(57)【要約】【課題】新たな抗癌剤を提供する。【解決手段】玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体を有効成分とする抗癌剤。【選択図】  図１
2015042627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体を有効成分とする抗癌剤。
【請求項２】
アシル化ステロール配糖体が次の化学式であらわされる化合物である請求項１記載の抗癌剤。
【化１】
2015042627.tif 000008
(i) 化学式（１）中のXは以下の群から選択されるいずれかである。
パルミトイル基
オレオイル基
リノレオイル基
(ii) 化学式（１）中のＹは以下の群から選択されるいずれかである
β-シトステリル基
カンペステリル基
スチグマステリル基
【請求項３】
経口剤である請求項１又は請求項２に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物由来のステロール配糖体の抗癌効果についてすでにいくつかの提案がなされている。
例えば、特許文献１は、ユリ科植物オルトニガラム・サンデルシアエの植物体から抽出したアシル化ステロイド配糖体を有効成分とする抗癌剤が記載されている。
特許文献２は、タシロイモ科の植物であるタッカ・エスクイロリーから抽出された細胞増殖抑制作用を有するステロイド配糖体を有効成分とする抗癌剤が記載されている。
特許文献３は、ユリ科の植物であるガルトニア・キャンディカンスから抽出されたステロイド配糖体を有効成分とする抗癌剤が提案されている。
特許文献４にはキョウチクトウ（ネリウム・インディクム）から抽出したステロイド配糖体を有効成分とする抗癌剤が記載されている。
特許文献５には大豆由来のアシル化ステロール配糖体がＤＮＡ合成酵素を阻害することから、この作用を応用した抗癌剤が提案されている。
これらの提案については、いまだ使用可能な癌治療剤として実用化されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０９−４８７９６号公報
【特許文献２】特開２０００−２３９２９６号公報
【特許文献３】特開２００１−２６９８号公報
【特許文献４】特開２００７−３２６８５５号公報
【特許文献５】特開２０１１−２１３６０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、植物由来ステロイド配糖体画分の研究を行い、その新しい用途と作用について研究を進めたところ、玄米糠由来のアシル化ステロイド（ステロール）配糖体を含有する抽出画分に抗癌剤としての作用を見出し、本発明を完成させた。
本発明は、玄米由来ステロール配糖体を有効成分とする抗癌剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体を有効成分とする抗癌剤。
（２）アシル化ステロール配糖体が次の化学式であらわされる化合物である（１）記載の抗癌剤。
【０００６】
【化１】
2015042627.tif 000003
(i) 化学式（１）中のXは以下の群から選択されるいずれかである。
パルミトイル基
オレオイル基
リノレオイル基
(ii) 化学式（１）中のＹは以下の群から選択されるいずれかである
β-シトステリル基
カンペステリル基
スチグマステリル基
（３）経口剤である（１）又は（２）記載の抗癌剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体が新たな抗癌剤として提供される。特に化学式（１）で示される化合物が抗癌剤として有効である。本発明の抗癌剤は濃度依存的に抗癌作用を示す。抗癌作用は１００μｇ/ｍＬの濃度でがん細胞５０％以上に効果を示し、８００μｇ/ｍＬ以上の濃度でがん細胞の生育を１０％以下に抑制できた。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】発芽玄米由来のアシル化ステロール配糖体が濃度依存的に大腸がん細胞の生育を抑制することを示すグラフである。
【図２】発芽玄米由来のアシル化ステロール配糖体が大腸がん細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導することを示す画像である。
【図３】発芽玄米由来のアシル化ステロール配糖体と該配糖体を構成する各種植物ステロールの大腸がん細胞生育抑制作用を比較したグラフである。
【図４】発芽玄米由来のアシル化ステロール配糖体と非アシル化該配糖体の大腸がん細胞生育抑制作用を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に使用する玄米から抽出されたアシル化ステロール配糖体を含有する画分（以下「ＡＳＧ」と称する場合がある）は、玄米から得た糠をヘキサンで中性脂質を除去し、得られた残渣をさらに有機溶媒にて抽出した脂質画分に含まれ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離・濃縮することが出来る。なお玄米は部分的に発芽させた発芽玄米であってもよい。
玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体は、いわゆる米糠から極微量抽出される成分である。このアシル化ステロール配糖体を医薬あるいは飲食品、ペット用医薬や飼料に応用する場合は、抽出されたアシル化ステロール配糖体そのものを使用するのであって、玄米そのものあるいは玄米の粉末など玄米由来のアシル化ステロール配糖体を抽出する前の状態で使用することは想定されていない。またこの玄米由来のアシル化ステロール配糖体は動物試験での毒性もほとんどない安全な物質であることが確認されている。
【００１０】
本発明は、抗癌剤として、あるいは動物用医薬として利用することができる。剤型は、公知の方法により助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口摂取（投与）することができる。カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液状として摂取（投与）できる。
摂取（投与）量は、摂取（投与）方法と、対象者の年齢、病状や一般状態等によって変化し得るが、成人では体重1kg当たり通常、１日当たり有効成分として０.１〜５００ｍｇが適当である。
【００１１】
＜玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体の調製について＞
１．糠成分を採取する玄米は、玄米又は発芽玄米を原料として用いることができる。発芽玄米は公知の方法により調製することができる。本出願人は、発芽玄米について多数の提案をしており、例えば、特許第３４２３９２７号公報、特許第３６１１８０４号公報、特許第３７３８０２５号公報等に開示された発芽玄米の製法によって得ることができる。
玄米又は発芽玄米を５〜１５％程度搗精して糠成分を採取する。この糠成分を最初に、ヘキサンにて脱脂する。この脱脂工程は、一般の糠を脱脂して米糠油を採取する方法と同様である。したがって、脱脂処理後の廃棄される米糠を使用することもできる。
本発明では、この脱脂糠を原料として、さらに、有機溶媒を用いてアシル化ステロール配糖体画分を抽出する。
その他の方法としては、米糠を物理的に圧縮して得られた油からアシル化ステロール配糖体を抽出する事も出来る。
【００１２】
２．本発明に係る発芽玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体とは式（１）に示す構造のステロール配糖体を含有する。このアシル化ステロール配糖体を以下ＡＳＧと略称する。
【００１３】
【化１】
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(i) 化学式（１）中のＸは以下の群から選択されるいずれかである。
パルミトイル基
オレオイル基
リノレオイル基
(ii) 化学式（１）中のＹは以下の群から選択されるいずれかである。
β-シトステリル基
カンペステリル基
スチグマステリル基
【実施例】
【００１４】
以下に試験例、実施例を示し本発明を具体的に説明する。
[マウス大腸がん細胞を用いた抗癌効果の評価]
アシル化ステロール配糖体含有画分（ＡＳＧ）をマウス大腸がん細胞の培養系に添加して生育抑制効果を検討した。
【００１５】
＜ＡＳＧの調製例＞
上記した米糠をヘキサンで脂質成分中の中性脂質を除去後、残渣を、ヘキサン、クロロホルム及びメタノールを用いてＡＳＧの粗抽出液を調製した。このＡＳＧ粗抽出液からクロロホルム：メタノール（２：１）混合液で抽出し、シリカゲル担体カラムクロマトグラフィーによって、ＡＳＧの調製を行った。
試験に用いたＡＳＧの抽出は発芽玄米約２，０００kgを搗精して得られた糠２００kg（搗精度１０％）を用いて行った。玄米糠（５００ｇ）が浸る量のヘキサンを加え十分に撹拌した後ガーゼでろ過を行い、脱脂糠を得た。その後、ヘキサンを揮発させた脱脂糠１．５ｋｇに対してクロロホルム:メタノール２：１を（３Ｌ）加えて総脂質画分を抽出し、抽出液をエバポレーターで乾固させ乾固物を得た。
【００１６】
乾固物は３００ｍＬのクロロホルム：ヘキサン＝１：１に溶解し、クロロホルムで膨潤させた直径１０ｃｍ×長さ１００ｃｍ(メルク社製シリカゲル６０を８０ｃｍ充填)のカラムに全溶解液をアプライした。溶液がイアトロビーズに全てしみ込んだ後、クロロホルム：ヘキサン＝１：１(７，８４０ｍＬ)、クロロホルム(２０，１６０ｍＬ）、クロロホルム:メタノール=９：１(１０，０８０ｍＬ)の順でそれぞれを通液した。クロロホルム:メタノール=９：１の通液により分離した暗緑色の溶液だけを全て採取した。
採取した暗緑色の溶液はエバポレーターで乾固させ試験に供した。
表１に各工程での収量を示す。
【００１７】
【表１】
2015042627.tif 000005
総脂質画分はクロロホルム：メタノール＝２：１で糠から抽出して得られた画分である。  
【００１８】
［ASG分析］
抽出した最終乾固物中のＡＳＧの分析は以下の条件で行った。この条件では、アシル化ステロール配糖体の混合物が単一ピークとして検出される。この分析の結果、最終乾固物には、ＡＳＧが７２.６％含まれていることが判明した。
分析条件
検出器    ：ＣｏｒｎａＴＭ  ＣＡＤＴＭ  Ｃｈａｒｇｅｄ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
カラム    ：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  Ｓｉ  ６０（５μｍ，１２５×４ｍｍ  ｉ．ｄ．，Ｍえｒｃｋ）
カラム温度：４０℃
流  速    ：1 ｍＬ /ｍｉｎ.
