(57)【要約】非変性ゲル用のマーカーセットが提供される。当該タンパク質分子量マーカーは液体状で提供され、４℃の液体状態で少なくとも２ヵ月間、−２０℃で少なくとも１年間安定である。また、前記マーカー及び液体状の安定な未変性タンパク質マーカーを含むキットを使用して、電気泳動によりタンパク質の分子量を測定する方法も提供される。更に、液体状分子量マーカーを販売することによって収入を得る方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる分子量を有し、ネイティブの立体構造を有する、少なくとも２つのタンパク質を含有する溶液を含み、
非変性ゲルにおけるマーカーセットのタンパク質の移動度がそれらの分子量の関数であり、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットのタンパク質が−２０℃で少なくとも１ヶ月間安定である、
ネイティブ電気泳動用の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが商品である、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項３】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットがレディー・トゥー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）型の市販調製物である、請求項２記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項４】
前記少なくとも２つのタンパク質が、溶液中で４℃で少なくとも１ヶ月間安定である、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項５】
前記少なくとも２つのタンパク質が、溶液中で−２０℃で少なくとも１年間安定である、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項６】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがプロテアーゼ阻害剤である、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項７】
前記プロテアーゼ阻害剤がトリプシン阻害剤である、請求項６記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項８】
前記プロテアーゼ阻害剤がダイズトリプシン阻害剤である、請求項７記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項９】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが少なくとも１つの発色団又は少なくとも１つのフルオロフォアを含む、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが１つの発色団を含む、請求項９記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのタンパク質がフィコシアニン、アロフィコシアニン又はフィコエリトリンである、請求項１０記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのタンパク質がＢ−フィコエリトリンである、請求項１１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１３】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが、７００ｋＤａ超の天然の分子量を有する、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１４】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがアポフェリチンである、請求項１３記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１５】
前記アポフェリチンがウマ由来のアポフェリチンである、請求項１４記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１６】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが、少なくとも１ＭＤａの分子量を有する、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１７】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがＩｇＭである、請求項１６記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１８】
ＩｇＭがウシ血清由来のＩｇＭである、請求項１７記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項１９】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２０】
乳酸デヒドロゲナーゼがブタ由来の乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項１９記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２１】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２２】
異なる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２３】
異なる分子量を有する少なくとも４つのタンパク質を含む、請求項２２記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２４】
異なる分子量を有する少なくとも５つのタンパク質を含む、請求項２３記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２５】
異なる分子量を有する少なくとも６つのタンパク質を含む、請求項２４記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２６】
ＩｇＭ、アポフェリチン、Ｂ−フィコエリトリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＢＳＡ及びダイズトリプシン阻害剤を含む、請求項２５記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２７】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが、４℃で少なくとも１ヶ月の貯蔵寿命を示す、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２８】
前記溶液が抗菌剤を含む、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項２９】
前記溶液が変性作用を有する界面活性剤以外の界面活性剤を含む、請求項１記載の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット。
【請求項３０】
異なる分子量を有し、ネイティブの立体構造を有する少なくとも２つのタンパク質を含有する溶液を含む液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを含む容器であって、非変性ゲルにおける前記少なくとも２つのタンパク質の移動度がそれらの分子量の関数であり、前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが４℃で少なくとも１ヶ月間安定である、容器、および、
液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット及び／又は少なくとも１つのネイティブゲル試薬を含む第二容器であって、前記少なくとも１つのネイティブゲル試薬が、クーマシーＧ−２５０色素、非変性サンプル緩衝液、変性作用を有さない界面活性剤、又は事前成型非変性ゲルである、第二容器
を含む、キット。
【請求項３１】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット中の前記少なくとも２つのタンパク質の各々が、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを含む少なくとも２つの容器を含む、請求項３０記載のキット。
【請求項３３】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが３つ以上の容器により提供される、請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
異なる容器により提供される２つ以上の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを含み、前記２つ以上の液体状のタンパク質分子量マーカーセットの各々が異なるタンパク質のセットを含む、請求項３３記載のキット。
【請求項３５】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを含む容器と事前成型非変性ゲルとを含む、請求項３０記載のキット。
【請求項３６】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがプロテアーゼ阻害剤である、請求項３０記載のキット。
【請求項３７】
前記プロテアーゼ阻害剤がトリプシン阻害剤である、請求項３６記載のキット。
【請求項３８】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが発色団を含む、請求項３０記載のキット。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのタンパク質がＢ−フィコエリトリンである、請求項３８記載のキット。
【請求項４０】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが少なくとも１ＭＤａの分子量を有する、請求項３０記載のキット。
【請求項４１】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがＩｇＭである、請求項４０記載のキット。
【請求項４２】
ネイティブ条件下で少なくとも１つのタンパク質の推定分子量若しくは相対分子量を測定する方法であって、
タンパク質を含むサンプルと、少なくとも２つのタンパク質の溶液を含有する液体状タンパク質分子量マーカーセットを含むサンプルとをネイティブゲルにアプライする段階（前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット中のタンパク質は４℃で少なくとも１ヶ月間安定である）と、
ネイティブゲルにおいて前記サンプル及び前記液体状タンパク質分子量マーカーを電気泳動させる段階と、
前記サンプル中の１つ以上のタンパク質の移動を、液体状タンパク質分子量マーカーセット中の１つ以上のタンパク質と比較し、それによりネイティブ条件下で少なくとも１つのタンパク質の推定分子量若しくは相対分子量を測定する段階と
を含む、方法。
【請求項４３】
前記サンプル中の１つ以上のタンパク質の移動距離を、液体状タンパク質分子量マーカーセット中の２つ以上のタンパク質のうちの少なくとも２つの移動距離と比較して、前記１つ以上のタンパク質の推定分子量若しくは相対分子量を測定する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルが、非変性ゲルにおける、液体状タンパク質分子量マーカーセットとは別のウェル又はローディングゾーンにロードされる、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
レディー・トゥー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）型の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを提供し、可溶化又は更なる希釈を行わずに前記ネイティブゲルに直接アプライする、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
前記アプライ段階の前に、顧客に前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーを凍結形態又は解凍された液状形態で出荷することを更に含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
前記アプライ段階の前に、４℃で１ヵ月間液体状未変性タンパク質分子量セットを保存することを更に含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
ネイティブゲルへのアプライが、ネイティブのトリスグリシンゲルへのアプライ、ネイティブのトリス酢酸ゲルへのアプライ、又はブルーネイティブゲルへのアプライである、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
ネイティブゲルに、タンパク質を含有するサンプル、及び、異なる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質の溶液を含む液体状タンパク質分子量マーカーセットを含有するサンプルをアプライすることを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
ネイティブゲルに、タンパク質を含有するサンプル、及び、異なる分子量を有する少なくとも４つのタンパク質の溶液を含む液体状タンパク質分子量マーカーセットを含有するサンプルをアプライすることを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５１】
