(57)【要約】【課題】既存の不飽和脂肪酸精製法における課題を解決し、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置を提供すること。【解決手段】Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、および、Ｃ１カラムからなる群から選択される少なくとも２種類のカラム、好ましくは、少なくとも３本のＣ１８カラムおよび少なくとも１本のＣ８カラムおよび／またはＣ４カラムおよび／またはＣ１カラムを備えるＳＭＢクロマトグラフィーを用いる分離法および装置を提供することによって、上記課題は、解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）少なくとも３本のＣ１８カラム；
（２）Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、およびＣ１カラムからなる群から選択される、少なくとも１本のカラム；ならびに、
（３）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
【請求項２】
前記試料が、蒸留した試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂溶性物質が、脂肪酸または脂肪酸誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂溶性物質が、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールエステルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、および、Ｃ１カラムからなる群から選択される少なくとも２種類の、少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
【請求項６】
前記試料が、蒸留した試料である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脂溶性物質が、脂肪酸または脂肪酸誘導体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記脂溶性物質が、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールエステルからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）少なくとも３本のＣ１８カラム；
（２）Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、およびＣ１カラムからなる群から選択される、少なくとも１本のカラム；ならびに、
（３）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）原料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
【請求項１０】
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、および、Ｃ１カラムからなる群から選択される少なくとも２種類の、少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）原料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
【請求項１１】
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）少なくとも２種類の、少なくとも４本の逆相カラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
【請求項１２】
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）少なくとも２種類の、少なくとも４本の逆相カラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）原料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４、および／または、Ｃ１カラムを用いる擬似移動層クロマトグラフィーによる分離精製法ならびにそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
不飽和脂肪酸類は、分子量、化学的性質が類似するため、相互に分離・精製することが難しい。従来より脂肪酸あるいはモノエステルの混合物から特定の脂肪酸を分離する方法としては、主として沸点の差、分子量の差、溶解度の差が利用されてきた。例えば、蒸留、分子ふるい、および、超臨界流体抽出が知られている。また二重結合数による分離法としては、ウインタリング、尿素付加、銀錯体形成、および、溶剤分別が挙げられる。
【０００３】
さらに銀イオン処理樹脂やC18充填剤を用いたクロマト法などがあるが、簡便である一方で分離が不十分であったり、高度精製は可能であるものの、工業的な大量処理には不向きであるなど、それぞれ一長一短がある。以下にこれまで不飽和脂肪酸およびその誘導体の精製に用いられてきた技術の課題について記載する。代表的な分離・精製法としては、例えば、（１）真空精密蒸留法、（２）分子蒸留法、（３）尿素付加法、（４）硝酸銀処理法、（５）固定層方式クロマトグラフィー、および、（６）擬似移動層クロマトグラフィーが挙げられる。各方法の特徴と課題は、以下のとおりである。
（１）真空精密蒸留法
特徴：各成分の沸点差を利用して分離する方法である。
課題：熱変性が有りうる。高純度品を精製する際に長時間がかかる。
（２）分子蒸留法
特徴：蒸留の際に熱的影響が少ない。
