(57)【要約】特に、増幅反応中のプライマーダイマーの形成を減少させるプライマーの３’末端領域に特定の改変核酸塩基を含有するプライマー、およびその様々な使用方法を開示する。一実施形態において、本発明にしたがうポリヌクレオチドは、その３’末端から４ヌクレオチド以内に、少なくとも１つの改変されたピリミジン核酸塩基を含む。別の実施形態において、本発明は、これらの改変核酸塩基を用いたプライマー伸長法、オリゴヌクレオチド連結法、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドの３’末端から４ヌクレオチド以内の少なくとも１つの改変されたピリミジン核酸塩基を含むポリヌクレオチドであって、該改変されたピリミジン核酸塩基が構造：
【化１】
2008535518.tif 000009
を含み、ここで、Ｒは、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６置換アルキル、Ｃ３−Ｃ１０アリール、Ｃ３−Ｃ１０置換アリール、Ｃ３−Ｃ１０アリールエーテル、Ｃ３−Ｃ１０置換アリールエーテル、−ＣＦ３、−ＮＲ１Ｒ１、Ｃ３−Ｃ６環状アルキル、Ｃ３−Ｃ６置換環状アルキル、フェニル、置換フェニルおよびＣ５−Ｃ１０ヘテロアリールから選択され、Ｒ１は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６置換アルキル、Ｃ３−Ｃ１０アリール、Ｃ３−Ｃ１０置換アリールから選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
Ｒは−Ｈである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ＲはＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＲはＣ１−Ｃ６置換アルキルである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＲはＣ３−Ｃ１０アリールである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＲはＣ３−Ｃ１０置換アリールである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｒは−ＣＦ３である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｒはアミノである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｒは置換アミノである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ＲはＣ３−Ｃ６環状アルキルである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＲはＣ３−Ｃ６置換環状アルキルである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｒはフェニルである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｒは置換フェニルである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｒはヘテロアリールである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
少なくとも１つの改変されたピリミジン核酸塩基は、前記ポリヌクレオチドの３’末端から３ヌクレオチド以内である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
少なくとも１つの改変されたピリミジン核酸塩基は、前記ポリヌクレオチドの３’末端から２ヌクレオチド以内である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
少なくとも１つの改変されたヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドはプライマーである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドは３’末端で伸長可能である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
検出可能な標識、クエンチャー、マイナーグルーブバインダーまたはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドはその３’末端で伸長不能なプローブである、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
プライマー伸長法であって、
ｉ）ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングし、プライマー鋳型複合体を形成するように、該ポリヌクレオチドプライマーを該変性ＤＮＡ鋳型にアニーリングさせる工程と、
ｉｉ）二本鎖アンプリコンを形成するためにプライマー鋳型複合体のプライマー部分を伸長させる工程とを含み、
該ポリヌクレオチドプライマーが、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドである、方法。
【請求項２３】
伸長させる工程の後に、前記二本鎖アンプリコンを変性させる工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも１回繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも１０回繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも２０回繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも３０回繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも４０回繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記伸長させる工程が、ＤＮＡアンプリコンフラグメントを形成するために伸長可能なヌクレオチド三リン酸および伸長不能なヌクレオチド三リン酸の存在下で行なわれる、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡアンプリコンフラグメントを検出する工程を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
プライマー伸長法であって、
ｉ）第１ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ第２ポリヌクレオチドプライマーが該変性ＤＮＡ鋳型の第２鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングして、第１および第２プライマー鋳型複合体を形成するように、該第１ポリヌクレオチドプライマーおよび該第２ポリヌクレオチドプライマーを該変性ＤＮＡ鋳型の第１および第２鎖にアニーリングさせる工程と、
ｉｉ）二本鎖ＤＮＡアンプリコンを形成するために該第１および第２プライマー鋳型複合体のうちの少なくとも１つのプライマー部分を伸長させる工程とを含み、
該第１ポリヌクレオチドプライマーまたは該第２ポリヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つが請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドである、方法。
【請求項３２】
前記形成する工程の後、前記アニーリングさせる工程の前に、変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖および第２変性ＤＮＡ鋳型を形成するために該ＤＮＡ鋳型を変性させる工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記伸長させる工程の後に、前記二本鎖ＤＮＡアンプリコンを変性させる工程を含む、請求項３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも１回繰り返される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも１０回繰り返される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも２０回繰り返される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程が、少なくとも３０回繰り返される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記プライマー部分を伸長させる工程の前に、ポリヌクレオチドプローブが変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖上の相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングするか、または該ポリヌクレオチドプローブが該変性ＤＮＡ鋳型の第２鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングするように、該ポリヌクレオチドプローブを該変性ＤＮＡ鋳型の第１または第２鎖のうちの一方にアニーリングさせる工程を含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドプローブが、少なくとも１つの検出可能な標識を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドプローブが、クエンチャー、マイナーグローブバインダーのうちの少なくとも一方またはそれらの両方をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドプローブが、請求項２１に記載のポリヌクレオチドである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの前記改変されたプリン核酸塩基は、前記プローブの３’末端から２ヌクレオチド以内である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つの前記改変されたプリン核酸塩基は、前記プローブの３’末端から１ヌクレオチド以内である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記改変されたプリン核酸塩基は、前記プローブの３’末端ヌクレオチドである、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチド連結法であって、
ｉ）第１ポリヌクレオチド鎖が変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第１相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ第２ポリヌクレオチド鎖が該変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第２相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングするように、該ＤＮＡ鋳型にアニーリングした該第１および第２ポリヌクレオチド鎖を含む複合体を形成する工程であって、該変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第２相補的ポリヌクレオチド配列が該変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第１相補的ポリヌクレオチド配列に対して５’に位置する、工程と、
ｉｉ）該第１および第２ポリヌクレオチド鎖間で安定な共有結合を形成する工程とを含み、
該第１ポリヌクレオチド鎖または該第２ポリヌクレオチド鎖のうちの少なくとも１つが請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドである、方法。
【請求項４６】
標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法であって、
（ａ）第１および第２ポリヌクレオチドプローブが標的鎖内の第１および第２標的領域とそれぞれハイブリダイズし、第１ハイブリダイゼーション複合体を形成するために有効な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを、
（ｉ）該標的鎖内の第１標的領域に相補的である配列を含有する該第１ポリヌクレオチドプローブ、および
（ｉｉ）該標的鎖内の第２標的領域に相補的である配列を含む該第２ポリヌクレオチドプローブであって、該第２標的領域が該第１標的領域に対して５’に位置し、少なくとも１ヌクレオチド塩基で該第１標的領域に重複する、該第２ポリヌクレオチドプローブ、を含む第１プローブ対と反応させる工程と、
（ｂ）該標的鎖、該第１プローブ、および該第１プローブの３’末端ヌクレオチドに隣接して位置する５’末端ヌクレオチドを有する該第２プローブの第１フラグメントを含む第２ハイブリダイゼーション複合体を形成するために、該第１ハイブリダイゼーション複合体において該第２プローブを切断する工程と、
（ｃ）該標的鎖にハイブリダイズした第１連結鎖を形成するために、該第１プローブを該第２プローブのハイブリダイズしたフラグメントに連結する工程と、
（ｄ）該標的鎖から該第１連結鎖を変性させる工程と、
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１つまたは複数の追加のサイクルを実施する工程であって、ただし最終サイクルでは工程（ｄ）が任意に省略される、工程とを含み、
該第１プローブ、該第２プローブのうちの少なくとも一方またはそれらの両方は請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドである方法。
【請求項４７】
前記第１領域は、前記第２領域と１ヌクレオチド塩基で重複する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’ヒドロキシル基以外の基で終結する、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’リン酸基で終結する、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）第３および第４ポリヌクレオチドプローブが標的相補鎖内の第１および第２領域とそれぞれハイブリダイズし、第３ハイブリダイゼーション複合体を形成するために有効な条件下で、該標的相補鎖を、
（ｉ）該標的相補鎖内の第１領域に相補的である配列を含有する該第３ポリヌクレオチドプローブ、および
（ｉｉ）該標的相補鎖内の第２領域に相補的である配列を含有する該第４ポリヌクレオチドプローブであって、該第２領域が該第１領域に対して５’に位置し、少なくとも１ヌクレオチド塩基で該第１領域に重複する、該第４ポリヌクレオチドプローブ、を含む第２プローブ対と反応させる工程と、
