(57)【要約】  リラキシン−３のキメラポリペプチド、そのプレプロポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに関連する発現ベクターおよび宿主細胞を記述する。該ポリペプチドは、アッセイ方法で使用しうるＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２との受容体−リガンド複合体を調製するのに使用しうる。
2008512091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖を含んでなる、生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項２】
前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択される、請求項１に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項３】
前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖がインスリン様５のＡ鎖である、請求項２に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド。
【請求項５】
第一のペプチド結合によりリラキシンＣ鎖に結合されたリラキシンＢ鎖（該リラキシンＣ鎖は第二のペプチド結合によりリラキシン／インスリンファミリーメンバーのＡ鎖にさらに結合される）、ならびに、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間の第二のペプチド結合およびＣ鎖とＢ鎖の間の第一のペプチド結合から選択される最低１個の位置に挿入されたプロテアーゼ切断部位を含んでなる、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ａ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択される、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記プロテアーゼ切断部位がＣ鎖およびＡ鎖を結合するペプチド結合に挿入されている、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記プロテアーゼ切断部位がフリン切断部位である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
（ｉ）配列番号７に示されるところのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするその相補物、よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項５に記載のポリヌクレオチドによりコードされるプレプロポリペプチド。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドによりコードされるプレプロポリペプチド。
【請求項１２】
組換え宿主細胞中での発現に適する発現ベクターであって、前記ベクターが請求項９に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、上記ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる受容体成分を含んでなる受容体−リガンド複合体であって、前記受容体成分が、請求項１に記載の生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるリガンド成分に結合されている、上記複合体。
【請求項１５】
前記生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有しかつ放射性同位体標識を担持する、請求項１４に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１６】
前記受容体成分が、単離された細胞膜若しくは脂質小胞と会合したＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１７】
前記受容体成分および前記リガンド成分がそれぞれ実質的に純粋な形態にある、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１８】
受容体成分がＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方を含んでなる、請求項１５に記載の受容体−リガンド複合体。
【請求項１９】
（ａ）請求項５に記載の第一の発現ベクター、および挿入されたプロテアーゼ切断部位でリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドを切断するためのプロテアーゼを発現する第二のベクターで宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすること；ならびに
（ｂ）リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドおよびプロテアーゼ双方が発現されるように宿主細胞を増殖させて、それによりプロテアーゼがリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドの前記挿入されたプロテアーゼ切断部位でペプチド結合を切断して成熟リラキシン−３キメラポリペプチドを生じること
を含んでなる、組換え細胞からの成熟リラキシン−３キメラポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
プロテアーゼがフリンであり、かつ、プロテアーゼ切断部位がフリン部位である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２をコードする発現ベクターで形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞の細胞表面上で受容体成分を発現させること；および該受容体成分をリラキシン−３キメラポリペプチドと複合体形成させることをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）化合物を含んでなる試験サンプルを、（ｉｉ）最低１種の受容体および請求項１に記載のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）を実施した後に、最低１種の受容体の生物学的活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で測定した生物学的活性を、化合物を含有しない対照サンプルをアッセイ試薬と接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体の生物学的活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２３】
前記最低１種の受容体がラット由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記最低１種の受容体がヒト由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的活性を前記測定することが、受容体−リガンド複合体の形成を同定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
リガンド成分が放射標識され、また、受容体−リガンド複合体の形成を前記同定することがオートラジオグラフィーを実施することを含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的活性を前記測定することが二次メッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的活性を前記測定することが、細胞内カルシウムイオン濃度若しくは細胞内ｃＡＭＰ濃度により
二次メッセンジャー応答を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記最低１種の受容体が、ＧＰＣＲ１３５宿主細胞若しくはＧＰＣＲ１４２宿主細胞からの単離された細胞膜と会合され、また、該最低１種の受容体の生物学的活性を前記測定することが、３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３３Ｐ−ＧＴＰγＰおよび３２Ｐ−ＧＴＰγＰよりなる群から選択されるγ−リン酸標識ＧＴＰ分子を使用して、単離された膜のタンパク質リン酸化の量を測定することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
リラキシン−３キメラポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）最低１種の受容体を、試験化合物、および請求項１に記載の標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該最低１種の受容体に結合する該標識リラキシン−３キメラポリペプチドの量を測定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で得られる量を、該最低１種の受容体を試験化合物の非存在下で該標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階
を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体に結合する化合物の同定方法。
【請求項３２】
前記最低１種の受容体がラット由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記最低１種の受容体がヒト由来の生物学的サンプルの一成分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
標識リラキシン−３キメラポリペプチドが、リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖を含んでなり、前記リラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖が、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖およびインスリン様６のＡ鎖よりなる群から選択され、かつ、該標識リラキシン−３キメラポリペプチドが放射標識で標識されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
標識キメラリラキシン−３ポリペプチドが、配列番号２３に示されるところのアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般として、生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド、ならびにそれらの製造法、および例えばアッセイ試薬としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リラキシン−３（ＩＮＳＬ７としてもまた知られる）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２のリガンドであることが見出されている。特許文献１および特許文献２（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０００３】
ＧＰＣＲは、ホルモン、神経伝達物質、ペプチド、脂質、イオン、光、臭気物質、ヌクレオチド、脂肪酸誘導体および他の化学媒介物質を包含する多様な細胞外シグナルの伝達を司る膜貫通受容体タンパク質である。例えば特許文献３を参照されたい。ＧＰＣＲは優れた薬物標的として確立されている、すなわち、それらは市販の薬物の５０％の標的であるため、それらは薬物の発見にとりわけ重要である。増大する数の疾患がＧＰＣＲと関連することが見出されている。ＧＰＣＲを標的とする薬物は、心血管系から胃腸ないしＣＮＳおよび他者までの広範な障害を処置するのに使用されている（非特許文献１）。
【０００４】
ＧＰＣＲ媒介性のシグナル伝達事象は、ＧＰＣＲへの特異的リガンドの結合に際してしばしば開始される。各ＧＰＣＲは、細胞外Ｎ末端ドメイン、７個の別個の膜貫通セグメント、および細胞内Ｃ末端ドメインから構成される。ＧＰＣＲの細胞外Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン若しくは細胞内ループへのリガンドの結合は、ＧＰＣＲと関連する細胞内のヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）の活性化に至るコンホメーション変化をもたらす。これらの活性化型Ｇタンパク質は、順に、細胞の生理学を調節する多様な細胞内応答を媒介する。従って、リガンドは、ＧＰＣＲの生理学的機能の解明手段、ならびにＧＰＣＲのシグナル伝達活動を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【０００５】
現在のところ、わずか約２００種のＧＰＣＲが、約７０種の既知のリガンドにより活性化される既知のＧＰＣＲと分類されている。配列分析により、ＧＰＣＲはヒトゲノムの最大のスーパーファミリーの１種（すなわちＧＰＣＲをコードする１０００を超える遺伝子で評価された）に属することが発見された（非特許文献２）。多数の推定のＧＰＣＲが、それらの天然のリガンドが未知であるため、オーファン受容体として記述されている。これらの特徴付けられていないオーファンＧＰＣＲのいくつかは治療薬として有用でありうる。ＧＰＣＲに対する特異的リガンドの同定は、これらのオーファンＧＰＣＲの潜在的な治療上の利益の利用へのカギである（非特許文献３）。
【０００６】
上で示されたとおり、リラキシン−３（ＩＮＳＬ７としてもまた知られる）は、ＧＰＣＲ１３５ならびにＧＰＣＲ１４２のリガンドであることが見出された。非特許文献４；および非特許文献５を参照されたい。リラキシン−３はインスリン／リラキシンスーパーファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、３個のジスルフィド結合により連結されるペプチドサブユニット（Ａ鎖およびＢ鎖）を特徴とする。該３個のジスルフィド結合の２個はサブユニット間結合であり、そして別の１個はＢ鎖中の鎖内結合である。該ファミリー中で、インスリン、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２は、１膜貫通受容体であるチロシンキナーゼ／成長因子受容体によるグルコース代謝およびシグナルの調節に関与していると報告された。リラキシン／インスリンスーパーファミリーの別のメンバーはインスリン様（ＩＮＳＬ）５であり（非特許文献６）、これはＧＰＣＲ１４２の選択的リガンドであると考えられている（例えば特許文献４（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。該ファミリーの２種の他のメンバーは、ＬＧＲ７および／若しくはＬＧＲ８のリガンドのリラキシンおよびＩＮＳＬ３であり、Ｎ末端細胞外ドメインにロイシン豊富な反復配列をもつＧＰＣＲである。リラキシン−３はＬＧＲ７の付加的なリガンドであることもまた報告された。
【０００７】
ＧＰＣＲ１４２の発現パターンは、脳中での発現に加えて豊富な末梢組織分布を伴い、ＧＰＣＲ１３５およびリラキシン−３のものと異なる（非特許文献５）。われわれは、ＧＰＣＲ１４２が、ヒト、サル、ウシおよびブタの間で高度に保存されているが、しかし、マウスおよびラット双方のげっ歯類種におけるリラキシン−３遺伝子のかなりの程度の保存にもかかわらず、マウスではより少なく保存され、また、ラットで偽遺伝子が存在し、ＧＰＣＲ１４２がげっ歯類でＧＰＣＲ１３５と異なる機能および減少された機能を有することを示唆することを見出した。ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の全部の生理学的機能は完全に解明されるべきままである。リラキシン−３のｉｎ  ｖｉｖｏ投与はまた、脳および末梢の双方で発現されるＬＧＲ７も活性化する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。従って、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２の機能のｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、これら２種の受容体サブタイプの選択的薬理学的ツールの欠如により混乱されている。
【特許文献１】米国仮出願第６０／４９３，９４１号、２００３年８月７日出願
【特許文献２】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５６６６号、２００４年２月２５日出願
【特許文献３】ＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０２／００７１９号
【特許文献４】米国仮出願第６０／５８０，０８３号
【非特許文献１】Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８、Ｂｒｉｔｉｓｈ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１２５：１３８７−１３９２
【非特許文献２】Ｃｉｖｅｌｌｉら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４：２３０−２３７
【非特許文献３】Ｈｏｗａｒｄら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２２：１３２−１４０
【非特許文献４】Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４
【非特許文献５】Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７６５−５０７７０
【非特許文献６】Ｃｏｎｋｌｉｎら  １９９９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６０（１）：５０−５６
【非特許文献７】Ｈｓｕら、２０００、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１４：１２５７−１２７１
【非特許文献８】Ｈｓｕら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：６７１−６７４
【非特許文献９】Ｔａｎら、１９９９、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１２７：９１−９８
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
リラキシン−３の生物学的に活性のキメラポリペプチドが今や発見された。
【０００９】
従って、全般的な一局面において、本発明は、リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン／インスリンポリペプチドファミリーメンバーのＡ鎖を含んでなる、生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドに関する。好ましい態様において、該Ａ鎖は、リラキシン−１のＡ鎖、リラキシン−２のＡ鎖、インスリン様３のＡ鎖、インスリン様４のＡ鎖、インスリン様５のＡ鎖若しくはインスリン様６のＡ鎖である。より好ましくは、該Ａ鎖はインスリン様５のＡ鎖である。なおより好ましくは、該キメラペプチドは、配列番号２３
に示されるところのアミノ酸配列を有するヒトリラキシン−３のＡ鎖／ヒトＩＮＳＬ５のＢ鎖である。
【００１０】
本発明はまた、上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも向けられる。従って、全般的な一局面において、本発明は、第一のペプチド結合によりリラキシンＣ鎖に結合されたリラキシンＢ鎖（該Ｃ鎖は第二のペプチド結合によりリラキシン／インスリンファミリーメンバーのＡ鎖にさらに結合される）、ならびに、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間の第二のペプチド結合およびＣ鎖とＢ鎖の間の第一のペプチド結合から選択される最低１個の位置に挿入されたプロテアーゼ切断部位を含んでなる、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドに関する。好ましい一態様において、該プロテアーゼ切断部位、好ましくはフリン切断部位は、Ｃ鎖およびＡ鎖を結合するペプチド結合に挿入される。好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列番号７に示されるところのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、およびストリンジェントな条件下でこうしたポリヌクレオチドにハイブリダイズするその相補物から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
別の局面において、本発明はこうしたポリヌクレオチドによりコードされるプレプロポリペプチドに向けられる。
【００１２】
なお別の局面において、本発明は、組換え宿主細胞中での発現に適する発現ベクターに関し、該ベクターは前述のポリヌクレオチドを含んでなる。
【００１３】
本発明の別の局面は、該発現ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明の付加的な全般的一局面は、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる受容体成分を含んでなる受容体−リガンド複合体に関し、該受容体成分は、生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるリガンド成分に結合される。好ましい態様において、該ポリペプチドは、配列番号２３に対応しかつ放射性同位体標識を担持する。他の好ましい態様において、該受容体成分は、単離された細胞膜若しくは脂質小胞と会合したＧＰＣＲ１３５および／若しくはＧＰＣＲ１４２を含んでなる。好ましくは、該受容体およびリガンド成分はそれぞれ実質的に純粋な形態にある。
【００１５】
さらなる全般的な一局面において、本発明は：（ａ）上述されたところの第一の発現ベクター、および挿入されたプロテアーゼ切断部位でリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドを切断するためのプロテアーゼを発現する第二のベクターで宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすること；ならびに、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドおよびプロテアーゼ双方が発現されるように宿主細胞を増殖させて、それによりプロテアーゼがリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドの該挿入されたプロテアーゼ切断部位でペプチド結合を切断して成熟リラキシン−３キメラポリペプチドを生じることを含んでなる、組換え細胞からの成熟リラキシン−３キメラポリペプチドの製造方法に関する。好ましくは、該方法は：ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２をコードする発現ベクターで形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞の細胞表面上で受容体成分を発現させること；および該受容体成分をリラキシン−３キメラポリペプチドと複合体形成させることをさらに含んでなる。
【００１６】
本発明はまた、全般として：（ａ）化合物を含んでなる試験サンプルを、受容体および生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるアッセイ試薬と接触させること；（ｂ）その後、該受容体の生物学的活性を測定すること；ならびに（ｃ）測定された生物学的活性を、化合物を含有しない対照サンプルをアッセイ試薬と接触させることにより得られる対照測定値と比較することを含んでなる、ＧＰＣＲ１３５および／若し
くはＧＰＣＲ１４２の生物学的活性を調節する化合物の同定方法に関する。好ましくは、該受容体はラット若しくはヒト由来の生物学的サンプルの一成分である。生物学的活性の測定は、（例えばオートラジオグラフィーを使用して）受容体−リガンド複合体の形成を同定すること、または（例えば細胞内カルシウムイオン濃度若しくは細胞内ｃＡＭＰ濃度により）二次メッセンジャー応答を測定することを含みうる。例えば、受容体は、ＧＰＣＲ１３５宿主細胞若しくはＧＰＣＲ１４２宿主細胞からの単離された細胞膜と会合させることができ、また、生物学的活性は、３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、３３Ｐ−ＧＴＰγＰ若しくは３２Ｐ−ＧＴＰγＰのようなγ−リン酸標識ＧＴＰ分子を使用して、単離された膜のタンパク質リン酸化の量を測定することにより、測定しうる。
【００１７】
別の局面において、本発明は：（ａ）受容体を、試験化合物、および標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させること；（ｂ）該受容体に結合する該標識リラキシン−３キメラポリペプチドの量を測定すること；ならびに、（ｃ）段階（ｂ）で測定された量を、該受容体を試験化合物の非存在下で該標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させることにより得られる対照測定値と比較することを含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２から選択される最低１種の受容体に結合する化合物の同定方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の局面、特徴および利点は、本発明の詳細な記述およびその好ましい態様ならびに付随する請求の範囲を包含する以下の開示から明らかであろう。
［発明の詳細な記述］
本明細書で引用される、若しくは本明細書で引用される受託番号に対応する全部の刊行物の開示は、ここに引用することにより組み込まれる。本明細書に定義されないか若しくは別の方法で下に示されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、当該技術分野で一般に理解されると同一の意味するところを有する。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「含んでなる」、「包含する」および「含有する」という用語は、それらの公然の制限しない意味で使用される。
【００２０】
以下は本明細でときに使用される略語である：
ｂｐ＝塩基対
Ｃａ２＋＝カルシウムイオン
ｃＡＭＰ＝環状アデノシン一リン酸
ｃＤＮＡ＝相補ＤＮＡ
ＣＮＳ＝中枢神経系
ｋｂ＝キロ塩基対；１０００塩基対
ｋＤａ＝キロダルトン；１０００ダルトン
ＧＰＣＲ＝Ｇタンパク質共役受容体
Ｇタンパク質＝ＧＴＰ結合タンパク質
ＧＴＰ＝グアノシン５’−三リン酸
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＳｉＲＮＡ＝小分子干渉ＲＮＡ
ＵＴＲ＝非翻訳領域
【００２１】
上に示されるとおり、本発明のある一般的な態様は、単離された生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチド、該リラキシン−３キメラポリペプチドが生じる未熟なプレプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、こうしたポリヌクレオチドを含んで
なる発現ベクター、およびこうしたベクターによりトランスフェクト若しくは形質転換された組換え宿主細胞に関する。
【００２２】
例示的リラキシン−３ポリペプチドは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号ＮＰ＿５４３１４０）、ラット（配列番号５１）（Ｂｕｒａｚｉｎら、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、８２：１５５３−１５５７；ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号ＮＰ＿７３３７６７；ヒトのものに対する７６．４％の配列同一性）、マウス（配列番号４９）（Ｂａｔｈｇａｔｅら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：１１４８−１１５７；ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号ＸＰ＿１４６６０３；ヒトのものに対する７８．７％の配列同一性）、ならびにブタおよびサルを包含する他の動物で同定されたリラキシン−３オルソログを包含する。これらのポリペプチドは、適するキメラを形成するためのリラキシン−３ユニットの供給源として使用し得る。
【００２３】
「リラキシン−３キメラポリペプチド」若しくは「リガンド成分」は、ジスルフィド架橋すなわち結合により連結されたリラキシン−３ポリペプチドのＢ鎖およびリラキシン／インスリンファミリーメンバーのＡ鎖、若しくはこうした成熟ポリペプチドすなわち分泌型タンパク質の機能上同等なフラグメントを含有する分泌型タンパク質である、成熟リラキシン−３キメラポリペプチド若しくはその活性フラグメントを意味している。
【００２４】
「リラキシン／インスリンファミリーメンバー」は、指定されたポリペプチドに関して、機能の相同性（例えば類似の型の受容体との会合のような類似の生物学的活性を有する）若しくはアミノ酸配列の相同性をもつポリペプチドである。例示的リラキシン／インスリンファミリーメンバーのポリペプチドは、リラキシン−１、リラキシン−２、リラキシン−３のようなリラキシンポリペプチド、ならびにインスリン様３（ＩＮＳＬ３）、インスリン様４（ＩＮＳＬ４）、インスリン様５（ＩＮＳＬ５）およびインスリン様６（ＩＮＳＬ６）のようなＩＮＳＬともまた命名されるインスリン様ポリペプチドを包含する。リラキシン／インスリンファミリーメンバーの例示的オルソログは、付随する配列表で同定されるオルソログを包含する。従って、例示的態様において、リラキシン−３キメラポリペプチドは、リラキシン−３成分、および上述されたリラキシン／インスリンファミリーメンバーのオルソログのいずれかからのリラキシン／インスリンファミリーメンバーの成分由来である。
【００２５】
「リラキシン−３キメラプレプロポリペプチド」はリラキシン−３キメラポリペプチドの前駆体を意味している。
【００２６】
リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドおよびポリペプチドの好ましい態様は、例えば、（１）以下のキメラ（Ｂ鎖／Ａ鎖）、すなわちヒトリラキシン−３／リラキシン−１プレプロポリペプチド（配列番号１１）および成熟ポリペプチド（配列番号１９）、ヒトリラキシン−３／リラキシン−２プレプロポリペプチド（配列番号１２）および成熟ポリペプチド（配列番号２０）、ヒトリラキシン−３／ＩＮＳＬ３プレプロポリペプチド（配列番号１３）および成熟ポリペプチド（配列番号２１）、ヒトリラキシン−３／ＩＮＳＬ４プレプロポリペプチド（配列番号１４）および成熟ポリペプチド（配列番号２２）、ヒトリラキシン−３／ＩＮＳＬ５プレプロポリペプチド（配列番号１５）および成熟ポリペプチド（配列番号２３）、若しくはヒトリラキシン−３／ＩＮＳＬ６プレプロポリペプチド（配列番号１６）および成熟ポリペプチド（配列番号２４）に対する最低５０％、より好ましくは最低６０％、より好ましくは最低７０％、より好ましくは最低８０％、より好ましくは最低９０％、およびなおより好ましくは１００％のアミノ酸配列の同一性を有するプレプロポリペプチドおよび成熟ポリペプチド；または（２）こうしたリラキシン−３キメラポリペプチドに対して生じさせた抗体、例えばポリクローナル若しくはモノクローナル抗体に結合することが可能であるプレプロポリペプチド若しくはポリペプチドを包含する。
【００２７】
「生物学的に活性」であるポリペプチド若しくはポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるところの生物学的活性を発揮する。こうした活性は、第二のタンパク質との会合若しくはそれに対する酵素活性のような直接活性、または第二のタンパク質との該タンパク質の相互作用により媒介される細胞のシグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。生物学的活性は、下述される例示的技術のような標準的技術に従って測定しうる。
【００２８】
例えば、下述される好ましいリラキシン−３キメラポリペプチドにより有される生物学的活性は、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８に結合しない一方でＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２に高親和性で結合して、それによりＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＲＣ１４２のいずれかおよびそれらで支配されるシグナル伝達事象を選択的に刺激するその能力である。ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２の例示的一生物学的活性は、リラキシン−３キメラポリペプチドへの結合に際して、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２が、ＧＴＰに対する高親和性を有するＧタンパク質を活性化することを介して環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）およびカルシウムのような細胞内シグナル伝達分子（二次メッセンジャー分子）の濃度を変える一連の事象を活性化することである。これらの細胞内シグナル伝達分子は、順に、細胞の生理学および挙動を変える。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「ＧＰＣＲ１３５」および「ＧＰＣＲ１４２」それぞれは：（１）ヒト受容体タンパク質（場合によってはＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２）に対する約６０％以上の配列同一性を有するか；（２）ヒトタンパク質に対し生じさせた抗体、例えばポリクローナル若しくはモノクローナル抗体に結合することが可能であるか；または（３）ヒト受容体ｃＤＮＡに対する約６０％以上のヌクレオチド配列の同一性を有する配列を有する核酸分子にストリンジェントなのハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチドを指す。
