(57)【要約】【課題】簡便かつ迅速に高精度に血液検体中のＡＴＰ濃度を測定できる方法及びこの方法に使用できるキットを提供する。【解決手段】以下の工程１〜５を含む血液検体中に含まれるＡＴＰ測定方法及びそれに用いるキット。工程１:ＡＴＰ含有試料溶液を得る工程、工程２:ＡＴＰ含有試料溶液とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを含有する緩衝液（ｐＨ７．８）を混合して１〜５分保持する工程、（但し、工程１における希釈倍率と工程２における希釈倍率との積は５０倍以上である。）工程３:工程２で得た混合物とピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液（ｐＨ５．７）を混合して保持する工程、（但し、工程３における希釈倍率は２０倍以上であり、かつ工程１における希釈倍率と工程２における希釈倍率、工程４:工程３で得た混合物に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて保持する工程、および工程５:ＡＴＰの濃度を判定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程１〜５を含み、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールＳである、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記する）の測定方法。
工程１:血液検体をＡＴＰの少なくとも一部が遊離するように前処理してＡＴＰ含有試料溶液を得る工程、
工程２:工程１で得たＡＴＰ含有試料溶液の少なくとも一部とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを含有する緩衝液（ｐＨ７．８±０．３）を混合して１〜５分保持する工程、
（但し、工程１における希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と工程２における希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）との積は５０倍以上である。希釈倍率は容量基準である。）
工程３:工程２で得た混合物の少なくとも一部とピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液（ｐＨ５．７±０．３）を混合して所定時間保持する工程、
（但し、工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３の緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）は２０倍以上であり、かつ工程１における希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と工程２における希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）と工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３の緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）の積は１０００倍以上である。希釈倍率は容量基準である。）、
工程４:工程３で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および
工程５:工程４で得た混合物の色からＡＴＰの濃度を判定する工程。
【請求項２】
工程４で得た混合物の色を目視観察して、検体中に含まれるＡＴＰの濃度が、あらかじめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発色試薬がキシレノールオレンジである場合には、検体中に含まれるＡＴＰ濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程４で得た混合物が紫を呈し、低いときには黄または橙を呈するように、下記工程２〜４の条件を設定し、
前記発色試薬がクロマズロールＳである場合には、検体中に含まれるＡＴＰ濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程４で得た混合物が青を呈し、低いときには橙を呈するように、下記工程２〜４の条件を設定する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程４で得た混合物の吸光度を測定して、検体中に含まれるＡＴＰの濃度を求める請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血液検体が血液サンプルをＡＴＰが遊離するように前処理した物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程２の保持時間は２〜３分であり、工程３の所定保持時間は３分以上であり、工程４の所定保持時間は３分以上であり、工程２、３及び４の合計保持時間は８〜２０分である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程２において、所定保持時間経過後即座に、混合液は、工程３におけるピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液と混合する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下の試薬１〜６を含み、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に用いられる、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記する）の測定用キット。
１:アデノシンモノリン酸、およびホスホエノールピルビン酸、
２:アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
３:ピルビン酸オキシダーゼ、並びに
４:酸、鉄(II)、および発色試薬（但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールＳである）
５：緩衝液Ａ（ｐＨ７．８±０．３）
６：緩衝液Ｂ（ｐＨ５．７±０．３）
【請求項９】
