(57)【要約】  本発明は、配列番号１〜３３の配列、好ましくは配列番号２、３、または４の配列のいずれかを含むガレクチン‐１の発現を減少させるのに好適なＲＮＡｉ分子、薬剤としてのその使用、あるいは癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫を治療し、および／または進行を遅延させるための薬剤を製造するのに好適なＲＮＡｉ分子に関する。本発明はまた、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫を治療し、進行を遅延させ、腫瘍細胞、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫の細胞の遊走を低減し、および／または化学療法、放射線療法、免疫療法、および／または遺伝子療法を含む群から選択される、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫を治療するための癌治療法の効率を高めるための組成物および方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞のガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するための、配列番号２、３、４、１、または５〜３３の配列、および好ましくは配列番号２、３、または４の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含むＲＮＡ配列の使用。
【請求項２】
配列番号２、３、４、１、または５〜３３の配列、および好ましくは配列番号２、３、または４の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含む、腫瘍細胞のガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子。
【請求項３】
腫瘍細胞のガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するための、配列番号３５、３６、３７、３４、または３８〜６６の配列、および好ましくは配列番号３５、３６、または３７の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含むＤＮＡ配列の使用。
【請求項４】
ｄｓＲＮＡの産生に適切な発現ベクターに該ＤＮＡ配列を挿入する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
配列番号３５、３６、３７、３４、または３８〜６６の配列、および好ましくは配列番号３５、３６、または３７の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含む発現ベクター。
【請求項６】
癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬品としての、請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、または請求項５に規定するベクターの使用。
【請求項７】
癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させるための医薬品としての、請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、または請求項５に規定するベクターの使用。
【請求項８】
癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬品を製造するための、請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、または請求項５に規定するベクターの使用。
【請求項９】
癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させるための医薬品を製造するための、請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、または請求項５に規定するベクターの使用。
【請求項１０】
化学療法、放射線療法、免疫療法、および／または遺伝子療法を含む群から選択される癌治療法のいずれかと組み合せて、該ＲＮＡｉ分子および／または該ベクターを使用する、請求項６〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の治療に好適な活性化合物と組み合せて、該ＲＮＡｉ分子および／または該ベクターを使用する、請求項６〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、または請求項５に規定するベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬組成物。
【請求項１３】
請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、または請求項５に規定するベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させるための医薬組成物。
【請求項１４】
被験体に同時投与、個別投与、または逐次投与するための、請求項１２もしくは１３に記載の医薬組成物、ならびに癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療し、および／またはその進行を遅延させるのに好適な活性化合物を含むキット。
【請求項１５】
前記被験体に、請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、請求項５に規定するベクター、および／または請求項１２もしくは１３に規定する組成物を投与することを含む、被験体の癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療する方法。
【請求項１６】
前記被験体に、請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、請求項５に規定するベクター、および／または請求項１２もしくは１３に規定する組成物を投与することを含む、被験体の癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させる方法。
【請求項１７】
該細胞と、請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、請求項５に規定するベクター、および／または請求項１２もしくは１３に規定する組成物と腫瘍細胞を接触させることを含む、腫瘍細胞のガレクチン‐１の発現を減少させる方法。
【請求項１８】
請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、請求項５に規定するベクター、および／または請求項１２もしくは１３に規定する組成物を投与することを含む、腫瘍細胞、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞の遊走を低減させる方法。
【請求項１９】
請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、請求項５に規定するベクター、および／または請求項１２もしくは１３に規定する組成物を投与することを含む、アポトーシスに対する腫瘍細胞、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞の耐性を低減させる方法。
【請求項２０】
化学療法、放射線療法、免疫療法、および／または遺伝子療法を含む群から選択される、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための癌治療法の効力を高める方法であって、
‐  請求項２に規定するＲＮＡｉ分子、請求項５に規定するベクター、および／または請求項１２もしくは１３に規定する組成物を投与すること、および
‐  前記癌治療法を同時投与、個別投与、または逐次投与すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略的に、腫瘍の進行に関与する標的遺伝子（ガレクチン‐１）の遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ技術の使用に関する。より具体的には、本発明は、癌、例えば、神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫を治療するためのＲＮＡｉ分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０００年以来、新規な抗癌剤の開発には、前臨床相から第ＩＩＩ相臨床試験までを通して、インビボ主導の最適化から約１２００のプロジェクトが含まれる（非特許文献１）。これらの１２００のプロジェクトの１５％未満は、第Ｉ〜ＩＩＩ相臨床試験下にある。細胞毒性薬と細胞増殖抑制薬、およびシグナル伝達経路阻害剤が開発中の２つの最大の群である。抗血管新生化合物、およびモノクローナル抗体などの生物薬とともに、それらは、２０００年以来、臨床相でアッセイされた抗癌薬の約７０％を占める。さらに、臨床試験下の抗癌薬の１９％が、ホルモン療法、細胞周期阻害剤、化学的予防阻害剤、およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に属する。上記と比較して、わずか３種の抗遊走性（抗転移性）化合物、すなわち、腫瘍学で臨床試験下にあるもののうち２％が臨床試験にかけられた。
【０００３】
より有効な細胞毒性薬および細胞増殖抑制剤、ならびに癌細胞を標的とするモノクローナル抗体が有効であるにもかかわらず、進行した疾患および／または転移性疾患患者の治療では依然として不満の声が高い。シグナル伝達経路の阻害剤の使用はさらに複雑である。そのような経路が、癌の進行中、同時に全て活性化されるわけではないからである。むしろ、対応する標的が腫瘍組織に存在する場合にのみ、特定の阻害剤を施用する必要がある。従って、個々の患者は、自身の腫瘍の分子プロファイリングを受けてから任意の治療を受ける必要があり、それによって治療効率および費用対効果が減少し、遅れが生じてから、有効な治療が開始可能になる。
【０００４】
上記の点から、癌に対処するための新規な治療的手法が依然として必要とされている。新規な細胞標的が必要であり、これらの標的に効率よく作用できる治療分子も必要である。好ましくは、その細胞標的は様々な癌に関与し、例えば、癌細胞の遊走および転移など、様々な疾患機序で役目を果たすであろう。
【０００５】
本来はガラクトース特異的レクチンと名付けられたガレクチンは、哺乳動物において、１５のメンバーからなるファミリーである。このファミリーの各メンバーは、正常組織および新生物組織の限定されたセットで発現し、別個の生物学的機能に関連付けられる（非特許文献１０）。ガレクチンは、Ｎ‐およびＯ‐グリカンを容易に架橋することができるホモ二量体またはオリゴマー、ならびにＥＣＭで同様のグリカンを有する細胞表面に存在する糖脂質を形成する。加えて、β‐ガラクトシド含有原形質膜複合糖質の架橋によって、細胞のシグナル伝達、接着、および生存が調節される。ほとんどのガレクチンは、細胞外作用物質として記載されているが、細胞内機能も記載されている。それらは、癌が関与する細胞過程を含め、生物学的過程でいくつかの重要な役割を果たすことが判明している。そのようなものとして、ガレクチンの役割は、癌および他の増殖性疾患に非常に強く結びついている。
【０００６】
より詳細には、本発明者らは、腫瘍または腫瘍周辺組織でのガレクチン‐１の発現または過剰発現は、腫瘍の悪性進行の徴候とみなすことができ、患者の思わしくない予後を伴ことが多く、遠隔（転移）または周辺正常組織への腫瘍細胞の転移、および腫瘍免疫回避に関係することが多いと考えている。
