(57)【要約】【課題】ＤＮＡマイクロアレイを用いる核酸検出する場合に、検査コストと測定時間を抑制することができる複数遺伝子検出方法を提供する。【解決手段】第１の検出ステップにおける検出結果に基づいて、検出作業を続行するか否かを判断する判断ステップと、判断ステップによる判断が肯定された場合にのみ、第２の標識剤により標識化された標的遺伝子の有無を検出する第２の検出ステップと、を備える。第２の検出ステップでは、第１の標識化ステップ、第２の標識化ステップおよび第１の検出ステップを経由した遺伝子に対して標的遺伝子の有無を検出する。【選択図】図１
2015042152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の遺伝子の有無を同時に検出する複数遺伝子検出方法において、
サンプルから抽出された複数の遺伝子に対して第１の標識剤を用いて標識化を行う第１の標識化ステップと、
前記複数の遺伝子に対して前記第１の標識剤とは異なる第２の標識剤を用いて標識化を行う第２の標識化ステップと、
前記第１の標識剤により標識化された標的遺伝子の有無を検出する第１の検出ステップと、
前記第１の検出ステップにおける検出結果に基づいて、検出作業を続行するか否かを判断する判断ステップと、
前記判断ステップによる判断が肯定された場合にのみ、前記第２の標識剤により標識化された標的遺伝子の有無を検出する第２の検出ステップと、
を備え、
前記第２の検出ステップでは、前記第１の標識化ステップ、前記第２の標識化ステップおよび第１の検出ステップを経由した遺伝子に対して標的遺伝子の有無を検出することを特徴とする複数遺伝子検出方法。
【請求項２】
前記第１の検出ステップでは、前記第１の標識化ステップおよび前記第２の標識化ステップを経由した遺伝子に対して標的遺伝子の有無を検出することを特徴とする請求項１に記載の複数遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記第１の検出ステップでは、細胞から抽出された核酸または前記遺伝子に由来したタンパク質の有無を検出することを特徴とする請求項１または２に記載の複数遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記第１の検出ステップでは、核酸増幅反応を行わせることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の複数遺伝子検出方法。
【請求項５】
前記第１の検出ステップでは、一定の処理による核酸増幅反応終了後に標的遺伝子の有無を検出することを特徴とする請求項４に記載の複数遺伝子検出方法。
【請求項６】
前記第１の検出ステップでは、一定の処理による核酸増幅反応の途中で標的遺伝子の有無を検出し、標的遺伝子が検出された場合にはその時点で前記判断ステップにおける判断が肯定されることを特徴とする請求項４に記載の複数遺伝子検出方法。
【請求項７】
前記第２の検出ステップでは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子の有無を検出することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の複数遺伝子検出方法。
【請求項８】
少なくとも一部が弾性体で形成され、前記弾性体が外力を受けて変形することにより内容物を移送または封止することで化学処理を行わせる化学処理用カートリッジを用いて、前記第１の標識化ステップと、前記第１の検出ステップと、を実行することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の複数遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種以上の遺伝子の有無を同時に検出する複数遺伝子検出方法に関し、とくに繰り返して遺伝子の有無を検出する場合に適した複数遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品、医薬品、化粧品などの産業分野では、個々の製品や中間品であるサンプルに対して、例えば菌などの有無を調べるため、微生物の遺伝子検査が行われている。遺伝子検査の手順として、例えば以下の工程がとられる。
