(57)【要約】  本発明は、免疫原として有用なタンパク質／ポリペプチド担体分子を含むペプチド免疫原のコンジュゲートを生産する方法を対象とし、ここでペプチド免疫原はタンパク質担体に、担体の、または場合により結合したリンカー分子のアミノ酸残基上の活性化官能基を介して結合され、そしてここでアミノ酸残基上の任意の非結合反応性官能基はキャッピングにより不活性化され、これにより担体分子の免疫学的機能性は保持されるが、コンジュゲートの安全性または効果を下げる可能性がある望ましくない反応に関する傾向を減少させる。さらに、本発明はそのような免疫原生成物およびそのような方法により作成されたそのような免疫原生成物を含有する免疫原組成物にも関する。
2008505052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド免疫原を、該ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基を介して、１もしくは複数の官能基を有するタンパク質／ポリペプチド担体に結合する方法であって：
（ａ）タンパク質／ポリペプチド担体または、場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に結合したポリペプチドリンカーの１もしくは複数の官能基を誘導化して反応性部位を持つ誘導化担体を生成し；
（ｂ）工程（ａ）の誘導化タンパク質／ポリペプチド担体を、ペプチド免疫原が誘導化タンパク質／ポリペプチド担体に官能基を介して結合するような反応条件下でペプチド免疫原のアミノ酸の反応性基と反応させ；そして
（ｃ）さらにコンジュゲートをキャッピング試薬と反応させて、誘導化タンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性未反応官能基を不活性化し、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項２】
担体がヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体がＴ−細胞エピトープを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
担体がバクテリアトキソイドである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
担体がインフルエンザ血球凝集素である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
担体がＰＡＤＲＥポリペプチドである請求項３に記載の方法。
【請求項７】
担体がマラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質である請求項３に記載の方法。
【請求項８】
担体がＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）である請求項３に記載の方法。
【請求項９】
担体が熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）である請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
担体がヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）由来のポリペプチドである請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
担体が破傷風トキソイドである請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
バクテリアトイソイドがＣＲＭ１９７である請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
担体が組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼである請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４である請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４である請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２である請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７である請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８である請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
担体が免疫応答を刺激または強化する増殖因子またはホルモンである請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
増殖因子またはホルモンがＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ペプチド免疫原がバクテリアに由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
バクテリアが肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、シュードモナス  エアレーションズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒａｔｉｏｎｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ペプチド免疫原がウイルスに由来するタンパク質抗原から誘導化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ペプチド免疫原が真菌に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
真菌がカンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ペプチド免疫原が寄生生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
寄生生物がプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）およびリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ペプチド免疫原が真核生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
真核生物がヒトである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヒト由来のペプチド免疫原が悪性腫瘍から誘導化される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍抗原が腎臓細胞癌腫抗原、胸部癌腫抗原、癌胎児性抗原、メラノーマ（ＭＡＧＥ）抗原および前立腺ガン特異的抗原からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ペプチド免疫原がヒトＡβポリペプチドに由来する請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＣ−末端領域から誘導化される請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドの内部領域から誘導化される請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
Ａβペプチド免疫原がＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数のフラグメントが別のペプチド免疫原に融合されている請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の分子のＮ−末端に融合されている請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＣ−末端に融合されている請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端でＡβペプチド免疫原の異なる分子のＣ−末端に融合されている請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＮ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項４１、４２、４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項４１、４２、４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が異種ペプチドの１もしくは複数の分子に連結されている請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
異種ペプチドがＴ−細胞エピトープ、Ｂ−細胞エピトープおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態に一緒に連結されている請求項４０に記載の方法。  
【請求項５２】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態中の異なるＡβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子に一緒に連結されている請求項４０に記載の方法。  
【請求項５３】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５５】
タンパク質／ポリペプチド担体または場合により結合されたポリペプチドリンカーの１もしくは複数のアミノ酸分子の官能基が、架橋化試薬を使用して誘導化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
誘導化試薬がゼロ−長の架橋化試薬である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
誘導化試薬がホモ二官能性架橋化試薬である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
誘導化試薬がヘテロ二官能性架橋化試薬である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
タンパク質／ポリペプチド担体がハロアセチル化試薬と反応させられる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
ヘテロ二官能性架橋化試薬が、タンパク質／ポリペプチド担体の１もしくは複数のアミノ酸残基の１級またはε−アミン官能基、およびペプチド免疫原の１もしくは複数のアミノ酸残基のペンダントチオール基と反応する試薬である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
ヘテロ二官能性架橋化試薬がＮ−スクシンイミジルブロモアセテート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
１級またはε−アミン官能基がリシンである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ペンダントチオール基がペプチド免疫原のシステイン残基である請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
システイン残基がペプチド免疫原がアミノ末端に局在している請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
システイン残基がペプチド免疫原がカルボキシ末端に局在している請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
システイン残基がペプチド免疫原の内部に局在している請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
ペンダントチオール基がチオール化試薬により生成される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
チオール化試薬がＮ−アセチルホモシステインチオラクトンである請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性官能基を不活性化するために使用されるキャッピング試薬が、システアミン、Ｎ−アセチルシステアミンおよびエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７０】
活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性官能基を不活性化するために使用されるキャッピング試薬が、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウムおよびアンモニアからなる試薬群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７１】
ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基が遊離のスルフヒドリル基である請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
１もしくは複数の官能基が、場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に結合したリンカー上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項７３】
リンカーがペプチドリンカーである請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ペプチドリンカーがポリリシンである請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
構造：
【化１】
2008505052.tif 000041
ここでＣはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化可能な官能基であり、そしてここでｍは０より大きな整数であるが、８５以下である、
を有するタンパク質／ポリペプチド担体にペプチド免疫原を結合する方法であって：
（ａ）タンパク質／ポリペプチド担体、または場合により結合したリンカー分子の１もしくは複数の官能基を誘導化して反応性部位を持つ誘導化分子を生成し；
（ｂ）工程（ａ）の誘導化タンパク質／ポリペプチド担体を、ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基と反応させて共有的にカップリングしたペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートを形成し；そして
（ｃ）さらに該コンジュゲートをキャッピング試薬と反応させて、キャッピングした基が他の分子と自由に反応しないようにし、活性化タンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性官能基を不活性化して、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持して、式：
【化２】
2008505052.tif 000042
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸｄはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここで
Ｐはタンパク質担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したペプチド免疫原分子であり、
Ｒはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、
ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そして
ｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
を有するキャッピングされたペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートを生成する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項７６】
担体が血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
担体がＴ−細胞エピトープを含む請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
担体がバクテリアトキソイドである請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
担体がインフルエンザ血球凝集素である請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
担体がＰＡＤＲＥポリペプチドである請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
担体がマラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質である請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
担体がＢ型肝炎表面抗原（ＨＳＢＡｇ１９−２８）である請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
担体が熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）である請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
担体がヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）由来のポリペプチドである請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
担体が破傷風トキソイドである請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
バクテリアトイソイドがＣＲＭ１９７である請求項７８に記載の方法。
【請求項８７】
担体が連鎖球菌ｒＣ５ａペプチダーゼである請求項７７に記載の方法。
【請求項８８】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４である請求項７７に記載の方法。
【請求項８９】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４である請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２である請求項７７に記載の方法。
【請求項９１】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７である請求項７７に記載の方法。
【請求項９２】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８である請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
担体が免疫応答を刺激または強化する増殖因子またはホルモンである請求項７５に記載の方法。
【請求項９４】
増殖因子またはホルモンがＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項９６】
ペプチド免疫原がバクテリアに由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
バクテリアが肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエーラ  エンテロバクター（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌からなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ペプチド免疫原がウイルスに由来するタンパク質抗原から誘導化される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
ペプチド免疫原が真菌に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
真菌がカンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ペプチド免疫原が寄生生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
寄生生物がプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）およびリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）からなる群から選択される請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ペプチド免疫原が真核生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項９６に記載の方法。
【請求項１０５】
真核生物がヒトである請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
ヒト由来のペプチド免疫原が悪性腫瘍から誘導化される請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
腫瘍抗原が腎臓細胞癌腫抗原、胸部癌腫抗原、癌胎児性抗原、メラノーマ（ＭＡＧＥ）抗原および前立腺ガン特異的抗原である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
ペプチド免疫原がヒトＡβポリペプチドに由来する請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化される請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＣ−末端領域から誘導化される請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドの内部領域から誘導化される請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
ペプチド免疫原がＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
ペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１４】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が別のペプチド免疫原に融合されている請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＮ−末端に融合されている請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＣ−末端に融合されている請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＮ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
ＡβフラグメントがＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項１１５、１１６、１１７または１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
ＡβフラグメントがＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１１５、１１６、１１７または１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が異種ペプチドの１もしくは複数の分子に融合されている請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
異種ペプチドがＴ−細胞エピトープ、Ｂ−細胞エピトープおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態に一緒に連結されている請求項１１４に記載の方法。  
【請求項１２６】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態中の異なるＡβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子に一緒に連結されている請求項１１４に記載の方法。  
【請求項１２７】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項１２５または１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１２５または１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
タンパク質／ポリペプチド担体または場合により結合されたポリペプチドリンカーの１もしくは複数のアミノ酸分子の官能基が、架橋化試薬を使用して誘導化される、請求項７５に記載の方法。
【請求項１３０】
誘導化試薬がゼロ−長の架橋化試薬である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
誘導化試薬がホモ二官能性架橋化試薬である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
誘導化試薬がヘテロ二官能性架橋化試薬である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
タンパク質／ポリペプチド担体がハロアセチル化試薬と反応させられる、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
ヘテロ二官能性架橋化試薬が、タンパク質／ポリペプチド担体の１もしくは複数のアミノ酸残基の１級またはε−アミン官能基、およびペプチド免疫原の１もしくは複数のアミノ酸残基のペンダントチオール基と反応する試薬である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
ヘテロ二官能性架橋化試薬がＮ−スクシンイミジルブロモアセテート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
１級またはε−アミン官能基がリシンである請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
タンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基リシンの１級またはε−アミン官能基のＮ−スクシンイミジルブロモアセテートを用いた誘導化が、タンパク質／ポリペプチド担体のリシン残基上の１級またはε−アミン残基のブロモアセチル化を生じる、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
ペンダントチオール基がペプチド免疫原のシステイン残基である請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３９】
システイン残基がペプチド免疫原がアミノ末端に局在している請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
システイン残基がペプチド免疫原がカルボキシ末端に局在している請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
システイン残基がペプチド免疫原の内部に局在している請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
ペンダントチオール基がチオール化試薬により生成される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
チオール化試薬がＮ−アセチルホモシステインチオラクトンである請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体の遊離の反応性官能基を不活性化するために使用されるキャッピング試薬が、システアミン、Ｎ−アセチルシステアミンおよびエタノールアミンからなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項１４５】
活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性官能基を不活性化するために使用されるキャッピング試薬が、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウムおよびアンモニアからなる試薬群から選択される請求項７５に記載の方法。
【請求項１４６】
ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基が遊離のスルフヒドリル基である請求項７５に記載の方法。
【請求項１４７】
１もしくは複数の官能基が、場合によりタンパク質／ポリペプチドに結合したリンカー上にある、請求項７５に記載の方法。
【請求項１４８】
リンカーがペプチドリンカーである請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
ペプチドリンカーがポリリシンである請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
タンパク質／ポリペプチド担体が式：
【化３】
2008505052.tif 000043
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化可能な官能基であり、そしてここでｍは０より大きな整数であるが、８５以下である、
を有するペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートであって、式：
【化４】
2008505052.tif 000044
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸｄはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここでＰはタンパク質担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したペプチド免疫原分子であり、Ｒはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持し、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
で表されるペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲート。
【請求項１５１】
担体が血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項１５０に記載のコンジュゲート。
【請求項１５２】
担体がＴ−細胞エピトープを含む請求項１５０に記載のコンジュゲート。
【請求項１５３】
担体がバクテリアトキソイドである請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５４】
担体がインフルエンザ血球凝集素である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５５】
担体がＰＡＤＲＥポリペプチドである請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５６】
担体がマラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５７】
担体がＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５８】
担体が熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５９】
担体がヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）由来のポリペプチドである請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６０】
担体が破傷風トキソイドである請求項１５３に記載のコンジュゲート。
【請求項１６１】
バクテリアトイソイドがＣＲＭ１９７である請求項１５３に記載のコンジュゲート。
【請求項１６２】