ネイティブゲルに、タンパク質を含有するサンプル、及び、異なる分子量を有する少なくとも５つのタンパク質の溶液を含む液体状タンパク質分子量マーカーセットを含有するサンプルをアプライすることを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５２】
ネイティブゲルに、タンパク質を含有するサンプル、及び、異なる分子量を有する少なくとも６つのタンパク質の溶液を含む液体状タンパク質分子量マーカーセットを含有するサンプルをアプライすることを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがプロテアーゼ阻害剤である、請求項４２記載の方法。
【請求項５４】
前記プロテアーゼ阻害剤がトリプシン阻害剤である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが発色団を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも１つのタンパク質がＢ−フィコエリトリンである、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが、少なくとも１ＭＤａの分子量を有する、請求項４２記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがＩｇＭである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
未変性タンパク質分子量スタンダードを販売することによって収入を得る方法であって、
ａ）異なる分子量を有し、ネイティブの立体構造を有する少なくとも２つのタンパク質を含有する溶液を含む、ネイティブ電気泳動用の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを顧客に提供すること
を含む、方法。
【請求項６０】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが４℃で少なくとも１ヶ月間安定である、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
ｂ）前記顧客に、
前記液体状タンパク質分子量マーカーセット中の前記２つ以上のタンパク質の分子量、又は、
インターネットアクセスによって利用可能な、前記液体状タンパク質分子量マーカーセット中の前記２つ以上のタンパク質の分子量を提供するウェブサイトのワールドワイドウェブアドレス、
のうちの少なくとも１つが記載されている説明書を提供することと、
ｃ）液体状タンパク質分子量マーカーセットの提供と引きかえに顧客から収入を受けることと
を更に含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
前記顧客にウェブサイトを提供することを更に含み、前記顧客が前記ウェブサイトにアクセスすることにより前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを注文できる、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも２つのタンパク質を含有する溶液を含む液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入するための購入機能を顧客に提供することを含み、前記購入機能が液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入するために使用される、
収入を得る方法。
【請求項６４】
液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入することを更に含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記提供が、購入機能及び液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットのいずれか又はその両方の供給業者により実施される、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
前記顧客が、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入するために購入機能を使用する、請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
前記購入機能が、電話システム及び／又はコンピュータに基づくシステムにより提供される、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記購入機能がインターネットに基づくシステムにより提供される、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
前記購入機能が非変性ゲルを購入するために更に使用される、請求項６３記載の方法。
【請求項７０】
前記購入機能がクーマシーブルー染色液を購入するために更に使用される、請求項６３記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも２つのタンパク質を含有する溶液を含む液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを販売することを含む、収入を得る方法。
【請求項７２】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが、４℃で少なくとも１ヶ月の貯蔵寿命を示す、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
対価を得るために顧客に、少なくとも２つのタンパク質を含有する溶液を含む液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを販売することを含む、収入を得る方法。
【請求項７４】
前記対価が金銭である、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記液体状タンパク質分子量マーカーセットが異なる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含有する溶液を含む、請求項５９、６３、７１又は７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７６】
前記液体状タンパク質分子量マーカーセットが異なる分子量を有する少なくとも４つのタンパク質を含有する溶液を含む、請求項５９、６３、７１又は７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７７】
前記液体状タンパク質分子量マーカーセットが異なる分子量を有する少なくとも５つのタンパク質を含有する溶液を含む、請求項５９、６３、７１又は７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７８】
前記液体状タンパク質分子量マーカーセットが異なる分子量を有する少なくとも６つのタンパク質を含有する溶液を含む、請求項５９、６３、７１又は７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７９】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがプロテアーゼ阻害剤である、請求項５９、６３、７１又は７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８０】
前記プロテアーゼ阻害剤がトリプシン阻害剤である、請求項８０記載の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが発色団を含む、請求項５９、６３、７１又は７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８２】
前記少なくとも１つのタンパク質がＢ−フィコエリトリンである、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つが、少なくとも１ＭＤａの分子量を有する、請求項５９、６３、７１又は７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも２つのタンパク質の少なくとも１つがＩｇＭである、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
２つ以上のタンパク質を含有する溶液、及び、商品が液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットであることを示すラベルを含む、商品。
【請求項８６】
顧客に配送される、請求項８５記載の商品。
【請求項８７】
４℃で少なくとも１ヶ月の貯蔵寿命を示す、請求項８５記載の商品。
【請求項８８】
４℃で少なくとも１ヶ月の貯蔵寿命を示す、請求項８５記載の商品。
【請求項８９】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが、−２０℃で少なくとも１年間安定である、請求項８５記載の商品。
【請求項９０】
前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットがレディー・トゥー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）型の調製物である、請求項８５記載の商品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
２００５年１０月７日に出願された本特許出願は、米国特許法§１１９（ｅ）に従い、米国特許仮出願第６０／６９４８１６号（２００５年６月２７日出願）及び第６０１７２４６６８号の優先権を主張し、それらの全開示内容が本発明に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は広義には生体分子の分離に関し、具体的には生体分子の電気泳動分離用のスタンダードに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
最近のプロテオミクスに関する研究の急増により、新しく同定されたタンパク質の特性を解析し、タンパク質−タンパク質相互作用を研究するプロテオミクス研究領域の早期の発展に寄与するための、より多くのツールに対するニーズを生み出した。ネイティブ電気泳動は、この研究領域の研究者を支援するツールの１つである。他に類のない解像度電気泳動能力と組み合わせた、未変性タンパク質の形態及びタンパク質の複雑な四次構造を維持する能力により、この技術はタンパク質−タンパク質相互作用の分析のための強力なツールである。従来のネイティブ電気泳動は、トリス−グリシンシステムを使用した高いｐＨ条件であるため、高ｐＨ条件感受性のタンパク質に悪影響を与えるおそれがあり、ゆえに未変性タンパク質分析でもごく限られた範囲でのみ適用されていた。より広い適用性を有し、中性付近での操作ｐＨを特徴とする技術はＳｃｈａｅｇｇｅｒ及びｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ（１９９１）により開発され、ブルーネイティブ  ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＢＮ  ＰＡＧＥ）と名づけられた。
【０００４】
天然のゲル電気泳動を使用してタンパク質−タンパク質間相互作用及び高次構造を評価するためには、信頼性が高く精密な分子量マーカーが必要となる。しかしながら、当該マーカーは変性剤の非存在下で一定の移動プロフィールを保持しなければならないにもかかわらず、液状のそれらの時間経過における安定性は予測可能でないため、それらは信頼性に欠けるか、あるいは使用において不都合が存在していた。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ネイティブ電気泳動のタンパク質分子量マーカーセットであって、当該分子量マーカーのセットが、異なる分子量を有する２つ以上のタンパク質の液状混合物である、上記セットの提供に関する。好ましい実施態様では、本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、２２℃の条件で、液状で少なくとも２ヵ月間安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、４℃の条件で、液状で少なくとも３ヵ月間安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、−２０℃で凍結させた液体の状態で少なくとも１年安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、−２０℃で凍結させた液体の状態で少なくとも３年間安定である。
【０００６】
若干の好ましい実施態様では、当該マーカーは視覚的に検出可能なタンパク質マーカーを含有する。
【０００７】
若干の好ましい実施態様では、当該マーカーはプロテアーゼ阻害剤であるタンパク質を含有する。
【０００８】
若干の好ましい実施態様では、当該マーカーは７００ｋＤａを超える分子量で移動するタンパク質を含有する。若干の好ましい実施態様では、当該マーカーは１ＭＤａを超える分子量で移動するタンパク質を含有する。若干の好ましい実施態様では、当該マーカーは少なくとも１．２ＭＤａの分子量で移動するタンパク質を含有する。
【０００９】
若干の好ましい実施態様では、本発明はネイティブ電気泳動用のタンパク質分子量マーカーセットであって、当該分子量マーカーセットが３以上、４以上、５以上又は６つ以上の異なる分子量の液体状のタンパク質の混合物である上記セットの提供に関する。本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、−２０℃で凍結させた液体の状態で少なくとも１年間安定である。
【００１０】
別の態様では、本発明はネイティブ電気泳動用のタンパク質分子量マーカーセットを含むキットであって、当該分子量マーカーのセットが２以上、３以上、４以上、５以上又は６つ以上の異なる分子量の液体状のタンパク質の混合物である上記キットの提供に関する。本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、−２０℃で凍結させた液体の状態で少なくとも１年間安定である。当該キットは更に、電気泳動のための試薬（１つ以上の色素、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の電気泳動用緩衝液又は１つ以上の電気泳動ゲルなど）を含む。当該キットは更に使用説明書を含んでもよい。