【０００７】
本発明者らは、ガレクチン‐１の発現または過剰発現が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非ホジキン（ＮＨ）リンパ腫、膵癌、頭頸部癌、黒色腫、および神経膠腫（脳腫瘍）で特に重要な役割を果たしうることを見出している。これらの６種の癌型は、女性患者で見られる全ての癌の約１９．８％以上、および男性患者で見られる全ての癌の約３７．２％以上を占める。従って、これらの癌型の効率的な標的化からメリットを得る男女患者数は、年間約１，２６１，０００人の新規癌患者であろう。
【０００８】
例えば、ガレクチン‐１は、正常組織および膵炎と比較して膵管腺癌で過剰発現する（非特許文献１７；非特許文献３６）。腫瘍細胞の分化レベルに関する事実（非特許文献４）である。膵星細胞は、膵線維症の発生、慢性膵炎および膵癌の病理学的特徴で重要な役割を果たす。非特許文献１４は、ラット膵星細胞の活性化は、膵星細胞の機能を調節するガレクチン‐１の発現増加に関連することを示した。
【０００９】
ガレクチン‐１の発現は、頭部頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）で確認されている。それは、攻撃性と関連して（非特許文献８）腫瘍浸潤区画内（非特許文献１６）で発現する。
【００１０】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者は、腺癌が顕著に現れる患者の中で、ガレクチン‐１の発現が陽性であることが多い。ガレクチン‐１の発現は、悪性腫瘍の進行に伴って上昇する傾向があり、腫瘍細胞の増殖活性に関連しうる好ましくない独立予後因子である（非特許文献４０；非特許文献１５）。
【００１１】
黒色腫細胞に組換えガレクチン‐１を細胞外で加えると、ラミニンまたはフィブロネクチンへの細胞接着（非特許文献４３）、ならびに糖タンパク９０Ｋ／ＭＡＣ‐２ＢＰとの相互作用による細胞凝集（非特許文献４２）の用量依存的な上昇が誘発される。ガレクチン‐１の免疫調節作用、および癌細胞でのガレクチン‐１の発現とこれらの腫瘍の攻撃性との相関（非特許文献３３）から、本発明者らは、腫瘍細胞が、ガレクチン‐１の分泌を通じてＴ細胞のエフェクター機能を損ない、この機序により腫瘍部位で平衡が免疫抑制環境に傾く一因になっていると仮定する。非特許文献３４は、ガレクチン‐１介在免疫調節と、腫瘍免疫回避へのその寄与との間の関連性を提唱した。黒色腫組織内でガレクチン‐１の阻害効果を遮断すると、結果として腫瘍塊が減少し、インビボでの腫瘍特異的Ｔ細胞応答の発生が刺激されることになった。このことから、ガレクチン‐１が、エフェクターＴ細胞の生存または分極を調節することによって腫瘍の免疫特権の一因となりうるという考えが支持され、かつ癌の治療剤に潜在的な関わりを有するＴ細胞アポトーシス操作に対する潜在的分子標的であることが示唆される。
【００１２】
正常リンパ組織の血管壁はガレクチン‐１を発現しないが、リンパ腫の血管壁は血管密度と関連してガレクチン‐１を発現する（非特許文献１１）。皮膚Ｔ細胞リンパ腫中の悪性Ｔ細胞であるSezary細胞（Sezary症候群または菌状息肉腫）は、ＣＤ７発現の損失および細胞糖鎖形成の変化によるガレクチン‐１誘発アポトーシスを含む、様々なアポトーシス誘発媒介物に耐性を示す。最新の証拠では、また、ガレクチン‐１（ｄＧａｌ‐１）が、前骨髄球細胞系や活性化した好中球上ばかりでなく、ヒトＴ白血病ＭＯＬＴ‐４細胞の原形質膜上でホスファチジルセリン（アポトーシス細胞の貪食性に関与する初期アポトーシスマーカー）が曝露するのを誘発し得るが、これにより細胞死が起こらずに、細胞に食作用除去を行うように準備させるということが示されている。
【００１３】
ガレクチン‐１は、生理学的脳過程において最も重要なガレクチンファミリーメンバーであることが報告されている（非特許文献１０；非特許文献７；非特許文献４５）。本発明は、少なくとも部分的には、ガレクチン‐１がヒト神経膠腫の悪性腫瘍の発生に直接関与するという知見に基づく。
【００１４】
ヒト神経膠腫患者で、ガレクチン‐１の発現レベルおよびパターンは悪性腫瘍の発生と相関する（非特許文献７）。近年の高度星細胞腫の臨床試料の調査では、ヒト悪性神経膠腫での低レベルのガレクチン‐１発現は、そのような悪性神経膠腫患者の異例の長期生存と関連することが判明した（非特許文献７）。これに反して、高レベルのガレクチン‐１発現が、ヒト外科試料および動物モデルにおける高度の浸潤性星状膠細胞腫で観察されている（非特許文献７）。
【００１５】
高レベルのガレクチン‐１の発現は、ヒト神経膠腫での悪性腫瘍の発生と相関するが、そのようなヒト神経膠腫での悪性腫瘍の発生は、ガレクチン‐３の発現の顕著な減少にも関連する（非特許文献７）。これらのデータは、神経膠腫悪性腫瘍の発生において、ガレクチン‐１とガレクチン‐３の役割が異なることを示唆している。従って、癌一般に対処する治療を目的とする抗ガレクチン‐３戦略の使用を、特に神経膠腫には当てはめることができない。
【００１６】
悪性神経膠腫の攻撃的挙動にガレクチン‐１が直接的に関与することが報告されている（非特許文献６；非特許文献３２； 非特許文献１８；非特許文献４４）。
【００１７】
例えば、本出願人は、Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞の培地にガレクチン‐１をインビトロで添加することによって、それらの遊走能力が顕著に上昇することを示している（非特許文献６；非特許文献３２）。こうした効果は、アクチン細胞骨格再構築、および低分子量ＧＴＰ分解酵素ＲｈｏＡでの発現増加を伴っていた（非特許文献６）。これに反して、ガレクチン‐１のアンチセンスｍＲＮＡ用発現ベクターを安定して形質移入することにより、低レベルのガレクチン‐１を構成的に発現するヒトＵ８７神経膠芽腫細胞（Ｕ８７／Ｇ１‐）を設計した。インビボでは、ヌードマウスにＵ８７／Ｇ１‐細胞を頭蓋内移植することによって、対照細胞を移植したマウスと比較して生存期間が大きく延長した（非特許文献６）。インビトロでは、Ｕ８７／Ｇ１‐細胞は、親（ｗｔ）細胞および偽形質移入細胞よりも運動性がはるかに劣った（非特許文献６）。これらの細胞でガレクチン‐１の発現が長期欠乏すると、細胞増殖特性は改変されなかったが、Boydenチャンバにおいて細胞接着および浸潤が損なわれ、マトリックスメタロプロテイナーゼ‐２の発現、分泌、および活性が低下した。マトリックスメタロプロテイナーゼ‐２は、ヒト神経膠腫の悪性腫瘍の発生で顕著な役割を発揮する（非特許文献３１）。星状膠細胞腫でガレクチン‐１の発現および分泌レベルが低下すると、これらの星状膠細胞腫でのＭＭＰ‐２の発現および分泌レベルが低下する。順次、星状膠細胞腫の能力が低減し、脳実質が侵襲される特徴である（非特許文献６）。
【００１８】
ガレクチン‐１が、星状膠細胞腫の接着、運動、および浸潤を促進する分子メカニズムの研究をさらに進めるために、偽形質移入細胞および野生型細胞にアンチセンスガレクチン‐１ベクターを安定して形質移入した効果もまた、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析により比較した。（癌に潜在的に関与する６３１個の遺伝子のうち）９１個の遺伝子の発現は少なくとも２倍上昇した。タンパク質レベルの上昇は、ｐ２１ｗａｆ／ｃｉｐ１、ｃｕｌｌｉｎ‐２、ｐ５３、α９β１インテグリン、ＡＤＡＭ‐１５、およびＭＡＰ‐２について免疫細胞化学法を行うことによって確認された。α９β１インテグリンおよびＡＤＡＭ‐１５タンパク質の発現パターンでは大きな差も観察された。
【００１９】
癌一般を治療するのにガレクチン阻害剤の使用が報告されている。例えば、ある型の癌に対処するために抗ガレクチン‐４または抗ガレクチン‐９による治療的手法の使用が提案されている。しかし、本発明は、ガレクチン‐４またはガレクチン‐９を標的とはしない。
【００２０】
特許文献１は、ＧＡＬ‐１またはＧＡＬ‐４と結合し、かつ／またはその活性を阻害する治療化合物を投与することによって、被験体で胸部腫瘍の増殖および／または転移を阻害する方法について記載している。その治療化合物は、一種または複数の糖類に結合させたアミノ酸またはポリペプチドである。ある場合には、治療化合物としてＧＡＬ‐１の一部およびＧＡＬ‐１タンパク質自体（例えば、結合ドメインの一部）が使用され、またある場合には、治療剤として、非ＧＡＬタンパク質（例えば、グリコアミン）が使用される。記載した手法は、乳癌の治療を標的とし、異なる病理から構成される上記の癌、例えば、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、頭頸部癌、黒色腫、および膵臓癌の治療には適切でも有効でもない。
【００２１】
特許文献２は、化学療法剤の毒性を増強するために、ガレクチン‐３の抗アポトーシス活性を阻害する薬剤（例えば「ガレクチン‐３阻害剤」）の投与を組み合せることによって、様々な型の癌および他の増殖性疾患の治療を高める方法および組成物について記載している。しかし、ガレクチン‐３は、神経膠腫の発生では役目を担っていない（非特許文献７）。ガレクチン‐３の発現レベルは、神経膠腫疾患の進行中、および悪性腫瘍が発生しているとき、劇的に低下する（非特許文献７）。従って、癌一般に対処する治療を目的とする抗ガレクチン３戦略の使用は、特に神経膠腫には当てはめることができない。ガレクチン‐３の抗アポトーシス活性およびその阻害を基礎とする上記手法は、従って神経膠腫の治療に有効ではない。
【００２２】
上記の点から、当技術分野では、癌、特に悪性神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫に対処するための治療的手法が依然必要なことは明らかである。従って、本発明の目的は、癌、特に、ガレクチン‐１の発現または過剰発現が関与する癌を治療するための、特に、悪性神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫を治療するための、核酸化合物、組成物、および方法を提供し、それらは現在施用されている組成物および方法の欠点の少なくともいくつかを克服するものである。
【特許文献１】米国特許第２００３／０１０９４６４号
【特許文献２】国際公開第２００４／０９１６３４号
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、概略的に、６種の癌型の悪性度の進行におけるガレクチン‐１の役割に関し、従って本発明は、ヒト癌一般に、特に、悪性神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫に対処するための抗ガレクチン‐１治療的手法の使用に関する。本発明の治療的手法は、特に、ヒト星状膠細胞腫でガレクチン‐１の発現をノックダウンすることを目的とする、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）手法、アンチセンス手法、ウイルスベクター手法、または他の任意の関連手法に関連する抗ガレクチン‐１ツールの使用を基礎とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
第一の態様では、本発明は、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するためのＲＮＡ核酸配列の使用に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するための、配列番号１〜３３の配列、好ましくは配列番号２、３、または４の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含むＲＮＡ配列の使用に関する。
【００２５】
