(57)【要約】  本発明者等は、可溶性エリスロポエチン結合タンパク質および該エリスロポエチン結合タンパク質に対する抗体の両者が、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）と共に哺乳動物に投与される時、エリスロポエチンにより通常惹起される血圧上昇を防止または低減し、一方でＥｐｏ処置の目的であるヘマトクリットの上昇に影響を及ぼさないことを発見した。本発明は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）を哺乳動物に投与し；そして、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を該哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における貧血を処置する方法を提供する。本発明はさらに、Ｅｐｏの投与されている哺乳動物における高血圧を低減する方法、ならびに、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐおよび／またはＥｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質を含有する薬学的組成物を提供する。
2008505191.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）を哺乳動物に投与し；そして、
可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を該哺乳動物に投与することを含む、
哺乳動物における貧血を処置する方法。
【請求項２】
物質が可溶性Ｅｐｏ−ｂｐである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性Ｅｐｏ−ｂｐが哺乳動物のＥｐｏレセプターの可溶性部分のフラグメントを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
可溶性Ｅｐｏ−ｂｐが配列番号２の少なくとも３０残基のフラグメントを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
可溶性Ｅｐｏ−ｂｐが配列番号２の少なくとも３０残基のフラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
可溶性Ｅｐｏ−ｂｐが配列番号２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
可溶性Ｅｐｏ−ｂｐが配列番号２である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
物質が、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
認識タンパク質が配列番号２に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
認識タンパク質が抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が抗体フラグメントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体フラグメントがＦａｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｅｐｏおよび物質が一諸に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｅｐｏおよび物質が別々に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
投与される物質の量が、投与されるＥｐｏの量と少なくとも等モルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
投与される物質の量が、投与されるＥｐｏの量とほぼ等モルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
物質が、哺乳動物におけるエリスロポエチン誘発性血圧上昇を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）が投与されている哺乳動物における高血圧を低減する方法であって、
可溶性エリスロポエチン結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質の有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１９】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）；および、
可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質、
を含む薬学的組成物。
【請求項２０】
認識タンパク質が配列番号２に対する抗体である、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
Ｅｐｏ−ｂｐが配列番号２である、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でエリスロポエチン（Ｅｐｏ）レセプターに結合する認識タンパク質、
を含む薬学的組成物。
【請求項２３】
認識タンパク質が配列番号２に対する抗体である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
可溶性エリスロポエチン結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、
を含む薬学的組成物。
【請求項２５】
Ｅｐｏ−ｂｐが配列番号２である、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
Ｅｐｏ−ｂｐが、
（ａ）アミノ末端およびカルボキシ末端を有する第一ポリペプチドセグメント（このセグメントはカルボキシ末端に配列番号７を有する）；および、
（ｂ）配列番号２からなる第二ポリペプチドセグメント（この第二ポリペプチドセグメントは第一ポリペプチドセグメントのカルボキシ末端に共有結合している）、
からなる融合タンパク質を発現し；そして、
その融合タンパク質をトロンビンで開裂する、
ことを含むプロセスの生成物である、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
薬物療法に使用するための、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質。
【請求項２８】
エリスロポエチン誘発性高血圧の低減に有効な医薬を製造するための、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質の使用。
【請求項２９】
薬物療法に使用するための、
（ａ）エリスロポエチン；ならびに、
（ｂ）可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質、
を含む組成物。
【請求項３０】
成分（ｂ）を含有しない比較組成物よりも高血圧を誘発しにくい、貧血の処置に有効な医薬を製造するための、
（ａ）エリスロポエチン；ならびに、
（ｂ）可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質、
を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００４年５月１７日出願の米国実用特許出願第１０／８４８６８９号、エリスロポエチン関連高血圧を防止するための組成物および方法、に対する優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチンは、ＰＲＯＣＲＩＴ（エポエチン）、ＥＰＯＧＥＮ（エポエチン）、およびＡＲＡＮＥＳＰ（ダルベポエチン）という商標で販売されている。エリスロポエチンは、貧血、特に慢性腎不全および癌化学療法に関連する貧血の処置を適応とする。
【０００３】
脈管形成因子エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、赤血球形成の刺激によりヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度を増加させ、血液粘度（１−５）および血圧（１−１４）の上昇を招く。臨床試験では、組換えヒトＥｐｏによる処置を受けた透析患者のほぼ三分の一が血圧上昇を示している。Ｅｐｏは末梢血管抵抗を増大させ、粘度上昇により心拍出量を低下させると主張されてきた（６）。Ｅｐｏにより引き起こされる高血圧、例えば循環血液量増加症、血漿レニンおよびアンギオテンシンの増加、ならびにアドレナリン過活動、血漿アルギニンバソプレシン増加、キニンおよびプロスタグランジン減少に対するさらなるメカニズムを示唆する者もいる（１５）。日内振幅の過度の持続的上昇、血圧の過度変動および血圧上昇は、血管運動クロノーム（時間構造）の変化に基づいているのかも知れない。ホルモンその他の物質が、一つには遺伝的に血圧の日内変動に寄与する因子であるかも知れない。
【０００４】
高血圧は、心血管合併症発現における最も重要な危険因子の一つである。高血圧は概日リズムにより著しい影響を受ける。身体のホルモン濃度は、顕著な自発的日内（約２４時間）変動と共に昼夜変動し、それが血圧および心拍数に影響を及ぼす。悪性疾患の刺激と阻害の違いを生み出し得るのに充分重要なリズムもある。
