(57)【要約】【課題】本発明の目的は、高い発光強度を示す生物発光共鳴エネルギー移動が生じるキメラタンパク質を提供することにある。【解決手段】実施形態に係るキメラタンパク質は、Ｎ末端側に位置する蛍光タンパク質、Ｃ末端側に位置する発光タンパク質および前記蛍光タンパク質と前記発光タンパク質との間に位置するリンカーから成り、前記蛍光タンパク質と前記発光タンパク質との間で生物発光共鳴エネルギー移動が生じる。そして、前記リンカーは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＧＳＧＧＸ１Ｘ２ＶＤＧＴＰＸ３ＱＸ４ＷＬというアミノ酸配列（配列番号１）を含み、Ｘ１はＤまたはＡであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＷまたはＲであり、Ｘ４はＲまたはＰである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端側に位置する蛍光タンパク質、Ｃ末端側に位置する発光タンパク質および前記蛍光タンパク質と前記発光タンパク質との間に位置するリンカーから成り、前記蛍光タンパク質と前記発光タンパク質との間で生物発光共鳴エネルギー移動が生じるキメラタンパク質であって、
前記リンカーは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＧＳＧＧＸ１Ｘ２ＶＤＧＴＰＸ３ＱＸ４ＷＬというアミノ酸配列（配列番号１）を含み、Ｘ１はＤまたはＡであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＷまたはＲであり、Ｘ４はＲまたはＰであるキメラタンパク質。
【請求項２】
前記リンカーは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＴＭＶＳＫＧＳＧＧＤＥＶＤＧＴＰＷＱＲＷＬというアミノ酸配列（配列番号２）またはＧＳＧＧＡＧＶＤＧＴＰＲＱＰＷＬというアミノ酸配列（配列番号３）を含む請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記発光タンパク質は、４５０から５００ｎｍの最大発光波長で発光する発光タンパク質であり、前記蛍光タンパク質は、４５０から５００ｎｍの波長の光によって励起される蛍光タンパク質である請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記発光タンパク質は、セレンテラジンまたはその類縁体を基質とする発光タンパク質である請求項３に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記発光タンパク質は、深海エビ由来のルシフェラーゼまたはその改変体、あるいはレニラルシフェラーゼまたはその改変体である請求項４に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記蛍光タンパク質は、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓまたは配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項３に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
配列番号４または配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＧＳＧＧＸ１Ｘ２ＶＤＧＴＰＸ３ＱＸ４ＷＬというアミノ酸配列（配列番号１）を含み、Ｘ１はＤまたはＡであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＷまたはＲであり、Ｘ４はＲまたはＰであり、リンカーとして使用できるポリペプチド。
【請求項９】
ＴＭＶＳＫＧＳＧＧＤＥＶＤＧＴＰＷＱＲＷＬというアミノ酸配列（配列番号２）またはＧＳＧＧＡＧＶＤＧＴＰＲＱＰＷＬというアミノ酸配列（配列番号３）を有する請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸。
【請求項１１】
配列番号１１または配列番号１２に示される塩基配列を有する請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項８に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有する核酸。
【請求項１３】
