(57)【要約】  本発明は、食物タンパク質の肉食性家畜の口腔細菌微生物叢におけるプレバイオティクス効果を抑制する方法であって、水溶性食物リン酸塩を含んでなる、プレバイオティクス効果抑制剤を肉食性家畜に投与することにからなる方法に関する。この抑制剤は、単独で、または家畜用または非家畜用処方物を介して投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肉食性家畜の口腔細菌微生物叢における、食物タンパク質のプレバイオティクス効果を抑制する方法であって、水溶性食物リン酸塩を含んでなる、プレバイオティクス効果抑制剤を肉食性家畜に投与することからなる、方法。
【請求項２】
前記抑制剤がピロリン酸ナトリウムまたはトリポリリン酸ナトリウムから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記食物リン酸塩を前記動物の唾液に少なくとも0.5%溶解させることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記食物リン酸塩を単独で動物に投与することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抑制剤を、前記肉食性家畜の食物との混合物として提供することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抑制剤を前記食物に即時添加することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記抑制剤を前記食物と予め混合することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記食物が、家庭用食料、または、乾燥、含水もしくは半含水工業食物、スナック、トリーツから選択される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記食物リン酸塩を獣医用または非獣医用製剤を介して前記動物に投与することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抑制剤が水溶性食物リン酸塩の混合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
肉食性家畜の口腔細菌微生物叢における、食物タンパク質のプレバイオティクス効果を抑制するための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の水溶性食物リン酸塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肉食性家畜の口腔の細菌微生物叢における、食物タンパク質のプロバイオティクスまたはプレバイオティクス効果の抑制方法に関する。本発明は、水溶性食物リン酸塩を用いることによって上記効果を抑制することからなる。
【背景技術】
【０００２】
イヌやネコの口腔には、様々な細菌微生物叢が生息しており、これは好気性微生物叢と嫌気性微生物叢とに分類される。この微生物叢は、口腔粘膜、歯、および唾液に見出され、後者にあってはそれが水性状態であるため、微生物叢の発生の環境となり、かつまた微生物叢の拡散のキャリヤーともなっている。
【０００３】
動物の口腔は、誕生時は無菌であるが、若い動物が食物を吸収すると、まもなく好気性および嫌気性細菌が速やかにコロニーを形成する。これらの食物は無菌でないだけでなく、その中のタンパク質は唾液中に拡散し、または粘膜上および歯の上もしくは間に残留し、細菌微生物叢の発育を促進する。次に、これらのタンパク質は、微生物叢に対してプレバイオティクス(prebiotic)またはプロバイオティクス効果(probiotic effect)を有するといわれている(プロ(pro)は”for”に由来し、バイオ(bio)は生命(life)に由来するのであり、抗生物質とは異なる)。唾液腺によって無菌的に産生される唾液は、食物タンパク質の存在なしでは細菌微生物叢の発育および拡散の環境となることは決してなかったことに留意すべきである。
【０００４】
本発明において、「プレバイオティクス(prebiotic)」または「プロバイオティクス(probiotic)」という用語は、微生物の成長および/または代謝活性を促進する同一の効果を定義する目的で区別なしに用いられる。
【０００５】
不運なことには、ネコやイヌでは、口腔内の衛生措置を日常的に実施することは困難である。食事後の消毒薬による口の洗浄および練り歯磨きによる歯の摩擦およびブラッシングは、ヒトほどは一般に行われていない。一方、ネコやイヌには、「家庭用」食料(“household” rations)、または「ペットフード」と呼ばれる市販の食物を頻繁に、一日数回給餌されることが増加している。後者は、乾燥、含水(moist)または半含水(semi-moist)食物、スナック(snacks)、トリーツ(treats)であってもよい。起源や体裁とは関わりなく、これら総ての食物は動物または植物起源のタンパク質を提供し、これらは動物の栄養摂取に必要であると確かに認められているものであるが、口腔細菌微生物叢の発育に好都合な残渣を残す。