課題：分離能が低い。
（３）尿素付加法
特徴：溶解した尿素が結晶化する際に直鎖の分子を取り込みながら、六角柱状の付加物結晶を形成する性質を利用。
課題：選択性が低い。尿素付加物の派生による廃棄物処理。
（４）硝酸銀処理法
特徴：脂肪酸の二重結合に対して硝酸銀溶液が錯体を形成する性質を利用。
課題：銀の価格が不安定。夾雑物を抱き込む。
（５）固定層クロマトグラフィー
特徴：熱的影響が少ない。高精度な分離が可能。
課題：溶離液の使用量が多い。工業的な製造には向かない。
（６）擬似移動層クロマトグラフィー
特徴：溶離液の使用量が少なく、連続操作のため工業化に向いている。
課題：不飽和脂肪酸の分離によく用いられるＣ１８充填剤が高価である。単一溶媒しか使用できないので、グラジエントで分離ができない。
【０００４】
擬似移動層（以下「ＳＭＢ」ともいう）クロマトグラフィーは、従来の固定層クロマトグラフィーと異なり溶離液の使用量が少なく、連続操作が可能であることから工業的なクロマト精製によく利用されている。例えば、ｐ−キシレンはＳＭＢにより５０万ｔ／年製造されている。
【０００５】
一般的に、グラジエントを利用することによって、経時的に溶出条件を変化させることが可能であり、その結果、各成分間の分離が改善され、かつ、溶出までの時間が短縮される。しかしながらＳＭＢクロマトグラフィーでは、単一のカラムクロマトグラフィーにおいて行われるような異なる溶媒の割合を一定時間で変化させるグラジエントを利用することができず、単一の溶離液しか利用できない。
【０００６】
エイコサペンタエン酸エチルエステル（以下ＥＰＡエチル）の精製技術として、例えば特許文献１及び２では、不飽和脂肪酸およびその誘導体の工業的に優れた精製技術としてＳＭＢクロマトグラフィーが挙げられている。ＳＭＢクロマトグラフィーは、原料を連続的に供給しながらカラム吸着剤の層に形成される各画分の分布を定常状態に保つことにより目的成分である高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を連続的に取り出すことができる。
【０００７】
高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を分離する際に、カラム充填剤はＣ１８シリカゲルを使用することが多いが分離性能に対して高価であり工業化において更なる性能の向上が課題となる。
【０００８】
そこで、既存の不飽和脂肪酸精製法における課題を解決し、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置が求められている。
【０００９】
また、近年、不飽和脂肪酸は必須脂肪酸としてサプリメントで注目されているだけでなく、特にＥＰＡエチルがスイッチＯＴＣとして閉塞性動脈硬化症、高脂血症治療薬として認可を受けたため、医薬品グレードのＥＰＡエチルの市場が拡大している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２０１３−５１６３９８
【特許文献２】特開平８−２１８０９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
既存の不飽和脂肪酸精製法における課題を解決し、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置を提供することを課題とする。
【００１２】
また、高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を分離する際に、カラム充填剤はＣ１８シリカゲルを使用することが多いが分離性能に対して高価であることから、比較的安価な不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置を提供すること、並びに、分離性能の向上を課題とする。
【００１３】
本発明は、魚油、藻類の抽出油、遺伝子組み換え植物からの抽出油などの動植物および微生物油脂由来の高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からの精製技術、特に医薬品グレードの製品を工業的に安価に製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、ＳＭＢクロマトグラフィーにおいて、複数種類のカラムを同時に用いることによって、上記課題が解決された。
【００１５】
例えば、本発明では、ＳＭＢクロマトグラフィーにおいて、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４、および／または、Ｃ１カラムを用いる複数のシリカゲルカラムを４本以上用いる。溶離液としては、例えば、順層系（ｎ−ヘキサン）を用いることができるが、これに限定されない。
【００１６】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）少なくとも３本のＣ１８カラム；
（２）Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、およびＣ１カラムからなる群から選択される、少なくとも１本のカラム；ならびに、
（３）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
（項目２）
前記試料が、蒸留した試料である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記脂溶性物質が、脂肪酸または脂肪酸誘導体である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記脂溶性物質が、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールエステルからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、および、Ｃ１カラムからなる群から選択される少なくとも２種類の、少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
