(57)【要約】【課題】  皮膚のバリア機能を改善する物質およびこのような作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】  ヒト３次元培養表皮モデルに被験物を接触させて、培養表皮モデル中のガレクチン−７を測定し、これを抑制する物質を探索する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させ、前記モデルの細胞中のガレクチン−７の減少量を指標として、皮膚バリア機能を改善または経表皮水分蒸散量を抑制する剤をスクリーニングする方法。
【請求項２】
ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させる際にあらかじめガレクチン−７を増加させる成分を添加する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガレクチン−７を増加させる成分がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法でスクリーニングされたガレクチン−７産生抑制剤。
【請求項５】
ガレクチン−７産生を抑制する剤を有効成分とする皮膚バリア機能改善剤。
【請求項６】
ガレクチン−７産生を抑制する剤を有効成分とする経表皮水分蒸散量抑制剤。
【請求項７】
ガレクチン−７産生抑制剤がセイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン抽出物のいずれかである請求項５または請求項６に記載の剤。
【請求項８】
セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン抽出物のいずれかを含有する肌荒れ改善剤。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚バリア機能改善または経表皮水分蒸散量を抑制する剤のスクリーニング方法に関する。さらにこの方法により得られた剤を有効成分とするガレクチン産生抑制剤、皮膚バリア機能改善剤ならびに経表皮水分蒸散量抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚には、熱や痛みなどの外部刺激を生体内に伝える働きに加え、水分の蒸散を防いだり、外部刺激や物理的刺激から体内を保護するバリア機能が存在する。この様な皮膚機能は、温度、湿度、過度の摩擦、生活リズムの変調、ストレス、化学物質との接触、洗浄などにより低下することが知られている。また皮膚の乾燥が進むと、刺激に対し過敏になり、刺激を受け易くなる等の皮膚症状が生じる。さらにこの状態が進めば、体外からの細菌や有害物質の侵入による直接的な障害、アレルギー反応などが生じ、アトピー性皮膚炎、皮脂欠乏性湿疹等の皮膚障害の発症に繋がる。  
さらにまた、皮膚は、見た目の美しさに直接影響するため、多くの女性にとって大きな関心事である。肌状態を健康に保つことを目的とし、皮膚バリア機能改善剤（特許文献１特開２０１３−６８３６号公報）、保湿作用を改善するためのタイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤（特許文献２：特開２０１２−２０１６６５号公報）等を含有する皮膚外用剤などの様々な試みがなされている。
しかし、これらの提案は、満足のいく効果を有するとは言い難い。また、皮膚バリア機能には種々の物質や生体内のカスケードが関与することが知られており、複数の物質を使用することがより効果的であると一般的に言われている。このような状況から種々の物質の開発がこれまで求められてきた。
【０００３】
近年、皮膚バリア機能を担う表皮内成分の生合成を活性化させる特定の物質が、肌荒れに対して改善効果を有するという報告がなされ、注目されている。また、バリア機能に関する研究が精力的に進められ、ＮＭＦや細胞間脂質だけでなく、表皮顆粒層に存在するイトジャンクションと呼ばれる構造が皮膚のバリア機能に重要であることが明らかになった。
【０００４】
タイトジャンクションは、隣接する細胞同士を密着させるだけでなく、細胞と細胞の隙間をシールすることで物質の透過を制御する結合装置である。したがって、クローディンやオクルディンなどのタイトジャンクション構成タンパク質が何らかの原因で減少した場合、タイトジャンクションの構造的な破壊が起こり、物質の透過バリアとして機能しなくなることによって、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状が引き起こされる。
【０００５】
このタイトジャンクションの状態は経上皮電気抵抗値（Transepithelial  electrical resistance：ＴＥＲ）を測定することで評価できることが知られている。
【０００６】
