(57)【要約】本発明は治療用の抗ベータ７抗体、これらの抗体を含む組成物及びその使用方法を提供する。本発明はＭＡｄＣＡＭ−アルファ４ベータ７結合及び胃腸上皮への白血球リクルートメント、結合及びアレルギー、喘息、ＩＢＤ（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）、糖尿病、移植に関わる炎症、対宿主性移植片病及び／又は同種移植片障害及びベータ７インテグリンにより媒介される他の生物学的／生理学的な活性の調節を包含する、ベータ７インテグリン媒介経路を調節することに関連する方法、組成物、キット及び製造物品を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体であって、該ポリペプチド又は抗体は、
（ａ）下記：
（ｉ）配列Ａ１−Ａ１１を含むＨＶＲ−Ｌ１、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）であるもの、
（ｉｉ）配列Ｂ１−Ｂ８を含むＨＶＲ−Ｌ２、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）であるもの、
（ｉｉｉ）配列Ｃ１−Ｃ１０を含むＨＶＲ−Ｌ３、ここでＣ１−Ｃ１０はＱＱＧＮＳＬＬＰＮＴ（配列番号３）であるもの、
（ｉｖ）配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であるもの、
（ｖ）配列Ｅ１−Ｅ１７を含むＨＶＲ−Ｈ２、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）であるもの；および、
（ｖｉ）配列Ｆ１−Ｆ１１を含むＨＶＲ−Ｈ３、ここでＦ１−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）であるもの、
からなる群より選択される少なくとも１つのＨＶＲ配列；
を含む、抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体。
【請求項２】
少なくとも１つの変異体ＨＶＲを含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体であって、該変異体ＨＶＲが配列番号１、２、３、４、５又は６に示す何れかの配列において、少なくとも１つの残基の修飾を含む、ポリペプチド又は抗体。
【請求項３】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１内のＡ８がＳ、Ｄ又はＴであり、かつＡ９がＬである請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項４】
ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号１又は７又は８又は９を含み、ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号２又は６７又は６８を含み、ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号３を含み、ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号４を含み、ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号５を含み、ＨＶＲ−Ｈ３が相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１に対して配列番号６又は６６を含むか、相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１に対して配列番号６３又は６４又は６５を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項５】
前記ポリペプチド又は抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）又は配列番号１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＱからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ及びＳからなる群より選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）又は配列番号２、６７又は６８の変異体であり、ここでアミノ酸Ｂ１はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸからなる群より選択され（ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ４はＳ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群より選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）又は配列番号３の変異体であり、ここでアミノ酸Ｃ８はＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＹからなる群より選択され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であり、
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）又は配列番号５の変異体であり、ここでアミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸１３はＰ、Ｈ、Ｄ及びＡからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群より選択され；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）又は配列番号６、６３、６４、６５又は６６の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２はＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、ならびに／又は、アミノ酸Ｆ１１はＦ及びＹからなる群より選択される、
請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項６】
前記抗体がヒト化されている請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項７】
前記フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列である請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項８】
前記修飾が置換、挿入又は欠失である請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項９】
ＨＶＲ−Ｌ１変異体が以下の位置：Ａ２（Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；
Ａ３（Ｓ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＴ）；Ａ４（Ｅ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶ）；Ａ５（Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹ）；Ａ６（Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲ）；Ａ７（Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ８（Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｔ又はＮ）；Ａ９（Ｌ、Ｙ、Ｉ又はＭ）；Ａ１０（Ｌ、Ａ、Ｉ、Ｍ又はＶ）及びＡ１１（Ｈ、Ｆ、Ｓ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）置換を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１０】
ＨＶＲ−Ｌ２変異体が以下の位置：Ｂ１（Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｅ、Ｃ、Ｄ、Ｇ又はＭ）、Ｂ５（Ｑ又はＳ）、Ｂ６（Ｓ、Ｒ又はＬ）及びＢ７（Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｋ又はＶ）の何れかの組み合わせにおいて１〜４（１、２、３又は４）置換を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１１】
ＨＶＲ−Ｌ３変異体が位置Ｃ８（Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｔ又はＶ）において少なくとも１つの置換を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１２】
ＨＶＲ−Ｈ２変異体が以下の位置：Ｅ２（Ｙ、Ｖ、Ｄ又はＦ）、Ｅ６（Ｓ又はＧ）、Ｅ１０（Ｓ又はＹ）、Ｅ１２（Ｎ、Ａ、Ｄ又はＴ）、Ｅ１３（Ｐ、Ｄ、Ａ又はＨ）、Ｅ１５（Ｌ又はＶ）、Ｅ１７（Ｓ又はＧ）の何れかの組み合わせにおいて１〜７（１、２、３、４、５、６又は７）置換を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１３】
ＨＶＲ−Ｈ３変異体が以下の位置：Ｆ２（Ｒ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＳ）及びＦ１１（Ｆ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて１又は２置換を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１４】
配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１５】
配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１６】
配列番号９の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１７】
フレームワーク位置に少なくとも１つの修飾をさらに含み、該少なくとも１つの修飾が重鎖位７１又は７３又は７８にある、請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１８】
７１位のアミノ酸がＲ又はＡであり、そして７３位のアミノ酸がＮ又はＴであり、そして７８位のアミノ酸がＦ又はＡ又はＬである請求項１７記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１９】
７１、７３及び／又は７８位に置換を含む重鎖ヒトサブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１７記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２０】
前記置換がＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ａ又はＬ７８Ｆである請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２２】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８がＳである請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２３】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８がＤである請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２４】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９がＬである請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２５】
配列ＨＶＲ−Ｈ２の位置Ｅ１−Ｅ１及び配列ＨＶＲ−Ｈ３の位置Ｆ１−Ｆ１１の間のフレームワーク配列がＨＦＲ３−１−ＨＦＲ３−３１であり、そしてＨＦＲ３−６がＡ又はＲであり、ＨＦＲ３−８がＮ又はＴであり、そしてＨＦＲ３−１３がＬ又はＡ又はＦである、請求項２記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２６】
ヒト化抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントであって、ここで該抗体又は結合フラグメントのヒトベータ７に対する１価の親和性が、図１Ａ（配列番号１０）及び／又は図１Ｂ（配列番号１１）あるいは図９Ａ（配列番号１２）及び／又は図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含む抗体の１価の親和性と実質的に同じか、またはそれより大きい、抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２７】
前記親和性が図１Ａ（配列番号１０）及び図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１０，０００倍高い、請求項２６記載の抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２８】
ヒトベータ７に対する前記抗体の１価の親和性が、図１Ａ（配列番号１０）及び図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体の１価の親和性より少なくとも３倍高い、請求項２７記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項２９】
図１Ａ（配列番号１０）及び図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体が、ＨＢ−２９３の標記を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＴＣＣ下に寄託されているハイブリドーマ細胞株により生産される請求項２６又は２７記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項３０】
前記結合親和性がＫｄ値で表示される請求項２６記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３１】
前記結合親和性がＢｉａｃｏｒｅＴＭ又はラジオイムノアッセイにより測定される請求項２６記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３２】
ヒトκサブグループＩ軽鎖コンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項３３】
重鎖ヒトサブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項３４】
前記ポリペプチド又は抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）又は配列番号１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＱからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ及びＳからなる群より選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）又は配列番号２、６７又は６８の変異体であり、ここでアミノ酸Ｂ１はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸからなる群より選択され（ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ４はＳ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群より選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）又は配列番号３の変異体であり、ここでアミノ酸Ｃ８はＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＹからなる群より選択され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であり、
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）又は配列番号５の変異体であり、ここでアミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸１３はＰ、Ｈ、Ｄ及びＡからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群より選択され；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）又は配列番号６、６３、６４、６５又は６６の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２はＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、ならびに／又は、アミノ酸Ｆ１１はＦ及びＹからなる群より選択される、
請求項２６記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３５】
重鎖フレームワーク７１位がアミノ酸Ｒ又はＡを含み、及び／あるいは重鎖フレームワーク７３位がアミノ酸Ｔ又はＮを含み、及び／あるいは重鎖フレームワーク７８位がアミノ酸Ｆ又はＡ又はＬを含み、配列が重鎖フレームワーク７１位に含む、請求項３４記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３６】
ヒトベータ７インテグリンサブユニットと第２のインテグリンサブユニット及び／又はリガンドとの相互作用を、該ベータ７インテグリンに請求項２の抗体を接触させることにより阻害する方法。
【請求項３７】
前記第２のインテグリンサブユニットがアルファ４インテグリンサブユニットであり、かつ前記リガンドがＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ又はフィブロネクチンである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記アルファ４インテグリンサブユニットがヒト由来である請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記リガンドがヒト由来である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記第２のインテグリンサブユニットがアルファＥインテグリンサブユニットであり、かつ前記リガンドがＥ−カドヘレインである請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記アルファＥインテグリンサブユニットがヒト由来である請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記リガンドがヒト由来である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記阻害により、炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される障害の症状が低減又は緩和される請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
請求項２のポリペプチド又は抗体及び製薬用担体を含む組成物の有効量を哺乳類に投与することによって、障害を経験している哺乳類におけるベータ７インテグリン媒介細胞接着及び／又はリクルートメントを調節する方法。
【請求項４５】
前記障害が炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳類がヒトである請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
第２の生物薬剤又は化学療法剤を投与する工程を更に包含する、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記調節により、アルファ４インテグリン、アルファＥインテグリン、ＭＡｄＣａｍ、ＶＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン及び／又はフィブロネクチンとのベータ７インテグリンの相互作用が阻害される請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
請求項１、２、５、２６又は３４のいずれかに記載の抗ベータ７結合ポリペプチド、抗体又はその結合フラグメント及び製薬用担体を含む組成物。
【請求項５０】
請求項１、２、５、２６又は３４のいずれかに記載の抗ベータ７結合ポリペプチド、抗体又はその結合フラグメントを含む組成物と、製薬用担体と、該組成物が障害を治療する方法における使用のためのものであることを示すラベルを含む製造物品であって、ここで該障害が炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される、製造物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年９月３日出願の米国暫定出願番号６０／６０７，３７７に対して３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下に優先権を請求する３７ＣＦＲ§１．５３（ｂ）（１）の下に出願された非暫定出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は一般的に分子生物学及び成長因子調節の分野に関する。より詳細には、本発明はベータ７サブユニットを含有するインテグリンの生物学的活性のモジュレーター及び該モジュレーターの使用に関わる。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
インテグリンは細胞接着から遺伝子調節まで多くの細胞過程に関与しているα／βヘテロ２量体細胞表面受容体である（非特許文献１及び非特許文献２）。数種のインテグリンは疾患過程に関連付けられており、薬剤発見の潜在的標的として広範に注目されている（非特許文献３）。免疫系においては、インテグリンは炎症過程の間の白血球の移動、接着及び浸潤に関与している（非特許文献４）。インテグリンの示差的発現は細胞の接着特性を調節し、そして異なるインテグリンが異なる炎症応答に関与している。非特許文献５。ベータ７インテグリン（すなわちアルファ４ベータ７（α４β７）及びアルファＥベータ７（αＥβ７））は主に単球、リンパ球、好酸球、好塩基球及びマクロファージ上で発現されるが、好中球上では発現されない。非特許文献６。α４β７インテグリンの主要リガンドは内皮表面蛋白粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）及び血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）である（非特許文献７）。炎症部位における高内皮細静脈（ＨＥＶ）上に発現されるＭＡｄＣＡＭ及び／又はＶＣＡＭへのα４β７の結合は内皮への白血球の堅固な接着とそれに続く炎症組織への溢出をもたらす（非特許文献８）。αＥβ７インテグリンに対する主要リガンドは上皮内リンパ球（ＩＥＬ）表面蛋白、Ｅカドヘレインであり、これはαＥβ７担持細胞の上皮リンパ球への接着を促進する。α４β７、ＭＡｄＣＡＭ又はＶＣＡＭに対して指向されたモノクローナル抗体は喘息のような慢性炎症性疾患（非特許文献９）、慢性関節リューマチ（ＲＡ；非特許文献１０）、結腸炎（非特許文献１１）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ；非特許文献１２；非特許文献１３）の動物モデルにおける効果的なモジュレーターであることがわかっている。ベータ７サブユニットに指向されたモノクローナル抗体はインテグリンサブユニットに結合することがわかっている（非特許文献１４）が、非ヒト又は非ヒト化抗体としては、それらは臨床的有用性を欠いている。
【０００４】
アルファ４ベータ７インテグリンとそのリガンドＭＡｄＣＡＭ及び／又はＶＣＡＭとの間の相互作用、並びに、アルファＥベータ７インテグリンとそのリガンドＥ−カドヘリンとの間の相互作用を阻害するヒト化抗体又はその結合フラグメントのような高度に特異的な化合物が望まれている。これらの化合物は喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、臓器移植の合併症及び同種移植片関連障害のような慢性炎症性疾患の治療のために有用である。
【０００５】
本明細書において引用する全ての参考文献は、特許出願及び公開物を含めて、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【非特許文献１】Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｃｅｌｌ，１９９２，６９：１１−２５
【非特許文献２】Ｈｅｍｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０，８：３６５−３６８
【非特許文献３】Ｓｈａｒａｒ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９５，１６：３５９−３７８
【非特許文献４】Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４，１７９：１１４５−１１５４
【非特許文献５】Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２：６０−６６
【非特許文献６】Ｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６０：５７７−５８４
【非特許文献７】Ｍａｋａｒｅｍ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：４００５−４０１１
【非特許文献８】Ｃｈｕｌｕｙａｎ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９５，１６：３９１−４０４
【非特許文献９】Ｌａｂｅｒｇｅ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１９９５，１５１：８２２−８２９
【非特許文献１０】Ｂａｒｂａｄｉｌｌｏ，Ｃ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９５，１６：３７５−３７９
【非特許文献１１】Ｖｉｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７：２４８８−２４９７
【非特許文献１２】Ｐｏｄａｌｓｋｉ，Ｄ．Ｋ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１，３２５：９２８−９３７
【非特許文献１３】Ｐｏｗｒｉｅ，Ｆ．ら、Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，２：１１５−１２３
【非特許文献１４】Ｔｉｄｓｗｅｌｌ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９：１４９７−１５０５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
本発明は部分的には、重要で好都合な治療標的として存在する一般的には生物学／細胞経路であるベータ７含有インテグリンの関与する生物学的経路の拮抗剤種々の発見に基づいている。このような生物学的経路は、例えば、炎症、特に慢性炎症性障害、例えば喘息、アレルギー、ＩＢＤ、糖尿病、移植及び対宿主性移植片病を包含する。本発明はアルファ４ベータインテグリンの細胞外部分へのＭＡｄＣＡＭ及びＶＣＡＭ−１の結合、及び、アルファＥベータ７インテグリン相互作用とのＥ−カドヘリン相互作用に干渉することを包含する、ベータ７インテグリン媒介細胞接着及び／又はリクルートメント（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）に干渉することに基づいた組成物及び方法を提供する。本明細書に記載した本発明の拮抗剤はベータ７インテグリンを介した異常又は望ましくないシグナリングに関連する病理学的状態をターゲティングする場合に使用するための重要な治療薬及び診断剤を提供する。従って、本発明はＭＡｄＣＡＭ−アルファ４ベータ７結合及び胃腸上皮への白血球リクルートメント、結合及びアレルギー、喘息、ＩＢＤ（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）、糖尿病、移植に関わる炎症、対宿主性移植片病及び／又は同種移植片障害及びベータ７インテグリンにより媒介される他の生物学的／生理学的な活性の調節を包含する、ベータ７インテグリン媒介経路を調節することに関連する方法、組成物、キット及び製造物品を提供する。
【０００７】
１つの特徴において、本発明は治療における使用に適しており、そして、ベータ７インテグリン媒介経路の分断の種々の段階を誘発することができる抗ベータ７治療薬を提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は、Ｆａｂフラグメントとしての抗体が図１Ａ及び１Ｂ又は図９Ａ及び９Ｂに示す軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるマウスＦａｂフラグメントと実質的に同じヒトベータ７への結合親和性を有するヒト化抗ベータ７抗体を提供する。別の実施形態においては、本発明は、Ｆａｂフラグメントとしての抗体が図１Ａ及び１Ｂに示す軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列又は図９Ａ及び９Ｂに示す可変ドメイン配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるマウス又はラットＦａｂフラグメントよりも低値、例えば少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７又は少なくとも１０倍低値である、ヒトベータ７への結合親和性を有する、ヒト化抗ベータ７抗体を提供する。或いは、本発明のヒト化抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントはヒトベータ７に対して１価の親和性を示し、その親和性は図１Ａ（配列番号１０）及び／又は図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び／又は図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含む抗体のヒトベータ７に対する１価の親和性と実質的に同じかそれより大きい。ヒトベータ７に対する大きい親和性を有する抗体又はその結合フラグメントは、図１Ａ（配列番号１０）及び／又は図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び／又は図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１００００倍高値である親和性を示す。
【０００８】
別の実施形態においては、Ｆａｂフラグメントとしての抗体が、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示す軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるげっ歯類（例えばラット又はマウス）のＦａｂフラグメントよりも高値、例えば少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０又は少なくとも１００倍高値であるヒトベータ７に対する結合親和性を有する。１つの実施形態において、上記げっ歯類ＦａｂフラグメントはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＴＣＣＨＢ−２９３の下に寄託されているハイブリドーマ細胞株により生産されるＦＩＢ５０４．６４と標記されるラット抗体の可変ドメイン配列を含むＦａｂフラグメントの結合親和性を有する。別の実施形態においては、本発明のヒト化Ｆａｂフラグメントは本発明のヒト化抗ベータ７抗体のいずれかにより生産される抗体の可変ドメイン配列を含むＦａｂフラグメントの結合親和性を有する。当該分野で十分確立されている通り、リガンドのその受容体への結合親和性は種々の試験の何れかを用いて測定することができ、そして種々の定量的数値において表示できる。従って、１つの実施形態において、結合親和性はＫｄ値として表示し、内因性結合親和性（例えば最小限化されたアビディティー作用を伴う）を反映している。一般的に、そして好ましくは、結合親和性は無細胞系又は細胞関連の状況の何れかに関わらず、インビトロで測定される。本明細書において詳述する通り、結合親和性における倍差は、Ｆａｂ形態のヒト化抗体の結合親和性の値及び参照物／比較物のＦａｂ抗体（例えばドナー超可変領域配列を有するマウス抗体）の結合親和性の値の比として定量することができ、ここで結合親和性の値は同様の試験条件下で測定される。即ち、１つの実施形態において、結合親和性における倍差は、Ｆａｂ形態のヒト化抗体及び上記参照物／比較物のＦａｂ抗体のＫｄ値の比として測定される。例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｂ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＥＬＩＳＡを包含する本明細書に記載するものを包含する当該分野で知られた多くの試験の何れかを用いることにより結合親和性の測定値を得ることができる。
【０００９】
種々の特徴及び実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体は本出願の潜在的請求項の以下のセット：
（ａ）下記：
（ｉ）配列Ａ１−Ａ１１を含むＨＶＲ−Ｌ１、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）であるもの、
（ｉｉ）配列Ｂ１−Ｂ８を含むＨＶＲ−Ｌ２、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）であるもの、
（ｉｉｉ）配列Ｃ１−Ｃ９を含むＨＶＲ−Ｌ３、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）であるもの、
（ｉｖ）配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であるもの、
（ｖ）配列Ｅ１−Ｅ１７を含むＨＶＲ−Ｈ２、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）であるもの；および、
（ｖｉ）配列Ｆ２−Ｆ１１を含むＨＶＲ−Ｈ３、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）であるもの、
からなる群より選択される少なくとも１、２、３、４又は５又は超可変領域（ＨＶＲ）配列；
を含む抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントを含む抗体を指向している。
【００１０】
請求項１のポリペプチド又は抗体の実施形態においては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８及び９に示す配列の少なくとも１つの残基少なくとも１つの修飾を変異体ＨＶＲ配列が含む、変異体ＨＶＲ少なくとも１つをポリペプチド又は抗体が含んでいる。
【００１１】
請求項１又は２の別の実施形態においては、本発明はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントを含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）を含み；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）を含み；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）を含み；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）を含み；
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）を含み；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３は相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１についてアミノ酸配列ＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）を含むか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）である。
【００１２】
請求項１の更に別の実施形態又は実施形態の何れかにおいて、本発明はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントを含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）又は配列番号１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群より選択され、及び／又は、アミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ及びＲからなる群より選択され、及び／又は、アミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＱからなる群より選択され、及び／又は、アミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ及びＳからなる群より選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）又は配列番号２、６７又は６８の変異体であり、ここでアミノ酸Ｂ１はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸからなる群より選択され（ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）、及び／又はアミノ酸Ｂ４はＳ及びＤからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ及びＲからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ７はＩＶＥ及びＫからなる群より選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）又は配列番号３の変異体であり、ここでアミノ酸Ｃ８はＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＹからなる群より選択され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であり、
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）又は配列番号５の変異体であり、ここでアミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ及びＤからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸１３はＰ、Ｈ、Ｄ及びＡからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群より選択され；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）又は配列番号６、６３、６４、６５又は６６の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２はＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、及び／又は、アミノ酸Ｆ１１はＦ及びＹからなる群より選択される。
【００１３】
請求項１の１つの実施形態又は本発明の抗体の何れかにおいて、重鎖フレームワーク７１位（Ｋａｂａｔナンバリング法による）におけるアミノ酸はＲ、Ａ及びＴからなる群より選択され；及び／又は重鎖フレームワーク７３位（Ｋａｂａｔナンバリング法による）におけるアミノ酸はＮ及びＴからなる群より選択され；及び／又は重鎖フレームワーク７８位（Ｋａｂａｔナンバリング法による）におけるアミノ酸はＦ、Ａ及びＬからなる群より選択される。
【００１４】
請求項１の１つの実施形態又は本発明の抗体の何れかにおいて、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ１は配列番号１を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ２は配列番号２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ３は配列番号３を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ１は配列番号４を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ２は配列番号５を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ３は、相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１に配列番号６又は６６を、又は相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１に配列番号６３、６４又は６５を含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１はＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）を含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１はＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）を含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）を含む。１つの実施形態においてこれらの配列（本明細書に記載する通りの組み合わせにおいて）を含む抗体はヒト化又はヒト型のものである。
【００１５】
１つの特徴において、本発明は１、２、３、４、５又は６つのＨＶＲを含む抗体を提供し、ここで各ＨＶＲは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８及び９からなる群より選択される配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるものであり、そしてここで配列番号１、７、８又は９はＨＶＲ−Ｌ１に相当し、配列番号２はＨＶＲ−Ｌ２に相当し、配列番号３はＨＶＲ−Ｌ３に相当し、配列番号４はＨＶＲ−Ｈ１に相当し、配列番号５はＨＶＲ−Ｈ２に相当し、そして配列番号６はＨＶＲ−Ｈ３に相当する。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号１、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号７、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号８、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号９、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号９、２、３、４、５及び６６、又は配列番号９、２、３、４、５、６３、又は配列番号９、２、３、４、５、６４、又は配列番号９、２、３、４、５、６５、又は配列番号９、６７、３、４、５、６４、又は配列番号９、６８、３、４、５、６４を含む。
【００１６】
本発明の抗体における変異体ＨＶＲはＨＶＲ内の１つ以上の残基の修飾を有してよく、及び／又はフレームワーク領域をヒト化してよい。ＨＶＲ及び／又はフレームワークの修飾が存在する本発明の実施形態は例えば本出願の以下の潜在的請求項を包含する。
【００１７】
請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここで変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＳ、Ｄ又はＴであり、そしてＡ９はＬであるもの。
３．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここで抗体はヒト化されているもの。
４．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでフレームワーク配列の少なくとも一部はヒトコンセンサスフレームワーク配列であるもの。
５．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここで上記修飾が置換、挿入又は欠失であるもの。
６．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｌ１変異体が以下の位置：Ａ２（Ｇ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ３（Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＴ）；Ａ４（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶ）；Ａ５（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹ）；Ａ６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲ）；Ａ７（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ８（Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ）；Ａ９（Ｌ、Ｉ又はＭ）；Ａ１０（Ａ、Ｉ、Ｍ又はＶ）及びＡ１１（Ｆ、Ｓ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）置換を含むもの。
７．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｌ２変異体が以下の位置：Ｂ１（Ｎ）、Ｂ５（Ｓ）、Ｂ６（Ｒ又はＬ）及びＢ７（Ｔ、Ｅ、Ｋ又はＶ）のの何れかの組み合わせにおいて１〜４（１、２、３又は４）置換を含むもの。
８．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｌ３変異体が位置Ｃ８（Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｔ又はＶ）において少なくとも１つの置換を含むもの。
９．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｈ２変異体が以下の位置：Ｅ２（Ｖ、Ｄ又はＦ）、Ｅ６（Ｇ）、Ｅ１０（Ｙ）、Ｅ１２（Ａ、Ｄ又はＴ）、Ｅ１３（Ｄ、Ａ又はＨ）、Ｅ１５（Ｖ）、Ｅ１７（Ｇ）の何れかの組み合わせにおいて１〜７（１、２、３、４、５、６又は７）置換を含むもの。
１０．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｈ３変異体が以下の位置：Ｆ２（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＳ）及びＦ１１（Ｙ）の何れかの組み合わせにおいて１又は２置換を含むもの。
１１．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含むもの。
１２．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含むもの。
１３．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって配列番号９の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含むもの。
１４．請求項１１〜１３の何れか１項に記載の抗体であって、７１、７３及び／又は７８位に置換を含む重鎖サブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含むもの。
１５．請求項１４又はその実施形態の１つの抗体であって、置換がＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及び／又はＬ７８Ａであるもの。
１６．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、配列番号３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含むもの。
１７．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、変異体ＨＶＲ−Ｌ１のＡ８がＳであるもの。
１８．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、変異体ＨＶＲ−Ｌ１のＡ８がＤであるもの。
１９．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、変異体ＨＶＲ−Ｌ１のＡ９がＬであるもの。
２０．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、配列番号Ｅ１−Ｅ１７とＦ１−Ｆ１１の間のフレームワーク配列がＨＦＲ３−１−ＤＦＲ３−３１であり、ＨＦＲ３−６はＡ又はＲであり、ＨＦＲ３−８はＮ又はＴであり、そしてＨＦＲ３−１３がＬ又はＡ又はＦであるもの。
２１．ヒト化抗ベータ７抗体であって、ここで抗体のヒトベータ７に対する１価の親和性が図９に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含むラット抗体の１価の親和性と実質的に同じであるもの。
２２．ヒト化抗ベータ７抗体であって、ここで抗体のヒトベータ７に対する１価の親和性が図９に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含むラット抗体の１価の親和性の少なくとも３倍高値であるもの。
２３．請求項２１又は２２記載のヒト化抗体であって、ラット抗体がＨＢ−２９３の標記を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＴＣＣ下に寄託されているハイブリドーマにより生産されるもの。
２４．請求項２１〜２３の何れかに記載の抗体であって、結合親和性がＫｄ値で表示されるもの。
２５．請求項２１〜２４の何れかに記載の抗体であって、結合親和性がＢｉａｃｏｒｅＴＭ又はラジオイムノアッセイで測定されるもの。
２６．請求項１記載の抗体であって、ヒトκサブグループ軽鎖コンセンサスフレームワーク配列を含むもの。
２７．請求項１記載の抗体であって、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含むもの。
２８．請求項２７記載の抗体であって、フレームワーク配列が７１、７３及び／又は７８位に置換を含むもの。
２９．請求項２８記載の抗体であって、上記置換がＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及び／又はＬ７８Ａにあるか、７１位の置換アミノ酸がＲ又はＡであり、及び／又は７８位のアミノ酸置換がＮ又はＴであり、及び／又は７８位のアミノ酸置換がＬ又はＡ又はＦであるもの。
３０．請求項２８記載の抗体であって、上記置換がＬ７８Ｆ又はＡ７８Ｆ又はＡ７８Ｌ又はＬ７８Ａであるもの。
３１．ヒトベータ７インテグリンサブユニットの第２のインテグリンサブユニット及び／又はリガンドとの相互作用を阻害する方法であって、請求項１〜３０の何れか１項の抗体を第２のインテグリンサブユニット及び／又はリガンドに接触させることによる方法。
３２．請求項３１記載の方法であって、第２のインテグリンサブユニットがアルファ４インテグリンサブユニットであり、そしてリガンドがＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ又はフィブロネクチンであるもの。
３３．請求項３２記載の方法であって、アルファ４インテグリンサブユニットがヒト型であるもの。
３４．請求項３３記載の方法であって、リガンドがヒト型であるもの。
３５．請求項３２記載の方法であって、第２のインテグリンサブユニットがアルファＥインテグリンサブユニットであり、そしてリガンドがＥ−カドヘリンであるもの。
３６．請求項３５記載の方法であって、アルファＥインテグリンサブユニットがヒト型であるもの。
３７．請求項３６記載の方法であって、リガンドがヒト型であるもの。
３８．請求項３１記載の方法であって、阻害により、炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される障害の症状が低減又は緩和されるもの。
【００１８】
本発明の別の実施形態は以下のものを包含する。
【００１９】
１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１変異体は配列番号１、７、８又は９であるか、又は以下の位置：Ａ２（Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ３（Ｓ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＴ）；Ａ４（Ｅ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶ）；Ａ５（Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹ）；Ａ６（Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲ）；Ａ７（Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ８（Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ）；Ａ９（Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＭ）；Ａ１０（Ｌ、Ａ、Ｉ、Ｍ又はＶ）及びＡ１１（Ｈ、Ｆ、Ｓ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて相対的な位置Ａ１〜Ａ１１において１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）置換を含む配列番号１、７、８又は９のＨＶＲ−Ｌ１変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号２、６７又は６８であるか、又は、以下の位置：Ｂ１（Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ又はＸ（Ｘは何れかのアミノ酸を示す））、Ｂ４（Ｓ）、Ｂ５（Ｑ又はＳ）、Ｂ６（Ｓ、Ｒ又はＬ）及びＢ７（Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｋ又はＶ）の何れかの組み合わせにおいて相対的な位置Ｂ１−Ｂ８において１〜４（１、２、３、４、４又は５）置換を含む配列番号２、６７又は６８のＨＶＲ−Ｌ２変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号３であるか、又はＨＶＲ−Ｌ３は位置Ｃ８（Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｔ又はＶ）のような位置において相対的な位置Ｃ１−Ｃ８において少なくとも１つの置換を含む配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号４である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号５であるか、又は以下の位置：Ｅ２（Ｙ、Ｖ、Ｄ又はＦ）、Ｅ６（Ｓ又はＧ）、Ｅ１０（Ｓ又はＹ）、Ｅ１２（Ｎ、Ａ、Ｄ又はＴ）、Ｅ１３（Ｐ、Ｄ、Ａ又はＨ）、Ｅ１５（Ｌ又はＶ）、Ｅ１７（Ｓ又はＧ）の何れかの組み合わせにおいて相対的な位置Ｅ１〜Ｅ１７において１〜７（１、２、３、４、５、６又は７）置換を含むＨＶＲ−Ｈ２の変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号６、６３、６４、６５又は６６であるか、又は、以下の位置：Ｆ２（Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＳ）及びＦ１１（Ｆ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて、配列番号６３，６４及び６５に関しては相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１において、又は、配列番号６及び６６に関しては相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１において、１又は２置換を含む配列番号６、６３、６４、６５又は６６のＨＶＲ−Ｈ３変異体である。本明細書の観点においては置換アミノ酸は当該分野で知られた、及び／又は、本明細書に記載した手法を用いて日常的に評価できるものであるため、各位置に続くカッコ内の文字は、適切には別のアミノ酸の当業者のよく知るコンセンサス又は他のアミノ酸に関する例示される置換（即ち置き換え）アミノ酸を示す。
【００２０】
１つの実施形態においてＨＶＲ−Ｌ１は配列番号１の配列を有する。１つの実施形態において変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＤである。１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＳである。１つの実施形態において変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬである。１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＤであり、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬである。１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＳであり変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬである。本発明の１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３におけるこれらの変異は、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号６又は６６（相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１に関して）又は配列番号６３又は６４又は６５（相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１に関して）を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２１】
１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＩであり、そしてＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２２】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８、Ａ９及びＡ１０はそれぞれＤ、Ｌ及びＶであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２３】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８及びＡ９はそれぞれＮ及びＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２４】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８及びＡ９はそれぞれＰ及びＬであり、そして変異体ＨＶＲ−Ｌ２におけるＢ６及びＢ７はそれぞれＲ及びＴであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２５】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ２、Ａ４、Ａ８、Ａ９及びＡ１０はそれぞれＳ、Ｄ、Ｓ、Ｌ及びＶであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２６】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ５及びＡ９はそれぞれＤ及びＴであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２７】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ５及びＡ９はそれぞれＮ及びＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２８】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の抗体又は抗ベータ７結合ポリペプチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号９、２、３、４、５及び６４を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。別の実施形態において、各ＨＶＲは、配列番号９、６７、３、４、５及び６４をこの順序において含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。別の実施形態において、各ＨＶＲは、配列番号９、６８、３、４、５及び６４をこの順序において含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。別の実施形態において、各ＨＶＲは、配列番号９、２又は６７又は６８、３、４、５及び６６をこの順序において含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００３０】
一部の実施形態においては、上記変異体ＨＶＲ−Ｌ１抗体変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。抗体変異体がＨＶＲ−Ｌ１Ａ８（Ｐ）及びＡ９（Ｌ）及びＨＶＲ−Ｌ２Ｂ６（Ｒ）及びＢ７（Ｔ）を含む場合は、一部の実施形態においては上記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２変異体は更にＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号３、４、５及び６に示す配列をこの順序に含む。
【００３１】
一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の１つの実施形態において、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ１０がＶである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号３を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＣ８がＬである変異体ＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＣ８がＷであるＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号６を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記抗体の変異体はＦ１がＱである変異体ＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ２を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び５に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＦ１がＲである変異体ＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ２を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び５に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態においては、本発明の変異体抗体はＡ４がＱである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ６がＩである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ７がＳである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ８がＤ又はＮである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号２を含むＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＢ１がＮである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ５がＳである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ６がＬである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ７がＶである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ７がＥ又はＫである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号３を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＣ８がＷ、Ｙ、Ｒ又はＳである変異体ＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号５を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ２がＦである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ２がＶ又はＤである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ６がＧである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１０がＹである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１２がＡ、Ｄ又はＴである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１３がＤ、Ａ又はＮである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１５がＶである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１７がＧである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号６を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＦ１１がＹである変異体ＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００４０】
一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００４１】
宿主被験体における使用のための治療薬は好ましくは、その宿主において薬剤に対抗する免疫原性応答を殆ど、又は、全く誘発しない。１つの実施形態において、本発明はこのような薬剤を提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は宿主被験体において配列番号１０及び／又は１１（図１Ａ及び１Ｂ）又は配列番号１２及び／又は１３（ラット抗マウスＦｉｂ５０４アミノ酸配列を示す図９Ａ及び９Ｂ）を含む配列を含む抗体と比較して、実質的に低減された水準のヒト抗げっ歯類抗体応答（例えば抗マウス又は抗ラット応答）又はヒト抗ヒト応答を誘発する及び／又は誘発すると予測されるヒト化抗体を提供する。別の実施形態において、本発明はヒト抗げっ歯類（例えばヒト抗マウス（ＨＡＭＡ）又はヒト抗マウス）又はヒト抗ヒト抗体応答（ＨＡＨＡ）を誘発しない、及び／又は、誘発しないと予測されるヒト化抗体を提供する。
【００４２】
本発明のヒト化抗体はその重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインにおいて１つ以上のヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域（例えばフレームワーク）を含む。一部の実施形態においては、追加的な修飾１つ以上がヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域配列内に存在する。１つの実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインはヒトコンセンサスフレームワークを含み、これは１つの実施形態においてはサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列である。１つの実施形態において、本発明の抗体は少なくとも１つのアミノ酸位置において修飾された変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む。例えば、１つの実施形態において、変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列は７１、７３、７８及び／又は９４位の１つ以上において置換を含んでよい。１つの実施形態においては、そのような置換は何れかの組み合わせにおけるＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ａ及び／又はＲ９４Ｍである。
【００４３】
当該分野で知られるとおり、そして後により詳細に説明するとおり、アミノ酸位置／抗体の超可変領域を決定する境界は、当該分野で知られた観点及び種々の定義に応じて変動することができる（後述参照）。可変ドメイン内の一部の位置は、それらの位置がある１つのセットの基準の下においては超可変領域内にあると考えられるが、異なるセットの基準の下においては超可変領域外にあると考えられるという点において、ハイブリッド超可変位置とみなしてよい。これらの位置の１つ以上はまた伸長した超可変領域内にも存在することができる（後述参照）。本発明はこれらのハイブリッド超可変位置内の修飾を含む抗体を提供する。１つの実施形態において、ハイブリッド超可変位置は重鎖可変ドメイン内の位置２６−３０、３３−３５Ｂ、４７−４９、４９、５７−６５、９３、９４及び１０２の１つ以上を包含する。１つの実施形態において、これらのハイブリッド超可変位置は軽鎖可変ドメイン内の位置２４−２９、３５−３６、４６−４９、４９、５６及び９７の１つ以上を包含する。１つの実施形態において、本発明の抗体はハイブリッド超可変位置１つ以上において修飾された変異体ヒトサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は位置２８−３５、４９、５０、５２ａ、５３、５４、５８−６１、６３、６５、９４及び１０２の１つ以上において修飾された変異体ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む重鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、抗体はＴ２８Ｆ、Ｆ２９Ｉ、Ｓ３０Ｔ、Ｓ３１Ｎ、Ｙ３２Ｎ、Ａ３３Ｙ、Ｍ３４Ｗ及びＳ３５Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ４９Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＶ５０Ｆ又はＶ５０Ｄ又はＶ５０Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ５３Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ５４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ５８Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ６０Ｎ又はＡ６０Ｄ又はＡ６０Ｔ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＤ６１Ｐ又はＤ６１Ａ又はＤ６１Ｈ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＶ６３Ｌ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ６５Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＲ９４Ｍ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＲ９４Ａ又はＲ９４Ｅ又はＲ９４Ｇ又はＲ９４Ｑ又はＲ９４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ９５Ｔ置換を含む。１つの実施形態において、抗体は位置２８−３５、４９、５０、５２ａ、５３、５４、５８−６１、６３、６５、９４及び１０２において置換１つ以上を有し、そして更に、Ｒ７１Ａ又はＮ７３Ｔ又はＬ７８Ａ又はＬ７８Ｆの１つ以上を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ１０２Ｆ置換を含む。これらの置換は重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及び／又はＨＶＲ−Ｈ３にあることが図１Ｂを参照することによりわかる。
【００４４】
１つの実施形態において本発明の抗体は位置２７、２９−３１、３３、３４、４９、５０、５３−５５、９１及び９６の１つ以上において修飾された変異体ヒトサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、抗体はＱ２７Ｅ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＩ２９Ｖ置換を含む。
１つの実施形態において、抗体はＳ３０Ｄ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＮ３１Ｔ又はＮ３１Ｓ又はＮ３１Ｄ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ３２Ｌ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ３４Ｈ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ４９Ｋ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ５０Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ５３Ｑ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＬ５４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＥ５５Ｉ又はＥ５５Ｖ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ９１Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＷ９６Ｎ又はＷ９６Ｌ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ２５Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ２５からＧ、Ｓ、Ｔ又はＶへの置換を含む。
１つの実施形態において、抗体は置換の以下の軍の１つ以上から選択される修飾を含む。例えば、１つの実施形態において、抗体はＳ２６からＧ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ又はＴへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＱ２７からＥ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ２８からＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＩ２９からＶ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ３０からＤ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＮ３１からＤ、Ｔ、Ｅ又はＧへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ３２からＬＩ又はＭへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＬ３３からＡ、Ｉ、Ｍ又はＶへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ３４からＨ、Ｆ、Ｙ又はＳへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ４９からＫ又はＮへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ５０Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ５３Ｑ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＬ５４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＥ５５からＶ、Ｉ又はＫへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ９１Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＷ９６からＮ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＹへの置換を含む。これらの置換は軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及び／又はＨＶＲ−Ｌ３にあることが図１Ａを参照することによりわかる。
【００４５】
本発明の抗体は、抗体が所望の生物学的特性（例えば所望の結合親和性）を示す限り、何れかの適当なヒト又はヒトコンセンサス軽鎖フレームワーク配列を含むことができる。１つの実施形態において、本発明の抗体はヒトκ軽鎖のフレームワーク配列の一部分（又は全て）を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はヒトκサブグループＩフレームワークコンセンサス配列の一部分（又は全て）を含む。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、計算の４９位及び重鎖の９４位が伸長されたＨＶＲに包含される限り、そして、その４９位がＫであり、その９４位が必然ではないが好ましくはＭであり、そしてＲでもあってよい限り、配列番号３４〜４１及び図１、７及び８に示すフレームワーク配列を含む重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００４７】
本発明の拮抗剤はベータ７関連の作法、例えばアルファ４インテグリンサブユニットとの会合、アルファＥインテグリンサブユニットとの会合、アルファ４ベータ７インテグリンのＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンとの結合、及び、アルファＥベータ７インテグリンのＥ−カドヘリンとの結合の１つ以上の特徴を調節するために使用できる。これらの作用は何れかの生物学的に該当する機序、例えばベータ７サブユニット又はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７２量体インテグリンに結合するリガンドの分断により、及び／又は、２量体インテグリンの形成が阻害されるようにアルファ及びベータインテグリンのサブユニットの間の会合を分断することにより、調節することができる。従って、１つの実施形態において本発明はベータ７へのアルファ４の結合を阻害するベータ７拮抗剤抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はＭＡｄＣＡＭへのアルファ４ベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はＶＣＡＭ−１へのアルファ４ベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はフィブロネクチンへのアルファ４ベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファＥへのベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はＥ−カドヘリンへのアルファＥベータ７インテグリンの結合を分断する。干渉は直接又は間接的であることができる。例えば、ベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ２量体化領域の配列内のベータ７に結合してよく、これにより、インテグリンサブユニットの相互作用及びインテグリン２量体の形成を阻害する。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン内の配列に結合してよく、これによりその結合相手（例えばアルファ４ベータについてはフィブロネクチン、ＶＣＡＮ及び／又はＭＡｄＣＡＭ；又はアルファＥベータ７インテグリンについてはＥ−カドヘリン）とのその結合ドメインの相互作用を防止する。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はインテグリンサブユニット２量体化ドメイン又はリガンド結合ドメイン内にはないが、そのベータ７拮抗剤抗体結合によりベータ７ドメインがその結合相手（例えばアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット及び／又はリガンド、例えばフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はＥ−カドヘリン）と相互作用する能力が妨害されるような配列に結合してよい。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体は、アルファ４又はアルファＥサブユニットとのベータ７の２量体化が妨害されるようにベータ７（例えば細胞外ドメイン）に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はベータ７及び／又はアルファ４ベータ７及び／又はアルファＥベータ７インテグリンがそれぞれのリガンドに結合する能力が妨害されるようにベータ７に結合する。例えば、１つの実施形態において、本発明はベータ７分子への結合によりその分子の２量体化を阻害する拮抗剤抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちフィブロネクチン、ＶＣＡＭ及び／又はＭＡｄＣＡＭ）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファＥベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちＥ−カドヘリン）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はヘテロ２量体化を含むベータ７の２量体化（即ちアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット分子とのベータ７の２量体化）を妨害する。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はアミノ酸１７６〜２３７をマッピングするベータ７インテグリンサブユニット上のエピトープに結合する。別の実施形態においては、本発明の拮抗剤抗体はＦｉｂ５０４．６４（ＡＴＣＣＨＢ−２９３）と実質的に同じエピトープであるベータ７インテグリン上のエピトープに結合する。エピトープ結合の測定は例えば競合結合分析のような標準的手法により行う。
【００５０】
１つの特徴において、本発明は図１３のアミノ酸置換の表において示すＨＶＲ配列の１、２、３、４、５又は全ての組み合わせを含む抗体を提供する。
【００５１】
宿主被験体における使用のための治療薬は好ましくはその被験体において薬剤に対する免疫原性の応答を全く誘発しない。１つの実施形態において本発明はそのような薬剤を提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は宿主被験体において配列番号１０、１１、１２及び／又は配列番号１３の配列番号を含む抗体（ラット抗マウスＦｉｂ５０４（ＡＴＣＣＨＢ−２９３）、図１及び９）と比較して実質的に低減された水準でヒト抗ラット又はヒト抗マウス又はヒト抗ヒト抗体応答を誘発する、及び／又は、誘発すると予測されるヒト化抗体を提供する。別の例においては、本発明はヒト抗マウス、ヒト抗ラット又はヒト抗ヒト抗体応答を全く誘発しない、及び／又は、誘発しないと予測されるヒト化抗体を提供する。
【００５２】
本発明のヒト化抗体はその重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン内に１つ以上のヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域（例えばフレームワーク）配列を含んでよい。一部の実施形態においては、１つ以上の別の修飾がヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域の配列内に存在する。１つの実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインはヒトコンセンサスフレームワーク配列を含み、これは１つの実施形態においてサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列である。１つの実施形態においては、本発明の抗体は少なくとも１つのアミノ酸位置において修飾された変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む。例えば、１つの実施形態において、変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列は、９４位は本発明の伸長重鎖超可変領域Ｈ３の一部であるが、７１、７３、７８及び／又は９４位の１つ以上において置換を含んでよい。１つの実施形態において、上記置換は何れかの組み合わせにおけるＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、Ｎ７８Ａ及び／又はＲ９４Ｍである。
【００５３】
本発明の抗体は、抗体が所望の生物学的特性（例えば所望の結合親和性）を示す限り、何れかの適当なヒト又はヒトコンセンサス軽鎖フレームワーク配列を含むことができる。１つの実施形態において本発明の抗体はヒトκ軽鎖のフレームワーク配列の少なくとも１部分（又は全て）を含む。１つの実施形態において本発明の抗体はヒトκサブグループＩのフレームワークコンセンサス配列の少なくとも１部分（又は全て）を含む。
【００５４】
本発明の拮抗剤はベータ７関連作用の１つ以上の特徴を調節するために使用することができる。例えば、ベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７２量体化領域の配列内のベータ７に結合し、そしてこれによりインテグリンサブユニットの相互作用及びインテグリン２量体の形成を阻害してよい。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン内の配列に結合してよく、これによりその結合相手（例えばアルファ４ベータについてはフィブロネクチン、ＶＣＡＮ及び／又はＭＡｄＣＡＭ；又はアルファＥベータ７インテグリンについてはＥ−カドヘリン）とのその結合ドメインの相互作用を防止する。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はインテグリンサブユニット２量体化ドメイン又はリガンド結合ドメイン内にはないが、そのベータ７拮抗剤抗体結合によりベータ７ドメインがその結合相手（例えばアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット及び／又はリガンド、例えばフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はＥ−カドヘリン）と相互作用する能力が妨害されるような配列に結合してよい。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体は、アルファ４又はアルファＥサブユニットとのベータ７の２量体化が妨害されるようにベータ７（例えば細胞外ドメイン）に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はベータ７及び／又はアルファ４ベータ７及び／又はアルファＥベータ７インテグリンがそれぞれのリガンドに結合する能力が妨害されるようにベータ７に結合する。例えば、１つの実施形態において、本発明はベータ７分子への結合によりその分子の２量体化を阻害する拮抗剤抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちフィブロネクチン、ＶＣＡＭ及び／又はＭＡｄＣＡＭ）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファＥベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちＥ−カドヘリン）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はヘテロ２量体化を含むベータ７の２量体化（即ちアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット分子とのベータ７の２量体化）を妨害する。
【００５６】
一部の場合において、インテグリンの一部としてのベータ７サブユニット、又は、２量体としてのアルファ４ベータ７インテグリン又はアルファＥベータ７インテグリンへのリガンド（例えばフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はアルファＥ）の結合に干渉しないベータ７拮抗剤抗体を有することが好都合である。従って、１つの実施形態において、ベータ７上のフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はＥ−カドヘリン結合部位には結合しないが、代わりに生物学的に活性なインテグリンが形成されないようにベータ７サブユニットとアルファサブユニット（例えばアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット）の間の相互作用を阻害するような抗体を提供する。１つの例においては、本発明の拮抗剤抗体は他の拮抗剤抗体１つ以上とともに使用することができ、その場合、拮抗剤はベータ７インテグリン軸内の異なる過程及び／又は機能にターゲティングされる。即ち、１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体は別のベータ７又はアルファ／ベータインテグリン拮抗剤（例えばアルファ４ベータ７抗体）、例えばモノクローナル抗体、又は、ヒト化抗体、又は、マウス抗体から誘導されるか、又は誘導された抗体と同じか、作用上同じの結合特性又は特異性を有するモノクローナル抗体のような抗体により結合されるエピトープとは異なるベータ７上のエピトープに結合する。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明はそれぞれのインテグリンへのベータ７−アルファ４又は−アルファＥの多量体化並びにリガンド結合を妨害するベータ７拮抗剤抗体を提供する。例えば、アルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニットとのベータ７の２量体化を阻害する本発明の拮抗剤抗体は、更に、ベータ７又はインテグリン２量体への結合に関してリガンドと競合する能力を有してよい（例えばそれはフィブロネクチン、ＶＣＡＭ及び／又はＭＡｄＣＡＭのベータ７及び／又はアルファ４ベータ７への結合に干渉するか；又は、ベータ７又はアルファＥベータ７へのＥ−カドヘリンの結合に干渉してよい）。