【００３０】
「受容体成分」は、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれか、またはＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２いずれかの活性フラグメントを指す。
【００３１】
好ましい態様において、受容体成分は、ヒトＧＰＣＲ１３５若しくはヒトＧＰＣＲ１４２いずれかに対する６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９６パーセント以上、なおより好ましくは１００％のアミノ酸配列の同一性を有する生物学的に活性のポリペプチドである。他の好ましい態様において、受容体成分は、ヒトＧＰＣＲ１３５  ｃＤＮＡ若しくはヒトＧＰＣＲ１４２  ｃＤＮＡに対する６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５パーセント以上のヌクレオチド配列の同一性を有する配列を有する核酸分子にストリンジェントなのハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
【００３２】
ＧＰＣＲ１３５はまたＳＡＬＰＲとも呼ばれる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２０００、Ｇｅｎｅ、２４８：１８３−１８９；ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号ＢＡＡ９３００１；ｃＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド受託番号Ｄ８８４３７）。例示的ＧＰＣＲ１３５分子は、ヒト（配列番号２５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＡＡ９３００１、Ｑ９ＮＳＤ７およびＮＰ＿０５７６５２）、ラット（配列番号４６および配列番号４７、ヒトのものに対する８５．９％の配列同一性）、マウス（配列番号４５、ヒトのものに対する８６．４％の配列同一性）、ならびにブタおよびサルを包含する他の動物で同定されたオルソログを包含する。受容体ＧＰＣＲ１３５の活性フラグメントは、哺乳動物のリラキシン３に結合することおよびＧタンパク質を活性化することのようなその生物学的活性を維持する受容体タンパク質のいかなるフラグメントも意味している。ヒトＧＰＣＲ１３５のタンパク質若しくはｃＤＮＡ配列は、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ００／２３１１１号、同第ＷＯ００／２４８９１号、同第ＷＯ０１／４８１８９号、同第ＷＯ０１／６２７９７号、同第ＷＯ０１／７４９０４号、および同第ＷＯ０１／８５７９１号明細書に開示されている。
【００３３】
好ましいＧＰＣＲ１４２オルソログは、ヒトＧＰＣＲ１４２（配列番号２７）、マウスＧＰＣＲ１４２（配列番号２６）、サルＧＰＣＲ１４２（配列番号２９）、ウシＧＰＣＲ１４２（配列番号３０）およびブタＧＰＣＲ１４２（配列番号３１）を包含する。ＧＰＣＲ１４２の活性フラグメントは、哺乳動物のリラキシン３に結合することおよびＧタンパク質を活性化することのようなＧＰＣＲ１４２の生物学的活性を維持するポリペプチドを意味している。ヒトＧＰＣＲ１４２のｃＤＮＡ若しくはタンパク質配列は、米国特許第５，９５５，３０９号明細書、ならびにＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０１／３６４７１号、同第ＷＯ  ０２／６１０８７号、および同第ＷＯ  ０２／００７１９号明細書に提供される。
【００３４】
好ましい態様において、リラキシン−３キメラポリペプチドは単離若しくは精製されている。「単離された」若しくは「精製された」ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生かつ単離される細胞若しくは組織供給源からの細胞性物質若しくはタンパク質汚染物質を実質的に含まない、または該ポリペプチドが化学合成される場合は化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まないものを指すことを意図している。例えば、細胞性物質を実質的に含まないポリペプチドは、約３０％、若しくは好ましくは２０％、若しくはより好ましくは約１０％、若しくはなおより好ましくは５％（乾燥重量で）未満の汚染するタンパク質を含有する調製物を包含し得る。ポリペプチドが組換えで製造される場合、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まない。例えば、培地はタンパク質調製物の容量の約２０％、若しくはより好ましくは１０％、若しくはなおより好ましくは５％未満に相当する。タンパク質を化学合成により製造する場合、それは、好ましくは化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは、該タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質若しくは他の化学物質から分離されている。従って、ポリペプチド若しくはタンパク質のこうした調製物は、約３０％、若しくは好ましくは２０％、若しくはより好ましくは１０％、若しくはなおより好ましくは５％（乾燥重量で）未満の、目的のポリペプチド以外の化学的前駆物質若しくは化合物を有する。
【００３５】
生物学的に活性のポリペプチドは数種の異なる物理的形態を有し得る。ポリペプチドは完全長の新生すなわちプロセシングされていないポリペプチド、若しくは部分的にプロセシングされたポリペプチド、またはプロセシングされたポリペプチドの組合せとして存在し得る。完全長の新生ポリペプチドは、該完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特異的タンパク質分解性の切断事象により翻訳後に修飾され得る。フラグメント若しくはフラグメントの物理的会合は、完全長ポリペプチドに関連した生物学的活性を有し得；もちろん、個々のフラグメントと関連する生物学的活性の程度は変動し得る。
【００３６】
指定されたポリペプチドの「活性フラグメント」は、該ポリペプチドの生物学的活性を維持するこうしたポリペプチドのフラグメント若しくは誘導体を意味している。例えば、活性フラグメントは、所望の生物学的活性を維持しかつ保存されたモチーフを有する改変された配列をもたらす、完全長タンパク質に対し適切な欠失、置換若しくは付加を行うことにより得ることができる。例えばリラキシン−３／ＩＮＳＬ５キメラポリペプチドの活性フラグメントの生物学的活性は、例えば、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８に結合若しくはそれらを刺激しない一方でＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２に選択的に結合しかつそれらを刺激する能力により明示され得る。
【００３７】
適するフラグメント若しくは誘導体を得るために、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２に選択的に結合する発明のリラキシン−３キメラポリペプチドの能力のような目的の生物学的活性を消失させずに、完全長のポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド中でどのアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを付加、欠失若しくは置換しうるかを決定することは、当業者の範囲内にある。例えば、特定のポリペプチドフラグメント若しくは誘導体の配列を類似のペプチドのものと比較して、活性を維持するために保存されることが必要である相同な残基若しくは領域を決定しうる。
【００３８】
適するアミノ酸置換は、１アミノ酸を類似の構造および／若しくは化学特性を有する別のアミノ酸で置換することにより、すなわち保存的アミノ酸置換を行うことにより決定しうる。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／若しくは両親媒性の性質の類似性に基づき行いうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを包含し；極性の中性アミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを包含し；正に荷電した（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リシンおよびヒスチジンを包含し；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。適する変動は、組換えＤＮＡ技術を使用してポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失若しくは置換を実験的に行うこと、および生じる組換えバリアントを活性についてアッセイすることにより慣例で決定しうる。
【００３９】
「ポリペプチド」はペプチド結合により相互と直鎖に結合された２個若しくはそれ以上のアミノ酸を含んでなるいかなるペプチド若しくはタンパク質も指す。本明細書で使用されるところの該用語は、当該技術分野で例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともまた称される短い鎖、ならびに、その多くの型が存在する、当該技術分野でタンパク質としばしば称されるより長い鎖の双方を指す。該用語はまた、上で論考されたところのプロ、プレプロおよび成熟形態を包含する多様な形態のタンパク質も指す。
【００４０】
ポリペプチドはしばしば、２０種の天然に存在するアミノ酸と一般に称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有すること、ならびに、末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸を、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような天然の過程、ならびに当該技術分野で既知の化学修飾技術のいずれかにより、所定のポリペプチド中で修飾し得ることが認識されるであろう。ポリペプチド中に天然に存在する一般的な修飾は、基本的教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに研究論文に記述されており、そして従って当業者の範囲内にある。本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の修飾は、いくつかを挙げれば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性の付加、ならびにユビキチン化である。
【００４１】
グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰ−リボシル化のような数種の一般的な修飾は、ＰＲＯＴＥＩＮＳ――ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３）を包含する多くの基礎的教科書に記述されている。ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｊｏｈｎｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８３）中、Ｗｏｌｄ、“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”、ｐｐ．１−１２；Ｓｅｉｆｔｅｒら（１９９０）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２、６２６−６４６；およびＲａｔｔａｎら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”（１９９２）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６３、４８−６２により提供されるもののような、この主題に関する多くの総説もまた入手可能である。
【００４２】
既知であるとおりかつ上で示されたとおり、ポリペプチドは常に完全に直鎖状であるわけでないことが認識されるであろう。例えば、ポリペプチドは、天然のプロセシングを介して若しくは人的操作によりを包含して、翻訳後に修飾され得る。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドを、翻訳以外の天然の過程および全くの合成方法により同様に合成し得る。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノ若しくはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中のどこにも存在し得る。例えば、共有修飾によるポリペプチドのアミノ若しくはカルボキシル基または双方の封鎖は天然に存在するおよび合成のポリペプチドで一般的であり、そしてこうした修飾は本発明のポリペプチド中に存在し得る。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくは他の細胞中で作成されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性のプロセシングの前にほとんど不可避的にＮ−ホルミルメチオニンであることができる。ペプチドの翻訳後修飾の間に、ＮＨ２末端のメチオニン残基が欠失され得る。従って、本発明は、タンパク質のメチオニンを含有するおよびメチオニンなしの双方のアミノ末端バリアントの使用を企図している。
【００４３】
ポリペプチド中に存在する修飾は、しばしば、それがどのように作成されるかの関数であることができる。クローン化した遺伝子を宿主中で発現させることにより作成されるポリペプチドについて、例えば、修飾の性質および程度は、大部分で、宿主細胞の翻訳後修飾能力および該ポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されることができる。例えば、既知であるとおり、グリコシル化はしばしば例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主中で起こらない。従って、グリコシル化が望ましい場合は、グリコシル化する宿主、一般には真核生物細胞中でポリペプチドを発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を実施し、そして、この理由から、昆虫細胞発現系が、とりわけ天然のグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために開発された。同様の考慮が他の修飾に当てはまる。同一の型の修飾が所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同一若しくは変動する程度で存在し得ることが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含有し得る。一般に、本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」という用語は、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることにより組換えで合成されたポリペプチド中に存在するものを包含する全部のこうした修飾を包含する。
【００４４】
好ましい態様において、リラキシン−３キメラポリペプチドは、リラキシン−３の鎖Ｂが、リラキシン−３の鎖Ａでないリラキシン−３／インスリンファミリーメンバーの鎖Ａに結合されているポリペプチドである。好ましいリラキシン−３の鎖Ｂ：リラキシン／インスリンファミリーメンバーの鎖Ａのキメラポリペプチドが生じられるプレプロポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供される。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により一緒に結合された最低２個の核酸分子の直鎖状ポリマーを指し、そしてリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドを含みうる。
【００４６】
本明細書で使用されるところの「核酸」という用語は、１個若しくはそれ以上のヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくは双方より構成される分子を指す。該用語はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの単量体お
よびポリマーを包含し、リボヌクレオチドおよび／若しくはデオキシリボヌクレオチドは、ポリマーの場合に５’から３’結合を介して一緒に結合されている。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドポリマーは一本鎖若しくは二本鎖でありうる。しかしながら、結合は、例えば５’から３’結合を含んでなる核酸を包含する当該技術分野で既知の結合のいずれも包含しうる。ヌクレオチドは天然に存在することができるか、若しくは天然に存在する塩基対と塩基対の関係を形成することが可能である合成で製造されるアナログでありうる。塩基対形成の関係を形成することが可能である天然に存在しない塩基の例は、アザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびに、ピリミジン環の炭素および窒素原子の１個若しくはそれ以上がヘテロ原子、例えば酸素、イオウ、セレン、リンなどにより置換されている他の複素環塩基アナログを包含する。さらに、「核酸配列」という用語は相補配列を企図しており、そして、核酸配列およびその相補物の双方に実質的に相同であるいかなる核酸配列も包含する。
【００４７】
ポリヌクレオチドの好ましい態様において、該分子は単離されている。「単離された」核酸分子若しくはポリヌクレオチドは、異なる核酸配列をもつ核酸分子若しくはポリヌクレオチドから実質的に分離されているものである。本発明の単離された核酸分子の態様は、好ましくはラット起源、より好ましくはヒト起源のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡならびにＲＮＡを包含する。
【００４８】
「遺伝子バリアント」若しくは「バリアント」は、集団中の最低１個体中の特定の１遺伝子座に存在しかつ野性型と異なる特定の遺伝子バリアントを意味している。
【００４９】
「ストリンジェントなのハイブリダイゼーション条件」は当該技術分野で既知の意味するところを有する。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲の手引は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、および（１９８９）Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ、“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。ストリンジェントなのハイブリダイゼーション条件は、特定の配列を考慮して適して選択しうる。
【００５０】
より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイズする。例示的ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度ｐＨで特定の配列の熱的融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃より低い温度を包含する。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在する際に、Ｔｍで、平衡でプローブの５０％が占有されている）温度（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核濃度で）である。例示的ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０ないし８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンの塩濃度、例えば約０．０１ないし１．０Ｍナトリウムイオン濃度（若しくは他の塩）、ならびに短いプローブ（例えば１０ないし５０ヌクレオチド）について最低約３０℃、および長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド以上）について最低約６０℃の温度をさらに包含する。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加もまた包含しうる。選択的若しくは特異的ハイブリダイゼーションのため、例示的な正のシグナルはバックグラウンドの最低２倍、場合によってはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍である。具体的に説明するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、若しくは、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄を伴う、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート。こうした洗浄は５、１５、３０
、６０、１２０分若しくはそれ以上実施し得る。
【００５１】
当該技術分野で既知のとおり、選択的スプライシング部位が遺伝子のイントロン若しくはエキソン配列中に見出され、バリアントポリペプチド遺伝子産物を生じさせることができる。慣例の実験により、選択的若しくは潜在的スプライス接合部位を、イントロン若しくはエキソン配列すなわちリラキシン／インスリンファミリー遺伝子内で見出して、多様なリラキシン／インスリンファミリー転写物を生じることができ、そして本発明の範囲内の他のリラキシン−３キメラポリペプチドを究極的に製造するのに使用しうる。こうしたイントロン若しくはエキソンの選択的若しくは潜在的スプライス接合部位の種間および個体間の多形性の不均一性（一集団中の個体間の特定の一遺伝子座の遺伝子変異）が存在し得ることもまた既知である。こうした不均一性は、上および下述されるリラキシン−３キメラポリペプチドと関連する生物学的活性を有する変動する長さのアミノ酸配列をもつ多様なリラキシン−３キメラポリペプチドを得るために、当業者により活用され得る。こうした代替のリラキシン−３キメラポリペプチド、およびこうした代替のリラキシン−３キメラポリペプチドが生じるプレプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、従って、本発明の範囲内にある。
【００５２】
加えて、代替のリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドをコードする発明のポリヌクレオチドは、遺伝暗号の冗長性を利用することにより合成若しくは選択しうる。多様な制限部位を生じるサイレント変化のような多様なコドン置換を、特定の原核生物若しくは真核生物系でのプラスミド若しくはウイルスのベクターへのクローニングまたは発現を至適化するように導入しうる。ポリヌクレオチド配列中の突然変異は、該ポリペプチド、または、コードされるポリペプチドのいずれかの部分の特性を改変して野性型タンパク質が会合するタンパク質に対する親和性、抗体に対する親和性、若しくは分解／ターンオーバー速度のような特徴を変えるように該ポリペプチドに付加された他のペプチドのドメイン中で反映されうる。特定の機能の変更が望ましい場合は、挿入、欠失若しくは非保存的変化を工作して、変えられた機能しかし保持された生物学的活性をもつポリペプチドを製造し得る。こうした機能の変化は、例えば、該所望の生物学的活性が維持される限りは本発明のポリペプチドの生化学的特徴の１種若しくはそれ以上を変え得る。例えば、適切な変化は、発現に選んだ宿主細胞中での発現、スケールアップなどにより良好に適するポリペプチドを生成させるように選択し得る。
【００５３】
発明のリラキシン−３キメラポリペプチドが生じるプレプロポリペプチドをコードする核酸配列は、下の実施例に記述されるもののような技術を使用してまたクローン化もしうる。当該技術分野で既知の多様な手順のいずれも、本発明の核酸分子を製造するのに使用し得る。例えば、鋳型としてｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー、または上で同定された適する細胞からの全ｍＲＮＡ、およびプライマーとして適切なオリゴヌクレオチドを使用して、発明のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるポリペプチド鎖若しくはドメインをコードする核酸配列を、標準的ＰＣＲ増幅技術に従って増幅し得る。ＰＣＲからそのように増幅した核酸配列を使用して、開示されるリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドをコードする発明のポリヌクレオチドを構築し得る。開示されるプレプロポリペプチドをコードするそのように構築したポリヌクレオチドをその後、適切なベクターにクローン化し得、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付け得る。プライマーは標準的合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して製造し得る。
【００５４】
本発明の核酸配列の別の単離方法は、当業者に利用可能な手順を使用して、ゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリー、または全ｍＲＮＡを１種若しくはそれ以上の天然の若しくは人工的に設計したプローブでプロービングすることである。例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏ
ｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１９９２を参照されたい。好ましいプローブは３０から５０までの塩基を有することができる。こうしたプローブは、該プローブの同定を助長するために分析的に検出可能な試薬で標識し得る。有用な試薬は、例えば、放射性同位元素、蛍光色素、若しくは検出可能な産物の形成を触媒することが可能な酵素を包含する。該プローブは、当業者が、リラキシン／インスリンファミリーメンバーをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡポリヌクレオチドの相補コピーを単離することを可能にする。該プローブはまた、当業者が、マウス、ならびにヒト、ラット、サル、ウシおよびブタからのようなＧＰＲＣ１３５をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡポリヌクレオチドの相補コピーを単離すること、ならびにマウス、ならびにヒト、サル、ウシおよびブタからのようなＧＰＲＣ１４２をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡポリヌクレオチドの相補コピーを単離することも可能にする。
【００５５】
核酸配列の別の製造方法は、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用する標準的合成技術による。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーの製造、若しくは同定された供給源細胞からの全ｍＲＮＡの単離は、当該技術分野で既知の標準的技術により実施し得る。これらの技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に見出し得る。
【００５６】
さらなる態様は、バリアントでないリラキシン−３キメラポリペプチドと異なる特性を有するがしかしなおその生物学的活性を維持するポリペプチドをコードする、天然に存在することが既知でないいかなるこうしたヌクレオチド変動も有する工作されたポリヌクレオチドを提供する。ＤＮＡ配列は、天然に存在するリラキシン−３／インスリンファミリーメンバーの鎖Ａ、鎖Ｂ若しくは鎖Ｃペプチドの特性と異なる特性を有する鎖Ａ、鎖Ｂ若しくは鎖Ｃペプチドをコードするように、人的に変えることができる。ＤＮＡ配列の既知の変化方法は、部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を包含する。部位特異的突然変異誘発を使用して、サイレント突然変異、保存的突然変異若しくは非保存的突然変異をもたらし得る１個若しくはそれ以上のＤＮＡ残基を変えうる。キメラ遺伝子は、ヒトリラキシン−３／インスリンファミリーメンバー遺伝子中の鎖若しくはドメインを置換するように類似の若しくは異なるリラキシン−３／インスリンファミリーメンバー遺伝子のこうした鎖若しくはドメインを交換することにより製造しうる。同様に、遺伝子およびタンパク質の同定および単離を容易にするための親和性標識のようなドメインをリラキシン−３／インスリンファミリーメンバー遺伝子に付加する、融合遺伝子を製造し得る。
【００５７】
本明細書に開示されるリラキシン−３キメラポリペプチド、ならびに、例えば多形バリアント、種間バリアントならびに種間ホモログおよびアレル、ならびに工作されたバリアントの生物学的活性は、例えば、推定のリラキシン−３キメラポリペプチドバリアントの、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８に結合若しくはそれらを刺激しない一方でＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を結合かつ刺激することの選択性を検査することにより確認し得る。例えば、配列番号２３のアミノ酸配列を有するリラキシン−３／ＩＮＳＬ５キメラポリペプチドの生物学的活性を、生物学的活性の保存を確認するための他のリラキシン−３／キメラポリペプチドバリアントとの比較における陽性対照として使用し得る。
【００５８】
好ましい一態様において、リラキシン−３キメラポリペプチドは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列に対する最低９５％の配列同一性を有する生物学的に活性のポリペプチドである。とりわけ好ましい一態様において、リラキシン−３キメラポリペプチドは配列番号２３に示されるところの配列を有する。
【００５９】
当該技術分野で既知のところの「配列同一性若しくは類似性若しくは相同性」は、配列を比較することにより決定されるところの２種若しくはそれ以上のポリペプチド配列または２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野で、「同一性」はまた、場合によっては、こうした配列の一連のものの間の一致により決定されるところのポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列間の配列の関係性の程度も意味している。
【００６０】
２種のアミノ酸配列若しくは２種の核酸の同一性若しくは類似性パーセントを決定するため、配列を至適の比較の目的上整列する（例えば、第二のアミノ若しくは核酸配列との最適のアライメントのため、第一のアミノ酸若しくは核酸配列の配列中にギャップを導入し得る）。対応するアミノ酸位置若しくはヌクレオチド位置のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドをその後比較する。第一の配列中のある位置が第二の配列中の対応する位置と同一若しくは類似のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドにより占有される場合には、該分子はその位置で同一若しくは類似である。２配列間の同一性若しくは類似性パーセントは、該配列により共有される同一若しくは類似の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数（例えば重なる位置）×１００）。
【００６１】
同一性および類似性双方は容易に計算し得る。同一性パーセントの計算においては正確な一致のみをカウントする。配列間の同一性若しくは類似性を決定するのに一般に使用される方法は、例えばＣａｒｉｌｌｏら、１９８８、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３に開示されるものを包含する。同一性の好ましい決定方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるよう設計される。同一性および類似性の例示的決定方法はまた商業的コンピュータプログラムでも提供されている。２配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい一例は、Ｋａｒｌｉｎら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３−５８７７でのように改変されたＫａｒｌｉｎら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。比較の目的上、ギャップをつけたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２に記述されるとおり利用し得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の離れた関係を検出する累次検索を実施し得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。加えて、ＦＡＳＴＡ法（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）を使用し得る。配列の比較に有用な数学的アルゴリズムの別の好ましい例は、Ｍｙｅｒｓら、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２（１）：３８７）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。
【００６２】
