(57)【要約】本発明は、新規な極性蛍光色素および消化物質色素、ならびに強化された極性を有するマイナーグルーブバインダに関する。さらに、本発明は、自動化合成の条件下、極性アルソナート色素でラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを製造する方法、およびそのようなプローブを使用する方法に関する。したがって、一実施形態で、本発明は、１種以上のアルソナート基で置換された蛍光化合物を含む極性蛍光色素であって、該蛍光化合物は、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間で励起と、４４０ｎｍと１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光とを有する蛍光色素を提供する。
2008535945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のアルソナート基で置換された蛍光化合物を含む極性蛍光色素であって、該蛍光化合物は、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間に励起を、４４０ｎｍと１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光を有する蛍光色素。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化１】
2008535945.tif 000078
（式中、
Ｒ１は、水素、アルキル、−ＣＨＯ、−ＮＯ２、−ＣＨ２Ｒ１１、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ２は、水素、−ＣＮ、アルキル、アラルキル、ハロアルキルまたは−ＣＨ２Ｒ１１であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ４は、−ＮＲ１２Ｒ１３であり、ここで、Ｒ１２およびＲ１３は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニルであり、またはＲ１２およびＲ１３は一緒になって複素環を形成し；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ１１は、−ＣＯＯＨ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ１１の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）
の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）：
【化２】
2008535945.tif 000079
（式中、
Ｒ１５は、水素、アルキル、アラルキル、ハロアルキルまたは−ＣＮであり；
Ｒ１６は、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ１７およびＲ１８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたはハロアルキルであり；
Ｒ１９は、水素、場合によってはヒドロキシ、ハロゲン、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ２ＯＨで置換されているアルキル、場合によってはヒドロキシ、ハロゲン、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ２ＯＨで置換されているアリール、または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基である）
の化合物。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008535945.tif 000080
（式中、
ｍは、１、２、３、４または５であり；
Ｒ２４およびＲ２５は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８およびＲ２９は、同じまたは異なり、独立して、水素、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されているアルキルまたはアリールであり；
Ｒ３１およびＲ３２は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ３０は、独立して、水素、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３３、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アリール、アルキルチオ、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＳＯ２Ｒ３３、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３３は、ヒドロキシ、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＳＯ３Ｒ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＡｓ（＝Ｏ）（ＯＲ３４）２、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＯＲ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＯＲ３４または−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＮ（Ｒ３４）２（ｊは２〜６の間の整数）であり；
各Ｒ３４は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２４およびＲ２８は、場合によっては、５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２５およびＲ２９は、場合によっては、５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２６およびＲ２８は、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５〜９員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２７およびＲ２９は、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で場合によっては置換されてもよい５〜９員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２６およびＲ３１は、場合によっては、水素、アルキル、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で場合によっては置換されてもよい５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２７およびＲ３２は、場合によっては、水素、アルキル、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で場合によっては置換されてもよい５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；および
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）
の化合物。
【請求項５】
式（ＩＶ）：
【化４】
2008535945.tif 000081
（式中、
各Ｒ３５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
ｎは、１、２または３であり；
ｐは、１または２であり；
各Ｒ３６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ３７およびＲ３８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールまたは−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３９は、場合によっては、１個以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ３５およびＲ３６の少なくとも１個は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）
の化合物。
【請求項６】
式（Ｖ）：
【化５】
2008535945.tif 000082
（式中、
ｖは、０、１、２、３、４、５または６であり；
Ｙは、各環において６個の原子を有する１または２個の縮合芳香族環を形成するために必要な原子を示し、各環原子は、同じまたは異なり、独立して、＝ＣＲ４６−、＝Ｎ＋Ｒ４７−または＝Ｎ−であり；
Ｗは、各環において６個の原子を有する１または２個の縮合芳香族環を形成するために必要な原子を示し、各環原子は、同じまたは異なり、独立して、＝ＣＲ４６−、＝Ｎ＋Ｒ４７−または＝Ｎ−であり；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｃ（Ｒ４８）２−または−ＮＲ４９−であり；
Ｒ２０およびＲ２３は、同じまたは異なり、独立して、アルキル、アラルキルまたはヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、−ＣＯＯＨ、アルコキシ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはトリアルキルアンモニウムで置換されている置換アルキル、またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ５２およびＲ５３は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アルキル置換ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ２１および各Ｒ２２は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、メルカプト、アリールオキシ、複素環、イミニウムイオン、Ｌ−Ｒｘであり、または２個の隣り合うＲ２１およびＲ２２あるいは任意の２個の隣り合うＲ２２は、場合によっては、アルキル、ハロゲンまたはオキソで置換されている４、５または６員環の炭素環を形成し；あるいは１個の炭素をはさんだ２個のＲ２２は、それらが結合する炭素と一緒になって、場合によっては、アルキル、ハロゲン、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ（＝Ｏ）、＝Ｓまたは＝Ｃ（Ｒ５０）２で置換されている４、５または６員環の炭素環を形成し；
各Ｒ４６およびＲ４７は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
各Ｒ４８およびＲ４９は、同じまたは異なり、独立して、水素または場合によっては、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されるアルキルであり；
各Ｒ５０は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、シアノ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ４８であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ２０、Ｒ２３、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２およびＲ５３の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）
の化合物。
【請求項７】
式（ＶＩ）：
【化６】
2008535945.tif 000083
（式中、
ｙは、１、２または３であり；
ｘは、０、１、２または３であり；
各Ｒ５６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ５７は、アルキル、アラルキルまたはヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、−ＣＯＯＨ、アルコキシ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノもしくはトリアルキルアンモニウムで置換されているアルキル、またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ５８ａおよびＲ５８ｂは、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、またはヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２もしくはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｒ５９は、水素、アルキルまたはアラルキルであり；
各Ｒ６０は、同じまたは異なり、独立して、水素、−ＮＲ６１ａＲ６１ｂ、アルキル、アリール、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ６１ａおよびＲ６１ｂは、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、またはヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２もしくはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ５６、Ｒ５８ａ、Ｒ５８ｂ、Ｒ６０およびＲ６１ａおよびＲ６１ｂの少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）
の化合物。
【請求項８】
式（ＶＩＩ）：
【化７】
2008535945.tif 000084
（式中、
各Ｒ６２は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、アルキル、またはヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２もしくはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
各Ｒ６３およびＲ６４は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、アルキル、またはヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２もしくはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ６２、Ｒ６３およびＲ６４の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）
の化合物。
【請求項９】
式（ＶＩＩＩ）：
【化８】
2008535945.tif 000085
（式中、
ｚは、１、２または３であり；
Ｔは、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｓ（＝Ｏ）２であり；
Ｑは、−ＯＲ７１または−ＮＲ７２Ｒ７３であり；
Ｕは、−ＯＲ７４または−ＮＲ７５Ｒ７６であり；
各Ｒ６８およびＲ６５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アリールまたは−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ６６およびＲ６７は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルまたはＬ−Ｒｘであり；
各Ｒ７０は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素上の２個のＲ８はオキソを形成し；
各Ｒ７１およびＲ７４は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルカルボニルまたはアリールカルボニルであり；
各Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５およびＲ７６は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり；あるいは
Ｒ７１およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７４およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７２およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７３およびＲ６６は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７５およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７６およびＲ６７は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ６５、Ｒ６６、Ｒ６７、Ｒ６８およびＲ７１の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）
の化合物。
【請求項１０】
式（ＩＸ）：
【化９】
2008535945.tif 000086
（式中、
Ｒ４０およびＲ４３は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アリール、アルコキシまたは−Ｌ−Ｒｘであり、ただし、Ｒ４０およびＲ４３の少なくとも１つは−Ｌ−Ｒｘであり；
各Ｒ４１は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素上の２個のＲ８はオキソを形成し；
ｑは、０、１または２であり；
Ｒ４２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ４１およびＲ４２の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）
の化合物。
【請求項１２】
アルソナートエステル基を有する色素で置換されているオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド結合体。
【請求項１３】
前記色素が、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間に励起を、４４０ｎｍと１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光を有する蛍光色素である請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記色素が、前記オリゴヌクレオチドが標的に結合する前に、報告蛍光団から発せられた蛍光を吸収するように構成された非蛍光性消光物質である請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記色素が、請求項２〜１０のいずれかに記載の化合物である請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
さらに、ＭＧＢ基を含む請求項１２〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ＭＧＢ基が極性アルソナート基で置換されている請求項１６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、分子標識、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ、サンライズプローブ、立体配置的に補助されたプローブおよびＴａｑＭａｎＴＭプローブから選択されたプローブである請求項１２〜１７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド結合体。
【請求項１９】
標的核酸を直接的に検出する方法であって、
式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）の１種以上の色素化合物に結合体化するオリゴヌクレオチドを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、該オリゴヌクレオチドは、さらに、１以上の極性アルソナート基で場合によっては置換されているＭＧＢを含むステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドプローブを生物学的サンプルに添加するステップであって、該プローブは、該標的核酸に対して相補的または実質的に相補的であるステップと；
該プローブを、適切な条件下で充分な時間、該標的核酸とハイブリッド形成させるステップと；
該色素から放射された蛍光を検出するステップと；
を含む方法。
【請求項２０】
式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）（式中、Ｒｘはホスホルアミダイト基である）でのいずれかの色素試薬を使用して、自動化合成でオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
ホスホルアミダイト方法を使用して、オリゴヌクレオチドの自動化合成を実施して、色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドの−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を脱保護し、−ＡｓＯ３２−または−ＡｓＯ３Ｈ−から選択される負電荷極性基を有する色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドを反応媒体から単離するステップと；
を含む方法。
【請求項２１】
さらに、前記オリゴヌクレオチド中のＭＧＢを結合体化するステップを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＭＧＢが、アルソナート基で置換されている請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、該プローブは、該蛍光色素が該消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
該標的が存在する場合、該プローブを該標的とハイブリッド形成させ、該標的をＴａｑポリメラーゼによって切断するＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
該蛍光シグナルを、該切断された色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含む方法。
【請求項２４】
分子標識アッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、該プローブは、該蛍光色素が該消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと；
該色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
該標的が存在する場合、該プローブを該標的とハイブリッド形成させ、それによって該蛍光色素と該消光物質色素とを離すＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
該蛍光シグナルを、該消光していない蛍光色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含む方法。
【請求項２５】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
プライマーと、式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、該プローブは、該蛍光色素が該消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと
該色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
該プライマーを標的ＤＮＡとハイブリッド形成させ、それによって、標的ＤＮＡ上の該プローブを延長するＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
該延長されたプローブを熱変性し、該消光物質色素を切り離すステップと；
該延長されたプローブを冷却し、内部再配列を可能にし、標的特異的方法で該蛍光色素に蛍光発光させるステップと；
該蛍光シグナルを該蛍光色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、結合体化されたアルソン酸から誘導された、強化された極性を有する、新規な蛍光色素、消光物質色素およびマイナーグルーブバインダに関する。さらに、本発明は、細胞を染色する方法、タンパク質をラベルする方法および自動化合成条件下で極性アルソナート色素を結合体化したオリゴヌクレオチドプローブを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
色素でラベルされた合成オリゴヌクレオチドは、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ標的用の配列特異的プローブとして、何年も使用されてきている。これらの方法は、特異的核酸標的の識別および定量を可能にするため、法医学的分子生物学および医学的診断において広い用途を有している。ＤＮＡプローブの初期の用途は、放射性ラベル（代表的には、３２Ｐ）を依存していたが、最近の方法は、化学発光および蛍光基を含むレポーター分子を使用する。改良された機器設備によって、これらの分光光度法の感度は、放射性ラベル化の方法に迫るあるいは越えることを可能にしている。高量子収率を持つ蛍光色素は、特に、高感度検出試薬が望まれる、生物学的用途に適している。
【０００３】
近年開発された検出方法は、プローブハイブリダイゼーションの検出のために、蛍光強度の直接検出ではなく、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）方法を採用する。このタイプのアッセイでは、消光物質分子の吸収スペクトルがドナー蛍光団の放射スペクトルと重なり、２つの分子が接近した場合、ＦＲＥＴがドナー蛍光団（レポーター）とアクセプター分子（消光物質）との間で起こる。ドナー蛍光団の励起状態のエネルギーは、共鳴双極子誘起双極子相互作用によって隣のアクセプターに移動し、ドナー蛍光の消光に帰する。ドナー分子とアクセプター分子との間のエネルギー移動の効率は、分子間の距離に非常に依存する。蛍光消光の他のメカニズムも知られ、たとえば、衝突または電荷移動消光がある。
【０００４】
通常、ＦＲＥＴに基礎を置く検出方法は、ドナー蛍光の消光が効率的であるようにドナー蛍光団およびアクセプター分子が接近するように設計されている。アッセイの間、ドナー分子とアクセプター分子は、蛍光が起こるように離れている。ＦＲＥＴ系検出アッセイは、核酸ハイブリダイゼーションおよび酵素化学の分野で発展してきた。ＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイの数種のフォームが見直されている（非特許文献１）。消光は、また、非ＦＲＥＴメカニズム、たとえば、衝突消光（非特許文献２参照）によっても起こる。
【０００５】
レポーター蛍光団と消光物質とを含むオリゴヌクレオチドプローブは、通常、非蛍光性である。しかし、そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、検出可能な蛍光を放出することにより、ハイブリダイゼーションが起こった後、標的配列の存在をレポートすることが可能である。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ方法は、オリゴヌクレオチドプローブの配置を変え、あるいはプローブからの色素を酵素的に切断するので、レポーター蛍光団および消光物質は、物理的に離れはじめ、蛍光はそれによって回復する。ＤＮＡ増幅が「リアルタイム」ＰＣＲで起こる時、蛍光性となるオリゴヌクレオチドプローブを使用するアッセイフォーマットは、詳細が、非特許文献３および非特許文献４）に記載されている。さらに、リアルタイムＰＣＲにおいてＤＮＡプローブとして有用な蛍光団−オリゴヌクレオチド−消光物質結合体は、詳細が、特許文献１、特許文献２および特許文献３に記載されている。
【０００６】
しかし、蛍光色素および消光物質は、それらの一般的な疎水性特性により、核酸プローブの物理的特性が実質的に変化するかもしれない。プローブが複数の色素を結合体化している場合、またはプローブが、マイナーグルーブバインダまたはインターカレータのように、プリンの多い配列または他の疎水性残基を含む場合、これは、特に難しい問題である。
【０００７】
この問題は、数種の極性基、通常、スルホン酸基含有色素をプローブに導入することによって部分的に解決されている。スルホン酸基は、色素分子に負の電荷をもたらし、該電荷は、スルホニル部分によって与えられる増加した極性によって、凝集体を形成する分子の固有の傾向を減らす［非特許文献５］。また、環スルホン化も、Ｃｙ３、Ｃｙ５［非特許文献６］、カスケードブルー［非特許文献７］の様な多くの色素の明るさを水性媒体中で増加し、ローダミン色素の光安定性を大きく増す［非特許文献８］。これらの色素のいくつかは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から市販されており、商標Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素として知られている。これらの水溶性色素は、活性化スクシンイミジルエステルとして販売され、タンパク質および核酸用の普及したラベルである。極性スルホニル蛍光色素は、特許文献５、特許文献６および特許文献７に記載されている。
【０００８】
高い量子効率および親水性を保持するように、向上した特性を有する、生物学的染色のための極性色素、オリゴヌクレオチドプローブおよび極性色素に結合体化するタンパク質を提供すること、および自動化合成により、そのような色素標識プローブを提供することの必要性が業界には残っている。
