(57)【要約】  本発明は、患者の癌の段階又は重症度を決定する或いは癌患者に行っている治療の効果をモニターする目的で、種々のタイプの癌、特に、肺癌、乳癌、結腸直腸癌及び膀胱癌の治療に有用な化合物を同定及び評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法に関する。その上、本発明は、新規な薬物を開発する目的で、癌治療物質の効力を発見、同定、開発及び評価することにも関し、さらに、タンパク質であるコリンキナーゼαの発現及び／又は活性、並びに／或いはそのような発現の効果を阻害する薬剤にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を同定及び評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ）腫瘍細胞、好ましくは、肺、乳房、結腸、直腸又は膀胱の腫瘍細胞の培養物を、適切な条件下で適切な期間、相互作用するように候補化合物と接触させること、
ｂ）コリンキナーゼα遺伝子又はコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを検出及び定量化すること、及び
ｃ）前記発現レベルを、候補化合物で治療されていない腫瘍細胞の対照培養物の発現レベルと比較すること
を含む方法。
【請求項２】
癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を発見、同定、開発及び評価する方法における、コリンキナーゼα遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はペプチド配列の使用。
【請求項３】
コリンキナーゼαタンパク質の発現及び／又は活性を阻害すること、或いはコリンキナーゼαタンパク質の過剰発現による発癌効果を阻害することを特徴とする薬剤。
【請求項４】
ａ）コリンキナーゼαタンパク質中に存在する１つ又は複数のエピトープに対して特異的な抗体又は抗体の組合せ、好ましくは、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体；抗体の断片又は抗体鎖、
ｂ）コリンキナーゼαタンパク質の過剰発現及び／又は活性による発癌効果を阻害する、小型の有機又は無機の分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス分子、リボザイム、三重らせん分子、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含むが、それらに限定されない、毒素、放射性原子を有する分子又は化学療法剤等の細胞障害性薬剤、並びに
ｃ）コリンキナーゼαタンパク質の発現及び／又は活性による発癌効果を阻害する、コリンキナーゼαタンパク質のアンタゴニスト化合物
によって形成される群から選択される、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための、請求項３及び４に記載の薬剤。
【請求項６】
癌、好ましくは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌又は膀胱癌の治療のための医薬品の調製における、請求項３又は４に記載の薬剤の使用。
【請求項７】
請求項３から５までに記載の治療有効量の１種又はいくつかの薬剤を、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的組成物。
【請求項８】
別の活性成分、好ましくは、コリンキナーゼαタンパク質の機能を阻害しない活性成分を含有することを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
好ましくは膀胱癌の治療のための、請求項３及び４に記載の薬剤。
【請求項１０】
請求項３、４及び９に記載の治療有効量の１種又はいくつかの薬剤を、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的組成物。
【請求項１１】
別の活性成分、好ましくは、コリンキナーゼαタンパク質の機能を阻害しない活性成分を含有することを特徴とする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
乳癌、肺癌又は膀胱癌の患者の生存期間を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、患者から抽出した癌性の組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、前記検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーＲＮＡのレベル、前記タンパク質の濃度及びその酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも１種のパラメータの測定によって評価すること、並びに得られた値を１つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することを含む方法。
【請求項１３】
癌患者に投与した治療の効果をモニターするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、抗腫瘍剤、好ましくは、請求項３から５まで及び９に記載の薬剤、又はそれを含有する、請求項７及び８並びに１０及び１１に記載の薬学的組成物を投与した患者から抽出した組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、前記検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーＲＮＡのレベル、前記タンパク質の濃度及びその酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも１種のパラメータの測定によって評価すること、並びに得られた値を１つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することを特徴とする方法。
【請求項１４】
好ましくは膀胱癌の治療のための化合物の効力を同定及び評価するための、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項１５】
好ましくは膀胱癌の治療のための化合物の効力を発見、同定、開発及び評価する方法における、コリンキナーゼα遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はペプチド配列の請求項２に記載の使用。
【請求項１６】
好ましくは膀胱癌の治療のための医薬品の調製における、請求項３及び４に記載の薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな医薬品を開発する目的で、癌、特に、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療に用いる化合物の効力を同定及び評価するための方法に関するものであり、さらに、コリンキナーゼαタンパク質の発現及び／又は活性、並びに／或いはこの発現の影響を阻害する薬剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
コリンキナーゼ（ＣＫ、ＣＨＫ及びＣｈｏＫとしても知られる）は、ケネディ経路又はホスファチジルコリン（ＰＣ）合成経路の最初の酵素であり、マグネシウム（Ｍｇ２＋）の存在下、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）をリン酸基供与体として使用して、コリンをホスホリルコリン（ＰＣｈｏ）にリン酸化する。様々な発癌遺伝子が仲介する形質転換は、高レベルのコリンキナーゼ活性を誘導し、その産物ＰＣｈｏの細胞内レベルの異常な増加を引き起こす。このことは、ヒトの腫瘍の発生におけるコリンキナーゼの役割を間接的に支持する。しかし、コリンキナーゼの活性化とは関係がなく、腫瘍細胞中の高レベルの本代謝産物を説明できるであろう、別のＰＣｈｏ産生の機構が存在する。
【０００３】
腫瘍及び形質転換した細胞においてコリンキナーゼ酵素の活性が増加する証拠があるものの、活性の増加と腫瘍の形質転換との間に明確な因果関係が確立されていないことから、発癌の過程との関係が十分に実証されているわけではない。一方、この効果の原因である分子は、まだ同定されていない。
【０００４】
ヒト並びにその他の哺乳類及びげっ歯類（ラット、マウス、ウシ、モルモット、ウサギ、サル）の両方で、コリンキナーゼに相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）な一次構造を有するポリペプチドをコードする約２００種の遺伝子配列が同定されており、コリンキナーゼαａ、コリンキナーゼαｂ、コリンキナーゼα３、コリンキナーゼβ１、コリンキナーゼβ２、コリンキナーゼＣＫＢ−１コリン／エタノールアミンキナーゼ、コリンキナーゼ様エタノールアミンキナーゼ、Ｃｏｔｓ、Ｄｕｆｆ２２７、Ｃｏｇ３１７３、ＣＰＴ１Ｂ、ＳＦ１、ＳＨＯＸ２、ＦＨＯＤ２、ＦＬＪ１２２４２、ＫＲＴ５、ＦＢＬ、ＡＲＬ６ＩＰ４等と命名されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ＃２１９５４１を参照）。実のところ、１９８２年以来、ラット、マウス及びヒトから単離した異なる組織中に、コリンキナーゼ活性を有するが、異なる物理化学的性質を示す、少なくとも３種のアイソザイムがあるという生化学的な証拠が存在している。
【０００５】
最近になって、実証されたコリンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする少なくとも３種の遺伝子がヒトゲノム中で同定されており、ｃｋ−α、ｃｋ−β及びＨＣＥＫＶ（米国特許第２００３１８６２４１号）と命名されている。さらに、ｃｋ遺伝子がコードするタンパク質に３０〜６５％相同であるタンパク質をコードするいくつかの遺伝子も同定されている。それらの例として、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）に記載されている遺伝子ＣＡＩ１６６０２、ＣＨＫＬ、ＣＡＩ１６６００、ＣＡＩ１６５９９、ＣＡＨ５６３７１、ＣＡＩ１６６０３、ＢＡＡ９１７９３、ＣＡＩ１６５９８等、及び（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｕｍｔａｂ？ｔｏｏｌ＝ａｓｄｂｌａｓｔ＆ｊｏｂｉｄ＝ｂｌａｓｔ−２００５０４１２−１８０７２１２７）に記載されている遺伝子ＣＰＴ１Ｂ、ＥＫＩ２、ＳＦ１、ＳＨＯＸ２、ＦＨＯＤ２、ＦＬＪ１２２４２、ＫＲＴ５、ＦＢＬ、ＡＲＩ６１ｐ＄、ＴＯＭＭ４０、ＭＬＬ等があげられる。異なるコリンキナーゼのアイソザイムに非常に関連のある特徴は、コリン基質又はＡＴＰリン酸供与体に対する親和性の点で、さらに、活性型（これらは二量体として提示される場合もあれば、四量体として提示される場合もある）の点でさえも重要な差異を伴う異なる生化学的性質を有することである。したがって、同定された異なるコリンキナーゼアイソザイムのいずれかとヒトの腫瘍における過剰発現に起因する腫瘍化能力との間に直接的な関係があるか否かを規定することが必要である。
【０００６】
一方、コリンキナーゼの阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてヌードマウスへ外挿された発癌遺伝子によって形質転換された細胞において、効果的に腫瘍に対抗する新たな戦術であることが実証されている。最近になって、いくつかのヒトの乳癌におけるコリンキナーゼ活性の増加が発表されており、コリンキナーゼの変化は、肺、結腸直腸、前立腺の腫瘍等、いくつかのヒトの腫瘍における頻繁な現象であることが見出されている。
【０００７】
一部のパラメータとその他のパラメータとの間の相関関係にもかかわらず、現在のところ、ヒト細胞においてコリンキナーゼの過剰発現に発癌活性及び腫瘍活性があるということを明確に確立する証拠は存在しない。ヘミコリニウム−３［Ｃｕａｄｒａｄｏ  Ａ．，Ｃａｒｎｅｒｏ  Ａ．，Ｄｏｌｆｉ  Ｆ．，Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｂ．及びＬａｃａｌ  Ｊ．Ｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８，２９５９−２９６８（１９９３）；Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｂ．，ｄｅｌ  Ｐｅｓｏ  Ｌ．，Ｍｏｎｔａｎｅｒ  Ｓ．，Ｅｓｔｅｖｅ  Ｐ．及びＬａｃａｌ  Ｊ．Ｃ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，１４１−１４９（１９９５）；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ，Ｒ．，Ｓａｎｉｇｅｒ，Ｌ．，Ｃａｍｐｏｓ，Ｊ．，Ｎｕｎｅｚ，Ｍ．Ｃ．，Ｋｈａｌｅｓｓ，Ｆ．，Ｇａｌｌｏ，Ｍ．Ａ．，Ｅｓｐｉｎｏｓａ，Ａ，Ｌａｃａｌ，Ｊ．Ｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１５，２２８９−２３０１（１９９７）］、又はスペイン特許出願第ＥＳ２００５０３２６３号の低毒性のメチレンキノン等のコリンキナーゼ活性阻害剤が、抗腫瘍活性を提示することを示す証拠がある。しかし、上記の文献にも、それ以外の従来技術にも、実証されたコリンキナーゼ活性（ｃｋ−α、ｃｋ−β、ＨＣＥＫＶ等）を有する、ヒトの組織中で同定された種々のアイソザイムが、検出された酵素活性の原因であろうという決定的な証拠もなければ、抗腫瘍活性が認められている阻害剤による阻害に対してアイソザイムのうちのどれが感受性であるかも示されていない。癌における治療標的としてのそれの有望な使用を確立できるようにするためには、このような同定が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主要な目的は、癌、特に、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を発見し、同定し、且つ評価するためのｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法である。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を発見し、同定し、開発し、且つ評価するための方法における、コリンキナーゼα遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はペプチド配列の使用に基づく。