（ｂ）該標的相補鎖、該第３プローブ、および該第３プローブの３’末端ヌクレオチドに隣接して位置する５’末端ヌクレオチドを有する該第４プローブの第１フラグメントを含む第４ハイブリダイゼーション複合体を形成するために、前記第２ハイブリダイゼーション複合体において該第４プローブを切断する工程と、
（ｃ）該標的相補鎖にハイブリダイズした第２連結鎖を形成するために該第３プローブを該第４プローブのハイブリダイズしたフラグメントに連結する工程と、
（ｄ）該標的相補鎖から該第２連結鎖を変性させる工程と、
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１つまたは複数の追加のサイクルを実施する工程であって、ただし最終サイクルにおいて工程（ｄ）が任意で省略される工程とを含む、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記第３プローブもしくは前記第４プローブのうちの少なくとも一方またはそれらの両方は、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第３プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項５４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記第３プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する、請求項５４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第４プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項５４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第４プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する、請求項５４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１、第２、第３および第４プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第４プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’ヒドロキシル基以外の基で終結する、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記第４プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’リン酸基で終結する、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記プローブの少なくとも１つは、検出可能な標識を含有する、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記標識が蛍光標識である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記標識が放射性標識である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記標識が化学発光標識である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記標識が酵素である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１プローブおよび前記第３プローブのうちの少なくとも１つは、検出可能な標識を含有する、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１プローブおよび第３プローブのそれぞれは、検出可能な標識を含有する、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１プローブおよび第３プローブ上の検出可能な標識は同一である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第２プローブおよび第４プローブのうちの少なくとも１つは、検出可能な標識を含有する、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記第２プローブおよび第４プローブのそれぞれは、検出可能な標識を含有する、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記第２プローブおよび第４プローブは、同一の検出可能な標識を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記切断する工程は、前記第２ハイブリダイゼーション複合体と結合していない第２プローブから第２フラグメントを生成し、前記方法は、該第２プローブ由来の該第２フラグメントを検出する工程をさらに含む、請求項５４〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記切断する工程は、前記第４ハイブリダイゼーション複合体と結合していない第４プローブから第２フラグメントを生成し、前記方法は、該第４プローブ由来の該第２フラグメントを検出する工程をさらに含む、請求項５４〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記第２プローブおよび第４プローブのうちの少なくとも１つが、（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）該蛍光色素が蛍光励起エネルギーを受けるとき、該蛍光色素からの蛍光発光を消光させることができるクエンチャー色素の両方を含有し、前記切断する工程は該第２プローブおよび／または該第４プローブにおける該蛍光色素と該クエンチャー色素との共有結合を切断し、それによって該蛍光色素からの観察可能な蛍光シグナルを増加させる、請求項７４〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２プローブおよび第４プローブが、それぞれ、（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）クエンチャー色素を含有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
両方の第２フラグメントを検出する工程をさらに含む、請求項７４〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記第２フラグメントが、前記標的鎖に実質的に相補的ではない１つまたは複数の連続するヌクレオチドを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記１つまたは複数の連続するヌクレオチドは、１〜２０個のヌクレオチドを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
固体支持体上に前記第２フラグメントを固定化する工程をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２フラグメントを電気泳動に供する工程をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
質量分析法によって前記第２フラグメントを検出する工程をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
最終サイクル後に前記第２フラグメントを検出する工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８５】
複数のサイクル中または後に前記第２フラグメントを検出する工程をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８６】
全サイクル中に前記第２フラグメントを検出する工程を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
少なくとも１回のサイクル後に、前記第１ハイブリダイゼーション複合体、前記第２ハイブリダイゼーション複合体、またはそれらの両方を検出する工程をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８８】
Ｒはシアノである、請求項１および１５〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
Ｒはニトロである、請求項１および１５〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
Ｒはシアノである、請求項２２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
Ｒはニトロである、請求項２２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本教示は、核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において適用するための化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の存在を検出することは、医学的診断、法医学および遺伝子分析を含む様々な分野において様々に適用するためにおいて重要な役割を果たす。ＰＣＲは、標的核酸配列の選択的増幅によって標的核酸の存在を検出するための高感受性手段を提供できる核酸増幅法の一例である。
【０００３】
ＰＣＲなどの核酸増幅に伴う重大な問題は、非特異的増幅産物の生成である。ＰＣＲ反応において問題となることがある非特異的増幅プロセスの一例は、「プライマーダイマー」増幅である。プライマーダイマー増幅は、例えば、プライマーの３’末端領域がそれ自体または他のプライマーとのある程度の相補性を有する場合に生じ得る。そのようなプライマーは、相互にハイブリダイズして、プライマーダイマーを形成する。プライマーダイマーの増幅は、次に、順にさらなる増幅のための鋳型として作用し得るプライマーダイマーアンプリコンをもたらす。そのようなプロセスの１つの結果は、感受性の減少を生じさせるプライマーの枯渇またはさらには意図した標的核酸を増幅できなかったことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記問題を複雑にするものとして、ＰＣＲ反応中の極めて過剰なプライマーの添加により、３’末端領域での弱い相補性でさえもプライマーダイマーアンプリコンが生じさせることが周知である。結果として、ＰＣＲなどの増幅反応におけるプライマーダイマー形成を抑制する試薬および方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、プライマーの３’末端領域内へ特定の改変された核酸塩基を組み込むと増幅反応中のプライマーダイマーアンプリコンの形成に有益な影響を及ぼすことができることが見いだされている。
【０００６】
一部の実施形態では、本教示は、ポリヌクレオチドの３’末端から４ヌクレオチド以内の少なくとも１つの改変されたピリミジン核酸塩基を含むポリヌクレオチドであって、この改変されたピリミジン核酸塩基は、構造：
【０００７】
【化２】
2008535518.tif 000002
（式中、Ｒは、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６置換アルキル、Ｃ３−Ｃ１０アリール、Ｃ３−Ｃ１０置換アリール、Ｃ３−Ｃ１０アリールエーテル、Ｃ３−Ｃ１０置換アリールエーテル、−ＣＦ３、アミン、置換アミン、Ｃ３−Ｃ６環状アルキル、Ｃ３−Ｃ６置換環状アルキル、フェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールから選択される）を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
一部の実施形態では、Ｒは−Ｈであってもよい。一部の実施形態では、ＲはＣ１−Ｃ６アルキルであってもよい。一部の実施形態では、ＲはＣ１−Ｃ６置換アルキルであってもよい。一部の実施形態では、ＲはＣ３−Ｃ１０アリールであってもよい。一部の実施形態では、ＲはＣ３−Ｃ１０置換アリールであってもよい。一部の実施形態では、Ｒは−ＣＦ３であってもよい。一部の実施形態では、Ｒはアミノであってもよい。一部の実施形態では、Ｒは置換アミノであってもよい。一部の実施形態では、ＲはＣ３−Ｃ６環状アルキルであってもよい。一部の実施形態では、ＲはＣ３−Ｃ６置換環状アルキルであってもよい。一部の実施形態では、Ｒはフェニルであってもよい。一部の実施形態では、Ｒは置換フェニルであってもよい。一部の実施形態では、Ｒはヘテロアリールであってもよい。一部の実施形態では、Ｒはシアノであってもよい。一部の実施形態では、Ｒはニトロであってもよい。
【０００９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの改変されたピリミジン核酸塩基は、ポリヌクレオチドの３’末端から３ヌクレオチド以内である。一部の実施形態では、少なくとも１つの改変されたピリミジン核酸塩基は、ポリヌクレオチドの３’末端から２ヌクレオチド以内である。一部の実施形態では、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドである。
【００１０】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドはプライマーであってもよい。一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは３’末端で伸長可能である。
【００１１】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは、検出可能な標識、クエンチャーまたはマイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）のうちの少なくとも１つを含むことができる。一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドはプローブとして機能できる。
【００１２】
一部の実施形態では、本教示は、プライマー伸長法であって、ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングし、プライマー鋳型複合体を形成するように、ポリヌクレオチドプライマーを変性ＤＮＡ鋳型にアニーリングさせる工程と、二本鎖アンプリコンを形成するためにプライマー鋳型複合体のプライマー部分を伸長させる工程とを含み、このポリヌクレオチドプライマーが本教示によるプライマーである、方法を提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、本教示は、プライマー伸長法であって、伸長させる工程の後に、二本鎖アンプリコンを変性させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも１回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも１０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも２０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも３０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも４０回繰り返すことができる。
