(57)【要約】  本発明は、免疫抑制反応の媒介における使用のための方法および組成物に関する。本発明の組成物は、免疫抑制活性を有するエキソソームを含んでなる。かかるエキソソームは、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞をはじめとする種々の異なる細胞タイプに由来するものであってよい。エキソソームの単離に先立って、前記エキソソームの免疫抑制活性を増強することが可能な分子を発現するように細胞を遺伝子操作するか、かつ／または細胞をサイトカインもしくはサイトカインインヒビターなどの１種以上の作用物質（これもまたエキソソームの免疫抑制活性を増強することが可能である）に曝露することができる。本発明はまた、免疫系の望ましくない活性化に関連した疾患および障害の治療のための、そのようなエキソソームの使用にも関する。本発明は、免疫抑制性であることが示された血清から直接的に単離されたエキソソームも包含する。2008505104.tif 000003
2008505104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞の培養物から調製した有効量のエキソソームを被験体に投与するステップを含む、そのような処置を必要とする被験体において免疫応答を阻害する方法。
【請求項２】
培養中に、前記抗原提示細胞を増強物質に曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増強物質を発現するように前記抗原提示細胞を遺伝子操作する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記増強物質がＩＬ−４である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記増強物質がＩＬ−４である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記増強物質がＩＬ−１０である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項８】
前記増強物質がＩＬ−１０である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記増強物質がＦａｓＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記増強物質がＦａｓＬである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
阻害される免疫応答が関節炎として表れている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記関節炎が関節リウマチである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
阻害される免疫応答が創傷に関連した炎症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
阻害される免疫応答がアレルギーとして表れている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
阻害される免疫応答が喘息として表れている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
阻害される免疫応答がＩ型糖尿病として表れている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
阻害される免疫応答が自己免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己免疫応答が、以下のもの：関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、Ｉ型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、クローン病、乾癬、グレーヴス病、セリアック病、円形脱毛症、中枢神経系脈管炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、ギラン・バレー症候群、結節性多発性動脈炎、特発性血小板紫斑病、巨細胞大動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、アジソン病、強直性脊椎炎、ライター症候群、高安動脈炎、および白斑からなる群より選択される自己免疫疾患として表れている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血清から調製した有効量の濃縮エキソソームを被験体に投与するステップを含む、そのような処置を必要とする被験体において免疫応答を阻害する方法。
【請求項２０】
前記血清が、ガラスビーズの存在下でインキュベートされた末梢血から調製される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ガラスビーズの存在下でのインキュベーションの前に前記末梢血に増強物質を添加する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増強物質がインターロイキン１受容体アンタゴニストタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
阻害される免疫応答が関節炎として表れている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記関節炎が関節リウマチである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
阻害される免疫応答が創傷に関連した炎症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
阻害される免疫応答がアレルギーとして表れている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
阻害される免疫応答が喘息として表れている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
阻害される免疫応答がＩ型糖尿病として表れている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
阻害される免疫応答が自己免疫応答である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記自己免疫応答が、以下のもの：関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、Ｉ型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、クローン病、乾癬、グレーヴス病、セリアック病、円形脱毛症、中枢神経系脈管炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、ギラン・バレー症候群、結節性多発性動脈炎、特発性血小板紫斑病、巨細胞大動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、アジソン病、強直性脊椎炎、ライター症候群、高安動脈炎、および白斑からなる群より選択される自己免疫疾患として表れている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
増強物質の存在下で抗原提示細胞を培養し、培養上清からエキソソームを回収することにより調製されたエキソソームを含んでなる組成物。
【請求項３２】
前記増強物質がサイトカインである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記増強物質が、インターロイキン４およびインターロイキン１０からなる群より選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記増強物質がサイトカインインヒビターである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記増強物質がインターロイキン１受容体アンタゴニストタンパク質である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記増強物質がＮＦκＢインヒビターである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３７】
増強物質を発現するように遺伝子操作された抗原提示細胞を培養し、培養上清からエキソソームを回収することにより調製されたエキソソームを含んでなる組成物。
【請求項３８】
前記増強物質がサイトカインである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記増強物質が、インターロイキン４およびインターロイキン１０からなる群より選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記増強物質がサイトカインインヒビターである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記増強物質がインターロイキン１受容体アンタゴニストタンパク質である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記増強物質がＦａｓＬである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４３】
血清からエキソソームを回収することにより調製されたエキソソームを含んでなる組成物。
【請求項４４】
ガラスビーズとともにインキュベートされた末梢血サンプルから調製された血清からエキソソームを回収することにより調製されたエキソソームを含んでなる組成物。
【請求項４５】
インキュベートされる末梢血サンプルに増強物質を添加する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記増強物質がインターロイキン１受容体アンタゴニストタンパク質である、請求項４５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  導入
本発明は、免疫抑制反応の媒介における使用のための方法および組成物に関する。本発明の組成物は、免疫抑制活性を有するエキソソームを含んでなる。かかるエキソソームは種々の異なる細胞タイプ由来であってよく、その細胞タイプには、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞が含まれる。エキソソームの単離に先立って、前記エキソソームの免疫抑制活性を増強することが可能な分子を発現するように細胞を遺伝子操作するか、ならびに／あるいは細胞をサイトカインまたはサイトカインインヒビターなどの１種以上の作用物質（これもまたエキソソームの免疫抑制活性を増強することが可能である）に曝露してよい。また本発明は、免疫系の望ましくない活性化に関連する疾患および障害の治療のための、前記エキソソームの使用に関する。また本発明は、免疫抑制性であることが示されている血清から直接単離されたエキソソームを包含する。
【背景技術】
【０００２】
２．  発明の背景
自己免疫障害は、自分自身の抗原に対する寛容の喪失、「自己の」抗原（自己抗原）に対するリンパ球反応性の活性化、および標的器官の病理学的損傷を特徴とする。自己免疫障害には、関節リウマチ、骨関節炎、アレルギー、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患１型糖尿病、炎症性障害、喘息、等が含まれる。ほとんどの状況で、自己免疫は末梢性寛容によって妨げられる可能性があり、それは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞（ＤＣ）、およびエフェクターＴ細胞の間の一連の多段階相互作用が関与すると推定される過程である。
【０００３】
例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は消耗性の全身性自己免疫疾患であり、遠位可動（diarthriodial）関節の慢性炎症を特徴とする。ＲＡが確立されると、罹患した関節は、軟骨および骨の進行性の劣化に寄与する炎症細胞の浸潤および滑膜の過形成を示し、結果として正常な関節機能が完全に喪失する。最近、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの炎症誘発活性をモジュレートする生体物質について、新規の抗関節炎薬としての有効性が示されている（Evans and Robbins, J. Rheumatol. 21:779-782 (1994); Robbins and Evans, Gene Ther. 3:187-189 (1996); Evans and Robbins, Curr Opin Rheumatol. 8:230-234 (1996); Evansら, Arthritis Rheum. 42:1-16 (1999); Ghivizzaniら, Clin Orthop. 379 (Suppl):S288-299 (2000)）。
【０００４】
さらに、関節炎の動物モデルで種々の治療的作用物質の遺伝子導入が有効であることが示されている。特に、種々の治療的作用物質、例えばｓＴＮＦ−α受容体、ＩＬ−１Ｒａ、ｓＩＬ−１受容体Ｉ型およびＩＩ型、ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびＩＬ−４を発現するアデノウイルスベクターの関節内局所注入および全身性注入は、関節炎のマウス、ラット、およびウサギモデルで顕著な抗関節炎効果を付与することができた（Arend, Lancet. 341: 155-156 (1993); Bandaraら, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10764-10768 (1993);  Ghivizzaniら, Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 4613-4618 (1998);  Moriら, J. Immunol. 157:3178-3182 (1996); Joostenら, Arthritis Rheum. 39:797-809 (1996);  Kimら, Arthritis Res. 2:293-302; Kimら, J. Immunol. 164: 1576-1581 (2000)）。
【０００５】
興味深いことに、遺伝子導入によって片方の関節または足に前記治療的作用物質を局所送達すると、反対側の膝または無処置の足で治療効果が得られた。例えば、エプスタイン・バーウイルスによってコードされるＩＬ−１０遺伝子であるｖＩＬ−１０を発現するアデノウイルスベクターを関節内注射すると、注射された膝だけでなく、反対側の対照の膝においても、疾患の病変が減少し、白血球の浸潤が減少し、軟骨代謝が改善された（Lechmanら, J. Immunol. 163:2202-2208 (1999)）。膝関節炎のウサギモデルで行われた当初の観察に基づいて、前記効果は対側効果（contralateral effect）と称された。ウサギ、ラットおよびマウスの関節にレトロウイルスベクター、リポソームを注射した場合、および遺伝子改変型滑膜線維芽細胞を用いた場合でさえも、同様の効果が観察されている（Ghivizzaniら, Gene Ther. 4:977-982 (1997); Ceponisら, Arthritis Rheum. 44:1908-1916 (2001); Kimら Mol Ther. 6:591-600 (2002)）。
【０００６】
前記効果についての最近の分析では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）の機能の改変が、遠位関節に対する抗原特異的効果の付与に主要な役割を果たすことが示唆されている（Whalenら, Mol Ther. 4:543-550 (2001); Kimら, J. Immunol. 166:3499-3505 (2001)）。特に、培養中の遺伝子改変された骨髄由来ＤＣが、マウスモデルにおいて確立した関節炎を回復させるために有効な作用物質であるという知見によって、ＤＣの治療上の役割がさらに立証されている。例えば、ＩＬ−４またはＦａｓＬをＤＣに遺伝子導入した後、確立した関節炎を有するマウスに注射すると、関節炎の顕著な退行が生じ、処置後少なくとも２か月間で処置マウスの半数以上が疾患を有しないようになった（Kimら, J. Immunol. 166:3499-3505 (2001); Kimら, Mol Ther. 6:584-590 (2002); Moritaら, J. Clin Invest. 107:1275-84）。
【０００７】
樹状細胞は、免疫応答の制御に重大な役割を果たす専門のＡＰＣであり、種々の機構によって自己免疫応答を増加または減少させることができる。また、免疫抑制性分子を発現するように遺伝子操作されたＤＣは、外来移植片の拒絶および自己免疫障害を軽減するための魅力的なアプローチであるとみなされている（Luら, 1999, J. Leukoc. Biol. 66:293-296）。例えば、組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターによって細胞障害性Ｔリンパ球抗原４−免疫グロブリン（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）をＤＣに送達すると、同種レシピエント中での前記ＤＣの寛容原性（tolerogenicity）および生存を促進することが示されている（Luら, 1999, Gene Ther. 6:554-563）。
【０００８】
しかし、前記アプローチに関連する潜在的な問題が存在する。例えば、低反応性の未成熟ＤＣの投与によって宿主における寛容原性が向上する場合があるが、ウイルスに基づくベクターによるＤＣの形質導入は成熟を刺激する可能性があり、免疫賦活能の増強が生じるかもしれない（Reaら, 1999, J. Virol. 73:10245-10253）。ゆえに、疾患の発症を遅延させる、その潜在的な治療効果にもかかわらず、樹状細胞全体の投与は望ましくない結果を招く可能性がある。
【０００９】
ＤＣを含めた種々の細胞タイプが、エキソソームと称される小型の脂質小胞を放出することは、３０年以上にわたって詳細に報告されている。エキソソームは３０〜１００ｎｍのサイズの小さな粒子であり、当初の報告では、５’ヌクレオチダーゼ活性およびトランスフェリン受容体を含有し、後期エンドソーム区画由来であり、腫瘍細胞株（Culvenorら, J. Cell Biochem. 20:127-138 (1982)）および網状赤血球（Johnstoneら J. Biol. Chem. 262:9412-9420 (1987)）から放出される小型の粒子であると報告された。エキソソームは内向きまたは逆向きの出芽によって生成され、それによって、サイトゾルおよび特定の膜結合タンパク質の露出した細胞外ドメインを含有する粒子が生じる（Stoorvogelら, Traffic 3:321-330 (2002)）。エキソソームは、アポトーシス小体ならびに原形質膜の分断によって生じると思われるより大型の微小胞とは異なることが示されている。多数の細胞タイプでエキソソームが生成されることが示されていて、その細胞タイプには、樹状細胞、網状赤血球、Ｔリンパ球、Ｂ細胞、血小板、上皮細胞および腫瘍細胞が含まれる（Johnstoneら Blood. 74:1844-1851 (1989); Petersら, Eur J. Immunol. 19:1469-1475 (1989); Raposoら, J. Exp Med. 183:1161-1172 (1996); Heijnenら, Blood 94:3791-3799 (1999); Theiryら, J. Cell. Biol. 147:599-610 (1999); Wolfersら, Nature Med. 7:297-303 (2001); van Niel and Heyman, Am J. Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283:G251-255 (2002)）。高純度のＤＣ由来エキソソームは、特定のサイトゾルタンパク質、例えばチュブリン、アクチンおよび特定のアクチン結合性タンパク質ならびにＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗原、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、ｌａｍｐ−２、αＭ−β２インテグリン、テトラスパニンＣＤ９およびＣＤ６３、およびＭＦＧＥ８／ラクトアドヘリンを含有することが示されている（Raposoら, J. Exp Med. 183:1161-1172 (1996); Theiryら, J. Cell. Biol. 147:599-610 (1999); Escolaら, J. Biol Chem. 273:20121-20127 (1998); Theryら, J. Immunol. 166:7309-7318 (2001)）。
