(57)【要約】  化学療法薬と組み合わせて、異常に増殖する細胞において細胞死を促進するための方法および使用、および対象において増殖性疾患を治療するための方法および使用であって、細胞を、化学療法薬で治療されている細胞に対してグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を変更する薬剤に接触させること、または、化学療法薬で治療されている細胞に対してグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を変更する薬剤を対象に投与すること、を含む方法および使用を提供する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）活性を変更する薬剤の治療有効量を、それらを必要とし、かつ、現在化学療法を受けている対象、に投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療方法。
【請求項２】
ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量を、それらを必要とする対象に、化学療法薬と組み合わせて投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療方法。
【請求項３】
前記細胞増殖性疾患は、癌である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記癌は、結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、鼻咽頭癌、子宮頸癌、皮膚癌および白血病から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌は、結腸直腸癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対象は、ヒトである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を細胞内で変更することを含む、現在化学療法を受けている細胞に細胞死を誘導する方法。
【請求項８】
細胞を化学療法薬に接触させることと組み合わせて、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を細胞内で変更することを含む、細胞に細胞死を誘導する方法。
【請求項９】
前記変更は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記変更は、ｐ５３活性化転写を阻害する、請求項７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記変更は、細胞を、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤に接触させることを含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学療法は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項１または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項１または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドを含む、請求項１または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項２または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記化学療法薬は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドである、請求項２または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化を引き起こす、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、競合的ＡＴＰ阻害剤である、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、Ｍｇ２＋の競合的阻害剤である、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、蛋白質キナーゼ阻害剤である、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＧＳＫ−３βのチロシンリン酸化の活性化を阻害する、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、リチウム含有化合物である、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＬＹ２１１９３０１またはそれらの機能的類縁体または塩化リチウムである、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＳＫ−３β活性の変更は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＳＫ−３β活性の変更は、ｐ５３活性化転写を阻害する、請求項１〜６および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
現在化学療法を受けている対象の細胞増殖性疾患を治療するための、グリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用。
【請求項２８】
対象の細胞増殖性疾患を治療するための、化学療法薬と組み合わせたグリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用。
【請求項２９】
現在化学療法を受けている対象の細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における、グリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用。
【請求項３０】
対象の細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における、化学療法薬と組み合わせたグリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用。
【請求項３１】
前記細胞増殖性疾患は、癌である、請求２７〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記癌は、結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、鼻咽頭癌、子宮頸癌、皮膚癌および白血病から選択される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記癌は、結腸直腸癌である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記対象は、ヒトである、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
現在化学療法を受けている細胞に細胞死を誘導するための、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用。
【請求項３６】
細胞に細胞死を誘導するための、化学療法薬と組み合わせたＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用。
【請求項３７】
現在化学療法を受けている細胞に細胞死を誘導するための薬剤の製造における、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用。
【請求項３８】
細胞に細胞死を誘導するための薬剤の製造における、化学療法薬と組み合わせたＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用。
【請求項３９】
前記化学療法は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２７、２９、３５および３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記化学療法は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項２７、２９、３５および３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
前記化学療法は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドを含む、請求項２７、２９、３５および３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２８、３０、３６および３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項２８、３０、３６および３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
前記化学療法薬は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドである、請求項２８、３０、３６および３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４５】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化を引き起こす、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４６】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、競合的ＡＴＰ阻害剤である、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４７】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、Ｍｇ２＋の競合的阻害剤である、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４８】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、蛋白質キナーゼ阻害剤である、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４９】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＧＳＫ−３βのチロシンリン酸化の活性化を阻害する、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、リチウム含有化合物である、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５１】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＬＹ２１１９３０１またはそれらの機能的類縁体または塩化リチウムである、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記使用は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
前記使用は、ｐ５３活性化転写を阻害する、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
（ａ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βを試験化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βの活性は、前記試験化合物の存在下で変更されるかどうかを決定するステップと、
を含む、細胞増殖性疾患を治療するために有用な化合物の同定方法。
【請求項５５】
ステップ（ａ）は、前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βを発現する細胞を前記試験化合物と接触させることを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項５４または５５のいずれかで定義した方法によって同定された化合物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]本明細書は、その内容を本明細書に参考として援用した、２００４年７月９日出願の米国仮出願第６０／５８６２９６号の利益および優先権を請求する。
【発明の分野】
【０００２】
[0002]本発明は、一般的に、癌を含む増殖性疾患の治療方法、特に、増殖細胞におけるアポトーシスの促進方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
[0003]通常、細胞は、ある一定の環境下、制御された方法でしか細胞が分裂および増殖しないような、成長および増殖を制御する機構を備えている。細胞はまた、細胞成長および増殖を制御する正常な制御機構が妨害されたとき、細胞死またはアポトーシスを誘導する機構を備えている。しかし、場合によっては、このような増殖制御およびアポトーシスの機構の崩壊は細胞増殖の抑制解除を可能にし、生物の増殖性疾患または疾病をもたらす可能性がある。このような増殖性疾患には、癌ならびに乾癬、疣贅およびケロイドなどのその他の細胞過多病変が含まれる。
【０００４】
