(57)【要約】本発明は、非分裂細胞及び分裂細胞へ核酸を伝達するのに有用なヤギ関節炎脳炎ウイルス系ベクター及びベクターシステムに関する。該ベクターシステムを用いて非分裂及び分裂細胞に核酸を伝達する方法も開示する。
2008512110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）ＣＡＥＶ５’ＬＴＲとＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列との間の非翻訳領域、及び（ii）前記非翻訳領域の３’の末端に連結されたＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列の１ないしＸ番目ヌクレオチド（このとき、Ｘは６１３未満である）を必須構成要素とするヤギ関節炎脳炎ウイルス（ｃａｒｐｒｉｎｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＣＡＥＶ）ＣＡＥＶパッケージ配列；及び
ｂ）前記パッケージ配列と作動可能に連関された、ポリアデニル化、ＲＮＡ輸送、逆転写及び統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に要求されるシス−作用エレメント（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む、転移ベクター。
【請求項２】
前記Ｘが６０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５及び６００からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項３】
前記Ｘが下記の群から選択されることを特徴とする請求項１記載の転移ベクター：
（１）Ｘは２５超過６００未満、
（２）Ｘは２５超過５００未満、
（３）Ｘは２５超過４００未満、
（４）Ｘは２５超過３００未満、
（５）Ｘは２５超過２００未満、
（６）Ｘは５０超過６００未満、
（７）Ｘは５０超過５００未満、
（８）Ｘは５０超過４００未満、
（９）Ｘは５０超過３００未満、
（１０）Ｘは５０超過２００未満、
（１１）Ｘは７５超過６００未満、
（１２）Ｘは７５超過５００未満、
（１３）Ｘは７５超過４００未満、
（１４）Ｘは７５超過３００未満、
（１５）Ｘは７５超過２００未満、
（１６）Ｘは１００超過６００未満、
（１７）Ｘは１００超過５００未満、
（１８）Ｘは１００超過４００未満、
（１９）Ｘは１００超過３００未満、
（２０）Ｘは１００超過２００未満、
（２１）Ｘは１２５超過６００未満、
（２２）Ｘは１２５超過５００未満、
（２３）Ｘは１２５超過４００未満、
（２４）Ｘは１２５超過３００未満、
（２５）Ｘは１２５超過２００未満、
（２６）Ｘは１５０超過６００未満、
（２７）Ｘは１５０超過５００未満、
（２８）Ｘは１５０超過４００未満、
（２９）Ｘは１５０超過３００未満、
（３０）Ｘは１５０超過２００未満、
（３１）Ｘは２００超過６００未満、
（３２）Ｘは２００超過５００未満、
（３３）Ｘは２００超過４００未満、
（３４）Ｘは２００超過３００未満、
（３５）Ｘは２００超過２００未満、
（３６）Ｘは２５０超過６００未満、
（３７）Ｘは２５０超過５００未満、
（３８）Ｘは２５０超過４００未満、及び
（３９）Ｘは２５０超過３００未満。
【請求項４】
前記Ｘが４０超過６１３未満であることを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項５】
前記Ｘが５７超過６１３未満であることを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項６】
前記Ｘが約３２７であることを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項７】
前記ｇａｇ−コード配列の開始コドンがｇａｇタンパク質の翻訳を防止するために変異されたことを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項８】
前記開始コドンがＴＡＧに変異されたことを特徴とする請求項７に記載の転移ベクター。
【請求項９】
前記開始ＡＴＧコドンから下流ｘ塩基対に位置したｇａｇ−コード配列のＡＴＧコドンがｇａｇタンパク質の翻訳を防止するために変異され、この時、ｘが３０未満であることを特徴とする請求項７に記載の転移ベクター。
【請求項１０】
前記ｘが約２１であることを特徴とする請求項９に記載の転移ベクター。
【請求項１１】
ＲＲＥ領域をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項１２】
Ｕ３領域が欠失されたＣＡＥＶ３’ＬＴＲをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項１３】
異種プロモーターをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項１４】
前記異種プロモーターがヒトサイトメガロウイルス主前初期プロモーター（ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ）であることを特徴とする請求項１３に記載の転移ベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが図３Ｃに示されたｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１構造を有することを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項１６】
転写カセットをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の転移ベクター。
【請求項１７】
前記転写カセットが異種プロモーターに作動可能に連結された所望のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１６に記載の転移ベクター。
【請求項１８】
前記請求項１の転移ベクターとともに、ＣＡＥＶｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列とＲＲＥを含む第１ポリヌクレオチド、及びウイルスエンベロープ−コード配列を含む第２ポリヌクレオチドを含むパッケージベクターシステムを含むことを特徴とするベクターシステム。
【請求項１９】
前記転移ベクターが転写カセットをさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項２０】
前記転写カセットが異種プロモーターに作動可能に連結された所望のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１９に記載のベクターシステム。
【請求項２１】
前記ウイルスエンベロープ−コード配列が非ＣＡＥＶエンベロープ−コード配列であることを特徴とする請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項２２】
前記非ＣＡＥＶエンベロープ−コード配列がＶＳＶ−Ｇ−コード配列またはＧａＬＶ−コード配列であることを特徴とする請求項２１に記載のベクターシステム。
【請求項２３】
前記エンベロープ−コード配列がＶＳＶ−Ｇ−コード配列であることを特徴とする請求項２２に記載のベクターシステム。
【請求項２４】
前記エンベロープ−コード配列がＧａＬＶ−コード配列であることを特徴とする請求項２２に記載のベクターシステム。
【請求項２５】
前記ベクターシステムがｒｅｖ−コード配列を含む第３ポリヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載ベクターシステム。
【請求項２６】
前記ベクターシステムがｖｉｆ−コード配列を含む第４ポリヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする請求項１８または請求項２５に記載のベクターシステム。
【請求項２７】
前記第１ポリヌクレオチドが前記ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含むことを特徴とする請求項１８、請求項２５または請求項２６のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項２８】
前記第２ポリヌクレオチドが前記ウイルスエンベロープ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含むことを特徴とする請求項１８、請求項２１または請求項２２のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項２９】
前記第１ポリヌクレオチドが前記ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含み、前記第２ポリヌクレオチドが前記ウイルスエンベロープ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項３０】
前記第３ポリヌクレオチドが前記ｒｅｖ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載のベクターシステム。
【請求項３１】
前記第４ポリヌクレオチドが前記ｖｉｆ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載のベクターシステム。
【請求項３２】
前記異種調節配列がプロモーターであることを特徴とする請求項２７、請求項２８、請求項２９、請求項３０または請求項３１に記載のベクターシステム。
【請求項３３】
前記パッケージベクターシステムがコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＣＡＥＶパッケージ配列を有しないことを特徴とする請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項３４】
前記パッケージベクターシステムが５’末端領域を有しないＣＡＥＶゲノムのスプライスドナー部位がｇａｇ開始コドンとの間に存在することを特徴とする請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項３５】
前記第１ポリヌクレオチドを含むベクター１と及び前記第２ポリヌクレオチドを含むベクター２とを含むことを特徴とする請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項３６】
前記第１ポリヌクレオチドを含むベクター１、前記第２ポリヌクレオチドを含むベクター２、及び前記第３ポリヌクレオチドを含むベクター３を含むことを特徴とする請求項２５に記載のベクターシステム。
【請求項３７】
前記第１ポリヌクレオチドを含むベクター１、前記第２ポリヌクレオチドを含むベクター２、前記第３ポリヌクレオチドを含むベクター３、及び前記第４ポリヌクレオチドを含むベクター４を含むことを特徴とする請求項２６に記載のベクターシステム。
【請求項３８】
前記第１ポリヌクレオチド及び前記第３ポリヌクレオチドを含むベクター１、及び前記第２ポリヌクレオチドを含むベクター２とを含むことを特徴とする請求項２５に記載のベクターシステム。
【請求項３９】
前記第１ポリヌクレオチド及び前記第４ポリヌクレオチドを含むベクター１、及び前記第２ポリヌクレオチドを含むベクター２とを含むことを特徴とする請求項２６に記載のベクターシステム。
【請求項４０】
前記ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列がＭＣＭＶ  ＭＩＥＰプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする請求項３２に記載のベクターシステム。
【請求項４１】
前記ベクター１が図２Ａに示されたｐＭＧＰ／ＲＲＥの構造を有することを特徴とする請求項４０に記載のベクターシステム。
【請求項４２】
前記ウイルスエンベロープ−コード配列がＨＣＭＶ  ＭＩＥＰに作動可能に連結されたＶＳＶ−Ｇ−コード配列であり、前記ベクター２がβ−グロビンイントロンをさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載のベクターシステム。
【請求項４３】
前記ベクター２が図６Ａに示されたｐＨＧＶＳＶ−Ｇの構造を有することを特徴とする請求項４２に記載のベクターシステム。
【請求項４４】
前記ウイルスエンベロープ−コード配列がＭＣＭＶ  ＭＩＥＰに作動可能に連結されたＧａＬＶ−コード配列であり、前記ベクター２が真核性伸長因子１−αイントロンをさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載ベクターシステム。
【請求項４５】
前記ベクター２が図６Ｂに示されたｐＭＹＫＥＦ−１／ｅｎｖの構造を有することを特徴とする請求項４４に記載のベクターシステム。
【請求項４６】
前記ベクター３が図５に示されたｐＨＹＫ／ｒｅｖの構造を有することを特徴とする請求項３６に記載のベクターシステム。
【請求項４７】
前記ベクター４が図４に示されたｐＨＹＫ／ｖｉｆの構造を有することを特徴とする請求項３７に記載のベクターシステム。
【請求項４８】
１）請求項２０のベクターシステムで細胞をトランスフェクションさせる段階；
２）前記細胞をＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子の生産が可能な条件下で培養する段階（この時、前記ベクター粒子は感染性及び形質導入コンピテントであり複製欠損である）；及び
３）前記ベクター粒子を回収する段階
を含むＣＡＥＶ系ベクター粒子を生産する方法。
【請求項４９】
請求項４８の方法によって生産されたベクター粒子。
【請求項５０】
請求項４９のベクター粒子及び担体を含む組成物。
【請求項５１】
請求項１８ないし請求項４７のうちいずれか一項のベクターシステムを含むキット。
【請求項５２】
哺乳類細胞に請求項４９のベクター粒子を接触させることを含む、ポリペプチドを哺乳類細胞に伝達する方法。
【請求項５３】
前記細胞がベクター粒子との接触前に哺乳類から分離されたことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳類細胞が分裂細胞であることを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳類細胞が非分裂細胞であることを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳類細胞がＣＤ３４＋幹細胞であることを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４９のベクター粒子を脊椎動物に投与することを含む、ポリペプチドを脊椎動物に伝達する方法。
【請求項５８】
請求項１ないし請求項１７のうちいずれか一項の転移ベクターを含むキット。
【請求項５９】
前記第１ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項１８ないし請求項４７のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６０】
前記第１及び第３ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項２８、請求項３０、請求項３２、請求項３６または請求項３８のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６１】
前記第１及び第４ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項２６ないし請求項２８、請求項３１、請求項３２、請求項３７、請求項３９、請求項４１、請求項４３または請求項４５のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６２】
前記第１、第３及び第４ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項２６ないし請求項２８、請求項３１、請求項３２、請求項３７、請求項３９、請求項４１、請求項４３または請求項４５のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６３】
前記第１及び第２ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項１８ないし請求項２４、請求項２６、請求項２９、請求項３３ないし請求項３５、請求項４０、請求項４２、請求項４４または請求項４６のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６４】
前記第１、第２及び第３ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項２５ないし請求項２８、請求項３０、請求項３２、請求項３６または請求項３８のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６５】
前記第１、第２及び第４ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項２６ないし請求項２８、請求項３１、請求項３２、請求項３７、請求項３９、請求項４１、請求項４３または請求項４５のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６６】
前記第１、第２、第３、及び第４ポリヌクレオチドを含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項２６ないし請求項２８、請求項３１、請求項３２、請求項３７、請求項３９、請求項４１、請求項４３または請求項４５のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６７】
前記ベクター１及び２を含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項３５ないし請求項４７のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６８】
前記ベクター１、２と３を含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項３６ないし請求項４６のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項６９】
前記ベクター１、２、３と４を含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項３６ないし請求項４７のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項７０】
前記ベクター１を含む細胞をさらに含むことを特徴とする請求項３５ないし請求項４７のうちいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項７１】
１）ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥを含む細胞を製造する段階；
２）前記で得られた細胞を請求項１７の転移ベクターでトランスフェクションさせる段階；
３）得られた細胞をＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子の生産が可能な条件下で培養する段階（この時、前記ベクター粒子は感染性及び形質導入コンピテントであり複製欠損である）；及び
４）前記ベクター粒子を回収する段階
を含む、ＣＡＥＶ系ベクター粒子を生産する方法。
【請求項７２】
１）ＣＡＥＶ５’ＬＴＲとＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列との間の非翻訳領域、及び
２）前記非翻訳領域の３’末端に連結されたＣＡＥＶ１ないし６１３未満のｇａｇ−コード配列を必須構成要素とするＣＡＥＶパッケージ配列を含むベクター。
【請求項７３】
前記ベクターが配列番号６８と少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項１５に記載の転移ベクター。
【請求項７４】
前記ベクター１が配列番号７７と少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項４１に記載のベクターシステム。
【請求項７５】
前記ベクター２が配列番号７４と少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項４３に記載のベクターシステム。
【請求項７６】
前記ベクター２が配列番号７２と少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項４５に記載のベクターシステム。
【請求項７７】
前記ベクター３が配列番号７５と少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項４６に記載のベクターシステム。
【請求項７８】
前記ベクター４が配列番号７６と少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項４７に記載のベクターシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの伝達に有用なレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）ベクターに関し、より具体的には、非分裂及び分裂細胞にポリヌクレオチドを輸送するに有用なヤギ関節炎脳炎ウイルス（ｃａｐｒｉｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ、ＣＡＥＶ）系ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）は、分裂細胞のみならず非分裂細胞も感染させることができるレトロウイルスのサブグループである。レンチウイルス由来のベクターは、分裂及び非分裂細胞のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）に安定的に統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されて長期間遺伝子の発現を媒介することができるので、外来遺伝子を標的細胞に伝達するための理想的な道具である（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，２００１；Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓａｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｓｍｉ，２００１）。
【０００３】
レンチウイルスは、非霊長類（例：猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）及びビスナウイルス）のみならず、霊長類（例：ヒト及びサル免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ））を含む多くの脊椎動物の種から分離されており、特に、ＨＩＶ及びＳＩＶが現在最もよく知られている。しかし、ベクターが伝染性及び病原性形態に組み換へる可能性があるため、人間において、このようなシステムのヒトへの使用は、深刻な安全性問題がある。従って、遺伝子治療の場合、非霊長類レンチウイルスを用いることが好ましい。
【０００４】
非霊長類レンチウイルスベクターのうち、ＦＩＶ（Ｃｕｒｒａｎ及びＮｏｌａｎ，２００２）及びＥＩＡＶ［ＵＳ２００１／００４４１４９］由来のベクターが最も盛んに研究され、その他の非霊長類ベクターに対してはほとんど研究されていない。
【０００５】
ＣＡＥＶは、すべてのレンチウイルスと同様に分化した細胞及び非分裂細胞のみならず、分裂細胞を用いて感染及び複製することができる。ＣＡＥＶの生物学的の下記の特徴から本願のウイルスが遺伝子転移／治療ベクターとして有力な候補であることが分かる。第一、ＣＡＥＶの正常宿主はヤギ類であり、ＣＡＥＶによってヒトが感染されたケースは報告されていない。第二、ＣＡＥＶは、レンチウイルスのうちＨＩＶ−１とは系統分類学的に最も類似しないゲノムである。第三、ＣＡＥＶのゲノム構成は、他のレンチウイルスに比べて相対的に簡単である。ＣＡＥＶゲノムは、三つの構造遺伝子（ｇａｇ，ｐｏｌ，及びｅｎｖ）及び三つの調節遺伝子／アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ，ｔａｔ，及びｒｅｖ）を含む。
【０００６】
しかし、これらの長所にもかかわらず、ＣＡＥＶ系伝達システムを開発させるための不断な努力が成功せず、その結果、安全性がなく、かつ非效率的な組み換え型ウイルスベクター生産システムなどの実用的でないＣＡＥＶ系遺伝子伝達システムを得られた。
【０００７】
１９９８年、Ｌ．セリー−ラカルら（Ｌ．Ｍｓｅｌｌｉ−Ｌａｋｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．）は、第１世代ＣＡＥＶ系システムを報告したが、前記システムのウイルス力価（１０−１８７ＴＵ／ｍｌ）は有用なレベルに至らなかった。前記著者らは、このような非效率性が細胞質内へのゲノムＲＮＡ蓄積の不足及びベクターＲＮＡの低いパッケージ效率に起因すると説明した。前記研究の他の問題点は、そのパッケージシステムとして伝染性野生型ウイルス（ヘルパーウイルス）を用いる点であり、これをヒトに適用することは実用的でない。
【０００８】
したがって、広範囲な分裂及び非分裂細胞への遺伝子転移を伝達するに当って媒介することができる安全で、かつ有効なＣＡＥＶ系レンチウイルスベクターシステムの開発が要求されている。
【非特許文献１】Ｇｉｌｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，２００１
【非特許文献２】Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９
【非特許文献３】Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６
【非特許文献４】Ｓａｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｓｍｉ，２００１
【非特許文献５】Ｃｕｒｒａｎ及びＮｏｌａｎ，２００２
【非特許文献６】ＵＳ２００１／００４４１４９
【非特許文献７】Ｌ．Ｍｓｅｌｌｉ−Ｌａｋｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、幅広くは外来のポリヌクレオチドの標的細胞への伝達に有用なＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の生産にある。このようなベクター粒子は抗ウイルス、抗腫瘍及び／または遺伝子治療に用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上述したＣＡＥＶ系ベクター生産システムに用いられる転移ベクターを提供し、前記の転移ベクターは、
（ａ）（ｉ）ＣＡＥＶ５’ＬＴＲとＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列との間の非翻訳領域、及び（ii）前記非翻訳領域の３’末端に連結されたＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列の１ないしＸ番目ヌクレオチド（このとき、Ｘは６１３未満）を必須構成要素とするＣＡＥＶパッケージ配列；及び
（ｂ）前記パッケージ配列と作動可能に連結された、ポリアデニル化反応、ＲＮＡ輸送、逆転写及び組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に要求されるシス作用エレメント（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む。
【００１１】
本発明の一実施態様において、Ｘは６０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５及び６００からなる群から選択される。
【００１２】
本発明の他の実施態様において、Ｘは
（ａ）Ｘは２５超過６００未満、
（ｂ）Ｘは２５超過５００未満、
（ｃ）Ｘは２５超過４００未満、
（ｄ）Ｘは２５超過３００未満、
（ｅ）Ｘは２５超過２００未満、
（ｆ）Ｘは５０超過６００未満、
（ｇ）Ｘは５０超過５００未満、
（ｈ）Ｘは５０超過４００未満、
（ｉ）Ｘは５０超過３００未満、
（ｊ）Ｘは５０超過２００未満、
（ｋ）Ｘは７５超過６００未満、
（ｌ）Ｘは７５超過５００未満、
（ｍ）Ｘは７５超過４００未満、
（ｎ）Ｘは７５超過３００未満、
（ｏ）Ｘは７５超過２００未満、
（ｐ）Ｘは１００超過６００未満、
（ｑ）Ｘは１００超過５００未満、
（ｒ）Ｘは１００超過４００未満、