【００１０】
本発明の別の目的は、癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のために、コリンキナーゼαタンパク質の発現及び／又は活性を阻害することを特徴とする薬剤を提供することからなる。
【００１１】
本発明の別の目的は、癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための、１種又はいくつかの治療薬を、薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的組成物である。
【００１２】
また、癌患者に投与された治療の効果をモニターするためのｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法も本発明の目的であり、これは、抗腫瘍剤、好ましくは、請求項３から５に記載の薬剤を投与した患者から抽出した組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、当該検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーＲＮＡのレベル、当該タンパク質の濃度及びその酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも１種のパラメータを測定し、得られた値を１つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することによって評価することを特徴とする。
【００１３】
最後に、本発明の別の目的は、本発明を実行するための診断用キットからなる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本特許出願の理解を助けるために、いくつかの用語及び表現の意味を、本発明の文脈に沿って、以下に定義するものとする。
【００１５】
「対象」又は「個体」という用語は、哺乳動物の種の一員を指し、家畜、霊長類及びヒトを含むが、これらに限定されない。対象は、好ましくは、男性又は女性のヒトであり、年齢及び人種は問わない。
【００１６】
「癌（ｃａｎｃｅｒ）」という用語は、隣接する組織に侵入及び遠隔の臓器に拡散することができる異常な又は無制限の細胞の増殖を特徴とする疾患を指す。
【００１７】
「癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」という用語は、異常な又は無制限の細胞の増殖の結果生じる組織を指す。
【００１８】
「乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ又はｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」という用語は、悪性で増殖性の乳腺細胞の障害を指す。
【００１９】
「結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ又はｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」という用語は、悪性で増殖性の結腸細胞の障害を指す。
【００２０】
「直腸癌（ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ又はｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」という用語は、悪性で増殖性の直腸細胞の障害を指す。
【００２１】
「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」という用語は、良性（非癌性）又は悪性（癌性）の腫瘍形成過程の結果生じる異常な組織の腫瘤のいずれかを指す。
【００２２】
「遺伝子」という用語は、タンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチドの分子鎖を指す。
【００２３】
「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸を指す。ＤＮＡ配列は、デオキシリボヌクレオチド配列である。
【００２４】
「ｃＤＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を指す。
【００２５】
「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸を指す。ＲＮＡ配列は、リボヌクレオチド配列である。
【００２６】
「ｍＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーリボ核酸を指し、これは、タンパク質を翻訳する全ＲＮＡの一部分である。
【００２７】
「から転写されたｍＲＮＡ」という用語は、遺伝子が発現し、タンパク質に翻訳されるための第１のステップとしての遺伝子（ＤＮＡ）のｍＲＮＡへの転写を指す。
【００２８】
「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ又はｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）配列とデオキシリボヌクレオチド（ＲＮＡ）配列とを区別せずにそれらのどちらかを指す。
【００２９】
「タンパク質」という用語は、アミノ酸の分子鎖を指し、これらのアミノ酸は、共有結合又は非共有結合によって結びついている。この用語には、全ての形の翻訳後の修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化又はアセチル化が含まれる。
【００３０】
「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、タンパク質の断片を意味するアミノ酸の分子鎖を指す。「タンパク質」という用語と「ペプチド」という用語とは、区別なく使用される。
【００３１】
「抗体」という用語は、標的分子に対して特異的な結合活性を示す糖タンパク質を指し、この標的分子は、「抗原」と呼ばれる。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体或いはそれらの完全な抗体又は抗体の断片のいずれかを含む。さらに、この用語は、ヒト抗体、ヒト化抗体及びヒト以外の源の抗体を含む。「モノクローナル抗体」は、単一の抗原の部位、即ち「決定基」に対して作られる、高度に特異的な抗体の均一な集団である。「ポリクローナル抗体」は、異なる抗原決定基に対して作られる抗体の不均質な集団を含む。
【００３２】
「エピトープ」という用語は、本発明で使用する場合には、タンパク質の抗原決定基を指し、これは、特異的な抗体が認識する、タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３３】
「治療標的」という用語は、それに対して薬物又は治療的化合物を設計し、臨床的に適用することができるヌクレオチド配列又はペプチド配列を指す。
【００３４】
「アンタゴニスト」という用語は、それが拮抗する分子の生物学的活性を阻害する分子を指す。アンタゴニスト分子の例として、とりわけ、タンパク質、ペプチド、天然のペプチド配列の変異体及び（５００ダルトン未満の分子量を有する）小型の有機分子があげられる。
【００３５】
本発明で使用する「正常値」という用語は、健常な個体に存在する体内の特定のタンパク質、ｍＲＮＡ又はその他の代謝産物のレベルを指す。
【００３６】
本発明で使用する正常な組織という用語は、非癌性の組織を指し、市販の細胞培養を含む。
【００３７】
本発明は、腫瘍の過程、特に、肺癌、乳癌及び結腸直腸癌において、コリンキナーゼαタンパク質の発現が増加するという発見、並びに当該タンパク質の過剰発現が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍を誘導し、したがって、本酵素の発現及び／又は活性の阻害は、癌、特に、肺癌、乳癌及び結腸直腸癌を治療するための優れた方法となるという驚くべき発見に基づいている。したがって、コリンキナーゼαは、ヒトの腫瘍形成における非常に有望な治療標的となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
この意味で、本発明は、第１に、個体において癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の存在を検出するための、個体において当該癌の段階又は重症度を判定するための、或いは当該癌を有する個体に投与した治療の効果をモニターするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ）当該個体の検体中の、コリンキナーゼαタンパク質、コリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡ、又は対応するｃＤＮＡを検出及び／又は定量化すること、及び
ｂ）個体の検体中に検出された、コリンキナーゼαタンパク質の量、コリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡの量、又は対応するｃＤＮＡの量を、対照の個体の検体中又は同一の個体の以前の検体中に検出されたコリンキナーゼαタンパク質の量、コリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡの量、又は対応するｃＤＮＡの量と、或いは正常基準値と比較すること
を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明が提供する方法は、高い感受性及び高い特異性を有し、癌、好ましくは、肺癌、乳癌及び結腸直腸癌と診断された対象又は個体に基づき、このような対象又は個体では、コリンキナーゼα遺伝子の転写されたｍＲＮＡのレベル、又はコリンキナーゼα遺伝子がコードするタンパク質（コリンキナーゼαタンパク質）の濃度が、これらの癌腫の病歴を有しない対象からの検体中の対応するレベルと比較して高い。しかし、コリンキナーゼβ遺伝子のヒトにおける発現は、癌のこれまでに言及したタイプのうちのいずれとも相関しない。
【００４０】
本方法は、個体から検体を得るためのステップを含む。異なる体液の検体を扱うことができ、それらの例として、尿、血液、血漿、血清、胸水、腹水、関節液、胆汁、胃液、脳脊髄液、糞便、唾液、気管支鏡検体液等があげられる。検体は、いずれかの従来の方法、好ましくは、外科的切除によって得ることができる。
【００４１】
検体は、特定のタイプの癌とこれまでに診断された対象、又は診断されていない対象から得ることができ、或いは癌、特に、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌に対して治療を受けている対象、又はこれまでに治療されたことがある対象から得ることもできる。
【００４２】
さらに、本方法は、検体からタンパク質の抽出液又は全ＲＮＡ抽出液のいずれかを得るのために、検体抽出のステップを含む。これらの２種の抽出液のうちの１種は、次の相で扱う材料を意味する。全タンパク質又は全ＲＮＡを抽出するためのプロトコールは、当業者には周知である（Ｃｈｏｒｎｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，１６２：１５６；Ｃｈｏｒｎｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９３，１５：５３２；Ｍｏｌｉｎａ，Ｍ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９，５９：４３５６−４３６２）。
【００４３】
分析しようとする個体及び対照の個体から採取した検体中のコリンキナーゼα遺伝子の転写されたｍＲＮＡのレベル又はその相補的なｃＤＮＡ、コリンキナーゼαタンパク質の濃度をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて測定するものであれば、いずれの従来のアッセイも癌を検出するための本発明の枠組みにおいて使用することができる。
【００４４】
したがって、本発明は、コリンキナーゼαタンパク質の濃度の測定値又はコリンキナーゼα遺伝子の発現レベルの測定値のいずれかに基づいて、癌、特に、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の存在を検出するための、個体において当該癌の段階又は重症度を判定するための、或いは当該癌を有する個体に投与した治療の効果をモニターするための方法を提供する。
【００４５】
コリンキナーゼαタンパク質を検出しようとする場合には、本発明の方法は、検体からのタンパク質の抽出液を、コリンキナーゼαタンパク質の１つ又は複数のエピトープに対する１つ又は複数の特異的な抗体の組成物と接触させるための第１のステップと、抗体及びコリンキナーゼαタンパク質が形成する複合体を定量化するための第２のステップとを含む。
【００４６】
特異的な抗原−抗体複合体の形成を検出及び定量化するために、多種多様な免疫学的測定法が利用可能である。多数の競合的及び非競合的なタンパク質結合アッセイがこれまでに記載されており、これらの多くが市販されている。
【００４７】
