(57)【要約】  本発明は、X線結晶学によるFc受容体タンパク質、特に野生型FcγRIIaの三次元構造の決定、ならびにFc受容体の生物活性を調節する試剤を同定し、修飾する上で該構造の使用に関する。また、FcγRIIaに関する新規な二量体構造およびFc受容体タンパク質の生物活性を調節する試剤に関する新規な標的部位も開示する。
2008512083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fc受容体タンパク質(FcR)の生物活性を調節する試剤を同定する方法であって:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより前記受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を設計するか、選択することによって候補試剤を同定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
HRS88二量体の単量体間の相互作用調節を目的として、候補試剤を同定するための請求項1に記載の方法であって、
(i)各単量体の部分が表されているHRS88二量体またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより単量体間の相互作用を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと;
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を設計するか、選択することによって候補試剤を同定するステップと、を含む方法。
【請求項３】
Fc受容体タンパク質(FcR)の生物活性を調節する候補試剤に関する化合物および/または化学的複合体をスクリーニングする方法であって、
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより前記受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を同定するために、前記化合物または化学的複合体をスクリーニングするステップと、を含む方法。
【請求項４】
HRS88二量体の単量体間の相互作用の調節を目的として、候補試剤に関する化合物および/または化学的複合体をスクリーニングするための請求項3に記載の方法であって、
(i)各単量体の部分が表されているHRS88二量体またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより単量体間の相互作用を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと;
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を同定するために、前記化合物および/または化学的複合体をスクリーニングするステップと、を含む方法。
【請求項５】
Fc受容体タンパク質(FcR)の生物活性を調節する候補試剤を修飾する方法であって:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより前記受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との所望のレベルの相互作用を提供する上で、前記候補試剤よりも有利な三次元構造を有する試剤を提供するために、前記候補試剤を修飾するステップと、を含む方法。
【請求項６】
改善された活性を有する試剤を提供するために、HRS88二量体の単量体間の相互作用調節を目的として、候補試剤を修飾するための請求項5に記載の方法であって、
(i)各単量体の部分が表されているHRS88二量体またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより単量体間の相互作用を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと;
(ii)前記標的部位との所望のレベルの相互作用を提供する上で、前記候補試剤よりも有利な三次元構造を有する試剤を提供するために、前記候補試剤を修飾するステップと、を含む方法。
【請求項７】
前記標的部位が、
(a)免疫グロブリン結合部位を形成する表面;
(b)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間に二量体化界面を形成する表面;
(c)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間に大型グルーブ(部位A)を形成する表面;および
(d)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間の二量体化界面に隣接したキャビティー、チャネルおよび2つの同一ポケット(部位B)を形成する表面、からなる群から選択されるHRS88上の表面である請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的部位が、免疫グロブリン結合部位であり、前記免疫グロブリン結合部位の表面が、アミノ酸残基113-116、129、131、133、134、155、156および158-160の配座により規定された構造を含む請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記標的部位が、二量体化界面であり、前記二量体化界面の表面が、HRS88二量体のうち一方の単量体のアミノ酸残基26、33、54-56、58、102、103、105、142および143、ならびに前記二量体の他方の単量体の等しい残基の配座により規定された構造を含む請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的部位が、HRS88二量体の部位Aであり、前記部位Aの表面が、HRS88二量体のうち一方の単量体のアミノ酸残基22-24、60、107、109、110、112、114-118、131、133-138、140および160、ならびに前記二量体の他方の単量体の等しい残基の配座により規定された構造を含む請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的部位が、HRS88二量体の部位Bであり、前記部位Bの表面が、HRS88二量体のうち一方の単量体のアミノ酸残基12-16、26、96、100および105、ならびに前記二量体の他方の単量体の等しい残基の配座により規定された構造を含む請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
生物活性の変化した高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)変異体を設計する方法であって、
(i) HRS88またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップと;
(ii) 生物活性の変化したHRS88変異体を提供するために前記モデルを修飾するステップと、を含む方法。
【請求項１３】
生物活性の変化したHRS88二量体の変異体を設計するための請求項12に記載の方法であって、
(i)各単量体の部分が表されているHRS88二量体またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップと;
(ii)生物活性の変化したHRS88二量体の変異体を提供するために前記モデルを修飾するステップと、を含む方法。
【請求項１４】
前記三次元構造モデルが、少なくとも表3の原子座標データを用いて作製される請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
HRS88二量体が、空間群C2221の対称操作を表3の原子座標データに適用することによって作製される請求項9に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、インシリコ法である請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するコンピュータであって、試剤が相互作用でき、それによりFc受容体タンパク質(FcR)の活性を調節できる標的部位の三次元構造を前記構造モデルが含み、
(i)表3の原子座標データを含む機械可読データ貯蔵媒体;
(ii)機械可読データ貯蔵媒体に含まれる前記原子座標データを処理する指示を貯蔵するためのワーキングメモリー;
(iii)前記三次元構造モデルを作製するために、前記原子座標データの処理を目的に、前記ワーキングメモリーおよび前記機械可読データ貯蔵媒体に連結させた中央処理装置;
(iv)前記三次元構造モデルの画像をディスプレイするために、前記中央処理装置に連結させたディスプレイ、を含むコンピュータ。
【請求項１８】
(v)化学成分および置換基の範囲に関して原子座標データを受信し、貯蔵する手段であって、前記中央処理装置が、前記受信手段および貯蔵手段と相互作用することができ、化合物または化学的複合体を組み立てるために好適な化学成分および置換基を、前記化学成分および置換基の範囲から選択し、前記ディスプレイ上に、HRS88タンパク質またはその一部の前記三次元構造モデルの画像と同時に画像が提供され得る、前記中央処理装置によって作製された三次元構造に基づいて、前記標的部位との相互作用が可能である手段;および/または
(vi)化合物および/または化学的複合体の範囲に関して原子座標データを受信し、保存する手段であって、前記中央処理装置は、化合物および/または化学的複合体の範囲から選択された化合物または化学的複合体に関する三次元構造を作製するために前記受信手段および保存手段と相互作用でき、前記ディスプレイ上に、HRS88タンパク質またはその一部の前記三次元構造モデルの画像と同時に前記三次元構造の画像を提供し、それにより前記選択された化合物または化学的複合体が、前記標的部位と相互作用できるかどうかを評価できる手段、
をさらに含む請求項17に記載のコンピュータ。
【請求項１９】
表3の原子座標データを含む機械可読データ貯蔵媒体。
【請求項２０】
請求項1から4のいずれか一項に記載の方法に従って同定された候補薬剤。
【請求項２１】
請求項5または6の方法に従って製造された試剤。
【請求項２２】
請求項12または13に従って設計された高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)の変異体。
【請求項２３】
対象においてFcRの生物活性を調節するための薬剤の調製における、請求項20に記載された候補試剤、請求項21に記載された試剤または請求項22に記載された変異体の使用。