（項目６）
前記試料が、蒸留した試料である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記脂溶性物質が、脂肪酸または脂肪酸誘導体である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記脂溶性物質が、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールエステルからなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目９）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）少なくとも３本のＣ１８カラム；
（２）Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、およびＣ１カラムからなる群から選択される、少なくとも１本のカラム；ならびに、
（３）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン；
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）原料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
（項目１０）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、および、Ｃ１カラムからなる群から選択される少なくとも２種類の、少なくとも４本のカラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）原料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
（項目１１）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離方法であって、
ここで、該ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離を行う装置が、以下：
（１）少なくとも２種類の、少なくとも４本の逆相カラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該方法は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）試料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、方法。
（項目１２）
ＳＭＢクロマトグラフィーを用いる脂溶性物質の分離装置であって、以下：
（１）少なくとも２種類の、少なくとも４本の逆相カラム；ならびに、
（２）カラム間を連結する、カラム本数と同数の循環ライン
備え、
ここで、該装置は、以下：
（ａ）溶離液を第１の循環ラインに供給する工程；
（ａ）原料を第３の循環ラインに供給する工程；
（ｃ）第２の循環ラインおよび第４の循環ラインより分離溶液を抜き出す工程；ならびに、
（ｄ）該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインを切り替える工程；
を包含する方法によって脂溶性物質を分離し、ここで、該第１の循環ラインないし該第４の循環ラインは、上流より下流に、該第１の循環ライン、該第２の循環ライン、該第３の循環ライン、および、該第４の循環ラインの順番に並ぶ、装置。
【発明の効果】
【００１７】
本発明にしたがって、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＳＭＢクロマトグラフィーの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２０】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２１】
本明細書において使用される用語「ＳＭＢクロマトグラフィー」とは、液体クロマトグラフィーの原理を利用する分離法であって、原料中の特定の成分と、別の特定の成分に対して異なる選択的吸着能力を有する吸着剤が充填された複数の単位充填層を直列に連結するとともに、最下流部の単位充填層と最上流部の単位充填層とを連結し、無端状の循環系を形成した移動層をいう。
【００２２】
本明細書において使用される用語「原料の供給口」とは、ＳＭＢクロマトグラフィーに供される原料の供給口をいう。本明細書において使用される用語「成分抜き出し位置」とは、ＳＭＢクロマトグラフィーに供された溶液のカラムからの出口をいう。
【００２３】
本明細書において使用される用語「上流」とは、溶離液が流れ込む側をいい、用語「下流」とは、溶離液が流れ出す側をいう。
【００２４】
本明細書において使用される用語「循環ライン」とは、隣接するカラムを連結する部分をいう。循環ラインは、上流の成分抜き出し位置と下流の原料の供給口とを連結するか、あるいは、最下流の成分抜き出し位置と最上流の原料の供給口とを連結する。
【００２５】
本明細書において使用される用語「循環ラインを切り替える」とは、上流から下流にカラムＡ−カラムＢ−カラムＣ−カラムＤの順番で隣接する一連のカラムにおいて、カラムＢの出口とカラムＣの入口を連結する循環ラインを、（ｉ）カラムＡの出口とカラムＢの入口を連結する循環ラインとするか、または、（ｉｉ）カラムＣの出口とカラムＤの入口を連結する循環ラインとするかのいずれかをいう。
【００２６】