担体が連鎖球菌ｒＣ５ａペプチダーゼである請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６３】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６４】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６５】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６６】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６７】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８である請求項１５２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６８】
担体が免疫応答を刺激または強化する増殖因子またはホルモンである請求項１５０に記載のコンジュゲート。
【請求項１６９】
増殖因子またはホルモンがＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項１６８に記載のコンジュゲート。
【請求項１７０】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項１５０に記載のコンジュゲート。
【請求項１７１】
ペプチド免疫原がバクテリアに由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項１７０に記載のコンジュゲート。
【請求項１７２】
バクテリアが肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエーラ  エンテロバクター（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌からなる群から選択される、請求項１７１に記載のコンジュゲート。
【請求項１７３】
ペプチド免疫原がウイルスに由来するタンパク質抗原から誘導化される、請求項１７０に記載のコンジュゲート。
【請求項１７４】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される、請求項１７３に記載のコンジュゲート。
【請求項１７５】
ペプチド免疫原が真菌に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項１７０に記載のコンジュゲート。
【請求項１７６】
真菌がカンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からなる群から選択される、請求項１７５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７７】
ペプチド免疫原が寄生生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項１７０に記載のコンジュゲート。
【請求項１７８】
寄生生物がプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）およびリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）からなる群から選択される請求項１７７に記載のコンジュゲート。
【請求項１７９】
ペプチド免疫原が真核生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項１７０に記載のコンジュゲート。
【請求項１８０】
真核生物がヒトである請求項１７９に記載のコンジュゲート。
【請求項１８１】
ヒト由来のペプチド免疫原が悪性腫瘍から誘導化される請求項１８０に記載のコンジュゲート。
【請求項１８２】
腫瘍抗原が腎臓細胞癌腫抗原、胸部癌腫抗原、癌胎児性抗原、メラノーマ（ＭＡＧＥ）抗原および前立腺ガン特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）からなる群から選択される、請求項１８１に記載のコンジュゲート。
【請求項１８３】
ペプチド免疫原がヒトＡβポリペプチドに由来する請求項１８０に記載のコンジュゲート。
【請求項１８４】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化される請求項１８３に記載のコンジュゲート。
【請求項１８５】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＣ−末端領域から誘導化される請求項１８３に記載のコンジュゲート。
【請求項１８６】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドの内部領域から誘導化される請求項１８３に記載のコンジュゲート。
【請求項１８７】
ペプチド免疫原がＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１８３に記載のコンジュゲート。
【請求項１８８】
ペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１８３に記載のコンジュゲート。
【請求項１８９】
Ａβの１もしくは複数の分子が別のペプチド免疫原の１もしくは複数の分子に融合されている請求項１８３に記載のコンジュゲート。
【請求項１９０】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＮ−末端に融合されている請求項１８９に記載のコンジュゲート。
【請求項１９１】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＣ−末端に融合されている請求項１８９に記載のコンジュゲート。
【請求項１９２】
Ａβペプチド免疫原の分子がそのＣ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項１８９に記載のコンジュゲート。
【請求項１９３】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＮ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項１８９に記載のコンジュゲート。
【請求項１９４】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項１９０、１９１、１９２または１９３に記載のコンジュゲート。
【請求項１９５】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１９０、１９１、１９２または１９３に記載のコンジュゲート。
【請求項１９６】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が異種ペプチドの１もしくは複数の分子に連結されている請求項１８９に記載のコンジュゲート。
【請求項１９７】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項１９６に記載のコンジュゲート。
【請求項１９８】
ＡβフラグメントがＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項１９６に記載のコンジュゲート。
【請求項１９９】
異種ペプチドがＴ−細胞エピトープ、Ｂ−細胞エピトープおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１９６に記載のコンジュゲート。
【請求項２００】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態に一緒に連結されている請求項１８９に記載のコンジュゲート。  
【請求項２０１】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態中の異なるＡβペプチド免疫原の１もしくは複数のコピーに連結されている請求項１８９に記載のコンジュゲート。  
【請求項２０２】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項２００または２０１に記載のコンジュゲート。
【請求項２０３】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２００または２０１に記載のコンジュゲート。
【請求項２０４】
請求項７５に記載の方法に従い生成され、そして式：
【化５】
2008505052.tif 000045
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸｄはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここでＰはタンパク質担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したペプチド免疫原分子であり、Ｒはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、これが担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘導する担体のその能力を保持し、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
を有するペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲート。
【請求項２０５】
担体がヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項２０４に記載のコンジュゲート。
【請求項２０６】
担体がＴ−細胞エピトープを含む請求項２０４に記載のコンジュゲート。
【請求項２０７】
担体がバクテリアトキソイドである請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２０８】
担体がインフルエンザ血球凝集素である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２０９】
担体がＰＡＤＲＥポリペプチドである請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１０】
担体がマラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１１】
担体がＢ型肝炎表面抗原（ＨＳＢＡｇ１９−２８）である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１２】
担体が熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１３】
担体がヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）由来のポリペプチドである請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１４】
担体が破傷風トキソイドである請求項２０７に記載のコンジュゲート。
【請求項２１５】
バクテリアトイソイドがＣＲＭ１９７である請求項２０７に記載のコンジュゲート。
【請求項２１６】
担体が連鎖球菌ｒＣ５ａペプチダーゼである請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１７】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１８】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１９】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２２０】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２２１】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８である請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２２２】
担体が免疫応答を刺激または強化する増殖因子またはホルモンである請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２２３】
増殖因子またはホルモンがＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項２２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２２４】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質、真菌のタンパク質、寄生生物のタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項２０６に記載のコンジュゲート。
【請求項２２５】
ペプチド免疫原がバクテリアに由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２２６】
バクテリアが肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエーラ  エンテロバクター（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌からなる群から選択される、請求項２２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２２７】
ペプチド免疫原がウイルスに由来するタンパク質抗原から誘導化される、請求項２２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２２８】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される、請求項２２７に記載のコンジュゲート。
【請求項２２９】
ペプチド免疫原が真菌に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２３０】
真菌がカンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からなる群から選択される、請求項２２９に記載のコンジュゲート。
【請求項２３１】
ペプチド免疫原が寄生生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２３２】
寄生生物がプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）およびリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）からなる群から選択される請求項２３１に記載のコンジュゲート。
【請求項２３３】
ペプチド免疫原が真核生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２３４】
真核生物がヒトである請求項２３３に記載のコンジュゲート。
【請求項２３５】
ヒト由来のペプチド免疫原が悪性腫瘍から誘導化される請求項２３４に記載のコンジュゲート。
【請求項２３６】
腫瘍抗原が腎臓細胞癌腫抗原、胸部癌腫抗原、癌胎児性抗原、メラノーマ抗原および前立腺ガン特異的抗原からなる群から選択される、請求項２３５に記載のコンジュゲート。
【請求項２３７】
ペプチド免疫原がヒトＡβポリペプチドに由来する請求項２３４に記載のコンジュゲート。
【請求項２３８】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化される請求項２３７に記載のコンジュゲート。
【請求項２３９】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＣ−末端領域から誘導化される請求項２３７に記載のコンジュゲート。
【請求項２４０】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドの内部領域から誘導化される請求項２３７に記載のコンジュゲート。
【請求項２４１】
Ａβペプチド免疫原がＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２３７に記載のコンジュゲート。
【請求項２４２】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２３７に記載のコンジュゲート。
【請求項２４３】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が別のペプチド免疫原に融合されている請求項２３７に記載のコンジュゲート。
【請求項２４４】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＮ−末端に融合されている請求項２４３に記載のコンジュゲート。
【請求項２４５】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＣ−末端に融合されている請求項２４３に記載のコンジュゲート。
【請求項２４６】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項２４３に記載のコンジュゲート。
【請求項２４７】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＮ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項２４３に記載のコンジュゲート。
【請求項２４８】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項２４４、２４５、２４６または２４７に記載のコンジュゲート。
【請求項２４９】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２４４、２４５、２４６または２４７に記載のコンジュゲート。
【請求項２５０】
Ａβの１もしくは複数のフラグメントが異種ペプチドの１もしくは複数の分子に連結されている請求項２４３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５１】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項２５０に記載のコンジュゲート。
【請求項２５２】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２５０に記載のコンジュゲート。
【請求項２５３】
異種ペプチドがＴ−細胞エピトープ、Ｂ−細胞エピトープおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項２５０に記載のコンジュゲート。
【請求項２５４】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態に一緒に連結されている請求項２４３に記載のコンジュゲート。  
【請求項２５５】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態中の異なるＡβペプチド免疫原の１もしくは複数のコピーに連結されている請求項２４３に記載のコンジュゲート。  
【請求項２５６】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項２５４または２５５に記載のコンジュゲート。
【請求項２５７】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２４５または２５５に記載のコンジュゲート。
【請求項２５８】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が異種ペプチドの１もしくは複数の分子に連結されている、請求項２４３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５９】
異種ペプチドがＴ−細胞エピトープ、Ｂ−細胞エピトープおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項２５８に記載のコンジュゲート。
【請求項２６０】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２５８に記載のコンジュゲート。
【請求項２６１】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２５８に記載のコンジュゲート。
【請求項２６２】
請求項７５に記載の方法により生成したペプチド免疫原とタンパク質／ポリペプチド担体とのコンジュゲートを、１もしくは複数の製薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含んでなる免疫原性組成物。
【請求項２６３】
担体がヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項２６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６４】
担体がＴ−細胞エピトープを含む請求項２６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６５】
担体がバクテリアトキソイドである請求項２６４に記載の方法。
【請求項２６６】
担体がインフルエンザ血球凝集素である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６７】
担体がＰＡＤＲＥポリペプチドである請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６８】
担体がマラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６９】
担体がＢ型肝炎表面抗原（ＨＳＢＡｇ１９−２８）である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７０】
担体が熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７１】
担体がヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）由来のポリペプチドである請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７２】
バクテリアトキソイドが破傷風トキソイドである請求項２６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７３】
バクテリアトイソイドがＣＲＭ１９７である請求項２６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７４】
担体が連鎖球菌ｒＣ５ａペプチダーゼである請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７５】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７６】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７７】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７８】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７９】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８である請求項２６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８０】
担体が免疫応答を刺激または強化する増殖因子またはホルモンである請求項２６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８１】
増殖因子またはホルモンがＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項２８０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８２】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質、真菌のタンパク質、寄生生物のタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項２６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８３】
ペプチド免疫原がバクテリアに由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８４】
バクテリアが肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエーラ  エンテロバクター（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌からなる群から選択される、請求項２８３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８５】
ペプチド免疫原がウイルスに由来するタンパク質抗原から誘導化される、請求項２８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８６】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される、請求項２８５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８７】
ペプチド免疫原が真菌に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８８】
真菌がカンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からなる群から選択される、請求項２８７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８９】
ペプチド免疫原が寄生生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９０】
寄生生物がプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）およびリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）からなる群から選択される請求項２８９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９１】
ペプチド免疫原が真核生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項２８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９２】
真核生物がヒトである請求項２９１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９３】
ヒト由来のペプチド免疫原が悪性腫瘍から誘導化される請求項２９２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９４】
ペプチド免疫原が腎臓細胞癌腫抗原、胸部癌腫抗原、癌胎児性抗原、メラノーマ抗原および前立腺ガン特異的抗原からなる群から選択される、請求項２９３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９５】
ペプチド免疫原がヒトＡβポリペプチドに由来する請求項２９２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９６】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化される請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９７】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＣ−末端領域から誘導化される請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９８】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドの内部領域から誘導化される請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９９】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３００】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０１】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で、同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＮ−末端に融合されている請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０２】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＣ−末端に融合されている請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０３】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０４】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＮ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０５】
ＡβフラグメントがＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項３０１、３０２、３０３または３０４に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０６】
ＡβフラグメントがＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３０１、３０２、３０３または３０４に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０７】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が異種ペプチドの１もしくは複数の分子に連結されている請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０８】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項３０７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０９】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３０７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１０】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態に一緒に連結されている請求項２９５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１１】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態中の異なるＡβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子に連結されている請求項２９５に記載の免疫原性組成物。  
【請求項３１２】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項３１０または３１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１３】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３１０または３１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１４】
１もしくは複数のアジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦ、５２９ＳＥ、ＩＬ−１２、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バクテリアリポ多糖、アミノアルキルグルコサミンリン酸塩化合物、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）、ポリペプチド、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、百日咳トキシン（ＰＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）非耐熱性トキシン（ＬＴ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βからなる群から選択される請求項２６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１５】
ペプチド免疫原がＡβであり、担体がＣＲＭ１９７であり、そしてアジュバントが５２９ＳＥである請求項３１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１６】
