(57)【要約】  本発明は、大腸菌による発酵工程とその後の精製工程とを含むＫ５多糖の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）発酵槽で行うことができ、
−バッチ増殖段階と、
−１回または数回のフェッドバッチ増殖段階と、
−温度を下げ、培地のｐＨを９までの値に上げる冷却段階と、
−バイオマスを培養培地から分離する段階と、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階と、
を含む、Ｋ５多糖を産生する大腸菌株の発酵工程と、
ｂ）培養培地および／またはバイオマスを使用する精製工程と、
を含むＫ５多糖の製造方法。
【請求項２】
培養培地および／またはバイオマスを出発材料とする精製工程が、
−約７−約１１の値へのｐＨの調整、
−第一回目の沈殿、
−沈殿物の溶解、
−得られた懸濁液の濾過、および、
−アルコール沈殿、
を含む請求項１に記載のＫ５多糖の製造方法。
【請求項３】
バッチ増殖段階後に、指数増加量の基質フィードを伴う２回のバッチ増殖段階を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
冷却段階の前に、一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
バッチ増殖段階で培地中の炭素源が消耗したときに一回目のフェッドバッチ増殖段階を開始することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
−バッチ増殖段階で培地中の炭素源が消耗したときに一回目のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
−必要ならば、酸素移動の極限の結果として溶存酸素の濃度が有意に低下したときに、その後のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
を特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
−バッチ増殖段階中の培地中の炭素源が消耗したときに一回目のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
−必要ならば、酸素移動の極限の結果として溶存酸素の濃度が有意に低下したときに、その後のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
−全部の培養フィード培地が発酵槽に注入されたかまたはｐＨの変化が検出されたときに、冷却段階を開始すること、
を特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
炭素源がグルコースまたはグリセロールであることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
炭素源がグリセロールであることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
炭素源がグリセロールであり、その濃度がバッチ増殖段階の出発培養培地中で約１０−約９０ｇ／ｌの範囲であり、フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中では約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
バッチ増殖段階の培地の窒素源が酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、ＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４から成ることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
バッチ増殖段階の出発培養培地中の窒素源がＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
バッチ増殖段階の出発培養培地中の窒素源の濃度が約１−約１０ｇ／ｌの範囲であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階のｐＨを調整するために、窒素源がＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階のｐＨを調整するために、窒素源が約２０％濃度のＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バッチ増殖段階の培地の窒素源が、出発培養培地では約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４であり、バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではｐＨを調整するために約２０％濃度のＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
増殖温度が約１０℃−約４０℃の範囲であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
増殖温度は、バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約３０℃であり、必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約２５℃であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
−炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度は、
−バッチ増殖段階では出発培養培地中に約１０−約９０ｇ／ｌの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階ではフィード培地中に約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲であり、
−増殖温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約３０℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約２５℃である
ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
−炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度が、
−バッチ増殖段階では出発培養培地中に約１０−約９０ｇ／ｌの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階ではフィード培地中に約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲であり、
−バッチ増殖段階の培地の窒素源が
−出発培養培地では約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではｐＨを調整するために約２０％濃度のＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給される
ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