多様な態様において、発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞中でのこうしたポリヌクレオチドによりコードされるリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドの発現、すなわちコードされるｍＲＮＡ若しくはタンパク質の産生のための、こうした宿主細胞中へのこうしたポリヌクレオチドの導入のため、発現ベクターに挿入される。ある態様において、本発明のキメラポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により製造される。発現されるリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドは、対応する成熟形態をｉｎ  ｖｉｖｏでプロセシング
され、そして生じる組換え宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多様な用途のため単離するか、若しくはこうした組換え宿主細胞内での多様な他のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を調節するのに役立つ。
【００６３】
ベクター中の若しくは細胞染色体に組込まれたのいずれかのＤＮＡ分子を含有する細胞である宿主細胞は、内因性のＤＮＡ分子を含有する天然の宿主細胞若しくは組換え宿主細胞のいずれでもあり得る。例示的宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞および動物細胞を包含する。好ましい宿主細胞は哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞を包含する。
【００６４】
「細胞」という用語は、検出方法の感度に適切な最低１個の細胞若しくは複数の細胞を指す。本発明に適する細胞は細菌でありうるが、しかし好ましくは酵母、昆虫若しくは哺乳動物のような真核生物である。細胞は、内因性のＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方の天然の宿主細胞、あるいは、好ましくは、細胞表面上で増大された量の哺乳動物のＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方を発現する、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方にとっての組換え宿主細胞であり得る。
【００６５】
「組換え宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列により形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞である。本明細書で使用されるところの細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に、こうした外因性ＤＮＡにより「形質転換され」ている。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組込まれ（共有結合され）ていても若しくはされていなくてもよい。原核生物および酵母において、例えば、外因性ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム要素上に維持されうる。真核生物細胞に関して、安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞は、外因性ＤＮＡが染色体複製により娘細胞により遺伝されるようにそれが染色体中に組込まれるようになったものである。この安定性は、該外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の一集団から構成される細胞株若しくはクローンを樹立する該真核生物細胞の能力により示される。組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株のような哺乳動物細胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコ由来細胞株のような昆虫細胞を包含する、原核生物若しくは真核生物でありうる。「組換え宿主細胞」という用語は特定の被験体細胞のみならずしかしまたこうした細胞の子孫若しくは潜在的な子孫もまた指すことがさらに理解される。突然変異若しくは環境の影響のいずれかにより、後に続く世代である種の改変が発生し得るため、こうした子孫は事実上親細胞と同一でないことがあるが、しかし、該用語の範囲内になお包含される。
【００６６】
クローンは、有糸分裂により単一細胞すなわち共通の祖先から生じる細胞の一集団である。細胞株は、多くの世代の間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定な増殖が可能である初代細胞のクローンである。
【００６７】
別の局面において、本発明は、開示されるリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドをコードする発明のポリヌクレオチドを発現することが可能である核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。好ましい一態様において、好ましい発現ベクターは、発明のリラキシン−３／ＩＮＳＬ５キメラプレプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する。
【００６８】
「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントを挿入し得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される
宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えばエピソーム以外の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノムに組込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒になって複製される。さらに、ある種のベクター（発現ベクター）は、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指図することが可能である。組換えＤＮＡ技術で有用なベクターはプラスミドの形態にありうる。あるいは、同等の機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態のベクターを使用しうる。
【００６９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での本発明の核酸の発現に適する形態の核酸を含んでなる。従って、組換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に使用されるべき宿主細胞に基づき選択されたプロモーターのような１種若しくはそれ以上の制御配列を包含し得る。組換え発現ベクターに関して使用される場合、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、若しくはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中での）該ヌクレオチド配列の発現を見込む様式で制御配列（１個若しくは複数）に連結されていることを意味することを意図している。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択および所望のタンパク質の発現のレベル、ならびに該ベクターの意図される使用のような因子に依存し得ることが、当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に記述されるところの核酸によりコードされる融合タンパク質若しくはペプチドを包含するタンパク質若しくはペプチドを産生させ得る。本発明のベクターの例示的一応用は、下述されるところの治療的処置方法での使用である。
【００７０】
「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの制御配列を意味している。プロモーターはしばしば遺伝子の転写開始部位の上流（すなわち５’から３’）にある。「遺伝子」は、コーディング領域、コーディング領域に先行する（「５’ＵＴＲ」）および後に続く（「３’ＵＴＲ」）非コーディング領域、ならびに個々のコーディングセグメント（「エキソン」）の間の介在非コーディング配列（「イントロン」）を包含する、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の産生に関与するＤＮＡのセグメントである。「コードすること」は、ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの３塩基トリプレット（「コドン」）での特定のアミノ酸若しくは終止シグナルの指定を指す。
【００７１】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、または真核生物細胞（例えば昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞若しくは哺乳動物細胞）中での本発明のポリペプチドの発現のため設計し得る。適する宿主細胞は慣例に決定しうる。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写かつ翻訳され得る。
【００７２】
原核生物でのタンパク質の発現は、融合若しくは非融合いずれのタンパク質の発現も指図する構成的若しくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で実施しうる。融合ベクターは、タンパク質に多数のアミノ酸を（通常は組換えタンパク質のアミノ末端に）付加する。こうした融合ベクターは、典型的には、以下の目的、すなわち組換えタンパク質の発現を増大させるため；組換えタンパク質の溶解性を増大させるため；アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製で補助するため；およびマーカーとしてはたらくことにより組換えタンパク質の検出を助長するための１種若しくはそれ以上のため使用される。しばしば、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするため、タンパク質分解性の切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接
合部に導入する。こうした酵素およびそれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。例示的融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、プロテインＡ若しくはポリＨｉｓを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈら、１９８８、Ｇｅｎｅ、６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）若しくはｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を包含する。
【００７３】
適する誘導可能な非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８、Ｇｅｎｅ、６９：３０１−３１５）およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９０、６０−８９）を包含する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質発現を最大化するための一戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する損なわれた能力をもつ宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである。本発明の核酸配列のこうした変化は、標準的ＤＮＡ合成技術により実施し得る。
【００７４】
別の好ましい態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）中の発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ、６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒＪａｎら、１９８２、Ｃｅｌｌ、３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）およびｐＰｉｃＺ若しくはＰｉｃｈｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。
【００７５】
あるいは、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、例えばｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１−３９）を包含する。組換え発現に有用な商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を包含する。
【００７６】
なお別の好ましい態様において、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。哺乳動物発現ベクターの例は、例えば、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｉｎａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ、６：１８７−１９５）を包含する。組換えプロテアーゼＣＯＸ−３発現に適し得る商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、例えば、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）を包含する。
【００７７】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの例は、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅら、１９８８、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏら、１９８９、ＥＭＢＯ  Ｊ、８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（ＢａｎｅｉＪｉら、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎら、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｍｅら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば乳ホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許公開第２６４，１６６号明細書）を包含する。発達的に調節されるプロモーターは、例えばｍａｒｉｎｅ  ｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３７４−３７９）およびβ−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓら、１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、３：５３７−５４６）もまた包含する。
【００７８】
数種の発現系は、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸還元酵素のような遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーター若しくは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指図下にポリペプチドをコードする配列をもつ、昆虫細胞中でバキュロウイルスベクターを使用することのような、遺伝子増幅を伴わない高収量発現系もまた適する。
【００７９】
発現ベクター中に包含され得る要素はまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で機能するレプリコン、組換えプラスミドをもつ細菌の選択を可能にするため抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするためのプラスミドの不可欠でない領域中のユニークな制限部位も包含する。選ばれる特定の抗生物質耐性遺伝子は決定的でなく、当該技術分野で既知の多くの耐性遺伝子のいずれも適する。必要な若しくは所望の場合にそれらが真核生物細胞中でのＤＮＡの複製を妨害しないような原核生物配列を選びうる。
【００８０】
ベクター中にアンチセンスの向きにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換えベクターを製造しうる。すなわち、ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で、制御配列に作動可能に連結される。多様な細胞型中でアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンスの向きにクローン化された核酸に作動可能に連結された制御配列、例えばウイルスプロモーターおよび／若しくはエンハンサーを選ぶことができるか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的若しくは細胞型特異的発現を指図する制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下に産生され、その活性が該ベクターを導入する細胞型により決定され得る組換えプラスミド、ファージミド若しくは弱毒化ウイルスの形態であることができる。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（“Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”、Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照されたい。
【００８１】
組換えベクター系はまた、哺乳動物細胞中で小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成を指図するようにも調製しうる。多くの生物体が、遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲ
ＮＡ）が細胞中に存在する場合に、ＲＮＡ干渉として知られる過程によりいかなる遺伝子発現も抑制するための機構を有する。特定の遺伝子の活性を低下させるためにｄｓＲＮＡを使用する技術は、蠕虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用して最初に開発され、そしてＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉと命名された（Ｆｉｒｅら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡｉは、以来、多くの生物体中で有用であることが見出され、また、最近、培養物中の哺乳動物細胞に拡大された（Ｍｏｓｓ、２００１、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１１：Ｒ７７２−７７５による総説を参照されたい）。ＲＮＡｉが２１−２５ヌクレオチドの小型ＲＮＡの生成を伴うことが示された場合に重要な進歩がなされた（Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：２９３−２９６；Ｚａｍｏｒｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１：２５−３３）。これらの小分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡは、最初は該過程が開始するより大きなｄｓＲＮＡから生じることができ、そしてついには分解される標的ＲＮＡに対し相補的である。ｓｉＲＮＡはそれら自身が両端で短いオーバーハングを伴う二本鎖であり；それらはガイドＲＮＡとして作用して、相補的領域の標的の単一の切断を指図する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５：１８８−２００；Ｚａｍｏｒｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１：２５−３３）。
【００８２】
マウスＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２に相補的であるヌクレオチドを含んでなるｓｉＲＮＡは、例えばＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ０１／７５１６４号明細書に記述される方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造しうるか、若しくは安定な発現系を使用して哺乳動物からｉｎ  ｖｉｖｏで製造し得る。哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡの合成を指図する例示的一ベクター系はｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：５５０−５５３）である。
【００８３】
本発明の例示的ベクターは、細菌−酵母若しくは細菌−動物細胞若しくは細菌−真菌細胞若しくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡのシャトリングを可能にする、特別に設計されたベクターもまた包含する。無数のクローニングベクターが当業者に既知であり、そして、適切なクローニングベクターの選択は当業者の範囲内にある。原核生物および真核生物双方の細胞のための他の適する発現系については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記の第１６および１７章を参照されたい。
【００８４】
組換え宿主細胞は、本発明の組換えベクターを導入することにより製造しうる。トランスフェクションに適し得かつ商業的に入手可能である、哺乳動物種由来の細胞株は、例えば、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、ショウジョウバエ若しくはネズミＬ細胞、およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、ならびにサル腎細胞を包含する。
【００８５】
ベクターＤＮＡは、慣習的形質転換若しくはトランスフェクション技術を介して原核生物若しくは真核生物細胞に導入し得る。本明細書で使用されるところの「形質転換」若しくは「トランスフェクション」という用語は、細胞が外来ＤＮＡを取り込みかつそれらの染色体にその外来ＤＮＡを組込んでも若しくは組込まなくてもよい過程を指す。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するのに適する既知の手順のいずれも、発現ベクターを導入するのに使用しうる。これらは、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）のような試薬、リポソーム、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、微小注入、プラスミドベクター、ウイルスベクター、遺伝子銃粒子加速（Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ）の使用、またはクローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ若しくは他の外来遺伝物質の宿主細胞へのいずれかの他の既知の導入方法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）を包含する。使用される選択された特定の遺伝子工学手順は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ若しくは遺伝子を発現することが可能な宿主細胞中に最低１種の遺伝子を成功裏に導入することが可能であるべきである。
【００８６】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さな画分のみが該外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込みうることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性についての）をコードする遺伝子を、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入しうる。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を賦与するものを包含する。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定し得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を導入した細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【００８７】
別の態様において、細胞、細胞株若しくは微生物内での内因性核酸の発現の特徴を、挿入される調節エレメントが内因性遺伝子と効果的に連結されかつ内因性遺伝子を制御、調節若しくは活性化するような、細胞、安定細胞株若しくはクローン化した微生物のゲノム中に異種調節エレメントを挿入することにより改変し得る。異種調節エレメントは、例えば米国特許第５，２７２，０７１号およびＷＩＰＯ公開第ＷＯ  ９１／０６６６７号明細書に記述されるところの標的を定められた相同的組換えのような技術を使用して、それが内因性遺伝子と効果的に連結されかつその発現を活性化するような、安定細胞株若しくはクローン化した微生物に挿入し得る。
【００８８】
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子を上述された発現ベクターにクローン化すること、こうしたベクターを本明細書に記述されるところの原核生物若しくは真核生物宿主細胞に導入すること、および組換えタンパク質の産生に適する条件下で該宿主細胞を増殖させることにより組換え的に発現させ得る。
【００８９】
発現ベクターを含有する細胞をクローン的に増殖させることができ、そして個々に分析してそれらが本発明のポリペプチドを産生するかどうかを決定しうる。動物のリラキシン−３キメラポリペプチドを発現する宿主細胞クローンの同定は、抗動物リラキシン−３キメラポリペプチド抗体との免疫学的反応性、およびＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２の結合若しくは刺激のような宿主細胞関連のリラキシン−３キメラポリペプチドの存在を包含するいくつかの手段により行い得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は当該技術分野の熟練内にある。ポリペプチドの組換え的発現技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、上記に記述されている。
【００９０】
本発明のポリペプチドはまた、当該技術分野で利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および／若しくは転写系を使用しても製造し得る。例えば、合成のリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドｍＲＮＡ、または形質転換若しくはトランスフェクトした細胞から単離したリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドｍＲＮＡを、コムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を包含する多様な細胞を含まない系中で効率的に翻訳し得る。あるいは、発明のリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドｃＤＮＡのコーディング配列を、Ｔ７プロモーターの制御下にクローン化し得る。その後、この構築物を鋳型として使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写および翻訳系で、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から商業的に入手可能なもののようなＴＮＴ  Ｔ７結合網状赤血球ライセート系を使用して、タンパク質を製造し得る。
【００９１】
一般的な一局面において、本発明は、リラキシン−３キメラポリペプチド成分およびＧ
ＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２受容体成分を含んでなる受容体−リガンド複合体に、向けられる。本発明のいくつかの態様において、リガンドおよび受容体の複合体が検出、同定、形成若しくは単離される。
【００９２】
複合体（例えば、ＧＰＣＲ１３５および／若しくはＧＰＣＲ１４２ポリペプチドと一緒のリラキシン−３キメラポリペプチド）の成分は、当業者に既知の方法により精製し得る。例えば、それらは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ＨＰＬＣならびにＦＰＬＣ、ならびに抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組合せ若しくは個別の適用により、天然若しくは組換えの宿主細胞からの細胞ライセートおよび抽出物から精製し得る。さらに、あるいは、本発明のポリペプチドは、標準的ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得、そして上述されたとおり精製し得る。
【００９３】
本発明の単離かつ精製されたリラキシン−３キメラポリペプチドは、試験生物学的サンプル中で選択的に検出、同定若しくは刺激する、またはＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のためのアッセイ方法で（すなわちＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８を検出、同定若しくは刺激しない一方で）、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２調節活性を有する化合物の同定方法で、およびＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２の調節により媒介される医学的状態の処置において使用しうる。
【００９４】
こうした方法のある態様において、天然に存在するＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含有する生物学的サンプルを、例えば、脳、脾、胎盤、肺、肝、腎、膵、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、リンパ節および扁桃腺、またはＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２ホモログのいずれかの他の供給源のような哺乳動物組織から単離する。血液、血漿、血清、精液、尿若しくはいずれかの他の哺乳動物の体液のような体液もまた、天然のＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２ポリペプチドの供給源としてはたらき得る。培養哺乳動物細胞株は、天然のＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含有する生物学的サンプルのなおさらなる例示的供給源である。
【００９５】
とりわけ好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含有する生物学的サンプルは、哺乳動物脳組織、好ましくはラット脳組織、およびより好ましくはヒト脳組織由来である。なお他の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含有する生物学的サンプルは、Ｇ２９２（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＲＬ−１４２３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＣＬ−２）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＃  ＴＩＢ−１５２）およびＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ  ＃  ＴＩＢ−２０）のようなヒト細胞株由来である。なおさらなる好ましい態様において、ポリペプチドは、末梢血および単球由来樹状細胞から実質的に精製された単球由来である。末梢血から実質的に精製された単球の精製方法は当該技術分野で既知であり；例えば、こうした細胞は、ＣＤ１４マイクロビーズに吸着させ、そしてその後Ａｕｔｏ  Ｍａｃｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分離しうる。単球からの樹状細胞の例示的一派生方法は、無エンドトキシン培地および試薬中でＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下に単球を培養することである。
【００９６】
「リガンド成分」は、上述されたもののような本発明のリラキシン−３キメラポリペプチドを指す。好ましい一態様において、リガンド成分は、ヒトから発するリラキシン／インスリンファミリーメンバーの鎖Ａにジスルフィド結合を介して結合されている、ヒト、マウス若しくはラットから発するリラキシン−３の鎖Ｂから構成される。好ましくは、リガンド成分は組換え的に発現される。好ましいリガンド成分は、付随する配列表に同定されるリラキシン−３キメラポリペプチドに対応する。
【００９７】