（１）ＤＮＡ抽出：対象とする微生物に適合するＤＮＡ抽出キットを用いて、サンプルからＤＮＡを抽出する。
（２）ＰＣＲ増幅：抽出されたＤＮＡを元にＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅するとともに、蛍光標識プライマーを介して標的ＤＮＡへの蛍光標識を行う。
（３）一本鎖化：反応後に得られた標的ＤＮＡの増幅断片を加熱装置により熱変性し、一本鎖の状態にする。
（４）ハイブリダイゼーション：標的ＤＮＡ検出用のプローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイ上に一本鎖DNAを添加し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション完了後、DNAマイクロアレイ上のハイブリダイズしなかった一本鎖DNAを洗浄液で除去する。
（５）測定：蛍光読取装置により、蛍光を発するスポットを測定する。スポットの位置からサンプル中に存在している菌種等を判別する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１０１４２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の遺伝子検査では、結果的に微生物が検出されない場合においても、常にＤＮＡマイクロアレイを使用するため、検査コストが高くなる。また、ハイブリダイゼーションには３０分から数時間の時間がかかるため測定に長時間を要する。
【０００５】
本発明の目的は、ＤＮＡマイクロアレイを用いる核酸検出する場合に、検査コストと測定時間を抑制することができる複数遺伝子検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の複数遺伝子検出方法は、２種以上の遺伝子の有無を同時に検出する複数遺伝子検出方法において、サンプルから抽出された複数の遺伝子に対して第１の標識剤を用いて標識化を行う第１の標識化ステップと、前記複数の遺伝子に対して前記第１の標識剤とは異なる第２の標識剤を用いて標識化を行う第２の標識化ステップと、前記第１の標識剤により標識化された標的遺伝子の有無を検出する第１の検出ステップと、前記第１の検出ステップにおける検出結果に基づいて、検出作業を続行するか否かを判断する判断ステップと、前記判断ステップによる判断が肯定された場合にのみ、前記第２の標識剤により標識化された標的遺伝子の有無を検出する第２の検出ステップと、を備え、前記第２の検出ステップでは、前記第１の標識化ステップ、前記第２の標識化ステップおよび第１の検出ステップを経由した遺伝子に対して標的遺伝子の有無を検出することを特徴とする。
本発明の複数遺伝子検出方法によれば、判断ステップによる判断が肯定された場合にのみ、第２の標識剤により標識化された標的遺伝子の有無を検出するので、検査コストと測定時間を抑制することができる。
【０００７】
前記第１の検出ステップでは、前記第１の標識化ステップおよび前記第２の標識化ステップを経由した遺伝子に対して標的遺伝子の有無を検出してもよい。
【０００８】
前記第１の検出ステップでは、細胞から抽出された核酸または前記遺伝子に由来したタンパク質の有無を検出してもよい。
【０００９】
前記第１の検出ステップでは、核酸増幅反応を行わせてもよい。
【００１０】
前記第１の検出ステップでは、一定の処理による核酸増幅反応終了後に標的遺伝子の有無を検出してもよい。
【００１１】
前記第１の検出ステップでは、一定の処理による核酸増幅反応の途中で標的遺伝子の有無を検出し、標的遺伝子が検出された場合にはその時点で前記判断ステップにおける判断が肯定されてもよい。
【００１２】
前記第２の検出ステップでは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子の有無を検出してもよい。
【００１３】