−バッチ増殖段階の培地の窒素源が、
−出発培養培地では約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではｐＨを調整するために約２０％濃度のＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給され、
−増殖温度が、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約３０℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約２５℃である、
ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
発酵工程が、以下の段階、すなわち、
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約１２℃に下げｐＨを約７．５−約９の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含むこと、および、
前記工程を以下のパラメーターで行うこと、すなわち、
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約３０℃、
−他の２回のフェッドバッチ増殖段階中は約２５℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度の（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはｐＨを調整するために約２０％の濃縮ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中で約１０−約９０ｇ／ｌの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中で約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲の濃度である、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
バッチ増殖段階、フェッドバッチ増殖段階および冷却段階の後で遠心によってバイオマスを培養培地から分離することを特徴とする請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
分離後に、バイオマスと培養培地とを約８０℃の温度で約１時間−約３時間の範囲の期間維持することによって失活させることを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
精製工程の一回目の沈殿は第四級アンモニウム塩を用いて行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
第四級アンモニウム塩が塩化ベンゼトニウムである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
精製工程の最初の沈殿物を、特に１０％濃度で使用する酢酸ナトリウムに再溶解させることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
精製工程で生じた濾液をメタノール沈殿させることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
精製工程の一回目の沈殿が塩化ベンゼトニウムを用いて行われること、この沈殿物を酢酸ナトリウムに再溶解させ、濾別し、精製工程で生じた濾液をメタノール沈殿させることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
精製後に得られた生成物を過酸化水素によって１回または数回脱色することを特徴とする請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
精製後に得られた生成物を過酸化水素によって３回脱色することを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
精製し過酸化水素で３回脱色した後に得られた生成物に過酸化水素による脱色処理をもう一度行うことを特徴とする請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
プロテアーゼで処理する工程を含むことを特徴とする請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
使用されるプロテアーゼがアルカラーゼであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
精製工程が以下の段階：
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階；
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに再溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−各々の精製で得られた２つの調製物を合せる段階；
−Ｋ５多糖の沈殿、遠心および乾燥を行う段階；
を含むことを特徴とする請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
発酵工程が、以下の段階：
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約１２℃に下げｐＨを約７．５−約９の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含むこと、および、
前記工程を以下のパラメーターで行うこと：
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約３０℃、
−他の２回のフェッドバッチ増殖段階中は約２５℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度の（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはｐＨを調整するために約２０％の濃縮ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中で約１０−約９０ｇ／ｌの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中で約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲の濃度であること、および、
精製工程が以下の段階：
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階；
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに再溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−各々の精製で得られた２つの調製物を合せる段階；
−Ｋ５多糖の沈殿、遠心および乾燥を行う段階；
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法によって産生された多糖が酵素的および／または化学的な脱アセチル化、Ｎ−再硫酸化、Ｃ−５エピマー化および／またはＯ−硫酸化の反応基質として使用されることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法によって産生された多糖が半合成ヘパリン（バイオヘパリン）を得るための基質として使用されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