ガレクチンとは、ガラクトース（β−ガラクトシド構造）を認識し結合あるいは糖鎖同士を架橋する蛋白質の総称であり、発生、分化、形態形成、腫瘍転移、アポトーシス（細胞死）といった生命現象に関与することが明らかになっている。現在、哺乳類のガレクチンとしてガレクチン−１からガレクチン−１５まで１５種類が知られている。ヒトの場合、ガレクチン−５、ガレクチン−６、ガレクチン−１４、ガレクチン−１５に相当するものがなく、現在のところ１０種類であるが、今後さらに増える可能性もある。ガレクチンは、その形から大きく３つのサブグループに分けられている。第１のグループは、糖鎖と結合する部分（糖鎖結合ドメイン２)：carbohydrate recognition domain, CRD）を１つ持っているプロトタイプ（proto-type）、２番目は１個の糖鎖結合ドメインに糖鎖とは結合しない別のドメインが繋がった構造を持つキメラタイプ（chimera-type）、３番目は２つの糖鎖結合ドメインから成るタンデムリピートタイプ（tandem-repeat-type）である。プロトタイプとキメラタイプは糖鎖結合ドメインを１つしか持っていないが、２つの分子が結合すること（ダイマー形成）によって、実質的にタンデムリピートタイプと同じように２つの糖鎖と結合する。
【０００７】
ガレクチン−７は、哺乳動物重層上皮で検出され、ケラチノサイトでは基底層から角質層まで検出される。重層上皮分布は表皮、食道上皮、扁平上皮化した気道上皮、子宮外頸部上皮、下咽頭から喉頭上皮、肛門上皮などが属する。ケラチノサイトにおけるガレクチン-７の発現は、Ca2+濃度に影響されないことから角質化の程度により制御されないことがわかっている（非特許文献１：Differetiation、1998、63、159-168)。
また、特許文献３（特開2006-182744 号公報）にはガレクチン−７発現促進物質のスクリーニング方法及びガレクチン−７成分配合の組成物を塗ることによる保湿作用や皮膚症状改善作用が開示されている。さらに特許文献４（特開平９−２１６８３３号公報）にはガレクチンの１種又は２種以上を含む外用剤が皮膚のしわ、弾力低下といった老化症状の予防、改善および創傷治癒効果を有することが開示されている。しかしガレクチン−７の、細胞内の量と皮膚バリア機能との関係や、ガレクチン−７と経表皮水分蒸散量の関係については何も明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−６８３６号公報
【特許文献２】特開２０１２−２０１６６５号公報
【特許文献３】特開２００６−１８２７４４号公報
【特許文献４】特開平９−２１６８３３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Differetiation、1998、63、159-168
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、皮膚バリア機能を改善または経表皮水分蒸散量を抑制する剤及びガレクチン−７の産生抑制剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１１】
本発明は以下の構成である。
（１）ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させ、前記モデルの細胞中のガレクチン−７の減少量を指標として、皮膚バリア機能を改善または経表皮水分蒸散量を抑制する剤をスクリーニングする方法。
（２）ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させる際にあらかじめガレクチン−７を増加させる成分を添加する（１）に記載の方法。
（３）ガレクチン−７を増加させる成分がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である（２）に記載の方法。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の方法でスクリーニングされたガレクチン−７産生抑制剤
（５）ガレクチン−７産生を抑制する剤を有効成分とする皮膚バリア機能改善剤。
（６）ガレクチン−７産生を抑制する剤を有効成分とする経表皮水分蒸散量抑制剤。
（７）ガレクチン−７産生抑制剤がセイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン果皮抽出物のいずれかである（５）または（６）に記載の剤。
（８）セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン果皮抽出物のいずれかを含有する肌荒れ改善剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、各種の成分や物質から皮膚バリア機能を改善または経表皮水分蒸散量を抑制する剤をスクリーニングする方法を提供することができる。
また本発明により、肌荒れ改善とともに発現量が低減するガレクチン−７の産生抑制剤をスクリーニングすることができた。また、ガレクチン−７の産生抑制剤、肌荒れ改善剤、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）低下剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】セイヨウシロヤナギとカニナバラのエキスがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン−７の産生を抑制することを示すグラフ。