したがって、コリンキナーゼαタンパク質を、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの完全な抗体又は抗体の断片のいずれか、「組合せ体（ｃｏｍｂｉ−ｂｏｄｙ）」、及びコリンキナーゼαタンパク質に対して特異的な抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ断片等の抗体を用いて定量化することができる。これらの抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体及びヒト以外の源の抗体である。これらのアッセイで使用する抗体は、標識してもよいし、標識しなくてもよい。非標識の抗体は、凝集アッセイで使用することができ、標識した抗体は、多種多様なアッセイで使用することができる。抗体を標識するために使用することができる標識分子として、放射性ヌクレオチド、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素の基質又は補助因子、酵素阻害剤、粒子、染料及び誘導体があげられる。
【００４８】
非標識の抗体（一次抗体）及び標識した抗体（二次抗体）を使用する、本発明で使用することができる多種多様な周知のアッセイがある。これらの手法として、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）、競合的ＥＩＡ（競合的酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ法（二重抗体サンドイッチエライザ法）、免疫細胞化学的及び免疫組織化学的な手法、タンパク質のバイオチップ又は特異的抗体を含むマイクロアレイの使用に基づく手法、或いは尿試験紙等の型式でのコロイドの沈殿に基づくアッセイがあげられる。ＥＦＮＢ２タンパク質又はＥＤＮＲＡタンパク質を検出及び定量化するその他の方法として、親和性クロマトグラフィーの手法、リガンド結合アッセイ又はレクチン結合アッセイがあげられる。
【００４９】
本発明の方法における好ましい免疫測定法は、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法（ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ）である。コリンキナーゼαタンパク質の１つ又は複数のエピトープに対して特異的な、いずれかの抗体又は抗体の組合せを、本免疫測定法で使用することができる。本測定法の多くの可能な型式のうちの１つの例では、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又はこの抗体の断片又は抗体の組合せで固相をコートし、これを分析しようとする検体と接触させ、抗原−抗体複合体を形成するために適切な期間にわたり、適切な条件でインキュベートする。非特異的な複合体を除去するための適切な条件で洗浄した後、シグナルを発生する化合物に結合した、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又はこの抗体の断片又はこれらの抗体の組合せを含む指示薬を、抗原−抗体複合体と共に、適切な条件下で、適切な期間にわたりインキュベートする。分析しようとする検体中のコリンキナーゼαタンパク質の存在を、それが存在する場合には、発生したシグナルを測定することによって検出及び定量化する。分析しようとする検体中に存在するコリンキナーゼαタンパク質の量は、そのようなシグナルに比例する。
【００５０】
コリンキナーゼα遺伝子がコードするタンパク質ではなく、コリンキナーゼα遺伝子に対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出しようとする場合には、癌腫をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて検出するための本発明の方法は、種々のステップを有する。即ち、検体を得、全ＲＮＡを抽出した後、本発明の方法におけるコリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡ又は対応するｃＤＮＡの検出は、全ＲＮＡ抽出液中に存在する当該ｍＲＮＡ、又は当該ｍＲＮＡの逆転写によって合成した対応するｃＤＮＡを増幅する第１のステップと、コリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの増幅産物を定量化する第２のステップとを含む。
【００５１】
ｍＲＮＡを増幅する例は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）、及びそれに続くポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）からなる。ＰＣＲは、ヌクレオチド配列の混合物中に含有する特定のヌクレオチド配列（標的）を増幅する手法である。ＲＣＲでは、標的ヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの対を過剰量で使用する。次いで、ポリメラーゼ活性を有する酵素（ＤＮＡ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）が、標的ヌクレオチド配列を鋳型として使用して各プライマーを伸長する。次いで、伸長産物を、元の標的鎖を解離して、標的配列に変換する。新しいプライマー分子がハイブリダイズし、ポリメラーゼがそれらを伸長する。サイクルを繰り返して、標的配列の数を指数関数的に増加させる。本手法は、米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号に記載されている。ＰＣＲ増幅産物を検出及び定量化するための多くの方法が、これまでに記載されており、それらのいずれかを本発明で使用することができる。本発明の好ましい方法では、増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって検出する。
【００５２】
別の例では、ｍＲＮＡの検出を、例えば、ノーザンブロット法等の泳動法によって、ｍＲＮＡをナイロン製のメンブレンに移動させ、それをコリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡ又は対応するｃＤＮＡの特異的なプローブを用いて検出することによって行う。
【００５３】
特定の実施形態では、コリンキナーゼα遺伝子に対応するｍＲＮＡの増幅及び定量化を、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって、同時に行う。
【００５４】
個体からの検体中の問題の癌腫をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて検出するための本発明の方法の最後のステップは、個体からの検体のコリンキナーゼαタンパク質の量、コリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡの量、又は対応するｃＤＮＡの量を、対象の検体中又は同一の個体の以前の検体中に検出されたコリンキナーゼαタンパク質の量、コリンキナーゼα遺伝子のｍＲＮＡの量、又は対応するｃＤＮＡの量と、或いは正常基準値と比較することを含む。
【００５５】
第２の目的では、本発明は、また、癌、好ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を同定及び評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ）腫瘍細胞、好ましくは、肺、乳房、結腸又は直腸の腫瘍細胞の培養物を、適切な条件下で適切な期間、相互作用するように候補化合物と接触させること、
ｂ）コリンキナーゼα遺伝子又はコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを検出及び定量化すること、及び
ｃ）当該発現レベルを、候補化合物を用いて治療されていない腫瘍細胞の対照培養物の発現レベルと比較すること
を含む方法も提供する。
【００５６】
コリンキナーゼα遺伝子又はコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルの定量化は、個体中の肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の存在をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて検出するための本発明の方法で示した定量化と同様にして行う。
【００５７】
薬剤が、コリンキナーゼα遺伝子の発現レベルを低下させる、又は当該遺伝子の高い発現の効果を逆にする、好ましくは、細胞増殖のレベルを低下させる場合、本薬剤は、癌治療の候補となる。
【００５８】
したがって、本発明の別の目的は、癌、特に、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の治療のための化合物の有効性を発見、同定、開発及び評価する方法における、コリンキナーゼα遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はペプチド配列の使用に関する。有望な薬物分子の治療標的への競合的又は非競合的な結合に基づく薬物スクリーニングの方法によって最近もたらされている重要性を指摘しなければならない。
【００５９】
本発明のさらに別の目的は、癌、特に、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の存在を検出するための、個体において当該癌の段階又は重症度を判定するための、或いはこれらの癌のうちのいずれかを有する個体に投与した治療の効果をモニターするためのコリンキナーゼα遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はペプチド配列の使用に関する。
【００６０】
本発明の別の目的は、コリンキナーゼαタンパク質の発現及び／又は活性を阻害することを特徴とする薬剤を提供することからなる。これらの薬剤（本発明によって同定及び評価することができる）は、
ａ）コリンキナーゼαタンパク質中に存在する１つ又は複数のエピトープに対して特異的である、抗体又は抗体の組合せ、好ましくは、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体（抗体の断片、一本鎖抗体又は抗イディオタイプ抗体であることもできる）、
ｂ）コリンキナーゼαタンパク質の発現及び／又は活性を阻害する、小型の有機又は無機の分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、三重らせん分子等を含むが、それらに限定されない、毒素、放射性原子を有する分子又は化学療法剤等の細胞障害性薬剤、並びに
ｃ）コリンキナーゼαタンパク質の１つ又は複数の機能を阻害する、コリンキナーゼαタンパク質のアンタゴニスト化合物
によって形成される群から選ぶことができる。
【００６１】
また、治療有効量の１種又はいくつかのこれまでに言及した薬剤を、１種又は複数の賦形剤及び／又は担体物質と共に含む薬学的組成物も、本発明の目的をなす。さらに、当該組成物は、コリンキナーゼαタンパク質の機能を阻害しない、その他の活性成分を含むこともできる。
【００６２】
賦形剤、担体物質及び補助的な物質は、処方又は製剤のその他の化合物と組み合わせることができ、治療する生物体に対していずれの有害作用も示さないように、それらは、薬学的及び薬理学的に容認できなければならない。薬学的な組成物又は処方として、経口投与又は（皮下、皮内、筋肉内及び静脈内を含む）非経口投与に適するものがあげられるが、最良の投与経路は、患者の状態によって異なる。処方は、単位用量の形態であることができる。処方は、薬学の分野で既知の方法によって調製する。投与する活性物質の量は、治療の詳細によって異なることができる。
【００６３】
本出願のさらなる態様は、本発明を実行するための診断用キットからなる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、適切な容器に、コリンキナーゼαタンパク質を特に認識する抗体と、担体とを含むキットを含む。別の特定の実施形態では、本キットを、個体において癌、望ましくは、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌の存在を検出するために、個体において当該癌の段階又は重症度を判定するために、或いは当該癌を有する個体に投与した治療の効果をモニターするために使用する。
【００６４】
本発明の最後の態様は、乳癌、肺癌又は膀胱癌の患者の生存期間を診断するためのｉｎ  ｖｉｒｔｏにおける方法であって、患者から抽出した癌性の組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、当該検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーＲＮＡのレベル、当該タンパク質の濃度及び当該タンパク質の酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも１種のパラメータを測定し、得られた値を１つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することによって評価することを含む方法からなる。
【００６５】
以下の実施例によって、本発明を説明する。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
アイソフォームのコリンキナーゼ活性
図１に示すように、酵素ＣＫα２（５２ｋＤａ、アミノ酸４５７個）及びＣＫβ１（４５ｋＤａ、アミノ酸３９５個）は共に、ＡＴＰ及びマグネシウムの存在下でコリンからホスホリルコリンを産生するそれらの能力によって決定すると、強力なコリンキナーゼ活性を有する（図１Ａ）。この活性は、両方の組換え体、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中にも、ヒトＨＥＫ２９３細胞内への形質移入後にも、発現しているのが認められる。しかし、両方の酵素はコリンキナーゼ活性を有するという事実にも関わらず、生存している細胞のホスホリルコリンの細胞内レベルは、同等には変化せず、コリンキナーゼβを過剰発現している細胞内では、実質的に検出不可能である（図１Ｂ）。これらの結果は、これらの２種のタンパク質の生理学的な調節及び生物学的な機能、したがって、腫瘍形成におけるこれらの挙動には、差がある可能性があることを示唆している。
【００６７】
（実施例２）
抗体の特異性
