(57)【要約】本発明は、タンパク質を精製するための方法を提供する。特に、方法は、インプロセス接線流ろ過工程の使用を伴わずに、2工程非アフィニティークロマトグラフィープロセスを使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）インプロセス（in-process）接線流ろ過工程がない、イオン交換クロマトグラフィー工程および疎水性電荷誘導クロマトグラフィー工程に、混合物を供する工程、ならびに（b）ターゲットタンパク質を単離する工程を含む、ターゲットタンパク質および1つまたは複数の混入物質を含む混合物を精製するための方法。
【請求項２】
（a）インプロセス接線流ろ過工程がない、陽イオン交換クロマトグラフィー工程に、混合物を供する工程、および（b）ターゲットタンパク質を単離する工程を含む、ターゲットタンパク質および1つまたは複数の混入物質を含み、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーに供されている混合物を精製するための方法。
【請求項３】
（a）インプロセス接線流ろ過工程がない、疎水性電化誘導クロマトグラフィー工程に、混合物を供する工程、および（b）ターゲットタンパク質を単離する工程を含む、ターゲットタンパク質および1つまたは複数の混入物質を含み、イオン交換クロマトグラフィーに供されている混合物を精製するための方法。
【請求項４】
陽イオン交換クロマトグラフィーに、かつ疎水性電荷誘導クロマトグラフィーに、混合物を供する工程、ならびに約100百万分率（ppm）またはそれ未満の宿主細胞タンパク質および約10pg/mgまたはそれ未満の核酸の純度まで、ターゲットタンパク質を単離する工程を含む、ターゲットタンパク質ならびに宿主細胞タンパク質および核酸から選択される混入物質を含む混合物を精製するための方法。
【請求項５】
ウイルス不活性化工程をさらに含む、請求項1〜4記載の方法。
【請求項６】
ウイルス不活性化工程がインプロセス工程である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
混合物が細胞培養上清から調製される、請求項1〜4記載の方法。
【請求項８】
陽イオン交換クロマトグラフィーが、3〜10のpH範囲で行われる、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項９】
陽イオン交換クロマトグラフィーが、4.0〜8.0のpH範囲で行われる、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項１０】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィーが、3〜10のpH範囲で行われる、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項１１】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィーが、4.0〜9.0のpH範囲を用いて行われる、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項１２】
ターゲットタンパク質が、pH3〜9で、かつ0.1〜40mS/cmの伝導度範囲で、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合する、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項１３】
ターゲットタンパク質が、pH4.0〜8.0で、かつ0.5〜10mS/cmの伝導度で、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合する、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項１４】
ターゲットタンパク質が、pH5〜10で、かつ0〜90mS/cmの伝導度範囲で、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーカラムに結合する、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項１５】
ターゲットタンパク質が、pH6〜9で、かつ2〜9mS/cmの伝導度範囲で、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーカラムに結合する、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項１６】
ターゲットタンパク質が、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合し、かつカラムが、3〜9のpH範囲および0.1〜40mS/cmの伝導度範囲を有する洗浄緩衝液を用いて洗浄される、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項１７】
ターゲットタンパク質が、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合し、かつカラムが、4.0〜8.0のpH範囲および0.5〜10mS/cmの伝導度範囲を有する洗浄緩衝液を用いて洗浄される、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項１８】
ターゲットタンパク質が、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーカラムに結合し、かつカラムが、5〜10のpH範囲および0〜90mS/cmの伝導度範囲を有する洗浄緩衝液を用いて洗浄される、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項１９】
ターゲットタンパク質が、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーカラムに結合し、かつカラムが、6〜9のpH範囲および0.1〜9mS/cmの伝導度範囲を有する洗浄緩衝液を用いて洗浄される、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項２０】
ターゲットタンパク質が、3〜10のpH範囲および0.1〜40mS/cmの伝導度範囲で、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項２１】
ターゲットタンパク質が、4.0〜8.0のpH範囲および5〜15mS/cmの伝導度範囲で、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項２２】
ターゲットタンパク質が、3.0〜7.0のpH範囲および0〜20mS/cmの伝導度範囲で、疎水性電荷誘導交換クロマトグラフィーカラムから溶出する、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項２３】
ターゲットタンパク質が、4.0〜6.0のpH範囲および0.1〜2.0mS/cmの伝導度範囲で、疎水性電荷誘導交換クロマトグラフィーカラムから溶出する、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項２４】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程が、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチルおよびオルトホスフェートから選択される陽イオン交換リガンドを使用する、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項２５】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程が、Poros HS、Poros S、カルボキシ-メチル-セルロース、BAKERBOND ABX（商標）、アガロース上に固定されたスルホプロピルおよびアガロース上に固定されたスルホニル、MonoS、MiniS、Source 15S、30S、SP Sepharose、CM Sepharose、 BAKERBOND Carboxy-Sulfon、WP CBX、WPスルホニック（WP Sulfonic）、 Hydrocell CM、Hydrocel SP、UNOsphere S、Macro-Prep High S、Macro-Prep CM、Ceramic HyperD S、Ceramic HyperD CM、Ceramic HyperD Z、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、Trisacryl M SP、Trisacryl LS SP、Spherodex LS SP、DOWEX 微細メッシュ強酸陽イオン樹脂、DOWEX MAC-3、Matrex Cellufine C500、Matrex Cellufine C200、Fractogel EMD SO3-、Fractogel EMD SE、Fractogel EMD COO-、Amberlite 弱および強陽イオン交換体、Diaion弱および強陽イオン交換体、TSK Gel SP-5PW-HR、TSK Gel SP-5PW、Toyopearl CM (650S、650M、650C)、Toyopearl SP (650S、650M、650C)、CM (23、32、52)、SE(52、53)、P11、エクスプレス-イオン（Express-Ion） Cならびにエクスプレス-イオンSから選択される陽イオン交換樹脂上で行われる、請求項1、2または4記載の方法。
【請求項２６】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー工程が、リンカーアームおよび／またはリガンド構造上に、脂肪族鎖および少なくとも1つのイオウ原子を有する、イオン化可能芳香族または複素環構造を含む、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーリガンドを使用する、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項２７】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィーリガンドが、2-アミノメチルピリジン、3-アミノメチルピリジンおよび4-アミノメチルピリジン、2-メルカプトピリジン、4-メルカプトピリジンまたは4-メルカプトエチルピリジン、メルカプト酸、メルカプトアルコール、イミダゾリルに基づくもの、メルカプトメチルイミダゾール、2-メルカプトベンズイミダゾール、アミノメチルベンズイミダゾール、ヒスタミン、メルカプトベンズイミダゾール、ジエチルアミノプロピルアミン、アミノプロピルモルホリン、アミノプロピルイミダゾール、アミノカプロン酸、ニトロヒドロキシ安息香酸、ニトロチロシン／エタノールアミン、ジクロロサリチル酸、ジブロモチラミン、クロロヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、チオフェノール、グルタチオン、ビサルフェート、および色素、またはその誘導体から選択される群を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー工程が、MEP HyperCelから選択される疎水性電荷誘導樹脂を用いて行われる、請求項1、3または4記載の方法。
【請求項２９】
混入物質が、宿主細胞タンパク質、宿主細胞代謝産物、宿主細胞構成タンパク質、核酸、内毒素、産物関連混入物質、脂質、および培地添加剤または培地派生物から選択される、請求項1〜4記載の方法。
【請求項３０】
ターゲットタンパク質が抗体または抗体断片である、請求項1〜4記載の方法。
【請求項３１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
抗体が完全ヒト抗体である、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
抗体が、抗CTLA4抗体および抗CD30抗体から選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
抗体が、一本鎖抗体分子、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体および多重特異性抗体から選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
抗体断片がFab、Fab'、F(ab')2およびFvから選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３６】
ターゲットタンパク質がイムノアドヘシンである、請求項1〜4記載の方法。
【請求項３７】
