(57)【要約】【課題】固体培養による酵素生産性が高く、栄養要求性であり、かつ目的の箇所に構造遺伝子を導入可能な麹菌変異株、当該麹菌変異株から得られた形質転換体、当該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法の提供。【解決手段】アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株の栄養要求性変異株に対して、ｌｉｇＤ遺伝子を欠損させたことを特徴とする、麹菌変異株；前記栄養要求性変異株が、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株のｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部が欠損したウリジン要求性変異株である、前記記載の麹菌変異株；前記ウリジン要求性変異株に、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする、形質転換体；前記記載の形質転換体を、草本類バイオマスを用いて固体培養することを特徴とする、糖化酵素の生産方法、である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＯＫ２７Ｌ株の栄養要求性変異株に対して、ｌｉｇＤ遺伝子を欠損させたことを特徴とする、麹菌変異株。
【請求項２】
前記栄養要求性変異株が、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株のｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部が欠損したウリジン要求性変異株である、請求項１に記載の麹菌変異株。
【請求項３】
前記ウリジン要求性変異株が、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）Ｈ０１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７４９）である、請求項２に記載の麹菌変異株。
【請求項４】
アスペルギルス・オリゼＨ０２株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０）である、請求項１に記載の麹菌変異株。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載の麹菌変異株に、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする、形質転換体。
【請求項６】
前記糖化酵素遺伝子が、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記糖化酵素遺伝子が、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項８】
ｐｙｒＧ遺伝子及び前記糖化酵素遺伝子が、染色体中に組み込まれている、請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の形質転換体を、草本類バイオマスを用いて固体培養することを特徴とする、糖化酵素の生産方法。
【請求項１０】
前記草本類バイオマスが、稲わら又はコーンストーバである、請求項９に記載の糖化酵素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体培養に好適であり、かつ遺伝子組換えの宿主として好適な麹菌変異株、当該麹菌変異株から得られた形質転換体、及び、当該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加えて、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）など輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスやリグノセルロース等のセルロース系バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。
【０００３】
稲わらやコーンストーバ等の固形のバイオマスの表面上で、糖化酵素を産生する麹菌を培養することにより、当該バイオマスを糖化処理することができる。麹菌により糖化能の高い糖化酵素の遺伝子を導入した形質転換体を用いることにより、この糖化処理効率を向上させることができる。
【０００４】
一方で、麹菌等の微生物へ外来遺伝子を導入して形質転換する際には、目的の外来遺伝子が導入された微生物のみを選択的に選抜するために、宿主として、ｐｙｒＧ（オロチジンリン酸脱炭酸酵素）遺伝子やｓＣ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子等を欠損させた栄養要求性株を使用する方法が一般的に用いられている（例えば、非特許文献１又は２参照。）。例えば、ｐｙｒＧ遺伝子欠損によりウリジン要求性となった株を宿主とし、目的の遺伝子とｐｙｒＧ遺伝子を組み合わせて導入した後にウリジン不含培地で培養すると、形質転換株のみが増殖するため、効率的に遺伝子組み換え菌を選抜することができる。
【０００５】
また、これまでにｌｉｇＤ（ＤＮＡ連結酵素）遺伝子の欠損による相同組換え効率を向上させ（例えば、非特許文献３参照。）、かつ相同組換えを利用してｐｙｒＧ遺伝子をリサイクリング（マーカーリサイクリング）する方法が知られている（例えば、非特許文献４参照。）。遺伝子組換えを行う場合、ｌｉｇＤ遺伝子を欠損させることにより、目的遺伝子がゲノム上にランダムに導入されるのを抑制し、狙った場所に遺伝子が導入された株を効率的に構築することができる。また、マーカーリサイクリング技術により、従来１マーカー遺伝子につき１回の遺伝子導入の選抜しか行われていなかったのに対し、１マーカー遺伝子を複数回の遺伝子導入における選抜に使用することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nemoto，et.al.，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，2012，vol.76(8)，p.1477〜1483.
【非特許文献２】Yamada，et.al.，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，1997，vol.61(8)，p.1367〜1369.
【非特許文献３】Takahashi，et.al.，Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，vol.112(6)，p.529〜534.