ＡＴＰ抽出用試薬またはヌクレオチド抽出用試薬をさらに含む請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含む請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
キットの説明書を含む請求項８〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
希釈血液検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む請求項８〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記容器がキュベット、マルチタイタープレート、または遠沈管である請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液検体のＡＴＰ測定方法及びこの方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、患者の重症度評価法として APACHE II スコアが広範に用いられているが、検査項目が多く、重症度評価に最低でも24 時間の時間を要する。また APACHE II スコアは入院予測死亡率であり、患者の病気の重症度をリアルタイムに評価してはいない。最近、健常者の末梢血中のＡＴＰレベルは0.5〜1.2 mMであり、死亡に至る患者はその最低値を下回っているため、ＡＴＰレベルが重症度の指標になりうることが徳島大学の千田らによって報告された(非特許文献１PLOS ONE, 8, e60561 (2013))。
【０００３】
従来、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の測定には生物発光法が用いられてきた。この方法は、ホタルルシフェラーゼが触媒する生物発光反応を利用したものであり、ＡＴＰに対して高い特異性を持つとともに迅速な結果を与える。生菌数と生菌から抽出したＡＴＰ濃度はよい正の相関があるため、食品工業などで利用されている。しかし、生物発光法は発光量を測定するための高価な専用装置を必要とする。そのため、代表的なATP測定法であるルシフェラーゼ発光法は、測定器が医療現場で普及していないため採用が困難と考えられている。
【０００４】
測定装置が普及していない医療現場、必ずしも精度良い結果を必要としない現場、特定の濃度（カットオフ値）でスクリーニングを行う現場では、比色計または目視判定による比色法が好まれる。特に医療現場では、インフルエンザの迅速診断キットなどのように結果を目視で判定できるものが好まれている。
【０００５】
食品等の検体中に含まれる細菌数に応じたＡＴＰ濃度を目視判定できる方法が知られている（特許文献１）。この方法は、ＡＭＰおよびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の存在下、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）で作用することによりＡＴＰ濃度に応じてピルビン酸を増幅かつ蓄積させ、これにピルビン酸オキシダーゼ作用させることにより過酸化水素を生成させ、さらに鉄（II）イオンを加えて、鉄（III）イオンとなったものを発色剤、例えば、キシレノールオレンジと反応させることにより、黄，紫と呈色させる方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本特許第4940432 号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】PLOS ONE, 8, e60561 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載の方法では特定濃度以上で紫に呈色させることが可能であるため、スクリーニング操作が容易に行える利点がある。しかし、前述のように特許文献１に記載の方法は食品等の検体中に含まれる細菌数に応じたＡＴＰ濃度測定に特化した方法であった。しかし、血液検体中のＡＴＰ測定においては、特許文献１に記載の方法は、本発明者らの検討の結果、以下の問題があることが判明した。
（１）測定時間が長く、迅速性に問題がある。
（２）測定精度が低い。
（３）測定結果がばらつく。
（４）緩衝液の性能を補うための酸添加が必要。
【０００９】
そこで本発明は、上記（１）〜（４）の課題を解決した、簡便かつ迅速に高精度に血液検体中のＡＴＰ濃度を測定できる方法及びこの方法に使用できるキットを提供することを目的とする。特に本発明は、医療現場に普及している比色計でも定量可能であり、あるいは目視での判定も可能な血液検体中のＡＴＰ濃度の測定方法及びキットを提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、上記問題を解決して、本発明の目的を達成するために種々の検討を行った。
（１）の測定時間が長く、迅速性に問題がある点については、特許文献１に記載の方法の測定条件はｎＭレベルの微量のＡＴＰに対して最適化されたものであるため、血液検体のように高濃度のＡＴＰの測定には適さないことを突き止めた。
（２）の測定精度が低いことについては、血液検体中のＡＴＰ濃度の変化の幅が小さいく、特許文献１に示される方法は、濃度が桁で変化する場合に適しているためと推察された。
（３）の測定結果のばらつきについては、血液検体中にはアスコルビン酸及びピルビン酸が含まれており、これらの血液成分が特許文献１に示される方法では測定結果のばら付きを生じさせる原因であることを本発明者らは解明した。
（４）酵素反応に適した緩衝液の性能を補うために途中の操作で行う必要があった酸添加を不要とできる方法を開発した。
【００１１】
本発明者らは、上記（１）〜（４）に関しての知見に基づいてさらに検討した結果、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［１］
以下の工程１〜５を含み、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールＳである、血液検体中に含まれるＡＴＰの測定方法。
工程１:血液検体をＡＴＰの少なくとも一部が遊離するように前処理してＡＴＰ含有試料溶液を得る工程、
工程２:工程１で得たＡＴＰ含有試料溶液の少なくとも一部とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを含有する緩衝液（ｐＨ７．８±０．３）を混合して１〜５分保持する工程、