単離タンパク質を配合して薬学的組成物にする工程をさらに含む、請求項1〜4記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、インプロセス（in-process）接線流ろ過工程の使用を伴わない、2工程非アフィニティークロマトグラフィープロセスを用いた、タンパク質精製に関する。特に、本発明は、ポリペプチド（組換えタンパク質、抗体、抗体断片、FabおよびFv関連産物、一本鎖抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、抗体断片由来のものを含む多重特異性抗体、Fc様領域および抗体様分子との融合タンパク質、例えばイムノアドヘシン）および1つまたは複数の混入物質を含む組成物から、ポリペプチドを精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質の大規模で経済的な精製は、生物薬剤産業にとって、益々重要な問題となってきている。治療タンパク質は、典型的には、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドから、このタンパク質を発現するように操作された原核または真核細胞株を用いて産生される。細胞に供給された構成要素および細胞性副産物の混合物から所望のタンパク質を適切な純度に、例えばヒト治療用物質として使用するのに十分な純度になるまで、分離することは、いくつかの理由から、生物製剤製造者にとって厄介な課題となっている。
【０００３】
タンパク質に基づく薬学的製品の製造者は、極度に厳しい純度要件を含めた、厳密な規制標準に従わなければならない。安全性を確実にするため、米国食品医薬品局（FDA）などの監督官庁は、タンパク質に基づく薬学的製品が、組換えタンパク質の凝集物、断片および変異体などの、産物関連混入物質、ならびに宿主細胞タンパク質、培地構成要素、ウイルス、DNAおよび内毒素などの、プロセス関連混入物質の両方を含めた不純物を、実質的に含まないことを要求する。生物薬剤産業では、多様なタンパク質精製スキームが利用可能であり、かつ広く用いられているが、これらは典型的には、薬学的に許容しうる純度に到達するために、抗体の場合にはプロテインA精製などのアフィニティー精製工程を含む。
【０００４】
進歩したクロマトグラフィーおよびろ過法の出現にもかかわらず、アフィニティークロマトグラフィーは、なお、治療的等級の純度を達成するために、生物薬剤抗体精製のための純度、収量、およびスループット要件を満たす捕捉工程として、しばしば使用される。プロテインAクロマトグラフィーは抗体に高い結合アフィニティー（ヒトIgGに対して約10-8M）を有し、かつ不純物の99.5%もの量を除去可能であるにもかかわらず、アフィニティークロマトグラフィーは、商業規模で治療タンパク質を精製する際に用いるには、高価な精製工程である。プロテインAが非アフィニティー媒体より有意により高価であるだけでなく、樹脂が不安定であり、清浄化が困難であり、リガンドの漏出があり、かつ精製産物に混入するプロテインAまたはプロテインA関連化合物が免疫原性である可能性があるなどの問題もある。しかし、コストが高いことおよびアフィニティー媒体が不安定であることが、タンパク質に基づく治療用物質、特に高用量および／または長期投与を必要とするものの最終的なコストを増加させる。クロマトグラフィーは単独で、下流プロセシングコストの3分の2を占めることも可能であり、かつモノクローナル抗体に関しては、アフィニティー捕捉カラムのための樹脂のコストが、原材料コストを圧倒し得る（Rathore et al, Costing Issues in the Production of Biopharmaceuticals, BioPharm International, Feb 1, 2004（非特許文献1）を参照されたい）。
【０００５】
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いたとしても、いくつかの精製工程を組み合わせなければ、適切な純度はしばしば達成されず、それによってコストがさらに増加し、かつ産物収量が減少する。抗体は、市場にある治療用生物製剤の益々高い割合を占めつつあり、かつ癌、自己免疫疾患、感染性疾患、心臓血管疾患、および移植拒否の治療のための開発においては、より少ない工程を用いて、かつしたがってより低いコストを実現しつつ、タンパク質を精製可能なプロセスに対する必要性がある。
【０００６】
その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第2003/0229212号（特許文献1）は、非アフィニティークロマトグラフィー精製工程後、高性能接線流ろ過（HPTFF）工程を用いて、宿主細胞タンパク質を含有する混合物から抗体を精製するための方法を記載する。CHOP（チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質）の減少によって決定した際、この精製プロセスは、陽イオン交換精製後、約144,780 ppm CHOP、陰イオン交換精製後、約410 ppm CHOP、およびHPTFF精製（最終工程）後、約17〜21 ppm CHOPの混入物質レベルを生じ、それによって、3工程非アフィニティープロセスを提供した。抗体を含有する混合物から、タンパク質、DNAおよび内毒素などの不純物（相対的サイズを限定しない）を分離し、かつタンパク質オリゴマーおよび分解産物を排除するため、荷電膜を用いる、HPTFFの精製工程が、最終純度を達成するのに必須であった。
【０００７】
さらに、HPTFFは不都合な点を有し、すなわち（1）タンパク質治療用物質の開発、最適化およびスケールアップにおける、余分な工程であり、膜清浄化、検証、大規模GMPカセット（HPTFF用にはまだ入手可能でない）の市販、ならびに、さらなる緩衝液、装置およびより長いプロセス時間を必要とし、かつ（2）抗体完全性を損なう（分解もしくは凝集または分子活性に影響を及ぼす他の分子変化によって）ことによって、産物の潜在的な損失の危険を冒す一方、コストを増加させる。
【０００８】
したがって、HPTFFに基づかず、アフィニティーに基づく精製および他の多工程精製プロセスと比較してコストが減少した、2工程非アフィニティープロセスから、高純度のタンパク質治療用物質を得ることが望ましいと考えられる。非アフィニティー精製プロセスが、宿主細胞タンパク質、核酸、内毒素、産物関連混入物質、例えばタンパク質の凝集、酸化、脱アミド化または分解型、および培地添加剤、例えば脂質、ビタミン、インスリン、メトトレキセート、アミノ酸、グルコースなどの炭素供給源等を除去可能であれば、好都合であると考えられる。
【０００９】
多様な種類のタンパク質に適用可能で、拡大可能、制御可能であり、かつより安く再使用可能な樹脂を使用する、精製スキームを開発すると、全体の薬剤開発において、非常に初期の段階で、このスキームを製品開発に組み込むことが可能であると考えられる。精製スキームの設計に対するこのアプローチは、これがなければ、薬剤開発において、後で、またはより悪いことには認可後に、必要となり得る、製造プロセスに対する、コストがかかる変化を最小限にし得る。プロセスが拡大され、かつGMP製造条件に近づくにつれて、樹脂充填および緩衝液調製に関連するものを含めて、さらなる内在性の複雑さが生じる。プロセス工程を排除することにより、精製スキームを単純化し、かつスループットおよび生産性を最大限にする一方、精製中の分子の完全性および純度を維持することによって、製造プロセスおよびその能力を改善してもよい。したがって、高品質でかつ安全な薬剤物質を生じ得る、単純でかつ効率的なプロセスで出発することが望ましく、かつ好適であると考えられる。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第2003/0229212号
【非特許文献１】Rathore et al, Costing Issues in the Production of Biopharmaceuticals, BioPharm International, Feb 1, 2004
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー工程またはインプロセス緩衝液交換工程（例えばTFFまたはHPTFF）を含まない2工程精製プロセスを用いることによって、ポリペプチドおよびタンパク質、特にモノクローナル抗体などの組換えタンパク質を、関心対象の分子、ならびに宿主タンパク質および培地構成要素などの他の物質などの少なくとも1つの混入物質を含む、汚染された混合物から精製可能であるという予期せぬ発見に基づく。それどころか、第一の工程から第二の工程に移るには、pH操作のみが必要である。したがって、本発明の2工程プロセスは、同様に高レベルのタンパク質純度を達成するために、典型的にはアフィニティークロマトグラフィーまたは多工程方法論に頼る、タンパク質精製のコストを実質的に減少させる。
【００１２】
本発明において、無視し得る量の不純物[例えば、100万分率（ppm）未満の量のCHOPなどの宿主細胞タンパク質]を含有する高純度タンパク質組成物を得るため、順序に関わりなく、かつアフィニティークロマトグラフィーを使用せずに、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性電荷誘導クロマトグラフィーの工程を用いて、治療的等級になるまでタンパク質を非常に精製する。以下の実施例に記載する、本発明の特定の態様において、HCP CHOPレベルは、20ppm未満に減少した。クロマトグラフィー工程は交換可能であり、したがって、必要性に応じて、実施者が方法を調整することが可能になることが本発明の方法の利点である。さらに、本発明の精製プロセスは、関心対象の宿主細胞タンパク質を除去するだけでなく、核酸、内毒素、産物関連混入物質、例えばタンパク質の凝集、酸化、脱アミド化または分解型、および培地添加剤、例えば脂質、ビタミン、インスリン、メトトレキセート、アミノ酸、グルコースなどの炭素供給源等を除去可能である。
【００１３】
本発明は、治療的等級の組成物を調製する際に使用するのに適した、非常に純粋なタンパク質組成物を得るため、限定されるわけではないが、抗体、Fc様領域および抗体様分子との融合タンパク質、例えばイムノアドヘシンを含む組換えタンパク質の精製のための方法を提供する。その結果、非常に純粋なタンパク質組成物が、治療的等級物質を調製する際に使用するのに適しており、かつこれをヒト治療に直接使用してもよいことが、本発明の方法の利点である。
【００１４】
したがって、1つの態様において、本発明の方法は、（a）インプロセス接線流ろ過工程がない、イオン交換精製工程および疎水性電荷誘導精製工程に、混合物を供する工程、ならびに（b）ターゲットタンパク質を単離する工程によって、ターゲットタンパク質および1つまたは複数の混入物質を含有する混合物を精製することに関する。
【００１５】
特定の態様において、この方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーに、かつ疎水性電荷誘導クロマトグラフィーに、混合物を供する工程、ならびに100百万分率（ppm）またはそれ未満の宿主細胞タンパク質および10pg/mgまたはそれ未満の核酸の純度まで、ターゲットタンパク質を単離する工程によって、ターゲットタンパク質ならびに宿主細胞タンパク質（例えばCHOP）および核酸などの1つまたは複数の混入物質を含有する混合物を精製することに関する。
【００１６】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で用いられる、「タンパク質」は、一般的に、ペプチド結合によって一緒に連結された、典型的には少なくとも5アミノ酸またはそれより多くを有する、ペプチドおよびタンパク質を指す。タンパク質は、抗体、受容体、リガンド融合タンパク質（天然状態では融合していない2つまたはそれより多いポリペプチドの少なくとも部分を含む）等であってもよく、例えばその全体が参照により本明細書に組み入れられ、かつ本発明の方法にしたがって精製し得る多様なタンパク質を列挙する、US2003022921およびUS20030166869を参照されたい。ポリペプチドは、任意の生物（原核または真核）由来であってもよく、特に哺乳動物由来であってもよい。さらに、本発明の方法にしたがって精製されるタンパク質またはポリペプチドは、抗体、その断片、または変異体であってもよい。
【００１７】
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、イムノアドヘシン、およびリガンド特異的結合ドメインを保持するかまたはこのドメインを含むように修飾されている場合には、抗体断片を含む。抗体は、関心対象の「抗原」、例えば生物学的に適切な治療用ターゲットであってもよいポリペプチド、または非ポリペプチド抗原（例えば腫瘍関連糖脂質抗原など；米国特許第5,091,178号を参照されたい）に対して向けられてもよい。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、かつ疾患または障害を患う哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において、治療的利益を生じ得る。ポリペプチド抗原には、膜貫通分子（例えば受容体）および増殖因子などのリガンドが含まれる。例示的な抗原には、上に論じるポリペプチドが含まれる。抗体を生成するための抗原の調製および抗体産生は、当技術分野に周知である。可溶性抗原、または任意で他の分子にコンジュゲート化されている断片を、抗体を生成するための免疫原として用いてもよい。受容体などの膜貫通分子に関しては、これらの断片（例えば受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として用いてもよい。あるいは、膜貫通分子を発現している細胞を免疫原として用いてもよい。こうした細胞は、天然供給源（例えば癌細胞株）に由来してもよいし、または膜貫通分子を発現するように、組換え技術によって形質転換されている細胞であってもよい。