【００５８】
本発明のベータ７拮抗剤抗体の１つの実施形態において、ベータ７への拮抗剤の結合はリガンド結合活性化細胞接着を阻害する。本発明のベータ７拮抗剤抗体の別の実施形態において、細胞内のベータ７への拮抗剤の結合は、ベータ７含有インテグリンが発現される細胞及び／又は組織への細胞のリクルートメントを阻害する。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はベータ７の細胞外ドメインのアミノ酸１７６〜２５０（場合によりアミノ酸１７６〜２３７）の少なくとも一部（Ｔｉｄｓｗｅｌｌ，Ｍ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４９７−１５０５）又はその変異体に特異的に結合し、そしてリガンドＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ、フィブロネクチン及び／又はＥ−カドヘリンの結合を低減又はブロックする。１つの実施形態において、このようなリガンド結合ブロッキングは、ベータ７含有リガンドを発現する細胞へのリガンドを発現する細胞の付着を妨害、低減及び／又は防止する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体は残基１７６〜２３７を含むベータ７のアミノ酸配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はベータ７の残基１７６〜２３７からなる群より選択される配列の少なくとも１つの一部又は全てにより形成されるコンホーメーションエピトープに特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はヒトベータ７の残基１７６〜２３７の配列又は残基１７６〜２５０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性又は同様性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体はハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ−２９３により生産される抗ベータ７抗体Ｆｉｂ５０４と同様のエピトープに結合する。
【００６０】
１つの特徴において、本発明は本発明の拮抗剤抗体１つ以上及び担体を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、担体は製薬上許容しうるものである。
【００６１】
１つの特徴において、本発明は本発明のベータ７拮抗剤抗体をコードする核酸を提供する。
【００６２】
１つの特徴において、本発明は本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００６３】
１つの特徴において、本発明は本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは何れかの型、例えば、組み換えベクター、例えば発現ベクターであることができる。種々の宿主細胞の何れかを使用できる。１つの実施形態において、宿主細胞は原核生物の細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉである。１つの実施形態において宿主細胞は真核生物の細胞、例えば哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００６４】
１つの特徴において、本発明は本発明の拮抗剤を製造するための方法を提供する。例えば本発明はベータ７拮抗剤抗体（これは本明細書においては完全長及びそのフラグメントを包含する）の製造方法を提供し、その方法はその抗体（又はそのフラグメント）をコードする本発明の組み換えベクターを適当な宿主細胞内で発現させること、及び、その抗体を回収することを含む。
【００６５】
１つの特徴において、本発明は容器；及び容器内に含有された組成物を含む製造物品を提供し、ここで組成物は本発明のベータ７拮抗剤抗体１つ以上を含む。１つの実施形態において、組成物は本発明の核酸を含む。１つの実施形態において、拮抗剤抗体を含む組成物は更に、担体を含み、これは一部の実施形態においては製薬上許容しうるものである。１つの実施形態において、本発明の製造物品は更に被験体に組成物（例えば拮抗剤抗体）を投与するための説明書を含む。
【００６６】
１つの特徴において、本発明は本発明のベータ７拮抗剤抗体１つ以上を含む組成物を含む第１の容器；及び緩衝液を含む第２の容器を含むキットを提供する。１つの実施形態において、緩衝液は製薬上許容しうるものである。１つの実施形態において、拮抗剤抗体を含む組成物は更に担体を含み、これは一部の実施形態においては製薬上許容しうるものである。１つの実施形態において、キットは更に被験体に組成物（例えば拮抗剤抗体）を投与するための説明書を含む。
【００６７】
ベータ７インテグリン及びそのリガンドは疾患状態において多様に発現される。［腸内皮上のＭＡｄＣＡＭ−１の発現は炎症性腸疾患（ＵＣ及びＣＤ）を有する患者の粘膜炎症の部位において増大し、そしてＵＣ及びＣＤ患者の結腸固有層もまたＩＢＳ対照と比較して増大したＣＤ３＋及びａ４ｂ７＋細胞を示している（Ｓｏｕｚａ  Ｈ．，ら、Ｇｕｔ  ４５：８５６（１９９９）参照）。ＭＡｄＣＡＭ−１発現は肝臓疾患の門脈炎症に伴って観察されており、そして炎症中の肝臓へのアルファ４ベータ７＋リンパ球のリクルートメントにおいて重要である。（Ｈｉｌｌａｎ，Ｋ．ら、Ｌｉｖｅｒ．１９（６）：５０９−１８（１９９９））。肝臓の血管上のＭＡｄＣＡＭ−１はＩＢＤ及び原発性硬化性胆管炎を有する患者に由来するａ４ｂ７＋リンパ球の接着を裏付けている。接着は抗ＭＡｄＣＡＭ−１、抗アルファ４ベータ７又は抗アルファ４抗体により阻害されている（Ｇｒａｎｔ  ＡＪ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３３（５）：１０６５−７２（２００１））。ＭＡｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ及びＥ−カドヘリンは脳内皮細胞上及び／又は延焼した中枢神経系の微細血管上に発現される。ベータ７インテグリンはＣＮＳの脱髄疾患に寄与している（Ｋａｎｗａｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３，１４６（２０００））。アルファ４ベータ７の発現は対照群及びＵＣ患者よりもＣＤのＬＰＬにおいて有意に高値であった（Ｏｓｈｉｔａｎｉ，Ｎ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，７１５−７１９（２００３））。ＣＤ患者由来のＩＥＬを慢性的に刺激し、そして末梢よりリクルートした（Ｍｅｒｅｓｓｅ，Ｂ．，ら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，６９４−７００（２００１））。ヒト肝臓病においては、アルファＥベータ７Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）は、肝細胞及び胆管上皮上にＥ−カドヘリンが発現しているヒト肝臓内に優先的に蓄積する（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．，ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９，９１８−９２４（２００３））。慢性膵臓炎においては、ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は腸上皮内リンパ球と同様、慢性膵臓炎において膵臓に浸潤している（Ｍａｔｔｈｉａｓ，Ｐ．，ら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔ路炎テロｌ９３：２１４１−２１４７（１９９８））。アルファＥベータ７のアップレギュレーションは特定の上皮の関与とともに全身エリテマトーデス患者において観察されている（Ｐａｎｇら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：１４５６−１４６３（１９９８））。シェーグレン症候群においては、ＣＤ８＋アルファＥベータ７＋Ｔ細胞は腺房上皮細胞に接着し、アポトーシスを誘導することによりこれを殺傷している（Ｋｒｏｎｅｌｄら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２７：２１５−２１８，１９９８）。インテグリンアルファ４ベータ７及びアルファＥベータ７は皮膚炎症の間のＴ細胞表皮向性において役割を果たしており、皮膚同種移植片拒絶に寄与している（Ｓｕｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７４，１２０２，２００２）。Ｔｅｒａｋｉ及びＳｈｉｏｈａｒａは、乾癬上皮におけるＣＤ８＋Ｔ細胞上のａＥｂ７インテグリンの優先���発現を示している（Ｔｅｒａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４７．１１１８，２００２）。喀痰Ｔリンパ球は喘息、ＣＯＰＤ及び正常被験体において活性化ＩＥＬ（ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋）である（Ｌｅｃｋｉｅら、Ｔｈｏｒａｘ  ５８．２３，２００３）。ＣＤ１０３＋（ａＥｂ７＋）ＣＴＬは臨床的腎臓同種移植片拒絶の間に移植片上皮とともに蓄積する（Ｈａｄｌｅｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７２，１５４８，２００１）］。即ち１つの実施形態において、本発明は上記した疾患状態の１つ以上のような疾患を低減又は緩和するためにベータ７インテグリン−リガンド相互作用を阻害するための本発明のベータ７拮抗剤抗体の使用を提供する。１つの実施形態において、本発明の抗体は炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）、炎症性肝疾患、ＣＮＳの炎症、慢性膵臓炎、全身エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬及び皮膚炎症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患、アレルギー、自己免疫疾患、移植片拒絶、腎臓移植片拒絶、対宿主性移植片病、糖尿病及びがんを包含する炎症性疾患のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造において使用される。
【００６８】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により離間した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。
【００６９】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により離間した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【００７０】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により離間した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
【００７１】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により離間した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の製造物品の使用を提供する。
【００７２】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により離間した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。
【００７３】
本発明はベータ７インテグリン媒介細胞−細胞相互作用の過程の脱調節に関わる疾患状態を調節するために有用な方法及び組成物を提供する。ベータ７インテグリンは複数の生物学的及び生理学的な機能、例えば炎症性障害及びアレルギー性反応に関与している。即ち、１つの特徴において、本発明は本発明の抗体を被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００７４】
１つの特徴においては、本発明はベータ７インテグリン媒介炎症を阻害する方法を提供し、その方法は、本発明の抗体の有効量に細胞又は組織を接触させることによりリンパ球又はＢ細胞及びベータ７インテグリン発現細胞への結合を阻害することを含む。
【００７５】
１つの特徴において、本発明は被験体におけるベータ７インテグリン結合の脱調節に関わる病理学的状態を治療する方法を提供し、その方法は本発明の抗体の有効量を被験体に投与することにより、その状態を治療することを含む。
【００７６】
１つの特徴において、本発明はベータ７インテグリン（例えばアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７インテグリン）を発現する細胞へのベータ７インテグリンリガンドを発現するリンパ球（例えばＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン又はフィブロネクチンを発現する細胞）の結合を阻害する方法を提供し、方法は、本発明の抗体をその細胞に接触させることにより細胞の接着を阻害又は防止し、そして炎症反応の低減を誘発することを含む。
【００７７】
１つの特徴において、本発明は、ベータ７インテグリンの増大した発現又は活性、又は、ある細胞上のベータ７インテグリンと別の細胞上のベータ７インテグリン受容体との間の増大した相互作用に関わる炎症性障害を治療又は予防するための方法を提供し、その方法は本発明の抗体の有効量をそのような治療の必要な被験体に投与することによりその炎症性障害を効果的に治療又は予防することを含む。１つの実施形態において、その炎症性障害は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態においては、その炎症性障害はアレルギー性反応である。
【００７８】
本発明の方法は何れかの適当な病理学的状況、例えばベータ７インテグリン結合経路の脱調節に関わる細胞及び／又は組織に影響するように使用することができる。ベータ７インテグリンは主に白血球上に発現される（Ｔｉｄｓｅｌｌ，Ｍ．ら、（１９９７）上出）。１つの実施形態において、白血球は本発明の方法においてターゲティングされ、そしてベータ７インテグリンのリガンドを発現する細胞への結合を防止される。例えば、Ｅ−カドヘリンを発現する上皮内リンパ球は本発明によれば拮抗剤抗ベータ７抗体によりアルファＥベータ７インテグリン発現細胞への結合を防止される。ＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンを発現する細胞は本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体によりアルファ４ベータ７を発現する白血球への結合を防止される。
【００７９】
本発明の方法は更に別の治療工程を含むことができる。例えば、１つの実施形態において、方法は更に、ターゲティングされた細胞及び／又は組織（例えば腸内壁の内皮細胞）が抗ＴＮＦ抗体、又は限定しないが例えば５−ＡＳＡ化合物のような小型分子の治療薬に曝露される工程を含む。
【００８０】
本明細書に記載する通り、ベータ７インテグリンは重要な生物学的過程を媒介し、その脱調節は多くの病理学的状態をもたらす。従って、本発明の方法の１つの実施形態において、ターゲティングされる細胞（例えば内皮細胞）は、ベータ７インテグリンのベータ７インテグリンリガンドを発現する細胞（ここで細胞は例えばリンパ球であってよく、そしてリガンドはＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ又はＥ−カドヘリンであってよい）の接着が、本発明の抗ベータ７拮抗剤抗体の非存在下の細胞と比較して、妨害、阻害又は防止されているものである。１つの実施形態において、本発明の方法はリンパ球のホーミングを阻害することにより、ベータ７インテグリン発現部位における炎症を阻害する。例えば、本発明の拮抗剤との接触により、細胞は、ベータ７インテグリンのリガンドを発現する細胞に接着することができなくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８１】
（発明を実施するための形態）
本発明はベータ７シグナリング経路の阻害剤を発見及び／又は使用するための方法、組成物、キット及び製造物品を提供する。
【００８２】
これらの方法、組成物、キット及び製造物品の詳細を本明細書に記載する。
【００８３】
（一般的手法）
本発明の実施は、特段の記載が無い限り、当該分野で知られた分子生物学（例えば組み換え手法）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の手法を使用する。このような手法は文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７及び定期改訂版）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄ．，１９９４）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓら、２００１）に詳述されている。
【００８４】
（定義）
「ベータ７サブユニット」又は「β７サブユニット」とはヒトβ７インテグリンサブユニットを意味する（Ｅｒｌｅら、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１００９−１１０１６）。ベータ７サブユニットはアルファ４インテグリンサブユニット、例えばヒトα４サブユニットと会合する（Ｋｉｌｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｌｚｍａｎｎ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３：３４７−３５４）。アルファ４ベータ７インテグリンは成熟リンパ球の大部分、並びに、一部集団の胸腺細胞、骨髄細胞及び肥満細胞において発現される。（Ｋｉｌｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｍｕｒａｎｔ（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２５９１−２５９７；Ｇｕｒｉｓｈら、（１９９２）１４９：１９６４−１９７２；及びＳｈａｗ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３５）。ベータ７サブユニットはまたアルファＥサブユニット、例えばヒトアルファＥインテグリンサブユニットとも会合する（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．，ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３４５９）。アルファＥベータ７インテグリンは腸上皮内リンパ球（ｉＩＥＬ）上に発現される（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．（１９９３）上出）。本発明のヒト化抗ベータ７抗体に結合するベータ７サブユニットは天然に存在するものであり、そして可溶性であるか、細胞表面に局在化する。
【００８５】
「アルファＥサブユニット」又は「アルファＥインテグリンサブユニット」又は「αＥサブユニット」又は「ＣＤ１０３」とは上皮内リンパ球上のベータ７インテグリンに会合することがわかっているインテグリンサブユニットを意味し、このアルファＥベータ７インテグリンはＥ−カドヘリンを発現する腸上皮へのｉＥＬの結合を媒介する（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３４５９；Ｓｈａｗ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３５）。
【００８６】
「ＭＡｄＣＡＭ」又は「ＭＡｄＣＡＭ−１」は本発明の観点においては互換的に使用され、そして蛋白粘膜アドレシン細胞接着分子１を指し、これは短い原形質テール部及び免疫グロブリン様ドメインよりなる細胞外配列を含む１本鎖ポリペプチドである。マウス、ヒト及びマカクのＭＡｄＣＡＭ−１に関するｃＤＮＡがクローニングされている（Ｂｒｉｓｋｉｎ，ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３；４６１−４６４；Ｓｈｙｊａｎら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２８５１−２８５７）。
【００８７】
「ＶＣＡＭ−１」又は「血管細胞接着分子−１」、「ＣＤ１０６」とは、活性化された内皮上に発現されるアルファ４ベータ７及びアルファ４ベータ１のリガンドを指し、そして
炎症中の白血球の結合及び遊出のような内皮白血球相互作用において重要である。
【００８８】
「Ｅ−カドヘリン」とはカドヘリンのファミリーのメンバーであり、Ｅ−カドヘリンは上皮細胞上に発現される。Ｅ−カドヘリンはアルファＥベータ７インテグリンのリガンドであり、腸上皮へのｉＥＬ発現アルファＥベータ７の結合を媒介するが、リンパ球ホーミングにおけるその機能は不明である（Ｅ−カドヘリンの発現はＴＧＦ−ベータ１によりアップレギュレートされる）。
【００８９】
「フィブロネクチン」とは組織修復、胚形成、血液凝固及び細胞の遊走／接着に関与している。これはＥＣＭ（細胞外マトリックス）におけるリンカーして作用し、血漿中には２量体（血漿中フィブロネクチン）として存在する。血漿中の型は肝細胞により合成されるのに対し、ＥＣＭ型は線維芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、マクロファージ並びに特定の上脾細胞により生産される。この観点において、それは、アルファ４ベータ７インテグリンと相互作用し、リンパ球のホーミング又は接着の特徴を媒介する。フィブロネクチンのＥＣＭ型はコラーゲン又はプロテオグリカン基質に細胞をアンカリングすることにより一般的な細胞接着分子として作用する。フィブロネクチンはまた細胞外マトリックスの種々の成分に、そして細胞表面上の膜結合フィブロネクチン受容体に結合することによりＥＣＭとの細胞相互作用を組織化する働きを有する。最後に、フィブロネクチンは胚形成の間の細胞遊走の事象において重要である。
【００９０】
「胃腸炎症障害」は粘膜中に炎症及び／又は潰瘍を誘発する慢性障害の１群である。これらの障害は例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性結腸炎、非決定性結腸炎及び感染性結腸炎）、粘膜炎（例えば口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性腸炎及び食道炎を包含する。
【００９１】
「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は本明細書においては互換的に使用し、炎症及び／又は潰瘍を誘発する腸の疾患を指し、そしてクローン病及び潰瘍性結腸炎を包含する。
【００９２】
「クローン病（ＣＤ）」又は「潰瘍性結腸炎（ＵＣ）」は病因道の慢性の炎症性の腸の疾患である。クローン病は、潰瘍性結腸炎とは異なり、腸の如何なる部分にも生じ得るものである。最も顕著な特徴としてのクローン病は腸壁の顆粒状の赤紫色の浮腫性の肥厚である。炎症の発生に従い、これらの肉芽腫からその外周境界が消失し、周囲の組織と一体化する場合が多い。下痢及び腸閉塞が主要な臨床特徴である。潰瘍性結腸炎と同様、クローン病の過程は持続性又は回帰性、軽度又は重度となるが、ただし結腸炎とは異なり、クローン病は腸の罹患区分の切除によって治癒されない。クローン病の患者の大部分はある時点において手術を必要とするが、その後の回帰は一般的であり、継続的な医療処置が通常となる。
【００９３】
クローン病は口腔から肛門に至る消化管の何れかの部分が関与するものであるが、典型的には回結腸、小腸及び結腸−肛門直腸の領域に生じる。組織病理学的には、疾患は断続的な肉芽腫、陰窩膿瘍、索裂及びアフタ性潰瘍により顕在化する。炎症の浸潤は混在性であり、リンパ球（Ｔ及びＢ細胞の両方）、プラズマ細胞、マクロファージ及び好中球よりなる。ＩｇＭ及びＩｇＧ分泌プラズマ細胞、マクロファージ及び好中球の不均衡な増大を伴う。
【００９４】
抗炎症剤スルファサラジン及び５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）は軽度に活動性の結腸のクローン病を治療するために有用であり、そして疾患の退行を維持するために一般的に処方されている。メトロイダゾール及びシプロフロキサシンはスルファサラジンと薬効において同様であり、そして肛門周囲疾患を治療するために特に有用であると考えられる。さらに深刻な場合では、コルチコステロイドは活動性の再燃の治療に効果があり、さらに退行を維持することが可能である。アザチオプリン及び６−メルカプトプリンもまたコルチコステロイドの長期投与を必要とする患者において良好な結果をもたらしている。これらの薬剤は長期の予防においても役割を果たすことが可能である。残念なことに、一部の患者においては作用が開始される前に極めて長期の遅延（６ヶ月まで）がある場合がある。
【００９５】
下痢止め薬もまた一部の患者において兆候的緩解をもたらす。栄養療法又は単元的食餌が患者の栄養状態を改善し、そして急性の疾患の兆候的改善を誘導する場合があるが、持続性の臨床的退行を誘導するわけではない。抗生物質は二次的な小規模の腸内細菌の過剰増殖を治療する場合、及び、化膿性の合併症を治療する場合に使用されている。
【００９６】
「潰瘍性結腸炎（ＵＣ）」は大腸に生じる。疾患の過程は持続性又は回帰性、軽度又は重度となる。最早期の幹部はリーベルキューン陰窩の基底部における膿瘍の形成を伴った炎症性の浸潤である。これらの膨張し崩壊した陰窩の癒着状態は積層する粘膜をその血液供給から分断し、潰瘍をもたらす。疾患の症状は、痙攣、下腹部痛、直腸出血及び糞粒子の乏しい血液、膿汁及び粘膜より主になる頻繁な軟便を包含する。急性、重度又は慢性、非退行性の潰瘍性結腸炎では全結腸摘出が必要となる場合がある。
【００９７】
ＵＣの臨床特徴は極めて変動的であり、そして発症は潜行性又は突然であり、そして下痢、テネスムス及び回帰性の直腸出血を包含する場合がある。全結腸に急激な発症があれば、中毒性巨大結腸、致命的な緊急事態が起こる場合がある。腸外の顕在的特長は関節炎、膿皮壊疽、ブドウ膜炎及び結節性紅斑を包含する。
【００９８】
ＵＣの治療は軽度の症例ではスルファラジン及び関連のサリシレート含有薬剤、そして重度の症例ではコルチコステロイド剤を使用する。サリシレート又はコルチコステロイドの局所投与は場合によっては、特に疾患が遠位の腸に限局されている場合は有効であり、そして全身使用と比較して低減された副作用を有する。鉄及び抗下痢剤の投与のような補助的処置が場合により適応される。アザチオプリン、６−メルカプトプリン及びメトトレキセートは場合により、難治性のコルチコステロイド依存症例において処方される場合がある。
【００９９】
アミノ酸残基／位置の「修飾」とは、本明細書においては、出発アミノ酸配列と比較し他場合の一次アミノ酸配列の変化を指し、その場合、その変化はそのアミノ酸残基／位置が関与する配列の改変に起因している。例えば、典型的な修飾は残基（又はその位置における）の別のアミノ酸による置換（例えば保存的又は非保存的置換）、その残基／位置に隣接するアミノ酸１つ以上（一般的に５又は３未満）の挿入、及び、その残基／位置の欠失を包含する。「アミノ酸置換」又はその変異は、異なるアミノ酸残基による所定の（出発の）アミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の置き換えを指す。一般的に、そして、好ましくは、修飾により出発（又は「野生型」）のアミノ酸を含むポリペプチドと比較して変異体ポリペプチドの少なくとも１つ物理生物化学的活性が改変される。例えば、抗体の場合、改変される物理生物化学的活性は、標的分子に対する結合親和性、結合能力及び／又は結合作用であることができる。
【０１００】
「アミノ酸」という用語は本明細書の範囲内においては、その最も広範な意味において使用され、そして天然に存在するＬα−アミノ酸又は残基を包含する意味を有する。天然に存在するアミノ酸に関して一般的に使用される１文字及び３文字の略記法を本明細書において使用する（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７１−９２，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）。用語はＤ−アミノ酸並びに化学修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類縁体、蛋白に通常は取り込まれない天然に存在するアミノ酸、例えばノルロイシン及びアミノ酸に特徴的であることが当該分野で知られている特性を有する化学合成された化合物を包含する。例えば、天然のＰｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化合物のコンホーメーション制限を可能にするフェニルアラニン又はプロリンの類縁体又はミメティックもアミノ酸の定義に包含される。このような類縁体及びミメティックは本明細書においては、アミノ酸の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ，  Ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．５，ｐ．３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３）に記載されている。一文字を使用して天然に存在するアミノ酸の１つを標記する場合は、その標記は関連する文献に一般的に掲載されているものと同様である（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，  Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｉｎｃ．１９９４，ｐ．５７参照）。
【０１０１】
「単離された」抗体とは、その天然の環境の成分から発見され、そして分離及び／又は回収されたものである。その天然の環境の夾雑物成分は抗体の診断又は治療上の使用に干渉する可能性があり、そして、酵素、ホルモン及び他の蛋白性又は非蛋白性の溶質を包含する。好ましい実施形態においては抗体の精製は（１）Ｌｏｗｒｙ法で測定した場合に抗体９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケンサーの使用によりＮ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件化のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質となるまで行う。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分も存在しなくなるため、組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含する。しかしながら通常は単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により製造する。
【０１０２】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基ナンバリング」又は「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置ナンバリング」という用語及びその変形例は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに関して使用されているナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを用いれば、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短鎖化又はそれの内部への挿入に相当する過少な、又は付加的なアミノ酸を含有してよい。例えば、重鎖可変ドメインはＨ２の残基５２の後に単一のアミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を含んでよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所定の抗体について、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより決定してよい。
【０１０３】
「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という用語は、本明細書においては、２つの数値（一般的には１つは本発明の抗体に関わるものであり、もう１つは参照物／比較物の抗体に関わるもの）の間の差が、その数値（例えばＫｄ値）が尺度となる生物学的特徴の観点内で、殆ど又は全く生物学的及び／又は統計学的に有意でないと当業者が考えるほど十分高い程度の２つの数値間の同様性を指す。このような２つの数値の差は好ましくは、参照物／比較物抗体の数値の関数として、約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【０１０４】
「結合親和性」とは一般的に分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば抗原）との間の非共有結合性の相互作用の合計の強度を指す。特段の記載が無い限り本明細書においては、「結合親和性」とは結合対（例えば抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映している内因性の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は本明細書に記載するもののような当該分野で知られた一般的な方法により測定できる。低親和性抗体は一般的に緩徐に抗原に結合し、そして容易に解離する傾向にあるのに対し、高親和性抗体は一般的に急速に抗原に結合し、より長時間結合状態で残存する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該分野で知られており、その何れも本発明の目的のために使用できる。特定の例示される実施形態は後に記載する。
【０１０５】
１つの実施形態において、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」とは、本発明によれば、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いながら、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性（ＲＩＡ）を測定する後述の試験により説明される通り、未標識の抗原の段階力価物の存在下（１２５Ｉ）標識抗原の最小濃度でＦａｂを平衡化させ、次に、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合抗原をキャプチャーすることにより測定する（Ｃｈｅｎ，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。試験の条件を確立するために、マイクロプレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中キャプチャー用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）５ｕｇ／ｍｌで一夜コーティングし、そしてその後、室温で２〜５時間（約２３℃）ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングした。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中、１００ｐＭ又は２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（例えばＰｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の試験と合致）。次に目的のＦａｂを一夜インキュベートするが、インキュベートは確実に平衡が達成されるようにより長時間（例えば６５時間）継続してよい。その後、混合物を室温インキュベーション（例えば１時間）のためにキャプチャープレートに移す。次に溶液を取り出し、プレートｗＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、シンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）１５０ｕｌ／ウェルを添加し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を競合的結合試験で使用するために選択する。別の実施形態によれば、Ｋｄ又はＫｄ値は〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化でキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（���ｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌赤色キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【０１０６】
本発明による「ｏｎ速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」はまた〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた上記表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化でキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。しかしながら上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発行＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。本発明による「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、１つの実施形態においては、抗体のＦａｂ型と抗原分子を用いながら、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性（ＲＩＡ）を測定する後述の試験により説明される通り、未標識の抗原の段階力価物の存在下（１２５Ｉ）標識抗原の最小濃度でＦａｂを平衡化させ、次に、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合抗原をキャプチャーすることにより測定する（Ｃｈｅｎ，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。試験の条件を確立するために、マイクロプレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中キャプチャー用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）５ｕｇ／ｍｌで一夜コーティングし、そしてその後、室温で２〜５時間（約２３℃）ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングした。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中、１００ｐＭ又は２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の試験と合致）。次に目的のＦａｂを一夜インキュベートするが、インキュベートは確実に平衡が達成されるようにより長時間（例えば６５時間）継続してよい。その後、混合物を１時間室温インキュベーションのためにキャプチャープレートに移す。次に溶液を取り出し、プレートｗＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、シンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）１５０ｕｌ／ウェルを添加し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を競合的結合試験で使用するために選択する。別の実施形態によれば、Ｋｄ又はＫｄ値は〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化でキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌赤色キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【０１０７】
１つの実施形態において、本発明による「ｏｎ速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」はまた〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた上記表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化でキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。しかしながら上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【０１０８】
「実質的に低減された」又は「実質的に異なる」という表現は、本明細書においては、２つの数値（一般的には１つは本発明の抗体に関わるものであり、もう１つは参照物／比較物の抗体に関わるもの）の間の差が、その数値（例えばＫｄ値、ＨＡＭＡ応答）が尺度となる生物学的特徴の観点内で、統計学的に有意であると当業者が考えるほど十分高い程度の２つの数値間の同様性を指す。このような２つの数値の差は好ましくは、参照物／比較物抗体の数値の関数として、約１０％超、好ましくは約２０％超、好ましくは約３０％超、好ましくは約４０％超、好ましくは約５０％超である。
【０１０９】
ペプチド又はポリペプチドの配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、配列をアラインし、そして必要に応じてギャップを導入することにより最大パーセント配列同一性を達成した後の、そして何れかの保存的置換も配列同一性の部分とはみな佐内場合の、特定のペプチド又はポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアライメントは例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような市販されているコンピューターソフトウエアを用いながら、当該分野で知られた種々の方法において達成することができる。アライメントを測定するための適切なパラメーター、例えば比較される配列の完全長にわたる最大アライメントを達成するために必要な何れかのアルゴリズムは問う業者が決定できる。しかしながら本明細書の目的のためには、％アミノ酸同一性の値は配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して得られるものであり、その場合、ＡＬＩＧＮ−２プログラムのための完全なソースコードは以下の表Ａに示す通りである。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著作されたものであり、以下の表Ａに示すソースコードは米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下にそれが登録されている米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）内にユーザードキュメンテーションとともに提出されている。ＡＬＩＧＮＢ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公的に入手するか、又は、以下の図８内に示すソースコードからコンパイルしてよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄ上でのしようのためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、そして変化しない。
【０１１０】
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較のために使用する状況においては、所定のアミノ酸Ａの、所定のアミノ酸Ｂに対する又はそれとの又はそれに対向する％アミノ酸配列同一性（これは所定のアミノ酸Ｂに対する又はそれとの又はそれに対向する所定の％アミノ酸配列同一性を有するか含む所定のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は以下の通り計算する。
【０１１１】
割合Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムアライメントにおいて、同一マッチと評点されたアミノ酸残基の数であり、そしてＹはＢ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合は、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。
【０１１２】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値はＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを用いながら直前のパラグラフにおいて記載した通りに得た。
【０１１３】
【化１】
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【０１１４】
【化２】
2008512382.tif 000003
【０１１５】
【化３】
2008512382.tif 000004
【０１１６】
【化４】
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【０１１７】
【化５】
2008512382.tif 000006
【０１１８】
【化６】
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【０１１９】
【化７】
2008512382.tif 000008
【０１２０】
【化８】
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【０１２１】
【化９】
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【０１２２】
【化１０】
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【０１２３】
【化１１】
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【０１２４】
【化１２】
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【０１２５】
【化１３】
2008512382.tif 000014
【０１２６】
【化１４】
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【０１２７】
【化１５】
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【０１２８】
【化１６】
2008512382.tif 000017
【０１２９】
【化１７】
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【０１３０】
【化１８】
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【０１３１】
【化１９】
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【０１３２】
【化２０】
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【０１３３】
【化２１】
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【０１３４】
【化２２】
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【０１３５】
【化２３】
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【０１３６】
【化２４】
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【０１３７】
【化２５】
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【０１３８】
【化２６】
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「ベクター」という用語は本明細書においては、自身が連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これは更に別のＤＮＡセグメントがライゲーションされていてよい環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウィルスベクターであり、その場合更に別のＤＮＡセグメントがウィルスゲノム内にライゲーションされていてよい。特定のベクターは自身が導入されている宿主細胞内において自己複製することができる（例えば複製の細菌起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞内への導入により宿主細胞のゲノム内に組み込まれることができ、これにより宿主細胞ゲノムとともに複製される。更にまた特定のベクターは自身が作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向することができる。このようなベクターは本明細書においては、「組み換え発現ベクター」（又は単に「組み換えベクター」）と称する。一般的に、組み換えＤＮＡ手法において利用される発現ベクターはプラスミドの形態である場合が多い。本明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用されている形態であるため、互換的に使用してよい。
【０１３９】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、本明細書においては、何れかの長さのヌクレオチドの重合体を指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ヌクレオチドはデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又は、その類縁体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼにより、又は合成反応により重合体に取り込まれることができる何れかの基質であることができる。ポリヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びその類縁体を含んでよい。存在する場合は、ヌクレオチド構造に対する修飾は重合体の組み立ての前又は後に付与してよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてよい。ポリヌクレオチドは合成後に更に例えば標識とのコンジュゲーションにより修飾されてよい。他の型の修飾は、例えば天然に存在するヌクレオチド１つ以上の類縁体による「キャップ」置換、ヌクレオチド間修飾、例えば未荷電連結による（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カーバメート等）、及び、荷電連結（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）によるもの、懸垂部分を含有するもの、例えば蛋白（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレーターを有するもの（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート形成剤を含有するもの（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化性金属等）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結部を有するもの（例えばアルファ芳香族核酸等）、並びに、未修飾形態のポリヌクレオチドを包含する。更にまた、糖に通常存在するヒドロキシル基の何れかは、例えばホスホネート基、ホスフェート基により置き換えられているか、標準的な保護基により保護されているか、又は、別のヌクレオチドへの追加的連結部を作成するために活性化されていてよく、或いは、固体又は半固体の支持体にコンジュゲートされていてよい。５’及び３’末端のＯＨはホスホリル化されるか、又は、アミン又は炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分により置換されていることができる。他のヒドロキシルはまた標準的保護基に誘導体化されていてよい。ポリヌクレオチドはまた当該分野で一般的に知られたリボース又はデオキシリボース糖の類縁体形態、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環糖類縁体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類縁体及び非塩基性類縁体、例えばメチルリボシドを含有してよい。１つ以上のホスホジエステル連結部が別の連結基により置き換えられていてよい。これらの代替的連結基は、例えばホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）で置き換えられている実施形態を包含し、ここで各Ｒ又はＲ’は独立して、Ｈ又は場合によりエーテル（−Ｏ−）結合を含有する置換又は未置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルキルである。ポリヌクレオチド中の全連結部が同一である必要はない。前期はＲＮＡ及びＤＮＡを包含する本明細書に記載する全てのポリヌクレオチドに適用する。
【０１４０】
「オリゴヌクレオチド」とは本明細書においては、必然ではないが一般的に約２００ヌクレオチド長未満の短鎖の一般的には１本鎖の一般的には合成されたポリヌクレオチドを一般的に指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関して上記したものは等しく、そして完全にオリゴヌクレオチドに適用できる。
【０１４１】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は最も広範な意味において互換的に使用され、そしてモノクローナル抗体’例えば完全長又は未損傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す限りにおいて二重特異性抗体）を包含し、そして特定の抗体フラグメント（本明細書においてより詳述する）も包含してよい。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟のものであることができる。
【０１４２】
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の一部分のみを含未、その部分は好ましくは未損傷の抗体中に存在する場合にその部分に通常関わる機能の少なくとも１つ、好ましくは大部分又は全てを保持している。１つの実施形態において、抗体フラグメントは未損傷の抗体の抗原結合部位を含み、そしてこれにより、抗原に結合する能力を保持している。別の実施形態においては、抗体フラグメント、例えばＦｃ領域を含むものは、未損傷の抗体中に存在する場合にＦｃ領域に通常関わる生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合等の少なくとも１つを保持する。１つの実施形態において、抗体フラグメントは未損傷の抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する１価の抗体である。例えばそのような抗体フラグメントはフラグメントにインビボ安定性を付与することができるＦｃ配列に連結した結合アームを抗原上に含んでよい。
【０１４３】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は少量において存在する可能性のある可能な天然に存在する突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原に対して指向されている。更に又、種々の決定基（エピトープ）に対して指向されている種々の抗体を典型的には包含するポリクローナル抗体調整物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向されている。
【０１４４】
本明細書に記載するモノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖は特定の種に由来するか、特定の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相当する配列に同一又は相同であるが、鎖の残余部分は、別の種に由来するか、別の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相当する配列に同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体のフラグメントを、それらが所望の生物学的活性を示す限り、包含する（米国特許４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１４５】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種（レシピエント抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである（レシピエント抗体）。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は相当する非ヒト残基により置き換えられている。更に又、ヒト化抗体はレシピエント抗体内にもドナー抗体内にも存在しない残基を含んでよい。このような修飾は抗体の性能を更に精鋭化させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、そしてＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれである少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は場合により、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含むことになる。詳細についてはＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照できる。更に又以下の文献：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；ＩＩａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）及びそこに引用されている参考文献を参照できる。
【０１４６】
［抗原」は抗体が選択的に結合する所定の抗原である。標的抗原はポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に存在する又は合成の化合物であってよい。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。「アクセプターヒトフレームワーク」とは、本明細書の目的のためには、ヒト免疫グロブリンフレームワークから、又は、ヒトコンセンサスフレームワークから誘導されたＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から誘導された」アクセプターヒトフレームワークはそれと同じアミノ酸配列を含んでよく、又は、既存のアミノ酸配列の変化を含有していてよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合は、好ましくは５以下、好ましくは４以下又は３以下の既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨに存在する場合は、好ましくはそのような変化は７１Ｈ、７３Ｈおよび７８Ｈ位のわずか３、２又は１つにのみあり；例えば、そのような位置にあるアミノ酸残基は７１Ａ、７３Ｔおよび７８Ａであってよい。１つの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは配列においてＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に同一である。
【０１４７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は一部のヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列において最も一般的に存在するアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般的にその一部のヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的に配列のサブグループはＫａｂａｔら、のサブグループである。１つの実施形態において、ＶＬについては、サブグループはＫａｂａｔら、の場合のようにサブグループカッパＩである。１つの実施形態において、ＶＨについては、サブグループはＫａｂａｔら、の場合のようにサブグループＩＩＩである。
【０１４８】
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」はＫａｂａｔら、の可変軽鎖カッパサブグループＩのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は以下の配列：
【０１４９】
【化２７】
2008512382.tif 000028
の各々の少なくとも一部分又は全てを含む。
【０１５０】
「ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク」はＫａｂａｔら、の可変重鎖サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。１つの実施形態において、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は以下の配列：
【０１５１】
【化２８】
2008512382.tif 000029
の各々の少なくとも一部分又は全てを含む。
【０１５２】
「未修飾のヒトフレームワーク」はアクセプターヒトフレームワークと同じアミノ酸配列を有するヒトフレームワークであり、例えばアクセプターヒトフレームワークにおけるヒトから非ヒトへのアミノ酸置換を有さないものである。
【０１５３】
「改変された超可変領域」とは本発明の目的のためには、１つ以上（例えば１〜約１６）のアミノ酸置換をそこに含む超可変領域である。
【０１５４】
「未修飾超可変領域」とは本発明の目的のためには、誘導元の非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する超可変領域であり、即ち１つ以上のアミノ酸置換をそこに含まないもの
含む超可変領域である。
【０１５５】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」という用語は、本明細書においては、配列内で超可変であり、及び／又は、構造的に定義されたループを形成する抗体可変止めの領域を指す。一般的に、抗体は６超可変領域；３つをＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）内に、そして３つをＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）内に含む。多くの超可変領域の定義が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列の可変性に基づいており、そして、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭの超可変領域はＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の折衷を示し、そしてＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアにより使用されている。「接触」超可変領域は使用可能な複合体結晶構造の分析に基づいている。これらの超可変領域の各々に由来する残基を以下に示す。
【０１５６】
【表１】
2008512382.tif 000030
超可変領域は以下の通り、即ち：ＶＬ内の２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は４９−５６又は５０−５６又は５２−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、及びＶＨ内の２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）の「伸長超可変領域」を含んでよい。可変ドメイン残基はこれらの定義の各々につき上記Ｋａｂａｔ等の定義に従ってナンバリングされている。
【０１５７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１５８】
「ヒト抗体」はヒトにより生産される抗体に相当するか、及び／又は、本明細書に開示するヒト抗体を製造するための手法の何れかを用いて作成されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０１５９】
「親和性成熟」抗体は、１つ以上の改変をそのＣＤＲ１つ以上内に有するものであり、これによりそのような改変を保有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性が向上しているものである。好ましい親和性成熟抗体は標的抗原に対してナノモル、或いは更にピコモルレベルの親和性を有することになる。親和性成熟抗体は当該分野で知られた操作法により製造される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）はＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発はＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；ｌＪａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）により記載されている。
【０１６０】
「ブロッキング」抗体又は「拮抗剤」抗体はそれが結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減するものである。好ましいブロッキング抗体又は拮抗剤抗体は抗原の生物学的活性を実質的又は完全に阻害する。
【０１６１】
「アゴニスト抗体」とは本明細書においては、目的のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【０１６２】
「障害」とは本発明の物質／分子又は方法による治療から利益を被る何れかの状態である。これには問題となる障害に哺乳類を罹患し易くしている病理学的状態を包含する慢性及び急性の障害又は疾患が包含される。本明細書において治療されるべき障害の非限定的な例は、悪性又は良性の腫瘍；非白血病性及びリンパ球性の悪性疾患；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質性及び胞胚腔の障害；及び炎症性、免疫学的及び他の血管形成関連の障害を包含する。
【０１６３】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳類の免疫系の要素が哺乳類における罹病を誘発、媒介又は他の態様において寄与するような疾患を意味する。同様に包含されるものは免疫応答の刺激又は介入が疾患の進行に対して緩解作用を有するような疾患である。この用語に包含されるものは免疫媒介炎症性疾患、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、新生物形成等である。
【０１６４】
本発明に従って治療することができる一部免疫又はＴ細胞媒介である免疫関連及び炎症性疾患の例は、全身エリテマトーデス、慢性関節リューマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節障害、全身硬化症（硬皮症）、特発性炎症性ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、申請糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発性神経障害又はギヤン‐バレー症候群及び慢性脱髄性多発性神経障害、肝胆疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝臓親和性のウィルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫症及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性結腸炎；クローン病）、グルテン感受性腸症及びホウイップル病、自己免疫又は免疫媒介性の皮膚疾患、例えば水疱性皮膚疾患、多発性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、移植関連の疾患、例えば移植片拒絶及び対宿主性移植片病、感染性疾患、例えばウィルス製疾患、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型肝炎等、細菌感染症、カビ感染症、原虫感染症及び寄生虫感染症を包含する。
【０１６５】
本明細書においては互換的に使用される「自己免疫障害」又は「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織から生じる、及び、これに対して指向される、非悪性の疾患又は障害である。本明細書に記載する自己免疫疾患は特に悪性又は癌性の疾患又は状態を除外し、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫疾患又は障害の例は
炎症性応答、例えば炎症性皮膚疾患、例えば感染及び皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）；全身硬皮症及び硬化症；炎症性腸疾患に関わる応答（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）；呼吸窮迫症候群（例えば成人呼吸窮迫症候群、ＡＲＤＳ）；痴呆症；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；結腸炎；糸球体腎炎；アレルギー性状態、例えば湿疹及び喘息及び他のＴ細胞浸潤関与の状態及び慢性炎症性応答；アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全；慢性関節リューマチ；全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病（例えばＩ型糖尿病又はインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；早発性糖尿病；及び典型的には結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎において観察されるサイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅発性の過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血（アディソン病）；白血球漏出の関わる疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器傷害症候群；溶血性貧血（例えばクリオグロブリン血又はクームス陽性貧血）；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介疾患；抗糸球体既定膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート‐イートン筋衰弱症候群；類天疱瘡水疱；天疱瘡；自己免疫性多発性内分泌腺症；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫性血小板減少症等を包含する。
【０１６６】
「胃腸炎症傷害」という用語は炎症及び／又は潰瘍を粘膜に誘発する一群の慢性障害である。用語はそのまま、炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性結腸炎、非決定性結腸炎及び感染性結腸炎）、粘膜炎（例えば口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性腸炎及び食道炎を包含する。
【０１６７】
「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語はある程度の異常な細胞増殖を伴う障害を指す。１つの実施形態において、細胞増殖性障害は癌である。
【０１６８】
「腫瘍」とは、本明細書においては、悪性又は良性に関わらず全ての新生物性の細胞の成育及び全ての前癌性および癌性の細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」は本明細書において言及する限り相互に排除されない。
【０１６９】
「癌」及び「癌性」という用語は典型的には調節できない細胞の成育／増殖を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか描写するものである。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病を包含する。このような癌のより特定の例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫瘍、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は至急の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫及び種々の型の東部及び軽侮の癌を包含する。
【０１７０】
血管形成の脱調節は本発明の組成物及び方法により治療できる多くの障害をもたらす場合がある。これらの障害は非新生物性及び新生物性の状態の両方を包含する。新生物は例えば上記したものを包含する。非新生物性の障害は例えば望ましくない、又は、異常な肥大、関節炎、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性プラーク、糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、例えば未熟児網膜症、水晶体後腺維増殖症、血管新生緑内障、加齢関連黄斑変性、糖尿病性斑状浮腫、角膜血管新生、角膜グラフト血管新生、角膜グラフト拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、角の血管新生（皮膚紅潮）、眼の血管新生性疾患、血管再狭窄、動脈静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管腺維腫、甲状腺肥大（グレーブス病を含む）、角膜及び他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺傷害／ＡＲＤＳ、敗血症、一次肺高血圧症、悪性肺滲出、脳水腫（例えば急性卒中／閉鎖性頭部傷害／外傷に関連）、滑膜炎症、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣症、子宮内膜炎、体液サードスペース形成疾患（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮線維症、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病及び潰瘍性結腸炎）、腎臓同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない、又は、異常な組織嵩増大（非癌）、血友病性関節、肥大瘢痕、毛髪増殖阻害、オースラー‐ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖、硬皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心内膜液浸出（例えば心内膜炎に関連するもの）及び供水を包含する。
【０１７１】
本明細書においては、「治療」とは治療すべき個体又は細胞の本来の過程を改変させる試みにおける臨床介入を指し、予防的に、又は臨床病理過程の間の何れかに実施できる。治療の望ましい作用は、疾患の発症又は再発の防止、症状の緩解、何れかの直接又は間接的な疾患帰結の軽減、転移の防止、疾患進行速度の低減、疾患状況の緩和又は沈静化、及び、予後の軽快又は改善を包含する。一部の実施形態においては、本発明の抗体は疾患又は障害の発症を遅延するために使用される。
【０１７２】
「有効量」とは所望の治療又は予防上の結果を達成するために、必要な用量及び時間において、有効である量を指す。
【０１７３】
本発明の物質／分子、アゴニスト又は拮抗剤の「治療有効量」は個体の疾患状況、年齢、性別及び体重、及び、物質／分子、アゴニスト又は拮抗剤が個体において所望の応答を誘発する能力のような要因に従って変動する。治療有効量は又、物質／分子、アゴニスト又は拮抗剤の何れかの毒性又は有害な作用よりも治療上有益な作用が勝っているものである。「予防有効量」は所望の予防結果を達成するために、必要な用量及び時間において、有効である量を指す。必然ではないが典型的には、予防用量は疾患の前又は早期の段階において被験体において使用されるため、予防有効量は治療有効量よりも低値となる。
【０１７４】
「細胞毒性剤」という用語は本明細書においては、細胞の機能を阻害又は防止、及び／又は細胞の破壊を誘発する物質を指す。用語は放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインタカレーション剤、酵素及びそのフラグメント、例えば核溶解酵素、抗生物質及び毒素、例えば小分子毒素又は細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素並びにそのフラグメント及び／又は変異体、及び、以下に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を包含する。他の細胞毒性剤は以下に記載する。殺腫瘍性の薬剤は腫瘍細胞の破壊を誘発する。
【０１７５】
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学物質である。化学療法剤の例はアルキル化剤類、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ；エチレンイミン類及びメチラメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスホアミド及びトリメチロールオメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン類；ベツリン酸；カンプトテシン（例えば合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テミポシド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード類、例えばクロランブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸酸化メクロレタミン、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ジネマイシン、例えばジネマイシンＡ；クスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連の色素蛋白エネジン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オーソラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、���えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、デキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル類、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノェブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド類、例えばマイタンシン及びアンサミトシン類；マイトグアゾン；マイトキサトロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピアルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＡＶＲＡＸＡＮＥＴＭＣｒｅｍｏｐｈｏｒ−非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イソフォスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノヴァントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えばレチン酸；カペシタラビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記物質��何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体；並びに上記物質の二者以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ、即ちシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの複合療法の略称、及びＦＯＬＦＯＸ、即ち５−ＦＵ及びロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いた治療用法の略称等、を包含する。
【０１７６】
この定義に同様に包含されるものは癌の生育を促進することが可能であるホルモンの作用を調節、低減、ブロック又は阻害する作用を有し、そして、全身投与又は身体全体投与の形態となる場合が多い抗ホルモン剤である。それらはそれら自体がホルモンであってよい。例示されるものは、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン類；エストロゲン受容体ダウンレギュレート剤（ＥＲＤ）；卵巣を阻害又はシャットダウンする機能を有する薬剤、例えば黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン；他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲステロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー、ファドゾロール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アラストロゾールを包含する。更に又、化学療法剤のこのような定義にはビスホスホネート類、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチロロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のような異常な細胞増殖に関与するとされるシグナリング経路内の遺伝子の発現を阻害するもの；ワクチン類、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン類、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤、別名ＧＷ５７２０１６）；及び上記物質の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体も包含される。
【０１７７】
「生育阻害剤」とは、本明細書において使用する場合は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてその生育がベータ７活性化に依存している細胞の成育を阻害する化合物又は組成物を指す。即ち、生育阻害剤はＳ期におけるベータ７依存性細胞のパーセンテージを実質的に低減するものであってよい。生育阻害剤の例は細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置において）ブロックする薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤を包含する。伝統的なＭ期ブロッカーはビンカ類（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンエトポシド及びブレオマイシンを包含する。Ｇ１を停止させる薬剤はまたＳ期停止にまで作用を派生させるものがあり、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−Ｃが挙げられる。更に詳細な説明はＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，  ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １の表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇ」、Ｍｕｒａｊａｎｕら、（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５），ｐ．１３に記載されている。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は共にイチイの木から誘導される抗癌剤である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）はパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類縁体である。パクリタキセル及びドセタキセルはチュブリン２量体からの微小管の組み立てを促進し、そして脱重合を防止することにより微小管を安定化させ、これが細胞における有糸分裂を阻害する。
【０１７８】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【０１７９】
本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体を用いた複合療法に用いられる化合物は、抗体（例えば他の抗ベータ７拮抗剤抗体（Ｆｉｂ２１、２２、２７、３０、（Ｔｉｄｓｗｅｌｌ，Ｍ．（１９９７）上出）又はそのヒト化誘導体）、抗α４抗体（例えばＡＮＴＥＧＥＮ（登録商標））、抗ＴＮＦ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））又は非蛋白化合物、例えば５−ＡＳＡ化合物ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＳＡＴＭ、ＲＯＷＡＳＡＴＭ、ＣＯＬＡＺＡＬＴＭ及び他の化合物、例えばＰｕｒｉｎｅｔｈｏｌ及びステロイド、例えばプレドニソンを包含する。ある実施形態においては、本発明は本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体の単独、又は、炎症の治療の同じく有用である第２の化合物との組み合わせによる、ヒト患者のような患者を治療する方法を包含する。１つの実施形態において、第２の化合物はＦｉｂ２１、２２、２７、３０又はそのヒト化誘導体）、抗アルファ４抗体、ＡＮＴＥＧＥＮ（登録商標）、抗ＴＮＦ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、５−ＡＳＡ化合物、ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＳＡＴＭ、ＲＯＷＡＳＡＴＭ、ＣＯＬＡＺＡＬＴＭ、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ及びステロイド及びプレドニソンからなる群より選択される。本発明の１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体の投与は第２の化合物の用量を実質的に低減する。１つの実施形態において、第２の薬剤の用量における上記低減は少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体及び第２の化合物の低減された用量の組み合わせは第２の化合物単独の投与と実質的に同か更に良好な程度にまで患者における症状を緩解する。
【０１８０】
（ＨＡＭＡ応答を低減又は消失させる変異体抗体の作成）
ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス（ヒト抗ラット又はヒト抗ヒトにも適用）応答の低減又は消失は適当な治療薬の臨床開発の重要な側面である。例えばＫｈａｘｚａｅｌｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（１９８８），８０：９３７；Ｊａｆｆｅｒｓら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８６），４１：５７２；Ｓｈａｗｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５），１３５：１５３０；Ｓｅａｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．（１９８４），３．１３８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（１９８３），６２：９８８；Ｈａｋｉｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４７：１３５２；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎｔｕｒｅ（１９８８），３３２：３２３；Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９０），５０：１４９５を参照できる。本明細書に記載する通り、本発明はＨＡＭＡ応答が低減又は消失するようにヒト化された抗体を提供する。これらの抗体の変異体もまた一部は後に詳述する当該分野で知られた日常的方法を用いて得ることができる。
【０１８１】
例えば本明細書に記載した抗体に由来するアミノ酸配列はフレームワーク及び／又は超可変配列の多様化のための出発（親）配列として機能できる。出発超可変配列が連結する選択されたフレームワーク配列は本明細書においてはアクセプターヒトフレームワークと称する。アクセプターヒトフレームワークはヒト免疫グロブリン（そのＶＬ及び／又はＶＨ領域）由来であるかこれから誘導してよいが、好ましくはアクセプターヒトフレームワークはヒトコンセンサスフレームワーク由来であるかこれから誘導され、その理由はそのようなフレームワークはヒト患者における免疫原性が最小限又は皆無であることがわかっているためである。
【０１８２】
アクセプターがヒト免疫グロブリンから誘導される場合は、場合により、ヒトフレームワーク配列のコレクション中の種々のヒトフレームワーク配列にドナーフレームワーク配列をアラインさせることによりドナーフレームワーク配列への自身の相同性に基づいて選択されたヒトフレームワーク配列を選択し、そして、アクセプターとして最も相同性の高いフレームワーク配列を選択してよい。
【０１８３】
１つの実施形態において、ヒトコンセンサスフレームワークは本明細書においては、ＶＨサブグループＩＩＩ及び／又はＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列由来であるか、又は、それより誘導される。
【０１８４】
即ち、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは以下：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３８）を含むＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号３９）を含むＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＸ１ＤＸ２ＳＫＮＴＸ３ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４２）を含むＦ３４、個々でＸ１はＡ又はＲ、Ｘ２はＴ又はＮ、そしてＸ３はＡ、Ｌ又はＦ、
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４１）を含むＦＲ４、
のフレームワーク配列の１つ、２つ、３つ又は全てを含んでよい。
ＶＨコンセンサスフレームワークの例は、下記：
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号１９）；
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２０−２２）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４８）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４９−５１）；
ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５２）；
ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５３−５５）；
ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５６）；
ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５７−５８）；
ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５９）；又は
ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号６０−６２）を包含する。
【０１８５】
１つの実施形態において、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは以下：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３８）を含むＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号３９）を含むＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４３）、ＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４４）を含むＦＲ３、
ＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＦＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４５）、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＦＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４６）、
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４１）を含むＦＲ４、
のフレームワーク配列の１つ、２つ、３つ又は全てを含んでよい。
【０１８６】
ＶＬアクセプターヒトフレームワークは以下：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３４）を含むＦＲ１、
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩ（配列番号３５）を含むＦＲ２、
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３６）を含むＦＲ３、
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３７）を含むＦＲ４、
のフレームワーク配列の１つ、２つ、３つ又は全てを含んでよい。
ＶＬコンセンサスフレームワークの例は、下記：
ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１４）；
ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（伸長ＨＶＲ−Ｌ２）（配列番号１５）；
ヒトＶＬカッパサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１６）；
ヒトＶＬカッパサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１７）；又は、
ヒトＶＬカッパサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号１８）、
を包含する。
【０１８７】
アクセプターは配列において選択されたヒトフレームワーク配列に同一であってもよいが、それがヒト免疫グロブリン又はヒトコンセンサスフレームワーク由来であるかについては、本発明は、ヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と相対比較した場合の既存のアミノ酸の置換をアクセプター配列が含んでいてよいことを意図している。これらの既存の置換は好ましくは最小限；通常はヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と相対比較して４、３、２又は１アミノ酸置換の相違のみである。
【０１８８】
非ヒト抗体の超可変領域残基はＶＬ及び／又はＶＨアクセプターヒトフレームワーク内に取り込まれる。例えば、ＫａｂａｔＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ残基。Ａｂｍ残基及び／又は接触残基に相当する残基を取り込んでよい。或いは、伸長超可変領域残基、２４−３４（Ｌ１）、４９−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）も取り込まれる。
【０１８９】
超可変領域残留物の「取り込み」を本明細書において論じるが、当然ながらこれは種々の方法で達成することができ、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は、自身のフレームワーク領域がアクセプターヒトフレームワーク領域に変化するようにマウス可変ドメイン配列をコードする核酸を突然変異させることによるか、又は、超可変ドメインの残基が非ヒト残基に変化するようにヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を突然変異させることによるか、又は、所望の配列をコードする核酸を合成することによる等して作成することができる。
【０１９０】
本明細書の例においては、超可変領域グラフト変異体は書く超可変領域に対する別個のオリゴヌクレオチドを用いながら、ヒトアクセプター配列をコードする核酸のＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発により作成した。Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍａｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）。適切な変化は適切な超可変領域抗原相互作用を補正して再構築するための日常的な手法を用いてフレームワーク及び／又は超可変領域内に導入することができる。
【０１９１】
ファージ（ミド）ディスプレイ（本明細書においては一部の観点においてファージディスプレイと称する）は、配列無作為化により作成されたライブラリ内に多くの異なる潜在的変異体抗体を作成し、そして、スクリーニングするための好都合で迅速な方法として使用できる。しかしながら、改変された抗体を作成してスクリーニングするための他の方法も当業者は使用できる。
【０１９２】
ファージ（ミド）ディスプレイの技術は抗原のようなリガンドに結合する新規な蛋白を作成し、そして選択するための強力な手段を提供している。ファージ（ミド）ディスプレイの技術を用いることにより、高い親和性を有する標的分子に結合する配列を発見するために急速にソーティングすることができる蛋白変異体の大型ライブラリの作成が可能になる。変異体ポリペプチドをコードする核酸は一般的に、遺伝子ＩＩＩ蛋白又は遺伝子ＶＩＩＩ蛋白のようなウィルス被膜蛋白をコードする核酸に融合される。蛋白又はポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子ＩＩＩ蛋白の一部分をコードする核酸配列に融合されている１価のファージミドディスプレイが開発されている（Ｂａｓｓ，Ｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９（１９９０）；Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５（１９９１））。１価のファージミドディスプレイ系においては、遺伝子融合は低水準で発現され、そして野生型の遺伝子ＩＩＩ蛋白はもまた粒子の感染性が保持されるように発現される。ペプチドライブラリを作成し、そのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許において開示されている（例えば米国特許５，７２３，２８６、米国特許５，４３２，０１８、５，５８０，７１７ウィルス被膜蛋白をコードする核酸、例えば５，４２７，９０８及び米国特許５，４９８，５３０）。
【０１９３】
抗体又は抗原結合ポリペプチドのライブラリは無作為ＤＮＡ配列の挿入による単一遺伝子の改変によるか、又は、関連遺伝子のファミリーのクローニングによるなど、多くの方法において作成されている。ファージ（ミド）ディスプレイを用いて抗体又は抗原結合フラグメントをディスプレイするための方法は米国特許５，７５０，３７３、５，７３３，７４３、５，８３７，２４２、５，９６９，１０８、６，１７２，１９７、５，５８０，７１７及び５，６５８，７２７に記載されている。次に所望の特性を有する抗体又は抗原結合蛋白の発現があるか、ライブラリをスクリーニングする。
【０１９４】
鋳型核酸内に選択されたアミノ酸を置換させる方法は当該分野で確立されており、その一部は本明細書に記載するとおりである。例えば、超可変領域残基はＫｕｎｋｅｌ法を用いて置換することができる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）を参照できる。
【０１９５】
オリゴヌクレオチドの配列は改変すべき超可変領域残基に対して設計されたコドンセット１つ以上を包含する。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするために使用される種々のヌクレオチドトリプレット配列のセットである。コドンセットは、ＩＵＢコードに従って以下に示す通り、特定のヌクレオチド又はヌクレオチドの等モル混合物を指定する文字を用いて表示することができる。
【０１９６】
（ＩＵＢコード）
Ｇ  グアニン
Ａ  アデニン
Ｔ  チミン
Ｃ  シトシン
Ｒ（Ａ又はＧ）
Ｙ（Ｃ又はＴ）
Ｍ（Ａ又はＣ）
Ｋ（Ｇ又はＴ）
Ｓ（Ｃ又はＧ）
Ｗ（Ａ又はＴ）
Ｈ（Ａ又はＣ又はＴ）
Ｂ（Ｃ又はＧ又はＴ）
Ｖ（Ａ又はＣ又はＧ）
Ｄ（Ａ又はＧ又はＴ）Ｈ
Ｎ（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）。
【０１９７】
例えば、コドンセットＤＶＫにおいて、ＤはアヌクレオチドＡ又はＧ又はＴであることができ；ＶはＡ又はＧ又はＣであることができ；そしてＫはＧ又はＴであることができる。このコドンセットは１８種の異なるコドンを示すことができ、そしてアミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ及びＣｙｓをコードすることができる。
【０１９８】
オリゴヌクレオチド又はプライマーセットは標準的な方法を用いて合成できる。あるセットのオリゴヌクレオチドは例えばコドンセットにより与えられる全ての可能な組み合わせのヌクレオチドトリプレットを示し、そしてアミノ酸の所望のグループをコードする配列を含有する固相合成により合成することができる。特定の位置において選択されたヌクレオチド「縮重度」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当該分野でよく知られている。特定のコドンセットを有するヌクレオチドのこのようなセットは市販の核酸合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能）を用いて合成することができるか、又は、市販品を購入できる（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤより入手）。従って、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは典型的には異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを包含し、その差異は全体的配列内のコドンセットにより確立される。オリゴヌクレオチドは、本発明に従って使用する場合は、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、そしてクローニング目的のための制限酵素部位を包含することもできる。
【０１９９】
１つの方法においては、変異体アミノ酸をコードする核酸配列はオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発により作成できる。この手法はＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５０４（１９８７）に記載されている通り当該分野でよく知られている。慨すれば、ＤＮＡ鋳型に所望のコドンセットをコードするオリゴヌクレオチドセットをハイブリダイズさせることにより変異体アミノ酸をコードする核酸配列を作成し、個々で、鋳型は可変領域核酸鋳型配列を含有するプラスミドの１本鎖形態である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込むことになり、そしてオリゴヌクレオチドセットにより提供されるコドンセットを含有することになる鋳型の完全な第２の相補鎖を合成する。
【０２００】
一般的に少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用する。旨適オリゴヌクレオチドは突然変異のためのコーディングヌクレオチドの何れかの側面上の鋳型に完全に相補的である１２〜１５ヌクレオチドを有する。これによりオリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは例えばＣｒｅａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：５７６５（１９７８）に記載のもののような当該分野で知られた手法を用いて容易に合成される。
【０２０１】
ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販品のＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９ベクターが適している）から誘導されるベクター、又は、Ｖｉｅｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：３（１９８７）により記載されている複製の１本鎖ファージ起点を含有するベクターにより生成される。即ち、突然変異すべきＤＮＡをこれらのベクターの１つに挿入することにより１本鎖鋳型を作成することができる。１本鎖鋳型の製造は上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【０２０２】
ネイティブのＤＮＡ配列を改変するためには、オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条件化に１本鎖鋳型にハイブリダイズさせる。ＤＮＡ重合酵素、通常はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを次に添加することにより、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いながら鋳型の相補鎖を合成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖が遺伝子１の突然変異した型をコードし、そして他方の鎖（元の鋳型）が遺伝子１のネイティブの未改変の配列をコードするようなヘテロ２本鎖分子が形成される。次にこのヘテロ２本鎖分子を適当な宿主細胞、通常は原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１内に形質転換する。細胞を成育させた後、それらをアガロースプレートにプレーティングし、３２−ホスフェートで放射標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングすることにより突然変異したＤＮＡを含有する細菌コロニーを発見する。
【０２０３】
上記した方法はプラスミドの両方の鎖が突然変異を含有するホモ２本鎖分子が形成されるように修飾してよい。修飾は以下の通り行う。１本鎖オリゴヌクレオチドを上記した通り１本鎖鋳型にアニーリングする。３種のデオキシリボヌクレオチド、即ちデオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）をｄＣＴＰ−（ａＳ）と称される修飾チオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）と組み合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異下塩基以外は鋳型と同一のＮＤＡ鎖が形成される。更に又、ＤＮＡのこの新しい鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含有しており、このため、制限エンドヌクレアーゼによる消化から保護される。２本鎖のヘテロ２本鎖の鋳型鎖が適切な制限酵素でニック処理された後、鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ又は他の適切なヌクレアーゼにより、突然変異誘発すべき部位を含有する領域を過ぎた部分で消化することができる。次に反応を停止して部分的に飲み１本鎖となった分子を得る。次に４種全てのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、ＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼの存在下ＤＮＡポリメラーゼを用いて完全な２本鎖のＤＮＡホモ２本鎖を形成する。このホモ２本鎖分子を次に適当な宿主細胞に形質転換する。
【０２０４】
上記した通り、オリゴヌクレオチドセットの配列は鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さのものであり、そして又、必然ではないが、制限部位を含有してよい。ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクターから誘導されるベクター、又は、Ｖｉｅｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：３（１９８７）により記載されている複製の１本鎖ファージ起点を含有するベクターにより生成される。即ち、突然変異すべきＤＮＡをこれらのベクターの１つに挿入することにより１本鎖鋳型を作成することができる。１本鎖鋳型の製造は上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【０２０５】
別の方法によれば、ライブラリは各々のセットが異なる配列のオリゴヌクレオチドの複数を有する、上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットを与えることにより形成することができ、異なる配列はオリゴヌクレオチドの配列内に与えられるコドンセットにより確立される。可変ドメイン鋳型核酸配列に沿った上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットをポリメラーゼ連鎖反応において使用することによりＰＣＲ産物の「ライブラリ」を形成することができる。ＰＣＲ産物は、それらが確立された分子生物学の技術を用いて他の関連又は未関連の核酸配列、例えばウィルス被膜蛋白及び２量体化ドメインと融合できることから、「核酸カセット」と称することができる。
【０２０６】
ＰＣＲプライマーの配列は超可変領域内の溶媒接触可能な高度に多様な位置に対して設計されたコドンセット１つ以上を包含する。上記した通り、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチドトリプレット配列のセットである。
【０２０７】
適切なスクリーニング／選択工程を介して選択された所望の基準に合致する抗体のセレクタントは、標準的な組み換え手法を用いて単離し、そしてクローニングすることができる。
【０２０８】
（ベクター、宿主細胞及び組み換え方法）
本発明の抗体の組み換え製造のためには、それをコードする核酸を単離し、そして複製可能なベクターに挿入してその後のクローニング（ＤＮＡの増幅）に付すか、又は、発現に付す。抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法（例えば抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる等）を用いながら容易に単離して配列決定される。多くのベクターが使用可能である。ベクターの選択は部分的には使用する宿主細胞による。一般的に、好ましい宿主細胞は原核生物又は真核生物（一般的に哺乳類）起源の何れかのものである。
【０２０９】
（原核生物の宿主細胞を用いた抗体の作成）
（ベクターの構築）
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は標準的な組み換え手法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ細胞のような抗体生産細胞から所望のポリヌクレオチド配列を単離して配列決定する。或いは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成装置又はＰＣＲ手法を用いて合成することができる。得られた後、ポリペプチドをコードする配列を原核生物宿主内で複製し、非相同ポリヌクレオチドを発現することができる組み換えベクター内に挿入する。当該分野で入手可能であり知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用できる。適切なベクターの選択はベクターに挿入すべき核酸の大きさ、及び、ベクターで形質転換すべき特定の宿主細胞により主に決定されることになる。各ベクターは、その機能（非相同ポリヌクレオチドの増幅又は発現又は両方）及びそれが入る特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、種々の成分を含有する。ベクター成分は一般的に、例えば複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、非相同核酸インサート及び転写終止配列を包含する。
【０２１０】
一般的にレプリコン及び宿主細胞と適合する種から誘導される制御配列を含有するベクターをその宿主と組み合わせて使用する。ベクターは通常は複製部位、並びに、形質転換された細胞における表現型選択をもたらすことができるマーキング配列を担持している。例えばＥ．ｃｏｌｉは典型的にはＥ．ｃｏｌｉ種から誘導されるプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有しており、従って、形質転換された細胞を発見するための簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージはまた、内因性蛋白の発現のために微生物により使用されることができるプロモーターを含有するか、含有するように修飾されていてよい。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はＣａｒｔｅｒ等の米国特許５，６４８，２３７に詳細に記載されている。
【０２１１】
更に又、レプリコン及び宿主微生物と適合する制御配列を含有するファージベクターをそれらの宿主と組み合わせて形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．−１１のようなバクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２のような感受性宿主細胞を形質転換するために使用できる組み換えベクターを作成するときに利用してよい。
【０２１２】
本発明の発現ベクターはポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含んでよい。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する未翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは典型的には２つのクラス、即ち誘導及び構成プロモーターに属する。誘導プロモーターは例えば栄養の有無又は温度変化のような培養条件の変化に応答してその制御下にシストロンの転写の増大した水準を開始するプロモーターである。
【０２１３】
種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介して原料ＤＮＡからプロモーターを取り出すこと、及び、本発明のベクター内への単離されたプロモーター配列を挿入することにより、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。ネイティブのプロモーター配列及び多くの非相同のプロモーターの両方が標的遺伝子の直接の増幅及び／又は発現を指向するために使用してよい。一部の実施形態においては、非相同のプロモーターは、ネイティブ標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的により高値の転写および発現された標的遺伝子のより高値の収率を可能にすることから、これらが利用されている。
【０２１４】
原核生物を用いる場合の使用に適するプロモーターはＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターを包含する。しかしながら、細菌内で機能する他のプロモーター（例えば他の既知の細菌又はファージのプロモーター）が同様に適している。そのヌクレオチド配列は公開されており、これにより当業者であればそれらを、何れかの必要な制限部位を供給するためにリンカー又はアダプターを用いながら標的の軽鎖及び重鎖（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）をコードするシストロンに作動可能にライゲーションすることが可能である。
【０２１５】
本発明の１つの特徴において、組み換えベクター内の各シストロンは膜を通過する発現されたポリペプチドの転座を指向する分泌シグナル配列成分を含む。一般的にシグナル配列はベクターの成分であってよく、又は、ベクター内に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの部分であってよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞により認識されプロセシングされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）もので無ければならない。非相同ポリペプチドに対してネイティブであるシグナルペプチドを認識又はプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合は、シグナル配列は例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は熱安定性エンテロロキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群より選択される原核生物シグナル配列により置換される。本発明の１つの実施形態において、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０２１６】
別の特徴においては、本発明の免疫グロブリンの製造は宿主細胞の原形質内において起こることができ、従って各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点に監視、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は原形質内において発現され、折り畳まれ、そして組み立てられて機能的免疫グロブリンを形成する。特定の宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ系統）はジスルフィド結合の形成に好都合な原形質条件を提供し、これにより、発現された蛋白サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０２１７】
本発明は、分泌され適切に組み立てられた本発明の抗体の収率を最大限にするために発現されたポリペプチド成分の定量的比を調節する発現系を提供する。そのような調節は少なくとも一部的にはポリペプチド成分に関する翻訳強度を同時に調節することにより達成される。
【０２１８】
翻訳強度を調節するための１つの手法はＳｉｍｍｏｎｓ等の米国特許５，８４０，５２３に開示されている。それはシストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。あるＴＩＲに関して、一連のアミノ酸又は核酸配列変異体をある範囲の翻訳強度で作成することができ、特定の鎖の所望の発現水準のためにこの因子を調節する好都合な手段が提供される。ＴＩＲ変異体は、ヌクレオチド配列のサイレントな変化が好ましいものの、アミノ酸配列を改変する可能性があるコドンの変化をもたらす従来の突然変異誘発手法により作成することができる。ＴＩＲの改変は例えばＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の数又は間隔の改変、並びに、シグナル配列の改変を包含する。突然変異体シグナル配列を形成するための１つの方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させないコーディング配列の始点における「コドンバック」の形成である（即ち変化はサイレントである）。これは各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができ；更に又、一部のアミノ酸、例えばロイシン、セリン及びアルギニンは、データバンク作成に複雑性を与えることができる複数の第１及び第２の位置を有する。この突然変異誘発方法はＹａｎｓｕｒａら、（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｃｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳細に記載されている。
【０２１９】
好ましくは、ベクターのセットを、そこに含まれる各シストロンに対してある範囲のＴＩＲ強度となるように形成する。この限定されたセットは、各鎖の発現水準の比較並びに種々のＴＩＲ強度の組み合わせの下の所望の抗体産物の収量をもたらす。ＴＩＲ強度はＳｉｍｍｏｎｓ等の米国特許５，８４０，５２３に詳細に記載されている通り、受容体遺伝子の発現水準を定量することにより測定できる。翻訳強度比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲを選択して本発明の発現ベクターコンストラクトと組み合わせる。
【０２２０】
本発明の抗体を発現するために適する原核生物宿主細胞は例えばグラム陰性又はグラム陽性の生物のような原始細菌及び真正細菌を包含する。有用な細菌の例はエシェリシア
（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、バチルス（例えばＢ・サブチルス）、腸内細菌、シュードモナス種（例えばＰ・アエルギノーサ）、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルクレブシエラ、プロテウス、シゲラ、リゾビア、ビトレオシラ又はパラコッカスを包含する。１つの実施形態において、グラム陰性菌体を使用する。１つの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ菌体を本発明の宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の例は、菌株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体、例えば遺伝子型Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ｌａｃＩｑｌａｃＬ８ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ｋａｎＲを有する菌株３３Ｄ３を包含する（米国特許５，６３９，６３５）。他の菌株及びその誘導体、例えばＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉλ１７７１（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）もまた適している。これらの例は例示的なものであり、限定するものではない。所定の遺伝子型を有する上記した細菌の何れかの誘導体を構築するための方法は当該分野で知られており、そして例えばＢａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。細菌の菌体内のレプリコンの複製能力を考慮しながら適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチア又はサルモネラ種はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを用いてレプリコンを供給する場合には、宿主として使用するのに適している。典型的には、宿主細胞は最小量の蛋白分解酵素を分泌しなければならず、そして細胞培養物には追加的なプロテアーゼ阻害剤を配合することが望ましい。
【０２２１】
（抗体の製造）
宿主細胞は上記した発現ベクターで形質転換し、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜調整された従来の栄養培地中で培養する。
【０２２２】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、又は、染色体組込物により複製可能であるように厳格細胞の宿主内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適する標準的な手法を用いて行う。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は一般的にはかなりの細胞壁バリアを含有する細菌細胞に対して使用されている。形質転換の別の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。更に別の手法はエレクトロポレーションである。
【０２２３】
本発明のポリペプチドを製造するために使用する原核生物の細胞は当該分野で知られ、そして選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成育させる。適当な培地の例はルリア培地（ＬＢ）＋必要な栄養補給物である。一部の実施形態においては、培地は又発現ベクターを含有する原核生物の細胞の成育を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選ばれた選択物質を含有してよい。例えば、アンピシリンをアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成育のための培地に添加してよい。
【０２２４】
炭素、窒素及び無機物リン酸塩の補給源に加えて何れかの必要な補給物も単独で導入するか、又は他の補給物又は培地との混合物として、例えば複合窒素源として、適切な濃度において含んでよい。場合により、培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール及びジチオスレイトールからなる群より選択される１つ以上の還元剤を含有してよい。
【０２２５】
原核生物宿主細胞は適当な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉの生育のためには、例えば好ましい温度は約２０℃〜約３９℃の範囲、より好ましくは約２５℃〜約３７℃、更に好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは主に宿主生物に応じて約５〜約９の範囲である。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ｐＨは好ましくは約６．８〜約７．４、更に好ましくは約７．０である。
【０２２６】
誘導プロモーターを本発明の発現ベクター中において使用する場合、蛋白の発現はプロモーターの活性化に適する条件下に誘導する。本発明の１つの特徴において、ＰｈｏＡプロモーターをポリペプチドの転写を制御するために使用する。従って、形質転換された宿主細胞は導入のためのホスフェート制限培地中で培養する。好ましくは、ホスフェート制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えばＳｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７参照）。種々の他のインデューサーも当該分野で知られる通り、使用されるベクターコンストラクトに応じて使用してよい。
【０２２７】
１つの実施形態において、本発明の発現されたポリペプチドは宿主細胞のペリプラズム内に分泌させ、それより回収する。蛋白の回収では、典型的には細胞の破壊を、一般的には浸透圧ショック、超音波又は細部溶解のような手段により行う。細胞が破壊された後に細胞の破砕物又は全細胞を遠心分離又は濾過により分離してよい。蛋白は例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより更に精製してよい。或いは、蛋白を培地中に移しそこで単離することもできる。生成した蛋白を更に精製するために、細胞を培地から除去し、培養上澄みを濾過し、濃縮してよい。発現されたポリペプチドは更に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットのような一般的に知られた方法を用いて単離及び同定することができる。
【０２２８】
本発明の１つの特徴において、抗体の製造は醗酵法により大量に実施される。種々の大規模供給バッチ醗酵賞作法が組み換え蛋白の製造のために使用できる。大規模醗酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの醗酵器は酸素と栄養物、特にグルコース（好ましい炭素原子／エネルギー源）を分散させるために攪拌羽根車を使用する。小規模醗酵とは一般的に約１００リットル以下の容量であり、約１リットル〜約１００リットルの範囲であることができる醗酵器内の醗酵を指す。
【０２２９】
醗酵過程においては、蛋白発現の誘導は典型的には細胞が所望の密度、例えば細胞が早期定常期である約１８０〜２２０のＯＤ５５０となるまで適当な条件下に生育させた後に開始する。当該分野で知られる通り、そして、上記した通り、使用されるベクターコンストラクトに応じて種々のインデューサーを使用してよい。細胞は誘導の前に短時間生育させてよい。細胞は通常は約１２〜５０時間誘導するが、より長時間又は短時間も使用してよい。
【０２３０】
本発明のポリペプチドの製造収率及び品質を向上させるためには、種々の醗酵条件を変更できる。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な組み立て及び折り畳みを向上させるためには、追加的なベクター過剰発現シャペロン蛋白、例えばＤｓｂ蛋白（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペピチジルプロピルシストランス−イソメラーゼ）を使用して宿主原核生物細胞を同時形質転換することができる。シャペロン蛋白は宿主細胞内で生産された非相同蛋白の適切な折り畳み及び溶解性を促進することがわかっている。Ｃｈｅｎら、（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許６，０８３，７１５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許６，０２７，８８８；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅら、（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０２３１】
発現された非相同蛋白（特に蛋白分解的に感受性であるもの）の蛋白分解を最小限にするためには、蛋白分解酵素に関して欠損である特定の宿主系統を本発明のために使用できる。例えば、宿主細胞株はプロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組み合わせのような知られた細菌性プロテアーゼをコードする遺伝子内で遺伝子突然変異が起こるように修飾してよい。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損の系統が使用可能であり、例えばＪｏｌｙら、（１９９８）、上出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許５，２６４，３６５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許５，５０８，１９２；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０２３２】
１つの実施形態において、蛋白分解酵素について欠損であり、そしてシャペロン蛋白１つ以上を過剰発現するプラスミドで形質転換されているＥ．ｃｏｌｉ菌株が本発明の発現系における宿主細胞として使用される。
【０２３３】
（抗体の精製）
１つの実施形態においては、本発明において製造された抗体蛋白を更に精製してその後の試験及び使用のためにかなり均質とされた調製物を得る。当該分野で知られた標準的な蛋白精製方法を使用することができる。以下の操作法、即ち、免疫アフィニティー又はイオン交換カラム上の分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＣＬ、シリカゲル上又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過等が精製操作法の例である。
【０２３４】
１つの特徴において、固相上に固定化されたプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用する。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高親和性で結合するスタフィロコッカス・アウレウス由来の４１ｋＤの細胞壁蛋白である。Ｌｉｎｄｍａｒｋら、（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡを固定化する固相は好ましくはガラス又はシリカの表面を含むカラム、より好ましくは制御された細孔を有するガラスカラム又はケイ酸カラムである。一部の適用例においては、カラムは、夾雑物の非特異的結合を防止するために、試薬、例えばグリセロールでコーティングされている。
【０２３５】
精製の第１工程として、上記した細胞培養物から誘導された調製物をプロテインＡ固定化固相上に適用し、プロテインＡへの目的の抗体の特異的結合を行う。次に固相を洗浄して固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に溶出により固相から目的の抗体を回収する。
【０２３６】
（真核生物宿主細胞を用いた抗体の作成）
ベクター成分は限定的ではないが一般的にはシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子１つ以上、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終止配列の１つ以上を含む。
【０２３７】
（ｉ）シグナル配列成分
真核細胞宿主細胞において使用するためのベクターもまた目的の成熟蛋白又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドを含有してよい。好ましく選択される非相同のシグナル配列は宿主細胞により認識されプロセシングされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳類細胞発現においては、哺乳類シグナル配列、並びに、ウィルス分泌リーダー、例えば単純疱疹ｇＤシグナルが使用できる。
【０２３８】
このような前駆体領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに読み枠内でライゲーションされる。
【０２３９】
（ｉｉ）複製起点
一般的に複製起点成分は哺乳類発現ベクターには必要ではない。例えばＳＶ４０起点は典型的には、それが早期プロモーターを含有しているためにのみ使用してよい。
【０２４０】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは選択遺伝子、即ち選択可能なマーカーとも称されるものを含有してよい。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するか（ｂ）該当する場合は栄養要求性欠損を補充するか、又は（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養を補給する蛋白をコードする。
【０２４１】
選択スキームの一例は宿主細胞の生育を停止させる薬剤を利用する。非相同遺伝子で良好に形質転換された細胞は薬剤耐性を付与する蛋白を生産し、そしてこのため、選択環境において生存することができる。このような優性選択の例は薬剤ネオマイシン、マイコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０２４２】
哺乳類細胞に対する適当な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンカルボキシラーゼ等のような、抗体核酸を取り込む能力を有する細胞の発見を可能にするものである。
【０２４３】
例えばＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培地中で全形質転換体を培養することによりまず発見される。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である（例えばＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）。
【０２４４】
或いは、抗体、野生型ＤＨＦＲ蛋白及び他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）はアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８のような選択可能なマーカーに関する選択剤を含有する培地中における細胞生育により選択できる。米国特許４，９６５，１９９を参照。
【０２４５】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物により認識されるプロモーターを含有しそして抗体ポリペプチド核酸に作動可能に連結している。プロモーター配列は真核生物について知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子が転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に存在する別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、個々でＮは何れかのヌクレオチドである。大部分の真核生物遺伝子の３’末端は、コーディング配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに挿入するのに適する。
【０２４６】
哺乳類宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから、非相同哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより、これらのプロモーターが宿主細胞系と適合する限りにおいて、制御される。
【０２４７】
ＳＶ４０ウィルスの早期及び後期プロモーターは、好都合には、複製のＳＶ４０ウィルス起点を同様に含有するＳＶ４０制限フラグメントとして得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは好都合にはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして得られる。ベクターとしてウシパピローマウィルスを使用する哺乳類宿主内でＤＮＡを発現するための系は米国特許４，４１９，４４６に開示されている。この系の修飾は米国特許４，６０１，９７８に記載されている。更に又、単純疱疹ウィルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下のマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照できる。或いは、ラウス肉腫ウィルス長末端リピートをプロモーターとして使用できる。
【０２４８】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより増大する場合が多い。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら典型的には真核細胞ウィルス由来のエンハンサーを使用することにある。例示されるものは複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及び、アデノウィルスエンハンサーを包含する。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関してはＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照できる。エンハンサーは抗体−ポリペプチドをコードする配列に対して５’又は３’側の位置においてベクター内にスプライシングしてよいが、好ましくはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０２４９】
（ｖｉ）転写終止成分
真核生物宿主細胞内で使用される発現ベクターは典型的には転写の終止のため、及び、ｍＲＮＡの安定化のために必要な配列も含有する。このような配列は真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの一般的には５’側、そして場合により３’側の未翻訳領域が得られる。これらの領域は抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終止成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示されている発現ベクターを参照できる。
【０２５０】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ベクター内でＤＮＡをクローニング又は発現するための適当な宿主細胞はここでは本明細書に記載した高等真核生物の細胞、例えば脊椎動物の宿主細胞を包含する。培養物（組織培養）中の脊椎動物の細胞の増殖は類型的な操作法になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例はＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓系統（２９３又は懸濁培養物中での生育のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｎｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、モンキー腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ科腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０２５１】
宿主細胞は抗体製造のための上記した発現又はクローニングベクターで形質転換氏、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養する。
【０２５２】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を製造するために使用する宿主細胞は種々の培地中で培養してよい。Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地が宿主細胞を培養するために適している。更に又Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；又は５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；又は米国特許Ｒｅ．３０，９８５に記載の培地の何れも宿主細胞のための培地として使用してよい。これらの培地の何れも必要に応じてホルモン類及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン又は表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、干渉物質（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗体（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ剤）、微量元素（マイクロモル範囲の終濃度で通常存在する無機の化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源を補給してよい。何れかの他の必要な補給物もまた当業者の知るとおり適切な濃度で含有させてよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用したものであり、そして当業者には容易に想到されるものである。
【０２５３】
（ｉｘ）抗体の精製
組み換え手法を用いる場合、抗体は細胞内に生産させるか、又は、培地に直接分泌させることができる。抗体が細胞内に生産される場合は、第１工程年、宿主細胞又は溶菌破断物である粒状の破砕物を例えば遠心分離又は限外濾過により除去する。抗体を培地に分泌させる場合は、そのような発現系の上澄みを一般的にはまず市販の蛋白濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを上記工程の何れかにおいて使用することにより蛋白分解を阻害してよく、そして、抗生物質を添加して偶発的な夾雑菌の生育を防止してよい。
【０２５４】
細胞から調製された抗体組成物は例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、ここではアフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの妥当性は抗体内に存在する何れかの免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプによるものである。プロテインＡはヒトγ１、γ２又はγ４の重鎖に基づく抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５；１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドを結合させるマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも使用できる。機械的に安定なマトリックス、例えば制御された細孔を有するガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンはアガロースで達成できるものよりも早い流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製のために適している。蛋白精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上の分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＣＬ、シリカゲル上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上のクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈降法もまた回収すべき抗体に応じて使用される。
【０２５５】
何れかの予備的精製工程の後、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、好ましくは低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍ塩）において実施される約２．５〜４．５のｐＨの溶出を用いた低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに付す。
【０２５６】
（活性試験）
本発明の抗体は当該分野で知られた種々の試験により、その物理的／化学的特性及び生物学的機能について特性化することができる。
【０２５７】
精製された免疫グロブリンは更に、一連の試験、例えばＮ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズエクスクルージョン高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量スペクトル分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化により特性化することができる。
【０２５８】
本発明の特定の実施形態においては、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。一部の実施形態においては、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、本発明において使用できる抗原結合試験の例は、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降試験、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイのような手法をもちいた何れかの直接又は競合的な結合試験を包含する。例示される抗原結合試験は実施例のセクションにおいて後述する。
【０２５９】
１つの実施形態において、本発明は一部ではあるが全てではないエフェクター機能を保有する改変された抗体を意図しており、これにより、インビボの抗体の半減期が重要であるが、なお特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）は不必要であるか有害であるような多くの適用のための望ましい候補となっている。特定の実施形態においては、所望の特性のみが維持されていることを確実にするため、生産された免疫グロブリンのＦｃ活性を測定する。インビトロ及び／又はインビボの細胞毒性試験を実施することによりＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合試験を実施することにより抗体がＦｃγＲ結合を欠失している（従ってＡＤＣＣ活性も欠失していると考えられる）がＦｃＲｎ結合能力は保持していることを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに大使、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページ上の表３に総括されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロの試験の例は米国特許５，５００，３６２又は５，８２１，３３７に記載されている。このような試験のための有用なエフェクター細胞は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。或いは、或いは追加的に、目的分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、例えばＣｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９８８）に開示されているもののような動物モデル中で評価してよい。Ｃｌｑ結合試験もまた抗体がＣｌｑに結合することができない、即ちＣＤＣ活性を欠失していることを確認するために実施してよい。補体活性化を評価するためには、例えばＣａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているＣＤＣ試験を実施してよい。ＦｃＲｎ結合及びインビボのクリアランス／半減期の測定は例えば実施例のセクションに記載するような当該分野で知られた方法を用いて実施することができる。
【０２６０】
（ヒト化抗体）
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当該分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は非ヒトである原料からそこに導入されたアミノ酸残基１つ以上を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は頻繁には「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインに由来する。ヒト化は本質的にはヒト抗体の相当する配列の超可変領域配列を置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ等の方法に従って実施することができる（Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って実施することができる。従ってそのような「ヒト化」抗体は、未損傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種の相当する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許４，８１６，５６７）である。実際、ヒト化抗体は典型的には、一部の超可変領域残基及びおそらくは一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似の部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
【０２６１】
ヒト化抗体の作成において使用すべき軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性を低減するためには極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従えば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次にげっ歯類のものに最も近かったヒト配列がヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして許容される（Ｓｉｍｓら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１）。別の方法は軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から誘導した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に対して使用してよい（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
【０２６２】
抗原に対する高い親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化させることが更に重要である。この目標を達成するためには、１つの方法によれば、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いながら、ヒト化抗体を製造する。三次元の免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者のよく知るものである。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元コンホーメーション構造を説明してディスプレイするコンピュータープログラムがしようできる。これらのディスプレイを精査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、即ち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を選択肢、レシピエント及びインポート配列から、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特性が達成されるように組み合わせることができる。一般的に超可変領域残基は、抗原結合への影響においては直接、そして最も大きく関与している。
【０２６３】
（抗体変異体）
１つの特徴において、本発明はＦｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面において修飾を含む抗体フラグメントを提供し、その場合、修飾はヘテロ２量体化を刺激及び／又は促進する。これらの修飾は第１のＦｃポリペプチドへの隆起部及び第２のＦｃポリペプチドへの陥没部の導入を含み、ここで隆起部は陥没部に位置付けすることが可能であり、これにより第１及び第２のＦｃポリペプチドの複合体形成が促進される。これらの修飾を有する抗体の形成方法は当該分野で知られており、例えば米国特許５，７３１，１６８に記載されている。
【０２６４】
一部の実施形態においては、本明細書に記載した抗体のアミノ酸配列の修飾が意図される。例えば抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望まれる場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は抗体核酸に適切なヌクレオチドの変化を導入することによるか、又は、ペプチド合成により製造される。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を包含する。欠失、挿入及び置換の何れかの組み合わせが最終コンストラクトに到達するまで行ってよいが、ただし最終コンストラクトは所望の特性を保有しなければならない。アミノ酸の改変は配列が作成される時点で被験体となる抗体のアミノ酸配列に導入してよい。
【０２６５】
突然変異誘発のために好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の発見のための有用な方法はＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載される通り「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称される。ここでは、残基又は標的残基の群を発見（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｎのような荷電残基）し、そして中性又は逆に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置き換えることにより抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与える。次に置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置を、置換の位置において、又はそのための、追加的又は別の変異体を導入することにより精査する。即ち、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されるが、突然変異そのものの性質は予め決定されなくてよい。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するためには、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域において実施し、そして発現された免疫グロブリンで所望の活性を有するものをスクリーニングする。
【０２６６】
アミノ酸配列の挿入は、１残基〜１００以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシ末端の融合、並びに、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内の挿入を包含する。末端挿入の例はＮ末端メチオニル残基を有する抗体又は細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体を包含する。抗体分子の他の挿入による変異体は、血清中の抗体の半減期を増大させる酵素（例えばＡＤＥＰＴ）又はポリペプチドに対する抗体のＮ又はＣ末端への融合を包含する。
【０２６７】
変異体の別の型はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は異なる残基で置き換えられた抗体分子内のアミノ酸残基少なくとも１つを有する。置換突然変異誘発の最大の関心部位は超可変領域を包含するが、ＦＲ改変もまた意図される。保存的な置換は「好ましい置換」と題して表２に示すものである。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合は、表２において「例示される置換」と命名されたもの、又はアミノ酸のクラスに関して後述するような、より実質的な変化を導入して産物をスクリーニングしてよい。
【０２６８】
【表２】
2008512382.tif 000031
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は（ａ）例えばシート又はらせん状のコンホーメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチドの骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は、（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するその作用において有意に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸はその側鎖の特性における同様性に従って、下記の通りグループ分けしてよい（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）未荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｅ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０２６９】
或いは、天然に存在する残基を共通側鎖の特性に基づいて、下記の通りグループ分けしてよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２７０】
非保存的置換はこれらのクラスの一方のメンバーを別のクラスと交換することを包含する。このように置換された残基はまた保存的置換の部位内に、より好ましくは残余（非保存）部位内に導入されてもよい。
【０２７１】
置換変異体の１つの型では、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の超可変領域残基の１つ以上が置換される。一般的に、得られた変異体でその後の開発のために選択されるものはそれらが形成される元となった親抗体と相対比較して向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換変異体を形成するための好都合な方法では、ファージディスプレイを用いたアフィニティー成熟化を行う。慨すれば、幾つかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を形成する。このようにして形成された抗体を、フィラメントファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイする。ファージディスプレイされた変異体を次に、本明細書に開示したその生物学的活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。修飾に関する候補超可変領域部位を発見するためには、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施することにより抗原結合に大きく寄与している超可変領域残基を発見することができる。或いは、又は追加的に、抗体と抗原の間の接触店を発見するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益である場合がある。このような接触残基及び近隣の残基は本発明において考案した手法により置換のための候補である。このような変異体を形成した後、変異体のパネルを本明細書に記載するとおりスクリーニングに付し、そして該当する試験１つ以上において優れた特性を有していた抗体を選択してその後の開発に付す。
【０２７２】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られた種々の方法により製造される。これらの方法は、例えば天然原料（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又は、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及び以前に作成された抗体変異体又は非変異体型のカセット突然変異誘発による作成を包含する。
【０２７３】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内にアミノ酸修飾１つ以上を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を形成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体はヒンジシステインを包含するアミノ酸位置１つ以上においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでよい。
【０２７４】
本明細書の記載及び当該分野の教示に従って、一部の実施形態においては、本発明の方法で使用する抗体は例えばＦｃ領域において野生型の対応する抗体と比較して改変１つ以上を含んでよいことを意図している。これらの抗体はしかしなお、その対応野生型と比較して治療利用性のために必要な実質的に同じ特性を保持している。例えば改変された（即ち向上した、又は低減した）Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存細胞毒性）（ＣＤＣ）をもたらすように、例えばＷＯ９９／５１６４２に記載する通り、特定の改変をＦｃ領域において行うことができる。同様にＦｃ領域変異体の別の例に関わるＤｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許５，６４８，２６０；米国特許５，６２４，８２１；及びＷＯ９４／２９３５１も参照できる。
【０２７５】
（免疫コンジュゲート）
本発明はまた細胞毒性剤、例えば化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）又は放射性同位体（例えば放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
【０２７６】
細胞毒性又は細胞生育阻害性の薬剤、即ち癌治療において腫瘍細胞を殺傷する薬剤（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許４，９７５，２７８）の局所送達のための抗体−薬剤コンジュゲートの使用は、理論的には、腫瘍への薬剤部分のターゲティングされた送達及びそこにおける細胞内蓄積を可能にし、その場合、これらのコンジュゲート薬剤の全身投与は正常細胞並びに排除しようとする腫瘍細胞に許容できない水準の毒性をもたらす可能性がある（Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら、（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。このため最小限の毒性で最大の薬効とすることが求められている。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はともにこれらの方策において有用であることが報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法において使用されている薬剤はダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセート及びビンデシンである（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）上出）。抗体−毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素は細菌性毒素、例えばジフテリア毒素、植物性毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら、（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら、（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら、（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３）及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）を包含する。毒素は、チュブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を包含する機序によりその細胞毒性及び細胞増殖阻害作用を示す。一部の細胞毒性剤は大型の抗体又は蛋白の受容体リガンドにコンジュゲートされると不活性化されるか、活性が低下する傾向を示す。
【０２７７】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）はチオ尿素リンカーキレーターにより結合された正常及び悪性のＢリンパ球の表面上に存在するＣＤ２０抗原に対して指向されたマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体と１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体よりなる抗体−放射性同位体コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎら、（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７；Ｗｉｓｅｍａｎら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２；Ｗｉｔｚｉｇら、（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３；Ｗｉｔｚｉｇら、（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＲＩＮはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与により重度及び長期間の血球減少症が大部分の患者において起こる。カリケアマイシンに連結されたｈｕＣＤ３３抗体よりなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＹＬＯＴＡＲＧＴＭ（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は注射による急性骨髄性白血病の治療のために２０００年に認可されている（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許４９７０１９８；５０７９２３３；５５８５０８９；５６０６０４０；５６９３７６２；５７３９１１６；５７６７２８５；５７７３００１）。マイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１にジスルフィドリンカーＳＰＰを介して連結されたｈｕＣ２４２抗体よりなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメトラシン（Ｉｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は結腸癌、膵臓癌、胃癌及びその他のようなＣａｎＡｇを発現する癌の治療のための第ＩＩ相治験段階に入っている。マイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１に連結された抗前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体よりなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は前立腺癌の潜在的治療のために開発中である。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びドラスタチンの合成類縁体はキメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のＬｅｗｉｓＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液悪性疾患上のＣＤ３０に特異的）（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１（７）：７７８−７８４；及びＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ら、（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２，１４５８−１４６５）にコンジュゲートされており、そして治療薬開発中である。薬剤コンジュゲート細胞毒性剤としての使用のための他の化合物は、例えばオーリスタチンＥ（ＡＥ）、ＭＭＡＦ（薬剤のＣ末端においてフェニルアラニンを有するオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変異体）及びＡＥＶＢ（オーリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン、ＡＥのＣ末端を介した酸不安定性のリンカー）を包含する。抗体に薬剤を結合させるための有用なコンジュゲートリンカーは例えばＭＣ（まれイミドカプロイル）、ＶａｌＣｉｔ（バリン−シトルリン、プロテアーゼ切断性リンカーにおけるジペプチド部位）、シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルカルバモイル、リンカーの「自己犠牲型」部分）、Ｍｅ（リンカーペプチド結合がカテプシンＢによりその切断を防止するように修飾されているＮ−メチル−バリンシトルリン）、ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ（抗体システインに結合したマレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）及びＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）を包含する。これら及び他の有用な薬剤コンジュゲート及びその製造は例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＤｏｒｏｎｉｎａ，Ｓ．Ｏ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：７７８−７９４（２００３）に開示されている。特に好ましいリンカー分子は例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えばＣａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば米国特許４，５６３，３０４参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えばＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（例えばＹｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５−３９９（１９７９）参照）及びＮ−スクシンイミジル４−メチル−４−［２−（５−ニトロピリジル）ジチオ］ペンタノエート（ＳＭＮＰ）（例えば米国特許４，５６３，３０４参照）を包含する。
【０２７８】
このような免疫コンジュゲートの形成において有用な化学療法剤は上記の通りである。使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  Ｆｏｒｄｉｉ蛋白、ジアンシン蛋白、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用できる。例は２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを包含する。抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性蛋白カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成される。例えば、リシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。
【０２７９】
抗体及び１つ以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテセン及びＣＣ１０６５及び毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体のコンジュゲートもまた本発明において意図している。
【０２８０】
（マイタンシン及びマイタンシノイド）
１つの実施形態において本発明の抗体（完全長又はフラグメント）は１つ以上のマイタンシノイド分子にコンジュゲートする。
【０２８１】
マイタンシノイドはチュブリン重合を阻害することにより機能する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは東アフリカの潅木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許３，８９６，１１１）。その後、特定の微生物もまたマイタンシノイド、例えばマイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステルを生産することが発見された（米国特許４，１５１，０４２）。合成のマイタンシノール及びその誘導体及び類縁体は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，１３７，２３０；４，２４８，８７０；４，２５６，７４６；４，２６０，６０８；４，２６５，８１４；４，２９４，７５７；４，３０７，０１６；４，３０８，２６８；  ４，３０８，２６９；４，３０９，４２８；４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３１７，８２１；４，３２２，３４８；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；４，３６４，８６６；４，４２４，２１９；４，４５０，２５４；４，３６２，６６３；および４，３７１，５３３に開示されている。
【０２８２】
（マイタンシノイド−抗体コンジュゲート）
その治療指数を向上させる試みにおいて、マイタンシン及びマイタンシノイドは腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされている。マイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びその治療用途は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，２０８，０２０、５，４１６，０６４及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）はヒト結腸直腸癌に対して指向されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結したＤＭ１と指名されたマイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対しては高度に細胞毒性であることがわかり、そしてインビボの腫瘍生育試験において抗腫瘍活性を示している。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）はヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７に、又は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体にジスルフィドリンカーを介してマイタンシノイドをコンジュゲートしている免疫コンジュゲートを記載している。ＴＡ．１−マイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性は細胞当たり３ｘ１０５ＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対してインビトロで試験されている。薬剤コンジュゲートは有利のマイタンシノイド薬剤と同様の細胞毒性の程度を達成しており、これは抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大させることができた。Ａ７−マイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいて低い全身細胞毒性を示した。
【０２８３】
（抗体−マイタンシノイドコンジュゲート（免疫コンジュゲート））
抗体マイタンシノイドコンジュゲートは抗体又はマイタンシノイド分子の何れかの生物学的活性を有意に低下させること無くマイタンシノイド分子に抗体を化学的に連結することにより製造する。抗体分子当たり平均３〜４個のマイタンシノイド分子をコンジュゲートすると抗体の機能又は溶解性に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞毒性を増強する場合に有効であることがわかっているが、１分子毒素／抗体であっても抗体単独の使用よりも細胞毒性を増強できることが期待される。マイタンシノイドは当該分野でよく知られており、そして知られた手法により合成するか、又は、天然原料から単離することができる。適当なマイタンシノイドは例えば米国特許５，２０８，０２０に、そして、上記した他の特許又は非特許の公開物に開示されている。好ましいマイタンシノイドはマイタンシノール及び芳香環において、又は、マインタンシノール分子の他の位置において修飾されているマインタンシノール類縁体、例えば種々のマインタンシノールエステルである。
【０２８４】
抗体−マイタンシノイドコンジュゲートを作成するための当該分野で知られた連結基は多数存在し、例えば米国特許５，２０８，０２０又は欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１及びＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されているもの等が挙げられる。連結基は上記特許に開示されている通りジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基を包含するが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０２８５】
抗体とマイタンシノイドのコンジュゲートは種々の２官能性蛋白カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成してよい。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を与えるためのＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８））及びＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を包含する。
【０２８６】
リンカーは連結部の型に応じて種々の位置においてマイタンシノイド分子に結合してよい。例えば、エステル結合は従来のカップリング手法を用いてヒドロキシル基との反応により形成してよい。反応はヒドロキシル基を有するＣ３位、ヒロドキシメチルで修飾されたＣ１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ１５位及びヒドロキシル基を有するＣ２０位において起こってよい。好ましい実施形態においては、連結はマイタンシノール又はマイタンシノール類縁体のＣ３位において形成される。
【０２８７】
（カリケアマイシン）
目的の免疫コンジュゲートの別のものはカリケアマイシン分子１つ以上にコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはピコモル未満の濃度において２本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの製造に関しては米国特許５，７１２，３７４、５，７１４，５８６、５，７３９，１１６、５，７６７，２８５、５，７７０，７０１、５，７７０，７１０、５，７７３，００１、５，８７７，２９６を参照することができる（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。使用してよいカリケアマイシンの構造的類縁体は例えばγ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩｌ（Ｈｉｍｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及び上記したＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄへの米国特許）。抗体をコンジュゲートできる別の抗腫瘍剤は抗葉酸エステルであるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは両方とも細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介内在を介したこれらの薬剤の細胞内取り込みはその細胞毒性作用を大きく増大させる。
【０２８８】
（他の細胞毒性剤）
