(57)【要約】  ＰＤＥ４に対して活性な化合物が開示される。また，Ｘ線結晶学を用いて決定されたＰＤＥ４Ｂの結晶構造，および分子スキャフォールドの同定，ＰＤＥ４Ｂに結合してこれを調節するリガンドの開発，および既知のリガンドに基づく改良されたリガンドの同定のためのＰＤＥ４Ｂ結晶および構造情報の使用も開示される。
2008512380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学構造：
【化１】
2008512380.tif 000349
［式中，
ｋは，−ＣＲ６Ｒ７Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
Ｚは，Ｏ，Ｓ，またはＮＲ９であり；
ｔは，ＮまたはＣＨであり；
ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔとｙの両方がＮであることはなく；
ｕ，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣ−Ａであり，ｕ，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨであり；
Ａは，
【化２】
2008512380.tif 000350
からなる群より選択される構造を有し；
Ｒ６およびＲ７は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ８は，それぞれの場合に独立して，−ＯＲ９，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ８がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ８がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ９は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ９がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ９がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択されるか；または
Ｒ１０およびＲ１１は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１２およびＲ１３は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択されるか；または
Ｒ１２およびＲ１３は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１４は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１４がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１４がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１５は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１５がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１５がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択されるか；または
各Ｒ１５は，これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環と縮合した５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよく；
Ｒ１６は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１６がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１６がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択され；
Ｒ１７は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１７がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１７がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１８は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
Ｒ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
ただし，化合物は以下
【化３】
2008512380.tif 000351
の化合物ではない］
を有する化合物，およびそれらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体。
【請求項２】
ｔおよびｙはＣＨである，請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｔはＣＨであり，およびｙはＮである，請求項１記載の化合物。
【請求項４】
ｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
ここで，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，
ここで，アリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよく；および
Ｚ，ｔ，ｙ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，Ａ，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ９，Ｒ１５，Ｒ１６，Ｒ１７，およびＲ１８は，上で定義したとおりである，請求項３記載の化合物。
【請求項５】
構造：
【化４】
2008512380.tif 000352
を有する，請求項３記載の化合物。
【請求項６】
ｔ，ｕ，ｗ，およびｘはそれぞれＣＨであり，ｖはＣ−Ａであり，およびｙはＮであり，このことにより，構造：
【化５】
2008512380.tif 000353
を有する化合物を与える，請求項５記載の化合物。
【請求項７】
ｔ，ｕ，ｖ，およびｘはそれぞれＣＨであり，ｗはＣ−Ａであり，およびｙはＮであり，このことにより構造：
【化６】
2008512380.tif 000354
を有する化合物を与える，請求項５記載の化合物。
【請求項８】
ｔ，ｖ，ｗ，およびｘはＣＨであり，ｕはＣ−Ａであり，およびｙ＝Ｎであり；
ここで，Ａは，構造：
【化７】
2008512380.tif 000355
［式中，ｋ，Ｚ，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ９，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，Ｒ１５，およびＲ１９は上で定義したとおりである］
を有し，このことにより，以下の化学構造：
【化８】
2008512380.tif 000356
を有する化合物を与える，請求項１記載の化合物。
【請求項９】
ｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され，
ここで，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
ここで，アリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい，請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１５は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択されるか，または各Ｒ１５は，これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環と縮合した５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよい，請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１５が任意に置換されていてもよい低級アルキルであるとき，低級アルキルは，フルオロ，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリールおよび任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい，請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１記載の化合物；および
薬学的に許容しうる担体
を含む組成物。
【請求項１３】
ＰＤＥ４Ｂの調節が治療上の利益を与える疾病または状態に罹患しているかまたはそのリスクを有する被験者を治療する方法であって，以下：
【化９】
2008512380.tif 000357
［式中，
ｋは，−ＣＲ６Ｒ７Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
Ｚは，Ｏ，Ｓ，またはＮＲ９であり；
ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙは，それぞれ独立して，ＮまたはＣＲ１であり，ただし，ｕおよびｔの１つ以下がＮであり，およびｖ，ｗ，ｘおよびｙの２つ以下がＮであり；
Ｒ１は，それぞれの場合に独立して，水素，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４，およびＡからなる群より選択され，ただし，少なくとも１つのＲ１はＡであり；
Ａは，置換アリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ８は，それぞれの場合に独立して，−ＯＲ９，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ８がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ８がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ９は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ９がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ９がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択されるか；または
Ｒ１０およびＲ１１は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１２およびＲ１３は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択されるか；または
Ｒ１２およびＲ１３は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１４は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１４がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１４がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；および
Ｒ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択される］
の化学構造を有する有効量の化合物を前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項１４】
Ａは，
【化１０】
2008512380.tif 000358
［式中，
Ｒ１５は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１５がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１５がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択されるか；または
各Ｒ１５は，これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環に縮合している５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよく；
Ｒ１６は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１６がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１６がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択され；
Ｒ１７は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１７がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１７がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；および
Ｒ１８は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択される］
からなる群より選択される構造を有する，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ａは，以下の構造：
【化１１】
2008512380.tif 000359
を有する，請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１個以下はＮである，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ｔはＣＨであり，ｙはＮであり，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣ−Ａであり，およびｕ，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
化合物が以下の構造：
【化１２】
2008512380.tif 000360
を有する，請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物がヒトへの投与用に認可されている，請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記疾病または状態は，ＰＤＥ４Ｂ媒介性疾病または状態である，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記疾病または状態が，喘息，気管支炎，アレルギー性気管支炎，慢性閉塞性肺疾患，嚢胞性線維症，特発性肺線維症，サルコイドーシス，肺高血圧症，アレルギー性気管支炎，気腫，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンティングトン舞踏病，多発性硬化症，慢性関節リウマチ，クローン病，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，アトピー性皮膚炎，骨粗鬆症，大理石骨病，パジェット病，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ球性白血病，急性リンパ芽球性白血病，重症急性呼吸器症候群，および早期陣痛からなる群より選択される，請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
請求項１２記載の組成物を含むキット。
【請求項２３】
前記組成物がヒトへの投与について認可されたものであることを示す文書をさらに含む，請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
前記組成物が，喘息，気管支炎，アレルギー性気管支炎，慢性閉塞性肺疾患，嚢胞性線維症，特発性肺線維症，サルコイドーシス，肺高血圧症，アレルギー性気管支炎，気腫，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンティングトン舞踏病，多発性硬化症，慢性関節リウマチ，クローン病，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，アトピー性皮膚炎，骨粗鬆症，大理石骨病，パジェット病，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ球性白血病，急性リンパ芽球性白血病，重症急性呼吸器症候群，および早期陣痛からなる群より選択される適応症について認可されたものである，請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
ＰＤＥ４に対して活性な改良された調節剤を開発する方法であって，
式Ｉにしたがう複数の試験化合物のいずれかがＰＤＥ４に対して活性な参照化合物と比較して改良された１またはそれ以上の所望の薬理学的特性を与えるか否かを判定し；そして
前記所望の薬理学的特性について改良を有する化合物を選択し，このことにより改良された調節剤を得る，ことを含む方法。
【請求項２６】
前記所望の薬理学的特性が，ＰＤＥ４Ｂに対してＰＤＥ４Ｄより少なくとも１０倍高い活性である，請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記所望の薬理学的特性が，０．１０μＭ未満のＩＣ５０である，請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記参照化合物が式Ｉの化合物である，請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記改良された調節剤の少なくとも１つの誘導体が試験化合物として用いられ，および前記判定および選択が繰り返される，請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
ＰＤＥ４Ｂに対して改良された特異性を有するリガンドを開発する方法であって，
複数のホスホジエステラーゼに結合する化合物を同定し；
前記化合物の誘導体がＰＤＥ４Ｂに対して前記化合物より高い特異性を有するか否かを判定し，このことにより，ＰＤＥ４Ｂに対して改良された特異性を有するリガンドを得る，ことを含む方法。
【請求項３１】
前記化合物が前記複数のホスホジエステラーゼのいずれに対するものより少なくとも１０倍高い親和性をもってＰＤＥ４Ｂに結合する，請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物は，少なくとも１つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用する，請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物は，前記複数のホスホジエステラーゼに弱く結合する，請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記複数のホスホジエステラーゼはＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄを含む，請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
前記複数のホスホジエステラーゼはＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ５Ａを含む，請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物は式Ｉの化合物である，請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
表１または２に示される座標を有する，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの結晶形を含む結晶。
【請求項３８】
さらにもう１つの重金属原子を含む，請求項３７記載の結晶。
【請求項３９】
前記結晶形は，ＰＤＥ４Ｂと結合化合物との共結晶を含む，請求項３７記載の結晶。
【請求項４０】
前記結合化合物は，少なくとも１つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用する，請求項３９記載の結晶形。
【請求項４１】
前記共結晶がＸ線ビーム中にある，請求項３９記載の結晶形。
【請求項４２】
前記結晶がＸ線ビーム中にある，請求項３７記載の結晶形。
【請求項４３】
ＰＤＥ４Ｂの結晶を得る方法であって，ＰＤＥ４Ｂ蛋白質を５−２０ｍｇ／ｍｌで，３０％ＰＥＧ４００，０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５），１ｍＭの結合化合物，４℃；または２０％ＰＥＧ３０００，０．２Ｍ  Ｃａ（ＯＡｃ）２，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０），１ｍＭの結合化合物，１５．９ｍｇ／ｍｌの蛋白質，４℃；または１．８Ｍ−２．０Ｍ硫酸アンモニウム，０．１Ｍ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０−１０．５），０．２Ｍ硫酸リチウムと実質的に同等の結晶化条件に供することを含む方法。
【請求項４４】
さらに，前記結晶化条件を最適化することを含む，請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｂ結合化合物との共結晶であって，前記結合化合物は式Ｉの化合物を含む共結晶。
【請求項４６】
前記共結晶がＸ線ビーム中にある，請求項４５記載の共結晶。
【請求項４７】
ホスホジエステラーゼの構造を決定する方法であって，
ＰＤＥ４Ｂ構造の電子表示からホモロジーモデルを作成し，ここで，前記ＰＤＥ４Ｂ構造は，表１または２の原子座標を表し；そして
前記ホモロジーモデルをホスホジエステラーゼの前記構造と同等とみなす，ことを含む方法。
【請求項４８】
前記作成することが，
ＰＤＥ４Ｂと前記ホスホジエステラーゼとの間で保存されているアミノ酸残基を同定し；
前記ＰＤＥ４Ｂ構造中の複数の保存アミノ酸の原子座標を前記ホスホジエステラーゼの対応するアミノ酸に移動させて，前記ホスホジエステラーゼの概略構造を提供し；そして
前記ホスホジエステラーゼ中の残りのアミノ酸残基の構造の電子表示を用いて前記ホスホジエステラーゼの残部を表す構造を構築する，
ことを含む，請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
さらに，前記ホモロジーモデルを，前記ホスホジエステラーゼの１またはそれ以上の結晶からの低解像度Ｘ線回折データとフィッティングさせることを含む，請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
表１または２からの保存残基の座標を用いる，請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記ホスホジエステラーゼがＰＤＥ５Ａである，請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
表１または２に示される座標に対応する原子座標表示を含む，ＰＤＥ４Ｂの結晶構造の電子表示。
【請求項５３】
図解表示を含む，請求項５２記載の電子表示。
【請求項５４】
前記ＰＤＥ４Ｂは本質的にＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインからなる，請求項５２記載の電子表示。
【請求項５５】
ＰＤＥ４Ｂに基づくホスホジエステラーゼのホモロジーモデルの電子表示であって，ここで，前記ホモロジーモデルは，表１または２の保存残基原子座標を利用することを特徴とする電子表示。
【請求項５６】
生物学的因子を開発する方法であって，ＰＤＥ４Ｂ結晶構造を分析し，そして前記生物学的因子を形成するための少なくとも１つの基礎構造を同定することを含む方法。
【請求項５７】
前記基礎構造はエピトープを含み，および前記方法はさらに，前記エピトープに対する抗体を開発することを含む，請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記基礎構造は変更された活性を与えると予測される変異部位を含み，および前記方法はさらに，前記部位において変異を作成し，このことにより改変されたＰＤＥ４Ｂを得ることを含む，請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
前記基礎構造は，別の成分が付着するための付着点を含む，請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
前記別の成分は，ペプチド，ポリペプチド，固相材料，リンカー，および標識からなる群より選択される，請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
前記別の成分を付着させることをさらに含む，請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
ＰＤＥ４Ｂに結合する可能性を有する化合物を同定する方法であって，化合物の少なくとも１つの電子表示をＰＤＥ４Ｂ結合部位の電子表示中でフィッティングさせることを含み，ここで，前記結合部位は，表４からの保存結合部位残基の座標の電子表示を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
前記電子表示がさらに，前記結合部位において複合体を形成している結合化合物の電子表示を含む，請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
ＰＤＥ４Ｂと複合体形成した化合物のコンピュータ表示を除去し，そしてコンピュータデータベースからの化合物のコンピュータ表示をＰＤＥ４Ｂの活性部位のコンピュータ表示とフィッティングさせ；そして
好都合な幾何学的フィットおよびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて前記活性部位に最もよくフィットする化合物を潜在的結合化合物として同定する，
ことを含む，請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
ＰＤＥ４Ｂと複合体形成した化合物のコンピュータ表示を，１またはそれ以上の化学基の欠失または付加またはその両方により改変し；
コンピュータデータベースからの化合物のコンピュータ表示をＰＤＥ４Ｂの活性部位のコンピュータ表示とフィッティングさせ；そして
好都合な幾何学的フィットおよびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて前記活性部位に最もよくフィットする化合物を潜在的結合化合物として同定する，
ことを含む，請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
ＰＤＥ４Ｂと複合体形成した化合物のコンピュータ表示を除去し；そして
化合物検索コンピュータプログラムを用いて前記化合物と構造的類似性を有する化合物についてデータベースを検索するか，または化合物構築コンピュータプログラムを用いて前記化合物の一部を類似する化学構造で置き換える，
ことを含む，請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
ＰＤＥ４Ｂと複合体を形成する前記化合物が非加水分解性ｃＧＭＰ類似体である，請求項６３記載の方法。
【請求項６８】
前記フィッティングが，前記化合物が保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基の１またはそれ以上と相互作用するか否かを判定することを含む，請求項６２記載の方法。
【請求項６９】
ＰＤＥ４Ｂ結合化合物またはその誘導体を，前記ＰＤＥ４Ｂ結合化合物の実質的なＰＤＥ４Ｂ結合を保持するように付着成分に結合させる方法であって，前記ＰＤＥ４Ｂ結合化合物またはその誘導体を前記付着成分の結合についてエネルギー的に許容される部位に結合させることを含む方法。
【請求項７０】
前記付着成分が固相媒体に結合させるためのリンカーであり，および前記方法がさらに，前記化合物または誘導体を前記エネルギー的に許容される部位に結合したリンカーを介して固相媒体に結合させることを含む，請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記ホスホジエステラーゼが，少なくとも１つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基とマッチする保存残基を含む，請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記リンカーは無痕跡リンカーである，請求項７０記載の方法。
【請求項７３】
前記ホスホジエステラーゼ結合化合物またはその誘導体が前記固相媒体に結合した前記リンカー上で合成される，請求項７０記載の方法。
【請求項７４】
複数の前記化合物または誘導体がコンビナトリアル合成で合成される，請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記化合物の前記固相媒体への付着により親和性媒体が生ずる，請求項７０記載の方法。
【請求項７６】
前記付着成分は標識を含む，請求項６９記載の方法。
【請求項７７】
前記標識は蛍光団を含む，請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
ＰＤＥ４Ｂ結合化合物と，前記改変型化合物のＰＤＥ４Ｂへの結合がエネルギー的に許容される部位においてこれに結合したリンカー成分を含む改変型化合物。
【請求項７９】
前記リンカーは固相に付着されている，請求項７８記載の化合物。
【請求項８０】
前記リンカーは，標識を含むかまたはこれに付着されている，請求項７８記載の化合物。
【請求項８１】
前記リンカーは無痕跡リンカーである，請求項７８記載の化合物。
【請求項８２】
前記結合化合物は式Ｉの化合物である，請求項７８記載の化合物。
【請求項８３】
ホスホジエステラーゼのリガンドを開発する方法であって，前記ホスホジエステラーゼは，１またはそれ以上の保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基にマッチした保存残基を含んでおり，該方法は，前記ホスホジエステラーゼに結合するＰＤＥ４Ｂ結合化合物が結晶構造中において前記１またはそれ以上の保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用するか否かを判定することを含む方法。
【請求項８４】
前記ホスホジエステラーゼは，少なくとも２つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基とマッチする保存残基を含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
さらに，前記化合物が前記ホスホジエステラーゼを調節するか否かを判定することを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
前記決定することが，前記化合物を前記ホスホジエステラーゼの結合部位においてコンピュータフィッティングさせることを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
さらに，前記ホスホジエステラーゼと前記化合物との共結晶を形成することを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８８】
さらに，前記化合物の前記ホスホジエステラーゼとの結合の向きを決定することを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８９】
前記結合化合物は式Ｉの化合物である，請求項８３記載の方法。
【請求項９０】
ＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｄとの間で選択性を有する化合物を同定する方法であって，
化合物がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄと少なくとも１つの異なる部位で異なるように相互作用するか否かを分析することを含み，ここで，異なる相互作用は前記選択性を示す，ことを特徴とする方法。
【請求項９１】
前記分析が，
前記化合物の電子表示をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示中でフィッティングさせ；そして
前記フィッティングに基づいて，前記化合物が異なるように相互作用するか否かを判定する，
ことを含む，請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
初期化合物の電子表示をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示にフィッティングさせ，ここで，前記初期化合物はＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの両方に結合し；
前記初期化合物の前記電子表示を，少なくとも異なる部位で相互作用する少なくとも１つの成分で改変し；そして
改変された化合物がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに異なるように結合するか否かを判定する，
ことを含む，請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
前記改変された化合物が前記初期化合物と異なるより高い程度で結合する，請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
さらに，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに対して異なるように相互作用する化合物を異なる活性についてアッセイすることを含む，請求項９０記載の方法。
【請求項９５】
前記化合物が式Ｉの化合物である，請求項９０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は，ＰＤＥ４のアイソフォームであるＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄを含むホスホジエステラーゼＰＤＥ４のリガンドの開発，およびＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄの結晶構造の使用に関する。さらに，本発明は，ＰＤＥ４に対する活性を有する化合物，およびこれを使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
以下に提供される情報は，読者の理解を助けることのみを意図するものである。提供される情報および引用される参考文献のいずれも，本発明に対する従来技術であると認めるものではない。引用される参考文献のそれぞれは，その全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００３】
発明の背景
ホスホジエステラーゼ(PDE)は，最初にSutherland及び共同研究者(Railら，J．Biol．Chem.，232巻：1065-1076頁(1958年)；Butcherら，J．Biol．Chem.，237巻：1244-1250頁(1962年))によって発見された。PDEのスーパーファミリーは二つの大きな分類，クラスIとクラスIIに分けられ(Charbonneau．H.，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation  and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.編)267-296頁，John  Wiley  &  Sons，Inc.，New  York(1990年))，これは，認識可能な配列類似性をもたない。クラスIとしては，全ての公知の哺乳類PDEが挙げられ，別々の遺伝子の産物である11個の特定されたファミリーから構成される(Beavoら，MoI．Pharmacol.，46巻：399-405頁(1994年)；Contiら，Endocr．Rev.，16巻：370-389頁(1995年)；Degermanら，J．Biol．Chem.，272巻：6823-6826頁(1997年)；Houslay，M.D.，Adv．Enzyme  Regul，35巻：303-338頁(1995年)；Bolger，G.B.，Cell  Signal，6巻：851-859頁(1994年)；Thompsonら，Adv．Second  Messenger  Phosphoprotein  Res.，25巻：165-184頁(1992年)；Underwoodら，J．Pharmacol．Exp．Ther.，270巻：250-259頁(1994年)；Michaeliら，J.．Biol．Chem.，268巻：12925-12932頁(1993年)；Soderlingら，Proc．Natl．Acad．Sci  U.S.A.，95巻：8991-8996頁(1998年)；Soderlingら，J．Biol．Chem.，273巻：15553-15558頁(1998巻)；Fisherら，J．Biol．Chem.，273巻：15559-15564頁(1998年))。PDEによっては，cAMPの加水分解に対して非常に特異的である(PDE4，PDE7，PDE8)が，あるものは非常にcGMP-特異的(PDE5，PDE6，PDE9)であり，あるものは混合特異性をもつ(PDE1，PDE2，PDE3，PDE10，PDE11)(Conti，Molecular  Endocrinology，14:1317-1327(2000))。
【０００４】
特徴付けされた哺乳類PDEは全て二量体であるが，PDEそれぞれの機能に関してこの二量体構造の重要性というのは知られていない。PDEはそれぞれPDEファミリーのアミノ酸配列の高い保存率(25〜30%)で約270個のアミノ酸の保存された触媒的ドメインを有し，これはその調節ドメインのカルボキシル末端に位置する。特定のPDEのアクチベーターは，酵素構造内に配置された自己阻害ドメインの影響を緩和するようである(Sonnenbergら，J．Biol．Chem.，270巻：30989-31000頁(1995年)；Jinら，J．Biol．Chem.，267巻：18929-18939頁(1992年))。
【０００５】
PDEは，リン原子で構造の反転によってその３’-位置でリン原子と酸素原子との間の環式ヌクレオチドホスホジエステル結合を開裂する(Goldbergら，J．Biol．Chem.，255巻：10344-10347頁(1980年)；Burgersら，J．Biol．Chem.，254巻：9959-9961頁(1979年))。これは明らかに，イオン化したH2OのOH−によるインライン求核攻撃によるものである。PDE内の保存された金属結合モチーフに結合した金属は，OH−を攻撃し易くすると提案されてきた(Francisら，J．Biol．Chem.，269巻：22477-22480頁(1994年))。触媒の動的特性は，触媒に必要な(単数または複数種類の)二価カチオンと環式ヌクレオチドに関してランダムオーダーメカニズムと一致する(Srivastavaら，Biochem．J.，308巻：653-658頁(1995年))。全ての公知の哺乳類PDEの触媒ドメインは，縦に一列に並んだ二つの配列(HX3  BXn(E/D))を含み，そのそれぞれはサーモリシンなどのメタロエンドプロテアーゼの単一のZn2+-結合部位に似ている(Francisら，J．Biol．Chem.，269巻：22477-22480頁(1994年))。PDE5はZn2+を特異的に結合し，PDE4，PDE5，及びPDE6の触媒活性は，サブマイクロモル濃度のZn2+によって支持される(Francisら，J．Biol．Chem.，269巻：22477-22480頁(1994年)；Percivalら，Biochem．Biophys．Res．Commim.，241巻：175-180頁(1997年))。Zn2+-結合モチーフのそれぞれが独立してZn2+に結合するか，または二つのモチーフが相互作用して新規なZn2+-結合部位を形成するのかは知られていない。PDEによる環式ヌクレオチドのホスホジエステラーゼ結合を開裂する触媒機構は，ペプチドのアミドエステルを開裂する特定のプロテアーゼの触媒機構と似ているかもしれないが，PDEに縦に一列に並んで配列された二つのZn2+モチーフの存在が新しい。
【０００６】
SutherlandとRallのグループ(Berthetら，J．Biol．Chem.，229巻：351-361頁(1957年))は，1950年代後半になって，それによってカフェインがcAMP  PDE活性の肝臓か関与するグリコーゲン分解及びｃAMP蓄積におけるグルカゴンの作用，アデニリルシクラーゼの刺激剤の作用を強める，(単数または複数種類の)メカニズムの少なくとも一部に気づいた。以来，化学者は，広く使用されていた3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を含む，多くのPDE阻害剤を合成してきた。その多くの化合物並びにカフェインは，非選択性であり，且つPDEファミリーの多くを阻害する。PDE研究における重要な一つの利点は，PDE4阻害剤，ロリプラム及びPDE5阻害剤，シルデナフィルなどのファミリー特異的阻害剤の発見/設計であった。
【０００７】
細胞におけるPDE機能を正確に調節するには，環式ヌクレオチドレベルを狭い濃度範囲に維持することが重要である。基底レベルの２〜４倍以上のcGMPに上昇すると，通常，最大の生理学的応答を生じる。PDEの調節には三つの一般的なスキームがある：(a)基質利用性による調節，たとえば二重特異性PDE(たとえばPDE1，PDE2，PDE3)のどれかで起こりえる，他方との競合により一方の環式ヌクレオチドの加水分解速度を変えたり，環式ヌクレオチドレベルを増加させた後の，質量的作用によってPDE活性を刺激する；(b)インスリンによるPDE3活性の刺激(Degermanら，J．Biol．Chem.，272巻：6823-6826頁(1997年))；この酵素によりPDE6相互作用を変えるトランスデューシンシステム(Yamazakiら，J．Biol．Chem.，255巻：11619-11624頁(1980年))を介するフォトンによるPDE6活性の刺激；またはCa2+/カルモジュリンとの高い相互作用によるPDE1活性の刺激となる，細胞間シグナル伝達(たとえば，リン酸化事象，Ca2+，ホスファチジン酸，イノシトールホスフェート，タンパク質-タンパク質相互作用)を変える細胞外シグナルによる調節；(c)フィードバック調節，たとえば，cAMP上昇後にPKAにより触媒作用を受けたPDE１，PDE3，若しくはPDE4(Contiら，Endocr．Rev.，16巻：370-389頁(1995年)；Degermanら，J．Biol．Chem.，272巻：6823-6826頁(1997年)；Gettysら，J．Biol．Chem.，262巻：333-339頁(1987年)；Florioら，Biochemistry，33巻：8948-8954頁(1994年))，PDE2へのアロステリックcGMP結合によって，cGMP上昇後のcAMP若しくはcGMPの分解を促進させることにより，またはcAMP-上昇剤に細胞を長期暴露させた後に高濃度のPDE3若しくはPDE4によって発生する脱感作などのPDEタンパク質レベルの調節により(Contiら，Endocr．Rev.，16巻：370-389頁(1995年)，Shethら，Throm．Haemostasis，77巻：155-162頁(1997年))または，PDE5含有量における発生的に関係する変化によって調節される。上記に概説したこの三つのスキームのどれかに影響を与え得る他の因子は，プレニル化などによる共有結合の修飾または，細胞内の区画の間のPDEの転座及びPDE一次構造における特異的な標的配列により作用を受ける，細胞の区画化である(cellular  compartmentalization)(Houslay，M.D.，Adv．Enzyme  Regul，35巻：303-338頁(1995年))。
【０００８】
PDEスーパーファミリーの中で，10個のファミリーのうち４つ(PDE2，PDE5，PDE6，及びPDE10)は，種々の基質特異性の触媒作用部位に加えて，高いcGMP-特異的アロステリック(非触媒作用的)cGMP-結合部位を含む。これらの二量体dGMP-結合PDEのモノマーはそれぞれ，タンパク質のアミノ末端部分に縦に一列に含まれ且つ配置された約110個のアミノ酸の二つの同族dGMP-結合部位を含む(Charbonneau，H.，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation  and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.，編)267-296頁(1990年)；McAllister-Lucasら，J．Biol．Chem.，270巻：30671-30679頁(1995年))。PDE2では，これらの部位へのcGMPの結合によって，触媒的部位でcAMPの加水分解を刺激する(Beavoら，MoI．Pharmacol，46巻：399-405頁(1994年))。PDE2はcGMP並びにcAMPを加水分解し，cGMP加水分解は，正の協同的速度論に従ってアロステリックサイトにおけるcGMP結合により刺激される(Manganielloら，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation，and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.，編，61-85頁，John  Wiley  &  Sons，Inc.，New  York(1990年))。これは，組織cGMPレベルの調節の負のフィードバックプロセスを示し(Manganielloら，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation，and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.編，61-85巻，John  Wiley  &  Sons，Inc.，New  York(1990年))，これはcAMP機能停止のcGMP刺激により表される環式ヌクレオチド経路の間のクロストークに加えて起きる。PDE6のアロステリック部位へのcGMPの結合は，触媒作用に影響を与えることは示されていないが，この結合は，調節タンパク質，トランスデューシン，及びPDE6の阻害γサブユニットの相互作用を調節することができる(Yamazakiら，Adv．Cyclic  Nucleotide  Protein  Phosphorylation  Res.，16巻：381-392頁(1984年))。
【０００９】
PDE4サブファミリーは，４つの構成員から構成される：PDE4A，ＰＤＥ４Ｂ(配列番号1)，PDE4C，及びPDE4D(配列番号２)(Contiら，(2003年)J．Biol  Chem．278年：5493-5496頁)。このPDE4酵素は，基質としてcGMPよりもcAMPに対して優先傾向を示す。これらの酵素は，おそらく二量体形成を媒介するN-末端調節ドメインを有し，これにより最適にPDE活性が調節される。さらに，活性は，このアップストリーム調節ドメインのcAMP-依存性プロテインキナーゼリン酸化部位を介して調節される。これらの酵素は，偏在的に発現されるが，重要なことにはリンパ球中で発現される。
【００１０】
PDE4酵素の阻害剤は，炎症性疾患の処置で有用であると提案されてきた。ＰＤＥ４Ｂのノックアウトによって生存応力のあるマウスが得られたが(Jin及びConti(2002年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，99巻，7628-7633頁)，ＰＤＥ４Ｄのノックアウトでは生存率が低下した(Jinら，(1999年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，96巻，11998-12003頁)。PDE4Dノックアウト遺伝子型は，他の生育環境のマウス系で繁殖させることによって奪回できる。これらのPDE4Dノックアウト胎児からの気道上皮細胞は，アドレナリンアゴニストに対して非常に低い過敏性を示し，このことは，気道炎症疾患において治療標的としてPDE4Dを示唆している(Hansenら，(2000年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，97巻，6751-6756頁)。PDE4B-ノックアウトマウスは，症状が殆どなく，且つ正常な気道感受性を有する。Ｄｅｌｇａｄｏら（ＭｅｄＳｃｉＭｏｎｉｔ，２００３，９：ＢＲ２５２−２５９）は，アトピー性皮膚炎を有する患者の血液単核球白血球におけるＰＤＥ４活性の上昇が記述されていること，および炎症性細胞におけるヒスタミンとＰＤＥ４との推定される関連性に鑑みて，ヒスタミンはＵ−９３７細胞においてＨ２レセプター刺激およびｃＡＭＰ増加を介してＰＤＥ４活性をアップレギュレートしていることを報告している。
【００１１】
対照的に，ＰＤＥ４Ｂノックアウトマウスからの単球は，LPSに対する応答が低い(Jin及びConti(2002年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，99巻，7628-7633頁)。このことは，種々のPDE4Dに対して選択性を有するPDE4B化合物は，副作用が少ない，抗炎症活性を示すことを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって，当該技術分野においては，ＰＤＥ４，例えばＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄのより効力の高い，特異的な阻害剤および調節剤，およびこれらを設計する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は，ＰＤＥ４，例えば，ＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄアイソフォームに対して活性な化合物を提供する。特に，本発明は，以下に記載される式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，およびＩｅの化合物を提供する。すなわち，本発明は，ＰＤＥ４の調節が関与する治療方法において用いることができる化合物，ならびにＰＤＥ４，および他のＰＤＥの別の調節剤を開発するための分子スキャフォールドを提供する。本発明はさらに，ＰＤＥ４Ｂに関する構造情報を使用して別のＰＤＥ４Ｂ調節剤を誘導することを含む。
【００１４】
１つの観点においては，本発明は以下の構造：
【化１３】
2008512380.tif 000003
式Ｉ
［式中，
ｋは，−ＣＲ６Ｒ７Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，ａｎｄ−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
ＺはＯ，Ｓ，またはＮＲ９であり；
ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙは，それぞれ独立して，ＮまたはＣＲ１であり，ただし，ｕおよびｔの１つ以下がＮであり，ｖ，ｗ，ｘおよびｙの２つ以下がＮであり；
Ａは，置換アリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１は，それぞれの場合に独立して，水素，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４，およびＡからなる群より選択され，ただし，少なくとも１つのＲ１はＡであり；
Ｒ６およびＲ７は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ８は，それぞれの場合に独立して，−ＯＲ９，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ８がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ８がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ９は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ９がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ９がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択されるか；または
Ｒ１０およびＲ１１は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１２およびＲ１３は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択されるか；または
Ｒ１２およびＲ１３は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１４は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１４がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１４がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択される］
を有する式Ｉの化合物，これらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体を提供する。
【００１５】
本発明の１つの態様においては，式Ｉのｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１つ以下がＮである。１つの態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１つ以下がＮである。１つの態様においては，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘはＣＲ１であり，ｙはＮまたはＣＲ１である。さらに別の態様においては，ｔはＣＨである。１つの態様においては，ｔはｓＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣ−Ａであり，ｕ，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。ただし，化合物は以下の化合物
【化１４】
2008512380.tif 000004
ではない。
【００１６】
本発明の１つの態様においては，ｔはＣＨであり，ｙはＮであり，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣ−Ａであり，ｕ，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨであり，ただし，化合物は以下の化合物
【化１５】
2008512380.tif 000005
ではない。
【００１７】
上述のいずれかの態様に加えて，式ＩのＡは，置換フェニル，ジアルコキシフェニル，ピラゾールカルボキシルエステル，置換ピリジン，置換ピリミジン，および置換チエノピリミジンからなる群より選択される。１つの態様においては，Ａは，以下の基のいずれかの構造を有し，ここで，波線は式Ｉの二環のコア構造への結合を示す：
【化１６】
2008512380.tif 000006
［式中，
Ｒ１５は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１５がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１５がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択されるか；または
両方のＲ１５は，これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環に縮合した５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよく；
Ｒ１６は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１６がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１６がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択され；
Ｒ１７は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１７がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１７がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１８は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ａｎｄ任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択される］。
【００１８】
上述のいずれかの態様に加えて，式Ｉの化合物のｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され，ここで，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，ここで，アリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００１９】
本発明のある態様においては，式Ｉの化合物は式Ｉａ：
【化１７】
2008512380.tif 000007
式Ｉａ
［式中，ｔ，ｖ，ｗ，ｘ，ｙ，ｋおよびＡは，上述の式Ｉで定義したとおりである］
およびこれらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体の構造を有する。
【００２０】
１つの態様においては，式Ｉａの化合物のＡは，以下の基の１つの構造を有し，ここで，波線は式Ｉａの二環のコア構造への結合を示す：
【化１８】
2008512380.tif 000008
［式中，Ｒ１５，Ｒ１６，Ｒ１７およびＲ１８は，上述の式Ｉで定義したとおりである］。
【００２１】
本発明の別の態様においては，ｔ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１つ以下はＮである。１つの態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１つ以下がＮである。１つの態様においては，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘはＣＲ１であり，ｙはＮまたはＣＲ１である。さらに別の態様においては，ｔはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｖ，ｗ，およびｘの２つはＣＲ１であり，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｖ，ｗ，およびｘはＣＨである。別の態様においては，ｔ，ｖ，ｗ，ｘおよびｙはＣＨである。別の態様においては，ｔ，ｖ，ｗおよびｘはＣＨであり，ｙはＮである。別の態様においては，ｔおよびｙはＣＨであり，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＣＨであり，ｙはＮであり，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。式Ｉａの上述のいずれかの態様に加えて，化合物は以下の化合物：
【化１９】
2008512380.tif 000009
ではない。
【００２２】
１つの態様においては，式Ｉａの化合物のｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され，ここで，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，ここで，アリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００２３】
本発明のある態様においては，式Ｉの化合物は式Ｉｂ：
【化２０】
2008512380.tif 000010
式Ｉｂ
［式中，ｔ，ｕ，ｗ，ｘ，ｙ，ｋおよびＡは，上述の式Ｉで定義したとおりである］
およびこれらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体の構造を有する。
【００２４】
１つの態様においては，式Ｉｂの化合物のＡは以下のいずれかの構造を有し，ここで，波線は式Ｉｂの二環のコア構造への結合を示す：
【化２１】
2008512380.tif 000011
［式中，Ｒ１５，Ｒ１６，Ｒ１７およびＲ１８は，上述の式Ｉで定義したとおりである］。
【００２５】
本発明の別の態様においては，ｔ，ｕ，ｗ，ｘ，およびｙの１つ以下がＮである。１つの態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１つ以下がＮである。１つの態様においては，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘはＣＲ１であり，ｙはＮまたはＣＲ１である。さらに別の態様においては，ｔはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｕ，ｗ，およびｘの２つはＣＲ１であり，ｕ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｕ，ｗ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｕ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｕ，ｗ，およびｘはＣＨである。別の態様においては，ｔ，ｕ，ｗ，ｘおよびｙはＣＨである。別の態様においては，ｔはＣＨであり，ｙはＮであり，ｕ，ｗ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｕ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔ，ｕ，ｗおよびｘはＣＨであり，ｙはＮである。別の態様においては，ｔおよびｙはＣＨであり，ｕ，ｗ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｕ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである。式Ｉｂの上述のいずれかの態様に加えて，化合物は以下の化合物
【化２２】
2008512380.tif 000012
ではない。
【００２６】
本発明の１つの態様においては，式Ｉｂの化合物のｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され，ここで，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，ここで，アリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００２７】
ある態様においては，式Ｉの化合物は，式Ｉｃ：
【化２３】
2008512380.tif 000013
式Ｉｃ
［式中，ｔ，ｕ，ｖ，ｘ，ｙ，ｋおよびＡは，上述の式Ｉで定義したとおりである］
およびこれらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体の構造を有する。
【００２８】
１つの態様においては，式Ｉｃの化合物のＡは，以下の基のいずれかの構造を有し，ここで，波線は式Ｉｃの二環のコア構造への結合を示す：
【化２４】
2008512380.tif 000014
［式中，Ｒ１５，Ｒ１６，Ｒ１７およびＲ１８は，上述の式Ｉで定義したとおりである］。
【００２９】
本発明の別の態様においては，ｔ，ｕ，ｖ，ｘ，およびｙの１つ以下がＮである。１つの態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１つ以下がＮである。１つの態様においては，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘはＣＲ１であり，ｙはＮまたはＣＲ１である。さらに別の態様においては，ｔはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｕ，ｖ，およびｘの２つはＣＲ１であり，ｕ，ｖおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｕ，ｖ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｕ，ｖおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＮまたはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，ｔおよびｙは両方ともＮであることはなく，ｕ，ｖ，およびｘはＣＨである。別の態様においては，ｔ，ｕ，ｖ，ｘおよびｙはＣＨである。別の態様においては，ｔ，ｕ，ｖおよびｘはＣＨであり，ｙはＮである。別の態様においては，ｔおよびｙはＣＨであり，ｕ，ｖ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｕ，ｖおよびｘの他のものはＣＨである。別の態様においては，ｔはＣＨであり，ｕ，ｖ，およびｘの１つはＣＲ１であり，ｕ，ｖ，およびｘの他のものはＣＨであり，ｙはＮまたはＣＨであり，ただし，化合物が以下の構造：
【化２５】
2008512380.tif 000015
を有する場合，Ｒ１は，水素，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，任意に置換されていてもよい低級アルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択される。
【００３０】
本発明の１つの態様においては，式Ｉｂの化合物のｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され，ここで，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，ここで，アリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００３１】
本発明のある態様においては，式Ｉの化合物は，式Ｉｄ：
【化２６】
2008512380.tif 000016
式Ｉｄ
［式中，ｋは，上述の式Ｉで定義したとおりであり，Ａは以下の基のいずれかの構造：
【化２７】
2008512380.tif 000017
［式中，Ｒ１５，Ｒ１６，Ｒ１７およびＲ１８は，上述の式Ｉで定義したとおりである］
を有し，ここで，波線は式Ｉｄの二環のコア構造への結合を示す］
およびこれらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体の構造を有する。
【００３２】
本発明の１つの態様においては，式Ｉｄの化合物のｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され，ここで，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，ここで，アリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００３３】
本発明のある態様においては，式Ｉの化合物は，式Ｉｅ：
【化２８】
2008512380.tif 000018
式Ｉｅ
［式中，ｋおよびＲ１５は，上述の式Ｉで定義したとおりである］
およびこれらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体の構造を有する。
【００３４】
本発明の１つの態様においては，式Ｉｅの化合物のｋは，−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され，式中，Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，ここでアリールおよびヘテロアリールは，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよく，さらに，Ｒ１５は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択されるか，または各Ｒ１５は，これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環と縮合した５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよい。さらに別の態様においては，Ｒ１５が任意に置換されていてもよい低級アルキルであるとき，アルキルは，フルオロ，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリールおよび任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００３５】
式Ｉの化合物（例えば，式Ｉａ，式Ｉｂ，および式Ｉｃの化合物）についての本発明のある態様においては，式Ｉに示される二環の環構造は以下のいずれか：
【化２９】
2008512380.tif 000019
【化３０】
2008512380.tif 000020
である。
【００３６】
式Ｉの化合物について，環の位置は以下のインドールコアに示されるように特定されるが，本明細書において用いる場合，上述の他の二環のコア構造のそれぞれについても対応する番号付けを用いる。式Ｉにおける二環のコア，または化合物が式Ｉにおける二環のコアを含むとの表示，および同様の意味を有する語句は，式Ｉの化合物を包含する本発明の態様について本明細書に記載される二環の構造または成分を表す：
【化３１】
2008512380.tif 000021
【００３７】
本発明の特定の態様においては，式Ｉの化合物（例えば，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，式Ｉｄ，および式Ｉｅ）は，実施例の化合物におけるように１位に置換基を有し；実施例の化合物におけるように３位に置換基を有し；実施例の化合物におけるように４位に置換基を有し；実施例の化合物におけるように５位に置換基を有し；実施例の化合物におけるように１位および３位に置換基を有し；実施例の化合物におけるように１位および４位に置換基を有し；実施例の化合物におけるように１位および５位に置換基を有する。
【００３８】
本発明の特定の態様においては，上述の二環の構造の１またはそれ以上が式Ｉに包含され，例えば，上述の二環のコア構造の任意の１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，または３３個が式Ｉに包含される。
【００３９】
本発明のある態様においては，式Ｉの化合物（例えば，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，および式Ｉｄ）のＡは，置換アリール（例えばフェニル）；置換ヘテロアリール（例えば，５員または６員のヘテロアリール環）；１，２，または３個のアルコキシ基（例えば，メトキシ，エトキシ，およびプロポキシ）で置換されたアリール（例えばフェニル）；１，２，または３個のアルコキシ基で置換されたヘテロアリール；１，２，または３個のアルキルエーテル基，アルキルチオエーテル基，またはこれらの組み合わせで置換されたアリール；１，２，または３個のアルキルエーテル基，アルキルチオエーテル基，またはこれらの組み合わせで置換されたヘテロアリール；ジアルコキシフェニル；ジアルキルチオフェニル；ジアルコキシヘテロアリール；ジアルキルチオヘテロアリール；二置換アリール（例えばフェニル）（ここで，置換基は，同じであっても異なっていてもよく，例えばヒドロキシル，アルコキシ，アルキルエステル，−ＳＨ，チオエーテル，チオエステルである）；二置換ヘテロアリール（ここで，置換基は，同じであっても異なっていてもよく，例えば，ヒドロキシル，アルコキシ，アルキルエステル，−ＳＨ，チオエーテル，チオエステルである）。アリールまたはヘテロアリールが二置換されているある態様においては，置換基は隣接する環炭素原子上にあり（例えばカテコールまたはカテコールジエステル），６員の環については，２つの置換基は分子の残部に対する環の結合に対してメタであってもパラであってもよい。ある態様においては，Ａは置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり，分子の残部に結合している環原子と遠い方（例えば，６員の環についてはメタ位）の第２の原子に置換を有する。ある態様においては，これがアリールまたはヘテロアリール基上の唯一の置換基である。
【００４０】
本発明のある態様においては，式Ｉの化合物（例えば，式Ｉａ，式Ｉｂ，式Ｉｃ，式Ｉｄおよび式Ｉｅ）のｋは，任意に置換されていてもよいアリール；任意に置換されていてもよいヘテロアリール；任意に置換されていてもよいナフチル；任意に置換されていてもよい二環のヘテロアリール；アルコキシまたはアルキルチオで置換されているナフチル；アルコキシまたはアルキルチオで置換されているヘテロアリールを含む。例えば，ｋ中のＲ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ９，Ｒ１２，Ｒ１３またはＲ１４は，そのように特定される基である。上述の特定の態様においては，アルキル成分は，メチル，エチル，またはプロピルである。
【００４１】
特定の態様においては，Ａとｋとの組み合わせは，任意のＡ（２つ前の段落で特定される）および任意のｋ（前の段落で特定される）を包含する。例えば，Ａは置換フェニルであり，ｋは任意に置換されていてもよいナフチルを含む；Ａは置換された５員または６員のヘテロアリールであり，ｋは任意に置換されていてもよいナフチルを含む；Ａは置換フェニルであり，ｋは任意に置換されていてもよい二環のヘテロアリールを含む；Ａは置換された５員または６員のヘテロアリールであり，ｋは任意に置換されていてもよい二環のヘテロアリールを含む，などが挙げられる。
【００４２】
本発明のある態様においては，Ｎ，Ｏ，ＳまたはＣ（Ｚ）が，Ｎ，Ｏ，Ｓ，またはＣ（Ｚ）にも結合している炭素，アルケニル基のアルケン炭素原子にも結合している炭素，またはアルキニル基のアルキン原子にも結合している炭素に結合している化合物は除かれる。したがって，ある態様においては以下の結合を含む化合物は本発明から除かれる：−ＮＲ−ＣＨ２−ＮＲ−，−Ｏ−ＣＨ２−ＮＲ−，−Ｓ（Ｏ）０−２−ＣＨ２−ＮＲ−，−Ｃ（Ｚ）−ＣＨ２−ＮＲ−，−ＮＲ−ＣＨ２−Ｏ−，−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−，−Ｓ（Ｏ）０−２−ＣＨ２−Ｏ−，−Ｃ（Ｚ）−ＣＨ２−Ｏ−，−ＮＲ−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）０−２−，−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）０−２−，−Ｓ（Ｏ）０−２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）０−２−，−Ｃ（Ｚ）−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）０−２−，−ＮＲ−ＣＨ２−Ｃ（Ｚ）−，−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｚ）−，−Ｓ（Ｏ）０−２−ＣＨ２−Ｃ（Ｚ）−，−Ｃ（Ｚ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｚ）−，−ＮＲ−ＣＨ＝ＣＨ−，−ＮＲ−Ｃ≡Ｃ−，−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨ−，−Ｏ−Ｃ≡Ｃ−，−Ｓ（Ｏ）０−２−ＣＨ＝ＣＨ−，−Ｓ（Ｏ）０−２−Ｃ≡Ｃ−，−Ｃ（Ｚ）−ＣＨ＝ＣＨ−，または−Ｃ（Ｚ）−Ｃ≡Ｃ−。
【００４３】
すなわち，第１の観点においては，本発明は，本明細書に記載される式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの新規化合物を提供する。
【００４４】
本発明の別の観点は，治療上有効量の式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物（またはこれらのいずれかの一般式の化合物のサブグループに属する化合物），および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体，賦形剤または希釈剤を含む，医薬処方物などの組成物を提供する。
【００４５】
特定の態様においては，組成物は，複数の異なる薬学的に活性な化合物を含んでいてもよく，これは複数の式Ｉの化合物であってもよく，式Ｉの１またはそれ以上の化合物と組み合わせて他の化合物を含んでいてもよい。この文脈において，"他の化合物"との用語は，疾病または医学的状態の１またはそれ以上の症状を予防，軽減または改善するのに，および／または治療している被験者の生存を長くするのに有効な量で被験者に与えられる化合物を表し，ここで，疾病または医学的状態とは本明細書において挙げられるものである。
【００４６】
関連する観点においては，本発明は，本明細書に記載される組成物を含むキットを提供する。特定の態様においては，組成物は，バイアル，瓶またはフラスコ等に包装されていてもよく，これはさらに，箱，封筒，またはバッグ中に包装されていてもよい；組成物は米国食品医薬品局または哺乳動物，例えばヒトへの投与に関する同様の規制機関により認可された医薬組成物である；組成物は，ＰＤＥ４媒介性疾病または状態について哺乳動物，例えばヒトに対する投与が認可されている医薬組成物である；キットは，組成物がＰＤＥ４媒介性疾病または状態について哺乳動物，例えばヒトへの投与に適しているか認可されているとの注意書きまたは他の表示を含む；組成物は，単位投与量または１回投与量の形で，例えば，１回投与量の丸薬，カプセルとして包装されている。本明細書において用いる場合，"哺乳動物"との用語は，任意の哺乳動物種を示し，限定されないが，家畜（例えば，ヒツジ，ヤギ，ウシ），家庭動物（例えば，イヌ，ネコ），実験動物（例えば，ラット，マウス），他の霊長類，およびヒトを含む。
【００４７】
別の関連する観点においては，式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物は，治療を必要とする被験者においてＰＤＥ４媒介性疾病または状態（またはＰＤＥ４アイソフォームにより媒介される疾病または状態（例えば，ＰＤＥ４Ｂ−またはＰＤＥ４Ｄ−媒介性疾病または状態），またはＰＤＥ４の調節が治療上の効用を与える疾病または状態を治療するための医薬品を製造するために用いることができる。
【００４８】
別の観点においては，本発明は，治療または予防を必要とする哺乳動物において，哺乳動物に治療上有効量の式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物，そのような化合物のプロドラッグ，またはそのような化合物またはプロドラッグの薬学的に許容しうる塩を投与することにより，疾病または状態を治療または予防する方法を提供し，ここで，疾病または状態は，ＰＤＥ４媒介性疾病または状態またはＰＤＥ４の調節が治療上の効用を与える疾病または状態である。化合物は単独で用いてもよく，医薬組成物の一部であってもよい。
