(57)【要約】【課題】いわゆる健康茶として喫飲されている茶外茶に後発酵処理を施すことで、蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵茶を含む蛋白質糖化反応生成阻害剤を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題を解決するために、ルイボス茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が強化された後発酵ルイボス茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤、ハマ茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が強化された後発酵ハマ茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤、甜茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が強化された後発酵甜茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤、柿の葉茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が強化された後発酵柿の葉茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤などを提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルイボス茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵ルイボス茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項２】
ハマ茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵ハマ茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項３】
甜茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵甜茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項４】
柿の葉茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵柿の葉茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１又は２以上の蛋白質糖化反応阻害剤を含む飲食品。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１又は２以上の蛋白質糖化反応阻害剤を含む健康食品。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１又は２以上の蛋白質糖化反応阻害剤を含む食品添加物。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１又は２以上の蛋白質糖化反応阻害剤を含む医薬品。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか１又は２以上の蛋白質糖化反応阻害剤を含む医薬部外品。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか１又は２以上の蛋白質糖化反応阻害剤を含む化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶外茶に後発酵処理を施すことで蛋白質糖化反応阻害作用が増強した茶外茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤及び、当該蛋白質糖化反応阻害剤を含有する飲食品や医薬品などに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質糖化反応（以下、糖化反応と省略）は、Ｌ．Ｃ．Ｍａｉｌｌａｒｄがアミノ酸と還元糖を加熱すると褐色の色素が生成することを発見したことからメイラード反応として知られるようになった。近年、この糖化反応が老化現象、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などにも関与していることが明らかになっている。例えば、糖化反応により蛋白質は褐変化するが、これにより、肌などにくすみが生じることになる。また、糖化反応により皮膚や骨のコラーゲンが硬化することにより、皮膚や骨の弾力及びしなやかさが損なわれてしまう。そこで、生体に様々な影響を及ぼす糖化反応を阻害するための研究が種々行われている。
【０００３】