コリンキナーゼα酵素、半精製され、産生段階では抗原として、過程の残りの段階では産生の対照として発現させたタンパク質、を認識するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が開発されている。コリンキナーゼαに対して開発されているにもかかわらず、両方の酵素（ＣＫα及びＣＫβ）は、それらの配列を通して全体で６５％の相同性を有し、コリン結合ドメイン及び触媒活性ドメイン等の一部の保存領域では相同性が７５％に達するという事実から、どのアイソザイムが、産生されたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を認識することができるかを調べることが必要である。我々は、使用したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方が、コリンキナーゼαに対して特異的であり、これらは、コリンキナーゼβを認識しないことを確認している。このために、コリンキナーゼαタンパク質及びコリンキナーゼβタンパク質を、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で過剰発現させ、これらの２種のタンパク質が存在し、活性であることを調べた（図２Ａ）後、それらを、これを用いて過去に研究されたポリクローナル抗体［Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ，Ａ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｒ．，Ｒａｍｏｓ，Ｍ．Ａ．，Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｉｌｖａ，Ｊ．，Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｏｎｉｌｌａ，Ｆ．，Ｌａｃａｌ，Ｊ．Ｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，４３１７−４３２２（２００２）；Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ，Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ａ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｉｎｅｒｏ，Ｌ．，Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｏｎｉｌｌａ，Ｆ．，Ｒｏｓｅｌｌ，Ｒ．，Ｌａｃａｌ，Ｊ．Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９６，５８０−５８３（２００２）］、及びコリンキナーゼαに対して産生させた新たなモノクローナル抗体の両方を用いて、免疫検出の手法（ウエスタンブロット）によって分析した。図２Ｂに示すように、これは、これらの抗体のうちの２種を用いた例を示すが、活性が８０倍増加する条件でのコリンキナーゼβの過剰発現によってさえも、これらの抗体のうちで、このアイソフォームを認識するものはないが、コリンキナーゼαは、全ての場合において同一の条件及び内在性の対照のレベルの両方において高度に認識されている。これらの結果は、このポリクローナル抗体を使用したこのグループの過去の研究は、コリンキナーゼαを、ヒト腫瘍に由来する細胞系内及び分析した腫瘍自体の中で過剰発現したアイソザイムとして定義していることを示している。
【００６８】
定義によればポリクローナル抗体は分子内の異なるエピトープを認識すること、さらに、コリンキナーゼαの配列とコリンキナーゼβの配列とは６５％相同であり、一部の領域、特に、触媒領域及び基質領域並びにＡＴＰ結合領域が位置するコンセンサスドメイン領域では７５％に達することを考慮すると、これらの結果は予想外である。
【００６９】
（実施例３）
腫瘍に対する特異性：異なるヒト腫瘍中でのコリンキナーゼαの変化。
コリンキナーゼαに対する特異性が証明されている抗体が入手可能であることから、乳癌、結腸癌及び肺癌等の先進国で今日最も重要な腫瘍のうちのいくつかにおけるコリンキナーゼαの発現の可能な変化を研究ができるようになった。本研究を行うために、各患者がこれらのタイプの癌のうちの１種を有する３８から５０人の異なる患者からの検体のパラフィン切片を作製し、コリンキナーゼαの発現を免疫組織化学（ＩＨＱ）、細胞及び組織の不可欠な部分である生体分子成分を「ｉｎ  ｓｉｔｕ（生体内原位置）」において検出及び同定することを可能にし、且つどこの病院の病理解剖部でも自動化して行うことができる手法によって分析している。これらの患者の乳房、結腸又は肺の検体から、
＊いずれの症例も、コリンキナーゼαを認識する抗体を用いた腫瘍の染色は、高度に特異的であり、腫瘍組織と正常な隣接する組織とを明確に区別することができ；
＊正常な組織が染色された症例は１つもなく；
＊コリンキナーゼα酵素は、このタイプの腫瘍では６２から１００％の間の範囲の発生率で過剰発現し、ヒトの腫瘍形成においては、本アイソフォーム、コリンキナーゼα、が深く関係することを実証していること
が見出された。
【００７０】
図３に、今日肺癌症例の８０％を占める肺大細胞癌（ＮＳＣＬＣ）について得られた結果の例を認めることができる。認められるように、腫瘍節に対して特異的なコリンキナーゼαの細胞質の染色が、これまで示してきたように、６２％の検体を特異的に染色している。
【００７１】
この概念にしたがって、３８人の乳癌患者について同様の研究を行ったところ、ここでも、腫瘍組織に特異的なコリンキナーゼαの過剰発現が症例の９７％に観察された（図４）。
【００７２】
最後に、また、結腸癌においても、コリンキナーゼαの発現の研究を行った。この目的ために、４年超の観察経過を有する結腸癌の異なる患者からの４０検体のパラフィン切片を作製した。ｉｎ  ｓｉｔｕにおいてＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ期の癌腫を用いて、分析を開始した。前回と同様に、各標本の腫瘍組織に隣接する正常組織を、正常組織として使用した。４０検体のいずれの症例においても、正常組織が陽性に染色されることはなく、腫瘍組織におけるコリンキナーゼα染色の高い特異性を確認した。これらの腫瘍組織では、ここでも、全症例において、本酵素の過剰発現を観察した（図５Ａ）。これらの結果は、結腸癌において本酵素のこのアイソフォームが深く関係することを支持している。さらに、本結果は、新生物発生前の病変、異なる程度の形成異常を有するＡＣＦ及びポリープ、の分析に至り、本分析の結果は、コリンキナーゼαの過剰発現は、形成異常の際に生じる結腸組織の腫瘍の過程における早期の現象であることを明らかに示している。このことは、コリンキナーゼαが、これらの腫瘍では、「ゲートキーパー」遺伝子として挙動している可能性があり、したがって、有望な新たな治療標的として適することを示唆している。図５Ｂは、ポリープを示し、正常組織においては染色が実質的に検出不可能であり、形成異常（二核性細胞）が起こりはじめると、染色が増加し、腫瘍の腫瘤内で著しさが増す様子を認めることができる。
【００７３】
（実施例４）
腫瘍に対する特異性：コリンキナーゼα酵素の発癌挙動
今日最も重要なヒト腫瘍のうちのいくつかにおけるコリンキナーゼαの調節不全の非常に高い発生率を考慮して、本タンパク質が単独で発癌能力を有するか否か、すなわち、コリンキナーゼαに発癌活性があるか否かを決定する研究を行った。本研究を行うために、まず、本遺伝子が足場非依存性培地中で増殖能を与えるか否かを研究した。これは、形質転換能を測定することになる。ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、を対照としての空のベクター及びコリンキナーゼα発現ベクターを用い形質移入し、軟寒天中に播種した。図６に認められるように、本タンパク質の過剰発現は、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びイヌ上皮ＭＤＣＫ細胞の両方の発癌の形質転換を誘導するのに十分である。
【００７４】
コリンキナーゼαにヒトＨＥＫ２９３細胞における形質転換活性があることを考慮して、これらが発癌する可能性をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分析した。そのために、免疫抑制マウス（Ｎｕ／Ｎｕ）に、対照としての空のベクター又はコリンキナーゼα発現ベクターのいずれかを過剰発現している１×１０６個のヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を注入した。腫瘍の増殖を、注入後５０日間、少なくとも週に２回モニターした。対照の細胞は、注入されたマウスのいずれにおいても、いかなる腫瘍も誘導しなかったが、コリンキナーゼαを過剰発現している細胞は、３０匹の注入されたマウス中８匹において腫瘍を誘導し（２６％）、これらは、４５日後に平均０．６ｃｍ３に達した（図７）。これらの結果は、コリンキナーゼαの過剰発現は、腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて誘導するのに十分であり、したがって、ヒトの腫瘍形成における良好な治療標的として有望であることを示している。コリンキナーゼαによって発生した腫瘍が、コリンキナーゼαの増加した発現及び活性を維持するか否かを確認するために、腫瘍を外科的に抽出し、可溶化し、本酵素の活性及び発現のレベルを、対照としてのＨＥＫ２９３Ｔ親細胞のそれらのレベルに対して決定した。図８に認められるように、分析した腫瘍の全てが、接種前に得られたレベルと同様の高い発現及び酵素活性のレベルを維持しており、これは、コリンキナーゼαの過剰発現が腫瘍形成をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて誘導することを示している。
【００７５】
（実施例５）
薬理学的特異性
ヒト腫瘍におけるコリンキナーゼαアイソフォームの発癌活性及びその高い発生率の過剰発現を確認し、次いで、阻害剤ＭＮ５８ｂ［Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ，Ｒ．，Ｓａｎｉｇｅｒ，Ｌ．，Ｃａｍｐｏｓ，Ｊ．，Ｎｕｎｅｚ，Ｍ．Ｃ．，Ｋｈａｌｅｓｓ，Ｆ．，Ｇａｌｌｏ，Ｍ．Ａ．，Ｅｓｐｉｎｏｓａ，Ａ．，Ｌａｃａｌ，Ｊ．Ｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１５，２２８９−２３０１（１９９７）；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ，Ｒ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．，Ｌａｃａｌ  Ｊ．Ｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３１１２−３１１８（１９９９）；Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ  Ａ．，Ｂａｎｅｚ−Ｃｏｒｏｎｅｌ  Ｍ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｒ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ．，Ｏｌｍｅｄａ  Ｄ．，Ｍｅｇｉａｓ  Ｄ．，Ｌａｃａｌ  Ｊ．Ｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：６７３２−６７３９（２００４）］の抗腫瘍効果が、本コリンキナーゼαアイソフォームに対して特異的であるか、そうではなく、阻害剤がコリンキナーゼβアイソフォームと相互作用することができることにも起因する可能性があるかを研究した。コリンキナーゼα及びコリンキナーゼβの２種のアイソフォームは、基質結合ドメイン及び触媒領域において７５％もの相同性を有することから、この確認は必要である。そのために、２種のコリンキナーゼアイソフォーム（ＣＫα及びＣＫβ）を、大腸菌株中で発現させた。この大腸菌は、コリンキナーゼ活性を欠き、したがって、何らかの酵素活性が観察されるとすると、それは、もっぱら組換えによって発現させたコリンキナーゼアイソフォームによるものである。図９に認められるように、コリンキナーゼαの酵素活性は、ＭＮ５８ｂを用いた処理によって、同一の阻害剤がβアイソフォームに及ぼす効果より顕著な効果で影響を受けている。事実、ＭＮ５８ｂは、コリンキナーゼαに対して、コリンキナーゼβに対してより２０倍活性が高い。
【００７６】
腫瘍が、コリンキナーゼαを過剰発現させることによってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発生したこと、及びＭＮ５８ｂが、本アイソフォームに対して特異的であることを考慮して、ＣｈｏＫαが誘導する腫瘍の増殖が、ＭＮ５８ｂによる阻害に感受性であるか否かを確認した。そのために、コリンキナーゼα酵素の高い過剰発現を示すｃｋα遺伝子を形質移入した１×１０６個のヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、免疫抑制Ｎｕ／Ｎｕマウスの皮下に注入した。腫瘍が、０．１ｃｍ３の腫瘍容積に達した時点で、特異的コリンキナーゼα阻害剤ＭＮ５８ｂを用いて治療を開始した。無菌の生理的血清中の本阻害剤を５ｍｇ／Ｋｇの用量で、連続して５日、腹腔内に注射し、９日間休ませた。対照のマウスには、担体を同等の用量で、同一の日程にしたがって投与し、腫瘍を少なくとも週に２回モニターした。図１０に示すように、コリンキナーゼαの阻害の結果、腫瘍の増殖が強く阻害され、腫瘍の増殖の低下が８０％に達している。これらの結果は、コリンキナーゼαの過剰発現がｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の誘導に十分であるばかりか、腫瘍細胞の増殖もコリンキナーゼαの活性に依存することを示している。
【００７７】
（実施例６）
遺伝子的特異性