【００１４】
一部の実施形態では、本教示は、プライマー伸長法であって、伸長させる工程がＤＮＡアンプリコンフラグメントを形成するために伸長可能なヌクレオチド三リン酸および伸長不能なヌクレオチド三リン酸の存在下で行なわれる方法を提供する。一部の実施形態では、プライマー伸長法は、ＤＮＡアンプリコンフラグメントを検出する工程を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本教示は、プライマー伸長法を提供し、この方法は：ｉ）第１ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ第２ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の第２鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングして、第１および第２プライマー鋳型複合体を形成するように、第１ポリヌクレオチドプライマーおよび第２ポリヌクレオチドプライマーを変性ＤＮＡ鋳型の第１および第２鎖にアニーリングさせる工程と、ｉｉ）二本鎖ＤＮＡアンプリコンを形成するために第１および第２プライマー鋳型複合体のうちの少なくとも１つのプライマー部分を伸長させる工程とを含み、第１ポリヌクレオチドプライマーまたは第２ポリヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つが本教示によるポリヌクレオチドであり得る。
【００１６】
一部の実施形態では、本教示はプライマー伸長法を提供し、この方法は、アニーリングさせる工程の前に、第１ポリヌクレオチドプライマー、第２ポリヌクレオチドプライマー、ＤＮＡ鋳型、および他のプライマー伸長試薬を含む混合物を形成する工程を含む。一部の実施形態では、本教示は、プライマー伸長法を提供し、この方法は、形成する工程の後、アニーリングさせる工程の前に、変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖および第２変性ＤＮＡ鋳型を形成するためにＤＮＡ鋳型を変性させる工程を含む。一部の実施形態では、本教示は、伸長させる工程の後に、二本鎖ＤＮＡアンプリコンを変性させる工程を含むプライマー伸長法を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で１〜１００回繰り返すことができる。二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で１〜５０回繰り返すことができる。本教示は、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程を繰り返すために１〜１００回のあらゆる可能な範囲を含むことが理解される。つまり、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、１〜最大１００回およびその間の任意の回数、繰り返すことができる。例えば、１〜１０の範囲は、１〜１０の間の全整数を用いてあらゆる可能な範囲、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を含むことが理解される。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で１回を超えて繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で１０回を超えて繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で２０回を超えて繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で３０回を超えて繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で４０回を超えて繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、任意で５０回を超えて繰り返すことができる。
【００１８】
一部の実施形態では、本教示は、プライマー部分を伸長させる工程の前に、ポリヌクレオチドプローブが変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖上の相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ／またはポリヌクレオチドプローブが変性ＤＮＡ鋳型の第２鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングするように、ポリヌクレオチドプローブを変性ＤＮＡ鋳型の第１または第２鎖にアニーリングさせる工程を含むプライマー伸長法を提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、クエンチャー、マイナーグローブバインダーのうちの少なくとも一方またはそれらの両方をさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは本教示のポリヌクレオチドであってもよい。
【００１９】
一部の実施形態では、本教示は、オリゴヌクレオチド連結法を提供し、この方法は、ｉ）第１ポリヌクレオチド鎖が変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第１相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ第２ポリヌクレオチド鎖が変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第２相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングするように、ＤＮＡ鋳型にアニーリングした第１および第２ポリヌクレオチド鎖を含む複合体を形成する工程であって、変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第２相補的ポリヌクレオチド配列が変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第１相補的ポリヌクレオチド配列に対して５’に位置する、工程と、ｉｉ）第１および第２ポリヌクレオチド鎖間で安定な共有結合を形成する工程とを含み、ここで、第１ポリヌクレオチド鎖または第２ポリヌクレオチド鎖のうちの少なくとも１つが本教示のポリヌクレオチドである。
【００２０】
一部の実施形態では、本教示は、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）第１および第２ポリヌクレオチドプローブが標的鎖内の第１および第２標的領域とそれぞれハイブリダイズし、第１ハイブリダイゼーション複合体を形成するために有効な条件下で、標的ポリヌクレオチド鎖を、
（ｉ）標的鎖内の第１標的領域に相補的である配列を含有する第１ポリヌクレオチドプローブおよび
（ｉｉ）標的鎖内の第２標的領域に相補的である配列を含む第２ポリヌクレオチドプローブであって、第２標的領域が第１標的領域に対して５’に位置し、少なくとも１ヌクレオチド塩基で第１標的領域に重複する、第２ポリヌクレオチドプローブ、を含む第１プローブ対と反応させる工程と、
（ｂ）標的鎖、第１プローブ、および第１プローブの３’末端ヌクレオチドに隣接して位置する５’末端ヌクレオチドを有する第２プローブの第１フラグメントを含む第２ハイブリダイゼーション複合体を形成するために、第１ハイブリダイゼーション複合体において第２プローブを切断する工程と、
（ｃ）標的鎖にハイブリダイズした第１連結鎖を形成するために第１プローブを第２プローブのハイブリダイズしたフラグメントに連結する工程と、
（ｄ）標的鎖から第１連結鎖を変性させる工程と、
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１つまたは複数の追加のサイクルを実施する工程であって、ただし最終サイクルでは工程（ｄ）が任意に省略される工程とを含み、第１プローブ、第２プローブのうちの少なくとも一方またはそれらの両方は本教示によるポリヌクレオチドである。
【００２１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの上記改変されたプリン核酸塩基は、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはその両方の３’末端から２ヌクレオチド以内である。一部の実施形態では、少なくとも１つの前記改変されたプリン核酸塩基は、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはその両方の３’末端から１ヌクレオチド以内である。一部の実施形態では、改変されたプリン核酸塩基は、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはそれらの両方の３’末端ヌクレオチドである。
【００２２】
一部の実施形態では、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはそれらの両方は、検出可能な標識、クエンチャーもしくはマイナーグルーブバインダーのうちの少なくとも１つまたはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、第１領域は、第２領域と１ヌクレオチド塩基で重複する。一部の実施形態では、第１プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する。一部の実施形態では、第１プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する。一部の実施形態では、第２プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する。一部の実施形態では、第２プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する。一部の実施形態では、第２プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’ヒドロキシル基以外の基で終結する。一部の実施形態では、第２プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’リン酸基で終結する。
【００２３】
一部の実施形態では、本教示は、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）第３および第４ポリヌクレオチドプローブが標的相補鎖内の第１および第２領域にそれぞれハイブリダイズし、第３ハイブリダイゼーション複合体を形成するために有効な条件下で、標的相補鎖を、
（ｉ）標的相補鎖内の第１領域に相補的である配列を含有する第３ポリヌクレオチドプローブ、および
（ｉｉ）標的相補鎖内の第２領域に相補的である配列を含有する第４ポリヌクレオチドプローブであって、第２領域が第１領域に対して５’に位置し、少なくとも１ヌクレオチド塩基で第１領域に重複する、第４ポリヌクレオチドプローブを含む、第２プローブ対と反応させる工程と、
（ｂ）標的相補鎖、第３プローブ、および第３プローブの３’末端ヌクレオチドに隣接して位置する５’末端ヌクレオチドを有する第４プローブの第１フラグメントを含む第４ハイブリダイゼーション複合体を形成するために、第２ハイブリダイゼーション複合体において第４プローブを切断する工程と、
（ｃ）標的相補鎖にハイブリダイズした第２連結鎖を形成するために第３プローブを第４プローブのハイブリダイズしたフラグメントに連結する工程と、
（ｄ）標的相補鎖から第２連結鎖を変性させる工程と、
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１つまたは複数の追加のサイクルを実施する工程であって、ただし最終サイクルにおいて工程（ｄ）が任意で省略される工程とを含む。一部の実施形態では、第３プローブもしくは第４プローブのうちの少なくとも一方またはそれらの両方は本教示によるポリヌクレオチドである。
【００２４】
一部の実施形態では、少なくとも１つの上記改変されたプリン核酸塩基は、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはその両方の３’末端から２ヌクレオチド以内である。一部の実施形態では、少なくとも１つの上記改変されたプリン核酸塩基は、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはその両方の３’末端から１ヌクレオチド以内である。一部の実施形態では、上記改変されたプリン核酸塩基は、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはそれらの両方の３’末端ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、第１ポリヌクレオチドプローブ、第２ポリヌクレオチドプローブまたはそれらの両方は、検出可能な標識、クエンチャーもしくはマイナーグルーブバインダーのうちの少なくとも１つまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、第３プローブの５’末端は、任意でヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する。一部の実施形態では、第３プローブの５’末端は、任意でヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する。一部の実施形態では、第４プローブの５’末端は、任意でヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する。一部の実施形態では、第４プローブの５’末端は、任意でヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結する。一部の実施形態では、第１、第２、第３および第４プローブの５’末端は、任意でヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する。一部の実施形態では、第４プローブの３’末端は、任意でヌクレオチド３’ヒドロキシル基以外の基で終結する。一部の実施形態では、第４プローブの３’末端は、任意でヌクレオチド３’リン酸基で終結する。一部の実施形態では、これらのプローブのうちの少なくと１つは検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、標識は蛍光標識であってもよい。一部の実施形態では、標識は放射性標識であってもよい。一部の実施形態では、標識は化学発光標識であってもよい。一部の実施形態では、標識は酵素であってもよい。一部の実施形態では、第１プローブおよび第３プローブのうちの少なくと１つは検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、第１プローブおよび第３プローブのそれぞれは検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、第１プローブおよび第３プローブ上の検出可能な標識は同一である。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブのうちの少なくと１つは検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブのそれぞれは検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブは同一の検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、上記切断する工程は、第２ハイブリダイゼーション複合体と結合していない第２プローブから第２フラグメントを生成し、該方法は、第２プローブ由来の第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、上記切断する工程は、第４ハイブリダイゼーション複合体と結合していない第４プローブから第２フラグメントを生成し、該方法は、第４プローブ由来の第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブのうちの少なくとも１つは（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）蛍光色素が蛍光励起エネルギーを受けるとき、蛍光色素からの蛍光発光を消光させることができるクエンチャー色素の両方を含有し、上記切断する工程は第２プローブおよび／または第４プローブ内の蛍光色素とクエンチャー色素との共有結合を切断し、それによって蛍光色素からの観察可能な蛍光シグナルを増加させる。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブはそれぞれ、（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）クエンチャー色素を含有する。
