑからのラッカーゼ陽性画分を集め、ＣｏｎｔｒａＳｅｐ（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）により濃縮した。試料を、予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ゲル濾過カラムに注入した。ゲル濾過において用いた緩衝液は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）であった。組換えＴａＬｃｃ１ラッカーゼの精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥが、図４に示されている。
【実施例６】
【０１３３】
組換えＴａＬｃｃ１ラッカーゼの特性評価
精製した組換えＴｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＴａＬｃｃ１を、実施例２に記載されているように、至適ＰＨ、熱安定性、およびｐＩに関して評価した。分子量を、すでに記載されているように（Ｐａｌｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ（商標）飛行時間装置（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ）で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により求めた。ＴａＬｃｃ１のレドックス電位もまた、Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）に従って、ｐＨ５．０で、複合Ｐｔ／ＡｇＣｌ／ＫＣｌ微小電極により求めた。
評価結果は表６にまとめてある。
【０１３４】
表６．組換えＴｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＴａＬｃｃ１（ｒＴａＬｃｃ１）および野生型ＴａＬｃｃ１（ｗｔ  ＴａＬｃｃ）ラッカーゼの特性の要約。ｎｄ＝求めていない。
【表６】
2008512999.tif 000007
【０１３５】
組換えＴａＬｃｃ１ラッカーゼの活性に対する様々な化合物の阻害作用を、実施例２に記載したようにして求めた。結果は表７に示されている。
【０１３６】
表７．組換えＴｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ（ｒＴａＬｃｃ１）活性の、様々な化合物による阻害。阻害は、基質としてＡＢＴＳを用いて標準的な条件における酸素消費測定によって試験した（実施例２）。比較として、野生型Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａラッカーゼ（ｗｔ  ＴａＬｃｃ）の阻害の結果もまた示されている。ｎｄ＝求めていない。
【表７】
2008512999.tif 000008
【０１３７】
精製したＴａＬｃｃ１の比活性を、実施例２に記載したように、ＡＢＴＳ、ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）、シリンガルダジン、およびグアイアコールに対して求めた。ＡＢＴＳでの活性測定を、２５℃で、２５ｍＭのコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）で、他での活性を、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で実施した。結果は表８に示されている。
【０１３８】
表８．組換えＴａＬｃｃ１（ｒＴａＬｃｃ１）の比活性と野生型酵素（ｗｔＴａＬｃｃ）の比活性の比較。
【表８】
2008512999.tif 000009
【０１３９】
本明細書に記載した生物化学的データは、組換えＴａＬｃｃ１が、培養上澄み液から精製した野生型Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼと同じタンパク質であることを明白に示している。
【０１４０】
ＴｈｉｅｌａｖｉａおよびＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓのラッカーゼの動力学的パラメータ
動力学的パラメータ、ミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ）、代謝回転数（ｔｕｒｎ−ｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒ、ｋｃａｔ）、特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を、ＡＢＴＳおよび２，６−ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）、およびシリンガルダジンで求めた。ＡＢＴＳについての測定は２５ｍＭのコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）中で行った。シリンガルダジンおよびＤＭＰでは、４０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）と２５ｍＭのコハク酸緩衝液で行った。全ての活性アッセイを２５℃で実施した。動力学的パラメータを非線形回帰カーブ・フィッティングにより概算した。結果は表９に示されている。値を、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ（Ｍａｌ）ラッカーゼのものと比較した。