本発明の抗体にコンジュゲートできる他の抗腫瘍剤はＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許５，０５３，３９４、５，７７０，７１０に記載の総称ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られる薬剤ファミリー、並びに、エスペラマイシン（米国特許５，８７７，２９６）を包含する。
【０２８９】
使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ蛋白、ジアンシン蛋白、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。例えば１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照できる。
【０２９０】
本発明は更に抗体と核溶解活性を有する化合物との間に形成される免疫コンジュゲートを意図している（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）。
【０２９１】
腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は高度に放射性の原子を含んでよい。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用される。例示されるものはＡｔ２１３、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を包含する。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（時期共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、更にヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２９２】
放射標識又は他の方式を知られた方法でコンジュゲートに取り込ませてよい。例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いながら、ペプチドを性合成するか、又はアミノ酸化学合成法により合成してよい。ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１のような標識をペプチド内のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合できる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら、（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いてヨウ素−１２３を取り込むことができる。Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）は他の方法を詳細に説明している。
【０２９３】
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性の蛋白カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成してよい。例えば、リシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。リンカーは細胞内での細胞毒性剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許５，２０８，０２０）を使用してよい。
【０２９４】
本発明の化合物は例えば、市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．Ｕ．Ｓ．Ａ．より）交差結合剤：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて製造されたＡＤＣも意図している。例えば２００３−２００４Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ、ｐ４６７−４９８を参照できる。
【０２９５】
（抗体薬剤コンジュゲートの製造）
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）においては、抗体（Ａｂ）を１つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体当たり約１〜約２０薬剤部分にリンカー（Ｌ）を介してコンジュゲートする。式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ          Ｉ
のＡＤＣは、数種類の経路により、当業者の知る有機化学の反応、条件及び試薬を用いながら、例えば（１）共有結合を介したＡｂ−Ｌを形成するための２価リンカー試薬との抗体の親核基の反応、及び、その後の薬剤部分Ｄとの反応；及び（２）共有結合を介したＤ−Ｌを形成するための２価リンカー試薬との薬剤部分の親核基の反応、及び、その後の抗体の親核基との反応、により製造してよい。
【０２９６】
抗体上の親核基は例えば、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）糖ヒドロキシル又はアミノ基であって抗体がグリコシル化されるところを包含する。アミン、チオール及びヒドロキシル基は親核性であり、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハライド；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を包含するリンカー部分及びリンカー試薬上の親電子基と共有結合を形成するように反応することができる。特定の抗体は還元性の鎖間ジスルフィド、即ちシステイン架橋を有する。抗体はＤＴＴ（ジチオスレイトール）のような還元剤による処理によりリンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性としてよい。即ち各システイン架橋は理論的には２つの反応性チオール親核物質を形成することになる。２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）とのリジンの反応を介して抗体に別の親核基を導入することができ、これによりアミンからチオールへの変換がもたらされる。
【０２９７】
本発明の抗体薬剤コンジュゲートはまたリンカー試薬又は薬剤の上の親核性置換基と反応することができる親電子部分を導入するための抗体の修飾により製造してもよい。グリコシル化抗体の糖は例えば過ヨウ素酸塩の酸化剤で酸化することによりアルデヒド又はケトン基とし、これをリンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応させてよい。形成されるイミンシッフ塩基の基は安定な連結部を形成するか、又は、例えばボロハイドライド試薬で還元することにより、安定なアミン連結部を形成してよい。１つの実施形態において、ガラクトースオキシダーゼ又はｍ−過ヨウ素酸ナトリウムの何れかとのグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により薬剤上の適切な基と反応できる蛋白中のカルボニル（アルデヒド又はケトン）基を形成してよい（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態においては、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含有する蛋白をｍ−過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの形成を行う（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許５３６２８５２）。このようなアルデヒドは薬剤部分又はリンカー親核物質と反応することができる。
【０２９８】
同様に、薬剤部分上の親核基は、例えば、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハライド；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を包含するリンカー部分及びリンカー試薬上の親電子基と共有結合を形成するように反応することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアンヒドラジド基を包含する。
【０２９９】
或いは、抗体及び細胞毒性剤を含む融合蛋白、例えば組み換え手法又はペプチド合成により、作成してよい。ＤＮＡの長さは、相互に隣接するか、又は、コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分断されたコンジュゲートの２つの部分をコードする該当領域を含む。
【０３００】
更に別の実施形態においては、抗体は腫瘍のプレターゲティングにおいて利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートしてよく、その場合、抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、その後、キレート剤を用いて循環系から未結合のコンジュゲートを除去し、そして次に細胞毒性剤（例えば放射性核種）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０３０１】
（抗体誘導体）
本発明の抗体誘導体は、当該分野で知られ容易に入手できる別の非蛋白性部分を含有するように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適する部分は水溶性重合体である。水溶性重合体の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。重合体は何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合する重合体の数は変動してよく、そして、１つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用する重合体の数及び／又は種類は、例えば向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体を特定の条件下の治療に使用するのか等を考慮しながら決定することができる。
【０３０２】
（医薬品製剤）
本発明の抗体を含む治療用製剤は、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥した製剤の形態において、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））に所望の程度の純度を有する抗体を混合することにより保存用に製造される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は使用される用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、そして、緩衝物質、例えばリン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン又は他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；セタノール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、２糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−蛋白複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。
【０３０３】
本発明の製剤は又、治療すべき特定の適応症のために必要に応じて１つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補足的な活性を有するものを含有してよい。このような分子は適宜、意図する目的のために有効である量において、組み合わせて存在する。
【０３０４】
活性成分はまた例えばコアセルベーション法によるか、又は、界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマクロエマルジョン中に捕獲させてもよい。このような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０３０５】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過メンブレンを通過する濾過により容易に達成される。
【０３０６】
持続放出製剤を製造してよい。持続放出製剤の適当な例は本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、そのようなマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い時間に蛋白を放出する。カプセル化免疫グロブリンが身体内に長時間残存する場合、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として、変性するか凝集し、生物学的活性を消失するか、又は、免疫原性が変化する可能性がある。合理的な方策は関与する機序に応じて安定化のために考案することができる。例えば、凝集の機序がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されれば、スルフィドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用、及び、特定の重合体マトリックス組成物の開発により安定化を達成してよい。
【０３０７】
（用途）
本発明の抗体は例えばインビトロ、エクスビボ及びインビボの治療方法において使用してよい。本発明の抗体はインビトロ、エクスビボ及びインビボで特定の抗原の活性を部分的又は完全にブロックするための拮抗剤として使用できる。更に又、本発明の抗体の少なくとも一部は他の種由来の抗原の活性を中和することができる。従って、本発明の抗体は例えば抗原を含有する細胞培養物において、ヒト被験体において、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類被験体（例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス）において、特定の抗原活性を阻害するために使用できる。１つの実施形態において、本発明の抗体は抗原活性が阻害されるように抗原に抗体を接触させることにより抗原活性を阻害すために使用できる。好ましくは、抗原はヒト蛋白分子である。
【０３０８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、抗原活性が有害であるような障害に罹患した被験体において、被験体における抗原活性が阻害されるように本発明の抗体を被験体に投与することを含む抗原を阻害するための方法において使用することができる。好ましくは、抗原はヒト蛋白分子であり、そして被験体はヒト被験体である。或いは、被験体は本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳類であることができる。更に又、被験体は抗原が導入されている（例えば抗原の投与によるか、又は、抗原トランスジーンの発現による）哺乳類であることができる。本発明の抗体は治療目的のためにヒト被験体に投与することができる。更に又、本発明の抗体は獣医科用途のため、又は、ヒト疾患の動物モデルとしての、免疫グロブリンが交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳類（例えば霊長類、ブタ又はマウス）に投与できる。後者に関しては、そのような動物モデルは本発明の抗体の治療薬効を評価する（例えば用量及び投与の時間的過程の試験）ために有用である。治療上有用な本発明のブロッキング抗体は、例えば抗ＨＥＲ２、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗インターフェロン及び抗組織因子の抗体を包含する。本発明の抗体は抗原分子の１つ以上の異常な発現及び／又は活性に関連する疾患、障害又は状態、例えば悪性及び良性の腫瘍；非白血病性及びリンパ性の悪性疾患；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質性及び胞胚腔の障害；及び炎症性、血管形成及び免疫学的な障害の治療、阻害、進行の遅延、再発の防止／遅延、軽減又は防止のために使用することができる。
【０３０９】
１つの特徴において、本発明のブロッキング抗体はリガンド抗原に特異的であり、そして、リガンド抗原が関与するリガンド−受容体相互作用をブロックするか、これに干渉することにより抗原活性を阻害し、これにより、相当するシグナル経路及び他の分子又は細胞の事象を阻害することができる。本発明は更に、必ずしもリガンド結合を防止しないが受容体の活性化に干渉し、これにより通常ではリガンド結合により開始される何れかの応答を阻害する受容体特異的抗体を特徴とする。本発明は又、リガンド−受容体複合体に優先的又は排他的に結合する抗体を包含する。本発明の抗体はまた特定の抗原受容体のアゴニストとして機能することができ、これによりリガンド媒介受容体活性化の全て又は部分的な活性を強化、増強又は活性化する。
【０３１０】
特定の実施形態においては、細胞毒性剤とコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲートを患者に投与する。一部の実施形態においては、免疫コンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原は、細胞により内在化され、それが結合する標的細胞の殺傷において、免疫コンジュゲートの増大した治療薬効をもたらす。１つの実施形態において、細胞毒性剤は標的細胞内の核酸をターゲティングするか、又は、それに干渉する。そのような細胞毒性剤の例は本明細書に記載した化学療法剤の何れか（例えばマイタンシノイド又はカリケアマイシン）、放射性同位体、又は、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼを包含する。
【０３１１】
本発明の抗体は治療において単独で、又は、他の組成物と組み合わせて使用できる。例えば、本発明の抗体は他の抗体、化学療法剤（化学療法剤のカクテルを包含する）、他の細部毒性剤、抗血管形成剤、サイトカイン及び／又は成長阻害剤と同時投与してよい。本発明の抗体が腫瘍の生育を阻害する場合、やはり腫瘍生育を阻害する他の治療薬１つ以上とそれを組み合わせることが特に望ましい場合がある。例えば、本発明の抗体は投与スキームにおいて、例えば本明細書に記載した疾患の何れか、例えば結腸直腸癌、転移性乳癌及び腎臓癌の治療において、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばＡＶＡＳＴＩＮ）及び／又は抗ＥｒｂＢ抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体）と組み合わせてよい。或いは、又は追加的に、患者は複合放射線療法を受けてよい（例えば体外からの放射線照射又は放射標識薬剤、例えば抗体を用いた治療）。上記したこのような複合療法は複合投与（２種以上の薬剤を同じ、又は別個の製剤中に含有させる）及び本発明の抗体の投与を副次的治療の投与の前、及び／又は後に行う個別投与を包含する。
【０３１２】
本発明の抗体（及び副次的治療薬）は何れかの適当な手段、例えば非経腸、皮下、腹腔内、肺内及び鼻内、及び、所望により局所投与、患部内投与により投与される。非経腸注入は筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を包含する。更に又、抗体は適宜、特に抗体の漸減用量によるパルス注入により投与される。投薬は何れかの適当な経路、例えば注射、例えば静脈内又は皮下注射により行うことができ、これは部分的には投与が短期であるか長期であるかにより決まる。
【０３１３】
本発明の抗体組成物は良好な医療上の慣行に合致した態様において製剤され、容量決定され、そして投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は必然ではないが場合より問題となる障害の防止又は治療のために現在使用中の薬剤１つ以上とともに製剤される。そのような他剤の有効量は製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に応じたものである。これらは一般的には以前に使用されていたものと同じ用量及び投与経路において、又は、以前に使用されていた用量の１〜９９％で使用される。
【０３１４】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独使用、又は、化学療法剤のような他剤との組み合わせにおいて）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に応じて変動する。抗体は適宜、患者に対し、単回、又は一連の治療に渡って投与する。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量である。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、投与は所望の疾患症状の阻害が起こるまで持続する。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。即ち、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は間歇的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０、例えば約６抗体投薬を受けるように）投与してよい。初期の高値の負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。例示される用量用法は約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量を投与した後、抗体約２ｍｇ／ｋｇの週当たり維持用量を含む。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
【０３１５】
（製造物品）
本発明の別の特徴において、上記した疾患の治療、予防及び／又は診断のために有用な物質を含有する製造物品が提供される。製造物品は容器及び容器上又はそれに伴ったラベル又はパッケージインサートを含む。適当な容器は例えばビン、バイアル、シリンジ等を包含する。容器は種々の材料、例えばガラス又はプラスチックから形成してよい。自身、又は他の組成物と組み合わせた場合に状態の治療、予防及び／又は診断に有効となる組成物を容器が保持しており、そして滅菌された接触口を有してよい（例えば容器は静脈内投与用の溶液バッグ又は皮下注射針により穿刺可能な蓋つきのバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージインサートは組成物が例えば癌のような選択された状態の治療のために使用されることを示す。更に又、製造物品は（ａ）その中に含有される組成物の入った第１の容器、ここで組成物は本発明の抗体を含むもの、及び（ｂ）その中に含有される組成物の入った第２の容器、ここで組成物は別の細胞毒性剤を含むもの、を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造物品は更に第１及び第２の抗体組成物を例えば癌のような特定の状態の治療のために使用できることを示すパッケージインサートを含んでよい。或いは、又は追加的に、製造物品は更に製薬上許容しうる緩衝液、例えば注射用殺菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器を含んでよい。それは更に商業上又は使用者の観点から望ましい他の物質、例えば他の緩衝物質、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含んでよい。
【０３１６】
以下に本発明の方法及び組成物の例を示す。上記した一般的説明が与えられたとすれば種々の他の実施形態が実施されてよいことが当然理解される。
【実施例】
【０３１７】
本明細書の実施例はアルファ４ベータ７インテグリンのベータ７サブユニットに結合するラット抗マウス抗体からのヒト化抗ベータ７抗体の形成を説明する。
【０３１８】
（実施例１：ベータ７拮抗剤抗体のヒト化）
（材料及び方法）
残基の番号はＫａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。１文字アミノ酸略記法を用いる。ＤＡＮ縮重はＩＵＢコードを用いて表示する（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。
【０３１９】
アクセプターヒトコンセンサスフレームワークへの直接超可変領域グラフト−この作業に用いたファージミドｐＶＯ３５０−２ｂは本質的にＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載の通りｐｈｏＡプロモーターの制御下の２オープンリーディングフレームを有する１価のＦａｂ−ｇ３ディスプレイベクターとした。第１のオープンリーディングフレームはアクセプター軽鎖のＶＬ及びＣＨ１ドメインに融合したｓｔＩＩシグナル配列よりなり、第２のものはアクセプター重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインに縮合したｓｔＩＩシグナル配列とそれに続く小型のファージ被膜蛋白Ｐ３のトランケーション型よりなるものである（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．ら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２）。
【０３２０】
ラットＦｉｂ５０４（ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ−２９３により生産された抗体ＦＩＢ５０４．６４、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｐ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８，ＵＳＡ）由来のＶＬ及びＶＨドメインをヒトコンセンサスカッパＩ（ｈｕＫＩ）及びヒトサブグループＩＩＩコンセンサスＶＨ（ｈｕＩＩＩ）ドメインとアラインさせた。超可変領域（ＨＶＲ）グラフトを作成するために、以下のフレームワークに使用した。即ち、ＨｕＫＩは軽鎖可変ドメインフレームワークについて使用した（図１Ａ及び７参照）。重鎖可変ドメインフレームワーク、アクセプターＶＨフレームワークについては、３位置：Ｒ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８ＡにおいてｈｕｍＩＩＩ配列から異なっている修飾ヒトサブグループＩＩＩ（ｈｕｍＩＩＩ）コンセンサスＶＨドメインを使用してよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２８５（１９９２）参照）（図１Ｂ参照）。本発明の抗体の世代においては、５０４Ｋ−ＲＦグラフトはやはり以下のアミノ酸置換：Ａ７１Ｒ及びＡ７８Ｆを行うことにより修飾ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスＶＨドメインから製造した。
【０３２１】
ラットＦｉｂ５０４（ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ−２９３により生産）抗体由来の超可変領域を操作してアクセプターヒトサブグループＩＩＩこせＶＨフレームワーク内にいれ、直接のＨＶＲ−グラフト（Ｆｉｂ５０４グラフト）を形成した（図１Ｂ参照）。ＶＬドメインにおいては、ラットＦｉｂ５０４由来の以下の領域、即ち位置２４−３４（Ｌ１）、５２−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）をヒトコンセンサスアクセプターｈｕＫＩにグラフトした（図１Ａ）。ＶＨドメインにおいては、位置２６−３５（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）及び９４−１０２（Ｈ３）をグラフトした（図１Ｂ）。更に、第２のＨＶＲ−グラフト、Ｆｉｂ５０４Ｋグラフトを、Ｌ２の拡張定義に基づいてＨＶＲ内にＶＬ４９位を含むように構築した（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）参照）。ＭａｃＣａｌｌｕｍ等は抗体及び抗原の複合体の結晶構造を分析しており、そして軽鎖の４９位及び重鎖の４９位及び９４位が抗原接触領域の部分であり、従ってこれらの位置が本明細書に開示したヒト化抗ベータ７抗体に関するＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３の定義内に包含されることを発見した。
【０３２２】
直接グラフト変異体は各超可変領域について別個のオリゴヌクレオチドを使用しながらＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７）上出）により形成した正しいクローンをＤＮＡ配列決定により評価した。
【０３２３】
（超可変領域のソフトランダム化（ｓｏｆｔ  ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ））
「ソフトランダム化」（米国特許出願６０／５４５，８４０参照）の工程は抗体の超可変領域のような選択された蛋白配列のバイアスした突然変異誘発のための操作法を指す。方法はマウス、ラット又は他の出発超可変領域配列へのバイアスを維持しつつ、約１０〜５０パーセントの突然変異を各選択位置において導入する。この手法は使用されるライブラリ配列の容量を増大させ、そして抗体により認識される抗原エピトープの変化を回避する。このソフトランダム化手法によれば、マウス超可変領域配列へのバイアスを維持する方策を用いながら、配列の多様性が各超可変領域に導入される。これはＧａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１（１９９４）により最初に報告された位置決めオリゴヌクレオチド合成法を用いて達成された。しかしながら、非ヒト超可変領域残基への変更を維持するための他の方法、例えばエラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング等も使用される。
【０３２４】
ここで使用する方法に従えば、突然変異すべき超可変領域内のある位置について、野生型アミノ酸をコードするコドンをヌクレオチドの混合物（例えば７０−１０−１０−１０混合物）とともに位置づけすることにより、各選択された超可変領域位置において約５０％の突然変異がもたらされる。これを達成するためには、ヌクレオチドの７０−１０−１０−１０混合物のような他の３ヌクレオチドの夾雑物混合物を低濃度としながら突然変異すべき野生型超可変領域アミノ酸をコードするコドンを合成する。即ち、例えば、ＰＲＯ（ＣＣＧ）のソフトランダム化のためには、合成された第１の位置は７０％のＣ及び各々１０％のＧ、Ｔ及びＡの混合物であり；第２の位置は７０％のＣ及び各々１０％のＡ、Ｇ及びＴの混合物であり；そして第３の位置は７０％のＧ及び各々１０％のＡ、Ｃ及びＴの混合物である。バイアスは所定の位置において合成されるコドン、特定のアミノ酸をコードするコドンの数、及び、合成混合物のヌクレオチド組成によりオリゴヌクレオチド合成が位置付けられる程度に応じて上方又は下方に調節することができると考えられる。
【０３２５】
ソフトランダム化オリゴヌクレオチドはマウス、ラット又は他の出発超可変領域配列に続いてパターン化することができ、そして直接の超可変領域グラフトにより定義される同じ領域を包含する。場合により、２位置、ＶＨドメインのＨ２及びＨ３の始点のアミノ酸はその多様性が限定されてよく：コドンＲＧＣはＡ、Ｇ、Ｓ又はＴをコードする４９位について使用してよく、そして９４位においてはＭ又はＲをコードするコドンＡＫＧを使用してよい。
【０３２６】
ファージライブラリの作成−各超可変領域について設計されたランダム化オリゴヌクレオチドプールを３７℃で１時間、オリゴヌクレオチド６６０ｎｇ、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＡＴＰ、２０ｍＭＤＴＴ及び５Ｕポリヌクレオチドキナーゼを含有する６点の２０μｌ反応物において別個にホスホリル化した。次に６点のホスホリル化オリゴヌクレオチドプールを最終容量５００μｌとなるように５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２中においてＫｕｎｋｅｌ鋳型２０μｇと合わせ、オリゴヌクレオチドの鋳型に対する比を３とした。混合物を９０℃で４分、５０℃で５分アニーリングし、次に氷上で冷却した。過剰の未アニーリングオリゴヌクレオチドは、アニーリングしたＤＮＡの過剰な変性を防止するために改良されたプロトコルを用いながらＱＩＡＱＵＩＣＫＴＭＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎキット２８１０６、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で除去した。アニーリング混合物５００μｌにＱｉａｇｅｎ緩衝液ＰＢ１５０μｌを添加し、そして混合物を２本のシリカカラムの間にスプリットした。Ｑｉａｇｅｎ緩衝液ＰＥ７５０μｌで各カラムを洗浄し、カラムを乾燥させるために過剰に回転させた後、各カラムを１１０μｌの１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８で溶出させた。次に、室温で３時間１μｌの１００ｍＭＡＴＰ、１０μｌの２５ｍＭｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々２５ｍＭ）、１５μｌの１００ｍＭＤＴＴ、２５μｌの１０ＸＴＭ緩衝液（０．５ＭトリスｐＨ７．５、０．１ＭＭｇＣｌ２）、２４００ＵのＴ４リガーゼ、及び３０ＵのＴ７ポリメラーゼを添加することにより、アニーリングして洗浄した鋳型（２２０μｌ）をフィルインした。
【０３２７】
フィルイン産物はトリス−酢酸−ＥＤＴＡ／アガロースゲル上で分析した（Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３−３６３（２０００））。３つのバンドが通常は観察され、最下部のバンドは正しくフィルインされ、ライゲーションされた産物であり、中央のバンドはフィルインされたが未ライゲーションであり、そして最上部のバンドは排除された鎖である。最上部のバンドはＴ７ポリメラーゼの内因性の副次的活性により生成し、そして回避することは困難である（Ｌｅｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１１７４−１１１８４（１９８３）が；しかしながら、このバンドは最下部のバンドより３０倍低値の効率でしかトランスフォームされず、通常はライブラリには殆ど影響しない。中央のバンドは最終ライゲーション反応のための５’ホスフェートが存在しないことに起因するものであり；このバンドは効率的にトランスフォームされ、主に野生型配列を与える。
【０３２８】
次にＳｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３−３６３（２０００）に記載の通りフィルイン産物を洗浄し、ＳＳ３２０細胞へのエレクトロポレーションに付し、そしてＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージの存在下に増殖させた。ライブラリのサイズは１〜２ｘ１０９独立クローンの範囲であった。初期ライブラリ由来のランダムクローンはライブラリの品質を評価するために配列決定した。
【０３２９】
ファージ選択−抗前兆ヒトインテグリンアルファ４ベータ７を２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９９７））において発現させ、Ｆｉｂ５０４アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてファージ選択のための標的として使用した。ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ．Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）上の固定化のために、１００μｌのヒトインテグリンアルファ４ベータ７を４℃で一夜、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、２ｍＭＣａＣｌ２，２ｍＭＭｇＣｌ２及び２ｍＭＭｎＣｌ２（ＴＢＳＭ）中５μｇ／ｍｌとなるようにコーティングした。ウェルを１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＭを用いて１時間ブロッキングした。選択の第１回目では標的でコーティングした８ウェルを使用し；標的コーティングウェル１枚を次の回の選択用に用いた。ファージは培養上澄みから回収し、１％ＢＳＡ及び０．０５％ＴＷＥＥＮＴＭ２０を含有するＴＢＳＭ（ＴＢＳＭＢＴ）中に懸濁した。２時間ウェルに結合させた後、未結合のファージを０．０５％ＴＷＥＥＮ２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で十分洗浄することにより除去した。結合ファージは、ウェルを１００ｍＭＨＣ１で３０分間インキュベートすることで溶出する。Ｔｏｐ１０細胞及びＭ１３／Ｋ０７ヘルパーファージを用いながらファージを増幅し、そして２ＵＴ、５０μｇ／ｍｌカルバナシリン中３７℃で一夜生育させた。標的コーティングウェルから溶出したファージの力価を非標的コーティングウェルから回収したファージの力価と比較することによりリッチ化を評価した。４回の選択を行った後、ランダムクローンを選択して配列分析に付した。
【０３３０】
Ｆａｂ生産及びアフィニティー測定−親和性測定のためのＦａｂ蛋白を発現するためにファージディスプレイベクターの重鎖とｇ３の間に停止コドンを導入した。クローンはＥ．ｃｏｌｉ３４Ｂ８細胞に形質転換し、３０℃でＡＰ５培地中生育させた’Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７））。細胞を遠心分離により回収し、１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８に懸濁し、マイクロフルイダイザーを用いて崩壊させた。ＦａｂはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０３３１】
親和性の測定はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により行った。ヒト化Ｆｉｂ５０４Ｆａｂ変異体をＣＭ５センサーチップ上に１０ｍＭ策酸塩ｐＨ４．５中で固定化（２５０〜１５００応答単位（ＲＵ）の範囲）し、そして２％ｎ−オクチルグルコシド含有ＴＢＳＭ中のヒトインテグリンアルファ４ベータ７の倍々希釈物を注入した。各試料は５分間の会合及び５〜６０分間の解離時間で分析した。各注入の後、８Ｍ尿素の１分間注射３回を用いてチップを再生した。結合応答はブランクのフローセルからＲＵを差し引くことにより補正した。ｋｏｎ及びｋｏｆｆの同時フィットの１対１ロングミュアモデルを用いて速度論的分析を行った。
【０３３２】
（結果及び考察）
ラットＦｉｂ５０４のヒト化−ヒト化のために使用したヒトアクセプターフレームワークはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）のために使用したフレームワークに基づいており、そしてコンセンサスヒトカッパ１（ｈｕＫＩ）ＶＬドメイン及びヒトサブグループＩＩＩ（ｈｕｍＩＩＩ）コンセンサスＶＨドメインの変異体よりなるものである。この変異体ＶＨドメインはヒトコンセンサスからの３つの変化、即ちＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８Ａを有する。ラットＦｉｂ５０４のＶＬ及びＶＨドメインを各々ヒトカッパＩ及びサブグループＩＩＩドメインとアラインし；各超可変領域（ＨＶＲ）を発見し、そしてヒトアクセプターフレームワークにグラフトし、ファージ上のＦａｂとしてディスプレイされ得るＨＶＲグラフト（５０４グラフト）を形成した（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０３３３】
使用可能な抗体及び抗原の複合体の結晶構造に基づいて、ＭａｃＣａｌｌｕｍ等（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））は頻繁に抗原と接触する可変ドメイン残基に基づいたＨＶＲの定義を提案している。即ち、重鎖の位置４９Ｇ及び９４ＭをＦｉｂ５０４のＨＶＲグラフト内に包含させた（図１Ｂ）。更に又、第２のＨＶＲグラフトであるＦｉｂ５０４Ｋグラフトもまた、軽鎖の位置４９ＫがやはりＨＶＲ−Ｌ２の接触定義内にあり、そして抗原接触部として機能することができるため、この位置を含むように作成した（図１Ａ）。Ｆｉｂ５０４又はＦｉｂ５０４Ｋグラフトの何れかがファージ上にディスプレイされた場合に固定化アルファ４ベータ７への結合に関して試験したが結合は観察されなかった。
【０３３４】
Ｆｉｂ５０４及びＦｉｂ５０４−ＫＨＶＲグラフトの両方を用いてＨＶＲ領域の各々が同時にソフトランダム化されるようにライブラリを作成した。各ＨＶＲグラフトライブラリは選択４回について固定化されたアルファ４ベータ７に対してパンした。リッチ化は観察されず、そしてＤＮＡ配列分析のために採取されたクローンは６ＨＶＲ領域にターゲティングされたランダム配列変化のみをディスプレイした。
【０３３５】
２つのさらなるＶＨフレームワーク配列である「ＲＬ」及び「ＲＦ」をアクセプターフレームワークとして調べたところ、７１位及び７８位に変化を含有していた。７１位はヒトサブグループＩＩＩコンセンサスの場合と同様にアルギニンに変化しており、そして７８位はヒトサブグループＩＩＩコンセンサスの場合と同様にロイシン（アクセプターフレームワーク「ＲＬ」）又はヒトサブグループＩＩコンセンサス及びラットＦｉｂ５０４ＶＨフレームワークの場合と同様にフェニルアラニン（アクセプターフレームワーク「Ｒｆ」）に変化していた（図１０Ａ）。「ＲＬ」（Ｆｉｂ５０４−ＲＬ及びＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＬ）又は「ＲＦ」（Ｆｉｂ５０４−ＲＦ及びＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦ）アクセプターフレームワーク内のＦｉｂ５０４又はＦｉｂ５０４Ｋの何れかがファージ上にディスプレイされた場合には固定化アルファ４ベータ７への結合に関して試験した。「ＲＦ」フレームワークを用いた場合のＦｉｂ５０４Ｋグラフトについてのみ特異的ファージ結合が観察された（図１０Ｂ）。Ｙ４９Ｋ（軽鎖）及びＬ７８Ｆ（重鎖）を欠失した他のグラフトと相対比較した場合のＦｉｂ５０４−ＲＦグラフトをディスプレイするファージの中等度の結合は有用なアクセプターフレームワークを選択する場合のこれらの位置の重要性を示している。
【０３３６】
Ｆｉｂ５０４Ｋ−ＲＬ及びＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦグラフトについて６ＨＶＲの各々において同時にソフトランダム化の手法を用いて以前と同様にライブラリを作成し、そして上記した通り４回の選択について固定化アルファ４ベータ７上でソーティングした。Ｆｉｂ５０４Ｋ−ＲＦグラフトによるライブラリについてのみリッチ化が観察された。Ｆｉｂ５０４Ｋ−ＲＦライブラリの第４回から得られたクローンを配列分析のために選択し、そしてＨＶＲ−Ｌ１にターゲティングされたアミノ酸変化が判明した。大部分のクローンはＹ３２Ｌの変化を含有しており；更に、３１位は頻繁にはＤ、Ｓ、Ｐ又はＮに変化していた（図１Ｃ）。出発グラフトＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦのほかに、３クローンは発現され、そしてＦａｂ蛋白として精製し、そして更に上記した通りＢｉａｃｏｒｅで分析した。クローンｈｕ５０４−５、ｈｕ５０４−１６及びｈｕ５０４−３２（置換Ｔ３１Ｓ＋Ｙ３２Ｌ（変異体ｈｕ５０４．５）、Ｙ３２Ｌ（変異体ｈｕ５０４．１６）又はＴ３１Ｄ＋Ｙ３２Ｌ（変異体ｈｕ５０４．３２）を含有する配列番号１の変異体；図１Ｃ参照）はＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦグラフトと相対比較してアルファ４ベータ７への優れた結合を示し、そしてアルファ４ベータ７に対するキメラＦｉｂ５０４Ｆａｂの親和性に合致するか、それを超過していた。Ｂｉａｃｏｒｅ分析の結果は以下の表３に示す通りであり、そして本明細書に開示したＨＶＲ及び／又はフレームワークの領域内の選択された変異が出発抗体と相対比較して向上した親和性を有するアルファ４ベータ７への拮抗剤抗体を形成したことを示している。表３の結果は、ヒト化変異体５０４．３２がアルファ４ベータ７に３倍より堅固に結合することにより出発ラット抗体と相対比較して親和性の最大の増加をもたらしたことを示している。
【０３３７】
【表３】
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表３の結果は又、高親和性の抗原結合の回復にとってＨＶＲ−Ｌ１の再設計が重要であったことを示している。特に突然変異Ｙ３２Ｌは種々のクローンの中で最も頻繁に観察された。３１位における他の変化及びＨＶＲ−Ｈ１全体に渡る多くの他の置換は十分耐容性を示していると考えられ、そして別の向上をもたらしている場合がある、これらの結果から、元のラット抗体のものと合致するかそれを超える親和性を生じさせるヒトフレームワークにグラフトしたＦｉｂ５０４の親和性を向上させることができる複数の配列変化が存在することは明らかである。
【０３３８】
即ちヒトアクセプタースカホールド内への６ラットＦｉｂ５０４ＨＶＲのグラフトから出発し、４９位（リジン）を含むためのＨＶＲ−Ｌ２の拡張、４９位（グリシン）を含むためのＨＶＲ−Ｈ２の拡張、及び、９４位（メチオニン）を含むためのＨＶＲ−９４の拡張、並びに、アミノ酸変化のＶＨＲ−Ｌ１の３２位（ここではＬ又はＩがＹを置き換える）及び、場合により、ＶＨＲ−Ｌ１の３１位（ここでは例えばＴがＤ又はＳにより置き換えられる）となる。有用なフレームワークアミノ酸変化はＶＨドメインの７１位（Ａ７１Ｒ）及び７８位（Ｌ７８Ｆ）において生じる。このようなアミノ酸変化は、例えばアルファ４ベータ７インテグリンに対して３倍向上した結合親和性を有する完全ヒト抗体である変異体ｈｕ５０４．３２をもたらす。更に又、本明細書に記載した選択されたヒト化抗体は親ラットＦｉｂ５０４抗体に少なくとも匹敵する生物学的活性を有することが判明している（本明細書の実施例３参照）。
【０３３９】
（実施例２：別のヒト化Ｆｉｂ５０４ＨＶＲ変異体）
ヒト化変異体Ｆｉｂ５０４．３２のＨＶＲアミノ酸配列を更に修飾することにより、ベータ７インテグリンサブユニット及び／又はベータ７サブユニットを含有するインテグリンの活性に拮抗する能力を有する別の変異体を形成した。
【０３４０】
広範なアミノ酸スキャンライブラリの形成−変異体ｈｕ５０４．３２のベータ７結合変異体を形成することができる他のアミノ酸残基に対する選択されたＨＶＲ位置をスキャンするためのライブラリを、３つのオリゴヌクレオチド、即ち、ｈｕ５０４．３２ＨＶＲ−Ｌ１配列へのバイアスを有するＨＶＲ−Ｌ１の一部をソフトランダム化するために設計された５０４−Ｌ１（即ち、配列番号ＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号４７、相対的な位置Ａ２−Ａ１１に対する）を上記の通りソフトランダム化した）；及び軽鎖の位置ＨＶＲ−Ｌ３の９６位及び重鎖のＨＶＲ−Ｈ３の９４位にＮＮＳを導入するＨＶＲ−Ｌ３の５０４−Ｎ９６及びＨＶＲ−Ｈ３の５０４−Ｍ９４を用いて形成し、これにより全２０アミノ酸をこれらの位置とした。これらの３オリゴヌクレオチドを用いて、軽鎖における３停止コドン（ＨＶＲ−Ｌ１の３１及び３２位、及び、ＨＶＲ−Ｌ３の９６位）及び重鎖における１停止コドン（ＨＶＲ−Ｈ３の９４位）を含有する鋳型を用いながら上記したとおり広範なアミノ酸スキャンライブラリを形成した
ｈｕ５０４−３２の広範なアミノ酸スキャン−ＨＶＲ−Ｌ１において可能な好ましい配列をより完全に探索するため、及び、５０４−３２の安定性を増大させるために、本発明者らはａ）ヒト化の間に変化が観察された領域における５０４−３２のＨＶＲ−Ｌ１（即ちＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号４７、相対的な位置Ａ２−Ａ１１に対する）をソフトランダム化し（図１Ｃ）、そして、ｂ）ＨＶＲ−Ｌ３におけるＮ９６及びＨＶＲ−Ｈ３におけるＭ９４において全ての可能なアミノ酸を与えるファージライブラリを設計した。前記した固定化完全長ヒトインテグリンアルファ４ベータ７に対する選択４回の後、９６のランダムクローンを選択して配列分析に付した。広範なアミノ酸スキャンライブラリの各位置においてアミノ酸が検出される頻度は、ｈｕ５０４−３２に存在するＨＶＲ−Ｌ１配列及び重鎖９４位のメチオニンが高親和性結合のためには指摘であることを示唆している（図１２）。変異体５０４．３２から出発した選択により得られた最も好ましいアミノ酸（図１２）を黄色で示す。これとは対照的に、アスパラギンもｈｕ５０４−３２の軽鎖の９６位に存在し、広範なアミノ酸スキャンにおけるこの位置において観察されたロイシンの高頻度は突然変異Ｎ９６Ｌがアルファ４ベータ７に対するヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の親和性を更に向上させ、そしてこの位置におけるいかなる潜在的な脱アミドの問題も排除することを示唆している。図１２の情報は又、置き換えアミノ酸の数が親和性の実質的な損失を伴うことなく殆どの位置で耐容性が示されていることを示唆している。例えば、ＨＶＲ−Ｈ３のＭ９４における酸化を排除するためには、グルタミン又はアルギニンを置換すればよいと考えられる。
【０３４１】
限定的なアミノ酸スキャンライブラリの形成−限定されたアミノ酸スキャンのための６ライブラリは６種のＫｕｎｋｅｌ鋳型を利用しており、各々が６ＨＶＲの１つないに位置する１つの停止コドンを含有するようにした。各ライブラリは、ベータ７又はアルファ４ベータ７への結合に関する後の試験についてアミノ酸残基を改変するために、単一のＨＶＲをコードする単一のオリゴヌクレオチドを用いながら、図１１Ａ（「コドン」のコラム）に示すコドンを利用しながら作成した。同じ操作法を用いて抗ベータ７抗体のアミノ酸残基を改変し、そして、アルファＥベータ７インテグリンへの結合に関してそれらを試験した。
【０３４２】
ｈｕ５０４−３２の限定的なアミノ酸スキャン−ヒト軽鎖及び重鎖コンセンサス配列により近似しているｈｕ５０４−１６を作成し、そして工程において、結合のために必要なラットＦｉｂ５０４の最小配列エレメントを発見するために、ｈｕ５０４−１６の限定的なアミノ酸スキャンを設計した。６ライブラリを作成し、ｈｕ５０４−１６とヒトコンセンサスカッパＩ軽鎖又はサブグループＩＩＩ重鎖の間で異なる部位において各ＨＶＲをターゲティングし（図１Ａおよび１Ｂ）；ラット又はヒトのアミノ酸の何れかをライブラリのこれらの位置とした（図１１Ａ）。オリゴヌクレオチド合成及び突然変異誘発の間に両方のアミノ酸に対してコーディングを適合させるために、別のアミノ酸もまた一部の場合においては導入した（図１１Ａのコードされたアミノ酸を参照）。限定的なアミノ酸スキャンライブラリを上記した通り固定化された完全長のヒトインテグリンアルファ４ベータ７に対して選択し、そして、約３２のランダムクローンを第３回の後に各ライブラリから配列決定した。各位置において検出された各アミノ酸の頻度を図１１Ｂ及び１１Ｃに示す。
【０３４３】
広範なアミノ酸スキャンの場合と同様、限定的なアミノ酸スキャンもまたヒト化Ｆｉｂ５０４における多くの位置においてどのような変化が耐容性であるかに関する情報を提供する。しかしながら広範なアミノ酸スキャンとは異なり、限定的なアミノ酸スキャンにおいてランラム化される各位置において可能な多様性は数個のアミノ酸に限定されていた。即ち、所定の位置における何れかの観察された置換の欠如は、特定の残留物が変化され得ないことを示しているわけではなく、又、所定の位置における何れかの特定のアミノ酸の高頻度はそれが高親和性のための最良の解決法であることを必ずしも示しているわけではない。
【０３４４】
一部の位置（軽鎖の２７、２９、３０，５３，５４位及び重鎖の５０、５４、５８、６０、６１及び６５位）においてはヒトコンセンサスアミノ酸が極めて高頻度で選択され、ヒトコンセンサスへの復帰突然変異がヒトアルファ４ベータ７への結合を劇的に改変しないことを示唆している。実際、軽鎖（ＨＶＲ−Ｌ２内）の５４位において、ヒトコンセンサスアミノ酸はラットＦｉｂ５０４由来のアミノ酸よりもより頻繁に選択されており、５０４−３２で起こったこの変化が有用なベータ７結合抗体を与えることを示している。
【０３４５】
更に又、ライブラリ設計の結果として、ヒトコンセンサス及びラットＦｉｂ５０４の何れからも誘導されていないアミノ酸は、ある位置においてはより頻繁に選択されており、そして、ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の親和性を向上させるための潜在的置換を与える。これらには、例えば、軽鎖のＤ３０Ａ及びＩ５５Ｖ及び重鎖のＹ５０Ｆが包含される。これらの２つのライブラリから得られた結果は、多くのＨＶＲ位置が他のアミノ酸置換に耐容性を示し、そしてなお、同等の生物学的活性を保持していることを示している。
【０３４６】
観察されたアミノ酸変化の総括を図１３及び１５に示す。図１５はＫａｂａｔナンバリング又は相対的ナンバリング系に従ってナンバリングされた位置における本発明の抗体変異体のＣＤＲにおける位置の各々において有用な種々のアミノ酸を総括する。図１３及び１５に示す変異体により包含される別の抗体の各々は本発明の実施形態である。
【０３４７】
（実施例３：細胞接着試験）
細胞表面上に発現されたリガンドに本発明のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の一部が結合する能力を細胞接着試験により試験した。アルファ４ベータ７及び他のベータ７インテグリン、アルファＥベータ７への結合はインテグリンのその天然の受容体への結合を妨害するヒト化変異体の能力により試験した。細胞表面上に発現されたベータ７サブユニット単独へのヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の結合も同様に試験した。操作法及び結果を以下に記載する。
【０３４８】
ＩｇＧ生産−ヒトＦｉｂ５０４ＩｇＧ変異体を軽鎖及び重鎖に関する別個のベクターを用いて２９３細胞において一過性に発現させた（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）上出）。ベクターは軽鎖及び重鎖の各々につき適当な発現ベクター内に軽鎖又は重鎖の可変ドメインをサブクローニングすることにより構築した。ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の１．１ＬのＣＨＯ細胞培養物の上澄みを０．４５ｕｍのフィルターで濾過し、緩衝液Ａ（１０ｍＭトリスｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ）中に平衡化させておいた新しい１ｍＬＨｉＴｒａｐプロテインＡＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。試料は４℃で一夜０．８ｍＬ／分で適用した。次に各カラムの洗浄及び平衡化を緩衝液Ａ３０ｍｌを用いて行った。抗体の溶出は０％から１００％緩衝液Ｂ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０）となるまで１ｍｌ／分で１４分の一次勾配を用いながらＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で室温でクロマトグラフィーにより行った。得られた１ｍｌ画分を即座に１ＭトリスｐＨ８を７５ｕｌ添加することにより中和した。溶出した蛋白は２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、そしてピーク画分をプールし、ＰＤ１０Ｇ−２５セファデックス使い捨てサイジングカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でＰＢＳ中に脱塩した。蛋白はＯＤ２８０により検出し、ピーク画分をプールした。ＰＢＳ中の抗体を０．２２ｕｍ濾過し、４℃で保存した。アミノ酸分析を用いてこれらの精製された抗体の濃度を定量し、そして、数値は２つの別個の測定の平均から割り付けた。
【０３４９】
（ＢＣＦＣＦ標識）
実施例３に示す試験の各々において、細部を以下の操作法に従って標識した。接着試験に使用した全ての細胞は、ベータ７サブユニットでトランスフェクトしたＲＰＭＩ８８６６細胞及び３８Ｃ１３細胞（３８Ｃ１３ベータ７細胞）用には１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、そして、アルファＥベータ７トランスフェクト２９３細胞（アルファＥベータ７２９３細胞）用には１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２：ＤＭＥＭ混合物（５０：５０）中において、１０ｕＭの２’，７’−ビス−（２−カルボキシルエチル）−５−（及び−６）−カルボキシフルオレセインのアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ）により標識した。細胞は３０分間標識し、そして、試験培地を用いて２回洗浄した。細胞密度はＲＰＭＩ８８６６及び３８Ｃ１３ベータ７細胞についてはｍｌ当たり３ｘ１０６個に調節し、そしてアルファＥベータ７２９３細胞については２．２ｘ１０６個に調節した。
【０３５０】
（ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体のＭＡｄＣＡＭへのアルファ４ベータ７の結合の妨害）
ＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ細胞接着：ＲＰＭＩ８８６６細胞はその表面上にアルファ４ベータ７を発現する（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）。ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体（ｈｕ５０４変異体）を固相上にコーティングされたＩｇＧに融合させたＲＰＭＩ８８６６とＭＡｄＣＡＭの混合物に接触させた。ＲＰＭＩ８８６６細胞のＭＡｄＣＡＭ−１への結合の５０％阻害をもたらすヒト化Ｆｉｂ５０４変異体濃度（ＩＣ５０）は、４℃一夜Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭ９６穴プレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ、１００μ／ウェルのＭＡｄＣＡＭ−１−１−Ｉｇ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ここでＩｇはＦｃ領域へのＭＡｄＣＡＭ−１の融合物を指す）でコーティングすることにより測定した。室温で１時間２００ｕｌ／ウェルの５ｍｇ／ｍｌＢＳＡでプレートをブロッキングした後、試験培地（ＲＰＭＩ１６４０倍値、Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標）、Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ，ＵＳＡ，５ｍｇ／ｍＬＢＳＡ添加）中ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体５０μｌを各ウェルに添加し、そして試験培地５０μｌ中１５０，０００ＢＣＥＣＦ標識細胞（ＢＣＥＣＦ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。ウェルを試験培地１５０μｌで２回洗浄し、未結合の細胞を除去した。結合した細胞は５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５中０．１％ＳＤＳ１００μｌで可溶化した。溶解した細胞から放出された蛍光の量は４８５ｎｍ励起５３０ｎｍ発光の波長においてＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＧＥＭＩＮＩＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により測定した。試験における各ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体のＩＣ５０値を得るために、４パラメーターの非線形最小自乗フィットを用いながら各試験において添加したヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の濃度の関数として蛍光値を分析した。ＩＣ５０及びＩＣ９０値は４パラメーターのフィットから推定した。図１４は結果の例示的プロットである。被験変異体の各々に関するＩＣ９０及びＩＣ５０値は表４において以下に示す通りである。
【０３５１】
【表４】
2008512382.tif 000033
＊Ｅｘｐ１／Ｅｘｐ２は反復試験の結果を示す。
【０３５２】
（ＶＣＡＭへのアルファ４ベータ７結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体妨害）
ＲＰＭＩ８８６６／７ｄＶＣＡＭ−１細胞接着：ＲＰＭＩ８８６６／７ｄＶＣＡＭ−１試験はプレートをコーティングするために７ｄＶＣＡＭ−１（ＡＤＰ５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外はＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇと同様のフォーマットである。結果はＭＡｄＣＡＭ結合実験に関して上記した通り分析した。被験変異体の各々に関するＩＣ９０及びＩＣ５０値は表５において以下に示す通りである。
【０３５３】
【表５】
2008512382.tif 000034
＊Ｅｘｐ１／Ｅｘｐ２は反復試験の結果を示す。
【０３５４】
（ヒトＥカドヘリンへのアルファＥベータ７結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の妨害）
アルファＥベータ７の２９３／ｈｕＥ−カドヘリン細胞接着：２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）上出）をアルファＥ及びベータ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）でトランスフェクトした。試験フォーマットはプレートをコーティングするためにｈｕＥ−カドヘリン（６４８−ＥＣ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を２μｇ／ｍｌで使用した以外はＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇと同様である。次にプレートを５ｍｇ／ｍｌＢＳＡで上記した通りブロッキングし、そして、試験培地（Ｆ−１２：ＤＭＥＭ（５０：５０）、５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ添加）中ＦＩＢ５０４変異体５０μｌを各ウェルに添加し、そして試験培地５０ｕｌ中１１０，０００ＢＣＥＣＦ標識細胞を各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ウェルを試験培地１５０μｌで２回洗浄し、そして溶解細胞から放出された蛍光の量を上記した通り測定した。３実験から得られた結果を表６に示す。
【０３５５】
【表６】
2008512382.tif 000035
（ＭＡｄＣＡＭへのベータ７の結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の妨害）
３８Ｃ１３ベータ７／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ細胞接着試験：３８Ｃ１３ベータ７／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ試験はプレートをコーティングするためにｍｕＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外はＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇと同様のフォーマットである。３８Ｃ１３アルファ４＋マウスリンパ腫細胞（Ｃｒｏｗｅ，Ｄ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４４１１−１４４１８（１９９４））を、アルファ４ベータ７が細胞表面上に発現されるようにインテグリンベータ７をコードするＤＮＡでトランスフェクトした。アルファ４ベータ７と会合している細胞膜とＭＡｄＣＡＭとの間の相互作用を妨害する抗体変異体の能力を上記の通り調べた。試験結果は表７に示す。（２実験のＩＣ５０及びＩＣ９０値を示す）。
【０３５６】
【表７】
2008512382.tif 000036
マウスＶＣＡＭへのベータ７の結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の妨害
３８Ｃ１３ベータ７／ｍｕＶＣＡＭ−１−Ｉｇ細胞接着試験：３８Ｃ１３ベータ７／ｍｕＶＣＡＭ−１−Ｉｇ試験はプレートをコーティングするためにｍｕＶＣＡＭ−１−Ｉｇ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外はＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ／ＲＰＭＩ８８６６に従って実施した。試験結果は表８に示す。（２実験のＩＣ５０及びＩＣ９０値を示す）。
【０３５７】
【表８】
2008512382.tif 000037
ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体結合試験の結果は、本発明のヒト化抗体はその標的ベータ７インテグリンサブユニット並びにアルファ４ベータ７及びアルファＥベータ７インテグリンに、ほぼ出発ラット抗体の親和性で、そして、一部の実施形態においてはより大きい親和性で、結合することを示している。即ち、本発明のヒト化抗ベータ７抗体は抗ベータ７インテグリン治療、特にヒトの治療において有用である。
【０３５８】
（本発明のｈｕ５０４．３２変異体の相対的活性）
本明細書に記載した細胞接着試験方法に従って、ｈｕ５０４．３２抗体の種々のアミノ酸変異体がベータ７含有受容体のそのリガンドへの結合を阻害する能力について、それらをヒト及びマウスの細胞接着試験において試験した。ＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ試験は上記した通り実施した。アルファＥベータ７−２９３／ｈｕＥ−カドヘリン試験はリガンドとしてのヒトＥ−カドヘリン−Ｆｃの使用により変更した（ヒトＥ−カドヘリン−Ｆｃ、６４８−ＥＣ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。ヒトフィブロネクチン（ｈｕＦＮ４０）とＰＲＭＩ８８６６細胞上のヒトアルファ４ベータ７受容体の相互作用を阻害するｈｕ５０４．３２の相対的能力も調べた。これらの試験のために使用したＲＰＭＩ８８６６／ｈｕフィブロネクチン（ｈｕＦＮ４０）試験はプレートをコーティングするためにヒトフィブロネクチンアルファ−キモトリプシン処理フラグメント４０ｋＤａ（Ｆ１９０３、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外は本明細書に開示したＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ試験と同様のフォーマットとした。
【０３５９】
マウスベータ７含有受容体とマウスＭＡｄＣＡＭ−１又はマウスＶＣＡＭ−１との相互作用を阻害するｈｕ５０４．３２変異体の能力を調べた。マウスＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ及びマウスＶＣＡＭ−１−Ｆｃはｈｕ５０４．３２変異体によりマウスベータ７を発現するマウスリンパ腫アルファ４＋細胞（３８Ｃ１３ベータ７細胞）との相互作用を阻害された。マウスＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ及びＶＣＡＭ−１−Ｆｃの細胞接着試験をヒトＭＡｄＣＡＭ−１及びＶＣＡＭに関して本明細書に記載したものと同様に実施した。リガンドがＦｃ領域に融合する場合は、細胞上のＦｃ受容体を室温で５分間１０６個の細胞当たり０．５μｇの抗−ＣＤ１６／３２抗体（抗ＦｅγＩＩＩ／ＩＩ受容体抗体、カタログ番号５５３１４２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でブロッキングした。５０μｌの試験培地中１５０，０００標識細胞を各ウェルに添加し、３７℃で１３分インキュベートした。ウェルを洗浄し、そして、溶解した細胞から放出された蛍光の量を上記した通り測定した。ヒト細胞接着試験のための対照抗体はヒト血清アルブミンに対するマウスモノクローナル抗体６Ｂ１１とした（カタログ番号ａｂ１０２４４、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）。マウス細胞接着試験のための対照抗体はインテグリンベータ７への結合に関してリガンド又はＦｉｂ５０４と競合しないラット抗マウスインテグリンベータ７抗体Ｍ２９３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とした。
【０３６０】
ヒト及びマウスの細胞接着試験について３連の試験の結果をそれぞれ表９及び１０に示す。
【０３６１】
【表９】
2008512382.tif 000038
【０３６２】
【表１０】
2008512382.tif 000039
ｈｕ５０４．３２抗体は重鎖ＣＤＲ３の９４位にメチオニンを有する。変異体Ｍ９４Ｑ（又はｈｕ５０４．３２Ｑ）及びＭ９４Ｒ（又はｈｕ５０４．３２Ｒ）はそれぞれｈｕ５０４．３２変異体の９４にグルタミン又はアルギニンを有する。ｈｕ５０４．３２Ｍ、Ｑ及びＲ抗体は試験の各々においてインテグリンベータ７受容体−リガンド相互作用を実質的に低減し、従って、ベータ７媒介細胞接着の強力な阻害剤であった。
【０３６３】
（インビボの抗体ｈｕ５０４．３２Ｒ活性）
ｈｕ５０４．３２抗体変異体がインテグリンベータ７受容体−リガンド相互作用を低減し、そしてインビボのマウス炎症性腸疾患モデルにおける炎症結腸へのリンパ球のリクルートメントを低減する能力をインビボで試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣＢ１７ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）より入手した。ＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ高Ｔ細胞再形成ＳＣＩＤ結腸炎マウスは、ドナーＢＡＬＢ／ｃマウスからＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ高Ｔ細胞を単離し、そして、１００μｌＰＢＳ中３ｘ１０５個を静脈内に移行させることにより作成した。対照ＳＣＩＤマウスにはＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ高Ｔ細胞を投与しなかった。４週目におけるベースラインからの１０％体重減少又はピーク体重から１５％という投与群割付基準に合致する再形成ＣＤ４＋マウスは炎症性腸疾患を誘導したとみなし、投与のために選択した。
【０３６４】
試験抗体投与日においてドナーＢＡＬＢ／ｃマウスの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞を採取し、Ｃｒ５１で放射標識した。投与では予め抗ＧＰ１２０抗体、ｈｕ５０４．３２抗ベータ７抗体、ｈｕ５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体又は無抗体（対照）を２００μｇ／１００μｌＰＢＳ静脈内投与した。抗体投与後３０分に、Ｃｒ５１標識ＭＬＮ細胞を４ｘ１０６細胞／１００μｌの濃度で注射した。標識細胞注射後１時間にマウスを安楽死させ、脾臓、結腸及びパイアー斑を採取し、計量し、そして臓器当たりの総Ｃｒ５１放射能を測定した。図１６はこれらの試験の結果の棒グラフであり、炎症性腸疾患を経験しているマウスの結腸への放射標識Ｔ細胞のホーミングをブロックする抗体の相対的な能力を示している。炎症結腸へのＴ細胞のホーミングは陰性対照である抗ＧＰ１２０抗体と相対比較してｈｕ５０４．３２及びｈｕ５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体により阻害された。脾臓への分布は抗体の全てについて同様であった。即ちｈｕ５０４．３２及びｈｕ５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体はインビボの炎症結腸へのＴ細胞のホーミングを効果的に阻害した。
【０３６５】
抗体グリケーションはアルファ４ベータ７受容体へのＭＡｄＣＡＭ−１の結合をブロックするｈｕ５０４．３２Ｒ変異体の能力に影響していない。
【０３６６】
蛋白の非酵素的グリコシル化であるグリケーションは抗体−リガンド相互作用に影響する場合がある（例えばＫｅｎｎｅｄｙ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８（２）：２４５−５１（１９９４）参照）。５０４．３２Ｒの４９位のグリケーション、５０４．３２Ｒ変異体の軽鎖４９位（ＨＶＲ−Ｌ２相対的な位置Ｂ１）のグリケーションが観察されているが、アルファ４ベータ７受容体発現ＲＰＭＩ８８６６細胞へのＭＡｄＣＡＭ−１の結合をブロックする抗体変異体の能力に有意な影響を示していない。グリケーション及びグリケーション水準の測定は標準的な電子スプレーイオン化質量スペクトル分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により、そして、ボロネートアフィニティークロマトグラフィーにより実施した。グリケーションに関する試験に有用なボロネートアフィニティーＨＰＬＣ法は例えばＱｕａｎ  Ｃ．Ｐ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１（２０）：４４４５−４４５４（１９９９）及びＬｉ  Ｙ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，９０９：１３７−１４５（２００１）に記載されている。細胞接着試験は本明細書に開示するＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ細胞接着試験に従って実施した。
【０３６７】
本発明の別の実施形態においては、４９位におけるグリケーションは、リジン以外のアミノ酸を４９位が含む場合は低減又は排除される。本発明のポリペプチド又は抗体は４９位（ＨＶＲ−Ｌ２相対的な位置Ｂ１）のアミノ酸としてアミノ酸Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹのいずれかを包含し、ここで各文字は標準的な１文字アミノ酸標記に従うアミノ酸を指す。５０４．３２Ｒ変異体（又は他の５０４変異体）の軽鎖の４９位のアミノ酸はＲ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ又はＬからなる群より選択される。４９位において有用なアミノ酸は、例えばファージ（変異体）上にｈｕ５０４．３２ＲＦａｂをディスプレイ（ファージライブラリを作成）すること、及び、２０個の天然に存在するアミノ酸の各々に対するコドンを、４９位のコドンにおいて別個に置換することにより、選択される。４９位において改変されたｈｕ５０４．３２Ｒ変異体を発現するファージを、インテグリンベータ７及び／又はインテグリンベータ７を含む受容体、例えばアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７受容体への結合に関して試験する。ベータ７インテグリン又はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７受容体に結合するこれらの変異体を、本明細書に記載する通り、インテグリンベータ７受容体−リガンド結合を阻害する能力、及び、インビボの薬効に関して、更にスクリーニングする。別の、天然に存在する、又は天然に存在しないアミノ酸を標準的な突然変異誘発手法により４９位に置換させ、そして、細胞接着及び本明細書に記載したインビボ試験において試験してよい。或いは、軽鎖の４９位のアミノ酸はリジン（Ｋ）以外のアミノ酸であり、そして何れかの他のＨＶＲ又はフレームワーク又は軽鎖及び／又は重鎖の位置のアミノ酸を改変することにより、インテグリンベータ７の生物学的活性を低減することにより炎症の低減のために有用である結合親和性、インビトロ又はインビボの生物学的活性、薬物胴体、薬剤クリアランス及び免疫原性を示す変異体抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体を選択する。突然変異誘発及びそのようなポリペプチド又は抗体の変異体の選択は、本明細書に開示した通り、そして他の標準的手法に従って実施される。そのような変異体抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体は、本明細書に開示したヒト化Ｆｉｂ５０４変異体のいずれかにより示される結合親和性の１０，０００倍以内、或いは１００倍以内、１０００倍以内、或いは１０倍以内、或いは５倍以内、或いは２倍以内のインテグリンベータ７結合親和性を示す。
【０３６８】
上記した明細書は当業者を本発明実施可能とするために十分であると考えられる。寄託した実施形態は本発明の特定の特徴の単一の説明として意図されており、そして機能的に等価ないかなる構築も本発明の範囲内に包含されるため、本発明は寄託した構築によりその範囲において限定されるものではない。本発明における物質の寄託は本明細書に含まれる書面による説明がその最良の様式を含む本発明の如何なる特徴の実施を可能とするために不十分であることの受諾を構成せず、又それが示している特定の説明に請求項の範囲を限定するものともみなされない。実際、本明細書に示し、記載したもののほかに本発明の種々の変更が上記記載より当業者には明らかとなり、そして添付する請求項の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０３６９】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは以下の可変軽鎖及び重鎖の配列：軽鎖ヒトサブグループカッパＩコンセンサス配列（図１Ａ、配列番号２３）、重鎖ヒトＩＩＩコンセンサス配列（図１Ｂ、配列番号２４）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変軽鎖（図１Ａ、配列番号１０）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変重鎖（図１Ｂ、配列番号１１）、及び、ヒト化抗体変異体：ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変軽鎖（図１Ａ、配列番号２５）、ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変重鎖（図１Ｂ、配列番号２６）、変異体ｈｕ５０４．５（ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフトからのアミノ酸変異は変異体ｈｕ５０４．５、ｈｕ５０４．１６及びｈｕ５０４．３２について図１Ａ（軽鎖）及び図１Ｂ（重鎖）に示す通り）のアライメントを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは以下の可変軽鎖及び重鎖の配列：軽鎖ヒトサブグループカッパＩコンセンサス配列（図１Ａ、配列番号２３）、重鎖ヒトＩＩＩコンセンサス配列（図１Ｂ、配列番号２４）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変軽鎖（図１Ａ、配列番号１０）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変重鎖（図１Ｂ、配列番号１１）、及び、ヒト化抗体変異体：ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変軽鎖（図１Ａ、配列番号２５）、ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変重鎖（図１Ｂ、配列番号２６）、変異体ｈｕ５０４．５（ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフトからのアミノ酸変異は変異体ｈｕ５０４．５、ｈｕ５０４．１６及びｈｕ５０４．３２について図１Ａ（軽鎖）及び図１Ｂ（重鎖）に示す通り）のアライメントを示す。
【図１Ｃ】ベータ７結合抗体をもたらすｈｕ５０４ＫグラフトのＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ２における別のアミノ酸置換は図１Ｃに示す。
【図２】図２Ａ及び２ＢはヒトコンセンサスサブグループＩＩＩ配列の軽鎖（図２Ａ、配列番号２７）及び重鎖（図２Ｂ、配列番号２８）の完全長配列を示す。ＨＶＲは下線部である。
【図３】図３Ａ及び３ＢはラットＦｉｂ５０４超可変領域（明細書記載）をヒトカッパＩコンセンサス配列軽鎖内（図３Ａ、配列番号２９）及びヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列重鎖内（図３Ｂ、配列番号３０）にグラフトしたヒト化抗体５０４グラフトの完全長配列を示す。ＨＶＲは下線部である。
【図４】図４Ａ及び４Ｂはｈｕ５０４グラフトの軽鎖の４９位がＹ４９Ｋ置換となっているヒト化５０４Ｋグラフトの完全長配列を示す。ｈｕ５０４Ｋグラフト軽鎖は配列番号３１により示され、ｈｕ５０４Ｋグラフト重鎖は配列番号３０により示される。ＨＶＲは下線部である。
【図５】図５Ａ及び５Ｂはｈｕ５０４グラフトの重鎖の７１及び７８位がｈｕ５０４グラフト配列からＡ７１Ｒ置換及びＡ７８Ｆ置換となっているｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフトの完全長配列を示す。ｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフト軽鎖は配列番号３１により示され、ｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフト重鎖は配列番号３２により示される。ＨＶＲは下線部である。
【図６】図６Ａ及び６Ｂはｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフトの重鎖（配列番号３２）及びｈｕ５０４Ｋグラフトの軽鎖におけるＴ３１Ｄ及びＹ３２Ｌ置換（配列番号３３）を含むｈｕ５０４．３２変異体の完全長配列を示す。ＨＶＲは下線部である。
【図７】図７Ａ−図７Ｂは以下の配列識別子を用いた本発明の実施における使用のための例示されるアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク（図７Ａ、Ｂ）ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１４）ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号１５）ヒトＶＬカッパサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１６）ヒトＶＬカッパサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１７）ヒトＶＬカッパサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号１８）斜線部は軽鎖ＨＶＲを示す（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３で表示）。
【図８Ａ】図８Ａ−図８Ｂは以下の配列識別子を用いた本発明の実施における使用のための例示されるアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク（図８Ａ、Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号１９）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２０−２２）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４８）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４９−５１）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５２）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５３−５５）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５６）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５７−５８）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５９）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号６０−６２）
【図８Ｂ】図８Ａ−図８Ｂは以下の配列識別子を用いた本発明の実施における使用のための例示されるアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク（図８Ａ、Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号１９）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２０−２２）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号４８）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４９−５１）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５２）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５３−５５）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５６）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５７−５８）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔＣＤＲ（配列番号５９）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号６０−６２）
【図９】図９Ａ及び９ＢはハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ−２９３により生産されるラット抗マウスインテグリンベータ７Ｆｉｂ５０４抗体の可変鎖のアミノ酸配列を示す。ＨＶＲは下線部である。可変軽鎖は図９Ａ（配列番号１２）に示し、そして可変重鎖は図９Ｂ（配列番号１３）に示す。
【図１０】図１０Ａは種々のコンセンサス配列（ｈｕサブグループＩ−ＩＩＩ）の重鎖におけるアミノ酸位置を示す。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体の開発のために使用したコンセンサス配列、ラットＦｉｂ５０４及びｈｕ５０４−ＲＬフレームワークは本明細書の実施例に記載する。図１０Ｂは実施例１に記載する「ＲＬ」又は「ＲＦ」フレームワーク修飾の関数としてのｈｕ５０４グラフト及びｈｕ５０４Ｋグラフト抗体へのアルファ４ベータ７の相対的結合を示す棒グラフである。
【図１１Ａ−１】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ａはｈｕ５０４．１６変異体においてアミノ酸置換の限定された範囲を与えることにより実施した親和性成熟に起因するＨＶＲの変化を表にしたものである。結果は本明細書の実施例２に記載したｈｕ５０４．１６変異体における個別に修飾されたＨＶＲを有するライブラリから得ている。箱内のアミノ酸の略記はベータ７結合抗体（ファージ選択抗体）においてより頻繁に観察されたアミノ酸である。
【図１１Ａ−２】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ａはｈｕ５０４．１６変異体においてアミノ酸置換の限定された範囲を与えることにより実施した親和性成熟に起因するＨＶＲの変化を表にしたものである。結果は本明細書の実施例２に記載したｈｕ５０４．１６変異体における個別に修飾されたＨＶＲを有するライブラリから得ている。箱内のアミノ酸の略記はベータ７結合抗体（ファージ選択抗体）においてより頻繁に観察されたアミノ酸である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ｂ及び１１Ｃは実施例２に記載した突然変異誘発及び選択により検出可能なｈｕ５０４．１６変異体（軽鎖、図１１Ｂ；重鎖、図１１Ｃ）におけるアミノ酸置換の数と型を示す図１１Ａの結果の棒グラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ｂ及び１１Ｃは実施例２に記載した突然変異誘発及び選択により検出可能なｈｕ５０４．１６変異体（軽鎖、図１１Ｂ；重鎖、図１１Ｃ）におけるアミノ酸置換の数と型を示す図１１Ａの結果の棒グラフである。
【図１２】図１２は実施例２に記載したｈｕ５０４．３２変異体のＨＶＲにおける可能なアミノ酸置換の広範な範囲を与えることにより実施したアフィニティー突然変異の結果を表にしたものである。箱部は実施例２の突然変異誘発及び選択方法によりベータ７結合抗体として検出された抗体において最も頻繁に検出されたアミノ酸を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは抗マウスＦｉｂ５０４（ＡＴＣＣ−２９３）及びヒトコンセンサス（左コラム）のＨＶＲ配列を示す。実施例に記載した試験により各ＨＶＲについて観察されたアミノ酸置換（ソフトアミノ酸ランダム化、ブロードアミノ酸置換スキャン、及び限定的アミノ酸置換スキャンにより観察されたアミノ酸置換）の例（限定しない）を右側に示す（本発明の変異体に適用可能なヒト化のためにＨＶＲを修飾する有用な方法は２００４年２月１９日出願の米国暫定出願６０／５４５，８４０に記載されている）。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは抗マウスＦｉｂ５０４（ＡＴＣＣ−２９３）及びヒトコンセンサス（左コラム）のＨＶＲ配列を示す。実施例に記載した試験により各ＨＶＲについて観察されたアミノ酸置換（ソフトアミノ酸ランダム化、ブロードアミノ酸置換スキャン、及び限定的アミノ酸置換スキャンにより観察されたアミノ酸置換）の例（限定しない）を右側に示す（本発明の変異体に適用可能なヒト化のためにＨＶＲを修飾する有用な方法は２００４年２月１９日出願の米国暫定出願６０／５４５，８４０に記載されている）。
【図１４】図１４は実施例３に記載する抗体濃度の関数としてのＭＡｄＣＡＭへのＦｉｂ５０４及び変異体抗体の結合の例示的グラフ表示である。抗体に関するＩＣ５０及びＩＣ９０値を測定した。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは抗体の６ＨＶＲに関するＫａｂａｔナンバリングシステム及び相対的ナンバリングシステム（Ａ−Ｆ）に従った位置に関する５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体に関わる軽鎖及び重鎖のＨＶＲアミノ酸配列を示す。重鎖ＦＲ３領域の７１、７３及び７８位のアミノ酸も示す。有用なアミノ酸置換はまたＨＶＲ又は重鎖ＦＲ３領域における位置の多くについても列挙する。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは抗体の６ＨＶＲに関するＫａｂａｔナンバリングシステム及び相対的ナンバリングシステム（Ａ−Ｆ）に従った位置に関する５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体に関わる軽鎖及び重鎖のＨＶＲアミノ酸配列を示す。重鎖ＦＲ３領域の７１、７３及び７８位のアミノ酸も示す。有用なアミノ酸置換はまたＨＶＲ又は重鎖ＦＲ３領域における位置の多くについても列挙する。
【図１６】図１６は炎症性腸疾患を経験しているマウスの結腸への放射標識Ｔ細胞のホーミングをブロックする５０４．３２Ｍ及び５０４．３２Ｒ抗体の相対的能力の棒グラフである。
【図１Ａ】
2008512382.tif 000040
【図１Ｂ】
2008512382.tif 000041
【図１Ｃ】
2008512382.tif 000042
【図２】
2008512382.tif 000043
【図３】
2008512382.tif 000044
【図４】
2008512382.tif 000045
【図５】
2008512382.tif 000046
【図６】
2008512382.tif 000047
【図７】
2008512382.tif 000048
【図８Ａ】
2008512382.tif 000049
【図８Ｂ】
2008512382.tif 000050
【図９】
2008512382.tif 000051
【図１０】
2008512382.tif 000052
【図１１Ａ−１】
2008512382.tif 000053
【図１１Ａ−２】
2008512382.tif 000054
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
2008512382.tif 000056
【図１２】
2008512382.tif 000057
【図１３Ａ】
2008512382.tif 000058