【００１１】
別の態様では、本発明は、電気泳動を用いてタンパク質又はタンパク質複合体のネイティブにおける分子量を決定する方法であって、タンパク質若しくはタンパク質複合体の移動距離を、本発明に記載の分子量マーカー中の２つ以上のタンパク質の移動距離と比較する方法の提供に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は収入を得る方法であって、液体状の分子量スタンダードのセットを顧客に提供して、その対価（例えば金銭）を得る方法の提供に関する。
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明では、組み換えＤＮＡ技術及びタンパク質化学の分野において使用する多くの用語が広範囲に使用される。かかる用語の範囲を含めた、本明細書及び特許請求の範囲を明確にかつ一貫して理解するために、以下の通り定義する。
【００１４】
本発明では、「１つの（“ａ”、“ａｎ”、および“ｏｎｅ”）」の用語は、対象となる事項が「少なくとも１つ」又は「１つ以上」であることを意味する。但し、それらが記載されている文脈において特定又は釈明される場合を除く。
【００１５】
本発明では、「約」又は「凡そ」の用語は、いかなる数値の場合も、その特定の値の±１０％の値を意味する。例えば「約５０℃」（又は「凡そ５０℃」）とは、４５℃から５５℃までの温度範囲（境界を含む）のことを指す。同様に、「約１００ｍＭ」（又は「及び１００ｍＭ」）とは、９０ｍＭから１１０ｍＭまで濃度範囲（境界を含む）のことを指す。
【００１６】
本発明における「ネイティブ」という用語は、変性していない又は非変性であるという意味であり、特に１）ペプチド又はタンパク質間の分子間相互作用を崩壊させない条件であって、それらの三次元構造（天然状態のタンパク質、又は無細胞インビトロ翻訳システムにおいて合成されたタンパク質の三次元構造のいずれか）を維持する条件か、又は２）天然状態のタンパク質、又は無細胞インビトロ翻訳システムにおいて合成されたタンパク質の三次元構造と同じ又は実質的に同じ三次元構造を有するタンパク質のことを指す。三次元構造は、タンパク質の二次構造、三次構造又は四次構造であってもよい。
【００１７】
「ネイティブゲル」又は「非変性ゲル」は、変性物質（例えばタンパク質構造を崩壊させる変性作用を有する界面活性剤であって、例えば陰イオン系界面活性剤（例えばＳＤＳ又はＬＤＳ）又はカオトロピック剤（尿素、ホルムアミド、グアニジン、ヨウ化カリウムなど））を含まないゲルのことを指す。
【００１８】
本発明では、「未変性分子量マーカー」、「ネイティブマーカー」及び「未変性タンパク質スタンダード」は、非変性状態の２つ以上のタンパク質であって、２つ以上のタンパク質が異なる分子量を有し、少なくとも１つのタンパク質分離操作（例えばネイティブゲル電気泳動）により分離できるものを指す。
【００１９】
本明細書で使用される「ラベル」という用語は、標的又は化合物に結合させた本発明の方法に使用する際に、直接又は間接的に（例えばそのスペクトル特性、形態又は活性に関して）検出可能である化学基又はタンパク質を意味する。ラベルは直接検出可能（フルオロフォア、発色団）であってもよく、間接的に検出可能（ハプテン又は酵素）であってもよい。かかるラベルとしては、限定はされないが、放射線計数装置で測定できる放射性同位元素、分光光度計で視覚的に観察若しくは測定できる色素、染色物質又は他の発色団、スピンラベルアナライザで測定できるスピンラベル、及び蛍光ラベル（フルオロフォア）（出力シグナルは、適切な分子アダクトの励起によって発生し、染色物質に吸収される光による励起によって視覚化できるか、又は、例えば標準的な蛍光測定器又は画像処理システムで正確に測定できる）が挙げられる。化学発光物質をラベルとし、シグナル化合物若しくは金属含有物質の化学的修飾によって出力シグナルを発生させてもよく、又は酵素をラベルとし、酵素に依存する第２のシグナル（例えば無色の基質からの着色生成物の形成）を発生させてもよい。ラベルという用語は、基質に続いて添加することにより検出可能なシグナルを生成する共役分子に選択的に結合できる「タグ」又はハプテンのことを指してもよい。例えば、タグとしてビオチンを使用し、更にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とアビジン又はストレプトアビジンとのコンジュゲートを使用してタグと結合させ、更に比色基質（例えばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、又は蛍光基質（例えばＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製））を使用してＨＲＰの存在を検出することができる。多くのラベルが当業者に公知であり、ＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ  （９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＤ−ＲＯＭ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００２），上記．に記載されている粒子、染色物質、フルオロフォア、ハプテン、酵素及びそれらの比色基質、蛍光及び化学発光基質及びその他のラベルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
本明細書で用いられる「直接検出可能な」という用語は、材料の存在又は材料から発生するシグナルが、化学的処理又は物質の添加を必要とせずに観察、計測又はフィルムによって直接検出可能である態様のことを指す。
【００２１】
「染色物質」とは視覚的に検出可能なラベルである。染色物質は例えば発色団又はフルオロフォアであってもよい。フルオロフォアは可視光又は非可視光（例えば紫外線）によって励起状態となることができる。
【００２２】
「アミノ酸」とは、２０種の天然のアミノ酸であってもよく、又は天然において産生されるか、あるいは化学的若しくは酵素的誘導体化、又は合成によって生物体の外側に産生されるアミノ酸の誘導体（例えばヒドロキシプロリン、セレノメチオニン、アジドアミノ酸など）であってもよい。
【００２３】
「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有する残基に見られる互換性のことを指す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸として、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられ、脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸の群として、セリン及びトレオニンが挙げられ、酸性側鎖を有する一群のアミノ酸として、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、アミノ基含有側鎖を有する一群のアミノ酸として、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸として、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられ、塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸として、リジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられ、硫黄含有側鎖を有する一群のアミノ酸として、システイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保守的アミノ酸置換の群としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００２４】
本発明では、「タンパク質」とはポリペプチド又は一連の２つ以上のアミノ酸を意味し、それらは天然物あるいは合成物（修飾アミノ酸又は天然において公知でないアミノ酸）であってもよく、ペプチド結合により結合している。具体的には、「ペプチド」とは１０ｋＤａ未満のポリペプチドを指す。本発明では、「タンパク質」の用語にはペプチドが包含される。本発明の文脈において、「タンパク質」の用語は、マルチサブユニット構造のタンパク質複合体のことを指す場合もある。
【００２５】
「天然に存在する」という用語は、同じ組成を有する物質が天然において存在するという事実のことを指す。例えば、ウイルスなどの生物体に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、天然の供給源から単離されるポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、並びに実験室において故意に修飾しなかったポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は「天然に存在する」。
【００２６】
他の核酸（又はヌクレオチド）又はタンパク質（又はアミノ酸）配列に「由来」する核酸（又はヌクレオチド）又はタンパク質（又はアミノ酸）配列とは、それが由来する少なくとも一部の配列と同じであるか、又はそれが由来する少なくとも一部の配列と高い相同性を有する配列にいずれかを指す。天然のタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列を、「天然のタンパク質から派生したアミノ酸配列」と称してもよい。天然の核酸配列に由来する核酸配列を、「天然の核酸から派生した核酸配列」と称してもよい。「相同性が高い」とは、アミノ酸レベルで配列が少なくとも８０％同一である、アミノ酸レベルで好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくはアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一であることを意味する。本発明のタンパク質スタンダードでは、２つの核酸配列は、それらが少なくとも６５％同一、好ましくは少なくとも７０％同一であるとき「相同性を有する」といい、それらが少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一であるとき「高い相同性を有する」という。
【００２７】
「組換え技術」には、組換え型核酸の製造又は使用法が包含され、（組換えを行い、天然の類似した核酸分子と構造的に異なる核酸分子とした核酸）。当該組換え技術では、例えば制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、組換え酵素、メチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼなどを使用して、キメラ核酸分子を作製し、ヌクレオチド配列を変化させ、あるいは核酸配列中への核酸の添加又は削除を行うことができる。当該組換え技術には、生物体から直接又は間接的に単離した核酸分子を、他の供給源由来の１つ以上の核酸配列と連結させる方法が含まれる。例えば、他の供給源からの配列はいかなる核酸配列でもあってもよく、例えば遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター配列、転写エンハンサー配列、転写におけるインデューサー又はプロモーターと結合する配列、転写終結配列、翻訳制御配列、ＩＲＥＳ、スプライス部位、ポリＡ付加配列、ポリＡ配列など）ベクター、タンパク質コード配列などが挙げられる。ある核酸分子の供給源とは異なる供給源からの核酸配列は、生物体から単離されて直接又は間接的に異なる生物体のゲノムに由来する又はゲノム中の核酸配列であってもよい。ゲノム中の核酸配列は、染色体の配列であってもよく、また染色体外の配列（例えばエピソームの核酸配列又は細胞オルガネラのゲノムの核酸配列であってもよい）。組換え技術にはまた、核酸を細胞に導入する方法が包含され、例えば形質転換、ウイルスによるトランスフェクションなどにより細胞内に組換え核酸分子を形成させる方法が挙げられる。「組換え技術」にはまた、核酸コンストラクト（例えば組換えＲＮＡ分子）による生成物及び組換えタンパク質の合成及び単離が包含される。「組換え技術」の用語は、「遺伝子工学」及び「組換え［ＤＮＡ］技術」と相互に交換可能に使用される。
【００２８】
「組換えタンパク質」とは、組換え核酸分子又はコンストラクトから産生されるタンパク質である。組換えタンパク質は、組換え核酸コンストラクトを有する細胞（生物体の細胞又は培養された原核若しくは真核生物の細胞）内で産生させることもでき、あるいは例えばインビトロ転写及び／又は翻訳システムを使用してインビトロで産生させることもできる。
【００２９】
「実質的に異ならない」又は「実質的に同じ」とは、比較対象となる組成物又は成分が、比較される値の大きい方に対して１０％未満しか異ならないことを意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる「精製された」という用語は、タンパク質の調製物であって、例えば、細胞混合物中、又は内因的に存在するタンパク質若しくは複合体（血清タンパク質若しくは細胞溶解物など）が存在する環境中に、当該タンパク質に関連して通常存在するタンパク質の混入が実質的にないものを指す。
【００３１】
「実質的に精製された」という用語は、ある種又は活性の状態が支配的な種又は活性として存在すること（例えば、モルベースで組成物中の他のいかなる個々の種又は活性よりも多いこと）を指し、好ましくは、実質的に精製されたフラクションとは、対象となる種又は活性が、存在する全ての高分子又は活性が少なくとも約５０％（モル濃度、重量又は活性ベース）含まれる組成物を指す。通常、実質的に純粋な組成物とは、組成物に存在するすべての高分子種又は活性に対してそれが約８０％以上、好ましくは約８５％、９０％又は９５％以上含まれる組成物を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、検出又は定量化のための生体分子又は分析物を含有するあらゆる材料を意味する。
【００３３】