【非特許文献４】Mizutani，et.al.，Fungal Genetics and Biology，2008，vol.45，p.878〜889.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、草本類バイオマスを用いて固体培養による酵素生産性が高く、栄養要求性であり、かつ目的の箇所に構造遺伝子を導入可能な麹菌変異株、当該麹菌変異株から得られた形質転換体、当該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る麹菌変異株、形質転換体、及び糖化酵素の生産方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］  アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＯＫ２７Ｌ株の栄養要求性変異株に対して、ｌｉｇＤ遺伝子を欠損させたことを特徴とする、麹菌変異株。
［２］  前記栄養要求性変異株が、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株のｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部が欠損したウリジン要求性変異株である、前記［１］の麹菌変異株。
［３］  前記ウリジン要求性変異株が、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）Ｈ０１株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７４９）である、前記［２］の麹菌変異株。
［４］  アスペルギルス・オリゼＨ０２株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０）である、前記［１］の麹菌変異株。
［５］  前記［２］〜［４］のいずれかの麹菌変異株に、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする、形質転換体。
［６］  前記糖化酵素遺伝子が、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記［５］に記載の形質転換体。
［７］  前記糖化酵素遺伝子が、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属菌由来のアクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記［５］に記載の形質転換体。
［８］  ｐｙｒＧ遺伝子及び前記糖化酵素遺伝子が、染色体中に組み込まれている、前記［５］〜［７］のいずれかの形質転換体。
［９］  前記［５］〜［８］のいずれかの形質転換体を、草本類バイオマスを用いて固体培養することを特徴とする、糖化酵素の生産方法。
［１０］  前記草本類バイオマスが、稲わら又はコーンストーバである、前記［９］の糖化酵素の生産方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る麹菌変異株は、固体培養に適しており、かつ栄養要求性株であるため、外来遺伝子を導入する遺伝子組換えの宿主として好適である。また、ｌｉｇＤ遺伝子が欠損されているために、非相同的組換えが抑制されるため、染色体中の目的の箇所に構造遺伝子を導入することができる。このため、当該麹菌変異株に糖化酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体は、固体培養により効率よく糖化酵素を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マーカーリサイクリング法を利用してウリジン要求性変異株からｌｉｇＤ遺伝子を欠損させた麹菌変異体を製造する方法の模式図である。
【図２】参考例１において、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）に属する各株の酵素生産収率の測定結果を示した図である。
【図３】実施例１において、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株を１２０時間培養した後のウリジン含有ＣＤプレート培地の写真図である。
【図４】実施例１において、アスペルギルス・オリゼＨＯ１株を１２０時間培養した後のウリジン含有ＣＤプレート培地の写真図である。
【図５】実施例１において、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株を１２０時間培養した後のウリジン含有ＣＤプレート培地の写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜麹菌変異株＞
本発明に係る麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株（株式会社秋田今野商店より入手可能である。）（以下、「ＡＯＫ２７Ｌ株」と略すことがある。）の栄養素の合成等に関する遺伝子の機能を欠損させることにより、栄養要求性を獲得した変異株に対して、ｌｉｇＤ遺伝子を欠損させたことを特徴とする。ｌｉｇＤ遺伝子は、ゲノムに生じるランダムな切れ目の修復に必要な酵素である。本発明に係る麹菌変異株では、ｌｉｇＤ遺伝子が欠損しているため、非相同性組換えが生じず、染色体中のランダムな位置に導入されることが防止される。このため、相同組換えにより染色体中の目的の箇所に外来遺伝子を導入することができる。
【００１２】
また、本発明に係る麹菌変異株は、栄養要求性を備える。このため、本発明に係る麹菌変異株を遺伝子組み換えの宿主として用いることにより、効率的に遺伝子組み換え体を取得することができる。本発明に係る麹菌変異株が備える栄養要求性としては、ウリジン要求性が好ましい。
【００１３】
本発明に係る麹菌変異株は、要求される栄養素を添加させた培地（ウリジン要求性の場合には、ウリジンを添加させた培地）で培養する以外は、ＡＯＫ２７Ｌ株と同様の培地や培養条件により培養することができる。