【００４９】
疾病または状態の治療または予防に関連する本発明の観点および態様においては，疾病または状態は，例えば，限定されないが，急性または慢性肺疾患，例えば閉塞性疾患（例えば，喘息，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），嚢胞性線維症），間質性肺疾患（例えば，特発性肺線維症，サルコイドーシス），血管性肺疾患（例えば，肺高血圧症），気管支炎，アレルギー性気管支炎，または気腫である。本発明の態様による治療に関して企図されるさらに別の疾病または状態としては，例えば，限定されないが，ＣＮＳ疾患，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病およびハンティングトン舞踏病；炎症性自己免疫疾患，例えば，多発性硬化症，慢性関節リウマチおよびクローン病，ならびに他の炎症性疾患，例えば，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，およびアトピー性皮膚炎；骨疾患，例えば，骨粗鬆症，大理石骨病，およびパジェット病；癌，例えば，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ球性白血病，急性リンパ芽球性白血病；重症急性呼吸器症候群；および早期陣痛が挙げられる。治療または予防しうる特定の疾病または疾患には，本明細書に記載されるもの，および本明細書に引用される文献に記載されるものが含まれる。
【００５０】
本発明の化合物およびその使用に関するある態様においては，化合物ＰＤＥ４Ｂまたはそのアイソフォーム，例えばＰＤＥ４ＢまたはＰＤＥ４Ｄに特異的である。式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物を含む観点のある態様においては，化合物は，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの両方に特異的であるか，ＰＤＥ４Ｂに特異的であるか，またはＰＤＥ４Ｄに特異的である。そのような特異性は，化合物がＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄに対して他の酵素より，またはＰＤＥ４Ｄと比較してＰＤＥ４Ｂに対して，またはＰＤＥ４Ｂと比較してＰＤＥ４Ｄに対して，少なくとも５倍高い活性（好ましくは少なくとも５倍，１０倍，２０倍，５０倍，または１００倍またはそれ以上高い活性）を有することを意味し，ここで，活性は，適当なアッセイ，例えば，当業者に知られるかまたは本明細書に記載されるいずれかのアッセイを用いて決定される。
【００５１】
ある態様においては，本発明の化合物は，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの少なくとも１つに対して，一般に認められているＰＤＥ４活性アッセイで判定して，１００ｎＭ未満，５０ｎＭ未満，２０ｎＭ未満，１０ｎＭ未満，５ｎＭ未満，または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。１つの態様においては，式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物は，ＰＤＥ４Ｂに対して，１００ｎＭ未満，５０ｎＭ未満，２０ｎＭ未満，１０ｎＭ未満，５ｎＭ未満，または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有するであろう。１つの態様においては，式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物は，ＰＤＥ４Ｄに対して，１００ｎＭ未満，５０ｎＭ未満，２０ｎＭ未満，１０ｎＭ未満，５ｎＭ未満，または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有するであろう。１つの態様においては，ａｏｆ式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物は，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの両方に対して，１００ｎＭ未満，５０ｎＭ未満，２０ｎＭ未満，１０ｎＭ未満，５ｎＭ未満，または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有するであろう。上述の態様のいずれかに加えて，本発明の化合物は，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの一方に対するＩＣ５０がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの他方に対するＩＣ５０の約５倍，または１０倍，または２０倍，または５０倍，または少なくとも約１００倍であるように，ＰＤＥ４ＢまたはＰＤＥ４Ｄのいずれかの特異的阻害剤であろう。
【００５２】
本発明のある態様においては，ＰＤＥ４に対する活性を有する式Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ，Ｉｄ，またはＩｅの化合物は，所望の薬理学的特性をも有するであろう。特定の態様においては，所望の薬理学的特性は，２時間より長い（または，４時間より長い，または８時間より長い）血清半減期，水溶性，および１０％を越える（または２０％を越える）経口生物利用可能性の任意の１つまたはそれ以上である。
【００５３】
ＰＤＥ４，またはそのアイソフォーム，例えばＰＤＥ４ＢまたはＰＤＥ４Ｄに対して活性を有する式Ｉの化合物の同定はまた，ＰＤＥ４に対して活性を有する複数の式Ｉの試験化合物が，ＰＤＥ４に対して活性を有する参照化合物と比較して改良された１またはそれ以上の所望の薬理学的特性を与えるか否かを判定し，所望の薬理学的特性を改良する化合物があればこれを選択し，このことにより，改良された調節剤を提供することにより，ＰＤＥ４（またはそれぞれのＰＤＥ４アイソフォーム）に対して活性を有する追加の化合物，例えば，改良された調節剤を同定または開発する方法を提供する。ある態様においては，所望の薬理学的特性は，ＰＤＥ４Ｂに対してＰＤＥ４Ｄに対するより少なくとも２倍，４倍，６倍，８倍，１０倍，２０倍，５０倍，１００倍，または１００倍以上高い活性である。さらに別の態様においては，所望の薬理学的特性は，１０μＭ未満，１μＭ未満，１００ｎＭ未満，１０ｎＭ未満，または１ｎＭ未満のＩＣ５０である。
【００５４】
調節剤開発を包含する本発明の特定の態様においては，所望の薬理学的特性とは，所望の薬理学的特性は，２時間より長い（または，４時間より長い，または８時間より長い）血清半減期，水溶性，および１０％を越える（または２０％を越える）経口生物利用可能性である。
【００５５】
また，調節剤開発を包含する本発明の特定の態様においては，参照化合物は式Ｉの化合物である。このプロセスは多数回繰り返すことができ，すなわち，誘導体の調製，および／または追加の関連化合物の選択および関連化合物のそのような追加の誘導体の評価を多数ラウンド，例えば，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０またはそれ以上のラウンドで行うことができる。
【００５６】
さらに別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂに関する構造情報を，例えば，式Ｉの化合物または分子スキャフォールドまたは式Ｉのスキャフォールドコアとともに利用する。さらに，１またはそれ以上の他のＰＤＥ，例えば，ＰＤＥ５Ａ，ＰＤＥ４Ｄに関する構造情報を利用することができる。
【００５７】
本発明はまた，ＰＤＥ４Ｂに結合するリガンドを開発する方法を提供し，この方法は，ＰＤＥの結合部位に結合する１またはそれ以上の化合物を分子スキャフォールドとして同定し；ＰＤＥとの共結晶中の少なくとも１つの分子スキャフォールドの向きを決定し；分子スキャフォールドの，改変したときに分子スキャフォールドとＰＤＥとの結合親和性または結合特異性またはその両方を変更させる１またはそれ以上の化学構造を同定し；そして，分子スキャフォールドの化学構造の１またはそれ以上が改変されて変更された結合親和性または結合特異性またはその両方でＰＤＥに結合するリガンドを与えるリガンドを合成することを含む。そのようなスキャフォールドは，例えば，式Ｉの化合物であることができ，式Ｉにおけるようなスキャフォールドコアを含むか，または式Ｉにおけるような二環のコアを含む。
【００５８】
また別の態様においては，本発明は，ＰＤＥ４Ｂに結合するリガンドを開発または同定する方法を提供する。この方法は，ＰＤＥとの共結晶中の少なくとも１つの分子スキャフォールドの向きを決定し，ここで，分子スキャフォールドは，ＰＤＥの結合部位に結合する１またはそれ以上の化合物中に含まれ；分子スキャフォールドの，改変したときに分子スキャフォールドとＰＤＥとの間の結合親和性または結合特異性またはその両方を変更させる１またはそれ以上の化学構造を同定し；そしてそのようにして同定された化学構造を改変して，変更された結合親和性または結合特異性またはその両方でＰＤＥに結合するリガンドを提供することを含む。そのようなスキャフォールドは，例えば，式Ｉの化合物であることができ，式Ｉにおけるようなスキャフォールドコアを含むか，または式Ｉにおけるような二環のコアを含む。
【００５９】
関連する観点においては，本発明は，ＰＤＥ４（またはＰＤＥ４アイソフォーム，例えばＰＤＥ４ＢまたはＰＤＥ４Ｄ）に特異的なリガンドを開発する方法を提供し，この方法は，複数のホスホジエステラーゼに結合する化合物の誘導体が，特定のホスホジエステラーゼに対して親化合物が他のホスホジエステラーゼに対するものよりも高い特異性を有するか否かを判定することを含む。１つの態様においては，複数のホスホジエステラーゼはＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄを含む。別の態様においては，複数のホスホジエステラーゼはＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ５Ａを含む。さらに別の態様においては，複数のホスホジエステラーゼに結合する化合物は，複数のホスホジエステラーゼのいずれかに対する結合より少なくとも２倍，例えば，４倍，６倍，８倍，１０倍，２０倍，５０倍，または１００倍高い親和性をもってＰＤＥ４Ｂに結合する。さらに別の態様においては，複数のホスホジエステラーゼに結合する化合物は弱く結合し，ここで，"弱く"とは，化合物のＩＣ５０が１μＭより高いこと，例えば，２μＭ，５μＭ，１０μＭ，２０μＭ，５０μＭ，１００μＭ，２００μＭ，５００μＭ，１ｍＭ，またはそれ以上であることを示す。
【００６０】
別の観点においては，本発明は，ＰＤＥ４Ｂに結合する改良されたリガンドを得る方法を提供し，この方法は，この特定のＰＤＥに結合する化合物を同定し，この化合物が１またはそれ以上の保存活性部位残基と相互作用するか否かを判定し，そしてこの化合物の誘導体が親結合化合物より高い親和性またはより高い特異性またはその両方をもってこのＰＤＥに結合するか否かを判定することを含む。親化合物より高い親和性またはより高い特異性またはその両方をもって結合すれば，この誘導体は改良されたリガンドである。このプロセスはまた，選択と誘導化の連続するラウンドで，および／または複数の親化合物で行って改良されたリガンド特性を有する化合物または複数の化合物を与えることができる。同様に，誘導体化合物を試験し，選択して，そのＰＤＥに対する高い選択性を与えるか，または特定の標的の組，例えば，ＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄを含むホスホジエステラーゼのサブセットに対する交叉反応性を与えることができる。特定の態様においては，既知のＰＤＥ４Ｂ阻害剤を用いてより高い親和性および／またはより高い特異性を有する誘導体を開発することができ，好ましくはＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄ構造情報を用いて，ＰＤＥ４Ｄと比較してＰＤＥ４Ｂに対してより高い特異性を有するものを開発することができる。
【００６１】
式Ｉについては，式Ｉにより表される複数のスキャフォールドコアが存在する。そのようなスキャフォールドコアは式Ｉについて上述した二環のコアを含み，上で特定した置換基群Ａのアリールまたはヘテロアリール基が結合している。すなわち，上で示される二環のコアのそれぞれについて，Ａの位置のそれぞれについて，および二環のコアに結合したＡの最初の成分であるアリールおよびヘテロアリール基のそれぞれについて，対応するスキャフォールドコアが存在する。
【００６２】
別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂに関する構造情報を用いて，ＰＤＥ４Ｂ構造の電子表示からホモロジーモデルを作成することにより，別のホスホジエステラーゼの構造を決定することを助けることもできる。次に，そのようなホモロジーモデルを他のホスホジエステラーゼの構造と同等とみなす。
【００６３】
典型的には，そのようなホモロジーモデルの作成は，既知の構造を有する既知のＰＤＥ，例えばＰＤＥ４Ｂと，目的とする他のホスホジエステラーゼ（例えばＰＤＥ５Ａ）との間で保存されているアミノ酸残基を同定し；既知の構造中の複数の保存アミノ酸の原子座標を他のホスホジエステラーゼの対応するアミノ酸に移動させて，そのホスホジエステラーゼのおおよその構造を与え；そして，他のホスホジエステラーゼ中の残部のアミノ酸残基の構造の電子表示を用いて，他のホスホジエステラーゼの残部を表す構造を構築する，ことを含む。特に，ＰＤＥ４Ｂに関しては，表１および２の座標を用いることができる。結合部位中の保存残基を用いることができる。
【００６４】
ホスホジエステラーゼ構造の場の部分の開発を助けるために，例えば，保存残基を連結することを助けるために，および／またはポリペプチドの末端部分の座標をよりよく特定するために，ホモロジーモデルは，ホスホジエステラーゼの１またはそれ以上の結晶からの低い解像度のＸ線回折データを利用してもよく，これにフィッティングさせてもよい。
【００６５】
用いられるＰＤＥ４Ｂ構造情報は，種々の様々な変種，例えば，全長の野生型，天然に生ずる変種（例えば，アレル変種およびスプライシング変種），野生型または天然に生ずる変種の切断型変種，全長または切断型の野生型または天然に生ずる変種の変異体（これは１またはそれ以上の部位で変異されていてもよい）のものであることができる。例えば，種々の他のホスホジエステラーゼ構造と近いＰＤＥ４Ｂ構造を提供するために，結合部位中の保存残基に対する変異を含む変異ＰＤＥ４Ｂを用いることができる。
【００６６】
別の観点においては，本発明は，ＰＤＥ４Ｂの結晶形を含む結晶を提供し，これは，より短い長さのＰＤＥ４Ｂ，例えばホスホジエステラーゼドメインであってもよく，例えば，表１，２，および３に示される原子座標を有する。結晶形は，１またはそれ以上の重金属原子，例えば，Ｘ線結晶学に有用な原子を含むことができる。結晶はまた，共結晶中に結合化合物，例えば，ＰＤＥ中の１またはそれ以上の保存活性部位残基，これらの残基のまたは任意の２個，任意の３個，任意の４個，任意の５個，任意の６個と相互作用する結合化合物を含んでいてもよく，および，例えば，既知のＰＤＥ阻害剤を含んでいてもよい。そのようなＰＤＥ結晶は種々の環境中にあることができ，例えば，結晶学プレート中に存在してもよく，Ｘ線結晶学用にマウントしてもよく，および／またはＸ線ビーム中に存在してもよい。ＰＤＥは，種々の形，例えば，本明細書に記載されるような野生型，変種，切断型，および／または変異形の形であることができる。
【００６７】
本発明はさらに，ＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｂ結合化合物との共結晶を提供し，これはより短いＰＤＥ，例えば，ホスホジエステラーゼドメインであってもよい。ある態様においては，結晶中の結合化合物は，１またはそれ以上の保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用する。有益には，そのような共結晶は，少なくとも３オングストローム，２．５オングストローム，２．０オングストローム，１．８オングストローム，１．７オングストローム，１．５オングストローム，１．４オングストローム，１．３オングストローム，または１．２オングストロームでＰＤＥの構造決定を可能とするのに十分なサイズおよび質のものである。共結晶は，例えば，結晶学プレート中にあってもよく，Ｘ線結晶学用にマウントしてもよく，および／またはＸ線ビーム中にあってもよい。そのような共結晶は，例えば，ＰＤＥと結合化合物との間の相互作用に関する構造情報を得るために有益である。
【００６８】
特定の態様においては，結合化合物は，式Ｉにおけるような二環のコアまたはスキャフォールドコア構造を含むか，または式Ｉの化合物である。
【００６９】
ＰＤＥ４Ｂ結合化合物は，ＰＤＥ中の保存活性部位残基の少なくとも１つ，またはこれらの残基の任意の２，３，４，５，または６個と相互作用する化合物を含むことができる。ＰＤＥ４Ｂに結合する例示的化合物としては，本明細書に引用される参考文献に記載される化合物が含まれる。
【００７０】
同様に，さらに別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂ結晶および共結晶を得る方法が提供される。１つの観点においては，ＰＤＥ４Ｂ蛋白質を，５−２０ｍｇ／ｍｌ，例えば，８−１２ｍｇ／ｍｌで，３０％ＰＥＧ４００，０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５），１ｍＭの結合化合物，４℃；または２０％ＰＥＧ３０００，０．２  ＭＣａ（ＯＡｃ）２，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０），１ｍＭの結合化合物，１５．９ｍｇ／ｍｌの蛋白質，４℃；または１．８Ｍ−２．０Ｍ硫酸アンモニウム，０．１Ｍ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０−１０．５），０．２Ｍ硫酸リチウムと実質的に同等の結晶化条件に供することによりＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの結晶を得る方法が提供される。
【００７１】
結晶化条件は，最初に，スクリーニングキット，例えば，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ，ＣＡ）スクリーニングキット１を用いて同定することができる。結晶が得られた条件を選択し，示された結晶化条件に基づいて結晶化条件を最適化することができる。続く結晶学を支援するために，ＰＤＥをセロノメチオニンで標識することができる。また，上述したように，ＰＤＥは例えば，切断してホスホジエステラーゼドメインとするなどの種々の形態のいずれであってもよく，これは種々の長さのものでありうる。
【００７２】
別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂに対して活性な化合物（例えば，本明細書に記載される方法を用いて開発される化合物）を同定することによって，ＰＤＥを，ＰＤＥと結合し，１またはそれ以上の活性部位残基と相互作用する化合物と接触させることにより，ＰＤＥ活性を調節することが可能となる。化合物は，好ましくは，ＰＤＥの活性を少なくとも１０％，より好ましくは少なくとも２０％，３０％，４０％，または５０％調節するのに十分なレベルで提供される。多くの態様においては，化合物は，約１μＭ，１００μＭ，または１ｍＭ，または１−１００ｎＭ，１００−５００ｎＭ，５００−１０００ｎＭ，１−１００μＭ，１００−５００μＭ，または５００−１０００μＭの範囲内の濃度である。
【００７３】
関連する観点においては，本発明は，異常なＰＤＥ４活性（例えば，異常なＰＤＥ４Ｂ，ＰＤＥ４Ｄ活性）により特徴づけられる疾病または状態に罹患した被験者を治療する方法を提供し，この方法は，本明細書に記載される方法により同定された化合物を被験者に投与することを含む。
【００７４】
ＰＤＥ４Ｂの結晶は開発され分析されており，そのような結晶中のリガンドの結合モードが決定されているため，本発明の別の観点は，これらのＰＤＥ（これはより短い長さのＰＤＥであってもよい）の電子表示，例えば，表１および２にＰＤＥ４Ｂについて示されている座標と対応するＰＤＥ４Ｂの原子座標表示を含む電子表示または図解表示，例えば二次構造および／または鎖フォールディングを示す図解表示，および保存活性部位残基をも示していてもよい図解表示を提供する。ＰＤＥは，野生型，アレル変種，変異体型，または例えば本明細書に記載されるような改変型であってもよい。特に，ＰＤＥは本質的にＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインからなる。
【００７５】
電子表示はまた，特定の残基の電子表示を他の残基の電子表示で置き換えることにより改変することができる。すなわち，例えば，表１または２に記載されるＰＤＥ４Ｂの座標に対応する原子座標表示を含む電子表示は，結合部位中の特定の保存残基の座標を，異なるアミノ酸で置き換えることにより改変することができる。改変の後，改変により影響を受けるであろう既知の相互作用を可能とするように，全体構造の表示を調節することができる。ほとんどの場合，２以上の残基が関与する改変は，反復して行う。
【００７６】
さらに，結合部位におけるＰＤＥ４Ｂ結合化合物または試験化合物，例えば，非加水分解性ｃＡＭＰ類似体またはシルデナフィルのコア構造を含む化合物の電子表示を含めることができる。
【００７７】
同様に，関連する観点においては，本発明はＰＤＥ４Ｂの一部の電子表示を提供し，これは結合部位（これは活性部位でありうる）であってもよく，またはホスホジエステラーゼドメイン，例えば，ＪＣ１５１９（配列番号１）のＰＤＥ４Ｂ残基１５２−５２８，または本明細書に記載される他のホスホジエステラーゼドメインであってもよい。結合部位またはホスホジエステラーゼドメインは，種々の方法で，例えば，結合部位のまわりの残基の原子座標の表示として，および／または結合部位表面の輪郭として表示することができ，結合部位における特定の残基，例えば保存残基の結合特性の表示を含むことができる。結合部位は，好ましくは１個以下の重金属原子を含み；結合化合物または試験化合物，例えば式Ｉのコア構造を含む化合物が結合部位に存在していてもよく；結合部位は野生型，変種，変異体形，または改変型のＰＤＥ４Ｂのものであることができ；電子表示は，表１または２における保存残基の座標の表示を含む。
【００７８】
さらに別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂの構造および配列情報を別のＰＤＥのホモロジーモデルにおいて用いることができる。そのようなモデルに高い解像度の，例えば，少なくとも１．７，１．５，１．４，１．３，または１．２オングストロームの解像度のＰＤＥ４Ｂの構造情報を用いれば有益である。
【００７９】
さらに別の観点においては，本発明は，改変されたＰＤＥ４Ｂ結晶構造の電子表示を提供し，これは，表１および／または２の原子座標に基づいて改変されたＰＤＥ４Ｂの原子座標の電子表示を含む。例示的態様においては，挙げられた表の１つの原子座標を，保存残基の原子座標を異なるアミノ酸の原子座標で置き換えることにより改変することができる。改変には，置換，欠失（例えば，Ｃ末端および／またはＮ末端の欠失），挿入（内部，Ｃ末端，および／またはＮ末端）および／または側鎖修飾が含まれる。
【００８０】
別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂ構造情報は，ＰＤＥ４Ｂ構造を分析して生物学的因子を形成するための少なくとも１つの基礎構造を同定することにより，ＰＤＥ４Ｂに基づく有用な生物学的因子を開発する方法を提供する。そのような基礎構造は抗体形成のためのエピトープを含むことができ，この方法は，例えば，エピトープを提示する組成物を哺乳動物，例えばウサギ，モルモット，ブタ，ヤギまたはウマに注入することにより，このエピトープに対する抗体を生成することを含む。基礎構造はまた，変異がＰＤＥ４Ｂの活性を変更すると予測されるかまたは変更することが知られている変異部位を含むことができ，この方法は，その部位に変異を作成することを含む。さらに，基礎構造は，別の成分，例えば，ペプチド，ポリペプチド，固相材料（例えば，ビーズ，ゲル，クロマトグラフィー媒体，スライド，チップ，プレート，およびウエル表面），リンカー，および標識（例えば，蛍光団等の直接標識またはビオチンまたは特異的結合対の他のメンバー等の間接標識）を結合させる結合点を含むことができる。この方法は，分離成分を結合させることを含んでいてもよい。
【００８１】
別の観点においては，本発明は，化合物の少なくとも１つの電子表示をＰＤＥ結合部位の電子表示中でフィッティングさせることにより，潜在的ＰＤＥ４Ｂ結合化合物を同定する方法を提供する。結合部位の表示は，ＰＤＥ分子のより大きい部分または全体の電子表示の一部であってもよく，または触媒ドメインのみまたは結合部位または活性部位の表示であってもよい。電子表示は上述されているものであってもよく，または本明細書に記載されるものであってもよい。ＰＤＥ４Ｂについては，電子表示は，表１および／または２にしたがう座標の表示を含む（特に，先に提唱されているＰＤＥ４Ｂ構造と有意に異なる座標を有する残基）。ある態様においては，ＰＤＥ４Ｂと複合体形成する化合物は，非加水分解性のｃＧＭＰ類似体である。
【００８２】
特定の態様においては，この方法は，コンピュータデータベースからの化合物のコンピュータ表示をＰＤＥの活性部位のコンピュータ表示とフィッティングさせることを含み，そして，ＰＤＥ分子と複合体形成した化合物のコンピュータ表示を除去し，潜在的結合化合物として好ましい幾何学的フィッティングおよびエネルギー的に好ましい相補的相互作用に基づいて活性部位と最もよくフィッティングする化合物を同定することを含む。特定の態様においては，化合物は既知のＰＤＥ４Ｂ阻害剤，例えば，本明細書に引用される参考文献に記載されるもの，またはその誘導体である。
【００８３】
別の態様においては，この方法は，１またはそれ以上の化学基の欠失，付加またはその両方によりＰＤＥ分子と複合体形成した化合物のコンピュータ表示を改変し；コンピュータデータベースからの化合物のコンピュータ表示をＰＤＥ分子の活性部位のコンピュータ表示とフィッティングさせ；そして，潜在的結合化合物として好ましい幾何学的フィッティングおよびエネルギー的に好ましい相補的相互作用に基づいて活性部位と最もよくフィッティングする化合物を同定することを含む。ある態様においては，フィッティングは，潜在的結合化合物が保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基の１またはそれ以上と相互作用するか否かを判定することを含む。
【００８４】
さらに別の態様においては，この方法はＰＤＥと複合体形成した化合物のコンピュータ表示を除去し，化合物検索コンピュータプログラムを用いて複合体形成した化合物と構造的類似性を有する化合物についてデータベースを検索するか，または化合物構築コンピュータプログラムを用いて複合体形成した化合物の一部を類似の化学構造で置き換えることを含む。
【００８５】
化合物のフィッティングは，化合物がＰＤＥの１またはそれ以上の保存活性部位残基と相互作用するか否かを判定することを含むことができる。フィッティングについて選択される化合物またはＰＤＥと複合体形成する化合物は，例えば，既知のＰＤＥ４Ｂ阻害剤化合物であってもよく，そのような化合物のコア構造を含む化合物であってもよい。
【００８６】
別の観点においては，本発明は，結合化合物のＰＤＥ４Ｂへの結合を実質的に変化させずにＰＤＥ４Ｂ結合化合物を付着成分に結合させる方法，ならびにＰＤＥ４Ｂ結合化合物上の結合部位を同定する方法を提供する。この方法は，ＰＤＥ４Ｂの結合部位に結合した結合化合物のための付着成分の結合についてエネルギー的に許容される部位を同定し，そして化合物またはその誘導体をエネルギー的に許容される部位で付着成分に結合させることを含む。この文脈において，"実質的に結合を変化させる"とは，結合後に，ＩＣ５０が３対数単位，例えば，１ｎＭから１μＭより少ない変化を表す。ある態様においては，結合化合物は式Ｉの化合物である。
【００８７】
付着成分は，例えば，固相にまたは別の分子にまたは別の成分に結合するためのリンカー（無痕跡リンカーを含む）を含むことができる。そのような結合は，例えば，複数の化合物のコンビナトリアル合成において見られるように，固相媒体上に結合したリンカー上で化合物または誘導体を合成することにより形成することができる。同様に，固相媒体への結合は，親和性媒体（例えば，親和性クロマトグラフィー用に）を提供することができる。
【００８８】
付着成分はまた標識を含むことができ，これは，蛍光団等の直接的に検出可能な標識であってもよく，例えば，ビオチン等の特異的結合対のメンバー等の間接的に検出可能な標識であってもよい。
【００８９】
ＰＤＥ４Ｂ結合化合物のエネルギー的に許容される部位を同定しうることはまた，関連する観点において，好ましくは改変した化合物がＰＤＥ４Ｂに結合するのにエネルギー的に許容される部位においてリンカーが結合している，改変された結合化合物を提供する。リンカーは，上述した付着成分に結合させることができる。
【００９０】
本発明の別の観点は，改変されたＰＤＥ４Ｂを，天然のＰＤＥ４Ｂより他のホスホジエステラーゼにより類似するように改変することを含み，さらに他の変異または他の改変を含んでいてもよい，改変されたＰＤＥ４Ｂポリペプチドを提供する。種々の態様においては，ポリペプチドは，全長ＰＤＥ４Ｂポリペプチドを含み，改変されたＰＤＥ４Ｂ結合部位を含み，ＰＤＥ４Ｂに由来する保存部位を含む少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０，または８０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００９１】
本発明のさらに別の観点は，化合物がホスホジエステラーゼと結合し，ＰＤＥ４Ｂ結晶または表１および／または２に示される座標を有するＰＤＥ４Ｂ結合モデル中でそのような活性部位残基と相互作用するか否かを判定することにより，それぞれ保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基の任意の１，２，３，４，５，または６個とマッチする保存残基を含むホスホジエステラーゼのリガンドを開発する方法を提供する。この方法はまた，化合物がホスホジエステラーゼの活性を調節するか否かを判定することを含んでいてもよい。好ましくは，ホスホジエステラーゼは，同じ長さのホスホジエステラーゼドメインセグメントにわたって少なくとも５０，５５，６０，または７０％の同一性を有する。ある態様においては，化合物は式Ｉの化合物である。
【００９２】
さらに別の観点においては，本発明は，ホスホジエステラーゼのリガンドを開発するかまたは同定する方法を提供し，ここで，ホスホジエステラーゼは，１またはそれ以上のＰＤＥ４Ｂ活性部位残基とマッチする保存残基を含む。この方法は，ＰＤＥ４Ｂ結合化合物が前記ホスホジエステラーゼに結合するか否かを判定し，そしてＰＤＥ４Ｂ結合化合物が結晶構造中で１またはそれ以上の保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用するか否かを判定することを含む。さらに別の態様においては，この方法は，ホスホジエステラーゼに結合するＰＤＥ４Ｂ結合化合物が結晶構造中で１またはそれ以上の保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用するか否かを判定することを含む。
【００９３】
特定の態様においては，判定は，ホスホジエステラーゼの結合部位で化合物をコンピュータフィッティングさせることを含み，および／またはこの方法は，ホスホジエステラーゼと化合物との共結晶を形成することを含む。そのような共結晶は，化合物のホスホジエステラーゼとの結合の向きを決定するために使用することができ，および／またはホスホジエステラーゼの，例えば結合部位および相互作用するアミノ酸残基等の構造情報を提供することができる。そのような結合の向きおよび／または他の構造情報は，Ｘ線結晶学を用いて達成することができる。
【００９４】
本発明はまた，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼに結合するか，および／またはＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ活性を調節する（例えば阻害する）化合物，例えば，本明細書に記載される方法により同定される化合物を提供する。したがって，ＰＤＥ４Ｂ結合化合物，分子スキャフォールド，およびリガンドまたは調節剤に関する本発明の観点においては，化合物は弱い結合化合物であり；中程度の結合化合物であり；強い結合化合物であり；化合物はＰＤＥ中の１またはそれ以上の保存活性部位残基と相互作用し；化合物は小分子であり；化合物は複数の異なるホスホジエステラーゼ（例えば，少なくとも２，３，４，５，７，１０，またはそれ以上の異なるホスホジエステラーゼ）と結合する。特に，本発明は，同定されたまたは選択された化合物を提供する。
【００９５】
さらに別の態様においては，本発明は，特定の異なる部位を利用することによりＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｄとの間で選択性を有する化合物を同定する方法を提供する。この方法は，化合物がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの少なくとも１つの異なる部位で相互作用するか否かを分析することを含み，ここで，異なる相互作用はそのような選択性を示す。異なる部位は，結晶構造の比較から同定する。"異なる部位"との用語は，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの化学的特徴が化合物と異なるように相互作用する部位，すなわち位置を表す。"化学的特徴"との用語は，化学反応性（結合を含む）を担う構造的および化学的特性を示すことが当業者には理解され，例えば，限定されないが，結合ドナーまたはアクセプター，疎水性／親油性部位，正にイオン化可能な部位，負にイオン化可能な部位，電荷密度，電気陰性度等が挙げられる。
【００９６】
特定の態様においては，分析は，化合物の電子表示を，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示中でフィッティングさせ，前記フィッティングに基づいて，化合物が異なるように相互作用するか否かを判定することを含み；この方法は，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの両方に結合する初期化合物を選択し，初期化合物の電子表示をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示中でフィッティングさせ，初期化合物の電子表示を，少なくとも異なる部位で相互作用する少なくとも１つの成分を用いて改変し，そして，改変した化合物がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに異なるように結合するか否かを判定することを含み；改変した化合物は，初期化合物より高い程度で異なるように結合し；この方法はまた，異なるように結合する化合物をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに対する異なる活性についてアッセイすることを含み；初期化合物はシルデナフィルスキャフォールド構造を含み；初期化合物はシルデナフィルコアを含むことができる。シルデナフィルは，１−［４−エトキシ−３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）フェニルスルホニル］−４−メチルピペラジンである。ある態様においては，結合化合物は式Ｉの化合物である。
【００９７】
結合化合物と組み合わせたＰＤＥ４Ｂの原子座標に関連する上述の種々の観点においては，表１または２に与えられる座標を使用することができる。次に，慣用のモデリング法を用いてこれらの座標を調節して，シルデナフィルと異なる構造を有する化合物とフィッティングさせることができ，したがって，現在記述されているＰＤＥ４Ｂ調節剤と異なるＰＤＥ４Ｂ調節剤の開発に用いることができる。本明細書の構造座標は先に記載されている構造中の明らかな誤りを訂正しており（例えば，図４に重ねた構造により示されるように），したがって，ＰＤＥ４Ｂリガンド開発に，およびＰＤＥ４Ｂ構造情報の他の用途，例えば本明細書に記載される用途により適合しているため，先に記載されているＰＤＥ４Ｂ構造座標の代わりに本明細書に提供されるＰＤＥ４Ｂ結晶座標を用いることができる。
【００９８】
追加の観点および態様は，以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９９】
好ましい態様の詳細な説明
表１は，残基１５５−５０７を含むヒトＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの原子座標を提供する。この表において，種々のカラムは以下の内容を有している（最も左のカラムから）：
原子：表の列の関連する成分を表す；
原子番号：座標の表中における任意原子番号指定を表す；
原子名：特定の座標に存在する原子の識別；
チェインＩＤ：チェインＩＤとは，結晶中の蛋白質の１つのモノマー，例えば，チェイン"Ａ"を表すか，または結晶中に存在する他の化合物を表す，例えば，ＨＯＨは水，Ｌはリガンドまたは結合化合物。蛋白質モノマーの複数のコピーは異なるチェインＩｄを有する；
残基番号：鎖中のアミノ酸残基番号；
Ｘ，Ｙ，Ｚ：それぞれＸ，Ｙ，およびＺ座標の値；
占有度：結晶中で原子が観察される時間の割合を示す。例えば，占有度＝１とは，原子が常に存在することを示す；占有度＝０．５は，原子が５０％の時間存在することを示す；
Ｂ因子：原子の熱運動の指標；
元素：元素の識別。
【０１００】
表２は，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン５０との共結晶の原子座標データを示す。
【０１０１】
表３は，本明細書に記載される研究において用いたＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのアミノ酸および核酸配列を示す。
【０１０２】
表４は，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄのホスホジエステラーゼドメインのアラインメントを示し，選択的リガンドを設計するために活用することができる３つの領域がその領域の下の黒四角で示される。
【０１０３】
表５は，実施例１４５−１４７に記載される，ＰＤＥ４ＢまたはＰＤＥ４Ｄの阻害を評価するアッセイにおける，例示的な式Ｉの化合物の活性を示す。
【０１０４】
本明細書において用いる場合，特に記載しないかぎり以下の定義が適用される。
【０１０５】
"ハロ"または"ハロゲン"とは，単独でも組み合わせでも，すべてのハロゲン，すなわち，クロロ（Ｃｌ），フルオロ（Ｆ），ブロモ（Ｂｒ），またはヨード（Ｉ）を意味する。
【０１０６】
"ヒドロキシル"とは，基−ＯＨを表す。
【０１０７】
"チオール"または"メルカプト"とは，基−ＳＨを表す。
【０１０８】
"アルキル"とは，単独でも組み合わせでも，１−２０個，好ましくは１−１５個の炭素原子（特に記載しない限り）を有する，アルカンから誘導されたラジカルを意味する。これは直鎖アルキルでも分枝鎖アルキルでもよく，シクロアルキル部分を含むかこれにより中断された直鎖または分枝鎖のアルキル基を含む。直鎖または分枝鎖のアルキル基は，任意の利用可能な点に結合して安定な化合物を生成する。この例としては，限定されないが，４−（イソプロピル）−シクロヘキシルエチルまたは２−メチル−シクロプロピルペンチルが挙げられる。多くの態様において，アルキルは，１−１５，１−８，１−６，１−４，または１−２個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のアルキル基であり，例えば，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，ｔ−ブチル等である。"任意に置換されていてもよいアルキル"とは，アルキルまたは，独立して任意の利用可能な点に結合した，ハロ，ヒドロキシ，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアシルオキシ，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいシクロアルキルオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルオキシ，チオール，任意に置換されていてもよい低級アルキルチオ，任意に置換されていてもよいアリールチオ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールチオ，任意に置換されていてもよいシクロアルキルチオ，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルキルスルフィニル，任意に置換されていてもよいアリールスルフィニル，任意に置換されていてもよいヘテロアリールスルフィニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルスルフィニル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルスルフィニル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニル，任意に置換されていてもよいアリールスルホニル，任意に置換されていてもよいヘテロアリールスルホニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルスルホニル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルスルホニル，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいアミド，任意に置換されていてもよいアミジノ，任意に置換されていてもよい尿素，任意に置換されていてもよいアミノスルホニル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，任意に置換されていてもよいアリールスルホニルアミノ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールスルホニルアミノ，任意に置換されていてもよいシクロアルキルスルホニルアミノ，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルスルホニルアミノ，任意に置換されていてもよいアルキルカルボニルアミノ，任意に置換されていてもよいアリールカルボニルアミノ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールカルボニルアミノ，任意に置換されていてもよいシクロアルキルカルボニルアミノ，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルカルボニルアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアシル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されてい��もよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロおよびシアノからなる群より選択される１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成しているアルキルを表す。
【０１０９】
"低級アルキル"とは，１−６個の炭素原子を有するアルキル基を表す。"任意に置換されていてもよい低級アルキル"とは，低級アルキルまたは，独立して，任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成している低級アルキルを表す。
【０１１０】
"低級アルキレン"とは，１−６個の炭素原子を有する，直鎖または分枝鎖の二価アルカンから同じ炭素原子または異なる炭素原子から２つの水素原子が除かれて誘導されたラジカルを表す。低級アルキレンの例としては，限定されないが，−ＣＨ２−，−ＣＨ２ＣＨ２−，および−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−が挙げられる。
【０１１１】
"アルケニル"とは，単独でまたは組み合わせて，２−２０個，好ましくは２−１７個，より好ましくは２−１０，さらにより好ましくは２−８，最も好ましくは２−４個の炭素原子および少なくとも１つの，好ましくは１−３個の，より好ましくは１−２個の，最も好ましくは１個の炭素−炭素二重結合を含む，直鎖，分枝鎖または環状の炭化水素を意味する。シクロアルケニル基の場合，２以上の炭素−炭素二重結合の共役は環に芳香性を付与するようなものではない。炭素−炭素二重結合は，シクロプロピルを除いてシクロアルキル部分中に含まれていてもよく，または直鎖または分枝鎖部分中に含まれていてもよい。アルケニル基の例としては，エテニル，プロペニル，イソプロペニル，ブテニル，シクロヘキセニル，シクロヘキセニルアルキル等が挙げられる。"任意に置換されていてもよいアルケニル"とは，アルケニルまたは，独立して，任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成しているアルケニルを表す。
【０１１２】
"低級アルケニル"とは，１−６個の炭素原子を有するアルケニル基を表す。"任意に置換されていてもよい低級アルケニル"とは，低級アルケニルまたは，任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成している低級アルケニルを表す。
【０１１３】
"アルキニル"とは，単独でまたは組み合わせて，２−２０個の，好ましくは２−１７個の，より好ましくは２−１０個の，さらにより好ましくは２−８個の，最も好ましくは２−４個の炭素原子を含み，少なくとも１つの，好ましくは１個の炭素−炭素三重結合を含む，直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。アルキニル基の例としては，エチニル，プロピニル，ブチニル等が挙げられる。"任意に置換されていてもよいアルキニル"とは，アルキニルまたは，独立して，任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成しているアルキニルを表す。
【０１１４】
"低級アルキニル"とは，１−６個の炭素原子を有するアルキニル基を表す。"任意に置換されていてもよい低級アルキニル"とは，低級アルキニルまたは，任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成している低級アルキニルを表す。
【０１１５】
"アルコキシ"または"低級アルコキシ"とは，基−ＯＲａを表し，ここで，Ｒａは，それぞれアルキルまたは低級アルキルである。"任意に置換されていてもよいアルコキシ"または"任意に置換されていてもよい低級アルコキシ"とは，Ｒａがそれぞれ任意に置換されていてもよいアルキルまたは任意に置換されていてもよい低級アルキルであるアルコキシまたは低級アルコキシを表す。
【０１１６】
"アシルオキシ"とは，基−ＯＣ（Ｏ）Ｒｂを表し，ここで，Ｒｂは，水素，低級アルキル，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，またはヘテロアリールである。"任意に置換されていてもよいアシルオキシ"とは，Ｒｂは，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるアシルオキシを表す。
【０１１７】
"アリールオキシ"とは，基−ＯＲｃを表し，ここで，Ｒｃはアリールである。"任意に置換されていてもよいアリールオキシ"とは，Ｒｃが任意に置換されていてもよいアリールであるアリールオキシまたはアリールオキシを表す。
【０１１８】
"ヘテロアリールオキシ"とは，基−ＯＲｄを表し，ここで，Ｒｄはヘテロアリールである。"任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ"とは，Ｒｄが任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるヘテロアリールオキシを表す。
【０１１９】
"シクロアルキルオキシ"とは，基−ＯＲｅを表し，ここで，Ｒｅはシクロアルキルである。"任意に置換されていてもよいシクロアルキルオキシ"とは，Ｒｅが任意に置換されていてもよいシクロアルキルであるシクロアルキルオキシを表す。
【０１２０】
"ヘテロシクロアルキルオキシ"とは，基−ＯＲｆを表し，ここで，Ｒｆはヘテロシクロアルキルである。"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルオキシ"とは，Ｒｆが任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルであるヘテロシクロアルキルオキシを表す。
【０１２１】
"アルキルチオ"または"低級アルキルチオ"とは，基−ＯＲｇを表し，ここで，Ｒｇは，それぞれアルキルまたは低級アルキルである。"任意に置換されていてもよいアルキルチオ"または"任意に置換されていてもよい低級アルキルチオ"とは，Ｒｇがそれぞれ，任意に置換されていてもよいアルキルまたは任意に置換されていてもよい低級アルキルであるアルキルチオまたは低級アルキルチオを表す。
【０１２２】
"アリールチオ"とは，基−ＳＲｈを表し，ここで，Ｒｈは，アリールである。"任意に置換されていてもよいアリールチオ"とは，Ｒｈが任意に置換されていてもよいアリールであるアリールチオを表す。
【０１２３】
"ヘテロアリールチオ"とは，基−ＳＲｉを表し，ここで，Ｒｉはヘテロアリールである。"任意に置換されていてもよいヘテロアリールチオ"とは，Ｒｉが任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるヘテロアリールチオを表す。
【０１２４】
"シクロアルキルチオ"とは，基−ＳＲｊを表し，ここで，Ｒｊはシクロアルキルである。"任意に置換されていてもよいシクロアルキルチオ"とは，Ｒｊが任意に置換されていてもよいシクロアルキルであるシクロアルキルチオを表す。
【０１２５】
"ヘテロシクロアルキルチオ"とは，基−ＳＲｋを表し，ここで，Ｒｋはヘテロシクロアルキルである。"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルチオ"とは，Ｒｋが任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルであるヘテロシクロアルキルチオを表す。
【０１２６】
"アシル"とは，基−Ｃ（Ｏ）ＲＬを表し，ここで，ＲＬは，水素，低級アルキル，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，またヘテロアリールである。"任意に置換されていてもよいアシル"とは，ＲＬが，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，また任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるアシルを表す。
【０１２７】
"任意に置換されていてもよいアミノ"とは，基−ＮＲｍＲｎを表し，ここで，ＲｍおよびＲｎは，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいアシル，また任意に置換されていてもよいスルホニルであるか，または，ＲｍおよびＲｎは，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまた任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成する。
【０１２８】
"任意に置換されていてもよいアミド"とは，基−Ｃ（Ｏ）ＮＲｏＲｐを表し，ここで，ＲｏおよびＲｐは，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるか，またはＲｏおよびＲｐは，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまた任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成する。
【０１２９】
"任意に置換されていてもよいアミジノ"とは，基−Ｃ（＝ＮＲｑ）ＮＲｒＲｓを表し，ここで，Ｒｑ，Ｒｒ，およびＲｓは，独立して，水素また任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１３０】
"任意に置換されていてもよい尿素"とは，基−ＮＲｔＣ（Ｏ）ＮＲｕＲｖを表し，ここで，Ｒｔは，水素また任意に置換されていてもよい低級アルキルであり，ＲｕおよびＲｖは，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリールまた任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるか，またはＲｕおよびＲｖは，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまた任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成する。
【０１３１】
"任意に置換されていてもよいスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）２Ｒｗを表し，ここで，Ｒｗは，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，また任意に置換されていてもよいヘテロアリールである。
【０１３２】
"任意に置換されていてもよいアミノスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｘＲｙを表し，ここで，ＲｘおよびＲｙは，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，また任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるか，またはＲｘおよびＲｙは，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまた任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成する。
【０１３３】
"カルボキシル"とは，基−Ｃ（Ｏ）ＯＲｚを表し，ここで，Ｒｚは，水素，低級アルキル，シクロアルキル，ヘテロシクロアルキル，アリール，またはヘテロアリールである。"任意に置換されていてもよいカルボキシル"は，Ｒｚが，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，また任意に置換されていてもよいヘテロアリールであるカルボキシルを表す。
【０１３４】
"アリール"とは，フェニルまたはナフチル等の芳香族炭化水素を含む環系を表し，これは，好ましくは５−７個，より好ましくは５−６個の環メンバーのシクロアルキルと縮合していてもよい。"任意に置換されていてもよいアリール"とは，アリール，または任意の利用可能な点に結合した，１−３個の，アルキルの定義の段落で定義した基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで置換されて安定な化合物を生成しているアリールを表す。"置換アリール"とは，任意の利用可能な点に結合した１−３個の，アルキルの定義の段落で定義した基または置換基，または任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニル，で置換されて安定な化合物を生成しているアリールである。
【０１３５】
"アラルキル"とは，基−Ｒａａ−Ａｒを表し，ここでＡｒはアリール基であり，Ｒａａは低級アルキレンである。"任意に置換されていてもよいアラルキル"とは，アラルキルまたは，低級アルキレン基が任意の利用可能な点に結合したアルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成しているアラルキルを表し，ここで，アリール基は，任意の利用可能な点に結合した，１−３個の，アルキルの定義の段落で定義した基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで任意に置換されて，安定な化合物を生成していてもよい。
【０１３６】
"ヘテロアリール"とは，単独でまたは組み合わせて，Ｏ，Ｓ，およびＮからなる群より独立して選択される１またはそれ以上の，好ましくは１−４個，より好ましくは１−３個，さらにより好ましくは１−２個の複素原子を有する，５または６個の環原子を含む単環の芳香族環構造，または８−１０個の原子を有する二環芳香族基を表す。ヘテロアリールはまた酸化されたＳまたはＮ，例えば，スルフィニル，スルホニル，および３級環窒素のＮ−オキシドを含むことが意図される。炭素または窒素原子は，安定な芳香族環が保持されるようなヘテロアリール環構造の結合点である。ヘテロアリール基の例としては，限定されないが，ピリジニル，ピリダジニル，ピラジニル，キナオキサリル，インドリジニル，ベンゾ［ｂ］チエニル，キナゾリニル，プリニル，インドリル，キノリニル，ピリミジニル，ピロリル，オキサゾリル，チアゾリル，チエニル，イソオキサゾリル，オキサチアジアゾリル，イソチアゾリル，テトラゾリル，イミダゾリル，トリアジニル，フラニル，ベンゾフリル，およびインドリルが挙げられる。"任意に置換されていてもよいヘテロアリール"には，ヘテロアリールまたは，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで置換されて，任意の利用可能な炭素または窒素で結合して安定な化合物を生成するヘテロアリールが含まれる。"置換ヘテロアリール"とは，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基，または任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで置換されて，任意の利用可能な炭素または窒素に結合して安定な化合物を生成しているヘテロアリールである。
【０１３７】
"ヘテロアラルキル"とは，式−Ｒｂｂ−ＨｅｔＡｒを表し，ここで，ＨｅｔＡｒはヘテロアリール基であり，Ｒｂｂは低級アルキレンである。"任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル"とは，ヘテロアラルキルまたは，低級アルキレン基が任意の利用可能な点に結合したアルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で任意に置換されて安定な化合物を生成しているヘテロアラルキルを表し，ここで，ヘテロアリール基は，任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで任意に置換されて安定な化合物を生成していてもよい。
【０１３８】
"シクロアルキル"とは，１つの環あたり３−８個，より好ましくは３−６個の環メンバーを有する，飽和または不飽和の，非芳香族性の，単環，二環または三環の炭素環系を表し，例えば，シクロプロピル，シクロペンチル，シクロヘキシル，アダマンチル等が挙げられる。"任意に置換されていてもよいシクロアルキル"とは，シクロアルキルまたは，任意の利用可能な炭素または窒素に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで安定な化合物を生成しているシクロアルキルを表す。
【０１３９】
"シクロアルキルアルキル"とは，基−Ｒｃｃ−Ｃｙｃを表し，ここで，Ｃｙｃはシクロアルキル基であり，Ｒｃｃは低級アルキレン基である。"任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル"とは，シクロアルキルアルキルまたは，低級アルキレン基が任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成しているシクロアルキルアルキルを表し，ここで，シクロアルキル基は，利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで任意に置換されて安定な化合物を生成していてもよい。
【０１４０】
"ヘテロシクロアルキル"とは，５−１０個の原子を有し，このうち環中の１−３個炭素原子はＯ，ＳまたはＮの複素原子により置き換えられており，任意に，５−６員環のベンゾまたはヘテロアリールと縮合していてもよい，飽和または不飽和の，非芳香族性のシクロアルキル基を表す。ヘテロシクロアルキルはまた，酸化されたＳまたはＮ，例えば，スルフィニル，スルホニルおよび３級環窒素のＮ−オキシドを含むことが意図される。ヘテロシクロアルキル環の結合点は，安定な環が保持されるような炭素または窒素原子であｒく。ヘテロシクロアルキル基の例としては，限定されないが，モルホリノ，テトラヒドロフラニル，ジヒドロピリジニル，ピペリジニル，ピロリジニル，ピペラジニル，ジヒドロベンゾフリル，およびジヒドロインドリルが挙げられる。"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル"とは，ヘテロシクロアルキルまたは，任意の利用可能な炭素または窒素に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで置換されて安定な化合物を形成していてもよいヘテロシクロアルキルを表す。
【０１４１】
"ヘテロシクロアルキルアルキル"とは，基−Ｒｄｄ−Ｈｅｔを表し，ここで，Ｈｅｔはヘテロシクロアルキル基であり，Ｒｄｄは低級アルキレン基である。"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル"とは，ヘテロシクロアルキルアルキルまたは，低級アルキレン基が任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基で任意に置換されて安定な化合物を生成していてもよいヘテロシクロアルキルアルキルを表し，ここで，ヘテロシクロアルキル基は，任意の利用可能な点に結合した，アルキルの定義の段落で定義した１−３個の基または置換基，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，または任意に置換されていてもよい低級アルキニルで任意に置換されて安定な化合物を生成していてもよい。
【０１４２】
"任意に置換されていてもよいアルキルスルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）Ｒｅｅを表し，ここで，Ｒｅｅは，任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１４３】
"任意に置換されていてもよいアリールスルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）Ｒｆｆを表し，ここで，Ｒｆｆは，任意に置換されていてもよいアリールである。
【０１４４】
"任意に置換されていてもよいヘテロアリールスルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）Ｒｇｇを表し，ここで，Ｒｇｇは，任意に置換されていてもよいヘテロアリールである。
【０１４５】
"任意に置換されていてもよいシクロアルキルスルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）Ｒｈｈを表し，ここで，Ｒｈｈは，任意に置換されていてもよいシクロアルキルである。
【０１４６】
"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルスルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）Ｒｉｉを表し，ここで，Ｒｉｉは，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルである。
【０１４７】
"任意に置換されていてもよいアルキルスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊｊを表し，ここで，Ｒｊｊは，任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１４８】
"任意に置換されていてもよいアリールスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）２Ｒｋｋを表し，ここで，Ｒｋｋは，任意に置換されていてもよいアリールである。
【０１４９】
"任意に置換されていてもよいヘテロアリールスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）２ＲＬＬを表し，ここで，ＲＬＬは，任意に置換されていてもよいヘテロアリールである。
【０１５０】
"任意に置換されていてもよいシクロアルキルスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）２Ｒｍｍを表し，ここで，Ｒｍｍは，任意に置換されていてもよいシクロアルキルである。
【０１５１】
"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）２Ｒｎｎを表し，ここで，Ｒｎｎは，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルである。
【０１５２】
"任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＳ（Ｏ）２Ｒｐｐを表し，ここで，Ｒｐｐは，任意に置換されていてもよい低級アルキルであり，Ｒｏｏは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１５３】
"任意に置換されていてもよいアリールスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＳ（Ｏ）２Ｒｑｑを表し，ここで，Ｒｑｑは，任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒｏｏは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１５４】
"任意に置換されていてもよいヘテロアリールスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＳ（Ｏ）２Ｒｒｒを表し，ここで，Ｒｒｒは，任意に置換されていてもよいヘテロアリールであり，Ｒｏｏは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１５５】
"任意に置換されていてもよいシクロアルキルスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＳ（Ｏ）２Ｒｓｓを表し，ここで，Ｒｓｓは，任意に置換されていてもよいシクロアルキルであり，Ｒｏｏは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１５６】
"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＳ（Ｏ）２Ｒｔｔを表し，ここで，Ｒｔｔは，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルであり，Ｒｏｏは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１５７】
"任意に置換されていてもよいアルキルカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＣ（Ｏ）Ｒｕｕを表し，ここで，Ｒｕｕは，任意に置換されていてもよい低級アルキルであり，Ｒｏｏは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１５８】
"任意に置換されていてもよいアリールカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＣ（Ｏ）Ｒｖｖを表し，ここで，Ｒｖｖは，任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒｏｏは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１５９】
"任意に置換されていてもよいヘテロアリールカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＣ（Ｏ）Ｒｗｗを表し，ここで，Ｒｗｗは，任意に置換されていてもよいヘテロアリールであり，Ｒｏｏは水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１６０】
"任意に置換されていてもよいシクロアルキルカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＣ（Ｏ）Ｒｘｘを表し，ここで，Ｒｘｘは，任意に置換されていてもよいシクロアルキルであり，Ｒｏｏは水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１６１】
"任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲｏｏＣ（Ｏ）Ｒｙｙを表し，ここで，Ｒｙｙは，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルであり，Ｒｏｏは水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【０１６２】
本明細書において用いる場合，"組成物"および"医薬組成物"との用語は，治療上有意な量の活性剤を含む調製物を表し，これは，被験者への投与に適合する形で調製される。すなわち，調製物は，あらゆる成分が，合理的に思慮深い医療従事者がその調製物が通常の被験者に投与するのに適していないと考えるような量で含まれないものである。多くの場合，そのような医薬組成物は無菌調製物である。
【０１６３】
本明細書においてＰＤＥ４調節化合物，結合化合物またはリガンドに関連して用いる場合，"ＰＤＥ４ホスホジエステラーゼに特異的"，"ＰＤＥ４に特異的"との用語または同様の用語は，特定の化合物が，特定の生物に存在するかもしれない他のホスホジエステラーゼに対するより統計学的に高い程度で，例えば，少なくとも２，３，４，５，１０，２０，５０，１００，または１０００倍で，ＰＤＥ４に結合することを意味する。また，結合以外の生物学的活性を示す場合，"ＰＤＥ４に特異的"との用語は，特定の化合物が，他のホスホジエステラーゼに対するよりＰＤＥ４への結合に伴ってより高い生物学的活性を有することを示す（例えば，結合特異性について示されるレベルで）。好ましくは，特異性はまた，生物から提示されるかもしれない他の生物分子（ホスホジエステラーゼに限定されない）に対するものである。そのような結合および／または活性特異性は，特異性が他のＰＤＥ４アイソフォームに対するものでもあるように，ＰＤＥ４アイソフォーム，例えば，ＰＤＥ４Ａ，ＰＤＥ４Ｂ，ＰＤＥ４Ｃ，ＰＤＥ４Ｄに対するものであってもよい。ＰＤＥ４と相互作用するリガンドの文脈においては，"・・・に及ぼす活性"，"・・・に対する活性"との用語および同様の用語は，そのようなリガンドが，一般に許容されているＰＤＥ４活性アッセイで判定して，１またはそれ以上のＰＤＥ４に対して１０μＭ未満，１μＭ未満，１００ｎＭ未満，５０ｎＭ未満，２０ｎＭ未満，１０ｎＭ未満，５ｎＭ未満，または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有することを意味する。
【０１６４】
本明細書において用いる場合，"ＰＤＥ４媒介性"の疾病または状態との用語または同様の用語は，ＰＤＥ４の生物学的機能が疾病または状態の発症および／または経過に影響を与え，および／またはＰＤＥ４の調節が疾病または状態の発症，経過，および／または症状を変化させるような疾病または状態を表す。同様に，"ＰＤＥ４の調節が治療上の効用を与える"との語句は，被験者におけるＰＤＥ４の活性のレベルの調節が，そのような調節が疾病の重篤度および／または持続時間を低下させ，疾病または状態の発症の確率を低下させるか遅らせ，および／または疾病または状態の１またはそれ以上の症状の改善を引き起こすものであることを表す。ある場合には，疾病または状態は，ＰＤＥ４アイソフォーム，例えば，ＰＤＥ４Ｂ，ＰＤＥ４Ｃ，またはＰＤＥ４Ｄの１つにより媒介されるものであってもよい。
【０１６５】
本明細書の文脈において，"治療上有効な"との用語は，物質または物質の量が，疾病または医学的状態の１またはそれ以上の症状を予防，軽減，または改善するのに，および／または治療している被験者の生存を長くするのに有効であることを示す。
【０１６６】
"薬学的に許容しうる"との用語は，示される物質が，合理的に思慮深い医療従事者が治療すべき疾病または状態およびそれぞれの投与の経路を考慮して，その物質を患者に投与すること避けるような特性を有しないことを示す。例えば，注射用には，そのような物質が本質的に無菌であることが一般に要求される。
【０１６７】
"薬学的に許容しうる代謝産物"との用語は，被験者または患者の身体中における特定の化合物（またはその塩）の代謝により生ずる薬学的に許容しうる産物を表し，これは活性な産物であってもよい。化合物の代謝産物は，当該技術分野において知られる日常的な手法を用いて同定することができ，その活性は，例えば本明細書に記載される試験を用いて判定することができる。例えば，ある化合物においては，薬理学的活性を保持したまま１またはそれ以上のアルコキシ基が代謝されてヒドロキシル基となることができ，および／またはカルボキシル基がエステル化，例えばグルクロン酸化することができる。ある場合には，２以上の代謝産物が存在することがあり，ここで，中間体代謝産物はさらに代謝されて活性な代謝産物を生ずる。例えば，ある場合には，代謝的グルクロン酸化により生ずる誘導体化合物は不活性であるか低い活性のものでありえ，これはさらに代謝されて活性な代謝産物を生ずる。
【０１６８】
"薬学的に許容しうる塩"とは，特定の化合物の遊離酸および塩基の生物学的効力を保持し，生物学的にまたは他の理由により許容しえないものではない塩を意味する。本発明の化合物は，十分な酸性，十分な塩基性または両方の官能基を有していてもよく，したがって，多数の無機または有機塩基，および無機および有機酸のいずれかと反応して，薬学的に許容しうる塩を形成してもよい。薬学的に許容しうる塩の例としては，本発明の化合物と無機または有機酸または無機塩基との反応により製造される塩，例えば，ナトリウム，塩化物，硫酸塩，ピロ硫酸塩，重硫酸塩，亜硫酸塩，亜硫酸水素塩，リン酸塩，リン酸一水素塩，リン酸二水素塩，メタリン酸塩，ピロリン酸塩，塩化物，臭化物，ヨウ化物，アセテート，プロピオネート，デカノエート，カプリレート，アクリレート，ホルメート，イソブチレート，カプロレート，ヘプタノエート，プロピオレート，オキサレート，マロネート，スクシネート，スベレート，セバケート，フマレート，マレエート，ブチン−１，４ジオエート，ヘキシン−１，６−ジオエート，ベンゾエート，クロロベンゾエート，メチルベンゾエート，ジニトロベンゾエート，ヒドロキシベンゾエート，メトキシベンゾエート，フタレート，スルホネート，キシレンスルホネート，フェニルアセテート，フェニルプロピオネート，フェニルブチレート，シトレート，ラクテート，ガンマヒドロキシブチレート，グリコレート，タートレート，メタンスルホネート，プロパンスルホネート，ナフタレン−１−スルホネート，ナフタレン−２−スルホネート，およびマンデレートが挙げられる。
【０１６９】
"ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ"および"ＰＤＥ４Ｂ"との用語は，同じ長さのセグメントにわたる最大アラインメントについて，表４に示される天然のＰＤＥ４ＢのＧｅｎＢａｎｋポリペプチド配列ＪＣ１５１９（配列番号１）を参照してアミノ酸残基１５２−５２８（Ｓ１５２−Ｓ５２８）と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含むか，または，天然のＰＤＥ４ＢのＪＣ１５１９（配列番号１）のアミノ酸残基１５２−５２８からの少なくとも２００個の連続するアミノ酸と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含み，天然のＰＤＥ４Ｂリガンドへの結合を保持している，酵素的に活性なホスホジエステラーゼを意味する。好ましくは，配列同一性は少なくとも９５，９７，９８，９９％，またはさらに１００％である。好ましくは，特定される配列同一性のレベルは，少なくとも３００個の連続するアミノ酸残基の長さの配列にわたる。ＪＣ１５１９（配列番号１）のアミノ酸残基１５２−５２８で特定される配列はまた，ＮＰ＿００２５９１（配列番号２）（ＮＭ＿００２６００によりコードされる，配列番号４）のＳ３２４−Ｓ７００，ＡＡＢ９６３８１（配列番号５）のＳ３０９−Ｓ６８５，およびＡＡＡ３５６４３（配列番号６）のＳ１９４−Ｓ５７０としても入手可能である。したがって，挙げられる配列の１つにより同定されるアミノ酸残基もまた，挙げられる配列のいずれか別のものまたは他のマッチした配列においてマッチしたアミノ酸残基として表現することができる。
【０１７０】
用語「ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメイン」とは，ＰＤＥ４Ｂ中のホスホジエステラーゼ触媒領域を含む，長さの短いＰＤＥ４Ｂ（すなわち，全長ＰＤＥ４Ｂよりも少なくとも１００アミノ酸短い）を指す。本発明において使用するためには，ホスホジエステラーゼドメインがホスホジエステラーゼ活性を保持していることが極めて好ましく，天然ＰＤＥ４Ｂと比較して少なくとも５０％レベルのホスホジエステラーゼ活性が好ましく，天然活性の少なくとも６０，７０，８０，９０または１００％がより好ましい。
【０１７１】
本明細書において，用語「リガンド」および「調節剤」とは，同等に用いられて，標的生体分子，例えばキナーゼまたはホスホジエステラーゼなどの酵素の活性を調節する化合物を指す。一般に，リガンドまたは調節剤は小分子であり，「小分子」とは，分子量１５００ダルトン以下，好ましくは１０００ダルトン以下，８００ダルトン以下，または６００ダルトン以下の化合物を指す。したがって，「改良されたリガンド」とは，参照化合物より良好な薬理学的および／または薬物動態学的特性を有するものであり，「良好な」とは特定の生物系または治療的使用に関して定義され得る。スキャフォールドからのリガンドの開発という点では，リガンドはスキャフォールドの誘導体である。
【０１７２】
結合化合物，分子スキャフォールドおよびリガンドの関連では，用語「誘導体」または「誘導化合物」とは，親または参照化合物と共通のコア化学構造を含むが，少なくとも１つの構造上の相違を有することによって，例えば１個以上の置換基が付加されている，かつ／または除去されている，かつ／または置換されていることで，ならびに／あるいは１個以上の原子が異なる原子で置換されていることで異なる化学構造を有する化合物を指す。明確に別に指示しない限りは，用語「誘導体」は，親化合物を出発物質として，または中間体として用いて合成された誘導体を意味しないが，誘導体が親から合成され得る場合もある。
【０１７３】
したがって，用語「親化合物」とは，誘導化合物において維持されている構造上の特徴を有する，別の化合物にとっての参照化合物を指す。必ずしもそうではないが，親化合物が誘導体よりも単純な化学構造を有することが多い。
【０１７４】