「抗菌剤」とは、１つ以上の微生物を破壊するか又は成長を阻害する化合物であり、当該微生物は原核生物（例えばバクテリア）又は真核生物（例えば菌類）であってもよい。抗菌剤は、塩又は金属（例えば銀又は水銀）、アジ化化合物（例えばアジ化ナトリウム）又は天然もしくは合成化合物（有機抗生物質）などであってもよい。
【００３４】
「顧客」とは、ゲノム及びプロテオミックな製品及びサービスの供給を受けようとする、政府又は組織などの、あらゆる個人、研究所又は事業体（例えば会社、大学又は組織）のことを指す。顧客は通常、供給業者に対価（通常金銭）を支払うことによって製品又はサービスの供給を受ける。
【００３５】
「供給業者」とは、ゲノム及びプロテオミックな製品及びサービスを供給しようとする、あらゆる個人、研究所又は事業体（例えば会社、大学又は組織）のことを指す。供給業者は通常、顧客から対価（通常金銭）を受け取ることによって製品又はサービスを供給する。供給業者は通常、商品又はサービスを商業的に供給し、また商品に関しては、顧客に対して直接又は間接的に配送する。
【００３６】
「商品」とは、商品流通の過程で販売及び／又は配送される生産物を指す。例えば、商品は通常は販売され、更に出荷の際、供給業者から顧客に対して、直接配送される場合も、又は間接的に第三者経由で配送される場合もある。
【００３７】
液体状未変性タンパク質マーカーセット
本発明は、ネイティブゲル電気泳動用のタンパク質分子量マーカーセットであって、未変性タンパク質分子量マーカーセットが、異なる分子量を有する２つ以上の液状のタンパク質の混合物である当該セットの提供に関する。「液体状」という用語は、タンパク質のセットが溶液状態であることを意味するが、タンパク質分子量マーカーセットは凍結溶液として提供してもよい。異なる分子量を有する２つ以上のタンパク質の混合物は、非変性（ネイティブ）ゲルにおけるそれらの移動度が、それらの分子量と相関する態様で選択される。すなわち、ネイティブ分子量マーカーの全てのタンパク質セットでは、当該タンパク質セットはそれらの分子量の逆の順序の移動度を示し、すなわち、タンパク質セット中のより小さい分子量のタンパク質の移動度は、より大きな分子量のタンパク質よりも単位時間あたりで大きな移動距離を示す。好ましくは、非変性ゲル上の液状の未変性タンパク質マーカー中に含まれる少なくとも２つのタンパク質の移動度はそれらの分子量の関数であり、すなわち、ネイティブゲル電気泳動における液状の未変性タンパク質マーカーのセット中に含まれるタンパク質の移動度は分子量に対して（又は分子量の関数（例えば分子量の対数）として）プロットすることができ、また移動度対分子量の曲線及びその曲線を表す式は、０．９超好ましくは０．９５超、より好ましくは０．９７、０．９８又は０．９９超のＲ２値を有する態様で作成することができる。
【００３８】
好ましくは液体状未変性タンパク質マーカーセットには、異なる分子量を有する少なくとも２つのタンパク質（好ましくは少なくとも３つのタンパク質）であって、それらの移動度が分子量の関数であるタンパク質が含まれる。上記タンパク質の１つ以上はマルチサブユニットタンパク質であってもよい。マルチサブユニットタンパク質は複数の形態で液体状未変性タンパク質マーカーセット中に存在してもよく、ここで「複数の形態」とは、異なるサブユニット組成であることを指す。上記タンパク質の１つ以上は、複数の形態で存在するマルチサブユニットタンパク質であってもよく、異なる形態を有するマルチサブユニットタンパク質は異なる分子量を有し、異なる形態を有するマルチサブユニットタンパク質の移動度はそれらの分子量の関数である。液体状未変性タンパク質マーカーは、異なる分子量を有する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２０以上のタンパク質を含んでもよく、それら移動度がそれらの分子量の関数であり、それらの１つ以上がマルチサブユニットタンパク質であってもよい。マルチサブユニットタンパク質は、複数の形態で液体状未変性タンパク質マーカーセットに存在してもよい。異なる形態のマルチサブユニット液体状未変性タンパク質マーカーセットは異なる分子量を有してもよく、各形態のマルチサブユニットタンパク質の移動度が、それらの分子量の関数である。
【００３９】
幾つかの実施形態では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、５キロダルトン（ｋＤａ）〜２０００ｋＤａ、又は８ｋＤａ〜１５００ｋＤａの分子量を有する２つ以上のタンパク質を含む。タンパク質の各々は通常、ネイティブのポリアクリルアミドゲルで分離できる異なる分子量を有する。
【００４０】
若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、５０ｋＤａ以下〜２５０ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも２つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、５０ｋＤａ以下〜２５０ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、５０ｋＤａ以下〜５００ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、２０ｋＤａ以下〜２５０ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、２０ｋＤａ以下〜５００ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、２０ｋＤａ以下〜７００ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、５０ｋＤａ以下〜７００ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、２０ｋＤａ以下〜１，０００ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、５０ｋＤａ以下〜７００ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含む。
【００４１】
例えばマーカーセットは、２〜１５のタンパク質、また特定の例としては６〜１０のタンパク質を、５ｋＤａ〜２０００ｋＤａ、又は８〜１５００ｋＤａ、又は２０ｋＤａ〜１５００ｋＤａの範囲で含む。当該タンパク質の各々は通常異なる分子量を有し、ネイティブのポリアクリルアミドゲルで分離できる。
【００４２】
若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、２０ｋＤａ以下〜２５０ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも３つのタンパク質を含み、ネイティブゲル電気泳動における液体状未変性タンパク質マーカーセットのタンパク質の移動度が、分子量に対して（又は分子量の関数（例えば分子量の対数）として）プロットでき、移動度／分子量の曲線は、０．９超、好ましくは０．９５超、より好ましくは０．９７、０．９８又は０．９９超のＲ２値を有する態様で作成することができる。マーカーセットは、例えば２〜１５のタンパク質を含んでもよく、特定の例としては、６〜１０のタンパク質を、２０ｋＤａ以下〜５００ｋＤａ以上の分子量の範囲で含み、ネイティブゲル電気泳動における液体状未変性タンパク質マーカーセットのタンパク質の移動度が、分子量に対してプロットでき、移動度／分子量の曲線は、０．９超、好ましくは０．９５超、より好ましくは０．９７、０．９８又は０．９９超のＲ２値を有する態様で作成することができる。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは２０ｋＤａ以下〜７５０ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも６つのタンパク質を含み、ネイティブゲル電気泳動における液体状未変性タンパク質マーカーセットのタンパク質の移動度が、分子量に対してプロットでき、移動度／分子量の曲線は、０．９超、好ましくは０．９５超、より好ましくは０．９７、０．９８又は０．９９超のＲ２値を有する態様で作成することができる。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、２０ｋＤａ以下〜１，２００ｋＤａ以上にわたる分子量を有する少なくとも６つのタンパク質を含み、ネイティブゲル電気泳動における液体状未変性タンパク質マーカーセットのタンパク質の移動度が、分子量に対してプロットでき、移動度／分子量の曲線は、０．９超、好ましくは０．９５超、より好ましくは０．９７、０．９８又は０．９９超のＲ２値を有する態様で作成することができる。
【００４３】
本発明における「タンパク質」は、タンパク質又はペプチドであってもよく、互いに共有結合又は非共有結合的により結合する多サブユニットを有してもよい。本発明の用語「タンパク質」にはまた、タンパク質複合体が包含される。マルチサブユニットタンパク質又はタンパク質複合体のサブユニットは好ましくは、非変性条件の下で結合している状態が維持される。ネイティブにおけるタンパク質又はタンパク質複合体の分子量とは、サブユニット又は構成タンパク質が分離していないときのタンパク質又はタンパク質複合体の分子量である。更に、例えば異なるサブユニット組成及び異なる分子量によって特徴づけられる２つ以上の形態を有する複数の形態のタンパク質を有する態様も本発明の範囲内である。例えば、当該タンパク質は、二量体及び四量体、又は五量体及び六量体などとしてマーカーセットに存在してもよい。
【００４４】
本発明の液体状未変性タンパク質マーカーセットに含まれるタンパク質は、原核若しくは真核生物起源の天然のタンパク質であってもよく、それは、天然の供給源（例えば生物体、組織（血液、血漿又は血清を含む）、培養細胞又は細胞培養の培地）から単離することができる。本発明の液体状未変性タンパク質マーカーセットに含まれるタンパク質は、培養細胞（原核若しくは真核生物の細胞であってもよい）において合成される組換えタンパク質であってもよく、そのタンパク質が通常発現される細胞と同じでも異なってもよく、又はインビトロ翻訳システムにおいて合成されてもよい。液体状未変性タンパク質マーカーセットに含まれるタンパク質は、天然のタンパク質の変異体であってもよく、例えば、アミノ酸レベルで、天然のタンパク質と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。液体状未変性タンパク質マーカーセットに含まれるタンパク質は、人工タンパク質であってもよく、１つ以上の天然のタンパク質との配列同一性を有してもよく、又は有しなくてもよい。
【００４５】
本発明の液体状未変性タンパク質マーカーセットに含まれるタンパク質は、非変性電気泳動条件下で、それらの分子量の逆の順序の移動度を示す。そのため、１つ以上のタンパク質又はタンパク質複合体を含むサンプルとして、同じゲル上で本発明に記載のタンパク質分子量マーカーセットを用いることにより、研究者は１つ以上のタンパク質又はタンパク質複合体のサンプルのネイティブにおける分子量を、非変性電気泳動における分子量マーカーセットのタンパク質の移動距離と、１つ以上のタンパク質又はタンパク質複合体のサンプルの移動距離とを比較することによって推定できる。
【００４６】
好ましい実施態様では、セット中のタンパク質は液体調製物中に使用前に混合されている。そのため、使用前にユーザーがタンパク質を緩衝液中に溶解させる必要がなく、また適当な規模の異なる分子量のタンパク質を有するセットを調製するために個々のタンパク質溶液を混合する必要もない。若干の好ましい実施態様のタンパク質分子量マーカーセットのタンパク質は、液体状タンパク質分子量マーカーセットのアリコートをネイティブゲルに直接ロードできる濃度で含まれる。セット中の各タンパク質は、直接視認でき、又はタンパク質染色（例えばタンパク質染色物質又は色素（例えばクーマシー（登録商標）、ＳＹＰＲＯ（登録商標））又は銀染色）が可能な濃度で含まれる。例えば、未変性タンパク質分子量マーカーセットの提供された成分タンパク質の濃度は、１ミリリットル（ｍＬ）当り約５μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、又は好ましくは約１０μｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは約１００μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである。未変性タンパク質マーカーのセットに含まれる異なる成分タンパク質は、異なる濃度で存在してもよい。
【００４７】
好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、ネイティブ電気泳動（例えばトリス−グリシンネイティブゲル、トリス−酢酸ネイティブゲル又はブルーネイティブゲル）と適合性を有する緩衝液中にタンパク質を含有し、また非変性の「高分子量」化合物（例えばグリセロール）、及び任意に色素をサンプル容器に添加し、ロードを簡便化させてもよい。他の化合物（例えば塩、酸化防止剤、抗菌剤、還元剤、キレート剤）又はプロテアーゼ阻害剤を任意に添加してもよい。液体マーカータンパク質溶液には、１つ以上の変性作用を有さない界面活性剤を含有させてもよい。好ましくは、タンパク質を溶解させる緩衝液は、中性（ｐＨ６超〜８未満）又はその付近、好ましくは約６．５〜７．５のｐＨである。典型的な液体状ネイティブマーカーセットの溶液は、５０ｍＭのビストリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、０．００１％のポンソーＳである。
【００４８】
液体状ネイティブマーカーセットのタンパク質の安定性により、この「レディー・トゥー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）」としての簡便化が可能となる。本発明では、「安定性」とはタンパク質の分子量が変化する程に分解（例えばタンパク分解）されないことを意味するか、又はネイティブゲルにおけるタンパク質の移動度が変化する程に変性しないことを意味する。タンパク質の変性は、例えば、サブユニットの解離、タンパク質形態変化、凝集又はこれらの組合せによりゲルにおける移動度の変化を生じさせうる。
【００４９】