注入量    ：２０μＬ
サンプル溶媒：クロロホルム：メタノール（２：１，容量比l）
検量線濃度  ：６．２５，１２．５，２５，５０及び１００μｇ/ｍＬ（Ｍａｔｒｅａ；テクノケミカル社  /＃1118Ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ  ｓｔｅｒｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ  を標準品とした。当該標準品は、植物から抽出されたアシル化ステロール配糖体の混合物であり、主成分はβ-シトステリルグルコシドパルミテートである。）
移動相のグラジェント条件(下記表２参照)
【００１９】
【表２】
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【００２０】
[ＡＳＧ構成成分の分析]
上記のＨＰＬＣ法で分離したＡＳＧをＬＣマススペクトル法で分析し、構成する糖質、脂肪酸、ステロールを分析した。
ＬＣ／ＭＳの条件は以下のとおりである。
検出器：ＬＣＭＳ−２０２０（島津製作所）
ＡＰＣＩ：ポジティブモード
カラム：ＵＧ１２０（５μｍ、４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ×２５０ｍｍ  （資生堂）、カラム温度：５５℃
流速  １ｍＬ/ｍiｎ
注入量  ２０μＬ
移動相  アセトン：メタノール＝５０：５０（ｖ/ｖ）
分析時間  １３０分
分析結果を下記の表３に示す。
【００２１】
【表３】
2015042627.tif 000007
【００２２】
試験例１
［細胞培養試験］
マウス大腸がん細胞（Ｃ−２６）は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手した。
細胞の培養には１０％ウシ胎児血清とペニシリン・ストレプトマイシン１％を含むＲＰＭＩ１６４０を培地として用いた。また、培養は３７℃、５％ＣＯ２条件下で行った。細胞数は、トリパンブルーで染色後生細胞を、細胞数計測装置を用いて測定した。
【００２３】
(１)抗癌活性評価
活性は次のように測定した。継代培養によって８０％以上のコンフルエント状態になった細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるように調製し、調製後９６穴プレートの各ウェルに１００μＬずつ播種し、２４時間培養した。培養後、各被験物質をＤＭＳＯで溶解し、これを培地に０．３％添加し、各被験物質の最終濃度を０−８００μｇ/ｍＬとし、２４時間培養した。その後、各ウェルにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を１０μＬ添加し、インキュベーターで１−２時間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度(４５０ｎｍ)を測定し、次式にて、細胞生育率（％）を求めた（n=8）。
【００２４】
生存率(％)＝［(Ａｓ−Ａｂ１)／(Ａｃ−Ａｂ１)］×１００
Ａｓ＝試料添加の吸光度、Ａｂ１＝培地ブランクの吸光度
Ａｃ＝試料無添加の吸光度
【００２５】
（２）結果
図１に試験結果を示す。本発明の組成物は濃度依存的に抗癌作用を示す。抗癌作用は１００μｇ/ｍＬの濃度でがん細胞５０％以上に効果を示し、８００μｇ/ｍＬ以上の濃度でがん細胞の生育を１０％以下に抑制できた。
したがってマウス大腸がん細胞に対してＡＳＧの濃度に依存して生育を抑制することが明らかとなった。
【００２６】
試験例２
[細胞死のタイプ確認]
（１）方法
前記の大腸がん細胞の細胞死の状態が、細胞毒によるものでないことを確認するためＤＮＡ鎖分解物の標識（ＴＵＮＥＬ）法に基づく細胞レベルでの、アポトーシスの免疫組織化学的検出を行った。ＴＵＮＥＬ反応は、アポトーシスにより生成するＤＮＡ鎖分解物を優先的に標識する。したがって、細胞毒などに由来のネクローシスより誘導される一次ＤＮＡ鎖分解物と判別できる。
判定には、  In Situ Cell Death Detection Kit, AP（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用して行った。
ＡＳＧ濃度が０、５００μｇ／ｍＬ、２０００μｇ／ｍＬになるように添加し、６時間経過後の細胞のアポトーシス免疫組織化学的検出状態を観察した。
【００２７】
（２）結果
観察した画像を図２に示す。ＡＳＧを添加すると、無添加と比較して、濃度依存的にアポトーシスにより生成されるＤＮＡ分解物に対する免疫染色に強く反応するようになり、濃く着色されることが確認された。したがって、大腸がん細胞の細胞死は、毒性などによるものではなく、細胞のアポトーシスが濃度依存的に誘導された結果であることが確認された。
【００２８】
試験例３
［抗癌作用物質の特定１］
抗癌効果の作用物質（活性物質）を確認するため、前記のβ−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールを単独で大腸がん細胞の培養系に添加し、がん細胞に対する作用を試験した。
（１）方法
試験例１と同様に、継代培養によって80%以上のコンフルエント状態になった細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製し、調製後９６穴プレートの各ウェルに１００μＬずつ播種し、２４時間培養した。培養後、ＡＳＧ、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールを１０〜５００mg/ｍＬとなるようにＤＭＳＯで溶解し、これを培地に０．３％となるように添加した。すなわち各試料の最終濃度は１０μｇ/ｍＬ、２０μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ、２５０μｇ/ｍＬ、５００μｇ/ｍＬとなった。このＡＳＧ濃度条件で、24時間培養した。
