(57)【要約】  本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）のスプライスバリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子に関する。これはまた、前記核酸によりコードされる対応するポリペプチド、ならびに、脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するのに潜在的に有用な化合物を同定する方法であって、ＡＣＣ２スプライスバリアントの複合体またはその複合体の活性または量を調節するその能力に関して化合物をアッセイすることを含んでなる上記方法にも、関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）のスプライスバリアント、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアント、または配列番号１に開示される配列と同義語コドンの置換のみにより異なるバリアントであって、膜結合能を欠く上記バリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号３を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
配列番号３に開示されるポリペプチドのバリアントであって、それと少なくとも８５％の配列同一性を有する前記バリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１または２に記載の単離された核酸。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかにおける核酸を含んでなる、プラスミド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかにおける核酸を含んでなる、単離された細胞または細胞株。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかにおける核酸により形質転換またはトランスフェクトされた、単離された細胞または細胞株。
【請求項８】
哺乳動物、細菌、酵母もしくは昆虫の細胞または細胞株である、請求項６または７のいずれかに記載の細胞または細胞株。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列、それと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、またはそのＣ末端切断型を含んでなるポリペプチドであって、膜にアンカーすることができない前記ポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ）  ＡＣＣ２スプライスバリアントポリペプチド、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそのＣ末端切断型であって、膜にアンカーすることができない上記ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを含有する宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること；ならびに、
ｂ）  宿主細胞培養物から該ポリペプチドを回収すること；
を含んでなる上記方法。
【請求項１０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％の類似性を有する配列を含んでなる単離されたポリペプチドであって、膜に結合することができない上記ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
単離されたＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）タンパク質複合体。
【請求項１３】
ＡＣＣ２スプライスバリアントに選択的に結合可能な精製抗体。
【請求項１４】
ＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントに選択的に結合可能な、請求項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記ポリペプチドを調節する化合物を同定するためのアッセイにおける、請求項１０または１１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１６】
脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害の治療のための、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性または量を調節可能な化合物の使用。
【請求項１７】
脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害が、肥満、２型糖尿病及び異脂肪血症：からなる群より選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するのに潜在的に有用な化合物を同定する方法であって、
ＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質の活性または量を調節する能力に関して化合物をアッセイすることを含んでなる、上記方法。
【請求項１９】
前記アッセイが、
ｉ）  ＡＣＣ２スプライスバリアントを発現する細胞株を用いるか、または精製ＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質を用いた、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性の測定；及び、
ｉｉ）  ＡＣＣ２スプライスバリアントを発現する細胞株におけるＡＣＣ２スプライスバリアントの転写または翻訳の測定；
から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９のいずれかに記載の方法によって同定される化合物。
【請求項２１】
脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するのに潜在的に有用な化合物を同定する方法であって、
ＡＣＣ２とＡＣＣ２スプライスバリアントとを含んでなる複合体の活性または量を調節する能力に関して化合物をアッセイすることを含んでなる、上記方法。
【請求項２２】
単離されたＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体を用い、そして前記複合体の活性をマロニルＣｏＡ生成に関して測定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、前記複合体によって形成された、生成した無機リン酸塩のマラカイトグリーン検出の測定を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、１４ＣＯ２の１４Ｃ−マロニルＣｏＡへの取り込みの測定を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体の活性を、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体を発現する細胞株を用いて測定すること：を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体の転写及び／または翻訳を、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体を発現する細胞株を用いて測定することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患または障害が、肥満、２型糖尿病または異脂肪血症からなる群より選択される、請求項１８〜１９、または２１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項２１〜２７のいずれかに記載の方法によって同定される化合物。
【請求項２９】
医薬組成物を調製する方法であって、
（ｉ）  請求項１８〜１９、または２１〜２６のいずれかに記載の方法によって、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患を治療するのに有用な化合物を、同定すること；ならびに、
（ｉｉ）  該化合物または医薬的に許容可能なその塩を、医薬的に許容可能な賦形剤または希釈剤と混合すること；
を含んでなる上記方法。
【請求項３０】
脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、ＡＣＣ２スプライスバリアント核酸に対して選択的な阻害核酸分子、またはＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質に対する選択的抗体の使用。
【請求項３１】
脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体に対して選択的な阻害核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）のスプライスバリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子に関する。また、本発明は、前記核酸によりコードされる対応するポリペプチド、ならびに脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するのに潜在的に有用な化合物を同定する方法に関し、ここで該方法は、ＡＣＣ２スプライスバリアント複合体もしくはその複合体の活性または量を調節するその能力について、化合物をアッセイすることを含んでなる。
【０００２】
発明の背景
多くの最近の知見によれば、タンパク質多様性（単一の遺伝子から生じる多様性の程度について、場合によっては免疫系にも匹敵する）の発生元として、選択的プレｍＲＮＡスプライシングが挙げられている。選択的スプライシングのゲノム規模での解析に基づき、ヒト遺伝子の４０〜６０％ほどが、選択的スプライス形態を有すると予測されている。この過程により、構成的エキソンにより供される定常フレームワークにおけるいくつかのエキソンの、所望による包含または置換が可能になる。生じるタンパク質のアイソフォームは、特定の機能ドメイン間で一般的に異なるものの、共通の機能を有する（Lopez AJ. Annu Rev Genet, 32:279-305, 1998年；Graveley. Trends Genet. 17:100-107, 2001年）。また、選択的スプライシングにより、オープンリーディングフレームの中途での終結や、さらには、二つの異なるリーディングフレームにおける同じｍＲＮＡ配列の使用が導かれることがある（Quelleら、Cell. 83:993-1000, 1995年）。したがって、選択的スプライシングは、タンパク質に関する主要な機能的結論を有する可能性があり、タンパク質多様性が生じる際の選択的スプライシングの全体的な意義は、その広範性及び一部の遺伝子の極限の組み合わせ出力による。
【０００３】
過去２５年間に、肥満の発生率及び重症度の憂慮すべき増加が明らかになっている。これは、先進国と新興の第三世界国の双方で起こっている。例えば、米国人口の半分よりも多くが、過体重に冒されている。過剰の体重（西洋社会ではＢＭＩ＞２７、アジアでは＞２５）は、２型糖尿病、高血圧、異脂肪血症、循環器疾患、変形性関節炎及び一部の癌のリスク増加に関連する。体重減少は、これらの罹患の多くに著明な効果を有する可能性があり、例えば、２型糖尿病への進行は、ほとんどの場合予防可能である。しかしながら、有意かつ有益な体重減少は容易に達成可能であるにもかかわらず、最大の課題はその維持であり、体重回復は大多数の者にとって不可避である。したがって、この問題を特に解決する抗肥満剤によれば、主要な満たされていない臨床的ニーズを満たされるであろう。
【０００４】