例えば、特定の植物の抽出物が蛋白質糖化反応を抑制することについて有効であることが報告されている（特許文献１）。本出願人らは蛋白質糖化反応を抑制する植物として報告されているドクダミを後発酵させて得たドクダミ後発酵茶が、元来のドクダミ茶に対して蛋白質糖化反応阻害作用が優れていることを見出した（特願２０１３−０１８９１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１９５８４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、いわゆる健康茶として喫飲されている茶外茶に後発酵処理を施すことで、蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵茶を含む蛋白質糖化反応生成阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、第一の発明として、ルイボス茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵ルイボス茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤を提供する。また、第二の発明として、ハマ茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵ハマ茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤を提供する。また、第三の発明として、甜茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵甜茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤を提供する。また、第四の発明として、柿の葉茶を後発酵処理することにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵柿の葉茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤を提供する。
【０００７】
第五の発明として、第一の発明から第四の発明のいずれか１または２以上の蛋白質糖化反応阻害剤を含む飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、後発酵処理により蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵茶外茶を含む蛋白質糖化反応阻害剤などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】酸化発酵又は後発酵により得られる茶を説明するための図
【図２】試験１の試験結果を示す図
【図３】試験２の試験結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
<実施形態>
<概要>
【００１１】
本実施形態は、ルイボス茶、ハマ茶、甜茶、柿の葉茶の各茶外茶を後発酵させることで、それらの茶外茶が元来備える蛋白質糖化反応阻害作用が増強されることを示す。
<構成>
【００１２】
本実施形態に係る蛋白質糖化反応阻害剤は、ルイボス茶、ハマ茶、甜茶、柿の葉茶のそれぞれに後発酵処理を施した後発酵ルイボス茶、後発酵ハマ茶、後発酵甜茶、後発酵柿の葉茶のいずれかを含むものである。
【００１３】
「ルイボス茶」は、マメ科アスパラトゥス属の「ルイボス（Ａｓｐａｌａｔｈｕｓ  ｌｉｎｅａｒｉｓ）」の葉を原料とする茶外茶である。なお、「茶外茶」とは、チャノキの葉や茎などを原料とする「茶」に対して、チャノキ以外の植物の葉、茎、根などを原料とし、水や湯を注いで喫飲する飲料を意味する。
【００１４】
「ハマ茶」は、ジャケツイバラ科カワラケツメイ属の「カワラケツメイ（Ｃｈａｍａｅｃｒｉｓｔａ  ｎｏｍａｍｅ）」の葉や茎を原料とする茶外茶である。
【００１５】
「甜茶」は、バラ科キイチゴ属の「テンヨウケンコウシ（Ｒｕｂｕｓ  ｓｕａｖｉｓｓｉｍｕｓ）」の葉や茎を原料とする茶外茶である。
【００１６】
「柿の葉茶」は、カキノキ科カキノキ属の「カキノキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ  ｋａｋｉ）」の葉を原料とする茶外茶である。
【００１７】
「後発酵」とは、茶葉を微生物により発酵させることをいう。後発酵茶には、プーアル茶（中国）、バタバタ茶（富山県）、阿波番茶（徳島県）、碁石茶（高知県）、石鎚黒茶（愛媛県）などがある。
【００１８】
また、茶葉に施す「発酵」には、後発酵の他に「酸化発酵」がある。酸化発酵は、茶葉が元来もつ酸化酵素（ポリフェノールオキシダーゼ）による発酵をいう。図１を用いて、後発酵及び酸化発酵について説明する。
【００１９】
図１は、チャノキを原料とし酸化発酵又は後発酵を施すことで得られる茶を説明するための図である。図示するように、摘み取ったチャノキの葉や茎を加熱する（蒸す）ことで酸化発酵を止めたものが「緑茶」である。「ウーロン茶」は酸化発酵の途中で加熱して発酵を止めた半発酵茶である。ウーロン茶のように途中で発酵を止めることなく、完全に発酵させて得られるのが「紅茶」である。また、「団茶」は半発酵後に後発酵を施して得られる。
【００２０】
一方、後発酵を施すことで得られる後発酵茶の例としては、カビ付けによる好気発酵を施した「プーアル茶」や「バタバタ茶」があり、乳酸菌などのバクテリアによる嫌気発酵を施した「阿波番茶」があり、好気発酵と嫌気発酵とを組み合わせて施した「碁石茶」や「石鎚黒茶」がある。
【００２１】
本実施形態において、「後発酵ルイボス茶」とはルイボス茶の原料となるルイボスの葉や茎に後発酵処理を施して茶外茶とするものをいう。「後発酵ハマ茶」、「後発酵甜茶」、「後発酵柿の葉茶」についても同様に、それぞれの原料となる葉や茎に後発酵処理を施して得たものをいう。
【００２２】
後発酵処理の一例として、後述する試験において用いた後発酵処理を以下に説明する。まず、茶外茶の原料となるルイボスやカワラケツメイなどの葉や茎を、スライス又は寸切りにしてから乾燥させる。そして、乾燥させた葉や茎をさらにカット又は粉砕してカット体又は粉砕体を得る。他方で、プーアル茶や碁石茶などの後発酵茶を水中に投じ、その後発酵茶に存する微生物を該水中に移動させて抽出液を得る。そして、得られたカット体又は粉砕体に該抽出液を噴霧し１〜３週間程度発酵させる。その後、機械により又は天日により乾燥させることで、後発酵ルイボス茶や後発酵甜茶などを得ることができる。なお、機械による乾燥（機械乾燥）及び天日による乾燥（天日干し）は、一般的な緑茶を製造する際の設備や手法により行うことができる。