【図１３Ｂ】
2008512382.tif 000059
【図１４】
2008512382.tif 000060
【図１５Ａ】
2008512382.tif 000061
【図１５Ｂ】
2008512382.tif 000062
【図１６】
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【配列表】
2008512382000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年5月29日(2007.5.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体であって、該ポリペプチド又は抗体は、
（ａ）下記：
（ｉ）配列Ａ１−Ａ１１を含むＨＶＲ−Ｌ１、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）であるもの、
（ｉｉ）配列Ｂ１−Ｂ８を含むＨＶＲ−Ｌ２、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）であるもの、
（ｉｉｉ）配列Ｃ１−Ｃ１０を含むＨＶＲ−Ｌ３、ここでＣ１−Ｃ１０はＱＱＧＮＳＬＬＰＮＴ（配列番号３）であるもの、
（ｉｖ）配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であるもの、
（ｖ）配列Ｅ１−Ｅ１７を含むＨＶＲ−Ｈ２、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）であるもの；および、
（ｖｉ）配列Ｆ１−Ｆ１１を含むＨＶＲ−Ｈ３、ここでＦ１−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）であるもの、
からなる群より選択される少なくとも１つのＨＶＲ配列；
を含み、
少なくとも１つのＨＶＲが、配列番号１、２、３、４、５又は６に示す何れかの配列において、少なくとも１つの残基の修飾を含む変異体ＨＶＲである、
抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体。
【請求項２】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１内のＡ８がＳ、Ｄ又はＴであり、かつＡ９がＬである請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項３】
ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号１又は７又は８又は９を含み、ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号２又は６７又は６８を含み、ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号３を含み、ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号４を含み、ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号５を含み、ＨＶＲ−Ｈ３が相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１に対して配列番号６又は６６を含むか、相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１に対して配列番号６３又は６４又は６５を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項４】
前記ポリペプチド又は抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）又は配列番号１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＱからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ及びＳからなる群より選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）又は配列番号２、６７又は６８の変異体であり、ここでアミノ酸Ｂ１はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸからなる群より選択され（ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ４はＳ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群より選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）又は配列番号３の変異体であり、ここでアミノ酸Ｃ８はＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＹからなる群より選択され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であり、
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）又は配列番号５の変異体であり、ここでアミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸１３はＰ、Ｈ、Ｄ及びＡからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群より選択され；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）又は配列番号６、６３、６４、６５又は６６の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２はＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、ならびに／又は、アミノ酸Ｆ１１はＦ及びＹからなる群より選択される、
請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項５】
前記抗体がヒト化されている請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項６】
前記フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列である請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項７】
前記修飾が置換、挿入又は欠失である請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項８】
ＨＶＲ−Ｌ１変異体が以下の位置：Ａ２（Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；
Ａ３（Ｓ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＴ）；Ａ４（Ｅ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶ）；Ａ５（Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹ）；Ａ６（Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲ）；Ａ７（Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ８（Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｔ又はＮ）；Ａ９（Ｌ、Ｙ、Ｉ又はＭ）；Ａ１０（Ｌ、Ａ、Ｉ、Ｍ又はＶ）及びＡ１１（Ｈ、Ｆ、Ｓ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）置換を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項９】
ＨＶＲ−Ｌ２変異体が以下の位置：Ｂ１（Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｓ、Ｅ、Ｃ、Ｄ、Ｇ又はＭ）、Ｂ５（Ｑ又はＳ）、Ｂ６（Ｓ、Ｒ又はＬ）及びＢ７（Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｋ又はＶ）の何れかの組み合わせにおいて１〜４（１、２、３又は４）置換を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１０】
ＨＶＲ−Ｌ３変異体が位置Ｃ８（Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｔ又はＶ）において少なくとも１つの置換を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１１】
ＨＶＲ−Ｈ２変異体が以下の位置：Ｅ２（Ｙ、Ｖ、Ｄ又はＦ）、Ｅ６（Ｓ又はＧ）、Ｅ１０（Ｓ又はＹ）、Ｅ１２（Ｎ、Ａ、Ｄ又はＴ）、Ｅ１３（Ｐ、Ｄ、Ａ又はＨ）、Ｅ１５（Ｌ又はＶ）、Ｅ１７（Ｓ又はＧ）の何れかの組み合わせにおいて１〜７（１、２、３、４、５、６又は７）置換を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１２】
ＨＶＲ−Ｈ３変異体が以下の位置：Ｆ２（Ｒ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＳ）及びＦ１１（Ｆ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて１又は２置換を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１３】
配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１４】
配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１５】
配列番号９の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１６】
フレームワーク位置に少なくとも１つの修飾をさらに含み、該少なくとも１つの修飾が重鎖位７１又は７３又は７８にある、請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１７】
７１位のアミノ酸がＲ又はＡであり、そして７３位のアミノ酸がＮ又はＴであり、そして７８位のアミノ酸がＦ又はＡ又はＬである請求項１６記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１８】
７１、７３及び／又は７８位に置換を含む重鎖ヒトサブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１６記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項１９】
前記置換がＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ａ又はＬ７８Ｆである請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２１】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８がＳである請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２２】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８がＤである請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２３】
変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９がＬである請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２４】
配列ＨＶＲ−Ｈ２の位置Ｅ１−Ｅ１及び配列ＨＶＲ−Ｈ３の位置Ｆ１−Ｆ１１の間のフレームワーク配列がＨＦＲ３−１−ＨＦＲ３−３１であり、そしてＨＦＲ３−６がＡ又はＲであり、ＨＦＲ３−８がＮ又はＴであり、そしてＨＦＲ３−１３がＬ又はＡ又はＦである、請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項２５】
ヒト化抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントであって、ここで該抗体又は結合フラグメントのヒトベータ７に対する１価の親和性が、図１Ａ（配列番号１０）及び／又は図１Ｂ（配列番号１１）あるいは図９Ａ（配列番号１２）及び／又は図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含む抗体の１価の親和性と実質的に同じか、またはそれより大きい、抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２６】
前記親和性が図１Ａ（配列番号１０）及び図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１０，０００倍高い、請求項２５記載の抗体又はその結合フラグメント。
【請求項２７】
ヒトベータ７に対する前記抗体の１価の親和性が、図１Ａ（配列番号１０）及び図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体の１価の親和性より少なくとも３倍高い、請求項２６記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項２８】
図１Ａ（配列番号１０）及び図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体が、ＨＢ−２９３の標記を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＴＣＣ下に寄託されているハイブリドーマ細胞株により生産される請求項２５又は２６記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２９】
前記結合親和性がＫｄ値で表示される請求項２５記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３０】
前記結合親和性がＢｉａｃｏｒｅＴＭ又はラジオイムノアッセイにより測定される請求項２５記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３１】
ヒトκサブグループＩ軽鎖コンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項３２】
重鎖ヒトサブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１記載のポリペプチド又は抗体。
【請求項３３】
前記ポリペプチド又は抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）又は配列番号１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＱからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ及びＳからなる群より選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）又は配列番号２、６７又は６８の変異体であり、ここでアミノ酸Ｂ１はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸからなる群より選択され（ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ４はＳ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ及びＲからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群より選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）又は配列番号３の変異体であり、ここでアミノ酸Ｃ８はＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＹからなる群より選択され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であり、
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）又は配列番号５の変異体であり、ここでアミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ及びＤからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸１３はＰ、Ｈ、Ｄ及びＡからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群より選択され、ならびに／又は、アミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群より選択され；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）又は配列番号６、６３、６４、６５又は６６の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２はＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、ならびに／又は、アミノ酸Ｆ１１はＦ及びＹからなる群より選択される、
請求項２５記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３４】
重鎖フレームワーク７１位がアミノ酸Ｒ又はＡを含み、及び／あるいは重鎖フレームワーク７３位がアミノ酸Ｔ又はＮを含み、及び／あるいは重鎖フレームワーク７８位がアミノ酸Ｆ又はＡ又はＬを含み、配列が重鎖フレームワーク７１位に含む、請求項３３記載の抗体又は結合フラグメント。
【請求項３５】
ヒトベータ７インテグリンサブユニットと第２のインテグリンサブユニット及び／又はリガンドとの相互作用を阻害するための組成物であって、該組成物は、該ベータ７インテグリンに対する請求項１の抗体を含む、組成物。
【請求項３６】
前記第２のインテグリンサブユニットがアルファ４インテグリンサブユニットであり、かつ前記リガンドがＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ又はフィブロネクチンである請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
前記アルファ４インテグリンサブユニットがヒト由来である請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
前記リガンドがヒト由来である請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
前記第２のインテグリンサブユニットがアルファＥインテグリンサブユニットであり、かつ前記リガンドがＥ−カドヘレインである請求項３５記載の組成物。
【請求項４０】
前記アルファＥインテグリンサブユニットがヒト由来である請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記リガンドがヒト由来である請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記阻害により、炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される障害の症状が低減又は緩和される請求項３５記載の組成物。
【請求項４３】
請求項１のポリペプチド又は抗体及び製薬用担体を含む、障害を経験している哺乳類におけるベータ７インテグリン媒介細胞接着及び／又はリクルートメントを調節するための組成物であって、かつ有効量である、組成物。
【請求項４４】
前記障害が炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
前記哺乳類がヒトである請求項４３記載の組成物。
【請求項４６】
第２の生物薬剤又は化学療法剤を更に含む、請求項４３記載の組成物。
【請求項４７】
前記調節するための組成物が、アルファ４インテグリン、アルファＥインテグリン、ＭＡｄＣａｍ、ＶＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン及び／又はフィブロネクチンとのベータ７インテグリンの相互作用を阻害する、請求項４３記載の組成物。
【請求項４８】
請求項１、４、２５又は３３のいずれかに記載の抗ベータ７結合ポリペプチド、抗体又はその結合フラグメント及び製薬用担体を含む組成物。
【請求項４９】
請求項１、４、２５又は３３のいずれかに記載の抗ベータ７結合ポリペプチド、抗体又はその結合フラグメントを含む組成物と、製薬用担体と、該組成物が障害を治療する方法における使用のためのものであることを示すラベルを含む製造物品であって、ここで該障害が炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される、製造物品。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年９月３日出願の米国暫定出願番号６０／６０７，３７７に対して３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下に優先権を請求する３７ＣＦＲ§１．５３（ｂ）（１）の下に出願された非暫定出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は一般的に分子生物学及び成長因子調節の分野に関する。より詳細には、本発明はベータ７サブユニットを含有するインテグリンの生物学的活性のモジュレーター及び該モジュレーターの使用に関わる。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
インテグリンは細胞接着から遺伝子調節まで多くの細胞過程に関与しているα／βヘテロ２量体細胞表面受容体である（非特許文献１及び非特許文献２）。数種のインテグリンは疾患過程に関連付けられており、薬剤発見の潜在的標的として広範に注目されている（非特許文献３）。免疫系においては、インテグリンは炎症過程の間の白血球の移動、接着及び浸潤に関与している（非特許文献４）。インテグリンの示差的発現は細胞の接着特性を調節し、そして異なるインテグリンが異なる炎症応答に関与している。非特許文献５。ベータ７インテグリン（すなわちアルファ４ベータ７（α４β７）及びアルファＥベータ７（αＥβ７））は主に単球、リンパ球、好酸球、好塩基球及びマクロファージ上で発現されるが、好中球上では発現されない。非特許文献６。α４β７インテグリンの主要リガンドは内皮表面蛋白粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）及び血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）である（非特許文献７）。炎症部位における高内皮細静脈（ＨＥＶ）上に発現されるＭＡｄＣＡＭ及び／又はＶＣＡＭへのα４β７の結合は内皮への白血球の堅固な接着とそれに続く炎症組織への溢出をもたらす（非特許文献８）。αＥβ７インテグリンに対する主要リガンドは上皮内リンパ球（ＩＥＬ）表面蛋白、Ｅカドヘレインであり、これはαＥβ７担持細胞の上皮リンパ球への接着を促進する。α４β７、ＭＡｄＣＡＭ又はＶＣＡＭに対して指向されたモノクローナル抗体は喘息のような慢性炎症性疾患（非特許文献９）、慢性関節リューマチ（ＲＡ；非特許文献１０）、結腸炎（非特許文献１１）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ；非特許文献１２；非特許文献１３）の動物モデルにおける効果的なモジュレーターであることがわかっている。ベータ７サブユニットに指向されたモノクローナル抗体はインテグリンサブユニットに結合することがわかっている（非特許文献１４）が、非ヒト又は非ヒト化抗体としては、それらは臨床的有用性を欠いている。
【０００４】
アルファ４ベータ７インテグリンとそのリガンドＭＡｄＣＡＭ及び／又はＶＣＡＭとの間の相互作用、並びに、アルファＥベータ７インテグリンとそのリガンドＥ−カドヘリンとの間の相互作用を阻害するヒト化抗体又はその結合フラグメントのような高度に特異的な化合物が望まれている。これらの化合物は喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、臓器移植の合併症及び同種移植片関連障害のような慢性炎症性疾患の治療のために有用である。
【０００５】
本明細書において引用する全ての参考文献は、特許出願及び公開物を含めて、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【非特許文献１】Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｃｅｌｌ，１９９２，６９：１１−２５
【非特許文献２】Ｈｅｍｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０，８：３６５−３６８
【非特許文献３】Ｓｈａｒａｒ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９５，１６：３５９−３７８
【非特許文献４】Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４，１７９：１１４５−１１５４
【非特許文献５】Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２：６０−６６
【非特許文献６】Ｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６０：５７７−５８４
【非特許文献７】Ｍａｋａｒｅｍ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：４００５−４０１１
【非特許文献８】Ｃｈｕｌｕｙａｎ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９５，１６：３９１−４０４
【非特許文献９】Ｌａｂｅｒｇｅ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１９９５，１５１：８２２−８２９
【非特許文献１０】Ｂａｒｂａｄｉｌｌｏ，Ｃ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９５，１６：３７５−３７９
【非特許文献１１】Ｖｉｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７：２４８８−２４９７
【非特許文献１２】Ｐｏｄａｌｓｋｉ，Ｄ．Ｋ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１，３２５：９２８−９３７
【非特許文献１３】Ｐｏｗｒｉｅ，Ｆ．ら、Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，２：１１５−１２３
【非特許文献１４】Ｔｉｄｓｗｅｌｌ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９：１４９７−１５０５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
本発明は部分的には、重要で好都合な治療標的として存在する一般的には生物学／細胞経路であるベータ７含有インテグリンの関与する生物学的経路の拮抗剤についての種々の発見に基づいている。このような生物学的経路は、例えば、炎症、特に慢性炎症性障害、例えば喘息、アレルギー、ＩＢＤ、糖尿病、移植及び対宿主性移植片病を包含する。本発明はアルファ４ベータ７インテグリンの細胞外部分へのＭＡｄＣＡＭ及びＶＣＡＭ−１の結合、及び、アルファＥベータ７インテグリン相互作用とのＥ−カドヘリン相互作用に干渉することを包含する、ベータ７インテグリン媒介細胞接着及び／又はリクルートメント（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）に干渉することに基づいた組成物及び方法を提供する。本明細書に記載した本発明の拮抗剤はベータ７インテグリンを介した異常又は望ましくないシグナリングに関連する病理学的状態をターゲティングする場合に使用するための重要な治療薬及び診断剤を提供する。従って、本発明はＭＡｄＣＡＭ−アルファ４ベータ７結合及び胃腸上皮への白血球リクルートメント、結合及びアレルギー、喘息、ＩＢＤ（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）、糖尿病、移植に関わる炎症、対宿主性移植片病及び／又は同種移植片障害及びベータ７インテグリンにより媒介される他の生物学的／生理学的な活性の調節を包含する、ベータ７インテグリン媒介経路を調節することに関連する方法、組成物、キット及び製造物品を提供する。
【０００７】
１つの特徴において、本発明は治療における使用に適しており、そして、ベータ７インテグリン媒介経路の分断の種々の段階を誘発することができる抗ベータ７治療薬を提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は、Ｆａｂフラグメントとしての抗体が図１Ａ及び１Ｂ又は図９Ａ及び９Ｂに示す軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるマウスＦａｂフラグメントと実質的に同じヒトベータ７への結合親和性を有するヒト化抗ベータ７抗体を提供する。別の実施形態においては、本発明は、Ｆａｂフラグメントとしての抗体が図１Ａ及び１Ｂに示す軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列又は図９Ａ及び９Ｂに示す可変ドメイン配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるマウス又はラットＦａｂフラグメントよりも低い、例えば、少なくとも３分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７分の１又は少なくとも１０分の１である、ヒトベータ７への結合親和性を有する、ヒト化抗ベータ７抗体を提供する。或いは、本発明のヒト化抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントはヒトベータ７に対して１価の親和性を示し、その親和性は図１Ａ（配列番号１０）及び／又は図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び／又は図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含む抗体のヒトベータ７に対する１価の親和性と実質的に同じかそれより大きい。ヒトベータ７に対する大きい親和性を有する抗体又はその結合フラグメントは、図１Ａ（配列番号１０）及び／又は図１Ｂ（配列番号１１）又は図９Ａ（配列番号１２）及び／又は図９Ｂ（配列番号１３）に示す軽鎖及び重鎖の配列を含む抗体よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１００００倍高値である親和性を示す。
【０００８】
別の実施形態においては、Ｆａｂフラグメントとしての抗体が、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示す軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるげっ歯類（例えばラット又はマウス）のＦａｂフラグメントよりも高値、例えば少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０又は少なくとも１００倍高値であるヒトベータ７に対する結合親和性を有する。１つの実施形態において、上記げっ歯類ＦａｂフラグメントはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＴＣＣ  ＨＢ−２９３の下に寄託されているハイブリドーマ細胞株により生産されるＦＩＢ５０４．６４と標記されるラット抗体の可変ドメイン配列を含むＦａｂフラグメントの結合親和性を有する。別の実施形態においては、本発明のヒト化Ｆａｂフラグメントは本発明のヒト化抗ベータ７抗体のいずれかにより生産される抗体の可変ドメイン配列を含むＦａｂフラグメントの結合親和性を有する。当該分野で十分確立されている通り、リガンドのその受容体への結合親和性は種々の試験の何れかを用いて測定することができ、そして種々の定量的数値において表示できる。従って、１つの実施形態において、結合親和性はＫｄ値として表示し、内因性結合親和性（例えば最小限化されたアビディティー作用を伴う）を反映している。一般的に、そして好ましくは、結合親和性は無細胞系又は細胞関連の状況の何れかに関わらず、インビトロで測定される。本明細書において詳述する通り、結合親和性における倍差は、Ｆａｂ形態のヒト化抗体の結合親和性の値及び参照物／比較物のＦａｂ抗体（例えばドナー超可変領域配列を有するマウス抗体）の結合親和性の値の比として定量することができ、ここで結合親和性の値は同様の試験条件下で測定される。即ち、１つの実施形態において、結合親和性における倍差は、Ｆａｂ形態のヒト化抗体及び上記参照物／比較物のＦａｂ抗体のＫｄ値の比として測定される。例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｂ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＥＬＩＳＡを包含する本明細書に記載するものを包含する当該分野で知られた多くの試験の何れかを用いることにより結合親和性の測定値を得ることができる。
【０００９】
種々の特徴及び実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体は本出願の潜在的請求項の以下のセット：
（ａ）下記：
（ｉ）配列Ａ１−Ａ１１を含むＨＶＲ−Ｌ１、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）であるもの、
（ｉｉ）配列Ｂ１−Ｂ８を含むＨＶＲ−Ｌ２、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）であるもの、
（ｉｉｉ）配列Ｃ１−Ｃ９を含むＨＶＲ−Ｌ３、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）であるもの、
（ｉｖ）配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であるもの、
（ｖ）配列Ｅ１−Ｅ１７を含むＨＶＲ−Ｈ２、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）であるもの；および、
（ｖｉ）配列Ｆ２−Ｆ１１を含むＨＶＲ−Ｈ３、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）であるもの、
からなる群より選択される少なくとも１、２、３、４又は５又は超可変領域（ＨＶＲ）配列；
を含む抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントを含む抗体を指向している。
【００１０】
請求項１のポリペプチド又は抗体の実施形態においては、このポリペプチド又は抗体は、少なくとも１つの変異体ＨＶＲを含み、この変異体ＨＶＲの配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８及び９に示す配列のうちの少なくとも１つに、少なくとも１つの残基の修飾を含む。
【００１１】
請求項１又は２の別の実施形態においては、本発明はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントを含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）を含み；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）を含み；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）を含み；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）を含み；
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）を含み；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３は相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１についてアミノ酸配列ＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）を含むか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）である。
【００１２】
請求項１の更に別の実施形態又は実施形態の何れかにおいて、本発明はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む抗ベータ７抗体又はそのベータ７結合フラグメントを含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここでＡ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）又は配列番号１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群より選択され、及び／又は、アミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ及びＲからなる群より選択され、及び／又は、アミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＱからなる群より選択され、及び／又は、アミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ及びＳからなる群より選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここでＢ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２）、ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６７）又はＸＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号６８、ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）又は配列番号２、６７又は６８の変異体であり、ここでアミノ酸Ｂ１はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸからなる群より選択され（ここでＸは何れかのアミノ酸を示す）、及び／又はアミノ酸Ｂ４はＳ及びＤからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ及びＲからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群より選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここでＣ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号３）又は配列番号３の変異体であり、ここでアミノ酸Ｃ８はＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＹからなる群より選択され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号４）であり、
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここでＥ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）又は配列番号５の変異体であり、ここでアミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ及びＤからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸１３はＰ、Ｈ、Ｄ及びＡからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群より選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群より選択され；そして、
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここでＦ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６６）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここでＦ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６４）又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号６５）又は配列番号６、６３、６４、６５又は６６の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２はＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、及び／又は、アミノ酸Ｆ１１はＦ及びＹからなる群より選択される。
【００１３】
請求項１の１つの実施形態又は本発明の抗体の何れかにおいて、重鎖フレームワーク７１位（Ｋａｂａｔナンバリング法による）におけるアミノ酸はＲ、Ａ及びＴからなる群より選択され；及び／又は重鎖フレームワーク７３位（Ｋａｂａｔナンバリング法による）におけるアミノ酸はＮ及びＴからなる群より選択され；及び／又は重鎖フレームワーク７８位（Ｋａｂａｔナンバリング法による）におけるアミノ酸はＦ、Ａ及びＬからなる群より選択される。
【００１４】
請求項１の１つの実施形態又は本発明の抗体の何れかにおいて、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ１は配列番号１を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ２は配列番号２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｌ３は配列番号３を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ１は配列番号４を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ２は配列番号５を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲ−Ｈ３は、相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１に配列番号６又は６６を、又は相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１に配列番号６３、６４又は６５を含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１はＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号７）を含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１はＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号８）を含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号９）を含む。１つの実施形態においてこれらの配列（本明細書に記載する通りの組み合わせにおいて）を含む抗体はヒト化又はヒト型のものである。
【００１５】
１つの特徴において、本発明は１、２、３、４、５又は６つのＨＶＲを含む抗体を提供し、ここで各ＨＶＲは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８及び９からなる群より選択される配列を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなるものであり、そしてここで配列番号１、７、８又は９はＨＶＲ−Ｌ１に相当し、配列番号２はＨＶＲ−Ｌ２に相当し、配列番号３はＨＶＲ−Ｌ３に相当し、配列番号４はＨＶＲ−Ｈ１に相当し、配列番号５はＨＶＲ−Ｈ２に相当し、そして配列番号６はＨＶＲ−Ｈ３に相当する。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号１、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号７、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号８、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号９、２、３、４、５及び６を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々はこの順序において、配列番号９、２、３、４、５及び６６、又は配列番号９、２、３、４、５、６３、又は配列番号９、２、３、４、５、６４、又は配列番号９、２、３、４、５、６５、又は配列番号９、６７、３、４、５、６４、又は配列番号９、６８、３、４、５、６４を含む。
【００１６】
本発明の抗体における変異体ＨＶＲはＨＶＲ内の１つ以上の残基の修飾を有してよく、及び／又はフレームワーク領域をヒト化してよい。ＨＶＲ及び／又はフレームワークの修飾が存在する本発明の実施形態は例えば本出願の以下の潜在的請求項を包含する。
【００１７】
請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここで変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＳ、Ｄ又はＴであり、そしてＡ９はＬであるもの。
３．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここで抗体はヒト化されているもの。
４．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでフレームワーク配列の少なくとも一部はヒトコンセンサスフレームワーク配列であるもの。
５．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここで上記修飾が置換、挿入又は欠失であるもの。
６．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｌ１変異体が以下の位置：Ａ２（Ｇ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ３（Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＴ）；Ａ４（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶ）；Ａ５（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹ）；Ａ６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲ）；Ａ７（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ８（Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ）；Ａ９（Ｌ、Ｉ又はＭ）；Ａ１０（Ａ、Ｉ、Ｍ又はＶ）及びＡ１１（Ｆ、Ｓ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）置換を含むもの。
７．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｌ２変異体が以下の位置：Ｂ１（Ｎ）、Ｂ５（Ｓ）、Ｂ６（Ｒ又はＬ）及びＢ７（Ｔ、Ｅ、Ｋ又はＶ）のの何れかの組み合わせにおいて１〜４（１、２、３又は４）置換を含むもの。
８．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｌ３変異体が位置Ｃ８（Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｔ又はＶ）において少なくとも１つの置換を含むもの。
９．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｈ２変異体が以下の位置：Ｅ２（Ｖ、Ｄ又はＦ）、Ｅ６（Ｇ）、Ｅ１０（Ｙ）、Ｅ１２（Ａ、Ｄ又はＴ）、Ｅ１３（Ｄ、Ａ又はＨ）、Ｅ１５（Ｖ）、Ｅ１７（Ｇ）の何れかの組み合わせにおいて１〜７（１、２、３、４、５、６又は７）置換を含むもの。
１０．請求項１又はその実施形態の１つの抗体、ここでＨＶＲ−Ｈ３変異体が以下の位置：Ｆ２（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＳ）及びＦ１１（Ｙ）の何れかの組み合わせにおいて１又は２置換を含むもの。
１１．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含むもの。
１２．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含むもの。
１３．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって配列番号９の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１を含むもの。
１４．請求項１１〜１３の何れか１項に記載の抗体であって、７１、７３及び／又は７８位に置換を含む重鎖サブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含むもの。
１５．請求項１４又はその実施形態の１つの抗体であって、置換がＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及び／又はＮ７８Ａであるもの。
１６．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、配列番号３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含むもの。
１７．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、変異体ＨＶＲ−Ｌ１のＡ８がＳであるもの。
１８．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、変異体ＨＶＲ−Ｌ１のＡ８がＤであるもの。
１９．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、変異体ＨＶＲ−Ｌ１のＡ９がＬであるもの。
２０．請求項１又はその実施形態の１つの抗体であって、配列番号Ｅ１−Ｅ１７とＦ１−Ｆ１１の間のフレームワーク配列がＨＦＲ３−１−ＨＦＲ３−３１であり、ＨＦＲ３−６はＡ又はＲであり、ＨＦＲ３−８はＮ又はＴであり、そしてＨＦＲ３−１３がＬ又はＡ又はＦであるもの。
２１．ヒト化抗ベータ７抗体であって、ここで抗体のヒトベータ７に対する１価の親和性が図９に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含むラット抗体の１価の親和性と実質的に同じであるもの。
２２．ヒト化抗ベータ７抗体であって、ここで抗体のヒトベータ７に対する１価の親和性が図９に示す軽鎖及び重鎖の可変配列を含むラット抗体の１価の親和性の少なくとも３倍高値であるもの。
２３．請求項１１又は２２記載のヒト化抗体であって、ラット抗体がＨＢ−２９３の標記を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＴＣＣ下に寄託されているハイブリドーマにより生産されるもの。
２４．請求項１１〜２３の何れかに記載の抗体であって、結合親和性がＫｄ値で表示されるもの。
２５．請求項１１〜２４の何れかに記載の抗体であって、結合親和性がＢｉａｃｏｒｅＴＭ又はラジオイムノアッセイで測定されるもの。
２６．請求項１記載の抗体であって、ヒトκサブグループ軽鎖コンセンサスフレームワーク配列を含むもの。
２７．請求項１記載の抗体であって、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を含むもの。
２８．請求項１７記載の抗体であって、フレームワーク配列が７１、７３及び／又は７８位に置換を含むもの。
２９．請求項１８記載の抗体であって、上記置換がＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及び／又はＮ７８Ａにあるか、７１位の置換アミノ酸がＲ又はＡであり、及び／又は７８位のアミノ酸置換がＮ又はＴであり、及び／又は７８位のアミノ酸置換がＬ又はＡ又はＦであるもの。
３０．請求項１８記載の抗体であって、上記置換がＬ７８Ｆ又はＡ７８Ｆ又はＡ７８Ｌ又はＬ７８Ａであるもの。
３１．ヒトベータ７インテグリンサブユニットの第２のインテグリンサブユニット及び／又はリガンドとの相互作用を阻害する方法であって、請求項１〜３０の何れか１項の抗体を第２のインテグリンサブユニット及び／又はリガンドに接触させることによる方法。
３２．請求項３１記載の方法であって、第２のインテグリンサブユニットがアルファ４インテグリンサブユニットであり、そしてリガンドがＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ又はフィブロネクチンであるもの。
３３．請求項３２記載の方法であって、アルファ４インテグリンサブユニットがヒト型であるもの。
３４．請求項３３記載の方法であって、リガンドがヒト型であるもの。
３５．請求項３２記載の方法であって、第２のインテグリンサブユニットがアルファＥインテグリンサブユニットであり、そしてリガンドがＥ−カドヘリンであるもの。
３６．請求項３５記載の方法であって、アルファＥインテグリンサブユニットがヒト型であるもの。
３７．請求項３６記載の方法であって、リガンドがヒト型であるもの。
３８．請求項３１記載の方法であって、阻害により、炎症、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、糖尿病、臓器移植に起因する炎症、対宿主性移植片病、及び、同種移植片障害に関連する炎症からなる群より選択される障害の症状が低減又は緩和されるもの。
【００１８】
本発明の別の実施形態は以下のものを包含する。
【００１９】
１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１変異体は配列番号１、７、８又は９であるか、又は以下の位置：Ａ２（Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ３（Ｓ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＴ）；Ａ４（Ｅ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶ）；Ａ５（Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹ）；Ａ６（Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲ）；Ａ７（Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶ）；Ａ８（Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ）；Ａ９（Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＭ）；Ａ１０（Ｌ、Ａ、Ｉ、Ｍ又はＶ）及びＡ１１（Ｈ、Ｆ、Ｓ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて相対的な位置Ａ１〜Ａ１１において１〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）置換を含む配列番号１、７、８又は９のＨＶＲ−Ｌ１変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号２、６７又は６８であるか、又は、以下の位置：Ｂ１（Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ又はＸ（Ｘは何れかのアミノ酸を示す））、Ｂ４（Ｓ）、Ｂ５（Ｑ又はＳ）、Ｂ６（Ｓ、Ｒ又はＬ）及びＢ７（Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｋ又はＶ）の何れかの組み合わせにおいて相対的な位置Ｂ１−Ｂ８において１〜４（１、２、３、４、４又は５）置換を含む配列番号２、６７又は６８のＨＶＲ−Ｌ２変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号３であるか、又はＨＶＲ−Ｌ３は位置Ｃ８（Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｔ又はＶ）のような位置において相対的な位置Ｃ１−Ｃ８において少なくとも１つの置換を含む配列番号３のＨＶＲ−Ｌ３変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号４である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号５であるか、又は以下の位置：Ｅ２（Ｙ、Ｖ、Ｄ又はＦ）、Ｅ６（Ｓ又はＧ）、Ｅ１０（Ｓ又はＹ）、Ｅ１２（Ｎ、Ａ、Ｄ又はＴ）、Ｅ１３（Ｐ、Ｄ、Ａ又はＨ）、Ｅ１５（Ｌ又はＶ）、Ｅ１７（Ｓ又はＧ）の何れかの組み合わせにおいて相対的な位置Ｅ１〜Ｅ１７において１〜７（１、２、３、４、５、６又は７）置換を含むＨＶＲ−Ｈ２の変異体である。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号６、６３、６４、６５又は６６であるか、又は、以下の位置：Ｆ２（Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＳ）及びＦ１１（Ｆ又はＹ）の何れかの組み合わせにおいて、配列番号６３，６４及び６５に関しては相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１において、又は、配列番号６及び６６に関しては相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１において、１又は２置換を含む配列番号６、６３、６４、６５又は６６のＨＶＲ−Ｈ３変異体である。本明細書の観点においては置換アミノ酸は当該分野で知られた、及び／又は、本明細書に記載した手法を用いて日常的に評価できるものであるため、各位置に続くカッコ内の文字は、適切には別のアミノ酸の当業者のよく知るコンセンサス又は他のアミノ酸に関する例示される置換（即ち置き換え）アミノ酸を示す。
【００２０】
１つの実施形態においてＨＶＲ−Ｌ１は配列番号１の配列を有する。１つの実施形態において変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＤである。１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＳである。１つの実施形態において変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬである。１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＤであり、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬである。１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＳであり変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬである。本発明の１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３におけるこれらの変異は、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号６又は６６（相対的な位置Ｆ２−Ｆ１１に関して）又は配列番号６３又は６４又は６５（相対的な位置Ｆ１−Ｆ１１に関して）を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２１】
１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８はＩであり、そしてＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２２】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８、Ａ９及びＡ１０はそれぞれＤ、Ｌ及びＶであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２３】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８及びＡ９はそれぞれＮ及びＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２４】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ８及びＡ９はそれぞれＰ及びＬであり、そして変異体ＨＶＲ−Ｌ２におけるＢ６及びＢ７はそれぞれＲ及びＴであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２５】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ２、Ａ４、Ａ８、Ａ９及びＡ１０はそれぞれＳ、Ｄ、Ｓ、Ｌ及びＶであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２６】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ５及びＡ９はそれぞれＤ及びＴであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２７】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ５及びＡ９はそれぞれＮ及びＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２８】
１つの実施形態において、変異体ＨＶＲ−Ｌ１におけるＡ９はＬであり、この変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号２、３、４、５及び６を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の抗体又は抗ベータ７結合ポリペプチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、各ＨＶＲは、この順序において、配列番号９、２、３、４、５及び６４を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。別の実施形態において、各ＨＶＲは、配列番号９、６７、３、４、５及び６４をこの順序において含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。別の実施形態において、各ＨＶＲは、配列番号９、６８、３、４、５及び６４をこの順序において含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。別の実施形態において、各ＨＶＲは、配列番号９、２又は６７又は６８、３、４、５及び６６をこの順序において含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる。
【００３０】
一部の実施形態においては、上記変異体ＨＶＲ−Ｌ１抗体変異体は更に、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。抗体変異体がＨＶＲ−Ｌ１Ａ８（Ｐ）及びＡ９（Ｌ）及びＨＶＲ−Ｌ２Ｂ６（Ｒ）及びＢ７（Ｔ）を含む場合は、一部の実施形態においては上記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２変異体は更にＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号３、４、５及び６に示す配列をこの順序に含む。
【００３１】
一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の１つの実施形態において、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ１０がＶである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号３を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＣ８がＬである変異体ＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＣ８がＷであるＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号６を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記抗体の変異体はＦ１がＱである変異体ＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ２を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び５に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＦ１がＲである変異体ＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ２を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び５に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号１を含むＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態においては、本発明の変異体抗体はＡ４がＱである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ６がＩである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ７がＳである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。１つの実施形態において、本発明の変異体抗体はＡ８がＤ又はＮである変異体ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号２、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号２を含むＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＢ１がＮである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ５がＳである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ６がＬである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ７がＶである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態においては、本発明の抗体はＢ７がＥ又はＫである変異体ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、３、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号３を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＣ８がＷ、Ｙ、Ｒ又はＳである変異体ＨＶＲ−Ｌ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、４、５及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号５を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ２がＦである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ２がＶ又はＤである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ６がＧである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１０がＹである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１２がＡ、Ｄ又はＴである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１３がＤ、Ａ又はＮである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１５がＶである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＥ１７がＧである変異体ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明の抗体は配列番号６を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はＦ１１がＹである変異体ＨＶＲ−Ｈ３を含む。１つの実施形態において、上記変異体抗体は更にＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで各々は配列番号１、２、３、４及び６に示した配列をこの順序で含む。一部の実施形態においては、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７、８又は９を含む。一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００４０】
一部の実施形態においては、これらの抗体は更にヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、フレームワークコンセンサス配列は７１、７３及び／又は７８位に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態においては、７１位はＡ、７３位はＴ及び／又は７８位はＡである。これらの抗体の１つの実施形態において、これらの抗体は更にヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。
【００４１】
宿主被験体における使用のための治療薬は好ましくは、その宿主において薬剤に対抗する免疫原性応答を殆ど、又は、全く誘発しない。１つの実施形態において、本発明はこのような薬剤を提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は宿主被験体において配列番号１０及び／又は１１（図１Ａ及び１Ｂ）又は配列番号１２及び／又は１３（ラット抗マウスＦｉｂ５０４アミノ酸配列を示す図９Ａ及び９Ｂ）を含む配列を含む抗体と比較して、実質的に低減された水準のヒト抗げっ歯類抗体応答（例えば抗マウス又は抗ラット応答）又はヒト抗ヒト応答を誘発する及び／又は誘発すると予測されるヒト化抗体を提供する。別の実施形態において、本発明はヒト抗げっ歯類（例えばヒト抗マウス（ＨＡＭＡ）又はヒト抗マウス）又はヒト抗ヒト抗体応答（ＨＡＨＡ）を誘発しない、及び／又は、誘発しないと予測されるヒト化抗体を提供する。
【００４２】
本発明のヒト化抗体はその重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインにおいて１つ以上のヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域（例えばフレームワーク）を含む。一部の実施形態においては、追加的な修飾１つ以上がヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域配列内に存在する。１つの実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインはヒトコンセンサスフレームワークを含み、これは１つの実施形態においてはサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列である。１つの実施形態において、本発明の抗体は少なくとも１つのアミノ酸位置において修飾された変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む。例えば、１つの実施形態において、変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列は７１、７３、７８及び／又は９４位の１つ以上において置換を含んでよい。１つの実施形態においては、そのような置換は何れかの組み合わせにおけるＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ａ及び／又はＲ９４Ｍである。
【００４３】
当該分野で知られるとおり、そして後により詳細に説明するとおり、アミノ酸位置／抗体の超可変領域を決定する境界は、当該分野で知られた観点及び種々の定義に応じて変動することができる（後述参照）。可変ドメイン内の一部の位置は、それらの位置がある１つのセットの基準の下においては超可変領域内にあると考えられるが、異なるセットの基準の下においては超可変領域外にあると考えられるという点において、ハイブリッド超可変位置とみなしてよい。これらの位置の１つ以上はまた伸長した超可変領域内にも存在することができる（後述参照）。本発明はこれらのハイブリッド超可変位置内の修飾を含む抗体を提供する。１つの実施形態において、ハイブリッド超可変位置は重鎖可変ドメイン内の位置２６−３０、３３−３５Ｂ、４７−４９、４９、５７−６５、９３、９４及び１０２の１つ以上を包含する。１つの実施形態において、これらのハイブリッド超可変位置は軽鎖可変ドメイン内の位置２４−２９、３５−３６、４６−４９、４９、５６及び９７の１つ以上を包含する。１つの実施形態において、本発明の抗体はハイブリッド超可変位置１つ以上において修飾された変異体ヒトサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体は位置２８−３５、４９、５０、５２ａ、５３、５４、５８−６１、６３、６５、９４及び１０２の１つ以上において修飾された変異体ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む重鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、抗体はＴ２８Ｆ、Ｆ２９Ｉ、Ｓ３０Ｔ、Ｓ３１Ｎ、Ｙ３２Ｎ、Ａ３３Ｙ、Ｍ３４Ｗ及びＳ３５Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ４９Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＶ５０Ｆ又はＶ５０Ｄ又はＶ５０Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ５３Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ５４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ５８Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ６０Ｎ又はＡ６０Ｄ又はＡ６０Ｔ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＤ６１Ｐ又はＤ６１Ａ又はＤ６１Ｈ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＶ６３Ｌ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ６５Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＲ９４Ｍ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＲ９４Ａ又はＲ９４Ｅ又はＲ９４Ｇ又はＲ９４Ｑ又はＲ９４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＧ９５Ｔ置換を含む。１つの実施形態において、抗体は位置２８−３５、４９、５０、５２ａ、５３、５４、５８−６１、６３、６５、９４及び１０２において置換１つ以上を有し、そして更に、Ｒ７１Ａ又はＮ７３Ｔ又はＬ７８Ａ又はＬ７８Ｆの１つ以上を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ１０２Ｆ置換を含む。これらの置換は重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及び／又はＨＶＲ−Ｈ３にあることが図１Ｂを参照することによりわかる。
【００４４】
１つの実施形態において本発明の抗体は位置２７、２９−３１、３３、３４、４９、５０、５３−５５、９１及び９６の１つ以上において修飾された変異体ヒトサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。１つの実施形態において、抗体はＱ２７Ｅ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＩ２９Ｖ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ３０Ｄ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＮ３１Ｔ又はＮ３１Ｓ又はＮ３１Ｄ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ３２Ｌ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ３４Ｈ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ４９Ｋ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ５０Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ５３Ｑ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＬ５４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＥ５５Ｉ又はＥ５５Ｖ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ９１Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＷ９６Ｎ又はＷ９６Ｌ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ２５Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ２５からＧ、Ｓ、Ｔ又はＶへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体は置換の以下の群の１つ以上から選択される修飾を含む。例えば、１つの実施形態において、抗体はＳ２６からＧ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ又はＴへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＱ２７からＥ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ又はＶへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ２８からＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ又はＹへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＩ２９からＶ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ又はＲへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ３０からＤ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ又はＶへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＮ３１からＤ、Ｔ、Ｅ又はＧへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ３２からＬ、Ｉ又はＭへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＬ３３からＡ、Ｉ、Ｍ又はＶへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ３４からＨ、Ｆ、Ｙ又はＳへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ４９からＫ又はＮへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＡ５０Ｙ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＳ５３Ｑ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＬ５４Ｓ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＥ５５からＶ、Ｉ又はＫへの置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＹ９１Ｇ置換を含む。１つの実施形態において、抗体はＷ９６からＮ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＹへの置換を含む。これらの置換は軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及び／又はＨＶＲ−Ｌ３にあることが図１Ａを参照することによりわかる。
【００４５】
本発明の抗体は、抗体が所望の生物学的特性（例えば所望の結合親和性）を示す限り、何れかの適当なヒト又はヒトコンセンサス軽鎖フレームワーク配列を含むことができる。１つの実施形態において、本発明の抗体はヒトκ軽鎖のフレームワーク配列の一部分（又は全て）を含む。１つの実施形態において、本発明の抗体はヒトκサブグループＩフレームワークコンセンサス配列の一部分（又は全て）を含む。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、計算の４９位及び重鎖の９４位が伸長されたＨＶＲに包含される限り、そして、その４９位がＫであり、その９４位が必然ではないが好ましくはＭであり、そしてＲでもあってよい限り、配列番号３４〜４１及び図１、７及び８に示すフレームワーク配列を含む重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００４７】
本発明の拮抗剤はベータ７関連の作法、例えばアルファ４インテグリンサブユニットとの会合、アルファＥインテグリンサブユニットとの会合、アルファ４ベータ７インテグリンのＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンとの結合、及び、アルファＥベータ７インテグリンのＥ−カドヘリンとの結合の１つ以上の特徴を調節するために使用できる。これらの作用は何れかの生物学的に該当する機序、例えばベータ７サブユニット又はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７２量体インテグリンに結合するリガンドの分断により、及び／又は、２量体インテグリンの形成が阻害されるようにアルファ及びベータインテグリンのサブユニットの間の会合を分断することにより、調節することができる。従って、１つの実施形態において本発明はベータ７へのアルファ４の結合を阻害するベータ７拮抗剤抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はＭＡｄＣＡＭへのアルファ４ベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はＶＣＡＭ−１へのアルファ４ベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はフィブロネクチンへのアルファ４ベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファＥへのベータ７の結合を分断する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はＥ−カドヘリンへのアルファＥベータ７インテグリンの結合を分断する。干渉は直接又は間接的であることができる。例えば、ベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７の２量体化領域の配列内のベータ７に結合してよく、これにより、インテグリンサブユニットの相互作用及びインテグリン２量体の形成を阻害する。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン内の配列に結合してよく、これによりその結合相手（例えばアルファ４ベータについてはフィブロネクチン、ＶＣＡＮ及び／又はＭＡｄＣＡＭ；又はアルファＥベータ７インテグリンについてはＥ−カドヘリン）とのその結合ドメインの相互作用を防止する。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はインテグリンサブユニット２量体化ドメイン又はリガンド結合ドメイン内にはないが、そのベータ７拮抗剤抗体結合によりベータ７ドメインがその結合相手（例えばアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット及び／又はリガンド、例えばフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はＥ−カドヘリン）と相互作用する能力が妨害されるような配列に結合してよい。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体は、アルファ４又はアルファＥサブユニットとのベータ７の２量体化が妨害されるようにベータ７（例えば細胞外ドメイン）に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はベータ７及び／又はアルファ４ベータ７及び／又はアルファＥベータ７インテグリンがそれぞれのリガンドに結合する能力が妨害されるようにベータ７に結合する。例えば、１つの実施形態において、本発明はベータ７分子への結合によりその分子の２量体化を阻害する拮抗剤抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちフィブロネクチン、ＶＣＡＭ及び／又はＭＡｄＣＡＭ）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファＥベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちＥ−カドヘリン）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はヘテロ２量体化を含むベータ７の２量体化（即ちアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット分子とのベータ７の２量体化）を妨害する。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はアミノ酸１７６〜２３７をマッピングするベータ７インテグリンサブユニット上のエピトープに結合する。別の実施形態においては、本発明の拮抗剤抗体はＦｉｂ５０４．６４（ＡＴＣＣ  ＨＢ−２９３）と実質的に同じエピトープであるベータ７インテグリン上のエピトープに結合する。エピトープ結合の測定は例えば競合結合分析のような標準的手法により行う。
【００５０】
１つの特徴において、本発明は図１３のアミノ酸置換の表において示すＨＶＲ配列の１、２、３、４、５又は全ての組み合わせを含む抗体を提供する。
【００５１】
宿主被験体における使用のための治療薬は好ましくはその被験体において薬剤に対する免疫原性の応答を全く誘発しない。１つの実施形態において本発明はそのような薬剤を提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は宿主被験体において配列番号１０、１１、１２及び／又は配列番号１３の配列番号を含む抗体（ラット抗マウスＦｉｂ５０４（ＡＴＣＣ  ＨＢ−２９３）、図１及び９）と比較して実質的に低減された水準でヒト抗ラット又はヒト抗マウス又はヒト抗ヒト抗体応答を誘発する、及び／又は、誘発すると予測されるヒト化抗体を提供する。別の例においては、本発明はヒト抗マウス、ヒト抗ラット又はヒト抗ヒト抗体応答を全く誘発しない、及び／又は、誘発しないと予測されるヒト化抗体を提供する。
【００５２】
本発明のヒト化抗体はその重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン内に１つ以上のヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域（例えばフレームワーク）配列を含んでよい。一部の実施形態においては、１つ以上の別の修飾がヒト及び／又はヒトコンセンサス非超可変領域の配列内に存在する。１つの実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインはヒトコンセンサスフレームワーク配列を含み、これは１つの実施形態においてサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列である。１つの実施形態においては、本発明の抗体は少なくとも１つのアミノ酸位置において修飾された変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む。例えば、１つの実施形態において、変異体サブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列は、９４位は本発明の伸長重鎖超可変領域Ｈ３の一部であるが、７１、７３、７８及び／又は９４位の１つ以上において置換を含んでよい。１つの実施形態において、上記置換は何れかの組み合わせにおけるＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、Ｎ７８Ａ及び／又はＲ９４Ｍである。
【００５３】
本発明の抗体は、抗体が所望の生物学的特性（例えば所望の結合親和性）を示す限り、何れかの適当なヒト又はヒトコンセンサス軽鎖フレームワーク配列を含むことができる。１つの実施形態において本発明の抗体はヒトκ軽鎖のフレームワーク配列の少なくとも１部分（又は全て）を含む。１つの実施形態において本発明の抗体はヒトκサブグループＩのフレームワークコンセンサス配列の少なくとも１部分（又は全て）を含む。
【００５４】
本発明の拮抗剤はベータ７関連作用の１つ以上の特徴を調節するために使用することができる。例えば、ベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７２量体化領域の配列内のベータ７に結合し、そしてこれによりインテグリンサブユニットの相互作用及びインテグリン２量体の形成を阻害してよい。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン内の配列に結合してよく、これによりその結合相手（例えばアルファ４ベータ７についてはフィブロネクチン、ＶＣＡＭ及び／又はＭＡｄＣＡＭ；又はアルファＥベータ７インテグリンについてはＥ−カドヘリン）とのその結合ドメインの相互作用を防止する。別の例においては、ベータ７拮抗剤抗体はインテグリンサブユニット２量体化ドメイン又はリガンド結合ドメイン内にはないが、そのベータ７拮抗剤抗体結合によりベータ７ドメインがその結合相手（例えばアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット及び／又はリガンド、例えばフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はＥ−カドヘリン）と相互作用する能力が妨害されるような配列に結合してよい。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体は、アルファ４又はアルファＥサブユニットとのベータ７の２量体化が妨害されるようにベータ７（例えば細胞外ドメイン）に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はベータ７及び／又はアルファ４ベータ７及び／又はアルファＥベータ７インテグリンがそれぞれのリガンドに結合する能力が妨害されるようにベータ７に結合する。例えば、１つの実施形態において、本発明はベータ７分子への結合によりその分子の２量体化を阻害する拮抗剤抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファ４ベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちフィブロネクチン、ＶＣＡＭ及び／又はＭＡｄＣＡＭ）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はアルファＥベータ７インテグリンへのリガンドの結合（即ちＥ−カドヘリン）が妨害されるようにベータ７のリガンド結合ドメイン中の配列に特異的に結合する。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はヘテロ２量体化を含むベータ７の２量体化（即ちアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット分子とのベータ７の２量体化）を妨害する。