[0004]細胞蛋白質ｐ５３の変異および制御解除は、多くの癌を含む様々な細胞増殖性疾患に関与することが多い。正常で健康な細胞では、ｐ５３経路は、様々な有害刺激によって活性化され、細胞周期停止またはアポトーシスのいずれかをもたらすことができる。このプロセスにはｐ５３蛋白質の蓄積が必要で、これはその後標的遺伝子の転写を活性化することによって生理学的効果を媒介する（Ｂｕｒｎｓ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．、Ｊ  ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１８１：２３１〜２３９、１９９９；Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ  Ｏｒｅｎ、Ｍ．、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ、８：３５９〜３６８、１９９８；Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ，Ｃｅｌｌ、８８：３２３〜３３１、１９９７；Ｖｏｎｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄ  Ｌｕ、Ｘ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２：５９４〜６０４、２００２）。最近の証拠から、細胞はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２１の転写活性化によって細胞周期が停止するか（Ｄｅｎｇ，Ｃ．他、Ｃｅｌｌ、８２：６７５〜６８４、１９９５；Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１４：１５８４〜１５８８、２０００；Ｂｒｕｇａｒｏｌａｓ，Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ、３７７：５５２〜５５７、１９９５；ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．他、Ｃｅｌｌ、７５：８１７〜８２５、１９９３；Ｂａｔｅｓ，Ｓ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１７：１６９１〜１７０３、１９９８）またはＰｕｍａ、ＮｏｘａおよびＢａｘなどのアポトーシス誘発遺伝子の誘導によってアポトーシスを受ける（Ｖｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄ  Ｌｕ，Ｘ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２：５９４〜６０４、２００２；Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｌｏｗｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２：９０３０〜９０４０、２００３；Ｋｈｏ，Ｐ．Ｓ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：２１１８３〜２１１９２、２００４）ことが示唆される。ｐ５３応答までの細胞の運命を制御する正確な機構は十分に理解されていないが、ｐ５３応答は最終的には増殖停止に有利なｐ５３標的の転写とアポトーシスとの平衡に左右されると提言された。ほとんどの化学療法薬は、ｐ５３経路を活性化することによって細胞死を誘導する。したがって、ｐ５３遺伝子内の変異によってアポトーシス経路の回避が引き起こされ、より進行性の表現型および化学療法に対する耐性がもたらされる。
【０００５】
[0005]ｐ５３をベースにした薬理学の目的は、実用的な治療戦略にｐ５３の生物学的理解を応用し、したがって癌細胞を含めた機能障害性の増殖細胞においてアポトーシスを促進することである。ｐ５３標的遺伝子（Ｓｅｏａｎｅ，Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ、４１９：７２９〜７３４、２００２）またはｐ５３転写補因子（Ｉｙｅｒ，Ｎ．Ｇ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１：７３８６〜７３９１、２００４）のレベルを操作する遺伝学的試みは、ｐ５３標的の発現レベルにおける微妙な平衡を変更し、その結果ｐ５３依存性アポトーシスを促進する様々な系で使用されてきた。これらの実験はｐ５３によって誘導された細胞運命の細胞制御の理解に重要であるが、治療の結果もこれらの観察から得られなければならない。
【０００６】
[0006]最近の研究では、ｐ５３がミトコンドリアで直接アポトーシスを誘導できることが示唆された。ｐ５３は、アポトーシス誘発Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーＢａｘまたはＢａｋを直接活性化し（Ｓｅｏａｎｅ，Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、４１９：７２９〜７３４、２００２；Ｃｈｉｐｕｋ，Ｊ．Ｅ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３：１０１０〜１０１４、２００４；Ｍｉｈａｒａ，Ｍ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、１１：５７７〜５９０、２００３）、抗アポトーシスｂｃｌ−Ｘ１およびＢｃｌ２蛋白質と阻害的複合体を形成することが示された（Ｍｉｈａｒａ，Ｍ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、１１：５７７〜５９０、２００３）。これらの相互作用は、最終的にミトコンドリア透過化およびチトクロムｃ放出をもたらす。このｐ５３致死第２経路は、アポトーシスの早期段階と相関し、ｐ５３転写活性とは独立して起こり（Ｅｒｓｔｅｒ，Ｓ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４：６７２８〜６７４１、２００４）、ｐ５３の直接的な薬理学的活性化によって変更され得る（Ｅｒｓｔｅｒ，Ｓ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４：６７２８〜６７４１、２００４；Ｃｈｉｐｕｋ，Ｊ．Ｅ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、４：３７１〜３８１、２００３）。現在のところ、この経路の制御についてはほとんど知られていない。それにもかかわらず、このｐ５３依存性転写非依存性アポトーシス経路の薬理学的活性化は、癌を含めた増殖性疾患の治療に実行可能な戦略となるだろう。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]化学療法薬の大部分は、癌細胞の細胞死を誘導するｐ５３腫瘍抑制因子を活性化することによって作用する。しかし、ｐ５３のアポトーシス機能は、ｐ５３の変異またはｐ５３経路のその他の成分の変化によって癌細胞内で失われることが多く、このような変異または変化を含有する癌細胞では化学療法に対する耐性が生じる。ｐ５３アポトーシス機能が抑制されることによって、これらの癌細胞では化学療法薬の応答は制限されるだろう。さて、ヒト結腸直腸癌細胞を含む癌細胞などの増殖細胞におけるｐ５３機能の調節でのグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の特有の役割を説明する。本明細書で説明したように、ＧＳＫ−３βの薬理学的変更は、化学療法を受けている細胞でｐ５３アポトーシス機能を回復することができ、それによって化学療法を受けているヒト結腸直腸癌細胞を含むこのような癌細胞においてアポトーシスを促進し、さらにヒト結腸直腸癌細胞を含む癌細胞の化学療法に対する効率よい応答を可能にする。
【０００８】
[0008]したがって、一態様では、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）活性を変更する薬剤の治療有効量を、それらを必要とし、現在化学療法を受けている対象に投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。
【０００９】
[0009]他の態様では、化学療法薬と組み合わせてＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量を、それらを必要とする対象に投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。
【００１０】
[0010]他の態様では、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を細胞内で変更することを含む、現在化学療法を受けている細胞において細胞死を誘導する方法を提供する。
【００１１】
[0011]さらに他の態様では、細胞と化学療法薬との接触を組み合わせてグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を細胞内で変更することを含む、この細胞において細胞死を誘導する方法を提供する。
【００１２】
[0012]さらに他の態様では、現在化学療法を受けている対象において細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における場合を含む、グリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用を提供する。
【００１３】
[0013]対象における細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における場合を含む、化学療法薬と組み合わせたグリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用を提供する。
【００１４】
[0014]さらに他の態様では、現在化学療法を受けている細胞において細胞死を誘導するための薬剤の製造における場合を含む、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用を提供する。
【００１５】
[0015]細胞において細胞死を誘導するための薬剤の製造における場合を含む、化学療法薬と組み合わせたＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用も提供する。
【００１６】
[0016]他の態様では、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βを試験化合物と接触させ、前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βの活性が試験化合物の存在下で変更されるかどうかを決定することを含む、細胞増殖性疾患を治療するために有用な化合物の同定方法を提供する。
【００１７】
[0017]さらに他の態様では、前記方法によって同定された化合物も提供する。
【００１８】
[0018]本発明の他の態様および特性は、添付の図面と相まって本発明の具体的な実施形態の以下の説明を検討することによって当業者には明らかになるだろう。
【００１９】
[0019]図面において、ほんの一例として本発明の実施形態を例示する。
【詳細な説明】
【００２０】
[0049]本明細書で説明した本発明の方法は、化学療法を受けている細胞を含む、または化学療法薬との組合せを含む、増殖細胞におけるアポトーシス応答を促進、誘導または増強するためのＧＳＫ−３βの活性の変更に関する。
【００２１】
[0050]グリコーゲン合成酵素−３キナーゼ（ＧＳＫ−３）は、２種のアイソフォーム（αおよびβ）を有し、異なる情報伝達経路に関与する、構成的に発現したセリンチロシンキナーゼである（Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｆｒａｍｅ，Ｓ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２：７６９〜７７６、２００１）。ＧＳＫ−３βは、最初はグリコーゲン代謝に関与する重要な酵素として記載されたが、現在では多様な細胞機能を調節することが知られており、その機能には神経細胞およびその他の組織におけるアポトーシス誘発性の役割が含まれる（Ｗａｔｃｈａｒａｓｉｔ，Ｐ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８：４８８７２〜４８８７９、２００３；Ｈｅｔｍａｎ，Ｍ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０：２５６７〜２５７４、２０００；Ｂｉｊｕｒ，Ｇ．Ｎ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７５：７５８３〜７５９０、２０００）。
【００２２】
[0051]このｗｉｔｈｉｎメソッドは、ＧＳＫ−３βの薬理学的変更がｐ２１およびＰｕｍａを含む標的のｐ５３依存性トランス活性化を著しく損なうが、Ｂａｘのｐ５３依存性構造的活性化を促進し、チトクロムｃ放出、ミトコンドリア膜電位の減少およびカスパーゼ−９プロセシングをもたらすという、ここに記載した発見に基づいている。これらの所見は、ｐ５３が媒介する障害応答が、様々な化学療法薬に曝露した後に特に、細胞周期停止からアポトーシスへ転換され得ることを示している。この効果はＧＳＫ−３βの阻害的セリン９リン酸化の変更に関連すると思われるが、チロシンリン酸化には関連しないらしいことが発見された。アポトーシスの誘導は、Ｂａｘを必要とするがＰｕｍａは必要としないミトコンドリア直接経路によって生じるらしいことがさらに発見された。
【００２３】
[0052]本明細書で説明した発見では、ＧＳＫ−３βは核およびミトコンドリアの両方においてｐ５３活性の調節に関係することが認められる。ＧＳＫ−３βのアポトーシス誘発的役割を示すその他の研究とは対照的に、本発明の方法は、結腸直腸癌細胞などの癌細胞を含む化学療法を受けている増殖細胞において、ＧＳＫ−３βを薬理学的に変更するとｐ５３誘導性アポトーシスが劇的に促進されるという所見に基づいている。アポトーシスはｐ５３活性の転写活性の障害とまさに同時に起こり、Ｂａｘを必要とするがＰｕｍａは必要としないと考えられる直接的ミトコンドリアｐ５３活性によって媒介されるものと考えられる。特定の理論に結びつけられてはいないが、構成的に発現した細胞キナーゼＧＳＫ−３βは、ｐ５３経路の調節において２元の異なる役割を有するようであり、核ではｐ５３の転写活性を促進するが、ミトコンドリアではｐ５３の直接アポトーシス活性を抑制する。
【００２４】
[0053]したがって、本発明の方法は、化学療法を受けているが増殖が制御されていない細胞におけるＧＳＫ−３βの活性の変更に関する。このような変更によって、このような細胞でのアポトーシス応答の促進、誘導または増強が生じ、増殖性疾患の治療が可能となる。
【００２５】
[0054]一実施形態では、細胞内でグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を変更することを含む、細胞死を誘導する方法を提供する。
【００２６】