【００２５】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、両方の第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、第２フラグメントは、標的鎖に実質的に相補的ではない１つまたは複数の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の連続するヌクレオチドは、１〜２０個のヌクレオチドを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、固体支持体上に第２フラグメントを固定化する工程をさらに含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、第２フラグメントを電気泳動に供する工程をさらに含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、質量分析法によって第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、最終サイクル後に第２フラグメントを検出する工程を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、複数のサイクル中または後に第２フラグメントを検出する工程を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、全サイクル中に第２フラグメントを検出する工程を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本教示の方法は、少なくとも１回のサイクル後に、第１ハイブリダイゼーション複合体、第２ハイブリダイゼーション複合体、またはそれらの両方を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１回のサイクル後に、第３ハイブリダイゼーション複合体、第４ハイブリダイゼーション複合体、またはそれらの両方を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１回のサイクル後に、第１連結鎖、第２連結鎖、またはそれらの両方を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、検出する工程は電気泳動分離工程を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本教示は、フラグメント分析方法を提供し、この方法は：ｉ）オリゴヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングし、プライマー鋳型複合体を形成するように、オリゴヌクレオチドプライマーを変性ＤＮＡ鋳型にアニーリングさせる工程と、ｉｉ）ＤＮＡアンプリコンフラグメントを形成するためにデオキシリボ核酸および伸長不能なリボ核酸の存在下でプライマー鋳型複合体のプライマー部分を伸長させる工程と、ｉｉｉ）ＤＮＡアンプリコンフラグメントを検出する工程とを含み、オリゴヌクレオチドプライマーが本教示のポリヌクレオチドである。
【００２９】
以下のスキーム１は、所望のヌクレオチド配列を規定し得る複数（ｘ）のヌクレオチド「Ｎ」を含む代表的なポリヌクレオチドを示している。スキーム中、下付き文字１、２、３．．．ｘは３’末端に対するプライマー内のヌクレオチドの位置を意味しており、「．．．．．」は、ＮＸ〜Ｎ７の間の１つまたは複数の追加のヌクレオチドの可能性を示している。
【００３０】
５’−ＮＸ．．．．．Ｎ７Ｎ６Ｎ５Ｎ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１−３’
スキーム１
ここで、Ｎ１は代表的なポリヌクレオチドの３’末端に位置しており、代表的なポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドと呼ぶことができる。同様に、Ｎ２は第２ヌクレオチド位置に位置しており、３’末端から１ヌクレオチドであると言うことができる。同様に、Ｎ３は第３ヌクレオチド位置に位置しており、３’末端から２ヌクレオチドであると言うことができる。同様に、Ｎ４は第４ヌクレオチド位置に位置しており、３’末端から３ヌクレオチドであると言うことができる。本教示の核酸塩基をプライマー内に組み込んだ結果として生じる減少したプライマーダイマー形成の作用は、おおよそＮ４位置から３’末端に向かって本教示のポリヌクレオチドを全く有さないプライマーにおいて減少すると考えられる。
【００３１】
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、改変されたか、または天然に存在しないヌクレオチドを含有するポリマーを含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味するために互換的に使用される。さらに、用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）で開示されている）、ビシクロＤＮＡオリゴマー（Ｂｏｌｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４６６０−４６６７（１９９６））および関連構造を含むがそれらに限定されない、核酸塩基特異的塩基対合によって相補的ポリヌクレオチド鎖と二重鎖を形成できる骨格および複数の核酸塩基を含む任意の他のタイプのポリマーを意味する。
【００３２】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは、天然に存在する糖またはグリコシド部分、例えば、β−Ｄ−リボフラノースの骨格を含んでいてもよい。さらに、一部の実施形態では、本教示の改変されたヌクレオチドは、１つまたは複数の「糖アナログ」を含む骨格を含み得る。本明細書で使用する用語「糖アナログ」は、糖であるリボースのアナログを意味する。代表的なリボース糖アナログには、５より多いまたは少ない環原子を有する置換または未置換フラノース、例えばエリトロースおよびヘキソースならびに置換または未置換３〜６炭素の非環式糖が含まれるがそれらに限定されない。典型的な置換フラノースおよび非環式糖は、１つまたは複数の炭素原子が１つまたは複数の同一または異なる−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲもしくはハロゲン基（各Ｒは、独立して−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ３−Ｃ１４）アリールである）で置換されている置換フラノースおよび非環式糖である。５個の環原子を有する未置換および置換フラノースの例には、２’−デオキシリボース、２’−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルリボース、２’−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシリボース、２’−（Ｃ５−Ｃ１４）−アリールオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシ−リボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デ−オキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）−アリールオキシリボース、３’−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）−アリール−オキシリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシリボース−５’−三リン酸または２’，３’−ジデヒドロリボース−５’−三リン酸が含まれるが、それらに限定されない。さらなる糖アナログには、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））、すなわち例えば、参考として本明細書に援用されるＷｅｎｇｅｌ，  ら、ＷＯ９９／１４２２６およびＷｅｎｇｅｌ  Ｊ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３２：３０１−３１０（１９９８）に記載されている
【００３３】
【化３】
2008535518.tif 000003
のようなＣ−４’とＣ−２’での酸素原子との間のメチレン架橋を含有する糖アナログが含まれるが、それらに限定されない。
【００３４】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドには、リン酸塩骨格が１つまたは複数の「リン酸塩アナログ」を含むポリヌクレオチドが含まれる。用語「リン酸塩アナログ」は、リン原子が＋５酸化状態にあり、１つまたは複数の酸素原子が酸素ではない部分で置換されているリン酸塩のアナログを意味する。代表的なアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート、ブロノホスフェート、および関連する対イオン（そのような対イオンが存在する場合はＨ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｍｇ＋＋を含むが、それらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。リン酸塩アナログを含有する本教示のポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネートおよび／またはホスホロアミデートを含み得る（Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：２６６２−２６６８（１９９５）参照）。ポリヌクレオチド結合の組み合わせもまた本教示の範囲内に含まれる。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ポリアミド核酸としても知られる）を含むＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラ内に組み込むことができる（例えばＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）を参照）。ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡに特徴的な糖−リン酸塩骨格の代わりにポリアミド骨格によって結合されている複素環式核酸塩基単位を含有している。ＰＮＡは、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列にハイブリダイズすることができる。ＰＮＡオリゴマーの合成およびＰＮＡオリゴマーの合成に使用される反応性モノマーは、例えば、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；第５，７７３，５７１号；第５，７３６，３３６号および第５，７６６，８５５号に記載されている。ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラ合成にとっての代替アプローチおよびＰＮＡ合成のためのモノマーは、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）に要約されている。
【００３６】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドのサイズは、長さが数ヌクレオチドのモノマー、例えば５〜８０から、長さが数百または数千ヌクレオチドのモノマーの範囲に及んでよい。例えば、本教示のポリヌクレオチドは、５〜５０個のヌクレオチド、５〜３０個のヌクレオチド、または５〜２０個のヌクレオチドを含有していてもよい。一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドが、例えば５〜３０個のヌクレオチドを含有する場合、そのような範囲は長さが５〜３０の間のあらゆる可能な範囲の整数、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０個のヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドが例えば「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列によって表される場合は常に、ヌクレオチドは左から右へ５’から３’の順序にあり、他に特に指示されない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、および「Ｔ」はチミジンを意味することが理解される。さらに、本教示のポリヌクレオチドが「Ｘ」を含む文字の配列によって表される場合は、「Ｘ」は可変ヌクレオチドモノマーを意味しており、「Ｘ」が「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」または「Ｔ」以外のヌクレオチドモノマーであることが理解される。