【０００５】
Ｅｐｏは、哺乳動物の腎臓の管周毛細血管床にある間質細胞および肝臓の静脈周囲の（perivenenous）肝細胞によって産生される３４kDaの糖タンパク質ホルモンである（３）。Ｅｐｏは低酸素症に応答して分泌され、アポトーシスを抑制し血球前駆細胞の分裂と最終成熟を誘発することにより赤血球分化の主たる誘導および調節因子として赤血球生成を調整する（１６）。これらの効果は、Ｅｐｏが特異的細胞表面レセプターに結合する事で仲介される（１７）。ヒトＥｐｏの主構造は１９８０年代半ばから知られている（１８、１９）が、その生物活性を付与するＥｐｏ分子の構造的特徴は殆ど知られていない。ヒトＥｐｏは、システイン２９とシステイン３３およびシステイン７とシステイン１６１を連結する２個のジスルフィド結合を含んでいる。いずれの結合も生物活性にとって必須である（１８）。ヒト遺伝子の単離およびそのチャイニーズハムスター卵巣セルライン中での発現の後にエポエチン（組換えヒトエリスロポエチン）が産生された（４）。この組換えＥｐｏは、天然タンパク質のカルボキシ末端アルギニンを欠失している点でのみ成熟天然タンパク質と相違する、１６５アミノ酸成熟タンパク質である。天然ヒトＥｐｏは１９３アミノ酸ペプチドとして翻訳され、ここから２７アミノ酸リーダー配列が開裂除去される（１９、２０）。組換えＥｐｏの見かけの分子量は約３０．４kDaであり、免疫学的には内因性ホルモンと等価であるように見え、完全な生物活性を表す（１９）。
【０００６】
Ｅｐｏで処置されたヒトおよび動物は、赤血球生成の刺激によりヘマトクリット%の増大およびヘモグロビンの増加を示す（２−５）。幾つかの研究結果が、ヒトにおけるヘマトクリットレベルの増大が血圧の上昇に相関していることを示唆している（２０）。Ｅｐｏによる貧血の処置を含む別の研究では、ヘマトクリット濃度の増大およびその結果としての、抗高血圧薬物治療を必要とするほど重篤な血圧上昇が２０−３０%の患者に示された（５）。
【０００７】
高血圧はエリスロポエチンによる処置から起こる最も頻繁且つ重要な合併症である。さらに、Ｅｐｏ処置の目的はヘマトクリットおよびヘモグロビンの増大であるが、ヘマトクリットが増大すればするほど致死率および心血管事象の危険度も大きくなることが判明した（PROCRIT warnings, www.rxlist.com/cgi/generic/epoetin-wcp.htm）。これは血圧上昇に起因すると思われる。何故なら血圧上昇の程度はヘマトクリット増大の程度に相関することが示されているためである（２０）。エポエチンのラベルには、管理されていない高血圧症の患者はエポエチンによる処置を受けるべきでないとの警告がある。
【０００８】
Ｅｐｏで処置されている患者の血圧上昇を防止または処置するための新たな方法および組成物が必要とされる。高血圧を惹起することなく貧血を処置するための新たな方法および組成物が必要とされる。
【０００９】
要約
本発明者等は、膜タンパク質Ｅｐｏレセプターの可溶性フラグメントである可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質が、Ｅｐｏと共に哺乳動物に投与される時、Ｅｐｏにより通常惹起される血圧上昇を防止し、一方でＥｐｏ処置の目的であるヘモグロビンおよびヘマトクリットの上昇に影響を及ぼさないことを発見した。Ｅｐｏ結合タンパク質に対する抗体が、Ｅｐｏの誘発するヘマトクリット上昇に影響せずにＥｐｏの惹起する血圧上昇を防止する事もまた見いだされた。
【００１０】
したがって本発明は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）を哺乳動物に投与し；そして、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を該哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における貧血を処置する方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を哺乳動物に投与することを含む、Ｅｐｏが投与されている哺乳動物における高血圧を低減する方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、薬物療法における、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質の使用を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、エリスロポエチン誘発性高血圧の低減に有効な医薬を製造するための、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質の使用を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、薬物療法における可溶性エリスロポエチン結合タンパク質の使用を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、エリスロポエチン誘発性高血圧の低減に有効な医薬を製造するための、可溶性エリスロポエチン結合タンパク質の使用を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、エリスロポエチン；ならびに可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を含む薬学的組成物を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様は、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質を含有する薬学的組成物を提供する。
【００１９】
本発明の別の態様は、薬物療法に使用するための、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を提供する。
【００２０】
本発明の別の態様は、エリスロポエチン誘発性高血圧の低減に有効な薬物を製造するための、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質の使用を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、薬物療法に使用するための、（ａ）エリスロポエチン；ならびに（ｂ）可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質、を含む組成物を提供する。
【００２２】
本発明の別の態様は、成分（ｂ）を含有しない比較組成物よりも高血圧を誘発しにくい、貧血の処置に有効な医薬を製造するための、（ａ）エリスロポエチン；ならびに（ｂ）可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質、を含む組成物の使用を提供する。
【００２３】
詳細な説明
定義
本明細書中使用する「エリスロポエチン」は、赤血球産生を刺激するエリスロポエチンの生物活性を有する、天然原料から単離されたエリスロポエチンおよび組換えまたは作り出されたエリスロポエチンを包含する。これはエポエチンおよびダルベポエチンを包含する。好ましくはこのエリスロポエチンは、ヒトエリスロポエチン、配列番号３と少なくとも７０%、より好ましくは少なくとも９０%のアミノ酸配列一致を有する。配列一致は、ＰｕｂＭｅｄウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/で、ヌクレオチド配列比較のためのデフォルトＢＬＡＳＴパラメータを用いて算出する。
【００２４】
本明細書中使用する「可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質」とは、抗体ではなく、水溶性であり、高い親和性でエリスロポエチンと結合し、そしてＥｐｏと共に哺乳動物に投与するとその哺乳動物におけるＥｐｏ誘発性血圧上昇の低減に有効であるタンパク質を指す。好ましくは、エリスロポエチンとの結合に関するこのタンパク質のＫＤは１０μM未満、より好ましくは１μM未満、より好ましくは１００nM未満、そして最も好ましくは２０nM未満である。ＫＤは例えば米国特許第５８４３７２６号の実施例６に記載のような競合的結合検定により決定できる。好ましくは、この可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質はＥｐｏレセプターの可溶性部分由来の配列または同部分に相同的な配列であるか、またはそれを包含する。ヒトＥｐｏレセプター配列は配列番号１（Winkelmann, J.C.ら、1990, Blood 76:24-30）である。ヒトＥｐｏレセプターの可溶性部分は配列番号１の残基２５−２５０である。特別な態様では、Ｅｐｏとの結合に関与するＥｐｏ結合タンパク質の残基は、配列番号１の対応残基と少なくとも７０%一致し、より好ましくは少なくとも８０%一致し、より好ましくは少なくとも９０％一致し、最も好ましくは同一である。
【００２５】
本明細書中使用する「Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分」とは、水性環境において細胞の細胞外表面上に露出しているＥｐｏレセプターの部分を指す。具体的には、これは配列番号１（ヒトＥｐｏレセプター）の残基２５−２５０である配列番号２、または他のＥｐｏレセプタータンパク質の相同的可溶性残基を指す。
【００２６】
