(57)【要約】【課題】微量検査を高精度かつ迅速にでき、液交換の精度が高く、操作や作業工程が簡便で検査系の構築がしやすいデバイスを提供すること。【解決手段】被検査物の検査に際して用いられるデバイスであって、板状で、その厚さ方向に向けて設けられた多数の貫通細孔を有するアッセイ用部材と、板状で、上記貫通細孔よりも微細な微細貫通孔を多数有し、上記アッセイ用部材に積層されて用いられる液透過用部材とを具備し、上記アッセイ用部材の上記貫通細孔に存在する被検査物は上記貫通細孔内に止まるが、検査に際して用いられる液体は上記微細貫通孔を通過し、上記液透過用部材を透過して外部に排出可能となされているデバイス。【選択図】図１
2015068750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検査物の検査に際して用いられるデバイスであって、
板状で、その厚さ方向に向けて設けられた多数の貫通細孔を有するアッセイ用部材と、
板状で、上記貫通細孔よりも微細な微細貫通孔を多数有し、上記アッセイ用部材に積層されて用いられる液透過用部材とを具備し、
上記アッセイ用部材の上記貫通細孔に存在する被検査物は上記貫通細孔内に止まるが、検査に際して用いられる液体は上記微細貫通孔を通過し、上記液透過用部材を透過して外部に排出可能となされている
ことを特徴とするデバイス。
【請求項２】
上記貫通細孔の容量が０．５〜２．０μリットルである請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
さらに、上記液透過用部材に積層されて用いられる液吸収体を具備し、
上記液吸収体に液体を吸収させることにより液体が上記液透過用部材を透過して排出される請求項１記載のデバイス。
【請求項４】
抗原−抗体反応を用いた検体評価に用いられる請求項１記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検査物の検査に際して用いられるデバイスに関し、
さらに詳しくは、微量検査を高精度かつ迅速にでき、液交換の精度が高く、操作や作業工程が簡便で検査系の構築がしやすいデバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生命科学分野等では、低分子からタンパク質、核酸のような高分子の化学物質の検査を行うが、その検査においてデバイスは重要である。
近年、検査においては、検査の高精度化、高速化、大量サンプルの処理（ハイスループット化）、サンプル及び試薬の使用量を微量化することによる高感度化及び低コスト化、現場での迅速検査に利用するための検査工程や操作の簡便さなどが求められており、微量検査においては反応槽の体積が小さいほど高速な反応が期待される。しかし、イムノアッセイなどの検査に小さな反応槽を用いると、夾雑物質や過剰の抗原・抗体の除去を効率よく行うための洗浄工程が難しい。この原因として、洗浄液の排出が容易に行えないことなどがあげられる。
また、イムノアッセイなどの検査においては、洗浄だけでなく、反応槽における非検査物の保持も重要であり、特に微量な対象を測定する検査では非検査物の保持量が低下するため、検査の精度が低下するという問題がある。
そこで、効率よくハンドリングでき、微量（微小）の非検査物の保持に適したデバイスが種々提案されている。
例えば、特許文献１では、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によるサンプル中の生物活性物質の濃度測定のデバイスとして、免疫吸着剤を結合するチューブ内の固体支持部と、流体注入口と、チューブ内の活動による放射を検出する検出器とを備え、チューブが、ほぼ単一面内を延びるマイクロチップ内部に配置され、それによって、このマイクロチップの面に沿って流体が送られるデバイスが提案されている。
また、例えば、特許文献２では、自動化システムとして、ナノスケールのキャピラリーの大きさの反応チャンバーのアレイを利用し、チャンバーの端部は変形可能な膜で一時的にシールされ、反応容器は毛管作用によって満たされ、そして空気置換、遠心力または他の手段によって分配され得るデバイスが提案されている。
また、例えば、抗原−抗体反応を用いたイムノアッセイにおいては、マイクロプレートで磁性粒子を用いて高速化とハイスループット化を行った新規の化学発光イムノアッセイを可能にするデバイス（非特許文献１）、簡単な操作によるポイント・オブ・ケア検査のためのマルチプレックスの化学発光イムノアッセイデバイスとして、紙製のシートにワックスプリントで印刷された３Ｄのｏｒｉｇａｍｉベースのデバイス（非特許文献２）、ＳｌｉｐＣｈｉｐのコンセプトを基にした紙製のデバイス（非特許文献３）などが提案されている。
また、化学発光イムノアッセイにおける磁性ビーズを具備するマイクロチャネルを用いたデバイス（非特許文献４）や特別にデザインされたマイクロ流路でマイクロビーズや磁性ビーズ以外の種類のビーズを具備するデバイス（非特許文献５）、洗浄における抗原・抗体の結合・非結合の分離（Ｂ／Ｆ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を改善したデバイス（非特許文献６及び７）、流体を貯蔵および／または送達するための方法およびデバイスとして、化学試薬もしくは生化学試薬またはリンス溶液のような、少なくとも第一の流体および第二の流体が、共通の容器内で互いに隔離されて維持され、そしてこの容器から、所定の化学反応または生化学反応を実施するための反応部位へと連続的に移されるデバイス（特許文献３）などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００５−５０９１５８号公報
【特許文献２】特表２００３−５０５７５１号公報
【特許文献３】特表２００７−５２４８５１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Zhao, L. X; Lin, J.-M. J.Biotechnol. 2005, 118, 177〜186.
【非特許文献２】Ge, L.; Wang, S. M; Song, X. R;Ge, S. G; Yu, J. H. Lab Chip 2012, 12, 3150〜3158
【非特許文献３】Liu, H.; Li, X.; Crook, R. M.Anal. Chem. 2013, 85, 4263〜4267.