【００５６】
一部の場合において、インテグリンの一部としてのベータ７サブユニット、又は、２量体としてのアルファ４ベータ７インテグリン又はアルファＥベータ７インテグリンへのリガンド（例えばフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はアルファＥ）の結合に干渉しないベータ７拮抗剤抗体を有することが好都合である。従って、１つの実施形態において、ベータ７上のフィブロネクチン、ＶＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ又はＥ−カドヘリン結合部位には結合しないが、代わりに生物学的に活性なインテグリンが形成されないようにベータ７サブユニットとアルファサブユニット（例えばアルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニット）の間の相互作用を阻害するような抗体を提供する。１つの例においては、本発明の拮抗剤抗体は他の拮抗剤抗体１つ以上とともに使用することができ、その場合、拮抗剤はベータ７インテグリン軸内の異なる過程及び／又は機能にターゲティングされる。即ち、１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体は別のベータ７又はアルファ／ベータインテグリン拮抗剤（例えばアルファ４ベータ７抗体）、例えばモノクローナル抗体、又は、ヒト化抗体、又は、マウス抗体から誘導されるか、又は誘導された抗体と同じか、作用上同じの結合特性又は特異性を有するモノクローナル抗体のような抗体により結合されるエピトープとは異なるベータ７上のエピトープに結合する。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明はそれぞれのインテグリンへのベータ７−アルファ４又は−アルファＥの多量体化並びにリガンド結合を妨害するベータ７拮抗剤抗体を提供する。例えば、アルファ４又はアルファＥインテグリンサブユニットとのベータ７の２量体化を阻害する本発明の拮抗剤抗体は、更に、ベータ７又はインテグリン２量体への結合に関してリガンドと競合する能力を有してよい（例えばそれはフィブロネクチン、ＶＣＡＭ及び／又はＭＡｄＣＡＭのベータ７及び／又はアルファ４ベータ７への結合に干渉するか；又は、ベータ７又はアルファＥベータ７へのＥ−カドヘリンの結合に干渉してよい）。
【００５８】
本発明のベータ７拮抗剤抗体の１つの実施形態において、ベータ７への拮抗剤の結合はリガンド結合活性化細胞接着を阻害する。本発明のベータ７拮抗剤抗体の別の実施形態において、細胞内のベータ７への拮抗剤の結合は、ベータ７含有インテグリンが発現される細胞及び／又は組織への細胞のリクルートメントを阻害する。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明のベータ７拮抗剤抗体はベータ７の細胞外ドメインのアミノ酸１７６〜２５０（場合によりアミノ酸１７６〜２３７）の少なくとも一部（Ｔｉｄｓｗｅｌｌ，Ｍ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１４９７−１５０５）又はその変異体に特異的に結合し、そしてリガンドＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン及び／又はＥ−カドヘリンの結合を低減又はブロックする。１つの実施形態において、このようなリガンド結合ブロッキングは、ベータ７含有リガンドを発現する細胞へのリガンドを発現する細胞の付着を妨害、低減及び／又は防止する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体は残基１７６〜２３７を含むベータ７のアミノ酸配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はベータ７の残基１７６〜２３７からなる群より選択される配列の少なくとも１つの一部又は全てにより形成されるコンホーメーションエピトープに特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗体はヒトベータ７の残基１７６〜２３７の配列又は残基１７６〜２５０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体はハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−２９３により生産される抗ベータ７抗体Ｆｉｂ５０４と同様のエピトープに結合する。
【００６０】
１つの特徴において、本発明は本発明の拮抗剤抗体１つ以上及び担体を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、担体は製薬上許容しうるものである。
【００６１】
１つの特徴において、本発明は本発明のベータ７拮抗剤抗体をコードする核酸を提供する。
【００６２】
１つの特徴において、本発明は本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００６３】
１つの特徴において、本発明は本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは何れかの型、例えば、組み換えベクター、例えば発現ベクターであることができる。種々の宿主細胞の何れかを使用できる。１つの実施形態において、宿主細胞は原核生物の細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉである。１つの実施形態において宿主細胞は真核生物の細胞、例えば哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００６４】
１つの特徴において、本発明は本発明の拮抗剤を製造するための方法を提供する。例えば本発明はベータ７拮抗剤抗体（これは本明細書においては完全長及びそのフラグメントを包含する）の製造方法を提供し、その方法はその抗体（又はそのフラグメント）をコードする本発明の組み換えベクターを適当な宿主細胞内で発現させること、及び、その抗体を回収することを含む。
【００６５】
１つの特徴において、本発明は容器；及び容器内に含有された組成物を含む製造物品を提供し、ここで組成物は本発明のベータ７拮抗剤抗体１つ以上を含む。１つの実施形態において、組成物は本発明の核酸を含む。１つの実施形態において、拮抗剤抗体を含む組成物は更に、担体を含み、これは一部の実施形態においては製薬上許容しうるものである。１つの実施形態において、本発明の製造物品は更に被験体に組成物（例えば拮抗剤抗体）を投与するための説明書を含む。
【００６６】
１つの特徴において、本発明は本発明のベータ７拮抗剤抗体１つ以上を含む組成物を含む第１の容器；及び緩衝液を含む第２の容器を含むキットを提供する。１つの実施形態において、緩衝液は製薬上許容しうるものである。１つの実施形態において、拮抗剤抗体を含む組成物は更に担体を含み、これは一部の実施形態においては製薬上許容しうるものである。１つの実施形態において、キットは更に被験体に組成物（例えば拮抗剤抗体）を投与するための説明書を含む。
【００６７】
ベータ７インテグリン及びそのリガンドは疾患状態において多様に発現される。［腸内皮上のＭＡｄＣＡＭ−１の発現は炎症性腸疾患（ＵＣ及びＣＤ）を有する患者の粘膜炎症の部位において増大し、そしてＵＣ及びＣＤ患者の結腸固有層もまたＩＢＳ対照と比較して増大したＣＤ３＋及びａ４ｂ７＋細胞を示している（Ｓｏｕｚａ  Ｈ．，ら、Ｇｕｔ  ４５：８５６（１９９９）参照）。ＭＡｄＣＡＭ−１発現は肝臓疾患の門脈炎症に伴って観察されており、そして炎症中の肝臓へのアルファ４ベータ７＋リンパ球のリクルートメントにおいて重要である。（Ｈｉｌｌａｎ，Ｋ．ら、Ｌｉｖｅｒ．１９（６）：５０９−１８（１９９９））。肝臓の血管上のＭＡｄＣＡＭ−１はＩＢＤ及び原発性硬化性胆管炎を有する患者に由来するａ４ｂ７＋リンパ球の接着を裏付けている。接着は抗ＭＡｄＣＡＭ−１、抗アルファ４ベータ７又は抗アルファ４抗体により阻害されている（Ｇｒａｎｔ  ＡＪ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３３（５）：１０６５−７２（２００１））。ＭＡｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ及びＥ−カドヘリンは脳内皮細胞上及び／又は延焼した中枢神経系の微細血管上に発現される。ベータ７インテグリンはＣＮＳの脱髄疾患に寄与している（Ｋａｎｗａｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３，１４６（２０００））。アルファ４ベータ７の発現は対照群及びＵＣ患者よりもＣＤのＬＰＬにおいて有意に高値であった（Ｏｓｈｉｔａｎｉ，Ｎ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，７１５−７１９（２００３））。ＣＤ患者由来のＩＥＬを慢性的に刺激し、そして末梢よりリクルートした（Ｍｅｒｅｓｓｅ，Ｂ．，ら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，６９４−７００（２００１））。ヒト肝臓病においては、アルファＥベータ７Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）は、肝細胞及び胆管上皮上にＥ−カドヘリンが発現しているヒト肝臓内に優先的に蓄積する（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．，ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９，９１８−９２４（２００３））。慢性膵臓炎においては、ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は腸上皮内リンパ球と同様、慢性膵臓炎において膵臓に浸潤している（Ｍａｔｔｈｉａｓ，Ｐ．，ら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ｌ９３：２１４１−２１４７（１９９８））。アルファＥベータ７のアップレギュレーションは特定の上皮の関与とともに全身エリテマトーデス患者において観察されている（Ｐａｎｇら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：１４５６−１４６３（１９９８））。シェーグレン症候群においては、ＣＤ８＋アルファＥベータ７＋Ｔ細胞は腺房上皮細胞に接着し、アポトーシスを誘導することによりこれを殺傷している（Ｋｒｏｎｅｌｄら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２７：２１５−２１８，１９９８）。インテグリンアルファ４ベータ７及びアルファＥベータ７は皮膚炎症の間のＴ細胞表皮向性において役割を果たしており、皮膚同種移植片拒絶に寄与している（Ｓｕｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７４，１２０２，２００２）。Ｔｅｒａｋｉ及びＳｈｉｏｈａｒａは、乾癬上皮におけるＣＤ８＋Ｔ細胞上のａＥｂ７インテ��リンの優先的発現を示している（Ｔｅｒａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４７．１１１８，２００２）。喀痰Ｔリンパ球は喘息、ＣＯＰＤ及び正常被験体において活性化ＩＥＬ（ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋）である（Ｌｅｃｋｉｅら、Ｔｈｏｒａｘ  ５８．２３，２００３）。ＣＤ１０３＋（ａＥｂ７＋）ＣＴＬは臨床的腎臓同種移植片拒絶の間に移植片上皮とともに蓄積する（Ｈａｄｌｅｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７２，１５４８，２００１）］。即ち１つの実施形態において、本発明は上記した疾患状態の１つ以上のような疾患を低減又は緩和するためにベータ７インテグリン−リガンド相互作用を阻害するための本発明のベータ７拮抗剤抗体の使用を提供する。１つの実施形態において、本発明の抗体は炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）、炎症性肝疾患、ＣＮＳの炎症、慢性膵臓炎、全身エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬及び皮膚炎症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患、アレルギー、自己免疫疾患、移植片拒絶、腎臓移植片拒絶、対宿主性移植片病、糖尿病及びがんを包含する炎症性疾患のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造において使用される。
【００６８】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により罹患した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。
【００６９】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により罹患した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【００７０】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により罹患した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
【００７１】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により罹患した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明の製造物品の使用を提供する。
【００７２】
１つの特徴において、本発明は、免疫（例えば自己免疫又は炎症性）障害、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）及びアレルギー反応（例えば呼吸系、皮膚、関節の障害、アレルギー性喘息、及び、ベータ７含有インテグリンにより媒介されるアレルギー反応により罹患した他の臓器）のような疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。
【００７３】
本発明はベータ７インテグリン媒介細胞−細胞相互作用の過程の調節異常に関わる疾患状態を調節するために有用な方法及び組成物を提供する。ベータ７インテグリンは複数の生物学的及び生理学的な機能、例えば炎症性障害及びアレルギー性反応に関与している。即ち、１つの特徴において、本発明は本発明の抗体を被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００７４】
１つの特徴においては、本発明はベータ７インテグリン媒介炎症を阻害する方法を提供し、その方法は、本発明の抗体の有効量に細胞又は組織を接触させることによりリンパ球又はＢ細胞及びベータ７インテグリン発現細胞への結合を阻害することを含む。
【００７５】
１つの特徴において、本発明は被験体におけるベータ７インテグリン結合の調節異常に関わる病理学的状態を治療する方法を提供し、その方法は本発明の抗体の有効量を被験体に投与することにより、その状態を治療することを含む。
【００７６】
１つの特徴において、本発明はベータ７インテグリン（例えばアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７インテグリン）を発現する細胞へのベータ７インテグリンリガンドを発現するリンパ球（例えばＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン又はフィブロネクチンを発現する細胞）の結合を阻害する方法を提供し、方法は、本発明の抗体をその細胞に接触させることにより細胞の接着を阻害又は防止し、そして炎症反応の低減を誘発することを含む。
【００７７】
１つの特徴において、本発明は、ベータ７インテグリンの増大した発現又は活性、又は、ある細胞上のベータ７インテグリンと別の細胞上のベータ７インテグリン受容体との間の増大した相互作用に関わる炎症性障害を治療又は予防するための方法を提供し、その方法は本発明の抗体の有効量をそのような治療の必要な被験体に投与することによりその炎症性障害を効果的に治療又は予防することを含む。１つの実施形態において、その炎症性障害は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態においては、その炎症性障害はアレルギー性反応である。
【００７８】
本発明の方法は何れかの適当な病理学的状況、例えばベータ７インテグリン結合経路の調節異常に関わる細胞及び／又は組織に影響するように使用することができる。ベータ７インテグリンは主に白血球上に発現される（Ｔｉｄｓｅｌｌ，Ｍ．ら、（１９９７）上出）。１つの実施形態において、白血球は本発明の方法においてターゲティングされ、そしてベータ７インテグリンのリガンドを発現する細胞への結合を防止される。例えば、Ｅ−カドヘリンを発現する上皮内リンパ球は本発明によれば拮抗剤抗ベータ７抗体によりアルファＥベータ７インテグリン発現細胞への結合を防止される。ＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンを発現する細胞は本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体によりアルファ４ベータ７を発現する白血球への結合を防止される。
【００７９】
本発明の方法は更に別の治療工程を含むことができる。例えば、１つの実施形態において、方法は更に、ターゲティングされた細胞及び／又は組織（例えば腸内壁の内皮細胞）が抗ＴＮＦ抗体、又は限定しないが例えば５−ＡＳＡ化合物のような小型分子の治療薬に曝露される工程を含む。
【００８０】
本明細書に記載する通り、ベータ７インテグリンは重要な生物学的過程を媒介し、その調節異常は多くの病理学的状態をもたらす。従って、本発明の方法の１つの実施形態において、ターゲティングされる細胞（例えば内皮細胞）は、ベータ７インテグリンのベータ７インテグリンリガンドを発現する細胞（ここで細胞は例えばリンパ球であってよく、そしてリガンドはＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ又はＥ−カドヘリンであってよい）の接着が、本発明の抗ベータ７拮抗剤抗体の非存在下の細胞と比較して、妨害、阻害又は防止されているものである。１つの実施形態において、本発明の方法はリンパ球のホーミングを阻害することにより、ベータ７インテグリン発現部位における炎症を阻害する。例えば、本発明の拮抗剤との接触により、細胞は、ベータ７インテグリンのリガンドを発現する細胞に接着することができなくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８１】
（発明を実施するための形態）
本発明はベータ７シグナリング経路の阻害剤を発見及び／又は使用するための方法、組成物、キット及び製造物品を提供する。
【００８２】
これらの方法、組成物、キット及び製造物品の詳細を本明細書に記載する。
【００８３】
（一般的手法）
本発明の実施は、特段の記載が無い限り、当該分野で知られた分子生物学（例えば組み換え手法）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の手法を使用する。このような手法は文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７及び定期改訂版）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄ．，１９９４）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓら、２００１）に詳述されている。
【００８４】
（定義）
「ベータ７サブユニット」又は「β７サブユニット」とはヒトβ７インテグリンサブユニットを意味する（Ｅｒｌｅら、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１００９−１１０１６）。ベータ７サブユニットはアルファ４インテグリンサブユニット、例えばヒトα４サブユニットと会合する（Ｋｉｌｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｌｚｍａｎｎ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３：３４７−３５４）。アルファ４ベータ７インテグリンは成熟リンパ球の大部分、並びに、一部集団の胸腺細胞、骨髄細胞及び肥満細胞において発現される。（Ｋｉｌｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｍｕｒａｎｔ（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２５９１−２５９７；Ｇｕｒｉｓｈら、（１９９２）１４９：１９６４−１９７２；及びＳｈａｗ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３５）。ベータ７サブユニットはまたアルファＥサブユニット、例えばヒトアルファＥインテグリンサブユニットとも会合する（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．，ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３４５９）。アルファＥベータ７インテグリンは腸上皮内リンパ球（ｉＩＥＬ）上に発現される（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．（１９９３）上出）。本発明のヒト化抗ベータ７抗体に結合するベータ７サブユニットは天然に存在するものであり、そして可溶性であるか、細胞表面に局在化する。
【００８５】
「アルファＥサブユニット」又は「アルファＥインテグリンサブユニット」又は「αＥサブユニット」又は「ＣＤ１０３」とは上皮内リンパ球上のベータ７インテグリンに会合することがわかっているインテグリンサブユニットを意味し、このアルファＥベータ７インテグリンはＥ−カドヘリンを発現する腸上皮へのｉＥＬの結合を媒介する（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３４５９；Ｓｈａｗ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３５）。
【００８６】
「ＭＡｄＣＡＭ」又は「ＭＡｄＣＡＭ−１」は本発明の観点においては互換的に使用され、そして蛋白粘膜アドレシン細胞接着分子１を指し、これは短い原形質テール部及び免疫グロブリン様ドメインよりなる細胞外配列を含む１本鎖ポリペプチドである。マウス、ヒト及びマカクのＭＡｄＣＡＭ−１に関するｃＤＮＡがクローニングされている（Ｂｒｉｓｋｉｎ，ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３；４６１−４６４；Ｓｈｙｊａｎら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２８５１−２８５７）。
【００８７】
「ＶＣＡＭ−１」又は「血管細胞接着分子−１」、「ＣＤ１０６」とは、活性化された内皮上に発現されるアルファ４ベータ７及びアルファ４ベータ１のリガンドを指し、そして炎症中の白血球の結合及び遊出のような内皮白血球相互作用において重要である。
【００８８】
「Ｅ−カドヘリン」とはカドヘリンのファミリーのメンバーであり、Ｅ−カドヘリンは上皮細胞上に発現される。Ｅ−カドヘリンはアルファＥベータ７インテグリンのリガンドであり、腸上皮へのｉＥＬ発現アルファＥベータ７の結合を媒介するが、リンパ球ホーミングにおけるその機能は不明である（Ｅ−カドヘリンの発現はＴＧＦ−ベータ１によりアップレギュレートされる）。
【００８９】
「フィブロネクチン」とは組織修復、胚形成、血液凝固及び細胞の遊走／接着に関与している。これはＥＣＭ（細胞外マトリックス）におけるリンカーして作用し、血漿中には２量体（血漿中フィブロネクチン）として存在する。血漿中の型は肝細胞により合成されるのに対し、ＥＣＭ型は線維芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、マクロファージ並びに特定の上脾細胞により生産される。この観点において、それは、アルファ４ベータ７インテグリンと相互作用し、リンパ球のホーミング又は接着の特徴を媒介する。フィブロネクチンのＥＣＭ型はコラーゲン又はプロテオグリカン基質に細胞をアンカリングすることにより一般的な細胞接着分子として作用する。フィブロネクチンはまた細胞外マトリックスの種々の成分に、そして細胞表面上の膜結合フィブロネクチン受容体に結合することによりＥＣＭとの細胞相互作用を組織化する働きを有する。最後に、フィブロネクチンは胚形成の間の細胞遊走の事象において重要である。
【００９０】
「胃腸炎症障害」は粘膜中に炎症及び／又は潰瘍を誘発する慢性障害の１群である。これらの障害は例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性結腸炎、分類不能大腸炎及び感染性結腸炎）、粘膜炎（例えば口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性腸炎及び食道炎を包含する。
【００９１】
「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は本明細書においては互換的に使用し、炎症及び／又は潰瘍を誘発する腸の疾患を指し、そしてクローン病及び潰瘍性結腸炎を包含する。
【００９２】
「クローン病（ＣＤ）」又は「潰瘍性結腸炎（ＵＣ）」は、未知の病因の慢性炎症性腸疾患である。クローン病は、潰瘍性結腸炎とは異なり、腸の如何なる部分にも生じ得るものである。最も顕著な特徴としてのクローン病は腸壁の顆粒状の赤紫色の浮腫性の肥厚である。炎症の発生に従い、これらの肉芽腫からその外周境界が消失し、周囲の組織と一体化する場合が多い。下痢及び腸閉塞が主要な臨床特徴である。潰瘍性結腸炎と同様、クローン病の過程は持続性又は回帰性、軽度又は重度となるが、ただし結腸炎とは異なり、クローン病は腸の罹患区分の切除によって治癒されない。クローン病の患者の大部分はある時点において手術を必要とするが、その後の回帰は一般的であり、継続的な医療処置が通常となる。
【００９３】
クローン病は口腔から肛門に至る消化管の何れかの部分が関与するものであるが、典型的には回結腸、小腸及び結腸−肛門直腸の領域に生じる。組織病理学的には、疾患は断続的な肉芽腫、陰窩膿瘍、裂傷及びアフタ性潰瘍により顕在化する。炎症の浸潤は混在性であり、リンパ球（Ｔ及びＢ細胞の両方）、プラズマ細胞、マクロファージ及び好中球よりなる。ＩｇＭ及びＩｇＧ分泌プラズマ細胞、マクロファージ及び好中球の不均衡な増大を伴う。
【００９４】
抗炎症剤スルファサラジン及び５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）は軽度に活動性の結腸のクローン病を治療するために有用であり、そして疾患の寛解を維持するために一般的に処方されている。メトロイダゾール及びシプロフロキサシンはスルファサラジンと薬効において同様であり、そして肛門周囲疾患を治療するために特に有用であると考えられる。さらに深刻な場合では、コルチコステロイドは活動性の再燃の治療に効果があり、さらに寛解を維持することが可能である。アザチオプリン及び６−メルカプトプリンもまたコルチコステロイドの長期投与を必要とする患者において良好な結果をもたらしている。これらの薬剤は長期の予防においても役割を果たすことが可能である。残念なことに、一部の患者においては作用が開始される前に極めて長期の遅延（６ヶ月まで）がある場合がある。
【００９５】
下痢止め薬もまた一部の患者において兆候的寛解をもたらす。栄養療法又は単元的食餌が患者の栄養状態を改善し、そして急性の疾患の兆候的改善を誘導する場合があるが、持続性の臨床的寛解を誘導するわけではない。抗生物質は二次的な小規模の腸内細菌の過剰増殖を治療する場合、及び、化膿性の合併症を治療する場合に使用されている。
【００９６】
「潰瘍性結腸炎（ＵＣ）」は大腸に生じる。疾患の過程は持続性又は回帰性、軽度又は重度となる。最早期の幹部はリーベルキューン陰窩の基底部における膿瘍の形成を伴った炎症性の浸潤である。これらの膨張し崩壊した陰窩の癒着状態は積層する粘膜をその血液供給から分断し、潰瘍をもたらす。疾患の症状は、痙攣、下腹部痛、直腸出血及び糞粒子の乏しい血液、膿汁及び粘膜より主になる頻繁な軟便を包含する。急性、重度又は慢性、非寛解性の潰瘍性結腸炎では全結腸摘出が必要となる場合がある。
【００９７】
ＵＣの臨床特徴は極めて変動的であり、そして発症は潜行性又は突然であり、そして下痢、テネスムス及び回帰性の直腸出血を包含する場合がある。全結腸に急激な発症があれば、中毒性巨大結腸、致命的な緊急事態が起こる場合がある。腸外の顕在的特長は関節炎、膿皮壊疽、ブドウ膜炎及び結節性紅斑を包含する。
【００９８】
ＵＣの治療は軽度の症例ではスルファラジン及び関連のサリシレート含有薬剤、そして重度の症例ではコルチコステロイド剤を使用する。サリシレート又はコルチコステロイドの局所投与は場合によっては、特に疾患が遠位の腸に限局されている場合は有効であり、そして全身使用と比較して低減された副作用を有する。鉄及び抗下痢剤の投与のような補助的処置が場合により適応される。アザチオプリン、６−メルカプトプリン及びメトトレキセートは場合により、難治性のコルチコステロイド依存症例において処方される場合がある。
【００９９】
アミノ酸残基／位置の「修飾」とは、本明細書においては、出発アミノ酸配列と比較し他場合の一次アミノ酸配列の変化を指し、その場合、その変化はそのアミノ酸残基／位置が関与する配列の改変に起因している。例えば、典型的な修飾は残基（又はその位置における）の別のアミノ酸による置換（例えば保存的又は非保存的置換）、その残基／位置に隣接するアミノ酸１つ以上（一般的に５又は３未満）の挿入、及び、その残基／位置の欠失を包含する。「アミノ酸置換」又はその変異は、異なるアミノ酸残基による所定の（出発の）アミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の置き換えを指す。一般的に、そして、好ましくは、修飾により出発（又は「野生型」）のアミノ酸を含むポリペプチドと比較して変異体ポリペプチドの少なくとも１つ物理生物化学的活性が改変される。例えば、抗体の場合、改変される物理生物化学的活性は、標的分子に対する結合親和性、結合能力及び／又は結合作用であることができる。
【０１００】
「アミノ酸」という用語は本明細書の範囲内においては、その最も広範な意味において使用され、そして天然に存在するＬα−アミノ酸又は残基を包含する意味を有する。天然に存在するアミノ酸に関して一般的に使用される１文字及び３文字の略記法を本明細書において使用する（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７１−９２，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）。用語はＤ−アミノ酸並びに化学修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類縁体、蛋白に通常は取り込まれない天然に存在するアミノ酸、例えばノルロイシン及びアミノ酸に特徴的であることが当該分野で知られている特性を有する化学合成された化合物を包含する。例えば、天然のＰｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化合物のコンホーメーション制限を可能にするフェニルアラニン又はプロリンの類縁体又は模倣体もアミノ酸の定義に包含される。このような類縁体及び模倣体は本明細書においては、アミノ酸の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ，  Ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．５，ｐ．３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３）に記載されている。一文字を使用して天然に存在するアミノ酸の１つを標記する場合は、その標記は関連する文献に一般的に掲載されているものと同様である（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，  Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｉｎｃ．１９９４，ｐ．５７参照）。
【０１０１】
「単離された」抗体とは、その天然の環境の成分から発見され、そして分離及び／又は回収されたものである。その天然の環境の夾雑物成分は抗体の診断又は治療上の使用に干渉する可能性があり、そして、酵素、ホルモン及び他の蛋白性又は非蛋白性の溶質を包含する。好ましい実施形態においては抗体の精製は（１）Ｌｏｗｒｙ法で測定した場合に抗体９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケンサーの使用によりＮ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件化のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質となるまで行う。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分も存在しなくなるため、組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含する。しかしながら通常は単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により製造する。
【０１０２】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基ナンバリング」又は「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置ナンバリング」という用語及びその変形例は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに関して使用されているナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを用いれば、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短鎖化又はそれの内部への挿入に相当する過少な、又は付加的なアミノ酸を含有してよい。例えば、重鎖可変ドメインはＨ２の残基５２の後に単一のアミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を含んでよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所定の抗体について、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより決定してよい。
【０１０３】
「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という用語は、本明細書においては、２つの数値（一般的には１つは本発明の抗体に関わるものであり、もう１つは参照物／比較物の抗体に関わるもの）の間の差が、その数値（例えばＫｄ値）が尺度となる生物学的特徴の観点内で、殆ど又は全く生物学的及び／又は統計学的に有意でないと当業者が考えるほど十分高い程度の２つの数値間の類似性を指す。このような２つの数値の差は好ましくは、参照物／比較物抗体の数値の関数として、約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【０１０４】
「結合親和性」とは一般的に分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば抗原）との間の非共有結合性の相互作用の合計の強度を指す。特段の記載が無い限り本明細書においては、「結合親和性」とは結合対（例えば抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映している内因性の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は本明細書に記載するもののような当該分野で知られた一般的な方法により測定できる。低親和性抗体は一般的に緩徐に抗原に結合し、そして容易に解離する傾向にあるのに対し、高親和性抗体は一般的に急速に抗原に結合し、より長時間結合状態で残存する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該分野で知られており、その何れも本発明の目的のために使用できる。特定の例示される実施形態は後に記載する。
【０１０５】
１つの実施形態において、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」とは、本発明によれば、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いながら、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性（ＲＩＡ）を測定する後述の試験により説明される通り、未標識の抗原の段階力価物の存在下（１２５Ｉ）標識抗原の最小濃度でＦａｂを平衡化させ、次に、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合抗原をキャプチャーすることにより測定する（Ｃｈｅｎ，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。試験の条件を確立するために、マイクロプレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中キャプチャー用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）５ｕｇ／ｍｌで一夜コーティングし、そしてその後、室温で２〜５時間（約２３℃）ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングした。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中、１００ｐＭ又は２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（例えばＰｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の試験と合致）。次に目的のＦａｂを一夜インキュベートするが、インキュベートは確実に平衡が達成されるようにより長時間（例えば６５時間）継続してよい。その後、混合物を室温インキュベーション（例えば１時間）のためにキャプチャープレートに移す。次に溶液を取り出し、プレートをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、シンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）１５０ｕｌ／ウェルを添加し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を競合的結合試験で使用するために選択する。別の実施形態によれば、Ｋｄ又はＫｄ値は〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（���ｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌赤色キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【０１０６】
本発明による「ｏｎ速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」はまた〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた上記表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。しかしながら上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発行＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。本発明による「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、１つの実施形態においては、抗体のＦａｂ型と抗原分子を用いながら、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性（ＲＩＡ）を測定する後述の試験により説明される通り、未標識の抗原の段階力価物の存在下（１２５Ｉ）標識抗原の最小濃度でＦａｂを平衡化させ、次に、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合抗原をキャプチャーすることにより測定する（Ｃｈｅｎ，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。試験の条件を確立するために、マイクロプレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中キャプチャー用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）５ｕｇ／ｍｌで一夜コーティングし、そしてその後、室温で２〜５時間（約２３℃）ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングした。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中、１００ｐＭ又は２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の試験と合致）。次に目的のＦａｂを一夜インキュベートするが、インキュベートは確実に平衡が達成されるようにより長時間（例えば６５時間）継続してよい。その後、混合物を１時間室温インキュベーションのためにキャプチャープレートに移す。次に溶液を取り出し、プレートｗＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、シンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）１５０ｕｌ／ウェルを添加し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を競合的結合試験で使用するために選択する。別の実施形態によれば、Ｋｄ又はＫｄ値は〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌赤色キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【０１０７】
１つの実施形態において、本発明による「ｏｎ速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」はまた〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた上記表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すればカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｌ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。しかしながら上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【０１０８】
「実質的に低減された」又は「実質的に異なる」という表現は、本明細書においては、２つの数値（一般的には１つは本発明の抗体に関わるものであり、もう１つは参照物／比較物の抗体に関わるもの）の間の差が、その数値（例えばＫｄ値、ＨＡＭＡ応答）が尺度となる生物学的特徴の観点内で、統計学的に有意であると当業者が考えるほど十分高い程度の２つの数値間の類似性を指す。このような２つの数値の差は好ましくは、参照物／比較物抗体の数値の関数として、約１０％超、好ましくは約２０％超、好ましくは約３０％超、好ましくは約４０％超、好ましくは約５０％超である。
【０１０９】
ペプチド又はポリペプチドの配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、配列をアラインし、そして必要に応じてギャップを導入することにより最大パーセント配列同一性を達成した後の、そして何れかの保存的置換も配列同一性の部分とはみな佐内場合の、特定のペプチド又はポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアライメントは例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような市販されているコンピューターソフトウエアを用いながら、当該分野で知られた種々の方法において達成することができる。アライメントを測定するための適切なパラメーター、例えば比較される配列の完全長にわたる最大アライメントを達成するために必要な何れかのアルゴリズムは当業者が決定できる。しかしながら本明細書の目的のためには、％アミノ酸同一性の値は配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して得られるものであり、その場合、ＡＬＩＧＮ−２プログラムのための完全なソースコードは以下の表Ａに示す通りである。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著作されたものであり、以下の表Ａに示すソースコードは米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下にそれが登録されている米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）内にユーザードキュメンテーションとともに提出されている。ＡＬＩＧＮＢ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公的に入手するか、又は、以下の図８内に示すソースコードからコンパイルしてよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、そして変化しない。
【０１１０】
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較のために使用する状況においては、所定のアミノ酸Ａの、所定のアミノ酸Ｂに対する又はそれとの又はそれに対向する％アミノ酸配列同一性（これは所定のアミノ酸Ｂに対する又はそれとの又はそれに対向する所定の％アミノ酸配列同一性を有するか含む所定のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は以下の通り計算する。
【０１１１】
割合Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムアライメントにおいて、同一マッチと評点されたアミノ酸残基の数であり、そしてＹはＢ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合は、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。
【０１１２】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値はＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを用いながら直前のパラグラフにおいて記載した通りに得た。
【０１１３】
【化１】
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【０１１４】
【化２】
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【０１１５】
【化３】
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【０１１６】
【化４】
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【０１１７】
【化５】
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【０１１８】
【化６】
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【０１１９】
【化７】
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【０１２０】
【化８】
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【０１２１】
【化９】
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【０１２２】
【化１０】
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【０１２３】
【化１１】
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【０１２４】
【化１２】
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【０１２５】
【化１３】
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【０１２６】
【化１４】
2008512382.tif 000077
【０１２７】
【化１５】
2008512382.tif 000078
【０１２８】
【化１６】
2008512382.tif 000079
【０１２９】
【化１７】
2008512382.tif 000080
【０１３０】
【化１８】
2008512382.tif 000081
【０１３１】
【化１９】
2008512382.tif 000082
【０１３２】
【化２０】
2008512382.tif 000083
【０１３３】
【化２１】
2008512382.tif 000084
【０１３４】
【化２２】
2008512382.tif 000085
【０１３５】
【化２３】
2008512382.tif 000086
【０１３６】
【化２４】
2008512382.tif 000087
【０１３７】
【化２５】
2008512382.tif 000088
【０１３８】
【化２６】
2008512382.tif 000089
「ベクター」という用語は本明細書においては、自身が連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これは更に別のＤＮＡセグメントがライゲーションされていてよい環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウィルスベクターであり、その場合更に別のＤＮＡセグメントがウィルスゲノム内にライゲーションされていてよい。特定のベクターは自身が導入されている宿主細胞内において自己複製することができる（例えば複製の細菌起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞内への導入により宿主細胞のゲノム内に組み込まれることができ、これにより宿主細胞ゲノムとともに複製される。更にまた特定のベクターは自身が作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向することができる。このようなベクターは本明細書においては、「組み換え発現ベクター」（又は単に「組み換えベクター」）と称する。一般的に、組み換えＤＮＡ手法において利用される発現ベクターはプラスミドの形態である場合が多い。本明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用されている形態であるため、互換的に使用してよい。
【０１３９】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、本明細書においては、何れかの長さのヌクレオチドの重合体を指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ヌクレオチドはデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又は、その類縁体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼにより、又は合成反応により重合体に取り込まれることができる何れかの基質であることができる。ポリヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びその類縁体を含んでよい。存在する場合は、ヌクレオチド構造に対する修飾は重合体の組み立ての前又は後に付与してよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてよい。ポリヌクレオチドは合成後に更に例えば標識とのコンジュゲーションにより修飾されてよい。他の型の修飾は、例えば天然に存在するヌクレオチド１つ以上の類縁体による「キャップ」置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結による（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カーバメート等）、及び、荷電連結（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）によるもの、ペンダント部分を含有するもの、例えば蛋白（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレーターを有するもの（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート形成剤を含有するもの（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化性金属等）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結部を有するもの（例えばアルファ芳香族核酸等）、並びに、未修飾形態のポリヌクレオチドを包含する。更にまた、糖に通常存在するヒドロキシル基の何れかは、例えばホスホネート基、ホスフェート基により置き換えられているか、標準的な保護基により保護されているか、又は、別のヌクレオチドへの追加的連結部を作成するために活性化されていてよく、或いは、固体又は半固体の支持体にコンジュゲートされていてよい。５’及び３’末端のＯＨはホスホリル化されるか、又は、アミン又は炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分により置換されていることができる。他のヒドロキシルはまた標準的保護基に誘導体化されていてよい。ポリヌクレオチドはまた当該分野で一般的に知られたリボース又はデオキシリボース糖の類縁体形態、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環糖類縁体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類縁体及び非塩基性類縁体、例えばメチルリボシドを含有してよい。１つ以上のホスホジエステル連結部が別の連結基により置き換えられていてよい。これらの代替的連結基は、例えばホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）で置き換えられている実施形態を包含し、ここで各Ｒ又はＲ’は独立して、Ｈ又は場合によりエーテル（−Ｏ−）結合を含有する置換又は未置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルキルである。ポリヌクレオチド中の全連結部が同一である必要はない。前記はＲＮＡ及びＤＮＡを包含する本明細書に記載する全てのポリヌクレオチドに適用する。
【０１４０】
「オリゴヌクレオチド」とは本明細書においては、必然ではないが一般的に約２００ヌクレオチド長未満の短鎖の一般的には１本鎖の一般的には合成されたポリヌクレオチドを一般的に指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関して上記したものは等しく、そして完全にオリゴヌクレオチドに適用できる。
【０１４１】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は最も広範な意味において互換的に使用され、そしてモノクローナル抗体（例えば完全長又は未損傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す限りにおいて二重特異性抗体）を包含し、そして特定の抗体フラグメント（本明細書においてより詳述する）も包含してよい。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟のものであることができる。
【０１４２】
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の一部分のみを含み、その部分は好ましくは未損傷の抗体中に存在する場合にその部分に通常関わる機能の少なくとも１つ、好ましくは大部分又は全てを保持している。１つの実施形態において、抗体フラグメントは未損傷の抗体の抗原結合部位を含み、そしてこれにより、抗原に結合する能力を保持している。別の実施形態においては、抗体フラグメント、例えばＦｃ領域を含むものは、未損傷の抗体中に存在する場合にＦｃ領域に通常関わる生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合等の少なくとも１つを保持する。１つの実施形態において、抗体フラグメントは未損傷の抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する１価の抗体である。例えばそのような抗体フラグメントはフラグメントにインビボ安定性を付与することができるＦｃ配列に連結した結合アームを抗原上に含んでよい。
【０１４３】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は少量において存在する可能性のある可能な天然に存在する突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原に対して指向されている。更に又、種々の決定基（エピトープ）に対して指向されている種々の抗体を典型的には包含するポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向されている。
【０１４４】
本明細書に記載するモノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖は特定の種に由来するか、特定の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相当する配列に同一又は相同であるが、鎖の残余部分は、別の種に由来するか、別の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相当する配列に同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体のフラグメントを、それらが所望の生物学的活性を示す限り、包含する（米国特許４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１４５】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種（レシピエント抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである（レシピエント抗体）。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は相当する非ヒト残基により置き換えられている。更に又、ヒト化抗体はレシピエント抗体内にもドナー抗体内にも存在しない残基を含んでよい。このような修飾は抗体の性能を更に精鋭化させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、そしてＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれである少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は場合により、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含むことになる。詳細についてはＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照できる。更に又以下の文献：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）及びそこに引用されている参考文献を参照できる。
【０１４６】
［抗原」は抗体が選択的に結合する所定の抗原である。標的抗原はポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に存在する又は合成の化合物であってよい。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。「アクセプターヒトフレームワーク」とは、本明細書の目的のためには、ヒト免疫グロブリンフレームワークから、又は、ヒトコンセンサスフレームワークから誘導されたＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から誘導された」アクセプターヒトフレームワークはそれと同じアミノ酸配列を含んでよく、又は、既存のアミノ酸配列の変化を含有していてよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合は、好ましくは５以下、好ましくは４以下又は３以下の既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨに存在する場合は、好ましくはそのような変化は７１Ｈ、７３Ｈおよび７８Ｈ位のわずか３、２又は１つにのみあり；例えば、そのような位置にあるアミノ酸残基は７１Ａ、７３Ｔおよび７８Ａであってよい。１つの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは配列においてＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に同一である。
【０１４７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は一部のヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列において最も一般的に存在するアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般的にその一部のヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的に配列のサブグループはＫａｂａｔら、のサブグループである。１つの実施形態において、ＶＬについては、サブグループはＫａｂａｔら、の場合のようにサブグループカッパＩである。１つの実施形態において、ＶＨについては、サブグループはＫａｂａｔら、の場合のようにサブグループＩＩＩである。
【０１４８】
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」はＫａｂａｔら、の可変軽鎖カッパサブグループＩのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は以下の配列：
【０１４９】
【化２７】
2008512382.tif 000090
の各々の少なくとも一部分又は全てを含む。
【０１５０】
「ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク」はＫａｂａｔら、の可変重鎖サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。１つの実施形態において、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は以下の配列：
【０１５１】
【化２８】
2008512382.tif 000091
の各々の少なくとも一部分又は全てを含む。
【０１５２】
「未修飾のヒトフレームワーク」はアクセプターヒトフレームワークと同じアミノ酸配列を有するヒトフレームワークであり、例えばアクセプターヒトフレームワークにおけるヒトから非ヒトへのアミノ酸置換を有さないものである。
【０１５３】
「改変された超可変領域」とは本発明の目的のためには、１つ以上（例えば１〜約１６）のアミノ酸置換をそこに含む超可変領域である。
【０１５４】
「未修飾超可変領域」とは本発明の目的のためには、誘導元の非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する超可変領域であり、即ち１つ以上のアミノ酸置換をそこに含まないものである。
【０１５５】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」という用語は、本明細書においては、配列内で超可変であり、及び／又は、構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は６超可変領域；３つをＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）内に、そして３つをＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）内に含む。多くの超可変領域の定義が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列の可変性に基づいており、そして、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭの超可変領域はＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の折衷を示し、そしてＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアにより使用されている。「接触」超可変領域は使用可能な複合体結晶構造の分析に基づいている。これらの超可変領域の各々に由来する残基を以下に示す。
【０１５６】
【表１】
2008512382.tif 000092
超可変領域は以下の通り、即ち：ＶＬ内の２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は４９−５６又は５０−５６又は５２−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、及びＶＨ内の２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）の「伸長超可変領域」を含んでよい。可変ドメイン残基はこれらの定義の各々につき上記Ｋａｂａｔ等の定義に従ってナンバリングされている。
【０１５７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１５８】
「ヒト抗体」はヒトにより生産される抗体に相当するか、及び／又は、本明細書に開示するヒト抗体を製造するための手法の何れかを用いて作成されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０１５９】
「親和性成熟」抗体は、１つ以上の改変をそのＣＤＲ１つ以上内に有するものであり、これによりそのような改変を保有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性が向上しているものである。好ましい親和性成熟抗体は標的抗原に対してナノモル、或いは更にピコモルレベルの親和性を有することになる。親和性成熟抗体は当該分野で知られた操作法により製造される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）はＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発はＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）により記載されている。
【０１６０】
「ブロッキング」抗体又は「拮抗剤」抗体はそれが結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減するものである。好ましいブロッキング抗体又は拮抗剤抗体は抗原の生物学的活性を実質的又は完全に阻害する。
【０１６１】
「アゴニスト抗体」とは本明細書においては、目的のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【０１６２】
「障害」とは本発明の物質／分子又は方法による治療から利益を被る何れかの状態である。これには問題となる障害に哺乳類を罹患し易くしている病理学的状態を包含する慢性及び急性の障害又は疾患が包含される。本明細書において治療されるべき障害の非限定的な例は、悪性又は良性の腫瘍；非白血病性及びリンパ球性の悪性疾患；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質性及び胞胚腔の障害；及び炎症性、免疫学的及び他の血管形成関連の障害を包含する。
【０１６３】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳類の免疫系の要素が哺乳類における罹病を誘発、媒介又は他の態様において寄与するような疾患を意味する。同様に包含されるものは免疫応答の刺激又は介入が疾患の進行に対して寛解作用を有するような疾患である。この用語に包含されるものは免疫媒介炎症性疾患、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、新生物形成等である。
【０１６４】
本発明に従って治療することができる部分的に免疫又はＴ細胞媒介である免疫関連及び炎症性疾患の例は、全身エリテマトーデス、慢性関節リューマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節障害、全身硬化症（硬皮症）、特発性炎症性ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、申請糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発性神経障害又はギヤン‐バレー症候群及び慢性脱髄性多発性神経障害、肝胆疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝臓親和性のウィルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫症及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性結腸炎；クローン病）、グルテン感受性腸症及びホウイップル病、自己免疫又は免疫媒介性の皮膚疾患、例えば水疱性皮膚疾患、多発性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、移植関連の疾患、例えば移植片拒絶及び対宿主性移植片病、感染性疾患、例えばウィルス製疾患、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型肝炎等、細菌感染症、カビ感染症、原虫感染症及び寄生虫感染症を包含する。
【０１６５】
本明細書においては互換的に使用される「自己免疫障害」又は「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織から生じる、及び、これに対して指向される、非悪性の疾患又は障害である。本明細書に記載する自己免疫疾患は特に悪性又は癌性の疾患又は状態を除外し、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫疾患又は障害の例は炎症性応答、例えば炎症性皮膚疾患、例えば感染及び皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）；全身硬皮症及び硬化症；炎症性腸疾患に関わる応答（例えばクローン病及び潰瘍性結腸炎）；呼吸窮迫症候群（例えば成人呼吸窮迫症候群、ＡＲＤＳ）；痴呆症；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；結腸炎；糸球体腎炎；アレルギー性状態、例えば湿疹及び喘息及び他のＴ細胞浸潤関与の状態及び慢性炎症性応答；アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全；慢性関節リューマチ；全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病（例えばＩ型糖尿病又はインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；早発性糖尿病；及び典型的には結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎において観察されるサイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅発性の過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血（アディソン病）；白血球漏出の関わる疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器傷害症候群；溶血性貧血（例えばクリオグロブリン血又はクームス陽性貧血）；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介疾患；抗糸球体既定膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート‐イートン筋衰弱症候群；類天疱瘡水疱；天疱瘡；自己免疫性多発性内分泌腺症；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫性血小板減少症等を包含する。
【０１６６】
「胃腸炎症傷害」という用語は炎症及び／又は潰瘍を粘膜に誘発する一群の慢性障害である。用語はそのまま、炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性結腸炎、分類不能大腸炎及び感染性結腸炎）、粘膜炎（例えば口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性腸炎及び食道炎を包含する。
【０１６７】
「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語はある程度の異常な細胞増殖を伴う障害を指す。１つの実施形態において、細胞増殖性障害は癌である。
【０１６８】
「腫瘍」とは、本明細書においては、悪性又は良性に関わらず全ての新生物性の細胞の成育及び全ての前癌性および癌性の細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」は本明細書において言及する限り相互に排除されない。
【０１６９】
「癌」及び「癌性」という用語は典型的には調節できない細胞の成育／増殖を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか描写するものである。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病を包含する。このような癌のより特定の例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫瘍、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は至急の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫及び種々の型の頭部及び頚部の癌を包含する。
【０１７０】
血管形成の調節異常は、多くの障害をもたらし得、これらは本発明の組成物及び方法により治療できる。これらの障害は非新生物性及び新生物性の状態の両方を包含する。新生物は例えば上記したものを包含する。非新生物性の障害は例えば望ましくない、又は、異常な肥大、関節炎、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性プラーク、糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、例えば未熟児網膜症、水晶体後腺維増殖症、血管新生緑内障、加齢関連黄斑変性、糖尿病性斑状浮腫、角膜血管新生、角膜グラフト血管新生、角膜グラフト拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、角の血管新生（皮膚紅潮）、眼の血管新生性疾患、血管再狭窄、動脈静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管腺維腫、甲状腺肥大（グレーブス病を含む）、角膜及び他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺傷害／ＡＲＤＳ、敗血症、一次肺高血圧症、悪性肺滲出、脳水腫（例えば急性卒中／閉鎖性頭部傷害／外傷に関連）、滑膜炎症、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣症、子宮内膜炎、体液サードスペーシング疾患（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮線維症、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病及び潰瘍性結腸炎）、腎臓同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない、又は、異常な組織嵩増大（非癌）、血友病性関節、肥大瘢痕、毛髪増殖阻害、オースラー‐ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖、硬皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心内膜液浸出（例えば心内膜炎に関連するもの）及び胸水を包含する。
【０１７１】
本明細書においては、「治療」とは治療すべき個体又は細胞の本来の過程を改変させる試みにおける臨床介入を指し、予防的に、又は臨床病理過程の間の何れかに実施できる。治療の望ましい作用は、疾患の発症又は再発の防止、症状の寛解、何れかの直接又は間接的な疾患帰結の軽減、転移の防止、疾患進行速度の低減、疾患状況の緩和又は沈静化、及び、予後の軽快又は改善を包含する。一部の実施形態においては、本発明の抗体は疾患又は障害の発症を遅延するために使用される。
【０１７２】
「有効量」とは所望の治療又は予防上の結果を達成するために、必要な用量及び時間において、有効である量を指す。
【０１７３】
本発明の物質／分子、アゴニスト又は拮抗剤の「治療有効量」は個体の疾患状況、年齢、性別及び体重、及び、物質／分子、アゴニスト又は拮抗剤が個体において所望の応答を誘発する能力のような要因に従って変動する。治療有効量は又、物質／分子、アゴニスト又は拮抗剤の何れかの毒性又は有害な作用よりも治療上有益な作用が勝っているものである。「予防有効量」は所望の予防結果を達成するために、必要な用量及び時間において、有効である量を指す。必然ではないが典型的には、予防用量は疾患の前又は早期の段階において被験体において使用されるため、予防有効量は治療有効量よりも低値となる。
【０１７４】
「細胞毒性剤」という用語は本明細書においては、細胞の機能を阻害又は防止、及び／又は細胞の破壊を誘発する物質を指す。用語は放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインタカレーション剤、酵素及びそのフラグメント、例えば核溶解酵素、抗生物質及び毒素、例えば小分子毒素又は細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素並びにそのフラグメント及び／又は変異体、及び、以下に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を包含する。他の細胞毒性剤は以下に記載する。殺腫瘍性の薬剤は腫瘍細胞の破壊を誘発する。
【０１７５】
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学物質である。化学療法剤の例はアルキル化剤類、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ；エチレンイミン類及びメチラメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスホアミド及びトリメチロールオメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン類；ベツリン酸；カンプトテシン（例えば合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テミポシド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード類、例えばクロランブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ジネマイシン、例えばジネマイシンＡ；クスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連の色素蛋白エネジン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オーソラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮���剤、例えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、デキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル類、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノェブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド類、例えばマイタンシン及びアンサミトシン類；マイトグアゾン；マイトキサトロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピアルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭＣｒｅｍｏｐｈｏｒ−非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イソフォスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノヴァントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えばレチン酸；カペシタラビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上��物質の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体；並びに上記物質の二者以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ、即ちシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの複合療法の略称、及びＦＯＬＦＯＸ、即ち５−ＦＵ及びロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いた治療用法の略称等、を包含する。
【０１７６】
この定義に同様に包含されるものは癌の生育を促進することが可能であるホルモンの作用を調節、低減、ブロック又は阻害する作用を有し、そして、全身投与又は身体全体投与の形態となる場合が多い抗ホルモン剤である。それらはそれら自体がホルモンであってよい。例示されるものは、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン類；エストロゲン受容体ダウンレギュレート剤（ＥＲＤ）；卵巣を阻害又はシャットダウンする機能を有する薬剤、例えば黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン；他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲステロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー、ファドゾロール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アラストロゾールを包含する。更に又、化学療法剤のこのような定義にはビスホスホネート類、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチロロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のような異常な細胞増殖に関与するとされるシグナリング経路内の遺伝子の発現を阻害するもの；ワクチン類、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン類、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤、別名ＧＷ５７２０１６）；及び上記物質の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体も包含される。
【０１７７】
「生育阻害剤」とは、本明細書において使用する場合は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてその生育がベータ７活性化に依存している細胞の成育を阻害する化合物又は組成物を指す。即ち、生育阻害剤はＳ期におけるベータ７依存性細胞のパーセンテージを実質的に低減するものであってよい。生育阻害剤の例は細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置において）ブロックする薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤を包含する。伝統的なＭ期ブロッカーはビンカ類（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンエトポシド及びブレオマイシンを包含する。Ｇ１を停止させる薬剤はまたＳ期停止にまで作用を派生させるものがあり、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−Ｃが挙げられる。更に詳細な説明はＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，  ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １の表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇ」、Ｍｕｒａｋａｍｉら、（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５），ｐ．１３に記載されている。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は共にイチイの木から誘導される抗癌剤である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）はパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類縁体である。パクリタキセル及びドセタキセルはチュブリン２量体からの微小管の組み立てを促進し、そして脱重合を防止することにより微小管を安定化させ、これが細胞における有糸分裂を阻害する。
【０１７８】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【０１７９】
本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体を用いた複合療法に用いられる化合物は、抗体（例えば他の抗ベータ７拮抗剤抗体（Ｆｉｂ２１、２２、２７、３０、（Ｔｉｄｓｗｅｌｌ，Ｍ．（１９９７）上出）又はそのヒト化誘導体）、抗α４抗体（例えばＡＮＴＥＧＥＮ（登録商標））、抗ＴＮＦ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））又は非蛋白化合物、例えば５−ＡＳＡ化合物ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＳＡＴＭ、ＲＯＷＡＳＡＴＭ、ＣＯＬＡＺＡＬＴＭ及び他の化合物、例えばＰｕｒｉｎｅｔｈｏｌ及びステロイド、例えばプレドニソンを包含する。ある実施形態においては、本発明は本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体の単独、又は、炎症の治療の同じく有用である第２の化合物との組み合わせによる、ヒト患者のような患者を治療する方法を包含する。１つの実施形態において、第２の化合物はＦｉｂ２１、２２、２７、３０又はそのヒト化誘導体）、抗アルファ４抗体、ＡＮＴＥＧＥＮ（登録商標）、抗ＴＮＦ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、５−ＡＳＡ化合物、ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＳＡＴＭ、ＲＯＷＡＳＡＴＭ、ＣＯＬＡＺＡＬＴＭ、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ及びステロイド及びプレドニソンからなる群より選択される。本発明の１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗ベータ７抗体の投与は第２の化合物の用量を実質的に低減する。１つの実施形態において、第２の薬剤の用量における上記低減は少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体及び第２の化合物の低減された用量の組み合わせは第２の化合物単独の投与と実質的に同か更に良好な程度にまで患者における症状を寛解する。
【０１８０】
（ＨＡＭＡ応答を低減又は消失させる変異体抗体の作成）
ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス（ヒト抗ラット又はヒト抗ヒトにも適用）応答の低減又は消失は適当な治療薬の臨床開発の重要な側面である。例えばＫｈａｘｚａｅｌｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（１９８８），８０：９３７；Ｊａｆｆｅｒｓら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８６），４１：５７２；Ｓｈａｗｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５），１３５：１５３０；Ｓｅａｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．（１９８４），３．１３８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（１９８３），６２：９８８；Ｈａｋｉｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１），１４７：１３５２；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８），３３２：３２３；Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９０），５０：１４９５を参照できる。本明細書に記載する通り、本発明はＨＡＭＡ応答が低減又は消失するようにヒト化された抗体を提供する。これらの抗体の変異体もまた一部は後に詳述する当該分野で知られた日常的方法を用いて得ることができる。
【０１８１】
例えば本明細書に記載した抗体に由来するアミノ酸配列はフレームワーク及び／又は超可変配列の多様化のための出発（親）配列として機能できる。出発超可変配列が連結する選択されたフレームワーク配列は本明細書においてはアクセプターヒトフレームワークと称する。アクセプターヒトフレームワークはヒト免疫グロブリン（そのＶＬ及び／又はＶＨ領域）由来であるかこれから誘導してよいが、好ましくはアクセプターヒトフレームワークはヒトコンセンサスフレームワーク由来であるかこれから誘導され、その理由はそのようなフレームワークはヒト患者における免疫原性が最小限又は皆無であることがわかっているためである。