本明細書中使用する「Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質」とは、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分に結合し、Ｅｐｏと共に哺乳動物に投与すると、その哺乳動物におけるＥｐｏ誘発性血圧上昇を低減するタンパク質を指す。この認識タンパク質は、Ｅｐｏレセプターに対する、またはＥｐｏ結合タンパク質に対する完全抗体［ここでこの抗体は、Ｅｐｏレセプターの可溶性部分に結合する］、またはそのような完全抗体の結合フラグメントであってよい。この認識タンパク質は、ヒトＥｐｏレセプターまたは他の哺乳動物Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分に、少なくとも１モルあたり１０５リットル、より好ましくは１０６、より好ましくは少なくとも１０７、最も好ましくは少なくとも１モルあたり１０８リットルの結合親和性で結合する非抗体タンパク質またはペプチド（例えば、ファージディスプレー結合により選択されるタンパク質またはペプチド）であってもよい。
【００２７】
本明細書中使用する「抗体」という語は、完全抗体および完全抗体の抗原結合フラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２抗体を包含する。「抗体」という語はさらに、モノクローナルおよびポリクローナル抗体（例えば抗血清）の両者を包含する。
【００２８】
物質の投与により「高血圧を低減する」という語は、その物質を投与しなかった時に集団のかなりの割合に起こる血圧の上昇を防止または低減することを包含する。
【００２９】
説明
本発明の方法は、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質（Ｅｐｏ−ｂｐ）、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を哺乳動物に投与することを含む。
【００３０】
本発明の幾つかの態様では、この物質は可溶性Ｅｐｏ−ｂｐである。
【００３１】
幾つかの態様では、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは哺乳動物Ｅｐｏレセプターの可溶性部分のフラグメントを含む。
【００３２】
特別な態様では、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、配列番号２（ヒトＥｐｏレセプター、配列番号１の残基２５−２５０）の少なくとも３０残基のフラグメントを含む。配列番号２は、ヒトＥｐｏレセプターの細胞外可溶性部分である。別の特別な態様では、この可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、配列番号２の少なくとも１５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００残基のフラグメントを含む。
【００３３】
特別な態様では、この可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは配列番号２であるか、またはこれを包含する。配列番号２である可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、米国特許第５８４３７２６号に記載のように発現され得る。大まかに言えば、配列番号２はグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｎ末端リーダー配列との融合タンパク質として発現される。配列番号２はトロンビン開裂部位によりＧＳＴリーダー配列から分離される。発現された融合タンパク質はトロンビンにより開裂して配列番号２を放出する。配列番号２のＥｐｏ−ｂｐはヒト血清および血漿中に天然に見いだされ、恐らくはＥｐｏレセプターの開裂産物として生成されると思われる（下記実施例２を参照されたい）。
【００３４】
特別な態様では、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、ＰｕｂＭｅｄウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/の、ヌクレオチド配列比較のためのデフォルトＢＬＡＳＴパラメータを用いて算出すると、配列番号２と少なくとも７０%、少なくとも８０%、または少なくとも９０%のアミノ酸配列一致を有する。
【００３５】
本発明の幾つかの態様では、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは配列番号８であり、これはアミノ末端にさらなる２個の残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒを有する配列番号２である。
【００３６】
本発明の一つの態様では、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、融合タンパク質を発現しそれをトロンビンで開裂することを含むプロセスの生成物である。この融合タンパク質は本質的には、カルボキシ末端にタンパク質分解性トロンビン開裂部位を有する第一ポリペプチドセグメント、および本質的に配列番号２からなる第二ポリペプチドセグメントからなる。第二セグメントのアミノ末端は第一セグメントのカルボキシ末端に共有結合している。可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、この融合タンパク質をトロンビンで開裂することによって生成される。
【００３７】
本発明の一つの態様では、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、アミノ末端においてペプチド配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）に連結している配列番号２を含む融合タンパク質を発現し、その融合タンパク質をトロンビンで開裂することを含むプロセスの生成物である。
【００３８】
本発明の一つの態様では、可溶性Ｅｐｏ−ｂｐは、（ａ）アミノ末端およびカルボキシ末端を有する第一ポリペプチドセグメント（このセグメントはカルボキシ末端に配列番号７を有する）；および（ｂ）配列番号２からなる第二ポリペプチドセグメント（この第二ポリペプチドセグメントは第一ポリペプチドセグメントのカルボキシ末端に共有結合している）からなる融合タンパク質を発現し；そしてその融合タンパク質をトロンビンで開裂することを含むプロセスの生成物である。
【００３９】
本発明の方法の、別の特別な態様では、この物質は、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質である。
【００４０】
認識タンパク質は、膜にある無傷のＥｐｏレセプター分子の細胞外可溶性部分に結合することにより、Ｅｐｏ誘導性血圧上昇の低減効果を発揮することができ、または、本来血液循環に存在している可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質に結合することによって（これはＥｐｏレセプターの細胞外可溶性部分と同じアミノ酸配列を持ち、よって該レセプターのタンパク質分解産物であるかも知れない）、または、これらのメカニズムの両方、もしくは他の未知のメカニズムによってその効果を発揮するのかも知れない。「Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質」としてこの物質の態様を記載することは、認識タンパク質の特徴を説明する意図を持つものであり、必ずしも認識タンパク質の作用メカニズムを説明しようとするものではない。
【００４１】
特別な態様では、認識タンパク質は配列番号２に結合する。即ち、認識タンパク質は配列番号２の中の幾らかの配列を認識しそれに結合する。例えばこの認識タンパク質は、配列番号２に対する抗体、Ｅｐｏレセプターに対する抗体［ここでこの抗体は配列番号２に結合する］、または配列番号２のペプチドフラグメントに対する抗体であり得る。
【００４２】
特別な態様では、認識タンパク質は抗体である。特別な態様では、この抗体は完全抗体である。特別な態様では、この抗体は抗体フラグメントである。例えば抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２、またはＦｖであってよい。
【００４３】
特別な態様では、抗体は配列番号２に対する抗体である。
【００４４】
別の特別な態様では、認識タンパク質は非抗体タンパク質またはペプチドである。例えばこれは、ファージディスプレーにより選択される認識ペプチドまたはタンパク質であってよい。ファージディスプレーを用いて結合ペプチドを選択する方法は、Sidhu SS, Lowman HB, Cunningham BC, and Wells JA: Phage display for selection of novel binding peptides.  Methods in Enzymology 2000; 328:333-363に開示されている。
【００４５】
特別な態様では、この物質は可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質およびＥｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上で該レセプターに結合する認識タンパク質の組み合わせである。
【００４６】