少なくとも一部が弾性体で形成され、前記弾性体が外力を受けて変形することにより内容物を移送または封止することで化学処理を行わせる化学処理用カートリッジを用いて、前記第１の標識化ステップと、前記第１の検出ステップと、を実行してもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の複数遺伝子検出方法によれば、判断ステップによる判断が肯定された場合にのみ、第２の標識剤により標識化された標的遺伝子の有無を検出するので、検査コストと測定時間を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明による複数遺伝子検出方法の手順を示す図。
【図２】本発明による複数遺伝子検出方法を実施する具体的な方法の一例を示す図。
【図３】化学処理用カートリッジの構成例を示す平面図。
【図４】化学処理用カートリッジの構成例を示す図であり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ図３のIV−IV線断面図。
【図５】化学処理用カートリッジの構成を示す図であり、（ａ）および（ｂ）は化学処理用カートリッジの平面図。
【図６】２段階目検出に使用可能な化学処理用カートリッジの構成例を示す平面図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図１〜図６を参照して、本発明による複数遺伝子検出方法の実施形態について説明する。
【００１７】
図１は、本発明による複数遺伝子検出方法の手順を示す図、図２は本発明による複数遺伝子検出方法を実施する具体的な方法の一例を示す図である。以下、図１〜図２を参照しつつ複数遺伝子検出方法の手順について、具体的な方法を含めて説明する。
【００１８】
ステップＳ１では、サンプルからＤＮＡを抽出する（図１）。ここでは、例えば、対象とする微生物に適合するＤＮＡ抽出キットを用いて、サンプルからＤＮＡを抽出することができる（図２）。
【００１９】
次に、ステップＳ２では、抽出されたＤＮＡを元にリアルタイムＰＣＲ法でＤＮＡ増幅反応を行うとともに、増幅された標的ＤＮＡ断片を蛍光標識する（図１）。ＤＮＡ増幅反応では、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ増幅するとともに増幅量を計測するための試薬である、リアルタイムＰＣＲ反応試薬を用い、リアルタイムＰＣＲ反応装置により温度サイクルをかけＰＣＲ増幅反応を行わせる（図２）。また、蛍光標識にあたり、例えば、第１の蛍光色素（インターカレーター型色素）を用いるとともに、後述するＤＮＡマイクロアレイ検出のためにプライマーに事前に標識された第２の蛍光色素を用いてＰＣＲ増幅産物に蛍光標識を行うことができる。第１の蛍光色素（インターカレーター型色素）および第２の蛍光色素が事前に標識されたプライマーは、リアルタイムＰＣＲ反応試薬の一成分として含ませることができる。このように、互いに異なる第１の蛍光色素および第２の蛍光色素により、後述する２段階の検出にそれぞれ必要な蛍光標識化を同時に行うことができる。この場合、第２の蛍光色素として、第１の蛍光色素と異なる蛍光波長を示す色素を用いることができる。
【００２０】
次に、ステップＳ３では、１段階目の蛍光検出を行う（図１）。ここでは、例えば、リアルタイムＰＣＲ反応装置によりインターカレーター由来の蛍光検出を行う（図２）。増幅反応により複数の標的ＤＮＡ断片のうち１種類でも増幅すれば、蛍光強度が増大する。増幅が起きなかった場合、蛍光強度は増加しない。
【００２１】
１段階目の蛍光検出における励起光波長および検出波長の組み合わせの例としては、青色励起光と緑色蛍光検出の組み合わせなどがある。
【００２２】
次に、ステップＳ４では標的遺伝子の有無を判定する（図１）。ここでは、例えば、ステップＳ３で検出された蛍光強度が閾値以上であるか否かを判断する（図２）。１段階目の蛍光検出時の蛍光強度が閾値未満であれば、標的ＤＮＡ（菌など）が存在しなかったという判定になり、操作は終了となる。１段階目の蛍光検出時の蛍光強度が閾値以上であれば、次のステップＳ５へ進む。