配列番号１３または配列番号１４に示される塩基配列を有する請求項１０に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、生物発光共鳴エネルギー移動が生じるキメラタンパク質およびそれに含まれるリンカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物発光イメージングやタンパク質間相互作用の研究において、生物発光共鳴エネルギー移動（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＢＲＥＴ）という現象が利用されている。
【０００３】
ＢＲＥＴとは、発光タンパク質が生物発光を触媒したときに生じたエネルギーが、電子の共鳴によって、蛍光タンパク質に移動する現象を意味する。この場合、発光タンパク質は供与体（ドナー）と呼ばれ、蛍光タンパク質は受容体（アクセプター）と呼ばれる。発光タンパク質と蛍光タンパク質とを適切なリンカーを介して融合させることで、発光タンパク質において化学発光を誘導させて、蛍光タンパク質から蛍光を生じさせることができる。
【０００４】
発光タンパク質と蛍光タンパク質とが融合したキメラタンパク質をプローブとして使用する場合、蛍光の発生のために励起光を照射する必要がない。そのため、蛍光タンパク質を使用する場合に生じる褪色や自家蛍光の問題を回避することができ、その結果、高い検出感度で使用することが可能となる。
【０００５】
そのようなＢＲＥＴを生じるキメラタンパク質の例として、特許文献１には、ドナーとしてウミシイタケルシフェラーゼを使用し、アクセプターとしてＹＦＰ等を使用したものが開示されている。
【０００６】
しかしながら、従来のキメラタンパク質によって生じる光の強度は不十分であり、また、その種類も限定的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２８３９５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高い発光強度を示す生物発光共鳴エネルギー移動が生じるキメラタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
実施形態に係るキメラタンパク質は、Ｎ末端側に位置する蛍光タンパク質、Ｃ末端側に位置する発光タンパク質および前記蛍光タンパク質と前記発光タンパク質との間に位置するリンカーから成り、前記蛍光タンパク質と前記発光タンパク質との間で生物発光共鳴エネルギー移動が生じる。そして、前記リンカーは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＧＳＧＧＸ１Ｘ２ＶＤＧＴＰＸ３ＱＸ４ＷＬというアミノ酸配列（配列番号１）を含み、Ｘ１はＤまたはＡであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＷまたはＲであり、Ｘ４はＲまたはＰである。
【００１０】
また、実施形態に係るポリペプチドは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＧＳＧＧＸ１Ｘ２ＶＤＧＴＰＸ３ＱＸ４ＷＬというアミノ酸配列（配列番号１）を含み、Ｘ１はＤまたはＡであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＷまたはＲであり、Ｘ４はＲまたはＰであり、リンカーとして使用できる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高い発光強度を示す生物発光共鳴エネルギー移動が生じるキメラタンパク質が提供され、さらに、汎用性の高いリンカーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施形態に係るキメラタンパク質の一例にＢＲＥＴを生じさせたときの発光スペクトルである。
【図２】図２は、実施形態に係るキメラタンパク質の別の例にＢＲＥＴを生じさせたときの発光スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、キメラタンパク質である。
【００１４】
実施形態に係るキメラタンパク質は、Ｎ末端側に位置する蛍光タンパク質、Ｃ末端側に位置する発光タンパク質および蛍光タンパク質と発光タンパク質との間に位置するリンカーから成る。
【００１５】
蛍光タンパク質は、ＧＦＰやＹＦＰといった、励起光を受けて蛍光を発するあらゆるタンパク質であってよい。ＢＲＥＴ効率の観点から、青い光、すなわち４５０−５００ｎｍの波長の励起光によって励起しやすいものが好ましく、その例は、ＹＦＰおよびＹＦＰ誘導体である。ＹＦＰのアミノ酸配列は配列番号８に示される。ＹＦＰ誘導体の一例は、Ｖｅｎｕｓである。Ｖｅｎｕｓのアミノ酸配列は配列番号９に示される。ＹＦＰ誘導体の別の例は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、これはＹＦＰのＣ末側が欠落したものである。
【００１６】