（但し、工程１における希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と工程２における希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）との積は５０倍以上である。希釈倍率は容量基準である。）
工程３:工程２で得た混合物の少なくとも一部とピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液（ｐＨ５．７±０．３）を混合して所定時間保持する工程、
（但し、工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３の緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）は２０倍以上であり、かつ工程１における希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と工程２における希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）と工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３の緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）の積は１０００倍以上である。希釈倍率は容量基準である。）、
工程４:工程３で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および
工程５:工程４で得た混合物の色からＡＴＰの濃度を判定する工程。
［２］
工程４で得た混合物の色を目視観察して、検体中に含まれるＡＴＰの濃度が、あらかじめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定する［１］に記載の方法。
［３］
前記発色試薬がキシレノールオレンジである場合には、検体中に含まれるＡＴＰ濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程４で得た混合物が紫を呈し、低いときには黄または橙を呈するように、下記工程２〜４の条件を設定し、
前記発色試薬がクロマズロールＳである場合には、検体中に含まれるＡＴＰ濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程４で得た混合物が青を呈し、低いときには橙を呈するように、下記工程２〜４の条件を設定する［２］に記載の方法。
［４］
工程４で得た混合物の吸光度を測定して、検体中に含まれるＡＴＰの濃度を求める［１］に記載の方法。
［５］
前記血液検体が血液サンプルをＡＴＰが遊離するように前処理した物である［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
工程２の保持時間は２〜３分であり、工程３の所定保持時間は３分以上であり、工程４の所定保持時間は３分以上であり、工程２、３及び４の合計保持時間は８〜２０分である［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］
工程２において、所定保持時間経過後即座に、混合液は、工程３におけるピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液と混合する［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］
以下の試薬１〜６を含み、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法に用いられる、血液検体中に含まれるＡＴＰの測定用キット。
１:アデノシンモノリン酸、およびホスホエノールピルビン酸、
２:アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
３:ピルビン酸オキシダーゼ、並びに
４:酸、鉄(II)、および発色試薬（但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールＳである）
５：緩衝液Ａ（ｐＨ７．８±０．３）
６：緩衝液Ｂ（ｐＨ５．７±０．３）
［９］
ＡＴＰ抽出用試薬またはヌクレオチド抽出用試薬をさらに含む［８］に記載のキット。
［１０］
境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含む［８］または［９］に記載のキット。
［１１］
キットの説明書を含む［８］〜［１０］のいずれか１項に記載のキット。
［１２］
希釈血液検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む［８］〜［１１］のいずれか１項に記載のキット。
［１３］
前記容器がキュベット、マルチタイタープレート、または遠沈管である［１２］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、血液検体を対象とするＡＴＰ濃度の測定方法において、特許文献１に記載の方法において解決すべき課題であることを本発明者らが見出した前記（１）〜（４）を解決し得る新たなＡＴＰ濃度の測定方法とこの方法に使用するキットを提供することができる。
より具体的には（１）測定時間が長く、迅速性に問題があった点については、各段階の所要時間を制御することで、測定開始から１５分以内で測定を完了することも可能になった。（２）測定精度が低い、および（３）測定結果がばらつくことに関しては、測定方法を構成する段階の構成や条件を変更することで解決した。さらに（４）緩衝液の性能を補うための酸添加を不要とする方法とした。
【００１４】
本発明の方法の一態様であるが、発色剤としてキシレノールオレンジを用いる場合、ＡＭＰおよびＰＥＰ濃度、ＡＫおよびＰＫの酵素活性、並びにＭｇ2+イオン濃度を所定の範囲にすることで、患者の重症度の評価において、正常値の最低値以上である場合には紫色、それを下回る場合には黄・橙系の色を呈するよう設定でき、かつ測定を１５分以内で行えるようにした。尚、いずれの最適値も特許文献１で推奨値として示される濃度範囲外であった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】各種濃度のＡＭＰおよびＰＥＰ（ＡＴＰ濃度一定）における、吸光度とＡＫ／ＰＫ反応の反応時間との関係を示す。