（ｓ）Ｘは１００超過３００未満、
（ｔ）Ｘは１００超過２００未満、
（ｕ）Ｘは１２５超過６００未満、
（ｖ）Ｘは１２５超過５００未満、
（ｗ）Ｘは１２５超過４００未満、
（ｘ）Ｘは１２５超過３００未満、
（ｙ）Ｘは１２５超過２００未満、
（ｚ）Ｘは１５０超過６００未満、
（ａａ）Ｘは１５０超過５００未満、
（ｂｂ）Ｘは１５０超過４００未満、
（ｃｃ）Ｘは１５０超過３００未満、
（ｄｄ）Ｘは１５０超過２００未満、
（ｅｅ）Ｘは２００超過６００未満、
（ｆｆ）Ｘは２００超過５００未満、
（ｇｇ）Ｘは２００超過４００未満、
（ｈｈ）Ｘは２００超過３００未満、
（ｉｉ）Ｘは２００超過２００未満、
（ｊｊ）Ｘは２５０超過６００未満、
（ｋｋ）Ｘは２５０超過５００未満、
（ｌｌ）Ｘは２５０超過４００未満、及び
（ｍｍ）Ｘは２５０超過３００未満
からなる群から選択される。
【００１３】
他の実施態様において、Ｘは４０超過６１３未満である。
また、他の実施態様において、Ｘは５７超過６１３未満である。
別の実施態様において、Ｘは約３２７である。
【００１４】
本発明の一実施態様において、ｇａｇ−コード配列の開始コドンは、ｇａｇタンパク質の翻訳を防止するために変異される。さらに他の実施態様において、その開始コドンがＴＡＧに変異される。
【００１５】
本発明の転移ベクターの他の実施態様において、ｇａｇ−コード配列のＡＴＧコドンは開始コドンＡＴＧの下流Ｘ塩基対に位置し、また前記開始コドンは、ｇａｇタンパク質の翻訳を防止するように変異され、この時、前記Ｘは３０未満である。また他の実施態様においてＸは約２１である。
【００１６】
本発明の転移ベクターはＲＲＥ領域をさらに含むことができる。
【００１７】
本発明の他の実施態様において、前記転移ベクターはＵ３領域が欠失されているＣＡＥＶ３’ＬＴＲを含む。
【００１８】
本発明の転移ベクターは、異種プロモーター（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をさらに含むことができる。本発明の一実施態様において、前記異種プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスの主前初期プロモーター（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ）である。また、他の実施態様において、前記転移ベクターはｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）である。
【００１９】
本発明の転移ベクターは、異種プロモーター（例：ヒトサイトメガロウイルス主前初期プロモーターＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ、またはマウスサイトメガロウイルス主前初期プロモーターＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ）に作動可能に連結された所望の異種ポリヌクレオチドを含む転写用カセットをさらに含むことができる。このような転移ベクターは、所望のポリヌクレオチドがウイルス粒子内へ併合することを可能にすることによって、内部にポリヌクレオチドを含む感染された宿主細胞の数を増大させるための手段を提供する。
【００２０】
また、本発明は、外来ポリヌクレオチドを哺乳類細胞への伝達に有用なＣＡＥＶ系、複製欠損ベクター粒子を生産するＣＡＥＶ系レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記ベクター粒子は、哺乳類細胞に感染及び形質導入させることができる。ベクターシステムは、上述した転移ベクター；及びＧＡＥＶｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥを含む第１ポリヌクレオチド、及びウイルスエンベロープ−コード配列を含む第２ポリヌクレオチドを含有するパッケージベクターシステムを含む。
【００２１】
一実施態様において、前記第２ポリヌクレオチドは非ＣＡＥＶ  ｅｎｖ−コード配列を含む。また、一実施態様において、前記第２ポリヌクレオチドはＶＳＶ−Ｇ−またはＧａＬＶ−コード配列を含む。
【００２２】
他の実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムはｒｅｖ−コード配列を含む第３ポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
また他の実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムはｖｉｆ−コード配列を含む第４ポリヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
更に他の実施態様において、上述した各ＣＡＥＶベクターシステムの第１ポリヌクレオチドは、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含む。
【００２５】
更に他の実施態様において、上述したＣＡＥＶベクターシステムの第２ポリヌクレオチドは、前記ウイルスエンべロープ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含む。
【００２６】
更に他の実施態様において、前記第３ポリヌクレオチドは、ｒｅｖ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含む。
【００２７】
更に他の実施態様において、前記第４ポリヌクレオチドは、ｖｉｆ−コード配列に作動可能に連結された異種調節配列をさらに含む。
【００２８】
本発明の一実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムは、コンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＣＡＥＶパッケージ配列を有しないパッケージベクターシステムを含む。また他の実施態様において、パッケージベクターシステムはスプライスドナー部位（ｓｐｌｉｃｅ  ｄｏｎｏｒ  ｓｉｔｅ）とｇａｇ開始コドンとの間のＣＡＥＶゲノムの５’末端領域が欠けている。
【００２９】
一実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムは、第１ポリヌクレオチドを含むベクター１及び第２ポリヌクレオチドを含むベクター２を含む。他の実施態様において、前記ベクターシステムは第１ポリヌクレオチドを含むベクター１、第２ポリヌクレオチドを含むベクター２、及び第３ポリヌクレオチドを含むベクター３を含む。他の実施態様において、前記ベクターシステムは第１ポリヌクレオチドを含むベクター１、第２ポリヌクレオチドを含むベクター２、第３ポリヌクレオチドを含むベクター３、及び第４ポリヌクレオチドを含むベクター４を含む。前記ベクター３はｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）であり、前記ベクター４はｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６）であり得る。
【００３０】
更に他の実施態様において、前記ベクターシステムは第１ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、及び第４ポリヌクレオチドを含むベクター１及び第２ポリヌクレオチドを含むベクター２を含む。
【００３１】
一実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムのベクター１は、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列及び異種プロモーターに作動可能に連結されたＲＲＥを含む。前記プロモーターはＭＣＭＶ  ＭＩＥＰであってもよい。他の実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムはベクター１ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）を含む。
【００３２】
更に他の一実施態様において、前記ＣＡＥＶベクターシステムのベクター２は異種プロモーターに作動可能に連結されたＶＳＶ−Ｇ−コード配列である。前記プロモーターは、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰであってもよい。前記ベクター２は、β−グロビンイントロン（ｂｅｔａ  ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｔｒｏｎ）をさらに含むことができる。また他の実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムはベクター２ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）を含む。
【００３３】
更に他の一実施態様において、前記ＣＡＥＶベクターシステムのベクター２は異種プロモーターに作動可能に連結されたＧａＬＶ ｅｎｖ−コード配列である。前記プロモーターはＭＣＭＶ―ＭＩＥＰである。前記ベクター２は真核生物延長因子１αイントロン（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ―１  ａｌｐｈａ  ｉｎｔｒｏｎ）をさらに含むことができる。また他の実施態様において、ＣＡＥＶベクターシステムはベクター２ｐＭＹＫＥＦ−１／ｅｎｖ（配列番号：７２）を含む。
【００３４】
本発明の他の実施態様は、哺乳類細胞の感染に有用なＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子を生産する方法である。前記方法は、（ａ）ＣＡＥＶ系粒子生産に適切な条件下で、上述のベクターシステムで細胞をトランスフェクションさせる段階（この時、前記ベクター粒子は、感染−及び形質導入に有効であり（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）、複製欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）である）、及び（ｂ）前記ベクター粒子を回収する段階を含む。
【００３５】
本発明は、ＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子及び任意な担体を含む組成物を提供し、この時、前記ベクター粒子は上述した方法によって生産できる。
本発明は、上述した転移ベクターまたはＣＡＥＶ系レンチウイルスベクターシステムを含むキットを提供する。
【００３６】
本発明は、ＣＡＥＶｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥ、及び選択的なウイルスｅｎｖ−コード配列を含むパッケージ細胞を提供する。前記パッケージ細胞は、ｒｅｖ−コード及び／またはｖｉｆ−コード配列をさらに含むことができる。前記細胞は、転移ベクターのＲＮＡ形態を感染及び形質導入させる能力があり、複製欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）であるベクター粒子にパッケージするに有用である。
【００３７】
一実施態様において、前記ベクターシステムは、上述した第１ポリヌクレオチドを含む細胞を含む。前記ベクターシステムは上述した第３及び／または第４ポリヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００３８】
他の実施態様において、前記ベクターシステムは、上述した第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含む細胞からなる。前記ベクターシステムは、上述した第３及び／または第４ポリヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００３９】
また他の実施態様において、前記ベクターシステムは、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥを含むベクター１を備える細胞からなる。前記ベクター１は、ｒｅｖ−コード及び／またはｖｉｆ−コード配列をさらに含むことができる。一方、前記細胞はＣＡＥＶｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥを含むベクター１、ｒｅｖ−コード配列を含むベクター２、及び／またはｖｉｆ−コード配列を備えるベクター３からなり得る。
前記実施態様において、前記ベクターシステムは、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥを含むベクター１、及びウイルスｅｎｖ−コード配列を含むベクター２を備える細胞からなり得る。前記ベクター１は、ｒｅｖ−コード及び／またはｖｉｆ−コード配列をさらに含むことができる。他方、前記細胞はＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥを含むベクター１、ウイルスｅｎｖ−コード配列を含むベクター２、及び選択的にｒｅｖ−コード配列を含むベクター３、及び／またはｖｉｆ−コード配列を含むベクター４を含むことができる。
【００４０】
本発明の他の態様は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを哺乳類細胞に伝達するか、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを複製する方法であり、前記方法は、前記ポリヌクレオチドを哺乳類細胞のゲノム内に統合することができる条件及び選択的に前記ポリヌクレオチドによってコードされた前記ポリペプチドを増殖させることができる条件下に、前記の哺乳類細胞を上述したベクター粒子と接触させる段階を含む。前記哺乳類細胞は分裂細胞、非分裂細胞またはＣＤ３４＋幹細胞であることができる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを哺乳類細胞に伝達する方法または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を複製する方法は、細胞をベクター粒子と接触させる前に哺乳動物から細胞を分離する段階をさらに含むことができる。前記方法は、細胞をベクター粒子と接触させた後に培養液内で前記細胞を増殖させる段階をさらに含むことができる。前記方法は、接触された細胞を増殖させる前または後に、その細胞を哺乳動物に再導入する段階をさらに含むことができる。
【００４１】
また、本発明は、伝達されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが脊椎動物における生物学的反応の検出や誘導するに十分な量で発現されるようにするために、所望の異種ポリヌクレオチドを含むＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子を脊椎動物に投与する段階（この時、前記ベクター粒子は、上述した方法によって生産される）を含む、ポリペプチドを脊椎動物に伝達する方法を提供する。
【００４２】
さらに、本発明は（ａ）ＣＡＥＶ５’ＬＴＲとＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列との間の非翻訳領域、及び（ｂ）前記非翻訳領域の３’末端に連結されたＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列の１ないしＸ番目のヌクレオチド（この時、Ｘは６１３未満である）で必須的にからなる、ＣＡＥＶパッケージ配列を含むベクターを提供する。
【００４３】
本発明者らは、前述したように、前記ＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子の生産がレンチウイルスベクター設計において、既存のＣＡＥＶ系ベクター粒子に比べて效率性及び安全性を向上させることを発見した。前記向上した效率性は、５’ＬＴＲとｇａｇ開始コドンとの間の非翻訳領域及びｇａｇ−コーディング領域の最適な長さを特定することによって達成され、これは効率的なカプシド化を可能にすることでウイルス力価を増大させる。また、ウイルス力価はパッケージプラスミドの設計時、強力な異種プロモーターを用いて向上できる。前記向上した安定性は、ｔａｔ−独立的な転移ベクター及び転移プラスミド系パッケージシステムの製作を通じて達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、特に、ＣＡＥＶ系レンチウイルスベクターシステム及び前記ベクターを用いて所望のポリペプチドを分裂及び非分裂細胞に伝達する方法に関する。
【００４５】
ＣＡＥＶゲノム
野生型ＣＡＥＶウイルスは、二本鎖ＤＮＡ中間体を通じて複製され、核タンパク質コア（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｒｅ）を含む球形のエンベロープを有するビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）でパッケージされる、二量体のＲＮＡゲノムを有する（単鎖、陽性極性）。前記ゲノムは、構造及び酵素タンパク質であるＧａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖをコーディングする三つの遺伝子、及び挿入されたウイルスゲノムの各末端における長い末端反復単位（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ；ＬＴＲ）を含む。また、前記ゲノムは、三つの調節タンパク質であるｖｉｆ，ｔａｔ及びｒｅｖをコードする。
【００４６】
前記ｇａｇ遺伝子は、内部構造タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はウイルス複製酵素をコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスが細胞表面への付着を媒介するエンベロープ糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする。Ｖｉｆタンパク質は、ウイルス感染度（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）に関連しており、Ｔａｔタンパク質は、５’ＬＴＲのトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に関連している。Ｒｅｖタンパク質及びその標的配列ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答配列）は、ウイルスＲＮＡの安全性、ウイルスＲＮＡスプライシングの調節、及び大型ＲＮＡ（スプライスされないか、または一度スプライスされた）の核から細胞質への輸送に関連している。プロウイルスＬＴＲ配列は、Ｕ３（構造タンパク質の下流に位置する独特の（ｕｎｉｑｕｅ）配列要素）、Ｒ（各ゲノム末端の短い反復配列）、及びＵ５（前記Ｒ配列直後の独特の配列要素）領域を含む。５’ＬＴＲのＵ３領域は、ウイルスプロモーター及びエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）を含む。ゲノムの３’末端は３’ＬＴＲにおけるポリアデニル化信号を含む。
【００４７】
ＣＡＥＶの野生型ゲノムは、またプロウイルス統合のためのＬＴＲ末端のａｔｔ（付着部位）などの多くのシス作用エレメント；５’ＬＴＲで挿入されたプロウイルスの転写開始を調節するプロモーター要素；５’ＬＴＲの下流に位置するＰＢＳ（プライマー結合位置）；５’−スプライス供与部位；パッケージ配列（ここでパッケージ部位はパッケージ信号と交換可能な意味を有する）；３’ＬＴＲの付近に位置するｐｐｔ（ポリプリントラクト）部位；及び３’ＬＴＲのポリアデニル化信号を含む。
【００４８】
ここで、「シス」という用語は、核酸の同一染色体または線形部分上に存在する遺伝子との関連を意味で用いられる。したがって、「シス欠陥」とは、核酸の線形配列上で発見される欠陥を意味する。また、「シス作用」という用語は、同一染色体または核酸の線形部分上に存在する遺伝子に対する調節遺伝子の制御効果に関連する意味で用いられる。例えば、下流ｍＲＮＡの合成に影響を及ぼすプロモーターは、シス作用の調節因子である。
ＣＡＥＶの二つの分離株に対するゲノムの全配列は知られており、前記配列は、生命工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）データベースにＮＣ＿００１４６３（配列番号：１）及びＡＦ３２２１０９（配列番号：２）（Ｓａｌｔａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、及びＧｊｅｒｓｅｔ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，非公開）として寄託されている。本発明による核酸は、ＣＡＥＶの特定の分離株に限定されず、ただそのゲノム配列の公知機能を維持する配列であることができる。例えば、類似する作用を有するタンパク質をコードする類似核酸配列が、前記遺伝子配列における自然変異がウイルス複製中に発生するということが当業界に知られている。
【００４９】
ＮＣ＿００１４６３（配列番号：１）及びＡＦ３２２１０９（配列番号：２）ゲノム配列の配列アラインメント（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を表１に示した。表１から分かるように、前記配列間に相当な核酸相同性があるが、明白な核酸レベルでの差を示す。特に、表２（配列番号：３ないし６）に記載されたＣＡＥＶ  ｇａｇ領域の変異可能性が重要である。ＮＣ＿００１４６３  ５’ＬＴＲ，ｐｏｌ，ｒｅｖ及びｖｉｆ遺伝子、及びそれに相応するＡＦ３２２１０９からの遺伝子の配列アラインメントは、表３−６（配列番号：７−１４）から確認することができる。また、ＣＡＥＶゲノムの多くの部分配列が公知及び寄託されている。例えば、寄託番号ＡＹ０８１１３９、ＡＹ１０１３４７、ＡＹ１０１３４８、ＡＹ０４７３６２、ＡＦ４０２６６８、ＡＦ４０２６６７、ＡＦ４０２６６６、ＡＦ４０２６６５、ＡＦ４０２６６４、ＡＪ３０５０４２、ＡＪ３０５０４１、及びＡＪ３０５０４０は、全て、ＣＡＥＶのブラジル型分離株のｇａｇ遺伝子配列を提供している。また、寄託番号ＡＦ０１５１８１、Ｌ７８４５３、Ｌ７８４５１、Ｌ７８４５０、Ｌ７８４４７、及びＬ７８４４６は、多様なＣＡＥＶ分離株のｇａｇ遺伝子配列を含む。寄託番号Ｘ６４８２８及びＭ６３１０６は、多様なＣＡＥＶ分離株のｒｅｖ遺伝子配列を含む。寄託番号ＡＦ０１５１８２、ＡＪ３０５０５３、Ｋ０３３２７、Ｌ７８４４８、Ｌ７８４５２及びＵ３５８１４は、多様なＣＡＥＶ分離株のｐｏｌ遺伝子を含む。ＮＣ＿００１４６３のｇａｇ遺伝子（配列番号：１５、１７）、ＡＦ０１５１８１（配列番号：１６、１７）、ＡＦ４０２６６４（配列番号：２０、２６）、ＡＦ４０２６６５（配列番号：２１、２７）、ＡＦ４０２６６６（配列番号：２２、２８）、ＡＦ４０２６６７（配列番号：２３、２９）、及びＡＦ４０２６６８（配列番号：２４、３０）のｇａｇ遺伝子間の配列アラインメントの差異は、表８から確認される。ＮＣ＿００１４６３のｇａｇ遺伝子（配列番号：３１、３５）と、ＡＪ３０５０４０（配列番号：３２、３６）、ＡＪ３０５０４１（配列番号：３３、３７）、及びＡＪ３０５０４２（配列番号：３４、３８）のｇａｇ遺伝子の配列アラインメントを表９に示す。ＮＣ＿００１４６３のｇａｇ遺伝子（配列番号：３９、４１）とＡＹ０４７３６２（配列番号：４０、４２）のｇａｇ遺伝子の配列アラインメントは表１０から分かる。ＮＣ＿００１４６３ｇａｇ遺伝子（配列番号：４３、４５）と、ＡＹ０８１１３９（配列番号：４４、４６）のｇａｇ遺伝子の配列アラインメントは、表１１から分かる。ＮＣ＿００１４６３（配列番号：４７、５０）のｇａｇ遺伝子と、ＡＹ１０１３４７（配列番号：４８、５１）及びＡＹ１０１３４８（配列番号：４９、５２）のｇａｇ遺伝子の配列アラインメントは表１２に表示される。ＮＣ＿００１４６３ｇａｇ遺伝子（配列番号：５３、５９）、Ｌ７８４４６（配列番号：５４、６０）、Ｌ７８４４７（配列番号：５５、６１）、Ｌ７８４５０（配列番号：５６、６２）、Ｌ７８４５１（配列番号：５７、６３）、及びＬ７８４５３（配列番号：５８、６４）のｇａｇ遺伝子の配列アラインメントは、表１３に記載されている。
【００５０】
前記アラインメントは、ベクターＮＴＩ（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ，Ｉｎｆｏｒｍａｘ社製，ＵＳＡ）を用いて下記のパラメーターを利用して行われた：
ペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の場合：
ギャップ（ｇａｐ）開始ペナルティ：１５
ギャップ伸長ペナルティ：６．６、ただしマルチプルアラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の場合のギャップ開始ペナルティは１５
ギャップ伸長ペナルティ：６．６
ギャップ分離ペナルティ：８
【００５１】
表１４には、前記提示されたｇａｇ遺伝子配列の配列ラインメントに対する相同性の百分率値が要約されている。表１５には、ＮＣ＿００１４６３（配列番号：１）及びＡＦ３２２１０９（配列番号：２）の全体ゲノムラインメント、及びｇａｇ、５ＬＴＲ，ｐｏｌ，ｒｅｖ及びｖｉｆ領域のアラインメントの相同性の百分率が要約されている。多様なＣＡＥＶ分離株からの多くの部分配列のみならず、二つのＣＡＥＶ分離株のゲノム配列が知られているため、一致する配列を容易に識別することができるので、多様なＣＡＥＶ配列を用いて本発明を実施するための過度の実験が必要でない。
【００５２】
本発明のＣＡＥＶベクター
本発明のベクターは、宿主細胞の広い系統分類学的範囲において、宿主細胞の核とは無関系にポリヌクレオチドまたは遺伝子を複製して発現するための手段を提供する。このような異種核酸の宿主細胞へのベクター媒介結合は、宿主細胞のトランスフェクションまたは感染を意味し、このとき感染はウイルス粒子の使用を意味し、トランスフェクションは核酸分子をそのまま使用することを意味する。
【００５３】
ここで用語「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体の生産に必要な調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びコード配列を含むＤＮＡ配列を意味する。本願における相互互換的に用いられる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、二つまたはその以上のように任意の長さを有するヌクレオチドポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方ともを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体（ａｎａｌｏｇｓ）（変形されたリン酸基、塩基または糖など）、またはＤＮＡポリメラーゼ或いはＲＮＡポリメラーゼなどの適切な酵素によりポリマーで結合することができる任意の基質であることができる。ポリペプチドは、全長コード配列またはポリペプチドの所望の活性を維持できる任意の長さを有する配列によりコードされることができる。
【００５４】
ここで用語「野生型」とは、自然発生源（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｓｏｕｒｃｅ）から分離されてその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を意味する。野生型遺伝子は、個体群のうち最も頻繁に観察されてその遺伝子の「一般的な」または「野生の」形態として任意に考案されたものである。これに対し、「変異された」または「突然変異体」とは、前記野生型遺伝子または遺伝子産物と比較するとき、配列または機能的特徴における変形（すなわち、変化した特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を意味する。自然発生突然変異体は分離でき、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較するとき、変化した特徴を有するという事実により識別することができる。
本願の明細書及び請求項で用いられる単数形は、文脈上明確に記載していない限り複数の引用物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」の意味には複数のポリヌクレオチドも含まれ、「幹細胞」の意味には複数の細胞も含まれる。
【００５５】