【図２】ガラクトースがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン−７の産生を抑制することを示すグラフ。
【図３】ラクトフェリンがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン−７の産生を抑制しないことを示すグラフ。
【図４】セラミド２とセラミド５の混合物がヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン−７の産生を抑制することを示すグラフ。
【図５】セラミド２とセラミド５の混合物が、ＳＤＳによって誘発される経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の上昇を抑制することを示すグラフ。
【図６】セイヨウシロヤナギエキスが、培養ヒト表皮角化細胞の経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ）を上昇させることを示すグラフ。
【図７】マンゴスチン果皮抽出物がヒト３次元培養表皮モデルの液体培地中のガレクチン−７の濃度を抑制することを示す測定結果のグラフ。
【図８】マンゴスチン果皮抽出物がヒト３次元培養表皮モデルの細胞中のガレクチン−７の濃度を抑制することを示す測定結果のグラフ。
【図９】マンゴスチン果皮抽出物がヒト３次元培養表皮モデル経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ)を抑制することを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
皮膚のバリア性は、皮膚内のガレクチン量が低下しているか否かを指標として評価することができる。ガレクチン−７産生抑制剤は皮膚バリア機能改善剤、ＴＥＷＬ抑制剤として使用できる。
本発明のスクリーニング方法において用いるヒト３次元培養表皮モデルとは、「培養下で維持される表皮組織」であって、ヒトの皮膚から採取した皮膚組織か、胚性幹細胞又は成体幹細胞を試験管内で分化させて得られた皮膚組織を、重層構造を維持しながら試験管内で培養した組織をいう。特にヒト由来については、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）、あるいはエピ・モデル２４のような商業的に入手可能なヒト３次元培養表皮モデル製品を用いることができる。
ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させる場合には、ヒト３次元培養表皮モデルが搭載された培養カップに、ＰＢＳ等の緩衝液等に任意の濃度で溶解した被験物質を添加した後インキュベートして、ガレクチン−７を測定しその作用を評価する。
なおヒト３次元培養表皮モデルを用いるスクリーニングにあたって、あらかじめ単層培養細胞を用いた細胞内外のガレクチンの減少を指標として予備スクリーニングを行うことで、スクリーニングの精度を向上させ、効率化することができる。
【００１５】
なおヒト３次元培養表皮モデルの試験においては、ヒト細胞のガレクチン−７を増加させる成分をあらかじめ添加しておくと、目的とする被験物質のガレクチン−７の産生抑制効果を検出しやすくなる。このような物質として、界面活性剤を例示することができる。とくに、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記載する）が好ましい。
ＳＤＳなどのガレクチン−７を増加させる成分をヒト３次元培養表皮モデルに添加する場合、ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質とＳＤＳなどのガレクチン−７を増加させる成分を同時に添加して培養し、細胞中のガレクチン−７の量を測定する。
【００１６】
ヒト３次元培養表皮モデル細胞中のガレクチン−７の量は、従来から知られている方法で測定することができる。例えば、ガレクチン−７に対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング等の方法を用いることができる。このような測定手段はすでに市販されている。代表的なガレクチン−７のエンザイムイムノアッセイキットとしてHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）、アブカム社製のGalectin 7 Human ELISA Kit（Abcam社）を例示することができる。ヒト３次元培養表皮モデル細胞からガレクチン−７を抽出する場合は、それ自体既知の生化学的方法、たとえば凍結融解法、超音波破砕法、ホモジュネート法等を介して可溶性画分を調製する。抽出後、速やかにガレクチン−７を測定する。
【００１７】
本発明のスクリーニングによって陽性（＋）と判定できる物質は、直接または製剤化して皮膚に直接塗布または飲用、注射あるいは噴霧することで皮膚のバリア機能を改善またはＴＥＷＬを抑制する剤、ガレクチン−７の抑制剤として使用することができる。