[0055]本明細書で使用したグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（「ＧＳＫ−３β」）とは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３のβアイソフォームのことで、細胞アポトーシス応答で役割を果たし、ヒトＧＳＫ−３βを含む哺乳類ＧＳＫ−３βを含む。この用語には、ＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性を有するＧＳＫ−３βの相同体、断片、誘導体または変種が含まれ、その活性は増殖細胞においてアポトーシス応答を誘導するために変更することができる。
【００２７】
[0056]２種の配列が特定の領域について実質的に同一であり、この配列の機能的活性が保存されている場合、１つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、もう１つの配列に対して「相同体」であるか、または「相同である」（本明細書では、「相同である」という用語は、進化関連を含まない）。最適に整列されたとき（ギャップ挿入を許容して）、少なくとも約５０％の配列同一性を有するか、またはその配列が定義された機能モチーフを有するならば、２種のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、実質的に同一であると見なされる。他の実施形態では、最適に整列した配列の特定の領域が少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である場合、実質的に同一である（すなわち、実質的同一性を有する）と見なすことができる。「関連のない」または「非相同性」配列は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと特定の相同領域が４０％未満同一であり、おそらく約３５％、３０％または２５％未満同一である。「同一性」および「同一な」という用語は、２種のペプチドまたは２種のポリヌクレオチド分子の間の配列類似性のことである。同一性は、整列した配列の各位置を比較することによって測定することができる。アミノ酸配列間の同一性の程度は、配列によって共有される位置、すなわち、特定の領域の同一アミノ酸または合致するアミノ酸の数の関数である。同一性を比較するための配列の最適な整列は、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ．から入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法、およびこれらのアルゴリズムのコンピュータ処理の実現（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびウィスコンシンジェネティックソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．のＴＦＡＳＴＡ）を含む当業界で公知な様々なアルゴリズムを使用して実施することができる。配列同一性はまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０に記載されたように、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して（発表された初期設定を使用して）測定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（インターネットのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／）から入手することができる。本明細書では、「相同なアミノ酸配列」には、ヒトＧＳＫ−３βを含む哺乳類ＧＳＫ−３βをコードする核酸配列の任意の部分に臨界融点（Ｔｍ）未満の２５〜３５℃でハイブリダイズする核酸配列によって、全体または部分的にコードされる任意のポリペプチドが含まれる。
【００２８】
[0057]ＧＳＫ−３βの変種もしくは誘導体とは、ＧＳＫ−３β蛋白質またはＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性を保持するそれらの断片、または点突然変異、挿入変異または欠失変異を含めて１種または複数のアミノ酸が変異しているが、ＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性をまだ保持しているＧＳＫ−３βのことである。したがって、変種または誘導体には、切断型および断片を含む欠失、挿入および添加、例えば、保存的置換、部位特異的変異および対立遺伝子変種、およびペプチドに共有結合した１種または複数の非アミノアシル基（糖、脂質などを参照のこと）を有するペプトイドを含む修飾ならびに翻訳後修飾が含まれる。本明細書では、「保存されたアミノ酸置換」または「保存的置換」という用語は、ペプチドの所与の位置で１アミノ酸を他のものに置換することを意味し、この置換は関連する機能を実質的に失うことなく行うことができる。このような変更を行う場合、アミノ酸残基のような置換は、側鎖置換の相対的類似性、例えば、大きさ、電荷、疎水性、親水性などに基づいて行うことができ、このような置換は、日常的な試験によって、ペプチドの機能に対するそれらの効果について測定することができる。
【００２９】
[0058]ＧＳＫ−３βの「アポトーシス調節活性」または「アポトーシス活性」とは、核におけるｐ５３転写活性化経路およびミトコンドリアにおけるｐ５３誘導性アポトーシスの直接効果を含む、ｐ５３アポトーシス経路と相互作用するか、またはｐ５３アポトーシス経路に影響を及ぼすＧＳＫ−３βの能力を意味する。ＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化によって少なくとも部分的に達成される。例えば、ヒトＧＳＫ−３βのＳｅｒ９のリン酸化の増加は、ミトコンドリアｐ５３アポトーシス直接経路のアポトーシス応答亢進をもたらす。ＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性はまた、ＧＳＫ−３βがｐ５３活性化転写を促進する能力を含むことができる。
【００３０】
[0059]細胞死を誘導すること、または細胞死の誘導とは、細胞死もしくはアポトーシスの開始、または細胞が細胞死もしくはアポトーシスを受ける能力もしくは傾向の増強、または細胞死もしくはアポトーシスを誘発することが可能な事象に対する細胞の感受性の増強を意味し、本明細書では、結果的な、直接的または間接的なＧＳＫ−３β活性変更の誘導を意味する。細胞死またはアポトーシスは、当業界で理解されるように、標準的アポトーシス測定法を使用して、または公知のアポトーシスマーカー、例えば、チトクロムｃ放出、ミトコンドリア膜電位の損失、カスパーゼ３活性化、カスパーゼ９プロセシング、ＰＡＲＰ切断または細胞培養物もしくは細胞集団におけるｓｕｂ−Ｇ１集団の増加を検出することによって測定することができる。細胞死の誘導は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施することができる。
【００３１】
[0060]細胞が誘導されるべき細胞、または増殖性疾患に関与する細胞を含めた増殖細胞である細胞を意味するとき、本明細書では特に指示がなければ、「細胞」という用語は、１個の細胞、複数の細胞または細胞の集団を意味する。この細胞は、増殖もしくは分裂の阻害が所望される任意の細胞、または細胞死の誘導が所望される任意の細胞であってよく、細胞周期停止もしくはアポトーシスを受ける能力の欠如した細胞を含む。この細胞は培養中の細胞であってよく、または患者内の細胞であってもよい。本明細書では、細胞の増殖とは、細胞総数の増加を導くＤＮＡ複製、増殖および分裂のプロセスのことである。この細胞は、ＧＳＫ−３β相同体を発現する任意の生物から得ることが可能で、特定の実施形態は、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞またはヒト細胞を含む哺乳類細胞である。
【００３２】
[0061]この細胞は、現在化学療法を受けている細胞であってよく、化学療法の治療の利益もしくは効果が変更と同時に細胞において進行するならば、ＧＳＫ−３β活性の変更と同時に、重複して、または連続していることを含む化学療法計画で現在治療されている細胞を意味する。したがって、「現在化学療法を受けている」には、ＧＳＫ−３βの活性を変更する期間より長いか、または短い期間適用される化学療法が含まれる。化学療法の治療および化学療法薬は当業界では公知で、本明細書でさらに説明する。
【００３３】
[0062]細胞死は、このような細胞におけるＧＳＫ−３β活性の変更によって細胞に誘導される。ＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性を「変更する」または「変更」とは、ｐ５３依存性アポトーシス経路の調節、誘導、実行もしくは相互作用を含む生物学的機能もしくは活性をＧＳＫ−３βが実施する能力を上方制御、下方制御、刺激、活性化、増加、中断、妨害、減少、制限、遮断または阻害して、それによって細胞死の誘導をもたらす任意の機構を意味する。変更は、ｐ５３依存性アポトーシスを増強もしくは誘導する効果、またはｐ５３活性化転写を阻害もしくは下方制御する効果を含む。変更は、例えば、翻訳後修飾、必要な翻訳後修飾の欠損もしくは欠如、欠失、挿入および置換変異を含むアミノ酸配列の変異または蛋白質消化によるＧＳＫ−３βの物理的改変を含む。変更はまた、ＧＳＫ−３βの標的であり、ＧＳＫ−３βが細胞周期進行または細胞死の阻害の実施と通常相互作用するアポトーシス因子と、ＧＳＫ−３βとの相互作用の安定化、誘導、拮抗、阻害または競合を含む。このような翻訳後修飾には、阻害的リン酸化、例えば、ＧＳＫ−３βのキナーゼ活性を減少させるセリンリン酸化、ならびにリン酸化活性化の阻害または下方制御、例えば、ＧＳＫ−３βのチロシンリン酸化レベルの減少が含まれる。変更はさらに、薬理学的変更、例えば、ＧＳＫ−３βの阻害剤、例えば、小分子阻害剤もしくは蛋白質もしくはペプチド阻害剤との拮抗、競合的または非競合的阻害を含む。
【００３４】
[0063]したがって、この細胞は、細胞中のＧＳＫ−３βの活性を変更するために処理される。変更は、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤で細胞を処理することによって実現することができる。この薬剤は、ＧＳＫ−３β活性の阻害剤、例えば、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の原因となるか、刺激するか、もしくは増強する分子またはＧＳＫ−３βの活性化したチロシンリン酸化を阻害するかもしくは下方制御する分子を含む、ＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性を阻害、妨害、競合または妨害する化合物であってよい。
【００３５】
[0064]この薬剤は低分子、ペプチド、蛋白質、抗体もしくはその機能的断片、酵素またはホルモンであってよい。この薬剤は、競合的ＡＴＰ阻害剤、Ｍｇ２＋の競合的阻害剤、または蛋白質キナーゼ阻害剤であってよい。
【００３６】
[0065]特定の実施形態では、この薬剤は、低分子ＬＹ２１１９３０１またはそれらの誘導体もしくは類縁体であり、その化学的構造を図８に示す。他の実施形態では、この薬剤は塩化リチウムを含むリチウムである。
【００３７】
[0066]例えば、細胞内への能動的もしくは受動的輸送によって、または細胞内への拡散によって、この薬剤を細胞の内部に運搬することができる。例えば、この薬剤が低分子の場合、細胞膜に可溶性であることが可能で、したがって細胞に浸透することができる。この薬剤はまた、細胞内への輸送を容易にする輸送タグを含むように変更することができる。特定の標的細胞によって薬剤が摂取されるようにするために、特定の輸送タグを使用することができる。例えば、本明細書に参考として全体を援用した米国特許第６８４４３１９号に記載されているように、肝細胞による薬剤の摂取を増加させるために、この薬剤はガラクトース残基を含むように変更することができる。この薬剤がペプチドの場合、含められたペプチドの細胞内への輸送を可能にする膜転位配列等の配列、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアンテナペディアホメオドメイン蛋白質から得られた浸透配列を含めることによって、その細胞による薬剤の摂取が促進される。あるいは、この薬剤は、例えば、リポソーム調製物中に薬剤を封入することによって、細胞によるこの薬剤の摂取を増加または誘導させるバイオ物質に含めることができる。ペプチドおよび蛋白質のリポソームによる細胞への輸送は公知で、例えば、本明細書に参考として援用した米国特許第６３７２７２０号および米国特許出願公開第２００３０１０８５９７号に記載されている。
【００３８】
[0067]したがって、ＧＳＫ−３βアポトーシス調節活性の変更は、細胞をこの薬剤に曝露して、細胞によって薬剤を摂取させ、薬剤をＧＳＫ−３β、ＧＳＫ−３βの標的と相互作用させ、そうでなければＧＳＫ−３βの活性を変更するためにｐ５３依存性アポトーシス経路と相互作用させることによって実施することができる。
【００３９】
[0068]この変更はさらに、化学療法薬と組み合わせて実現することができる。化学療法薬との「組合せ」とは、化学療法薬を細胞と接触させるか、または細胞に投与する期間中に、この変更を起こすことを意味する。ＧＳＫ−３βの変更および化学療法薬の投与は、同時に、または連続して行うことができ、それぞれのための各期間は隣接していてよく、または重複していてもよい。この変更およびそれぞれの投与は、１回または複数の別個の処置で実施してよく、または所望する結果を達成するために、必要な所与の期間継続して実施してもよい。
【００４０】
[0069]この細胞はさらに、化学療法薬の性質に応じて、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤で治療するために前述したのと同じ方法で、化学療法薬によって処理することができる。この細胞は、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の前後、または同時に化学療法薬で処理することができる。
【００４１】
[0070]この化学療法薬は、一般的に細胞に投与され、細胞毒性または細胞分裂停止効果を有する化合物であってよい。この化学療法薬は、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤がなくても、異常増殖する細胞において、ｐ５３依存性アポトーシスなどのアポトーシスを誘導する薬剤、またはｐ５３依存性細胞周期停止を含む細胞周期停止を誘導する薬剤であってよい。化学療法薬はまた、異常増殖する細胞の特性によって、例えば、ｐ５３もしくはｐ５３経路における改変もしくは変異によって、異常増殖する細胞においてｐ５３またはｐ２１を活性化するが、この細胞でアポトーシスは誘導しない薬剤であってよい。ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤と組み合わせて化学療法薬で細胞を処理すると、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤無しで認められるよりも高いレベルで、細胞死を誘導し、細胞死に対する感受性を増加させる。