Ｅｐｏおよび該物質は別々に、または一諸に投与できる。
【００４７】
特別な態様では、投与される該物質の量は、少なくとも投与されるＥｐｏの量と等モルである。
【００４８】
特別な態様では、投与される該物質の量は、投与されるＥｐｏの量とほぼ等モルである。例えば、投与される該物質のモル数は、投与されるＥｐｏのモル数の７５%および１２５％の間とすることができる。
【００４９】
貧血を処置する方法の特別な態様では、該物質は、哺乳動物におけるエリスロポエチン誘発性血圧上昇を低減する。即ち、Ｅｐｏおよび該物質が投与された場合、その哺乳動物の血圧は、Ｅｐｏのみが投与された場合よりも上昇が小さい。
【００５０】
好ましくは、Ｅｐｏを等モル量の該物質と共に哺乳動物に投与する場合、Ｅｐｏを単独でその哺乳動物に投与した場合に上昇する血圧の７５％以上、Ｅｐｏを単独でその哺乳動物に投与した場合に上昇する血圧のより好ましくは５０％以上は血圧が上昇しない。
【００５１】
本発明のある態様は、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質を含有する薬学的組成物である。
【００５２】
本発明の別な薬学的組成物は、エリスロポエチン；ならびに可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質、Ｅｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質、およびこれらの組み合わせから選ばれる物質を含む。
【００５３】
本発明の別な薬学的組成物は、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質を含む。
【００５４】
典型的には、この薬学的組成物は薬学的に許容され得る希釈剤または担体を含む。
【００５５】
認識タンパク質を含有する薬学的組成物のある態様では、この認識タンパク質は配列番号２に対する抗体である。
【００５６】
可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質を含有する薬学的組成物のある態様では、このＥｐｏ結合タンパク質は配列番号２である。
【００５７】
該物質、可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質、およびＥｐｏレセプターの細胞外可溶性部分上でＥｐｏレセプターに結合する認識タンパク質の、他の特別な態様は、本発明の方法について記載の通りである。
【００５８】
抗体の作製
抗体を作製するため、ＥｐｏレセプターまたはＥｐｏ−ｂｐを哺乳動物に直接投与するか、または、該タンパク質もしくはそのペプチドフラグメントを担体タンパク質に結合させることができる。好適な担体タンパク質は、スカシガイヘモシアニン、牛血清アルブミン、およびオボアルブミンを包含する。担体タンパク質に結合させる方法は、一段階グルタルアルデヒド結合およびHarlow, Edら、Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)に開示されているその他の方法を包含する。
【００５９】
脊椎動物に抗体産生を誘導するため、免疫原を用いてその脊椎動物を免疫する。好ましくは免疫原を、フロイントアジュバントのようなアジュバントと共に注射して免疫反応を増強する。好適な脊椎動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジおよびニワトリを包含する。
【００６０】
モノクローナル抗体を合成するハイブリドーマを当分野で公知の方法により製造できる。例えば、Wang, H.ら、Antibody Expression and Engineering, Am. Chem. Soc., Washington, DC (1995)を参照されたい。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は当分野で公知の方法により単離できる。例えば同文献およびHarlowらを参照されたい。
【００６１】
天然抗体は、２個の等しい軽（Ｌ）鎖および２個の等しい重（Ｈ）鎖から成る四量体である。ＬおよびＨ鎖は各々抗原認識および結合に関わる可変ドメインを持っている。可変ドメインの可変性は相補性決定領域（ＣＤＲ）に集中している。
【００６２】
本発明における使用のために企図される抗体は、免疫グロブリン全体、抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ、および類似フラグメント、ＣＤＲを包含する一本鎖抗体、ならびに類似の形態を包含する種々の形態のいずれであってもよく、これらは全て本明細書で使用する「抗体」という広範な用語の範囲内にある。
【００６３】
「抗体フラグメント」という語は、全長抗体の抗原結合部分を指す。抗体フラグメントは、約４アミノ酸、約１０アミノ酸、もしくは約３０アミノ酸またはそれ以上という小ささであってよい。抗体フラグメントの幾つかの種類は以下のようなものである：
【００６４】
（１）Ｆａｂは抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、無傷の軽鎖および１本の重鎖の一部を生成する、酵素パパインによる完全抗体の消化によって生成できる。完全な抗体分子あたり２個のＦａｂフラグメントが得られる。
【００６５】
（２）Ｆａｂ’は、完全抗体をペプシンで処理し、その後還元して無傷の軽鎖および重鎖の一部を生成することにより得られる抗体のフラグメントである。完全抗体分子あたり２個のＦａｂ’フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に１またはそれ以上のシステインを包含する数個の残基が加わっている点がＦａｂフラグメントと相違している。
【００６６】
（３）Ｆ（ａｂ’）２は、完全抗体をペプシンで消化し還元をしないことによって得られるフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、２個のジスルフィド結合により結合した２個のＦａｂ’フラグメントの二量体である。
【００６７】
（４）Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。Ｆｖは、緊密に非共有結合した１個のＨおよび１個のＬ鎖可変ドメインの二量体で構成される（ＶＨ−ＶＬ二量体）。この配置では、各々の可変ドメインの３個のＣＤＲが相互作用して抗原結合部位を規定する。合計して６個のＣＤＲがその抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら１個の可変ドメイン（またはある抗原に特異的な僅か３個のＣＤＲを含む、半分のＦｖ）でも、完全な結合部位より親和性は低いものの、抗原に結合する能力を有する。
【００６８】
（５）一本鎖抗体（ＳＣＡ）は、遺伝学的に融合した一本鎖分子として適当なポリペプチドリンカーにより連結した、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む遺伝子工学的に製造された分子として定義される。
【００６９】
ポリクローナル抗体の製造は当業者に周知である。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology, section 2.4.1 (1992)を参照されたい。モノクローナル抗体の製造もまた同様に常套的である。例えば、Harlowら、726頁を参照されたい。
【００７０】
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ操作方法は当業者に周知である。例えば、本発明に従って使用するためのモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)が最初に記載したハイブリドーマ法によって製造でき、または例えば米国特許第4816567号に記載のような組換え法によって製造できる。本発明と共に使用するためのモノクローナル抗体は、Clarksonら、Nature 352:624 (1991)、およびMarksら、J. Mol. Biol. 222:581 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。別の方法は、組換え手段によってモノクローナル抗体をヒト化し、ヒトに特異的且つ認識可能な配列を含む抗体を作製することを含んでいる。総説として、Holmesら、J. Immunol. 158:2192 (1997)およびVaswaniら、Annals. Allergy, Asthma & Immunol. 81:105 (1998)を参照されたい。
【００７１】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、具体的には「キメラ」抗体［ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導された、もしくは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一または相同的であり、一方、鎖の残部は別の種から誘導された、もしくは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一または相同的である］、および、そのような抗体のフラグメント［但し、これが所望の生物活性を示す限りにおいて］を包含する（米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81:6851 (1984)）。