本願で用いられる用語「レトロウイルス」は、それらの複製周期の間逆転写酵素を用いるＲＮＡウイルスを意味する。レトロウイルスゲノムＲＮＡは、逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに転換される。このようなウイルスの二本鎖ＤＮＡ形態は、感染された細胞の染色体内に統合されることができ；一段統合されると、これを「プロウイルス」と呼ぶ。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼIIに対する鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として提供され、新規ウイルス粒子の生産に必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を制御する。
【００５６】
本願で用いられる用語「レンチウイルス」は、疾病を徐々に進行させるレトロウイルスの一群（または属）を意味する。このような群に含まれるウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ヤギにおける脳炎（ビスナ）または肺炎（マイディ）を起こすビスナ・マイディ（ｖｉｓｎａ ｍａｅｄｉ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などが挙げられる。このようなウイルスによって発生する疾病の特徴は、長い潜伏期及び長引いた症状である。一般的に、前記ウイルスは、単球及びマクロファージを潜伏感染させ、これらから他の細胞に広がる。
【００５７】
ここで用語「ベクター」とは、転移ポリヌクレオチド（例：ＤＮＡ）断片を一つの細胞から他の細胞に転移する際に用いられる核酸分子を意味する。用語「伝達物質」（ｖｅｈｉｃｌｅ）は、時々「ベクター」と相互互換的に用いられる。伝達物質またはベクターの任意の形態は、このような定義内に含まれることにする。例えば、ベクターとしては、ウイルス粒子、プラスミド、トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）などが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００５８】
本発明のベクターの製作のための基本技術は、当該技術分野における通常の知識を有する当業者に既に知られており、［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）］のような引用文献において確認することができる。多様な方法がＤＮＡ断片を結合するために活用でき、これはＤＮＡ断片の末端性質を考慮して当業者が容易に選択できる。
【００５９】
本発明の好適なポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ）配列の例としては、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化信号（Ｐｆａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、ＳＶ４０初期領域ポリアデニル化部位（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）及びＳＶ４０後期領域ポリアデニル化部位（Ｃａｒｓｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ａｌｗｉｎｅ，１９８９）、β−グロビンポリＡ、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼポリＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明のプロモーターは、哺乳類またはウイルスから起因するプロモーターを含み、細胞で遠位の配列（プロモーター配列の５’末端に連結された配列）の転写を制御できる。前記プロモーター領域は、また転写の増大または減少に係わる調節要素を含むことができる。本発明に好適なプロモーターとしては、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス主前初期プロモーター（ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰまたはＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ）、伸長因子１アルファ（ｅｆ−１α）、及びラウス肉腫ウイルス長い末端反復プロモーター（ｐＲＳＶ）などが挙げられるが、これらに限定されない。イントロン配列は、またプロモーターと結合することができる。イントロン配列としては、ｅｆ−１αイントロン及びβ−グロビンイントロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、誘導可能な発現系（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いてもよい。誘導可能な発現系の例としては、エクジソン（ｅｃｄｙｓｏｎｅ）を用いた誘導可能な哺乳類発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＴｅｔ−Ｏｎ及びＴｅｔ−Ｏｆｆ遺伝子発現系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞−または組職−特異的プロモーターは、特定細胞の個体群内遺伝子配列の標的発現のために用いることができる。
【００６１】
発現を促進するため、プロモーターまたはターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）配列の上流、及びコーディング領域の下流でのエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）配列が本発明のベクターに選択的に含まれることができる。また、本発明のベクターは、細胞がベクターによって発現されたタンパク質を效率良く、かつ效果的に処理できるように、イントロン配列、局在配列（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または信号配列のような追加の核酸配列を含むことができる。前記イントロンの配列の例としては、β−グロビンイントロン（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）及びヒトＥＦ−１αイントロン（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）などが含まれる。このような追加の配列は、ベクターに挿入されて、転写を目的とする場合には、プロモーター配列に作動可能に連結されるか、または翻訳及び処理を目的とする場合には、開始及び処理配列にさらに連結される。一方、挿入された配列はベクター内のどこでも位置させることができる。
【００６２】
ここで用語「作動可能に連結された」とは、遺伝子配列の転写を作動可能に連結されたプロモーター配列によって、遺伝子配列の翻訳を作動可能に連結された翻訳調節配列によって；また遺伝子配列の翻訳後処理を作動可能に連結された処理配列によってそれぞれコントロールするように遺伝子配列とプロモーターまたは他の調節または処理配列との間に連結されたことを意味する。
【００６３】
ここで用語「ＳＩＮベクター」とは、３’ＬＴＲ内に切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｕ３領域を有する自己不活性化（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ベクターを意味する。逆転写の期間中に切断されたＵ３は５’ＬＴＲ内で複製され、その結果、転写能の損失及び内部プロモーターに対する阻害効果が生じる。
【００６４】
転移ベクターのパッケージ配列は、（ｉ）ＣＡＥＶ５’ＬＴＲとＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列との間の非翻訳領域、及び（ｉｉ）前記非翻訳領域の３’末端に連結されたＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列の１ないしＸ番目ヌクレオチド（このとき、Ｘは６１３未満である）を不可欠構成要素として含む。一実施態様において、Ｘは６０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５及び６００からなる群から選択される。
【００６５】
本発明の他の実施態様において、Ｘは下記からなる群から選択される：
（ａ）Ｘは２５超過６００未満、
（ｂ）Ｘは２５超過５００未満、
（ｃ）Ｘは２５超過４００未満、
（ｄ）Ｘは２５超過３００未満、
（ｅ）Ｘは２５超過２００未満、
（ｆ）Ｘは５０超過６００未満、
（ｇ）Ｘは５０超過５００未満、
（ｈ）Ｘは５０超過４００未満、
（ｉ）Ｘは５０超過３００未満、
（ｊ）Ｘは５０超過２００未満、
（ｋ）Ｘは７５超過６００未満、
（ｌ）Ｘは７５超過５００未満、
（ｍ）Ｘは７５超過４００未満、
（ｎ）Ｘは７５超過３００未満、
（ｏ）Ｘは７５超過２００未満、
（ｐ）Ｘは１００超過６００未満、
（ｑ）Ｘは１００超過５００未満、
（ｒ）Ｘは１００超過４００未満、
（ｓ）Ｘは１００超過３００未満、
（ｔ）Ｘは１００超過２００未満、
（ｕ）Ｘは１２５超過６００未満、
（ｖ）Ｘは１２５超過５００未満、
（ｗ）Ｘは１２５超過４００未満、
（ｘ）Ｘは１２５超過３００未満、
（ｙ）Ｘは１２５超過２００未満、
（ｚ）Ｘは１５０超過６００未満、
（ａａ）Ｘは１５０超過５００未満、
（ｂｂ）Ｘは１５０超過４００未満、
（ｃｃ）Ｘは１５０超過３００未満、
（ｄｄ）Ｘは１５０超過２００未満、
（ｅｅ）Ｘは２００超過６００未満、
（ｆｆ）Ｘは２００超過５００未満、
（ｇｇ）Ｘは２００超過４００未満、
（ｈｈ）Ｘは２００超過３００未満、
（ｉｉ）Ｘは２００超過２００未満、
（ｊｊ）Ｘは２５０超過６００未満、
（ｋｋ）Ｘは２５０超過５００未満、
（ｌｌ）Ｘは２５０超過４００未満、及び
（ｍｍ）Ｘは２５０超過３００未満。
【００６６】
他の実施態様において、Ｘは４０超過６１３未満である。さらに他の実施態様において、Ｘは約３２７である。転移ベクターの一実施態様において、ｇａｇ翻訳を開始するコドンが、変異されているか（例：ＡＴＧがＴＡＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧまたはＡＴＴ）欠失されている。本願で用いられる用語「コドン」とは、ＤＮＡまたはメッセンジャー（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）ＲＮＡ分子における配列をコントロールする特定アミノ酸の成長ポリペプチドを鎖の三つのヌクレオチドを指す。前記転移ベクターは、異種プロモーター及び一つ以上のシス−作用配列をさらに含み得る。
【００６７】
本願で用いられる用語「パッケージ信号」または「パッケージ配列」は、ウイルスＲＮＡがウイルスカプシドまたは粒子でカプシド化するのに要求される、ＣＡＥＶゲノムの５’ＬＴＲに隣接して位置する配列を意味する。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド化に要求される最小限のパッケージ信号（また、プサイ[Ψ]配列とをいう）を用いる。したがって、本願で用いられる用語「パッケージ配列」、「パッケージ信号」、「プサイ」、及び記号「Ψ」とは、ウイルス粒子形成期間中にＣＡＥＶ  ＲＮＡ鎖のカプシド化に要求される非コード配列を意味する。
【００６８】
本発明の他の実施態様において、前記転移ベクターは、また転写カセット（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を含み得る。ここで「転写カセット」とは、異種プロモーターに作動可能に連結された、遺伝因子の特定クループ、一般的に所望のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む核酸の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）または切片（ｓｅｇｍｅｎｔ）を意味する。前記カセットは、単一ユニットとして除去されるか、ベクターまたはプラスミドに挿入することができる。
【００６９】
本発明の転移ベクターの例が図３Ｃに示されている。図３Ｃは、プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）を示す。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰプロモーター、ＣＡＥＶ５’ＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５配列領域、ＰＢＳ位置を含む残りの非翻訳配列、ＡＴＧ→ＴＡＧ異種点突然変異を有するｇａｇ遺伝子の３２７  ｂｐ断片、ＲＲＥ領域及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ３’ＬＴＲ領域を含む、４，２３８  ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ２５３５−３１１８）及びカナマイシン耐性遺伝子領域（ｂｐ  ３３７０−４１８２）を含む。転移ベクターの他の例が図３Ａないし３Ｈに示されている。
【００７０】
本発明は、上述された転移ベクター及びパッケージベクターシステムを含むＣＡＥＶベクターシステムを提供する。前記パッケージベクターシステムは、第１及び第２ポリヌクレオチドベクター配列を含む。第１ポリヌクレオチド配列は、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ及びＲＲＥ−コード配列を含み、第２ポリヌクレオチドは、ウイルスエンベロープ−コード配列を含む。一実施態様において、第２ポリヌクレオチドは非ＣＡＥＶ外皮をコードする。
【００７１】
ここで「構造遺伝子」とは、ウイルスゲノムのカプシド化（例：パッケージ）に要求されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を意味し、ｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖなどがこれに属する。
【００７２】
本発明の第１パッケージベクターの一例が図２Ａに示されている。図２Ａは、プラスミドｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）を示す。前記プラスミドは、９，４４６塩基対（ｂｐ）を有し、ＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌコーディング領域、ＲＲＥ領域、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化信号を含む。前記ベクターは、またネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域、ＳＶ４０複製起点、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点、及びアンピシリン耐性遺伝子領域を含む。
【００７３】
本発明のウイルスベクターが感染させることができる細胞の宿主範囲は、他の近縁のウイルスからのエンベロープ遺伝子を用いて代えることができる。すなわち、特定ウイルスのエンベロープタンパク質が有する他のウイルスのカプシド化に関与する能力の長所を取って本願発明のＣＡＥＶベクターの宿主範囲を広げることが可能である。レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例は次の通りであるが、これらに限定されない：水疱性口内炎ウイルスのＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、モルニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、及びヒト免疫不全性ウイルス（ＨＩＶ）。こられのウイルスエンベロープタンパク質は、いずれも他のウイルスのゲノム及び基質性分を有して偽型ビリオンを效率的に形成する。ここで「偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）」とは、あるウイルスの核酸と他のウイルスのエンベロープタンパク質とからなるウイルス粒子を意味する。一般に、ＶＳＶ−Ｇ或いはＧａＬＶ偽型ベクターは非常に広い宿主範囲を有し、高いレベルの伝染能を有する反面、超遠心分離法により高い滴定濃図でペレット化させることができる（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【００７４】
本発明の第２パッケージベクターの一例が図６Ａ及び６Ｂに示されている。図６Ａは、プラスミドｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）を示す。ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）はＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ、β−グロビンイントロン領域、ＶＳＶ−Ｇコーディング領域、ＢＧＨポリアデニル化信号、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域、アンピシリン耐性遺伝子コーディング領域、及びＦ１複製起点を含む７，６２３  ｂｐのプラスミドである。図６Ｂは、プラスミドｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２）を示す。前記プラスミドは、ＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ、ヒトＥＦ１−αイントロン領域、ＧａＬＶ  ｅｎｖコーディング領域、ＢＧＨポリアデニル化信号、ＣｏｌＥ１複製起点、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域、及びアンピシリン耐性遺伝子コーディング領域を含む７，５７９  ｂｐを含む。
【００７５】
本発明の他の実施態様において、前記パッケージベクターは、Ｒｅｖをコードする第３ポリヌクレオチドを含む。感染された細胞において、Ｒｅｖは、転写物のＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）と結合して複製の後期にウイルス構造タンパク質の特徴的な一度スプライスされた転写物とプライスされない転写物の転写を誘導する。したがって、Ｒｅｖは、ウイルス遺伝子発現の一時的な調節を媒介する。哺乳類細胞のスプライス機構は、ｍＲＮＡが核内合成部位から細胞質への移動と繋がるので、ＲｅｖもＲＲＥを含むウイルス転写物の輸送にも影響を及ぼす。
【００７６】
本発明の第３パッケージベクターの一例が図５に示されている。図５は、プラスミドｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）を示す。ｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）は、ＨＣＭＶＭＩＥＰ、ｒｅｖ遺伝子コーディング領域、ＢＧＨポリアデニル化信号、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域、及びアンピシリン耐性遺伝子コーディング領域を含む５，４１９  ｂｐのプラスミドである。
【００７７】
本発明の他の実施態様において、前記パッケージベクターは、Ｖｉｆをコードする第４ポリヌクレオチドを含む。Ｖｉｆの結合は、パッケージ細胞株の選択によってビリオンの感染及びパッケージに必須的である。
【００７８】
本発明の第４パッケージベクターの一例が図４に示している。ｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ、ｖｉｆ遺伝子コーディング領域、ＢＧＨポリアデニル化信号、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域、及びアンピシリン耐性遺伝子コーディング領域を含む５，７２９  ｂｐのプラスミドである。
レトロウイルスベクターＤＮＡが細胞内にトランスフェクションされる時、染色体ＤＮＡに統合されるか、または統合されなく、以降に転写されることによってΨ配列を含む全長レトロウイルスベクターＲＮＡを生産する。この条件下で、ただベクターＲＮＡのみウイルスカプシド構造物としてパッケージされる。このような全複製欠損でウイルス粒子は、比較的に高効率でレトロウイルスベクターの標的細胞への伝達に用いることができる。
【００７９】
ここで「複製欠損」とは、感染性ビリオンが生じないように、完全で、かつ效果的に複製することができないウイルスを意味する（例：複製欠損レンチウイルス子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ））。また、ここで「複製コンピテント」とは、ウイルス複製により伝染性ビリオンが生成されるように複製能のある野生型ウイルスまたは変異ウイルスを意味する（例：複製コンピテントレンチウイルス子孫）。
【００８０】
パッケージングはまた、非誘導性（ｎｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）のみならず、誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であってもよい。誘導パッケージ細胞及びパッケージ細胞株におけるＣＡＥＶ粒子は、少なくとも一つ以上の誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）の作用で生産される。誘導細胞株を用いた好適な実施態様において、誘導物質はＴａｔである。非誘導パッケージ細胞株及びパッケージ細胞では、レンチウイルス粒子生産が起るために誘導性物質は必要としない。
【００８１】
ＣＡＥＶベクター配列
また、本発明において、機能的に同等の配列は、それぞれの固有配列（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と実質的に同一の機能を維持するＣＡＥＶゲノムの多様な断片を含む。このような断片は、関心のある特定遺伝子の要素の少なくとも約１０、１５個の連続的なヌクレオチド、少なくとも約２０個の連続的なヌクレオチド、少なくとも約２４、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３４０、３６０、３８０、またはその以上の全長を有する連続的なヌクレオチドを含むことができる。このような断片は、固有のウイルスゲノムを切断する制限酵素の使用によって；ウイルスゲノムの固有のヌクレオチド配列からヌクレオチド配列を合成することによって；またはＰＣＲ技術を用いて得られる（特に、Ｍｕｌｌｉｓ及びＦａｌｏｏｎａ，１９８７及びＥｒｌｉｃｈ，１９８９）参照）。また、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の結果のように、多様なベクターコンポーネントの変異体が本発明の方法に含まれる。下記にさらに詳しく説明するが、機能的同等性を決定する方法は当業界において周知である。
「変異体」としては、実質的に類似する配列が含まれる。したがって、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の場合、変異体にはウイルスベクターシステムの多様なコンポーネントと機能的に同等な配列が含まれる。例えば、変異ヌクレオチド配列には、部位特異的突然変位誘発などによって固有配列の機能を依然として維持する合成的に誘導されたヌクレオチド配列が含まれる。一般的に、本発明のヌクレオチド配列変異体またはアミノ酸配列変異体は、それぞれの固有ヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、一般的に８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有する。
【００８２】
本発明の変異体としては、本願に開示されたベクター（配列番号：６７−７９）の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含むか、またはこれらからなるポリヌクレオチド（例：ベクター）が含まれる。
【００８３】
当業者には、開示された核酸構造物の多くの保存的変異（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が機能的に同一の構造物を生産することが周知されている。特定核酸配列の保存的変異は、同一であるか、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、或いは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を意味する。遺伝子コードの縮退性のため、多数の機能的に同一の核酸は、所定のポリペプチドをコーディングする。例えば、遺伝子コードの縮退性のため、「静的置換ｓｉｌｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ)」(すなわち、コードされたポリペプチドの変異を引き起こさない核酸配列の置換)は、アミノ酸をコードする全ての核酸配列の特徴を含む。 同様に、パッケージまたはパッケージ可能な構造物のアミノ酸配列における一つまたはいくつかのアミノ酸において、 「保存的アミノ酸置換」は、非常に類似する特徴を有する他のアミノ酸に置換され、また開示された構造物と非常に類似するので、容易に確認できる。 例えば、コドン ＣＧＵ，ＣＧＣ，ＣＧＡ，ＣＧＧ，ＡＧＡ 及びＡＧＧは、全てアミノ酸アルギニンをコードする。 したがって、アルギニンがコドンによって特定される全ての位置において、前記コドンは、コーディングされたポリペプチドを変化させず、提示された任意の対応コドンに取り替えられることができる。このような核酸変異は 「保存的に変形された変異」の一種である「静的変異」である。 ポリペプチドをコードする本願の全ての核酸配列は、またあらゆる静的変異を提示する。当業者ならば、核酸における各コドン(通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧは除く)が基本技術により機能的に同一の分子を生産するように変形できるということが分かる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各 「静的変異」は、任意に提示された配列に含まれている。また、通常の技術者は、コードされた配列における単一アミノ酸または一部アミノ酸の一部(一般的に５％未満、さらに一般的に１％未満)を取り替えるか、または添加、或いは削除するそれぞれの置換、欠失または添加がアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸に置換させる「保存的変形変異(ｃｏｎｓｅｒｖｅｒｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ)」であることが分かる。 機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は既に当業界に知られている。下記の各６群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む:
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
また、文献（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照されたい。最後に、非機能的配列と同様に、核酸分子の活性を変化させない配列の添加は、基本核酸の保存的変形である。このようなそれぞれ開示された配列の保存的置換変異は本発明の特徴である。
【００８４】
本発明のベクターシステムで用いられる多様な全長または成熟（ｍａｔｕｒｅ）ポリペプチドのアミノ酸配列に関連して、変異体としては、固有のポリペプチドにおけるＮ末端及び／またはＣ末端の一つ以上のアミノ酸の欠失（切断ともいう）または添加；固有のポリペプチドにおいて、一つ以上の位置における一つ以上のアミノ酸の欠失または添加；または固有のポリペプチドにおける一つ以上の位置における一つ以上のアミノ酸の置換によって、固有のポリペプチド由来のポリペプチドが含まれる。例えば、そのような変異体は、遺伝的多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）または人的操作によって引き起こすことができる。一般的に、このような操作方法は当業界に知られている。
【００８５】
当業者ならば、与えられた核酸構造物内で置換を起こす多くの方法を知っている。そのような公知方法には、部位特異的突然変異誘発、縮退性オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅、核酸を含む細胞の突然変異誘発物質や放射線への露出、所望のオリゴヌクレオチドの化学的合成（例えば、大きい核酸を生産する連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）及び／またはクローニングに関連する）及びその他の公知技術が含まれる（Ｇｉｌｌａｍ及びＳｍｉｔｈ，１９７９）、（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｃｈｅｅｔｈａｍ，及びＲｅｅｓ，１９８７）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｉｎｎｉｓ，Ａｕｓｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｎｅｅｄｈａｍ  ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  及び  Ｍｕｌｌｉｓ参照（全て前記文献）。
