(57)【要約】      （修正有）【課題】形質転換体を用いたアルキルポリグリコシドの製造方法の提供。【解決手段】アルコールオキシダーゼ遺伝子を欠失、変異又は発現抑制した形質転換体である微生物、特に酵母を第２級アルコール又はケトンと糖とを含有する培地で培養し、一般式（Ｉ）で表わされる化合物を得る方法。2015123019.tif 000014【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の工程を含む、下記一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から下記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
【化１】
2015123019.tif 000012
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はＣｘＨ２ｘ＋１で表されるアルキル基を表し、ｘは１以上３以下の整数を表す。Ｒ２は水素原子又はＣｙＨ２ｙ＋１で表されるアルキル基を表し、ｙは１以上３以下の整数を表す。但し、Ｒ１とＲ２とが同時に水素原子であることはない。ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。）
【請求項２】
前記宿主が微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が酵母である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記酵母がカンジダ（Candida）属に属する菌類である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicola、Candida apicola、Candida  batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、及びCandida stellataからなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記第２級アルコール又はケトンの炭素原子数が１０以上２２以下である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子又はメチル基である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ２が水素原子又はメチル基である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
下記一般式（ＩＩ）で表される化合物。
【化２】
2015123019.tif 000013
（一般式（ＩＩ）中、ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルキルポリグリコシドの製造方法に関する。また、本発明は新規アルキルポリグリコシドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルキルポリグリコシドは、界面活性剤として各種の洗剤等に配合されている。アルキルポリグリコシドの工業的生産は、主に糖とアルコールを原料とした化学合成により行われているが、原料アルコールを多量に必要とし、高温・高圧下での反応を行うために原料グルコースが変性してしまう等の問題がある。
このような実情から、より効率のよい生産方法を求めて、微生物を用いたアルキルポリグリコシドの製造技術が検討されている。例えば、酵母の１種であるカンジダ・ボンビコーラ（Candida bombicola）を、糖とアルコールを含有する培地で培養すると、生産物としてアルキルポリグリコシドの一種であるアルキルソホロシドが得られることが知られている（特許文献１及び非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６４３３１５２号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biotechnology  Letters,  Volume  20,  No.  3,  1998,  pp.  215-218
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述の微生物を用いた製造方法は、常温・常圧下でのアルキルポリグリコシド製造を可能とするものの、原料アルコールに対するアルキルポリグリコシドの収率が低いという問題がある。
そこで、本発明は、アルキルポリグリコシドを効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、微生物を用いたアルキルポリグリコシドの製造技術について鋭意検討したところ、カンジダ・ボンビコーラ由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子の機能を低下させた形質転換体で、特定のアルキルポリグリコシドの産生率が有意に向上することを見出した。さらに、当該形質転換体により製造されたアルキルポリグリコシドの中に、新規のアルキルポリグリコシドを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記（１）及び（２）の工程を含む、下記一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）に関する。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から下記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
【０００８】
【化１】
2015123019.tif 000002
【０００９】
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はＣｘＨ２ｘ＋１で表されるアルキル基を表し、ｘは１以上３以下の整数を表す。Ｒ２は水素原子又はＣｙＨ２ｙ＋１で表されるアルキル基を表し、ｙは１以上３以下の整数を表す。但し、Ｒ１とＲ２とが同時に水素原子であることはない。ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。）
【００１０】
また、本発明は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物に関する。
【００１１】
【化２】
2015123019.tif 000003
【００１２】
