(57)【要約】  通常はＩＬ−２依存性の哺乳動物細胞をうまくトランスフェクションして、ＩＬ−２を、外的なＩＬ−２添加なしで増殖を維持するのに十分な量で発現させることができる。一つは小胞体でのみＩＬ−２を発現するが分泌しない細胞系であり、もう一つはＩＬ−２の分泌可能な細胞系であり、これらを開発し、試験した。ヒトドナー由来の一次細胞を用いた予備的な実験で、本発明の実行可能性を確認した。本発明は、遺伝学的に改変された細胞、それらの製造方法、加えて、癌の治療方法および免疫促進する方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に生理学的なレベルのＩＬ−２を発現する遺伝学的に改変された細胞を用いた免疫治療の方法であって、ここでＩＬ−２を発現する哺乳動物細胞は、
ＩＬ−２遺伝子を選択または構築し、
該ＩＬ−２遺伝子を有するレトロウイルスベクターを製造し、
ドナーまたは患者から細胞を回収し、
細胞を遺伝学的に改変し、
場合により、遺伝学的に改変された細胞を選択する
ことからなる方法によって製造され、さらに、該細胞は、それを必要とする患者に投与される、上記方法。
【請求項２】
ＩＬ−２遺伝子は、配列番号１１で示されるタンパク質、または、その機能的等価体をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＬ−２遺伝子は、配列番号１３で示されるタンパク質、または、その機能的等価体をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−２遺伝子は、配列番号８、配列番号１０、および、それらの機能的等価体から選択される遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および、Ｔ細胞から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＩＬ−２遺伝子は、ＩＬ−２が細胞の小胞体に向けて発現されるように改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
実質的に生理学的なレベルのＩＬ−２を発現する遺伝学的に改変された細胞の製造方法であって、
ＩＬ−２遺伝子を選択または構築し、
該ＩＬ−２遺伝子を有するレトロウイルスベクターを製造し、
ドナーまたは患者から細胞を回収し、
細胞を遺伝学的に改変し、
場合により、遺伝学的に改変された細胞を選択する、
ことからなる、上記方法。
【請求項９】
ＩＬ−２遺伝子は、配列番号１１で示されるタンパク質、または、その機能的等価体をコードする遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ−２遺伝子は、配列番号１３で示されるタンパク質、または、その機能的等価体をコードする遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬ−２遺伝子は、配列番号８、配列番号１０、および、それらの機能的等価体から選択される遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ＩＬ−２の生産が可能なトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法によって得られるトランスジェニック哺乳動物細胞であって、改変されていない状態の細胞は、増殖に関してＩＬ−２依存性であり、それらを有意な量で生産することができないが、該トランスジェニック細胞は、外的なＩＬ−２を必要とすることなく増殖を維持するのに十分な量でＩＬ−２を生産する、上記細胞。
【請求項１４】
ＩＬ−２が発現され、そして細胞の小胞体中に保留される、請求項１３に記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項１５】
患者に、治療上有効で生理学的に許容できる量の、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞を投与することを含む癌の治療方法。
【請求項１６】
細胞は、患者から採取され、トランスフェクションされ、そして同じ患者に戻される、請求項１〜７または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞は、ドナーから採取され、トランスフェクションされ、そして患者に投与される、請求項１〜７または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
トランスジェニック細胞の使用は、付加的、または、補足的な治療の一つであり、その他の治療の前に、その後に、または、実質的にそれと同時に行われる、請求項１〜７または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
トランスジェニック細胞の使用は、癌の治療における一次療法の一つである、請求項１〜７または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
免疫促進は、感染の治療または予防における処理の一つである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、遺伝子工学、遺伝学的に改変された細胞の生産、および免疫促進、具体的には、癌の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天免疫系の細胞障害性リンパ球であり、これらはＴおよびＢリンパ球とははっきり区別できる［１］。これらは、多くの病原微生物に対する先天免疫反応において重要な役割を果たす［２］［３］。加えて、いくつかのインビトロ［４］およびインビボ［５］の実験モデルで実証されているように、これらは強い抗腫瘍反応を仲介する。インビボでは、これらは、増殖および転移拡散を制御することができる［６］。また、ＮＫ細胞は、ヒト悪性腫瘍に対する耐性に寄与することがあり、これは、血液悪性腫瘍を治療するための幹細胞移植の場面で明らかに実証されている。これらの観察によって、例えば、インビボでのＮＫ細胞の活性を直接強化させるような特異的サイトカインまたはその他の刺激を用いることによって、インビボで癌患者のヒトＮＫ細胞の活性を高めることを目的とするいくつかの研究が推し進められてきた［７］。
【０００３】
ＮＫ細胞が介在する抗腫瘍作用は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、および、ＩＬ−２１［８−１１］［１２］などのサイトカインによって強化することができる。ＩＬ−２を癌患者に全身投与するための多数の試みがなされてきた。このような方策は、プロトコール、癌の型と段階、およびその他の因子に依存する混合型の臨床結果になった。しかしながら、ＩＬ−２の全身投与は、望ましくない副作用［１３−１５］、例えば心臓血管、胃腸、呼吸器および神経系に影響を及ぼす毒性を伴うことが多い。後者としては、思考障害、情緒の変化、食欲の損失、および、インフルエンザのような症状が挙げられる。ＩＬ−２が、主としてＮＫ活性を強化するために与えられるような状況では、ＮＫ細胞を刺激するが、望ましくない副作用をまったく生じない形態で投与することが理想的といえる。そのため、ＩＬ−２送達のための代替的アプローチに関する調査が進められてきた。
【０００４】