【００７２】
抗体フラグメントを作製する方法もまた当分野で公知である（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)を参照されたい）。本発明の抗体フラグメントは、当該抗体のタンパク質分解的加水分解によって、または、そのフラグメントをコードしているＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させることによって製造できる。抗体フラグメントは常法による完全抗体のペプシンまたはパパイン消化により得られる。例えば、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と表示される５Ｓフラグメントを得るための、ペプシンによる抗体の酵素的開裂により生成できる。このフラグメントをさらに、チオール還元剤、および場合によりジスルフィド結合の開裂で生成するスルフヒドリル基の保護基を用いて開裂させ、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを作製できる。 或いは、ペプシンを用いる酵素的開裂は、２個の一価Ｆａｂフラグメントおよび１個のＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えば米国特許第４０３６９４５号および第４３３１６４７号ならびにこれらに含まれる参考文献に記載されている。
【００７３】
重鎖を分離して一価軽−重鎖フラグメントを形成させる、またはフラグメントのさらなる開裂、またはその他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技術といった、抗体を開裂するその他の方法もまた、無傷の抗体により認識される抗原にそのフラグメントが結合する限り、利用できる。例えば、ＦｖフラグメントはＶＨおよびＶＬ鎖の結合を含む。この結合は非共有結合的であってよく、または、可変鎖が分子間ジスルフィド結合により連結、もしくはグルタルアルデヒドのような化学物質により架橋していてもよい。好ましくは、Ｆｖフラグメントはペプチドリンカーで繋がったＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、１個のオリゴヌクレオチドによって繋がったＶＨおよびＶＬドメインをコードしているＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を組み立てることによって製造する。この構造遺伝子を発現ベクター中に挿入し、その後これをＥ．ｃｏｌｉのような宿主細胞中に導入する。この組換え宿主細胞が、２個のＶドメインを架橋するリンカーを伴う単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は、例えばWhitlowら、Methods: a Companion to Methods in Enzymology, 2:97 (1991)；Birdら、Science 242:423 (1988)；Ladnerら、米国特許第４９４６７７８号；およびPackら、Bio/Technology 11:1271 (1993)に記載されている。
【００７４】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、しばしば抗原認識および結合に関与している。ＣＤＲペプチドは、目的抗体のＣＤＲをコードしている遺伝子をクローニングまたは組み立てることにより得られる。このような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって製造する。例えば、Larrickら、Methods: a Companion to Methods in Enzymology, 2:106 (1991)を参照されたい。
【００７５】
本発明は、非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト型およびヒト化型を企図している。このようなヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導した最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えば抗体の、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはその他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体は、大部分がヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエントのＣＤＲ由来の残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはウサギのＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基に置き換えられている。
【００７６】
幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見いだされない残基を含んでいることがある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練および最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質上全てを含み、その場合、ＣＤＲ領域の全てまたは実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そして、ＦＲ領域の全てまたは実質上全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部をも含むのが最適である。詳細については、Jonesら、Nature 321:522 (1986)；Reichmannら、Nature 332:323 (1988)；Presta, Curr. Opinion Struct. Biol. 2:593 (1992)；Holmesら、J. Immunol. 158:2192 (1997)；およびVaswaniら、Annals Allergy, Asthma & Immunol. 81:105 (1998)を参照されたい。
【００７７】
本発明の抗体は、その親和性、選択性、結合力またはその他望ましい性質を最適化するために突然変異させることもできる。抗体を突然変異させる一つの方法は、ファージディスプレーを用いる親和性成熟を含む。ファージディスプレーを用いる親和性成熟は、Lowmanら、Biochemistry 30:10832 (1991)に記載のプロセスを指し、Hawkinsら、J. Mol. Biol. 254:889 (1992)をも参照されたい。
【００７８】
ここで本発明を以下の非限定的実施例によって説明する。
【００７９】
実施例
実施例１
この実施例は、配列番号２を有すると考えられるＥｐｏ−ｂｐの製造を説明するものであり、これは米国特許第５８４３７２６号にも記載されている。
【００８０】
ＥｐｏＲ組換えベクターの組み立て。組換えプラスミド発現ベクターｐＪＹＬ２６を、ヒトＥｐｏレセプター細胞外可溶性ドメインコード配列を有するＰＣＲ生成物から、そしてプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（これはPharmaciaから購入した）から組み立てた。
【００８１】
全長ヒトＥｐｏＲｃＤＮＡ、配列番号４を鋳型として用いてＰＣＲ増幅を実施した。５’−センスプライマーは５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＡＡＣ−３’（配列番号５）であった。このプライマーは、５’末端にＢａｍＨ１リンカー配列を、そしてその後に全長ヒトＥｐｏＲタンパク質のアミノ酸２５−２９のコード配列を有する。３’−アンチセンスプライマーは５’−ＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＣＴ−３’（配列番号６）であった。このプライマーは、ＥｃｏＲ１リンカー、そしてその後に全長ＥｐｏＲのアミノ酸２５０から２４６までのコード配列に相補的な配列を有する。ＰＣＲは米国特許第５８４３７２６号に記載のように実施した。
【００８２】
このＰＣＲ生成物およびｐＧＥＸ−２ＴをＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１で消化し、消化されたＤＮＡをゲル電気泳動で精製した。ＰＣＲ生成物およびｐＧＥＸ−２Ｔ各々１μg/μlを含有する混合物でライゲーションを行った。ライゲーション生成物は〜５．５kbであると証明された。ライゲーションされたプラスミド混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。コロニーを成長させた。形質転換された各コロニーからＤＮＡを抽出し分析した。ＥｃｏＲ１およびＥｃｏＲ１とＢａｍＨ１で消化したＤＮＡのサイズを１％アガロースゲル中で調べ、予想されたサイズを確認した後に１個のコロニー由来のプラスミドを選択した。この方法は米国特許第５８４３７２６号に記載のように実施した。
【００８３】
ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ融合タンパク質の精製。組換えベクターｐＪＹＬ２６を含む形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。細胞抽出物をＧＳＨ−アガロースカラムを通過させた。結合したＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを還元グルタチオンで溶離した。これは米国特許第５８４３７２６号に記載のように遂行した。