【図２】各種濃度のＡＭＰ（ＡＴＰおよびＰＥＰ濃度一定）における、吸光度とＡＫ／ＰＫ反応の反応時間との関係を示す。
【図３】呈色が紫になる最少吸光度（０．３）に達する時間とＭｇ2+濃度との関係を示す。
【図４】各種活性のＡＫおよびＰＫにおける、吸光度とＡＫ／ＰＫ反応の反応時間との関係を示す。
【図５】キシレノールオレンジ濃度を変化させて測定した、吸光度とＡＴＰ濃度との関係を示す。
【図６】工程２の反応液にピルビン酸カリウムを添加し、その濃度に対して吸光度の変化割合（％）をプロットした結果である。
【図７】工程３の反応液に含まれるアスコルビン酸濃度に対して吸光度変化をプロットした結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［測定方法］
本発明の測定方法は、以下の工程１〜５を含み、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールＳである、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の測定方法である。
【００１７】
＜工程１＞
工程１は、血液検体をＡＴＰの少なくとも一部が遊離するように前処理して、ＡＴＰ含有試料溶液を得る工程である。
【００１８】
血液検体とは、生体から採取された組織や体液であれば特に制限されず、好ましくは、本発明の検査対象となりうるヒト（被検者）及びヒトをのぞく脊椎動物（被検動物）由来の血液試料を挙げることができる。被検動物としては、哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、鳥類を挙げることができ、好ましくはサル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、等の哺乳類の動物であり、中でもマウスを好適に例示することができる。血液試料としては、動脈（Artery：Ａ）血、肺動脈（Pulmonary Artery：ＰＡ）血、静脈（Vein：Ｖ）血、中心静脈（Central Vein：ＣＶ）血、末梢静脈血の何れであってもよい。また、ＡＴＰ濃度の測定を妨げない限りは、血液抗凝固剤や防腐剤などを適宜添加したり、血液中の特定の成分を除去あるいは凝縮して血液試料とすることもできる。
【００１９】
血液検体をＡＴＰの少なくとも一部が遊離するように前処理してＡＴＰ含有試料溶液を得る。ＡＴＰ含有試料溶液を得るには、市販のＡＴＰ抽出用試薬またはヌクレオチド抽出用試薬を用いることができる。市販のＡＴＰ抽出用試薬としては、例えば、ＡＭＥＲＩＣ−ＡＴＰ  Ｋｉｔ（販売元:和光純薬工業(株)）を挙げることができる。
【００２０】
ＡＴＰ含有試料溶液は、血液検体を２倍以上希釈したものであることが好ましく、希釈にはＡＴＰ抽出用試薬に含まれる抽出用溶液を適宜用いることができる。抽出用溶液の溶媒は、例えば、水であり、より具体的には緩衝液や生理食塩水またはそれらの混合物、さらにＡＴＰまたはヌクレオチド抽出用成分を含有するものであることができる。ＡＴＰまたはヌクレオチド抽出用成分としては、例えば、フェノール化合物などであることができる。血液検体から良好に（高い回収率で）ＡＴＰを遊離させてＡＴＰ含有試料溶液を得るという観点からは、血液検体を２倍以上希釈された状態にすることが好ましい。
【００２１】
ＡＴＰ含有試料溶液における、血液検体の希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）は、工程２におけるＡＴＰ含有試料溶液の希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）との積を５０倍以上にすることが、工程２における血液検体に含まれるピルビン酸の測定精度およびバラツキへの影響を無視できる程度に低減する、という観点から好ましい。この点については後述する。工程１で得られるＡＴＰ含有試料溶液は、血液検体を２倍以上希釈にしたものであれば、工程２におけるＡＴＰ含有試料溶液の希釈倍率を２５倍以上とすることで、工程１の希釈倍率および２の希釈倍率の積を５０倍以上とすることができる。工程２におけるＡＴＰ含有試料溶液の希釈倍率を低く抑えるという観点からは、工程１で得られるＡＴＰ含有試料溶液は、血液検体を３倍以上、例えば、３〜１０倍の範囲で希釈することが好ましい。例えば、工程１で得られるＡＴＰ含有試料溶液が、血液検体を５倍希釈したものである場合、工程２におけるＡＴＰ含有試料溶液の希釈倍率は、１０倍以上であれば、工程１および２の希釈倍率の積を５０倍以上とすることができる。
【００２２】
抽出用溶液が緩衝液であるか、または緩衝剤を含有する溶液の場合、ｐＨは特に限定されないが、後続の工程２における測定への影響を考慮して、工程２で用いられる緩衝液と同等のｐＨにすることが好ましい。
【００２３】
＜工程２＞
工程２は、工程１で得たＡＴＰ含有試料溶液の少なくとも一部とアデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）とを含有する緩衝液（ｐＨ７．８±０．３）を混合して１〜５分保持する工程である。工程２における酵素反応はＡＴＰの増幅反応およびピルビン酸生成反応であり、これらの反応開始を制御するという観点からは、ＡＴＰ含有試料溶液とＡＭＰ、ＰＥＰ、ＡＫおよびＰＫを含有する緩衝液の混合は、例えば、酵素（ＡＫおよびＰＫ）の一方と基質（ＡＭＰおよびＰＥＰ）をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう一方の酵素を加えるという方法を取ることができる。あるいは、酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう２つの酵素を加えるという方法を取ることもできる。すなわち、酵素の基質であるＡＭＰおよびＰＥＰを含有する緩衝液をＡＴＰ含有試料溶液と混合し、次いで、酵素であるＡＫおよびＰＫを含有する緩衝液を、上記ＡＭＰおよびＰＥＰを含有する緩衝液とＡＴＰ含有試料溶液との混合液に添加し、酵素反応を開始することが好ましい。少なくとも一方の酵素を最後に加えることが適当である。また、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したもの、あるいは酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを準備しておくことで、試薬添加の手間を省くこともできる。