【００４２】
[0071]化学療法薬は、増殖細胞においてｐ５３依存性アポトーシスまたはｐ５３依存性細胞周期停止を活性化することができるＤＮＡ損傷剤または遺伝子毒性剤であってよい。この化学療法薬は、限定はしないが、低分子、ペプチドもしくは蛋白質、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗物質、葉酸類縁体、プリン類縁体、ピリミジン類縁体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬またはサイトカインであってよい。好ましくは、この化学療法薬は、特定の細胞増殖性疾患および細胞種に対して有効であることが知られているものである。ある実施形態では、この化学療法薬はアドリアマイシン（ＡＤＲ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エトポシドまたはカンプトテシンまたはそれらの誘導体もしくは類縁体である。
【００４３】
[0072]ＧＳＫ−３β活性の変更は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有用で、異常に増殖する細胞に関連し、細胞死を誘導することが望ましい疾患または障害の治療または阻害に使用することができる。
【００４４】
[0073]したがって、ここでは、一実施形態として、ＧＳＫ−３βの活性を変更することを含む細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。この方法は、対象にＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量を投与することによって実施される。
【００４５】
[0074]「増殖性疾患」は、患者の細胞が異常に増殖し、健康な個体であれば増殖しないか、または制御された方法で増殖するはずのその細胞の無制御な増殖および分裂を引き起こす疾患である。この増殖性疾患は、悪性腫瘍もしくは非悪性腫瘍細胞集団の増殖を特徴とすることができる。このような疾患には、結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、鼻咽頭癌、子宮頸癌、皮膚癌、白血病を含む癌、陰部疣贅、乾癬およびケロイドを含む過形成皮膚病変、虚血性心疾患、後天性免疫不全症候群、血管炎、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、糸球体硬化症を引き起こす糸球体腎炎、線維症を引き起こす間質炎、線維症を引き起こす肺炎症が含まれる。増殖性疾患には、異常な増殖が含まれ、これはまた正常な創傷治癒の間に生じることが可能であり、過剰な瘢痕またはケロイド形成を引き起こす可能性があり、炎症状態の間に生じて、宿主免疫細胞が繊維芽細胞の増殖を誘発し、線維症を導く細胞外マトリックス成分を形成する組織損傷を引き起こすことが可能である。後者の例には、脳梗塞（脳卒中）、心筋梗塞（心発作）および急性虚血性腎細尿管損傷（一過性腎不全）に対する宿主免疫応答が含まれる。特定の実施形態では、この増殖性疾患は結腸直腸癌である。
【００４６】
[0075]細胞が患者に疾患をもたらすような異常増殖する細胞であるならば、またはその疾患の特徴がこのような細胞の増殖であるならば、その細胞は増殖性疾患に関連する。
【００４７】
[0076]増殖性疾患を「治療する」という用語は、臨床結果を含む有益な、または望ましい結果を得るための取り組みのことである。有益な、または望ましい臨床結果には、限定はしないが、１種または複数の症状または状態の軽減または緩解、疾患範囲の減少、疾患状態の安定化、疾患発症の予防、疾患拡散の予防、疾患進行の遅延化または緩徐化、疾患開始の遅延化または緩徐化、疾患状態の緩解または一時緩和および（部分的にせよ、全体的にせよ）寛解を含むことができる。「治療する」はまた、治療なしで予測される生存率を上回る患者の生存率の延長を意味することができる。「治療する」はまた、疾患の進行の阻害、疾患の進行の一時的な緩徐化を意味するが、より好ましくは、疾患の進行の永久的な停止に関与する。
【００４８】
[0077]対象は、増殖性疾患の治療を必要とする任意の動物であり、哺乳類を含み、ヒトを含み、現在化学療法を受けている対象を含む。
【００４９】
[0078]治療効果は、ＧＳＫ−３βのアポトーシス調節活性を変更する分子を含むＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤を患者に投与することによって実現される。ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤とは、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化を増加、増強または促進する薬剤を含む、前述のように細胞において変更を実施するために使用することができる任意の薬剤である。
【００５０】
[0079]ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤は、その有効量を患者に投与する。本明細書では、「有効量」という用語は、例えば、特定の増殖性疾患を治療するために所望する結果を実現するのに必要な用量および期間における有効量を意味する。
【００５１】
[0080]この薬剤は、当業界で公知の標準的技術を使用して患者に投与される。この薬剤は全身投与することが可能であり、または増殖性疾患に関与する増殖細胞が存在する部位に直接投与することも可能である。部位への輸送は、局所投与、部位への注射、または、例えば腫瘍部位への外科的移植を含む。
【００５２】
[0081]ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤の投与濃度および量は、治療する増殖性疾患、増殖性疾患に関連する細胞の種類、投与する分子の種類、投与様式、患者の年齢および健康状態に応じて変化する。
【００５３】
[0082]ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤は、前述のような化学療法薬と組み合わせて投与することができる。ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤と投与するための化学療法薬との「組合せ」は、同一の投与形態に一緒に製剤することができ、または別々の投与形態に製剤することができ、この別々の投与形態は、同一の投与様式または別々の投与様式によって投与するために、同一の形態または異なる形態であってよい。さらに、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤と投与する化学療法薬との組合せの投与は、同一の投与形態に一緒にしない場合、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤および化学療法薬を治療対象に同時に投与することを意味し、同時に、または任意の順番で連続して、または異なる時点に投与することができる。したがって、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤および化学療法薬は、所望する治療効果をもたらすために別々であっても十分に密接した時間内で投与することができる。
【００５４】
[0083]場合によっては化学療法薬と組み合わせたＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤は、単独治療として投与することができ、または放射線療法もしくはその他の抗ウイルス療法を含めたその他の治療と組み合わせて投与することができる。例えば、場合によっては化学療法薬と組み合わせたＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤は、原発腫瘍の外科的除去の前後いずれか、または放射線療法の投与などの治療の前後もしくは同時に投与することができる。
【００５５】
[0084]投与を助けるために、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤は、薬剤組成物の成分として、場合によっては前述のような化学療法薬を含む治療薬と共に製剤することができる。したがって、他の実施形態では、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤および薬剤として許容される希釈剤を含む医薬組成物を提供する。したがって、本発明はまた、一態様において、増殖性疾患の治療に使用するためのこのような医薬組成物を含む。この組成物は通常、薬剤として許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤および様々な適合担体を含有することができる。運搬の全形態のために、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤は生理学的塩溶液中に製剤することができる。ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤がペプチドまたは蛋白質の場合、ペプチドは投与に不安定な可能性があるので、標的細胞に運搬されるまで、ペプチドまたは蛋白質を保護および／または保存するために有用なリポソームまたはその他の生体物質に含めることが望ましい可能性がある。
【００５６】
[0085]この医薬組成物は、特定の増殖性疾患を治療するために有用なその他の治療薬、例えば、細胞毒性薬、例えば、化学療法薬をさらに含有することができる。
【００５７】
[0086]薬剤として許容される希釈剤の割合および同定は、選択した投与経路、生細胞との適合性および標準的医療行為によって決定される。一般的に、医薬組成物は、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤の生物学的特性を著しく損なわない成分と共に製剤される。
【００５８】
[0087]この医薬組成物は、患者に投与するために適した薬剤として許容される組成物の調製のための公知の方法によって調製することができ、したがって、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤の有効量および他の活性物質または活性物質類を、薬剤として許容される媒体を含む混合物中で一緒にする。適切な媒体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃａｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、ＵＳＡ  １９８５）に記載されている。これに基づいて、この医薬組成物は、薬剤として許容される１種または複数の賦形剤または希釈剤と関連して、ｐＨが適切で生体液と等張な緩衝液中に含有されたＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤の溶液を含むがそれだけには限らない。
【００５９】
[0088]この医薬組成物は、当業者であれば理解するように、選択した投与経路に応じて様々な形態で患者に投与することができる。本発明の組成物は、所望する部位に局所的に、外科的に、または注射によって投与することができる。
【００６０】
[0089]ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤の溶液は、生理学的に適切な緩衝液中で調製することができる。これらの調製物は、通常の保存および使用の条件下で、微生物増殖を阻害する保存剤を含有し、ＧＳＫ−３βの活性を変更する薬剤の機能を維持する。当業者であれば、適切な調製物の調製方法はわかるであろう。適切な調製物の選択および調製のための従来の方法および成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  および１９９９年に発行されたＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）に記載されている。
【００６１】
[0090]異なる実施形態では、この組成物は、制御されていない形態で増殖する細胞が患者内で局在する所望部位に、局所的に、または直接（皮下、静脈内、筋肉内などの）注射によって投与することができる。
【００６２】
[0091]使用する医薬組成物の用量は、治療する特定の症状、症状の重症度、年齢、身体状態、身長および体重を含む個々の患者の変数、治療期間、（もしあれば）併用治療の特性、特定の投与経路および医師の知識および経験内にあるその他の同様の要素によって左右される。これらの要素は、当業者には公知で、最小限の通常の実験で入手することができる。
【００６３】
[0092]前述の方法と矛盾しない形態で、細胞に細胞死を誘導するためにＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用、ならびに現在化学療法を受けている細胞および化学療法薬を併用している細胞を含む細胞において細胞死を誘導するための薬剤の製造におけるＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用もまたここで企図する。さらに、対象において細胞増殖性疾患を治療するためにグリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用、または現在化学療法を受けている対象および化学療法薬を併用している対象を含む対象における細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造においてグリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用を企図する。
【００６４】
[0093]ＧＳＫ−３βの活性を変更し、細胞増殖性疾患の治療に有用である、低分子またはペプチド調節剤を含む薬剤または化合物の同定またはスクリーニング方法も提供する。ＧＳＫ−３βを発現する細胞の場合を含め、化学療法を受けている細胞もしくは化学療法薬を併用している細胞を含めて、試験分子を、ＧＳＫ−３βに接触若しくは曝露させるか、または、ＧＳＫ−３βを含み、ＧＳＫ−３βと相互作用し、若しくはＧＳＫ−３βによって調節される生化学的経路に曝露する。一旦試験化合物がＧＳＫ−３βと接触したら、ＧＳＫ−３βが細胞中でアポトーシスを調節する能力を含むＧＳＫ−３βの活性を測定する。ＧＳＫ−３βの活性は、キナーゼ測定法、アポトーシス測定法を含む公知の測定法を使用して測定することができ、その上ＧＳＫ−３β内の阻害的セリンリン酸化部位におけるリン酸化状態およびリン酸化のレベルを調べることができる。