【００１０】
腫瘍抗原ペプチドでパルス（間欠的に処理）したＤＣ由来のエキソソーム（その場合、エキソソームは腫瘍抗原をその表面に露出する）は、マウスの抗腫瘍応答の刺激においてＤＣそのものと同等の有効性で有効であることが示されている（Zitvogelら, Nature Med. 4:594-600 (1998)）。腫瘍抗原ペプチドでパルスしたＤＣ由来のエキソソームを使用した臨床試験では、初期に肯定的な結果が報告されている（Andreら, Adv Exp Med Biol. 495:349-354 (2001); Morse.ら, Proc. Am. Soc. Oncol. 21 A42, p. 11a (2002)）。エキソソームは免疫賦活能を示すようであり、抗原提示細胞を感作することが可能である（Zitvogelら, ＵＳ２００４００２８６９２）。
【００１１】
またエキソソームは、なんらかの免疫抑制活性を有することが示されている。特定のＴ細胞、ならびに黒色腫細胞では、その表面にＦａｓＬを有してＴ細胞のアポトーシスを刺激することができるエキソソームが生成され、腫瘍の成長を可能にする（Andreolaら J. Exp Med. 195:1303-1316 (2002); Martinez-Lorenzoら, J. Immunol. 163:1274-1281 (1999)）。さらに、ＩＮＦ−γおよび消化型オボアルブミンの存在下で培養されたラット腸上皮細胞によって産生される、トレロソーム（tolerosomes）と称されるエキソソーム粒子は、注射後に抗原特異的寛容を誘発することができた（Karlssonら, Eur. J. Immunol. 31:2892-2900 (2001)）。
【００１２】
Pecheらは、同種ドナー由来のエキソソームを使用すると、ラットにおける移植片の生存が延長されることを報告した（Pecheら, Transplantation 76:1503-1510 (2003)）。しかし、著者らは、抗ドナーＭＨＣクラスＩＩ同種抗体産生の対応する増加もまた明らかにした。このことは免疫賦活効果が同時に存在することを示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ゆえに、自己免疫疾患および炎症性障害を治療する安全で有効な方法を開発する必要性が依然として存在する。本発明は、そのような疾患および障害を治療するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
３．  発明の要旨
本発明は、免疫抑制活性を有するエキソソームおよび前記エキソソームを生成および利用するための方法に関する。詳細には、本発明のエキソソームを哺乳動物宿主に投与して、望ましくない免疫応答を抑制することができる。
【００１５】
本発明のエキソソームは種々の異なる細胞由来であってよく、その細胞には、非限定的に、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞が含まれる。好ましくは、エキソソームの調製元である細胞を、遺伝子操作するか、ならびに／あるいは、非限定的にサイトカインまたはサイトカインインヒビターなどの作用物質で処理してよい。その後、エキソソームの回収を行う。
【００１６】
種々の実施形態で、本発明はエキソソームの組成物ならびに免疫抑制剤としてのその使用方法を提供する。本発明にしたがって治療される疾患および障害には、非限定的に、炎症および炎症に関連する症状、例えばアレルギー、喘息、関節炎および創傷治癒、ならびに非限定的に関節リウマチおよび糖尿病を含めた自己免疫疾患が含まれる。さらに、エキソソームの免疫抑制活性を考慮して、本発明は、エキソソームをアンタゴナイズすることによって免疫応答を促進する方法を提供する。それは、例えば、被験体における抗腫瘍性免疫を促進するための方法である。
【００１７】
４．  図面の簡単な説明
図１Ａ−Ｃ．  （Ａ）マウスＢＭ−ＤＣ由来のエキソソームの全載透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。バー＝２００ｎｍ。（Ｂ）いくつかのエキソソーム関連タンパク質の存在に関するエキソソームおよびＢＭＤＣライセートのウエスタンブロット解析。（Ｃ）ＭＨＣ ＩおよびＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現に関する、マウスＤＣ由来のエキソソームおよびＤＣのフローサイトメトリーによる分析。
【００１８】
図２．  骨髄樹状細胞（「ＢＭＤＣ」）由来のエキソソームの蛍光活性化セルソーティング（「ＦＡＣＳ」）による特性決定。
【００１９】
図３Ａ−Ｄ．  ＤＣ由来のエキソソームのｉｎ ｖｉｖｏでの輸送。ＰＫＨ６７標識エキソソームのＩＶ注射６時間後、（Ａ）ＭＯＭＡ−１＋および（Ｂ）ＥＲ−ＴＲ９＋のマクロファージおよび（Ｃ）ＣＤ１１ｃ＋のＤＣが、脾臓において、エキソソームを内部に取り込んでいることが示された。（Ｄ）種々の時点でのＣＤ８−αおよびＰＫＨ６７に関するＦＡＣＳによって評価された脾臓ＤＣのサブセットによる標識エキソソームの取り込み。
【００２０】
図４Ａ−Ｃ．  （Ａ）マウス骨髄ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームのフローサイトメトリーによる分析。この場合、精製済みエキソソームはＡｄ．対照およびＡｄ．ＦａｓＬで形質導入された骨髄ＤＣ由来である。（Ｂ）ＦａｓＬの発現を示すＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームのウエスタンブロット。（Ｃ）ＤＣ由来のエキソソーム画分の透過型電子顕微鏡写真。
【００２１】
図５．  ＦａｓＬを保持するＤＣおよびエキソソームで処置されたマウス足蹠における遅延型過敏性（ＤＴＨ）の抑制を実証する棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【００２２】
図６．  同種異系エキソソームおよびＤＣと比較して、同系エキソソームおよびＤＣを使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を実証する棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【００２３】
図７Ａ−Ｂ．  （Ａ）Ａｄ．Ψ５またはＡｄ．ＦａｓＬに感染させたエキソソームおよびＤＣを野生型およびＭＨＣ Ｉ欠損マウスに注射して使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ応答を実証する棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。（Ｂ）Ａｄ．Ψ５またはＡｄ．ＦａｓＬに感染させたエキソソームおよびＤＣを野生型またはＭＨＣ ＩＩ欠損マウスに注射して使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ応答を実証する棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【００２４】
図８．  免疫抑制性エキソソームの抗原特異性を実証する棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【００２５】
図９Ａ−Ｂ．  （Ａ）ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームのＤＴＨ抑制効果を比較する棒グラフ。ＤＣおよびエキソソームは、野生型またはｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスのいずれかから調製され、対照アデノウイルス（ｐｓｉ５）またはＦａｓＬを発現するアデノウイルス（ＦａｓＬ）のいずれかに感染させ、前もってＫＬＨで免疫した野生型マウスの足蹠に注射して戻し、その１２時間後、足蹠にＫＬＨを注射した。（Ｂ）野生型と比較して、ｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）マウスに注射して戻された、（Ａ）と同様に調製されたエキソソームのＤＴＨ抑制効果を示す棒グラフ。
【００２６】
図１０Ａ−Ｂ．  （Ａ）マウスのコラーゲン誘発関節炎モデルに注射されたＦａｓＬ発現ＤＣについての疾患進行の抑制を実証するグラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。（Ｂ）マウスのコラーゲン誘発関節炎モデルに注射されたＦａｓＬ提示エキソソームについての疾患進行の抑制を実証するグラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【００２７】
図１１Ａ−Ｂ．  （Ａ）リンパ球混合培養反応（ＭＬＲ）でのｖＩＬ−１０発現ＤＣ添加によるＴ細胞増殖の抑制を実証するグラフ。（Ｂ）リンパ球混合培養反応でのＡｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたＤＣから単離されたエキソソームの添加によるＴ細胞増殖の抑制を実証するグラフ。
【００２８】
図１２Ａ−Ｂ．  （Ａ）Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣおよび該ＤＣ／ｖＩＬ−１０由来エキソソームを使用した場合のマウス足蹠のＤＴＨ応答の抑制を示す棒グラフ。（Ｂ）組換えマウスＩＬ−１０で処理されたＢＭＤＣおよび組換えマウスＩＬ−１０で処理されたＤＣ由来のエキソソームを使用した場合のマウス足蹠のＤＴＨ反応の抑制を示す棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【００２９】
図１３Ａ−Ｃ．  （Ａ）Ａｄ−ｖＩＬ−１０で形質導入されたＢＭ−ＤＣ由来の無処理または凍結／解凍エキソソームの全載透過型電子顕微鏡写真。（Ｂ）Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＢＭ−ＤＣ由来の無処理または凍結／解凍エキソソーム調製物についての、Ｈｓｃ７０の存在を検出するウエスタンブロット。（Ｃ）Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたＤＣから単離された膜破壊エキソソームがＤＴＨ反応を抑制できないことを実証する棒グラフ。
【００３０】
図１４Ａ−Ｂ．  （Ａ）Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたＤＣから単離されたＭＨＣ ＩＩ枯渇エキソソームの免疫抑制効果を実証する棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。（Ｂ）組換えＩＬ−１０で処理されたＤＣから単離されたＭＨＣ ＩＩ枯渇エキソソームの免疫抑制効果を実証する棒グラフ。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【００３１】
図１５．  マウスのコラーゲン誘発関節炎モデルに注射されたｖＩＬ−１０発現ＤＣについての疾患進行の抑制を実証するグラフ。
【００３２】
図１６Ａ−Ｃ．  確立したコラーゲン誘発関節炎モデルにおけるＤＣ／ＩＬ−１０由来エキソソームの治療効果についての分析。（Ａ）Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたか、あるいは組換えマウスＩＬ−１０でパルスしたＤＢＡ１マウス骨髄ＤＣからエキソソームを単離し、確立したＣＩＡを有するマウスに投与した。（Ｂ）組換えＩＬ−１０でパルスしたＤＣ由来のエキソソームを２群に分け、その一方を３サイクルの凍結・解凍に付して膜を破壊し、その後、確立したＣＩＡを有するマウスに投与した。（Ｃ）確立されたＣＩＡマウスにおいて、組換えマウスＩＬ−１０の直接注射と比較して、ＤＣ／ｒｍＩＬ−１０由来のエキソソームを試験した。Ａ〜Ｃで、２８日目にウシＩＩ型コラーゲンで免疫し、ＬＰＳを投与したＤＢＡ１マウスに、３２日目（矢印によって示す）に精製済みエキソソームを静脈内注射した。確立されている巨視的なスコア化システムによってマウスを定期的にモニターした。そのスコア化システムは、すべての足に関する累積値で表され、最大限のスコアは１６である。
【００３３】
図１７．  マウスＤＴＨモデルにおける足蹠の膨大の増加。この場合、処置対象の足蹠には、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４から調製されたエキソソーム、ＤＣ／Ｐｓｉ５（対照）、ＤＣ／Ｐｓｉ５から調製されたエキソソーム（対照）、または生理食塩水（対照）を注射した。
【００３４】
図１８．  マウスＤＴＨモデルにおける足蹠の膨大の増加。この場合、処置対象の足蹠には、ＤＣ／ｓｍＩＬ−４、ＤＣ／ｓｍＩＬ−４から調製されたエキソソーム、ＤＣ／Ｐｓｉ５（対照）、ＤＣ／Ｐｓｉ５から調製されたエキソソーム（対照）、または生理食塩水（対照）を注射した。
【００３５】
図１９．  マウスＤＴＨモデルにおける足蹠の膨大の増加。この場合、処置対象の足蹠には、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４から調製されたエキソソーム、ＤＣ／ＦａｓＬ、ＤＣ／ＦａｓＬから調製されたエキソソーム、ＤＣ／Ｐｓｉ５（対照）、またはＤＣ／Ｐｓｉ５から調製されたエキソソーム（対照）を注射した。
【００３６】
図２０．  野生型またはｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）マウスのいずれかのマウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加。この場合、野生型またはｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスのいずれかから回収されたＤＣから調製され、可溶性（ｓｍＩＬ−４）または膜結合型（ｍｂｍＩＬ−４）ＩＬ−４のいずれかを発現するように改変されたエキソソームを注射した。
【００３７】
図２１Ａ−Ｂ．  （Ａ）同系または（Ｂ）同種異系マウスのいずれかに由来する、膜結合型ＩＬ−４で増強されたＤＣから調製されたエキソソームを注射した後のマウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加。
【００３８】
図２２．  マウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加を示す棒グラフ。この場合、野生型またはＢ７．１およびＢ７．２欠損（ＫＯ）マウスのいずれかの処置対象の足（黒色バー）には、Ａｄ．Ｐｓｉ５またはＩＬ−４遺伝子を有するアデノウイルスベクターのいずれかで処理されたＤＣから調製されたエキソソームを注射した。無処置の足のサイズは白抜きのバーによって表される。
【００３９】
図２３．  Ａｄ．ｐｓｉ＝５（対照）、Ａｄ．ｍＩＬ−４、またはＡｄ．ｍｂｍＩＬ−４のいずれかに感染させたＤＣから調製したエキソソームで処置されたＣＩＡモデルマウスの関節炎指数を示すグラフ。
【００４０】
図２４Ａ−Ｂ．  （Ａ）ＤＣ／ＩＬ−４由来のエキソソームで最初に処置されたマウスまたは（Ｂ）最初の被験体由来のＣＤ１１Ｃを投与されたマウスにおけるＤＴＨ反応。
【００４１】
図２５．  生理食塩水、無処理のＤＣ由来のエキソソーム、またはＤＣ／ＩＬ−４から調製されたエキソソームのいずれかで処置されたマウスにおける高血糖の発生を示すグラフ。
【００４２】
図２６．  無処理の全血清およびビーズで処理された全血清をＤＴＨモデルのマウスに投与した４８時間後の足蹠の膨大を示す棒グラフ。
【００４３】
図２７．  ＫＬＨ免疫マウス由来の血清、微小胞、およびエキソソームを使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を示す棒グラフ。
【００４４】
図２８．  種々の血清画分を使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を示す棒グラフ。この場合、追加免疫の４８時間後に膨大を測定した。
【００４５】
図２９．  種々の血清画分を使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を示す棒グラフ。この場合、ＫＬＨおよびＯＶＡ免疫マウスから血清を分離し、追加免疫の４８時間後に膨大を測定した。
【００４６】
図３０．  マウス血清から単離されたエキソソームの電子顕微鏡写真。
【００４７】
図３１．  抗ＭＨＣクラスＩＩを保持するビーズで標識された血清由来のエキソソームのＦＡＣＳ解析。
【００４８】
図３２．  マウスＤＴＨモデル（この場合のＤＴＨはＫＬＨに対するものである）における足膨大の増加を示す棒グラフ。この場合、処置対象の足には、（ａ）ＫＬＨ免疫マウスの血清から回収されたエキソソーム（群Ｉ）、（ｂ）無処置のマウスの血清から回収されたエキソソーム（群ＩＩ）、または（ｃ）生理食塩水（群ＩＩＩ）のいずれかを注射した。処置された足は黒色のバーで表され、反対側の足は白抜きのバーで表される。
【００４９】
図３３．  マウスＤＴＨモデル（この場合のＤＴＨはＫＬＨに対するものである）における足膨大の増加を示す棒グラフ。この場合、処置対象の足には、（ａ）ＫＬＨ免疫マウスの血清から回収されたエキソソーム；（ｂ）ＫＬＨ免疫マウスの血清から回収され、抗ＭＨＣＩＩ抗体であらかじめ吸収した（preabsorbed）エキソソーム；（ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ陽性のＫＬＨ免疫マウスの血清から回収されたエキソソーム；（ｄ）抗ＩｇＧ抗体であらかじめ吸収したエキソソーム枯渇対照；または（ｅ）生理食塩水のいずれかを注射した。
【００５０】
図３４．  マウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加を示す棒グラフ。この場合、（ａ）ＦａｓＬ欠損ｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスの血清由来のエキソソームを野生型レシピエントに投与；（ｂ）野生型マウスの血清由来のエキソソームを野生型レシピエントに投与；（ｃ）ｇｌｄマウスの血清由来のエキソソームをｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）レシピエントに投与；（ｄ）野生型マウスの血清由来のエキソソームをｌｐｒレシピエントに投与；または（ｅ）対照として生理食塩水を投与した。
【００５１】
図３５．  血清由来のエキソソームで処置されたマウスＤＴＨモデルにおける足膨大のＤＴＨ増加を示す棒グラフ。エキソソームは、エキソソームドナー動物を免疫した１４日後に回収し、レシピエント動物を免疫した１４日後に投与した。
【００５２】
図３６．  ３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の６時点で測定されたＶＡＳにおける痛みを示すグラフ。
【００５３】
図３７．  ３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の６時点で測定されたＳＥＳａｆｆ（感情的疼痛尺度：Affective Pain Scale）における痛みを示すグラフ。
【００５４】
図３８．  ３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の６時点で測定されたＳＥＳｓｅｎｓ（感覚的疼痛尺度：Sensitive Pain Scale）における痛みを示すグラフ。
【００５５】
図３９．  ３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の４時点で測定されたＯｓｗｅｓｔｒｙスコアにおける痛みを示すグラフ。
【００５６】
図４０Ａ−Ｆ．  Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清由来のエキソソーム濃縮画分の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）（（Ｂ）は濾過済みの血清から作成されたイメージである）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
５．  発明の詳細な説明
限定する目的ではなく、明確化のために、発明の詳細な説明を下記の節に分ける：
（ｉ）      エキソソームの細胞供給源；
（ｉｉ）    エキソソーム回収のための細胞のコンディショニング；
（ｉｉｉ）  細胞からのエキソソーム調製；
（ｉｖ）    血清からのエキソソーム調製；
（ｖ）      エキソソーム含有組成物；
（ｖｉ）    免疫抑制の方法；および
（ｖｉｉ）  エキソソーム媒介性の免疫抑制をアンタゴナイズする方法。
【００５８】
５．１  エキソソームの細胞供給源