【請求項２４】
FcRがFcγRIIaである請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
対象におけるFcRの生物活性を調節する方法であって、請求項20に記載された候補試剤、請求項21に記載された試剤または請求項22に記載された変異体を含む薬剤を、対象に投与することを含む方法。
【請求項２６】
薬剤を製造する方法であって、
(i)請求項1または2に記載の方法に従って試剤を同定し、請求項3または4に記載の方法に従って化合物および/または化学的複合体を同定するか、修飾試剤を提供するために請求項5または6に記載の方法に従って候補試剤を修飾すること、
(ii)前記試剤、化合物および/または化学的複合体または修飾試剤を化学的に合成すること、
(iii)Fc受容体媒介疾患または病態を治療するために、合成された試剤、化合物および/または化学的複合体または修飾試剤の能力を評価すること、および
(iv)前記薬剤を製造するために、好適な製薬的に許容できる送達媒体またはアジュバントと一緒に合成された試剤、化合物および/または化学的複合体または修飾試剤を製剤化すること、を含む方法。
【請求項２７】
対象におけるFc受容体媒介疾患または病態を治療する方法であって、Fc受容体(FcR)上の:
(a)免疫グロブリン結合部位を形成する表面;
(b)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間に二量体化界面を形成する表面;
(c)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間に大型グルーブ(部位A)を形成する表面;および
(d)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間の二量体化界面に隣接したキャビティー、チャネルおよび2つの同一ポケット(部位B)を形成する表面、から選択される表面に結合するHRS88の試剤または変異体の薬剤有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２８】
前記標的部位が、免疫グロブリン結合部位であり、前記免疫グロブリン結合部位の表面が、アミノ酸残基113-116、129、131、133、134、155、156および158-160の配座により規定された構造を含む請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的部位が、二量体化界面であり、前記二量体化界面の表面が、HRS88二量体のうち一方の単量体のアミノ酸残基26、33、54-56、58、102、103、105、142および143、ならびに前記二量体の他方の単量体の等しい残基の配座により規定された構造を含む請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的部位が、HRS88二量体の部位Aであり、前記部位Aの表面が、HRS88二量体のうち一方の単量体のアミノ酸残基22-24、60、107、109、110、112、114-118、131、133-138、140および160、ならびに前記二量体の他方の単量体の等しい残基の配座により規定された構造を含む請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的部位が、HRS88二量体の部位Bであり、前記部位Bの表面が、HRS88二量体のうち一方の単量体のアミノ酸残基12-16、26、96、100および105、ならびに前記二量体の他方の単量体の等しい残基の配座により規定された構造を含む請求項27に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、X線結晶学によるFc受容体タンパク質、特に、野生型FcγRIIaの三次元構造の決定、ならびに、Fc受容体の生物活性を調節する試剤の同定および修飾における前記構造の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々のクラスの抗体とFc受容体(FcR)との間の相互作用は、広範囲の免疫応答を開始させる。これらには、T細胞に対するMHC結合ペプチドの提示のための抗体特異的抗原の取込み、アレルギーにおける肥満細胞の脱顆粒、および免疫複合体に媒介された過敏症および炎症が含まれる。FcRはまた、はしかおよびデング熱におけるウィルス感染に対する認識分子として働くことが示されている。ヒトにおいて、最も広く認められ、多く存在しているIgG FcRは、FcγRIIaまたはCD32である。免疫複合体によるFcγRIIaの反復的トリガリングは、全身性エリテマトーデス(SLE)および慢性関節リウマチなどの抗体媒介自己免疫疾患に関連する炎症の慢性および急性エピソードをもたらす主要経路である(Hogarth、2002年に概説されている)。
【０００３】
ヒトFcγRIIaは、低レスポンダー(LR)および高レスポンダー(HR)野生型多型として分類される2種の主な対立遺伝子として存在する。タンパク質配列のレベルでの違いは、アミノ酸の134位(131位と称する文献も多い)に、LR受容体がヒスチジン(H)残基を有し、一方、HR受容体はアルギニン(R)残基を有していることである(Warmerdamら、1990年)。LR FcγRIIaとHR FcγRIIaの対立遺伝子間の違いは、マウスIgG1とヒトIgG2に結合する両者の能力の違いに関連している(Sautesら、1991年;Parrenら、1992年)。FcγRの遺伝子多型は、リウマチ疾患などの炎症性疾患における罹患率および治療用抗体の臨床評価における抗体依存性細胞毒性(ADCC)の有効性に関連していることが示されている(WengおよびLevy、2003年)。
【０００４】
他の全ての活性FcR分子とは対照的に、シグナリングITAM(免疫受容体チロシンベース活性モチーフ)は、FcγRIIaの細胞質末端内に位置している。他の活性FcR分子は、シグナリング事象の細胞内局面を媒介するITAM含有アクセサリー分子に結合する(Hogarth、2002年)。FcγRIIa糖タンパク質のLR対立遺伝子の結晶構造は、P21212結晶における二回軸の周囲に形成された大きな結晶学的二量体を有すると報告されている(Maxwellら、1999年)。このような配置によって、FcγRIIaの2つのITAM含有細胞質両末端が近接近位となる。他の結晶構造は、C2結晶からのFcγRIIaのHR対立遺伝子の非グリコシル化(大腸菌由来)形態が報告されており、これは、FcγRIIaのグリコシル化LR対立遺伝子に報告されているものと同じ二量体を形成しなかったことが、著者により概説されている(Sondermannら、2001年)。
【０００５】
Maxwellら(1992年)により記載されたLR FcγRIIaの結晶構造には、P21212結晶を生成させるために用いられたLR FcγRIIa cDNAの元のクローニングに導入された点変異があった。該変異は、LR FcγRIIa遺伝子の88位におけるセリンからフェニルアラニンのものであった。本明細書では以後、LR変異体を、LRF88と称する。LR野生型を、本明細書では以後、LRS88と称し、HR野生型を、本明細書では以後、HRS88と称する。
【０００６】
原理または構造ベースの薬物設計の過程は、当業者には説明または教示の必要はないが、一般読者のため、コンピュータ設計の簡単な説明を本明細書に示す。当業者は、化学エンティティーまたは断片を、標的分子に結合するそれらの能力に関してスクリーンするために、いくつかの方法のうちの1つを使用できる。例えば、スクリーニング法は、機械可読データ貯蔵媒体から作製した、コンピュータスクリーン上の標的分子またはその一部の肉眼検査から開始できる。次いで、選択された断片または化学エンティティーを、特定のまたは可能な結合ポケット(すなわち、標的部位)内に、種々の配向で配置、またはドッキングさせることができる。ドッキングは、Quanta(Accelrys社、米国、マサチューセッツ州、バーリントン)およびSobyl(Tripos Associates、米国、ミズーリ州、セントルイス)などのソフトウェアを用い、続いて、CHARMM(Accelrys社、米国、マサチューセッツ州、バーリントン)およびAMBER(Weinerら、1984年;Kollman, PA、米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ、カリフォルニア大学)などの標準的な分子力学力場を用いたエネルギー最小化および分子動態学によって達成される。
【０００７】
専門的コンピュータプログラムもまた、断片または化学エンティティーの選択の方法における補助となり得る。これには以下のものが挙げられる:
1.  GRID(Goodford、1985年)。GRIDは、英国、オックスフォード、オックスフォード大学から入手できる。
2.  MCSS(Miranker、1991年)。MCSSは、米国、マサチューセッツ州、バーリントン、Accelrys社から入手できる。
3.  AUTODOCK(Goodsell、1990年)。AUTODOCKは、米国、カリフォルニア州、ラジョラ、Scripps Research Instituteから入手できる。
4.  DOCK(Kuntz、1982年)。DOCKは、米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ、カリフォルニア大学から入手できる。
【０００８】
好適な化学エンティティーまたは断片が選択されたら、それらを単一の化合物または複合体に構築することができる。構築は、標的分子の構造座標に関連した、コンピュータスクリーン上に示された三次元画像上の該断片相互の関係を肉眼検査することによって進行させることができる。この後に、一般的に、QuantaまたはSybylなどのソフトウェアを用いて、手操作のモデル構築を行う。
【０００９】
個々の化学エンティティーまたは断片の結合において、当業者を補助する有用なプログラムとしては、以下のものが挙げられる:
1.  CAVEAT(Bartlettら、1989年)。CAVEATは、米国、カリフォルニア州、バクレー、カリフォルニア大学から入手できる。
2.  MACCS-3D(米国、カリフォルニア州、サンリーンドロ、MDL Information System)などの3Dデータベースシステム。この分野は、Martin、1992年に概説されている。
4.  HOOK(米国、マサチューセッツ州、バーリントン、Accelrys社から入手できる)。
【００１０】