ＮＫ−９２は、一次ヒトＮＫ細胞の表現型および機能的な特徴を有するインビトロで増殖させたＮＫ細胞系である［１６］。この細胞系は、増殖と生存に関して厳密にＩＬ−２依存性である。そのため、これらは、ＮＫ刺激におけるＩＬ−２作用を研究するための特に有用なモデルとして利用されている。機能的なＩＬ−２遺伝子をＮＫ−９２細胞に形質導入する、または、それらを他の手段で導入するいくつかの試みがなされてきた。これらの研究によれば、これらの手段によって発現されたＩＬ−２は、ＮＫ−９２の増殖と生存を刺激するという目的を満たすことが示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の根底にある主な目的は、ＩＬ−２全身投与の代替法を発見することであり、それに加えて、Ｔ細胞およびＮＫ細胞のようなＩＬ−２依存性細胞をエクスビボで培養するためにＩＬ−２添加を必要なくすることである。本発明者等の特定の目的の一つは、自己活性化させたＮＫ細胞を生成することである。本発明が提供するその他の目的および目標ならびに解決法、それに加えて、それらに関連する利点は、当業者には、詳細な説明、非限定的な実施例および特許請求の範囲を研究すれば明白になると予想される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、驚くべきことに、ＩＬ−２依存性の哺乳動物細胞は、ＩＬ−２を外的に添加することなく増殖を維持するのに十分な量でＩＬ−２（具体的にはＩＬ−２の非分泌型）が発現されるように、うまく形質導入が可能であることを見出した。本発明の研究で、本発明者等は、ＩＬ−２の３種の異なる型をクローニングし、培養された哺乳動物細胞中で発現させた。このコンストラクトの発現は、形質導入されたＣｏｓ−７細胞の免疫染色によって検証された。ＮＫ−９２細胞で、改変されたタンパク質の生物活性を評価した。驚くべきことに、小胞体（ＥＲ）は、ＮＫ−９２細胞の増殖および生存を促進するのに十分なＩＬ−２型を保留していた。その上、このようにして発現された細胞は、細胞毒性能を有していた。この研究により、サイトカインの分泌、従って起こり得るあらゆる望ましくない副作用を防ぐような方法で、ＮＫ−９２細胞でＩＬ−２を発現することが可能であることが実証される。本発明の発見の内容を考察した。
【０００７】
本発明は、参照により本明細書に含まれる添付の特許請求の範囲で定義されたような、遺伝学的に改変されたＩＬ−２を発現する細胞、それらの製造方法、加えて、治療方法、例えば免疫促進または免疫治療を提供する。
【０００８】
本発明は、遺伝子組換えＮＫ−９２細胞系であるＮＫ９２ＩＬ２ＥＲが、小胞体の限られた領域でＩＬ−２をＮＫ細胞の生存に十分なレベルで発現することを示す実施例によって例示される。その他の遺伝子組換えＮＫ−９２細胞系であるＮＫ９２ＩＬ２ＷＴは、改変されていない活性化されたＴ細胞の分泌量に匹敵する量でＩＬ−２を分泌することができる。優先権主張年中に行われた予備実験から、その結果は、健康なドナーから得られたヒト一次細胞に形質導入可能であることが示される。
【０００９】
図面の簡単な説明
以下の詳細な説明、実施例および添付の図面で、本発明をより詳細に説明する：
図１は、ＩＬ−２の改変型を発現するプラスミドの概略図を示す。Ｌ：リーダー；ＩＬ−２：インターロイキン２；ＥＲＲＳ：小胞体保留シグナル。
図２は、短期間（６日）の培養での、ＩＬ−２が形質導入されたＮＫ−９２細胞、および、親のＮＫ−９２細胞の増殖を示す棒グラフである。ＮＫ−９２細胞を、初期濃度２５０００細胞／ｍｌ、９０％ＣｅｌｌＧｒｏ(R)、１０％ＦＢＳ、および、５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２で培養した。０日目に、細胞をＰＢＳで徹底的に洗浄し、それまでの培養段階からのわずかな量のＩＬ−２も全て除去した。改変されていないＮＫ−９２細胞は、ＩＬ−２の非存在下で死滅したが、遺伝学的に改変された細胞は、添加されたＩＬ−２の存在下での細胞と同等に増殖した。
図３は、ＮＫ−９２ＧＦＰと、ＩＬ−２を発現するＮＫ−９２改変細胞とを１：１の比率で共培養した結果を示す棒グラフである。２５０００個のＩＬ−２を発現するＮＫ−９２細胞を、同数のＧＦＰを発現するＮＫ−９２細胞と混合した。それまでの培養物からの外的なわずかな量のＩＬ−２も全て排除するために、どちらの細胞群もＰＢＳで２回徹底的に洗浄した。４８時間後に、ＦＡＣＳ解析でＧＦＰ陽性細胞と陰性細胞との比率を定量した。ＮＫ−９２ＩＬ２ＥＲとの培養で、ＮＫ−９２ＧＦＰ細胞は死滅したが、これは、これらの細胞からのＩＬ−２の分泌がないことを証明している。
図４は、インビトロでの遺伝学的に改変されたＮＫ−９２のＩＬ−２生産を説明する棒グラフである。細胞を、２５０００細胞／ｍｌの開始濃度で６日間培養した。培地を交換してから４８時間後に上清を回収した。材料および方法の章で説明されているように、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いて上清中のＩＬ−２のレベルを測定した。その結果によれば、ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴのＩＬ−２生産および分泌は、Ｔ細胞のそれと同等だが、それに対して、ＮＫ９２ＩＬ２ＥＲ細胞の上清中のＩＬ−２レベルは、培地のみ（コントロール）と同等であったことが示される。
図５は、４時間の51Ｃｒ放出分析におけるＫ−５６２細胞に対する親の細胞と遺伝学的に改変された細胞の細胞毒性を示す。遺伝学的に改変された細胞は、改変されていない細胞と同等の細胞毒性能を保持する。
【００１０】
本発明を説明する前に、当然ながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびそれらの等価体によってのみ限定されるため、本明細書で用いられる用語は単に具体的な実施形態を説明するためだけに用いられ、制限を目的としない。
【００１１】
用語「処理」、「治療」、「治療用途」、「医薬品」および「医学的用途」 は、ヒトと動物の両方、または、 獣医学的用途を包含する。
【００１２】
用語「機能的等価体」は、本明細書で開示された配列と比較して異なるアミノ酸または塩基配列を有するが、インビトロおよびインビボで同じ機能を示すタンパク質またはヌクレオチド配列を定義する。機能的等価体の例は、野生型遺伝子によってコードされたタンパク質と同一な、または、それらと高い相同性を有するタンパク質の発現をコードする、改変された遺伝子または合成遺伝子である。
【００１３】
「トランスフェクション」は、物理的または化学的な手段による遺伝子移入を意味する。「形質導入」は、ウイルスベクターによる遺伝子移入を意味する。「安定な遺伝学的改変」は、遺伝学的改変が遺伝的に引き継がれることを意味し、これは、一般的に（必ずではないが）、細胞の染色体のいずれか一つに形質移入したＤＮＡが組み込まれることによって達成される。「一過性の遺伝学的改変」は、数週間または数ヶ月の時間経過における遺伝物質の欠失を意味する。
【００１４】
実施形態によれば、本発明は、ＩＬ−２を発現する哺乳動物細胞の製造方法を提供するものであり、本方法は、以下の工程：
ＩＬ−２遺伝子を選択または構築し、
前記ＩＬ−２遺伝子を有するレトロウイルスベクターを製造し、
ドナーから細胞を回収し、
前記細胞を遺伝学的に改変し、そして、
場合により、トランスフェクションされた細胞を選択すること、
からなる。
【００１５】
前記ＩＬ−２遺伝子は、好ましくは、配列番号１１で示されるタンパク質、または、それらの機能的等価体をコードする遺伝子である。前記ＩＬ−２遺伝子は、より好ましくは、配列番号１３で示されるタンパク質、または、それらの機能的等価体をコードする遺伝子である。最も好ましくは、前記遺伝子は、配列番号８、配列番号１０、または、それらの機能的等価体から選択される。
【００１６】
一実施形態によれば、哺乳動物細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および、Ｔ細胞から選択され、好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００１７】
その他の実施形態によれば、前記改変されたＩＬ−２遺伝子は、ＩＬ−２が前記細胞の小胞体へ向けて発現されるように改変される。
【００１８】
本発明はさらに、上記で概説し、さらに実施例でより詳細に特定した方法によって製造された、ＩＬ−２の生産が可能なトランスジェニック哺乳動物細胞を提供する。
【００１９】
本発明は、具体的には、トランスフェクションされていない状態では、増殖に関してＩＬ−２依存性であり、それらを有意な量で生産することができないが、それらのトランスジェニック細胞は、外的なＩＬ−２を必要とすることなく増殖を維持するのに十分な量でＩＬ−２を生産する哺乳動物細胞に関する。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、ＩＬ−２発現は、前記細胞の小胞体に限定される。例えば分泌シグナル（コンストラクト２，図１）を除去することによって単にＩＬ−２分泌を予防するのみでは、遺伝学的に改変された細胞に自己分泌型の増殖刺激を提供するのに十分ではない、ということに留意することが重要である。
【００２１】
また、本発明は、待機的、治癒的および予防的治療などの治療方法も提供する。一実施形態によれば、本発明は、癌の治療方法に関し、本方法は、前記患者に、上記で定義された治療上有効で生理学的に許容できる量のトランスジェニック細胞を投与することを含む。上記癌は、どのような癌の形態であってもよく、例えば、これらに限定されないが、結腸癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、肺癌、脳腫瘍、および、皮膚癌（黒色腫）が挙げられ、白血病およびリンパ腫も含まれる。目下、ＩＬ−２投与の作用は、主として転移性の腎臓癌と転移性の黒色腫で示されている。