本発明のエキソソームは種々の異なる細胞由来であってよく、その細胞としては、非限定的に、樹状細胞（「ＤＣ」）およびマクロファージなどの抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）が挙げられ、例えば、骨髄、脾臓、リンパ節、または胸腺などの組織からか、あるいは末梢血またはそれに由来する血清から回収してよい。本発明の範囲には、皮膚のランゲルハンス細胞または肝臓のクッパー（Kuppfer）細胞などの特殊化した抗原提示細胞がさらに包含される。それらはその起源の組織から調製することができる。特にＡＰＣおよびＤＣを回収する方法は当技術分野において公知である。
【００５９】
下記実施例で実証されるように、エキソソームの免疫抑制活性はＭＨＣクラスＩＩ抗原依存的であり、かつ、エキソソームドナーとレシピエントとの関係が同種異系である場合よりも同系である場合に非常に高いことが観察される。したがって、ドナーおよびレシピエントの同系性を最大にすることが望ましい。したがって、本発明は、ある哺乳動物種由来のエキソソームを別の動物種での免疫抑制に使用することを包含するが、好ましくは、ドナーおよび所期のレシピエントの動物種は同一であり、ならびに／あるいは、好ましくは、ドナーおよび所期のレシピエントのＭＨＣクラスＩＩ抗原は同一であり（あるいは、例えば、意図される組織移植物に採用される考慮すべき条件を使用して、実質的に類似または適合性であり）、ならびに／あるいは、好ましくは、ドナーおよび所期のレシピエントは同一（自家）または家族関係である（兄弟／姉妹；姉妹／姉妹；親／子）。同様に、エキソソームの免疫抑制活性は抗原特異的であるため、本発明の特定の非限定的な実施形態では、エキソソームドナーを抗原を用いて免疫してよく、その抗原はレシピエントにおいて反応が抑制されるべき対象の抗原である。
【００６０】
５．２  エキソソーム回収のための細胞のコンディショニング
本発明の好ましい非限定的な実施形態では、ＡＰＣをコンディショニングして、それから調製されるエキソソームの免疫抑制活性を増強する。本明細書中で使用される場合の「コンディショニング（調整）済み（Conditioned）」には、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＡＰＣを増強物質に曝露すること、ならびに（ｉｉ）増強物質を発現するようにＡＰＣを遺伝子操作することが含まれる。
【００６１】
増強物質は、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、およびＮＦκＢアンタゴニストであってよく、それには、非限定的に、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ｓＣＤ４０−Ｉｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＦａｓＬ、ＩＬ−１受容体アンタゴニストタンパク質（「ＩＲＡＰ」）、ｖＩＬ−１０、ｓＩＣＡＭ−１、ｓＩＣＡＭ−３、およびＴＲＡＩＬが含まれる。好ましい非限定的な実施形態では、増強物質はＩＲＡＰまたはＩＬ−１０またはＩＬ−４あるいはそれらの組み合わせである。例えば細胞培養中でＡＰＣに増強物質を投与する特定の非限定的な実施形態では、ＩＲＡＰの濃度は約５μｇ／ｍｌであってよく、またはＩＬ−１０の濃度は約１０００Ｕ／ｍｌであってよく、またはＩＬ−４の濃度は約１０００Ｕ／ｍｌであってよい。場合により、特定の抗原または特定の抗原供給源が公知である場合、そのような特定の抗原または特定の抗原供給源（例えば、固定したかまたは弱毒化された感染性物質）を無毒で非病原性の量で増強物質として培養に加えてよい。
【００６２】
本発明の一群の実施形態では、増強物質をコードする異種「増強性遺伝子」を発現するようにＡＰＣを遺伝子操作してよい。そのような「増強性遺伝子」には、非限定的に、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ｓＣＤ４０−Ｉｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＦａｓＬ、ＩＲＡＰ、ＶＩＬ−１０、ｓＩＣＡＭ−１、ｓＩＣＡＭ−３、およびＴＲＡＩＬをコードする核酸が含まれ、それはＡＰＣにおいて活性なプロモーターエレメントに作動的に連結されている。好ましい実施形態では、増強性遺伝子はＦａｓＬ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４またはＩＲＡＰである。増強性遺伝子の産物は、エキソソームの表面に発現させるか（例えば膜結合型）またはエキソソームの内部で発現させてよい。あるいは、非限定的にＤｅｌ１などの血管新生因子またはソーティングおよび局在化シグナルをコードする増強性遺伝子を発現するようにＡＰＣを操作してよい。増強性遺伝子は、当技術分野において公知の方法を使用して導入してよく、その方法には、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、などが含まれる。場合により、増強性遺伝子を適切な発現ベクターに組み込んで、その導入を容易にすることができる。本発明の非限定的な実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターであってよい。本発明の特定の好ましい実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルス由来である（一般的には、Horwitz, M.S., "Adenoviridae and Their Replication," in Virology, 2nd edition, Fieldsら, （編）, Raven Press, New York, 1990を参照のこと）。組換えアデノウイルスは、アデノウイルスキャリアに対して外来性のタンパク質をコードする核酸分子用の発現系としての使用に有利であり、その利点には、分裂細胞と非分裂細胞の両者に関する親和性、最小の病原可能性、ベクターストックの調製用の高い力価にまで複製する能力、および大きなインサートを輸送する能力が含まれる。Berkner, K.L., 1992, Curr. Top. Micro Immunol, 158:39-66; Jolly D., 1994, Cancer Gene Therapy, 1:51-64を参照のこと。
【００６３】
本発明の特定の非限定的な実施形態では、Ｅ１およびＥ３領域が実質的に欠失しているアデノウイルス血清型２（Ａｄ２）または血清型５（ＡＤ５）由来のアデノウイルスベクターに増強性遺伝子を保持させてよい。アデノウイルスベクター用の骨格として他のアデノウイルス血清型を使用することもでき、それには、とりわけ、Ａｄ６、Ａｄ９、Ａｄ１２、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ２６、Ａｄ２７、Ａｄ２８、Ａｄ３０およびＡｄ３９が含まれる。列挙されたこれらのアデノウイルス血清型のうち、Ａｄ２およびＡｄ５が好ましい。
【００６４】
例えば、適切なプロモーターエレメントに作動的に連結された増強性遺伝子を含み、場合によりウイルスベクターに含有された核酸を、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルへのカプセル化などの送達系を介してＡＰＣに提供してよい。
【００６５】
５．３  細胞からのエキソソーム調製
細胞からのエキソソーム調製は当技術分野において公知である；例えば、Raposoら, J. Exp. Med. 183:1161 (1996)を参照のこと。
【００６６】
本発明の特定の非限定的な実施形態では、以下の通り、好ましくは（培養培地中で、または遺伝子操作によって）増強物質によってコンディショニングされたＡＰＣの培養物からエキソソームを調製してよい。培養上清を回収し、３００ｇで５分間、１，２００ｇで２０分間、および１０，０００ｇで３０分間の３回の連続遠心分離に付して細胞および残渣を取り除き、その後、１００，０００ｇで１時間遠心分離してよい。次いで過剰の血清タンパク質を除去するために、エキソソームペレットをＰＢＳで洗浄し、再度１００，０００ｇで１時間遠心分離し、その後、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁してよい。ｍｉｃｒｏ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Bio-Rad, CA）によってエキソソームを定量することができ、好ましくは該アッセイによって測定されるタンパク質１ｍｇに対応するエキソソームの量をＰＢＳ２０ｍｌに懸濁してよい。場合により、電子顕微鏡観察によってエキソソームの完全性を確認してよく（図１Ａを参照のこと）、場合により、特徴的な表面マーカーに関するＦＡＣＳ解析によってエキソソームを特性決定してよい（下記セクション６および７を参照のこと）。
【００６７】
５．４  血清からのエキソソーム調製
本発明にしたがって免疫抑制に使用するエキソソームは、適切な被験体の血清から回収してよい。好ましくは、被験体は、その血清由来のエキソソームの所期のレシピエントでもある（自家投与）。エキソソームドナーおよびレシピエントが同一でない場合、エキソソーム媒介性の免疫抑制活性の抗原特異性およびＭＨＣクラスＩＩ依存性のために、ドナーおよびレシピエントはＭＨＣクラスＩＩ抗原適合性であり、かつ／またはレシピエントにおいて免疫が抑制されることが望まれる抗原にドナーを曝露しておくことが好ましい。
【００６８】
エキソソームはサイズが３０〜１００ｎＭの小さな粒子であるため、末梢血サンプルからより大きな細胞要素を除去することによって、例えば、限定目的ではなく、１５００ｇで１０分間の遠心分離によって、血清中にそれらを回収してよい。
【００６９】
好ましくは、連続遠心分離ステップによってエキソソームをさらに厳密に精製する。例えば、限定目的ではなく、細胞培養上清からエキソソームを調製するための上記で概説される方法、または等価な方法を使用してよい。そのような方法は、好ましくは、実験用超遠心機の使用を含む。非限定的な一例では、（標準の実験技術を使用して末梢血から回収された）血清から、１２００ｇで５分間、１，２００ｇで２０分間、および１０，０００ｇで３０分間の３回の連続遠心分離を行い、その後、１００，０００ｇで１時間遠心分離し、得られたペレットをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、次いで再度１００，０００ｇで１時間遠心分離することによってエキソソームを分離してよく、その後、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁してよい。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、血清およびエキソソームの回収に先立って、サイトカインの産生を刺激するためにビーズの存在下で末梢血をインキュベートしてよい。その目的で使用してよいビーズには、非限定的に、直径０．５〜１０ｍｍの範囲または０．５〜５ｍｍの範囲のガラスもしくはプラスチックビーズが含まれ、それは、場合により、リンパ球増殖を刺激するＣｒＳＯ４などの物質で処理されている（Migniniら, 2004, Preventive Med 39(4) 767-775; Rheeら, 2002, Clin Exp Immunol 127(3):463-469）。本発明の好ましい非限定的な一実施形態では、医療用グレードの直径２．５ｍｍで２１ｍｍ２の表面積を有するガラスビーズを使用する。その表面は、５０％ＣｒＳＯ４（Merck, Germany）中で５分間インキュベートすることによって処理され、次いでｐＨが蒸留水のｐＨと同一になり、ならびに洗浄液の伝導率が０．３μＳ未満になるまで蒸留水で洗浄されたものである。処理済みのビーズは、マイクロタイタープレート、遠心管、培養試験管、またはシリンジなどの適切な容器に入れてよく、その後、滅菌してよい（例えば、オートクレーブまたはガンマ線照射によって）。次いで末梢血をビーズの入った容器に入れ、その後、３７℃、５％ＣＯ２で例えば２４時間、無菌的にインキュベートしてよい。次いで、ビーズ／血液懸濁物から、例えば３５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって血清を回収してよい。典型的には、元の総末梢血容量の２０％が回収されるであろう。次いで、得られたエキソソームを含有する血清を−２０℃で保存してよい。Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清はこのようにして調製される（米国特許第６，７５９，１８８号および同第６，７１３，２４６号を参照のこと）。
【００７１】
本発明の、関連する特定の非限定的な実施形態では、ビーズとインキュベートする前、またはその代わりに、末梢血サンプルにＩＲＡＰを加えてよい。例えば、末梢血１ｍｌあたりＩＲＡＰ５μｇを加えてよい。
【００７２】
本発明の好ましい非限定的な実施形態では、場合によりビーズおよび／またはＩＲＡＰとインキュベートされた末梢血から、固形（formed）血液成分を除去するための遠心分離（例えば３０００〜５０００ｇで１０分間）を行い、その後、例えば１００，０００ｇで１時間の超遠心を行うことによって血清を回収し、それによって、エキソソームの濃縮調製物を調製してよい。得られたペレットを生理食塩水に再懸濁してよく、その後、好ましくは滅菌してよい（例えば、０．２μｍフィルターを通して濾過することによって）。ペレットを懸濁する容量によってエキソソームの濃度が決まる。好ましくは、その濃度は、血清約１００ｍｌ：エキソソーム濃縮物１ｍｌ（「１００×濃縮物」）〜血清２ｍｌ：エキソソーム濃縮物１ｍｌ（「２×濃縮物」）の範囲、好ましくは血清約５０ｍｌ：エキソソーム濃縮物１ｍｌ（「５０×濃縮物」）〜血清５ｍｌ：エキソソーム濃縮物１ｍｌ（「５×濃縮物」）の範囲、好ましくは血清約１０ｍｌ：エキソソーム濃縮物１ｍｌ（「１０×濃縮物」）である。
【００７３】
５．５  エキソソーム含有組成物
本発明は、エキソソームが適切な医薬用担体に懸濁されているエキソソーム含有組成物を提供する。
【００７４】
本発明の組成物は、エキソソームの濃度が、平均的な投与対象またはエキソソームの所期のレシピエントのいずれかの血清中のその濃度と比較して濃縮されていることを特徴とすることができる。非限定的な実施形態では、その濃度は、血清と比較して、約１００×〜２×の範囲、または５０×〜５×の範囲であってよく、あるいは約１０×である。
【００７５】
本発明の組成物は、前記セクションに記載のように、増強物質で処理されたＡＰＣまたは末梢血から得られたエキソソームを含んでよい。
【００７６】
本発明の組成物は、超遠心によって調製されたエキソソームを含んでよい。
【００７７】
好ましい非限定的な一群の実施形態では、本発明は、増強物質によってコンディショニングされた被験体のＡＰＣを培養し、次いで該コンディショニングされたＡＰＣの培養培地からエキソソームを単離することによって調製されたエキソソームを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００７８】
別の好ましい非限定的な群の実施形態では、本発明は、末梢血をガラスビーズとインキュベートし、末梢血から血清を回収し、超遠心によって血清からエキソソームを単離することによって調製されたエキソソームを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００７９】
別の好ましい非限定的な群の実施形態では、本発明は、増強物質、好ましくはＩＲＡＰの存在下で末梢血をガラスビーズとインキュベートし、末梢血から血清を回収し、好ましくは超遠心によって、血清からエキソソームを単離し、好ましくはエキソソーム濃縮調製物を得ることによって調製されたエキソソームを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００８０】
５．６  免疫抑制の方法
本発明は、有効量のＡＰＣ由来のエキソソームを被験体に投与するステップを含む、そのような処置を必要とする被験体において免疫応答を減少させ、阻害し、または予防するための方法を提供する。減少／阻害／予防は、炎症パラメータ、例えば炎症の臨床徴候（膨大、潮紅、蓄熱、痛み、制限された関節可動性、発疹、炎症性神経障害、髄膜炎、脳炎）、アレルギーまたは喘息の臨床徴候（くしゃみ、そう痒、咳嗽、発疹、じんま疹、喘鳴）、炎症性腸疾患の臨床徴候（痙攣、便中の血液および／または粘液）または臨床マーカー、例えばＣＲＰ、ＥＳＲ、ＷＢＣの減少によって立証してよい。
【００８１】
免疫応答の減少、阻害、または予防が望まれる疾患および障害には、非限定的に、関節炎、アレルギー、喘息、または自己免疫疾患、例えば、非限定的に、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosis）、強皮症、シェーグレン症候群、Ｉ型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、クローン病、乾癬、グレーヴス病、セリアック病、円形脱毛症、中枢神経系脈管炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、ギラン・バレー症候群、結節性多発性動脈炎、特発性血小板紫斑病、巨細胞動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、アジソン病、強直性脊椎炎、ライター症候群、高安動脈炎、および白斑が含まれる。本発明にしたがって処置することが望ましい他の症状には、筋ジストロフィーなどの疾患、および軟部組織、靭帯、もしくは骨の偶発的または医原性の創傷、または非免疫性の現象によって損傷した組織、例えば心筋梗塞後の心筋などの、炎症が適正な治癒を妨害しうる症状が含まれる。
【００８２】
本発明の方法は、本発明にしたがって調製された有効量のエキソソームを、そのような処置を必要とする被験体に投与するステップを含む。例えば、前記セクションに記載のエキソソーム組成物を投与してよい。エキソソームは任意の臨床的経路によって投与してよいが、好ましくは、例えば外科的処置中に、静脈内、筋肉内、関節内、皮下、くも膜下腔内に投与するか、あるいは局所注射もしくは点滴注入によって投与する。
【００８３】
投与されるエキソソームの量は以下の通りであってよく、あるいは臨床的に、例えば、被験体ごとに決定される通りであってよい。特定の非限定的な実施形態では、約５〜１００μｇの範囲のタンパク質を有するエキソソームの量、または約５０μｇのタンパク質を有するエキソソームの量を、被験体体重１キログラムあたりに投与してよい。「特定の量のタンパク質を有するエキソソーム」との表現は、エキソソーム調製物中に存在するタンパク質の量が定量され（例えば、セクション５．３に記載のようにＢｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙによって、またはタンパク質を測定するための別の標準的技術によって）、タンパク質の量が、投与されるエキソソームの用量についての指標として使用されることを意味する。本発明の一群の特定の非限定的な実施形態では、約２０〜５０ｍｌの範囲、約５０〜１００ｍｌの範囲、約１００〜２００ｍｌの範囲、約２００〜３００ｍｌの範囲、約３００〜４００ｍｌの範囲、または約４００〜５００ｍｌの範囲の末梢血から回収された血清由来のエキソソームの量をヒト被験体に投与してよい。本発明の別の群の特定の非限定的な実施形態では、約１００μｇ〜５ｍｇの範囲のタンパク質、または約５００μｇ〜２ｍｇの範囲のタンパク質を有するエキソソームの量をヒト被験体に投与してよい。
【００８４】
特定の非限定的な実施形態では、本発明は、抗原提示細胞の培養物から調製された有効量のエキソソームを被験体に投与するステップを含む、そのような処置を必要とする被験体において免疫応答を阻害する方法を提供する。本明細書中で使用される「抗原提示細胞の培養物」とは、当技術分野において公知の方法によって回収され抗原提示細胞に関して富化された細胞の培養物である；かかる培養物は必ずしも１００％純粋でなくてよい。
【００８５】
５．７  エキソソーム媒介性の免疫抑制をアンタゴナイズする方法
ＡＰＣ由来のエキソソームは免疫抑制性であることが見出されているため、それらは、特定の条件下で、例えば、腫瘍または感染に対する宿主の免疫応答を抑制するという面において、悪影響を及ぼすであろう。したがって、本発明は、免疫の増加が望まれる部位に有効量のＡＰＣ由来エキソソームインヒビターを投与するステップを含む、そのような望ましくない免疫抑制を阻害する方法を提供する。そのようなインヒビターは、例えば、図１Ｃ、２および４Ａに示される、エキソソーム関連抗原、例えばトランスフェリンまたは任意の表面分子に対する抗体であってよい。
【実施例】
【００８６】
６．  実施例：エキソソームの特性決定−Ｉ
ＤＣ由来のエキソソームの免疫調節の役割を実証するために、ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−４中で高密度で培養されたＣ５７ＢＬ／６マウス骨髄前駆体からＤＣを産生させた。次いで、ＤＣによって産生されたエキソソームを分画遠心法によって培養培地から単離し、電子顕微鏡観察、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリーによって特性決定した。