骨格筋は、全身の脂質酸化の大部分に関与しており、筋肉に送達される脂質の主要な運命は、酸化力のある燃料としての使用のためである。血漿中の非エステル化遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）は、空腹時及び軽度の運動において筋肉の燃料ニーズの８０〜９０％を占めるが、一方、循環、細胞間または細胞内トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）由来脂肪酸は、燃料の需要がより持続する場合に、ほとんどの脂質酸化を占める。筋肉の脂質代謝の制御は、基質の利用可能度、及びそれに続く細胞内での遊離脂肪酸の輸送に依存する。遊離脂肪酸基質の筋肉への送達は、ＴＡＧの形態で最初にエステル化された遊離脂肪酸の動員及び輸送に依存する。肥満においては、遊離脂肪酸が過剰供給されることにより、ＴＡＧ合成に向けての代謝及び筋肉内貯蔵が促進される。現在では、インスリン抵抗性が、骨格筋における過剰の筋肉細胞内ＴＡＧと密接に関連することが、確立されている（(Krssakら、Diabetologia 42:113-6, 1999年）。
【０００５】
臨床において、体重減少維持の失敗は、脂肪酸酸化の障害と強く関連し（Valtuenaら、Int J. Obes. Relat. Metab. Disord. 21:811-7, 1997a; Valtuenaら、Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 21:267-732, 1997b）、肥満の薬物療法における主な障害である。概念的には、骨格筋などの酸化力のある組織においてアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）により生成するマロニルＣｏＡが減少すると、脂肪酸酸化速度が高くなり、呼吸商（ＲＱ）が低下することが期待されることになる。したがって、これは、体重減少後の肥満患者において、酸化の潜在性を向上する可能性がある。したがって、ＡＣＣ２がないとマウスで痩せたフェノタイプが生じることから、ＡＣＣ２は、有望な抗肥満標的として提唱されており（Abu-Elheigaら、Science 291:2613-2664, 2001年）、そしてその阻害は、マロニルＣｏＡの低下を介した、レプチンにより誘導される脂肪酸酸化の増加における後期工程である。
【０００６】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）には、二つの公知のアイソフォームが存在する。細胞質型で肝臓及び脂肪組織に優性発現するＡＣＣ１（ＡＣＣα）と、ミトコンドリアに会合していると考えられ、骨格筋及び心臓に主に発現するＡＣＣ２（ＡＣＣβ）である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、ＡＴＰにより駆動されるアセチルＣｏＡのカルボキシル化を触媒して、マロニルＣｏＡを形成する。ＡＣＣ１によって生成するマロニルＣｏＡは脂肪酸合成において用いられる一方、ミトコンドリア表面で局所的にＡＣＣ２によって形成されることが想定されるマロニルＣｏＡは、パルミトイルＣｏＡシャトル系（ＣＰＴ−１）を制御する。マロニルＣｏＡは、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ−１）の強力な阻害剤であり、そしてその結果として、これは、脂肪酸のミトコンドリアへの流入を減少させる。このように、ＡＣＣ２活性が低下すると、局所的なマロニルＣｏＡレベルが低下し、脂肪酸β酸化が増加するとともに、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成が低下することになる（Munday. Biochem Soc Trans. 30:1059-64, 2001年）。
【０００７】
このように、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（EC 6.4.1.2）は、炭素結合形成リガーゼの酵素ファミリーに属する。ビオチンをコファクターとして用いて、ＡＣＣは、ＡＴＰにより駆動される複数工程の反応においてアセチルＣｏＡをカルボキシル化して、マロニルＣｏＡを形成する：
【０００８】
【化１】
2008505637.tif 000002
【０００９】
ヒトアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２は、ミトコンドリア外膜中の疎水性Ｎ末端にアンカーすると考えられている（Abu-Elheigaら、Proc Natl Acad Sci U S A. 97(4):1444-9, 2000年）。該酵素は、２４５８アミノ酸の大きな単一ポリペプチド鎖（〜２８０ｋＤａ）上に三つの機能ドメインを有し、これらは協働して上記に示す一部の反応を行う。
【００１０】
ＡＣＣ１は、重合、脱重合及びリン酸化によって短期間に制御されることが知られている。クエン酸は、ＡＣＣの生理学的アロステリック活性化因子であると考えられ、そしてＡＣＣ１プロトマーのフィラメント様構造への複数工程の重合を誘導することが実証されている。クエン酸の結合は、不活性ＡＣＣ１プロトマーの最初のコンフォメーション変化を引き起こし、これは、続くダイマー形成（４個のＡＣＣ１ペプチドから構成される「ダイマー」）を誘発する。この最初の複合体形成は、ＡＣＣ重合の全体における律速段階であると考えられている。ＡＣＣ２もまた、クエン酸により活性化されることが実証されている。しかしながら、ＡＣＣ２単量体／プロトマーのミトコンドリア外膜への付着が、酵素が重合可能な程度を制限すると予想されるため、メカニズムは明らかでない。新規に発見されたＡＣＣ２のスプライスバリアントであるＡＣＣ２（１ｂ）は、膜結合配列を欠損し、クエン酸により誘導されるＡＣＣ２との多量体を形成する際の細胞質内のパートナーであることが示唆されている。
【００１１】
しかしながら、カルボキシラーゼ反応のクエン酸活性化は、酵素の二量体と多量体の双方の出現に先行するかのようにみえる。この知見は、酵素の代謝回転の開始が酵素複合体の形成に依存しておらず、したがって、ミトコンドリアのマロニルＣｏＡ形成における、想定されるＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）の連携を必要としないことを示唆している。その代わり、重合の機能及び重要性は、例えばＡＭＰＫ及び／またはｃＡＭＰ  ＰＫなどのキナーゼによるリン酸化を不活化することによる、ＡＣＣ代謝回転の構造的な保護であると考えられている。このように、ＡＣＣ２プロトマーは、クエン酸によって最初に活性化されるにもかかわらず、急速に上記のキナーゼに接近可能となり、そしてＡＣＣ２（１ｂ）と会合していないならば、同時リン酸化によって遮断されることになる。したがって、ＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体形成を防ぐ化合物は、それ自体が活性化を防ぐのではなく、むしろ細胞のエネルギー制御機構による酵素の下流阻害を引き起こすことになる。このように、クエン酸によって誘導される複合体形成をブロックするようにＡＣＣ及び／またはＡＣＣ２（１ｂ）と相互作用する化合物は、ミトコンドリア表面でのマロニルＣｏＡ生成を減速させ、そしてそれゆえにミトコンドリアにおける脂肪酸酸化速度を増加させるのにも、有用であることになる。免疫沈降試験より、ＡＣＣ１とＡＣＣ２のヘテロ二量体化の前例がある。ある試験において（Dyckら、Eur J Biochem 1999年）、ラット心臓ＡＣＣ２と共沈降するより低分子量の産物が、単にストレプトアビジン−ＨＲＰを用いることによって（すなわち、ＡＣＣ１を直接的にではなく、ビオチン標識したＡＣＣ１サイズのタンパク質を同定することによって）、検出された。ＡＣＣ２（１ｂ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離されるときに、ＡＣＣ１とほぼ同じ速度で移動することが予想される。しかしながら、同じ研究者が、ＡＣＣ１に対する特異的抗体を用いるときに、ＡＣＣ−２がＡＣＣ１と免疫共沈降することを示していることにも、留意すべきである。へテロ二量体形成に関するさらなる裏づけは、ラット肝臓ＡＣＣ１とＡＣＣ２の免疫共沈降実験（Winzら、JBC 269(20):14438-14445, 1994年）からもたらされ、ここでは、二つのアイソフォームから構成される１：１複合体が報告されている。加えて、ＡＣＣ１及びＡＣＣ２は、非変性ＰＡＧＥにかけた場合に一緒に移動することが実証された。骨格筋及び心臓などの酸化力のある組織においてＡＣＣ１が比較的少量であることは、これらの器官において、例えばＡＣＣ２（１ｂ）などの別の制御パートナーがあることを、示唆している。
【００１２】
ＡＣＣ２をコードする遺伝子は第１２染色体上に位置し、そしてゲノム配列はＥＭＢＬ登録ＡＣ００７６３７に開示されている。ヒトＡＣＣ２のｃＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬ登録ＨＳＵ８９３４４に見つけられる。この二つの配列の配列比較により、ヒトＡＣＣ２遺伝子が５２個のコーディングエキソンからなることが示される。また、配列を比較することにより、公表されたＡＣＣ２のｃＤＮＡ配列における多数の誤りが確認される。したがって、本発明者は、ＡＣＣ２のｃＤＮＡをクローニングし、そして再度配列決定した。補正された配列を、配列番号２に示す。  関連するタンパク質。ＡＣＣ２遺伝子を表すと考えられるマウスゲノム配列は、ヒト酵素と最も高い相同性（〜９１％）を示す。ラットＡＣＣ２の誤りの多いデータベース配列は、ヒトＡＣＣ２と８３％の同一性を有する。ヒトのＡＣＣ１とＡＣＣ２は、７６％の同一性である（類似性〜８２％）。
【００１３】
発明の概要
本発明は、本明細書でＡＣＣ２（１ｂ）と称される、ＡＣＣ２のスプライスバリアントの発見から生じる。ＡＣＣ２（１ｂ）のｍＲＮＡは、ヒト骨格筋、心臓、脂肪組織及び肝臓中に検出されている。該スプライスバリアントは、膜アンカードメインを欠損し、そしてＡＣＣ２の制御パートナーであって、膜にアンカーするＡＣＣ２とともにクエン酸により誘導されるポリマーを形成すると考えられている。加えて、ＡＣＣ２（１ｂ）は、脂肪酸酸化のコントロールにおいてマロニルＣｏＡ軸の一部を構成する上流／下流のキナーゼ及びホスファターゼの制御作用の、潜在的なメディエーターである。本発明の目的は、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの代謝性疾患の理解において重要な役割を有するタンパク質を、提供することである。本目的は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）のスプライスバリアント、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアント、あるいは配列番号１に開示される配列と同義語コドンの置換のみにより異なるバリアントであって、膜結合能を欠損する上記バリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子を提供するという点において、達成されている。このスプライスバリアントを、野生型ＡＣＣ２と同じスクリーニング、診断、療法等に用いることが可能である。
【００１４】
本発明のさらなる側面によると、上記の核酸を含んでなるプラスミドが、提供される。さらに、配列番号１のアミノ酸配列、それと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、またはそのＣ末端切断型を含んでなるポリペプチドであって、膜にアンカーすることができない前記ポリペプチドを生成するための方法であって、
ａ）  ＡＣＣ２スプライスバリアントポリペプチド、またはそれと少なくとも８５％配列同一性を有するポリペプチド、またはそのＣ末端切断型であって、膜にアンカーすることができない上記ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを含有する宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること； 及び、