得られたバイオヘパリンを次に約１５００−約６５００Ｄａの範囲の分子量をもつＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）を得るためのフラグメンテーション反応で基質として使用することを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＬＭＷＨが、より特定的に約３５００−約５５００Ｄａの範囲の分子量をもつ低分子量ヘパリンであるか、または、より特定的に約１５００−約３０００Ｄａの範囲の分子量をもつ超低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌による発酵工程と精製工程とを順次に行うことによってＫ５多糖を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｋ５多糖を得るためのいくつかの方法が公知である。Ｋ５多糖は外的腸感染症の原因となる大腸菌株から得ることができる。
【０００３】
Ｋ５多糖は、等モル量のグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成り、これらが基本単位として４−ベータ−グルクロニル−１，４−アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミンを構成し、基本単位が直線状に反復してＫ５多糖鎖が形成される。
【０００４】
【化１】
2008512105.tif 000002
【０００５】
この基本単位は、完全に脱硫酸化されＮ−アセチル化されたヘパリンに構造類似性を有しており、従って、動物器官から抽出されるヘパリンの極めて有利な代替材料となり得る、すなわち、発酵によって産生されたＫ５多糖の化学的修飾によってヘパリンを製造するために使用し得る。
【０００６】
生合成によって得られたヘパリンは、以下のようにして製造される。微生物大腸菌を培養してＫ５多糖を産生させ、次いでこれを化学処理してヘパリンとする。Ｋ５多糖からヘパリンを製造する方法は記載されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９９１，２７５（１）：１５１−８；国際特許ＷＯ９２／１７５０７；Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，２００１，２７（５）：４３７−４３；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００３，２１（１１）：１３４３−４６）。一般的に、Ｋ５多糖からヘパリンを合成するためには、脱アセチル化およびＮ−再硫酸化、Ｃ−５エピマー化およびＯ−硫酸化の処理が必要である。
【０００７】
ヘパリンの有用性は特にその抗凝血性および抗血栓性にある。しかしながら、ヘパリンは使用条件が限られるという欠点を有している。特にその高い抗凝血活性（ａＩＩａ）が出血を引き起こすこともある（Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，５  ｓｕｐ．３，１９９９）。本発明によれば、酵素的または化学的な解重合によって半合成ヘパリンから低分子量ヘパリン（３０００−６５００Ｄａ）または超低分子量ヘパリン（１５００−３０００Ｄａ）を得ることが可能であり、これらの抗ＩＩａ活性は５ＩＵ／ｍｇ未満であるのに抗Ｘａ活性は特に１４０−１９０ＩＵ／ｍｇの範囲である。
【０００８】
Ｋ５多糖の多くの製造方法が従来技術に記載されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８１，１１６：３５９−３６４；ＥＰＯ４８９６４７，ＷＯ０１／０２５９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８８，１１７：１１２−１２５）。これらの方法は特に、グルコース中、３７℃で行う単一増殖段階から成る大腸菌の発酵工程と、本質的にイオン交換カラム処理から成るＫ５多糖の精製工程とを順次に含む。
【０００９】
発酵工程に関しては、本発明方法の発酵工程は、少なくともその１つがフィードを伴う増殖段階である複数の増殖段階と冷却段階とを含み、この発酵工程を精製工程に組合せることによって従来技術に記載された値の１０倍にも達する収率が得られる。
【００１０】
実際、従来技術に記載された大腸菌の発酵によるＫ５多糖の生合成方法はいずれも極めて低収率であるという重大な欠点を有している。例えば、従来技術による細胞外形態のＫ５多糖の製造方法では、単離されたＫ５多糖の収率は２００−８５０ｍｇ／ｌにすぎない。
【００１１】
このような低収率ではＫ５多糖の工業生産を計画すること、従って、半合成による半合成ヘパリンの工業生産を計画することができない。しかしながら、動物由来でないヘパリンおよび低分子量または超低分子量ヘパリンに対する需要は大きい。
【００１２】
従って、本発明の１つの目的は、細胞外形態のＫ５多糖の新規な製造方法を提供することである。
【００１３】
本発明の方法は本質的に２つの工程、すなわち、発酵工程と精製工程とを含む。
【００１４】
本発明の方法によれば、従来技術に記載された方法で得られる濃度の１０倍に達する濃度のＫ５多糖を得ることが可能である。従って本発明によれば、１０ｇ／ｌもの濃度のＫ５多糖を得ることが可能である。このような濃度は、発酵工程と精製工程との組合せによって得られるものである。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の１つの目的は、
−発酵槽で行うことができ、
−バッチ増殖段階と、
−１回または数回のフェッドバッチ増殖段階と、
−温度を下げ、培地のｐＨを９までの値に上げる冷却段階と、
−バイオマスを培養培地から分離する段階と、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階と、
を含む、Ｋ５多糖を産生する大腸菌株の発酵工程と、
−培養培地および／またはバイオマスを使用する精製工程と、
を含むＫ５多糖の製造方法である。
【００１６】
本発明の目的はより特定的には、上記のようなＫ５多糖の製造方法であって、培養培地および／またはバイオマスを出発材料とするその精製工程がイオン交換カラムによる処理工程を含むものでなく、
−約７−約１１の値へのｐＨの調整、
−沈殿、
−沈殿物の溶解、
−得られた懸濁液の濾過、および、
−アルコール沈殿、
を記載の順序で含んでいる。
【００１７】
発酵
本発明によるＫ５多糖の製造に使用できる大腸菌株は、パブリックコレクション例えばＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｓｍｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）またはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）から得られる。あるいは、これらの菌株を臨床的に単離し、次いで文献に記載されたように莢膜の抗原型のキャラクタリゼーションを行ってもよい（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８８  １１７：１１２−１２５）。