発光タンパク質は、化学発光を触媒するあらゆるタンパク質であってよい。発光タンパク質の例はルシフェラーゼである。ルシフェラーゼの例は、ホタルに由来するもの、バクテリアに由来するもの、および海洋生物に由来するものである。
【００１７】
発光タンパク質は、４５０から５００ｎｍの最大発光波長で発光する発光タンパク質であることが好ましい。そのような発光タンパク質の例は、海洋生物に由来するルシフェラーゼである。海洋生物に由来するルシフェラーゼの多くは、セレンテラジンまたはその類縁体を基質（イミダゾピラジン骨格を有する基質）としており、その一例は、ウミシイタケに由来するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのアミノ酸配列を配列番号６に示す。別の例は、深海エビに由来するルシフェラーゼであり、これはプロメガ株式会社からＮａｎｏＬｕｃという名称で市販されている。ＮａｎｏＬｕｃのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００１８】
リンカーは、蛍光タンパク質と発光タンパク質とをつなぐポリペプチドである。リンカーは、蛍光タンパク質と発光タンパク質との間でＢＲＥＴが生じるようなアミノ酸配列を有している。リンカーにおけるアミノ酸残基の数は、ＢＲＥＴの効率が高まるように適宜設定されてよい。
【００１９】
リンカーは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＧＳＧＧＸ１Ｘ２ＶＤＧＴＰＸ３ＱＸ４ＷＬというアミノ酸配列（配列番号１）を含む。ここにおいて、Ｘ１はＤまたはＡであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＷまたはＲであり、Ｘ４はＲまたはＰである。
【００２０】
リンカーの具体例の１つは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＴＭＶＳＫＧＳＧＧＤＥＶＤＧＴＰＷＱＲＷＬというアミノ酸配列（配列番号２）を有するリンカーである。また別の具体例は、ＧＳＧＧＡＧＶＤＧＴＰＲＱＰＷＬというアミノ酸配列（配列番号３）を有するリンカーである。
【００２１】
実施形態に係るキメラタンパク質の具体例の１つは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するキメラタンパク質である。このキメラタンパク質では、蛍光タンパク質はＹＦＰであり、発光タンパク質はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼであり、リンカーはＴＭＶＳＫＧＳＧＧＤＥＶＤＧＴＰＷＱＲＷＬとなっている。
【００２２】
実施形態に係るキメラタンパク質の別の具体例は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するキメラタンパク質である。このキメラタンパク質では、蛍光タンパク質はＹＦＰであり、発光タンパク質はＮａｎｏＬｕｃであり、リンカーはＧＳＧＧＡＧＶＤＧＴＰＲＱＰＷＬとなっている。
【００２３】
実施形態に係るキメラタンパク質では、高効率のＢＲＥＴが生じ、その結果、高い強度で蛍光を検出することが可能となる。発光強度の低さから従来のＢＲＥＴプローブの使用が避けられていた研究分野においても、実施形態に係るキメラタンパク質を使用することが可能となり、研究の促進をもたらすことが予想される。
【００２４】
本発明の第２の実施形態は、リンカーとして使用できるポリペプチドである。
【００２５】
このポリペプチドは、アミノ酸を一文字表記で示した場合に、ＧＳＧＧＸ１Ｘ２ＶＤＧＴＰＸ３ＱＸ４ＷＬというアミノ酸配列（配列番号１）を含む。ここにおいて、Ｘ１はＤまたはＡであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＷまたはＲであり、Ｘ４はＲまたはＰである。
【００２６】
第２の実施形態のポリペプチドの例は、ＴＭＶＳＫＧＳＧＧＤＥＶＤＧＴＰＷＱＲＷＬというアミノ酸配列（配列番号２）またはＧＳＧＧＡＧＶＤＧＴＰＲＱＰＷＬというアミノ酸配列（配列番号３）を有するものである。
【００２７】
第２の実施形態のポリペプチドの末端には、それぞれ蛍光タンパク質および発光タンパク質を融合させることができる。使用する蛍光タンパク質および発光タンパク質の種類や組み合わせには限定がなく、種々のＢＲＥＴプローブを作製することができる。
【００２８】
第２の実施形態によれば、ＢＲＥＴプローブを作製するためのリンカーとして高い汎用性を有したポリペプチドが提供される。
【００２９】
従来、ＢＲＥＴプローブのリンカーは、蛍光タンパク質と発光タンパク質との組み合わせごとに設計されていた。例えば、グリシンとセリンとが交互に並んだポリペプチドを使用して、リンカーの最適な長さを決定し、その後、リンカー部分に対してランダムに変異を導入して、適切なアミノ酸配列が決定されていた。このように、従来、リンカーの決定は大きな負担を要するものであった。