驚くべきことに、本発明者らは、特にｓｉＲＮＡを使用するＲＮＡｉ関連手法によって得られた、ガレクチン‐１の発現の下方制御の大きさおよび持続時間が、アンチセンスオリゴヌクレオチド手法を使用し得ることができるものよりもはるかに大きいことを認めた。加えて、ＲＮＡｉ手法は、臨床へ適用するのにアンチセンスオリゴヌクレオチド手法よりもはるかに適切である。
【００２６】
さらに、驚くべきことに本発明者らは、ＲＮＡｉ分子、例えば、配列番号２の配列、そのフラグメントまたは誘導体を含むｓｉＲＮＡが、神経膠腫、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頸部癌、非ホジキンリンパ腫、および黒色腫から得た腫瘍細胞で、ガレクチン‐１の発現の減少に予期せぬ劇的効力を発揮することを認めた。「ｓｉＲＮＡ‐１」（配列番号２の配列を含む）について実施例、および図５、６で実証したものなど、ガレクチン‐１の下方調節における、これらのＲＮＡｉ分子の有利な効力は極めて驚くべきものである。さらに、ＲＮＡｉ分子、例えば、配列番号２の配列、そのフラグメントまたは誘導体を含むｓｉＲＮＡの利点は、これらが、腫瘍細胞、特に、神経膠腫、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頸部癌、非ホジキンリンパ腫および黒色腫から得た腫瘍細胞に浸透する性向が高いことである（共焦点顕微鏡によってインビトロで観察、およびｇａｌ‐１に対して配列番号２のｓｉＲＮＡを標的とする蛍光を用いる蛍光顕微鏡によってインビボで観察）。
【００２７】
第二の態様では、本発明は、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するための、ＤＮＡ核酸配列の使用に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するための、配列番号３４〜６６の配列、好ましくは配列番号３５、３６、または３７の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含むＤＮＡ配列の使用に関する。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡの産生に適切な発現ベクターに前記ＤＮＡ配列を挿入する。別の実施形態では、本発明はまた、配列番号３４〜６６の配列、好ましくは配列番号３５、３６、または３７の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含む発現ベクターにも関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、医薬品として、神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための、および／あるいは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬品を製造するための、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子または発現ベクターの使用に関する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための、および／あるいは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させるための、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子または発現ベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、被験体へ同時投与、個別投与、または逐次投与するための、本明細書で規定した医薬組成物および活性化合物を含むキットをも含む。
【００３１】
他の態様では、本発明は、さらに、神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療する方法、ならびに神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させる方法に関する。
【００３２】
本発明はまた、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を下方調節する方法も提供する。
【００３３】
本発明は、さらに、腫瘍細胞、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞の遊走を低減させる方法に関する。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明はさらに、化学療法、放射線療法、免疫療法、および／または遺伝子療法を含む群から選択される、アポトーシスに対する腫瘍細胞、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞の耐性を低減させる方法、ならびに神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための癌治療法の効力を高める方法を提供する。
【００３５】
本発明は、神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための核酸、ＲＮＡｉ分子、組成物、および方法を提供するが、これらは、プロアポトーシス活性とは異なる活性を有し、かつそれぞれの腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を下方調節することを基礎とする。本発明は、核酸、ＲＮＡｉ分子、組成物、および方法を提供するが、これらは、罹患被験体で、神経膠腫癌、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅らせ、それによって患者の生存期間を増大させることができる。本発明は、さらに、新規な核酸、ＲＮＡｉ分子、組成物、および方法を提供するが、これらは、腫瘍細胞、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞の遊走レベルを減少させることができる。これらの薬剤はまた、これらの遊走腫瘍細胞で、一定のレベルのアポトーシスを修復し、それによって現在のプロアポトーシス化学療法剤に対する、遊走が制限されたこれらの腫瘍細胞の一定のレベルの感受性を修復し、プロアポトーシス癌治療法の効力を高めることができる。例えば、そのような核酸、ＲＮＡｉ分子、組成物、および方法は、これらの遊走星状膠細胞腫で一定のレベルのアポトーシスを修復しながら、脳実質中へ星状膠細胞腫の遊走レベルを減少させることができる。従って、本発明の組成物および方法は、現在のプロアポトーシス化学療法剤に対する、遊走が制限されたこれらの星状膠細胞腫の一定のレベルの感受性を修復し、プロアポトーシス癌治療法の効力を高める。
【００３６】
本発明の別の態様を以下の詳細な説明に照らして明らかにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
神経膠腫は、全脳腫瘍の５０％超を占め、小児および成人で突出して最も一般的な原発性脳腫瘍である（KleihuesおよびCavenee、2000；Lefrancら、2005a）。神経膠腫には、様々なレベルの攻撃性および悪性度によって特徴付けた３つの病理組織学的下位群が含まれる。すなわち、上衣細胞腫（全神経膠腫の＜１０％）、乏突起細胞腫（全神経膠腫の５〜３０％）、および星細胞腫（全神経膠腫の６０〜７０％）である。悪性星状膠細胞の神経膠腫は、正常な脳実質中に散在して浸潤するその能力により最悪の予後を伴っており、従って世界保健機関（ＷＨＯ）等級でＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ等級腫瘍（KleihuesおよびCavenee、2000；Lefrancら、2005a）に含まれる。これらの腫瘍に罹患している患者の場合には、予後は依然として暗澹としている（KleihuesおよびCavenee、2000）。全神経膠腫型中、最も悪性形態である神経膠芽腫患者の生存期間中央値（ＷＨＯでＩＶ等級）は、多様な攻撃的治療を用いてですら１年の範囲である。現在まで、神経膠芽腫患者で完治した例は一例もない（Lefrancら、2005a）。神経膠芽腫は、全神経膠腫の約５０％、すなわち、成人で全固形腫瘍の２〜３％、および小児で全固形腫瘍の１０〜１５％を占める。従って、悪性神経膠腫は、攻撃的に増殖し拡大するだけでなく、離れた脳組織へのその変わらぬ浸潤性によっても特徴づけられるので、悪性神経膠腫は、全ての癌の中で、首尾よく治療するには最も厄介な癌の中に含まれる（Lefrancら、2005a）。
【００３８】
脳実質中の高レベルの星状膠細胞腫は、切除空洞部に主として隣接する神経膠腫のみならず、原発部位から離れた神経膠腫も急速に再発させる（３〜６ヵ月以内）。脳実質中への星状膠細胞腫遊走レベルは、放射線療法および／または化学療法によっても低下させることができない。なぜなら、ｉ）遊走星状膠細胞腫はアポトーシスに対して耐性であり、かつｉｉ）今日使用されている放射線療法および化学療法剤の大部分はプロアポトーシス剤であるからである（Lefrancら、2005a）。
【００３９】
この点により、従来技術では、悪性神経膠腫に対処するために、アポトーシス経路とは無関係な新しい型の治療手法に高い必要性があることは明らかである。
【００４０】
多数のシグナル経路は、遊走神経膠腫細胞で活性化される。細胞遊走に関与する一つまたは複数のシグナル経路に対する阻害剤の使用による、悪性神経膠腫の治療が示唆されている。しかし、これらの経路が全て、任意の一種の神経膠腫で同時に構成的に活性化されるわけではないことは、一つの大きな欠点である（Lefrancら、2005a）。従って成功するためには、そのような戦略は、対応する標的が腫瘍組織に存在する場合に限り、特定の阻害剤の適用を必要とするはずである。従って、そのような戦略は、それらの遊走性神経膠腫細胞に対処するための任意の治療を受ける前に、個々の患者に自身の腫瘍分子プロファイリングを受けてもらう必要がある。そのような戦略は、効率、高費用効率からかけ離れており、有効な治療を開始できる前に、貴重な時間的遅れを伴うことは明らかである（Lefrancら、2005a）。
【００４１】
膵癌すなわち膵臓癌腫は、最も一般的には導管腺癌のことである。これらは、膵外分泌部癌または管状膵癌であり、膵癌診断例の９０％超を構成する。膵島細胞腫瘍または膵内分泌部腫瘍は、典型的には、診断例の１０％未満を構成する。
【００４２】
頭頚部癌は、被験体の頭部頚部領域組織のあらゆる癌腫を包含する。そのような頭部頚部癌腫には、例えば、口、食道、咽頭、喉頭、甲状腺腺、舌、唇、唾液腺、鼻、鼻傍、上咽頭、上鼻腔、および鼻腔腫瘍、感覚神経芽細胞腫、扁平上皮癌、悪性黒色腫、副鼻腔未分化癌（ＳＮＵＣ）、または血液新生物が含まれる。同様に含まれるものには、頚部リンパ節、喉頭前リンパ節、肺食道傍リンパ節、および顎下リンパ節を含む局所リンパ節の癌腫がある（Harrison's Principles of Internal Medicine, eds., Isselbacherら, McGraw-Hill, Inc., 13th Edition, pp1850-1853, 1994）。
【００４３】
黒色腫は、皮膚、ならびに、例えば口腔、食道、肛門管、膣、軟膜および／または結膜、または眼を含む他の器官のメラニン細胞系から生じる悪性または良性腫瘍をさす。限定しない黒色腫の例には、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、表在拡大型黒色腫などが含まれる。
【００４４】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）には、その３種のサブタイプ、すなわち、肺腺癌、肺扁平上皮癌、および肺大細胞癌のいずれかが含まれる。
【００４５】