【００６５】
[0094]細胞増殖性疾患を治療するために有用な薬剤または化合物のスクリーニング方法は、化合物のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために非常に適している。したがって、前述の方法および測定法は、単一の試験化合物または複数の試験化合物または試験化合物ライブラリーのいずれかを使用することができる。後者の場合、化合物の組合せによってもたらされる相乗効果も同定し特徴付けることができる。ある種の実施形態では、本発明のスクリーニング／試験方法の１段階または複数の段階は自動化することができる。このような測定系は、測定条件を有用にすることができ、最適にする様々な手段を含むことができる。このような手段は、限定はしないが、例えば、ｐＨおよびイオン強度を制御するために適切な緩衝溶液、ＧＳＫ−３β活性および安定性のための任意の必要成分（例えば、蛋白質分解酵素阻害剤）の提供、最適ＧＳＫ−３β活性およびまたは安定性のための温度制御手段およびＧＳＫ−３β活性の検出を可能にする検出手段を含むことができる。限定はしないが、以下の、放射標識（例えば、３２Ｐ）、抗体をベースとした検出、蛍光、化学ルミネセンス、分光法（例えば、変化した分光特性を有する産物の生成）、様々なレポーター酵素または蛋白質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、緑色蛍光蛋白質）、特異的結合試薬（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）およびその他の１種または組合せを含む様々なこのような検出手段を使用することができる。
【００６６】
[0095]低分子またはＧＳＫ−３βのペプチド修飾因子を含む、本明細書で説明した方法によって同定されたようなＧＳＫ−３βの活性を変更できる分子も本発明で企図する。前述の化合物は、ＧＳＫ−３βの活性を変更するため、細胞における細胞死を誘導するため、または対象における細胞増殖性疾患を治療するために使用することができるか、または前述の使用のいずれかのための薬剤の製造において使用することができる。
【００６７】
[0096]本明細書で言及した文書はすべて、全体を参考として本明細書に援用する。
【００６８】
[0097]本発明の様々な実施形態を本明細書で開示したが、多くの応用および変更は当業者の通常の一般的知識に従って本発明の範囲内で行うことができる。このような変更は、実質的に同じ方法で同じ結果を実現するために本発明の任意の態様のために公知の同等物の置換物を含む。本明細書で使用した技術用語および科学用語はすべて、特に定義しなければ、本発明の当業者によって通常理解されるのと同様の意味を有する。
【実施例】
【００６９】
[0098]実施例１
[0099]材料および方法
[00100]細胞培養および薬剤処理：ヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６およびその同質遺伝子型ｐ５３−／−、Ｐｕｍａ−／−、Ｂａｘ−／−およびｐ５３誘導性ＤＬＤ細胞系はＢｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ博士（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＭＤ）から恵与された。ＲＫＯおよびＲＫＯ／Ｅ６細胞はＡＴＣＣから入手した。細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培養した。培養用試薬および培地はすべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であった。５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、エトポシドおよび塩化リチウムはＳｉｇｍａから購入した。ＧＳＫ−３β特異的低分子阻害因子ＬＹ２１１９３０１は、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）から恵与され、ＳＢ−２１６７６３、ＳＢ−４１５２８３はＢＩＯＭＯＬから入手した。
【００７０】
[00101]ウェスタンブロッティング、免疫沈降法およびマイクロアレイ分析：細胞をかき取り、収集して、既に記載されたように（Ｙｕ，Ｑ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６２：５７４３〜５７４８、２００２）溶解した。簡単に説明すると、細胞を細胞溶解緩衝液（０．３％  ＮＰ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）で氷上で３０分間溶解し、この溶解物を４℃で１２０００×ｇで１５分間遠心分離することによって透明にした。蛋白質濃度を定量して（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、蛋白質試料（５０μｇ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移した。以下の蛋白質に対する抗体を使用した：ｐ５３（ＤＯ−１）、ｐ２１、ＰＡＲＰ、ＧＳＫ−α／β、α−チューブリン、およびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｐｕｍａ（Ａｂ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、Ｂａｘ（Ｓｉｇｍａ）、リン酸化（Ｓｅｒ９／２１）−ＧＳＫ−３α／βおよびカスパーゼ９（Ｃｅｌｌ、Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、リン酸化（Ｔｙｒ２１６／２７９）−ＧＳＫ−３α／β（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、チトクロムｃ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）。Ｂａｘの構造変化を検出するために、細胞を１％Ｃｈａｐｓ緩衝液で溶解し、可溶性画分をＢａｘモノクローナル抗体（６Ａ７、ＢＤ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で免疫沈降させ、その後抗Ｂａｘポリクローナル抗体によってイムノブロッティングした。マイクロアレイ分析を記載されたように実施した（Ｋｈｏ，Ｐ．Ｓ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：２１１８３〜２１１９２、２００４）。
【００７１】
[00102]ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ分析およびカスパーゼ３活性：細胞を収集し、７０％エタノールで固定した。固定した細胞をＲＮアーゼ（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）で染色した。染色された細胞のＤＮＡ含量は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で蛍光標示式細胞分取器によって分析した。細胞周期画分は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して定量した。カスパーゼ３活性を測定するために、細胞を指示通りＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）溶液（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で固定して、次にＦＩＴＣ−結合ウサギ抗活性カスパーゼ３モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。カスパーゼ３検出が陽性の細胞の定量は、フローサイトメトリーによって実施した。
【００７２】
[00103]ＲＮＡ干渉：ｐ５３のノックダウンベクターを作製するために、以下のヌクレオチドが１９個の配列、ｇａｃｔｃｃａｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃ（配列番号１）を使用した。このオリゴヌクレオチド対を製造元の指示に従ってレトロウイルス発現ベクターｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）にクローニングした。簡単に説明すると、２９３細胞にｐ５３  ｓｈＲＮＡ構築物を４８時間形質導入して、ウイルス粒子を作製した。ｐ５３  ｓｈＲＮＡの安定的形質導入クローンを確立するために、５μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下でＨＣＴ１１６細胞にレトロウイルスのストックを感染させた。感染細胞は、２μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシン選択を行った。安定的クローンはさらに増殖させて、ｐ５３の発現についてウェスタンブロット分析によってスクリーニングした。ＳＭＡＲＴプール（登録商標）ＧＳＫ−３βおよびＧＳＫ−３α  ｓｉＲＮＡおよび陰性対照ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ社から購入した。
【００７３】
[00104]アデノウイルス感染：アデノウイルスＡｄ−ＬａｏＺおよびＡｄ−ｐ５３は、Ｓｈｉｂｉｎ  Ｚｈｏｕ博士（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＭＤ）から入手した。細胞は集密度５０％まで増殖させ、記載された通りに組換えアデノウイルスを感染させた（Ｙｕ，Ｊ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：１４５１７〜１４５２２、１９９９）。感染後２４時間して、細胞を薬剤で指示した時間処理した。
【００７４】
[00105]細胞内分画：細胞はミトコンドリア溶解緩衝液（２１０ｍＭ  マンニトール、７０ｍＭ  スクロース、１０ｍＭ  ヘペス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、蛋白質分解酵素阻害剤カクテル）中で、Ｄｏｕｎｃｅホモゲナイザーで溶解し、１０００×ｇで遠心分離を行い、核をペレットにした。核除去後の上清を１００００×ｇで遠心分離して、ミトコンドリアリッチな重い膜画分をペレットにして、得られた上清をさらに遠心分離して細胞質画分を得た。細胞質またはミトコンドリア画分の全蛋白質（３０μｇ）のイムノブロット分析を行った。
【００７５】
[00106]ミトコンドリア膜透過性遷移の測定：４℃で３００×ｇで５分間遠心分離することによって細胞を収集した。ミトコンドリア膜透過性遷移は、製造元の指示に従って細胞をＪＣ−１（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色することによって測定した。ミトコンドリア膜透過性遷移は、赤色蛍光の減少したミトコンドリア、すなわち膜電位（ΔΨｍ）の低下を示したミトコンドリアを有する細胞をフローサイトメトリー測定することによって定量した。データは、低ΔΨｍの細胞の割合で示す。
【００７６】
[00107]結果
[00108]低分子ＧＳＫ−３β阻害剤は、ヒト結腸直腸癌細胞において、ｐ５３に依存して遺伝毒性剤誘発アポトーシスを促進する：ヒト結腸直腸癌ＨＣＴ１１６細胞では、ＤＮＡ損傷剤アドリアマイシン（ＡＤＲ）およびＤＮＡ類縁体５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）によるｐ５３活性化は、それぞれ細胞周期停止およびアポトーシスを引き起こす（Ｂｕｎｚ，ｐ．他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０４：２６３〜２６９、１９９９）。ｐ５３応答を変更する細胞因子を調べるために、一連の蛋白質キナーゼ阻害剤をスクリーニングして、それらのＤＮＡ損傷応答に対する効果を調べた。特定のＧＳＫ−３β低分子阻害剤（ＬＹ２１１９３０１）がＡＤＲ誘発性ｐ５３応答を増殖停止から細胞死に効率よく変換することを発見した。図１Ａおよび１Ｂは、ＡＤＲで２４時間処理されたＨＣＴ１１６細胞は細胞死を明らかに誘導することなく細胞周期停止する（Ｇ１およびＧ２／Ｍ期の両方で停止）ことを示す。ＡＤＲおよびＬＹ２１１９３０１で一緒に細胞を処理すると、ＡＤＲまたはＬＹ２１１９３０１（約３〜５％）単独で処理した細胞と比較して、ｓｕｂ−Ｇ１集団（約５９％）によって証明されるように細胞死の顕著な増加が生じた。対照的に、細胞死の相乗的誘導は、同条件下のｐ５３ノックアウトＨＣＴ１１６細胞（図１Ａおよび１Ｂ）では認められなかったので、細胞死はｐ５３依存性であることが示唆された。同様の結果がカスパーゼ３活性測定法を使用することによって得られた（図２）ので、細胞死はアポトーシスが原因であった。ＬＹ２１１９３０１はまた、エトポシドおよびカンプトテシン（ＣＰＴ）を含むその他のＤＮＡ損傷剤に応答してｐ５３誘導性アポトーシスを誘発した（図３）。同様の結果はまた、他のｐ５３野生型結腸癌細胞系、ＲＫＯで認められたが、ＳＷ４２０およびＨＴ２９などのｐ５３変異腫瘍では認められなかった（図４、データは示さず）。さらに、ＬＹ２１１９３０１は、ｐ５３のないＨＣＴ１１６細胞ではアポトーシスの増加は認められなかったので、ｐ５３に絶対的に依存した形態で５−ＦＵ誘導性アポトーシスに非常に敏感であった（図５）。珍しいことに、用量作用実験では、結腸直腸癌の治療で最も一般的に使用される化学療法薬の１つである５−ＦＵによるアポトーシス誘導を、ＬＹ２１１９３０１が１０倍増加させることが示された。したがって、ＧＳＫ−３βの薬理学的阻害は、ｐ５３が媒介する損傷反応を増殖停止からアポトーシスに変換するだけでなく、さらにｐ５３誘導性アポトーシス応答に感作させることであった。両方の場合において、ＧＳＫ−３βを不活性化すると、ｐ５３を必要とするアポトーシスプロセスが誘発されるか、感作される。
【００７７】