【００２４】
下記に本発明の方法で用いる反応スキームを示す。
【化１】
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【００２５】
工程１における希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と工程２における希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）との積は５０倍以上である。尚、希釈倍率は特に断らない限り容量基準である。
【００２６】
ＡＴＰ含有試料溶液中には、血液に含まれる夾雑物としてピルビン酸、アスコルビン酸、およびクエン酸が含まれ、工程２における酵素反応では生成物がピルビン酸であることから、夾雑物としてのピルビン酸濃度が高いと、測定精度に悪影響を及ぼす。そのため、工程１のＡＴＰ含有試料溶液における血液検体の希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と、工程２におけるＡＴＰ含有試料溶液の希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）との積を上記範囲にすることで、ＡＴＰ濃度測定に対する誤差を無視できる程度にすることができる。
【００２７】
工程１のＡＴＰ含有試料溶液における血液検体の希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と、工程２におけるＡＴＰ含有試料溶液の希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）との積は、工程２における血液検体に含まれるピルビン酸の測定精度およびバラツキへの影響を無視できる程度に低減する、という観点から好ましくは１００倍以上である。工程１および２の希釈倍率の積の上限は、測定の感度や測定に用いる全液量などを考慮すると１０００倍であり、好ましくは５００倍、より好ましくは２５０倍である。
【００２８】
酵素反応は、混合液を１〜５分、好ましくは２〜３分より好ましくは２分１５秒〜２分４５秒の範囲で保持することで行うことが好ましい。本発明の方法において、工程２における保持時間の設定は定量性を担保するために重要である。
工程２における保持時間をより厳密に設定するために、工程２において、所定保持時間経過後即座に、混合液は、工程３におけるピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液と混合することが好ましい。前述のように工程１のＡＴＰ含有試料溶液における血液検体の希釈倍率と、工程２におけるＡＴＰ含有試料溶液の希釈倍率との積を所定の範囲に制御し、さらに、工程２における酵素反応の時間を上記範囲に制御することで、血液検体中のＡＴＰ測定をより高精度に行うことができる。酵素反応は、室温（例えば、１０〜３０℃）で行うことができる。
【００２９】
工程２で用いる緩衝液のｐＨは、ＡＫおよびＰＫの活性を考慮してｐＨ７．８±０．３とする。また、工程２で用いる緩衝液に含まれる緩衝剤は、工程４で鉄（ＩＩ）−ＸＯ系を用いる場合は、鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その例として、限定されるものではないが、グッド緩衝剤をあげることができる。具体的にはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、3-モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、2 - [4 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などがあげられる。尚、リン酸およびクエン酸は、工程４において、鉄と結合し発色反応を阻害するため良好な発色が得られない、という実験結果が得られている。そこで、試料中にリン酸やクエン酸が含まれる場合は、アルミニウムイオンなどを添加することでそれらを封鎖することが適当である。
【００３０】
上記酵素反応では、ＡＫの反応により、ＡＴＰおよびＡＭＰからＡＤＰが合成され、ＰＫの反応により、ＡＤＰとＰＥＰとから、ＡＴＰとピルビン酸が合成される。したがって、検体中にＡＴＰが含まれている場合、上記２つの酵素反応により、ＡＴＰの量が増幅され、かつピルビン酸が蓄積される。
【００３１】
工程２における混合液中でのアデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）の濃度は、例えば、１〜１０ｍＭの範囲、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の濃度は、例えば、１〜２０ｍＭの範囲、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の活性は、例えば、０．５〜２．５Ｕ／ｍｌの範囲、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）は、例えば、０．５〜２．５Ｕ／ｍｌの範囲とすることができる。
【００３２】
工程２で用いる上記緩衝液にはさらにＭｇ2+を含有させることができる。Ｍｇ2+は酵素反応に必要な金属イオンであり、工程２における混合液中の濃度は、例えば、０．５〜６０ｍＭの範囲とすることができる。工程２における酵素反応を促進して短時間での測定を可能にするという観点からは、Ｍｇ2+濃度は、例えば、０．５〜５０ｍＭの範囲とすることができ、より好ましくは１〜１０ｍＭの範囲とすることができる。
【００３３】
＜工程３＞
工程３は、工程２で得た混合物の少なくとも一部とピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯ）を含有する緩衝液（ｐＨ５．７±０．３）を混合して所定時間保持する工程である。
【００３４】
工程３では、工程２の反応の生成物であるピルビン酸が、ＰｙＯの作用により、酸素およびＰｉ（リン酸）と反応して、アセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生成する。
【００３５】