【００１８】
本発明の発酵工程は、発酵槽で大腸菌を使用して行うものであり、
−バッチ増殖段階と、
−指数増加量または一定量のフィードを伴う１回または複数のフェッドバッチ増殖サイクルと、
−温度を約１０−１２℃に下げｐＨを約７．５−９に上げる冷却段階と、
−バイオマスを培養培地から分離する段階と、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階と、
を含む。
【００１９】
本発明によれば“バッチ増殖”という表現は、フィードまたは抜取りを伴うことなく反応装置で微生物を増殖させることを意味する。
【００２０】
本発明によれば“フェッドバッチ増殖”という表現は、管理量の基質フィードを伴うが抜取りを伴うことなく反応装置で微生物を増殖させることを意味する。
【００２１】
本発明によれば、発酵工程は特に、バッチ増殖段階の後に指数増加量の基質フィードを伴う２回のバッチ増殖段階を含む。
【００２２】
本発明によれば、発酵工程は、冷却段階の前に一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階を含む。
【００２３】
本発明の発酵工程では、一回目のフェッドバッチ増殖段階が、バッチ増殖段階の培地中の炭素源の消耗と共に開始される。
【００２４】
より特定的には本発明によれば、バッチ増殖段階の培地中の炭素源が消耗したときに一回目のフェッドバッチ増殖段階が、開始され、必要ならば行われるその後のフェッドバッチ増殖段階は酸素移動の極限の結果として溶存酸素の濃度が有意に低下したときに開始される。
【００２５】
本発明によれば、バッチ増殖段階の各々は上記の時期に開始され、冷却段階は培養フィード培地の全量が発酵槽に注入されたとき、または、ｐＨ変化が検出されたときに開始される。
【００２６】
本発明によれば、バッチ増殖段階、（１回または複数の）フェッドバッチ増殖段階および冷却段階の後に、遠心によってバイオマスを培地から分離する。分離後、バイオマスおよび培養培地を除染する。具体的には、これらを約８０℃の温度で１−３時間失活させる。次に上清および／またはペレットを使用してＫ５多糖を精製する。
【００２７】
ｐＨはバッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階中はＮＨ４ＯＨもしくはＮＨ３の添加によって約６．５に維持するが、最終段階中に約８．５まで上昇する。
【００２８】
溶存酸素の濃度は、撹拌速度、空気流量の変更、流入空気の酸素富化または過酸化水素の添加などの操作によって空気飽和量の約１５−約８０％に維持する。
【００２９】
本発明の発酵工程中の増殖温度は約１０℃−約４０℃である。より特定的には、バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約３０℃であり、必要ならば行うその後のフェッドバッチ増殖段階では約２５℃である。Ｋ５多糖を高収率で得るためには３０℃から２５℃への移行が特に重要である。
【００３０】
使用される培養培地は合成培養培地である。本発明によれば炭素源はグルコースまたはグリセロールである。本発明によれば好ましい炭素源はグリセロールである。
【００３１】
より特定的に、本発明の発酵工程の炭素源がグリセロールであり、その濃度はバッチ増殖段階の出発培養培地中では約１０−約９０ｇ／ｌの範囲であり、フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中では約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲である。実験実施例１は、Ｋ５多糖を高濃度で得るためには、炭素源としてグリセロールを使用すること、および、フィード培地中のグリセロール濃度を増加させることの重要性を示している。
【００３２】
本発明によれば、バッチ増殖段階の培地の窒素源が酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、ＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４でよい。
【００３３】
本発明によれば、バッチ増殖段階の出発培養培地中の窒素源は特にＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４である。これらは特に約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度で使用される。
【００３４】
本発明によれば、バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階中の窒素源はｐＨを調整するために、ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給される。その濃度は好ましくは約２０％である。
【００３５】
より特定的には、本発明の発酵工程で、バッチ増殖段階の培地の窒素源が、出発培養培地では約１−約１０ｇ／ｌの濃度のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４であり、バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階中はｐＨを調整するために約２０％濃度のＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給される。
【００３６】
本発明の１つの目的は上記に記載のような発酵工程を含むＫ５多糖の製造方法であり、該発酵工程では、
−炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度は、
−バッチ増殖段階の出発培養培地中に約１０−約９０ｇ／ｌの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中に約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲であり、
−増殖温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約３０℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約２５℃である。
【００３７】
本発明の１つの目的はまた、上記に記載のような発酵工程を含むＫ５多糖の製造方法であり、該発酵工程では、
−炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度が、
−バッチ増殖段階の出発培養培地中に約１０−約９０ｇ／ｌの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中に約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲であり、
−バッチ増殖段階の培地の窒素源が
−出発培養培地では約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではｐＨを調整するために約２０％濃度のＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給される。
【００３８】
本発明の１つの目的はまた、上記に記載のような発酵工程を含むＫ５多糖の製造方法であり、該発酵工程では、
−バッチ増殖段階の培地の窒素源が、