【特許文献１】米国特許第６，７２７，３５６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６５３，４７３号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３２３，３３７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，１３０，１０１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２６８，４８６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３９９，３９２号明細書
【非特許文献１】Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９２年，ｐ．３１１−３５２
【非特許文献２】Ｗｅｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年，第６６巻，ｐ．１５００−１５０６
【非特許文献３】Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９８年，第１６巻，ｐ．４９−５３
【非特許文献４】Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９３年，第２１巻，ｐ．３７６１−３７６６
【非特許文献５】Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｒ．Ｂ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｌ．Ａ．，Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｓ．Ｒ．，Ｌｅｗｉｓ  ＣＪ．，Ｗａｇｇｏｎｅｒ  Ａ．Ｓ．，「Ｃｙａｎｉｎｅ  ｄｙｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ：ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ．」，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年，第４巻，ｐ．１０５−１１１
【非特許文献６】Ｗｅｓｓｅｎｄｏｒｆ  Ｍ．Ｗ．，Ｂｒｅｌｊｅ  Ｔ．Ｃ．，「Ｗｈｉｃｈ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ｉｓ  ｂｒｉｇｈｔｅｓｔ？Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｃｅｉｎ，ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ａｎｄ  Ｃｙａｎｉｎｅ  ３．１８．」，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２年，第９８巻，ｐ．８１−８５
【非特許文献７】Ｗｈｉｔａｋｅｒ  Ｊ．Ｅ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．，Ｍｏｏｒｅ  Ｐ．Ｌ．，Ｈｅｗｉｔｔ  Ｐ．Ｃ．，Ｒｅｓｓｅ  Ｍ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．，「Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ，ｒｅａｃｔｉｖｅ，ｂｌｕｅ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｙｅｓ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｃｅｒｓ．」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，第１９８巻，ｐ．１１９−１３０
【非特許文献８】Ｐａｎｃｈｕｋ−Ｖｏｌｏｓｈｉｎａ  Ｎ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．，Ｂｉｓｈｏｐ−Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｊ．，Ｂｈａｌｇａｔ  Ｍ．Ｋ．，Ｍｉｌｌａｒｄ  Ｐ．Ｊ．，Ｍａｏ  Ｆ．，Ｌｅｕｎｇ  Ｗ．−Ｙ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．，「Ａｌｅｘａ  Ｄｙｅｓ，ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ｔｈａｔ  Ｙｉｅｌｄ  Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｂｒｉｇｈｔ，Ｐｈｏｔｏｓｔａｂｌｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．」，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，１９９９年，第４７巻，第９号，ｐ．１１７９−１１８８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、少なくとも１つのアルソナート基を含む新規な色素、およびそれに結合体化するオリゴヌクレオチドプローブおよびタンパク質を提供する。さらに、本発明は、自動化合成によって、アルソナート含有色素でラベルされたオリゴヌクレオチドを製造する方法、およびアルソナート色素標識オリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。
【００１０】
したがって、一実施形態で、本発明は、１種以上のアルソナート基で置換された蛍光化合物を含む極性蛍光色素であって、該蛍光化合物は、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間で励起と、４４０ｎｍと１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光とを有する蛍光色素を提供する。
【００１１】
他の実施形態で、本発明は、式（Ｉ）：
【００１２】
【化１０】
2008535945.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、水素、アルキル、−ＣＨＯ、−ＮＯ２、−ＣＨ２Ｒ１１、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ２は、水素、−ＣＮ、アルキル、アラルキル、ハロアルキルまたは−ＣＨ２Ｒ１１であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ４は、−ＮＲ１２Ｒ１３であり、ここで、Ｒ１２およびＲ１３は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニルであり、またはＲ１２およびＲ１３は一緒になって複素環を形成し；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ１１は、−ＣＯＯＨ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ１１の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）で表される化合物を提供する。
【００１３】
他の実施形態で、本発明は、式（ＩＩ）：
【００１４】
【化１１】
2008535945.tif 000004
（式中、
Ｒ１５は、水素、アルキル、アラルキル、ハロアルキルまたは−ＣＮであり；
Ｒ１６は、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ１７およびＲ１８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたはハロアルキルであり；
Ｒ１９は、水素、場合によってはヒドロキシ、ハロゲン、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ２ＯＨで置換されているアルキル、場合によってはヒドロキシ、ハロゲン、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ２ＯＨで置換されているアリール、または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基である）で表される化合物を提供する。
【００１５】
他の実施形態で、本発明は、式（ＩＩＩ）：
【００１６】
【化１２】
2008535945.tif 000005
（式中、
ｍは、１、２、３、４または５であり；
Ｒ２４およびＲ２５は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８およびＲ２９は、同じまたは異なり、独立して、水素、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されているアルキルまたはアリールであり；
Ｒ３１およびＲ３２は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ３０は、独立して、水素、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３３、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アリール、アルキルチオ、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＳＯ２Ｒ３３、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３３は、ヒドロキシ、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＳＯ３Ｒ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＡｓ（＝Ｏ）（ＯＲ３４）２、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＯＲ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＯＲ３４または−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＮ（Ｒ３４）２（ｊは２〜６の間の整数）であり；
各Ｒ３４は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２４およびＲ２８は、場合によっては、５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２５およびＲ２９は、場合によっては、５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２６およびＲ２８は、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５〜９員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２７およびＲ２９は、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５〜９員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２６およびＲ３１は、場合によっては、水素、アルキル、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２７およびＲ３２は、場合によっては、水素、アルキル、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；および
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）で表される化合物を提供する。
【００１７】
他の実施形態で、本発明は、式（ＩＶ）：
【００１８】
【化１３】
2008535945.tif 000006
（式中、
各Ｒ３５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
ｎは、１、２または３であり；
ｐは、１または２であり；
各Ｒ３６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ３７およびＲ３８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールまたは−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３９は、場合によっては、１個以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ３５およびＲ３６の少なくとも１個は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）で表される化合物を提供する。
【００１９】
他の実施形態で、本発明は、式（Ｖ）：
【００２０】
【化１４】
2008535945.tif 000007
（式中、
ｖは、０、１、２、３、４、５または６であり；
Ｙは、各環において６個の原子を有する１または２個の縮合芳香族環を形成するために必要な原子を示し、各環原子は、同じまたは異なり、独立して、＝ＣＲ４６−、＝Ｎ＋Ｒ４７−または＝Ｎ−であり；
Ｗは、各環において６個の原子を有する１または２個の縮合芳香族環を形成するために必要な原子を示し、各環原子は、同じまたは異なり、独立して、＝ＣＲ４６−、＝Ｎ＋Ｒ４７−または＝Ｎ−であり；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｃ（Ｒ４８）２−または−ＮＲ４９−であり；
Ｒ２０およびＲ２３は、同じまたは異なり、独立して、アルキル、アラルキルまたはヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、−ＣＯＯＨ、アルコキシ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはトリアルキルアンモニウムで置換されているアルキル、またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ５２およびＲ５３は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アルキル置換ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ２１および各Ｒ２２は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、メルカプト、アリールオキシ、複素環、イミニウムイオン、Ｌ−Ｒｘ、または２個の隣り合うＲ２１およびＲ２２あるいは任意の２個の隣り合うＲ２２は、場合によっては、アルキル、ハロゲンまたはオキソで置換されている４、５または６員環の炭素環を形成し；あるいは１個の炭素をはさんだ２個のＲ２２は、それらが結合する炭素と一緒になって、場合によっては、アルキル、ハロゲン、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ（＝Ｏ）、＝Ｓまたは＝Ｃ（Ｒ５０）２で置換されている４、５または６員環の炭素環を形成し；
Ｒ４６およびＲ４７はそれぞれ同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ４８およびＲ４９はそれぞれ同じまたは異なり、独立して、水素または場合によっては、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されるアルキルであり；
各Ｒ５０は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、シアノ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ４８であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ２０、Ｒ２３、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２およびＲ５３の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）またはＡｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）で表される化合物を提供する。
【００２１】
他の実施形態で、本発明は、式（ＶＩ）：
【００２２】
【化１５】
2008535945.tif 000008
（式中、
ｙは、１、２または３であり；
ｘは、０、１、２または３であり；
各Ｒ５６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ５７は、アルキル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、−ＣＯＯＨ、アルコキシ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはトリアルキルアンモニウムで置換されているアラルキルまたはアルキル、またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ５８ａおよびＲ５８ｂは、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｒ５９は、水素、アルキルまたはアラルキルであり；
各Ｒ６０は、同じまたは異なり、独立して、水素、−ＮＲ６１ａＲ６１ｂ、アルキル、アリール、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ６１ａおよびＲ６１ｂは、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ５６、Ｒ５８ａ、Ｒ５８ｂ、Ｒ６０およびＲ６１ａおよびＲ６１ｂの少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）で表される化合物を提供する。
【００２３】
他の実施形態で、本発明は、式（ＶＩＩ）：
【００２４】
【化１６】
2008535945.tif 000009
（式中、
各Ｒ６２は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
各Ｒ６３およびＲ６４は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ６２、Ｒ６３およびＲ６４の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）で表される化合物を提供する。
【００２５】
他の実施形態で、本発明は、式（ＶＩＩＩ）：
【００２６】
【化１７】
2008535945.tif 000010
（式中、
ｚは、１、２または３であり；
Ｔは、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｓ（＝Ｏ）２であり；
Ｑは、−ＯＲ７１または−ＮＲ７２Ｒ７３であり；
Ｕは、−ＯＲ７４または−ＮＲ７５Ｒ７６であり；
各Ｒ６８およびＲ６５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アリールまたは−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ６６およびＲ６７は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルまたはＬ−Ｒｘであり；
各Ｒ７０は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
各Ｒ７１およびＲ７４は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルカルボニルまたはアリールカルボニルであり；
各Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５およびＲ７６は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり；あるいは
Ｒ７１およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７４およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７２およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７３およびＲ６６は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７５およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７６およびＲ６７は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ６５、Ｒ６６、Ｒ６７、Ｒ６８およびＲ７１の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む）で表される化合物を提供する。
【００２７】
他の実施形態で、本発明は、式（ＩＸ）：
【００２８】
【化１８】
2008535945.tif 000011
（式中、
Ｒ４０およびＲ４３は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アリール、アルコキシまたは−Ｌ−Ｒｘであり、ただし、Ｒ４０およびＲ４３の少なくとも１つは−Ｌ−Ｒｘであり；
各Ｒ４１は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
ｑは、０、１または２であり；
Ｒ４２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ４１およびＲ４２の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）で表される化合物を提供する。
【００２９】
一つの態様で、本発明は、アルソナートエステル基を有する色素で置換されているオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド結合体を提供する。
【００３０】
特に、該色素は、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間に励起を、４４０と１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光を有する蛍光色素、あるいはオリゴヌクレオチドが標的に結合する前に、報告蛍光団から発せられた蛍光を吸収するように構成された非蛍光性消光物質である。通常、色素は、式（Ｉ〜ＶＩＩＩ）のいずれかによって示される。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、さらに、ＭＧＢ基を含んでもよい。通常ＭＧＢ基は、極性アルソナート基で置換されている。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドが、分子標識、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ、サンライズプローブ、立体配置的に補助されたプローブおよびＴａｑＭａｎＴＭプローブから選択されたプローブであるオリゴヌクレオチド結合体を提供する。
【００３２】
他の態様では、本発明は、標的核酸を直接的に検出する方法であって、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）で表される１種以上の色素化合物に結合体化するオリゴヌクレオチドを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得、該オリゴヌクレオチドは、さらに、１以上の極性アルソナート基で場合によっては置換されているＭＧＢを含み；色素標識オリゴヌクレオチドプローブを生物学的サンプルに添加し、該プローブは、標的核酸に対して相補的または実質的に相補的であり；プローブを、適切な条件下で充分な時間、標的核酸とハイブリッド形成し；色素から放射された蛍光を検出する方法を提供する。
【００３３】
他の態様では、本発明は、式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）（式中、Ｒｘはホスホルアミダイト基である）でのいずれかの色素試薬を使用して、自動化合成でオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、ホスホルアミダイト方法を使用して、オリゴヌクレオチドの自動化合成を実施して、色素標識オリゴヌクレオチドを得；色素標識オリゴヌクレオチドの−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を脱保護し、−ＡｓＯ３２−または−ＡｓＯ３Ｈ−から選択される負電荷極性基を有する色素標識オリゴヌクレオチドを得；色素標識オリゴヌクレオチドを反応媒体から単離する方法を提供する。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、プローブは、蛍光色素が消光物質色素によって消光されるようにする配置にあり；色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加し；標的が存在する場合、プローブを標的とハイブリッド形成させ、標的をＴａｑポリメラーゼによって切断するＰＣＲ温度サイクルを実行し；蛍光シグナルを、切断色素からリアルタイムに読み取る方法を提供する。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、分子標識アッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、プローブは、蛍光色素が消光物質色素によって消光されるようにする配置にあり；色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加し；標的が存在する場合、プローブを標的とハイブリッド形成させ、それによって蛍光色素と消光物質色素とを離すＰＣＲ温度サイクルを実行し；蛍光シグナルを、消光していない蛍光色素からリアルタイムに読み取る方法を提供する。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、プライマーと、式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、プローブは、蛍光色素が消光物質色素によって消光されるようにする配置にあり；色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加し；プライマーを標的ＤＮＡとハイブリッド形成させ、それによって、標的ＤＮＡ上のプローブを延長するＰＣＲ温度サイクルを実行し；延長された熱変成プローブを熱変性し、消光物質色素を切り離し；延長されたプローブを冷却し、内部再配列を可能にし、標的特異的方法で蛍光色素に蛍光発光させ；蛍光シグナルを蛍光色素からリアルタイムに読み取る方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
先に記載したように、本発明は、新規な蛍光色素、消光物質および強化された極性を持つマイナーグルーブバインダに関する。さらに、本発明は、極性アルソナート色素でラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを、自動化合成の条件下で製造する方法に関する。
１．定義
本明細書で使用される以下の用語は、以下の意味を持つ。
【００３８】
「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子を有する、直鎖または分岐状、非環状または環状、不飽和または飽和脂肪族炭化水素を意味し、一方用語「低級アルキル」は、アルキルと同じ意味を持つが、１〜６個の炭素原子を含む。代表的な飽和直鎖アルキルとして、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられ、一方、飽和分岐状アルキルとして、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環状アルキルとして、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２−シクロヘキシルなどが挙げられ、一方、不飽和環状アルキルとして、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、−ＣＨ２−シクロヘキセニルなどが挙げられる。また、環状アルキルは、本明細書では、「シクロアルキル」とも言う。不飽和アルキルは、隣り合う炭素原子の間に少なくとも１個の二重または三重結合を含む（それぞれ、「アルケニル」または「アルキニル」と言う）。代表的な直鎖および分岐状アルケニルとして、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブンテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられ、一方代表的な直鎖および分岐状アルキニルとして、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが挙げられる。他に規定されない限り、本発明のアルキルは、場合によっては、１個以上の任意の本明細書で規定するような「置換基」によって、置換されうる。
【００３９】
「アラルキル」は、アリール基によって置換されたアルキルを言う。該アルキルおよびアリール基は本明細書に規定した通りである。他に規定されない限り、本発明のアラルキルは、場合によっては、１個以上の任意の本明細書で規定するような「置換基」によって置換されうる。
【００４０】
「アルコキシ」は、式：−Ｏ−アルキルのラジカルを言う。例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシなどが挙げられる。低級アルコキシは、１〜５個の炭素を含む基を言う。
【００４１】
「アシル」は、式：−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（式中、Ｒは、アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、複素環またはヘテロアリールであり、アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、複素環およびヘテロアリールは本明細書で規定する通りである）で表されるラジカルを言う。代表的なアシル基として、アセチル、ベンゾイル、プロピオニル、イソブチリル、ｔ−ブトキシカルボニルなどが挙げられる。