【００３０】
これに対し、実施形態に係るポリペプチドは、種々のＢＲＥＴプローブのリンカーとして使用できる蓋然性が高く、リンカーを設計する際の第１候補として使用して、リンカーの設計の負担を大幅に低減することができる。
【００３１】
本発明の第３の実施形態は、核酸である。
【００３２】
実施形態に係る核酸は、第１の実施形態に係るキメラタンパク質をコードする塩基配列を有する。その例は、配列番号１１に塩基配列が示される核酸であり、これは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するキメラタンパク質をコードする。別の例は、配列番号１２に塩基配列が示される核酸であり、これは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するキメラタンパク質をコードする。
【００３３】
実施形態に係る核酸は、また、第２の実施形態に係るポリペプチドをコードする塩基配列を有する。その例は、配列番号１３に塩基配列が示される核酸であり、これは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の例は、配列番号１４に塩基配列が示される核酸であり、これは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００３４】
実施形態に係る核酸によれば、実施形態に係るキメラタンパク質およびポリペプチドの遺伝子を保管し、また、容易に使用することができる。
【実施例】
【００３５】
実施形態に係るキメラタンパク質を２つ作製し、ＢＲＥＴを生じさせ、発光スペクトルを測定した。
【００３６】
１つ目のキメラタンパク質として、ＹＦＰとレニラルシフェラーゼとが、ＴＭＶＳＫＧＳＧＧＤＥＶＤＧＴＰＷＱＲＷＬというアミノ酸配列（配列番号２）を有するリンカーでつながったキメラタンパク質（配列番号４）を作製した。
【００３７】
このキメラタンパク質において、レニラルシフェラーゼの基質を添加し、化学発光を誘導し、発光スペクトルを測定した。その結果を図１に示す。
【００３８】
図１のスペクトルによると、最大発光波長は５５０ｎｍ付近であることがわかる。また、４８０ｎｍ付近にも低いピークが存在することがわかる。５５０ｎｍ付近のピークはＹＦＰに由来するものであり、４８０ｎｍ付近のピークはレニラルシフェラーゼに由来するものであると予想される。すなわち、レニラルシフェラーゼとＹＦＰとの間でＢＲＥＴが生じたことがわかる。５５０ｎｍ付近のピークは、４８０ｎｍ付近のピークに対して約７．８倍であり、非常に高い効率でＢＲＥＴが生じたことがわかる。また、５５０ｎｍ付近のピークは高い値を示しており、高い強度の発光が得られることがわかる。
【００３９】
５５０ｎｍ付近には、ＣＣＤの波長感度のピークがあり、その量子収率は９０％程度である。したがって、ＣＣＤにて撮像する場合、このキメラタンパク質はＢＲＥＴプローブとして優れている。
【００４０】
なお、このキメラタンパク質において、レニラルシフェラーゼの基質を添加し、化学発光を誘導し、目視にて確認したところ、黄緑色の発光が観察された。
【００４１】
２つ目のキメラタンパク質として、ＹＦＰとＮａｎｏＬｕｃ（プロメガ株式会社）とが、ＧＳＧＧＡＧＶＤＧＴＰＲＱＰＷＬというアミノ酸配列（配列番号３）を有するリンカーでつながったキメラタンパク質（配列番号５）を作製した。
【００４２】
このキメラタンパク質において、ＮａｎｏＬｕｃの基質を添加し、化学発光を誘導し、発光スペクトルを測定した。その結果を図２に示す。
【００４３】
図２のスペクトルによると、最大発光波長は５４０ｎｍ付近であることがわかる。また、４６０ｎｍ付近にもピークが存在することがわかる。５４０ｎｍ付近のピークはＹＦＰに由来するものであり、４６０ｎｍ付近のピークはＮａｎｏＬｕｃに由来するものであると予想される。すなわち、ＮａｎｏＬｕｃとＹＦＰとの間でＢＲＥＴが生じたことがわかる。５４０ｎｍ付近のピークは、４６０ｎｍ付近のピークに対して約３．５倍であり、高い効率でＢＲＥＴが生じたことがわかる。また、５４０ｎｍ付近のピークは非常に高い値を示しており、非常に高い強度の発光が得られることがわかる。
【００４４】
なお、このキメラタンパク質において、ＮａｎｏＬｕｃ基質を添加し、化学発光を誘導し、目視にて確認した。１つ目のキメラタンパク質と比較して、ＮａｎｏＬｕｃ由来の青色の成分がやや生じるものの、ＹＦＰ由来の黄緑色の成分が強く、全体として黄緑色が観察された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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