リンパ腫は、リンパ球中で発生する癌である。それらは、広く２つのカテゴリー：ホジキン病および非ホジキンリンパ腫に分類される。「非ホジキンリンパ腫」という用語は、広範であり、ホジキン病ではないリンパ腫全てを包含する。リンパ腫は、いかに迅速に、いかに攻撃的に増殖するかに応じて３つの型に分けられる。低悪性度は、最も緩慢に増殖する型であり、「低悪性腫瘍」リンパ腫と呼ばれる場合もある。中悪性度リンパ腫は急速に増殖し、高悪性度リンパ腫は、最速で最も攻撃的に増殖する型である。
【００４６】
しかし、今までのところ、上記膵癌、頭頚部癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、非ホジキンリンパ腫、および神経膠腫を含むヒト癌に対処するのに、標的としてガレクチン‐１をベースとする適切な戦略は開発されていない。さて、本出願人は、ヒト癌一般、悪性ヒト神経膠腫、好ましくは神経膠芽腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌および非ホジキンリンパ腫に対処するための改善された戦略、特に抗ガレクチン‐１治療的手法をベースとする戦略を示す。本発明は、癌、特に、神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫の発生および悪性度において、ガレクチン‐１の役割に関するいくつかの態様を含む。より具体的には、本発明は、標的遺伝子、特に、ガレクチン‐１遺伝子の発現のノックダウンに作用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用に関する。
【００４７】
定義
本明細書で使用する「アポトーシス」という用語は、発生中および他の正常な生物学的過程中で、望ましくない、または無用な細胞が排出される生理過程をさす。アポトーシスは、正常な生理学的状態下で生じる細胞死機序であり、その細胞は積極的に自己の消滅（「細胞自殺」）に参加している。
【００４８】
本明細書で使用する「標的遺伝子」は、被験体でサイレンスする必要がある遺伝子を意味し、本明細書では特にヒトガレクチン‐１遺伝子をさす。
【００４９】
「ＲＮＡ干渉」すなわち「ＲＮＡｉ」は、当初植物および蠕虫で観察された現象に適用された用語であり、そこでは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって特異的方式および転写後方式で遺伝子発現が阻止される。ＲＮＡｉによって、インビトロまたはインビボで遺伝子発現を阻害する有用な方法が提供される。
【００５０】
本発明において、「ｄｓＲＮＡ」という表現は、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができる二本鎖ＲＮＡに関係づけられる。本発明によれば、標的遺伝子の、ＲＮＡｉまたはＲＮＡ介在遺伝子サイレンシングを標的とすることができる、任意の好適な二本鎖ＲＮＡフラグメントを使用することができる。本明細書で使用する「二本鎖リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）」は、不対ヌクレオチドの一本鎖突出が存在するにもかかわらず、ＲＮＡ二重鎖を形成する二本鎖を含む任意のＲＮＡ分子、フラグメント、またはセグメントをさす。二本鎖ＲＮＡは、アニールした相補鎖を含み、そのうち一本の鎖は、下方調節すべき標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対応する（すなわち、そのｍＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対する）ヌクレオチド配列を含む。二本鎖ＲＮＡの他方の鎖は、この標的ヌクレオチド配列に相補する。
【００５１】
二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを介在させる能力を有するので、下方調節すべき標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に十分類似しているだけでよい。従って、本発明は、遺伝子変異、系統多型性、または進化の分岐によると推定される配列変動に耐えうるという利点がある。標的配列と、そのｄｓＲＮＡ配列のヌクレオチド配列との間の許容的なヌクレオチドミスマッチ数は、わずか５塩基対中の１対、または１０塩基対中の１対、または２０塩基対中の１対、または５０塩基対中の１対である。
【００５２】
本発明によれば、「ｄｓＲＮＡ」または「二本鎖ＲＮＡ」は、前記発現が干渉を起こすことができるＲＮＡに関する場合はいつでも、アニールして合わされる２つの分離したＲＮＡ鎖（センスおよびアンチセンス）から形成しうる。あるいは、ｄｓＲＮＡは、フォールド・バック・ステム・ループ構造またはヘアピン構造を有してよく、その場合、ｄｓＲＮＡの２本のアニールしている鎖は共有結合している。この実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、部分的に自己相補的な単一のＲＮＡ配列の異なる領域から形成する。
【００５３】
本明細書で使用する「ＲＮＡｉ分子」という用語は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびインビボで切断してｓｉＲＮＡを形成できる他のＲＮＡ分子を含む、二本鎖ＲＮＡ分子をさす総称である。ＲＮＡｉ分子は、標的核酸配列と同一または実質的に同一な長い一配列のｄｓＲＮＡ、あるいは標的核酸配列のほんの一領域に同一または実質的に同一な短い一配列のｄｓＲＮＡを含むことができる。
【００５４】
被験体ＲＮＡｉ分子は、「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」であってよい。ｓｉＲＮＡ分子は通常二本鎖分子として合成され、その際、各鎖は約１９〜３０ヌクレオチド長であり、さらにいっそう好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を召集し、特異的配列と対をなすことによって、その複合体を標的ｍＲＮＡに誘導すると理解されている。その結果、標的ｍＲＮＡは、そのタンパク質複合体中のそのヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、３'ヒドロキシル基を含む。ある実施形態では、長めの二本鎖ＲＮＡを、例えば、その酵素ダイサーの存在下で処理することによって、ｓｉＲＮＡ構築体を産生することができる。
【００５５】
あるいは、ＲＮＡｉ分子は、ヘアピンＲＮＡまたはｓｈＲＮＡとして名付けられたヘアピン構造形をなす。ヘアピンＲＮＡは、外来的に合成し、またはインビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成することができる。好ましくは、所望の遺伝子を確実に連続し安定して抑制するために、そのようなヘアピンＲＮＡを細胞または動物中で設計する。ｓｉＲＮＡは、細胞中でヘアピンＲＮＡを処理することによって産生できることは当技術分野で公知ある。
【００５６】
本発明のＲＮＡｉ分子は、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を低減し、生体利用能を改善し、製剤特性を改善し、かつ／または他の薬剤動態特性を変化させるために、リン酸‐糖の主鎖またはヌクレオシドに修飾を加えてよい。
【００５７】
ある場合には、ＲＮＡｉ分子の少なくとも一鎖は、約１〜約６ヌクレオチド長、例えば、２〜４ヌクレオチド長の３'突出を有する。より好ましくは、３'突出は１〜３ヌクレオチド長である。ある実施形態では、一鎖が３'突出を有し、他方の鎖が平滑末端または同様に突出を有する。突出の長さは、各鎖で同じでも、または異なってよい。ＲＮＡｉ分子の安定性をさらに高めるために、３'突出を分解しないように安定化させることができる。一実施形態では、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなど、プリンヌクレオチドを含めることによってＲＮＡを安定化する。あるいは、修飾した類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２'‐デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３'突出の置換は、耐容性があり、ＲＮＡｉの効率に影響を与えない。
【００５８】
ＲＮＡｉ分子の生成は、化学的合成法または組換え核酸技術によって行うことができる。ＲＮＡｉ分子は、酵素によって、または部分的／総合的有機合成によって生成しうる。インビトロでの酵素合成または有機合成によって、修飾した任意のリボヌクレオチドを導入することができる。
【００５９】
ＲＮＡｉ分子は、当業者に知られている数種の技術を使用し精製することができる。例えば、ＲＮＡｉ分子を精製するためにゲル電気泳動法を使用することができる。あるいは、ＲＮＡｉ分子を精製するために、非変性カラムクロマトグラフィーなど、非変性法を使用することができる。さらに、ＲＮＡｉ分子を精製するために、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心法、抗体を用いるアフィニティ精製を使用することができる。
【００６０】
核酸、ＲＮＡｉ分子および発現構築体
一態様では、本発明は、標的遺伝子、好ましくは腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減させるのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するための核酸配列の使用に関する。
【００６１】
本明細書で使用する「標的遺伝子の発現を低減させる」という用語は、特異的かつ転写後方式で標的遺伝子の発現を阻止する本発明のＲＮＡｉ分子の能力をさす。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子を調製するためのＲＮＡ配列の使用に関する。前記ｓｉＲＮＡ分子は、以下の基準に一つまたは複数、好ましくは全てによって特徴付けられる。
‐  標的ｍＲＮＡと、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましい少なくとも８０％の配列同一性、よりさらに好ましい少なくとも９０％の配列同一性を有する。
‐  標的遺伝子のエクソン領域を標的とする配列を有する。
‐  標的遺伝子の３'末端を標的にするのではなく、標的遺伝子の５'末端を優先的に標的にする。
【００６３】
さらに好ましい実施形態では、このｓｉＲＮＡ分子は、さらに、以下の基準の一つまたは複数によって特徴付けられる。
‐  核酸長が、１５〜２５ヌクレオチド長、好ましくは１８〜２２ヌクレオチド長、好ましくは１９ヌクレオチド長である。
‐  ＧＣ含量率が３０〜５０％で構成される。
‐  その３'末端にＴＴ（Ｔ）配列がある。
‐  二重鎖形態を取ったときも、二次構造を示さない。
‐  Ｔｍ（融解温度）が２０℃未満である。
‐  ヌクレオチド配列中に表１に示すヌクレオチドを有し、その際、ｈはａ、ｃ、ｔ／ｕであってｇではなく、ｄはａ、ｇ、ｔ／ｕであってｃではなく、ｗはａまたはｔ／ｕであってｇまたはｃではない。
【００６４】
【表１】
2008535504.tif 000002
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明は、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するために、以下の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含むＲＮＡ配列の使用に関する。
【表２】
2008535504.tif 000003
【００６６】