請求項２６２に記載の有効量の免疫原性組成物を個体に投与することを含んでなる、哺乳動物個体において免疫応答を誘導する方法。
【請求項３１７】
担体がヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項３１６に記載の方法。
【請求項３１８】
担体がＴ−細胞エピトープを含む請求項３１６に記載の方法。
【請求項３１９】
担体がバクテリアトキソイドである請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２０】
担体がインフルエンザ血球凝集素である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２１】
担体がＰＡＤＲＥポリペプチドである請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２２】
担体がマラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２３】
担体がＢ型肝炎表面抗原である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２４】
担体が熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２５】
担体がヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）由来のポリペプチドである請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２６】
バクテリアトキソイドが破傷風トキソイドである請求項３１９に記載の方法。
【請求項３２７】
バクテリアトイソイドがＣＲＭ１９７である請求項３１９に記載の方法。
【請求項３２８】
担体が連鎖球菌ｒＣ５ａペプチダーゼである請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２９】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３３０】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３３１】
担体が溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３３２】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３３３】
担体がクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８である請求項３１８に記載の方法。
【請求項３３４】
担体が免疫応答を刺激または強化する増殖因子またはホルモンである請求項３１６に記載の方法。
【請求項３３５】
増殖因子またはホルモンがＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項３３４に記載の方法。
【請求項３３６】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項３１６に記載の方法。
【請求項３３７】
ペプチド免疫原がバクテリアに由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項３３６に記載の方法。
【請求項３３８】
バクテリアが肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエーラ  エンテロバクター（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌からなる群から選択される、請求項３３７に記載の方法。
【請求項３３９】
ペプチド免疫原がウイルスに由来するタンパク質抗原から誘導化される、請求項３３６に記載の方法。
【請求項３４０】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される、請求項３３９に記載の方法。
【請求項３４１】
ペプチド免疫原が真菌に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項３３６に記載の方法。
【請求項３４２】
真菌がカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からなる群から選択される、請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４３】
ペプチド免疫原が寄生生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項３３６に記載の方法。
【請求項３４４】
寄生生物がプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）およびリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）からなる群から選択される請求項３４３に記載の方法。
【請求項３４５】
ペプチド免疫原が真核生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される請求項３３６に記載の方法。
【請求項３４６】
真核生物がヒトである請求項３４５に記載の方法。
【請求項３４７】
ヒト由来のペプチド免疫原が悪性腫瘍から誘導化される請求項３４７に記載の方法。
【請求項３４８】
ペプチド免疫原が腎臓細胞癌腫抗原、胸部癌腫抗原、癌胎児性抗原、メラノーマ（ＭＡＧＥ−１）抗原および前立腺ガン特異的抗原から誘導化される、請求項３４７に記載の方法。
【請求項３４９】
ペプチド免疫原がヒトＡβポリペプチドに由来する請求項３４６に記載の方法。
【請求項３５０】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化される請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５１】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＣ−末端領域から誘導化される請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５２】
ペプチド免疫原がＡβポリペプチドの内部領域から誘導化される請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５３】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３５０に記載の方法。
【請求項３５４】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５５】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＮ−末端に融合されている請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５６】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で同じＡβペプチド免疫原の別の分子のＣ−末端に融合されている請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５７】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＣ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５８】
Ａβペプチド免疫原の１つの分子がそのＮ−末端で異なるＡβペプチド免疫原の分子のＣ−末端に融合されている請求項３４９に記載の方法。
【請求項３５９】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項３５５、３５６、３５７または３５８に記載の方法。
【請求項３６０】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３５５、３５６、３５７または３５８に記載の方法。
【請求項３６１】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が異種ペプチドの１もしくは複数のコピーに連結されている請求項３４９に記載の方法。
【請求項３６２】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択される請求項３６１に記載の方法。
【請求項３６３】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択される請求項３６１に記載の方法。
【請求項３６４】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態に一緒に連結されている請求項３４９に記載の方法。
【請求項３６５】
Ａβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子が、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態中の異なるＡβペプチド免疫原の１もしくは複数の分子に連結されている請求項３４９に記載の方法。  
【請求項３６６】
Ａβペプチド免疫原がＡβポリペプチドのＮ−末端領域から誘導化され、そしてＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１２、３−７、１−３および１−４からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３６４または３６５に記載の方法。
【請求項３６７】
Ａβペプチド免疫原がＡβ７−１１、３−２８、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβのフラグメントである請求項３６４または３６５に記載の方法。
【請求項３６８】
１もしくは複数のアジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦ、５２９ＳＥ、ＩＬ−１２、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バクテリアリポ多糖、アミノアルキルグルコサミンリン酸塩化合物、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）、ポリペプチド、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、百日咳トキシン（ＰＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）非耐熱性トキシン（ＬＴ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βからなる群から選択される請求項２６２に記載の方法。
【請求項３６９】
ペプチド免疫原がＡβであり、担体がＣＲＭ１９７であり、そしてアジュバントが５２９ＳＥである請求項３６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連分野
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、すべての目的に関して引用により全部、本明細書に編入する２００３年１２月１７日に出願された特許文献１の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
適応免疫の本質は、外来物質の存在に対して反応する生物の能力であり、そして侵入物と特異的に相互作用し、そしてそれから宿主を保護することができる成分（抗体および細胞）を生産する。「抗原」または「免疫原」は、この種の免疫応答を誘導することができ、そしてまたそれに対して製造された感作細胞および抗体と相互作用することができる物質である。
【０００３】
抗原または免疫原は通常、免疫系の種々の成分を認識し、そして相互作用する明確な抗原性部位または「エピトープ」を含む高分子である。それらは合成有機化学物質、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ＲＮＡ，ＤＮＡまたは多糖からなる個別の分子として存在することができ、またはそれらは細胞構造（バクテリアまたは真菌）またはウイルスの一部でもよい（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  １９８８ａ，ｂ，ｃ；Ｍａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０００４】
短いペプチドのような低分子は、通常、免疫応答の産物と相互作用することができるが、たいていはそれだけで応答を引き起こすことができない。これらのペプチド免疫原（または「ハプテン」とも呼ばれる）は、実際には不完全な抗原であり、それら自体が免疫原性を生じたり、または抗体生産を誘発したりすることはできないが、それらを適切な担体とカップリングさせることにより免疫原性とすることができる。担体は通常、より高分子量のタンパク質抗原であり、インビボに投与した時、免疫学的応答を引き起こすことができる。
【０００５】
免疫応答では、抗体はＴ−ヘルパー（ＴＨ）細胞と一緒にＢ−リンパ球により生産そして分泌される。多くのハプテン−担体系では、Ｂ細胞はハプテンおよび担体の両方に特異的な抗体を生産する。これらの場合、Ｔリンパ球は担体上に特異的な結合ドメインを有するが、ハプテンのみでは認識しない。一種の相乗効果により、ＢおよびＴ細胞は協同してハプテンに特異的な抗体応答を生じる。そのような免疫応答が起こった後、宿主が続いてハプテンのみで追加免疫されれば、通常、宿主は初期免疫感作後に形成された記憶細胞からハプテンに特異的な抗体を生産することにより応答するだろう。
【０００６】
より大きな高分子上の幾つかの重要なエピトープ構造を模する合成ハプテンを、しばしば担体に結合して、より大きな「元の（ｐａｒｅｎｔ）」分子に対する免疫応答を生成する。例えば短いペプチドセグメントはタンパク質の既知の配列から合成し、そして担体にカップリングして天然のタンパク質に対する免疫原性を誘導することができる。免疫原生産に対するこの種の合成法が、現行のほとんどのワクチンの作成に対する研究の基礎となった。しかし多くの場合、合成ペプチド−担体コンジュゲートを使用することによって単にＢ細胞応答が生成されるが、十分に計画しても常に完全（ｉｎｔａｃｔ）な抗原に対する完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）な防御免疫が獲得されるとは限らない。より大きなウイルス粒子またはバクテリア細胞に由来する短いペプチドエピトープにより生じる免疫応答は、Ｂ細胞レベルで記憶を生じるに十分なだけかもしれない。これらの場合、今では細胞傷害性Ｔ細胞応答が防御免疫のより重要な指標であると受け入れられている。Ｂ細胞およびＴ細胞の両方を認識するための正しいエピトープ結合部位を持つペプチド免疫原の設計は、今日、免疫学において最も難しい研究分野の１つである。
【０００７】
これらの分子を大きな「担体」分子に結合することにより、小さく、または良くない免疫原性分子の免疫原性を上げる取り組みが数十年間、成功裏に利用されてきた（例えば非特許文献１を参照にされたい）。例えば多くの免疫原性組成物が記載され、それらは精製された筴膜ポリマーを担体タンパク質に結合して、この「担体効果」を活かすことにより、より効果的な免疫原性組成物を生成する（非特許文献２）。またコンジュゲートは、通常、遊離の多糖で免疫感作した時に幼児で観察される良くない抗体応答を迂回することが示された（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００８】
ハプテン−担体コンジュゲートは、ホモ二官能性、ヘテロ二官能性またはゼロ−長架橋剤のような種々の架橋結合／カップリング試薬を使用して成功裏に作成されてきた。多くのそのような方法が現在、サッカリド、タンパク質およびペプチドをペプチド担体にカップリングするために利用可能である。ほとんどの方法がアミン、アミド、ウレタン、イソチオウレアまたはジスルフィド結合を生成し、またはチオエーテルの場合もある。反応性部位を担体および／またはハプテン分子の反応性アミノ酸分子の側鎖中に導入するカップリング試薬を使用することの欠点は、もし中和されなければ反応性部位がインビトロ（すなわちコンジュゲート（１もしくは複数）の官能性または安定性に悪影響を及ぼす）またはインビボ（すなわち調製物で免疫感作されたヒトまたは動物における副作用の潜在的危険性をもたらす）で望ましくない分子と自由に反応する点である。そのような過剰な反応性部位は、種々の既知の化学反応を利用してこれらの部位を不活性化するため反応させるか、またはキャッピングすることができるが、これらの反応はそうではなくコンジュゲートの官能性を破壊するかもしれない。これは特に反応性部位を担体分子に導入することによりコンジュゲートを作成することを試す場合に、その大きなサイズおよびより複雑な構造（ハプテンに比べて）が化学処理の破壊効果に対して、より攻撃され易くなるために問題が多い。実際に、所望する「担体効果」の特性を有する免疫原性組成物として機能するために、生じるコンジュゲートの能力を保存しながら、最初に担体を活性化し、次いでハプテンを結合反応を用いて反応させ、そして最後に残る反応性部位を「キャッピングする」ことによりコンジュゲートを作成する方法の例は知られていない。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／５３０，４８０号明細書
【非特許文献１】Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３，１９３９
【非特許文献２】Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：５８２−５９１，１９８４
【非特許文献３】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０７：３４６，１９８５
【非特許文献４】Ｉｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２９４，１９８６
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な要約
本発明は、ペプチド免疫原とタンパク質／ポリペプチド担体との免疫原コンジュゲートを生産する方法を対象とし、ここでペプチド免疫原は、リシン残基のような担体のアミノ酸残基の誘導化された官能基を介して担体に結合され、そしてここでアミノ酸残基の任意の非結合誘導化官能基は、キャッピングを介して不活性化されて、それらがタンパク質／ポリペプチドを含む他の分子と反応することを遮断し、これにより担体の官能性を保護して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持する。
【００１０】
１つの態様では、発明はペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基を介して、ペプチド免疫原を１もしくは複数の官能基を有するタンパク質／ポリペプチド担体に結合する方法を対象とし、この方法は：（ａ）タンパク質／ポリペプチド担体の１もしくは複数の官能基を誘導化して反応性部位を持つ誘導化分子を生成し；（ｂ）工程（ａ）の誘導化タンパク質／ポリペプチド担体を、ペプチド免疫原が誘導化タンパク質／ポリペプチド担体に官能基を介して結合するような反応条件下で、ペプチド免疫原のアミノ酸の残基の反応性基と反応させ；そして（ｃ）さらにコンジュゲートをキャッピング試薬と反応させて、活性化タンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性反応官能基を不活性化し、これによりそうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対する担体の官能性を保存する工程を含んでなる。
【００１１】
１つの態様では、タンパク質／ポリペプチド担体は、ヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＮ−ＤＲ結合ペプチド（ＰＡＤＲＥポリペプチド）、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＳＢＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、カルメット  ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、微生物表面成分認識接着マトリックス分子（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｒｅｃｏｇｉｎｉｚｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子／ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される。
【００１２】
別の態様ではタンパク質／ポリペプチド担体はＴ−細胞エピトープを含む。
【００１３】
さらに別の態様では、タンパク質／ポリペプチド担体は上記のような破傷風トキソイド、コレラトキシンまたはコレラトキシン変異体のようなバクテアリトキソイドである。好適な態様では、タンパク質／ポリペプチド担体はＣＲＭ１９７である。
【００１４】
さらに別の態様では、タンパク質／ポリペプチド担体はインフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスＣＳタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＳＢＡｇ１９−２８）、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）またはヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）由来のポリペプチドであることができる。
【００１５】
さらに好適な態様では、タンパク質／ポリペプチド担体は連鎖球菌ｒＣ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４または溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７およびクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８から選択される。
【００１６】
１つの態様では、タンパク質／ポリペプチド担体は免疫応答を刺激または強化する増殖因子またはホルモンであり、そしてＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される。
【００１７】
別の態様では、ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質および真核生物のタンパク質から選択される。
【００１８】
別の態様では、ペプチド免疫原は肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエーラ  エンテロバクター（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌に由来するバクテアリタンパク質から誘導化される。
【００１９】
別の態様では、ペプチド免疫原はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択されるウイルスに由来するタンパク質抗原から誘導化される。
【００２０】
さらに別の態様では、ペプチド免疫原はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種から選択される真菌に由来するタンパク質抗原から誘導化される。
【００２１】
別の態様では、ペプチド免疫原がプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）およびリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）から選択される寄生生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される。
【００２２】
さらに別の態様では、ペプチド免疫原が真核生物に由来するタンパク質抗原から誘導化される。好適な態様では、真核生物はヒトである。
【００２３】
さらに別の好適な態様では、ヒト由来のペプチド免疫原が悪性腫瘍から誘導化される。より好適な態様では、ペプチド免疫原は腎臓細胞癌腫、胸部癌腫、メラノーマおよび前立腺癌腫に由来する腫瘍抗原である。別の好適な態様では、ペプチド抗原は腫瘍抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）から誘導化される。
【００２４】
１つの観点では、本発明はＡβ内の特定のエピトープに対して免疫応答の誘発するＡβペプチドまたはＡβのフラグメントまたはその類似体を含んでなるペプチド免疫原を提供する。本発明の免疫原性ペプチドには、免疫原性の異種ペプチドを含む。幾つかの免疫原性ペプチドでは、Ａβフラグメントが担体に連結されて免疫原性異種ペプチドを形成し、そして次いでこの異種ペプチドは本発明の方法を使用して担体に連結されてコンジュゲートを形成する。
【００２５】
本発明の別の観点では、ペプチド免疫原はＡβの少なくとも残基１〜５のＮ−末端セグメントを含んでなるポリペプチドであり、Ａβの最初の残基はポリペプチドのＮ−末端残基であり、ここでポリペプチドはＡβのＣ−末端セグメントが無い。本発明のさらに別の態様では、ペプチド免疫原はＡβのＮ−末端セグメントを含んでなるポリペプチドであり、セグメントはＡβの残基１〜３から始まり、そしてＡβの残基７〜１１で終わる。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβのＮ−末端セグメントに対する免疫応答を誘導する作用物質であり、このセグメントはＡβ４３の残基１２〜４３内のエピトープに対する免疫応答を誘導せずにＡβの残基１〜３から始まり、そしてＡβの残基７〜１１で終わる。本発明の別の観点では、ペプチド免疫原は異種アミノ酸配列に対してヘルパーＴ細胞応答を、そしてそれによりＮ−末端セグメントに対するＢ細胞応答を誘導する異種アミノ酸配列に連結されたＡβのセグメントを含んでなる異種ポリペプチドである。
【００２６】
幾つかのペプチド免疫原では、ＡβのＮ−末端セグメントはそのＣ−末端で異種ポリペプチドに連結されている。幾つかのペプチド免疫原では、ＡβのＮ−末端セグメントはそのＮ−末端で異種ポリペプチドに連結されている。幾つかのペプチド免疫原では、ＡβのＮ−末端セグメントはそのＮおよびＣ末端で第１および第２の異種ポリペプチドに連結されている。幾つかのペプチド免疫原では、ＡβのＮ−末端セグメントはそのＮ末端で異種ポリペプチドに連結され、そしてそのＣ末端でＮ−末端セグメントの少なくとも１つさらなるコピーに連結されている。幾つかのペプチド免疫原では、ポリペプチドはＮ−末端からＣ−末端、ＡβのＮ−末端セグメント、Ｎ−末端セグメントの複数のさらなるコピー、および異種アミノ酸セグメントを含んでなる。
【００２７】
幾つかの上記ペプチド免疫原の観点では、ポリペプチドはさらに少なくとも１つのＮ−末端セグメントのコピーを含んでなる。幾つかの上記ペプチド免疫原では、フラグメントはＡβ４３中の少なくとも５Ｃ−末端アミノ酸が無い。
【００２８】
幾つかの上記ペプチド免疫原の観点では、フラグメントはＡβに由来する最高１０個の連続するアミノ酸を含んでなる。
【００２９】
別の観点では、本発明は多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態と呼ぶ形態であり得るＡβ内の特定のエピトープに対する免疫原応答を誘発するＡβペプチドまたはＡβのフラグメントまたはその類似体を含んでなるペプチド免疫原を提供する。
【００３０】
本発明の幾つかの上記観点では、ペプチド免疫原はＡβののＮ−末端半分に由来する。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１１、１−１２、１−１６、３−６および３−７からなる群から選択されるＡβのフラグメントである。本発明の幾つかの上記観点では、ペプチド免疫原はＡβの内部領域に由来する。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１３−２８、１５−２４、１７−２８および２５−３５からなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの上記観点では、ペプチド免疫原はＡβのＣ−末端に由来する。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ３３−４２、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１１、１−１２、１−１６、１−２８、３−６、３−７、１３−２８、１５−２４、１７−２８、２５−３５、３３−４２、３５−４０および３５−４２からなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−５、Ａβ１−７、Ａβ１−９およびＡβ１−１２からなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−５−Ｌ、Ａβ１−７−Ｌ、Ａβ１−９−ＬおよびＡβ１−１２−Ｌ（ここでＬはリンカーである）からなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−５−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−７−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−９−Ｌ−ＣおよびＡβ１−１２−Ｌ−Ｃ（ここでＣはシステインアミノ酸残基である）からなる群から選択されるＡβフラグメントである。
【００３１】
本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１６−２２、Ａβ１６−２３、Ａβ１７−２３、Ａβ１７−２４、Ａβ１８−２４およびＡβ１８−２５からなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１６−２２−Ｃ、Ａβ１６−２３−Ｃ、Ａβ１７−２３−Ｃ、Ａβ１７−２４−Ｃ、Ａβ１８−２４−ＣおよびＡβ１８−２５−Ｃ（ここでＣはシステインアミノ酸残基である）からなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＣ−Ａβ１６−２２、Ｃ−Ａβ１６−２３、Ｃ−Ａβ１７−２３、Ｃ−Ａβ１７−２４、Ｃ−Ａβ１８−２４およびＣ−Ａβ１８−２５（ここでＣはシステインアミノ酸残基である）からなる群から選択されるＡβフラグメントである。
【００３２】
上記免疫原の幾つかでは、異種ポリペプチドはＴ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープおよびその組み合わせを有するペプチドからなる群から選択される。
【００３３】
１つの態様では、タンパク質／ポリペプチド担体または場合により結合されたポリペプチドリンカーの１もしくは複数のアミノ酸分子の官能基は、架橋結合試薬を使用して誘導化される。別の態様では、誘導化試薬は誘導化試薬はゼロ−長の架橋結合試薬である。別の態様では、誘導化試薬はホモ二官能性架橋結合試薬である。さらに別の態様では、誘導化試薬はヘテロ二官能性架橋結合試薬である。
【００３４】
好適な態様では、ヘテロ二官能性架橋化試薬が、タンパク質／ポリペプチド担体の１もしくは複数のアミノ酸分子の１級またはε−アミン官能基、およびペプチド免疫原の１もしくは複数のアミノ酸分子のペンダントチオール基と反応する試薬である。１つの態様では、ヘテロ二官能性試薬がＮ−スクシンイミジルブロモアセテートである。
【００３５】
別の態様では、１級またはε−アミン官能基がリシンである。さらに別の態様では、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテートを用いたタンパク質／ポリペプチド担体のリシンの１級またはε−アミン官能基の誘導化は、タンパク質／ポリペプチド担体のリシン分子上の１級またはε−アミン残基のブロモアセチル化を生じる。さらに好適な態様では、ペンダントチオール基はペプチド免疫原のシステイン残基であり、これはペプチド免疫原のアミノ末端、ペプチド免疫原のカルボキシ末端またはペプチド免疫原の内部に位置することができる。
【００３６】
別の態様では、ペンダントチオール基は、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬（２−イミノチラン）ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル２−ピリジルジチオトルエン）、スルホＬＣ  ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジルピリジルジチオプロピオンアミドヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（スクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート）のようなチオール化試薬により生成される。好適な態様では、活性化タンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性官能基を不活性化するために使用されるキャッピング試薬は、システアミン、Ｎ−アセチルシステアミンおよびエタノールアミンからなる群から選択される。