本発明の液体状ネイティブマーカーセットは、−２０℃以下で少なくとも１年間安定であり、例えば−２０℃以下で少なくとも３年間安定である。好ましくは、当該液体状ネイティブマーカーセットは４℃以下の温度で少なくとも１ヶ月間安定である。好ましくは、液体状ネイティブマーカーセットは４℃以下の温度で少なくとも２ヵ月間安定である。若干の態様では、液体状ネイティブマーカーセットは４℃で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月間安定であるか、又は、−２０℃で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２４、３６、４８及び６０ヶ月間安定である。
【００５０】
これらの安定性の基準は、マーカーセットの高温度によるロット試験及び加速劣化試験に基づいてもよい。加速劣化に基づく、相当する貯蔵期間の算出は、Ｑ１０＝２．０と仮定した場合の以下の方程式により行われる。ＴＬ日における相当貯蔵時間＝２．０［（ＴＨ−−ＴＬ）／１０］×ＴＨで保存した日数式中、ＴＬは低温（℃）であり、ＴＨは高温（℃）である。例えば、３０℃における３０日の保存は、−２０℃における９６０日の保存に相当する（２．０［（３０−−２０）／１０］×３０＝９６０）。
【００５１】
移動度が一致すること
液体状ネイティブ分子量マーカーセットは、所定の温度で所定の期間にわたり、１ロットのマーカーセットのアリコートの貯蔵後、当該マーカーセットを、以前試験したときに安定であるとされた他のロットのマーカーセットと共に、互いに隣接するレーンにおいてゲル電気泳動を行ったとき、＋／−０．０２のＲｆ（滞留係数（Retardation Factor））単位の許容範囲内で、試験ロットのマーカーバンドのＲｆ（移動度）と、以前安定であると判断されたロットの同じマーカーバンドが一致する態様として安定である（Ｒｆ単位は、個々のタンパク質の移動距離を、全ての移動距離で除した数値である）。
【００５２】
非マーカーバンドが最小であること
好ましくは、液体状ネイティブ分子量マーカーセットは、所定の温度で所定の期間にわたる貯蔵後、マーカーセットをゲル電気泳動にかけ、ゲルを染色し、更にスキャンして画像解析（デンシトメーター）を実施したとき、マーカー以外のいかなるバンドの強度（ピーク高）も、２つの隣接するマーカーバンドの弱い方（ピーク高が小さい方）の強度に対して２０％以下である態様として安定である。
【００５３】
一貫した電気泳動パターン
好ましくは、液体状ネイティブ分子量マーカーセットは、所定の温度で所定の期間にわたる貯蔵後、マーカーセットをゲル電気泳動にかけ、ゲルを染色し、マーカーセットの視覚による試験を行った場合に、これらの基準から安定であると判断された過去のロットの液体状ネイティブマーカーの性能と比較したときに、パフォーマンス（例えばバンド鋭さ）において他のいかなる顕著な相違も見出せない態様として安定である。
【００５４】
本発明のマーカーセットは、複数ロットのマーカーセットが、加速老化試験において一貫した移動度、最小の非マーカーバンド、及び一貫した電気泳動パターンの基準をクリアーできる意味において安定であり、それによりマーカーセットは液体（凍結）状態において、−２０℃で少なくとも６ヵ月間安定で、信頼性が高い。
【００５５】
好ましい実施態様では、本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、−２０℃の液体（冷凍）形態で少なくとも１年間安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明のタンパク質分子量マーカーセットは、−２０℃の液体（冷凍）形態で少なくとも３年間安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明の液体状タンパク質分子量マーカーセットは、４℃の液状形態で少なくとも１ヶ月間安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明の液体状タンパク質分子量マーカーセットは、４℃の液状形態で少なくとも２ヵ月間安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明の液体状タンパク質分子量マーカーセットは、４℃の液状形態で少なくとも３ヵ月間安定である。若干の好ましい実施態様では、本発明の液体状タンパク質分子量マーカーセットは、４℃の液状形態で少なくとも６ヵ月間安定である。
【００５６】
好ましくは、本発明の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットは、−２０℃で少なくとも１年の貯蔵寿命を示す。若干の好ましい実施態様では、本発明の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットは、４℃で少なくとも１ヵ月の貯蔵寿命を示す。貯蔵寿命とは、商品が大多数の顧客の予想に一致する態様のパフォーマンスを示すことを意味する。この場合、液体状ネイティブマーカーは顧客が許容できるだけの期間において一貫したパフォーマンスを示し、当該貯蔵寿命期間において移動度の変化が５％以下に留まる。好ましくは、当該マーカーは貯蔵寿命期間における移動度変化が２．５％以下に留まり、より好ましくは、貯蔵寿命期間における移動度変化が２％以下に留まり、より好ましくは、貯蔵寿命期間における移動度変化が１％以下に留まり、更に好ましくは、貯蔵寿命期間における移動度変化が０．２％以下に留まる。
【００５７】
好ましくは、液体状ネイティブマーカーは顧客が許容できるだけの期間においてバンド強度及びパターンが維持され、貯蔵寿命期間におけるバンド幅又は強度の変化が２０％以下に留まる。若干の好ましい実施態様では、当該マーカーは貯蔵寿命期間におけるバンド強度及びパターンの変化が１０％以下に留まる。
【００５８】
本発明の液体状ネイティブ分子量マーカーセットに含有させるタンパク質は、液体形態においてネイティブの立体構造が安定に保たれるという以外に、トリス−グリシン及びブルーネイティブゲル電気泳動システムにおいて良好な移動特性及びバンド解像度を提供する特性を有するという観点から選択される。特にトリス−グリシンゲルの場合、タンパク質が電気泳動条件の操作ｐＨ（トリスグリシンネイティブ電気泳動条件はゲルシステムの操作において約９．３のｐＨを生じさせる）より低いｐＩを有することが、陽極へのそれらの移動が緩衝液システムにおけるそれらの電荷によって妨害されないために必要である。移動距離を算出し、バンドを確認するとき、シャープなバンド解像度であることは有利である。
【００５９】
好ましい実施態様では、ネイティブゲル電気泳動用のタンパク質分子量マーカーセットは、３つ以上のタンパク質、４つ以上のタンパク質、５つ以上のタンパク質又は６つ以上のタンパク質を含有する。マーカー調製物中に多種類のタンパク質を含有させることにより、サンプルタンパク質の分子量測定の範囲及び正確さが増加する。液状のレディー・トゥー・ロード（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｌｏａｄ）形態の単一のネイティブマーカー調製物中の、６つのタンパク質の組合せ（各々がネイティブ電気泳動システムにおいて１つ以上の高解像度のバンドを示し、混合物中の各タンパク質が４℃で少なくとも１ヶ月間安定である）により、タンパク質分子量測定の正確さ、及びユーザに対するより大きな簡便性を提供する。
【００６０】
本発明の天然の液体状分子量マーカーセットは、液状において安定で望ましい分子量範囲をカバーするタンパク質のセットとして調製される。好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは、異なる分子量を有する３つ以上のタンパク質を含む。若干の好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットは異なる分子量を有する４以上、５以上又は６つ以上のタンパク質を含む。マーカーセット中の１つ以上のタンパク質は、複数のオリゴマー形態として存在してもよい。タンパク質は、最高５０ｋＤａ、最高１００ｋＤａ、最高２００ｋＤａ、最高４００ｋＤａ又は最高８００ｋＤａの分子量範囲にわたってもよい。好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーセットに含まれるタンパク質は１ＭＤａ以上の分子量範囲にわたってもよい。
【００６１】
ネイティブの液体状分子量マーカーセットにおいて使用するオリゴマータンパク質は、いかなる個数のサブユニットを有してもよい。オリゴマータンパク質のサブユニットは、同じであっても異なってもよい。場合によっては、分子量マーカーセットの１つ以上タンパク質は１つ以上のネイティブの形態で提供され、この場合異なるネイティブの形態は異なる分子量を示す。例えば、マルチサブユニットタンパク質は、異なるサブユニット組成又は異なるオリゴマー形態を有するネイティブの形態でマーカーセット中に存在してもよく、それによりゲルにおいて複数のマーカーバンドが得られる。
【００６２】
本発明は、セット中のタンパク質の１つ以上がネイティブにおける７００ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質分子量マーカーセットの提供に関する。本発明はまた、セット中のタンパク質の１つ以上がネイティブにおける１ＭＤａ（１０００ｋＤａ）以上の分子量を有するタンパク質分子量マーカーセットの提供に関する。本発明はまた、セット中のタンパク質の１つ以上がネイティブにおける１．２ＭＤａ（１２００ｋＤａ）以上の分子量を有するタンパク質分子量マーカーセットの提供に関する。
【００６３】
液体状ネイティブ分子量マーカーセットの成分タンパク質は、約０．０５〜５ｍｇ／ｍＬの濃度、好ましくは約０．１〜約２．５ｍｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約０．２〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製してもよい。液体状マーカーセット中の各成分タンパク質は好ましくは、タンパク質染色によって視覚化したときに、十分な解像度及び強度の電気泳動バンドが得られる態様で最適化される。
【００６４】
他の新しい態様として、本発明は、セット中のタンパク質の少なくとも１つが視覚的に検出可能である分子量マーカーセットの提供に関する。例えば、未変性タンパク質ゲル用の分子量マーカーセットに含まれるタンパク質の１つ以上は、１つ以上の発色団又はフルオロフォアを含有してもよい。液体状ネイティブマーカーセット中のタンパク質は、天然の蛍光タンパク質であってもよく、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体（野生型ＧＦＰよりも輝度を増強させた、又は吸収及び放出波長を変化させた変異体を含む）、又は赤色蛍光タンパク質（Ｄｓレッド又は他の花虫綱動物の蛍光タンパク質）又はその変異体（野生型の蛍光花虫綱動物タンパク質と比較して輝度を増強させた、又は吸収及び放出波長を変化させた変異体を含む）が挙げられる。本発明の若干の態様では、フィコビリソームのタンパク質は１つのタンパク質分子量マーカーである。例えば、フィコシアニン、アロフィコシアニン又はフィコエリトリンが分子量マーカーセットのタンパク質の１つであってもよい。フィコエリトリン（例えばフィコエリトリンＲ、Ｂ又はＹ）は、ゲル上のその位置においてユーザが直ちに視認可能な赤色を生じさせるという利点を有する。それらはネイティブにおける分子量の順に移動するため、ユーザは、マーカーレーンの各場所でタンパク質を確認することができる。当該タンパク質を使用することにより、ゲル電気泳動中でさえも、サンプルの移動速度又は染色若しくは非染色タンパク質の位置を評価することが可能となる。本発明は、液状において４℃で少なくとも２ヵ月間、及び−２０℃で少なくとも１年間安定であるタンパク質を多種類含む液体状ネイティブマーカーセットであって、少なくとも１つのタンパク質がゲル上でそのネイティブの、染色されない形態で視認可能である当該セットの提供に関する。
【００６５】
若干の好ましい実施態様では、本発明の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットは、少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤をタンパク質マーカーの１つとして含む。プロテアーゼ阻害剤は、存在しうる混入プロテアーゼを特異的に阻害することによってマーカーセットの安定性を向上させることができる。例えば、マーカーセット中の１つ以上のタンパク質の調製においては、微量のプロテアーゼが存在してもよい。プロテアーゼ阻害剤は、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ又はメタロプロテアーゼの阻害剤であってもよい。例えば、タンパク質マーカーセットは、タンパク質分子量マーカーとしてトリプシン阻害剤（例えば卵白トリプシン阻害剤又はダイズトリプシン阻害剤）を含有してもよい。
【００６６】
使用方法
ネイティブゲル電気泳動の間、本発明の分子量マーカーセット中のタンパク質は、それらのネイティブにおける分子量の関数である速度で移動する。すなわち、本発明の未変性タンパク質液体マーカーを使用して、同じ電気泳動にかけられたタンパク質複合体又はタンパク質のネイティブにおける分子量を、サンプルのタンパク質マーカー及びタンパク質の移動距離を使用して推定することができる。例えば、電気泳動中にサンプルタンパク質が移動した距離を、電気泳動中に１つ以上のマーカータンパク質が移動した距離と比較して、サンプルタンパク質の相対的なサイズを測定することができる。他の例では、セットに含まれるタンパク質の分子量（又は分子量の関数）は、ネイティブゲルによる液体状タンパク質マーカーセットの電気泳動により得られたそれらの移動距離の直接的又は間接的な関数としてプロットすることができる。例えば、セットに含まれるタンパク質の分子量の対数を、ネイティブゲルによる液体状タンパク質マーカーセットの電気泳動により得られたそれらの移動距離の直接的又は間接的な関数としてプロットすることができる。得られる曲線を使用して、同じゲルのその移動距離から、サンプルタンパク質の推定分子量を測定することができる。一例を挙げると、タンパク質分子量マーカーセットの各タンパク質の分子量の対数は、移動距離の関数としてプロットすることができ、１つ以上のサンプルタンパク質又はタンパク質複合体のネイティブにおける分子量は、得られるネイティブにおける分子量マーカー曲線及び同じゲルで電気泳動させた１つ以上のサンプルタンパク質又はタンパク質複合体の移動距離を使用して推定することができる。