【００８７】
６．１  材料および方法
マウス：すべて７〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２Ｋｂ）マウスおよびオスＤＢＡ１／ＬａｃＪ（Ｈ−２Ｋｑ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Bar Harbor, ME）から購入した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（Pittsburgh, PA）の無菌動物施設で動物を飼育した。
【００８８】
骨髄由来ＤＣの産生および培養：Kimら, J. Immunol. 166:3499-3505 (2001)に記載のように骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）を産生させた。簡潔には、マウス脛骨および大腿から骨髄を回収し、ナイロンメッシュに通して骨の小片および残渣を取り除いた。０日目に、０．８３Ｍ ＮＨ４Ｃｌバッファーで混入した赤血球を溶解し、Ａｂ（ＲＡ３−３Ａ１／６．１、抗Ｂ２２０；２．４３、抗Ｌｙｔ２；ＧＫ１．５、抗Ｌ３Ｔ４;すべてAmerican Type Culture Collection, Manassas, VAより入手）およびウサギ補体（Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY）の反応混液でリンパ球を枯渇させた。次いで、完全培地（ＣＭ；１０％ＦＢＳ、５０μＭ ２−ＭＥ、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００ＩＵ／ｍｌペニシリンを含有するＲＰＭＩ １６４０）中で２４時間、細胞を培養し、接着性マクロファージを除去した。次いで１日目に、組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）および組換えマウスＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を含有する新鮮なＣＭに非接着性細胞を入れた。細胞を４日間培養し、５日目に、アデノウイルスによる形質導入または組換えサイトカイン処理のために回収した。
【００８９】
アデノウイルス感染では、１×１０６ＤＣ／ウェルを２４ウェルプレートに入れ、５×１０７ＰＦＵの各組換えアデノウイルスを総容量１ｍｌの無血清培地に加えた。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を回収し、ＰＢＳ中で５回洗浄し、新鮮な培地を加えた。７日目に、感染ＤＣおよびエキソソームを回収し、よく洗浄し、動物に注射した。
【００９０】
エキソソーム精製：以前に報告されたように分画遠心法によって７日目のＢＭＤＣ培養物の細胞培養上清からエキソソームを調製した（Raposoら, J. Exp Med. 183:1161-1172 (1996)）。簡潔には、各ＢＭＤＣ培養物から回収された培養上清を、３００ｇ（５分）、１，２００ｇ（２０分）、および１０，０００ｇ（３０分）の３回の連続遠心分離に付して細胞および残渣を取り除き、その後、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。過剰の血清タンパク質を除去するために、エキソソームペレットを大容量のＰＢＳで洗浄し、１００，０００ｇで１時間遠心分離し、最終的に、以後の研究のために１２０μｌのＰＢＳに再懸濁した。ｍｉｃｒｏ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Bio-Rad, CA）によってエキソソームを定量した。各バッチをタンパク質含量によって標準化し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるマウスでの研究のために、２０μｌのＰＢＳに１μｇを懸濁した。ＭＨＣ ＩＩの吸収のために、１００μｌの洗浄済み抗マウスＭＨＣ ＩＩ常磁性ビーズ（Miltenyi Biotech）を、あらかじめ希釈済みのエキソソーム（１μｇ／２０μｌ）とインキュベートした。インキュベーションは、穏やかに振盪しながら、４℃で１時間行った。磁気を用いた分離後、微量遠心管に保持されなかった画分をＰＢＳで調節して元の容量にした。ドライアイス／エタノール浴中で瞬間凍結（snap freezing）し、その後３７℃の水浴中で温めることを３回繰り返し、あらかじめ希釈済みのエキソソームの凍結／解凍を実施した。最終エキソソーム調製物中のＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０の混入濃度をＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ（Endogen）によって決定した。
【００９１】
電子顕微鏡観察：分画遠心法によってエキソソームを精製し、Ｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコーティンググリッドに１０μｌを載せ、中性１％水性リンタングステン酸（phosphotungastic acid）１０μｌでネガティブ染色し、ＪＥＯＬ−１２１０コンピュータ制御高コントラスト１２０ｋｖ透過型電子顕微鏡を使用して観察した。
【００９２】
タンパク質解析：細胞に関して、２５Ｇ注射針を６０回通過させることによって、ＣＬＡＰ（キモトリプシン、ロイペプチン、アプロチニン、およびペプスタチン、各１００μＭ）を添加した１０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸、２５０ｍＭショ糖、ｐＨ７．４中でホモジナイズし、それによって全膜（total membrane）からサイトゾルを分離した。１，２００ｇで遠心分離して、核および細胞残渣から上清を除去した。１００，０００ｇで１時間遠心分離した後、ペレット中に全膜を回収した。次いで１０μｇの細胞ライセートまたはエキソソーム調製物を５−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上にトランスファーし、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Amersham）を使用してウエスタンブロットによって検出した。
【００９３】
ＦＡＣＳ解析：大多数の培養細胞（６０〜９５％）において、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson, Sunnyvale, CA）による、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ならびにＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの発現に関する表現型解析によってＤＣを規定した。エキソソームに関して、最終容量３０〜１００μｌ中で室温で１５分間、３０μｇのペレット化エキソソームを１０μｌの直径４μｍのアルデヒド／スルファートラテックスビーズ（Interfacial Dynamics, Portland, OR）とインキュベートし、その後、ＰＢＳ１ｍｌ中で穏やかに撹拌しながら２時間インキュベートした。１００ｍＭグリシン中で３０分間インキュベートすることによって反応を停止させた。エキソソームコーティングビーズをＦＡＣＳ洗浄バッファー（ＰＢＳ中の３％ＦＣＳ、および０．１％ＮａＮ３）中で３回洗浄し、ＦＡＣＳ洗浄液５００μｌに再懸濁した。ビーズを各一次抗体と１時間インキュベートし、その後、必要であればＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体中でインキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Becton Dickinson, San Diego, CA）で分析した。Ｌｙｓｉｓ ＩＩ ＦＡＣＳｃａｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）を使用してデータ収集および分析を実施した。
【００９４】
６．２  結果
全載透過型電子顕微鏡観察によるエキソソームペレットの超微細構造の分析では、特徴的な受け皿型の直径４０〜９０ｎｍのエキソソームについての顕著な富化が示された（図１Ａ）。ウエスタンブロット解析では、ＤＣ由来のエキソソームは、エキソソーム関連タンパク質ＣＤ７１およびＨｓｐ７０に関して陽性である（図１Ｂ）が、エキソソームにおいて見出されないタンパク質、例えばＨｓｐ９０、インバリアント鎖、およびカルネキシンに関しては陰性であることが実証された。エキソソーム画分の無傷の小胞の性質をさらに実証するために、ｅＧＦＰ／Ｃ５７マウスのＢＭＤＣからエキソソームを精製した。その理由は、その動物の体内の大多数の細胞はマーカータンパク質ｅＧＦＰを構成的に発現しているからである（図１Ｂ）。高度に富化されたエキソソーム画分のウエスタン解析では、かなりのレベルの完全長ｅＧＦＰが示された。したがって、可溶性ｅＧＦＰがＢＭＤＣ由来のエキソソームの内腔の保護環境内にカプセル化されていることが示唆される。
【００９５】
ＤＣ由来のエキソソーム画分を表面タンパク質に関するフローサイトメトリーによってさらに調査した。１００，０００×ｇで遠心した後にエキソソームを回収し、ラテックスビーズに結合させ、マウスＤＣ結合型白血球性マーカータンパク質に対する複数のモノクローナル抗体で染色した。エキソソームの表面はＭＨＣ ＩＩに関して高レベルで陽性に染色され、より中程度のレベルでＭＨＣ Ｉ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）が検出された（図１Ｃ）。総合すると、これらのデータは、他者によって報告されるＤＣ由来エキソソーム関連タンパク質の多数のマーカーを含有する無傷のエキソソームにについて富化することができることを実証する（Stoorvogelら, Traffic. 3:321-330 (2002); Raposoら, J. Exp Med. 183:1161-1172 (1996); Kleijmeerら, Traffic. 2:124-137 (2001)）。
【００９６】
７．  実施例：エキソソームの特性決定−ＩＩ
表面抗原．図２は、ＤＣ由来のエキソソームの表面表現型を実証するＦＡＣＳ解析の結果を示す。エキソソームを、ＣＤ１１ｂ（ＭＨＣクラスＩＩの分析用）またはＭＨＣクラスＩＩ（ＩＡｄ）抗体でコーティングされた４．５μｍビーズとインキュベートした。ビーズを使用してエキソソームのサイズを増加させ、ＦＡＣＳによって検出可能となるようにした。次いで、ビーズでコーティングされたエキソソームを指定のタンパク質に対するＰＥ ｍＡｂで標識した。図２に記載の表面抗原に加えて、骨髄由来のエキソソームはＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ５４、ＭＦＧ−Ｅ８、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ９に関しても陽性であった。かなりの割合のエキソソームがＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよび膜結合型ＴＮＦ−αに関して陽性であったが、ＣＤ８−α、ＣＤ３２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ１０７ａ（Ｌａｍｐ−１）、ＣＤ９５およびＴｒａｉｌに関しては陰性であった。興味深いことに、その調製元のＤＣのうちの少ない割合しかＦａｓＬ陽性ではなかったにもかかわらず、９９％のエキソソームがＦａｓＬ（ＣＤ１７８）に関して陽性であった。この結果は、ＦａｓＬがエキソソームに優先的にソーティングされることを示唆し、その場合、いかなる理論にも拘束されないが、このことは、観察された治療効果の付与に本質的な役割を果たすと思われる。
【００９７】
輸送．図３Ａ−Ｄは、ＤＣ由来のエキソソームのｉｎ ｖｉｖｏでの輸送を示す。ＢＤＭＣ由来のエキソソームをＰＫＨ６７で標識し、マウスにＩＶ注射し、注射２時間後からマウスを分析した（Kimら, J. Immunol. 166:3499-3505 (2001)）。脾性辺縁帯のＭＯＭＡ−１＋のマクロファージ、ＥＲ−ＴＲＰ＋のマクロファージおよびＣＤ１１ｃ＋のＤＣにおいて標識エキソソームを検出した。ＣＤ１１ｃ＋のＤＣでは、エキソソームがＬａｍｐ−１＋のエンドサイトーシス小胞と共存していることが見出された。さらに、まず、エキソソームはＣＤ８−α陰性ＣＤ１１ｃ＋の細胞によって取り込まれ、標識エキソソームに関するＣＤ８−α＋Ｄｃ陽性の割合は経時的に増加した。２４時間後、エキソソームはＴ細胞領域のＣＤ１１ｃ＋のＤＣと共存していることが示された。また、エキソソーム陽性ＤＣの分析では、それらがＤＣ成熟マーカー（ＩＡｂ、ＣＤ８６またはＣＤ５４）をアップレギュレーションしないことが示された。これらの結果は、ＤＣ由来のエキソソームが、脾臓に認められる未成熟ＤＣならびにマクロファージによって効率的に内部に取り込まれ、ＤＣの成熟を誘発することなく、ＤＣの成熟能に影響することもないことを示唆する。ゆえにエキソソーム機能に関するワーキングモデルは、それらが脾臓およびリンパ節の抗原提示細胞のサブセットと相互作用し、そして次にＴ細胞応答を抑制し、その結果、調節性Ｔ細胞集団の誘導が生じるのであろうというものである。
【００９８】
８．  実施例：ＤＣ／ＦａｓＬ由来のエキソソームは免疫抑制活性を有する
記号「ＤＣ／‘Ｘ’」（記号中の‘Ｘ’はＦａｓＬ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、などの作用物質である）は、樹状細胞からエキソソームを調製する前に、樹状細胞がＸを発現するように操作されたか、あるいはＤＣがＸに曝露されたことを示す。
【００９９】
８．１  ＤＣ／ＦａｓＬ由来のエキソソームは外因性ＦａｓＬを保持する
以下の実施例は、外因性遺伝子を形質導入されたＤＣから単離されたエキソソームがその遺伝子産物を提示することが可能であることを実証する。特に、ＤＣがＦａｓＬ遺伝子を保持するアデノウイルスベクターで形質導入されている場合、そのＤＣ由来のエキソソームはＦａｓＬを提示する。
【０１００】
８．１．１  材料および方法
ＤＣの産生：以前に報告されたように骨髄由来ＤＣを産生させた（Whalenら, Mol Ther. 4:543-550 (2001); Kimら, J. Immunol. 166:3499-3505 (2001); Kimら, Mol Ther. 6:584-590 (2002)）。簡潔には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脛骨および大腿から骨髄を回収した。混入赤血球を溶解し、抗体の反応混液（ＲＡ３−３Ａ１／６．１、抗Ｂ２２０；２．４３、抗Ｌｙｔ２；ＧＫ１．５、抗Ｌ３Ｔ４；すべてATCC, MDより入手）でリンパ球を枯渇させた。次いで完全培地（ＣＭ）中で２４時間、細胞を培養して、接着性マクロファージを除去した。次いで、１０００Ｕ／ｍｌのｍＧＭ／ＣＳＦおよびｍＩＬ−４を含有する新鮮なＣＭに非接着性細胞を入れた。細胞を４日間培養し、アデノウイルスによる形質導入のために回収した。アデノウイルス感染では、総容量１ｍｌの無血清培地中で１×１０６のＤＣを５×１０７ＰＦＵのウイルスと混合した。２４時間インキュベートした後、ＤＣをＰＢＳで３回よく洗浄し、さらに４８時間インキュベートした。８日目に、エキソソームの精製および感染ＤＣの回収のために培養上清を回収した。
【０１０１】
エキソソームの単離：以前に報告された方法に軽微な変更を加えてエキソソームを単離した（Raposoら, J. Exp Med. 183:1161-1172 (1996)）。回収済みの培養上清を、３００ｇで１０分間、１２００ｇで２０分間、および３０００ｇで３０分間遠心分離した。最終の遠心分離から得られた上清を、超遠心機で１００，０００ｇで１時間、再度遠心分離した。エキソソームペレットを生理食塩水中で洗浄し、１００，０００ｇで１時間遠心分離し、生理食塩水に再懸濁した。
【０１０２】
フローサイトメトリー：ＤＣの表現型解析では、マウス表面分子（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｈ−２Ｋｂ、Ｉ−Ａｂ、および適切なアイソタイプ対照）に対するＰＥ−またはＦＩＴＣ−コンジュゲートモノクローナル抗体でＤＣを染色した。
【０１０３】
ＦＡＣＳ解析では、最終容量２０μｌ中で室温で１５分間、エキソソームを５μｌの直径４μｍのアルデヒド／スルファートラテックスビーズとインキュベートした。各ビーズ／エキソソームサンプルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇを加えた後、インキュベーションを１５分間継続した。１ｍｌの生理食塩水を加え、その後、穏やかに振盪しながら７５分間のインキュベーションを行った。１００ｍＭグリシンと３０分間インキュベートすることによって反応を停止させた。エキソソームコーティングビーズを抗体で染色し、ＦＡＣＳバッファー（生理食塩水中の３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー４００μｌに再懸濁した。ＤＣおよびエキソソームをＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickenson, CA）によって調べた。
【０１０４】
電子顕微鏡観察：分画遠心法によってエキソソームを精製し、Ｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコーティンググリッドに１０μｌを載せ、中性１％水性リンタングステン酸１０μｌでネガティブ染色し、ＪＥＯＬ−１２１０コンピュータ制御高コントラスト１２０ｋｖ透過型電子顕微鏡を使用して観察した。骨髄由来ＤＣを単離した。５日目に、単離されたＤＣの半分をＡｄ．ＦａｓＬに感染させた。上記のようにエキソソームを単離した。
【０１０５】
タンパク質解析およびウエスタンブロッティング：５マイクログラムのエキソソームタンパク質およびＤＣライセートを１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離した。タンパク質をニトロセルロース膜（Amersham）上にブロットした。ブロッキング後、抗体、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼを膜に接触させ、Ｘ線フィルムを使用してｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Perkin Elmer Life Science）によって検出した。
【０１０６】
８．１．２  結果
Ａｄ．ｅＧＦＰまたはＡｄ．ＦａｓＬでの形質導入の１日後によく洗浄した後、感染したマウスＤＣを４８時間培養し、分画遠心法によって上清からエキソソームを単離した。１０６個のマウス骨髄ＤＣは４８時間にわたって１〜２μｇのエキソソームを産生した。次いで、ＭＨＣおよび共刺激分子の存在に関してＤＣおよび単離されたＤＣ由来のエキソソームを分析した。その分析は、ラテックスビーズにカップリングされた抗体とのインキュベーション、その後のフローサイトメトリーによって行った。図４Ａ〜Ｃに示されるように、Ａｄ．ｅＧＦＰおよびＡｄ．ＦａｓＬで形質導入されたＤＣならびに対照で形質導入されたＤＣ由来のエキソソームは、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子、ＣＤ１１ｃならびに共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６に関して陽性であった（図４Ａ）。さらに、抗ＦａｓＬ抗体を使用するウエスタン解析によって、ＤＣ／ＦａｓＬおよびＤＣ／ＦａｓＬ由来のエキソソームはともに約４０ＫｄａのヒトＦａｓＬトランスジーンに関して陽性であることが示された（図４Ｂ）。これらの結果は、Ａｄ／ＦａｓＬで形質導入されたＤＣ由来のエキソソームが、タンパク質分解されていない、無傷のＦａｓＬならびにＭＨＣ、共刺激分子、およびＣＤ１１ｃを含有していたことを実証する。ＥＭによるエキソソーム画分の分析では、かなりの数の、エキソソームに特徴的な受け皿型の小胞が示された（図４Ｃ）。
【０１０７】
８．２  足蹠膨大アッセイにおいて、ＦａｓＬを提示するエキソソームを局所投与すると、処置された足および反対側の足の両方において遅延型過敏性（「ＤＴＨ」）に関連する膨大が減少した
ＦａｓＬを発現するように遺伝子改変されたＤＣ、ならびにその改変型ＤＣ由来のエキソソームがｉｎ ｖｉｖｏで炎症を抑制できるかどうかを試験するために、ＤＴＨマウスモデルを利用した。このモデルでは、特定の抗原、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミン（ＯＶＡ）でマウスを免疫し、その後、免疫の１０〜１４日後にその特定の抗原を後肢の足蹠（footpad）に注射することによってＴｈ１媒介性の炎症反応を誘発する。