【００２３】
ステップＳ５では、標的ＤＮＡ断片を一本化変性する（図１）。ここではＰＣＲ反応後に得られた標的ＤＮＡの増幅断片を加熱装置により熱変性し、一本鎖の状態にする。
【００２４】
次に、ステップＳ６では、ハイブリダイゼーションを行う（図１）。ここでは、図２に示すように、標的ＤＮＡ検出用のプローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイ上に一本鎖ＤＮＡを添加し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション完了後、ＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを洗浄液で除去する。
【００２５】
次に、ステップＳ７では、２段階目の検出として、ＤＮＡマイクロアレイ読取装置により、第２の蛍光色素由来の蛍光を発するスポットを蛍光画像として確認する（図１、図２）。そして、スポットの位置からサンプルに存在している菌種などを判別する。２段階目の蛍光検出における励起光波長および検出波長の組み合わせの例としては、緑色励起光と赤色蛍光検出の組み合わせなどがある。
【００２６】
このように、上記実施形態の複数遺伝子検出方法によれば、１段階目の蛍光検出により標的ＤＮＡが検出される場合にのみ２段階目の蛍光検出を実行し、１段階目の蛍光検出により標的ＤＮＡが検出されない場合には、２段階目の蛍光検出を実行しない。このため、ＤＮＡマイクロアレイの消費を必要最小限にでき、検査コストと検査時間が低減される。
【００２７】
実際の検査工程において、検査対象の不良（標的微生物が混入しているなどの場合）は少数である。例えば、不良品が全体の中の１０％であり、９０％は良品（標的微生物が混入していない）と仮定する。また、１段階目の蛍光検出のコストと、２段階目の蛍光検出のコストの比が０．４：０．６であると仮定する。このとき、多量のサンプルを処理した場合の平均コストは以下のようになる。
【００２８】
0.9 × 0.4a + 0.1 × (0.4a + 0.6a) = 0.46a  
【００２９】
このように、サンプルの全数について２段階目の蛍光検出まで実行する場合のコスト（＝a）に対し、コストを半減できる。不良品がさらに少ない場合には、コスト低減効果もより高くなる。
【００３０】
上記実施形態では、核酸の有無を検出するための１段階目の検出方法として、インターカレーター蛍光の強度検出を行っているが、電気泳動や、蛍光標識プローブを用いた蛍光変化などを用いることもできる。また、１段階目の検出時の蛍光標識プローブとしてTaqManプローブやモレキュラービーコンなどを使用することができ、スコーピオンプローブ、ヘアピンプローブなどその構造は問わない。
【００３１】
１段階目の検出方法として電気泳動を用いる場合には、増幅長の情報が得られ、蛍光標識プローブを用いる場合は配列特異性を確認でき、検出精度が向上するという利点がそれぞれある。
【００３２】
上記実施形態のように、核酸を増幅する場合には検出感度が向上するという利点がある。さらにリアルタイムＰＣＲのように反応中に蛍光検出（ステップＳ３）および判定（ステップＳ４）を行えれば、迅速に次の操作（２段階目の検出）へ移行できるという利点がある。
【００３３】
核酸増幅反応後に１段階目の検出を行う場合、核酸増幅の手段としては、リアルタイムＰＣＲ法に限定されることなく、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＴＲＣ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ＲＣＡなどを用いることができる。また、非対称ＰＣＲ、nested ＰＣＲなどの手法を用いることもできる。
【００３４】
１段階目の蛍光検出（ステップＳ３）および標的遺伝子の有無の判定（ステップＳ４）を核酸増幅反応中に行ってもよい。この場合、標的遺伝子の存在が認められた時点で２段階目の検出のための操作に移行することにより、検査時間をより短縮することができる。一方、増幅反応後に標的遺伝子の有無の判定を行う場合には、標的遺伝子が充分に増幅された後に検出を行うため比較的安価な検出装置が適用できるという利点がある。