本発明のリガンドおよび受容体の複合体の他の好ましい態様において、リガンド成分を、放射性同位元素若しくは蛍光分子のような検出可能な剤で標識する。標識技術は使用される標識剤の型に基づき選択され、そして当業者の範囲内にある。例えば、標識は、リガンド分子の原子の１個を対応する放射活性同位元素で置換することにより達成し得る。水素原子はリチウム、３Ｈで置換し得；炭素原子は炭素−１４すなわち１４Ｃで置換し得るか；若しくはストロンチウム原子をストロンチウム−３８すなわち３８Ｓｒで置換し得る。別の例示的標識方法においては、リガンドのいずれかの原子を放射活性同位元素で置換することよりむしろ、同位元素をリガンド分子に付加し得る。こうした放射活性同位元素は、例えば、ヨウ素−１２５すなわち１２５Ｉおよび鉄−５９すなわち５９Ｆｅを包含する。なお別の例示的標識方法において、標識は、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかでのペプチドの合成の間にメチオニン−３５（３５Ｓ）若しくはリン酸−３３（３３Ｐ、タンパク質リン酸化について）のような適切な放射標識前駆体を使用することにより実施し得る。好ましくは、本発明のリガンド成分はヨウ素−１２５すなわち１２５Ｉで標識する。
【００９８】
複合体の受容体成分は、好ましくは哺乳動物のＧＰＣＲ１３５若しくは哺乳動物のＧＲＣＰ１４２である。より好ましくは、複合体の受容体はヒトＧＰＣＲ１３５若しくはヒトＧＰＣＲ１４２である。
【００９９】
ある好ましい一態様において、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方は、宿主細胞、好ましくは組換え宿主細胞の細胞表面上で発現される。別の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方は、宿主細胞、好ましくは組換え宿主細胞からの単離された細胞膜と会合している。なお別の好ましい態様において、複合体の受容体成分は、発明のリラキシン−３キメラポリペプチドリガンドに結合することが可能なＧＰＣＲ１３５のフラグメント若しくはＧＰＣＲ１４２のフラグメントである。当業者に利用可能なリガンド成分および受容体の複合体のいずれかの適する構成方法を使用して、こうした複合体を形成させうる。例えば、こうした方法は、一般に、リガンド成分を含んでなるサンプルを、受容体を含んでなるサンプルと混合することを含んでなる。
【０１００】
リガンド成分を含んでなるサンプルは、リガンド成分を含有する組織若しくは細胞抽出物、または精製されたリガンド成分であり得る。このサンプルは、リガンド成分の天然の供給源、例えばヒトを包含する温血動物のリガンド成分の内因性の宿主細胞若しくは組織から調製し得る。好ましくは、リガンド成分を含んでなるサンプルは、増大された量の該リガンド成分を発現する組換え宿主細胞から調製する。リガンド成分の組換え宿主細胞は、機能的リガンド成分を発現することが可能なＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより構築しうる。
【０１０１】
ヒト若しくは他の温血動物の組織若しくは細胞からの製造において、リガンド成分のキメラを、ヒト若しくは他の温血動物の組織若しくは細胞をホモジェナイズすること、ホモジェネートを酸若しくは別の適する抽出剤で抽出すること、およびリガンド成分のポリペプチドを抽出物から単離することを含んでなる方法により精製かつ単離し得る。
【０１０２】
多数の適する手順のいずれも、発明のリラキシン−３キメラポリペプチドまたはＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２が精製されている場合に使用し得る。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質をポリペプチドに可逆的に融合し得る。適切なリガンドを用い、該ポリペプチドを精製カラムに選択的に吸着させ得、そしてその後比較的純粋な形態でカラムから遊離させ得る。融合タンパク質をその後酵素活性により除去する。ポリペプチドはまた、免疫親和性カラムを使用しても精製し得る。
【０１０３】
組換えタンパク質は、好ましくはプロモーター誘導後に、形質転換した細菌若しくは真核生物細胞により大量に発現されうるが；しかし、発現は構成的であり得る。ＩＰＴＧを用いるプロモーター誘導は誘導可能なプロモーター系の一例である。細胞は当該技術分野の標準的手順に従って増殖させうる。新鮮若しくは凍結細胞をタンパク質の単離に使用しうる。
【０１０４】
細菌中で発現させたタンパク質は不溶性の凝集物（封入体）を形成しうる。当該技術分野で記述されている数種のプロトコルは、リラキシン−３キメラポリペプチド、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を含有する封入体の精製に適する。例えば、封入体の精製は、例えば５０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションによる細菌細胞の破壊による封入体の抽出、分離および／若しくは精製を必要としうる。細胞懸濁液は、フレンチプレスの２〜３回の通過を使用して溶解し得るか、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してホモジェナイズし得るか、若しくは氷上で超音波処理し得る。代替の細菌溶解方法は当業者に明らかであろう（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）。
【０１０５】
必要な若しくは所望の場合は、封入体を可溶化することができ、そして溶解された細胞懸濁液を遠心分離して不要な不溶性物質を除去しうる。封入体を形成したタンパク質は、適合性の緩衝液での希釈若しくは透析により再生しうる。適する溶媒は、尿素（約４Ｍから約８Ｍまで）、ホルムアミド（最低約８０％、容量／容量基準）および塩酸グアニジン（約４Ｍから約８Ｍまで）を包含する。凝集物を形成するタンパク質を可溶化することが可能である数種の溶媒、例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸は、免疫原性および／若しくは活性の欠如により付随される該タンパク質の不可逆的変性の可能性により、この手順での使用に不適切でありうる。塩酸グアニジンおよび類似の剤は変性剤であるとは言え、この変性は不可逆的でなく、そして変性剤の除去（例えば透析による）若しくは希釈に際して再生が起こることができ、免疫学的にかつ／若しくは生物学的に活性のタンパク質の再形成を可能にする。他の適する緩衝液は当該技術分野で既知である。所望のポリペプチドは、例えばＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いる標準的分離技術により、他の細菌タンパク質から分離する。
【０１０６】
あるいは、細菌周辺質からポリペプチドを精製することが可能である。細菌の溶解後、タンパク質が細菌の周辺質に輸送される場合に、細菌の周辺質画分を低温浸透圧ショック若しくは当該技術分野で既知の別の方法により単離し得る。組換えタンパク質を周辺質から単離するため、細菌細胞を遠心分離してペレットを生じさせ得る。２０％ショ糖を含有する緩衝液にペレットを再懸濁しうる。細胞を溶解するため、細菌を遠心分離することができ、そしてペレットを氷冷５ｍＭ  ＭｇＳＯ４に再懸濁しかつ氷浴中でおよそ１０分間保ちうる。細胞懸濁液を遠心分離することができ、そして上清を傾斜かつ保存しうる。上清中に存在する組換えタンパク質を、当該技術分野で既知の標準的分離技術により宿主タンパク質から分離し得る。
【０１０７】
最初の段階として、例えば、タンパク質混合物が複雑である場合、最初の塩分画を使用して、不要な宿主細胞タンパク質（若しくは細胞培地由来のタンパク質）の多くを目的の組換えタンパク質から分離し得る。例示的な塩は、タンパク質混合中の水の量を効果的に減少させることによりタンパク質を沈殿させる硫酸アンモニウムである。タンパク質はその後、それらの溶解性に基づき沈殿する。タンパク質が疎水性になるほど、それがより低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿することがよりありそうになる。例示的一単離プロトコルは、生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％の間となるようにタンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを添加することを包含する。この濃度はタンパク質の最も疎水性のもの
を沈殿させることができる。沈殿物をその後廃棄し（目的のタンパク質が疎水性でない場合）、そして目的のタンパク質を沈殿させることが既知の濃度まで硫酸アンモニウムを上清に添加する。沈殿物をその後緩衝液中で可溶化し、そして過剰の塩を除去して、例えば透析若しくはダイアフィルトレーションにより所望の純度を達成する。冷エタノール沈殿のようなタンパク質の溶解性に頼る他の既知の方法を使用して、複雑なタンパク質混合物を分画し得る。
【０１０８】
他の例において、発明のリラキシン−３キメラポリペプチド、またはＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２の分子量を使用して、多様な孔径のメンブレン（例えばＡｍｉｃｏｎ若しくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅのメンブレン）を通す限外濾過を使用してより大きいおよびより小さい大きさのタンパク質からそれを単離し得る。第一段階として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質の分子量より小さい分子量カットオフを有する孔径をもつメンブレンを通し限外濾過する。限外濾過の保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をその後、目的のタンパク質の分子量より大きい分子カットオフをもつメンブレンに対し限外濾過する。組換えタンパク質はメンブレンを通過して濾液中に進むことができる。濾液をその後クロマトグラフィー分離し得る。
【０１０９】
発明のキメラポリペプチドは、正味の表面電荷、疎水性、および異種分子に対する親和性に基づいてもまた他のタンパク質から分離し得る。加えて、タンパク質に対し生じさせた抗体をカラムマトリックスに複合させ得、そして該タンパク質を免疫精製し得る。これらの方法の全部が当該技術分野で既知である。クロマトグラフィー技術は、いかなる適するスケールでも、および多くの異なる製造元（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの機器を使用して実施し得ることが、当業者に明らかであろう。
【０１１０】
本発明はまた、リラキシン−３キメラポリペプチドに特異的に結合する抗体の同定も可能にする。こうしたリラキシン−３キメラポリペプチド特異的抗体は、リラキシン−３キメラポリペプチドの活性の調節のため、およびリラキシン−３キメラポリペプチドを検出するためのイムノアッセイのためを包含する多数の応用を有する。イムノアッセイを使用して、リラキシン−３キメラポリペプチドを定性的若しくは定量的に分析し得る。こうした技術の全般的な概要は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９８８）に見出し得る。
【０１１１】
リラキシン−３キメラポリペプチドのポリペプチドと特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＵＵＮＯＬＯＧＹ（１９９１）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、上記；Ｇｏｄｉｎｇ、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（第２版  １９８６）；およびＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照されたい）。こうした技術は、ファージ若しくは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体製造、ならびにウサギ若しくはマウスを免疫することによるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造を包含する（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１；Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３４１：５４４−５４６を参照されたい）。
【０１１２】
多数のリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなる免疫原を使用して、リラキシン−３キメラポリペプチドと特異的に反応性の抗体を製造しうる。例えば、リラキシン−３キメラポリペプチド若しくはその抗原フラグメントを、本明細書に記述されるとおり単離する。組換えタンパク質を、上述されたところの真核生物若しくは原核生物細胞中で発現させ得、そして全般として上述されたとおり精製し得る。組換えタンパク質はモノクローナル若しくはポリクローナル抗体の製造のための好ましい免疫原である。あるいは、本明
細書に開示される配列由来かつ担体タンパク質に複合させた合成ペプチドを免疫原として使用し得る。天然に存在するタンパク質もまた、純粋若しくは不純のいずれの形態でも使用しうる。生成物をその後、抗体を産生することが可能な動物に注入する。タンパク質を測定するためのイムノアッセイでのその後の使用のため、モノクローナル若しくはポリクローナルいずれの抗体も生成させうる。
【０１１３】
ポリクローナル抗体の製造方法は当該技術分野で既知である。例示的一方法において、近交系のマウス（例えばＢＡＬＢ／Ｃマウス）若しくはウサギを、フロイントのアジュバントのような標準的アジュバントおよび標準的免疫化プロトコルを使用して、該タンパク質で免疫する。免疫原調製物に対する該動物の免疫応答を、試験出血を採取すること、および該ポリペプチドに対する反応性の力価を測定することによりモニターする。該免疫原に対し適切に高力価の抗体が得られる場合に、血液を動物から収集しかつ抗血清を調製する。該タンパク質に対し反応性の抗体について濃縮するための抗血清のさらなる分画を、所望の場合に行い得る（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、上記を参照されたい）。
【０１１４】
モノクローナル抗体は、当該技術分野で記述される多様な技術により得ることができる。簡潔に具体的に説明するため、所望の抗原で免疫した動物からの脾細胞を、例えば骨髄腫細胞との融合（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９７６、６：５１１−５１９を参照されたい）により不死化しうる。代替の不死化方法は、エプスタイン−バーウイルス、癌遺伝子若しくはレトロウイルスでの形質転換を包含する。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングし、そしてこうした細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注入を包含する多様な技術により高めることができる。あるいは、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１により概説された一般的プロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体若しくはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離しうる。
【０１１５】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を収集することができ、そしてイムノアッセイ、例えば固体支持体上に固定された免疫原を用いる固相イムノアッセイで免疫原タンパク質に対し滴定しうる。具体的に説明するため、１０４若しくはそれ以上の力価を伴うポリクローナル抗血清を選択し、そして競合結合イムノアッセイを使用して、無関係のタンパク質若しくはなお他の生物体からの関係するタンパク質に対するそれらの交差反応性について試験する。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、１μＭ、０．１μＭ若しくは０．０１μＭまたはより良好なＫｄで結合しうる。
【０１１６】
抗リラキシン−３キメラポリペプチド抗体を使用して、個々のリラキシン−３キメラポリペプチドを多様なイムノアッセイ法により検出し得る。免疫学的およびイムノアッセイの手順の総説については、ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（ＳｔｉｔｅｓとＴｅｒｒ編、第７版  １９９１）を参照されたい。さらに、イムノアッセイは、ＥＮＺＹＭＥ  ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；およびＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、上記に広範囲に総説されているいくつかの構成のいずれでも実施し得る。
【０１１７】
生物学的に活性のリラキシン−３キメラポリペプチドは、多数の既知の免疫学的結合アッセイのいずれかを使用して検出かつ／若しくは定量し得る（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号明細書を参照されたい）。一般的なイムノアッセイの総説については、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ：ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３）；ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（ＳｔｉｔｅｓとＴｅｒｒ編、第７版  １９９１）もまた参照されたい。免疫学的結合アッセイ（若しくはイムノアッセイ）は、一般に、最適なタンパク質若しくは抗原（この場合はリラキシン−３キメラポリペプチド若しくはその抗原性下位配列）に特異的に結合する抗体を使用する。該抗体は当該技術分野で既知のいずれかの適する手段により製造しうる。
【０１１８】
イムノアッセイはまた、抗体および抗原により形成される複合体に特異的に結合しかつそれを標識する標識剤も使用しうる。標識剤はそれ自身が抗体／抗原複合体を含んでなる部分の１つでありうる。従って、標識剤は、標識リラキシン−３キメラポリペプチド若しくは標識抗リラキシン−３キメラポリペプチド抗体でありうる。あるいは、標識剤は、抗体／リラキシン−３キメラポリペプチド複合体に特異的に結合する二次抗体のような第三の部分でありうる（二次抗体は、好ましくは第一の抗体が生じられる種の抗体に特異的である）。プロテインＡ若しくはプロテインＧのような免疫グロブリン定常領域を特異的に結合することが可能な他のタンパク質を標識剤として使用しうる。これらのタンパク質は、多様な種からの免疫グロブリン定常領域との強い非免疫原性の反応性を表す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら、１９７３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１：１４０１−１４０６；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：２５８９−２５４２を参照されたい）。標識剤は、ストレプトアビジンのような別の分子が特異的に結合し得るビオチンのような検出可能な部分で修飾し得る。多様な検出可能な部分が当該技術分野で既知である。
【０１１９】
アッセイを通じ、インキュベーションおよび／若しくは洗浄段階が、試薬の各組合せ後に適切でありうる。インキュベーション段階は約５秒から数時間まで、場合によっては約５分から約２４時間まで変動し得る。しかしながら、インキュベーション時間はアッセイ形式、抗原、溶液の容量、濃度などに依存することができる。アッセイは周囲温度で実施しうるが、とは言え、それらは１０℃ないし４０℃のようなある範囲の温度で実施し得る。
【０１２０】
サンプル中のリラキシン−３キメラポリペプチドを検出するためのイムノアッセイは、競合的若しくは非競合的のいずれであってもよい。非競合的イムノアッセイは抗原の量を直接測定するアッセイである。例えば、好ましい一サンドイッチアッセイにおいて、抗リラキシン−３キメラポリペプチド抗体はそれらが固定されている固体支持体に直接結合され得る。これらの固定された抗体がその後、試験サンプル中に存在するリラキシン−３キメラポリペプチドを捕捉する。かように固定されたリラキシン−３キメラポリペプチドはその後、標識を担持する第二のリラキシン−３キメラポリペプチド抗体のような標識剤により結合される。あるいは、第二の抗体は標識を欠いてもよいが、しかし、それは順に、第二の抗体が生じられる種の抗体に特異的な標識された第三の抗体により結合されうる。第二若しくは第三の抗体は、しばしば、検出可能な部分を提供するために、別の分子（例えばストレプトアビジン）が特異的に結合するビオチンのような検出可能な部分で修飾される。
【０１２１】
競合アッセイにおいて、サンプル中に存在するリラキシン−３キメラポリペプチドの量は、サンプル中に存在する未知のリラキシン−３キメラポリペプチドにより抗リラキシン−３キメラポリペプチド抗体から置換された（競合された）、既知の添加された（外因性の）リラキシン−３キメラポリペプチドの量を測定することにより間接的に測定しうる。例示的一競合アッセイにおいて、既知の量のリラキシン−３キメラポリペプチドをサンプルに添加し、そしてサンプルをその後、リラキシン−３キメラポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体に結合された外因性のリラキシン−３キメラポリペプチドの量は、サンプル中に存在するリラキシン−３キメラポリペプチドの濃度に反比例する。例示的一態様において、抗体を固体支持体上に固定する。抗体に結合されたリラキシン−
３キメラポリペプチドの量は、リラキシン−３キメラポリペプチド／抗体複合体中に存在するリラキシン−３キメラポリペプチドの量を測定することによるか、若しくは、あるいは、残存する複合体形成されないタンパク質の量を測定することによるかのいずれかで測定しうる。リラキシン−３キメラポリペプチドの量は、標識リラキシン−３キメラポリペプチド分子を提供することにより検出しうる。
【０１２２】
ハプテン阻害アッセイは別の具体的に説明する競合アッセイである。このアッセイにおいて、既知のリラキシン−３キメラポリペプチドを固体支持体上に固定する。既知の量の抗リラキシン−３キメラポリペプチド抗体をサンプルに添加し、そしてサンプルをその後、固定したリラキシン−３キメラポリペプチドと接触させる。既知の固定されたリラキシン−３キメラポリペプチドに結合された抗リラキシン−３キメラポリペプチド抗体の量は、サンプル中に存在するリラキシン−３キメラポリペプチドの量に反比例する。再度、固定された抗体の量を、抗体の固定された画分若しくは溶液中に残存する抗体の画分のいずれかを検出することにより測定しうる。検出は、抗体が標識されている場合は直接的であっても、若しくは上述されたところの抗体に特異的に結合する標識された部分のその後の添加により間接的であってもよい。
【０１２３】
核酸アッセイもまた、サンプル中のリラキシン−３キメラポリペプチドのポリヌクレオチドまたはＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のＤＮＡおよびＲＮＡの存在について検出するのに使用しうる。例示的態様は、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮアーゼ保護、Ｓ  １分析、ＰＣＲおよびＬＣＲのような増幅技術、ＲＴＰＣＲ、ならびにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような当該技術分野で既知の適する技術を包含する。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸を、その後の解釈および分析のため細胞の形態を保存しつつ細胞内のハイブリダイゼーションに利用可能となるような方法で、その細胞周囲から解放する。Ｓｉｎｇｅｒら、１９８６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２３０−２５０；Ｈａａｓｅら、１９８４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７：１８９−２２６；およびＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）もまた参照されたい。
【０１２４】
上で挙げられたとおり、本発明のキメラリガンド成分は、既知のペプチド合成手順によってもまた製造し得る。ペプチド合成方法は、適する固相合成および液相合成技術から選択しうる。例えば、所望のペプチドは、タンパク質を構成することが可能な部分的なペプチド若しくはアミノ酸をその残余の部分と縮合すること、および生成物が保護基を有する場合は該保護基を除去することにより製造し得る。ペプチド合成の間の縮合および脱保護方法は、文献、例えば：ＢｏｄａｎｓｚｋｙとＯｎｄｅｔｔｉ、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９６６；ＳｃｈｒｏｅｄｅｒとＬｕｅｂｋｅ、“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９６５；Ｉｚｕｍｉｙａら、“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、丸善、１９７５；ＹａｊｉｍａとＳａｋａｋｉｂａｒａ、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  １、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ”、２０５、１９７７；およびＹａｊｉｍａ（編）、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ−Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ、１４、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、廣川書店に記述されている。
【０１２５】
ペプチド合成反応後に、タンパク質産物を、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーおよび再結晶のような慣習的精製技術の適する組合せにより精製かつ単離し得る。単離されたタンパク質が遊離の形態にある場合、それを既知の方法により適する塩に転化し得る。逆に、単離された生成物が塩である場合は、それを当該技術分野
で既知のものから選択される適する方法により遊離ペプチドに転化し得る。
【０１２６】
ポリペプチドのアミドは、アミド化に適するペプチド合成のための樹脂を使用することにより得ることができる。例示的樹脂は、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル−アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニルヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、および４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂を包含する。こうした樹脂を使用して、その□−アミノ基および官能側鎖基（Ｒ基）が適して保護されているアミノ酸を、当業者に既知である多様な縮合技術により、目的のペプチドの配列に従って樹脂上で縮合する。一連の反応の終了時に、ペプチド若しくは保護されたペプチドを樹脂から分離し、そして保護基を除去して目的のペプチドを得る。
【０１２７】
ＧＰＲＣ１３５受容体、ＧＰＣＲ１４２受容体若しくは双方の受容体を含んでなるサンプルは、細胞表面上で発現された受容体（１種若しくは複数）をもつ無傷の宿主細胞、該受容体（１種若しくは複数）の宿主細胞からの単離された細胞膜、またはリガンドに結合することが可能である該受容体（１種若しくは複数）の精製されたセグメントを含み得る。ＧＰＣＲ１３５受容体若しくはＧＰＣＲ１４２受容体の内因性宿主細胞もまた使用し得る。ある好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２、若しくはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方を含んでなる内因性宿主細胞を使用する。
【０１２８】
ＧＰＣＲがときにその細胞外ドメインでその内因性リガンドに結合することが既知である。こうした結合ドメインは、配列分析、タンパク質−タンパク質相互作用分析、タンパク質構造分析、若しくはこれらの方法の組合せのような当業者に既知の多様な方法により同定し得る。例えば、代謝調節型グルタミン酸受容体のリガンド結合ドメインは、その細胞外ドメイン中のビーナスフライトラップ（Ｖｅｎｕｓ  ｆｌｙｔｒａｐ）モジュール（ＶＦＴＭ）として同定された（Ｏ’Ｈａｒａら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｎ、１１（１）：４１−５２；Ｄａｖｉｄら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：３３４８８−３３４９５）。好ましい一態様において、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２いずれかのリガンド成分結合ドメインを、上の方法を使用して最初に同定し得、そして、こうしたリガンド成分結合ドメインは、組換え的に発現、精製、そして本発明の複合体の形成で使用し得る。
【０１２９】
ある態様において、発明のリラキシン−３キメラポリペプチドは、例えばジスルフィド架橋により連結されたポリペプチドの２本の鎖（Ａ鎖およびＢ鎖）から構成される分泌型タンパク質として組換え的に製造され、ここでプロテアーゼがそれらの未熟なプレプロポリペプチド前駆体からの成熟キメラポリペプチドの産生に関与する。シグナル配列ペプチダーゼが、プレプロポリペプチドからシグナル配列を切断して、リラキシン−３キメラプロポリペプチドをもたらす。リラキシン−３キメラプロポリペプチドはその後、プロホルモン転換酵素により鎖Ａ、ＢおよびＣに切断される。所定のキメラポリペプチドのそのように切断されたＡ鎖およびＢ鎖は、ジスルフィド結合の形成により結合されて成熟リラキシン−３キメラポリペプチドを生じ；Ｃ鎖は除去され、そして成熟リラキシン−３キメラポリペプチドの一部分でない。プロホルモン転換酵素は、数種のニューロン細胞若しくは内分泌細胞のようなホルモンが分泌されるある種の細胞型中でのみ選択的に発現されるため、リラキシン−３キメラポリペプチドはしばしば、それがＣＯＳ７のような別の細胞型から組換え的に発現される場合に、至適な効率までプロセシングされない。
【０１３０】
「結合」若しくは「連結された」は、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドのような２個若しくはそれ以上の化学的実体が、共有結合、イオン結合、静電結合、水素結合、ロ
ンドン分散力、ファンデルワールス相互作用、若しくは疎水性相互作用の１種若しくは複数の形成を介するような、結合若しくは別の方法で会合される結合若しくは結合力を指す。好ましくは、発明のリラキシン−３キメラポリペプチドの製造において使用される結合は共有結合の形成により遂げられる。
【０１３１】
「プロホルモン転換酵素（ＰＣ）」は、Ｃａ２＋依存性セリンプロテアーゼのファミリーを指し、その全部が細菌のエンドプロテアーゼズブチリシン（細菌）および酵母ケキシンに対する相同性を有する。フリン／対形成塩基性アミノ酸切断酵素（ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）（ＰＡＣＥ）としてもまた知られるこのファミリーは、例えば、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６、およびＰＣ７／ＰＣ８／リンパ腫プロタンパク質転換酵素、ならびにＳＫＩ−１を包含する。それらはそれらの触媒ドメイン内の５０〜７５％のアミノ酸同一性の程度を共有する（ＰＣに関する総説については、Ｓｅｉｄａｈら、１９９９、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、８４８（１−２）：４５−６２を参照されたい）。
【０１３２】
リラキシン−３キメラポリペプチドは：第一のペプチド結合によりリラキシン−３のＣ鎖に結合されたリラキシン−３のＢ鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドをコ―ドすることが可能なＤＮＡ分子を構築すること（該Ｃ鎖は第二のペプチド結合によりリラキシン／インスリンファミリーメンバーのＡ鎖にさらに結合され、また、リラキシン−３プレプロポリペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間の第二のペプチド結合およびＣ鎖とＢ鎖の間の第一のペプチド結合よりなる群から選択される最低１個の位置にプロテアーゼ切断部位が挿入され）；リラキシン−３プレプロポリペプチドを発現することが可能なベクターを構築すること；挿入されたプロテアーゼ切断部位（１個若しくは複数）で該リラキシン−３プレプロポリペプチドを切断し得るプロテアーゼを発現することが可能な別のベクターを構築すること；双方のベクターを宿主細胞に導入すること；ならびに、プロテアーゼがリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドの挿入されたプロテアーゼ切断部位（１個若しくは複数）でペプチド結合を切断して成熟リラキシン−３キメラポリペプチドを生じることができるように、改変されたリラキシン−３プレプロポリペプチドおよびプロテアーゼの双方の発現に適する条件下で該宿主細胞を増殖させることを含んでなる段階により、組換え宿主細胞から製造しうる。
【０１３３】
配列分析は、フリン（プロホルモン転換酵素の１メンバー）が、天然のリラキシン−３プレプロポリペプチドの鎖ＣとＢの間のペプチド結合を切断し、また、別の同定されていないプロテアーゼが天然のプロペプチドの鎖ＡとＣの間のペプチド結合を切断することを示唆した。ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ（ＲＧＲＲ）というアミノ酸配列をもつフリン切断部位を、鎖ＡおよびＣのペプチド接合部に挿入しうる。この変異体リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドの発現ベクターおよびフリンの別の発現ベクターを宿主細胞にコトランスフェクトする。適する増殖条件下で、リラキシン−３キメラプレプロポリペプチドは成熟ポリペプチドＡ、ＢおよびＣにほとんど完全にプロセシングされる。フリンの代わりに他のプロテアーゼもまた使用し得る。同一のプロテアーゼ切断部位を、キメラプレプロポリペプチドの鎖ＡとＣ、および鎖ＣとＢの間に挿入し得る。使用し得るプロテアーゼの例は、例えばフリン、ＰＣ１およびＰＣ２のようなプロホルモン転換酵素を包含する（Ｈｏｓａｋａら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１２１２７−１２１３０；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：３５６４−３５６８；Ｔｈｏｍａｓら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５２９７−５３０１）。