【０１４１】
表９．ＡＢＴＳ、シリンガルダジン、およびＤＭＰについて求めた、組換えＴａＬｃｃ１の動力学的パラメータ。比較として、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ（ＭａＬ）のよく知られているラッカーゼの値もまた示されている。
【表９】
2008512999.tif 000010
【実施例７】
【０１４２】
様々なｐＨ値でのデニムの漂白におけるＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の性能
宿主としてＴｈｒｉｃｈｏｄｅｒｍａを用いて生産した組換えＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤を、実施例７〜１２における用途試験の全てにおいて用いた。ＴａＬｃｃ１製剤（菌株ＲＦ５５９８に由来）を、デニムを漂白する能力について試験し、市販のラッカーゼ製剤であるＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と比較した。
【０１４３】
Ｌｅｅ  Ｃｏｏｐｅｒ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、１１１−１０６０−５５５２２−６５、ＭＡＳＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｏｙ、フィンランド、前の名称はＭ．Ａ．Ｓ．Ｉ．ｊｅａｎｓ  Ｏｙ）のジーンズ（経糸がリング糸、緯糸がオープン−エンド糸からなり、前もって糊抜きされ中性ＥＣＯＳＴＯＮＥ（登録商標）セルラーゼにより処理されたもの）を試験試料として用いた。ラッカーゼ処理を、ＬＰ−２  Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｏｍｅｔｅｒ中で、次の様に実施した。約１０ｇのデニムの試験片（１５×１４ｃｍ）を、２００ｍｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５、６または７）が入った１．２リットルの容器に入れ、容器を静置した。酵素をメディエータ（シリンガ酸メチル、ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ａｓｓｉｓｔ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））と共に、またはそれなしに、加えた。酵素を２００ｎｋａｔ／（布地の重量１ｇ）、メディエータを１０ｍｇ／（布地の重量１ｇ）とした。実施例７〜１２の全てにおいて、酵素活性は、実施例１と同様に基質としてＡＢＴＳを用いて求めたが、クエン酸−リン酸緩衝液を用いた。Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｏｍｅｔｅｒを５０℃で３０分間運転し、その後、Ｌａｕｎｄｅｒの温度を１０分間８０℃に上げた。試験片を温水で注意深くすすぎ、タンブラーで半乾きに乾かし、その後、空気乾燥した。
【０１４４】
漂白効果を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊の色空間座標（光源Ｄ６５／２°）を用いてミノルタの分光光度計ＣＭ  １０００（ミノルタ）により反射値として色を測定することによって評価した。試験片の両側からの色を、ラッカーゼ処理の前後に測定した。各測定値は数回（少なくとも１０回）の測定値の平均である。
【０１４５】
表１０および図８は、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼがデニムのインジゴ染料の脱色において、市販のＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅに比べて、５から７の全てのｐＨ値（ｐＨ６が最適である）で優れていたことを明白に示している。ＴａＬｃｃ１製剤だけが、最高の明度値を有する強く漂白された外観を実現できた。デニムの裏側での明度の増加と青さの減少もまた、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤とメディエータで処理したデニムで最高であった。メディエータなしでは、ラッカーゼはデニムに注目すべき効果をもたなかった（表１１）。後から行ったＴａＬｃｃ１ラッカーゼによる漂白試験は、この酵素が広いｐＨ範囲（４〜８）でよく働くことを示した。
【０１４６】
表１０．ｐＨ５〜７、Ｌａｕｎｄｅｒ中で、ラッカーゼ製剤とメディエータにより処理したデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【表１０】
2008512999.tif 000011
【０１４７】
表１１．ｐＨ５〜７、Ｌａｕｎｄｅｒで、メディエータなしのラッカーゼ製剤、またはメディエータだけで処理したデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【表１１】