本明細書において使用される用語「逆相カラム」とは、移動相の極性が固定相の極性より高い分離系で使用されるカラムをいう。代表的な逆相カラムとしては、逆相シリカゲルカラムが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
本明細書において使用される用語「逆相シリカゲルカラム」とは、逆相シリカゲルを担体とするクロマトグラフィーカラムをいう。代表的な逆相シリカゲルカラムとしては、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、Ｃ４カラム、Ｃ１カラムが挙げられるがこれらに限定されない。逆相シリカゲルカラムは脂溶性からイオン性物質まで、広い範囲の化合物の分離に応用でき、現在もっとも広く用いられている手法である。
【００２８】
本明細書において使用される用語「Ｃ１８カラム」とは、オクタデシルシリル基で表面が修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲルを担体として使用するクロマトグラフフィーカラムをいう。単にＯＤＳカラムとも称する。
【００２９】
本明細書において使用される用語「Ｃ８カラム」とは、オクチル基で表面が修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲルを担体として使用するクロマトグラフフィーカラムをいう。
【００３０】
本明細書において使用される用語「Ｃ４カラム」とは、ブチル基で表面が修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲルを担体として使用するクロマトグラフフィーカラムをいう。
【００３１】
本明細書において使用される用語「Ｃ１カラム」とは、トリメチル基で表面が修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲルを担体として使用するクロマトグラフフィーカラムをいう。
【００３２】
本発明において使用するＳＭＢクロマトグラフィーは、４本以上のカラムを含む。本発明のＳＭＢクロマトグラフィーは、好ましくは、３本以上のＣ１８カラム、および、１本以上のＣ８カラムおよび／またはＣ４カラムおよび／またはＣ１カラムを備える。両者の好ましい組み合わせの比率としてＣ１８カラム：Ｃ８カラムおよび／またはＣ４カラムおよび／またはＣ１カラム＝３：１〜１２が挙げられる。
【００３３】
本発明のＳＭＢクロマトグラフィーに供する原料に用いる溶媒は、カラムクロマトグラフィーに供することができる液体である限り、あらゆる純度の液体を使用してもよい。例えば、原料から抽出した液体について、真空精密蒸留、ろ過、尿素付加、硝酸銀処理、および、固定層クロマトグラフィーからなる群から選択される方法によって目的脂肪酸を一部濃縮した液体を原料として使用することができる。用いる原料は遊離型脂肪酸又はエタノールやメタノールなどの低級アルコールエステルであることが望ましい。原料が固体の場合はメタノール、エタノール、ヘキサンなどの溶媒で溶解して用いる。
【００３４】
本願明細書で使用する場合、「真空精密蒸留」とは、ＥＰＡの場合、ＥＰＡを含む炭素鎖数が２０の成分は魚油脂肪酸の中で中間の沸点に位置しており、バッチ式の場合、単塔式蒸留装置を用いる事が、連続蒸留の場合、二塔式装置ないしは四塔式装置が必要となる。二塔式であればＣ１９以下の成分（初留）を留出させ、その残留分を第二塔に送りＣ２０成分を（主留）を分取することをいう。
【００３５】
本願明細書で使用する場合、「ろ過」とは、フィルターおよび／または吸着剤による原料の脱色や、過酸化物の除去をする方法をいう。代表的には、窒素雰囲気下で原料と吸着剤を混合・撹拌し、フィルタープレスにより吸着剤を除く方法をいう。本発明の方法においては、好ましい吸着剤としてシリカゲル、活性白土、活性炭、ゼオライトが挙げられるがこの限りではない。
【００３６】
本願明細書で使用する場合、「尿素付加」とは、原料と尿素メタノール溶液を混合し冷却、飽和脂肪酸やモノ不飽和脂肪酸を取り込んだ尿素付加物を形成させ、これをろ別する方法をいう。代表的には、尿素付加物からｎ−ヘキサン抽出し、シリカゲル処理の後、ｎ−ヘキサンを留去して目的の不飽和脂肪酸を得る方法をいう。
【００３７】
本願明細書で使用する場合、「硝酸銀処理」とは、高度不飽和脂肪酸エチルの場合、原料と硝酸銀溶液を撹拌し、未反応エステルを例えばｎ−ヘキサン抽出した後水相を希釈または加温、遊離したエステルを再度ｎ−ヘキサンにて抽出することにより目的の高度不飽和脂肪酸エチルの濃縮を行う方法をいう。
【００３８】
本願明細書で使用する場合、「固定層クロマトグラフィー」とは、カラムに充填剤を詰め、原料を溶離液で通過させることにより目的の成分を含む画分を取り出し、濃縮する方法をいう。本発明の方法においては、好ましい充填剤としてシリカゲル、逆相シリカゲル、硝酸銀含浸シリカゲルが挙げられるがこの限りではない。
【００３９】
本明細書において使用される用語「溶離液」とは、溶離液供給口Ｄを通じて供給される溶液である。使用するゲルおよび分離対象である物質に応じて、当業者は、容易に溶離液を決定することが可能である。逆相シリカゲルカラムを用いて脂溶性物質を分離する場合に使用可能な溶離液としては、極性の高い溶媒が一般的に用いられ、代表的には、水／メタノール、メタノール、エタノール、水/エタノール、水/アセトニトリル、アセトニトリル、アセトン、イソプロパノールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４０】