【００４２】
「アリール」は、場合によっては置換されているフェニルまたはナフチルを言う。アリールの規範的な置換基として、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル（ここで、アルコキシ部分は１〜１５個の炭素を含む）、アリールオキシカルボニル（ここで、アリールオキシ部分は６〜２０個の炭素を含む）またはヘテロアリールカルボニル（ここで、ヘテロアリール部分は３〜１５個の炭素原子を含む）の１種以上が挙げられる。他に規定されない限り、本発明のアリールは、場合によっては、１個以上の任意の本明細書で規定するような「置換基」によって置換されうる。
【００４３】
「アリールオキシ」は、式：−Ｏ−アリールで表されるラジカルを言う。アリールオキシの一例は、フェノキシである。
【００４４】
「アルキルカルボニル」は、式：−Ｃ（Ｏ）−アルキルで表されるラジカルを言う。例として、メチルカルボニル、エチルカルボニルなどが挙げられる。
【００４５】
「アリールカルボニル」は、式：−Ｃ（Ｏ）−アリールで表されるラジカルを言う。例として、フェニルカルボニルおよびナフチルカルボニルが挙げられる。
【００４６】
「アミノアルキル」は、１個以上の水素が、アミノ基で置き換えられたアルキルのサブセットを言う。アミノ基の水素は、さらに、１個以上のアルキル、アリール、シクロアルキル、複素環またはヘテロアリールによって置換されうる。
【００４７】
「モノアルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」は、１または２個の水素がそれぞれアルキル基で置き換えられたアミノ基を言う。
【００４８】
「トリアルキルアンモニウム」は、式：−Ｎ＋（アルキル）３で表されるカチオンを言う。
【００４９】
「アルキルチオ」は、式：−Ｓ−アルキルで表されるラジカルを言う。アルキルは本明細書で規定する通りである。
【００５０】
「アリールチオ」は、式：−Ｓ−アリールで表されるラジカルを言う。アリールは本明細書で規定する通りである。
【００５１】
「２−シアノアルキル」は、１個以上の水素がシアノ基で置き換えられたアルキルのサブセットを言う。２−シアノアルキルの一例は、シアノエチルである。
【００５２】
「炭素環」は、飽和、部分的に飽和（不飽和）あるいは芳香族である、炭素環原子のみを有する、３〜７員環単環、または７または１４員環２環または３環状環を意味する。炭素環は、さらに、１〜５個の本明細書で規定するような置換基で置換されてもよい。芳香族炭素環は、本明細書では、「アリール」とも言う。炭素環の例として、炭素環状ラジカルがあり、シクロヘキサン、シクロヘキセン、ノルボルナン、ニルボルネン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、フェニル、ナフタレニル、インダニル、インデニル、アズレニル、フルオレニル、アントラセニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。他に規定されない限り、本発明の炭素環は、場合によっては、１個以上の任意の本明細書で規定するような「置換基」によって置換されうる。
【００５３】
「電子吸引基」は、電子が不足するあるいは正に帯電した部分を言う。例として、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｓ（Ｏ）２−アルキルおよび−Ｎ＋（アルキル）３が挙げられる。
【００５４】
「ハロアルキル」は、１個以上の水素がハロゲンで置き換えられたアルキルのサブセットを言う。ハロアルキルの一例は、トリフルオロメチルである。
【００５５】
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を言う。
【００５６】
「複素環」は、飽和、不飽和または芳香族の、窒素、酸素、硫黄およびヒ素から独立して選択される１〜４個の複素原子を含む、５〜７員環単環または７〜１０員環２環、複素環状環であって、窒素および硫黄複素原子は、場合によっては酸化されてもよく、窒素複素原子は、場合によっては、四級化されてもよい環であり、前記任意の複素環が縮合されベンゼン環を形成する２環状環を含む。複素環は、場合によっては、１〜５個の置換基で置換されてもよい。複素環は、任意の複素原子または炭素原子を介して結合してもよい。芳香族複素環は、「ヘテロアリール」とも言う。代表的なヘテロアリールは、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、アザインドリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ベンゾキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾキサジアゾリル、チアジアゾリル、インダゾリルおよびキナゾリニルである。上に列挙したヘテロアリールに加えて、複素環は、モルホリニル、ピロリジノリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなども含む。他に規定されない限り、本発明の複素環は、場合によっては、１個以上の任意の本明細書で規定するような「置換基」によって置換されうる。
【００５７】
「オキソ」は＝Ｏを言う。
【００５８】
「スルホニル」は、式：−ＳＯ３Ｒ（式中、Ｒは、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは生物学的適合性カチオンである）で表されるラジカルを言う。
【００５９】
「アルキルスルホニル」は、式：−ＳＯ３−アルキルで表されるラジカルを言い、アルキルは本明細書で規定する通りである。
【００６０】
「ホスホニル」は、式：−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）（ＯＲ’’）（式中、Ｒ’およびＲ’’はそれぞれ同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは生物学的適合性カチオンである）で表されるラジカルを言う。
【００６１】
用語本明細書で使用する「置換された」は、前記基の任意のもの（たとえば、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリールおよび複素環）であって、少なくとも１個の水素原子が置換基で置き換えられたものを意味する。関連する用語「置換基」は、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、アルキルスルホニル、メルカプト、シアノ、ニトロ、−ＣＯＯＨ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリール、複素環、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲｃＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂまたは式：−Ｊ−Ｇ−Ｒａ［式中、Ｊは、アルカンジイル、置換アルカンジイルまたは直接結合であり、アルカンジイルは、同じまたは異なる炭素原子から取った２個の水素原子を有する２価のアルキルを言い；Ｇは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−または直接結合（ここで、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、同じまたは異なり、独立して、水素、アミノ、アルキル、置換アルキル（ハロゲン化アルキルを含む）、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環または置換複素環であり、あるいはＲａおよびＲｂは、これらが結合する窒素原子と一緒になって、複素環または置換複素環を形成する）である］を言う。
【００６２】
「蛍光団」は、４００と１１５０ｎｍとの間の蛍光放射極大を持つ化合物を言う。通常、蛍光団は、電子が非局在化している延長共役システムを有する化合物である。これらの化合物として（括弧内はｎｍで示した放射極大である）、Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＧＦＰ（Ｒｅｄ  Ｓｈｉｆｔｅｄ）（５０７）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＴＭ−１（５０９）、カルセイン（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、ローダミン１１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、ローダミン１２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ（登録商標）−１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、フィコエリトリンＲ＆Ｂ（５７５）、ローダミンファロイジン（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、ピロニンＹ（５８０）、ローダミンＢ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５），Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（６１５）、ナイルレッド（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−フィコシアニン（６４２）、Ｃ−フィコシアニン（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ（登録商標）−３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、チアジカルボシアニン（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）が挙げられる。本発明の目的のために、蛍光団は、アルソナート基のような負電荷極性基１個以上で修飾することができる。先に検討したように、これらの修飾蛍光団の極性の増加によって、オリゴヌクレオチドのような生物物質に結合体化した後でさえそれらの量子収率を高く保持する傾向がある。
【００６３】
「オリゴヌクレオチド」は、約３〜１００個のヌクレオチド単位のオリゴマーを言う。ヌクレオチド単位は、核酸中に自然に見られる主要な複素環塩基（ウラシル、シトシン、チミン、アデニンおよびグアニン）全て、および天然起源のおよび合成された変種、ならびにこれらの塩基の類縁体、たとえば、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−Ｎ４エテノシトシン、４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよび６−アミノ−４−ヒドロキシ［３，４，ｄ］ピリミジンを含む。オリゴヌクレオチドの「糖」あるいはグリコシド部分は、デオキシリボース、リボース、２−フルオロリボース、２−Ｏアルキルまたはアルケニルリボース（ここで、アルキル基は１〜６個の炭素を有してもよく、アルケニル基は２〜６個の炭素を有してもよい）を含んでもよい。天然起源のヌクレオチドにおいて、および本明細書に記載された変種および類縁体において、デオキシリボースまたはリボース部分は、フラノース環を形成し、グリコシル結合は、β構造であり、プリン塩基は９−位で、ピリミジンは１−位で、ピラゾロピリミジンは１−位で糖部分に結合する。今のところ、本発明によれば、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）が好ましく、したがって、好ましい糖は、２−デオキシリボースである。ＯＤＮのヌクレオチド単位は、業界でよく知られているように、「リン酸塩」骨格によって相互接続している。「オリゴヌクレオチド結合体」は、一般的に、他の有機部分、たとえば色素化合物に共有結合で結合するオリゴヌクレオチドを言う。
【００６４】
本明細書で使用される用語「色素」は、通常、オリゴヌクレオチドまたはマイナーグルーブバインダのような生物物質に結合体化する、検出可能な色素化合物を広く言う。本明細書では、色素複合生物物質を「色素標識」生物物質とも言う。本発明の目的のために、色素は、蛍光色素、消光物質色素またはＩＲ色素が可能である。
【００６５】
蛍光色素は、その高い検出感度を蛍光団成分に負い、蛍光団成分は、消光物質も生物物質中に存在する場合、レポーター蛍光団も含む。用語「蛍光団」は、先に規定した通りである。通常は、蛍光色素は、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間に励起を、４４０と１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光を有する。
【００６６】
消光物質色素あるいは「消光物質」は、レポーター蛍光団が放射しないように、エネルギーポテンシャルを励起したレポーター蛍光団から引き離すように構成されている非蛍光発色団を言う。本発明では、消光物質は、通常は、マイナーグルーブバインダ（ＭＧＢ）を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとカップリングされている。
【００６７】
本発明のＩＲ色素は、ＵＶ視覚領域内で吸収し、ＩＲ領域（７８０〜１１５０ｎｍ）近傍で放射する。色素は、ＩＲ領域近傍で目に見えない状態で「輝き」、可視光域では非常に熱い金属に似ているので、通常、ＩＲ照射線を「熱線」と呼ぶ。したがって、生物学的標識の基本的な光学色素と同様に、ＩＲ色素標識は、可視光域内で放射し、現代の光学電子機器によって検出することができる。
【００６８】
「リンカー」は、蛍光団を物質に接触させ、結合体化する共有結合の多様な群である。共有結合は、安定な化学的結合の組合せが可能で、場合によっては、単、二重、三重または芳香族炭素−炭素結合、さらに炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合およびリン−窒素結合を含む。リンカーは、通常、少なくとも２官能性である。すなわち、２個の官能基を含み、そのうちの１個は蛍光団に結合するものであり、他は反応基に結合するものである。結合は、通常、カルボキシレートエステル、アミド、エーテル、チオエーテル、スルホンアミド、尿素、ウレタン、またはホスホルアミダイト部分を形成することになる。たとえば、多くの蛍光団は、カルボキシレートエステル、カルボキシアミド、またはスルホンアミド部分の形成によって、リンカーに容易にカップリングすることができるようにするカルボン酸またはスルホン酸基を有する。同様に、リンカーは、反応基にカップリングすることができ、これによって、興味のある物質に結合体化することになる。
【００６９】
通常、リンカーは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を有し、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジン結合および芳香族またはヘテロ芳香族結合の任意の結合で構成されている。共有結合は、直鎖または環状、あるいはこれらの組合せであってもよい。直鎖結合の例として、ポリメチレン、ポリエチレングリコール、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アミノアルコールおよびジオールが挙げられる。「アミノアルコール」は、式：−ＮＨ−Ｙ−Ｏ−（式中、Ｙは、アルカンジイルまたは置換アルカンジイルである）で表されるジラジカルを言い、アルカンジイルは、異なる炭素原子から取った２個の水素原子を有する２価のアルキルを言う。「ジオール」は、式：−Ｏ−Ｙ−Ｏ−（式中、Ｙは先に規定した通り）で表されるジラジカルを言う。環状基を有するリンカーは、通常、ヌクレオシドまたは修飾されたヌクレオシドを含む。これらのリンカーは、ホスホルアミダイト反応基と結合し、これは次いで、オリゴヌクレオチドの伸長骨格に簡単にカップリングすることができるので、オリゴヌクレオチドの自動化合成において特に有用である。リンカー中のヌクレオシドのリボース基の５’−末端ヒドロキシ基は、反応シーケンス中で次の塩基とカップリングすることによって、オリゴヌクレオチド鎖の伸長を継続することができる。リンカー中の５’−末端ヒドロキシ基は、通常、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基によって保護されている。さらに、ヌクレオシドリンカーの塩基上の他の基は、自動化合成の間保護が求められるかもしれない。保護すべき部位および使用すべき保護剤の認定は、当業者の知識の範囲内である。保護基は、通常、所定のリンカー内の１〜３０個の非水素原子は除外され数えられない。
【００７０】
「反応基」または「Ｒｘ」は、色素を興味のある物質に反応結合体化しうる官能基を言う。通常、該物質は、色素の共有結合に関して適切な官能基を有する「生物物質」または「生体分子」である。とりわけ、本発明の色素を結合体化するのに特に有用な適切な「生物物質」または「生体分子」として、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝物、毒物、環境汚染物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸高分子、炭水化物、脂質、イオン錯形成部分および非生物学的高分子が挙げられる。あるいは、生物物質として、細胞、細胞系、細胞フラグメントまたは非細胞粒子が挙げられる。これらの中で、例として、ウィルス粒子、細菌粒子、ウィルス成分、生体細胞（たとえば、動物細胞、植物細胞、細菌、酵母、または原生生物）、あるいは細胞成分が挙げられる。好ましい生物物質は、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、チラミン、ポリサッカライド、イオン錯形成部分、ヌクレオチド、核酸高分子、ハプテン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、高分子、高分子微粒子、生物細胞またはウィルスが挙げられる。一実施形態では、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸高分子のような生体高分子の結合体も、本発明の追加の色素を含む、第２蛍光色素または消光物質色素でラベルされ、エネルギー移行ペアを形成する。
【００７１】
さらに典型的には、生物物質は、自動化合成における、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの成長鎖である。物質は、ＣＰＧまたはポリスチレンのような、通常オリゴヌクレオチドの自動化合成において使用される固形支持体も含みうる。結合体化されるべき物質に色素を結合するために使用される反応基の選択は、通常、複合すべき物質の反応部位および所望の共有リンカーのタイプまたは長さに依存する。先に記載した物質に関して存在する官能基のタイプは、通常、アミン類、チオール類、アルコール類、フェノール類、アルデヒド類、ケトン類、ホスフェート類、イミダゾール類、２置換アミン類、アルソナートエステル類、プリン類、ピリミジン類、カルボン酸類、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドは、同じまたは異なってもよい複数の色素と結合体化してもよい。たとえば、消光物質色素とレポーター蛍光団とを同じオリゴヌクレオチドに結合体化してもよい。反応条件の注意深いコントロールによりある選択性を得ることができるが、標識の選択性は、適正な反応基を持つ色素の選択によって得るのが最も良い。
【００７２】
通常、Ｒｘは、アミン、チオール、アルコール、アルデヒドまたはケトンと反応するであろう。一実施形態では、Ｒｘは、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、アルキルハライド、アミン、無水物、アニリン、アリールハライド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセタミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジン類を含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホルアミダイト、スルホニルハライドまたはチオール基である。好ましくは、Ｒｘは、カルボン酸、サクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホルアミダイト、アミン、ハロアセタミド、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、またはアジドパーフルオロベンザミド基である。
【００７３】
ある実施形態では、カルボン酸のサクシンイミジルエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルであるＲｘが、色素−オリゴヌクレオチド結合体を製造するために特に有用である。カルボキシル性官能基のこれらの活性化形態は、その上にあるアミン基のような反応部位を介してオリゴヌクレオチドまたは固形支持体に結合体化する。
【００７４】
他の実施形態では、ホスホルアミダイトであるＲｘが、オリゴヌクレオチドの自動化合成において特に有用である。ホスホルアミダイトは、弱酸性条件下でヒドロキシ基に対して反応性があり、自動化オリゴヌクレオチド合成において、オリゴヌクレオチドの成長鎖の５’−末端ヒドロキシ基と容易にカップリングするであろう。代表的なホスホルアミダイトは、シアノエチルホスホルアミダイトである。
【００７５】
「色素試薬」は、リンカーを介して反応基とカップリングする色素を言う。色素試薬は、オリゴヌクレオチド配列中の可変性位置に導入することができる構成ブロックである。具体的な必要性に依るが、色素試薬は、固形支持体の反応性部位に直接的に反応することができ、塩基付加の合成シークエンスを開始することができる。色素試薬は、オリゴヌクレオチドの成長鎖と反応することができ、該試薬の異なる部分上の保護ヒドロキシル基を介して、配列の伸長を継続することができる。最終的に、色素試薬は、５’−末端で、オリゴヌクレオチドの伸長を止めるために使用することもできる。先に検討したように、色素がホスホルアミダイト基にカップリングしている「ホスホルアミダイト試薬」は、自動化オリゴヌクレオチド合成にとって、特に有用である。
【００７６】
「極性基」は、より大きな電気陰性度と電子をひきつける傾向を持つ原子群全体を言い、近くの原子または原子群と分け合っている。極性基は、必ずというわけではないが、通常、負電荷である。極性基の例として、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）、ホスホン酸（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）、アルソン酸（−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）およびこれらのエステル類および塩類が挙げられる。
【００７７】
用語「アルソナート」は、一般的に、遊離アルソン酸（−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）で置換された有機部分および／またはアルソナートエステルを言う。用語「アルソナートエステル」は、遊離のアルソン酸の２個の保護形態のどちらか１つを言う。特に、アルソナートエステルは、式：−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ）２で表されるアルソナートジエステルまたは式：−Ａｓ（ＯＲ）４で表されるアルソナートオルソエステルでありうる。アルソナートジエステルは、類似の変換反応でケタール形態とし、式：−Ａｓ（ＯＲ）４で表されるアルソナートオルソエステルを得るのが有利である。
【００７８】
各Ｒは、同じまたは異なり、独立して、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、通常、アルキル−ＯＨ、アリール−ＯＨおよびヘテロアリール−ＯＨの反応残基である。さらに典型的には、アルソナートエステルの２個の任意のＲ基は互いに結合し、キレート形態をとってもよい。換言すれば、色素化合物のアルソン酸置換基は、２個または３個の炭素原子によって離された２個の酸素原子を有するキレート化剤と反応させることによって、キレート化エステル形態に変換することができる。そのようなキレート化剤として、エチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキザール、グリコール酸、グリオキシル酸、プロピレングリコール、ピナコール（２，３−ジメチル−２，３−ブタンジオール）、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、３−ヒドロキシプロピオン酸、マロンアルデヒドおよびピロカテコールが挙げられる。
【００７９】
アルソナートジエステルおよびアルソナートオルソエステル中のＲ基の存在によって、アルソン酸の電荷が中和され、それによって、自動化オリゴヌクレオチド合成におけるラベルされた色素試薬の親和性が強化される。本明細書の後で検討するように、Ｒ基は、容易に除去され、負電荷アルソン酸極性基を得る。
【００８０】
「アルキルアルソナート」は、１個以上のアルソナート基で置換されたアルキルを言う。「アリールアルソナート」は、１個以上のアルソナート基で置換されたアリール基を言う。「ヘテロアリールアルソナート」は、１個以上のアルソナート基で置換されたヘテロアリールを言う。
【００８１】
「固形支持体」は、オリゴヌクレオチド合成に沿う要請のある任意の支持体を言い、たとえば、ガラス、制御孔ガラス（ＣＰＧ）、高分子材料、ポリスチレン、被覆ガラスなどが挙げられる。「固形支持体」は、上で列挙した材料で作られたビーズ、ハチ巣、アレイまたはチップの形で使用することができる。
【００８２】
「生物学的適合性カチオン」は、生物学的適合性のある、正に帯電したイオンであって、生体分子に悪影響を与えないものを言う。なかでも、適切なカチオンとして、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、アンモニウム、アルキルアンモニウムまたはアルコキシアンモニウム塩、あるいはピリジニウム塩が挙げられる。
【００８３】
「マイナーグルーブバインダ」（ＭＧＢ）は、分子量が約１５０〜約２０００ドルトンの分子のラジカルを言い、これは、非挿入方法で、会合定数が約１０３Ｍ−１を超える、２本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのハイブリッドのマイナーグローブ中に結合する。そのような化合物は、大きく変化する化学構造を有するので、公知のマイナーグローブ結合化合物の全ての一般化学式は示せないが、ＤＮＡのマイナーグローブ中に結合しうる化合物は、一般的に言えば、半月形の３次元構造を有する。通常、ＭＧＢは、ペプチド結合を介して互いにカップリングした縮合複素環の数種の単位の化学構造を有する。
【００８４】
従来技術の殆どのマイナーグローブ結合化合物は、２本鎖ＤＮＡのＢ型の領域が多い、Ａ−Ｔ（アデニンおよびチミン）が強く好まれる。米国特許第５，８０１，１５５号明細書は、共役的に結合するマイナーグルーブバインダ（ＭＧＢ）を有するオリゴヌクレオチドは、相補的標的に関して、修飾されたオリゴヌクレオチドより配列特異的であると開示する。さらに、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド結合体は、より短いオリゴヌクレオチドとハイブリゼ−ションをされた非修飾オリゴヌクレオチドと比較した場合、相補的ＤＮＡ標的鎖とのハイブリッド安定性が実質的に増加する。
２．新規な色素および色素試薬
先に記載したように、強化された極性を持つ色素は、主にその高い水溶性および生物学的親和性のために、数多くの有用な適応を提供する。スルホン酸極性基を有する色素は、核酸およびタンパク質をラベルするために、さらに生体物質を染色するために、広く使用されている。市販の色素のいくつかの例を図１および２に示す。
【００８５】
アルソン酸ＨＡｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）２の有機誘導体は、１９世紀から公知であり、アゾ色素に水溶性を与える。多くのこれらの化合物が、新しい色素および薬物の研究においてＰａｕｌ  Ｅｈｒｌｉｃｈのような有名な科学者によって合成された。毒性が殆どないスルホネート類は、高極性が必要不可欠な色素特性である場合、殆どの適用のために次の世紀でより普及し始めた。今日、比較的少数のアルソン色素が、殆ど分析化学および生物医学研究における適用のために、使用されている。Ｔｈ、Ｕ、Ｚｒの検出用［Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ７１，３７５，１９７４］、およびＣｄ、Ｚｎ検出［Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９７４，６８，７３］用の、よく知られ、広く使用されている試薬ＡｒｓｅｎａｚｏＩＩＩ（２，７−ビス［（２−アルソノフェニル）アゾ］−１，８−ジヒドロキシ−３，６−ナフタレンジスルホン酸）は、Ｓａｖｖｉｎ  Ｓ．Ｂ．によって１９５９年合成された［見本用にＢａｓａｒｇｉｎ，Ｎ．Ｎ．，Ｉｖａｎｏｖ，Ｖ．Ｍ．，Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ  Ｖ．Ｖ．およびＭｉｋｈａｉｌｏｖａ  Ａ．Ｖ．“４０Ｙｅａｒｓ  ｓｉｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｓｅｎａｚｏ  ＩＩＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ”Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５５，Ｎｏ．３，２０００参照のこと］。アルソン酸色素は、タンパク質に関し特異的親和性を持つことが実証され、したがって、生体物質の選択的染色またはラベル付けに使用することができる。アルソノフェニルジアゾニウム塩とタンパク質との反応の結果得られるアルソノフェニルアゾタンパク質、アゾ色素は、凝結防止特性および抗リンパ腫特性を持つことが報告されている［Ｂｒｏｏｍｅ  Ｊ．Ｄ．およびＫｉｄｄ  Ｊ．Ｇ．“Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｒｓｅｎｉｃ  Ａｚｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｉ．Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｒｓｅｎｉｃ  Ａｚｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ａｒｅｓｅｎｉｃａｌｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｓ  Ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｍａ  Ａｇｅｎｔｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２０：４４９−４６６，１９６４］。アゾフェニルアルソン色素は、サブチリシンと結合体を形成することが示されている［Ｇｌａｚｅｒ  Ａ．Ｎ．“Ｔｈｅ  Ｔｉｍｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−（４’−Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｐｈｅｎｙｌａｒｓｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５９，９９６−１００２，１９６８］。