【００３７】
特に好適な態様では、活性化タンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性官能基を不活性化するために使用されるキャッピング試薬は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムおよびアンモニアからなる試薬群から選択される。
【００３８】
１つの態様では、ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基は遊離のスルフヒドリル基である。
【００３９】
別の態様では、１もしくはは複数の官能基がリンカー上にあり、これは場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に結合している。好適な態様では、リンカーはペプチドリンカーである。さらに好適な態様では、ペプチドリンカーはポリリシンである。
【００４０】
別の態様では、本発明はタンパク質／ポリペプチドのペプチド免疫原を、構造：
【００４１】
【化１】
2008505052.tif 000003
【００４２】
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化可能な官能基であり、そしてここでｍは０より大きな整数であるが、８５以下である、
を有するタンパク質／ポリペプチド担体に結合する第２の方法を対象とし、この方法は：
（ａ）タンパク質／ポリペプチド担体、または場合により結合したリンカー分子の１もしくは複数の官能基を誘導化して反応性部位を持つ誘導化担体を生成し；（ｂ）工程（ａ）の誘導化タンパク質／ポリペプチド担体を、ペプチド免疫反応のアミノ酸の反応性基と反応させて、共有的にカップリングしたペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートを形成し；そして（ｃ）さらに該コンジュゲートをキャッピング試薬と反応させて、活性化タンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性官能基を不活性化し、キャッピングした基がタンパク質／ポリペプチドを含む他の分子と自由に反応しないようにし、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持して、式：
【００４３】
【化２】
2008505052.tif 000004
【００４４】
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸｄはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここで
Ｐはタンパク質担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したペプチド免疫原分子であり、Ｒはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
を有するキャップ化ペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートを形成する工程を含んでなる。
【００４５】
上記の第１の方法に関する詳細な態様は、第２の方法により調製される丁度記載したコンジュゲートにも応用することができる。
【００４６】
１つの態様では、本発明はペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートを対象とし、ここでタンパク質／ポリペプチド担体は式：
【００４７】
【化３】
2008505052.tif 000005
【００４８】
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化可能な官能基であり、そしてここでｍは０より大きな整数であるが、８５以下である、
を有し、そしてここでキャップ化ペプチド−免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートが式：
【００４９】
【化４】
2008505052.tif 000006
【００５０】
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸｄはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここでＰはタンパク質担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したペプチド免疫原分子であり、Ｒはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持し、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
を有する。
【００５１】
上記の第１および第２の方法に関する詳細な態様は、丁度記載したコンジュゲートにも応用することができる。
【００５２】
別の態様では、本発明は本発明の第２の方法に従い生成され、そして式：
【００５３】
【化５】
2008505052.tif 000007
【００５４】
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸｄはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここでＰはタンパク質担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したペプチド免疫原分子であり、Ｒはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持し、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
を有するペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートを対象とする。
【００５５】
上記の第２の方法に関する詳細な態様は、丁度記載したような第２の方法により生成したコンジュゲートにも応用することができる。
【００５６】
別の態様では、本発明は本発明の第２の方法により生成したペプチド免疫原とタンパク質／ポリペプチド担体とのコンジュゲートを、１もしくは複数の製薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤およびアジュバントと一緒に含んでなる免疫原性組成物を対象とする。
【００５７】
上記の第２の方法およびそれにより生成されたコンジュゲートに関する詳細な態様も、丁度記載したコンジュゲートを含有する免疫原組成物に応用することができる。
【００５８】
別の態様では、本発明は本発明の有効量の免疫原組成物を個体に投与することを含んでなる、哺乳動物個体において免疫応答を誘導する方法を対象とする。
【００５９】
本発明のコンジュゲートを含有する免疫原組成物に応用することができる詳細な態様は、これら免疫原組成物の使用法を対象とする本発明の態様にも応用することができる。
【００６０】
【表１】
2008505052.tif 000008
【００６１】
【表２】
2008505052.tif 000009
【００６２】
【表３】
2008505052.tif 000010
【００６３】
【表４】
2008505052.tif 000011
【００６４】
発明の詳細な説明
本発明は、ペプチド免疫原−担体コンジュゲートの生成法を対象とし、ここで活性化中に生成される担体上の未反応活性官能基は、それらがさらに反応することを防止するためにＮ−アセチルシステアミンのようなキャッピング試薬を使用することにより不活性化される。また本発明はそれらの方法により生成したキャップ化担体−ペプチド免疫原コンジュゲートおよび該コンジュゲートを含んでなる免疫原組成物も対象とする。
【００６５】
サッカリドのような小さく、またはよくない免疫原性分子の免疫原性を、結合を介して上げる取り組みが数十年間、成功裏に利用され（例えばＧｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９３９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３を参照にされたい）、そして多くの免疫原性組成物が記載され、ここでは精製された筴膜ポリマーが担体タンパク質に結合されて、この「担体効果」を活かすことにより、より効果的な免疫原性組成物が生成されてきた。例えばＳｃｈｎｅｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：３６１−３７６，１９８０）は微生物により引き起こされる侵襲性疾患に対する免疫を付与するインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ多糖タンパク質コンジュゲートを記載する。ＰＲＰ（ポリリボシルリビトールホスフェート、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ））のコンジュゲートは、多糖単独に基づく免疫原組成物よりも効果的であることが示された（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４０：２４５；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：５８２−５９１）。また結合は、通常、遊離の多糖で免疫感作した時に幼児で観察される良くない抗体応答を迂回することが示された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０７：３４６；Ｉｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２９４）。
【００６６】
ヒトの日常的な免疫感作では標準的なプラクティスとなっている、タンパク質担体としてバクテリアのトキシンまたはトキソイド（例えば破傷風またはジフテリア）を使用するさらなる利点は、トキシンまたはトキソイドに対して所望する免疫が筴膜ポリマーを付随する病原体に対する免疫と一緒に誘導されるという点である。
【００６７】
また抗原決定基／ハプテン−担体コンジュゲートも、カップルしたハプテン上の明確な化学的エピトープを識別することができる高度に特異的なモノクローナル抗体を生産するために使用されている。生じるモノクローナルはしばしばエピトープ構造および天然のタンパク質間の相互作用を調査するために使用される。多くの場合で、これらモノクローナルを生成するために使用する抗原決定基／ハプテンは、より大きなタンパク質の表面上で重要な抗原性部位を表す小さいペプチドセグメントである。抗原決定基／ハプテン−担体コンジュゲートの生成に使用される成功した担体に関する基準は、潜在的免疫原性、抗原決定基／ハプテンとの結合のための適切な官能基の存在、誘導化後でも合理的な溶解性、およびインビボでの毒性の欠如である。
【００６８】
これらの基準は、本発明の方法により生成されるコンジュゲートにより満たされる。コンジュゲートは本明細書に記載する結合法を使用して生成される任意の適切なペプチド免疫原−担体コンジュゲートであることができる。コンジュゲートは本発明の方法を使用して生成され、ここで以下の構造：
【００６９】
【化６】
2008505052.tif 000012
【００７０】
を有するタンパク質／ポリペプチド担体がタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合され、ここでＣはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化可能な官能基であり、そしてここでｍは０より大きな整数であるが、８５以下である、
がペプチド免疫原に共有結合され、そしてここでペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートは以下の式を有し、以下の式：
【００７１】
【化７】
2008505052.tif 000013
【００７２】
式中、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、そしてＸｄはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基であり、Ｐはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したペプチド免疫原であり、Ｒはタンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基、または場合によりタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合したペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持し、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
により表される。
担体の選択
ペプチド免疫原の中には免疫応答を誘導するための適切なエピトープを含むが、小さすぎて免疫原性とはならないものもある。この状況では、ペプチド免疫原を適切な担体に連結して免疫応答を誘発することを助ける。本発明の方法により生成されるペプチド免疫原−担体コンジュゲートの上記の概略表示では、Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、これにペプチド免疫原が担体自体の上のアミノ酸残基の誘導化官能基を介して直接的に、または担体に共有結合されたペプチドリンカー上の誘導化官能基を介して間接的に結合される。適切なタンパク質／ポリペプチド担体には限定するわけではないがアルブミン（ヒト血清アルブミンを含む）、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、破傷風トキソイド、または減少した毒性を有する他の病原性バクテリアに由来するトキソイド（ジフテリア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コレラ、またはピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のような変異体を含む）、または弱毒化トキシン誘導体を含む。１つのそのような担体はジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ１９７タンパク質（配列番号４０）である。
【００７３】
他の担体には、例えば少なくとも７５％のすべてのヒトＭＨＣアリルで、多ＭＨＣアリル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＭＨＣ  ａｌｌｅｌｅｓ）に結合するＴ細胞エピトープを含む。そのような担体は時折、「汎用的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）Ｔ細胞エピトープ」として当該技術分野では知られている。汎用的Ｔ細胞エピトープを持つ例示的な担体は以下を含む：
【００７４】
【表５】
2008505052.tif 000014
【００７５】
免疫応答を刺激または強化し、そしてペプチド免疫原またはハプテンを結合することができる他の担体には、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβペプチド、ＩＬ−２、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン、およびＭＩＰ−１αおよびβおよびＲＡＮＴＥＳのようなケモカインを含む。免疫原性ペプチドは、すべての目的について引用により全部本明細書に編入するＯ’Ｍａｈｏｎｙにより国際公開第９７／１７１６３および同第９７／１７６１４号パンフレットに記載された組織をわたる輸送を強化するタンパク質／ペプチド担体に連結することもできる。
【００７６】
さらに担体には、組換え連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、１６６４および２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７およびＴ８５８、増殖因子およびホルモンを含む。
【００７７】
本発明の１つの好適な態様では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７、１次配列に１つのアミノ酸の変化を有するジフテリアトキシンの非毒性変異体である。分子のアミノ酸５２位に存在するグリシンは、単一核酸コドンの変化によリグルタミン酸に置き換えられる。この変化により、タンパク質はＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を欠き、そして非毒性となる。これは５８，４０８Ｄａの分子量を有する。ＣＲＭ１９７は、引用により本明細書に編入する米国特許第５，６１４，３８２号明細書に従い、組換え発現により大量に生産される。サッカリドならびにペプチドのＣＲＭ１９７への結合は、リシン残基のε−アミノ基を介して連結することにより行われる。これはＣＲＭ１９７がＢ細胞エピトープとして優れており、そして安全な担体であることから、幾つかの市販されている製品を介して十分に確立された。
免疫原性ペプチド
本明細書で使用する用語「ペプチド免疫原」または「ハプテン」は、哺乳動物への投与で免疫応答を生成するように誘発、促進または誘導することができる、任意のタンパク質またはサブユニット構造／フラグメント／それらから誘導化される類似体である。特にこの用語は、本明細書に開示する方法を使用して担体にカップリングすることができる任意の起源（バクテリア、ウイルスまたは真核生物）に由来するポリペプチド抗原決定基を指す。そのようなポリペプチド免疫原／抗原決定基は、ウイルス、バクテリアまたは真核細胞起源であることができる。
【００７８】
バクテリア細胞に由来するペプチド免疫原には、バクテリア細胞の表面または分泌タンパク質から誘導化されたものを含み、これはタンパク質に基づく免疫原組成物に使用することができる。バクテリア株の例には肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、シゲーラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、オーロイオコッカス  オチチディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）およびＢ群連鎖球菌を含む。
【００７９】
ウイルスに由来するペプチド免疫原の例には、幾つかを挙げればヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、水痘性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）、コロナウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から誘導化されるものを含む。
【００８０】
真菌ペプチド免疫原の例には、カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種を含む。
寄生生物抗原には、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種およびリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種等から誘導化されるものを含む。
【００８１】
様々なヒトの疾患を防止し、処置し、予防し、または軽減する免疫治療薬として使用するために担体に結合することができる真核生物のペプチド免疫原の例は腫瘍細胞に付随するもの、Ａβから誘導化されるもの、アルツハイマー病（ＡＤ）に特徴的なプラークの主要な成分である３９〜４３アミノ酸のペプチド、好ましくは４２アミノ酸（米国特許第４，６６６，８２９号明細書；Ｇｌｅｎｎｅｒ  ＆  Ｗｏｎｇ（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０；１１３１，Ｈａｒｄｙ（１９８４）ＴＩＮＳ  ２０：１１３１；Ｈａｒｄｙ（１９７７）ＴＩＮＳ  ２０：１５４を参照にされたい）、アミリンのアミロイドペプチドから誘導化されるもの、ＩＩ型糖尿病に関わる膵臓小島により生産されるポリペプチド物質、アテローム硬化症に関わる低密度リポタンパク質遺伝子産物から誘導化されるペプチド、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびＧＤＦ−８のような炎症性サイトカインおよび増殖因子から誘導化される抗原性ペプチドを含む。そのような真核生物のペプチド免疫原にはＴ細胞（ＣＴＬ）またはＢ細胞エピトープを含むことができる。
【００８２】
「ＣＴＬエピトープ」は、限定するわけではないが腎臓細胞癌腫抗原、胸部癌腫抗原、癌胎児性抗原、メラノーマ（ＭＡＧＥ）抗原、および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）のような前立腺ガン特異的抗原、Ｃ型肝炎抗原を含む腫瘍に随伴する抗原のような有力な標的抗原の選択されたエピトープ領域から誘導化されたものである。
【００８３】
Ａβ（β−アミロイドペプチドまたはＡ４ペプチドとしても知られている（米国特許第４，６６６，８２９号明細書；Ｇｌｅｎｎｅｒ  ＆  Ｗｏｎｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０；１１３１（１９８４）を参照されたい）は、３９〜４３アミノ酸のペプチドであり、これはアルツハイマー病の特徴的プラークの主要成分である。Ａβはβおよびγセクレターゼと呼ばれる２つの酵素による、より大きなタンパク質ＡＰＰのプロセッシングにより生成される（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ  ２０：１５４（１９９７）を参照されたい）。アルツハイマー病に関連するＡＰＰ中の既知の突然変異は、βおよびγセクレターゼ部位の近位で、またはＡβ内で起こる。例えば７１７位はそのＡβへのプロセッシングでＡＰＰのγ−セクレターゼ開裂部位に近く、そして６７０／６７１位は、β−セクレターゼ開裂部位に近い。突然変異はＡβが形成される開裂反応と相互作用することによりＡＤを引き起こして、生じるＡβの４２／４３アミノ酸形の量を増加させると考えられる。
【００８４】
Ａβは古典的および代替的補体カスケードの両方に結合し（ｆｉｘ）、そして活性化することができる希有な特性を有する。特にこれはＣ１ｑに結合し、そして最終的にはＣ３ｂｉに結合する。この会合はマクロファージへの結合を促進して、Ｂ細胞の活性化を導く。加えて、Ｃ３ｂｉはさらに分解し、次いでＢ細胞上のＣＲ２にＴ細胞依存的様式で結合して、これらの細胞の活性化を１０，０００倍上昇させる。このメカニズムでＡβは他の抗原の免疫応答も過剰に生じるようにさせる。
【００８５】
Ａβには数種の自然に存在する形態がある。Ａβのヒト形は、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３を指す。これらペプチドの配列およびそれらのＡＰＰ前駆体との関係は、Ｈａｒｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＮＳ  ２０：１５５−１５８（１９７７）の図１により具体的に説明されている。例えばＡβ４２は配列：
【００８６】
【表６】
2008505052.tif 000015
【００８７】
を有する。
【００８８】
Ａβ４１、Ａβ４０およびＡβ３９は、それぞれＣ−末端からＡｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ、およびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌを省略することによりＡβ４２と異なる。Ａβ４３は、Ｃ−末端にトレオニン残基が存在することによりＡβ４２とは異なる。
【００８９】
Ａβのフラグメントであるペプチド免疫原は、幾つかの理由から本発明の用途には完全な分子よりも有利である。第１にＡβ内の特定のエピトープのみがアルツハイマー病の処置に有用な免疫応答を誘導するので、そのようなエピトープを含有するフラグメントの等用量の質量は、完全なＡβの投薬用量よりも高いモル濃度の有用な免疫原性エピトープを提供する。第２に、Ａβの特定のペプチド免疫原は、Ａβが派生するＡＰＰタンパク質に対して重要な免疫原性応答を生成することなくアミロイド沈着に対する免疫原性応答を生成する。第３に、Ａβのペプチド免疫原はその短いサイズにより完全なＡβよりも製造が単純である。第４に、Ａβのペプチド免疫原は完全なＡβと同じ様式で凝集せず、担体を含むコンジュゲートの調製が単純となる。
【００９０】
Ａβの幾つかのペプチド免疫原は、天然のペプチドに由来の少なくとも２、３、５、６、１０または２０個の連続するアミノ酸の配列を有する。幾つかのペプチド免疫原は、Ａβに由来する１０、９、８、７、５または３個の連続する残基より多くはない。好適な態様では、ＡβのＮ−末端半分に由来するペプチド免疫原がコンジュゲートの調製に使用される。好適なペプチド免疫原にはＡβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１１、３−７、１−３および１−４を含む。例えばＡβ１−５の表示は、Ａβの残基１−５を含むＮ−末端フラグメントを示す。Ｎ−末端から始まり、そしてＡβの残基７−１１内の残基で終わるＡβフラグメントが特に好ましい。フラグメントＡβ１−１２も使用できるが、それほど好ましくない。幾つかの方法では、フラグメントはＡβ１−１０以外のＮ−末端フラグメントである。他の好適なフラグメントには、Ａβ１３−２８、１５−２４、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２、および他の内部フラグメントおよびＣ−末端フラグメントを含む。
【００９１】
本発明の幾つかのＡβペプチドは、ヒト患者または動物への投与でＡβの残基１６と２５との間の１もしくは複数のエピトープに特異的に結合する抗体を生成する免疫原ペプチドである。好適なフラグメントにはＡβ１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４および１８−２５を含む。残基１６と２５の間のエピトープに特異的に結合する抗体は、Ａβのプラークに結合せずに可溶性Ａβに特異的に結合する。これらの種類の抗体は、患者または動物モデルの脳中のＡβ沈着のプラークは特異的には結合せずに、患者または動物モデルで循環する可溶性Ａβに特異的に結合することができる。抗体の可溶性Ａβへの特異的結合は、Ａβがプラークに取り込まれることを阻害し、すなわち患者にプラークが発生することを抑制するか、またはそのようなプラークが処置を投与する前にすでに発生している場合は、プラークのサイズまたは頻度をさらに増加させることを抑制する。
【００９２】
好ましくは投与されるＡβのフラグメントは、フラグメントに対するＴ細胞応答を生じるエピトープを欠いている。一般にＴ細胞エピトープは１０個の連続するアミノ酸より大きい。故にＡβの好適なフラグメントは、５〜１０、または好ましくは７〜１０個の連続するアミノ酸のサイズ、または最も好ましくは７個の連続するアミノ酸、すなわちＴ細胞応答を生じることなく抗体応答を生じるために十分な長さである。Ｔ細胞エピトープはフラグメントの免疫原活性には必要でなく、そして望ましくない炎症応答を患者の一部に引き起こす恐れがあるので、Ｔ細胞エピトープが存在しないことが好ましい（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，３６９７−３７０１；Ｓｅｎｉｏｒ  （２００２）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．１，３）。
【００９３】
フラグメントＡβ１５−２５およびその７〜８個の連続するアミノ酸のサブフラグメントは、これらのペプチドがＡβペプチドに対して一貫して高い免疫応答を生じるので好ましい。これらのフラグメントにはＡβ１６−２２、Ａβ１６−２３、Ａβ１６−２４、Ａβ１７−２３、Ａβ１７−２４、Ａβ１８−２４およびＡβ１８−２５を含む。特に好適なＡβ１５−２５サブフラグメントは、７個の連続するアミノ酸長である。表示Ａβ１５−２１は、例えばＡβの残基１５〜２１を含み、そしてＡβの他の残基を欠くフラグメント、そして好ましくは７〜１０個の連続するアミノ酸を示す。これらのフラグメントは末端特異的（ｅｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む抗体応答を生成することができる。
【００９４】
Ａβのペプチド免疫原は、アミロイド沈着の排除（ｃｌｅａｒｉｎｇ）または防止における活性についてスクリーニングする必要がある（国際公開第００／７２８８０号パンフレットを参照されたい。これはすべての目的についてその全部を本明細書に編入する）。ＡβのＮ−末端フラグメントの投与は、インビボおよびインビトロでＡβ沈着を認識する抗体の生産を誘導する。自然に存在するＡβ形に存在する少なくとも１つ、そして場合によっては少なくとも５または１０個のＣ−末端アミノ酸を欠くフラグメントを、幾つかの方法では使用する。例えばＡβ４３のＣ−末端から５個のアミノ酸を欠くフラグメントは、ＡβのＮ−末端から最初の３８個のアミノ酸を含む。
【００９５】
特に示さない限り、Ａβに対する参照には上記の自然なヒトアミノ酸配列ならびに対立遺伝子、種および誘導されたバリアントを含む類似体を含む。類似体は典型的には１、２もしくは数箇所の位置で、しばしば保存的置換により自然に存在するペプチドとは異なる。類似体は典型的には自然なペプチドと少なくとも８０または９０％の配列同一性を現す。また類似体の中には１、２もしくは数箇所の位置で非天然アミノ酸またはＮ−もしくはＣ−末端アミノ酸の修飾を含むものもある。例えばＡβの１および／または７位の天然のアスパラギン酸残基は、イソアスパラギン酸に置き換えることができる。
【００９６】
非天然アミノ酸の例はＤ、アルファ、アルファ−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、イプシロン−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、オメガ−Ｎ−メチルアルギニン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、ガンマ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびイソアスパラギン酸である。また免疫原性ペプチドには、Ａβおよびそのフラグメントの類似体を含む。本発明の幾つかの治療薬はオールＤペプチド、例えばオールＤＡβ、オールＤＡβフラグメント、またはオールＤＡβもしくはオールＤＡβフラグメントの類似体である。フラグメントおよび類似体は、国際公開第００／７２８８０号パンフレットに記載されているように、予防的または治療的効力について、未処置またはプラセボ対照と比較してトランスジェニック動物モデルでスクリーニングすることができる。
【００９７】
またペプチド免疫原にはより長いポリペプチドも含み、これには例えばＡβペプチドの免疫原を他のアミノ酸と一緒に含む。例えば好適な免疫原性ペプチドには異種アミノ酸配列に対するヘルパーＴ細胞応答、そしてこれによりＡβセグメントに対するＢ細胞応答を誘導する異種アミノ酸配列に連結されたＡβのセグメントを含んでなる融合タンパク質を含む。そのようなポリペプチドは、予防的または治療的効力について国際公開第００／７２８８０号パンフレットに記載されているように、未処置またはプラセボ対照と比較して動物モデルでスクリーニングすることができる。
【００９８】
Ａβペプチド、類似体、免疫原フラグメントまたは他のポリペプチドは、分けられた（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）、または凝集した形態で投与されることができる。分けられたＡβまたはそのフラグメントとは、単量体のペプチド単位を意味する。分けられたＡβまたはそのフラグメントは一般に可溶性であり、そして自己凝集して可溶性オリゴマー、プロトフィブリルおよびＡＤＤＬを形成することができる。Ａβおよびそのフラグメントのオリゴマーは通常、可溶性であり、そして主にアルファ−ヘリックスまたはランダムコイルとして存在する。凝集したＡβまたはそのフラグメントとは、不溶性のベータシートアッセンブリーに会合したＡβまたはそのフラグメントのオリゴマーを意味する。凝集したＡβまたはそのフラグメントは、繊維状ポリマーも意味する。繊維は通常、不溶性である。幾つかの抗体は可溶性Ａβまたはそのフラグメント、または凝集したＡβまたはそのフラグメントのいずれかに結合する。抗体の中には可溶性Ａβまたはそのフラグメント、および凝集したＡβまたはそのフラグメントの両方に結合するものもある。
【００９９】
また免疫原ペプチドは単量体の免疫原ペプチドの多量体も含む。Ａβペプチド以外の免疫原ペプチドは、上に列挙したＡβの１もしくは複数の好適なフラグメント（例えばＡβ１−３、１−７、１−１０および３−７）に対する免疫応答を誘導するはずである。
【０１００】