【非特許文献４】Choi, J.-W; Ahn, C. H; Bhansali,S.; Henderson, H. T. Sens. Actuator, B. 2000, 68, 34〜39.
【非特許文献５】Sato, K.; Tokeshi, M.; Odake, T.;Kimura, H.; Ooi, T.; Nakao, M.; Kitamori, T. Anal. Chem. 2000, 72, 1144〜1147.
【非特許文献６】Kai, J.; Puntambekar, A.; Santiago,N.; Lee, S. H; Sehy, D. W; Moore, V.; Han, J.; Ahn, C. H. Lab Chip 2012, 12,4257〜4262.
【非特許文献７】Siuti, P.; Retterer, S. T; Choi, C.-K;Doktycz, M. J. Anal. Chem. 2012, 84, 1092〜1097.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１及び２に係るデバイスは、微量の被検査物の保持がいまだ不十であるという問題があった。
また、非特許文献１〜３に係るデバイスは、検査における作業工程数が多く煩雑で時間がかかり、また、検査に必要なサンプル及び試薬の量も多いという問題があった。
また、非特許文献４及び５に係るデバイスは、液交換が困難で、結合抗体と非結合抗体の分離（Ｂ／Ｆ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）が不十分で精度が低いという問題があった。
また、非特許文献６及び７に係る提案の方法は、検査系の構築や操作が難しいという問題があった。
また、特許文献３に係るデバイスは、特別な装置を必要とするため簡易に検査系の構築がしにくいという問題があった。
このため、微量検査を高精度かつ迅速にでき、液交換の精度が高く、操作や作業工程が簡便で検査系の構築がしやすいデバイスの開発が要望されている。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、微量検査を高精度かつ迅速にでき、液交換の精度が高く、操作や作業工程が簡便で検査系の構築がしやすいデバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解消すべく鋭意検討した結果、デバイスの穴を小さくしても洗浄液の排出が容易となるように、デバイスを、被検査物を保持する層と液を排出するための層との２層構造に構成することにより上記目的を達成し得ることを知見し、さらに改良することにより、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の各発明を提供するものである。
１．被検査物の検査に際して用いられるデバイスであって、
板状で、その厚さ方向に向けて設けられた多数の貫通細孔を有するアッセイ用部材と、
板状で、上記貫通細孔よりも微細な微細貫通孔を多数有し、上記アッセイ用部材に積層されて用いられる液透過用部材とを具備し、
上記アッセイ用部材の上記貫通細孔に存在する被検査物は上記貫通細孔内に止まるが、検査に際して用いられる液体は上記微細貫通孔を通過し、上記液透過用部材を透過して外部に排出可能となされている
ことを特徴とするデバイス。
２．上記貫通細孔の容量が０．５〜２．０μリットルである１記載のデバイス。
３．さらに、上記液透過用部材に積層されて用いられる液吸収体を具備し、
上記液吸収体に液体を吸収させることにより液体が上記液透過用部材を透過して排出される１記載のデバイス。
４．抗原−抗体反応を用いた検体評価に用いられる１記載のデバイス。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のデバイスによれば、微量のサンプルや試薬を用いて行う検査において、被検査物を保持した状態で、微量の液を高精度で簡便かつ迅速に液交換を行うことができ、微量検査を高精度で行うことを可能にするものである。
また、本発明のデバイスは、複雑な装置や手法を用いることなく、高精度の液交換を、被検査物を保持した状態で、簡便かつ迅速に行うことができるため、検査の系の構築や操作が簡単にでき、また、液交換のタイミングを人為的制御の下で行うことができるため、検査の自動化（ハイスループット化）を可能にするものである。
また、本発明のデバイスは、検査に必要なサンプル及び試薬の量が微量でも高精度な検査が可能であるため、検査の高感度化や検査試薬の低コスト化を実現でき、また、廃液も微量であるため環境負荷が低いものである。
本発明のデバイスは、上述の特性と効果から、抗原−抗体反応を用いた検体評価に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明のデバイスの一実施形態のアッセイ部材及び液透過部材を示す斜視図である。
【図２】図２Ａは、本発明のデバイスの一実施形態に溶液を入れた場合の図１のＡ−Ａ断面における説明図であり、ＢはＡのＢ部拡大図である。
【図３】図３は、図１の液透過用部材の斜視図である。
【図４】図４は、図３のＩＶ部拡大図である。
【図５】図５は、本発明のデバイスの一実施形態（液吸収体を含む）を示す斜視図である。
【図６】図６は、図５に示す実施形態のデバイスにおける溶液の排出過程を説明するための説明図であり、Ａは溶液が保持されている状態を、Ｂは溶液が吸収体に吸収されて排出される状態を示す説明図である。
【図７】図７は、本発明のデバイスの一実施形態で用いられる、アッセイ部材の製造工程の概要を示す説明図である。
【図８】図８は、実施例１で得られたデバイスの貫通細孔部分の図面代用写真である。
【図９】図９は、実施例１の貫通細孔内の微細貫通孔上のマイクロビーズを示す図面代用写真である。
【図１０】図１０は、実施例１における被検査物濃度と得られた相対シグナル強度との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１０】
１：デバイス、１０：アッセイ用部材、１１：貫通細孔、１２：担体、２０：液透過用部材、２１：内層、２２：微細貫通孔、３０：液吸収体、４０：溶液