【００１４】
（栄養要求性変異株）
本発明に係る麹菌変異株の親株である栄養要求性変異株は、ＡＯＫ２７Ｌ株の栄養素の合成等に関する遺伝子の全長又は一部を欠損させることにより、栄養要求性が付与された株である。後記参考例１に示すように、ＡＯＫ２７Ｌ株は、固体培養した際の酵素生産効率が、他のアスペルギルス・オリゼよりも優れている。つまり、本発明に係る麹菌変異株は、元々固体培養による酵素生産効率の高い株に栄養要求性を付与した上で、ｌｉｇＤ遺伝子を欠損させた株である。
【００１５】
例えば、ＡＯＫ２７Ｌ株にウリジン要求性を付与するために、ｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部を欠損させる。その他、ｓＣ遺伝子やｎｉａＤ遺伝子の全長又は一部を欠損させてもよい。ｐｙｒＧ遺伝子等の全長又は一部を欠損する方法は、特に限定されるものではなく、プロトプラスト−ＰＥＧ法、自然変異法等のように微生物の遺伝子組み換えにおいて公知の技術の中から適宜選択して用いることができる。本発明に係る麹菌変異株の親株としては、ウリジン要求性変異株が好ましく、アスペルギルス・オリゼＨ０１株（以下、「ＨＯ１株」と略すことがある。）がより好ましい。
【００１６】
（ｌｉｇＤ遺伝子の欠損方法）
前記ウリジン要求性変異株等の栄養要求性変異株からｌｉｇＤ遺伝子を欠損させた麹菌変異体を製造する方法としては、マーカーリサイクリング法を利用した方法が好ましい。図１に、前記ウリジン要求性変異株に対するｐｙｒＧ遺伝子のリサイクリング法のスキームの模式図を示す。ｌｉｇＤ遺伝子を欠損させるための相同組換えには、ｐｙｒＧ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片（図中、「ｌｉｇＤ欠損用断片」）を用いる。このｌｉｇＤ欠損用断片は、ｐｙｒＧ遺伝子配列の上流側と下流側に、それぞれ、染色体中のｌｉｇＤ遺伝子の上流側と下流側の配列と相同的な配列を付加し、さらにｐｙｒＧ遺伝子配列の下流側に、ｐｙｒＧ遺伝子配列の上流側近傍の領域と相同的な領域を付加したものである。ウリジン要求性変異株に導入されたｌｉｇＤ欠損用断片は、染色体中のｌｉｇＤ遺伝子が存在する領域において相同組換えを起こす結果、ｌｉｇＤ遺伝子に代えてｐｙｒＧ遺伝子が組み込まれる。ウリジン不含培地で生育させることにより、ｐｙｒＧ遺伝子が組み込まれた形質転換体のみを選抜する。この選抜されたクローンを５’−ＦＯＡプレート培地で培養することにより、分子内相同組換えによってｐｙｒＧ遺伝子が切り出された結果、再び５−ＦＯＡ耐性となり生育してきたコロニーを得ることにより、ｌｉｇＤ遺伝子とｐｙｒＧ遺伝子の両方が欠損している麹菌変異株（本発明に係る麹菌変異株）が得られる。
【００１７】
本発明に係る麹菌変異株に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体は、当該糖化酵素を非常に効率よく産生することができる。当該形質転換体の作製時に、当該糖化酵素遺伝子と共に、栄養要求性を付与するためにＡＯＫ２７Ｌ株から欠損させた遺伝子も導入することにより、栄養要求性の有無を指標として当該糖化酵素遺伝子導入株を効率よく取得することができる。
【００１８】
＜形質転換体＞
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る麹菌変異株のうち、ｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部を欠損させたウリジン要求性変異株に、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする。ｐｙｒＧ遺伝子と糖化酵素遺伝子の両方を導入することにより、形質転換体はウリジン不含培地でも生育可能となる。このため、遺伝子導入後の麹菌をウリジン不含培地で培養することにより、形質転換体のみが選抜できる。
【００１９】
本発明に係る形質転換体としては、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子は、染色体外の染色体外遺伝子として保持されていてもよいが、糖化酵素の発現安定性の点から、染色体中に組み込まれているものがより好ましい。
【００２０】
例えば、ｐｙｒＧ遺伝子を発現させるための発現カセットと、糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットとを組み込んだ発現ベクターを、前記麹菌変異株に導入することにより、形質転換体が得られる。なお、ｐｙｒＧ遺伝子を発現させるための発現カセットを組み込んだ発現ベクターと、糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットとを組み込んだ発現ベクターの両方を前記麹菌変異株に導入してもよいが、ウリジン要求性による選抜精度の点から、両遺伝子の発現カセットは１の発現ベクターに乗せて形質転換するほうが好ましい。
【００２１】
ここで、発現カセットとは、構造遺伝子を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、構造遺伝子と宿主細胞内で機能するプロモーターとターミネーターとを含む。発現カセットには、さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。また、ｐｙｒＧ遺伝子を発現させるための発現カセットと、糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットとは、それぞれ別個の発現カセットであってもよく、１の発現カセット内に、ｐｙｒＧ遺伝子と糖化酵素遺伝子の両方を含んでいてもよい。
【００２２】
また、発現カセットを組み込む発現ベクターとしては、アスペルギルス・オリゼをはじめとする麹菌に対する形質転換に使用可能な公知のベクターの中から適宜選択して、必要に応じて適宜改変したものを用いることができる。
【００２３】