当業者によく知られているように、標的部位に対する単一の化合物または複合体の構築を段階的様式で、上記のように一度に1種の断片または化学エンティティーで進める代わりに、阻害化合物または他の標的結合性化合物を、全体として、または新たに設計できる。このような達成方法としては、以下のものが挙げられる:
1.  LUDI(Bohm、1992年)。LUDIは、米国、マサチューセッツ州、バーリントン、Accelrys社から入手できる。
2.  LEGEND(Nishibata、1991年)。LEGENDは、米国、マサチューセッツ州、バーリントン、Accelrys社から入手できる。
3.  LeapFrog(Tripos Associates、米国、ミズーリ州、セントルイス)。
【００１１】
他の分子モデリング法もまた、使用でき、例えば、Chohen、1990年およびNaviaら、Current Opinion in Structural Biology 2: 202〜210頁、1992年を参照されたい。
【００１２】
上記の方法によって単一の化合物または化学的複合体を設計、または選択したら、標的部位にエンティティーが結合し得る効率を試験し、コンピュータ評価により最適化することができる。例えば、効果的エンティティーは、その結合状態と遊離状態との間のエネルギー(すなわち、小さな結合変形エネルギー)において比較的小さな違いを示すことが好ましい。したがって、約10kcal/モル以下、好ましくは7 kcal/モル以下の結合変形エネルギーを有する最も効率的なエンティティーが設計されることが好ましい。さらに、いくつかのエンティティーは、総結合エネルギーの同様な1つ超の配座で標的部位と相互作用できる。これらの場合、結合変形エネルギーは、遊離エンティティーのエネルギーと該要素が標的部位に結合する際に見られる配座の平均エネルギーとの間の違いと考えられる。
【００１３】
標的部位に結合するように設計されたかまたは選択された化合物または化学的複合体は、その結合状態で、標的タンパク質との斥力的静電相互作用が好ましくは無いように、さらにコンピュータ上で最適化できる。このような非相補的(例えば、静電的)相互作用としては、斥力的電荷-電荷、双極子-双極子および電荷-双極子の相互作用が挙げられる。特に、該エンティティーが標的部位に結合している場合、該エンティティーまたは他のエンティティーと標的部位との間の全ての静電相互作用の総和が、結合のエンタルピーに中性または有利な寄与をなすことが好ましい。
【００１４】
化合物の変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価するために、当業界において専門的コンピュータソフトウェアが利用できる。このような使用のために設計されたプログラムの例としては: Gaussian92、改訂版C(Frisch, MJ、Gaussian社、米国、ペンシルベニア州、ピッツバーグ);AMBER、4.0版(Kollman, PA、米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ、カリフォルニア大学);QUANTA/CHARMM;およびInsightII/Discover(Accelrys社、米国、マサチューセッツ州、バーリントン)が挙げられる。これらのプログラムは、例えば、Silicon Graphics O2 ワークステーションまたはIntel CPUベースのLinuxクラスターを用いて実施できる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージも当業者に知られているであろう。
【００１５】
上記のとおり、化合物または化学的複合体を最適に設計または選択したら、例えば、その結合特性を改善または変更するために、修飾することができる。したがって、化合物に関して、その原子または側鎖のいくつかに置換を施すことができる。一般に、この種の最初の置換は保存的であり、すなわち、置換基は、元の基とおよそ同じサイズ、形状、疎水性および電荷を有する。当然のことながら、配座を変化させることが当業界で知られている成分は避けなければならないことを認識する必要がある。次いで、このような置換された化学的化合物を、上記に詳述した同じコンピュータ法によって特異的標的部位へのフィット効率に関して分析できる。
【００１６】
他の方法は、全体的に、または部分的に標的部位と相互作用できる化合物または化学的複合体に関する小型分子データベースのコンピュータスクリーニングである。このスクリーニングにおいて、標的部位へのこのようなエンティティーのフィットの質を形状相補性によって、または相互作用エネルギーの予測によって判定できる(例えば、Mengら、1992年を参照)。
【非特許文献１】Chohe、1990年およびNaviaら、Current Opinion in Structural Biology 2: 202〜210頁、1992年
【特許文献１】国際出願PCT/AU87/00159号(公開番号WO 87/07277)
【特許文献２】国際出願PCT/AU95/00606号(公開番号WO96/08512)
【特許文献３】国際出願PCT/AU2003/001734号(公開番号WO2004/058747)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第1の態様において、本発明は、Fc受容体タンパク質の生物活性を調節する試剤を同定する方法を提供し、前記方法は:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)、低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該受容体の生物学的活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を設計するかまたは選択することによって候補試剤を同定するステップとを含む。
【００１８】
第2の態様において、本発明は、Fc受容体の生物活性を調節する候補試剤に関して、化合物および/または化学的複合体をスクリーニングする方法を提供し、前記方法は:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)、低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を同定するために、前記化合物および/または化学的複合体をスクリーニングするステップとを含む。
【００１９】
第3の態様において、本発明は、Fc受容体の生物活性を調節する候補試剤を修飾する方法を提供し、前記方法は:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)、低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)該候補試剤を修飾して、前記標的部位との所望のレベルの相互作用を提供するのに該候補試剤よりも有利な三次元構造を有する試剤を提供するステップとを含む。
【００２０】
第4の態様において、本発明は、生物活性の変化した高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)または低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)の変異体を設計する方法を提供し、前記方法は:
(i)HRS88またはLRS88またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップと;
(ii)該モデルを修飾して、生物活性の変化したHRS88 またはLRS88の変異体を提供するステップとを含む。
【００２１】
第5の態様において、本発明は、高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)、低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するコンピュータを提供し、試剤が相互作用でき、それによりFc受容体の活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含み、前記コンピュータは:
(i)表3の原子座標データを含む機械可読データ貯蔵媒体(例えば、ハードドライブ、フロッピー(登録商標)ディスクまたはCD-ROMなどの磁気的または光学的貯蔵媒体)と;
(ii)機械可読データ貯蔵媒体に含まれた前記原子座標データ処理用の指示を貯蔵するためのワーキングメモリーと;
(iii)前記原子座標データを処理して、前期三次元構造モデルを作製するための、前記ワーキングメモリーおよび前記機械可読データ貯蔵媒体に結合させた中央処理装置と;
(iv)前期三次元構造モデルの画像を表示するための、前記中央処理装置に結合させたディスプレイとを含む。
【００２２】
第6の態様において、本発明は、表3の原子座標データを含む機械可読データ貯蔵媒体を提供する。
【００２３】
第7の態様において、本発明は、第1または第2の態様の方法によって同定された候補試剤、第3の態様によって作製した試剤または第4の態様によって設計した高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)または低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)の変異体を提供する。
【００２４】
第8の態様において、本発明は、対象におけるFc受容体の生物活性を調節する薬剤の調製における、第7の態様の高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)または低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)の試剤または変異体の使用を提供する。
【００２５】
第9の態様において、本発明は、対象におけるFc受容体の生物活性を調節する方法を提供し、前記方法は、第7の態様の高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)または低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)の試剤または変異体を含む薬剤を投与することを含む。
【００２６】
第10の態様において、本発明は、薬剤を作製する方法を提供し、前記方法は:
(i)第1の態様の方法に従って試剤を同定し、第2の態様の方法に従って化合物および/または化学的複合体を同定し、第3の態様の方法に従って候補試剤を修飾し、修飾された試剤を提供すること、
(ii)前記試剤、化合物および/または化学的複合体または修飾された試剤を化学的に合成すること、
(iii)Fc受容体に媒介された疾患または病態を治療するために、合成された試剤、化合物および/または化学的複合体または修飾された試剤の能力を評価すること、および