ｂ）  宿主細胞培養物から、該ポリペプチドを回収すること；
を含んでなる上記方法が、提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によると、配列番号１に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％の類似性を有する配列を含んでなる単離されたポリペプチドであって、膜結合が不可能な上記ポリペプチドが、提供される。
【００１６】
本発明の別の側面によると、選択的にＡＣＣ２スプライスバリアントと結合可能な精製抗体が、提供される。
本発明の一側面によると、脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害の治療のための、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性または量を調節可能な化合物の使用が、提供される。
【００１７】
本発明の別の側面によると、脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するのに潜在的に有用な化合物を同定する方法であって、ＡＣＣ２スプライスバリアントのタンパク質の活性または量のその調節能に関して化合物をアッセイすることを含んでなる上記方法が、提供される。
【００１８】
本発明の別の側面によると、単離されたＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）タンパク質複合体が、提供される。したがって、脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するのに潜在的に有用な化合物を同定するための方法であって、ＡＣＣ２とＡＣＣ２スプライスバリアントを含んでなる複合体の活性または量のその調節能に関して化合物をアッセイすることを含んでなる上記方法が、提供される。
【００１９】
さらに、野生型ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントを含んでなる複合体は、マロニルＣｏＡを生成する酵素の生理学的な形態である。したがって、今回初めて、この複合体を、組換え技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することが可能である。したがって、この複合体を、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの代謝性疾患の治療において潜在的な治療の利点を伴う化合物を同定するためのスクリーニングにて、用いることが可能である。
【００２０】
さらに、ＡＣＣ２スプライスバリアントの核酸に対して選択的な阻害核酸分子、またはＡＣＣ２スプライスバリアントのタンパク質に対する選択的抗体の、脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するための薬剤の製造における使用が、提供される。加えて、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体に対して選択的な阻害核酸分子の、脂肪酸酸化能の障害に関連する疾患または障害を治療するための薬剤の製造における使用が、提供される。
【００２１】
発明の詳細な説明
したがって、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＡＣＣ２スプライスバリアント、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアント、または配列番号１に開示される配列と同義語コドンの置換のみにより異なるバリアントであって、膜にアンカーすることができない上記バリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子を、提供する。本発明はまた、前記配列の相補体を含んでなる核酸分子も提供する。本発明はまた、出願の核酸分子を含有する発現ベクター、ならびに前記核酸で形質転換された宿主細胞も、提供する。本発明はまた、ＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体を形成するように、ＡＣＣ２の野生型（膜アンカー）とスプライスバリアント型の双方を発現するための発現系も、提供する。本発明はまた、前記複合体の活性を調節する化合物のスクリーニングにおける、このＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体の使用も、提供する。本発明はまた、精製ＡＣＣ２スプライスバリアントポリペプチド、具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するもの、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するもの、またはそのＣもしくはＮ末端切断型であって、膜にアンカーすることができない上記バリアントも、提供する。本発明はまた、本発明のＡＣＣ２スプライスバリアントの発現または活性を調節する化合物であって、具体的には肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害における治療価値を有してもよい化合物を同定するためのアッセイも、提供する。
【００２２】
本発明の最初の側面によると、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＡＣＣ２のスプライスバリアント、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアント、あるいは配列番号１と同義語コドンの置換のみにより異なるバリアントであって、膜アンカー能を欠損する上記バリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子が、提供される。一実施態様において、ＡＣＣ２スプライスバリアントは、配列番号３に開示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２３】
本発明の別の側面によると、配列番号３に開示されるＮ末端の１６アミノ酸配列を有するＡＣＣ２ポリペプチド、またはこの１６アミノ酸領域内に４アミノ酸未満の置換を伴うものであって、膜にアンカーすることができない上記バリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子が、提供される。本発明の別の側面によると、１〜８位（配列番号４）により表されるシグナルペプチド／標的ペプチドドメインがないＡＣＣ２ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離された核酸分子が、提供される。当業者に明らかであろうように、遺伝子コードの縮重は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない、所与のコード配列における多数のヌクレオチド置換を可能にする。このように、本発明はまた、掲載した配列中に開示されるヌクレオチド配列をコードするＡＣＣ２スプライスバリアントのいずれかと、このような同義語コドンの置換のみにより異なる単離された核酸も、提供する。実施例１０の遺伝子多型解析は、見いだされた個体間の差異の詳細を供する。
【００２４】
本発明の具体的な実施態様において、核酸は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチドを含んでなり、ここで前記核酸は、配列番号３に示されるＮ末端を有するＡＣＣ２スプライスバリアントのポリペプチドをコードする。別の実施態様において、本発明はまた、配列番号３に開示されるポリペプチドのバリアントであって、それと少なくとも８１％の配列同一性を有する前記バリアントをコードするヌクレオチド配列も、包含する。一実施態様において、核酸は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２５】
別の側面において、本発明は、単離されたＡＣＣ２（１ｂ）ポリペプチドを提供する。一実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列；またはそれと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する配列；またはそのＣ末端切断型を有する。具体的な実施態様は、配列番号３に示されるＮ末端配列を有するバリアントである。
【００２６】
別の側面において、本発明は、特定の残基に対して保存的アミノ酸置換を行って、ＡＣＣ２活性を保持する自然発生でないスプライスバリアントを作り出した、ＡＣＣスプライスバリアントタンパク質を、提供する。保存的置換は、好ましくは、触媒に関係していない部分にてなされる。
【００２７】
「単離された」の語は、材料がその元の環境（例えば、自然に発生しているならば、自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する自然発生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、しかし、自然系において共存する材料の一部または全部から分離される、同ポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは、単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であることが可能であり、かつ／あるいは、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であることが可能であり、そして、ベクターまたは組成物がその自然環境の一部でないという点で、なお単離されることが可能である。
【００２８】
さらに別の側面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列、それと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、またはそのＣ末端切断型を含んでなるポリペプチドであって、膜にアンカーすることができない前記ポリペプチドを産生するための方法を、提供する。該方法は、ａ）ＡＣＣ２スプライスバリアントのポリペプチド、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそのＣ末端切断型であって、膜にアンカーすることができない上記ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを含有する宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること；ならびに、ｂ）宿主細胞培養物から、該ポリペプチドを回収すること；を含んでなる。
【００２９】
適切な異種分泌シグナル（ＳＵＣ２またはα因子由来のものなど）を用いて、培養液中へのポリペプチド分泌を確認するならば、このようなタンパク質を、細胞自体から、または培養液から回収することが可能である。
【００３０】
さらに別の側面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列、それと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、またはそのＣ末端切断型を含んでなるポリペプチドであって、配列番号３に示される配列もまた含んでなる前記ポリペプチドを産生するための方法を、提供する。該方法は、ａ）ＡＣＣ２スプライスバリアントのポリペプチド、またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ配列番号３に示されるＮ末端の１６アミノ酸を含んでなるポリペプチド、またはそのＣ末端切断型をコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを含有する宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること；ならびに、ｂ）宿主細胞培養物から、該ポリペプチドを回収すること；を含んでなる。