【０１８２】
アクセプターがヒト免疫グロブリンから誘導される場合は、場合により、ヒトフレームワーク配列のコレクション中の種々のヒトフレームワーク配列にドナーフレームワーク配列をアラインさせることによりドナーフレームワーク配列への自身の相同性に基づいて選択されたヒトフレームワーク配列を選択し、そして、アクセプターとして最も相同性の高いフレームワーク配列を選択してよい。
【０１８３】
１つの実施形態において、ヒトコンセンサスフレームワークは本明細書においては、ＶＨサブグループＩＩＩ及び／又はＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列由来であるか、又は、それより誘導される。
【０１８４】
即ち、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは以下：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３８）を含むＦＲ１、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号３９）を含むＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＸ１ＤＸ２ＳＫＮＴＸ３ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４２）を含むＦ３４、個々でＸ１はＡ又はＲ、Ｘ２はＴ又はＮ、そしてＸ３はＡ、Ｌ又はＦ、
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４１）を含むＦＲ４、
のフレームワーク配列の１つ、２つ、３つ又は全てを含んでよい。
ＶＨコンセンサスフレームワークの例は、下記：
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号１９）；
ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２０−２２）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号４８）；
ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４９−５１）；ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５２）；
ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５３−５５）；
ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５６）；
ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５７−５８）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５９）；又は
ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号６０−６２）を包含する。
【０１８５】
１つの実施形態において、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは以下：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３８）を含むＦＲ１、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号３９）を含むＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４３）、ＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４４）を含むＦＲ３、
ＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＦＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４５）、ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＦＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号４６）、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４１）を含むＦＲ４、
のフレームワーク配列の１つ、２つ、３つ又は全てを含んでよい。
【０１８６】
ＶＬアクセプターヒトフレームワークは以下：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３４）を含むＦＲ１、
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩ（配列番号３５）を含むＦＲ２、
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号３６）を含むＦＲ３、
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３７）を含むＦＲ４、
のフレームワーク配列の１つ、２つ、３つ又は全てを含んでよい。
ＶＬコンセンサスフレームワークの例は、下記：
ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１４）；
ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（伸長ＨＶＲ−Ｌ２）（配列番号１５）；
ヒトＶＬカッパサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１６）；
ヒトＶＬカッパサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１７）；又は、
ヒトＶＬカッパサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号１８）、
を包含する。
【０１８７】
アクセプターは配列において選択されたヒトフレームワーク配列に同一であってもよいが、それがヒト免疫グロブリン又はヒトコンセンサスフレームワーク由来であるかについては、本発明は、ヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と相対比較した場合の既存のアミノ酸の置換をアクセプター配列が含んでいてよいことを意図している。これらの既存の置換は好ましくは最小限；通常はヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と相対比較して４、３、２又は１アミノ酸置換の相違のみである。
【０１８８】
非ヒト抗体の超可変領域残基はＶＬ及び／又はＶＨアクセプターヒトフレームワーク内に取り込まれる。例えば、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ残基。Ａｂｍ残基及び／又は接触残基に相当する残基を取り込んでよい。或いは、伸長超可変領域残基、２４−３４（Ｌ１）、４９−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）も取り込まれる。
【０１８９】
超可変領域残基の「取り込み」を本明細書において論じるが、当然ながらこれは種々の方法で達成することができ、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は、自身のフレームワーク領域がアクセプターヒトフレームワーク領域に変化するようにマウス可変ドメイン配列をコードする核酸を突然変異させることによるか、又は、超可変ドメインの残基が非ヒト残基に変化するようにヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を突然変異させることによるか、又は、所望の配列をコードする核酸を合成することによる等して作成することができる。
【０１９０】
本明細書の例においては、超可変領域グラフト変異体は各超可変領域に対する別個のオリゴヌクレオチドを用いながら、ヒトアクセプター配列をコードする核酸のＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発により作成した。Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍａｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）。適切な変化は適切な超可変領域抗原相互作用を補正して再構築するための日常的な手法を用いてフレームワーク及び／又は超可変領域内に導入することができる。
【０１９１】
ファージ（ミド）ディスプレイ（本明細書においては一部の観点においてファージディスプレイと称する）は、配列無作為化により作成されたライブラリ内に多くの異なる潜在的変異体抗体を作成し、そして、スクリーニングするための好都合で迅速な方法として使用できる。しかしながら、改変された抗体を作成してスクリーニングするための他の方法も当業者は使用できる。
【０１９２】
ファージ（ミド）ディスプレイの技術は抗原のようなリガンドに結合する新規な蛋白を作成し、そして選択するための強力な手段を提供している。ファージ（ミド）ディスプレイの技術を用いることにより、高い親和性を有する標的分子に結合する配列を発見するために急速にソーティングすることができる蛋白変異体の大型ライブラリの作成が可能になる。変異体ポリペプチドをコードする核酸は一般的に、遺伝子ＩＩＩ蛋白又は遺伝子ＶＩＩＩ蛋白のようなウィルス被膜蛋白をコードする核酸に融合される。蛋白又はポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子ＩＩＩ蛋白の一部分をコードする核酸配列に融合されている１価のファージミドディスプレイが開発されている（Ｂａｓｓ，Ｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９（１９９０）；Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５（１９９１））。１価のファージミドディスプレイ系においては、遺伝子融合は低水準で発現され、そして野生型の遺伝子ＩＩＩ蛋白はもまた粒子の感染性が保持されるように発現される。ペプチドライブラリを作成し、そのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許において開示されている（例えば米国特許５，７２３，２８６、米国特許５，４３２，０１８、５，５８０，７１７ウィルス被膜蛋白をコードする核酸、例えば５，４２７，９０８及び米国特許５，４９８，５３０）。
【０１９３】
抗体又は抗原結合ポリペプチドのライブラリは無作為ＤＮＡ配列の挿入による単一遺伝子の改変によるか、又は、関連遺伝子のファミリーのクローニングによるなど、多くの方法において作成されている。ファージ（ミド）ディスプレイを用いて抗体又は抗原結合フラグメントを提示するための方法は米国特許５，７５０，３７３、５，７３３，７４３、５，８３７，２４２、５，９６９，１０８、６，１７２，１９７、５，５８０，７１７及び５，６５８，７２７に記載されている。次に所望の特性を有する抗体又は抗原結合蛋白の発現があるか、ライブラリをスクリーニングする。
【０１９４】
鋳型核酸内に選択されたアミノ酸を置換させる方法は当該分野で確立されており、その一部は本明細書に記載するとおりである。例えば、超可変領域残基はＫｕｎｋｅｌ法を用いて置換することができる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）を参照できる。
【０１９５】
オリゴヌクレオチドの配列は改変すべき超可変領域残基に対して設計されたコドンセット１つ以上を包含する。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするために使用される種々のヌクレオチドトリプレット配列のセットである。コドンセットは、ＩＵＢコードに従って以下に示す通り、特定のヌクレオチド又はヌクレオチドの等モル混合物を指定する文字を用いて表示することができる。
【０１９６】
（ＩＵＢコード）
Ｇ  グアニン
Ａ  アデニン
Ｔ  チミン
Ｃ  シトシン
Ｒ（Ａ又はＧ）
Ｙ（Ｃ又はＴ）
Ｍ（Ａ又はＣ）
Ｋ（Ｇ又はＴ）
Ｓ（Ｃ又はＧ）
Ｗ（Ａ又はＴ）
Ｈ（Ａ又はＣ又はＴ）
Ｂ（Ｃ又はＧ又はＴ）
Ｖ（Ａ又はＣ又はＧ）
Ｄ（Ａ又はＧ又はＴ）Ｈ
Ｎ（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）。
【０１９７】
例えば、コドンセットＤＶＫにおいて、ＤはヌクレオチドＡ又はＧ又はＴであることができ；ＶはＡ又はＧ又はＣであることができ；そしてＫはＧ又はＴであることができる。このコドンセットは１８種の異なるコドンを示すことができ、そしてアミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ及びＣｙｓをコードすることができる。
【０１９８】
オリゴヌクレオチド又はプライマーセットは標準的な方法を用いて合成できる。あるセットのオリゴヌクレオチドは例えばコドンセットにより与えられる全ての可能な組み合わせのヌクレオチドトリプレットを示し、そしてアミノ酸の所望のグループをコードする配列を含有する固相合成により合成することができる。特定の位置において選択されたヌクレオチド「縮重度」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当該分野でよく知られている。特定のコドンセットを有するヌクレオチドのこのようなセットは市販の核酸合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能）を用いて合成することができるか、又は、市販品を購入できる（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤより入手）。従って、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは典型的には異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを包含し、その差異は全体的配列内のコドンセットにより確立される。オリゴヌクレオチドは、本発明に従って使用する場合は、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、そしてクローニング目的のための制限酵素部位を包含することもできる。
【０１９９】
１つの方法においては、変異体アミノ酸をコードする核酸配列はオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発により作成できる。この手法はＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５０４（１９８７）に記載されている通り当該分野でよく知られている。慨すれば、ＤＮＡ鋳型に所望のコドンセットをコードするオリゴヌクレオチドセットをハイブリダイズさせることにより変異体アミノ酸をコードする核酸配列を作成し、個々で、鋳型は可変領域核酸鋳型配列を含有するプラスミドの１本鎖形態である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを取り込むことになり、そしてオリゴヌクレオチドセットにより提供されるコドンセットを含有することになる鋳型の完全な第２の相補鎖を合成する。
【０２００】
一般的に少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは突然変異のためのコーディングヌクレオチドの何れかの側面上の鋳型に完全に相補的である１２〜１５ヌクレオチドを有する。これによりオリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは例えばＣｒｅａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：５７６５（１９７８）に記載のもののような当該分野で知られた手法を用いて容易に合成される。
【０２０１】
ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販品のＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９ベクターが適している）から誘導されるベクター、又は、Ｖｉｅｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：３（１９８７）により記載されている複製の１本鎖ファージ起点を含有するベクターにより生成される。即ち、突然変異すべきＤＮＡをこれらのベクターの１つに挿入することにより１本鎖鋳型を作成することができる。１本鎖鋳型の製造は上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【０２０２】
ネイティブのＤＮＡ配列を改変するためには、オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条件化に１本鎖鋳型にハイブリダイズさせる。ＤＮＡ重合酵素、通常はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを次に添加することにより、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いながら鋳型の相補鎖を合成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖が遺伝子１の突然変異した型をコードし、そして他方の鎖（元の鋳型）が遺伝子１のネイティブの未改変の配列をコードするようなヘテロ２本鎖分子が形成される。次にこのヘテロ２本鎖分子を適当な宿主細胞、通常は原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１内に形質転換する。細胞を成育させた後、それらをアガロースプレートにプレーティングし、３２−ホスフェートで放射標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングすることにより突然変異したＤＮＡを含有する細菌コロニーを発見する。
【０２０３】
上記した方法はプラスミドの両方の鎖が突然変異を含有するホモ２本鎖分子が形成されるように修飾してよい。修飾は以下の通り行う。１本鎖オリゴヌクレオチドを上記した通り１本鎖鋳型にアニーリングする。３種のデオキシリボヌクレオチド、即ちデオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）をｄＣＴＰ−（ａＳ）と称される修飾チオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）と組み合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一のＮＤＡ鎖が形成される。更に又、ＤＮＡのこの新しい鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含有しており、このため、制限エンドヌクレアーゼによる消化から保護される。２本鎖のヘテロ２本鎖の鋳型鎖が適切な制限酵素でニック処理された後、鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼ又は他の適切なヌクレアーゼにより、突然変異誘発すべき部位を含有する領域を過ぎた部分で消化することができる。次に反応を停止して部分的にのみ１本鎖となった分子を得る。次に４種全てのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、ＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼの存在下ＤＮＡポリメラーゼを用いて完全な２本鎖のＤＮＡホモ２本鎖を形成する。このホモ２本鎖分子を次に適当な宿主細胞に形質転換する。
【０２０４】
上記した通り、オリゴヌクレオチドセットの配列は鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さのものであり、そして又、必然ではないが、制限部位を含有してよい。ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクターから誘導されるベクター、又は、Ｖｉｅｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：３（１９８７）により記載されている複製の１本鎖ファージ起点を含有するベクターにより生成される。即ち、突然変異すべきＤＮＡをこれらのベクターの１つに挿入することにより１本鎖鋳型を作成することができる。１本鎖鋳型の製造は上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のセクション４．２１〜４．４１に記載されている。
【０２０５】
別の方法によれば、ライブラリは各々のセットが異なる配列のオリゴヌクレオチドの複数を有する、上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットを与えることにより形成することができ、異なる配列はオリゴヌクレオチドの配列内に与えられるコドンセットにより確立される。可変ドメイン鋳型核酸配列に沿った上流及び下流のオリゴヌクレオチドセットをポリメラーゼ連鎖反応において使用することによりＰＣＲ産物の「ライブラリ」を形成することができる。ＰＣＲ産物は、それらが確立された分子生物学の技術を用いて他の関連又は未関連の核酸配列、例えばウィルス被膜蛋白及び２量体化ドメインと融合できることから、「核酸カセット」と称することができる。
【０２０６】
ＰＣＲプライマーの配列は超可変領域内の溶媒に接触可能であり、かつ非常に多様な位置に対して設計されたコドンセット１つ以上を包含する。上記した通り、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチドトリプレット配列のセットである。
【０２０７】
適切なスクリーニング／選択工程を介して選択された所望の基準に合致する抗体のセレクタントは、標準的な組み換え手法を用いて単離し、そしてクローニングすることができる。
【０２０８】
（ベクター、宿主細胞及び組み換え方法）
本発明の抗体の組み換え製造のためには、それをコードする核酸を単離し、そして複製可能なベクターに挿入してその後のクローニング（ＤＮＡの増幅）に付すか、又は、発現に付す。抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法（例えば抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる等）を用いながら容易に単離して配列決定される。多くのベクターが使用可能である。ベクターの選択は部分的には使用する宿主細胞による。一般的に、好ましい宿主細胞は原核生物又は真核生物（一般的に哺乳類）起源の何れかのものである。
【０２０９】
（原核生物の宿主細胞を用いた抗体の作成）
（ベクターの構築）
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は標準的な組み換え手法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ細胞のような抗体生産細胞から所望のポリヌクレオチド配列を単離して配列決定する。或いは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成装置又はＰＣＲ手法を用いて合成することができる。得られた後、ポリペプチドをコードする配列を原核生物宿主内で複製し、異種ポリヌクレオチドを発現することができる組み換えベクター内に挿入する。当該分野で入手可能であり知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用できる。適切なベクターの選択はベクターに挿入すべき核酸の大きさ、及び、ベクターで形質転換すべき特定の宿主細胞により主に決定されることになる。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅又は発現又は両方）及びそれが入る特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、種々の成分を含有する。ベクター成分は一般的に、例えば複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート及び転写終止配列を包含する。
【０２１０】
一般的にレプリコン及び宿主細胞と適合する種から誘導される制御配列を含有するベクターをその宿主と組み合わせて使用する。ベクターは通常は複製部位、並びに、形質転換された細胞における表現型選択をもたらすことができるマーキング配列を担持している。例えばＥ．ｃｏｌｉは典型的にはＥ．ｃｏｌｉ種から誘導されるプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有しており、従って、形質転換された細胞を発見するための簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージはまた、内因性蛋白の発現のために微生物により使用されることができるプロモーターを含有するか、含有するように修飾されていてよい。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はＣａｒｔｅｒ等の米国特許５，６４８，２３７に詳細に記載されている。
【０２１１】
更に又、レプリコン及び宿主微生物と適合する制御配列を含有するファージベクターをそれらの宿主と組み合わせて形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．−１１のようなバクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２のような感受性宿主細胞を形質転換するために使用できる組み換えベクターを作成するときに利用してよい。
【０２１２】
本発明の発現ベクターはポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含んでよい。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する未翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは典型的には２つのクラス、即ち誘導及び構成プロモーターに属する。誘導プロモーターは例えば栄養の有無又は温度変化のような培養条件の変化に応答してその制御下にシストロンの転写の増大した水準を開始するプロモーターである。
【０２１３】
種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介して原料ＤＮＡからプロモーターを取り出すこと、及び、本発明のベクター内への単離されたプロモーター配列を挿入することにより、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。ネイティブのプロモーター配列及び多くの異種のプロモーターの両方が標的遺伝子の直接の増幅及び／又は発現を指向するために使用してよい。一部の実施形態においては、異種のプロモーターは、ネイティブ標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的により高値の転写および発現された標的遺伝子のより高値の収率を可能にすることから、これらが利用されている。
【０２１４】
原核生物を用いる場合の使用に適するプロモーターはＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターを包含する。しかしながら、細菌内で機能する他のプロモーター（例えば他の既知の細菌又はファージのプロモーター）が同様に適している。そのヌクレオチド配列は公開されており、これにより当業者であればそれらを、何れかの必要な制限部位を供給するためにリンカー又はアダプターを用いながら標的の軽鎖及び重鎖（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）をコードするシストロンに作動可能にライゲーションすることが可能である。
【０２１５】
本発明の１つの特徴において、組み換えベクター内の各シストロンは膜を通過する発現されたポリペプチドの転座を指向する分泌シグナル配列成分を含む。一般的にシグナル配列はベクターの成分であってよく、又は、ベクター内に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの部分であってよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞により認識されプロセシングされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）もので無ければならない。異種ポリペプチドに対してネイティブであるシグナルペプチドを認識又はプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合は、シグナル配列は例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群より選択される原核生物シグナル配列により置換される。本発明の１つの実施形態において、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０２１６】
別の特徴においては、本発明の免疫グロブリンの製造は宿主細胞の原形質内において起こることができ、従って各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点に関し、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は原形質内において発現され、折り畳まれ、そして組み立てられて機能的免疫グロブリンを形成する。特定の宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ−株）はジスルフィド結合の形成に好都合な原形質条件を提供し、これにより、発現された蛋白サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０２１７】
本発明は、分泌され適切に組み立てられた本発明の抗体の収率を最大限にするために発現されたポリペプチド成分の定量的比を調節する発現系を提供する。そのような調節は少なくとも一部的にはポリペプチド成分に関する翻訳強度を同時に調節することにより達成される。
【０２１８】
翻訳強度を調節するための１つの手法はＳｉｍｍｏｎｓ等の米国特許５，８４０，５２３に開示されている。それはシストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。あるＴＩＲに関して、一連のアミノ酸又は核酸配列変異体をある範囲の翻訳強度で作成することができ、特定の鎖の所望の発現水準のためにこの因子を調節する好都合な手段が提供される。ＴＩＲ変異体は、ヌクレオチド配列のサイレントな変化が好ましいものの、アミノ酸配列を改変する可能性があるコドンの変化をもたらす従来の突然変異誘発手法により作成することができる。ＴＩＲの改変は例えばＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の数又は間隔の改変、並びに、シグナル配列の改変を包含する。突然変異体シグナル配列を形成するための１つの方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させないコーディング配列の始点における「コドンバック」の形成である（即ち変化はサイレントである）。これは各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができ；更に又、一部のアミノ酸、例えばロイシン、セリン及びアルギニンは、データバンク作成に複雑性を与えることができる複数の第１及び第２の位置を有する。この突然変異誘発方法はＹａｎｓｕｒａら、（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｃｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳細に記載されている。
【０２１９】
好ましくは、ベクターのセットを、そこに含まれる各シストロンに対してある範囲のＴＩＲ強度となるように形成する。この限定されたセットは、各鎖の発現水準の比較並びに種々のＴＩＲ強度の組み合わせの下の所望の抗体産物の収量をもたらす。ＴＩＲ強度はＳｉｍｍｏｎｓ等の米国特許５，８４０，５２３に詳細に記載されている通り、受容体遺伝子の発現水準を定量することにより測定できる。翻訳強度比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲを選択して本発明の発現ベクターコンストラクトと組み合わせる。
【０２２０】
本発明の抗体を発現するために適する原核生物宿主細胞は例えばグラム陰性又はグラム陽性の生物のような原始細菌及び真正細菌を包含する。有用な細菌の例はエシェリシア（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、バチルス（例えばＢ・サブチルス）、腸内細菌、シュードモナス種（例えばＰ・アエルギノーサ）、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルクレブシエラ、プロテウス、シゲラ、リゾビア、ビトレオシラ又はパラコッカスを包含する。１つの実施形態において、グラム陰性菌体を使用する。１つの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ菌体を本発明の宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の例は、菌株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体、例えば遺伝子型Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ｌａｃＩｑｌａｃＬ８ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ｋａｎＲを有する菌株３３Ｄ３を包含する（米国特許５，６３９，６３５）。他の菌株及びその誘導体、例えばＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉλ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）もまた適している。これらの例は例示的なものであり、限定するものではない。所定の遺伝子型を有する上記した細菌の何れかの誘導体を構築するための方法は当該分野で知られており、そして例えばＢａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。細菌の菌体内のレプリコンの複製能力を考慮しながら適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチア又はサルモネラ種はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを用いてレプリコンを供給する場合には、宿主として使用するのに適している。典型的には、宿主細胞は最小量の蛋白分解酵素を分泌しなければならず、そして細胞培養物には追加的なプロテアーゼ阻害剤を配合することが望ましい。
【０２２１】
（抗体の製造）
宿主細胞は上記した発現ベクターで形質転換し、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜調整された従来の栄養培地中で培養する。
【０２２２】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、又は、染色体組込物により複製可能であるように原核生物の宿主内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適する標準的な手法を用いて行う。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は一般的にはかなりの細胞壁バリアを含有する細菌細胞に対して使用されている。形質転換の別の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。更に別の手法はエレクトロポレーションである。
【０２２３】
本発明のポリペプチドを製造するために使用する原核生物の細胞は当該分野で知られ、そして選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成育させる。適当な培地の例はルリア培地（ＬＢ）＋必要な栄養補給物である。一部の実施形態においては、培地は又発現ベクターを含有する原核生物の細胞の成育を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選ばれた選択物質を含有してよい。例えば、アンピシリンをアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成育のための培地に添加してよい。
【０２２４】
炭素、窒素及び無機物リン酸塩の補給源に加えて何れかの必要な補給物も単独で導入するか、又は他の補給物又は培地との混合物として、例えば複合窒素源として、適切な濃度において含んでよい。場合により、培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール及びジチオスレイトールからなる群より選択される１つ以上の還元剤を含有してよい。
【０２２５】
原核生物宿主細胞は適当な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉの生育のためには、例えば好ましい温度は約２０℃〜約３９℃の範囲、より好ましくは約２５℃〜約３７℃、更に好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは主に宿主生物に応じて約５〜約９の範囲である。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ｐＨは好ましくは約６．８〜約７．４、更に好ましくは約７．０である。
【０２２６】
誘導プロモーターを本発明の発現ベクター中において使用する場合、蛋白の発現はプロモーターの活性化に適する条件下に誘導する。本発明の１つの特徴において、ＰｈｏＡプロモーターをポリペプチドの転写を制御するために使用する。従って、形質転換された宿主細胞は導入のためのホスフェート制限培地中で培養する。好ましくは、ホスフェート制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えばＳｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７参照）。種々の他のインデューサーも当該分野で知られる通り、使用されるベクターコンストラクトに応じて使用してよい。
【０２２７】
１つの実施形態において、本発明の発現されたポリペプチドは宿主細胞のペリプラズム内に分泌させ、それより回収する。蛋白の回収では、典型的には細胞の破壊を、一般的には浸透圧ショック、超音波又は細部溶解のような手段により行う。細胞が破壊された後に細胞の破砕物又は全細胞を遠心分離又は濾過により分離してよい。蛋白は例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより更に精製してよい。或いは、蛋白を培地中に移しそこで単離することもできる。生成した蛋白を更に精製するために、細胞を培地から除去し、培養上澄みを濾過し、濃縮してよい。発現されたポリペプチドは更に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットのような一般的に知られた方法を用いて単離及び同定することができる。
【０２２８】
本発明の１つの特徴において、抗体の製造は醗酵法により大量に実施される。種々の大規模供給バッチ醗酵手順が組み換え蛋白の製造のために使用できる。大規模醗酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの醗酵器は酸素と栄養物、特にグルコース（好ましい炭素原子／エネルギー源）を分散させるために攪拌羽根車を使用する。小規模醗酵とは一般的に約１００リットル以下の容量であり、約１リットル〜約１００リットルの範囲であることができる醗酵器内の醗酵を指す。
【０２２９】
醗酵過程においては、蛋白発現の誘導は典型的には細胞が所望の密度、例えば細胞が早期定常期である約１８０〜２２０のＯＤ５５０となるまで適当な条件下に生育させた後に開始する。当該分野で知られる通り、そして、上記した通り、使用されるベクターコンストラクトに応じて種々のインデューサーを使用してよい。細胞は誘導の前に短時間生育させてよい。細胞は通常は約１２〜５０時間誘導するが、より長時間又は短時間も使用してよい。
【０２３０】
本発明のポリペプチドの製造収率及び品質を向上させるためには、種々の醗酵条件を変更できる。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な組み立て及び折り畳みを向上させるためには、追加的なベクター過剰発現シャペロン蛋白、例えばＤｓｂ蛋白（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペピチジルプロピルシストランス−イソメラーゼ）を使用して宿主原核生物細胞を同時形質転換することができる。シャペロン蛋白は宿主細胞内で生産された異種蛋白の適切な折り畳み及び溶解性を促進することがわかっている。Ｃｈｅｎら、（１９９９）Ｊ
Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許６，０８３，７１５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許６，０２７，８８８；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅら、（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０２３１】
発現された異種蛋白（特に蛋白分解的に感受性であるもの）の蛋白分解を最小限にするためには、蛋白分解酵素を欠損する特定の宿主系統を本発明のために使用できる。例えば、宿主細胞株はプロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組み合わせのような知られた細菌性プロテアーゼをコードする遺伝子内で遺伝子突然変異が起こるように修飾してよい。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損の系統が使用可能であり、例えばＪｏｌｙら、（１９９８）、上出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許５，２６４，３６５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許５，５０８，１９２；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０２３２】
１つの実施形態において、蛋白分解酵素を欠損し、そしてシャペロン蛋白１つ以上を過剰発現するプラスミドで形質転換されているＥ．ｃｏｌｉ菌株が本発明の発現系における宿主細胞として使用される。
【０２３３】
（抗体の精製）
１つの実施形態においては、本発明において製造された抗体蛋白を更に精製してその後の試験及び使用のためにかなり均質とされた調製物を得る。当該分野で知られた標準的な蛋白精製方法を使用することができる。以下の操作法、即ち、免疫アフィニティー又はイオン交換カラム上の分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＣＬ、シリカゲル上又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過等が精製操作法の例である。
【０２３４】
１つの特徴において、固相上に固定化されたプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用する。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高親和性で結合するスタフィロコッカス・アウレウス由来の４１ｋＤの細胞壁蛋白である。Ｌｉｎｄｍａｒｋら、（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡを固定化する固相は好ましくはガラス又はシリカの表面を含むカラム、より好ましくは制御された細孔を有するガラスカラム又はケイ酸カラムである。一部の適用例においては、カラムは、夾雑物の非特異的結合を防止するために、試薬、例えばグリセロールでコーティングされている。
【０２３５】
精製の第１工程として、上記した細胞培養物から誘導された調製物をプロテインＡ固定化固相上に適用し、プロテインＡへの目的の抗体の特異的結合を行う。次に固相を洗浄して固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に溶出により固相から目的の抗体を回収する。
【０２３６】
（真核生物宿主細胞を用いた抗体の作成）
ベクター成分は限定的ではないが一般的にはシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子１つ以上、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終止配列の１つ以上を含む。
【０２３７】
（ｉ）シグナル配列成分
真核細胞宿主細胞において使用するためのベクターもまた目的の成熟蛋白又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドを含有してよい。好ましく選択される異種のシグナル配列は宿主細胞により認識されプロセシングされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳類細胞発現においては、哺乳類シグナル配列、並びに、ウィルス分泌リーダー、例えば単純疱疹ｇＤシグナルが使用できる。
【０２３８】
このような前駆体領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに読み枠内でライゲーションされる。
【０２３９】
（ｉｉ）複製起点
一般的に複製起点成分は哺乳類発現ベクターには必要ではない。例えばＳＶ４０起点は典型的には、それが早期プロモーターを含有しているためにのみ使用してよい。
【０２４０】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは選択遺伝子、即ち選択可能なマーカーとも称されるものを含有してよい。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するか（ｂ）該当する場合は栄養要求性欠損を補充するか、又は（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養を補給する蛋白をコードする。
【０２４１】
選択スキームの一例は宿主細胞の生育を停止させる薬剤を利用する。異種遺伝子で良好に形質転換された細胞は薬剤耐性を付与する蛋白を生産し、そしてこのため、選択環境において生存することができる。このような優性選択の例は薬剤ネオマイシン、マイコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０２４２】
哺乳類細胞に対する適当な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンカルボキシラーゼ等のような、抗体核酸を取り込む能力を有する細胞の発見を可能にするものである。
【０２４３】
例えばＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培地中で全形質転換体を培養することによりまず発見される。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）。
【０２４４】
或いは、抗体、野生型ＤＨＦＲ蛋白及び他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）はアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８のような選択可能なマーカーに関する選択剤を含有する培地中における細胞生育により選択できる。米国特許４，９６５，１９９を参照。
【０２４５】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物により認識されるプロモーターを含有しそして抗体ポリペプチド核酸に作動可能に連結している。プロモーター配列は真核生物について知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子が転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に存在する別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、個々でＮは何れかのヌクレオチドである。大部分の真核生物遺伝子の３’末端は、コーディング配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに挿入するのに適する。
【０２４６】
哺乳類宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより、これらのプロモーターが宿主細胞系と適合する限りにおいて、制御される。
【０２４７】
ＳＶ４０ウィルスの早期及び後期プロモーターは、好都合には、複製のＳＶ４０ウィルス起点を同様に含有するＳＶ４０制限フラグメントとして得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは好都合にはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして得られる。ベクターとしてウシパピローマウィルスを使用する哺乳類宿主内でＤＮＡを発現するための系は米国特許４，４１９，４４６に開示されている。この系の修飾は米国特許４，６０１，９７８に記載されている。更に又、単純疱疹ウィルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下のマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照できる。或いは、ラウス肉腫ウィルス長末端リピートをプロモーターとして使用できる。
【０２４８】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより増大する場合が多い。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら典型的には真核細胞ウィルス由来のエンハンサーを使用することにある。例示されるものは複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及び、アデノウィルスエンハンサーを包含する。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関してはＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照できる。エンハンサーは抗体−ポリペプチドをコードする配列に対して５’又は３’側の位置においてベクター内にスプライシングしてよいが、好ましくはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０２４９】
（ｖｉ）転写終止成分
真核生物宿主細胞内で使用される発現ベクターは典型的には転写の終止のため、及び、ｍＲＮＡの安定化のために必要な配列も含有する。このような配列は真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの一般的には５’側、そして場合により３’側の未翻訳領域が得られる。これらの領域は抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終止成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示されている発現ベクターを参照できる。
【０２５０】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ベクター内でＤＮＡをクローニング又は発現するための適当な宿主細胞はここでは本明細書に記載した高等真核生物の細胞、例えば脊椎動物の宿主細胞を包含する。培養物（組織培養）中の脊椎動物の細胞の増殖は類型的な操作法になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例はＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓系統（２９３又は懸濁培養物中での生育のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、モンキー腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ科腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ １４４２）ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０２５１】
宿主細胞は抗体製造のための上記した発現又はクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養する。
【０２５２】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を製造するために使用する宿主細胞は種々の培地中で培養してよい。Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地が宿主細胞を培養するために適している。更に又Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；又は５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；又は米国特許Ｒｅ．３０，９８５に記載の培地の何れも宿主細胞のための培地として使用してよい。これらの培地の何れも必要に応じてホルモン類及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン又は表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗体（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ剤）、微量元素（マイクロモル範囲の終濃度で通常存在する無機の化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源を補給してよい。何れかの他の必要な補給物もまた当業者の知るとおり適切な濃度で含有させてよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用したものであり、そして当業者には容易に想到されるものである。
【０２５３】
（ｉｘ）抗体の精製
組み換え手法を用いる場合、抗体は細胞内に生産させるか、又は、培地に直接分泌させることができる。抗体が細胞内に生産される場合は、第１工程として、宿主細胞又は溶解断片である粒状の破砕物を例えば遠心分離又は限外濾過により除去する。抗体を培地に分泌させる場合は、そのような発現系の上澄みを一般的にはまず市販の蛋白濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを上記工程の何れかにおいて使用することにより蛋白分解を阻害してよく、そして、抗生物質を添加して偶発的な夾雑菌の生育を防止してよい。
【０２５４】
細胞から調製された抗体組成物は例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、ここではアフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの妥当性は抗体内に存在する何れかの免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプによるものである。プロテインＡはヒトγ１、γ２又はγ４の重鎖に基づく抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５；１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドを結合させるマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも使用できる。機械的に安定なマトリックス、例えば制御された細孔を有するガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンはアガロースで達成できるものよりも早い流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製のために適している。蛋白精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上の分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＣＬ、シリカゲル上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上のクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈降法もまた回収すべき抗体に応じて使用される。
【０２５５】
何れかの予備的精製工程の後、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、好ましくは低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍ塩）において実施される約２．５〜４．５のｐＨの溶出を用いた低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに付す。
【０２５６】
（活性試験）
本発明の抗体は当該分野で知られた種々の試験により、その物理的／化学的特性及び生物学的機能について特性化することができる。
【０２５７】
精製された免疫グロブリンは更に、一連の試験、例えばＮ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズエクスクルージョン高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量スペクトル分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化により特性化することができる。
【０２５８】
本発明の特定の実施形態においては、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。一部の実施形態においては、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、本発明において使用できる抗原結合試験の例は、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降試験、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイのような手法をもちいた何れかの直接又は競合的な結合試験を包含する。例示される抗原結合試験は実施例のセクションにおいて後述する。
【０２５９】
１つの実施形態において、本発明は一部ではあるが全てではないエフェクター機能を保有する改変された抗体を意図しており、これにより、インビボの抗体の半減期が重要であるが、なお特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）は不必要であるか有害であるような多くの適用のための望ましい候補となっている。特定の実施形態においては、所望の特性のみが維持されていることを確実にするため、生産された免疫グロブリンのＦｃ活性を測定する。インビトロ及び／又はインビボの細胞毒性試験を実施することによりＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合試験を実施することにより抗体がＦｃγＲ結合を欠失している（従ってＡＤＣＣ活性も欠失していると考えられる）がＦｃＲｎ結合能力は保持していることを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに大使、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページ上の表３に総括されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロの試験の例は米国特許５，５００，３６２又は５，８２１，３３７に記載されている。このような試験のための有用なエフェクター細胞は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。或いは、或いは追加的に、目的分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、例えばＣｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９８８）に開示されているもののような動物モデル中で評価してよい。Ｃｌｑ結合試験もまた抗体がＣｌｑに結合することができない、即ちＣＤＣ活性を欠失していることを確認するために実施してよい。補体活性化を評価するためには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているＣＤＣ試験を実施してよい。ＦｃＲｎ結合及びインビボのクリアランス／半減期の測定は例えば実施例のセクションに記載するような当該分野で知られた方法を用いて実施することができる。
【０２６０】
（ヒト化抗体）
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当該分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は非ヒトである原料からそこに導入されたアミノ酸残基１つ以上を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は頻繁には「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインに由来する。ヒト化は本質的にはヒト抗体の相当する配列の超可変領域配列を置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ等の方法に従って実施することができる（Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って実施することができる。従ってそのような「ヒト化」抗体は、未損傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種の相当する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許４，８１６，５６７）である。実際、ヒト化抗体は典型的には、一部の超可変領域残基及びおそらくは一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似の部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
【０２６１】
ヒト化抗体の作成において使用すべき軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性を低減するためには極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従えば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次にげっ歯類のものに最も近かったヒト配列がヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして許容される（Ｓｉｍｓら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１）。別の方法は軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から誘導した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に対して使用してよい（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
【０２６２】
抗原に対する高い親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化させることが更に重要である。この目標を達成するためには、１つの方法によれば、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いながら、ヒト化抗体を製造する。三次元の免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者のよく知るものである。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元コンホーメーション構造を説明して表示するコンピュータープログラムが使用できる。これらのディスプレイを精査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、即ち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を選択肢、レシピエント及びインポート配列から、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特性が達成されるように組み合わせることができる。一般的に超可変領域残基は、抗原結合への影響においては直接、そして最も大きく関与している。
【０２６３】
（抗体変異体）
１つの特徴において、本発明はＦｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面において修飾を含む抗体フラグメントを提供し、その場合、修飾はヘテロ２量体化を刺激及び／又は促進する。これらの修飾は第１のＦｃポリペプチドへの隆起部及び第２のＦｃポリペプチドへの陥没部の導入を含み、ここで隆起部は陥没部に位置付けすることが可能であり、これにより第１及び第２のＦｃポリペプチドの複合体形成が促進される。これらの修飾を有する抗体の形成方法は当該分野で知られており、例えば米国特許５，７３１，１６８に記載されている。
【０２６４】
一部の実施形態においては、本明細書に記載した抗体のアミノ酸配列の修飾が意図される。例えば抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望まれる場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は抗体核酸に適切なヌクレオチドの変化を導入することによるか、又は、ペプチド合成により製造される。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を包含する。欠失、挿入及び置換の何れかの組み合わせが最終コンストラクトに到達するまで行ってよいが、ただし最終コンストラクトは所望の特性を保有しなければならない。アミノ酸の改変は配列が作成される時点で目的の抗体のアミノ酸配列に導入してよい。
【０２６５】
突然変異誘発のために好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の発見のための有用な方法はＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載される通り「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称される。ここでは、残基又は標的残基の群を発見（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｎのような荷電残基）し、そして中性又は逆に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置き換えることにより抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与える。次に置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置を、置換の位置において、又はそのための、追加的又は別の変異体を導入することにより精査する。即ち、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されるが、突然変異そのものの性質は予め決定されなくてよい。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するためには、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域において実施し、そして発現された免疫グロブリンで所望の活性を有するものをスクリーニングする。
【０２６６】
アミノ酸配列の挿入は、１残基〜１００以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシ末端の融合、並びに、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内の挿入を包含する。末端挿入の例はＮ末端メチオニル残基を有する抗体又は細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体を包含する。抗体分子の他の挿入による変異体は、血清中の抗体の半減期を増大させる酵素（例えばＡＤＥＰＴ）又はポリペプチドに対する抗体のＮ又はＣ末端への融合を包含する。
【０２６７】
変異体の別の型はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は異なる残基で置き換えられた抗体分子内のアミノ酸残基少なくとも１つを有する。置換突然変異誘発の最大の関心部位は超可変領域を包含するが、ＦＲ改変もまた意図される。保存的な置換は「好ましい置換」と題して表２に示すものである。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合は、表２において「例示される置換」と命名されたもの、又はアミノ酸のクラスに関して後述するような、より実質的な変化を導入して産物をスクリーニングしてよい。
【０２６８】
【表２】
2008512382.tif 000093
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は（ａ）例えばシート又はらせん状のコンホーメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチドの骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は、（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するその作用において有意に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸はその側鎖の特性における類似性に従って、下記の通りグループ分けしてよい（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｅ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０２６９】
或いは、天然に存在する残基を共通側鎖の特性に基づいて、下記の通りグループ分けしてよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２７０】
非保存的置換はこれらのクラスの一方のメンバーを別のクラスと交換することを包含する。このように置換された残基はまた保存的置換の部位内に、より好ましくは残余（非保存）部位内に導入されてもよい。
【０２７１】
置換変異体の１つの型では、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の超可変領域残基の１つ以上が置換される。一般的に、得られた変異体でその後の開発のために選択されるものはそれらが形成される元となった親抗体と相対比較して向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換変異体を形成するための好都合な方法では、ファージディスプレイを用いたアフィニティー成熟化を行う。慨すれば、幾つかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を形成する。このようにして形成された抗体を、フィラメントファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として提示する。ファージディスプレイされた変異体を次に、本明細書に開示したその生物学的活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。修飾に関する候補超可変領域部位を発見するためには、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施することにより抗原結合に大きく寄与している超可変領域残基を発見することができる。或いは、又は追加的に、抗体と抗原の間の接触点を発見するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益である場合がある。このような接触残基及び近隣の残基は本発明において考案した手法により置換のための候補である。このような変異体を形成した後、変異体のパネルを本明細書に記載するとおりスクリーニングに付し、そして該当する試験１つ以上において優れた特性を有していた抗体を選択してその後の開発に付す。
【０２７２】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られた種々の方法により製造される。これらの方法は、例えば天然原料（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又は、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及び以前に作成された抗体変異体又は非変異体型のカセット突然変異誘発による作成を包含する。
【０２７３】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内にアミノ酸修飾１つ以上を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を形成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体はヒンジシステインを包含するアミノ酸位置１つ以上においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでよい。
【０２７４】
本明細書の記載及び当該分野の教示に従って、一部の実施形態においては、本発明の方法で使用する抗体は例えばＦｃ領域において野生型の対応する抗体と比較して改変１つ以上を含んでよいことを意図している。これらの抗体はしかしなお、その対応野生型と比較して治療利用性のために必要な実質的に同じ特性を保持している。例えば改変された（即ち向上した、又は低減した）Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存細胞毒性）（ＣＤＣ）をもたらすように、例えばＷＯ９９／５１６４２に記載する通り、特定の改変をＦｃ領域において行うことができる。同様にＦｃ領域変異体の別の例に関わるＤｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許５，６４８，２６０；米国特許５，６２４，８２１；及びＷＯ９４／２９３５１も参照できる。
【０２７５】
（免疫コンジュゲート）
本発明はまた細胞毒性剤、例えば化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）又は放射性同位体（例えば放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
【０２７６】
細胞毒性又は細胞生育阻害性の薬剤、即ち癌治療において腫瘍細胞を殺傷する薬剤（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許４，９７５，２７８）の局所送達のための抗体−薬剤コンジュゲートの使用は、理論的には、腫瘍への薬剤部分のターゲティングされた送達及びそこにおける細胞内蓄積を可能にし、その場合、これらのコンジュゲート薬剤の全身投与は正常細胞並びに排除しようとする腫瘍細胞に許容できない水準の毒性をもたらす可能性がある（Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら、（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。このため最小限の毒性で最大の薬効とすることが求められている。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はともにこれらの方策において有用であることが報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法において使用されている薬剤はダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセート及びビンデシンである（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）上出）。抗体−毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素は細菌性毒素、例えばジフテリア毒素、植物性毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら、（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら、（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら、（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３）及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）を包含する。毒素は、チュブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を包含する機序によりその細胞毒性及び細胞増殖阻害作用を示す。一部の細胞毒性剤は大型の抗体又は蛋白の受容体リガンドにコンジュゲートされると不活性化されるか、活性が低下する傾向を示す。
【０２７７】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）はチオ尿素リンカーキレーターにより結合された正常及び悪性のＢリンパ球の表面上に存在するＣＤ２０抗原に対して指向されたマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体と１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体よりなる抗体−放射性同位体コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎら、（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７；Ｗｉｓｅｍａｎら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２；Ｗｉｔｚｉｇら、（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３；Ｗｉｔｚｉｇら、（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＲＩＮはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与により重度及び長期間の血球減少症が大部分の患者において起こる。カリケアマイシンに連結されたｈｕＣＤ３３抗体よりなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＹＬＯＴＡＲＧＴＭ（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は注射による急性骨髄性白血病の治療のために２０００年に認可されている（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許４９７０１９８；５０７９２３３；５５８５０８９；５６０６０４０；５６９３７６２；５７３９１１６；５７６７２８５；５７７３００１）。マイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１にジスルフィドリンカーＳＰＰを介して連結されたｈｕＣ２４２抗体よりなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメトラシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は結腸癌、膵臓癌、胃癌及びその他のようなＣａｎＡｇを発現する癌の治療のための第ＩＩ相治験段階に入っている。マイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１に連結された抗前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体よりなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は前立腺癌の潜在的治療のために開発中である。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びドラスタチンの合成類縁体はキメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のＬｅｗｉｓＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液悪性疾患上のＣＤ３０に特異的）（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１（７）：７７８−７８４；及びＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ら、（２００３）Ｂｌｏｏｄ，１０２，１４５８−１４６５）にコンジュゲートされており、そして治療薬開発中である。薬剤コンジュゲート細胞毒性剤としての使用のための他の化合物は、例えばオーリスタチンＥ（ＡＥ）、ＭＭＡＦ（薬剤のＣ末端においてフェニルアラニンを有するオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変異体）及びＡＥＶＢ（オーリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン、ＡＥのＣ末端を介した酸不安定性のリンカー）を包含する。抗体に薬剤を結合させるための有用なコンジュゲートリンカーは例えばＭＣ（まれイミドカプロイル）、ＶａｌＣｉｔ（バリン−シトルリン、プロテアーゼ切断性リンカーにおけるジペプチド部位）、シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルカルバモイル、リンカーの「自己犠牲型」部分）、Ｍｅ（リンカーペプチド結合がカテプシンＢによりその切断を防止するように修飾されているＮ−メチル−バリンシトルリン）、ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ（抗体システインに結合したマレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）及びＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）を包含する。これら及び他の有用な薬剤コンジュゲート及びその製造は例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＤｏｒｏｎｉｎａ，Ｓ．Ｏ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：７７８−７９４（２００３）に開示されている。特に好ましいリンカー分子は例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えばＣａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば米国特許４，５６３，３０４参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えばＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（例えばＹｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５−３９９（１９７９）参照）及びＮ−スクシンイミジル４−メチル−４−［２−（５−ニトロピリジル）ジチオ］ペンタノエート（ＳＭＮＰ）（例えば米国特許４，５６３，３０４参照）を包含する。
【０２７８】
このような免疫コンジュゲートの形成において有用な化学療法剤は上記の通りである。使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  Ｆｏｒｄｉｉ蛋白、ジアンシン蛋白、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用できる。例は２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを包含する。抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性蛋白カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成される。例えば、リシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。
【０２７９】
抗体及び１つ以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテセン及びＣＣ１０６５及び毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体のコンジュゲートもまた本発明において意図している。
【０２８０】
（マイタンシン及びマイタンシノイド）
１つの実施形態において本発明の抗体（完全長又はフラグメント）は１つ以上のマイタンシノイド分子にコンジュゲートする。
【０２８１】
マイタンシノイドはチュブリン重合を阻害することにより機能する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは東アフリカの潅木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許３，８９６，１１１）。その後、特定の微生物もまたマイタンシノイド、例えばマイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステルを生産することが発見された（米国特許４，１５１，０４２）。合成のマイタンシノール及びその誘導体及び類縁体は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，１３７，２３０；４，２４８，８７０；４，２５６，７４６；４，２６０，６０８；４，２６５，８１４；４，２９４，７５７；４，３０７，０１６；４，３０８，２６８；  ４，３０８，２６９；４，３０９，４２８；４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３１７，８２１；４，３２２，３４８；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；４，３６４，８６６；４，４２４，２１９；４，４５０，２５４；４，３６２，６６３；および４，３７１，５３３に開示されている。
【０２８２】
（マイタンシノイド−抗体コンジュゲート）
その治療指数を向上させる試みにおいて、マイタンシン及びマイタンシノイドは腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされている。マイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びその治療用途は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，２０８，０２０、５，４１６，０６４及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）はヒト結腸直腸癌に対して指向されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結したＤＭ１と指名されたマイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対しては高度に細胞毒性であることがわかり、そしてインビボの腫瘍生育試験において抗腫瘍活性を示している。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）はヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７に、又は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体にジスルフィドリンカーを介してマイタンシノイドをコンジュゲートしている免疫コンジュゲートを記載している。ＴＡ．１−マイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性は細胞当たり３ｘ１０５ＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対してインビトロで試験されている。薬剤コンジュゲートは有利のマイタンシノイド薬剤と同様の細胞毒性の程度を達成しており、これは抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大させることができた。Ａ７−マイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいて低い全身細胞毒性を示した。
【０２８３】
（抗体−マイタンシノイドコンジュゲート（免疫コンジュゲート））
抗体マイタンシノイドコンジュゲートは抗体又はマイタンシノイド分子の何れかの生物学的活性を有意に低下させること無くマイタンシノイド分子に抗体を化学的に連結することにより製造する。抗体分子当たり平均３〜４個のマイタンシノイド分子をコンジュゲートすると抗体の機能又は溶解性に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞毒性を増強する場合に有効であることがわかっているが、１分子毒素／抗体であっても抗体単独の使用よりも細胞毒性を増強できることが期待される。マイタンシノイドは当該分野でよく知られており、そして知られた手法により合成するか、又は、天然原料から単離することができる。適当なマイタンシノイドは例えば米国特許５，２０８，０２０に、そして、上記した他の特許又は非特許の公開物に開示されている。好ましいマイタンシノイドはマイタンシノール及び芳香環において、又は、マイタンシノール分子の他の位置において修飾されているマイタンシノール類縁体、例えば種々のマイタンシノールエステルである。
【０２８４】
抗体−マイタンシノイドコンジュゲートを作成するための当該分野で知られた連結基は多数存在し、例えば米国特許５，２０８，０２０又は欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１及びＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されているもの等が挙げられる。連結基は上記特許に開示されている通りジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基を包含するが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０２８５】
抗体とマイタンシノイドのコンジュゲートは種々の２官能性蛋白カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成してよい。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を与えるためのＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８））及びＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を包含する。
【０２８６】
リンカーは連結部の型に応じて種々の位置においてマイタンシノイド分子に結合してよい。例えば、エステル結合は従来のカップリング手法を用いてヒドロキシル基との反応により形成してよい。反応はヒドロキシル基を有するＣ３位、ヒロドキシメチルで修飾されたＣ１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ１５位及びヒドロキシル基を有するＣ２０位において起こってよい。好ましい実施形態においては、連結はマイタンシノール又はマイタンシノール類縁体のＣ３位において形成される。
【０２８７】
（カリケアマイシン）