このような物質として（本発明のスクリーニング方法で陽性と判定された物質として）セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン果皮抽出物を例示できる。
セイヨウシロヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ａｌｂａ）はホワイトウィロウとも呼ばれるヤナギ属の落葉高木で、深く亀裂の入った灰茶色の樹皮を持つ。セイヨウシロヤナギの樹皮から抽出物を得ることができるが、特に葉や枝からも抽出物を得ることができる。抽出溶媒は、水、有機溶媒を使用することが可能であるが、水を主成分とする抽出溶媒を用いることが好ましい。セイヨウシロヤナギエキスは市販されており、これを皮膚バリア機能改善またはＴＥＷＬ抑制の目的に使用することができる。
【００１８】
カニナバラエキスはカニナバラ（Ｒｏｓａ  ｃａｎｉｎａ）から抽出されたエキスである。カニナバラは西洋ノバラ、Ｄｏｇ  ｒｏｓｅとも呼ばれるバラ属の落葉低木で茎は弓
なりに立ち、曲がったとげがある。カニナバラの全草から抽出物を得ることができるが、特に果実（ローズヒップ）から抽出物を得ることが好ましい。抽出溶媒は、水、有機溶媒を使用することが可能であるが、水またはアルコールを主成分とする抽出溶媒を用いることが好ましい。カニナバラエキスは市販されており、これを皮膚バリア機能改善またはＴＥＷＬ抑制の目的に使用することができる。
【００１９】
ガラクトースはアルドヘキソースの一種であり、乳糖の構成糖である。Ｄ，Ｌ形の両方が存在する。一般にＤ−ガラクトースが単にガラクトースと呼ばれる。Ｄ−ガラクトースはラクトースを加水分解、またはラクターゼによって酵素分解することで得ることができる。天然に遊離で存在することはまれである。Ｌ−ガラクトースは寒天、アマニ等に含まれる多糖類中に見出されている。
本発明にあっては、Ｄ体、Ｌ体のいずれでも皮膚バリア機能改善剤、ＴＥＷＬ抑制剤として使用可能であるがＤ体が特に好ましい。
【００２０】
セラミド２やセラミド５は、細胞膜中に存在するスフィンゴミエリンを構成するセラミドの一種であり、ヒト表皮中に存在している成分である。近年研究が進みセラミドとしては７種に分類されている。セラミド２とセラミド５はそれぞれ有機合成が可能で、また化粧品原料としてセラミド２又はセラミド５を高濃度に含む組成物が市販されている。本発明においては、これを皮膚バリア機能改善またはＴＥＷＬ抑制の目的に使用することができる。またセラミド２とセラミド５の混合物も市販されており、両者を含有する組成物が皮膚バリア機能改善またはＴＥＷＬ抑制の目的に使用することが好ましい。
【００２１】
マンゴスチン果皮抽出物はマンゴスチン（Garcinia mangostana）の果実の果皮から抽出される。マンゴスチンは熱帯果実で、果実の外観は柿に似ていて、径５〜８ｃｍほどで、厚さ約０．７ｃｍの果皮があり、４〜８個の果肉がミカンの袋状に並んでいる。原産地はマレー半島付近とされ、熱帯地域で栽培されている。果実の利用方法としては、成熟果の生食のほか、可食部分を砂糖煮した加工品がある。また、果皮部分はタンニンと黄色色素マンゴスチンを含んでおり、タンニンは皮なめし用に、黄色色素は更紗の染料として重用されているが、多くの果皮は果肉を利用した後、破棄されている。果皮の成分であるタンニンおよび黄色色素マンゴスチンには抗菌作用があり、一般生菌、カビ、酵母、乳酸菌等に対して抗菌力を有することが知られている。本発明は廃棄される果皮を原料として利用できる。抽出溶媒は、水、有機溶媒を使用することが可能であるが、水またはアルコールを主成分とする抽出溶媒を用いることが好ましい。マンゴスチン果皮抽出物は市販されており、これを本発明の皮膚バリア機能改善またはＴＥＷＬ抑制の目的に使用することができる。
【００２２】
セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン果皮抽出物含む組成物や本発明の方法でスクリーニングされた物質を、ガレクチン−７抑制剤、皮膚バリア機能改善剤、ＴＥＷＬ抑制剤として製剤化するにあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピ
セルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料などが好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン界面活性剤類、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。
【００２３】
本発明の皮膚バリア機能改善剤、ＴＥＷＬ抑制剤、ガレクチン−７抑制剤を含有する組成物として医薬品、化粧品、食品、飲料などを例示できる。その投与経路も、経口投与、経皮投与のいずれもが可能である。なかでも経皮投与が特に好ましく、化粧品や皮膚外用医薬などの経皮組成物の形態を採用することが好ましい。経口投与などにより、有効成分を皮膚に到達させることもできる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例、試験例を示し、本発明を詳細に説明する。
１．皮膚バリア機能を改善またはＴＥＷＬを抑制する剤のスクリーニング