「化学構造」または「化学基礎構造」とは，分子の一部を構成する，いずれかの定義可能な原子または原子の群を意味する。通常，スキャフォールドまたはリガンドの化学基礎構造は，スキャフォールドまたはリガンドの標的分子との結合において役割を有し得るか，スキャフォールドまたはリガンドの三次元形状，帯電および／または配座特性に影響を及ぼし得る。
【０１７５】
標的と，潜在的結合化合物間の相互作用に関連して，用語「結合する」とは，潜在的結合化合物が，標的と，一般的なタンパク質との会合（すなわち，非特異的結合）と比較して統計学的に有意な程度に会合することを示す。したがって，用語「結合化合物」とは，標的分子と統計学的に有意な会合を有する化合物を指す。結合化合物は特定の標的と１ｍＭ以下の解離定数（ｋｄ）で相互作用することが好ましい。結合化合物は，本明細書に記載されるような「低い親和性」，「極めて低い親和性」，「極端に低い親和性」，「中程度の親和性」，「中程度に高い親和性」または「高い親和性」で結合し得る。
【０１７６】
標的と結合する化合物に関連して，用語「より高い親和性」とは，化合物が参照化合物よりも，または参照条件における，すなわち，より低い解離定数での同一化合物よりも強固に結合することを示す。特定の実施形態では，より高い親和性とは，少なくとも２，３，４，５，８，１０，５０，１００，２００，４００，５００，１０００または１０，０００倍高い親和性である。
【０１７７】
また，生体分子標的と結合する化合物に関連して，用語「より高い特異性」とは，化合物が，適切な結合条件下で存在し得る別の生体分子または複数の生体分子とよりも特定の標的とより高い程度で結合することを示し，ここでこのような他の生体分子との結合によって特定の標的との結合とは異なる生物活性が生じることを示す。通常，特異性はその他の生体分子の限定されたセット，例えば，ＰＤＥ４Ｂの場合には，その他のホスホジエステラーゼ（例えばＰＤＥ５Ａ）または他のＰＤＥ４アイソフォーム（例えばＰＤＥ４Ｄ）またはさらにその他の種類の酵素に対するものである。特定の実施形態では，より高い特異性とは，少なくとも２，３，４，５，８，１０，５０，１００，２００，４００，５００または１０００倍高い特異性である。
【０１７８】
化合物の標的との結合に関連して，用語「相互作用する」とは，結合している化合物から特定のアミノ酸残基までの距離が５．０オングストローム以下となることを示す。特定の実施形態では，化合物から特定のアミノ酸残基までの距離は４．５オングストローム以下，４．０オングストローム以下，または３．５オングストローム以下である。このような距離は，例えば，共結晶学を用いて求めることができ，または活性部位における化合物のコンピュータフィッティングを用いて推定することができる。
【０１７９】
ＰＤＥ４Ｂの特定のアミノ酸残基について，ポリペプチド残基番号は，ＮＣＢＩタンパク質配列受託番号ＪＣ１５１９（配列番号１）（例えば，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（９），６４７０−６４７６（１９９３）；Ｏｂｅｒｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２９（２），２３９−２４７（１９９３）；およびＢｏｌｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３（１０），６５５８−６５７１（１９９３）に記載される）に対応する番号付けにより規定される。上述したように，他のマッチしたＰＤＥ４Ｂ配列からの別の番号付けを用いることもできる。
【０１８０】
「分子スキャフォールド」または「スキャフォールド」とは，共通構造要素を含む複数の分子を形成するよう，１以上のさらなる化学部分を共有結合，修飾，排除させることができる，簡単な標的結合分子を意味する。このような部分としては，それだけには限らないが，ハロゲン原子，ヒドロキシル基，メチル基，ニトロ基，カルボキシル基，またはそれだけには限らないが，本願に列挙されたものを含むいずれかのその他の種類の分子基が挙げられる。分子スキャフォールドは少なくとも１種の標的分子と，好ましくはタンパク質ファミリー中の複数の分子と結合し，標的分子は酵素，受容体またはその他のタンパク質であることが好ましい。スキャフォールドの好ましい特性としては，スキャフォールド上の１以上の置換基が標的分子結合部位中の結合ポケット中に位置するような標的分子結合部位での結合；特に合成反応によって化学修飾でき，その結果コンビナトリアルライブラリーを容易に構築できる，化学的に扱いやすい構造を有すること；スキャフォールドとタンパク質結合部位との結合を妨害しない部分を結合でき，その結果スキャフォールドまたはライブラリーメンバーを，リガンドを形成し，さらなる所望の特性を達成するよう修飾できる，例えばリガンドが細胞および／または指定の器官に活性に輸送されるようにできる，またはさらなる分析のためにリガンドがクロマトグラフィーカラムに結合されるようにできる，化学位置を有することを挙げることができる。したがって，分子スキャフォールドは，結合親和性および／または特異性，またはその他の薬理学的特性を改良するための修飾に先立って同定された標的結合分子である。
【０１８１】
用語「スキャフォールドコア」とは，種々の置換基を結合できる，分子スキャフォールドのコア構造を指す。したがって，特定の化学的分類のいくつかのスキャフォールド分子については，スキャフォールドコアはすべてのスキャフォールド分子に共通している。多くの場合，スキャフォールドコアは１以上の環構造からなるかまたはこれを含む。
【０１８２】
「結合部位」とは，リガンドが非共有結合できる，標的分子の領域を意味する。結合部位は特定の形を具現しており，結合部位内に存在する複数の結合ポケットを含むことが多い。特定の形は分子の分類，例えば分子ファミリー内で保存されていることが多い。ある分類内の結合部位はまた，保存された構造，例えば，化学部分，結合ポケットの存在および／または結合部位または結合部位のある部分での帯電などを含む場合があり，そのすべてが結合部位の形に影響を及ぼし得る。
【０１８３】
「結合ポケット」とは，結合部位内の具体的な容積を意味する。結合ポケットは，しばしば結合部位中の特定の形，窪み，または空洞であり得る。結合ポケットは，別の分子の非共有結合において重要である，特定の化学基または構造，例えば分子間のイオン性，水素結合またはファンデルワールス相互作用に寄与する基などを含み得る。
【０１８４】
標的分子に結合している結合化合物に関連して「配向」とは，結合ポケットおよび／または少なくとも部分的に結合ポケットを決定づける標的分子の原子に対する，結合化合物（少なくともその構成原子のいくつかを参照して定義できる）の空間的関係を意味する。
【０１８５】
本発明における標的分子の関連では，用語「結晶」とは，Ｘ線結晶学にとって適した種類の標的分子の規則正しい集合を指す。すなわち，Ｘ線のビームで照射されると，集合からＸ線回析パターンが生じる。したがって，結晶は，回析パターンを生じない標的分子の集塊またはその他の複合体とは区別される。
【０１８６】
「共結晶」とは，標的分子と非共有結合しており，Ｘ線またはタンパク質結晶学による解析にとって適当な結晶形で存在している，化合物，分子スキャフォールドまたはリガンドの複合体を意味する。好ましい実施形態では，標的分子−リガンド複合体はタンパク質−リガンド複合体であり得る。
【０１８７】
語句「結合親和性または結合特異性を変更する」とはそれぞれ，第１の化合物のもう１つのものに対する結合定数を変化させること，または第１の化合物の第２の化合物に対する結合レベルを，第１の化合物の第３の化合物に対する結合レベルと比較して変化させることを指す。例えば，特定のタンパク質に対する化合物の結合特異性は，その特定のタンパク質との結合の相対レベルが，化合物の無関係のタンパク質との結合と比較して増加する場合に増加する。
【０１８８】
本明細書において試験化合物，結合化合物および調節剤（リガンド）に関連して，用語「合成すること」および同様の用語は，１種以上の前駆体物質からの化学合成を意味する。
【０１８９】
語句「分子スキャフォールドの化学構造が修飾される」とは，誘導分子が，分子スキャフォールドのものとは異なるが依然として共通コア化学構造上の特徴を含む化学構造を有することを意味する。この語句は，誘導体の合成の前駆体として分子スキャフォールドが用いられることを必ずしも意味するわけではない。
【０１９０】
「アッセイすること」とは，実験条件の作製および実験条件の特定の結果に関するデータの収集を意味する。例えば，酵素は，検出可能な基質に対して作用するその能力に基づいてアッセイできる。化合物またはリガンドは，特定の標的分子または複数の分子と結合するその能力に基づいてアッセイできる。
【０１９１】
化合物の「セット」とは，化合物を集めたもの意味する。化合物は構造上関連があるものでも，ないものでもあり得る。
【０１９２】
本明細書において用いる場合，"調節すること"または"調節する"との用語は，生物学的活性，特に特定の生物分子，例えばＰＤＥ４またはＰＤＥ４Ｂ等のそのアイソフォームに伴う生物学的活性を変更させる効果を表す。例えば，特定の生物分子のアゴニストまたはアンタゴニスは，その生物分子，例えば，酵素の活性を調節する。
【０１９３】
"ＰＤＥ４活性"との用語は，ＰＤＥ４の生物学的活性，特にホスホジエステラーゼ活性を表す。同様の用語は，特定のＰＤＥ４アイソフォーム，例えば，ＰＤＥ４Ａ，ＰＤＥ４Ｂ，ＰＤＥ４Ｃ，およびＰＤＥ４Ｄにも適用される。
【０１９４】
調節剤であるかまたは調節剤であり得る化合物の使用，試験またはスクリーニングの文脈においては，用語「接触させること」とは，化合物が特定の分子，複合体，細胞，組織，生物，または化合物とその他の特定の物質との間に結合相互作用および／または化学反応が生じる可能性があるように，その他の指定の物質に対して十分に近接させることを意味する。
【０１９５】
Ｉ．一般
本発明は，ＰＤＥ４Ｂの阻害剤である式の化合物，およびＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ活性を調節する構造を有する改良された化合物を開発するための，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ構造，構造情報，および関連する組成物を使用する方法を提供する。
【０１９６】
ＰＤＥ４阻害剤およびその使用に関する多数の公開特許がある。そのような公開のほとんどは，ＰＤＥ４Ｄに焦点を当てている。例えば，Ｍａｒｆａｔら，米国特許６，５５９，１６８は，ＰＤＥ４阻害剤，特にＰＤＥ４Ｄ阻害剤を記載しており，別のＰＤＥ４阻害剤を記載する別の公開特許を引用する。そのような別の公開には，Ｍａｒｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９８／４５２６８；Ｓａｃｃｏｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許４，８６１，８９１；Ｐｏｎ，米国特許５，９２２，５５７；およびＥｇｇｌｅｓｔｏｎ，ＷＯ９９／２０６２５が含まれる。
【０１９７】
Ａｉｔ  Ｉｋｈｌｅｆら（米国特許公開２００３００６４３７４，出願番号１０／９８３，７５４）は，ＰＤＥ４Ｂに活性な化合物および神経毒の治療，例えば，神経変性性疾患，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，ハンティングトン舞踏病，および脳虚血の治療におけるその使用を記載する。
【０１９８】
上述で引用されたすべての文献はその全体を，例えば，限定されないが，阻害剤およびその用途の説明，ならびにアッセイ，合成，およびＰＤＥおよび誘導体の同定および製造を本明細書の一部としてここに引用する。
【０１９９】
ＰＤＥ４Ｂと関連する疾病の例
ＰＤＥ４Ｂの調節は，多数の様々な疾病および状態の治療と関連づけられている。多数の公開特許がＰＤＥ４阻害剤およびその使用を記載している。そのような公開特許のほとんどは，ＰＤＥ４Ｄに着目している。例えば，Ｍａｒｆａｔら（米国特許６，５５９，１６８）は，ＰＤＥ４阻害剤，特にＰＤＥ４Ｄ阻害剤を記載し，さらに別のＰＤＥ４阻害剤を記載する別の公開特許を引用している。そのような別の公開特許としては，Ｍａｒｆａｔら（ＷＯ９８／４５２６８）；Ｓａｃｃｏｏｍａｎｏら（米国特許４，８６１，８９１）；Ｐｏｎ（米国特許５，９２２，５５７）；およびＥｇｇｌｅｓｔｏｎ（ＷＯ９９／２０６２５）がある。
【０２００】
Ａｉｔ  Ｉｋｈｌｅｆら（米国特許公開２００３００６４３７４，出願番号１０／９８３，７５４）は，ＰＤＥ４Ｂに活性な化合物および神経毒の治療，例えば，神経変性性疾患，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，ハンティングトン舞踏病，および脳虚血の治療におけるその使用を記載する。
【０２０１】
すなわち，ＰＤＥ４Ｂ調節剤は，ＰＤＥ４，特にＰＤＥ４Ｂに関連するそのような状態の治療または予防に用いることができる。治療しうる追加の状態としては，限定されないが，急性または慢性の肺疾病，例えば閉塞性疾病（例えば，喘息，慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ），嚢胞性線維症），間質性肺疾患（例えば，特発性肺線維症，サルコイドーシス），血管肺疾病（例えば，肺高血圧），気管支炎，アレルギー性気管支炎，および気腫が挙げられる。本発明の態様により治療が意図される別の疾病または状態としては，例えば，限定されないが，ＣＮＳ疾病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病およびハンティングトン舞踏病；炎症性自己免疫疾患，例えば多発性硬化症，慢性関節リウマチおよびクローン病，ならびに他の炎症性疾患，例えば，脳虚血，炎症性大腸疾患，および潰瘍性大腸炎；骨疾病，例えば，骨粗鬆症，大理石骨病，およびパジェット病；癌，例えば，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ性白血病，急性リンパ芽球性白血病；重症急性呼吸器症候群；および早期陣痛が挙げられる。
【０２０２】
ＩＩ．結晶性ＰＤＥ４Ｂ
結晶性ＰＤＥ４Ｂには，天然結晶，ホスホジエステラーゼドメイン結晶，誘導体結晶および共結晶が含まれる。天然結晶は通常，結晶型のＰＤＥ４Ｂに相当する実質的に純粋なポリペプチドを含む。ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメイン結晶は，通常，結晶型の実質的に純粋なＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインを含む。ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ機能の阻害剤の開発に関連して，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインをそれぞれ構造決定に使用することが有利であるが，これは短い配列を使用することで構造決定が単純になるからである。この目的のために有用であるには，ホスホジエステラーゼは活性でなくてはならず，かつ／または天然型結合を保持していなくてはならず，したがって，このことはホスホジエステラーゼが実質的に正常な３Ｄ構造をとるということを示す。
【０２０３】
本発明の結晶性ホスホジエステラーゼおよびホスホジエステラーゼドメインは天然に存在するかまたは天然のホスホジエステラーゼに限定されるものではないということは理解されなくてはならない。実際，本発明の結晶は，天然ホスホジエステラーゼの突然変異体の結晶を含む。天然ホスホジエステラーゼの突然変異体は，天然ホスホジエステラーゼ中の少なくとも１個のアミノ酸残基を，異なるアミノ酸残基で置き換えることによって，または天然ポリペプチド内のもしくは天然ポリペプチドのＮもしくはＣ末端でアミノ酸残基を付加もしくは欠失することによって得られ，突然変異体が由来する天然ホスホジエステラーゼと実質的に同じ三次元構造を有する。
【０２０４】
実質的に同じ三次元構造を有することとは，天然ホスホジエステラーゼドメインの少なくとも約５０％〜１００％のＣα原子がスーパーポジション中に含まれる場合に，突然変異体が由来する天然ホスホジエステラーゼの原子構造座標とともにスーパーインポーズすると，二乗平均平方根偏差が約２Å以下である原子構造座標のセットを有することを意味する。
【０２０５】
ホスホジエステラーゼの三次元構造を大きく妨害しないアミノ酸置換，欠失および付加は，幾分かは，置換，付加または欠失が生じるホスホジエステラーゼの領域に応じて変わる。分子の高度に可変性の領域では，分子の三次元構造を大きく破壊することなく非保存的置換ならびに保存的置換が許容され得る。高度に保存された領域または重大な二次構造を含む領域では，保存的アミノ酸置換が好ましい。このような保存された領域および可変領域は，ＰＤＥ４Ｂと，その他のホスホジエステラーゼとの配列アラインメントによって同定できる。
【０２０６】
保存的アミノ酸置換は当分野ではよく知られており，関連するアミノ酸残基の極性，電荷，可溶性，疎水性，親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われる置換が挙げられる。例えば，負に帯電したアミノ酸としては，アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられ，正に帯電したアミノ酸としては，リシンとアルギニンが挙げられ，同様の親水性値を有する帯電していない極性頭部を含むアミノ酸としては，以下のものが挙げられる：ロイシン，イソロイシン，バリン；グリシン，アラニン；アスパラギン，グルタミン；セリン，トレオニン；フェニルアラニン，チロシン。その他の保存的アミノ酸置換は当分野ではよく知られている。
【０２０７】
化学合成によって全体としてまたは一部分として得られるホスホジエステラーゼについては，置換または付加に利用できるアミノ酸の選択は，遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されない。実際，本明細書に記載される突然変異体は，遺伝的にコードされないアミノ酸を含んでいてもよい。一般的に知られている遺伝的にコードされないアミノ酸の多数の保存的アミノ酸置換は，当技術分野ではよく知られている。その他のアミノ酸の保存的置換は，遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比較した，それらの物理的特性に基づいて決定できる。
【０２０８】
いくつかの例では，ｃＤＮＡをコードするポリペプチド中に好都合なクローニング部位を提供するために，ポリペプチドの精製を補助するために，およびポリペプチドの結晶化のために，天然ホスホジエステラーゼのアミノ酸残基を置換，欠失および／または付加することが特に有利または好都合であり得る。天然ホスホジエステラーゼドメインの三次元構造を実質的に変更しないこのような置換，欠失および／または付加は，当業者には明らかであろう。
【０２０９】
本明細書において考慮される突然変異体はすべてホスホジエステラーゼ活性を示す必要はないことに注目すべきである。実際，ホスホジエステラーゼ活性を妨害するが，ドメインの三次元構造を大きくは変更しないアミノ酸置換，付加または欠失が本発明によって特に考慮される。このような結晶ポリペプチドまたはそれから得られる原子構造座標を，天然ドメインと結合する化合物を同定するために使用できる。これらの化合物は，天然ドメインの活性に影響を及ぼし得る。
【０２１０】
本発明の誘導体結晶は，１個以上の重金属原子と共有結合している結晶ホスホジエステラーゼポリペプチドを含み得る。このポリペプチドは天然または突然変異ホスホジエステラーゼに相当し得る。誘導体結晶を提供するのに有用な重金属原子としては，それだけには限らないが例として，金，水銀，セレンなどが挙げられる。
【０２１１】
本発明の共結晶は通常，1種以上の化合物と結合している結晶ホスホジエステラーゼドメインポリペプチドを含む。結合は共有結合であってもよく，非共有結合であってもよい。このような化合物としては，それだけには限らないが，補因子，基質，基質類似体，阻害剤，アロステリックエフェクターなどが挙げられる。
【０２１２】
III．Ｘ線結晶学を用いる三次元構造決定
Ｘ線結晶学は，分子の三次元構造を解き明かす方法である。分子の構造は，回析格子として結晶を用いてＸ線回析パターンから算出する。タンパク質分子の三次元構造は，そのタンパク質の濃縮した水溶液から成長した結晶から生じる。Ｘ線結晶学のプロセスは以下のステップを含み得る：
（ａ）ポリペプチドを合成および単離すること（あるいは得ること），
（ｂ）調節剤を伴ってか伴わずに，ポリペプチドを含む水溶液から結晶を成長させること，
（ｃ）結晶からＸ線回析パターンを集めること，単位セル寸法および対称性を決定すること，電子密度を決定すること，ポリペプチドのアミノ酸配列を電子密度に対してフィッティングすること，および構造を精密化すること。
【０２１３】
ポリペプチドの製造
本明細書に記載される天然および突然変異型ホスホジエステラーゼポリペプチドは，当技術分野で周知の技術を用いて，全体または一部を化学合成できる（例えば，クレートン(Creighton)（１９８３）バイオポリマーズ(Biopolymers)２２（１）：４９〜５８頁参照）。
【０２１４】
あるいは，当業者に周知の方法を使用して，天然または突然変異型ホスホジエステラーゼポリペプチドコード配列と適当な転写／翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法としては，インビトロ組換えＤＮＡ技術，合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば，マニアティス(Maniatis)，Ｔ（１９８９）モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular cloning : A laboratory Manual.)。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)，ニューヨーク。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；およびオーズベル(Ausubel)，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４）カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology.)，ジョン・ウィレー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)，ニュージャージー州，セコーカス(Secaucus)に記載される技術を参照。
【０２１５】
種々の宿主発現ベクター系を利用してホスホジエステラーゼコード配列を発現できる。これらとしては，それだけには限らないが，ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換えバクテリオファージＤＮＡ，プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換えウイルス発現ベクター（例えば，バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系，ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換えウイルス発現ベクター（例えば，カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ，タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）に感染したか，組換えプラスミド発現ベクター（例えば，Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系などの微生物が挙げられる。これらの系の発現エレメントはその強度および特異性の点で様々である。
【０２１６】
用いる宿主／ベクター系に応じて，構築プロモーターおよび誘導プロモーターをはじめとするいくつかの適した転写および翻訳エレメントのいずれをも発現ベクターに使用できる。例えば，細菌系におけるクローニングの際には，誘導プロモーター，例えばバクテリオファージλのｐＬ，ｐｌａｃ，ｐｔｒｐ，ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などを使用でき，昆虫細胞系におけるクローニングの際には，バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用でき，植物細胞系におけるクローニングの際には，植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば，熱ショックプロモーター，ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーター），クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば，ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター，ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を使用でき，哺乳類細胞系におけるクローニングの際には，哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば，メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば，アデノウイルス後期プロモーター，ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用でき，ホスホジエステラーゼドメインＤＮＡの多重コピーを含む細胞株の作製の際には，ＳＶ４０，ＢＰＶおよびＥＢＶベースのベクターを適当な選択マーカーとともに使用できる。
【０２１７】
用いるＤＮＡ操作，ベクター，種々の種類の細胞についての方法，ベクターを細胞に組み込む方法，発現技術，タンパク質精製および単離法，およびタンパク質濃縮法を説明する例示的方法は，ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１８７３８に詳細に開示されている。この公開は参照により，図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。当業者には，このような記載を本発明に適用でき，それに容易に適応させることができることは当然であろう。
【０２１８】
結晶成長
結晶は，種々の技術によって精製および濃縮されたポリペプチドを含有する水溶液から成長させる。これらの技術としては，バッチ，液体，ブリッジ，透析，蒸気拡散および水滴法が挙げられる。参照により，すべての図，表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる，マクファーソン(McPherson)（１９８２）ジョン・ウィレー，ニューヨーク，マクファーソン（１９９０）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１８９：１〜２３頁，ウェバー(Webber)（１９９１）アドバンセズ・イン・プロテイン・ケミストリー(Advances in Protein Chemistry)４１：１〜３６頁。
【０２１９】
本発明の天然結晶は，概して，沈殿物をポリペプチドの濃縮溶液に添加することによって成長させる。沈殿物はタンパク質を沈殿させるのに必要な濃度のすぐ下の濃度で添加する。制御蒸発によって水を除去し，沈殿条件を生じさせ，これを結晶成長が終わるまで維持する。
【０２２０】
本発明の結晶のための，例示的結晶化条件を実施例に記載する。当業者ならば，例示的結晶化条件を変更できることは認識するであろう。このような変化量は，単独または組合せて使用できる。さらに，その他の結晶化条件は，例えば，このようなその他の条件を同定するための結晶化スクリーニングプレートを用いることによって見出すことができる。次いで，それらの代替条件を，必要に応じて最適化し，より大きなまたはより良質な結晶を提供することができる。
【０２２１】
本発明の誘導体結晶は，天然結晶を，重金属原子の塩を含有する母液に浸すことによって得ることができる。天然結晶を，約０．１ｍＭ〜約５ｍＭのチメロサル，４−クロロメルリ安息香酸(chloromeruribenzoic acid)またはＫＡｕ（ＣＮ）２を含有する溶液に約２時間〜約７２時間浸すことによって，Ｘ線結晶構造の決定における同形置換として使用するのに適した誘導体結晶が得られることがわかっている。
【０２２２】
本発明の共結晶は，天然結晶を，ホスホジエステラーゼと結合する化合物を含有する母液に浸すことによって得ることができ，または結合化合物の存在下でホスホジエステラーゼポリペプチドを共結晶化することによって得ることができる。
【０２２３】
一般に，ホスホジエステラーゼと結合化合物の共結晶化は，対応するホスホジエステラーゼを結合化合物を含まずに結晶化するために同定した条件を用いて達成できる。ホスホジエステラーゼに対して複数の異なる結晶化条件が同定されている場合には，どの条件が最良の共結晶をもたらすかを決定するためにこれらを試験することができることが有利である。共結晶化のための条件を最適化することも有益であり得る。あるいは，例えば，結晶化についてスクリーニングし，次いでそれらの条件を最適化することによって，共結晶を得るための新規結晶化条件を決定することができる。例示的共結晶化条件を実施例に示す。
【０２２４】
ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の単位セル寸法および三次元構造の決定
結晶が成長すると，ガラスキャピラリーチューブまたはその他の封入装置に入れ，Ｘ線発生器およびＸ線検出装置と連結している保持装置上にマウントすることができる。Ｘ線回析パターンの収集は，当業者によって十分に立証されている。例えば，デュクルー(Ducruix)およびゲイジ(Geige)，（１９９２），ＩＲＬプレス，英国，オックスフォードおよび本明細書に引用される参照文献参照。Ｘ線のビームは結晶に入り，次いで結晶から回析する。Ｘ線検出装置を利用して結晶から広がる回析パターンを記録できる。こういった機器の古いモデルのＸ線検出装置は，１つのフィルムであるが，最新機器はＸ線回析散乱をデジタル記録する。Ｘ線供給源は種々の型のものであり得るが，高輝度供給源，例えばシンクロトロンビーム供給源を用いることが有利である。
【０２２５】
ペプチド分子または分子複合体の結晶型の三次元構造を得る方法は，当技術分野では周知である。例えば，デュクルーおよびゲイジ（１９９２）ＩＲＬプレス，英国，オックスフォードおよび本明細書に引用される参照文献を参照。以下は，Ｘ線回析データから分子または複合体の三次元構造を決定するプロセス中のステップである。
【０２２６】
結晶からＸ線回析パターンを収集した後，結晶中の単位セル寸法および配向を決定できる。それらは回析放射ならびにこういった放射から作られるパターン間の間隔から決定できる。単位セル寸法はオングストローム（１Å＝１０−１０メートル）単位で三次元で，および各頂点の角度によって特徴づけられる。結晶中の単位セルの対称性もこの段階で特徴づけられる。結晶中の単位セルの対称性によって，反復パターンを同定することによって収集したデータの複雑性が単純化される。単位セルの対称性および寸法の適用を以下に説明する。
【０２２７】
各回析パターン放射は，ベクトルとして特徴づけられ，方法のこの段階で収集したデータにより各ベクトルの振幅が決まる。ベクトルの位相は複数の技術を用いて決定できる。一方法では，同形置換と呼ばれる方法であるが，重原子を結晶にソークすることができ，これらの重原子をＸ線回析における参照点として用いることによってベクトルの位相を調べることができる（オトウィノウスキ(Otwinowski)，（１９９１），英国，ダーズベリー，８０〜８６）。同形置換法は通常２種以上の重原子誘導体を利用する。
【０２２８】
もう１つの方法では，すでに構造の決定されている結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅および位相を，構造未知の結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅に適用し，続いてこれらのベクトルの位相を決定することができる。この第２の方法は分子置換として知られており，参照として用いられるタンパク質構造は，注目するタンパク質と密接に関連した構造を有していなくてはならない。（ナラザ(Naraza)（１９９４）プロテインズ(Proteins)１１：２８１〜２９６頁）。したがって，構造既知のホスホジエステラーゼからのベクトル情報，例えば本明細書に報告されているものは，構造未知の別のホスホジエステラーゼの分子置換解析にとって有用である。
【０２２９】
結晶の単位セルを表すベクトルの位相を決定すると，ベクトル振幅および位相，単位セル寸法および単位セル対称性をフーリエ変換関数中の項として使用できる。フーリエ変換関数によって，これらの測定値から単位セル中の電子密度を算出する。単位セル中の分子の１つまたは分子複合体の１つを表す電子密度は，電子密度マップと呼ぶことができる。次いで，種々のコンピュータプログラムを用いて，配列のアミノ酸構造または結晶性ポリペプチドと複合体を形成している化合物の分子構造を，電子密度とフィッティングすることができる。プロセスのこのステップはモデルビルディングとも称され，Ｔｕｒｂｏ／ＦＲＯＤＯまたは「Ｏ」などのコンピュータプログラムを用いることによって達成できる。（ジョーンズ(Jones)（１９８５）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)１１５：１５７〜１７１頁）。
【０２３０】
次いで，実験的に求めた電子密度にフィッティングしたアミノ酸構造から理論上の電子密度マップを算出できる。理論上の電子密度マップおよび実験的電子密度マップを互いに比較することができ，これら２つのマップ間の一致はＲ因子と呼ばれるパラメーターによって表すことができる。低い値のＲ因子は，理論上の電子密度マップと実験的電子密度マップの間の高度にオーバーラップする電子密度を表す。
【０２３１】
次いで，理論上の電子密度マップを精密化するコンピュータプログラムを用いてＲ因子を最小化する。当業者によって，Ｘ−ＰＬＯＲなどのコンピュータプログラムをモデル精密化のために使用できる。（ブルンガー(Brunger)（１９９２）ネイチャー(Nature)３５５，４７２〜４７５頁）。精密化は反復プロセスで達成できる。第1のステップは，電子密度マップにおいて規定される原子の構造の変化を引き起こし得る。原子の構造は温度の上昇をシミュレートすることによって変更でき，これにより結合の振動周波数が増加し，構造中の原子の位置が改変される。原子撹乱プロセスにおける特定の点では，通常，原子間の相互作用を許容結合角および結合の長さ，ファンデルワールス相互作用，水素結合，イオン性相互作用および疎水性相互作用という点で規定する力場を，原子の系に適用できる。好都合な相互作用は自由エネルギーという言葉で表すことができ，原子は，自由エネルギー最小が達成されるまで多数の反復の間を動かされ得る。精密化プロセスは，Ｒ因子が最小値に達するまで反復され得る。
【０２３２】
分子または分子複合体の三次元構造は，最小Ｒ値を特徴とする理論上の電子密度にフィッティングする原子によって表される。次いで，各原子を座標によって三次元に規定する三次元構造のファイルを作製することができる。そのような構造座標ファイルの例は表１に示される。
【０２３３】
ＩＶ．ＰＤＥ４Ｂの構造
例示的結合化合物と共に複合体形成している，結晶性ＰＤＥ４ＢホスホジエステラーゼドメインおよびＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの高解像度三次元構造および原子構造座標を説明する。構造座標を得るために用いた方法は実施例に示す。結晶性ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの原子構造座標は表１に列挙される。共結晶座標は，例えば，本明細書に記載される種々の態様において，単独でタンパク質の座標と同様に使用できるが，このような共結晶は結合化合物の結合モードを示すか裏付けるものであるので有利であり得，また結合化合物の存在に応じたタンパク質原子のシフトを含み得る。
【０２３４】
当業者ならば，Ｘ線結晶学によって決定される原子構造座標には誤差を伴うということは認識するであろう。したがって，一般に，天然結晶，ホスホジエステラーゼドメイン結晶，誘導体結晶または共結晶であろうとなかろうと，本明細書に記載される座標の表に示される構造座標に，主鎖原子（Ｎ，Ｃａ，ＣおよびＯ）を用いてスーパーインポーズすると，約１．５Å以下の二乗平均平方根偏差（「ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．」）を有する，PDEの結晶について得られた構造座標のいずれかのセットは，結晶化しているタンパク質の少なくとも約５０％〜１００％の主鎖原子がスーパーポジションに含まれる場合には，この表に示される構造座標と同一であると考えられるということは理解されなくてはならない。
【０２３５】
Ｖ．結晶および原子構造座標の使用
本発明の結晶，特にそれから得られた原子構造座標は多種多様な用途を有する。例えば，本明細書に記載される結晶は，当技術分野で公知のまたは後に開発されるホスホジエステラーゼの使用法のいずれかにおいて出発点として使用できる。このような使用法としては，例えば，ホスホジエステラーゼの天然または突然変異型触媒ドメインと結合する分子を同定することが挙げられる。結晶および構造座標は，新規治療薬を開発することに向けたアプローチとして，ホスホジエステラーゼ活性を調節するリガンドを同定するためには特に有用である。詳しくは，結晶および構造情報は，分子スキャフォールドを利用してリガンドを開発する方法において有用である。
【０２３６】
本明細書に記載される構造座標は，さらなるホスホジエステラーゼの結晶構造，ならびに阻害剤，アゴニスト，アンタゴニストおよびその他の分子などのリガンドとこのようなホスホジエステラーゼとの共結晶との構造を決定するための位相合わせモデルとして使用できる。構造座標，ならびにそれから得られた三次元構造のモデルもまた，天然または突然変異型ホスホジエステラーゼの溶液ベースの構造，例えばＮＭＲによって得られたものの解明を補助するために使用できる。
【０２３７】
ＶＩ．ホスホジエステラーゼ構造の電子表示
ホスホジエステラーゼまたはホスホジエステラーゼの一部（例えば，ホスホジエステラーゼ活性部位）の構造情報は，多数の異なる方法で表すことができる。特に有用なものは電子表示であり，これは表示により迅速かつ好都合なデータ操作および構造修飾が可能となるためである。電子表示は多数の種々のストレージ媒体または記憶媒体，しばしばコンピュータにより読み取り可能な媒体に埋め込むことができる。それだけには限らないが例としては，コンピュータランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ），フローピーディスク，磁気ハードドライブ，磁気テープ（アナログまたはデジタル），コンパクトディスク（ＣＤ），光学ディスク，ＣＤ−ＲＯＭ，メモリーカード，デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）などが挙げられる。ストレージ媒体は分離できるか，コンピュータシステムの一部であり得る。このようなコンピュータシステムは，専用の，特殊用途の，または内蔵されたシステム，例えばＸ線結晶学システムの一部を形成するコンピュータシステムであってもよく，汎用コンピュータであってもよい（Ｘ線結晶学システム中のセンサー装置などのその他の設備とデータ接続を有することができる）。多くの場合，このような電子表示によって示される情報はまた，例えば，紙に，画像表示として（例えば，２次元としてまたは疑似三次元画像としてコンピュータモニター上に）または三次元物理的モデルとして，物理的にまたは視覚的に二次元または三次元で表すことができる。このような物理的表示はまた，単独または電子表示と関連して使用できる。例示的な有用な表示としては，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
【０２３８】
原子座標表示
表示の１つの型として，分子構造，構造の一部または複合体（例えば，共結晶）中の特定の原子の位置を表す原子座標の羅列または表がある。このような表示はまた，さらなる情報，例えば特定の座標の占有率に関する情報を含み得る。１つのこのような原子座標表示は表１の座標情報を電子形式で含む。
【０２３９】
エネルギー表面または相互作用表面表示
別の表示としては，例えば，活性部位またはその他の結合部位のエネルギー表面表示があり，これは電子および立体相互作用のエネルギー表面を表す。このような表示もまたその他の特徴を含み得る。例としては，特定のアミノ酸残基または特定のアミノ酸残基上の基，例えば，Ｈ結合もしくはイオン性相互作用に参加し得る残基または基の表示を含むことができる。このようなエネルギー表面表示は種々の利用可能なコンピュータプログラムのいずれかを用いて原子座標表示から容易に作製することができる。
【０２４０】
構造表示
さらにもう１つの表示として構造表示，すなわち，物理的表示またはこのような物理的表示の電子表示がある。このような構造表示としては，分子または複合体の特定の特徴の関連位置の表示が挙げられるが，これは構造的特徴間の結合に関することが多い。例えば，中でも，すべての原子が結合している；水素以外の原子が結合している；重大な電子相互作用に参加し得る側鎖原子の表示は含むか含まない，主鎖原子が結合している構造を表すことができる。しかし，すべての特徴が結合している必要はない。例えば，分子または複合体の一部の構造表示については，特徴を表すことができるために構造的特徴（例えば，結合部位でリガンドとの有意な結合相互作用を有し得るアミノ酸残基の原子）は重大である。そのようなアミノ酸残基は互いに結合していない場合もある。
【０２４１】
構造表示はまた，図式表示でもあり得る。例えば，図式表示は図式的に二次および／または三次構造を表すことができる。このようなポリペプチドの図式表示内に，特定のアミノ酸残基もしくは残基上の基，例えば，結合部位中の保存された残基，および／または結合化合物と相互作用し得る残基もしくは基を含めることができる。電子構造表示は，例えば，その機能のために設計されたコンピュータプログラムを用いて原子座標情報から，および／または別の形の構造情報の解釈に基づいて手動入力で電子表示を構築することによって作製できる。物理的表示は，例えば，コンピュータ生成画像の画像を印刷することによって，または３Ｄモデルを構築することによって作製できる。そのような印刷された表示の例は，図２に示されるリボンダイアグラムである。
【０２４２】
ＶＩＩ．構造座標を用いる，構造未知のホスホジエステラーゼの構造決定
構造座標，例えば表１に示されるものを用いて，構造未知のホスホジエステラーゼの三次元構造を決定することができる。以下に記載した方法は，構造既知のポリペプチドの構造座標を，別のデータセット，例えばアミノ酸配列，Ｘ線結晶学回析データまたは核磁気共鳴（ＮＭＲ）データに適用することができる。本発明の好ましい実施形態は，修飾されたホスホジエステラーゼ，その他の天然ホスホジエステラーゼおよび関連ポリペプチドの三次元構造を決定することに関する。
【０２４３】
アミノ酸相同性を用いる構造
ホモロジーモデリングは，構造既知のポリペプチドの構造座標を，構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列に適用する方法である。この方法は，ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造のコンピュータ表示，構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュータ表示，およびアミノ酸の構造の標準コンピュータ表示を用いて達成する。ホモロジーモデリングは一般に，（ａ）既知構造を有する，および有さないポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすることと，（ｂ）既知構造中の保存されたアミノ酸の座標を，構造未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に移すこと，その結果生じる三次元構造を精密化することと，（ｄ）残りのポリペプチドの構造を構築することとを含む。当業者ならば，ステップ（ａ）における配列アラインメントステップから，２つのタンパク質間で保存されたアミノ酸を決定できることは承知している。
【０２４４】
前記の方法は当業者にはよく知られている（グリア(Greer)（１９８５）サイエンス(Science)２２８：１０５５頁）；ブランデル(Blundell)ら．Ａ（１９８８）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１７２：５１３頁。当業者によってホモロジーモデリングに利用できる例示的コンピュータプログラムとしては，アクセレリス社(Accelerys Inc.)によって流通されているインサイト(Insight)IIモデリングパッケージ中のホモロジーモジュールがある。
【０２４５】
アミノ酸配列のアラインメントは，まず構造既知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュータ表示を，構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列の上に置くことによって達成する。次いで，配列中のアミノ酸を比較し，相同であるアミノ酸の群（例えば，化学的性質−脂肪族，芳香族，極性または帯電において同様であるアミノ酸側鎖）を一緒にしてグループ化する。この方法によって，ポリペプチドの保存された領域が検出され，アミノ酸挿入または欠失が明らかとなる。このようなアラインメントおよび／または，配列アラインメントおよび解析ソフトウェアを用いて完全にコンピュータで実施できる。
【０２４６】
構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすると，構造既知のポリペプチドのコンピュータ表示中の保存されたアミノ酸の構造を，構造が未知であるポリペプチドの対応するアミノ酸に移す。例えば，既知構造のアミノ酸配列中のチロシンをフェニルアラニン，未知構造のアミノ酸配列中の対応する相同アミノ酸で置き換えることができる。
【０２４７】
非保存領域中に位置するアミノ酸の構造は，標準ペプチド幾何学または分子シミュレーション技術，例えば分子ダイナミクスのいずれかを用いて手作業で割り当てるべきものである。プロセスの最終ステップは，分子ダイナミクスおよび／またはエネルギー最小化を用いて全構造を精密化することによって達成する。ホモロジーモデリング法は当業者にはよく知られており，種々のタンパク質分子を用いて実施されている。例えば，セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ，ミオシン軽鎖タンパク質キナーゼの触媒ドメインに相当するポリペプチドの三次元構造が，ｃ−ＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットからホモロジーモデリングされた。（ナイトン(Knighton)ら（１９９２）サイエンス２５８：１３０〜１３５頁）。
【０２４８】
分子置換を用いる構造
分子置換は，構造既知のポリペプチドのＸ線回析データを，配列未知のポリペプチドのＸ線回析データに適用する方法である。この方法を利用して，振幅が既知である場合にのみ構造未知のポリペプチドのＸ線回析データを表す位相を規定することができる。Ｘ−ＰＬＯＲは，分子置換のために用いられる，広く用いられているコンピュータソフトウェアパッケージである。ブルンガー(Brunger)（１９９２）ネイチャー３５５：４７２〜４７５頁。ＡＭＯＲＥは，分子置換に用いられるもう１つのプログラムである。ナバザ(Navaza)（１９９４）アクタ・クリスタログラフィカ(Acta Crystallographica)Ａ５０：１５７〜１６３頁。得られた構造は３Åより大きい二乗平均平方根偏差を示さないことが好ましい。
【０２４９】
分子置換の目標は，２種の結晶から得た電子回析データをマッチさせることによって単位セル中の原子の位置をアラインすることである。Ｘ−ＰＬＯＲなどのプログラムは４つのステップを含み得る。第1のステップは，単位セル中の分子数を決定することおよびそれらの間の角度を規定することであり得る。第２のステップは，単位セル中の分子の配向を規定するために回析データを回転させることを含み得る。第３のステップは，単位セル中の分子を正しく位置づけるために三次元の電子密度を翻訳することであり得る。Ｘ回析データの振幅および位相が決定されると，参照データセットから実験によって算出された電子回析マップと新規データセットから算出された電子回析マップとを比較することによってＲ因子を算出することができる。３０〜５０％の間のＲ因子は，この方法によって単位セル中の原子の配向が合理的に決定されていることを示す。プロセスの第４のステップは，本明細書に記載される，および当業者に公知の反復精密化技術を用いて新規電子密度マップを精密化することによってＲ因子を約２０％に低下させることであり得る。
【０２５０】
ＮＭＲデータを用いる構造
Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドまたはポリペプチド複合体の構造座標を，核磁気共鳴（ＮＭＲ）データからのポリペプチドの三次元構造の解明に向けて適用することができる。この方法は当業者には用いられている。（ビュートリッヒ(Wuthrich)（１９８６），ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク：１７６〜１９９頁；プフルグラス(Pflugrath)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)１８９：３８３〜３８６頁；クライン(Kline)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１８９：３７７〜３８２頁）。ポリペプチドの二次構造は二次元ＮＮＲデータを用いることによって容易に決定されることが多いが，二次構造の個々の要素間の空間的関係は同じようには容易に決定できない。Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドの三次元構造を規定する座標は，ＮＭＲ分光学者を，関連構造のポリペプチド中の二次構造要素間のこういった空間的相互関係の理解へ導き得る。
【０２５１】
二次構造要素間の空間的相関関係についての知識によって，二次元ＮＭＲ実験から得られる核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）データが大幅に単純化され得る。さらに，ＮＭＲ技術によって二次構造を決定した後に結晶学座標を適用することは，ポリペプチド配列中の特定のアミノ酸に関連するＮＯＥの割り当てが単純化されるだけで，ポリペプチド構造のＮＭＲ解析に大きくバイアスをかけるものではない。逆に言えば，ポリペプチドの二次構造を決定しながらＮＯＥデータを単純化するために結晶学座標を用いることは，タンパク質構造のＮＭＲ解析にバイアスをかける。
【０２５２】
ＶＩＩＩ．構造座標を用いるホスホジエステラーゼ機能の調節剤の構造ベースの設計
構造ベースの調節剤設計および同定法は強力な技術であり，これは多種多様な潜在的調節剤および化学官能基を含むコンピュータデータベースの検索を含み得る。調節剤のコンピュータ化した設計および同定は，コンピュータデータベースが，化学ライブラリーよりも，しばしば１桁規模で多くの化合物を含むので有用である。構造ベースの薬物設計および同定の概説については，カンツ(kuntz)ら（１９９４），アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ(Accounts of Chemical Research)２７：１１７頁，ガイダ(Guida)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチャラル・バイオロジー(Current Opinion in Structural Biology)４：７７７頁，コールマン(Colman)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー４：８６８頁参照。
【０２５３】
構造座標によって規定されるポリペプチドの三次元構造を，これらの設計法，例えば，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願,すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１の構造座標によって利用できる。さらに，本明細書に記載される，ホモロジー，分子置換およびＮＭＲ技術によって決定されるホスホジエステラーゼの三次元構造もまた調節剤設計および同定法に適用できる。
【０２５４】
調節剤を同定するために，天然ホスホジエステラーゼの構造情報，特に，ホスホジエステラーゼの活性部位の構造情報を使用できる。しかし，ホスホジエステラーゼと1種以上の結合化合物との1種以上の共結晶から得られる構造情報を利用することは有利であり得る。また，結合化合物が試験化合物に共通する構造コアを有する場合にも有利であり得る。
【０２５５】
分子データベースの検索による設計
合理的設計の一方法では，分子のデータベースから得た化合物のコンピュータ表示をドッキングすることによって調節剤を検索する。公的に入手可能なデータベースとしては，例えば以下のものがある：
ａ）モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＡＣＤ
ｂ）国立癌研究所製のＮＣＩ
ｃ）ケンブリッジ結晶データセンター製のＣＣＤＣ
ｄ）ケミカル・アブストラクト・サービス(Chemical Abstract Service)製のＣＡＳＴ
ｅ）ダーウェント・インフォメーション・リミテッド(Derwent Information Limited)製のダーウェント(Derwent)
ｆ）メイブリッジ・ケミカル・カンパニー(Maybridge Chemical Company)ＬＴＤ製のメイブリッジ(Maybridge)
ｇ）アルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company)製のアルドリッチ(Aldrich)
ｈ）チャップマン＆ホール(Chapman & Hall)製の天然物のディレクトリ。
【０２５６】
このようなデータベースの１つ（モレキュラー・デザインズ・リミテッド・インホメーション・システムズ(Molecular Designs Limited Information Systems)によって流通されているＡＣＤ）には，合成によって誘導されたか，天然物である化合物が含まれている。当業者に利用できる方法によって，二次元で表されるデータセットを，三次元で表されるものへ変換することができる。これらの方法は，トライポス・アソシエイテス(Tripos Associates)製のＣＯＮＣＯＲＤまたはモレキュラー・シミュレーションズ・リミテッド(Molecular Simulations Limited)製のＤＥ−コンバーター(Converter)のようなコンピュータプログラムによって可能である。
【０２５７】
当業者には，構造ベースの調節剤設計の複数の方法が知られている。（カンツ(Kuntz)ら，（１９８２），ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)１６２：２６９頁，カンツら，（１９９４），アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ(Accounts of Chemical Research)２７：１１７頁；メン(Meng)ら，（１９９２），ジャーナル・オブ・コンピュータ・ケミストリー(Journal of Computer Chemistry)１３：５０５頁；ボーム(Bohm)，（１９９４），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン(Journal of Computer-Aided Molecular Design)８：６２３頁）。
【０２５８】
合理的調節剤設計の当業者に広く用いられているコンピュータプログラムとして，カリフォルニア大学サンフランシスコ校製のＤＯＣＫがある。このコンピュータプログラムおよびそのようなプログラムによって利用される一般的な方法を，以下の３つの適用で説明する。これらの技術のいくつかに関するより詳細な情報は，アクセレリス・ユーザー・ガイド１９９５に見出すことができる。この目的に用いられる通常のコンピュータプログラムは，以下のステップまたは機能を含むプロセスを実施できる：
（ａ）タンパク質から既存の化合物を除去すること，
（ｂ）コンピュータプログラム（ＤＯＣＫなど）を用いて，または化合物を活性部位にインタラクティブに移動させることによって，別の化合物の構造を活性部位にドッキングすること，
（ｃ）化合物と活性部位原子間の空間を特性決定すること，
（ｄ）（ｉ）化合物と活性部位の間の空の空間にフィッティングでき，（ｉｉ）化合物と結合できる分子断片のライブラリーを検索すること，
（ｅ）前記で見出した断片を化合物に結合させ，新規の修飾された化合物を評価すること。
【０２５９】
パート（ｃ）は，活性部位の原子と化合物の間に形成される幾何学および相補的相互関係を特性決定することを指す。好都合な幾何学的適合性は，化合物と活性部位原子間に，都合の悪い立体的相互作用を形成せずに相当な表面積が共有される場合に得られる。当業者ならば，本方法はパート（ｄ）および（ｅ）を省略し，多数の化合物のデータベースをスクリーニングすることによって実施できるということは気付くであろう。
【０２６０】
ホスホジエステラーゼ機能の調節剤の構造ベースの設計および同定はアッセイスクリーニングとともに使用できる。化合物のより大きなコンピュータデータベース（約１０，０００種の化合物）を，ほんの数時間またはさらに短い間で検索できるので，コンピュータベースの方法によって，ホスホジエステラーゼ機能の潜在的調節剤として生化学または細胞アッセイにおいて試験される化合物を縮小できる。
【０２６１】
構造ベースの調節剤設計についての前記の説明は，すべてを包含しているわけではなく，文献にはその他の方法も報告されており，使用することができる。例えば：
（１）ＣＡＶＥＡＴ：ケミカル・アンド・バイオロジカル・プロブレムズ・イン・モレキュラー・レコグニション(Chemical and Biological Problems in Molecular Recognition)，中のバートレット(Bartlett)ら，（１９８９），ロバート(Roberts) ，Ｓ．Ｍ．，レイ(Ley) ，Ｓ．Ｖ．，キャンベル(Campbell)，Ｍ．Ｍ．編，ロイヤル・ソサイエティー・オブ・ケミストリー(Royal Society of Chemistry，ケンブリッジ１８２〜１９６頁。
（２）ＦＬＯＧ：ミラー(Miller)ら，（１９９４），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン(Journal of Computer-Aided Molecular Design)８：１５３頁。
（３）ＰＲＯ  調節剤：クラーク(Clark)ら，（１９９５），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン９：１３頁。
（４）ＭＣＳＳ：ミランカー(Miranker)およびカープラス(karplus)，（１９９１），プロテインズ(Proteins)：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス(Structure, Function, and Genetics)１１：２９頁。
（５）ＡＵＴＯＤＯＣＫ：グッドセル(Goodsell)およびオルソン(Olson)，（１９９０），プロテインズ：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス８：１９５頁。
（６）ＧＲＩＤ：グッドフォード(Goodford)，（１９８５），ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)２８：８４９頁。
【０２６２】
ＰＤＥ４Ｂとの複合体中の化合物を修飾することによる設計
潜在的調節剤として化合物を同定するもう１つの方法は，既存の調節剤をポリペプチド活性部位において修飾することである。例えば，調節剤のコンピュータ表示を，ＰＤＥ４Ｂ活性部位のコンピュータ表示内で修飾することができる。この技術のための詳細な指示は，例えば，ＬＵＤＩ中，アクセレリス・ユーザー・マニュアル(Accelerys User Manual)，１９９５に見出すことができる。調節剤のコンピュータ表示は，通常，化学基または複数の化学基を欠失させることまたは化学基または複数の化学基を付加することによって修飾する。
【０２６３】
化合物への各修飾の際に，修飾される化合物および活性部位の原子を，立体構造中でシフトすることができ，２つの分子間に形成される何らかの相補的相互作用とともに調節剤と活性部位原子間の距離のスコアをつけることができる。スコアリングは，好都合な幾何学的適合性および好都合な相補的相互作用が得られた時に完了できる。好都合なスコアを有する化合物が潜在的調節剤である。
【０２６４】
ＰＤＥ４Ｂと結合する化合物の構造を修飾することによる設計
構造ベースの調節剤設計の第３の方法は，調節剤構築または調節剤検索コンピュータプログラムによって設計された化合物をスクリーニングすることである。こういった種類のプログラムの例は，モレキュラー・シミュレーションズ・パッケージ，カタリスト(Molecular Simulations Package,Catalyst)に見出すことができる。このプログラムを用いるための説明はモレキュラー・シミュレーションズ・ユーザー・ガイド（１９９５）に記録されている。この適用に用いられるその他のコンピュータプログラムとしては，モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＩＳＩＳ／ＨＯＳＴ，ＩＳＩＳ／ＢＡＳＥ，ＩＳＩＳ／ＤＲＡＷおよびトライポス・アソシエーテス(Tripos Associates)製のＵＮＩＴＹがある。
【０２６５】
これらのプログラムは，化合物−ホスホジエステラーゼ複合体の三次元構造の活性部位から除去された化合物の構造上で動作させることができる。このような化合物上でプログラムを動作させることは，それが生物学的に活性な立体構造にあるために好ましい。
【０２６６】
調節剤構築コンピュータプログラムとは，ホスホジエステラーゼまたはその他の生体分子と複合体を形成している化合物中の複数の化学基のコンピュータ表示を，コンピュータデータベースから得た複数の基で置き換えるために使用できるコンピュータプログラムである。調節剤検索コンピュータプログラムとは，コンピュータデータベースから，特定の生体分子と結合している化合物と同様の三次元構造および同様の化学基を有する化合物のコンピュータ表示を検索するために使用できるコンピュータプログラムである。
【０２６７】
通常のプログラムは，以下の一般的なステップを用いることによって動作し得る：
（ａ）化合物を，水素結合ドナーまたはアクセプター，疎水性／親油性部位，正にイオン化可能な部位または負にイオン化可能な部位などの化学的特徴によってマッピングすること；
（ｂ）マッピングされた特徴に幾何学的制約を加えること；および
（ｃ）（ｂ）で作製したモデルでデータベースを検索すること。
【０２６８】
当業者ならば，（ｂ）のモデルには化合物のすべての可能な化学的特徴が存在する必要はないということも認識している。モデルのいずれかのサブセットを使用して，データベース検索のための種々のモデルを作製することができる。
【０２６９】
分子スキャフォールドを用いる調節剤設計
本発明はまた，分子ファミリーに広く作用できる分子スキャフォールドと称される化合物を設計する方法，および／または分子スキャフォールドを使用して，そのようなファミリーの個々のメンバーまたは複数のメンバーを標的とするリガンドを設計する方法を利用できることが有利である。このような分子スキャフォールドを用いる設計は，参照によりその全文が本明細書に組み込まれる，ヒルト(Hirth)およびミルバーン(Milburn)，米国特許出願１０／３７７，２６８に記載されている。このような分子スキャフォールドを用いる設計および開発を，一部，以下に記載する。
【０２７０】
好ましい実施形態では，分子はタンパク質であることができ，１）特定のタンパク質ファミリーに作用するよう化学的に設計されており，かつ／または，２）より分子スキャフォールドに近い挙動をする特性を有する，つまり，それらが，それらを注目するファミリー中の1種以上のタンパク質との結合に対して特異的にする化学的部分構造を有することを意味する化学化合物のセットを集めることができる。あるいは，個々の標的分子に対して選択的に活性である分子スキャフォールドを設計できる。
【０２７１】
分子スキャフォールドの有用な化学的特性は，以下の特徴のうちの１以上を含み得るがそれに限定されるものではない：約３５０ダルトンより小さい，または約１５０〜約３５０ダルトンの間，または約１５０〜約３００ダルトンの間の平均分子量；ｃｌｏｇＰが３より低いこと；回転可能な結合数が４未満である；水素結合ドナーおよびアクセプターの数が５より少ないか，または４より少ないこと；極性表面積が５０Å２未満であること；スキャフォールドと結合しているコンビナトリアルライブラリーから得た化学置換基がタンパク質結合部位中のポケット中に突き出ることができるような配向でのタンパク質結合部位での結合；および置換基結合点に化学的に扱いやすい構造を有し，それを修飾でき，それによって迅速にライブラリー構築が可能となること。
【０２７２】
「ｃｌｏｇＰ」とは，化合物の算出されたｌｏｇＰを意味し，「Ｐ」はオクタノールと水の間の分配計数を指す。
【０２７３】
用語「分子の極性表面積（ＰＳＡ）」とは，分子中の極性原子（通常，酸素，窒素および結合されている水素）の表面寄与の合計を指す。極性表面積は薬物輸送特性，例えば腸内吸収または血液脳関門透過と十分に相関があることがわかっている。
【０２７４】
コンビナトリアルライブラリーに含めるための，別個の化合物のさらなる有用な化学的特性としては，化合物の，少なくとも１種の注目するタンパク質との結合を妨害せず，ライブラリーメンバーに所望の特性を付与する化学部分を化合物に結合させる，例えば，ライブラリーメンバーを，注目する細胞および／または器官に活発に輸送されるようにする能力，または組織などの用途のため，およびプロテオミクスプロファイリング目的のクロマトグラフィーカラム（例えば，ビオチンなどの分子を介するストレプトアビジンカラム）などの装置を結合させる能力が挙げられる。
【０２７５】
当業者ならば，使用するための特定の必要条件に応じてスキャフォールドまたはライブラリーメンバーが有すること望ましいものであり得るその他の特性，およびこういった特性を有する化合物も，同様に探し，同定することができるということを認識するであろう。アッセイのために化合物を選択する方法は，当業者には知られており，例えば，米国特許題６，２８８，２３４号，同６，０９０，９１２号，同５，８４０，４８５号に記載された方法および化合物があり，これらの各々は参照により，すべての図表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
【０２７６】
種々の実施形態では，本発明は，分子ファミリーの複数のメンバーと結合し，共通の分子スキャフォールドを含むリガンドを設計する方法を提供する。すなわち，化合物セットを，分子ファミリー，例えば，タンパク質ファミリーの複数のメンバーとの結合についてアッセイすることができる。複数のファミリーメンバーと結合する１種以上の化合物を，分子スキャフォールドとして同定できる。標的分子の結合部位でのスキャフォールドの配向が決定されており，化学的に扱いやすい構造が同定されている場合は，１種または数種の分子スキャフォールドから開始してリガンドのセットを合成して，複数のリガンドに到達することができ，ここで各リガンドは，スキャフォールドに対して変更されたまたは変化した結合親和性または結合特異性で分子ファミリーの別個の標的分子と結合する。したがって，同一の分子スキャフォールドに基づいて分子ファミリーの個々のメンバーを選択的に標的とし，それらに対して特異的に作用する複数の薬物リード分子が設計できる。
【０２７７】
ＩＸ．結合アッセイ
本発明の方法は，化合物と標的分子との結合を検出できるアッセイを含み得る。統計的に有意水準でのこのような結合は，アッセイシグナルが標的分子との結合を表す，すなわちバックグラウンドとは区別されるという，少なくとも９０％の信頼水準を有することが好ましく，少なくとも９５，９７，９８，９９％またはより大きな信頼水準を有することがより好ましい。対照を用いて標的結合を非特異的結合と区別することが好ましい。本発明のアッセイはまた，標的分子との低親和性結合について化合物をアッセイすることを含み得る。種々の標的型について，結合を示す多種多様なアッセイが知られており，本発明に使用できる。タンパク質ファミリーにわたって広く作用する化合物は，その結合性が広いことから個々の標的に対して高親和性を有する可能性は低い。したがって，本明細書に記載されるアッセイは，低親和性，極めて低い親和性，および極度に低い親和性で結合する化合物の同定を考慮する。したがって，作用強度（すなわち結合親和性）は，有用である可能性のある結合化合物の第一義的なものでもなく，さらに最も重要なものでもない，同定のしるしである。むしろ，低親和性，極めて低い親和性または極度に低い親和性で結合する化合物でさえ，リガンド設計プロセスの次のフェーズに続けることができる分子スキャフォールドとして考えることができる。
【０２７８】
「低親和性」での結合とは，標準条件下での解離定数（ｋｄ）が１μＭより大きい標的分子との結合を意味する。「極めて低い親和性」での結合とは，標準条件下での前記のｋｄが約１００μＭである結合を意味する。「極めて低い親和性」での結合とは，標準条件下での前記のｋｄが約１ｍＭである結合を意味する。「中程度の親和性」とは，標準条件下でのｋｄが約２００ｎＭ〜約１μＭである結合を意味する。「中程度に高い親和性」とは，ｋｄが約１ｎＭ〜約２００ｎＭの結合を意味する。「高親和性」での結合とは，標準条件下でのｋｄが約１ｎＭより低い結合を意味する。例えば，低親和性結合は，標的分子の結合部位への低い適合のために，またはスキャフォールドもしくはリガンドの標的分子の結合部位との結合を引き起こすよう存在する，より高い親和性結合が生じる場合と比較して少数の非共有結合，もしくは弱い共有結合のために生じ得る。結合の標準条件とは，ｐＨ７．２，３７℃で１時間である。例えば，ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭバッファー，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ  １５ｍＭ，ＡＴＰ  ２μＭおよびウシ血清アルブミン１μｇ／ウェルの１００μｌ／ウェルを３７℃で１時間使用できる。
【０２７９】
結合化合物はまた，標的分子の活性に対するその作用によって特性決定できる。したがって「低活性」化合物は，標準条件下で１μＭより高い阻害濃度（ＩＣ５０）または励起濃度（ＥＣ５０）を有する。「極めて低い活性」とは，標準条件下で約１００μＭというＩＣ５０またはＥＣ５０を意味する。「極度に低い活性」とは，標準条件下で約１ｍＭというＩＣ５０またはＥＣ５０を意味する。「中程度の活性」とは，標準条件下で２００ｎＭ〜１μＭというＩＣ５０またはＥＣ５０を意味する。「中程度に高い活性」とは，１ｎＭ〜２００ｎＭというＩＣ５０またはＥＣ５０を意味する。「高い活性」とは，標準条件下で１ｎＭより低いＩＣ５０またはＥＣ５０を意味する。ＩＣ５０（またはＥＣ５０）は，化合物が存在しない場合の活性と比較して，測定されている標的分子（例えば，酵素またはその他のタンパク質）活性の５０％の活性が失われる（または獲得される）化合物の濃度として規定される。活性は当業者に公知の方法を用いて，例えば，酵素反応の出現によって生じたいずれかの検出可能な産物またはシグナル，または測定されているタンパク質によるその他の活性を測定することによって測定できる。
【０２８０】
結合アッセイに関連して，「バックグラウンドシグナル」とは，標的分子と結合する，試験化合物，分子スキャフォールド，またはリガンドの不在下において特定のアッセイの標準条件下で記録されるシグナルを意味する。当業者ならば，バックグラウンドシグナルを決定するための認められた方法が存在し，広く利用可能であるということは理解されよう。
【０２８１】
「標準偏差」とは，分散の平方根を意味する。分散は分布がどのように広がっているかという尺度である。その平均から各数の平均偏差平方としてコンピュータによって計算される。例えば，数１，２および３については，平均は２であり，分散は以下である：
【数１】
2008512380.tif 000022
【０２８２】
タンパク質ファミリーにわたって広く作用するスキャフォールドを設計または発見するためには，注目するタンパク質を，化合物収集物またはセットに対してアッセイできる。アッセイは酵素アッセイまたは結合アッセイであり得ることが好ましい。いくつかの実施形態では，スクリーニングされている化合物の可溶性を高め，次いで，低親和性で結合するものまたはバックグラウンドシグナルの標準偏差の約３倍大きなシグナルを生じるものを含む，アッセイにおいて活性を示すすべての化合物を解析することが望ましい場合がある。アッセイは適したアッセイであればいずれであってもよく，例えば，２種の結合パートナー間の結合親和性を測定する結合アッセイなどがある。本発明の実施において有用であり得る各種スクリーニングアッセイは当技術分野では公知であり，例えば米国特許第５，７６３，１９８号，同５，７４７，２７６号，同５，８７７，００７号，同６，２４３，９８０号，同６，２９４，３３０号および同６，２９４，３３０号に記載されたものがあり，これらの各々は参照により，すべての図表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
アッセイの種々の実施形態では，少なくとも１種の化合物，少なくとも約５％，少なくとも約１０％，少なくとも約１５％，少なくとも約２０％または少なくとも約２５％の化合物が低親和性で結合し得る。一般に，化合物の約２０％までが，スクリーニングアッセイにおいて活性を示すことができ，次いで，これらの化合物をハイスループット共結晶学，化合物を共通の構造特性（例えば，構造コアおよび／または形および極性特性）を有するクラスに分類するコンピュータによる解析，および活性を示す化合物間の共通化学構造の同定を用いて直接解析できる。
【０２８４】
当業者ならば，決定は特定の状況の必要性にとって適切である基準に基づいたものであり得るということ，および決定はコンピュータソフトウェアプログラムによってなすことができるということは理解されよう。ほとんどどんな数のスキャフォールドも含んでクラスを作製でき，選択される基準は，任意の数のスキャフォールドが，有利であると思われる各クラスに到達するまで，徐々に厳しい基準に基づくものであり得る。
【０２８５】
表面プラスモン共鳴
結合パラメーターは表面プラスモン共鳴を用いて，例えば，固定化された結合成分でコーティングされたビアコア(BIAcore)（登録商標）チップ（ビアコア，ジャパン(Biacore， Japan)）を用いて測定できる。表面プラスモン共鳴を用いて，ｓＦｖまたは標的分子に対するその他のリガンド間の反応の微視的結合定数および解離定数を特性決定する。このような方法は，参照により本明細書に組み込まれる以下の参照文献に概説されている。ベリー(Vely)Ｆら，（２０００）ホスホペプチド−ＳＨ２ドメイン相互作用を調べるためのビアコア（登録商標）解析(BIAcore(R) analysis to test phosphopeptide-SH2 domain interactions)，メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)１２１：３１３〜２１頁，リパロト(Liparoto)ら，（１９９９）インターロイキン−２受容体複合体のバイオセンサー解析(Biosensor analysis of the interleukin-2 receptor complex)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・レコグニッション(Journal of Molecular Recognition)１２：３１６〜２１頁，リップシュルツ(lipschultz)ら，（２０００）表面プラスモン共鳴を用いる複合体動力学の解析のための実験設計(Experimental design for analysis of complex kinetics using surface plasmon resonance)，メソッヅ(Methods)２０（３）：３１０〜８頁，マルムクヴィスト(Malmqvist)，（１９９９）ビアコア：生体分子の相互作用を特性決定するための親和性バイオセンサーシステム(BIACORE: an affinity biosensor system for characterization of biomolecular interactions)，バイオケミカル・ソサイエティー・トランサクションズ２７：３３５〜４０頁，アルサン(Alfthan)，（１９９８）抗体工学におけるツールとしての表面プラスモン共鳴バイオセンサー(Surface plasmon resonance biosensors as a tool in antibody engineering)，バイオセンサーズ＆バイオエレクトロニクス(Biosensors & Bioelectronics)１３：６５３〜６３頁，フィバッシュ(Fivash)ら，（１９９８）高分子相互作用のためのビアコア(BIAcore for macromolecular interaction)，カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechnology)９，９７〜１０１頁，プライス(Price)ら，（１９９８）ＩＳＯＢＭ  ＴＤ−４ワークショップでの概略報告：ＭＵＣ１ムチンに対する５６種のモノクローナル抗体の解析(Summary report on the ISOBM TD-4 Workshop: analysis of 56 monoclonal antibodies against the MUC1 mucin.)チューモア・バイオロジー(Tumour Biology)１９付録１：１〜２０頁，マルムクヴィスト(Marmqvist)ら，（１９９７）生体分子相互作用解析：タンパク質の機能解析のための親和性バイオセンサー技術(Biomolecular interaction analysis: affinity biosensor technologies for functional analysis of proteins)，カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)１：３７８〜８３頁，オーシャネシー(O'Shannessy)ら，（１９９６），バイオセンサー技術によるリガンド結合の特性決定における偽一次速度式挙動から得た偏差の解釈(Interpretation of deviations from pseudo-first-order kinetic behavior in the characterization of ligand binding by biosensor technology)，アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)２３６：２７５〜８３頁，マルムボリ(Malmborg)ら，（１９９５）抗体工学におけるツールとしてのビアコア(BIAcore as a tool in antibody engineering)，ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ(Journal of lmmunological Methods.)１８３：７〜１３頁，ヴァン・レゲンモルテ��(Van Regenmortel)，（１９９４）組換えタンパク質を特性決定するためのバイオセンサーの使用(Use of biosensors to characterize recombinant proteins)，デベロップメンツ・イン・バイオロジカル・スタンダーダイゼーション(Developments in Biological Standardization)８３：１４３〜５１頁およびオーシャネシー(O'Shannessy)，（１９９４）高分子相互作用の運動速度定数および平衡結合定数の決定：表面プラスモン共鳴文献の批評(Determination of kinetic rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions: a critique of the surface plasmon resonance literature)，カレント・オピニオンズ・イン・バイオテクノロジー(Current Opinions in Biotechnology)５：６５〜７１頁。