【００８４】
Ｅｐｏ−ｂｐの精製。ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、Ｅｐｏ−ｂｐをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼから分離する、トロンビン特異的タンパク質分解的開裂認識配列を含んでいる。この開裂認識配列のアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）である。融合タンパク質をトロンビンで開裂し、Ｅｐｏ−ｂｐをＥｐｏ−アガロースカラムへのアフィニティ結合により精製した。これは米国特許第５８４３７２６号に記載のように遂行した。この方法により生成したＥｐｏ−ｂｐのアミノ末端、したがってトロンビン開裂部位は実験的に決定しなかった。トロンビン開裂は、配列番号２のＥｐｏ−ｂｐを生成すると考えられる。しかしながら、トロンビンは他の部位、例えば認識配列のＡｒｇおよびＧｌｙの間を開裂して、配列番号２のアミノ末端にＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドが結合したタンパク質を生成するかも知れない（配列番号８）。
【００８５】
実施例２
この実施例は、配列番号２のアミノ酸配列を有する可溶性Ｅｐｏ結合タンパク質であるＥｐｏ−ｂｐ、およびＥｐｏ−ｂｐに対するＦａｂ抗体を、Ｅｐｏと共に、またはＥｐｏ無しでラットに投与した効果を調べる実験を記載している。
【００８６】
実験方法
材料
グルタチオン（ＧＳＨ）−アガロース、ｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクターおよびＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−５０はPharmacia(Mechanicsburg, PA)から購入した。ＰＣＲ試薬はPerkin-Elmer Cetus(Norwalk, CT)からのものであり、ＡＦＦＩＧＥＬ（登録商標）１５はBioRad(Richmond, CA)からのものであった。バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ、制限酵素およびイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）はBRL Gibco(Gaithersburg, MD)から購入した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIはBio 101, La Jolla, CAからのものであった。ニトロセルロースはSchleicher & Schuell Co.(Keene, NH)からのものであった。化学ルミネセンス（ＥＣＬ）試薬および１２５Ｉ−ＥｐｏはAmersham(Arlington Heights, IL)からのものであり、非標識化ＥｐｏはChugai-Upjohn(Rosemont, IL)の寄贈品であった。トロンビン、トリプシン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスファート（ＤＦＰ）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、２，７−ジクロロフルオレセイン、ビオチン−アミドカプロイルヒドロアジド、アルカリホスファターゼコンジュゲート、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム、およびｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ｏＰＤ）はSigma(St. Louis, MO)からのものであった。ビオチン化ウサギ抗ヒツジ抗体、アビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびＩｇＧ精製キットはPierce Co.(Rockford, IL)からのものであった。ストレプトアビジンペルオキシダーゼはBoehringer Manheim Corp(Indianapolis, IN)から購入し、マイクロプレートはCorning Costa(Cambridge, MA)からのものであった。他のすべての化学物質は試薬等級のものであった。
【００８７】
Ｅｐｏ−ｂｐ、Ｅｐｏ−ｂｐに対するＦａｂ抗体（αＥｐｏ−ｂｐ）、およびＥｐｏに対するＦａｂ抗体（αＥｐｏ）は本発明者等の実験室で製造した。Ｅｐｏ−ｂｐは米国特許第５８４３７２６号に記載のように製造した。Ｅｐｏ−ｂｐは配列番号２のアミノ酸配列を持っていた。全長ヒトＥｐｏＲｃＤＮＡ（配列番号４）はDr. Bernard G. Forget, Yale Universityからのものであった。オリゴヌクレオチドはInstitute of Human Genetics, University of Minnesota, Minneapolisの微量化学施設により合成された。他のすべての化学物質は試薬等級であった。
【００８８】
動物実験
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを大学の動物飼育施設で、Ｐｕｒｉｎａ  Ｃｈｏｗおよび飲用水を自由に摂取させて飼育した。４：００から１８：００まで点灯する交互の明暗サイクルに維持したラットの血圧、ヘマトクリット、体重および脾臓重量に及ぼすＥｐｏの効果の概日段階依存性を調査した。有効な処置時間を求めるため、５週齢ラットを対照または処置群に割り当て、各群を５匹のラットから成るそれぞれ６つの亜群で構成し、００、０４、０８、１２、１６および２０時という６つの試験時間とした。Ｅｐｏ処置（Ｒｘ）対生理食塩水およびその他の処置群における体重、血圧およびヘマトクリットの、ベースラインの群相互の相違が統計学的に有意とならないよう、ラットを無作為に群に分けた。
【００８９】
Ｅｐｏまたは生理食塩水を、４週間、週に２回皮下注射する直前および直後に、血圧、ヘマトクリット、および体重を測定した。エポエチン研究報告（４）に基づきＥｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐ、およびαＥｐｏ−ｂｐの投与量を決定した。Ｅｐｏ用量は体重１kgあたり５０単位とし、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐはＥｐｏと等モル量を投与した。エリスロポエチン（エポエチン）はAmgen Company（Thousand Oaks, CA）からのものであった。アフィニティ精製Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐは本発明者等の実験室で製造した。抗体をＦａｂフラグメントまで消化し、このＦａｂ抗体を精製した。
【００９０】
血圧測定のため、ペントバルビタール（５０mg/kg）麻酔下で大腿動脈にカニューレを挿入した。実験終了時に脾臓を秤量し撮影した。脳、心臓、大動脈、ならびにＬ−およびＲ−腎臓の重量もまた測定した。
【００９１】
前駆細胞のリガンド結合部位およびＥｐｏおよびＥｐｏＲの検出：
３−４週間毎にＥｐｏ−ｂｐを３ヶ月間接種したヒツジでαＥｐｏ−ｂｐを作製した。血清を採取した後、抗体を精製し、パパインで消化してＦａｂ抗体を作製した。このＦａｂを精製した。製造者の説明に従いＦａｂを蛍光標識した。これらの材料を用いて血液および／または組織試料中のＥｐｏレセプターを検出した。負の対照細胞には抗体を添加せず、正の対照細胞には免疫前血清のＩｇＧ由来のＦａｂを加えた。抗体結合部位（Ｅｐｏレセプター）について調べるために骨髄細胞をＰＢＳで洗浄し、丸底管にウェルあたり１−３ｘ１０３細胞を分注し、５００gで２分間遠心してペレットとした。上清を除去し、フルオレセインコンジュゲートしたＦａｂ抗体１００μlを加えた。よく混合した後、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中１%ＦＣＳおよび０．０１%ＮａＮ３を含有する緩衝液４００μlを加えて細胞を３回洗浄し、５００gで２分間遠心して上清を除いた。細胞を総体積５０μlまでのＰＢＳ中に再懸濁し、倒立蛍光顕微鏡で分析した。
【００９２】
