(57)【要約】本発明は、体液中の総ｒａｓ ｐ２１、特に対照の体液中の総ｒａｓ ｐ２１レベルの連続変化の検出および定量を対象とする。さらに、本発明は、総ｒａｓ ｐ２１を、一つ以上の他のタンパク質、例えば、腫瘍性タンパク質、血管新生因子、腫瘍マーカー、阻害因子、増殖因子受容体、転移タンパク質、および腫瘍抑制因子と併せて検出および定量することを対象とする。開示される方法は、前腫瘍／腫瘍疾患を診断／予後診断し、および前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者のための治療を選択するのに有用である。開示される方法はさらに、患者の前腫瘍／腫瘍疾患の状態を監視するために、および／または患者が抗癌治療にどのように反応しているかを監視するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象における活性化ｒａｓ経路に関連する前腫瘍／腫瘍疾患を検出する方法であって：
（ａ）対照集団の個体から採取された体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを免疫学的に検出および定量する；
（ｂ）対象から経時的に採取された対応する体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量する；および
（ｃ）前記対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルを、前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルと比較する；工程を含み、
前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルより高い前記対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが、対象における活性化ｒａｓ経路および前腫瘍／腫瘍疾患の存在の指標となることを特徴とする方法。
【請求項２】
前腫瘍／腫瘍疾患の予後に関連し、前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１の平均レベルに対する前記対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが、前記対象に関するより良好なまたはより悪い予後の指標となることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記予後が、奏功率（ＲＲ）、完全奏功臨床効果（ＣＲ）、部分奏功臨床効果（ＰＲ）、病勢安定臨床効果（ＳＤ）、無進行期間（ＴＴＰ）、および生存期間（ＴＴＤ）より成る群から選択される臨床的結果であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記対象の試料が治療前の試料であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、乳房滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、細胞質ゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗液および気管支肺胞洗浄液より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記体液が血清または血漿であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）の対照集団の個体が、対象と同一の性別の個体であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）および（ｂ）の免疫学的検出および定量が、サンドイッチＥＬＩＳＡの形のイムノアッセイ、または等価の検定法により行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
サンドイッチＥＬＩＳＡまたは等価の検定法が、モノクローナル抗体の使用を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＨＢ１００５４から分泌されるＲａｓ１７を捕捉モノクローナル抗体として使用し、かつＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマＨＢ９４２６から分泌されるＲａｓ１０を検出モノクローナル抗体として使用することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
検出モノクローナル抗体Ｒａｓ１０がビオチン化されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
活性化ｒａｓ経路と関連する前腫瘍／腫瘍疾患が、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、メラノーマ、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、頭頚部癌、肝細胞癌および血液系腫瘍より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
対象の試料中の一または複数の他のタンパク質のレベルを検出または検出および定量するためのイムノアッセイの使用をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記一または複数の他のタンパク質が、阻害因子、腫瘍性タンパク質、増殖因子受容体、血管新生因子、転移タンパク質、腫瘍マーカーおよび腫瘍抑制因子より成る群から選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
阻害因子がメタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）であり、腫瘍性タンパク質がＨＥＲ−２／ｎｅｕであり、増殖因子受容体が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）より成る群から選択され、血管新生因子が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、転移タンパク質がウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）であり、腫瘍マーカーが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、および腫瘍抑制因子がｐ５３であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前腫瘍／腫瘍疾患を有するヒト患者の治療選択の方法であって：
（ａ）対照集団の個体から採取された体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを免疫学的に検出および定量する；
（ｂ）患者から経時的に採取された対応する体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量する；
（ｃ）前記患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルを、前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルと比較する；および
（ｄ）前記患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルと前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルとの差に基づき、および患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルの連続変化を考慮して、患者を治療するために従来の癌治療および／またはｒａｓ指向癌治療を用いるか否かを決定する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記患者の試料が治療前の試料であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを上回るとわかった場合、および患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化が対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを上回る傾向にあるレベルを示す場合、前記患者はｒａｓ発癌遺伝子により生じた前腫瘍／腫瘍疾患を有すると結論付けられ、およびｒａｓ指向治療を用いて患者を治療することが決定されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前腫瘍／腫瘍疾患の予後に関連し、前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１の平均レベルに対する前記患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが、前記患者に関するより良好なまたはより悪い予後の指標となり、前記工程（ｄ）での決定がその予後に基づきなされることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記予後が、奏功率（ＲＲ）、完全奏功臨床効果（ＣＲ）、部分奏功臨床効果（ＰＲ）、病勢安定臨床効果（ＳＤ）、無進行期間（ＴＴＰ）、および生存期間（ＴＴＤ）より成る群から選択される臨床的結果であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ｒａｓ指向治療が、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子（ＦＴＩ）、チロシンキナーゼ阻害因子、ビスアリール尿素、およびｒａｓのアンチセンス阻害因子より成る群から選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
ｒａｓ指向治療がビスアリール尿素ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記患者の試料中の一または複数の他のタンパク質のレベルを検出または検出および定量するためのイムノアッセイの使用をさらに含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
前記一または複数の他のタンパク質が、阻害因子、腫瘍性タンパク質、増殖因子受容体、血管新生因子、転移タンパク質、腫瘍マーカーおよび腫瘍抑制因子より成る群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
阻害因子がメタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）であり、腫瘍性タンパク質がＨＥＲ−２／ｎｅｕであり、増殖因子受容体が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）より成る群から選択され、血管新生因子が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、転移タンパク質がウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）であり、腫瘍マーカーが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、および腫瘍抑制因子がｐ５３であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記患者の体液試料が、治療に反応していない癌患者に由来するものであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２７】
患者における前腫瘍／腫瘍疾患の状態を監視し、および／または前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者が治療にどう反応するかを監視する方法であって：
経時的に患者から採取された体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量することを含み；
経時的な総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベル上昇が、疾患の進行または治療に対するネガティブな反応を示唆し、および総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベル低下が、疾患の寛解または治療に対するポジティブな反応を示唆することを特徴とする。
【請求項２８】
前記治療がｒａｓ指向治療であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前腫瘍／腫瘍疾患の予後に関連し、前記患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが、前記患者に関するより良好なまたはより悪い予後の指標となることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記予後が、奏功率（ＲＲ）、完全奏功臨床効果（ＣＲ）、部分奏功臨床効果（ＰＲ）、病勢安定臨床効果（ＳＤ）、無進行期間（ＴＴＰ）、および生存期間（ＴＴＤ）より成る群から選択される臨床的結果であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記患者の試料が、治療前の試料であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記患者の試料中の一または複数の他のタンパク質のレベルを検出または検出および定量するためのイムノアッセイの使用をさらに含むことを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記一または複数の他のタンパク質が、阻害因子、腫瘍性タンパク質、増殖因子受容体、血管新生因子、転移タンパク質、腫瘍マーカーおよび腫瘍抑制因子より成る群から選択されることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