本発明の状況では、「フラグメントおよび誘導体」という用語は、５'末端もしくは３'末端、両端、または内部的に、伸展しまたは短縮し、あるいは一端で伸展し他端で短縮するという点で、元の核酸とは異なる可能性のある核酸をさす。ただし、得られたＲＮＡｉ分子の機能、すなわち、標的遺伝子の下方調節は無効になることも、または阻害されることもない。「フラグメントおよび誘導体」という用語はまた、元の配列の一個または複数のヌクレオチドが、当業者が利用できる方法によって、他のヌクレオチドによって置換され、および／または（化学的に）修飾されているという点で、元の核酸とは異なりうる核酸もさす。ただし、得られたＲＮＡｉ分子の機能は無効になることも、または阻害されることもない。典型的には、「フラグメントおよび誘導体」は、元の核酸に対して、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、または少なくとも９９％もの配列同一性を示しうる。２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、前記配列を配列させること、および整列配列中の総位置数に対する、整列配列中で２つの配列が同じ核酸塩基を含む位置数を定量することによって計算できる。
【００６７】
上記配列またはその相補的配列のいずれかは、ＲＮＡｉ分子、すなわち、二本鎖ＲＮＡ分子を調製するために使用しうることは当業者には明らかである。当業者ならば、先に開示した核酸、特にＲＮＡを得る場合のＲＮＡｉ分子の調製法は理解している。手短に言えば、本発明の核酸の相補鎖を任意の利用可能な方法によって合成し、好適な条件下で本発明の核酸にその相補鎖をアニールする。アニーリング条件、例えば、温度およびインキュベーション時間は、それぞれの核酸配列に応じて調節しうる。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明は、ＲＮＡｉ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子を調製するための、配列番号２の配列、そのフラグメントまたは誘導体を含むＲＮＡ配列の使用に関する。好ましくは、配列番号２の配列を使用して得られる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を本明細書ではｓｉＲＮＡ‐１とも表す。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＮＡｉ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子を調製するための、配列番号３の配列、そのフラグメントまたは誘導体を含むＲＮＡ配列の使用に関する。好ましくは、配列番号３の配列を使用して得られる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を本明細書ではｓｉＲＮＡ‐２とも表す。
【００７０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＮＡｉ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子を調製するための、配列番号４の配列、そのフラグメントまたは誘導体を含むＲＮＡ配列の使用に関する。好ましくは、配列番号４の配列を使用して得られる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を本明細書ではｓｉＲＮＡ‐３とも表す。
【００７１】
所望の機能を発揮するために、すなわち、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減させるために、標的細胞、好ましくはヒト癌細胞、例えば、ヒトグリア細胞、または膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞に、先に規定した本発明のリボ核酸から調製した本発明によるＲＮＡｉ分子、特にｓｉＲＮＡ分子を送達する。
【００７２】
動物細胞に（リボ）核酸を導入する数種の公知の方法があり、そのどれも本発明で使用することができ、方法は宿主に依存する。最も簡単には、この核酸は、標的細胞／標的組織に直接注入することができる。他の方法には、レシピエント細胞と、その核酸を含む細菌プロトプラストとの融合；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン脂質のような組成物、またはリポソームの使用；あるいは受容体介在エンドサイトーシス、微粒子銃パーティクルガン（「遺伝子銃」法）、ウイルスベクターによる感染、電気穿孔法などのような方法が含まれる。標的細胞に本明細書で規定したＲＮＡｉ分子を送達するのに適切な他の技術または方法には、ポリ（乳酸‐Ｃｏ‐グリコール酸）ポリマー微小球から本明細書で規定したＲＮＡｉ分子を連続送達する方法（参照、Bennyら、2005）、あるいは外科的切除腔中の生成物を、依然として手術部位に存在する腫瘍細胞に送達する、例えば、神経外科的切除腔中の生成物を、依然として脳実質中に存在する腫瘍細胞に送達するマイクロポンプに、保護した（安定させた）ＲＮＡｉ分子を直接注入する方法が含まれる。これらは他の抗遊走性化合物を使用するために既に詳述した通りである（参照、Lefrancら、2003）。Kawakamiら（2004）が詳述したように、本明細書で規定した安定化させたＲＮＡｉ分子を対流強化送達する方法を使用することもできる。別の可能性は、MeneiおよびBenoit（2003）によって近年論評されたような、移植可能な薬剤放出性生分解性小球体の使用である。様々な上記の送達モードまたは方法の組合せも使用できることは明らかである。
【００７３】
好ましい手法は、本発明のＲＮＡｉ分子を送達するオンマヤ貯留槽（マイクロポンプ）、それに対する生分解性微小球中にカプセル化したＲＮＡｉ分子、または両手法を同時に使用することである。本発明が対象とする、（神経膠腫に加えて）他の５つの癌型、すなわち非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、頭頸部癌、黒色腫および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）にも、マイクロポンプの使用に基づく同様の手法を使用することができる。
【００７４】
ＲＮＡｉ技術によってインビボ遺伝子サイレンシングを実施する際の主たる障害は送達である。熱安定性、ヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善し、ＲＮＡｉツールの細胞取込みを高めるために、様々な手法を試験した。それらには以下のものが含まれる。
‐  ロックされた核酸（ＬＮＡ、Elmenら、2005）、ホスホロチオ酸置換（Harbothら、2003）、２'‐フルオロ置換（Harbothら、2003）、２'‐Ｏ‐メチル置換（Czaudernaら、2003）、安定化させたstealth（登録商標）ＲＮＡｉ（Invitrogen）など、化学的修飾。
‐  様々な型のリポソーム［免疫リポソーム、ＰＥＧ化した（免疫）リポソーム］、カチオン脂質およびポリマー、ナノ粒子、またはデンドリマー、ポリ（乳酸‐Ｃｏ‐グリコール酸）ポリマー微小球、移植可能な薬剤放出性生分解性微小球などによるＲＮＡｉツールのカプセル化（Zhangら、2004；Shiら、2000；Schiffelersら、2004）。
‐  ＲＮＡｉツールと、ヌクレアーゼ阻害剤・アウリント・リカルボン酸のような保護剤との同時注射（Spankuchら、2004）。
【００７５】
好ましくは、場合により安定化し、カプセル化し、またはそうでなければ上記のように修飾した本発明のＲＮＡｉツールは、腫瘍部位、例えば、原発腫瘍および／または転移に送達することができる。局在送達を実現する方法は、他に記載したようなオンマヤ貯留槽の使用である。本発明のＲＮＡｉツールを腫瘍細胞に向かわせる別の方法は、抗体を標的とする細胞型特異的送達の使用である。
【００７６】
例えば、ＲＮＡｉ（例えばｓｉＲＮＡ）は、腫瘍細胞を特異的に認識するＦａｂと複合体を形成し、例えば、Ｆａｂ‐プロタミン‐複合型（Songら、2005）を形成することができ、またはＲＮＡｉを免疫リポソーム中にカプセル化することができる。そのような抗体を標的とするＲＮＡｉツール、例えば、ナノ粒子形ツールを様々な手段によって、例えば全身投与し（静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経口投与、経鼻吸入など）、または例えばオンマヤ貯留槽を使用して局所的に投与することもできる。抗体を標的とする送達は、特に、自然にガレクチン‐１を発現する組織で発生する腫瘍の治療に有用であることが証明されるであろう。この例では、腫瘍細胞を免疫標的化すると、腫瘍周辺の正常組織でガレクチン‐１の発現を減少させることに関わる副作用が最小限に抑えられるはずである。
【００７７】
本発明のＲＮＡｉツールの吸入投与、例えば、鼻内スプレーまたはエアロゾル混合物の形での投与が使用することができ、特に頭頚部癌、例えば、ある種の頭部頚部扁平上皮癌および非小細胞肺癌に有用であろう。
【００７８】
ｓｉＲＮＡのインビボ送達は、例えば、裸状態の、または脂質カプセル化したｓｉＲＮＡ分子の静脈内投与（Schiffelersら、2004；Morrisseyら、2005）、脳室投与（Thakkerら、2004）、もしくは鼻腔内投与（Zhangら、2005）が記載されており、免疫リポソームまたはウイルス粒子中にカプセル化したｓｈＲＮＡベクターの静脈内投与もまた記載されている（Spankuchら、2004；Zhangら、2004）。参照により本明細書に組み込む。
【００７９】
本ＲＮＡｉ分子の効果、すなわち標的遺伝子の発現の減少は、例えば上記のように、細胞に分子を直接施用した場合、ほんの一時的であると考えられる。腫瘍細胞でＲＮＡｉ分子を安定して産生するためには、それぞれの標的ＲＮＡｉ分子をコード化する核酸、好ましくはＤＮＡを発現ベクターに組み込む場合に、それが好都合になりうる。以下に記載したような適切な要素を与えて、所望のＲＮＡｉ分子を形成することが可能な対応する二本鎖ＲＮＡに、そのＤＮＡは転写される。
【００８０】
従って、本発明の別の態様によれば、本発明によるＲＮＡｉ分子をコード化するヌクレオチド配列の、宿主細胞への導入を促進し、および／または発現を促進し、および／または維持を促進する発現構築体を提供する。発現構築体は、おそらく市販されているプラスミド、ウイルス、またはベクター中に挿入することができる。
【００８１】
従って、別の実施形態では、本発明は、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子を調製するためのＤＮＡ配列の使用に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を低減するのに適切なＲＮＡｉ分子を調製するための、配列番号３４〜６６の配列のいずれかを含むＤＮＡ配列、そのフラグメントまたは誘導体の使用に関する。
【表３】
2008535504.tif 000004
［表中、Ｎはａ、ｃ、ｔ、またはｇであり、ｘは４〜１５で構成される］
【００８２】
上に列挙した配列番号３４〜６６の配列は、それぞれ、配列番号１〜３３に示したＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列、リンカー、および前記ＤＮＡに相補する配列を含む。リンカーは、４〜１５ヌクレオチド長であることが好ましく、リンカーは４〜１０ヌクレオチド長であることがより好ましく、最も好ましくは４〜８ヌクレオチド長である。リンカーは、任意の好適なヌクレオチド配列からなりうる。好ましくは、前記列挙した配列は、４〜１５ヌクレオチドリンカーによって分離されたガレクチン‐１遺伝子由来の１９nt配列（大文字のＮについて、Ｎはａ、ｃ、ｔ、またはｇであり、ｘは４〜１５で構成される）、同じ１９nt配列の逆相補鎖由来の１９nt配列から構成され、その３'末端にｔｔ（ｔ）配列を有する。
【００８３】