(iv)合成された試剤、化合物および/または化学的複合体または修飾された試剤を、好適な、製薬的に許容できる送達媒体またはアジュバントによって製剤化し、前記薬剤を作製することを含む。
【００２７】
第11の態様において、本発明は、対象における、Fc受容体に媒介された疾患または病態を治療する方法を提供し、前記方法は、Fc受容体(FcR)上の:
(a)免疫グロブリン結合部位を形成する表面;
(b)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間または2つのLRS88単量体間に二量体界面を形成する表面;
(c)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間または2つのLRS88単量体間に大型グルーブ(部位A)を形成する表面;および
(d)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間または2つのLRS88単量体間の二量体界面に隣接したキャビティー、チャネルおよび2つの同一ポケット(部位B)を形成する表面から選択された表面に結合する高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)または低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)の試剤または変異体の薬剤有効量を前記対象に投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本出願者は、C2221において結晶化したFcγRIIaのHRS88野生型の結晶構造を決定し、この受容体に見られる結晶パッキングと、以前LRF88に見られたものとの間には著しい違いがあることを見出した。さらに、本出願者は、該結晶構造から、ヒトの免疫グロブリン(例えば、IgG1)の2つのFcタンパク質を容易に調整するFcγRIIa受容体の新規な二量体を明らかにした。この新規な二量体は、FcγRIIaのシグナリング複合体に内因的に関与しており、したがって、この受容体および他の細胞膜結合タンパク質受容体の生物学ならびに調節の解明に使用されると考えられる。より具体的には、本出願者により同定されたHRS88の新規な二量体は、Fc受容体の生物活性を調節する試剤の同定および修飾に使用される。
【００２９】
したがって、第1の態様において、本発明は、Fc受容体タンパク質(FcR)の生物活性を調節する試剤を同定する方法を提供し、前記方法は:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)、低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を設計するかまたは選択することによって候補試剤を同定するステップとを含む。
【００３０】
好ましい一形態において、該方法は、HRS88またはLRS88の二量体の単量体間の相互作用を調節する候補試剤を同定する方法であり、前記方法は:
(i)HRS88、またはLRS88の各単量体の部分が表されている二量体またはその一部の、三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより、該単量体間の相互作用を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を設計するかまたは選択することによって候補試剤を同定するステップとを含む。
【００３１】
第2の態様において、本発明は、Fc受容体タンパク質(FcR)の生物活性を調節する候補試剤に関して、化合物および/または化学的複合体をスクリーニングする方法を提供し、前記方法は:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)、低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を同定するために、前記化合物および/または化学的複合体をスクリーニングするステップとを含む。
【００３２】
好ましい一形態において、HRS88またはLRS88の二量体の単量体間の相互作用を調節する候補試剤に関して、化合物および/または化学的複合体をスクリーニングする方法が提供され、前記方法は:
(i)HRS88またはLRS88の各単量体の部分が表されている二量体またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該単量体間の相互作用を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を同定するために、前記化合物および/または化学的複合体をスクリーニングするステップとを含む。
【００３３】
第3の態様において、本発明は、Fc受容体タンパク質(FcR)の生物活性を調節する候補試剤を修飾する方法を提供し、前記方法は:
(i)高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)、低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該受容体の生物活性を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)該候補試剤を修飾して、前記標的部位との所望のレベルの相互作用を提供する上で該候補試剤よりも有利な三次元構造を有する試剤を提供するステップとを含む。
【００３４】
好ましい一形態において、活性が改良された試剤を提供するためにHRS88またはLRS88の二量体の単量体間の相互作用を調節する候補試剤を修飾する方法が提供され、前記方法は:
(i)HRS88またはLRS88の各単量体の部分が表されている二量体またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップであって、試剤が相互作用でき、それにより該単量体間の相互作用を調節できる標的部位の三次元構造を、前記構造モデルが含むステップと、
(ii)前記標的部位との所望のレベルの相互作用を提供する上で、該試剤候補よりも有利な三次元構造を有する試剤を提供するために、該候補試剤を修飾するステップとを含む。
【００３５】
本発明の第1から第3の態様の方法は、インシリコ法であることが好ましい。
【００３６】
第1から第3の態様の各方法のステップ(i)で作製した三次元構造モデルは、少なくとも、候補試剤または創製試剤(すなわち、修飾候補試剤)が、好ましくはHRS88またはその一部、あるいは、HRS88の二量体またはその一部と相互作用(例えば、結合)できる標的部位の三次元構造を含む。HRS88の三次元構造内のアミノ酸に関する原子座標データは、本明細書後記の表3に提供されている。したがって、第1から第3の態様の方法で作製された三次元構造モデルは、少なくとも表3の原子座標データを用いて作製されることが好ましい。
【００３７】
表3の原子座標データは、HRS88の二量体の単量体のうちの1つを表している。当業者には理解されるだろうが、表3の原子座標に空間基C2221の対称的操作を適用することによって、該二量体の他の単量体を容易に作製できる。適切な対称的操作は:
1   0   0        X       0          XSYM
0  -1   0   ×   Y   +   155.88  =  YSYM
0   0  -1        Z      -88.10      ZSYM
である。
【００３８】
第1の態様の方法において、候補試剤を同定するステップ(すなわち、ステップ(ii))は、標的部位にフィットし相互作用する三次元構造を有する化合物または化学的複合体を設計し選択するための上記の方法によって達成できる。
【００３９】
第1の態様の方法は、遊離状態から標的部位との相互作用状態(例えば結合状態)になった時の該候補試剤の変形エネルギーを評価するステップをさらに含む。該変形エネルギーは、好ましくは10kcal/モル以下、より好ましくは7kcal/モル以下である。候補試剤の変形を評価するステップに加えて、またはその代わりに、第1の態様の方法は、候補試剤と標的部位との相互作用(例えば結合)のエンタルピーを評価するステップを含むことができる。該候補試剤は、該相互作用のエンタルピーに、中性または有利な寄与をなすことが好ましい。
【００４０】
第2の態様の方法において、標的部位との相互作用を可能にする三次元構造を有する化合物または化学的複合体を同定するために、化合物または化学的複合体をスクリーニングするステップ(すなわち、ステップ(ii))は、上記の方法によって達成できる。スクリーニングされた化合物および/または化学的複合体は、好適な化合物および/または化学的複合体のライブラリまたはデータベース(例えば、ACD-SC(Chemicals Directory Screening Compoundsより入手可能)、MDL社、米国、カリフォルニア州、サンリーンドロ)に帰属し得る。
【００４１】
第3の態様の方法において、候補試剤を修飾するステップ(すなわち、ステップ(ii))は、化合物上の1つまたは複数の基(例えば官能基)の置換など、上記の方法にょって達成できる。
【００４２】
第1から第3の態様の方法において、候補試剤および試剤は、小型化学分子(SCE)およびモノクローナル抗体から選択されることが好ましい。
【００４３】
第1から第3の態様の方法において、例えば、FcRに結合すること、またはFcRの作用を模倣すること、例えば2つのFcRタンパク質の二量体化を防ぐことによってFcRを介する細胞のシグナル伝達を阻害すること、または例えば2つのFcRタンパク質の二量体化を増強させることによってFcRへの細胞のシグナル伝達または結合を増強させること、によって、該試剤は生物活性を調節できる。
【００４４】
第1から第3の態様の方法において、該標的部位は、HRS88またはLRS88上の:
(a)免疫グロブリン結合部位を形成する表面;
(b)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間または2つのLRS88単量体間に二量体界面を形成する表面;
(c)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間または2つのLRS88単量体間に大型グルーブ(本明細書では以後部位Aと称す)を形成する表面;および
(d)二量体化受容体の2つのHRS88単量体間または2つのLRS88単量体間の二量体界面に隣接したキャビティー、チャネルおよび2つの同一ポケット(本明細書では以後部位Bと称す)を形成する表面から選択された表面から選択される表面であることが好ましい。
【００４５】