阻害因子がメタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）であり、腫瘍性タンパク質がＨＥＲ−２／ｎｅｕであり、増殖因子受容体が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）より成る群から選択され、血管新生因子が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、転移タンパク質がウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）であり、腫瘍マーカーが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、および腫瘍抑制因子がｐ５３であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記患者の体液試料が、治療に反応していない癌患者に由来するものであることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３６】
総ｒａｓ ｐ２１および／またはＨＥＲ−２／ｎｅｕのレベルの上昇が、早期再発または転移の高い可能性の指標となることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝医学の一般的分野、および腫瘍学および免疫学の分野に関するものである。より詳細には、本発明は、体液中の総ｒａｓ ｐ２１、特に対象の体液中の総ｒａｓ ｐ２１レベルの連続変化の検出および定量に関する。さらに、本発明は、総ｒａｓ ｐ２１を、例えば腫瘍性タンパク質、血管新生因子、腫瘍マーカー、阻害因子、増殖因子受容体、転移タンパク質、および腫瘍抑制因子といった一つ以上の他のタンパク質と併せて検出および定量することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ｒａｓファミリーの発癌遺伝子（ラット肉腫ウイルスと相同）は、シグナル伝達に関与する細胞タンパク質のＧタンパク質ファミリーに属する。ｒａｓ遺伝子は、細胞膜の内表面に位置しおよびＧＴＰアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。通常は、細胞膜受容体に結合する増殖因子によって誘起される際、ｒａｓタンパク質はＧＴＰと結合し、ｒａｓシグナルの活性化を結果として生じる。ｒａｓ遺伝子ファミリーは、ヒトの癌で見出される最も一般的に活性化される発癌遺伝子に含まれる、三つの主要なメンバー（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓ）を有する。他のｒａｓ遺伝子ファミリーメンバーは、Ｒｈｏ／Ｒａｃ、Ｒａｂ、ＡｒｆおよびＲａｎサブファミリーを含む。
【０００３】
三つの主要なｒａｓ遺伝子（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、およびＨ−ｒａｓ）は、全ての真核細胞で細胞膜の内表面上に見出される、アミノ酸１８９個の２１ｋＤアルファ／ベータシートタンパク質をコードする。三つのｒａｓ遺伝子にコードされるアイソフォーム（Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲａｓおよびＫ−Ｒａｓと表示される）は、本分野では集合的に「ｐ２１」または「ｒａｓ ｐ２１」として知られ、および高度のホモロジー（＞９０％）および共通の下流エフェクターおよび上流グアニン−ヌクレオチド交換因子（ＧＥＦＳ）を共有する。ｒａｓ遺伝子ファミリーのその他のメンバーについてそうであるように、ｒａｓ ｐ２１は細胞シグナル伝達に重要な細胞内ＧＤＰ／ＧＴＰ結合Ｇタンパク質であり、細胞膜中の受容体チロシンキナーゼから核へのシグナルを変換し、正常細胞増殖および分化を調節する［Ｐｒｕｉｔｔ ａｎｄ Ｄｅｒ （２００２）］。１２、１３、または６１位アミノ酸の置換によって活性化されたｒａｓ ｐ２１タンパク質は、高い形質転換能力を有する腫瘍性タンパク質として作用しうる。ｒａｓ ｐ２１の変異形は、ＧＴＰ加水分解を還元することによって構成的に活性状態に固定され、その結果として細胞増殖のためのシグナルが制御されない。変異または過剰発現された場合、ｐ２１タンパク質は発癌性である。Ｒａｓ ｐ２１タンパク質は、乳癌の５０〜６０％で過剰発現されており、および全ての癌の約３０％、特に膵臓癌および結腸癌で変異している。
【０００４】
ｒａｓ発癌遺伝子の変異性活性化は、さまざまな癌および前駆病変で同定されている。変異性に活性化されたｒａｓ遺伝子は、胃、食道、卵巣、前立腺および乳房腫瘍ではまれであるが、肺癌の２０〜４０％、急性骨髄性白血病の３０％、結腸直腸腫瘍および甲状腺腫瘍の４０〜５０％および膵臓腫瘍の＞８０％で報告されている。全体として、全てのヒト新生物の約３０％がｒａｓ遺伝子変異を含むことが報告されている。［非特許文献１；非特許文献２］ Ｈ−ｒａｓ変異は、膀胱、腎臓、および甲状腺癌で一般的である；Ｋ−ｒａｓ変異は非小細胞肺癌、結腸直腸癌および膵臓癌に存在する；およびＨ−ｒａｓ変異はメラノーマ、肝細胞癌、および血液系腫瘍でみられる。［非特許文献１．］発癌性ｒａｓ変異体による細胞の形質転換は、ゼラチナーゼおよびストロメライシンといったメタロプロテイナーゼの発現を増大させる可能性があり、それは腫瘍転移を促進しうる。加えて、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現は、Ｋ−ｒａｓ−およびＨ−ｒａｓ形質転換された上皮細胞においてＲａｆ経路を通じて増大する。
【０００５】
変異ｒａｓ ｐ２１に対して過剰発現ｒａｓ ｐ２１の予後診断的意義について本分野でいくらか議論されている。例えば、非特許文献３は、半定量的ウェスタンブロットによって検出されたｐ２１レベル上昇は初期乳癌患者における重要な予後指標であることを報告した。２００１年にはしかし、非特許文献４は、結腸直腸癌におけるｐ２１ｒａｓ腫瘍性タンパク質発現を免疫組織化学試験を用いて調査し、および、決してｒａｓ ｐ２１でなく、ｐ２１ｒａｓの遺伝子変化が、結腸直腸癌の生物学的攻撃性を決定するのに重要であると結論した。
【０００６】
腫瘍においてｒａｓを検出するためにしばしば用いられる抗体は、ｒａｓ ｐ２１の三種類の型全て（Ｈ−、Ｎ−およびＫ−ｒａｓ）、変異型および野生型の両方に結合する汎反応性抗体である。例えば、非特許文献５は、結腸直腸腺癌におけるｒａｓ ｐ２１の意義を調べるための免疫組織化学試験に汎反応性 Ｍａｂ Ｒａｓ １１を使用し、およびｒａｓ ｐ２１は増殖活性と明らかに相関し、および独立した予後診断的価値を有することを見出した。 
ｒａｓ ｐ２１のヒト組織における定量的検定法が利用可能であるが、より以前に記載されたｒａｓ ｐ２１のヒト体液における検定法はせいぜい半定量的である。ｒａｓは正常に発現されているため、活性化（アップレギュレートされたおよび／または変異性に刺激された）ｒａｓ腫瘍性タンパク質経路の指標、例えば、ｒａｓ ｐ２１レベルにおける上昇レベルまたは変化が、ｒａｓに導かれる発癌、またはｒａｓに導かれる腫瘍の状態変化を検出するために使用できる、循環ｒａｓ ｐ２１レベルにおける上昇または連続変化の定量的検定法があれば有用である。
【０００７】
特許文献１（Ｃａｒｎｅｙ，Ｗ．Ｐ．，１９９５）は、正常ヒト血漿中の総ｒａｓ ｐ２１の半定量的イムノアッセイを記載するが対応する血清ではない。その特許文献１はまた、正常ヒト血漿のＥＬＩＳＡ検定において総ｒａｓ ｐ２１を検出するための、汎反応性ＭａｂＲａｓ１７の使用を記載する。
【０００８】
２０００年までに、少なくとも２名の研究者が、肺癌患者の血清中のｒａｓタンパク質の存在を報告している。１９９１年には、非特許文献６が、肺癌患者１１名中５名および非悪性肺疾患患者２１名中２名の血清中にｒａｓをイムノブロットを用いて検出し、および呼吸器癌の早期検出のためのマーカーとしてのｒａｓの使用を示唆した。Ａｎｄｅｒｓｏｎ他もまた、ヒト肺癌患者の血漿中のｒａｓレベルをウェスタンブロットを用いて分析した。［非特許文献７−９］Ａｎｄｅｒｓｏｎ他の１９９６年の試験では、ｒａｓレベルは患者のうち４５％に対して正常対照のうち６％で上昇した。Ａｎｄｅｒｓｏｎ他の試験の一部では、総ｒａｓタンパク質（正常および変異体ｒａｓと反応する）を検出する一次抗体Ｒａｓ１０が使用された。ＲａｓレベルはＢｒａｎｄｔ−Ｒａｕｆ（１９９１）の試験またはＡｎｄｅｒｓｏｎ他の試験のどちらでも定量（ピコグラムで）されなかった。
【０００９】
非特許文献１０は、ｒａｓ ｐ２１は肺癌患者血清にも、またはどの試験群由来の血清からも検出できなかったこと、およびしたがってｒａｓは肺癌の早期検出のためのマーカーとして有用と考えることはできないと報告した。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）は、男性肺癌患者６５名、２９非悪性肺疾患患者２９名、および対照４４名の血清を、Ｈ、ＫおよびＮ−ｒａｓと反応するＡｂ−１（クローンＹ１３−２５９由来汎反応性抗ｒａｓ ｐ２１ラットＭａｂ）を用いて、三つの異なるウェスタンブロット法で検定した。しかし、標準において１ｎｇのｒａｓタンパク質が測定可能であったにもかかわらず、彼はｒａｓをそれらの血清試料中に検出できなかった。
【００１０】
非特許文献１１は、乳癌患者由来の血漿中のｒａｓ ｐ２１レベルを、ウェスタンブロット、コンピューターを利用した画像分析（統合ピクセルユニット）、および汎反応性抗ｒａｓ抗体を用いて調べた。Ｒｕｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）は、乳癌患者の５３％において検出可能レベルの野生型ｒａｓを見出した；乳癌患者における平均レベルは、陽性対照（良性乳房疾患患者の２７％および健常対照の２６％）において見出された平均野生型ｒａｓレベルよりも定性的に高かった。非特許文献１２は、化学療法の前および経過全体にわたっての両方で、 ｒａｓを含む９つの異なる発癌遺伝子 タンパク質産物の血清レベルにおける連続変化を調べた。ここでも、Ｒｕｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００２） および Ｐｅｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）の検定の両方のｒａｓ測定は半定量的なだけであった。
【００１１】
過剰発現されたｒａｓもまた活性化ｒａｓ経路を示しうるため、変異ｒａｓと関連していない癌においてさえ、変異および過剰発現ｒａｓ ｐ２１の両方を測定することが非常に重要でありうる。例えば、ｒａｓは乳癌の５０〜６０％で過剰発現されおよび５％未満で変異しているが、おそらくＨＥＲ−２／ｎｅｕまたは他の発癌遺伝子の活性化のため、変異性に活性化されたｒａｓが乳癌増殖および進行を促進しうるという多数の実験的証拠がある。［非特許文献１３．］
発明者らは、体液中の総ｒａｓ ｐ２１レベルにおける連続変化を測定するために使用できる定量的イムノアッセイを発見しており、その変化は活性化（アップレギュレートおよび／または変異性に刺激された）ｒａｓ経路の指標として有用である。その新規のイムノアッセイは、汎反応性モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）Ｒａｓ１７およびＲａｓ１０またはＲａｓ１０．２の使用を含み、そのそれぞれが総ｒａｓ ｐ２１タンパク質（正常および変異活性化ｒａｓ ｐ２１の両方）と結合する。Ｍａｂｓ Ｒａｓ１７およびＲａｓ１０は以前に記載されている［Ｃａｒｎｅｙ，Ｗ．Ｐ．，特許文献２，特許文献１，特許文献３ および 特許文献４］；しかし、イムノアッセイにおけるＭａｂｓ Ｒａｓ１７およびＲａｓ１０の組み合わせの使用は以前に記載されていない。
【００１２】
本発明は、アップレギュレートされたかまたは変異性に刺激された活性化ｒａｓ経路を検出するために、体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１レベルの変化を検出するための定量的検出法を開示する。そのような検定法は、単独でまたは、ｒａｓの上流（ＴＩＭＰ−１）の癌マーカーのレベル、またはレベル他のタンパク質のレベルと組み合わせて、ｒａｓ経路を標的とする患者治療を選択するために使用されうる。腫瘍形成におけるｒａｓの重要性のために、例えばｒａｓタンパク質発現の阻害（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ｒａｓ活性化に必須の膜局在化の妨害（例えばＲａｓファルネシル化阻害因子を用いて）［非特許文献１４および１５］、またはｒａｓの下流エフェクターの阻害（例えば、Ｒａｆセリン／スレオニンキナーゼ）によってＭＡＰＫシグナルカスケードの構成的活性化を阻害［非特許文献１６］といった、ｒａｓを標的とする抗癌治療を開発するためにいくつかの方法が取られている。ｒａｓ経路を標的とする治療の一つの有望な候補は、ｒａｆキナーゼおよびＶＥＧＦＲの両方を阻害することが知られている、ビスアリール尿素ソラフェニブ（ＢＡＹ−４３−９００６）である。［非特許文献１７］
本発明まで、癌患者がｒａｓ ｐ２１に導かれる腫瘍を有するか否かを決定する高感度な、定量的および定型的な血清検査は存在しなかった。本発明の検定法は、定型的に、血清だけでなく血漿および他の体液にも使用されうる、そうした高感度なおよび定量的な検定法を提供する。
【特許文献１】米国特許第５，４４３，９５６号明細書
【特許文献２】米国特許第 ５，２６２，５２３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，０８１，２３０号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２００，７６４号明細書
【非特許文献１】Ａｄｊｅｉ，Ａ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９３（１４）： １０６２−１０７４ （Ｊｕｌｙ １８，２００１）
【非特許文献２】Ｂｏｓ，Ｊ．Ｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９： ４６８２−４６８９ （１９８９）
【非特許文献３】Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１７（３）： １６１ −１６９ （Ｊａｎ−Ｆｅｂ １９９１）
【非特許文献４】Ｋａｒｅｌｉａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒ，１６（２）： ９７−１０４ （２００１）
【非特許文献５】Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２７（１２）： １６４６−１６４９ （１９９１）
【非特許文献６】Ｂｒａｎｄｔ−Ｒａｕｆ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｏｃｃｕｐ．Ｍｅｄ．，３３（９）： ９５１−９５５ （Ｓｅｐｔ．１９９１）
【非特許文献７】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ，３４９： １２１−１２６ （１９９６）
【非特許文献８】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ，４０３（１−２）： ２２９−２３５ （１９９８）
【非特許文献９】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｑ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ．２０４（１）： ５５−６０ （Ｏｃｔ．２００１）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．．３８（４）： ３０１−３０５ （２０００）
【非特許文献１１】Ｒｕｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，１８５（１）： ７１−７８ （Ｎｏｖ．８，２００２）
【非特許文献１２】Ｐｅｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，６４（５）： ４０１−４０６ （１９９０）
【非特許文献１３】Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４： ４５８５ − ４５９２ （２００４）
【非特許文献１４】Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ （Ｓｕｐｐｌ．），２２： １４５−１５０ （１９９５）
【非特許文献１５】Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７０（４５）： ２６８０２−２６８０６ （Ｎｏｖ．１０，１９９５）
【非特許文献１６】Ｐｒｕｉｔｔ ａｎｄ Ｄｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７１ ： １−１０ （２００２）
【非特許文献１７】Ｗｉｌｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４： ７０９９−７１０９ （Ｏｃｔ．１，２００４）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ヒト体液中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルにおける連続変化を測定するための、定量的イムノアッセイの使用に関する。前記連続変化は、ｒａｓシグナル伝達経路の活性化状態の指標として特に有用であり、ここで「活性化」はアップレギュレーションおよび変異性活性化の両方を含むと定義される。本発明の方法の基礎となる理論によると、総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の上昇（総ｒａｓ ｐ２１レベルにおける連続変化によって検出される）は、ヒト対象における前腫瘍／腫瘍疾患の存在を示す、活性化ｒａｓシグナル伝達経路の指標と考えられている。本発明のイムノアッセイは、臨床的に−診断的におよび／または予後的に、前癌および／または癌（前腫瘍／腫瘍疾患）を検出するために、および患者治療選択のための治療的補助として、患者における前腫瘍／腫瘍疾患の状態の監視、または前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者がどのように治療に反応するかの監視に使用されうる。本発明のイムノアッセイに好ましい使用は、患者の状態を監視すること、および患者治療のための最適な方法についての決断を行うことである。
【００１４】
総ｒａｓ ｐ２１における連続変化をイムノアッセイによって検定するための好ましい試料は、ヒト体液の試料であり、体液のうち特に：血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、乳房滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、細胞質ゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗液および気管支肺胞洗浄液を含みうる。検定のために好ましい体液は、血液、血清、および血漿、より好ましくは、血清または血漿である。特に好ましい体液試料は、治療前試料、および治療に反応していない患者から採取された試料を含む。
【００１５】
一態様では、本発明は活性化ｒａｓ経路に関連する前腫瘍／腫瘍疾患を検出するための診断／予後診断（予測）法に関する。ヒト対象において活性化ｒａｓ経路に関連する前腫瘍／腫瘍疾患を検出する一つの方法は下記の工程を含む：
（ａ）対照集団の個体から採取された体液の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを免疫学的に検出および定量する；
（ｂ）経時的に対象から採取された対応する体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量する；および
（ｃ）対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルを、対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルと比較する；
ここで対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを上回る、対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルは、対象における活性化ｒａｓ経路および前腫瘍／腫瘍疾患の存在を示唆する。工程（ａ）の対照集団の個体は、性別はどちらでもよく、または対象と同じ性別でよい。
【００１６】
ヒト対象において活性化ｒａｓ経路に関連する前腫瘍／腫瘍疾患を検出する前記方法は、前腫瘍／腫瘍疾患の予後診断的なものであり、対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１の平均レベルと相対的な対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが前記対象についてより良好なまたはより悪い予後を示唆する。好ましくは、前記予後は、奏功率（ＲＲ）、完全奏功臨床効果（ＣＲ）、部分奏功臨床効果（ＰＲ）、病勢安定臨床効果（ＳＤ）、無進行期間（ＴＴＰ）、および生存期間（ＴＴＤ）より成る群から選択される臨床的結果である。
【００１７】
前記方法は、例えば、サンドイッチイムノアッセイ、好ましくはサンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）または同等の検定法の形のイムノアッセイによるような、標準形式でありうる。好ましい形式は、モノクローナル抗体、好ましくは抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗体の使用を含むサンドイッチＥＬＩＳＡ、好ましくは捕捉モノクローナル抗体がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＨＢ１００５４から分泌されるＲａｓ１７が指定されることを特徴としおよび検出モノクローナル抗体がＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマＨＢ９４２６から分泌されるＲａｓ１０、またはＲａｓ１０ハイブリドーマＨＢ９４２６のサブクローンから分泌されるＲａｓ１０．２が指定されることを特徴とするサンドイッチＥＬＩＳＡである。より好ましくは、検出モノクローナル抗体Ｒａｓ１０またはＲａｓ１０．２はビオチン化されている。 
前記方法は、疾患が活性化ｒａｓ経路と関連する、癌疾患または前癌疾患を診断および／または予後診断（予測）できる。そのような癌疾患または前癌疾患のうち典型的なのは、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、メラノーマ、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、頭頚部癌、肝細胞癌および血液系腫瘍、およびそのような癌に繋がる前癌より成る群から選択されるものである。結腸、結腸直腸、肺癌および乳癌、およびそれに繋がる前癌は、ヒト体液中の総ｒａｓ ｐ２１の連続変化を検出する診断／予後診断（予測）検定方法の特に標的と考えられる。
【００１８】
本発明の別の一態様は、前腫瘍／腫瘍疾患を有するヒト患者のための治療選択の方法として、ヒト体液中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルの変化を測定するための定量的イムノアッセイに関する。一つのそのような治療選択の方法は下記の工程を含む：
（ａ）対照集団の個体から採取された体液の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを免疫学的に検出および定量する；
（ｂ）経時的に患者から採取された対応する体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量する；
（ｃ）患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルを、対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルと比較する；および
（ｄ）患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルと対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルとの差に基づき、および患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルの連続変化を考慮して、患者を治療するために従来の癌治療および／またはｒａｓを標的とする癌治療を用いるか否かを決定する。例えば、患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを上回るとわかった場合、および患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化が対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを上回る傾向にあるレベルを示す場合、その患者はｒａｓ発癌遺伝子に導かれる前腫瘍／腫瘍疾患を有するという結論付けがなされ、および、単独でまたは一つ以上の他の抗癌治療と併せて、ｒａｓ指向治療を用いて患者を治療することが決定される。
【００１９】
好ましくは、前記ｒａｓ指向治療は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子（ＦＴＩ）、チロシンキナーゼ阻害因子、ビスアリール尿素およびｒａｓのアンチセンス阻害因子より成る群から選択される。より好ましくは、前記ｒａｓ指向治療は、ビスアリール尿素ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）である。
【００２０】
本発明の別の一態様は、患者における前腫瘍／腫瘍疾患の状態を監視、および／または前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者が治療にどう反応するかを監視する方法としてのイムノアッセイの使用に関するものであり、経時的に患者から採取された体液の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量することを含み、経時的な総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベル上昇が疾患進行または治療に対するネガティブな反応を示唆し、および総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベル低下が疾患寛解または治療に対するポジティブな反応を示唆する。前記治療は、従来の抗癌治療、非慣習的な抗癌治療、および／またはｒａｓ指向治療でありうる。好ましい体液試料は、試料の種類のうちでも特に、治療前試料、または治療に反応していない癌患者由来の試料でありうる。
【００２１】
本発明のさらに別の一態様は、診断／予後診断（予測）方法、前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者のための治療選択の方法、患者において前腫瘍／腫瘍疾患の状態を監視、および前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者がｒａｓ指向治療または他の治療にどのように反応するかを監視する方法のような、本発明の方法において、一つ以上の他のタンパク質のレベルと組み合わせて、総ｒａｓ ｐ２１レベルの変化を検出するために定量的イムノアッセイを使用することに関する。好ましくは、本発明の検定法においてｒａｓ ｐ２１と共に定量するのが有用な前記の他のタンパク質は、阻害因子、腫瘍性タンパク質、増殖因子受容体、血管新生因子、転移タンパク質、腫瘍マーカーおよび腫瘍抑制因子である。好ましくは、前記阻害因子はメタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）であり、前記腫瘍性タンパク質はＨＥＲ−２／ｎｅｕであり、前記増殖因子受容体は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）より成る群から選択され、前記血管新生因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、前記転移タンパク質はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）であり、前記腫瘍マーカーは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、および前記腫瘍抑制因子はｐ５３である。