（一般式（ＩＩ）中、ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を高収率で製造する方法を提供することができる。また、本発明によれば、新規のアルキルポリグリコシドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例で作製したKSMΔura-ura株及びKSMΔAOX株の、菌体内アルコールオキシダーゼ活性を示した図である。
【図２】実施例で作製したａ）KSMΔura-ura株及びｂ）KSMΔAOX株を、2-テトラデカノールを基質として培養した培養液のGC分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．一般式（Ｉ）で表される化合物
本発明の製造方法によれば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を高い収率で得ることができる。
【００１６】
【化３】
2015123019.tif 000004
【００１７】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はＣｘＨ２ｘ＋１で表されるアルキル基を表し、ｘは１以上３以下の整数を表す。Ｒ２は水素原子又はＣｙＨ２ｙ＋１で表されるアルキル基を表し、ｙは１以上３以下の整数を表す。但し、Ｒ１とＲ２とが同時に水素原子であることはない。ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。
一般式（Ｉ）において、ｘは好ましくは１以上２以下、より好ましくは１である。Ｒ１は水素原子又はメチル基が好ましい。
ｙは好ましくは１以上２以下、より好ましくは１である。Ｒ２は水素原子又はメチル基が好ましい。
ｎは好ましくは９以上１５以下、より好ましくは９以上１３以下である。
Ｒ１及びＲ２で置換されたアルキレン鎖中の総炭素原子数（Ｒ１及びＲ２がアルキル基の場合はその炭素原子を含む）は１０以上２２以下であることが好ましく、１０以上１８以下であることがより好ましく、１２以上１８以下であることがさらに好ましく、１２以上１６以下であることがよりさらに好ましい。
Ｒ３及びＲ４は、水素原子が好ましい。
【００１８】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ１が水素原子でありＲ２がメチル基である化合物、すなわち下記一般式（ＩＩ）で表される化合物は新規化合物である。
【００１９】
【化４】
2015123019.tif 000005
【００２０】
一般式（ＩＩ）中、ｎ、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ、前記一般式（Ｉ）のｎ、Ｒ３、Ｒ４と同義であり、好ましい範囲も同様である。
【００２１】
前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、アルキル鎖に水酸基を有するアルキルポリグリコシドである。当該化合物は、界面活性剤として洗浄剤に、乳化剤や抗菌剤として香粧品等に用いることができる。特に、一般式（ＩＩ）で表される化合物は直鎖アルキル基に水酸基が付加した構造を有し、このような構造を有する非イオン性界面活性剤は、乳化、分散、湿潤性に優れ、高い起泡性を示す。
前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、後述する本発明の製造方法により得ることができ、形質転換体の宿主、培地に含有させる糖、第２級アルコール、ケトンの種類を適宜選択することにより、種々の化合物を製造することができる。
【００２２】
２．製造方法
本発明の製造方法では、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を用いる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００２３】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、カンジダ・ボンビコーラ（Candida bombicola（別称：Starmerella bombicola又はTorulopsis bombicola））NBRC10243株由来のアルコールオキシダーゼである。アルコールオキシダーゼ（以下、「ＡＯＸ」とも略記する）は、アルコール酸化酵素の１種で、アルコールをアルデヒドに酸化する反応を触媒する。後述の実施例で示すように、当該タンパク質を欠失した形質転換体は、アルコールオキシダーゼ活性が大幅に低下する。
【００２４】
本発明の製造方法では、前記（ａ）のタンパク質と機能的に均等な前記（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子も用いることができる
前記（ｂ）において、アミノ酸配列の同一性は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明においてアミノ酸配列の同一性とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性は通常の方法により解析することができるが、本発明の同一性はリップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより測定する。
【００２５】
また、前記（ｃ）において、「１又は数個のアミノ酸」は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、１〜１０個のアミノ酸であることが好ましく、１〜５個のアミノ酸であることがより好ましく、１〜３個のアミノ酸であることがさらに好ましい。
【００２６】
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と５５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号２は、カンジダ・ボンビコーラNBRC10243株由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子の塩基配列である。
【００２７】
前記（ｅ）において、塩基配列の同一性は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明において塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性は通常の方法により解析することができるが、本発明の同一性はリップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより測定する。
【００２８】
