(57)【要約】【課題】本発明は新規コモンマーモセット（Callithrix jacchus）胚性幹細胞の培養物及び細胞株、並びにそれらの使用に関する。【解決手段】本発明のコモンマーモセット胚細胞は、(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる。該幹細胞は好ましくは、全能性である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コモンマーモセット（Callithrix jacchus)由来の胚性幹細胞の精製調製物であって、(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる、前記精製調製物。
【請求項２】
胚性幹細胞が全能性である、請求項１記載の精製調製物。
【請求項３】
幹細胞がSSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、及びTRA1-81マーカーに陽性であり、かつSSEA-1マーカーに陰性である、請求項１記載の精製調製物。
【請求項４】
幹細胞が、Nanog、Oct3/4、Sox2、gp130、mCG、HEB、及びBex1/Rex3からなる群から選ばれる1以上の細胞マーカーをさらに発現する、請求項３記載の精製調製物。
【請求項５】
幹細胞が高テロメラーゼ活性を示す、請求項４記載の精製調製物。
【請求項６】
幹細胞が少なくとも３ヶ月間、in vitroで未分化増殖できる、請求項１記載の精製調製物。
【請求項７】
幹細胞が少なくとも６ヶ月間、in vitroで未分化増殖できる、請求項１記載の精製調製物。
【請求項８】
幹細胞が少なくとも１年間、in vitroで未分化増殖できる、請求項１記載の精製調製物。
【請求項９】
少なくとも３ヶ月間の連続培養後に、三胚葉全てに分化できる、請求項１記載の精製調製物。
【請求項１０】
少なくとも６ヶ月間の連続培養後に、三胚葉全てに分化できる、請求項１記載の精製調製物。
【請求項１１】
少なくとも１年間の連続培養後に、三胚葉全てに分化できる、請求項１記載の精製調製物。
【請求項１２】
コモンマーモセット（Callithrix jacchus)の胚性幹細胞から作製された細胞株であって、(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる、前記細胞株。
【請求項１３】
SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、及びTRA1-81マーカーに陽性であり、かつSSEA-1マーカーに陰性である、請求項１２記載の細胞株。
【請求項１４】
Nanog、Oct3/4、Sox2、gp130、mCG、HEB、及びBex1/Rex3からなる群から選ばれる1以上の細胞マーカーをさらに発現する、請求項１３記載の細胞株。
【請求項１５】
遺伝的に改変されたコモンマーモセット（Callithrix jacchus)を作製する方法であって、
(a) 請求項１記載の幹細胞に突然変異を導入すること、及び
(b) 該幹細胞を、コモンマーモセットに移植すること、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記コモンマーモセットにおいて前記幹細胞の分化及び増殖を解析するステップをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該幹細胞中に外来遺伝子を導入する、請求項１６記載の解析方法。
【請求項１８】
遺伝的改変を有するコモンマーモセット（Callithrix jacchus）であって、(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる遺伝的に改変されたコモンマーモセット胚性幹細胞を、コモンマーモセットに導入して得られる、前記コモンマーモセット。
【請求項１９】
幹細胞が全能性である、請求項１８記載のコモンマーモセット。
【請求項２０】
コモンマーモセット（Callithrix jacchus）の胚性幹細胞を移植された免疫不全の齧歯類であって、該胚性幹細胞が(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる、前記免疫不全の齧歯類。
【請求項２１】
幹細胞が全能性である、請求項２０記載の免疫不全の齧歯類。
【請求項２２】
齧歯類がマウス又はラットである、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
マウスが無胸腺ヌードマウス、C.B-17/重症複合型免疫不全症（scid）マウス、及びNOD/SCIDマウスからなる群から選ばれる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
マウスがNOD/SCID/γcnullマウスである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
マウスがさらに導入遺伝子を保持する、請求項２３記載のマウス。
【請求項２６】
マウスが細胞に基づく療法に感受性の疾患又は状態の動物モデルである、請求項２５記載のマウス。
【請求項２７】
前記疾患又は状態がパーキンソン病、糖尿病、外傷性脊髄損傷、プルキンエ細胞変性、デュシェーヌ筋ジストロフィー、心疾患、視力喪失、及び難聴からなる群から選ばれる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
胚性幹細胞が胚様体の形態である、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
胚性幹細胞が分化型である、請求項２０記載の方法。
【請求項３０】
分化した幹細胞が、筋細胞、神経細胞、及び血液細胞からなる群から選ばれる、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規コモンマーモセット（Callithrix jacchus）胚性幹細胞の培養物及び細胞株、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ES細胞）は哺乳動物の初期胚から得られる全能細胞に由来し、in vitroで無限未分化増殖が可能である（Evans及びKaufman, Nature 292:154(1981)、Martin, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7634 (1981)）。ES細胞はin vivoであらゆる細胞型に分化可能であり（Evansら, Nature 292:154-156 (1981)、Bradleyら, Nature 309:255-256 (1984)）、またin vitroで様々な細胞に分化できる（Doetschmanら, J. Embryol. Exp. Morph., 87:27-45 (1985)、Wobusら, Biomed. Biochim. Acta, 47:965-973 (1988)、Robbinsら, J. Biol. Chem., 265:11905-11909 (1990)）。非ヒト霊長類及びヒト胚性幹細胞株が確立されている（例えば、Thomson及びMarshall, Curr Top Dev Biol 38:133-65 (1998)、Thomsonら, Proc Natl Acad Sci USA 92:7844-7848 (1995)、及びThomsonら, Science 282:1145-1147 (1998)を参照されたい）。霊長類胚性幹細胞は、例えば米国特許第5,843,780号（1998年12月1日発行）に記載されている。サル由来の胚性幹細胞は、米国特許出願公報2003/0157710 A1（2003年8月21日発行）に開示されている。
【０００３】