本発明の免疫原ペプチドは、本発明の方法を使用して担体に連結されてコンジュゲートを形成する。免疫原ペプチドはそのアミノ末端で、そのカルボキシル末端で、または両方で担体に連結されてコンジュゲートを形成することができる。場合により、免疫原ペプチドの多くの反復がコンジュゲート中に存在することができる。
【０１０１】
ＡβのＮ−末端フラグメントは、そのＣ−末端で担体ペプチドに連結されてコンジュゲートを形成することができる。そのようなコンジュゲートでは、ＡβのフラグメントのＮ−末端残基がコンジュゲートのＮ−末端残基を構成する。したがってそのようなコンジュゲートは、遊離状態であるＡβのＮ−末端残基を必要とするエピトープに結合する抗体を誘導するのに効果的である。本発明の幾つかの免疫原ペプチドは、コンジュゲートを形成するためにＣ−末端で担体ペプチドの１もしくは複数のコピーに連結したＡβのＮ−末端セグメントの複数の反復を含んでなる。そのようなコンジュゲートに取り込まれたＡβのＮ−末端フラグメントは時折、Ａβ１−３から始まり、そしてＡβ７−１１で終わる。Ａβ１−７、１−３、１−４、１−５および３−７は、Ａβの好適なＮ−末端フラグメントである。幾つかのコンジュゲートは、Ａβの異なるＮ−末端セグメントを直列に含んでなる。例えば、コンジュゲートはＡβ１−７に続いて担体に連結されたＡβ１−３を含んでなることができる。
【０１０２】
幾つかのコンジュゲートでは、ＡβのＮ−末端セグメントがそのＮ−末端で担体ペプチドに連結される。ＡβのＮ−末端セグメントと同じ変化を、Ｃ−末端連結を用いて使用することができる。幾つかのコンジュゲートはＡβのＮ−末端セグメントのＮ−末端に連結された担体ペプチドを含んでなり、これは次いでＡβの１もしくは複数のさらなるＮ−末端セグメントに直列に連結される。好ましくはそのような免疫原Ａβフラグメントはいったん適切な担体に連結されれば、Ａβの他のフラグメントに向かうことなくＡβフラグメントに特異的に向けられた免疫応答を誘導する。
【０１０３】
本発明の免疫原ペプチドは、免疫原性の異種ペプチドを含む。免疫原ペプチドの中には、Ａβフラグメントが担体に連結されて免疫原性の異種ペプチドを形成するものもある。この異種ペプチドは本発明の方法を使用して担体に連結されてコンジュゲートを形成する。これらの免疫原性の異種ペプチドの幾つかは、米国特許第５，１９６，５１２号明細書、欧州特許第３７８，８８１号および同第４２７，３４７号明細書に記載されているような破傷風トキソイドエピトープに連結されたＡβのフラグメントを含んでなる。場合により免疫原ペプチドは、例えば担体のＮおよびＣ末端の両方で１もしくは多数の担体のコピーに連結されて、免疫原性の異種ペプチドを形成することができる。他のこれら免疫原性の異種ペプチドは、米国特許第５，７３６，１４２号明細書に記載された担体ペプチドに連結されたＡβのフラグメントを含んでなる。例えば免疫原性の異種ペプチドは、Ａβ１−７、続いてＡβ１−３、続いて担体を含んでなることができる。そのような免疫原性の異種ペプチドの例には：
【０１０４】
【表７】
2008505052.tif 000016
【０１０５】
【表８】
2008505052.tif 000017
【０１０６】
を含む。
【０１０７】
幾つかの免疫原性の異種ペプチドは、式２ｘにより表される免疫原ペプチドの多量体を含んでなり、ここでｘは１〜５の整数である。好ましくはｘは１、２または３であり、２が最も好適である。ｘが２である時、そのような多量体はＭＡＰ４と呼ばれる好適な形態で連結された４つの免疫原ペプチドを有する（米国特許第５，２２９，４９０号明細書を参照にされたい）。そのような免疫原ペプチドは、次いで本発明の方法を使用して担体に連結されてコンジュゲートを形成する。
【０１０８】
ＭＡＰ４形態を以下に示し、ここで分枝構造はＮ−末端およびリシンの側鎖アミンの両方でペプチド合成を開始することにより生産される。リシンが配列に取り込まれ、そして分枝される回数に依存して、生じる構造は多くのＮ−末端を与える。この例では、４つの同一のＮ−末端が分枝したリシン含有コア上に生産された。そのような多重性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）はコグネイトＢ細胞の応答性を大きく強化する。
【０１０９】
【化８】
2008505052.tif 000018
【０１１０】
そのような免疫原性の異種ペプチドの例には：
【０１１１】
【表９】
2008505052.tif 000019
【０１１２】
【化９】
2008505052.tif 000020
【０１１３】
を含む。
【０１１４】
Ａβペプチド、類似体、活性フラグメントまたは他のポリペプチドは、会合した形または多量体形または解離形で投与することができる。また治療薬は単量体の免疫原物質の多量体を含む。Ａβペプチド以外の作用物質は上に列挙したＡβ（例えば１−１０、１−７、１−３および３−７）の１もしくは複数の好適フラグメントに対する免疫応答を誘導すべきであり、そして本発明の方法を使用して担体に結合され得る。好ましくはそのような作用物質がいったん適切な担体に結合されれば、Ａβの他のフラグメントに向かうことなくこれらのフラグメントの１つに特異的に向けられた免疫応答を誘導する。ペプチド免疫原と担体との結合を促進するために、さらなるアミノ酸を抗原決定基の末端に付けることができる。このさらなる残基もペプチド免疫原の物理的または化学的特性を修飾するために使用することができる。チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸等のようなアミノ酸は、ペプチド免疫原のＣ−またはＮ−末端に導入することができる。加えて、グリシンおよびアラニンのようなアミノ酸を含有するペプチドリンカーも導入することができる。さらに抗原決定基は、末端ＮＨ２−基のアシル化により、例えばアルカノイル（Ｃ１−Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化により、末端カルボキシアミド化、例えばアンモニア、メチルアミン等により修飾されることにより自然な配列とは異なることができる。場合により、これらの修飾は支持体または他の分子を連結するための部位を提供することができる。
【０１１５】
本明細書に開示する方法を使用して、本発明のコンジュゲートを生成するために使用するペプチド免疫原は、連結を介して合わせてポリマー（多量体）を形成するか、または混合物として連結を含まずに組成物中に配合することができる。ペプチドが同一のペプチドに連結される場合、これによりホモポリマー、複数の反復するエピトープ単位が与えられる。例えば多抗原ペプチド技術を使用して、ＣＴＬおよび／または抗体ペプチドおよびペプチドの両方を含有するポリマーを構築する。ペプチドが異なる場合（例えば異なるウイルスサブタイプを表すカクテル、サブタイプ中の異なるエピトープ、異なるＨＬＡ拘束特異性、またはＴ−ヘルパーエピトープを含むペプチド）、反復単位を持つヘテロポリマーが提供される。共有結合に加えて、分子間および構造内結合を形成することができる非共有的連結も意図する。
【０１１６】
そのようなペプチド免疫原およびそれらの類似体は、固相ペプチド合成または組換え発現により合成されるか、あるいは天然資源から得られる。自動化ペプチド合成器が、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティ、カリフォルニア州）のような多くの供給元から市販されている。
【０１１７】
組換え発現は、バクテリア（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような）、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞で行うことができる。組換え発現に関する手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（コールドスプリングハーバーラ出版、ニューヨーク、第２版、１９８９）に記載されている。幾つかの免疫原ペプチドは市販されている（例えばアメリカン  ペプチド  カンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）社、サニーヴァレ、カリフォルニア州およびカリフォルニア  ペプチド  リサーチ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社、ナパ、カリフォルニア州）。
【０１１８】
ペプチドまたは他の化合物のランダムライブラリーも、ペプチド免疫原としての適性をスクリーニングすることができる。組み合わせライブラリーは、段階的様式で合成することができる多くの種類の化合物について生成することができる。そのような化合物にはポリペプチド、ベータ回転模造物、ホルモン、オリゴマー性Ｎ−置換グリシン、およびオリゴカルバメート等を含む。化合物の大きな組み合わせライブラリーは、国際公開第９５／１２６０８号、同第９３／０６１２１号、同第９４／０８０５１号、同第９５／３５５０３号および同第９５／３０６４２号パンフレット（それぞれすべての目的について、引用により本明細書に編入する）に記載されているコード化合成ライブラリー（Ｃｏｄｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ：ＥＳＬ）法により構築することができる。ペプチドライブラリーもファージディスプレイ法（例えばＤｅｖｌｉｎ、国際公開第９１／１８９８０号パンフレットを参照にされたい）により作成することができる。
免疫原ペプチドのタンパク質担体への誘導化および結合
ペプチド免疫原のタンパク質／ポリペプチド担体への結合部位、およびペプチド免疫原を担体に結合するために使用する架橋結合剤の性質の両方が、それに対して生成される抗体の特異性に重要である。正しい認識には、ペプチド免疫原は適切な方向を持つ担体にカップリングされなければならない。続いて抗体に、担体が無い遊離ペプチドを認識させるために、ペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体コンジュゲートは、ペプチド免疫原を露出および接近可能な状態で存在しなければならない。最適な方向性はペプチド免疫原上の特異的部位に対して架橋結合反応を向けることにより達成されることが多い。ペプチド免疫原を用いてこれを行うための１つの方法は、ペプチド合成中に末端システイン残基を付けることによる。これにより担体への結合のためにペプチドの１つの末端にスルフヒドリル基が提供される。この基を介した架橋結合は、ペプチド免疫原の１つの末端のみに結合を提供し、これにより一貫した方向性が確実となる。
【０１１９】
ペプチド免疫原−担体コンジュゲートにおいて、目標は担体の天然状態または安定性を維持することではなく、ハプテンを最も可能性があるように免疫系に提示することである。この目標を達成するために、結合化学の選択はハプテンに対して生成した抗体に生じる力価、親和性および特異性を制御することができる。場合により非制限様式で抗原を提示するために十分な長さのスペーサーアームを含有する架橋結合剤を選択することが重要になるかもしれない。担体表面上のペプチド免疫原の密度を制御することも重要かもしれない。少なすぎるペプチド免疫原の置換は、応答をほとんど生じないか、または生じない。ペプチド免疫原の密度が高すぎると、実際には免疫抑制および応答の減少を引き起こす恐れがある。さらに架橋剤自体が望ましくない免疫応答を生じ得る。これらの事柄から、適切な架橋結合剤だけでなく、適切なタンパク質／ペプチド担体とペプチド免疫原の比率の選択も考慮する必要がある。
【０１２０】
タンパク質／ペプチド担体をペプチド免疫原に結合する種々の手段が可能である。イオン的相互作用は、リシンのε−アミノ基の末端またはそれを介して可能である。残基の側基とペプチド免疫原との間の水素結合も可能である。最後にタンパク質／ペプチド担体と免疫原ペプチドとの間の立体配置的相互作用は、安定な結合を生じ得る。
【０１２１】
ペプチド免疫原−担体コンジュゲートは、ゼロ−長、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤のような種々の架橋コンジュゲート剤を使用して成功裏に作成されてきた。生物結合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のための最も小さな利用可能な試薬系は、いわゆるゼロ−長架橋剤である。これらの化合物はさらなる原子を含まない結合を形成することにより、２つの分子の結合を媒介する。すなわち分子の１つの原子がスペーサーである。多くの結合スキームにおいて、最終的な複合体は外来構造を架橋結合される物質に付ける化学成分により一緒に結合される。幾つかの応用では、これらの介入リンカーの存在が意図する用途に決定的となり得る。例えばペプチド免疫原−担体コンジュゲートの調製では、複合体は結合したハプテンに対する免疫応答を生じることを意図して形成される。場合によりこの応答により生産される抗体の一部は、結合手順で使用する架橋結合剤に対する特異性を有する。ゼロ−長の架橋結合剤は、２つの物質間の直接的連結を媒介することによりこの種の交差反応性の可能性を排除する。
【０１２２】
修飾に使用する第１の架橋結合剤であったホモ二官能性試薬および高分子の結合は、両末端に同じ官能基を含む生物反応性化合物からなった（Ｈａｒｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｄ，１９６６）。これらの試薬は両分子上の同じ共通する基と共有的に反応することにより、１つのタンパク質をもう別のタンパク質に結ぶことができた。すなわち１つのタンパク質のリシンのε−アミンまたはＮ−末端アミンを、第２のタンパク質上の同じ官能基に、ホモ二官能性試薬の存在下で単に２つを一緒に混合することにより架橋結合することができた。
【０１２３】
ヘテロ二官能性結合試薬は、タンパク質および高分子上の２つの異なる官能的標的にカップリングすることができる２つの異なる反応基を含む。例えば架橋剤の１部はアミン反応基を含むことができ、一方、もう１つのタンパク質はスルフヒドリル反応基からなることができる。この結果は架橋結合反応を目的分子の選択部分に向ける能力であり、これにより結合工程により良い制御を生じる。
【０１２４】
ヘテロ二官能性試薬は、ホモ二官能性架橋剤を使用してしばしば得られる重合化の程度を限定する２または３段階工程で、タンパク質および他の分子を架橋結合するために使用される。
【０１２５】
現在、ゼロ−長のホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤を使用して、ペプチド免疫原をペプチド／ポリペプチド担体にカップリングするためにの多くの方法を使用することができる。多くの方法がアミン、アミド、ウレタン、イソチオウレアまたはジスルフィド結合を、または場合によりチオエーテル結合を生じる。タンパク質またはペプチドをペプチドにカップリングするためのより一般的な方法は、二官能性架橋試薬を利用する。これらは、各末端に活性基を有する小さいスペーサー分子である。スペーサー分子は、同一または異なる活性基を各末端に有することができる。最も普通の活性な官能基、カップリング基および形成される結合は：
１．アルデヒド−アミノ→２級アミン
２．マレイミド−スルフヒドリル→チオエーテル
３．シクシンイミド−アミノ→−アミド
４．イミデートエステル−アミノ→アミド
５．フェニルアジド−アミノ→フェニルアミン
６．アシルハライド−スルフヒドリル→チオエーテル
７．ピリジルジスルフィド−スルフヒドリル→ジスルフィド
８．イソチオシアナト−アミノ→イソチオウレア
上記担体タンパク質の反応性は、担体タンパク質がペプチド免疫原に結合され得るような、架橋結合剤により修飾されるその能力という意味で、分子の３次元構造における個々のアミノ酸のアミノ酸組成および配列の位置により、ならびにペプチド免疫原のアミノ酸組成により決定される。
【０１２６】
タンパク質／ペプチド担体と他のペプチド（例えばタンパク質／ペプチド担体およびペプチド免疫原）との間のリンカー（Ｌ）の場合、スペーサーは典型的にはＡｌａ、Ｇｌｙまたは非極性アミノ酸もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。特定の態様では、中性スペーサーはＡｌａである。場合により存在するスペーサーは同じ残基からなる必要はなく、したがってヘテロ−またはホモ−オリゴマーであることができる。例示的なスペーサーにはＡｌａのホモ−オリゴマーを含む。存在する時には、スペーサーは通常、少なくとも１もしくは２個の残基、より通常には３〜６個の残基である。別の態様では、タンパク質／ペプチド担体はペプチド免疫原に、好ましくはアミノ末端に配置されたタンパク質／ペプチド担体を用いて結合される。ペプチドはＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等のような中性リンカーにより連結され、そしてさらに典型的にはＳｅｒ−Ｓｅｒ連結等を介してペプチドコンジュゲートのアミノ末端に付けられたＬｙｓ残基（（ＰＡＭ）２−Ｌｙｓ）のアルファおよびイプシロンアミノ基に付けられたパルミチン酸等のような脂質残基を含むことができる。
【０１２７】
本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−５−Ｌ、Ａβ１−７−Ｌ、Ａβ１−９−ＬおよびＡβ１−１２−Ｌからなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の幾つかの観点では、リンカーはＧＡＧＡ（配列番号１０）である。
【０１２８】
ペプチド免疫原を担体を用いて結合し易くするために、さらなるアミノ酸を抗原決定基の末端に加えることができる。またさらなる残基は、ペプチド免疫原の物理的または化学的特性を修飾するためにも使用することができる。チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸等のようなアミノ酸を、ペプチド免疫原のＣ−もしくはＮ−末端に導入することができる。さらにグリシンおよびアラニンのようなアミノ酸を含有するペプチドリンカーも導入することができる。加えて抗原性決定基は、末端ＮＨ２−基のアシル化により、例えばアルカノイル（Ｃ１−Ｃ２０）またはチオグリコリルアシル化、末端カルボキシアミド化、例えばアンモニア、メチルアミン等による修飾により自然な配列とは異なることができる。場合により、これらの修飾は支持体または他の分子を連結するための部位を提供することができる。
【０１２９】
本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−５−Ｃ、Ａβ１−７−Ｃ、Ａβ１−９−ＣおよびＡβ１−１２−Ｃからなる群から選択されるＡβフラグメントであり、ここでＣはシステインアミノ酸残基である。本発明の幾つかの観点では、ペプチド免疫原はＡβ１−５−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−７−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−９−Ｌ−ＣおよびＡβ１−１２−−Ｌ−Ｃからなる群から選択されるＡβフラグメントである。
【０１３０】
ペプチド免疫原はタンパク質／ペプチド担体に直接的に、またはペプチド免疫原のアミノまたはカルボシ末端のいずれかでリンカーを介して連結される。ペプチド免疫原またはタンパク質／ペプチド担体のいずれかのアミノ末端をアシル化することができる。加えて、ペプチド免疫原−タンパク質／ペプチド担体コンジュゲートは、以下に記載するようなＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒのような１もしくは複数の連結残基を介して特定のアルカノイル（Ｃ１−Ｃ２０）脂質に連結することができる。他の有用な脂質部分にはコレステロール、脂肪酸等がある。
【０１３１】
ペプチド免疫原は化学的架橋結合により担体に連結することができる。免疫原を担体に連結する技術には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１７３：７２３）、およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、これはシステイン残基をハプテンに加えることにより提供できる）を使用したジスルフィド結合の形成を含む。これらの試薬はそれら自体と１つのタンパク質上のペプチドのシステイン残基との間にジスルフィド結合を、そしてリシン上のε−アミノを、または他のアミノ酸の遊離アミノ基を介したアミド結合を作成する。そのような種々のジスルフィド／アミド形成剤がＩｍｍｕｎｅ．Ｒｅｖ．６２：８５（１９８２）に記載されている。他の二官能性カップリング剤はジスルフィド結合よりはむしろチオエーテル結合を形成する。チオエーテル形成試薬には、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルを含む。カルボキシル基は、それらをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と合わせることにより活性化することができる。
【０１３２】
最も頻繁には、リシン残基は担体タンパク質上に見いだされる最も豊富なアミノ酸残基であり、そしてこれらの残基は架橋結合剤を使用して修飾されて、次にハプテンにカップリングされる求核部位を生成する。このカップリングは化学的に活性なハプテン分子上の親水性側鎖を介してなされる。これらには幾つかを挙げれは、アルギニンのグアニジル基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の（−カルボキシル基、システインのスルフヒドリル基、およびリシンのε−アミノ基がある。ここで他の分子にカップリングすることができるように、タンパク質の修飾は、タンパク質担体またはハプテン分子上の任意の側鎖と反応する架橋結合剤を使用してなされる。
【０１３３】
本発明の１つの観点では、リンカー分子を含むか、または含まない担体タンパク質は、求核性基を導入するためにさらに修飾することができる、担体タンパク質分子に反応性部位を導入する試薬で官能化（誘導化）される。１つの態様では、担体はシステインのスルフヒドリル基、リシンの１級ε−アミン基、α−アミンのα末端、メチオニンのチオエーテルおよびヒスチジンの両イミダゾリル側鎖の窒素のようなタンパク質のアミノ酸残基上の多数の官能基と優先的に反応するハロアセチル化試薬と反応させる（Ｇｕｒｄ，１９６７）。好適な態様では、担体タンパク質のリシン残基上の１級ε−アミン基がｂＮ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテートで誘導化されて、ブロモアセチル化担体を生成する。ペプチド免疫原と活性化タンパク質担体の結合は、活性化担体をペプチド免疫原を含有する溶液にゆっくりと加えることにより行った。
【０１３４】
本発明の方法を使用することにより、上記のＢ章で検討したペプチド免疫原は、上記のＡ章で検討した任意の担体に結合することができる。本発明の方法から生じたコンジュゲートは、受動／能動免疫療法で使用するＡβに対して抗体を生成するための免疫原として使用される。さらに担体に連結されたＡβまたはＡβフラグメントは、Ａβに対するモノクローナル抗体の生産で実験動物に投与することができる。
【０１３５】
本発明の１つの観点では、コンジュゲートはＡβ１−７−ＣＲＭ１９７、（Ａβ１−７ｘ３）−ＣＲＭ１９７、および（Ａβ１−７ｘ５）−ＣＲＭ１９７からなる群から選択されるコンジュゲートである。本発明の１つの観点では、コンジュゲートはＣＲＭ１９７−Ａβ１−５、ＣＲＭ１９７−Ａβ１−７、ＣＲＭ１９７−Ａβ１−９およびＣＲＭ１９７−Ａβ１−１２からなる群から選択されるコンジュゲートである。本発明の別の観点では、コンジュゲートはＡβ１−５−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１−７−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１−９−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１−１２−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１６−２３−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１７−２４−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１８−２５−Ｃ−ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１９７−Ｃ−Ａβ１６−２３、ＣＲＭ１９７−Ｃ−Ａβ１７−２４、ＣＲＭ１９７−Ｃ−Ａβ１８−２５、Ａβ１６−２２−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１７−２３−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１８−２４−Ｃ−ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１９７−Ｃ−Ａβ１６−２２、ＣＲＭ１９７−Ｃ−Ａβ１７−２３およびＣＲＭ１９７−Ｃ−Ａβ１８−２４からなる群から選択されるコンジュゲートである。本発明のさらに別の観点では、コンジュゲートはＡβ１−５−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１−７−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ａβ１−９−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ１９７およびＡβ１−１２−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ１９７からなる群から選択されるからなる群から選択されるコンジュゲートである。
キャッピング
反応性部位を担体および／またはハプテン分子上の反応性アミノ酸分子の側鎖に導入するカップリング試薬を使用することの欠点は、反応性部位が中和されていなければ、インビトロまたはインビボのいずれかで任意の望ましくない分子と自由に反応する点である。本発明の方法では、未反応官能基のキャッピングがペンダント反応基を持つコンジュゲートと反応性基を不活性化／キャップする試薬との反応によりなされる。本発明の結合法で使用する不活性化／キャッピング試薬の例には、Ｎ−アセチルシステアミンおよびエタノールアミンがある。あるいはキャッピングはアンモニアまたは重炭酸アンモニウムとの反応によりなされ、いずれもハロアセチル基をアミノアセチル基に変換する。またキャッピングは水酸化ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムを使用してアルカリ性ｐＨ（９．０−９．８）でも行われ、これはハロアセチル基をヒドロキシアセチル基に変換する。ハロアセチル基をアミノアセチルまたはヒドロキシアセチル基に変換する１つの利点は、システアミン誘導体、エタノールアミン等との反応に反して、アンモニアまたは水酸化物／炭酸塩との反応による比較的小さいサイズの化学的官能基の導入である。生じるキャップ化官能基、例えばアミノアセチルまたはヒドロキシアセチルは、コンジュゲートの担体タンパク質部分に比較的少ない不安定性（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｃｅ）を与える。キャップ化されたペプチド免疫原−担体タンパク質は、クロマトグラフィー（ゲル濾過、イオン交換、疎水性相互作用または親和性）、透析、限外濾過−透析濾過、硫酸アンモニウムまたはアルコールを用いた分別沈殿等のような既知の方法を使用して、必要に応じて精製される。
免疫原コンジュゲートおよび組成物
キャップ化されたペプチド免疫原−担体タンパク質コンジュゲートは、予防および／または治療目的で免疫原組成物中にて哺乳動物、特にヒトに投与される。本発明のコンジュゲートは、免疫原に対する免疫応答を誘発および／または強化するために使用される。例えばＣＴＬ−担体コンジュゲートは、ウイルス感染  、アミロイド形成疾患、ガン等を処置および／または防止するために使用される。あるいは抗体応答を誘導するポリペプチド免疫原−担体コンジュゲートも使用される。本発明のコンジュゲートを使用して処置できる疾患の例は、種々のバクテリア感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生生物感染およびガンを含む。
【０１３６】
治療的応用では、本発明のコンジュゲートはアルツハイマー病のようなアミロイド形成疾患、ガンにすでに罹患した、または病原性微生物に感染した個体に投与される。疾患の潜伏期または急性期に、本発明のコンジュゲートを他の処置と別個に、または適切ならば一緒に用いて処置することができる。
【０１３７】
治療的応用では本発明の免疫原組成物は、微生物、アミロイドプラーク、またはガン細胞上で発現される腫瘍抗原に対して効果的なＣＴＬ応答または体液性応答が誘発されるために、そして治癒するために、または少なくとも部分的に疾患の進行、症状および／または合併症を止めるために十分な量で患者に投与される。これを達成するために十分な量を、「治療に有効な用量」と定める。この使用に有効な量は、一部はペプチド組成物、投与様式、処置する疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、および処方する医師の判断に依存する。
【０１３８】
本発明の免疫原組成物の治療に有効な量は、一般に治療または予防的投与の初回免疫感作については、７０ｋｇの患者について約０．１μｇ〜約１０，０００μｇのペプチド、通常は約０．１〜約８０００μｇ、好ましくは約０．１〜約５０００μｇ、そして最も好ましくは約０．１〜約１０００μｇの間の範囲である。これらの投与に続いて、約０．１μｇ〜約１０００μｇのペプチドの追加免疫投薬用量が、特異的免疫応答を測定することにより患者の応答および状態に依存して追加免疫感作の処方に準じて数週間から数カ月にわたり続けられる。
【０１３９】
さらに本発明はバクテリア感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生生物感染、アミロイド形成疾患またはガンを予防的に防止し、かつ／または改善するために使用される。有効量は上記の通りである。さらに当業者は、適切ならば追加免疫し、そして投薬用量および投薬計画を調整することにより、予防的処置をどのように調整または修飾するかを知っている。
【０１４０】
治療的投与は疾患の最初の兆候または腫瘍の検出もしくは外科的除去、または急性の感染の場合は診断直後に始められる。これに続いて追加免疫投与は疾患の進行が停止するか、または逆行するか、または症状が実質的に弱まるまで、そしてその後の期間続けられる。慢性的感染では、初期の高用量に続いて追加免疫感作の投与が必要となるかもしれない。
【０１４１】
感染した個体を本発明の組成物で処置することは、急に感染した個体における感染の消散を促進することができる。慢性感染を起こし易い（または素因がある）個体には、組成物は急性または慢性の感染からの進行的変化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を防止する方法において有用である。例えば本明細書に記載するように影響を受け易い個体が感染前、または感染中に同定された場合、組成物は彼らを標的とすることができ、大多数に投与する必要性を最小にする。
【０１４２】
また本発明のコンジュゲートは、慢性感染を処置し、そして免疫系を刺激して潜伏感染している個体のウイルスに感染した細胞を排除するために使用される。一定量の本発明の免疫原組成物を、免疫応答を効果的に誘発および／または強化するために十分な製剤および投与様式で提供することが重要である。すなわち慢性感染の処置には、代表的な用量は７０ｋｇの患者について投与あたり約０．１μｇ〜約１０，０００μｇのペプチド、通常は約０．１〜約８０００μｇ、好ましくは約０．１〜約５０００μｇの間、そして最も好ましくは約０．１〜約１，０００μｇの間の範囲である。免疫感作投与に続いて追加免疫感作が、確立した間隔、例えば１から４週間、可能であればより長期間、個体を効果的に免疫感作するために必要とされ得る。慢性感染の場合、投与は少なくとも臨床的症状または研究室での試験が、ウイルス感染が排除されたか、または実質的に停止したことを示すまで、そしてその後の一定期間、続けられるべきである。
【０１４３】
治療的または予防的処置用の本発明の免疫原組成物は、予防的および／または治療的処置に非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内または筋肉内の手段により投与することができる。免疫原性作用物質の１つの典型的な投与経路は皮下であるが、他の経路も等しく効果的となり得る。他の通常の経路は筋肉内注射である。この種の注射は最も多くは腕または脚の筋肉に行われる。幾つかの方法では、作用物質は沈積が蓄積する直接特定の組織に直接注射され、これは例えば頭蓋内注射である。筋肉内注射または静脈内注入は、抗体の投与に好適である。幾つかの方法では、特定の治療用抗体が頭蓋に直接注射される。投与の容易さから、本発明の免疫原組成物は経口投与に特に適している。さらに本発明は非経口投与用の免疫原組成物を提供し、これは許容され得る担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁されたペプチドまたはコンジュゲートの溶液を含んでなる。
【０１４４】