特許文献１に記載の方法では、この工程２で酸を用いていた。しかし、本発明の方法では、この段階で酸を用いることなく、ｐＨ５．７±０．３の緩衝液を用いる。さらに、工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３の緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）は２０倍以上とする。加えて、工程１における希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と工程２における希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）と工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３の緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）の積は１０００倍以上とする。
【００３６】
まず、工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３のＰｙＯを含有する緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）は２０倍以上とする。例えば、工程２で得た混合物の少なくとも一部を５０としたときに、ＰｙＯを含有する緩衝液の混合比（容量比）は９５０以上とすることで、工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３の緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）は２０倍以上とすることができる。工程２で得た混合物とＰｙＯを含有する緩衝液の混合比（容量比）を５０：９５０以上とすることで、ｐＨ５．７±０．３の緩衝液の緩衝能により、工程２で得た混合物に含まれる緩衝液の緩衝力を抑えて、得られる混合物のｐＨをｐＨ５．７±０．３の範囲に制御することができる。これにより、酸を用いることなく工程２の酵素反応を停止させることができ、その結果、測定精度を向上させることができ、酸を用いる煩わしさを解消することができる。工程３も室温（例えば、１０〜３０℃）で行うことができる。
【００３７】
さらに、工程１における希釈倍率（ＡＴＰ含有試料溶液／血液検体）と工程２における希釈倍率（（緩衝液＋ＡＴＰ含有試料溶液）／ＡＴＰ含有試料溶液）と工程３における希釈倍率（（工程２で得た混合物少なくとも一部＋工程３のＰｙＯを含有する緩衝液）／工程２で得た混合物少なくとも一部）の積は１０００倍以上とすることで、血液検体中に含まれるアスコルビン酸のＰｙＯの酵素反応及び工程4における錯体生成反応（アスコルビン酸によるFe3+イオンの還元）に対する悪影響を抑制することもでき、測定精度を向上させることができる。工程１〜３の希釈倍率の積は、血液検体中に含まれるアスコルビン酸のＰｙＯの酵素反応に対する悪影響を抑制して測定精度をより向上させるという観点からは２０００倍以上である。工程１〜３の希釈倍率の積の上限は、測定の感度や測定に用いる全液量などを考慮すると４０００倍であり、好ましくは３５００倍である。
【００３８】
工程３で用いる緩衝液に用いる緩衝剤としては、工程２と同様に、工程４で鉄（ＩＩ）−ＸＯ系を用いる場合は、鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その例として、限定されるものではないが、グッド緩衝剤をあげることができる。具体的にはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、2 - モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（2 - ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）などがあげられる。工程３における反応ｐＨは、ＰｙＯが十分な活性を示すという観点からも、ｐＨ５．７±０．３の範囲が好ましい。
【００３９】
工程３は、所定時間行うが、この所定時間は、例えば、工程３の所定保持時間は３分以上であることが好ましく、上限は例えば６０分であり、より好ましくは３〜５分間程度である。
ピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙＯ）は、例えば、工程３における混合液中で１〜１０Ｕ／ｍｌの範囲とすることができる。
【００４０】
＜工程４＞
工程４は、工程３で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程である。工程４では、工程３で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄（ＩＩ）、および発色試薬を加えて所定時間保持する。発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールＳである。これらの発色剤は、検体中のＡＴＰ濃度に応じた吸光度を示す他に、測定条件を制御することで、ＡＴＰ濃度の境界値の前後で色の変化を生じさせることもできる。
【００４１】
工程４では、発色試薬としてキシレノールオレンジを用いる場合、工程３の反応の生成物である過酸化水素と鉄（ＩＩ）［Ｆｅ2+］が、酸性条件下（Ｈ+イオンの存在下）で、反応して鉄（ＩＩＩ）［Ｆｅ3+］が生成する。次いで、鉄（ＩＩＩ）［Ｆｅ3+］とキシレノールオレンジとが反応し、単核キシレノールオレンジ−鉄錯体が生成し、さらにこの単核キシレノールオレンジ−鉄（ＩＩＩ）［Ｆｅ3+］とが反応して複核キシレノールオレンジ−鉄錯体が生成する。
【００４２】
発色試薬としてクロマズロールＳを用いる場合には、単核クロマズロールＳ−鉄錯体および複核クロマズロールＳ−鉄錯体が形成される。
【００４３】
工程４で用いる酸は、例えば、塩酸であることができるが塩酸以外に、硝酸、硫酸等を用いることもできる。また、鉄（ＩＩ）は、例えば、硫酸第一鉄アンモニウム（モール塩）等であることができる。工程４も室温（例えば、１０〜３０℃）で行うことができる。
【００４４】
工程２〜４における各保持は、好ましくは工程２の保持時間は２〜３分であり、工程３の所定保持時間は３分以上であり、上限は例えば６０分であり、工程４の所定保持時間は３分以上であり、上限は例えば３０分であり、工程２、３及び４の合計保持時間は、好ましくは８〜２０分である。より好ましい態様においては、工程２の保持時間は２．５分であり、工程３の所定保持時間は３分であり、工程４の所定保持時間は５分であり、工程２〜４を含む全ての工程（工程１を除く）の操作に必要時間を約１２分とすることもできる。