【００１８】
「抗体断片」には、全長抗体の少なくとも部分、および典型的にはその抗原結合または可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv断片；一本鎖抗体分子；ダイアボディ；直鎖抗体；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００１９】
用語「モノクローナル抗体」は、慣用的な意味で用いられ、少量で存在し得る、あり得る天然存在突然変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一であるような、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。これは、典型的には、抗原の異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる多様な抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的であり、これに対して、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。用語「モノクローナル」は、抗体を記載する際、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての、抗体の特性を示し、かつ何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするとは見なされない。例えば、本発明で用いるモノクローナル抗体を、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)に最初に記載された慣用的なハイブリドーマ技術を用いて産生してもよいし、または組換えDNA法 (例えば米国特許第4,816,567号を参照されたい)を用いて作製してもよい。また、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597(1991); ならびに米国特許第5,223,409号;米国特許第5,403,484号;米国特許第5,571,698号;米国特許第5,427,908号;米国特許第5,580,717号;米国特許第5,969,108号;米国特許第6,172,197号;米国特許第5,885,793号;米国特許第6,521,404号;米国特許第6,544,731号;米国特許第6,555,313号;米国特許第6,582,915号;および米国特許第6,593,081号に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーからモノクローナル抗体を単離してもよい。
【００２０】
本明細書記載のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一であるかまたは相同である一方、鎖の残りが、別の種由来の、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体とともに、所望の生物学的活性を示す場合には、こうした抗体の断片における、対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」および「ヒト化」抗体が含まれる (米国特許第4,816,567号; およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体である。大部分、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基で置換されている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもまたドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも部分も含み、これは典型的にはヒト免疫グロブリンのものである。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【００２１】
上述のように調製されたネズミ・モノクローナル抗体の配列に基づいて、キメラまたはヒト化抗体を調製してもよい。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAを、関心対象のネズミ・ハイブリドーマから得てもよく、かつ標準的分子生物学技術を用いて、非ネズミ（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作してもよい。例えば、キメラ抗体を生成するため、当技術分野に公知の方法を用いて、ヒト定常領域にネズミ可変領域を連結してもよい(例えば、Cabilly et al.に対する米国特許第4,816,567号を参照されたい)。ヒト化抗体を生成するため、当技術分野に公知の方法を用いて、ヒト・フレームワーク内にネズミCDR領域を挿入してもよい(例えば、Winterに対する米国特許第5,225,539号、ならびにQueen et al.に対する米国特許第5,530,101号;第5,585,089号;第5,693,762号および第6,180,370号を参照されたい)。
【００２２】
本明細書記載のモノクローナル抗体には、また、例えばヒト患者の血液からを含めて、多様な供給源から単離してもよいし、またはトランスジェニック動物を用いて組換えにより調製してもよい、「ヒト」抗体も含まれる。こうしたトランスジェニック動物の例には、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するKM-Mouse（登録商標）(Medarex, Inc., Princeton, NJ) (WO 02/43478を参照されたい)、Xenomouse（登録商標）(Abgenix, Inc., Fremont CA;例えば、Kucherlapati et al.に対する米国特許第5,939,598号;第6,075,181号;第6,114,598号;第6,150,584号および第6,162,963号に記載される)、ならびにHuMAb-Mouse（登録商標）(Medarex, Inc.; 例えば、Taylor, L. et al.(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al.(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al.(1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al.(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al.(1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al.(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851、米国特許第5,545,806号;第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,789,650号;第5,877,397号;第5,661,016号;第5,814,318号;第5,874,299号;および第5,770,429号;第5,545,807号;ならびにPCT公報WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884、およびWO 99/45962、Korman et al.に対するWO 01/14424)が含まれる。本発明のヒト・モノクローナル抗体はまた、免疫に際して、ヒト抗体応答が生じ得るように、ヒト免疫細胞が再構成されている、SCIDマウスを用いても調製可能である。こうしたマウスは、例えば、Wilson et al.に対する米国特許第5,476,996号および同第5,698,767号に記載されている。
【００２３】
用語「超可変領域」は、抗原結合の原因となる、抗体のアミノ酸残基を記載するよう用いられる。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基（すなわち軽鎖可変ドメインの残基24〜34 (Ll)、50〜56 (L2)および89〜97 (L3)、ならびに重鎖可変ドメインの残基31〜35 (Hl)、50〜65 (H2)および95〜102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)を参照されたい)および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基(すなわち軽鎖可変ドメインの残基26〜32 (Ll)、50〜52 (L2)および91〜96 (L3) 、ならびに重鎖可変ドメインの残基26〜32 (Hl)、53〜55 (H2)および96〜101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」または「FR」残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２４】
本明細書で用いられる、用語「イムノアドヘシン」は、異種「アドヘシン」タンパク質（例えば受容体、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を合わせた、抗体様分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位（抗原と組み合わさる部位）以外の（すなわち「異種」である）所望の結合特異性を持つアドヘシン・アミノ酸配列、ならびに免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、好ましくは、γl、γ2、またはγ4重鎖由来であり、これは、これらの領域を含むイムノアドヘシンが、プロテインAクロマトグラフィーによって精製可能であるためである(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。本発明の方法にしたがって、イムノアドヘシンを精製してもよい。
【００２５】
用語「リガンド結合ドメイン」は、任意の天然細胞表面受容体、または対応する天然受容体の少なくとも定性的なリガンド結合を保持するその任意の領域もしくは誘導体を指す。特定の態様において、受容体は、免疫グロブリン・スーパー遺伝子ファミリーのメンバーに相同な細胞外ドメインを有する、細胞表面ポリペプチド由来である。免疫グロブリン・スーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、にもかかわらずこの定義に特に含まれる他の受容体は、サイトカインの受容体であり、かつ特に、チロシンキナーゼ活性を持つ受容体（受容体チロシンキナーゼ）、ヘマトポエチンおよび神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバー、ならびに細胞接着分子、例えば（E-、L-およびP-）セレクチンである。
【００２６】
用語「受容体結合ドメイン」は、細胞接着分子を含む、受容体の任意の天然リガンド、または対応する天然リガンドの少なくとも定性的な受容体結合能を保持する、こうした天然リガンドの任意の領域もしくは誘導体を指すよう用いられる。この定義は、とりわけ、上述の受容体のリガンド由来の結合配列を特に含む。
【００２７】
「抗体−イムノアドヘシン・キメラ」は、抗体（本明細書に定義するようなもの）の少なくとも1つの結合ドメインと、少なくとも1つのイムノアドヘシン（本出願に定義するようなもの）を合わせた分子を含む。例示的な抗体−イムノアドヘシン・キメラは、Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727(1991)およびChamow et al., J. Immunol. 153:4268(1994)に記載される二重特異性CD4-IgGキメラである。
【００２８】
本明細書で用いられる、「混合物」は、関心対象のポリペプチド（精製が望ましいもの）および1つまたは複数の混入物質、すなわち不純物を含む。ポリペプチドを産生する宿主細胞または生物から直接、混合物を得てもよい。限定を意図することなく、本発明の方法にしたがって精製可能な混合物の例には、採取された細胞培養液、細胞培養上清および馴化細胞培養上清が含まれる。「部分的に精製」されている混合物は、クロマトグラフィー工程、例えば非アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等にすでに供されている。「条件化混合物」は、所望のクロマトグラフィー性能を達成するように、pHおよび／または伝導度範囲および／または緩衝マトリックスを設定するため、緩衝液交換、希釈、塩添加、pH滴定またはろ過の1つまたは複数に混合物を供することによって、本発明の方法で用いるクロマトグラフィー工程用に調製されている混合物、例えば細胞培養上清である。「条件化混合物」を用いて、第一のクロマトグラフィーカラム上への装填条件を標準化してもよい。一般的に、当技術分野に周知の多様な分離手段を通じて、例えばろ過または遠心分離を用いて、バイオリアクター運転の終了時に、ブロス中の他の構成要素から死んだ細胞および生存細胞を物理的に分離することによって、または特定の範囲のpH、伝導度および緩衝剤種濃度に、細胞培養上清を濃縮および／またはダイアフィルトレーションすることによって、混合物を得てもよい。