本明細書において使用される用語「脂溶性物質」とは、ｎ−ヘキサン又はエタノールなどの有機溶媒に溶解する化合物をいう。本発明における脂溶性物質としては、例えば、脂肪酸またはその誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明における「脂溶性物質」としては、例えば、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸等のω３系脂肪酸またはそれらの低級アルコールエステル、並びに、γ−リノレン酸、アラキドン酸等のω６系脂肪酸又はそれらのメタノールやエタノールの低級アルコールエステルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書において使用される用語「低級アルコールエステル」とは、脂肪酸またはその誘導体と低級アルコールとのエステルをいう。本明細書において使用される用語「低級アルコール」とは、炭素数１０以下の直鎖または分岐の任意のアルコールをいう。
【００４２】
（ＳＭＢクロマトグラフィー）
ＳＭＢクロマトグラフィーでは、無端状の循環系に対して原料と溶離液とを供給し、カラム内（単位充填層）を高速で移動するＸ成分（すなわち、弱親和性成分）と、カラム内を低速で移動するＹ成分（すなわち、親和性成分）とをそれぞれ異なる位置から抜き出す。そして、ＳＭＢクロマトグラフィーは、原料供給位置、溶離液供給位置、Ｘ成分抜き出し位置、およびＹ成分抜き出し位置を、一定の位置関係に保ちながら流体循環方向下流側に順次移動させることで、原料供給を連続的に行う処理操作を擬似的に実現する。その結果、層内での各成分の分布状態はほぼ一定の幅で移動し、各成分の抜出位置も、純度・濃度ともに高い部分を取り続けることが可能な操作方式である。
【００４３】
例示的なＳＭＢクロマトグラフィーを図１に示す。カラム１〜４を循環ラインで接続し、各カラム間の循環ラインに原料供給口Ｆ、溶離液供給口Ｄ、親和性成分の抜出口Ａ、弱親和性成分の抜出口Ｂを設け、循環する流れの方向に一定時間ごとに順次バルブを切り替えていく（すなわち、循環ラインを切り替えていく）。
【００４４】
例えば、原料供給口Ｆから供給された原料は、溶離液供給口Ｄから供給された溶離液のために、カラム３からカラム２に向かって移動する。その際、弱親和性成分であるＸ成分は、カラムに対する親和性が弱いため、より高速でカラムを移動する。逆に、親和性成分であるＹ成分は、カラムに対する親和性が強いため、より低速でカラムを移動する。その結果、Ｘ成分およびＹ成分の両者は異なる速度で移動し、その結果、これら両者は分離されていく。Ｘ成分とＹ成分を連続して分離するためには、これら両者の間の位置に原料供給口Ｆを提供する必要がある。Ｙ成分は、Ｘ成分よりも低速でカラムを移動するものの、溶離液供給口Ｄから供給された溶離液のために移動し続けるため、循環する流れの方向に一定時間ごとに順次バルブを切り替え、原料供給口ＦをＸ成分とＹ成分との間に維持する必要がある。すなわち、図１において一定時間経過後に、カラム４をカラム３の位置に移動させ、カラム３をカラム２の位置に移動させ、カラム２をカラム１の位置に移動させ、カラム１をカラム４の位置に移動させる（言い換えると、カラム１とカラム２を連結する循環ラインをカラム２とカラム３を連結する循環ラインに切り替え、カラム２とカラム３を連結する循環ラインをカラム３とカラム４を連結する循環ラインに切り替え、カラム３とカラム４を連結する循環ラインをカラム４とカラム１を連結する循環ラインに切り替え、カラム４とカラム１を連結する循環ラインをカラム１とカラム２を連結する循環ラインに切り替える。）。その結果、原料供給口Ｆは、カラム４とカラム３の間に移動し、弱親和性成分の抜出口Ｂは、カラム３とカラム２の間に移動し、溶離液供給口Ｄは、カラム２とカラム１の間に移動し、親和性成分の抜出口Ａは、カラム１とカラム４の間に移動する。
【００４５】
本発明のＳＭＢクロマトグラフィーでは、４本以上のカラムを用いるが。カラムの本数は特に限定されない。好ましくは、カラムの本数は、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、１２本、１３本、１４本、１５本、１６本、１７本、１８本、１９本、２０本であるが、これらに限定されない。カラム本数を４本よりも多くする場合、原料供給口Ｆと弱親和性成分の抜出口Ｂとの間、弱親和性成分の抜出口Ｂと溶離液供給口Ｄとの間、溶離液供給口Ｄと親和性成分の抜出口Ａとの間、および／または、親和性成分の抜出口Ａと原料供給口Ｆとの間に複数本のカラムを備えてもよい。
【００４６】
（C１８シリカゲルについて）
脂肪酸エステルの分離によく利用されるＣ１８シリカゲルはシリカゲル表面の水酸基にオクタデシルシリル基を結合させ、炭素鎖１８の疎水性分子を表面から伸ばした構造を取っている。この疎水性分子と各成分との間に生じる疎水性相互作用により充填剤への保持力が変化し、成分が分離される。保持の強さに関しては以下のような傾向がある。
（１）試料分子の二重結合が少ないほど保持が強い。
（２）試料分子の分子量が大きいほど保持が強い。
このため、特に高度不飽和脂肪酸の中でも利用価値の高いエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）やドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）は、天然由来の類縁物質であるエイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ω３）やアラキドン酸（Ｃ２０：４ω６）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）などの各成分の間で分子量や二重結合数の関係からＣ１８シリカゲルでの分離の難易度が高い。よって従来のＳＭＢで高純度品を得るために十分に成分を分離させる場合は、試料に対して充填剤を増やすか、試料の注入量を下げる必要がある。
【００４７】
（Ｃ８、Ｃ４、Ｃ１シリカゲルについて）
Ｃ８及びＣ４シリカゲルはＣ１８シリカゲルが炭素鎖１８の疎水性分子がシリカゲルに結合しているのに対し、それぞれ炭素鎖８、４の疎水性分子が結合している。このためＣ１８シリカゲルと比較し次のような特性を持つ。