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について実施例を示してさらに具体的に説明するが本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
【００１２】
以下、本発明を、図面を参照し、さらに詳細に説明する。
＜全体構成＞
本発明のデバイスは、被検査物の検査に際して用いられるデバイスである。
本発明のデバイス１の全体構成を、図１を参照して説明すると、本実施形態のデバイス１は、円板状で、その厚さ方向に向けて設けられた多数の貫通細孔１１を有するアッセイ用部材１０と、円板状で、貫通細孔１１よりも微細な微細貫通孔２２を多数有し、アッセイ用部材１０に積層されて用いられる液透過用部材２０とを具備する。
そして、検査に際しては、図２に示すように、アッセイ用部材１０の貫通細孔１１に存在する被検査物は貫通細孔１１内に止まるが、検査に際して用いられる液体は微細貫通孔２２を通過し、液透過用部材２０を透過して外部に排出可能となされている。この点については後述してさらに詳説する。まず、各部材について説明する。
【００１３】
＜アッセイ用部材＞
本実施形態で用いられるアッセイ部材１０は、図１及び図２Ａに示すように、その幅方向に向けて貫通して設けられた、多数の貫通細孔１１を有し、貫通細孔１１は、図２Ａに示すようにアッセイ部材１０の厚さ方向に向けて設けられており、厚さ方向の上部及び下部が解放されて貫通穴となされている。
貫通細孔１１の形状は厚み方向に貫通していれば、特に制限されず、例えば、円筒状、四角筒状、ハニカム状、三角柱状をはじめとする多角柱状などの形状を用いることができる。
アッセイ部材１０の厚みは、微量の溶液を用いることができ検査に用いる反応を安定して行う観点から０．０５〜３ｍｍであるのが好ましい。なお、本実施形態においては、１．０ｍｍである。
アッセイ部材１０の直径は、検査における操作性のしやすさ等の観点から、１０〜１００ｍｍであるのが好ましい。なお、本実施形態では、直径３３ｍｍである。また形状は円形のほか四角形，平行四辺形などがあり、その大きさは１０〜１００ｍｍ四方であるのが好ましい。
図１に示す貫通細孔１１の大きさｄは、微量の溶液を用いることができ検査に用いる反応を安定して行う観点から０．１ｍｍ〜３．０ｍｍであるのが好ましい。なお、本実施形態では１．５ｍｍである。
貫通細孔１１が設けられる部分やその数は、特に制限されず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で任意に設けることができるが、表面１ｃｍ２あたり１〜２５００個であるのが好ましく、貫通細孔１１と貫通細孔１１とのピッチが等間隔であるのが、被検査物の処理、ハンドリングの容易さ、などの観点から好ましい。
各貫通細孔の容積は、０．５〜２．０μリットルであるのが、貫通細孔１１内での反応を安定して行うこと、溶液の排出を容易にできることから検査の精度が高くなるので、この範囲内とするのが好ましい。
アッセイ部材１０の形成材料としては、シリコーン製樹脂、ポリプロピレンなどの樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）樹脂、ポリエステル樹脂，ポリアクリルアミド樹脂などを用いることができる。本実施形態においては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）樹脂である。
【００１４】
＜液透過用部材＞
液透過性部材２０は、図２〜４に示すように、貫通細孔１１よりも微細な微細貫通孔２２を多数有し（本実施形態においては径方向に区分される円形の内層２１部分に微細貫通孔２２を有する）、微細貫通孔２２は、液透過用部材２０がアッセイ用部材１０に積層されているため、その多数が貫通細孔１１と連通されている。
微細貫通孔２２の形状は、厚み方向に貫通していれば、特に制限されず、例えば、円筒状、三角柱，四角柱、ハニカム状，多角柱などの形状とすることができる。
微細貫通孔２２は、上記貫通細孔の溶液の排出を行う観点から、少なくともアッセイ部材１０に積層された際に貫通細孔１１と接触する部分においては設けられる必要があるが、本実施形態においては全体に設けられている。
微細貫通孔２２の大きさは、貫通細孔１１における溶液の保持が可能で、且つ、毛細管現象により該溶液が排出されるようになされていれば、特に制限されないが、微量の溶液を高精度に排出させる観点から、大きさ（孔径）が０．０１〜５０μｍであるのが好ましい。なお、本実施形態においては直径１０μｍとなされている。
また、微細貫通孔２２の数については、特に制限されないが、高精度の溶液排出（残液が少なく）を行う観点から、液透過性部材２０に密に形成させているのが好ましく、表面１ｍｍ２あたり１〜２．５×１０８個であるのが好ましい。
液透過性部材２０の形状は、本実施形態では円盤状のものを用いているが、板状であれば、特に制限されない。
液透過性部材２０の大きさは、本実施形態では、直径３３ｍｍであるが、特に制限されず所望の大きさとすることができる。また、厚さも本実施形態では約１ｍｍとしているが、特に制限されない。
液透過性部材２０の形成材料は、本実施形態では、ガラス製のものを用いているが、特に制限されず、アルミナ、ポリエチレン，ポリエステル，ＰＤＭＳなどのポリマーなどの形成材料を用いることができる。
このような微細貫通孔２２が形成されていることにより、図５Ａに示すように、本実施形態のデバイス１に検査で用いる溶液４０を貫通細孔１１に入れた場合、その溶液が微細貫通孔２２の底部側で、外側に突出する形状のメニスカスが形成される。これは、図５Ｂに示すように溶液の重力（Ｇ）と、溶液のラプラス圧（ΔＰ）とのバランスがとれてつりあっているために形成されるもので、この状態においては溶液が保持されている。
これにより、本実施形態のデバイス１の貫通細孔１１の溶液を保持することができ、且つ貫通細孔１１の微量の液の排出を高精度に効率的に行うこと、すなわち、デバイスにおける液透過性部材２０側から、後述する液吸収体などを用いて液を吸収するなどすることにより、微量の溶液を残液がほとんどなく迅速に排出することができる。