Thomsonら, PNAS（上掲）によると、霊長類ES細胞は本質的な特徴として、(i) 着床前又は着床前後の胚に由来すること、(ii) 長期にわたる未分化増殖、及び(iii)長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全ての派生物を形成する安定した発生能、を有する必要がある。本発明は、そのような特徴を有するマーモセット由来の胚細胞及び細胞株を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、マーモセット（Callithrix jacchus）由来の胚細胞調製物及び細胞株に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明はコモンマーモセット（Callithrix jacchus）由来の胚性幹細胞の精製調製物であって、(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる、前記精製調製物に関する。
【０００６】
好ましい実施態様において、コモンマーモセット由来の胚性幹細胞は全能性である。
【０００７】
1つの実施態様において、前記精製調製物における胚性幹細胞はSSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、及びTRA1-81マーカーに陽性であり、かつSSEA-1マーカーに陰性である。
【０００８】
別の実施態様において、前記精製調製物における胚性幹細胞は神経クラスIII βチューブリン、及び乏突起膠細胞マーカーであるO4マーカーに陽性である。
【０００９】
さらにもう１つの実施態様において、前記精製調製物における胚性幹細胞は高テロメラーゼ活性を示す。
【００１０】
さらなる実施態様において、前記精製調製物における胚性幹細胞は少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約10ヶ月間、少なくとも約１年間、少なくとも約18ヶ月間、又は少なくとも約２年間、in vitroで未分化増殖できる。
【００１１】
さらに別の実施態様において、前記精製調製物における胚性幹細胞は、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約10ヶ月間、少なくとも約１年間、少なくとも約18ヶ月間、又は少なくとも約２年間の連続培養後に、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能である。
【００１２】
別態様において、本発明はコモンマーモセット（Callithrix jacchus）の胚性幹細胞から作製された細胞株であって、(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる、前記細胞株に関する。
【００１３】
好ましくは、該細胞株は全能性である。
【００１４】
１つの実施態様において、前記細胞株はSSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、及びTRA1-81マーカーに陽性であり、かつSSEA-1マーカーに陰性である。
【００１５】
別の実施態様において、前記細胞株は神経クラスIII βチューブリン、及び乏突起膠細胞マーカーであるO4マーカーに陽性である。
【００１６】
異なる態様において、本発明は遺伝的に改変されたマーモセット（Callithrix jacchus）を作製する方法であって：
(a) 上記特性を有するコモンマーモセット幹細胞に突然変異を導入すること、及び
(b) 該幹細胞をコモンマーモセットに移植すること
を含む前記方法に関する。
【００１７】
該方法は、コモンマーモセットにおける幹細胞の分化及び増殖を解析するステップをさらに含みうる。
【００１８】
特定の実施態様において、幹細胞は1以上の外来遺伝子を保持していてもよく、及び／またはノックアウトされた内在性遺伝子をもう１つ有していてもよく、及び／または１以上の自然突然変異を保持してもよい。
【００１９】
別態様において、本発明は遺伝子改変を有するコモンマーモセット（Callithrix jacchus）であって、(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる遺伝的に改変されたコモンマーモセット胚性幹細胞を、コモンマーモセットに導入して得られる、前記コモンマーモセットに関する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、ヒト幹細胞を細胞に基づく療法に感受性の疾患又は状態のコモンマーモセット（Callithrix jacchus）動物モデルへ移植すること、及び前記ヒト幹細胞の移植に対するそのコモンマーモセットの応答をモニターすること、を含む幹細胞アッセイ法に関する。
【００２１】
別態様において、本発明は、ヒト幹細胞をコモンマーモセット（Callithrix jacchus）に移植すること、及びそのコモンマーモセットにおけるヒト幹細胞の分化及び増殖を解析すること、を含むアッセイ法に関する。
【００２２】
さらにもう１つの態様において、本発明は、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）の胚性幹細胞を移植された免疫不全の齧歯類であって、該胚性幹細胞が(i) in vitroで長期未分化増殖が可能であり、(ii) 長期培養において、コモンマーモセットの染色体特性の全てが存在する核型を著しい変化なしに維持し、(iii) 長期培養後でさえ、三胚葉（外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）全てへの分化が可能であり、かつ(iv) in vivoで奇形腫を形成できる、前記免疫不全の齧歯類に関する。
【００２３】
好ましくは移植された幹細胞は全能性である。
【００２４】
齧歯類は例えば、無胸腺ヌードマウス、C.B-17/重症複合型免疫不全症（scid）マウス、又はNOD/SCIDマウス等のラット、マウス、又はモルモットでありうる。
【００２５】
マウスのような齧歯類は、細胞に基づく療法への感受性が見込まれるヒトの疾患又は状態のモデルとなりうる。該疾患及び状態は、パーキンソン病、糖尿病、外傷性脊髄損傷、プルキンエ細胞変性、デュシェーヌ筋ジストロフィー、心疾患、視力喪失、及び難聴を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
ラットやマウスなどの齧歯類は1以上の突然変異、さらに免疫不全をもたらすのに必要な突然変異を有していてもよく、それは標的となるヒトの疾患又は状態のモデル化をもたらす。該突然変異は、自然突然変異、1以上の導入遺伝子の導入又は1以上の内在性遺伝子のノックアウト、及びそれらの任意の組み合わせを含みうる。
【００２７】
幹細胞は未分化型、胚様体の形態、及び／又は分化型でありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
Ａ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)は当業者にとって、本出願で使用される多くの用語について一般的な指針を与える。
【００２９】
当業者は、本発明の実施に当たり使用することができる、本明細書で記載されているものと同一又は同等である多くの方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は本明細書に記載の方法及び材料には少しも限定されない。
【００３０】
「胚盤胞」は約150個の細胞からなる着床前胚である。胚盤胞は、外側の細胞層（栄養外胚葉）、液体で満たされた空洞（卵割腔）、及び内部の細胞塊（内細胞塊）で構成されている球体からなる。
【００３１】
「多分化性」幹細胞は、体内の限られた細胞及び組織のみを再生できる幹細胞である。
【００３２】