【００２２】
非常に好ましくは、前記の他のタンパク質は、例えばＴＩＭＰ−１およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ−２（「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」）のような、ｒａｓ経路を活性化するタンパク質である。例えば、総ｒａｓ ｐ２１および／またはＨＥＲ−２／ｎｅｕのレベル上昇は、腫瘍または腫瘍転移の早期の再発のより高い確率を示しうる。最も有望な治療結果のための最適な治療の組み合わせを選択するために、臨床的展望、治療上の資源および診断／予後診断（予測）パラメーターを広げることは、癌患者を、総ｒａｓ ｐ２１およびそのような他のタンパク質、特にｒａｓ経路を活性化するタンパク質の両方について連続変化を検査することは有用である。
【００２３】
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略語
下記の略語がここで用いられる：
ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
℃：摂氏
ＣＥＡ：癌胎児性抗原
ＣＶ：変動係数
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸
ＥＧＦＲ：上皮増殖因子受容体
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検定法
ＦＴＩ：ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子
ＧＤＰ：グアノシン二リン酸
ＧＥＦＳ：グアニン−ヌクレオチド交換因子
ＧＴＰ：グアノシン三リン酸
Ｇタンパク質：グアニルヌクレオチド依存性タンパク質
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ｋＤ：キロダルトン
Ｍ：モル濃度
Ｍａｂ：モノクローナル抗体
ＭＡＰ：分裂促進因子活性化タンパク質
ｍｌ：ミリリットル
ｍＭ：ミリモル濃度
Ｎ：正常または数（文脈に応じて）
ＮＤ：検出されず
ＮＥＤ：疾患徴候無し
Ｎｇ：ナノグラム
ｎｍ：ナノメートル
ＯＤ：光学密度
ｐｇ：プロテオグリカン
ＰＤＧＦＲ：血小板由来増殖因子 受容体
Ｐ．Ｒｅｓｐ：患者の反応
Ｐｒｏｇ：増悪
Ｒｅｃｕｒ：再発
ＳＤ：標準偏差
Ｓｔａｂ：安定
Ｓｔｇ：ステージ
ＴＩＭＰ−１：メタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
μｇ：マイクログラム
μｌ：マイクロリットル
Ｕｎｋ：不明
ｕＰＡ：ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子
ＶＥＧＦＲ：血管内皮増殖因子受容体
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、ヒト体液中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルの連続変化を測定する定量的イムノアッセイに関するものであり、そのアッセイは、診断的に／予後診断（予測）的にヒトにおいて、活性化ｒａｓ経路と関連している前腫瘍／腫瘍疾患を検出または監視するのに、または前記前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者のための治療を選択するのに有用である。ここでは、「活性化ｒａｓ経路」はｒａｓ ｐ２１タンパク質の過剰発現または変異のどちらかによって活性化されたｒａｓ経路と定義され、およびしたがってアップレギュレートされたおよび／または変異性に刺激されたｒａｓ経路を包含する。さらに、ここでは、「総ｒａｓ ｐ２１タンパク質」は、変異活性化および正常（野生型）ｐ２１タンパク質（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓタンパク質を含む）の両方を含む。
【００２５】
活性化ｒａｓ経路と関連する前腫瘍／腫瘍疾患の典型は下記の通りであり、および書きに繋がる前癌である：結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、メラノーマ、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、頭頚部癌、肝細胞癌および血液系腫瘍。特に、総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルは、単独でまたは他のタンパク質、特に他の腫瘍性タンパク質のレベルと組み合わせて、臨床的結果を予測するためにおよび／または治療選択における補助として使用されうる。
【００２６】
本発明の検定法は、診断および／または予後診断（予測）、すなわち、診断法／予後診断（予測）法でありうる。「診断／予後診断（予測）」の語はここでは下記の過程を、臨床的背景に応じて個別にまたは累積的に包含すると定義される：疾患の存在を判定、疾患の性質を判定、疾患を識別、疾患状態の可能な結果に関して予測、症例の性質および症状によって示される通りの疾患からの回復に関しての見込みを判定、患者の疾患状態を監視、疾患の再発について患者を監視、および／または患者にとって好ましい治療計画を決定。本発明の診断／予後診断（予測）方法は、例えば、腫瘍または前腫瘍疾患の存在について集団をスクリーニング、腫瘍疾患を発症するリスクを判定、腫瘍および／または前腫瘍疾患の存在を診断、腫瘍疾患を有する患者の疾患状態を監視、および／または腫瘍疾患の経過についての予測を判定するために有用である。
【００２７】
本発明は、上記に示す通りのさまざまな前腫瘍／腫瘍疾患の存在についてスクリーニングするのに有用である。そのような検定法は、腫瘍を検出、腫瘍の増殖を監視、および疾患の診断および予後診断（予測）を助けるのに使用されうる。本検定法はまた、癌転移の存在を検出、および癌化学療法および／または放射線療法後の腫瘍組織の非存在を確認するために使用されうる。本検定法はさらに、癌化学療法および腫瘍再出現を監視するために使用されうる。
【００２８】
本方法は、前腫瘍／腫瘍疾患を診断されたかまたはその疑いのあるヒト対象から採取された連続体液試料中に存在する総ｒａｓ ｐ２１タンパク質がもしあればそれを定量することを含む。定量された総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルは、対照集団の個体から採取された体液試料における平均レベルと比較され、ここで平均レベルを上回る総ｒａｓ ｐ２１タンパク質は活性化ｒａｓ経路を示す。ここでは、「平均を上回る」レベルの総ｒａｓ ｐ２１タンパク質は、対照試料でみられる平均レベルより２標準偏差（ＳＤ）高いレベルを指す。対照集団の個体はどちらの性別でもよく、または対象と同じ性別の人に限定されうる。
【００２９】
ここでは、「癌」および「腫瘍」は等価の意味を有し、および「前癌」および「前腫瘍」は等価の意味を有する。前腫瘍／腫瘍疾患の診断／予後診断（予測）の指標としての発癌遺伝子の遺伝子発現産物の検出の使用は、当業者によって通常と見なされる。しかし、活性化ｒａｓと関連する前腫瘍／腫瘍疾患を検出または監視するための、体液中のｒａｓレベル、特に循環ｒａｓレベルの連続変化を定量的に測定するような手法の使用は新規である。
【００３０】
体液の連続試料
本発明の好ましい一実施形態では、総ｒａｓ ｐ２１タンパク質は、連続して経時的に採取されたヒト体液試料で定量される。そのような体液試料は、体液試料の中でも特に、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、乳房滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、細胞質ゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗液および気管支肺胞洗浄液でありうる。好ましい体液は、体液試料の中でも特に、例えば、血清またはヘパリン、クエン酸またはＥＤＴＡで処理された血漿試料を含み、および新鮮または冷凍でありうる。そのような体液標本は、治療前、治療中、または治療後に採取でき、または治療に反応しない患者から採取されうる。ここでは、「経時的連続変化」または「連続試料」は、背景および状況に応じて、対象にとって適切と考えられる期間にわたって採取された試料の連続検査を意味する。例えば、癌患者スクリーニングのためには、連続試料は患者の初診、診断後、手術前および／または手術後に採取されうる；一方、前腫瘍疾患のための集団スクリーニングのためには、連続試料は年一回ベースで採取されうる。
【００３１】
イムノアッセイ
本発明の方法に記載の典型的なおよび好ましいイムノアッセイは、材料および方法の項で後述されおよび実施例１から８のデータを得るために用いられたサンドイッチＥＬＩＳＡである。ここに開示される方法に加えて、代替の方法がヒト体液中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質を定量するために使用されうることが理解できる。他の好ましいサンドイッチアッセイが、例えば発光標識といった他の視覚化方法と共に使用されうる。他の標識は、下記の標識化標識の項で詳述される。
【００３２】
多数の形式が、本発明の方法との使用のために適用されうる。ヒト体液中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の検出および定量は、本分野で一般に知られる検定法の中でも特に、例えば、ｂｙ酵素結合免疫吸着検定法、ラジオイムノアッセイ、二重抗体サンドイッチアッセイ、凝集検定法、蛍光イムノアッセイ、免疫金を用いる免疫走査電子顕微鏡法によって実施されうる。そのような検定法での総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の定量は、本分野で公知の従来の方法によって適応されうる。好ましい実施形態である、循環総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベル、または他の体液中のそのようなレベルにおける連続変化は、従来の方法を用いて担体表面上に捕捉抗体が固定化されているサンドイッチアッセイによって検出および定量される。
【００３３】
検定法に用いられる適当な担体は、担体の中でも特に、ポリプロピレン、ポリスチレン、置換ポリスチレン、ポリアクリルアミド（例えばポリアミドおよびポリ塩化ビニル）、ガラスビーズ、アガロース、およびニトロセルロースを特に含む。
【００３４】
典型的なイムノアッセイ
典型的なおよび好ましいＥＬＩＳＡサンドイッチイムノアッセイが、材料および方法の項に、および実施例１〜８に記載される。その典型的なＥＬＩＳＡは、ＭａｂＲａｓ１７を捕捉抗体として、およびビオチン化Ｍａｂ１０．２（ハイブリドーマＲａｓ１０のサブクローンによって産生される）を検出抗体として使用する。捕捉ＭａｂＲａｓ１７はマイクロタイタープレートウェル上に固定化され；希釈ヒト血清／血漿試料またはｒａｓ ｐ２１標準（組み換え野生型Ｈ−ｒａｓタンパク質）が３時間３７℃にてウェル中でインキュベートされ、総ｒａｓ ｐ２１抗原をＭａｂ１７によって結合させる。ウェルの洗浄後、固定化されたｒａｓ ｐ２１抗原はビオチン化検出抗体ＭａｂＲａｓ１０．２に３０分間室温にて（２０〜２７℃）曝露され、その後ウェルは再び洗浄される。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体が次いで添加される（３０分間室温にて）。最後の洗浄後、結合ペルオキシダーゼ活性を検出するためにＴＭＢブルー基質がウェルに添加される（および３０分間室温にてインキュベートされる）。反応は２．５Ｎ硫酸の添加によって停止され、および吸収が４５０ｎｍにて測定される。試料の吸収値のｒａｓ標準との相関が、総ｒａｓ ｐ２１の定量値をｐｇ／ｍｌ血清または血漿として決定可能にする。
【００３５】
組み合わせ検定法：Ｒａｓおよび他のタンパク質のレベル
対象前腫瘍／腫瘍疾患に応じて、例えば阻害因子、腫瘍性タンパク質、増殖因子受容体、血管新生因子、転移タンパク質、腫瘍マーカー、および腫瘍抑制因子、特にｒａｓ経路に随伴するものといった他のタンパク質が、ｒａｓ ｐ２１と同時の検出および定量に適しうることが理解できる。ｒａｓ ｐ２１との同時検査に適する典型的なおよび好ましい他のタンパク質は、メタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、およびｐ５３を含む。本発明の方法に適した好ましい他のタンパク質を検出するための検定法は当業者に公知である。例えば、ヒト体液中のＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＴＩＭＰ−１の定量のためのイムノアッセイは、ヒト血清または血漿中のＴＩＭＰ−１のｎｇ／ｍｌ値を測定できるＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＴＩＭＰ−１ ＥＬＩＳＡ ［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ （ＵＳＡ），ｗｗｗ．ｏｎｃｏｇｅｎｅ．ｃｏｍ］のように市販されている。実施例８に記載される通り、連続結腸直腸癌血清試料および正常血清試料が、総ｒａｓ ｐ２１およびＴＩＭＰ−１レベルの療法について検定された。
【００３６】
予後診断
ｒａｓ ｐ２１および／または他のタンパク質のレベルの監視は、前腫瘍／腫瘍疾患の臨床的結果を示しうる。臨床的結果を評価する好ましい方法は、奏功率（ＲＲ）、臨床効果［完全奏功（ＣＲ）、部分奏功（ＰＲ）、および病勢安定（ＳＤ）を含む］、無進行期間（ＴＴＰ）、および生存期間（ＴＴＤ）に基づく方法である。予後を評価する他の方法が本分野で公知でありおよび使用されうる。
【００３７】
抗体