【００６７】
ネイティブゲルシステム上の分子量の測定は正確ではないが、天然の形態における目的の１つ以上のタンパク質の分子量を推定できるため有用性を発揮しうる。本発明の液体状ネイティブマーカーセットを使用して、非変性条件下でタンパク質複合体又はタンパク質の推定分子量若しくは相対分子量を測定でき、そこでは目的のタンパク質及び分子量マーカーセットが非変性ゲルに別にロードされる。タンパク質サンプル及び液体状マーカーセットはゲル電気泳動にかけられ、マーカータンパク質及び１つ以上のサンプルタンパク質の移動距離が測定される。タンパク質の分子量（又は分子量の対数）は、それらの移動距離の関数としてプロットされる。サンプルタンパク質の分子量は、値をその移動距離に対応する曲線に置くことにより決定される。
【００６８】
若干の好ましい実施態様では、目的のタンパク質若しくはタンパク質複合体、又は目的のサンプルでは、アクリルアミド濃度の異なる多種類のネイティブゲルで電気泳動を行ってもよい。各電気泳動操作において、本発明のマーカータンパク質セットは、同じゲル上で他のサンプルと一緒に泳動する。異なるアクリルアミド濃度における各マーカーの移動度から、１つ以上のサンプルタンパク質の分子量、又は周知のファーガソンプロット線を使用して複合体の分子量を推定する（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，”Ｎａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｃｕｒｖｅｓ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｐｌｏｔｓ）”ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）、ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ，（１９８６）。
【００６９】
ネイティブゲルは、いかなるポリマー又はポリマーの組合せで調製してもよく、それによりポアサイズが所定のポリマー濃度において比較的均一な（又は一定の範囲内の）ゲルが得られる。ポリアクリルアミドゲルはタンパク質の分離用の典型的なゲルである。ポリアクリルアミドゲルはいかなる濃度であってもよく、目的のタンパク質を分離できる。例えば、ポリアクリルアミドゲルは約１．５％〜約３０％のポリアクリルアミド濃度、好ましくは約２％〜約２５％のポリアクリルアミド濃度、更に本発明において特に好ましい実施態様では約２．５％〜約２０％のポリアクリルアミド濃度である。またポリアクリルアミドゲルには通常、若干のパーセンテージで架橋結合ポリマー（例えばＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）を含有させる。若干の好ましい実施態様では、当該ポリアクリルアミドゲルは、ゲルのポリアクリルアミドの濃度が低濃度から高濃度への濃度勾配を有するゲルである。例えば、未変性タンパク質電気泳動において使用する勾配ゲルは、３％〜１２％のポリアクリルアミドの濃度勾配、又は４％〜１６％のポリアクリルアミドの濃度勾配を有してもよい。タンパク質及びペプチド分離用の重合ゲルを調製し使用する方法には、タンパク質及びペプチド分離用の非変性ゲルを調製し使用することが包含され、公知技術である。
【００７０】
例えば、トリス−グリシン又はトリス−酢酸ゲルが未変性タンパク質分離に使用でき、又はビストリスポリアクリルアミドゲルを用いた「ブルーネイティブ」（ＢＮ）ゲルを使用することもできる。未変性タンパク質分離用のトリスグリシン及びトリス酢酸ゲルは従来技術において周知である。またブルーネイティブゲルの使用（陰極緩衝液、タンパク質サンプル緩衝液又はその両方にクーマシー（登録商標）Ｇ−２５０色素が含まれる）は従来技術において公知であり、Ｓｃｈａｇｇｅｒ  Ｈ及びｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ  Ｇ（１９９１）”Ｂｌｕｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：２２３−２３１、Ｓｃｈａｇｇｅｒ  Ｈ，Ｃｒａｍｅｒ  ＷＡ，ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ  Ｇ（１９９４）”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  ｂｌｕｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｎａｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：２２０−２３０、及びＳｃｈａｇｇｅｒ  Ｈ（２００１）”Ｂｌｕｅ−ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｌｓ  ｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＩ．６５：２３１−２４４．に記載されている。この電気泳動方法では、クーマシー（登録商標）Ｇ−２５０色素はネイティブ状態のタンパク質と結合し、タンパク質に負電荷を与える。負に荷電するクーマシー（登録商標）染色タンパク質はそれらの分子量と比例した速度で陽極側に移動する。
【００７１】
未変性タンパク質マーカーを他のタンパク質分離及び解析技術のスタンダードとして使用してもよく、限定されないが例えば半固体（例えばゲル）又は液体溶媒での等電点電気泳動、ＨＰＬＣ及びＦＰＬＣなどの、分子量、荷電又はそれらの組み合わせに基づくクロマトグラフィ分離など、電気泳動（限定されないが例えばキャピラリー電気泳動、フリーフロー電気泳動、非変性（ネイティブ）ゲル電気泳動、変性ゲル電気泳動、質量分析及びクロマトフォーカシングなど）が挙げられる。これらの方法では、未変性タンパク質スタンダードはタンパク質（好ましくは非変性）を含むサンプルに添加してもよく、又は上記の分析若しくは分離法を用い、サンプルと並列若しくは直列に、分析若しくは分離してもよい。１つ以上の未変性タンパク質スタンダードのシグナル強度、分離時間又は距離を、同じパラメータの１つ以上のサンプルタンパク質と比較して、１つ以上のサンプルタンパク質の分子量、サイズ、濃度、電荷又は電化対質量比率の比較値若しくは算出値を得えることができる。
【００７２】
典型的な液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット
本発明は、未変性タンパク質分子量マーカーセット用のタンパク質であって、１）４℃で少なくとも１ヶ月間の安定性を示し、２）−２０℃で少なくとも１年間の安定性を示し、及び３）トリス−グリシン及びブルーネイティブゲルシステムで電気泳動したときにシャープ（非拡散）なバンド解像度を示すタンパク質の提供に関する。当該タンパク質には、ウシ血清から単離したＩｇＭ、ウマの脾臓から単離したアポフェリチン、Ｂ−フィコエリトリン、ブタの心臓から単離した乳酸デヒドロゲナーゼ、ウシ血清アルブミン、及びダイズトリプシン阻害剤を含有することが確認されている。ネイティブの形態のこれらのタンパク質の分子量を表１に示す。
【００７３】
マーカーとして使用するタンパク質は、様々な供給源から任意に取得することが可能であり、例えば、免疫グロブリンＭ（ウシ血清、Ｓｉｇｍａ  Ｉ８１３５）、免疫グロブリンＭ（ウシ血清、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＡＩＭ０７）、免疫グロブリンＭ（マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）０２−６８００）、免疫グロブリンＭ（Ｒａｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）０２−９８８８）、アポフェリチン（ウマ脾臓、Ｓｉｇｍａ  Ａ３６６０）、アポフェリチン（ウマ脾臓、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  １７８４４０）、アポフェリチン（ウマ脾臓、ＭＰ  Ｂｉｏ  １００２６０）、Ｂ−フィコエリトリン（単細胞赤色藻類、Ａｌｅｘｉｓ６１０−１４５−Ｍ００２）、Ｂ−フィコエリトリン（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｉｄｕｍ又はＰｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｄｕｍ由来、Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ  １００３０１）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４２７２１１から乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｈｅａｒｔ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ウシ心臓、Ｓｉｇｍａ  Ｌ３９１６）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ブタ心臓、Ｓｉｇｍａ  Ｌ７５２５）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ウサギ筋肉、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４２７２１７）、アルブミン（ウシ血清、Ｓｉｇｍａ  Ａ２１５３）、アルブミン（ウシ血清、Ｓｉｇｍａ  Ａ０２８１）、アルブミン（ウシ血清、Ｓｉｇｍａ  Ａ３０５９）、アルブミン（ウシ血清、Ｓｉｇｍａ  Ａ８５３１）、アルブミン（ウシ血清、フィッシャーＢＰ１６０５−１００）、アルブミン（ウシ血清、ＶＷＲ  ＥＭ−２９０５）、アルブミン（ウシ血清、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ２３８０４０）、トリプシン阻害剤（ダイズ、Ｆｌｕｋａ（シグマ）９３６１９）、トリプシン阻害剤（ダイズ、Ｆｌｕｋａ（シグマ）９３６２０）、トリプシン阻害剤（ダイズ、ＵＳＢ  ２１７３０）、トリプシン阻害剤（ダイズ、Ｓｉｇｍａ  Ｔ９００３）、トリプシン阻害剤（ダイズ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ６５０３５７）及びトリプシン阻害剤（ダイズ、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｋ２１３）。
表１：液体状未変性マーカーセットのタンパク成分
【表１】
2008547035.tif 000002
【００７４】
列記したタンパク質のうちの２つ以上を、液体状ネイティブマーカーセットとして、いかなる組合せで用いてもよい。液体状未変性タンパク質マーカーセットの好ましい組成は、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清ＩｇＭ、０．４ｍｇ／ｍＬのウマ脾臓アポフェリチン、０．２ｍｇ／ｍＬの藻類Ｂ−フィコエリトリン、０．２ｍｇ／ｍＬのブタ心臓乳酸デヒドロゲナーゼ、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン及び０．２ｍｇ／ｍＬのダイズトリプシン阻害剤である。
【００７５】
これらのタンパク質（安定性、貯蔵寿命及びネイティブのポリアクリルアミドゲル上の非拡散バンドを提供することの特性のために選択される）をそれぞれ独立に使用して、そのマーカータンパク質のネイティブゲルにおける移動を、１つ以上のサンプルタンパク質のそれと比較してもよい。本発明は、同じネイティブゲル上において、比較用に分子量マーカーとしてウシ血清ＩｇＭを使用して、１つ以上のタンパク質のネイティブにおける相対分子量を測定する方法を包含する。本発明はまた、同じネイティブゲル上において、比較用に分子量マーカーとして馬の脾臓アポフェリチンを使用して、１つ以上のタンパク質のネイティブにおける相対分子量を測定する方法を包含する。本発明はまた、同じネイティブゲル上において、比較用に分子量マーカーとしてＢ−フィコエリトリンを使用して、１つ以上のタンパク質のネイティブにおける相対分子量を測定する方法を包含する。本発明はまた、同じネイティブゲル上において、比較用に分子量マーカーとして豚のような心臓乳酸デヒドロゲナーゼを使用して、１つ以上のタンパク質のネイティブにおける相対分子量を測定する方法を包含する。本発明はまた、同じネイティブゲル上において、比較用に分子量マーカーとしてウシ血清アルブミンを使用して、１つ以上のタンパク質のネイティブにおける相対分子量を測定する方法を包含する。本発明はまた、同じネイティブゲル上において、比較用に分子量マーカーとしてダイズトリプシン阻害剤を使用して、１つ以上のタンパク質のネイティブにおける相対分子量を測定する方法を包含する。
【００７６】
液体状ネイティブマーカーを有するキット
液体状ネイティブマーカーセットはキットとして販売してもよく、当該キットは２つ以上のタンパク質を含有する液体状混合物としての未変性タンパク質分子量マーカーを含む少なくとも１つのチューブ又はバイアルを有する。チューブ又はバイアルには、５μＬ〜５ｍＬの液体ネイティブマーカー（例えば１０μＬ〜２．５ｍＬ、例えば２５μＬ〜１ｍＬ又は１００μＬ〜５００μＬ）が含まれていてもよい。
【００７７】
好ましい実施態様では、液体状未変性タンパク質マーカーキットは、ネイティブ電気泳動（例えばトリス−グリシンネイティブゲル、トリス−行酢酸塩ネイティブゲル又はブルーネイティブゲル）との適合性を有する非変性緩衝液中のマーカータンパク質を含み、非変性の「高分子」化合物（例えばグリセロール）及び任意に染色物質を添加してサンプルウェルへのロードを簡便化してもよい。他の化合物（例えば塩、酸化防止剤、抗菌剤（例えばアジ化ナトリウム）、還元剤、キレート剤又はプロテアーゼ阻害剤）を任意に加えてもよい。キットとして提供される液体マーカータンパク質溶液には、変性作用を有さない１つ以上の界面活性剤を添加してもよい。典型的な液体状ネイティブマーカーセット容液は、５０ｍＭのビストリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのグリセロール、０．００１％のポンソーＳ及びアジ化ナトリウムを含む。