【００３５】
１段階目検出の検出対象は、ＤＮＡに限定されない。例えば、２段目検出の検出対象となるＤＮＡに由来するタンパクや糖鎖を検出対象としてもよい。また、１段階目検出の検出対象をＤＮＡ以外の核酸（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）としてもよい。サンプルとなる細胞は、微生物細胞、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが含まれ、ウィルス感染細胞や癌化した細胞などでも良い。検出対象は上記実施形態に限定されない。
【００３６】
１段階目検出における検出方法は限定されない。例えば、タンパクの有無を検出する場合、電気泳動、ELIZAに代表される抗原抗体反応、質量分析などを適用することができる。このような方法により、核酸の抽出が困難な場合などに対応可能となり、例えば、芽胞などに対しても検出が可能となる。
【００３７】
１段階目検出は、プラスチック製反応チューブ、ガラス試験管、スライドガラスなどを用いることができる。また、その操作は手動またはロボットを併用した半自動など、１段階目の検出方法に応じて適切に選ばれる。後述する化学反応用カートリッジを用いて操作を自動化、あるいは半自動化することもできる。
【００３８】
１段階目検出および２段階目検出において遺伝子を検出するための標識（ラベル）として、蛍光色素だけでなく、金コロイド粒子等の金属微粒子や放射性粒子、あるいは透過光や反射光等で検出する色素粒子を用いてもよい。重要な点は、１段階目検出と２段階目検出とで異なる色素を用いるなどして１段階目検出および２段階目検出のための標識が干渉しあわないようにすることであり、これにより１段階目検出で使用済みの溶液を２段階目検出の対象として使用することが可能となる。
【００３９】
上記実施形態では、１段階目検出の前に２段階目検出に必要な標識化を行っているが、１段階目検出の後に２段階目検出のための標識化を行ってもよい。
【００４０】
次に、本発明による複数遺伝子検出方法を実施するための化学反応用カートリッジについて説明する。
【００４１】
例えば、特開２００７−１０１４２８号公報には、少なくとも一部が弾性体で形成され、弾性体が外力を受けて変形することにより内容物を移送または封止することで化学処理を行わせる化学処理用カートリッジが開示されている。化学処理用カートリッジは、その密閉性によりコンタミネーションが効果的に防止されるとともに、測定手順がその構造によって規定され、作業者によるばらつきが抑制されるなど、微生物検査などに適した特性を有する。
【００４２】
以下、化学処理用カートリッジの構成例および化学処理用カートリッジを用いた操作について説明する。
【００４３】
図３は、化学処理用カートリッジの構成例を示す平面図、図４（ａ）、図４（ｂ）および図４（ｃ）は、それぞれ図３のIV−IV線断面図である。
【００４４】
図４に示すように、化学処理用カートリッジ１０は、シリコンゴム等の透明な材質を用いて形成された弾性部材１Ａおよび弾性部材１Ｂと、弾性部材１Ａ，１Ｂよりも硬質な基板１Ｃとを、積層して構成される。
【００４５】
弾性部材１Ａおよび弾性部材１Ｂは互いに気密的に接着されるとともに、内容物を受け入れるウェルおよび流路がそれらの非接着領域として形成される。
【００４６】
図３に示すように、化学処理用カートリッジ１０には、弾性部材１Ａおよび弾性部材１Ｂの非接着領域として、サンプルを受け入れるウェル２１と、予め溶解液が収容されたウェル２２と、サンプルと溶解液を混合するためのウェル２３と、予め洗浄液等が収容されたウェル２４およびウェル２５と、サンプル、および洗浄液を混合するためのウェル２６と、ＰＣＲ増幅を行うためのウェル３１と、ウェル３１に接続されたウェル３１ａと、ウェル２１へサンプルを注入するための注入路４１と、ウェル２１およびウェル２３を接続する流路４２と、ウェル２２およびウェル２３を接続する流路４３と、ウェル２３およびウェル２６を接続する流路４５と、ウェル２６およびウェル３１を接続する流路４６と、ウェル３１に接続された流路４８と、が形成されている。