【０２８６】
ビアコア（登録商標）は表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学特性を使用して，金／ガラスセンサーチップインターフェース，デキストランバイオセンサーマトリックスの表面に位置するデキストランマトリックスに結合しているタンパク質濃度の変化を検出する。簡潔には，タンパク質は既知の濃度でデキストランマトリックスと共有結合しており，タンパク質のリガンドをデキストランマトリックスを通して注入する。センサーチップ表面の反対側に向けられた近赤外線が反射され，また，金フィルム中にエバネセント波を誘導し，これが順に，共鳴角として知られる特定の角度での反射光の強度低下を引き起こす。センサーチップ表面の屈折率が変更されれば（例えば，リガンドの，結合されるタンパク質への結合によって），共鳴角のシフトが生じる。この角度シフトを測定でき，１０００ＲＵが１ｎｇ／ｍｍ２という表面タンパク質濃度の変化に相当するような共鳴単位（ＲＵ）として表す。これらの変化は，センサーグラム(sensorgram)のｙ軸に沿って時間に関して表示され，これはいずれかの生物反応の会合および解離を表す。
【０２８７】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ
ＨＴＳは通常自動化アッセイを用いて，所望の活性について多数の化合物を検索する。通常，ＨＴＳアッセイは，特定の酵素または分子に対して作用する化学物質についてスクリーニングすることによって新規薬物を見出すために用いる。例えば，ある化学物質が酵素を不活化する場合に，疾病を引き起こす細胞内プロセスの阻止において有効であるとわかる場合がある。ハイスループット法によって研究者が，ロボットハンドリングシステムおよび結果の自動解析を用いて各標的分子に対して何千もの種々の化学物質を極めて迅速にアッセイすることが可能になる。
【０２８８】
本明細書において，「ハイスループットスクリーニング」または「ＨＴＳ」とは，ロボットスクリーニングアッセイを用いる，多数の化合物（ライブラリー），通常，数十〜数十万の化合物の迅速なインビトロスクリーニングを指す。ウルトラハイスループットスクリーニング（ｕＨＴＳ）は通常，１日当たり１００，０００より多くの試験に加速されたハイスループットスクリーニングを指す。
【０２８９】
ハイスループットスクリーニングを達成するためには，サンプルをマルチコンテナ担体またはプラットフォームに保管することが有利である。マルチコンテナ担体によって，複数の候補化合物の同時測定反応が容易になる。マルチウェルマイクロプレートも担体として使用できる。このようなマルチウェルマイクロプレートおよび多数のアッセイにおけるその使用方法は当技術分野では公知であるだけでなく，市販もされている。
【０２９０】
スクリーニングアッセイには，校正目的およびアッセイの要素の適切な操作を確認する目的で対照を含めることができる。通常は反応物のすべてを含むが化学ライブラリーのメンバーは含まないブランクウェルを含める。もう１つの例として，調節剤が探索されている酵素の既知の阻害剤（またはアクチベーター）を，アッセイの一サンプルと共にインキュベートしてもよく，得られた酵素活性の低下（または増加）をコンパレータまたは対照として用いる。当然のことながら，調節剤を酵素アクチベーターまたは阻害剤と組合せて，さもなくば既知の酵素調節剤の存在によって引き起こされる酵素活性化または抑圧を阻害する調節剤を見出すこともできる。同様に，スフィンゴ脂質標的に対するリガンドを探索する場合には，標的の既知のリガンドを対照／校正アッセイウェル中に存在させることができる。
【０２９１】
スクリーニングアッセイの際の酵素反応および結合反応の測定
例えば，マルチコンテナ担体中で酵素反応および結合反応の進行を測定する技術は当技術分野では公知であり，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
【０２９２】
分光光度アッセイおよび分光蛍光アッセイは当技術分野では周知である。このようなアッセイの例としては，ゴードン(Gordon)，Ａ．Ｊ．およびフォード(Ford)，Ｒ．Ａ．（１９７２）ザ・ケミスツ・コンパニオン：ア・ハンドブック・オブ・プラティカル・データ，テクニーク・アンド・リファレンシズ(The Chemist's Companion: A Handbook Of Practical Data, Techniques, And References)ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク，４３７頁に記載されるような過酸化物の検出のための比色アッセイの使用が挙げられる。
【０２９３】
蛍光分光分析法を使用して反応生成物の生成をモニターできる。蛍光法は，一般に，吸収法よりも感度が高い。蛍光プローブの使用は当業者にはよく知られている。概説については，バッシュフォード(Bashford)ら，（１９８７）スペクトロフォトメトリー・アンド・スペクトロフルオロメトリー：ア・プラクティカル・アプローチ(Spectrophotometry and Spectrofluorometry : A Practical Approach)，９１〜１１４頁，ＩＲＬプレス社(IRL Press Ltd.)およびベル(Bell)，（１９８１）スペクトロスコーピー・イン・バイオケミストリー(Spectroscopy In Biochemistry)，第１巻，１１５〜１９４頁，ＣＲＣプレス(CRC Press)。
【０２９４】
分光蛍光法では，酵素を，標的酵素によって処理されるとその内部蛍光が変化する基質に曝露する。通常，基質は非蛍光であり，1以上の反応によってフルオロフォアに変換される。それだけには限らない例として，アンプレックス(Amplex)（登録商標）レッド試薬（モレキュラー・プローブス，オレゴン州，ユージーン）を用いてＳＭアーゼ活性を検出できる。アンプレックス（登録商標）レッドを用いてスフィンゴミエリナーゼ活性を測定するために，以下の反応が生じる。まず，ＳＭアーゼがスフィンゴミエリンを加水分解してセラミドとホスホリルコリンが生じる。第２に，アルカリホスファターゼがホスホリルコリンを加水分解してコリンが生じる。第３に，コリンがコリンオキシダーゼによって酸化されてベタインとなる。最後に，Ｈ２Ｏ２が，ホースラディッシュぺルオキシダーゼの存在下で，アンプレックス（登録商標）レッドと反応して蛍光生成物，レゾルフィンを生じ，それからのシグナルは蛍光分光分析を用いて検出する。
【０２９５】
蛍光偏光法（ＦＰ）は，大きな分子，例えば受容体タンパク質との結合の際に生じる，フルオロフォアの分子回転速度の低下と，それによって結合しているリガンドによる偏光蛍光発光が可能になることに基づいている。ＦＰは，平面偏光光での励起後にフルオロフォア発光の垂直および水平成分を測定することによって実験的に定まる。偏光発光は，フルオロフォアの分子回転が低下する場合に増加する。フルオロフォアは，大きな分子（すなわち，受容体）と結合し，フルオロフォアの分子回転を低下させる場合に大きな偏光シグナルを生じる。偏光シグナルの規模は，蛍光リガンド結合の程度と定量的に関連している。したがって，「結合している」シグナルの偏光は，高親和性結合の維持に応じて変わる。
【０２９６】
ＦＰは均質な技術であり，反応は極めて迅速であり，平衡に到達するのに数秒〜数分かかる。試薬は安定であり，大きなバッチを調製でき，その結果高い再現性が得られる。これらの特性のために，ＦＰは高度に自動化可能であるとわかっており，単一の，予混，トレーサー−受容体試薬を用いて単一のインキュベーションで実施されることが多い。概説については，オーウィック(Owicki)ら，（１９９７），ハイスループットスクリーニングにおける蛍光偏光アッセイの適用(Application of Fluorescence Polarization Assays in High-Throughput Screening)，ジェネティック・エンジニアリング・ニュウス(Genetic Engineering News)１７：２７頁参照。
【０２９７】
ＦＰは，その読み出した情報が発光光度と独立しているので特に望ましく(チェコビッチ(Checovich)，Ｗ．Ｊ．ら，（１９９５）ネイチャー３７５：  ２５４〜２５６頁，ダンドリカー(Dandliker)，Ｗ．Ｂ．ら，（１９８１）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)７４：３〜２８頁）したがって，蛍光発光をクエンチする着色化合物の存在には非感受性である。ＦＲおよびＦＲＥＴ（以下参照）は，スフィンゴ脂質受容体とそのリガンド間の相互作用をブロックする化合物を同定するのに適している。例えば，パーカー(Parker)ら，（２０００）蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体−リガンド結合およびキナーゼ／ホスフェートアッセイ(Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assay)，ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・スクリーニング(Journal of Biomolecular Screening)５：７７〜８８頁参照。
【０２９８】
ＦＰアッセイに使用できるスフィンゴ脂質に由来するフルオロフォアは市販されている。例えば，モレキュラープローブス(Molecular Probes)（オレゴン州，ユージーン）は，現在，スフィンゴミエリンおよび１種のセラミドフルオロフォアを販売している。これらは，それぞれＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシルホスホコリン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−スフィンゴミエリン），Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬ  Ｃ１２−スフィンゴミエリン）およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬＣ５−セラミド)。米国特許第４，１５０，９４９号，(ゲンタマイシンのイムノアッセイ)には，フルオレセインチオカルバニルゲンタマイシンをはじめとするフルオレセイン標識したゲンタマイシンが開示されている。当業者に周知の方法を用いてさらなるフルオロフォアを調製できる。
【０２９９】
例示的正常および偏光蛍光リーダーとしては，ポラリオン(POLARION)（登録商標）蛍光偏光システム（テカン(Tecan)  ＡＧ，スイス，ホンブレッヒティコン(Hombrechtikon)）が挙げられる。その他のアッセイ用の一般的なマルチウェルプレートリーダー，例えばヴェルサマックス(VERSAMAX)（登録商標）リーダーおよびスペクトラマックス(SPECTRAMAX)（登録商標）マルチウェルプレートスペクトロフォトメーター（双方ともモレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices)）も利用できる。
【０３００】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は，相互作用を検出するためのもう1つの有用なアッセイであり，これは記載されている。例えば，ハイム(Heim)ら，（１９９６）カレント・バイオロジー(Current Biology)６：１７８〜１８２頁，ミトラ(Mitra)ら，（１９９６）ジーン(Gene)１７３：１３〜１７頁およびセルビン(Selvin)ら，（１９９５）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)２４６：３００〜３４５頁参照。ＦＲＥＴは，既知の励起および発光波長を有する，近接近している２種の蛍光物質間のエネルギーの移動を検出する。例としては，タンパク質を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質として発現できる。２種の蛍光タンパク質が近接している場合，例えばタンパク質が標的分子と特異的に相互作用する場合に，共鳴エネルギーが，励起された分子から別のものへ移動し得る。結果として，サンプルの発光スペクトラムがシフトし，これを蛍光光度計，例えばｆＭＡＸマルチウェル蛍光光度計（モレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices），カリフォルニア州，サニーベール）によって測定することができる。
【０３０１】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は，標的分子との相互作用を検出するために特に有用なアッセイである。ＳＰＡは製薬産業において広く用いられており，記載されている（ハンゼルマン(Hanselman)ら，（１９９７）ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ(Journal of Lipid Research)３８：２３６５〜２３７３頁，カール(kahl)ら，（１９９６）アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)２４３：２８２〜２８３頁，アンデンフレンド(Undenfriend)ら，（１９８７）アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)１６１：４９４〜５００頁）。米国特許第４，６２６，５１３号および同４，５６８，６４９号および欧州特許第０，１５４，７３４号も参照。ある市販のシステムは，フラッシュプレート(FLASHPLATE)（登録商標）シンチラントコートされたプレート（ＮＥＮライフ・サイエンス・プロダクツ(NEN Life Science Products)，マサチューセッツ州，ボストン）を用いている。
【０３０２】
標的分子は，種々の周知の手段によってシンチレータープレートと結合できる。融合タンパク質，例えば，ＧＳＴ，Ｈｉｓ６またはＦｌａｇ融合タンパク質と結合するよう誘導体化されているシンチラントプレートを利用できる。標的分子がタンパク質複合体または多量体である場合には，まず一方のタンパク質またはサブユニットをプレートに結合することができ，次いで，結合条件下で複合体のもう一方の成分を後で加えることができ，その結合している複合体が得られる。
【０３０３】
通常のＳＰＡアッセイでは，発現プール中の遺伝子産物を放射標識しておき，これをウェルに加え，固定化された標的分子である固相およびウェル中のシンチラントコーティングとの相互作用を可能にする。アッセイを直ちに測定してもよいし，平衡に到達させることもできる。どちらにしても，放射標識がシンチラントコーティングと十分に近接する場合に，トップカウントＮＸＴ(TOPCOUNT NXT)（登録商標）マイクロプレートシンチレーションカウンター（パッカード・バイオサイエンス社(Packard BioScience Co.)，コネチカット州，メリデン）などの装置によって検出可能なシグナルが生じる。放射標識された発現産物が標的分子と結合する場合には，放射標識は，検出可能なシグナルを生じるのに十分なほど長くシンチラントと近接しているままである。
【０３０４】
対照的に，標的分子と結合しないか，短時間しか結合しない，標識されたタンパク質は，バックグラウンドを上回るシグナルを生じるのに十分なほど長い間シンチラントと近いままではない。ランダムなブラウン運動によって引き起こされるシンチラントの近くで過ごす時間もいずれも，有意な量のシグナルをもたらさない。同様に，発現ステップの際に用いられる，残存する組み込まれていない放射標識も存在し得るが，標的分子と相互作用しているというよりもむしろ溶液中にあるため，有意なシグナルは生成しない。これらの非結合相互作用は，それゆえ，あるレベルのバックグラウンドシグナルを引き起こすが，これは数学的に除去できる。多すぎるシグナルが得られる場合には，塩またはその他の修飾因子を，所望の特異性が得られるまでアッセイプレートに直接加えることができる（ニコールズ(Nichols)ら，（１９９８）アナリティカル・バイオケミストリー，２５７：１１２〜１１９頁）。
【０３０５】
化合物および分子スキャフォールドのアッセイ
スキャフォールドの好ましい特徴としては，低分子量（例えば，３５０Ｄａ未満，または約１００〜約３５０ダルトン，または約１５０〜約３００ダルトン）であることが挙げられる。スキャフォールドのｃｌｏｇＰは−１〜８であることが好ましく，６，５または４未満がより好ましく，３未満が最も好ましい。特定の実施形態では，ｃｌｏｇＰは，−１〜上限２，３，４，５，６または８の範囲であるか，０〜上限２，３，４，５，６または８の範囲である。回転可能な結合の好ましい数は，５未満であり，４未満がより好ましい。水素結合ドナーおよびアクセプターの数は６より小さいことが好ましく，５より小さいことがより好ましい。有用であり得るさらなる基準は，極性表面積が５未満である。特定の適用についての基準を同定するのに有用であり得る手引きは，リピンスキ(Lipinski)ら，（１９９７）アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー２３，３〜２５頁に見出すことができ，これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０３０６】
スキャフォールドは，スキャフォールドの置換部分をタンパク質結合部位のポケット中に位置させる立体配置で，所定のタンパク質結合部位と結合できることが好ましい。また，特に合成反応によって，化学的に修飾し，コンビナトリアルライブラリーを容易に作製できる，化学的に扱いやすい群を有することが，スキャフォールドの好ましい特徴であり得る。また，スキャフォールド上にその他の部分を結合でき，スキャフォールドと注目するタンパク質との結合を妨害しないが，スキャフォールドを所望の特性，例えば，スキャフォールドの細胞および／または器官への活発な輸送，解析を容易にするためにスキャフォールドをクロマトグラフィーカラムに結合されることを可能にすること，または別の所望の特性を達成させる位置を有することも好ましいことであり得る。分子スキャフォールドは標的分子と何らかの親和性で，例えば高親和性，中程度の親和性，低親和性，極めて低い親和性または極端に低い親和性で結合できる。
【０３０７】
したがって，前記の基準を利用して，所望の特質を有する，試験するための多数の化合物を選択することができる。記載した基準を有する多数の化合物は，市場で入手でき，方法が適用される個々の必要性に応じてアッセイのために選択できる。
【０３０８】
「化合物ライブラリー」または「ライブラリー」とは，種々の化学構造を有する種々の化合物の収集物である。化合物ライブラリーはスクリーニング可能である。すなわち，その中の化合物ライブラリーメンバーをスクリーニングアッセイに付すことができる。好ましい実施形態では，ライブラリーメンバーは，約１００〜約３５０ダルトン，または約１５０〜約３５０ダルトンという分子量を有し得る。ライブラリーの例は前記で示されている。
【０３０９】
本発明のライブラリーは，標的分子と低親和性で結合する少なくとも１種の化合物を含み得る。候補化合物のライブラリーは，多数の異なるアッセイ，例えば前記のもの，例えば蛍光偏光アッセイによってアッセイできる。ライブラリーは，化学合成されたペプチド，ペプチドミメティックス，または大きいものであるか小さいものであり，焦点が絞られたものであるか焦点が絞られたものでない，コンビナトリアルケミカルのアレイからなっていてもよい。「焦点が絞られた」とは，化合物の収集物が，従前に特性決定された化合物および／またはファルマコフォア構造を用いて調製されていることを意味する。
【０３１０】
化合物ライブラリーは，自然源から単離された分子，人工的に合成された分子，または１種以上の部分，例えば独立に単離されるか無作為に合成された部分を有するような方法で合成され，単離され，そうでなければ調製された分子を含み得る。化合物ライブラリー中の分子の種類としては，それだけには限らないが，有機化合物，ポリペプチドおよび核酸（それらの用語は本明細書に用いられる通りである），ならびにそれらの誘導体，コンジュゲートおよび混合物が挙げられる。
【０３１１】
本発明の化合物ライブラリーは市場で購入でき，または調製でき，またはそれだけには限らないが，コンビナトリアルケミストリー技術，発酵法，植物および細胞抽出物手順などをはじめとするいずれかの手段によって獲得できる（例えば，クウィルラ(Cwirla)ら，（１９９０）バイオケミストリー(Biochemistry)，８７，６３７８〜６３８２頁，ホーテン(Houghten)ら，（１９９１）ネイチャー(Nature)，３５４，８４〜８６頁，ラム(Lam)ら，（１９９１）ネイチャー，３５４，８２〜８４頁，ブレナー(Brenner)ら，（１９９２），プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Prociidings of the National Academy of Sciences of the United States of America)，８９，５３８１〜５３８３頁，Ｒ．Ａ．ホーテン(Houghten)，（１９９３）トレンヅ・イン・ジェネティクス(Trends in Genetics)，９，２３５〜２３９頁，Ｅ．Ｒ．フェルダー(Felder)，（１９９４），チミア(Chimia)，４８，５１２〜５４１頁，ギャロップ(Gallop)ら，（１９９４）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)，３７，１２３３〜１２５１頁，ゴードン(Gordon)ら，（１９９４）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー，３７，１３８５〜１４０１，カレル(Carell)ら，（１９９５），ケミストリー・アンド・バイオロジー(Chemistry and Biology)，３，１７１〜１８３頁，マッデン(Madden)ら，パースペクティブス・イン・ドラッグ・ディスカベリー・アンド・デザイン(Perspectives in Drug Discovery and Design)２，２６９〜２８２頁，エレブル(Lebl)ら，（１９９５）バイオポリマーズ(Biopolymers)，３７，１７７〜１９８頁参照）；共有分子構造の周りに集められた小分子，種々の市販のおよび市販されていない群，天然物によって集められた化学物質の収集物，海洋生物，真菌，細菌および植物の抽出物。
【０３１２】
好ましいライブラリーは，均一な反応混合物中に調製でき，ライブラリーのメンバーからの反応していない試薬の分離はスクリーニングに先立って必要ではない。多数のコンビナトリアルケミストリーアプローチが固体化学に基づいたものであるが，液相コンビナトリアルケミストリーはライブラリーを作製可能である（サン(Ｓｕｎ)ＣＭ．（１９９９）液相コンビナトリアルケミストリーにおける最近の進歩(Recent advances in liquid-phase combinatorial chemistry)，コンビナトリアル・ケミストリー＆ハイスループットスクリーニング(Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening)２：２２９〜３１８頁。
【０３１３】
種々の種類の分子のライブラリーを，それから1以上の事前に選択した特質を有するメンバーを獲得するために調製するが，これは，それだけには限らないが，パラレルアレイ合成(ホートン(Houghton)，（２０００）アニュアル・レビュー・オブ・ファーマコロジー・アンド・トキシコロジー(Annual Reviews of Pharmacology and Toxicology)４０：２７３〜８２頁)，パラレルアレイおよび混合物ベースの合成コンビナトリアルケミストリー，液相コンビナトリアルケミストリー（メリット(Merritt)，（１９９８）コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング(Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening)１（２）：５７〜７２頁，液相コンビナトリアルケミストリー，コー(Coe)ら，（１９９８〜９９）モレキュラー・ディバーシティー(Molecular Diversity)４（１）：３１〜８頁，液相コンビナトリアルケミストリー，サン(Sun)（１９９９）コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２（６），２９９〜３１８頁，液相コンビナトリアル・ケミストリーにおける最近の進歩(Recent advances in liquid-phase combinatorial chemistry)；可溶性ポリマーでの合成(synthesis on soluble polymer)（グラバート(Gravert)ら，(１９９７)カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)１（１）：１０７〜１３頁），可溶性ポリマーでの合成：新規反応および小分子の構築(Synthesis on soluble polymers: new reactions and the construction of small molecules)などを含む種々の技術によって調製できる。例えば，ドーレ(Dolle)ら，（１９９９）ジャーナル・オブ・コンビナトリアル・ケミストリー(Journal of Combinatorial Chemistry)１（４）：２３５〜８２頁，コンビナトリアルライブラリー合成の広範囲にわたる調査(Comprehensive survey of cominatorial library synthesis)：１９９８，フレイジンガー(Freidinger)ＲＭ．，(１９９９)ペプチドおよびタンパク質受容体の非ぺプチド性リガンド(Nonpeptidic ligands for peptide and protein receptors)，カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)およびクンヅ(Kundu)ら，プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Progress in Drug Research)，５３：８９〜１５６頁，コンビナトリアルケミストリー：ペプチドおよび非ペプチドライブラリーの，ポリマーによって支持される合成(Combinatorial chemistry: polymer supported synthesis of peptide and non-peptide libraries)参照。化合物には，同定を容易にするために臨床的にタグをつけることができる（チャバラ(Chabala)（１９９５）カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー６（６）：６３３〜９頁，固相コンビナトリアルケミストリーおよびリードを同定するための新規タギング法(Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads)）。
【０３１４】
炭水化物のコンビナトリアル合成およびオリゴサッカライドを含むライブラリーは記載されている（シュバイツァー(Schweizer)ら，（１９９９）カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー３（３）：２９１〜８頁，炭水化物のコンビナトリアル合成(Combinatorial synthesis of carbohydrate)）。天然物ベースの化合物ライブラリーの合成も記載されている（ウェスヨハン(Wessjohann)，（２０００）カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー４（３）：３０３〜９頁，天然物ベースの化合物ライブラリーの合成(Synthesis of natural-product based compound libraries)）。
【０３１５】
核酸のライブラリーは，それだけには限らない例として，アプタマーの単離のために，本明細書に記載されたものをはじめとする種々の技術によって調製される。ストレプトアビジン磁性ビーズ上に提示されたオリゴヌクレオチドおよびポリアミノオリゴヌクレオチドを含むライブラリーが知られている（マルキエヴィッツ(Markiewicz)ら，（２０００）合成オリゴヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーおよびその適用(Synthetic oligonucleotide combinatorial libraries and their applications)，ファルマコ(Farmaco)５５:１７４〜７頁）。核酸ライブラリーは，パラレルサンプリングと合わせることができ，自動質量分析（エンジャルバル(Enjalbal)Ｃ．マルチネス(Martinez)Ｊ．オーバグナック(Aubagnac)ＪＬ，(２０００)コンビナトリアルケミストリーにおける質量分析(Mass  spectrometry in combinatorial chemistry)，マス・スペクトロメトリー・レビューズ(Mass Spectrometry Reviews)１９：１３９〜６１頁）およびパラレルタギング（ペリン(Perrin)ＤＭ，認識および触媒のための核酸：特色，制限および将来の展望(Nucleic acids for recognition and catalysis: landmarks, limitations, and looking to the future)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング３：２４３〜６９頁）などの複雑な手順をともなわず複雑度を低下できることが知られている。
【０３１６】
ペプチドミメティックスは，コンビナトリアルケミストリーおよび固相合成を用いて同定されている（キム(Kim)ＨＯ．カーン(kahn)Ｍ．（２０００）合理的薬物設計とコンビナトリアルケミストリーの融合：ぺプチド二次構造ミメティックスの開発および適用(A merger of rational drug design and combinatorial chemistry : development and application of peptide secondary structure mimetics)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング３：１６７〜８３頁，アルオベイディ(al-obeidi)，（１９９８）モレキュラー・バイオテクノロジー(Molecular Biotechnology)９（３）：２０５〜２３頁，ペプチドおよびぺプチドミメリックライブラリー(Peptide and peptidomimetric libraries)。分子多様性および薬物設計(Molecular diversity and drug design)）。合成は完全に無作為であってもよく，一部既知ポリペプチドに基づいたものであってもよい。
【０３１７】
ポリペプチドライブラリーは，種々の技術にしたがって調製できる。簡潔には，ファージディスプレイ技術を用いてポリペプチドリガンドを製造でき（グラム(Gram)Ｈ．，（１９９９）タンパク質分解およびシグナル伝達におけるファージディスプレイ(Phage display in proteolysis and signal transduction)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２：１９〜２８頁），これをペプチドミメティックスの合成の基礎として使用できる。ポリペプチド，制約されたペプチド，タンパク質，タンパク質ドメイン，抗体，一本鎖抗体断片，抗体断片および抗体混合領域が，選択のために繊維状ファージ上にディスプレイされる。
【０３１８】
ヒト一本鎖Ｆｖ抗体の個々の変異体の大きなライブラリーが製造されている。例えば，シーゲル(Siegel)ＲＷ．アレン(Allen)Ｂ，パブリック(Pavlik)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．ブラッドブリー(Bradbury)Ａ．，（２０００）ペプチド標的上で選択された一本鎖抗体を用いるタンパク質複合体のマススペクトル解析：機能ゲノム学への適用(Mass spectral analysis of a protein complex using single-chain antibodies selected on a peptide target: applications to functional genomics)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)３０２：２８５〜９３頁，ポール(Poul)ＭＡ．ベセリル(Becerril)Ｂ．ニールセン(Nielsen)ＵＢ．モリソン(Morisson)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．，（２０００）ファージライブラリーからの腫瘍特異的インターナライジングヒト抗体の選択(Selection of tumor-specific internalizing human antibodies from phage libraries.)出典ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)３０１：１１４９〜６１頁，アメルスドーファー(Amersdorfer)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．，（２００１）抗ボツリヌス菌ｓｃＦｖ抗体を作製するためのファージライブラリー(Phage libraries for generation of anti-botulinum scFv antibodies)，メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)１４５：２１９〜４０頁，ヒューズ−ジョーンズ(Hughes-Jones)ＮＣ．バイ(Bye)ＪＭ．ゴリック(Gorick)ＢＤ．マークス(Marks)ＪＤ．アウエハント(Ouwehand)ＷＨ．，（１９９９）ＶＨおよびＶＬ生殖系列遺伝子を用いるＲｈ  Ｆｖファージ−抗体の合成(Synthesis of Rh Fv phage-antibodies using VH and VL germline genes)，ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー(British Journal of Haematology)１０５：８１１〜６頁，マッコール(McCall)ＡＭ．アモロソ(Amoroso)ＡＲ．ソーテス(Sautes)Ｃ．マークス(Marks)ＪＤ．ウェイナー(Wiener)ＬＭ．，（１９９８）ヒトファージディスプレイライブラリーに由来する抗マウスＦｃγＲＩＩ一本鎖Ｆｖ断片の特性決定(Characterization of anti-mouse Fc gamma RII single-chain Fv fragments derived from human phage display libraries)，イムノテクノロジー(Immunotechnology)４：７１〜８７頁，シーツ(Sheets)ＭＤ．アメルスドーファー(Amersdorfer)Ｐ．フィナーン(Finnern)Ｒ．サージェント(Sargent)Ｐ．リンドクイスト(Lindquist)Ｅ．シーア(Schier)Ｒ．ヘミングセン(Hemingsen)Ｇ．ウォン(Wong)Ｃ．ゲルハルト(Gerhart)ＪＣ．マークス(Marks)ＪＤ．リンドクイスト(Lindquist)Ｅ．，（１９９８）大きな非免疫ファージ抗体ライブラリーの効率的な構築：タンパク質抗原に対する高親和性ヒト一本鎖抗体の作製（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ１９９９  ９６：７９５で現れる印刷された誤植）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ９５：６１５７〜６２頁参照。
【０３１９】
計算機化学（例えば，クンヅ(Kundu)Ｂ．カーレ(khare)ＳＫ．ラストギ(Rastogi)ＳＫ．，（１９９９）コンビナトリアルケミストリー：ペプチドおよび非ペプチドライブラリーのポリマーによって支持された合成(Combinatorial chemistry:polymer supported synthesis of peptide and non-peptide libraries)，プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Progress in Drug research)５３：８９〜１５６頁）およびデータベース検索およびドッキング，ｄｅ  ｎｏｖｏ薬物設計およびリガンド結合親和性の推定を用いる構造ベースのリガンドの使用（ジョセフ−マッカーシーＤ．，（１９９９）構造ベースのリガンド設計に対する計算論的アプローチ(Computational approaches to structure-based ligand design)，ファーマコロジ・アンド・セラピューティクス(Pharmacology & Therapeutics)８４：１７９〜９１頁，カークパトリック(Kirkpatrick)ＤＬ．ワトソン(Watson)Ｓ．ウルハク(Ulhaq)Ｓ．，（１９９９）構造ベースの薬物設計：コンビナトリアルケミストリーおよび分子モデリング(Stracture-based drug design: combinatorial chemistry and molecular modeling)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２：２１１〜２１頁，エリゼーエフ(Eliseev)ＡＶ．レーン(lehn)ＪＭ．，（１９９９）ダイナミックコンビナトリアルケミストリー：分子ライブラリーの進化的形成およびスクリーニング(Dynamic combinatorial chemistry: evolutionary formation and screening of molecular libraries)，カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbiology & Immunology)２４３：１５９〜７２頁，ボルガー(bolger)ら，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)２０３：２１〜４５頁，マーチン(Martin)，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー２０３：５８７〜６１３頁，ニードル(Niedle)ら，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー２０３：４３３〜４５８頁，米国特許第６，１７８，３８４号）を含む精巧な戦略の助けを借りて，焦点が絞られた化学物質またはスマートケミカルおよびファルマコフォアライブラリーを設計することができる。
【０３２０】
Ｘ．結晶学
結合化合物を決定した後，標的に結合している化合物の配向を決定する。この決定には，分子スキャフォールド化合物と標的との共結晶についての結晶学が含まれることが好ましい。大部分のタンパク質の結晶学的プラットフォームは，機器の物理的パラメーターと操作上の都合により最大約５００の，タンパク質標的に結合している化合物，リガンドまたは分子スキャフォールドの共複合体を解析するように，設計することができることが好ましい。結合活性を有するスキャフォールドの数が結晶学法の適用に都合のよい数を超える場合には，少なくとも１つの共通の化学構造を有していることまたは他の所望の特徴を有していることに基づいて，スキャフォールドを群別してもよいし，１以上のクラスから代表的な化合物を選択してもよい。所望の数のクラス（例えば，５００）が得られるまで，一層厳しい判定基準によってクラスを作成することができる。クラスは，例えば，全てがピロール環，ベンゼン環，または他の化学的特徴を有するクラスでは，分子スキャフォールド間の化学構造類似性に基づいたものであり得る。同様に，クラスが形態特徴，例えば，空間充填特徴に基づいたものであってよい。
【０３２１】
共結晶学解析は，各スキャフォールドを，スクリーニングアッセイにおいて活性を示したスキャフォールドの濃度においてその標的と共複合体化することにより実施することができる。この共複合体化は，標的分子とともに低濃度の有機溶媒を使用し，その後，各スキャフォールドを有する標的を濃縮することにより達成することができる。好ましい実施形態では，これらの溶媒は５％未満の有機溶媒，例えば，水または別の水性溶媒中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），エタノール，メタノールまたはエチレングリコールなどである。標的分子と複合体化した各スキャフォールドを，次いで，適した数（４および２０程度）の結晶化スクリーニング条件を用いてスクリーニングすることができる。好ましい実施形態では，約９６の結晶化スクリーニング条件を実施して，共複合体化および結晶化条件，ならびに標的分子の結合部位におけるスキャフォールドの配向についての十分な情報を得ることができる。さらに，結晶構造を解析して，結合しているスキャフォールドが，物理的に，分子ファミリーメンバーの結合部位内または１以上の結合ポケット内でどのように配向しているかを決定することができる。
【０３２２】
タンパク質ファミリーに対してどれが最も適したスキャフォールドであるかを決定するためには，標的タンパク質に結合した化合物の原子座標を決定することが望ましい。そのため，原子座標を決定するにはＸ線結晶学的解析が最も好ましい。選択された化合物は，医薬品化学の適用についてさらに試験することができる。化合物は，医薬品化学用に選択することができ，標的分子におけるそれらの結合位置に基づいて試験される。例えば，化合物が結合部位に結合する場合には，標的分子の結合部位におけるその化合物の結合位置を，化合物の化学的に扱いやすい構造または部分構造において行われ得る化学に関して，さらに化合物のそのような修飾が標的の結合部位の構造または部分構造とどのように相互作用するのかについて検討することができる。従って，標的の結合部位およびスキャフォールドの化学を調査することで，より高い有効性および／または選択性でリガンドに到達するためのスキャフォールドの改変方法について決定することができる。このプロセスによって，共複合体から直接得られた構造および化学情報を利用することにより，有益な薬物製品をもたらすであろうリード化合物をより効率的かつ迅速に設計することが可能であり，結果，より直接的なリガンドの設計を可能にする。種々の実施形態では，結合する全てのスキャフォールドについて，または特定の親和性で結合するものだけ，例えば，高親和性，中程度の親和性，低親和性，極めて低い親和性または極端に低い親和性で結合するものだけについて共結晶学を実施することが望ましい。また，親和性の任意の組合せで結合するスキャフォールドの選択について，共結晶学を実施することも有利であろう。
【０３２３】
標準的なＸ線タンパク質回折研究，例えば，Ｘ線イメージプレート検出器またはシンクロトロンビームラインを用いるＲｉｇａｋｕ  ＲＵ−２００（登録商標）（リガク(Rigaku)，日本，東京）を使用することによるなどを共結晶で実施し，標準的なＸ線検出器，例えばＣＣＤ検出器またはＸ線イメージプレート検出器などで回折データを測定することができる。
【０３２４】
約２００の共結晶にＸ線結晶学を実施すると，通常，約５０の共結晶の構造がもたらされ，それによって化学における検証に約１０のスキャフォールドが提供され，最終的には標的分子に対して約５の選択的リードがもたらされる。
【０３２５】
仮想アッセイ
提供する一セットの座標から複合体化された標的と化合物の三次元グラフを作成する市販のソフトウェアを使用して，化合物が標的に結合した場合にどのように配向されているかを図で示し，研究することができる（例えば，ＱＵＡＮＴＡ（登録商標），アクセレリス(Accelerys)，カリフォルニア州，サンディエゴ）。従って，標的の結合部位における結合ポケットの存在は，本発明において特に有用であり得る。これらの結合ポケットは，結晶学的構造決定によって示され，標的の結合部位への化合物の結合に関与する正確な化学的相互作用を示す。当業者ならば，その図を用いて，複合体において非占有スペースがどこに存在し，どの化学的部分構造がそのスペースを埋めるのに適したサイズおよび／または電荷特性を有しているのかを検討することにより，結合または別の所望の効果を強化するために，化学基を付加し，置換し，修飾し，または除去するスキャフォールドの場所を決定できることが分かるであろう。また，当業者ならば，結合部位内の領域がフレキシブルであり得，スキャフォールドの結合の結果としてその特性が変化することができ，所望の効果を達成するために，化学基をそういった領域に特異的にターゲッティングできることも分かるであろう。分子スキャフォールド上の特定の位置を，適した化学的部分構造が結合できる場所および立体構造，ならびにどの部位が最も有利な化学を利用可能にするのかについて検討することができる。
【０３２６】
標的タンパク質への化合物の結合力を理解することにより，どの化合物をスキャフォールドとして使用するのが最も有利なのか，そしてリガンドの設計においてどの特性を操作するのが最も効果的なのかが明らかになる。当業者ならば，立体結合，イオン結合，水素結合，および他の影響力が標的−化合物複合体の維持または強化の一因として考えられるということが分かるであろう。脱溶媒和ペナルティーのような他のエネルギー効果を明らかにするために，自動計算法，例えばドッキングおよび／または自由エネルギー摂動（ＦＥＰ）でさらなるデータを得てもよい。選択された化合物は，標的との化学的相互作用についての情報を得るために，または化合物の結合の選択性を高め得る化学修飾を解明する目的で使用することができる。
【０３２７】
共結晶構造のデータを用いて，コンピュータモデル，例えば，相同性モデル（すなわち，既知の，実験的に得られた構造に基づくもの）を構築することができる。標的分子がタンパク質または酵素である場合には，相同性モデルの作成に好ましい共結晶構造が，モデリングされるタンパク質配列の結合部位において高い配列同一性を有し，それらのタンパク質は選択的に同じクラスおよび／またはフォールドファミリー内のものとなる。タンパク質クラスの活性部位において保存される残基の知識を用いて，結合部位を厳密に表す相同性モデルを選択することができる。さらに，相同性モデルを使用して，標的タンパク質に対するアポまたは共結晶構造が存在する代替物タンパク質の構造情報をマッピングすることができる。
【０３２８】
仮想スクリーニング法，例えば，ドッキングはまた，スキャフォールド，化合物および／またはコンビナトリアルライブラリーメンバーの，相同性モデルとの結合形態ならびに親和性の予測にも使用できる。このデータを用い，コンピュータソフトウェアを使って「仮想実験」を実施することにより，多大な資源をセーブすることができ，当業者ならば，実際にリガンドを合成し，共結晶化を行う必要なく，どの化合物が適したスキャフォールドまたはリガンドであるのかを決定することが可能になる。このようにして，どの化合物が実際の合成および共結晶化に値するかを決定することができる。このような化学的相互作用を理解することは，標的タンパク質とより有利に相互作用し，および／または他のものよりも一タンパク質ファミリーメンバーに対して選択性の高い薬物の発見および設計に役立つ。従って，これらの原理を適用することにより，優れた特性を有する化合物を発見することができる。
【０３２９】
もちろん，共結晶の形成を促すために，標的分子製剤に共結晶化を促進する添加剤を含めることができる。タンパク質または酵素の場合では，調べるスキャフォールドをタンパク質製剤に添加し，それが濃度約１ｍｇ／ｍｌで存在することが好ましい。また，製剤が０％〜１０％（ｖ／ｖ）間の有機溶媒，例えば，ＤＭＳＯ，メタノール，エタノール，プロパンジオールもしくは１，３  ジメチルプロパンジオール（ＭＰＤ）またはそれらの有機溶媒のいくつかの組合せを含んでいてもよい。化合物を，好ましくは有機溶媒に濃度約１０ｍＭに溶かし，それをタンパク質サンプルに濃度約１００ｍＭに添加する。次いで，タンパク質−化合物複合体をタンパク質の終濃度，約５〜約２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。複合体化および濃縮ステップは，９６-ウェルフォーマットの濃縮装置（例えば，アミコン社(Amicon  Inc.)，ニュージャージー州，ピスカタウェイ）を用いて実施できることが好都合である。結晶化している製剤中に存在するバッファーおよび他の試薬は，結晶化を促進するかまたは結晶化条件に適合する他の成分，例えばＤＴＴ，プロパンジオール，グリセロールを含み得る。
【０３３０】
結晶化実験は，濃縮したタンパク質−化合物複合体の少分量（１μｌ）を９６ウェルフォーマットに入れ，９６結晶化条件下でサンプリングすることにより準備できる（他のスクリーニングフォーマット，例えば，９６ウェルより大型のプレートも使用できる）。結晶は，一般に９６ウェル結晶化プレートを異なる温度に置くことを含み得る標準的な結晶化プロトコールを用いて得ることができる。必要に応じて，各タンパク質−化合物複合体について温度以外の因子を変えた共結晶化も検討することができる。例えば，大気圧，光または酸素の有無，重量の変化および多くの他の変数は全て調べることができる。当業者ならば，変化させ，検討することが有利であり得る他の変数が分かるであろう。
【０３３１】
リガンドの設計および調製
リガンドの設計および調製は，活性なスキャフォールドセット間で共通する化学構造を検討することにより，構造および／または共結晶化データがあってもなくても実施することができる。このプロセスでは，構造−活性仮説を立てることができ，相当な数のスキャフォールド（低親和性で結合するものを含む）に存在することが分かった化学構造が，スキャフォールドの結合にいくらかの影響を及ぼしていると仮定することができる。この結合が生物系（例えば，治療される哺乳類）において起こる場合には，それが所望の生化学的効果を誘導すると推測することができる。最大結合数および／または構造−活性仮説の誤りを立証するために，新規または改変スキャフォールドまたはスキャフォールドから得られたコンビナトリアルライブラリーを調べることができる。次いで，残った仮説を用いて，所望の結合および生化学的効果を達成するリガンドを設計できる。
【０３３２】
しかし，多くの場合では，所望の結合効果（例えば，より高い親和性でのまたはより高い選択性での結合）を達成するためのスキャフォールド改変法の検討には，共結晶学データを有していることが好ましい。タンパク質および酵素の場合では，共結晶学データにより，分子スキャフォールドが結合部位に結合しているタンパク質の結合ポケットが示され，スキャフォールド上の化学的に扱いやすい基に修飾を加えることができることは明らかである。例えば，タンパク質結合部位またはポケットにある小容量のスペースが，スキャフォールドをその容量を埋める小さな化学基を含むように修飾することによって埋めることができる。空隙容量が埋まることによって，より強い結合親和性が生じ，またはタンパク質ファミリーの別のメンバーとの望ましくない結合がなくなると考えられる。同様に，共結晶学データにより，スキャフォールド上の化学基を欠失させることで結合の障害が少なくなり，その結果としてより強い結合親和性または特異性が生じ得ることも示すことができる。
【０３３３】
タンパク質の結合部位またはポケットに位置する帯電した化学基の存在をうまく利用することが望ましい。例えば，正電荷を有する基に，分子スキャフォールド上に導入した負に帯電した基を補ってもよい。こうすることによって結合親和性または結合特異性が高まり，その結果，より所望のリガンドが得られると考えられる。多くの場合では，タンパク質結合部位またはポケットの領域は，それらの領域におけるアミノ酸の違いに基づいて，あるファミリーメンバーが別のものに変わることが知られている。このような領域が化学的付加を受けると，化合物を，あるタンパク質標的に対して他のものよりも特異的であることを可能にし，またはより強い親和性で結合することを可能にする特定の相互作用（例えば，疎水性相互作用，静電相互作用またはエントロピー相互作用）が生じるか，または消失する場合があり，そうすることによって，特定のファミリーメンバーに対してより強い選択性または親和性を有する化合物を合成することが可能になる。加えて，特定の領域に，他の領域よりもフレキシブルであることが知られているアミノ酸が含まれていてもよい。これは，タンパク質の二次構造，例えばαヘリックスまたはβ鎖の要素を結ぶループに含まれるアミノ酸に見られることが多い。これらのフレキシブルな領域を化学的部分の付加の対象として，注目するタンパク質標的と化合物との間で生じる特定の相互作用の可能性を高めることもできる。また，インシリコで仮想スクリーニング法を行って，タンパク質ファミリーまたはクラスのメンバーに関する化学的付加，除去，修飾および／または置換の化合物への影響を評価することもできる。
【０３３４】
スキャフォールドへの化学構造または部分構造の付加，除去または修飾は，任意の適した化学的部分を用いて実施することができる。例えば，以下の部分（一例として挙げており，限定を意図したものではない）を利用することができる：水素，アルキル，アルコキシ，フェノキシ，アルケニル，アルキニル，フェニルアルキル，ヒドロキシアルキル，ハロアルキル，アリール，アリールアルキル，アルキルオキシ，アルキルチオ，アルケニルチオ，フェニル，フェニルアルキル，フェニルアルキルチオ，ヒドロキシアルキル−チオ，アルキルチオカルバミルチオ，シクロヘキシル，ピリジル，ピペリジニル，アルキルアミノ，アミノ，ニトロ，メルカプト，シアノ，ヒドロキシル，ハロゲン原子，ハロメチル，酸素原子（例えば，ケトンまたはＮ−オキシドを形成する）または硫黄原子（例えば，チオール，チオン，ジアルキルスルホキシドまたはスルホンを形成する）が利用できる部分の例の全てである。
【０３３５】
利用できる構造または部分構造のさらなる例として，アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，カルボキサミド，ニトロおよびエステル部分からなる群から独立に選択される１つ，２つまたは３つの置換基で場合によって置換されていてもよいアリール；式−ＮＸ２Ｘ３のアミン（式中，Ｘ２およびＸ３は，水素，飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択される）；ハロゲンまたはトリハロメチル；式−ＣＯＸ４のケトン（式中，Ｘ４はアルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；式−（Ｘ５）ｎＣＯＯＨのカルボン酸または式（Ｘ６）ｎＣＯＯＸ７のエステル（式中，Ｘ５，Ｘ６およびＸ７はアルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択され，ｎは０または１である）；式（Ｘ８）ｎＯＨのアルコールまたは式−（Ｘ８）ｎＯＸ９のアルコキシ部分（式中，Ｘ８およびＸ９は飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択され，前記環はアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，ニトロおよびエステルからなる群から独立に選択される１つ以上の置換基で場合によって置換されていてもよく，ｎは０または１である）；式ＮＨＣＯＸ１０のアミド（式中，Ｘ１０はアルキル，ヒドロキシルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択され，前記環はアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，ニトロおよびエステルからなる群から独立に選択される１つ以上の置換基で場合によって置換されていてもよい）；ＳＯ２，ＮＸ１１Ｘ１２（式中，Ｘ１１およびＸ１２は水素，アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，カルボキサミド，ニトロおよびエステル部分からなる群から独立に選択される１つ，２つまたは３つの置換基で場合によって置換されていてもよい，単素環または複素環部分；式−ＣＨＯのアルデヒド；式−ＳＯ２Ｘ１３のスルホン（式中，Ｘ１３は飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；ならびに式−ＮＯ２のニトロである。
【０３３６】
分子スキャフォールドおよびリガンド上の結合部位の同定
ホスホジエステラーゼおよびその他の酵素のリガンドの同定および開発に加えて，結合部位における分子スキャフォールドまたは他の結合化合物の配向を決定することにより，結合分子の別の成分への結合についてエネルギー的に許容される部位の同定が可能になる。このような部位では，結合される成分の存在に伴ういかなる自由エネルギーの変化も，化合物とホスホジエステラーゼとの結合を，結合が壊れる程度に不安定化することはないはずである。好ましくは，結合に伴う結合エネルギーが少なくとも４ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきであり，より好ましくは少なくとも６ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１５ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは２０ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきである。特定の部位に結合が存在することによって結合エネルギーが３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下，４ｋｃａｌ／ｍｏｌ，５ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは１５ｋｃａｌ／ｍｏｌしか低下しないことが好ましい。
【０３３７】
多くの場合では，適した結合部位が，結合化合物が結合部位に結合される際に溶媒に露出される部位である。いくつかの場合では，過剰のエネルギーコストを負担することなく酵素の一部に微小変位を起こす結合部位を使用できる。露出部位は種々の方法によって同定することができる。例えば，図形表示または三次元モデルを利用して露出部位を同定できる。図形表示（コンピュータディスプレーなど）では，結合部位に結合されている化合物のイメージを視覚的に検証して，この原子または基が，溶媒に露出し，こうした原子または基での結合が酵素と結合化合物の結合を妨げないように配向されている，化合物の原子または基を明示することができる。結合のエネルギーコストは，結合とエントロピー変化によってもたらされるであろう変化または変形に基づいて算出することができる。
【０３３８】
数多くの異なる種類の成分を結合することができる。熟練者ならば，種々の結合に用いられる化学を熟知している。結合することができる成分の例としては，それだけには限らないが，中でも，固相成分，例えばビーズ，プレート，チップおよびウェル；直接または間接標識；リンカー（トレースレスリンカーであってよい）が挙げられる。このようなリンカーは，それら自身が他の成分，例えば，固相媒体，標識および／または結合部分と結合していてもよい。
【０３３９】
化合物の結合エネルギーと分子を別の成分と結合するための結合エネルギーへの影響は，種々の入手可能なソフトウェアのいずれかを使用するかまたは手動計算により概算することができる。一例が以下のとおりである。
【０３４０】
２種類のキナーゼ：ＰＩＭ−１およびＣＤＫ２に対する異なる有機分子の結合エネルギーを評価するために計算を行った。検討する有機分子に，スタウロスポリン，ＰＤＥ５Ａと結合すると確認されている化合物，そしていくつかのリンカーを含めた。
【０３４１】
タンパク質−リガンド複合体間の結合エネルギー計算値は，トライポス(Tripos)製ソフトウェアスイートのＦｌｅｘＸ  ｓｃｏｒｅ（Ｂｏｈｍスコアリング関数の実行）を使用して得た。その方程式の形を以下の式で示す：
ΔＧｂｉｎｄ＝ΔＧｔｒ＋ΔＧｈｂ＋ΔＧｉｏｎ＋ΔＧｌｉｐｏ＋ΔＧａｒｏｍ＋ΔＧｒｏｔ
（式中，ΔＧｔｒはリガンドの回転および並進エントロピーの総合損失である定数項であり，ΔＧｈｂはリガンドとタンパク質間で形成される水素結合であり，ΔＧｉｏｎはリガンドとタンパク質間のイオン相互作用であり，ΔＧｌｉｐｏはタンパク質−リガンド接触面に相当する親油性相互作用であり，ΔＧａｒｏｍはタンパク質の芳香環とリガンド間の相互作用であり，そしてΔＧｒｏｔは結合時にリガンドにおける回転可能な結合を制限するエントロピーペナルティーである）。
【０３４２】
この方法により，結晶構造が存在する標的タンパク質に対してリード化合物が有するべき自由エネルギーが評価される（その自由エネルギーがフレキシブルリンカーのエントロピーペナルティーである）。従って，それを用いて，リンカーがスクリーニングされた分子と結合することによって生じた自由エネルギーペナルティー，およびリンカーの自由エネルギーペナルティーを克服するためにリード化合物が有するべき結合エネルギーを評価することができる。この方法では溶媒和を計上していないため，リンカーを別の結合複合体，例えばビオチン：ストレプトアビジン複合体などを介して固相に結合する場合ではエントロピーペナルティーを過大評価する可能性がある。
【０３４３】
共結晶は，ＰＩＭ−１の残基とＣＤＫ２の対応する残基とをスーパーインポーズすることによりアラインした。これらの算出に使用したＰＩＭ−１構造はＰＩＭ−１と結合化合物との共結晶であった。使用したＣＤＫ２：スタウロスポリン共結晶は，ブルックヘブン(Brookhaven）データベースファイル  ｌａｑｌのものであった。タンパク質に水素原子を添加し，Ｓｙｂｙｌ内のアンバー(AMBER)９５パラメーターを用いて原子電荷を得た。トライポス製Ｓｙｂｙｌモデルリングスイートで，記載した化合物の修飾を行った。
【０３４４】
これらの計算により，所与の標的（スタウロスポリン：ＣＤＫ２など）と強く結合する化合物の結合エネルギー計算値が−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌより低く，一方，優れたスキャフォールドまたは最適化されていない結合化合物の結合親和性計算値が−１５〜−２０の範囲であり得ることが示される。リンカー，例えばエチレングリコールまたはヘキサトリエンとの結合に対する自由エネルギーペナルティーは，一般に＋５〜＋１５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であると推定される。
【０３４５】
リンカー
本発明において使用するのに適したリンカーには多くの異なる種類のものが有り得る。リンカーは，結合化合物や特定用途に利用する別の成分との結合に適合するリンカー化学などの因子に基づき，特定用途に向けて選択することができる。さらなる因子としては，それだけには限らないが，リンカー長，リンカーの安定性およびリンカーを適切な時期に除去する能力が挙げられる。例示的リンカーとしては，それだけには限らないが，ヘキシル，ヘキサトリエニル，エチレングリコールおよびペプチドリンカーが挙げられる。また，例えば，プラケット(Plunkett)，Ｍ．Ｊ．およびエルマン(Ellman)，Ｊ．Ａ．，（１９９５），ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Journal of Organic Chemistry)６０：６００６頁に記載されているように，トレースレスリンカーを使用することもできる。
【０３４６】
結合化合物との結合に利用される典型的な官能基としては，それだけには限らないが，カルボン酸，アミン，ヒドロキシルおよびチオールが挙げられる（それらの例は，「低分子量化合物ライブラリーの固体支持体上でのコンビナトリアルおよびパラレル合成(Solid-supported combinatorial and parallel synthesis of small molecular weight compound libraries)」；（１９９８）テトラヘドロン・オーガニック・ケミストリー・シリーズ第１７巻;ペルガモン(Tetrahedron organic chemistry series Vol. 17; Pergamon);８５頁；に見出すことができる）。
【０３４７】
標識
前記のとおり，結合化合物または結合化合物と結合しているリンカーに，標識を結合することもできる。このような結合は，直接的（結合化合物に直接結合される）でもよいし，または間接的（結合化合物と直接または間接的に結合している成分に結合される）でもよい。このように標識することによって化合物の検出が直接あるいは間接的に可能になる。標識の結合は，従来の化学を用いて実施することができる。標識としては，例えば，蛍光標識，放射性同位元素，光散乱粒子，吸光性粒子，磁性粒子，酵素および特異的結合剤（例えば，ビオチンまたは抗体標的部分）が挙げられる。
【０３４８】
固相媒体
結合化合物と直接または間接的に結合できる成分のさらなる例として，種々の固相媒体が挙げられる。リンカーと標識の結合と同様に，固相媒体との結合も従来の化学を用いて実施できる。このような固相媒体としては，例えば，ビーズ，ナノ粒子および繊維などの小型成分（例えば，懸濁液中またはゲルもしくはクロマトグラフィーマトリックス中のもの）が挙げられる。同様に，固相媒体として，プレート，チップ，スライドおよびチューブなどのより大きなものも挙げられる。多くの場合では，このようなものの一部分にのみ（例えば，一般に平面上の一スポットもしくは他の局所要素にまたは一ウェルもしくはウェルの一部に）結合化合物が結合される。
【０３４９】
生物剤の同定
タンパク質についての構造情報を入手することによってまた，有用な生物剤，例えば抗体開発のためのエピトープの同定，活性に影響を及ぼすと思われる突然変異部位の同定，標識，リンカー，ペプチドおよび固相媒体などの物質とタンパク質の結合を可能にする結合部位の同定もなされる。
【０３５０】
抗体（Ａｂｓ）には，バイオテクノロジー，医薬および診断法をはじめとする種々の分野で多様な用途があり，実際に，生命科学研究では抗体は最も有効なツールの１つである。タンパク質抗原に対して向けられたＡｂｓは，線状または天然の三次元（３Ｄ）エピトープのいずれかを認識することができる。３Ｄエピトープを認識するＡｂｓの獲得には，免疫原として天然タンパク質全体（または未変性のコンホーメーションをとる一部分）を使用する必要があるが，残念ながら，これは様々な技術的な理由（例えば，天然タンパク質があまり入手できず，タンパク質が毒性を有し，または高密度抗原提示を利用することが望ましい）から必ずしも選択されない。このような場合には，ペプチドを用いた免疫を代替法とする。もちろん，この方法によって生じたＡｂｓは，線状エピトープを認識するが，起源の天然タンパク質については認識する場合も認識しない場合もある。それでもやはり，それらのＡｂｓは標準的な実験室応用（ウエスタンブロットなど）にとって有用である。免疫原として使用するペプチドの選択は，特定の選抜ルールに従い，および／またはエピトープ予測ソフトウェアを使用することにより成し遂げることができる。
【０３５１】
抗原ペプチドの予測法は絶対確実というものではないが，タンパク質由来のどのペプチド断片に抗原性がある可能性が高いかを判定するのに従うことができるいくつかのルールがある。これらのルールもまた，特定のペプチドに対するＡｂが天然タンパク質を認識する可能性を高めることに基づく。
１．抗原ペプチドは，溶媒露出領域に位置し，疎水性および親水性残基の両方を含まなければならない。
・既知３Ｄ構造のタンパク質の場合，種々のプログラム（とりわけ，ＤＳＳＰ，ＮＡＣＥＳＳまたはＷＨＡＴＩＦなど）を使用して溶媒露出度を決定できる。
・３Ｄ構造が分かっていない場合は，以下のウェブサーバーのいずれかを用いて，露出度を予測する：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰｒｅｄＡｃｃ（ｃ）  ＡＣＣｐｒｏ
２．ヘリックス領域に位置するペプチドを避け，二次構造（ＳＳ）モチーフを結ぶ長いループに存在するペプチドを選択することが好ましい。これにより，Ａｂが天然タンパク質を認識する可能性が高まる。このようなペプチドは，例えば，結晶構造または結晶構造をベースとする相同性モデルから同定できる。
・既知３Ｄ座標を有するタンパク質の場合，ブルックヘブンデータバンクにある関連エントリーの配列関連性からＳＳを得ることができる。ＰＤＢｓｕｍサーバーでは，ｐｄｂレコードのＳＳ解析も提供している。
・二次構造が全く得られない場合には，以下のサーバーのいずれかから予測を得る：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰＳＩ−ＰＲＥＤ，ＮＮＳＰなど。
３．可能ならば，タンパク質のＮおよびＣ末端領域にあるペプチドを選択する。タンパク質のＮおよびＣ末端領域は，通常溶媒露出し，構造化されていないため，それらの領域に対するＡｂｓも天然タンパク質を認識する可能性が高い。
４．細胞表面糖タンパク質の場合，最初のペプチドからＮ−グリコシル化に関するコンセンサス部位を含むものを排除する。
・Ｎ−グリコシル化部位は，ＳｃａｎｐｒｏｓｉｔｅまたはＮｅｔＮＧｌｙｃを使用して，検出することができる。
【０３５２】
さらに，抗原決定基の予測を目的とする，実験により決定したエピトープの種々の生理化学的性質（フレキシビリティ，親水性度，露出度）に基づくいくつかの方法が公開されており，それらの方法を使用することができる。Ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘおよびＰｒｅｄｉｔｏｐがその例である。
【０３５３】
抗原決定基の予測を目的とするおそらくは最も簡単な方法は，恐らく，実験により決定したエピトープのアミノ酸残基の頻度に基づくコラスカー(Kolaskar)およびトンガオンカー(Tongaonkar)の方法であろう（コラスカーおよびトンガオンカー（１９９０）タンパク質抗原の抗原決定基の予測のための半経験的方法(A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens.)。ＦＥＢＢＳレター(Letter)  ２７６（１〜２）：１７２〜１７４頁）。予測アルゴリズムは以下のとおり動作する：
１．各オーバーラッピング７量体の平均的な傾向を算出し，その結果を７量体の中央の残基（ｉ＋３）に割り当てる。
２．タンパク質全体の平均を算出する。
３．（ａ）タンパク質全体の平均が１．０より大きい場合には，平均的な傾向が１．０より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
４．（ｂ）タンパク質全体の平均が１．０より小さい場合には，タンパク質全体の平均より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
５．全ての残基が上記ステップ３により選択される８量体（原本書類では６量体）を見つけ出す。
【０３５４】
コラスカーおよびトンガオンカーの方法は，ＧＣＧパッケージからでも入手することが可能であり，その方法はコマンドｅｇｃｇで動作する。
【０３５５】
また，結晶構造により，その残基での突然変異によってタンパク質の活性が変更する可能性がある残基の同定も可能になる。このような残基としては，例えば，基質と相互作用する残基，保存された活性部位の残基，および三次の相互作用に関わる秩序二次構造の領域内にある残基が挙げられる。活性に作用する可能性が高い突然変異は，異なる分子関係によって異なる。活性に作用する活性部位での突然変異は，通常，電荷−電荷または水素結合相互作用を排除し，または立体的干渉をもたらす置換または欠失である。活性に作用する可能性が高い二次構造領域または分子相互作用領域での突然変異としては，例えば，領域の疎水性／親水性を変更するか，または活性部位付近もしくはその部位を含む領域に，活性部位の重要な残基が置き換わるのに十分な変形を導入する置換が挙げられる。このような置換および／もしくは欠失ならびに／または挿入は認識されるため，突然変異の予測される構造および／またはエネルギー効果は，従来のソフトウェアを使用して算出できる。
【０３５６】
ＸＩ．ホスホジエステラーゼ活性アッセイ
活性調節剤についてアッセイしおよび／または特定のホスホジエステラーゼもしくは群またはホスホジエステラーゼ群の調節剤の特異性を決定するために，ホスホジエステラーゼ活性についてのいくつかの異なるアッセイを利用できる。以下の実施例に記載されているアッセイの他，当業者ならば，利用できる他のアッセイを知っており，特定の用途に向けてアッセイを改変できる。例えば，使用できるアッセイはPDEに関する多数の研究論文に記載されている。例えば，有用なアッセイは，Fryburgら，米国特許公開2002/0165237,Thompsonら，米国特許公開2002/0009764,Pamukcuら，米国特許出願09/046,739,およびPamukcuら,米国特許6,500,610に記載されている。
【０３５７】
ＰＤＥ４Ｂに使用できるホスホジエステラーゼ活性についてのアッセイは，実施例に記載した手順を用い，精製されたＰＤＥ４Ｂを用いる以下の手順に従って実施できる。
【０３５８】
さらなる代替アッセイでは結合測定を使用できる。例えば，この種のアッセイは，蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）フォーマット，またはストレプトアビジンまたはリン特異的抗体と結合しているドナーおよびアクセプター試薬を変更することによるアルファスクリーン(ΑlphaScreen)（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法(amplified luminescent proximity homogeneous assay)）フォーマットの使用のいずれかにフォーマットできる。
【０３５９】
ＸＩＩ．有機合成技術
コンピュータベースの調節剤設計および同定の汎用性は，コンピュータプログラムによってスクリーニングされる構造の多様性にある。コンピュータプログラムにより，極めて多数の分子を含むデータベースを検索することができ，酵素とすでに複合体を形成している調節剤を多種多様な化学的官能基で修飾することができる。この化学的多様性の結果として，ホスホジエステラーゼ機能調節剤候補が予測できない化学形態をとり得る。これらの調節剤候補を構築するという課題に対応する技術分野では，多様な有機合成技術が存在する。これらの有機合成法の多くは当業者が利用する標準的な参照文献情報源に詳述されている。このような参照文献の一例に，１９９４年３月，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌがある。従って，有機化学合成の当業者ならば，コンピュータベースの方法で同定されたホスホジエステラーゼ機能の調節剤候補を合成するのに有用な技術を容易に利用することができる。
【０３６０】
ＸＩＩＩ．  異性体，プロドラッグ，および活性な代謝物
本発明の化合物は，本明細書中に一般式および特定の化合物として記載される。さらに，本発明の化合物は，多数の異なる形または誘導体として存在することができ，これらはすべて本発明の範囲内である。これらには，例えば，互変異性体，エナンチオマー，立体異性体，ラセミ混合物，位置異性体，塩，プロドラッグ（例えばカルボン酸エステル），溶媒和形，異なる結晶形または多型，および活性な代謝産物がある。
【０３６１】
Ａ．互変異性体，立体異性体，位置異性体，および溶媒和形
ある種の化合物は互変異性を示すかもしれないことが理解される。そのような場合，本明細書中の式の描画は可能な互変異性形の１つのみを明示的に示す。したがって，本発明の範囲内で，式は示される化合物の任意の互変異性の形を表すことを意図しており，単に式の描画により示される特定の互変異性形に限定されないことが理解されるべきである。
【０３６２】
同様に，本発明の化合物のあるものは，１またはそれ以上のキラル中心を含み，したがって，２またはそれ以上の立体異性体の形で存在しうる。すなわち，このような化合物は，単一の立体異性体（すなわち，本質的に他の立体異性体を含まない），ラセミ体，および／またはエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物として存在しうる。すべてのこのような単一の立体異性体，ラセミ体およびこれらの混合物は，本発明の範囲内に含まれることが意図される。特に記載しない限り，すべてのそのような立体異性形は本明細書に記載される式の範囲に含まれる。
【０３６３】
ある態様においては，本発明のキラル化合物は，少なくとも８０％（６０％エナンチオマー過剰（"ｅ．ｅ．"）またはジアステレオマー過剰（"ｄ．ｅ．"）），または少なくとも８５％（７０％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．），９０％（８０％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．），９５％（９０％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．），９７．５％（９５％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．），または９９％（９８％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）の単一のアイソマーを含む形である。当業者には一般に理解されるように，１つのキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は，本質的に２つの可能なエナンチオマーの１つからなるものであり（すなわち，エナンチオマー的に純粋），２以上のキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は，ジアステレオマー的に純粋でありかつエナンチオマー的に純粋であるものである。ある態様においては，化合物は光学的に純粋な形で存在する。
【０３６４】
その合成が二重結合，特に炭素−炭素二重結合に１つの基を付加することを含む化合物の場合，付加は，二重結合で結合した原子のいずれで生じてもよい。そのような化合物については，本発明はそのような位置異性体の両方を含む。
【０３６５】
さらに，式は，同定された構造の溶媒和した形ならびに溶媒和していない形をカバーすることを意図する。例えば，示される構造は水和された形および水和されていない形の両方を含む。溶媒和物の他の例には，イソプロパノール，エタノール，メタノール，ＤＭＳＯ，酢酸エチル，酢酸，またはエタノールアミンと組み合わせた構造が含まれる。
【０３６６】
Ｂ．プロドラッグおよび代謝物
本明細書に記載されている式および化合物に加えて，本発明はまた，プロドラッグ（一般的に薬学的に許容しうるプロドラッグ），活性な代謝誘導体（活性代謝物），およびそれらの薬学的に許容しうる塩も含む。
【０３６７】
この文脈において，プロドラッグとは，生理学的条件下でまたは加溶媒分解により変換されて，特定の化合物またはそのような化合物の薬学的に許容しうる塩となる化合物である。一般的な例は，カルボン酸のアルキルエステルである。