2008512999.tif 000012
【実施例８】
【０１４８】
様々な温度でのデニムの漂白におけるＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の性能
菌株ＲＦ５５９８に由来するＴａＬｃｃ１酵素製剤（実施例７）の、様々な温度でのデニム漂白能力を試験し、市販のラッカーゼ製剤であるＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と比較した。
【０１４９】
試験系およびデニムは実施例７の通りであったが、Ｌａｕｎｄｅｒでのラッカーゼおよびメディエータによる処理条件を、ｐＨ６で、３０分間、温度３０〜８０℃とした。また、酵素を、Ｌａｕｎｄｅｒで温度を上げる代わりに、アルカリ処理により次の様にして不活性化した。試験片を容器から取り出した後、試験片を、ＮａＯＨを含む温水（ｐＨ１１．５）に１０分間漬け、温水で注意深くリンスした。試験片をタンブラーで半乾きに乾かし、その後、空気乾燥した。漂白効果を、実施例７におけるように、反射値として色を測定することにより評価した。
【０１５０】
表１２および図９は、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼが、デニムの漂白において、４０〜８０℃で、ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅに比べて優れていた（明度がより増した）ことを示している。６０〜７０℃の温度がＴａＬｃｃ１にとって最適であり、デニム地の外観は強く色落ちした。ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅでは、インジゴは中程度にしか脱色されなかった。
【０１５１】
表１２．様々な温度で、Ｌａｕｎｄｅｒで、ラッカーゼおよびメディエータにより処理したデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【表１２】
2008512999.tif 000013
【実施例９】
【０１５２】
ラッカーゼ−メディエータ系によるデニムの漂白における酵素使用量の効果
予めＥＣＯＳＴＯＮＥ（商標）セルラーゼにより洗浄したＬｅｅ  Ｃｏｏｐｅｒのジーンズ（実施例７）を、ラッカーゼ使用量を変えながら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株ＲＦ５５９８によるＴａＬｃｃ１ラッカーゼ生成物およびＤｅｎｉＬｉｔｅ  Ｂａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）により処理した。ラッカーゼ処理を、各酵素にとって最適な条件下（表１３に示す）に、ＥｌｅｃｔｒｏｌｕｘのＷａｓｃａｔｏｒ  ＦＯＭ  ７１  ＣＬＳ洗濯脱水機を用いて実施した。シリンガ酸メチル（実施例７）をメディエータとして用いた。排水後、ＮａＯＨにより１１を超えるｐＨに上げ（１０分、６０℃）、３回リンスすることによって、ラッカーゼを不活性化した。布地をタンブラーで乾燥した。
【０１５３】
表１３．異なる使用量でのＴａＬｃｃ１およびＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅラッカーゼ製剤による漂白試験において用いたプロセス・パラメータ。
【表１３】
2008512999.tif 000014
【０１５４】
漂白効果を、ラッカーゼ処理後の色を反射値として測定することによって評価し（実施例７と同様）、それらの値を前もって測定した値（セルラーゼ処理後に）と比較した。表１４および図１０における結果は、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼの漂白性能が、使用量の増加により大幅に向上したことを示している。
【０１５５】
ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅでは、使用量の効果は少なかった。時間を３０分から６０分に増やすと、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼの性能はさらに向上した。ＤｅｎｉＬｉｔｅでは、３０分を超えて処理時間を延ばしても、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｉ（２０００）において検討されているように、漂白性能がそれ以上上がることはない。ＴａＬｃｃ１ラッカーゼでは、多量の次亜塩素酸ナトリウムの使用によってのみ通常得られる非常に強い漂白効果を実現することが可能であった。また、擦れた外観は保たれた。今日まで、ラッカーゼ−メディエータ系の使用により得られた、デニムの明度のこのように大きな増加は、報告されていない。
【０１５６】
表１４．Ｌａｕｎｄｅｒで、異なる使用量を用いてラッカーゼ製剤およびメディエータにより処理したデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【表１４】
2008512999.tif 000015
【実施例１０】
【０１５７】