【００２９】
用語「不純物」および「混入物質」、ならびにその文法的な変形は、交換可能に用いられ、関心対象のタンパク質を含有する組成物から除去されていることが望ましい、関心対象のタンパク質以外の、任意の物質を意味する。混入物質には、限定されるわけではないが、任意の生物学的高分子、例えば宿主細胞タンパク質（例えばCHOP）、関心対象のタンパク質以外のポリペプチド、核酸（例えばDNAおよびRNA）、脂質、糖類、内毒素、細菌または酵母などの他の微生物、培地構成要素、およびクロマトグラフィー中に試料内に浸出し得るクロマトグラフィーに用いられる吸着剤の一部である任意の分子等が含まれる。
【００３０】
用語「関心対象のタンパク質」および「ターゲットタンパク質」は、交換可能に用いられ、本発明の方法にしたがって、混合物から精製することが望ましい、上述のようなタンパク質、例えば抗体を指す。
【００３１】
用語「宿主細胞タンパク質」、または「HCP」は、ターゲットタンパク質を発現する宿主細胞の代謝（細胞内および細胞外）に由来する任意のタンパク質を指し、宿主細胞のゲノムから発現される任意のタンパク質、または組換えにより発現され、かつターゲットタンパク質とは見なされないタンパク質を含む。宿主細胞は、ターゲットタンパク質を発現可能な任意の細胞、特に哺乳動物（例えばCHO、およびNS0などのネズミ骨髄腫細胞株）、昆虫、細菌、植物および酵母細胞株であってもよい。本発明の特定の態様において、HCPは、「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」、または「CHOP」であり、これは、チャイニーズハムスター卵巣（「CHO」）細胞培養由来の任意の宿主細胞タンパク質（「HCP」）を指す。HCPは、一般的に、関心対象のタンパク質を含有する、細胞培地または溶解物[（例えば採取細胞培養液（「HCCF」））]中の不純物として存在する。関心対象のタンパク質を含む混合物中に存在するHCPの量は、関心対象のタンパク質の純度の度合いの尺度を提供する。典型的には、タンパク質混合物中のHCPの量は、混合物中の関心対象のタンパク質の量に比較した百万分率として表される。
【００３２】
用語「百万分率」または「ppm」は、本明細書において交換可能に用いられ、本発明の方法によって精製される関心対象のタンパク質の純度の尺度を指す。単位ppmは、タンパク質が溶液中にある場合、ミリグラム／ミリリットルの関心対象のタンパク質あたりの、ナノグラム／ミリリットルのHCPの量を指す[すなわち、以下の実施例に記載するように、HCP ppm=(CHOP ng/ml)/(関心対象のタンパク質mg/ml)]。凍結乾燥によるなど、タンパク質が乾燥している場合、ppmは、(HCP ng)/(関心対象のタンパク質mg)を指す。
【００３３】
用語「純度」、およびその文法的な変形は、ポリペプチドおよび1つまたは複数の不純物を含有する混合物からの少なくとも1つの不純物の、完全にであってもまた部分的にであってもよい、除去を意味するように用いられ、この除去は、それによって、組成物中のポリペプチドの純度レベルを改善する（すなわち組成物中の不純物の量（ppm）を減少させることによって）。本発明にしたがって、2つの非アフィニティークロマトグラフィー工程を伴い、かつインプロセスTFF工程を伴わずに、精製を行う。本発明の方法は、関心対象のタンパク質を精製して、ELISAで測定した際、100ppm未満のHCP、および好ましくは90ppm未満、80ppm未満、70ppm未満、60ppm未満、50ppm未満、40ppm未満、30ppm未満、20ppm未満、10ppm未満、または5ppm未満のHCPを含有する組成物を得ることも可能である。
【００３４】
本明細書で用いられる、用語「単離する」、およびその文法的な変形は、混入物質、不純物および他の物質を実質的に含まずに、関心対象のタンパク質を含有する、均質な組成物を得るための、さらなる物質からの関心対象の精製タンパク質の、例えば関心対象のタンパク質を精製するために用いたカラムまたは樹脂からの分離を指す。
【００３５】
用語「クロマトグラフィー」は、プロセスの特定の緩衝条件下で、pI、疎水性、サイズおよび構造などの溶質の特性のため、多かれ少なかれ、強く溶質に吸着するかまたは溶質を保持する、吸着剤を通じた、混合物のパーコレーションによって、混合物中の関心対象の溶質、例えば関心対象のタンパク質を、他の溶質から分離するプロセスを指す。
【００３６】
「吸着剤」は、関心対象の分子との直接相互作用または吸着剤に付着した化合物との相互作用のいずれかによる接着によって、表面に別の物質を吸着させることが可能な、任意の固形でかつ固定された物質である。多様な種類のクロマトグラフィーで有用な吸着剤が当技術分野に周知であり、かつ商業的供給源を通じて、容易に入手可能である。
【００３７】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」および「タンパク質アフィニティークロマトグラフィー」は交換可能に用いられ、通常、結合部位での、空間的相補性および1つまたは複数の種類の化学的相互作用、例えば静電気力、水素結合、疎水性力、および／またはファンデルワールス力の組み合わせとして、関心対象のタンパク質が、生体特異的リガンドに可逆的にかつ特異的に結合するタンパク質分離技術を指す。これらの相互作用は、等電点、疎水性またはサイズなどの、分子の一般的な特性によるのではなく、例えばプロテインAおよび抗体相互作用に関する疎水性でかつ正確なタンパク質ドメインの適合などの、関心対象の分子およびリガンドに由来する特異的な相互作用の結果である。プロテインAは、吸着剤の例であり、これを、Fc領域を含有する分子に結合させるため、固体支持体、例えばSepharoseに固定してもよい。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ostrove (1990)、Guide to Protein Purification, Methods of Enzymology 182: 357-379を参照されたい。
【００３８】
それぞれの特異的結合タンパク質を精製するために、任意のリガンドを用いてもよい。好ましくは、二重特異性リガンドは、クロマトグラフィー固相物質に共有結合され、かつ溶液がクロマトグラフィー固相物質と接触するにつれて、溶液中の関心対象のタンパク質（例えば抗体、酵素、または受容体タンパク質）にアクセス可能である。関心対象のタンパク質は、クロマトグラフィー工程中に生体特異的リガンド（例えば抗原、基質、補因子、またはホルモン）に対する特異的結合アフィニティーを保持し、一方、混合物中の他の溶質および／またはタンパク質は、リガンドに認識可能にまたは特異的に結合しない。固定されたリガンドに関心対象のタンパク質が結合すると、混入タンパク質またはタンパク質不純物がクロマトグラフィー媒体の中を通過し、一方、関心対象のタンパク質が、固相物質上の固定されたリガンドに特異的に結合したままであることが可能になる。次いで、低pH、高pH、低塩、高塩、競合リガンド等を用いて、固定されたリガンドから、特異的に結合したタンパク質を除去し、かつこのタンパク質は、溶出緩衝液とともに、クロマトグラフィーカラムの中を通過する。これより前にカラムの中を通過するのを許した、関心対象のタンパク質に比較して、より低い相対的濃度を有する混入タンパク質、ならびに核酸および内毒素などの他の種類の混入物質もまた、存在し得る。
【００３９】
用語「特異的結合」および「結合特異性」、ならびにその文法的な変形は、結合部位での静電気力、水素結合、疎水性力、および／またはファンデルワールス力の1つまたは複数の種類とカップリングされた、結合部位でのタンパク質およびリガンド構造の空間的相補性の組み合わされた効果を必要とする、関心対象のタンパク質およびリガンドの間の、一般的に特異的でかつ可逆的な相互作用を記載する。リガンドは、化学的に修飾可能な基を有するべきであり、これによってその結合活性を破壊することなく、マトリックスに付着することが可能になる。リガンドは、理想的には、自由溶液中で10-4〜10-8Mの範囲で、結合物質に対するアフィニティーを有するべきである。結合部位での空間的相補性がより高く、かつ他の力がより強い場合には、タンパク質のそれぞれのリガンドに対する結合特異性がより高くなると考えられる。特異的結合の限定されない例には、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、酵素−補因子結合、金属イオンキレート、DNA結合タンパク質−DNA結合、制御タンパク質−タンパク質相互作用等が含まれる。
【００４０】
用語「非アフィニティークロマトグラフィー」および「非アフィニティー精製」は、アフィニティークロマトグラフィーを用いず、むしろ溶質（例えば関心対象のタンパク質）および吸着性マトリックス間の非特異的結合相互作用を必要とする、精製工程を指す。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「非特異的結合」は、相互作用部位での、非特異的相互作用を通じる、例えば静電気力、水素結合、疎水性力、および／またはファンデルワールス力を通じるが、アフィニティー（特異的）結合におけるような、非構造的な力の効果を増進する構造的相補性を欠く、関心対象のタンパク質および固相マトリックスに結合したリガンドまたは他の化合物間の相互作用を指す。アフィニティーではなく、非特異的結合に頼るクロマトグラフィープロセスの例には、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陰イオンおよび陽イオン交換）および疎水性電荷誘導クロマトグラフィーが含まれる。
【００４２】
用語「疎水性電荷誘導クロマトグラフィー」（または「HCIC」）は、混合物中の関心対象のタンパク質が、二重の様式で（すなわち結合のための1つの様式および溶出のための別の様式がある）、添加される塩（例えば離液性の塩）の非存在下で、穏やかな疎水性相互作用を通じて、イオン化可能リガンド[Boschetti et al., 2000, Genetic Engineering News 20(13)を参照されたい]に結合する、混合様式のクロマトグラフィープロセスの一種である。「疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂」は、分離能力のため、チオ親和性（thiophilic）効果（すなわちチオ親和性クロマトグラフィーの特性を利用する）、疎水性およびイオン化可能基の組み合わされた特徴を有するリガンドを含有する固相である。したがって、本発明の方法で用いるHCIC樹脂は、中性（生理学的）またはわずかに酸性のpH、例えば約pH5〜10、好ましくは約pH6〜9.5で、イオン化可能であり、かつ穏やかに疎水性であるリガンドを含有する。このpH範囲では、リガンドは主に非荷電であり、かつ穏やかな非特異的疎水性相互作用を介して、関心対象のタンパク質に結合する。pHが減少するにつれて、リガンドは、電荷を獲得し、かつpHシフトのため、溶質に向かう静電電荷反発によって、疎水性結合が破壊される。
【００４３】
HCICで使用するのに適したリガンドの例には、リンカーアームおよび／またはリガンド構造上に、脂肪族鎖および少なくとも1つのイオウ原子を有する、任意のイオン化可能芳香族または複素環構造が含まれる（例えば、ピリジン構造を有するもの、例えば2-アミノメチルピリジン、3-アミノメチルピリジンおよび4-アミノメチルピリジン、2-メルカプトピリジン、4-メルカプトピリジンまたは4-メルカプトエチルピリジン、メルカプト酸、メルカプトアルコール、イミダゾリルに基づくもの、メルカプトメチルイミダゾール、2-メルカプトベンズイミダゾール、アミノメチルベンズイミダゾール、ヒスタミン、メルカプトベンズイミダゾール、ジエチルアミノプロピルアミン、アミノプロピルモルホリン、アミノプロピルイミダゾール、アミノカプロン酸、ニトロヒドロキシ安息香酸、ニトロチロシン／エタノールアミン、ジクロロサリチル酸、ジブロモチラミン、クロロヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、チオフェノール、グルタチオン、ビサルフェート、および色素、その誘導体を含む；その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Burton and Harding, Journal of Chromatography A 814:81-81(1998)およびBoschetti, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 49:361-389(2001)を参照されたい）。HCIC樹脂の例には、MEP HYPERCEL (Pall Corporation; East Hills, NY)が含まれる。
【００４４】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」は、関心対照の溶質が、混合物中の溶質不純物または混入物質よりも強くまたは弱く、荷電化合物と非特異的に相互作用するように、関心対象のイオン化可能溶質（例えば混合物中の関心対照のタンパク質）が、固相イオン交換物質に（例えば共有結合によって）連結された反対に荷電したリガンドと、適切なpHおよび伝導度の条件下で相互作用する、クロマトグラフィープロセスを指す。混合物中の混入溶質をイオン交換物質のカラムから洗い流してもよいし、または混入溶質は、関心対象の溶質より迅速にもしくはそれより遅く、樹脂に結合するかもしくは樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」には、特に、陽イオン交換、陰イオン交換、および混合様式クロマトグラフィーが含まれる。