【００１５】
＜被検査物＞
本明細書において、被検査物は、本発明のデバイスを用いて検査を行う際に検査をされるものをいい、本実施形態においては、特定のタンパク質（ヒトＩｇＡ）であるが、特に制限されず、化学物質全般、オルガネラ、細胞、ウイルス、微生物、微粒子、土壌なども含まれる。
被検査物は、本実施形態においては図５のＡに示すような担体１２に結合するようになされ、これにより被検査物はアッセイ用部材１０の貫通細孔１１内に止まるが、検査に際して用いられる液体４０は微細貫通孔２２を通過して外部に排出可能となされている。これにより、被検査物をアッセイ部材内に保持した状態で液交換を必要とする検査を効率的に行うことができる。
本発明のデバイスを用いて行うことができる検査としては、抗原抗体−反応を用いた検査、核酸―核酸ハイブリダイゼーションを用いた検査、タンパク質、核酸、糖、低分子などの物質間相互作用を用いた検査などがあげられる。
上記被検査物を貫通細孔１１内に止まらせる方法としては、公知の手法を特に制限なく用いることができ、例えば、微細貫通孔２２の孔径より大きい担体や貫通細孔１１の壁面などに被検査物を結合させる方法、１０の壁面に非検査物を結合させる方法などが挙げられるが、表面積が大きく被検査物の結合量を多くできる観点から、市販のマイクロビーズ等の担体を用いる方法が好ましい。
上記被検査物を結合させる方法としては、たとえば抗体や受容体などのタンパク質、核酸などの被検査物と結合する物質を上記の担体や壁面に結合させ、それに被検査物を結合させる方法を用いることもできる。
【００１６】
＜液吸収体＞
本発明のデバイスは、さらに、図５に示すように液透過用部材２０に積層されて用いられる液吸収体３０を具備するのが好ましい。液吸収体３０は液透過用部材２０に脱着可能な状態で積層されている。
本実施形態においては、検査において洗浄のための溶液等溶液４０を貫通細孔１１に投入すると図６Ａに示すように溶液が貫通細孔１１から微細貫通孔２２内に充てんされる。この状態で得、図６Ｂに示すように液吸収体３０を液透過部材２０に積層（接触）させた場合、液吸収体３０が溶液４０を吸収することによって溶液４０が液透過用部材２０を透過して排出される。これは、微細貫通孔２２が毛細管現象を起こすような小径であるため、液吸収体の無い状態では液を保持するように働くが、液吸収体を積層すると内部の液を吸引力（図６Ｂ中に示すＦａ）により液吸収体に吸収させるように働く。これによって液の排出が行われる。
このように構成されていることにより、複雑な装置や手法を用いることなく、且つ吸収体３０の液透過用部材２０の底部への積層（接触）という簡単な操作で、簡便かつ迅速に、液の排出を、液吸収体３０の液吸収力を利用しより高精度に行うことができる。
また、液吸収体３０の積層（接触）による液排出は、操作を人為的に制御することが可能であるため、液の保持及び排出のタイミングも制御することが可能になり、検査の自動化も行いやすくなる。
また、操作が簡便であることから、検査の系の構築や操作が簡単にできるため、検査の自動化やハイスループット化も可能にするものである。
液吸収体３０の形成材料は、例えば、通常の濾紙の他、ガラスフィルター、ニトロセルロース紙，キャピラリープレートなどを用いることができ、液の吸収力が強いものであるのが好ましい。
液吸収体３０の大きさや厚みは、液を十分に吸収できる大きさと厚みを有していれば特に制限されない。
【００１７】
＜製造方法＞
本発明のデバイスの製造方法を説明する。
上記アッセイ部材の製造方法は、特に制限されず、樹脂製造の分野などにおける公知の方法を用いて製造することができる。
一例として、ＰＤＭＳ樹脂で製造する方法を図７に示して説明する。
まず、ＰＤＭＳ樹脂を成型するための鋳型を作製する。鋳型の製造は、光硬化性樹脂のコーティングを行う工程と、フォトマスクを介して紫外線露光による光硬化を行う工程と、フォトマスクにより光がさえぎられて硬化していない樹脂を除去する洗浄工程と、を行うことにより実施できる。こうして得られた鋳型を用いて、樹脂の除去された部分にＰＤＭＳ樹脂前駆体と硬化剤との混合物を流し込み、硬化反応及び成形の工程を行うことにより、上記アッセイ部材を得ることができる。
上記液透過用部材の製造方法も特に限定されず、例えば、特開２００４−２４１２９８号公報などに記載されるような微細管を集合させた後に成型するなどの方法で製造することができる。マルチキャピラリープレート（製品名：キャピラリープレート、Ｊ５０２２−１６、：浜松ホトニクス社製）、ナノポーラスアルミナ膜（Ｓｍａｒｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ社製）などの市販品を用いることもできる。
また、上記アッセイ部材と上記液透過用部材との積層の方法は、特に制限されず、液漏れや検査結果に悪影響を及ぼすなど本発明の趣旨を逸脱しなければ、公知の方法を用いることができる。例えば、本実施形態のように上記アッセイ部材がＰＤＭＳ樹脂などの場合は透過性部材に圧着することにより積層することができる。また、ポリプロピレン樹脂等の場合は接着剤により積層するなど公知の方法で積層することができる。
また、液吸収体の積層方法も特に制限されず、公知の手法を用いて行うことができる。
【００１８】
＜使用方法＞
本発明のデバイスは、特に制限されず、さまざまな検査に用いることができるが、抗原抗体−反応を用いた検体評価、核酸―核酸ハイブリダイゼーションを用いた検体評価、タンパク質、核酸、糖、低分子などの物質間相互作用を用いた検体評価など被検査物の保持し液交換工程を必要とする検体評価に好適に使用することができ、特に、抗原抗体−反応を用いた検体評価に好適に用いることができる。
このような抗原抗体−反応を用いた検体評価としては、化学発光免疫測定法（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  （ＣＬＩＡ））、酵素結合免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ  （ＥＬＩＳＡ））、蛍光免疫測定法（ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  （ＦＩＡ））などが挙げられ、これらの方法に本発明のデバイスを用いることができる。