「多能性」幹細胞は、胎盤を除く体内の全ての細胞及び組織を再生できる幹細胞である。胚性幹細胞が多能性か否かは通常、細胞培養において自発的に細胞を分化させるか、分化して特定の細胞型を形成するよう細胞を操作するか、又は奇形腫と呼ばれる良性腫瘍の形成について調べるために免疫抑制マウスに該細胞を注射することにより、調べる。奇形腫は通常、分化又は部分的に分化した多くの細胞型の混合物を含み、これは胚性幹細胞が複数の細胞型へ分化できることを示すものである。
【００３３】
「全能性」幹細胞は、胎盤を含む体内の全ての細胞及び組織を再生できる幹細胞である。そのような幹細胞は、外胚膜を含む生体全体を生み出すことができる。すなわち、例えば受精卵又は接合子は全能性である。
【００３４】
本明細書において「未分化」という用語は、専門化した細胞型になるのに有意な程度まで変化していない細胞に言及するために使用される。
【００３５】
本明細書において「細胞に基づく療法」という用語は、例えば損傷を受けた又は枯渇した成体細胞集団又は組織を修復する等の所望の治療効果を達成するのに必要な特定の細胞型への幹細胞の分化を誘導することを伴う、あらゆる療法に言及するために使用される。
【００３６】
詳細な説明
本発明の実施には別途示した場合を除き、本発明の技術分野の技能の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、細菌学、細胞生物学、及び生化学の標準的技術を用いる。そのような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第2版(Sambrookら, 1989)、“Animal Cell Culture” (R.I. Freshney著, 1987)、“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller及びM.P. Calos著, 1987)、“Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubelら著, 1987)、及び“Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols” (Kursad Turksen著, Humana Press, Totowa NJ, 2001)のような文献において、十分に説明されている。
【００３７】
1998年にヒト胚性幹(ES)細胞株の確立(Thomsonら, Science 282:1145-1147 (1998))に成功して以来、分化した胚性幹細胞の特定臓器への移植は、優れた治療可能性があると期待されてきた。しかしながら、in vivoでヒト胚細胞に基づく療法（幹細胞療法）の安全性及び有効性を確認するのは、ヒトでの実験を規制する倫理法規により非常に困難であった。したがって、前臨床試験のために非ヒト霊長類を用いた動物モデルを確立することが必要不可欠であった。
【００３８】
コモンマーモセット(Callithrix jacchus)は、新世界霊長類種である。該動物は小型で（体重は約350〜400グラム）、妊娠期間が短く（約114日）、12〜18ヶ月で性成熟に達する。マカクと異なり、マーモセットは1度の妊娠で通常双子か3つ子を出産する。さらに、プロスタグランジン類縁体によりマーモセット卵巣周期を同調させ、複数の雌から齢数を一致させた胚を収集し、及び70〜80％の成功率で、同調させたレシピエントに胚を導入することができる(Lopataら, Fertil Steril 50:503-509 (1988)、Summersら, J Reprod Fertil 79:241-250 (1987)、及びMarshallら, J Med Primatol 26:241-247 (1997))。これらの生殖特性により、複数の胚をルーチンにかつ効率的に導入できるので、マーモセットはヒトの疾患のトランスジェニック及びノックアウト動物モデルをつくるのに、優れた霊長類種となる。
【００３９】
本発明は、新規（全能性）コモンマーモセット胚性細胞株（CMES細胞株）の確立に基づくものであり、遺伝子ターゲティングにより様々なヒト疾患に関する非ヒト霊長類動物モデルの構築を容易にする。
【００４０】
未分化ヒト胚性幹細胞に特徴的な分子マーカーの発現を受けて、本発明者らはコモンマーモセットの造血系及び免疫系がヒトのものと非常に類似していることを実証した。すなわち、糖鎖抗原であるSSEA-1は2型ポリラクトサミンのフコシル化誘導体であり、マウス胚の後期卵割段階に現れることが知られている。SSEA-1は、未分化マウスES細胞で強く発現される。マウスES細胞は分化によりSSEA-1の発現が喪失するのが特徴であり、場合によってはSSEA-3及びSSEA-4の出現を伴いうる。対照的に、ヒトES及びEC細胞は、その分化がSSEA-3及びSSEA-4のダウンレギュレーション及びSSEA-1のアップレギュレーションによって特徴付けられるにも関わらず、通常、SSEA-1でなくSSEA-3及びSSEA-4を発現する。未分化ヒトES細胞はまた、ケラタン硫酸関連抗原、TRA-1-60、及びTRA-1-81を発現する。後述の実施例に記載の免疫組織化学的試験は、ヒト胚性幹細胞と同様に、未分化コモンマーモセット胚性幹細胞(CMES)がSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、及びTRA-1-81を発現し、SSEA-1を発現しないことを実証した。したがって、コモンマーモセットは幹細胞療法の前臨床試験のための優れた実験動物モデルである。これは、そのサイズのため実験動物としてコモンマーモセットが比較的扱い易いことからも、とりわけ当てはまる。
【００４１】
したがって、コモンマーモセット（CM）ES細胞株は、in vitro及びin vivoでのES細胞分化の調節機構を理解するためだけでなく、様々なヒトの疾患の霊長類動物モデルとして使用する遺伝的に改変されたコモンマーモセットを作製するための強力なツールである。
【００４２】
さらに、CMES細胞株は内皮細胞、神経細胞、血液細胞、筋細胞等のような特定の細胞型を産生するのに有用であり、それらは組織移植に使用しうる。
【００４３】
CMES細胞株は、例えばSCID、NOD/SCID、及びNOD/SCID/γcnullマウス（例えば米国特た許公報20030182671、Dewanら, J. Virol. 77(9):5286-94 (2003)、及びMiyakawaら, Biochem. Biophys. RES. Commun. 313(2):258-62 (2004)を参照されたい。これらの開示全体が参照により本明細書に明確に組み入れられるものとする）のような、様々なマウスモデルにおける腫瘍の生成にさらに利用できる。その後腫瘍を分離し、系統特異的マーカーを使用することにより、例えば、蛍光活性化細胞選別（FACS）法の利用又は所望の組織の直接顕微解剖により、所望の細胞型を選別しうる。分化細胞は、神経障害、内分泌障害、造血障害等の様々な疾患を治療するために、成獣に再導入されうる。
【００４４】
本発明の一部の方法は、外来遺伝子の幹細胞への導入を伴う。遺伝子導入は通常、当技術分野でよく知られる技術によりレトロウイルスベクターを用いて行われる。レトロウイルスは、一本鎖RNA分子をゲノムとして含みエンベロープを有するウイルスである。感染に続き、ウイルスゲノムは二本鎖DNAに逆転写され、発現される宿主ゲノムに組み込まれる。ウイルスゲノムは少なくとも３つの遺伝子：gag（コアタンパク質をコードする）、pol（逆転写酵素をコードする）、及びenv（ウイルスエンベロープタンパク質をコードする）を含む。ゲノムの各末端には、プロモーター／エンハンサー領域及びウイルス組込みに関与する配列を含む長い末端反復（LTR）がある。さらに、ウイルスDNAをパッケージングするのに必要な配列及びRNAスプライス部位がenv遺伝子上にある。マウスモデルで使用されるレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo-MLV)に基づくものが最も多い。さらにレンチウイルスは、例えばNOGマウスのような実験動物への遺伝子導入に利用できる。
【００４５】