【００８６】
固有の核酸または固有のポリペプチドの変異体は、固有の配列または固有のポリペプチドと実質的な相同性を有する。変異体においては、１ないし１０個の少数のアミノ酸残基、６〜１０個、５個、４、３、２または１個のアミノ酸残基のように小数の残基が異なる。核酸配列の変異体においては、１ないし３０個の少数のヌクレオチド残基、６〜２０個、５個、４、３、２または１個のヌクレオチド残基のように少数の残基が異なる。
【００８７】
「配列相同性」は、変異体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定の連続的な断片を引用配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対してアラインメントして比較する時、変異体配列と引用配列内に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を確認することによって決定する。配列の間の配列アラインメント(ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ) 及び相同性決定方法は、当業界に知られている。 二つの塩基配列の最適のアラインメントに関連して、変異核酸配列の連続的な断片は、引用核酸配列に対して追加の核酸または欠失された核酸を有することができる。同様に、二つのアミノ酸配列の最適のアラインメントのために、変異アミノ酸配列の連続的な断片は、引用アミノ酸配列に対して追加のアミノ酸残基または欠失されたアミノ酸残基を有することができる。引用ヌクレオチド配列または引用アミノ酸配列の比較のために用いられる連続的な断片は、最小２０個の連続的なヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含み、３０、４０、５０、１００またはその以上の核酸またはアミノ酸残基を含むことができる。変異体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列におけるギャップの介在包含に関わる、増加された配列相同性に対する訂正は、ギャップペナルティを指定することによって行われる。
【００８８】
二つの配列間の相同性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、アミノ酸配列の相同性百分率は、１２のギャップ開始ペナルティ及び２のギャップ伸長ペナルティを有するアフィン６ギャップ検索（ａｆｆｉｎｅ  ６  ｇａｐ  ｓｅａｒｃｈ）、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２（ＢＬＯＳＵＭ  ｍａｔｒｉｘ  ６２）を用いるスミス−ウォーターマン相同性検索アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて決定することができる。一方、核酸配列の相同性百分率は、２５のギャップ開始ペナルティ及び５のギャップ伸長ペナルティを用いるスミス−ウォーターマン相同性検索アルゴリズムを用いて決定することができる。このような配列相同性決定法は、例えば、タイムロジッグバージョンＧ（Ｔｉｍｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｇ）からのデサイファハードウェア加速装置（ＤｅＣｙｐｈｅｒ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）を用いて行うことができる。前記スミス−ウォーターマン相同性検索アルゴリズムは、スミス及びウォーターマンにより教示されており、本願で引用した。一方、デフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を用いるアラインメントプログラムＧＣＧギャップ（ＧＣＧ  Ｇａｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）を用いることができる。ＧＣＧギャッププログラムは、ニードルマンーヴィンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用し、３のギャップ開始ペナルティ及び１のギャップ伸長ペナルティを有してヌクレオチド配列アラインメントのために用いることができる。また、二つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好適な他の例としては、カーリン及びアルチュール（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３）によって変形されたカーリン及びアルチュールによるアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。このようなアルゴリズムは、アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）のＮブラスト（ＮＢＬＡＳＴ）及びＸブラスト（ＸＢＬＡＳＴ）プログラムに反映されえた。ブラスト（ＢＬＡＳＴ）ヌクレオチド検索法は、Ｎブラストプログラム、スコア（ｓｃｏｒｅ）＝１００、ワードの長さ（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）＝１２の条件に行われて十分な配列相同性を有するヌクレオチド配列を得ることができる。ブラストタンパク質の検索法は、Ｘブラストプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３の条件で行われて十分な配列相同性を有するアミノ酸を得ることができる。比較の目的でギャップアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るためには、アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に提示されたようにギャップブラスト（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）が用いられることができる。一方、分子間の距離関系（ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）を検索する反復検索（ｉｔｅｒａｔｅｄ  ｓｅａｒｃｈ）を行うためにＰＳＩブラスト（ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ）を用いることができる（前記アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）参照）。ブラスト、ギャップブラスト及びＰＳＩブラストプログラムを用いる場合、各プログラム（例：Ｘブラスト及びＮブラスト）のデフォルトパラメーターが用いられることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。配列比較に用いられる数学的アルゴリズムの他の非限定的な例としては、マイヤーズ及びミラー（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７）のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ）の一部であるアラインプログラム（ＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に反映されている。アミノ酸配列比較のためにアラインプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０分子量残基表（ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップのペナルティ、及び４のギャップのペナルティを用いることができる。また、アミノ酸配列の相同性百分率は、ベクターＮＴＩ（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ，Ｉｎｆｏｒｍａｘ社製，ＵＳＡ）を用いて決定することができる。
【００８９】
当業者は、提供された配列及び一般的にＣＡＥＶに関して当業界に公知のものに基づいて、本発明の所望の核酸を選別することができる。レンチウイルスのライフサイクル、ゲノム構造、発生調節及び関連分子生物学は、去る１０年間の集中的な研究の焦点になって来た。多くのレティバイロスゲノムにおける多くの変異の特定效果が知られている。また、一部ＣＡＥＶ菌株の核酸配列変異が知られている。なお、通常のタンパク質及び核酸の特性に関する通常の知識を有する当業者は、本願の配列リストに開示された核酸及びポリペプチドと類似するか、または同等な活性を有する適切な配列を選択することができる。
【００９０】
最後に、大部分の核酸に対する変形は、所望の特性に対する適合した分析における一連のスクリーニング技術により確認される。例えば、コードされたポリペプチドの免疫学的特性における変形は、適切な免疫学的分析によって検索することができる。相補的な核酸に対する核酸雑種形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、コードされたタンパク質の酸化還元反応または熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、または凝集傾向などのような他の性質に対する変形も基本技術によって全て分析される。
関心のあるポリヌクレオチド
【００９１】
当業者にとって周知の如く、挿入された関心のあるポリペプチドのヌクレオチド配列は、任意のヌクレオチド配列である。例えば、ポリヌクレオチド配列は、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子または選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）遺伝子配列である。本願で用いられたレポーター遺伝子配列は発現時、その存在または活性が感知されることができるタンパク質を生産するようにする任意の遺伝子配列であることができる。適合したレポーター遺伝子の代表的な例としては、ガラクトキナーゼ（ｇａｌａｃｔｏｋｉｎａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ラクタマーゼ（β−ｌａｃｔａｍａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。一方、レポーター遺伝子は、その発現が細胞生理に影響を及ぼす遺伝子産物を生み出す任意の遺伝子配列である。本発明のポリヌクレオチド配列は、既に一つ以上のプロモーター、開始配列、または処理配列を有する一つ以上の遺伝子配列を含むことができる。
【００９２】
選択マーカー遺伝子配列は、その存在によりこれを含む細胞を選択的に増殖させるタンパク質を発現することができる任意の遺伝子配列である。選択マーカー遺伝子の例としては、抗生物質：ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシンなど）に対する宿主耐性を付与するか、またはアミノ酸類似体に対する宿主耐性を付与するか、或いはその他の厳しい（ｉｍｐｅｒｍｉｓｓｉｂｌｅ）培養の条件下で追加の炭素源上でバクテリアの成長を可能にする遺伝子配列が含まれる。
【００９３】
レポーターまたは選択マーカー遺伝子配列は、一般細胞における容易なベクターの認識または選別を可能にする。本発明の一実施態様において、レポーター遺伝子配列は、一般的に哺乳類の細胞は存在しないので、その存在によりこれらの細胞におけるベクターの存在を明確に立証することができる酵素またはその他のタンパク質をコードすることができる。
【００９４】
本発明の転移ベクターは、異種核酸またはポリヌクレオチドをウイルス粒子にさらに結合させるようにすることで、内部に異種核酸を含む感染された宿主細胞の数を増大させるための手段を提供することができる。異種ポリヌクレオチドの結合は、ウイルス粒子内での異種核酸の複製、及び以後の異種タンパク質の生産を促進させる。本願において、異種タンパク質は、タンパク質の全部または一部が宿主細胞により発現されないタンパク質またはその断片と定義される。核酸または遺伝子配列が、遺伝子を細胞内に導入するために用いられたウイルスベクターの野生型内に元より存在しない場合、異種であると称する。本願で用いられた用語である異種核酸配列またはポリヌクレオチド配列は、核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチド配列または異種ポリヌクレオチド配列は、また適切な生物学的活性タンパク質またはポリペプチド、兔疫性または抗原性タンパク質或いはポリペプチド、または治療活性タンパク質或いはポリペプチドのような所望の産物のコード配列を含むことができる。ポリペプチドは、宿主細胞内の内因性タンパク質の欠乏または非存在（ｎｏｎｅｘｉｓｔｅｎｔ）発現を補充することができる。このような遺伝子配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせを含む多様なソースから由来し得る。また、このような遺伝子配列は、自然のイントロンを含むか、または含まないゲノムＤＮＡを含むことができる。さらに、このようなゲノムＤＮＡは、プロモーター配列またはポリアデニル化配列と連結させて取得することができる。本発明の遺伝子配列としては、ｃＤＮＡが好ましい。ゲノムまたはｃＤＮＡは、様々な方法によって得ることができる。ゲノムＤＮＡは、当業界に公知の方法によって適切な細胞から抽出及び分離されることができる。なお、ｍＲＮＡは、細胞から分離されて逆転写または他の方法を通じてｃＤＮＡの製造に用いることができる。一方、ポリヌクレオチド配列は、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）ＲＮＡ配列と同様にＲＮＡ配列と相補的な配列を含むことができ、このようなアンチセンス配列は、個体細胞内に投与されて個体細胞内の相補的なポリヌクレオチドの発現を阻害することができる。
【００９５】
異種遺伝子の発現は、抗体反応を達成させる兔疫性または抗原性タンパク質またはポリペプチドを提供することができる。このように発生された抗体は、動物の血液、血清または腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）のような体液から回収することができる。
【００９６】
また、異種遺伝子は、転写されることができる任意の関心のある核酸であることができる。一般的に外来遺伝子は、ポリペプチドをコードする。望ましくは、前記ポリペプチドは特定の治療効果を有する。前記ポリペプチドは、宿主細胞内の欠乏または非存在な内因性タンパク質の発現を補充することができる。前記ポリペプチドは、宿主細胞にキメラシグナル伝逹受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（アメリカ特許第５，３５９，０４６号参照）のような新たな性質を付与することができる。当業者ならば、本願における開示され、かつ当業界に知られている技術を用いて外来遺伝子の適合性を決定することができる。例えば、当業者は、外来遺伝子がカプシド化に適切な大きさを有するか、または遺伝子産物が適切に発現されるかがわかる。
【００９７】
本発明における用いることができる特定の異種タンパク質は、本発明に必ずしも必要なものではない。    
【００９８】
また、本発明における用いることができる異種タンパク質の具体例としては、ジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂｒｏｗｎ，ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ，１９８７）、凝固因子VIII（Ｗｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＦＴＲ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，１９９１）、オルニチン・トランスカルバミラーゼ（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ；ＯＴＣ）（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、及びα１−アンチトリプシン（α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）（Ｆａｇｅｒｈｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｘ，１９８１）などがある。
【００９９】
多くの異種タンパク質をコーディングする遺伝子が当業界に知られており、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリ（ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）からクローニングされることができる［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，ｓｕｐｒａ］。このような遺伝子の例としては、ジストロフィン遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、凝固因子VIII遺伝子（Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、ＣＦＴＲ遺伝子（Ｒｏｍｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｒｉｏｒｄａｎ，１９８９）、ＯＴＣ遺伝子（Ｈｏｒｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、及びα１−アンチトリプシン遺伝子（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）などがある。
【０１００】
また、動脈硬化症のような血管増殖性疾患の治療のためのＲｂ（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、及び癌（Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｃｌａｙｍａｎ，１９９５）及びＨＩＶ疾患（Ｂｒｉｄｇｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｒｖｅｒ，１９９５）の治療のためのｐ５３のような異種タンパク質をコードする遺伝子を本発明に用いることができる。
【０１０１】
ベクターは、常に機能的な異種遺伝子産物をコードする必要がなく、真核性酵素の阻害物質として作用する部分遺伝子産物もコードすることができる（Ｗａｒｎｅ，Ｖｉｃｉａｎａ，ａｎｄ  Ｄｏｗｎｗａｒｄ，１９９３；Ｗａｎｇ，１９９１）。
【０１０２】
好ましくは、本発明の方法による分子導入によって細胞内遺伝子調節分子の発現を調節することができる。ここで「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」とは、遺伝子が過発現される場合にはその発現を抑制し、低発現される場合にはその発現を増大させることを意味する。細胞増殖性疾患が遺伝子の発現に関連する場合、翻訳レベルにおける遺伝子発現を阻害する拡散配列を用いることができる。例えば、アンチセンス核酸または三重抗原（ｔｒｉｐｌｅｘ  ａｇｅｎｔ）でｍＲＮＡを遮蔽させるか、或いはリボザイムでこれを切断することによって特定ｍＲＮＡの転写または翻訳を遮断するために、アンチセンス核酸、リボザイムまたは三重抗原などを用いることができる。
【０１０３】
アンチセンス核酸は、特定ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。細胞内において、アンチセンス核酸は対応ｍＲＮＡと混成結合して二本鎖分子を形成する。細胞が二本鎖ＲＮＡを翻訳することができないので、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を阻害する。約１５個の核酸またはその以上のアンチセンスオリゴマーが好ましいが、これは容易に合成でき、標的細胞内への導入時に、大きい分子に比べて問題発生の可能性が少ない。遺伝子の生体内翻訳を阻害するアンチセンス方法の使用は、当業界に知られている（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８）。
【０１０４】
アンチセンス核酸は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）における蓄積されるアミロイド前駆体タンパク質のように変異タンパク質または過渡な活性の遺伝子産物の発現を遮断するために用いることができる。また、このような方法は、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、遺伝性パキスン病及びその他疾患の治療に有用である。さらにアンチセンス核酸は、毒性に係わるタンパク質発現の阻害にも有用である。
【０１０５】
オリゴマーが二重らせん（ｄｏｕｂｌｅ−ｈｅｌｉｃａｌ）ＤＮＡの周囲に結合させる三重化方法（ｔｒｉｐｌｅｘ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）として公知の機構によって、オリゴヌクレオチドの転写を遅延させるために用いることができる。したがって、三重化合物は、選択された遺伝子の特定位置を認識するように考案できる（Ｍａｈｅｒ，Ｗｏｌｄ，ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ，１９９１；Ｈｅｌｅｎｅ、１９９１）。
【０１０６】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）と類似する方法で、他の二本鎖ＲＮＡを特異的に切断することができる能力を有するＲＮＡ分子である。このようなＲＮＡをコードする核酸配列の変形を通じてＲＮＡ分子における特定の核酸配列を認識して切断する分子を加工することが可能である（Ｃｅｃｈ，１９８８）。このような方法の主な長所は、特定配列を有するｍＲＮＡのみを不活性化させるということである。
【０１０７】
好ましくは、生物学的反応修飾物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）をコードする核酸を転移させる。例えば、このようなカテゴリーには、１ないし１２の「インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）」に分類される多くのサイトカインをコードする核酸などの免疫強化剤が含まれる。また、前記カテゴリーには、同一機構によって必須的に作用しないが、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、特にγインターフェロン（γ−ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び料粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などが含まれる。先天的酵素欠損または免疫欠如の治療のために、このような核酸を骨髄細胞またはマクロファージに伝達することが好ましい。成長因子、毒性ペプチド、リガンド、受容体またはその他の生理的に重要なタンパク質をコードする核酸も特定の非分裂細胞に導入することができる。
【０１０８】
したがって、本発明の組み換え型ＣＡＥＶベクターシステムは、抗−ＨＩＶ分子としてＨＩＶ感染された細胞（例：Ｔ細胞またはマクロファージ）の治療に用いることができる。また、例えば、嚢胞性線維症の治療のために嚢胞性線維症膜コンダイタンス制御因子（ＣＦＴＲ）に対する遺伝子を有する本発明の組み換え型レンチウイルスで呼吸器上皮細胞を感染させることができる。
【０１０９】
したがって、本発明の組み換え型ＣＡＥＶベクターシステムは、数多くの人間疾病の治療のために用いることができる。ＣＡＥＶベクターシステムが適用可能な人間疾患の代表的な例としては、アルツハイマー病、パキスン病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン疾、ベータサラセミア（ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）、網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、大脳白質萎縮症（ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ＳＣＩＤ）、フェニールケトン尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ）、チロシン血症（ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａ）、Ａ及びＢ型血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）、ウィルソン症（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ヒト免疫不全（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅｓｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ＣＡＥＶベクター粒子
本発明の方法において、感染性及び複製欠損ＣＡＥＶベクター粒子は、当業界における公知の技術と組み合わせた本願に開示された方法によって製造することができる。前記方法には、本発明のベクター発現システムによりレンチウイルス許容細胞をトランスフェクションさせる段階；トランスフェクションされた細胞においてＣＡＥＶ由来粒子を生産する段階；及び前記細胞からウイルス粒子を回収する段階を含む。
【０１１１】
本願で用いられた用語「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、外来ＤＮＡ真核細胞へ導入することを意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランフェクション、エレクトロポレーション顕微注入法、リポソーム融合、リポフェクション及び原形質融合などの当業界における公知の多くの方法を用いて行うことができるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本願で用いられた用語「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」とは、トランスフェクションよりもむしろ感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を手段としてウイルスまたはレトロウイルスベクター粒子を用いる遺伝子伝達を意味する。ある実施態様において、レトロウイルスベクターは形質導入される。これによって「形質導入された遺伝子」は、レンチウイルスまたはベクター感染及びプロウイルスの統合を通じて細胞に導入された遺伝子である。特定の実施態様において、ＣＡＥＶウイルスベクター粒子は「標的細胞」または宿主細胞へ遺伝子を形質導入する。
【０１１３】
また、細胞内における感染性ウイルス粒子の生産を促進させる段階は、基本細胞の培養成長技法と同様に通常的な技術を用いて行うことができる。
【０１１４】
感染されたウイルス粒子を回収する段階は、通常の技術を用いて行うことができる。例えば、公知のように感染性粒子は、細胞培養液の上澄み液から回収することができる。必要であれば、回収されたウイルス粒子を精製することができる。適切な精製技法は、通常の技術者に知られている。
【０１１５】