具体的にはたとえば下記工程を順次行う検査方法（ＣＬＩＡ）に応用することができる。
（ＣＬＩＡ）
まず、本発明のデバイスの貫通細孔のブロッキング（ウェルのブロッキング工程）を行い、引き続き、予め被検査物を結合させるための１次抗体を結合させたマイクロビーズ（担体）の分注（第１抗体結合マイクロビーズの分注工程）、洗浄工程の後、被検査物と１次抗体との反応（被検査物の反応工程）、洗浄工程の後、被検査物と酵素標識された第２抗体との反応（第２抗体の反応工程）、洗浄工程の後、発光反応を行い、発光量を測定する（発光反応工程）。
本発明のデバイスを用いることにより、この検査方法のようにビーズの分注や数回の洗浄を行うなど、細孔中の被検査物と液とを複数回分離しなければならない検査方法に際しても、液交換を高精度で簡便に行うことができるため、評価に要する時間や労力を短縮できる。また、本発明のデバイスは、廃液が簡易且つ簡便にできるため、貫通細孔の大きさを小さくすることが可能となり、一つのデバイスで多量又は多種の検体を検査することが可能である。
【００１９】
本発明は上述した実施形態に何ら制限されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形可能である。
たとえば、上記貫通細孔や上記微細貫通孔などに、非特異的吸着防止、親水性処理、撥水処理、光検出する場合において光学的干渉を防止するための反射など処理や、化学物質の電気的な検出用の電極や、温度センサー、ｐＨセンサーなどの各種センサーを設けてもよい。
本明細書において、検査とは、科学分野における分析、試験または実験などを意味し、特に制限されるものではなく、また、検査の準備段階なども含む。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明について実施例及び比較例を示してさらに具体的に説明するが本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
〔実施例１〕本発明のデバイスを用いたＣＬＩＡ（ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ希釈系列試料の測定）
＜デバイスの製造＞
（アッセイ用部材の製造：アッセイ用部材（ＰＤＭＳシート）製造のための鋳型の作成）
１９の貫通細孔（内径１．５ｍｍ、貫通細孔間の間隔：５．５ｍｍ）を具備するアッセイ用部材製造のための鋳型を作成するためのフォトマスクのデザインをＡｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ（登録商標）を用いて行い、通常のフォトマスクを作成した。
次に、略円形のガラス基板に、ネガ型光硬化性樹脂（製品名：ＳＵ−８  ３０５０、日本化薬社製）を厚さ１．２ｍｍになるように、スピンコート法でコーティングした。
コーティング後のガラス基板を、紫外線（露光量：０．０５ｍＪ／ｃｍ２）で、上記フォトマスクを通して露光した。
紫外線露光後の上記光硬化性樹脂コーティングガラス基板を、現像液（製品名：ＳＵ−８  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、日本化薬社製）中に約１５分間浸透し、露光されなかった部分の光硬化性樹脂を溶解して除いた後、水で基板を洗浄し、ガラス基板上にＰＤＭＳシート（アッセイ用部材）を製造するための鋳型を作製した。
上記鋳型の形状は、アッセイ用部材の貫通細孔に相当する部分が凸状の略円筒形状のものである。
【００２１】
（アッセイ用部材（ＰＤＭＳシート）の製造）
ＰＤＭＳプレポリマーと硬化剤（製品名：ＰＤＭＳ  ｋｉｔ、東レダウコーニング社製）とを、ＰＤＭＳプレポリマー１０重量部に対して硬化剤０．５重量部の割合で混合し、真空ポンプで脱気した後、予め作成した上記鋳型に注ぎ、６５℃、１時間の条件で硬化させた。
硬化後、鋳型から剥がし、アッセイ用部材としてのＰＤＭＳシートを得た。
得られたＰＤＭＳシートの拡大写真を図１０に示す。貫通細孔の形状は円筒状で厚み方向に貫通しており、サイズは高さ（厚み方向）が１．２ｍｍ、直径が１．５ｍｍであった。
【００２２】
（液透過用部材（マルチキャピラリーガラスプレート）の洗浄と親水性処理）
液透過性部材として、ガラス製のマルチキャピラリープレート（製品名：キャピラリープレート、Ｊ５０２２−１６、：浜松ホトニクス社製）を使用した。該液透過用部材は、全体部分の直径が３３ｍｍ、そのうち、直径２７ｍｍ部分が微細貫通孔を有し、厚さが１ｍｍ、微細貫通孔の形状は円筒形状で厚み方向に貫通しており、その内径が１０μｍである。
引き続き行う化学発光免疫測定（ＣＬＩＡ）のための前処理として、製造過程において吸着した不純物等を除去するため、上記液透過性部材を洗浄した。
洗浄は、まず、上記液透過性部材を中性洗剤にオーバーナイトでゆっくり振盪させながら浸した後、超純水、アセトン、クロロフォルム、アセトン及び超純水の溶媒中でそれぞれ１５分ずつ超音波洗浄を行った後、濃度９８％（ｗ／ｗ）の硫酸と濃度３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水とを体積比で３：１の割合で使用直前に混合した溶液に３０分間浸した後、超純水中で超音波処理を１５分間することにより行った。
次に、キャピラリーの表面を親水性にするため、濃度０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に浸し１５分間処理した後、ゆっくり振盪させながら超純水で１５分間浸し、窒素ガスの吹付けを行い、６５℃で２０分間ベーキング処理を行った。
【００２３】
（液透過用部材のブロッキング処理）
洗浄後の液透過用部材は、濃度１%のＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、Ｍｅｒｃｋ社製)を含有する濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で４℃、一昼夜浸すことにより、ブロッキング処理を行った。