発現ベクターを本発明に係る麹菌変異株へ導入する形質転換方法は特に限定されるものではなく、アスペルギルス・オリゼをはじめとする麹菌に対する遺伝子導入を行う際に使用される各種方法により行うことができる。当該形質転換方法としては、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、ＰＥＧ−カルシウム法（Mol.Gen.Genet.,vol.218,p.99〜104（1989））、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法等が挙げられる。形質転換後に、ウリジン不含培地で培養することにより、発現カセットが導入された形質転換体のみを生育させて選抜する。
【００２４】
本発明に係る麹菌変異株は、ｌｉｇＤ遺伝子が欠損しているため、各発現カセットは、相同組み換えを利用して染色体中に組み込む。このため発現カセットは、染色体中の当該発現カセットを導入したい部分の上流側と下流側の塩基配列（それぞれ５００ｂｐ以上）で挟まれた状態で発現ベクターに組み込む。相同組み換えにより、ｐｙｒＧ遺伝子や糖化酵素遺伝子を、染色体中の目的の箇所に効率よく導入することができる。
【００２５】
本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、一般的に植物バイオマスやリグノセルロース等のセルロース系バイオマスの糖化処理に使用される糖化酵素であることが好ましい。当該糖化酵素としては、例えば、グルコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）、グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）等が挙げられる。本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせて導入させてもよい。
【００２６】
本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、糖化力の強い糖化酵素をコードする遺伝子であることが好ましい。例えば、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される１種、又は２種以上を組み合わせて導入させることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、耐熱性の高い糖化酵素であることも好ましい。セルロース系バイオマスに対する糖化処理は、比較的高温で行うことにより、糖化効率をより高められるためである。
【００２８】
＜糖化酵素の生産方法＞
本発明に係る糖化酵素の生産方法は、本発明に係る形質転換体を、草本類バイオマスを用いて固体培養することを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、元々固体培養において酵素生産収率の高いＡＯＫ２７Ｌ株を親株とするため、他のアスペルギルス・オリゼを親株として製造された形質転換体よりも、固体培養により糖化酵素を高収率で生産できる。
【００２９】
当該方法において基質として用いられる固体は、草本類バイオマスが好ましく、稲わら又はコーンストーバがより好ましい。
【００３０】
なお、本発明に係る形質転換体により生産された糖化酵素は、当該形質転換体を直接基質に接触させて糖化反応に用いてもよく、当該形質転換体から粗精製又は精製した糖化酵素として使用してもよい。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
［参考例１］
アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・アワモリの各株（ＲＩＢ４０株、ＲＩＢ１２８株、ＡＯＫ２０株、ＡＯＫ２Ｐ株、ＡＯＫ２７Ｌ株、ＡＯＫ６５株、ＡＯＫ１３９株、ＡＯＫ２１０株、ＡＯＫ２４１株、ＡＯＫ１５９７株、ＡＯＫ１５０５株、ＡＯＫ１５０６株、ＡＯＫ１５０８株、ＡＯＫ１５０９株、及びＡＯＫ１５１０株）（いずれも秋田今野商店より入手。）について、菌体外に分泌した全酵素量に基づいて酵素の生産収率を算出して比較した。ここで、「酵素の生産収率」とは、投入した炭素源当たりの生産酵素量であり、下記式により算出した。
式：［酵素の生産収率］＝［分泌した全酵素量］÷［投入したデキストリン量］
【００３３】
具体的には、まず、稲藁を目開き３ｍｍのメッシュを通過する大きさに粉砕し、乾燥質量に対して２５質量％の濃度のアンモニア水を１：１の質量比となるように混合した。得られた混合物を、常温（約２０℃）で１２０時間保持した後、減圧下で６０〜８０℃の温度に加熱することによりアンモニアを気化させて分離することにより、アンモニア処理イナワラを作製した。
これとは別に、各麹菌株を、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）培地（３質量／容量％  デキストリン、０．１質量／容量％リン酸２水素カリウム、０．２質量／容量％  塩化カリウム、０．０５質量／容量％  硫酸マグネシウム、０．００１質量／容量％  硫酸鉄、０．３質量／容量％  硝酸ナトリウム）培地にて１週間培養し、胞子懸濁液を作製した。
【００３４】
アンモニア処理イナワラ（含水率：約１０％）１ｇに対してデキストリン（和光純薬工業社製）の１０％溶液を１ｍＬ加え、さらに２Ｍ  塩酸（和光純薬工業社製）を０．０８５ｍＬ加えてｐＨ６に調整することにより、ベースとなる基質サンプルを作製した。ｐＨは、基質サンプル１ｇに対して５ｍＬの超純水を加えて懸濁した溶液のｐＨを測定した。
次に、基質サンプル５ｇを５０ｍＬ容プラスチックチューブ（ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー社製）に測り取り、１２１℃、１５分間の条件でオートクレーブ処理した。オートクレーブ後の基質サンプルに、１×１０６個の胞子を植菌し、撹拌した後に滅菌シャーレ（旭硝子社製）に移し、３０℃、９５％ＲＨで４０時間培養した。また同時に、胞子を植菌しないサンプル（ネガティブコントロール）も同様に実施した。