【００８６】
前記アルソン酸色素は蛍光性ではない。したがって、蛍光性アルソン酸色素は、その極性および高い検出可能蛍光シグナルのため、タンパク質および核酸の細胞染色およびラベル付けのような技術において、新しい利点を提供する。その高い感受性蛍光シグナルのため、これらの蛍光色素は、一般的に、非常に低い濃度で使用され、環境に悪影響を及ぼすことなく、あるいは非常に小さな影響しか及ぼさない。
【００８７】
３価のヒ素、またはＡｓ（ＩＩＩ）系蛍光色素は、そのチオールに対する高い親和性のため、生物学的ラベルとして使用される（たとえば、米国特許第６，９３３，３８４号、６，６８６，４５８号、６，４５１，５６９号、６，０５４，２７１号、６，００８，３７８号および５，９３２，４７４号明細書参照）。しかし、ヒ素（ＩＩＩ）化合物の毒性に関する懸念によってその適用が非常に制限されている。
【００８８】
Ａｓ（Ｖ）としても知られている５価のヒ素化合物は、Ａｓ（ＩＩＩ）よりも毒性がずっと少ない。したがって、本発明は、１個以上のアルソン酸基またはアルソナートエステル基で置換された新規な蛍光色素および消光物質色素を提供する。色素中に存在する各エステル基は、脱保護された時、負電荷を提供することができ、それによって、そのような色素でラベルされたオリゴヌクレオチドプローブの特性を改善することができる。
【００８９】
アルソン酸基は、数多くの公知の色素相溶性がある。アルソン酸基は、アルソン酸基が色素のスペクトル性質、たとえば、励起波長および放射波長、量子収率、蛍光性の寿命において、測定可能な変化を引き起こさない場合、所定の色素と併用可能である。アルソン酸基で修飾されうる色素の例として、以下の発色団およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ローダミン、キサンチン、カルボシアニン、フタロシアニン、ポルフィリン、トリフェニルメタン、スクアライン、チオスクアライン、クロコニウム色素、テトラゾリウム色素、インジゴ、アゾ色素、キノン、フェナジンおよびサフラニン、フェノチアジン、クマリン、フェナンチリジン、アクリジンおよびアクリドン、フルオレンおよびフルオレノン、４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン、１，８−ナフタルイミド。他の置換基として、極性の増強のための、スルホネートおよびホスホネートを挙げることができる。アルソン酸基を有するフッ化色素は、強化された光安定性およびより高い蛍光量子収率とともに、増強された極性および輝度を発揮しうる。フッ素原子は、複素環状環およびカルボシアニン架橋部に導入されうる。
【００９０】
さらに、本発明は、本発明の色素、リンカーおよび反応基を含む色素試薬を提供する。色素試薬は、オリゴヌクレオチド、マイナーグルーブバインダまたは固形支持体に反応して結合体化しうる。さらに具体的には、本発明は、極性アルソン酸置換基がそのエステル形態でマスクされている、修飾された極性蛍光および消光物質色素試薬を提供する。アルソナートエステルを含む色素は、オリゴヌクレオチドの合成のホスホルアミダイト方法に適合する有機溶剤に可溶である。色素の負の電荷を除去することによって、色素を自動化オリゴヌクレオチド合成に組み込むことができる。負の電荷は、合成後復元され、１個以上の極性基を持つ色素でラベルされたオリゴヌクレオチドを与える。したがって、これらのホスホルアミダイト試薬は、５’−ホスホルアミダイト試薬を使用する逆合成において、アルソナート色素を、合成オリゴヌクレオチドの５’末端、内部位置、または３’末端に導入するために使用することができる。オリゴヌクレオチド合成の完了時、アルソナートエステル類は、脱プロトン化することができ、負の電荷は復元される。
【００９１】
したがって、一実施形態で本発明は、アルソナート極性基を有する蛍光色素、およびそのような蛍光色素を含む色素試薬を提供する。該蛍光色素は、３４０ｎｍと１１００ｎｍとの間に励起を、４４０と１１５０ｎｍとの間に最高蛍光発光を有する。
【００９２】
具体的には、一実施形態では、本発明の化合物は、１個以上のアルソナート基によって置換された７−アミノコラミン誘導体である。本発明の７−アミノコラミン色素は、以下の一般式（Ｉ）で示される。
【００９３】
【化１９】
2008535945.tif 000012
（式中、
Ｒ１は、水素、アルキル、−ＣＨＯ、−ＮＯ２、−ＣＨ２Ｒ１１、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ２は、水素、−ＣＮ、アルキル、アラルキル、ハロアルキルまたは−ＣＨ２Ｒ１１であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ４は、−ＮＲ１２Ｒ１３であり、ここで、Ｒ１２およびＲ１３は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニルであり、またはＲ１２およびＲ１３は一緒になって複素環を形成し；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ１１は、−ＣＯＯＨ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ１１の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である。）
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１個が−Ｌ−Ｒｘを含む場合、式（Ｉ）は、オリゴヌクレオチド、ＭＧＢまたは固形支持体に結合しうるアルソナート色素試薬を示す。通常、Ｒ１１が、−Ｌ−Ｒｘ部分にカップリングすべき反応部位を提供する。たとえば、Ｒ１１が−ＣＯＯＨの場合、色素は、−ＮＨ２基を有する−Ｌ−Ｒｘ部分に容易にカップリングすることができ、アルソナート色素試薬を得る。そのようなアルソン酸色素のカルボン酸誘導体を以下に図示する。
【００９４】
【化２０】
2008535945.tif 000013
リンカーは、必ずしもそうではないが、通常、アルキレン鎖のような原子の直鎖基である。−ＮＨ２基を有していることに加えて、リンカーは、通常、反応基Ｒｘとさらにカップリングするために、他の反応性部位を有する。
【００９５】
市販の固形支持体のほとんどが、ＣＰＧのように、アミン基を持つので、固形支持体に結合するために、Ｒｘはアミン反応基である可能性がある。アミン反応基の例として、サクシンイミジルまたはペンタフルオロフェニルカルボキレートエステルのようなカルボン酸および活性化カルボン酸が挙げられる。特に自動化合成の間、オリゴヌクレオチドに結合するためには、Ｒｘはホスホルアミダイト基である。さらに、自動化オリゴヌクレオチド合成の目的のためには、そのような色素試薬中の極性アルソン酸基は、通常、それらのエステル形態、特にそれらのアルソナートオルソエステル形態にマスクされる。
【００９６】
式（Ｉ）の色素試薬の具体的な例では、以下の構造を持つ。
【００９７】
【化２１】
2008535945.tif 000014
この例では、７−アミノコラミンがアルソナートオルソエステルで置換されている。さらに、リンカー部分は、５−ヒドロキシ保護ヌクレオシド（たとえば、２−デオキシウリジン）を含む。反応基はホスホルアミダイトであり、これは、自動化合成中、容易にオリゴヌクレオチドとカップリングすることができる。脱保護後、ＤＭＴｒ保護５−ヒドロキシは、塩基付加の鎖を延ばすことができ、色素標識オリゴヌクレオチドの合成を完成する。負電荷アルソン酸基とは異なり、アルソナートエステル基は、自動化合成の反応条件と適合性がある。
【００９８】
他の実施形態では、本発明の化合物は、一般式（ＩＩ）で示される。
【００９９】
【化２２】
2008535945.tif 000015
（式中、
Ｒ１５は、水素、アルキル、アラルキル、ハロアルキルまたは−ＣＮであり；
Ｒ１６は、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ１７およびＲ１８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたはハロアルキルであり；
Ｒ１９は、水素、場合によってはヒドロキシ、ハロゲン、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ２ＯＨで置換されているアルキル、場合によってはヒドロキシ、ハロゲン、−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ２ＯＨで置換されているアリール、または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基である。）
通常、Ｒ１９が、−Ｌ−Ｒｘ部分にカップリングすべき反応部位を提供する。たとえば、Ｒ１９が−ＣＯＯＨ基を含む場合、色素は、−ＮＨ２基を有する−Ｌ−Ｒｘ部分に容易にカップリングすることができ、アルソナート色素試薬を得る。あるいは、Ｒ１９は−ＯＨ基を含んでもよく、これは、ホスホルアミダイト基に直接カップリングすることができる。色素試薬に容易に変換することができる色素として以下の例が示される。
【０１００】
【化２３】
2008535945.tif 000016
【０１０１】
【化２４】
2008535945.tif 000017
式（ＩＩ）の色素試薬の例は、以下の構造によって図示される。
【０１０２】
【化２５】
2008535945.tif 000018
この例では、リンカーはアルキレン鎖であり、反応基はホスホルアミダイト基である。アルソン酸極性基は、オルソエステル形態でマスクされる。自動化オリゴヌクレオチド合成では、オリゴヌクレオチドプローブの所定の配列において、最後の構成ブロックとして使用することができる。
【０１０３】
他の実施形態で、本発明の化合物は、１個以上のアルソナートエステル基で置換されたローダミンである。これらの化合物は、以下の一般式（ＩＩＩ）で示される。
【０１０４】
【化２６】
2008535945.tif 000019
（式中、
ｍは、１、２、３、４または５であり；
Ｒ２４およびＲ２５は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８およびＲ２９は、同じまたは異なり、独立して、水素、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されているアルキルまたはアリールであり；
Ｒ３１およびＲ３２は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ３０は、独立して、水素、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３３、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アリール、アルキルチオ、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＳＯ２Ｒ３３、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２または−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３３は、ヒドロキシ、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＳＯ３Ｒ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＡｓ（＝Ｏ）（ＯＲ３４）２、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＯＲ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＯＲ３４または−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＮ（Ｒ３４）２（ｊは２〜６の間の整数）であり；
各Ｒ３４は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２４およびＲ２８は、場合によっては、５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２５およびＲ２９は、場合によっては、５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２６およびＲ２８は、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５〜９員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２７およびＲ２９は、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５〜９員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２６およびＲ３１は、場合によっては、水素、アルキル、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ２７およびＲ３２は、場合によっては、水素、アルキル、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい５または６員環の複素環を形成してもよく；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；および
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む。）
一実施形態では、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８およびＲ２９は、それぞれ、水素である。Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ、アルソン酸である。したがって、式（ＩＩＩ）の色素は、以下の構造を有する。
【０１０５】
【化２７】
2008535945.tif 000020
通常、Ｒ３０が−Ｌ−Ｒｘ部分にカップリングすべき反応部位を提供する。たとえば、Ｒ３０が−ＣＯＯＨの場合、色素は、−ＮＨ２基を有する−Ｌ−Ｒｘ部分に容易にカップリングし、アルソナート色素試薬を得ることができる。アルソン酸色素のそのようなカルボン酸誘導体の例を以下に図示する。
【０１０６】
【化２８】
2008535945.tif 000021
他の実施形態では、Ｒ２６およびＲ３１は、場合によっては、５または６員複素環を形成してもよく、Ｒ２７およびＲ３２は、場合によっては、５または６員複素環を形成してもよい。規範的な化合物は、式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）による、以下の分子フレームワークを有し、ここで、各５または６員環は、場合によっては、それぞれ、Ｒ５４およびＲ５５で置換されている。各Ｒ５４およびＲ５５は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である。点線の結合は、Ｎ含有複素環において、異なる不飽和の度合いある可能性があることを示す。
【０１０７】
【化２９】
2008535945.tif 000022
【０１０８】
【化３０】
2008535945.tif 000023
通常、式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）のＮ含有複素環は、さらに、１個以上の置換基、Ｒ５４およびＲ５５で置換されている。Ｒ５４およびＲ５５は、それぞれ、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたは極性アルソン酸基で置換されているアルキルである。たとえば、Ｒ５４およびＲ５５は、それぞれ、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０１０９】
さらに、フェニル基は１個以上のＲ３０基で置換されている。通常、Ｒ３０が対応色素試薬の−Ｌ−Ｒｘ部分を提供する。たとえば、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＳＯ３Ｒ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ＪＡｓ（＝Ｏ）（ＯＲ３４）２、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＯＲ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＯＲ３４または−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＮ（Ｒ３４）２（ｊは、２〜６の間の整数）のような−Ｌ−Ｒｘ部分は、フェニル基の−ＳＯ３Ｈまたは−ＣＯＯＨ置換基にカップリングすることができる。Ｒ３４は、通常、反応基（Ｒｘ）であり、アルキル、アリール、ヘテロアリールである可能性がある。たとえば、Ｒ３４は、ペンタフルオロフェニルまたはマレイミドである。式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）の色素のカルボン酸誘導体の例を以下に図示する。対応する色素試薬のいくつかを表１に示す。
【０１１０】
【化３１】
2008535945.tif 000024
【０１１１】
【化３２】
2008535945.tif 000025
さらなる実施形態では、式（ＩＩＩＢ）のＲ２４およびＲ２８は、場合によっては、５または６員複素環を形成してもよく、Ｒ２５およびＲ２９は、場合によっては、５または６員複素環を形成してもよい。規範的な化合物は、式（ＩＩＩＣ）による、以下の分子フレームワークを有する。
【０１１２】
【化３３】
2008535945.tif 000026
点線の結合は、Ｎ含有複素環において、異なる不飽和の度合いある可能性があることを示す。各Ｎ含有複素環は、場合によっては、−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されうる。
【０１１３】
通常、Ｒ３０が、追加の極性基を提供する。たとえば、Ｒ３０は、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ２）ｊＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ２）ｊＡｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、−ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＯＨまたは−ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ２）ｊＯＨ（ｊは２〜６の間の整数）である。
【０１１４】
あるいは、Ｒ３０が、対応色素試薬の−Ｌ−Ｒｘ部分を提供する。たとえば、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＳＯ３Ｒ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＡｓ（＝Ｏ）（ＯＲ３４）２、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＯＲ３４、−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＯＲ３４または−ＮＨ（ＣＨ２）ｊＮ（Ｒ３４）２（ｊは２〜６の間の整数）のような−Ｌ−Ｒｘ部分は、フェニル基の−ＳＯ３Ｈまたは−ＣＯＯＨ置換基にカップリングすることができる。Ｒ３４は、通常、反応基（Ｒｘ）であり、アルキル、アリール、ヘテロアリールである可能性がある。たとえば、Ｒ３４はペンタフルオロフェニルまたはマレイミドである。式（ＩＩＩＣ）のそのような色素試薬の例を表Ｉに示す。
【０１１５】
さらなる実施形態では、Ｒ２７およびＲ２９は、場合によっては、５〜９員複素環を形成してもよく、Ｒ２６およびＲ２８は、場合によっては、５〜９員複素環を形成してもよく、各複素環は、場合によっては、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されてもよい。一実施形態では、各Ｎ含有複素環は５または６員環である。他の実施形態で、各Ｎ含有複素環は、９員環２環状環である。規範的な分子フレームワーク、式（ＩＩＩＤ）を以下に示す。
【０１１６】
【化３４】
2008535945.tif 000027
式（ＩＩＩ）の化合物の全てが蛍光性ではないことが認められる。窒素が自由に回転する場合、換言すれば、ベンゼン環で縮合環内に閉じ込められていない場合、該化合物は、光のエネルギーを熱として発散することができる。そのような化合物は、本明細書で規定するような消光物質として使用することができる。たとえば、式（ＩＩＩＡ）〜（ＩＩＩＣ）で示される化合物は、蛍光化合物であり、式（ＩＩＩＤ）で示される化合物は消光物質である。
【０１１７】
先に検討したように、Ｒ３０基の１つが−Ｌ−Ｒｘの場合、式（ＩＩＩ）の化合物は、色素試薬である。特に、自動化オリゴヌクレオチド合成の目的のために、色素試薬中の極性基は、通常、それらのアルソナートエステル形態でマスクされる。式（ＩＩＩ）の蛍光性ローダミン色素試薬およびローダミン消光物質色素試薬の具体的な例を表１に示す。それらの活性化エステル形態の追加のローダミン消光物質色素を図７に図示する。
表Ｉ
【０１１８】
【表１】
2008535945.tif 000028
【０１１９】
【表２】
2008535945.tif 000029
【０１２０】
【表３】
2008535945.tif 000030
ａ．消光物質色素
ｂ．反応性カルボキシル基は、ＣＰＧ支持体の−ＮＨ２基とカップリングする。
【０１２１】
他の実施形態で、本発明は、強化された極性を有する蛍光消光物質色素および自動化合成用のその対応色素試薬を提供する。消光物質色素およびその試薬は、以下の一般式（ＩＶ）で表すことができる。
【０１２２】
【化３５】
2008535945.tif 000031
（式中、
各Ｒ３５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
ｎは、１、２または３であり；
ｐは、１または２であり；
各Ｒ３６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３−、アルコキシ、アミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３９、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ３７およびＲ３８は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールまたは−Ｌ−Ｒｘであり；
Ｒ３９は、場合によっては、１個以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２で置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ３５およびＲ３６の少なくとも１個は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である。）
Ｒ３７およびＲ３８の少なくとも１つが−Ｌ−Ｒｘの場合、本発明は、自動化オリゴヌクレオチド合成に適切な色素試薬を提供する。アルソナート基を持つ蛍光消光物質色素試薬の例を以下に示す。
【０１２３】
【化３６】
2008535945.tif 000032
【０１２４】
【化３７】
2008535945.tif 000033
他の代表的なリンカーおよび反応基は、米国特許第６，６５３，４７３号および第６，７２７，３５６号明細書に記載されているものである。極性消光物質色素試薬の追加の例示を図１０に図示する。
【０１２５】
他の実施形態で、本発明は、蛍光性カルボシアニン色素誘導体および以下の一般式（Ｖ）で表される色素試薬を提供する。
【０１２６】
【化３８】
2008535945.tif 000034
（式中、
ｖは、０、１、２、３、４、５または６であり；
Ｙは、各環において６個の原子を有する１または２個の縮合芳香族環を形成するために必要な原子を示し、各環原子は、同じまたは異なり、独立して、＝ＣＲ４６−、＝Ｎ＋Ｒ４７−または＝Ｎ−であり；
Ｗは、各環において６個の原子を有する１または２個の縮合芳香族環を形成するために必要な原子を示し、各環原子は、同じまたは異なり、独立して、＝ＣＲ４６−、＝Ｎ＋Ｒ４７−または＝Ｎ−であり；
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｃ（Ｒ４８）２−または−ＮＲ４９−であり；
Ｒ２０およびＲ２３は、同じまたは異なり、独立して、アルキル、アラルキルまたはヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、−ＣＯＯＨ、アルコキシ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはトリアルキルアンモニウムで置換されているアルキル、またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ５２およびＲ５３は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アルキル置換ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ２１および各Ｒ２２は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、メルカプト、アリールオキシ、複素環、イミニウムイオン、Ｌ−Ｒｘ、または２個の隣り合うＲ２１およびＲ２２あるいは任意の２個の隣り合うＲ２２は、場合によっては、アルキル、ハロゲンまたはオキソで置換されている４、５または６員環の炭素環を形成し；あるいは１個の炭素をはさんだ２個のＲ２２は、それらが結合する炭素と一緒になって、場合によっては、アルキル、ハロゲン、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ（＝Ｏ）、＝Ｓまたは＝Ｃ（Ｒ５０）２で置換されている４、５または６員環の炭素環を形成し；
Ｒ４６およびＲ４７はそれぞれ同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、アリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ４８およびＲ４９はそれぞれ同じまたは異なり、独立して、水素または場合によっては、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されるアルキルであり；
各Ｒ５０は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、シアノ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ４８であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ２０、Ｒ２３、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２およびＲ５３の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）またはＡｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である。）
具体的には、一実施形態において、式（Ｖ）は、式（Ｖａ）で表される、Ｃｙ５シアニン色素誘導体である。
【０１２７】
【化３９】
2008535945.tif 000035
（式中、Ｒ２０、Ｒ２３、Ｒ４８、Ｒ４６、Ｒ５２およびＲ５３は、先に規定した通りである）
より具体的な実施形態では、各Ｒ４８、Ｒ５２およびＲ５３はメチルであり、各Ｒ２０およびＲ２３は、同じまたは異なり、独立して、−（ＣＨ２）ｔＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｔＡｓＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｔＣＯＯＨまたは−（ＣＨ２）ｔＯＨ（ｔは１〜６の間の整数）であり、各Ｒ４６は−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）またはＡｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である。
【０１２８】
さらなる実施形態では、式（Ｖ）は、式（Ｖｂ）で表される別のタイプのＣｙ５シアニン色素誘導体である。
【０１２９】
【化４０】
2008535945.tif 000036
（式中、Ｒ２０、Ｒ２３、Ｒ４８、Ｒ４６、Ｒ５２およびＲ５３は、先に規定した通りであり、ｕは１または２である。）