別の実施形態では、上に列挙したＤＮＡ配列を発現ベクターに、好ましくはｄｓＲＮＡを産生できる発現ベクターに挿入する。
【００８４】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号３４〜６６の配列、好ましくは配列番号３５、３６、または３７の配列、そのフラグメントまたは誘導体のいずれかを含む発現ベクターに関する。
【００８５】
本発明ではまた、ｄｓＲＮＡを生じる２本の相補鎖の発現は、同一または異なる２つのプロモーターによって操作されることが企図される。その場合は、２本の相補鎖を分離するヌクレオチドリンカーは削除される。さらに、その場合、１個または２個の発現ベクターに、２本の相補的ｓｉＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡを乗せてよいことは当業者には明らかである。
【００８６】
本明細書で規定したｄｓＲＮＡを形成する転写産物を生み出すことができる発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター、または組込型ベクターであり得る。従って、本発明はまた、上記ＤＮＡ配列のいずれかを含むベクターにも関する。発現ベクターは、真核生物発現ベクター、またはレトロウイルスベクター、プラスミド、バクテリオファージ、または通常生物工学分野で使用される他の任意のベクターであることが好ましい。そのようなベクターは、当業者には周知である。必要または所望に応じて、真核細胞でｍＲＮＡの合成を目的とした調節要素に、ＤＮＡ核酸を作動的に連結することができる。
【００８７】
本明細書で使用する「調節配列」および「制御配列」という用語は広範な意味で理解され、その配列をライゲートしおよび／または作動可能に連結した配列の発現の、操作および／または調節を行うことが可能な調節核酸配列をさす。真核生物中での発現には、制御配列は一般的にプロモーター、ターミネーター、時にはエンハンサー、および／または、５'ならびに３'非翻訳配列を含むが、イントロンまたは同様の要素を含んでもよく、例えば、ベクターの安定および増幅、宿主ゲノム中へ首尾よく送達し、および／または組み込むための選択を促進しまたは誘発するような要素、例えば、ゲノム中の所望部位で相同組換えを促進する領域などを含んでよい。「制御配列」という用語は、最小限、発現に必要な全成分を含むものとし、また追加の有利な成分を含んでもよい。「制御配列」という用語は、プロモーター、すなわち、細胞、組織、または器官で核酸分子の発現を活性化し、または増進することができる配列を包含する。
【００８８】
ｄｓＲＮＡの発現を操作するために、これらのベクターは、通常、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを含み、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＨ１またはＵ６プロモーターも含む。それは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが、哺乳動物細胞中で比較的多量の短鎖ＲＮＡを発現し、３〜６個のウリジン鎖を組み込んで転写を終了させるからである。ＩＩＩ型プロモーターは、転写される配列の完全に上流にあり、それによってそのＲＮＡｉ分子中にプロモーター配列を含める必要性がなくなる。所望のＲＮＡｉ分子をコード化するＤＮＡが、一つのプロモーターから転写されるのであれば、好ましいＤＮＡは、その鎖のそれぞれに、その標的遺伝子の所望のコード領域およびその逆相補的配列を含むことになる。その場合、そのコード配列およびその逆相補的配列は、ヌクレオチドリンカーによって分離され、得られた転写産物はそれ自体に折り畳まれ、いわゆるステムループ構造を形成し、いわゆるｓｈＲＮＡ分子が形成されるようになる。ｓｈＲＮＡは、特異的プロモーターから転写され、ＤＩＣＥＲＲＮＡｓｅによって処理されて短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になり、ＲＩＳＣに組み込まれ（Dykxhoomら、2003）、続いて標的化したｍＲＮＡを不活化させる。
【００８９】
場合により、発現ベクター中に一個または複数の転写停止配列を組み込むことができる。「転写停止配列」という用語は、転写単位最後の制御配列を包含し、その配列は一次転写産物の３'末端処理とポリアデニル化および転写停止の信号を送る。転写または翻訳エンハンサーなど、追加の調節要素を発現構築体に組み込ことができる。
【００９０】
治療目的では、レトロウイルスベクターの使用が、標的細胞へ所望の核酸を送達するのに最も適していることが証明されている。
【００９１】
本発明のＤＮＡ配列を含むＲＮＡｉ発現ベクターは、上記の送達方法のいずれかによって標的細胞中に導入することができる。
【００９２】
使用、組成物、およびキット
本発明によるＲＮＡｉ分子および／またはベクターは、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬品として、あるいは癌、好ましくは神経膠腫（好ましくは、神経膠芽腫を治療するため）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬品を製造するために使用することができる。
【００９３】
本発明によるＲＮＡｉ分子および／またはベクターはまた、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させるための医薬品として、あるいは癌、好ましくは神経膠腫（好ましくは神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させるための医薬品を製造するために使用することができる。
【００９４】
本明細書で使用する「癌の進行を遅延する」という用語は、癌の再増殖を３０％超、好ましくは５０％超、よりさらに好ましくは７０％超遅延し、かつ／または罹患被験体の生存期間を延長することをいう。
【００９５】
本発明によるＲＮＡｉ分子および／またはベクターは、単独で、あるいは化学療法、放射線療法、免疫療法、および／または遺伝子療法を含む群から選択される癌治療法のいずれかと組み合せて使用することができる。
【００９６】
本明細書で使用する「癌治療法」という用語は、放射線療法、化学療法、免疫療法、遺伝子ベース治療法、およびそれらの組合せを包含することを意味する。「放射線療法」という用語は、照射を使用する癌治療をさす。「化学療法」という用語は、化学物質、いわゆる化学療法剤による癌治療をさす。本明細書で使用する「免疫療法」という用語は、免疫薬剤の使用によって癌細胞が排出されるように免疫系の反応を刺激することをさす。「遺伝子ベース治療法」という用語は、個体に遺伝物質（ＤＮＡまたはおそらくＲＮＡ）を移送することに基づく癌治療をさす。
【００９７】
別の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡｉ分子および／または発現ベクターは、単独で、あるいは癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の治療に適切な一種または複数の活性化合物と組み合せて使用することができる。「活性化合物」という用語は、癌、好ましくは神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の治療に使用される、ＲＮＡｉ分子またはベクター以外の化合物をさす。好ましくは、活性化合物は、放射線療法剤；それだけには限らないが、テモゾロマイド、ビンクリスチン、ビノレルビン、プロカルバジン、カルムスチン、ロムスチン、タキソール、タキソテール、タモキシフェン、レチノイン酸、５‐フルオロウラシル、シクロホスファミド、およびサリドマイドを含む化学療法剤；それだけには限らないが、活性化したＴ細胞やパルスした樹状細胞などの免疫療法剤；ならびに／あるいは本明細書で規定したＲＮＡｉ分子の送達と同時に行う、神経膠腫細胞へのＣＤ３、ＣＤ７、およびＣＤ４５の遺伝子移送が関与し取り組まれる遺伝子ベース治療剤を含む群から選択することができる。
【００９８】
本発明のＲＮＡｉ分子および／または発現ベクターは、単独で、または一種以上の活性化合物と組み合せて投与することができる。後者は、ＲＮＡｉ分子および／または発現ベクターの投与の前に、後に、または同時に投与することができる。本発明によるＲＮＡｉ分子および／または発現ベクター、またはその活性化合物の用量、ならびにインキュベーションの継続時間および温度は様々であり、すなわち、治療しようとする被験体に依存する。
【００９９】
本発明のさらに別の目的は、治療有効量の本明細書で規定したＲＮＡｉ分子および／または発現ベクター、ならびに薬学的に許容される担体、すなわち一種または複数の薬学的に許容される担体物質および／または添加物を含む医薬調製物である。
【０１００】
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医者、または他の臨床医が探し求める、組織、系、動物、またはヒトで生物学的または医学的応答を引き出す、ＲＮＡｉ分子および／または発現ベクター量を意味する。
【０１０１】
従って、別の実施形態では、本発明は、癌、好ましくは神経膠腫（好ましくは神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための、本発明によるＲＮＡｉ分子および／または発現ベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。さらに別の実施形態では、本発明は、癌、好ましくは神経膠腫（好ましくは神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫進行を遅延させるための、本発明によるＲＮＡｉ分子および／または発現ベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【０１０２】
本発明による医薬組成物は、さらに、先に規定した少なくとも一種の活性化合物を含んでよい。
【０１０３】
本発明による医薬組成物は、例えば、丸剤、錠剤、ラッカー被膜錠剤、糖衣錠、顆粒、硬および軟ゼラチンカプセル、水溶液、アルコール溶液、または油性溶液、シロップ、乳濁液、または懸濁液の形で経口投与し、または例えば座薬の形で経直腸的に投与することができる。投与は、注射溶液または注入溶液の形で非経口的に、例えば、皮下、筋肉内、または静脈内に行うこともできる。他の適切な投与形には、例えば、軟膏、チンキ、スプレー、または経皮治療系の形など、経皮または局所投与、あるいは鼻内スプレーまたはエアロゾル混合物の形での吸入投与、あるいは、例えば、マイクロカプセル、インプラント、またはロッドがある。
【０１０４】
本医薬組成物の調製は、自体公知の方法で行うことができる。この目的のために、本核酸および／または本活性化合物は、一種または複数の固体または液体医薬用担体物質および／または添加物（または補助物質）とともに、さらに必要に応じて、治療的または予防的作用を有する他の医薬活性化合物を組み合せて、適切な投与形または剤形にし、次いでこれをヒト医学において調合薬として使用することができる。丸剤、錠剤、糖衣錠、および硬ゼラチンカプセルの製造には、例えば、乳糖、澱粉、例えば、トウモロコシ澱粉もしくは澱粉誘導体、タルク、ステアリン酸、またはその塩などを使用することができる。軟ゼラチンカプセルおよび座薬用担体は、例えば、脂肪、ワックス、半固体および液体ポリオール、天然油もしくは硬化油などである。溶液、例えば、注射液、または乳濁液、またはシロップを調製するのに好適な担体には、例えば、水、生理食塩水、アルコール、例えば、エタノール、グリセロール、ポリオール、ショ糖、転化糖、グルコース、マンニトール、植物油などがある。例えば、注射用または注入用調製物を調製するために、本核酸および／または本活性化合物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を使用することもできる。マイクロカプセル、インプラント、またはロッドに好適な担体には、例えば、グリコール酸と乳酸のコポリマーがある。