「抗体」の語はここでは、もっとも広義で用いられおよび具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および目的の生物活性を示す限り抗体断片を包含する。本発明の方法に記載の有用な抗体は、従来の方法論によっておよび／または遺伝子工学によって調製されうる。本発明に記載の好ましい抗体は、「汎反応性」であるもの、すなわち総ｒａｓ ｐ２１（野生型および変異活性化ｒａｓ ｐ２１の両方）、およびＨａｒｖｅｙ、ＫｉｒｓｔｅｎおよびＮ−ｒａｓ ｐ２１の三つのファミリーと結合する抗体である。非常に好ましいのは、本発明の典型的なイムノアッセイに使用される抗体であるＲａｓ１７およびＲａｓ１０抗体、または目的の生物活性を示す限りＲａｓ１７およびＲａｓ１０ハイブリドーマのサブクローンによって産生される抗体である（例えば親Ｒａｓ１０ハイブリドーマのサブクローン由来のＲａｓ１０．２Ｍａｂ）。
【００３８】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合または可変ドメインを含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、二重特異性抗体、線形抗体、および１本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された二重特異性抗体を含む多重特異性抗体を含む。
【００３９】
「モノクローナル抗体」の語はここでは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、その集団を構成する各抗体は少量存在しうる可能な天然に存在する変異以外は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。さらに、典型的にはさまざまな決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を対象とする。修飾語「モノクローナル」は、ｉｎｄｉｃａｔｅｓ抗体の実質的に均一な集団から得られているという抗体の性質を示し、および何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明にしたがって使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製が可能であり、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）によって作製されうる。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリから、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２： ６２４−６２８ （１９９１） および Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２： ５８１−５９７ （１９９１）に記載の方法を用いて単離されうる。
【００４０】
モノクローナル抗体はここでは特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一かまたは相同であり、一方で鎖の残りが別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一かまたは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、および目的の生物活性を示す限りそのような抗体の断片を含む［米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ，８１； ６８５１−６８５５ （１９８４）］。
【００４１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、そこではレシピエントの超可変領域残基が、目的の特異性、親和性、および容量を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類といった非ヒト種由来の超可変領域残基（ドナー抗体）で置換されている。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体にはみられない残基を含みうる。そのような改変は、抗体性能をさらに改良するために実施される。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのものと対応する全てまたは実質的に全ての超可変領域、および全てまたは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一個、および典型的には二個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた随意的に、典型的にはヒト免疫グロブリンの、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１ ：５２２− ５２５ （１９８６）； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２： ３２３−３２９ （１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２： ５９３−５９６ （１９９２）を参照。
【００４２】
「１本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨおよびＶＬドメイン間に、ｓＦｖが抗原結合のための目的の構造をとることを可能にするポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５ （１９９４）を参照。
【００４３】
「二重特異性抗体」の語は、二個の抗原結合部位を有する小さい抗体断片をいい、その断片は、同一ポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。短すぎて同一鎖上の二つのドメイン間の対形成ができないリンカーを使用することによって、それらのドメインは別の鎖の相補ドメインと対形成するよう強制され、および二個の抗原結合部位を生じる。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット； および Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ．ＵＳＡ，９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）により完全に記載される。
【００４４】
「線形抗体」の表現は、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）： １０５７−１０６２ （１９９５）に記載された抗体をいう。要約すると、そのような抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄ区域（ＶＨ−ＣＨＩ−ＶＨ−ＣＨＩ）を含む。線形抗体は二重特異性または単特異性でありうる。
【００４５】
本発明に記載の有用な代表的なモノクローナル抗体は、以前のＣａｒｎｅｙ他の特許［米国特許第５，０８１，２３０号明細書；米国特許第５，４４３，９５６号明細書；米国特許第６，２００，７６４号明細書］に記載されたＭａｂｓＲａｓ１７およびＲａｓ１０を含む。本発明に記載の有用なモノクローナル抗体は、例えば臨床試料中で、さまざまな予後診断的臨床検査において総ｒａｓ ｐ２１タンパク質を特定するのに役立つ。
【００４６】
抗体の調製を含む、ここで有用な他の分子生物学的方法を記載する一般的テキストは、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．； １９８９） Ｖｏｌ．１−３； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．［Ｅｄｓ．］，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２０００），Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８８），Ｐａｕｌ ［Ｅｄ．］； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｕｅｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （１９９８），および Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９８）を含む。
【００４７】
標識
総ｒａｓ ｐ２１タンパク質を特定するための本発明に記載の有用な抗体は、任意の従来の方法によって標識化されうる。本発明に記載の好ましい標識はホースラディッシュペルオキシダーゼであり、および抗体を標識化する好ましい方法は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を用いることによる。
【００４８】
必要に応じて、トレーサーとして用いられる本発明のイムノアッセイに使用される抗体は、可視シグナルまたは可視化されうるシグナルを結果として生じる任意の方法で直接にまたは間接に標識化されうる。検出可能なマーカー物質は、３Ｈ、１２５Ｉ、および１３１Ｉといった放射性核種；蛍光物質、例えばフルオレセインイソチオシアネートおよび他の蛍光色素、フィコビリンタンパク質、フィコエリトリン、希土類キレート、テキサスレッド、ダンシルおよびローダミン；比色試薬（色素原）；電子不透明物質、例えば金コロイド；生物発光物質；化学発光物質；色素；酵素、特に例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルファ−、ベータ−ガラクトシダーゼ；補酵素；酵素基質；酵素補助因子；酵素阻害因子；酵素サブユニット；金属イオン；フリーラジカル；または形成された免疫複合体の存在または量を検出または測定する手段を提供する任意の他の免疫学的に活性または不活性な物質を含む。典型的な酵素基質の組み合わせは、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、およびアルカリホスファターゼおよびパラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）である。
【００４９】
本発明に記載のもう一つの好ましい検出、または検出および定量系は、発光シグナル、生物発光（ＢＬ）または化学発光（ＣＬ）を生じる。化学発光（ＣＬ）または生物発光（ＢＬ）検定法では、強度または総発光が測定されおよび未知分析物の濃度と関連づけられる。光は、ルミノメーター（検出器として光電子増倍管）または電荷結合素子を用いて定量的に、または写真フィルムまたはＸ線フィルムによって定性的に測定されうる。そのような検定法を用いることの主な利点は、その単純さおよび、非常に少量の分析物の検出および／または定量を可能にする分析感度である。
【００５０】
典型的な発光標識は、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホニルカルボキサミド、ルミノール、ウンベリフェロン、イソルミノール誘導体、光タンパク質、例えばエクオリン、およびホタル、海産細菌、ＶａｒｇｕｌｌａおよびＲｅｎｉｌｌａ由来ルシフェラーゼである。ルミノールは随意的に、好ましくは４−ヨードフェノールまたは４−ヒドロキシ桂皮酸より成る群から選択されるエンハンサー分子と使用されうる。アクリジニウムエステルは、本発明に記載のＣＬ標識の好ましい種類の一つである。典型的には、ＣＬシグナルは塩基性条件下で酸化剤との処理によって生じる。
【００５１】
また好ましい発光検出系は、シグナル（検出可能なマーカー）が基質との酵素反応によって生じる系である。ＣＬおよびＢＬ検出系が、特にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびキサンチン−オキシダーゼ標識を検定するために開発されている。ＡＰおよびＨＲＰは、さまざまなＣＬおよびＢＬ反応によって定量されうる二種類の好ましい酵素標識である。例えば、ＡＰは、アダマンチル１，２−ジオキセタンアリールリン酸基質（例えばＡＭＰＰＤまたはＣＳＰＤ；［Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．，"Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ，" ａｔ ｐ．１６７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （ｅｄ．Ｒ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ） （ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ； Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．； １９９５）］；好ましくは４−メトキシ−４−（３−リン酸フェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］の二ナトリウム塩とエンハンサー分子ありまたは無しで、好ましくは二塩化１−（トリオクチルホスホニウムメチル）−４−（トリブチルホスホニウムメチル）ベンゼンといった基質と共に使用されうる。ＨＲＰは好ましくは、２’，３’，６’−トリフルオロフェニルＳ−メトキシ−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラートといった基質と共に使用される。
【００５２】
ＣＬおよびＢＬ反応は、酵素のだけでなく、他の基質、補助因子、阻害因子、金属イオンなどの分析にも適用されうる。例えば、ルミノール、ホタルルシフェラーゼ、および海産細菌ルシフェラーゼ反応は、それぞれ過酸化物、ＡＴＰ、およびＮＡＤＰＨの産生または消費の指標反応である。それらは、オキシダーゼ、キナーゼ、およびデヒドロゲナーゼを含む他の反応とカップリングでき、およびカップリングされた反応の任意の成分（酵素、基質、補助因子）を測定するために使用されうる。
【００５３】
検出可能なマーカーは、本発明の検定法に使用される抗体と、直接的にまたは間接的に結合されうる。検出可能な標識の典型的な間接的結合は、抗体とマーカーとの間の結合対の使用、またはシグナル増幅系の使用である。
【００５４】