【００２４】
（デバイスの組み立て）
ブロッキング後の液透過用部材を、０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ｔｗｅｅｎ２０）溶液を含有する濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．０)で洗浄した後、窒素ガスの吹付けを行い、６５℃で２０分間ベーキング処理を行い、予め洗浄した上記ＰＤＭＳシート(アッセイ用部材)を上記液透過用部材に付着させて組み立てることにより、図１に示す本発明のデバイスを得た。
（装置）
本発明のデバイスへの送液装置として、インクジェット装置（製品名：ペーパーレスレコーダＰＨＷ、富士電機社製）を用いた。
上記インクジェット装置は、ピエゾ方式で、４つの吐出チャンネルを具備するものである。
上記インクジェット装置の調製は、Ｃｈｅｎ，Ｆ．ＭらＴａｌａｎｔａ  ２０１３，１０７，１１１〜１１７ページに記載の方法で予め行った。
インクジェット装置の制御は、自作のハードウェア及びソフトウェアを用いた。
インクジェット装置のピエゾ素子に入力する駆動波形の制御は、自作した増幅回路（電圧０−１００Ｖ，パルス幅０−２５５μｓ）を用いて行った。
【００２５】
次に、本発明のデバイスを用いて行うＣＬＩＡ用に、上記インクジェット装置の各チャンネル及び溶液における駆動波形及びパルス幅条件の至適化を行い、その条件における吐出液量を計測した。その結果を表１に示す。
なお、本明細書において、ＲＳＤ％は相対標準偏差を％表示したものを意味し、「ｎ＝」は試行回数を意味する。
表１に示す結果から、本発明で用いられる上記インクジェット装置は正確に微量の送液を行うことができることが分かる。
【００２６】
【表１】
2015068750.tif 000003
【００２７】
インクジェット装置の上記貫通細孔の上への正確な位置制御は、電動ＸＹステージ（製品名：ＭＭＵ−６０Ｘ、中央精機社製）を自作したソフトウェアを用いて、常法により行った。
【００２８】
＜化学発光免疫測定（ＣＬＩＡ）＞
得られた本発明のデバイス、および上記のインクジェット装置を用いて、ＣＬＩＡを行った。
【００２９】
（第１抗体結合ビーズの調整）
本実施例におけるＣＬＩＡにおいて、第１抗体はマイクロビーズに結合させて用いた。
第１抗体結合させたマイクロビーズの調整は、以下のように行った。
表面にカルボキシ基が導入されたマイクロビーズ（製品名：Ｐｏｌｙｂｅａｄ（登録商標）  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ２０．０μｍ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（２．５％  Ｓｏｌｉｄ−Ｌａｔｅｘ），  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を製品説明書の記載に従って洗浄した。
洗浄後のマイクロビーズを濃度０．１ＭのＭＥＳ緩衝液に再懸濁し、濃度２％のＮ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ′−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を等量投入して混合した後、室温で３〜４時間インキュベーションし、インキュベーション後のマイクロビーズを５〜６分間の遠心処理で沈殿させ、上清を除去した。なお、この洗浄処理は、複数回（３回）繰り返し行った。
ＥＤＣ処理後のマイクロビーズを濃度０．２Ｍのホウ酸緩衝液に再懸濁し、２００μgの第１抗体としての抗ｈｕｍａｎ  ＩｇＡヤギ抗体（製品名：Ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  （Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加した後、転倒型ミキサーで穏やかに混合しながら、室温、オーバーナイトでインキュベーションし、第１抗体をマイクロビーズにカップリングさせ結合させた。
カップリング後のマイクロビーズを洗浄した。洗浄工程における上清中の上記第１抗体の量は減少しており、減少した量はマイクロビーズへ結合した量であることを示している。
第一抗体結合マイクロビーズは、濃度０．２５Ｍのエタノールアミンで、未反応基をブロッキングした後、１％濃度のＢＳＡを含む濃度０．２Ｍのホウ酸緩衝液でインキュベーションし、タンパク質の非特異的結合サイトもブロッキングした。
ブロッキング後の第一抗体結合マイクロビーズは、濃度０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、マイクロビーズの最終濃度が２．５％（ｗ／ｖ）になるように再懸濁して、使用まで、低温保存した。
【００３０】
（ＣＬＩＡ：条件の至適化）
本実施例のＣＬＩＡにおける以下に記載する条件については、Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，８５（１５），７４１３〜７４１８ページに記載した実験で至適化したものである。
上記ウェルのブロッキング溶液の組成は、本実施例で得られた本発明のデバイスを用いて行ったＣＬＩＡにおいて、バックグラウンドが低くなるブロッキング溶液組成の検討を行い、バックグラウンドが最も低い溶液組成として選択したものである。
インキュベーションにおける湿度条件は、本実施例で得られた本発明のデバイスを用いて行ったＣＬＩＡにおいて、結果として得られるシグナル強度が高く且つ安定している湿度の検討を行い、選択した湿度である。
第１抗体結合マイクロビーズのウェルあたりの分注量は、本実施例で得られた本発明のデバイスを用いて行ったＣＬＩＡにおいて、結果として得られるシグナルが高くなる分注量の検討を行い、選択した量であり、１ウェルあたりのマイクロビーズの数は、１３６４８±５７２（ｎ＝１０）個である。