目的の免疫コンジュゲートの別のものはカリケアマイシン分子１つ以上にコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはピコモル未満の濃度において２本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの製造に関しては米国特許５，７１２，３７４、５，７１４，５８６、５，７３９，１１６、５，７６７，２８５、５，７７０，７０１、５，７７０，７１０、５，７７３，００１、５，８７７，２９６を参照することができる（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。使用してよいカリケアマイシンの構造的類縁体は例えばγ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩｌ（Ｈｉｍｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及び上記したＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄへの米国特許）。抗体をコンジュゲートできる別の抗腫瘍剤は抗葉酸エステルであるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは両方とも細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介内在を介したこれらの薬剤の細胞内取り込みはその細胞毒性作用を大きく増大させる。
【０２８８】
（他の細胞毒性剤）
本発明の抗体にコンジュゲートできる他の抗腫瘍剤はＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許５，０５３，３９４、５，７７０，７１０に記載の総称ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られる薬剤ファミリー、並びに、エスペラマイシン（米国特許５，８７７，２９６）を包含する。
【０２８９】
使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ蛋白、ジアンシン蛋白、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。例えば１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照できる。
【０２９０】
本発明は更に抗体と核溶解活性を有する化合物との間に形成される免疫コンジュゲートを意図している（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）。
【０２９１】
腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は高度に放射性の原子を含んでよい。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用される。例示されるものはＡｔ２１３、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を包含する。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、更にヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２９２】
放射標識又は他の標識を知られた方法でコンジュゲートに取り込ませてよい。例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いながら、ペプチドを生合成するか、又はアミノ酸化学合成法により合成してよい。ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１のような標識をペプチド内のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合できる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いてヨウ素−１２３を取り込むことができる。Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）は他の方法を詳細に説明している。
【０２９３】
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性の蛋白カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成してよい。例えば、リシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。リンカーは細胞内での細胞毒性剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許５，２０８，０２０）を使用してよい。
【０２９４】
本発明の化合物は例えば、市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．Ｕ．Ｓ．Ａ．より）交差結合剤：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて製造されたＡＤＣも意図している。例えば２００３−２００４Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ、ｐ４６７−４９８を参照できる。
【０２９５】
（抗体薬剤コンジュゲートの製造）
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）においては、抗体（Ａｂ）を１つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体当たり約１〜約２０薬剤部分にリンカー（Ｌ）を介してコンジュゲートする。式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ          Ｉ
のＡＤＣは、数種類の経路により、当業者の知る有機化学の反応、条件及び試薬を用いながら、例えば（１）共有結合を介したＡｂ−Ｌを形成するための２価リンカー試薬との抗体の親核基の反応、及び、その後の薬剤部分Ｄとの反応；及び（２）共有結合を介したＤ−Ｌを形成するための２価リンカー試薬との薬剤部分の親核基の反応、及び、その後の抗体の親核基との反応、により製造してよい。
【０２９６】
抗体上の親核基は例えば、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）糖ヒドロキシル又はアミノ基であって抗体がグリコシル化されるところを包含する。アミン、チオール及びヒドロキシル基は親核性であり、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハライド；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を包含するリンカー部分及びリンカー試薬上の親電子基と共有結合を形成するように反応することができる。特定の抗体は還元性の鎖間ジスルフィド、即ちシステイン架橋を有する。抗体はＤＴＴ（ジチオスレイトール）のような還元剤による処理によりリンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性としてよい。即ち各システイン架橋は理論的には２つの反応性チオール親核物質を形成することになる。２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）とのリジンの反応を介して抗体に別の親核基を導入することができ、これによりアミンからチオールへの変換がもたらされる。
【０２９７】
本発明の抗体薬剤コンジュゲートはまたリンカー試薬又は薬剤の上の親核性置換基と反応することができる親電子部分を導入するための抗体の修飾により製造してもよい。グリコシル化抗体の糖は例えば過ヨウ素酸塩の酸化剤で酸化することによりアルデヒド又はケトン基とし、これをリンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応させてよい。形成されるイミンシッフ塩基の基は安定な連結部を形成するか、又は、例えばボロハイドライド試薬で還元することにより、安定なアミン連結部を形成してよい。１つの実施形態において、ガラクトースオキシダーゼ又はｍ−過ヨウ素酸ナトリウムの何れかとのグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により薬剤上の適切な基と反応できる蛋白中のカルボニル（アルデヒド又はケトン）基を形成してよい（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態においては、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含有する蛋白をｍ−過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの形成を行う（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許５３６２８５２）。このようなアルデヒドは薬剤部分又はリンカー親核物質と反応することができる。
【０２９８】
同様に、薬剤部分上の親核基は、例えば、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハライド；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を包含するリンカー部分及びリンカー試薬上の親電子基と共有結合を形成するように反応することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアンヒドラジド基を包含する。
【０２９９】
或いは、抗体及び細胞毒性剤を含む融合蛋白、例えば組み換え手法又はペプチド合成により、作成してよい。ＤＮＡの長さは、相互に隣接するか、又は、コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分断されたコンジュゲートの２つの部分をコードする各々の領域を含む。
【０３００】
更に別の実施形態においては、抗体は腫瘍のプレターゲティングにおいて利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートしてよく、その場合、抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、その後、キレート剤を用いて循環系から未結合のコンジュゲートを除去し、そして次に細胞毒性剤（例えば放射性核種）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０３０１】
（抗体誘導体）
本発明の抗体誘導体は、当該分野で知られ容易に入手できる別の非蛋白性部分を含有するように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適する部分は水溶性重合体である。水溶性重合体の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。重合体は何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合する重合体の数は変動してよく、そして、１つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用する重合体の数及び／又は種類は、例えば向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体を特定の条件下の治療に使用するのか等を考慮しながら決定することができる。
【０３０２】
（医薬品製剤）
本発明の抗体を含む治療用製剤は、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥した製剤の形態において、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））に所望の程度の純度を有する抗体を混合することにより保存用に製造される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は使用される用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、そして、緩衝物質、例えばリン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン又は他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；セタノール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、２糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−蛋白複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。
【０３０３】
本発明の製剤は又、治療すべき特定の適応症のために必要に応じて１つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含有してよい。このような分子は適宜、意図する目的のために有効である量において、組み合わせて存在する。
【０３０４】
活性成分はまた例えばコアセルベーション法によるか、又は、界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマクロエマルジョン中に捕獲させてもよい。このような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０３０５】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過メンブレンを通過する濾過により容易に達成される。
【０３０６】
持続放出製剤を製造してよい。持続放出製剤の適当な例は本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、そのようなマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い時間に蛋白を放出する。カプセル化免疫グロブリンが身体内に長時間残存する場合、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として、変性するか凝集し、生物学的活性を消失するか、又は、免疫原性が変化する可能性がある。合理的な方策は関与する機序に応じて安定化のために考案することができる。例えば、凝集の機序がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されれば、スルフィドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用、及び、特定の重合体マトリックス組成物の開発により安定化を達成してよい。
【０３０７】
（用途）
本発明の抗体は例えばインビトロ、エクスビボ及びインビボの治療方法において使用してよい。本発明の抗体はインビトロ、エクスビボ及びインビボで特定の抗原の活性を部分的又は完全にブロックするための拮抗剤として使用できる。更に又、本発明の抗体の少なくとも一部は他の種由来の抗原の活性を中和することができる。従って、本発明の抗体は例えば抗原を含有する細胞培養物において、ヒト被験体において、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類被験体（例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス）において、特定の抗原活性を阻害するために使用できる。１つの実施形態において、本発明の抗体は抗原活性が阻害されるように抗原に抗体を接触させることにより抗原活性を阻害すために使用できる。好ましくは、抗原はヒト蛋白分子である。
【０３０８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、抗原活性が有害であるような障害に罹患した被験体において、被験体における抗原活性が阻害されるように本発明の抗体を被験体に投与することを含む抗原を阻害するための方法において使用することができる。好ましくは、抗原はヒト蛋白分子であり、そして被験体はヒト被験体である。或いは、被験体は本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳類であることができる。更に又、被験体は抗原が導入されている（例えば抗原の投与によるか、又は、抗原トランスジーンの発現による）哺乳類であることができる。本発明の抗体は治療目的のためにヒト被験体に投与することができる。更に又、本発明の抗体は獣医科用途のため、又は、ヒト疾患の動物モデルとしての、免疫グロブリンが交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳類（例えば霊長類、ブタ又はマウス）に投与できる。後者に関しては、そのような動物モデルは本発明の抗体の治療薬効を評価する（例えば用量及び投与の時間的過程の試験）ために有用である。治療上有用な本発明のブロッキング抗体は、例えば抗ＨＥＲ２、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗インターフェロン及び抗組織因子の抗体を包含する。本発明の抗体は抗原分子の１つ以上の異常な発現及び／又は活性に関連する疾患、障害又は状態、例えば悪性及び良性の腫瘍；非白血病性及びリンパ性の悪性疾患；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質性及び胞胚腔の障害；及び炎症性、血管形成及び免疫学的な障害の治療、阻害、進行の遅延、再発の防止／遅延、軽減又は防止のために使用することができる。
【０３０９】
１つの特徴において、本発明のブロッキング抗体はリガンド抗原に特異的であり、そして、リガンド抗原が関与するリガンド−受容体相互作用をブロックするか、これに干渉することにより抗原活性を阻害し、これにより、相当するシグナル経路及び他の分子又は細胞の事象を阻害することができる。本発明は更に、必ずしもリガンド結合を防止しないが受容体の活性化に干渉し、これにより通常ではリガンド結合により開始される何れかの応答を阻害する受容体特異的抗体を特徴とする。本発明は又、リガンド−受容体複合体に優先的又は排他的に結合する抗体を包含する。本発明の抗体はまた特定の抗原受容体のアゴニストとして機能することができ、これによりリガンド媒介受容体活性化の全て又は部分的な活性を強化、増強又は活性化する。
【０３１０】
特定の実施形態においては、細胞毒性剤とコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲートを患者に投与する。一部の実施形態においては、免疫コンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原は、細胞により内在化され、それが結合する標的細胞の殺傷において、免疫コンジュゲートの増大した治療薬効をもたらす。１つの実施形態において、細胞毒性剤は標的細胞内の核酸をターゲティングするか、又は、それに干渉する。そのような細胞毒性剤の例は本明細書に記載した化学療法剤の何れか（例えばマイタンシノイド又はカリケアマイシン）、放射性同位体、又は、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼを包含する。
【０３１１】
本発明の抗体は治療において単独で、又は、他の組成物と組み合わせて使用できる。例えば、本発明の抗体は他の抗体、化学療法剤（化学療法剤のカクテルを包含する）、他の細胞毒性剤、抗血管形成剤、サイトカイン及び／又は成長阻害剤と同時投与してよい。本発明の抗体が腫瘍の生育を阻害する場合、やはり腫瘍生育を阻害する他の治療薬１つ以上とそれを組み合わせることが特に望ましい場合がある。例えば、本発明の抗体は投与スキームにおいて、例えば本明細書に記載した疾患の何れか、例えば結腸直腸癌、転移性乳癌及び腎臓癌の治療において、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばＡＶＡＳＴＩＮ）及び／又は抗ＥｒｂＢ抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体）と組み合わせてよい。或いは、又は追加的に、患者は複合放射線療法を受けてよい（例えば体外からの放射線照射又は放射標識薬剤、例えば抗体を用いた治療）。上記したこのような複合療法は複合投与（２種以上の薬剤を同じ、又は別個の製剤中に含有させる）及び本発明の抗体の投与を副次的治療の投与の前、及び／又は後に行う個別投与を包含する。
【０３１２】
本発明の抗体（及び副次的治療薬）は何れかの適当な手段、例えば非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻内、及び、所望により局所投与、患部内投与により投与される。非経口注入は筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を包含する。更に又、抗体は適宜、特に抗体の漸減用量によるパルス注入により投与される。投薬は何れかの適当な経路、例えば注射、例えば静脈内又は皮下注射により行うことができ、これは部分的には投与が短期であるか長期であるかにより決まる。
【０３１３】
本発明の抗体組成物は良好な医療上の慣行に合致した態様において製剤され、容量決定され、そして投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は必然ではないが場合より問題となる障害の防止又は治療のために現在使用中の薬剤１つ以上とともに製剤される。そのような他剤の有効量は製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に応じたものである。これらは一般的には以前に使用されていたものと同じ用量及び投与経路において、又は、以前に使用されていた用量の１〜９９％で使用される。
【０３１４】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独使用、又は、化学療法剤のような他剤との組み合わせにおいて）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に応じて変動する。抗体は適宜、患者に対し、単回、又は一連の治療に渡って投与する。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量である。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、投与は所望の疾患症状の阻害が起こるまで持続する。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。即ち、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は間歇的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０、例えば約６抗体投薬を受けるように）投与してよい。初期の高値の負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。例示される用量用法は約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量を投与した後、抗体約２ｍｇ／ｋｇの週当たり維持用量を含む。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
【０３１５】
（製造物品）
本発明の別の特徴において、上記した疾患の治療、予防及び／又は診断のために有用な物質を含有する製造物品が提供される。製造物品は容器及び容器上又はそれに伴ったラベル又はパッケージインサートを含む。適当な容器は例えばビン、バイアル、シリンジ等を包含する。容器は種々の材料、例えばガラス又はプラスチックから形成してよい。自身、又は他の組成物と組み合わせた場合に状態の治療、予防及び／又は診断に有効となる組成物を容器が保持しており、そして滅菌された接触口を有してよい（例えば容器は静脈内投与用の溶液バッグ又は皮下注射針により穿刺可能な蓋つきのバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージインサートは組成物が例えば癌のような選択された状態の治療のために使用されることを示す。更に又、製造物品は（ａ）その中に含有される組成物の入った第１の容器、ここで組成物は本発明の抗体を含むもの、及び（ｂ）その中に含有される組成物の入った第２の容器、ここで組成物は別の細胞毒性剤を含むもの、を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造物品は更に第１及び第２の抗体組成物を例えば癌のような特定の状態の治療のために使用できることを示すパッケージインサートを含んでよい。或いは、又は追加的に、製造物品は更に製薬上許容しうる緩衝液、例えば注射用殺菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器を含んでよい。それは更に商業上又は使用者の観点から望ましい他の物質、例えば他の緩衝物質、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含んでよい。
【０３１６】
以下に本発明の方法及び組成物の例を示す。上記した一般的説明が与えられたとすれば種々の他の実施形態が実施されてよいことが当然理解される。
【実施例】
【０３１７】
本明細書の実施例はアルファ４ベータ７インテグリンのベータ７サブユニットに結合するラット抗マウス抗体からのヒト化抗ベータ７抗体の形成を説明する。
【０３１８】
（実施例１：ベータ７拮抗剤抗体のヒト化）
（材料及び方法）
残基の番号はＫａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。１文字アミノ酸略記法を用いる。ＤＡＮ縮重はＩＵＢコードを用いて表示する（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。
【０３１９】
アクセプターヒトコンセンサスフレームワークへの直接超可変領域グラフト−この作業に用いたファージミドｐＶＯ３５０−２ｂは本質的にＬｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載の通りｐｈｏＡプロモーターの制御下の２オープンリーディングフレームを有する１価のＦａｂ−ｇ３ディスプレイベクターとした。第１のオープンリーディングフレームはアクセプター軽鎖のＶＬ及びＣＨ１ドメインに融合したｓｔＩＩシグナル配列よりなり、第２のものはアクセプター重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインに縮合したｓｔＩＩシグナル配列とそれに続く小型のファージ被膜蛋白Ｐ３のトランケーション型よりなるものである（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．ら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２）。
【０３２０】
ラットＦｉｂ５０４（ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−２９３により生産された抗体ＦＩＢ５０４．６４、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８，ＵＳＡ）由来のＶＬ及びＶＨドメインをヒトコンセンサスカッパＩ（ｈｕＫＩ）及びヒトサブグループＩＩＩコンセンサスＶＨ（ｈｕＩＩＩ）ドメインとアラインさせた。超可変領域（ＨＶＲ）グラフトを作成するために、以下のフレームワークに使用した。即ち、ＨｕＫＩは軽鎖可変ドメインフレームワークについて使用した（図１Ａ及び７参照）。重鎖可変ドメインフレームワーク、アクセプターＶＨフレームワークについては、３位置：Ｒ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８ＡにおいてｈｕｍＩＩＩ配列から異なっている修飾ヒトサブグループＩＩＩ（ｈｕｍＩＩＩ）コンセンサスＶＨドメインを使用してよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２８５（１９９２）参照）（図１Ｂ参照）。本発明の抗体の生成においては、５０４Ｋ−ＲＦグラフトはまた、以下のアミノ酸置換：Ａ７１Ｒ及びＡ７８Ｆを行うことにより修飾ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスＶＨドメインから製造した。
【０３２１】
ラットＦｉｂ５０４（ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−２９３により生産）抗体由来の超可変領域を操作してアクセプターヒトサブグループＩＩＩコンセンサスＶＨフレームワーク内にいれ、直接のＨＶＲ−グラフト（Ｆｉｂ５０４グラフト）を形成した（図１Ｂ参照）。ＶＬドメインにおいては、ラットＦｉｂ５０４由来の以下の領域、即ち位置２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）をヒトコンセンサスアクセプターｈｕＫＩにグラフトした（図１Ａ）。ＶＨドメインにおいては、位置２６−３５（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）及び９４−１０２（Ｈ３）をグラフトした（図１Ｂ）。更に、第２のＨＶＲ−グラフト、Ｆｉｂ５０４Ｋグラフトを、Ｌ２の拡張定義に基づいてＨＶＲ内にＶＬ４９位を含むように構築した（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）参照）。ＭａｃＣａｌｌｕｍ等は抗体及び抗原の複合体の結晶構造を分析しており、そして軽鎖の４９位及び重鎖の４９位及び９４位が抗原接触領域の部分であり、従ってこれらの位置が本明細書に開示したヒト化抗ベータ７抗体に関するＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３の定義内に包含されることを発見した。
【０３２２】
直接グラフト変異体は各超可変領域について別個のオリゴヌクレオチドを使用しながらＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７）上出）により形成した正しいクローンをＤＮＡ配列決定により評価した。
【０３２３】
（超可変領域のソフトランダム化（ｓｏｆｔ  ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ））
「ソフトランダム化」（米国特許出願６０／５４５，８４０参照）の工程は抗体の超可変領域のような選択された蛋白配列のバイアスした突然変異誘発のための操作法を指す。方法はマウス、ラット又は他の出発超可変領域配列へのバイアスを維持しつつ、約１０〜５０パーセントの突然変異を各選択位置において導入する。この手法は使用されるライブラリ配列の容量を増大させ、そして抗体により認識される抗原エピトープの変化を回避する。このソフトランダム化手法によれば、マウス超可変領域配列へのバイアスを維持する方策を用いながら、配列の多様性が各超可変領域に導入される。これはＧａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１（１９９４）により最初に報告された位置決めオリゴヌクレオチド合成法を用いて達成された。しかしながら、非ヒト超可変領域残基への変更を維持するための他の方法、例えば誤りがちのＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング等も使用される。
【０３２４】
ここで使用する方法に従えば、突然変異すべき超可変領域内のある位置について、野生型アミノ酸をコードするコドンをヌクレオチドの混合物（例えば７０−１０−１０−１０混合物）とともに位置づけすることにより、各選択された超可変領域位置において約５０％の突然変異がもたらされる。これを達成するためには、ヌクレオチドの７０−１０−１０−１０混合物のような他の３ヌクレオチドの夾雑物混合物を低濃度としながら突然変異すべき野生型超可変領域アミノ酸をコードするコドンを合成する。即ち、例えば、ＰＲＯ（ＣＣＧ）のソフトランダム化のためには、合成された第１の位置は７０％のＣ及び各々１０％のＧ、Ｔ及びＡの混合物であり；第２の位置は７０％のＣ及び各々１０％のＡ、Ｇ及びＴの混合物であり；そして第３の位置は７０％のＧ及び各々１０％のＡ、Ｃ及びＴの混合物である。バイアスは所定の位置において合成されるコドン、特定のアミノ酸をコードするコドンの数、及び、合成混合物のヌクレオチド組成によりオリゴヌクレオチド合成が位置付けられる程度に応じて上方又は下方に調節することができると考えられる。
【０３２５】
ソフトランダム化オリゴヌクレオチドはマウス、ラット又は他の出発超可変領域配列に続いてパターン化することができ、そして直接の超可変領域グラフトにより定義される同じ領域を包含する。場合により、２位置、ＶＨドメインのＨ２及びＨ３の始点のアミノ酸はその多様性が限定されてよく：コドンＲＧＣはＡ、Ｇ、Ｓ又はＴをコードする４９位について使用してよく、そして９４位においてはＭ又はＲをコードするコドンＡＫＧを使用してよい。
【０３２６】
ファージライブラリの作成−各超可変領域について設計されたランダム化オリゴヌクレオチドプールを３７℃で１時間、オリゴヌクレオチド６６０ｎｇ、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、２０ｍＭ  ＤＴＴ及び５Ｕポリヌクレオチドキナーゼを含有する６点の２０μｌ反応物において別個にホスホリル化した。次に６点のホスホリル化オリゴヌクレオチドプールを最終容量５００μｌとなるように５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中においてＫｕｎｋｅｌ鋳型２０μｇと合わせ、オリゴヌクレオチドの鋳型に対する比を３とした。混合物を９０℃で４分、５０℃で５分アニーリングし、次に氷上で冷却した。過剰の未アニーリングオリゴヌクレオチドは、アニーリングしたＤＮＡの過剰な変性を防止するために改良されたプロトコルを用いながらＱＩＡＱＵＩＣＫＴＭＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎキット２８１０６、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で除去した。アニーリング混合物５００μｌにＱｉａｇｅｎ緩衝液ＰＢ１５０μｌを添加し、そして混合物を２本のシリカカラムの間にスプリットした。Ｑｉａｇｅｎ緩衝液ＰＥ７５０μｌで各カラムを洗浄し、カラムを乾燥させるために過剰に回転させた後、各カラムを１１０μｌの１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８で溶出させた。次に、室温で３時間１μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰ、１０μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々２５ｍＭ）、１５μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、２５μｌの１０ＸＴＭ緩衝液（０．５ＭトリスｐＨ７．５、０．１ＭＭｇＣｌ２）、２４００ＵのＴ４リガーゼ、及び３０ＵのＴ７ポリメラーゼを添加することにより、アニーリングして洗浄した鋳型（２２０μｌ）をフィルインした。
【０３２７】
フィルイン産物はトリス−酢酸−ＥＤＴＡ／アガロースゲル上で分析した（Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３−３６３（２０００））。３つのバンドが通常は観察され、最下部のバンドは正しくフィルインされ、ライゲーションされた産物であり、中央のバンドはフィルインされたが未ライゲーションであり、そして最上部のバンドは排除された鎖である。最上部のバンドはＴ７ポリメラーゼの内因性の副次的活性により生成し、そして回避することは困難である（Ｌｅｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１１７４−１１１８４（１９８３）が；しかしながら、このバンドは最下部のバンドより３０倍低値の効率でしかトランスフォームされず、通常はライブラリには殆ど影響しない。中央のバンドは最終ライゲーション反応のための５’ホスフェートが存在しないことに起因するものであり；このバンドは効率的にトランスフォームされ、主に野生型配列を与える。
【０３２８】
次にＳｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３−３６３（２０００）に記載の通りフィルイン産物を洗浄し、ＳＳ３２０細胞へのエレクトロポレーションに付し、そしてＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージの存在下に増殖させた。ライブラリのサイズは１〜２ｘ１０９独立クローンの範囲であった。初期ライブラリ由来のランダムクローンはライブラリの品質を評価するために配列決定した。
【０３２９】
ファージ選択−抗全長ヒトインテグリンアルファ４ベータ７を２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９９７））において発現させ、Ｆｉｂ５０４アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてファージ選択のための標的として使用した。ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ．Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）上の固定化のために、１００μｌのヒトインテグリンアルファ４ベータ７を４℃で一夜、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、２ｍＭ  ＣａＣｌ２，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２ｍＭ  ＭｎＣｌ２（ＴＢＳＭ）中５μｇ／ｍｌとなるようにコーティングした。ウェルを１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＭを用いて１時間ブロッキングした。選択の第１回目では標的でコーティングした８ウェルを使用し；標的コーティングウェル１枚を次の回の選択用に用いた。ファージは培養上澄みから回収し、１％ＢＳＡ及び０．０５％ＴＷＥＥＮＴＭ２０を含有するＴＢＳＭ（ＴＢＳＭＢＴ）中に懸濁した。２時間ウェルに結合させた後、未結合のファージを０．０５％ＴＷＥＥＮ２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で十分洗浄することにより除去した。結合ファージは、ウェルを１００ｍＭ  ＨＣ１で３０分間インキュベートすることで溶出する。Ｔｏｐ１０細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いながらファージを増幅し、そして２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌカルバナシリン中３７℃で一夜生育させた。標的コーティングウェルから溶出したファージの力価を非標的コーティングウェルから回収したファージの力価と比較することにより濃縮を評価した。４回の選択を行った後、ランダムクローンを選択して配列分析に付した。
【０３３０】
Ｆａｂ生産及びアフィニティー測定−親和性測定のためのＦａｂ蛋白を発現するためにファージディスプレイベクターの重鎖とｇ３の間に停止コドンを導入した。クローンはＥ．ｃｏｌｉ３４Ｂ８細胞に形質転換し、３０℃でＡＰ５培地中生育させた（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７））。細胞を遠心分離により回収し、１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ８に懸濁し、マイクロフルイダイザーを用いて崩壊させた。ＦａｂはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０３３１】
親和性の測定はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により行った。ヒト化Ｆｉｂ５０４Ｆａｂ変異体をＣＭ５センサーチップ上に１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．５中で固定化（２５０〜１５００応答単位（ＲＵ）の範囲）し、そして２％ｎ−オクチルグルコシド含有ＴＢＳＭ中のヒトインテグリンアルファ４ベータ７の２倍希釈物を注入した。各試料は５分間の会合及び５〜６０分間の解離時間で分析した。各注入の後、８Ｍ尿素の１分間注射３回を用いてチップを再生した。結合応答はブランクのフローセルからＲＵを差し引くことにより補正した。ｋｏｎ及びｋｏｆｆの同時フィットの１対１ロングミュアモデルを用いて速度論的分析を行った。
【０３３２】
（結果及び考察）
ラットＦｉｂ５０４のヒト化−ヒト化のために使用したヒトアクセプターフレームワークはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）のために使用したフレームワークに基づいており、そしてコンセンサスヒトカッパ１（ｈｕＫＩ）ＶＬドメイン及びヒトサブグループＩＩＩ（ｈｕｍＩＩＩ）コンセンサスＶＨドメインの変異体よりなるものである。この変異体ＶＨドメインはヒトコンセンサスからの３つの変化、即ちＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８Ａを有する。ラットＦｉｂ５０４のＶＬ及びＶＨドメインを各々ヒトカッパＩ及びサブグループＩＩＩドメインとアラインし；各超可変領域（ＨＶＲ）を発見し、そしてヒトアクセプターフレームワークにグラフトし、ファージ上のＦａｂとして提示され得るＨＶＲグラフト（５０４グラフト）を形成した（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０３３３】
使用可能な抗体及び抗原の複合体の結晶構造に基づいて、ＭａｃＣａｌｌｕｍ等（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））は頻繁に抗原と接触する可変ドメイン残基に基づいたＨＶＲの定義を提案している。即ち、重鎖の位置４９Ｇ及び９４ＭをＦｉｂ５０４のＨＶＲグラフト内に包含させた（図１Ｂ）。更に又、第２のＨＶＲグラフトであるＦｉｂ５０４Ｋグラフトもまた、軽鎖の位置４９ＫがやはりＨＶＲ−Ｌ２の接触定義内にあり、そして抗原接触部として機能することができるため、この位置を含むように作成した（図１Ａ）。Ｆｉｂ５０４又はＦｉｂ５０４Ｋグラフトの何れかがファージ上に提示された場合に固定化アルファ４ベータ７への結合に関して試験したが結合は観察されなかった。
【０３３４】
Ｆｉｂ５０４及びＦｉｂ５０４−ＫＨＶＲグラフトの両方を用いてＨＶＲ領域の各々が同時にソフトランダム化されるようにライブラリを作成した。各ＨＶＲグラフトライブラリは選択４回について固定化されたアルファ４ベータ７に対して選別した。濃縮は観察されず、そしてＤＮＡ配列分析のために採取されたクローンは６つのＨＶＲ領域にターゲティングされたランダム配列変化のみを提示した。
【０３３５】
２つのさらなるＶＨフレームワーク配列である「ＲＬ」及び「ＲＦ」をアクセプターフレームワークとして調べたところ、７１位及び７８位に変化を含有していた。７１位はヒトサブグループＩＩＩコンセンサスの場合と同様にアルギニンに変化しており、そして７８位はヒトサブグループＩＩＩコンセンサスの場合と同様にロイシン（アクセプターフレームワーク「ＲＬ」）又はヒトサブグループＩＩコンセンサス及びラットＦｉｂ５０４ＶＨフレームワークの場合と同様にフェニルアラニン（アクセプターフレームワーク「ＲＦ」）に変化していた（図１０Ａ）。「ＲＬ」（Ｆｉｂ５０４−ＲＬ及びＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＬ）又は「ＲＦ」（Ｆｉｂ５０４−ＲＦ及びＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦ）アクセプターフレームワーク内のＦｉｂ５０４又はＦｉｂ５０４Ｋの何れかがファージ上に提示された場合には固定化アルファ４ベータ７への結合に関して試験した。「ＲＦ」フレームワークを用いた場合のＦｉｂ５０４Ｋグラフトについてのみ特異的ファージ結合が観察された（図１０Ｂ）。Ｙ４９Ｋ（軽鎖）及びＬ７８Ｆ（重鎖）を欠失した他のグラフトと相対比較した場合のＦｉｂ５０４−ＲＦグラフトを提示するファージの中等度の結合は有用なアクセプターフレームワークを選択する場合のこれらの位置の重要性を示している。
【０３３６】
Ｆｉｂ５０４Ｋ−ＲＬ及びＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦグラフトについて６ＨＶＲの各々において同時にソフトランダム化の手法を用いて以前と同様にライブラリを作成し、そして上記した通り４回の選択について固定化アルファ４ベータ７上でソーティングした。Ｆｉｂ５０４Ｋ−ＲＦグラフトによるライブラリについてのみ濃縮が観察された。Ｆｉｂ５０４Ｋ−ＲＦライブラリの第４回から得られたクローンを配列分析のために選択し、そしてＨＶＲ−Ｌ１にターゲティングされたアミノ酸変化が判明した。大部分のクローンはＹ３２Ｌの変化を含有しており；更に、３１位は頻繁にはＤ、Ｓ、Ｐ又はＮに変化していた（図１Ｃ）。出発グラフトＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦのほかに、３クローンは発現され、そしてＦａｂ蛋白として精製し、そして更に上記した通りＢｉａｃｏｒｅで分析した。クローンｈｕ５０４−５、ｈｕ５０４−１６及びｈｕ５０４−３２（置換Ｔ３１Ｓ＋Ｙ３２Ｌ（変異体ｈｕ５０４．５）、Ｙ３２Ｌ（変異体ｈｕ５０４．１６）又はＴ３１Ｄ＋Ｙ３２Ｌ（変異体ｈｕ５０４．３２）を含有する配列番号１の変異体；図１Ｃ参照）はＦｉｂ５０４Ｋ−ＲＦグラフトと相対比較してアルファ４ベータ７への優れた結合を示し、そしてアルファ４ベータ７に対するキメラＦｉｂ５０４Ｆａｂの親和性に合致するか、それを超過していた。Ｂｉａｃｏｒｅ分析の結果は以下の表３に示す通りであり、そして本明細書に開示したＨＶＲ及び／又はフレームワークの領域内の選択された変異が出発抗体と相対比較して向上した親和性を有するアルファ４ベータ７への拮抗剤抗体を形成したことを示している。表３の結果は、ヒト化変異体５０４．３２がアルファ４ベータ７に３倍より堅固に結合することにより出発ラット抗体と相対比較して親和性の最大の増加をもたらしたことを示している。
【０３３７】
【表３】
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表３の結果は又、高親和性の抗原結合の回復にとってＨＶＲ−Ｌ１の再設計が重要であったことを示している。特に突然変異Ｙ３２Ｌは種々のクローンの中で最も頻繁に観察された。３１位における他の変化及びＨＶＲ−Ｈ１全体に渡る多くの他の置換は十分耐容性を示していると考えられ、そして別の向上をもたらしている場合がある、これらの結果から、元のラット抗体のものと合致するかそれを超える親和性を生じさせるヒトフレームワークにグラフトしたＦｉｂ５０４の親和性を向上させることができる複数の配列変化が存在することは明らかである。
【０３３８】
即ちヒトアクセプタースカホールド内への６ラットＦｉｂ５０４ＨＶＲのグラフトから出発し、４９位（リジン）を含むためのＨＶＲ−Ｌ２の拡張、４９位（グリシン）を含むためのＨＶＲ−Ｈ２の拡張、及び、９４位（メチオニン）を含むためのＨＶＲ−９４の拡張、並びに、アミノ酸変化のＶＨＲ−Ｌ１の３２位（ここではＬ又はＩがＹを置き換える）及び、場合により、ＶＨＲ−Ｌ１の３１位（ここでは例えばＴがＤ又はＳにより置き換えられる）となる。有用なフレームワークアミノ酸変化はＶＨドメインの７１位（Ａ７１Ｒ）及び７８位（Ｌ７８Ｆ）において生じる。このようなアミノ酸変化は、例えばアルファ４ベータ７インテグリンに対して３倍向上した結合親和性を有する完全ヒト抗体である変異体ｈｕ５０４．３２をもたらす。更に又、本明細書に記載した選択されたヒト化抗体は親ラットＦｉｂ５０４抗体に少なくとも匹敵する生物学的活性を有することが判明している（本明細書の実施例３参照）。
【０３３９】
（実施例２：別のヒト化Ｆｉｂ５０４ＨＶＲ変異体）
ヒト化変異体Ｆｉｂ５０４．３２のＨＶＲアミノ酸配列を更に修飾することにより、ベータ７インテグリンサブユニット及び／又はベータ７サブユニットを含有するインテグリンの活性に拮抗する能力を有する別の変異体を形成した。
【０３４０】
広範なアミノ酸スキャンライブラリの形成−変異体ｈｕ５０４．３２のベータ７結合変異体を形成することができる他のアミノ酸残基に対する選択されたＨＶＲ位置をスキャンするためのライブラリを、３つのオリゴヌクレオチド、即ち、ｈｕ５０４．３２ＨＶＲ−Ｌ１配列へのバイアスを有するＨＶＲ−Ｌ１の一部をソフトランダム化するために設計された５０４−Ｌ１（即ち、配列ＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号４７、相対的な位置Ａ２−Ａ１１に対する）を上記の通りソフトランダム化した）；及び軽鎖の位置ＨＶＲ−Ｌ３の９６位及び重鎖のＨＶＲ−Ｈ３の９４位にＮＮＳを導入するＨＶＲ−Ｌ３の５０４−Ｎ９６及びＨＶＲ−Ｈ３の５０４−Ｍ９４を用いて形成し、これにより全２０アミノ酸をこれらの位置とした。これらの３オリゴヌクレオチドを用いて、軽鎖における３停止コドン（ＨＶＲ−Ｌ１の３１及び３２位、及び、ＨＶＲ−Ｌ３の９６位）及び重鎖における１停止コドン（ＨＶＲ−Ｈ３の９４位）を含有する鋳型を用いながら上記したとおり広範なアミノ酸スキャンライブラリを形成した。
ｈｕ５０４−３２の広範なアミノ酸スキャン−ＨＶＲ−Ｌ１において可能な好ましい配列をより完全に探索するため、及び、５０４−３２の安定性を増大させるために、本発明者らはａ）ヒト化の間に変化が観察された領域における５０４−３２のＨＶＲ−Ｌ１（即ちＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号４７、相対的な位置Ａ２−Ａ１１に対する）をソフトランダム化し（図１Ｃ）、そして、ｂ）ＨＶＲ−Ｌ３におけるＮ９６及びＨＶＲ−Ｈ３におけるＭ９４において全ての可能なアミノ酸を与えるファージライブラリを設計した。前記した固定化完全長ヒトインテグリンアルファ４ベータ７に対する選択４回の後、９６のランダムクローンを選択して配列分析に付した。広範なアミノ酸スキャンライブラリの各位置においてアミノ酸が検出される頻度は、ｈｕ５０４−３２に存在するＨＶＲ−Ｌ１配列及び重鎖９４位のメチオニンが高親和性結合のためには指摘であることを示唆している（図１２）。変異体５０４．３２から出発した選択により得られた最も好ましいアミノ酸（図１２）を黄色で示す。これとは対照的に、アスパラギンもｈｕ５０４−３２の軽鎖の９６位に存在し、広範なアミノ酸スキャンにおけるこの位置において観察されたロイシンの高頻度は突然変異Ｎ９６Ｌがアルファ４ベータ７に対するヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の親和性を更に向上させ、そしてこの位置におけるいかなる潜在的な脱アミドの問題も排除することを示唆している。図１２の情報は又、置き換えアミノ酸の数が親和性の実質的な損失を伴うことなく殆どの位置で耐容性が示されていることを示唆している。例えば、ＨＶＲ−Ｈ３のＭ９４における酸化を排除するためには、グルタミン又はアルギニンを置換すればよいと考えられる。
【０３４１】
限定的なアミノ酸スキャンライブラリの形成−限定されたアミノ酸スキャンのための６ライブラリは６種のＫｕｎｋｅｌ鋳型を利用しており、各々が６つのＨＶＲの１つ内に位置する１つの停止コドンを含有するようにした。各ライブラリは、ベータ７又はアルファ４ベータ７への結合に関する後の試験についてアミノ酸残基を改変するために、単一のＨＶＲをコードする単一のオリゴヌクレオチドを用いながら、図１１Ａ（「コドン」のコラム）に示すコドンを利用しながら作成した。同じ操作法を用いて抗ベータ７抗体のアミノ酸残基を改変し、そして、アルファＥベータ７インテグリンへの結合に関してそれらを試験した。
【０３４２】
ｈｕ５０４−３２の限定的なアミノ酸スキャン−ヒト軽鎖及び重鎖コンセンサス配列により近似しているｈｕ５０４−１６を作成し、そして工程において、結合のために必要なラットＦｉｂ５０４の最小配列エレメントを発見するために、ｈｕ５０４−１６の限定的なアミノ酸スキャンを設計した。６ライブラリを作成し、ｈｕ５０４−１６とヒトコンセンサスカッパＩ軽鎖又はサブグループＩＩＩ重鎖の間で異なる部位において各ＨＶＲをターゲティングし（図１Ａおよび１Ｂ）；ラット又はヒトのアミノ酸の何れかをライブラリのこれらの位置とした（図１１Ａ）。オリゴヌクレオチド合成及び突然変異誘発の間に両方のアミノ酸に対してコーディングを適合させるために、別のアミノ酸もまた一部の場合においては導入した（図１１Ａのコードされたアミノ酸を参照）。限定的なアミノ酸スキャンライブラリを上記した通り固定化された完全長のヒトインテグリンアルファ４ベータ７に対して選択し、そして、約３２のランダムクローンを第３回の後に各ライブラリから配列決定した。各位置において検出された各アミノ酸の頻度を図１１Ｂ及び１１Ｃに示す。
【０３４３】
広範なアミノ酸スキャンの場合と同様、限定的なアミノ酸スキャンもまたヒト化Ｆｉｂ５０４における多くの位置においてどのような変化が耐容性であるかに関する情報を提供する。しかしながら広範なアミノ酸スキャンとは異なり、限定的なアミノ酸スキャンにおいてランダム化される各位置において許容される多様性は数個のアミノ酸に限定されていた。即ち、所定の位置における何れかの観察された置換の欠如は、特定の残基が変化され得ないことを示しているわけでもなく、又、所定の位置における何れかの特定のアミノ酸の高頻度はそれが高親和性のための最良の解決法であることを必ずしも示しているわけでもない。
【０３４４】
一部の位置（軽鎖の２７、２９、３０，５３，５４位及び重鎖の５０、５４、５８、６０、６１及び６５位）においてはヒトコンセンサスアミノ酸が極めて高頻度で選択され、ヒトコンセンサスへの復帰突然変異がヒトアルファ４ベータ７への結合を劇的に改変しないことを示唆している。実際、軽鎖（ＨＶＲ−Ｌ２内）の５４位において、ヒトコンセンサスアミノ酸はラットＦｉｂ５０４由来のアミノ酸よりもより頻繁に選択されており、５０４−３２で起こったこの変化が有用なベータ７結合抗体を与えることを示している。
【０３４５】
更に又、ライブラリ設計の結果として、ヒトコンセンサス及びラットＦｉｂ５０４の何れからも誘導されていないアミノ酸は、ある位置においてはより頻繁に選択されており、そして、ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の親和性を向上させるための潜在的置換を与える。これらには、例えば、軽鎖のＤ３０Ａ及びＩ５５Ｖ及び重鎖のＹ５０Ｆが包含される。これらの２つのライブラリから得られた結果は、多くのＨＶＲ位置が他のアミノ酸置換に耐容性を示し、そしてなお、同等の生物学的活性を保持していることを示している。
【０３４６】
観察されたアミノ酸変化の総括を図１３及び１５に示す。図１５はＫａｂａｔナンバリング又は相対的ナンバリング系に従ってナンバリングされた位置における本発明の抗体変異体のＣＤＲにおける位置の各々において有用な種々のアミノ酸を総括する。図１３及び１５に示す変異体により包含される別の抗体の各々は本発明の実施形態である。
【０３４７】
（実施例３：細胞接着試験）
細胞表面上に発現されたリガンドに本発明のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の一部が結合する能力を細胞接着試験により試験した。アルファ４ベータ７及び他のベータ７インテグリン、アルファＥベータ７への結合はインテグリンのその天然の受容体への結合を妨害するヒト化変異体の能力により試験した。細胞表面上に発現されたベータ７サブユニット単独へのヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の結合も同様に試験した。操作法及び結果を以下に記載する。
【０３４８】
ＩｇＧ生産−ヒトＦｉｂ５０４ＩｇＧ変異体を軽鎖及び重鎖に関する別個のベクターを用いて２９３細胞において一過性に発現させた（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）上出）。ベクターは軽鎖及び重鎖の各々につき適当な発現ベクター内に軽鎖又は重鎖の可変ドメインをサブクローニングすることにより構築した。ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の１．１ＬのＣＨＯ細胞培養物の上澄みを０．４５ｕｍのフィルターで濾過し、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  トリスｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に平衡化させておいた新しい１ｍＬＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。試料は４℃で一夜０．８ｍＬ／分で適用した。次に各カラムの洗浄及び平衡化を緩衝液Ａ３０ｍｌを用いて行った。抗体の溶出は０％から１００％緩衝液Ｂ（１００ｍＭ  グリシン、ｐＨ３．０）となるまで１ｍｌ／分で１４分の一次勾配を用いながらＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で室温でクロマトグラフィーにより行った。得られた１ｍｌ画分を即座に１ＭトリスｐＨ８を７５ｕｌ添加することにより中和した。溶出した蛋白は２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、そしてピーク画分をプールし、ＰＤ１０Ｇ−２５セファデックス使い捨てサイジングカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でＰＢＳ中に脱塩した。蛋白はＯＤ２８０により検出し、ピーク画分をプールした。ＰＢＳ中の抗体を０．２２ｕｍ濾過し、４℃で保存した。アミノ酸分析を用いてこれらの精製された抗体の濃度を定量し、そして、数値は２つの別個の測定の平均から割り付けた。
【０３４９】
（ＢＣＥＣＦ標識）
実施例３に示す試験の各々において、細部を以下の操作法に従って標識した。接着試験に使用した全ての細胞は、ベータ７サブユニットでトランスフェクトしたＲＭＰＩ８８６６細胞及び３８Ｃ１３細胞（３８Ｃ１３ベータ７細胞）用には１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、そして、アルファＥベータ７トランスフェクト２９３細胞（アルファＥベータ７２９３細胞）用には１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２：ＤＭＥＭ混合物（５０：５０）中において、１０ｕＭの２’，７’−ビス−（２−カルボキシルエチル）−５−（及び−６）−カルボキシフルオレセインのアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ）により標識した。細胞は３０分間標識し、そして、試験培地を用いて２回洗浄した。細胞密度はＲＰＭＩ８８６６及び３８Ｃ１３ベータ７細胞についてはｍｌ当たり３ｘ１０６個に調節し、そしてアルファＥベータ７２９３細胞については２．２ｘ１０６個に調節した。
【０３５０】
（ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体のＭＡｄＣＡＭへのアルファ４ベータ７の結合の妨害）
ＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ細胞接着：ＲＰＭＩ８８６６細胞はその表面上にアルファ４ベータ７を発現する（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）。ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体（ｈｕ５０４変異体）を固相上にコーティングされたＩｇＧに融合させたＲＰＭＩ８８６６とＭＡｄＣＡＭの混合物に接触させた。ＲＰＭＩ８８６６細胞のＭＡｄＣＡＭ−１への結合の５０％阻害をもたらすヒト化Ｆｉｂ５０４変異体濃度（ＩＣ５０）は、４℃一夜Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭ９６穴プレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルのＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ここでＩｇはＦｃ領域へのＭＡｄＣＡＭ−１の融合物を指す）でコーティングすることにより測定した。室温で１時間２００ｕｌ／ウェルの５ｍｇ／ｍｌＢＳＡでプレートをブロッキングした後、試験培地（ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標）、Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ，ＵＳＡ，５ｍｇ／ｍＬＢＳＡ添加）中ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体５０μｌを各ウェルに添加し、そして試験培地５０μｌ中１５０，０００ＢＣＥＣＦ標識細胞（ＢＣＥＣＦ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。ウェルを試験培地１５０μｌで２回洗浄し、未結合の細胞を除去した。結合した細胞は５０ｍＭ  トリス塩酸ｐＨ７．５中０．１％ＳＤＳ１００μｌで可溶化した。溶解した細胞から放出された蛍光の量は４８５ｎｍ励起５３０ｎｍ発光の波長においてＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＧＥＭＩＮＩＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により測定した。試験における各ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体のＩＣ５０値を得るために、４パラメーターの非線形最小自乗フィットを用いながら各試験において添加したヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の濃度の関数として蛍光値を分析した。ＩＣ５０及びＩＣ９０値は４パラメーターのフィットから推定した。図１４は結果の例示的プロットである。被験変異体の各々に関するＩＣ９０及びＩＣ５０値は表４において以下に示す通りである。
【０３５１】
【表４】
2008512382.tif 000095
＊Ｅｘｐ１／Ｅｘｐ２は反復試験の結果を示す。
【０３５２】
（ＶＣＡＭへのアルファ４ベータ７結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体妨害）
ＲＰＭＩ８８６６／７ｄＶＣＡＭ−１細胞接着：ＲＰＭＩ８８６６／７ｄＶＣＡＭ−１試験はプレートをコーティングするために７ｄＶＣＡＭ−１（ＡＤＰ５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外はＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇと同様のフォーマットである。結果はＭＡｄＣＡＭ結合実験に関して上記した通り分析した。被験変異体の各々に関するＩＣ９０及びＩＣ５０値は表５において以下に示す通りである。
【０３５３】
【表５】
2008512382.tif 000096
＊Ｅｘｐ１／Ｅｘｐ２は反復試験の結果を示す。
【０３５４】
（ヒトＥカドヘリンへのアルファＥベータ７結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の妨害）
アルファＥベータ７の２９３／ｈｕＥ−カドヘリン細胞接着：２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）上出）をアルファＥ及びベータ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）でトランスフェクトした。試験フォーマットはプレートをコーティングするためにｈｕＥ−カドヘリン（６４８−ＥＣ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を２μｇ／ｍｌで使用した以外はＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇと同様である。次にプレートを５ｍｇ／ｍｌＢＳＡで上記した通りブロッキングし、そして、試験培地（Ｆ−１２：ＤＭＥＭ（５０：５０）、５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ添加）中ＦＩＢ５０４変異体５０μｌを各ウェルに添加し、そして試験培地５０ｕｌ中１１０，０００ＢＣＥＣＦ標識細胞を各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ウェルを試験培地１５０μｌで２回洗浄し、そして溶解細胞から放出された蛍光の量を上記した通り測定した。３実験から得られた結果を表６に示す。
【０３５５】
【表６】
2008512382.tif 000097
（ＭＡｄＣＡＭへのベータ７の結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の妨害）
３８Ｃ１３ベータ７／ｍｕＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ細胞接着試験：３８Ｃ１３ベータ７／ｍｕＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ試験はプレートをコーティングするためにｍｕＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外はＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇと同様のフォーマットである。３８Ｃ１３アルファ４＋マウスリンパ腫細胞（Ｃｒｏｗｅ，Ｄ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４４１１−１４４１８（１９９４））を、アルファ４ベータ７が細胞表面上に発現されるようにインテグリンベータ７をコードするＤＮＡでトランスフェクトした。アルファ４ベータ７と会合している細胞膜とＭＡｄＣＡＭとの間の相互作用を妨害する抗体変異体の能力を上記の通り調べた。試験結果は表７に示す。（２実験のＩＣ５０及びＩＣ９０値を示す）。
【０３５６】
【表７】
2008512382.tif 000098
マウスＶＣＡＭへのベータ７の結合のヒト化Ｆｉｂ５０４変異体の妨害
３８Ｃ１３ベータ７／ｍｕＶＣＡＭ−１−Ｉｇ細胞接着試験：３８Ｃ１３ベータ７／ｍｕＶＣＡＭ−１−Ｉｇ試験はプレートをコーティングするためにｍｕＶＣＡＭ−１−Ｉｇ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外はマウスＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ／ＲＰＭＩ８８６６に従って実施した。試験結果は表８に示す。（２実験のＩＣ５０及びＩＣ９０値を示す）。
【０３５７】
【表８】
2008512382.tif 000099
ヒト化Ｆｉｂ５０４変異体結合試験の結果は、本発明のヒト化抗体はその標的ベータ７インテグリンサブユニット並びにアルファ４ベータ７及びアルファＥベータ７インテグリンに、ほぼ出発ラット抗体の親和性で、そして、一部の実施形態においてはより大きい親和性で、結合することを示している。即ち、本発明のヒト化抗ベータ７抗体は抗ベータ７インテグリン治療、特にヒトの治療において有用である。
【０３５８】
（本発明のｈｕ５０４．３２変異体の相対的活性）
本明細書に記載した細胞接着試験方法に従って、ｈｕ５０４．３２抗体の種々のアミノ酸変異体がベータ７含有受容体のそのリガンドへの結合を阻害する能力について、それらをヒト及びマウスの細胞接着試験において試験した。ＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ試験は上記した通り実施した。アルファＥベータ７−２９３／ｈｕＥ−カドヘリン試験はリガンドとしてのヒトＥ−カドヘリン−Ｆｃの使用により変更した（ヒトＥ−カドヘリン−Ｆｃ、６４８−ＥＣ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。ヒトフィブロネクチン（ｈｕＦＮ４０）とＰＲＭＩ８８６６細胞上のヒトアルファ４ベータ７受容体の相互作用を阻害するｈｕ５０４．３２の相対的能力も調べた。これらの試験のために使用したＲＰＭＩ８８６６／ｈｕフィブロネクチン（ｈｕＦＮ４０）試験はプレートをコーティングするためにヒトフィブロネクチンアルファ−キモトリプシン処理フラグメント４０ｋＤａ（Ｆ１９０３、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を２ｕｇ／ｍｌで使用した以外は本明細書に開示したＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇ試験と同様のフォーマットとした。
【０３５９】
マウスベータ７含有受容体とマウスＭＡｄＣＡＭ−１又はマウスＶＣＡＭ−１との相互作用を阻害するｈｕ５０４．３２変異体の能力を調べた。マウスＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ及びマウスＶＣＡＭ−１−Ｆｃはｈｕ５０４．３２変異体によりマウスベータ７を発現するマウスリンパ腫アルファ４＋細胞（３８Ｃ１３ベータ７細胞）との相互作用を阻害された。マウスＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ及びＶＣＡＭ−１−Ｆｃの細胞接着試験をヒトＭＡｄＣＡＭ−１及びＶＣＡＭに関して本明細書に記載したものと同様に実施した。リガンドがＦｃ領域に融合する場合は、細胞上のＦｃ受容体を室温で５分間１０６個の細胞当たり０．５μｇの抗−ＣＤ１６／３２抗体（抗ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体抗体、カタログ番号５５３１４２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でブロッキングした。５０μｌの試験培地中１５０，０００標識細胞を各ウェルに添加し、３７℃で１３分インキュベートした。ウェルを洗浄し、そして、溶解した細胞から放出された蛍光の量を上記した通り測定した。ヒト細胞接着試験のための対照抗体はヒト血清アルブミンに対するマウスモノクローナル抗体６Ｂ１１とした（カタログ番号ａｂ１０２４４、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）。マウス細胞接着試験のための対照抗体はインテグリンベータ７への結合に関してリガンド又はＦｉｂ５０４と競合しないラット抗マウスインテグリンベータ７抗体Ｍ２９３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とした。
【０３６０】
ヒト及びマウスの細胞接着試験について３連の試験の結果をそれぞれ表９及び１０に示す。
【０３６１】
【表９】
2008512382.tif 000100
【０３６２】
【表１０】
2008512382.tif 000101
ｈｕ５０４．３２抗体は重鎖ＣＤＲ３の９４位にメチオニンを有する。変異体Ｍ９４Ｑ（又はｈｕ５０４．３２Ｑ）及びＭ９４Ｒ（又はｈｕ５０４．３２Ｒ）はそれぞれｈｕ５０４．３２変異体の９４位にグルタミン又はアルギニンを有する。ｈｕ５０４．３２Ｍ、Ｑ及びＲ抗体は試験の各々においてインテグリンベータ７受容体−リガンド相互作用を実質的に低減し、従って、ベータ７媒介細胞接着の強力な阻害剤であった。
【０３６３】
（インビボの抗体ｈｕ５０４．３２Ｒ活性）
ｈｕ５０４．３２抗体変異体がインテグリンベータ７受容体−リガンド相互作用を低減し、そしてインビボのマウス炎症性腸疾患モデルにおける炎症結腸へのリンパ球のリクルートメントを低減する能力をインビボで試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣＢ１７ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）より入手した。ＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ高Ｔ細胞再形成ＳＣＩＤ結腸炎マウスは、ドナーＢＡＬＢ／ｃマウスからＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ高Ｔ細胞を単離し、そして、１００μｌＰＢＳ中３ｘ１０５個を静脈内に移行させることにより作成した。対照ＳＣＩＤマウスにはＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ高Ｔ細胞を投与しなかった。４週目におけるベースラインからの１０％体重減少又はピーク体重から１５％という投与群割付基準に合致する再形成ＣＤ４＋マウスは炎症性腸疾患を誘導したとみなし、投与のために選択した。
【０３６４】
試験抗体投与日においてドナーＢＡＬＢ／ｃマウスの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞を採取し、Ｃｒ５１で放射標識した。投与では予め抗ＧＰ１２０抗体、ｈｕ５０４．３２抗ベータ７抗体、ｈｕ５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体又は無抗体（対照）を２００μｇ／１００μｌＰＢＳ静脈内投与した。抗体投与後３０分に、Ｃｒ５１標識ＭＬＮ細胞を４ｘ１０６細胞／１００μｌの濃度で注射した。標識細胞注射後１時間にマウスを安楽死させ、脾臓、結腸及びパイアー斑を採取し、計量し、そして臓器当たりの総Ｃｒ５１放射能を測定した。図１６はこれらの試験の結果の棒グラフであり、炎症性腸疾患を経験しているマウスの結腸への放射標識Ｔ細胞のホーミングをブロックする抗体の相対的な能力を示している。炎症結腸へのＴ細胞のホーミングは陰性対照である抗ＧＰ１２０抗体と相対比較してｈｕ５０４．３２及びｈｕ５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体により阻害された。脾臓への分布は抗体の全てについて同様であった。即ちｈｕ５０４．３２及びｈｕ５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体はインビボの炎症結腸へのＴ細胞のホーミングを効果的に阻害した。
【０３６５】
抗体グリケーションはアルファ４ベータ７受容体へのＭＡｄＣＡＭ−１の結合をブロックするｈｕ５０４．３２Ｒ変異体の能力に影響していない。
【０３６６】
蛋白の非酵素的グリコシル化であるグリケーションは抗体−リガンド相互作用に影響する場合がある（例えばＫｅｎｎｅｄｙ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８（２）：２４５−５１（１９９４）参照）。５０４．３２Ｒの４９位のグリケーション、５０４．３２Ｒ変異体の軽鎖４９位（ＨＶＲ−Ｌ２相対的な位置Ｂ１）のグリケーションが観察されているが、アルファ４ベータ７受容体発現ＲＰＭＩ８８６６細胞へのＭＡｄＣＡＭ−１の結合をブロックする抗体変異体の能力に有意な影響を示していない。グリケーション及びグリケーション水準の測定は標準的な電子スプレーイオン化質量スペクトル分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により、そして、ボロネートアフィニティークロマトグラフィーにより実施した。グリケーションに関する試験に有用なボロネートアフィニティーＨＰＬＣ法は例えばＱｕａｎ  Ｃ．Ｐ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１（２０）：４４４５−４４５４（１９９９）及びＬｉ  Ｙ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，９０９：１３７−１４５（２００１）に記載されている。細胞接着試験は本明細書に開示するＲＰＭＩ８８６６／ＭＡｄＣＡＭ−１−Ｆｃ細胞接着試験に従って実施した。
【０３６７】
本発明の別の実施形態においては、４９位におけるグリケーションは、リジン以外のアミノ酸を４９位が含む場合は低減又は排除される。本発明のポリペプチド又は抗体は４９位（ＨＶＲ−Ｌ２相対的な位置Ｂ１）のアミノ酸としてアミノ酸Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹのいずれかを包含し、ここで各文字は標準的な１文字アミノ酸標記に従うアミノ酸を指す。５０４．３２Ｒ変異体（又は他の５０４変異体）の軽鎖の４９位のアミノ酸はＲ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ又はＬからなる群より選択される。４９位において有用なアミノ酸は、例えばファージ（変異体）上にｈｕ５０４．３２ＲＦａｂを提示（ファージライブラリを作成）すること、及び、２０個の天然に存在するアミノ酸の各々に対するコドンを、４９位のコドンにおいて別個に置換することにより、選択される。４９位において改変されたｈｕ５０４．３２Ｒ変異体を発現するファージを、インテグリンベータ７及び／又はインテグリンベータ７を含む受容体、例えばアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７受容体への結合に関して試験する。ベータ７インテグリン又はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ７受容体に結合するこれらの変異体を、本明細書に記載する通り、インテグリンベータ７受容体−リガンド結合を阻害する能力、及び、インビボの薬効に関して、更にスクリーニングする。別の、天然に存在する、又は天然に存在しないアミノ酸を標準的な突然変異誘発手法により４９位に置換させ、そして、細胞接着及び本明細書に記載したインビボ試験において試験してよい。或いは、軽鎖の４９位のアミノ酸はリジン（Ｋ）以外のアミノ酸であり、そして何れかの他のＨＶＲ又はフレームワーク又は軽鎖及び／又は重鎖の位置のアミノ酸を改変することにより、インテグリンベータ７の生物学的活性を低減することにより炎症の低減のために有用である結合親和性、インビトロ又はインビボの生物学的活性、薬物胴体、薬剤クリアランス及び免疫原性を示す変異体抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体を選択する。突然変異誘発及びそのようなポリペプチド又は抗体の変異体の選択は、本明細書に開示した通り、そして他の標準的手法に従って実施される。そのような変異体抗ベータ７結合ポリペプチド又は抗体は、本明細書に開示したヒト化Ｆｉｂ５０４変異体のいずれかにより示される結合親和性の１０，０００倍以内、或いは１００倍以内、１０００倍以内、或いは１０倍以内、或いは５倍以内、或いは２倍以内のインテグリンベータ７結合親和性を示す。
【０３６８】
上記した明細書は当業者を本発明実施可能とするために十分であると考えられる。寄託した実施形態は本発明の特定の特徴の単一の説明として意図されており、そして機能的に等価ないかなる構築も本発明の範囲内に包含されるため、本発明は寄託した構築によりその範囲において限定されるものではない。本発明における物質の寄託は本明細書に含まれる書面による説明がその最良の様式を含む本発明の如何なる特徴の実施を可能とするために不十分であることの受諾を構成せず、又それが示している特定の説明に請求項の範囲を限定するものともみなされない。実際、本明細書に示し、記載したもののほかに本発明の種々の変更が上記記載より当業者には明らかとなり、そして添付する請求項の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０３６９】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは以下の可変軽鎖及び重鎖の配列：軽鎖ヒトサブグループカッパＩコンセンサス配列（図１Ａ、配列番号２３）、重鎖ヒトＩＩＩコンセンサス配列（図１Ｂ、配列番号２４）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変軽鎖（図１Ａ、配列番号１０）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変重鎖（図１Ｂ、配列番号１１）、及び、ヒト化抗体変異体：ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変軽鎖（図１Ａ、配列番号２５）、ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変重鎖（図１Ｂ、配列番号２６）、変異体ｈｕ５０４．５（ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフトからのアミノ酸変異は変異体ｈｕ５０４．５、ｈｕ５０４．１６及びｈｕ５０４．３２について図１Ａ（軽鎖）及び図１Ｂ（重鎖）に示す通り）のアライメントを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは以下の可変軽鎖及び重鎖の配列：軽鎖ヒトサブグループカッパＩコンセンサス配列（図１Ａ、配列番号２３）、重鎖ヒトＩＩＩコンセンサス配列（図１Ｂ、配列番号２４）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変軽鎖（図１Ａ、配列番号１０）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変重鎖（図１Ｂ、配列番号１１）、及び、ヒト化抗体変異体：ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変軽鎖（図１Ａ、配列番号２５）、ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変重鎖（図１Ｂ、配列番号２６）、変異体ｈｕ５０４．５（ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフトからのアミノ酸変異は変異体ｈｕ５０４．５、ｈｕ５０４．１６及びｈｕ５０４．３２について図１Ａ（軽鎖）及び図１Ｂ（重鎖）に示す通り）のアライメントを示す。
【図１Ｃ】ベータ７結合抗体をもたらすｈｕ５０４ＫグラフトのＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ２における別のアミノ酸置換は図１Ｃに示す。
【図２】図２Ａ及び２ＢはヒトコンセンサスサブグループＩＩＩ配列の軽鎖（図２Ａ、配列番号２７）及び重鎖（図２Ｂ、配列番号２８）の完全長配列を示す。ＨＶＲは下線部である。
【図３】図３Ａ及び３ＢはラットＦｉｂ５０４超可変領域（明細書記載）をヒトカッパＩコンセンサス配列軽鎖内（図３Ａ、配列番号２９）及びヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列重鎖内（図３Ｂ、配列番号３０）にグラフトしたヒト化抗体５０４グラフトの完全長配列を示す。ＨＶＲは下線部である。
【図４】図４Ａ及び４Ｂはｈｕ５０４Ｋグラフトの軽鎖の４９位がＹ４９Ｋ置換となっているヒト化５０４Ｋグラフトの完全長配列を示す。ｈｕ５０４Ｋグラフト軽鎖は配列番号３１により示され、ｈｕ５０４Ｋグラフト重鎖は配列番号３０により示される。ＨＶＲは下線部である。
【図５】図５Ａ及び５Ｂはｈｕ５０４グラフトの重鎖の７１及び７８位がｈｕ５０４グラフト配列からＡ７１Ｒ置換及びＡ７８Ｆ置換となっているｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフトの完全長配列を示す。ｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフト軽鎖は配列番号３１により示され、ｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフト重鎖は配列番号３２により示される。ＨＶＲは下線部である。
【図６】図６Ａ及び６Ｂはｈｕ５０４Ｋ−ＲＦグラフトの重鎖（配列番号３２）及びｈｕ５０４Ｋグラフトの軽鎖におけるＴ３１Ｄ及びＹ３２Ｌ置換（配列番号３３）を含むｈｕ５０４．３２変異体の完全長配列を示す。ＨＶＲは下線部である。
【図７】図７Ａ−図７Ｂは以下の配列識別子を用いた本発明の実施における使用のための例示されるアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク（図７Ａ、Ｂ）ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１４）ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号１５）ヒトＶＬカッパサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１６）ヒトＶＬカッパサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（配列番号１７）ヒトＶＬカッパサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（配列番号１８）斜線部は軽鎖ＨＶＲを示す（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３で表示）。
【図８Ａ】図８Ａ−図８Ｂは以下の配列識別子を用いた本発明の実施における使用のための例示されるアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク（図８Ａ、Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号１９）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２０−２２）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号４８）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４９−５１）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５２）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５３−５５）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５６）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５７−５８）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５９）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号６０−６２）
【図８Ｂ】図８Ａ−図８Ｂは以下の配列識別子を用いた本発明の実施における使用のための例示されるアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク（図８Ａ、Ｂ）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号１９）ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号２０−２２）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号４８）ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号４９−５１）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５２）ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５３−５５）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５６）ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号５７−５８）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスＫａｂａｔ  ＣＤＲ（配列番号５９）ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸長超可変領域（配列番号６０−６２）
【図９】図９Ａ及び９ＢはハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−２９３により生産されるラット抗マウスインテグリンベータ７Ｆｉｂ５０４抗体の可変鎖のアミノ酸配列を示す。ＨＶＲは下線部である。可変軽鎖は図９Ａ（配列番号１２）に示し、そして可変重鎖は図９Ｂ（配列番号１３）に示す。
【図１０】図１０Ａは種々のコンセンサス配列（ｈｕサブグループＩ−ＩＩＩ）の重鎖におけるアミノ酸位置を示す。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体の開発のために使用したコンセンサス配列、ラットＦｉｂ５０４及びｈｕ５０４−ＲＬフレームワークは本明細書の実施例に記載する。図１０Ｂは実施例１に記載する「ＲＬ」又は「ＲＦ」フレームワーク修飾の関数としてのｈｕ５０４グラフト及びｈｕ５０４Ｋグラフト抗体へのアルファ４ベータ７の相対的結合を示す棒グラフである。
【図１１Ａ−１】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ａはｈｕ５０４．１６変異体においてアミノ酸置換の限定された範囲を与えることにより実施した親和性成熟に起因するＨＶＲの変化を表にしたものである。結果は本明細書の実施例２に記載したｈｕ５０４．１６変異体における個別に修飾されたＨＶＲを有するライブラリから得ている。箱内のアミノ酸の略記はベータ７結合抗体（ファージ選択抗体）においてより頻繁に観察されたアミノ酸である。
【図１１Ａ−２】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ａはｈｕ５０４．１６変異体においてアミノ酸置換の限定された範囲を与えることにより実施した親和性成熟に起因するＨＶＲの変化を表にしたものである。結果は本明細書の実施例２に記載したｈｕ５０４．１６変異体における個別に修飾されたＨＶＲを有するライブラリから得ている。箱内のアミノ酸の略記はベータ７結合抗体（ファージ選択抗体）においてより頻繁に観察されたアミノ酸である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ｂ及び１１Ｃは実施例２に記載した突然変異誘発及び選択により検出可能なｈｕ５０４．１６変異体（軽鎖、図１１Ｂ；重鎖、図１１Ｃ）におけるアミノ酸置換の数と型を示す図１１Ａの結果の棒グラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｃ。図１１Ｂ及び１１Ｃは実施例２に記載した突然変異誘発及び選択により検出可能なｈｕ５０４．１６変異体（軽鎖、図１１Ｂ；重鎖、図１１Ｃ）におけるアミノ酸置換の数と型を示す図１１Ａの結果の棒グラフである。
【図１２】図１２は実施例２に記載したｈｕ５０４．３２変異体のＨＶＲにおける可能なアミノ酸置換の広範な範囲を与えることにより実施したアフィニティー突然変異の結果を表にしたものである。箱部は実施例２の突然変異誘発及び選択方法によりベータ７結合抗体として検出された抗体において最も頻繁に検出されたアミノ酸を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは抗マウスＦｉｂ５０４（ＡＴＣＣ−２９３）及びヒトコンセンサス（左コラム）のＨＶＲ配列を示す。実施例に記載した試験により各ＨＶＲについて観察されたアミノ酸置換（ソフトアミノ酸ランダム化、広範なアミノ酸置換スキャン、及び限定的アミノ酸置換スキャンにより観察されたアミノ酸置換）の例（限定しない）を右側に示す（本発明の変異体に適用可能なヒト化のためにＨＶＲを修飾する有用な方法は２００４年２月１９日出願の米国暫定出願６０／５４５，８４０に記載されている）。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは抗マウスＦｉｂ５０４（ＡＴＣＣ−２９３）及びヒトコンセンサス（左コラム）のＨＶＲ配列を示す。実施例に記載した試験により各ＨＶＲについて観察されたアミノ酸置換（ソフトアミノ酸ランダム化、広範なアミノ酸置換スキャン、及び限定的アミノ酸置換スキャンにより観察されたアミノ酸置換）の例（限定しない）を右側に示す（本発明の変異体に適用可能なヒト化のためにＨＶＲを修飾する有用な方法は２００４年２月１９日出願の米国暫定出願６０／５４５，８４０に記載されている）。
【図１４】図１４は実施例３に記載する抗体濃度の関数としてのＭＡｄＣＡＭへのＦｉｂ５０４及び変異体抗体の結合の例示的グラフ表示である。抗体に関するＩＣ５０及びＩＣ９０値を測定した。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは抗体の６ＨＶＲに関するＫａｂａｔナンバリングシステム及び相対的ナンバリングシステム（Ａ−Ｆ）に従った位置に関する５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体に関わる軽鎖及び重鎖のＨＶＲアミノ酸配列を示す。重鎖ＦＲ３領域の７１、７３及び７８位のアミノ酸も示す。有用なアミノ酸置換はまたＨＶＲ又は重鎖ＦＲ３領域における位置の多くについても列挙する。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは抗体の６ＨＶＲに関するＫａｂａｔナンバリングシステム及び相対的ナンバリングシステム（Ａ−Ｆ）に従った位置に関する５０４．３２Ｒ抗ベータ７抗体に関わる軽鎖及び重鎖のＨＶＲアミノ酸配列を示す。重鎖ＦＲ３領域の７１、７３及び７８位のアミノ酸も示す。有用なアミノ酸置換はまたＨＶＲ又は重鎖ＦＲ３領域における位置の多くについても列挙する。
【図１６】図１６は炎症性腸疾患を経験しているマウスの結腸への放射標識Ｔ細胞のホーミングをブロックする５０４．３２Ｍ及び５０４．３２Ｒ抗体の相対的能力の棒グラフである。
【国際調査報告】
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