本明細書に用いられる用語の「界面」とは、直接接触している(すなわち、疎水性の、ファンデルワールスの、または静電的な接触)別個のポリペプチド鎖(例えばFcγRIIaの単量体1と単量体2)の原子群および残基ならびにタンパク質: タンパク質相互作用に寄与していると当然考えられる、必ずしも直接接触しているとは限らない近傍の残基を言う。
【００４６】
該標的部位が免疫グロブリン結合部位である場合、該表面はアミノ酸残基、113-116、129、131、133、134、155、156および158-160の配座によって規定された構造を含むことが好ましい。
【００４７】
該標的部位が二量体化界面である場合、該表面は、HRS88二量体(またはLRS88二量体)の一方の単量体のアミノ酸残基、26、33、54-56、58、102、103、105、142および143、ならびに該二量体の他方の単量体の等しい残基の配座によって規定された構造を含むことが好ましい。
【００４８】
該標的部位がHRS88二量体の部位Aである場合、該表面は、HRS88二量体(またはLRS88二量体)の一方の単量体のアミノ酸残基、22-24、60、107、109、110、112、114-118、131、133-138、140および160、ならびに該二量体の他方の単量体の等しい残基の配座によって規定された構造を含むことが好ましい。
【００４９】
該標的部位がHRS88二量体(またはLRS88二量体)の部位Bである場合、該表面は、HRS88二量体(またはLRS88二量体)の一方の単量体のアミノ酸残基、12-16、26、96、100、および105、ならびに該二量体の他方の単量体の等しい残基の配座によって規定された構造を含むことが好ましい。
【００５０】
上記(a)から(d)の好ましい標的部位の1つと相互作用する(例えば結合する)試剤は、FcRタンパク質、特にFcγRIIaの生物活性を、該受容体による細胞のシグナル伝達を阻害するかまたは増強することによって、または免疫グロブリンタンパク質(例えばIgG)またはその断片のFc部分に対する該受容体の結合を阻害するか増強させることによって調節できる。
【００５１】
第4の態様において、本発明は、生物活性の変化した高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)または低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)の変異体を設計する方法を提供し、該方法は:
(i)HRS88またはLRS88またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップと;
(ii)該モデルを修飾して、生物活性の変化したHRS88 またはLRS88の変異体を提供するステップとを含む。
【００５２】
用語の「変異体」とは、HRS88またはLRS88とは異なるが、生物活性における類似性を保持している任意の分子を言う。したがって、変異体はHRS88またはLRS88との実質的に全体的構造類似性を有するか、HRS88またはLRS88の1つまたは複数の領域とのみ構造類似性を有する(例えば、可溶性HRS88変異体は、HRS88の細胞外領域とのみ構造類似性を有し得る)。典型的には、HRS88またはLRS88の変異体は、HRS88またはLRS88のアミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸を加えること、HRS88またはLRS88のアミノ酸配列から1つまたは複数のアミノ酸を欠失させることおよび/またはHRS88またはLRS88のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸を置換することによって、またはそれらの結果として提供される。アミノ酸配列の変更を生じさせるアミノ酸の転移および他の変異変化もまた包含される。アミノ酸の置換には、保存的または非保存的アミノ酸置換が含まれ得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、同様の特徴を有し、該ポリペプチドの生物学的機能を実質的に変化させない他のアミノ酸によって置き換わることを意味する。典型的な保存的アミノ酸置換は、下記の表1に提供されている。考えられる具体的な保存的置換は: G、A、V、I、L、M;D、E、N、Q;S,C,T;K、R、H: およびP,Nα-アルキルアミノ酸である。一般に、保存的アミノ酸置換は、(a)置換領域におけるペプチド主鎖の構造、(b)置換部位におけるポリペプチドの電荷または疎水性、および/または(c)置換部位における側鎖の大きさ、に実質的な影響を及ぼさないということに基づいて選択される。変異体が合成によって調製される場合、該変異体はまた、γ-カルボキシグルタミン酸およびヒドロキシプロリンなど、遺伝子コードによってコードされない1つまたは複数のアミノ酸を含み得る。例えば、L-アミノ酸ではなくD-アミノ酸を含み得る。第4の態様による変異体の好ましい一実施形態において、該変異体は、HRS88のペプチド模倣物などの模倣物である。
【００５３】
第4の態様の方法の好ましい一形態において、生物活性の変化したHRS88またはLRS88の二量体変異体を設計する方法が提供され、前記方法は:
(i)各単量体の部分が表されているHRS88またはLRS88の二量体またはその一部の三次元構造モデルを作製するステップと;
(ii)該モデルを修飾して、生物活性の変化したHRS88またはLRS88の二量体の変異体を提供するステップとを含む。
【００５４】
本発明の第4の態様の方法は、インシリコ法であることが好ましい。
【００５５】
第4の態様の方法は、変化した有益な機能を有するタンパク質を設計するための手段を、該構造および該タンパク質の個々のアミノ酸間の相互作用を分析することによって提供する。例えば、IgまたはIgの免疫複合体に対する結合を改善させた治療用タンパク質を設計して、細胞に対する免疫複合体の結合を防ぐために、または、Igまたはその複合体に対するFcRの結合時の細胞シグナル伝達などの生体応答を増強させるために、治療用化合物として使用することができる。このように、該三次元構造の知見に基づいて、改善を含むように改変された組換え可溶性FcRを作製することができる。
【００５６】
第4の態様の方法のステップ(i)で作製された三次元構造モデルは、少なくとも、候補試剤または創製試剤が、好ましくはHRS88またはその二量体と相互作用(例えば結合)できる標的部位の三次元構造を含む。第4の態様の方法のステップ(i)で作製された三次元構造モデルは、少なくとも表3の原子座標データを用いて作製されることが好ましい。
【００５７】
HRS88もしくはその二量体(またはLRS88もしくはその二量体)の変異体による組換えタンパク質は、当業者によく知られた任意の方法によって調製できる。例えば、変異体を提供するためになされた修飾が1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む場合、該組換えタンパク質は、Fc受容体(例えばHRS88)をコードするDNA分子の部位指向的変異によって、変異体タンパク質をコードするDNA分子を先ず作製し、その後、好適な宿主細胞内で該DNA分子を発現させることによって調製できる。FcγRIIaをコードするDNA分子、およびFcγRIIaおよびその変異体(可溶性変異体を含めて)をコードするDNA分子を発現させる方法は、国際出願PCT/AU87/00159号(公開番号WO 87/07277)および国際出願PCT/AU95/00606号(公開番号WO96/08512)に開示されている。これら2つの国際特許出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれていることに考慮されたい。
【００５８】
第1から第4の態様の方法において、該モデルは、HRS88または免疫グロブリン(例えばIgG)またはその一部に結合するタンパク質のFc部分をさらに含み得る。好ましい一形態において、該モデルのFc部分/免疫グロブリンに関する原子座標は、タンパク質データバンクに提供されているFcγRIII-Fc複合体に関する座標から得られる(PDBコードIE4Kを参照)。
【００５９】
第5の態様において、本発明は、高レスポンダーFcγRIIa(HRS88)または低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)またはその一部の三次元構造モデルを作製するコンピュータを提供し、前記構造モデルは、試剤が相互作用し、それによりFc受容体タンパク質(FcR)の活性を調節できる標的部位の三次元構造を含み、前記コンピュータは:
(i)表3の原子座標データを含む機械可読データ貯蔵媒体(例えば、ハードドライブ、フロッピー(登録商標)ディスクまたはCD-ROMなどの磁気的または光学的貯蔵媒体)と;
(ii)機械可読データ貯蔵媒体に含まれた前記原子座標データ処理用の指示を貯蔵するためのワーキングメモリーと;
(iii)前記原子座標データを処理して、前期三次元構造モデルを作製するための、前記ワーキングメモリーおよび前記機械可読データ貯蔵媒体に結合させた中央処理装置と;
(iv)前期三次元構造モデルの画像を表示するための、前記中央処理装置に結合させたディスプレイとを含む。
【００６０】
該コンピュータはさらに:
(v)ある範囲の化学成分および置換基に関する原子座標データを受信し貯蔵するための手段であって、中央処理装置が前記受信および貯蔵手段と相互作用でき、前記範囲の化学成分および置換基から好適な化学成分および置換基を選択し、前記ディスプレイ上に、HRS88、LRS88またはその一部の前記三次元構造モデルの画像と同時に画像が提供できる前記中央処理装置によって作製された三次元構造に基づいて、前記標的部位と相互作用できる化合物または化学的複合体を組み立てる手段;および/または
(vi)ある範囲の化合物および/または化学的複合体に関する原子座標データを受信し貯蔵するための手段であって、中央処理装置が前記受信および貯蔵手段と相互作用でき、前記範囲の化合物および/または化学的複合体から選択されたある化合物または化学的複合体に関する三次元構造モデルを作製し、前記ディスプレイ上に、HRS88、LRS88またはその一部の前記三次元構造モデルの画像と同時に前記三次元構造の画像を提供し、それによって、前記選択された化合物または化学的複合体が前記標的部位と相互作用できるかどうかを評価できる手段を含む。
【００６１】
該範囲の化学成分および置換基に関する原子座標データならびに該範囲の化合物および/または化学的複合体に関する原子座標データは好適なデータベースから得ることができる。
【００６２】
第6の態様において、本発明は、表3の原子座標データを含む機械可読データ貯蔵媒体を提供する。
【００６３】