さらに具体的な実施形態では、各Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ４８はメチルであり、各Ｒ２０およびＲ２３は同じまたは異なり、独立して、−（ＣＨ２）ｔＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｔＡｓＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｔＣＯＯＨまたは−（ＣＨ２）ｔＯＨ（ｔは１〜６の間の整数）であり、各Ｒ４６は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）またはＡｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である。
【０１３０】
他の実施形態では、１個の炭素をはさんだ２個のＲ２２は、これらが結合する炭素と一緒になって、４、５または６員炭素環を形成する。これらの化合物は、以下の式（Ｖｃ）でさらに具体的に表すことができる。
【０１３１】
【化４１】
2008535945.tif 000037
（式中、
Ｘは、１個の４−、５−または６−員炭素環状環を形成するために必要な原子を表し、該炭素環状環は、場合によっては、アルキル、ハロゲン、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ（＝Ｏ）、＝Ｓまたは＝Ｃ（Ｒ５０）２で置換され、
α＋β＝ｖ−２であり、他のＲ基、ＹおよびＷは全て先に規定した通りである。）
具体的には、一実施形態では、炭素環はシクロブテンであり、αおよびβは、それぞれ０であり、ＹおよびＷはそれぞれ、縮合ベンゼンである。これらの色素は、一般的に、スクアラインおよびチオスクアライン色素と言い、以下の式（Ｖｄ）で表すことができる。
【０１３２】
【化４２】
2008535945.tif 000038
（式中、Ｒ５１は、アルキル、ハロゲン、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ（＝Ｏ）、＝Ｓまたは＝Ｃ（Ｒ５０）２であり、他のＲ基は全て先に規定した通りである。）
より具体的には、各Ｒ４８、Ｒ５２およびＲ５３はメチルであり、各Ｒ２０およびＲ２３は同じまたは異なり、独立して、−（ＣＨ２）ｔＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｔＡｓＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｔＣＯＯＨまたは−（ＣＨ２）ｔＯＨ（ｔは１〜６の間の整数）であり、各Ｒ４６は−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）またはＡｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、Ｒ２２はヒドロキシ、メルカプトまたは置換アルキルである。）
アルソン酸基を持つスクアラインおよびチオスクアライン色素は、高い水溶性とこのクラスの色素の固有のスペクトル特性との実用的に有用な組合せを与える。これらの色素は、スペクトル特性が非常に環境に依存するため、生物学的結合体化と染色用に実用的に有用である［米国特許出願公開第２００３／０２３５８４６号明細書］。スクアライン系生物学的ラベルは、高ストークスシフト、水溶液中の遊離の色素のように、より低い量子収率（φ＝０．１５）、および生体分子に結合したとき非常に高い量子収率（φ＝０．６〜０．７）を発現する［Ｏｓｗａｌｄ  Ｂ．，Ｐａｔｓｅｎｋｅｒ  Ｌ．，Ｄｕｓｃｈｌ  Ｊ．，Ｓｚｍａｃｉｎｓｋｉ  Ｈ．，Ｗｏｌｆｂｅｉｓ  Ｏ．Ｓ．，Ｔｅｒｐｅｔｓｃｈｎｉｇ  Ｅ．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｑｕａｒａｉｎｅ  ｄｙｅｓ，ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｄｉｏｄｅ  ｌａｓｅｒ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｓ」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．Ｎｏｖ−Ｄｅｃ，１０（６），ｐ９２５−３１，１９９９］。
【０１３３】
他の具体的な実施形態では、炭素環状は、シクロヘキセンであり、αおよびβは、それぞれ１であり、ＹおよびＷは、それぞれ、縮合ベンゼンであり、式（Ｖ）の化合物は、蛍光性ＩＲ色素である。それらは、以下の式（Ｖｅ）で表すことができる。
【０１３４】
【化４３】
2008535945.tif 000039
（式中、Ｒ５１は、アルキル、ハロゲン、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ（＝Ｏ）、＝Ｓまたは＝Ｃ（Ｒ５０）２であり、他のＲ基は全て先に規定した通りである。）
より具体的には、各Ｒ４８、Ｒ５２およびＲ５３はメチルであり、各Ｒ２０およびＲ２３は、同じまたは異なり、独立して、−（ＣＨ２）ｔＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｔＡｓＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｔＣＯＯＨまたは−（ＣＨ２）ｔＯＨ（ｔは１〜６の間の整数）であり、各Ｒ４６は、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）またはＡｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、Ｒ２２はヒドロキシ、メルカプトまたは置換アルキルである。
【０１３５】
他の具体的な実施形態では、炭素環状はシクロヘキセンであり、αおよびβはそれぞれ１であり、ＹおよびＷはそれぞれ縮合ナフタレンであり、式（Ｖ）の化合物は蛍光性ＩＲ色素である。これらは、以下の式（Ｖｆ）にしたがって表すことができる。
【０１３６】
【化４４】
2008535945.tif 000040
（式中、Ｒ５１はアルキル、ハロゲン、アルキルチオ、アリールチオ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ（＝Ｏ）、＝Ｓまたは＝Ｃ（Ｒ５０）２であり、ｕは１または２であり、他のＲ基は全て先に規定した通りである。）
より具体的には、各Ｒ４８、Ｒ５２およびＲ５３はメチルであり、各Ｒ２０およびＲ２３は同じまたは異なり、独立して、−（ＣＨ２）ｔＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｔＡｓＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｔＣＯＯＨまたは−（ＣＨ２）ｔＯＨ（ｔは１〜６の間の整数）であり、各Ｒ４６は−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）またはＡｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、Ｒ２２はヒドロキシ、メルカプトまたは置換アルキルである。
【０１３７】
Ｒ２０、Ｒ２３、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、Ｒ４９、Ｒ５２およびＲ５３の少なくとも１つが−Ｌ−Ｒｘの場合、本発明は、自動化オリゴヌクレオチド合成に適切な色素試薬を提供する。
【０１３８】
一実施形態では、Ｒｘは、そのペンタフルオロフェニルエステル形態の活性化カルボン酸である。該基は特にアミン反応性であり、アミン官能基を有するＭＧＢ、固形支持体、色素、またはオリゴヌクレオチドに結合することができる。具体的な例を以下に示す。
【０１３９】
【化４５】
2008535945.tif 000041
さらなる実施形態では、本発明は、以下の一般式（ＶＩ）で表される、強化された極性および安定性を持つ修飾蛍光性ＩＲ色素を提供する。
【０１４０】
【化４６】
2008535945.tif 000042
（式中、
ｙは、１、２または３であり；
ｘは、０、１、２または３であり；
各Ｒ５６は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
Ｒ５７は、アルキル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、−ＣＯＯＨ、アルコキシ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはトリアルキルアンモニウムで置換されているアラルキルまたはアルキル、またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ５８ａおよびＲ５８ｂは、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｒ５９は、水素、アルキルまたはアラルキルであり；
各Ｒ６０は、同じまたは異なり、独立して、水素、−ＮＲ６１ａＲ６１ｂ、アルキル、アリール、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ６１ａおよびＲ６１ｂは、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ５６、Ｒ５８ａ、Ｒ５８ｂ、Ｒ６０およびＲ６１ａおよびＲ６１ｂの少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む。）
式（ＶＩ）の化合物の代表的な例として、さらに、式（ＶＩａ）（ここで、Ｒ６０はアルソン酸基であり、Ｒ５７は、−ＳＯ３Ｈ、−ＡｓＯ３Ｈ２、−ＣＯＯＨおよび−ＯＨのような極性基で終了したアルキルまたはアルキレン鎖であり、Ｒ５９はｔ−ブチル基であり、Ｒ６０はジアルキルアミノ基である）で表されるものもある。
【０１４１】
【化４７】
2008535945.tif 000043
（各Ｑは、独立して、Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＡｓＯ３Ｈ２、−ＣＯＯＨまたは−ＯＨであり、ｚは１〜６である）（ＶＩａ）
さらなる実施形態では、本発明は、以下の一般式（ＶＩＩ）で表される、強化された極性および安定性を持つ、他の修飾蛍光性ＩＲ色素を提供する。
【０１４２】
【化４８】
2008535945.tif 000044
（式中、
各Ｒ６２は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成し；
各Ｒ６３およびＲ６４は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２、アルキル、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘで置換されているアルキルであり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ６２、Ｒ６３およびＲ６４の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む。）
さらなる実施形態では、本発明は、１個以上のアルソナートエステル基で置換された蛍光性キサンチン誘導体を提供する。これらの化合物は、以下の一般式（ＶＩＩＩ）で表すことができる。
【０１４３】
【化４９】
2008535945.tif 000045
（式中、
ｚは、１、２または３であり；
Ｔは、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｓ（＝Ｏ）２であり；
Ｑは、−ＯＲ７１または−ＮＲ７２Ｒ７３であり；
Ｕは、−ＯＲ７４または−ＮＲ７５Ｒ７６であり；
各Ｒ６８およびＲ６５は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アリールまたは−ＣＨ２Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−ＣＨ２Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
各Ｒ６６およびＲ６７は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルまたはＬ−Ｒｘであり；
各Ｒ７０は、同じまたは異なり、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）、−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２またはＬ−Ｒｘであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素上の２個のＲ８はオキソを形成し；
各Ｒ７１およびＲ７４は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルカルボニルまたはアリールカルボニルであり；
各Ｒ７２、Ｒ７３、Ｒ７５およびＲ７６は、同じまたは異なり、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり；あるいは
Ｒ７１およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７４およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７２およびＲ６８は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７３およびＲ６６は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７５およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；あるいは
Ｒ７６およびＲ６７は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員環の複素環を形成し；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ６５、Ｒ６６、Ｒ６７、Ｒ６８およびＲ７１の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり、あるいは−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を含む。）
通常、Ｒ７１およびＲ７４は、それぞれ、アルキルカルボニルであり、さらに典型的には、ｔ−ブチルカルボニルである。
【０１４４】
Ｒ７４およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員複素環を形成し、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、より具体的には、以下の式（ＶＩＩＩａ）で表すことができる。
【０１４５】
【化５０】
2008535945.tif 000046
Ｒ７５およびＲ６５は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員複素環を形成し；およびＲ７６およびＲ６７は、これらが結合する炭素と一緒になって、５または６員複素環を形成し、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、より具体的には、以下の式（ＶＩＩＩｂ）で表すことができる。
【０１４６】
【化５１】
2008535945.tif 000047
Ｒ６６、Ｒ６７およびＲ７０の少なくとも１つが−Ｌ−Ｒｘの場合、本発明は、自動化オリゴヌクレオチド合成に適切なキサンチン色素試薬を提供する。
【０１４７】
一実施形態では、Ｒｘは、自動化オリゴヌクレオチド合成用のホスホルアミダイト基である。他の実施形態で、Ｒｘは、そのペンタフルオロフェニルエステル形態において、カルボン酸、イソチオシアネートまたはマレイミド基、活性化カルボン酸である。具体的なキサンチン色素試薬を図８および９に図示する。
【０１４８】
さらなる実施形態では、本発明は、以下の一般式（ＩＸ）で表される、強化された極性および疎水性を持つ、修飾ＭＧＢを提供する。
【０１４９】
【化５２】
2008535945.tif 000048
（式中、
Ｒ４０およびＲ４３は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アリール、アルコキシまたは−Ｌ−Ｒｘであり、ただし、Ｒ４０およびＲ４３の少なくとも１つは−Ｌ−Ｒｘであり；
各Ｒ４１は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、スルホニル、ホスホニル、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素上の２個のＲ８はオキソを形成し；
ｑは、０、１または２であり；
Ｒ４２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２であり；
Ｌは、一重共有結合またはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を含む共有結合であり、一重、二重、三重の任意の結合、または芳香族炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合および炭素−硫黄結合から構成され；および
Ｒｘは、反応基であり、
ただし、Ｒ４１およびＲ４２の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である。）
一実施形態では、本発明は、式（ＩＸ）（式中、Ｒ４１およびＲ４２の少なくとも１つは、−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２である）のＭＧＢを提供する。
【０１５０】
本発明のＭＧＢは、オリゴヌクレオチド、色素および固形支持体に、反応基を介して、反応によって結合する。しかも、自動化オリゴヌクレオチド合成の目的のために、色素試薬中の極性基は、通常、アルソナートエステル形態でマスクされている。以下は、極性基を有するＭＧＢの２つの具体的な例示である。
【０１５１】
【化５３】
2008535945.tif 000049
これらの例示において、反応基は、そのペンタフルオロフェニルエステル形態の活性化カルボン酸である。該基は、特にアミン反応性であり、アミン官能基を有するＭＧＢ、固形支持体、色素またはオリゴヌクレオチドに結合することができる。
３．極性色素を使用する適用および方法
一つの態様で、本発明は、１個以上のアルソナート基：−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を有する式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）の色素化合物を、生物学的サンプルと、所望の条件下で、測定可能な光学応答を得るのに十分な濃度で組み合わせることによる、生物学的サンプルの染色における、１個以上の極性アルソン基を有する色素化合物の使用方法を提供する。
【０１５２】
本発明の一態様では、本発明の色素化合物を、サンプルを認識あるいは定量することができるように、直接にサンプルを染色またはラベルするために使用する。たとえば、そのような色素を、生物学的標的測定対象物用のアッセイの一部として、生物学的または非生物学的流体中の検出可能なトレーサー元素として；染色されたサンプルは照射され、腫瘍細胞または組織を選択的に破壊する、腫瘍の光力学的治療としての目的のために；あるいは普通、一重項酸素の光増感生成によって、動脈内プラークまたは細胞を光で切除するために、加えてもよい。好ましい一実施形態では、色素結合体を、結合体化された物質は特定の結合ペアの相補的メンバーであるリガンドを含むサンプルを染色するために使用する。
【０１５３】
通常、サンプルを、液体源から直接、あるいは固体物質（有機または無機）からの洗浄液として、細胞が培養されるために導入された成長培地として、または細胞が評価のために置かれた緩衝溶液として得る。サンプルが細胞を含む場合、該細胞は、場合によっては、微生物を含む単一の細胞であり、あるいは多細胞生物、胚、組織、組織生検体、線維、バイオフィルムなどを含む２または３次元の層において他の細胞と関連する複数細胞である。
【０１５４】
あるいはサンプルは固体で、場合によっては、液体または蒸気からろ過によって除去されたスミア、スクラップまたは濃縮水である。本発明の一つの態様では、サンプルを、生物液体、たとえば、分離されたまたは未ろ過の生物液体、たとえば、尿、髄液、血液、リンパ液、組織均質化物、細胞間隙液、細胞抽出物、粘液、唾液、痰、便、生理的分泌物または他の類似の液体から得る。あるいは、サンプルを、環境源、たとえば、土、水、または空気から得；または工業的源、たとえば、廃液流れ、水資源、供給ライン、あるいは製造ロットから取る。
【０１５５】
さらに他の実施形態では、サンプルを、固体または半固体マトリックス上または中に置く。本発明の一つの態様では、マトリックスは膜である。他の態様では、マトリックスは、核酸またはタンパク質を分離し特徴付けるために使用されるような電気泳動ゲル、または電気泳動ゲルから膜への移動によって製造されるブロットである。他の態様では、マトリックスは、シリコンチップまたはガラススライドであり、関心のある測定対象物がアレイ中のチップまたはスライド上に固定されている（たとえば、サンプルはマイクロアレイ中にタンパク質または核酸高分子を含む）。さらに他の態様では、マトリックスは、マイクロウェルプレートまたは微小流体チップであり、サンプルは、自動化方法、通常、ハイスループットスクリーニングアッセイ、たとえば薬剤スクリーニングの種々の方法により分析される。
【０１５６】
本発明の色素化合物は、一般的に、先に記載した本発明の色素化合物と関心のあるサンプルとを、検出可能な光学応答を得るように選択された条件下で組み合わせることによって利用される。本明細書で使用される用語「色素化合物」は、請求項の色素の全ての態様のものを言い、反応性色素および生物物質または生体分子に結合体化する色素の両方を含む。色素化合物は、通常、共有結合またはサンプルの元素と結合または結合体化する非共有結合を形成し、あるいは単に、サンプルまたはサンプルの部分の境界内に存在する。次にサンプルは、光学応答を誘発するように選択された波長で照射される。通常、サンプルの染色は、光学応答を標準または予想される応答とさらに比較することによって、サンプルの特定の特性を測定するために使用される。
【０１５７】
検出可能な光学応答は、観察によってあるいは機器を使用して検出可能な光学シグナルの変化あるいはその発生を意味する。通常、検出可能な応答は、蛍光における変化、たとえば、蛍光、蛍光寿命、蛍光極性化の輝度、励起または放射波長分布、あるいはこれらの組合せにおける変化である。標準または予想される応答と比べた染色の度合いおよび／または位置は、サンプルが所定の特性を持つかどうかあるいはどの程度持つかを示す。本発明のいくつか色素は、蛍光発光を殆ど見せないかもしれないが、しかしそれでも発色色素として有用である。そのような発色団は、ＦＲＥＴ適用においてエネルギー受容体として、あるいは単に所望の色をサンプルまたはサンプルの一部に付与するために有用である。
【０１５８】
生物学的適用に関して、本発明の色素化合物は、通常、水性で、殆ど、業界で一般的に知られている方法に従って製造された水溶液または水性混和性溶液中で使用される。色素化合物の正確な濃度は、実験条件および所望の結果に依るが、通常、約１ナノモル〜１ミリモル、あるいはこれ以上の範囲である。最適濃度は、最小バックグラウンド蛍光を伴う満足な結果が得られるまで、系統変動によって決定される。
【０１５９】
色素化合物を生物学的成分でサンプルを染色するために使用するのが最も有利である。サンプルは、成分（完全細胞、細胞抽出物、細菌、ウィルス、細胞小器官およびこれらの混合物を含む）、あるいは単一成分または複数の成分の均質群（たとえば、天然または合成アミノ酸、核酸または炭水化物高分子、あるいは脂質膜結合体を含む）の不均質混合物を含んでもよい。これらの色素は、一般的に、使用の濃度内で、生きている細胞および他の生物学的成分に無毒である。
【０１６０】
色素化合物は、色素化合物と関心のあるサンプル成分との間の接触を促進する任意の方法でサンプルと組み合わせる。通常、色素化合物または色素化合物を含有する溶液を、サンプルに単に加える。本発明のある色素、特に１つ以上のスルホン酸またはアルソン酸部分によって置換されている色素は、生物学的細胞の膜に不浸透である傾向があり、ひとたび生細胞が中に入ると通常、よく保持される。形質膜を透過する処理、たとえば、電気穿孔法、ショック処理、または高細胞外ＡＴＰを使用して、選択された色素化合物を細胞に導入することができる。あるいは、選択された色素化合物を、たとえば、圧力マイクロインジェクション、スクラップローディング、パッチクランプ法または食菌作用によって、細胞に物理的に挿入することができる。
【０１６１】
その天然のエステル形態のアルソナート色素は、生物学的膜に付着あるいは貫通してもよい。場合によっては、該エステル形態は、微細環境において加水分解し、膜の片面に、あるいは細胞の内側に色素の極性形態を与え、その結果研究または診断ツールを提供する。
【０１６２】
脂肪族アミンまたはヒドラジン残基を導入する色素を細胞に微量注入することができ、それらは、適当な位置で、ホルムアルデヒドまたはグルタルデヒドのようなアルデヒド固定液によって固定されうる。この固定によって、そのような色素は、神経細胞トレースのような細胞内適用に有用な色素となる。
【０１６３】
リン脂質のような親油性置換基を持つ色素化合物は、たとえば、膜構造用のプローブとしての用途のために、リポソーム、リポタンパク質、フィルム、プラスティック、親油性微粒子球または類似の物質中に導入するために、あるいはトレースのために、脂質集合体に非共有結合で導入される。親油性色素は、膜構造の蛍光性プローブとして有用である。
【０１６４】
化学反応性色素化合物は、多種多様な物質上の対応する官能基に共有結合し、先に記載した色素結合体を形成する。細胞の表面上の、細胞膜内の、細胞内器官のような細胞内区画内の、あるいは細胞の細胞質内のラベル反応性部位に色素化合物を使用することによって、サンプルにおける、それらの存在または量、接近可能性、あるいはそれらの空間的および時間的分布の測定を可能にする。光反応性色素は、生物細胞の外膜の光ラベル成分と同様に、あるいは細胞用の光定着型極性トレーサーとして使用することができる。
【０１６５】
本発明の方法に使用できる好ましい化合物として、Ｒｘが、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アミン、アジド、ヒドラジン、ハロアセタミド、アルキルハライド、イソチオシアネートまたはマレイミド基である化合物；生物物質が、抗体、ペプチド、レクチン、ポリサッカライド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、核酸高分子、イオン錯形成部分、脂質、または１個以上の同じまたは異なる追加の蛍光団に結合してもよい、非生物学的有機高分子または高分子微粒子である化合物が挙げられる。
【０１６６】
場合によっては、サンプルを、染色後洗浄し、残留する、過剰のあるいは結合していない色素化合物を除去する。サンプルは、場合によっては、染色途中に、洗浄溶液、透過化処理および／または固定化溶液、および追加の検査試薬を含む溶液を始めとする、他の溶液の１種以上と組み合わせる。追加の検査試薬は、通常、業界で一般的に公知の方法に従って、特異的細胞成分、細胞内物質の存在、または細胞状態に基づいて検出可能な応答を引き起こす。追加の検査試薬が、対象色素化合物のスペクトル特性と異なる特性を持つ生成物を持つまたは生成する場合は、多色適用が可能である。これは、追加の検査試薬が、染色色素の特性とは検出において異なるスペクトル特性を持つ本発明の色素または色素結合体である場合、特に有用である。
【０１６７】
色素結合体である本発明の化合物は、業界で広く知られている方法に従って使用され、たとえば、顕微鏡検査法および免疫蛍光測定法におけるにおける抗体結合体の用途；および核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび核酸シークエンス用のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド結合体（たとえば、米国特許第５，３３２，６６６号明細書、Ｐｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；米国特許第５，１７１，５３４号明細書、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；米国特許第４，９９７，９２８号明細書、Ｈｏｂｂｓ（１９９１）；および国際公開第９４／０５６８８号パンフレット、Ｍｅｎｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．；これら全ては参照によって組み込まれる）が挙げられる。本発明の複数の独立した色素の色素結合体は、多色適用の有用性を有する。
【０１６８】
染色後または染色途中のいつでも、サンプルを選択された光の波長で照射し、検出可能な光学応答を得、光学応答を検出するための方法で観察する。本発明の色素化合物を照射するために有用な装置として、携帯型紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザーおよびレーザーダイオードが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射源は、場合によっては、レーザースキャナ、蛍光マイクロプレートレ−ダー、標準のまたはミニ蛍光光度計、あるいはクロマト検出器に組み込まれている。本発明の好ましい実施形態は、以下に記す領域が比較的安価な励起ソースの出力に非常に適合しているので、６３３〜６３６ｎｍ、６４７ｎｍ、６６０ｎｍ、６８０ｎｍまたは近傍の、および７００ｎｍを超える波長で、励起可能な色素である。
【０１６９】
光学応答を、場合によっては、可視的検査によって、以下の装置、すなわち、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャナ、蛍光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、エピ蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメータ、蛍光マイクロプレートリーダの任意のものを使用することによって、光電子増倍管のような、シグナルを増幅する手段によって、検出する。サンプルを、フローサイトメータを使用して検査する場合、サンプルの検査は、場合によっては、それらの蛍光応答に従い、サンプルの特性の仕分けを含む。
【０１７０】