【００３７】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは増幅反応におけるプライマーとして機能できる。本明細書で使用する「プライマー」は、１つまたは複数のヌクレオチドモノマーの添加または連結プローブの連結によって伸長可能である３’末端を有すると本明細書で定義されるポリヌクレオチドを意味する。
【００３８】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは、それぞれが改変された核酸塩基を独立して含む１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。
【００３９】
本明細書で使用する用語「改変された核酸塩基」は、１つまたは複数の官能基の添加および／または欠失、複素環構造における相違（すなわち、炭素のヘテロ原子との置換、またはその逆）、および／または１つまたは複数の置換基の付加によって天然に存在する塩基（例、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵ）とは相違する核酸塩基を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、本教示とともに使用するための改変された核酸塩基は、構造：
【００４１】
【化４】
2008535518.tif 000004
（式中、Ｒは、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６置換アルキル、Ｃ３−Ｃ１０アリール、Ｃ３−Ｃ１０置換アリール、Ｃ３−Ｃ１０アリールエーテル、Ｃ３−Ｃ１０置換アリールエーテル、−ＣＦ３、−ＮＲ１Ｒ１、Ｃ３−Ｃ６環状アルキル、Ｃ３−Ｃ６置換環状アルキル、フェニル、置換フェニルおよびヘテロアリールから選択され、Ｒ１は、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６置換アルキル、Ｃ３−Ｃ１０アリール、Ｃ３−Ｃ１０置換アリールである）を有する改変されたピリミジン核酸塩基を含む。
【００４２】
本明細書で使用する「アルキル」は、親アルカン、アルケンまたはアルキンの単一炭素原子から１個の水素原子を除去することによって生成される飽和または不飽和の、分枝状、直鎖状または環状一価炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアルキル基には、メチル（メタニル）；例えばエタニル、エテニル、エチニルなどのエチル類；例えばプロパン−１−イル、プロパン−２−イル（イソプロピル）、シクロプロパン−１−イル、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル、シクロプロプ−１−エン−１−イルなどのプロピル類；シクロ−プロプ−２−エン−１−イル、プロプ−１−イン−１−イル、プロプ−２−イン−１−イルなど；例えばブタン−１−イル、ブタン−２−イル（ｓｅｃ−ブチル）、２−メチル−プロパン−１−イル（イソブチル）、２−メチル−プロパン−２−イル（ｔ−ブチル）、シクロブタン−１−イル、ブト−１−エン−１−イル、ブト−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブト−１−エン−１−イル、シクロ−ブト−１−エン−３−イル、シクロブタ−ｌ，３−ジエン−１−イル、ブト−１−イン−１−イル、ブト−１−イン−３−イル、ブト−３−イン−１−イルなどのブチル類などが含まれるが、それらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用する「アリール」は、芳香族環系の単一炭素原子から１個の水素原子を除去することによって生成される一価芳香族炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアリール基には、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどに由来するラジカルが含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、アリール基は（Ｃ５−Ｃ２０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）アリールである。さらなるアリール基は、フェニル（Ｃ６アリール）およびナフチル（Ｃ１０アリール）である。
【００４４】
本明細書で使用する「置換アルキル」、「置換アリールエーテル」、「置換アリール」、「置換アミン」、「置換環状アルキル」、または「置換フェニル」におけるような「置換（された）」は、アルキル、アリール、アミン、環状アルキルもしくはフェニル部分が１つまたは複数の水素ではない置換基によって置換されていることを意味する。そのような置換基には、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＦ３、アミン、−ＯＨ、−ＣＣｌ３、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＣＯ２Ｒ、−ＳＯ３Ｒ、−ＰＯ３ＲＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲおよび−ＮＯ２（式中、Ｒは、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルもしくはＣ３−Ｃ１０アリールのいずれかであってもよい）が含まれるが、それらに限定されない。本明細書で使用する「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯまたはＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を有する任意の芳香族環系を意味する。ヘテロアリール部分の例には、フラン、チオフェン、ピリジン、ピロール、ピラジン、キノリンおよびピペリジンが含まれるが、それらに限定されない。
【００４５】
一部の実施形態では、本教示に使用するための改変された核酸塩基には、Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｋ．，ら、Ｊ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．４７，４５８−８（１９８２）およびＣｈｕ，Ｃ．Ｋ．，ら、，Ｊ．Ｈｅｔ  Ｃｈｅｍ．，ｖ．１４，１１１９−２１（１９７７）において最初に公開されたプソイドイソシチジン
【００４６】
【化５】
2008535518.tif 000005
の２’−デオキシ誘導体が含まれるが、それらに限定されない。
【００４７】
本教示と関連して使用するための様々なＲ置換基を有する改変された核酸塩基のさらなる例および調製は当技術分野において知られており、Ａｓｈｋｉｎａｚｉ，Ｒ．，ら、ＷＯ０１０１９８０１Ａ１，Ｈｌａｖｋａ，Ｊ．，ら、、米国特許第４，５７７，０１８号、Ｈｌａｖｋａ，Ｊ．，ら、，Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ．，２２（５），１３１７−２２（１９８５），Ｓｋｕｌｎｉｃｋ，Ｈ．，ら、，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８（１２），１８６４−９（１９８５），Ｌａｚａｒｕｓ，Ｒ．，ら、，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（２４），６８３４−４１（１９８１），Ｈｕｎｔｅｒ，Ｊ．，ら、，ＤＥ  ２５２２０９０，Ｗｉｅｒｅｎｇａ，Ｗ．，ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３（３），２３７−９（１９８０）およびその中で言及された参考文献に記載されたものが含まれるが、それらに限定されない。
【００４８】
本教示と関連して使用するための、核酸塩基およびヌクレオシド／ヌクレオチドならびにこれらを作製する方法のさらなる例は、Ｓｃｉｆｉｎｄｅｒ（登録商標）Ｓｃｈｏｌａｒ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（登録商標）などを含む当技術分野において知られている様々なデータベースの中に見いだすことができる。本教示と関連して使用するためのさらなるヌクレオシドおよびヌクレオチドは、当業者であれば、本明細書および上述した参考文献に提供される教示と組み合わせてか、またはそれとは独立して、当該分野において周知の化学合成方法によって容易に入手できる。
【００４９】
天然に存在する塩基、改変された塩基および塩基アナログのあらゆる互変異性体形は、本教示のポリヌクレオチドに含めることができる。
【００５０】
したがって、通常の塩基、改変されたピリミジン核酸塩基、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）、糖改変、またはＤＮＡ、ＰＮＡもしくはＤＮＡ／ＰＮＡキメラの骨格改変の任意の組み合わせを有するポリヌクレオチドは本教示の範囲内に含まれる。
【００５１】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの検出可能な標識、非蛍光クエンチャーおよび／または少なくとも１つの安定化部分に結合体化させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの検出可能な標識、非蛍光クエンチャーおよび／または少なくとも１つの安定化部分に結合体化している本教示のポリヌクレオチドは、増幅反応においてプローブまたはプライマーとして機能することができる。
【００５２】
用語「検出可能な標識」は、本教示のポリヌクレオチドに付加させた場合に公知の検出手段を用いてそのようなポリヌクレオチドを検出可能にさせる任意の部分を意味する。代表的な検出可能な標識には、適切な検出器、または結合対（例えば、標識抗体またはアビジン）の検出可能な抗リガンドに対して高い親和性で特異的に結合できるリガンド（例えば、抗原またはビオチン）によって標識された化合物の直接検出を可能にする、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識または化学発光標識が含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、標識は、フルオレセインもしくはローダミン色素などの蛍光色素またはＦＲＥＴ色素などの蛍光色素対であってもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の「非蛍光クエンチャー」部分を含み得る。本明細書で使用する「非蛍光クエンチャー」には、例えば特定のアゾ色素（例、ＤＡＢＣＹＬまたはＤＡＢＳＹＬ色素およびそれらの構造アナログ）、トリアリールメタン色素（例えば、マラカイトグリーンまたはフェノールレッド）、４’，５’−ジエーテル置換フルオレセイン（米国特許第４，３１８，８４６号）、不斉のシアニン色素クエンチャー（例えば、Ｌｅｅ  ら、、米国特許第６，０８０，８６８号およびＬｅｅ，ら、、米国特許第６，３４８，５９６号を参照）、または１つまたは複数のアミノ窒素原子において芳香族もしくはヘテロ芳香族環系によって置換されている３−および／または６−アミノキサンテンの非蛍光誘導体（Ｈａｕｇｌａｎｄ，  ら、、米国特許第６，３９９，３９２号）が含まれるが、それらに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用する「非蛍光」は、本明細書に記載した任意の方法について記載したアッセイ溶液中の消光部分の蛍光効率が、発光−λｍａｘで５％以下の発光であることを示している。一部の実施形態では、発光−λｍａｘで１％以下の発光である。本教示の一部の実施形態では、共有結合した消光部分は、発光−λｍａｘで約０．１％未満の量子収率を示す。一部の実施形態では、発光−λｍａｘで約０．０１％未満である。
【００５５】
一部の実施形態では、本教示のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの「安定化部分」に結合体化していてもよい。本明細書で使用する用語「安定化部分」は、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）部分を含むがそれに限定されない部分を意味する。文献には、様々の適切なマイナーグルーブバインダーが記載されている。例えば、Ｋｕｔｙａｖｉｎ，ら、、米国特許第５，８０１，１５５号；Ｗｅｍｍｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ  Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：３５５−３６１（１９９７）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．Ｌ．，Ｋｏｐｋａ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４４：３２３−３３４（１９９７）；Ｚｉｍｍｅｒ，Ｃ  ＆  Ｗａｈｎｅｒｔ，Ｕ．Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．  ４７：３１−１１２（１９８６）およびＲｅｄｄｙ，Ｂ．Ｓ．Ｐ．，Ｄｏｎｄｈｉ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｏｗｎ，Ｊ．  Ｗ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．，８４：１−１１１（１９９９）を参照されたい。
【００５６】
リンカーを通してポリヌクレオチドへＭＧＢ（ならびに上述したフルオロフォアおよびクエンチャーなどのレポーター基）を付加させるために適切な方法は、例えば、米国特許第５，５１２，６７７号；同第５，４１９，９６６号；同第５，６９６，２５１号；同第５，５８５，４８１号；同第５，９４２，６１０号および同第５，７３６，６２６号に記載されている。マイナーグルーブバインダーには、例えば、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３−Ｈ７）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート（ＣＤＰＩ３）のトリマーおよびＮ−メチルピロール−４−カルボキシ−２−アミド（ＭＰＣ５）のペンタマーが含まれる。さらなるＭＧＢ部分は、米国特許第５，８０１，１５５号に開示されている。特定の実施形態では、ＭＧＢは、付着した水溶性強化基（例、糖またはアミノ酸）を有していてもよい。
【００５７】