【０１０８】
８．２．１  材料および方法
骨髄からの単離後、ＤＣをＡｄ．Ψ５またはＡｄ．ＦａｓＬに感染させた。セクション８．１に記載のようにエキソソームを精製した。
【０１０９】
ＤＴＨモデルへのエキソソームの投与：フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中で１：１で乳化された抗原（ＫＬＨまたはＯＶＡ）１００μｇを１箇所の背側部位に注射することによってＣ５７ＢＬ／６マウスを感作した。１０日後、免疫したマウスの一方の後肢の足蹠に１０６個のＤＣまたはＤＣ由来のエキソソーム１μｇを注射し、その１２時間後に抗原に曝露した。反対側の足蹠には、ＤＣまたはエキソソームの代わりに等容量の生理食塩水を投与した。生理食塩水２０μｌに溶解された抗原２０μｇを両足蹠に注射することによってマウスを抗原に曝露した。曝露の２４、４８および７２時間後に足蹠の膨大を測定した。抗原での追加免疫注射の前およびその後に、結果を膨大の差異（×０．０１ｍｍ）として表した。
【０１１０】
統計解析：スチューデントｔ検定を使用し、また分散分析によって、結果を比較した。
【０１１１】
８．２．２  結果
図５に示されるように、ＤＣ／ＦａｓＬまたはＤＣ／ＦａｓＬ由来エキソソームを送達すると、抗原の注射の２４、４８および７２時間後に、処置された足だけでなく、無処置の反対側の足においても足膨大が顕著に抑制された。対照的に、ＤＣ／Ψ５または対照ＤＣ由来のエキソソームを注射しても、ＤＴＨ応答を阻害することはできなかった。これらの結果は、ＦａｓＬを発現する遺伝子改変型ＤＣ、ならびにＤＣ／ＦａｓＬ由来のエキソソームが、処置された足だけでなく、反対側の無処置の足においてもＤＴＨ応答の抑制に等しく有効であることを実証する。
【０１１２】
関節炎の複数の異なる動物モデルにおいて、種々の異なる治療用遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ送達すると、いずれの送達においても対側効果が観察される（Kimら, J. Immunol. 164:1576-1581 (2000); Whalenら, J. Immunol. 162:3625-3632 (1999); Lechmanら, J. Immunol. 163:2202-2208 (1999); Ghivizzaniら, Proc Natl Acad Sci U S A. 95:4613-4618 (1998); Kimら, J. Immunol. 166:3499-3505 (2001); Ijimaら, Hum Gene Ther. 12:1063-1077 (2001); Kimら, Mol Ther. 6:584-590 (2002); Smeetsら, Arthritis Rheum. 48:2949-2958 (2002); Lechmanら, Gene Ther. 10:2029-2035 (2003)）。
【０１１３】
８．３  ＦａｓＬを提示する同系エキソソームによる遅延型過敏性の抑制
８．３．１  材料および方法
ＤＣ由来のエキソソームが炎症を抑制できるメカニズムを調べるために、観察された効果がＭＨＣ依存的および抗原特異的であるかどうかを調べた。エキソソームのＤＴＨ応答阻害能がＭＨＣ依存的であるかどうかを決定するために、同種異系エキソソームがｉｎ ｖｉｖｏでＤＴＨ応答を抑制できるかどうかを調べた。同系エキソソームの供給源としてＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ，Ｉ−Ａｂ）マウス由来のＤＣを使用し、一方、同種異系エキソソームの供給源としてＢａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２ｄ，Ｉ−Ａｄ）由来のＤＣを使用した。同系および同種異系のＤＣ由来のエキソソームのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＤＴＨ抑制能を調べるために、ＫＬＨ免疫マウスの両側の後肢の一方に同系または同種異系エキソソームを注射し、その１２時間後に、両後肢に抗原を注射した。４８時間後に足蹠の膨大の程度を測定した。
【０１１４】
８．３．２  結果
同種異系ＤＣ由来のエキソソームはＤＴＨ応答を抑制できなかった（図６）。対照的に、同系マウス由来の、Ａｄ．ＦａｓＬで形質導入されたＤＣまたはＤＣ／ＦａｓＬ由来のエキソソームを注射すると、ＤＴＨの抑制が観察された。さらに、同系ＤＣ／ＦａｓＬ由来のエキソソームによる局所処置を施すと、処置された足および無処置の反対側の足の両方において足膨大が減少した。また、このｉｎ ｖｉｖｏでの結果は、そのＥｘｏ／ＦａｓＬの効果が、ＦａｓＬを保持する細胞膜の注射に由来する、広範囲に及ぶアポトーシスの誘発のためではないことを実証する。
【０１１５】
８．４  ＦａｓＬを提示するエキソソームの遅延型過敏性の抑制はＭＨＣクラスＩＩ依存的である
８．４．１  材料および方法
ＤＣおよびエキソソームによって付与される免疫調節の性質をさらに調べるために、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ欠損マウスの両者からＤＣを調製し、Ａｄ．ＦａｓＬまたはＡｄ．Ψ５に感染させた。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ欠損マウスのＤＣ／ＦａｓＬまたはＤＣ／Ψ５からエキソソームを単離し、ＫＬＨ免疫マウスの後肢に注射した。
【０１１６】
８．４．２  結果
クラスＩ欠損マウス由来の遺伝子改変型ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームの注射は、治療効果の大きさに対して最低限の効果しか有さない（図７Ａ）。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ欠損マウス由来のＦａｓＬ発現ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームを注射すると、どちらの場合も、治療的な抗炎症性効果が完全に抑止された（図７Ｂ）。これらの結果は、ＤＣ／ＦａｓＬの治療効果が、クラスＩではなくＭＨＣクラスＩＩ依存的であることを示し、ＤＴＨ応答の調節に関するＣＤ４＋Ｔ細胞の主要な役割と合致する（Ptakら, J. Immunol. 146:469-475 (1991)）。さらに、その結果は、ＤＴＨ応答についての観察された調節に関して、エキソソームが、ＤＣと同様に、クラスＩではなくクラスＩＩを必要とすることを示す。
【０１１７】
８．５  エキソソーム媒介性の遅延型過敏性応答の阻害は抗原特異的である
８．５．１  材料および方法
ＦａｓＬを提示するエキソソームが免疫応答の抗原依存的な抑制をもたらすことができることを実証するために、マウスをＫＬＨに対して免疫した。ＤＣを調製し、Ａｄ．ＦａｓＬまたはＡｄ．ｅＧＦＰに感染させ、次いで、ＫＬＨまたはＯｖａタンパク質のいずれかでパルスした。個々のＤＣ培養物からエキソソームを調製し、免疫したマウスに注射し、その直後にＫＬＨを注射してＤＴＨ応答を誘発した。応答を４８時間後に測定した。
【０１１８】
８．５．２  結果
図８に示されるように、Ａｄ．ＦａｓＬ感染、ＫＬＨパルス済みＤＣ由来のエキソソームは、注射された足ならびに無処置の反対側の足において炎症を減少させた。対照的に、Ｏｖａパルス済み、ＦａｓＬ発現ＤＣ由来のエキソソームは、ＫＬＨ処理、Ａｄ．ｅＧＦＰ感染ＤＣ由来のエキソソームと同様に、炎症を中程度にしか抑制できなかった。これらの結果は、ＦａｓＬ発現ＤＣ由来のエキソソームが抗原特異的な様式で炎症を抑制できることを示唆する。
【０１１９】
８．６  ＦａｓＬ欠損マウスの樹状細胞から調製されたエキソソームは遅延型過敏性応答を抑制できなかった
８．６．１  材料および方法
野生型またはｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスのいずれかからＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームを単離し、対照アデノウイルスまたはＦａｓＬを発現するアデノウイルスに感染させた。ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームを、あらかじめＫＬＨに対して免疫された野生型マウスの足蹠に注射して戻し、その１２時間後に足蹠にＫＬＨを注射した。そして抗原注射後の足膨大の程度を測定した。また、野生型およびｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−マウス）由来のエキソソームをｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）マウスに注射して戻して、エキソソームおよびＤＣの効果がレシピエントマウス中の機能的Ｆａｓの存在を必要とすることを実証した。
【０１２０】
ｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウス由来のＤＣおよびエキソソームは、注射された足および反対側の足においてＤＴＨ応答を抑制できなかったが、ｇｌｄ ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームをＡｄ．ＦａｓＬで形質導入するとその効果が回復した（図９Ａ）。さらに、ＦａｓＬを含有するエキソソームならびにＤＣ−ＦａｓＬはｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）マウスにおいて効果がなかった（図９Ｂ）。
【０１２１】
８．７  ＦａｓＬを保持するエキソソームを投与するとコラーゲン誘発関節炎モデルにおいて疾患の重症度が改善された
ＤＣ／ＦａｓＬ由来のエキソソームがコラーゲン誘発関節炎を治療できることを実証するために、マウスコラーゲン誘発関節炎モデルにエキソソームを注射した。
【０１２２】
８．７．１  材料および方法
７〜８週齢のオスＤＢＡ／１ ｌａｃＪ（Ｈ−２ｑ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Bar Harbor, ME）から購入し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒの無菌動物施設で飼育した。０．０５Ｍ酢酸中の２ｍｇ／ｍｌの濃度のウシＩＩ型コラーゲン（Chondrex）を等容量のフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中で乳化し、マウスの尾のつけ根に注射した。
【０１２３】
確立されている巨視的なスコア化システム（０〜４の範囲）によってマウスをモニターした：０，正常；１，紅斑（erythma）を伴う検出可能な関節炎；２，顕著な膨大および潮紅；３，関節から指にかけての重篤な膨大および潮紅；および４，最大の膨大および強直症を伴う変形。巨視的スコアの平均をすべての足に関する累積値として表した。マウスあたりの最大限のスコアは１６である（ｎ＝７）。
【０１２４】
ＤＣをＡｄ／ＦａｓＬまたはＡｄ／Ψ５に感染させ、２８日目に、ウシＩＩ型コラーゲンで免疫したＤＢＡ１マウスに、感染ＤＣから単離したエキソソームを静脈内注射した。
【０１２５】
８．７．２  結果
ＤＣ／ＦａｓＬ（図１０Ａ）およびＦａｓＬを提示するエキソソーム（図１０Ｂ）での処置では、１回の処置後に、疾患の発症を遅延させ、かつ関節炎の進行を抑制することができ、一方、Ｅｘｏ／Ψ５対照群では、ＤＣ対照および生理食塩水対照と比較して、疾患の退行に関する中程度の効果が示された。これらの結果は、ＦａｓＬを発現するＤＣ由来のエキソソームの１回の注射によってコラーゲン誘発関節炎を抑制できることを示唆する。同様に、確立した疾患を有するマウス（３２日目）にＥｘｏ／ＦａｓＬを注射した場合も疾患が抑制された。
【０１２６】
９．  実施例：ＤＣ／ＩＬ−１０由来のエキソソームは免疫抑制活性を有する
９．１  ＩＬ−１０を提示するＢＭＤＣ由来のエキソソームのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける機能
ＢＭ−ＤＣ由来のエキソソームがＴ細胞の増殖を抑制する能力を実証するために、混合白血球反応（ＭＬＲ）へのＤＣ由来のエキソソームの添加の効果を調査した。潜在的に免疫抑制性であるＤＣ由来のエキソソームの供給源として、ウイルス性ＩＬ−１０（ｖＩＬ−１０）と称される、エプスタイン・バーウイルスによってコードされるＩＬ−１０遺伝子を発現するアデノウイルスで形質導入されたＢＭＤＣを使用した。ｖＩＬ−１０を関節内に遺伝子導入すると、抗原誘発関節炎（ＡＩＡ）ウサギモデルおよびコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデル（５，６）の両者において炎症が抑制されることが示されている。対照として、ルシフェラーゼを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ．Ｌｕｃ）で形質導入されたＢＭ−ＤＣを使用した。
【０１２７】
９．１．１  材料および方法
ベクターの構築およびアデノウイルスの作製：以前に報告されている標準的プロトコルにしたがって、ウイルス性ＩＬ−１０を発現するアデノウイルス（Ａｄ．ｖＩＬ−１０）および改良型緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルス（Ａｄ．ｅＧＦＰ）を構築し、増殖させ、力価測定した（Kimら, Arthritis Res. 2:293-302 (2000)）。簡潔には、ＤＮＡ、アデノウイルス５由来のＥ１およびＥ３欠失型アデノウイルス骨格（ｐｓｉ５）およびアデノウイルスシャトルベクターであるｐＡｄｌｏｘの同時トランスフェクション後に、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する２９３細胞（ＣＲＥ８細胞）における相同組換えによって組換えアデノウイルスを作製した。ヒトＣＭＶプロモーターの制御下で挿入されたｃＤＮＡ配列を発現させる。ＣｓＣｌ勾配超遠心によって組換えアデノウイルスを精製し、無菌のウイルス保存バッファー中で透析し、アリコートに分け、使用時まで−８０℃で保存した。ＣＲＥ８細胞を培養し、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ（Life Technologies, Gaithersburg, MD）中で維持した。
【０１２８】
リンパ球混合培養反応：丸底９６ウェルプレート中でｉｎ ｖｉｔｒｏミクロ培養するためにＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からＴ細胞を精製した。各ウェルに、対照Ｃ５７ＢＬ／６由来のＤＣもしくは遺伝子改変型Ｃ５７ＢＬ／６由来のＤＣ（ｖＩＬ−１０、ｒＩＬ−１０またはルシフェラーゼ）またはその単離されたエキソソームのいずれかとともに５×１０４個の脾臓Ｔ細胞を播種した。５：１、１０：１、２０：１、および４０：１のＴ細胞：ＤＣ比でＴ細胞にＤＣを加えた。培養５日目に、各ウェルに１μＣｉの３Ｈ−チミジンを加え、その１６時間後に回収した。ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｂｅｔａ ｃｏｕｎｔｅｒ（Wallac, Truku, Finland）で増殖性Ｔ細胞の放射性標識を測定した。
【０１２９】
９．１．２  結果
Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣをＭＬＲに加えると、３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定されるＴ細胞の増殖をほとんど完全に抑制できたが、形質導入されていないＤＣを加えてもほとんど効果を示さないか、または全く効果を示さなかった（図１１Ａ）。Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたＢＭ−ＤＣによって分泌されたエキソソームは、Ｔ細胞増殖に関して４分の１への中程度の減少を示した（図１１Ｂ）。これらのデータは、免疫抑制性ｖＩＬ−１０発現性ＤＣから単離されたエキソソームがＴ細胞の増殖をブロックできること、および無改変ＢＭＤＣ由来のエキソソームがそれ自体で部分的な抗炎症特性を有している可能性があることを示唆する。
【０１３０】
９．２  ＩＬ−１０を提示するエキソソームは遅延型過敏性モデルにおいて炎症を抑制できる
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＢＭ−ＤＣ由来のエキソソームの抗炎症性効果を実証するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遅延型過敏性モデルを使用した。このモデルは、以前、一方の後肢の足蹠にＡｄ．ｖＩＬ−１０を注射すると、注射された足蹠および反対側の足蹠の両方において炎症が抑制されることを示すために使用されている。さらに、ＤＴＨモデルにおいて局所性Ａｄ．ｖＩＬ−１０送達後に観察された対側効果は内因性ＡＰＣによって付与されたことが養子移入実験によって示されている。感作済みマウスの群の右後肢の足蹠に、無処理もしくは遺伝子改変型ＤＣまたはこれらの細胞の培養培地由来のエキソソームのいずれかを注射した。反対側の足蹠には同様の容量の生理食塩水注射を投与した。１２時間後、各足蹠をＫＬＨ２０μｇに曝露し、疾患誘発の２４、４８および７２時間後に足蹠の膨大をモニターした。
【０１３１】
９．２．１  材料および方法
遅延型過敏性：０日目に、フロイント完全アジュバント（Difco, Detroit, MI）中で１：１で乳化された抗原（ＯＶＡ）１００μｇを皮下注射することによってマウスを感作した。２週間後、あらかじめ感作されたマウスの一方の後肢の足蹠に、１×１０６個の処理済みＤＣ（５０μｌのＰＢＳ中）または各実験ＤＣ群由来の精製済みエキソソーム１μｇ（５０μｌのＰＢＳ中）のいずれかを注射した。実験ＤＣ群には、５０ｍｏｉのＡｄ．ルシフェラーゼで形質導入されたＤＣおよび５０ｍｏｉのＡｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣが含まれる。反対側の足蹠には、等容量の生理食塩水を注射した。１日後、マウスの両後肢の足蹠に、５０μｌのＰＢＳに溶解された抗原２０μｇを注射することによって抗原に曝露し、２４時間、４８時間、および７２時間後にバネ付きカリパス（Dyer Co. Lancaster, PA）で足蹠を測定した。その結果を、膨大に基づくサイズ差（ｍｍ×１０−２）として表した。
【０１３２】
統計解析：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアプログラムを使用してすべてのデータを分析した。スチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡの両者を使用して群の比較を実施した。
【０１３３】
９．２．２  結果
図１２に示されるように、生理食塩水対照動物におけるＤＴＨ応答は重篤であり、足の厚みの平均増加は２ｍｍを超えた。しかし、Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入された１×１０６個のＢＭ−ＤＣを投与されたマウスの注射された足蹠では、足蹠の膨大が５０％以上減少した。また、これらの同一の動物の生理食塩水で処置された反対側の足蹠で、炎症の減少（４０％）が観察された。興味深いことに、Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＢＭＤＣ由来の１マイクログラムの分泌エキソソームの注射はさらにより保護性であり、生理食塩水対照マウスと比較して足膨大が６５％抑制された。さらにまた、Ａｄ．ｖＩＬ−１０／エキソソームで処置された関節の反対側の足蹠においても顕著な減少が観察された（図９Ａ）。Ａｄ．Ｌｕｃ／ＤＣ、Ａｄ．Ｌｕｃ／エキソソーム、無処理ＤＣまたは無処理ＤＣ由来のエキソソームを投与しても、足蹠の膨大の顕著な減少は観察されなかった。これらのデータは、Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＢＭＤＣ由来のエキソソームが、感作済みマウスに局所送達されると、処置された足蹠および無処置の反対側の足蹠の両方においてＤＴＨを抑制できることを示唆する。
【０１３４】
９．３  組換えＩＬ−１０で処理されたＤＣ由来のエキソソームは免疫抑制性である
９．３．１  材料および方法
上で実施された実験は、Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣ由来のエキソソームが免疫抑制性であることを示唆するが、低レベルのＡｄ．ｖＩＬ−１０またはｖＩＬ−１０タンパク質がエキソソーム調製物に混入した可能性がある。アデノウイルスの感染またはｖＩＬ−１０タンパク質の混入が、観察された効果に寄与しなかったことを示すために、ＢＭ−ＤＣを、培養中で２４時間、１μｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−１０タンパク質で処理し、生成されたエキソソームを、実施例９に記載のようにＣ５７ＢＬ／６マウスの遅延型過敏性モデルを利用してｉｎ ｖｉｖｏで試験した（図１２Ｂ）。