当業者の必要によってＣＡＥＶ標準溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、本発明のベクター及び方法を用いて製造することができる。ウイルス標準溶液の製造方法は、当業界に知られており、例えば［（Ｓｏｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）及び（Ｌａｎｄａｕ  ａｎｄ Ｌｉｔｔｍａｎ，１９９２）］に記載されている。本発明の標準溶液を生産する方法において、レンチウイルス許容細胞は、本発明のベクターシステムでトランスフェクションされる。その後、前記細胞を適切な細胞培養条件下で培養し、上述した細胞培養液からＣＡＥＶ粒子を回収する。適切な許容細胞株としては、ヒト細胞株２９３、２９３Ｔ、及びＨｅＬａサル細胞株Ｖｅｒｏ、及びヤギ細胞株ＧＳＭ及びＣｈ１Ｅｓなどを含むが、これらに限定されない。また、本発明のベクターは、安定（ｓｔａｂｌｅ）したパッケージ細胞（すなわち、その自体では感染性ウイルス粒子を産出できないが、ＣＡＥＶ構造タンパク質を安定的に発現する細胞）及びウイルス生成細胞（ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；ＶＰＣ）の製造に有用である。レトロウイルスタンパク質を発現するパッケージ細胞を製造する方法は、当業界に知られており、例えば、アメリカ特許第４，６５０，７６４号（Ｔｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）などにそのような方法が実施されており、それはそのまま本願に適用される。本発明の範囲内において、パッケージ細胞は本発明に提示された少なくとも一つのＣＡＥＶパッケージベクターからのＣＡＥＶ核酸を含むレンチウイルス許容宿主細胞を含み、前記核酸配列は、パッケージ信号欠陥であるので、細胞が複製コンピテント感染性ウイルスを生産することはできないが、少なくとも一つ以上のＣＡＥＶ構造タンパク質を生産するようにする。
【０１１６】
パッケージ細胞は、ＣＡＥＶ許容宿主細胞（例：ヒト胎児腎臓２９３または２９３Ｔ細胞）を前記公知方法によって適切なＣＡＥＶ核酸配列でトランスフェクションさせて製造されることができる。したがって、その結果得られたパッケージ細胞は、少なくとも一つのＣＡＥＶ構造タンパク質を発現して生産することができる。しかし、このパッケージ細胞は、依然として組み換え型ＣＡＥＶウイルスを生産することができない。その後パッケージ細胞が他の核酸配列、例えば、関心のある異種遺伝子や適切なパッケージ信号を含む転移ベクターでトランスフェクションさせることができる。一旦、追加の配列または複数の配列でトランスフェクションされると、前記パッケージ細胞は、異種遺伝子を含むＣＡＥＶウイルスストックの提供に用いることができるが、前記ウイルス自体は複製インコンピテントである。その結果、得られたウイルス生成細胞（ＶＰＣ）は、関心のある異種遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生産することができる。
【０１１７】
遺伝子転移及び治療
単一遺伝子における変化による多くのヒト遺伝症は、遺伝子治療の主要候補である。本願で用いられた用語「遺伝子治療」または「遺伝子転移」とは、臨床治療のための細胞内への遺伝子挿入と定義される。遺伝子治療の多くの適用方法、特に、幹細胞の遺伝子挿入による方法が公知され、広範囲に検討されている。生体外または生体内の治療遺伝子転移のための標的細胞としては、造血幹細胞、リンパ球、血管内皮細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、呼吸上皮細胞（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、ケラチン生成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、骨・筋細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ）、肝細胞（ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ  ｃｅｌｌ）及び癌細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
また、本発明の遺伝子転移技術は、ペプチドプロセシングの確認及び多様なタンパク質の機能ドメインの確認に用いることができる。上記プロセシング処理及び細胞内運命(ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ)における細胞特異的差異を研究するために、特定タンパク質のためにクローニングされたｃＤＮＡまたはゲノム配列を生体内または生体外の相異なる標的細胞に導入することができる。強力なプロモーターの調節下にてコード配列を位置付けることにより、相当量の目的タンパク質を生成することができる。また、タンパク質プロセシング、細胞内選別または生物学的活性に関わる特定残基は、コード配列の離れた残基の突然変異変化によって決定することができる。
【０１１９】
また、本発明の遺伝子転移技術は、タンパク質の発現を調節し、その細胞内事象の調節能力を評価する手段に適用できる。分化における役割のようなタンパク質の特定機能は組職培養で研究することができる反面、他の関連特性における変化を観察するためには発達過程における相異なる時期に生体内システムへの再導入が必要である。
【０１２０】
遺伝子転移は、特定遺伝子の発現を調節する核酸配列及び細胞因子を研究するための手段を提供する。このような研究の一例としては、レポーター遺伝子に調節要素を融合させてレポーター遺伝子の発現を分析することができる。
【０１２１】
また、遺伝子転移は、症状に対する理解及び治療の提供に実質的な潜在的利用可能性を有する。欠陥遺伝子が公知であるかクローニングされた多くの遺伝疾患がある。一部の場合、このようなクローニングされた遺伝子の機能は知られている。一般的に、前記病状は二種に分けられる：一般的に劣性遺伝され、通常酵素の欠乏状態と；優性遺伝され、最小限時々調節または構造タンパク質が係わる不均衡状態。欠乏状態疾患の場合、遺伝子転移は、アンチセンス突然変異を用いて前記疾患に対する動物モデルを作り出すだけでなく、代替療法のために発病組職に正常遺伝子を伝達するために用いることができる。不均衡疾患状態の場合、遺伝子転移は、モデルシステムにおける病状を作り出すために用いることができ、このモデルシステムは、病状を好転させるための研究に用いることができる。本願で用いられたように、病状は、疾患を起こして徐々に悪化する欠乏や不均衡を部分的にまたは全体的に処理することによって治癒される。変異を起こすか、または欠陥を治療する核酸配列の部位特異的統合も用いることができる。
【０１２２】
本発明の方法は、神経細胞、グリア細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）または間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、または本発明の組み換え型レンチウイルスで感染された細胞の生体外移植、中枢神経系または心室腔（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃａｖｉｔｉｅｓ）への感染、または宿主脳表面の硬膜下（ｓｕｂｄｕｒａｌ）感染に関わる「グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」に有用である。このようなグラフティング方法は、通常の技術者に知られており、文献［Ｎｅｕｒａｌ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＣＮＳ，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ＆Ｓｔｅｎｅｖｉ，ｅｄｓ．（１９８５）］に開示されている。
【０１２３】
タンパク質産物の欠乏による疾病の場合、遺伝子転移はアンチセンス変異を用いて疾病に対する動物モデルを作り出すだけでなく、代替療法のために患部組職に正常遺伝子を導入するに用いることができる。例えば、筋肉、脾臓または肝細胞の感染のために因子VIIIまたはIXコーディング核酸をＣＡＥＶ粒子内に導入させることができる。
【０１２４】
遺伝子治療、特に幹細胞遺伝子の挿入を通じた遺伝子治療の多数の適用方法が知られており、広範囲に検討されている。本願で用いられた用語「幹細胞」としては、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉（特に、筋肉の）幹細胞、及び肝臓幹細胞などを含むが、これらに限定されない。幹細胞は生体内組織を再増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）することができる。造血幹細胞は、発達初期のヒト造血細胞由来の前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）である。
【０１２５】
また、造血幹細胞を用いた遺伝子治療は、一般的に欠陥タンパク質の生産または遺伝子発現の非正常レベルを引き起こすリンパ球様細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ）または骨髄性細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ）における遺伝子非正常の治療に有用である。
このような多くの疾患において、欠陥遺伝子の正常複写体（ｃｏｐｙ）または機能的相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）の導入、及び少量でも消失遺伝子（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ）の生産は有益な效果をもたらす。同時に、遺伝子産物の過発現は、有害な效果をもたらすと予想されない。造血幹細胞への遺伝子転移が潜在的に有用な疾患の非包括的な例は次の通りである。このような疾患には、一般的に骨髓疾患、赤血球系細胞欠陥、代謝性疾患などが含まれる。造血幹細胞の遺伝子治療は、グロビン遺伝子または凝固因子遺伝子（例：因子IX及び因子Ｘ遺伝子）に欠陥があるα−及びβ−サラセミア、鎌状赤血球貧血（ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ）及びＡ型及びＢ型血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）のような血液細胞の遺伝子疾患治療に有益である。他の望ましい例としては、Ｔ及びＢリンパ細胞に毒性のある特定副産物を取り除くように支援するアデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＤＡ）酵素が欠けて患者が感染に対して無防備状態となる重症複合型免疫不全症（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＣＩＤＳ）の治療がある。このような患者は、過去に行われた患者のリンパ細胞の代わりに、ＡＤＡ遺伝子をその造血幹細胞に導入する遺伝子治療を受けるための理想的な候補である。他の疾病としては、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）が欠陥シトクロム ｂ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ）を発現する慢性肉芽腫症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）及びマクロファージの非正常グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子生産によるゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）などがある。
【０１２６】
また、パキスン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）などの神経退行性疾患は、ＧＤＮＦ（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）遺伝子を線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）及び黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ）に導入させる遺伝子治療の魅力的な目標である（Ｋｏｒｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１２７】
癌の多様な形態を治療する方法も遺伝子治療に含まれる。ＣＡＥＶベクターは、例えば、毒素（ｔｏｘｉｎ）または癌細胞を特異的に死滅させるアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導物質をコードする遺伝子を含むことができる。腫瘍特異的な殺細胞は、腫瘍細胞のみが自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ）を発現するという条件下にて癌性造血細胞に自殺遺伝子を導入することで行うことができる。自殺遺伝子産物は、一般的に非毒性薬剤を毒性誘導体に転換させて細胞に致死感受性を付与する。例えば、酵素シトシンデアミナーゼは、非毒性物質５’−フルオロシトシンを毒性誘導体である５−フルオロウラシルに転換させる（Ｍｕｌｌｅｎ，Ｋｉｌｓｔｒｕｐ，ａｎｄ  Ｂｌａｅｓｅ，１９９２）。例えば、腫瘍特異的リンパ球細胞は、抗腫瘍活性を有する遺伝子産物を腫瘍部位に部位特異的に伝達し、このような遺伝子産物の全身伝達になる毒性を避けるように遺伝学的に変形できる。また、遺伝子治療のアプローチは、化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）の毒性效果に対して耐性である骨髓細胞に適用可能である。
【０１２８】
遺伝子治療は、ＨＩＶ及びＨＴＬＶ−１感染のようなウイルス感染の予防または治療に有用である。例えば、造血幹細胞は、ＨＩＶ感染に対して耐性を付与するように遺伝学的に変形できる。一つのアプローチとしては、特別にアンチセンスＲＮＡを用いるか、または存在するウイルスの制御経路を破壊することでウイルス遺伝子発現を阻害することである。レトロウイルスＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡは、ＨＩＶ（Ｒｈｏｄｅｓ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，１９９１）及びＨＴＬＶ−１（ｖｏｎ  Ｒｕｄｅｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｏａ，１９８９）を含む多くのレトロウイルスの複製を阻害すると報告されている（Ｔｏ，Ｂｏｏｔｈ，ａｎｄ  Ｎｅｉｍａｎ，１９８６）。
【０１２９】
造血幹細胞における遺伝子治療が有用な他の領域としては、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）の緩和が挙げられる。治療遺伝子は、例えば、自己反応性（ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ）細胞の自滅及び除去を引き起こす正常細胞のアポトーシス信号を再構成することができるＢまたはＴ細胞信号分子をコードすることができる。
【０１３０】
診断及び研究、そして遺伝子治療のための生体外細胞形質転換（例：胞形質転換された細胞の宿主細胞への再融合を通じた）が通常の技術者に知られている。本発明の一実施態様において、対象有機体の細胞が分離され、関心のあるポリペプチドを含む本発明のベクターでトランスフェクションさせてから対象有機体（例：患者）に再び再融合される。
【０１３１】
生体外形質転換に好適な多様な細胞型が通常の技術者に知られている。特に、好ましい細胞は、上述された幹細胞（例：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，及びここに引用された患者から細胞を分離して培養する方法に関する論議参照）である。形質転換された細胞は、当業界に公知の方法（Ｋｕｃｈｌｅｒ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｋｕｃｈｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．，及び  Ａｔｌａｓ（１９９３）ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（Ｐａｒｋｓ  ｅｄ）ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ．参照）によって培養される。哺乳類細胞系は、時々細胞単一層からなるが、哺乳類細胞サスペンション（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を用いることができる。一方、哺乳類細胞株の好ましい例としては、ＨＥＣ−１−Ｂ細胞株、ＶＥＲＯ及びＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ；ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８，ＢＨＫ，Ｃｏｓ−７またはＭＤＣＫ細胞株（例：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｓｕｐｒａ参照）などが含まれる。
【０１３２】
また、Ｔ細胞またはＢ細胞は、一部の生体外遺伝子転移工程で用いることができる。Ｔ及びＢ細胞を分離するための多くの技法が知られている。表面マーカーの発現は、このような細胞の分離及び精製を容易にする。
【０１３３】
要約すれば、本発明のウイルスベクターは、分裂または非分裂細胞を安定的に形質導入させ、異種遺伝子を安定的に発現させるに用いることができる。このようなベクター系を用いると、前記細胞の生理作用に影響を及ぼすタンパク質をコードする分裂または非分列細胞への遺伝子を導入することが可能である。したがって、本発明のベクターは、疾病または細胞生理作用の実験的変形のための遺伝子治療に有用であり得る。
【０１３４】
キット（Ｋｉｔ）
本発明の他の目的は、本願の方法を用いるためのベクターを含むキットまたは薬剤送達システムを提供することである。全ての標的レトロウイルス粒子の投与に要求される必須物質及び試薬は、キットに含まれる（例：パッケージ細胞構造物または細胞株）。キットの構成成分は、多様な製剤として提供される。一つ以上のＣＡＥＶ粒子は、一つ以上の薬剤（例：化学治療剤）とともに、単一の薬学的に許容可能な組成物または分離された薬学的に許容可能な組成物に製剤化できる。
【０１３５】
また、このようなキットまたは薬剤送達システムの構成要素は、乾燥または凍結乾燥された形態で提供することができる。試薬または構成要素が乾燥形態で提供された場合、一般的に、他の輸送手段で供給される適切な溶媒の添加により再構成される。さらに、本発明のキットは、標的ＣＡＥＶ粒子に対する服用及び／または投与情報に関連された指示書を含む。なお、本発明のキットまたは薬剤伝達システムは、所望のバイアル（ｖｉａｌ）に維持されるが、一般的に注射または中空成型された（ｂｌｏｗ−ｍｏｌｄｅｄ）プラスチック容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）のような市販用密集バイアルなどが用いられる。前記容器の数及び形態に関系なく、キットは最終構造体組成物の対象体内注射／投与または位置移動を助けるための器具を含むか、またはこれによりパッケージすることができる。このような器具は、塗布器（ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ）、吸入器、シリンジ（ｓｙｒｉｎｇｅ）、ピペット（ｐｉｐｅｔｔｅ）、鉗子（ｆｏｒｃｅｐ）、計量スプーン（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｓｐｏｏｎ）、眼球点滴器（ｅｙｅｄｒｏｐｐｅｒ）またはこのような任意の医学的に承認された伝達手段である。
【０１３６】
以下の実施例は、本発明を多様な側面から説明するが、本発明の方法を限定するものではない。
【実施例】
【０１３７】
下記の実施例は、本発明の特定の実施態様及び側面を提示しており、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１３８】
下記実施例は、本発明の組み換え型ＣＡＥＶ系レンチウイルスベクターシステムが公知のＨＩＶ系レンチウイルスシステムと同様に発現において、效果的であるという発見を立証する。前記実施例は、本発明のＣＡＥＶ系ベクター粒子生産システムのゲノムＲＮＡ転写、カプシド化、翻訳、逆転写、及び統合レベルが、長期間にわたって非常に效果的な遺伝子転移システムとして認められているＨＩＶ−１系レンチウイルスベクターシステム（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）に匹敵することを示している。
これは少なくとも三つのプラスミド共トランスフェクション方法に基づいて、ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、及び選択的にｒｅｖ遺伝子の発現を要求する、高力価のＣＡＥＶ系ベクターシステムの構造に対する第一番目の報告である。
【０１３９】
物質及び方法
プラスミド構造
母体プラスミド（ｐａｒｅｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）。
本発明のＣＡＥＶベクターから由来された母体プラスミドは、マリスザン博士（Ｄｒ．Ｍａｒｉｅ  Ｓｕｚａｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｎｔｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌｅ  ＩＮＳＥＲＭ，フランス）により提供されたプラスミドｐＷＴＥ−ＢＭ及びｐＣＡＥＶ−ＬＴＲである。ｐＷＴＥ−ＢＭプラスミドは、ｅｎｖ，ｒｅｖ及びＵ３ 領域を含む０．４  ｋｂ  Ｈｉｎｄ  III断片及び１３３７塩基対のスタッファー断片(ｓｔｕｆｆｅｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ)を除いて全長誘電体 ＣＡＥＶ  ｃＤＮＡを含む。プラスミドｐＣＡＥＶ−ＬＴＲは、ｐＷＴＥ−ＢＭから除外された０．４  ｋｂ  Ｈｉｎｄ III 断片を含む(Ｓａｌｔａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，1９９０；  Ｓａｌｔａｒｅｌｌｉ，１９９３)。 これらのベクターはいずれも野生型ウイルスを生産することができない。
【０１４０】
ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター（ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）及びｐＭＧＰ／ＲＥＶ／ＲＲＥ）。
ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）プラスミドは、ＰＷＴＥ−ＢＭ由来のｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドである（図２Ａに示されている）。ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）プラスミドは、ＭＣＭＶ主前初期プロモーター（ＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ），ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、及びｒｅｖ反応配列（ＲＲＥ）を含む。また、ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）プラスミドは、抗生物質選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子をコードする。前記プラスミド構造において、ｐＷＴＥ−ＢＭから派生されたｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子断片（ＣＡＥＶゲノムの５１２ないし５０４６番目ヌクレオチド）は、いくつかのＰＣＲ及びサブクローニング段階用標準プロトコールを用いてｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）クローニングベクターでサブクローニングされた。ＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ断片は、プラスミドｐＭＹＫ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）から切断されてｇａｇ遺伝子の上流に挿入され、ＲＲＥ領域（ＣＡＥＶゲノムの７８２４ないし８１８３番目ヌクレオチドまたは７８４９ないし８１５０番目ヌクレオチド）は、ｐｏｌ遺伝子の下流に挿入された。ｐＭＧＰ／ＲＥＶ／ＲＲＥは、ＣＡＥＶ  ｒｅｖ遺伝子を含む他のｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドである（図２ｂに示されている）。また、ＣＡＥＶの主スプライスドナー部位（ＣＡＥＶゲノムの３３０ないし３４６番目ヌクレオチド）がＭＣＭＶプロモーターの下流に挿入された。
【０１４１】
転移ベクター（ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄシリーズ）。
ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄシリーズに属するプラスミド（図３Ａ−３Ｈに示されている）（配列番号：６７−７１、７３、７８、及び７９）は、本発明の転移ベクター設計のための最適のパッケージ配列を確認するために作製された。前記シリーズ内の各プラスミドは、相異なる長さの５’非翻訳領域及び ｇａｇ−コーディング領域の開始部分を含むように設計されて、このような領域における多様な長さの效果を並んで比較し得るようにした。 特に安全性の問題を処理するために、このようなプラスミドは、 ３’ＬＴＲが欠失されたＵ３領域を有する ＳＩＮ(ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ) ベクターで設計された。トランス作用因子であるｔａｔがない転移ベクターからベクター ＲＮＡが高レベルで発現されるように、５’ＬＴＲのＵ３領域をＨＣＭＶ  ＭＩＥＰに置換した。また、ポリアデニル化、ＲＮＡ輸送、逆転写、及び統合に要求される全ての公知のシス作用配列要素が前記転移ベクターシリーズに含まれた。
【０１４２】
ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄシリーズのプラスミド（配列番号：６７−７１、７３、７８、７９）は、次のような方法で作製された。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ（ＰＢＳ不足のネガティブコントロールベクター）（配列番号：７３）（図３Ａ）は、ただ５’ＬＴＲ内の５’非翻訳配列(Ｒ 及びＵ５領域)(ＣＡＥＶゲノムの１ないし１６３番目ヌクレオチド)のみを含むように設計された。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ０（配列番号：６７）（図３Ｃ）は全ての５’非翻訳領域（ＣＡＥＶゲノムの１ないし５１１番目ヌクレオチド）を含むように設計された。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）（図３Ｃ）は、全ての５’非翻訳領域及び点突然変異を有するｇａｇ遺伝子の３２７ｂｐ断片（ＣＡＥＶゲノムの１ないし８３９番目ヌクレオチド）を含むように設計された。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ２（配列番号：６９）（図３ｄ）は全ての５’非翻訳領域及び点突然変異を有するｇａｇ遺伝子の６１２ｂｐ断片（ＣＡＥＶゲノムの１ないし１１２４番目ヌクレオチド）を含むように設計された。プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ３（配列番号：７０）（図３Ｅ）は全ての５’非翻訳領域及び点突然変異を有するｇａｇ遺伝子の９０８ｂｐ断片（ＣＡＥＶゲノムの１ないし１４２０番目ヌクレオチド）を含むように設計された。プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ４（配列番号：７１）（図３Ｆ）は、５’非翻訳領域全部及び点突然変異を有するｇａｇ  遺伝子の１，１９８ｂｐ断片（ＣＡＥＶ誘電体の１ないし１７１０番目ヌクレオチド）を含むように設計された。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１／ｈｌａｃＺ（配列番号：７８）（図  ３Ｇ）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ及びｌａｃＺ遺伝子からなる発現カセットをｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）内に挿入させて作製された。プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ６０／ｈｌａｃＺ（配列番号：７８）（図３Ｈ）は、点突然変異を有するｇａｇ遺伝子の最初の６０ｂｐ断片を含むｇａｇ遺伝子の長さ（ＣＡＥＶの１ないし５６９番目ヌクレオチド）を除いてはｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）と同一の設計を有する。