本教示のポリヌクレオチドは、例えばポリヌクレオチド鎖伸長または連結反応におけるプライマーおよび／またはプローブとしての使用を見出され得る。本明細書で使用する「鎖伸長反応」は、少なくとも１つの本教示のポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたは連結プローブとして）が少なくとも１つのＤＮＡ鋳型鎖にアニーリングできるプライマー伸長反応を意味する。ポリヌクレオチド鎖伸長反応におけるアニーリングさせる工程の後に、プライマーは、次に、アンプリコンまたは伸長産物を形成するために少なくとも１ヌクレオチド伸長させることができる。または、ポリヌクレオチド鎖伸長反応におけるアニーリングさせる工程の後に、プライマーは連結産物を形成するために第２連結プローブに連結させることができる。本教示は、例えば、Ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＩＩ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９７），Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｅ．，  Ｋｌａｐｈｏｌｚ，Ｓ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｏｓｋａｍｓ，Ｊ．  Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７），Ｉｎｎｉｓ，  Ｍ．ら、，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），  Ｃｈｅｎ，Ｃ．  ら、、米国特許出願公開２００３／０２０７２６６Ａ１、  Ｅｒｌｉｃｈ，ら、、米国特許第５，３１４，８０９号、米国特許第６，２２１，６０６号およびＢｉ，Ｗ．，  ら、、米国特許第６，５１１，８１０号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、非同期ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＤＮＡ配列決定、反復される（ｃｙｃｌｅｄ）ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、およびフラグメント分析を含むが、それらに限定されないあらゆる可能な鎖伸長反応を含む。本教示のオリゴヌクレオチドは、それぞれが適切な場合にプライマーまたはプローブのいずれかとして上記のプライマー伸長反応のいずれかにおいて使用できる。
【００５８】
一部の実施形態では、本教示は、プライマー伸長法を提供し、この方法は、ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングしてプライマー鋳型複合体を形成するように、ポリヌクレオチドプライマーを変性ＤＮＡ鋳型へアニーリングさせる工程と、二本鎖アンプリコンを形成するためにプライマー鋳型複合体のプライマー部分を伸長させる工程とを含み、ここで、このポリヌクレオチドプライマーが本教示によるプライマーである。
【００５９】
一部の実施形態では、本教示は、伸長させる工程の後に、二本鎖アンプリコンを変性させる工程を含むプライマー伸長法を提供する。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも１回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも１０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも２０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも３０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも４０回繰り返すことができる。
【００６０】
一部の実施形態では、本教示は、プライマー伸長法を提供し、この方法は、ｉ）第１ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ第２ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の第２鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングして、第１および第２プライマー鋳型複合体を形成するように、第１ポリヌクレオチドプライマーおよび第２ポリヌクレオチドプライマーを変性ＤＮＡ鋳型の第１および第２鎖にアニーリングさせる工程と、ｉｉ）二本鎖ＤＮＡアンプリコンを形成するために第１および第２プライマー鋳型複合体のうちの少なくとも１つのプライマー部分を伸長させる工程とを含み、第１ポリヌクレオチドプライマーまたは第２ポリヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つが本教示によるポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程の前に、本方法は第１ポリヌクレオチドプライマー、第２ポリヌクレオチドプライマー、ＤＮＡ鋳型、ならびに例えば緩衝液およびポリメラーゼを含む他のプライマー伸長試薬を含む混合物を形成する工程を含むことができる。一部の実施形態では、本教示において使用するためのポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、Ｐｗｏ、ＵＩＴｍａ、およびＴｔｈポリメラーゼならびにそれらの酵素的に活性な突然変異体および改変体を含むが、それらに限定されない少なくとも１つの他の熱安定性ポリメラーゼを含むことができる。そのようなポリメラーゼは、周知であるか、かつ／または市販されている。ポリメラーゼについての説明は、特に、ワールドワイドウエブＵＲＬ：ｔｈｅ−ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｙｒｌ９９８／ｊａｎ／ｐｒｏｆｉｌｅ１＿９８０１０５．ｈｔｍｌで見いだすことができる。
【００６１】
一部の実施形態では、形成する工程の後、アニーリングさせる工程の前に、本方法は、変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖および第２変性ＤＮＡ鋳型を形成するためにＤＮＡ鋳型を変性させる工程を含むことができる。一部の実施形態では、伸長させる工程の後に、二本鎖ＤＮＡアンプリコンを変性させる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、１〜１００回繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、１０〜１００回繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、２０〜１００回繰り返すことができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡアンプリコンをアニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、３０〜１００回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも１回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも１０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも２０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも３０回繰り返すことができる。一部の実施形態では、アニーリングさせる工程、伸長させる工程、および変性させる工程は、少なくとも４０回繰り返すことができる。
【００６２】
一部の実施形態では、本教示はプライマー伸長法を提供し、この方法は、プライマー部分を伸長させる工程の前に、ポリヌクレオチドプローブが変性ＤＮＡ鋳型の第１鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ／またはポリヌクレオチドプローブが変性ＤＮＡ鋳型の第２鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングするように、ポリヌクレオチドプローブを変性ＤＮＡ鋳型の第１または第２鎖へアニーリングさせる工程を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、クエンチャー、マイナーグローブバインダーのうちの少なくとも一方またはこれらの両方をさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは本教示のポリヌクレオチドであってもよい。
【００６３】
一部の実施形態では、本教示は、「フラグメント分析」または「遺伝子分析」法を提供し、ここで、標識されたポリヌクレオチドフラグメントは、標識されたプライマーまたはヌクレオチドを用いて鋳型指向性酵素合成を通して生成することができ、このフラグメントはサイズ依存性分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され得；そして分離されたフラグメントは分離に引き続いて、例えば、レーザー誘起蛍光によって検出できる。一部の実施形態では、複数のクラスのポリヌクレオチドは同時に分離され、異なるクラスは分光法により分解できる（ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖａｂｌｅ）標識によって識別される。
【００６４】
一部の実施形態では、本教示は、４つの可能性のある末端塩基と１セットの分光法により分解できる色素のメンバーとの間で対応が確立されるように、末端ヌクレオチドによって、フラグメントのクラスを同定および規定することのできるできるフラグメント分析法を提供する。そのようなセットは、市販される分光光度計を用いて発光および吸光帯域幅を測定することによって当技術分野において知られている蛍光色素から容易に組み立てられる。一部の実施形態では、フラグメントのクラスは、ＤＮＡ配列決定の連鎖停止法、すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定、またはＳａｎｇｅｒタイプの配列決定を通して形成される。
【００６５】
Ｓａｎｇｅｒタイプの配列決定は、その配列を決定できる一本鎖または二本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合成を含む。合成は、オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型にアニーリングする場所に基づいて規定の部位で開始される。合成反応は、連続的なＤＮＡ伸長を補助しないヌクレオチドアナログの組み込みによって停止される。代表的な連鎖停止ヌクレオチドアナログには、３’から５’ＤＮＡ鎖伸長に必要とされる３’−ＯＨ基を欠く２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が含まれる。ｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸）と４つのｄｄＮＴＰのうちの１つとの適正な比率が使用される場合は、酵素触媒される重合は、ｄｄＮＴＰが組み込まれる各部位において鎖の集団の一部で終結される。標識されたプライマーまたは標識されたｄｄＮＴＰが各反応のために使用される場合は、配列情報は、高分解能電気泳動による分離後に蛍光によって検出することができる。連鎖停止法では、本発明の色素は、配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに付加させることができる。本方法では、蛍光色素分子は、例えばＦｕｎｇ，ら、、米国特許第４，７５７，１４１号における教示にしたがって、プライマーの５’末端の相補的官能基へか、プライマーの核酸塩基上にか；または、例えば、参考として本明細書に援用されるＨｏｂｂｓら、欧州特許出願第８７３０５８４４．０号およびＨｏｂｂｓら、Ｊ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４：３４２０（１９８９）に開示されているアルキニルアミノ連結基を介して、ジデオキシヌクレオシドの核酸塩基上へ連結させることができる。
【００６６】
一部の実施形態では、標識されたポリヌクレオチドは、好ましくは例えば、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｅｄｓ．，Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８１；Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８４；または米国特許第５，３７４，５２７号、同第５，６２４，８００号および／または同第５，５５２，０２８号に開示されたような電気泳動によって分離できる。一部の実施形態では、電気泳動マトリックスのタイプは、約２〜２０重量％の濃度（重量対容積）を有する架橋されたかまたは架橋されていないポリアクリルアミドであってもよい。一部の実施形態では、ポリアクリルアミド濃度は約４〜８％である。一部の実施形態では、例えばＤＮＡ配列決定では、電気泳動マトリックスは、変性剤、例えば尿素、ホルムアミドなどを含むことができる。そのようなマトリックスを構築するための詳細な方法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、“Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ９８％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ｏｒ  ７  Ｍ  Ｕｒｅａ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：２９９−３０５（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、“Ｃｈａｉｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｄｏｕｂｌｅ−  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４：３７８７−３７９４（１９７５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１７９−１８５（１９８２）；ａｎｄ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に示される。特定の分離において使用される最適な電気泳動条件、例えばポリマー濃度、ｐＨ、温度、および変性剤の濃度は、分離すべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、それらが一本鎖または二本鎖のいずれであるか、および電気泳動によって情報が求められるクラスの性質を含む多数の要因に依存することが理解される。
【００６７】
電気泳動による分離に続いて、標識されたポリヌクレオチドは、例えば、標識されたポリヌクレオチド上の色素からの蛍光発光を測定する工程によって検出できる。そのような検出を実施するために、標識されたポリヌクレオチドは、高強度水銀放電ランプ、レーザーなどの標準的な手段によって照射される。一部の実施形態では、照射手段は、約６００ｎｍを超える波長の照射光線を有するレーザーである。一部の実施形態では、色素−ポリヌクレオチドは、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザーまたは固体ダイオードレーザーによって生成されるレーザー光によって照射される。照射後、標識されたポリヌクレオチドの蛍光強度は、光電子増倍管、電荷結合デバイス（ｃｈａｒｇｅｄ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）などの感光性検出器によって測定できる。代表的な電気泳動検出システムは、例えば米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号および同第４，８１１，２１８号などの他の場所で記載されている。