【００４７】
化学処理用カートリッジ１０のウェルまたは流路に内容物が注入された状態では、その内容物の圧力により弾性部材１Ａおよび弾性部材１Ｂが互いに引き離される。例えば、図４（ｂ）では、ウェル３１の領域に内容物が存在する状態を示している。内容物がない領域では、その弾性により弾性部材１Ａおよび弾性部材１Ｂが接触した状態が復元する。
【００４８】
図３および図４（ｂ）に示すように、化学処理用カートリッジ１０にローラ６等を押し付けつつ移動させることにより、ローラ６等と基板１Ｃとの間で弾性部材１Ａおよび弾性部材１Ｂを挟み込む位置を移動させて、内容物を搬送することができる。
【００４９】
また、図３および図４に示すように、基板１には、ＤＮＡ解析のためのＤＮＡチップ５１が埋め込まれ、複数のターゲットＤＮＡに対応するプローブが配置されたＤＮＡチップ５１の表面は弾性部材１Ａの表面と面一とされている。また、流路４８はＤＮＡチップ５１を収容する領域に接続されている。
【００５０】
次に、本実施例の化学処理用カートリッジを用いてＰＣＲ増幅を行い、さらにＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡを、ＤＮＡチップを用いて分析する一連の手順について説明する。
【００５１】
最初に、注射針等を用いることで、ウェル２１に注入口４１を介してサンプルが注入される。
【００５２】
次に、図４（ｂ）に示すように、ローラ６をカートリッジに押し付けながら右方に回転させると弾性部材２Ａ，２Ｂが弾性変形し、ウェル２１に収容されたサンプルと、ウェル２２に収容された溶解液とが、それぞれ流路４２および流路４３を介してウェル２３に到達し、両者が混合される。溶解液は界面活性剤を含んでおり、ウェル２３においてサンプル中の細胞が破壊される。
【００５３】
さらにローラ６を回転させると、混合液は流路４５を介してウェル２６に到達する。またこのとき、ウェル２４およびウェル２５に収容された洗浄液などが、ウェル２６において混合液に合流する。
【００５４】
次に、ローラ６をウェル２６からウェル３１まで流路４６に沿って移動させることで、サンプル中のＤＮＡをウェル３１に移送する。またこのとき、ウェル３１ａに予め収容されている試薬をウェル３１に移送する。
【００５５】
ウェル３１ａ内の試薬には、プライマー、デオキシリボヌクレオチド混合液およびＤＮＡ合成酵素が含まれており、ウェル３１の温度を制御することで、ウェル３１においてＤＮＡのＰＣＲ増幅が行われる。ウェル３１の温度は、例えばヒータやペルチエ素子を用いた装置により制御される。
【００５６】
ＰＣＲ増幅の終了後、ローラ６を回転させると、ウェル３１において生成されたＰＣＲ産物が、流路４８を介しＤＮＡチップ５１の表面に移送される。
【００５７】
ＤＮＡチップ５１の表面に移送されたＰＣＲ産物内のＤＮＡはＤＮＡチップ５１の特定のプローブに結合するため、蛍光によるＤＮＡ解析を行うことができる。弾性部材１Ａは透明な材質からなるため、ＤＮＡ解析に際しては、例えば、ＤＮＡチップ５１を化学処理用カートリッジ１０の外側からカメラで撮像することで、必要な画像を取り込むことができる。
【００５８】
次に、本実施形態の化学処理用カートリッジ１０では、ウェル３１をＰＣＲ産物内のＤＮＡの有無ないし量を検出する第１の検出部（１段階目検出を行う部位）として使用することができる。以下、ウェル３１を第１の検出部として利用する形態について実施例１および実施例２として説明する。
【実施例１】
【００５９】
図３および図４（ｃ）に示すように、化学処理用カートリッジ１０のウェル３１には、透明な弾性部材１Ａを介して励起光が照射され、ウェル３１内部からの蛍光は弾性部材１Ａを透過して受光素子７で検出される。ウェル３１に対して化学処理用カートリッジ１０に対して斜めの方向から励起光を照射し、ウェル３１に正対する位置に設置した受光素子７で蛍光を検出すればよい。
【００６０】