[00109]観察されたアポトーシス増加が本当にｐ５３依存性であり、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞の長期培養の結果としての表現型特性によるものではないことを確かめるために、ｐ５３発現をｐ５３  ｓｈＲＮＡによって著しくサインレントさせた安定的ＨＣＴ１１６細胞系を作製した（図６、左図）。これらの細胞におけるｐ５３ノックダウンは、ＬＹ２１１９３０１およびＡＤＲもしくは５ＦＵと一緒に処理することによって、対照ベクターを発現する細胞と比較して、アポトーシス誘導が著しく減少した（図６、右図）。ｐ５３応答に対するＬＹ２１１９３０１のアポトーシス効果はまた、他のｐ５３野生型結腸癌細胞系ＲＫＯにおいて認められたが、ｐ５３が不活性な対応するＲＫＯ／Ｅ６細胞では認められなかった（図７）。同様に、アポトーシスは、その他のｐ５３変異結腸癌細胞系ＳＷ４８０およびＨＴ２９では誘導されなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＧＳＫ−３β阻害剤ＬＹ２１１９３０１はインタクトなｐ５３を厳密に必要とする形態でアポトーシスを促進することを示唆する。
【００７８】
[00110]ＧＳＫ−３βの薬理学的変更はｐ５３依存性アポトーシスを促進するが、ＧＳＫ−３αは促進しない：ＧＳＫ−３β変更が前記観察の原因となることを確かめるために、３種類のその他の構造的に関係のない低分子ＧＳＫ−３阻害剤、ＳＢ−２１６７６３、ＳＢ−４１５２８６および塩化リチウム（ＬｉＣｌ）の効果を調べた（図８）。前者２種の化合物は選択的ＧＳＫ−３阻害剤である競合的ＡＴＰ阻害剤であり（Ｃｏｇｈｌａｎ，Ｍ．Ｐ．他、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、７：７９３〜８０３、２０００）、一方、リチウムは、その他の蛋白質キナーゼに阻害作用を与えずに、Ｍｇ２＋の競合的阻害剤として作用することによってＧＳＫ−３βを阻害する（Ｗａｔｃｈａｒａｓｉｔ，Ｐ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８：４８８７２〜４８８７９、２００３；Ｒｙｖｅｓ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｒｗｏｏｄ，Ａ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８０：７２０〜７２５、２００１；Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９３：８４５５〜８４５９、１９９６）。ＬＹ２１１９３０１と同様に、リチウム処理は化学療法薬に曝露したＨＣＴ１１６細胞においてｐ５３依存性の形態で強力にアポトーシスを誘導した（図９）。驚くべきことに、ＳＢ−１２６７６３およびＳＢ−４１５２８６は、２０μＭまで濃度を高めてもＡＤＲ処理細胞に影響をまったく及ぼさなかった（図１０）。このことは、２５０ｎＭの低濃度でＡＤＲ処理細胞においてアポトーシスを誘導することができたＬＹ２１１９３０１とは対照的である（図１０）。ＳＢ−２１６７６３およびＳＢ−４１５２８６がＤＮＡ損傷に応じてｐ５３経路を遮断するかどうかを調べるために、イムノブロット分析を実施し、これら２種の阻害剤がｐ５３の安定性およびＤＮＡ損傷によるｐ５３媒介ｐ２１誘導に影響を及ぼさないことを発見した（図１１）。したがって、ＬＹ２１１９３０１がストレスを受けた細胞においてアポトーシスを誘導する能力は、ｐ５３−ｐ２１経路を阻害する能力と密接に関連するようである。ＤＮＡ損傷後、我々の結果によって、ＬＹ２１１９３０１はｐ５３安定性およびｐ２１誘導を妨害し、その他の阻害剤はｐ５３作用に影響を及ぼさなかったことが示される。
【００７９】
[00111]これらの化合物がＧＳＫ−３βに個別に作用するかどうかを調べるために、イムノブロット分析を実施した。ＧＳＫ−３は、２種類のアイソフォーム（αおよびβ）を含有し、それらの活性はＴｙｒ２１６／Ｔｙｒ２７９のリン酸化の活性化によって、またはＳｅｒ２１／Ｓｅｒ９の阻害的リン酸化によって調節することができる（Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｆｒａｍｅ，Ｓ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２：７６９〜７７６、２００１）。特異的ＧＳＫ−３阻害剤は、活性化したチロシンリン酸化を阻害するか、または阻害的セリン自動リン酸化を誘導することができる（Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｆｒａｍｅ，Ｓ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２：７６９〜７７６、２００１；Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｍ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、３：４７９〜４８７、２００４；Ｚｈａｎｇ，Ｆ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８：３３０６７〜３３０７７、２００３；Ｃｏｌｅ，Ａ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、３７７：２４９〜２５５、２００４）。このように、これらの特異的残基のリン酸化状態は、ＧＳＫ−３α／β活性の代理マーカーとして使用された。ＨＣＴ１１６細胞をＬＹ２１１９３０１およびリチウムで処理すると、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化のまったく同じ増加が引き起こされ、ＧＳＫ−３αではその程度はずっと少なかった（図１２、列２および５）。対照的にＳＢ−１２６７６３およびＳＢ−４１５２８６はＧＳＫ−３αのセリン２１リン酸化を誘導するのみで、ＧＳＫ−３βのセリン９リン酸化はむしろわずかに減少させた（図１２、列３および４）。さらに、ＬＹ２１１９３０１は、ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３β両方の活性チロシンリン酸化をほとんど完全に遮断し、ＳＢ−１２６７６３およびＳＢ−４１５２８６はＧＳＫ−３αのチロシンリン酸化のみを減少させた（図１２、列３および４）。ＬＹ２１１９３０１およびリチウムならびにＳＢ−１２６７６３およびＳＢ−４１５２８６の両方は以前、ペプチドをベースとしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質キナーゼ測定法を使用することによってＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３βの阻害で同等に有効であることが示されたが、これらの結果は、ＬＹ２１１９３０１およびリチウムはＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３βの両方を阻害するが、主にＧＳＫ−３βに作用し、一方ＳＢ−１２６７６３およびＳＢ−４１５２８６はＨＣＴ１１６細胞においてＧＳＫ−３αのみに阻害的であることを示している（Ｃｏｇｈｌａｎ，Ｍ．Ｐ．他、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、７：７９３〜８０３、２０００）。したがって、ＧＳＫ−３阻害剤のアポトーシス効果は、ＧＳＫ−３βの特異的不活性化に関連するが、ＧＳＫ−３αには関連しないようである。リチウムは、ＬＹ２１１９３０１とは対照的に、ＧＳＫ−３α／βのチロシンリン酸化の活性化を遮断しないが（図１２、列５）、アポトーシス表現型をまだ誘導できることが重要である。したがって、チロシンリン酸化の活性化の阻害は、ＧＳＫ−３β阻害剤のアポトーシス効果に必要ではない。代わりに、ＧＳＫ−３βの阻害的セリン９リン酸化の誘導は、ＬＹ２１１９３０１およびリチウムの両方の一般的な特徴であり、したがってアポトーシス効果に関連すると思われる。リチウムは、おそらくＧＳＫ−３依存性ホスファターゼ１を阻害することによって、ＧＳＫ−３自体の直接阻害によるセリン自動リン酸化を増大させることが知られているので、ＧＳＫ−３βのＬＹ２１１９３０１およびリチウムによるセリン９リン酸化の誘導は、ＡＫＴなどのその他の上流キナーゼの活性化の結果ではないようである（Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９３：８４５５〜８４５９、１９９６）。さらに、ＡＫＴを阻害するＬＹ２９４００２で細胞を処理してもＬＹ２１１９３０１およびリチウムによって誘発されたセリン９リン酸化は遮断されなかった（データは示さず）。
【００８０】
[00112]ＲＮＡ干渉によるＧＳＫ−３βのノックダウンがまた、ＤＮＡ損傷誘導性アポトーシスを感作するかどうかを試験するために、ＨＣＴ１１６細胞をＧＳＫ−３β、ＧＳＫ−３αまたは陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ  ｓｉＲＮＡ）で４８時間形質導入し、その後エトポシド処理を行った。図１３は、ＲＮＡ干渉がＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３βそれぞれの発現を効率的かつ特異的にノックダウンしたことを示している。しかし、明らかなＰＡＲＰ切断は認められなかったので、ＧＳＫ−３βまたはＧＳＫ−３αのノックダウンがエトポシドに応答して細胞死をよりもたらすことはなかった。したがって、ＧＳＫ−３βレベルの減少だけではＤＮＡ損傷に応答した細胞死の誘発には不十分であった。この所見は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリン９リン酸化の誘導がＤＮＡ損傷に応答した結腸直腸癌細胞における効率的なアポトーシス誘導に重要であるという見解と一致する。セリン９リン酸化を誘導できなかったＧＳＫ−３β  ｓｉＲＮＡは、ＧＳＫ−３β阻害剤のアポトーシス効果を模倣できなかった。
【００８１】
[00113]次に、アポトーシスおよびｐ５３機能に対するＧＳＫ阻害剤の様々な効果の基礎となる機構を調べた。ＧＳＫ−３は細胞質区分および核区分の両方に存在し、ＧＳＫ−３α／βはＳｅｒ−２１（α）およびＳｅｒ−９（β）のリン酸化によって阻害され、Ｔｙｒ−２７９（α）またはＴｙｒ−２１６（β）のリン酸化によって活性化されるので、ＧＳＫ阻害剤処理およびＤＮＡ損傷後のＧＳＫ−３のリン酸化状態の変化を探索した。エトポシド処理後、特異的抗Ｓｅｒ−９／２１または抗Ｔｙｒ−２１６抗体によって評価すると、細胞質および核ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３βのレベルもリン酸化状態も変化はなかった（図１４）。興味深いことに、ＬＹ２１１９３０１は細胞質および核両方においてＧＳＫ−３βのセリンリン酸化を誘発し、αおよびβ両方のアイソフォームのチロシンリン酸化を遮断した。対照的に、その他２種のＧＳＫ阻害剤は、細胞質においてはＧＳＫ−３αのセリンリン酸化を誘発したが、核では誘発せず、ＧＳＫ−３βのセリンリン酸化には影響を及ぼさなかった。一貫して、ＳＢ−１２６７６３およびＳＢ−４１５２８６は核においてＧＳＫ−３βの活性チロシンリン酸化を遮断しなかった。これらのデータによって、ＬＹ２１１９３０１はＧＳＫ−３βに対して高い選択性を有し、一方その他２種の阻害剤は主に細胞質ＧＳＫ−３αを阻害するが、両方ともｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定法を使用するとＧＳＫ−３αと同じくらい効率的にＧＳＫ−３βを阻害することが示された（Ｃｏｇｈｌａｎ他、２０００）。このデータは、核ＧＳＫ−３βはＤＮＡ損傷に応答してｐ５３機能を調節するがＧＳＫ−３αは調節しないことを示しており、このことはＤＮＡ損傷に対する細胞応答を調節する能力と高い関連性がある。注目すべきことに、核ＧＳＫ−３βの阻害は、ｐ５３存在量の基準レベルを減少させるのに十分であり、ＧＳＫ−３βは、正常細胞およびストレスを受けた細胞の両方でｐ５３蓄積を調節することを示唆している。
【００８２】
[00114]ＧＳＫ−３βの薬理学的変更は、遺伝毒性ストレスに応答したｐ５３蓄積およびｐ５３標的遺伝子のトランス活性化を損なう：ＧＳＫ−３βのｐ５３応答に対する効果を測定するために、ｐ５３およびｐ５３標的のイムノブロット分析を実施した。ＨＣＴ１１６（図１５）およびＲＫＯ（図１６）細胞を、ＬＹ２１１９３０１の存在下または非存在下で、ＡＤＲ、エトポシドおよび５−ＦＵで処理した。化学療法薬で処理した細胞は、ｐ５３の累積およびｐ２１およびＰｕｍａなどのその標的遺伝子の活性化を示し、それぞれは成長停止およびアポトーシスを媒介した。ＬＹ２１１９３０１の存在下では、ｐ２１およびＰｕｍａの誘導のように、化学療法によって誘導されたｐ５３蓄積は著しく着実に損なわれた。したがって、ＬＹ２１１９３０１は遺伝毒性ストレスに応答したｐ５３蓄積を損ない、その転写活性を減少させた。結腸癌のミトコンドリア媒介アポトーシスに欠かせないことが知られているｐ５３標的、Ｂａｘの発現は、ｐ５３活性化の後に誘導されなかったことは重要である（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：９８９〜９９２、２０００）。このことは、Ｂａｘは結腸癌細胞においてｐ５３の確固とした標的ではないという以前の報告と一致する（Ｙｕ，Ｊ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：１４５１７〜１４５２２、１９９９；Ｋｏｋｏｎｔｉｓ，Ｊ．Ｍ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０：６５９〜６６８、２００１）。したがって、ＬＹ２１１９３０１処理はＢａｘレベルに何ら影響を与えなかった（図１５および１６）。同様に、同じようにＧＳＫ−３βを阻害するリチウムによる処理はまた、ＡＤＲ、エトポシドおよび５−ＦＵに応答したｐ５３蓄積を損ない、ｐ５３標的遺伝子ｐ２１の誘導を減少させた（図１７、左図）。アポトーシス表現型と一致して、ＬＹ２１１９３０１またはリチウムの存在下において遺伝毒性剤で処理した細胞ではＰＡＲＰ切断が著しく増加した。対照的に、これらの細胞においてＧＳＫ−３αに対してのみ阻害的であるＳＢ−１２６７６３およびＳＢ−４１５２８６は、ｐ５３蓄積およびｐ２１誘導に影響を及ぼさず、ＰＡＲＰ切断を誘導しなかった（図１７、右図）。
【００８３】
[00115]その他のｐ５３標的にこれらの所見を適用するために、マイクロアレイ分析を使用してｐ５３誘導遺伝子の包括的な発現プロファイリングを実施した。既にＨＣＴ１１６細胞でｐ５３応答遺伝子のサブセットを同定した（Ｋｈｏ，Ｐ．Ｓ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：２１１８３〜２１１９２、２００４）。ＡＤＲおよびＬＹ２１１９３０１による同時処理は、これらの遺伝子の誘導を一様に弱めるので（図１８）、ＧＳＫ−３βはｐ５３依存性トランス活性化において重要で全体的な役割を担うことが示唆される。ＧＳＫ−３β不活性化は、Ｐｕｍａを含むｐ５３標的のトランス活性化を阻害しながらｐ５３媒介アポトーシスを促進するという矛盾した所見から、ＧＳＫ−３β阻害剤はｐ５３媒介転写とは独立した機構によってｐ５３依存性アポトーシスを促進するという興味を引く可能性が生じる。