【０１３４】
好ましい態様において、ＨＡ、ポリＨｉｓ若しくはＦＬＡＧのような標識を、発明の改変したリラキシン−３キメラプレプロポリペプチドにいずれか付加し得る。「標識」という用語は、標識を含有するタンパク質の単離、精製若しくは検出を容易にするアミノ酸配
列若しくはアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。多様なこうした標識が当業者に既知であり、そして本発明での使用に適する。適する標識は、例えば、ＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジン、ＦＬＡＧ、および多様な抗体エピトープ結合部位を包含する。ＰＣＲのような、こうしたＤＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列中のある種の所望の変化を引き起こすようにＤＮＡ分子を改変することが既知の技術を使用しうる。とりわけ好ましい一態様において、ＦＬＡＧ標識を発明のリラキシン−３キメラポリペプチドに付加する。
【０１３５】
発明のリラキシン−３キメラポリペプチドとＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の間の同定された相互作用は、こうした受容体若しくはこうした受容体−リガンド複合体の活性の調節におけるそれらの潜在的有効性若しくは選択性について化合物を同定するためのスクリーニング方法若しくはアッセイにおける、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２、またはＧＰＣＲ１３５／リラキシン−３キメラポリペプチド複合体若しくはＧＰＣＲ１４２／リラキシン−３キメラポリペプチド複合体いずれかの使用を見込む。
【０１３６】
従って、本発明の別の一般的な局面は、：（ａ）化合物を含んでなる試験サンプルを、で定義されたところの最低１種の受容体およびリラキシン−３キメラポリペプチドを含んでなるアッセイ試薬と接触させる段階；（ｂ）段階（ａ）を実施した後に該最低１種の受容体の生物学的活性を測定する段階；ならびに（ｃ）段階（ｂ）で測定した生物学的活性を、化合物を含有しない対照サンプルをアッセイ試薬と接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体の生物学的活性を調節する化合物の同定方法に関する。
【０１３７】
本発明の好ましい一態様において、生物学的活性の測定は、受容体−リガンド複合体の形成を同定することを含んでなる。本発明の受容体−リガンド複合体は、上述されたところの、精製されたタンパク質の形態、またはリガンド成分を含有する細胞若しくは組織抽出物の形態のリガンド成分を、受容体成分を発現する宿主細胞に添加することにより形成させ得る。
【０１３８】
直接検出（例えば放射活性、発光、光学若しくは電子密度）または間接的検出（例えばＦＬＡＧエピトープのようなエピトープ標識、若しくはワサビペルオキシダーゼのような酵素標識）を提供するもののような多様な標識を使用して、リガンド成分を標識し得る。とりわけ好ましい一態様において、リガンド成分を放射標識し、そして受容体−リガンド複合体の形成の同定はラジオグラフィーにより実施する。
【０１３９】
本発明の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２は、宿主細胞の細胞表面上の膜の成分である。
【０１４０】
他の好ましい態様において、上述された最低１種の受容体の生物学的活性の調節は、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体を発現する宿主細胞、若しくはこうした最低１種の受容体を含んでなる単離された膜の二次メッセンジャー応答を測定することにより測定する。例えば、複合体の生物学的活性は、活性化されたＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２により誘発されるシグナル伝達事象により測定し得る。このシグナル伝達事象は、当該技術分野で既知の１種若しくはそれ以上の適する方法を使用して、細胞の形態、移動若しくは走化性のような細胞の生理学の１種若しくはそれ以上の変化を測定することによって、間接的に測定しうる。それはまた、シグナル伝達経路に関与するタンパク質のリン酸化、例えばＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）のリン酸化を測定することにより直接に測定もし得る。例えばγ−リン酸で放射標識したＡＴＰ若しくはＧＴＰ分子を使用することによる、タンパク質リン酸化の測定方法が当該技術分野で既知である。蛍光分子、若しくは３５Ｓ、３２Ｐなどのような放射活性同
位体のような多様な標識を使用して、ＧＴＰ分子をγ−リン酸で標識し得る。
【０１４１】
発明の受容体／リガンド複合体の生物学的活性はまた、当該技術分野で既知の多数の適する技術のいずれかを使用して、二次メッセンジャー分子の細胞内濃度によっても測定し得る。例えば、ｐＨ変化はアクリジンオレンジのようなｐＨ感受性の色素を使用して測定し得る。カルシウム濃度は、蛍光分析画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）若しくは共焦点顕微鏡を使用して、ｆｌｕｏ−３（五カリウム塩、細胞非透過性の形態；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）若しくはｆｌｕｏ−３（ＡＭ）（アセトキシメチルエステルの形態のｆｌｕｏ−３、Ｔｅｆｌａｂｓ）（例えば、Ｌｉｕら、２００１、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２９９：１２１−１３０を参照されたい）のようなＣａ２＋に感受性の蛍光指示薬の光学的画像化を介して測定し得る。ｃＡＭＰ濃度は、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥ環状ＡＭＰアッセイ系（１２５Ｉ）、カタログ番号ＳＭＰ００１Ａ、ＮＥＮ；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：３５８２６−３５８３２もまた参照されたい）を使用して、若しくは、β−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子の発現がｃＡＭＰ応答配列（ｃｒｅ）の制御下にあるレポーター系（Ｍｏｎｔｍｉｎｙら、１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１３（５）：１８４−１８８）を介して検出し得る。
【０１４２】
試験化合物は、２種の細胞（機能的ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の双方を含有する第一の細胞、ならびに第一のものに同一であるがしかし機能的ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を欠くか、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の双方を欠く第二のもの）に対するその影響を比較することによりさらに特徴付けし得る。この技術はこれらのアッセイのバックグラウンドノイズの確立においてもまた有用である。当業者は、この制御機構が、機能的ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の調節に応答性である細胞の変化の容易な選択もまた可能にすることを認識するであろう。従って、好ましい例示的態様において、該スクリーニング方法は：（ａ）細胞表面上に発現されたＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方を有する第一の細胞を、リガンド成分および試験化合物と接触させる段階；（ｂ）試験化合物に対する第一の細胞での二次メッセンジャー応答を測定する段階、および、第一の細胞がリガンド成分とのみ接触されているがしかし試験化合物とされない対照のものとそれを比較する段階；（ｃ）第二の細胞をリガンド成分および試験化合物と接触させる段階；ここで、該第二の細胞は、それが細胞表面上にＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２の一方若しくは双方を発現しないことを除き第一の細胞にそれ以外は同一であり；（ｄ）試験化合物に対する第二の細胞の二次メッセンジャー応答を測定する段階、および、第二の細胞がリガンド成分とのみ接触されているがしかし試験化合物とされない対照のものと該二次メッセンジャー応答を比較する段階；ならびに（ｅ）（ｂ）の比較結果を（ｄ）のものと比較する段階を含んでなる。
【０１４３】
一方がその細胞表面上に受容体成分を発現しかつ他方がしないことを除きそれ以外は同一である２種の細胞を得る多数の方法が存在する。一態様において、第一の細胞は、その細胞表面上にＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれかを構成的に発現する、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２いずれかの組換え宿主細胞であり、また、第二の細胞は、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２組換え細胞が構築される親細胞である。別の態様において、細胞表面上でのその発現が誘導可能なプロモーターの制御下であるような、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれかの組換え宿主細胞が構築される。第一の細胞は、その表面上でのＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれかの発現を可能にする誘導可能な条件下で増殖された組換え細胞であり、そして、第二の細胞は、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれかの発現を可能にしない、誘導可能でない条件下で増殖された組換え細胞である。なお別の態様において、第一の細胞は、その表
面上にポリペプチドを発現するＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれかの天然の宿主細胞であり、そして第二の細胞は、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２いずれかの遺伝子が突然変異誘発により不活性化されている天然の宿主由来の変異体細胞である。標準的な分子生物学の方法を使用して、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれかの組換え宿主細胞を構築し得るか、またはＧＰＣＲ１３５遺伝子若しくはＧＰＣＲ１４２遺伝子のいずれかを不活性化し得る。
【０１４４】
本発明の他の好ましい態様において、上述されたアッセイ方法を、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２が成分である単離された膜とともに使用する。該膜は、その細胞表面上にＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２のいずれか、またはＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の双方を発現する天然の宿主細胞から、あるいは、好ましくは、その細胞表面上に増大された量のこうした受容体（１種若しくは複数）を発現する組換え宿主細胞から単離し得る。それはまた、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２宿主細胞を含んでなる組織からも単離し得る。あるいは、該受容体（１種若しくは複数）を含んでなる合成膜を、当該技術分野で利用可能である手段により製造し得る。
【０１４５】
上述されたとおり同定される活性の化合物若しくは調節物質、ならびに発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび発現ベクターを、ＧＰＣＲ１３５および／若しくはＧＰＣＲ１４２の調節、またはリラキシン−３若しくはリガンドのこうした受容体（１種若しくは複数）との相互作用、あるいは受容体／リガンド複合体（１種若しくは複数）により媒介される疾患若しくは障害に苦しめられている被験体の処置において、治療薬として使用しうる。こうした疾患若しくは障害は、例えば、ＣＮＳ障害（不安、統合失調症、うつ、気分、睡眠／覚醒）、代謝障害、摂食／飲酒障害、水および栄養素の恒常性、ならびに内分泌障害、聴覚処理障害、視覚的注意および衝動性眼球運動障害、触覚刺激の処理に関連する障害、知覚処理、統合および運動制御に関連する障害、ならびに制御性知覚認識に関連する障害、ストレスの多い状況での感覚運動反射、ならびに外側中隔、手綱、上丘、下丘、扁桃体、視床、脚間核、視床下部、視索上核、背側縫線、歯状回、嗅球および孤束の異常な機能活性と関連する障害を包含しうる。こうした調節物質はまた、不妊症のような生殖障害および機能不全を処置するのにも使用することができ、また、避妊薬として使用しうる。例えば、Ｇｏｔｏら、２００１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４３８：８６−１２２；Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ、８８（１５）：６４１３−６４１７；Ａｄａｍｓら、２０００、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８５８（１）：１７７−１８０；Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８（５０）：５０７５４−５０７６４；Ｃｈａｌｍｅｒｓら、１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５（１０）：６３４０−６３５０；Ｐｏｔｔｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９１：８７７７−８７８１；Ｖａｎ  Ｐｅｔｔら、２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４２８：１９１−２１２を参照されたい）。
【０１４６】
生物学的活性を低下させる調節物質はしばしば阻害剤と称され、受容体若しくはリガンドの発現、活性若しくは相互作用（例えば、ＧＰＣＲ１３５／リラキシン−３キメラポリペプチド複合体の発現若しくは活性ＧＰＣＲ１４２／リラキシン−３キメラポリペプチド複合体の発現若しくは活性、または双方の受容体／リラキシン−３キメラポリペプチド複合体の発現若しくは活性、あるいは受容体若しくはリガンドを個別に）を低下、予防、不活性化、脱感作、拮抗、抑制、共抑制、廃止、下方制御若しくはそれらと競合する化合物を包含する。生物学的活性を増大させる調節物質はしばしば活性化物質と称され、受容体
および／若しくはリガンドの発現、活性若しくは相互作用を増大させる、遂げる、活性化する、共活性化する、感作する、協同する、刺激する、助長する、促進する、感作する若しくは上方制御する化合物を包含する。「調節物質」は、「阻害剤」および「活性化物質」の双方、ならびにアゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニストを包含することを意図している。
【０１４７】
化合物の同定方法は、慣習的な実験室の形式を使用して、若しくはハイスループットに適合されたアッセイで実施し得る。「ハイスループット」という用語は、同時に複数のサンプルの若しくは迅速に単独のサンプルの容易なスクリーニングを可能にするアッセイデザインを指し、そしてロボット操作の能力を包含し得る。ハイスループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成するために試薬の使用を減少させるか若しくは操作の数を最少化するように至適化されているアッセイ設計である。アッセイ形式の例は、９６ウェル若しくは３８４ウェルプレート、空中浮遊液滴、および液体を取り扱う実験に使用される「実験室チップ（ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）」マイクロチャンネルチップを包含する。もちろん、プラスチック成型および液体取扱装置の小型化が進歩する際に、若しくは改良されたアッセイ装置が設計される際に、より多数のサンプルが、発明のアッセイを使用してより効率的にスクリーニングされることが可能であろう。
【０１４８】
スクリーニングの候補化合物は、多数の化学的分類から、好ましくは有機化合物の分類から選択し得る。候補化合物は巨大分子であり得るとは言え、好ましくは候補化合物は小分子有機化合物、すなわち５０以上かつ２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な１個若しくはそれ以上の官能化学基を有する。好ましい候補化合物は、最低１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基、好ましくは最低２個のこうした官能基、およびより好ましくは最低３個のこうした官能基を有する。候補化合物は、上で例示された官能基の１個若しくはそれ以上で置換された、環状炭素若しくは複素環構造部分および／または芳香族若しくは多環芳香族構造部分を含み得る。候補化合物はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上の誘導体若しくは構造アナログ、またはそれらの組合せなどのような生体分子でもあり得る。化合物が核酸である場合、化合物は好ましくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子であるが、とは言え非天然の結合若しくはサブユニットを有する改変された核酸もまた企図している。
【０１４９】
候補化合物は、合成若しくは天然の化合物のライブラリーを包含する多様な供給源から得ることができる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する、多様な有機化合物および生体分子の無作為および指向された合成のための多数の手段が利用可能である。候補化合物はまた：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な同時固相若しくは溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる（例えばＬａｍ、１９９７、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．、１２：１４５を参照されたい）。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーを利用可能であるか、若しくは慣例で製造しうる。加えて、天然のおよび合成で製造したライブラリーおよび化合物は、慣習的な化学的、物理的および生化学的手段により慣例に改変し得る。
【０１５０】
さらに、既知の薬理学的剤を、該剤の構造アナログを製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化およびアミド化のような指向された若しくは無作為の化学修飾にかけることができる。候補化合物は、ＧＰＣＲの若しくは発明のリラキシン−３キメラポリペ
プチドの１種に結合かつ／またはその機能若しくは活性を調節する既存の化合物に基づくことができる。従って、候補の剤の供給源は、ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２若しくは発明のリラキシン−３キメラポリペプチドに類似の構造をもつＧＰＣＲの活性化物質若しくは阻害剤を包含する分子の既知の若しくはスクリーニングされたライブラリーである。こうした化合物の構造は、より多い若しくはより少ない化学的部分または異なる化学的部分を含有するように該分子の１個若しくはそれ以上の位置で変更しうる。アナログ活性化物質／阻害剤のライブラリーの創製において該分子に対しなされる構造の変化は、指向された、無作為、または指向されたおよび無作為の置換および／若しくは付加の双方の組合せであり得る。
【０１５１】
多様な他の試薬もまたアッセイ混合物に包含し得る。これらは、至適のタンパク質−タンパク質および／若しくはタンパク質−核酸結合を助長するのに使用し得る、塩、緩衝剤、中性のタンパク質（例えばアルブミン）および洗剤のような試薬を包含する。こうした試薬はまた、反応成分の非特異的なすなわちバックグラウンドの相互作用も低下させ得る。ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させる他の試薬もまた使用し得る。
【０１５２】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で、例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７：２６７８に見出し得る。化合物のライブラリーは、溶液中で（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：４１２−４２１）またはビーズ（Ｌａｍ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１８６５−１８６９）若しくはファージ（例えばＳｃｏｔｔら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６−３９０を参照されたい）上に提示し得る。
【０１５３】
従って、一般的な一局面において、本発明は：（ａ）最低１種の受容体を、試験化合物および標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させる段階；（ｂ）該最低１種の受容体に結合する標識リラキシン−３キメラポリペプチドの量を測定する段階；ならびに（ｃ）段階（ｂ）で測定した量を、試験化合物の非存在下で最低１種の受容体を標識リラキシン−３キメラポリペプチドと接触させることにより得られる対照測定値と比較する段階を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体に結合する化合物の同定方法に関する。
【０１５４】
なお他の態様において、本発明は：ａ）受容体成分を試験化合物および標識リガンド成分と接触させる段階；ｂ）最低１種の受容体に結合する標識リガンド成分の量を測定する段階；ならびにｃ）（ｂ）の測定された量を、試験化合物の非存在下で受容体（１種若しくは複数）を標識リガンド成分と接触させることにより得られる対照測定値にものと比較する段階を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２よりなる群から選択される最低１種の受容体に結合する化合物の同定方法を提供する。
【０１５５】
好ましい例示的一態様において、細胞表面上に最低１種の受容体を発現する受容体宿主細胞（組換え若しくは天然）を結合アッセイに使用し得る。別の好ましい例示的態様において、最低１種の受容体を含んでなる単離された膜調製物を結合アッセイに使用し得る。なお別の好ましい態様において、発明のリラキシン−３キメラポリペプチドに結合することが可能である最低１種の受容体の実質的に精製された細胞外フラグメントを結合アッセイに使用し得る。
【０１５６】
最低１種の受容体に結合する標識リガンド成分若しくはそのフラグメントの量は、未結
合の標識リガンド成分若しくはフラグメントを最低１種の受容体を最初に分離すること、および最低１種の受容体と会合している標識の量をその後測定することにより測定し得る。
【０１５７】
未結合の標識リガンド成分からの最低１種の受容体タンパク質の分離は多様な方法で達成し得る。便宜的には、最低１種の受容体を固体支持体に固定することができ、それからリガンド成分を容易に分離し得る。固体支持体は、多様な素材から、および多様な形状、例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティックおよび樹脂粒子に作成し得る。支持体は、好ましくは、主としてバックグラウンド結合を最少にするため、ならびに分離の容易さおよび費用のためにＳ／Ｎ比を最大にするよう選ぶ。
【０１５８】
分離は、例えば、ビーズ若しくはディップスティックをリザーバから取り出すこと、マイクロタイタープレートのウェルのようなリザーバを空にするか若しくは希釈すること、またはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム若しくはフィルターを洗浄溶液若しくは溶媒ですすぐことにより遂げることができる。分離段階は好ましくは複数のすすぎ若しくは洗浄を包含する。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、ウェルは、例えば、塩、緩衝剤、洗剤、非特異的タンパク質などのような特異的結合に参画しないインキュベーション混合物の成分を包含する洗浄溶液で数回洗浄し得る。固体支持体が磁性ビーズである場合、ビーズを洗浄溶液で１回若しくはそれ以上洗浄し得、そして磁石を使用して単離し得る。
【０１５９】
最低１種の受容体は多数の方法を使用して固体支持体に固定し得る。一態様において、最低１種の受容体タンパク質がマトリックスに結合されることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質若しくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）若しくはグルタチオン誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させ得、それをその後試験化合物および標識リガンド成分と組合せ、そして、該混合物を複合体形成に伝導性の条件下で（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベートする。インキュべーション後に、ビーズ若しくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合の成分も除去し、そして、例えば上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれかで複合体形成を測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして、最低１種の受容体への標識リガンド成分の結合のレベルを、標準的技術を使用して測定し得る。
【０１６０】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る。例えば、最低１種の受容体を、ビオチンおよびストレプトアビジンの複合を利用して固定し得る。ビオチニル化ポリペプチドを、当該技術分野で既知の技術（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州ロックフォードから入手可能なビオチニル化キット）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し得、そしてストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定し得る。
【０１６１】
あるいは、受容体（１種若しくは複数）と反応性しかし該最低１種の受容体のリガンド成分若しくは試験化合物への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに結合し得、そして該最低１種の受容体をその後、抗体複合によりウェル中で捕捉し得る。
【０１６２】
直接検出（例えば放射活性、発光、光学若しくは電子密度）または間接的検出（例えばＦＬＡＧエピトープのようなエピトープ標識、若しくはワサビペルオキシダーゼのような酵素標識）を提供するもののような多様な標識を、リガンド成分若しくはそのフラグメン
トのいずれを標識するのにも使用し得る。
【０１６３】
候補化合物の存在および非存在下でのリガンド成分に対する該最低１種の受容体の相互作用は、反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成し得る。こうした容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を包含する。
【０１６４】
さらに、受容体は構成的活性を生じるように改変し得る。この構成的活性はインバースアゴニストにより抑制され得る。
【０１６５】
ある態様若しくは本発明において、こうした調節活性を有すると同定された化合物の治療上有効な量をそれの必要な被験体に投与することを含んでなる、受容体若しくはリガンドの活性、発現若しくは相互作用の調節により媒介される医学的状態の処置方法が提供される。「処置すること」という用語は、医学的状態の症状若しくは原因を予防、低下、減少、抑制、軽減若しくは緩和することを包含する。こうした処理は治療的若しくは予防的であり得る。本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は、処置、観察若しくは実験の対象である動物を指す。好ましくは、被験体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１６６】
「製薬学的有効量」は、所望の調節効果を達成するのに十分な量若しくは用量である。特定の処置に適する量は、モデル化、用量増大試験若しくは臨床試験のような慣例の方法により、および、慣例の因子、例えば投与若しくは薬物送達の様式若しくは経路、剤の薬物動態、障害若しくは状態の重症度および経過、被験体の以前の若しくは進行中の治療、被験体の健康状態および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断を考慮に入れることにより確かめうる。例示的用量は、単一若しくは分割された投薬量単位（例えば１日２回、１日３回、１日４回）で、１日あたり被験体の体重１ｋｇあたり約０．００１から約２００ｍｇまで、好ましくは約０．０５ないし１００ｍｇ／ｋｇ／日、若しくは約１ないし３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある。７０ｋｇのヒトについては、具体的に説明する投薬量は約０．０５から約７ｇ／日まで、若しくは約０．２ないし約２．５ｇ／日である。
【０１６７】
患者の状態の改善が一旦起これば、予防的若しくは維持処置のため用量を調節しうる。例えば、投薬量若しくは投与頻度、または双方を、症状の関数として、所望の治療若しくは予防効果が維持されるレベルまで低下させうる。もちろん、症状が適切なレベルまで軽減された場合は処置を中止しうる。患者は、しかしながら、症状のいかなる再発に際しても、長期間、間欠的処置を必要としうる。
【０１６８】
本発明の化合物若しくは処置剤は、本発明の製薬学的組成物を処方するため、単独で、または１種若しくはそれ以上の他の有効成分と組合せで使用しうる。本発明の製薬学的組成物は、上述されたところの方法を使用して決定しうる、製薬学的有効量の調節活性を有する化合物を含んでなる。「製薬学的に許容できる賦形剤」は、製薬学的剤の投与を容易にするために製薬学的組成物に添加されるかまたはベヒクル、担体若しくは希釈剤として別の方法で使用されかつそれと適合性である不活性物質のような、被験体への投与に対し毒性、生物学的に容認し得ない、若しくは別の方法で生物学的に不適ではない物質を指す。賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖および多様な型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを包含する。
【０１６９】
製薬学的剤の１個若しくはそれ以上の投薬単位を含有する製薬学的組成物の送達形態物は、当業者に既知の適する製薬学的賦形剤および調合技術を使用して製造しうる。組成物は、経口、非経口、直腸、局所若しくは眼経路または吸入により本発明の方法で投与しうる。
【０１７０】
製剤は、錠剤、カプセル剤、小袋、糖衣錠、散剤、顆粒剤、トローチ剤、再構成のための粉末、液体製剤若しくは坐剤の形態にありうる。好ましくは、組成物は静脈内注入、局所投与若しくは経口投与のため処方する。
【０１７１】
経口投与のためには、本発明の化合物は錠剤若しくはカプセル剤の形態で、または溶液、乳剤若しくは懸濁剤として提供し得る。経口組成物を製造するため、該剤は、例えば１日約０．０５から約５０ｍｇ／ｋｇまで、若しくは１日約０．０５から約２０ｍｇ／ｋｇまで、若しくは１日約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇまでの投薬量を生じるように処方しうる。
【０１７２】
経口錠剤は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、着香料、着色剤および保存剤のような製薬学的に許容できる賦形剤と混合した有効成分を包含しうる。適する不活性増量剤は炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、乳糖、デンプン、糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどを包含する。例示的な液体の経口賦形剤はエタノール、グリセロール、水などを包含する。デンプン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デンプングリコール酸ナトリウム、結晶性セルロースおよびアルギン酸が適する崩壊剤である。結合剤はデンプンおよびゼラチンを包含しうる。滑沢剤は、存在する場合、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクでありうる。所望の場合は、錠剤は、胃腸管での吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリン若しくはジステアリン酸グリセリンのような物質で被覆しうるか、または腸溶コーティングで被覆しうる。
【０１７３】
経口投与のためのカプセル剤は硬および軟ゼラチンカプセルを包含する。硬ゼラチンカプセル剤を製造するためには、有効成分を固体、半固体若しくは液体の希釈剤と混合しうる。軟ゼラチンカプセル剤は、有効成分を水、ラッカセイ油若しくはオリーブ油のような油、流動パラフィン、短鎖脂肪酸のモノおよびジグリセリドの混合物、ポリエチレングリコール４００若しくはプロピレングリコールと混合することにより製造しうる。