種々の希釈剤、賦形剤およびバッファー、例えば水、緩衝水、リン酸緩衝化生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は通常の周知滅菌技術により滅菌されることができ、あるいは滅菌濾過されることができる。生じた水溶液はそのまま使用されるために包装されるか、または凍結乾燥されることができ、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌溶液と合わせられる。組成物は緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレート等のような製薬学的に許容され得る補助物質を、生理学的条件に近づけるために必要に応じて含むことができる。
【０１４５】
固体組成物について、通例の非毒性固体担体を使用することができる。これらには例えば製薬学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロース、炭酸マグネシウム等を含むことができる。経口投与には、製薬学的に許容され得る非毒性の組成物は、すでに列挙した担体のような通常に使用される任意の賦形剤、および一般に１０〜９０％の有効成分（すなわち本発明の１もしくは複数のコンジュゲート）、そしてさらに好ましくは２５〜７５％を包含させることにより形成される。
【０１４６】
製薬学的製剤中の本発明の免疫原組成物の濃度は、約０．１％未満から、通常少なくとも約２０％から多くても２０％〜５０重量％以上で広く変動することができ、そして主に特定の投与様式に従い流体の容量、粘性等により選択される。
【０１４７】
本発明のコンジュゲートは、リポソームを介して投与することもでき、リポソームはコンジュゲートをリンパ組織のような特定の組織に標的させるために、あるいは感染細胞に対して目標とする選択性のために、ならびにペプチド組成物の半減期の上昇に役立つ。リポソームにはエマルション、泡沫、ミセル、不溶性単層、液体結晶、リン脂質分散物、ラメラ層等を含む。これらの調製物では、送達される組成物はリポソームの一部として、単独で、または例えばリンパ球細胞に広く存在する受容体に結合する分子と結合して包含される。これらの分子は、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体を、または他の治療用もしくは免疫原組成物を一緒に含む。すなわち本発明の所望の組成物で充填されたリポソームをリンパ球細胞の部位に向けることができ、次いでここでリポソームは選択した治療薬／免疫原ペプチド組成物を送達する。本発明で使用するためのリポソームは、一般に中性および負に荷電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールを含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般にリポソームサイズ、耐酸性および血流中でのリポソームの安定性を考慮して導かれる。例えばＳｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号明細書（引用により本明細書に編入する）に記載されているような、様々な方法をリポソームの調製に使用することができる。
【０１４８】
免疫細胞を標的とするために、リポソームに包含されるリガンドは所望する免疫系の細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントを含むことができる。本発明の組成物を含有するリポソーム懸濁物は、静脈内、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）等に、とりわけ投与様式、送達される組成物および処置する疾患の段階に従い変動する用量で投与され得る。
【０１４９】
エーロゾル投与には、本発明の組成物は好ましくは表面活性剤および推進薬と一緒に微細に分割された状態で供給される。典型的な組成物の割合は、０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０％である。もちろん表面活性剤は非毒性でなければならず、そして好ましくは推進薬中で溶解性である。そのような代表的な作用剤は、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸およびオレイン酸のような６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環式無水物とエステルもしくは部分エステルである。混合または天然グリセリドのような混合エステルを使用してもよい。表面活性剤は組成物の０．１〜２０重量％を構成し、好ましくは０．２５〜５％である。組成物のバランスは、通常は推進薬である。また所望により鼻内送達用のレシチンのように担体を含めることもできる。
【０１５０】
本発明の組成物はモノクローナル抗体を作成するためにも使用することができる。そのような抗体は診断薬または治療薬として有用となり得る。
【０１５１】
本発明の組成物は診断用試薬としての用途を見いだすこともできる。例えば本発明の組成物は、ポリペプチド免疫原を使用する処置法に対する特定個体の感受性を測定するために使用することができ、すなわち既存の処置プロトコールを修飾するために、または罹患した個体の予後を測定するために役立つことができる。さらに本発明の組成物は、どの個体が慢性感染を発症する実質的な危険性があるかを予測するためにも使用することができる。
【０１５２】
本発明のコンジュゲートは、場合により疾患および／またはその症状の処置および／または改善に少なくとも部分的に効果的である他の作用物質と組み合わせて投与することができる。アミロイド沈着が脳で起こるアルツハイマー病およびダウン症候群の場合、本発明のコンジュゲートは脳血管関門を渡る本発明の作用物質の通過を上げる他の作用物質と一緒に投与することができる。
【０１５３】
免疫原組成物は典型的にはアジュバントを含む。アジュバントは免疫原または抗原と一緒に投与された時、免疫応答を強化する物質である。多数のサイトカインまたはリンホカインは免疫調節活性を有することが示され、すなわちアジュバントとして使用することができ、それらには限定するわけではないがインターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば米国特許第５，７２３，１２７号明細書を参照にされたい）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（およびその変異体形）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば米国特許第５，０７８，９９６号明細書を参照にされたい）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦおよび腫瘍壊死因子αおよびβを含む。本発明に有用なさらに別のアジュバントには、限定するわけではないがＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを含むケモカインを含む。セレクチン、例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのような接着分子もアジュバントとして有用である。さらに別の有用なアジュバントには限定するわけではないが、ムチン様分子、例えばＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１、ＬＥＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５のようなインテグリンファミリーのメンバー、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３のような免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌのような同時刺激分子、血管増殖因子、神経成長因子、繊維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１および血管内皮増殖因子のような増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＦ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６を含む受容体分子を含む。さらに別のアジュバント分子には、カスパーゼ（ＩＣＥ）を含む。国際公開第９８／１７７９９号および同第９９／４３８３９号パンフレット（すべての目的に関して、引用により全部、本明細書に編入する）を参照にされたい。
【０１５４】
免疫応答を強化するために使用する適切なアジュバントには、限定するわけではないが米国特許第４，９１２，０９４号明細書（すべての目的に関して、引用により全部、本明細書に編入する）に記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；コリキサ（Ｃｏｒｉｘａ）、ハミルトン、マサチューセッツ州）を含む。またアジュバントとして使用するために適切であるのは、コリキサ（ハミルトン、マサチューセッツ州）から入手可能であり、そして米国特許第６，１１３，９１８号明細書（引用により全部、本明細書に編入する）に記載されているリピドＡ類似体またはアミノアルキルグルコサミンフォスフェート化合物（ＡＧＰ）またはその誘導体もしくは類似体である。１つのそのようなＡＧＰは２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカンシラミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ［（Ｓ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシ−テトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グリコピラノシド（これは５２９（ＲＣ５２９としても知られている；コリキサ）としても知られている）である。この５２９アジュバントは、水性状態（５２９ＡＦ）または安定なエマルション（５２９ＳＥ）として配合される。
【０１５５】
さらに別のアジュバントには、鉱物油および水エマルション、リン酸カルシウムのようなカルシウム塩、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロン酸、ポリオール、ムラミルジペプチド、死んだボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、米国特許第５，０５７，５４０号明細書（参考３により本明細書に編入する）に記載されたＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（アンチジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）、フラミンガム、マサチューセッツ州）のようなサポニン、およびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生成された粒子、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、バクテリアリポ多糖、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（参照により本明細書に編入する米国特許第６，２０７，６４６号明細書）、百日咳トキシン（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）非耐熱性トキシン（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９を含む；例えば国際公開第９３／１３３０２号および同第９２／１９２６５号パンフレット（すべての目的について引用により本明細書に編入する）を参照にされたい。
【０１５６】
またアジュバントとして有用であるのは、コレラトキシンおよびその変異体であり、国際公開第００／１８４３４号パンフレット（ここでアミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸以外、好ましくはヒスチジン）に置き換えられている）に記載されているものを含む。同様のＣＴトキシンまたは変異体が、国際公開第０２／０９８３６８号パンフレット（ここでアミノ酸１６位のイソロイシンが別のアミノ酸に単独で、またはアミノ酸６８位のセリンの別のアミノ酸への置換と組み合わせて置き換えられ；および／またはアミノ酸７２位のバリンが別のアミノ酸に置き換えられている）に記載されている。他のＣＴトキシンが国際公開第０２／０９８３６９号パンフレット（ここでアミノ酸２５位のアルギニンが別のアミノ酸に置き換えられ；および／またはアミノ酸がアミノ酸４９位に挿入され；および／または２つのアミノ酸がアミノ酸３５および３６位に挿入されている）に記載されている。
【０１５７】
本明細書を通して、記載する結果を説明するための任意の理論に対する参考は、本発明の範囲を限定するものではないと理解される。本発明が機能する方法とは無関係に、本明細書に記載する結果および利点は、本発明の以下の実施例を参照にすることにより達成することができる。
【０１５８】
当業者は多くの変更および修飾を、添付する特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく行えることが明らかである。本明細書で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、各刊行物、特許または特許出願が具体的に、そして個別に引用により包含しているように、それらを全部、すべての目的に関して同程度に包含する。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
ＣＲＭ１９７のＡβペプチドへの結合
ハプテン／抗原性ペプチドのコンジュゲートは、活性化担体ＣＲＭ１９７（これは３９個のリシン残基を有する）を、ペンダントチオール基を有するハプテン／抗原性ペプチドに以下に記載する方法を使用して反応させることにより行った（図１）。すべてのＡβペプチドは、これらのペプチドをシステイニルスルフヒドリル基を介して担体タンパク質に結合し易くするためにカルボキシ末端にシステイン残基を含んだ。これらのペプチドは固相合成により生産された。
Ｉ．活性化
ＣＲＭ１９７の遊離アミノ基は、過剰なブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、セントルイス、ミズーリ州）を用いた反応によりブロモアセチル化した（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｅｄａ，１９８６）。ＣＲＭ１９７（〜１５ｍｇ）の氷冷溶液に、１０（容量／容量）％の１．０Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）を加えた。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（使用したＣＲＭ１９７の重量に等しい）を２００μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ＣＲＭ１９７にゆっくりと加え、そして暗中、室温にて１時間穏やかに混合した。生じたブロモアセチル化（活性化）タンパク質は、ＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を溶出液として使用して脱塩（Ｐ６−ＤＧ）カラムを通すことにより精製した。精製後、活性化ＣＲＭ１９７に対応する画分をプールし、そしてタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイにより予想した。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理する前後の両方のタンパク質のアミノ基は、ブロモアセチル化の指標として役立つ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）で処理した（Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２）。
ＩＩ．結合
結合前に、ペプチドを５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）［Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬］と反応させて、遊離−ＳＨ基の含量を確認した（６２〜８８％の間で還元された）。最初の４種のＡβペプチド（リンカーを持たないアミノ酸１〜７、ＧＡＧＡＣリンカーを持つアミノ酸１〜１２、ＧＡＧＡＣリンカーを持つアミノ酸１〜９、およびＧＡＧＡＣリンカーを持つアミノ酸１〜７）については、約８．０〜１０．０ｍｇのペプチドを約２０ｍｇ／ｍｌの濃度に滅菌水に溶解した。ペプチドを冷却活性化ＣＲＭ１９７に１：１の比率（重量／重量）でゆっくりと加え、そしてｐＨを約７．０〜７．２に２０〜３６μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加えて調整した。生じた物質は暗中、４℃で一晩穏やかに混合し、続いて暗中で２回、１リットルのＰＢＳ、ｐＨ７．２を交換することにより透析した。次の４種をＡβペプチド（リンカーを持たないアミノ酸１〜５、リンカーを持たないアミノ酸１〜９、リンカーを持たないアミノ酸１〜１２、およびリンカーを持つアミノ酸１〜５）について、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬を用いた反応を使用して遊離−ＳＨ基を確認した。ＣＲＭ１９７をブロモアセチル化し、精製し、そしてＴＮＢＳＡと前に記載したように反応させた。各ペプチドのｐＨは２．２ｘ溶解ペプチドの容量で０．１Ｍ  ＮａＰＯ４（ｐＨ８．５）を加えることにより７．０に調整した。ペプチドは、冷却活性化ＣＲＭ１９７に１：１の比率でゆっくりと加え、そして暗中、４℃で一晩反応させた。生じた物質を透析した。最後に対照ペプチド（逆方向の１〜１２ｍｅｒ）は、以下の修飾を用いて上記のようにＣＲＭ１９７に結合させた。ペプチドのｐＨを７．０に調整するというよりは、活性化ＣＲＭ１９７のｐＨを約７．５に、２０（容量／容量）％の０．５Ｍ  ＮａＰＯ４（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。透析後、各コンジュゲートを滅菌した１５ｍＬのポリプロピレン管に移し、アルミホイルで包み、そして４℃に保存した。次いで担体上の反応性アミノ残基の活性化は、質量分析を使用して引き続き確認した。
【０１６０】
【表１０】
2008505052.tif 000021
【０１６１】
実施例２
Ａβペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製および限外濾過による精製
ＣＲＭ１９７のブロモアセチル化
０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中のＣＲＭ１９７（１００ｍｇ）を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍＬに溶解）と１：１の重量比率でアルゴン雰囲気下にて反応させた。反応物は必要に応じて滴定し、７．０にｐＨを維持した。混合物は室温にて１．５時間、暗中で撹拌した。反応混合物はＵＦ／ＤＦ系の保持リザーバー（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のラボスケールＴＦＦ、ビレリカ、マサチューセッツ州）に１．２μｍで濾過した。精製は１０Ｋまたは３０Ｋ  ＵＦ膜を使用して、０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対する透析濾過（３０倍）により行った。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７は、０．２μｍのフィルターを通すことにより濾過した。ブロモアセチル化の程度は、活性化ＣＲＭ１９７をシステインと反応させ、続いてアミノ酸分析そして生成したカルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の定量により測定した。
Ａβペプチドおよびブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の結合およびＮ−アセチルシステアミンを用いたキャッピング
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７（５０ｍｇ）を反応容器に移した。２〜８℃を維持しながら、この撹拌溶液に１Ｍの炭酸／重炭酸ナトリウムを加えた。滴定を行って目標とするｐＨ９．０にアルゴン雰囲気下で達した。別個に、５０ｍｇのＡβペプチドを計り取り、そして注射用水（ＷＦＩ）に２０ｍｇ／ｍＬで溶解した。この溶液にｐＨ９．０が達成されるまで１Ｍの炭酸／重炭酸ナトリウムを加えた。ペプチド溶液をブロモアセチル化ＣＲＭ１９７溶液に加え、そして混合物を２〜８℃で１４〜１８時間撹拌した。残るブロモアセチル基は、２０倍モル過剰のＮ−アセチルシステアミンで２〜８℃にて３〜６時間、キャッピングした。
【０１６２】
反応混合物はＵＦ／ＤＦ系の保持リザーバー（ミリポア、ＸＬ）に１．２μｍのフィルターを通して入れ、そしてコンジュゲートは室温で１０Ｋまたは３０ＫのＭＷＣＯ膜（ミリポア）を使用して、０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して３０倍まで透析濾過することにより精製した。保持物を集め、そして０．２μｍで濾過し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、アミノ酸分析によりタンパク質含量（ローリーまたはマイクロ−ＢＣＡ比色アッセイ）に関して、そしてマウスにおける免疫原性について分析した。
実施例３
未反応ブロモアセチル基のアミノアセチル基へのキャッピングによる変換
上記実施例２で調製したブロモアセチル化ＣＲＭ１９７（５０ｍｇ）を反応容器に移した。この撹拌溶液に、２〜８℃を維持しながら、１Ｍの炭酸／重炭酸ナトリウムを加えた。滴定を行って目標とするｐＨ９．０にアルゴン雰囲気下で達した。別個に、５０ｍｇのＡβペプチドを計り取り、そしてＷＦＩに２０ｍｇ／ｍＬで溶解した。この溶液にｐＨ９．０が達成されるまで１Ｍの炭酸／重炭酸ナトリウムを加えた。ペプチド溶液をブロモアセチル化ＣＲＭ１９７溶液に加え、そして混合物を２〜８℃で１４〜１８時間撹拌した。残るブロモアセチル基は、８％の重炭酸アンモニウム溶液を使用して２〜８℃にて４時間、キャッピングした。
【０１６３】
反応混合物はＵＦ／ＤＦ系の保持リザーバー（ミリポア、ＸＬ）に１．２μｍのフィルターを通して入れ、そしてコンジュゲートは室温で１０Ｋまたは３０ＫのＭＷＣＯ膜を使用して、０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して３０倍まで透析濾過することにより精製した。保持物を集め、そして０．２μｍで濾過し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、アミノ酸分析によりタンパク質含量（ローリーまたはマイクロ−ＢＣＡ比色アッセイ）に関して、そしてマウスにおける免疫原性について分析した。
実施例４
ペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチドコンジュゲートの結合およびキャッピングの程度の評価としてのＳ−カルボキシメチルシステインおよびＳ−カルボキシメチルシステアミンの定量的測定 
ブロモアセチル活性化化学を使用して生成したタンパク質−ペプチドコンジュゲートの酸加水分解は、結合した部位のシステインに由来する酸安定性Ｓ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の形成、およびキャッピングした部位のシステアミンに由来する酸安定性Ｓ−カルボキシメチルシステアミン（ＣＭＣＡ）の形成を生じた（図２）。コンジュゲートおよびキャッピングしたリシンのすべては、リシンに変換して戻し、そしてそのまま検出した。すべての他のアミノ酸は、加水分解条件により破壊したトリプトファンおよびシステインを除いて遊離のアミノ酸に加水分解して戻した。アスパラギンおよびグルタミンはそれぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸に変換した。
【０１６４】
コンジュゲートサンプルを脱イオン水で１ｍｇ／ｍＬ未満の総タンパク質濃度に希釈した。各コンジュゲートの２つの１０マイクログラムのアリコートを乾燥させ、そして１００μＬの６Ｎ  ＨＣｌ［ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）］、５μＬの融解フェノール［シグマ−アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）］および１μＬの２−メルカプトエタノール［シグマ−アルドリッチ］に再懸濁した。次いでサンプルを真空（１００ｍＴ）下、１１０℃で２２時間インキュベーションした。生じた加水分解物を乾燥させ、２５０μＬのベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｎａ−Ｓクエン酸ナトリウムサンプル希釈バッファー（ｐＨ２．２）［ベックマンインスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社、フラートン、カリフォルニア州］に再懸濁し、そしてワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）０．２μｍナイロンシリンジチップフィルターおよび１ｍＬのシリンジを使用して濾過した。
次いで各サンプルをベックマン６３００アミノ酸分析機のサンプルループに乗せ、そして分析機に配置した。各加水分解サンプルおよび対照のアミノ酸は、イオン交換クロマトグラフィーにより分離し、続いてベックマンのニンヒドリンＮｉｎＲＸ溶液と１３５℃で反応させた。次いで誘導化したアミノ酸は５７０ｎｍおよび４４０ｎｍの可視領域で検出した（表１を参照にされたい）。５００ピコモルの各アミノ酸を含有するアミノ酸の標準組［ピアスアミノ酸標準Ｈ］を、各組の分析についてサンプルおよび対照と一緒に分析した。Ｓ−カルボキシメチルシステイン［シグマ−アルドリッチ］を標準に加えた。
【０１６５】
【表１１】
2008505052.tif 000022
【０１６６】
各標準ピークの面積を、各サンプルの比例評価に関して定量的均等物として使用した。プロリンは４４０ｎｍで測定し、そして最も近いアミノ酸であるグルタミン酸を使用して５７０ｎｍでの均等物に変換した。
【０１６７】
これらの各ピコモル値は、タンパク質中に存在する理論的なリシン値に対するリシンのピコモルの比較を使用してアミノ酸残基のモル比に変換した。リシンはシステインおよびシステアミンへのリシンの共有結合および予想される類似の加水分解に基づきこの評価に選択した。次いでアミノ酸の生じたモル数は、タンパク質のアミノ酸組成と比較し、そしてＣＭＣおよびＣＭＣＡに関する値と一緒に報告した。ＣＭＣ値は結合の程度の評価について直接使用し、そしてＣＭＣＡ値はキャッピングの程度の評価について直接使用した。
実施例５
Ａβ−ＣＲＭ１９７ペプチドコンジュゲートの特性決定および至適化
結合を確認するために、すべてのペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートをアミノ酸分析およびマトリックスアシステッドレーザー励起イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により分析した。各コンジュゲートに関して、各１モルのＣＲＭ１９７に結合したペプチドのモル数を、アミノ酸分析（Ｓ−カルボキシメチルシステイン残基の数）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定した。各方法により測定した値は、概して一致した。
Ｉ．サイズ排除クロマトグラフィー
バッチ濃縮サンプルを貯蔵庫から取り出し、そして室温に暖めた。Ａβペプチドコンジュゲートサンプルを穏やかに混合して、確実に均一な調製物とした。Ａβペプチドコンジュゲートサンプルをエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）マイクロ遠心機で遠心して、粒子を除いた。上清をトーソーハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷクロマトグラフィー用に取り出した（トーソーハース、シュツットガルト、ドイツ）。トーソーハースＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムをＨＰＬＣシステムに連結し、そして圧限界を１．４ＭＰａに設定した。カラムは少なくとも３０ｍＬのＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２±０．１）で０．７５ｍＬ／分の流速で平衡化した。ＡβペプチドコンジュゲートサンプルをトーソーハースＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに以下のパラメーターを使用して乗せた：
Ａβペプチドコンジュゲートサンプルの濃度：１．５±１．０ｍｇ／ｍＬ
流速：０．７５ｍＬ／分
サンプル容量：０．１ｍＬ
流した時間：３０分
吸収は２８０ｎｍおよび２１０ｎｍの両方で監視した。長期間の保存には、トーソーハースＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムを少なくとも５０ｍＬの２０％エタノールで０．５〜１．０ｍＬ／分の流速で平衡化した。
ＩＩ．ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
活性化（ブロモアセチル化）ＣＲＭ１９７およびＡβペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、中性ｐＨ、プレ−キャストポリアクリルアミドミニ−ゲル系およびＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動バッファー用いて、ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）、フランクフルト、ドイツ）を使用したＳＤＳ−Ｇｅｌにより調査した。各活性化ＣＲＭまたはコンジュゲートの８ｕｇアリコートを、還元サンプルバッファーと混合し、そして１００℃で５分間煮沸した。コンジュゲートおよび分子量（ＭＷ）標準（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバット、カリフォルニア州）を、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝系に基づく１０％（重量／容量、アクリルアミド）ＮｕＰａｇｅゲル（ノベックス）に乗せ、そしてＭＥＳ  ＳＤＳ泳動バッファー−ＰＡＧＥ（レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ））で泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルはピアスのＧｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）で染色した。Ａβペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、天然ＣＲＭのバンドの上の６６ｋＤａ付近に主要バンドを、そして１２０ｋＤａ付近に二量体のバンドをわずかな多量体バンド（示さず）と共に表した。
ＩＩＩ．ペプチド−ＣＲＭ１９７コンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
質量分析は、およその結合の程度を即座に知るために使用した。活性化ＣＲＭ１９７およびコンジュゲートサンプルの適切なアリコートは、マトリックスとして３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（シナピン酸：ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）を使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＭＡＴＬａｓｅｒｍａｔ２０００マススペクトロメーター、リンゴーズ、ニューヨーク州）により測定した活性化ＣＲＭ１９７の分子量は、６０．５ｋＤａ付近を中心に見いだされ、そしてコンジュゲートは結合の程度に依存して６５ｋＤａから７４ｋＤａまで変動した（データは示さず）。ＣＲＭ１９７中、最高２２個のリシン（〜５０％）が１：１の比率で修飾されたことが分かった。
ＩＶ．至適化実験
活性化および結合の程度は、試薬：タンパク質比、反応温度および反応バッファーのｐＨの関数である。結合反応用の再現性のある工程制御パラメーターを得るために、幾つかの例を以下に与え、最適なｐＨ条件を同定するために行った最適な結合条件を具体的に説明する。結果（図３）は、Ａβ５ｍｅｒ（ＤＡＥＦＲＣ）（配列番号１）ならびにＡβ７ｍｅｒ（ＤＡＥＦＲＨＤＣ）（配列番号２）への結合反応がｐＨ依存的であり、そして反応条件のｐＨが上がると、より高い修飾／結合の程度が得られることを示した。５ｍｅｒおよび７ｍｅｒペプチドのＴＦＡ塩を使用して、結合の程度は負荷したペプチドの量を変えてｐＨ９．０で評価した（図４）。これらの結果から、ＣＲＭ分子あたり定めたコピー数のペプチドコンジュゲートが、結合工程中のペプチド／活性化ＣＲＭ比を変動させることにより生成され得ることは明らかである。同様の実験を、Ａβ７ｍｅｒペプチドの酢酸塩を使用して行った。
【０１６８】