遺伝子導入は、アデノウイルスベクターによっても実施できる。アデノウイルスは、エンベロープをもたない線形二本鎖DNAゲノムを有する20面体ウイルスである。アデノウイルスは、細胞表面受容体との相互作用により非分裂細胞に感染し、エンドサイトーシスにより細胞内に侵入する。アデノウイルスのゲノムは宿主細胞のゲノムには組み込まれないので、アデノウイルスベクターからの発現は一時的である。
【００４６】
本発明は、様々なヒトの疾患及び状態の治療のための、新しい、細胞に基づく療法の研究及び開発を可能にする。そのような治療は、心臓、肺、血液、神経、鎌状細胞の疾患、聴覚障害、睡眠障害等の治療のための幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞の使用に基づいており、パーキンソン病、アルツハイマー病、老化、及び１型糖尿病を標的とすることを含む再生医療において非常に大きな可能性を秘めている。
【００４７】
本発明のさらなる詳細は次の非限定的な実施例で説明される。
【実施例】
【００４８】
材料及び方法
動物
マーモセット胚を得るため、1975年から維持されている実験動物繁殖コロニーから15組のつがいのコモンマーモセット（２年齢超）を選択した。各つがいの動物は、ケージに別々にいれた。ケージのサイズは39×60×70 cmであった。本研究は、CIEAの動物倫理委員会によって承認されており、CIEAのガイドラインに従い実施した。
【００４９】
胚の収集
15頭の雌動物を３つのグループにわけた。各グループの動物の排卵周期は、既に報告されているとおり(Summers, P.M., J Reprod Fertil 73:133-8 (1985))、プロスタグランジン(PG) F2α類縁体クロプロステノール(0.75 mg/頭 Estrumate(登録商標), Takeda Schering-Plough K.K., Osaka, Japan)を黄体期の10日後以降に投与して、同調させた。血漿試料(0.1 ml)を、クロプロステノール注射後2、9、10、及び13日目に大腿静脈より収集し、後述のとおりEIAアッセイにより血漿プロゲステロン濃度を測定することにより、排卵日を決定した。排卵日(０日目)は、血清プロゲステロンレベルが10 ng/mlに到達した前日として定めた(Harlow, C.R., J Zool Lond 201:273-282 (1983))。胚は排卵後7〜10日目に、0.5 mg/頭の塩酸メデトミジン(Domitor(登録商標), Meiji, Tokyo, Japan)又は0.25-0.5 mg/頭のフルニトラゼパム(Silece（登録商標）, Eisai, Tokyo, Japan)、及び70 mg/頭の塩酸ケタミン(動物用Ketalar 50, Sankyo Lifetech Co., Tokyo, Japan)の筋肉注射で麻酔した後、手術により回収した(Summers, P.M., J Reprod Fertil 79:241-50 (1987))。子宮頸部及び両方の卵管は正中線開腹術により体外に取り出してクランプ固定し、子宮腔は近位部から子宮頸部にかけて、10%のウシ胎仔血清(FBS; JRH, Tokyo, Japan)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM; Invitrogen, Tokyo, Japan)2.5 mlで洗い流した。洗い流した培地は、子宮底を通って子宮腔に設置した23ゲージの注射針を使って回収した。クロプロステノールも、製造業者の推奨に従ってDPCプロゲステロン(Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA)を用いて投与した。
【００５０】
胚性幹細胞株の単離及び培養
内細胞塊（ICM）は既に開示されているように(Solter及びKnowles, Proc Natl Acad Sci USA 72:5099-5102 (1975))、免疫手術により単離した。簡潔にいうと、マーモセット胚盤胞の透明帯を、DMEMで3回洗い流した。栄養外胚葉を取り除くために、胚盤胞を、抗マーモセット線維芽細胞ウサギ血清のDMEM中10倍希釈液とともに37℃、5％CO2下で45分間インキュベートした。DMEMで3回洗い流した後、モルモット補体(Invitrogen, Tokyo, Japan)のDMEM中5倍希釈液を用いて、胚盤胞を37℃、5％CO2下で30分間インキュベートした。免疫手術後、栄養外胚葉をピペッティングによって取り除き、ICMを単離した。ICMは3500 radでガンマ線照射したマウス胚性フィーダー(MEF)層上にプレーティングした。10〜14日後、ICMをトリプシン-EDTA試薬中に解離させ、新鮮なMEF層上に再びプレーティングした。ICM及びその増殖細胞は、20%ノックアウト血清リプレイスメント(KSR;Invitrogen)、1 mM L-グルタミン、0.1 mM MEM 非必須アミノ酸、0.1 mM β-メルカプトエタノール (2-ME；Stigma, Tokyo, Japan)、100 IU/mlペニシリン、100 μg/ml硫酸ストレプトマイシン、250 ng/mlアムホテリシンB、及び10 ng/ml白血病抑制因子を添加した80%ノックアウトDMEMからなるCMES培地を用いて培養した。細胞を分割するため、未分化CMES細胞コロニーを、1 mM CaCl2 及び20％KSRを添加した0.25％トリプシンを用いて処理し、フィーダー細胞から分離させた。取り出したコロニーは、機械的に10〜50個の細胞に分け、放射線照射した新しいMEF上に再びプレーティングした。
【００５１】
免疫組織化学的染色
細胞表面マーカーの発現を調べるために、アルカリフォスファターゼ染色キット(Sigma, Tokyo, Japan)を製造業者の使用説明書に従い使用し、アルカリフォスファターゼを検出した。免疫染色のため、ES細胞を4％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝食塩水（PBS）を用いて室温で10分間固定し、その後0.3%H2O2を加えて10分間室温でインキュベートした。発生段階特異的な胚抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4 (Developmental Studies Hybridoma Bank)、TRA-1-60、及びTRA-1-81 (Chemicon, Temecula, CA)に対する一次抗体は、抗体希釈液（DAKO ChemMate, Dako, Glostrup, Denmark)で希釈した後、室温で１時間インキュベートした。次の一次抗体（希釈）：抗SSEA-1抗体(1:50)、抗SSEA-3抗体(1:10)、抗SSEA-4抗体(1:50)、抗TRA1-60抗体及び抗TRA1-81抗体(10μg/ml)を使用した。PBSで３回洗浄後、ビオチン化二次抗体シンプルステインPOマルチシステム(Nichirei Corporation, Tokyo, Japan)を該細胞とともに30分間室温でインキュベートした。サンプルはPBSで３回洗浄し、結合モノクローナル抗体の局在は、DABホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体を用いて検出した。
【００５２】
免疫不全マウスへの移植後に形成された腫瘍の免疫組織化学的分析では、収集した腫瘍は中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。パラフィンブロックを切片化し、免疫組織化学的染色に供した。ケラチン(WSS)、デスミン、CD31、及びGFAPに対する一次抗体（全てDakoCytomation, Tokyo, Japanから購入)をそれぞれ1:200、1:200、1:10、及び1:50に希釈し、パラフィン切片とともにインキュベートした。結合したモノクローナル抗体の局在は、Envision System (DakoCytomation)を用いて検出した。