【００３１】
このように、別の側面において、本発明は、本発明の核酸で形質転換された細胞及び細胞株を、提供する。例えば、形質転換された細胞は、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫の細胞であってもよい。
【００３２】
本発明のさらなる側面によると、ＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体を調製するための方法であって、野生型及びスプライスバリアント型のＡＣＣ２を発現可能な宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し；（ｂ）該ポリペプチドに複合体を形成させ；そして、（ｃ）該複合体を回収すること；を含んでなる上記方法が、提供される。
【００３３】
本発明の別の側面によると、単離されたＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）タンパク質複合体が提供される。前記の単離されたタンパク質複合体は、膜調製物または画分上に存在するか、またはそれと会合してもよい。
【００３４】
本発明の別の側面によると、治療への潜在性を有する化合物のスクリーニングにおける、組換えにより産生したＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体の使用が、提供される。
本発明の別の側面によると、治療への潜在性を有する化合物のスクリーニングにおける、単離されたＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体の使用が、提供される。
【００３５】
別の側面において、本発明は、ＡＣＣ２スプライスバリアントに選択的に結合する精製抗体、ならびに本発明のＡＣＣ２スプライスバリアントのタンパク質と選択的に結合する抗体を作製するための方法を、提供する。選択的に結合するとは、天然の全長ＡＣＣ２またはその任意の一部、あるいはＡＣＣ２スプライスバリアント以外の任意の他のタンパク質またはポリペプチドに実質的に結合できないことを意味する。当業者は、選択的抗体を設計及び調製するために、野生型ＡＣＣ２とそれに対する種々のスプライスバリアント型との間のアミノ酸配列の差異を同定することが可能である。重要な差異は、Ｎ末端領域にある。本明細書では、抗体結合に関して、「選択的な」及び「特異的な」の語を同義的に用いる。
【００３６】
本発明の別の側面において、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性または量を調節することが可能な化合物の使用であって、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患の治療のための上記使用が、提供される。
【００３７】
本発明のＡＣＣ２スプライスバリアントの量の調節を、例えば遺伝子発現レベルまたはメッセージ安定性の変化を介してもたらしてもよい。ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性の化合物による調節を、例えば、ＡＣＣ２スプライスバリアントのタンパク質またはＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体に結合する化合物を介して、もたらしてもよい。一実施態様において、ＡＣＣ２スプライスバリアントの調節は、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性または量を低下させることが可能な化合物を含んでなる。別の実施態様において、ＡＣＣ２スプライスバリアントの調節は、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性または量を増加させることが可能な化合物を含んでなる。別の実施態様において、ＡＣＣ２活性の調節は、ＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体の活性または量を阻害可能な化合物、あるいはそれ自体の複合体形成によって、影響を受ける。ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性を調節可能な化合物の例は、抗体である。抗体は、任意の適切な方法を用いて作製可能である。例えば、精製ポリペプチドを利用して、特異的な抗体を調製してもよい。「抗体」の語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ及び一本鎖Ｆｖなどの種々のタイプの抗体コンストラクトを含むことが、意図される。抗体は、約１０７Ｍ−１を超えるかまたはそれと同等のＫａにて結合するならば、特異的に結合していると定義される。結合親和性を、例えば、Scatchardら、Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660（1949年）に記載されるものなどの、慣用の技術を用いて、測定することが可能である。
【００３８】
ポリクローナル抗体を、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットなどの多様な源から、当該技術分野において周知の手順を用いて、容易に作出することが可能である。一般には、抗原を、典型的には非経口注射を介して、宿主動物に投与する。抗原の免疫原性を、例えばフロイント完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバントの使用を介して、増強してもよい。追加免疫に続いて、少量の血清試料を採取し、そして抗原に対する反応性について検査する。このような測定に有用な種々のアッセイの例としては、「Antibodies: A Laboratory Manual」（Harlow及びLane（編集）、コールドスプリングハーバー研究所プレス、1988年）に記載のもの；ならびに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ及びサンドイッチアッセイなどの手順が挙げられ、米国特許第4,376,110及び第4,486,530を参照されたい。
【００３９】
モノクローナル抗体を、周知の手順を用いて容易に調製してもよく、例えば、米国特許第RE 32,011；第4,902,614；第4,543,439及び第4,411,993；「Monoclonal Antibodies, Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses」（Plenum Press, Kennett, McKearn及びBechtol（編集）（1980年））を参照されたい。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体を、Alting-Meesらの「Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas」（Strategies in Molecular Biology 3: 1-9（1990年））に記載されるものなどの別の技術を用いて、作製することが可能である。該文献は、参照によって本明細書に記載されているものとする。同様に、結合パートナーを、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み入れるための組換えＤＮＡ技術を用いて、構築することが可能である。このような技術は、Larrickら（Biotechnology 7: 394、1989年）において記載されている。
【００４１】
単離及び精製した後に、抗体を用いて、確立されたアッセイプロトコールを用いて、試料中の抗原の存在を検出してもよく、例えば、D. M. Kemenyによる「A Practical Guide to ELISA」（ペルガモンプレス、オックスフォード、英国）を参照されたい。
【００４２】
本発明の別の側面によると、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害の治療のための薬剤の調製における、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性または量を調節可能な化合物の使用が、提供される。
【００４３】
このように、本発明はまた、本発明のＡＣＣ２スプライスバリアントの遺伝子もしくはタンパク質の発現または活性を調節可能な、小分子または他の化合物を同定するためのアッセイも、提供する。このようなアッセイを、形質転換されていない細胞、確立された細胞株または本発明の形質転換された細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいは、正常な非ヒト動物またはトランスジェニック動物を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで、行ってもよい。
【００４４】
具体的には、アッセイは、本発明の核酸の発現の変化（増加または減少）、このような核酸によりコードされるタンパク質産物レベルの増加または減少、あるいはこのようなタンパク質の活性の増加または減少の存在を検出してもよい。
【００４５】
本発明のさらに別の側面によると、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患の治療に潜在的に有用な化合物を同定する方法であって、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性または量の調節能について化合物をアッセイすることを含んでなる上記方法が、提供される。好ましくは、アッセイは、
ｉ）ＡＣＣ２スプライスバリアントを発現する細胞株を用いるか、または精製ＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質を用いた、ＡＣＣ２スプライスバリアントの活性の測定；
ｉｉ）ＡＣＣ２スプライスバリアント及びＡＣＣ２野生型を発現する細胞株を用いるか、または精製ＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）タンパク質複合体を用いた、ＡＣＣ２活性の測定；ならびに、
ｉｉｉ）ＡＣＣ２スプライスバリアントを発現する細胞株における、ＡＣＣ２スプライスバリアントの転写または翻訳の測定；
から選択される。
【００４６】
該方法は、単離されたＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体を用い、そしてマロニルＣｏＡ生成に関して前記複合体の活性を測定することによって、実行可能である。該測定は、無細胞アッセイにおいては、前記複合体により形成された生成した無機リン酸塩のマラカイトグリーン検出を用いて、または１４ＣＯ２の１４Ｃ−マロニルＣｏＡへの取り込みの測定によって、実行可能である。該方法は、細胞ベースアッセイにおいては、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体を発現する細胞株を用いて、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体の活性を測定することによって、実行可能である。ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体を発現する細胞株を用いて、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントの複合体の転写及び／または翻訳の測定を実行可能である。一実施態様において、疾患または障害は、肥満、２型糖尿病または異脂肪血症からなる群より選択される。
【００４７】
ＡＣＣ２スプライスバリアントの転写または翻訳に対する試験化合物の効果を測定するために用いられるアッセイは、
ｉ）  例えばノーザンブロット解析または定量性リアルタイムＰＣＲを用いた、形成されたＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡの量の測定；