次亜塩素酸ナトリウムによる漂白と比較した、ラッカーゼ−メディエータ系によるデニムの漂白
様々なタイプのデニムを、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株ＲＦ５５９７によるＴａＬｃｃ１ラッカーゼ生成物、およびＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）により処理し、得られた結果を次亜塩素酸による漂白と比較した。全て合わせて２７片の異なる種類のデニム（ジーンズ全体）（糊抜き後にセルラーゼにより様々な着古しレベルに前もって洗浄されていたか、あるいはＥＣＯＳＴＯＮＥ（商標）Ａ２００（６０℃、１０分）により糊抜きだけされていた）を試験のために集めた（表１５）。これらのジーンズはインジゴで染色されたデニムからなっていたが、例外としてＥｎｇｌｉｓｈジーンズは、硫化染料で下染めされ、インジゴで染色されたデニムを含んでいた。ジーンズを、同じ１着のジーンズからの片が全ての試験で使用できるような仕方で裁断した。
【０１５８】
ジーンズはインジゴ染色デニムからなっていたが（右綾デニム（ｒｉｇｈｔ  ｈａｎｄ  ｔｗｉｌｌ））、Ｅｎｇｌｉｓｈジーンズは、硫化染料で下染めされインジゴで染色されたデニムを含んでいた。元の（すなわち、糊抜きしていない）デニム地の重量は、典型的には、４７５ｇ／ｍ２（１４ｏｚ／ｙｄ２）より大きかった。１０ｃｍ×１０ｃｍの３つの片の重量を、室温で（約２２℃、相対湿度は約６４％）２４時間の定温放置の後に測定して求めた。
【０１５９】
表１５．漂白試験に用いたデニム試料
【表１５】
2008512999.tif 000016
【０１６０】
ラッカーゼ処理を、各酵素にとっての最適条件（表１６に記載されている）の下で、ＥｌｅｃｔｒｏｌｕｘのＷａｓｃａｔｏｒ  ＦＯＭ  ７１  ＣＬＳ洗濯脱水機により実施した。シリンガ酸メチル（実施例７）をメディエータとして用いた。排水後、ＮａＯＨによりｐＨを１１より高くしてラッカーゼを不活性化し（１０分、６０℃）てから、３回リンスした。布地をタンブラーで乾燥した。
【０１６１】
表１６．ＴａＬｃｃ１およびＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅラッカーゼ製剤による漂白試験において用いたプロセス・パラメータ。
【表１６】
2008512999.tif 000017
【０１６２】
次亜塩素酸ナトリウムによる漂白を、表１７に記載されている条件の下で、ラッカーゼ処理したのと同じジーンズから得たデニムを用いて、ＥｌｅｃｔｒｏｌｕｘのＷａｓｃａｔｏｒ  ＦＯＭ  ７１  ＣＬＳ洗濯脱水機により実施した。２５ｍｌ／ｌの次亜塩素酸ナトリウム溶液（１０％）を加える前に、水酸化ナトリウムを加えたがこれは処理の間、ｐＨを１０．５より大きく保つためである。漂白液を排水した後、１：２０の液比による２分間のリンスを1回おこなってから、チオ硫酸ナトリウムにより脱塩素した。脱塩素した後、デニム試料を、１：２０の液比で３回（各２分）リンスした。布地をタンブラーで乾燥した。
【０１６３】
表１７．次亜塩素酸ナトリウムによる漂白および脱塩素において用いたプロセス・パラメータ。
【表１７】
2008512999.tif 000018
【０１６４】
漂白効果を、実施例７におけるように、色を反射値として測定することによって評価した。得られた結果は表１８〜２０および図１１に示されている。セルラーゼ処理された各タイプの全てのデニム試料で、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼは、前記条件の下で、ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅラッカーゼ（約５５〜２００％良好）、および次亜塩素酸ナトリウム（実に６０〜１１５％良好）に比べて優れていた。糊抜きだけが行われていた布地では、ＴａＬｃｃ１製剤により得られた漂白効果（デニムの表側でのＬ＊の増加）は、次亜塩素酸ナトリウムによるものと同等またはより良好であり、ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅによるものより１００％を超えて良好であった。用いられたデニムおよびセルラーゼ処理のタイプに応じて、様々な外観が得られた。「硫化染料で下染め」したデニムは漂白が最も困難であった。
【０１６５】
表１８．ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤（ＲＦ５５９７）により処理されたデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【表１８】
2008512999.tif 000019
【０１６６】
表１９．ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅラッカーゼにより処理されたデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【表１９】
2008512999.tif 000020
【０１６７】
表２０．次亜塩素酸ナトリウムにより処理されたデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【表２０】