これらの結果は全て、新たな抗腫瘍戦略の設計のための新しい治療標的としてのコリンキナーゼαの可能性を支持している。しかし、阻害剤ＭＮ５８ｂの場合のように、化学阻害剤が特異的に特定の酵素に対して設計されているにもかかわらず、それらの抗増殖作用は、研究者が気づいていない効果を用いてもたらされている場合がある。文献には、特異的にキナーゼに対して設計された阻害剤が、相互に密接に関連してすらいない、その他のキナーゼにも影響を与えることを示す多数の実例が存在する。ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）の使用によって、特定の酵素との干渉の効果をより正確に確立することを可能にする最近の過去数年で開発されたアプローチがある。これは、特定のタンパク質に対するｍＲＮＡを、残りの細胞タンパク質に影響を与えることなく、正確に且つ選択的に排除することができる。ここでは、コリンキナーゼαに対して特異的な阻害剤ＭＮ５８ｂの使用による薬理学的な干渉は、ｓｉＲＮＡの手法によるコリンキナーゼαの特異的阻害によって、遺伝子レベルで確証されることを確認した。本手法は、ＣｈｏＫαを、癌における新たな治療標的として決定的に確証することを可能にするであろう。この目的のために、コリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズすることができる、したがって、本タンパク質の発現を特異的に遮断することができるオリゴヌクレオチド（これは、ｓｉＣＨＫＡと呼ばれている）を生成した。まず、本ｓｉＲＮＡが、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるコリンキナーゼα、内在性のタンパク質及びＧＳＴに融合させて同一の細胞に形質移入したＣｈｏＫαの両方、の発現を効率的に遮断することを確認した（図１１）。
【００７８】
コリンキナーゼαに対して特異的な本干渉ＲＮＡは本タンパク質の発現を効率的に遮断できることが本当であることを確認し、次いで、ヒトの乳癌ＭＩＤＡ−ＭＩ３−２３１に由来する腫瘍細胞におけるその効果を確認した。この乳癌においては、ＭＮ５８ｂを用いたコリンキナーゼの薬理学的な阻害が、アポトーシスの誘導による強い抗腫瘍効果を誘導することが過去に記載されている。図１２に認められるように、これらの細胞で得られる形質移入の効率は低いにもかかわらず、ｓｉＣＨＫＡのＭＤＡ−ＭＢ−２３１への形質移入は、コリンキナーゼαの発現及びその酵素活性の両方の阻害を意味することが観察された。コリンキナーゼαのｓｉＲＮＡによる遺伝子的阻害の効果がＭＮ５８ｂを用いた薬理学的阻害によって得られる効果と類似することを確認し、したがって、コリンキナーゼαに対する効果の特異性を疑いの余地なく実証するために、干渉ｓｉＣＨＫＡを形質移入した後の細胞の生存率を測定した。ＭＮ５８ｂを用いて腫瘍細胞を処置した後に生じたように、コリンキナーゼαの干渉薬剤を形質移入した細胞に関して特異的なアポトーシスによる死滅に伴う細胞の生存率の低下が観察されている（図１３）。
【００７９】
最後に、ＲＭＮ５８ｂで生じたように、干渉ｓｉＣＨＫＡの発現は、コリンキナーゼαに特異的であり、正常な初代ヒト乳腺細胞ＨＭＥＣ（ヒト乳腺上皮細胞）の生存率に対して効果がないことを確認した。これまでに記載したように、腫瘍細胞がコリンキナーゼαを恒常的に過剰発現することを考慮すると、これらの細胞においては、本タンパク質のベースライン発現は非常に低い。しかし、初代細胞ＨＭＥＣにおいてはコリンキナーゼαのベースライン発現がこのように低いにもかかわらず、コリンキナーゼα酵素の発現が明らかに干渉されており、腫瘍細胞で起きることとは異なり、これらの細胞が、アポトーシスによって死滅することはないが、細胞周期が停止する様子を認めることができる（図１４）。これは、阻害剤ＰＡＮ５８ｂを用いて処置した同一の細胞において認められる結果［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ．，Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ  Ａ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｆ．，Ｒａｍｏｓ  Ｍ．Ａ．，Ｎｕｎｅｚ，Ｍ．ｄｅｌ  Ｃ．，Ｃａｍｐｏｓ，Ｊ．Ｍ，Ｌａｃａｌ  Ｊ．Ｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：８８０３−８８１２（２００３）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ，Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ  Ａ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｆ．，Ｌａｃａｌ  ＪＣ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：８２４７−８２５９（２００４）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ．，Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ  Ａ．，Ｂａｎｅｚ−Ｃｏｒｏｎｅｌ  Ｍ．，Ｍｅｇｉａｓ  Ｄ．，Ｎｕｎｅｚ  Ｍ．Ｃ及びＬａｃａｌ  Ｊ．Ｃ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ  ２６：９９９−１００８（２００５）］と一致する結果である。
【００８０】
（実施例７）
コリンキナーゼαの乳癌に対する効果：生存率
コリンキナーゼαの腫瘍の発生及び発展における関与を確証する定量的なデータを得るために、コリンキナーゼαが特異的に関係すると思われるタイプの癌（乳癌、肺癌及び膀胱癌）を有する患者における発現及び当該患者の発展の予後との可能な関係を定量化する追加のアッセイを行った。
【００８１】
一方、コリンキナーゼαの発現を、メッセンジャーＲＮＡを患者の検体から単離することによって定量的に分析した。そのために、自動化リアルタイム定量ＰＣＲ反応を、研究の対象のメッセンジャーＲＮＡ、ＣｈｏＫαに対応するメッセンジャーＲＮＡ、のみを認識する特異的なＴａｑｍａｎプローブを用いて行った。得られたデータは、正常組織の対照検体を基準にして１０を底とした対数目盛で表されている。
【００８２】
乳癌に関して得られたデータの場合、得られた結果を図１５ａに示す。中位のＣｈｏＫαの活性化を上回るレベルを有する検体は、より悪い予後（リンパ節の存在、転移の発生、低い生存率）を有する患者に対応することを観察することができる。このデータは、図１５ｂ及び１５ｃのデータによって確証されている。図１５ｂでは、乳癌患者６３人から得たデータを用いて作製したが、ＣｈｏＫαの発現の平均値（遺伝子の相対的な発現単位として計算した、２−△△ｃｔ法（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．及びＳｃｈｍｉｔｔｔｇｅｎ，Ｔ．Ｄ．（２００１）「リアルタイム定量ＰＣＲ及び２（−デルタデルタＣ（Ｔ））法を使用する相対的な遺伝子発現データの分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ２（−Ｄｅｌｔａ  Ｄｅｌｔａ  Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５，４０２−４０８）を用いてｍＲＮＡレベルから計算した）が、転移を呈している患者では、そうでない患者と比較してはるかに高いことを観察することができる。これらの患者の生存の確率を、コントールと比較したＣｈｏＫαの発現の増加と有意に連動している（ｐ＜０．００１）リンパ節の存在によって表してみると、陽性のリンパ節の存在が増加するにつれて生存率が有意に低下している（ｐ＝０．０４６）様子を古典的なＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線（Ｋａｐｌａｎ  ＥＬ，Ｍｅｉｅｒ  Ｐ，「不完全な観察からのノンパラメトリックな推定（Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ）」Ｊ．Ａｍ．Ｓｔａｔ．Ａｓｓｏｃ．，５３：４５７−４８１（１９５８））で観察することができ（図１５ｃ）、これは、患者の生存をＣｈｏＫαの発現によって表した場合（ｐ＝０．０５９）に観察される傾向と同一である。
【００８３】
（実施例８）
コリンキナーゼαの肺癌における効果：過剰発現レベル及び生存率
肺癌におけるコリンキナーゼαの過剰発現の重要性に関する研究を補完するために、いくつかの試験を行った。
【００８４】
まず、肺癌患者に由来する細胞系中の当該酵素に対応するｍＲＮＡのレベルを、ここでも、特異的なＴａｑｍａｎプローブを用いる自動化リアルタイム定量ＰＣＲ反応によって検出した。反応は、最も一般的なタイプの肺癌（７５〜８５％）、すなわち、非小球性又はＮＳＣＬＣ（非小細胞性肺癌）に対応する、Ｈ４６０系及びＨ１２９９系で表される細胞系、並びにその他のタイプの癌、すなわち、小球性又はＳＣＬＣ（小細胞性肺癌）に対応する、Ｈ５１０系及びＨ８２系で表される細胞系の両方に関して行い、データを正常な初代ヒト気管支上皮細胞ＢＥＣに対して対数目盛で表した。結果を、図１６ａに示す。このデータは、モノクローナル抗体を用いる免疫測定法による、各々のこれらの細胞系中のタンパク質のレベルの検出に関するデータ（図１６ｂ）、及び標識された基質（Ｃｈｏ）から産生した放射活性によって標識された産物（ＰＣｈｏ）を３０分後に測定することにより検出可能な同一の系中の酵素活性に関するデータ（図１６ｃ）で補完されている。対照と比較した増加が、全ての場合に観察され、これは、ＳＣＬＣ系、とりわけＨ５１０の場合において特に顕著である。
【００８５】
また、ＭＮ５８ｂの添加により起こした当該細胞系におけるＣｈｏＫ阻害の抗増殖効果も調べ、以下の表に示す結果を得た。表中、括弧内の数字は、初代細胞と比較した各々の細胞の感受性を示す。全ての分析した期間において、初代細胞と癌に由来する４種の細胞系との間の差は顕著であった（ｐ：＜０．００１）。
【００８６】
【表１】
2008535511.tif 000002
【００８７】
これらの結果は、肺癌患者からのヒトの腫瘍検体、特に、早期に腫瘍を抽出したＮＳＣＬＣ患者からの組織におけるＣｈｏＫαの過剰発現の研究で補完されている。図１７は、早期に手術を受けた当該患者におけるＣｈｏＫαに対応するメッセンジャーＲＮＡのリアルタイム定量ＰＣＲ分析から得た結果を示す。これらの結果は、５３％の症例において、疾患のこのような早期に、ＣｈｏＫαはすでに正常な組織と比較して過剰発現していることを示している。ここでも、ＣｈｏＫαの発現と癌の重症度（段階及び転移の有無）との関係を分析すると、表２に示すように、より高い腫瘍の悪性度には高いＣｈｏＫαの発現が伴うことが観察された。
【００８８】
【表２】
2008535511.tif 000003
ａ腫瘍が小さく、リンパ節の関与は殆ど又は全くなく、転移もない段階
ｂ腫瘍がより大きく、リンパ節が関与し、転移がある段階
【００８９】
図１８に示すグラフから観察できるように、乳癌の場合と同様に、ＮＳＣＬＣの初期では、肺癌におけるＣｈｏＫαの過剰発現が、より悪い予後に伴う。これらの図から、直接的なＣｈｏＫαの発現が検出されない患者では、生存率が終始値１で維持されているが、ＣｈｏＫαの発現が検出される患者では、確率が減少し、無疾患での生存と評価される期間、すなわち、患者が手術を受けてから再発を経験するまでに経過する期間の中央値が９ヵ月であることを認めることができる。
【００９０】
（実施例９）
コリンキナーゼαの膀胱癌における効果：過剰発現レベル及び生存率
また、膀胱癌の患者においても、類似の研究を行った。まず、膀胱癌の患者に由来する細胞系の当該酵素に対応するｍＲＮＡのレベルを、ここでも、肺癌の場合に関する実施例８で記載したものと同様の、特異的なＴａｑｍａｎプローブを用いる自動化リアルタイム定量ＰＣＲ反応によって検出した。ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＷ７８０、ＴＣＣＳｕｐ及びＵＭＶＣ３の系を使用し、データを、正常な不死化膀胱細胞ＵｒｏｔＳａに対して対数目盛で表した。結果を、図１９ａに示す。データは、モノクローナル抗体を用いる免疫測定法による各々のこれらの細胞系中のタンパク質のレベルに関する検出データ（図１９ｂ）、及びその中の検出可能な酵素活性の評価（図１９ｃ）で補完された。異なる細胞系は、正常な不死化ＵｒｏｔＳａ細胞と比較して増加したＣｈｏＫαのレベルを示し、また、膀胱癌に由来する細胞中の本タンパク質の発現の増加にも、コリンキナーゼ酵素の活性の同様な増加が伴うことを観察することができる。
【００９１】
さらに、ＭＮ５８ｂの添加により起こしたこれらの細胞系におけるＣｈｏＫ阻害の抗増殖効果も調べ、以下の表に示す結果を得た。表中、括弧内の数字は、ＵｒｏｔＳＡについて得たデータはこれに関する比較を行うには十分には信頼できないとみなされたことから、より低いＣｈｏＫのレベルを有する細胞系であるＴＣＣＳｕｐと比較した誘導係数を示す。
【００９２】
【表３】
2008535511.tif 000004
【００９３】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察される効果との一致を確立するために、膀胱癌を有する９０人の患者の腫瘍組織中のＣｈｏＫαの発現を、マイクロアレイの手法、具体的には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０チップを使用して分析した。得られた結果を、図２０ａに示す。当該表中、半数をやや上回る４９人の患者が１から３倍の発現誘導係数を示し、２５人の患者が３から８倍の発現誘導係数を示すが、患者のうちの１２人においては、発現誘導係数は８から２４倍であった様子を観察することができる。
【００９４】
マイクロアレイを用いて得たデータを、リアルタイム定量ＰＣＲアッセイ（Ｔａｑｍａｎプローブを用いるアッセイ）によって確証し、その結果を、図２０ｂに示す。当該アッセイでは、正常なヒトの膀胱組織からの市販のＲＮＡを基準として使用し、ＧＡＰＤＨを内在性の対照として使用した。分析した２０検体（これらのうちの１０検体は、より低いＣｈｏＫαの発現を有する１０人の患者に対応し、その他の１０検体は、最も高い発現を有する１０人の患者に対応する）のうちの１８検体において、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のマイクロアレイについてのＣｈｏＫαの発現の結果は、Ｔａｑｍａｎプローブを用いる分析と一致した。腫瘍におけるＣｈｏＫαの過剰発現率は、５５％であった。過剰発現を有する患者は、最も転移性であった。