【００２２】
また、本発明は、実質的に生理学的なレベルのＩＬ−２を発現する遺伝学的に改変された細胞を用いた免疫促進方法も提供し、本方法において、ＩＬ−２を発現する哺乳動物細胞は、以下の工程：ＩＬ−２遺伝子を選択または構築し；前記ＩＬ−２遺伝子を有するレトロウイルスベクターを製造し；ドナーまたは患者から細胞を回収し；前記細胞を遺伝学的に改変し；場合により、遺伝学的に改変された細胞を選択し、そして、前記改変された細胞を、それを必要とする患者に投与すること、からなる方法によって製造される。
【００２３】
上述したように、前記ＩＬ−２遺伝子は、好ましくは、配列番号１１で示されるタンパク質、または、それらの機能的等価体をコードする遺伝子である。前記ＩＬ−２遺伝子は、より好ましくは、配列番号１３で示されるタンパク質、または、それらの機能的等価体をコードする遺伝子である。最も好ましくは、前記遺伝子は、配列番号８、配列番号１０、または、それらの機能的等価体から選択される。
【００２４】
また、本発明は、患者の免疫系を刺激する方法も提供し、本方法は、前記患者に、上記で定義された治療上有効で生理学的に許容できる量のトランスジェニック細胞を投与することを含む。前記免疫促進または免疫治療は、癌の治療、または、感染の治療もしくは予防における工程の一つであることが想定される。上記で定義されたように、上記癌は、どのような癌の形態であってもよく、例えば、これらに限定されないが、結腸癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、肺癌、脳腫瘍、および、皮膚癌（黒色腫）が挙げられ、白血病およびリンパ腫も含まれる。
【００２５】
上記の方法において、前記細胞は、好ましくは患者から採取され、遺伝子改変され、同じ前記患者に戻される。しかしながら、前記細胞は、ドナーから採取され、遺伝子改変され、前記患者に投与されることも想定される。
【００２６】
前記トランスジェニック細胞の使用は、その他の治療の前に、その後に、または、実質的にそれと同時に行われる追加の、または、補足的な治療の一つであってもよい。癌の治療において、前記トランスジェニック細胞は、細胞毒性の薬物、放射線療法、外科的介入またはそれらの組み合わせの前に、それらの後に、または、それらと実質的に同時に投与することができる。しかしながら、前記トランスジェニック細胞の使用は、癌の治療における一次療法の一つとすることもまた想定される。
【００２７】
本発明はまた、癌の治療、または、感染の治療もしくは予防に使用するための、医薬組成物または医薬品を製造するための前記細胞の使用も包含する。癌のタイプは、どのような癌のタイプであってもよいが、好ましくは上記で定義された癌のタイプの１つである。
【００２８】
本発明者等の研究によれば、サイトカインのコード配列にＥＲ保留シグナルを付加することによって、本来は全身に作用するサイトカインであるＩＬ−２に、厳密に自己分泌型のシグナル伝達様式を付与することが可能であることが実証される。レトロウイルスによって遺伝学的に改変されたＮＫ−９２ナチュラルキラー細胞系は、外的に添加されたＩＬ−２の非存在下で増殖し続ける。これまでの研究［２６，２７］によれば、安定なトランスフェクションによるＮＫ−９２遺伝子の改変が報告されている。ＴＲ−ＩＬ−２−ＮＫ−９２細胞は、５.５ｎｇ／１０6／２４時間で生産し、ＮＫ−９２ＭＩは、１２６０ｐｇ／ｍｌ／４８時間／１０6で生産し、ＮＫ−９２ＣＩは、１５ｐｇ／ｍｌ／４８時間／１０6で生産する。これらの細胞系のうちいくつかは、一次細胞と比較して有意に高いレベルのＩＬ−２を生産し、これは、トランスフェクションの際の多コピープラスミドの組み込みによって説明することができ、場合によっては有害とみなされることがある。本発明のＮＫ−９２ＩＬ２ＷＴは、１８.３ｐｇ／ｍｌ／４８時間／１０6で生産し、これは、活性化された一次ヒトＴ細胞と同等である（４０ｐｇ／ｍｌ／４８時間／１０6）。
【００２９】
ＥＲを標的化したコンストラクトの分泌は、バックグラウンドと同等であったが、細胞はよく増殖した。この驚くべき発見は、ＥＲ保留ＩＬ−２が、細胞膜までの間にＥＲ中でその受容体に結合することによって説明することができる。また、直接ＥＲからの、受容体−リガンド複合体からシグナル伝達が起こる可能性もある。シグナル伝達の類似の様式が、ＧＭ−ＣＳＦ［２９］、および、ＩＬ−３［３０］に関して説明されている。
【００３０】
形質移入した免疫エフェクター細胞を保持するための患者へのＩＬ−２の全身投与は、強い副作用を伴う。ＩＬ２ＥＲ−細胞としてそれら自身の増殖を促進することができるＮＫ細胞を送達することは、全身注射の副作用を起こすことなく、活性化されたＮＫ細胞によって天然に生産されたサイトカイン（例えばＴＮＦ−ａおよびＩＦＮ−ｇ）、および、さらなる局所的なＩＬ−２の分泌（ＩＬ２ＷＴ細胞）を介して周囲の免疫細胞へ刺激を提供し、これは、癌の免疫治療において直接の抗腫瘍作用のために有利である可能性があり、同様に、その他の適用では、免疫促進が望ましい場合に有利である可能性がある。
【００３１】
トランスジェニックＩＬ−２産生細胞は、腫瘍細胞（一般的にはサイレンス化したＮＫ細胞）の防御機構に耐性になる可能性が高いという点で驚くべき利点を有する。遺伝子移入により得られたＩＬ−２生産は、細胞に自己刺激特性を付与する。
【００３２】
１つの実施形態において、トランスジェニックＩＬ−２産生ＮＫ細胞もＩＬ−２を分泌する場合、それらは周囲のトランスフェクションされていない細胞を刺激し、生理学的なレベルで分泌されたＩＬ−２を介して免疫系に局所化された刺激作用を提供する。これは、その他の方法ではこれまで達成されていない。
【００３３】
すなわち、本発明者等は、ＩＬ−２注射の形態での全身性の補助がない状態で、直接的な抗腫瘍作用が可能であり、さらに、ＮＫ細胞によって天然に生産されたサイトカインの局所的分泌、または、追加のＩＬ−２を介した局所化された免疫刺激も可能な、癌の免疫治療のための遺伝学的に改変された細胞を提供する。発明者等は、細胞外区画へサイトカインを分泌することなく、遺伝学的に改変された細胞に自己分泌型の増殖刺激を提供するＥＲ保留ＩＬ−２の能力を示した。
【００３４】
本発明のその他の利点は、時間がかかり高価なエクスビボでの培養工程を回避できることである。時間の節約だけでも有意であるが、エクスビボでの患者に投与される細胞の取り扱いが厳密に調節されるという点も重要な改善としている。
【００３５】
さらに、細胞増殖を促進するためのＩＬ−２の投与は、エクスビボかまたはインビボかにかかわらず、必要なくなる。インビボでの用途では、ＩＬ−２の全身投与の副作用が回避される。
【００３６】
従来技術のその他の問題は、本発明の方法、および、改変された細胞によって克服され、同様に、それに関連する利点は、本発明の詳細な説明、実施例、図および添付の配列表をより詳細に研究することによって当業者には明白と思われる。
【００３７】
〔実施例〕
材料および方法
細胞系
レトロウイルス生産には、細胞系フェニックスＧＰ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＧＰ）を用いた（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，スタンフォード，カリフォルニア州のＧａｒｒｙ  Ｐ．Ｎｏｌａｎ博士（Ｐｈ．Ｄ．）の許可済）。免疫染色には、アフリカミドリザルから誘導された細胞系のＣｏｓ−７（ＤＳＭＺ，ブラウンシュバイク，ドイツ）を用いた。両方の細胞系を、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／ｌグルコース、および、ピリドキシンを含み、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ−インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が追加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−インビトロジェン社，ペーズリー，スコットランド）で培養した。
【００３８】