2008512999.tif 000021
表２０．次亜塩素酸ナトリウムにより処理されたデニムの表側の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向であり、＋ｂ＊は黄色方向である。
【実施例１１】
【０１６８】
ラッカーゼによるしみの除去
ＴａＬｃｃ１（ＲＦ５５９８）およびＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅ製剤の、しみを除去する能力について試験した。次のような人工汚染布を用いた：草によるしみ（Ａｒｔ．１６４、ＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｅｎ、ドイツ）、茶によるしみ（Ａｒｔ．１６７、ＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｅｎ、ドイツ）。布地は５．８ｃｍ×５．８ｃｍの試験片に裁断した。ラッカーゼ処理を、ＬＰ−２  Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｏｍｅｔｅｒ中で、次の通り実施した。
【０１６９】
約５ｇの汚れた布地を、１５０ｍｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）が入った１．２リットルの容器に入れ、容器を静置した。酵素を、メディエータ（シリンガ酸メチル、ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ａｓｓｉｓｔ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））と共に、あるいはそれなしで、ラッカーゼ活性単位で加えた（実施例７）。酵素の使用量は、２００ｎｋａｔ／（布地１ｇ）、メディエータ使用量は１０ｍｇ／（布地１ｇ）であったが、例外として４０℃では、２０ｎｋａｔ／ｇおよび２ｍｇ／ｇの使用量を用いた。Ｌａｕｎｄｅｒ  Ｏｍｅｔｅｒを、ｐＨ６で、６０分間、４０、５０または６０℃で運転した。その後、試験片を、水を流しながら、また温水を入れた振盪フラスコ内で注意深くリンスし、空気乾燥した。
【０１７０】
しみの除去効果を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間座標を用いて色を反射値として測定することによって評価した（実施例７）。試験片の色をラッカーゼ処理の前後で測定した。
【０１７１】
しみ除去試験の結果は表２１、表２２および図１２〜１５に示されている。メディエータを使用したＴａＬｃｃ１製剤は、６０℃で草によるしみを除去した場合、ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩより効果的（最大のａ＊値＝最少の緑色、最大の明度Ｌ＊）であった（図１２、表２１）。目視による評価でも最良の結果であった。４０℃でも、ＴａＬｃｃ１はＤｅｎｉＬｉｔｅより僅かに良好であった（図１４、表２３）。メディエータなしでは、草によるしみを除去する効果は低かった。
【０１７２】
メディエータを用いるＴａＬｃｃ１ラッカーゼはまた、茶のしみの除去においても、６０℃で、ＤｅｎｉＬｉｔｅより効果的であった。それは、図１３および表２１における最大の明度と最小の赤色値がそれを示す。目視評価でも同様であった。４０℃でも、ＴａＬｃｃ１は、特に使用量が多い場合、僅かに良好であった（図１５、表２２）。メディエータなしでは、ラッカーゼは、茶のしみに対し見るべき効果がなかった。４０℃では、草および茶によるしみの除去はより温度が高い場合と比べて困難であった。
【０１７３】
表２１．５０および６０℃でのラッカーゼによるしみの除去試験の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向、＋ｂ＊は黄色方向、＋ａ＊は赤色方法、−ａ＊は緑方向である。未処理の人工汚染布、メディエータ、および緩衝液のコントロールを比較として用いた。
【表２１】
2008512999.tif 000022
【０１７４】
表２１．４０℃でのラッカーゼによるしみの除去試験の色測定。Ｌ＊は明度を示し、−ｂ＊は青色方向、＋ｂ＊は黄色方向、＋ａ＊は赤色方法、−ａ＊は緑方向である。人工汚染布の未処理のもの、メディエータ、および緩衝液のコントロールを比較として用いた。
【表２２】
2008512999.tif 000023
【実施例１２】
【０１７５】
ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤を用いる、染料の脱色
菌株ＲＦ５５９７からの得たＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤を、メディエータであるシリンガ酸メチル（実施例７）の存在の下で、またはそれなしで、様々な染料を脱色する能力について試験した。実験を、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６）に溶かした１００ｍｌの染料が入った２５０ｍｌの振盪フラスコで実施した。１２ｍｇ／１００ｍｌの染料濃度を用いた。酵素を１００ｍｌ当たり２００ｎｋａｔ（または２０ｎｋａｔ）、メディエータを１００ｍｌ当たり１０（または１）ｍｇ使用した。振盪フラスコを５０℃で３０、９０および１５０分間、インキュベートした。目視評価のために、３．５ｍｌの試料を試験管に取った。