【００９５】
ＣｈｏＫαの過剰発現と転移の進行との関係を、アレイから得た全ての患者からのＣｈｏＫα発現データを用いて確証し、その結果を、図２１ａ及び２１ｂに示す。図２１ａは、リンパ節の存在（両端の白抜き四角印によってつながっている値）又は転移の発生（両端の黒丸印によってつながっている値）に関する陽性患者と陰性患者との間でのＣｈｏＫαの発現レベルの平均の差異を示す。しかし、図２１ｂは、低いＣｈｏＫαの発現を有する患者群（左の１対の棒）、中間のＣｈｏＫαの発現を有する患者群（グラフの真中にある１対の棒）又は高いＣｈｏＫαの発現を有する患者群（グラフの右側にある１対の棒）において、転移のある患者（黒塗りの棒、■）及び転移のない患者（斜線の棒、／／）の割合の差異を示すグラフである。このグラフから、低い発現の群では、転移のある患者の百分率（５３％）は、転移のない患者の百分率（４７％）と比べそれほど高くはないが、高いＣｈｏＫαの発現の群では、その大部分である７２％に転移があり、残りの２８％には転移がない様子を認めることができる。ＣｈｏＫαの発現と転移の発生との間には関係が認められるが、これは、統計的に有意なレベルには達していない。
【００９６】
膀胱癌のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣｈｏＫαの過剰発現の関連性を実証するために、また、ＭＢＴ−２（マウス膀胱腫瘍）細胞を使用して、膀胱で腫瘍が発生する場合に生じるものに生理学的に非常に類似している正所性膀胱癌モデルを使用した。これらの細胞では、正常なマウスの細胞と比較してＣｈｏＫαをすでに過剰発現しているが、高まったＣｈｏＫαの発現がこれらの腫瘍の攻撃性又は侵襲性を増強するか否かを評価する目的のために、本タンパク質をさらにより過剰発現させている。そのために、空のベクターを含有し、ＣｈｏＫα遺伝子を発現させることを可能にする配列を欠くＭＢＴ−２細胞（対照群のマウス、３匹のマウスからなる）、又は当該酵素をコードする配列を有するベクターを形質移入したことによってＣｈｏＫαを過剰発現するＭＢＴ−２細胞（ＣｈｏＫα群のマウス、３匹のマウスからなる）を、マウスの膀胱にカテーテルを用いて直接接種した。両群について、ガドリニウムの対象を用いる核磁気共鳴によって腫瘍の発生及びマウスにおける疾患の展開（身体の状態、生存、腫瘍の組織学的研究、腎臓及びその他の臓器への可能な侵入の分析・・・）をモニターした。細胞接種後１９日において、ＣｈｏＫαマウスの状態は悪化しており、２匹のマウスは非常に大きな腫瘍を有したが、空のベクターを投与したマウス（対照群）は、細胞接種後５０日になって状態の悪化が始まった。
【００９７】
実施例７、８及び９の結果は、ＣｈｏＫαは、ヒトの乳癌、肺癌及び膀胱癌において高い発生率で過剰発現することを確証している。この過剰発現には、より高い悪性度を示す臨床的なパラメータであるリンパ節の存在、転移及び低い患者の生存が伴う。
【００９８】
（実施例１０）
遺伝子的特異性：誘導性の干渉のモデル
トランジェントアッセイで行った、実施例６に記載したアッセイで実証したように、腫瘍細胞におけるＣｈｏＫαの干渉は、アポトーシスによる細胞死を誘導し、致命的であることを考慮すると、この種の研究で干渉構築物を発現する安定した細胞集団を得ることは不可能ではない。トランジェントアッセイでは、少ないパーセントの可変性の細胞集団が影響を受けるが、全集団が影響を受けることはなく、これが、結果を覆い隠してしまう。構築物の効果を、構築物を均質に発現する集団上で研究するのがよりよいであろう。したがって、体質的に安定なモデルである必要はないであろう。このことから、ＣｈｏＫαの発現が均質に干渉される集団を得ることができる誘導性の干渉モデルが必要になる。
【００９９】
これを得るために、干渉配列が、その発現を阻止する抑制因子下にある構築物中で、干渉配列を発現させる。対象の誘導性の構築物を、その発現を阻止する抑制因子と共に同時形質移入させ、本構築物を有する均質な集団を選択した後、細胞を誘導因子で処理し、これによって、構築物による干渉の発現を可能にし、したがって、本タンパク質の発現を干渉することが可能になる。
【０１００】
本アッセイのために設計した誘導性のモデルでは、ＣｈｏＫαの干渉構築物を、ベクターｐＳＵＰＥＲＩＯＲ−ｐｕｒｅ（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社）で発現させ、抑制因子を、ベクターｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で発現させる。誘導因子は、ドキシサイクリンであり、これは、抑制因子に結合すると、抑制因子が対応する配列に結合するのを阻止し、したがって、干渉配列の発現はこれ以降阻止されない。この系の機構を、図２２に示す。
【０１０１】
図２３及び２４は、Ｃｈ−ｉｎｄ−１細胞、すなわち、誘導剤ドキシサイクリンを用いて処理すると干渉構築物を発現することができるＭＤＡ−ＭＢ−２３１に由来する細胞系において得た結果を示す。図２３は、本誘導性の系が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｃｈ−ｉｎｄ−１を生成させる、乳腺癌に由来する親対照系）で起きるのと同様に、ＣｈｏＫαの化学的阻害に依然として感受性であることを示す。というのは、コリンキナーゼ阻害剤であるＭＮ５８ｂ又はＲＳＭ９３６を用いて処理して得る結果は、両方の系で類似しているからである。しかし、図２４は、ドキシサイクリンを用いる干渉モデルの誘導は、Ｃｈ−ｉｎｄ−１系においてのみ起こることができることから、ＣｈｏＫαの遺伝子的な阻害が、両方の細胞系を１０μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを用いて処理すると、Ｃｈ−ｉｎｄ−１においてのみ起こる様子を示す。なぜなら、Ｃｈ−ｉｎｄ−１系は、抑制因子の結合を阻止して干渉ＲＮＡの合成を起こすことができる構築物を有する系であるからである。ＣｈｏＫαの遺伝子的な阻害は、（ｐＣＮＡによって決定した）細胞の増殖の低下及び（アポトーシスの指標であるＰＡＲＰｄｉｇ、分解されたＰＡＲＰタンパク質によって決定した）アポトーシスによる細胞死の増加と相関する。効果は、１０日後にはじめて認められるが、これは、まだ始まったばかりの状態であり、実験開始２０日後には、さらにより顕著になる（集団は、ＣｈｏＫαを殆ど発現しない）。
【０１０２】
誘導性のモデルを用いて得た結果は、以前にトランジェントで得たデータを確証し、観察された効果は、ＣｈｏＫαの特異的阻害によるものであることを示している。
【０１０３】
（実施例１１）
発癌におけるＣｈｏｋβの過剰発現の可能な効果の評価
発癌においてコリンキナーゼβ（ＣｈｏＫβ）の過剰発現が有する可能性がある効果を評価し、異なる癌性の組織及び癌性の組織に由来する細胞系に認められるコリンキナーゼの活性の増加の原因は、もっぱらコリンキナーゼαとしてもよかろうものなのか、それともコリンキナーゼβも関与する可能性があるものなのかを確証するために、いくつかのアッセイを行った。
【０１０４】
まず、ポリクローナル抗−ＣｈｏＫβ１抗体を生成した。それの特異性を、３群の形質移入したＨｅｋ２９３Ｔ細胞、及び空のベクターを形質移入した１群の対照細胞の中で調べた。それら３群のうち、第１群にはＣｈｏＫαを発現する構築物を形質移入し、第２群にはＣｈｏＫβを発現させることができる構築物を形質移入し、第３群はキメラタンパク質であるＣｈｏＫα−ＧＦＰを発現する構築物を有した。図２５のＡ部に認められるように、免疫検出アッセイは、当該抗体の特異性を示した。これは、ＣｈｏＫβを発現する細胞及びキメラタンパク質であるＣｈｏＫα−ＧＦＰを発現する細胞の両方でシグナルを出させたが、ＣｈｏＫαの発現の構築物を形質移入した細胞に対応するレーンではシグナルは発生しなかった。しかし、これらの後者の細胞では、ＣｈｏＫαに対して作られたモノクローナル抗体は、ＣｈｏＫαに対応する高さで発生するバンドでシグナルを発生した。
【０１０５】
発癌におけるＣｈｏｋβの過剰発現の可能な効果を調べるために、その可能な形質転換活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてアッセイした。そのために、１×１０６個のヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を注入した胸腺欠損マウス（Ｎｕ／Ｎｕ）を、ここでも使用した。この細胞には、対照としての空のベクター、コリンキナーゼαの発現ベクター、又はコリンキナーゼβの発現ベクターのいずれかを形質移入し、さらに、最後の群では、コリンキナーゼのα及びβのアイソザイムのそれぞれを発現するベクターを同時形質移入した。腫瘍の増殖を、注入後、１３週間にわたり少なくとも週に２回モニターした。図２６で観察することができるように、ＣｈｏＫαの発現ベクターを形質移入した細胞を投与したマウスにおいては、腫瘍の誘導が明らかに観察されたが、ＣｈｏＫβの発現ベクターを形質移入した細胞を投与したマウスにおいては、腫瘍の誘導は観察されなかった。両方のベクター、ＣｈｏＫαの発現ベクター及びＣｈｏＫβの発現ベクター、を形質移入した細胞を投与したマウスにおいては、ＣｈｏＫαの発現単独で観察された規模よりはるかに小さい規模で、わずかな腫瘍の誘導が観察され、それは、形質移入した細胞を注入してから１１週間超で観察されたことを認めるのは驚きに価し、このことは、ＣｈｏＫβは直接的又は間接的にＣｈｏＫαを調節し、それによって、ＣｈｏＫβはＣｈｏＫαの発癌活性を阻害する可能性があることを示すことができる。
【０１０６】
本データは、癌患者から抽出した組織中にコリンキナーゼβ酵素が過剰発現しているか否かを調べることによって補完された。図２７は、手術を受けた患者からの肺の検体を得、検体からメッセンジャーＲＮＡを単離し、特異的なＴａｑｍａｎプローブを用いる自動化リアルタイム定量ＰＣＲ反応を行ったデータを示す。得られたデータを、正常な組織の対照検体を基準にして、１０を底とした対数として表している。当該図中、ＣｈｏＫαで起きたこととは異なり、殆どの分析した検体において、正常な組織のＣｈｏＫβの発現と比較して、ＣｈｏＫβの発現が減少している様子が観察できる。
【０１０７】
本データは、コリンキナーゼβの過剰発現が腫瘍の発生及び発達と相関しないことを示唆する。
【０１０８】
実施例で示した結果は全て、コリンキナーゼαを腫瘍性の疾患の治療における新たな治療標的として、明確に支持している。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図Ａはコリンキナーゼα及びコリンキナーゼβを過剰発現させた後のヒトＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ヒト胚性腎臓細胞）抽出液中のコリンキナーゼ活性（ＣｈｏＫ）を示すグラフである（ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるコリンキナーゼ活性アッセイ）。図Ｂは生存している細胞の細胞内ホスホリルコリンレベルを示すグラフである（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるコリンキナーゼ活性アッセイ）。
【図２】図Ａはコリンキナーゼα及びコリンキナーゼβを過剰発現させた後のヒトＣＨｏｋ２９３Ｔ細胞中のＣｈｏＫ活性を示すグラフである。図Ｂは図Ａに示したと同一の抽出液中のコリンキナーゼαに対して産生させたモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図３】ＮＳＣＬＣ（肺大細胞癌）におけるコリンキナーゼαの過剰発現を、免疫組織化学的手法によって決定した図である。
【図４】乳癌におけるコリンキナーゼαの過剰発現を、免疫組織化学的手法によって決定した図である。
【図５】図Ａは結腸癌におけるコリンキナーゼαの過剰発現を、免疫組織化学的手法によって決定した図である。図Ｂは新生物発生前の病変から腫瘍の腫瘤へと進行する染色が認められるポリープを示す図である。
【図６】ヒトコリンキナーゼαを過剰発現している細胞の足場非依存性増殖を示す図である。分析した２種の細胞系、Ｈｅｋ２９３及びＭＤＣＫ、において産生したコロニーの数及びその相対的な大きさの両方が示されている。
【図７】Ｎｕ／Ｎｕマウスでのコリンキナーゼαのｉｎ  ｖｉｖｏにおける発癌活性を示す図である。
【図８】ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて誘導した腫瘍内のコリンキナーゼαの発現及び酵素活性を示す図である。
【図９】阻害剤ＭＮ５８ｂのコリンキナーゼαに対する特異性を示す図である。組換えによるヒトのコリンキナーゼα又はコリンキナーゼβのタンパク質を発現させた大腸菌抽出液を、ＭＮ５８ｂが存在しない場合（０）又はＭＮ５８ｂの濃度を増加させて存在させた場合を分析した。
【図１０】コリンキナーゼαの過剰発現が誘導した腫瘍に対する阻害剤ＭＮ５８ｂの抗腫瘍効果を示す図である。
【図１１】ｓｉＲＮＡの手法によってヒトＨｅＫ２９３Ｔ細胞におけるコリンキナーゼαの発現の遮断を示す図である。
【図１２】ウエスタンブロットＡ）及びＢ）によって、並びに酵素活性Ｃ）によって求めた、ヒトの乳癌に由来する由来する腫瘍細胞におけるｓｉＲＮＡによるコリンキナーゼαの発現の遮断を示す図である。
【図１３】ヒトの乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるコリンキナーゼαの特異的な干渉ＲＮＡによって誘導したアポトーシスによる死滅を示す図であり、Ａ）はヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーにより分析した図であり、Ｂ）はアポトーシスによる死滅に伴うＰＡＲＰの消化を示す図である。