（１）表皮モデル
ヒト３次元培養表皮モデルを用いた。
ヒト３次元培養表皮モデルとして、LabCyte EPI-MODEL24ウェルタイプ（エピ・モデル24、株式会社ジャパンティッシュエンジニアリング製）を用いて、ヒト３次元培養表皮モデルの細胞中のガレクチン−７の抑制能を評価した。
ヒト３次元培養表皮モデルについて、ゲル培養から液体培地へ培地交換し、一晩37℃5%CO2インキュベータにて前培養した。なお３次元培養表皮モデルはヒト表皮の状態を生理的、機能的に再現したインビトロモデルとして利用されている。
【００２５】
（２）試験サンプル
セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、ラクトフェリンの4成分を選択した。
【００２６】
（３）ガレクチン産生抑制試験  １（セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス）
ヒト３次元培養表皮モデルが搭載された培養カップに被験物質を表１に示す濃度で添加し、24時間37℃5%CO2インキュベータ中で培養した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
培養終了後、３次元培養表皮モデルをPBS(−)で洗浄した。ついで、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、Wako）を0.03%の濃度で添加し、4時間後PBS(−)で洗浄した。
ヒト３次元培養表皮モデルのヒト表皮組織をサンプルチューブ（TM-626  2.0ml容）に移し、ZB-50（ジルコニア5.0φ）1個とcell lysis buffer350μL加えて、ビーズ式細胞破砕装置を用いて2,800rpm120秒間ホモジナイズして、ホモジネート液を得た。このホモジネート溶液を、4,400Ｇで遠心分離して混入するポリカーボネート膜や不溶性タンパク質を沈殿物させて分離した。
培養液をDeep plateに移し、ガレクチン−７濃度およびタンパク量を測定した。
なお、ガレクチン−７の測定は、Human Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、３回測定し、結果を平均値±標準偏差で表した（図１）。
セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキスはいずれもヒト３次元表皮モデルのガレクチン−７産生を抑制した。
【００２９】
（４）ガレクチン産生抑制試験  ２（ガラクトース）
上記と同様にしてガラクトースをヒト３次元培養表皮モデルに添加しガレクチン−７を測定した。試験に用いたガラクトース試料は培養液中で表２に示す濃度になるように調整し、添加した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
ガレクチン−７の測定は、同様にHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、３回測定し、結果を平均値±標準偏差で表した（図２）。
ガラクトースはヒト３次元培養表皮モデルのガレクチン−７産生を抑制した。
【００３２】
（５）ガレクチン産生抑制試験  ３（ラクトフェリン）
市販の化粧品原料であるラクトフェリンＳ（一丸ファルコス株式会社製）をＰＢＳで20倍または100倍に希釈して  上記と同様にヒト３次元表皮モデルに添加しガレクチン−７を測定した。
なお20倍希釈物をラクトフェリン１、100倍希釈物をラクトフェリン２として結果に表示している。
【００３３】
ガレクチン−７の測定は、前記（３）の試験と同様にHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、３回測定し、結果を平均値±標準偏差で表した（図３）。
図３に示すように、ラクトフェリンはヒト３次元表皮モデルのガレクチン−７産生を抑制しなかった。
【００３４】
（６）ガレクチン産生抑制試験  ４（セラミド２とセラミド５の混合物）
市販の化粧品原料であるセラミド２およびセラミド５を等量混合し、０．５％水添レシチン溶液で４０００倍に希釈してセラミド２とセラミド５の混合溶液を調整した。この混合溶液にはセラミド２とセラミド５がそれぞれ２５０μｇ／ｍｌ含有されている。この混合溶液を、上記と同様にヒト３次元表皮モデルにセラミド２とセラミド５がそれぞれ12.5μｇ/ｍｌになるように添加した。またSDS負荷後のヒト３次元表皮モデルに同様に添加し、培養した。培養終了後にヒト３次元表皮モデル中のガレクチン−７量を測定した。
ガレクチン−７の測定は、同様にHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、２回測定し、結果を平均値で表した（図４）。
【００３５】
セラミド２とセラミド５の混合物は図４に示す通り、ＳＤＳによって誘導されるガレクチン−７の産生を顕著に抑制した。 
【００３６】
２．皮膚バリア機能の評価
（１）ＴＥＷＬの抑制試験  １