ｉｉ）  例えばウエスタンブロット解析またはＥＬＩＳＡなどの免疫化学的解析を用いた、形成されたＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質の量の測定；
ｉｉｉ）  ＡＣＣ２スプライスバリアントを発現する細胞における、上述のようなＡＣＣ２スプライスバリアントの活性の測定；
に基づくことが可能である。
【００４８】
アッセイにおいて用いられる細胞は、ＡＣＣ２スプライスバリアントを天然に発現する細胞か、または組換えＡＣＣ２スプライスバリアントを発現するトランスフェクトされた細胞であることが可能である。好ましくは、ＡＣＣ２スプライスバリアントは、ヒト組換えＡＣＣ２スプライスバリアントである。
【００４９】
単独の、または野生型ＡＣＣ２と共発現させたＡＣＣ２スプライスバリアントを、細菌、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞ならびにヒト及び動物細胞などの多様な宿主において発現させてもよい。組換え真核宿主細胞が、特に好ましい。例としては、酵母、ならびにヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類起源の細胞株を始めとする哺乳動物細胞、ならびに、ショウジョウバエ及びカイコ由来細胞株を始めとする昆虫細胞が挙げられる。用いられてもよく、かつ市販されている哺乳動物種由来細胞株としては、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ATCC CCL 1.3）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ATCC CCL 1.2）、ＨＥＫ  ２９３（ATCC CRL 1573）、Ｒａｊｉ（ATCC CCL 86）、ＣＶ−１（ATCC CCL 70）、ＣＯＳ−１（ATCC CRL 1650）、ＣＯＳ−７（ATCC CRL 1651）、ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL 61）、３Ｔ３（ATCC CCL 92）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ATCC CRL 1658）、ＨｅＬａ（ATCC CCL 2）、Ｃ１２７Ｉ（ATCC CRL 1616）、ＢＳ−Ｃ−１（ATCC CCL 26）及びＭＲＣ−５（ATCC CCL 171）が挙げられる。
【００５０】
単独の、または野生型ＡＣＣ２と共発現させたＡＣＣ２スプライスバリアントをコードする核酸を含んでなる発現ベクターを、リン酸カルシウム形質転換、ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換、陽イオン性脂質を介したリポフェクション、電気穿孔または感染を始めとする多数の技術のいずれか一つを介して、宿主細胞に導入して、ポリペプチドを発現させてもよい。
【００５１】
形質転換された宿主細胞を、例えば限界希釈によって、増殖させ、そしてクローン化し、そして解析して、組換えＡＣＣ２スプライスバリアント／野生型ＡＣＣ２の発現レベルを測定する。単独の、または野生型ＡＣＣ２を伴うＡＣＣ２スプライスバリアントを発現する形質転換された宿主細胞の同定を、抗体との免疫学的反応性及び／または本明細書に記載されるアッセイを用いた生物活性の検出を始めとするいくつかの手段によって、成し遂げてもよい。
【００５２】
遺伝子発現の転写制御は、遺伝子の転写を媒介する転写因子の結合を指示するプロモーター中の特定のＤＮＡエレメントによって、媒介される。真核細胞の転写因子を、二つの主な群：ｉ）転写の開始に近位のプロモーター配列と相互作用し、それによってＲＮＡポリメラーゼＩＩの動員により転写を開始する、基本転写因子、ならびに、ｉｉ）特定の遠位プロモーターエレメントに結合し、それによって基本転写機構との接触により転写を調節する、転写因子；に分けることが可能である。真核生物体における基本的な生理学的過程とは、細胞がその環境と連絡し、そしてホルモン及び成長因子などのシグナリング分子を介した細胞外刺激に応答することが可能であるということである。このようなシグナリングの最終的な事象は、転写因子が特定の遠位プロモーターエレメントに結合して、例えば、遺伝子発現の増加または組織特異的な遺伝子発現へと導くことである。それらの制御的役割のために、プロモーターエレメントは、治療剤のスクリーニングのための推定される標的である。
【００５３】
適切な宿主細胞は、ＡＣＣ２スプライスバリアントを発現することが公知の細胞であるか、またはＡＣＣ２スプライスバリアントの転写に影響を与えることが可能な転写因子を発現することが公知の細胞である。好ましくは、特定の転写因子をコードするＤＮＡでトランスフェクトした宿主細胞を用いて、定義された転写因子とＡＣＣ２スプライスバリアントのプロモーターとの相互作用を研究することが可能である。
【００５４】
ＡＣＣ２スプライスバリアントの転写に対する試験化合物の効果を測定するために用いられるアッセイは、レポーター遺伝子系を用いたＡＣＣ２スプライスバリアントのプロモーター活性の測定に基づくことが可能である。レポーター遺伝子系は、ＡＣＣ２スプライスバリアントのプロモーターを構成している核酸分子またはそのフラグメントを含んでなる発現系であり、ここで、発現系はレポーター遺伝子をさらに含んでなり、プロモータ及びレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現がＡＣＣ２スプライスバリアントのプロモーターによって制御されるように配置される。形成されるレポータータンパク質の量は、ＡＣＣ２スプライスバリアントのプロモーター活性の指標として用いられる。
【００５５】
レポーター遺伝子系の構築に用いることが可能な適切なレポーター遺伝子は、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）遺伝子及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【００５６】
本発明の別の側面によると、医薬組成物を調製する方法であって、
ｉ）  肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患の治療に有用な化合物を、本明細書に記載されるような方法によって同定すること；ならびに、
ｉｉ）  化合物または医薬的に許容可能なその塩を、医薬的に許容可能な賦形剤または希釈剤と混合すること；
を含んでなる上記方法が、提供される。
【００５７】
診断または予後への適用は、各スプライスバリアント型の相対量の測定に基づいて、存在してもよい。治療への適用のさらなる方法は、種々のスプライスバリアント型の発現または量を調節することによって利用可能であってもよい。
【００５８】
このように、本発明のさらなる側面によると、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患を発症する個体の感受性を判定する方法であって、個体が発現するＡＣＣ２の野生型とスプライスバリアント型の相対量を測定し、そして肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患を発症する個体の感受性を、存在する相対量に基づいて判定することを含んでなる上記方法が、提供される。
【００５９】
本発明のさらなる側面によると、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患の重症度を診断する方法であって、個体が発現するＡＣＣ２の野生型とスプライスバリアント型の相対量を測定し、そして疾患の重症度を存在する相対量に基づいて判定することを含んでなる上記方法が、提供される。
【００６０】
一実施態様においては、ＡＣＣ２の型の量を、筋肉の生検試料より測定する。さらなる実施態様において、該診断方法を用いて、治療のタイプを評価することが可能である。さらなる実施態様において、該方法を用いて、個体が発現するＡＣＣ２の全長型とスプライスバリアント型の相対量を、治療の間にモニターすることによって、個体の治療の有効性を評価することが可能である。例えば、治療の前、間及び後にモニターすることによる。
【００６１】
別の側面において、本発明はまた、脂肪酸酸化能の障害に関連する障害を有する個体を診断する方法であって、本発明のＡＣＣ２スプライスバリアントの存在または相対量について個体をアッセイすることを含んでなる上記方法も、提供する。特定の実施態様において、該障害は肥満である。適切なアッセイとしては、核酸ベースのアッセイ（本発明の核酸、または本発明の核酸を特異的に同定可能なものを用いる）及びタンパク質ベースのアッセイ（本発明の抗体またはポリペプチドを用いる）が挙げられる。
【００６２】
本発明のさらに別の側面において、患者から得たＤＮＡ試料中のＡＣＣ２スプライスバリアント遺伝子またはその選択部分の配列解析を含んでなる診断方法であって、肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患を発症する感受性を判定するための上記方法が、提供される。
【００６３】
本発明による遺伝子の知識はまた、例えばアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡの使用による、ｉｎ  ｖｉｖｏでその発現を制御する能力も、提供する。特定の遺伝子または遺伝子転写物（例えば、本明細書において特定されたＡＣＣ２スプライスバリアント）の発現レベルを阻害するかまたは弱める一つの治療手段は、アンチセンス療法を用いることである。アンチセンス療法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成セグメント（「オリゴヌクレオチド」）であって、特定のｍＲＮＡ配列を鏡映し、かつタンパク質産生をブロックするよう設計された、アンチセンス核酸分子を利用する。形成されると、ｍＲＮＡは、効果的にＲＮＡ配列を読み、そして遺伝子により指示された特定のタンパク質分子を製造する細胞のタンパク質産生「工場」であるリボソームに、結合する。アンチセンス分子が、（例えば、天然オリゴヌクレオチドとして、または適切なアンチセンス発現ベクターを介して）細胞に送達されるならば、それは、その配列が標的塩基配列の相補体であるよう設計されているため、メッセンジャーＲＮＡに結合する。二つの鎖が結合すると、ｍＲＮＡは、コードされたタンパク質のリボソームによる製造をもはや指示することができず、そして細胞の酵素によって急速に分解され、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチドを解放して、これが別のｍＲＮＡ同一メッセンジャー鎖を求め、そして不能にする。
【００６４】
本明細書にて教示されるＡＣＣ２スプライスバリアントの遺伝子及びｍＲＮＡ配列を知った上で、当業者は、適切なアンチセンス核酸の治療用分子を設計し、そしてそれを必要に応じて投与することが可能である。
【００６５】