【０１７４】
経口投与のための液体は、懸濁剤、溶液、乳剤若しくはシロップ剤の形態にありうるか、または使用前の水若しくは他の適するベヒクルでの再構成のための乾燥生成物として提示しうる。こうした液体組成物は、場合によっては：懸濁化剤（例えばソルビトール、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルなど）のような製薬学的に許容できる賦形剤；非水性ベヒクル、例えば油（例えばアーモンド油若しくはヤシ油）、プロピレングリコール、エチルアルコール若しくは水；保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピルまたはソルビン酸）；レシチンのような湿潤剤；および、所望の場合は着香料若しくは着色剤を含有しうる。
【０１７５】
本発明の組成物は経口以外の経路によってもまた投与しうる。例えば、組成物は直腸投与のため坐剤として処方しうる。静脈内、筋肉内、腹腔内若しくは皮下経路を包含する非経口使用のため、本発明の剤は、適切なｐＨおよび等張性に緩衝された滅菌の水性溶液若しくは懸濁剤で、または非経口で許容できる油中で提供しうる。適する水性ベヒクルは、リンゲル液および等張の塩化ナトリウムを包含する。こうした形態物は、アンプル若しくは使い捨て注入装置のような単位投与剤形物で、適切な用量をそれから引き出しうるバイアルのような多用量剤形物で、または注入可能な製剤を調製するのに使用し得る固体の形態若しくは前濃縮物で提示されることができる。具体的に説明する注入用量は、数分から数日までの範囲にわたる期間にわたり、製薬学的担体と混合された約１から１０００μｇ／ｋｇ／分の剤の範囲にわたりうる。
【０１７６】
局所投与のためには、ベヒクルに対し約０．１％ないし約１０％の薬物の濃度で、剤を
製薬学的担体と混合しうる。本発明の剤の別の投与様式は、経皮送達に影響を及ぼすための貼付剤製剤を利用しうる。
【０１７７】
剤は、あるいは、例えば適する担体もまた含有するスプレー製剤で、鼻若しくは経口経路を介する吸入により本発明の方法で投与しうる。
【０１７８】
本発明の別の態様は、本発明の製薬学的に許容できるベクターを含んでなる製薬学的に許容できる組成物を投与することを含んでなる、医学的状態の処置方法を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、いずれかの適する方法、例えばウイルスベクターでの感染、リポソームに基づく方法、遺伝子銃粒子加速および裸のＤＮＡ注入を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に導入しうる。
【０１７９】
こうした治療上有用な核酸は生物学的に活性のタンパク質のコーディング配列を包含する。こうした配列は、上述されたとおり、プロモーターに作動可能に連結しうる。核酸は、それ自身が直接治療上有効である細胞の形態で投与しうる（例えばある種のアンチセンス若しくはリボザイム分子）。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエート若しくはメチルホスホネートのようなＲＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体、または他のアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物でありうる。アンチセンス分子は、微小注入法、リポソーム被包化、若しくはアンチセンス配列をもつベクターからの発現により細胞に導入しうる。
【０１８０】
遺伝子治療技術を使用して、生物学的に活性のタンパク質を標的生物体の細胞に導入しうる。具体的に説明するために、レシピエント宿主細胞の感染によるＤＮＡの移入を媒介するウイルスベクターにＤＮＡを連結する。適する例示的ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ複合物若しくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合物を使用する受容体媒介性の標的を定められたＤＮＡ移入、リポフェクション膜融合、または直接微小注入法のようなウイルス以外の技術により遺伝子治療のための細胞に移入し得る。目的の遺伝子との使用に適する遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓにより編、Ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トタワ、１９９６に例示されている。
【０１８１】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはポリペプチド、またはリラキシン−３若しくは受容体の活性の小分子調節物質を含んでなる製薬学的に有効な組成物は、製薬学的に許容できる担体の混合状態によるような既知の方法に従って処方しうる。こうした担体および処方方法の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳに見出しうる。効果的な投与に適する製薬学的に許容できる組成物を形成するために、こうした組成物は、有効量のポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは調節物質を含有することができる。
【０１８２】
本発明の他の具体的に説明する特徴および好ましい態様を以下の実施例に記述する。
実施例
【実施例１】
【０１８３】
リラキシン−３キメラポリペプチド、ＧＰＣＲ、ＬＧＲのクローニング、発現および精製、ならびにそれらをコードする発現ベクター
キメラポリペプチド発現構築物の構築
一連のキメラポリペプチドは、αペプチドシグナルペプチド、ＦＬＡＧ標識、ヒトリラキシン−３のＢ鎖、ヒトリラキシン−３のＣ鎖、および以下、すなわちリラキシン−１（
Ｈｕｄｓｏｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０１：６２８−６３１）、リラキシン−２（Ｈｕｄｓｏｎら、１９８４、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、３：２３３３−２３３９）、ＩＮＳＬ３（Ａｄｈａｍら、１９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６８：２６６６８−２６６７２）、ＩＮＳＬ４（Ｋｏｍａｎら、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１：２０２３８−２０２４１）、ＩＮＳＬ５（Ｃｏｎｋｌｉｎら、１９９９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６０：５０−５６）、ＩＮＳＬ６（Ｌｏｋら、２０００、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、６２：１５９３−１５９９）、インスリンの１種からのＡ鎖、若しくはシステイン残基のみが変えられないままであった一方で全部の他のアミノ酸残基が無作為に割り当てられた人工的Ａ鎖のコーディング領域を包含した遺伝子カセットを創製することにより製造した。各構築物のＣ鎖およびＡ鎖の接合部は、発明のキメラポリペプチドのコーディング領域をＰＣＲ増幅したＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲ発現ベクター（Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４）由来の人工的フリン切断部位（ＲＧＲＲ）を含有した。このフリン切断部位は、フリンと共発現される場合に該キメラプロペプチドの効率的なｉｎ  ｖｉｖｏ切断を見込んだ（Ｈｏｓａｋａら、１９９１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ   Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６６：１２１２７−１２１３０；Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４）。
【０１８４】
キメラペプチドのコーディング領域のＰＣＲ増幅
リラキシン−３／リラキシン−１（Ｒ３／Ｒ１）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン−１のＡ鎖を含んでなる。こうしたキメラポリペプチドのＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲ（Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４）を使用し、また、プライマーＰ１（番号３２）（５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  Ｔ  ３’）およびＰ２配列番号３３）（５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＧ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ３’）を使用してＰＣＲ増幅した。
【０１８５】
リラキシン−３／リラキシン−２（Ｒ３／Ｒ２）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖およびリラキシン−２のＡ鎖を含んでなる。こうしたキメラポリペプチドのＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲ（上を参照されたい）を使用し、また、上述されたプライマーＰ１（上の配列番号３２）およびＰ３（配列番号３４）（５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ
ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＡ
ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＴＧＣ
ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ
ＣＣＣ  ＡＧＧ  ３’）を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０１８６】
リラキシン−３／ＩＮＳＬ３（Ｒ３／Ｉ３）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖およびＩＮＳＬ３のＡ鎖を含んでなる。こうしたキメラポリペプチドのＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲ（上を参照されたい）を使用し、また、プライマーＰ１（上の配列番号３２）およびＰ４（配列番号３５）（５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＴＣＧ
ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧ  ３’）を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０１８７】
リラキシン−３／ＩＮＳＬ４（Ｒ３／Ｉ４）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖およびＩＮＳＬ４のＡ鎖を含んでなる。こうしたキメラポリペプチドのＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲを使用し、また、プライマーＰ１（上の配列番号３２）およびＰ５（配列番号３６）（５’ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ３’）を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０１８８】
リラキシン−３／ＩＮＳＬ５（Ｒ３／Ｉ５）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖およびＩＮＳＬ５のＡ鎖を含んでなる。こうしたキメラポリペプチドのＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲを使用し、また、プライマーＰ１（上の配列番号３２）およびＰ６（配列番号３７）（５’ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ３’）を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０１８９】
リラキシン−３／ＩＮＳＬ６（Ｒ３／Ｉ６）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖およびＩＮＳＬ６のＡ鎖を含んでなる。該ＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲを使用し、また、プライマーＰ１（上の配列番号３２）およびＰ７（配列番号３８）（５’ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＡ
ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ
ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＧＧＡ
ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧ  ３’）を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０１９０】
リラキシン−３／インスリン（Ｒ３／Ｉ）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖およびインスリンのＡ鎖を含んでなる。該ＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲを使用し、また、プライマーＰ１（上の配列番号３２）およびＰ８（配列番号３９）（５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧ  ３’）を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０１９１】
リラキシン−３／人工的Ａ鎖（Ｒ３／Ａ）キメラポリペプチドは、リラキシン−３のＢ鎖、ならびに、保存されたシステイン残基および他の位置の自由裁量で割り当てたアミノ酸を含んでなるＡ鎖を含んでなる。該ＤＮＡコーディング領域を、鋳型として改変ヒトリラキシン−３発現ベクターＲｅｌａｘｉｎ−３  ＲＲを使用し、また、プライマーＰ１（上の配列番号３２）およびＰ９（配列番号４０）（５’ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ
ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＧＴＣ
ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＣＡＧ
ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧ  ３’）を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０１９２】
リラキシン−３キメラペプチドの発現ベクターの構築
上述されたリラキシン−３キメラポリペプチドコーディング領域のＰＣＲ産物を、ＤＮＡ制限酵素Ｐｓｔ  １およびＢａｍ  Ｈ１で消化し、そして哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ  ｓｐｏｒｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＰｓｔ１とＢａｍ  Ｈ１部位の間にクローン化した。各構築物の挿入物領域を配列決定して配列の同一性を確認した。
キメラペプチドの発現および精製
発明のキメラポリペプチドのアミノ酸配列を図２に描く。
【０１９３】
記述される多様なリラキシン−３キメラポリペプチド発現構築物のそれぞれを、ヒトフリン発現プラスミド（Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４）とＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション３日後に、トランスフェクトした細胞の馴化培地中に分泌された組換えペプチドを抗ＦＬＡＧアフィニティーカラムでアフィニティー精製し、エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で切断してＮ末端ＦＬＡＧ標識（Ｓｉｇｍａ）を除去し、そしてその後、Ｃ−１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。精製したペプチドを、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けして純度を確認した。Ｒ３／Ｒ２、Ｒ３／Ｉ３、Ｒ３／Ｉ５およびＲ３／Ｉ６のタンパク質発現レベルは、約１ｍｇ／Ｌであったリラキシン−３野性型ペプチドの産生に比較可能であった（Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４）。Ｒ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｉ４の産生レベルはおよそ２００μｇ／Ｌでより低かった。Ｅ３／ＩおよびＥ３／Ａキメラを作成するための試みは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合に検出可能なペプチドをもたらさなかった。
ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８の分子クローニング
組換えＧＰＲＣ１３５および組換えＧＰＣＲ１４２のクローニング、製造法および使用法は、Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４、Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７６５−５０７７０、特許出願、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ００／２３１１１号、同第ＷＯ００／２４８９１号、同第ＷＯ０１／４８１８９号、同第ＷＯ０１／６２７９７号、同第ＷＯ０１／７４９０４号および同第ＷＯ０１／８５７９１号明細書、米国仮出願第６０／５８０，０８３号明細書、ならびに米国特許出願第１０／７８６，４７８号明細書（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【０１９４】
完全なコーディング領域を含有するヒトＬＧＲ７  ｃＤＮＡを、以下の２種のプライマー、すなわち、フォワードプライマー（配列番号４１）：５’ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ３’；およびリバースプライマー（配列番号４２）：５’ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＡ  ３’）（それぞれ公開された配列（Ｈｓｕら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４：１２５７−１２７１；Ｈｓｕら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：６７１−６７４）に従って設計した）を使用して、ヒト脳ｃＤＮＡプール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）からＰＣＲ増幅した。
【０１９５】
完全なコーディング領域を含有するヒトＬＧＲ８  ｃＤＮＡは、以下の２種のプライマーフォワードプライマー（配列番号４３）：５’ＴＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ３’；リバースプライマー（配列番号４４）：５’ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＴＣ  ３’）（それぞれ、公開された配列（Ｈｓｕら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：６７１−６７４）に従って設計した）を使用して、ヒト精巣ｃＤＮＡプール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＰＣＲ増幅した。生じるＬＧＲ７およびＬＧＲ８  ｃＤＮＡをそれぞれ個別に哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化し、そして挿入物領域を配列決定して、それぞれＬＧＲ７およびＬＧＲ８に対する配列の同一性を確認した。
【実施例２】
【０１９６】
ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８に対するリラキシン−３のＢ鎖のアゴニスト活性の特徴付け
合成ヒトリラキシン−３のＢ鎖単独がＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方に対するアゴニストであるがしかしＡ鎖はそうでないことが示された（Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４およびＬｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７６５−５０７７０）。それらの研究を、本明細書で、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞（Ｌｉｕら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５９：４２０−４２６）で反復した。こうしたＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞で、細胞内ｃＡＭＰ濃度の増大は増大したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現につながり、その活性は、基質としてクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）を使用して測定する。
【０１９７】
該結果は、リラキシン−３のＢ鎖が、ＧＰＣＲ１３５（８８ｎＭのＥＣ５０値で、図１Ａ）若しくはＧＰＣＲ１４２（１２５ｎＭのＥＣ５０値で、図１Ｂ）を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞中のフォルスコリンで刺激したβ−ガラクトシダーゼ活性を用量依存性の様式で阻害したことを示す。平行実験で、ヒトリラキシン−３のＢ鎖はＬＧＲ７（図１Ｃ）若しくはＬＧＲ８（図１Ｄ）いずれかを発現する細胞を活性化しなかった一方、ブタリラキシンおよびヒトリラキシン−３は、ＬＧＲ７発現細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激し（それぞれ０．２５ｎＭおよび１．４ｎＭのＥＣ５０値で、図１Ｃ）、また、ブタリラキシンおよびヒトＩＮＳＬ３は、ＬＧＲ８発現細胞でのβ−ガラクトシダーゼ活性を誘導した（それぞれ１．５ｎＭおよび０．１６ｎＭのＥＣ５０値で、図１Ｄ）。
【実施例３】
【０１９８】
放射リガンド結合によるリラキシン−３キメラポリペプチドの薬理学的特徴付け
発明のキメラポリペプチドを、それらの受容体結合特性を評価するため、放射リガンド結合アッセイでＧＰＣＲ１３５（図３Ａ）、ＧＰＣＲ１４２（図３Ｂ）、ＬＧＲ７（図３Ｃ）およびＬＧＲ８（図３Ｄ）のリガンドとして試験した。
【０１９９】
ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の放射リガンド結合アッセイは、以前に記述されたとおり（Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４、およびＬｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７６５−５０７７０）実施した。ＧＰＣＲ１３５発現ベクター若しくはＧＰＣＲ１４２発現ベクター（それぞれ上述された）いずれかで一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞からの膜を、９６ウェルプレート中で、最終濃度１００ｐＭの［１２５Ｉ］−リラキシン−３とともにインキュベートした。競合結合研究のためのペプチドを、結合緩衝液［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ウシ血清アルブミン、０．１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）］中の結合混合物（最終容量：２００μｌ）に添加した。結合混合物を室温で１時間インキュベートし、０．３％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ）で予め飽和させたＧＦＣプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）を通して濾過し、そして冷洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄した。Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−４０を各ウェルに添加し、そして結合した［１２５Ｉ］−リラキシン−３をシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ／ＮＴＸ、Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。
【０２００】
ＬＧＲ７およびＬＧＲ８の放射リガンド結合アッセイは、１５ｃｍ培養皿中、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした生存ＣＯＳ−７細胞を使用して実施した。トランスフェクション２日後に、トランスフェクトした細胞を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を使用して１５ｃｍ培養皿から剥離し、９６ウェルの不透明ポリ−Ｄ−リシン被覆培養プレートに接種し、そして放射リガンド結合アッセイに使用した。ＬＧＲ７については、［１２５Ｉ］−リラキシン−３をトレーサーとして使用した。ＬＧＲ８については、［１２５Ｉ］−ＩＮＳＬ３（比活性：２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をトレーサーとして使用した。［１２５Ｉ］標識したトレーサーを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１％ウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭを含有する結合緩衝液中１００ｐＭの最終濃度で結合反応に添加した。未標識のリラキシン−３およびリラキシン−３キメラポリペプチドを、示されるとおり（図３）競合体として多様な濃度で結合アッセイに添加した。結合混合物を室温で１時間インキュベートした。未結合の放射リガンドを、結合緩衝液の吸引により除去した。細胞をＰＢＳで洗浄した。結合した放射リガンドをシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ／ＮＴＸ）でカウントした。結果を、Ｐｒｉｓｍ  ３．０プログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して分析した。ＩＣ５０値は、最大の特異的結合の５０％を阻害するリガンド濃度を表す。
【０２０１】
ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８についての多様なキメラポリペプチドのＩＣ５０値を表１に列挙する。
【０２０２】
該結果は、Ｒ３／Ｉ４を除く全部のキメラポリペプチドが、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方を高親和性で（すなわち低ナノモル濃度範囲のＩＣ５０値で）、しかし効力のわずかな差違を伴い結合したことを示した。Ｒ３／Ｉ４は最高濃度（１μＭ）でわずかな結合を示した。キメラポリペプチドＲ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２およびＲ３／Ｉ３は、リラキシン−３のものに同様である低ナノモル濃度範囲のＩＣ５０値でＬＧＲ７に結合した。Ｒ３／Ｉ６は１５ｎＭのＩＣ５０値でＬＧＲ７を結合した。それぞれナノモル濃度以下および低ナノモル濃度範囲のＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２に対する親和性を示したＲ３／Ｉ５キメラポリペプチドは、約０．５μＭのＩＣ５０値を伴い、ＬＧＲ７に対するより低い親和性を示した。Ｒ３／Ｉ４は試験した最高濃度（１μＭ）ででさえＬＧＲ７に対し不活性であった。キメラポリペプチドのいずれも、ＬＧＲ８を高親和性で結合しなかった。Ｒ３／Ｉ４、Ｒ３／Ｉ５、Ｒ３／Ｉ６はＬＧＲ８に対する結合親和性を示さなかった一方、キメラポリペプチドＲ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２およびＲ３／Ｉ３は、それぞれＬＧＲ８に対する控えめな結合親和性を示した（０．５μＭないし１μＭ以上のＩＣ５０値）。
【実施例４】
【０２０３】
機能アッセイにおけるリラキシン−３キメラポリペプチドの薬理学的特徴付け
発明のキメラポリペプチドを、それぞれ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞（上を参照されたい）の別個のプール（各プールは、示されるとおり、代表的受容体の１つを安定に発現する）でのそれぞれＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８いずれかを活性化するそれらの能力について独立に試験した（図４）。
【０２０４】
細胞を、１０％胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＧ４１８（４００ｍｇ／Ｌ）を添加したＭＥＭ中３０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養プレートに接種した。ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を発現
する細胞について、フォルスコリンを５μＭの最終濃度で細胞に添加して、細胞内ｃＡＭＰ蓄積を刺激した。異なる濃度の発明のポリペプチドのそれぞれをその後細胞に添加して、フォルスコリン誘発性のｃＡＭＰ蓄積を阻害した。ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８を発現する細胞については、細胞内ｃＡＭＰを、多様な濃度の発明のキメラポリペプチドのそれぞれで刺激した。
【０２０５】
全部の細胞について、キメラポリペプチドを添加した後、細胞を３７℃のインキュベーター中で追加の６時間インキュベートした。培地をその後吸引し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性を、以前に記述された（Ｌｉｕら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５９：４２０−４２６）とおり測定した。結果をＰｒｉｓｍ  ３．０ソフトウェアにより解析した。ＥＣ５０値は、それぞれ、フォルスコリン誘発性のβ−ガラクトシダーゼ活性の最大の阻害の５０％（ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２）、または最大のキメラポリペプチド誘発性のβ−ガラクトシダーゼ活性の５０％（ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８）を達成したキメラポリペプチド濃度を表す。
【０２０６】
該結果は、試験した全部のキメラポリペプチドがＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方に対しアゴニストとして作用することを示した。キメラポリペプチドＲ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２、Ｒ３／Ｉ３およびＲ３／Ｉ５は、低ナノモル濃度範囲のＥＣ５０値を伴い、野性型リラキシン−３のものと比較して、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２に対し同様の効力を示した。キメラポリペプチドＲ３／Ｉ６は、各受容体について約１０ｎＭのＥＣ５０値を伴い、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２双方に対しわずかにより少なく強力であった。キメラポリペプチドＲ３／Ｉ４は、試験した最高濃度（１μＭ）でのみ、ＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２を刺激した（表２ならびに図４Ａおよび４Ｂ）。
【０２０７】
ＬＧＲ７を安定に発現する細胞について、結果は、キメラポリペプチドＲ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２およびＲ３／Ｉ３が約１ないし５ｎＭのＥＣ５０値を伴い高い効力を表したことを示した。キメラポリペプチドＲ３／Ｉ６は、１０ｎＭのＥＣ５０値を伴い、ＬＧＲ７に対するより低い効力を示した。キメラポリペプチドＲ３／Ｉ５（ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２に対する強力なアゴニスト、上を参照されたい）は、およそ４００ｎＭのＥＣ５０値を伴い、ＬＧＲ７に対する低い効力を示した。ＬＧＲ８を安定に発現する細胞については、キメラポリペプチドＲ３／Ｒ１が、試験した最高濃度（１μＭ）でわずかな活性を示した。Ｒ３／Ｒ２およびＲ３／Ｉ３キメラポリペプチドは、それぞれが、それぞれ約６００ｎＭおよび３００ｎＭのＥＣ５０値を伴うより高い効力を示した。試験した他のキメラポリペプチドのいずれも、このアッセイでＬＧＲ８に対する活性を示さなかった（表２、ならびに図４Ｃおよび４Ｄ）。
【０２０８】
組換えＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８を発現しない対照ＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞は、いずれのポリペプチドに対しても応答しなかった。
【実施例５】