−出発培養培地では約１−約１０ｇ／ｌの範囲のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではｐＨを調整するために約２０％濃度のＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３によって供給され、
−増殖温度が、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階では約３０℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約２５℃である。
【００３９】
最も特定的に本発明の１つの目的はまた、上記に記載のようなＫ５多糖の製造方法であり、該方法では、
発酵工程が、以下の段階、すなわち、
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約１２℃に下げｐＨを約７．５−約９の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含み、
上記段階を以下のパラメーターで行う、すなわち、
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約３０℃、
−他の２回のフェッドバッチ増殖段階中は約２５℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはｐＨを調整するために約２０％の濃縮ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中で約１０−約９０ｇ／ｌの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中で約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲の濃度である。
【００４０】
第二工程：Ｋ５多糖の精製
本発明の１つの目的はまた、精製工程を含む上記のようなＫ５多糖の製造方法である。この精製工程では、発酵ブロスの遠心上清またはこの遠心で得られたペレットの再懸濁液から成るＫ５多糖含有溶液のｐＨを約７−約１１に調整し、この溶液から多糖を沈殿させる。次に沈殿物を洗浄し、再溶解し、濾過し、次いで沈殿させる。
【００４１】
本発明によれば、精製工程の一回目の沈殿は第四級アンモニウム塩を用いて行う。この沈殿はより特定的には塩化ベンゼトニウムを用いて行う。
【００４２】
本発明によれば、精製工程の最初の沈殿物を、特に１０％濃度で使用する酢酸ナトリウムに再溶解させる。
【００４３】
更に、本発明によれば、精製工程で得られた濾液をメタノール沈殿させる。
【００４４】
より特定的には、本発明による精製工程の一回目の沈殿が塩化ベンゼトニウムを用いて行われ、この沈殿物を酢酸ナトリウムに再溶解し、次いで濾過し、精製工程で生じた濾液をメタノール沈殿させる。
【００４５】
本発明によれば、上記に記載のような精製後に得られた生成物を場合によっては過酸化水素によって１回または数回脱色処理する。より特定的には、精製後の過酸化水素処理を３回行う。
【００４６】
必要な場合には、上記のように精製した生成物を過酸化水素で３回脱色処理した後、残留汚染物を除去するために追加の過酸化水素処理を行う。この処理は得られる生成物の純度を改善し得る。従って本発明の１つの目的はまた、精製および３回の過酸化水素処理後に追加の過酸化水素による脱色をさらに含むＫ５多糖の製造方法である。
【００４７】
必要な場合には、上記精製工程のいずれか１つの後でＫ５多糖をプロテアーゼで処理する。実験実施例８で後述するように、プロテアーゼによる処理は、ほぼ定量的収率で産生されるＫ５多糖の純度を有意に向上させ得る。従って本発明の目的は特に、精製工程中のプロテアーゼ処理を含むＫ５多糖の製造方法である。本発明のプロテアーゼは好ましくはアルカラーゼである。
【００４８】
最後に、Ｋ５多糖を沈殿させ、遠心し、乾燥する。
【００４９】
従って本発明の１つの目的は最も特定的には、上記に記載のような精製工程を含むＫ５多糖の製造方法であって、精製工程で以下の段階：
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階；
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに再溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−各々の精製工程で得られた２つの調製物を合せる段階；
−Ｋ５多糖の沈殿、遠心および乾燥を行う段階；
を行う方法である。
【００５０】
従って本発明の１つの目的は好ましくは、発酵工程と精製工程とを含むＫ５多糖の製造方法であって、発酵工程が、以下の段階：
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約１２℃に下げｐＨを約７．５−約９の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含み、
上記段階が以下のパラメーターで行われる、すなわち：
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約３０℃、
−他の２回のフェッドバッチ増殖段階中は約２５℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約１−約１０ｇ／ｌの範囲の濃度のＮＨ４ＯＨ、ＮＨ３または（ＮＨ４）２ＨＰＯ４によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはｐＨを調整するために約２０％の濃縮ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中に約１０−約９０ｇ／ｌの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中に約２５０−約１２００ｇ／ｌの範囲の濃度であり、
精製工程が以下の段階：
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階；
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−ｐＨを約７−約１１の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を１０％酢酸ナトリウムに再溶解し、
−１０％酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって３回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階；
−各々の精製工程で得られた２つの調製物を合せる段階；
−Ｋ５多糖を沈殿、遠心および乾燥させる段階を含む方法である。
【００５１】
このようにして本発明方法では、従来技術に記載された方法で得られる収率の１０倍にもなるような収率が得られる。
【００５２】
本発明によれば、上記に記載の方法によって製造された多糖が酵素的および／または化学的な脱アセチル化、Ｎ−再硫酸化、Ｃ−５エピマー化および／またはＯ−硫酸化の反応基質として使用される。より特定的には本発明によれば、上記に記載の方法によって製造された多糖が半合成ヘパリン（バイオヘパリン）を得るための基質として上記反応の１つで使用される。
【００５３】
本発明によれば、得られたバイオヘパリンを次に、約１５００−約６５００Ｄａの範囲の分子量をもつＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）を得るためのフラグメンテーション反応で基質として使用する。