【０１３５】
９．３．２  結果
組換えマウスＩＬ−１０で処理されたＤＣ由来のエキソソームは、抗原への曝露の４８時間後に強い免疫抑制効果を生じた。それは、処置された足において足膨大が６分の１に減少し、無処置の反対側の足では３分の１に減少したことによって実証される。総合すると、これらの結果は、マウスＩＬ−１０で処理されたＢＭＤＣ由来のエキソソームが、処置された足蹠および無処置の反対側の足蹠の両方においてＤＴＨを抑制でき、この効果のメカニズムとしてアデノウイルスの混入が実質的に除外されることを実証する。エキソソーム調製物中で、ＥＬＩＳＡによって組換えＩＬ−１０タンパク質が検出されなかったことに留意することも重要である。
【０１３６】
９．４  膜破壊はエキソソームの免疫抑制能を喪失させる
９．４．１  材料および方法
１００，０００×ｇ富化ペレット画分中に存在するエキソソームがＤＴＨモデルにおける治療効果の付与に重要であることを確認するために、無傷のエキソソーム粒子の有効性に関する必要条件を調べた。
【０１３７】
ＤＣまたはＡｄ．ルシフェラーゼもしくはＡｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣ由来のエキソソームを単離し、４サイクルの凍結／解凍に付した。５μｇの調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって分離し、Ｈｓｃ７０に関してブロットした。
【０１３８】
エキソソームがＤＴＨ応答の抑制に無傷の膜を必要とするかどうかを試験するために、Ａｄ−ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣ由来の１μｇの無傷または凍結／解凍エキソソームをＫＬＨ免疫マウスの一方の後肢の足蹠に注射して処置した（図１０Ｃ）。２４時間後、各足蹠をＫＬＨで追加免疫し、足蹠の膨大の程度を測定した。
【０１３９】
９．４．２  結果
４サイクルの凍結／解凍によってエキソソームの完全性が破壊されたことが電子顕微鏡観察によって実証された（図１３Ａ）。実際、可溶性のエキソソーム関連タンパク質Ｈｓｃ７０は凍結／解凍処理エキソソーム画分では検出されなかったが、無処理エキソソームには共存していた（図１３Ｂ）。
【０１４０】
無傷のｅｘｏ／ｖＩＬ−１０で処置された群では足蹠の膨大の減少が観察されたが、凍結／解凍処理ｅｘｏ／ｖＩＬ−１０を注射された群は、生理食塩水または対照ＤＣ由来のエキソソームで処置された対照群と同様に足膨大の減少を示さなかった。これらの結果は、複数サイクルの凍結／解凍によってエキソソームの膜構造が破壊され、それによってＤＴＨモデルにおけるエキソソームの免疫抑制能が失われたことを実証する。
【０１４１】
９．５  遅延型過敏性応答の抑制に必要とされるＭＨＣクラスＩＩ含有エキソソーム
以下のデータは、ＤＴＨ応答の抑制に関する、ＭＨＣクラスＩＩ陽性エキソソームを枯渇させることの影響を実証する。
【０１４２】
９．５．１  材料および方法
Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＢＭＤＣ由来のエキソソームを前処理のために４つのサンプルに分け、その後、感作済みマウスに注射した（図１４Ａ）。第一のエキソソームサンプルはマウスＭＨＣ ＩＩに特異的な常磁性ビーズであらかじめ吸収し（Ｅｘｏ／ｖＩＬ−１０（ＭＨＣ ＩＩ ＩＰ））、第二のサンプルは、ＤＣ由来のエキソソーム上に存在しない細胞表面分子であるＮＫ１．１に特異的な常磁性ビーズであらかじめ吸収した（Ｅｘｏ／ｖＩＬ−１０（ＩＰ対照））。第三のサンプルは複数サイクルの凍結／解凍に付し（Ｅｘｏ／ｖＩＬ−１０（Ｆ／Ｔ））、第四のサンプルは無処理のままにした。次いで、エキソソームサンプルをマウスの一方の後肢の足蹠に注射し、１２時間後、両後肢の足蹠においてＤＴＨによって誘発された足蹠の膨大を以後７２時間にわたって測定した。
【０１４３】
９．５．２  結果
対照ＤＣ由来のエキソソームは足蹠の膨大に関して効果を有さず、一方、Ａｄ．ｖＩＬ−１０／エキソソームは、注射された足蹠および無処置の反対側の足蹠の両方においてＤＴＨを劇的にブロックすることができた。ＮＫ１．１ビーズであらかじめ吸収したエキソソーム調製物は免疫抑制活性を示した。しかし、Ａｄ．ｖＩＬ−１０／エキソソームサンプルをクラスＩＩビーズであらかじめ吸収すると、ほぼ１００％のｉｎ ｖｉｖｏ活性が抑止された。重要なことに、クラスＩＩ陽性エキソソームが結合しているその常磁性ビーズそのものを注射すると、吸収していないＡｄ−ｖＩＬ−１０エキソソームの場合に観察される活性と同様の免疫抑制活性が得られた。組換えマウスＩＬ−１０タンパク質で処理されたＤＣ由来のエキソソームは、ＭＨＣ ＩＩ枯渇後のＤＴＨ応答の場合と同様の結果を示した（図１４Ｂ）。その結果は互いに合致していた。また、Ａｄ−ｖＩＬ−１０または組換えＩＬ−１０処理ＤＣ由来の両方のエキソソームにおいて複数回の凍結／解凍サイクルを経た製剤は活性を失っていた（図１３Ｃ）。これらのデータは、エキソソーム画分をマウスに投与した場合に観察されるｉｎ ｖｉｖｏの抗炎症性効果がＭＨＣクラスＩＩ依存的であることを示唆する。ＭＨＣクラスＩＩはエキソソーム表面に高レベルで存在するため、このことは、マウスで観察されるｉｎ ｖｉｖｏ活性がエキソソームに起因することを示唆する。さらにまた、小胞の完全性も必要とされるようである。また、これらのｉｎ ｖｉｖｏの抗炎症性効果は構造的に無傷のＭＨＣクラスＩＩ陽性エキソソームに特異的であるようであり、その効果のメカニズムとしてアデノウイルスの混入が実質的に除外される。
【０１４４】
９．６  ＩＬ−１０を提示するエキソソームはマウスのコラーゲン誘発関節炎を抑制できる
９．６．１  材料および方法
４℃で一晩撹拌することによって、ウシＩＩ型コラーゲン（Chondrex L.L.C., Redmond, WA）を０．０５Ｍ酢酸中に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、等容量のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中で乳化した。コラーゲン１００μｇを用いて尾のつけ根で皮内的にマウスを免疫した。初回免疫後の２１日目に、マウスにフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のＩＩ型コラーゲンの皮内追加免疫注射を行った。確立されている巨視的なスコア化システム（０〜４の範囲）によって１日おきにマウスをモニターした：０＝正常；１＝紅斑を伴う検出可能な関節炎；２＝顕著な膨大および潮紅；３＝関節から指にかけての重篤な膨大および潮紅；および４＝最大の膨大および強直症を伴う変形。巨視的スコアの平均をすべての足に関する累積値として表した。マウスあたりの最大限のスコアは１６である。また、バネ付きカリパスで各足の厚みを測定し、全４足の厚みを加算することによって各マウスの足膨大を算出した。群あたり１０匹のマウスを用いてｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施し、２回繰り返して再現性を確かめた。
【０１４５】
関節リウマチ（ＲＡ）は消耗性の自己免疫疾患であり、遠位可動（diarthroidial）関節の慢性炎症および軟骨組織の進行性の破壊を特徴とする。ＤＢＡ１／ｌａｃＪ（Ｈ−２ｋｑ）系統にウシＩＩ型コラーゲンを注射すると、関節において同様の病状ならびに炎症を誘発できる。ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームがコラーゲン誘発関節炎を治療する能力を調べるために、ＤＣをＡｄ−ｖＩＬ−１０に感染させ、その後、得られたエキソソームを、ウシＩＩ型コラーゲンで免疫されたＤＢＡ１マウスに静脈内注射した。２８日目に注射を実施し、その直後に疾患が発症した。
【０１４６】
９．６．２  結果
ＤＣ／ｖＩＬ−１０またはＤＣ／ｖＩＬ−１０由来のエキソソームのいずれかを１回注射することによって、関節炎の発症を遅延させ、かつその重症度を減少させることができたが、生理食塩水を注射された対照群では、疾患が通常通りに進行した（図１５）。この結果は、ＩＬ−１０を発現するＤＣ由来のエキソソームの１回の注射が、自己免疫性、炎症性疾患において全身性の治療効果を付与することができる遺伝子改変型ＤＣの注射に匹敵することを示す。
【０１４７】
疾患の予防研究におけるＤＣ由来のエキソソームの分析に加えて、確立したＣＩＡを有するマウスにおいてＤＣ−ＩＬ−１０由来のエキソソームを試験した。Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣまたは組換えＩＬ−１０で処理されたＤＣ由来のエキソソームを、確立した疾患を有するマウスに静脈内注射した（図１６Ａ−Ｃ）。ｅｘｏ−ＩＬ−１０処置群における疾患の抑制が予防研究で示された抑制より劣っていたとはいえ、Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣおよび組換えＩＬ−１０で処理されたＤＣ由来の両エキソソームは、確立した疾患の重症度を減少させることができた（図１６Ａ）。さらに、エキソソームを凍結／解凍処理すると治療効果が抑止され（図１６Ｂ）、一方、組換えＩＬ−１０を直接注射しても疾患の進行に影響はなかった（図１６Ｃ）。
【０１４８】
１０．  実施例：ＤＣ／ＩＬ−４由来のエキソソームは免疫抑制活性を有する
１０．１  ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４およびそれから調製されたエキソソームは遅延型過敏性応答を抑制する
膜結合型ＩＬ−４を保持するアデノウイルスベクター（Ａｄ．ｍｂｍＩＬ−４）または陰性対照ウイルス（Ａｄ．Ｐｓｉ５またはΨ５）のいずれかで樹状細胞をトランスフェクトした。これらのＤＣの一部分からエキソソームを調製した。次いで、本明細書中に記載のマウス足蹠ＤＴＨモデルにおいてＤＣおよびエキソソームを試験した。その結果は図１７に示される通りである。ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４およびＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４から調製されたエキソソームはともに、注射された足およびその反対側の足の両方においてＤＴＨ応答を抑制した。したがって、膜結合型ＩＬ−４の増強物質としての有効性が実証される。
【０１４９】
１０．２  ＤＣ／ｓｍＩＬ−４およびそれから調製されたエキソソームは遅延型過敏性応答を抑制する
可溶型ＩＬ−４を保持するアデノウイルスベクター（Ａｄ．ｓＩＬ−４）または陰性対照ウイルス（Ａｄ．Ｐｓｉ５またはΨ５）のいずれかで樹状細胞をトランスフェクトした。これらのＤＣの一部分からエキソソームを調製した。次いで、本明細書中に記載のマウス足蹠ＤＴＨモデルにおいてＤＣおよびエキソソームを試験した。その結果は図１８に示される通りである。ＤＣ／ｓｍＩＬ−４およびＤＣ／ｓｍＩＬ−４から調製されたエキソソームはともに、注射された足およびその反対側の足の両方においてＤＴＨ応答を抑制した。したがって、可溶性ＩＬ−４の増強物質としての有効性が実証される。
【０１５０】
１０．３  ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４およびそれから調製されたエキソソームならびにＤＣ／ＦａｓＬおよびそれから調製されたエキソソームは遅延型過敏性応答を阻害した
１０．３．１  材料および方法
ウイルスに感染していないか、あるいはＡｄ．ｅＧＦＰ対照ベクター、Ａｄ．ＦａｓＬまたは膜結合型ＩＬ−４を保持するアデノウイルスベクター（Ａｄ．ｍｂＩＬ−４）に感染させたＣ５７／ＢＬ６骨髄由来のＤＣからエキソソームを単離した。精製済みエキソソーム（１μｇの総タンパク質量）ならびに種々のＤＣ集団（５×１０５個の細胞）を、あらかじめＫＬＨに対して免疫されたマウスの右足蹠に注射した。エキソソームまたはＤＣの注射の２４時間後、左右後肢の足蹠にＫＬＨ抗原を注射し、処置された足蹠およびその反対側の左の足蹠の両方に関して４８時間にわたって膨大の程度を測定した。
【０１５１】
１０．３．２  結果
ＦａｓＬまたはＩＬ−４改変型ＤＣ由来のエキソソーム画分がＤＴＨ応答の阻害に有効であるかどうかを決定するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスからＤＣを単離し、アデノウイルスの感染によってＦａｓＬまたはＩＬ−４を発現するように遺伝子改変した。これらの実験では、ＩＬ−４に融合させたＣＤ２８の膜貫通領域を含有する膜結合型ＩＬ−４を使用した（ｍｂｍＩＬ−４）。次いで、ＤＣおよびエキソソーム画分を右の後肢の足蹠に注射し、その２４時間後に両後肢の足蹠に抗原を注射した。興味深いことに、ＤＣおよびＡｄ．ＦａｓＬおよびＡｄ．ｍｂｍＩＬ−４に感染させたＤＣ由来のエキソソーム画分はともに、処置された足だけでなく、反対側の足においても同様に、炎症反応を抑制することができた（図１９）。この結果は、エキソソームおよびその由来のＤＣが、抗原特異的である何らかのメカニズムによって、局所注射後に、全身性の免疫抑制を付与できることを示唆する。いかなる特定の理論にも拘束されないが、エキソソームは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、特異的抗原をプロセシングしている流入領域リンパ節の抗原提示細胞と相互作用し、その結果、抗原特異的な抑制が生じる可能性がある。
【０１５２】
１０．４  ＤＣ／ＩＬ−４由来のエキソソームはＦａｓＬおよびＦａｓを必要とする
野生型およびｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスからＤＣを単離し、可溶性（ｓｍＩＬ−４）または膜結合型（ｍｂｍＩＬ−４）マウスＩＬ−４のいずれかを発現するように改変した。ＤＣ集団およびＤＣ由来のエキソソームを、野生型またはｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）マウスのいずれかの足蹠に注射して戻し、足蹠に抗原を注射した後の足膨大に対する影響を測定した。
【０１５３】
ＤＣ／ＩＬ−４（膜結合型または可溶性のいずれか）から単離されたエキソソームは、ＤＴＨ応答を抑制するために、レシピエント中のＦａｓＬならびにＦａｓを必要とする（図２０）。
【０１５４】
１０．５  エキソソームの免疫抑制には同系性が必要とされる
図２１Ａ−Ｂに示されるように、同種異系ではなく、同系のＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４から調製されたエキソソームだけがマウス足蹠モデルにおいてＤＴＨ応答を抑制することが観察された。このことは、エキソソーム媒介性の免疫抑制におけるＭＨＣクラスＩＩ抗原の役割と合致する。
【０１５５】
１０．６  ＤＣ／ＩＬ−４由来のエキソソームはＢ７．１およびＢ７．２を必要とする
１０．６．１．  材料および方法
Ｂ７．１およびＢ７．２がともに欠損しているマウスからＤＣを単離し（ＫＯ）、対照（Ｐｓｉ−５）またはＩＬ−４発現性アデノウイルスベクターのいずれかに感染させた。種々のＤＣ集団からエキソソームを単離し、次いで、それ（１μｇのエキソソーム）をＫＬＨ免疫マウスの一方の足に注射した。注射された足ならびに無処置の足において足膨大の程度を測定した。
【０１５６】
１０．６．２  結果
図２２に示されるように、アデノウイルスによる遺伝子導入によってＩＬ−４を発現するように改変された野生型ＤＣ由来のエキソソームはＤＴＨ応答を抑制することができたが、Ｂ７．１／Ｂ７．２二重ＧＫＯ（「ＫＯ」）ＤＣ由来のエキソソームはＤＴＨ応答に対して影響しなかった。さらに、Ｂ７欠損ＤＣは、Ｂ７欠損ＤＣ由来のエキソソームの場合に観察された結果と同様に、ＤＴＨ応答に対して影響を有さなかった。Lohrら, 2003, Nature Immunol. 4:664によれば、糖尿病を抑制するためのＴ調節細胞の誘導に関して、Ｂ７に関する同様の必要条件が観察されている。
【０１５７】
さらに、免疫抑制性ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームがＣＤ４＋ＣＤ２５＋のＴ細胞の集団を刺激することが観察されており、この細胞集団は調節性Ｔ細胞集団である可能性がある。
【０１５８】
１０．７  ＤＣ／ＩＬ−４由来のエキソソームはコラーゲン誘発関節炎モデルの関節炎を改善させる
１０．７．１  材料および方法
擬感染、あるいはＡｄ．ｐｓｉ−５（対照）、Ａｄ．ｍＩＬ−４、またはＡｄ．ｍｂｍＩＬ−４のいずれかに感染させたＤＢＡ１骨髄由来のＤＣからエキソソームを単離した。次いで、疾患の発症後（３２日目）に、エキソソーム（１μｇの総タンパク質量）をＤＢＡ１マウスに静脈内注射した。１か月の期間にわたって各処置群の各足に関して関節炎の重症度をモニターした（スケール０〜４、最大スコア１６）。
【０１５９】
１０．７．２  結果
図２３に示されるように、ＤＣ／ＩＬ−４および特にＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４から調製されたエキソソームで処置すると、疾患の進行をブロックすることができた（３２日目には、すべての被験動物が疾患病態の徴候を示した）。一部の処置マウスは無疾患のようであった。
【０１６０】
１１．  免疫抑制活性の養子移入
図２４Ａ−Ｂに示されるように、エキソソームで処置されたマウス由来のＣＤ１１Ｃ細胞を養子移入するとＤＴＨ応答をブロックすることができた。このことは、ＣＤ１１Ｃ陽性細胞が免疫抑制性エキソソームによる調節に関する標的であることを実証する。
【０１６１】
１２．  糖尿病のマウスモデルにおけるエキソソーム媒介性の高血糖の抑制
１２．１  材料および方法
若いＮＯＤマウスの骨髄からＤＣを作成し、Ａｄ．ＩＬ−４に感染させるか、または感染させなかった。ＤＣ集団由来のエキソソームを単離し、１μｇのエキソソームを５〜６週齡のＮＯＤマウスに静脈内注射した。生理食塩水（sale）処置を対照として使用した。次いで、高血糖に関して動物をモニターした。
【０１６２】
１２．２  結果
ＣＩＡマウスモデルで観察された顕著な治療効果に基づいて、高血糖（hypoglycemia）の発症をブロックする活性に関して免疫抑制性ＤＣの能力を同様に試験した。ＩＬ−４を発現するように改変された、若いＮＯＤマウス（３〜４週齢）の骨髄由来のＤＣを静脈内注射すると、１０週齢で投与された場合に高血糖になるＮＯＤマウスの割合が減少することが観察された。さらに、ＮＦ−κＢインヒビター（二本鎖ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド）で処理されて、より未成熟なＤＣ表現型（低ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０）になったＮＯＤマウスの骨髄由来のＤＣで処置すると、ＮＯＤマウスの高血糖の発症を抑制できることが示された。これらの観察ならびにＣＩＡモデルでの結果と合致して、ＦａｓＬを発現するように遺伝子改変されたＤＣは、膵島炎の初期に投与された場合、ＮＯＤマウスの高血糖の発症を抑制することが示されている（J. Mountz）。ゆえに、ＩＬ−４またはＦａｓＬのいずれかを発現するように改変されているか、あるいはＮＦ−κＢインヒビターで処理された免疫抑制性ＤＣは、疾患を予防するか、または回復させることができる場合がある。
【０１６３】
図２５に示されるように、上記実験では、Ａｄ．Ｉｌ−４で形質導入されたＤＣ由来のエキソソームはＮＯＤマウスの高血糖の発症を遅延させ、ならびにその発症の頻度を減少させることができた。
【０１６４】
１３．  実施例：血清から調製されたエキソソーム
１３．１  血清を適用するとＤＴＨ応答が抑制される
１３．１．１  材料および方法
Ｃ５７ＢＬ６マウスをＫＬＨの皮内注射で免疫した。２週間後、マウスから血液を回収した。サンプルを１５００ｇで１０分間遠心分離して血清を単離した。合計で５０μｌの血清をＫＬＨ免疫マウスの後肢に注射し、その２４時間後に、両側後肢にＫＬＨ抗原を追加免疫注射した。ＫＬＨの追加免疫注射の４８時間後に足蹠の膨大を測定した。
【０１６５】
１３．１．２  結果
ビーズと２４時間インキュベートされた、未処置のマウス由来の血清を注射すると、生理食塩水処理対照と比較して、膨大のいくらかの減少が示された（図２６，群Ｉを参照のこと）。インキュベーションまたはビーズなしで、ＫＬＨ免疫マウス由来の血清を注射すると、生理食塩水対照と比較して、足蹠の膨大の最大の減少が示された（図２６，群ＩＩを参照のこと）。ヒトおよびマウスから単離できる血清の量に適切な小型のシリンジであるＭｉｎｉｋｉｎを用いてインキュベートされた場合およびそれを用いずにインキュベートされた場合の、ＫＬＨ免疫マウス由来の血清を注射すると、生理食塩水処理対照と比較して、膨大のいくらかの減少が示された（図２６，群ＩＩＩおよびＩＶを参照のこと）。
【０１６６】