ＣＡＥＶ  ｖｉｆ発現ベクター（ｐＨＹＫ／ｖｉｆ）（配列番号：７６）。
迅速でかつ效率的なウイルス複製のために要求されることと知られたｖｉｆ遺伝子（ＣＡＥＶゲノムの５００６ないし５６９５番目ヌクレオチド）は、真核細胞発現ベクターｐＨＹＫ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（図４）にクローニングされた。
【０１４３】
ＣＡＥＶ  ｒｅｖ発現ベクター（ｐＨＹＫ／ｒｅｖ）（配列番号：７５）。
ＲＲＥとの相互作用でウイルス遺伝子発現を、転写後レベルに調節するｒｅｖ遺伝子は、二つのエクソン（第１エクソンは、ＣＡＥＶゲノムの６，０１２ないし６，１２３番目ヌクレオチドに位置し、そして第２エクソンは、ＣＡＥＶゲノムの８５１４ないし８８０３番目ヌクレオチドに位置する）からなる。Ｒｅｖ／ＲＲＥシステムは、非スプライスされたＲＮＡの核外輪送を促進し、レンチウイルス複製に必須的であると知られている。ｒｅｖ遺伝子の全長ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲにより合成され、ｐＨＹＫベクターにサブクローニングされた（図５）。
【０１４４】
ウイルスエンベロープ遺伝子発現ベクター。
本願で用いられたエンベロープ遺伝子発現ベクターシステムは、プラスミドｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）及びプラスミドｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２）（図６Ａ及び６Ｂ）である。プラスミドｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）は、水疱性口内炎ウイルス−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）糖タンパク質を発現するように設計され、プロモーターとしてβ−グロビンイントロンを有するＨＣＭＶＭＩＥＰを含む。ｐＭＹＫＥＦ−１／ｅｎｖ（配列番号：７２）は、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）エンベロープタンパク質を発現するように考案され、プロモーターとして真核細胞伸長因子−１αを有するＭＣＭＶ  ＭＩＥＰを含む。
【０１４５】
ＭｕＬＶ−及びＨＩＶ−１−系プラスミド。
対照群ベクターシステムとして、ｐＭＦＧ／ｌａｃ／Ｚｐｕｒｏ及びｐＨＲ／ｌａｃＺベクターが本発明に用いられ、これらはそれぞれマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及び１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）由来のｌａｃＺ−含有レトロウイルスベクターである。ＭｕＬＶ及びＨＩＶ−１ベクターシステムのパッケージプラスミドとしては、ｐＥＱＰＡＭ３（Ｐｅｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）及びｐＣＭＶΔＲ８−２がそれぞれ用いられた。ＨＩＶ−１パッケージプラスミドｐＣＭＶΔＲ８−２は、ＨＩＶ−１ｖｐｕ遺伝子をコードし、ｅｎｖ遺伝子において、１．３−ｋｂ  ＢｇｌＩＩ断片が欠失されたことを除き、ｐＣＭＶΔＲ９（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）と同一である。
ベクター粒子生産
偽型ＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子は、トランスフェクションの一日前に６ウェル培養皿（ｄｉｓｈ）当り５×１０！５細胞濃度で分株された２９３Ｔ細胞に、三つ以上のプラスミドのリポソーム媒介一時的形質転換を行って生産した。三つのプラスミド共トランスフェクションはｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、転移ベクタープラスミド、及びｅｎｖ−コードプラスミドの１：１：１モル比で行った。四つのプラスミド共トランスフェクションは、ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、転移ベクタープラスミド、ｅｎｖ−コードプラスミド、及びｒｅｖ−発現プラスミドの３：３：３：１モル比で行った。五つのプラスミド共トランスフェクションは、ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、転移ベクタープラスミド、ｅｎｖ−コーディングプラスミド、ｒｅｖ−発現プラスミド及びｖｉｆ−発現プラスミドの３：３：３：１：１モル比で行った。ウイルスベクター粒子を含む培養上澄液は４８時間後に回収され、０．４５μＭ薄膜フィルターで濾過した後（Ｎａｌｇｅｎｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）、すぐ用いるか、または−７０℃のディープフリーザー（ｄｅｅｐ−ｆｒｅｅｚｅｒ）に保管した。
【０１４６】
生体内形質導入
形質導入は、ウイルスベクター粒子を８μｇ／ｍｌポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）存在下に２９３Ｔ細胞に４時間加えた後、新鮮な培地を添加して行った。４８時間後、前記細胞を１％ホルムアルデヒド及び０．２％グルタルアルデヒドからなる溶液で固定させ、３００μｇの５−ブロモ−４−クルロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）、４ｍＭフェロシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ）、４ｍＭフェロシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ）及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ￥２を含む溶液で３７℃で１２時間染色した後、ベータ−ｇａｌ発現（Ｂｅｔａ−Ｇａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を分析した。力価は、ｍｌ当りＬａｃＺ形成単位（ＬａｃＺ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）（ＬＦＵ／ｍｌ）として青色焦点（ｆｏｃｕｓ）の数を測定して決定することができる。
ＲＴ−ＰＣＲ分析
培養された細胞または細胞上澄液からトリゾール試薬（ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる方法によって全てのＲＮＡを抽出した。前記全てのＲＮＡは、ＲＮＡ分解酵素のないＤＮＡ分解酵素Ｉ（ＲＮａｓｅｆｒｅｅ−ＤＮａｓｅ  Ｉ，１ｕｎｉｔ／ｍｇのＤＮＡを３７℃で２０分間処理、Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）で処理してＤＮＡ汚染物を取り除いた。ＤＮＡ分解酵素Ｉの反応は、前記ＤＮＡ分解酵素とともに提供されるＲＱ１  ＤＮＡ分解酵素停止液（ＲＱ１  ＤＮａｓｅ  ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えて中止させ、ＲＮＡは、アルエヌイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる方法を通じて精製された。精製されたＲＮＡを逆転写（ＲＴ）反応（３７℃で９０分）を通じてｃＤＮＡに逆転写した。具体的に、ＲＴ反応はＭｕＬＶ逆転写酵素、オリゴ−ｄＴプライマーまたはＣ−末端特異的プライマー、及びｄＮＴＰｓ混合物存在下に行われた。ＰＣＲ増幅は、鋳型ＤＮＡの半定量分析（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のために特異的プライマーを有して行われた。具体的に、ＰＣＲ産物ＤＮＡは、熱安定性Ｅｘ  Ｔａｑポリメラゼー、配列特異的ＤＮＡプライマー、及びｄＮＴＰｓ混合物存在下にｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡから合成された。
【０１４７】
サザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）
ゲノムＤＮＡは、偽型ＨＩＶ−１またはＣＡＥＶベクター粒子のいずれか一つの形質導入された細胞、及び非形質導入された対照細胞（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ）からディーエヌイージー組職キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて製造された。ＨＩＶ−１ベクター形質導入された細胞からのゲノムＤＮＡ１０μｇをＢａｍＨ  Ｉ及びＫｐｎ  Ｉで消化した。ＣＡＥＶベクター形質導入された細胞からゲノムＤＮＡ各１０μｇをＥｃｏＲ  Ｉ及びＳｓｐ  Ｉでダブル消化した。消化されたゲノムＤＮＡは０．７％アガロースゲル電気泳動によって分離し、陽イオンに電荷されたナイルロ膜（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転移させた。Ｄｉｇ標識付きのプローブをｌａｃＺ遺伝子特異的なプライマー（フォワードプライマー：ＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号：６５）、リバースプライマー：ＡＡＣＴＣＧＣＣＧＣＡＣＡＴＣＴＧＡＡＣ（配列番号：６６））を用いたＰＣＲによって製造し、サザンハイブリッド化は、Ｄｉｇ適用マニュアル（Ｄｉｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｍａｎｕａｌ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行われた。
【０１４８】
細胞の成長停上（Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｒｅｓｔ）及び成長を止まった細胞のＦＡＣＳ分析
２９３Ｔ細胞をアフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）処理（２５ｕｇ／ｍｌ）で成長を停止させ、その後ＣＡＥＶウイルスベクター粒子で形質導入させた。陽性対照群または陰性対照群として、細胞をＨＩＶ−１ベクターまたはＭｕＬＶ  レトロウイルスベクターのいずれか一方に並んで形質導入させた。形質導入後２日後に細胞をベータ−ｇａｌ分析のためのＸ−ｇａｌで染色させた。アフィジコリン処理された細胞におけるアフィジコリンは、感染前または感染後に存在した。
【０１４９】
細胞の成長停止をＦＡＣＳ分析によって確認した。アフィジコリン処理されたまたは処理されない対照群細胞をＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールで−２０℃で一晩中固定させ、ヨウ化プロピジウム（１００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及びＲＮＡｓｅ  Ａ（１００μｇ／ｍｌ）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で室温で１時間処理した。細胞をＦＡＣＳで分析し、細胞周期のＧ１，Ｓ及びＧ２／Ｍ段階における全ての生きている細胞の百分率を算出した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎｊｏｓｅ，ＣＡ）。
【０１５０】
実施例１
ＣＡＥＶ系レンチウイルスベクター粒子の生産
複製欠損レンチウイルス粒子は、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ＣＡＥＶ  ｅｎｖ−発現プラスミド及び転移ベクタープラスミドの最小３−プラスミドシステムを利用したヒト２９３Ｔ細胞の一時的共トランスフェクションによって生産した。４−プラスミドシステムでは、ＣＡＥＶ  ｒｅｖ発現プラスミドが追加され、５−プラスミドシステムでは、ＣＡＥＶ  ＶＩＦ発現プラスミドが追加される。效率的なパッケージのために転移ベクターは、ｇａｇタンパク質の発現を予防するために開始ＡＴＧコドン及び下流に位置したＡＴＧコドンにおける変異（ＡＴＧからＴＡＧに）が導入された、ｇａｇ−コード配列の開始部分を含むように考案された。ＲＲＥはパッケージ效率を増大させるために含まれ、４−及び５−プラスミドシステムにおけるｒｅｖは、ＣＡＥＶ  ｍＲＮＡの排出のためにベクターから発現された。転移ベクタープラスミドにおける内部ＨＣＭＶ−ＭＩＥＰプロモーターとして作動するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、レポーター遺伝子として挿入された。５’ＬＴＲのＵ３領域は強力なウイルスプロモーターであるＨＣＭＶ−ＭＩＥＰで代替されてベクターゲノムがｔａｔ独立的になるようにした。
【０１５１】
転移ベクターＲＮＡ転写レベル。
転移ベクターからのゲノムＲＮＡの転写レベルは、パッケージ細胞からの組み換え型ウイルスベクターの高い力価の生産に媒介する重要な要素中の一つである。本発明において、ＨＣＭＶエンヘンサ／プロモーター要素は、転移ベクターＲＮＡの安全でかつ效率的な転写のためのＨＣＭＶ／ＣＡＥＶハイブリッドＬＴＲプロモーターシステムの製作に用いられた。ハイブリッドＬＴＲプロモーターを含むｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ（配列番号：６７−７１、７３、７８、及び７９）シリーズの転移ベクタープラスミドの転写レベルを試験すために、各転移ベクタープラスミドをパッケージプラスミド（ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）、ｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）、ｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６）、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）またはｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２））とともに、リポソーム媒介トランスフェクションによってヒトＴ細胞に導入させた。４８時間培養後、トランスフェクションされた細胞から全てのＲＮＡを精製し、ベクターＲＮＡ転写物を測定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を行った。ＣＡＥＶ転移ベクターに対するＰＣＲプライマーセット（ＲＲＥ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ）は、ＲＲＥ領域部分をコーディングする３４８−ｂｐ  ＰＣＲ産物を合成するように設計された。ＨＩＶ−１転移ベクターであるｐＨＲｌａｃＺ（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）に対する他のＰＣＲプライマーセット（ｌａｃＺ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ）は、ｌａｃＺ遺伝子をコードする６４５ｂｐ  ＰＣＲ産物を合成するように設計された。図７に示したように、本発明のＣＡＥＶ転移ベクターは、ＨＩＶ−１系レンチウイルス転移ベクターと匹敵するべきレベルのＲＮＡ転写物を生産した。
【０１５２】
ベクター粒子の形成及び放出。
成熟及び感染性ウイルスベクター粒子の形成及び放出を試験するため、ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）ｅｎｖ発現プラスミド、ｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）ｒｅｖ発現プラスミド、ｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６）ｖｉｆ発現プラスミド、及びｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ６０／ｈｌａｃＺ（配列番号：７８）転移ベクタープラスミドをヒト２９３Ｔ細胞（ＤｕＢｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）でリポソーム媒介共トランスフェクションさせてＣＡＥＶベクター粒子を生産した。トランスフェクションの後４８時間に培養上澄液をトランスフェクションされた細胞から回収し、感染のために８ｕｇ／ｍｌポリブレン存在下に新鮮なヒト２９３Ｔ細胞に適用させた。その結果は、本発明の５個のプラスミドシステムがＭｕＬＶ系レンチウイルスベクターシステム（ｐＥＱＰＡＭ３，ｐＭＦＧ／ｌａｃＺ／ｐｕｒｏ，ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４））（Ｏｒｙ，Ｎｅｕｇｅｂｏｒｅｎ，ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９６；Ｐｅｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）と匹敵するべきウイルスベクター粒子力価を生産することができることを示している（図８に提示）。
【０１５３】
実施例２
ベクター粒子生産に対するＲｅｖ及びＶｉｆ発現效果
ベクター粒子の生産に対するＣＡＥＶ  ｒｅｖ及びｖｉｆ調節遺伝子発現の效果を決定するために、（１）ｒｅｖ−及びｖｉｆ−コード配列を有しない、３−プラスミドシステム（ｐＣＡＨ／ＳＩＮ，ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）またはｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２））、（２）ｖｉｆ−コード配列を有しない、４−プラスミドシステム（ｐＣＡＨ／ＳＩＮ，ｐＭＧＰ／ＲＲ（配列番号：７７）、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）またはｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２）、ｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５））、及び（３）ｒｅｖ−及びｖｉｆ−コード配列を全て含む、５−プラスミドシステム（ｐＣＡＨ／ＳＩＮ，ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）またはｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２）、ｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）、ｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６））のベクター粒子生産システムをベクター粒子生産におけるその效率性に対して並んで試験した。各システムのプラスミドを２９３Ｔ細胞でトランスフェクションさせた。トランスフェクション後２日に、転移ベクターＲＮＡ及びビリオンＲＮＡをトランスフェクションされた細胞及びトランスフェクションされた細胞の培地からそれぞれ抽出し、転移ベクターＲＮＡゲノムを検出するためにｌａｃＺプライマーセットとともにＲＴ−ＰＣＲ鋳型として用いた。
【０１５４】
図９に示したように、パッケージ細胞における転移ベクターＲＮＡの発現レベルは、ｒｅｖまたはｖｉｆ遺伝子の発現に独立的であるが、（図９におけるレイン１、２及び３）、ｒｅｖの不在下でカプシド化された転移ベクターＲＮＡの量（図９のレイン４）は、ｒｅｖ存在下での量（図９のレイン５）よりもはるかに低い。しかし、意外にもｖｉｆ存在下でカプシド化されたＲＮＡをもってＲＴ−ＰＣＲで測定されたベクター粒子の力価（図９のレイン６）は、ＣＡＥＶ  ｖｉｆがないときの量（図９のレイン５）よりも低かった。このような結果は、ベクター粒子生産のためにＣＡＥＶ  ｒｅｖ及びｖｉｆが求められていないが、ｒｅｖは效率的なベクター粒子生産のために望ましいということを示す。
ｖｉｆ発現に関連された本発明の結果は、ｖｉｆ遺伝子がヤギ滑膜細胞でＣＡＥＶの效率的複製のために必須的であり、ウイルス複製周期の末期（例：ＲＮＡカプシド化、宿主細胞からウイルス粒子放出）に影響を及ぼすという、ハルマスェら（Ｈａｒｍａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈａｒｍａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）によって報告された結果と一致しない。前記不一致に対するもっともらしい説明としては、組み換え型ＣＡＥＶベクター粒子の産生においてヤギ細胞の代わりにヒト２９３Ｔ細胞を用いたからである。このような解釈は、ｖｉｆ及びウイルス生産細胞がウイルス感染性に対するｖｉｆ作用を調節することができるというセロドらによって提示された仮説（Ｓｅｒｏｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）により裏付けられる。
【０１５５】
実施例３
最適のパッケージ信号配列の確認
ＣＡＥＶ転移ベクターＲＮＡのカプシド化のための最適のパッケージ信号配列を確認するため、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−コーディング領域の相異なる部分及び５’ＬＴＲとｇａｇ開始コドンとの間の非翻訳領域を含むシリーズプラスミドを、次のような方法でこのベクター粒子生産效率性に対して比較した。ヒト２９３Ｔ細胞をｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）ｅｎｖ発現プラスミド、ｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）ｒｅｖ発現プラスミド、ｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６）ｖｉｆ発現プラスミド、及びｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ（配列番号：６７−７１、７３、７８、及び７９）転移ベクターシリーズプラスミドで共トランスフェクションさせた。陰性対照群として、ＣＡＥＶ転移ベクターｐＣＡＭ／ｌａｃＺ（Ｌ）をパッケージプラスミド無しにトランスフェクションさせた。トランスフェクションしてから２日後に、ビリオンＲＮＡをトランスフェクションされた細胞の培養液から抽出してＣＡＥＶ転移ベクターシリーズＲＮＡゲノムを検出するためのＲＲＥプライマーセットまたはＨＩＶ−１転移ベクターＲＮＡゲノムを検出するためのｌａｃＺプライマーセットとともにＲＴ−ＰＣＲ鋳型として用いた。図１０に示したように、ｇａｇ領域の最初の３２７ｂｐのみならず、全長５’ＬＴＲを含むｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）でトランスフェクションされたウイルス生産２９３Ｔ細胞から回収された培養液からウイルスＲＮＡを含むウイルス粒子の效率的な放出を示す強力なＰＣＲ産物信号が得られた（図１０のレイン３）。このような信号は、陽性対照群であるＨＩＶ−１ベクターを用いて得られたもの匹敵するべきものであるので、本発明のカプシド化されたＣＡＥＶ転移ベクターＲＮＡの量がＨＩＶ−１系転移ベクター（図１０のレイン８）にも匹敵することを意味する。ｇａｇ−コーディング領域の最初の６１２ｂｐまたはそれ以上を有するＣＡＥＶ転移ベクターのパッケージ效率は顕著に低減された（レイン４、５及び６）。転移ベクターがｇａｇ−コード配列が無しに用いられた時、ＰＣＲ産物信号が検出されなかった（図１０のレイン１及び２）。陰性対照群は転移ベクターのみでトランスフェクションされ、陽性対照群であるＨＩＶ−１ベクターは、ｐＣＭＶΔＲ８−２、ｐＨＲ／ｌａｃＺ及びｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）とともにトランスフェクションされた（図１０のレイン７及び８）。
【０１５６】
つまり、転移ベクターが５’ＬＴＲとｇａｇ開始コドンとの間の全ての非翻訳領域のみならず、Ｎ−末端ｇａｇ−コード配列の約６００ｂｐ未満を含む場合、転移ベクターＲＮＡは、パッケージ細胞内で效率良くカプシド化された。このような結果は、パッケージ配列内のＲＮＡの２次構造の役目がＲＮＡカプシド化における１次構造よりさらに重要であるということを意味する。
【０１５７】
実施例４
ＣＡＥＶベクタービリオンの偽型化
組み換え型ＣＡＥＶベクタービリオンがＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質のみならず、ＧａＬＶ糖タンパク質に偽型化できるかどうかを決定するために、ＧａＬＶ発現ベクター及びｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２）、またはＶＳＶ−Ｇ発現ベクター及びｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）のいずれか一つで転移ベクタープラスミド及びパッケージプラスミドとともにヒト２９３Ｔ細胞を共トランスフェクションさせた。トランスフェクション後４２時間後に、トランスフェクションされた細胞から放出された偽型ビリオン粒子を含む培養上澄液を回収し、０．４５μｍ薄膜フィルタで精製し、２９３Ｔヒト標的細胞を感染させるために用いた。感染後一日目に、ゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ分離キット（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＨＬ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した後、ＰＣＲ実験を行って統合されたプロウイルスｃＤＮＡを検出した。予想の如く、ＣＡＥＶベクター（図１１のレイン１）は、ＭｕＬＶ−（図１１のレイン３）及びＨＩＶ−１系ベクター（図１１のレイン４）に比べてＶＳＶ−Ｇタンパク質によって效率的に偽型化された。また、ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターシステムとは異なり、本発明のＣＡＥＶベクターは、ＧａＬＶエンベロープ（図１１のレイン２）でも成功的に偽型化された。このようなＣＡＥＶベクターのＧａＬＶエンベロープを用いた偽型化能は臨床レベルのレンチウイルスベクターシステムの開発に大きなメリットを与えることができる。ＭｕＬＶ（ｐＥＱＰＡＭ３，ｐＭＦＧ／ｌａｃＺ／ｐｕｒｏ及びｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）でトランスフェクションされる）及びＨＩＶ−１（ｐＣＭＶΔＲ８−２，ｐＨＲ／ｌａｃＺ及びｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）でトランスフェクションされる）ベクター対照群は、レイン３及び４にそれぞれ提示されている。
【０１５８】
実施例５
ＣＡＥＶパッケージ細胞株の生産
ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）及びｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）ベクターは、真核細胞における選別のためのｎｅｏｒ遺伝子をコードする。ｇａｇ−ｐｏｌ及びｒｅｖ発現ベクターで共トランスフェクション後、效率的な選別のために、ｎｅｏ！ｒ遺伝子をバクテリアｇｐｔ遺伝子のような他の抗生剤耐性遺伝子に置換させて他のＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターを作製することができる。一方、ｇａｇ，ｐｏｌ及びｒｅｖ遺伝子をコードするパッケージプラスミドシステムが用いられることができる。ＣＡＥＶパッケージタンパク質を発現する安定的な（ｓｔａｂｌｅ）２９３Ｔ細胞を産生することができるかどうかを決定するために、選択培地下で抗生剤耐性コロニーを選別する。安定的な２９３Ｔ細胞からの組み換え型ＣＡＥＶベクターの生産は、ＣＡＥＶベクター生産のための安定パッケージ細胞株生産の容易性を示している。
【０１５９】
実施例６
宿主染色体内へのＣＡＥＶ系ベクターｃＤＮＡの統合