治療の潜在性を伴うアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を、確立された技術を用いて実験により判定することが可能である。本発明のＡＣＣ２スプライスバリアント遺伝子の発現を低下させる方法を、哺乳動物細胞において可能にするため、アンチセンス発現コンストラクトの例を、例えばｐＲＥＰ１０ベクター（インビトロジェン・コーポレーション）を用いて、容易に構築することが可能である。転写物は、このタイプのコンストラクトでトランスフェクトされた細胞において、遺伝子の翻訳を阻害することが予想される。アンチセンス転写物は、天然の遺伝子転写物の翻訳を阻害するのに有効であり、そして本明細書に記載される効果（例えば、組織生理の制御）を誘導することが可能である。ＡＣＣ２スプライスバリアント遺伝子のｍＲＮＡのいずれの部分とも相補的かつハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、治療での使用が意図される。１９９７年６月１７日に発行された米国特許第5,639,595「Identification of Novel Drugs and Reagents」には、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を呈するオリゴヌクレオチド配列を同定する方法について完全に記載されている。該出願は、参照により本明細書に記載されているものとする。ＡＣＣ２スプライスバリアント遺伝子配列由来のランダムなオリゴヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを、細胞に形質転換する。次いで、細胞を、所望のオリゴヌクレオチド活性がもたらすフェノタイプに関してアッセイする。所望のフェノタイプの細胞が同定されたならば、所望の活性を有するオリゴヌクレオチドの配列を同定することが可能である。同定は、ベクターを回収することによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、ならびに挿入された核酸材料を含有する領域の配列決定により、遂行してもよい。アンチセンス分子を、アンチセンス療法用に合成してもよい。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートなどのＤＮＡの安定誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどのＲＮＡの安定誘導体、あるいは他のオリゴヌクレオチドミメティックであってもよい。１９９７年７月２９日に発行された米国特許第5,652,355「Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates」、または１９９７年７月２９日に発行された米国特許第5,652,356「Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides」は、生理学的に安定なアンチセンス分子の合成及び効果について記載しており、該出願は、参照により本明細書に記載されているものとする。アンチセンス分子を、マイクロインジェクション、リポソーム封入によって、またはアンチセンス配列を保有するベクターからの発現によって、細胞内に導入してもよい。
【００６６】
上記のように、アンチセンス核酸分子をＲＮＡとしても提供してよく、これは、いくつかの安定型ＲＮＡが長い半減期を有し、ベクターを使用せずに直接的に投与されてもよいことが、現在、当該技術分野において公知のためである。加えて、ＤＮＡコンストラクトを、リポソーム、受容体を介したトランスフェクション、及び当該技術分野に公知の他の方法によって、細胞に送達してもよい。
【００６７】
標的遺伝子と連携するためのアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを、慣用の手段を用いて、上述のような標準的な分子生物学及び／または化学合成によって作製することが可能である。所望の場合には、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解を防ぐように、または細胞膜を介して継代を促進するように化学修飾してもよく、ならびに／あるいは、例えばリボザイムなどのｍＲＮＡを不活化可能な物質を、それと連結させてもよく、そして本発明はこのようなコンストラクトにまで及ぶ。
【００６８】
アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを、ＡＣＣ２スプライスバリアント遺伝子産物の産生が過剰に制御されているか、または制御が十分でないことに関わるヒトにおける疾患または障害の治療に、利用してもよい。
【００６９】
あるいは、リボザイム分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡを切断及び破壊するよう設計してもよい。リボザイムは、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。ハンマーヘッド型リボザイムは、ヌクレオチド配列において標的ＲＮＡの少なくとも一部と相補的なハイブリダイズする領域、ならびに標的ＲＮＡを認識し、そして切断するのに適応した触媒領域を、含んでなる。ハイブリダイズする領域は、好ましくは、少なくとも９ヌクレオチドを含有する。このようなリボザイムの設計、構築及び使用は当該技術分野において周知であり、そしてHaselhoff及びGerlach（Nature 334:585-591, 1988年）により十分に記載されている。別の選択肢では、三重らせん構造を形成するようにＡＣＣ２スプライスバリアント遺伝子の５’領域とハイブリダイズするよう設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、ＡＣＣ２スプライスバリアント遺伝子の転写をブロックまたは低下させてもよい。別の選択肢では、プラスミドベクターにクローニングした、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドまたは短い（１８〜２５ｂｐ）ＲＮＡｉのＡＣＣ２スプライスバリアント配列を、二本鎖ＲＮＡを哺乳動物細胞に導入してＡＣＣ２スプライスバリアントのメッセンジャーＲＮＡを阻害し、かつ／またはその分解をもたらすように設計する。ＡＣＣ２スプライスバリアントのＲＮＡｉ分子は、アデニン／アデニン（ＡＡ）または少なくとも（任意の塩基−Ａ、Ｕ、ＣまたはＧ）Ａで始まってもよく、そして好ましい長さが２１塩基対である、１８または１９または２０または２１または２２または２３または２４または２５塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子からなってもよく、そして２個のヌクレオチド３’オーバーハング、またはヘアピン形成４５〜５０ｍｅｒ  ＲＮＡ分子を有する個々のＡＣＣ２スプライスバリアント配列に特異的であってもよい。このような阻害ＲＮＡ小分子の設計、構築及び使用は当該技術分野において周知であり、かつ以下により十分に記載されている：Elbashirら（Nature 411(6836):494-498, 2001年）；Elbashirら（Genes & Dev. 15:188-200, 2001年）；Harborth, J.ら（J. Cell Science 114:4557-4565, 2001年）；Mastersら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8012-8017, 2001年）；及び、Tuschlら（Genes & Dev. 13:3191-3197, 1999年）。
【００７０】
本発明のさらなる側面によると、ＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質またはＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）タンパク質複合体上で作用する小分子薬物、あるいはＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡに対して作用する阻害核酸分子を用いた治療を必要とするヒトを治療する方法であって、
ｉ）  ヒトから得た適切な試料中のＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡのレベルを、測定すること；
ｉｉ）  ＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡの正常レベルを参照することにより、ヒトの状態を判定すること；及び、
ｉｉｉ）  有効量の薬物または阻害核酸分子を投与すること；
を含んでなる上記方法が、提供される。
【００７１】
本発明のさらなる側面によると、ＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質またはＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）タンパク質複合体上で作用する小分子薬物、あるいはＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡに対して作用する阻害核酸分子を用いた治療を必要とするヒトを治療する方法であって、
ｉ）  ヒトから得た適切な試料中のＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質またはＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）タンパク質複合体のレベルを、測定すること；及び、
ｉｉ）  前記タンパク質の正常レベルを参照することにより、ヒトの状態を判定すること；及び、
ｉｉｉ）  ＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡに対して作用する、有効量の薬物または阻害核酸分子を投与すること；
を含んでなる上記方法が、提供される。
【００７２】
肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害を患う患者の治療方法であって、ＡＣＣ２スプライスバリアントの転写または発現を低下させることが可能な化合物または核酸分子を患者に投与することを含んでなる、上記治療方法。
【００７３】
肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害を患う患者の治療方法であって、ＡＣＣ２スプライスバリアントｍＲＮＡを標的とする阻害核酸分子を患者に投与することを含んでなる、上記治療方法。
【００７４】
肥満、２型糖尿病、異脂肪血症、及び脂肪酸酸化能の障害に関連する他の障害などの疾患を治療するための薬剤の製造における、ＡＣＣ２スプライスバリアント核酸に対する阻害核酸分子、またはＡＣＣ２スプライスバリアントタンパク質に対する抗体の使用。
【００７５】
本発明の上記の側面のそれぞれにおいて、「阻害核酸分子」は、アンチセンス、リボザイム、三重らせん、アプタマー（aptemer）及びＲＮＡｉ分子：からなる群より選択される。
【００７６】
特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記されるすべての出版物は、参照により本明細書に記載されているものとする。
【００７７】
実験セクション
これより、本発明を、以下の非限定的な実施例に関して例示していくことにする。
パーキンエルマーCetus社から入手可能なＡＭＰＬＩＴＡＱ（商標登録）を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの源として用いる。
【００７８】
本発明の実行には、特に示されない限り、当該技術分野における技能の範囲内にあるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の慣用の方法が用いられるであろう。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第３版）」（Sambrookら編集、コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（2001年））； 「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編集、John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク州（2002年））； 「DNA Cloning 3: A Practical Approach, 第Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ巻」（Glover及びHames編集、ＩＲＬプレス、オックスフォード（1995年））； 「Methods in Enzymology」（Colowick及びKaplan編集、アカデミックプレス）、「Handbook of Experimental Immunology」（Weirら編集、第５版、Blackwell Scientific Publications, Ltd., エディンバラ（1997年））； 「Fields Virology（第３版）第Ｉ及びＩＩ巻」（Fields、Knipe及びHowley編集、Lippincott Williams & Wilkins Pubs.（1996年））； 「Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control」（Flintら編集、ＡＳＭプレス（1999年））； 「Current Protocols in Immunology」（Coliganら編集、John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク州（2002年））を参照されたい。