【００４５】
句「イオン交換物質」は、負に荷電する（すなわち陽イオン交換樹脂）または正に荷電する（すなわち陰イオン交換樹脂）、固相を指す。1つの態様において、1つまたは複数の荷電リガンド（または吸着剤）を例えば共有結合によって固相に付着させることによって、電荷を提供してもよい。あるいは、またはさらに、電荷は、固相に内在性の特性であってもよい（例えば、全体の負電荷を有するシリカの場合のように）。
【００４６】
「陽イオン交換樹脂」は、負に荷電し、かつ固相上をまたは固相中を通過する水性溶液中の陽イオンと交換するための未結合（free）陽イオンを有する、固相を指す。陽イオン交換樹脂を形成するのに適した、固相に付着し、負に荷電した任意のリガンド、例えばカルボキシレート、スルホネートおよび以下に記載するような他のものを用いてもよい。市販されている陽イオン交換樹脂には、限定されるわけではないが、例えば、スルホネートに基づく基（例えば、GE HealthcareのMonoS、MiniS、Source 15Sおよび3OS、SP Sepharose Fast Flow（商標）、SP Sepharose High Performance、Tosoh のToyopearl SP-650SおよびSP-650M、BioRadのMacro-Prep High S、Pall TechnologiesのCeramic HyperD S、Trisacryl MおよびLS SPおよびSpherodex LS S); スルホエチルに基づく基(例えばEMDのFractogel SE、Applied BiosystemsのPoros S-10およびS-20); スルホプロピルに基づく基 (例えば、TosohのTSK Gel SP 5PW およびSP-5PW-HR 、Applied BiosystemsのPoros HS-20およびHS 50); スルホイソブチルに基づく基(例えばEMDのFractogel EMD SO3−); スルホキシエチルに基づく基 (例えば、WhatmanのSE52, SE53およびエクスプレス-イオン（Express-Ion）S)、カルボキシメチルに基づく基(例えば、GE HealthcareのCM Sepharose Fast Flow、Biochrom Labs Inc.のHydrocell CM、BioRadのMacro-Prep CM、Pall TechnologiesのCeramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、MilliporeのMatrx Cellufine C500およびC200、WhatmanのCM52、CM32、CM23およびエクスプレス-イオンC、TosohのToyopearl CM-650S、CM-650MおよびCM-650C); スルホン酸およびカルボン酸に基づく基(例えばJ.T. BakerのBAKERBOND Carboxy-Sulfon);カルボン酸に基づく基(例えばJ.T BakerのWP CBX、Dow Liquid SeparationsのDOWEX MAC-3、Sigma-AldrichのAmberlite弱陽イオン交換体、DOWEX弱陽イオン交換体、およびDiaion弱陽イオン交換体、ならびにEMDのFractogel EMD COO-); スルホン酸に基づく基(例えば、Biochrom Labs Inc.のHydrocell SP、Dow Liquid Separations のDOWEX微細メッシュ強酸陽イオン樹脂、J. T. Baker のUNOsphere S、WPスルホニック（WP Sulfonic）、SartoriusのSartobind S膜、Sigma-AldrichのAmberlite 強陽イオン交換体、DOWEX強陽イオンおよびDiaion強陽イオン交換体);ならびにオルトリン酸に基づく基(例えばWhatmanのP11）を有するものが含まれる。
【００４７】
「陰イオン交換樹脂」は、正に荷電し、したがって、1つまたは複数の正に荷電したリガンドが付着した固相を指す。陰イオン交換樹脂を形成するのに適した固相に付着した任意の正に荷電したリガンド、例えば四級アミノ基を用いてもよい。市販されている陰イオン交換樹脂には、Applied BiosystemsのDEAEセルロース、Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50、SartoriusのSartobind Q、MonoQ、MiniQ、Source 15Qおよび3OQ、Q、DEAE およびANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose high Performance、QAE SEPHADEX（商標）およびFAST Q SEPHAROSE（商標） (GE Healthcare)、J.T. BakerのWP PEI、WP DEAM、WP QUAT、Biochrom Labs Inc.のHydrocell DEAEおよびHydrocell QA、BioradのUNOsphere Q、Macro-Prep DEAEおよびMacro-Prep High Q 、Pall TechnologiesのCeramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、Trisacryl MおよびLS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil MおよびMustang Q、Dow Liquid SeparationsのDOWEX微細メッシュ強塩基I型およびII型陰イオン樹脂およびDOWEX MONOSPHER E 77、弱塩基陰イオン、MilliporeのIntercept Q膜、Matrex Cellufine A200、A500、Q500、およびQ800、EMDのFractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAEおよびFractogel EMD DMAE、Sigma-AldrichのAmberlite弱強陰イオン交換体I型およびII型、DOWEX 弱および強陰イオン交換体I型およびII型、Diaion弱および強陰イオン交換体I型およびII型、Duolite、TosohのTSKゲルQ およびDEAE 5PWおよび5PW-HR、Toyopearl SuperQ-650S、650Mおよび650C、QAE-550C および650S、DEAE-650Mおよび650C、WhatmanのQA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、エクスプレス-イオンDおよびエクスプレス-イオンQが含まれる。
【００４８】
「混合様式イオン交換樹脂」は、陽イオン性、陰イオン性、および／または疎水性部分で共有的に修飾された固相を指す。混合様式イオン交換樹脂の例には、BAKERBOND ABX（商標） (J. T. Baker; Phillipsburg, NJ)、セラミックヒドロキシアパタイトI型およびII型ならびにフッ化物ヒドロキシアパタイト(BioRad; Hercules, CA)ならびにMEP およびMBI HyperCel (Pall Corporation; East Hills, NY)が含まれる。
【００４９】
用語「チオ親和性」は、チオエーテル基にごく近接して存在するスルホン基に対して、タンパク質が有する選択性を指す(Porath et al, 1985)。「チオ親和性クロマトグラフィー」は「チオ親和性吸着クロマトグラフィー」としても公知であり、チオ親和性領域および芳香族アミノ残基を含有する、関心対象のタンパク質が、タンパク質単離のためのイオウ含有リガンドに結合する、非アフィニティークロマトグラフィーの一種である。ジビニルスルホン(Sepharose 4Bにカップリングしたもの)を、β-メルカプトエタノールで還元することによって、チオ親和性ゲルを調製してもよい。チオ親和性吸着クロマトグラフィーは、電子供与体−受容体特性に基づき、かつ疎水性に基づくクロマトグラフィーとは別個である。疎水性会合およびイオン性相互作用は、チオエチルスルホン構造が、顕著な疎水性またはイオン性電荷を所持しないため、チオ親和性吸着剤では起こらない。市販されているチオ親和性クロマトグラフィー樹脂の例には、Fractogel EMD TA (Merck; Rahway, NJ)、Uniflow およびSuperflow樹脂(Clontech)、ならびにT-Gel (Pierce)が含まれる。
【００５０】
用語「固相」は、1つまたは複数のリガンドが接着可能な任意の非水性マトリックスを意味するように用いられ、またはサイズ排除クロマトグラフィーの場合、樹脂のゲル構造を指すことも可能である。固相は、この方式で、リガンドに接着可能な任意のマトリックスであってもよく、例えば精製カラム、別個の粒子の不連続相、膜、フィルター、ゲル等である。固相を形成するのに使用可能な物質の例には、多糖（アガロースおよびセルロースなど）およびシリカなどの他の機械的に安定なマトリックス（例えば制御孔ガラス）、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子およびこれらのいずれかの誘導体が含まれる。本発明は、クロマトグラフィー工程で使用するための任意の特定の固相物質に限定されず、かつ一般の当業者は、本発明で使用するのに適した固相物質を選択可能であると考えられる。
【００５１】
用語「界面活性剤」は、イオン性、双性イオン性および非イオン性界面活性剤を指し、タンパク質の凝集を防止し、かつ関心対象のタンパク質への混入物質の非特異的相互作用または結合を防止するのに有用であり、かつ浄化、平衡化、装填、装填後洗浄、溶出または剥離緩衝液を含む、本発明で使用する多様な緩衝液中に存在してもよい。特定の態様において、界面活性剤を洗浄緩衝液に添加する。本発明で使用可能な界面活性剤の例には、限定されるわけではないが、ポリソルベート（例えばポリソルベート20または80）；ポロキサマー（例えばポロキサマー188）;Triton；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）；ラウレル（laurel）硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-、またはステアリル-スルホベタイン；ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-またはステアリル-ザルコシン；リノレイル-、ミリスチル-、またはセチル-ベタイン；ラウロアミドプロピル-、コカミドプロピル-、リノレアミドプロピル-、ミリスタミドプロピル-、パルミドプロピル-、またはイソステアラミドプロピル-ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル-、パルミドプロピル-、またはイソステアラミドプロピル-ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウムまたはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；MONAQUAT（商標）シリーズ（Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.）；Igepal CA-630、Pluronic、Triton、BRIJ、Atlas G2127、Genapol、HECAMEG、LUBROL PX、MEGA、NP、THESIT、TOPPS、CHAPS、CHAPSO、DDMAU、EMPIGEN BB、AWITTERGENTおよびC12E8が含まれる。任意の作業緩衝液に界面活性剤を添加してもよく、かつまた関心対象の分子を含有するフィード中に界面活性剤が含まれてもよい。界面活性剤は、タンパク質精製プロセスで使用するのに適した任意の量、例えば約0.001%〜約20%、かつ典型的には約0.01%〜約1%で存在してもよい。特定の態様において、CEXCの洗浄緩衝液中で、ポリソルベート80を用いる。
【００５２】