第7の態様において、本発明は、第1または第2の態様の方法に従って同定された鉱本発明の試剤、第3の態様に従って作製された試剤または第4の態様に従って設計されたHRS88の変異体を提供する。
【００６４】
第7の態様の候補試剤、試剤または変異体は、対象におけるFcR(特に、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIcなどのFcαR、FcεR、FcγRから選択されたFcR、およびそれらの混合物)の生物活性を調節するための薬剤を調製するために使用できる。該薬剤は、例えば、IgGに媒介された組織損傷の減少;動物におけるIgG液性免疫応答の刺激;およびオプソニゼーションまたはFcγR依存エフェクター機能(例えば、抗体依存FcγR媒介細胞毒性作用、貪食作用または細胞伝達物質の放出)により、限定はしないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌または感染性疾患(例えば、HIV、ヘルペス、細菌感染、酵母感染または寄生感染などの経口感染)などの特定疾患の治療のために動物に投与される抗体の治療効果の改善のために使用できる。
【００６５】
第7の態様の試剤は、小型化学エンティティー(SCE)およびモノクローナル抗体から選択されることが好ましい。
【００６６】
したがって、第8の態様において、本発明は、対象におけるFcR(特にFcγRIIa)の生物活性を調節するための薬剤の調製における、第7の態様の候補試剤、試剤または変異体の使用法を提供する。
【００６７】
また、第9の態様において、本発明は、対象におけるFcR(特にFcγRIIa)の生物活性を調節するための方法を提供し、前記方法は、第7の態様の候補試剤、試剤または変異体を含む薬剤の投与を含む。
【００６８】
第8および第9の態様において言及されている対象は、ヒトまたは他の動物(例えばコンパニオン動物および家畜)であり得る。
【００６９】
本発明の薬剤の製造において、第7の態様の候補試剤、試剤または変異体は、対象への投与のために、製薬的に許容できる送達媒体またはアジュバントと共に製剤化できる。投与は、例えば、筋肉内注射、静脈内投与、エアロゾルスプレーによる鼻腔内投与、および経口投与などの任意の好適な様式によるものであり得る。
【００７０】
対象に投与できる第7の態様の候補試剤、試剤または変異体の量は、対象の免疫状態および治療される疾患または病態の重症度など、多数の因子によって変化し得る。しかし、例えば、第7の態様の薬剤は、約0.001 mg/kg体重から10 mg/kg体重、好ましくは、0.1 mg/kg体重から1 mg/kg体重の用量で、対象に投与できる。
【００７１】
第10の態様において、本発明は、薬剤を製造する方法を提供し、前記方法は:
(i)第1の態様方法に従って試剤を同定すること、第2の態様方法に従って化合物および/または化学的複合体を同定すること、または第3の態様方法に従って候補試剤を修飾し、修飾試剤を提供すること、
(ii)前記試剤、化合物および/または化学的複合体または修飾試剤を化学的に合成すること、
(iii)合成された試剤、化合物および/または化学複合体または修飾試剤が、Fc受容体媒介の疾患または病態を治療する能力を評価すること、および
(iv)好適な製薬的に許容できる送達媒体またはアジュバントと共に合成された試剤、化合物および/または化学複合体または修飾試剤を製剤化して前記薬剤を製造すること、を含む。
【００７２】
第11の態様において、本発明は、対象のFc受容体媒介疾患または病態を治療する方法を提供し、前記方法は、
(a)免疫グロブリン結合部位を形成する表面;
(b)二量化受容体の2つのHRS88単量体間または 2つのLRS88単量体間に二量化界面を形成する表面;
(c)二量化受容体の2つのHRS88単量体間または2つの LRS88単量体間に大型グルーブ(部位A)を形成する表面;および
(d)二量化受容体の2つのHRS88単量体間または2つの LRS88単量体間の二量化界面に隣接したキャビティー、チャネルおよび2つの同一ポケット(部位B)を形成する表面、から選択されたFc受容体(FcR)上の表面に結合するHRS88または LRS88の試剤または変異体の治療的有効量を前記対象に投与することを含む。
【００７３】
FcR上の前記表面の1つへの結合において、HRS88または LRS88の試剤または変異体は、免疫グロブリンのFcRへの結合阻害を生じさせることが好ましい。
【００７４】
第11の態様に言及されているFcRは、FcαR、FcεR、FcγR(例えば、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIc)およびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましい。前記FcRはFcγRIIaであることが最も好ましい。
【００７５】
第11の態様方法により治療を受けることができるFcR媒介疾患または病態は、IgG媒介組織損傷、IgE媒介疾患または病態、炎症、自己免疫疾患(例えば、リウマチ様関節炎、全身性紅斑性狼瘡、免疫血小板減少症、好中球減少症、および溶血性貧血)からなる群から選択できる。
【００７６】
第11の態様方法は、抗体の凝集物が生成するか、抗体と、内因性抗原または外因性抗原との接触によって免疫複合体が生成するFcR媒介疾患または病態を治療するために使用することもできる。このような疾患としては、免疫複合体疾患、自己免疫疾患、感染性疾患(例えば、デング熱ウィルス-デング出血性熱および麻疹ウィルス感染)および血管炎(例えば、結節性多発動脈炎、および全身性血管炎)が挙げられる。
【００７７】
本発明の性質を、より明確に理解できるように、その好ましい形態を、以下の非限定例を参照として次に記載する:
【００７８】
表1は、HRS88糖タンパク質の構造決定に用いられたX線データおよび結晶学的分子構造精密化に関する統計値の概要を提供している。HRS88結晶からのデータは、40 kVおよび20 mAで操作されたMicroMax007/R-AxisIV++回転陽極X線発生器システムを用いて得られた。データは、HKLスート版1.97(HKL Research社、米国)のDENZOおよびスケールパックプログラムを用いて縮小化し、また基準化した。この結晶構造を、CNSプログラムパッケージ版1.0(Brungerら、1998年)を用いて解析し、精密化した;
【００７９】
表2は、HRS88野生型FcγRIIa結晶の主として結晶学的二量体を形成するタンパク質単量体に関連する4Å未満の原子間距離を提供している。これらの距離が算出される二量体受容体形態は、提供された原子座標(表3)と関連する標準的対称操作を用いて容易に作製される。二量体受容体形態を図3に図解している;
【００８０】
表3は、HRS88の結晶構造に関する精密化された原子座標を提供している。
【００８１】
表4は、HRS88二量体結晶構造の部位AへのVIB153リガンドの最高ランクで結合した配向性に関する原子座標を提供している。
【００８２】
表5は、HRS88二量体結晶構造の部位BへのVIB153リガンドの最高ランクで結合した配向性に関する原子座標を提供している。
【００８３】
表6は、HRS88二量体結晶構造の部位AへのVIB197リガンドの最高ランクで結合した配向性に関する原子座標を提供している。
【００８４】
表7は、HRS88二量体の部位BへのVIB197リガンドの最高ランクで結合した配向性に関する原子座標を提供している。
【００８５】
(実施例)
(実施例1)
野生型HRS88 FcγRIIa糖タンパク質の2.3Å結晶構造の決定
材料と方法
タンパク質調製の説明
野生型HRS88 FcγRIIa cDNA(134位にArgおよび88位にSer)は、スプライス重なり拡大PCRにより作製され、バキュロウィルス発現系を用いてSF21昆虫細胞内で発現された。短時間で、Gibco SF900培地(Invitrogen Australia Pty社、オーストラリア、Vic)中のSF21細胞を、10×200 mlフラスコ中、2×106個の細胞/mlの密度に増殖させた。細胞を、5 mlのウィルスストック/フラスコの添加により感染させ、27℃で72時間維持した。この受容体は、Qセファロース上のアニオン交換LRF88 FcγRIIaに関して以前に記載されたとおり(Powellら、1999年)、熱凝集免疫グロブリン結合セファロース上のアフィニティークロマトグラフィステップにより精製した上澄液であった。精製HRS88糖タンパク質を、75mMのNaCl、5mMのトリス緩衝液pH7.4中で透析し、Micosep 10K濃縮器(Pall社、米国、ニューヨーク州)を用いて5 mg/mlと10 mg/mlとの間に濃縮し、結晶化実験まで4℃に維持した。
【００８６】
HRS88糖タンパク質の結晶は、75 mMのNaCl、5 mMの5mMのトリス緩衝液pH7.4中4 mg/mlのタンパク質による2μlの座位滴下を伴う蒸気拡散法により生成された。この結晶化溶液にはまた、30%PEG 4000と0.2Mの硫酸アンモニウムとを含んだ。結晶は18℃で形成した。結晶を溶液から取り出し、X線分散分析に供した。HRS88結晶からのデータは、40 kVおよび20 mAで操作したMicroMax007/R-AxisIV++回転陽極X線発生器システムを用いて得られた。データは、HKLスート版1.97(HKL Research社、米国)のDENZOおよびスケールパックプログラムを用いて縮小化され、また基準化された。この結晶構造は、CNSプログラムパッケージ版1.0(Brungerら、1998年)を用いて解析され、精密化された。
【００８７】
結果と考察
結晶学的データと精密統計学は、表1に要約されており、一方、結晶構造に関する精密化原子座標は、表3に見られる。
【００８８】
LRF88変異体の結晶構造は、以前に記載されていた(タンパク質データバンクコード1FCG: Maxwellら、1999年、およびPowellら、1999年)。FcγRIIaのヒトLR対立遺伝子の発現および結晶化に用いられた元のcDNAのクローニングおよび増幅時にLRF88が形成され、単一アミノ酸置換は、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられた非プルーフリーディングTaqポリメラーゼによって導入された(ヌクレオチド配列の88位のセリンをフェニルアラニンに置換)。LRF88糖タンパク質は、昆虫細胞において過剰発現され、結晶構造は、2.0Åと決定された。しかしながら、決定されており、タンパク質データバンク(PDB)に供託された関連Fc受容体に関する全ての構造とLRF88単量体が、極めて類似した総合的三次元構造を共有していることから、この結晶構造に対するF88変異体の作用が何であるかは明白ではなかった。