【００５３】
in vitro分化神経細胞の免疫蛍光染色のために、スライド及び切片を、10%正常ヤギ血清及び0.3%Triton X-100を含むPBSとともにプレインキュベートした後、ウサギ抗THポリクローナル抗体(Chemicon AB152)を含む10%通常ヤギ血清及び0.3%Triton X-100のPBS溶液中で一晩インキュベートした。Alexa（商標）488 ヤギ抗ウサギIgG抗体及びAlexa（商標）568ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を二次抗体として2時間にわたり加えた。最後に、標本を蒸留水で希釈した2μg/mlヘキスト33528染色液に浸した。顕微鏡写真は全てZeiss-Axiocam画像化システムで分析した。
【００５４】
核型分析
ES細胞は、25 cm2ボトルでの集密培養の継代により調製した。新鮮培地で３時間インキュベートした後、コルセミド(Invitrogen, Tokyo, Japan)を最終濃度が0.02μg/mlになるように20分間加えた。その後、該細胞をPBSで洗浄し、トリプシンを用いて解離させ、遠沈させた。ペレットを室温で0.56％ KCl中に十分に再懸濁させた。遠心分離した後、低張液を除去し、穏やかにピペッティングしてペレットをメタノール／酢酸＝3:1（vol/vol）で固定した。100 rpmで遠心分離した後、細胞をスライドに塗抹する前に５分間の固定を２回行った。スライドは一晩風乾させ、新たにつくった５％ギムザ液で10分間染色し、蒸留水ですすいだ。ギムザ（G）バンド分染法で核型並びに染色体数の解析もそれぞれ5及び30個の分裂中期塗抹標本を使用して行った。
【００５５】
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性は、TRAPEZEテロメラーゼ検出キット(Chemicon, Tokyo, Japan)を用いて測定した。全ての手順は製造業者の使用説明書に従って行った。簡潔にいうと、約1×106個の細胞から細胞抽出物を取得し、クマシーブルー染色タンパク質定量試薬 BSAスタンダード（Pierce Inc., Rockford, IL)を用いて、タンパク質濃度を標準化した。85℃で10分間サンプルをインキュベートすることにより、加熱不活化したコントロールを取得した。その細胞抽出物の一定分量(1.5μg)を使用し、製造業者の使用説明書に従いPCRを行った。PCR産物を、12.5％非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、テロメラーゼ活性をサイバーグリーン染色（Invitrogen）により検出した。
【００５６】
PCR-1本鎖形成高次構造多型(PCR-SSCP)法
主要組織適合性複合体遺伝子DRBのSSCP解析を、既に開示されているように(Wuら, J Mol Evol 51:214-222 (2000))行った。次のPCRプライマーを使用した: MA-DR-2r,
5'-CTCTCCGCGGCACTAGGAAC-3' (配列番号1)
5'-GCACGTTTCTTGGAGTATAGC-3' (配列番号2)
【００５７】
RT-PCR
QuickPrep Micro mRNA精製キット(Amersham Biotech, Buckinghamshire, UK)を製造業者の使用説明書に従い使用し、Poly(A)+ RNAを単離した。第一鎖cDNAを、未分化ES細胞又はEB由来のpoly(A)+ RNA 1 μgからImProm-II cDNA合成キット(Promega, Tokyo, Japan)を用いて合成した。ネガティブコントロールとして、ImProm-II逆転写酵素の不存在下で、poly(A)+ RNA 1μgをcDNA合成反応混合物と反応させた。cDNA合成に続き、cDNA合成反応混合物の1/20をPCRの鋳型として使用した。新鮮なICMのRT-PCR解析を行うため、ICMを７個の胚盤胞から収集し、poly(A)+ RNA単離に使用した。その後、単離したpoly(A)+ RNAの半分は第一鎖cDNA合成に使用し、もう半分は上述のとおりネガティブコントロールとして使用した。
【００５８】
各プライマーは標的遺伝子にあわせて設計した。次の(順方向及び逆方向)プライマー対を使用した。  
Nanog:
5'-AAACAGAAGACCAGAACTGTG-3' (配列番号３)及び
5'-AGTTGTTTTTCTGCCACCTCT-3' (配列番号４);
Oct3/4:
5'-CCTGGGGGTTCTATTTGGGA-3' (配列番号５)及び
5'-TTTGAATGCATGGGAGAGCC-3' (配列番号６);
FoxD3:
5'-CGACGACGGGCTGGAGGAGAA-3' (配列番号７)及び
5'-ATGAGCGCGATGTACGAGTA-3' (配列番号８);
Sox-2:
5'-AGAACCCCAAGATGCACAAC-3' (配列番号９)及び
5'-GGGCAGCGTGTACTTATCCT-3' (配列番号１０);
CD34:
5'-AGCCTGTCACCTGGAAATGC-3' (配列番号１１)及び
5'-CGTGTTGTCTTGCTGAATGGC-3' (配列番号１２);
ネスチン:
5'-GCCCTGACCACTCCAGTTTA-3' (配列番号１３)及び
5'-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC-3' (配列番号１４);
α-フェトプロテイン:
5'-GCTGGATTGTCTGCAGGATGGGGAA-3' (配列番号１５)及び
5'-TCCCCTGAAGAAAATTGGTTAAAAT-3' (配列番号１６);
マーモセット絨毛性ゴナドトロピン(mCG)β
5'-CCCTGTGTGTGTCGCCTTT-3' (配列番号１７);及び
5'-CTAATGGAGGGTCTGCTGGC-3' (配列番号１８);
Bex1/Rex3:
5'-ACAGGCAAGGATGAGAGAAG-3' (配列番号１９)及び
5'-CCCACGTAAACAAGTGACAG-3' (配列番号２０);
HEB:
5'-ACTGAAACAAAGAAAGGATGAAAACC-3' (配列番号２１)及び
5'-CCCTTTCTATCTTCTGTTCAGGGTTC-3' (配列番号２２);
gp130:
5'-AAACAGAACAGCATCCAGTC-3' (配列番号２３)及び
5'-AGTTGAGGCATCTTTGGTCC-3 (配列番号２４);
白血病抑制因子受容体(LIFR):
5'-TTTCTTGGCATTTACCAGG-3' (配列番号２５)及び
5'-GCTATTTTGGAAGGTGGTG-3' (配列番号２６);
β-アクチン:
5'-TCCTGACCCTSAAGTACCCC-3' (配列番号２７)及び
5'-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3' (配列番号２８)
CD34、α-フェトプロテイン、及びmCFを除き、PCR産物の予測サイズはヒトの配列から推定した。予測したPCR産物は約190 bp (nanog)、約530 bp (oct3/4)、約200 bp (Sox-2)、約356 bp (FoxD3)、約200 bp (ネスチン)、627 bp (CD34)、200 bp (α-フェトプロテイン)、約559 bp (gp130)、約269 bp (Bex1/Rex3)、約165 bp (HEB)、286 bp (mCG)、約514 bp (LIFR)、及び418 bp (β-アクチン)であった。PCR反応混合物(25μl)は、1×PCR緩衝液(10 mM Tris-HCl (pH 9.0)、1.5 MgCl2、50 mM KCl)、0.2 mM dNTP、各プライマー0.5μg、及びTaqポリメラーゼ 2.5Uを含有した。増幅は、95℃で１分間の変性、60℃で30秒間のアニーリング、72℃での伸長を35サイクル行った。各遺伝子のそれぞれのRT-PCR産物は、DNA配列決定により検証した（データは示していない）。