他の態様では、本発明は、式（Ｉ）−（ＶＩＩＩ）（式中、Ｒｘは、ホスホルアミダイト基である）で表される色素試薬を、自動化オリゴヌクレオチド合成において使用する方法であって、
ホスホルアミダイト方法を使用して、オリゴヌクレオチドの自動化合成を行い、色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップであって、色素試薬は、オリゴヌクレオチドの固形支持体または伸長鎖に結合体化するステップと；
反応媒体から色素標識オリゴヌクレオチドを単離するステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドの極性基を脱保護し、負電荷極性基を有する色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む方法を提供する。
【０１７１】
亜リン酸トリエステル、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホニル化学によるオリゴヌクレオチドの固相合成に関する手法の詳しい説明は、広く出回っている。たとえば、Ｉｔａｋｕｒａ，米国特許第４，４０１，７９６号明細書；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４５８，０６６号および４，５００，７０７号明細書；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２（１９８１）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０３：３１８５−３１９１（１９８１）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４：１−１７（１９８２）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｎｅｓ，第２章，Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，第３章，およびＳｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，第４章：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ（編集），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９８４）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２７：４６９−４７２（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７（１９８６）；Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２４：５８４３−５８４６（１９８３）；およびＳｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：４５３９−４５５７（１９８４）を参照のこと。これらは参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
【０１７２】
一般的に、カップリングサイクルにおいて利用されるモノマーヌクレオチドの供給のタイミングおよび濃度は、市販のＤＮＡ合成装置において使用される市販のホスホルアミダイトに典型的なプロトコルと相違しない。これらの場合、モノマーを含有する溶液を、市販の合成装置上の過剰のホスホルアミダイトのために備えられたポート上の受け口に単に加えればよい（たとえば、モデル３８０Ｂ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。しかし、特定のモノマーのカップリング効率が他のホスホルアミダイトより実質的に低い場合、合成を最適化するために、試薬の供給のタイミングまたは濃度を変える必要があるかもしれない。低カップリング効率を訂正するためのオリゴヌクレオチド合成プロトコルの最適化方法は、当業者にはよく知られている。一般的には、供給する試薬の濃度または試薬の量を増加して、より高いカップリング効率を達成する。カップリング効率を測定する方法もよく知られている。たとえば、５’−ヒドロキシル保護基がジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）である場合、カップリング効率は、ＤＭＴｒ基から酸性が除かれる間、ＤＭＴｒカチオン濃度を測定することによって決定してもよい。ＤＭＴｒカチオン濃度は、普通、酸洗浄液をスペクトル−測光的にモニターすることによって測定する。酸／ＤＭＴｒ溶液は、明るいオレンジ色である。あるいは、キャッピングによって、カップリングしなくなったオリゴヌクレオチドはさらなる延長を阻止されるので、カップリング効率を、たとえば、キャピラリー電気泳動法またはＨＰＬＣを利用して、オリゴヌクレオチドの完全長に対する欠失長さの比を比較することによって算出してもよい。
【０１７３】
固相オリゴヌクレオチド合成は、数多くの固形支持体を使用して行ってもよい。適切な支持体は、保護されたモノマーの結合のための官能基を提供するもので、これは合成されたオリゴヌクレオチド中で３’末端塩基となる。支持体は、特定の合成化学において利用される試薬に対して不活性でなければならない。適切な支持体は当業者によく知られている。固形支持体材料として、ポリアクリロイルモルホリド、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックスおよびカルボキシル官能化Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい支持体は、アミノ官能化制御細孔ガラスおよびポリスチレンである。
【０１７４】
固相オリゴヌクレオチド合成は、出発点として、固形支持体にカップリングした、完全に保護されたモノマー（たとえば、保護ヌクレオシド）を必要とする。このカップリングは、通常、３’−ヒドロキシルを介する。通常、リンカー基は、１端が、共有結合で３’−ヒドロキシルに、もう１端が供給結合で固形支持体に結合する。次いで、第１合成サイクルで、縮合反応によって、ヌクレオチドモノマーをその３’−リン酸塩を介して結合ヌクレオシドの５’−ヒドロキシルにカップリングし、３’−５’ホスホジエステル架橋を形成する。続く合成サイクルで、Ｐ１−修飾モノマーを含むヌクレオチドモノマーを最後に結合したヌクレオチドの５’−ヒドロキシルに付加する。この方法において、オリゴヌクレオチドは、固形支持体に結合する３’末端を有する「成長」オリゴヌクレオチドを生成する、３’から５’方向で合成される。
【０１７５】
ヌクレオシドモノマーを固形支持体に結合させる方法は、当業者には数多く知られている。通常、スクシネートまたはヘミスクシネートを介して制御細孔ガラスに共有結合されたモノマーが一般的に使用される。ヘミスクシネートを介して制御細孔ガラスにカップリンされた、従来の保護されたヌクレオシドは、数多くの供給元（たとえば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎｉｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．；およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から市販されている。
【０１７６】
一度完全長のオリゴヌクレオチドが合成されれば、オリゴヌクレオチドを脱保護し、使用する前に、固形支持体から切り離す。切り離しおよび脱保護は、同時に、または任意の順番で順番に行ってもよい。２つの手順は、ある保護基が、固形支持体から切り離される前に、オリゴヌクレオチドから除去され、他の基が溶液中の切り離されたオリゴヌクレオチドから脱保護されるように、ばらばらに行ってもよい。手順の順序は、存在する特定のブロック部分、固形支持体への特定の結合、および合成を行う個々の優先性に依存する。脱保護が切り離しに先行する場合は、保護基をオリゴヌクレオチドから洗い流してもよく、これには固形支持体上の結合が残っている。逆に、脱保護が切り離しの後に続く場合は、除去された保護基は、オリゴヌクレオチドが存在する溶液中に残る。オリゴヌクレオチドは、使用の前に、これらの保護基からの単離を要求されることがしばしばある。
【０１７７】
好ましい実施形態および殆どの商業的ＤＮＡ合成では、５’−ヒドロキシル上の保護基は、合成の最終段階で除去される。次いで、オリゴヌクレオチドが固形支持体から切り離され、残った脱保護は溶液中で行われる。５’−ヒドロキシル保護基の除去は、通常、次のヌクレオチドモノマーのカップリングの前に、末端５’−ヒドロキシル保護基を除去するために、合成で利用したものと同じ試薬での処理を必要とする。５’−ヒドロキシル保護基がジメトキシトリチル基である場合、脱保護は、酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸またはトリフルオロ酢酸での処理により達成することができる。
【０１７８】
オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドであり、２’−ヒドロキシル基がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）部分でブロックされている場合は、後の基は合成の最後に、テトラヒドロフラン中で、テトラブチルアンモニウムフルオリドを使用して除去してもよい。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４７１７−４７２４（１９９０）参照。フェノキシアセチル保護基は、アルコール中、無水アンモニアで除去することができる（ＴＢＤＭＳ基が安定で、オリゴヌクレオチドが切り離されない条件下で）。シチジンのベンンゾイル保護基は、アルコール中、無水アンモニアでも除去する。
【０１７９】
切り離され、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、直接的使用してもよいし（脱保護試薬を取り除くために、凍結乾燥または蒸発された後）または使用の前に精製してもよい。合成オリゴヌクレオチドの精製は、一般的に、完全長のオリゴヌクレオチドを、脱保護ステップで除去された保護基から、さらに重要なこととして、次のヌクレオチドモノマーとカップリングしなかったオリゴヌクレオチドを合成中にキャップする時生成した、欠失型オリゴヌクレオチドから単離するために、望ましい。
【０１８０】
オリゴヌクレオチド精製技術は、当業者によく知られている。方法として、シリカプレートにおける薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、サイズ分画（たとえば、ショーデックスカラムを使用して）、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびアニオン交換クロマトグラフィー（たとえば、ｍｏｎｏ−Ｑカラムを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）が挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチド精製の検討に関しては、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，第５章およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，第６章：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ（編集），ＩＲＬ，Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８４）を参照のこと。
４．色素標識オリゴヌクレオチドプローブ
本発明は、さらに、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の検出において有用な、色素標識オリゴヌクレオチドプローブ、または色素−オリゴヌクレオチド結合体を提供する。
【０１８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）の色素標識の少なくとも１つを導入する、一本鎖の天然または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）およびＬＮＡ（ロック核酸）である。色素標識は、共有結合を介してオリゴヌクレオチドの配列中に導入される。そうすると、反応基を持つ色素試薬は、固形支持体またはオリゴヌクレオチドにカップリングされ、所定の位置でオリゴヌクレオチドの配列に導入される。
【０１８２】
先に検討したように、本発明の色素試薬は、ホスホルアミダイト方法を使用するオリゴヌクレオチドの自動化合成に特に適切であるが、これに限定されない。そのような色素試薬の反応基は、ホスホルアミダイト類、たとえば、シアノエチル保護ホスホルアミダイトである。色素試薬中の極性基は、該色素試薬がいかなる負の電荷も持たないように、それらのエステル形態にマスクされる。したがって、マスクされた色素試薬は、自動化合成において要求される無水および弱酸性条件に適合性がある。オリゴヌクレオチド合成の完了した時、エステル保護基は除去され、−ＡｓＯ３２−または−ＡｓＯ３Ｈ−のような負電荷極性基は再生される。
【０１８３】
したがって、他の実施形態では、本発明は、１個以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）２または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２（式中、
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成する）を有する蛍光性および／または消光物質色素でラベルされたオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８４】
さらなる実施形態では、色素標識オリゴヌクレオチドは、結合効率およびハイブリッド化安定性を改良するため、さらに１以上の小溝結合剤（ＭＧＢ）を含む。ＭＧＢそれ自身は、場合によっては、ハイブリッド化条件により適用するために、強化された極性および親水性の極性基を１個以上含むように修飾されうる。より具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドは、場合によっては、式（Ｖｌ）のＭＧＢに結合体化する。
【０１８５】
一実施形態では、色素標識オリゴヌクレオチドを、ポスト合成結合体化中に、色素を、固形支持体上または溶液中のオリゴヌクレオチドに導入することによって製造する。
【０１８６】
他の実施形態で、本発明のオリゴヌクレオチドを、以下のステップを含む自動化合成によって製造する。
色素の全負電荷極性基を、色素はこれ以上負の電荷を持たないように、エステル化によって保護するステップであって、該色素はさらにオリゴヌクレオチドに結合体化しうる反応基を持つステップと；
オリゴヌクレオチドの自動化合成を、ホスホルアミダイト方法を行い、色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドを反応媒体から単離するステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドの極性基を脱保護し、負電荷極性基を得るステップ。
【０１８７】
より具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドを、以下のステップを含む自動化合成によって製造する。
１種以上の−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、同じまたは異なり、独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；あるいは
Ｒ６およびＲ７は結合し一緒になって、ヒ素と、Ｒ６およびＲ７が結合する２個の酸素原子とを含む５または６員環の複素環を形成し、ここで、−Ｒ６−Ｒ７−は、−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は、同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣接する炭素の２個のＲ８は、それらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは同じ炭素の２個のＲ８はオキソを形成する）を有する、式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）の色素試薬を準備するステップと；
ホスホルアミダイト方法を使用して、オリゴヌクレオチドの自動化合成を行い、色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドの−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ６）（ＯＲ７）または−Ａｓ（ＯＲ６）２（ＯＲ７）２を脱保護し、−ＡｓＯ３２−または−ＡｓＯ３Ｈ−から選択される負電荷極性基を有する色素標識オリゴヌクレオチドを得るステップと；
反応媒体から色素標識オリゴヌクレオチドを単離するステップ。
【０１８８】
本発明の色素標識オリゴヌクレオチドは、多種多様のＤＮＡ増幅／定量化方法における生物学的サンプル中の核酸の相補的鎖の検出、たとえば、５’−ヌクレアーゼアッセイ、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、核酸塩基配列増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）のための、および液相または固相（たとえばアレイ）アッセイにおける、標的の直接検出のためのプローブとして有用である。
【０１８９】
さらに、本発明の色素標識オリゴヌクレオチドは、実質的にいかなるフォーマットのプローブ、たとえば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ、分子標識、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ／プライマー、ＳｕｎｒｉｓｅプローブＴＭ、立体配置的に補助されたプローブ、ライトアッププローブおよび侵入物検出プローブとして使用することができる。国際公開第０１／８６００１号パンフレットは、核酸増幅、検出および定量における暗い消光物質を有する核酸プローブを記載し、この出願はその全体を本明細書に組み入れる。
【０１９０】
したがって、本発明は、式（Ｉ−ｌｌｌ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）の色素化合物の１以上に結合体化するオリゴヌクレオチドを使用し、オリゴヌクレオチドに対する相補的配列を有する標的を直接検出する方法であって、該オリゴヌクレオチドは、場合によっては、さらに１以上のアルソン極性基で置換されているかもしれないＭＧＢを含み、
以下のステップ：
色素標識オリゴヌクレオチドプローブを生物学的サンプルに加えるステップであって、プローブは標的核酸に対して相補的あるいは実質的に相補的であるステップと；
適切な条件下、充分な時間、プローブと標的核酸とでハイブリッド形成させるステップと；
色素から放射される蛍光を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【０１９１】
消光物質色素および蛍光性レポーター色素（該色素の１または両方ともが少なくとも１個の極性アルソン酸基を有する）の両方を持つオリゴヌクレオチドは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプローブとして特に有用である。ＰＣＲ技術は、特異的なＤＮＡ配列を増幅し、ＤＮＡプローブアッセイを一重ＤＮＡ標的から実行することを可能にする。ＰＣＲ技術の「リアルタイム」変更形態は、スペクトルフルオロメトリック温度サイクラを使用して、流れに任せて、ＰＣＲの進展の検出を可能にする。３つの極性アッセイフォーマットは、ＰＣＲが進むにつれて蛍光性となるＤＮＡプローブを使用し、ＴａｑＭａｎＴＭ、分子標識およびＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーが挙げられ、その全てが定量のために蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に依存するプローブのハイブリッド化である。
【０１９２】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、蛍光色素を通常５’塩基上に、および消光色素を通常３’塩基上に含むオリゴヌクレオチドである。照射された時、励起された蛍光色素は、蛍光するのではなく、エネルギーを近くの消光色素分子に伝達し、非蛍光性物質となる。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、ＰＣＲ生成物の内部領域にハイブリッド形成するように設計される。ＰＣＲの間、ポリメラーゼは、ＴａｑＭａｎＴＭプローブが結合されているテンプレートを複製し、ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを切り離す。これにより蛍光性色素と消光色素が離され、これ以上ＦＲＥＴは起こらない。蛍光は、各サイクルで増加し、プローブ切断の速度に比例する。
【０１９３】
また、分子標識は、蛍光性色素および消光色素も含むが、消光色素が蛍光色素に直接隣接する場合、ＦＲＥＴだけが起こる。分子標識は、溶液中で遊離し、蛍光色素および消光物質を非常に近くで橋かけしながら、ヘアピン構造を導入するように設計される。分子標識が標的に対してハイブリッド形成する場合、蛍光色素および消光物質は離され、ＦＲＥＴは起こらず、照射で蛍光色素は、光を放つ。ＴａｑＭａｎＴＭプローブと違い、分子標識は、増幅反応の間、原型を保つように設計され、シグナル測定のため、各サイクルで標的に対して再結合しなければならない。
【０１９４】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブおよびプライマーは、ＤｘＳ社の独占技術である。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーは、プライマーが共有結合でプローブに結合する２官能性分子である。該分子は、蛍光団（レポーター）および消光物質も含む。標的の非存在下で、消光物質は、蛍光団によって放射された蛍光をほぼ吸収する。ＰＣＲ反応の間、標的の存在下で、蛍光団および消光物質は、互いに離れ、これにより、放射された蛍光が増加する。蛍光を反応チューブ内で検出、測定することができる。
【０１９５】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーは、通常、プローブ元素を５’末端に持つ。プローブは、蛍光団を１末端に、消光物質をもう１つの末端に持つ自己相補的ステム配列である。プライマー配列は、５’末端が修飾されている。ヘアピンループの始めにＰＣＲブロッカーを含む（普通、ＨＥＧモノマーがブロッキング剤として加えられる）。最初のＰＣＲサイクルでは、プライマーが標的にハイブリッド形成し、ポリメラーゼの作用により延長される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーを、複数のプローブを使用することによって、ポイント変異の検査および同定のために使用することができる。各プローブに異なる蛍光団のタグを付け、異なる色を作ることができる。
【０１９６】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーでは、プローブは、プライマーに物理的にカップリングしており、シグナル形成に導く反応が単分子反応であることを意味する。これは、ＴａｑＭａｎＴＭまたは分子標識のような他の技術によって要求される２分子衝突とは対照をなしている。
【０１９７】
ＰＣＲ延長の１サイクルが完了した後、新しく合成された標的領域を、プローブとして同じ鎖に結合する。変性およびアニーリングの第２サイクルの後、プローブおよび標的がハイブリッド形成する。ヘアピンループの変性には、生成した新しいＤＮＡ２本鎖よりもエネルギーを必要としない。したがって、ヘアピン配列は、新しく生成したＰＣＲ生成物の一部にハイブリッド形成する。これにより、蛍光団を消光物質から離す結果となり、放射を起こす。
【０１９８】
異なる放射スペクトルを持つ蛍光色素は異なるプローブに結合してもよいので、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ、分子標識およびＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーは、同じサンプル内で複数のＤＮＡ種を測定することが可能である（多重ＰＣＲ）。多重ＰＣＲは、内部制御を共増幅させ、シングルチューブ内での対立遺伝子識別し、均質アッセイを可能にする。これらのハイブリッド化プローブは、ＰＣＲにおいて真の標的にのみハイブリッド形成し、プライマーダイマーや他の偽の生成物には形成しない。
【０１９９】
したがって、一つの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素が消光物質色素によって消光するように配置された、本発明の蛍光性色素と消光物質色素とを含み、これらの色素の１つあるいは両方が、１以上のアルソン極性基を含む。オリゴヌクレオチドは、リアルタイムＰＣＲにおいて、「分子標識」として有用である。
【０２００】
一実施形態では、本発明は、ＴａｑＭａｎＴＭアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、プローブは、蛍光色素が消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
標的が存在する場合、プローブを標的とハイブリッド形成させ、標的をＴａｑポリメラーゼによって切断するＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
蛍光シグナルを、切断された色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含む方法を提供する。
【０２０１】
他の実施形態では、本発明は、分子標識アッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、プローブは、蛍光色素が消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと；
色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
標的が存在する場合、プローブを標的とハイブリッド形成させ、それによって蛍光色素と消光物質色素とを離すＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
蛍光シグナルを、消光していない蛍光色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含む方法を提供する。
【０２０２】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイを使用して、実際の使用における標的配列の増幅を検出する方法であって、
プライマーと、式（ＩＶ）の消光物質色素に結合体化するオリゴヌクレオチドと、式（Ｉ−ＩＩＩ）および（Ｖ−ＶＩＩＩ）のいずれかの蛍光色素とを含む色素標識オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、各色素は、１個以上の極性アルソナート基を有し、プローブは、蛍光色素が消光物質色素によって消光されるようにする配置にあるステップと
色素標識オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応媒体に添加するステップと；
プライマーを標的ＤＮＡとハイブリッド形成させ、それによって、標的ＤＮＡ上のプローブを延長するＰＣＲ温度サイクルを実行するステップと；
延長された熱変成プローブを熱変性し、消光物質色素を切り離すステップと；
延長されたプローブを冷却し、内部再配列を可能にし、標的特異的方法で蛍光色素に蛍光発光させるステップと；
蛍光シグナルを蛍光色素からリアルタイムに読み取るステップと；
を含む方法を提供する。
５．合成
ａ．アルソナート基導入の一般的スキーム
アルソナート色素は、市販のアリールアルソン酸から出発して製造することができ、これは引き続き色素化合物とすることができる。この手法は、スキーム１に従って、アルソン酸カルボシアニン色素の合成によって図示することができる。
【０２０３】
特に、アルサニル酸（Ａ２）は、公知の文献方法［Ｂａｒｔ  Ｊｕｓｔｕｓ  Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．４２９，１００，１９２２］に従って、塩酸中、硝酸ナトリウムで処理することによって、対応するジアゾニウム塩（Ａ３）に変換することができる。塩化スズ（ＩＩ）を使用して、公知の手順［Ｚｈａｎｇ，Ｐｅｎｇ；Ｍｅｎｇ，Ｊｉｂｅｎ；Ｌｉ，Ｘｉａｏｌｉｕ；Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｔｅｒｕｏ；Ｗａｎｇ，Ｙｏｎｇｍｅｉ  Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．３９，１，ｐ１７９−１８４，２００２］に類似の方法によって、ジアゾニウム塩を還元し、対応するヒドラジン（Ａ４）とする。類似のスルホニルインドールを合成するために報告された方法［Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｒ．Ｂ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｌ．Ａ．，Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｓ．Ｒ．，Ｌｅｗｉｓ  Ｃ．Ｊ．およびＷａｇｇｏｎｅｒ  Ａ．Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４（２），ｐ１０５−１１１，１９９３］に類似して、ヒドラジンＡ４のＦｉｓｈｅｒ環化反応によって、対応するインドール（Ａ５）およびインドリニウム塩（Ａ６）とする。これらの刊行物は、さらに、スルホニルインドールからスルホニルカルボシアニン色素を製造する方法を記載し、該方法は、本発明のアルソナートカルボシアニン色素を組み立てるために使用することができる。同様に、これらの刊行物に記載された、異なるＮ−置換体を製造する方法は、同じように、多種多様なＮ−置換基を有するアルソナート色素（Ａ１）の製造にも適用することができる。通常、Ｎ−置換基は、色素を核酸、タンパク質および他の生体分子に導入するための、反応基を有するリンカー（−Ｌ−Ｒｘ部分）を提供する。