本発明で用いる「緩衝液」は、酸−塩基共役構成要素の作用によって、酸または塩基の添加によるpHの変化に抵抗する溶液である。本発明の方法においては、緩衝液の所望のpHおよび精製プロセスの特定の工程に応じて、多様な緩衝液を使用してもよい[Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)を参照されたい]。本発明の方法に望ましいpH範囲を制御するのに使用可能な緩衝液構成要素の限定されない例には、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、リン酸、アンモニウム緩衝液、例えば酢酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、およびTris等、ならびにこれらの組み合わせ、TRIS-リンゴ酸-NaOH、マレイン酸、クロロ酢酸、ギ酸、安息香酸、プロピオン酸、ピリジン、ピペラジン、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、トリシン、ビシン、TAPS、エタノールアミン、CHES、CAPS、メチルアミン、ピペリジン、0-ホウ酸、炭酸、乳酸、ブタンアンジオン酸、ジエチルマロン酸、グリシルグリシン、HEPPS、HEPPSO、イミダゾール、フェノール、POPSO、コハク酸、TAPS、アミンに基づくもの、ベンジルアミン、トリメチルもしくはジメチルもしくはエチルもしくはフェニルアミン、エチレンジアミン、またはモホリン（mopholine）が含まれる。さらなる構成要素（添加剤）が、必要に応じて、緩衝液中に存在してもよく、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩を用いて、緩衝液イオン強度を調整してもよく；かつアミノ酸（グリシンおよびヒスチジンなど）、カオトロープ（尿素など）、アルコール（エタノール、マンニトール、グリセロール、およびベンジルアルコールなど）、界面活性剤（上記を参照されたい）、および糖（スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、およびフルクトースなど）などの他の添加剤も用いてもよい。緩衝液構成要素および添加剤、ならびに用いる濃度は、本発明で実施するクロマトグラフィーの種類にしたがって、多様であり得る。
【００５３】
緩衝液のpHおよび伝導度は、精製プロセスのどの工程で緩衝液を用いるかに応じて多様であり得る。CEXCにおいて、精製工程および使用する緩衝液に応じて、緩衝液のpHは、3〜10の間、より好ましくは約pH 4.0〜8.0の間であってもよく；伝導度は、約0.1〜40mS/cm、より好ましくは伝導度約0.5〜15mS/cmであってもよい。HCICにおいて、精製工程および使用する緩衝液に応じて、緩衝液のpHは、約3〜10の間、より好ましくは約pH 4.0〜9.0の間であってもよく；伝導度は、約0.0（WFI;注射用水）〜90.0mS/cm、より好ましくは約0.1〜9.0mS/cmであってもよい。精製プロセス全体で用いる緩衝液を、各クロマトグラフィー工程に関して、以下により詳細に記載する。
【００５４】
「浄化」溶液は、典型的には、いかなる結合混入物質、例えば生物学的起源のものも、精製プロセス前に除去することによって、樹脂を清浄化するために用いられる。本発明の方法にしたがって選択される特定のカラムおよび樹脂と適合するという条件で、この目的のため、任意の所望の緩衝液を用いてもよい。好ましくは、浄化溶液のpHは高く、例えばpH 10またはそれより高く、より好ましくはpH 11またはそれより高く、かつさらにより好ましくはpH 12またはそれより高いか；あるいは、浄化溶液のpHは低くてもよく、例えばpH 4またはそれ未満、より好ましくはpH 3またはそれ未満であってもよい。特定の態様において、1N NaOH、pH≧12を含む浄化溶液を用いて、HCICおよびCEXCカラムを清浄化する。
【００５５】
「平衡化緩衝液」は、精製のため、関心対象のタンパク質を含有する混合物をカラムに装填する前に、クロマトグラフィーカラムのpHおよび伝導度を調整するために用いられる。この目的のために用いてもよい適切な緩衝液、例えば、上述の緩衝液などが当技術分野に周知であり、かつ関心対象のタンパク質を精製するためのクロマトグラフィー工程に用いられる、選択された樹脂と適合するpHの任意の緩衝液が含まれる。この緩衝液を用いて、関心対象のポリペプチドを含む混合物を装填する。平衡化緩衝液は、関心対象のポリペプチドが樹脂に結合するような、または関心対象のタンパク質がカラムの中を流れる一方、1つもしくは複数の不純物がカラムに結合するような、伝導度および／またはpHを有する。好ましい態様において、クロマトグラフィーカラムの平衡化は、pHおよび伝導度が、平衡化緩衝液の、それぞれ±0.2および±0.4mS/cm内、より好ましくは、平衡化緩衝液の、それぞれ±0.1および±0.2mS/cm内である場合、完了する。好ましい態様において、CEXCおよびHCICの平衡化緩衝液種は、リン酸ナトリウムに基づく。CEXCにおいて、平衡化緩衝液のpHは、約3〜約9、より好ましくは約4.0〜8.0のpH、約0.1〜約40mS/cm、より好ましくは約0.5〜10.0mS/cmの伝導度である。HCICにおいて、平衡化緩衝液のpHは、約5〜約10、より好ましくは約6〜9のpH、約0.0（WFI）〜約90mS/cmの伝導度、より好ましくは約2.0〜9mS/cmの伝導度である。
【００５６】
「装填緩衝液（loading buffer）」は、関心対象のタンパク質を含有する混合物をカラム上に装填するために用いられる。装填緩衝液として、任意の適切な溶液を用いてもよい。本プロセスにおける装填緩衝液の伝導度およびpHは、関心対象のタンパク質が樹脂に結合する一方、混入物質が、カラムの中を流れることが可能であるように、選択される。好ましくは、装填緩衝液を緩衝液交換してもよい。また、溶出緩衝液などの、先の精製工程由来の緩衝混合物から、装填緩衝液を調製してもよい。選択した樹脂とともに、装填緩衝液として使用するのに適した緩衝液は、例えば上述のものなど、当技術分野に周知である。一般の当業者には、CEXCおよびHCICの装填緩衝液を、CEXCおよびHCICの平衡化緩衝液に関して上述したような、匹敵する（同じでないとしても）pHおよび伝導度で用いてもよいことが認識されるものとする。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「洗浄緩衝液」または「装填後洗浄」は、関心対象のタンパク質を溶出する前に、イオン交換樹脂から1つまたは複数の不純物を溶出するために用いられる緩衝液を指す。用語「洗浄」、およびその文法的な変形は、クロマトグラフィー樹脂中または樹脂上の、適切な洗浄緩衝液の通過を記載するよう用いられる。好適には、洗浄、平衡化および装填緩衝液は、同じであってもよいが、これは必要とはされない。緩衝液のpHおよび伝導度は、1つまたは複数の不純物が樹脂から溶出する一方、樹脂が関心対象のポリペプチドを保持するようなものである。望ましい場合、洗浄緩衝液は、ポリソルベートなどの上述のような界面活性剤を含有してもよい。関心対象のタンパク質を精製するため、上述の緩衝液などの、選択された樹脂と適合するpHの任意の適切な緩衝液を用いてもよい。洗浄緩衝液のpHおよび伝導度の選択は、関心対象のタンパク質を有意に溶出させることなく、HCPおよび他の混入物質を除去するために重要である。関心対象のタンパク質よりもより親水性であり、かつより酸性であるかまたはより塩基性である混入物質を除去するため、かつ溶出工程前に、系の伝導度を減少させるため、混合物を装填した後、HCICおよびCEXCクロマトグラフィーでは、続く洗浄工程で用いる洗浄緩衝液において、伝導度およびpHを減少させるか、または維持するか、または増加させてもよい。特定の態様において、HCICクロマトグラフィーに関しては、伝導度のみを減少させ、かつCEXCの装填後洗浄には、平衡化、装填および装填後洗浄に用いる緩衝液のpHまたは伝導度のいずれにも、いかなる変化も含まれない。
【００５８】
特定の態様において、CEXCで用いる洗浄緩衝液はリン酸ナトリウムである。CEXCで用いる洗浄緩衝液のpHは、約3〜約9、より好ましくは約4.0〜約8.0のpH；および約0.1〜約40mS/cmの伝導度、より好ましくは約0.5〜約10mS/cmの伝導度である。
【００５９】
HCICで用いる洗浄緩衝液は、所望のpHおよび伝導度を達成するのに適した任意の緩衝液であってもよく、かつ上述の緩衝液から選択可能である。特定の態様において、HCICで用いる洗浄緩衝液はリン酸ナトリウムである。HCICで用いる洗浄緩衝液のpHは、約5〜約10、より好ましくは約6〜約9のpH；および約0.0（WFI）〜約90mS/cmの伝導度、より好ましくは約0.1〜約9mS/cmの伝導度である。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「溶出緩衝液」は、固相（すなわちクロマトグラフィー樹脂）から関心対象のタンパク質を溶出させるために用いる緩衝液を指す。用語「溶出」、およびその文法的な変形は、関心対象のタンパク質が、樹脂に結合不能となり、かつしたがってクロマトグラフィーカラムから溶出されるように、適切な条件を用いることによって、例えばクロマトグラフィー物質を取り巻く緩衝液のイオン強度もしくはpHを改変することによって、リガンドに関する競合分子を付加することによって、分子の疎水性を改変することによって、またはリガンドの化学特性（例えば電荷）を変化させることによって、分子、例えば関心対象のポリペプチドをクロマトグラフィー物質から除去することを指す。用語「溶出液」は、溶出をカラム上に適用した際、関心対象のポリペプチドを含有するカラムから離れた流出液を指す。関心対象のポリペプチドを溶出した後、必要に応じて、カラムを再生し、浄化し、かつ保存してもよい。
【００６１】
プロセスで用いる特定のCEXCまたはHCIC樹脂から、関心対象のタンパク質が溶出されるように、溶出緩衝液のpHおよび伝導度を選択する。溶出緩衝液として使用するのに適した緩衝液を上述する。特定の態様において、CEXCおよびHCICクロマトグラフィーで用いる溶出緩衝液は、それぞれ、リン酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムである。
【００６２】
CEXCで用いる溶出緩衝液のpHは、約3.0〜約10、より好ましくは約4〜約8のpH；および約0.1〜約40mS/cmの伝導度、より好ましくは約5〜約15mS/cmの伝導度である。
【００６３】
HCICで用いる溶出緩衝液のpHは、約3.0〜約7.0、より好ましくは約4.0〜約6.0のpH；および約0.0（WFI）〜約20mS/cmの伝導度、より好ましくは約0.1〜約2mS/cmの伝導度であってもよい。
【００６４】
所望の場合、さらなる溶液を用いて、再利用のためにカラムを調製してもよい。例えば「再生溶液」を用いて、精製プロセスで用いたカラムから、固く結合した混入物質を「剥離する」かまたは除去してもよい。典型的には、再生溶液は、実質的にいかなる残った不純物および関心対象のタンパク質も、樹脂から除去するのに十分な伝導度およびpHを有する。
【００６５】
本明細書で用いられる、用語「伝導度」は、水性溶液が、特定の温度で2つの電極間に電流を伝導する能力を指す。電流は、溶液中のイオン輸送によって流れる。したがって、水性溶液中に存在するイオンの量が増加すると、溶液はより高い伝導度を有すると考えられる。本発明の方法において、精製が典型的に行われる温度は、特定のpH範囲内で、約4℃〜約37℃、より好ましくは約15〜約25℃であってもよい。
【００６６】
伝導度の測定単位は、センチメートルあたりのミリジーメンス（mS/cm）であり、かつ標準的な伝導度計を用いて測定可能である。イオン濃度を変化させることによって、溶液の伝導度を改変してもよい。例えば、所望の伝導度を達成するため、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩（例えばNaClまたはKCl）の濃度を改変してもよい。好ましくは、以下の実施例に記載するように、塩濃度を修飾して、所望の伝導度を達成する。
【００６７】
ポリペプチドの「pI」または「等電点」は、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と平衡を保つpHを指す。多様な慣用的方法論にしたがって、例えばポリペプチド上のアミノ酸および／またはシアル酸残基の正味電荷から、または等電点電気泳動法を用いることによって、pIを計算してもよい。
【００６８】
本明細書で用いられる、「低pH保持」は、ウイルス不活性化（すなわちウイルス力価の少なくとも2対数の減少、より好ましくは少なくとも3対数の減少）を達成するための、pH減少が約pH5.0未満、好ましくは約pH4.0未満、より好ましくは約pH3.7未満、かつ最も好ましくは約pH3.4〜約3.6までである、関心対象のタンパク質を含有する溶出液のpHの減少、その後、第二のクロマトグラフィー工程のために溶出液を調製するため、または関心対象の産物の分子完全性に対して安定性を提供するマトリックスに産物を運ぶための、pHの増加を指す。関心対象のタンパク質を含有する溶出液に任意の適切な酸、例えば1N HClまたは氷酢酸を適用して、低pH保持のため、pHを減少させてもよい。より中性の範囲にpHを戻すため、溶出液に、任意の適切な塩基、例えば1N NaOHまたは1N Trisを適用してもよい。低pH保持は、典型的には、少なくとも0.5mS/cmの伝導度の増加を生じる。低pH保持を第一のクロマトグラフィー工程後に行い、かつ第二のクロマトグラフィー工程が陽イオン交換クロマトグラフィーである場合、pHの増加は、適切なpH範囲内である可能性が高く、これは、約3.0〜約9.0、好ましくは約4.0〜8.0である。低pH保持を第一のクロマトグラフィー工程後に行い、かつ第二のクロマトグラフィー工程がHCICである場合、pHの増加は、HCICに適したpH範囲内である可能性が高く、これは、約pH5〜約pH10.0、好ましくは約pH6.0〜約9.0である。低pH保持を、第二のクロマトグラフィー後に行うこともまた可能であるが、本発明の方法では、実験上、好適であるため、クロマトグラフィー工程の間に行うよう選択されている。一般の当業者には、低pH保持工程が、本発明の方法によって達成可能な純度のレベルを達成するために、必須ではないことが認識されるものとする。
【００６９】