【００５９】
分化能の解析
a)胚様体(EB)の形成
胚様体(EB)の形成について調べるため、未分化ES細胞をMEFから取り出し、20%KSR及び2 mM CaCl2を含む0.25%トリプシンPBSを用いて解離させ、細菌培養用シャーレで10〜21日間、10%FBSを添加したDMEMで培養した。培地は２日おきに交換した。
【００６０】
b)In vivo分化の解析：奇形腫形成
マウスにおける奇形腫形成について調べるため、1〜5×106個のCMES細胞を、５週令の免疫不全NOD-scid/γcKO (NOG)マウス(Itoら, Blood 100:3175-3182 (2002))の腹部に皮下注射した。注射後4〜8週で、腫瘍をマウスから切除した。切除した腫瘍はホルムアルデヒド緩衝液中で固定し、パラフィンブロックに包埋し、免疫組織化学的及び組織学的検査に供した。
【００６１】
c)In vitro分化
i)神経細胞
間質PA6細胞を12 mmのカバースリップ上にプレーティングし、準集密状態まで増殖させた。0日目に、10％KSR、0.1 mM 2-ME、及び10-7 Mアスコルビン酸塩を添加したGlasgow-MEM（GMEM)培地で、5×104個のES細胞をカバースリップ上のPA6細胞と共培養した。共培養の最初の10日間、培地は２日おきに交換した。12日目に、0.1 mM 2-ME及び10-7 M アスコルビン酸塩を含み、N-2添加剤(Invitrogen)を加えたGMEMに培地を交換し、20日目まで培養を継続した。その後、細胞は4％パラホルムアルデヒドPBS溶液で固定した。
【００６２】
ii)造血細胞
CMES細胞は、15% FBS、100μg/mlトランスフェリン、10μg/mlインスリン、50μg/mlアスコルビン酸、及び0.45 mMモノチオグリセロールを含んだイスコフ改変ダルベッコ培地（Invitrogen）中でのEB形成により、造血細胞に分化した。CMES細胞(104 個の細胞/9 cm皿)を、サイトカインを加えず14〜18日間培養した後、造血コロニーアッセイに供した。造血コロニーは、ES由来の分化細胞（105個）を、製造業者の使用説明書に従い、メソカルトGF+培地(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)で増殖させることにより調べた。10〜14日後にコロニー形成ユニット(CFU)をカウントし、メイ・ギムザ染色したサイトスピンサンプルを用いて顕微鏡で細胞形態を確認した。
【００６３】
結果
コモンマーモセットES細胞株の確立
マーモセットはPGF2α投与後、10.7±1.3日(n＝70)で排卵した。卵巣周期制御システムを使うことで、同一動物から３週ごとに受精卵を入手できるようになった。70個の胚盤胞から免疫手術で単離した60個のICM（ICM単離率は85.7%であった）を、放射線照射したMEF層上にプレーティングし、10代を超える継代の間、11個のICMを培養した（誘導率18.3%）。現在までに11個のICM由来の細胞のうち3個が１年を超えて培養されている。ICM由来の細胞は全て、扁平、高密度で堅固なコロニー形態を示し、高い細胞核：細胞質比率を示した（図１A、B）。これらの派生細胞の形態は、ヒト、アカゲザル、及びカニクイザル由来のものを含め霊長類ES細胞として報告されているもの(Thomsonら, Proc Natl Acad Sci USA 92:7844-7848 (1995)、Reubinoffら, Nat Biotechnol 18: 399-404 (2000)、Suemoriら, Dev Dyn 222:273-279 (2001)、Thomsonら, Science 282:1145-1147 (1998)、Mitalipovaら, Stem Cells 21:521-526 (2003))と非常に類似していた。霊長類ES細胞は培養の際に、自発的な分化を示すこと、及び白血病抑制因子はES細胞を未分化形態に維持しないことが報告されてきた(Reubinoffら, 上掲、及びSuemoriら, 上掲)。コモンマーモセットICM由来の細胞株も低頻度の分化能を示した。しかしながら、殆どのICM由来細胞が細胞の未分化形態を維持した。FBSの品質が、未分化霊長類ES細胞を維持するために重要であり、同じ製造業者からのFBSでもロットが異なれば、この品質が変動しうることが知られている。したがって、既知組成の無血清添加剤KSRをマーモセットES細胞の確立及び培養に使用した。KSRを培養に使用した場合、CMESコロニーはより高密度で堅固であるように見え、またそれらはFBSを培地中に用いた場合には外観上扁平であった。幹細胞を維持するため、カニクイザルES細胞を分離する方法を、マーモセットICM由来細胞の継代培養(Suemoriら, 上掲)に適用した。この培養系で、１年を超えてCMES細胞の連続培養が維持された。
【００６４】
未分化CMES細胞株の特徴
ICM由来の細胞の未分化状態について確認するため、３つの株（CMES 20、30、及び40）全てについて、未分化ES細胞に特異的な細胞表面マーカーの発現を調べた。図1C〜1Gに示すとおり、ICM由来の細胞株はアルカリフォスファターゼ活性を示し（図1C）、SSEA-3(図1E)、SSEA-4(図1F)、TRA-1-60(図1G)、及びTRA-1-81(図1H)を発現したが、SSEA-1(図1D)を発現しなかった。３つの細胞株全てが正常な46, XX核型(図2)及びテロメラーゼ活性（図3A）を維持した。これら３つのICM由来細胞株もまた、Nanog、Oct3/4、Sox2、gp130、mCG、HEB、及びBex1/Rex3のmRNA、並びに低レベルのFoxD3及びネスチンのmRNAを発現した（図4A）。逆に、LIFRのmRNAはRT-PCRで検出されなかった。３つの細胞株は全て同一の遺伝子発現パターンを示し、これらの細胞がCMES細胞であることを示した。新鮮なICMとICM由来の細胞株の遺伝子発現パターンを比較するため、新鮮なICMを使用してRT-PCR解析を行った。その結果、Nanog、Oct3/4、及びSox2のmRNAの発現が観察されたが、FoxD3及びネスチンのmRNAは新鮮なICMでは検出されなかった(図4B)。
【００６５】
３つのCMES細胞株全てについて、PCRベースの一本鎖形成高次構造多型 (PCR-SSCP)法でMHC-DRB1遺伝子型を調べた。図3Bに示すとおり、３つのCMES株は、SSCPパターンが異なることから、独立に確立されたことが確認された。これら３つのCMES細胞株のうち、No. 30及びNo. 40は同じ両親由来であった。
【００６６】
分化能
他の霊長類ES細胞と同様、CMES細胞はMEFでの培養の際に、自発的に分化する。しかしながら、CMES細胞の完全な分化は、MEF由来の抑制因子のいくつかの増殖因子により抑制された。分化の程度を評価するため、50個のCMES細胞クラスターをMEFに蒔いた。その結果、コロニー(n=6)の22〜74%(平均42.6%)が、形態的に未分化のES細胞であった（データは示していない）。しかしながら、CMES細胞が未分化状態を維持するにはそれが細胞クラスターである必要があるため、各細胞の分化率は不明であった。
【００６７】