【００２３】
上述した後発酵ルイボス茶や後発酵ハマ茶などを含む蛋白質糖化反応阻害剤は、これを含有する飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、化粧品、医薬部外品などとして応用することが可能である。例えば、医薬品や医薬部外品とする場合には、上記の蛋白質糖化反応阻害剤を粉体や粒体としカプセルに充填したり、あるいは、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加して打錠機等を用いて錠剤としてもよい。また、食品添加物や健康食品とする場合には、医薬品などのようにカプセルや錠剤のような形態で提供してもよいし、飲料、調味料、菓子等の各種の食品に蛋白質糖化反応阻害剤を添加した態様で提供することもできる。
<試験１>
【００２４】
本試験は、上述したルイボス茶、甜茶、ハマ茶、柿の葉茶の各茶外茶と、それら各茶外茶に後発酵処理を施した後発酵茶をサンプルとして、後発酵処理の前後における蛋白質糖化反応阻害作用を測定し、蛋白質糖化反応阻害作用の変化を検証した。具体的には、ブドウ糖含有リン酸緩衝液にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とサンプルを加え４０時間反応させた後、マイクロプレートリーダーでＡＧＥｓ蛍光を測定し、５０％生成阻害濃度ＩＣ５０値（ｍｇ／ｍＬ）を算出した。
【００２５】
また、後述する試験２において、上記各サンプルを用いて、後発酵の前後におけるポリフェノール量についても測定した。具体的には、サンプルの総ポリフェノール量（カテキン当量）を既知のフォーリン−チオカルト法で測定した。
【００２６】
本試験のサンプルとして上述のルイボス茶、甜茶、ハマ茶、柿の葉茶の各茶外茶の他に、フトモモ科バンジロウ属のグァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）を原料とするグァバ茶、キク科シカギク属のジャーマンカモミール（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ ｒｅｃｕｔｉｔａ）を原料とするカモミール茶、シソ科シソ属のシソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）を原料とするシソ葉茶を用いた。なお、サンプルに用いた茶外茶は、すべて株式会社ひかわが製造したものである。サンプル調製及び試験方法、結果などについて以下に詳述する。
（１）サンプルの調製
【００２７】
８０℃に加熱した蒸留水４０ｍＬ中に各茶葉１ｇを加えて、８０℃に設定したウォーターバス中で１時間抽出した。次に、各茶葉抽出液をアルミトレイにのせ、水分を蒸発させて、各茶葉抽出液の原液濃度を算出した。
（２）蛋白質糖化反応阻害作用の測定
【００２８】
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍｍｏｌ/Ｌ、グルコース溶液２．０ｍｏｌ/Ｌ、ＨＳＡ４０ｍｇ/ｍＬ（Ｓｉｇｍａ社）、硫酸キニーネ５μｌ／ｍＬをそれぞれ調製した。そして、調製したサンプルを１、１０、１００倍の３段階に希釈し、希釈液を作成した。
【００２９】
１．５ｍＬエッペンチューブに各サンプル３本ずつ、ＨＳＡを以下の表１に示す容量で反応液を分注した。サンプルを加えた溶液として、グルコース溶液を加えた「サンプル（＋）」とグルコース溶液を加えない「サンプル（−）」を作成した。また、反応系のＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｒｅｆ）としては精製水を分注してグルコース溶液を加えた「Ｒｅｆ（＋）」とグルコース溶液を加えない「Ｒｅｆ（−）」とを同様に作成した。
【表１】
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【００３０】
続いて、１．５ｍＬエッペンチューブをボルテックスで十分に撹拌した。そして、６０℃に設定したインキュベーターに反応液を入れた１．５ｍＬエッペンチューブを４０時間静置し反応させた。反応後, ボルテックスで十分に撹拌した．
【００３１】
９６ウェルマイクロプレートにキニーネ、精製水、各反応液を２００μＬずつ分注した（ｎ＝３）。そして、マイクロプレートリーダーで励起波長３７０ｎｍ、検出波長４４０ｎｍに設定し、蛍光を測定した。そして、サンプルによる蛍光性ＡＧＥｓの５０％生成抑制作用ＩＣ50（蛋白質糖化反応阻害作用）を、以下の手順により算出した。
【００３２】
（３）蛋白質糖化反応阻害作用の算出
１）キニーネ、精製水、各反応液の蛍光値を計算した。
２）（キニーネ−精製水）を計算した。
３）各反応液の平均値から精製水の蛍光値を引いた。
４）３）の値÷２）の値）×１０００を計算した。
５）４）の値の差[サンプル（＋）−サンプル（−）]、[Ｒｅｆ（＋）−Ｒｅｆ（−）]を計算した。
６）Ｒｅｆ（＋）−Ｒｅｆ（−）＝100とし、サンプルの蛍光性ＡＧＥｓ生成阻害作用（%）を、下記の数式により計算した。
【数１】
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【００３３】
７）蛍光性ＡＧＥｓ生成阻害作用（３濃度）からサンプル濃度と蛍光性ＡＧＥｓ生成阻害作用の回帰式を求めた。
８）求めた回帰式から、ｙ＝５０としたときのｘの値を求め、これより５０％生成抑制作用ＩＣ50の値とした。