【００７８】
本発明の具体的実施態様は、異なる分子量を有し、ネイティブの立体構造を有する少なくとも２つのタンパク質を含有する溶液を含む液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを含む容器であって、非変性ゲルにおける前記少なくとも２つのタンパク質の移動度がそれらの分子量の関数であり、前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットが４℃で少なくとも１ヶ月間安定である容器と、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを含有する第二容器と、及び／又は少なくとも１つのネイティブゲル試薬とを含むキットであって、前記少なくとも１つのネイティブゲル試薬が、クーマシーＧ−２５０色素、非変性サンプル緩衝液、変性作用を有さない界面活性剤、又は事前成型非変性ゲルであるキットの提供に関する。
【００７９】
好ましくは、キット中の液体状ネイティブマーカーセットは、タンパク質マーカーセットのアリコートを更に希釈しないでゲルに直接ロードする濃度で提供されるが、若干の用途ではマーカーを電気泳動前に希釈してもよい。例えば、前記少なくとも２つのタンパク質の各々又は前記液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット中のタンパク質は、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。
【００８０】
ゲル中の１レーンに０．５μＬ〜５０μＬをロードすることができ、クーマシー、ＳＹＰＲＯ又は銀染色などにより視覚化できるように、液体状タンパク質マーカーを調製することができ、好ましくは１μＬ〜２５μＬを、ゲル中の１レーンにロードし、クーマシー、ＳＹＰＲＯ又は銀染色により視覚化できるように調製する。
【００８１】
液体状マーカーセットは、２つ以上の容器を含むキットとして提供してもよい。この方法では、ユーザは、１つの容器を４℃で保存し、その他の容器を−２０℃で保存してより長期間保存することができる。例えば、キットは２、３以下の通り４、５又はそれ以上の容器として提供してもよく、その結果、ユーザは第一の容器を即時使用のためにマーカーを解凍することなく４℃で簡便に保存することができ、第一容器の中身が減少するまでは−２０℃でその他の容器を保存することができる。
【００８２】
異なるタンパク質組成を有するマーカーセットを、単一のキット中に含めてもよい。例えば、異なるマーカーセットは、異なる分子量範囲を有するタンパク質セットを含んでもよい。
【００８３】
当該キットは少なくとも１つのタンパク質精製、単離若しくは調製用の試薬、又は少なくとも１つのゲル試薬、例えばサンプル又はタンパク質の可溶化緩衝液、変性作用を有さない界面活性剤（例えばドデシルマルトシド、オクチルグルコシド、ジギトニン）、クーマシー（登録商標）Ｇ−２５０）、ゲルローディング緩衝液、電気泳動緩衝液、事前成型ネイティブゲル又はゲル染色液を更に含んでなってもよい。事前成型ネイティブゲルは、例えばトリス−グリシンゲル、トリス−酢酸ゲル又はＢｉｓ−トリスゲルであってもよい。当該キットには、ａ）電気泳動のマーカーの使用法、及び好ましくはｂ）同じゲルにおいて電気泳動させる１つ以上のサンプルタンパク質の分子量を推定する際の、上記マーカーの液体状ネイティブマーカーセットとしての使用法に関する情報を記載した説明書を含めてもよい。あるいは、当該説明書にはユーザに指示をａ）若しくはｂ）、又はその両方に関する情報を記載したウェブサイトを参照として掲載してもよい。
【００８４】
収益方法
本発明の具体的態様は、商品流通を利用して販売される商品である液体状未変性タンパク質マーカーセットの提供に関する。商品は通常、ラベルを付与し及び／又はキットとして販売される。液体状未変性タンパク質マーカーセットは、供給業者（例えば営利を目的とする事業体）により顧客に販売される。好ましい態様の商品は、レディー・トゥー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）型の市販用の調製物であり、溶液中の未変性タンパク質スタンダードセットに含まれる少なくとも２つのタンパク質が凍結状態若しくは液体状態で商業的供給業者からユーザに提供される。市販用の分子量マーカーセットは、適当な緩衝液中に適当な濃度で調製してもよく、特に少なくとも一部の液体状タンパク質分子量マーカーセットがゲルに直接ロードできる態様が好ましい。
【００８５】
本発明の他の実施形態は、液体状未変性タンパク質分子量マーカーを販売することによって収入を得る方法の提供に関する。当該方法は、ネイティブ電気泳動用の液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入する手段を提供することを含む。液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットは、異なる分子量を有し、ネイティブの立体構造を有する少なくとも２つのタンパク質の溶液を含む。当該方法は、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入する手段を起動させ、支払い情報を入力するステップを更に含んでもよい。当該方法は更に、顧客からマーカーセットの提供者への支払いステップを含んでもよい。当該セットは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０又は２５種類のタンパク質を含んでもよい。
【００８６】
マーカーセットを購入する手段は、バイオリサーチ用試薬の業者が分子量マーカーの販売に用いるいかなる販売方法を含めてもよい購入機能である。当該方法としては、電話システム及び／又はコンピュータベースのシステムなどが挙げられる。非限定的な例として、当該方法は、インターネットページ、又は他のローカルネットワーク若しくはワイドエリアネットワーク上のページに表示された分子量マーカー購入のためのリンクを含んでもよい。それに加え、又はその代わりに、当該手段は電話又は文書によるオーダーシステムであってもよい。他の手段としては、従来のメール又はオーダーによる直接的なオーダー、あるいは例えば販売員経由による口頭によるオーダーであってもよい。液体状ネイティブマーカーは供給センターに在庫させてもよく、顧客は液体状ネイティブマーカーを含む１つ以上の容器を取り、ページ、本若しくは元帳に、又はコンピュータを使用して取った量を記録してもよく、それは在庫センターの一部で行ってもよく、又は顧客のパーソナルコンピュータ（ＰＣ）経由のアクセスでもよい。商品の取り出し及びその取り出し記録は購入者が行ってもよく、又は在庫センター又は商品の供給元が行ってもよい。製品取り出しの記録は、液体状ネイティブマーカーの代金を支払う顧客の側の合意を構成する。顧客は分子量マーカーセットを購入するために上記のいずれかの典型的な手段を使用する。
【００８７】
マーカーセットの購入の際、顧客は供給業者に対価を提供する。通常、顧客から供給業者に払われる購入品の対価の形態は金銭である。通常、外部ベンダーである供給業者は対価と引きかえに顧客（通常はエンドユーザー顧客）にマーカーセットを出荷する。在庫センターを経由する場合、外部ベンダーは通常、研究機関又は会社内の在庫センターに出荷し、購入者は液体状ネイティブマーカーセットを取り出し、その後（典型的には商品取り出し記録を基に供給業者が発行する請求を受領した後に）購入料金を支払う。顧客が未変性タンパク質ゲルを購入するいかなる典型的な顧客であってもよいことが理解されよう。例えば、当該顧客は、調査機関（例えば研究所又は営利団体）の研究者であってもよい。顧客は医学診断企業又は製薬企業であってもよい。
【００８８】
マーカーセットは例えば２〜１５種類のタンパク質を含んでもよく、具体的な例としては、５ｋＤａ〜２０００ｋＤａ又は８〜１５００ｋＤａの分子量を有する６〜１０種類のタンパク質を含む。タンパク質の各々は通常、ネイティブのポリアクリルアミドゲルで分離できる異なる分子量を有する。
【００８９】
マーカーは例えば、クーマシーＧ２５０染色ゲルの１レーン当り０．５ドル〜２０ドル、好ましくは１ドル〜１０ドルのコストとすることができる。例えば、マーカーチューブには、５μＬ〜２５００μＬの液体状マーカーセットを含めることができ、１ドル〜５０００ドルのコストとするとができるが、通常は５０ドル〜２５００ドルである。例えば、チューブには液体マーカーセットを２００μＬ〜３００μＬを含めてもよく、その濃度は、２〜１０μＬをゲルレーン上へロードしてもクーマシーブルー染色によって視覚化できるのに十分な濃度である。２００μＬ〜３００μＬチューブにかかるコストは、例えば５０ドル〜５００ドル（米ドル）でありえる。
【００９０】
当該購入機能は、本発明に係る分子マーカーに直接又は間接的に関連する製品の購入にも使用できる。例えば、当該購入機能は非変性ゲルの購入に更に使用してもよく、事前成形した単一濃度又は３〜２０％のアクリルアミド濃度勾配ゲル（ネイティブのトリスグリシンゲル（例えばＮｏｖｅｘ（登録商標））、トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、など）、ネイティブのトリス酢酸ゲル（例えばＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標））、トリス酢酸ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）及びビストリスゲル（例えばＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）など）、及び／又はクーマシー（登録商標）Ｇ−２５０などのクーマシー（登録商標）ブルー染色物質が例示されるがこれらに限定されない。液体状ネイティブマーカーなどの購入に含めてもよい他の染色物質は、限定されないが、銅タンパク質ゲル染色、銀タンパク質ゲル染色及びＳＹＰＲＯ（登録商標）ゲル染色が例示される。関連製品としては、電気泳動緩衝液が挙げられる。
【００９１】
顧客に販売する液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを以下に記載する。例えば、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットは通常、４℃で少なくとも１ヶ月間安定であり、具体的態様では少なくとも４℃で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２ヶ月間、又は−２０℃で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２４、３６、４８ヶ月間、並びに４℃又は−２０℃で６０ヶ月間以上安定である。
【００９２】
当該方法は、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを輸送することを更に含んでもよい。例えば、当該輸送は州間の商業的な輸送であってもよい。当該輸送は通常、供給業者によって顧客に対して行われる。当該顧客は通常、供給業者と同じ設備内に存在しない。当該輸送は通常、運送業者又は政府組織（例えば米郵政公社）によって行われる。
【００９３】
本発明に係る他の実施態様は、収入を得る方法であって、少なくとも２つのタンパク質の溶液を含有する液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入するための購入機能を顧客に提供することを含み、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットを購入する際に購入機能が使用されると、購入機能及び液体状未変性タンパク質分子量マーカーセットの供給業者において収入が発生する方法に関する。
【００９４】
他の実施形態では、本発明はまた、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット及び／又は本発明に係るキットの販売方法であって、電話注文システムの入力機能を顧客に提示することと、及び／又はコンピュータシステムの一部としてエントリのデータ入力フィールド又は選択可能リストを顧客に提出することを含み、当該液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット及び／又は当該キットが入力機能を使用して確認される方法の提供に関する。入力機能がコンピュータシステムの一部である（例えばインターネットサイトの１つ以上のページに表示される）場合、顧客に対して通常オンライン購入機能（例えばオンラインショッピングカート）が表示され、顧客は当該購入機能を使用して、希望する液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット及び／又はキットを購入する。一態様では、複数の識別子を顧客に提供し、その各々が液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット、及び／又は異なるボリュームのキットを識別し、又は成型ネイティブゲル又は染色物質（例えばクーマシー（登録商標）染色）などの関連製品と共に識別される。当該方法は、液体状未変性タンパク質分子量マーカーセット及び／又は本発明に係るキットを購入する購入機能を起動させることを更に含んでもよい。
【００９５】
例えば、当該収入を得る方法は、販売の申し出（例えば購入機能にリンクを付与すること）と、及び／又は２つ以上のタンパク質をレディー・トゥー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）型の調製物として含有する液体状未変性タンパク質マーカーセットを販売することを含む。すなわち、本発明に係る収入を得る方法の例では、未変性タンパク質マーカーセットは、ネイティブ電気泳動（例えばトリスグリシンネイティブゲル、トリス酢酸ネイティブゲル又はブルーネイティブゲル）との適合性を有する液緩衝液中に含まれ、非変性の「高分子量」化合物（例えばグリセロール）、及び任意に色素をサンプル容器に添加し、ロードを簡便化させてもよい。他の化合物（例えば塩、酸化防止剤、抗菌剤、還元剤、キレート剤）又はプロテアーゼ阻害剤を任意に添加してもよい。液体マーカータンパク質溶液には、１つ以上の変性作用を有さない界面活性剤を含有させてもよい。好ましくは、タンパク質を溶解させる緩衝液は、中性（ｐＨ６超〜８未満）又はその付近、好ましくは約６．５〜７．５のｐＨである。典型的な液体状ネイティブマーカーセットの溶液は、５０ｍＭのビストリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、０．００１％のポンソーＳである。溶液は抗菌剤（例えばアジ化ナトリウム）を任意に含んでもよい。当該購入機能は、電話による購入機能又はインターネットページに提供される購入機能（例えばインターネットショッピングカート機能の一部）であってもよい。