（１）保持力が弱い。
（２）立体選択性が小さい。
これによりＣ１８にはない分離パターンを示し、物質によってはＣ１８シリカゲルよりも良好な分離条件を与える（例  キニーネとリドカイン）。
【００４８】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
（比較例１）
比較例として、Ｃ１８シリカゲルのみを用いた結果を記載する。
【００５０】
出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を使用した。原料濃度は、２００ｇ／Ｌ（メタノール溶液）であった。原料供給量は、１時間当り充填剤１Ｌ当り１０．５ｍＬ（１０．５ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）であった。充填剤は、Ｃ１８シリカゲル４本を用いた。カラムサイズは、直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍであった。溶離液としてのメタノールを、溶離液量１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で使用した。
【００５１】
結果として得られた精製品は、ＥＰＡエチルを純度９８．３％で含んでいた。類縁物質として、以下の物質が含まれていた：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．３１％
アラキドン酸エチル：          ０．４２％
イコサテトラエン酸エチル：    ０．４６％
その他の不純物：              ０．５１％。
【００５２】
ＥＰＡの回収率は８９％、ＰＯＶ（過酸化物価）は１．９、ＡＶ（酸価）は０．０３、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．５であった。以上の結果からこの製品は医薬、化粧品、食品分野で利用可能であることが判明した。
【００５３】
（実施例１）
Ｃ１８カラムとＣ８カラムを用いた結果は、以下のとおりである。
【００５４】
出発原料は、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂であった。原料濃度は、２００ｇ／Ｌ（メタノール溶液）であり、原料供給量を１時間当り充填剤１Ｌ当り２１ｍＬ（２１  ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）とした。使用したカラムは、Ｃ１８シリカゲルのカラム３本と、Ｃ８シリカゲルカラム１本であった（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのメタノールを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０  Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で使用した。
【００５５】
その結果、純度９８．３％のＥＰＡエチルが得られた。類縁物質として以下を含んでいた：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．２２％
アラキドン酸エチル：          ０．３２％
イコサテトラエン酸エチル：    ０．５５％
その他の不純物：              ０．６１％。
【００５６】
ＥＰＡの回収率は９２％であり、ＰＯＶ（過酸化物価）は２．２であり、ＡＶ（酸価）は０．０４であり、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．６であった。
【００５７】
以上の結果からＣ１８カラムのみを使用した比較例１と比較すると、原料供給量は約２倍まで処理可能となった。したがって、本発明では、従来より少ない充填剤量で医薬品グレードのＥＰＡエチルを製造できることが明らかになった。
【００５８】
（実施例２）
Ｃ１８カラムとＣ８カラムの比率を実施例１から変更して用いた結果は、以下のとおりである。
【００５９】
出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を使用した。原料濃度は、２００ｇ／Ｌ（メタノール溶液）であり、原料供給量として、１時間当り充填剤１Ｌ当り２１  ｍＬ（２１  ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）を使用した。使用したカラムは、Ｃ１８シリカゲルカラム２本、および、Ｃ８シリカゲルカラム２本である（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのメタノールを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０  Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で使用した。
【００６０】
その結果、純度９５．０％のＥＰＡエチルが得られた。類縁物質として、以下を含んでいた：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．６０％
アラキドン酸エチル：          ０．８４％
イコサテトラエン酸エチル：    １．３７％
その他の不純物：              ２．１９％
ＥＰＡの回収率は８０％であり、ＰＯＶ（過酸化物価）は２．０であり、ＡＶ（酸価）は０．０２であり、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．７であった。
【００６１】
以上の結果から比較例１と比較すると純度は３．３％低下したが、原料供給量は約２倍まで処理可能となった。