【図１４】初代ヒト乳腺上皮細胞ＨＭＥＣにおけるコリンキナーゼαの特異的干渉ＲＮＡを示す図であり、Ａ）は腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比較した正常ＨＭＥＣ細胞中のコリンキナーゼαの発現の基底レベルを示し、Ｂ）はＨＭＥＣ中のコリンキナーゼαとの干渉を示し、Ｃ）はコリンキナーゼαの干渉が初代ヒトＨＭＥＣ細胞の細胞死を誘導しないことを示す。
【図１５】乳癌組織におけるコリンキナーゼαの過剰発現を示す図である。図１５ａは乳癌患者の組織中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡをリアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な組織検体に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。図１５ｂはコリンキナーゼαの発現の平均値を、２−△△ｃｔ法を用いて転移のない個人（第１の棒、「無」と表示されている）又は転移のある個人（第２の棒、「有」と表示されている）におけるｍＲＮＡレベルから計算した遺伝子の相対的な発現単位として表している。図１５ｃはリンパ節が存在する患者（下の線、灰色の記号†で表示されている）又はリンパ節が存在しない患者（上の線、黒色の記号†で表示されている）の経過月数から求めた、疾患がない場合の生存の確率の展開を示している。
【図１６】肺癌に由来する細胞系中のコリンキナーゼαの発現を示す図である。図１６ａはＮＳＣＬＣ（Ｈ１２９９及びＨ４６０）又はＳＣＬＣ（Ｈ５１０及びＨ８２）のタイプの癌に由来する細胞系中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な初代気管支上皮細胞（ＢＥＣ）に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。図１６ｂは正常な気管支上皮細胞（ＢＥＣ）並びに肺癌Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｈ５１０及びＨ８２に由来する細胞系において、モノクローナル抗体を用いる免疫測定法によって検出したコリンキナーゼαタンパク質を示す。その直ぐ下に、これらの同一の検体中のチューブリンについて得たシグナルを示している。図１６ｃは対応する棒の下に示す各々の細胞系中で標識したコリンから産生した、放射活性によって標識されたＰＣｈｏのシグナルによって表されるコリンキナーゼ活性を示している。シグナルは、３０分後に、タンパク質１マイクログラムあたりで検出した。
【図１７】肺癌ＮＳＣＬＣ患者から早期に抽出した腫瘍の組織中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡの発現を示す図である。リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な組織の検体に存在する量との比を、１０を底とした対数で表している。
【図１８】肺癌患者の長期にわたる生存率の展開を、コリンキナーゼαの発現が検出される場合（破線、−＋−）及び検出されない場合（実線、＋）を、月数で表す図である。ＩからＩＶ期の患者の全体的な生存（グラフは左上部に位置している）、ＩからＩＶ期の患者の無疾患での生存（患者が手術を受けてから再発するまでに経過する期間）（グラフは左下部に位置している）、ＩＡ〜ＩＩＩＡ期癌の症例の生存（グラフは右上部に位置している）及びＩＡ〜ＩＩＩＡ期の症例の無疾患での生存（グラフは右下部に位置している）を示している。
【図１９】膀胱癌に由来する細胞系のおけるコリンキナーゼαの発現を示す図である。図１９ａは膀胱癌に由来する細胞系中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な不死化膀胱ＵｒｏｔＳａ細胞に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。棒は、左から右に、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＷ７８０、ＴＣＣＳｕｐ及びＵＭＶＣ３の系に対応する。図１９ｂは正常な不死化膀胱細胞（ＵｒｏｔＳａ）、並びに膀胱癌ＴＣＣｓｕｐ、Ｊ８２、ＵＭＶＣ３、ＳＷ７８９及びＨＴ１３７６に由来する細胞系、さらに、陰性の対照（Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞）及び陽性の対照（Ｈｅｋ−ＣｈｏＫ細胞、コリンキナーゼαを発現するプラスミドが形質移入されている）中のコリンキナーゼαタンパク質を、モノクローナル抗体を用いる免疫測定法によって検出している。その直ぐ下に、同一の検体中のチューブリンについて得たシグナルを示している。図１９ｃは対応する棒の下に示す各々の細胞系中で標識したコリンから産生した、放射活性によって標識されたＰＣｈｏのシグナルによって表されるコリンキナーゼ活性を示している。シグナルは、３０分後に、タンパク質１マイクログラムあたりで検出した。
【図２０】膀胱癌の患者におけるコリンキナーゼαの発現を示す図である。図２０ａは９０人の患者の腫瘍組織から、マイクロアレイであるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０を用いて、発現の平均値を得、誘導係数の値によって、１から３倍の誘導（最初の棒）、３から８倍の誘導又は８から２４倍の誘導（第３の棒）の異なる群に分類した。図２０ｂは膀胱癌を有する２０人の患者のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と不死化した正常な膀胱ＵｒｏｔＳａ細胞に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。水平線は、それを超えると、より悪い予後の展開が患者に伴うレベルを示している。
【図２１】コリンキナーゼαの発現とリンパ節及び／又は転移の存在との関係を示す図である。図２１ａはリンパ節の存在（白抜き四角印、□で表示されている値）又は転移（黒丸印、●で表示されている値）に関する陽性患者及び陰性患者におけるコリンキナーゼαの発現レベルの平均を示している。両群間のレベルの差を見つけるのに役立つとみなされた特徴に関して、陽性又は陰性の個人に対応する平均値を、直線によりつないでいる。図２１ｂはコリンキナーゼαの発現のレベルによって分類した患者の群：低い（左の１対の棒）、中間（グラフの真中にある１対の棒）又は高い（グラフの右側にある１対の棒）について、転移のある患者（黒塗りの棒、■）及び転移のない患者（斜線の棒、／／）の割合を示している。
【図２２】それに基づいてＲＮＡ干渉を合成することができる構築物の作用機構を示す図である。抑制因子の存在下（左側、「発現しない」、構築物に結合し、ＲＮＡ合成を阻止する）。誘導因子（ドキシサイクリン）が存在すると、これは、抑制因子に結合し、抑制因子が干渉構築物に付加するのを阻止し、干渉ＲＮＡの合成を可能にする（右側、「発現する」）。
【図２３】増殖許容的条件下（「対照」の列）又はコリンキナーゼの化学的阻害剤であるＭＮ５８ｂ（真中の列）又はＲＳＭ９３６（右の列）の存在下におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（上の段のプラーク）及びＣｈ−ｉｎｄ−１細胞（下の段のプラーク）増殖を示す図である。
【図２４】１０日後（「１０ｄ」）又は２０日後（「２０ｄ」）に、１０μｇ／ｍｌのドキシサイクリンが存在しない場合（「−」）又は存在する場合「＋」のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（「ＭＤＡ」と表示した棒）及びＣｈ−ｉｎｄ−１細胞（「Ｃｈｉｎｄ１」と表示した棒）の挙動を示す図である。Ａ：コリンキナーゼαのレベルとＧＡＰＤＨのレベルとの間の比による、コリンキナーゼαの遺伝子的な阻害の効果；Ｂ：ｐＣＮＡのレベルとＧＡＰＤＨのレベルとの間の比による、細胞増殖の効果；Ｃ：５００ｎｍにおける吸光度の値から推定した、異なる時点において観察した誘導因子が存在しない場合（破線）又は存在する場合（実線）のＣｈ−ｉｎｄ−１細胞の細胞生存率；Ｄ：分解されたＰＡＲＰタンパク質のレベルと全ＰＡＲＰタンパク質のレベルとの間の比（ＰＡＲＰｄｉｇ／全ＰＡＲＰ）による、アポトーシス誘導の効果。
【図２５】ポリクローナル抗体のコリンキナーゼβに対する特異性を示す図である。Ａ：ポリクローナル抗コリンキナーゼβ抗血清が、空のベクター（「空」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼα発現ベクター（「ＣｈｏＫＡ」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼβ発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ」と呼ばれるレーン）、及びキメラタンパク質、コリンキナーゼβ−グリーン蛍光タンパク質、発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ５’ＧＦＰ」と呼ばれるレーン）を形質移入した細胞の検体と相互作用する免疫測定法。矢印は、コリンキナーゼβ及びキメラタンパク質のバンドの高さを示している。Ｂ：ポリクローナル抗コリンキナーゼα抗体が、空のベクター（「空」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼα発現ベクター（「ＣｈｏＫＡ」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼβ発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ」と呼ばれるレーン）、及びキメラタンパク質、コリンキナーゼβ−グリーン蛍光タンパク質、発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ５’ＧＦＰ」と呼ばれるレーン）を形質移入した細胞の検体と相互作用する免疫測定法。矢印は、コリンキナーゼαのバンドの高さを示している。
【図２６】コリンキナーゼαとコリンキナーゼβの腫瘍化能力を比較した図である。平方センチメートルで測定した腫瘍の容積の展開；ｘ軸上に、空のベクター（データを菱形印「◆」で示す）、コリンキナーゼα発現ベクター（データを四角印「■」で示す）、コリンキナーゼβ発現ベクター（データを三角印「▲」で示す）及びコリンキナーゼα発現ベクター＋コリンキナーゼβ発現ベクター（データをｘ印、「Ｘ」で示す）を形質移入した細胞をマウスに注入してから経過した週を示す。
【図２７】肺癌患者の組織中のコリンキナーゼβのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲで検出した図である。検出された量と正常な組織に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。
【図５】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月13日(2007.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療のための化合物の有効性を同定及び評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ）腫瘍細胞の培養物を、適切な条件下で適切な期間、相互作用するように候補化合物と接触させること、
ｂ）コリンキナーゼα遺伝子又はコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを検出及び定量化すること、及び
ｃ）前記発現レベルを、候補化合物で治療されていない腫瘍細胞の対照培養物の発現レベルと比較すること
を含む方法。
【請求項２】
前記培養物の腫瘍細胞が、肺、乳房、結腸、直腸又は膀胱の腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌の治療のための化合物の有効性を発見、同定、開発及び評価する方法における、コリンキナーゼα遺伝子又はそれに由来するタンパク質の使用であって、前記化合物がコリンキナーゼαタンパク質の発現及び／又は活性を阻害すること、或いは前記化合物がコリンキナーゼαタンパク質の過剰発現による発癌効果を阻害することを特徴とする使用。
【請求項４】
前記癌が、肺癌、乳癌、結腸直腸癌又は膀胱癌である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
乳癌、肺癌又は膀胱癌の患者の生存期間を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、患者から抽出した癌性の組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、前記検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーＲＮＡのレベル、前記タンパク質の濃度及びその酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも１種のパラメータを測定し、得られた値を１つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することによって評価することを含む方法。
【請求項６】
癌患者に投与した治療の効果をモニターするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、抗腫瘍剤を投与した患者から抽出した組織検体中のコリンキナーゼαタンパク質の発現レベルを、前記検体中の、コリンキナーゼαタンパク質のメッセンジャーＲＮＡのレベル、前記タンパク質の濃度及びその酵素活性から選択される、コリンキナーゼαタンパク質に関連のある少なくとも１種のパラメータを測定し、得られた値を１つ又は複数の正常な非癌性の組織検体に対応する値と比較することによって評価することを特徴とする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