【００６８】
一部の実施形態では、本教示は、フラグメント分析法を提供し、この方法は、ポリヌクレオチドプライマーが変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングして、プライマー鋳型複合体を形成するように、ポリヌクレオチドプライマーを変性ＤＮＡ鋳型へアニーリングさせる工程と、ＤＮＡアンプリコンフラグメントを形成するために伸長可能なヌクレオチド三リン酸および伸長不能なヌクレオチド三リン酸の存在下でプライマー鋳型複合体のプライマー部分を伸長させる工程と、ＤＮＡアンプリコンフラグメントを検出する工程とを含む。一部の実施形態では、このポリヌクレオチドプライマーは本教示のオリゴヌクレオチドであってもよい。本教示によるフラグメント分析法のさらなる実施形態は、例えば、参考として本明細書に援用される米国特許第６，２２１，６０６号に見いだすことができる。
【００６９】
本明細書で使用する「連結反応」は、対立遺伝子特異的連結プローブが少なくとも１つのＤＮＡ鋳型鎖へアニーリングされ、プローブ鋳型複合体を形成する反応を意味する。アニーリングさせる工程後に、共有結合は、次に連結産物を形成するために連結剤（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）によってプローブおよび第２オリゴヌクレオチドフラグメントの間で形成される。本発明による連結剤は、任意の数の酵素的または化学的（すなわち、非酵素）剤を含み得る。例えば、リガーゼは、適切な条件下で、隣接ポリヌクレオチドの３’−ＯＨおよび５’−リン酸塩の間でホスホジエステル結合を形成する酵素的連結剤である。温度感受性リガーゼには、バクテリオファージＴ４リガーゼ、バクテリオファージＴ７リガーゼ、および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）リガーゼが含まれるが、それらに限定されない。熱安定性リガーゼには、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼが含まれるが、それらに限定されない。熱安定性リガーゼは、原核生物、真核生物、または古細菌生物を含むがそれらに限定されない好熱性または超好熱性生物から入手できる。一部のＲＮＡリガーゼもまた、本発明の方法において使用できる。
【００７０】
化学的連結剤には、制限なく、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外光などの活性化剤、縮合剤、および還元剤が含まれる。自己連結反応（ａｕｔｏｌｉｇａｔｉｏｎ）、すなわち連結剤の不在下での自発的な連結もまた本発明の範囲内に含まれる。化学的連結方法についての詳細なプロトコルおよび適切な反応性基についての説明は、特に、Ｘｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２７：８７５−８１（１９９９）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９（１９９４）；Ｋａｎａｙａ  ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７４２３−３０（１９８６）；Ｌｕｅｂｋｅ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３００５−０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：２２１−２４（１９９４）；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９９）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３（１９９４）；Ｐｕｒｍａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３７１３−１９（１９９２）；Ａｓｈｌｅｙ  ａｎｄ  Ｋｕｓｈｌａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：２９２７−３３（１９９１）；Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｏｒｇｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３６７１−９１（１９８８）；Ｓｏｋｏｌｏｖａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３２：１５３−５５（１９８８）；Ｎａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇｉｌｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２７２２−２８（１９６６）；米国特許第５，４７６，９３０号；およびＲｏｙｅｒ，ＥＰ３２４６１６Ｂ１の中に見いだすことができる。一部の実施形態では、連結剤は「活性化」剤または還元剤である。化学的連結が使用される場合は、第１プローブの３’末端および第２プローブの５’末端は連結を促進するために適切な反応性基を含むべきである。
【００７１】
一部の実施形態では、本教示は、オリゴヌクレオチド連結法を提供し、この方法は、ｉ）第１ポリヌクレオチド鎖が変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第１相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングし、かつ第２ポリヌクレオチド鎖が変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第２相補的ポリヌクレオチド配列にアニーリングするように、ＤＮＡ鋳型にアニーリングした第１および第２ポリヌクレオチド鎖を含む複合体を形成する工程であって、変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第２相補的ポリヌクレオチド配列が変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の第１相補的ポリヌクレオチド配列に対して５’に位置する、工程と、ｉｉ）第１および第２ポリヌクレオチド鎖間で安定な共有結合を形成する工程とを含み、第１ポリヌクレオチド鎖または第２ポリヌクレオチド鎖のうちの少なくとも１つが本教示のポリヌクレオチドである。
【００７２】
一部の実施形態では、本教示は、オリゴヌクレオチド連結法を提供し、この方法は、第１オリゴヌクレオチドが変性ＤＮＡ鋳型の鎖上の相補的オリゴヌクレオチド配列にアニーリングして、第１オリゴヌクレオチド鋳型複合体を形成するように、第１オリゴヌクレオチドを変性ＤＮＡ鋳型の鎖にアニーリングさせる工程と、第２オリゴヌクレオチド鋳型複合体を形成するために第２オリゴヌクレオチドに相補的である第１オリゴヌクレオチド鋳型複合体上のオリゴヌクレオチド配列へ第２オリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程であって、第１オリゴヌクレオチドの３’末端および第２オリゴヌクレオチドの５’末端が変性ＤＮＡ鋳型の隣接するヌクレオチドと結合するように、第２オリゴヌクレオチドを第１オリゴヌクレオチド鋳型複合体にアニーリングさせる工程と、第１オリゴヌクレオチドの３’末端と第２オリゴヌクレオチドの５’末端との間で安定な共有結合を形成する工程とを含む。一部の実施形態では、第１オリゴヌクレオチドまたは第２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは本教示のオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００７３】
一部の実施形態では、本教示は、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）第１および第２ポリヌクレオチドプローブが標的鎖内の第１および第２標的領域とそれぞれハイブリダイズし、第１ハイブリダイゼーション複合体を形成するため、ならびに第３および第４ポリヌクレオチドプローブが標的相補鎖内の第１および第２標的領域とそれぞれハイブリダイズし、第２ハイブリダイゼーション複合体を形成するために有効な条件下で、標的ポリヌクレオチド鎖および標的相補鎖を、
（ｉ）標的鎖内の第１標的領域に相補的である配列を含有する第１ポリヌクレオチドプローブおよび
（ｉｉ）標的鎖内の第２標的領域に相補的である配列を含む第２ポリヌクレオチドプローブであって、第２標的領域が第１標的領域に対して５’に位置し、第１標的領域に少なくとも１ヌクレオチド塩基で重複する第２ポリヌクレオチドプローブを含む、第１プローブ対、ならびに
（ｉ）標的相補鎖内の第１領域に相補的である配列を含有する第３ポリヌクレオチドプローブおよび
（ｉｉ）標的相補鎖内の第２標的領域に相補的である配列を含有する第４ポリヌクレオチドプローブであって、第２領域が第１領域に対して５’に位置し、第１領域に少なくとも１ヌクレオチド塩基で重複する、第４ポリヌクレオチドプローブを含む第２プローブ対を反応させる工程と、
（ｂ）（ｉ）標的鎖、第１プローブ、および第１プローブの３’末端ヌクレオチドに隣接して位置する５’末端ヌクレオチドを有する第２プローブの第１フラグメントを含む第３ハイブリダイゼーション複合体、ならびに（ｉｉ）標的相補鎖、第３プローブ、および第３プローブの３’末端ヌクレオチドに隣接して位置する５’末端ヌクレオチドを有する第４プローブの第１フラグメントを含む第４ハイブリダイゼーション複合体を形成するために、第１ハイブリダイゼーション複合体において第２プローブ、および第２ハイブリダイゼーション複合体において第４プローブを切断する工程と、（ｃ）標的鎖にハイブリダイズした第１連結鎖を形成するために、第２プローブのハイブリダイズしたフラグメントに第１プローブを連結させ、標的相補鎖にハイブリダイズした第２連結鎖を形成するために第４プローブのフラグメントに第３プローブを連結させる工程と、（ｄ）標的鎖から第１連結鎖を、および標的相補鎖から第２連結鎖を変性させる工程と、（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１つまたは複数の追加のサイクルを実施する工程であって、ただし最終サイクルにおいて工程（ｄ）が任意で省略される、工程とを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、第１領域は、第２領域と１ヌクレオチド塩基で重複してよい。一部の実施形態では、第１および第３プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結してよい。一部の実施形態では、第１および第３プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結してよい。一部の実施形態では、第２および第４プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結してよい。一部の実施形態では、第２および第４プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基で終結してよい。一部の実施形態では、第１、第２、第３および第４プローブの５’末端は、それぞれ独立してヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結してよい。一部の実施形態では、第２および第４プローブの３’末端は、それぞれ独立してヌクレオチド３’ヒドロキシル基以外の基で終結してよい。一部の実施形態では、第２および第４プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’リン酸基で終結してよい。
【００７５】
一部の実施形態では、これらのプローブのうちの少なくと１つは検出可能な標識を含有していてもよい。一部の実施形態では、標識は蛍光標識であってもよい。一部の実施形態では、標識は放射性標識であってもよい。一部の実施形態では、標識は化学発光標識であってもよい。一部の実施形態では、標識は酵素であってもよい。一部の実施形態では、第１プローブおよび第３プローブのうちの少なくと１つは検出可能な標識を含有してよい。一部の実施形態では、第１プローブおよび第３プローブのそれぞれは検出可能な標識を含有してよい。一部の実施形態では、第１プローブおよび第３プローブ上の検出可能な標識は同一であってもよい。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブのうちの少なくとも１つは検出可能な標識を含有してよい。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブのそれぞれは検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブは同一の検出可能な標識を含有してよい。
【００７６】
一部の実施形態では、切断する工程は、第３ハイブリダイゼーション複合体と結合していない第２プローブから第２フラグメントを生成し、本方法は、上記第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。
【００７７】
一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブのうちの少なくとも１つは（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）蛍光色素が蛍光励起エネルギーを受けるとき、蛍光色素からの蛍光発光を消光させることができるクエンチャー色素の両方を含有し、上記切断する工程は第２プローブおよび／または第４プローブにおける蛍光色素とクエンチャー色素との間の共有結合を切断し、それによって蛍光色素からの観察可能な蛍光シグナルを増加させる。一部の実施形態では、第２プローブおよび第４プローブはそれぞれ、（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）クエンチャー色素を含有していてもよい。
【００７８】
一部の実施形態では、上記切断する工程は、第４ハイブリダイゼーション複合体と結合していない第４プローブから第２フラグメントを生成し、本方法は、両方の第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、第２フラグメントは、標的鎖に実質的に相補的ではない１つまたは複数の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の連続するヌクレオチドは、１〜２０個のヌクレオチドを含む。
【００７９】