ヒト３次元培養表皮モデルは、表皮と同様の構造と機能を有している。前記のガレクチン−７スクリーニングに用いたヒト３次元培養表皮モデルをホモジナイズ前に培養カップ上のＴＥＷＬをフランツセル型アダプター付属のポータブル水分蒸散計（VapoMeter、Delfin製）で測定した。測定結果を対照（試料無添加）に対する蒸散率（相対％）を求めで表３に示す。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
ヒト３次元培養表皮モデルのガレクチン−７産生を抑制する成分はいずれも、ＴＥＷＬを顕著に抑制した。しかしラクトフェリンは逆にＴＥＷＬをわずかながら上昇させた。したがってガレクチン−７は皮膚のＴＥＷＬの抑制の指標として利用可能であることが分かる。
【００３９】
（２）ＴＥＷＬの抑制試験  ２
試験１と同様にして、セラミド２とセラミド５の混合物のＴＥＷＬ抑制試験を実施した。
測定結果を図５に示す。セラミド２とセラミド５の混合物は、ＳＤＳによって誘発されるＴＥＷＬの増加を顕著に抑制した。
【００４０】
（３）セイヨウシロヤナギエキスを用いたTransepithelial  electrical  resistance（経上皮電気抵抗値：ＴＥＲ）の測定試験
上記スクリーニングで選択した物質が直接的に皮膚バリア機能の改善することを確認するため、セイヨウシロヤナギエキスを用いてタイトジャンクションの指標であるＴＥＲ測定試験を行った。
【００４１】
方法・結果
正常ヒト角化細胞（NHEK(Neo)細胞：タカラバイオ社より購入）を1 × 105 cells / 0.5ｍｌ /wellになるように直径 12 mmの１２ウェルプレート（孔径0.4μmポリエステル製メンブラン処理：商品名Transwell(Corning incorporated)）に播種し、各Well の細胞が120% コンフルエントになるまで培養した。次いで試料を添加し、Millicell ERS ohmmeter (Millipore, Bedford, MA, USA) でTER値を測定した。各ウェルを3回ずつ測定し、平均値を算出した。
代表的な試料としてセイヨウシロヤナギエキス（ダーマヴェール）を１．８ｍＭ塩化カルシウム水溶液0.00125％濃度になるように調整した溶液を用いた。
ＴＥＲは18時間、24時間、36時間40時間、44時間経過後に測定した。測定結果を図６に示す。
【００４２】
セイヨウシロヤナギエキスは正常ヒト角化細胞のＴＥＲ値を上昇させることから細胞間のタイトジャンクションを強化することが明らかとなった。
【００４３】
３．マンゴスチン果皮抽出物を用いたガレクチン−７抑制作用の確認試験及びＴＥＷＬ試験
マンゴスチン果皮抽出物について同様にガレクチン−７抑制作用及び皮膚バリア機能に対する効果を試験した。
（１）SDS惹起ガレクチン−７抑制試験(３次元培養表皮モデル)
培養カップに入った３次元培養表皮モデル  LabCyte EPI-MODEL24（株式会社ジャパンティッシュエンジニアリング）を、液体培地に浸して、一晩37℃5%CO2インキュベータにて馴化培養した。その後、培養カップの表皮モデルにマンゴスチン果皮熱水抽出物（日本新薬株式会社製  固形分濃度10質量％）を固形分濃度として0.05％含有するPBS(-)溶液（ControlはPBS(-)のみ）を50μl添加し、24時間37℃5%CO2インキュベータにて培養した。  
PBS(−)で洗浄後、バリア機能を低下する目的で界面活性剤であるSDS（ドデシル硫酸ナトリウム、Wako）を0.03%の濃度にPBS(-)で希釈した溶液50μlを培養カップの表皮モデルに添加し、4時間処理した。
PBS(−)で洗浄後、培養カップの表皮モデル上のＴＥＷＬをフランツセル型アダプターを付属したポータブル水分蒸散計VapoMeter、Delfin製）で同一検体ごとに2回測定し、平均値をTEWL値とした。
培養カップを浸していた液体培地を回収し、適宜希釈してガレクチン−７のELISA測定を実施した。また、ヒト３次元培養表皮モデルの組織をサンプルチューブ（TM-626  2.0ml容）に移し、ZB-50（ジルコニア5.0φ）1個とcell lysis buffer350μLを加えて、ビーズ式細胞破砕装置に供して2,800rpm120secの条件でホモジネート、遠沈してポリカーボネート膜や不溶性タンパクを沈殿物として分離し、上澄みをDeep plateに移し、ガレクチン−７のELISA測定（Gal-7 Assay Kit   Human Galectin-7   DuoSet Economy Pack   R&D Systems Inc.）とTotal protein assayを実施した。なお、各系列３カップずつを使用した。
【００４４】
（２）結果
図７にヒト３次元培養表皮モデルの液体培地中のガレクチン−７の濃度の測定結果を示す。図８にヒト３次元培養表皮モデルの細胞中のガレクチン−７の濃度の測定結果を示す。図７、図８中の「マンゴスチン果皮0.05」は、マンゴスチン果皮熱水抽出物を固形分濃度として0.05％含有するPBS(-)溶液の50μl添加を行った試験系を示す。図７、図８中の「SDS0.03」は、SDSを0.03%の濃度にPBS(-)で希釈した溶液50μlの添加を行った試験系を示す。