「接線流ろ過」または「TFF」または「交差流ろ過」は、膜の上部に渡って、試料混合物が循環する一方、適用された圧によって、特定の溶質および小分子が膜の中を通過する、ろ過プロセスを指す。TFFでは、典型的には、溶液は、フィルター膜と平行に流れる。膜を渡る圧力差は、液体およびろ過可能溶質（分子量が膜の分子量より小さいかまたはそのように挙動するもの、例えば球状タンパク質）がフィルターの中を流れるようにする。溶液が膜上を繰り返し通過する一方、フィルターの中を通過した液体は、別個の回路内に連続的に取り除かれるため、これを連続流プロセスとして行ってもよい。HPTFF（高性能接線流ろ過）においては、膜が荷電されているため、混入物質を分離するために、分子のサイズおよび電荷の両方を用いる（米国特許第2003/0229212号を参照されたい）。所望の場合、TFFを用いて、緩衝液を交換してもよく、この場合、本発明の方法を開始する前に、クロマトグラフィー樹脂上に結合するのにより適した別の緩衝液中に、関心対象のタンパク質を可溶化する。言い換えると、TFFを第一のクロマトグラフィー工程前に用いてもよいが、本発明の方法で用いる緩衝液および樹脂は、1つの樹脂から次の樹脂への直接の移動を可能にするため、インプロセスTFF工程（すなわち2つのクロマトグラフィー工程間でTFFが起こる）は不要である。
【００７０】
本明細書で用いられる、「インプロセス」は、本発明の方法において、第一のクロマトグラフィーカラムの装填工程を始めるより後であるが、第二のクロマトグラフィーカラムの溶出ピークの収集より前に行われる、任意の方法論、工程、操作等を指す。インプロセス方法論は純度の変化を直接生じ得る（インプロセスTFFなど）し、または純度の変化を直接生じない（調整の結果が、いかなる純度変化も直接引き起こさないpHおよび／または伝導度調整など）。
【００７１】
本発明の方法を用いて、治療的等級タンパク質純度を達成することが望ましい可能性もあり、この場合、任意で、当技術分野に周知のさらなる工程を使用して、外来および内因性のウイルスの両方に対するウイルス・クリアランス能を達成してもよく、こうした工程は例えば、以下にさらに記載する、低pH不活性化およびウイルスろ過法（VR CUNO (CUNO)またはDV20（Pall Technologies）などのウイルス用の特別に荷電された膜ろ過を含む）である。
【００７２】
本明細書で用いられる、「深層ろ過」は、典型的にはフィルターマトリックス内に粒子を保持する設計によって特徴付けられる、深層フィルターを用いるろ過法である。深層フィルターの容量は、典型的には深さ、例えばマトリックスの10”または20”によって定義され、かつしたがって、固体の保持容量である。本発明の方法において、深層フィルターを用いて、精製スキームのウイルス・クリアランス能を改善してもよいが、これは任意の工程であり、かつ本発明の方法の純度レベルを達成するために必要ではない。ウイルス除去用の深層フィルターは、精製スキームの任意の時点で使用可能であるが、フィルターのコストが高いため、好ましくは、プロセス体積が低い、最初のクロマトグラフィー工程後に用いられる。
【００７３】
方法の説明
本発明の方法において、CEXCおよびHCICを任意の順序で用いて、約100ppm HCPまたはそれ未満と同程度に低く、かつ99%モノマー純度またはそれを超えるのと同程度に高く、関心対象のタンパク質を精製することも可能である。この高レベルの純度を得るために、さらなるクロマトグラフィー工程は必要ではない。
【００７４】
関心対象のタンパク質を産生するように遺伝子操作されている生存宿主細胞によって、このタンパク質を産生してもよい。細胞を遺伝子操作してタンパク質を産生する方法は、当技術分野に周知である。例えば、各々、参照により特に本明細書に組み入れられる、Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)、ならびに米国特許第5,534,615号および同第4,816,567号を参照されたい。こうした方法には、タンパク質をコードし、かつ発現を可能にする核酸を、生存宿主細胞に導入する工程が含まれる。これらの宿主細胞は、培養中で増殖している細菌細胞、真菌細胞、または好ましくは動物細胞であってもよい。細菌宿主細胞には、限定されるわけではないが、大腸菌（E. coli）細胞が含まれる。適切な大腸菌株の例には: HB101、DH5α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539、および外来DNAを切断できない、任意の大腸菌株が含まれる。使用可能な真菌宿主細胞には、限定されるわけではないが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞が含まれる。使用可能な動物細胞株のいくつかの例は、CHO、VERO、DXB11、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、NSO およびWI138である。当業者に周知の方法を用いて、新規動物細胞株を樹立してもよい(例えば形質転換、ウイルス感染、および／または選択によって)。特定の態様において、関心対象のタンパク質をCHO細胞(例えば、WO 94/11026を参照されたい)で産生する。多様な種類のCHO細胞、例えばCHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB11、CHO/dhfr―およびCHO-Sが当技術分野に公知である。
【００７５】
細胞破片からのタンパク質精製のための混合物の調製は、まず、タンパク質の発現方式に応じる。あるタンパク質は、細胞から直接、取り巻く増殖培地に分泌される一方、他のタンパク質は細胞内に保持される。細胞内で産生されるこうしたタンパク質では、機械的剪断、浸透圧ショック、および酵素処理などの、任意の多様な方法を用いて、細胞を破壊してもよい。破壊によって、細胞の全内容物がホモジネート内に遊離し、かつ加えて、遠心分離によってまたはろ過によって除去可能な、細胞内断片も生じる。より低い度合いであるが、細胞の自然死およびタンパク質産生実行の経過中の細胞内宿主細胞タンパク質の遊離のため、直接分泌されるタンパク質で、類似の問題が生じる。
【００７６】
組換え技術を用いた際、関心対象のタンパク質を細胞内で、細胞質周辺腔で産生するか、または培地内に直接分泌することも可能である。本発明の方法は、細胞破片を除去するのに、いかなる特定の方法論にも頼らない。当業者がこれを達成するために任意の方法を使用してもよい。第一の工程として、タンパク質が細胞内で産生される場合、宿主細胞または溶解した断片のいずれであっても、精製用の混合物を調製するため、例えば遠心分離またはろ過工程によって、粒子状破片を除去可能である。タンパク質が培地内に分泌される場合、精製用の混合物を調製するため、例えば接線流ろ過（TTF）または深層ろ過によって、細胞培地から組換え宿主細胞を分離してもよい。
【００７７】
本発明にしたがって、関心対象のタンパク質を含有する混合物が得られた場合には、上述のように、適切な条件下、望ましいとおりのいずれかの順序でHCICおよびCEXCクロマトグラフィーの組み合わせを用いて（図1を参照されたい）、混合物中の混入物質からの分離を行う。他のインプロセス精製工程、例えばTFFまたはHPTFFのいずれも、本発明の方法によって達成可能な純度レベルを達成するために必要とはされない。クロマトグラフィーの第二の工程において、精製用の混合物を調製するため、2つのクロマトグラフィー工程間で、必要に応じて、pH操作のみを行う。
【００７８】
特定の態様において、用いるHCIC樹脂はMEP HyperCel（Pall Corp.）であり、かつCEXC樹脂はPoros 50HS（Applied Biosystems）である。これらのクロマトグラフィー技術は、電荷および疎水性を含む、多様な特性に基づいて、タンパク質の混合物を分離する。本質的に、これらの分離法は、物質がカラムのさらに下へと通過するにつれて、物理的分離を達成するため、タンパク質および他の分子が長いカラムを異なる速度で下方に移動するようにする。上述のような適切な条件下で、クロマトグラフィー工程によって、関心対象のタンパク質が、カラムに接着する一方、他の物質がカラムを通過することが可能になる。次いで、適切な緩衝液によって、関心対象のタンパク質が差次的に溶出される。あるいは、適切な条件下で、カラムに不純物を接着させる一方、関心対象のタンパク質がカラムの中を通過する、すなわち関心対象のタンパク質が「フロースルー」に存在することによって、不純物から所望のタンパク質を分離してもよい。
【００７９】
一般の当業者は、望ましい場合、本発明の方法に低pH保持を組み入れてもよいことを認識するものとする。治療タンパク質の産生のため、監督官庁はウイルス・クリアランスを要求するため、異なる化学的作用様式に基づいて、ウイルス不活性化およびクリアランスの少なくとも2つの別個の工程がある必要があり、これらは典型的には低pH保持およびウイルスろ過工程である。低pH保持は、典型的には、精製された試料のpHシフトを使用し（例えば以下の実施例を参照されたい）、かつ第二のクロマトグラフィー工程用に調製するのに必要なpH操作中に組み入れ可能である。一般の当業者は、第二のカラム上に適用する前に、関心対象のタンパク質を含有する混合物が、適切に緩衝されているという条件で、低pH保持によって典型的には達成されるウイルス・クリアランスを達成するために当技術分野に公知の任意の方法論を用いて、2つのクロマトグラフィー工程間のpH保持を達成してもよいことを認識するものとする。
【００８０】
例えば、限定を意図することなく、1N HClまたは氷酢酸を用いて、HCIC溶出液のpHを約3.4〜3.6のpH範囲に減少させ、その後、2M Tris pH9.0で、溶出液のpHを約6.2に増加させることによって、HCIC後の低pH保持を達成可能であり；あるいは、CEXC後、1N HClまたは氷酢酸を用いて、CEXC溶出液のpHを、約3.4〜3.6のpH範囲に減少させ、かつ2M Tris pH9.0で、溶出液のpHを約7.0に増加させてもよい。pH保持は、典型的には、伝導度の少なくとも0.5mS/cmの増加を生じると考えられる。
【００８１】
一般の当業者は、本発明の方法で用いる低pH保持工程の適切なタイミング条件を認識すると思われる。典型的には、低pH保持は、少なくとも約30分間、好ましくは約45分間、より好ましくは約60分間まで、かつ最も好ましくは約90分間まで行われる。特定の精製スキームにおいて、精製されるタンパク質に応じて、低pH保持を5時間まで行うことが望ましい可能性もある。
【００８２】
治療的等級タンパク質配合が望ましい場合、第二のウイルスクリアランス工程、例えばウイルスろ過工程を使用してもよいが、これは本発明の方法によって達成可能な純度レベルを達成するのに必要ではない。ウイルスおよび他の生物学的物質を除去するため、好ましくはポリオウイルスを除去可能な20nmより小さい孔サイズを持つ、本発明の方法で使用可能なろ過装置が当技術分野に周知である（例えば、Ultipor（登録商標） VF Grade DV20またはDV50およびFiltron（登録商標）TFF (Pall Corporation, East Hills, NY); Viresolve (Millipore, Billerica, MA); VR CUNO (CUNO; Meriden, CT); ならびにPlanova（登録商標） (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, IL）)。
【００８３】
任意の機械的手段によって、本発明のクロマトグラフィー工程を行ってもよい。カラム中でクロマトグラフィーを行ってもよい。圧を伴いまたは伴わずに、かつ上部から下部へまたは下部から上部へ、カラムを用いてもよい。カラム中の流体の流れの方向を、クロマトグラフィープロセス中に逆転させてもよい。また、引力、遠心分離、またはろ過を含む、任意の適切な手段によって、試料を装填し、洗浄し、かつ溶出するために用いる液体から、固体支持体を分離するバッチプロセスを用いて、クロマトグラフィーを行ってもよい。また、クロマトグラフィー樹脂に関して記載するものと同じ化学的原理を用いて、他のものより強く、試料中のある分子を吸収するかまたは保持する荷電フィルターと試料を接触させることによって、クロマトグラフィーを行ってもよい。本発明で用いるカラムの調製における工程を、実施者の個々の必要を満たすように調整してもよいが、以下の説明を指針として提供し、かつ一般の当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、適切な改変を行ってもよいことを認識すると思われる。製造者の指示にしたがって、カラムを調製する。精製前に、典型的には、浄化溶液を用いてカラムを浄化し、次いで離液性の塩、例えば1M NaClを用いて荷電し、かつ平衡化緩衝液を用いて平衡化する。浄化工程中、生物学的起源の混入物質を含む、結合したいかなる混入物質を有する樹脂も清浄化するため、典型的には、浄化溶液をカラム上に適用した後、約30分間、好ましくは約1時間、保持する。電荷工程は、浄化溶液を置換することによって、樹脂を中和し、例えば、CEXCでは、NaClを用いて、カラムからNaOHを除去し、かつ樹脂リガンドを正に荷電したイオンと接触させつつ維持してもよい。カラムが荷電された後、関心対象のタンパク質と結合するように、樹脂のpHおよび伝導度を調製するため、平衡化緩衝液を用いて、カラムを平衡化する。例えば、pHおよび伝導度が、それぞれ、平衡化緩衝液のpHおよび伝導度の±0.1以内および±0.2mS/cm以内である場合、カラムは平衡化されたと見なされ得る。
【００８４】