ウェル３１においてＰＣＲ産物内のＤＮＡを検出する手法としては、インターカレーターを用いる方法およびＱＰ（Quenching Probe/Primer）法などがある。
【００６１】
インターカレーターを用いる方法では、サイバーグリーン（Ｒ）などのインターカレーターをウェル３１ａの試薬内に事前に混合しておけばよい。ＰＣＲ溶液にインターカレーターが存在することにより、ＰＣＲ産物が生じると励起光の照射に応じて蛍光を発し、ＰＣＲ産物が生じない場合には蛍光を発しないため、増幅産物の有無および産物量を検出することができる。
【００６２】
ＱＰ法はある種の蛍光色素にグアニン塩基が近づくと発する蛍光が減少するという「蛍光消光現象」を利用して、目的の遺伝子を検出する手法である。蛍光標識したシトシンを末端にもち、目的遺伝子に特異的に結合するような配列に設計したプローブ（QProbe）またはプライマ（QPrimer）は、目的遺伝子と結合するとグアニンの影響を受けて蛍光が減少する。したがって、このように設計したプローブ（QProbe）またはプライマ（QPrimer）を用いて、ウェル３１からの蛍光量を測定することで、ＰＣＲ産物量を計測できる。例えば、ＰＣＲ前後にそれぞれ蛍光量を測定し、その差からＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物量を計測することができる。なお、この蛍光量の差とＰＣＲ産物量の関係は、あらかじめ検量により求めておく。このＱＰ法を用いる場合には、プローブ（QProbe）またはプライマ（QPrimer）をウェル３１ａの試薬内に事前に混合しておけばよい。
【００６３】
以上の手法を用いることにより、ウェル３１内のＰＣＲ産物量がわかるため、ＤＮＡチップ５１におけるハイブリダイゼーションにかける時間等を適切に制御することが可能となる。
【００６４】
例えば、ウェル３１内のＰＣＲ産物量が多い場合にはハイブリダイゼーションにかける時間を短くすることで、検査の迅速化とともにハイブリダイゼーションの飽和を防止できる。また、ウェル３１内のＰＣＲ産物量が少ない場合にはハイブリダイゼーションにかける時間を長くすることにより、感度の低下を防止し、高いＳ／Ｎ比を確保できる。なお、後者の場合には、作業者やシステムにアラームを通知するようにしてもよい。
【００６５】
このように、ウェル３１内のＰＣＲ産物量を把握することで、ハイブリダイゼーションを含む後段（２段階目検出）の測定工程を制御することが可能となる。また、ウェル３１で検出されたＰＣＲ産物量を後段の測定工程に反映させず、ウェル３１内のＰＣＲ産物量を記録するのみであっても、その記録を品質管理のための情報として有効に利用できる。
【００６６】
ウェル３１内で標的ＤＮＡが検出されない場合には、ハイブリダイゼーションを含む後段（２段階目検出）の測定工程は不要となるため、この時点で操作を終了することにより、検出時間を短縮することができる。
【実施例２】
【００６７】
ウェル３１内でＰＣＲ産物が検出されない場合、例えば、測定値が所定値以下の場合には、サンプル中に目的の微生物がないことが判るため、そのサンプルについてはその時点で測定を停止することができる。この場合、上記のように、化学処理用カートリッジ１０を用いてウェル３１内でのＰＣＲ産物の検出までの処理を行い、その後のＤＮＡチップ５１による検査を省略すればよい。インライン測定では、多くの場合に特定微生物の有無が問題とされるという事情があるため、特定微生物の有無のみをウェル３１において検出すれば、後段の工程を合理的なものとすることができる。例えば、ＰＣＲ産物が存在しなければ、その時点で測定を停止し、次のサンプルの検査に移行することができる。また、菌種動転はＰＣＲ産物が検出された場合、例えば、測定値が所定値以上の場合のみに行えばよい。また、工場における出荷検査など、品質管理が行われている場合には、ほとんどの場合に特定微生物は検出されないはずである。つまり多くの場合、後半の菌種同定の工程は不要になるため、工場全体として大幅な検査時間の短縮を図ることができる。
【００６８】
図５（ａ）は、化学処理用カートリッジ１０におけるウェル３１までの処理を可能とした化学処理用カートリッジ１０Ａの構成を示す平面図である。