ＮＫ−９２細胞系を、ＬＧＣプロモケム／ＡＴＣＣ（ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ／ＡＴＣＣ，ボロス，スウェーデン）から購入した。ＮＫ−９２細胞を、１０％ＦＢＳおよび５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ(R)）、カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ），カリフォルニア州，米国）が追加された幹細胞培地（セルグロ（ＣｅｌｌＧｒｏ(R)））中で維持した。セルグロ(R)ＳＣＧＭは、造血幹および前駆細胞（セルジェニックス（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ），フライブルグ，ドイツ）の培養のための、ＧＭＰ（医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準）品質の無血清培地である。プロロイキン(R)は、ＧＭＰ品質のインターロイキン−２であり、これを、アリコートにし、１０6ＩＵ／ｍｌのストック濃度で−２０℃で保存した。
【００３９】
ナチュラルキラー細胞の標的として、ヒト骨髄性白血病細胞系のＫ−５６２（ＬＧＣプロモケム／ＡＴＣＣ，ボロス，スウェーデン）を用いた。Ｋ−５６２細胞を、１０％ＦＢＳが追加されたＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン）中で培養した。
【００４０】
全ての細胞系を、３７℃、５％ＣＯ2、および、９５％湿度でインキュベートし、２〜３日間ごとに継代培養した。全ての培地を＋４℃で保存し、ＦＢＳを５６℃で１時間加熱不活性化し、−２０℃で保存した。初期の継代からの細胞のアリコートを、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），セントルイス，ミズーリ州，米国）／９０％ＦＢＳ中で凍結し、後で再構成するために−１５０℃で保存した。カルシウム、マグネシウムおよび炭酸水素ナトリウム非含有のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をインビトロジェンから購入し、４℃で保存した。
【００４１】
全ての細胞群を、ＵＶモジュール（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）Ｕ−ＲＦＬＴ５０）を備えた倒立顕微鏡（オリンパスＣＫ４０）を用いて一定の間隔を置いて観察し、トリパンブルー排除法を用いて細胞生存率を、さらにマイコプラスマ汚染を定期的にモニターした。データ収集と解析のために、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を、セルクエスト（Ｃｅｌｌ  ＱｕｅｓｔTM）３．３解析ソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），カリフォルニア州，米国）と共に用いた。各サンプルにおいて、側方散乱と前方散乱で定義される生存可能な細胞の解析領域において少なくとも１００００個の細胞を得た。
【００４２】
プラスミド
ＩＬ−２ｃＤＮＡテンプレートを含むｐＯＲＦ−ｈＩＬ２プラスミドを、インビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）から購入した。必要なＩＬ−２プライマーを、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）６．６ソフトウェア（モレキュラー・バイオロジー・インサイト社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ），コロラド州，米国）を用いて設計し、それらをＤＮＡテクノロジーＡｐＳ（ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡｐＳ，オーフス，デンマーク）に注文した。以下のプライマーを用いて、ＩＬ−２変異体をＰＣＲでクローニングした：
配列番号１：野生型ＩＬ−２［TTA CAA TTG ATC ACC GGC GAA GGA GG］（フォワード）、および、
配列番号２：［TTA ATC GAT GTA TCT TAT CAT GTC G］（リバース）；
配列番号３：細胞質内の（リーダーなし）ＩＬ−２［ACC GCC ATG GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AA］（フォワード）、および、
配列番号４：［TTA ATC GAT GTA TCT TAT CAT GTC G］（リバース）；および、
配列番号５：小胞体  ＩＬ−２［TTA CAA TTG ATC ACC GGC GAA GGA GG］（フォワード）、および
配列番号６：［TCA CAG TTC GTC CTT CTC GCT GCC AGT CAG TGT TGA GAT GAT GCT TT］（リバース、小胞体保留シグナルを含む）。
【００４３】
そのＰＣＲ産物を、ｐＣＲ(R)４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ(R)ベクター（インビトロジェン）にクローニングした。ＴＯＰＯ(R)クローニングおよび形質転換工程を、製造元の説明書に従って行った。制限分析とサイクルシーケンスを用いてクローンを解析し、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＦ９１−ＭＣＳｇにサブクローニングした。
【００４４】
Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｂａｕｍ教授（ハノーバー医科大学（Ｈａｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ），ハノーバー，ドイツ）から親切にも寄贈された、マウス白血病ウイルスベースのレトロウイルスベクターｐＳＦ９１−ＧＦＰ−ｇＰＲＥから、ｐＳＦ９１−ＭＣＳｇを誘導した。さらなる構築を容易にするために、ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ＧＦＰおよびｇＰＲＥを含む）を、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｒｕＩ、ＳａｌＩ、および、ＭｆｅＩのための制限部位を含む合成オリゴヌクレオチドクローニング部位で置き換えた（配列番号７）。その後、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてのｇＰＲＥ要素をＭｆｅＩ部位に再度挿入し、ｐＳＦ９１−ＭＣＳｇを作製した。ｅＧＦＰベクター構築のために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），パロアルト，カリフォルニア州）由来のｅＧＦＰ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（この間に含まれている）を用いて放出させ、ｐＳＦ９１−ＭＣＳｇのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ間（この間に含まれている）に挿入し、得られたプラスミドを、ｐＳＦ９１−ＧＮ３ｇと名付けた。全てのコンストラクトを制限マッピングで確認し、部分的に配列解析した。最終的に、３種のコンストラクトを製造した；
野生型ＩＬ−２を発現する（分泌する）第一の配列（配列番号８）、
比較として、細胞質に標的化した第二の配列（配列番号９）を構築した。
最後に、小胞体に標的化した第三の配列（配列番号１０）を構築した。
これらプラスミドの概略図については、図１を参照。
【００４５】
また、それに対応するアミノ酸配列も添付の配列表で示す:
配列番号１１：ＩＬ−２野生型
配列番号１２：リーダーなしＩＬ−２
配列番号１３：ＩＬ−２ＥＲ。
【００４６】
キアプレップ８・ターボ・ミニプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ  ８  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）、キアプレップ８ミニプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ  ８  ｍｉｎｉｐｒｅｐ）、および、キアゲン(R)プラスミド・マキシ（Ｑｉａｇｅｎ(R)Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．），カリフォルニア州，米国）を用いて、さらに場合によっては、ジーンエリュートＨＰ・プラスミド・ミディプレップ・キット（Ｇｅｎｅｌｕｔｅ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（シグマ−アルドリッチ）を用いて、プラスミドＤＮＡを精製した。上記の全てのキットを、製造元の説明書に従って用いた。