典型的には、濃縮され、かつ適切に緩衝された塩（すなわち装填緩衝液）中で緩衝液交換された細胞培養上清である、装填混合物を調製する。平衡化緩衝液と任意で同じであってもよい、装填緩衝液を用いて、組換え宿主細胞から得た装填混合物（すなわち精製が望ましい、関心対象のタンパク質を含有する）を、平衡化カラム（CEXCまたはHCICいずれか）上に装填する。混合物は、カラムの固相の中を流れ、関心対象のタンパク質および他の不純物（例えばタンパク質がCHO細胞内で産生される場合、HCP）が、固相に差次的に結合し、それによって、タンパク質および混入物質が、クロマトグラフィーカラムの中を通過するにつれて、分離が可能になる。
【００８５】
混合物をカラム上に装填し、かつ混合物が樹脂に結合したら、記載するような洗浄緩衝液を用いた洗浄工程を行って、カラムから混入物質を一掃する。任意で、例えば数分間（例えば5〜10分間）の滞留時間に対応する流速を用いて、他の洗浄および溶出工程より遅い流速で、第一の洗浄工程を行ってもよい（が必要ではない）。以下にさらに詳細に流速を論じる。HCPの除去を最大にするためには、洗浄緩衝液のpHおよび伝導度は、特にHCICクロマトグラフィーの場合、最初の洗浄中、重要である。本発明の方法において、CEXCクロマトグラフィーの洗浄工程は、核酸および残存HCPを除去する一方、関心対象のタンパク質を保持する。HCICクロマトグラフィーの最初の洗浄工程は、HCPを除去する一方、第二の洗浄は、より親水性の混入物質、例えばHCPを除去する。HCICでは、核酸の大部分が、非結合画分中を流れるため、HCICは、核酸除去に非常に効率的である。HCICを第一のカラムとして使用する場合、第三の洗浄工程を使用して、任意の親水性混入物質のレベルをさらに減少させてもよい。
【００８６】
カラムから関心対象のタンパク質を溶出するため、上述のように適切な溶出緩衝液を用いて、関心対象のタンパク質の結合を無効にして、カラムから離れるようにする。緩衝液組成物中の緩衝剤、塩、および／または他の化合物の種類および濃度は、緩衝液が、関心対象のタンパク質と比較して、差次的に不純物を溶出する一方、関心対象のタンパク質が不純物に比較して保持されるようなものである。溶出中に関心対象のタンパク質が回収されるように、指針として本明細書に提供する実施例を用いて、一般の当業者は、装填、洗浄、および溶出緩衝液に適したpHおよび伝導度範囲を容易に決定可能である。関心対象のタンパク質を含有する溶出液中で、HCPを最小限にするため、以下に記載する減少した流速を使用してもよく、これは例えば、2分間の滞留時間に対応する流速より速くなく、より好ましくは3分間の滞留時間に対応するものより速くなく、より好ましくは10分間の滞留時間に対応するものより速くない。関心対象のタンパク質がカラムから除去されるのにつれて、吸光度によって測定されるように、ベースラインを5〜25%の間で超える、上昇するA280から下降するA280のピークの形成に基づいて、これを収集する。ベースラインは、緩衝液がカラムの中を通過する間、250〜280nmで、平衡化緩衝液の吸光度を測定することによって、一般の当業者により、容易に決定可能である。HCPの収集を減少させて、関心対象のタンパク質を含有する精製された組成物を調製するため、関心対象のタンパク質を含有する溶出液を、ピークの最大の高さの25%より前に収集することが好ましく、これは、HCPが、HCIC樹脂に関しては、より遅い時間またはより低いpHの際に溶出する傾向があるためである。
【００８７】
本質的に、本発明で用いる分離法は、混入物質が、長いカラムを異なる速度で下方に移動するようにして、これらがカラムのさらに下へと通過するにつれて増加する、物理的分離を達成する一方、関心対象のタンパク質は、クロマトグラフィー媒体に接着し、かつ次いで緩衝液に応じて、差次的に溶出される。本発明の精製法において、混合物がカラム（HCICまたはCEXC）を下方に移動する最大速度は、30分間の滞留時間より長くなく、好ましくは10分間より長くなく、より好ましくは6分間より長くなく、さらにより好ましくは3分間より長くなく、かつ最も好ましくは2分間より長くない。本発明の特定の態様において、CEXC工程の流速は、約2分間より長くない滞留時間に対応し；HCIC工程では、3分間より長くない。流速は、本発明の方法によって得られ得る純度レベルを達成するために本質的ではないが、指針の目的で、速度を提供する。一般の当業者は、必要に応じて流速を修正してもよい。
【００８８】
本発明のプロセスによるタンパク質精製の好ましい尺度は、宿主細胞タンパク質除去の尺度である。精製タンパク質は、好ましくは、上に定義するように、均質な組成物である。精製の任意の段階での試料のタンパク質濃度を、任意の適切な方法によって決定してもよい。こうした方法は、当技術分野に周知であり、かつ：1）Lowryアッセイ法、Bradfordアッセイ法、Smithアッセイ法、およびコロイド性金アッセイ法などの比色法；2）タンパク質のUV吸収特性を利用する方法；および3）同じゲル上の公知の量のタンパク質標準との比較に頼る、ゲル上の染色タンパク質バンドに基づく視覚的概算を含む。例えば、Stoschek (1990), Quantitation of Protein, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymol. 182: 50-68を参照されたい。当技術分野に公知の多様な手段によって、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ法(ELISA; 例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Reen (1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), in Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32: 461-466を参照されたい)によって、関心対象のタンパク質を含有する均質な組成物のタンパク質混入を決定してもよい。
【００８９】
関心対象のタンパク質を含有する均質な組成物に存在しうるDNAの量を任意の適切な方法によって決定してもよい。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用するアッセイ法を用いてもよい。DNAを10pg/mg未満のレベルに減少させてもよい。
【００９０】
こうして回収されたタンパク質を、生物薬剤的に許容しうる組成物中に配合してもよく、かつこれを、こうした分子に関して公知である、多様な診断、治療または他の使用のために用いる。
【００９１】
関心対象のタンパク質を含有する溶出液を収集した後、クロマトグラフィーに用いた緩衝液または塩を含むが、より高いモル濃度または修正されたpHである溶液を用いて、クロマトグラフィー媒体を剥離することによって、カラムに結合したままであり得るいかなるタンパク質も遊離させてもよい。次いで、クロマトグラフィー媒体から大部分のまたはすべてのタンパク質を遊離させ、かつクロマトグラフィー媒体中に存在し得るいかなる微生物混入も減少させるかもしくは排除する効果を有すると考えられる溶液（例えば再生溶液）を用いて、カラムを再生してもよい。続いて、カラムをリンスし、かつ微生物増殖を阻止する溶液中で保存してもよい。こうした溶液は、水酸化ナトリウムを含んでもよいが、エタノール、アジ化ナトリウム、ベンジルアルコールまたは高濃度の離液性塩などの、他の試薬もまた用いてもよい。
【００９２】
本発明を立証する目的で、以下の実施例を提供し、かつこれは限定されることを意図しない。
【００９３】
実施例
本発明は、本発明の精製法を用いた抗体の精製を記載する。MedarexのHuMAb Mouse（登録商標）を用いて、活性化T細胞関連抗原（CTLA-4）および腫瘍関連抗原（CD30）に対する完全ヒト抗体を調製した。CHO DG44細胞を用いて、トランスフェクトーマを調製した。中性pH（7〜8）および10〜16mS/cmの間の伝導度で、合成で血清を含まない定義された培地を用いて、細胞培養を行った。DG44 CHO細胞を約3〜10x106細胞/mlの密度まで増殖させた。60MO2 CUNOフィルター（Meriden, CT）を用いたろ過によって、細胞培養を清澄化した。生じた細胞培養上清を濃縮し、かつ35mMまたは70mMリン酸ナトリウム、pH6.2のいずれかにおいてダイアフィルトレーションした。MEP Hypercelを捕捉樹脂として用いる実験では、濃縮し、かつダイアフィルトレーションした細胞培養上清を、1M NaOHで滴定することによって、装填物をpH7に調整した。2つの抗体のいずれかを含有する混合物の精製を、以下に記載するようないずれかの方向で行った。
【００９４】
表1および2は、治療的等級タンパク質物質の産生のための本発明の精製プロセスにおける2つの工程の例を示す。このプロセス（A）において、第一の非アフィニティーCEXCクロマトグラフィー工程は、捕捉のためにPoros 50HS樹脂を用いる、陽イオン交換クロマトグラフィー（表1）であり、その後、1N HClまたは氷酢酸を用いて溶出液のpHを3.4〜3.6に減少させ、かつ2M Tris pH9.0で、画分のpHを7.0に増加させる、低pH保持が続いた。第二の非アフィニティー工程は、捕捉のためにMEP HyperCel樹脂を用いるHCIC（表2）であった。低pH保持は、典型的には、伝導度の約2mS/cmの増加を生じた。表1および2に示すような各樹脂用の平衡化、装填、洗浄および溶出緩衝液を用いて、プロセスを実行した。どちらの精製工程もインプロセス緩衝液交換工程を用いず、すなわち試料は、低pH保持の一部としてのpH操作のみを用いて、1つのクロマトグラフィー工程から次の工程に進行した。
【００９５】
CEXCおよびHCICクロマトグラフィー工程が逆転した、すなわち表2の工程を最初に行い、その後、表1の工程が続く、治療的等級タンパク質物質の産生のための別のプロセス（B）を行った。第一の非アフィニティークロマトグラフィー工程は、表2に記載するような、捕捉のためにMEP HyperCel樹脂を用いるHCICであった。1N HClまたは氷酢酸を用いた低pH保持を行って、MEP溶出液のpHを3.4〜3.6に減少させ、その後、2M Tris、pH9.0で、画分のpHを6.2に増加させた。低pH保持は、典型的には、伝導度の約2mS/cmの増加を生じた。第二の（CEXC）クロマトグラフィー工程は、表1に記載するような、ポリッシング（polishing）のためにPoros 50HS樹脂を用いる、CEXCであった。表に示すような各樹脂用の平衡化、装填、洗浄および溶出緩衝液を用いて、プロセスを実行した。別のプロセスのいずれの精製工程もインプロセス緩衝液交換工程を含まず、すなわち試料は、低pH保持の一部としてのpH操作のみを用いて、1つのクロマトグラフィー工程から次の工程に進行した。
【００９６】
（表１）抗体捕捉またはポリッシングのための陽イオン交換クロマトグラフィー：主な操作詳細の要約
2008535913.tif 000002
結合能は、15mg/ml樹脂で一定であった。流速を、対応する滞留時間で表し、より広い実験柔軟性を提供する。作業温度は、15〜25℃で多様であった。NaP=リン酸ナトリウム。  
【００９７】
（表２）抗体捕捉またはポリッシングのためのMEP HyperCelクロマトグラフィー：主な詳細の要約
2008535913.tif 000003
結合能は、15mg/ml樹脂で一定であった。流速を、対応する滞留時間で表し、より広い実験柔軟性を提供する。作業温度は、15〜25℃で多様であった。NaP=リン酸ナトリウム。
【００９８】
CHOPレベルを確認する標準的ELISA法、DNAレベルを確認するPCR、および抗体のモノマー純度を確認するHPLC-SECを用いると、2つの精製法AおよびBの各々は、100ppm未満の宿主細胞タンパク質（以下の表3を参照されたい）、10pg未満のDNA/mg抗体、かつ99%より高いモノマーを含有する均質な組成物を達成し、これによって、治療的等級産物までの精製物質のさらなるプロセシングおよび配合が可能になる。第一の工程後の混入物質濃度は、CHOPに関しては200〜1500ng/mgの間、かつ95〜100%モノマーで多様であった。2つの異なる完全ヒトモノクローナル抗体を用いたプロセスAおよびBの結果を表3に報告する。
【００９９】
（表３）示唆される精製スキームを用いた混入物質除去の要約
2008535913.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明の2工程精製プロセスの流れ図を示し、パネルAおよびパネルBは、異なる順番で用いられる同じ樹脂を指す。パネルAは、本発明の精製プロセスの第一の態様に対応し、陽イオン交換クロマトグラフィー（CEXC）が捕捉クロマトグラフィー工程であり、その後、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（HCIC）が続き、2つのクロマトグラフィー工程間には、pH操作のみがある。パネルBは、第二の態様に対応し、HCICが捕捉クロマトグラフィー工程であり、その後、CEXCが続き、2つのクロマトグラフィー工程間には、pH操作のみがある。捕捉中の適切な結合pHは、パネルAでは6.2であり、かつパネルBでは7.0である。
【図１】
2008535913.tif 000005
【国際調査報告】
2008535913.tif 000006
2008535913.tif 000007
2008535913.tif 000008