【０１０５】
医薬調製物にはまた、添加物、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、分散剤、防腐剤、甘味料、着色料、香味料、芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、溶媒、溶解剤、持効性効果をもたらす薬剤、浸透圧を変化させる塩、コーティング剤、または酸化防止剤を含むことができる。
【０１０６】
好ましくは、本発明の組成物は、シクロベータデキストリンおよび／または同様の化合物を含む、または含まないＧＬＰ／ＧＭＰ溶媒に溶解して投与する。
【０１０７】
投与すべき一種または複数の活性化合物と組み合せて使用する、ＲＮＡｉ分子および／または発現ベクター投薬量または量は、個々の事例に依存し、通常、最適効果を得るために個々の状況に合わせられる。従って、治療しようとする疾患の性質および重症度、また治療しようとするヒトまたは動物の性別、年齢、体重および個々の応答性、使用する化合物の作用の効力および持続時間、療法が急性用もしくは慢性用または予防的なものであるかどうか、あるいは本核酸および／またはＲＮＡｉ分子および／または発現ベクターに加えて他の活性化合物も投与するかどうかに依存する。
【０１０８】
特に好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は注射可能であり非経口投与される。本組成物は、例えば、脳疾患患者に薬剤を投与するのに使用される標準的オンマヤ貯留槽（マイクロポンプ）によって投与することができる。これらのマイクロポンプは、神経膠腫を神経外科的に切除するまで皮下（頚部）に配置される。そのようなマイクロポンプによって、腫瘍細胞に生成物（本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または医薬組成物）を送達できるようになる。送達する化合物、例えば、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または医薬組成物は、数ヶ月間または数年間週１、２回注射するのが好ましい。技術的問題がある場合には、マイクロポンプを取り換えることもできる。
【０１０９】
上記オンマヤ貯留槽（マイクロポンプ）などの貯留槽を使用する送達は、癌型、特に、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、膵臓癌、頭頚部癌、および非小細胞肺癌の細胞の腫瘍に、生成物（本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または医薬組成物）を送達するのにも適用することができる。例えば、静脈内カテーテル付きマイクロポンプによって、生成物（本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または医薬組成物）を単独で、または他の療法、例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法などに加えて、患者に、例えば、患者の血流に送達することができる。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体に同時投与、個別投与、または逐次投与するための、本発明による医薬組成物および本明細書で規定した活性化合物を含むキットを提供する。
【０１１１】
治療法
いかなる理論にも限定されることなく、本発明者らは、ノックダウンし、それによって腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現を著しく減少させるという治療上のメリットを、以下のように調節できることを意図している。
‐  ガレクチン‐１が、癌、特に神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫での細胞遊走特徴および／または転移過程に直接関与すると仮定した場合、癌細胞の遊走レベルを減少し、それによって転移の形成を遅らせ、または隣接する正常組織（例えば、神経膠腫の場合には脳）への癌浸潤の局所領域的過程を遅延させる。
‐  遊走が制限されたこれらの癌細胞で、プロアポトーシス剤に対する感受性を増大させる。なぜなら、（ａ）遊走癌細胞は、アポトーシス耐性であることが多い。（ｂ）遊走が制限される癌細胞は、アポトーシスに感受性になり、それによってプロアポトーシス剤感受性になりうる。（ｃ）上記癌型に対処するために今日使用されるほとんどの薬剤はプロアポトーシス薬である。従って、癌患者の腫瘍細胞でガレクチン‐１をノックダウンすることの直接的な治療上のメリットに加えて（上記参照）、本発明はまた、抗ガレクチン‐１手法とともに化学療法および／または放射線療法の併用を意図している。
‐  免疫系の攻撃から自らを守る腫瘍細胞の能力の減少。腫瘍細胞による分泌されたガレクチン‐１が、癌細胞を破壊するために結合している活性化したＴ細胞で、劇的な細胞死プロセスを誘発するからである。すなわち、癌患者の腫瘍細胞でガレクチン‐１をノックダウンする直接的な治療上のメリットの他に（上記参照）、本発明はまた、抗ガレクチン‐１をノックダウンする手法を加えて、免疫療法（例えば、活性化したＴ細胞を使用）および／または遺伝子療法［ヒト腫瘍細胞へのガレクチン‐１細胞死受容体（ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ４５、ＣＤ９５など）の標的化した形質移入を使用］の併用を意図している。
【０１１２】
例えば、星状膠細胞腫でノックダウンし、それによってガレクチン‐１の発現を有意に減少させる治療上のメリットは以下の通りである。
【０１１３】
ガレクチン‐１は、少なくとも３つの別個のレベルで悪性神経膠腫の遊走特性に関与する。すなわち、
‐  インテグリンα９β１およびＡＤＡＭ１５の発現レベルの調節による星状膠細胞腫接着レベル、
‐  ＲｈｏＡ発現における改変を通じて、アクチン細胞骨格の組織化の修飾による星状膠細胞腫の運動性レベル（Cambyら、2002）、
‐  ＭＭＰ‐２の発現および分泌レベルの改変による星状膠細胞腫浸潤性レベル。
【０１１４】
ヒト神経膠腫細胞でガレクチン‐１の発現をノックダウンすることによって、患者の脳への星状膠細胞腫の浸潤を低減することができ、従って疾患の進行を遅延させ、患者の生存期間を延長することができる。
【０１１５】
さらに、ガレクチン‐１は、神経膠腫細胞の遊走特性を直接活性化し（Cambyら、2001；Roriveら、2001；Rao、2003）、臨床および実験データから、遊走性神経膠腫細胞に関与する細胞内シグナル経路が、それらの細胞に、アポトーシスに対する耐性、すなわち、化学療法により誘発し、放射線療法により誘発したアポトーシスに対する耐性を取得させることが実証されている。星状膠細胞腫の遊走レベルが減少することにより、テモゾロマイドなど、プロアポトーシス剤に対する実験用神経膠腫の感受性が上昇することが実証された（Lefrancら、2005b）。従って、ヒト神経膠腫で星状膠細胞腫の遊走能力を減少させると、脳実質中への星状膠細胞腫の遊走レベル、次いでプロアポトーシス剤に対する星状膠細胞腫の耐性を減少する特徴、次いでテモゾロマイドなど、プロアポトーシス剤に対する腫瘍剤の感受性の上昇を修復する新規な特徴が減少される。従って、神経膠腫患者の星状膠細胞腫でガレクチン‐１をノックダウンする直接的な治療上のメリットに加え（上記参照）、本発明者らは、本発明者らの抗ガレクチン‐１手法と、化学療法（テモゾロマイドまたはＰＣＶ合剤の使用に関連するものとして）および／または放射線療法との併用も主張する。
【０１１６】
さらに、腫瘍細胞によって分泌されたガレクチン‐１は、Ｔ‐リンパ球の細胞死を誘発し、それゆえに腫瘍免疫回避に好都合である強力な免疫調整薬である（Rubinsteinら、2004；Luiら、2005）。従って、神経膠腫細胞によるガレクチン‐１の発現のノックダウンは、そのように腫瘍に対するＴ細胞免疫応答に好都合に、神経膠腫の周囲組織でガレクチン‐１の放出を減少させる。従って、神経膠腫患者の星状膠細胞腫でガレクチン‐１をノックダウンする直接的な治療上のメリットの他に（参照、ポイント１）、本発明者らはまた、ヒト神経膠腫を治療するための本発明者らの抗ガレクチン‐１をノックダウンする手法を加えて、免疫療法（例えば、活性化したＴ細胞を使用）および／または遺伝子療法［ヒト星状膠細胞腫へのガレクチン‐１細胞死受容体（ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ４５、ＣＤ９５など）の標的化した形質移入の使用］との併用も主張する。
【０１１７】
上記の点から、本発明は、被験体の癌、好ましくは神経膠腫（好ましい神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための、該被験体に本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または組成物を投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、該被験体に、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または組成物を投与するステップを含む、被験体の癌、好ましくは神経膠腫（好ましくは神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫の進行を遅延させる方法に関する。本明細書で使用する「被験体」という用語は、好ましくは、ヒトをさすが、例えば、家畜、研究動物、または愛玩動物を標的とする獣医学的適用もまた本発明の範囲内である。
【０１１８】
上記の点から、本発明はさらに、ガレクチン‐１の発現を下方調節する方法を提供し、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または組成物を投与するステップを含む。
【０１１９】
本明細書で使用する「ガレクチン‐１の発現を下方調節する」という用語は、ガレクチン‐１の（転写後）発現を好ましくは５０％超、より好ましくは７０％超、さらにいっそう好ましくは９０％超削減することをいう。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または組成物を投与するステップを含む、腫瘍細胞、好ましくは、神経膠腫（好ましくは神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞の遊走を低減させる方法に関する。
【０１２１】
本明細書で使用する「腫瘍細胞の遊走を減少させる」という用語は、遊走腫瘍細胞数を好ましくは３０％超、より好ましくは５０％超、さらにいっそう好ましくは７０％超削減することをいう。
【０１２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または組成物を投与するステップを含む、アポトーシスに対する、腫瘍細胞、好ましくは神経膠腫（好ましくは神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫細胞の耐性を低減させる方法に関する。
【０１２３】
本明細書で使用する「アポトーシスに対する腫瘍細胞の耐性を低減させる」という用語は、アポトーシスに対して耐性である腫瘍細胞数を好ましくは３０％超、より好ましくは５０％超、さらにいっそう好ましくは７０％超削減することをいう。
【０１２４】
さらに、本発明は、化学療法、放射線療法、免疫療法、および／または遺伝子療法を含む群から選択される、癌、好ましくは神経膠腫（好ましい神経膠芽腫）、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、または非ホジキンリンパ腫を治療するための癌治療法の効力を高める方法であって、本明細書で規定したＲＮＡｉ分子、ベクター、または組成物を投与するステップ、ならびに該癌治療法を同時投与、個別投与、または逐次投与するステップを含む方法を提供する。