【００４７】
トランスフェクションおよび形質導入
フェニックスＧＰ細胞およびＣｏｓ−７細胞を、３５ｍｍの細胞培養ウェルあたり、ベクターコンストラクトプラスミドそれぞれ３μｇおよび２μｇ、ならびに、ｐＭＤ−Ｇ（１μｇ）（水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする、ジュネーブ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，ジュネーブ，スイス）の遺伝学および微生物学教室（Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）のＤ．Ｔｒｏｎｏ博士によって親切にも提供された）で一時的にトランスフェクションした。このフェニックスＧＰをトランスフェクションした後、形質導入実験のためにウイルス上清を回収し、免疫染色のためにトランスフェクションされたＣｏｓ−７細胞を用いた。トランスフェクションのために、フージーン６（Ｆｕｇｅｎｅ  ６）試薬（ロシュ・ベーリンガー・マンハイム（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ），ドイツ）を、製造元の説明書に従って用いた。簡単に言えば、ＤＮＡプラスミドベクターとフージーン試薬を、細胞培地（体積１００μｌ）中で１／２の質量／体積比で混合し、１５分間後に細胞に添加した。ポジティブコントロールとして、レトロウイルス主鎖中にＧＦＰを含むプラスミド（ｐＳＦ９１−ＧＮ３ｇ）を用いた。トランスフェクションの２４時間および４８時間後に上清を回収し、０.４５μｍのミルレックス−ＧＰ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ）シリンジトップフィルター（ミリポア社（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），ベッドフォード，マサチューセッツ州）を通過させてろ過し、すぐに形質導入に用いた。ポジティブコントロールにおけるトランスフェクション効率は、常に５０％より高かった。
【００４８】
上記ベクターを含む上清を用いて、ＮＫ−９２細胞に形質導入し、この細胞を、ＩＬ−２上清３００μｌ、および、４μｇ／ｍｌ臭化ヘキサジメトリジン（ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ(R)），シグマ−アルドリッチ）の存在下で１０００×ｇで１時間遠心分離した。
【００４９】
増殖
発現されたインターロイキン−２の生物活性を、ＩＬ−２依存性細胞系ＮＫ−９２を用いた細胞増殖分析によって測定した。細胞増殖を、製造元の推奨に従って、トリパンブルー染色による生存率測定と細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（ロシュ・ベーリンガー・マンハイム）を用いて、ブッヒャー（Ｂｕｅｒｃｈｅｒ）製チャンバーで細胞を計数することによって定量した。
【００５０】
ＩＬ−２で形質導入したＮＫ−９２細胞の上清における分泌されたインターロイキン−２の定量分析
ヒトインターロイキン−２の定量的な測定のために、ＯｐｔＥＩＡTMヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡキットＩＩ（ＢＤバイオサイエンシズ・ファーミンジェン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ），サンディエゴ，カリフォルニア州，米国）を、製造元の説明書に従って用いた。
【００５１】
免疫染色
ＩＬ−２で改変されたＣｏｓ−７細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温（ＲＴ）で１５分間固定した。固定した後、細胞をＰＢＳでリンスし、ＮＰ４０（Ｖｙｓｉｓ  Ｉｎｃ，イリノイ州，米国）の１％ＰＢＳ溶液と室温で１０分インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中に０.１％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）（シグマ−アルドリッチ）、０.１％ＢＳＡ−ｃ（アウリオン（Ａｕｒｉｏｎ），オランダ）、および、５％ヤギ血清（ダコ社（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ），グロストルップ，デンマーク）を含むブロッキング緩衝液で３０分間ブロックした。細胞を、ＰＢＳ／０.１％トゥイーン２０で３回、４分間洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した５μｇ／ｍｌの一次精製ラット抗ヒトＩＬ−２抗体（ＢＤバイオサイエンシズ・ファーミンジェン）と共に４５分インキュベートした。次に、細胞を再度、ＰＢＳ／０.１％トゥイーン２０で５分間、４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中の５μｇ／ｍｌの二次オレゴングリーン４８８ｎｍヤギ抗ラットＩｇＧ抗体と共に１時間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ／トゥイーン２０でリンスし、ＰＢＳで１：４０００に希釈したヘキスト染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｓｔａｉｎ）（モレキュラープローブスＢＶ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＢＶ），ライデン，オランダ）を用いて室温で５分間、対比染色し、続いてＰＢＳで１回洗浄した。ＣＣＤカメラ（モデルＳ／Ｎ３７０ＫＬ０５６５，クック社（Ｃｏｏｋｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），ニューヨーク州，米国）を備えたライカ製のＤＭＲＸＡ顕微鏡（ライカ・マイクロシステムズ社（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＧｍｂＨ），ヴェッツラー，ドイツ）を用いて、蛍光顕微鏡検査法によって細胞を可視化した。ＤＡＰＩ／ヘキストに設定されたフィルター、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３およびＣｙ５を、クロマ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ブラットルボロ，バーモント州，米国）から得た。スライドブック（Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ）２．１．５ソフトウェア（インテリジェント・イメージング・イノベーションズ社（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，デンバー，コロラド州，米国）、および、アドビ・フォトショップ（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）５．０（アドビ・システムズ（Ａｄｏｂｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，シアトル，ワシントン州，米国）を用いて画像を得た。
【００５２】
ＩＬ−２発現の場が実際に小胞体中にあることを確かめるために、第二の免疫染色を行った。形質導入後に、ＮＫ−９２細胞を、製造元の説明書に従ってＥＲ−トラッカー（ＥＲ−ＴｒａｃｋｅｒTM）ブルー−ホワイトＤＰＸ（モレキュラープローブス，ユージーン，米国）で染色した。ＥＲ−トラッカーは、小胞体を特異的に染色する。ＰＢＳで洗浄後に、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＮＰ４０で膜透過させ、ＩＬ−２抗体で上述のように染色した。
【００５３】
異なる形態のＩＬ−２を発現するＮＫ−９２細胞と、ＧＦＰが改変されたＮＫ−９２細胞との共培養