１３．２  血清由来のエキソソームはＤＴＨ応答を抑制する
１３．２．１  材料および方法
ＫＬＨの皮内注射でマウスを免疫した。２週間後、マウスから血液を回収し、４時間氷冷した。サンプルを１５００ｇで１０分間遠心分離して血清を単離した。次いで、分画遠心法によってエキソソームを単離した。回収された血清を１５００ｇで２０分間および３０００ｇで３０分間遠心分離した。最終の遠心分離から得られた上清を、再度、超遠心機で１００，０００ｇで１時間遠心分離した。エキソソームペレットを生理食塩水で洗浄し、１００，０００ｇで１時間遠心分離し、生理食塩水に再懸濁した。
【０１６７】
５０マイクロリットルの生理食塩水中の１マイクログラムのエキソソームをＫＬＨ免疫マウスの後肢の足蹠に注射した。他方の後肢には、同一の量の生理食塩水を投与した。２４時間後、マウスの両後肢に、５０μｌの生理食塩水中の２０マイクログラムのＫＬＨ抗原を注射した。ＫＬＨの追加免疫注射の４８時間後に足蹠の膨大を測定した。
【０１６８】
簡潔には、各ＢＭＤＣ培養から回収された培養上清を、３００ｇ（５分）、１，２００ｇ（２０分）、および１０，０００ｇ（３０分）の３回の連続遠心分離に付して細胞および残渣を取り除き、その後、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。過剰の血清タンパク質を除去するために、エキソソームペレットを大容量のＰＢＳで洗浄し、１００，０００ｇで１時間遠心分離し、最終的に、以後の研究のために１２０μｌのＰＢＳに再懸濁した。
【０１６９】
微小胞を得るために、血清を３，０００ｇ（２０分）および１０，０００ｇ（３０分）で遠心し、ペレットを生理食塩水に再懸濁した。エキソソームペレットを取り出す超遠心後に血清の上清を得た。その上清は以後の遠心分離の対象とはしなかった。
【０１７０】
１３．２．２  結果
ＫＬＨ免疫マウス由来の血清の微小胞、血清のエキソソーム、および全血清を投与すると、生理食塩水処理対照または未処置のマウス由来の血清をＤＴＨマウスに投与した場合と比較して、膨大の減少が生じる（図２７）。エキソソームは膨大の最大の減少を生じ、全血清の使用よりも顕著に大きな減少を示した（図２７，群ＩＩ）。ＫＬＨ免疫マウス由来の血清のエキソソームは、ＫＬＨ免疫マウス由来の上清、凍結／解凍済みエキソソーム、および超音波処理エキソソームより大幅な膨大の減少を生じさせ、非免疫マウス由来の上清およびエキソソームならびに生理食塩水処理対照より非常に大幅な減少を生じさせた（図２８）。群ＶＩＩは非免疫マウス由来の全血清で処置されている。群ＶＩＩＩは生理食塩水で処置された対照群である。ＫＬＨ免疫マウス由来の血清のエキソソームを投与すると、ＯＶＡ免疫マウス由来の血清のエキソソームより非常に大幅な膨大の減少が示された（図２９）。
【０１７１】
１３．３  血清由来のエキソソームは、抗原特異的、ＭＨＣクラスＩＩ依存的様式で遅延型過敏性応答を抑制する
図３０は、マウス血清から精製されたエキソソームを示す電子顕微鏡写真である。図３１は、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体を保持するビーズで標識された血清由来のエキソソームのＦＡＣＳ解析である。留意すべきは、すべてのクラスＩＩ陽性エキソソームがＣＤ１７８（ＦａｓＬ）に関して陽性であると見出されたことである。
【０１７２】
図３２に示されるように、ＫＬＨに対して免疫されたマウスの血清から調製されたエキソソームはＫＬＨに対するＤＬＨの抑制に有効であったが、未処置のマウスの血清から調製されたエキソソームはそうではなかった。このことは抗原特異性を例証する。図３３は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原を保持するエキソソームに関して枯渇させた血清由来のエキソソーム調製物がほぼすべての免疫抑制活性を失ったことを実証し、このことは血清由来のエキソソームのＭＨＣクラスＩ依存性を例証する。図３４は、血清由来のエキソソームの免疫抑制効果が抗原での免疫の１４日後にピークに達することを例証する。
【０１７３】
１４．  実施例：血清から調製されたエキソソームはヒト被験体において免疫抑制性である
１４．１  インターロイキン−１受容体アンタゴニストでコンディショニングされた血清（ＯＲＴＨＯＫＩＮＥ（登録商標））は腰部神経根痛を減少させる
無作為、二重盲検臨床試験を実施して、８４患者の腰部神経根痛（lumbar radicular pain）の減少に関して、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストでコンディショニングされた血清の効果を評価した。データは、痛みの感覚を減少させるために、前記コンディショニングされた血清由来のエキソソームを使用し得ることを示す。
【０１７４】
１４．１．１  材料および方法
ビーズ調製：マイクロタイタープレート（２４および４８ウェル, Nunc, Denmark）または６０ｍｌシリンジ（Perfusor Syringes, Becton Dickinson, USA）中で血液をインキュベートした。シリンジは２００個のガラスビーズを含有していた。ガラスビーズは、直径が２．５ｍｍであり、２１ｍｍ２の表面積を有し、医療用グレードであった。滅菌再蒸留水でビーズを洗浄し、その伝導率が０．３μＳ未満になるようにした（Hanna Instruments, USA）。５０％ｖ／ｖ ＣｒＳＯ４（Merck, Germany）中で５分間インキュベートすることによってビーズの表面を処理した。次いで、ビーズを繰り返し洗浄して、そのｐＨが、水洗に使用された蒸留水のｐＨと同一になり、かつその伝導率が０．３μＳ未満になるようにした（Hanna Instruments, USA）。マイクロタイタープレートまたはシリンジにビーズを詰め、オートクレーブまたはガンマ線照射のいずれかによって滅菌した。
【０１７５】
血液培養技術：すべての実験で、ビーズが詰まった容器（マイクロタイタープレートまたは６０ｍｌシリンジ）に、２０〜５０歳の範囲の健康な男性または女性のドナーから新たに採取されたヒト全血を充填した。特に記載しない限り、抗凝固剤を使用しなかった。全血培養を滅菌層流条件下で確立した（Kendro, Germany）。インキュベーションは、２４時間間隔で、３７℃、５％ＣＯ２で無菌的に実行した（Kendro, Germany）。インキュベーション後、血清を回収し、遠心分離した（３５００ｒｐｍ，１０分間, Megafuge, Kendro, Germany）。マイクロタイタープレート２００ｍｌおよびシリンジ１０ｍｌから血清を回収した。それは元の総血液量の約２０％に相当する。その血清を−２０℃で保存した。その血清は、増加したレベルのインターロイキン−１−受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ならびに増加したレベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０を含有することが以前に示されている（Meierら, Inflam Res. 52:1-4 (2003)）。その血清は商業的にＯｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）としても知られている。
【０１７６】
患者に硬膜外神経周囲注射を週に１回で３度施した。客観的および主観的評価を患者１人につき６回（ｔ１〜ｔ６）行った。その評価には、視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）（Joyceら, Eur J Clin Pharmacol. 14:415-20 (1975)）、Ｏｓｗｅｓｔｒｙ疼痛質問表（Oswestry Pain Questionnaire）（Fairbankら Spine, 25:2940-2953(2000)）、ＳＦ−３６（略式健康調査）（Wareら, Med. Care, 30:473-483 (1992)）、および標準化された問診が含まれる。２ｍｌのＯｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）を注射した。一群にＩＬ１−Ｒａコンディショニング血清（Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標））を投与し、別の群にはトリアムシノロン１０ｍｇを投与し、最後の群にはトリアムシノロン５ｍｇを投与した。トリアムシノロンは、炎症、アレルギー、関節炎、および喘息を処置するために一般に使用されるステロイドである。トリアムシノロンは腰部神経根痛の減少に有効であることが示されている（無作為二重盲検試験, Kramer Eur Spine 1997）。
【０１７７】
１４．１．２  結果
各注射後に痛みの顕著な減少（ＶＡＳ）が生じた（ｐ＜０．０１）。Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）およびＴｒｉａｍ群の間には有意差があった（ｐ＜．００１）。Ｔｒｉａｍ群では６週間後（ｔ４）に痛みが増加するが、Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ群では減少が持続する（図３６）。Ｔｒｉａｍ ５ｍｇおよび１０ｍｇの間には有意差が無かった。ＳＥＳａｆｆ（感情的疼痛尺度：Affective Pain Scale）に関して、ｔ１およびｔ４の間で顕著な減少が認められたが、群間では差異がなかった（図３７）。ＳＥＳｓｅｎｓ（感覚的疼痛尺度：Sensitive Pain Scale）に関して、ｔ１およびｔ４の間で顕著な減少が認められたが、群間では差異がなかった（図３８）。Ｏｓｗｅｓｔｒｙスコアに関して、ｔ１およびｔ４の間で顕著な減少が認められたが、群間では差異がなかった（図３９）。３群のいずれにおいても顕著な有害影響は観察されなかった。
【０１７８】
Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）群で観察された結果は、低および高トリアムシノロン群に関する観察結果より非常に良好であった。
【０１７９】
１４．２  ＯＲＴＨＯＫＩＮＥ（登録商標）血清はエキソソームを含有する
１４．２．１  材料および方法
実施例１６に記載のように血清の調製物からエキソソーム画分を調製した。ヒト血液から血清を単離した。分画遠心法によって血清からエキソソームを富化し、Ｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコーティンググリッドに載せ、中性１％水性リンタングステン酸１０μｌでネガティブ染色し、ＪＥＯＬ−１２１０コンピュータ制御高コントラスト１２０ｋｖ透過型電子顕微鏡を使用して観察した。
【０１８０】
１４．２．２  結果
図４０Ａ〜Ｃは、富化Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清中のエキソソームの存在を明らかに示す。
【０１８１】
１４．３  ＯＲＴＨＯＫＩＮＥ（登録商標）血清からの濃縮エキソソームの調製
特殊表面処理を施したシリンジ（Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）シリンジ）中で全血をインキュベートすることによってエキソソームを生成した。細胞は６〜２４時間にわたって小胞体から小胞を排出させた。全血１ｍｌあたりＩＬ−１ｒａ（ＩＲＡＰ）５μｇを加えることによってこの過程を促進することができた（下記実施例Ａ〜Ｄ）。実施例Ａ〜Ｄでは、インキュベーション後に、５０００ｇで１０分間の遠心分離によって血液細胞から血清を分離した。そして、その血清は種々の量のエキソソームを含有していた。１００，０００ｇで１時間の２回目の遠心分離によって小胞の濃縮を実施した。遠心分離後に２０ｍｌの血清由来の約１ｍｌ容量のペレットを遠心バイアルの底から回収し、濾過（０．２μＭフィルターを通して）し、ねじ口バイアルに入れた。そのエキソソーム溶液１ｍｌを、後に患者に注射した。１回の注射として、高用量（例えば１ｍｌ量の濃縮エキソソーム５本分）を投与した事例もある。
【０１８２】
１４．４  濃縮エキソソームでのヒト被験体の処置
１４．４．１  実施例Ａ
エキソソーム処置前の症状：被験体は２２歳の男性であり、若年性関節リウマチ（仙腸骨炎、股関節炎、膝関節炎を伴うオリゴ−ＩＩ型、ＨＬＡ−Ｂ２７陽性）を約１０年間患っていた。患者は、ＭＴＸ １０ｍｇ／週およびデコルチン（decortin）５ｍｇ／週で処置されていたが、右膝の激しい痛みおよび膨大を患い続けており；被験体の腫脹した関節にステロイドを注射しても改善は生じなかった。
【０１８３】
エキソソーム処置前の検査時には、被験体は９０／６０ｍｍＨｇの血圧および肩運動の低下を示し、外転は５０度であった。両膝は極度に腫脹し、伸展障害（extension deficit）は１０度であった。被験体の膝のＸ線研究では、滲出液が認められたが、顕著な軟骨破壊は認められず、被験体の臀部のＸ線研究では、臀部関節形成術の適用を伴うレベルＩＶの軟骨破壊が示された。血液検査では、ＣＲＰ ９．９ｍｇ／ｄｌ；ＢＳＲ ５９；ＲＦ、ＣＣＰ−ＡＫおよびＡＮＡ陰性が示された。１１．３の貧血、および血小板５１１ ０００μｌであった。
【０１８４】
まとめると、被験体は慣用の治療に不応性の重い若年性関節炎の臨床徴候を示した。
【０１８５】
エキソソーム処置．上の１４．３に記載のように自家末梢血からエキソソームを調製した。右膝が非常に痛みを伴い、腫脹し、主要な罹患関節であったため、右膝関節に注射することを決定した。治療目標は、右膝の膨大および痛みを減少させること、および罹患した他の関節で治療効果を有することであった。２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームの、右膝への関節内注射を合併症なく実施した。
【０１８６】
注射の４週間後、両膝で痛みの１００％の減少が認められ、ＷＯＭＡＣスコアは両膝で顕著に減少し、両肩で痛みの１００％の減少が認められた。ＣＲＰレベルは６ｍｇ／ｄｌに減少し、右膝の膨大は処置前の値と比較して３ｃｍ減少した。患者はその転帰に非常に満足した。
【０１８７】
濃縮エキソソームの最初の注射の９週間後、２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームの２回目の注射を右膝に行い、２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームを左肩および左膝の各々に関節内注射した。右膝は１００％の改善を示すことが見出され、左膝は７０％の改善を示し、肩は８０％の改善を示した。
【０１８８】
２回目の注射の４週間後（最初の注射の１３週間後）、さらに濃縮エキソソーム処置を行った。
【０１８９】
処置後、患者の若年性関節リウマチは寛解状態であり、それは無関係のリウマチ専門医の評価によって確認された。ゆえに、濃縮エキソソーム治療は、その疾患過程の改善を得るためにＭＴＸおよびステロイドより有効であるようであった。
【０１９０】
１４．４．２  実施例Ｂ
エキソソーム処置前の症状：被験体は６５歳の男性であり、血清反応陽性関節リウマチを１０年間患っていた。被験体の母親もその疾患に罹患していた。被験体は激しい膝痛を訴え、Ｋｅｌｌｇｒｅｅｎの軟骨変性度（cartilage degradation grade）ＩＩＩ−ＩＶを示した。検査では、ＭＣＰで痛みを伴う手関節、肩運動の痛みを伴う低下、左膝からの滲出液、および両側の臀部内旋（inner rotation）の低下が示された。血液検査では、ＳＲ ２８／６５；ＣＲＰ ０．８ｍｇ／ｍｌ；ＲＦ ２１１Ｕ／ｍｌ；ＡＮＡ陰性，白血球７９００，血小板３５３ ０００が示された。Ｘ線研究では、手のＲＡ段階ＩＩ、および膝段階ＩＩＩ−ＩＶが示された。被験体は金治療で処置されていて、その治療はエキソソーム治療中も継続された。
【０１９１】
エキソソーム処置：１４．３に記載のように自家末梢血からエキソソームを調製した。各々が２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームで注射された両膝の関節内注射は合併症がなく、有害な副作用はなかった。
【０１９２】
注射の４週間後、患者を再検査し、全観察期間で非常に良好に処置を許容していることが見出された。患者は、処置前の値と比較して９８％の症状の改善を示した。ＷＯＭＡＣスコアは非常に顕著で良好な転帰の尺度（５０〜８０％）を示した。処置前の値と比較して膨大は完全に消失し、エキソソーム処置後に関節の直径が２ｃｍ減少した。
【０１９３】
４週間後、エキソソーム処置前の症状と比較して、左膝では改善の約５０％の、右膝では約３０％の痛みの再発が認められた。両膝の各々に２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームの２回目の関節内注射を実行した。２週間後、両膝の各々に２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームの３回目のエキソソーム注射を実行し、濃縮エキソソーム処置の痛みの症状と比較して、両膝においてこの時点で７０％の改善が見られた。
【０１９４】
２か月後、患者は、エキソソーム治療前の症状と比較して、両膝で８０％の痛みの改善を示した。ＷＯＭＡＣスコアは、継続して、処置前の値と比べて顕著に改善された。
【０１９５】
１４．４．３  実施例Ｃ．
エキソソーム処置前の症状：患者は２０歳の女性であり、膝の拘縮を伴う若年性スチール病（Morbus Still）（８年間認知）、両側臀部内部置換（endoprotheses）、両側外側膝軟骨変性、骨粗鬆症および心膜心筋炎を有していた。患者は長期間のステロイド治療を受けており、患者の疾患は、抗ＴＮＦ、ステロイド、ＭＴＸ、およびそれらの組み合わせなどの治療には不応性であるとみなされた。血液検査では、ＣＲＰ ２０ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＲ ９８、およびすべての他のパラメーターの重篤な免疫欠如の知見；２２９００／ｎｌの白血球増加（Leucocytois）、５６０ ０００／ｎｌの血小板増加が示された。被験体は有効性の欠如を理由に以前の治療を中断することに決めた。半年間、血液パラメータは基本的に不変のままであった。ＣＲＰ値は１２．３〜１１．５ｍｇ／ｍｌの範囲であり、白血球増加は２２ ３００／ｎｌであった。濃縮エキソソーム治療中、他の化学治療は施さなかった。
【０１９６】
エキソソーム処置．１４．３に記載のように自家末梢血からエキソソームを調製した。両膝の各々に２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームの関節内注射を合併症なく実行した。
【０１９７】
２週間後、両肩の各々に２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームを合併症なく関節内注射した。
【０１９８】
最初の注射の４週間後、患者は、処置前の値と比較して、左肩の痛みの１００％改善、右肩の痛みの７０％改善、および両膝の痛みの１００％改善を示した。
【０１９９】
最初の注射の８週間後、２０ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された１ｍｌの濃縮エキソソームを右肩に関節内注射した。
【０２００】
最初の注射の１５週間後、ＣＲＰは１２．３ｍｇ／ｍｌから８．３ｍｇ／ｍｌに減少していて、被験体は、膝が８０％良好であり、肩が約６０％良好であると報告した。
【０２０１】
最初の注射の１６週間後、濃縮エキソソームを両膝に関節内注射した。被験体は膝および肩の８０％改善を報告し、他の関節でも同様に５０％を超える改善が認められることを述べた。患者は、濃縮エキソソーム処置後の改善を考慮して、慣用の治療を再開する意思はないことを示した。
【０２０２】
エキソソームの最初の注射の７か月後、患者が有益な臨床効果のいくらかの減退を経験したため、エキソソームの用量を６倍に増量することを決定した。この時点で、ＣＲＰは８．６ｍｇ／ｍｌであり、白血球は２２ ５００／ｎｌであった。高用量のエキソソーム、すなわち１００ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された５ｍｌの濃縮エキソソームを両肩の各々に関節内注射した。
【０２０３】
１週間後、患者は高用量のエキソソームの注射前と比べて８０％改善を示すことが見出され、肩運動は外転について約３０度改善し；膝および手は５０％改善した。高用量の注射は肩に施されたにも関わらず、ＷＯＭＡＣスコアは膝に関して５０％を超える劇的な改善を示した。ＣＲＰは７．２ｍｇ／ｄｌに減少し、白血球は１８ ８００／ｍｌに減少した。
【０２０４】
１４．４．４  実施例Ｄ．
エキソソーム処置前の症状：患者は４９歳であり、１８年の病歴の花粉症および草および花粉に対する実証済みのアレルギーを有していた。
【０２０５】
エキソソーム処置．１４．３に記載のように自家末梢血からエキソソームを調製した。１００ｍｌのコンディショニング済み血清から調製された５ｍｌの濃縮エキソソームを皮下注射によって投与したところ、２週間後、花粉症の症状、例えばくしゃみならびに眼および鼻の炎症が顕著に減少した。くしゃみの頻度は１２４回／日から０回／日に減少した。その効果は花粉症の季節を通して持続した。処置によっていかなる有害な副作用も生じなかった。