【００７９】
本発明は、記載される特定の方法論、プロトコール、細胞株、ベクター及び試薬に限定されず、これらを変えてもよいことが、理解される。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
ヒトアセチルｃｏａカルボキシラーゼ２の新規スプライスバリアントであるＡＣＣ２（１ｂ）のコンピューターによる予測
ヒトＡＣＣ２の新規スプライスバリアントの配列を、新規の配列情報とコンピューターによる予測方法との組み合わせを用いて同定した。ヒトＡＣＣ２のＥＭＢＬ登録であるＨＳＵ８９３４４を、ヒトゲノムＤＮＡを含有するＥＭＢＬ登録に対してＢＬＡＳＴ検索した（Ｂｌａｓｔ２  ＮＣＢＩ）。第１２染色体から得たヒトＢＡＣクローンであるRCPI11-443D10は、ヒトＡＣＣ２をコードする遺伝子を含有することが見いだされた。該クローンのゲノム配列は、ＥＭＢＬ登録ＡＣ００７６３７に見つけられた。
【００８１】
ヒトＡＣＣ２の遺伝子構造を、ＨＳＵ８９３４４とＡＣ００７６３７との間の配列比較を用いて解析した。配列比較を用いてエキソンを予測し、そして正確なエキソン境界を、イントロンのスプライスコンセンサス部位を用いて予測した。配列比較は、ヒトＡＣＣ２遺伝子が５２個のコーディングエキソンからなることを示した。複数のミスマッチが、ＨＳＵ８９３４４の配列とＡＣ００７６３７のゲノム配列との間に見つけられた。ヒトＡＣＣ２の補正された配列を、ＡＣＣ２の予測されるコード配列を得るために、５２個のコーディングエキソンの配列を貼り合わせることによって作製した。一事例において、ＨＳＵ８９３４４の配列の一部を、異型のスプライスシグナルに隣接するイントロン配列からなると予測し、そしてそれゆえに、ヒトＡＣＣ２の予測される補正されたコード配列から削除した。
【００８２】
予測されるヒトＡＣＣ２配列を用いてＥＭＢＬのＥＳＴ部分に対して行ったＢｌａｓｔ２（ＮＣＢＩ）解析は、遺伝子エキソン２配列へとスプライスされる新規５’末端を有する二つのマウスＥＳＴ配列（マウスＥＳＴ  ＢＢ８５４１４５及びＢＢ８６６０６５）があることを示した。これら二つのＥＳＴの新規５’末端とヒトゲノムＤＮＡとの間の配列比較は、該配列がヒトにおいて保存されていることを示した。さらに、この保存された配列は、別の開始ＡＴＧを含有し、そしてマウスとヒト双方のゲノムＤＮＡにおいて、５’コンセンサススプライス部位が後に続くことが、見いだされた。したがって、この配列は、二者択一的に用いられるユニークなＡＣＣ２の開始エキソンをコードするようである。このエキソンを、（ＨＳＵ８９３４４において用いられる開始ＡＴＧを含有するエキソン１ａに対して）エキソン１ｂと称し、そして新たなエキソンを含む遺伝子構造のスキームを、図１に示す。
【００８３】
ヒトＡＣＣ２（１ｂ）の新規スプライスバリアントのコード部分を、エキソン１ｂのコード配列を予測されるエキソン２〜５２の配列へとスプライスすることによって、構築した（新規スプライス型の予測されるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、配列番号５及び１にそれぞれ示す）。
【００８４】
図２に、ヒトＡＣＣ２とヒトＡＣＣ２（１ｂ）のアミノ酸配列の配列比較を示す。配列比較は、以下のパラメータ：
ギャップの重み：８    平均マッチ：２．９１２
長さの重み：２    平均ミスマッチ：−２．００３
質：１１６６５    長さ：２４６１
割合：５．１７１    ギャップ：１
パーセント類似性：９９．５１２    パーセント同一性：９９．４２３
を用いたＧＣＧギャップ（ウィスコンシン社）を用いて行った。
【００８５】
（実施例２）
ヒトＡＣＣ２のクローニング
組換えＡＣＣ２産生のための手段を開発するために、ヒトＡＣＣ２をコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってヒト骨格筋ｍＲＮＡからクローニングした。ＡＣＣ２の７．５ｋｂ配列を網羅する三つのフラグメント全部をＰＣＲ増幅し、そして複数のクローンを配列決定した。
【００８６】
１〜３９２５の第一フラグメントを、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリから、プルーフリーディングポリメラーゼｐｆｕ（ストラタジーン社）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーは、それぞれ、順方向プライマーとして5’-ATGGTCTTGCTTCTTTGTCTATC-3’（配列番号６）、及び逆方向プライマーとして5’-GGCTGTTTAACACATAGGCGA-3’（配列番号７）であった。該産物を、「ＴＡ」クローニングベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、大腸菌（E. coli）ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ細胞（ストラタジーン社）に形質転換し、そして二本鎖を完全に配列決定した。
【００８７】
それぞれ３２５０〜５３５６ｂｐ及び５３３５〜７３０２ｂｐの第二及び第三フラグメントを、ヒト骨格筋ｃＤＮＡから、Taq-plus Precision（ストラタジーン社）を用いてＰＣＲ増幅した。第二ＰＣＲフラグメントに関しては、5’-CAGAGCATGGTGCAGTTGGT-3’（配列番号８）を順方向プライマーとして、そして5’-CCATGTCTTCCAGGAGAGGTCC-3’（配列番号９）を逆方向プライマーとして用いた。第三ＰＣＲフラグメントに関しては、5’-TCGTCATCGGCAATGACATA-3’（配列番号１０）を順方向プライマーとして、そして5’-GGTCCACCTCCGGCCC-3’（配列番号１１）を逆方向プライマーとして用いた。該ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、そして大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ  １０細胞（インビトロジェン社）に形質転換し、そして二本鎖を配列決定した。
【００８８】
その結果は、すべてのクローンのヌクレオチド配列が、公開されたｃＤＮＡ配列（受入番号NM_001993）とは有意に異なるが、しかしヒトゲノムプロジェクトならびに公開データベース中に見つけられるＥＳＴから得られたゲノム配列とはかなり一致することを、示した。
【００８９】
完全長のＡＣＣ２  ｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターから消化されてできた三つのフラグメントの連結によって、貼り合わせた。これらのフラグメントは、１〜３２８８ｂｐ、３２８８〜５３２３ｂｐ及び５３２３〜７３０２ｂｐを含み、ＢａｍＨ１部位を、二つの内部部位を繋ぎ合わせるために用いた。完全長ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）内に連結した。
【００９０】
ｐｃＤＮＡ−ＡＣＣ２のＣＯＳ−７細胞及びＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションにより、ヒトＡＣＣ２に対する抗体によって検出されるように、高レベルのＡＣＣ２発現が生じた。
【００９１】
ヒトＡＣＣ２のＮ末端領域におけるＮ末端選別シグナルのコンピューターによる予測を、ｉＰＳＯＲＴ予測ソフトウェアを用いて行った（Bannaiら、Bioinformatics 18:2, 298-305, 2002年）。ヒトＡＣＣ２（配列番号２）、及びコンピューターによるヒトＡＣＣ２のＮ末端切り詰めを解析し、そしてｉＰＳＯＲＴにより予測を行った。完全長ヒトＡＣＣ２は、シグナルペプチドを包含することが予測された。配列：ＭＶＬＬＬの切り詰めは、ｉＰＳＯＲＴ予測を「シグナルペプチド」から「ミトコンドリア輸送ペプチド」へと変える。配列：ＭＶＬＬＬＣＬを排除するさらなるＮ末端切り詰めは、ヒトＡＣＣ２のＮ末端における標的サインの消失をもたらす。
【００９２】
（実施例３）
ヒト組織のＴａｑＭａｎ解析により、ＡＣＣ２（１ｂ）転写物の存在を確認する
ｈＡＣＣ２（１ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを、プライマーエクスプレス１．５ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて設計した。順方向プライマー5´-AGTCCTGCCAAGTGCAAGATCT-3´（配列番号１２）、逆方向プライマー5´-TCTGTGCAGGTCCAGCTTCTT-3´（配列番号１３）及びＦＡＭ標識プローブ5´-TGATCGCGAAGTAAAGCCGAGCATGT-3´（配列番号１４）を、エキソン１Ｂ及びエキソン２を網羅するよう設計した。ヒト酸性リボソームリンタンパク質（ｈ３６Ｂ４）のプライマー及びＶＩＣ標識プローブを、内在性対照として用いた。
【００９３】
第一鎖ｃＤＮＡを、スーパースクリプトＩＩＩ（インビトロジェン社）及びオリゴＤｔプライマーを用いて、１００ｎｇのポリＡ＋  ＲＮＡ（脂肪組織）及び１μｇのＲＮＡ（心筋、骨格筋及び肝臓）から合成した。ヒト心筋（アンビオン社）、骨格筋（アンビオン社）、肝臓（ＢＤバイオサイエンシズ社）及び脂肪組織（ＢＤバイオサイエンシズ社）におけるＡＣＣ２（１ｂ）の発現を測定するため、リアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩプリズム７５００検出システム、アプライド・バイオシステムズ社）を用いた。ＰＣＲを、Taqman Universal PCR Mastermix（アプライド・バイオシステムズ社）を用いることによって行い、これにプライマー及びプローブを加え、そして予想されるサイズのリアルタイムＰＣＲ産物を、３％アガロースゲル上で確認した。７５００リアルタイムＰＣＲシステム・シーケンス検出ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ社）を、解析に用いた。図３中の結果は、ＡＣＣ２（１ｂ）の転写物レベルが、脂肪組織＞骨格筋＞心筋＝肝臓であり、試料（ｎ＝４）間でほとんどまたは全くばらつきがないことを示している。
【００９４】
（実施例４）
ヒトＡＣＣ２（１ｂ）のクローニング
ＡＣＣ２（１ｂ）クローンを作製するために、我々は、エキソン１のみが、ＡＣＣ２とそのスプライスバリアントであるＡＣＣ２（１ｂ）との間で異なるとの事実を用いた。補正された配列（配列番号２）のヒトＡＣＣ２をコードするｃＤＮＡを含有するベクターを、出発材料として用いた。二つの制限酵素Ｎｈｅ１及びＨｉｎｄ３の切断部位を用いて、ＡＣＣ２のＮ末端の配列を切り離し、そしてこれをユニークなＡＣＣ２（１ｂ）のＮ末端をコードするフラグメントに置き換えた。Ｎｈｅ１認識配列は、ＡＣＣ２開始コドンのすぐ上流にあるベクターのマルチクローニング部位に存在し、一方で、Ｈｉｎｄ３部位は、ＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）との間で共通の、下流の天然配列中に存在した。ユニークなＡＣＣ２（１ｂ）のＮ末端をコードし、さらにそれに続く共通のＡＣＣ２／ＡＣＣ２（１ｂ）配列も含むｃＤＮＡを、ヒト心臓ｃＤＮＡから、Taqplus（商標登録）precision（ストラタジーン社）を用いて増幅した。Ｎｈｅ１部位を含有する順方向ＰＣＲプライマーは、5´-ATAAGCTAGCGCCACCATGAGTCCTGCCAAGTGCA-3´（配列番号１５）であり、そして天然Ｈｉｎｄ３部位下流の逆方向プライマーは、5´-TCCTCCGCACTCTCAGCCTTCCGGATT-3´（配列番号１６）であった。