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように改変されたＮＫ−９２細胞を、ＩＬ−２で改変されたＮＫ−９２細胞と１：１の比率で混合した。共培養実験を、６ウェルプレートで以下のように行った：２５０００個のＩＬ−２を発現するＮＫ−９２細胞を、同数のＧＦＰを発現するＮＫ−９２細胞と混合した。それまでの培養物から外的なわずかな量のＩＬ−２も全て排除するために両方の細胞群をＰＢＳで２回徹底的に洗浄した。４８時間後に、ＦＡＣＳ解析でＧＦＰ陽性細胞と陰性細胞との比率を定量した。
【００５４】
細胞毒性分析
細胞毒性の機能を、標準的な４時間の51Ｃｒ放出分析で３連で測定した。簡単に言えば、１×１０6個のＫ５６２細胞を51Ｃｒ（１００μｌ）で標識し、３７℃で１時間インキュベートした。トリパンブルー排除法の色素を用いてエフェクター細胞を計数し、標的細胞と混合して、エフェクターを得た：標的の比率は１０：１、３：１、１：１、および、０.３：１とした。ネガティブコントロールとして、セルグロ培地を用い、ポジティブコントロール細胞を、１％トリトンＸとインキュベートした。Ｖ底型の９６ウェルプレートで３７℃で４時間インキュベートした後、上清７０μｌを各ウェルから吸引して、パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）のコブラ・オート−ガンマ（Ｃｏｂｒａ  Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ）５０００シリーズカウントシステム（メリデン，コネチカット州，米国）を用いて計数した。自然発生による放出の比率を以下の式から計算した：％51Ｃｒ放出量＝（サンプル−自然発生）／（最大放出量−自然発生）×１００。
優先権主張年中に、健康なドナー由来の一次細胞を用いてさらなる実験を行った。
【００５５】
一次ドナー細胞の培養
軟膜の細胞を、カロリンスカ大学病院（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，フッディンゲ，ストックホルム，スウェーデン）の健康な血液バンクのドナーから得て、同じ日に培養を開始した（０日目）。ＰＢＭＣを、リンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，ニエガード（Ｎｙｅｇａａｒｄ），オスロ，ノルウェイ）を用いた濃度勾配遠心分離によって単離した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で２回洗浄した後に、トリパンブルー色素排除法で細胞生存率を評価し、細胞を６ウェルの培養皿（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ），ベクトン・ディッキンソン（Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，フランス）製）上で０.２５×１０6細胞／ｍｌで平板培養した。全ての培養で、５％ヒト血清（バイオウィッタカー（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ），キャンブレックス・バイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），ウォーカーズビル，メリーランド州，米国）、５００ＩＵ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ），ニュージャージー州，米国）、および、１０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ−３（オルソ・バイオテック社（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．），ラリタン，ニュージャージー州，米国）を添加したセルグロＳＣＧＭ培地（セルジェニックス，フライブルグ，ドイツ）を用いた。５日目に、ＯＫＴ−３を洗浄して除き、その後、細胞を５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、および、５％ヒト血清が追加されたセルグロ培地（ＯＫＴ−３非含有）中で培養した。次に、１〜２日ごとに、２１日目まで培養に新しい培地を添加した。細胞の部分集合の絶対細胞数（ＡＣＣ）を、細胞の部分集合のパーセンテージに、同じ時点での培養の細胞の総数を掛けることにより得た。
【００５６】
ＮＫ細胞のレトロウイルスによる形質導入
ＳＦ９１ｇ−ＩＬ２ｗｔ、ＳＦ９１ｇ−ＩＬ２−Ｌ、ＳＦ９１ｇ−ＩＬ２ＥＲ、および、ＳＦ９１ｇ−ＧＮ３（ＧＦＰコントロール）レトロウイルスベクターを生産する安定して形質導入されたレトロウイルス産生細胞系を、１０％ＦＣＳが追加されたＤＭＥＭ中で成長させた。細胞がやや密集状態になったら、新しい新鮮な培地を２４時間添加した。最後に、上清を回収し、０.４５μｍフィルター（ミリポア，ビレリカ，マサチューセッツ州，米国）でろ過し、−７０℃で凍結した。回収および採取した上清は、０.５×１０6ウイルス粒子／ｍｌのタイター（ＨｅＬａ細胞で測定）を有していた。この産生細胞系から生産されたウイルス粒子は、ＧＡＬＶ（テナガザル（Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｐｅ）白血病ウイルス）エンベロープを含む。培地を、８μｇ／ｍｌポリブレン（シグマ）と５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で、１.０００ｇで室温で２時間遠心分離して、レトロウイルスを含む上清（３の重複感染度（ＭＯＩ））で交換することによって、全ての形質導入を行った。遠心分離の後、上清を、ＮＫ細胞培地（セルグロ培地，５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、および、５％ヒト血清を含む）で交換し、細胞を２１日目まで増殖させた。コントロールとして、同じドナーのＰＢＭＣを成長させ、形質導入した細胞と同様の条件下で擬似感染させた。
【００５７】
結果
ＮＫ−９２細胞におけるＩＬ−２発現による細胞増殖に対する作用
ＩＬ−２発現のための３種のコンストラクトを評価した；１種は、野生型ＩＬ−２を発現し、１種は、ＩＬ−２を細胞質に標的化し、１種は、ＩＬ−２を小胞体に標的化する（図１）。これらの細胞質内コンストラクトは、生物学的に不活性であった（データ示さず）。
形質導入後に、遺伝子発現させるために細胞をＩＬ−２の存在下で４日間培養し、次に、ＰＢＳで十分に洗浄し、培養条件下でＩＬ−２添加または無添加のいずれかで維持した。この実験には、発明者等により開発された２種のＩＬ−２が形質導入された細胞系；ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴ、および、ＮＫ９２ＩＬ２ＥＲが選択された。図２で示されるように、形質導入されていないＮＫ−９２コントロール細胞は、ＩＬ−２を除去してから培養６日目に死滅した。それに対して、ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴとＮＫ９２ＩＬ２ＥＲは、外的なＩＬ−２が追加されたＮＫ−９２細胞と同様の増殖曲線を示した（図２）。
ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴとＮＫ９２ＩＬ２ＥＲの増殖の特徴は、ほぼ１年間の連続培養の後でも安定であった。
【００５８】
小胞体に局所化され、限定されたＩＬ−２発現
まず、小胞体に局所化された発現のためのベクターの機能性を、Ｃｏｓ−７細胞への一過性トランスフェクションによって解析した。Ｃｏｓ−７細胞は、顕微鏡イメージングにおいて明確な形態を示すため、形質導入されたタンパク質の発現をモニターするために、該細胞を選択した。モノクローナルラット抗ヒトＩＬ−２抗体を用いたＩＬ−２ＥＲで形質導入されたＣｏｓ−７細胞の間接的な免疫蛍光法によれば、小胞体での局在化に伴い明るい緑色の染色が示された。（データ示さず）。
【００５９】
小胞体中でのＩＬ−２の発現は、近接する細胞に対してバイスタンダー増殖促進を示さない