【０２０９】
ＧＰＣＲ１３５発現細胞へのＲ３／Ｉ５の結合
本実施例に記述される全部の実験は、米国国立保健研究所により承認かつ公表されたところの実験動物に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ
ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って実施した。
【０２１０】
成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１５０〜２００ｇ）を二酸化炭素により窒息死させた。ラット脳を頭蓋から即座に取り出し、そしてドライアイス（すなわち固体の昇華するＣＯ２）中で迅速に凍結した。２０ミクロン厚の矢状切片を、Ｃｒｙｏｓｔａｔマイクロトーム（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５０５Ｅ、Ｍｉｋｒｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して切断し、そして付着性顕微鏡スライドガラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏ
ｓｔ＋  Ｐｌｕｓ、ＶＷＲ）に融解マウントした。切片を使用まで−７０℃に保った。切片を融解し、そして冷空気流下に乾燥し、そしてその後、切片を４００ｍｌジャーに浸積することにより、インキュベーション緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ２、０．２２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中、室温で１５分間プレインキュベートした。切片を冷空気流下に再度乾燥し、そして、０．５％ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有するインキュベーション緩衝液中で、５ｐＭの［１２５Ｉ］−リラキシン−３（比活性２２００Ｃｉ／ｍモル）若しくは［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５（比活性２２００Ｃｉ／ｍモル）とともに６０分間インキュベートした。非特異的結合を１００ｎＭのヒトリラキシン−３の存在下で測定した。インキュベーション後に、過剰の放射リガンドを、スライドを４℃でインキュベーション緩衝液を含有するジャーに浸積し、次いで水に短時間浸積することによる３回の反復洗浄（各洗浄１０分）で洗い流した。切片を乾燥し、そして富士フイルムイメージングプレート（ＢＡＳ−ＭＳ  ２０２５）に４８時間露光した。画像化プレートを、Ｆｕｊｉ  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ分析装置（ＢＡＳ−５０００）を使用して走査し、そしてＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  Ｖ３．１２ソフトウェアを使用して可視化した。
【０２１１】
該結果は、［１２５Ｉ］−リラキシン−３（図５Ａ）および［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ３（図５Ｂ）双方が高親和性でＧＰＣＲ１３５発現細胞に結合する一方、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５は［１２５Ｉ］−リラキシン−３より低い非特異的結合を生じたことを示した。加えて、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５はＬＧＲ７への有意の結合を示さなかった一方、［１２５Ｉ］−リラキシン−３は示した。［１２５Ｉ］−リラキシン−３をラット脳切片で放射リガンドとして使用した場合、総結合と非特異的結合（１００ｎＭの未標識リラキシン−３の存在下で測定した）の間に実質的な差違が観察されなかった（図５Ｃ）。対照的に、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５を放射リガンドとして使用した場合、非特異的結合が低下した（図５Ｄ）。ＧＰＣＲ１３５様結合部位が、皮質、嗅球および上丘領域で観察された（図５Ｄ）。
【０２１２】
上の実施例からの結果の論考
ＧＰＣＲ１３５は脳中で優先的に発現される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２０００、Ｇｅｎｅ、２４８：１８３−１８９；Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４）。ＧＰＣＲ１３５を活性化するための脳中のリラキシン−３のｉｎ  ｖｉｖｏ投与を使用して、ＧＰＣＲ１３５の生理学的役割を研究し得るが、しかしながら、こうした研究は、また脳中で発現される（Ｔａｎら、１９９９、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１２７：９１−９８；Ｈｓｕら、２０００、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１４：１２５７−１２７１；Ｈｓｕら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：６７１−６７４）リラキシン−３によるＬＧＲ７の活性化により混乱される（Ｓｕｄｏら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：７８５５−７８６２）。ＧＰＣＲ１３５を特異的に活性化するがしかしＬＧＲ７はしない選択的リガンドが、ＧＰＣＲ１３５のｉｎ  ｖｉｖｏ機能を研究するために望ましい。従って、発明のリラキシン−３キメラポリペプチド、例えばＲ３／Ｉ５、すなわちＧＰＣＲ１３５に対する高親和性（Ｋｄ約０．５ｎＭ）しかしＬＧＲ７に対する低親和性（Ｋｄ約０．５μＭ）を表すペプチドは、ＧＰＣＲ１４２を有しないラットでのようなＧＰＣＲ１３５のｉｎ  ｖｉｖｏの機能研究を容易にする。
【０２１３】
１２５Ｉ−リラキシン−３がＬＧＲ７もまた標識するという事実に加え、［１２５Ｉ］−リラキシン−３ポリペプチドの疎水性の性質は、放射リガンドオートラジオグラフィー研究で適用される場合に高いバックグラウンドをもたらす。リラキシン−３のＢ鎖へのＩＮＳＬ５のＡ鎖の付加は、ＧＰＣＲ１３５に対する選択性および低下された疎水性を有する分子をもたらし、より低い非特異的結合をもたらす。組換えＧＰＣＲ１３５若しくはＬＧＲ７を発現する単層細胞を使用して、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５は、高親和性でＧＰＣ
Ｒ１３５を結合し、かつ、［１２５Ｉ］−リラキシン−３の結合に類似の総結合を、しかし５ないし１０倍より少ない非特異的結合を伴い生じた。加えて、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５はＬＧＲ７を標識しない一方、［１２５Ｉ］−リラキシン−３は標識し、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５を放射リガンドオートラジオグラフィー研究のための有利なツールとして確認する。放射リガンドオートラジオグラフィーでのラット脳切片での［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５の直接適用は、ＧＰＣＲ１３５のｍＲＮＡ分布と重なる特異的結合部位を示した。痕跡濃度で適用した［１２５］−Ｒ３／Ｉ５はＬＧＲ７を結合しないため、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５は、ＧＰＣＲ１４２受容体タンパク質を発現しないラット脳中でのＧＰＣＲ１３５受容体のオートラジオグラフィーを選択的に研究するのに有利に使用しうる。
【０２１４】
該結果は、最低２００μｇ／ＬのキメラポリペプチドＲ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２、Ｒ３／Ｉ３、Ｒ３／Ｉ４、Ｒ３／Ｉ５およびＲ３／Ｉ６が、使用した組換え系により産生されたこともまた示し、インスリン／リラキシンファミリーの多くのメンバーからのＡ鎖が、保存されたシステイン残基を除き制限された配列の保存を担持するとは言え、タンパク質フォールディング、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、およびタンパク質安定性の維持について概して相互に交換可能であることを示した。しかしながら、Ａ鎖中でシステイン残基のみが未変化のまま残されかつ全部の他のアミノ酸が自由裁量で割り当てられたキメラペプチドＲ３／Ａは該組換え系で産生されず、ある種の構造のコンホメーション（１種若しくは複数）を、生物学的に活性のリラキシン−３キメラを生じるために満たすべきである（例えば、適合性のＡ鎖は、哺乳動物細胞中でのタンパク質産生を可能にするためにリラキシン−３のＢ鎖と対形成すべきである）ことを示唆した。Ｒ３／Ｉキメラ産生の欠如は同一の理由により説明されうる。
【０２１５】
リラキシン、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５若しくはＩＮＳＬ６からのＡ鎖（しかしインスリンからのＡ鎖でない）とのリラキシン−３のＢ鎖の成功裏の対形成を理解するための努力において、該ファミリーの全部の既知のメンバーのアミノ酸配列を比較した（図６）。インスリン／リラキシンファミリーの多様なメンバーからについてのアミノ酸配列の比較は、インスリン、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２を除き、該ファミリーの他のメンバーからのＢ鎖が、リラキシン−３のＢ鎖のＡｒｇ８およびＡｒｇ１６に対応する２個の保存された正に荷電したアミノ酸（Ａｒｇ若しくはＬｙｓ）を有することを示した。対照的に、インスリンのＢ鎖は対応する位置にＨｉｓおよびＧｌｕを有する。同様に、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２双方は対応する位置にＴｈｒおよびＡｓｐを有する。これらの結果は、インスリンおよびＩＧＦが他のメンバーに比較して該ファミリーの際だったメンバーでありうることを示唆する。インスリンおよびＩＧＦからのＡ鎖は、構造上他のメンバーのものと異なるとみられ、従って、リラキシン−３のＢ鎖と適合性でない。リラキシンおよびＩＮＳＬ３中の前述の正に荷電したアミノ酸が受容体（すなわちＬＧＲ７およびＬＧＲ８）の結合および活性化に重要であるという証拠（Ｂｕｌｌｅｓｂａｃｈら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２２９５７−２２９６０；Ｂｕｌｌｅｓｂａｃｈら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：３０７３−３０７８；２０００；Ｔａｎら、２００２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４５７：１５３−１６０）を考えれば、インスリンおよびＩＧＦは、１個の膜貫通／チロシンキナーゼ受容体を通じてシグナルを発するファミリーの際だったメンバーであることがありそうである（Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：７５６−７６１；Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８６、ＥＭＢＯ  Ｊ、５：２５０３−２５１２）。リラキシン、リラキシン−３、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５およびＩＮＳＬ６を包含する該ファミリーの他のメンバーは、全部、ＧＰＣＲを通じてシグナルを発するとみられる（Ｈｓｕら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、１４：３０３−３０９を参照されたい）。配列／構造の差違、およびこれらのペプチドがシグナルを発する２種の異なる方法に基づけば、リラキシン、リラキシン−３、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５およびＩＮＳＬ６が、インスリンおよびＩＧＦと異なるリラキシンサブファミリーを規定することが考えられる。
【０２１６】
放射リガンド結合アッセイおよび機能アッセイからの結果は、Ｒ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２、Ｒ３／Ｉ３を包含するキメラが、ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２およびＬＧＲ７に対するそれらのリガンド活性に関して、リラキシン−３の野性型ペプチドの特性と実質的に類似のアゴニスト特性を有することを示した。リラキシン−３のＢ鎖単独が、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２を活性化するのに十分であり、リラキシン−３のＢ鎖がＧＰＣＲ１３５若しくはＧＰＣＲ１４２と直接相互作用する必要なアミノ酸残基を含有しうることを示唆する。リラキシン−３のＢ鎖への該ファミリーの他のメンバーからのＡ鎖の付加で、該キメラペプチドのいくつかがＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２に対する高親和性を表すであろうことが予期された。リラキシン−１、リラキシン−２、リラキシン−３およびＩＮＳＬ３は、ＬＧＲ７（Ｈｓｕら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：６７１−６７４；Ｓｕｄｏら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：７８５５−７８６２）、ＬＧＲ８（Ｋｕｍａｇａｉら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：３１２８３−３１２８６；Ｂｏｇａｔｃｈｅｖａら、２００３、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１７：２６３９−２６４６）、若しくは双方（Ｈｓｕら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：６７１−６７４）のいずれかの天然のリガンドであるため、期待されたとおり、Ｒ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２、Ｒ３／Ｉ３は、リラキシン−３に非常に類似の薬理学的特性（すなわちＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２およびＬＧＲ７の強力なリガンド）を表した。リラキシン−３はＬＧＲ８のリガンドでない（Ｓｕｄｏら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：７８５５−７８６２）とは言え、Ｒ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２およびＲ３／Ｉ３は、たとえ非常に低い効力でであっても、ＬＧＲ８に対するリガンド活性を示したこともまた注目される。それらのキメラは、ＬＧＲ８の天然のリガンドであるリラキシン−１、リラキシン−２若しくはＩＮＳＬ３のいずれかからのＡ鎖を有するため、それらのキメラ中のＡ鎖がＬＧＲ８と相互作用しかつそれを刺激することが可能である。リラキシン−３のＢ鎖単独がＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８を活性化するのに十分でないことが示された。しかしながら、リラキシンおよびＩＮＳＬ３のＢ鎖が、リラキシンおよびＩＮＳＬ３がＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８に結合しかつそれらを活性化するために重要な役割を演じていることが報告されている（Ｂｕｌｌｅｓｂａｃｈら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２２９５７−２２９６０；Ｂｕｌｌｅｓｂａｃｈら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：３０７３−３０７８；Ｔａｎら、２００２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４５７：１５３−１６０）。これらの結果は、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８がそれらのリガンドのＢ鎖およびＡ鎖双方と相互作用することを示唆している。加えて、本明細書の結果は、リラキシン−３のＢ鎖、ならびにＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８の天然のリガンドからのＡ鎖をもつキメラが、ＬＧＲ７に対するより高い親和性を有するか若しくはＬＧＲ８に対し活性である傾向があった傾向を反映している。逆に、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８のリガンドでないメンバーからのＡ鎖をもつリラキシン−３キメラペプチドは、それらがＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２に対する高親和性をなお保持しうるとは言え、ＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８に対するより低い親和性を有するか若しくは親和性を有しない。
【０２１７】
本明細書に開示される結果から、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８に対しＧＰＣＲ１３５／ＧＰＣＲ１４２に対する高度に選択的なキメラはＲ３／Ｉ５である。Ｒ３／Ｉ５はＧＰＣＲ１３５／ＧＰＣＲ１４２に対する高親和性を保持するが、しかしＬＧＲ７に対する低親和性を表し、そしてＬＧＲ８に対し不活性であり、ＩＮＳＬ５がＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８の天然のリガンドでないかも知れないことを示す。キメラペプチドＲ３／Ｉ６は、ＧＰＣＲ１３５／ＧＰＣＲ１４２およびＬＧＲ７に対する合理的に高い親和性（１０〜１５ｎＭ）を示したが、しかしＬＧＲ８に対し不活性であり、ＩＮＳＬ６の同族の受容体がＬＧＲ７の密接な近隣体（ｎｅｉｇｈｂｏｒ）でありうることを示唆したが；しかしながら、それはＬＧＲ８ではないようである。キメラペプチドＲ３／Ｉ４はＬＧＲ７およびＬＧＲ８に対する活性を有さず、ＩＮＳＬ４がＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８のリガンドでないことを示唆した。Ｒ３／Ｉ４キメラペプチドは、ＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２に対するリガンド活性に関して、リラキシン−３のＢ鎖単独に比較して向上された活性を示した。ＩＮＳＬ４がヒトでのみ見出される（Ｋｏｍａｎら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２０２３８−２０２４１；Ｈｓｕら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、１４：３０３−３０９）ことを考えれば、ＩＮＳＬ４はリラキシンサブファミリーの独特なメンバーであることができ、かつ、はっきりと異なる構造を有し；従って、ＩＮＳＬ４のＡ鎖は、ＧＰＣＲ１３５／ＧＰＣＲ１４２と高親和性で相互作用するための適切な配置で、Ｒ３／Ｉ４キメラ中のリラキシン−３のＢ鎖を提示することが可能でなかった。
【０２１８】
【表１】
2008512091.tif 000003
【０２１９】
【表２】
2008512091.tif 000004
【実施例６】
【０２２０】
材料および方法
リラキシンファミリータンパク質の製造および精製
実施例１に記述されるリラキシン−３／ＩＮＳＬ５（Ｒ３／Ｉ５）キメラポリペプチド発現構築物を、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、フリン発現ベクター（Ｌｉｕら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：５０７５４−５０７６４）とともにＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をＧ４１８（４００ｍｇ／Ｌ）下で選択し、そして、安定な形質転換体を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用するウエスタンブロッティングによりＲ３／Ｉ５融合タンパク質産生について分析した。高レベルのＲ３／Ｉ５発現ならびにプレプロポリペプチドの徹底的なプロセシングを伴うクローンを、１リットル醗酵槽中で増殖させた。Ｎ末端ＦＬＡＧ標識Ｒ３／Ｉ５キメラペプチドを、その後、記述されたＬｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：５０７５４−５０７６４のとおり、抗ＦＬＡＧカラムを使用して培地から精製した。一旦調製されれば、目的のタンパク質を発現する安定細胞を、５０ないし１５０ｋＤａのＭＷＣＯメンブレンを伴うＣｅｌｌＭａｘキャピラリー細胞培養装置に接種し、そしてＣｅｌｌＭａｘ  Ｑｕａｄ細胞培養装置（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ、カリフォルニア州ランチョドミンゲス）を使用して維持した。形質転換したＨＥＫ−２９３細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１×非必須アミノ酸混合物、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、５０μ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全部、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガンから）を補充したダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。バイオリアクター中のメンブレンの分子量カットオフが生成物の分子半径よりはるかにより大きかったため、供給瓶からの培地を精製のため保持し、そして細胞チャンバーを破壊しないまま残した。バイオリアクター装置を、ＣＯ２レベルを６％に設定した３７℃のインキュベーターに入れた。
【０２２１】
バイオリアクターからの濃縮した培地に、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含有するアフィニティーカラムを通過させた。カラム容量および表面の形状は、各精製のスケールについて至適化した。濃縮した培地を重力によりカラムを通過させ、２０カラム容量のダルベッコのリン酸緩衝生理的食塩水（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）で洗浄し、そして１００ｍＭグリシンＨＣｌ  ｐＨ３．５で溶出した。カラムを、等モル濃度のトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５（即座に生成物のｐＨを中和した）を含有する試験管に１カラム容量の画分で溶出した。ＦＬＡＧ標識の除去は、３７℃で一夜インキュベートした１０単位／ｍｌのエンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して達成した。
【０２２２】
切断されアフィニティー精製したタンパク質の最終精製をＨＰＬＣにより達成した。タンパク質を、Ａｋｔａクロマトグラフ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に接続した１０ｍｍ直径×２５０ｍｍのＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州ヘスペリア）に負荷した。移動相は０．１％トリフルオロ酢酸であり、３ｍｌ／分でカラムを通して流した。タンパク質をアセトニトリル勾配でカラムから溶出した。精製された画分のアリコートを凍結乾燥し、そして−８０℃で保存した。
【０２２３】
放射リガンドの製造
Ｒ３およびＲ３／Ｉ５キメラの放射ヨウ素化は、以前に記述された（Ｖａｌｅら、１９８３、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２（２）：９９−１０９）とおり達成した。簡潔には、１ｍＣｉのＮａ［１２５Ｉ］を、７０μｌの１００ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７．４中で１０μｇのペプチドおよび１０μｇのクロラミンＴと室温で３０秒間反応させた。反応を５０μｌの１０ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンでクエンチし、その後Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｘｉ−Ｃｌｅａｎ  Ｃ１８カートリッジ（Ａｌｌｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して前精製した。逆相分離（前精製および勾配ＨＰＬＣ）の親水性相は０．１％ＴＦＡであり、また、溶離液はアセトニトリル中１％ＴＦＡであった。Ｍａｘｉ−Ｃｌｅａｎ溶離液から部分的凍結乾燥によりアセトニトリルを除去した後、標識化合物をＶｙｄａｃ（カリフォルニア州ヘスペリア）分析用Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムを使用する勾配ＨＰＬＣによりさらに精製した。２％ＣＨ３ＣＮ／分の勾配を使用し、そして画分を０．７５分ごとに収集した。それぞれの場合に、ヨウ素化した生成物と試薬の間でベースライン分離が達成された。
【０２２４】
放射リガンド競合結合アッセイ
該アッセイは、Ｌｉｕら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８：５０７５４−５０７６４に以前に記述されたとおり、［１２５Ｉ］ヒトＲ３および［１２５Ｉ］ヒトＲ２（それぞれ２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性）を使用して実施した。ラットＧＰＣＲ１３５若しくはＬＧＲ７を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞からの細胞膜を、多様な濃度のヒトリラキシン（Ｒ１）、Ｒ３およびＲ３／Ｉ５の存在下で、［１２５Ｉ］ヒトＲ３若しくは［１２５Ｉ］ヒトリラキシン−２（Ｒ２）（最終濃度１００ｐＭ）とともにインキュベートした。反応を室温で１時間インキュベートし、そして、細胞収集装置（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、コネチカット州メリデン）を使用して、９６ウェルＧＦＰプレート（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ）を通して膜を濾過した。フィルターを氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。５０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ４０（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ）を各ウェルに添加し、そしてプレートをＴｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＴＸ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ）でカウントした。非特異的結合を、ＧＰＣＲ１３５について１００ｎＭのＲ３、およびＬＧＲ７について１００ｎＭのリラキシンの存在下で測定した。結果をＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して解析した。
【０２２５】
動物
成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１５０〜２００グラム）を全実験で使用した。それらは１２：１２時間の明：暗周期でケージあたり２匹収容し、そして食餌および水への自由な到達を有した。本研究で記述される全実験は、米国国立保健研究所により承認かつ公表されたところの実験動物に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って実施した。
【０２２６】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび受容体オートラジオグラフィーのための組織調製
ラットを二酸化炭素により窒息させた。脳を即座に頭蓋から取り出し、そしてドライアイス中で急速に凍結させた。２０ミクロン厚の前頭切片を、Ｃｒｙｏｓｔａｔマイクロトーム（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５０５Ｅ、Ｍｉｋｒｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して切断し、そして付着性顕微鏡用スライドガラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ＋  Ｐｌｕｓ、ＶＷＲ）に融解マウントした。切片は使用まで−７０℃で保った。領域分布研究のための切片作成プロトコルは、脳全体を包括する一連の冠状切片を包含した。嗅球、皮質および上丘の水準の隣接切片を使用して、濃度結合曲線を生成した。
【０２２７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｓｉｍｍｏｎｓら（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（３）：１６９−１８１）から採用したプロトコルを使用して実施した。完全長のプローブを、ｐＣＩ−Ｎｅｏプラスミドにクローン化した完全長のラットＧＰＣＲ１３５  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３９４５０１）から調製した。転写は、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）のリボプローブ複合Ｔ３／Ｔ７キットおよびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（マサチューセッツ州ボストン）からの［３５Ｓ］−ＵＴＰを使用して達成した。上述されたとおり調製した２０ミクロンの切片を、四ホウ酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含むｐＨ９．５に緩衝した４０ｇ／ｌパラホルムアルデヒドを使用して、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ＋スライドガラスに固定した。固定は４℃で３０分間進行させ、その後、スライドガラスをダルベッコのＰＢＳで洗浄し、３μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で処理し、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリエタノールアミン中１：４００の無水酢酸でアセチル化し、２×ＳＳＣですすぎ、そして一連のアルコール浴中で脱水した。組織を室温の真空デシケーター中で２時間乾燥した後に、ハイブリダイゼーション溶液（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（３）：１６９−１８１）を適用した。ガラス製カバーガラスをスライドに適用し、気泡を除去し、そしてスライドガラスの外側をＤＰＸ封入液（Ｆｌｕｋａ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）で封止し、そしてスライドガラスを６０℃で一夜インキュベートした。カバーガラスをその後４×ＳＳＣ中で除去し、そしてスライドガラスを４×ＳＳＣ浴中で４回洗浄した。スライドガラスをその後２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）で処理し、すすぎ、そして増大するストリンジェントな（０．５×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣ）の浴中で洗浄した。ストリンジェントな洗浄は、６５℃で３０分間の５０％ホルムアミドを含む０．２×ＳＳＣであった。ストリンジェントな洗浄後に、スライドガラスを０．１×ＳＳＣで洗浄し、そして一連のエタノールにより脱水した。スライドガラスをその後真空デシケーター中で乾燥し、そしてオートラジオグラフィーフィルム（Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲ、ニューヨーク州ロチェスター）に４週間露光し、その後Ｋｏｎｉｃａ  ＳＲＹ−１０１Ａフィルムプロセッサ（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州ウエイン）を使用して処理した。
【０２２８】
ラット脳切片での受容体のオートラジオグラフィー
切片を融解しかつ冷空気流下に乾燥し、そしてその後、切片を４００ｍｌジャーに浸積することにより、インキュベーション緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ２、０．２２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中室温で１５分間プレインキュベートした。切片を冷空気流下に再度乾燥し、そして、０．５％ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するインキュベーション緩衝液中で、７ｐＭの［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５（比活性２２００Ｃｉ／ｍモル）とともに６０分間インキュベートした。ヒトＲ３若しくはリラキシンによる［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ３結合部位の阻害を、数種の脳領域（嗅球、皮質および上丘）で実施した。非特異的結合を１００ｎＭのヒトＲ３の存在下で測定した。インキュベーション後に、スライドを４℃でインキュベーション緩衝液を含有するジャーに浸積し（３回１０分）、次いで水に短時間浸積することにより、過剰の放射リガンドを洗い流した。切片を乾燥し、そして富士フイルムイメージングプレート（ＢＡＳ−ＭＳ  ２０２５）に４８時間露光させた。画像化プレートを、Ｆｕｊｉ  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ分析装置（ＢＡＳ−５０００、Ｆｕｊｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、コネチカット州）を使用して走査し、かつ、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  Ｖ３．１２ソフトウェア（Ｆｕｊｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、コネチカット州）を使用して可視化した。