【０３６８】
Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈ．３１−３２（Ｅｄ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１）に記載されているように，プロドラッグは，概念的に２つの非排他的カテゴリー，すなわち，バイオ前駆体プロドラッグおよび担体プロドラッグに分けることができる。一般に，バイオ前駆体プロドラッグは，１またはそれ以上の保護基を含み，対応する活性な薬剤化合物と比較して不活性であるかまたは低い活性を有する化合物であり，代謝または加溶媒分解により活性形に変換される。活性な薬剤の形および放出された代謝産物は，許容しうるほど低い毒性しか有しないはずである。典型的には，活性薬剤化合物の形成には，以下のいずれかのタイプの代謝プロセスまたは反応が関与する。
【０３６９】
酸化反応，例えば，アルコール，カルボニル，および酸官能基の酸化，脂肪族炭素の水酸化，脂肪族環状炭素原子の水酸化，芳香族炭素原子の酸化，炭素−炭素二重結合の酸化，窒素含有官能基の酸化，ケイ素，リン，ヒ素およびイオウの酸化，酸化的Ｎ−脱アルキル化，酸化的Ｏ−およびＳ−脱アルキル化，酸化的脱アミノ化，ならびに他の酸化反応。
【０３７０】
還元反応，例えば，カルボニル基の還元，アルコール基および炭素−炭素二重結合の還元，窒素含有官能基の還元，および他の還元反応。
【０３７１】
酸化状態を変化させない反応，例えば，エステルおよびエーテルの加水分解，炭素−窒素単結合の加水分解性切断，非芳香族複素環の加水分解性切断，多重結合における水素化および脱水素，脱水素反応の結果として生ずる新規原子結合，加水分解性脱ハロゲン化，水素ハロゲン化物分子の除去，および他のそのような反応。
【０３７２】
担体プロドラッグは，例えば，取り込みおよび／または作用部位への局所デリバリーを改善する輸送成分を含む薬剤化合物である。そのような担体プロドラッグについては，好ましくは，薬剤成分と輸送成分との間の結合は共有結合であり，プロドラッグは不活性であるかまたは薬剤化合物より活性が低く，プロドラッグおよび放出される輸送成分は許容しうる程度に無毒性である。輸送成分が取り込みを促進することが意図されているプロドラッグについては，典型的には，輸送成分の放出は迅速であるべきである。別の場合には，遅延放出を与える成分，例えば，ある種のポリマーまたは他の成分，例えばシクロデキストリンを利用することが望ましい（例えば，Ｃｈｅｎｇら，米国特許公開２００４００７７５９５，出願番号１０／６５６，８３８（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。そのような担体プロドラッグはしばしば，経口的に投与される薬剤について有益である。担体プロドラッグは，例えば，以下の特性の１またはそれ以上を改善するために用いることができる：親油性の増加，薬理学的効果の持続の増加，部位特異性の増加，毒性および有害な反応の低下，および／または薬剤処方の改善（例えば，安定性，水溶性，望ましくない感覚刺激性または生理化学的特性の抑制）。例えば，親油性は，ヒドロキシル基を親油性カルボン酸で，またはカルボン酸基をアルコール，例えば脂肪族アルコールでエステル化することにより増加させることができる（Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈ．３１−３２，Ｅｄ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１）。
【０３７３】
プロドラッグは，単一の工程でプロドラッグ形から活性な形になってもよく，またはそれ自体活性を有するかまたは不活性である１またはそれ以上の中間体形を有してもよい。
【０３７４】
代謝産物，例えば，活性な代謝産物は，上述のプロドラッグ，例えばバイオ前駆体プロドラッグと重複する。すなわち，そのような代謝産物は，薬学的に活性な化合物であるか，またはさらに代謝されて，被験者または患者の身体中の代謝プロセスから生ずる誘導体である，薬学的に活性な化合物となる化合物である。これらのうち，活性な代謝産物はそのような薬学的に活性な誘導体化合物である。プロドラッグについては，プロドラッグ化合物は一般に不活性であるかまたは代謝産物より低い活性を有する。活性な代謝産物については，親化合物は活性な化合物であってもよく，不活性なプロドラッグであってもよい。
【０３７５】
プロドラッグおよび活性な代謝産物は，当該技術分野において知られる日常的な手法を用いて同定することができる。例えば，Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４０：２０１１−２０１６；Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８６：７５６−７５７；Ｂａｇｓｈａｗｅ，１９９５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｒｅｓ  ３４：２２０−２３０；Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈ．３１−３２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００１を参照。
【０３７６】
Ｃ．薬学的に許容しうる塩
化合物は，製薬上許容される塩として製剤することができるかまたはその形でありうる。製薬上許容される塩は，それらの投与量および投与濃度において無毒の塩である。このような塩を調製することで，化合物の生理学的作用を妨げることなく，その物理的特徴が変わり，薬理学的使用が容易になり得る。物理的性質の有用な変化としては，経粘膜投与を容易にするための融点の低下および，より高濃度の薬物の投与を容易にするための溶解度の上昇が挙げられる。
【０３７７】
製薬上許容される塩としては，酸付加塩（硫酸塩，塩化物，塩酸塩，フマル酸塩，マレイン酸塩，リン酸塩，スルファミン酸塩，酢酸塩，クエン塩，乳酸塩，酒石酸塩，メタンスルホン酸塩，エタンスルホン酸塩，ベンゼンスルホン酸塩，ｐ−トルエンスルホン酸塩，シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキナ酸塩を含むものなど）が挙げられる。製薬上許容される塩は，酸（塩酸，マレイン酸，硫酸，リン酸，スルファミン酸，酢酸，クエン酸，乳酸，酒石酸，マロン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，シクロヘキシルスルファミン酸，フマル酸およびキナ酸など）から得ることができる。
【０３７８】
また，製薬上許容される塩として，塩基性付加塩（酸性官能基（カルボン酸またはフェノールなど）が存在している場合にベンザチン，クロロプロカイン，コリン，ジエタノールアミン，エチレンジアミン，メグルミン，プロカイン，アルミニウム，カルシウム，リチウム，マグネシウム，カリウム，ナトリウム，アンモニウム，アルキルアミンおよび亜鉛を含むものなど）も含まれる。例えば，レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第１９版，マックパブリッシング社(Mack Publishing Co.)，ペンシルバニア州，イーストン第２巻，１４５７頁，１９９５参照。このような塩は，適した対応塩基を用いて調製することができる。
【０３７９】
製薬上許容される塩は，標準的な技術により調製することができる。例えば，遊離塩基形態の化合物を適した溶媒（適した酸を含む水溶液またはアルコール水溶液など）に溶かし，その後，溶液を蒸発させることにより単離する。もう１つの例では，遊離塩基と酸を有機溶媒中で反応させることにより塩を調製する。
【０３８０】
すなわち，例えば，特定の化合物が塩基である場合，所望の薬学的に許容しうる塩は，当該技術分野において利用可能な任意の適当な方法により製造することができる。例えば，遊離塩基を無機酸，例えば，塩酸，臭化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸等で，または有機酸，例えば，酢酸，マレイン酸，コハク酸，マンデル酸，フマル酸，マロン酸，ピルビン酸，シュウ酸，グリコール酸，サリチル酸，ピラノシド酸，例えば，グルクロン酸またはガラクチュロン酸，アルファ−ヒドロキシ酸，例えば，クエン酸または酒石酸，アミノ酸，例えば，アスパラギン酸またはグルタミン酸，芳香族酸，例えば，安息香酸または桂皮酸，スルホン酸，例えば，ｐ−トルエンスルホン酸またはエタンスルホン酸等で処理する。
【０３８１】
同様に，特定の化合物が酸である場合，所望の薬学的に許容しうる塩は，任意の適当な方法により，例えば，遊離酸を無機または有機塩基で，例えば，アミン（１級，２級または３級），アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物等で処理することにより製造することができる。適当な塩の例としては，グリシンおよびアルギニン等のアミノ酸，アンモニア，１級，２級および３級アミン，およびピペリジン，モルホリンおよびピペラジン等の環状アミンから誘導される有機塩，およびナトリウム，カルシウム，カリウム，マグネシウム，マンガン，鉄，銅，亜鉛，アルミニウムおよびリチウムから誘導される無機塩が挙げられる。
【０３８２】
異なる化合物の薬学的に許容しうる塩は複合体として存在していてもよい。複合体の例としては，８−クロロテオフィリン複合体（例えば，ジメンヒドリネート：ジフェンヒドラミン８−クロロテオフィリン（１：１）複合体；ドラマミンと類似）および種々のシクロデキストリン包摂複合体が挙げられる。
【０３８３】
特に記載しない限り，本明細書における化合物の特定は，そのような化合物の薬学的に許容しうる塩を含む。
【０３８４】
Ｄ．多型
固体である薬剤の場合には，化合物および塩が異なる結晶または多型で存在しうることは当業者には理解され，これらはすべて本発明および特定された式の範囲内であることが意図される。
【０３８５】
ＸＩＶ．投与
本方法および化合物は，一般にヒト患者に対する治療に使用することができるが，同様に，他の脊椎動物，例えば，他の霊長類，スポーツ用動物およびペット，例えば，ウマ，イヌおよびネコにおける類似または同一疾病を治療する目的でも使用することができる。
【０３８６】
適した投与形は，一部，使用または投与経路，例えば，経口経路，経皮経路，経粘膜経路，吸入または注射（非経口）による経路に応じて変わる。このような投与形によって化合物を標的細胞に到達させることが可能にならなくてはならない。他の因子については，当技術分野では周知であり，それらには，毒性や化合物または組成物の作用を遅延させる投与形などの考慮が含まれる。技術および製剤については，一般にRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, PA, 2005（参照により本明細書の一部とされる）に見られる。
【０３８７】
化合物は，製薬上許容される塩として製剤できる。製薬上許容される塩は，それらの投与量および投与濃度において無毒の塩である。このような塩を調製することで，化合物の生理学的作用を妨げることなく，その物理的特徴が変わり，薬理学的使用が容易になり得る。物理的性質の有用な変化としては，経粘膜投与を容易にするための融点の低下および，より高濃度の薬物の投与を容易にするための溶解度の上昇が挙げられる。
【０３８８】
製薬上許容される塩としては，酸付加塩（硫酸塩，塩化物，塩酸塩，フマル酸塩，マレイン酸塩，リン酸塩，スルファミン酸塩，酢酸塩，クエン塩，乳酸塩，酒石酸塩，メタンスルホン酸塩，エタンスルホン酸塩，ベンゼンスルホン酸塩，ｐ−トルエンスルホン酸塩，シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキナ酸塩を含むものなど）が挙げられる。製薬上許容される塩は，酸（塩酸，マレイン酸，硫酸，リン酸，スルファミン酸，酢酸，クエン酸，乳酸，酒石酸，マロン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，シクロヘキシルスルファミン酸，フマル酸およびキナ酸など）から得ることができる。
【０３８９】
また，製薬上許容される塩として，塩基性付加塩（酸性官能基（カルボン酸またはフェノールなど）が存在している場合にベンザチン，クロロプロカイン，コリン，ジエタノールアミン，エチレンジアミン，メグルミン，プロカイン，アルミニウム，カルシウム，リチウム，マグネシウム，カリウム，ナトリウム，アンモニウム，アルキルアミンおよび亜鉛を含むものなど）も含まれる。例えば，レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第１９版，マックパブリッシング社(Mack Publishing Co.)，ペンシルバニア州，イーストン第２巻，１４５７頁，１９９５参照。このような塩は，適した対応塩基を用いて調製することができる。
【０３９０】
製薬上許容される塩は，標準的な技術により調製することができる。例えば，遊離塩基形態の化合物を適した溶媒（適した酸を含む水溶液またはアルコール水溶液など）に溶かし，その後，溶液を蒸発させることにより単離する。もう１つの例では，遊離塩基と酸を有機溶媒中で反応させることにより塩を調製する。
【０３９１】
異なる化合物の製薬上許容される塩が複合体として存在していてもよい。複合体の例としては，８−クロロテオフィリン複合体（例えば，ジメンヒドリナート：ジフェンヒドラミン  ８−クロロテオフィリン（１：１）複合体；ドラマミン(Dramamine)に類似）および種々のシクロデキストリン包接化合物が挙げられる。
【０３９２】
組成物を製造するために担体または賦形剤を使用することができる。担体または賦形剤は，化合物の投与を容易にするように選択する。担体の例としては炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖（ラクトース，グルコースまたはスクロースなど）またはデンプンタイプ，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油，ポリエチレングリコールおよび生理的に適合する溶媒が挙げられる。生理的に適合する溶媒の例としては，注射用蒸留水（ＷＦＩ）の滅菌溶液，生理食塩水およびデキストロースが挙げられる。
【０３９３】
化合物は，静脈内，腹腔内，皮下，筋肉内，経口，経粘膜，直腸，吸入または経皮をはじめ，種々の経路によって投与することができる。経口投与用には，例えば，化合物をカプセル剤，錠剤および液体製剤（シロップ剤，エリキシル剤および濃縮ドロップ剤など）のような従来の経口投与形に製剤することができる。
【０３９４】
経口用医薬製剤は，例えば，活性化合物を固体賦形剤と合わせ，得られた混合物を場合によって粉砕し，必要に応じて，錠剤または糖衣錠コアを得るために適した補助剤を加えた後，その顆粒混合物を加工することにより得ることができる。適した賦形剤としては，特に，糖類（ラクトース，スクロース，マンニトールまたはソルビトールを含む）；セルロース調製物（例えば，トウモロコシデンプン，コムギデンプン，コメデンプン，ジャガイモデンプン，ゼラチン，トラガカントガム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）），および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）のような増量剤がある。必要に応じて，架橋ポリビニルピロリドン，寒天またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）のような崩壊剤を添加してよい。
【０３９５】
糖衣錠コアには適したコーティングを施す。このために，濃縮糖溶液を使用でき，濃縮糖溶液には，例えば，アラビアガム，タルク，ポリ−ビニルピロリドン，カルボポール(carbopol)ゲル，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，ならびに適した有機溶媒または溶媒混合物を場合によって含めてもよい。確認用または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために，錠剤または糖衣錠コーティング剤に染料または色素を添加してよい。
【０３９６】
経口使用可能な医薬製剤としては，ゼラチンからできた押し込み型カプセル剤（「ゲルキャップ」），ならびにゼラチンと可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）からできた密閉ソフトカプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤には，有効成分が，増量剤（ラクトースなど），結合剤（デンプンなど）および／または滑沢剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど），さらに，場合によって安定剤と混合した状態で含まれる。ソフトカプセル剤では，活性化合物が適した液体（脂肪油，流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）に溶解または懸濁してもよい。さらに，安定剤を添加してもよい。
【０３９７】
また，注射（非経口投与）（例えば，筋肉内，静脈内，腹腔内および／または皮下）を用いてもよい。注射用には，本発明の化合物を滅菌溶液，好ましくは生理的に適合するバッファーまたは溶液（生理食塩水，ハンクス溶液またはリンガー溶液など）中に製剤する。さらに，化合物を固体形態に製剤し，それを使用直前に再溶解しまたは懸濁してもよい。凍結乾燥形態もまた製造することができる。
【０３９８】
経粘膜または経皮手段による投与もまたあり得る。経粘膜または経皮投与用には，バリアに浸透させるのに適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は，当技術分野では一般に知られており，それらとしては，例えば，経粘膜投与には，胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに，浸透しやすくするために界面活性剤を使用してよい。経粘膜投与は，例えば，鼻腔用スプレーまたは坐剤（直腸または膣）によって行ってよい。
【０３９９】
吸入用には，本発明の化合物を乾燥粉体または適当な溶液，懸濁液，またはエアロゾルとして製剤することができる。粉体および溶液は，当該技術分野において知られる適当な添加物とともに製剤することができる。例えば，粉体は，適当な粉体ベース，例えば，ラクトースまたはスターチを含むことができ，溶液は，プロピレングリコール，滅菌水，エタノール，塩化ナトリウムおよび他の添加物，例えば，酸，アルカリおよびバッファ塩を含むことができる。そのような溶液または懸濁液は，スプレー，ポンプ，アトマイザー，またはネブライザなどを用いて吸入により投与することができる。本発明の化合物はまた，他の吸入療法，例えば，プロピオン酸フルチカゾン，ジプロピオン酸ベクロメタゾン，トリアムシノロン・アセトニド，ブデソニド，およびフロ酸モメタゾン等のコルチコステロイド；アルブテロール，サルメテロールおよびホルモテロール等のベータアゴニスト；臭化イプラトロプリウムまたはチオトロピウム等の抗コリン剤；トレプロスチナールおよびイロプロスト等の血管拡張剤；ＤＮＡａｓｅ等の酵素；治療用タンパク質；イムノグロブリン抗体；一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド；トブラマイシン等の抗生物質；ムスカリンレセプターアンタゴニスト；ロイコトリエンアンタゴニスト；サイトカインアンタゴニスト；プロテアーゼ阻害剤；クロモリンナトリウム；ネドクリルナトリウム；およびナトリウムクロモグリケートとともに用いてもよい。
【０４００】
任意の投与経路用に組み合わせた使用には，本発明の化合物と，同じ投与経路でデリバリーされる１またはそれ以上の他の治療剤，および任意の製剤，例えば，投与されたときにその治療活性を維持するように２つの化合物が化学的に結合している製剤とを一緒にデリバリーすることも含まれることが理解される。組み合わせ使用には，共製剤または化学的に結合した化合物の製剤を投与すること，または，化合物を別々の製剤として投与することが含まれる。別々の製剤は，１つのデバイスから，例えば同じ吸入デバイス，同じシリンジなどによりデリバリーすることによって一緒に投与してもよく，別々のデバイスから一緒に投与してもよく，この場合，一緒に投与するとは，互いに短時間の間に投与されることを意味する。本発明の化合物と，同じ経路でデリバリーされる１またはそれ以上の追加の治療剤との共製剤には，１つのデバイスにより投与することができるように材料を一緒にした調製物が含まれ，これは例えば，１つの製剤中に組み合わせられた別々の化合物，または化学的に結合しているがなおそれらの生物学的活性を維持するように修飾されている化合物を含む。そのような化学的に結合させた化合物は，インビボで実質的に維持される結合を有していてもよく，または結合がインビボで切断されて２つの活性な成分が分離してもよい。
【０４０１】
投与すべき種々の化合物の量は，標準的な手順により化合物ＩＣ５０，化合物の生物学的半減期，被験者の年齢，背格好および体重，ならびに被験者の関連疾患などの因子を考慮して決定することができる。これらの重要性およびその他の因子については，当業者には周知である。一般に，用量は治療される被験者のｋｇ当たり約０．０１〜５０ｍｇ間，好ましくは０．１〜２０ｍｇ間である。複数回投与を用いてよい。
【０４０２】
ＸＶ．ＰＤＥ４Ｂの操作
ヒトをはじめとする種々の哺乳類由来のＰＤＥ４Ｂの全長コード配列およびアミノ酸配列が分かっているため，組換えＰＤＥ４Ｂのクローニング，構築，組換えタンパク質の生産および精製，ＰＤＥ４Ｂの他の生物への導入，ならびにＰＤＥ４Ｂのその他の分子生物学的操作は容易に行われる。
【０４０３】
核酸操作，例えば，サブクローニング，プローブ標識（例えば，クレノウポリメラーゼ，ニックトランスレーション，増幅を用いるランダム−プライマー標識），配列決定，ハイブリダイゼーションなどのための技術については，科学文献や特許文献（例えば，サムブロック(Sambrook)編，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）第１〜３巻，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory)，（１９８９）；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，オーズベル編，ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York)（１９９７）；ラボラトリー・テクニークス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー：ハイブリダイゼーション・ウィズ・ヌクレイック・アシッド・プローブズ，パートＩ。セオリー・アンド・ヌクレイック・アシッド・プレパレーション，ティーセン編，エルゼビア，ニューヨーク(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y.)（１９９３）参照）において詳細に開示されている。
【０４０４】
核酸配列は，ＰＣＲ，等温法，ローリングサークル法などのような増幅法を用いて，さらなる使用のために必要に応じて増幅することができ，それらの方法は当業者ならば周知である。例えば，サイキ，ＰＣＲプロトコール中の「ゲノムＤＮＡの増幅」，イニス編，アカデミック・プレス，カリフォルニア州，サンディエゴ(Saiki, "Amplification of Genomic DNA" in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA)１９９０，１３〜２０頁；ワラム(Wharam)ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research)。２００１年６月１日，２９（１１）：Ｅ５４−Ｅ５４；ハフナー(Hafner)ら，バイオテクニークス(Biotechniques)２００１年４月；３０（４）：８５２〜６頁，８５８頁，８６０頁各所；チョン(Zhong)ら，バイオテクニークス２００１年４月；３０（４）：８５２〜６頁，８５８頁，８６０頁各所参照。
【０４０５】
核酸，ベクター，キャプシッド，ポリペプチドなどは，当業者ならば周知の，多数ある一般的手段のいずれかによって解析し，定量することができる。これらの手段としては，例えば，分析生化学的方法（ＮＭＲ，分光測光法，Ｘ線撮影法，電気泳動，キャピラリー電気泳動，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ），薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびハイパーディフュージョンクロマトグラフィー(hyperdiffusionchromatography)など），種々の免疫学的方法（例えば，液体またはゲル沈降反応，免疫拡散法，免疫電気泳動，放射性免疫測定法（ＲＩＡ），酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ），免疫蛍光測定法），サザン解析，ノーザン解析，ドットブロット解析，ゲル電気泳動（例えば，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），核酸もしくは標的またはシグナル増幅法，放射性標識法，シンチレーション計測およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０４０６】
本発明の方法の実施に使用される核酸の準備および操作は，ゲノムサンプルからクローニングし，必要に応じて，例えば，ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンから単離または増幅したインサートをスクリーニングし，再クローニングすることにより行うことができる。本発明の方法に使用される核酸の供給源としては，例えば，哺乳類人工染色体（ＭＡＣ），例えば，米国特許第５，７２１，１１８号；同６，０２５，１５５号参照；ヒト人工染色体，例えば，ローゼンフェルド(Rosenfeld)（１９９７）ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)１５：３３３〜３３５頁参照；酵母人工染色体（ＹＡＣ）；細菌人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体，例えば，ウーン(Woon)（１９９８）ゲノミクス(Genomics)５０：３０６〜３１６頁参照；Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ），例えば，カーン(Kern)（１９９７）バイオテクニークス２３：１２０〜１２４頁参照；コスミド，組換えウイルス，ファージまたはプラスミドに含まれるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
【０４０７】
本発明の核酸は，プロモーターに機能しうる形で連結され得る。プロモーターは，核酸の転写を命令する核酸制御配列の一モチーフまたはアレイであり得る。プロモーターは，転写開始部位付近に必須核酸配列（例えば，ポリメラーゼII系プロモーターの場合には，ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターはまた，場合によって，転写開始部位から数千塩基対ほどのところに存在し得る遠位エンハンサーまたはレプレッサーエレメントも含む。「構成的」プロモーターとは，大抵の環境および発生条件下で機能するプロモーターである。「誘導」プロモーターとは，環境または発生調節下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターとは，ある生物の特定の組織タイプでは機能するが，同じ生物のそれ以外の組織タイプでは機能しないプロモーターである。「機能しうる形で連結される」とは，核酸発現制御配列（プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど）と第２核酸配列との機能的連結（この連結により，発現制御配列が第２配列に対応する核酸の転写を命令する）を意味する用語である。
【０４０８】
本発明の核酸はまた，発現ベクターおよびクローニング媒体（例えば，本発明のポリペプチドをコードする配列）にも提供され得る。本発明の発現ベクターおよびクローニング媒体には，ウイルス粒子，バキュロウイルス，ファージ，プラスミド，ファージミド，コスミド，フォスミド，細菌人工染色体，ウイルスＤＮＡ（例えば，ワクシニア，アデノウイルス，ファウルポックスウイルス(foul pox virus)，仮性狂犬病およびＳＶ４０誘導体），Ｐ１由来人工染色体，酵母プラスミド，酵母人工染色体および特定の目的宿主に特異的な他のベクター（バチルス属(Bacillus)，アスペルギルス属(Aspergillus)および酵母など）が含まれる。本発明のベクターには，染色体，非染色体および合成ＤＮＡ配列が含まれる。数多くの適したベクターが，当業者には公知であり，市販されている。
【０４０９】
本発明の核酸を，必要に応じて，通常の分子生物学的方法を用いて種々のベクターのいずれかにクローニングすることができる；増幅した核酸をインビトロでクローニングする方法については，例えば，米国特許第５，４２６，０３９号に開示されている。増幅した配列のクローニングを容易にするために，制限酵素部位をＰＣＲプライマー対に「組み込む」ことができる。科学文献や特許文献において詳細に記載されている種々の従来の技術によって，ベクターをゲノムに導入するかまたは細胞の細胞質または核に導入し，発現させてもよい。例えば，ロバーツ(Roberts)（１９８７）ネイチャー(Nature)３２８：７３１頁；シュネイダー(Schneider)（１９９５）プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション(Protein Expression and Purification)６４３５：１０；サムブロック(Sambrook)，ティーセンまたはオーズベル参照。ベクターは自然源から単離することができるし，ＡＴＣＣもしくはＧｅｎＢａｎｋライブラリーのような供給元から入手することができるし，または合成または組換え法により調製することもできる。例えば，本発明の核酸は，細胞で安定してまたは一時的に発現される発現カセット，ベクターまたはウイルス（例えば，エピソーム発現系）で発現させることができる。発現カセットおよびベクターに選択マーカーを組み込んで，形質転換細胞および配列に選択可能な表現型を与えることができる。例えば，宿主ゲノムへ組み込む必要がないように，選択マーカーがエピソームでの保持および複製のためにコードするものであってよい。
【０４１０】
本発明のペプチドまたはポリペプチドのインシトゥー発現のために，核酸をインビボで投与することができる。核酸は，「裸のＤＮＡ」として（例えば，米国特許第５，５８０，８５９号参照）投与することができるし，または発現ベクター（例えば，組換えウイルス）の形で投与することもできる。核酸は下記のように，腫瘍周辺または腫瘍内を含む任意の経路によって投与することができる。インビボで投与されるベクターは，組換えにより改変したエンベロープまたは非エンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルス（好ましくはバキュロウイルス科(baculoviridiae)，パルボウイルス科(parvoviridiae)，ピコルノウイルス科(picornoviridiae)，ヘルペスウイルス科(herpesveridiae)，ポックスウイルス科(poxviridae)，アデノウイルス科(adenoviridiae)，またはピコルナウイルス科(picornnaviridiae)から選択される）を含むウイルスゲノム由来のものであってよい。親ベクターの性質それぞれの有利な長所を生かしたキメラベクターもまた使用してよい（例えば，フェン(Feng)（１９９７）ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)１５：８６６〜８７０頁参照）。このようなウイルスゲノムは，組換えＤＮＡ技術により，本発明の核酸を含むように改変することができ，複製欠損性であるか，条件付きで複製するかまたは複製能を有するようにさらに操作することができる。別の態様では，ベクターがアデノウイルスゲノム（例えば，ヒトアデノウイルスゲノム由来の複製能のないベクター，例えば，米国特許第６，０９６，７１８号；同６，１１０，４５８号；同６，１１３，９１３号；同５，６３１，２３６号参照）；アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノム由来のものである。レトロウイルスベクターとしては，ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ），ギボンザル(gibbon ape)白血病ウイルス（ＧａＬＶ），サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ），ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ），およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる。例えば，米国特許第６，１１７，６８１号；同６，１０７，４７８号；同５，６５８，７７５号；同５，４４９，６１４号；ブッシュシェール(Buchscher)（１９９２）ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Journal of Virology)６６：２７３１〜２７３９頁；ヨハン(Johann)（１９９２）ジャーナル・オブ・ヴィロロジー６６：１６３５〜１６４０頁）参照。例えば，核酸およびペプチドのインビトロ生産において，ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法において，標的核酸を細胞に形質導入するために，アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクターを使用することができる，例えば，米国特許第６，１１０，４５６号；同５，４７４，９３５号；オカダ(Okada)（１９９６）ジーン・セラピー(Gene Therapy)３：９５７〜９６４頁参照。
【０４１１】
本発明はまた，融合タンパク質，ならびにそれらをコードする核酸にも関する。本発明のポリペプチドは，異種ペプチドまたはポリペプチド（安定性の上昇または精製の簡易化などの所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチドなど）と融合することができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドを合成し，例えば，より免疫原性の高いペプチドを生産する目的で，組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離するために，抗体および抗体を発現しているＢ細胞を同定および単離するために，など，それに連結される１以上のさらなるドメインとの融合タンパク質として発現させることもできる。検出および精製を容易にするドメインとしては，例えば，固定化金属上での精製を可能にするポリヒスチジントラクトおよびヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド，固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン，ならびにＦＬＡＧＳ  エクステンション／アフィニティー精製システム（イムネックス社(ImmunexCorp)，ワシントン州，シアトル）で利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインとモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドとの間に，切断可能なリンカー配列（第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ（インビトロゲン(Invitrogen)，カリフォルニア州，サンディエゴ）など）を含めることにより精製が容易になる。例えば，発現ベクターには，６個のヒスチジン残基と連結されたエピトープをコードする核酸配列，それに続いてチオレドキシンとエンテロキナーゼ切断部位が含まれる（例えば，ウィリアムス(Williams)（１９９５）バイオケミストリー３４：１７８７〜１７９７頁；ドベリ(Dobeli)（１９９８）プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション(Protein Expression and Purification)１２：４０４〜４１４頁参照）。ヒスチジン残基により検出および精製を容易にする一方で，エンテロキナーゼ切断部位により融合タンパク質の残留物からエピトープを精製するための手段を提供する。一態様では，本発明のポリペプチドをコードする核酸が，翻訳されたポリペプチドまたはその断片の分泌を命令することが可能なリーダー配列により適切な段階で構成される。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の適用に関する技術については，科学文献や特許文献（例えば，クロール(Kroll)（１９９３）  ＤＮＡ・アンド・セル・バイオロジー（DNA and Cell Biology)１２：４４１〜５３頁参照）において詳細に開示されている。
【０４１２】
本発明の核酸およびポリペプチドは，例えば，スクリーニングおよび診断法に用いるために固相支持体に結合することができる。固相支持体としては，例えば，メンブレン（例えば，ニトロセルロースまたはナイロン），マイクロタイターディッシュ（例えば，ＰＶＣ，ポリプロピレンまたはポリスチレン），試験管（ガラスまたはプラスチック），ディップスティック（例えば，ガラス，ＰＶＣ，ポリプロピレン，ポリスチレン，ラテックスなど），微量遠心管，またはガラス，シリカ，プラスチック，金属もしくはポリマービーズ，あるいは他の支持体（紙など）が挙げられる。一固相支持体には，ペプチドに対して操作したヒスチジンタグに対する特異性によって結合する金属（例えば，コバルトまたはニッケル）含有カラムを使用する。
【０４１３】
固相支持体への分子の結合は，直接（すなわち，分子が固相支持体と接する）でもよいし，または間接（「リンカー」が支持体に結合されており，このリンカーと目的の分子が結合する）的でもよい。分子は，共有結合により（例えば，システイン残基の単一反応性チオール基を利用（例えば，コリウオド(Colliuod)（１９９３）バイオコンジュゲート・ケミストリー(BioconjugateChemistry)４：５２８〜５３６頁参照））または非共有結合により，具体的に言えば，例えば，固定化抗体（例えば，シューマン(Schuhmann)（１９９１）  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  ３：  ３８８〜３９１頁；ルー(Lu)（１９９５）アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)６７：８３〜８７頁参照；ビオチン／ストレプトアビジン系（例えば，イワネ(Iwane)（１９９７）バイオフィジオロジー・アンド・バイオケミストリー・リサーチ・コミュニケーションズ(Biophysiology. Biochemistry Research Communications)２３０：７６〜８０頁を参照）；金属キレート化，例えば，Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム（例えば，Ｎｇ  （１９９５）ラングミュア(Langmuir)１１：４０４８〜５５頁を参照）；ポリヒスチジン融合物の結合用，金属キレート化自己組織化単分子膜（例えば，シーガル(Sigal)（１９９６）アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)６８：４９０〜４９７頁参照）を介して，固定化することができる。
【０４１４】
間接結合は，市販されている種々のリンカーを用いて得ることができる。反応性末端は，種々の官能基のいずれかであり，それらとしては，それだけには限らないが：アミノ反応末端（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル，イミドエステル，アルデヒド，エポキシド，ハロゲン化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネートおよびハロゲン化ニトロアリールなど）；およびチオール反応末端（二硫化ピリジル，マレイミド，チオフタルイミドおよび活性ハロゲンなど）が挙げられる。ヘテロ二官能性架橋剤は，２つの異なる反応性末端（例えば，アミノ反応性末端とチオール反応性末端）を有するものであり，一方，ホモ二官能性試薬は，２つの同じ反応性末端（例えば，スルフヒドリル含有化合物の架橋を可能にするビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ））を有するものである。スペーサーは，さまざまな長さであってよく，脂肪族でも芳香族でもよい。市販のホモ二官能性架橋剤の例としては，それだけには限らないが，ジメチルアジポイミデート二塩酸塩（ＤＭＡ）；ジメチルピメリミデート二塩酸塩（ＤＭＰ）；およびジメチルスベリミデート二塩酸塩（ＤＭＳ）などのイミドエステルが挙げられる。ヘテロ二官能性試薬としては，市販の活性ハロゲン−ＮＨＳ活性エステルカップリング剤（Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテートおよびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＬＡＢ）など）およびスルホスクシンイミジル誘導体（スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）（ピアス(Pierce)）など）が挙げられる。別のカップリング剤がＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（ピアス・ケミカルズ(Pierce Chemicals)，イリノイ州，ロックフォード）のようなチオール開裂可能なヘテロ二官能性薬剤である。
【０４１５】
また，本発明のポリペプチドおよびペプチドを固相支持体に結合するために抗体を使用することもできる。これはペプチド特異的抗体をカラムに結合することによって直接行われるか，または例えば，既知エピトープ（例えば，タグ（例えば，ＦＬＡＧ，ｍｙｃ）または適した免疫グロブリン定常領域配列（「イムノアドヘシン」，例えば，カポン(Capon)（１９８９）ネイチャー３７７：５２５〜５３１頁（１９８９）参照）に結合された，モチーフを有するペプチドを含むように融合タンパク質キメラを作製することによっても行われる。
【０４１６】
本発明の核酸またはポリペプチドをアレイに固定化するか，または塗布してもよい。組成物（例えば，小分子，抗体，核酸など）のライブラリーを本発明の核酸またはポリペプチドの活性と結合し，またはそれを調整するそれらの能力についてスクリーニングし，またはモニタリングするために，アレイを使用することができる。例えば，本発明の一態様では，モニタリングパラメーターが本発明の核酸を含む遺伝子の転写物発現である。アレイまたは「バイオチップ」上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによる，細胞の転写物，または細胞の転写物を代表するか，もしくは細胞の転写物と相補的である核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションにより，細胞の１以上または全ての転写物を測定することができる。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を用いることによって，細胞の転写物の一部または全てを同時に定量することができる。また，ゲノム核酸を含むアレイを用いて，本発明の方法によって作製した新たな操作株の遺伝子型を決定することもできる。また，ポリペプチドアレイを用いて，複数のタンパク質を同時に定量することもできる。
【０４１７】
本明細書において「アレイ」または「マイクロアレイ」または「バイオチップ」または「チップ」とは，複数の標的エレメントであり，各標的エレメントが，支持体表面の規定範囲に固定化された，規定量の１以上のポリペプチド（抗体を含む）または核酸を含んでいる。本発明の方法の実施において，既知アレイならびに／またはアレイの作製および使用の方法全て，またはそれらの変形を，例えば，米国特許第６，２７７，６２８号；同６，２７７，４８９号；同６，２６１，７７６号；同６，２５８，６０６号；同６，０５４，２７０号；同６，０４８，６９５号；同６，０４５，９９６号；同６，０２２，９６３号；同６，０１３，４４０号；同５，９６５，４５２号；同５，９５９，０９８号；同５，８５６，１７４号；同５，８３０，６４５号；同５，７７０，４５６号；同５，６３２，９５７号；同５，５５６，７５２号；同５，１４３，８５４号；同５，８０７，５２２号；同５，８００，９９２号；同５，７４４，３０５号；同５，７００，６３７号；同５，５５６，７５２号；同５，４３４，０４９号に開示されているように，全部または一部において組み込むことができる；例えば，ＷＯ９９／５１７７３；ＷＯ９９／０９２１７；ＷＯ９７／４６３１３；ＷＯ９６／１７９５８も参照；例えば，ジョンストン(Johnston)（１９９８）カレント・バイオロジー(Current Biology)８：Ｒ１７１〜Ｒ１７４頁；シューマー(Schummer)（１９９７）バイオテクニークス２３：１０８７〜１０９２頁；カーン(Kern)（１９９７）バイオテクニークス２３：１２０〜１２４頁；ソリナス−トルド(Solinas-Toldo)（１９９７）ジーンズ・クロモソームス・アンド・キャンサー(Genes,Chromosomes& Cancer)２０：３９９〜４０７頁；ボウテル（Bowtell）（１９９９）ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)付録２１：２５〜３２頁も参照。公開されている米国特許出願番号２００１００１８６４２；同２００１００１９８２７；同２００１００１６３２２；同２００１００１４４４９；同２００１００１４４４８；同２００１００１２５３７；同２００１０００８７６５も参照。
【０４１８】
宿主細胞および形質転換細胞
本発明はまた，本発明の核酸配列，例えば，本発明のポリペプチドをコードする配列または本発明のベクターを含む形質転換細胞も提供する。宿主細胞は，当業者ならばよく知っている，原核細胞，真核細胞（細菌細胞，真菌細胞，酵母細胞，哺乳類細胞，昆虫細胞または植物細胞など）を含む宿主細胞のいずれかであり得る。典型的な細菌細胞としては，大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ），放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ），ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属内のさまざまな種が挙げられる。典型的な昆虫細胞としては，ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９が挙げられる。典型的な動物細胞としては，ＣＨＯ，ＣＯＳもしくはボーズ(Bowes)黒色腫またはマウスもしくはヒト細胞系が挙げられる。適切な宿主の選択は，当業者の能力の範囲内である。
【０４１９】
ベクターは，種々の技術のいずれかを用いて宿主細胞に導入でき，それらの技術には，形質転換，トランスフェクション，形質導入，ウイルス感染，遺伝子銃またはＴｉ媒介性遺伝子導入が含まれる。具体的な方法として，リン酸カルシウムトランスフェクション，ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション，リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる。
【０４２０】
操作した宿主細胞は，プロモーターを活性化し，形質転換体を選択し，または本発明の遺伝子を増幅する必要に応じて改変した従来の培養液で培養することができる。適した宿主株を形質転換し，宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後，適切な手段（例えば，温度シフトまたは化学的誘導）によって選択したプロモーターを誘導でき，細胞に所望のポリペプチドまたはその断片を生産させるために，それらをさらなる期間培養できる。
【０４２１】
細胞は，遠心分離により回収し，物理的または化学的手段により破砕することができ，得られた未精製の抽出物をさらなる精製用に確保しておく。タンパク質の発現に使用した微生物細胞は，任意の便宜な方法によって破砕することができ，その方法としては，凍結融解サイクリング，音波処理，機械的破砕または細胞溶解剤の使用が挙げられる。このような方法については，当業者ならば周知である。発現したポリペプチドまたは断片は，回収し，組換え細胞培養物から，硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿，酸抽出，陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー，ホスホセルロースクロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする方法によって精製することができる。必要に応じて，ポリペプチド構造を完成させる際に，タンパク質リフォールディング段階を用いることができる。必要に応じて，最終精製段階で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。
【０４２２】
組換えタンパク質を発現させるために，種々の哺乳類細胞培養系も使用することができる。哺乳類発現系の例としては，サル腎臓繊維芽細胞ＣＯＳ−７系および適合ベクター由来のタンパク質を発現することが可能な他の細胞系（Ｃ１２７，３Ｔ３，ＣＨＯ，ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系など）が挙げられる。
【０４２３】
宿主細胞による構築物を従来どおりに使用して，組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産することができる。組換え生産方法において使用する宿主によって，ベクターを含む宿主細胞によって生産されるポリペプチドは，グリコシル化されていてもよく，グリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた，開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいても含まなくてもよい。
【０４２４】
また，本発明のポリペプチドを生産するために，無細胞翻訳系を使用することもできる。無細胞翻訳系は，ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸に機能しうる形で連結されたプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用する。いくつかの態様では，インビトロ転写反応を行う前にＤＮＡ構築物を線状化する。次いで，転写されたｍＲＮＡを適した無細胞翻訳抽出物（ウサギ網状赤血球抽出物など）とともにインキュベートして，所望のポリペプチドまたはその断片を生産する。
【０４２５】
発現ベクターには，形質転換宿主細胞選択用の表現型形質を提供するために１以上の選択マーカー遺伝子を含めることができる。（真核細胞培養物にはジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性など，または大腸菌においてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性など）。
【０４２６】
哺乳類細胞における一時的発現では，目的のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを，哺乳類発現ベクター，例えば，インビトロゲン社(InvitrogenCorporation)（米国，カリフォルニア州，サンディエゴ；カタログ番号Ｖ４９０−２０）から市販されているｐｃＤＮＡ１に組み込むことができる。このベクターは，真核細胞系でのｃＤＮＡ発現用および原核生物におけるｃＤＮＡ解析用に設計された４．２ｋｂの多機能プラスミドベクターであり，ベクターには，ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー，スプライスセグメントおよびポリアデニル化シグナル，ＳＶ４０およびポリオーマウイルス複製起点，ならびに配列決定および突然変異誘発のために一本鎖ＤＮＡをレスキューするＭ１３複製起点，センスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の生産のためのＳｐ６およびＴ７  ＲＮＡプロモーターおよびＣｏｌ  Ｅ１様高コピープラスミド複製起点が組み込まれている。ポリリンカーは，ＣＭＶプロモーターの下流（およびＴ７プロモーターの３’）に適切に配置されている。
【０４２７】
まず，ｐｃＤＮＡＩポリリンカーの適切な制限部位に組み込まれた上記ファージミドからｃＤＮＡインサートを外す。ジャンクションから配列決定を実施して，ｐｃＤＮＡＩにおける正確な挿入方向を確認する。次いで，得られたプラスミドを，一時的発現のために，選択した哺乳類細胞宿主，例えば，サル由来の，繊維芽細胞様ＣＯＳ−１系統細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，メリーランド州，ロックビルよりＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０として入手可能）に導入する。
【０４２８】
タンパク質をコードするＤＮＡの一時的発現では，例えば，サムブロックら，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル１９８９，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー・ニューヨーク１６．３０〜１６．３７によって記載されている手法に従って，ＤＥＡＥ媒介性ＤＮＡトランスフェクションによりＣＯＳ−１細胞を１０６  ＣＯＳ細胞当たり約８μｇ  ＤＮＡでトランスフェクトし，クロロキンで処理する。典型的な方法は以下のとおりである。簡潔には，ＣＯＳ−１細胞を密度５×１０６細胞／ディッシュにてプレーティングし，その後，ＦＢＳ補給ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間増殖させる。次いで，培地を除去し，細胞をＰＢＳ，続いて，培地で洗浄する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中にＤＥＡＥデキストラン（０．４ｍｇ／ｍｌ），１００μＭクロロキン，１０％ＮｕＳｅｒｕｍ，ＤＮＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含むトランスフェクション溶液を細胞に１０ｍｌ量適用する。３７℃にて３時間のインキュベーション後，上記のように細胞をＰＢＳと培地で洗浄し，その後，１０％ＤＭＳＯのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１分間ショックを与える。細胞を１０％ＦＢＳ補給培地で２〜３日間増殖させ，インキュベーション終了時にディッシュを氷上に置き，氷冷ＰＢＳで洗浄した後，細胞を掻きとって取り出す。次いで，細胞を１０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により回収し，タンパク質発現にその後使用するために細胞ペレットを液体窒素で凍結する。凍結細胞の一定分量の融解物のノーザンブロット解析により，保存下の細胞における受容体コードｃＤＮＡの発現を確認する。
【０４２９】
同様に，安定したトランスフェクト細胞系も，例えば，宿主として２つの異なる細胞種：ＣＨＯ  Ｋ１およびＣＨＯ  Ｐｒｏ５を使用して調製することができる。これらの細胞系を構築するために，関連タンパク質についてコードするｃＤＮＡを，安定した発現が可能な哺乳類発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロゲン(Invitrogen)）に組み込むことができる。この部位への挿入ではｃＤＮＡがサイトメガロウイルスプロモーターの発現制御下，ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化部位とターミネーターの上流，選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０初期プロモーターにより制御される）を含むベクターバックグラウンド内に置かれる。
【０４３０】
上記のように構築したプラスミドを導入するための典型的なプロトコールは，以下のとおりである。まず，宿主ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳ補給ＭＥＭ培地に密度５×１０５にて播種する。２４時間増殖させた後，プレートに新鮮培地を追加し，３時間後，リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法（サムブロックら，前掲）により細胞をトランスフェクトする。簡潔には，ＤＮＡ  ３μｇを混合し，カルシウム緩衝液とともに室温にて１０分間インキュベートする。同量のリン酸緩衝液を加え，懸濁液を室温にて１５分間インキュベートする。次ぎに，インキュベートした懸濁液を細胞に４時間適用し，除去し，１５％グリセロール含有培地で細胞にショックを与える。３分後，細胞を培地で洗浄し，通常の増殖条件において２４時間インキュベートする。Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）含有１０％ＦＢＳ補給α−ＭＥＭ培地でネオマイシンに耐性を示す細胞を選択する。約２〜３週間後，Ｇ４１８耐性細胞のコロニーをそれぞれ単離し，クローン選抜した後，アッセイ用に増殖させる。
【実施例】
【０４３１】
本発明に関連する多数の実施例を以下に記載する。ほとんどの場合，代替の手法も用いることができる。実施例は例示を意図するものであり，本発明の範囲を制限または限定するものではない。
【０４３２】
実施例１：式Ｉａの化合物の合成
スキーム−１
【化３２】
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工程１−式ＩＩＩの合成
式ＩＩＩの化合物は，市販の化合物ＩＩから，塩基，例えば，トリエチルアミン，ピリジン，水性水酸化物等の存在下で，極性溶媒，例えば，ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または水の存在下で，脱離基，例えば，クロロ，トシル等を含む試薬と反応させることにより製造することができる（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄｅｄ．；ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，蒸発させることにより単離することができる。
【０４３３】
工程２−式ＩＶの合成
式ＩＶの化合物は，化合物ＩＩＩから，四塩化炭素中の臭素またはＴＨＦ中のＮ−ブロモスクシンイミドと反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４３４】
工程３−式Ｖの合成
式Ｖの化合物は，化合物ＩＶから，Ｓｕｚｕｋｉ反応条件下でボロン酸と反応させることにより製造することができる（Ｓｍｉｔｈ  Ｍ．Ｂ．；Ｍａｒｃｈ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈｅｄ．；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１ｐ８６８）。あるいは，化合物ＩＶはまた，Ｓｔｉｌｌｅ，Ｎｅｇｉｓｈｉまたは酸化銅カップリング反応条件下で，それぞれスズ試薬，亜鉛試薬または銅試薬と反応させて，化合物Ｖを得ることができる。（ＳｍｉｔｈＭ．Ｂ．；Ｍａｒｃｈ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，５ｔｈｅｄ．；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１  ｐ９３１）。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４３５】
工程４−式ＶＩの合成
式ＶＩの化合物は，化合物Ｖを，フッ化物（シリル保護基用−フッ化テトラブチルアンモニウムまたはフッ化アンモニウム）（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄｅｄ．；ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９，ｐ６２０），塩基（アリールスルホン保護基用−水性水酸化カリウム）（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄｅｄ．；ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９，ｐ６１５），または酸（カルバメート用−トリフルオロ酢酸）（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄｅｄ．；ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９，ｐ２７２）と反応させ，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することにより，製造することができる。
【０４３６】
工程５−式Ｉａの合成
式Ｉａの化合物は，化合物ＶＩを塩基性条件下で求核試薬，例えば，酸塩化物，塩化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネート，アルキルハロゲン化物，ベンジルハロゲン化物等と反応させることにより製造することができる（Ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｓｍｉｔｈ  Ｍ．Ｂ．；Ｍａｒｃｈ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，５ｔｈｅｄ．；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４３７】
実施例２：式Ｉａの化合物の別法による合成
スキーム−２
【化３３】
2008512380.tif 000024
工程１−式ＶＩＩの合成
式ＶＩＩの化合物は，市販の化合物ＩＩから，低温で，例えば−２０℃で，四塩化炭素中の臭素と反応させることにより，またはＴＨＦ中のＮ−ブロモスクシンイミドと反応させることにより，製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４３８】
工程２−式ＩＶの合成
式ＩＶの化合物は，化合物ＶＩＩから，塩基，例えば，トリエチルアミン，ピリジン，水性水酸化物等の存在下で，極性溶媒，例えば，ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または水中で，脱離基，例えばクロロ，トシル等を含む試薬と反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，蒸発させることにより単離することができる。
【０４３９】
工程３−式Ｖの合成
式Ｖの化合物は，化合物ＩＶから，Ｓｕｚｕｋｉ反応条件下でボロン酸と反応させることにより製造することができる。あるいは，化合物ＩＶはまた，Ｓｔｉｌｌｅ，Ｎｅｇｉｓｈｉまたは酸化銅カップリング反応条件下で，それぞれスズ試薬，亜鉛試薬または銅試薬と反応させて，化合物Ｖを得ることができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４４０】
工程４−式ＶＩの合成
式ＶＩの化合物は，化合物Ｖを，フッ化物（シリル保護基用−フッ化テトラブチルアンモニウム，またはフッ化アンモニウム），塩基（アリールスルホン保護基用−水性水酸化カリウム），または酸（カルバメート用−トリフルオロ酢酸）と反応させ，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することにより，製造することができる。
【０４４１】
工程５−式Ｉａの合成
式Ｉａの化合物は，化合物ＶＩを塩基性条件下で求核試薬，例えば酸塩化物，塩化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネート等と反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４４２】
実施例３：式Ｉａの化合物の別法による合成
スキーム−３
【化３４】
2008512380.tif 000025
工程１−式ＶＩＩＩの合成
式ＶＩＩＩの化合物は，化合物ＩＶから，Ｇｉｌｍａｎら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５７，７９，３０７７）に記載されるようにして，ボロン酸のトリブチルエステルと反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４４３】
工程２−式Ｖの合成
式Ｖの化合物は，化合物ＶＩＩＩをＳｕｚｕｋｉ反応条件下で式Ａ−ＢｒまたはＡ−Ｉの化合物と反応させ，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することにより，製造することができる。
【０４４４】
工程３−式ＶＩの合成
式ＶＩの化合物は，化合物Ｖを，フッ化物（シリル保護基用−フッ化テトラブチルアンモニウム，またはフッ化アンモニウム），塩基（アリールスルホン保護基用−水性水酸化カリウム），または酸（カルバメート用−トリフルオロ酢酸）と反応させ，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することにより，製造することができる。
【０４４５】
工程４−式Ｉａの合成
式Ｉａの化合物は，化合物ＶＩを塩基性条件下で求核試薬，例えば，酸塩化物，塩化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネート等と反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４４６】
実施例４：式Ｉａの化合物の別法による合成
スキーム−４
【化３５】
2008512380.tif 000026
工程１−式ＩＸの合成
式ＩＸの化合物は，化合物ＶＩＩを塩基性条件下で求核試薬，例えば，酸塩化物，塩化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネート，アルキルハロゲン化物，ベンジルハロゲン化物等と反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４４７】
工程２−式Ｉａの合成
式Ｉａの化合物は，化合物ＩＸから，Ｓｕｚｕｋｉ反応条件（水性塩基およびＰｄ（０）触媒またはジオキサン中のＫＦおよびＰｄ（０）触媒を用いる無水条件）でボロン酸と反応させることにより製造することができる。あるいは，化合物ＸＩはまた，Ｓｔｉｌｌｅ，Ｎｅｇｉｓｈｉまたは酸化銅カップリング反応条件下で，それぞれスズ試薬，亜鉛試薬または銅試薬と反応させて，化合物Ｉａを得ることができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４４８】
実施例５：式Ｉａの化合物の別法による合成
スキーム−５
【化３６】
2008512380.tif 000027
工程１−式Ｘの合成
式Ｘの化合物は，化合物ＩＸから，Ｇｉｌｍａｎら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５７，７９，３０７７）に記載されるようにして，ボロン酸のトリブチルエステルと反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４４９】
工程２−式Ｉａの合成
式Ｉａの化合物は，化合物ＸをＳｕｚｕｋｉ反応条件下で式Ａ−ＢｒまたはＡ−Ｉの化合物と反応させ，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することにより製造することができる。
【０４５０】
実施例６：式Ｉａの化合物の別法による合成
スキーム−６
【化３７】
2008512380.tif 000028
工程１−式ＶＩの合成
式ＶＩの化合物は，化合物ＶＩＩから，Ｓｕｚｕｋｉ反応条件（水性塩基およびＰｄ（０）触媒またはジオキサン中のＫＦおよびＰｄ（０）触媒を用いる無水条件）でボロン酸と反応させることにより製造することができる。あるいは，化合物ＶＩＩはまた，Ｓｔｉｌｌｅ，Ｎｅｇｉｓｈｉまたは酸化銅カップリング反応条件下で，それぞれスズ試薬，亜鉛試薬または銅試薬と反応させて，化合物ＶＩを得ることができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４５１】
工程２−式Ｉａの合成
式Ｉａの化合物は，化合物ＶＩを，塩基性条件下で，求核試薬，例えば，酸塩化物，塩化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネート，アルキルハロゲン化物，ベンジルハロゲン化物と反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０４５２】
実施例７：中間体３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１の合成
スキーム−７
【化３８】
2008512380.tif 000029
工程１−３−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン３の製造
７−アザインドール（２，３．５７ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でテトラヒドロフラン（２４０ｍＬ）に溶解した。テトラヒドロフラン中のＮ−ブロモスクシンイミド（５．３８ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）を−４０℃で窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を数時間撹拌し，この間に室温までゆっくり暖まり，反応はＴＬＣで追跡した。水中（１Ｍ）チオ硫酸ナトリウム五水和物（７．５０ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）で反応をクエンチした。２層を分離し，水性層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水，ブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，蒸発乾固させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２５−４０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を白色固体３（４．２０ｇ，２１．３ｍｍｏｌ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝１９８．５．
【０４５３】
工程２−１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン４の製造
３−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（３，２８０ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）をアセトン（１５ｍＬ）に溶解し，炭酸カリウム（２２０ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）を加え，次に塩化ベンゼンスルホニル（０．２ｍＬ，１．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩加熱還流し，濾過し，減圧下で濃縮した。得られた固体をフラッシュクロマトグラフィー（５％−２０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製して，所望の生成物４（３００ｍｇ，４７％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５５．０．
【０４５４】
工程３−１−ベンゼンスルホニル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン５の製造
１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４，１．００ｇ，２．９６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１６ｍＬ）に溶解し，３，４−ジメトキシフェニルボロン酸（１．３５ｇ，７．４１ｍｍｏｌ），テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２００ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ），および１Ｍ炭酸カリウム（８ｍＬ）を加えた。反応混合物をＣＥＭディスカバー電子レンジで１２０℃で１０分間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し，酢酸エチルと水との間に分配した。有機部分を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，濾液をシリカに吸着させた。混合物をフラッシュクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製して，所望の生成物５（９０９ｍｇ，７８％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９４．９．
【０４５５】
工程４−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１の製造
１−ベンゼンスルホニル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５，２９０ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）をエタノール（４ｍＬ）に溶解し，水酸化カリウムペレット（３３０ｍｇ，５．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液をＣＥＭディスカバー電子レンジ装置で１２０℃で１０分間加熱した。反応混合物を濃縮乾固し，残渣を酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウムとの間に分配した。有機部分を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，濾液を濃縮して，所望の生成物１を得，これをさらに精製することなく用いた（１９１ｍｇ）。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝２５５．１．
【０４５６】
実施例８：鍵となる中間体３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１の合成の別法
スキーム−８
【化３９】
2008512380.tif 000030
工程１−３−ブロモ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６の製造
丸底フラスコに，窒素雰囲気下で３−ブロモ−７−アザインドール（３，２．６ｇ，１３．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）および水素化ナトリウム（ミネラルオイル中６０％分散物，）（５５０ｍｇ，１４．０ｍｍｏｌ）を入れた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し，次にジ−ｔｅｒｔ−ブチルニ炭酸（４．０ｇ，１８．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し，水に注加し，酢酸エチル中に抽出した。有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物６を固体（３．０ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）として得た。
【０４５７】
工程２−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１の製造
丸底フラスコに，３−ブロモ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６，２．８ｇ，９．４ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（１００ｍＬ），テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（５００ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ），３，４−ジメトキシフェニルボロン酸（２．１ｇ，１１ｍｍｏｌ）および１ＭＫ２ＣＯ３溶液（５０ｍＬ）を反応混合物を６５℃で一晩撹拌した。反応混合物を水に注加し，酢酸エチル中に抽出した。有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸マグネシウムで乾燥した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサンおよび酢酸エチルの勾配系）で精製して，標題化合物１（５００ｍｇ，２ｍｍｏｌ，２０％）および３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，４−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．１ｇ，５．９ｍｍｏｌ，６３％）を得た。後者の化合物は，ＴＦＡまたはＨＣｌ等の酸試薬で処理することにより，所望の化合物１に容易に変換することができる。
【０４５８】
実施例９：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン７の合成
スキーム−９
【化４０】
2008512380.tif 000031
８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン７の製造
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジン，１，（５０ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４ｍＬ）に溶解した。水性水酸化カリウム（５０％ｗｔ／ｖｏｌ，３００μＬ）およびテトラブチルアンモニウム硫酸水素（２ｍｇ，０．００７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌した。反応液に塩化８−キノリン−スルホニル（４８ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し，残渣をブラインおよび酢酸エチルで洗浄した。有機部分を無水硫酸ナトリウムで乾燥し，濾過した。濾液を濃縮し，調製用TLC（７５％酢酸エチル：ヘキサン）で精製した。生成物を酢酸エチルでシリカから溶出し，濾過した。濾液を濃縮して，７（１４ｍｇ，１６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４５．９．