【０１７６】
表２３の結果は、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼが、メディエータの存在下に、インジゴカルミン、レマゾール・ブリリアント・ブルー（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  １９）およびシバクロン・ブリリアント・レッド３Ｂ−Ｐを大幅に、またＰｏｎｔａｍｉｎｅ  Ｂａｓｔ  Ｏｒａｎｇｅをある程度、脱色できることを示している。インジゴカルミンの脱色は非常に速く、青色は３０分以内に薄い黄色に変わる。インキュベーションを延長しても、試料の色はそれ以上変わらなかったので、全ての染料で反応は９０分以内に完了するようである。
【０１７７】
表２３．ＴａＬｃｃ１（ＲＦ５５９７）ラッカーゼ製剤による染料の脱色。処理時間は３０および６０分。−：目で見て分かる変化なし、＋：目で見て分かる脱色、＋＋：かなりの脱色、＋＋＋  完全／ほぼ完全な脱色
【表２３】
2008512999.tif 000024
【０１７８】
（参考文献）
2008512999.tif 000025
2008512999.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼ（ＴａＬｃｃ１）の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を示す図である。レーン１：ＭＷマーカー（１７５、８３、６２、４７、３２．５、２５、１６．５、および６．５ｋＤａ）、レーン２：培養上澄み液、レーン３：  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ後の画分、レーン４〜７：ゲル濾過後の画分。約３〜６μｇのタンパク質を各レーンに注入。タンパク質はクマシー・ブリリアント・ブルーで染色。
【図２】精製Ｔｈｅｌａｖｉａラッカーゼ（Ｐ  ＴＬ）および粗酵素（ＣＥ）の、グアイアコールで求めた至適ｐＨを示す図である。
【図３】野生型Ｔｈｉｅｌａｖｉａラッカーゼ（ＴａＬ）の５０および６０℃での熱安定性を示す図である。
【図４】組換えＴａＬｃｃ１の精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）。レーン１：  ＭＷマーカー（１７５、８３、６２、４７．５、３２．５、２５、１６．５ｋＤａ）、レーン２：培養上澄み液、レーン３：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ後の画分、レーン４：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ後の画分、レーン５〜９：ゲル濾過後の画分を示す図である。
【図５】精製したＴｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ｗｔ  ＴａＬｃｃ１から得られたトリプシンペプチド配列およびこの配列をコード可能なコドンを示す図である。
【図６Ａ】Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７  Ｔａｌｃｃ１遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列を示す図である。停止コドンは配列の下のアステリスクによって示されている。推定イントロンの位置およびイントロンのスプライシング・コンセンサス・シグナル（５’ＧＴＰｕＮＧＰｙ、３’ＰｙＡＧ、内部ＮＮＣＴＰｕＡＰｙ）はそれぞれ、小文字および太字で表わされている。推定シグナル・ペプチド（ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ２．０プログラムにより解析された）、および成熟Ｃ−末端アミノ酸配列（精製組換えＴａＬｃｃ１タンパク質から求められた）には下線が引かれている。精製ｗｔ  ＴａＬｃｃ１から得られたトリプシンペプチド配列の位置は配列の下の破線により表されている。銅結合に関与する保存残基は強調して示されている。推定Ｎ−グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）は太字で表されている。
【図６Ｂ】Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７  Ｔａｌｃｃ１遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列を示す図である。停止コドンは配列の下のアステリスクによって示されている。推定イントロンの位置およびイントロンのスプライシング・コンセンサス・シグナル（５’ＧＴＰｕＮＧＰｙ、３’ＰｙＡＧ、内部ＮＮＣＴＰｕＡＰｙ）はそれぞれ、小文字および太字で表わされている。推定シグナル・ペプチド（ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ２．０プログラムにより解析された）、および成熟Ｃ−末端アミノ酸配列（精製組換えＴａＬｃｃ１タンパク質から求められた）には下線が引かれている。精製ｗｔ  ＴａＬｃｃ１から得られたトリプシンペプチド配列の位置は配列の下の破線により表されている。銅結合に関与する保存残基は強調して示されている。推定Ｎ−グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）は太字で表されている。