【００９５】
ＡＣＣ２のｃＤＮＡを包含するベクターと上記のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ産物の双方を、制限酵素Ｎｈｅ１及びＨｉｎｄ３を用いて消化し、切断された産物を取り除き、次いで挿入断片（ＰＣＲ産物）をベクター内に連結した。生じた連結産物を、大腸菌ＴＯＰ−１０細胞に形質転換し、そしてＡＣＣ２（１ｂ）配列のベクター内への挿入を、ジデオキシ配列決定により確認した。
【００９６】
（実施例５）
ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＣＣ２（１ｂ）の機能発現
実施例１及び３に記載されるｃＤＮＡを包含するベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）２９３細胞の一過性トランスフェクションに用いた。５μｇの上記プラスミド／１０ｃｍペトリ皿で、細胞に、親油性トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。細胞単層は、トランスフェクション時（第１日）に〜６０％コンフルエントであり、そして回収時（第４日）には完全にコンフルエントであった。これらのトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得た細胞溶解物を、１４ＣＯ２固定化アッセイを用いて、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性についてモニターした。図４に示されるデータは、クエン酸により刺激された、発現したＡＣＣ２（１ｂ）の活性を示す。ＡＣＣ２でトランスフェクトされた細胞から得た溶解物とともに行った、ＡＣＣ２（１ｂ）細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、二つのタンパク質間の分子量の予想される差異を示し、ここで前者は、完全長ＡＣＣ２よりもわずかに速く移動した（データは示さず）。このように、ＡＣＣ２のスプライスバリアントであるＡＣＣ２（１ｂ）は、クエン酸により刺激される触媒活性、ならびにゲル電気泳動中の予想されるより速い移動速度を実証している。Ｎ末端ＡＣＣ２配列を特異的に認識する抗体（エピトープ＝アミノ酸４５〜６４）ならびに共通のＡＣＣ２／ＡＣＣ２（１ｂ）配列に対する抗体（エピトープ＝アミノ酸１３３５〜１３５４）を用いた比較ウエスタン解析を、行った。前者の抗体はＡＣＣ２ペプチドのみを認識したが、後者はＡＣＣ２ペプチドとＡＣＣ２（１ｂ）ペプチドの双方を識別し、したがって、二つのタンパク質間のＮ末端配列の差異が確認された。
【００９７】
（実施例６）
ＡＣＣ２（１ｂ）抗体
ユニークなヒトＡＣＣ２（１ｂ）のＮ末端と同一の合成ペプチドMSPAKCKICFPDREVK（配列番号３）を、ウサギの免疫に用いた。同ペプチドを、樹脂に結合させ、そして生じた血清のアフィニティ精製に利用すると、ＡＣＣ２（１ｂ）を特異的に認識するＩｇＧ画分が得られた。ＡＣＣ２、ＡＣＣ２（１ｂ）及びモックをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得た細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてタンパク質を、１：５０００に希釈した産生されたproduce抗体（二次抗体＝１：２５０００に希釈したヤギ抗ウサギＨＲＰ結合）を用いるウエスタンブロットのために、ＰＶＤＦに移行した。ＥＣＬプラス（化学発光）を用いた検出、及びそれに続くフィルムへの露出により、ＡＣＣ２ペプチドがクマシー染色により確認されるように存在するにもかかわらず、モックをトランスフェクトされた細胞溶解物においてもＡＣＣ２をトランスフェクトされた細胞溶解物においても全く認識されないＡＣＣ２（１ｂ）に相当する特異的バンドが、同定された（図５）。
【００９８】
（実施例７）
ヒト心臓及び骨格筋の免疫染色
図６は、ベンタナ社のヤギ抗ウサギ抗体（ＨＲＰ結合、１：５００希釈）と組み合わせて、実施例６に記載したＡＣＣ２（１ｂ）抗体（１：１００希釈）で染色した、ヒト骨格筋を示す。染色を、１０倍過剰の合成ペプチドMSPAKCKICFPDREVK（配列番号３）の非存在下（図６Ａ）または存在下（図６Ｂ）、あるいは第一抗体なし（図６Ｃ）で行った。図６Ａ及び図６Ｂの比較は、ペプチドによる前吸着が染色をブロックし、そしてそれによってＡＣＣ２（１ｂ）抗体と内因性酵素との間の特異的相互作用が実証されることを、示している。さらに、図６Ｃは、第二抗体のみの存在下では発色しないため、染色が第一抗体のみによって媒介されることを実証している。しかしながら、完全長ＡＣＣ２とスプライスバリアントであるＡＣＣ２（１ｂ）の双方を認識する抗体（ＡＣＣ２−４、１：１００希釈）を用いたヒト骨格筋の免疫染色は、ペプチドMSPAKCKICFPDREVK（配列番号３）による前吸着によってブロックされず（図６Ｄ）、ＡＣＣ２（１ｂ）抗体と内因性エピトープであるＡＣＣ２（１ｂ）との間の相互作用における特異性を、さらに支持している。図６Ｅ及びＦは、１：１００希釈を用いたヒト心筋（心房）のＡＣＣ２（１ｂ）抗体による染色を示す。このように、ＡＣＣ２（１ｂ）スプライスバリアントのタンパク質は、ＡＣＣ２（１ｂ）が骨格筋及び心臓などの酸化力のある天然のヒト組織の免疫染色によって検出可能なことから、天然に存在することが示されている。
【００９９】
（実施例８）
ＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体の形成
ＨｉｓタグをＣ末端上に融合させたヒトＡＣＣ２を、発現させる（ｈＡＣＣ２−６ｘＨｉｓ）。発現させた融合タンパク質を含有する細胞溶解物を、クエン酸非存在下でニッケル樹脂カラムと平衡化させ、そしてそれに結合させる。組換えヒトＡＣＣ２（１ｂ）を包含する細胞溶解物を、適切な量のクエン酸を含有する溶剤を含むカラムに通して、ＡＣＣ２のコンフォメーション移行、及びそれに続く、ニッケル樹脂に結合しているＡＣＣ２と添加した可溶性ＡＣＣ２（１ｂ）との間の複合体形成を、誘導する。平衡化バッファーを用いていかなる過剰のＡＣＣ２（１ｂ）も洗い落とした後に、適切な濃度のイミダゾールを含有する溶出バッファーを加え、そしてＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）生成物を収集し、そして試験化合物用に用いた。形質転換されて、生理学的に関連性のあるレベルのＡＣＣ２とＡＣＣ２（１ｂ）双方を発現する細胞株を、確立することが可能である。
【０１００】
（実施例９）
ＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体による、マロニルＣｏＡ生成を阻害する化合物のスクリーニング
無細胞アッセイにおけるＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体の阻害を、触媒中に形成される生成した無機リン酸塩のマラカイトグリーン検出と、１４ＣＯ２の酸安定性１４Ｃ−マロニルＣｏＡへの取り込みの直接測定の双方を用いて、モニターすることが可能である。組換えヒトＡＣＣ２−ＡＣＣ２（１ｂ）複合体を発現する全細胞における化合物の効果を、処理細胞対対照細胞から得た細胞溶解物中のマロニルＣｏＡ濃度をモニターすることにより、測定する。マロニルＣｏＡ濃度を、ミディアムスループット・スクリーニングに適したＨＰＬＣに基づくプロトコールを用いて、検出する。
【０１０１】
（実施例１０）
ＡＣＣ２遺伝子の遺伝子多型の検討
肝臓ＲＮＡを、ヨーロッパ起源の米国出身の１４例の個体から得て、そしてＡＣＣ２のｃＤＮＡを、ＡＣＣ２に特異的なプライマー（７３３６〜７３５５）を用いて、各試料から調製した。ＡＣＣ２の最も共通の配列を得るため、１１個の重複するＰＣＲ産物を、個々のｃＤＮＡから作製した。順方向プライマーにはＭ１３Ｆ配列を、そして逆方向プライマーにはＭ１３Ｒ配列を付けた。さらに、エキソン１、３６、４１及び５１を、５例の血縁関係にないヨーロッパ人から得たゲノムＤＮＡから、ならびに６０例の血縁関係にないヨーロッパ人から得たＤＮＡプールから、増幅させた。個々のＰＣＲ産物を、Ｍ１３Ｆ及びＭ１３Ｒプライマーを用いた色素ターミネーターによる配列決定によって、双方向に配列決定した。配列のトレースを、アセンブリーとクオリティに関して、polyphred／phrap／consedパッケージを使って遺伝子多型解析した。Ｓｅｑｍａｎを用いて、コンセンサス配列と配列番号２に開示された配列とを配列比較した。最も共通のハプロタイプのＡＣＣ２を同定するために、エキソン１１、４２及び４５も、血縁関係にないヨーロッパ人から得た２８のリンパ芽球腫細胞株におけるゲノムＤＮＡから配列決定した。
【０１０２】
【表１】
2008505637.tif 000003
【０１０３】
１１の遺伝子多型が、ＡＣＣ２のコード配列（配列番号２）においてみられた。これらの遺伝子多型に加えて、４５０６位にdb SNP rs2241220、Ｃ−Ｔがある。すべての肝臓の配列はホモ接合型のＣであるが、配列番号２はその位置にＴを有する。加えて、配列番号２は、５２５位及び１７９１位により低頻度のアリルを有する。しかしながら、これらの三つの位置は、アミノ酸配列に影響を及ぼさない。我々はまた、３’ＵＴＲの９番目の塩基における、約５０％のアリル頻度を伴うＡ−Ｇ遺伝子多型（rs2075262）、ならびにイントロン１０におけるアリル頻度が７％のＳＮＰ（rs7978168）及びイントロン４１におけるアリル頻度が２０％のＳＮＰ（rs2075259）も同定した。
【０１０４】
【表２】
2008505637.tif 000004
【０１０５】
配列番号２に示される配列は、最も共通のハプロタイプ１を表す。
１４例の個体は、１０％の頻度のアリルを検出する９５％の確率をもたらすであろう。最も共通の配列がどの配列であるかの見積もりに影響を及ぼす他のＳＮＰがあるとは、考えにくい。ハプロタイプ解析は、五つの異なるタンパク質配列を実証し、ここで三つの配列が、ポピュレーション内で共通である可能性が高い。ハプロタイプ１は最も共通であるが、しかし染色体の５０％のみを表す。アミノ酸置換は、保存的である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、新たなエキソン１ｂを含むヒトＡＣＣ２遺伝子構造を、スキームに示したものである。該遺伝子は、およそ１３０ｋｂであり、かつ、二者択一的に用いられる二つの開始ＡＴＧ含有開始エキソン（エキソン１ａ及びエキソン１ｂと称される）を含む、５３個のコーディングエキソンを含んでなる。
【図２】図２は、ヒトＡＣＣ２とヒトＡＣＣ２（１ｂ）のアミノ酸配列の配列比較を示す。
【図３】図３は、リアルタイムＰＣＲを用いて測定した、ヒト心臓、肝臓、骨格筋、脾臓及び脂肪組織中のＡＣＣ２（１ｂ）のＲＮＡ発現レベルを示す。
【図４】図４は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における、クエン酸により刺激された、発現したＡＣＣ２（１ｂ）の活性を示す。
【図５】図５ａ〜５ｂは、ＡＣＣ２、ＡＣＣ２（１ｂ）及びモックをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得た細胞溶解物の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続くウエスタンブロット解析の結果を示す。
【図６】図６ａ〜ｆは、ヒト心臓及び骨格筋の免疫染色を示す。
【図１】
2008505637.tif 000005
【図２】
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2008505637.tif 000007
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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