【０２０６】
１４．５  ＯＲＴＨＯＫＩＮＥ（登録商標）血清を使用する別の臨床研究
上記セクション１４．１およびMeierら, Inflam Res. 52:1-4 (2003)に記載のように血清を調製した。これらの患者シリーズでは、追加の外的ＩＬ−１ｒａを使用せず、エキソソームを濃縮するための１００ ０００ｇの遠心分離ステップを実施しなかった。したがって、低濃縮のエキソソーム集団に加えて、自家サイトカインおよび成長因子が存在する。
【０２０７】
関節リウマチおよび手の関節変化を有し、慣用の治療で以前に処置されているか、あるいは以前には無処置の５６人の患者を、種々の罹患ＲＡ関節にＯｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清を週２回で４〜６回注射して（２ｍｌ／注射）処置した。臨床追跡は４年まで継続した。平均の痛みの改善は、処置前の値と比較して、３か月後に６５．３１％ＳＥ ７．００であった。応答者の割合は６８．８％であった。応答者とは、これらの患者が、３か月後に、注射前の値と比較して、罹患した関節で少なくとも５０％の痛みの改善を有したことを示す。平均では、これらの値は処置後の時間に応じて減少した。罹患した関節にステロイドをさらに同時注射しても、Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清の注射と比較して、３か月の結果に対する、有益な、統計学的に有意な影響はなかった。副作用は生じなかった。
【０２０８】
本発明の範囲は、本明細書中に記載の具体的な実施形態によって限定されるべきではない。事実、前記説明および添付の図面から、本明細書中に記載の改変に加えて本発明の種々の改変が当業者に自明になるであろう。そのような改変は特許請求の範囲内に入るものとする。
【０２０９】
本明細書中では種々の刊行物が引用されているが、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１Ａ】マウスＢＭ−ＤＣ由来のエキソソームの全載透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を示す。バー＝２００ｎｍ。
【図１Ｂ】いくつかのエキソソーム関連タンパク質の存在に関するエキソソームおよびＢＭＤＣライセートのウエスタンブロット解析を示す。
【図１Ｃ】ＭＨＣ ＩおよびＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現に関する、マウスＤＣ由来のエキソソームおよびＤＣのフローサイトメトリーによる分析を示す。
【図２】骨髄樹状細胞（「ＢＭＤＣ」）由来のエキソソームの蛍光活性化セルソーティング（「ＦＡＣＳ」）による特性決定を示す。
【図３】ＤＣ由来のエキソソームのｉｎ ｖｉｖｏでの輸送について示す。ＰＫＨ６７標識エキソソームのＩＶ注射６時間後、（Ａ）ＭＯＭＡ−１＋および（Ｂ）ＥＲ−ＴＲ９＋のマクロファージおよび（Ｃ）ＣＤ１１ｃ＋のＤＣが、脾臓において、エキソソームを内部に取り込んでいることが示された。（Ｄ）種々の時点でのＣＤ８−αおよびＰＫＨ６７に関するＦＡＣＳによって評価された脾臓ＤＣのサブセットによる標識エキソソームの取り込み。
【図４Ａ】マウス骨髄ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームのフローサイトメトリーによる分析を示す。この場合、精製済みエキソソームはＡｄ．対照およびＡｄ．ＦａｓＬで形質導入された骨髄ＤＣ由来である。
【図４Ｂ】ＦａｓＬの発現を示すＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームのウエスタンブロットを示す。
【図４Ｃ】ＤＣ由来のエキソソームの画分の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図５】ＦａｓＬを保持するＤＣおよびエキソソームで処置されたマウス足蹠における遅延型過敏性（ＤＴＨ）の抑制を実証する棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図６】同種異系エキソソームおよびＤＣと比較して、同系エキソソームおよびＤＣを使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を実証する棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図７Ａ】Ａｄ．Ψ５またはＡｄ．ＦａｓＬに感染させたエキソソームおよびＤＣを野生型およびＭＨＣ Ｉ欠損マウスに注射して使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ応答を実証する棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図７Ｂ】Ａｄ．Ψ５またはＡｄ．ＦａｓＬに感染させたエキソソームおよびＤＣを野生型またはＭＨＣ ＩＩ欠損マウスに注射して使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ応答を実証する棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図８】免疫抑制性エキソソームの抗原特異性を実証する棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図９】（Ａ）ＤＣおよびＤＣ由来のエキソソームのＤＴＨ−抑制効果を比較する棒グラフである。ＤＣおよびエキソソームは、野生型またはｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスのいずれかから調製され、対照アデノウイルス（ｐｓｉ５）またはＦａｓＬを発現するアデノウイルス（ＦａｓＬ）のいずれかに感染させ、前もってＫＬＨで免疫された野生型マウスの足蹠に注射して戻し、その１２時間後、足蹠にＫＬＨを注射した。（Ｂ）野生型と比較して、ｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）マウスに注射して戻された、（Ａ）と同様に調製されたエキソソームのＤＴＨ抑制効果を示す棒グラフである。
【図１０Ａ】マウスのコラーゲン誘発関節炎モデルに注射されたＦａｓＬ発現ＤＣについての疾患進行の抑制を実証するグラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図１０Ｂ】マウスのコラーゲン誘発関節炎モデルに注射されたＦａｓＬ提示エキソソームについての疾患進行の抑制を実証するグラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図１１Ａ】リンパ球混合培養反応（ＭＬＲ）でのｖＩＬ−１０発現ＤＣの添加によるＴ細胞増殖の抑制を実証するグラフである。
【図１１Ｂ】リンパ球混合培養反応での、Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたＤＣから単離されたエキソソームの添加によるＴ細胞増殖の抑制を実証するグラフである。
【図１２Ａ】Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＤＣおよび該ＤＣ／ｖＩＬ−１０由来エキソソームを使用した場合のマウス足蹠のＤＴＨ応答の抑制を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】組換えマウスＩＬ−１０で処理されたＢＭＤＣおよび組換えマウスＩＬ−１０で処理されたＤＣ由来のエキソソームを使用した場合のマウス足蹠のＤＴＨ反応の抑制を示す棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図１３Ａ】Ａｄ−ｖＩＬ−１０で形質導入されたＢＭ−ＤＣ由来の無処理または凍結／解凍エキソソームの全載透過型電子顕微鏡写真である。
【図１３Ｂ】Ａｄ．ｖＩＬ−１０で形質導入されたＢＭ−ＤＣ由来の無処理または凍結／解凍エキソソーム調製物についての、Ｈｓｃ７０の存在を検出するウエスタンブロットである。
【図１３Ｃ】Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたＤＣから単離された膜破壊エキソソームがＤＴＨ反応を抑制できないことを実証する棒グラフである。
【図１４Ａ】Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたＤＣから単離されたＭＨＣ ＩＩ枯渇エキソソームの免疫抑制効果を実証する棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図１４Ｂ】組換えＩＬ−１０で処理されたＤＣから単離されたＭＨＣ ＩＩ枯渇エキソソームの免疫抑制効果を実証する棒グラフである。「＊」はｐ＜０．０１での有意性を示す。
【図１５】マウスのコラーゲン誘発関節炎モデルに注射されたｖＩＬ−１０発現ＤＣについての疾患進行の抑制を実証するグラフである。
【図１６】確立したコラーゲン誘発関節炎モデルにおけるＤＣ／ＩＬ−１０由来エキソソームの治療効果についての分析を示す。（Ａ）Ａｄ．ｖＩＬ−１０に感染させたか、あるいは組換えマウスＩＬ−１０でパルスしたＤＢＡ１マウス骨髄ＤＣからエキソソームを単離し、確立したＣＩＡを有するマウスに投与した。（Ｂ）組換えＩＬ−１０でパルスしたＤＣ由来のエキソソームを２群に分け、その一方を３サイクルの凍結・解凍に付して膜を破壊し、その後、確立したＣＩＡを有するマウスに投与した。（Ｃ）確立されたＣＩＡマウスにおいて、組換えマウスＩＬ−１０の直接注射と比較して、ＤＣ／ｒｍＩＬ−１０由来のエキソソームを試験した。Ａ〜Ｃで、２８日目にウシＩＩ型コラーゲンで免疫し、ＬＰＳを投与したＤＢＡ１マウスに、３２日目（矢印によって示す）に精製済みエキソソームを静脈内注射した。確立されている巨視的なスコア化システムによってマウスを定期的にモニターした。そのスコア化システムは、すべての足に関する累積値で表され、最大限のスコアは１６である。
【図１７】マウスＤＴＨモデルにおける足蹠の膨大の増加を示す。この場合、処置対象の足蹠には、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４から調製されたエキソソーム、ＤＣ／Ｐｓｉ５（対照）、ＤＣ／Ｐｓｉ５から調製されたエキソソーム（対照）、または生理食塩水（対照）を注射した。
【図１８】マウスＤＴＨモデルにおける足蹠の膨大の増加を示す。この場合、処置対象の足蹠には、ＤＣ／ｓｍＩＬ−４、ＤＣ／ｓｍＩＬ−４から調製されたエキソソーム、ＤＣ／Ｐｓｉ５（対照）、ＤＣ／Ｐｓｉ５から調製されたエキソソーム（対照）、または生理食塩水（対照）を注射した。
【図１９】マウスＤＴＨモデルにおける足蹠の膨大の増加を示す。この場合、処置対象の足蹠には、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４、ＤＣ／ｍｂｍＩＬ−４から調製されたエキソソーム、ＤＣ／ＦａｓＬ、ＤＣ／ＦａｓＬから調製されたエキソソーム、ＤＣ／Ｐｓｉ５（対照）、またはＤＣ／Ｐｓｉ５から調製されたエキソソーム（対照）を注射した。
【図２０】野生型またはｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）マウスのいずれかのマウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加を示す。この場合、野生型またはｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスのいずれかから回収されたＤＣから調製され、可溶性（ｓｍＩＬ−４）または膜結合型（ｍｂｍＩＬ−４）ＩＬ−４のいずれかを発現するように改変されたエキソソームを注射した。
【図２１】（Ａ）同系または（Ｂ）同種異系マウスのいずれか由来の、膜結合型ＩＬ−４で増強されたＤＣのいずれかから調製されたエキソソームを注射した後のマウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加を示す。
【図２２】マウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加を示す棒グラフである。この場合、野生型またはＢ７．１およびＢ７．２欠損（ＫＯ）マウスのいずれかの処置対象の足（黒色バー）には、Ａｄ．Ｐｓｉ５またはＩＬ−４遺伝子を有するアデノウイルスベクターのいずれかで処理されたＤＣから調製されたエキソソームを注射した。無処置の足のサイズは白抜きのバーによって表される。
【図２３】Ａｄ．ｐｓｉ＝５（対照）、Ａｄ．ｍＩＬ−４、またはＡｄ．ｍｂｍＩＬ−４のいずれかに感染させたＤＣから調製したエキソソームで処置されたＣＩＡモデルマウスの関節炎指数を示すグラフである。
【図２４】（Ａ）ＤＣ／ＩＬ−４由来のエキソソームで最初に処置されたマウスまたは（Ｂ）最初の被験体由来のＣＤ１１Ｃを投与されたマウスにおけるＤＴＨ反応を示す。
【図２５】生理食塩水、無処理のＤＣ由来のエキソソーム、またはＤＣ／ＩＬ−４から調製されたエキソソームのいずれかで処置されたマウスにおける高血糖の発生を示すグラフである。
【図２６】無処理の全血清およびビーズで処理された全血清をＤＴＨモデルのマウスに投与した４８時間後の足蹠の膨大を示す棒グラフである。
【図２７】ＫＬＨ免疫マウス由来の血清、微小胞、およびエキソソームを使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を示す棒グラフである。
【図２８】種々の血清画分を使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を示す棒グラフである。この場合、追加免疫の４８時間後に膨大を測定した。
【図２９】種々の血清画分を使用した場合のマウス足蹠におけるＤＴＨ抑制を示す棒グラフである。この場合、ＫＬＨおよびＯＶＡ免疫マウスから血清を分離し、追加免疫の４８時間後に膨大を測定した。
【図３０】マウス血清から単離されたエキソソームの電子顕微鏡写真である。
【図３１】抗ＭＨＣクラスＩＩを保持するビーズで標識された血清由来のエキソソームのＦＡＣＳ解析を示す。
【図３２】マウスＤＴＨモデル（この場合のＤＴＨはＫＬＨに対するものである）における足膨大の増加を示す棒グラフである。この場合、処置対象の足には、（ａ）ＫＬＨ免疫マウスの血清から回収されたエキソソーム（群Ｉ）、（ｂ）無処置のマウスの血清から回収されたエキソソーム（群ＩＩ）、または（ｃ）生理食塩水（群ＩＩＩ）のいずれかを注射した。処置された足は黒色のバーで表され、反対側の足は白抜きのバーで表される。
【図３３】マウスＤＴＨモデル（この場合のＤＴＨはＫＬＨに対するものである）における足膨大の増加を示す棒グラフである。この場合、処置対象の足には、（ａ）ＫＬＨ免疫マウスの血清から回収されたエキソソーム；（ｂ）ＫＬＨ免疫マウスの血清から回収され、抗ＭＨＣＩＩ抗体であらかじめ吸収した（preabsorbed）エキソソーム；（ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ陽性のＫＬＨ免疫マウスの血清から回収されたエキソソーム；（ｄ）抗ＩｇＧ抗体であらかじめ吸収したエキソソーム枯渇対照；または（ｅ）生理食塩水のいずれかを注射した。
【図３４】マウスＤＴＨモデルにおける足膨大の増加を示す棒グラフである。この場合、（ａ）ＦａｓＬ欠損ｇｌｄ（ＦａｓＬ−／−）マウスの血清由来のエキソソームを野生型レシピエントに投与；（ｂ）野生型マウスの血清由来のエキソソームを野生型レシピエントに投与；（ｃ）ｇｌｄマウスの血清由来のエキソソームをｌｐｒ（Ｆａｓ−／−）レシピエントに投与；（ｄ）野生型マウスの血清由来のエキソソームをｌｐｒレシピエントに投与；または（ｅ）対照として生理食塩水を投与した。
【図３５】血清由来のエキソソームで処置されたマウスＤＴＨモデルにおける足膨大のＤＴＨ増加を示す棒グラフである。エキソソームは、エキソソームドナー動物を免疫した１４日後に回収し、レシピエント動物を免疫した１４日後に投与した。
【図３６】３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の６時点で測定されたＶＡＳにおける痛みを示すグラフである。
【図３７】３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の６時点で測定されたＳＥＳａｆｆ（感情的疼痛尺度：Affective Pain Scale）における痛みを示すグラフである。
【図３８】３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の６時点で測定されたＳＥＳｓｅｎｓ（感覚的疼痛尺度：Sensitive Pain Scale）における痛みを示すグラフである。
【図３９】３群：Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清および２群のＴｒｉａｍに関する注射後の４時点で測定されたＯｓｗｅｓｔｒｙスコアにおける痛みを示すグラフである。
【図４０Ａ−Ｃ】Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清由来のエキソソーム濃縮画分の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である（（Ｂ）は濾過済みの血清から作成されたイメージである）。
【図４０Ｄ−Ｆ】Ｏｒｔｈｏｋｉｎｅ（登録商標）血清由来のエキソソーム濃縮画分の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。
【図１Ａ】
2008505104.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2008505104.tif 000006
【図２】
2008505104.tif 000007
【図３】
2008505104.tif 000008
【図４Ａ】
2008505104.tif 000009
【図４Ｂ】
2008505104.tif 000010
【図４Ｃ】
2008505104.tif 000011
【図５】
2008505104.tif 000012
【図６】
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【図７Ａ】
2008505104.tif 000014
【図７Ｂ】
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【図８】
2008505104.tif 000016
【図９】
2008505104.tif 000017
【図１０Ａ】
2008505104.tif 000018
【図１０Ｂ】
2008505104.tif 000019
【図１１Ａ】
2008505104.tif 000020
【図１１Ｂ】
2008505104.tif 000021
【図１２Ａ】
2008505104.tif 000022
【図１２Ｂ】
2008505104.tif 000023
【図１３Ａ】
2008505104.tif 000024
【図１３Ｂ】
2008505104.tif 000025
【図１３Ｃ】
2008505104.tif 000026
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
2008505104.tif 000029
【図１６】
2008505104.tif 000030
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2008505104.tif 000034
【図２１】
2008505104.tif 000035
【図２２】
2008505104.tif 000036
【図２３】
2008505104.tif 000037
【図２４】
2008505104.tif 000038
【図２５】
2008505104.tif 000039
【図２６】
2008505104.tif 000040
【図２７】
2008505104.tif 000041
【図２８】
2008505104.tif 000042
【図２９】
2008505104.tif 000043
【図３０】
2008505104.tif 000044
【図３１】
2008505104.tif 000045
【図３２】
2008505104.tif 000046
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2008505104.tif 000049
【図３６】
2008505104.tif 000050
【図３７】
2008505104.tif 000051
【図３８】
2008505104.tif 000052
【図３９】
2008505104.tif 000053
【図４０Ａ−Ｃ】
2008505104.tif 000054
【図４０Ｄ−Ｆ】
2008505104.tif 000055
【国際調査報告】
2008505104.tif 000056
2008505104.tif 000057