Ａβ１−７／ＣＲＭコンジュゲートについて、キャッピング工程はＣＲＭあたりのＣＭＣＡのモルをＣＲＭあたりのＣＭＣのモルと比較することにより評価した。全ＣＭＣおよびＣＭＣＡは試験した各ペプチド：ＣＲＭ比について一定であったので、キャッピング工程は完全であると推定された（図５）。コンジュゲート中の全修飾は１９から２１の間であり、ブロモアセチル化されたリシン数に匹敵した（図５）。これらの実験はペプチドの対イオンとしてＴＦＡを用いて行った。Ａβ１−７／ＣＲＭ結合はＴＦＡ塩ではなくペプチドの酢酸塩を使用して繰り返し、そしてこれらのデータを図５および６に示す。キャッピング工程は２０から２２の間に止まる各点について、全ＣＭＣおよびＣＭＣＡで完了したようであった。Ａβ−ＣＲＭ結合反応に関する条件は、ｐＨ９．０で至適化され、結合の程度は反応中、ＣＲＭに対するペプチド比率により制御された。比率を０．１から１．５に変えることにより、結合の程度を変動させることができる（図６）。
【０１６９】
活性化および結合の程度は、試薬：タンパク質比、反応温度および反応バッファーのｐＨの関数である。各コンジュゲートに関する修飾（結合）の程度は、各コンジュゲートの質量値から活性化ＣＲＭ１９７の質量値を差し引き、そしてコンジュゲートを調製するために使用したペプチドの質量で除算することにより算出した。すべてのコンジュゲートに関する修飾（結合）の程度を表２に記載する。
【０１７０】
結合の程度は、１モルのＣＲＭ１９７あたり形成されたＳ−カルボキシメチルシステイン残基の予想される量により測定される値とも比べた（表２も参照にされたい）。
【０１７１】
【表１２】
2008505052.tif 000023
【０１７２】
実施例６
Ａβペプチドコンジュゲートの免疫原性実験
それぞれＣＲＭ１９７に結合したＡβのＮ−末端残基１−５、１−７、１−９および１−１２に広がるペプチド（リンカー配列ＧＡＧＡＣを含むか、または含まない）、およびアミノ酸１２からアミノ酸１までの逆配列のＡβのＮ−末端に対応するペプチド（１〜１２ｍｅｒの逆配列）は、非結合Ａβ１−１２ｍｅｒペプチドと一緒にＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）Ｑ−２１を含む製剤中でマウスを免疫感作するために使用した。各群のマウスは、２０μｇのアジュバントＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１を用いて配合した、３０μｇまたは５μｇのいずれかの用量の１つのサンプルが、実験の始め（０週）および続いて３および６週に皮下に免疫感作された。実験のプロトコールは表３に具体的に説明する。
【０１７３】
表３に示すように、それぞれＣＲＭ１９７に結合したＡβのＮ−末端残基１−５、１−７、１−９および１−１２に広がるペプチド（リンカー配列ＧＡＧＡＣを含むか、または含まない）、およびアミノ酸１２からアミノ酸１までの逆配列のＡβのＮ−末端に対応するペプチド（１〜１２ｍｅｒの逆配列）は、非結合Ａβ１−１２ｍｅｒペプチドと一緒にＱＳ−２１を含む製剤中でマウスを免疫感作するために使用した。各群のマウスは、２０μｇのアジュバントＱＳ−２１を用いて配合した、３０μｇまたは５μｇのいずれかの用量の１つのサンプルが、実験の始め（０週）および続いて３および６週に皮下にワクチン接種された。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、各群５匹のマウスで全実験に使用した。注射容量＝１００μｌ；Ｂ＝採血；Ｖ＝ワクチン接種；Ｅ＝瀉血物。
【０１７４】
抗−Ａβ力価は、以下に記載するようにＡβおよびＣＲＭ１９７に対するＥＬＩＳＡにより測定された。簡単に説明すると、コースター９６ウェルプレート（＃３５９１）を一晩、室温にて２μｇ／ｍＬのＡβ１−４２で滅菌炭酸塩／重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中で被覆した。プレートを空け、そして室温で２時間、２００μｌ／ウェルの０．０５％ＢＳＡ（１ＸＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中）でブロッキングした。ブロッキングしたプレートを空にし、プレートをＴＢＳ、０．１％Ｂｒｉｊ−３５（アジドを含まない）洗浄バッファーを含有するプレートワッシャーで洗浄した。すべての１次抗血清は０．０５％ＢＳＡ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０２％アジドを含有する１ＸＰＢＳ中）で連続希釈し、そして１００μＬの各希釈物を適切なプレートウェルに移し、そして室温で２時間インキュベーションした。プレートはその後、空にし／そして上記のように洗浄した。サザンバイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（市、州）からのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ２次抗体を０．０５％ＢＳＡ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０２％アジドを含有するＰＢＳ中）で１：１０００倍に希釈し、そして１００μＬを各ウェルに加え、そして室温で１時間インキュベーションした。次いでプレートを空にし／上記のように洗浄し、そして最後に室温で１時間、ジエタノールアミン／ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８中に調製した１００μＬ／ウェルの１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート基質溶液とインキュベーションした。発色は５０μＬ／ウェルの３Ｎ  ＮａＯＨを加えて止めた。プレートは６９０ｎＭの参照を用いて４０５ｎＭで読んだ。終点力価は０．１ＡＵのＯ．Ｄ．で算出した。
【０１７５】
【表１３】
2008505052.tif 000024
【０１７６】
【表１４】
2008505052.tif 000025
【０１７７】
ＣＲＭ１９７ＥＬＩＳＡ
グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の９６ウェルプレート（＃６５００１１）は３７℃にて９０分間、５．０μｇ／ｍＬ（１００μｌ／ウェル）のＣＲＭ１９７を用いて、滅菌炭酸塩／重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中で被覆した。プレートを空け、そして１ＸＴＢＳ、０．１％Ｂｒｉｊ−３５洗浄バッファーを含有するプレートワッシャーで洗浄した。すべての１次抗血清は１ＸＰＢＳ（０．３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＥＤＴＡを含有する）で連続希釈し、そして１００μＬの各希釈物を適切なプレートウェルに移し、そして３７℃で１時間インキュベーションした。次いでプレートを空にし／上記のように洗浄した。サザンバイオテックからのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ２次抗体を１ＸＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０２％アジドを含有する）で１：１０００倍に希釈し、そして１００μＬを各ウェルに加え、そして３７℃で１時間インキュベーションした。次いでプレートを空にし／上記のように洗浄し、そして最後に室温で１時間、ジエタノールアミン／ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８中に調製した１００μＬ／ウェルの１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート基質溶液とインキュベーションした。発色は５０μＬ／ウェルの３Ｎ  ＮａＯＨを加えて止めた。プレートは６９０ｎＭの参照を用いて４０５ｎＭで読んだ。終点力価は０．１ＡＵのＯ．Ｄ．で算出した。
【０１７８】
表４〜６は、Ａβに対する終点ＥＬＩＳＡ力価を具体的に説明する。初回免疫感作後、すべての８種のコンジュゲート（負の対照を除く）は測定できるＡβＩｇＧ免疫応答を誘導した。しかし５μｇ用量ではなく３０μｇ用量のＡβは初回免疫感作後３週目で陽性の応答を与えた。すべてのコンジュゲートの中で、リンカーに結合していないＡβ１−７ペプチドが、実験した他のコンジュゲートと同じか、またはそれより良い応答を誘発した。５μｇの用量で、Ａβ１−５Ｃは８〜１６週で、より良かった。Ａβ１−７Ｃは３０μｇ用量で最高であった。５または３０μｇ用量のいずれかで２回および３回免疫感作した後の抗体力価の分析は、ほとんどのコンジュゲートについてＡβに対する最大の免疫応答が２回目の免疫感作後に見られたことを示す。少なくともマウスでは、３回目の免疫感作は免疫応答を強化しないようであった。しかしＡβペプチドは、ペプチドに対して最大の免疫応答に達するために３０μｇの用量での３回の免疫感作が必要であった（表５）。長期間にわたり抗体低下という意味では、コンジュゲートで免疫感作された群からの抗体レベルは、その群内の最高レベルと比べて２から３倍まで減少した。６週および８週からの個々のサンプルを分析して、各群に関してＡβに対するＧＭＴを算出して、コンジュゲート群が実質的に他よりも良いかどうかを見た。Ａβ１−５Ｃ、Ａβ１−７ＣおよびＡβ１−９Ｃコンジュゲートから６週目の力価の統計分析は、Ａβ１−７コンジュゲートが有意に、より高い力価を誘導したことを示した。この実験から、リンカー配列ＧＡＧＡＣはペプチドに対する免疫応答の強化に貢献しなかったことも明らかである。
【０１７９】
【表１５】
2008505052.tif 000026
【０１８０】
表４．アミロイドＡβペプチドのＮ−末端で変動する長さに広がるペプチドコンジュゲートの５μｇ用量に由来する抗血清を使用した、Ａβに対する０、３、６、８、１３および１６週目のＥＬＩＳＡ終点力価。参照：Ｅｌａｎハイパーイミューン（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ）ポリクローナル＃５９２＝３，０７３，３０７。Ｏ．Ｄ．０．１ＡＵでの終点。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、２０μｇのＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１と配合された５μｇの上記抗原を含むＳＣ−Ｎで、０、３および６週に免疫感作された。
【０１８１】
【表１６】
2008505052.tif 000027
【０１８２】
表５．アミロイドＡβペプチドのＮ−末端で変動する長さに広がるペプチドコンジュゲートの３０μｇ用量に由来する抗血清を使用した、Ａβに対する０、３、６、８、１３および１６週目のＥＬＩＳＡ終点力価。参照：Ｅｌａｎハイパーイミューンポリクローナル＃５９２＝３，０７３，３０７。Ｏ．Ｄ．０．１ＡＵでの終点。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、２０μｇのＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１と配合された３０μｇの上記抗原を含むＳＣ−Ｎで、０、３および６週に免疫感作された。
【０１８３】
【表１７】
2008505052.tif 000028
【０１８４】
表６．アミロイド−ＡβのＮ−末端で変動する長さに広がるペプチドコンジュゲートの３０μｇ用量に由来する抗血清を使用した、Ａβに対する６および８週のＥＬＩＳＡ終点ＧＭＴ。参照：Ｅｌａｎハイパーイミューンポリクローナル＃５９２＝３，０７３，３０７。Ｏ．Ｄ．０．１ＡＵでの終点。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、２０μｇのＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１と配合された３０μｇの上記抗原を含むＳＣ−Ｎで、０、３および６週に免疫感作された。
ａ．Ｔｕｒｋｙ−Ｋｒａｍｅｒを使用した１−５Ｃ、１−７Ｃおよび１−９Ｃからの６週目の力価の統計分析は、１−５Ｃ対１−７Ｃのみ間の統計的差異を示すが、スチューデントＴ検定を使用した分析では、１−５Ｃ対１−７Ｃおよび１−５Ｃ対１−９Ｃの間の統計的差異を示す。
ｂ．１−５Ｃ、１−７Ｃおよび１−９Ｃからの８週目の力価の統計分析は、３群間の統計的差異を示さない。しかし１−５Ｃ対１−７Ｃの間には差異を示すことができる傾向があるようである。
ＰＤＡＰＰマウスの脳組織染色
ＰＤＡＰＰ脳組織染色アッセイは、Ａβペプチドコンジュゲートおよび／またはＡβ１−４２抗血清の機能性の指標を提供する。個々のマウス群に由来する血清サンプルは、アミロイドペプチドを含有するＰＤＡＰＰマウスの脳組織プラークを認識するそれらの能力について別々に分析した。結果を表７Ａおよび７Ｂに示す。Ａβ５ｍｅｒコンジュゲートの抗血清を除いて、プラークの認識に用量に関係する応答があった。リンカーとは無関係に、３０μｇのコンジュゲートが誘導した抗血清は５μｇのコンジュゲートの抗血清よりも良い反応性パターンを有した。しかしＡβ５ｍｅｒコンジュゲートの抗血清は、５μｇ群の反応性に類似するか、または良いようである。これらすべての結果を比較すると、Ａβ１−５ｍｅｒからＡβ１−９ｍｅｒまでで作られたコンジュゲートがマウスにおいてプラークを認識する免疫応答の誘発に十分であり、そしてリンカーの存在は必須ではないと結論づけられる。以下の結論をこの実験から引き出すことができる：（ａ）すべてのペプチドコンジュゲートは、担体タンパク質ＣＲＭ１９７に対して非結合ＣＲＭ１９７対照に比べて等しいか、わずかに高いレベルの高い力価の抗血清を誘導した（示さず）。（ｂ）ＧＡＧＡＣリンカーを持つコンジュゲートは、リンカーが無いコンジュゲートと比べて免疫原性または機能性を強化しなかった。（ｃ）免疫原性データおよびＰＤＡＰＰ脳組織染色（機能的抗体の最初の指標）は、Ａβ１−５ｍｅｒおよびＡβ１−７ｍｅｒのコンジュゲートがさらなる開発に好適な免疫原となるであろうことを示す。
【０１８５】
【表１８】
2008505052.tif 000029
【０１８６】
【表１９】
2008505052.tif 000030
【０１８７】
実施例７
サルを対象とした免疫原性実験
６匹のサルのグループは、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、ａｌｕｍまたはＲＣ５２９ＳＥ製剤のいずれかをアジュバントとして加えた３０ｕｇの７ｍｅｒコンジュゲート（全コンジュゲート）を、０、２９および５８日に受けた。さらに含んだグループは、ａｌｕｍ（Ａｌ（ＯＨ）３）またはＲＣ５２９ＳＥのいずれかを含む３０ｕｇの５ｍｅｒコンジュゲート、そして陽性対照としてＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１を含む７５および３００μｇのＡβであった。陽性対照は２週間毎に免疫感作した。３６および６４日に、抗−Ａβ抗体力価を測定した（図７〜９）。３６日に、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、ＡｌｕｍおよびＲＣ５２９ＳＥを含む７ｍｅｒ／ＣＲＭコンジュゲートが、それぞれ１０１１０、１３３３０および１７０９０のＧＭＴ力価を誘発した（図７）。対照的に、Ａβ１−４２に加えたＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１は、７５および３００μｇの用量レベルでそれぞれ２２３および１７３４のＧＭＴを誘発した。Ａβ５ｍｅｒコンジュゲートは、ａｌｕｍで２１３４、そしてＲＣ−５２９ＳＥで１５９８０の力価を誘発した。６４日に、すなわちＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１またはＲＣ５２９ＳＥのいずれかを含むコンジュゲートの３回の投与後、２回目の投与後よりも実質的に高い力価を誘導した（７ｍｅｒ／ＲＣ−５２９ＳＥについてＧＭＴ６９９１０；Ａβ５ｍｅｒ／ＲＣ−５２９ＳＥについて２１６４０；そしてＡβ７ｍｅｒ／ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１について３０３１０）（図８）。ａｌｕｍを含むコンジュゲートは、第３回目の免疫感作後に２回目の免疫感作後よりも減少した力価を誘発した。Ａβ７ｍｅｒコンジュゲートは、Ａβ５ｍｅｒコンジュゲートに比べて良い応答を誘発したようである。サルでは、Ａβ７ｍｅｒコンジュゲートにＲＣ−５２９ＳＥまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１をアジュバントとして加えると、最高の応答を誘発した（図９）。ａｌｕｍを含むＡβ７ｍｅｒコンジュゲートに対する応答は、穏やかであるか、またはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１を含む３００ｕｇのＡβ１−４２に類似した。
【０１８８】
この実施例から幾つかの結論を引き出すことができる。第１に両コンジュゲートは霊長類において大変免疫原性である。第２に、免疫原製剤中のアジュバントの存在は、免疫応答に重要な影響を及ぼす。第３にアルミニウムアジュバントを除いて、ＲＣ−５２９ＳＥおよびＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１は、少なくとも３回の投与まで、各免疫感作後に免疫応答を強化した（図９）。総じて、Ａβ７ｍｅｒコンジュゲートは５２９の存在下でより高い抗体応答を誘導し、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１がそれに続いた（図９を参照にされたい）。
実施例８
多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）コンジュゲートの調製およびそれらの免疫原性実験
担体上に多抗原性部位を生成するために、幾つかの方法を利用することができる。事前の実施例では、各抗原性部位を定めた結合およびキャッピング化学により担体に別個に結合した。この実施例では、多抗原性部位をＡβ１−７ｍｅｒの直列反復の固相合成により構築する。あるいはこれらの直列反復は、至るところに記載したリシンコアを介した連結を用いて、または用いずにＴ細胞エピトープとカップリングさせることができる。これらの多抗原性ペプチドは、担体タンパク質への結合のためにさらなるシステイニル残基を用いて合成された。１つの反復単位を有するペプチド（１−７）、カルボキシル末端にさらなるシステイニル残基を持つ３つの反復単位を有するペプチド（１−７）３、および５つの反復単位を有するペプチド（１−７）５を合成した。これらのペプチドはブロモアセチル化ＣＲＭに、それらのＣ−末端システイン残基を介して一晩共有結合させた。反応はｐＨ９．０〜９．２で行い、加えたペプチド：ＣＲＭ比率を表８に概略した。ペプチドと反応しなかったブロモアセチル基を、Ｎ−アセチルシステアミンでキャッピングした。これらのロットは、ＣＲＭに結合したＡβ１−７ペプチドの１つのコピー、３つの直列コピーおよび５つの直列コピーをそれぞれ含むコンジュゲートを表す。表８はサンプルの特性を簡単に概説する。
【０１８９】
【表２０】
2008505052.tif 000031
【０１９０】
ペプチド負荷量（担体あたりのＡβ１−７ペプチドの平均数）およびキャッピング数（表９）は、アミノ酸分析により測定される担体あたりの独自なアミノ酸（ＣＭＣまたはＣＭＣＡ）の数である。ＣＭＣおよびＣＭＣＡ値はリシンを参照にした。
【０１９１】
【表２１】
2008505052.tif 000032
【０１９２】
Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（１グループ１０匹）を、皮下に１または０．１μｇのＡβ／ＣＲＭコンジュゲートペプチドで免疫感作した。半分のマウスは１００μｇのアジュバントＡｌ（ＯＨ）３を配合した組成物で免疫感作し、そして半分はアジュバント無しで免疫感作した。免疫感作は０および３週に計画した。採血は０、３および６週に計画した。血清サンプルはＡβ１−４２ｍｅｒペプチドに対する抗体応答について分析した。結果を表１０に示す。
【０１９３】
【表２２】
2008505052.tif 000033
【０１９４】
すべてのコンジュゲートは、初回免疫感作後に抗−Ａβ１−４２抗体力価を誘導し、そしてレベルは追加免疫後に実質的に上昇した。アルミニウムアジュバント無しで、用量応答の違いは３週および６週の採血で分かった。より高い用量は高い力価の抗体応答を誘発した。アルミニウムアジュバントは、アジュバントを加えないグループに比べて両用量レベル（０．１および１μｇ）で３週目に実質的に高い抗体応答を誘発した。２回目の免疫感作後、１μｇ用量で与えられたコンジュゲートが抗体レベルに５〜１０倍の上昇を誘発した。この用量レベルで、３および５反復ペプチドコンジュゲートは、１つの反復を含むコンジュゲートよりも高い抗体応答を誘導した。ＣＲＭ担体に対する力価も測定し、そしてこれらを表１１に列挙する。
【０１９５】
【表２３】
2008505052.tif 000034
【０１９６】
表１１のデータは、アジュバントを含まないグループが大変低いレベルの抗−ＣＲＭ抗体応答を２回の免疫感作後でも１μｇならびに０．１μｇの両方の用量レベルで誘導したことを示す。しかし水酸化アルミニウムアジュバントを含むコンジュゲートは、１μｇ用量で実質的レベルの抗−ＣＲＭ抗体応答を誘導し、そして０．１μｇ用量では大変低い応答を誘導した。アジュバントの存在下で、ＣＲＭ力価は１つの反復コンジュゲートで最高であり、３つの反復コンジュゲートでは中程度であり、そして５つの反復コンジュゲートでは最低であった。ペプチド用量あたりのＣＲＭ用量がＡβ（１−７）５／ＣＲＭで最低であり、そしてＡβ（１−７）１／ＣＲＭで最高なのでこれは予想通りである。差異は６週目の０．１μｇ用量でのみ統計的に有意であった。
【０１９７】
本発明の目的は、抗原性ハプテンに対して高い力価の免疫原応答を誘発することであり、担体タンパク質に対しては必ずしも必要ではない。特定の状況下では、担体タンパク質に対する免疫応答がほとんど無いか、または無く、ハプテン抗原決定基に対して最適な免疫応答を誘発することが望ましい。そのような応用にはアジュバントを配合していない多抗原決定基の直列反復を有するコンジュゲートが必要性を満たすだろう。
実施例９
種々の担体タンパク質を持つＡβ−ペプチドコンジュゲートの調製およびそれらの免疫原性
この実施例は、６種の異なる担体タンパク質を使用したコンジュゲートの免疫原性を比較する。Ａβ１−７の酢酸塩は、ブロモアセチル化担体に１：１の重量比でｐＨ９にて加えた。Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐを除くすべてのコンジュゲートは、Ｎ−アセチルシステアミンでキャッピングした。すべての選択的担体は組換えバクテリアタンパク質であり、ＣＲＭ（ジフテリアトキソイド）、組換えＣ５ａペプチダーゼ（ｒＣ５ａｐ；ストレプトコッカス  アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）からクローン化、Ｄ１３０ＡおよびＳ５１２Ａ突然変異を含む）、ＯＲＦ１２２４、１６６４、２４５２（すべてＡ型溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からクローン化）、およびＴ３６７、Ｔ８５８（それぞれクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からクローン化）である。使用した担体の要約は、表１２に見いだされる。各Ａβ１−７コンジュゲートのこれら担体への結合およびキャッピングの程度は表１３に表す。  この実験は、組換えＣ５ａペプチダーゼコンジュゲートが、ＣＲＭを含む試験した他のほとんどの担体よりもＡβに対して高い力価を誘導したことを示した。この差異は水酸化アルミニウムを受けた群の６週目の力価について統計的に有意であった。さらに、Ａβ１−７／Ｔ８５８コンジュゲートは、アジュバント無しでほとんどの他のコンジュゲートよりも有意に免疫原性であった。唯一、ＣＲＭ対照コンジュゲートに対して良くない成果のコンジュゲートはＡβ１−７／Ｔ３６７であり、これはウエスタンブロットによりＡβ特異的モノクローナル抗体とも反応しなかったコンジュゲートであった。この実験により多数の他の担体をＡβペプチドに対して免疫感作するため成功裏に使用できることが確認される。
【０１９８】
【表２４】
2008505052.tif 000035
【０１９９】
【表２５】
2008505052.tif 000036
【０２００】
結合の結果：ペプチド負荷量（担体あたりのＡβ１−７ペプチドの平均数）およびキャッピング数はアミノ酸分析により測定される担体あたり独自なアミノ酸（ＣＭＣまたはＣＭＣＡ値）の数である。ＣＭＣおよびＣＭＣＡ値は、リシンを参照とした。
免疫感作の結果
この実験における各グループに関する幾何平均力価を、表１４に列挙する。アジュバントの存在にもかかわらず３週目に、Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐは、Ａ型溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、１６６４、２４５２、またはクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７およびＴ８５８を用いて調製した対応するコンジュゲートよりも有意に高い抗−Ａβ力価を誘導した。アジュバントの不存在下では３週目に、Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐも、Ａβ１−７／Ｔ８５８を除くすべての他のコンジュゲートよりも免疫原性であった。Ａｌ（ＯＨ）３無しのＴ８５８コンジュゲートは、ＯＲＦ１２２４、ＯＲＦ１６６４、ＯＲＦ２４５２およびアジュバント無しのＣＲＭコンジュゲートよりも高い力価を誘導した。唯一、Ａβ１−７／ＣＲＭよりも有意に免疫原性が低いコンジュゲートはＡβ１−７／Ｔ３６７（ｐ＜０．００００２）であった。Ｔ３６７担体は３週および６週目の両方で、アジュバント有り、または無しで良くなかった。６週目で、水酸化アルミニウムを含むｒＣ５ａｐコンジュゲートは、Ａβ１−７／ＯＲＦ２４５２を除く他のすべてのコンジュゲートよりも免疫原性であった（ｐ＜０．０４）。アジュバント無しでは、Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐおよびＡβ１−７／Ｔ８５８の両方がＯＲＦ１２２４、ＯＲＦ１６６４またはＴ３６７コンジュゲートよりも有意に高い力価を誘導した。水酸化アルミニウム無しのＡβ１−７／ＣＲＭは、Ａβ１−７／ＯＲＦ１６６４またはＡβ１−７／Ｔ３６７のいずれよりも高い力価を誘導した。
【０２０１】
【表２６】
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【０２０２】
実施例１０
さらなるＡβペプチド−タンパク質コンジュゲートの調製
Ｉ．活性化
解凍したＣＲＭ１９７（８ｍＬ、５９．８４ｍｇ、７．４８ｍｇ／ｍＬで）を、０．１Ｍの硼酸塩バッファー（ｐＨ９、３．９６８ｍＬ）に溶解して５ｍｇ／ｍＬの濃度とした。溶液を氷浴中で０〜５℃に冷却した。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５９．９ｍｇ）（アルドリッチ−シグマ）をＤＭＦ（１００μＬ）（アルドリッチ−シグマ）に溶解し、そしてＣＲＭ１９７の溶液に滴下した。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの添加で、沈殿が観察された。ｐＨをチェックした時、ｐＨ６に下がっていた。反応混合物のｐＨをさらに０．１Ｍの硼酸バッファーを加えることによりｐＨ９に戻した。次いで反応混合物は穏やかに掻き混ぜながら４℃で１時間撹拌した。混合物はＹＭ−１０ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心濃縮を使用して精製および濃縮し、そしてＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５で１０ｍＭ  硼酸塩を溶出液として使用して再精製した。ブラッドフォードの試薬（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ）に対して陽性の画分をプールし、そしてｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ−１０を使用して濃縮した。ブロモアセチル化の程度は、ブラッドフォードアッセイ（ライナー：ｌｉｎｅａｒ）により測定した。濃度は、５．３６ｍｇ／ｍＬであることが分かった（収量３０ｍｇ）。次いで最終濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整し、そして使用するまで冷凍庫で５％シュクロース中にて保存した。
ＩＩ．結合
各結合について、解凍したブロモアセチル化ＣＲＭ１９７を使用した。ペプチドは硼酸バッファー（１２５ｍｌの０．１Ｍ  硼酸バッファー中の２．５ｍｇ）に溶解した。ＡβペプチドＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）、ＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、ＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）およびＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号５０）ではわずかに不溶性が観察された。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７（５ｍｇ／ｍＬ）をペプチド溶液／懸濁液で処理した、混合物中のペプチドおよびタンパク質の比率は、１：２であった。ペプチドＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）、ＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、ＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）およびＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）を含むコンジュゲート混合物には濁りが観察された。次いで混合物はｐＨ（ｐＨ９）についてチェックし、そしてゆっくりと掻き混ぜながら４℃で一晩インキュベーションした。混合物の最終濃度を３ｍｇ／ｍＬにした後、インキュベーションした。ペプチドＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）およびＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号５０）を含むコンジュゲート混合物の濁りはインキュベーション後に消えた。しかしＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）およびＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）はまだわずかに濁っていた。可溶性ｍｏｃｋタンパク質コンジュゲートもシステアミンを用いて１：１（重量／重量）の比率で調製した。合成したペプチドはＢＩＯＳＯＵＲＣＥから約９５％の純度で得た。
オクタマー：
ＬＶＦＦＡＥＤＶＣ（配列番号４４）
ＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）
ＶＦＦＡＥＤＶＧＣ（配列番号４３）
ＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）
ＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）
ＣＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）
ヘプタマー：
ＶＦＦＡＥＤＶＣ（配列番号４９）
ＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号５０）
ＩＩＩ．タンパク質上の未反応リシン基のキャッピング
未反応リシンは、１／１（重量／重量）の比率でＮ−アセチルシステアミン（ＣＭＣＡ；アルドリッチ−シグマ）を用いて、暗中、掻き混ぜながら４℃で４時間キャッピングした。未反応ペプチドおよびキャッピング試薬は、コンジュゲートをＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｍｗカットオフ１０，０００）（ピアス）を使用してＰＢＳバッファー（２リットル）に対して一晩（１３時間）透析することにより除去した。バッファー交換および透析は２回行った（２ｘ１４時間）。わずかな不溶性がペプチドＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）およびＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）を含むコンジュゲートで観察された。次いですべてのコンジュゲートを保存剤中で４℃の冷蔵庫に保存した。
ＩＶ．タンパク質担体の特性決定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用してブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の質量、およびｍｏｃｋコンジュゲートＮ−アセチルシステアミン−ＣＲＭ１９７の質量を測定した。