形質導入後ＣＡＥＶベクターｃＤＮＡの統合を試験するため、ｐＭＧＰ／ＲＥＶ／ＲＲＥｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）ｅｎｖ発現プラスミド、及びｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１／ｈｌａｃＺ（配列番号：７９）転移ベクタープラスミドをヒト２９３Ｔ細胞でリポソーム媒介共トランスフェクションさせてＣＡＥＶベクター粒子を生産した。陽性対照群としてｐＣＭＶΔＲ８．２ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）ｅｎｖ発現プラスミド、及びｐＨＲ／ｌａｃＺ転移ベクターを２９３Ｔ細胞で共トランスフェクションさせることでＨＩＶ−１ベクター粒子を生産した。陰性対照群として、ただｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１／ｈｌａｃＺ（配列番号：７９）転移ベクタープラスミドのみをトランスフェクションさせた。トランスフェクション後４８時間後に、培養上澄液を各トランスフェクションされた細胞から回収して感染のために８μｇ／ｍｌポリブレン存在下で新鮮な２９３Ｔ細胞に適用させた。４８時間後、ゲノムＤＮＡを各形質導入された細胞から製造した後、制限酵素に切断してサザンブロット分析を行った。Ｄｉｇ標識付きのｌａｃＺプローブでＨＩＶ−１系転移ベクターに対する３．１５ｋｂ  ＢａｍＨ  Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉ断片、及びＣＡＥＶ系転移ベクター及び陰性対照群に対する１．３５ｋｂ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｓｐ  Ｉ断片を検出した。陽性対照群に対しては、ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１／ｈｌａｃＺ（配列番号：７９）転移ベクタープラスミドのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｓｐ  Ｉ  ＤＮＡ断片０．３ｎｇ及び３ｎｇが用いられた。図１２に示したように、本発明のＣＡＥＶ系転移ベクターは、ＨＩＶ−１系レンチウイルスの転移ベクターに匹敵するべきレベルで統合された。
【０１６０】
実施例７
非分裂細胞への遺伝子転移
２９３Ｔ細胞をＤＮＡ合成阻害物質であるアフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）で処理して６ウェル培養プレートに分株した後、ｌａｃＺマーカー遺伝子をコードするＣＡＥＶベクター粒子で形質導入させた。対照群として、細胞をｌａｃＺ発現ＭｕＬＶレトロウイルスベクター及びＨＩＶ−１レンチウイルスベクターで並んで感染させた。感染してから４８時間後に、形質導入の效率性を試験するため、形質導入されたｌａｃＺ遺伝子の発現をＸ−ｇａｌ染色法で測定した。図１４に示したように、ＭｕＬＶ由来ベクターはＤＮＡ合成阻害物質で処理されない細胞を效率的に感染させた。しかし、細胞がＤＮＡ合成阻害物質の処理によって細胞周期で停滞した時、形質導入效率は、顕著に低減した。一方、ＣＡＥＶ系ベクターは分裂細胞のみならず、非分裂ヒト細胞をＨＩＶ−１系ベクターに匹敵するべきレベルで效率的に形質導入させることができる。
【０１６１】
実施例８
筋肉細胞の生体内形質導入
本実施例において、ＣＡＨ／ＳＩＮｄ１／ｈｌａｃＺ（配列番号：７９）ＣＡＥＶベクターは、生体内筋肉細胞の形質導入に用いられる。マウス（Ｂｅｉｇｅ  ｓｔｒａｉｎ）の後足を４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下でＣＡＥＶベクター１００μｌで筋肉内注射した。二日後前記マウスを犠牲させて、感染された組職を凍結切片法（ｆｒｏｚｅｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）及びβ−ガラクトシダーゼ分析のために準備した。予想の通り、ＣＡＨ／ＳＩＮｄ１ｌａｃＺ（配列番号：７９）ＣＡＥＶベクターは、生体内筋肉細胞に效果的に形質導入される。
以上、本発明を特定の実施例を例えて説明したが、これらの実施例によって本発明が制限されることなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で多様な変形及び修正が可能であることは明らかである。
多くの他の変形及び修正が本発明の思想及び範囲内から本願で引用されたＮＣＢＩデータベースに寄託された配列、特許及び特許出願は引用によりその全体が詳細な説明に導入される。
表１
【表１】
2008512110.tif 000003
【表２】
2008512110.tif 000004
【表３】
2008512110.tif 000005
【表４】
2008512110.tif 000006
【表５】
2008512110.tif 000007
【表６】
2008512110.tif 000008
【表７】
2008512110.tif 000009
【表８】
2008512110.tif 000010
【表９】
2008512110.tif 000011
【表１０】
2008512110.tif 000012
【表１１】
2008512110.tif 000013
【表１２】
2008512110.tif 000014
【表１３】
2008512110.tif 000015
表２
【表１４】
2008512110.tif 000016
【表１５】
2008512110.tif 000017
【表１６】
2008512110.tif 000018
表３
【表１７】
2008512110.tif 000019
表４
【表１８】
2008512110.tif 000020
【表１９】
2008512110.tif 000021
【表２０】
2008512110.tif 000022
【表２１】
2008512110.tif 000023
【表２２】
2008512110.tif 000024
表５
【表２３】
2008512110.tif 000025
表６
【表２４】
2008512110.tif 000026
【表２５】
2008512110.tif 000027
表７
【表２６】
2008512110.tif 000028
【表２７】
2008512110.tif 000029
【表２８】
2008512110.tif 000030
表８
【表２９】
2008512110.tif 000031
【表３０】
2008512110.tif 000032
【表３１】
2008512110.tif 000033
【表３２】
2008512110.tif 000034
【表３３】
2008512110.tif 000035
【表３４】
2008512110.tif 000036
表９
【表３５】
2008512110.tif 000037
【表３６】
2008512110.tif 000038
【表３７】
2008512110.tif 000039
【表３８】
2008512110.tif 000040
【表３９】
2008512110.tif 000041
表１０
【表４０】
2008512110.tif 000042
【表４１】
2008512110.tif 000043
【表４２】
2008512110.tif 000044
表１１
【表４３】
2008512110.tif 000045
【表４４】
2008512110.tif 000046
【表４５】
2008512110.tif 000047
表１２
【表４６】
2008512110.tif 000048
【表４７】
2008512110.tif 000049
【表４８】
2008512110.tif 000050
【表４９】
2008512110.tif 000051
表１３
【表５０】
2008512110.tif 000052
【表５１】
2008512110.tif 000053
【表５２】
2008512110.tif 000054
【表５３】
2008512110.tif 000055
【表５４】
2008512110.tif 000056
【表５５】
2008512110.tif 000057
表１４
【表５６】
2008512110.tif 000058
【表５７】
2008512110.tif 000059
【表５８】
2008512110.tif 000060
【表５９】
2008512110.tif 000061
【表６０】
2008512110.tif 000062
表１５
【表６１】
2008512110.tif 000063
【引用文献】
【０１６２】
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990).
Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215(3), 403-10.
Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25(17), 3389-402.
Anderson, M. P., Rich, D. P., Gregory, R. J., Smith, A. E., and Welsh, M. J. 
(1991). Generation of cAMP-activated chloride currents by expression of CFTR. Science 251(4994), 679-82.
Bridges, S. H., and Sarver, N. (1995). Gene therapy and immune restoration for HIV disease. Lancet 345(8947), 427-32.
Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., and Yee, J. K. (1993). Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 90(17), 8033-7.
Carswell, S., and Alwine, J. C. (1989). Efficiency of utilization of the simian virus 40 late polyadenylation site: effects of upstream sequences. Mol Cell Biol 9(10), 4248-58.
Cech, T. R. (1988). Ribozymes and their medical implications. Jama 260(20), 
3030-4.
Chang, M. W., Barr, E., Seltzer, J., Jiang, Y. Q., Nabel, G. J., Nabel, E. G., Parmacek, M. S., and Leiden, J. M. (1995). Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product. Science 267(5197), 518-22.
Curran, M. A., and Nolan, G. P. (2002). Nonprimate lentiviral vectors. Curr Top Microbiol Immunol 261, 75-105.
Crawford, I., Maloney, P. C., Zeitlin, P. L., Guggino, W. B., Hyde, S. C., Turley, H., Gatter, K. C., Harris, A., and Higgins, C. F. (1991). Immunocytochemical localization of the cystic fibrosis gene product CFTR. Proc Natl Acad Sci U S A 88(20), 9262-6.
DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., and Calos, M. P. (1987). Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol 7(1), 379-87.
Erlich, H. A. (1989). Polymerase chain reaction. J Clin Immunol 9(6), 437-47.
Fagerhol, M. K., and Cox, D. W. (1981). The Pi polymorphism: genetic,biochemical,and clinical aspects of human alpha 1-antitrypsin. Adv Hum Genet 11, 1-62, 371-2.
Gilbert, J. R., and Wong-Staal, F. (2001). HIV-2 and SIV vector systems. Somat Cell Mol Genet 26(1-6), 83-98.
Gillam, S., and Smith, M. (1979). Site-specific mutagenesis using synthetic 
oligodeoxyribonucleotide primers: I. Optimum conditions and minimum  ologodeoxyribonucleotide length. Gene 8(1), 81-97.
Hall, C. V., Jacob, P. E., Ringold, G. M., and Lee, F. (1983). Expression and 
regulation of Escherichia coli lacZ gene fusions in mammalian cells. J Mol Appl Genet 2(1), 101-9.
Harmache, A., Bouyac, M., Audoly, G., Hieblot, C., Peveri, P., Vigne, R., and 
Suzan, M. (1995). The vif gene is essential for efficient replication of caprine arthritis encephalitis virus in goat synovial membrane cells and affects the late steps of the virus replication cycle. J Virol 69(6), 3247-57.
Harmache, A., Russo, P., Guiguen, F., Vitu, C., Vignoni, M., Bouyac, M., Hieblot, C., Pepin, M., Vigne, R., and Suzan, M. (1996). Requirement of caprine arthritis encephalitis virus vif gene for in vivo replication. Virology 224(1), 246-55.
Helene, C. (1991). The anti-gene strategy: control of gene expression by 
triplex-forming-oligonucleotides. Anticancer Drug Des 6(6), 569-84.
Hoffman, E. P., Brown, R. H., Jr., and Kunkel, L. M. (1987). Dystrophin: the 
protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51(6), 919-28.
Horwich, A. L., Fenton, W. A., Williams, K. R., Kalousek, F., Kraus, J. P., 
Doolittle, R. F., Konigsberg, W., and Rosenberg, L. E. (1984). Structure and expression of a complementary DNA for the nuclear coded precursor of human mitochondrial ornithine transcarbamylase. Science 224(4653), 1068-74.
Karlin, S., and Altschul, S. F. (1990). Methods for assessing the statistical 
significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc Natl Acad Sci U S A 87(6), 2264-8.
Karlin, S., and Altschul, S. F. (1993). Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. Proc Natl Acad Sci U S A 90(12), 5873-7.
Kim, S. J., Sadelain, M., Choi, K. H., Kim, H. K., Lee, J. S., and Chung, H. 
Y. (1997). Tetracycline-mediated suppression of gene expression with a new 
dicistronic retroviral vector. Mol Cells 7(4), 514-20.
Kim, S. Y., Lee, J. H., Shin, H. S., Kang, H. J., and Kim, Y. S. (2002). The 
human elongation factor 1 alpha (EF-1 alpha) first intron highly enhances expression of foreign genes from the murine cytomegalovirus promoter. J Biotechnol 93(2), 183-7.
Kordower, J. H., Emborg, M. E., Bloch, J., Ma, S. Y., Chu, Y., Leventhal, L., 
McBride, J., Chen, E. Y., Palfi, S., Roitberg, B. Z., Brown, W. D., Holden, J. E., Pyzalski, R., Taylor, M. D., Carvey, P., Ling, Z., Trono, D., Hantraye, P., Deglon, N., and Aebischer, P. (2000). Neurodegeneration prevented by lentiviral vector delivery of GDNF in primate models of Parkinson's disease. Science 290(5492), 767-73.
Landau, N. R., and Littman, D. R. (1992). Packaging system for rapid production of murine leukemia virus vectors with variable tropism. J Virol 66(8), 5110-3.
Lee, C. C., Pearlman, J. A., Chamberlain, J. S., and Caskey, C. T. (1991). 
Expression of recombinant dystrophin and its localization to the cell membrane. Nature 349(6307), 334-6.
Lemarchand, P., Jaffe, H. A., Danel, C., Cid, M. C., Kleinman, H. K., Stratford-Perricaudet, L. D., Perricaudet, M., Pavirani, A., Lecocq, J. P., and Crystal, R. G. (1992). Adenovirus-mediated transfer of a recombinant human alpha 1-antitrypsin cDNA to human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A 89(14), 6482-6.
Maher, L. J., 3rd, Wold, B., and Dervan, P. B. (1991). Oligonucleotide-directed DNA triple-helix formation: an approach to artificial repressors? Antisense Res Dev 1(3), 277-81.
Marcus-Sekura, C. J. (1988). Techniques for using antisense oligodeoxy
ribonucleotides to study gene expression. Anal Biochem 172(2), 289-95.
Miller, A. D. (1992). Human gene therapy comes of age. Nature 357(6378), 455-60.
Mitrophanous, K., Yoon, S., Rohll, J., Patil, D., Wilkes, F., Kim, V., Kingsman, S., Kingsman, A., and Mazarakis, N. (1999). Stable gene transfer to the nervous system using a non-primate lentiviral vector. Gene Ther 6(11), 1808-18.
Mselli-Lakhal, L., Favier, C., Da Silva Teixeira, M. F., Chettab, K., Legras, 
C., Ronfort, C., Verdier, G., Mornex, J. F., and Chebloune, Y. (1998). Defective RNA packaging is responsible for low transduction efficiency of CAEV-based vectors. Arch Virol 143(4), 681-95.
Mullen, C. A., Kilstrup, M., and Blaese, R. M. (1992). Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluorocytosine: a negative selection system. Proc Natl Acad Sci U S A 89(1), 33-7.
Mulligan, R. C. (1993). The basic science of gene therapy. Science 260(5110), 
926-32.
Mullis, K. B., and Faloona, F. A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro 
via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155, 335-50.
Murakami, K., Amaya, Y., Takiguchi, M., Ebina, Y., and Mori, M. (1988). 
Reconstitution of mitochondrial protein transport with purified ornithine carbamoyltransferase precursor expressed in Escherichia coli. J Biol Chem 263(34), 18437-42.
Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., and Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263-7.
Ory, D. S., Neugeboren, B. A., and Mulligan, R. C. (1996). A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc Natl Acad Sci U S A 93(21), 11400-6.
Persons, D. A., Mehaffey, M. G., Kaleko, M., Nienhuis, A. W., and Vanin, E. F. (1998). An improved method for generating retroviral producer clones for vectors lacking a selectable marker gene. Blood Cells Mol Dis 24(2), 167-82.
Pfarr, D. S., Rieser, L. A., Woychik, R. P., Rottman, F. M., Rosenberg, M., and Reff, M. E. (1986). Differential effects of polyadenylation regions on gene expression in mammalian cells. DNA 5(2), 115-22.
Rhodes, A., and James, W. (1991). Inhibition of heterologous strains of HIV by antisense RNA. Aids 5(2), 145-51.
Riordan, J. R., Rommens, J. M., Kerem, B., Alon, N., Rozmahel, R., Grzelczak, 
Z., Zielenski, J., Lok, S., Plavsic, N., Chou, J. L., and et al. (1989). Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 245(4922), 1066-73.
Roberts, S., Cheetham, J. C., and Rees, A. R. (1987). Generation of an antibody with enhanced affinity and specificity for its antigen by protein engineering. Nature 328(6132), 731-4.
Rommens, J. M., Iannuzzi, M. C., Kerem, B., Drumm, M. L., Melmer, G., Dean, M., Rozmahel, R., Cole, J. L., Kennedy, D., Hidaka, N., and et al. (1989). Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 245(4922), 1059-65.
Saltarelli, M., Querat, G., Konings, D. A., Vigne, R., and Clements, J. E. (1990). Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which generate infectious virus. Virology 179(1), 347-64.
Saltarelli, M. J., Schoborg, R., Gdovin, S. L., and Clements, J. E. (1993). The CAEV tat gene trans-activates the viral LTR and is necessary for efficient viral replication. Virology 197(1), 35-44.
Saltarelli, M. J., Schoborg, R., Pavlakis, G. N., and Clements, J. E. (1994). 
Identification of the caprine arthritis encephalitis virus Rev protein and its cis-acting Rev-responsive element. Virology 199(1), 47-55.
Sauter, S. L., and Gasmi, M. (2001). FIV vector systems. Somat Cell Mol Genet 
26(1-6), 99-129.
Seroude, V., Audoly, G., Gluschankof, P., and Suzan, M. (2002). Viral and 
cellular specificities of caprine arthritis encephalitis virus Vif protein. Virology 292(1), 156-61.
Smith, T. F., Waterman, M. S., and Fitch, W. M. (1981). Comparative biosequence metrics. J Mol Evol 18(1), 38-46.