培養後の基質全量を５０ｍＬ容プラスチックチューブに回収し、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）の０．５％溶液１５ｍＬを加えて撹拌し、４℃にて２時間静置した。静置後、４℃、１０，０００×ｇで１０分遠心し、上清を滅菌フィルター（メルク社製）により処理することにより、酵素液を取得した。
取得した酵素液１０μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られたバンドの強度より分泌された全酵素量を算出した。ネガティブコントロールをＨＰＬＣにより分析し、投入したデキストリン量を算出した。得られた全分泌酵素量と投入したデキストリン量から、前記式に基づいて酵素の生産収率を算出した。
【００３５】
各株の酵素の生産収率を図１に示す。この結果、ＡＯＫ２７Ｌ株は、スクリーニングに用いたアスペルギルス・オリゼの中で最も酵素生産能力が高く、一般的によく使用されている麹菌アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株と比べて約２倍も酵素生産能力が高かった。
【００３６】
［実施例１］
（ＨＯ１株の作製）
ＡＯＫ２７Ｌ株に対し、ｐｙｒＧ遺伝子をプロトプラスト−ＰＥＧ法による遺伝子組み換えにより欠損させ、ウリジン要求性を持つ固体培養で酵素生産性の高い麹菌アスペルギルス・オリゼＨＯ１株を得た。
【００３７】
具体的には、まず、ＡＯＫ２７Ｌ株（株式会社秋田今野商店より入手）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いてｐｙｒＧ遺伝子の上流配列（配列番号３）を、プライマー３（配列番号４）及びプライマー４（配列番号５）を用いてｐｙｒＧ遺伝子の下流配列（配列番号６）を、それぞれＰＣＲにて増幅した後精製することにより、ｐｙｒＧ遺伝子の上流配列遺伝子断片と下流配列遺伝子断片を取得した。ＰＣＲは、市販のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ、東洋紡績社製）を用い、精製は市販の精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
これとは別に、プラスミドｐＲＩ９１０（タカラバイオ社製）を制限酵素Ｓｍａ  Ｉ（タカラバイオ社製）により３０℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。
こうして得られた３つの遺伝子断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ社製）を用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）に形質転換し、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｙｒＧを取得した。
得られたプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｙｒＧを鋳型として、プライマー１及びプライマー４とＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２、東洋紡績社製）とを用いてＰＣＲ増幅し、前記精製キットを用いて精製し、麹菌形質転換用の遺伝子断片（ＡｏΔｐｙｒＧ断片）を取得した。
【００３８】
ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、ＡｏΔｐｙｒＧ断片を用い、ＡＯＫ２７Ｌ株を形質転換した。ＣＤ培地に、終濃度１ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸一水和物（和光純薬工業社製）と終濃度２０ｍＭ  ウリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加えたプレート培地を作製し、形質転換処理物から当該プレート培地で生育できる株を選択し、ｐｙｒＧ遺伝子欠損株であるＨＯ１株を得た。
【００３９】
なお、ＨＯ１株は、新たに作製された新株であり、固体培養に適しており、かつ効率的に遺伝子組換え可能であるという優れた特性を有する。そこで、出願人は、ＨＯ１株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に新規微生物として寄託した（寄託日：平成２５年１１月１２日）。受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７４９である。
【００４０】
（Ｈ０２株の作製）
マーカーリサイクリング法を利用して、ＨＯ１株からｌｉｇＤ遺伝子を欠損させたウリジン要求性を持つ固体培養で酵素生産性の高い麹菌アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（以下、「ＨＯ２株」と略すことがある。）を得た。
【００４１】
具体的には、ＨＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー５（配列番号７）及びプライマー６（配列番号８）を用いてｌｉｇＤ遺伝子の上流配列（配列番号９）を、プライマー７（配列番号１０）及びプライマー８（配列番号１１）を用いてｌｉｇＤ遺伝子の下流配列（配列番号１２）を、プライマー９（配列番号１３）及びプライマー１０（配列番号１４）を用いてマーカーリサイクリング用配列（配列番号１５）を、プライマー１１（配列番号１６）及びプライマー１２（配列番号１７）を用いてｐｙｒＧ遺伝子（配列番号１８）を、それぞれＰＣＲにて増幅した後精製することにより、各遺伝子断片を取得した。ＰＣＲは、市販のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ、東洋紡績社製）を用い、精製は市販の精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
これとは別に、プラスミドｐＲＩ９１０（タカラバイオ社製）を制限酵素Ｓｍａ Ｉ（タカラバイオ社製）により３０℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。