【０００６】
通常の微生物叢の発育によれば、制御の必要のある一過性の不快な息などの望ましくない美的効果が生じ得る。
【０００７】
この細菌微生物叢が口腔内で過度に発育すると、宿主動物は飼育者や獣医師に周知の多数の症状を示す可能性があり、ネコやイヌは歯肉上に襞を有しており「歯肉ポケット」を形成するので、一層その症状を示す可能性がある:
口臭(不快な息)、
歯肉炎(歯肉の炎症)、
歯周炎または歯周疾患(歯周、すなわち、歯を支持しかつ結びつける組織の集合の炎症)、
咽頭炎(咽頭粘膜の炎症)  。
【０００８】
この過度の病的発育は、単に望ましくない美的効果を引き起こす通常の発育とは異なり微生物叢の制御における問題と関連している。
【０００９】
これらの症状は、抗微生物薬を用いて治療することができる(Trevor Chin Quee, Trianthi Roussou and E.C.S. Chan, 「歯周病菌と思われる細菌に対するロドジル(Rodogyl)のイン・ビトロ活性」, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 24, No. 3, 1983, pp. 445-447; K.S. Kornman, B. Siegrist, W.A. Soskolne and K. Nuki, 「結紮配置およびメトロニダゾール治療後の、ビーグル犬の有力な培養可能な歯肉下微生物叢」, Journal of Periodontal Research, Vol. 16, 1981, pp. 251-258)。
【００１０】
しかしながら、抗微生物薬を用いるこれらの治療は、症状が既にはっきりと目に見えるようになったときに適用されるだけであるので、遅れてしまうことが多い。従って、細菌微生物叢が病的症状を引き起こす前にネコおよびイヌの口腔の細菌微生物叢の過度の発育を減少させる手段を見出すことが肝要である。
【発明の開示】
【００１１】
本出願人は、意外なことに食物リン酸塩が、肉食性家畜の口腔の微生物叢における、食物タンパク質のプレバイオティクス効果を抑制することができることを見出した。動物の唾液において活性であるためには、これらのリン酸塩が水溶性であることが重要である。従って、ピロリン酸またはポリリン酸ナトリウムを用いることが好ましい。リン酸塩は、単独でまたは食物を介して、または任意の獣医用または非獣医用製剤によって摂取することができる。いずれの場合にも、当業者であれば、少なくとも唾液の0.50%の含量となるのに十分な量で用いるリン酸塩を提供するであろう。
【００１２】
インディアナ大学の特許WO 93/25087号明細書によれば、リン酸塩、特にヘキサメタリン酸ナトリウムは、家畜に歯石を構成するカルシウム結晶の形成を防止するための、金属イオン封鎖剤および溶解剤として既に用いられてきた。しかしながら、この従来技術は、食物タンパク質の口腔細菌微生物叢におけるプレバイオティクス作用に対するリン酸塩の抑制効果については全く記載していない。
【００１３】
従って、本発明は、肉食性家畜の口腔細菌微生物叢における食物タンパク質のプレバイオティクス効果を抑制する方法であって、水溶性食物リン酸塩を含んでなる、プレバイオティクス効果抑制剤を肉食性家畜に投与することからなる方法に関する。
【００１４】
この抑制方法は、それが細菌叢の通常の発育を制御することを包含するときには非治療的方法である。
この抑制方法は、それが細菌叢の過度の発育を制御することを包含するときには治療目的となることができる。
【００１５】
本発明によれば、抑制剤は、単独の水溶性食物リン酸塩または水溶性食物リン酸塩の混合物からなっていてもよい。
水溶性食物リン酸塩は、当業者に周知であり、とりわけ、2004年2月25日の欧州連合の官報(official journal)に公表された指令(directive)70/524/CEE号によって認可されたものがある。
好ましくは、水溶性リン酸塩は、ヘキサメタリン酸ナトリウムとは異なり、有利にはピロリン酸塩およびポリリン酸塩から選択される。
本発明の好ましい態様によれば、食物リン酸塩は、動物の唾液に少なくとも0.5%溶解する量で用いられる。
【００１６】
本発明によれば、食物リン酸塩は単独で動物に投与することができ、または肉食性家畜の食物との混合物として提供することができる。
【００１７】
食物は、「家庭用」食料、または乾燥、含水もしくは半含水工業食物、スナック、トリーツから選択される。
【００１８】
有利には、追加の食物における食物リン酸塩の量は、1重量%以上であり、好ましくは2重量%まで(between and 2% by weight)である。
【００１９】
本発明によれば、抑制剤は食物に即時に(extemporaneously)加えることができ、あるいは予め混合しておくこともできる。
【００２０】