スキーム１
【０２０４】
【化５４】
2008535945.tif 000050
あるいは、アリールアルソナート色素は、スキーム２に図示した２つの手法のいずれかに従って、アルソン基を色素分子に直接導入することによって製造することができる。
【０２０５】
１つの手法では、色素を、ヒ素求電子試薬、たとえばヒ素酸［Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｂｅｒｔｈｅｉｍ  Ｃｈｅｍ  Ｂｅｒ．，４０，ｐ３２９３，１９０７；Ｂｅｎｄａ，Ｋａｈｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，４１，ｐ１６７４−１６７６，１９０８］、あるいは三塩化ヒ素［Ｖａｒｍａ，Ｒａｍａｎ，Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１６，ｐ５１５−５１６，１９３９］で反応させることによって、アルソナート基を色素分子（Ｂ２）の芳香族成分に求電子置換を介して直接的導入し、亜ヒ酸エステル中間体Ｂ３を得る。次いで、酸化によって、亜ヒ酸エステル中間体Ｂ３をアルソナートＢ１に変換する［Ｇｏｕｇｈ，Ｋｉｎｇ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，ｐ６６９−６８３，１９３０］。アルソナートＢ１を、ＰＣＩ３［Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｂｅｒｔｈｅｉｍ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，４３，ｐ９１８，１９１０；Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，４４，ｐ１２６４，１９１１］またはＳＯ２−Ｉ２−ＨＣｌ試薬［Ｇａｖｒｉｌｏｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｋｈｕｓｎｕｔｄｉｎｏｖａ  Ｆ．Ｍ．，Ｇｏｒｎｏｖａ  Ｎ．ＮＪ．Ｇｅｎ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ（Ｅｎｇｌ．Ｔｒａｎｓｌ．），５７，ｐ３００−３０３，１９８７；Ｚｈ．Ｏｂｓｈｃｈ．Ｋｈｉｍ．，５７，２，ｐ３５０−３５４，１９８７］での処理によって、ジクロロ亜ヒ酸エステルＢ３に変換しなおすことができる。
【０２０６】
第２の手法では、アミノ色素Ｂ４のアミノ基を置き換えることによって、アルソナート基を色素分子に導入することができる。具体的には、先ず、アミノ基をジアゾニウム塩Ｂ５に変換し、これを亜ヒ酸エステルの銅触媒置換え（Ｂａｒｔ反応）を行い、次いで、酸化によってアルソン置換基とし、Ｂ１［Ｂａｒｄｏｓ，Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，９，ｐ２２１−２２７，１９６６］を得る。
スキーム２
【０２０７】
【化５５】
2008535945.tif 000051
脂肪族アルソナート（Ｃ１）は、スキーム３に従って得ることができる。この手法では、先ず、色素（Ｃ２）の芳香族成分をアルキル化する。アルキル化として、クロロメチル化［Ｄａｃｋａ，Ｓｔａｎｉｓｌａｗ  Ｐｏｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，５７，１０−１２，ｐ１３４５−１３５２，１９８３］、ブロモメチル化［Ｇｉｂｓｏｎ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２５，ｐ５０４７−５０５７，１９６９］またはヨードメチル化［Ｓａｎｄｉｎ，Ｆｉｅｓｅｒ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６２，ｐ３０９８−３１０３，１９４０］が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、アルキル化色素（Ｃ３）を、無機亜ヒ酸エステル（Ｃ４）に変換し、酸化ステップによって、Ｃ１［Ｑｕｉｃｋ；Ａｄａｍｓ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４４，ｐ８１１，１９２２；Ｃｈｅｒｎｏｋａｌ’ｓｋｉｉ，Ｂ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ（Ｅｎｇｌ．Ｔｒａｎｓｌ．），３６，ｐ１６７４−１６７５，１９６６；Ｚｈ．Ｏｂｓｈｃｈ．Ｋｈｉｍ．３６，１６７７−１６７９，１９６６；Ｄｅｈｎ，Ｍｃ  Ｇｒａｔｈ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２８，ｐ３５２，１９０６］を得る。
スキーム３
【０２０８】
【化５６】
2008535945.tif 000052
ｂ．アルソナート色素の保護および脱保護
公知の技術に従って、極性アルソン酸色素、色素−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）２を、便利な非極性形態、たとえば、アルソンジエステル、色素−Ａｓ（＝Ｏ）（ＯＲ）２に転換することができる。先に検討したように、そのような保護形態は、自動化オリゴヌクレオチド合成に適合し、高い色素極性が結合体化または染色目的に望ましくない場合の適用において使用することができる。
【０２０９】
アルソンジエステル色素は、ＣａＣ２またはＣｕＳＯ４の存在下、アルソン酸をアルコールで処理することによって得ることができる［Ｃｈｅｒｎｏｋａｌ’ｓｋｉｉ  Ｂ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ（Ｅｎｇｌ．Ｔｒａｎｓｌ．），３６，ｐ１６７０−１６７３，１９６６；Ｚｈ．Ｏｂｓｈｃｈ．Ｋｈｉｍ．，３６，ｐ１６７３−１６７６，１９６６］。アルソンジエステルの別の製造方法は、二塩化亜ヒ酸エステルをアルコールで反応させ、次いで酸化して、アルソンジエステルを得る［Ｗｅｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ４５２，１９５７］ことに基づく。代表的な保護基は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮおよび−ＣＭｅ２−ＣＭｅ２−（ピナコール）である。これらの基は、オリゴヌクレオチド合成条件に適合し、スキーム４で図示される脱保護方法を適用することにより、容易に除去することができる。
【０２１０】
シアノエチルエステルは、オリゴヌクレオチドの自動化合成において、リン酸塩を保護するために普通に使用される［Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｔ．およびＳｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（編集者），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４］。この基はアンモニアまたはＤＢＵの存在下で除去することができ、そのメカニズムはβ脱離を含むと考えられる。したがって、一手法では、アルソンシアノエチルエステル（Ｄ２）を類似の方法で脱保護し、アルソン酸色素（Ｄ１）を得ることができる。
【０２１１】
あるいは、アルソン酸を、非環状シアノエチル保護基に類似の通常の方法で、２，３−ジヒドロキシ−２，３−ジメチル−サクシンニトリル（Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２８，１９６３，ｐ８２８−８３１）と反応させることによって、最初にオルソエステル（Ｄ３）変換することができる。該エステルは、アンモニアの存在下、β脱離を行い、アルソナートジエステルをその遊離酸の形（Ｄ１）に戻すことができる。同様に、色素アルソン酸（Ｄ４）の保護に関し、２，３−ジメチル−１，４−ビス（フェニルスフホジオキソ）ブタン−２，３−ジオール試薬を、公知の方法で製造することができる［Ｆａｒｋａｓ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ７４（７），１９９１，ｐ１５１１−１５１９］。該ジエステルは、酸の存在下、β脱離を行い、アルソナートジエステルをその遊離酸の形（Ｄ１）に戻すことができる。
スキーム４
【０２１２】
【化５７】
2008535945.tif 000053
保護条件が簡素であること、水性条件下でのキレートによりもたらされる増強された安定性および選択された誘導体に関する脱保護が簡単であることから、アルソン酸はキレート化保護が好ましい。先に記載したように、アルソン酸をアルコールおよびフェノール（ＲＯＨ）で直接反応させることによって、色素のアルソン酸を、そのオルソエステル形態：色素−Ａｓ（ＯＲ）４でマスクすることもできる。オルソエステルのキレート化形態は特に好ましく、ここで、２個のＲ基は一緒に結合し、環状エステル：色素−Ａｓ（Ｏ２Ｗ）２を形成する。通常、キレート化オルソエステルは、ベンゼンによる水の共沸脱離［Ｃａｓｅｙ  Ｊ．Ｐ．，Ｍｉｓｌｏｗ  Ｋ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｄ，ｐ１４１０−１４１１，１９７０］のような脱水条件下、ピロカテコールを始めとするジオールを使用する直接反応により得ることができる。エステル化の程度（ジエステル対オルソエステル）は、キレート化剤の性質ならびに反応および単離条件に大きく依存する。そのような反応のいくつかの例を図３に示す。
【０２１３】
より具体的には、色素化合物のアルソン酸置換基を、２個または３個の炭素原子によって離されている２個の反応性酸素を有するキレート試薬と反応させることによって、そのキレートオルソエステル形態に変換することができる。通常、ジオール系キレート試薬は、一般式Ｗ（ＯＨ）２（式中、Ｗは−［Ｃ（Ｒ８）２］Ｗ−（ｗは２または３）であり、各Ｒ８は同じまたは異なり、独立して、水素、ヒドロキシ、シアノ、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アリール、アルキル、アリール、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈであり、または隣り合う炭素の２個のＲ８が、これらが結合する炭素と一緒になって、アリールまたはヘテロアリールを形成し、あるいは２個の同じ炭素のＲ８がオキソを形成する）で表すことができる。
【０２１４】
適切なキレート試薬の例として、エチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキザール、グリコール酸、グリオキシル酸、プロピレングリコール、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、３−ヒドロキシプロピオン酸、マロンアルデヒドおよびピロカテコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
これらの試薬を持つアルソン酸のキレート化保護は、［Ｓａｌｍｉ，Ｍｅｒｉｖｕｏｒｉ，Ｌａａｋｓｏｎｅｎ  Ｓｕｏｍ．Ｋｅｍｉｓｔｉｌ．Ｂ；１９；１９４６；１０２，１０７］に開示される条件下、無水酢酸のような脱水試薬の存在下で達成することができる。さらに、これらのキレート化（保護）基は、標準アンモニア脱保護条件下で脱離するように設計することができる。この目的のため、保護基は、普通の水性条件、ｐＨ１−８で実質的に安定性を得、アンモニア水条件下で脱離するように最適化されるべきである。アンモニアは、求核剤または塩基、あるいは両方として作用することができる。アンモニア脱保護のそのようなメカニズムは、塩基およびリン酸塩の脱保護に関するオリゴヌクレオチド合成［Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｔ．およびＳｍｉｔｈ，１９８４］において十分証明されている。
【０２１６】
特に有用な保護試薬は、ピナコール（２，３−ジメチル−２，３−ブタンジオール）、２，４−ジメチル−２，４−ペンタンジオールおよび２−ヒドロキシイソ酪酸である。実施例１１で示すように、ピナコールおよびアルソン酸色素は、室温でアンモニア水によって加水分解することができる、安定なビス−ピナコーラートオルソエステルキレートを形成する。２，４−ジメチル−２，４−ペンタンジオールは、アンモニアでも分解する、安定なジエステルキレートを形成する。２−ヒドロキシイソ酪酸は、水性条件下では安定でないが、有機溶液中では安定な（１：１）キレートを形成する。
【０２１７】
特異的に設計されたジオールは、アルソン酸を同時に保護し、保護基の脱離で促進する化学的部分を提供する対立する目的に役立つかもしれない。そのために、スキーム５では、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｃ（Ｍｅ）ＣＮおよび−Ｃ（Ｍｅ）ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈのような付加物を持つジオール（Ｅ１，Ｅ２およびＥ３）を図示し、これらは、スキーム４で先に示したメカニズムに従って、β脱離を行うことができる。
スキーム５
【０２１８】
【化５８】
2008535945.tif 000054
特に、ジオールＥ１は、公知の手順［Ｐｒｚｙｂｙｔｅｋ  Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１７，ｐ１０９５，１８８４］に従って合成された。ジケトンＥ５を、Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３に従って、ＨＣＮ生成ジオールＥ２と反応させた。以下のＦａｒｋａｓ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．１９９１の手順によって、１，２：３，４−ジエポキシ−２，３−ジメチルブタンをチオフェノールと反応させ、ジオールＥ７を製造し、これをｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）で酸化し、保護試薬Ｅ３を得た。ジオールＥ１〜Ｅ３を、アルソン酸色素と、脱水条件下で反応させることができ［Ｓａｌｍｉ，Ｍｅｒｉｖｕｏｒｉ，Ｌａａｋｓｏｎｅｎ，１９４６］、対応するアルソンオルソエステルキレート３ａ（図３）、Ｆ１およびＦ２（スキーム６）を得る。
スキーム６
【０２１９】
【化５９】
2008535945.tif 000055
キレート３ａ（図３）およびＦ１の脱保護を、３ａはβ脱離によって、またはＦ１はγ−環化で補助されたアンモニア処理によって行った。Ｆ２の脱保護は、中間体Ｆ３を形成するために、ＤＢＵのような強塩基を必要とし、これを続いて塩基性条件化でさらに脱保護する。［４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）フェニル］アルソン酸［Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆ，Ｐｙｍａｎ，Ｒｅｍｆｒｙ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９３，ｐ１９００，１９０８］を、色素中のアルソン酸基の保護および脱保護の条件をどのようにして最適化するかを実証するための、簡単なモデル化合物として使用することができる。
【０２２０】
【化６０】
2008535945.tif 000056
スキーム７で図示するように、前記化合物は、ＰＣＩ３［Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｂｅｒｔｈｅｉｍ，１９１０−１９１１］による、またはＳＯ２−Ｉ２−ＨＣＩ試薬［Ｇａｖｒｉｌｏｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｋｈｕｓｎｕｔｄｉｎｏｖａ  Ｆ．Ｍ．，Ｇｏｒｎｏｖａ  Ｎ．Ｎ．１９８７］による処理によって、ジクロロアルシノ誘導体に還元された。ジクロロアルシノ色素誘導体は、アルコールで処理され、次いで酸化され、対応するアルソン酸ジエステル［Ｗｅｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９５７］を得る。
スキーム７
【０２２１】
【化６１】
2008535945.tif 000057
６．実験および例示
一般的説明
試薬および無水溶剤を含む溶剤の全ては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴＣＩ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒまたは他の化学品製造会社から購入した。制御細孔ガラス（ＣＰＧ）は、ＣＰＧ社または他の商業的ソースから購入することができる。蒸発は、回転蒸発器およびダイアフラムポンプを使用する、減圧下の溶剤の除去を言う。合成された色素の構造は、ＦｉｎｎｉｇａｎまたはＷａｔｅｒｓ装置上でＶａｒｉａｎまたはＢｒｕｋｅｒのようなＮＭＲ装置および質量分光器を使用して証明した。
反応混合物を、Ｖａｒｉａｎ，ＷａｔｅｒｓまたはＡｇｉｌｅｎｔの装置で、ＨＰＬＣあるいはＬＣ−ＭＳを使用するクロマトグラフィ、またはＥＭシリカゲルＴＬＣプレートを使用するＴＬＣによって分析した。ＵＶ−ＶＩＳスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのような数多くの市販のスペクトロメーターで取った。自動化オリゴヌクレオチド合成装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した。
【０２２２】
リアルタイムＰＣＲは、ケフェイド型ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）を使用して行った。
【０２２３】
スルホニル色素（たとえば、Ａｌｅｘａ５３２）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社から入手可能である。ＣｙＴＭ色素は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ社から入手可能である。
【０２２４】
ピロカテコール（カテコール）、グリオキシル酸、グリオキザール、エチレングリコール、１  ，４−ジブロモ−２，３−ブタンジオール、ｐ−およびｏ−アルサニリック酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０２２５】
１−アセチル−２，３−ジヒドロ−インドール−５−イルアミンは、インドリンから手順［Ｐｒａｓａｄ  Ｇ．Ｋ．Ｂ．，Ｂｕｒｃｈａｔ  Ａ．，Ｗｅｅｒａｔｕｎｇａ  Ｇ．，Ｗａｔｔｓ  Ｉ．，Ｄｍｉｔｒｉｅｎｋｏ  Ｇ．Ｉ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，３２（３８），ｐ５０３５−５０３８，１９９１］によって得た。
【０２２６】
１−アセチル−２，３−ジヒドロ−インドール−５−イルアミン−６−アルソン酸は、等量の１−アセチル−２，３−ジヒドロ−インドール−５−イルアミンとＨ３ＡｓＯ４とを混合し、乾燥し、得られた塩をデカン中で２０時間還流することによって得た。
【０２２７】
６−アセチル−３，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［１，２−ｂ：４，３−ｂ’］ジピロール−２−エトキシカルボニル−５−アルソン酸、ＭＧＢ構成ブロックは、１−アセチル−２，３−ジヒドロ−インドール−５−イルアミン−６−アルソン酸から、非アルソナン化化合物に関する以下のＦｉｓｈｅｒ環化反応手順［Ｓａｍｓｏｎｉｙａ  Ｓｈ．Ａ．，Ｋａｄｚｈｒｉｓｈｖｉｌｉ  Ｄ．Ｏ．，Ｇｏｒｄｅｅｖ  Ｅ．Ｎ．，Ｚｈｉｇａｃｈｅｖ  Ｖ．Ｅ．，Ｋｕｒｋｏｖｓｋａｙａ  Ｌ．Ｎ．，Ｓｕｖｏｒｏｖ  Ｎ．Ｎ．Ｃｈｅｍ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｏｍｐｄ．（Ｅｎｇｌ．Ｔｒａｎｓｌ．），１８（４），ｐ３８２−３８５，１９８２；Ｋｈｉｍ．Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌ．Ｓｏｅｄｉｎ．，１８（４），ｐ５０４−５０７，１９８２］により得た。
【０２２８】
図５に示すアルソン酸基含有ＭＧＢ試薬は、６−アセチル−３，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［１，２−ｂ：４，３−ｂ’］ジピロール−２−エトキシカルボニル−５−アルソン酸から、非酸類縁体に関する公表された手順［Ｂｏｇｅｒ  Ｄ．Ｌ．，Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｒ．Ｓ．，Ｉｎｖｅｒｇｏ  Ｂ．Ｊ．，Ｓａｋｙａ  Ｓ．Ｍ．，Ｉｓｈｉｚａｋｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１２，１２，ｐ４６２３−４６３２，１９９０］を使用して製造し、その後以下に記載する方法によってアルソン酸基の保護を行った。
【０２２９】
３，４−ジヒドロキシアジポニトリル（Ｅ１）は、公表された手順［Ｐｒｚｙｂｙｔｅｋ  Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１７，ｐ１０９５，１８８４］に従って得た。
【０２３０】
２，３−ジヒドロキシ−２，３−ジメチル−スクシンニトリルは、Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２８，１９６３，ｐ８２８−８３１によって記載されたようにして得た。
【０２３１】
２，３−ジメチル−１，４−ビス（フェニルチオ）ブタン−２，３−ジオールは、公知の手順［Ｆａｒｋａｓ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ７４（７），１９９１，ｐ１５１１−１５１９］によって製造し、これを、ｍ−クロロ過安息香酸を使用して酸化し、２，３−ジメチル−１，４−ビス（フェニルチオジオキソ）ブタン−２，３−ジオールとした。
【０２３２】
４−ヒドラジノフェニルアルソン酸（Ａ４）は、［Ｚｈａｎｇ，Ｐｅｎｇ；Ｍｅｎｇ，Ｊｉｂｅｎ；Ｌｉ，Ｘｉａｏｌｉｕ；Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｔｅｒｕｏ；Ｗａｎｇ，Ｙｏｎｇｍｅｉ  Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．３９，１，ｐ１７９−１８４，２００２］に記載された方法を使用して、４−ヒドラジノ安息香酸に類似した方法で得た。
【０２３３】
［４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）フェニル］アルソン酸は、［Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆ，Ｐｙｍａｎ，Ｒｅｍｆｒｙ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９３，ｐ１９００，１９０８］に記載された方法に従って得た。
方法Ａ
方法Ａは、リンカーおよびヌクレオシド中の１級アルコール基のＤＭＴｒ−保護について、典型的な手順を示す。一般的に言って、１級アルコール（１０ｍｍｏｌ）を有する化合物を乾燥ピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、アルゴン下、室温で撹拌した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣＩ，３．５ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を一部分加え、５時間撹拌した。混合物を蒸発させ、ジクロロメタン（５００ｍＬ）に取り、飽和ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌ溶液（各２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。抽出物を蒸発させ、残留物を、酢酸エチル、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィで精製し、ＤＭＴｒ保護アルコールを製造した。
方法Ｂ
方法Ｂは、ＣＰＧへ固定する一般的方法を示す。（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｔ．およびＳｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（編集者），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４も参照）。スキーム８は、アルソナート基を有する、式（ＩＩＩ）のキサンチン色素、リンカー基（ここで１級アルコールは、ＤＭＴｒによって保護されている）を図示する。リンカー基は、無水コハク酸での反応により修飾され、反応基：−ＣＯＯＨを与え、これは、次に、カップリングし、ＣＰＧ上のアミノ基となる。
【０２３４】
一般的に言えば、化合物１（１．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、無水コハク酸（０．１５ｇ，１．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）、および触媒として４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，０．０１ｇ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌し、１ｍＬの水により処置を１時間行い消光し、未反応無水物を加水分解した。混合物を蒸発し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）に取り、２Ｍの飽和ＮａＨＳＯ４溶液および飽和ＮａＣｌ溶液（各２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。抽出物を蒸発し、酢酸エチル、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を使用するシリカゲルカラムに素早く通した。精製された物質は、コハク酸を含んでいない。スクシネート中間体を、乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に再び溶解し、アミノ−ＣＰＧ（１ｇ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，０．３１ｇ，１．５ｍｍｏｌ）で処理し、アルゴン下で一晩撹拌した。修飾されたＣＰＧ  Ｅをろ過によって集め、エーテルでの洗浄によって精製した。修飾されたＣＰＧを酸で脱トリチルし、光学密度によって、放出されたＤＭＴｒ基を測定することによって負荷を定量した。アルソナート色素をオリゴヌクレオチドプローブの３’末端に導入するために、この修飾されたＣＰＧ２を直接使用した。
スキーム８
【０２３５】
【化６２】
2008535945.tif 000058
方法Ｃ
方法Ｃは、ホスホルアミダイトの製造に関する一般的方法を示す。（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｔ．，およびＳｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（編集者），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４も参照）。以下のスキーム９は、式（ＩＩＩ）１のキサンチン色素が標準の合成によりホスホルアミダイト化合物３とすることを図示する。
スキーム９
【０２３６】
【化６３】
2008535945.tif 000059
一般的に言えば、化合物１（１．０ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液に、Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（０．２ｇ，１．５５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下、室温で撹拌し、クロロホスファイト（２．５ｇ，１．０６ｍｍｏｌ）で滴下処理した。反応混合物を１時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液および飽和ＮａＣｌ溶液（各２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。抽出物を蒸発させ、最小限の量のエーテルに再度溶解し、撹拌ヘキサンに沈殿させた。固体３をろ過により集め、真空乾燥し、アルソナート色素の内部位置、オリゴヌクレオチドプローブの３’−または５’−末端への導入のために直接使用した。
方法Ｄ
方法Ｄは、アルソナートジエステルを製造する一般的な方法を示す。アルソナートジエステル色素およびアルソナート基を有するＭＧＢは、亜ヒ酸エステル二塩化物をアルコールで処理し、次いで酸化ステップを行う［Ｗｅｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２２，ｐ４５２，１９５７］ことによって得た。適切なアルコールの例として、ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＨＯＣＭｅ２−ＣＭｅ２ＯＨ（ピナコール）が挙げられるが、これらに限定されない。スキーム１０は、亜ヒ酸エステル二塩化物（−ＡｓＣＩ２）基を有する色素またはＭＧＢ（４）を、ピナコールの存在下、エステル化し、中間体亜ヒ酸エステル５を製造するのを図示する。次いで、ＳｅＯ２またはＨ２Ｏ２による酸化によって、色素（またはＭＧＢ）シアノエチルアルソナートジエステル６を製造する。
スキーム１０
【０２３７】
【化６４】
2008535945.tif 000060
特に、亜ヒ酸エステル二塩化物４を有する色素またはＭＧＢは、対応するアルソン酸１から、ＰＣＩ３処理［Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｂｅｒｔｈｅｉｍ，１９１０−１９１１］または色素またはＭＧＢのＡｓＣＩ３による直接求電子置換［Ｖａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９３９］によって得られる。