また、前記（ｆ）において、「ストリンジェントな条件」としては、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載のサザンハイブリダイゼーション法等が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに４２℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２９】
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、カンジダ・ボンビコーラ等の微生物からクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に変異を導入する場合、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。具体的には、ランダムにクローニングしたDNA断片を用いて相同組換えを起こさせる方法や、γ線等を照射することによりランダムな遺伝子の変異が可能である。
【００３０】
本発明の方法に用いる形質転換体は、宿主中の前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、欠失、変異又は発現抑制することで得られる。
形質転換体の宿主としては、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有するものであればよい。前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、宿主として好ましくは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。
当該微生物としては、取り扱い性の向上、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、酵母が好ましい。当該酵母としては、カンジダ（Candida）属に属する菌類、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する菌類、ピチア（Pichia）属に属する菌類、ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属に属する菌類、又はスターメレラ（Starmerella）属に属する菌類等が挙げられる。
前記カンジダ（Candida）属に属する菌類としては、Candida bombicola（別名:Starmerella bombicola)、Candida apicola、Candida  batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellata等が挙げられる。
ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する菌類、ピチア（Pichia）属に属する菌類、ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属に属する菌類、又はスターメレラ（Starmerella）属に属する菌類としては、Rhodotorula bogoriensis、Pichia anomala  PY1、又はWickerhamiella domericqiae等が挙げられる。
これらのなかでも、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、カンジダ（Candida）属に属する菌類が好ましく、Candida bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellataがより好ましく、Candida bombicolaがさらに好ましい。
なお、上記宿主微生物は、ATCC（American  Type  Culture  Collection）、NBRC  (Biological  Resource  Center,  NITE)等の生物遺伝資源ストックセンター等から入手することができる。
【００３１】
宿主ゲノムから前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する方法としては、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去する又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。なかでも、本発明においては、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を宿主ゲノムから物理的に欠失させた形質転換体であることが好ましい。
【００３２】
上記の欠失・変異・発現抑制方法は、相同組換えを用いて行うことができる。例えば、標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることができる。また、塩基置換や塩基挿入等の変異を導入した標的遺伝子をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子の機能を低下又は消失させることができる。また、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって宿主ゲノム上の標的遺伝子を分断して、その機能を低下又は消失させることができる。
このような相同組換えによる標的遺伝子の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、Besher  et  al.,  Methods  in  molecular  biology  47，p.291-302,  1995等の文献を参考に行うことができる。
【００３３】
宿主に相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドを導入する方法については、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びそれらの改変法等、酵母の形質転換に通常用いられている方法が挙げられる。
例えば電気パルス法により行う場合、対数増殖期まで増殖させた宿主細胞と、相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドとをソルビトール溶液等に懸濁して、電気パルスを加えればよい。相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドと宿主細胞とを接触させる際に、サーモンスパームＤＮＡ等のキャリアＤＮＡや、ポリエチレングリコール等を添加することにより、形質転換頻度を高めることも好ましい。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値（電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が約１０から２０ミリ秒で、パルス後の生菌率が約１０〜４０％となる条件とすることが好ましい。電気パルスを加えた後、菌液をソルビトール溶液を含む培地にまいて形質転換体を選択する。