本発明のもう一つの態様によれば、プレバイオティクス効果抑制剤は、肉食性家畜に、獣医用または非獣医用製剤にて投与される。
【００２１】
下記の非包括的および非制限的実施例により、本発明を例示することができる。
【実施例】
【００２２】
総ての実験に関し、口腔細菌微生物叢を除去し、保存培地に保持した後、下記のプロトコールに準じて人工唾液で培養した。
【００２３】
細菌微生物叢の採取および接種物の調製
体重が約5.50kgの「ヨーロピアン」種の2匹の雄ネコを、メデトミジン溶液0.085g/100mL(Domitor, ND)0.3mLおよびケタミン溶液10g/1000mL(Imalgene 1000, ND)0.26mLで麻酔した。
【００２４】
このようにして固定したそれぞれの動物において、唾液をピペットで無菌的に吸引し、歯の基部、歯肉および歯肉ポケットを無菌の外科用メスの背で擦った。
【００２５】
総ての試料を、無菌の保存培地を無菌の保存培地 (グリセロール25%を補足したBiokar製チオコレートレザツリン培地)100mLに移して、十分希釈した。試料を含む保存培地を、微小球(Cryobilles, ND, AES)を含む試験管に移した。次に、これらの試験管を37℃のインキュベーター中CO2下で広口瓶中で6時間インキュベーションした後、後に使用する目的で冷凍した。
【００２６】
後に使用するときには、それぞれの試験管を周囲温度で解凍した後、CO2下の広口瓶で37℃で12時間インキュベーションする。好気性および嫌気性菌は、下記の方法で計数する。次に、それぞれの試験管の内容を無菌の保存培地で希釈して、再活性化可能な微生物が0.2mL中に5000個(3.70 log 10)の接種物となるようにする。
【００２７】
細菌の計数方法
好気性微生物叢を、37℃で48時間インキュベーションしたトリプチカーゼ大豆培地(Biokar)上で培養した後、計数する。
【００２８】
嫌気性微生物叢を、CO2下広口瓶にて37℃で48時間インキュベーションした、無菌の脱繊維素ヒツジ血液5%を補足したシェードラー培地(Biokar)上で培養した後、計数する。
【００２９】
人工唾液
基本的人工唾液は、Philip L. AltmanとDorothy S. Dittmerの編纂および監修によるFederation of American Societies for Experimental Biologyから1968年に刊行された便覧「生物学ハンドブック−代謝(the manual Biological Handbooks-Metabolism)」の244頁の表31に準じて調製する。
【００３０】
この基本的唾液に0.5g/リットルの割合でL-システインを補足して、その酸化還元電位を低くし、好気性細菌微生物叢および嫌気性細菌微生物叢がいずれも生育可能にする。その全体を、以下、「人工唾液」という。
【００３１】
試験
人工唾液を、試験管当たり20mLの割合で試験管に分配する。それぞれの試験管に、試験を行うリン酸塩の存在または非存在下で、タンパク質を補足しまたは補足しない。それぞれの処理は、2本の試験管から構成される。
全体を、110℃で15分間オートクレーブ処理を行う。
次いで、それぞれの試験管に、上記接種物0.2mLを接種する。全体を振盪しながら、37℃でインキュベーター中でインキュベーションする。
24、48または72時間インキュベーションした後、好気性微生物叢および嫌気性微生物叢を上記の方法に準じて計数する。
それぞれの処理の結果は、人工唾液1mL当たりのC.F.U.(コロニー形成単位)のlog 10として表される、2本の試験管の計数の平均である。
【００３２】
試験1
処理としては、脱水した鳥肉食餌(タンパク質DSH, Societe des Proteines Industrielles, 56230 Berric, フランス, 力価は総窒素分の70%)をそれぞれ0、0.5、1.0および1.5%の割合で人工唾液へ組み込んだ。
【００３３】
表1によれば、タンパク質の非存在下では、好気性および嫌気性細菌微生物叢は、人工唾液のみでは生育しないかまたは生育が極めて困難である。しかしながら、タンパク質が0.5%程度の含量ででも存在すると、好気性微生物叢および嫌気性微生物叢はいずれもインキュベーション24時間から急増する。
この試験は、この食物タンパク質の口腔細菌微生物叢におけるプレバイオティクス効果を明らかに示している。
【００３４】
試験2
この試験では、1%の含量で人工唾液に配合された鳥肉タンパク質の乾燥加水分
解生成物(タンパク質MP9007、Societe des Proteines Industrielles製、力価は総窒素分の72.5%)のプレバイオティクス効果の抑制を、5%または10%の含量のリン酸三ナトリウムの存在下で試験する。
【００３５】
表2は、タンパク質MP9007のプレバイトティクス効果は、好気性微生物叢および嫌気性微生物叢のいずれに関しても10%配合されたリン酸三ナトリウムによって完全に抑制されることを示している。
5%のリン酸三ナトリウムの抑制作用も、完全ではないが、インキュベーション24時間では極めて顕著である。