続いて本発明者等は、少量のＩＬ−２が形質導入された細胞から周囲の培地に漏出するかどうか、加えて、それが、親のＮＫ−９２細胞の増殖の促進に十分であり得るのかどうかを調査しようとした。そのために、同数のＮＫ−９２のＩＬ−２で改変されたＮＫ−９２細胞系と、ＧＦＰで改変されたＮＫ−９２細胞系とを共培養し、増殖に関して評価した。培養してから４８時間後、ＮＫ−９２ＧＦＰ細胞の比率は、ＮＫ９２ＩＬ２ＥＲと混合した場合に著しく減少した（４５％）。それに対して、ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴ細胞と混合した場合、増殖の促進が観察された（図３）。培養してから２日後に、両方の群の比率はそれでもなお最初のほぼ５０％を保持しており、これは、ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴは、上清にＩＬ−２を分泌して、ＮＫ９２ＧＦＰの生存を促進していることを示す。
【００６０】
上清中のＩＬ−２の量を、酵素結合免疫吸着検査法で定量した。ＮＫ９２ＩＬ２ＥＲ細胞からの上清中に検出されたＩＬ−２レベルは、３.２ｐｇ／ｍｌ／１０6細胞／４８時間であった（図４）。これは、バックグラウンド（セルグロ(R)培地，ＦＣＳを含む）に匹敵する。ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴからの上清中のＩＬ−２濃度は、１８.３ｐｇ／ｍｌ／１０6細胞／４８時間であり、抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞からの上清（コントロール）は、４０.３ｐｇ／ｍｌ／１０6細胞／４８時間を示した。予備的な実験室データから、３０ｎｇ／ｍｌ（５００ＩＵ／ｍｌ）のＩＬ−２により、改変されていないＮＫ−９２細胞において最適な増殖が生じる（データ示さず）ことが示される。
【００６１】
遺伝学的にＩＬ−２で改変されたＮＫ−９２細胞群は、親のＮＫ−９２細胞系と比較して類似した細胞傷害効果を示す
ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴ、および、ＮＫ９２ＩＬ２ＥＲ系は、51Ｃｒで標識されたＫ５６２細胞を、親のＮＫ−９２細胞に匹敵するレベルで溶解させることができた。（図５）。１：１のエフェクター：標的の比率により、ＮＫ−９２細胞が５９％であったのに対して、平均５９.２％（ＮＫ９２ＩＬ２ＷＴ）、および、平均４６.４％（ＮＫ９２ＩＬ２ＥＲ）の細胞毒性活性が得られた。
【００６２】
優先権主張年中にドナーＰＢＭＣより増殖させた一次ＮＫ細胞で行われた予備実験により、外的に添加されたＩＬ−２の非存在下で、形質移入されたＩＬ２ｗｔ（配列番号８）、および、ＩＬ２ＥＲ（配列番号１０）遺伝子が、一次ヒトＮＫ細胞の増殖を促進する能力があることが実証された。
【００６３】
本発明を、発明者等が現在知っている最良の形態を構成する好ましい実施形態に関して説明したが、当然ながら、当分野の当業者には明白であると思われる様々な変化や改変は、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【００６４】
参考文献
1.  Trinchieri G Biology of natural killer cells. Adv Immunol. 1989; 47:187-376
2.  Unanue ER Studies in listeriosis show the strong symbiosis between the innate cellular system and the T-cell response. Immunol Rev. 1997; 158:11-25
3.  Biron CA, Nguyen KB, Pien GC, Cousens LP, Salazar-Mather TP Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annu Rev Immunol. 1999; 17:189-220
4.  Orange JS, Fassett MS, Koopman LA, Boyson JE, Strominger JL Viral evasion of natural killer cells. Nat Immunol. 2002; 3:1006-1012
5.  Wu J, Lanier LL Natural killer cells and cancer. Adv Cancer Res. 2003; 90:127-156
6.  Kiessling R, Klein E, Wigzell H “Natural”killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 1975; 5:112-117
7.  Seaman WE, Sleisenger M, Eriksson E, Koo GC Depletion of natural killer cells in mice by monoclonal antibody to NK-1.1. Reduction in host defense against malignancy without loss of cellular or humoral immunity. J Immunol. 1987; 138:4539-4544
8.  Kim S, Iizuka K, Aguila HL, Weissman IL, Yokoyama WM In vivo natural killer cell activities revealed by natural killer cell-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97:2731-2736
9.  Lowdell MW Natural killer cells in haematopoietic stem cell transplantation. Transfus Med. 2003; 13:399-404
10.  Parham P, McQueen KL Alloreactive killer cells: hindrance and help for haematopoietic transplants. Nat Rev Immunol. 2003; 3:108-122
11.  Ruggeri L, Capanni M, Casucci M, et al. Role of natural killer cell alloreactivity in HLA-mismatched hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 1999; 94:333-339
12.  Farag SS, Fehniger TA, Ruggeri L, Velardi A, Caligiuri MA Natural killer cell receptors: new biology and insights into the graft-versus-leukemia effect. Blood. 2002; 100:1935-1947
13.  Velardi A, Ruggeri L, Moretta A, Moretta L NK cells: a lesson from mismatched hematopoietic transplantation. Trends Immunol. 2002; 23:438-444
14.  Guven H, Gilljam M, Chambers BJ, et al. Expansion of natural killer (NK) and natural killer-like T (NKT)-cell populations derived from patients with B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL): a potential source for cellular immunotherapy. Leukemia. 2003; 17:1973-1980
15.  Lauwerys BR, Garot N, Renauld JC, Houssiau FA Cytokine production and killer activity of NK/T-NK cells derived with IL-2, IL-15, or the combination of IL-12 and IL-18. J Immunol. 2000; 165:1847-1853