目的遺伝子が欠失した形質転換体の選択は、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出して、目的遺伝子部位を含む領域を対象としてＰＣＲを行う方法、又は目的遺伝子領域に結合するＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法、等により行うことができる。
【００３４】
得られた形質転換体では、宿主（すなわち形質転換前の状態）に比べて、アルコールオキシダーゼ活性が低下している。なお、形質転換体でアルコールオキシダーゼ活性が低下することは、後述の実施例で用いた方法により確認できる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、形質転換体のアルコールオキシダーゼ活性を宿主のアルコールオキシダーゼ活性に対し７０％以下に低下させることが好ましく、５０％以下に低下させることがより好ましく、３０％以下に低下させることがさらに好ましく、２０％以下に低下させることがよりさらに好ましく、１０％以下に低下させることが特に好ましい。
【００３５】
前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子の欠失等によりアルコールオキシダーゼ活性が低下すると、形質転換体内のアルコール代謝経路（アルコールの酸化による脂肪酸合成経路）が阻害され、前記一般式（１）で表される化合物合成の原料となる第２級アルコールやケトンがアルコール代謝経路で消費されることなく有効利用されるため、前記一般式（１）で表される化合物の生産性が向上すると推測される。これまでカンジダ・ボンビコーラの第２級アルコール酸化経路についてはわかっておらず、前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子が第２級アルコールの酸化に関与することは、本発明者らにより今回新たに示された知見である。
【００３６】
本発明の製造方法は、前記形質転換体を用いて下記（１）及び（２）の工程により行われる。
（１）前記形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（２）得られた培養物から前記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
なお、本発明において形質転換体を培地で培養するとは、微生物や動植物あるいはその細胞・組織の培養はもちろん、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、培養物には、培養・栽培等した培地及び形質転換体が含まれる。
【００３７】
形質転換体を培養する培地は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物合成の原料として、第２級アルコール及びケトンの少なくとも一方、及び糖を含有する。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物の直接の合成原料は第２級アルコールであるが、その前駆体であるケトンも同様に原料として利用することができる。例えば、文献：A.  Brakemeierら  Biotechnology  Letters  (1998)  20,  215-218には、カンジダ・ボンビコーラが第２級アルコールの前駆体であるケトンを利用し、当該第２級アルコールを含むアルキルポリグリコシドを合成することが報告されている。
第２級アルコール及びケトンは、得られた化合物を界面活性剤として用いる観点から、炭素原子数１０以上が好ましく、１２以上が好ましい。また、炭素原子数２２以下が好ましく、１８以下がより好ましく、１６以下がさらに好ましく、１４以下がよりさらに好ましい。さらに、炭素原子数１０以上２２以下が好ましく、１０以上１８以下がより好ましく、１２以上１８以下がさらに好ましく、１２以上１６以下がよりさらに好ましく、１２以上１４以下が特に好ましい。
好ましい第２級アルコールの具体例としては、２−デカノール、２−ウンデカノール、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノール、２−ヘキサデカノール、２−ヘプタデカノール、２−オクタデカノール、３−デカノール、３−ウンデカノール、３−ドデカノール、３−トリデカノール、３−テトラデカノール、３−ペンタデカノール、３−ヘキサデカノール、３−ヘプタデカノール、３−オクタデカノール、４−デカノール、４−ウンデカノール、４−ドデカノール、４−トリデカノール、４−テトラデカノール、４−ペンタデカノール、４−ヘキサデカノール、４−ヘプタデカノール、４−オクタデカノール等の２級飽和又は不飽和アルコール等が挙げられる。
好ましいケトンの具体例としては、２−デカノン、２−ウンデカノン、２−ドデカノン、２−トリデカノン、２−テトラデカノン、２−ペンタデカノン、２−ヘキサデカノン、２−ヘプタデカノン、２−オクタデカノン、３−デカノン、３−ウンデカノン、３−ドデカノン、３−トリデカノン、３−テトラデカノン、３−ペンタデカノン、３−ヘキサデカノン、３−ヘプタデカノン、３−オクタデカノン、４−デカノン、４−ウンデカノン、４−ドデカノン、４−トリデカノン、４−テトラデカノン、４−ペンタデカノン、４−ヘキサデカノン、４−ヘプタデカノン、４−オクタデカノンなどの飽和または不飽和ケトンが挙げられる。
なかでも炭素原子数１０以上１８以下の直鎖アルキル基の第２級アルコールを用いることが好ましく、２−ウンデカノール、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノール、２−ヘキサデカノールがより好ましく、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノールがさらに好ましく、２−テトラデカノールがよりさらに好ましい。
前記糖は、入手性及び取り扱い性の向上の観点から、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、デンプン加水分解物（水あめ）、セルロース加水分解物、又は廃糖蜜（モラセス）が好ましい。なかでも、得られた化合物を界面活性剤として用いる観点から、グルコース、マルトース、又は廃糖蜜がより好ましく、グルコースがさらに好ましい。
【００３８】
第２級アルコール、ケトン及び糖以外の培地成分は、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