図９にＴＥＷＬを示す。図９中の「マンゴスチン果皮0.05」は、マンゴスチン果皮熱水抽出物を固形分濃度として0.05％含有するPBS(-)溶液の50μl添加を行った試験系を示す。図９中の「SDS（＋）」は、SDSを0.03%の濃度にPBS(-)で希釈した溶液の50μl添加を行った試験系を示す。
マンゴスチン果皮熱水抽出物は液体培地、ヒト３次元培養表皮モデルの細胞のいずれにおいても、ＳＤＳ負荷条件において増加したガレクチン−７を抑制した。また、ＴＥＷＬを抑制した。
【００４５】
以上の試験結果から、ヒト３次元培養表皮モデルを用いてガレクチン−７によりスクリーニングされた物質または組成物は、タイトジャンクションを強化して皮膚バリア機能を改善し、ＴＥＷＬを減少させることがわかった。またヒト３次元培養表皮モデルのガレクチン−７減少を指標とするスクリーニング方法は、皮膚バリア機能を改善する物質の探索に有用であることがわかった。
また本発明に係るスクリーニング方法によって選択される物質は、ＳＤＳによる刺激に反応していることから、化学物質や界面活性剤が原因で誘発される肌荒れを改善する。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年6月30日(2014.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
（６）ガレクチン産生抑制試験  ４（セラミド２とセラミド５の混合物）
市販の化粧品原料であるセラミド２およびセラミド５を等量混合し、０．５％水添レシチン溶液で４０００倍に希釈してセラミド２とセラミド５の混合溶液を調製した。この混合溶液にはセラミド２とセラミド５がそれぞれ２５０μｇ／ｍｌ含有されている。この混合溶液を、上記と同様にヒト３次元表皮モデルにセラミド２とセラミド５がそれぞれ12.5μｇ/ｍｌになるように添加した。またSDS負荷後のヒト３次元表皮モデルに同様に添加し、培養した。培養終了後にヒト３次元表皮モデル中のガレクチン−７量を測定した。
ガレクチン−７の測定は、同様にHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、２回測定し、結果を平均値で表した（図４）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
２．皮膚バリア機能の評価
（１）ＴＥＷＬの抑制試験  １
ヒト３次元培養表皮モデルは、表皮と同様の構造と機能を有している。前記のガレクチン−７スクリーニングに用いたヒト３次元培養表皮モデルをホモジナイズ前に培養カップ上のＴＥＷＬをフランツセル型アダプター付属のポータブル水分蒸散計（VapoMeter、Delfin製）で測定した。測定結果を対照（試料無添加）に対する蒸散率（相対％）を求めて表３に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
方法・結果
正常ヒト角化細胞（NHEK(Neo)細胞：タカラバイオ社より購入）を1 × 105 cells / 0.5ｍｌ /wellになるように直径 12 mmの１２ウェルプレート（孔径0.4μmポリエステル製メンブラン処理：商品名Transwell(Corningincorporated)）に播種し、各Well の細胞が120% コンフルエントになるまで培養した。次いで試料を添加し、Millicell ERS ohmmete
r (Millipore, Bedford, MA, USA) でTER値を測定した。各ウェルを3回ずつ測定し、平均値を算出した。
代表的な試料としてセイヨウシロヤナギエキス（ダーマヴェール）を１．８ｍＭ塩化カルシウム水溶液0.00125％濃度になるように調整した溶液を用いた。
ＴＥＲは18時間、24時間、36時間、40時間、44時間経過後に測定した。測定結果を図６に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させ、前記モデルの細胞中のガレクチン−７の減少量を指標として、皮膚バリア機能を改善または経表皮水分蒸散量を抑制する剤をスクリーニングする方法。
【請求項２】
ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させる際にあらかじめガレクチン−７を増加させる成分を添加する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガレクチン−７を増加させる成分がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法でスクリーニングされたガレクチン−７産生抑制剤。
【請求項５】
ガレクチン−７産生を抑制する剤を有効成分とする皮膚バリア機能改善剤。
【請求項６】
ガレクチン−７産生を抑制する剤を有効成分とする経表皮水分蒸散量抑制剤。
【請求項７】
ガレクチン−７産生抑制剤がセイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン果皮抽出物のいずれかである請求項５または請求項６に記載の剤。
【請求項８】
セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物、マンゴスチン果皮抽出物のいずれかを含有する肌荒れ改善剤。