【００５４】
本発明によればまた、得られたバイオヘパリンを、より特定的に約３５００−約５５００Ｄａの範囲の分子量をもつＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）、または、より特定的に約１５００−約３０００Ｄａの範囲の分子量をもつＶＬＭＷＨ（超低分子量）ヘパリンを得るためのフラグメンテーション反応の基質として使用することが可能である。
【００５５】
以下の実施例は本発明の代表例であるが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００５６】
応用例
【実施例１】
【００５７】
（１）手順
（ａ）発酵
発酵は２０リットルの発酵槽で大腸菌株ＡＴＣＣ２３５０６を使用して行う。
【００５８】
５−６０ｇ．ｌ−１のグリセロールと０．５−３ｇ．ｌ−１のＫＨ２ＰＯ４と１−１０ｇ．ｌ−１の（ＮＨ４）２ＰＯ４と０．５−５ｇ．ｌ−１のＭｇＳＯ４と０．２−４ｇ．ｌ−１のクエン酸と微量元素とから成る１００ｍｌの培地を収容した５００ｍｌ容の三角フラスコ中、３０℃で一夜凍結させた１．８ｍｌのバイアルを使用して大腸菌株のプレカルチャーを調製する。
【００５９】
２００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で増殖させる。生産用発酵槽に接種するためにこのプレカルチャーを使用する。また、グリセロール収容バイアルから直接的に発酵槽に接種してもよい。このプレカルチャーの目的は、発酵槽におけるバッチ増殖段階の持続時間を短縮することだけである。使用した培地は、ＲＦＢ  ＭＩＬ  １１／０４培地（Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９５，３９：５９−６５）の変種であり、それらの組成を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2008512105.tif 000003
2008512105.tif 000004
【００６１】
自己適応形管理アルゴリズムに基づくＩＲＩＳプログラム（Ｉｎｆｏｒｓ）によって制御されたＴＥＣＨＦＯＲＳ発酵槽（全容積２０ｌ、処理容積１２ｌ）で培養物を調製する。培地中の溶存酸素濃度、ｐＨ、撹拌速度、温度、通風空気の流速、圧力およびポンプ吐出量（基底調節量、フィード量、抑泡剤）はオンラインで測定し管理する。発酵槽の排出ガスの分析は質量分析計（ＰＲＩＭＡ  ６００Ｓ）を使用して行う。
【００６２】
以下の特性値のバッチモードで発酵させる。
−処理容量１２ｌ、
−初期容量８ｌ、
−追加容量４ｌ
−最終容量は１２ｌプラス基底容量、
−溶存酸素は空気飽和量の１５％−８０％の範囲（好ましくは３０％）に維持、
−温度は２０−４０℃の範囲（好ましくは３０℃）、
−ｐＨは濃ＮＨ４ＯＨまたはＮＨ３を加えて６．０−７．５（好ましくは６．５）に調整、
−圧力は０．３バール、０．５バールおよび０．８バール、
−初期通風は４ｌ．分−１（０．５ＶＶＭ）（４−２０ｌ．分−１の範囲で調整）、
−初期撹拌速度は２００ｒｐｍ（２００−１５００ｒｐｍの範囲で調整）。
【００６３】
培養は５つの工程、すなわち、バッチ増殖段階、次いで、基質フィードを伴う３回の異なるバッチ増殖段階、および、最終冷却段階を含む。
【００６４】
１．バッチ増殖段階
バッチモードの培養段階では、菌株の世代時間を二酸化炭素の発生量の測定値から算定し、管理された基質フィードを伴うバッチ増殖の最初の部分の初期速度を計算する：
Ｑ０＝（ＣＯ２ｐｍａｘ×ＶｏｌＦｅｒ）／（１０００×ＭＷＣＯ２×ＹＣＯ２／グリセロール×Ｇ０）
Ｑ０：濃縮培地の初期流速（１．時−１）；
ＣＯ２ｐｍａｘ：二酸化炭素の最大発生量（ｍｍｏｌ．ｌ−１．時−１）；
Ｇ０：管理された基質フィードを伴うバッチ増殖中に使用された濃縮培地中のグリセロールまたはグルコースの濃度（７５０ｇ．ｌ−１）；
ＶｏｌＦｅｒ：発酵槽中の液体容量；
ＭＷＣＯ２：ＣＯ２の分子量（ｇ．ｌ−１）；
ＹＣＯ２／グリセロール：グリセロール消費量あたりのＣＯ２の発生量。
【００６５】
２．指数増加量の基質フィードを伴う１回目のバッチ増殖段階
炭素源の消耗後、バイオマスの濃度を増加させるために、指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクルを開始する。新しい培地を供給するポンプのスイッチを入れる。ポンプの吐出量は時間の経過に伴って指数関数的に増加する。
Ｑ（ｔ）＝Ｑ０×２［ｔ／（τ×２．４）］
Ｑ０：フィードポンプの初期供給量（ｌ．時−１）；
ｔ：指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル開始後の経過時間；
τ：バッチ増殖中に測定した菌株世代時間。
【００６６】
予め測定した菌株世代時間に１−１０（好ましくは２．４）の範囲の補正率を乗算した値をこの供給量に算入する。この供給量は０．０５時−１から０．６５時−１の範囲の増殖率を微生物に与える。
【００６７】
３．指数増加量の基質フィードを伴う２回目のバッチ増殖段階
最初の酸素移動の極限に達すると、（溶存酸素＜２０％、撹拌速度＞１３５０ｒｐｍ、空気流速＞１９，５ｌ．分−１、圧力＝０．５バール）、この指数増加量の基質フィードを伴う１回目のバッチ増殖段階を停止する。管理された基質フィードを伴う１回目のバッチ増殖サイクルの開始時の８．４ｍｌ．時−１という流速に基づいて次の指数増加量のフィードを開始する。先行の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクルと同様に、４−１０の範囲（好ましくは６）の新しい補正率を世代時間に乗算する。この供給量は０．０５時−１から０．１６時−１の範囲の増殖率を微生物に与える。
【００６８】
同時に、培地中の酸素溶解度を増加させるために発酵槽の表示温度を２０−２５℃（好ましくは２５℃）に下げる。フィードポンプの新しい制御アルゴリズムは以下の式で表される：
Ｑ’（ｔ）＝０．００８４×２［ｔ／（τ×６）］
ｔ：指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル開始後に経過した時間；
τ：バッチ増殖中に測定した菌株世代時間。
【００６９】
酸素移動の極限は約３０時間の増殖後（管理された基質フィードを伴う１回目のバッチ増殖サイクル１０時間を含む）に出現するが、フィードポンプの実際の初期培地吐出量は約１５ｍｌ．時−１（ｔ＝１０時間）である。この低い供給量は、微生物の増殖を維持すると同時に系の溶存酸素を飽和量の３０％に調節する機能も果す。２回目の酸素移動の極限が出現するまでこの供給量を継続する。
【００７０】
４．一定量の基質フィード段階
２回目の酸素移動の極限（溶存酸素＜２０％、撹拌速度＞１３５０ｒｐｍ、空気流速＞１９．５ｌ．分−１、圧力＝０．５バール）が出現すると、指数増加量の培地フィードを１−２０ｍｌ．ｌ−１．時−１の範囲（好ましくは４．２ｍｌ．ｌ−１．時−１）の一定供給量に切換える。４ｌのフィード培地が注入されるかまたはｐＨの有意な低下（強力な酸素極限の指標となるＮＨ４ＯＨの完全消費）が検出されるまでこの供給量を継続する。
【００７１】
５．冷却段階
次にフィードポンプのスイッチを切り、発酵槽の温度を１０℃に下げる。この間に、ｐＨはＫ５多糖酵素リアーゼの活性に好ましい７．５−９（好ましくは８．５）という値まで自然に上昇するかまたはこのような値に調節できる。これらの条件を０−１０時間維持する。