【図１】図Ａはコリンキナーゼα及びコリンキナーゼβを過剰発現させた後のヒトＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ヒト胚性腎臓細胞）抽出液中のコリンキナーゼ活性（ＣｈｏＫ）を示すグラフである（ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるコリンキナーゼ活性アッセイ）。図Ｂは生存している細胞の細胞内ホスホリルコリンレベルを示すグラフである（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるコリンキナーゼ活性アッセイ）。
【図２】図Ａはコリンキナーゼα及びコリンキナーゼβを過剰発現させた後のヒトＣＨｏｋ２９３Ｔ細胞中のＣｈｏＫ活性を示すグラフである。図Ｂは図Ａに示したと同一の抽出液中のコリンキナーゼαに対して産生させたモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図３】ＮＳＣＬＣ（肺大細胞癌）におけるコリンキナーゼαの過剰発現を、免疫組織化学的手法によって決定した図である。
【図４】乳癌におけるコリンキナーゼαの過剰発現を、免疫組織化学的手法によって決定した図である。
【図５】図Ａは結腸癌におけるコリンキナーゼαの過剰発現を、免疫組織化学的手法によって決定した図である。図Ｂは新生物発生前の病変から腫瘍の腫瘤へと進行する染色が認められるポリープを示す図である。
【図６】ヒトコリンキナーゼαを過剰発現している細胞の足場非依存性増殖を示す図である。分析した２種の細胞系、Ｈｅｋ２９３及びＭＤＣＫ、において産生したコロニーの数及びその相対的な大きさの両方が示されている。
【図７】Ｎｕ／Ｎｕマウスでのコリンキナーゼαのｉｎ  ｖｉｖｏにおける発癌活性を示す図である。
【図８】ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて誘導した腫瘍内のコリンキナーゼαの発現及び酵素活性を示す図である。
【図９】阻害剤ＭＮ５８ｂのコリンキナーゼαに対する特異性を示す図である。組換えによるヒトのコリンキナーゼα又はコリンキナーゼβのタンパク質を発現させた大腸菌抽出液を、ＭＮ５８ｂが存在しない場合（０）又はＭＮ５８ｂの濃度を増加させて存在させた場合を分析した。
【図１０】コリンキナーゼαの過剰発現が誘導した腫瘍に対する阻害剤ＭＮ５８ｂの抗腫瘍効果を示す図である。
【図１１】ｓｉＲＮＡの手法によってヒトＨｅＫ２９３Ｔ細胞におけるコリンキナーゼαの発現の遮断を示す図である。
【図１２】ウエスタンブロットＡ）及びＢ）によって、並びに酵素活性Ｃ）によって求めた、ヒトの乳癌に由来する腫瘍細胞におけるｓｉＲＮＡによるコリンキナーゼαの発現の遮断を示す図である。
【図１３】ヒトの乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるコリンキナーゼαの特異的な干渉ＲＮＡによって誘導したアポトーシスによる死滅を示す図であり、Ａ）はヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーにより分析した図であり、Ｂ）はアポトーシスによる死滅に伴うＰＡＲＰの消化を示す図である。
【図１４】初代ヒト乳腺上皮細胞ＨＭＥＣにおけるコリンキナーゼαの特異的干渉ＲＮＡを示す図であり、Ａ）は腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比較した正常ＨＭＥＣ細胞中のコリンキナーゼαの発現の基底レベルを示し、Ｂ）はＨＭＥＣ中のコリンキナーゼαとの干渉を示し、Ｃ）はコリンキナーゼαの干渉が初代ヒトＨＭＥＣ細胞の細胞死を誘導しないことを示す。
【図１５】乳癌組織におけるコリンキナーゼαの過剰発現を示す図である。図１５ａは乳癌患者の組織中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡをリアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な組織検体に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。図１５ｂはコリンキナーゼαの発現の平均値を、２−△△ｃｔ法を用いて転移のない個人（第１の棒、「無」と表示されている）又は転移のある個人（第２の棒、「有」と表示されている）におけるｍＲＮＡレベルから計算した遺伝子の相対的な発現単位として表している。図１５ｃはリンパ節が存在する患者（下の線、灰色の記号†で表示されている）又はリンパ節が存在しない患者（上の線、黒色の記号†で表示されている）の経過月数から求めた、疾患がない場合の生存の確率の展開を示している。
【図１６】肺癌に由来する細胞系中のコリンキナーゼαの発現を示す図である。図１６ａはＮＳＣＬＣ（Ｈ１２９９及びＨ４６０）又はＳＣＬＣ（Ｈ５１０及びＨ８２）のタイプの癌に由来する細胞系中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な初代気管支上皮細胞（ＢＥＣ）に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。図１６ｂは正常な気管支上皮細胞（ＢＥＣ）並びに肺癌Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｈ５１０及びＨ８２に由来する細胞系において、モノクローナル抗体を用いる免疫測定法によって検出したコリンキナーゼαタンパク質を示す。その直ぐ下に、これらの同一の検体中のチューブリンについて得たシグナルを示している。図１６ｃは対応する棒の下に示す各々の細胞系中で標識したコリンから産生した、放射活性によって標識されたＰＣｈｏのシグナルによって表されるコリンキナーゼ活性を示している。シグナルは、３０分後に、タンパク質１マイクログラムあたりで検出した。
【図１７】肺癌ＮＳＣＬＣ患者から早期に抽出した腫瘍の組織中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡの発現を示す図である。リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な組織の検体に存在する量との比を、１０を底とした対数で表している。
【図１８】肺癌患者の長期にわたる生存率の展開を、コリンキナーゼαの発現が検出される場合（破線、−＋−）及び検出されない場合（実線、＋）を、月数で表す図である。ＩからＩＶ期の患者の全体的な生存（グラフは左上部に位置している）、ＩからＩＶ期の患者の無疾患での生存（患者が手術を受けてから再発するまでに経過する期間）（グラフは左下部に位置している）、ＩＡ〜ＩＩＩＡ期癌の症例の生存（グラフは右上部に位置している）及びＩＡ〜ＩＩＩＡ期の症例の無疾患での生存（グラフは右下部に位置している）を示している。
【図１９】膀胱癌に由来する細胞系のおけるコリンキナーゼαの発現を示す図である。図１９ａは膀胱癌に由来する細胞系中のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と正常な不死化膀胱ＵｒｏｔＳａ細胞に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。棒は、左から右に、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＷ７８０、ＴＣＣＳｕｐ及びＵＭＶＣ３の系に対応する。図１９ｂは正常な不死化膀胱細胞（ＵｒｏｔＳａ）、並びに膀胱癌ＴＣＣｓｕｐ、Ｊ８２、ＵＭＶＣ３、ＳＷ７８９及びＨＴ１３７６に由来する細胞系、さらに、陰性の対照（Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞）及び陽性の対照（Ｈｅｋ−ＣｈｏＫ細胞、コリンキナーゼαを発現するプラスミドが形質移入されている）中のコリンキナーゼαタンパク質を、モノクローナル抗体を用いる免疫測定法によって検出している。その直ぐ下に、同一の検体中のチューブリンについて得たシグナルを示している。図１９ｃは対応する棒の下に示す各々の細胞系中で標識したコリンから産生した、放射活性によって標識されたＰＣｈｏのシグナルによって表されるコリンキナーゼ活性を示している。シグナルは、３０分後に、タンパク質１マイクログラムあたりで検出した。
【図２０】膀胱癌の患者におけるコリンキナーゼαの発現を示す図である。図２０ａは９０人の患者の腫瘍組織から、マイクロアレイであるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０を用いて、発現の平均値を得、誘導係数の値によって、１から３倍の誘導（最初の棒）、３から８倍の誘導又は８から２４倍の誘導（第３の棒）の異なる群に分類した。図２０ｂは膀胱癌を有する２０人の患者のコリンキナーゼαのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲによって検出し、検出された量と不死化した正常な膀胱ＵｒｏｔＳａ細胞に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。水平線は、それを超えると、より悪い予後の展開が患者に伴うレベルを示している。
【図２１】コリンキナーゼαの発現とリンパ節及び／又は転移の存在との関係を示す図である。図２１ａはリンパ節の存在（白抜き四角印、□で表示されている値）又は転移（黒丸印、●で表示されている値）に関する陽性患者及び陰性患者におけるコリンキナーゼαの発現レベルの平均を示している。両群間のレベルの差を見つけるのに役立つとみなされた特徴に関して、陽性又は陰性の個人に対応する平均値を、直線によりつないでいる。図２１ｂはコリンキナーゼαの発現のレベルによって分類した患者の群：低い（左の１対の棒）、中間（グラフの真中にある１対の棒）又は高い（グラフの右側にある１対の棒）について、転移のある患者（黒塗りの棒、■）及び転移のない患者（斜線の棒、／／）の割合を示している。
【図２２】それに基づいてＲＮＡ干渉を合成することができる構築物の作用機構を示す図である。抑制因子の存在下（左側、「発現しない」、構築物に結合し、ＲＮＡ合成を阻止する）。誘導因子（ドキシサイクリン）が存在すると、これは、抑制因子に結合し、抑制因子が干渉構築物に付加するのを阻止し、干渉ＲＮＡの合成を可能にする（右側、「発現する」）。
【図２３】増殖許容的条件下（「対照」の列）又はコリンキナーゼの化学的阻害剤であるＭＮ５８ｂ（真中の列）又はＲＳＭ９３６（右の列）の存在下におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（上の段のプラーク）及びＣｈ−ｉｎｄ−１細胞（下の段のプラーク）増殖を示す図である。
【図２４】１０日後（「１０ｄ」）又は２０日後（「２０ｄ」）に、１０μｇ／ｍｌのドキシサイクリンが存在しない場合（「−」）又は存在する場合「＋」のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（「ＭＤＡ」と表示した棒）及びＣｈ−ｉｎｄ−１細胞（「Ｃｈｉｎｄ１」と表示した棒）の挙動を示す図である。Ａ：コリンキナーゼαのレベルとＧＡＰＤＨのレベルとの間の比による、コリンキナーゼαの遺伝子的な阻害の効果；Ｂ：ｐＣＮＡのレベルとＧＡＰＤＨのレベルとの間の比による、細胞増殖の効果；Ｃ：５００ｎｍにおける吸光度の値から推定した、異なる時点において観察した誘導因子が存在しない場合（破線）又は存在する場合（実線）のＣｈ−ｉｎｄ−１細胞の細胞生存率；Ｄ：分解されたＰＡＲＰタンパク質のレベルと全ＰＡＲＰタンパク質のレベルとの間の比（ＰＡＲＰｄｉｇ／全ＰＡＲＰ）による、アポトーシス誘導の効果。
【図２５】ポリクローナル抗体のコリンキナーゼβに対する特異性を示す図である。Ａ：抗コリンキナーゼβポリクローナル抗血清が、空のベクター（「空」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼα発現ベクター（「ＣｈｏＫＡ」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼβ発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ」と呼ばれるレーン）、及びキメラタンパク質、コリンキナーゼβ−グリーン蛍光タンパク質、発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ５’ＧＦＰ」と呼ばれるレーン）を形質移入した細胞の検体と相互作用する免疫測定法。矢印は、コリンキナーゼβ及びキメラタンパク質のバンドの高さを示している。Ｂ：抗コリンキナーゼαポリクローナル抗体が、空のベクター（「空」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼα発現ベクター（「ＣｈｏＫＡ」と呼ばれるレーン）、コリンキナーゼβ発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ」と呼ばれるレーン）、及びキメラタンパク質、コリンキナーゼβ−グリーン蛍光タンパク質、発現ベクター（「ＣｈｏＫＢ５’ＧＦＰ」と呼ばれるレーン）を形質移入した細胞の検体と相互作用する免疫測定法。矢印は、コリンキナーゼαのバンドの高さを示している。
【図２６】コリンキナーゼαとコリンキナーゼβの腫瘍化能力を比較した図である。平方センチメートルで測定した腫瘍の容積の展開；ｘ軸上に、空のベクター（データを菱形印「◆」で示す）、コリンキナーゼα発現ベクター（データを四角印「■」で示す）、コリンキナーゼβ発現ベクター（データを三角印「▲」で示す）及びコリンキナーゼα発現ベクター＋コリンキナーゼβ発現ベクター（データをｘ印、「Ｘ」で示す）を形質移入した細胞をマウスに注入してから経過した週を示す。
【図２７】肺癌患者の組織中のコリンキナーゼβのメッセンジャーＲＮＡを、リアルタイム定量ＰＣＲで検出した図である。検出された量と正常な組織に存在する量との比を、１０を底とした対数として表している。
【国際調査報告】
2008535511.tif 000034
2008535511.tif 000035
2008535511.tif 000036
2008535511.tif 000037
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2008535511.tif 000039
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