各反応のためのインキュベーション時間は、本実施例で得られた本発明のデバイスを用いて行ったＣＬＩＡにおいて、結果として得られるシグナルが高く且つ安定しているインキュベーション時間の検討を行い、選択した時間である。
第２抗体の濃度は、本実施例で得られた本発明のデバイスを用いて行ったＣＬＩＡにおいて、結果として得られるシグナルが高くリニアレンジが広くなる量の検討を行い、選択した量である。
発光反応の基質量は、本実施例で得られた本発明のデバイスを用いて行ったＣＬＩＡにおいて、結果として得られるシグナルが高く安定する基質量の検討を行い、選択した基質量である。
【００３１】
（ＣＬＩＡ：アッセイ部材の貫通細孔（ウェル）のブロッキング工程）
本発明のデバイスの貫通細孔（ウェル）をブロッキングするため、ウェルのブロッキング溶液としての濃度１％のＢＳＡを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を各ウェルにマイクロピペットを用いて２μＬずつ分注した。
上記ブロッキング溶液の分注後、本発明のデバイスを相対湿度（ＲＨ％）９７．５％にした湿箱に入れ、室温で１時間インキュベーションすることにより、ウェルのブロッキングを行った。
ブロッキング後、上記ブロッキング溶液の排出を行った。
上記ブロッキング溶液の排出は、本発明のデバイスの液透過部材の底部を、吸収体としての濾紙（製品名：ブレーン法濾紙、アドバンテック社製）に積層（接触）させることにより行った。溶液の排出は、微量の液を簡単な操作で極めて短時間に行うことができ、ウェルにおける残液はほぼ見られず高精度のものであった。
【００３２】
（第１抗体結合マイクロビーズの分注工程及び洗浄工程）
上記の第１抗体結合マイクロビーズ（ブロッキング後、濃度：２．５％（ｗ／ｖ））を濃度０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０倍に希釈した。
上記溶液排出後、ただちに、希釈後の第１抗体結合マイクロビーズ（濃度０．２５％（ｗ／ｖ））をマイクロピペットで各ウェルに２４μＬずつ分注した後、ウェルの洗浄を行った。
ウェルの洗浄は、ウェル洗浄液としての０．１％濃度のｔｗｅｅｎ２０を含有する濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液をマイクロピペットで２μＬずつ各ウェルに分注した後、上記溶液排出を行うことで実施した。
図９に本発明のデバイスの貫通細孔内にマイクロビーズが注入された状態を示す。図９に示すように、上記マイクロビーズは、微細貫通孔の孔径より大きいため、上記貫通細孔に止まり、かつ、上記マイクロビーズは第１抗体を結合して、第１抗体と結合する物質（被検査物、ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ）を保持するようになされているため、上記アッセイ用部材の上記貫通細孔に存在する被検査物を上記貫通細孔内に止め、検査に際して用いられる液体は上記微細貫通孔を通過し、上記液透過用部材を透過して外部に排出可能となされていることがわかる。
【００３３】
（被検査物の第１抗体との反応工程）
上記溶液排出後、ただちに、被検査物をウェルに投入した。本実施例においては、被検査物としてｈｕｍａｎ  ＩｇＡ（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｈｕｍａｎ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＩｇＡ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｔ  １．２  ｍｇ・ｍＬ−１）、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の希釈系列試料を用いた。
被検査物としての上記希釈系列試料の調製は、上記インクジェット装置の２つの異なるチャンネルを用いてｈｕｍａｎ  ＩｇＡと希釈用緩衝液とをインクジェット装置で同一ウェルに吐出し、それぞれの吐出液数を制御することでウェルあたりのｈｕｍａｎ  ＩｇＡ濃度を調製することにより行った。
具体的には、上記インクジェット装置のチャンネル１に濃度１μｇ・ｍＬ−１のｈｕｍａｎ  ＩｇＡを含む濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）溶液をロードし、チャンネル２に希釈緩衝液としての濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をロードし、ウェル中のｈｕｍａｎ  ＩｇＡの濃度がそれぞれ０．１、１．０、２．０、５．０、８．０、１５．０、３０．０、６０．０、１２０、２４０、４８０、１０００（ｎｇ・ｍＬ−１）になるように、且つ、１ウェルあたりの溶液量（吐出量）が２０００ｄｒｏｐｌｅｔｓ（８００ｎＬ）になるように、それぞれのチャンネルの液滴数を制御して吐出させて行った。
上記の被検査物の投入後、本発明のデバイスを相対湿度９７．５％の湿箱に入れ、室温で２５分間インキュベーションし、被検査物と第１抗体とを反応させた。
【００３４】
（洗浄工程、第２抗体と被検査物との反応）
被検査物のインキュベーション後、上記ウェル洗浄工程を５回繰り返して行った。
ウェル洗浄後、ただちに、第２抗体をウェルに投入した。
第２抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ｈｕｍａｎ  ＩｇＡヤギ抗体（製品名：Ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  （２ｎｄＡｂ−ＨＲＰ）を用いた。
第２抗体の各ウェルへ分注は、上記インクジェット装置の２つの異なるチャンネル（チャンネル２及び３）を用い２ｎｄＡｂ−ＨＲＰ溶液と希釈用緩衝液とをインクジェット装置で同一ウェルに吐出し、それぞれの吐出液数を制御して行った。
具体的には、上記インクジェット装置のチャンネル３に濃度１μｇ・ｍＬ−１の２ｎｄＡｂ−ＨＲＰを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をロードし、チャンネル２に上記希釈緩衝液をロードし、２ｎｄＡｂ−ＨＲＰの濃度が０．５μｇ・ｍＬ−１でウェルあたりの溶液量が２０００ｄｒｏｐｌｅｔｓ（約８００ｎＬ）になるように、それぞれの液滴数を制御して吐出させた。