【０２３８】
一般的に言えば、アルソン酸色素またはＭＧＢ１（１．０ｍｍｏｌ）の三塩化リン（２０ｍｌ）懸濁物を、アルゴン下、６０°までゆっくり加熱する。混合物を１５分間撹拌し、ロタバップ（ｒｏｔａｖａｐ）により蒸発させ、亜ヒ酸エステル二塩化物４を形成した。化合物４は湿度に敏感なので、さらに精製することは必要ではない。あるいは、非置換色素またはＭＧＢ（１．０ｍｍｏｌ）の三塩化ヒ素（１０ｍｌ）懸濁物をアルゴン下で撹拌しながら、１００°までゆっくり加熱した。混合物を３０分間撹拌し、乾燥エーテルまたはヘキサンに注ぎ入れ、亜ヒ酸エステル二塩化物４を析出させた。ジクロロ亜ヒ酸エステル４をキシレンで蒸発することによって乾燥し、次のステップのエステル化で直接使用した。ジクロロ亜ヒ酸エステル４（１．０ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（１０ｍＬ）溶液に、ピナコール（０．１３ｇ，１．１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で加え、混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を蒸発させ、残渣を、酢酸エチル、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって精製し、化合物５を製造した。１，４−ジオキサン、アセトンまたはＤＭＦの１Ｍ溶液中で、６０°で３時間、撹拌しながら、等量のＳｅＯ２で処理することによって、亜ヒ酸ジエステル５を酸化してアルソナートジエステル６とし、セライトによって赤色Ｓｅ析出物からろ過し、ロタバップ（ｒｏｔａｖａｐ）を使用して蒸発させた。キシレンを用いた共蒸発により微量のＤＭＦを除去し、その後、シリカゲルカラムで沈殿させた。混合物を、酢酸エチル、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を使用して、フラッシュクロマトグラフィによって精製し、アルソナートジエステル６を製造した。
【０２３９】
保護アルソナート色素またはＭＧＢ６を、先に記載した方法Ａ〜Ｃを使用して、ＣＰＧ上に固定、またはホスホルアミダイト試薬に変換した。
【０２４０】
記載したホスホルアミダイトおよびＣＰＧを使用したオリゴヌクレオチド合成を、自動化オリゴヌクレオチド合成［Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｔ．およびＳｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（編集者），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４］の標準のプロトコルを使用して行った。次いで、アンモニア中で、アルソナートエステルの脱保護を、スキーム１０で図示された条件下で行った。
方法Ｅ
方法Ｅは、アルソン酸色素のキレート化保護の一般的方法を示す。該方法は、ジエステルおよびオルソエステル保護アルソナートの両方を提供することができる。反応の結果は、キレート化剤の性質／構造、反応条件および単離中の処理に大きく依存する。アンモニア不安定性キレート化保護基の選ばれた例を図３に示す。
【０２４１】
酢酸（５ｍＬ）に、酸形態を単に溶解する、またはＨ２ＳＯ４（等量）をアルソナート色素のナトリウム、カリウムまたはトリアルキルアンモニウム塩の対応する量に添加することにより、アルソン酸色素誘導体（０．１ｍｍｏｌ）の酢酸（５ｍＬ）溶液を製造した。得られた溶液を、１．５倍過剰のキレート化剤、ジオールまたはピロカテコール、各アルソン酸基：１個のアルソン酸基を持つ色素に関して０．３ｍｍｏｌおよび２個のアルソン酸基を持つ色素に関して０．６ｍｍｏｌで処理した。グリコールアルデヒド、グリオキザール、グリコール酸、グリオキシル酸、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、３−ヒドロキシプロピオン酸、マロンアルデヒドのような他のキレート化剤を、ここで記載した方法と類似の方法で使用した。
【０２４２】
キレート化反応を、無水酢酸（０．２ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）の存在下、室温で１時間、または等容積のキシレンを持つ複数の真空蒸発により、水副生物を除去して行った。各蒸留の前に、新しいキシレンおよび酢酸を、同比率で加えた。蒸留は、少なくとも２回繰り返す必要がある。蒸発の実際の回数、反応時間および温度は、保護キレート化剤、使用されるジオールまたはピロカテコールに大きく依存し、反応の進行をモニターするために、ＴＣＬを使用して最適化される必要がある。通常、シリカゲル板上でＴＬＣを、２−ブタノン：ギ酸：ＭｅＯＨ：水（１２：１：１：１）の溶液系で行った。生成物（色素−Ａｓ（Ｏ２Ｗ）２を、ＥｔＯＡｃ：ＡｃＯＨ：ＭｅＯＨ混合物を使用する、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィ、またはＲＰ  ＨＰＬＣによって単離した。より具体的には、Ｏ２Ｗ（すなわち、−Ｏ−Ｗ−Ｏ−）がジオール（ピロカテコールを含む）残基であり、Ｗは本明細書で規定する通りである。
方法Ｆ
方法Ｆは、アルソン酸色素のカルボン酸誘導体の活性化エステルを製造する一般的方法を示す。
【０２４３】
乾燥カルボン酸結合体の乾燥トリエチルアミン（３．１ｍＬ）およびジクロロメタン（４０ｍＬ）０．５６Ｍ溶液に、アルゴン下でトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（３．８４ｍＬ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌する。ヘキサン（４０ｍＬ）を加え、色素のアルソン酸トリエチルアンモニウムのペンタフルオロフェニルエステル生成物を析出する。この活性化エステルを、中性または酸性条件下で、ＲＰ  ＨＰＬＣのシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。該試薬を、もし必要であれば、イオン交換し、ナトリウムまたはカリウム形とし、標準プロトコル［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ-Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，第１章-Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｍｉｎｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ］を使用して、アミンとのバイオ結合体化に直接使用した。
方法Ｇ
アルソナートエステル−保護色素の分解／脱保護速度の測定
保護色素（１ｍｇ）およびメチルレッド色素（０．５ｍｇ，内部標準，λｍａχ４８２ｎｍ）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、緩衝液または２５％アンモニア水溶液（４５ｍＬ）と混合した。サンプル（１ｍＬ）を分解の期間に取った。サンプルを迅速に真空下に置き、アンモニアを除去し、ＭｅＯＨに溶解、あるいは緩衝液中、ｐＨ１．６（０．１％トリフルオロ酢酸）〜７．５（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）の範囲でＨＰＬＣ分析のために直接使用した。ＨＰＬＣ分析を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ５ｕｍＣ１８  １１０Ａカラム（２５０×４．６ｍｍ）で、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．５）緩衝液中、ＭｅＣＮの０〜１００％勾配を使用して行った。クロマトグラムを、Ｖａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ＰＤＡ検出器を使用して、２００〜６００ｎｍの範囲で検出した。相対濃度の計算を、５２０ｎｍでのピーク面積に基づいて行った。内部標準は、８．６分でのピークを得た（λｍａχ４８２ｎｍ）。
【０２４４】
図１２は、ビスピナコール保護アゾ色素の塩基誘発脱保護に対応する典型的な速度曲線の例を図示する。
【実施例】
【０２４５】
実施例
以下の実施例に、本発明の特定の色素試薬およびそれらの製造を説明する。詳細な実験手順は、方法Ａ〜Ｆの任意の適正な組合せに従って得た。
【０２４６】
実施例１
実施例１は、アルソナートエステルを有する、式（ＩＩ）のホスホルアミダイト色素試薬である。色素試薬は、ホスホルアミダイト方法を使用する自動化オリゴヌクレオチド合成に適している。
【０２４７】
【化６５】
2008535945.tif 000061
該色素試薬を方法ＣおよびＤに従って製造した。
【０２４８】
実施例２
実施例２は、２個のアルソナートオルソエステルを有する、式（ＩＩＩ）のカルボン酸色素試薬を示す。色素試薬は、ＣＰＧのような固形支持体に結合し、オリゴヌクレオチド合成を開始するのに適している。
【０２４９】
【化６６】
2008535945.tif 000062
該色素試薬を方法ＢおよびＤに従って製造した。
【０２５０】
実施例３
実施例３は、ピナコールを保護キレート化剤として使用する、２個のアルソナートジエステルを有する、式（ＩＩＩ）のホスホルアミダイト色素試薬を示す。色素試薬は、ホスホルアミダイト方法を使用する、自動化オリゴヌクレオチド合成に適切である。
【０２５１】
色素試薬を、方法Ａ、Ｃ、ＤおよびＥに従って製造した。さらに詳しい合成経路を、図４に図示する。
【０２５２】
【化６７】
2008535945.tif 000063
実施例４
実施例４は、キレート化アルソナートエステルを有する、式（ＩＸ）のＭＧＢ中間体を示す。ＭＧＢを図５に図示されるように製造した。方法Ｅを使用して、活性化エステルを得た。
【０２５３】
【化６８】
2008535945.tif 000064
実施例５
実施例５は、アルソナートエステルおよび活性化反応基（−ＣＯＯＨのペンタフルオロフェニルエステル）を有する、式（ＶＩ）のＭＧＢを示す。
【０２５４】
【化６９】
2008535945.tif 000065
キレート化アルソナートエステルを有するＭＧＢを、Ｎ保護ピロロインドールサブユニットを使用し、ピナコールをジオールとして使用する方法Ｅに従って製造した。２個のピロロインドールサブユニットの結合を、先に図５に図示した、合成経路に従って行った。次の保護、脱保護を、さらに、図６に図示する。活性化エステル（ペンタフルオロフェニルエステル）を、方法Ｆを使用して得た。この活性化エステルを、バイオ結合体化のために、または第３ＭＧＢサブユニットを試薬に導入するために使用した。
【０２５５】
実施例６
実施例６は、アルソナートエステルおよびホスホルアミダイト反応基を有する式（ＩＶ）の蛍光消光物質色素試薬を示す。色素試薬は、ホスホルアミダイト方法を使用する、自動化オリゴヌクレオチド合成に適切である。
【０２５６】
【化７０】
2008535945.tif 000066
蛍光消光物質色素試薬を方法Ｃに従って製造した。
【０２５７】
実施例７
式（Ｖａ）の極性カルボシアニン色素Ｇ１の合成を、スキーム１１に図示する。色素化合物Ｇ１は、４−ヒドラジノフェニルアルソン酸（Ａ４）から、中間体Ｇ２〜Ｇ４を経て製造される。
スキーム１１
【０２５８】
【化７１】
2008535945.tif 000067
特に、２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スルホニルを得るために、中間体２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−アルソン酸（Ｇ２）を、スルホフェニルヒドラジンのＦｉｓｈｅｒ環化反応類似の方法で得た［Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｒ．Ｂ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｌ．Ａ．，Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｓ．Ｒ．，Ｌｅｗｉｓ  Ｃ．Ｊ．およびＷａｇｇｏｎｅｒ  Ａ．Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４（２），ｐ１０５−１１１，１９９３］
化合物Ｇ２を１，３−プロパンサルトンで処理することによって、以下、Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｒ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９３によって記載された一般手順と同じ手順で、１−（γ−スルホナートプロピル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−アルソン酸（Ｇ３）を得た。
【０２５９】
中間体Ｇ４を、Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｒ．Ｂ．，１９９３によって記載された方法の変種によって得た。Ｎ置換インドレニンＧ３（０．１４ｇ，０．３１ｍｍｏｌ）およびマロンアルデヒドジアニル塩酸塩（０．０９ｇ，０．３５ｍｍｏｌ）の酢酸（２ｍｌ）およびトリエチルアミン（０．０５ｍｌ）混合溶液を、Ａｒ下、３０分還流した。反応物に関し、出発インドレニンＧ３の消失と、混合物のＵＶスペクトルの変化を、ＨＰＬＣによってモニターした。反応混合物をエーテルで処理した。化合物Ｇ４を、不安定な固形析出物として単離し、さらに精製することなく、次のステップの対称または非対称色素の製造のために使用した。
【０２６０】
色素、２−｛５−［３’，３’−ジメチル−１’−（３−スルホプロピル）−１’，３’−ジヒドロインドリデン−５’−アルソナート］−ペンタ−１，３−ジエニル｝−３，３−ジメチル−１−（３−スルホプロピル）−３Ｈ−インドリウム−５−アルソン酸（Ｇ１）を、スルホシアニン色素の文献［Ｂｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｓ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３，２０００，ｐ２３２３−２３２４］に公表された一般的手順を使用して得た。Ｃ１の励起および放射スペクトルを図１１に示す。
【０２６１】
実施例８
ＩＲ色素Ｈ１の合成
式（ＶＩａ）の代表的なＩＲ色素Ｈ１の合成を、スキーム１２に示す。この実施例で、ｘは２であり、Ｒ５７は−（ＣＨ２）ＳＳＯ３Ｈであり、Ｒ６１ａおよびＲ６１ｂは、それぞれ、エチル基であり、Ｒ５８ａおよびＲ５８ｂは、それぞれ、メチル基である。
スキーム１２
【０２６２】
【化７２】
2008535945.tif 000068
Ｈ２を［Ｄｕｃｋｉ  Ｓ．，Ｈａｄｆｉｅｌｄ  Ｊ．Ａ．，Ｈｅｐｗｏｒｔｈ  Ｌ．Ａ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｎ．Ｊ．，Ｌｉｕ  Ｃ−Ｙ．，ＭｃＧｏｗｎ  Ａ．Ｔ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，７（２４），ｐ３０９１−３０９４，１９９７］に従って得た。
【０２６３】
中間体Ｈ３を、Ｈ２の酸触媒環化から得る。ｔ−ＢｕＭｇＣｌによる置換反応によって、２−メチル−４−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）クロメニリウム過塩素酸Ｈ４を製造する［Ｄｏｄｄｉ  Ｇ．，Ｅｒｃｏｌａｎｉ  Ｇ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．２，ｐ２７１−２７６，１９８６］。
【０２６４】
色素、１−（γ−スルホネートプロピル）−３，３−ジメチル−２−［３−（４−ｔ−ブチルベンゾピラン−２−イリデン）プロペン−１−イル］−３Ｈ−インドリウム−５−アルソン酸（Ｈ１）を、前記中間体Ｇ４と、クロメリニウム過塩素酸Ｈ４とを、スルホシアニン色素に関する文献［Ｂｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，２０００］で公表された一般的手順によって、縮合することによって得た。
【０２６５】
実施例９
ＩＲ色素Ｈ１０の合成
【０２６６】
【化７３】
2008535945.tif 000069
式（ＶＩＩ）のＩＲ色素シリーズＨ１０を、非置換ＩＲ色素に関して公表された手順［Ｉｓｈｃｈｅｎｋｏ  Ａ．Ａ．，Ｋｕｄｉｎｏｖａ  Ｍ．Ａ．，Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉｉ  Ｙｕ．Ｌ．，Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ  Ａ．Ｉ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ（Ｅｎｇｌ．Ｔｒａｎｓｌ．），ｐ１５０−１５７，１９８６；Ｚｈ．Ｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，２２（１），ｐ１７０−１７９，１９８６］に従って合成した。色素Ｈ１０の合成の例を、スキーム１３に図示する。
スキーム１３
【０２６７】
【化７４】
2008535945.tif 000070
特に、Ｒ，Ｒ’−置換中間体Ｈ７を、アルソナート置換Ｈ５を、塩基性条件下でシクロヘキサノンで縮合し、次いで、得られたＨ６を、ＦｅＣｌ３の存在下酸化的環化［Ａｌｌｅｎ，Ｓａｌｌａｎｓ  Ｃａｎ．Ｊ．Ｒｅｓ．，９，ｐ５７４−５７９，１９３３］を行うことによって得た。中間体Ｈ９を、  Ｒ’’置換Ｈ８から得た［Ｍａｋｉｎ  Ｓ．Ｍ．，Ｐｏｍｏｇａｅｖ  Ａ．Ｉ．  Ｂｏｉｋｏ  Ｔ．Ｎ．，Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖａ  Ａ．Ｐ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ（Ｅｎｇｌ．Ｔｒａｎｓｌ．），１７（１１），ｐ２０３３−２０３６，１９８１；Ｚｈ．Ｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１７（１１），ｐ２２７７−２２８１，１９８１；Ｍａｋｉｎ  Ｓ．Ｍ．，Ｐｏｍｏｇａｅｖ  Ａ．Ｉ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ（Ｅｎｇｌ．Ｔｒａｎｓｌ．），１８（１０），１９８２，ｐ１９１８−１９２０；Ｚｈ．Ｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１８（１０），ｐ２１７６−２１７９，１９８２］。次いで、Ｈ９を、２当量のＨ７にカップリングし、蛍光性ＩＲ色素Ｈ１０を得た。
【０２６８】
実施例１０
式（Ｖｄ）の、アルソン酸基を持つスクアラインおよびチオスクアライン色素を、２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−アルソン酸（Ｇ２）およびその誘導体、たとえば１−（γ−スルホナートプロピル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−アルソン酸（Ｇ３）から、米国特許出願公開第２００３／０２３５８４６号明細書に記載するようにして合成した。
【０２６９】
実施例１１
［４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）フェニル］アルソン酸ビス−ピナコレート
【０２７０】
【化７５】
2008535945.tif 000071
ジオールキレート試薬としてピナコールを使用し、方法Ｅにおいて概略を述べた手順に従って、上記の化合物を得た。キシレンでの２回の蒸発によって水の除去を達成した。移動層としてＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（１０：１）を使用し、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより、粗生成物を単離した。生成物をＭｅＯＨから結晶化し、オレンジ−黄色固体を得た。融点：２３９〜２４２°、シリカゲル板上にオレンジ色の単一スポット、Ｒｆ＝０．５（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ１０：１）
【０２７１】
【数１】
2008535945.tif 000072
化合物は、水性緩衝液中、ｐＨ１．６〜７．５の範囲で安定であるが、２５％アンモニア水中で分解し、これによって、オルソエステルが加水分解する。アンモニア中の分解を、方法Ｇに従って測定した。室温での完全分解速度（τ１／２）は、約３時間である。脱保護の完全反応速度を図１２に示す。ビスピナコール−保護色素（１３．３分でピーク，λｍａｘ：４３０ｎｍ）および明らかにモノピナコールで保護された中間体（９．５０分でピーク，λｍａｘ：４４０ｎｍ）は、同じ範囲で吸光度を有する。完全に脱保護された色素（６．０分でピーク）は、λｍａｘ：４８０ｎｍで極大吸光度を有する。
【０２７２】
実施例１２
［４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）フェニル］アルソン酸２，４−ジメチル−２，４−ペンタンジオールキレート
【０２７３】
【化７６】
2008535945.tif 000073
ジオールキレート試薬として２，４−ジメチル−２，４−ペンタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、方法Ｅで概略を述べた手順に従って、上記の化合物を得た。キシレンでの２回の蒸発によって水の除去を達成した。移動層としてＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（１０：１）を使用し、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより、粗生成物を単離した。生成物をＭｅＯＨから結晶化し、オレンジ−黄色固体を得た。融点：２３４〜２３８°、シリカゲル板上にオレンジ色の単一スポット、Ｒｆ＝０．５（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ１０：１）
【０２７４】
【数２】
2008535945.tif 000074
化合物は、水性緩衝液中、ｐＨ１．６〜７．５の範囲で比較的安定であるが、２５％アンモニア水中で素早く分解する。アンモニア中の分解を、方法Ｇに従って測定した。室温での完全分解速度（τ１／２）は、約１５分である。２，４−ジメチル−２，４−ペンタンジオール保護色素が、８．９分（λｍａχ：４４９ｎｍ）でピークとして観察された。脱保護色素（６．０分でピーク）は、λｍａｘ：４８０ｎｍで極大吸光度を有する。実際的に完全な脱保護が４時間後観察された。
【０２７５】
実施例１３
［４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）フェニル］アルソン酸、２−ヒドロキシ−イソラク酸を有するキレート
【０２７６】
【化７７】
2008535945.tif 000075
キレート試薬として２−ヒドロキシイソ酪酸を使用して、方法Ｅで概略を述べた手順に従って、上記の化合物を得た。キシレンでの２回の蒸発によって水の除去を達成した。移動層としてＥｔＯＡｃを使用し、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより、粗生成物を単離した。生成物をＭｅＯＨから結晶化し、オレンジ−黄色固体を得た。融点：２３３〜２３５°
【０２７７】
【数３】
2008535945.tif 000076
化合物は、水性緩衝液中、ｐＨ１．６〜７．５の範囲で非常に安定である。酸性条件ではすぐに分解し、ｐＨ７．５で数分以内に分解する。緩衝液中の分解を方法Ｇに従って測定した。室温、ｐＨ７．５での完全分解速度（τ１／２）は、約１０分である。実際的に完全な脱保護が２時間後に観察された。
【０２７８】
実施例１４
［４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）フェニル］アルソン酸ビス−カテコールキレート
【０２７９】
【化７８】
2008535945.tif 000077
キレート試薬として１，２−ジヒドロキシベンゼン（ピロカテコール）を使用して、方法Ｅで概略を述べた手順に従って、この化合物を得た。キシレンでの２回の蒸発によって得られた水の除去を達成した。化合物を、反応混合物から結晶化し、ろ過で集め、ＭｅＯＨで洗浄し、茶色の固体を得た。融点：２２０°（分解）
化合物は、水性緩衝液中、ｐＨ１．６〜７．５の範囲で非常に安定である。また、室温で２５％アンモニア水溶液中でも非常に安定である。化合物は３日間で分解が観察されたかった。ＨＰＬＣは、８．０分、λｍａｘ：４２５ｎｍでピークを示した。
【０２８０】
実施例１５
リアルタイムＰＣＲアッセイ
ＢＨＱ−１およびＢＨＱ−２消光物質色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からのＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ消光物質）を３’末端に結合し、本発明の蛍光色素を５’末端に結合体化したオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｅｐｈｉｅｄプローブ）を、以下のリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲアッセイで試験した。
【０２８１】
蛍光性モニターをケフェイドＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）で行った。各反応は、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０×ＰＣＲ緩衝液ストック）、４００μＭ各ｄＮＴＰ、２５０ｎＭ各プライマー、２００ｎＭケフェイドプローブ、２０単位／２５μｌ  ＳｕｐｅｒＡｓｅ−Ｉｎインヒビター、３単位／２５μｌ白金Ｔａｑポリメラーゼ、１単位／２５μｌ  Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴポリメラーゼ、テンプレートとして１ｎｇ／２５μｌ  Ｋ５６２ＲＮＡを含んでいた。循環プログラムは、１５分４２℃（１サイクル）、９５℃で１５秒を４５サイクル、次いで６０℃で３０秒であった。
【０２８２】
Ｋ５６２ＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲ検出を、２５０ｎＭのフォワードプライマー（５’  ＣＡＴ  ＴＣＧ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ３’）および２５０ｎＭのリバースプライマー（５’  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＴＡＧ  ３’）で行った。
【０２８３】
標的の増幅は、蛍光性シグナルの指数的増加によって検証した。蛍光性シグナルは、平均２５サイクルで特定の閾値を越えた。
【０２８４】
本明細書に記載されたおよび／または出願データーシートにリストとして挙げた、前記米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、および非特許文献の全ては、その全体を、参照によって本明細書に組み入れる。
【０２８５】
前記内容から、本発明の特定の実施形態を説明の目的のために、本明細書で記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、種々の変形がなされうることは理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の請求項以外のものには限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】数多くの市販のスルホニル含有色素を提示する。
【図２】数多くの市販のスルホニル含有色素を提示する。
【図３】色素、アルソン酸のアルソナートエステル基を含む色素への保護と形成したエステルの脱保護のメカニズムを示す。
【図４】アルソナート色素をオリゴヌクレオチドに導入するための、式（ＩＩＩ）で示されるホスホルアミダイト試薬を、自動化合成法を使用して合成する経路を示す。
【図５】固形支持体、色素および／またはオリゴヌクレオチドへの結合のための、保護アルソナート基を含む式（Ｖｌ）で表されるマイナーグルーブバインダ中間体の合成経路を示す。
【図６】固形支持体、色素および／またはオリゴヌクレオチドへの付着するための、保護アルソナート基を含む式（Ｖｌ）で表される他のマイナーグルーブバインダ中間体の合成経路を示す。
【図７】極性蛍光消光アルソン酸ローダミン色素、活性化エステル試薬を示す。
【図８】自動化合成に適するエステル保護アルソン酸キサンチン色素、ホスホルアミダイトを示す。
【図９】自動化合成法およびアミン類、チオール類およびジエン類との溶液結合体化によって、オリゴヌクレオチドへ導入するための、エステル保護アルソン酸キサンチン蛍光色素を示す。
【図１０】オリゴヌクレオチド類の自動化合成のための、固形支持体上の極性蛍光消光アルソナートアゾ色素を示す。
【図１１】アルソン酸カルボシアニン色素Ｇ１（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス緩衝液中に１．２５ｍＭ）の励起および放射スペクトルを示す。
【図１２】２５％アンモニア水による２０°でのモデルビスピナコール保護アゾ色素の脱保護の反応速度を示す。
【図１】
2008535945.tif 000087
【図２】
2008535945.tif 000088
【図３】
2008535945.tif 000089
【図４】
2008535945.tif 000090
【図５】
2008535945.tif 000091
【図６】
2008535945.tif 000092
【図７】
2008535945.tif 000093
【図８】
2008535945.tif 000094
【図９】
2008535945.tif 000095
【図１０】
2008535945.tif 000096
【図１１】
2008535945.tif 000097
【図１２】
2008535945.tif 000098
【国際調査報告】
2008535945.tif 000099
2008535945.tif 000100
2008535945.tif 000101
2008535945.tif 000102
2008535945.tif 000103
2008535945.tif 000104