【００３６】
試験3
この試験では、1%の含量で人工唾液に配合されたMP9007タンパク質のプレバイオティクス効果に関して、0.5%のみ配合されたリン酸三ナトリウムを再度試験する。前の試験のデーターを考慮して、この試験はインキュベーション24時間後に停止する。
【００３７】
表3は、0.5%配合されたリン酸三ナトリウムもまた、好気性微生物叢(7.75対8.16 log 10)および嫌気性微生物叢(7.75対8.54 log 10)のいずれに関してもMP9007タンパク質のプレバイオティクス効果を減少させることを示している。
【００３８】
試験4
この分析法は、人工唾液に1%配合されたMP9007タンパク質のプレバイオティクス効果に対する、0、0.5、1、1.5および2%配合されたトリポリリン酸ナトリウムの抑制効果を試験することからなる。
表4は、トリポリリン酸ナトリウムがタンパク質のプレバイオティクス効果を有意に抑制することを示している。
【００３９】
試験5
この分析法では、人工唾液に1%配合された脱水した大豆加水分解生成物(Nurish 1500 IP, ND, Solea Company, 力価は総窒素分の83%)のプレバイオティクス効果に対する、0、0.5、1、1.5および2%配合されたトリポリリン酸ナトリウムの抑制効果を試験する。
【００４０】
表5は、トリポリリン酸ナトリウムは、配合量に関係なく、使用した植物タンパク質の全プレバイオティクス効果を実質的に抑制することを示している。
【００４１】
試験6
この分析法では、人工唾液に0.5および1%配合された脱水した大豆加水分解生成物(Nurish 1500 IP, ND, Solea Company, 力価は総窒素分の83%)のプレバイオティクス効果に対する0、0.5、1、1.5および2%配合されたトリポリリン酸ナトリウムの抑制効果を試験した。
この分析法では、イヌから採取した口腔微生物叢を用いた。
【００４２】
表6に示される結果は、トリポリリン酸ナトリウムが、イヌの好気性および嫌気性口腔微生物叢における大豆加水分解生成物のプレバイオティクス効果を抑制することを示している。この抑制効果は、1%以上のトリポリリン酸塩の配合率で特に顕著である。
【００４３】
【表１】
2008505159.tif 000002
【００４４】
【表２】
2008505159.tif 000003
【００４５】
【表３】
2008505159.tif 000004
【００４６】
【表４】
2008505159.tif 000005
【００４７】
【表５】
2008505159.tif 000006
【００４８】
【表６】
2008505159.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月19日(2007.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性食物リン酸塩を含んでなる、肉食性家畜の口腔細菌微生物叢における、食物タンパク質のプレバイオティクス効果抑制剤。
【請求項２】
前記水溶性食物リン酸塩が、ピロリン酸ナトリウムまたはトリポリリン酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項1に記載の抑制剤。
【請求項３】
前記食物リン酸塩が、前記動物の唾液に少なくとも0.5%のレベルで溶解することを特徴とする、請求項１または２に記載の抑制剤。
【請求項４】
前記食物リン酸塩が単独で動物に投与されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項５】
前記肉食性家畜の食物との混合物として提供されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項６】
前記食物に即時添加されることを特徴とする、請求項５に記載の抑制剤。            
【請求項７】
前記食物と予め混合することを特徴とする、請求項５に記載の抑制剤。
【請求項８】
前記食物が、家庭用食料、または、乾燥、含水もしくは半含水工業食物、スナック、トリーツであることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項９】
獣医用または非獣医用製剤の形態で前記動物に投与されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項１０】
水溶性食物リン酸塩の混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の抑制剤。
【国際調査報告】
2008505159.tif 000008
2008505159.tif 000009
2008505159.tif 000010
2008505159.tif 000011
2008505159.tif 000012
2008505159.tif 000013
2008505159.tif 000014
2008505159.tif 000015