【図７】組換えＴａＬｃｃ１を生産するために、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉプロトプラストの形質転換に用いられた発現カセットｐＡＬＫ１６６７を示す図である。ラッカーゼ遺伝子はｃｂｈ１（ｃｅｌ７Ａ）プロモーター（ｐ  ｃｂｈ１）の制御の下にあり、転写の終了はｃｂｈ１ターミネーター配列を用いて確実にした。ａｍｄＳ遺伝子は形質転換マーカーとして含まれ、ｃｂｈ１の３’−隣接領域はｃｂｈ１プロモーターとともに、ｃｈｂ１遺伝子座への発現カセットのターゲティングを相同的組換えによって可能にするために用いた。
【図８】ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の、様々なｐＨ値でのデニム漂白における性能を示す図である。酵素使用量は２００ｎｋａｔ／（布地１ｇ）、メディエータ使用量は１０ｍｇ／（布地１ｇ）であった。
【図９】ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の、様々な温度でのデニム漂白における性能を示す図である。酵素使用量は２００ｎｋａｔ／（布地１ｇ）、メディエータ使用量は１０ｍｇ／（布地１ｇ）であった。
【図１０】ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤を用いるデニムの漂白への酵素使用量の効果を示す図である。実施例９に記載されているように漂白を実施した。ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅを比較として用いた。
【図１１Ａ】次亜塩素酸またはＤｅｎｉｌｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼによるＡ．Ｔｉｎｃａｎジーンズのデニムの漂白結果を示す図である。実施例１０に記載されているように漂白を実施した。
【図１１Ｂ】次亜塩素酸またはＤｅｎｉｌｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼによるＬｅｅ  Ｃｏｏｐｅｒジーンズのデニムの漂白結果を示す図である。実施例１０に記載されているように漂白を実施した。
【図１１Ｃ】次亜塩素酸またはＤｅｎｉｌｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼによるＷａｒｒｉｃｋジーンズのデニムの漂白結果を示す図である。実施例１０に記載されているように漂白を実施した。
【図１１Ｄ】次亜塩素酸またはＤｅｎｉｌｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼによるＥｎｇｌｉｓｈジーンズのデニムの漂白結果を示す図である。実施例１０に記載されているように漂白を実施した。
【図１２Ａ】ＤｅｎＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の６０℃での草のしみへの効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。［明度の値］
【図１２Ｂ】ＤｅｎＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の６０℃での草のしみへの効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。［ａ＊値（−ａ＊は緑色の方向、＋ａ＊は赤色の方向）］
【図１３Ａ】ＤｅｎＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の６０℃での茶のしみへの効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。［明度の値］
【図１３Ｂ】ＤｅｎＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅと比較した、ＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の６０℃での茶のしみへの効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。［ａ＊値（−ａ＊は緑色の方向、＋ａ＊は赤色の方向）］
【図１４Ａ】４０℃で、使用量を変えた場合のＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の草によるしみに対する効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅおよびメディータ・コントロールを比較のために用いた。［明度の値］