【００４５】
＜工程５＞
工程５は工程４で得た混合物の色からＡＴＰの濃度を判定する工程である。工程５では、工程４で得た混合物の色からＡＴＰの濃度を判定する。混合物の色は、発色試薬としてキシレノールオレンジを用いる場合には、波長５８５ｎｍ付近（±１ｎｍ）の吸光度、発色試薬としてクロマズロールＳを用いる場合には、波長６１５ｎｍ付近（±１ｎｍ）の吸光度を測定することで決定でき、別途作成した検量線と照合することで、検体中のＡＴＰ濃度（量）を算出できる。
【００４６】
工程４における反応により、検体に含まれていたＡＴＰ濃度に応じて、発色試薬がキシレノールオレンジの場合、単核キシレノールオレンジ−鉄錯体および複核キシレノールオレンジ−鉄錯体の生成量が決まる。これにより、検体中のＡＴＰ濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いとき紫、低いとき黄と、異なる色を呈し、これを目視観察することで検体中のＡＴＰ濃度レベルを判定することもできる。さらにそれにより、血液検体を採取した患者の重症度の評価をすることもできる。
【００４７】
発色試薬としてクロマズロールＳを用いた場合、検体に含まれていたＡＴＰ濃度に応じて、単核クロマズロールＳ−鉄錯体および複核クロマズロールＳ−鉄錯体の生成量が決まる。そして、検体中のＡＴＰ濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いとき青、低いとき橙と、異なる色を呈し、これを目視観察することで検体中のＡＴＰ濃度レベルを判定することができる。さらにそれにより、血液検体を採取した患者の重症度の評価することもできる。
【００４８】
本発明の方法においては、検体中に含まれるＡＴＰ濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときと低いときとで、工程４で得た混合物が呈する色が異なるように、条件を設定する。より具体的には、主に、工程３で生成する過酸化水素の濃度と工程４で用いる発色試薬の濃度を設定する。したがって、工程４における酸は、工程４におけるｐＨを調節するために加え、そのｐＨは生成する鉄（ＩＩＩ）イオンが加水分解を受けずに安定して存在でき、かつ錯体が生成できる条件を考慮して決定する。
【００４９】
発色試薬がキシレノールオレンジである場合についてより具体的に説明する。境界値を挟んで異なる色への発色は、判別しようとする濃度のＡＴＰから工程３において生成する過酸化水素のモル濃度をキシレノールオレンジのモル濃度の約１／４に設定することで達成できる。
【００５０】
キシレノールオレンジ濃度は、生成する過酸化水素の濃度に応じて設定するが、工程４における混合液中で１０〜４０μＭの範囲が好ましい。キシレノールオレンジ濃度は、さらに好ましくは２０〜４０μＭの範囲である。
【００５１】
［測定用キット］
本発明の測定用キットは、以下の試薬１〜６を含み、前記本発明の方法に用いられる、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸の測定用キットである。
１:アデノシンモノリン酸、およびホスホエノールピルビン酸、
２:アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
３:ピルビン酸オキシダーゼ、並びに
４:酸、鉄(II)、および発色試薬（但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールＳである）
５：緩衝液Ａ（ｐＨ７．８±０．３）
６：緩衝液Ｂ（ｐＨ５．７±０．３）
【００５２】
試薬１および２は、上記測定方法の工程２に使用される試薬であり、試薬１は酵素の基質、試薬２は酵素である。前述のように、ＡＴＰの増幅反応（ピルビン酸生成反応）の開始を制御するという観点からは、基質である試薬１と酵素である試薬２は、例えば、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう一方の酵素を加えるという方法、または酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう２つの酵素を加えるという方法を取ることができるので、本発明のキットにおいては、試薬１および２は、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したものと、他方の酵素の２つの試薬、または、酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものと２つの酵素の混合物の２つの試薬からなることができる。
【００５３】
これらの試薬は、例えば、ｐＨ緩衝液に溶解または分散したものであることが適当であり、試薬５として緩衝液Ａ（ｐＨ７．８±０．３）を含むことができる。緩衝液Ａに含まれる緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝剤をあげることができる。具体的には、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、3-モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、2 - [4 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などを用いることができる。
【００５４】
試薬３は、上記測定方法の工程３に用いる試薬（酵素）であり、ピルビン酸オキシダーゼからなる。また、ピルビン酸オキシダーゼは、そのまま、または、試薬１および２と同様に、緩衝液に溶解または分散したものであることができる。試薬６として緩衝液Ｂ（ｐＨ５．７±０．３）を含むことができる。緩衝液Ｂに含まれる緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝剤をあげることができる。具体的には、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、2 - モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（2 - ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）などを用いることができる。
【００５５】