【０４５９】
実施例１０：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−フェニルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８の合成
【化４１】
2008512380.tif 000032
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−フェニルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化フェニル−メタンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０９．０．
【０４６０】
実施例１１：１−（３−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン９の合成
【化４２】
2008512380.tif 000033
１−（３−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン９は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化（３−クロロフェニル）−メタンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４３．３．
【０４６１】
実施例１２：１−（ビフェニル−４−スルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０の合成
【化４３】
2008512380.tif 000034
１−（ビフェニル−４−スルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリンスルホニルの代わりに塩化ビフェニル−４−スルホニルを用いて製造した。粗生成物を調製ＴＬＣ（５０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製した。化合物を酢酸エチルでシリカから溶出し，濃縮して油状物を得た。油状物を最少量のメタノールで洗浄し，白色沈殿物を濾過により回収して，１０を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４７１．０．
【０４６２】
実施例１３：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１１の合成
【化４４】
2008512380.tif 000035
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（ナフタレン−２−スルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１１は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリンスルホニルの代わりに塩化２−ナフタレン−スルホニルを用いて製造した。粗生成物を調製用ＴＬＣ（５０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製した。化合物を酢酸エチルでシリカから溶出し，濃縮して，油状物を得た。油状物を最少量のメタノールで洗浄し，白色沈殿物を濾過により回収して，１１を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４５．０．
【０４６３】
実施例１４：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−メチル−ナフタレン−１−スルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１２の合成
【化４５】
2008512380.tif 000036
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−メチル−ナフタレン−１−スルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１２は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリンスルホニルの代わりに塩化４−メチル−ナフタレン−１−スルホニルを用いて製造した。粗油状物を酢酸エチルで洗浄すると固体が生じ，これをアセトニトリル：水およびメタノール：塩化メチレンで洗浄して，１２を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５８．９．
【０４６４】
実施例１５：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン１３の合成
【化４６】
2008512380.tif 000037
８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン１３は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリンスルホニルの代わりに塩化３−メチル−キノリン−８−スルホニルを用いて製造した。粗油状物を酢酸エチルで洗浄すると固体が生じ，これをアセトニトリル，メタノールおよび塩化メチレンで洗浄して，１３を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４６０．０．
【０４６５】
実施例１６：５−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−イソキノリン１４の合成
【化４７】
2008512380.tif 000038
５−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−イソキノリン１４は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリンスルホニルの代わりに塩化イソキノリン−５−スルホニルを用いて製造した。粗混合物を調製用ＴＬＣで，７５％酢酸エチル：ヘキサンおよび５０％酢酸エチル：ヘキサンで２回続けて操作して，１４を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４６．０．
【０４６６】
実施例１７：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−フェノキシ−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１５の合成
【化４８】
2008512380.tif 000039
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−フェノキシ−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１５は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリンスルホニルの代わりに塩化４−フェノキシ−ベンゼンスルホニルを用いて製造した。粗混合物をアセトニトリルから再結晶して，１５を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４８７．１．
【０４６７】
実施例１８：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（ナフタレン−１−スルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１６の合成
【化４９】
2008512380.tif 000040
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（ナフタレン−１−スルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１６は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリンスルホニルの代わりに塩化１−ナフタレンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４５．５．
【０４６８】
実施例１９：１−（４−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１７の合成
スキーム−１０
【化５０】
2008512380.tif 000041
１−（４−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１７の製造
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジン１（４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３．５ｍＬ）に溶解した。水素化ナトリウム（ミネラルオイル中６０％分散物，１０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を１５分間撹拌した。反応混合物に塩化（４−クロロ−フェニル）−メタンスルホニル（４０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩撹拌し，濃縮し，ブラインと酢酸エチルとの間に分配した。有機部分を無水硫酸ナトリウムで乾燥し，濾過し，濃縮した。生成物を逆相ＨＰＬＣで，４０−１００％アセトニトリル：０．１％水性ギ酸を用いて精製した。適当な画分を凍結乾燥して，１７をギ酸塩（７．５ｍｇ，１１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４３．０．
【０４６９】
実施例２０：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１８の合成
【化５１】
2008512380.tif 000042
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１８は，実施例１９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化（４−クロロ−フェニル）−メタンスルホニルの代わりに塩化（３−ニトロフェニル）−メタンスルホニルを用いて製造した。粗生成物を調製用ＴＬＣ（５０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５４．０．
【０４７０】
実施例２１：１−ベンゼンスルホニル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール１９の合成
スキーム−１１
【化５２】
2008512380.tif 000043
１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモインドール２０（３５０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６ｍＬ）に溶解した。溶液に３，４−ジメトキシフェニルボロン酸（３７９ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ），テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６０ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）および１Ｍ炭酸カリウム（３ｍＬ）を加えた。反応混合物をＣＥＭディスカバー電子レンジ装置で１２０℃で１０分間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し，酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウムとの間に分配した。有機部分を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過した。濾液をシリカゲルに吸着させ，フラッシュクロマトグラフィー（５％−５０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製して，所望の生成物１９（３５９ｍｇ，８８％）を得た。
【０４７１】
実施例２２：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン２１の合成
スキーム−１２
【化５３】
2008512380.tif 000044
工程１−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール２２の製造
１−ベンゼンスルホニル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール（３５０ｍｇ，０．８９ｍｍｏｌ）１９をエタノール（３ｍＬ）に溶解し，水酸化カリウムペレット（３８５ｍｇ，６．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をＣＥＭディスカバー電子レンジ装置で１２０℃で１０分間加熱した。反応混合物を濃縮乾固し，残渣を酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウムとの間に分配した。有機部分を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，濾液を濃縮して，所望の生成物２２を得，これをさらに精製することなく用いた（２０８ｍｇ，９２％）。
【０４７２】
工程２−８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン２１の製造
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール２２（７０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．０ｍＬ）に溶解した。臭化テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム（３ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）および水性水酸化カリウム（５０％ｗｔ／ｖｏｌ，５００μＬ）を加えた。反応混合物を５分間撹拌した。塩化８−キノリン−スルホニル（８９．５ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を２時間撹拌した。生成物を２Ｎ水酸化リチウムおよび塩化メチレンで抽出した。有機部分を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過した。濾液を濃縮し，フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン０％−５０％）で精製した。適当な画分を合わせ，濃縮して，２１（７６．１ｍｇ，９０％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４５．０．
【０４７３】
実施例２３：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン２４の合成
スキーム−１３
【化５４】
2008512380.tif 000045
８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン２４の製造
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジン，１，（４０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４ｍＬ）に溶解した。水性水酸化カリウム（５０％ｗｔ／ｖｏｌ，３００μＬ）および硫酸水素テトラブチルアンモニウム（２０ｍｇ，０．００７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌した。反応液に塩化６−メチル−キノリン−８−スルホニル（６８ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ，（Ｌｕｂｅｎｅｔｓ，Ｖ．Ｉ．；Ｓｔａｄｎｉｔｓｋａｙａ，Ｎ．Ｅ．；Ｎｏｖｉｋｏｖ，Ｖ．Ｐ．；Ｒｕｓｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．；３６；２０００；８５１−８５３）に記載のようにして製造）を加え，反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し，残渣をブラインおよび酢酸エチルで洗浄した。有機部分を無水硫酸ナトリウムで乾燥し，濾過した。濾液を濃縮し，得られた固体をアセトニトリルで洗浄して，２４（４３ｍｇ，６０％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４６０．１．
【０４７４】
実施例２４：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン２５の合成
【化５５】
2008512380.tif 000046
８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン２５は，実施例２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化６−メチル−キノリン−８−スルホニルを用いて製造した。粗生成物を濃縮した後，アセトニトリルを油状物に加え，静置した。得られた沈殿物を濾過し，アセトニトリルでさらに洗浄し，真空下で乾燥して，所望の生成物２５を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５９．１．
【０４７５】
実施例２５：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド２６の合成
スキーム−１４
【化５６】
2008512380.tif 000047
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−クロロ−フェニル）−アミド２６の製造
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジン１（４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をベンゼンに溶解し，テトラヒドロフラン（４ｍＬ）に溶解した４−クロロフェニルイソシアネート（３６ｍｇ，０．２４ｍｏｌ）を加えた。４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ，ｐｏｌｙｍｅｒｂｏｕｎｄ）を加えた。反応液をＣＥＭディスカバー電子レンジで２００℃で１０分間加熱した。混合物を濾過し，濃縮した。得られた固体を最少量のメタノールで洗浄し，濾過し，次にジクロロメタンで洗浄して，２６（２６ｍｇ，４０％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０８．４．
【０４７６】
実施例２６：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−クロロ−４−メトキシ−フェニル）−アミド２７の合成
【化５７】
2008512380.tif 000048
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−クロロ−４−メトキシ−フェニル）−アミド２７は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに３−クロロ−４−メトキシフェニルイソシアネートを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４３８．４．
【０４７７】
実施例２７：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸フェニルアミド２８の合成
【化５８】
2008512380.tif 000049
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸フェニルアミド２８は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりにフェニルイソシアネートを用いて製造した。最初に１２０℃で１５分間加熱した後，追加のフェニルイソシアネート（５００μＬ）を加え，反応液を再び電子レンジで１８０℃で３０分間加熱した。濃縮された固体を最少量のアセトニトリルで洗浄し，逆相ＨＰＬＣ（０．１％ギ酸：アセトニトリル）で精製して，所望の生成物２８を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３７４．３．
【０４７８】
実施例２８：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３，５−ジメトキシ−フェニル）−アミド２９の合成
【化５９】
2008512380.tif 000050
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３，５−ジメトキシ−フェニル）−アミド２９は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに３，５−ジメトキシフェニルイソシアネートを用い，電子レンジで２００℃で２０分間加熱して製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４３４．２．
【０４７９】
実施例２９：３−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−アミノ−安息香酸エチルエステル３０の合成
【化６０】
2008512380.tif 000051
３−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−アミノ−安息香酸エチルエステル３０は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに３−イソシアナト−安息香酸エチルエステルを用い，電子レンジで２００℃で２０分間加熱して製造した。最少量のメタノールおよび塩化メチレンで洗浄した後，反応混合物をメタノール：塩化メチレン（９５：５）に溶解し，静置した。得られた沈殿物を濾過により単離し，真空下で乾燥して，３０を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４６．５．
【０４８０】
実施例３０：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−フルオロ−３−ニトロ−フェニル）−アミド３１の合成
【化６１】
2008512380.tif 000052
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−フルオロ−３−ニトロ−フェニル）−アミド３１は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに１−フルオロ−４−イソシアナト−２−ニトロ−ベンゼンを用い，室温で２時間反応することにより製造した。得られた沈殿物をメタノールおよびジクロロメタンで洗浄し，真空下で乾燥して，３１を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４３７．５．
【０４８１】
実施例３１：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−メトキシ−フェニル）−アミド３２の合成
【化６２】
2008512380.tif 000053
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−メトキシ−フェニル）−アミド３２は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに３−メトキシ−フェニルイソシアネートを用いて製造した。濾過し，濃縮した後，反応混合物をアセトニトリルおよび最少量の水に再溶解し，静置した。得られた沈殿物を濾過により回収し，真空下で乾燥して，３２を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０４．４．
【０４８２】
実施例３２：４−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−アミノ−安息香酸エチルエステル３３の合成
【化６３】
2008512380.tif 000054
４−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−アミノ−安息香酸エチルエステル３３は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに４−イソシアナト−安息香酸エチルエステルを用いて製造した。
【０４８３】
実施例３３：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−アセチル−フェニル）−アミド３４の合成
【化６４】
2008512380.tif 000055
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−アセチル−フェニル）−アミド３４は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに３−アセチル−フェニルイソシアネートを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１６．３．
【０４８４】
実施例３４：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド３５の合成
【化６５】
2008512380.tif 000056
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド３５は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに３−フルオロ−イソシアナト−ベンゼンを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９２．０．
【０４８５】
実施例３５：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミド３６の合成
【化６６】
2008512380.tif 000057
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルアミド３６は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに５−イソシアナト−ベンゾ［１，３］ジオキソールを用いて製造した。最初の電子レンジ加熱の後，反応液を電子レンジで２１０℃で１０分間再加熱した。粗生成物をメタノール：塩化メチレンから再結晶して，３６を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１８．５．
【０４８６】
実施例３６：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３，４−ジクロロ−フェニル）−アミド３７の合成
【化６７】
2008512380.tif 000058
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３，４−ジクロロ−フェニル）−アミド３７は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに１，２−ジクロロ−４−イソシアナト−ベンゼンを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４３．５．
【０４８７】
実施例３７：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−ニトロ−フェニル）−アミド３８の合成
【化６８】
2008512380.tif 000059
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−ニトロ−フェニル）−アミド３８は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに１−イソシアナト−３−ニトロ−ベンゼンを用いて製造した。最初の電子レンジ加熱の後，反応液をＣＥＭディスカバー電子レンジ中で，さらに１当量の１−イソシアナト−３−ニトロ−ベンゼンとともに２００℃で６分間再加熱した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１９．２．
【０４８８】
実施例３８：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−メトキシ−フェニル）−アミド３９の合成
【化６９】
2008512380.tif 000060
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−メトキシ−フェニル）−アミド３９は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに４−メトキシフェニルイソシアネートを用いて製造した。最初の電子レンジ加熱の後，反応液を電子レンジで１９０℃で５分間再加熱した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０４．２．
【０４８９】
実施例３９：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−アセチル−フェニル）−アミド４０の合成
【化７０】
2008512380.tif 000061
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（４−アセチル−フェニル）−アミド４０は，２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに４−アセチルフェニルイソシアネートを用いて製造した最初の電子レンジ加熱の後，反応液を電子レンジで２２０℃で２０分間再加熱した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１６．２．
【０４９０】
実施例４０：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボチオ酸フェニルアミド４１の合成
スキーム−１５
【化７１】
2008512380.tif 000062
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボチオ酸フェニルアミド４１の製造
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジン１（５０ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）に溶解した。水素化ナトリウム（１０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，ミネラルオイル中６０％分散物）を加えた。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。１−イソチオシアナトベンゼン（３５μＬ，０．２９ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で４０分間撹拌した。生成物を濃縮し，残渣をブラインと酢酸エチルとの間に分配した。有機部分を無水硫酸ナトリウムで乾燥し，濾過し，濃縮して，固体を得た。固体を最少のメタノールで洗浄し，真空下で乾燥して，４１（３８ｍｇ，４９％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９０．２．
【０４９１】
実施例４１：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボチオ酸（３−メトキシ−フェニル）−アミド４２
【化７２】
2008512380.tif 000063
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボチオ酸（３−メトキシ−フェニル）−アミド４２は，実施例４０に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４０，１−イソチオシアナトベンゼンの代わりに１−クロロ−４−イソチオシアナトベンゼンを用いて製造した。
【０４９２】
実施例４２：８−［３−（２−メトキシ−ピリミジン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン４３の合成
スキーム−１６
【化７３】
2008512380.tif 000064
工程１−８−（３−ブロモ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル）−キノリン４４の製造
丸底フラスコに，３−ブロモ−７−アザインドール（３，１．１８ｇ，５．９９ｍｍｏｌ）および臭化テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム（１９３ｍｇ，０．６００ｍｍｏｌ）および５．０Ｍ水酸化ナトリウム（１５．４ｍＬ）を入れた。ジクロロメタン（５．９ｍＬ）中の塩化８−キノリン−スルホニル（１．６４ｇ，７．１９ｍｍｏｌ）を室温で滴加した。数時間後，すべての出発物質は消失した。３０ｍＬのジクロロメタンを加えた後，２層を分離した。水性層をジクロロメタンで洗浄した。合わせた有機層を１Ｍ炭酸水素ナトリウム，水およびブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。粗生成物を減圧下で濃縮し，カラムクロマトグラフィー（５５−８０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を淡黄色固体（４４，１．７２ｇ，４．４３ｍｍｏｌ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３８９．４．
【０４９３】
工程２−８−［３−（２−メトキシ−ピリミジン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン４３の製造
電子レンジ反応チューブ中で，８−（３−ブロモ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル）−キノリン（４４，６８ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ），２−メトキシ−ピリミジン−４−ボロン酸（６７．４ｍｇ，０．４３８ｍｍｏｌ），およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ，０．００８８ｍｍｏｌ）を，１．０Ｍの炭酸カリウム（０．５２ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（０．８４ｍＬ）中で混合した。得られた混合物をＣＥＭディスカバー電子レンジユニット中で１２０℃で１０分間加熱した。酢酸エチルおよび水を加え，２層を分離した。水性層を酢酸エチルで抽出し，合わせた有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥した。生成物を減圧下で濃縮し，得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（８０−９０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を白色固体（４３，０．００５ｇ，０．０１ｍｍｏｌ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１７．８．
【０４９４】
実施例４３：３−（２−メトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−フェニルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン４５の合成
【化７４】
2008512380.tif 000065
３−（２−メトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−フェニルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン４５は，実施例４２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化フェニルメタンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３８１．２．
【０４９５】
実施例４４：８−［３−（２−メチルスルファニル−ピリミジン−４−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン４６の合成
スキーム−１７
【化７５】
2008512380.tif 000066
工程１−８−［３−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン４７の製造
丸底フラスコに，８−（３−ブロモ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル）−キノリン（４４，３３５ｍｇ，０．８６３ｍｍｏｌ），ジボロンピナコールエステル（２６３ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ），および塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（１８ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ）を入れた。窒素雰囲気下で，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４．０ｍＬ）を加えた。フラスコを真空と窒素源との間に交互に接続することにより混合物をよく脱気した。得られた混合物を１００℃で一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却した後，これを水に注加し，酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水およびブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。生成物を減圧下で濃縮し，粗生成物をカラムクロマトグラフィー（５５％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を白色固体（４７，７０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４３５．８．
【０４９６】
工程２−８−［３−（２−メチルスルファニル−ピリミジン−４−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン４６の製造
電子レンジ反応チューブ中で，８−［３−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン（４７，７０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ），４−ヨード−２−メチルスルファニル−ピリミジン（１０１ｍｇ，０．４０２ｍｍｏｌ），およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（９．３ｍｇ，０．００８ｍｍｏｌ）を，水（０．４８ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（０．７７ｍＬ）中の１．０Ｍ炭酸カリウム中で混合した。得られた混合物をＣＥＭディスカバー電子レンジユニット中で１２０℃で１０分間加熱した。酢酸エチルおよび水を加え，２層を分離した。水性層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で濃縮して，粗精製物を得，これをカラムクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を淡黄色固体（４６，１０ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４３４．０．
【０４９７】
実施例４５：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン５２の合成
スキーム−１８
【化７６】
2008512380.tif 000067
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（６３８ｍｇ，２．５１ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し，水素化ナトリウム（６０％分散物，ミネラルオイル中，１００ｍｇ，２．５０ｍｍｏｌｅ）を反応混合物に少しずつ加えた。３０分間撹拌した後，塩化２−エトキシ−１−ナフトイル（６４６ｍｇ，２．７６ｍｍｏｌｅ）を加え，反応液を４時間撹拌した。反応混合物を２００ｍＬの氷水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重炭酸溶液，次に飽和硫酸水素カリウムで，次にブラインで洗浄した。得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製して，８００ｍｇ（７０％）の標題化合物を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５３．０６．
【０４９８】
実施例４６：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−ニトロ−ベンジル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン５３の合成
スキーム−１９
【化７７】
2008512380.tif 000068
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（３５ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌｅ）を１５ｍＬのＤＭＦに溶解し，水素化ナトリウム（６０％分散物，ミネラルオイル中，１０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を反応混合物に少しずつ加えた。３０分間撹拌した後，塩化ｍ−ニトロ−ベンジル（３０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌｅ）を反応混合物に加え，２時間撹拌した。反応混合物を５０ｍＬの氷水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム，次に飽和重炭酸カリウム，次にブラインで洗浄した。得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，４２ｍｇ（７１％）の標題化合物を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９０．１．
【０４９９】
実施例４７：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−４−ニトロ−フェニル）−メタノン５４の合成
スキーム−２０
【化７８】
2008512380.tif 000069
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（２５０ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌｅ）を５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジエチルイソプロピルアミン（２０５μＬ，１．２ｍｍｏｌ），２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸（２２８ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）およびブロモトリス（ピロロジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（５５０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を，撹拌した反応混合物に加えた。混合物を周囲温度で４時間撹拌し，飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和重硫酸カリウム溶液で順番に洗浄した。得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，３４０ｍｇ（７７％）の標題化合物を黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４８．２．
【０５００】
実施例４８：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］フェニルメタノン−アミド５５の合成
【化７９】
2008512380.tif 000070
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］フェニルメタノン−アミド５５は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化ベンゾイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３５９．２．
【０５０１】
実施例４９：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（３−ピリジリル）−メタノン−アミド５６の合成
【化８０】
2008512380.tif 000071
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（３−ピリジリル）−メタノン−アミド５６は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化ピリジン−３−カルボニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３６０．０．
【０５０２】
実施例５０：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−トリフルオロメチルピリジン−３−イル）−メタノン−アミド５７の合成
【化８１】
2008512380.tif 000072
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−トリフルオロメチルピリジン−３−イル）−メタノン−アミド５７は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化４−トリフルオロメチルピリジン−３−カルボニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４２８．０．
【０５０３】
実施例５１：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（１−ナフチル）−メタノン−アミド５８の合成
【化８２】
2008512380.tif 000073
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（１−ナフチル）−メタノンアミド５８は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化ナフチレン−１−カルボニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０９．１．
【０５０４】
実施例５２：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−クロロピリジン−３−イル）−メタノン−アミド５９の合成
【化８３】
2008512380.tif 000074
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−クロロピリジン−３−イル）−メタノン−アミド５９は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化２−クロロピリジン−３−カルボニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９３．９．
【０５０５】
実施例５３：１−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−２−（４−メトキシ−フェニル）−エタノン−アミド６０の合成
【化８４】
2008512380.tif 000075
１−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−２−（４−メトキシ−フェニル）−エタノン−アミド６０は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化（４−メトキシ−フェニル）−アセチルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０３．０．
【０５０６】
実施例５４：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−フェニル）−メタノン−アミド６１の合成
【化８５】
2008512380.tif 000076
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−フェニル）−メタノン−アミド６１は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化２−エトキシベンゾイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０３．５．
【０５０７】
実施例５５：酢酸６−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−ナフタレン−１−イルエステル−アミド６２の合成
【化８６】
2008512380.tif 000077
酢酸６−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−ナフタレン−１−イルエステル−アミド６２は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ安息香酸の代わりに５−アセトキシ−ナフタレン−２−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４６７．５．
【０５０８】
実施例５６：ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン６３の合成
【化８７】
2008512380.tif 000078
ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン６３は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボニルを用いて製造した。
【０５０９】
実施例５７：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−フルオロ−ナフタレン−１−イル）−メタノン６４の合成
【化８８】
2008512380.tif 000079
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−フルオロ−ナフタレン−１−イル）−メタノン６４は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ安息香酸の代わりに４−フルオロ−ナフタレン−１−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４２７．５．
【０５１０】
実施例５８：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（５−メトキシナフタレン−１−イル）−メタノン６５の合成
【化８９】
2008512380.tif 000080
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（５−メトキシナフタレン−１−イル）−メタノン６５は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ安息香酸の代わりに５−メトキシ−ナフタレン−２−カルボン酸を用いて製造した。
【０５１１】
実施例５９：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−イソキノリン−８−イル−メタノン６６の合成
【化９０】
2008512380.tif 000081
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−イソキノリン−８−イル−メタノン６６は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ安息香酸の代わりにキノリン−８−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１０．５．
【０５１２】
実施例６０：１−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−エタノン６７の合成
【化９１】
2008512380.tif 000082
１−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−エタノン６７は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化アセチルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝２７９．２．
【０５１３】
実施例６１：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−メトキシフェニル）−メタノン６８の合成
【化９２】
2008512380.tif 000083
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−メトキシフェニル）−メタノン６８は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフタレンカルボニルの代わりに塩化２−メトキシベンゾイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３８９．１５．
【０５１４】
実施例６２：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−［４−（３−メチル−ピリジン−４−イル）−ベンゼンスルホニル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン６９の合成
【化９３】
2008512380.tif 000084
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−［４−（３−メチル−ピリジン−４−イル）−ベンゼンスルホニル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン６９は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化４−（３−メチル−ピリジン−４−イル）−ベンゼンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４８７．０．
【０５１５】
実施例６３：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−オキサゾール−５−イル−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７０の合成
【化９４】
2008512380.tif 000085
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−オキサゾール−５−イル−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７０は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化４−オキサゾール−５−イル−ベンゼンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４６２．０．
【０５１６】
実施例６４：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−ピラゾール−１−イル−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７１の合成
【化９５】
2008512380.tif 000086
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（４−ピラゾール−１−イル−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７１は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化４−ピラゾール−１−イル−ベンゼンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４６１．０．
【０５１７】
実施例６５：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−オキサゾール−５−イル−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７２の合成
【化９６】
2008512380.tif 000087
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−オキサゾール−５−イル−ベンゼンスルホニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７２は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化３−オキサゾール−５−イル−ベンゼンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４６２．０．
【０５１８】
実施例６６：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−［４−（５−メチル−［１，３，４］オキサジアゾール−２−イル）−ベンゼンスルホニル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７３の合成
【化９７】
2008512380.tif 000088
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−［４−（５−メチル−［１，３，４］オキサジアゾール−２−イル）−ベンゼンスルホニル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７３は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化３−オキサゾール−５−イル−ベンゼンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４７７．０．
【０５１９】
実施例６７：１−（２−ベンゼンスルホニルメチル−ベンジル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７４の合成
【化９８】
2008512380.tif 000089
１−（２−ベンゼンスルホニルメチル−ベンジル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７４は，実施例４６に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化ｍ−ニトロ−ベンジルの代わりに１−ベンゼンスルホニルメチル−２−クロロメチル−ベンゼンを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４９９．１．
【０５２０】
実施例６８：１−ベンジル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７５の合成
【化９９】
2008512380.tif 000090
１−ベンジル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７５は，実施例４６に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化ｍ−ニトロ−ベンジルの代わりに塩化ベンジルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３４５．１．
【０５２１】
実施例６９：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（２−メチル−ナフタレン−１−イルメチル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７６の合成
【化１００】
2008512380.tif 000091
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（２−メチル−ナフタレン−１−イルメチル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７６は，実施例４６に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化ｍ−ニトロ−ベンジルの代わりに１−クロロメチル−２−メチル−ナフタレンを用いて製造した。
【０５２２】
実施例７０：４−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イルメチル］−ベンゾニトリル７７の合成
【化１０１】
2008512380.tif 000092
４−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イルメチル］−ベンゾニトリル７７は，実施例４６に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化ｍ−ニトロ−ベンジルの代わりに４−クロロメチルベンゾニトリルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３７０．２．
【０５２３】
実施例７１：１−ビフェニル−２−イルメチル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７８の合成
【化１０２】
2008512380.tif 000093
１−ビフェニル−２−イルメチル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７８は，実施例４６に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化ｍ−ニトロ−ベンジルの代わりに塩化２−フェニルベンジルを用いて製造した。
【０５２４】
実施例７２：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７９の合成
【化１０３】
2008512380.tif 000094
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン７９は，実施例４６に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化ｍ−ニトロ−ベンジルの代わりに塩化ｍ−トリフルオロメチルベンジルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１３．０．
【０５２５】
実施例７３：式Ｉｂの化合物の合成
スキーム−２１
【化１０４】
2008512380.tif 000095
工程１−式ＸＩＩの合成
化合物ＸＩは，７−アザインドールから，公表されている方法（Ｓｃｈｎｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｗ．；Ｌｕｏ，Ｊｉａｎｎ−Ｋｕａｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８０，４５，４０４５−４０４８）にしたがって製造することができ，式ＸＩＩの化合物は，化合物ＸＩから，スズキ反応条件（水性塩基およびＰｄ（０）触媒，またはジオキサン中のＫＦおよびＰｄ（０）触媒の無水条件）下でボロン酸と反応させることにより製造することができる。あるいは，化合物ＸＩはまた，Ｓｔｉｌｌｅ，Ｎｅｇｉｓｈｉまたは酸化銅カップリング反応条件下で，それぞれスズ試薬，亜鉛試薬または銅試薬と反応させて，化合物ＸＩＩを得ることができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０５２６】
工程２−式Ｉｂの合成
式Ｉｂの化合物は，化合物ＸＩＩを，塩基性条件下で，例えば，酸塩化物，塩化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネート，アルキルハロゲン化物，ベンジルハロゲン化物等の求核試薬と反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０５２７】
実施例７４：［４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン４８の合成
スキーム−２２
【化１０５】
2008512380.tif 000096
工程１−４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン５０の製造
電子レンジ反応チューブ中で，４−クロロ−７−アザインドール（４９，１．３６２ｇ，８．９２６ｍｍｏｌ）（７−アザインドールから公表されている方法（Ｓｃｈｎｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｗ．；Ｌｕｏ，Ｊｉａｎｎ−Ｋｕａｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８０，４５，４０４５−４０４８）にしたがって製造），３，４−ジメトキシフェニルボロン酸（４．０６ｇ，２２．３ｍｍｏｌ），およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（５２ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を，水（２７ｍＬ）中１．０Ｍ炭酸カリウムおよびテトラヒドロフラン（４３ｍＬ）中で混合した。得られた混合物をＣＥＭディスカバー電子レンジユニットで１５０℃で２０分間加熱した。酢酸エチルおよび水を加え，２層を分離した。水性層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で濃縮して，粗生成物を得，これをカラムクロマトグラフィー（４０−７０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を淡黄色固体（５０，９７４ｍｇ，３．８３ｍｍｏｌ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝２５５．２．
【０５２８】
工程２−［４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン４８の製造
水素化ナトリウム（６０％分散物ｉｎミネラルオイル，３９．９ｍｇ，０．９９７ｍｍｏｌ）をヘキサンで洗浄し，窒素雰囲気下に置き，１ｍＬのテトラヒドロフランを加えた。テトラヒドロフラン（６．２ｍＬ）中の４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５０，１９５ｍｇ，０．７６７ｍｍｏｌ）を加え，得られた混合物を室温で１０分間撹拌した。テトラヒドロフラン中の塩化２−エトキシナフトイル（２０２ｍｇ，０．８４４ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後，反応を水でクエンチし，２層を分離した。水性層を酢酸エチルで抽出下。合わせた有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で濃縮して，粗生成物を得，これをカラムクロマトグラフィー（３５−６０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を淡黄色固体（４８，２６２ｍｇ，０．５７９ｍｍｏｌ）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５３．２．
【０５２９】
実施例７５：［４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−フェニル）−メタノン５１の合成
【化１０６】
2008512380.tif 000097
［４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−フェニル）−メタノン５１は，実施例７４に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシナフトイオルの代わりに塩化２−エトキシ−ベンゾイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０３．３．
【０５３０】
実施例７６：式Ｉｃの化合物の合成
スキーム−２３
【化１０７】
2008512380.tif 000098
工程１−式ＸＩＶの合成
化合物ＸＩＩＩは，７−アザインドールから，公表されている方法（Ｍａｒｉｅ−Ｃｌａｕｄｅ，Ｖｉａｕｄ，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，１９９９，５０，１０６５−１０８０）にしたがって製造することができ，式ＸＩＶの化合物は，化合物ＸＩＩＩから，スズキ反応条件下（水性塩基およびＰｄ（０）触媒またはジオキサン中のＫＦおよびＰｄ（０）触媒を用いる無水条件）でボロン酸と反応させることにより製造することができる。あるいは，化合物ＸＩＩＩはまた，Ｓｔｉｌｌｅ，Ｎｅｇｉｓｈｉまたは銅酸化物カップリング反応条件下で，それぞれスズ試薬，亜鉛試薬または銅試薬と反応させて化合物ＸＩＶを得ることができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０５３１】
工程２−式Ｉｃの合成
式Ｉｃの化合物は，化合物ＸＩＶを，塩基性条件下で，例えば，酸塩化物，塩化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネート，アルキルハロゲン化物，ベンジルハロゲン化物等の求核試薬と反応させることにより製造することができる。生成物は，標準的な後処理法にしたがって，例えば，有機溶媒を用いて生成物を抽出し，カラムクロマトグラフィーにより精製することにより単離することができる。
【０５３２】
実施例７７：［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン８０の合成
スキーム−２４
【化１０８】
2008512380.tif 000099
工程１−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８２の製造
電子レンジ安全チューブ中で，５−ブロモ−７−アザインドール（８１，３９２ｍｇ，１．９９ｍｍｏｌ）（７−アザインドールから公表されている方法（Ｍａｒｉｅ−Ｃｌａｕｄｅ，Ｖｉａｕｄ，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，１９９９，５０，１０６５−１０８０）にしたがって製造），３，４−ジメトキシフェニルボロン酸（９０５ｍｇ，４．９７ｍｍｏｌ），およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１１ｍｇ，０．０９９ｍｏｌ）を，１．０Ｍの炭酸カリウム（６．０ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（９．５ｍＬ，０．１２ｍｏｌ）中で混合した。得られた混合物をＣＥＭディスカバー電子レンジユニット中で１２０℃で１０分間加熱した。酢酸エチルおよび水を加え，２層を分離した。水性層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で濃縮して，粗生成物を得，これをカラムクロマトグラフィー（４０−７０％酢酸エチル：ヘキサン）で精製して，所望の生成物を淡黄色固体（８２，２０７ｍｇ，４１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝２５５．２．
【０５３３】
工程２−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン８０の製造
水素化ナトリウム（ミネラルオイル中６０％分散物，１０．１ｍｇ，０．２５２ｍｍｏｌ）をヘキサンで洗浄し，窒素雰囲気下に置き，１ｍＬのテトラヒドロフランを加えた。テトラヒドロフラン（１．６ｍＬ）中の５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（８２，４９．３ｍｇ，０．１９４ｍｍｏｌ）を加え，得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。ＴＨＦ中の塩化２−エトキシナフトイオル（５１．１ｍｇ，０．２１３ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後，反応を水でクエンチし，２層を分離した。水性層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で濃縮して，粗生成物を得，これをカラムクロマトグラフィー（４０−５５％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，所望の生成物を液体として得た（８０，６１ｍｇ，７０％）。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５３．２．
【０５３４】
実施例７８：［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−フェニル）−メタノン８３の合成
【化１０９】
2008512380.tif 000100
［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−フェニル）−メタノン８３は，実施例７７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシナフトイオルの代わりに塩化２−エトキシ−ベンゾイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０３．２．
【０５３５】
実施例７９：（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−［３−（４−メタンスルホニル−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン８４の合成
【化１１０】
2008512380.tif 000101
スキーム−２５
【化１１１】
2008512380.tif 000102
工程１−（３−ブロモ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル）−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン８５の製造
３−ブロモ−７−アザインドール（５００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）３をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）に溶解し，水素化ナトリウム（２１０ｍｇ，５．３ｍｍｏｌ，ミネラルオイル中６０％分散物）および塩化２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル（７１０ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で３０分間撹拌し，氷水（１００ｍＬ）中に注加し，酢酸エチル中に抽出した。有機部分を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過し，濾液を濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル，ヘキサン中）により精製して，所望の生成物８５（８００ｍｇ，８０％）を得た。
【０５３６】
工程２−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−［３−（４−メタンスルホニル−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン８４の製造
（３−ブロモ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−ｙｌ）−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン８５（３５ｍｇ，０．００８８ｍｍｏｌ），４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸（３５ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（５ｍｇ）を，テトラヒドロフラン（１６ｍＬ）および炭酸カリウム溶液（８．０ｍＬ，１Ｍ水性）中で撹拌した。反応混合物を６０℃で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し，酢酸エチルとブラインとの間に分配した。有機部分を無水硫酸マグネシウムで乾燥し，濾過した。濾液を濃縮し，フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン２０％−１００％）で精製した。所望の生成物８４を淡黄色粉体として得た（１０ｍｇ，２０％）。
【０５３７】
実施例８０：（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−［３−（３−メタンスルホニル−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン８６の合成
【化１１２】
2008512380.tif 000103
（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−［３−（３−メタンスルホニル−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン８６は，実施例７９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸の代わりに３−メタンスルホニル−フェニルボロン酸を用いて製造した。
【０５３８】
実施例８１：３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−安息香酸ベンジルエステル８７の合成
【化１１３】
2008512380.tif 000104