【０２０３】
ＣＲＭ１９７およびブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の質量に基づき、１１個のリシン残基が修飾された。
（５９９４１．４６−５８５９０．２９）／１２２＝１１
ここで；ＣＲＭ１９７のＭｗは５８６２４．２９であり
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７のＭｗは５９９４１．４６であり
ブロモアセテートのＭｗは１２２である。
【０２０４】
ブロモアセチル化の程度は２８％より高かった。（ＣＲＭ１９７中の全リシン数は３９であった）。これら１１個の修飾されたリシン残基から、１０個がシステアミンでカップリングされた。カップリング効率は９０％であった。
（６１１４３−５９９４１）／１１９＝１０
ここで；ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７のＭｗは５９９４１．４６であり
ｍｏｃｋコンジュゲートのＭｗは６１１４３であり
Ｎ−アセチルシステアミンのＭｗは１１９であり
（１０／１１）ｘ１００＝９０
Ｖ．ペプチド−タンパク質コンジュゲートのトリス−トリシンプレキャストゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット分析による特性決定
タンパク質−ペプチドコンジュゲートはウエスタンブロットにより分析した。レーンは：マーカー（レーン１）；Ｌ−２８３７５  ２４／０１（レーン２）；Ｌ−２８３７５  ２４／０２（レーン３）；Ｌ−２８３７５  ２４／０３（レーン４）；Ｌ−２８３７５  ２４／０４（レーン５）；Ｌ−２８３７５  ２４／０５（レーン６）；Ｌ−２８３７５  ２４／０６（レーン７）；Ｌ−２８３７５  ２４／０７（レーン８）；Ｌ−２８３７５  ２４／０８（レーン９）；Ｌ−２８３７５  ２４／０９（ＭＯＣＫ）（レーン１０）；およびＢｒＡｃＣＲＭ１９７（レーン１１）である。マウスに由来するペプチド特異的モノクローナル抗体（２４８−６Ｈ９−８０６Ａβ１７−２８）を１次抗体（抗血清）として使用した（１：３０００希釈が最高であることがわかった）。ヤギ−抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰは２次抗体であった（１：１０００希釈）。ｍｏｃｋコンジュゲートおよび活性化ＣＲＭ１９７を除き、すべてのコンジュゲートが１次抗体により認識された（図１０を参照にされたい）。
タンパク質濃度
コンジュゲートサンプルのタンパク質濃度は、ピアスのＢＣＡアッセイにより測定した（表１５を参照にされたい）。
アミノ酸分析
アミノ酸分析は、結合の程度を測定するために行った。結合の程度は、コンジュゲートに見いだされるＣＭＣＡ（カルボキシメチルシステアミン）残基に基づき算出した。ＣＭＣＡはペプチドに結合した後の未反応活性化部位をキャップするために使用した（表１５を参照にされたい）。
【０２０５】
【表２７】
2008505052.tif 000038
【０２０６】
すべての比色アッセイは、マイクロプレート分光光度計およびＳＯＦＴｍａｘＰｒｏを使用して行った。
実施例１１
Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを対象としたＡβペプチドコンジュゲートの免疫原性実験
異系交配したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、それぞれＣＲＭ１９７に結合したＶＦＦＡＥＤＶＧ−Ｃ（配列番号４３）、ＬＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４４）、ＫＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号４５）、Ｃ−ＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）、Ｃ−ＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、Ｃ−ＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）、ＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４９）、ＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号５０）で、またはＡβ１−７ＣＲＭ１９７で免疫感作した（すべてアジュバントＲＣ５２９ＳＥを配合した）。１グループ１０匹の動物のうちの９匹に、実験の始め（０週）、続いて４週目に１つのＡβペプチドコンジュゲートを皮下に免疫感作した。血清は免疫感作の前、しかし同日に採血した。
同系交配Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＡβペプチドコンジュゲートの免疫原性実験
同系交配Ｂａｌｂ／ｃマウスは、前段落のように免疫感作したが、コンジュゲートおよびアジュバントで１２週目にも追加免疫感作した。
結果
両実験の血清は、Ａβ１３−２８ペプチド特異的ＩｇＧ抗体力価の分析用に集める。Ｂａｌｂ／ｃマウスに由来する血清も、分析用に１２週目の追加免疫より１日前、およびそれから１週間後に集める。実施例１１で使用する動物由来の脾臓細胞は、Ａβ１−４２に広がるペプチドの重複プール、完全長Ａβ１−４２、ＣＲＭ１９７またはポリクローナルアクチベーターでの刺激に対して、インビトロで応答するそれらの能力を評価する。分析は、インターロイキン４および５、およびインターフェロン−ガンマについて、Ｅｌｉｓｐｏｔの読み取りからなる。完了すると、Ａβペプチドコンジュゲートは上記および実施例６に記載したように評価される。
実施例１２
ＰＳＡＰＰマウスを対象としたＡβペプチドコンジュゲートの免疫原性実験
ＰＳＡＰＰマウスはＶＦＦＡＥＤＶＧ−Ｃ（配列番号４３）、ＬＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４４）、ＫＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号４５）、Ｃ−ＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）、Ｃ−ＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、Ｃ−ＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）、ＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４９）、ＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号５０）で免疫感作する。ＰＳＡＰＰマウスは変異体ＡＰＰおよびＰＳ１導入遺伝子を過剰発現する二重トランスジェニックマウスであり（ＰＳＡＰＰ）、Ｈｏｌｃｏｍｂ，ｅｔ，ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：９７−１１に記載されている。
ＰＤＡＰＰマウスを対象としたＡβペプチドコンジュゲートの免疫原性実験
ＰＤＡＰＰマウスはＶＦＦＡＥＤＶＧ−Ｃ（配列番号４３）、ＬＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４４）、ＫＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号４５）、Ｃ−ＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）、Ｃ−ＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、Ｃ−ＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）、ＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４９）、ＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号５０）で免疫感作する。ＰＤＡＰＰマウスはヒトＡＰＰの変異体形（ＡＰＰＶ７１Ｆ）を発現し、そして若年でアルツハイマー病を発症する（Ｂａｒｄ，ｅｔ，ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ６：９１６−９１９；Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：１６（１８）：５７９５−８１１）。
結果
両実験からの血清は、Ａβ１３−２８ペプチド特異的ＩｇＧ抗体力価の分析用に集める。完了したら、Ａβペプチドコンジュゲートは上記および実施例６および１１に記載されているように、ならびに状況恐怖条件付（ＣＦＣ）アッセイで評価する。
【０２０７】
状況恐怖条件付けは非常に信頼性があり、そしてほとんどの動物、例えば哺乳動物で迅速に得られる学習の共通形態である。試験動物は嫌悪的経験を伴うことから、事前に中性の刺激および／または環境を恐れる学習をする。（例えばＦａｎｓｅｌｏｗ，Ａｎｉｍ．Ｌｅａｒｎ．Ｂｅｈａｖ．１８：２６４−２７０（１９９０）；Ｗｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７：３３１−３３４（１９９７）；Ｃａｌｄａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７：３３５−３３７（１９９７）を参照にされたい）。
【０２０８】
状況恐怖条件付けは、例えば神経変性疾患または障害、Ａβ関連疾患または障害、アミロイド形成疾患または障害のような疾患または障害、認知機能に影響を及ぼす望ましくない遺伝的改変（例えば遺伝子変異、遺伝子破壊または望ましくない遺伝子型）の存在、および／または認知能力に関する作用物質、例えばＡβコンジュゲート剤の効力の結果として、認知機能または機能不全を測定するために特に有用である。したがってＣＦＣアッセイは、認知疾患または障害、特に脳の１もしくは複数の領域、例えば海馬、鉤状回、帯状回皮質、前前頭皮質、嗅周囲皮質、感覚性皮質および側頭葉内側部に影響を及ぼす疾患または障害を防止または処置する作用物質の治療効果を独立して試験し、かつ／または確認するための方法を提供する。
【０２０９】
典型的には、ＣＦＣアッセイは標準的な動物チャンバー、および聴覚（例えば８５ｄｂの白色雑音期間）、臭覚（例えばアーモンドまたはレモンエキス）、触覚（例えば床ケージのテクスチャー）および／または視覚キュー（閃光）とを対にした軽いショック（例えば０．３５ｍＡの足のショック）を含んでなる条件付けの採用を使用して行う。嫌悪体験（ショック）に対する応答は、典型的には硬直の１つ（呼吸を除く運動の不存在）であるが、瞬目を含んでもよく、または選択した試験動物に依存して結膜半月ひだの変化を含んでもよい。嫌悪応答は通常、訓練の初日に特徴付けて、条件付けていない恐れについてのベースラインを測定し、嫌悪応答は引き続き試験日に、例えば皮質および／またはキューの存在下で硬直を生じるが、嫌悪体験が無ければ、それぞれ皮質および／またはキューが条件付けた恐れと特徴付ける。信頼性を向上させるために、動物は典型的には無関係な技術者により別個に試験され、そして経時的に点数を付けられる。さらなる実験計画の詳細は、例えばＣｒａｗｌｅｙ，ＪＮ．わたしのマウスは何が悪いか：トランスジェニックおよびノックアウトマウスの行動的表現型（Ｗｈａｔ’ｓ  Ｗｒｏｎｇ  ｗｉｔｈ  ｍｙ  Ｍｏｕｓｅ：Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｉｃｅ）、ウィリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク（２０００）に見いだすことができる。
【０２１０】
例示的実験動物（例えばモデル動物）には、アルツハイマー病のようなアミロイド形成障害を特徴とする主な症状または病状を現す哺乳動物（例えば齧歯類または非ヒト霊長類）を含む。モデル動物は、所望の選択的同系交配により作出するか、またはそれらは痴呆障害と関係した遺伝子に目的とする遺伝子改変（例えば遺伝的突然変異、遺伝子破壊）のような当該技術分野で周知のトランスジェニック技術を使用して遺伝子工学的に作出して、目的とする遺伝子の異常な発現または機能を導くことができる。例えば、幾つかのトランスジェニックマウス種は、ＡＰＰを過剰発現し、そしてアミロイドプラーク病状を発症させ、かつ／またはアルツハイマー病に特徴的な認知欠如を発症させることに利用することができる（例えばＧａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．同上、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１５５０（１９９７）Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ  ａｎｄ  Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．；５９：１７５−８３を参照にされたい）。
【０２１１】
あるいはモデル動物は、アミロイド形成障害の特徴的な症状または病状に伴う解剖学的な脳の領域（例えば海馬、扁桃、嗅周囲皮質、内側中隔核、青斑、マンマラリーボディ（ｍａｍｍａｌａｒｙ  ｂｏｄｙ））または特異的ニューロン（例えばセロトニン作動性、コリン作動性、またはドーパミン作動性ニューロン）の正常な機能を除去または妨害する化学的化合物（例えばニューロトキシン、麻酔薬）、または外科的技術（例えば定位剥離、軸索切断、横断、吸引）を使用して作出することができる。特定の好適な態様では、動物モデルはアミロイド形成障害に伴う神経変性病状に加えて、学習または記憶に関連する顕著な認知欠損を現す。より好ましくは、認知欠失は加齢に伴い進行的に悪化して、その動物モデルにおける疾患の進行はアミロイド形成障害に罹患している個体における疾患の進行と類似する。
【０２１２】
本明細書に記載するコンジュゲートの機能性を試験するための状況恐怖条件付けおよび他のインビボアッセイは、野生型マウスまたは記憶に障害を導く特定の遺伝的改変を有するマウス、または神経変性疾患、例えばアルツハイマー病のマウスモデル（脳脊髄液（ＣＳＦ）または血漿に上昇した可溶性Ａβレベルを表すマウスモデルを含む）を使用して行うことができる。例えばアルツハイマー病の動物モデルには、年齢依存型記憶欠失およびプラークを表すヒトアミロイド前駆体タンパク質の“スウェーデン”型突然変異（ｈＡＰＰｓｗｅ；Ｔｇ２５７６）を過剰発現するトランスジェニックマウスを含む（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：９９−１０２）。本明細書に記載するコンジュゲートのインビボでの機能性は、Ｄｕｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８３，７１０−７１４に記載されているＰＳ−１変異体マウスを使用しても試験することができる。アルツハイマー病の他の遺伝的に改変されたトランスジェニックモデルは、Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ  ａｎｄ  Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．；５９：１７５−８３に記載されている。
【０２１３】
様々な観点において、本発明の方法は個体の認知を改善することができるＡβコンジュゲートの投与を含んでなり、ここでＡβコンジュゲートは個体の免疫治療的効力を適切に予想するアッセイを使用して同定されてきた。例示的な態様では、アッセイは少なくとも一部は、動物に試験免疫試薬を投与した後の動物の状況恐怖条件付け試験から測定される認知を、適切な対照と比較することに基づく動物モデルアッセイである。ＣＦＣアッセイは、潜在的な治療用化合物を用いて処置した動物（典型的にはマウスまたはラット）の認知における変化を評価する。特定の態様では、評価される認知における変化は、記憶障害状態の改善または記憶欠損の逆転である。したがって、ＣＦＣアッセイは認知疾患、そして特に脳の１もしくは複数の領域、例えば海馬、鉤状回、帯状回皮質、前前頭皮質、嗅周囲皮質、感覚性皮質および側頭葉内側部に影響を及ぼす疾患または障害を防止または処置する作用物質の治療効果を測定する直接的方法を提供する。そのようなＣＦＣアッセイは、２００４年１２月１５日に出願された同時係属中の米国特許出願第６０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号明細書に「免疫治療薬効果を予想するための状況恐怖条件付け（Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  Ｆｅａｒ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ）」という表題で（代理人処理番号ＥＬＮ−０５８−１に属する）、および米国特許出願第６０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号明細書に「免疫治療薬効果を予想するための状況恐怖条件付け（Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  Ｆｅａｒ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ）」という表題で（代理人処理番号ＥＬＮ−０５８−２に属する）（引用により全部、本明細書に編入する）検討されている。
【０２１４】
【表２８】
2008505052.tif 000039
【０２１５】
【表２９】
2008505052.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】Ａβペプチドフラグメントをタンパク質／ポリペプチド担体ＣＲＭ１９７に結合して、Ａβ／ＣＲＭ１９７コンジュゲートを形成するために使用した工程の化学を表す流れ図である。
【図２】Ａβ／ＣＲＭ１９７コンジュゲートのようなペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチドコンジュゲートの結合の程度の評価として、Ｓ−カルボキシメチルシステインおよびＳ−カルボキシメチルシステアミンを定量的に測定するために使用した酸加水分解化学を表す流れ図である。
【図３】Ａβペプチド／ＣＲＭコンジュゲート反応のｐＨ依存性を表す図である。
【図４】ペプチド：ＣＲＭ比へのＡβ−ペプチド／ＣＲＭ結合の依存性を表す図である。
【図５】Ａβ１−７／ＣＲＭコンジュゲートに関するキャッピング法の確認。反応のｐＨは９．１５であった。ペプチドを用いた反応時間は１６時間、Ｎ−アセチルシステアミンを用いたキャッピングは８時間であった。
【図６】種々のペプチド：ＣＲＭ比率を用いたペプチドへの結合およびキャッピング。反応のｐＨは９．０であった。ペプチドを用いた反応時間は１６時間、Ｎ−アセチルシステアミンを用いたキャッピングは８時間であった。
【図７】種々のアジュバントを含むＡβペプチドコンジュゲートで霊長類を免疫感作した後の霊長類の血清の３６日目の力価。
【図８】種々のアジュバントを含むＡβペプチドコンジュゲートで霊長類を免疫感作した後の霊長類の血清の６４日目の力価。
【図９】日にちおよび処置群による霊長類の力価。霊長類はアジュバントとしてａｌｕｍまたは５２９を含むＡβ１−７またはＡβ１−５ＣＲＭ１９７で免疫感作し、そして抗−Ａβ抗体の力価を２９、３６、５７および５４日に測定した。
【図１０】ペプチド−タンパク質コンジュゲートは、トリス−トリシンプレキャストゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット分析を使用して特性決定した。レーンは、マーカー（レーン１）；Ｌ−２８３７５  ２４／０１（レーン２）；Ｌ−２８３７５  ２４／０２（レーン３）；Ｌ−２８３７５  ２４／０３（レーン４）；Ｌ−２８３７５  ２４／０４（レーン５）；Ｌ−２８３７５  ２４／０５（レーン６）；Ｌ−２８３７５  ２４／０６（レーン７）；Ｌ−２８３７５  ２４／０７（レーン８）；Ｌ−２８３７５  ２４／０８（レーン９）；Ｌ−２８３７５  ２４／０９（Ｍｏｃｋ）（レーン１０）；およびＢｒＡｃＣＲＭ１９７（レーン１１）である。
【図１】
2008505052.tif 000046
【図２】
2008505052.tif 000047
【図３】
2008505052.tif 000048
【図４】
2008505052.tif 000049
【図５】
2008505052.tif 000050
【図６】
2008505052.tif 000051
【図７】
2008505052.tif 000052
【図８】
2008505052.tif 000053
【図９】
2008505052.tif 000054
【図１０】
2008505052.tif 000055
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月12日(2007.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ペプチド免疫原のあるアミノ酸残基に反応性基を導入する工程；
（ｂ）担体タンパク質の１もしくは複数の官能基の誘導化により担体タンパク質上に活性化された官能基を形成する工程；
（ｃ）コンジュゲートを形成する条件下で工程（ａ）のペプチド免疫原を工程（ｂ）の担体タンパク質と反応させる工程であって、ペプチド免疫の反応性基を担体タンパク質上の活性化された官能基に共有結合させる工程；および
（ｄ）さらに工程（ｃ）のコンジュゲートをキャッピング試薬と反応させ、担体タンパク質上の残存する活性化された官能基の全てを不活性化して免疫原コンジュゲートを形成し、これにより担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持する工程、
を含んでなる免疫原コンジュゲートの製造方法。
【請求項２】
担体タンパク質がヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ19-28）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ197タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体タンパク質がＣＲＭ197である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
担体タンパク質の１もしくは複数のアミノ酸分子の官能基が、架橋剤を使用して誘導化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
官能基がハロアセチル化試薬と反応させられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
担体タンパク質上の活性化された官能基の全てを不活性化するために使用されるキャッピング試薬が、システアミン、Ｎ−アセチルシステアミン、エタノールアミン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウムおよびアンモニアからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
担体タンパク質に共有結合したペプチド免疫原を含んで成る免疫原コンジュゲートであって、
担体タンパク質が式：
【化１】
2008505052.tif 000081
式中、Ｃは担体タンパク質であり、そしてＸは該担体タンパク質上のアミノ酸残基の誘導可能な官能基であり、そしてここでｍは０より大きな整数であるが、８５以下である、
で表され、かつ、免疫原コンジュゲートが式：
【化２】
2008505052.tif 000082
式中、Ｃは担体タンパク質であり、そしてＸdは該担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここでＰは担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導化官能基にペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基を介して共有結合したペプチド免疫原であり、Ｒは担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、これにより担体タンパク質の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘発するコンジュゲートの能力を保持し、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
で表される、ことを特徴とする上記免疫原コンジュゲート。
【請求項９】
担体タンパク質が血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ19-28）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ197タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
担体タンパク質がＣＲＭ197である請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法に従い生成され、そして式：
【化５】
2008505052.tif 000083
式中、Ｃは担体タンパク質であり、そしてＸdは担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導化官能基であり、そしてここでＰは担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導化官能基にペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基を介して共有結合したペプチド免疫原であり、Ｒは担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導化官能基に共有結合したキャッピング分子であり、これが担体の官能性を保存して、そうしなければ担体無しでは起こらないペプチド免疫原に対して望まれる免疫応答を誘導する担体のその能力を保持し、ｎは０より大きい整数であるが、８５以下であり、そしてｐは０より大きい整数であるが、８５未満である、
で表される、ことを特徴とする免疫原コンジュゲート。
【請求項１３】
担体タンパク質がヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ19-28）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ197タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
担体タンパク質がＣＲＭ197である請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質、真菌のタンパク質、寄生生物のタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により生成したペプチド免疫原と担体タンパク質とのコンジュゲートを、１もしくは複数の製薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤および／またはアジュバントと一緒に含んでなる免疫原性組成物。
【請求項１７】
担体タンパク質がヒト血清アルブミン、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザ血球凝集素、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアスポロゾイド周辺（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ19-28）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コレラトキシン、低下した毒性を有するコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性のＣＲＭ197タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ  Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１、成分認識微生物表面接着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびケモカインからなる群から選択される請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
担体タンパク質がＣＲＭ197である請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
ペプチド免疫原がバクテリアのタンパク質、ウイルスのタンパク質、真菌のタンパク質、寄生生物のタンパク質および真核生物のタンパク質からなる群から選択される、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
１もしくは複数のアジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦ、５２９ＳＥ、ＩＬ−１２、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バクテリアリポ多糖、アミノアルキルグルコサミンリン酸塩化合物、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）、ポリペプチド、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、百日咳トキシン（ＰＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）非耐熱性トキシン（ＬＴ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βからなる群から選択される請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
ペプチド免疫原に反応性基を導入する工程が反応性基を有するアミノ酸残基の付加を含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
アミノ酸残基が反応性基として−ＳＨを含むシステイン残基であるか、または反応生基をしてグアニジル基を含むアルギニン残基であるか、または反応性基トして−ＣＯＯＨ基を含むグルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるか、または反応性基として−ＮＨ２基を含むリジン残基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アミノ酸残基がペプチド合成中に付加によりペプチド免疫原中に導入される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ペプチド免疫原中への反応性基の導入工程がかような修飾に感受性のアミノ酸残基上のペンダントチオール基のチオール化剤を介する生成を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
チオール化剤がＮ−アセチルホモシステインチオラクトンを含んで成る請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アミノ酸残基がペプチド免疫原のアミノ末端またはペプチド免疫原のカルボキシ末端に局在している請求項２１、２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
担体タンパク質が該担体タンパク質に共有結合された１もしくは複数のポリペプチドリンカーをさらに含み、そして１もしくは複数の官能基が１もしくは複数のポリペプチドリンカーの置換基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基が遊離のスルフヒドリル基を含む請求項８または１２に記載の免疫原コンジュゲート。
【請求項２９】
遊離のスルフヒドリル基がシステイン残基の側鎖であるか、またはリジン残基のチオレート側鎖である請求項２８に記載の免疫原コンジュゲート。
【請求項３０】
ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基がグアニジル基、カルボキシル基またはε−アミノ基を含む請求項８または１２に記載の免疫原コンジュゲート。
【請求項３１】
担体タンパク質が該担体タンパク質に共有結合されたポリペプチドリンカーをさらに含むみ、そして官能基がポリペプチドリンカーの置換基を含む請求項８または１２記載の免疫原コンジュゲート。
【請求項３２】
ペプチド免疫原のアミノ酸残基が該ペプチド免疫原のアミノ末端または該免疫原ペプチドのカルボキシル末端に局在している請求項８または１２に記載の免疫原コンジュゲート。
【国際調査報告】
2008505052.tif 000084
2008505052.tif 000085
2008505052.tif 000086
2008505052.tif 000087
2008505052.tif 000088
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