ついで、各ウェルにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を１０μＬ添加し、インキュベーターで１−２時間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度(450nm)を測定し、同様に細胞生育率（％）を求めた（ｎ＝８）。
【００２９】
（２）結果
測定結果を図３に示す。化学式（１）のＹの構成成分であるβ−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールはいずれも単独では大腸がん細胞の生育を抑制しなかったがＡＳＧは濃度依存性でがん細胞の生育を抑制した。したがって、化学式（１）の構造を有する化合物(アシル化ステロール配糖体)が抗癌効果を発揮していることが明らかとなった。
【００３０】
［抗癌作用物質の特定２］
前記試験に用いたＡＳＧ抽出物には、少量であるが化学式（１）のＸ（アシル基）が脱アシルされた非アシル化配糖体が混入している。この非アシル化配糖体を分離するため、ＡＳＧ抽出物を再度シリカゲルカラムにアプライして、クロロホルム：メタノール＝９：３の溶媒で溶出し、精製アシル化ステロール配糖体と非アシル化ステロール配糖体を得た。この精製アシル化ステロール配糖体と非アシル化ステロール配糖体を単独で大腸がん細胞の培養系に添加し、がん細胞対する作用を試験した。
【００３１】
（１）方法
試験例１と同様に、継代培養によって80%以上のコンフルエント状態になった細胞を２×１０５cells/ｍＬになるように調製し、調製後96穴プレートの各ウェルに100μＬずつ播種し、24時間培養した。培養後、ＡＳＧ抽出物、精製ＡＳＧ、非アシル化配糖体を５００μｇ/ｍＬとなるように添加し、24時間培養した。
ついで、各ウェルにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を１０μＬ添加し、インキュベーターで１−２時間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度(４５０ｎｍ)を測定し、同様に細胞生育率（％）を求めた（ｎ＝８）。
【００３２】
（２）結果
測定結果を図４に示す。化学式（１）のＸの構成成分であるアシル基が脱アシル化された物質は、抗癌効果がアシル化ステロール配糖体の１/５以下であった。したがって、化学式（１）の構造を有する化合物(アシル化ステロール配糖体)のアシル基も抗癌効果の発揮に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【００３３】
試験例４
[ヒト正常細胞に対する試験]
（１）試験方法
正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ-Ａｄ：タカラバイオ株式会社より入手）を前記試験例１と同様にして培養し、培地中のＡＳＧ濃度を４００μｇ/ｍＬになるように添加してさらに培養した。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を使用して生育率を測定した。
【００３４】
(２)結果
ヒト正常皮膚細胞の生育率は、９９．４±４０５％であった（ｎ＝８）。
ＡＳＧは、ヒト正常細胞に対しては生育を抑制しないが、がん細胞に対しては生育阻害作用を有することが確認できた。
試験例１〜３の結果から、発芽玄米糠由来のアシル化ステロール配糖体は、濃度依存性でがん細胞のアポトーシスを誘導して抗癌作用を発揮することが分かった。またこの作用はがん細胞に特異的で、正常細胞には影響を及ぼさないことも明らかとなった。
【００３５】
以下に本発明のＡＳＧを用いた経口剤の処方例を示す。
処方例１
[カプセル剤]
（組成）
ＡＳＧ                                １００ｍｇ
ミツロウ                                １０ｍｇ
ぶどう種子オイル                      １１０ｍｇ
上記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンからなるカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。
【００３６】
処方例２
[錠剤]
（組成）
ＡＳＧ                                １５０ｍｇ
セルロース                              ８０ｍｇ
デンプン                                ２０ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル                      ２ｍｇ
上記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。
【００３７】
処方例３
[液剤]
（組成）                                  （配合；質量％）
果糖ブトウ糖液糖                          ５．００
クエン酸                                １０．４
Ｌ−アスコルビン酸                        ０．２０
香料                                      ０．０２
色素                                      ０．１０
ＡＳＧ                                    １．００
水                                      ８２．２８
【図１】
2015042627.tif 000009
【図２】
2015042627.tif 000010
【図３】
2015042627.tif 000011
【図４】
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