【００８４】
[00116]ＧＳＫ−３β阻害剤ＬＹ２１１９３０１は、外因性ｐ５３によって誘導されるアポトーシスを促進する：次に、ＧＳＫ−３β不活性化はまた、外因性ｐ５３の過剰発現によって誘導されるアポトーシスを促進するかどうかを調べた。２種のｐ５３発現系、テトラサイクリン誘導性ｐ５３発現結腸癌ＤＬＤ１細胞系（Ｙｕ，Ｊ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１４５１７〜１４５２２、１９９９）およびｐ５３を発現するアデノウイルスを感染させたＨＣＴ１１６細胞を使用した。両方の場合において、強制的なｐ５３発現によって誘導されたアポトーシスは、ＬＹ２１１９３０１の存在下で著しく増加した（図１９および２０）。これらの条件下では、ＬＹ２１１９３０１は、おそらくこの場合はｐ５３の非生理学的制御のために、異所的に発現したｐ５３蛋白質レベルまたはｐ２１のｐ５３依存性転写に影響を及ぼさなかった（図１９および２０、右図）。したがって、ｐ２１とＰｕｍａなどのｐ５３アポトーシス誘発標的の間の平衡を変更するとｐ５３応答を増殖停止からアポトーシスに変換することができることが報告されたので、アポトーシスのこのような誘導は、ｐ２１の発現減少が原因ではないものと思われる（Ｓｅｏａｎｅ，Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ、４１９：７２９〜７３４、２００２；Ｉｙｅｒ，Ｎ．Ｇ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１：７３８６〜７３９１、２００４）。
【００８５】
[O0117]ＧＳＫ−３β阻害剤によって促進されるアポトーシスはＢａｘを必要とするがＰｕｍａは必要としない：アポトーシス誘発性Ｂｃｌ２ファミリーのメンバーＢａｘおよびＰｕｍａは、ｐ５３媒介アポトーシスに関与してきた（Ｙｕ，Ｊ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、７：６７３〜６８２、２００１；Ｙｕ，Ｊ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００：１９３１〜１９３６、２００３）。ＧＳＫ−３β不活性化後のｐ５３依存性アポトーシスにおけるＢａｘおよびＰｕｍａの役割をさらに評価するために、相同組換えによってこれらの遺伝子のいずれかが除去されたＨＣＴ１１６細胞を使用した（Ｚｈａｎｇ，Ｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：９８９〜９９２、２０００；Ｙｕ，Ｊ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００：１９３１〜１９３６、２００３）。ＬＹ２１１９３０１およびＡＤＲまたはエトポシドで一緒に処理すると、Ｂａｘ−／−細胞は完全にアポトーシスに対して無反応になった（図２１）。対照的に、Ｐｕｍａ−／−細胞はまだ、親ＨＣＴ１１６細胞と同様に、著しいアポトーシスを受けることが可能であった（図２２）。一貫して、ＰＡＲＰ切断はＢａｘ−／−細胞では認められなかったが（図２３）、Ｐｕｍａ−／−細胞では明らかで（図２４）、両方の細胞系において、ＡＤＲまたはエトポシド処理後のｐ５３蓄積およびｐ２１誘導はＬＹ２１１９３０１によって同様に減少した（図２３および２４）。これらの結果は、ＧＳＫ−３β阻害剤によって誘発されるｐ５３依存性転写独立性アポトーシスは、Ｂａｘを必要とするがＰｕｍａを必要としない経路によって進行することを示す。この知見を支持するように、結腸癌ＬｏＶｏ細胞はＤＮＡ損傷時にＬＹ２１１９３０１によって誘導されるアポトーシスに耐性であった（データは示さず）。ＬｏＶｏ細胞はｐ５３野生型であるが、Ｂａｘ遺伝子内のフレームシフト変異によってＢａｘ蛋白質を発現しない（Ｉｏｎｏｖ，Ｙ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７：１０８７２〜１０８７７、２０００）。
【００８６】
[00118]ＧＳＫ−３β阻害は、Ｂａｘのｐ５３依存性構造的活性化を促進し、ミトコンドリア性細胞死を誘導する：Ｂａｘはアポトーシス中に構造変化を受けることが知られている（Ｗｏｌｔｅｒ，Ｋ．Ｇ．他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ１、１３９：１２８１〜１２９２、１９９７）。次に、ＧＳＫ−３β阻害剤がＤＮＡ損傷後にＢａｘの構造的活性化を誘導するかどうかを調べた。ＨＣＴ１１６細胞をＬＹ２１１９３０１および遺伝毒性剤ＡＤＲ、エトポシドおよび５−ＦＵで一緒に処理すると、構造的に活性のあるＢａｘのレベルが劇的に増加し（図２５）、前述のように特異的抗Ｂａｘモノクローナル抗体６Ａ７によって検出することができた（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．他、Ｃｅｌｌ、１０３：６４５〜６５４、２０００；Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎ，Ａ．他、Ｅｍｂｏ  Ｊ、１８：２３３０〜２３４１、１９９９）。同一条件下において、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞ではＢａｘ構造の変化は検出されなかったので（図２５）、Ｂａｘ活性化はｐ５３依存性であると思われる。一貫して、ＬＹ２１１９３０１の存在下で、ＤＮＡ損傷後にチトクロムｃ放出およびカスパーゼ９プロセシングが増加することは明らかであった（図２５、下図）。Ｂａｘ活性化は、ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ１１６細胞において同様に、ＬＹ２１１９３０１の存在下でｐ５３過剰発現と同時に認められた（図２６）。さらに、ＪＣ−１染色およびＦＡＣＳによって測定したところ、ミトコンドリア膜電位の著しい減少が、ＬＹ２１１９３０１およびその他の遺伝子毒性治療で同時に処理したＢａｘ＋／＋細胞では検出されたが、同条件下でＢａｘ−／−細胞では検出されなかった（図２７）。総合すると、これらの結果はＧＳＫ−３β阻害剤がＢａｘ媒介ミトコンドリア経路によってｐ５３依存性アポトーシスを促進することを示す。
【００８７】
[00119]前記の結果は、ＧＳＫ−３β阻害剤がミトコンドリアにおいてｐ５３蓄積を可能にし、したがってＤＮＡ損傷後に認められるアポトーシスの原因となる可能性を提起する。この問題を解決するために、エトポシドおよび５−ＦＵで処理した後、様々な時点での細胞質およびミトコンドリア両方におけるｐ５３蓄積をまずモニターした。ミトコンドリアではエトポシドまたは５−ＦＵ処理後２時間という早さでｐ５３が蓄積したが、細胞質では薬剤処理後６時間までｐ５３の蓄積は認められないことを発見した（図２８）。このことは、マウス胸腺において、ＤＮＡ損傷が、細胞死の第１弾を導く、迅速なｐ５３のミトコンドリアにおける蓄積の引き金となることを示した最近の報告と一致する（Ｅａｓｔｅｒ，Ｓ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４：６７２８〜６７４１、２００４）。しかし、ＨＣＴ１１６細胞のミトコンドリアにおけるエトポシド誘導性ｐ５３蓄積はアポトーシスを誘導しなかった。このことは、ミトコンドリアにおけるｐ５３蓄積自体はＨＣＴ１１６細胞におけるアポトーシスの活性化に十分ではないことを示している。さらに、ＬＹ２１１９３０１の存在下では、エトポシド誘導性ｐ５３蓄積は、細胞質およびミトコンドリアの両方で同様に減少したが（図２８）、これらの条件下でアポトーシスの着実な誘導はなかった。したがって、結腸直腸癌細胞におけるミトコンドリアｐ５３誘導は、結腸直腸癌細胞におけるアポトーシス誘導のレベルと相関せず、ｐ５３に応答に対するＧＳＫ−３β阻害剤のアポトーシス効果は、ｐ５３のミトコンドリアへの転位の増加によるものではないらしいと結論づけられた。
【００８８】
[00120]当業者であれば理解できるように、本明細書で説明した例示的実施形態は多くの変更が可能である。本発明は、むしろ、このような変更すべてをクレームによって定義された範囲内に包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】ＬＹ２１１９３０１（５μＭ）、ＡＤＲ（１μＭ）または両方で２４時間処理したＨＣＴ１１６およびＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞の細胞周期分布を示したフローサイトメトリープロフィールを示した図である。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図１Ｂ】野生型またはｐ５３を発現しないＨＣＴ１１６結腸直腸細胞で認められたアポトーシスの割合を示した図である。
【図２】図１Ａのように処理し、活性抗カスパーゼ３で染色したＨＣＴ１１６細胞のフローサイトメトリープロフィールを示した図である。活性カスパーゼ３陽性の細胞の割合を示す。
【図３】ＬＹ２１１９３０１と一緒に、または一緒にせずに、エトポシド（１０μＭ）またはカンプトテシン（ＣＰＴ、１００ｎＭ）で２４時間処理したＨＣＴ１１６およびＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞の細胞周期分布を示したフローサイトメトリープロフィールを示した図である。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図４】ＬＹ２１１９３０１と一緒に、または一緒にせずに、アドリアマイシンまたはエトポシドで、またはＬＹ２１１９３０１単独で処理したＲＫＯ細胞の細胞周期分布を示したフローサイトメトリープロフィールを示した図である。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図５】ＬＹ２１１９３０１の存在下または非存在下で、変化する５−ＦＵの濃度に対するＨＣＴ１１６細胞の用量反応を示した図である。アポトーシス画分はフローサイトメトリーによって測定した。
【図６】ｐ５３ｓｈＲＮＡまたは指示した対照ベクターを発現するＨＣＴ１１６細胞におけるｐ５３レベルの分析を示した図である（左図）。指示した細胞は、ＬＹ２１１９３０１およびＡＤＲ（１μＭ）または５−ＦＵ（１００μＭ）で２４時間処理し、フローサイトメトリー分析を行った。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図７】図１Ａのように処理したＲＫＯおよびＲＫＯ／Ｅ６細胞のフローサイトメトリープロフィールを示した図である。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図８】３種類のＧＳＫ−３阻害剤、ＬＹ２１１９３０１、ＳＢ−２１６７６３およびＳＢ−４１５２８６の化学構造を示した図である。
【図９】リチウムで処理したＨＣＴ１１６細胞および前記のようにＤＮＡ損傷したＨＣＴ１１６細胞のフローサイトメトリープロフィールを示した図である。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図１０】ＡＤＲおよびＳＢ−２１６７６３またはＳＢ−４１５２８６で処理したＨＣＴ１１６細胞の細胞周期分布を示したフローサイトメトリープロフィールを示した図である。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図１１】ＡＤＲと一緒に、または一緒にせずに、ＬＹ２１１９３０１、ＳＢ−２１６７６３およびＳＢ−４１５２８６で処理した細胞におけるｐ５３、ｐ２１、ＰＡＲＰおよびβ−アクチンの相対的レベルを示したイムノブロットを示した図である。
【図１２】リチウム、ＬＹ２１１９３０１、ＳＢ−２１６７６３またはＳＢ−４１５２８６で処理したＨＣＴ１１６細胞におけるリン酸化ｓｅｒ９／２１−ＧＳＫ３α／β、リン酸化ｔｙｒ２１６／２７９−ＧＳＫ３α／βおよび全ＧＳＫ３α／βのイムノブロット分析を示した図である。
【図１３】１０μＭのエトポシドで２４時間処理する前に、ＧＳＫ−３βまたはＧＳＫ−３α特異的ｓｉＲＮＡおよび陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣｓｉＲＮＡ）で形質導入したＨＣＴ１１６細胞を示した図である。ＧＳＫ−３α／βおよびＰＡＲＰ切断のレベルは、イムノブロッティングによって分析した。
【図１４】核および細胞質画分において、ＡＤＲと一緒に、または一緒にせずにＬＹ２１１９３０１、ＳＢ−２１６７６３またはＳＢ−４１５２８６で処理した細胞におけるリン酸化ｓｅｒ９／２１−ＧＳＫ３α／β、リン酸化ｔｙｒ２１６／２７９−ＧＳＫ３α／βおよび全ＧＳＫ３α／βのイムノブロット分析を示した図である。
【図１５】指示した時間および用量について、ＬＹ２１１９３０１の存在下または非存在下で、ＡＤＲ（上図）、エトポシド（中図）、５−ＦＵ（下図）で処理したＨＣＴ１１６細胞におけるｐ５３、ｐ２１、ｐｕｍａ、ＢａｘおよびＰＡＲＰのイムノブロット分析を示した図である。βアクチンは添加対照として示す。
【図１６】図１５のように処理したＲＫＯ細胞におけるｐ５３、ｐ２１、ｐｕｍａ、ＢａｘおよびＰＡＲＰのイムノブロット分析を示した図である。
【図１７】リチウムと一緒に、または一緒にせずに、指示した薬剤で処理したＨＣＴ１１６細胞（左図）、およびＬＹ２１１９３０１、ＳＢ−２１６６７３またはＳＢ−４１５２８６の存在下でＡＤＲで処理したＨＣＴ１１６細胞（右図）におけるｐ５３、ｐ２１、ｐｕｍａ、ＢａｘおよびＰＡＲＰのイムノブロット分析を示した図である。
【図１８】ＡＤＲ単独またはＡＤＲおよびＬＹ２１１９３０１で処理したＨＣＴ１１６におけるｐ５３−応答性遺伝子を示すマイクロアレイ分析を示した図である。ＨＣＴ１１６細胞でｐ５３標的として既に同定された１２個の選択遺伝子をクラスター分類するために、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＶｉｅｗｅｒおよびＴｒｅｅ  Ｖｉｅｗｅｒを使用した。
【図１９】２０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含む（ｔｅｔ  ｏｆｆ）、または含まない（ｔｅｔ  ｏｎ）培地で２４時間培養したｐ５３誘導性ＤＬＤ１細胞を示した図である。左図：ＬＹ２１１９３０１の存在下または非存在下におけるＤＬＤ１細胞のフローサイトメトリープロフィール。右図：ｐ５３、ｐ２１およびＰＡＲＰのレベルを示したウェスタンブロットである。