【図１４Ｂ】４０℃で、使用量を変えた場合のＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の草によるしみに対する効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅおよびメディータ・コントロールを比較のために用いた。［ａ＊値（−ａ＊は緑色の方向、＋ａ＊は赤色の方向）］
【図１５Ａ】４０℃で、使用量を変えた場合のＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の茶によるしみに対する効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅおよびメディータ・コントロールを比較のために用いた。［明度の値］
【図１５Ｂ】４０℃で、使用量を変えた場合のＴａＬｃｃ１ラッカーゼ製剤の茶によるしみに対する効果を示す図である。処理はｐＨ６で６０分間実施した。ＤｅｎｉＬｉｔｅ  ＩＩ  Ｂａｓｅおよびメディータ・コントロールを比較のために用いた。［ａ＊値（−ａ＊は緑色の方向、＋ａ＊は赤色の方向）］
【配列表フリーテキスト】
【０１８０】
〔配列表〕
配列番号１  ペプチド１の配列、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７  ＴａＬｃｃ１タンパク質からのトリプシンペプチド。
配列番号２  ペプチド２の配列、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７  ＴａＬｃｃ１タンパク質からのトリプシンペプチド。
配列番号３  ペプチド３の配列、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７  ＴａＬｃｃ１タンパク質からのトリプシンペプチド。
配列番号４  オリゴヌクレオチドプライマーＰＯＸ２６の配列。
配列番号５  オリゴヌクレオチドプライマーＰＯＸ２７の配列。
配列番号６  オリゴヌクレオチドプライマーＰＯＸ２８の配列。
配列番号７  オリゴヌクレオチドプライマーＰＯＸ２９の配列。
配列番号８  オリゴヌクレオチドプライマーＰＯＸ３０の配列。
配列番号９  オリゴヌクレオチドプライマーＰＯＸ３１の配列。
配列番号１０  プライマーＰＯＸ２７およびプライマーＰＯＸ３１を用いて得られたＰＣＲ断片の配列。
配列番号１１  Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７  ラッカーゼ１遺伝子（Ｔａｌｃｃ１）の核酸配列。
配列番号１２  Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７  ラッカーゼ１（ＴａＬｃｃ１）の推定アミノ酸配列。
【０１８１】
〔寄託〕
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｒｅｎａｒｉａ  ＡＬＫＯ４１９７は、２００４年９月２日に、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｕｐｓａｌａｌａａｎ  ８、３５８４  ＣＴ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダ）に寄託され、アクセッション番号ＣＢＳ  １１６０７１を与えられた。
プラスミドｐＡＬＫ１３４２を含む大腸菌株ＲＦ５４７３が、２００３年３月７日に、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （ＤＳＭＺ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に寄託され、アクセッション番号ＤＳＭ  １５４８４を与えられた。
【図１】
2008512999.tif 000027
【図２】
2008512999.tif 000028
【図３】
2008512999.tif 000029
【図４】
2008512999.tif 000030
【図５】
2008512999.tif 000031
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2008512999.tif 000033
【図７】
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【図８】
2008512999.tif 000035
【図９】
2008512999.tif 000036
【図１０】
2008512999.tif 000037
【図１１Ａ】
2008512999.tif 000038
【図１１Ｂ】
2008512999.tif 000039
【図１１Ｃ】
2008512999.tif 000040
【図１１Ｄ】
2008512999.tif 000041
【図１２Ａ】
2008512999.tif 000042
【図１２Ｂ】
2008512999.tif 000043
【図１３Ａ】
2008512999.tif 000044
【図１３Ｂ】
2008512999.tif 000045
【図１４Ａ】
2008512999.tif 000046
【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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