３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−安息香酸ベンジルエステル８７は，実施例７９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸の代わりに３−カルボベンジルオキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。
【０５３９】
実施例８２：３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８８の合成
【化１１４】
2008512380.tif 000105
３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８８は，実施例７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３，４−ジメトキシフェニルボロン酸の代わりに３−シクロペンチルオキシ，４−メトキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３０９．２０．
【０５４０】
実施例８３：３−（３−ベンジルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８９の合成
【化１１５】
2008512380.tif 000106
３−（３−ベンジルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８９は，実施例７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３，４−ジメトキシフェニルボロン酸の代わりに３−ベンジルオキシ，４−メトキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。
【０５４１】
実施例８４：３−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン９０の合成
【化１１６】
2008512380.tif 000107
３−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン９０は，実施例７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３，４−ジメトキシフェニルボロン酸の代わりに３，４−メチレンジオキシベンゼンボロン酸を用いて製造した。
【０５４２】
実施例８５：１−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−スルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン９１の合成
【化１１７】
2008512380.tif 000108
１−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−スルホニル）−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン９１は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−スルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５０．９７．
【０５４３】
実施例８６：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−５−メトキシ−インドール−１−スルホニル］−キノリン９２の合成
【化１１８】
2008512380.tif 000109
８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−５−メトキシ−インドール−１−スルホニル］−キノリン９２は，実施例２１および２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモインドールの代わりに１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモ−５−メトキシインドールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４７５．１０．
【０５４４】
実施例８７：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−５−クロロ−インドール−１−スルホニル］−キノリン９３の合成
【化１１９】
2008512380.tif 000110
８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−５−クロロ−インドール−１−スルホニル］−キノリン９３は，実施例２１および２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモインドールの代わりに１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモ−５−クロロインドールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４７９．１０．
【０５４５】
実施例８８：８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−５−メトキシ−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９４の合成
【化１２０】
2008512380.tif 000111
８−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−５−メトキシ−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９４は，実施例２１および２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化３−メチル−キノリン−８−スルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４８９．１０．
【０５４６】
実施例８９：８−［５−クロロ−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９５の合成
【化１２１】
2008512380.tif 000112
８−［５−クロロ−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９５は，実施例２１および２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニル，１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモインドールおよび３，４−ジメトキシフェニルボロン酸の代わりに，それぞれ塩化３−メチル−キノリン−８−スルホニル，１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモ−５−クロロ−インドールおよび３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５４７．１０．
【０５４７】
実施例９０：８−［５−クロロ−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９６の合成
【化１２２】
2008512380.tif 000113
８−［５−クロロ−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９６は，実施例２１および２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルおよび１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモインドールの代わりにそれぞれ塩化３−メチル−キノリン−８−スルホニルおよび１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモ−５−メトキシ−インドールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４９３．００．
【０５４８】
実施例９１：８−［５−メトキシ−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９７の合成
【化１２３】
2008512380.tif 000114
８−［５−メトキシ−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−３−メチル−キノリン９７は，実施例２１および２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニル，１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモインドールおよび３，４−ジメトキシフェニルボロン酸の代わりに，それぞれ塩化３−メチル−キノリン−８−スルホニル，１−ベンゼンスルホニル−３−ブロモ−５−メトキシ−インドールおよび３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５４３．２０．
【０５４９】
実施例９２：３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−ニトロ−４−フルオロ−フェニル）−アミド９８
【化１２４】
2008512380.tif 000115
３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸（３−ニトロ−４−フルオロ−フェニル）−アミド９８は，実施例２５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１および４−クロロフェニルイソシアネートの代わりに，それぞれ３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン８８および４−フルオロ−３−ニトロフェニルイソシアネートを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４９１．１０．
【０５５０】
実施例９３：１−ベンゼンスルホニル−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール９９
【化１２５】
2008512380.tif 000116
１−ベンゼンスルホニル−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール９９は，実施例２１に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３，４−ジメトキシフェニルボロン酸の代わりに３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４８．３１．
【０５５１】
実施例９４：８−［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン１００
【化１２６】
2008512380.tif 000117
８−［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン１００は，実施例２１および２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３，４−ジメトキシフェニルボロン酸および塩化ベンゼンスルホニルの代わりに３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニルボロン酸および塩化８−キノリンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４９９．０９．
【０５５２】
実施例９５：１−ベンゼンスルホニル−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０１
【化１２７】
2008512380.tif 000118
１−ベンゼンスルホニル−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０１は，実施例７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３，４−ジメトキシフェニルボロン酸の代わりに３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４９．１３．
【０５５３】
実施例９６：８−［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン１０２
【化１２８】
2008512380.tif 000119
８−［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン１０２は，実施例４２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−メトキシ−ピリミジン−４−ボロン酸の代わりに３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５００．２０．
【０５５４】
実施例９７：１−ベンゼンスルホニル−３−（３−ベンジルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０３
【化１２９】
2008512380.tif 000120
１−ベンゼンスルホニル−３−（３−ベンジルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０３は，実施例４２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−メトキシ−ピリミジン−４−ボロン酸および塩化キノリン−８−スルホニルの代わりに，それぞれ３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニルボロン酸およびベンゼン塩化スルホニルを用いて製造した。
【０５５５】
実施例９８：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−フェニル−イソオキサゾール−５−イルメチル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０４
【化１３０】
2008512380.tif 000121
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−（３−フェニル−イソオキサゾール−５−イルメチル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１０４は，実施例４６に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化ｍ−ニトロ−ベンジルの代わりに５−クロロメチル−３−フェニル−イソオキサゾールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１２．２３．
【０５５６】
実施例９９：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−［５−（３−ヨード−フェニル）−イソオキサゾール−３−イル］−メタノン１０５
【化１３１】
2008512380.tif 000122
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−［５−（３−ヨード−フェニル）−イソオキサゾール−３−イル］−メタノン１０５は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフトイルの代わりに塩化３−（３−ヨード−フェニル）−イソオキサゾール−５−カルボニルを用いて製造した。
【０５５７】
実施例１００：４−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−ベンゾニトリル１０６
【化１３２】
2008512380.tif 000123
４−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−ベンゾニトリル１０６は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフトイルの代わりに塩化４−シアノ−ベンゾイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３８４．２０．
【０５５８】
実施例１０１：（６−クロロ−ピリジン−３−イル）−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン１０７
【化１３３】
2008512380.tif 000124
（６−クロロ−ピリジン−３−イル）−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン１０７は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフトイルの代わりに塩化２−クロロニコチノイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９４．１０．
【０５５９】
実施例１０２：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−フェニル−ｔｒａｎｓ−シクロプロピル）−メタノン１０８
【化１３４】
2008512380.tif 000125
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−フェニル−ｔｒａｎｓ−シクロプロピル）−メタノン１０８は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフトイルの代わりに塩化ｔｒａｎｓ−２−フェニルシクロプロパン−カルボニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９９．１７．
【０５６０】
実施例１０３：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−ジメチルアミノ−ナフタレン−１−イル）−メタノン１０９
【化１３５】
2008512380.tif 000126
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−ジメチルアミノ−ナフタレン−１−イル）−メタノン１０９は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフトイルの代わりに塩化４−ジメチルアミノ−ナフタレン−１−カルボニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５２．２０．
【０５６１】
実施例１０４：酢酸２−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−フェニルエステル１１０
【化１３６】
2008512380.tif 000127
酢酸２−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−フェニルエステル１１０は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフトイルの代わりに酢酸２−クロロカルボニル−フェニルエステルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１７．２０．
【０５６２】
実施例１０５：（２，４−ジエトキシ−フェニル）−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン１１１
【化１３７】
2008512380.tif 000128
（２，４−ジエトキシ−フェニル）−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン１１１は，実施例４５に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化２−エトキシ−１−ナフトイルの代わりに塩化２，４−ジメトキシ−ベンゾイルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４７．２０．
【０５６３】
実施例１０６：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−［２−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−メタノン１１２
【化１３８】
2008512380.tif 000129
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−［２−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−メタノン１１２は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸の代わりに２−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ナフタレン−１−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５０７．１０．
【０５６４】
実施例１０７：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−プロポキシ−フェニル）−メタノン１１３
【化１３９】
2008512380.tif 000130
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−プロポキシ−フェニル）−メタノン１１３は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸の代わりに２−プロポキシ−ナフタレン−１−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１７．２０．
【０５６５】
実施例１０８：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−メチル−ナフタレン−１−イル）−メタノン１１４
【化１４０】
2008512380.tif 000131
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（４−メチル−ナフタレン−１−イル）−メタノン１１４は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸の代わりに４−メチル−ナフタレン−１−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４２３．２０．
【０５６６】
実施例１０９：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−キノリン−４−イル−メタノン１１５
【化１４１】
2008512380.tif 000132
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−キノリン−４−イル−メタノン１１５は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸の代わりにキノリン−４−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１０．２０．
【０５６７】
実施例１１０：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−メチル−キノリン−４−イル）−メタノン１１６
【化１４２】
2008512380.tif 000133
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−メチル−キノリン−４−イル）−メタノン１１６は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸の代わりに２−メチル−キノリン−４−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４２４．２０．
【０５６８】
実施例１１１：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（３−フェニル−キノリン−４−イル）−メタノン１１７
【化１４３】
2008512380.tif 000134
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（３−フェニル−キノリン−４−イル）−メタノン１１７は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸の代わりに３−フェニル−キノリン−４−カルボン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４８６．２０．
【０５６９】
実施例１１２：［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−フェノキシ−フェニル）−メタノン１１８
【化１４４】
2008512380.tif 000135
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−フェノキシ−フェニル）−メタノン１１８は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸の代わりに２−フェノキシ−安息香酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５１．１６．
【０５７０】
実施例１１３：［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン１１９
【化１４５】
2008512380.tif 000136
［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−メタノン１１９は，実施例７９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸の代わりに３−シクロペントキシ−４−メトキシフェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５０７．３０．
【０５７１】
実施例１１４：３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−安息香酸メチルエステル１２０
【化１４６】
2008512380.tif 000137
３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−安息香酸メチルエステル１２０は，実施例７９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸の代わりに３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４５１．１４．
【０５７２】
実施例１１５：３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−ベンズアミド１２１
【化１４７】
2008512380.tif 000138
３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−ベンズアミド１２１は，実施例７９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸の代わりに３−アミドフェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４３６．１４．
【０５７３】
実施例１１６：Ｎ−｛３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−フェニル｝−メタンスルホンアミド１２２
【化１４８】
2008512380.tif 000139
Ｎ−｛３−［１−（２−エトキシ−ナフタレン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−フェニル｝−メタンスルホンアミド１２２は，実施例７９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸の代わりに３−Ｎ−メタンスルホンアミドフェニルボロン酸を用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４８６．１０．
【０５７４】
実施例１１７：（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−［３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン１２３
【化１４９】
2008512380.tif 000140
（２−エトキシ−ナフタレン−１−イル）−［３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン１２３は，実施例７９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−メタンスルホニル−フェニルボロン酸の代わりに２−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−フェノールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４３９．１７．
【０５７５】
実施例１１８：［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−［２−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−メタノン１２４
【化１５０】
2008512380.tif 000141
［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−［２−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−メタノン１２４は，実施例４７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２−エトキシ−４−ニトロ−安息香酸および３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの代わりに２−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ナフタレン−１−カルボン酸および３−（３−シクロペントキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５６１．１０．
【０５７６】
実施例１１９：１−ベンゼンスルホニル−３−［３−メトキシ−４−（３−フェニル−イソオキサゾール−５−イルメトキシ）−フェニル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１２５
【化１５１】
2008512380.tif 000142
１−ベンゼンスルホニル−３−［３−メトキシ−４−（３−フェニル−イソオキサゾール−５−イルメトキシ）−フェニル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１２５は，実施例７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，２，３−ジメトキシ−フェニルボロン酸の代わりに５−［２−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−フェノキシメチル］−３−フェニル−イソオキサゾールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５３８．０６．
【０５７７】
実施例１２０：１−ベンゼンスルホニル−３−［３−メトキシ−４−（３−フェニル−イソオキサゾール−５−イルメトキシ）−フェニル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１２６
スキーム−２６
【化１５２】
2008512380.tif 000143
８−［４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−スルホニル］−キノリン１２６の製造
丸底フラスコに，４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（０．２２２ｇ，０．０００８７３ｍｏｌ），５０および臭化テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム（０．０２８２ｇ，０．００００８７４ｍｏｌ），および水（２．２５ｍＬ）中の５．０００Ｍの水酸化ナトリウムを入れた。塩化メチレン（０．６１６ｍＬ，０．００９６０ｍｏｌ）に溶解した塩化８−キノリン−スルホニル（０．２３８ｇ，０．００１０５ｍｏｌ）０℃で滴加した。反応液を周囲温度で３時間撹拌し，反応混合物を追加の２５ｍＬの塩化メチレンで希釈した。有機層を１Ｍ炭酸水素ナトリウム（水性）（３０ｍｌｘ２）で，次にブラインで洗浄した。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し，濾過し，減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，標題化合物を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４６．２０．
【０５７８】
実施例１２１：４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−フェニルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１２７
【化１５３】
2008512380.tif 000144
４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１−フェニルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１２７は，実施例１２０に記載されるものと同じプロトコルを用いて，塩化８−キノリン−スルホニルの代わりに塩化ベンジルスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４０９．２０．
【０５７９】
実施例１２２：４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール１２８
スキーム−２７
【化１５４】
2008512380.tif 000145
４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール１２８の合成
電子レンジ安全チューブ中で，４−ブロモインドール（１．３８３ｇ，０．００７０５４ｍｏｌ），３，４−ジメトキシフェニルボロン酸（３．２１ｇ，０．０１７６ｍｏｌ），ａｎｄテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．４１ｇ，０．０００３５ｍｏｌ）を，水（２１ｍＬ）中の１．００Ｍ炭酸カリウムおよびテトラヒドロフラン（３４ｍＬ，０．４２ｍｏｌ）中で混合した。得られた混合物を電子レンジ中で１００℃で１０分間加熱した。反応混合物を水と酢酸エチルとの間に分配した。水性層を酢酸エチルで抽出し，有機層を合わせ，ブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥した。反応混合物を減圧下で濃縮し，残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル，ヘキサン中）で精製して，１．０２ｇの標題化合物を淡緑色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝２５４．２０．
【０５８０】
実施例１２３：５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール１２９
【化１５５】
2008512380.tif 000146
５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール１２９は，実施例１２２に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−ブロモインドールの代わりに５−ブロモインドールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝２５４．２０
【０５８１】
実施例１２４：８−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン１３０
【化１５６】
2008512380.tif 000147
８−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン１３０は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジンの代わりに５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４５．２０
【０５８２】
実施例１２５：８−［４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン１３１
【化１５７】
2008512380.tif 000148
８−［４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−インドール−１−スルホニル］−キノリン１３１は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジンの代わりに４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドールを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４４５．１０
【０５８３】
実施例１２６：１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３２
【化１５８】
2008512380.tif 000149
１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３２は，実施例９に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジンおよび塩化キノリン−８−スルホニルの代わりに，それぞれ５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ−［２，３−ｂ］ピリジンおよび塩化ベンゼンスルホニルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９５．２０
【０５８４】
実施例１２７：４−［１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸エチルエステル１３５
【化１５９】
2008512380.tif 000150
スキーム−２８
【化１６０】
2008512380.tif 000151
工程１−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３３の製造
５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン，８２，（０．２７０ｇ，０．００１０６ｍｏｌ）を窒素雰囲気下でテトラヒドロフラン（８．５ｍＬ，０．１０ｍｏｌ）に溶解した。溶液を−４０℃で撹拌し，２．５ｍＬのテトラヒドロフランに溶解したヨード（０．２６９ｇ，０．００１０６ｍｏｌ）を加えた。冷却した反応混合物を２時間撹拌し，次に水（１Ｍ）中チオ硫酸ナトリウム五水和物（０．１３ｇ，０．０００５３ｍｏｌ）を加えてクエンチした。反応混合物を水（２０ｍＬ）と酢酸エチル（３０ｍＬ）との間に分配した。２層を分離し，水性層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水およびブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，次に減圧下で濃縮した。暗色の粗残渣をさらに精製することなく次の反応で用いた。
【０５８５】
工程２−１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３４の製造
丸底フラスコに，水（２．７３ｍＬ）中５．０００Ｍの水酸化ナトリウム中の５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン，１３３，（０．４０３ｇ，０．００１０６ｍｏｌ）および臭化テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム（０．０３４２ｇ，０．０００１０６ｍｏｌ）を入れた。塩化メチレン（０．７４７ｍＬ，０．０１１６ｍｏｌ）中の塩化ベンゼンスルホニル（０．２２５ｇ，０．００１２７ｍｏｌ）を滴加した。２時間後，３０ｍＬの塩化メチレンおよび３０ｍＬの水を加えた。有機層を分離し，１Ｍ炭酸水素ナトリウム（水性）（３０ｍｌｘ２），次に水（３０ｍｌ）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，次に減圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル，酢酸エチル／ヘキサン）により精製して，２９５ｍｇの所望の生成物を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５２１．０４
【０５８６】
工程３−４−［１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸エチルエステル１３５の製造
１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−ヨード−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（０．０８００ｇ，０．０００１５１ｍｏｌ），４−エチニル−安息香酸エチルエステル（０．０３２１ｇ，０．０００１８１ｍｏｌ），塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（０．００４８ｇ，０．０００００６９ｍｏｌ），およびヨウ化銅（Ｉ）（０．０００２４ｇ，０．０００００１３ｍｏｌ）を窒素雰囲気下でトリエチルアミン（０．８ｍＬ，０．００５ｍｏｌ）に溶解した。得られた混合物を６０℃に加熱し，窒素雰囲気下で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し，水（３０ｍＬ）を残渣に加えた。このスラリーをエーテルで抽出した（２０ｍＬ２Ｘ）。合わせた有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下で濃縮した。粗生成物をクロマトグラフィー（シリカゲル，酢酸エチル／ヘキサン）により精製して，８５ｍｇの標題生成物を淡橙色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５６７．１０
【０５８７】
実施例１２８：１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−フェニルエチニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３６
【化１６１】
2008512380.tif 000152
１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−フェニルエチニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３６は，実施例１２７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−エチニル−安息香酸エチルエステルの代わりにエチニル−ベンゼンを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４９５．２０
【０５８８】
実施例１２９：３−［１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸メチルエステル１３７
【化１６２】
2008512380.tif 000153
３−［１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸メチルエステル１３７は，実施例１２７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，４−エチニル−安息香酸エチルエステルの代わりに３−エチニル−安息香酸メチルエステルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝５５３．１０
【０５８９】
実施例１３０：５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−フェニルエチニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３８
【化１６３】
2008512380.tif 000154
５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−フェニルエチニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１３８は，実施例７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，１−ベンゼンスルホニル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの代わりに１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−フェニルエチニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３５５．２０
【０５９０】
実施例１３１：３−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸メチルエステル１３９
【化１６４】
2008512380.tif 000155
３−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸メチルエステル１３９は，実施例７に記載されるものと同じプロトコルを用いて，１−ベンゼンスルホニル−３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの代わりに３−［１−ベンゼンスルホニル−５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸メチルエステルを用いて製造した。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１３．２０
【０５９１】
実施例１３２：３−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸１４０
スキーム−２９
【化１６５】
2008512380.tif 000156
３−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸１４０の製造
電子レンジ安全チューブ中で，３−［５−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルエチニル］−安息香酸メチルエステル（０．０４９ｇ，０．０００１２ｍｏｌ）を水（１．７８ｍＬ）およびメタノール（７．１ｍＬ，０．１８ｍｏｌ）中の５．００Ｍの水酸化ナトリウムに溶解した。反応液を６０ワットで１００℃で１０分間暖めた。得られた透明な黄色溶液を減圧下で濃縮した。得られた水性スラリーを１ＭＨＣｌ（水性）で酸性にしてｐＨ５とし，酢酸エチル中に抽出した。有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，次に減圧下で濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルおよびメタノールから再結晶して，標題化合物を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３９９．２０
【０５９２】
実施例１３３：５−（１−ベンゼンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−２−メトキシ−フェノール１４１
スキーム−３０
【化１６６】
2008512380.tif 000157
５−（１−ベンゼンスルホニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−２−メトキシ−フェノール１４１の製造
Ｐａｒｒ圧力反応器に，１−ベンゼンスルホニル−３−（３−ベンジルオキシ−４−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（９２ｍｇ，０．０００２０ｍｏｌ），パラジウム（５０ｍｇ，０．００００５ｍｏｌ）１０％，テトラヒドロフラン（１５ｍＬ，０．１８ｍｏｌ）およびメタノール（１ｍＬ，０．０２ｍｏｌ）およびＨＣｌ溶液（３ｍＬ，０．０４ｍｏｌ）を入れた。反応液を水素雰囲気下で５０ｐｓｉで４時間振盪した。混合反応液をセライト（商標）を通し，減圧下で濃縮した。残渣を調製用TLC（酢酸エチル／ヘキサン１：１）で精製して，３１ｍｇの標題生成物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝３８１．１１．
【０５９３】
実施例１３４：３−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１４２
【化１６７】
2008512380.tif 000158
３−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１４２は，実施例８に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンおよび３，４−ジメトキシ−フェニルボロン酸の代わりに，それぞれ３−ブロモ−２−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンおよび５−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−ベンゾ［１，３］ジオキソールを用いて製造した。
【０５９４】
実施例１３５：３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１４３
【化１６８】
2008512380.tif 000159
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１４３は，実施例８に記載されるものと同じプロトコルを用いて，３−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの代わりに３−ブロモ−２−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを用いて製造した。
【０５９５】
実施例１３６：（４−アミノ−２−エトキシ−フェニル）−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−メタノン１４４
【化１６９】
2008512380.tif 000160
［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］−（２−エトキシ−４−ニトロ−フェニル）−メタノン，５４，（１００ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解した。触媒量の１０％Ｐｄ／Ｃ（７ｍｇ）を加え，フラスコにゴム中隔の蓋をした。フラスコを脱気し，水素を充填し，これを２回行った。最後に，反応液を水素ガス雰囲気下（バルーン）で一晩撹拌した。反応混合物をセライト（登録商標）を通して濾過し，ＥｔＯＡｃ（２ｘ７５ｍＬ）でよくすすぎ，減圧下で濃縮して，標題化合物（５６ｍｇ，６０％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４１８．２４
【０５９６】
実施例１３７：Ｎ−｛４−［３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボニル］−３−エトキシ−フェニル｝−メタンスルホンアミド１４５
【化１７０】
2008512380.tif 000161
丸底フラスコに，テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）中の（４−アミノ−２−エトキシフェニル）［３−（３，４−ジメトキシフェニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル］メトノン（５６ｍｇ，０．０００１３ｍｏｌ）を入れた。水素化ナトリウム（４．８ｍｇ，０．０００２０ｍｏｌ，ミネラルオイル中６０％分散物）を加え，塩化メタンスルホニル（３８ｍｇ，０．０００３４ｍｏｌ）を反応混合物に加え，次にこれを室温で一晩撹拌した。カラムクロマトグラフィー精製（シリカゲル）により，標題化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ＋］＋＝４９６．０８
【０５９７】
実施例１３８：ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのクローニング
ＰＤＥ４ＢｃＤＮＡ配列は，ヒト脳海馬ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，＃７１６９−１）から以下のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。
PDE4B-S:  5’-CCGAATT CATATG AGCATCTCACGCTTTGGAGTC-3’ 34 mer
PDE4B-A:  5’-TGTGCT CTCGAG TTAGCTGTGTCCCTCTCCCTCC-3’ 34 mer
次に，以下のプライマーを用いて，部位特異的変異誘発により内部ＮｄｅＩ部位を除く処理をした。
PDE4B-NDE1:  5’-GATATGTCTAAACACATGAGCCTGCTGGC-3’ 29 mer
PDE4B-NDE2:  5’-GCCAGCAGGCTCATGTGTTTAGACATATC-3’ 29 mer
得られたＰＣＲフラグメントをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し，ｐＥＴ１５Ｓベクターにサブクローニングした。
【０５９８】
この発現プラスミド中では，ＰＤＥ４Ｂ（ＮＣＢＩ配列ＪＣ１５１９，配列番号１）の残基１５２−５２８はＮ末端Ｈｉｓタグおよびそれに続くトロンビン切断部位とインフレームである。ｐＥＴ１５Ｓの配列をマルチクローニングサイトとともに以下に示す。
【化１７１】
2008512380.tif 000162
【０５９９】
ｐＥＴ１５Ｓベクターは，Ｎ末端Ｈｉｓ６を有する蛋白質を製造するための細菌発現用ｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に由来する。このベクターを，ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを別のフラグメントで置き換えることにより改変して，ＳａｌＩ部位および停止コドン（ＴＡＧ）を作成した。ベクターサイズは５８１４ｂｐである。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ部位を用いて挿入を行うことができる。用いたＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのアミノ酸配列および核酸配列を表３に示す。
【０６００】
実施例１３９：ＰＤＥ４Ｂの精製
ＰＤＥ４Ｂは，０．２ｍＭ酢酸亜鉛および１ｍＭＭｇＣｌ２を補充したテリフィック（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ）培地で成長させ，１ｍＭＩＰＴＧで２２℃で１６−２０時間誘導したＥ．ｃｏｌｉ細胞［ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ（ＲＩＬ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）］から精製した。遠心分離した細菌ペレット（典型的には１６Ｌから２００−２５０ｇ）を溶解バッファ（０．１Ｍリン酸カリウムバッファ，ｐＨ８．０，１０％グリセロール，１ｍＭＰＭＳＦ）に懸濁した。１００ｕｇ／ｍｌのリゾチウムを溶解物に加え，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ）で細胞を溶解した。細胞抽出物をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＡ６０００ローターで５０００ｒｐｍで１時間で清澄にし，上清をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＡ６００ローターで１７０００ｒｐｍでさらに１時間遠心分離する。清澄にした上清に５ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）を加え，２ｍｌのコバルトビーズ（５０％スラリー）を各３５ｍｌの抽出物に加える。Ｎｕｔａｔｏｒ上でビーズを４℃で３−４時間混合し，４０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によりビーズを回収する。ペレット化したビーズを溶解バッファで数回洗浄し，ビーズをＢｉｏＲａｄディスポーザブルカラムに充填する。結合したタンパク質を３−４カラム容量の０．１Ｍイミダゾール，次に０．２５Ｍイミダゾール（いずれも溶解バッファ中で調製）で溶出する。コバルトビーズから溶出されたタンパク質をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（２６／６０）で低塩バッファ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１４ｍＭベータ−メルカプトエタノール）中で分離する。この時点で，ＰＤＥタンパク質をトロンビンで室温で１６−２０時間処理する。ＰＤＥタンパク質は，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１０／１０）でアニオン交換クロマトグラフィーにより，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１４ｍＭベータ−メルカプトエタノール中ＮａＣｌ勾配を用いてＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でさらに精製する。
【０６０１】
実施例１４０：ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの結晶
ＰＤＥ４Ｂの結晶は，Ｉｎｔｅｌｌｉｐｌａｔｅ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ）を用いて，３０％ＰＥＧ４００，０．２ＭＭｇＣｌ２，０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．５，１ｍＭ結合リガンド，１５．９ｍｇ／ｍｌタンパク質中で，１μｌのタンパク質と１μｌの沈殿剤を混合することにより，４℃で成長させた。データは１．４オングストロームまで収集した。
【０６０２】
ＰＤＥ４Ｂ結晶はさらに，Ｉｎｔｅｌｌｉｐｌａｔｅ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ）を用いて，２０％ＰＥＧ３０００，０．２ＭＣａ（ＯＡｃ）２，０．１ＭＴｒｉｓｐＨ７．０，１ｍＭ結合リガンド，１５．９ｍｇ／ｍｌタンパク質中で，１μｌのタンパク質を１μｌの沈殿剤と混合することにより４℃で成長させた。データは１．７オングストロームまで収集した。
【０６０３】
実施例１４１：ＰＤＥ４Ｂの構造決定
ＰＤＥ４Ｂの構造は，先に寄託されているＰＤＥ４Ｂの座標を用いる分子置換を用いて解析した。決定されたＰＤＥ４Ｂ構造の原子座標を表１に示す（共結晶構造の座標を表２に示す）。
【０６０４】
実施例１４２：ＰＤＥ結合アッセイ
結合アッセイは種々の方法，例えば，当該技術分野において知られる種々の方法により実施することができる。例えば，上述するように，結合アッセイは，蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）フォーマットを用いて，またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを用いて実施することができる。
【０６０５】
あるいは，リガンドのＡＴＰ−結合部位への結合を測定しうる任意の方法を用いることができる。例えば，蛍光リガンドを用いることができる。ＰＤＥ４Ｂに結合すると，放出される蛍光は偏光される。阻害剤の結合により一旦置き換えられれば，偏光は減少する。
【０６０６】
競合結合アッセイによる化合物のＩＣ５０の測定（ただし，ＫＩは阻害剤結合の解離定数であり；ＫＤは，基質結合の解離定数である）。この系についてＩＣ５０，すなわち阻害剤結合定数および基質結合定数は，以下の式にしたがって相互に関係づけることができる。
放射性標識した基質を用いた場合：
【数２】
2008512380.tif 000163
標識基質の量が少ない場合：
ＩＣ５０〜ＫＩ
【０６０７】
実施例１４３：ＰＤＥ活性のアッセイ
例示的ホスホジエステラーゼアッセイとして，ＰＤＥ４Ｂ，ＰＤＥ５Ａ，および他のＰＤＥのホスホジエステラーゼ活性に及ぼす潜在的調節剤の影響を，以下のアッセイフォーマットで測定した。
【０６０８】
試薬
アッセイバッファ
５０ｍＭＴｒｉｓ，７．５
８．３ｍＭＭｇＣｌ２
１．７ｍＭＥＧＴＡ
０．０１％ＢＳＡ
４℃で保存
【０６０９】
ＲＮＡ結合ＹＳｉＳＰＡビーズ
ビーズは水中１００ｍｇ／ｍｌである。１Ｍ酢酸Ｚｎ／ＺｎＳＯ４溶液（３：１）および水を用いて１８ｍＭＺｎ中に５ｍｇ／ｍｌで希釈する。４℃で保存する。
【０６１０】
低対照化合物    ２０ＸＤＭＳＯストックの濃度
ＰＤＥ１Ｂ：８−メトキシメチルＩＢＭＸ    ２０ｍＭ
ＰＤＥ２Ａ：ＥＨＮＡ                      １０ｍＭ
ＰＤＥ３Ｂ：Ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ              ２ｍＭ
ＰＤＥ４Ｄ：Ｒｏｌｉｐｒａｍ              １０ｍＭ
ＰＤＥ５Ａ：Ｚａｐｒｉｎａｓｔ            １０ｍＭ
ＰＤＥ７Ｂ：ＩＢＭＸ                      ４０ｍＭ
ＰＤＥ１０Ａ：Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ      ４ｍＭ
【０６１１】
酵素濃度（２Ｘ最終濃度，アッセイバッファで希釈）
ＰＤＥ１Ｂ５０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ２Ａ５０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ３Ｂ１０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ４Ｄ５ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ５Ａ２０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ７Ｂ２５ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ１０Ａ５ｎｇ／ｍｌ
【０６１２】
放射性リガンド
［３Ｈ］ｃＡＭＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＴＲＫ５５９）。アッセイバッファ中に２０００Ｘで希釈する。
［３Ｈ］ｃＧＭＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＴＲＫ３９２）。ＰＤＥ５Ａアッセイ用のみ。アッセイバッファ中に２０００Ｘで希釈する。
【０６１３】
プロトコル
２ｍＭの９６ウエルマスタープレートからＢｉｏｍｅｋＦｘを用いて１μｌの化合物を３８４ウエルプレートに移すことにより，アッセイプレートを作製する。化合物の最終濃度は約１００μＭである。化合物を二重にアッセイするために各マスタープレートから二重のアッセイプレートを調製する。アッセイプレートのカラム２３に適当な対照化合物の２０ＸＤＭＳＯストックを１μｌ加える。これらは低対照である。
Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅライブラリアッセイプレートのカラム１および２，およびＭａｙｂｒｉｄｇｅライブラリアッセイプレートのカラム２１および２２は，１μｌのＤＭＳＯを含む。これらは高対照である。
ＢｉｏｍｅｋＦｘを用いて，１０μｌの放射性リガンドを各アッセイウエルにピペットで加え，次に同じチップを用いて１０μｌの酵素を各ウエルにピペットで加える。
アッセイプレートを透明のカバーで覆う。１０００ＲＰＭで軽く遠心分離し，プレートシェーカーで１０秒間混合する。３０℃で３０分間インキュベートする。ＢｉｏｍｅｋＦｘを用いて，各アッセイウエルに１０μｌのビーズ混合物を加える。ビーズは各アッセイプレートに加える直前にリザーバー中でよく混合する。プレートを新たな透明の覆いで再び密封する。プレート振盪器で１０秒間混合し，次に，１０００ＲＰＭで１分間遠心分離する。
プレートを計数ラックに置く。３０分以上放置し，次にＷａｌｌａｃ  ＴｒｉＬｕｘでプログラム８を用いて計数する。
データを酵素活性の％阻害として分析する。高対照の平均＝０％阻害。低対照の平均＝１００％阻害。
【０６１４】
実施例１４４：生化学および細胞アッセイにおいて用いるためのＰＰＡＲの発現および精製
遺伝子工学
ヒトホスホジエステラーゼ（ＰＤＥｓ）４Ｂおよび４Ｄをコードするプラスミドは，慣用のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて遺伝子工学処理した。全長ＰＤＥおよびＰＤＥ触媒ドメインのみを有する切断型の両方を，異種発現用に遺伝し光学処理した。使用した関連するＤＮＡ配列およびコードされる蛋白質配列がそれぞれ示される（下記参照）。ヒトＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄ遺伝子はいくつかのスプライシング変種を有する。全長発現用に選択されたスプライシング変種は，ＰＤＥ４Ｂ２（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｇｉ２９２３８７）およびＰＤＥ４Ｄ５（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｇｉ２７３５８５６）である。種々のヒト組織からクローニングされた相補的ＤＮＡは，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入して，これらをＰＣＲ反応において基質として用いた。特定の注文合成オリゴヌクレオチドプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，以下を参照）は，ＰＣＲ産物を開始し，プラスミドとのライゲーション用の適当な制限酵素切断部位を与えるよう設計した。
【０６１５】
触媒ドメインをコードするＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄ挿入物とのライゲーションのために用いたプラスミドは，Ｅ．ｃｏｌｉを用いる発現用のｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ）から誘導した。全長ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄ挿入物のライゲーションに用いたプラスミドはｐＦａｓｔＢａｃＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。これらのケースのすべてにおいて，ＰＤＥは金属親和性クロマトグラフィーを用いる精製のためにヒスチジンタグを含むよう改変した。
【０６１６】
ＰＤＥ４触媒ドメインのＥ．ｃｏｌｉにおける蛋白質発現および精製
蛋白質発現のためには，目的とする遺伝子を含むプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ株にトランスフォーメーションさせ，適当な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上でトランスフォーマントを選択した。単一コロニーを２００ｍｌＬＢ培地中で３７℃で４時間成長させた。ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄにおついては，すべての蛋白質発現は３０Ｌバイオリアクターを用いて大量発酵により行った。４００ｍｌのスターター培養物を３０ＬＴＢ培地に加え，３７℃でＯＤ６００ｎｍが２−５となるまで成長させた。培養物を２０℃に冷却し，０．５ｍＭＩＰＴＧ，１ｍＭＭｇＣｌ２および０．２ｍＭＺｎＯＡｃを加え，培養物をさらに１８時間成長させた。
【０６１７】
蛋白質精製のためには，すべての操作は４℃で行った。凍結したＥ．ｃｏｌｉ細胞ペレットを溶解バッファに再懸濁し，標準的な機会的方法を用いて溶解させた。可溶性蛋白質は，固定化金属親和性精製（ＩＭＡＣ）を用いてポリ−ヒスチジンタグにより精製した。それぞれのＰＤＥについて，精製は，ＩＭＡＣ（サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー）を利用して，３工程精製プロセスを用いて行った。ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの両方について，最終精製工程の前に，トロンビン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いてポリヒスチジンタグを除去した。
【０６１８】
アッセイ目的のために提供される蛋白質については，上述した発現条件を実施したが，ただし，精製は２工程のみであり，ポリヒスチジンタグは除去しなかった。酵素は５０％グリセロール中で保存した。
【０６１９】
昆虫細胞におけるバキュロウイルスを用いる全長ＰＤＥ４アイソフォームの蛋白質発現および精製
標準的なプロトコルを用いて発現させたＰＤＥ
ＰＤＥ４Ｂ２：Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびＴＥＶ切断部位を有する全長ヒトＰＤＥ４Ｂ２アイソザイムをバキュロウイルス感染昆虫細胞で発現させた。酵素は細胞溶解物から精製せず，したがって，酵素濃度は測定しなかった。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。
【０６２０】
ＰＤＥ４Ｄ５：Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびＴＥＶ切断部位を有する全長ヒトＰＤＥ４Ｄ５アイソザイムをバキュロウイルス感染昆虫細胞で発現させた。酵素は細胞溶解物から精製せず，したがって，酵素濃度は測定しなかった。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。
【０６２１】
プラスミド配列およびＰＣＲプライマーの情報
ＰＤＥ４Ｂ：
【化１７２】
2008512380.tif 000164
【０６２２】
ＰＣＲプライマー：
PDE4B  PDE4-S  CCGAATTCATATGAGCATCTCACGCTTTGGAGTC  316
PDE4B-A  TGTGCTCTCGAGTTAGCTGTGTCCCTCTCCCTCC  317
【０６２３】
ＰＤＥ４Ｄ：
【化１７３】
2008512380.tif 000165
ＰＣＲプライマー：
PDE4D  PDE4D-S  TCTGACTCATATGAGTATCCCAAGGTTTGGAGT  323
PDE4D-A  CTAGTGTCGACTTACACTTGACTGCCACTGTCCT  324
【０６２４】
ＰＤＥ４Ｂ２：
【化１７４】
2008512380.tif 000166
【化１７５】
2008512380.tif 000167
ＰＣＲプライマー：
PDE4B  PDE4B2-S  CGTGCAACATATGAAGGAGCACGGGGGCAC  3734
PDE4BFULL-A  TCCACCTCGAGAGGGGGATTATGTATCCAC  1898
【０６２５】
ＰＤＥ４Ｄ５：
【化１７６】
2008512380.tif 000168
【化１７７】
2008512380.tif 000169
ＰＣＲプライマー：
PDE4D  PDE4DFULL-S  GACCAGGCATATGGCTCAGCAGACAAGCCC  1911
PDE4DFULL-A  AGTTTGTCGACTGTTACGTGTCAGGAGAAC  1912
【０６２６】
実施例１４５．ＰＤＥ４  ＩＣ５０の決定
ＩＣ５０は，シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）により決定した。このアッセイの原理は，ＰＤＥ４の基質であるｃＡＭＰはＹｉｔｔｒｉｕｍ  Ｓｉｌｉｃａｔｅ  ＳＰＡビーズに弱く結合するのに対し，ＰＤＥ４の加水分解の生成物であるＡＭＰはこれに強く結合することに基づく。したがって，ＰＤＥ４加水分解により生じた［３Ｈ］ＡＭＰのみがＳＰＡビーズに結合し，シンチレーションシグナルを生ずるため，［３Ｈ］ｃＡＭＰのサンプルのＰＤＥ４加水分解の程度を測定することができる。
【０６２７】
ＩＣ５０アッセイに用いたＰＤＥ４酵素
ＰＤＥ４Ｂ：Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびトロンビン切断部位を有するヒトＰＤＥ４ＢのＳ１５２−Ｓ５２８からの触媒ドメインをＥ．ｃｏｌｉで発現させ，金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。実施例１４４を参照
ＰＤＥ４Ｄ：Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびトロンビン切断部位を有するヒトＰＤＥ４ＢのＳ３１６−Ｖ６９２からの触媒ドメインをＥ．ｃｏｌｉで発現させ，金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。実施例１４４を参照
ＰＤＥ４Ｂ２：実施例１４４を参照
ＰＤＥ４Ｄ５：実施例１４４を参照
【０６２８】
ＩＣ５０方法
試験した化合物（化合物および結果については表５を参照）は，化合物の強度により４ｍＭまたは４０μＭの出発濃度からＤＭＳＯ中で３倍で１１回連続希釈した。１μｌの各希釈物を白色ポリスチレン３８４ウエルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３７１０）の二重のウエルに移した。化合物希釈物に加えて，各アッセイプレートには，１μｌのＤＭＳＯ（０％酵素阻害を規定するため）または１μｌの２００μＭロフルミラスト（ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ）（１００％の酵素阻害を規定するため）を加えた対照ウエルを含めた。ＢｅｃｋｍａｎＦＸロボットを用いて，アッセイバッファ（５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５；８．３ｍＭＭｇＣｌ；１．７ｍＭＥＧＴＡ；０．０１％ＢＳＡ）中の１０μｌの［３Ｈ］ｃＡＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＴＲＫ５５９）を２ｍＣｉ／ｍｌで各アッセイウエルに移した。次に，アッセイバッファ中１０μｌのＰＤＥ４酵素を加え，プレートを１０００ｒｐｍで３０秒間振盪して，ｃＡＭＰ加水分解反応を開始させた。用いた酵素の濃度は以下のとおりである：ＰＤＥ４Ｂ，８０ｎｇ／ｍｌ；ＰＤＥ４Ｄ，４ｎｇ／ｍｌ；ＰＤＥ４Ｂ２，２．５μｌの５０％グリセロールストック／ｍｌ；ＰＤＥ４Ｄ５０．０８３μｌの５０％グリセロールストック／ｍｌ。アッセイプレートを覆い，３０℃で３０分間インキュベートした。ロボットで１８ｍＭＺｎＳＯ４中の５ｍｇ／ｍｌＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮＱ００１３）を１０μｌ加えることにより反応を停止した。アッセイプレートを透明なプラスチックフィルムで覆い，１０００ＲＰＭで１分間遠心分離してＳＰＡビーズを沈殿させ，Ｗａｌｌａｃ  ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンターを用いて計数した。ＩＣ５０は，生のアッセイデータから，ＭＤＬからのＡｓｓａｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウエアパッケージを用いて，非線形回帰曲線適合から計算した。
【０６２９】
実施例１４６
全血培養物をＬＰＳで刺激したときのＴＮＦアルファ産生により評価したＩＣ５０の決定
化合物をアッセイして，以下のアッセイプロトコルを用いて全血培養物からのＴＮＦ−α放出の阻害に基づいてＩＣ５０の値を求めた（試験した化合物および結果については表５を参照）。ＰＤＥ４Ｂが阻害されると，リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激した全血培養物からのＴＮＦ−α放出の阻害が阻害される。ＴＮＦ−α放出の測定を用いて，化合物をＰＤＥ４Ｂ阻害剤として評価した。
【０６３０】
化合物はＤＭＳＯ中に２０ｍＭで用意し，希釈プレートの１つの列にウエルあたり２μｌを加えた。２．５％熱失活ＦＢＳを含む９８μｌのＲＰＭＩ１６４０培地を化合物を含む各ウエルに加えた。２％ＤＭＳＯを含む同じ培地を用意し，希釈プレートの空のウエルのそれぞれに６０μｌを加えた。化合物は連続的に１：３で希釈し（３０μｌから６０μｌの培地），化合物あたり合計で８種類の濃度を用意した。５０μＭロフルミラストおよびピクラミラストを含むウエルを１００％阻害対照として用意し，２％ＤＭＳＯを含む培地を０％阻害対照として用いた。２０μｌアリコートの各サンプルを二重にアッセイプレートに移した。
【０６３１】
ヒトバフィコートは，ｔｈｅ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから入手し，１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２．５％熱失活ＦＢＳを含む７倍容量のＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した。１６０μｌアリコートの希釈した血液をアッセイプレートの各ウエルに加え，混合し，３７℃で５％ＣＯ２中で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈し２０μｌアリコートとして−２０℃で保存されていたＬＰＳ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ２６３７）を融解し，１０００倍に希釈して１μｇ／ｍｌとした。１時間のインキュベーション後，このうちの２０μｌアリコートを各サンプルに加えた（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳ）。ＬＰＳを加えないバックグラウンドサンプルも用意した。サンプルを振盪器中で９００ＲＰＭで１分間混合し３７℃で５％ＣＯ２中で４時間インキュベートした。次に，プレートを振盪器上に置いて９００ＲＰＭで１分間振盪し，次に減速度を５に設定して１００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清の上から７５μｌを注意深くピペットで新たなプレートに移し，−２０℃で凍結した。