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて、非処置ヒト対象における、Ｅｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐ、ならびにＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐに対する抗体のレベルを検出および測定した。ＥＩＡマイクロプレートを、Ｅｐｏ検出のための２μg/ウェルの抗Ｅｐｏで、そしてＥｐｏ−ｂｐを検出するための２μg/ウェルの抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体（αＥｐｏ−ｂｐ）で被覆した。循環している抗Ｅｐｏおよび抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体を検出するため、ＰＢＳ中１：１０希釈血清または血漿（ｐＨ７．４）２００μlでウェルを被覆した。プレートを室温で３０分間、または４℃で一晩インキュベートした。抗体または血清でプレートを被覆した後、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５% ＴＷＥＥＮ２０）２００μl/ウェルで３回洗浄した。ＰＢＳＴ中１%ＢＳＡ ２００μl/ウェルにより、非特異結合部位を室温で３０分間ブロックした。ウェルをＰＢＳＴ ２００μl/ウェルで３回洗浄した。結合した抗体を検出するため、Ｆａｂ抗Ｅｐｏ（Ｅｐｏ検出のため）、Ｅｐｏ（抗Ｅｐｏ抗体検出のため）、Ｆａｂ抗Ｅｐｏ−ｂｐ（Ｅｐｏ−ｂｐ検出のため）、およびＥｐｏ−ｂｐ（抗Ｅｐｏ−ｂｐ検出のため）に、ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン標識を本発明者等の実験室で結合させた。ＰＢＳＴ ２００μl中の適当なペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン標識タンパク質をウェルあたり２マイクログラム加えた。これらのウェルをＰＢＳＴ ２００μlで３回洗浄した。クエン酸緩衝液中のｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）溶液（１６０μl）を各ウェルに加えた（この溶液には、２４mMクエン酸塩、５１mM Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）中１０mg/mlが含まれ、使用直前に溶液１００mlに０．４mlの３% Ｈ２Ｏ２を添加した）。５M ＮａＯＨ ４０μlを添加して反応停止させ、４０５nmで吸光度を測定した。
【００９３】
統計学
両側スチューデントｔ検定、コサイナー法および線型最小二乗リズモメトリー（２１）によってデータを解析し、変動をデータの関数とした。データを平均値±ＳＥＭとして表す。０．０５未満のｐ値を有意と考えた。
【００９４】
結果
表１において、処置前には、全処置群における血圧、ヘマトクリット、および体重の群間の差異は統計学的に有意でなかった。全体的には、体重は対照に比較してＥｐｏにより低下した（２９５対３１３g、ｐ＜０．０１）。処置前の、Ｅｐｏ処置対対照、Ｅｐｏ−ｂｐ、およびαＥｐｏ−ｂｐ（Ｅｐｏ−ｂｐに対するＦａｂ抗体）処置群におけるレファレンスの日内血圧差は、統計学的に有意ではなかった（８７±２．８対８８．８±３．４、８８．７±２．５、８４．３±２．３mmHg）。処置の後、日内血圧はＥｐｏ処置群で有意に増大した。Ｅｐｏ処置対対照、Ｅｐｏ−ｂｐ、およびαＥｐｏ−ｂｐ処置群の群間比較は以下のとおりであった：各々１３６．２±２．３対１１６．２±１．７、１１８．４±２．１および１１６．６±２．１mmHg（各ｐ＜０．０００１）。しかしながらＥｐｏ−ｂｐまたはαＥｐｏ−ｂｐをＥｐｏと共に投与した場合、血圧は生理食塩水対照群と同等レベルに維持された：Ｅｐｏ−ｂｐ＋Ｅｐｏ群では１１８．３±１．７、そしてαＥｐｏ−ｂｐ＋Ｅｐｏ処置群では１２１．０±２．０mmHg。これらはＥｐｏ処置群（１３６．２±２．３）の血圧より有意に低かった（各ｐ＜０．０００１）。
【００９５】
【表１】
2008505191.tif 000003
【００９６】
Ｅｐｏ処置は、全体的に生理食塩水、Ｅｐｏ−ｂｐまたはαＥｐｏ−ｂｐ群と比較してヘマトクリットを著明に増大させ（各々６１．６対４２．７、４３．９および４４．１%）、６回の試験のそれぞれにおいて全てｐ＜０．０００１であった。Ｅｐｏ−ｂｐまたはαＥｐｏ−ｂｐをＥｐｏと共に投与しても、Ｅｐｏの誘発するヘマトクリット増大には殆ど影響を及ぼさなかった（Ｅｐｏで６１．６%、これに対してＥｐｏ＋Ｅｐｏ−ｂｐで５８．０%、Ｅｐｏ＋αＥｐｏ−ｂｐ Ｒｘで５９．１%のヘマトクリット）。しかしながら、重大なことに、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐはいずれもＥｐｏ誘発性血圧上昇を殆ど解消した（Ｅｐｏ処置群で１３６．２mmHg、これに対して生理食塩水対照で１１６．２、Ｅｐｏ＋Ｅｐｏ−ｂｐで１１８．３、Ｅｐｏ＋αＥｐｏ−ｂｐで１２１．０）。即ち、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐの両者は、Ｅｐｏ処置により惹起される血圧上昇からラットを防御した。
【００９７】
脾腫がＥｐｏ処置群の各ラットの特徴であった（脾臓重量は全体として１．５８g、これに対して生理食塩水では０．８６、Ｅｐｏ−ｂｐでは０．８９、そしてαＥｐｏ−ｂｐでは０．８５であり、それぞれのｐ＜０．０００１であった）。Ｅｐｏ−ｂｐまたはαＥｐｏ−ｂｐをＥｐｏと共に投与しても脾腫への影響はなかった。ＥｐｏＲｘ群では脳および心臓の重量が他の全群と比較して顕著に低下したが、大動脈および腎臓の重量は各群で似通っていた。
【００９８】
図１は、棒グラフ±標準誤差（ＳＥＭ）で日内血圧を全群比較したものを示す。Ｅｐｏ処置群は、他の５群全てと比較して血圧の著明な上昇があり、各々ｐ＜０．０００１であった。図２は、ＭＥＳＯＲにおける血圧の日内変動（約２４時間の平均）、各処置群における振幅および頂点位相（ピーク時間）を示す。Ｅｐｏ処置は他の全群に比較して日内血圧（ＭＥＳＯＲ）を顕著に上昇させた（全てｐ＜０．０００１）が、全群の振幅比較は有意に相違しなかった。処置後、Ｅｐｏ処置ラットのピーク時間は、対照、Ｅｐｏ−ｂｐまたはαＥｐｏ−ｂｐ処置群に比較して昼間にシフトした（１９：４０。これに対して各々０４：０８、０５：４４、０５：１６）。この夜行性動物において、Ｅｐｏ処置による夜間から昼間ピークへのシフト変化は明白である。Ｅｐｏ−ｂｐまたはαＥｐｏ−ｂｐをＥｐｏと共に投与する場合、このシフト変化は、依然としてＥｐｏ単独処置群と同じ昼間の範囲にとどまった（各々１４：４８、１９：２０）が、Ｅｐｏ−ｂｐ＋ＥｐｏおよびαＥｐｏ−ｂｐ＋Ｅｐｏ群の血圧レベルは対照群と類似であった。
【００９９】
表２は、Ｅｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐ処置後の６つの亜群における、体重、血圧、ヘマトクリットおよび脾臓重量の日内変動をまとめたものである。Ｅｐｏ処置ラットおよび他の任意の処置群の間の体重の相違は、６つの試験時間の間で統計学的に有意ではなかった。Ｅｐｏ処置群では、対照、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐ Ｒｘ群と比較して１２、１６、２０および００時に血圧の著しい上昇が検出されたが、０４および０８時には検出されなかった。Ｅｐｏ処置は、対照、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐ Ｒｘ群と比較して全体的に、そして６つの試験時間の各々においてヘマトクリットを顕著に増大させた（全てｐ＜０．０００１）。脾臓重量は、Ｅｐｏ処置群のラットにおいて、対照、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐ群と比較して全時点で有意に増大したが、体重は各時点で比較したところ、より低値であった。
【０１００】
【表２】
2008505191.tif 000004
【０１０１】
図３は、日内ヘマトクリット比較を示す。Ｅｐｏ処置では、ヘマトクリット増大があっただけではなく、ヘマトクリットのピーク時間が夜間（２０：１５）から昼近くの時間（１１：１６）にシフトした。このグラフでは、ａ（対照）、ｃ（Ｅｐｏ−ｂｐ）、およびｄ（αＥｐｏ−ｂｐ）の群が暗周期の面に位置し、一方ｂ（Ｅｐｏ）、ｅ（Ｅｐｏ＋Ｅｐｏ−ｂｐ）、およびｆ（Ｅｐｏ±αＥｐｏ−ｂｐ）の群が明周期の面に位置している。さらに、この夜行性動物においてこれは、Ｅｐｏ Ｒｘで夜間から日中ピークへの明白なシフト変化である。Ｅｐｏ（６１．６）対対照（４２．７）、Ｅｐｏ−ｂｐ（４３．９）およびαＥｐｏ−ｂｐ（４４．１）処置におけるヘマトクリット%のＭＥＳＯＲ比較は、各時点を比較すると、全て統計学的に有意であった（各ｐ＜０．０００１）。ヘマトクリットの日内頂点間振幅の差は処置群の間で有意に相違しなかった。しかしながら、Ｅｐｏ処置群の振幅は、Ｅｐｏを投与しなかった群より大きかった（Ｅｐｏで２．４０、Ｅｐｏ＋Ｅｐｏ−ｂｐで４．４１、そしてＥｐｏ±αＥｐｏ−ｂｐで３．５９。これらに対し、対照で１．６５、Ｅｐｏ−ｂｐで１．１３、およびαＥｐｏ−ｂｐで１．７３）。
【０１０２】
図４では、生理食塩水処置ラット（図４、パネルｄ）と比較して、脾腫が各Ｅｐｏ処置ラットを特徴付けていた（ａ、ｂおよびｃ）。脾臓重量は、対照、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐ Ｒｘ群と比較してＥｐｏ処置ラットでは著しく高かった（表１および２）。
【０１０３】
この結果は、Ｅｐｏ−ｂｐおよび／またはαＥｐｏ−ｂｐ処置有りまたは無しでのＥｐｏ処置の時間が重要となり得る事を示唆している。Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐはＥｐｏの惹起する血圧上昇を防止するが、Ｅｐｏが上昇させるヘマトクリットレベルを低減しない。
【０１０４】
臨床使用におけるＥｐｏの用量は、高血圧およびその他の臓器損傷といったさらなる全身および局所副作用を防止するため再評価すべきである。
【０１０５】
Ｅｐｏ−ｂｐおよびそれに対する抗体を用いて血球前駆細胞の結合部位が同定された。骨髄前駆細胞のレセプター部位を視覚化するため、フルオレセイン標識されたαＥｐｏ−ｂｐを使用した。フルオレセイン標識された前免疫Ｆａｂの使用では、そして負の対照細胞においてはレセプターは検出されなかった。しかしながら標識化αＥｐｏ−ｂｐは、巨核球、赤芽球、正赤芽球、および骨髄芽球上の結合部位を検出した（データは示していない）。