16.  Parrish-Novak J, Dillon SR, Nelson A, et al. Interleukin 21 and its receptor are involved in NK cell expansion and regulation of lymphocyte function. Nature. 2000; 408:57-63
17.  Strengell M, Matikainen S, Siren J, et al. IL-21 in synergy with IL-15 or IL-18 enhances IFN-gamma production in human NK and T cells. J Immunol. 2003; 170:5464-5469
18.  Liu CC, Perussia B, Young JD The emerging role of IL-15 in NK-cell development. Immunol Today. 2000; 21:113-116
19.  Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med. 1985; 313:1485-1492
20.  Stein RC, Malkovska V, Morgan S, et al. The clinical effects of prolonged treatment of patients with advanced cancer with low-dose subcutaneous interleukin-2. Br J Cancer. 1991; 63:275-278
21.  Atkins MB, Lotze MT, Dutcher JP, et al. High-dose recombinant interleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993. J Clin Oncol. 1999; 17:2105-2116
22.  Chada S, Ramesh R, Mhashilkar AM Cytokine- and chemokine-based gene therapy for cancer. Curr Opin Mol Ther. 2003; 5:463-474
23.  Panelli MC, White R, Foster M, et al. Forecasting the cytokine storm following systemic interleukin (IL)-2 administration. J Transl Med. 2004; 2:17
24.  Maas RA, Dullens HF, Den Otter W Interleukin-2 in cancer treatment: disappointing or (still) promising? A review. Cancer Immunol Immunother. 1993; 36:141-148
25.  Weisdorf DJ, Anderson PM, Blazar BR, et al. Interleukin 2 immediately after autologous bone marrow transplantation for acute lymphoblastic leukemia--a phase I study. Transplantation. 1993; 55:61-66
26.  Ochoa JB, Curti B, Peitzman AB, et al. Increased circulating nitrogen oxides after human tumor immunotherapy: correlation with toxic hemodynamic changes. J Natl Cancer Inst. 1992; 84:864-867
27.  Glauser FL, DeBlois G, Bechard D, et al. Cardiopulmonary toxicity of adoptive immunotherapy. Am J Med Sci. 1988; 296:406-412
28.  Ardizzoni A, Bonavia M, Viale M, et al. Biologic and clinical effects of continuous infusion interleukin-2 in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 1994; 73:1353-1360
29.  Miller JS, Tessmer-Tuck J, Blake N, et al. Endogenous IL-2 production by natural killer cells maintains cytotoxic and proliferative capacity following retroviral-mediated gene transfer. Exp Hematol. 1997; 25:1140-1148
30.  Gong JH, Maki G, Klingemann HG Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 1994; 8:652-658
31.  Nagashima S, Mailliard R, Kashii Y, et al. Stable transduction of the interleukin-2 gene into human natural killer cell lines and their phenotypic and functional characterization in vitro and in vivo. Blood. 1998; 91:3850-3861
32.  Tam YK, Maki G, Miyagawa B, et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Hum Gene Ther. 1999; 10:1359-1373
33.  Malek TR, Bayer AL Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat Rev Immunol. 2004; 4:665-674
34.  Laker C, Stocking C, Bergholz U, et al. Autocrine stimulation after transfer of the granulocyte/macrophage colony-stimulating factor gene and autonomous growth are distinct but interdependent steps in the oncogenic pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987; 84:8458-8462
35.  Browder TM, Abrams JS, Wong PM, Nienhuis AW Mechanism of autocrine stimulation in hematopoietic cells producing interleukin-3 after retrovirus-mediated gene transfer. Mol Cell Biol. 1989; 9:204-213
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＩＬ−２の改変型を発現するプラスミドの概略図を示す。
【図２】短期間（６日）の培養での、ＩＬ−２が形質導入されたＮＫ−９２細胞、および、親のＮＫ−９２細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図３】ＮＫ−９２ＧＦＰと、ＩＬ−２を発現するＮＫ−９２改変細胞とを１：１の比率で共培養した結果を示す棒グラフである。
【図４】インビトロでの遺伝学的に改変されたＮＫ−９２のＩＬ−２生産を説明する棒グラフである。
【図５】４時間の51Ｃｒ放出分析におけるＫ−５６２細胞に対する親の細胞と遺伝学的に改変された細胞の細胞毒性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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