例えば、宿主が微生物の場合、炭素源としてソルビトールやグリセリン等の糖アルコール類、クエン酸などの有機酸類等、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア水、尿素、大豆タンパク質、麦芽エキス、アミノ酸、ペプトン、コーンスティーブリカー等、無機塩類としてマンガン塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、鉄イオン、銅イオン、硫酸塩、リン酸塩等、ビタミン類としてビオチン、イノシトール等を用いることができる。
特に、宿主が酵母の場合には、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、尿素等、無機塩類として硫酸マグネシウム・７水和物、塩化ナトリウム、塩化カルシウム・２水和物、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等を用いることが好ましい。場合によっては消泡剤などを添加してもよい。
【００３９】
形質転換体の培養条件も、宿主の種類に応じて適宜好ましい培養条件を選択することができる。
例えば、宿主が微生物の場合には、培地のｐＨは２．５〜９．０程度に調節することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養温度は１５〜３５℃程度が好ましく、２５〜３２℃程度がより好ましい。培養時間は６〜２００時間程度が好ましく、２４〜１４８時間程度がより好ましい。必要により通気や攪拌を加えてもよい。
特に、宿主が酵母の場合には、培地のｐＨは用いる酵母が生育し得る範囲、例えば、ｐＨ３．０〜８．０程度に調節することが好ましい。培養温度は１５〜３５℃程度が好ましく、２８〜３２℃程度がより好ましい。培養時間は４８〜１４８時間程度が好ましく、振盪又は通気撹拌培養することが好ましい。
【００４０】
形質転換体を培養し前記一般式（Ｉ）で表される化合物を産生させた後、培養物（培養体や培養液等）から当該化合物を単離、精製等して回収する。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物を単離、回収する方法としては特に限定されず、通常微生物の培養上清からアルキルポリグリコシド成分を単離する際に用いられる方法により行うことができる。例えば、疎水やイオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理等の方法を用いることができる。
【００４１】
本発明の製造方法は、アルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を用いることで、原料の第２級アルコールやケトンに対し、高い収率でアルキルポリグリコシドを生産することができる。さらに、本発明の方法は、微生物等を用いた方法であり、常温・常圧下で行うことができる。そのため、原料である糖の変性が抑えられ、より効率的にアルキルポリグリコシドを生産することができる。
【００４２】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、化合物を開示する。
【００４３】
＜１＞  下記（１）及び（２）の工程を含む、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から前記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
【００４４】
＜２＞  前記宿主が微生物である、＜１＞項記載の方法。
＜３＞  前記微生物が酵母である、＜２＞項記載の方法。
＜４＞  前記酵母がカンジダ（Candida）属に属する菌類である、＜３＞項記載の方法。
＜５＞  前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicola、Candida apicola、Candida  batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、及びCandida stellataからなる群より選ばれる、＜４＞項記載の方法。
＜６＞  前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicolaである、＜５＞項記載の方法。
＜７＞  前記第２級アルコール又はケトンの炭素原子数が１０以上、好ましくは１２以上であり、２２以下、好ましくは１８以下、より好ましくは１６以下、さらに好ましくは１４以下である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞  前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子又はメチル基である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞  前記一般式（Ｉ）において、Ｒ２が水素原子又はメチル基である、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と５５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００４５】
＜１１＞  前記一般式（ＩＩ）で表される化合物。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４７】
［培地、培養条件］
カンジダ（Candida）属酵母の培養には、以下の培地を使用した。各培地は、121℃、20分のオートクレーブ後に混ぜ合わせて使用した。
また、前培養はφ24mm×200mm大型試験管（YPD培地5mL仕込み）にて30℃、250rpmで48時間振盪培養した種培養液を、φ24mm×200mm大型試験管（AG生産培地5mL仕込み）に2％（v/v）植菌し、30℃、250rpmで振盪培養した。
YPD培地：  1%  (D)-グルコース、1%  BactoTM  Yeast  Extract（日本BD社製）、1%  BactoTM  Tryptone（日本BD社製）
AG生産培地：  15%  (D)-グルコース、0.41%  クエン酸3ナトリウム（無水）、0.4%  BactoTM  Yeast  Extract、0.154%  塩化アンモニウム、0.07%  硫酸マグネシウム・７水和物、0.05%  塩化ナトリウム、0.027%  塩化カルシウム・2水和物、0.1%  リン酸2水素カリウム、0.012%  リン酸水素2カリウム  （1M  HClにてpH  5.8に調整）
最小培地：  0.68%  Yeast  nitrogen  base  without  amino  acids（日本BD社製）、2％(D)-グルコース