【００９６】
本発明にはまた、ネイティブスタンダードを販売することによって収入を得る方法が含まれる。当該方法は、本発明の液体状タンパク質分子量マーカーセットを顧客に提供することと、液体状タンパク質分子量マーカーセット中に含まれる２つ以上のタンパク質の分子量か、又は、インターネットアクセスによって利用可能な、前記液体状タンパク質分子量マーカーセット中に含まれる前記２つ以上のタンパク質の分子量を提供するウェブサイトのワールドワイドウェブアドレスのいずれか若しくは両方が記載されている説明書を提供することと、液体状タンパク質分子量マーカーセットの提供と引きかえに顧客から収入を受けることを含む。好ましい実施態様では、説明書、ウェブサイト又はその両方には、電気泳動スタンダードとして液体状ネイティブ分子量マーカーを使用してタンパク質の分子量を算出するための指示、及び／又は分子量マーカーのゲルバンドを示す典型的なゲルの画像が掲載される。
【００９７】
好ましくは、液体状ネイティブマーカーはキットとして注文され、顧客に提供される。収入を得る方法は、顧客に対して、顧客が液体状ネイティブ分子量マーカーセットを注文できるウェブサイトを提供することを含んでなってもよい。また、ウェブサイトでは電子的に処理を記録でき、請求書を発行できる。
【００９８】
以下に実施例を示すが、いささかも本発明を限定するものではない。
【００９９】
＜実施例１＞液体ネイティブマーカーセットの電気泳動
以下の濃度で、表１に示したタンパク質を含有する液体状未変性タンパク質マーカーセットを調製した。１ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ、０．４ｍｇ／ｍＬのアポフェリチン、０．３２ｍｇ／ｍＬのＢ−フィコエリトリン、０．３ｍｇ／ｍＬの乳酸デヒドロゲナーゼ、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．５ｍｇ／ｍＬのダイズトリプシン阻害剤。液体状ネイティブマーカーセット（ＬＮＭ）を、３つの異なるゲルシステムにより電気泳動させた。それぞれ、マーカー調製物（５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖグリセロール、０．００１％のポンソーＳ）を５μＬずつゲルに直接ロードした。図１Ａは、異なるゲルシステムで電気泳動し、クーマシー（登録商標）Ｇ−２５０色素（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）で染色した液体状ネイティブマーカーセットを示す。最も左のレーンは、マーカーセットを４−１６％のブルーネイティブアクリルアミドゲルで電気泳動させたときの結果を示す。中間のレーンは、マーカーセットを３−１２％のブルーネイティブアクリルアミドゲルで電気泳動させたときの結果を示す。ブルーネイティブゲルの場合、５０ｍＭのビストリス、５０ｍＭのトリシンを含む緩衝液を用い、９０分間、１５０Ｖ（一定）で電気泳動を行った。最も右のレーンは、約９．３の操作ｐＨにてマーカーを４−１２％のトリスグリシンゲルで電気泳動させたときの結果を示す。トリスグリシンゲルの場合、２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシンを含む緩衝液を用い、１１１分間、１２５Ｖ（一定）で電気泳動を行った。
【０１００】
図１Ｂは、３−８％及び７％のアクリルアミド・トリス酢酸ゲル電気泳動を行った、同じマーカー調製物を示し、図１Ｂは４−１２％、８−１６％及び４−２０％のアクリルアミド・トリス−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル電気泳動を行った、同じマーカー調製物を示す。いずれの場合も、ゲルをクーマシー（登録商標）Ｇ−２５０色素（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）で染色した。図２は、ストック液濃度を×０．０５希釈し、４−１２％、８−１６％、そして、４−２０％のアクリルアミド・トリス−グリシンゲルで電気泳動し、銀染色（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）タンパク質ゲル染色）した、同じ液体状ネイティブマーカー（ＬＮＭ）調製物を示す。
【０１０１】
これらの図は、当該マーカーの使用により、幾つかのゲルシステムにおいて実質的に検出可能な非マーカーバンドを生じさせることなく、それらの分子量の順に移動するシャープなバンドが得られることを示す。
【０１０２】
＜実施例２＞異なるゲルシステムにおける、液体状ネイティブマーカーセットの移動度
実施例１と同様に調製した液体状未変性タンパク質マーカーセット（ＬＮＭ）を、市販のマーカーセット（凍結乾燥形態で顧客に提供される「ＨＭＷマーカー」）と一緒に、３−１２％のブルーネイティブ（ＢＮ）ゲルで電気泳動させた。得られたＨＭＷマーカーからのタンパク質におけるＭＷ対Ｒｆの対数プロット線、及び液体ネイティブマーカー（非染色）未変性タンパク質スタンダードを図３に示す。スタンダード曲線は最適な二次多項式として作成した。ＨＭＷマーカー曲線の方程式は以下の通りである。ｙ＝１．７２８１ｘ２＋０．８６４ｘ＋３．１１２６；ＬＮＭセットの方程式は以下の通りである。ｙ＝０．１３０９ｘ２−２．２９０３ｘ＋３．７４２７。市販のマーカーセットのＲ二乗値は０．９７４６であった。実施例１のＬＮＭセットのＲ二乗値は０．９９４であった。
【０１０３】
図４は、同じ４−１６％のブルーネイティブゲルで電気泳動させた２つのマーカーセットを示す。スタンダード曲線は最適な一次式として作成した。ＨＭＷマーカー曲線の方程式は以下の通りである。ｙ＝−２．４２６５ｘ＋３．３９３３；ＬＮＭセットの方程式は以下の通りである。ｙ＝−２．５２４９ｘ＋３．４９８９。市販の「ＨＭＷマーカー」セットのＲ二乗値は０．９８８８であった。実施例１の液体状ネイティブマーカーセットのＲ二乗値は０．９９３であった。
【０１０４】
図５は、４−１２％のトリス−グリシンゲルで電気泳動させた２つのマーカーセットを示す。スタンダード曲線は最適な一次式として作成した。ＨＭＶマーカー曲線の方程式は以下の通りである。ｙ＝２．４７６２ｘ２−４．３４７２ｘ＋３．６１６９；ＬＮＭセットの方程式は以下の通りである。ｙ＝−２．６７４５ｘ２−０．０１４８ｘ＋２．９４７８。市販の「ＨＭＷマーカー」セットのＲ二乗値は０．９８４７であった。実施例１の液体状ネイティブマーカーセットのＲ二乗値は０．９９４であった。
【０１０５】
＜実施例３＞液体状ネイティブマーカーセットの安定性
３−１２％及び４−１６％のブルーネイティブゲルを用い、実施例１にて説明した本発明の新規な液体状ネイティブマーカーのロットを、実施例１に記載の組成を有する、以前に試験を通過したＬＮＭのロットと隣りあわせで電気泳動（１レーン当り５μＬ）させた。Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇキットによる染色後、ゲルを３００ｄｐｉのｔｉｆｆ画像としてスキャンし、色及びグレイスケール画像として保存した。画像分析（デンシトメトリ）を実施し、移動（Ｒｆ）及びピーク高の値を、サンプルレーンで検出されるすべてのバンドに関してＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアにより算出した。ＬＮＭのためのＱＣ仕様を、以下のように規定した：
移動：新規ロットのマーカーバンドのＲｆが、隣接するレーンにロードした、以前に試験を通過したロットのマーカーバンドにおけるＲｆ単位と、許容度＋／−０．０２Ｒｆで一致すること、
マイナーなバンド：いかなる非マーカーバンドのピーク高も、それに隣接する２つのマーカーバンドのピーク高の小さい方に対して２０％以下であること、
視覚：以前に試験を通過したロット比較し、新規なロットの視覚試験で、いかなる顕著なパフォーマンスの相違も見られないこと。
【０１０６】
異なるロットのＬＮＭのアリコートを、加速劣化シミュレーションを実施する目的で異なる温度で保存し、更に５μＬのアリコートをブルーネイティブ及びトリスグリシンゲルで電気泳動させた（図６）。染色ゲルの画像をＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアを使用したデンシトメトリにより解析し、方法の中で述べたようなＱＣ基準に従って、合格又は不合格のステータスを決定した。レーン１：市販の分子量マーカー；レーン２：ＬＮＭのロットＡ、４℃で９１日間保存；レーン３：ＬＮＭのロットＢ、４℃で６７日間保存；レーン４：ＬＮＭのロットＢ、２２℃で６７日間保存；レーン５：ＬＮＭのロットＢ、３０℃で６７日間保存；レーン６：ＬＮＭのロットＣ、４℃で６６日間保存；レーン７：ＬＮＭのロットＣ、２２℃で６６日間保存；レーン８：ＬＮＭのロットＣ、３０℃で６６日間保存。
【０１０７】
ＬＮＭのロットＣは、２２℃、６６日の時点ですべてのゲルにおいて安定性の基準を通過したが（図６、レーン７）、３０℃、６６日の時点（図６、レーン８）では基準を満たさなかった。ＬＮＭのロットＢは、ＬＤＨバンドの不適当なサンプルローディングのため、基準を満たさなかった（図６、レーン３−５）。長期の保存により出現する問題となるバンドは、それらのピーク高が隣接するマーカーバンドのピーク高の２０％を超えるとき、基準を満たさなくなる。問題となるバンドがロットＣ（図６、レーン７）の２２℃、６６日の時点で観察されるものの、それらは極わずかであり、ゆえにそれらは軽微であるとみなされ、安定性基準を満たすものと考えられる。加速劣化試験に関して述べた方程式を用いると、２２℃、６６日間の結果から、−２０℃では１２１３日（３．３年）、又は４℃では２３０日（７．６ヵ月）間と算出された。以上より、上記マーカーは−２０℃で少なくとも３年の保存安定性、又は４℃で少なくとも６ヵ月の保存安定性を示した。
【０１０８】
本願明細書の全ての引用文献は、全開示内容が援用される。本発明において用いられる見出しはあくまで便宜上のものであり、本発明を限定することを目的としない。見出しを有するセクション中の開示は、異なる見出しを有する他のセクション中での開示に適用することも可能である。本発明を上記実施例に関して記載したが、適切な修正変更を、本発明の技術思想と範囲の中で適宜実施できることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】異なるゲルシステムで電気泳動を行い、クーマシー（登録商標）Ｇ−２５０で染色された天然のマーカーを示す。本発明のネイティブマーカーを、（左から右に）４−１６％のブルーネイティブゲル、３−１２％のブルーネイティブゲル及び４−１２％のトリス−グリシンゲルで電気泳動したときの状態を示す。
【図１Ｂ】３−８％及び７％のアクリルアミド・トリス−酢酸ゲルで電気泳動した際の、本発明のネイティブマーカーを示す。
【図１Ｃ】６％、４−１２％、８−１６％及び４−２０％のアクリルアミド・トリス−グリシンゲルで電気泳動した際の、本発明のネイティブマーカーを示す。
【図２】ストック溶液の濃度に対して×０．０５まで希釈した同じマーカー組成物を、４−１２％、８−１６％及び４−２０％のアクリルアミド・トリス−グリシンゲルで電気泳動し、銀染色したときの状態を示す。
【図３】市販のＨＭＷマーカー（ダイヤモンド形）及び液体状未変性タンパク質スタンダード（正方形）タンパク質を、４−１６％のブルーネイティブゲルで電気泳動した際の、分子量対Ｒｆの対数プロット線を示す。最適な２次多項式を使用してスタンダード曲線をプロットした。
【図４】市販のＨＭＷマーカー（ダイヤモンド形）及び液体状未変性タンパク質スタンダード（正方形）タンパク質を、４−１６％のブルーネイティブゲルで電気泳動した際の、分子量対Ｒｆの対数プロット線を示す。最適な２次多項式を使用してスタンダード曲線をプロットし、方程式及びＲ２値を図示する。
【図５】市販のＨＭＷマーカー（ダイヤモンド形）及び液体状未変性タンパク質スタンダード（正方形）タンパク質を、４−１２％のトリス−グリシンゲルで電気泳動した際の、分子量対Ｒｆの対数プロット線を示す。最適な２次多項式を使用してスタンダード曲線をプロットし、方程式及びＲ２値を図示する。
【図６】異なるゲルシステムで電気泳動を行い、クーマシー（登録商標）Ｇ−２５０で染色された液体状のネイティブマーカー（ＬＮＭ）を示す。レーン１：市販の分子量マーカー。レーン２：ＬＮＭのロットＡ（４℃で９１日間保存）。レーン３：ＬＮＭのロットＢ（４℃で６７日間保存）。レーン４：ＬＮＭのロットＢ（２２℃で６７日間保存）。レーン５：ＬＮＭのロットＢ（３０℃で６７日間保存）。レーン６：ＬＮＭのロットＣ（４℃で６６日間保存）。レーン７：ＬＮＭのロットＣ（２２℃で６６日間保存）。レーン８：ＬＮＭのロットＣ（３０℃で６６日間保存）。Ａ）３−１２％のブルーネイティブゲルで電気泳動した本発明のネイティブマーカー。Ｂ）４−１６％のブルーネイティブゲルで電気泳動した本発明のネイティブマーカー。Ｃ）４−１２％のトリス−グリシンゲルで電気泳動した本発明のネイティブマーカー。
【図１Ａ】
2008547035.tif 000003
【図１Ｂ】
2008547035.tif 000004
【図１Ｃ】
2008547035.tif 000005
【図２】
2008547035.tif 000006
【図３】
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【図４】
2008547035.tif 000008
【図５】
2008547035.tif 000009
【図６】
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【国際調査報告】
2008547035.tif 000011