【００４２】
次いで、ｌｉｇＤ遺伝子の上流配列の遺伝子断片とｌｉｇＤ遺伝子の下流配列の遺伝子断片とプラスミドｐＲＩ９１０の遺伝子断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ社製）を用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）に形質転換し、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤを取得した。
得られたプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤを制限酵素Ｓｍａ Ｉ（タカラバイオ社製）により３０℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。
得られたプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤの遺伝子断片とｐｙｒＧ遺伝子断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ社製）を用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）に形質転換し、ｌｉｇＤ遺伝子の上流配列と下流配列の間にｐｙｒＧ遺伝子を導入したプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤ::ｐｙｒＧを取得した。
【００４３】
次に、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤ::ｐｙｒＧを制限酵素Ｓｍａ Ｉ（タカラバイオ社製）により３０℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。
得られたプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤ::ｐｙｒＧの遺伝子断片とマーカーリサイクリング用配列の遺伝子断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ社製）を用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）に形質転換し、ｐｙｒＧ遺伝子とｌｉｇＤ遺伝子の下流配列との間にマーカーリサイクリング用配列を導入したプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤ::ｐｙｒＧＲを取得した。
【００４４】
得られたプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｌｉｇＤ::ｐｙｒＧＲを鋳型として、プライマー５及びプライマー８とＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２、東洋紡績社製）とを用いてＰＣＲ増幅し、前記精製キットを用いて精製し、麹菌形質転換用の遺伝子断片（ＡｏΔｌｉｇＤ::ｐｙｒＧＲ断片、図１の「ｌｉｇＤ欠損用断片」に相当する。）を取得した。
【００４５】
ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、ＡｏΔｌｉｇＤ::ｐｙｒＧＲ断片を用い、ＨＯ１株を形質転換した。形質転換処理物からＣＤプレート培地で生育できる株を選択し、ｌｉｇＤ遺伝子欠損株を得た。
【００４６】
得られたｌｉｇＤ遺伝子欠損株の胞子懸濁液を、ＣＤ培地に終濃度１ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸一水和物と終濃度２０ｍＭ  ウリジンを加えたプレート培地（ウリジン含有ＣＤプレート培地）に、１×１０６個／プレートになるように植菌し、生育できる株を選択することにより、ｌｉｇＤ遺伝子とｐｙｒＧ遺伝子の両方が欠損した２遺伝子欠損株ＨＯ２株を得た。図３〜５に、１２０時間培養後のウリジン含有ＣＤプレート培地の写真を示す。ウリジン含有ＣＤプレート培地上で培養したところ、このＨＯ２株（図３）は、親株であるＨＯ１株（図４）及びＡＯＫ２７Ｌ株（図５）と同様に良好に増殖した。
【００４７】
なお、ＨＯ２株は、新たに作製された新株であり、固体培養に適しており、かつ染色体中の目的の箇所に効率的に遺伝子組換え可能であるという優れた特性を有する。そこで、出願人は、ＨＯ２株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に新規微生物として寄託した（寄託日：平成２５年１１月１２日）。受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０である。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明に係る麹菌変異株は、固体培養に適しており、かつ効率的に染色体中の目的の箇所に外来の遺伝子を導入することが可能な、栄養要求性株である。また、当該麹菌変異株に糖化酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体は、草本類バイオマスを用いた固体培養において当該糖化酵素の生産効率に優れている。このため、本発明は、例えば、セルロース系バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【受託番号】
【００４９】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７４９
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７５０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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