アルコール資化培地：  0.68%  Yeast  nitrogen  base  without  amino  acids（日本BD社製）、0.05%  BactoTM  Yeast  Extract、2％炭素源
【００４８】
［ゲノムＤＮＡ抽出］
カンジダ・ボンビコーラのゲノムＤＮＡは、φ24mm×200mm大型試験管（YPD培地、5mL仕込み）にて30℃、250rpmにて48時間振盪培養した培養液を、4℃、15000rpmにて1分遠心分離し集めた菌体から、Genとるくん(酵母用)High  Recovery（タカラバイオ社製）によって抽出した。
［ＰＣＲ］
ＰＣＲ反応にはPrimeStar  Max  DNA  Polymelase（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従い操作した。
【００４９】
実施例
１．ＡＯＸ１遺伝子欠損株の構築
（１）AOX1遺伝子欠失用プラスミドの構築
配列番号２に示すカンジダ・ボンビコーラのアルコールオキシダーゼ遺伝子（以下、AOX1遺伝子）欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを、下記の手法で構築した。
pUC-ΔAOXは、AOX1遺伝子の上流約1000bp、及び下流約1000bpの領域と相補する配列を有し、当該領域間にura3遺伝子が挿入されるよう設計した。
カンジダ・ボンビコーラ  KSM36株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すＰＣＲプライマーAOX1  US  in  F1（配列番号３）及びAOX1  US-ura  R（配列番号４）、Pura3  F（配列番号５）及びura3  R（配列番号６）、ura-AOX1  LS  F（配列番号７）、AOX1  LS  in  R1（配列番号８）を用い、AOX1遺伝子の上流約1000bpの領域、ura3遺伝子、AOX1遺伝子の下流約1000bpの領域のＤＮＡ断片を増幅した。
次に、プラスミドpUC118を鋳型とし、表１に示すＰＣＲプライマーpUC  in  F2（配列番号９）及びpUC  in  R2（配列番号１０）を用いてプラスミド領域を増幅し、これをInfusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて、上記のＤＮＡ断片と結合した。得られたプラスミドを、大腸菌DH5αに導入し、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含むLB寒天培地上にて培養し、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、目的のAOX1遺伝子欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを得た。
【００５０】
（２）カンジダ・ボンビコーラ  AOX1遺伝子欠失株の構築
M.  D.  DE.  Backerら，  Yeast（1999），  15，p.1609-1618.の手法に従い、pUC-ΔAOXを用いてKSMΔura3株を形質転換した。
I.  V.  Bogaertら，  Yeast（2008），25，p.273−278.に記載の手法により、カンジダ・ボンビコーラ  KSM36株より、ウラシル要求性株を選抜した。さらに、ウラシル要求性株の中から、ura3遺伝子領域に変異が挿入された株を選抜し、KSMΔura3株とした。
KSM36株とKSMΔura3株のura3遺伝子領域の配列を解析したところ、KSMΔura3株では、一塩基変異により、54位のシステイン（Cys）がチロシン（Tyr）に変化していた。KSMΔura3株は最小培地では生育できず、5-フルオロオロチン酸添加YPD培地、及びウラシル添加最小培地にて生育可能であった。また、KSMΔura3株に、カンジダ・ボンビコーラ  NBRC10243株由来の野生型ura3遺伝子を、上記IAN  Van  Bogaertらの手法にて導入したところ、最小培地にて生育可能となった。また、本菌株は、培地にウラシルを添加した場合、ソホロリピッド生産能は親株であるKSM36株と同等であった。
KSMΔura3株を300ppmのウラシルを添加したYPD培地5mLに植菌し、30℃、250rpm、48時間前培養した。培養液0.5mLを300ppmのウラシルを添加したYPD培地50mLに接種し、30℃、120rpmで約6時間培養した。生育した菌体を集菌した後、氷冷した滅菌水20mLで菌体を2回洗浄した。菌体を、氷冷した1mLの1M  ソルビトール溶液に懸濁し、5000rpmで5分間遠心し、上清を捨てた後、400μLの1M  ソルビトールを加えて懸濁した。菌体懸濁液を50μLずつ分注し、pUC-ΔAOXを2.5μg加えた。菌体懸濁液を、BIO-RAD  GENE  PULSER  II（バイオラッド社製）を用いてエレクトロポレーションした後、1M  ソルビトールを含む最小培地にまいて、30℃で1週間培養した。
得られた形質転換体から、ＰＣＲ法により、AOX1遺伝子の上流及び下流領域での二重交叉による相同組換えが生じた株を選抜した。得られた形質転換体よりゲノムDNAを抽出し、表１に示すプライマーAOX1  US  in  F1（配列番号３）及びAOX1  LS  in  R1（配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。この結果、得られた形質転換体あたり７０％の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔAOX株とした。
【００５１】
（３）カンジダ・ボンビコーラ  ウラシル遺伝子導入株の構築
AOX1遺伝子欠失株の対照菌株として、KSMΔura株に、AOX1遺伝子が欠失しないように、野生型ura3遺伝子をKSMΔura株の変異ura3領域に導入した株を作製した。
カンジダ・ボンビコーラ  KSM36株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すプライマーPura3  F（配列番号５）、及びura3  R2（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲ法にてura3領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Mighty  Cloning  Reagent  Set  Blunt  End（タカラバイオ社製）を用いて、pUC118DNA  HincII/BAP（タカラバイオ社製）へ挿入し、プラスミドpUC-ura3を得た。