【００６２】
（実施例３）
Ｃ１８カラムとＣ４カラムを用いた結果は、以下のとおりである。
【００６３】
出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を使用した。原料濃度は、２００ｇ／Ｌ（メタノール溶液）であり、原料供給量として、１時間当り充填剤１Ｌ当り２１  ｍＬ（２１  ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）を使用した。使用したカラムは、Ｃ１８シリカゲルカラム３本、および、Ｃ４シリカゲルカラム１本である（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのメタノールを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０  Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で使用した。
【００６４】
その結果、純度９８．２％のＥＰＡエチルが得られた。類縁物質として、以下を含んでいた：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．３０％
アラキドン酸エチル：          ０．２９％
イコサテトラエン酸エチル：    ０．４４％
その他の不純物：              ０．７７％
ＥＰＡの回収率は８７％であり、ＰＯＶ（過酸化物価）は２．１であり、ＡＶ（酸価）は０．０３であり、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．７であった。
【００６５】
以上の結果から比較例１と比較すると純度は０．１％低下したが、原料供給量は約２倍まで処理可能となった。またその他データから医薬品グレードまで精製できたことが判明した。
【００６６】
（実施例４）
Ｃ１８カラムとＣ４カラムの比率を実施例３から変更して用いた結果は、以下のとおりである。
【００６７】
出発原料として、ＥＰＡエチルエステルを７５％含有する油脂を使用した。原料濃度は、２００ｇ／Ｌ（メタノール溶液）であり、原料供給量として、１時間当り充填剤１Ｌ当り２１  ｍＬ（２１  ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）を使用した。使用したカラムは、Ｃ１８シリカゲルカラム２本、および、Ｃ４シリカゲルカラム２本である（カラムサイズ：直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍ）。溶離液としてのメタノールを、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０  Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で使用した。
【００６８】
その結果、純度９８．６％のＥＰＡエチルが得られた。類縁物質として、以下を含んでいた：
オクタデカテトラエン酸エチル：０．２４％
アラキドン酸エチル：          ０．２１％
イコサテトラエン酸エチル：    ０．３６％
その他の不純物：              ０．５９％
ＥＰＡの回収率は７６％であり、ＰＯＶ（過酸化物価）は２．５であり、ＡＶ（酸価）は０．０３であり、ＡｎＶ（アニシジン価）は０．７であった。
【００６９】
以上の結果から比較例１と比較すると純度は０．３％上がり、原料供給量は約２倍まで処理可能となった。またその他データから医薬品グレードまで精製できたことが判明した。
【００７０】
（Ｃ１８シリカゲルとＣ８、Ｃ４、Ｃ１シリカゲルの併用について）
本発明ではＳＭＢクロマトグラフィーに２種類以上の分離性能の異なるカラム充填剤を用いること、特に、Ｃ１８カラムと、Ｃ８カラムおよび／またはＣ４カラムおよび／またはＣ１カラムとの組み合わせを用いることによって、単一種類のカラム充填剤の使用によっては分離が困難である複数の物質についても、容易かつ簡便に分離が可能となった。また、本発明では、従来のＳＭＢクロマトグラフィーよりも高精度かつ大量に分離（例えば、医薬品グレードまで精製）を行うことを可能とする。また、本発明の一つの局面においては、高精度の分離を短時間で、かつ、安価に終了することも可能である。
【００７１】
理論に拘束されることは望まないが、Ｃ１８シリカゲル、Ｃ８シリカゲル、Ｃ４シリカゲル、および、Ｃ１シリカゲルは、立体選択性が低いことから、成分保持力の強さは分子量よりも極性の差に依存する。このことから例を挙げるとエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）とエイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ω３）のような分子量は同じだが、極性に差があるような成分について分離度を向上させたと考えられる。またＣ８、Ｃ４、Ｃ１シリカゲルは保持力が弱いことから、成分の注入から抜き出しまでの時間が短くなる。よってＣ１８シリカゲルと比較した時の処理量が増える。これによりＳＭＢのカラム充填剤として分離能と処理能力の最適な組み合わせを行うことで、従来のＣ１８シリカゲルと比較して充填剤あたりの処理能力を向上させ、製造コストの低減に貢献できたと考えられる。
【００７２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ、その範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明にしたがって、高効率の不飽和脂肪酸精製法およびそのための装置が提供される。
【図１】
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