【０１０６】
Ｅｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐ、ならびにＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐに対する抗体のレベルを、ヒトの処置されていない血清および血漿中で酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）によって測定した。ＥＩＡの結果を図５に示す。各測定の光学密度（ＯＤ）を８−１４個体試料の平均値±ＳＥＭとして二重で示す。図５に示したＯＤ値は、各試料のＯＤからブランクのＯＤ値を差し引くことにより算出した。血清および血漿のＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐのＯＤ値は互いに似通っていた：血清Ｅｐｏで０．３０８±０．０２６、血清Ｅｐｏ−ｂｐで０．２８９±０．０２２、血漿Ｅｐｏで０．２８９±０．０２８、および血漿Ｅｐｏ−ｂｐで０．２９９±０．０１５。抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体の血漿中レベルは他の３つの抗体範疇のものより著しく低値であった：血清αＥｐｏで０．０５８±０．００８、血清αＥｐｏ−ｂｐで０．０５２±０．００６、血漿αＥｐｏで０．０５４±０．０１３、および血漿αＥｐｏ−ｂｐで０．０３１±０．００４。血清αＥｐｏおよびαＥｐｏ−ｂｐレベルは似通っていたが、血漿αＥｐｏ−ｂｐ濃度は血清αＥｐｏ、血清αＥｐｏ−ｂｐ、および血漿αＥｐｏの濃度より著しく低値であった（ｐ＜０．０２５）。同じプレートで対照として調製した既知のＥｐｏ濃度を用いて、ＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐ値をmU/mlに変換した。mU/mlに変換した値は、血清Ｅｐｏ ２５．４±２．１７mU、血漿Ｅｐｏ ２４．２±２．３５mU、血清Ｅｐｏ−ｂｐ ２４．２±１．８４mU、血漿Ｅｐｏ−ｂｐ ２５．０±１．２６mUであった。この検定法は単純でラジオイムノアッセイ（Ｅｐｏで１７．７±６．３mU/ml）より鋭敏であり、ずっと低いＳＥＭを与える。さらに、この調製に使用した材料は、常法で用いられる放射性またはその他の毒性化学物質よりも環境に優しい。
【０１０７】
考察
予想通りＥｐｏ処置ラットでは、ヘマトクリットが全体的に且つ６つの試験時間の各々において顕著に増大した。加えて、Ｅｐｏ処置群で血圧上昇が観察され、脾腫がＥｐｏ処置された各ラットの特徴であった。Ｅｐｏ処置は血圧を著しく上昇させたのみならず、血圧のピーク時間を夜間から昼間へとシフトさせた。
【０１０８】
注目すべき事に、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐは、ヘマトクリットパーセントを減じることなく、Ｅｐｏの誘発する血圧上昇からラットをほぼ完全に防御した。この防御効果のメカニズムは分かっていない。しかしながらエポエチン（現在臨床使用されている組換えＥｐｏ）は、反復注射された場合に動物の生体に何らかの毒性物質を誘導するのではないかと推測できる。Ｅｐｏ−ｂｐはＥｐｏまたはその分解産物と結合し、αＥｐｏ−ｂｐもまたＥｐｏ処置により誘導される何らかの生成物に結合する可能性があることから、Ｅｐｏ−ｂｐおよび／またはαＥｐｏ−ｂｐがこの毒性物質に結合してそれを排除するのかも知れない。
【０１０９】
図２および３は、Ｅｐｏ、ならびにＥｐｏ＋Ｅｐｏ−ｂｐまたはＥｐｏ＋αＥｐｏ−ｂｐによる組み合わせ処置がピーク血圧の日内時間にシフトを惹起したことを示す。この事は、Ｅｐｏ、Ｅｐｏ＋Ｅｐｏ−ｂｐ、またはＥｐｏ＋αＥｐｏ−ｂｐによる処置の処置時間が結果に著しく影響していることを示唆している。ダールラットにおける高血圧に対する塩感受性に示されるように、内分泌処置に対する個体の遺伝的感受性もまた考慮せねばならない（２２、２３）。
【０１１０】
ヒトＥｐｏレセプター組換えベクターＪＹＬ２６のクローニングおよび純粋なヒトＥｐｏ−ｂｐおよびその抗体の精製は、リガンド結合部位の視覚化およびＥｐｏレセプターの位置する細胞型の同定を可能にする重要なベンチマークであった（Lee, 米国特許第５８４３７２６号）。リガンド結合部位を同定するため、本発明者等は幾つかの鋭敏且つ単純な方法を開発した。これらによって本発明者等はＥｐｏレセプターの構造を理解でき、またリガンド結合に関与する因子を調べることができ、そして前駆細胞の分化と増殖の調節に関わる他の因子を同定することができるかも知れない。この研究では、本発明者等の精製ヒトＥｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏの直接結合を報告する。本発明者等のＥｐｏ−ｂｐおよびその抗体は、本発明者等の知る限りでは、最初に精製された純粋なヒトＥｐｏレセプター遺伝子産物であって、nM濃度でＥｐｏおよびその抗体に特異結合する特徴がある。
【０１１１】
血球前駆細胞の結合部位は、Ｅｐｏ−ｂｐおよびその抗体を用いて調べられた。これらのデータは、全てのヒト血球前駆細胞がＥｐｏレセプターを含みＥｐｏに結合するという現在の提言を支持する。Ｅｐｏの生物生理学的メカニズムまたはＥｐｏ−Ｅｐｏレセプター相互作用に対する反応に関与する第二のメッセンジャー系が何であるかは分かっていない。この報告に提示される方法は、ＥｐｏまたはＥｐｏレセプターに関連する欠陥の同定を助け、前駆プロセスおよびリガンド結合におけるＥｐｏレセプター（ＥｐｏＲ）の役割を解明する助けとなるであろう。結果は、血球前駆細胞におけるＥｐｏ−ＥｐｏＲ相互作用の構造および機能的関係を理解する助けとなるであろう。鋭敏な検出は、血液細胞の産生および血液細胞産生の疾患におけるＥｐｏ−ＥｐｏＲ相互作用の役割を理解するのに役立ち、そして、血液学的悪性疾患および幾つかの全身性心血管疾患、例えば高血圧症の処置方法を開発するのに役立つかも知れない。
【０１１２】
結論
Ｅｐｏ処置は、生理食塩水対照、Ｅｐｏ−ｂｐ、および抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体（αＥｐｏ−ｂｐ）処置群に比較してヘマトクリットを全体として、そして６つの試験時間の各々において顕著に増大させた（全てｐ＜０．０００１）。Ｅｐｏで処置したラットにおいて、１２、１６、２０および００時に血圧上昇が検出されたが、０４または０８時には観察されなかった。Ｅｐｏ−ｂｐまたはαＥｐｏ−ｂｐをＥｐｏ処置と併せて投与した場合、血圧は対照群と同様のレベルに維持された。しかしながらヘマトクリットレベルは、Ｅｐｏ処置対Ｅｐｏ＋Ｅｐｏ−ｂｐまたはＥｐｏ＋αＥｐｏ−ｂｐ処置群で著しく変化しなかった（各々６１．６対５８．０または５９．１%）。このように、Ｅｐｏ−ｂｐおよびαＥｐｏ−ｂｐはＥｐｏ誘発性血圧上昇を低減または防止する。
【０１１３】
体重はＥｐｏ処置によって低下した。脾腫がＥｐｏ処置された各ラットの特徴であった。脳および心臓の重量は、他の全ての群と比較してＥｐｏ処置群で顕著に低値であった。これらのデータは、さらなる臓器損傷を防ぐため、Ｅｐｏ用量を再評価すべきであることを示唆している。日内変動の結果は、単独またはＥｐｏ−ｂｐおよび／またはαＥｐｏ−ｂｐと組み合わせたＥｐｏ処置の時間もまた重要となり得ることを示している。
【０１１４】
非処置ヒト志願者におけるＥｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐ、およびこれらタンパク質に対する抗体の血清および血漿中レベルを決定した。血清および血漿中ＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐレベルは似通っていた：それぞれＥｐｏ ２５．４±２．１７；２４．２±２．３５；およびＥｐｏ−ｂｐ ２４．２±１．８４；２５．０±１．２６mU/ml。血清αＥｐｏおよびαＥｐｏ−ｂｐレベルは似通っていたが、血漿αＥｐｏ−ｂｐレベルは血清もしくは血漿αＥｐｏまたは血清αＥｐｏ−ｂｐよりも著しく低かった。
【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
引用した全ての特許、特許書類、および参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】Ｅｐｏおよび他の物質で処置されたラットの各処置群の、平均日内血圧を示す棒グラフである。誤差の線分は標準誤差ＳＥＭを表す。
【図２】各処置群についての日内血圧測定値を示す。
【図３】ラットの処置群における日内ヘマトクリット変動の表示である。
【図４】Ｅｐｏ（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）、または生理食塩水（パネルＤ）で処置したラットから単離した脾臓の写真の概略図である。
【図５】ヒト志願者の血清および血漿中のＥｐｏ、αＥｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐ、およびαＥｐｏ−ｂｐの免疫検出から得た光学密度の棒グラフである。誤差の線分は標準誤差ＳＥＭを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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