発酵槽が１０℃まで冷えた後、バイオハザードレベル２の作業条件下でバイオマスを気密容器に採集する。ブロスを遠心してバイオマスを培地上清から分離する。分離後、８０℃で１時間３０分の熱処理によって撹拌しながら上清を除染する。バイオマス自体は８０℃で２時間３０分の処理によって除染する。上清およびバイオマスを−２０℃で保存する。
【００７２】
これらの試験には以下の条件を使用する：
−ＣＯＬ５Ｋ０００／００１：３０℃のバッチ増殖段階／３０℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階／冷却段階；
−ＣＯＬ５Ｋ００２：３０℃のバッチ増殖段階／３０℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階／２回目の３０℃の指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階／冷却段階；
−ＣＯＬ５Ｋ００３／００４：３０℃のバッチ増殖段階／３０℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階／２５℃で行う２回目の指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階／冷却段階；
−ＣＯＬ５Ｋ００５／００６：３０℃のバッチ増殖段階／３０℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階／２５℃で行う２回目の指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階／２５℃で行う一定量の基質フィードを伴う増殖段階／冷却段階。
【００７３】
ｂ）多糖の分析
多糖の分析は２工程で行う。
１．最初に多糖をその構成二糖に解重合する。
２．二糖混合物をＨＰＬＣによって分析する。
【００７４】
１．多糖の解重合
分析すべき約４０ｍｇのサンプルを２ｍｌのｐＨ７の酢酸塩バッファ（０．２９ｍｌの酢酸、５ｍｇのＢＳＡ、１５．８ｍｇの酢酸カルシウム、総量を５０ｍｌにする量の脱イオン水、２Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整）に再懸濁させ、２０ｍｇ／ｍｌを含有する溶液を得る。
【００７５】
同時に、リン酸塩バッファ（６８ｍｇのリン酸二水素カリウム、１０ｍｇのＢＳＡ、総量を５０ｍｌにする量の脱イオン水、１Ｎの水酸化カリウムでｐＨを７に調整）中に０．５ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩをそれぞれ含有する溶液を調製する。次にこれらの溶液を等しい割合で混合して最終のヘパリナーゼ１２３溶液を得る。
【００７６】
２０ｍｇ／ｍｌのサンプル溶液２５μｌ、酢酸塩バッファ２５μｌ、および、ヘパリナーゼ１２３溶液２５μｌを３００μｌ容の管で混合する。混合物を十分にホモジナイズし、室温で２４時間インキュベートして完全に解重合させる。
【００７７】
２．ＨＰＬＣによる多糖の分析
勾配ＨＰＬＣを使用し当業者に公知の方法に従って前項の混合物を分析する。以下の分析条件を使用する：
−カラム：Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＳＡＸ  ５μｍ、２５０×３ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、
−カラム温度：４０℃、
−流速：０．５ｍｌ／分、
−注入量：１０μｌ、
−２３４ｎｍでＵＶ検出、
−移動相：
溶媒Ａ：ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ  ｐＨ＝２．９
溶媒Ｂ：ＮａＣｌＯ４、Ｍ、ＮａＨ２ＰＯ４  ２．５ｍＭ  ｐＨ＝３
勾配：
【００７８】
【表２】
2008512105.tif 000005
【００７９】
二糖４−ベータ−グルクロニル−１，４−アルファ−Ｎ−アセチル−グルコサミンがＨＰＬＣによって検出される。
【００８０】
【化２】
2008512105.tif 000006
２）結果
対照ＣＯＬ５Ｋ０００に加えて異なる６つの発酵試験（ＣＯＬ５Ｋ００１−００６）を実施した。
【００８１】
これらの試験中に得られたＫ５多糖の濃度を表２に示す。
【００８２】
【表３】
2008512105.tif 000007
【００８３】
結果（図１、付記１）は、使用した手順の各々によって対照ＣＯＬ５Ｋ０００の２−１０倍のＫ５多糖の製造が可能であったことを明らかに示す。ＣＯＬＫ００６の主要パラメーターのプロフィルは、培地中のＫ５多糖の濃度増加が２回目のフェッドバッチ増殖段階の付加に関連していることを明らかに示す（図２、付記１）。
【００８４】
実施した試験は、培地中に精製した多糖の最大濃度を文献に記載された値に比較して大幅に増加させた。文献の量は９００ｍｇ．ｌ−１であったが、我々は１０ｇ．ｌ−１を上回る濃度を得た。
【００８５】
ＣＯＬ５Ｋ０００の処理プロセスと培養培地中の多糖濃度が増加したＣＯＬ５Ｋ００６の処理プロセスには主として以下の違いが存在した：
−炭素源としてグルコースの代わりにグリセロールを使用する：
−酸素移動の極限が出現したときに、低下させた増殖率の基質フィード段階（２回目および３回目のフィード段階）を付加することによって発酵総時間を延長する：
−フィード溶液のグリセロール濃度を増加する（５００ｇ．ｌ−１を７５０ｇ．ｌ−１にする）：
−処理終了時のｐＨを上げ、これによってＫ５多糖リアーゼの活性に有利な条件を成立させ、培養培地中に得られる多糖の量を増加させる。
【実施例２】
【００８６】
抽出プロセス
以下に記載の抽出工程は、上記で得られた発酵上清からＫ５多糖を単離するために行った。
【００８７】
実施例１で発酵槽ＣＯＬ５Ｋ００１から６．５リットルの熱失活上清が得られた。これは２４．７ｇのＫ５多糖を含有している。
【００８８】
５Ｎの水酸化ナトリウムを使用してこの溶液のｐＨを７．２に調整し、５０ｇ／ｌの塩化ベンゼトニウムを含有している６６３ｍｌの水溶液を注いだ（すなわち、Ｋ５多糖に対して１．２モル当量の塩化ベンゼトニウム）。反応媒体を室温で３０分間撹拌し、次いで４０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
【００８９】
得られたペレットを４リットルの脱イオン水で２回洗浄し、次いで５リットルの１０％酢酸ナトリウム溶液に入れて撹拌した。
【００９０】
１回目の塩化ベンゼトニウム沈殿で得られた上清を再度処理した。５Ｎの水酸化ナトリウムを使用してそのｐＨを７．２に調整し、５０ｇ／ｌの濃度の６６３ｍｌの塩化ベンゼトニウムを添加し、混合物を３０分間撹拌後に遠心した。
【００９１】
得られたペレットを４リットルの脱イオン水で２回洗浄し、次いで５リットルの１０％酢酸ナトリウム溶液に入れて撹拌した。２種類の再懸濁ペレットを含有している溶液を集め、Ｃｌａｒｃｅｌプレレイヤーを配備した焼結ガラス漏斗で濾過した。
【００９２】
濾液を４０リットルのメタノールに注いだ。得られた混合物を２５分間撹拌した後、一夜傾瀉した。翌日、４０００×ｇで１０分間遠心した。ペレットをメタノールで洗浄し、次いで２０Ｔｏｒｒ下、５０℃で３６時間乾燥した。
【００９３】
このようにして力価５４％をもつ３１．５ｇのＫ５多糖が得られた。収率は６８．８％であった。
【実施例３】
【００９４】
精製
実施例２で単離した生成物の力価が低かったので（わずか５４％）、追加の精製工程を実施した。
【００９５】