CMES細胞の自発的分化能を評価するため、EB及び奇形腫の形成について調べた。３つのCMES株はすべて、懸濁培養によりEBを形成した（図5A及びB）。懸濁培養を開始してから数日後に単一EBを形成し、２週間以内に嚢胞性EBを形成した。これらのEBは三胚葉のマーカー遺伝子であるネスチン、CD34、及びα-フェトプロテイン遺伝子のmRNAと、栄養外胚葉のマーカー遺伝子であるmCG、Bex1/Rex3及びHebのmRNAを発現した（図4A）。さらに、LIFR及びgp130の発現を観察した。しかしながら、EB培養から２週間後、Nanog、Oct 3/4、及びSox 2遺伝子の発現は中断された。対照的に、EBにおけるFoxD3の発現レベルは、未分化CMESの場合より高かった。より詳細に分化能を調べるため、CMES 20の細胞を、５匹の免疫不全NOGマウスに皮下注射した（Itoら, 上掲）。注射から８週間後、これらのマウスから皮下腫瘍を取り出し、組織学的分析に供した。腫瘍形成率は100%(5/5)であった。腫瘍は外胚葉性、中胚葉性、及び内胚葉性組織の胚性胚葉からなる奇形腫であることがわかった（図6A〜M）。奇形腫は５匹全てのNOGマウス(奇形腫形成率100%)で形成された。奇形腫において、外胚葉性組織は角化表皮(図6B、7F、及び6G)及び神経細胞(図6M)からなり、中胚葉性組織は筋肉(図6C及び6H)及び血管(図6I及び6J)から構成され、内胚葉組織は円柱上皮(図6A、6K、及び6L)を含んでいた。さらに、軟骨様組織 (図6A、6D、及び6E)及び脂肪細胞様組織(図6F)も観察した。これらの血管はヒト抗CD31抗体を用いた免疫組織化学的染色により、マウスの血管と区別された。気管支様構造及び消化管様構造を奇形腫内に時折認めた(図6A、6K、及び6L)。分化については、幾つかの組織特異的抗体を用いた免疫組織化学的分析により確認した。ES細胞が外胚葉細胞へ分化した証拠として、グリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)-陽性細胞が神経細胞として観察され(図6M)、奇形腫内の角化表皮様構造がより広い特異性(WSS)をもつケラチンを発現した(図6G)。奇形腫は、筋肉、血管及び軟骨といった中胚葉性組織に高頻度で分化した。筋肉様構造はデスミン発現を示し、CD31陽性細胞が血管様構造の血管内皮に存在した（図6J)。消化管様構造の存在は内胚葉への分化を示す。アルシアンブルー及びPAS染色は、円柱上皮からの粘液分泌を示した（図6L)。
【００６８】
CMES細胞のin vitro分化能を調べるために、間質細胞由来誘導活性(SDIA)の測定を実施した。PA6細胞上で20日間培養した後、霊長類ES細胞コロニーの大部分(67%, n=30)に多数の神経突起が出現し、それはクラスIII β-チューブリン陽性の有糸分裂後ニューロンを多数含んでいた（示していない）。SDIAは、マウス、カニクイザル、及びヒトES細胞において、チロシン水酸化酵素(TH)陽性ドーパミン作動性ニューロンの産生を誘導することが報告されている(Kawasakiら, Neuron 28:31-40 (2000)、Kawasakiら, Proc Natl Acad Sci USA 99:1580-1585 (2002)、Perrierら, Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-12548 (2004))。そのため、マーモセット細胞を同様の活性について調べた。誘導から2週間後、クラスIII β-チューブリン陽性の有糸分裂後ニューロンの14％が、細胞レベルでTH陽性であった(N=50)。これらの細胞を、トリプシン処理したES細胞から継代で平板培養した。ほとんどの細胞は単一細胞に由来したが、そのうちわずか15%がTHタンパク質を発現した。NOGマウスへの皮下移植により誘導された奇形腫様腫瘍では、幾つかのβIIIチューブリン陽性細胞をコロニーとして認めた。βIII陽性ニューロンの21％に、TH陽性ニューロンを認めた(n=113;データは示していない)。
【００６９】
造血細胞を誘導するため、EB形成をサイトカイン不含培地で進行させ、さらにCFUアッセイを実施した。CFU-M(単球/マクロファージ)コロニーがこれらの条件下で主に観察され(図7A)、サイトスピン調製物のメイ・ギムザ染色を用いて、マクロファージの主集団を顕微鏡下で確認した(図7B)。
【００７０】
考察
本研究では、トランスジェニック又は遺伝子ノックアウトマーモセットを将来生産するために、コモンマーモセット胚の安定供給を確保する胚収集システムを開発した。本発明者の結果は、PGF2α類縁体クロプロステノールの継続投与後でさえ、マーモセットの排卵が攪乱されないことを示す。そこで、クロプロステノール投与を用いて３週ごとに定期的に、同一動物からの胚収集を行った。このシステムにより、CMES細胞株を確立した。本研究では、報告されている免疫手術方法(Solter及びKnowles, Proc Natl Acad Sci USA 72:5099-5102 (1975))を使用した。胚盤胞からのICM単離率は高かったが（85.7%）、CMES誘導率は18.3%であり、他の霊長類ES細胞株で既になされている報告（ヒトについて35.7%、カニクイザルについて12.5%を含む）と同程度であった。CMES株の誘導率は、in vitroでの胚の発生能又は増殖ICMについて用いた継代方法を含む、培養したICMに使用した増殖方法に依存すると考えられた。
【００７１】
免疫組織化学的分析、酵素活性アッセイ、RT-PCR解析、及び核型分析の結果は、CMES細胞株が長期間にわたり未分化状態を維持することを示す。RT-PCRの結果は、未分化CMES細胞の遺伝子発現パターンがヒトES細胞のものと類似しており、マウスES細胞のものとは異なることを示す。未分化CMES細胞において、Ect3/4、Nanog、Sox2、mCG、HEB、及びBex1/Rex3遺伝子のmRNAの発現パターンは、ヒト又はマーモセットES細胞のものと同一である(Thomsonら, Biol Reprod 55:254-259 (1996)、Ginisら, Dev Biol 269:360-380 (2004))。対照的に、未分化CMESでは観察されたFoxD3の発現は非常に低レベルであった。新鮮なICMにおいて、Nanog、Oct3/4、及びSox2の発現は観察されたが、FoxD3及びネスチンの発現は観察されなかった。新鮮なICM及びCMES細胞の両方がNanog、Oct3/4、及びSox2のmRNAを発現することは、これらの遺伝子がin vitro及びin vivoで細胞の幹細胞性（stemness）を維持するのに必要であることを示唆する。未分化CMES細胞において、FoxD3及びネスチンの発現レベルは非常に低かったために、新鮮なICM中のこれらの遺伝子は、現在のRT-PCR解析の検出レベル以下で発現されている可能性がある。別の可能性として、FoxD3及びネスチン遺伝子は、培養したCMES中の自発的に分化したCMES細胞から増幅された可能性がある。後者の可能性は、EBにおけるFoxD3遺伝子発現の増加により裏付けられる。FoxD3遺伝子はマウスの未分化ES細胞で発現するため、霊長類とマウスのES細胞でFoxD3の発現パターンが異なることは、FoxD3がそれぞれのES細胞で異なる役割を果たしていることを表す。mCG及びBex1/REX3の発現は、栄養外胚葉細胞へのCMESの分化能を反映している。
【００７２】
未分化の霊長類ES細胞を維持する分子機構はほとんど知られておらず、MEFは未分化の霊長類細胞を維持するのに必須である。CMES細胞もまたMEFにおいて、低頻度で自発的に分化した。CMES細胞がgp130を発現し、LIFRを有しないのは、ヒトES細胞と同様であった。これらの結果は、未分化型CMES細胞の維持はLIFシグナルに依存しないことを示す。しかしながら、gp130の発現は、インターロイキン(IL)-6、オンコスタチンM、又はIL-11等の他のgp130-STAT3シグナルがCMES細胞の増殖及び分化において役割を果たすことを示唆した。霊長類ES細胞のMEF依存性は、ヒトES細胞を幹細胞療法に使用する際の１つの重大な障害となると考えられる。未分化霊長類ES細胞のMEF不含培養系の維持又は発達の分子機構を解明することは、ES細胞研究の重要なテーマの１つである。併せてこれらの結果は、CMES細胞の細胞特性及び活性が、ヒト及び他の霊長類ES細胞のものと類似していることを示す。
【００７３】