上記の第２抗体の投入後、本発明のデバイスを相対湿度９７．５％の湿箱に入れ、室温で２５分間インキュベーションし、第２抗体と被検査物とを反応させた。
【００３５】
（発光反応工程）
第２抗体のインキュベーション後、上記ウェル洗浄工程を５回繰り返して行った。
ウェル洗浄後、ただちに、化学発光用基質液をウェルに投入し、発光反応を行った。
化学発光基質液は、ルミノール（Ｌｕｍｉｎｏｌ）を基質とするＬｕｍｉｎｏｌ：Ｈ２Ｏ２＝１：１（ｖ／ｖ）溶液（製品名：ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｌｕｍｉｎｏｌ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  （Ｈ２Ｏ２）  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。
化学発光用基質液の各ウェルへの分注は、上記インクジェット装置のチャンネル４に濃度がＬｕｍｉｎｏｌ：Ｈ２Ｏ２＝１：１（ｖ／ｖ）溶液をロードし、ウェルあたりの溶液量が１８００ｄｒｏｐｌｅｔｓになるように液滴数を制御して吐出させることにより行った。
発光の検出は、室温で，インクジェットで上記試薬を吐出直後から約２分間測定することで行った。
なお、発光反応後の各ウェルにおける発光シグナルの検出は、光電子増倍管（ＰＭＴ）（製品名：Ｈ１０７２２、浜松ホトニクス社製）を用いて行った。
【００３６】
（結果・考察）
得られた結果を図１０に示す。図１０中の式は、ｘをｈｕｍａｎ  ＩｇＡ濃度（ｎｇ・ｍＬ−１）、ｙを相対シグナル強度（ｍＶ）とした場合における、検量線の直線部分においての一次回帰式である。リニアレンジはｈｕｍａｎ  ＩｇＡ濃度が１．０〜３１．２５ｎｇ・ｍＬ−１の範囲で、回帰式はｙ＝６７．９６ｘ＋１４１．５６（Ｒ２＝０．９９１２）であった。相関係数が高いことから、高精度であることがわかる。
また、検出限界（ｂｌａｎｋ±３ＳＤ）は０．１ｎｇ・ｍＬ−１という低濃度であった（図示せず）。このことから、本発明のデバイスを用いて行ったＣＬＩＡは、高感度でかつ高精度であることが分かる。
【００３７】
〔実施例２〜４〕本発明のデバイスを用いたＣＬＩＡ（ヒト唾液中のｈｕｍａｎ  ＩｇＡ濃度の測定）
実施例１における被検査物を、ボランティアの人間（検体１（実施例２）、検体２（実施例３），検体３（実施例４）、検体１〜３は異なる人間）から採取した唾液サンプルを緩衝液で１００００に希釈したものに変え、実験の回数をｎ＝５でＣＬＩＡを行った以外は、実施例１と同様にして、本発明のデバイスを得、ＣＬＩＡを行い、測定結果を得た。その結果を表２に示す。
【００３８】
〔比較例２〜４〕９６ウェルプレートを用いたＣＬＩＡ（ヒト唾液中のｈｕｍａｎ  ＩｇＡ濃度の測定）
実施例２〜４で用いた被検査物（１００００倍希釈した唾液サンプル）を用い、９６ｗｅｌｌプレートでＣＬＩＡを行った以外は実施例２〜４と同様に検査を行い、測定結果を得た。
それぞれの比較例で用いた被検査物は、比較例２の被検査物は実施例２と同じもの、比較例３の被検査物は実施例３と同じもの、比較例４の被検査物は実施例４と同じものである。
得られた測定結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2015068750.tif 000004
【００４０】
表２に示す結果から、本発明のデバイスを用いた検査結果は、被検査物が現実の試料（唾液）であっても、従来の９６ウェルプレートを用いた検査結果と同様の結果を示し、また検査結果のばらつき（ＲＳＤ％）が少ないことがわかる。
このことから、本発明のデバイスを用いた検査は、精度の高いものであることがわかる。
【００４１】
本発明のデバイスを用いた検査（実施例１）と、従来の９６ウェルプレートを用いた検査の比較を表３に示す。
【表３】
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【００４２】
表３から、本発明のデバイスを用いた検査は、従来の９６ウェルプレートを用いた場合と比較して、インキュベーション及び検査に要する時間が非常に短いことがわかる。そして、検査に要する時間が６０分以内であり、上述のように操作が簡便であることから、現場などで要求される迅速検査等にも利用することができる。
また、サンプルの使用量については、従来の９６ウェルプレートを用いた検査と比較すると１２６倍少ない使用量であり、検査試薬のコストを大幅に軽減でき、また、極めて微量の試料を解析が可能である。
検出限界についても、本発明のデバイスを用いた検査は、従来の９６ウェルプレートを用いた検査と比較して８．６倍高く、非常に高感度であることがわかる。
以上から、本発明のデバイスを用いた検査は、微量サンプルを簡便な操作で、高感度、短時間且つ低コストで行うことが可能であり、抗原−抗体反応を用いた検体評価に好適に用いることができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のデバイスは、微量サンプルを簡便な操作で、高感度、短時間で且つ低コストで行うことを可能であるため、さまざまな検査デバイスとして有用なものである。また、簡便に短時間で抗原−抗体反応を利用した検査を行うことが要求される感染症などを現場で検査するための装置やキットなどに利用することが可能である。
また、本発明のデバイスを用いた検査は、自動化や機械化が容易なため、ハイスループットの検査ができ、また、ウイルス、病原菌など危険なサンプルを人間が接触することなしに安全に行う必要がある検査に応用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図８】
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【図９】
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