実施例２で得られた重量３１．５ｇの粗生成物を磁気撹拌付きの三角フラスコで１．２リットルの脱イオン水に再懸濁させた。５Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを１１に調整した後、１５ｇの塩化ナトリウムと６ｍｌの３０％過酸化水素とを溶液に加えた。混合物を１０分間撹拌し、次いで撹拌しないで室温で一夜静置した。
【００９６】
４倍容のメタノールを溶液に加えることによってＫ５多糖を沈殿させた。混合物を３０分間撹拌し、次いで４０００ｒｐｍで１５分間遠心した。ペレットを２０Ｔｏｒｒ下、４５℃で３６時間オーブン乾燥した。このようにして、力価が５４％から６５％に改善された２３．５ｇのＫ５多糖が得られた。
【実施例４】
【００９７】
抽出と精製
実施例１の発酵槽ＣＯＬ５Ｋ００２から粗Ｋ５多糖を抽出して精製した。
【００９８】
実施例１で発酵槽ＣＯＬ５Ｋ００２から５．４リットルの熱失活上清が得られた。これは２１．１ｇのＫ５多糖を含有している。
【００９９】
実施例２に記載したようにＣＯＬ５Ｋ００２上清を塩化ベンゼトニウムで処理し、ペレットを酢酸塩溶液中で撹拌し、次いでＣｌａｒｃｅｌプレレイヤーを配備した焼結ガラス漏斗で濾過した。
【０１００】
濾液に含まれていたＫ５多糖を実施例２に記載したようにメタノール沈殿させ、次いで実施例３に詳述したように過酸化水素で脱色し、その後、過酸化水素による２回目の脱色を行った。
【０１０１】
最終的に、７８％の力価をもつ２５．３ｇのＫ５多糖が９０％を上回る収率で得られた。
【実施例５】
【０１０２】
抽出と精製
実施例４の発酵槽ＣＯＬ５Ｋ００３から粗Ｋ５多糖を抽出して精製した。
【０１０３】
実施例１で発酵槽ＣＯＬ５Ｋ００３から６リットルの熱失活上清が得られた。これは４５ｇのＫ５多糖を含有している。
【０１０４】
実施例２に記載したようにＣＯＬ５Ｋ００３上清を塩化ベンゼトニウムで処理し、ペレットを酢酸塩溶液中で撹拌し、次いでＣｌａｒｃｅｌプレレイヤーを配備した焼結ガラス漏斗で濾過した。
【０１０５】
濾液に含まれていたＫ５多糖を実施例２に記載したようにメタノール沈殿させ、次いで実施例４と同様に過酸化水素で２回処理し、その後、３回目の過酸化水素による脱色を行った。
【０１０６】
最終的に、８１％の力価をもつ３９．５ｇのＫ５多糖が７１％の収率で得られた。
【実施例６】
【０１０７】
ペレットの処理および精製の改善
先行の試験では上清だけを抽出して精製した。遠心沈降物中に存在するＫ５多糖を回収するために、実施例１の発酵槽ＣＯＬ５Ｋ００２から得られたペレット（３１．９ｇのＫ５多糖を含有する５ｋｇ）を等容量の脱イオン水に再懸濁させ、５ＮのＮａＯＨでｐＨを７．２に調整した。次に混合物を室温で２時間撹拌し、次いで４７００×ｇで９０分間遠心した。
【０１０８】
実施例２に記載したように上清を塩化ベンゼトニウムで処理し、ペレットを酢酸塩溶液中で撹拌し、次いでＣｌａｒｃｅｌプレレイヤーを配備した焼結ガラス漏斗で濾過した。
【０１０９】
濾液に含まれていたＫ５多糖を実施例２に記載したようにメタノール沈殿させ、次いで実施例５と同様に過酸化水素で３回処理した。
【０１１０】
力価７３％をもつ２９．６ｇのＫ５多糖が最終収率６８％で得られた。
【実施例７】
【０１１１】
ペレットの処理および精製の改善
実施例１の発酵槽ＣＯＬ５Ｋ００３から得られたペレット（２８．５ｇのＫ５多糖を含有する４．７５ｋｇ）を４．７５リットルの脱イオン水に再懸濁させ、５ＮのＮａＯＨでｐＨを７．２に調整した。次に混合物を室温で２時間撹拌し、次いで４７００×ｇで２時間遠心した。
【０１１２】
実施例２に記載したように上清を塩化ベンゼトニウムで処理し、ペレットを酢酸塩溶液中で撹拌し、次いでＣｌａｒｃｅｌプレレイヤーを配備した焼結ガラス漏斗で濾過した。
【０１１３】
実施例２に記載したように濾液に含まれていたＫ５多糖をメタノール沈殿させ、次いで実施例４と同様に過酸化水素で２回処理した。  力価６９％をもつ２５．９ｇのＫ５多糖が最終収率６３％で得られた。
【実施例８】
【０１１４】
酵素による除タンパク工程を含む精製
最終生成物の純度を改善するために酵素による除タンパク工程を実施した。
【０１１５】
実施例７で得られた１５．９ｇおよび実施例６で得られた２９．６ｇを含む４５．５ｇのＫ５多糖を１．８リットルの脱イオン水に再懸濁させた。
【０１１６】
ｐＨを７．０に調整した後、９１０μｌの液体アルカラーゼを添加し、混合物を撹拌しながら６０℃で５時間インキュベートした。
【０１１７】
次に２３ｇの塩と７．２リットルのメタノールとを添加し、混合物を３０分間撹拌し、次いで４０００×ｇで１５分間遠心した。
【０１１８】
ペレットを１．８リットルの脱イオン水に再懸濁させ、実施例３に記載したように過酸化水素で処理した。
【０１１９】
８９％の力価をもつ３６．４ｇのＫ５多糖が９８％の収率で得られた。
【実施例９】
【０１２０】
酵素による除タンパク処理と脱色処理との有効性の比較
２種類の処理の相対的有効性を評価するために、実施例７で得られた５ｇのＫ５多糖を過酸化水素またはアルカリ性アルカラーゼによって処理した。
【０１２１】
すなわち、実施例７で得られた５ｇのＫ５多糖を２００ｍｌの脱イオン水に再懸濁させ、溶液を実施例３と同様に過酸化水素で処理した。
【０１２２】
７６．９％の力価をもつ３．７５ｇのＫ５多糖が収率８３％で得られた。
【０１２３】
同様にして、実施例７で得られた５ｇのＫ５多糖を２００ｍｌの脱イオン水に再懸濁させた。しかしながら、過酸化水素で処理する代わりに、この溶液を６０℃に加熱し、そのｐＨを７に調整した。次いで１００μｌのアルカラーゼを溶液に添加し、混合物を６０℃で５時間インキュベートした。
【０１２４】
次にこの混合物を実施例２に記載したようにメタノール沈殿させた。
【０１２５】
８３％の力価をもつ３．６２ｇのＫ５多糖が収率８７％で得られた。これに比べて、過酸化水素処理では力価７６．９％および収率８３％であった。
【０１２６】
従って、除タンパク処理では、３回目の過酸化水素処理に比べて収率の改善および純度の向上が得られる。
【０１２７】
実施例１に記載したような発酵が終了したとき、ペレット減量はＣＯＬ５Ｋ００２で６０％、ＣＯＬ５Ｋ００３で４０％であった。実施例６および７に記載したようなこのペレットの再処理プロセスを開発したので、Ｋ５多糖の総抽出効率をＣＯＬ５Ｋ００２では３７％から７８％に向上させ、ＣＯＬ５Ｋ００３では４３％から６８％に向上させることが可能になったのである。
【０１２８】
実施例８に記載したような最後の除タンパク工程は、定量的収率（９８％）でＫ５多糖の純度を８９％に向上させ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ＣＯＬ５Ｋ０００からＣＯＬ５Ｋ００６までの処理で得られた多糖の量。黒い棒グラフは最終可能な多糖の推定量（単位ｇ）を表す；斑点入り棒グラフは上清中の多糖の最終濃度を表す（×２０、単位ｇ／ｌ）；三角印は培養物が示したＯＤ−６００ｎｍを表す。
【図２】ＣＯＬ５Ｋ００６の主要処理パラメーターのプロフィル。曲線１は培地中の溶存酸素のパーセンテージを表す；曲線２は培養物ＣＯＬＫ００６中のＣＯ２の発生速度を表す（単位ｎｍｏｌ．１−１時−１）；曲線３はフィード量／２０をｇ．ｌ−１で表す；曲線４は上清中のＫ５多糖の濃度（単位ｇ．ｌ−１）を表す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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