プラスミドpUC-ura3を用い、上記（２）と同様の手法にてKSMΔura株に導入した。得られた形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、プラスミド領域に設計したプライマーpUC  seq  1（配列番号１２）及びpUC  seq  2（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲによる組換えの確認を行った。この結果、得られた形質転換体あたり１１％の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔura-ura株とした。
【００５２】
【表１】
2015123019.tif 000006
【００５３】
２．アルコールオキシダーゼ活性の測定
カンジダ・ボンビコーラ  KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて30℃、250rpm、48時間、前培養した。前培養液を、炭素源として(Ｄ)-グルコース、及び１-ヘキサデカノールを10g/Lずつ添加したアルコール資化培地に1％植菌し、30℃、250rpmにて48時間培養した。培養後の菌体からミクロソーム膜タンパク質画分を調製し、アルコールオキシダーゼ活性（AOX活性）を測定した。なお、微生物のアルコールオキシダーゼは膜タンパク質画分に局在することが知られている。
【００５４】
ミクロソーム膜タンパク質画分の調製、及びアルコールオキシダーゼ活性の測定は、G.  D.  Kempら，Appl.  Microbiol.  Biotechnol.  (1988)，  29，p．370-374記載の方法に従い行った。
［ミクロソーム膜タンパク質画分の調製］
培養後の菌体20mLを、8000rpm、4℃にて10min遠心して集菌した後、菌体を10mLの生理食塩水で2回洗浄した。菌体を1/15M  リン酸バッファー（pH7.4）  500μLを加え懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械製）、及び媒体に0.5mmグラスビーズを用いて破砕した。500μLの1/15M  リン酸バッファー（pH7.4）を添加、混合し、破砕液を4℃、3000gで5分遠心し、破砕されなかった菌体を除去した。上清を4℃、20000gで60分遠心し、ミトコンドリアとペルオキシソーム画分を除去した。残った上清を回収し、4℃、100000gで90分遠心し、沈殿を回収し200μLの1/15M  リン酸バッファー（pH7.4）を添加し懸濁した。この懸濁液を、ミクロソーム膜タンパク質画分として、以下のアルコールオキシダーゼ活性の測定に用いた。
【００５５】
［アルコールオキシダーゼ活性の測定］
0.1M  リン酸バッファー（pH7.4）  100μL、2.8g/L  2,2’-azino-di  [3-ethylbenzothiazoline-(6)-sulfonic  acid]（ABTS）溶液  50μL、horseradish  peroxidase  47units/mL溶液  30μL、及びミクロソーム膜タンパク質画分  10μLを混合し、30℃で5分インキュベートした。その後、5mM  1-ドデカノール  DMSO溶液  10μLを添加し、0分、及び5分後の405nmにおける吸光度を測定した。アルコールオキシダーゼは、1μmolのアルコールを酸化し、2μmolのラジカルカチオンを産生する。1mMのラジカルカチオン型ABTSは405nmで18.4の吸光度を示すが、これは0.5mMの酸化された基質と同義である。そこで、1分間に0.0368の吸光度変化を、アルコールオキシダーゼ活性の1Uと定義した。
ミクロソーム膜タンパク質１ｇあたりのアルコールオキシダーゼ活性を図１に示す。
【００５６】
図１から明らかなように、AOX1遺伝子が欠失したKSMΔAOX株は、KSMΔura-ura株と比べて、アルコールオキシダーゼ活性が大幅に低下した。
【００５７】
３．KSMΔAOX株のジオール型アルキルポリグリコシド生産性
KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて、30℃、250rpmで48時間前培養した。前培養液を、AG生産培地30mL仕込み500mL坂口フラスコに2%植菌し、30℃、120rpmにて48時間培養した後、基質として２-テトラデカノールを10g/Lとなるよう添加した。
基質添加から72時間培養後の培養液を、下記のLC-MS分析及びGC分析に供した。
【００５８】
［LC-MS分析］
装置はUFLC  20A-LCMS  2020（島津製作所社製）を用い、カラムとしてL-column  ODS  4.6  x  150mm,  5μm（化学物質評価研究機構）を用いた。溶離液Aに0.01M  酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Bに0.01M酢酸アンモニウムメタノール溶液を用い、流量1mL/分、カラムオーブン温度40℃、50%（5分）→20%/min→90%→95%（5分）→100%（30分）のタイムプログラムにて行った。検出はネガティブイオンモードにて行った。
【００５９】
LC-MS分析の結果、KSMΔura-ura株の培養液では、10.5分に[M-H−]：579.5、11分に[M-H−]：621.5のピークが確認された。KSMΔAOX株の培養液では、上記の2ピークに加え、9分に[M-H−]：637.5のピークが確認された。文献：S.  Fleurackers.,  et.  al.,  (2010)  Eur.  J.  Lipid  Sci.  Technol.,  112,  655-662によれば、ジアセチルドデシルソホロシドがカンジダ・ボンビコーラにより生成し、その分子量が594であると報告されている。これらのことから、11分のピークはジアセチル-2-テトラデシルソホロシド、10.5分のピークはアセチル-2-テトラデシルソホロシドと考えられた。一方、KSMΔAOX株でのみ認められた9分の[M-H−]：637.5のピークは、ジアセチル-2-テトラデシルソホロシドに分子量16が付加され、かつピークの溶出位置が高極性側にシフトしていることから、ジアセチル-2-テトラデシルソホロシドのいずれかの位置に水酸基が付加されたものと考えられた。そこで次に、水酸基の付加位置をGC-MS分析により解析した。
【００６０】
［GC-MS分析］
培養液5mLより内部標準として１-オクタデカノールを0.05%添加した１-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った。次に、遠心エヴァポレーターにて乾固し、１M  NaOH水溶液を添加し、100℃で4時間処理した。続いて、１-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った後、遠心エヴァポレーターにて乾固し、トリメチルシリル（TMS）化試薬を用いて誘導体化した。TMS化したサンプルを以下のGC-FID、及びGC-MS法にて解析し、アルキルポリグリコシド生産量、及び残存基質量を得た。