【００３４】
（４）結果
【００３５】
図２は、上記試験の結果を示すものである。図中ＩＣ50値における「前」は、後発酵処理を施さないサンプルについてのＩＣ50値を示している。一方、「後」は、後発酵処理を施したサンプルについてのＩＣ50値を示している。「後／前比」は、後発酵処理の前後におけるＩＣ50値の比を示すものである。この「後／前比」の値が小さい程、後発酵処理による蛋白質糖化反応阻害作用の増強率が高かったことを示す。また、比較対象として、公知の蛋白質糖化反応阻害剤であるアミノグアニジン（和光純薬工業社製）のＩＣ50の値を記している。
【００３６】
図示するように、ルイボス茶、ハマ茶、甜茶、柿の葉茶において、後発酵化処理による蛋白質糖化反応阻害作用の増強が認められた。
<試験２>
【００３７】
本試験は、試験１で用いた各サンプルの後発酵の前後におけるポリフェノール量について測定した。近年の研究において、茶のポリフェノール類、とくにカテキン類に抗糖化活性があることが分かってきている。また、カテキン類においてもその種によって抗糖化活性に差異があることも分かってきている。そこで、各サンプルの後発酵の前後における総ポリフェノール量を測定し、抗糖化活性との関係について検討する。なお、「総ポリフェノール量」とは、サンプルに含まれ得る種々のポリフェノールの量の総量を意味する。
【００３８】
サンプルの総ポリフェノール量（カテキン当量）は既知のフォーリン−チオカルト法で測定した。試験方法及び結果について、以下に詳述する。
【００３９】
（１）カテキン検量線の作成
１）フォーリン−チオカルト試薬（ＦＣ試薬）を２倍希釈して、２倍希釈ＦＣ試薬を作製した。また０．４ｍｏｌ/ＬＮａ２ＣＯ２水溶液、及び、１ｍｇ／ｍＬカテキン試薬を調製した。
２）調製したカテキン試薬を、１、０．５、０．２５、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．０１、０．００６２５、０．００１、０．０ｍｇ／ｍＬの１１段階の希釈液を作成した。
３）作成したそれぞれの希釈液について、１．５ｍＬエッペンチューブに３本ずつ、下記の表２の通り反応液を分注した。なお、「カテキン（＋）」はカテキン試薬に２倍希釈ＦＣ試薬を加えた反応液であり、「カテキン（−）」はカテキン試薬に２倍希釈ＦＣ試薬を加えない反応液であり、また「ＦＣ」はカテキン試薬を加えずに２倍希釈ＦＣ試薬を加えた反応液である。
【表２】
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４）１．５ｍＬエッペンチューブをボルテックスで撹拌した。
５）３０℃に設定しておいたインキュベーターに、反応液を入れた１．５ｍＬエッペンチューブを３０分間静置し反応させた。
６）反応後、室温で３０分間冷却した。
７）９６ウェルプレートに反応液を各サンプル２００μＬずつ分注した。
８）マイクロプレートリーダーで波長を６６０ｎｍに設定し、吸光度を測定した。
９）検量線を作製した。
【００４０】
（２）サンプルの測定
１）各サンプル溶液を１０倍に希釈して１０倍希釈サンプル溶液を作製した。
２）１．５ｍＬエッペンチューブに各サンプル３本ずつ下記の表３の通り反応液を分注した。なお、「サンプル（＋）」は１０倍希釈サンプル溶液に２倍希釈ＦＣ試薬を加えた反応液であり、「サンプル（−）」は１０倍希釈サンプル溶液に２倍希釈ＦＣ試薬を加えない反応液であり、「ＦＣ」は１０倍希釈サンプル溶液を加えずに２倍希釈ＦＣ試薬を加えた反応液である。
【表３】
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３）１．５ｍＬエッペンチューブをボルテックスで十分に撹拌した。
４）３０℃に設定しておいたインキュベーターに、反応液を入れた１．５ｍＬエッペンチューブを３０分間静置し反応させた。
５）反応後、室温で３０分間冷却した。
６）９６ウェルプレートに反応液を各サンプル２００μＬずつ分注した。
７）マイクロプレートリーダーで波長を６６０ｎｍに設定し、吸光度を測定した。
８）カテキン検量線を用い、各サンプル溶液の総ポリフェノール量（カテキン当量）を求めた。
【００４１】
（３）結果
【００４２】
図３は、上記試験の結果を示すものである。図中総ポリフェノール量における「前」は、後発酵処理を施さないサンプルについての総ポリフェノール量を示している。一方、「後」は、後発酵処理を施したサンプルについての総ポリフェノール量を示している。図示するように、ルイボス茶、ハマ茶、甜茶、柿の葉茶、カモミール茶については、後発酵処理を施すことにより総ポリフェノール量が増加している。
【００４３】
また、試験１の結果と合わせて検討すると、後発酵処理を施すことにより蛋白質糖化反応阻害作用が増強したルイボス茶、ハマ茶、甜茶、柿の葉茶は、いずれも総ポリフェノール量が増加することが分かった。したがって、後発酵処理による蛋白質糖化反応阻害作用の増強には、総ポリフェノール量の増加が関与している可能性がある。また、総ポリフェノール量の増加は、ポリフェノールによる抗酸化作用の増強と捉えることもでき、すなわち、ルイボス茶、ハマ茶、甜茶、柿の葉茶に後発酵処理を施すことにより、それらの茶の抗酸化作用を増強し得ると言える。
<効果>
【００４４】
後発酵処理により蛋白質糖化反応阻害作用が増強した後発酵ルイボス茶、後発酵ハマ茶、後発酵甜茶、後発酵柿の葉茶のいずれかを含む蛋白質糖化反応阻害剤などを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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