【０２２９】
クレシルバイオレット染色を隣接切片で実施し、そして、ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（Ｐａｘｉｎｏｓら、１９９８、Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（出版社））のラット脳アトラスを使用して、領域を同定した。具体的説明の目的上、切片をオートラジオグラフィーフィルム（（Ｋｏｄａｋ  Ｏｍａｔ  ＡＲ、ニューヨーク州ロチェスター）に露光した。４週の露光後にそれらを自動的に発色させ、そしてＫｏｎｉｃａ  ＳＲＹ−１０１Ａ機械（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍａｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州ウエイン）に固定した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７．０およびＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ９．０を図の作成に使用した。
【０２３０】
Ｓ字状の競合結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用する直線回帰分析により当てはめた。ＩＣ５０値を曲線の計算から導出した。ＩＣ５０は、特異的放射リガンド結合の５０％阻害を生じる濃度である。
【０２３１】
結果
組換えラットＧＰＣＲ１３５およびＬＧＲ７受容体の放射リガンド競合結合分析
競合結合実験は、トレーサーとして［１２５Ｉ］−リラキシン−３（Ｒ３）および［１２５Ｉ］リラキシン−２（Ｒ２）を使用して（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）組換えラットＧＰＣＲ１３５およびＬＧＲ７受容体に対するＲ３／Ｉ５の親和性を比較するために、これら２受容体の膜調製物上でであった。Ｒ３／Ｉ５は、ラットＬＧＲ７（ＩＣ５０＞４００ｎＭ）を上回ってラットＧＰＣＲ１３５（ＩＣ５０＝０．５ｎＭ）に対し８００倍選択的であることが見出された。リラキシンは、ラットＧＰＣＲ１３５受容体を発現する細胞の［１２５Ｉ］Ｒ３結合部位に対し弱い親和性のみ表した（ＩＣ５０＞１μＭ）が、しかしラットＬＧＲ７受容体を発現する細胞では［１２５Ｉ］Ｒ２結合について強力に競合した（ＩＣ５０＝２００ｐＭ）。
【０２３２】
ラット脳切片上の［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位の薬理学的特徴付け
ラット脳スライドを７ｐＭの［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５とインキュベートした図８Ａ）。これらの結合部位の薬理学的特徴付けを、特異的［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合を阻害するＲ３若しくはリラキシンの効力を測定することにより、高結合密度が観察された数種の脳領域（すなわち嗅球、皮質および上丘）で実施した。１０ｎＭのＲ３若しくは１００ｎＭのリラキシン−１の存在下での上丘の水準での代表的画像をそれぞれ図８Ｂおよび８Ｃに示す。
【０２３３】
対応する競合結合曲線を図９に示す。多様な脳領域の［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位に対するＲ３の親和性（ＩＣ５０値）を表３に示す。低濃度から開始して、Ｒ３は検討した全領域で全部の［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位を置換した。Ｒ３による［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位の完全な置換は１０ｎＭで観察された（図８Ａおよび８Ｂ）。ＩＣ５０値は０．３から０．４ｎＭまでの範囲にわたった（表３）。傾き値は１と統計学的に異ならなかった。
【０２３４】
リラキシン−３と対照的に、検討した全領域で、リラキシンは１００ｎＭまでの濃度で、いかなる有意の量の［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合も置換しなかった（図８Ｃ）。
【０２３５】
ラット脳中のＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび［１２５Ｉ］Ｒ３／Ｉ５結合部位の解剖学的位置推定
ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡ受容体および［１２５Ｉ］Ｒ３／Ｉ５（７ｐＭ）結合部位の解剖学的分布を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および隣接冠状切片での受容体オートラジオグラフィーを使用して、ラット脳全体で詳細に研究した。一般に、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡ受容体の分布パターンは［１２５Ｉ］Ｒ３／Ｉ５結合部位の分布と重なる。半定量的概要を表４に提示する。ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび［１２５Ｉ］Ｒ３／Ｉ５結合部位の吻側尾側分布を示すオートラジオグラムを図１０（前および中脳）ならびに図１１（後脳）に示す。センスプローブとのインキュベーションはいかなるハイブリダイゼーションシグナルも生じなかった。非特異的結合を１００ｎＭのＲ３の存在下で定義し、そして低いことが見出された（図１０Ａ’’ないし１０Ｆ’’、および１１Ａ’’ないし１１Ｆ’’）。
【０２３６】
特異的ハイブリダイゼーションシグナルおよび結合部位は、嗅覚系、中隔、皮質、手綱、視床下部、扁桃体、視床、海馬体および数種の脳幹領域を包含する脳の別個の領域に制限された。
【０２３７】
高密度のｍＲＮＡおよび受容体結合部位の双方が、嗅球（図１０Ａ、１０Ａ’）および嗅核（図１０Ｂ、１０Ｂ’）で観察された。中隔（側方部）では、中程度のｍＲＮＡ密度が検出された一方、非常に低レベルの結合部位のみが検出可能であった（図１０Ｃ、１０Ｃ’）。視床下部内では、ｍＲＮＡおよび結合部位は室傍核（図１０Ｄ、１０Ｄ’、１０Ｅ、１０Ｅ’）および視索上核（図１０Ｄ、１０Ｄ’）に制限された。加えて、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡは視床下部外側野で検出された（図１０Ｄ）。後者の領域中で、低密度の結合部位のみが検出可能であった（図１０Ｄ’）。
【０２３８】
中程度ないし高密度のＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび結合部位の双方が、視床中で、主として室傍核および正中中心核（ｃｅｎｔｒｏ  ｍｅｄｉａｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ）で検出された（図１０Ｅ、１０Ｅ’）。海馬体内では、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡ標識はＣＡ３野および歯状回に制限された（図１０Ｆ）。低密度の結合部位のみがこれらの海馬領域で検出可能であった（図１０Ｆ）。手綱では、中程度ないし高密度のハイブリダイゼーションシグナルおよび結合部位の双方が検出された（図１０Ｆ、１０Ｆ’）。
【０２３９】
ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび結合部位は、扁桃体、稠密な標識を伴い内側、中心、外側核（図１０Ｅ、１０Ｅ’、１０Ｆ、１０Ｆ’）、および分界条の床核（図１０Ｄ、１０Ｄ’）内にもまた存在した。ｍＲＮＡおよび結合部位双方の強い標識は、扁桃体−海馬野でもまた観察された（図１１Ａ、１１Ａ’）。
【０２４０】
ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび結合部位双方の強い標識は、上丘（図１１Ａ、１１Ａ’、１１Ｂ、１１Ｂ’）および脚間核（図１１Ｂ、１１Ｂ’）で観察された。
【０２４１】
背側縫線の背側部、水道周囲灰白質領域および下丘内で、中程度ないし低密度のＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび結合部位が検出された（図１１Ｃ、１１Ｃ’、１１Ｄ、１１Ｄ’）。
【０２４２】
皮質外被（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｍａｎｔｌｅ）を通じて、ｍＲＮＡレベルに比較してより高密度のＧＰＣＲ１３５の結合部位が観察された（図１０および１１）。中程度の密度の結合部位が、運動（図１０Ｄ’）、体性感覚（図１０Ｄ’）、側頭および視覚（図１１Ｃ’）皮質で観察された。
【０２４３】
最後に、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび結合部位双方が、挿入核（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｉｎｃｅｒｔｕｓ）（図１１Ｅ、１１Ｅ’）、三叉神経脊髄路および孤束核（図１１Ｆ、１１Ｆ’）で見出された。
【０２４４】
【表３】
2008512091.tif 000005
【０２４５】
【表４】
2008512091.tif 000006
【０２４６】
【表５】
2008512091.tif 000007
【０２４７】
実施例６の結果の論考
Ｒ３／Ｉ５キメラの放射標識は、成功裏の結合オートラジオグラフィー研究に重要であったトレーサーを生じた。［１２５Ｉ］−Ｒ３を用いてＧＰＣＲ１３５結合部位の地図を描くための初期の努力は、Ｒ３が本質的に荷電しておらずかつ疎水性であるために不成功であった。［１２５Ｉ］−Ｒ３で到達可能な非特異的結合のレベルは組換え受容体系での研究に十分であるが；しかしながら、［１２５Ｉ］−Ｒ３トレーサーはオートラジオグラフィー結合研究の作業可能な環境の影響を受けにくかった。Ｒ３分子中のインスリン５のＡ鎖を置換することは、正味の荷電を負わせ、また、放射ヨウ素化したＲ３／Ｉ５キメラの非特異的結合を低下させる（図１１）。
【０２４８】
ラット中枢神経系中のＧＰＣＲ１３５結合部位は、（７ｐＭの濃度の）［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５の結合後に選択的に同定された。［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合は１０ｎＭのＲ３により完全に置換されたが、しかし１００ｎＭのリラキシンによりされず、ＧＰＣＲ１３５の薬理学と矛盾しない（図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃならびに表３）。ラットにおい
て、Ｒ３を結合することが既知であるＧＰＣＲ１３５以外の唯一の受容体はＬＧＲ７である。しかしながらＬＧＲ７はＲ３／Ｉ５に対する有意の親和性を欠く（図３Ｃおよび７Ｂ）。ＧＰＣＲ１４２はラットにおいて偽遺伝子であるため、観察された結合パターンを生じることが可能な唯一の既知の受容体はＧＰＣＲ１３５である。
【０２４９】
該データは、ＧＰＣＲ１３５受容体密度が、嗅球、感覚皮質、扁桃体、視床、三叉神経脊髄路、上丘および下丘のような知覚シグナルの処理について知られる領域で最も際だっていることを示す。観察されたｍＲＮＡ発現のレベルは、全般として、場所および相対強度において、［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５受容体結合のオートラジオグラフィーの結果と矛盾しなかった。ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡ発現が、結合のオートラジオグラフィーデータに基づき期待されるとみられたよりも大きかった（すなわち外側中隔、ＣＡ３野および歯状回）若しくはより小さかった（すなわち大脳皮質領域）例外が存在したが；しかしながら、結合部位および発現の相対強度は相互に類似していた。
【０２５０】
ＧＰＣＲ１３５へのＲ３／Ｉ５結合の結果の比較を、この系におけるシグナル伝達への洞察を得るために、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８へのリラキシン結合（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１５）：６４１３−６４１７）と行うことができる。Ｒ３は（海馬歯状回でのわずかな発現を伴い）ほとんど独占的に挿入核から発し（Ｂｕｒａｚｉｎら、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、２８：１５５３−１５５７；Ｌｉｕら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：５０７５４−５０７６４；およびＬｉｕら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：５０７６５−５０７７０）、また、挿入核の経路は十分に記述されている（Ｇｏｔｏら、２００１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４３８（１）：８６−１２２）ため、該分析は、どの脳領域中のどの受容体（ＬＧＲ７対ＧＰＣＲ１３５）がＲ３に応答するかを同定するのに役立つよう拡大し得る。
【０２５１】
ＧＰＣＲ１３５発現およびＧＰＣＲ１３５様受容体結合の多くの領域はリラキシンもまた結合する（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１５）：６４１３−６４１７）。リラキシントレーサーの使用は、脳中で見出されかつリラキシンに対する高親和性を共有するＬＧＲ７およびＬＧＲ８受容体を標識するはずである（Ｈｓｕら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、１４（７）：３０３−３０９；Ｈｓｕら、２００３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２０２：１６５−１７０；およびＨｓｕら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：６７１−６７４）。ＧＰＣＲ１３５（本明細書に開示される特異的トレーサーで可視化されるところの）およびＬＧＲ７／８（標識リラキシンで示されるところの（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１５）：６４１３−６４１７）の双方を明らかに担持する領域の例は、嗅球、前嗅核、視床下部室傍核、上丘、視床核（室傍および正中中心）、海馬歯状回ならびに脚間核を包含する。ＧＰＣＲ１３５発現およびＩ５／Ｒ３結合は挿入核で見出される一方、リラキシン結合は背側被蓋核中で見出される。ＯｓｈｅｒｏｆｆとＰｈｉｌｌｉｐｓにより観察された背側被蓋のリラキシン結合はＧＰＣＲ１３５発現／Ｒ３／Ｉ５結合の側方に位置するようである。従って、Ｒ３／Ｉ５結合部位およびリラキシン結合部位は、パラクリン（直接でない場合）の通信を可能にするように十分に近接しているようである。
【０２５２】
ＧＰＣＲ１３５発現の領域に類似であるＣＮＳ中のＲ３／Ｉ５結合の部位は、リラキシンに対する親和性を欠く多数の領域で見出される（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１５）：６４１３−６４１７）。選択的ＧＰＣＲ１３５発現およびＩ５／Ｒ３結合は、外側中隔、手綱、上丘および下丘で見ることができる。扁桃体でのＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡの発現およびＩ５／Ｒ３結合部位は、リラキシン結合部位について観察されたより広範囲であるようである。ＧＰＣＲ１３
５部位／ｍＲＮＡが、中心、内側、外側の扁桃核ならびに分界条床核を包括するためである。扁桃体のＧＰＣＲ１３５被覆は視床の腹外側領域の周囲に半円を創製するように完全である。ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよびＩ５／Ｒ３結合部位はまた、リラキシン結合が欠如している海馬のＣＡ３野でも見出される（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１５）：６４１３−６４１７）。
【０２５３】
ＯｓｈｅｒｏｆｆとＰｈｉｌｌｉｐｓは、ＧＰＣＲ１３５発現もＧＰＣＲ１３５様結合も検出されなかったリラキシン結合の領域を見出した。終板器官、脳弓下器官、視床下部弓状核、乳頭体脚、前視蓋前域核および視床下部後部は、全部リラキシンを結合するが、しかしＧＰＣＲ１３５の指標を欠く。
【０２５４】
ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよびＧＰＣＲ１３５様結合部位が検出される領域は、知覚認識への関与の共通の特徴を共有する。例えば、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよびＧＰＣＲ１３５結合部位のシグナルを示した嗅球および嗅核は、嗅覚シグナルの伝達の早期に中継する。同様に、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよび結合部位は、知覚情報が運動のため処理若しくは統合される視覚および体性感覚皮質で検出された。
【０２５５】
ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡおよびＩ５／Ｒ３結合部位は、リラキシン結合部位を欠く脳の若干の感覚野で見出された（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１５）：６４１３−６４１７）。Ｒ３／Ｉ５を結合した上丘は、視覚的注意および衝動性眼球運動へのその関与について知られている。聴覚入力は、内側膝状体および一次聴覚皮質への途上で、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡを発現しかつＩ５／Ｒ３結合部位を表す下丘を通過する。ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡの発現およびＧＰＣＲ１３５様結合部位は、触覚刺激の処理に関与する外側中隔でもまた検出された（Ａｄａｍｓ、２０００、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８５８（１）：１７７−１８０）。
【０２５６】
これらの領域でのＧＰＣＲ１３５発現およびＩ５／Ｒ３結合は、３つの重要な感覚（視覚、聴覚および触覚）における役割（１種若しくは複数）を示唆する。注目すべきことに、とりわけ強いＧＰＣＲ１３５様受容体結合を表す上丘は、これら３種の感覚を伴う知覚および運動機能に結びつけられている［Ｋｉｎｇ、２００４、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１４（９）：Ｒ３３５−Ｒ３３８］）。
【０２５７】
経路追跡研究は、ＣＮＳにおけるＲ３の支配的な供給源である挿入核の求心性および遠心性の突起の地図を描いた（Ｇｏｔｏら、２００１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４３８（１）：８６−１２２）。本明細書の結果（Ｌｉｕら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：５０７５４−５０７６４およびＬｉｕら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：５０７６５−５０７７０）をＧｏｔｏらのもの（Ｇｏｔｏら、２００１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４３８（１）：８６−１２２）と比較すれば、Ｒ３発現細胞は挿入核（ＮＩ）および隣接する中心灰白質中に見出される。ＮＩは、ＧＰＣＲ１３５を発現しかつＧＰＣＲ１３５様結合部位を有する多数の脳核（ｂｒａｉｎ  ｎｕｃｌｅｉ）に突起する。上行性ＮＩ線維は、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡを発現しかつ有意の濃度の結合部位を有する脚間核を通過する。脚間核を通過するＮＩ線維は、また顕著なＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡ発現およびＩ５／Ｒ３結合を示す視床にさらに突起する。若干のＮＩ線維は、われわれが結合部位およびｍＲＮＡ発現を示す視床下部にもまた突起する。まばらなＮＩ突起が、高密度の結合部位および強いＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡ発現を示す上丘に達する。ＮＩ突起はまた、扁桃体、視索上核、背側縫線、内側手綱および皮質野でもまた見出され、それらの全部はＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡを発現しかつ結合部位を示す。Ｒ３の軽度の発現を表すことが示されている（Ｂｕｒａｚｉｎら、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、８２：１５５３−１５５７）歯状回の側頭極へのＮＩニューロン突起は、ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡを弱く発現しかつＩ５／Ｒ３結合部位を有する。要約すれば、Ｇｏｔｏら（Ｇｏｔｏら、２００１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４３８（１）：８６−１２２）により同定された挿入核突起は、全般として、ＧＰＣＲ１３５様部位およびｍＲＮＡのわれわれの観察結果と矛盾しない。
【０２５８】
ＣＮＳ中のＲ３の主供給源として、ＮＩはＲ３およびＧＰＣＲ１３５により調節される生理学的機能に対し中心的であることが位置づけられている。Ｒ３を発現することに加え、ＮＩは、１型ＣＲＦ受容体のｍＲＮＡを強く発現する（Ｐｏｔｔｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：８７７７−８７８１）。嗅球、歯状回、扁桃体、上丘、下丘、背側縫線および孤束のような、ＧＰＣＲ１３５を発現する多数の領域は、ＣＲＦ−Ｒ１および／若しくはＣＲＦ−Ｒ２  ｍＲＮＡもまた発現する（Ｐｏｔｔｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：８７７７−８７８１；Ｃｈａｌｍｅｒｓら、１９９５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１５（１０）：６３４０−６３５０およびＶａｎ  Ｐｅｔｔ、２０００、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒ．、４２８：１９１−２１２）。ＧＰＣＲ１３５  ｍＲＮＡ発現およびＧＰＣＲ１３５様結合部位は、知覚の処理、統合および運動制御に関係する領域で顕著である。ＮＩはＣＲＦの脳下垂体以外の作用に関与していることが考えられる（Ｇｏｔｏら、２００１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４３８（１）：８６−１２２）。これらの要因を考慮すれば、ＮＩはストレスの多い条件下での知覚認識および感覚運動反射の調節に関与しているであろう。
【０２５９】
本発明の多様な利点および局面を、実施例および好ましい態様を参照することにより上で具体的に説明したとは言え、本発明の範囲は前述の記述により定義されず、しかし発明法の原理の下で適正に解釈されるところの以下の請求の範囲により定義されることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１Ａ−１Ｄ】リラキシン−３のＢ鎖によるＧＰＣＲ１３５およびＧＰＣＲ１４２の（しかしＬＧＲ７若しくはＬＧＲ８ではなく）の活性化を示す。図１Ａにおいて、ヒトＧＰＣＲ１３５を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞を、多様な濃度のリラキシン−３、リラキシン−３のＢ鎖、ブタリラキシン若しくはＩＮＳＬ３で刺激して、フォルスコリンで刺激したβ−ガラクトシダーゼ発現を阻害した。フォルスコリンは５μＭの最終濃度で細胞に添加してβ−ガラクトシダーゼ発現を刺激した。図１Ｂは、図１Ａでのように刺激した、ヒトＧＰＣＲ１４２を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞の結果を描く。図１Ｃにおいて、ヒトＬＧＲ７を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞を、多様な濃度のリラキシン−３、リラキシン−３のＢ鎖、ブタリラキシンおよびＩＮＳＬ３で刺激してβ−ガラクトシダーゼ発現を誘導した。細胞内β−ガラクトシダーゼ活性は、基質としてＣＲＧＰを使用しかつ５７０ｎｍの波長での吸光度を読み取る比色アッセイにより測定した。図１Ｄについて、ヒトＬＧＲ８を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞を図１Ｃでのとおり刺激した。
【図２】ヒトリラキシン−３およびリラキシン−３キメラポリペプチドのアミノ酸配列を示す。キメラポリペプチドは、異なるタンパク質若しくはポリペプチドからの特定のユニットを含有するハイブリッド分子である。描かれる全部のキメラポリペプチドはヒトリラキシン−３からの同一のＢ鎖を有する。キメラポリペプチドＲ３／Ｒ１、Ｒ３／Ｒ２、Ｒ３／Ｉ３、Ｒ３／Ｉ４、Ｒ３／Ｉ５、Ｒ３／Ｉ６およびＲ３／Ｉは、それぞれヒトリラキシン−１、リラキシン−２、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５、ＩＮＳＬ６およびインスリンからのＡ鎖配列を有する。Ｒ３／Ａは、保存されたシステイン残基が保持されかつアミノ酸配列の残部が自由裁量で割り当てられているＡ鎖を有する。
【図３Ａ−３Ｄ】放射リガンド結合アッセイを使用する多様なリラキシン−３キメラポリペプチドの特徴付けを具体的に説明する。多様なリラキシン−３キメラポリペプチドを、ヒト組換えＧＰＣＲ１３５（図３Ａ）、ＧＰＣＲ１４２（図３Ｂ）、ＬＧＲ７（図３Ｃ）若しくはＬＧＲ８（図３Ｄ）のそれらの受容体結合特性について特徴付けした。ＧＰＣＲ１３５、ＧＰＣＲ１４２およびＬＧＲ７について、［１２５Ｉ］−リラキシン−３を１００ｐＭの最終濃度で放射リガンドとして使用した。多様な未標識ペプチドを結合アッセイで競合体として使用した。ＬＧＲ８について、［１２５Ｉ］−ＩＮＳＬ３を１００ｐＭの最終濃度で放射リガンドとして使用した。多様な濃度のリラキシン−３キメラを包含する多様な未標識ペプチドを競合体として結合アッセイに添加した。多様な受容体に対する多様なキメラのＩＣ５０値を下の表１に提供する。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【図４Ａ−４Ｄ】生物機能アッセイにおけるリラキシン−３キメラポリペプチドのアゴニスト活性の評価を具体的に説明する。多様な濃度の多様なキメラポリペプチドを、ヒトＧＰＣＲ１３５（図４Ａ）若しくはＧＰＣＲ１４２（図４Ｂ）を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞に添加して、フォルスコリンで刺激したβ−ガラクトシダーゼ発現を阻害した。ヒトリラキシン−３を陽性対照として使用した。同時に、多様な濃度のキメラポリペプチドを、ヒトＬＧＲ７（図４Ｃ）およびＬＧＲ８（図４Ｄ）を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ／β−ｇａｌ細胞に添加して、β−ガラクトシダーゼ発現を刺激した。リラキシン−３およびＩＮＳＬ３をそれぞれＬＧＲ７およびＬＧＲ８の陽性対照として使用した。細胞内β−ガラクトシダーゼ活性を、基質としてＣＲＧＰを使用しかつ５７０ｎｍの波長での吸光度を読み取る比色アッセイにより測定した。４種の受容体に対する多様なキメラのＥＣ５０値を表２に列挙する。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【図５Ａ−５Ｄ】ＧＰＣＲ１３５およびＬＧＲ７に対する［１２５Ｉ］−リラキシン−３および［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５の結合特異性の比較分析を具体的に説明する。６ウェル培養皿中のＣＯＳ−７細胞を、ヒトＧＰＣＲ１３５およびＬＧＲ７でそれぞれトランスフェクトした。擬似トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を陰性対照として使用した。［１２５Ｉ］−リラキシン−３（図５Ａ）若しくは［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５（図５Ｂ）を、１μＭの未標識のリラキシン−３の非存在若しくは存在下のいずれかで１００ｐＭの最終濃度で細胞に添加して、それぞれ総結合および非特異的結合を測定した。図５Ｃは、ラット脳矢状切片での［１２５］−リラキシン−３結合のオートラジオグラムを描く。図５Ｄは、１００ｎＭの未標識のリラキシン−３の存在下で測定されたところの［１２５］−リラキシン−３の非特異的結合のオートラジオグラムを描く。図５Ｅは、ラット脳矢状切片での［１２５］−Ｒ３／Ｉ５結合のオートラジオグラムを描く。図５Ｅは、１００ｎＭの未標識のリラキシン−３の存在下で測定されたところの［１２５］−Ｒ３／Ｉ５の非特異的結合を描く。ＣＸ＝皮質、ＯＢ＝嗅球、ＳＣ＝上丘。
【図６】インスリン／リラキシンファミリーのメンバーのアミノ酸配列の比較を提供する。リラキシン−１（配列番号８０）、リラキシン−２（配列番号８１）、リラキシン−３（配列番号２８）、ＩＮＳＬ３（配列番号８２）、ＩＮＳＬ４（配列番号８３）、ＩＮＳＬ５（配列番号８４）およびＩＮＳＬ６（配列番号８５）のＢ鎖中の２個の保存された正に荷電したアミノ酸を太字で強調している。＊印は、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５およびＩＮＳＬ６のＢ鎖およびＡ鎖末端が予測に基づくことを示す。インスリン（配列番号８６）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）Ｉ（配列番号８７）およびＩＧＦ２（配列番号８８）のアミノ酸配列もまた提供する。
【図７Ａ−７Ｂ】組換え細胞中での、ラットＬＧＲ７と比較した、ラットＧＰＣＲ１３５受容体のリガンドとしてのＲ３／Ｉ５キメラの選択性の特徴付けを具体的に説明する。Ｒ３／Ｉ５キメラを、ラット組換えＧＰＣＲ１３５（図７Ａ）若しくはＬＧＲ７（図７Ｂ）受容体に対するその受容体結合特性について特徴付けした。［１２５Ｉ］−Ｒ３をトレーサーとして使用した（１００ｐＭ）。示されるデータは三重の実験の平均値±ＳＥＭである。
【図８Ａ−８Ｃ】ラット上丘（左半球）の水準の一連の冠状切片からのオートラジオグラム中の［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位の薬理学的特徴付けを描く。すなわち、７ｐＭの［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５（図８Ａ）を１０ｎＭのＲ３（図８Ｂ）若しくは１００ｎＭのリラキシン（図８Ｃ）と競合させた。図中で、ＳＣ＝上丘；Ｉ．Ｐ．＝脚間核；ＡＨｉ＝扁桃体−海馬野。
【図９】定量的オートラジオグラフィーにより決定されたところの未標識のＲ３によるラット上丘への［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位の置換を示す。連続した冠状切片を、増大する濃度のＲ３の存在下で７ｐＭの［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５とともにインキュベートした。データは三重の実験の平均±ＳＥＭである。
【図１０】ラット前脳および中脳（左半球）全体の一連の冠状切片からのオートラジオグラム中のＧＲＰＣ１３５  ｍＲＮＡ（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅおよび１０Ｆ）ならびに［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位（図１０Ａ’、１０Ｂ’、１０Ｃ’、１０Ｄ’、１０Ｅ’および１０Ｆ’）の吻側尾側分布を具体的に説明する。非特異的結合を１００ｎＭのＲ３の存在下で測定した（図１０Ａ’’、１０Ｂ’’、１０Ｃ’’、１０Ｄ’’、１０Ｅ’’および１０Ｆ’’）。図中で、Ａｍｙｇ＝扁桃体；ＢＮＳＴ＝分界条床核；ＣＡ３＝海馬ＣＡ３野：ＣＭ＝中心視床核；ＤＧ＝歯状回；Ｈａ＝手綱；ＬＨ＝視床下部外側野；ＭＣｘ＝運動皮質；ＯＢ＝嗅球；ＯＮ＝嗅核；ＰＶＡ＝視床室傍核；ＰＶＮ＝視床下部室傍核；Ｓ＝中隔；ＳＣｘ＝体性感覚皮質；ＳＯ＝視索上核。
【図１１】ラット後脳（左半球）全体の一連の冠状切片からのオートラジオグラム中のＧＲＰＣ１３５  ｍＲＮＡ（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ）および［１２５Ｉ］−Ｒ３／Ｉ５結合部位（図１１Ａ’、１１Ｂ’、１１Ｃ’、１１Ｄ’、１１Ｅ’、１１Ｆ’）の吻側尾側分布を具体的に説明する。非特異的結合を１００ｎＭのＲ３の存在下で測定した（図１１Ａ’’、１１Ｂ’’、１１Ｃ’’、１１Ｄ’’、１１Ｅ’’、１１Ｆ’’）。ＡＨｉ＝扁桃体−海馬野；ＤＧ＝歯状回；ＤＲＤ＝背側縫線背側部；ＩＣ＝下丘；ＩＰ＝脚間核；ＮＩ＝挿入核；ＰＡＧ＝水道周囲灰白質領域；ＳＣ＝上丘；Ｓｏｌ＝狐束核；Ｓｐ５＝三叉神経脊髄路；ＴＣｘ＝側頭皮質；ＶＣｘ＝視覚皮質。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５Ａ−５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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