【００８９】
図1に見ることができるように、野生型HRS88糖タンパク質の結晶は、多数の分枝点および成長不足のある針状晶束として形成するが、一方、LRF88変異体は、ほぼ常時、十分に形成された単結晶である。この異なる成長性により、LRF88の結晶格子が、三次元で確実に成長する能力によって実質的により均一性であるという指標が提供された。さらに、図2に見ることができるように、HRS88の結晶格子における分子の配列は、LRF88の構造に関して以前に決定されたものとは異なっている。すなわち、HRS88結晶の分子は、細胞膜に妥当に存在し得る二量体で配置されており、LRS88 FcγRIIa結晶中の分子はそのように配置されていない。
【００９０】
(実施例2)
野生型HRS88 FcγRIIa糖タンパク質の結晶学的二量体の説明および細胞外から細胞内へのシグナル伝達組立てのモデリング
方法と材料
HRS88 FcγRIIaの結晶学的二量体の説明と使用
そのC222l空間群に関連した情報を用いて、HRS88の結晶格子(表1)が提供された原子座標(表3)により構成した。細胞膜に生じるFcγRIIaの可能な細胞シグナル伝達組立てを同定するために以下の評価基準を適用した: (1)結晶学的二量体間の相互作用は、多数ありかつ化学的に適合性である必要があり;(2)繋留ポリペプチドによって細胞膜に通常固定されている残基は、二量体を膜に関連させると考えられる位置で出現すると思われる;および(3)受容体の活性部分(IgG結合)は、2つのリガンドを結合する位置に配置される必要がある。提供された原子座標(表3)から二量体の他方の半分(単量体2)を作製するために用いられた対称変換マトリックスは、
1   0   0        X       0          XSYM
0  -1   0   ×   Y   +   155.88  =  YSYM
0   0  -1        Z      -88.10      ZSYM
であった。
【００９１】
結果と考察
記載された評価基準(1)から(3)を用いて、結晶学的な2倍(すなわち、中心軸周囲を180℃回転)により関連するFcγRIIa二量体を同定し、HRS88結晶内に形成した(図3)。2つの単量体間に界面を形成する残基は、Fc受容体、特にFcγRIIaの生物活性を調節する試剤に対する好ましい標的となることが認識される。
【００９２】
HRS88 FcγRIIa二量体界面を構成する原子接触(4Åカットオフを適用して)の詳細な一覧を表2に提供している。調節剤は、記載した任意の界面残基の10Å半径以内にこれらの残基および全てのFcγRIIa残基を利用することによって界面残基にとっての標的となり得る。このような調節剤の例としては、小型化学エンティティー(SCE)、モノクローナル抗体、およびその相互作用分子または他の相互作用分子の修飾された溶解性変種が挙げられる。
【００９３】
野生型低レスポンダーFcγRIIa(LRS88)は、HRS88と同一の結晶格子を形成すると考えられ、その結果、HRS88と同一の三次元結晶構造を実質的に生成すると考えられている。特に、HRS88の二量体形成モデルは、LRS88に対する妥当なモデルになると考えられている。すなわち、FcγRIIa のHRS88およびLRS88の多形態変異体はアミノ酸配列において、単量体1: 単量体2の界面から十分に離れて位置している134位のみ(Arg対His)が異なることから、受容体の野生型LRS88形態と同一または実質的に同様な二量体界面が、存在していると考えられる。
【００９４】
(実施例3)
FcγRIIaの細胞外から細胞内へのシグナル伝達組立てのモデリング
材料と方法
HRS88の結晶学的2倍の二量体に関する変換原子座標、およびヒトFc のFc部分との複合体におけるFcγRIIIの複合体に関して供託された座標(PDBコード1E4K)(Sondermannら、2000年)を用いて、FcγRIIaの細胞外から細胞内へのシグナル伝達組立てをモデル化した。最小二乗フィッティングを用いてFcγRIIaおよびFcγRIII受容体座標のドメイン2の構造的に保存された残基を、剛体重ね合せのために用いた。
【００９５】
結果と考察
FcγRIIaの細胞外から細胞内へのシグナル伝達組立てモデルを作製し、図4に示している。HRS88の二量体への該複合体の結合は、Fcリガンドの2つの分子が、規則的組立て(立体的衝突をしない)へと結合することができる(図4)。無傷のIgGの抗原結合部分(Fab)もまた、モデル化された複合体の同側に出現するシグナル伝達組立てのこのモデルと適合できる。
【００９６】
【表１】
2008512083.tif 000003
【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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表3: 2.3Å分解能で測定されたHRS88野生型FcγRIIa糖タンパク質の原子座標
【００９９】
(実施例4)
治療用組成物の構造ベース設計のためのFcγRIIa標的部位
方法と材料
図5から図7に示されるように、HRS88結晶学的二量体構造の種々の図形は、Insight IIプログラムパッケージ、バージョン98.0(Accelrys)を用いて作製され、Connolly溶媒接触可能面が描写された(Connolly、1983年)。LIGPLOTプログラムを用いる標準的パラメーターによりプロットを作製した(Wallaceら、1995年)。
【０１００】
結果と考察
図5は、HRS88の主たる結晶学的二量体の溶媒接触可能面図を示しており、Tyr160の側鎖は、抗体および免疫複合体のための受容体結合部位に対する重要な寄与物であることから、該側鎖が強調表示されている。HRS88二量体の3つの直交図(図5)考査により、大型の溶媒充填グルーブが、受容体単量体間に存在していることが明らかになった。さらに、キャビティーとチャネルは、単量体1と単量体2の並列面の下方部分に形成されている。グルーブ、キャビティーおよびチャネルは、FcRタンパク質、特にFcγRIIaの生物活性を調節する試剤に対する新規な標的部位となっている。このような試剤は、例えば、FcγRIIa媒介の炎症を阻害または刺激する治療用組成物へと製剤化できる。
【０１０１】
HRS88二量体の破断図を、図6に示している。溶媒深触に対して接触可能であるか(灰色陰影面)、または接触不可能/埋もれている(黒色陰影領域)受容体の単量体の各々の領域を示している。埋もれた領域は、単量体1と2との間に界面を形成すると考えられている。FcγRIIa単量体の並列面は、提供された原子座標(表3)を用いて試剤の構造ベースの設計に好適な標的部位を形成すると考えられている。標的部位は、部位A(受容体の単量体間の大型グルーブ)および部位B(単量体1: 単量体2の界面に直接寄与している下方の残基に位置しているキャビティーとチャネル)として図6において確認される。部位Bは、中心キャビティー/チャネルおよび(B')と称される2つの同一ポケットからなる。治療用組成物の有効成分を含み得る試剤は、部位Aまたは部位Bを特異的に標的化できるか、あるいは、部位AおよびBに同時に結合できる。
【０１０２】
図7は、標識標的部位の表面に寄与するアミノ酸残基(単一文字コード)によるHRS88受容体の単量体の破断図を示している。マップ面(図7)を用いて、標的部位AおよびBに寄与するアミノ酸残基は、以下のとおり規定される:
部位Aは、主として以下の残基により形成される: Glu22、Asp23、Ser24、Lys60、Met107、Arg109、Cys110、Ser112、Lys114、Asp115、Lys116、Pro117、Leu118、Lys131、Ser133、Arg134、Leu135、Asp136、Pro137、Thr138、Ser140およびTyr160、ならびに
部位Bは、主として以下の残基により形成される: (キャビティーおよびチャネル)Pro14、Pro15、Trp16;(B'ポケット)Leu12、Glu13、Thr26、Pro96、Phe100およびThr105。
【０１０３】
受容体の単量体間の界面形成に直接関与するアミノ酸残基は、大部分が破断溶媒接触可能面モデル上の黒色陰影領域を形成する(図6および図7)。受容体の単量体1(鎖A)と単量体2(鎖B)上の界面残基を、略図で示している(図8)。具体的に、単量体1: 単量体2の界面に直接寄与するアミノ酸残基としては:
Thr26、Arg33、Gln54、Pro55、Ser56、Arg58、Glu102、Gly103、Thr105、Pro142およびGln143が挙げられる。
【０１０４】
界面残基の相互作用を変化させることによって、FcγRIIaに媒介された炎症を阻害または刺激する治療剤の有効性に直接または間接的に寄与することが予想される。界面残基の少なくとも1種、通常は1種以上と相互作用する場合に、直接的な効果が生じると考えられる。界面残基(例えば、上記に定義されたように標的部位AおよびB)に隣接した部位またはそれから離れた部位への薬剤の結合によって、間接的な効果が生じると考えられる。
【０１０５】
(実施例5)
HRS88結晶学的二量体への活性坑炎症性化合物の分子モデリング
方法と材料
HRS88の結晶学的二量体が、小型の化学エンティティー(SCE)との相互作用に好適な面を提供したかどうかを調べるために、VIB153およびVIB197(図9)と称される2種の化合物を、規定の標的部位AおよびBに結合させるための分子モデリングを用いた。VIB153およびVIB197は双方とも、FcγRIIa媒介の炎症に阻害活性を有することが以前に示されている(国際特許出願番号PCT/AU/2003/001734(公開番号WO 2004/058747)を参照、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれている)。
【０１０６】
分子モデリングのために、規則溶媒原子を、HRS88二量体の結晶座標から先ず取り出した。次に極性水素を、HRS88二量体構造に加えた。リガンド座標ファイル(VIB153およびVIB197)を、標準的タンパク質データバンク(PDB)フォーマット(Bermanら、2000年)で作製した。リガンド名は、PDBフォーマットが、3文字残基名だけを考慮に入れていることから、V53(VIB153)およびV97(VIB197)と略記される。自動化結合は、対ファンデルワールスと静電的エネルギー関数(8Åカットオフ)およびリガンド配座空間のねじれサンプリングを用いるMonte Carlo法であるリサーチアルゴリズムを用いて実施された(Hartら、1997年)。エネルギー関数は、1000回のトライアル中50のリガンドコンフォーマーのサンプリング後、リガンドの全ての結合配座をランク付けするために用いられた。標的部位は、以下のx、y、zの実空間座標: 部位A、x、y、z = 0.68、72.37、-45.70(Arg109付近)および;部位B、x、y、z = 9.18、74.17、-44.1(Pro15付近)の中心に置かれた1側面当り25Åを有する立方体グリッド(0.5Åのグリッドステップ)により規定された。