【０１２５】
本明細書で使用する「癌治療法の効力を高める」という用語は、従来の癌治療の改善を言い、従来の癌治療中に施用される抗癌組成物の量、例えば、放射線療法の照射量、化学療法における化学療法剤量、免疫療法における免疫療法剤量、または遺伝子ベース治療法におけるベクター量が減少すること、および／あるいは従来の癌の治療中に従来の用量または量で施用したときに、従来の療法および抗癌組成物の効力が増大することが含まれる。
【０１２６】
癌治療法中に施用される照射および化学療法剤の用量の削減にはいくつかの利点がある。照射または化学療法剤など、高価な抗癌組成物の使用の削減は、費用対効果が高いのみならず、施用した組成物の毒性、および患者においてその毒性に関連する副作用を減少させることができる。また、一般に、従来の用量で施用する抗癌組成物の効力の増大によって、従来の癌治療法の継続時間および反復回数を削減でき、それもまた費用対効果が高く、毒性および副作用の問題を減少させる点で患者の観点からも有利である。
【０１２７】
要約すると、本発明は、ヒト癌一般に、特に悪性ヒト神経膠腫、膵癌、頭頚部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、および非ホジキンリンパ腫に対処するための、抗ガレクチン‐１治療的手法の使用に関する。本発明の治療的手法は、ヒト腫瘍細胞でガレクチン‐１の発現をノックダウンすることを目的とする、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）手法、アンチセンス手法、ウイルスベクター手法、または他の任意の関連手法に関連する抗ガレクチン‐１ツールの使用を基礎とする。本発明の手法の技術的実現可能性をさらに、以下の非制限的実施例によって説明する。実施例では以下を実証する。
（Ｉ）  星状膠細胞腫でガレクチン‐１の発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）の使用（実施例１）、
（ＩＩ）  星状膠細胞腫でこれらのｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）を送達するために使用できるベクター型の例（実施例２）、および
（ＩＩＩ）  神経膠腫患者で本発明の抗ガレクチン‐１‐を基にした治療的手法を送達するのに臨床的に適切な、インビボモデルの使用をベースとする治療プロトコル（実施例３）。
【実施例１】
【０１２８】
ガレクチン‐１に対して標的化したｓｉＲＮＡ配列の例
受託番号ＢＣ０２０６７５（図１）、ＢＣ００１６９３（図２）およびＮＭ_００２３０５の配列を含む３配列のヒトガレクチン１（ＧｅｎＢａｎｋ製）を比較した（図３）。長さの違いに加え、ＮＭ_００２３０５は２つ位置で他の２配列と異なる。つまり位置１９にＣが挿入され、位置５２４でＴが欠落している。本発明によるＲＮＡｉ分子を同定するのに、これらの差による結果に違いはない。３３個の「ＡＡ」対をＢＣ０２０６７５（配列番号６７）由来の代表的配列中に見出すことができた。図１の配列中下線で示す。
【０１２９】
これらの配列に基づき、ヒトガレクチン‐１のｓｉＲＮＡ配列を調製するのに適切な３３個の推定ＤＮＡ核酸を同定し、以下、配列番号７０〜１０１として規定した。
【表４】
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【０１３０】
配列番号７１、７２、および７３の配列をさらに試験した。図３には、ヒトガレクチン‐１ｍＲＮＡ（受託番号ＮＭＪＤ０２３０５）上の配列番号７１（下線）、７２（太字）および７３（太字下線）の配列の位置を示す。
【０１３１】
上記配列に基づき、細胞に形質移入するために本実施例で使用した２つのｓｉＲＮＡの配列を図４に示し、ｓｉＲＮＡ‐１およびｓｉＲＮＡ‐３と名付けた。
【０１３２】
３頭の悪性神経膠腫インビトロモデル、すなわちＵ８７、Ｕ３７３、Ｈｓ６８３にこれらの配列を形質移入（リン酸カルシウムＣａＰによる）した後、ウエスタンブロット法および免疫細胞化学的蛍光染色によりガレクチン‐１のタンパク質の発現を確認した。これらの結果を図５に例示する。緑色蛍光は、ガレクチン‐１の特異的免疫細胞化学的発現を表す。これらの結果は、対照、すなわち非形質移入（ＣＴ）、ＣａＰ単独処理（ＣａＰ）、またはスクランブルｓｉＲＮＡ形質移入（Serb）細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ‐１形質移入細胞でガレクチン‐１の発現が９０％削減されたことを示す。劇的ではないが同様のガレクチン‐１の発現の減少をｓｉＲＮＡ‐３形質移入後に同様に観察した。スクランブル対照条件は、ｓｉＲＮＡ‐１の非特異的スクランブル配列である。この配列が任意の既知のヒトｍＲＮＡに対して特異性も持たないことは、ＢＬＡＳＴ配列比較によって確認した。
【実施例２】
【０１３３】
本発明によるｓｈＲＮＡ分子の例
本実施例では、Dr. D. Takaiが記載し公にしたプラスミドベクター（Department of Respiratory Medicine, University of Tokyo, Japan, Matsukuraら, 2003）に抗ガレクチン‐１ｓｈＲＮＡ配列をクローン化した。
【０１３４】
上記のようにｓｉＲＮＡ‐１およびｓｉＲＮＡ‐３配列をベースとするｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築した。クローニングを目的としてｓｈＲＮＡを発現させるために、ｓｉＲＮＡ配列の上流および下流にヌクレオチド配列を加えた。そのような構築体型によって細胞の細胞質で得られた最終産生物は、ｓｉＲＮＡ‐１およびｓｉＲＮＡ‐３配列に類似する。プラスミドベクターに挿入された配列は、プラスミドの配列決定部分によって確認した。
【０１３５】
Ｕ３７３神経膠芽腫モデルに、これらのベクターと、緑色蛍光タンパク質をコード化するＧＦＰレポーターベクターとを同時形質移入した。これらの細胞中のガレクチン‐１の発現は、蛍光免疫細胞化学によって検出した。結果を図６に示す。このプラスミドベクターを組み込んだ細胞（緑色蛍光によって判明）は、対照および隣接する非形質移入細胞と比較して、ガレクチン‐１の発現の著しい減少によって特徴付けられる（赤色蛍光色素によって特異的に判明）。ｓｉＲＮＡ‐１をコード化するベクターの形質移入が最も効率的であった。
【実施例３】
【０１３６】
抗ガレクチン‐１を基にしたＲＮＡｉ分子のインビボ実験的送達
ガレクチン‐１に対するインビボ送達ＲＮＡｉ関連化合物が、悪性神経膠腫患者に有益でありうることを証明するためには、臨床的に適切な実験モデルが必要である。これらのモデルが開発され、従来のマウスもしくはラット、またはヌードマウスもしくはラットの脳に、悪性のラットまたはヒト神経膠腫の同所移植を考える（Lefrancら、2002；Branleら、2002；Lefrancら、2003；Lefrancら、2004）。
【０１３７】
神経膠腫に対する臨床的慣例は、通常、腫瘍塊の外科的切除と、それに続いて非常に悪いこれら腫瘍についての予後に関与する、残りの浸潤細胞および遊走細胞に対処する傾向を有するアジュバント治療法である。神経膠腫の臨床的慣行に可能な限り近づけるために、神経膠腫細胞の同所移植によりマウスまたはラットの脳中に発生させた神経膠腫を外科的に摘除し、アジュバント実験用ＲＮＡｉ治療を行う。治療は、全身的注射により、またはカテーテルを通じ、手術部位にＲＮＡｉ関連化合物を送達するマイクロポンプによって、外科部位に直接施す。診療所でのように、実験的治療は、このように、手術後に残っている浸潤性悪性腫瘍細胞に施す（Lefrancら、2002；Branleら、2002；Lefrancら、2003；Lefrancら、2004）。
【実施例４】
【０１３８】
抗ガレクチン‐１を基にしたＲＮＡｉ分子のインビボ実験送達
実験用神経膠腫を治療するための抗ガレクチン‐１ｓｉＲＮＡ配列番号２（ｓｉＲＮＡ‐１）の代表的インビボ送達を図７に示す。本実施例では、腫瘍バルクから逸出し、脱バルク手術を逃れるような遊走神経膠腫細胞に対処するために、マイクロポンプに包埋し、第３脳室に送達する際に、どのようにしてｓｉＲＮＡをインビボで使用できるかを示す。
【０１３９】
Ｈｓ６８３神経膠腫細胞をヌードマウスの脳に定位的に移植した。移植後５日目に、第３脳室にｓｉＲＮＡを送達するそのカテーテルとともに、ｓｉＲＮＡ含有マイクロポンプを皮下に移植した。移植後１２、１９、および２６日目に、腫瘍へｓｉＲＮＡを定位的に注入した（時系列上のダイヤ）。数頭の動物には、テモダール（テモゾロマイド）静脈内注射（時刻表の矢印、生存曲線には白印）も施した。頭蓋内移植を施し抗ガレクチン‐１ｓｉＲＮＡおよびテモダールの併用投与で治療したマウスは、それらの腫瘍に対して対照よりも有意に長く生存した（Ｔ／Ｃ指数：１８３％）。（ＣＴ、黒丸‐制御；ＣＴ＋Ｔｅｒｎ、白丸、テモダール対照；ＳｂＩ、黒三角、スクランブルｓｉＲＮＡ；ＳｂＩ＋Ｔｅｒｎ、白三角、テモダールとともにスクランブルｓｉＲＮＡ；ＳｉＧａＨ、黒四角、抗ガレクチン‐１  ｓｉＲＮＡ；ＳｉＧａＩＩ＋Ｔｅｍ、白四角、テモダールとともに抗ガレクチン‐１ｓｉＲＮＡ）。
【０１４０】
本発明のｓｉＲＮＡなど、抗ガレクチン‐１  ＲＮＡｉで、癌、特に神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、膵臓癌、頭頚部癌および非小細胞肺癌患者を臨床的に治療するために、同等の手法を施用することができる。すなわち、そのような手法では、例えば、化学療法手順中に患者に、例えば、患者の血流に抗ガレクチン‐１ＲＮＡｉを送達する、静脈内カテーテル付きマイクロポンプを使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ホモサピエンスレクチン、ガラクトシド結合可溶性１（ガレクチン１）の核酸配列、受託番号ＢＣ０２０６７５、５５６bpを示す図である。
【図２】ホモサピエンスレクチン、ガラクトシド結合可溶性１（ガレクチン１）の核酸配列、受託番号ＢＣ００１６９３、５４３bpを示す図である。
【図３】ホモサピエンスレクチン、ガラクトシド結合可溶性１（ガレクチン１）の核酸配列、受託番号ＮＭ_００２３０５、５２６bpを示す図である。３個の推定ｓｉＲＮＡ配列の位置を示す［配列番号７１（下線）、７２（太字）、および７３（太字下線）］。
【図４】２個のｓｉＲＮＡ分子二次構造を示す図である。
【図５−１】本発明によるｓｉＲＮＡ分子を形質移入した細胞をガレクチン‐１のウエスタンブロット（図５Ａ）することによって、タンパク質の発現を示す図である。
【図５−２】本発明によるｓｉＲＮＡ分子を形質移入した細胞をガレクチン‐１の免疫細胞化学的蛍光染色（図５Ｂ）することによって、タンパク質の発現を示す図である。
【図６】本発明によるＲＮＡｉ発現ベクターを形質移入した細胞でのガレクチン‐１の発現を示す図である。容易に見つけられるように同時形質移入細胞を（＊）で表す。赤色蛍光は、ガレクチン‐１の免疫細胞化学的発現を示す。Ｕ６ＴｅｔＯは空ベクターである。４個のｓｈＲＮＡ構築体を試験した。一方のベクターｓｈ１‐２とｓｈ１‐３、および他方のベクターｈ３‐２とｓｈ３‐５は、それぞれ配列番号３５および３７の配列を含むプラスミドであり、それぞれｓｉＲＮＡ‐１およびｓｉＲＮＡ‐３に類似するｓｉＲＮＡ分子を発生させるｓｈＲＮＡ分子の発現を可能にする。
【図７】実験用神経膠腫を治療するための抗ガレクチン‐１ｓｉＲＮＡのインビボ送達を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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