【０６３２】
５０μｌアリコートのインキュベーションバッファ（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌイムノアッセイキット：ヒトＴＮＦ−αカタログ番号ＫＨＣ３０１１）をｈＴＮＦ−αに特異的なモノクローナル抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅキット）でコーティングしたプレートの各ウエルに加えた。上清血液サンプルを融解し，５０μｌアリコートを５０μｌの希釈剤バッファ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅキット）とともにインキュベーションバッファに加え，サンプルを室温で２時間インキュベートした。サンプルを３００μｌ／ウエルの洗浄バッファ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅキット）で４回洗浄した。１００μｌアリコートのビオチン化抗ＴＮＦアルファ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅキット）を加え，サンプルを室温で１時間インキュベートした。サンプルを３００μｌ／ウエルの洗浄バッファで４回洗浄した。１００μｌアリコートのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅキット）を加え，サンプルを室温で３０分間インキュベートした。サンプルを３００μｌ／ウエルの洗浄バッファで４回洗浄した。１００μｌアリコートのＣｈｒｏｍａｇｅｎ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅキット）を加え，サンプルを暗所で３０分間インキュベートした。各サンプルに１００μｌアリコートの停止溶液（２ＮＨ２ＳＯ４）を加え，サンプルをＷａｌｌａｃＶｉｃｔｏｒで，４５０ｎｍで０．１ｓｅｃ／ウエルで読んだ。
【０６３３】
実施例１４７．  ラット阻害実験
すべての実験は雄ラットＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳＢＲ（Ｃｒｌ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて行った。ラットを５つの群に分けた。化合物の投与量を表５に示す。
【０６３４】
順化期間終了時，絶食していないラットの体重を量り，永久マーカーで個別に識別し，ベヒクル，参照化合物または試験化合物のいずれかを体重に合わせて１０ｍＬ／ｋｇの容量で経口（ｐｏ）または腹腔内（ｉｐ）経路で投与した。動物をポリスチレンで標識し床におがくずを入れたケージに５匹ずつ集めた。ベヒクル，参照物質または試験物質を投与した２時間後，ラットに０．１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを１ｍＬ／ｋｇ体重の容量で静脈内（ｉｖ）注射した。ＬＰＳチャレンジの２時間後（または表３Ｂおよび４Ｂに示されるように），ガス（イソフルラン）麻酔下で眼窩後方穿刺を行うことにより，抗凝血剤なしで血液サンプルをチューブ内に回収した。サンプルを室温で５−１０分間凝固させ，次に氷上に置き，遠心分離（６０００ｘｇ，３分間，４℃）により調製し，使用するまで−２０℃で保存した。ＴＮＦαのレベルは，製造元の方法にしたがってＥＬＩＳＡ法により血清サンプル中で二重に測定した（Ｒａｔ  ＴＮＦαキット  ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＭ（ＲＴＡ００，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ，Ｆｒａｎｃｅ））。データは，観察されたＴＮＦαレベルの，ベヒクルを投与した動物群について観察されたＴＮＦαレベルに対する減少のパーセントで表した。
【０６３５】
実施例１４８：ＰＤＥ４Ｂの部位特異的変異誘発
ＰＤＥ４Ｂの変異誘発は，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｅｄｓ．Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．（１９９５）ＩＳＢＮ１−８９８４８６−０１−８，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＰＯ  Ｂｏｘ１，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．，に記載されている方法にしたがって行うことができる。
【０６３６】
インビトロ部位特異的変異誘発はタンパク質構造−機能相関，遺伝子発現およびベクターの改変を研究するために非常に貴重な手法である。文献にはいくつかの方法がみられるが，これらの方法の多くはテンプレートとして一本鎖ＤＮＡを必要とする。その理由は，歴史的に，再アニーリングを防止するために相補鎖を分離することが必要であったからである。部位特異的変異誘発においてＰＣＲを用いることによって，変性工程を用いて相補鎖を分離し，ＰＣＲプライマーの効率的な重合を可能とすることにより，鎖分離を行うことができる。したがって，ＰＣＲ部位特異的方法は，事実上いかなる二本鎖プラスミド中にも部位特異的変異を取り込ませることができ，Ｍ１３系のベクターや一本鎖レスキューを必要としない。
【０６３７】
ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発を行う場合には，任意の（望ましくない）二次部位変異のクローン増殖を防止するためにＰＣＲの間のサイクル数を減少させることがしばしば望ましい。限定されたサイクリングにより生成物の収率が低下することは，出発テンプレート濃度を増加させることにより補う。選択を用いて反応から来る親分子の数を減少させる。また，１つのＰＣＲプライマーセットを用いるために，長いＰＣＲ法を最適化することが望ましい。さらに，いくつかの熱安定性ポリメラーゼのエクステンダーゼ活性のため，ＰＣＲプライマーの一方または両方に変異が組み込まれているＰＣＲ生成産物の末端と末端とをライゲーションさせる前に，手順の中に末端を磨く工程を組み込むことがしばしば必要である。
【０６３８】
以下のプロトコルは，部位特異的変異誘発のための容易な方法を提供し，以下の工程を組み込むことにより上述の望ましい特徴を達成する：（ｉ）テンプレート濃度を慣用のＰＣＲ条件より約１０００倍増加させる；（ｉｉ）サイクル数を２５−３０から５−１０に減少させる；（ｉｉｉ）制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３，ここでＡ残基はメチル化されている）を加えて，親ＤＮＡに対して選択する（注：Ｅ．ｃｏｌｉのほぼすべての一般的な株から単離されたＤＮＡは配列５−ＧＡＴＣ−３でＤａｍ−メチル化されている）；（ｉｖ）ＰＣＲの信頼性を１０ｋｂまで高めるためにＰＣＲミックス中でＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒを使用する；（ｖ）ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ産物の末端を磨く，および（ｖｉ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で効率的な分子内ライゲーションを行う。
【０６３９】
プラスミドテンプレートＤＮＡ（約０．５ｐｍｏｌｅ）を，２５μｌの１ｘ変異誘発バッファ（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５；８ｍＭＭｇＣｌ２；４０ｕｇ／ｍｌＢＳＡ）中に１２−２０ｐｍｏｌｅの各プライマー（このうちの１つは５’リン酸を含んでいなければならない），各２５０μＭのｄＮＴＰ，２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，２．５ＵのＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含むＰＣＲカクテルに加える。
【０６４０】
ＰＣＲサイクルパラメータは以下のとおりである：９４℃４分間，５０℃２分間，７２℃２分間を１サイクル，次に，９４℃１分間，５４℃２分間および７２℃１分間を５−１０サイクル（工程１）。
【０６４１】
親テンプレートＤＮＡおよび新たに合成されたＤＮＡを取り込んだ直線化した変異誘発プライマーをＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。これにより，インビボメチル化親テンプレートおよびハイブリッドＤＮＡがＤｐｎＩで消化され，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにより直線状ＰＣＲ産物上のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基が除かれる。
【０６４２】
反応液を３７℃で３０分間インキュベートし，次に７２℃に移してさらに３０分間インキュベートする（工程２）。
【０６４３】
変異誘発バッファ（１ｘ，１１５μｌ，０．５ｍＭＡＴＰを含む）を，ＤｐｎＩ消化，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ処理ＰＣＲ産物に加える。
【０６４４】
溶液を混合し，１０μｌを新たなマイクロフュージチューブに入れ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２−４Ｕ）を加える。
【０６４５】
ライゲーション溶液を３７℃で６０分以上インキュベートする（工程３）。
【０６４６】
処置した溶液をコンピテントＥ．ｃｏｌｉにトランスフォーメーションする（工程４）。
【０６４７】
上述したＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発に加えて，他の方法も利用可能である。例えば，以下に記載されている方法：Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８−４９２；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：８７６４−８７８５；およびＰｒｏｍｅｇａのＧｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒ（商標）部位特異的変異誘発システムを用いる方法がある。
【０６４８】
本明細書において引用されるすべての特許および他の参考文献は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示しており，表および図面を含めその全体を，それぞれの参考文献の全体が個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０６４９】
当業者は，本発明は，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に好ましい態様の代表的なものとして記載される方法，変種および組成物は，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，その改変および他の用途をなすであろう。これらの改変は本発明の精神の中に包含され，特許請求の範囲により定義される。
【０６５０】
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。例えば，ＰＤＥ４Ｂタンパク質についての結晶化または共結晶化条件および／または種々のホスホジエステラーゼドメイン配列についての変形物を用いることができる。すなわち，そのような追加の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【０６５１】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。したがって，例えば，本明細書のそれぞれの場合について，"・・・を含む"，"本質的に・・・からなる"および"・・・からなる"との用語は，互いに他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではなく，そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の同等物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０６５２】
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語または他の代替物のグループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループのすべての個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【０６５３】
また，特に断らない限り，ある態様について種々の数値が与えられている場合，追加の態様は，任意の２つの異なる数値を範囲の終点としてとることにより記述される。そのような範囲もまた本明細書に記載される発明の範囲内である。
【０６５４】
すなわち，追加の態様も本発明の範囲内であり，特許請求の範囲の範囲内である。
【０６５５】
【表１】
2008512380.tif 000170
【０６５６】
【表２】
2008512380.tif 000171
【０６５７】
【表３】
2008512380.tif 000172
【０６５８】
【表４】
2008512380.tif 000173
【０６５９】
【表５】
2008512380.tif 000174
【０６６０】
【表６】
2008512380.tif 000175
【０６６１】
【表７】
2008512380.tif 000176
【０６６２】
【表８】
2008512380.tif 000177
【０６６３】
【表９】
2008512380.tif 000178
【０６６４】
【表１０】
2008512380.tif 000179
【０６６５】
【表１１】
2008512380.tif 000180
【０６６６】
【表１２】
2008512380.tif 000181
【０６６７】
【表１３】
2008512380.tif 000182
【０６６８】
【表１４】
2008512380.tif 000183
【０６６９】
【表１５】
2008512380.tif 000184
【０６７０】
【表１６】
2008512380.tif 000185
【０６７１】
【表１７】
2008512380.tif 000186
【０６７２】
【表１８】
2008512380.tif 000187
【０６７３】
【表１９】
2008512380.tif 000188
【０６７４】
【表２０】
2008512380.tif 000189
【０６７５】
【表２１】
2008512380.tif 000190
【０６７６】
【表２２】
2008512380.tif 000191
【０６７７】
【表２３】
2008512380.tif 000192
【０６７８】
【表２４】
2008512380.tif 000193
【０６７９】
【表２５】
2008512380.tif 000194
【０６８０】
【表２６】
2008512380.tif 000195
【０６８１】
【表２７】
2008512380.tif 000196
【０６８２】
【表２８】
2008512380.tif 000197
【０６８３】
【表２９】
2008512380.tif 000198
【０６８４】
【表３０】
2008512380.tif 000199
【０６８５】
【表３１】
2008512380.tif 000200
【０６８６】
【表３２】
2008512380.tif 000201
【０６８７】
【表３３】
2008512380.tif 000202
【０６８８】
【表３４】
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【０６８９】
【表３５】
2008512380.tif 000204
【０６９０】
【表３６】
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【０６９１】
【表３７】
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【０６９２】
【表３８】
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【０６９３】
【表３９】
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【０６９４】
【表４０】
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【０６９５】
【表４１】
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【０６９６】
【表４２】
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【０６９７】
【表４３】
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【０６９８】
【表４４】
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【０６９９】
【表４５】
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【０７００】
【表４６】
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【０７０１】
【表４７】
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【０７０２】
【表４８】
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【０７０３】
【表４９】
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【０７０４】
【表５０】
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【０７０５】
【表５１】
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【０７０６】
【表５２】
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【０７０７】
【表５３】
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【０７０８】
【表５４】
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【０７０９】
【表５５】
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【０７１０】
【表５６】
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【０７１１】
【表５７】
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【０７１２】
【表５８】
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【０７１３】
【表５９】
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【０７１４】
【表６０】
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【０７１５】
【表６１】
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【０７１６】
【表６２】
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【０７１７】
【表６３】
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【０７１８】
【表６４】
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【０７１９】
【表６５】
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【０７２０】
【表６６】
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【０７２１】
【表６７】
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【０７２２】
【表６８】
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【０７２３】
【表６９】
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【０７２４】
【表７０】
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【０７２５】
【表７１】
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【０７２６】
【表７２】
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【０７２７】
【表７３】
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【０７２８】
【表７４】
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【０７２９】
【表７５】
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【０７３０】
【表７６】
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【０７３１】
【表７７】
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【０７３２】
【表７８】
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【０７３３】
【表７９】
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【０７３４】
【表８０】
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【０７３５】
【表８１】
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【０７３６】
【表８２】
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【０７３７】
【表８３】
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【０７３８】
【表８４】
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【０７３９】
【表８５】
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【０７４０】
【表８６】
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【０７４１】
【表８７】
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【０７４２】
【表８８】
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【０７４３】
【表８９】
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【０７４４】
【表９０】
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【０７４５】
【表９１】
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【０７４６】
【表９２】
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【０７４７】
【表９３】
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【０７４８】
【表９４】
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【０７４９】
【表９５】
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【０７５０】
【表９６】
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【０７５１】
【表９７】
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【０７５２】
【表９８】
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【０７５３】
【表９９】
2008512380.tif 000268
【０７５４】
【表１００】
2008512380.tif 000269
【０７５５】
【表１０１】
2008512380.tif 000270
【０７５６】
【表１０２】
2008512380.tif 000271
【０７５７】
【表１０３】
2008512380.tif 000272
【０７５８】
【表１０４】
2008512380.tif 000273
【０７５９】
【表１０５】
2008512380.tif 000274
【０７６０】
【表１０６】
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【０７６１】
【表１０７】
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【０７６２】
【表１０８】
2008512380.tif 000277
【０７６３】
【表１０９】
2008512380.tif 000278
【０７６４】
【表１１０】
2008512380.tif 000279
【０７６５】
【表１１１】
2008512380.tif 000280
【０７６６】
【表１１２】
2008512380.tif 000281
【０７６７】
【表１１３】
2008512380.tif 000282
【０７６８】
【表１１４】
2008512380.tif 000283
【０７６９】
【表１１５】
2008512380.tif 000284
【０７７０】
【表１１６】
2008512380.tif 000285
【０７７１】
【表１１７】
2008512380.tif 000286
【０７７２】
【表１１８】
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【０７７３】
【表１１９】
2008512380.tif 000288
【０７７４】
【表１２０】
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【０７７５】
【表１２１】
2008512380.tif 000290
【０７７６】
【表１２２】
2008512380.tif 000291
【０７７７】
【表１２３】
2008512380.tif 000292
【０７７８】
【表１２４】
2008512380.tif 000293
【０７７９】
【表１２５】
2008512380.tif 000294
【０７８０】
【表１２６】
2008512380.tif 000295
【０７８１】
【表１２７】
2008512380.tif 000296
【０７８２】
【表１２８】
2008512380.tif 000297
【０７８３】
【表１２９】
2008512380.tif 000298
【０７８４】
【表１３０】
2008512380.tif 000299
【０７８５】
【表１３１】
2008512380.tif 000300
【０７８６】
【表１３２】
2008512380.tif 000301
【０７８７】
【表１３３】
2008512380.tif 000302
【０７８８】
【表１３４】
2008512380.tif 000303
【０７８９】
【表１３５】
2008512380.tif 000304
【０７９０】
【表１３６】
2008512380.tif 000305
【０７９１】
【表１３７】
2008512380.tif 000306
【０７９２】
【表１３８】
2008512380.tif 000307
【０７９３】
【表１３９】
2008512380.tif 000308
【０７９４】
【表１４０】
2008512380.tif 000309
【０７９５】
【表１４１】
2008512380.tif 000310
【０７９６】
【表１４２】
2008512380.tif 000311
【０７９７】
【表１４３】
2008512380.tif 000312
【０７９８】
【表１４４】
2008512380.tif 000313
【０７９９】
【表１４５】
2008512380.tif 000314
【０８００】
【表１４６】
2008512380.tif 000315
【０８０１】
【表１４７】
2008512380.tif 000316
【０８０２】
【表１４８】
2008512380.tif 000317
【０８０３】
【表１４９】
2008512380.tif 000318
【０８０４】
【表１５０】
2008512380.tif 000319
【０８０５】
【表１５１】
2008512380.tif 000320
【０８０６】
【表１５２】
2008512380.tif 000321
【０８０７】
【表１５３】
2008512380.tif 000322
【０８０８】
【表１５４】
2008512380.tif 000323
【０８０９】
【表１５５】
2008512380.tif 000324
【０８１０】
【表１５６】
2008512380.tif 000325
【０８１１】
【表１５７】
2008512380.tif 000326
【０８１２】
【表１５８】
2008512380.tif 000327
【０８１３】
【表１５９】
2008512380.tif 000328
【０８１４】
【表１６０】
2008512380.tif 000329
【０８１５】
【表１６１】
2008512380.tif 000330
【０８１６】
【表１６２】
2008512380.tif 000331
【０８１７】
【表１６３】
2008512380.tif 000332
【０８１８】
【表１６４】
2008512380.tif 000333
【０８１９】
【表１６５】
2008512380.tif 000334
【０８２０】
【表１６６】
2008512380.tif 000335
【０８２１】
【表１６７】
2008512380.tif 000336
【０８２２】
【表１６８】
2008512380.tif 000337
【０８２３】
【表１６９】
2008512380.tif 000338
【０８２４】
【表１７０】
2008512380.tif 000339
【０８２５】
【表１７１】
2008512380.tif 000340
【０８２６】
【表１７２】
2008512380.tif 000341
【０８２７】
【表１７３】
2008512380.tif 000342
【０８２８】
【表１７４】
2008512380.tif 000343
【０８２９】
【表１７５】
2008512380.tif 000344
【０８３０】
【表１７６】
2008512380.tif 000345
【０８３１】
【表１７７】
2008512380.tif 000346
【０８３２】
【表１７８】
2008512380.tif 000347
【０８３３】
【表１７９】
2008512380.tif 000348
【図面の簡単な説明】
【０８３４】
【図１】図１は，表３の配列を有するＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのリボンダイアグラム図解表示である。
【図２】図２は，今回のＰＤＥ４Ｂ構造と先に報告されているＰＤＥ４Ｂ結晶構造とのリボンダイアグラム図解表示の重ね合わせを示し，有意に構造が異なることが示される。
【図１】
2008512380.tif 000361
【図２】
2008512380.tif 000362
【配列表】
2008512380000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月4日(2007.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学構造：
【化１】
2008512380.tif 000366
［式中、
ｋは、−ＣＲ６Ｒ７Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，またはＮＲ９であり；
ｔはＣＨであり；
ｙは、ＮまたはＣＨであり；
ｖ，ｗおよびｘはＣＨであり；
Ａは、以下からなる群より選択される構造を有しており：
【化２】
2008512380.tif 000367
Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ８は、それぞれの場合に独立して、−ＯＲ９，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ８がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない）、任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ８がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ９は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ９がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ９がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１０および／またはＲ１１がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１０および／またはＲ１１がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択されるか；または
Ｒ１０およびＲ１１は、これらが結合している窒素と一緒になって、５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し；
Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１２および／またはＲ１３がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１２および／またはＲ１３がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択されるか；または
Ｒ１２およびＲ１３は、これらが結合している窒素と一緒になって、５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し；
Ｒ１４は、それぞれの場合に独立して、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１４がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１４がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１５は、それぞれの場合に独立して、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１５がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１５がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択されるか；または
各Ｒ１５は、これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環に縮合している５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１６は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１６がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１６がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択され；
Ｒ１７は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１７がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない）、任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１７がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない）、任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１８は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；および
Ｒ１９は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択される；
ただし、化合物は以下
【化３】
2008512380.tif 000368
の化合物ではない］
を有する化合物、これらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体。
【請求項２】
ｙがＣＨである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｙがＮである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
式中、ｋは、−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，
ここで、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい、請求項３または９９のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ａが以下の構造：
【化４】
2008512380.tif 000369
を有する、請求項３または９９のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
以下の構造：
【化５】
2008512380.tif 000370
を有する、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
以下の構造：
【化６】
2008512380.tif 000371
を有する、請求項５記載の化合物。
【請求項８】
以下の構造：
【化７】
2008512380.tif 000372
を有する、請求項５記載の化合物。
【請求項９】
ｋは−ＣＨ２Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；および
Ｒ８，Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，およびＲ１９は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され，
ここで、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよい低級チオアルキル，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいカルボキシル，任意に置換されていてもよいアルキルスルホニルアミノ，シアノおよびニトロからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１５は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択されるか，または各Ｒ１５は，これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環と縮合した５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよい，請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１５が任意に置換されていてもよい低級アルキルであるとき，低級アルキルは，フルオロ，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいアリールおよび任意に置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択される１−３個の置換基で任意に置換されていてもよい，請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１−１１，９６−９８または９９のいずれかに記載の化合物および薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項１３】
ＰＤＥ４Ｂの調節が治療上の利益を与える疾病または状態に罹患しているかまたはそのリスクを有する被験者を治療する方法であって，以下：
【化８】
2008512380.tif 000373
［式中，
ｋは，−ＣＲ６Ｒ７Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
Ｚは，Ｏ，Ｓ，またはＮＲ９であり；
ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙは，それぞれ独立して，ＮまたはＣＲ１であり，ただし，ｕおよびｔの１つ以下がＮであり，およびｖ，ｗ，ｘおよびｙの２つ以下がＮであり；
Ｒ１は，それぞれの場合に独立して，水素，ハロゲン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４，およびＡからなる群より選択され，ただし，少なくとも１つのＲ１はＡであり；
Ａは，置換アリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ８は，それぞれの場合に独立して，−ＯＲ９，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ８がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ８がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ９は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ９がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ９がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１０および／またはＲ１１がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択されるか；または
Ｒ１０およびＲ１１は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１２およびＲ１３は，それぞれの場合に独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１２および／またはＲ１３がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択されるか；または
Ｒ１２およびＲ１３は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成してもよく；
Ｒ１４は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１４がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１４がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；および
Ｒ１９は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択される］
の化学構造を有する有効量の化合物を前記被験者に投与することを含む方法。
【請求項１４】
Ａは，
【化９】
2008512380.tif 000374
［式中，
Ｒ１５は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１５がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１５がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択されるか；または
各Ｒ１５は，これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環に縮合している５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよく；
Ｒ１６は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１６がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１６がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択され；
Ｒ１７は，それぞれの場合に独立して，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，Ｒ１７がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，Ｒ１７がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；および
Ｒ１８は，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択される］
からなる群より選択される構造を有する，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ａは，以下の構造：
【化１０】
2008512380.tif 000375
を有する，請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，およびｙの１個以下はＮである，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ｔはＣＨであり，ｙはＮであり，ｕ，ｖ，ｗ，およびｘの１つはＣ−Ａであり，およびｕ，ｖ，ｗおよびｘの他のものはＣＨである，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
化合物が以下の構造：
【化１１】
2008512380.tif 000376
を有する，請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物がヒトへの投与用に認可されている，請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記疾病または状態は，ＰＤＥ４Ｂ媒介性疾病または状態である，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記疾病または状態が，喘息，気管支炎，アレルギー性気管支炎，慢性閉塞性肺疾患，嚢胞性線維症，特発性肺線維症，サルコイドーシス，肺高血圧症，アレルギー性気管支炎，気腫，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンティングトン舞踏病，多発性硬化症，慢性関節リウマチ，クローン病，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，アトピー性皮膚炎，骨粗鬆症，大理石骨病，パジェット病，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ球性白血病，急性リンパ芽球性白血病，重症急性呼吸器症候群，および早期陣痛からなる群より選択される，請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
請求項１２記載の組成物を含むキット。
【請求項２３】
前記組成物がヒトへの投与について認可されたものであることを示す文書をさらに含む，請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
前記組成物が，喘息，気管支炎，アレルギー性気管支炎，慢性閉塞性肺疾患，嚢胞性線維症，特発性肺線維症，サルコイドーシス，肺高血圧症，アレルギー性気管支炎，気腫，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンティングトン舞踏病，多発性硬化症，慢性関節リウマチ，クローン病，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，アトピー性皮膚炎，骨粗鬆症，大理石骨病，パジェット病，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ球性白血病，急性リンパ芽球性白血病，重症急性呼吸器症候群，および早期陣痛からなる群より選択される適応症について認可されたものである，請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
ＰＤＥ４に対して活性な改良された調節剤を開発する方法であって，
式Ｉにしたがう複数の試験化合物のいずれかがＰＤＥ４に対して活性な参照化合物と比較して改良された１またはそれ以上の所望の薬理学的特性を与えるか否かを判定し；そして
前記所望の薬理学的特性について改良を有する化合物を選択し，このことにより改良された調節剤を得る，ことを含む方法。
【請求項２６】
前記所望の薬理学的特性が，ＰＤＥ４Ｂに対してＰＤＥ４Ｄより少なくとも１０倍高い活性である，請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記所望の薬理学的特性が，０．１０μＭ未満のＩＣ５０である，請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記参照化合物が式Ｉの化合物である，請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記改良された調節剤の少なくとも１つの誘導体が試験化合物として用いられ，および前記判定および選択が繰り返される，請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
ＰＤＥ４Ｂに対して改良された特異性を有するリガンドを開発する方法であって，
複数のホスホジエステラーゼに結合する化合物を同定し；そして
前記化合物の誘導体がＰＤＥ４Ｂに対して前記化合物より高い特異性を有するか否かを判定し，このことにより，ＰＤＥ４Ｂに対して改良された特異性を有するリガンドを得る，ことを含む方法。
【請求項３１】
前記化合物が前記複数のホスホジエステラーゼのいずれに対するものより少なくとも１０倍高い親和性をもってＰＤＥ４Ｂに結合する，請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物は，少なくとも１つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用する，請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物は，前記複数のホスホジエステラーゼに弱く結合する，請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記複数のホスホジエステラーゼはＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄを含む，請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
前記複数のホスホジエステラーゼはＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ５Ａを含む，請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物は式Ｉの化合物である，請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
表１または２に示される座標を有する，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの結晶形を含む結晶。
【請求項３８】
さらにもう１つの重金属原子を含む，請求項３７記載の結晶。
【請求項３９】
前記結晶形は，ＰＤＥ４Ｂと結合化合物との共結晶を含む，請求項３７記載の結晶。
【請求項４０】
前記結合化合物は，少なくとも１つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用する，請求項３９記載の結晶形。
【請求項４１】
前記共結晶がＸ線ビーム中にある，請求項３９記載の結晶形。
【請求項４２】
前記結晶がＸ線ビーム中にある，請求項３７記載の結晶形。
【請求項４３】
ＰＤＥ４Ｂの結晶を得る方法であって，ＰＤＥ４Ｂ蛋白質を５−２０ｍｇ／ｍｌで，３０％ＰＥＧ４００，０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５），１ｍＭの結合化合物，４℃；または２０％ＰＥＧ３０００，０．２Ｍ  Ｃａ（ＯＡｃ）２，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０），１ｍＭの結合化合物，１５．９ｍｇ／ｍｌの蛋白質，４℃；または１．８Ｍ−２．０Ｍ硫酸アンモニウム，０．１Ｍ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．０−１０．５），０．２Ｍ硫酸リチウムと実質的に同等の結晶化条件に供することを含む方法。
【請求項４４】
さらに，前記結晶化条件を最適化することを含む，請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｂ結合化合物との共結晶であって，前記結合化合物は式Ｉの化合物を含む共結晶。
【請求項４６】
前記共結晶がＸ線ビーム中にある，請求項４５記載の共結晶。
【請求項４７】
ホスホジエステラーゼの構造を決定する方法であって，
ＰＤＥ４Ｂ構造の電子表示からホモロジーモデルを作成し，ここで，前記ＰＤＥ４Ｂ構造は，表１または２の原子座標を表し；そして
前記ホモロジーモデルをホスホジエステラーゼの前記構造と同等とみなす，ことを含む方法。
【請求項４８】
前記作成することが，
ＰＤＥ４Ｂと前記ホスホジエステラーゼとの間で保存されているアミノ酸残基を同定し；
前記ＰＤＥ４Ｂ構造中の複数の保存アミノ酸の原子座標を前記ホスホジエステラーゼの対応するアミノ酸に移動させて，前記ホスホジエステラーゼの概略構造を提供し；そして
前記ホスホジエステラーゼ中の残りのアミノ酸残基の構造の電子表示を用いて前記ホスホジエステラーゼの残部を表す構造を構築する，
ことを含む，請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
さらに，前記ホモロジーモデルを，前記ホスホジエステラーゼの１またはそれ以上の結晶からの低解像度Ｘ線回折データとフィッティングさせることを含む，請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
表１または２からの保存残基の座標を用いる，請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記ホスホジエステラーゼがＰＤＥ５Ａである，請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
表１または２に示される座標に対応する原子座標表示を含む，ＰＤＥ４Ｂの結晶構造の電子表示。
【請求項５３】
図解表示を含む，請求項５２記載の電子表示。
【請求項５４】
前記ＰＤＥ４Ｂは本質的にＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインからなる，請求項５２記載の電子表示。
【請求項５５】
ＰＤＥ４Ｂに基づくホスホジエステラーゼのホモロジーモデルの電子表示であって，ここで，前記ホモロジーモデルは，表１または２の保存残基原子座標を利用することを特徴とする電子表示。
【請求項５６】
生物学的因子を開発する方法であって，ＰＤＥ４Ｂ結晶構造を分析し，そして前記生物学的因子を形成するための少なくとも１つの基礎構造を同定することを含む方法。
【請求項５７】
前記基礎構造はエピトープを含み，および前記方法はさらに，前記エピトープに対する抗体を開発することを含む，請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記基礎構造は変更された活性を与えると予測される変異部位を含み，および前記方法はさらに，前記部位において変異を作成し，このことにより改変されたＰＤＥ４Ｂを得ることを含む，請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
前記基礎構造は，別の成分が付着するための付着点を含む，請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
前記別の成分は，ペプチド，ポリペプチド，固相材料，リンカー，および標識からなる群より選択される，請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
前記別の成分を付着させることをさらに含む，請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
ＰＤＥ４Ｂに結合する可能性を有する化合物を同定する方法であって，化合物の少なくとも１つの電子表示をＰＤＥ４Ｂ結合部位の電子表示中でフィッティングさせることを含み，ここで，前記結合部位は，表４からの保存結合部位残基の座標の電子表示を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
前記電子表示がさらに，前記結合部位において複合体を形成している結合化合物の電子表示を含む，請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
ＰＤＥ４Ｂと複合体形成した化合物のコンピュータ表示を除去し，そしてコンピュータデータベースからの化合物のコンピュータ表示をＰＤＥ４Ｂの活性部位のコンピュータ表示とフィッティングさせ；そして
好都合な幾何学的フィットおよびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて前記活性部位に最もよくフィットする化合物を潜在的結合化合物として同定する，
ことを含む，請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
ＰＤＥ４Ｂと複合体形成した化合物のコンピュータ表示を，１またはそれ以上の化学基の欠失または付加またはその両方により改変し；
コンピュータデータベースからの化合物のコンピュータ表示をＰＤＥ４Ｂの活性部位のコンピュータ表示とフィッティングさせ；そして
好都合な幾何学的フィットおよびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて前記活性部位に最もよくフィットする化合物を潜在的結合化合物として同定する，
ことを含む，請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
ＰＤＥ４Ｂと複合体形成した化合物のコンピュータ表示を除去し；そして
化合物検索コンピュータプログラムを用いて前記化合物と構造的類似性を有する化合物についてデータベースを検索するか，または化合物構築コンピュータプログラムを用いて前記化合物の一部を類似する化学構造で置き換える，
ことを含む，請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
ＰＤＥ４Ｂと複合体を形成する前記化合物が非加水分解性ｃＧＭＰ類似体である，請求項６３記載の方法。
【請求項６８】
前記フィッティングが，前記化合物が保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基の１またはそれ以上と相互作用するか否かを判定することを含む，請求項６２記載の方法。
【請求項６９】
ＰＤＥ４Ｂ結合化合物またはその誘導体を，前記ＰＤＥ４Ｂ結合化合物の実質的なＰＤＥ４Ｂ結合を保持するように付着成分に結合させる方法であって，前記ＰＤＥ４Ｂ結合化合物またはその誘導体を前記付着成分の結合についてエネルギー的に許容される部位に結合させることを含む方法。
【請求項７０】
前記付着成分が固相媒体に結合させるためのリンカーであり，および前記方法がさらに，前記化合物または誘導体を前記エネルギー的に許容される部位に結合したリンカーを介して固相媒体に結合させることを含む，請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記ホスホジエステラーゼが，少なくとも１つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基とマッチする保存残基を含む，請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記リンカーは無痕跡リンカーである，請求項７０記載の方法。
【請求項７３】
前記ホスホジエステラーゼ結合化合物またはその誘導体が前記固相媒体に結合した前記リンカー上で合成される，請求項７０記載の方法。
【請求項７４】
複数の前記化合物または誘導体がコンビナトリアル合成で合成される，請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記化合物の前記固相媒体への付着により親和性媒体が生ずる，請求項７０記載の方法。
【請求項７６】
前記付着成分は標識を含む，請求項６９記載の方法。
【請求項７７】
前記標識は蛍光団を含む，請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
ＰＤＥ４Ｂ結合化合物と，前記改変型化合物のＰＤＥ４Ｂへの結合がエネルギー的に許容される部位においてこれに結合したリンカー成分を含む改変型化合物。
【請求項７９】
前記リンカーは固相に付着されている，請求項７８記載の化合物。
【請求項８０】
前記リンカーは，標識を含むかまたはこれに付着されている，請求項７８記載の化合物。
【請求項８１】
前記リンカーは無痕跡リンカーである，請求項７８記載の化合物。
【請求項８２】
前記結合化合物は式Ｉの化合物である，請求項７８記載の化合物。
【請求項８３】
ホスホジエステラーゼのリガンドを開発する方法であって，前記ホスホジエステラーゼは，１またはそれ以上の保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基にマッチした保存残基を含んでおり，該方法は，前記ホスホジエステラーゼに結合するＰＤＥ４Ｂ結合化合物が結晶構造中において前記１またはそれ以上の保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用するか否かを判定することを含む方法。
【請求項８４】
前記ホスホジエステラーゼは，少なくとも２つの保存ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基とマッチする保存残基を含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
さらに，前記化合物が前記ホスホジエステラーゼを調節するか否かを判定することを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
前記決定することが，前記化合物を前記ホスホジエステラーゼの結合部位においてコンピュータフィッティングさせることを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
さらに，前記ホスホジエステラーゼと前記化合物との共結晶を形成することを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８８】
さらに，前記化合物の前記ホスホジエステラーゼとの結合の向きを決定することを含む，請求項８３記載の方法。
【請求項８９】
前記結合化合物は式Ｉの化合物である，請求項８３記載の方法。
【請求項９０】
ＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｄとの間で選択性を有する化合物を同定する方法であって，
化合物がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄと少なくとも１つの異なる部位で異なるように相互作用するか否かを分析することを含み，ここで，異なる相互作用は前記選択性を示す，ことを特徴とする方法。
【請求項９１】
前記分析が，
前記化合物の電子表示をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示中でフィッティングさせ；そして
前記フィッティングに基づいて，前記化合物が異なるように相互作用するか否かを判定する，
ことを含む，請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
初期化合物の電子表示をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示にフィッティングさせ，ここで，前記初期化合物はＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの両方に結合し；
前記初期化合物の前記電子表示を，少なくとも異なる部位で相互作用する少なくとも１つの成分で改変し；そして
改変された化合物がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに異なるように結合するか否かを判定する，
ことを含む，請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
前記改変された化合物が前記初期化合物と異なるより高い程度で結合する，請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
さらに，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに対して異なるように相互作用する化合物を異なる活性についてアッセイすることを含む，請求項９０記載の方法。
【請求項９５】
前記化合物が式Ｉの化合物である，請求項９０記載の方法。
【請求項９６】
以下の化学構造：
【化１２】
2008512380.tif 000377
［式中、
ｋは、−ＣＲ６Ｒ７Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，またはＮＲ９であり；
ｔは、ＮまたはＣＨであり；
ｙはＮまたはＣＨであり，ただし、ｔおよびｙの両方ともがＮではなく；
ｖ，ｗおよびｘはＣＨであり；
Ａは、以下からなる群より選択される構造を有し：
【化１３】
2008512380.tif 000378
Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ８は、それぞれの場合に独立して、−ＯＲ９，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ８がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない）、任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ８がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ９は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ９がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ９がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１０および／またはＲ１１がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１０および／またはＲ１１がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択されるか；または
Ｒ１０およびＲ１１は、これらが結合している窒素と一緒になって、５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し；
Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１２および／またはＲ１３がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１２および／またはＲ１３がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択されるか；または
Ｒ１２およびＲ１３は、これらが結合している窒素と一緒になって、５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し；
Ｒ１４は、それぞれの場合に独立して、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１４がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１４がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１５は、それぞれの場合に独立して、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１５がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１５がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択されるか；または
各Ｒ１５は、これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環に縮合している５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１６は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１６がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１６がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択され；
Ｒ１７は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１７がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない）、任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１７がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない）、任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１８は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；および
Ｒ１９は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
ただし、化合物は以下
【化１４】
2008512380.tif 000379
の化合物ではない］
を有する化合物、これらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体。
【請求項９７】
以下：
【化１５】
2008512380.tif 000380
［式中、
ｋは、−ＣＲ６Ｒ７Ｒ１９，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；
ＺはＯ，Ｓ，またはＮＲ９であり；
ｔはＮまたはＣＨであり；
ｙはＮまたはＣＨであり，ただし、ｔおよびｙの両方ともがＮではなく；
ｕ，ｖ，ｗおよびｘはＣＨであり；
Ａは、以下からなる群より選択される構造を有し：
【化１６】
2008512380.tif 000381
Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ８は、それぞれの場合に独立して、−ＯＲ９，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ８がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない）、任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ８がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＣ（Ｚ）には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ９は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ９がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ９がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＯ，ＮまたはＳには結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１０および／またはＲ１１がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１０および／またはＲ１１がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択されるか；または
Ｒ１０およびＲ１１は、これらが結合している窒素と一緒になって、５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し；
Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれの場合に独立して、水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１２および／またはＲ１３がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１２および／またはＲ１３がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は窒素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択されるか；または
Ｒ１２およびＲ１３は、これらが結合している窒素と一緒になって、５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルまたは任意に置換されていてもよいヘテロアリール環を形成し；
Ｒ１４は、それぞれの場合に独立して、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１４がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１４がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は−Ｓ（Ｏ）２−には結合していない）、任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１５は、それぞれの場合に独立して、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１５がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１５がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択されるか；または
各Ｒ１５は、これらが結合している酸素と一緒になって，フェニル環に縮合している５−７員の任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１６は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１６がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１６がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素は酸素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，および−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３からなる群より選択され；
Ｒ１７は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし、Ｒ１７がアルケニルであるとき，そのアルケン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない）、任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし、Ｒ１７がアルキニルであるとき，そのアルキン炭素はＮ，Ｏ，またはＳには結合していない）、任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ１８は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｚ）Ｒ８，−ＯＲ９，−ＳＲ９，−ＮＲ１０Ｒ１１，−Ｃ（Ｚ）ＮＲ１２Ｒ１３，−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１２Ｒ１３，および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４からなる群より選択され；および
Ｒ１９は、任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択される］
からなる群より選択される化学構造を有する化合物、これらのすべての塩，プロドラッグ，互変異性体および異性体。
【請求項９８】
ｔおよびｙがＣＨである、請求項９７記載の化合物。
【請求項９９】
ｔがＣＨであり、ｙがＮである、請求項９７記載の化合物。
【国際調査報告】
2008512380.tif 000382
2008512380.tif 000383
2008512380.tif 000384
2008512380.tif 000385
2008512380.tif 000386
2008512380.tif 000387