本発明の検定法の抗体を検出可能なマーカーと結合するために使用されうる典型的な結合対は、ビオチン／アビジン、ストレプトアビジン、または抗ビオチン；アビジン／抗アビジン；チロキシン／チロキシン結合グロブリン；抗原／抗体；抗体／抗抗体；糖／レクチン；ハプテン／抗ハプテン抗体；色素および疎水性分子／疎水性タンパク質結合部位；酵素阻害因子、補酵素または補助因子／酵素；ポリ核酸／相同なポリ核酸配列；フルオレセイン／抗フルオレセイン；ジニトロフェノール／抗ジニトロフェノール；ビタミンＢ１２／内因子；コルチゾン、コルチゾール／コルチゾール結合タンパク質；および特異的受容体タンパク質のリガンド／膜結合特異的受容体タンパク質である。本発明に記載の好ましい結合対は、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、より好ましくはビオチン／ストレプトアビジンである。
【００５５】
標識を直接的にまたは間接的に抗体へ結合するためのさまざまな手段が本分野で公知である。例えば、標識は共有的にまたは非共有的に結合されうる。典型的な抗体複合体化方法は： Ａｖａｒｍｅａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８ （Ｓｕｐｐｌ．７）： ７ （１９７８）； Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６２： ３０８ （１９７９）； Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，５３： １８７ （１９８２）； Ｅｋｅｋｅ ａｎｄ Ａｂｕｋｎｅｓｈａ，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．．１１ ： １５７９ （１９７９）； Ｅｎｇｖａｌｌ ａｎｄ Ｐｅｒｌｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０９： １２９ （１９７２）； Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｏｍｍ．，７： １ （１９７８）；およびＷｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋａｎｅ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐ．２１５ ［Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ； Ａｍｓｔｅｒｄａｍ （１９７８）］に記載されている。 
標識の性質に応じて、標識を検出および定量するためにはさまざまな方法が使用されうる。蛍光物質については、多数の蛍光光度計が利用可能である。化学発光物質については、ルミノメーターまたはフィルムが利用可能である。酵素については、蛍光、化学発光、または着色産物が、蛍光光度計、ルミノメーター、分光光度計、または目視によって判定または測定されうる。
【００５６】
アクリジニウム、ベンズアクリジニウム、またはアクリダン型のヘテロ環系を有するさまざまな種類の化学発光化合物が好ましい標識である。アクリジニウムおよびベンズアクリジニウムエステルは現在より好ましい化学発光化合物であり、好ましいアクリジニウムエステルは、ヘテロ環または、本分野でよく知られている通り、アクリジニウム、ベンズ［ａ］アクリジニウム、ベンズ［ｂ］アクリジニウム、ベンズ［ｃ］アクリジニウム、ベンズイミダゾールカチオン、キノリニウム、イソキノリニウム、キノリジニウム、環置換キノリニウム、フェナントリジニウム、およびキノキサリニウムといった環系を含む正の酸化状態にあるヘテロ原子を含む環系を有する化合物を含む。
【００５７】
トレーサーは、例えば Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９（８），１４７４−１４７９，（１９８３）のように当業者によく知られている通り、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステル上に存在する反応性官能基を、選択された抗体へ直接的または間接的に結合することによって調製されうる。特に好ましい化合物は、アリール環脱離基およびアリール環のパラまたはメタ位に存在する反応性官能基を有するアクリジニウムおよびベンズアクリジニウムエステルである。［米国特許第４，７４５，１８１号明細書および国際公開第９４／２１８２３号パンフレットを参照。］
Ｒａｓ指向治療
ここでは、「ｒａｓ指向治療」は、ｒａｓ経路を標的とする任意の治療を含み、ｒａｓタンパク質発現の阻害（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ｒａｓ活性化に必須の膜局在化の妨害（ｒａｓファルネシル化阻害因子）、またはｒａｓの下流エフェクターの阻害（例えば、Ｒａｆセリン／スレオニンキナーゼ）を含む。好ましいｒａｓ指向治療は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子（ＦＴＩ）、チロシンキナーゼ阻害因子、またはビスアリール尿素を含む。典型的なＦＴＩは、ＢＭＳ−２１４６６２［イミダゾール含有非ペプチドミメティックＦＴＩ； Ｃｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，２３ （１２）： ２８０５−２８１２ （Ａｐｒｉｌ ２０，２００５）； Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ （ＵＳＡ）］、ＦＴＩ−２１５３およびＦＴＩ−２７７［ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ （Ｃａｔ．Ｎｏ．３４４４５５５）； Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．．５９： ４９１９−４９２６ （１９９９）］、Ｒ１１５７７７［メチルキノロン； Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ （ＵＳＡ）］、および Ｓｃｈ６６３３６ ［Ｓａｒａｓａｒ（登録商標） または Ｌｏｎａｆａｍｉｂ（登録商標）；ベンゾシクロヘプタピリジルＦＴＩ； Ｔａｖｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３（１０）： １１０３− １１１４ （Ｊｕｎｅ ２００３）； Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ （ＵＳＡ）］である。
【００５８】
典型的なチロシンキナーゼ阻害因子はＡＺＤ３０４９である［プレニルトランスフェラーゼ阻害因子； ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，ｗｗｗ．ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ．ｃｏｍ］。ｒａｓの典型的なアンチセンス阻害因子はＩＳＩＳ２５０３である［ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ （ＵＳＡ）］。［ｒａｓを、またはｒａｓから下流の関連するエフェクターを標的とする他のｒａｓ指向治療については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｂｔｉｅ．ｏｒｇ／ｓｏｔｓ／ｈｔｍｌ／ＬｕｎｇＡｇｅｎｔｓ．ｈｔｍも参照。］ 
本発明に記載の好ましいｒａｓ指向治療は、酵素Ｒａｆキナーゼを阻害する低分子であるビスアリール尿素ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）である［Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ （ＵＳＡ），および Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ （ＵＳＡ）； Ｌｙｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ，８：２１９−２２５ （２００１） および Ｗｉｌｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ．（２００４）］。ソラフェニブは、細胞増殖を阻害するＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ［ＭＥＫ：ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ；ＥＲＫ：細胞外シグナル関連キナーゼ］シグナル伝達経路、および腫瘍血管新生を阻害するＶＥＧＦＲ−２／ＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達経路の両方を標的とする。ソラフェニブはそのため、活性化ｒａｓ経路および活性化ＶＥＧＦＲ−２／ＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達経路を有することがわかった患者のための、特に好ましい抗癌治療となる。
【実施例】
【００５９】
下記の実施例は説明のみを目的とし、およびいかなる方法でも本発明を限定しないことが意図される。
【００６０】
材料および方法
ヒト血清および血漿のための固相サンドイッチマイクロタイターＥＬＩＳＡ
試料調製ｒａｓ ｐ２１ＥＬＩＳＡによる分析に適した試料は、ヘパリン、クエン酸、またはＥＤＴＡで処理されたヒト血漿、およびヒト血清を含む。可能な干渉因子のため、ヒト血清および血漿の調製および検定には特別の注意を払わなければならない。希釈前に微量遠心分離によって、いかなる凝集物質も試料から除去されるべきである。試験すべき血清または血漿標本の初濃度は濃度５０％（標本の試料希釈剤での１：２希釈）を超えない。例えば、試料０．１５０ｍｌは試料希釈剤０．１５０ｍｌで希釈でき、および１００μｌをマイクロプレートウェルへ加える。
【００６１】
典型的な検定手順
精製Ｒａｓ１７Ｍａｂｓ［ＡＴＣＣへＨＢ１００５４として寄託されたＲａｓ１７ハイブリドーマから分泌された］は１μｇ／ｍｌへコーティング緩衝液（０．０３Ｍ無水炭酸ナトリウムおよび０．０７Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．６）で希釈され、および９６ウェルマイクロプレート［Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標） Ｆ８ ｌｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ，Ｐａｒｔ ＃１００１； Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ （ＵＳＡ）］のウェルへ吸着される（ウェル当たり１００μｌにて）。吸着は一夜（少なくとも１２時間）室温にて（２０℃〜２７℃）実施される。インキュベート期間の終了時に、ブロッキング溶液をウェルに加え（０．００２Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．００８Ｍリン酸水素二ナトリウム七水和物、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．２９ＭベータＤ−ラクトースおよび２％ＢＳＡ試薬グレード；ｐＨ７．４５）およびＯｙｓｔｅｒ Ｂａｙマイクロプレートコーター（Ｍｏｄｅｌ ＭＰＣＳ− ３） ［Ｏｙｓｔｅｒ Ｂａｙ Ｐｕｍｐ Ｗｏｒｋｓ，Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．（ＵＳＡ）］を用いて吸引した。コーティングされたマイクロプレートはＬｙｏＳｔａｒ（登録商標） Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｅｒ ［ＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｏｎｅ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｙ．（ＵＳＡ）］を用いて２２℃にて乾燥しおよび２〜８℃にて保存した。
【００６２】
ヒト血清試料およびｒａｓ ｐ２１標準［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｐ２１３８； Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ （ＵＳＡ）］は試料希釈剤［４％ＢＳＡプロテアーゼフリー（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃８２−０４５； ｗｗｗ．ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ．ｃｏｍ）、１０ μｇ／ｍｌ精製マウス ＩｇＧ （Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃３ＢＭ２２２； Ｓａｎｔｅｌ，ＣＡ，ＵＳＡ）および０．０９％アジ化ナトリウム］を用いて連続希釈する。ヘパリン、クエン酸、またはＥＤＴＡで処理した血漿試料を血清の代わりに使用しうる。希釈試料を次いでマイクロプレートウェルに加え（ウェル当たり１００μｌ）、および密閉したプレートを３時間３７℃にてインキュベートする。各ウェルをウェル当たり３００μＬのプレート洗浄液ｐＨ７．４［０．１３７Ｍ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１．４５ｍＭリン酸二水素カリウム、０．０８Ｍリン酸水素二ナトリウム七水和物、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］で６回洗浄する。各ウェルへ次いで、検出希釈剤［０．４％カゼイン、１．７ｍＭリン酸二水素ナトリウム、８．１ｍＭリン酸水素二ナトリウム七水和物、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、および０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．１５±０．１］で希釈された１００μｌのビオチン化Ｒａｓ１０．２Ｍａｂｓ［その親ハイブリドーマＲａｓ１０はＡＴＣＣにＨＢ９４２６として寄託されている］を添加する（Ｍａｂ終濃度０．５〜３．５μｇ／ｍｌ；検出Ｍａｂの力価測定および機能試験によって決定された最適濃度）。
【００６３】