CMES細胞の自発的な分化能は、EB形成（図５）及び奇形腫形成（図６）により実証された。EBのRT-PCR解析は、CMES細胞がin vitroで三胚葉に分化したことを示した。しかも、CMES細胞を免疫不全NOGマウスに皮下移植した場合、三次元組織構造からなる奇形腫が高効率(100%)で形成された。SCIDマウスを奇形腫形成実験に使用した場合も、奇形腫形成率は100%（2匹のNOD/SCIDマウスのうち2匹；データは示していない)であった。したがって、奇形腫の形成はCMES細胞が多分化能を有することを示す。また、奇形腫はいくつかの組織特異的抗体を用いた免疫組織化学手法で調べた。奇形腫で最も頻繁に観察される組織型は、軟骨(図6A、D、E)、筋肉(図6C及び6H)、及び血管(図6I)をはじめとする中胚葉であった。内胚葉性組織への分化頻度は、外胚葉性及び中胚葉性組織への分化頻度より低かったが、少なくとも１つのCMES細胞株(No. 20)を用いて内胚葉組織への分化が明らかに示された。興味深いことに、円柱上皮のアルシアンブルー及びPAS染色は細胞から粘液が分泌されていることを示し、このことはCMES細胞が機能的内胚葉細胞に分化できたことを示す(図6L)。奇形腫形成は、Thomsonら. (Biol Reprod 55:254-259 (1996))によって確立されたマーモセットES細胞株cj 11では実証されなかった。CMES及びcj 11はいずれも、類似する形態及び同一のマーカー発現パターンを示した。しかしながら、奇形腫形成についてWiCell Research Institute (Madison, WI)で作製されたマーモセットES細胞株を調べたところ、奇形腫でなく線維肉腫がNOD/SCIDマウスにおいて得られた(データは示していない)。
【００７４】
SDIAはCMES細胞株No. 20及び40を、in vitroでTH陽性ニューロンに分化させた(データは示していない)。EBから造血細胞へのIn vitro分化は、コロニーアッセイで測定した。造血コロニーの他のタイプは全実験(n>7)で見られなかったが、遺伝子導入法といった他の条件によっては、CMES細胞から様々な造血コロニーを誘導することができ、このことはCMES細胞が複数の造血系統に分化する能力があることを示唆している。これらの結果は、CMES細胞がin vitro及びin vivoの両方で機能的細胞へ分化する能力があるという知見を支持する。したがって、CMES細胞は再生療法又は再生医療の開発を目的とした前臨床試験で使用できる。
【００７５】
奇形腫の形成及びin vitroでの分化実験は、本発明のCMES細胞株の強力な分化能を示す。しかも本願はCMES細胞の多分化能を実証した初めての報告である。実際、胚様体及び奇形腫のin vitro形成は、本発明のCMES細胞株の全能性を示している。本発明のCMES細胞株は、ヒトES細胞を用いた再生療法の安全性及び有効性を予測するための前臨床動物モデル系の確立に、有用であることがわかる。CMESのキメリズム及び生殖細胞系伝達能については、さらなる研究が必要である。CMES細胞が生殖細胞系に伝達されない場合、キメラからの体細胞核移植又はCMESからの配偶子形成が、この問題を解決する１つの方法である(Toyookaら, Proc Natl Acad Sci USA 100:11457-11462 (2003)、Hubnerら, Science 300:1251-1256 (2003)、Simerlyら, Dev Biol 276:237-252 (2004))。
【００７６】
最近、ヒトES細胞又は非ヒトES細胞から分化した様々な種類の細胞が報告されている（例えば、Kawasakiら, Proc Natl Acad Sci USA 99:1580-1585 (2002)、Assadyら, Diabetes 50:1691-1697 (2001)、Schuldinerら, Brain RES 913:201-205 (2001)、Umeda ら, Development 131:1869-1870 (2004)、Harutaら, Invest Ophthalmol Vis Sci 45:1020-1025 (2004)、Mizusekiら, Proc Natl Acad Sci USA 100:5828-5833 (2003)、Kuoら, Biol Reprod 68:1727-1735 (2003)を参照されたい)。例えば造血細胞、ドーパミン作動性ニューロン、及びインスリン産生細胞がヒト又は霊長類のES細胞から生み出されている。しかしながら、これらの分化したES細胞を非ヒト霊長類に移植した報告は極めて稀である(Naraら, Nippon Rinsho 62:1643-1647 (2004))。実験動物として非ヒト霊長類を用いることに関しては、様々な問題がある。例えばアカゲザル又はカニクイザルはES細胞株が既に確立されているが、非常に高価で扱いにくい。しかも、ES細胞と動物間の免疫学的不適合性が、ES細胞移植の著しい障壁となりうる。この状況を考慮すると、コモンマーモセットは低コストで管理が容易といった重要な利点を有する。重要なことには、マーモセットは大きな閉鎖系コロニーで繁殖してきたので、マーモセットは免疫遺伝学的に近縁である。したがって、コモンマーモセット及びCMES細胞は、ヒトES細胞を用いた再生療法を開発するためだけでなく細胞分化のメカニズムを研究するためにも優れた実験モデル系を提供する。
【００７７】
本開示全体で引用されている全ての文献は、参照により本明細書に明確に組み入れられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】CMES細胞上のアルカリフォスファターゼ及び細胞表面マーカーの発現。（Ａ）、（Ｂ）未染色CMES細胞、（Ｃ）アルカリフォスファターゼ染色細胞;（Ｄ）SSEA-1染色細胞;（Ｅ）SSEA-3染色細胞;（Ｆ）SSEA-4染色細胞;（Ｇ）TRA1-60染色細胞;及び（Ｈ）TRA1-81染色細胞
【図２】CMES細胞の核型分析。CIEA-CMES NO.10についての結果を示す。３つの細胞株全てが6ヶ月を超える培養の後、正常な46,XX核型の染色体を示している。
【図３】（Ａ）CMES細胞株No. 20、30、40のテロメラーゼ活性。３つのCMES細胞株は全て高テロメラーゼ活性を示す。一方、MEFはテロメラーゼ活性を示さない。（Ｂ）MHC-DRB1遺伝子に関するCMES細胞のSSCP解析。SSCPの結果は、３つの細胞株全てが独立して誘導されたことを示す。
【図４】（Ａ）CMES細胞及び胚様体のRT-PCR解析。未分化CMES細胞は、Nanog、Oct3/4、Sox2、FoxD3、Bex1/Rex3、Heb、mCG、及びGP130並びに低レベルのネスチン遺伝子を発現した。2週間培養した胚様体はネスチン及びCD34の発現を示す。3週間培養した胚様体はネスチン、CD34、及びα-フェトプロテインの発現を示す。Oct3/4及びNanog遺伝子の発現は胚様体では中断している。未分化CMES細胞では発現されている。（Ｂ）新鮮なLCMのRT-PCR解析。ICMはNanog、Oct3/4、及びSox2遺伝子を発現した。FoxD3及びネスチンの発現は検出されなかった。
【図５】CMES細胞の自発的分化能。CMESの懸濁培養は、胚様体（EB）の形成を示す：（Ａ）単純胚様体、（Ｂ）嚢胞性胚様体。
【図６】奇形腫における分化CMES細胞、及び組織特異的マーカーの発現。（Ａ）軟骨様組織で囲まれた円柱上皮からなる気管支様構造を示す。（Ｂ）角化扁平表皮；（Ｃ）横紋筋；（Ｄ）脂肪細胞様組織（高倍率）；（Ｅ）軟骨様及び円柱上皮（高倍率）；（Ｆ）表皮；（Ｇ）サイトケラチンWSSに対する反応性；（Ｈ）デスミン発現筋；（Ｉ）毛細血管；（Ｊ）CD31陽性血管内皮細胞；（Ｋ）円柱上皮；（Ｌ）アリシアンブルーPAS陽性円柱上皮；（Ｍ）GFAP発現性神経細胞。
【図７】in vivoにおける造血CMES細胞の分化。（Ａ）CFU-M単球／マクロファージ様コロニーがこの条件下で優位を占めている。（Ｂ）コロニー形成細胞のメイ・ギムザ染色。その大部分がマクロファージからなることが確認できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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