Soneoka, Y., Cannon, P. M., Ramsdale, E. E., Griffiths, J. C., Romano, G., 
Kingsman, S. M., and Kingsman, A. J. (1995). A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors. Nucleic Acids Res 23(4), 628-33.
To, R. Y., Booth, S. C., and Neiman, P. E. (1986). Inhibition of retroviral 
replication by anti-sense RNA. Mol Cell Biol 6(12), 4758-62.
Toole, J. J., Knopf, J. L., Wozney, J. M., Sultzman, L. A., Buecker, J. L.,
Pittman,D. D., Kaufman, R. J., Brown, E., Shoemaker, C., Orr, E. C., and et al. (1984). Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature 312(5992), 342-7.
von Ruden, T., and Gilboa, E. (1989). Inhibition of human T-cell leukemia virus type I replication in primary human T cells that express antisense RNA. J Virol 63(2), 677-82.
Wang, C. C. (1991). A novel suicide inhibitor strategy for antiparasitic drug
development. J Cell Biochem 45(1), 49-53.
Warne, P. H., Viciana, P. R., and Downward, J. (1993). Direct interaction of 
Ras and the amino-terminal region of Raf-1 in vitro. Nature 364(6435), 352-5.
Weintraub, H. M. (1990). Antisense RNA and DNA. Sci Am 262(1), 40-6.
Wills, K. N., Maneval, D. C., Menzel, P., Harris, M. P., Sutjipto, S., 
Vaillancourt, M. T., Huang, W. M., Johnson, D. E., Anderson, S. C., Wen, S. F., and et al. (1994). Development and characterization of recombinant adenoviruses encoding human p53 for gene therapy of cancer. Hum Gene Ther 5(9), 1079-88.
Wion, K. L., Kelly, D., Summerfield, J. A., Tuddenham, E. G., and Lawn, R. M. 
(1985). Distribution of factor VIII mRNA and antigen in human liver and other tissues. Nature 317(6039), 726-9.
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ＣＡＥＶプロウイルスゲノムの構造を示す概略図である。
【図２Ａ】プラスミドｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）を示す図である。ｐＭＧＰ／ＲＲＥ（配列番号：７７）は、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌコーディング領域（ｂｐ７０９−５，２４３）の上流に位置するＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ領域（ｂｐ  １−６６０）、ＲＲＥ領域（ｂｐ  ５，４２６−５，６２７またはｂｐ５，３６８−５，６６９）、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化信号（ｂｐ  ５，７５１−５，９８４）を含む９，４４６ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ８，１５１−７，１５５）、ＳＶ４０複製起点（ｏｒｉｇｉｎｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｉｔｏｎ）（ｂｐ  ８，５０９−８，１５２）、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ６，１１５−６，６９８）、及びアンピシリン耐性遺伝子領域（ｂｐ  ９，３６２−８，５２８）を含む。
【図２Ｂ】プラスミドｐＭＧＰ／ＲＥＶ／ＲＲＥを示す概略図である。ｐＭＧＰ／ＲＥＶ／ＲＲＥは、ＣＡＥＶ  ｇａｇ―ｐｏｌコーディング領域（ｂｐ  ７２６−５，２５８）の上流に位置するＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ領域（ｂｐ  １−６６０に位置）及びＣＡＥＶの主スプライス供与部位（ｂｐ  ６８８−７０４）、ｒｅｖコーディング領域の第１エクソン（ｅｘｏｎ）（ｂｐ５，３８３−５，４９４）、ＲＲＥ領域（ｂｐ  ５，５４０―５，８４１）、ｒｅｖコーディング領域の第２エクソン（ｂｐ  ５，８８８−６，１７７）、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化信号（ｂｐ  ６，２２９−６，４６２）を含む９，９２４  ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ７，６３３−８，６２９）、ＳＶ４０複製起点（ｂｐ  ８，９８７−８，６３０）、Ｃｏｌ  Ｅ１  複製起点（ｂｐ  ６，５９３−７，１７６）、及びアンピシリン耐性遺伝子領域（ｂｐ  ９，８４０−９，００６）を含む。
【図３Ａ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ（配列番号：７３）を示す概略図である。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ（配列番号：７３）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５８８）、ＣＡＥＶ  ５’ＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５配列領域（ｂｐ  ６１１−７７２）、ＲＲＥ領域（ｂｐ  ７９６−１，１５４）、及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ  ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ １, ２７５−１，４５８）を含む３, ５６６ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  １，８６３−２，４６６）、及びカナマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ２，６９８−３，５１０）を含む。
【図３Ｂ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ０（配列番号：６７）を示す概略図である。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ０（配列番号：６７）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５８８）、ＣＡＥＶ５’ＬＴＲでのＲ−Ｕ５配列領域（ｂｐ  ６１１−７７２）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）を含む残余非翻訳配列（ｂｐ  ７７３−７８９）、ＲＲＥ領域（ｂｐ  １，１４１−１，４９９）、及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ  １，６２０−１，８０３）を含む３，９１１  ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ２，２０８−２，７９１）及びカナマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ３，０４３−３，８５５）を含む。
【図３Ｃ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）を示す概略図である。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５８８）プロモーター；ＣＡＥＶ  ５’ＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５配列領域（ｂｐ  ６１０−７７２）；ＰＢＳを含む残余非翻訳領域（ｂｐ  ７７３−７８９）；開始ＡＴＧコドン（ｂｐ  １１２１−１１２３）及び前記開始ＡＴＧコドンの下流に位置するＡＴＧコドン（ｂｐ  １１４２−１１４４）におけるＡＴＧからＴＡＧへの点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する、ｇａｇ遺伝子の３２７  ｂｐの断片（ｂｐ  １，１２１−１，４４８）；ＲＲＥ領域（ｂｐ  １，４６８−１，８２６）；及びＵ３領域欠失のＣＡＥ  Ｖ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ  １，９４７−２，１３０）を含む４，２３８ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ２，５３５−３，１１８）及びカナマイシン耐性遺伝子領域（ｂｐ  ３，３７０−４，１８２）を含む。
【図３Ｄ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ２（配列番号：６９）を示す概略図である。プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ２（配列番号：６９）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５８８）；ＣＡＥＶ  ５’ＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５配列領域（ｂｐ  ６１０−７７２）；ＰＢＳを含む残余非翻訳領域（ｂｐ  ７７３−７８９）；開始ＡＴＧコドン（ｂｐ  １１２１−１１２３）及び前記開始ＡＴＧコドンの下流に位置するＡＴＧコドン（ｂｐ  １１４２−１１４４）における点突然変異を有する、ｇａｇ遺伝子の６１２  ｂｐの断片（ｂｐ１，１２１−１，７３３）；ＲＲＥ領域（ｂｐ  １，７５３−２，１１１）；及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ  ２，２３２−２，４１５）を含む４，５２３  ｂｐプラスミドである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１  複製起点（ｂｐ  ２，８２０−３，４０３）及びカナマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ３，６５５−４，４６７）を含む。
【図３Ｅ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ３（配列番号：７０）を示す概略図である。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ３（配列番号：７０）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５８８）；ＣＡＥＶ  ５’ＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５配列領域（ｂｐ  ６１０−７７２）；ＰＢＳを含む残余非翻訳領域（ｂｐ  ７７３−７８９）；開始ＡＴＧコドン（ｂｐ  １１２１−１１２３）及び前記開始ＡＴＧコドンの下流に位置するＡＴＧコドン（ｂｐ  １１４２−１１４４）で点突然変異を有する、ｇａｇ遺伝子の９０８  ｂｐの断片（ｂｐ  １，１２１−２，０２９）；ＲＲＥ領域（ｂｐ  ２，０４９−２，４０７）；及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ  ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ  ２，５４９−２，７１１）を含む４，８１９  ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１  複製起点（ｂｐ  ３，１１６−３，６９９）及びカナマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ３，９５１−４，７６３）を含む。
【図３Ｆ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ４（配列番号：７１）を示す概略図である。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ４（配列番号：７１）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５８８）；ＣＡＥＶ  ５’ＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５配列領域（ｂｐ  ６１０−７７２）；ＰＢＳを含む残余非翻訳領域（ｂｐ  ７７３−１，１２０）；開始ＡＴＧコドン（ｂｐ  １１２１−１１２３）及び前記開始ＡＴＧコドンの下流に位置するＡＴＧコドン（ｂｐ  １１４２−１１４４）で点突然変異を有する、ｇａｇ遺伝子の１１９８  ｂｐの断片（ｂｐ  １，１２１−２，３１９）；ＲＲＥ領域（ｂｐ  ２，３４２−２，７００）；及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ  ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ  ２，８４２−３，００４）を含む５，１１２  ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ３，４０９−３，９９２）及びカナマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ４，２４４−５，０５６）を含む。
【図３Ｇ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１／ｈｌａｃＺ（配列番号：７９）を示す概略図である。ｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１／ｈｌａｃＺ（配列番号：７９）は、ｌａｃＺレポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）を発現するｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ１（配列番号：６８）由来の８，１２７  ｂｐのプラスミドである。前記ベクターは、二つのＨＣＭＶ  ＭＩＥＰプロモーター領域（それぞれｂｐ  １−５８８及びｂｐ  １，８６６−２，４６０に位置）；を含む残余非翻訳領域（ｂｐ  ７７３−７８９）；開始ＡＴＧコドン（ｂｐ  １１２１−１１２３）及び前記開始ＡＴＧコドンの下流に位置するＡＴＧコドン（ｂｐ  １１４２−１１４４）で点突然変異を有する、ｇａｇ遺伝子の３２５ｂｐの断片（ｂｐ  １，１２１−１，４４６）；ｌａｃＺ遺伝子コード配列（ｂｐ  ２，５４１−５，７１１）；及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ  ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ  ５，７８２−６，０１９）を含む。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ６，４２４−７，００７）、及びカナマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ７，２５９−８，０７１）を含む。
【図３Ｈ】プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ６０／ｈｌａｃＺ（配列番号：７８）を示す概略図である。プラスミドｐＣＡＨ／ＳＩＮｄ６０／ｈｌａｃＺ（配列番号：７８）は、二つのプロモーター領域であるＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（それぞれｂｐ  １−５８８及びｂｐ  １，５９５−２，１８９に位置）；ＣＡＥＶ  ５’ＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５配列領域（ｂｐ  ６１０−７７２）；ＰＢＳ位置を含む残余非翻訳領域（ｂｐ  ７７３−７８９  ｂｐ）；開始ＡＴＧコドン（ｂｐ  １１２１−１１２３）及び前記開始ＡＴＧコドンの下流に位置するＡＴＧコドン（ｂｐ  １１４２−１１４４）で点突然変異を有する、ｇａｇ遺伝子の６０ｂｐの断片（ｂｐ  １，１２１−１，１８１）；ＲＲＥ領域（ｂｐ  １，１９５−１，５６５）；ｌａｃＺ遺伝子コード配列（ｂｐ  ２，２７０−５，４４０）；及びＵ３領域欠失のＣＡＥＶ  ３’ＬＴＲ領域（ｂｐ  ５，５１１−５，７４８）を含む７，８５６ｂｐである。前記ベクターは、またＣｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ６，１５３−６，７３６）、及びカナマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ６，９８８−７，８００）を含む。
【図４】プラスミドｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６）を示す概略図である。ｐＨＹＫ／ｖｉｆ（配列番号：７６）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５９６）、ｖｉｆ遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ６９１−１，３８０）、ＢＧＨポリアデニル化信号（ｂｐ  １，４６７−１，６９５）、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  １，８２６−２，４０９）、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ３，８６２−２，８６６）、及びアンピシリン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ５，２７０−４，２３９）を含む５，７２９ｂｐのプラスミドである。
【図５】プラスミドｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）を示す図である。ｐＨＹＫ／ｒｅｖ（配列番号：７５）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５９６）、ｒｅｖ遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ６７２−１，０７３）、ＢＧＨポリアデニル化信号（ｂｐ  １，１５７−１，３８５）、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  １，５１６−２，０９９）、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ３，５５２−２，５５６）、及びアンピシリン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ４，９６０−３，９２９）を含む５，４１９ｂｐのプラスミドである。
【図６Ａ】プラスミドｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）を示す概略図である。ｐＨＧＶＳＶ−Ｇ（配列番号：７４）は、ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−５９６）、β−グロビンイントロン領域（ｂｐ  ７１４−１，５９９）、ＶＳＶ−Ｇコーディング領域（ｂｐ  １，６３２−３，３１２）、ＢＧＨポリアデニル化信号（ｂｐ  ３，３６１−３，５８９）、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ３，７２０−４，３０３）、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ５，７５６−４，７６０）、アンピシリン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ７，１６４−６，１３３）、及びＦ１複製起点（ｂｐ  ７，１６５−７，６２１）を含む７，６２３ｂｐのプラスミドである。
【図６Ｂ】プラスミドｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２）を示す概略図である。ｐＭＹＫＥＦ１／ｅｎｖ（配列番号：７２）は、ＭＣＭＶ  ＭＩＥＰ（ｂｐ  １−６６５）、ヒトＥＦ１−αイントロン領域（ｂｐ  ６６８−１，６１８）、ＧａＬＶ  ｅｎｖコーディング領域（ｂｐ  １，６９９−３７０１）、ＢＧＨポリアデニル化信号（ｂｐ  ３，８８５−４，１１８）、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点（ｂｐ  ４，３４９−４，８３２）、ネオマイシン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ６，２９０−５，２８４）、及びアンピシリン耐性遺伝子コーディング領域（ｂｐ  ７，４９６−６，６６６）を含む７，５７９ｂｐのプラスミドである。
【図７】ヒト２９３Ｔ標的細胞にトランスフェクションされた遺伝子転移ベクターから転写された転移ベクターＲＮＡの相対量を示す写真である。
【図８】ＣＡＥＶ（Ａ）及びＭｕＬＶ（Ｂ）ベクターによるヒト２９３Ｔ標的細胞へのゲノム導入を示す写真である。
【図９】トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞で発現されるか（レイン１、２及び３）２９３Ｔパッケージ細胞からカプシド化されて放出され（レイン４、５及び６）、転移ベクターＲＮＡの相対量を示す図である。
【図１０】ヒト２９３Ｔパッケージ細胞からカプシド化されて放出された転移ベクターＲＮＡの相対量を示す写真である。
【図１１】ＶＳＶ−ＧまたはＧａＬＶエンベロープタンパク質によって偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）レンチウイルスベクターの感染及び逆転写後、統合されたレトロウイルスｃＤＮＡの相対量を示す写真である。
【図１２】宿主細胞染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に統合されたウイルスｃＤＮＡの相対量を示す写真である。
【図１３】（Ａ）対照群細胞及び（Ｂ）Ｇ１停止細胞に対するＦＡＣＳ分析結果を示す二つのグラフである。
【図１４】（Ａ）形質導入された細胞の数、（Ｂ）分裂及び非分裂細胞に対するＨＩＶ−１、ＣＡＥＶ、及びＭｕＬＶ−由来のウイルスベクターの相対的形質導入の效率性をそれぞれ示すグラフである。
【図１】
2008512110.tif 000064
【図２Ａ】
2008512110.tif 000065
【図２Ｂ】
2008512110.tif 000066
【図３Ａ】
2008512110.tif 000067
【図３Ｂ】
2008512110.tif 000068
【図３Ｃ】
2008512110.tif 000069
【図３Ｄ】
2008512110.tif 000070
【図３Ｅ】
2008512110.tif 000071
【図３Ｆ】
2008512110.tif 000072
【図３Ｇ】
2008512110.tif 000073
【図３Ｈ】
2008512110.tif 000074
【図４】
2008512110.tif 000075
【図５】
2008512110.tif 000076
【図６Ａ】
2008512110.tif 000077
【図６Ｂ】
2008512110.tif 000078
【図７】
2008512110.tif 000079
【図８】
2008512110.tif 000080
【図９】
2008512110.tif 000081
【図１０】
2008512110.tif 000082
【図１１】
2008512110.tif 000083
【図１２】
2008512110.tif 000084
【図１３】
2008512110.tif 000085
【図１４】
2008512110.tif 000086
【配列表】
2008512110000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月2日(2007.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）ＣＡＥＶゲノムの１ないし５１１番目のヌクレオチドからなる５’非翻訳領域、及び（ii）前記５’非翻訳領域の３’の末端に連結されたＣＡＥＶ  ｇａｇ−コード配列の１ないしＸ番目のヌクレオチド（このとき、Ｘは６１３未満である）を必須構成要素とするＣＡＥＶパッケージ配列；及び
ｂ）前記ＣＡＥＶパッケージ配列に作動可能に連結されたシス−作用エレメントを含む、組み換え型ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）系転移ベクター。
【請求項２】
前記Ｘが約３２７であることを特徴とする請求項１記載の転移ベクター。
【請求項３】
前記ｇａｇ−コード配列の開始コドンが、ｇａｇタンパク質の翻訳を防止するように変異されたことを特徴とする請求項１記載の転移ベクター。
【請求項４】
前記開始コドンがＴＡＧに変異されたことを特徴とする請求項３記載の転移ベクター。
【請求項５】
前記開始コドンＡＴＧの２１塩基対の下流に位置するｇａｇ−コード配列のＡＴＧコドンが、ｇａｇタンパク質の翻訳を防止するように変異されたことを特徴とする請求項３記載の転移ベクター。
【請求項６】
前記シス−作用エレメントがＲＲＥ（ｒｅｖ−応答配列）領域、Ｕ３領域が欠失したＣＡＥＶ３’ＬＴＲ、及び異種プロモーターからなる群から選択された少なくとも一つの配列を含むことを特徴とする請求項１記載の転移ベクター。
【請求項７】
前記異種プロモーターがヒトサイトメガロウイルス主前初期プロモーター （ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰ）であることを特徴とする請求項６記載の転移ベクター。
【請求項８】
前記ベクターが図３Ｃに示されたｐＣＡＨ/ＳＩＮｄ１の構造を有することを特徴とする 請求項１記載の転移ベクター。
【請求項９】
前記ベクターが、配列番号６８と少なくとも７０%の相同性を有することを特徴とする請求項８記載の転移ベクター。
【請求項１０】
前記異種プロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子を含む転写カセットをさらに含むことを特徴とする請求項８記載の転移ベクター。
【請求項１１】
請求項１の転移ベクター及びパッケージベクターシステムを含み、前記パッケージベクターシステムは、ＣＡＥＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ−コード配列及びＲＲＥを含む第１ポリヌクレオチド、及びウイルスエンベロープ−コード配列を含む第２ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組み換え型ＣＡＥＶ系ベクターシステム。
【請求項１２】
前記転移ベクターが異種プロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子を含む転写カセットをさらに含むことを特徴とする請求項１１記載のベクターシステム。      
【請求項１３】
前記ウイルスエンベロープ−コード配列が、非ＣＡＥＶエンベロープ−コード配列であることを特徴とする請求項１１記載のベクターシステム。
【請求項１４】
前記非ＣＡＥＶエンベロープ−コード配列が、ＶＳＶ−Ｇ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ）糖タンパク質−コード配列またはＧａＬＶ（ｇｉｂｂｏｎ  ａｐｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）エンベロープタンパク質−コード配列であることを特徴とする請求項１３記載のベクターシステム。
【請求項１５】
前記ベクターシステムがｒｅｖ−コード配列を含む第３ポリヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載のベクターシステム。
【請求項１６】
前記ベクターシステムがｖｉｆ−コード配列を含む第４ポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項１１記載のベクターシステム。
【請求項１７】
前記パッケージベクターシステムがコンピテントＣＡＥＶパッケージ配列を欠いていることを特徴とする請求項１１記載のベクターシステム。
【請求項１８】
前記第１ポリヌクレオチドを含むベクター１、及び前記第２ポリヌクレオチドを含むベクター２とを含むことを特徴とする請求項１１記載のベクターシステム。
【請求項１９】
請求項１２の組み換え型ＣＡＥＶ系ベクターシステムで細胞をトランスフェクションさせて製造された複製欠損ベクター粒子を哺乳類細胞と接触させることを含む、ポリペプチドを哺乳類細胞に伝達する方法。
【請求項２０】
請求項１２の組み換え型ＣＡＥＶ系ベクターシステムで細胞をトランスフェクションさせて製造された複製欠損ベクター粒子を脊椎動物に投与することを含む、ポリペプチドを脊椎動物に伝達する方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月2日(2007.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008512110000001.app
【国際調査報告】
2008512110.tif 000223
2008512110.tif 000224
2008512110.tif 000225
2008512110.tif 000226