一部の実施形態では、本方法は、固体支持体上に第２フラグメントを固定化する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、第２フラグメントを電気泳動に供する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、質量分析法によって第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、最終サイクル後に第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、複数のサイクル中または後に第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、全サイクルの間に第２フラグメントを検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１回のサイクル後に、第１ハイブリダイゼーション複合体、第２ハイブリダイゼーション複合体、またはそれらの両方を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１回のサイクル後に、第３ハイブリダイゼーション複合体、第４ハイブリダイゼーション複合体、またはそれらの両方を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１回のサイクル後に、第１連結鎖、第２連結鎖、またはそれらの両方を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態では、前記検出する工程は、電気泳動による分離工程を含む。
【００８０】
標的ポリヌクレオチドを検出するための連結方法のさらなる実施形態は、参考としてその全体が本明細書に組み込まれるＢｉ，Ｗ．ら、の米国特許第６，５１１，８１０号に見いだすことができる。
【実施例】
【００８１】
材料および方法
他に特に指示されていない限り、全ての合成反応は、アルゴン雰囲気下で、オーブンまたは火炎乾燥したガラス器具中で実施した。塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、アルゴン下で水素化カルシウム（ＣａＨ２）から蒸留した。他に特に指示されていない限り、その他のすべての溶媒は、配給業者から受領したままで使用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した１ｍｍシリカゲルプレート上で実施し、ＵＶ光（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ；ＥＮＦ−２４０Ｃ型）で可視化したか、またはＫＭｎＯ４もしくはリンモリブデン酸により染色した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した平均粒径４０μｍのシリカゲルを用いて実施した。非誘導体化ＣＰＧ支持体は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ（Ｐ／Ｎ  ３６０１３９、カリフォルニア州フォスターシティー）から入手した。他に特に指示されていない限り、他のすべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。他に特に指示されていない限り、自動ＤＮＡ合成は、標準プロトコルにしたがって０．２μｍｏｌスケールでＡＢＩ３９４  ＤＮＡ合成装置で実施した。オリゴヌクレオチドは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム上で逆相ＨＰＬＣによって精製した。ＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、Ｍａｒｉｎｅｒ質量分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティー）で記録した。合成されたオリゴヌクレオチドの純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＥシステム上でキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって確かめた。
【００８２】
合成
２’−デオキシ−プソイドイソシチジンＣＰＧ：
２’−デオキシ−プソイドイソシチジンＣＰＧは、スキーム１によって合成した。Ｎ−ベンゾイル保護２’−デオキシ−プソイドイソシチジン（１）は、Ｍａｙｅｒ，Ａ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ｖ．２２，１９１９−２５（２００３）に記載されるように合成した。
【００８３】
【化６】
2008535518.tif 000006
４’−（３−カルボキシプロピオニル）−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−プソイドイソシチジン（２）：
０．７ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の３０ｍｇの１の攪拌溶液に、８．５ｍｇの無水コハク酸、２．９ｍｇのＤＭＡＰおよび１４μＬのトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を加えた。１２時間攪拌した後、混合物を７ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％クエン酸水溶液（１×７ｍＬ）および飽和塩化ナトリウムＮａＣｌ（１×７ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４により乾燥させ、蒸発させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１８ｍｇの４’−（３−カルボキシプロピオニル）−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−プソイドイソシチジンを得た。
【００８４】
２’−デオキシ−プソイドイソシチジンＣＰＧ（３）：
０．６ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の、上記で入手した１７ｍｇの５−トリフルオロメチル−４’−（３−カルボキシプロピオニル）−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシウリジンの溶液に、８．３ｍｇの２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサ−フルオロリン酸塩（ＨＢＴＵ）、５．７μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）および５９４ｍｇのＣＰＧ（３７μＭ／ｇ）を加えた。この混合液を２時間振とうし、次にＤＭＦ（４×２０ｍＬ）およびＴＨＦ（２×２０ｍＬ）で洗浄した。５−トリフルオロメチル−２’−デオキシウリジンＣＰＧ産物を高真空下で４時間乾燥させた。
【００８５】
２’−デオキシ−プソイドイソシチジンの３’末端オリゴヌクレオチド：
上述したように、自動ＤＮＡ合成は、標準プロトコルにしたがって０．２μｍｏｌスケールでＡＢＩ３９４  ＤＮＡ合成装置で実施した。オリゴヌクレオチドは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム上で逆相ＨＰＬＣによって精製した。その結果、表１に示したポリヌクレオチドを合成した。フォワードプライマーＡＴＩＲＦｃＣおよびリバースプライマーＡＴＩＲＲｃＣアンジオテンシンＩＩタイプ１受容体遺伝子（ＡＴＩＲ、１００ｂｐ）。フォワードプライマーＬＩＧＦｃＣおよびリバースプライマーＬＩＧＲｃＣは、ヒトＤＮＡリガーゼＩ遺伝子（ＬＩＧ、２５０ｂｐ）の一部を増幅する。フォワードプライマーＤ１０ＳＦｃＣおよびリバースプライマーＤ１０ＳＲｃＣは、ヒト染色体１０番クローンＲＰ１１−１４３Ｄ９（Ｄ１０Ｓ、１０２ｂｐ）の一部を増幅する。
【００８６】
【化７】
2008535518.tif 000007
増幅：
全てのｇＤＮＡ増幅は、反応液１５μＬに付き５，０００コピーのｇＤＮＡを用いて実施した。
【００８７】
増幅反応条件：
増幅は、以下の試薬を含有する未改変および／または改変プライマーのいずれかを用いて１５μＬの反応液中で実施した：
−  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３
−  ５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｖ／ｖ）ゼラチン
−  ０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、および０．４ｍＭ  ｄＵＴＰ
−  ０．０２５単位／μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｐ／Ｎ  Ｎ８０８−０１０７）
−  各２００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
−  鋳型無含有コントロール（ＮＴＣ）実験または１５ｎｇのゲノムＤＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｐ／Ｎ  ４０３０６２）のための水。
【００８８】
全てのＰＣＲ反応の進行はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ａｎｄ  ＲＴ−ＰＣＲ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、２００２）に記載されたようにＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティー）上でのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙによってリアルタイムでモニタリングした。
【００８９】
増幅反応分析：
全ての増副産物は、以下のようにゲル電気泳動によって分析した。ＰＣＲ反応混合液（１５μＬ）は、５μＬのヌクレアーゼ無含有水で希釈した。この溶液を２５ｂｐのＤＮＡラダーに沿って４％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐ／Ｎ  Ｇ５０１８−０４）を含むウエル内にロードした。電気泳動は、１２Ｖ  ＤＣおよび８８０ｍＡで３０分間にわたり実施した。ｄｓＤＮＡの臭化エチジウム染色バンドはＵＶ照射を用いて可視化し、Ｋｏｄａｋデジタルカメラを装備したＡｌｐｈａＤｉｇＤｏｃ  １０００ソフトウエア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ社、カリフォルニア州サンリアンドロ）によって定量した。
【００９０】
サーマルサイクリング：
増幅温度サイクリングは、以下のサーマルサイクリングプロトコルを用いて実施した。
【００９１】
【化８】
2008535518.tif 000008
各プライマー対について、未改変および３’改変プライマーを用いた増幅反応は、プライマー対に対応するｇＤＮＡを用いて実行した。さらに、未改変および３’改変プライマーを用いた増幅反応は、鋳型なしコントロール（ＮＴＣ）反応として、いかなる鋳型も用いずに実行した。
【００９２】
ゲル電気泳動分析は、上述したように実施した。ゲル電気泳動は、使用したプライマーセットに依存して、プライマーダイマーアンプリコンの形成を指示している未改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅において、約４０〜５０ｂｐで有意な量の非特異的増幅産物を示した。他方、有意に減少したプライマーダイマーアンプリコン形成は、３’改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅のゲル電気泳動画像において観察された。未改変プライマーを用いたｇＤＮＡ鋳型増幅反応のゲル電気泳動は、明白に所望の鋳型アンプリコンに対応するバンドを示し、さらにプライマーダイマーアンプリコン形成に対応するバンドも示した。
【００９３】
未改変プライマーを用いたＡＴＩＲ鋳型の増幅は、明白に所望の鋳型アンプリコンに対応する約１００ｂｐのバンドを示し、さらにプライマーダイマーアンプリコン形成に対応する約５０ｂｐのバンドも示した。他方、３’改変プライマーを用いたＡＴＩＲ鋳型の増幅は、明白に所望の鋳型アンプリコンに対応する約１００ｂｐのバンドを示したが、確認できるプライマーダイマーアンプリコン形成は示さなかった。
【００９４】
リアルタイムＰＣＲモニタリングは、未改変および３’改変プライマーを用いたＡＴＩＲ  ｇＤＮＡ増幅効率は酷似していることを示した。他方、未改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅は約３０のＣｔ値を生じさせたが、２’−デオキシ−プソイドイソシチジン改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅は第３７サイクルが終結するまで測定可能なシグナルを生じなかった。
【００９５】
未改変プライマーを用いたＬＩＧ鋳型の増幅は、明白に所望の鋳型アンプリコンに対応する約２５０ｂｐのバンドを示し、さらにプライマーダイマーアンプリコン形成に対応する約５０ｂｐの微かなバンドも示した。他方、３’改変プライマーを用いたＬＩＧ鋳型の増幅は、明白に所望の鋳型アンプリコンに対応する約２５０ｂｐでバンドを示したが、確認できるプライマーダイマーアンプリコン形成は示さなかった。
【００９６】
リアルタイムＰＣＲモニタリングは、未改変−および３’改変プライマーを用いたＬＩＧ  ｇＤＮＡ増幅効率は類似しており、それぞれ２６および３３のＣｔ値を有することを示した。他方、未改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅は約３６のＣｔ値を示したが、２’−デオキシ−プソイドイソシチジン改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅は５０サイクルの増幅を通して測定可能なアンプリコン形成を示さなかった。
【００９７】
未改変プライマーを用いたＤ１０Ｓ鋳型の増幅は、明白に所望の鋳型アンプリコンに対応する約１００ｂｐのバンドを示し、さらにプライマーダイマーアンプリコン形成に対応する約５０ｂｐのバンドも示した。他方、３’改変プライマーを用いたＤ１０Ｓ鋳型の増幅は、明白に所望の鋳型アンプリコンに対応する約１００ｂｐのバンドを示したが、視認できるプライマーダイマーアンプリコン形成は示さなかった。
【００９８】
リアルタイムＰＣＲモニタリングは、未改変−および３’改変プライマーを用いたＤ１０Ｓ  ｇＤＮＡ増幅効率は酷似しており、それぞれ２３および２６のＣｔ値を有することを示した。他方、未改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅は約２９のＣｔ値を示したが、２’−デオキシ−プソイドイソシチジン改変プライマーを用いたＮＴＣ増幅は第４０サイクルが終結するまで測定可能なシグナルを示さなかった。
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月17日(2008.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008535518000001.app
【国際調査報告】
2008535518.tif 000010
2008535518.tif 000011
2008535518.tif 000012
2008535518.tif 000013
2008535518.tif 000014
2008535518.tif 000015