GCは、装置として7890A（アジレント・テクノロジー社製）、カラムとしてDB-1  ms  25m×0.20mm×330μm（J&W  scientific社製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量1mL/min、昇温プログラム100℃（1分）→10℃/分→300℃（10分）にて行った。標準物質としてｎ−ドデシルマルトシド（CALBIOCHEM社製）を用い、18分から22分に検出されるアルキルポリグルコシド由来のピークを積算し、アルキルポリグルコシド量として算出した。
GC-MSは、装置として7890A-5975C（アジレント・テクノロジー社製）、カラムとしてDB-1  ms  25m×0.20mm×330μm（J&W  scientific社製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量1mL/min、昇温プログラム100℃（1min）→10℃/min→300℃（20min）にて行った。
【００６１】
GC分析の結果を図２に示す。なお、図２において、2-C14olは２−テトラデカノール、ISは内部標準として用いた１−オクタデカノール、2-C14ol由来AGは２−テトラデカノールにソホロシドが付加した下記構造式Ａで表される化合物由来のピークをそれぞれ示す。
【００６２】
【化５】
2015123019.tif 000007
【００６３】
図２に示すように、第２級アルコールである２-テトラデカノールを原料とした場合、KSMΔura-ura株では、2-C14ol由来AGのメインピーク以外に、高沸点側に副産物ピーク３が確認された。３のピークは野生株であるKSM36株の培養時にも観察された（図示せず）。一方、KSMΔAOX株では、KSMΔura-ura株と同様に３のピークが確認された他、KSMΔura-ura株にはないピーク４及び５が高沸点側に確認された。さらに、２-テトラデカノールと内部標準である１-オクタデカノールの間に、ピーク１及び２が確認された。
【００６４】
次に、GC-MS解析により、上記ピーク１〜５の各化合物（以下、ピーク１化合物等という）の水酸基の位置を決定した。
水酸基を有する脂肪酸類をTMS化した後にGC-MS解析を行った場合、水酸基の位置に寄らず常に水酸基を含むアルキル末端側のフラグメントイオンが得られる。フラグメントイオンの例を表２に示した。
【００６５】
【表２】
2015123019.tif 000008
【００６６】
GC-MS解析の結果、ピーク１化合物ではフラグメントイオンとして73及び117が、ピーク２化合物は73、103及び117が認められた。また、ピーク１及び２化合物は、2-テトラデカノールのTMS化物と内標である1-オクタデカノールのTMS化物の間に検出されるため、沸点もこの両者の中間と推定される。これらのことから、ピーク１化合物は2-テトラデカノールのω-1位が水酸化された2,13-テトラデカンジオールであり、ピーク２化合物は2-テトラデカノールのω末端が水酸化された1,13-テトラデカンジオールであると考えられた。
また、ピーク３化合物では73、117及び271.1、ピーク４化合物では73及び103、ピーク５化合物では73、117及び271.1がフラグメントイオンとして確認された。
ピーク４化合物では103のフラグメントイオンが認められることから、ピーク２化合物である1,13-テトラデカンジオールに糖転移したジオール型アルキルポリグリコシドと考えられた。さらに、117のピークが検出されないため、1,13-テトラデカンジオールの13位の水酸基に糖が転移されていると考えられた。これらの結果から、ピーク４化合物は、下記構造式４で示されるジオール型アルキルポリグリコシド（13-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)）のTMS化体であると考えられた。
【００６７】
【化６】
2015123019.tif 000009
【００６８】
ピーク３化合物とピーク５化合物は同じフラグメントイオンパターンを示した。ピーク５化合物はKSMΔAOX株培養時にのみ認められた。また、KSMΔAOX株ではAOX1遺伝子欠損により、１級アルコールを含むジオールが蓄積すると考えられる。これらのことから、KSMΔAOX株のみで認められたピーク５化合物は、ピーク２化合物である1,13-テトラデカンジオールの１位の水酸基に糖付加したジオール型アルキルポリグリコシド（13-hydroxy-1-O-tetradecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)、下記構造式５）のTMS化体であり、他方、ピーク３化合物は、ピーク１化合物である2,13-テトラデカンジオールのどちらかの水酸基に糖転移したジオール型アルキルポリグリコシド（12-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)、下記構造式３）のTMS化体であると考えられた。
上記考察は、カンジダ・ボンビコーラ野生株を用いて第２級アルコールと糖を反応させると、構造式３に示す化合物が生産されるとの報告（文献：EP0745608参照）とも一致するものであった。また、構造式５の化合物は新規化合物であった。
【００６９】
【化７】
2015123019.tif 000010
【００７０】
【化８】
2015123019.tif 000011
【００７１】
以上の結果から、KSMΔAOX株では、アルキル鎖のω末端又はω-1末端に水酸基を有するジオール型アルキルポリグリコシドが複数種類生産されることがわかった（ピーク３、４及び５化合物）。さらに、KSMΔAOX株は、KSMΔura-ura株では生産されないジオール型アルキルポリグリコシド（ピーク４及び５化合物）を生産できることがわかった。
【００７２】
GC−FID分析の結果、各ジオール型アルキルポリグリコシド量の合計は、KSMΔura-ura株で0.57g/L、KSMΔAOX株では7.65g/Lであった。
【００７３】
以上の結果から、KSMΔAOX株は、糖及び第２級アルコールを基質として、ω末端又はω-1末端に水酸基を有するジオール型アルキルポリグリコシドを高い収率で生産できることがわかった。
【図１】
2015123019.tif 000015
【図２】
2015123019.tif 000016
【配列表】
2015123019000001.app