試薬４は、上記測定方法の工程４に用いる試薬である。試薬４において、鉄（ＩＩ）は、例えば、硫酸第一鉄アンモニウム（モール塩）等であることができる。また、発色試薬はキシレノールオレンジ、クロマズロールＳであることができる。酸、鉄（ＩＩ）、および発色試薬（例えば、キシレノールオレンジ）は、あらかじめ混合しておくことができる。
【００５６】
本発明のキットは、上記試薬類に加えて、境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含むことができる。発色の色見本の色は、鉄（ＩＩ）および発色試薬の種類に応じて適宜選択できる。本発明のキットは、ＡＴＰ抽出用試薬またはヌクレオチド抽出用試薬をさらに含むこともできる。
【００５７】
本発明のキットは、上記試薬類に加えて、キットの説明書を含むこともできる。本発明のキットは、検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含むことができ、そのような容器としては、キュベット、マルチタイタープレートまたは遠沈管を挙げることができる。マルチタイタープレート、例えば、９６穴のマルチタイタープレートであることができる。尚、キュベット、マルチタイタープレート及び遠沈管は、透明であることもできるが、発色を肉眼で観察しやすいという観点から、色は白色であることが好ましい。
【実施例】
【００５８】
以下本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。但し、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００５９】
実施例１
本発明の方法を実施する操作方法の典型例を以下のスキームに示す。下記スキームに示す各条件は、以下に示す参考例１〜６の結果に基づいて決定したものである。検体中のＡＴＰは、ＡＴＰ試料作製（希釈倍率は記載せず、工程１）、及び工程２の反応の際（希釈倍率＝（２５＋４００＋７５）／２５）に希釈される。工程２の酵素反応でＡＴＰ増幅を行うため測定には支障はなく、むしろ血液検体中に含まれるピルビン酸からの妨害を回避するに役立つ。また、工程３で希釈する（希釈倍率＝（４０＋９６０）／４０）ことによりｐＨ調節のための酸の添加を不要にし、かつ血液検体中に含まれるアスコルビン酸の妨害を回避するに役立つ。
【００６０】
【化２】
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【００６１】
参考例１（ＡＭＰおよびＰＥＰ濃度）
図１および図２は、各種濃度のＡＭＰおよびＰＥＰにおいてＡＫ／ＰＫ反応の反応時間を変えながら、前記スキームと同様の操作をおこなって、反応時間に対して、吸光度をプロットしたものである。従来のＡＭＰおよびＰＥＰ濃度（０．５ ｍＭ；▽）では反応が非常に遅いのに対して、ＡＭＰおよびＰＥＰ濃度を８．５ ｍＭ（▲）にすることにより反応が迅速になった。さらに、ＡＭＰ濃度を最適化し、４．３ ｍＭ（△）を得た。なお、濃度は反応液中の値として示している。
【００６２】
参考例２（Ｍｇ2+濃度）
図３は前記スキームと同様の操作を行い、図１のような曲線を取得し、吸光度が０．３に到達する時間を直線補間によって求め、Ｍｇ2+濃度に対してプロットしたものである。反応濃度を５ ｍＭとした。これにより、従来は１０〜２０分かかっていた反応時間が３分程度となった。
【００６３】
参考例３（ＡＫおよびＰＫの酵素活性）
酵素活性を変えて図１のようなプロットを作成した結果を図４に示す。酵素活性を2 Ｕ／ｍｌ(反応液中の値)とすることにより、反応時間が２．５分程度となった。これ以上の活性でもよいがコストを考慮してこの値に定めた。
【００６４】
参考例４（キシレノールオレンジ濃度）
図５は反応液中でのキシレノールオレンジ濃度２０μＭ（●）および３０μＭ（○）において、前記スキームの操作を行うことにより、吸光度を測定し、既知濃度のＡＴＰ（ＡＴＰ含有試料溶液中の濃度で示している）に対してプロットした検量線である。キシレノールオレンジ濃度を３０μＭにすることにより、２０μＭ（●）と比べて検量線の吸光度スケールが約２倍拡張し、良好な感度で精度良い測定が可能となった。２０μＭは特許文献１で用いられている濃度で、これを用いるとＡＴＰ０．１ｍＭ以上では感度（傾き）がかなり低い。なお、血液試料の前処理をしたあとでの正常値の最低値は0.08 ｍＭである。本発明ではそれより高い場合は紫に、それより低い場合は黄・橙に呈色する。
【００６５】
参考例５（ピルビン酸の影響）
図６は工程２の反応液にピルビン酸カリウムを添加し、その濃度に対して吸光度の変化割合（（ピルビン酸を含むときの吸光度−ピルビン酸を含まないときの吸光度）/ （ピルビン酸を含まないときの吸光度）×１００％）をプロットしたものである。ピルビン酸濃度の増加とともに、吸光度変化が大きくなり、正の誤差を与えることがわかる。一般に、血清中のピルビン酸濃度は0.04-0.13 mMとされているため、図６から工程２時点でのピルビン酸濃度を多くとも0.001 ｍＭ以下にしておく必要がある。本法では工程２までに１００倍以上に希釈されるため、血中ピルビン酸の影響はないか、かなり小さいといえる。実際の測定上は、吸光度変化が５％以内であれば、血中ピルビン酸の影響は無視できる。
【００６６】
参考例６（アスコルビン酸の影響）
図７は工程３の反応液に含まれるアスコルビン酸濃度に対して吸光度変化（（アスコルビン酸を含むときの吸光度−アスコルビン酸を含まないときの吸光度）/（アスコルビン酸を含まないときの吸光度）×１００％）をプロットしたものである。アスコルビン酸濃度の増加とともに負の誤差を与えることを示している。血中のアスコルビン酸濃度は0.031-0.095 mMであるため、図７からアスコルビン酸濃度を工程３の時点で多くとも0.001 ｍＭ以下にしておく必要があると推定される。本法では工程３までに１０００倍以上希釈されるため、血中アスコルビン酸の影響はないか、かなり小さいといえる。実際の測定上は、吸光度変化が５％以内であれば、血中アスコルビン酸の影響は無視できる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は血液検体中のＡＴＰの濃度測定が関連する分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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