【００６９】
図５（ａ）に示すように、化学処理用カートリッジ１０Ａは、化学処理用カートリッジ１０からＤＮＡチップ５１の領域を取り除いた形態をとっており、ＰＣＲ産物の検出に至るまでの処理については、化学処理用カートリッジ１０と同一の構成とされている。このため、ＰＣＲ産物の有無やＰＣＲ産物量の検出を行う一次検査は化学処理用カートリッジ１０Ａを用いて行い、一次検査の結果、ＤＮＡチップによる測定が必要なサンプルについてのみ、再度、化学処理用カートリッジ１０によるＤＮＡチップによる二次検査を行うことにより、カートリッジにかかるコストを削減することができる。一般に、ＤＮＡチップは比較的高価であるため、ＤＮＡチップを用いた測定が不要となる可能性が高いサンプルについて化学処理用カートリッジ１０Ａによる予備的な検査を行うことで、コストダウンが図られる。二次検査に移行する場合、一次検査の結果に応じて、ＤＮＡチップ５１における検出感度を調整するようにしてもよい。
【００７０】
また、化学処理用カートリッジ１０Ａによる１段階目検出の結果、後段の工程（２段階目検出）が必要となった場合には、化学処理用カートリッジ１０Ａのウェル３１からサンプルを採取し、後段の工程を実行すればよい。
【００７１】
図５（ｂ）に示す化学処理用カートリッジ１０Ｂは、化学処理用カートリッジ１０からＤＮＡチップ５１を取り除いた構成を備えている。この場合には、化学処理用カートリッジ１０と共通の部材を用いて化学処理用カートリッジ１０Ｂを作成できる。化学処理用カートリッジ１０Ｂの使用方法は、化学処理用カートリッジ１０Ａと同様である。
【００７２】
図６は、２段階目検出に使用可能な化学処理用カートリッジの構成例を示す平面図である。
【００７３】
図６に示すように、化学処理用カートリッジ１０Ｃには、化学処理用カートリッジ１０と同様の形態でＤＮＡチップ５１が収容される。また、化学処理用カートリッジ１０Ｃには、注射針などを用いてウェル３１から取り出された溶液を受け入れるウェル５２と、ウェル５２とＤＮＡチップ５１の収容部とを接続する流路４３と、ウェル５２へ上記溶液を注入するための注入路５４と、が形成されている。
【００７４】
化学処理用カートリッジ１０Ｃに押し当てられたローラを回転させることにより、ウェル５２に収容されている溶液（ＰＣＲ産物を含む溶液）が流路５３を介しＤＮＡチップ５１の表面に移送され、ハイブリダイゼーションが行われる。
【００７５】
このように、化学処理用カートリッジを用いて２段階目検出を行うことができるが、１段階目検出のみを化学処理用カートリッジを用いて行い、２段階目検出は従来の方法によるハイブリダイゼーションを行ってもよい。
【００７６】
化学処理用カートリッジ１０、化学処理用カートリッジ１０Ａまたは化学処理用カートリッジ１０Ｂのウェル３１において行われるＰＣＲ産物の検出である１段階目検出は、リアルタイムＰＣＲ検出と同様、温度を上下している最中に実行することもできる。
【００７７】
また、化学処理用カートリッジにおける１段階目検出のための増幅は、ＰＣＲ増幅に限られず、リニア増幅、ＬＡＭＰ法等を適用してもよい。
【００７８】
さらに、化学処理用カートリッジにおける２段階目検出は、ＤＮＡチップ等によるハイブリダイゼーションを用いた方法に限定されず、電気泳動、シーケンサーなどを用いた方法でもよい。２段階目検出の方法に応じた構成を化学処理用カートリッジ内部に形成することができる。
【００７９】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、２種以上の遺伝子の有無を同時に検出する複数遺伝子検出方法に対し、広く適用することができる。
【符号の説明】
【００８０】
１０    化学処理用カートリッジ
１０Ａ  化学処理用カートリッジ
１０Ｂ  化学処理用カートリッジ
１０Ｃ  化学処理用カートリッジ
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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