プレートを３０分間室温にてインキュベートする。各ウェルを上記の通り６回洗浄し、および複合体希釈剤［１．７ｍＭリン酸二水素ナトリウム、８．１ｍＭリン酸水素二ナトリウム七水和物、０．１４５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％２−クロロアセトアミド、１％ＢＳＡプロテアーゼフリー、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．３］で１μｇ／ｍＬ以下に希釈された１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ［Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ４３−８３２３； ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ］を各ウェルに加える。プレートを室温にて３０分間インキュベートする。各ウェルを再び上記の通り６回洗浄し、および１００μｌの発色基質溶液［ＴＭＢブルー基質、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｓ１６０１； ｗｗｗ．ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ．ｃｏｍ］を各ウェルに加えて、結合したペルオキシダーゼ活性を検出する。プレートを３０分間室温にてインキュベートし、および反応を２．５Ｎ硫酸１００μｌの添加によって停止する。吸収は４５０ｎｍにてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ分光光度プレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ＃Ｖｍａｘ； ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ）を用いて測定し、およびＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ（商標） （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ； ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ）ソフトウェアプログラムを用いて分析する。
【００６４】
ヒト血清および血漿試料正常ヒトおよび癌患者由来の冷凍血漿および血清試料はＢｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．［Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ （ＵＳＡ）；現在はＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ （ｗｗｗ．ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）］から入手した。
【００６５】
実施例１
Ｒａｓ標準曲線
定量的分析は、Ｈａ ｒａｓ ｐ２１［組み換え野生型ｒａｓ ｐ２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｐ２１３８］を用いて標準曲線を作成することによって行った。図１は、さまざまな濃度 のＨａ−ｒａｓ ｐ２１タンパク質を固定化抗ｐ２１汎反応性モノクローナル抗体Ｒａｓ１７と反応させることによって、および捕捉されたｒａｓ ｐ２１タンパク質をビオチン化抗総ｐ２１モノクローナル抗体Ｒａｓ１０．２を用いて検出することによって作成された標準曲線を示す。イムノアッセイ手順は材料および方法で上述した通りであった。
【００６６】
実施例２
正常ヒト血清
マイクロプレートウェルを、上記の通り、抗総ｒａｓ ｐ２１捕捉抗体（ＭａｂＲａｓ１７）でコーティングした。計８２検体の正常ヒト血清（女性４２名、男性４０名；Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．から入手）を個別に、コーティングされたマイクロプレートでＥＬＩＳＡによって検査し、および血清中に存在するｒａｓ ｐ２１をビオチン化Ｒａｓ１０．２モノクローナル抗体を用いて検出した。４５０ｎｍでの吸収度を用いて、血清試料中の総ｒａｓ ｐ２１のレベルを測定した。結果は、一般的に、正常男性よりも正常女性でより高いレベルの総ｒａｓ ｐ２１タンパク質がみられたことを示した（平均は女性で１２２．４ｐｇ／ｍｌに対して男性で３３．１ｐｇ／ｍｌ）。
【表１−１】
2008547027.tif 000002
【表１−２】
2008547027.tif 000003
実施例３
血漿対血清
１６検体の対応する正常ヒト血清および血漿試料について、材料および方法は上述の通りで、総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。血漿レベルは、下記の表２で示す通り、血清レベルより平均して約２４％高かった。
【表２】
2008547027.tif 000004
【００６７】
実施例４
検定法の特徴
ヒト血清または血漿中の総ｒａｓ ｐ２１についてのＥＬＩＳＡアッセイ法の感度、特異性、精度および並列性が特徴づけられた（全ての場合で、ＭａｂＲａｓ１７を捕捉抗体として、およびＭａｂＲａｓ１０．２を検出抗体として使用）。
【００６８】
１．分析感度
分析物の最小検出可能濃度を、ゼロ用量試料（標準レベル１）の反復測定および平均＋２標準偏差の計算によって決定した。ｒａｓＥＬＩＳＡアッセイ法は総ｒａｓ ｐ２１タンパク質４．６ピコグラム／ｍｌを検出する。
【００６９】
２．特異性
交差反応性：Ｒａｂ３Ａ、Ｒａｃ−１、およびＲａｎは、Ｇタンパク質ファミリーの他のメンバーである。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＲＡＳ ｐ２１ ＥＬＩＳＡを、高レベルの各分析物で検証した。Ｒａｂ−３Ａだけが最小限の１．２２％にていくらかの交差反応性を示した。
【００７０】
３．精度
分析間精度：ヒト試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質を測定するための本ＥＬＩＳＡ検査の再現性を、別の時での同一血清の反復検査によって確認した（表３）。正常ヒト血清および血漿に組み換え野生型ｒａｓ ｐ２１［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を三つの異なる濃度で添加し、および８回の分析で、各回当たり８連で試験した。分析間変動は１０．０％以下であった。
【表３】
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【００７１】
分析内精度：正常ヒト血清および血漿にｒａｓ ｐ２１タンパク質を三つの異なる濃度で添加し、および８回の分析で、各回当たり８連で試験した。平均分析内変動は７％未満であった（表４）。
【表４】
2008547027.tif 000006
【００７２】
４．並列性
添加血清および血漿試料を最初に１：２希釈し、続いて２倍希釈を作製し、および全ての希釈をｒａｓ ｐ２１ＥＬＩＳＡで試験した。各希釈についての回収率（ｐｇ／ｍｌ）は適当な希釈係数で補正して計算した。結果は、試料希釈剤で希釈した添加血漿および血清試料はｒａｓ ｐ２１タンパク質の正確な回収を結果として生じることを示す（表５）。
【表５】
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【００７３】
実施例５
正常血清由来連続試料中のｒａｓレベル
正常者１５名（男性１３名、女性２名）由来の連続血清試料について、材料および方法は上述の通りで、ＥＬＩＳＡによって総ｒａｓ ｐ２１レベルを測定した。一般的に、試料は少なくとも３週間間隔で採取された。
【表６−１】
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【表６−２】
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実施例６
結腸癌患者における一点および連続Ｒａｓレベル
Ｒａｓは全ての癌の約２０％、特に結腸および膵臓癌で変異している。変異または過剰発現によって活性化されたｒａｓ経路は総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベル上昇を結果として生じうるという本発明の仮説に基づき、結腸癌患者由来の血清４８検体について、総ｒａｓ ｐ２１レベルを測定した（表７）。結腸癌患者由来の少なくとも４検体の血清（試料＃２００４、＃２０６５、＃２７８４および＃２７８５）が極めて高い総ｒａｓ ｐ２１レベルを示した。
【表７】
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【００７４】
しかし、総ｒａｓ ｐ２１タンパク質における連続変化は、一点検定法よりも、前腫瘍／腫瘍疾患のより有用な指標でありうる。ｒａｓ ｐ２１のレベル上昇は、結腸直腸癌再発または進行を示す可能性があり、および従来の治療またはｒａｓ経路を標的とする治療のどちらかで治療されるべき患者を特定しうる。ｒａｓ腫瘍性タンパク質のレベル上昇は、他の腫瘍学検査、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と併用されうる。
【００７５】
表８に示す通り、結腸癌患者７名に由来する連続血清試料について、材料および方法に記載のＥＬＩＳＡイムノアッセイ形式を用いて、総ｒａｓ ｐ２１レベルを測定した。ステージＩＶ結腸癌を有する特定の患者１名において、発明者らは下記の観察を行った：ｒａｓレベルは最初は相対的に安定に留まったが（表８、試料＃３７６６−２から＃３７６６−４）、しかし癌が進行するにつれ、ｒａｓレベルは６９ｐｇ／ｍｌへ、および次いで１２４ｐｇ／ｍｌへ上昇した。その患者は従来の治療を受けていた一方、癌の進行を示した。本発明のイムノアッセイはしたがって、ｒａｓ発癌遺伝子経路またはその経路の成分を特異的に阻害することを標的とする治療に反応しうる、従来の治療に反応していない患者を特定するために使用されうる。本発明のイムノアッセイはまた、ｒａｓ経路を標的とする治療に対する反応または反応の欠如を監視するために使用されうる。
【００７６】
別の一例は、ｒａｓ ｐ２１レベルが最初は相対的に安定に留まったステージＩＩ結腸癌患者のものである（表８、試料＃３７６７−１から＃３７６７−４）。癌が進行するにつれ、しかし（試料＃３７６７−５および＃３７６７−６）、ｒａｓレベルは１４２ｐｇ／ｍｌへ上昇し、および９５ｐｇ／ｍｌで高値に留まった一方、患者のＣＥＡレベルは正常の１．８ｎｇ／ｍｌへ低下した。この患者の例で示される通り、ＣＥＡは増悪に直面して減少した一方、ｒａｓレベルは上昇し、そのパターンは増悪と合致する。ｒａｓのレベル上昇はしたがって、ｒａｓ阻害因子治療に適する患者、またはｒａｓ発癌遺伝子経路を阻害するように特に標的化された治療に反応しうる従来の治療に反応していない患者を特定するために使用されうる。
【表８】
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【００７７】
実施例７
ステージＩ／ステージＩＩ乳癌におけるＲａｓ ｐ２１血清レベル
Ｒａｓ ｐ２１は乳癌の５０〜６０％で過剰発現されている。転移性乳癌（ＭＢＣ）患者における循環ｒａｓ腫瘍性タンパク質の治療前の上昇したレベルは、従来の治療または標的化抗ｒａｓ治療に適した患者を示しうる。
【００７８】
加えて、乳癌患者におけるｒａｓ ｐ２１単独のレベル上昇または低下は、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕのレベルと併せて、再発乳癌の早期指標でありうる。転移性乳癌（ＭＢＣ）患者におけるｒａｓまたはＨＥＲ−２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質の、治療前の上昇した循環レベルは、抗ｒａｓおよび／または抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ治療、従来の治療または標的化治療に適した患者を示しうる。
【００７９】
表９は、ステージＩまたはステージＩＩ乳癌患者由来の単一血清試料のイムノアッセイ（材料および方法で記載の通り）でみられる総ｒａｓ ｐ２１レベルを示す。個別の乳癌患者は、１００〜２００ｐｇ／ｍｌ範囲にある正常レベルと比較して高い総ｒａｓ ｐ２１レベルを示す。数名の患者は２６００〜２８００ｐｇ／ｍｌ範囲の極めて高いｒａｓ ｐ２１レベルを示す（例えば、試料＃１３２３、＃１３５７および＃１４３２を参照）、
【表９】
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【００８０】
実施例８
ヒト血清におけるＲａｓおよびＴＩＭＰ−１の同時発現
ｒａｓ ｐ２１レベルを他の腫瘍関連タンパク質と組み合わせて測定することは、特定の癌についての治療の選択を支援しうる。例えば、ｒａｓおよびｒａｓの上流のタンパク質の両方のレベルを測定することによって、活性化ｒａｓ経路に関連する腫瘍疾患に最も適した治療を決定しうる。
【００８１】
一つのそのような上流タンパク質がＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子）である。ＴＩＭＰ−１は大部分の組織および体液でみられる多機能タンパク質である；ＴＩＭＰ−１はマトリクスメタロプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害し、およびそれによって癌浸潤を妨げる。しかし、ＴＩＭＰ−１はまた、アポトーシスの阻害、悪性形質転換の誘導および細胞増殖の刺激といった他の機能を有し、および見かけ上ｒａｓを活性化する。ＴＩＭＰ−１は結腸直腸癌患者由来の血液中で上昇しており、および高いＴＩＭＰ−１レベルは悪い予後を予測する［３８］。ｒａｓおよびＴＩＭＰ−１の両方のレベルを監視することは、癌患者のための治療選択、治療に対する応答または応答の欠如、および腫瘍進行が起こっているか否か判定するための貴重な情報を提供する。
【００８２】
結腸直腸癌患者におけるｒａｓ ｐ２１およびＴＩＭＰ−１の連続試料は、標的化治療（ｒａｓおよび／またはＴＩＭＰ−１への）に対する反応を予測または監視するために有用でありうる。また、従来の抗癌治療に対する反応を予測するためにｒａｓおよびＴＩＭＰ−１を測定する有用性もありうる。
【００８３】