【図２０】指示したようにＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺ感染したＨＣＴ１１６細胞を、ＬＹ２１１９３０１またはＤＭＳＯで２４時間処理した図である。細胞をフローサイトメトリー分析し（左図）、ｐ５３、ｐ２１およびＰＡＲＰ（右図）でイムノブロット分析した。ＮＳ−添加対照。
【図２１】ＬＹ２１１９３０１存在下または非存在下で、ＡＤＲまたはエトポシドで２４時間処理したＨＣＴ１１６Ｂａｘ−／−細胞の細胞周期分布を示したフローサイトメトリープロフィールを示した図である。アポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分は示した通りである。
【図２２】図２１におけるようにＨＣＴ１１６Ｐｕｍａ−／−細胞のフローサイトメトリープロフィールを示した図である。
【図２３】指示したように処理したＨＣＴ１１６Ｂａｘ−／−細胞におけるｐ５３、ｐ２１およびＰＡＲＰのイムノブロット分析を示した図である。
【図２４】指示したように処理したＨＣＴ１１６Ｐｕｍａ−／−細胞におけるｐ５３、ｐ２１およびＰＡＲＰのイムノブロット分析を示した図である。
【図２５】指示した薬剤で２４時間処理したＨＣＴ１１６細胞におけるＢａｘ活性化を示すウェスタンブロットを示した図である（上図）。ＬＹ２１１９３０１およびＡＤＲまたはエトポシドで一緒に処理したＨＣＴ１１６細胞におけるチトクロムｃ放出およびカスパーゼ９の蛋白質分解性を示す細胞質ゾル細胞画分のウェスタンブロット（下図）。
【図２６】ＬＹ２１１９３０１で処理し、ｐ５３を誘導したＤＬＤ１細胞（左図）およびｐ５３を過剰発現したＨＣＴ１１６細胞（右図）、におけるＢａｘ活性化を示すＩＰ−ウェスタンブロットを示した図である。
【図２７】ＨＣＴ１１６およびＨＣＴ１１６Ｂａｘ−／−細胞におけるミトコンドリア膜電位の指標としてＪＣ−１染色を示すフローサイトメトリープロフィールを示した図である。Ψｍを欠如した細胞の割合を示す。
【図２８】エトポシドおよび５−ＦＵ処理後の細胞質およびミトコンドリアにおけるｐ５３蓄積の時間経過分析を示した図である（上図）。ＬＹ２１１９３０１の存在下または非存在下で、エトポシドで２４時間処理した後のｐ５３の蓄積。ｐ５３およびミトコンドリアマーカーＣｏｘＩＶのレベルは、ウェスタンブロット分析によって測定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月9日(2006.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）活性を変更する薬剤の治療有効量を、それらを必要とし、かつ、現在化学療法を受けている対象、に投与することを含み、前記変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、細胞増殖性疾患の治療法。
【請求項２】
ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量を、それらを必要とする対象に、化学療法薬と組み合わせて投与することを含み、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、細胞増殖性疾患の治療法。
【請求項３】
前記細胞増殖性疾患は、癌である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記癌は、結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、鼻咽頭癌、子宮頸癌、皮膚癌および白血病から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌は、結腸直腸癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対象は、ヒトである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を細胞内で変更することを含む、現在化学療法を受けている細胞に細胞死を誘導する方法であって、前記変更は、前記細胞を、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加によってグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を変更する薬剤に接触させることを含む、方法。
【請求項８】
細胞を化学療法薬に接触させることと組み合わせて、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を細胞内で変更することを含む、細胞に細胞死を誘導する方法であって、前記変更は、前記細胞を、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加によってグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β活性を変更する薬剤に接触させることを含む、方法。
【請求項９】
前記化学療法は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項１または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記化学療法は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項１または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記化学療法は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドを含む、請求項１または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項２または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法薬は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドである請求項２または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、競合的ＡＴＰ阻害剤である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、Ｍｇ２＋の競合的阻害剤である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、蛋白質キナーゼ阻害剤である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＧＳＫ−３βのチロシンリン酸化の活性化を阻害する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、リチウム含有化合物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＬＹ２１１９３０１またはそれらの機能的類縁体または塩化リチウムである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＳＫ−３β活性の変更は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＳＫ−３β活性の変更は、ｐ５３活性化転写を阻害する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
現在化学療法を受けている対象の細胞増殖性疾患を治療するための、グリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、使用。
【請求項２４】
対象の細胞増殖性疾患を治療するための、化学療法薬と組み合わせたグリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、使用。
【請求項２５】
現在化学療法を受けている対象の細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における、グリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、使用。
【請求項２６】
対象の細胞増殖性疾患を治療するための薬剤の製造における、化学療法薬と組み合わせたグリコーゲンＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の治療有効量の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、使用。
【請求項２７】
前記細胞増殖性疾患は、癌である、請求２３〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記癌は、結腸直腸癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、鼻咽頭癌、子宮頸癌、皮膚癌および白血病から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記癌は、結腸直腸癌である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記対象は、ヒトである、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
現在化学療法を受けている細胞に細胞死を誘導するための、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、使用。
【請求項３２】
細胞に細胞死を誘導するための、化学療法薬と組み合わせたＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、方法。
【請求項３３】
現在化学療法を受けている細胞に細胞死を誘導するための薬剤の製造における、ＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、方法。
【請求項３４】
細胞に細胞死を誘導するための薬剤の製造における、化学療法薬と組み合わせたＧＳＫ−３β活性を変更する薬剤の使用であって、ＧＳＫ−３β活性の変更は、ＧＳＫ−３βの阻害的セリンリン酸化の増加を含む、使用。
【請求項３５】
前記化学療法は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２３、２５、３１および３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記化学療法は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項２３、２５、３１および３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記化学療法は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドを含む、請求項２３、２５、３１および３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２４、２６、３２および３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記化学療法薬は、ｐ５３依存性細胞周期停止を誘導する、請求項２４、２６、３２および３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記化学療法薬は、アドリアマイシン、５−フルオロウラシルまたはエトポシドである、請求項２４、２６、３２および３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、競合的ＡＴＰ阻害剤である、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、Ｍｇ２＋の競合的阻害剤である、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、蛋白質キナーゼ阻害剤である、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＧＳＫ−３βのチロシンリン酸化の活性化を阻害する、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４５】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、リチウム含有化合物である、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４６】
ＧＳＫ−３β活性を変更する前記薬剤は、ＬＹ２１１９３０１またはそれらの機能的類縁体または塩化リチウムである、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記使用は、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導する、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４８】
前記使用は、ｐ５３活性化転写を阻害する、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４９】
（ａ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βを試験化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βの阻害的セリンリン酸化は、前期試験化合物の存在下で増加し、それによって前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βの活性が変更するかどうかを決定するステップと
を含む、細胞増殖性疾患を治療するために有用な化合物の同定方法。
【請求項５０】
ステップ（ａ）は、前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βを発現する細胞を前記試験化合物と接触させることを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４９または５０のいずれかで定義した方法によって同定された、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βの阻害的セリンリン酸化を増加させる化合物。
【国際調査報告】
2008505890.tif 000032
2008505890.tif 000033