治療前の上昇したｒａｓ ｐ２１およびＴＩＭＰ−１レベルは、ｒａｓおよび／またはＴＩＭＰ−１タンパク質を阻害することを意図する医薬を用いた治療のために患者を選択するのに、またはそのような医薬での治療に対する患者反応を予測するのに使用されうる。そのような治療は、例えばｒａｆキナーゼといったｒａｓ発癌遺伝子経路のさまざまな成分を阻害する医薬を含み、およびｒａｆキナーゼ阻害因子薬にまたはファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子（ＦＴＩ）に適用されうる。そのような治療はまた、ｒａｓに導かれる腫瘍に対する従来の治療、またはＴＩＭＰ−１機能を阻害することを意図する医薬を含む。
【００８４】
連続正常試料中のＲａｓおよびＴＩＭＰ−１レベル
正常者対照１５名（男性１３名、女性２名）由来の連続正常試料について、材料および方法で上述の通り、ＥＬＩＳＡによって総ｒａｓ ｐ２１およびＴＩＭＰ−１レベルを測定した（表１０に示す）。一般的に、試料は少なくとも３週間間隔で採取された。正常血清では、総ｒａｓ ｐ２１レベルは５０．６ｐｇ／ｍｌないし５６０ｐｇ／ｍｌで変動した；ＴＩＭＰ−１の正常レベルは１６７．８ｎｇ／ｍｌないし６１４．４ｎｇ／ｍｌの範囲であった。
【表１０】
2008547027.tif 000013
【００８５】
連続結腸癌試料中のＲａｓ ｐ２１、ＴＩＭＰ−１およびＣＥＡレベル
表１１に示す通り、結腸癌患者７名から連続的に採取された血清について、材料および方法で上述の通り、ＥＬＩＳＡによって総ｒａｓ ｐ２１およびＴＩＭＰ−１レベルを測定した。それらの患者のうち６名に由来する血清をまた、ＣＥＡについても検定した。
【００８６】
特定の１名のステージＩＶ結腸直腸癌患者では（表１１、患者＃３７６６）、ｒａｓレベルは５９ｐｇ／ｍｌから１２５ｐｇ／ｍｌへ上昇し、一方でＴＩＭＰ−１レベルは２６３から７０３ｎｇ／ｍｌへ上昇した。その患者は従来の治療を受けている一方で増悪を示した。そのデータは、総ｒａｓ ｐ２１およびＴＩＭＰ−１レベルが、そのような結腸直腸癌患者の管理に使用されうることを示唆する。
【表１１】
2008547027.tif 000014
【００８７】
ハイブリドーマ細胞株の寄託
ＡＴＣＣ寄託。下記の材料は現在１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９ （ＵＳＡ）のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）に寄託された。寄託はＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ（ブダペスト条約）の規定に基づいて実施した。生存可能な培養の維持は寄託日から３０年間保証されている。該ハイブリドーマおよびプラスミドは、ＡＴＣＣによってブダペスト条約の条項に基づいて利用可能にされ、および、関連する米国特許の発行に際して一般に対し、寄託されたハイブリドーマおよびその子孫の無制限の利用可能性を保証する、出願者およびＡＴＣＣの間の合意に支配される。
【００８８】
本出願の代理人は、適当な条件下で培養された際に寄託されている材料の培養が死滅または亡失または破棄された場合、通知に際して直ちに別の同一物で材料を差し替えることに合意している：
i． ハイブリドーマ 寄託日 ＡＴＣＣ＃ 
ii．  Ｒａｓ１０      １９８７年５月１２日      ＨＢ９４２６
iii．  Ｒａｓ１７      １９８９年５月２９日      ＨＢ１００５４
本発明の前記の実施形態の記載は、説明および記載の目的で提示されている。それらは網羅的であることまたは本発明を開示された正確な形に限定することを意図せず、および上記の教示に照らして明らかに多数の改変および変形が可能である。実施形態は本発明の原理およびその実際的応用を説明し、それによって当業者が本発明をさまざまな実施形態でおよび考えられる特定の使用に適するさまざまな改変と共に利用することが可能になるように選択および記載された。
【００８９】
引用された全ての参考文献は参照により本開示に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、材料および方法で、および実施例１で詳細に記載されるｒａｓ ｐ２１ＥＬＩＳＡ１の、本発明の検定法の好ましい一実施形態において、野生型組み換えｒａｓ ｐ２１標準を０、４０、１５０、３００、５００および７００ｐｇ／ｍｌの６種類の異なる濃度で反応させることによって作製された標準曲線例である。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月29日(2008.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化ｒａｓ経路に関連する前腫瘍／腫瘍疾患を検出する方法であって：
（ａ）対照集団の個体から採取された体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを免疫学的に検出および定量する；
（ｂ）対象から経時的に採取された対応する体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量する；および
（ｃ）前記対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルを、前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルと比較する；工程を含み、
前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルより高い前記対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが、対象における活性化ｒａｓ経路および前腫瘍／腫瘍疾患の存在の指標となることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１の平均レベルに対する前記対象の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが、前記対象に関するより良好なまたはより悪い予後の指標となることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記対象が前腫瘍／腫瘍疾患を有するヒト患者であり、該患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルと前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルとの差、および該患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルの連続的変化が、該患者を治療するために従来の癌治療および／またはｒａｓ指向癌治療を用いるか否かの指標となることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが前記対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを上回る場合、および患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化が対照試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質の平均レベルを上回る傾向にあるレベルを示す場合、ｒａｓ発癌遺伝子により生じた前腫瘍／腫瘍疾患が存在すること、およびｒａｓ指向治療を用いて治療すべきことが示唆されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ｒａｓ指向治療が、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子（ＦＴＩ）、チロシンキナーゼ阻害因子、ビスアリール尿素、およびｒａｓのアンチセンス阻害因子より成る群から選択されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
ｒａｓ指向治療がビスアリール尿素ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）の対照集団の個体が、対象と同一の性別の個体であることを特徴とする、請求項１または３記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）および（ｂ）の免疫学的検出および定量が、サンドイッチＥＬＩＳＡの形のイムノアッセイ、または等価の検定法により行われることを特徴とする請求項１または３記載の方法。
【請求項９】
サンドイッチＥＬＩＳＡまたは等価の検定法が、モノクローナル抗体の使用を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＨＢ１００５４から分泌されるＲａｓ１７を捕捉モノクローナル抗体として使用し、かつＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマＨＢ９４２６から分泌されるＲａｓ１０を検出モノクローナル抗体として使用することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
検出モノクローナル抗体Ｒａｓ１０がビオチン化されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記患者の体液試料が、治療に反応していない癌患者に由来するものであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１３】
活性化ｒａｓ経路に関連する前腫瘍／腫瘍疾患の状態を特定する方法であって：
前腫瘍／腫瘍疾患を有する患者から経時的に採取された体液試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質レベルの連続変化を免疫学的に検出および定量することを含み；
前記患者が治療を受けている患者であり、経時的な総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベル上昇が、疾患の進行または治療に対するネガティブな反応を示唆し、および総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベル低下が、疾患の寛解または治療に対するポジティブな反応を示唆することを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記治療がｒａｓ指向治療であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記患者の試料中の総ｒａｓ ｐ２１タンパク質のレベルが、前記患者に関するより良好なまたはより悪い予後の指標となることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記予後が、奏功率（ＲＲ）、完全奏功臨床効果（ＣＲ）、部分奏功臨床効果（ＰＲ）、病勢安定臨床効果（ＳＤ）、無進行期間（ＴＴＰ）、および生存期間（ＴＴＤ）より成る群から選択される臨床的結果であることを特徴とする請求項２または１５記載の方法。
【請求項１７】
前記患者の試料が、治療前の試料であることを特徴とする請求項２または３記載の方法。
【請求項１８】
前記患者の試料中の一または複数の他のタンパク質のレベルを検出または検出および定量するためのイムノアッセイの使用をさらに含むことを特徴とする請求項１、３および１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記一または複数の他のタンパク質が、阻害因子、腫瘍性タンパク質、増殖因子受容体、血管新生因子、転移タンパク質、腫瘍マーカーおよび腫瘍抑制因子より成る群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
阻害因子がメタロプロテイナーゼ−１組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）であり、腫瘍性タンパク質がＨＥＲ−２／ｎｅｕであり、増殖因子受容体が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）より成る群から選択され、血管新生因子が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、転移タンパク質がウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）であり、腫瘍マーカーが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、および腫瘍抑制因子がｐ５３であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記患者の体液試料が、治療に反応していない癌患者に由来するものであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
総ｒａｓ ｐ２１および／またはＨＥＲ−２／ｎｅｕのレベルの上昇が、早期再発または転移の高い可能性の指標となることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、乳房滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、細胞質ゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗液および気管支肺胞洗浄液より成る群から選択されることを特徴とする請求項１、３および１３いずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記体液が血清または血漿であることを特徴とする請求項１、３および１３いずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
活性化ｒａｓ経路と関連する前腫瘍／腫瘍疾患が、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、メラノーマ、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、頭頚部癌、肝細胞癌および血液系腫瘍より成る群から選択されることを特徴とする請求項１、３および１３いずれか１項記載の方法。
【国際調査報告】
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