【０１０７】
結果と考察
HRS88結晶学的二量体の部位AおよびBへの、VIB153およびVIB197リガンドの最高ランク(すなわち、最低エネルギー値)の結合配向性に関する原子座標を、表4から表7に示している。
【０１０８】
標的部位のいずれかにおけるVIB153の予測結合配座は、リガンドが、主としてHRS88の結晶学的二量体の単量体(鎖Aまたは単量体1)の一方と相互作用することを示した(図10)。標的部位Aに対するVIB153の結合は、グルーブを内張りしている面上の個々のキャビティーに入る2つのフェニルカルボキシレートに関係する。タンパク質構成物とカルボキシレート部分との間に4つの水素結合までが予測される。VIP153リガンドは、一連の疎水性ファンデルワールス相互作用によってさらに固定される(図10、パネルa)。VIB153と標的部位Bとの間の相互作用は、深いポケットへの入口付近の主要キャビティーに生じ、性質は主として疎水性である。興味深いことに、フェニルカルボキシレートの1つは、隣接グルーブ(部位A)内のポケットに結合し、Ser24との水素結合を形成する(図10、パネルb)。この同じ相互作用は、VIB153が部位Aに直接結合した場合に見られた。SCE様VIB153は、疎水結合および水素結合(静電的)相互作用の差し引きによってタンパク質に結合することが多いことから、この結合結果により、このリガンドには標的部位Aが好ましいことが示されている。
【０１０９】
HRS88の結晶学的二量体上の標的部位AへのVIB197の自動化結合でもまた、該リガンドが、モノマー1の残基(鎖A)と排他的に相互作用することが見られた。しかしながら、最高ランクの結合配座における全ての相互作用の性質は疎水性であった(図11、パネルa)。VIB197の潜在的な水素結合の供与体原子および受容体原子は、グルーブへの結合に使用されなかった。対照的に、部位Bと結合した場合、VIB197は、タンパク質との水素結合および疎水性相互作用の混合余分と結合した(図11、パネルb)。相互作用の大部分は、単量体1(鎖A)との間で生じるが、単量体2(鎖B)のLys11の側鎖は、VIB197リガンドとの水素結合およびファンデルワールス相互作用に関与する。VIB197は、部位Bの上部のキャビティーにおける結合ではなく、部位Bのチャネルの下部および単量体1(鎖B)の二量体界面の端部における隣接グルーブに結合した。部位Aおよび部位Bにおける結合配座の比較により、VIB197は、標的部位Bに優先的に結合していることが示されている。
【０１１０】
総合すると、HRS88の結晶学的二量体へのVIB153とVIB197の自動化結合の結果によって示されるのは、これらの化合物の可能な作用機序として、免疫複合体結合を直接的に阻害するよりはむしろ受容体の二量体形成を阻害することが考えられることである。この点において、予測された結合配座の全てが、FcγRIIa上の抗体結合部位(図10および図11の標識されたTyr160の周囲;また図4および図5を参照)から十分に離れて位置していることは注目に値した。さらに、自動化結合では、HRS88の結晶学的二量体の単量体1に近接してリガンドが優先的に配置された。したがって、リガンドがFcγRIIaの単量体に結合する場合、それらは、二量体界面の残基間の相互作用を変化させるかまたは阻止する、近傍効果または間接的効果を有する可能性が高いと考えられる。細胞表面でクラスター化する受容体に依るシグナル伝達および随伴性炎症を軽減するか、除去するためにHRS88二量体による妨害が提案されている。
【０１１１】
【表４】
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表4: VIB153リガンドのHRS88-FcγRIIaの結晶学的二量体の部位Aへの最高ランクの結合配向性に関する原子座標
【０１１２】
【表５】
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表5: VIB153リガンドのHRS88-FcγRIIaの結晶学的二量体の部位Bへの最高ランクの結合配向性に関する原子座標
【０１１３】
【表６】
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表6: VIB197リガンドのHRS88-FcγRIIaの結晶学的二量体の部位Aへの最高ランクの結合配向性に関する原子座標
【０１１４】
【表７】
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表7: VIB197リガンドのHRS88-FcγRIIaの結晶学的二量体の部位Bへの最高ランクの結合配向性に関する原子座標
【０１１５】
本明細書を通して、語の「含む(comprise)」、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形は、表示された要素、整数またはステップ、あるいは要素、整数またはステップの群を包含することを意味するが、その他の要素、整数またはステップあるいは要素、整数またはステップの群の排除を意味しているものではないことは解されるであろう。
【０１１６】
本明細書に記述された全ての刊行物は、参照として本明細書に組み込まれている。本明細書に含まれている文書、作用、物質、装置、製品などについてのいずれの考察も、本発明のコンテキストを単に提供する目的のためのものである。これら事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基盤の一部を形成しているか、本発明の各請求項の優先日前にオーストラリアまたは他国に存在した本発明に関連した分野における共通の一般的知見であったと認めていると考えるべきではない。
【０１１７】
多数の変更および/または改変が、幅広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に示された本発明に成され得ることは当業者によって認識されるであろう。したがって、該実施形態は、全ての点で例示的なものであって、限定的なものではないと考えるべきである。
【０１１８】
(参考文献)
2008512083.tif 000038
2008512083.tif 000039
2008512083.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】HRS88野生型(パネルa)およびLRF88変異体(パネルb)糖タンパク質として発現したFcγRIIaの結晶の顕微鏡写真を提供する図である。(a)75 mMのNaCl、5 mMの5mMのトリス緩衝液pH7.4中、4 mg/mlのタンパク質による2μlの座位滴下における蒸気拡散法により生成させたHRS88野生型FcγRIIaの結晶。この結晶化溶液はまた、30%PEG 4000と0.2Mの硫酸アンモニウムとを含んだ。結晶は18℃で形成した。(b)0.2 酢酸アンモニウム、0.1 クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.6および30% PEG 4000中、8mg/mlでのタンパク質溶液による5μlの懸滴における蒸気拡散法により生成させたLRF88変異体FcγRIIaの結晶。該結晶は37℃で核化し、18℃で成長させ維持した。
【図２】LRF88変異体(パネルaおよびb)ならびにHRS88野生型(パネルcおよびd)FcγRIIa糖タンパク質の結晶パッキング(格子)接触の比較を示す図である。(a)対称性の関連タンパク質単量体からのプロリン(P35*)ゲストリガンドに結合するPhe88、Trp90およびTrp113の側鎖を含む主要格子接触に関する電子密度(3.0бで輪郭化したF0-Fcオミット)マップを示すLRF88変異体FcγRIIaの高分解能結晶構造。電子密度モジュールに対応する精密化原子座標は、ボールアンドスティック画像として示されている。(b)炭素アルファトレースとして表示された、タンパク質単量体を有するFcγRIIaのLRF88変異体のab平面の結晶パッキング。パネルaに示された主要な格子接触の位置は、(*)で示されている。(c)電子密度(3.0бで輪郭化したF0-Fcオミット)マップを示すHRS88野生型FcγRIIaの結晶構造は、溶媒(水)分子は、P35*がLRF88変異体FcγRIIaの結晶において結合していた位置と同様の位置に結合していることを示している。野生型S88残基が、明らかに電子密度マップに配置されている。(d)炭素アルファトレースとして表示された、タンパク質単量体を有するFcγRIIaのHRS88野生型のab平面の結晶パッキング。結晶パッキング相互作用は、LRF88変異体に関するものと総体的に異なっている(パネルbを参照)。
【図３】結晶状態において見られるHRS88の主な二倍二量体の構造の図表示である。(a)形質膜(ページの下部)の方へ向いている上部および末端のポリペプチド残基に各タンパク質単量体のIgG結合表面を有する細胞の膜内組立てに好適な配向におけるHRS88二量体。(b)HRS88二量体を90°回転させて、受容体組立て物のこの側面図を作製した。
【図４】FcγRIIaの外側から内側へのシグナル伝達または活性化複合体に関する分子モデルを提供する図である。該モデルは、HRS88二倍二量体(図3)に関する座標とFcγRIII-Fc複合体に関して抽出された座標(PDBコード1E4K)(Sondermannら、2000年)との剛体重ね合せにより作製された。モデル化されたシグナル伝達複合体によって、結晶格子に見られるHRS88の二量体形は、2つのFc(または抗体)リガンド分子に同時に結合できることが示されている。該タンパク質のアミノ-(N)末端とカルボキシル-(C)末端が示されている。該抗体(Fab)の抗原結合部分が、2つの結合Fc分子のN-末端から現れている。
【図５】HRS88の二量体形の溶媒接触可能表面の図である。3つの直交図は: (a)2つの受容体単量体間に形成された大型の溶媒充填グルーブを明らかに示している配向における受容体二量体;(b)該受容体二量体の側面図、および;(c)2つの抗体(IgG)リガンドと相互作用できる2つの単量体上の表面を示している受容体二量体の端面図。パネル(c)に示された受容体二量体の中央にグルーブの下にあるキャビティーとチャネルが見える。図5から図7は、Insight IIプログラムパッケージ、98.0版(Accelrys)を用いて作製し、コノリー溶媒接触可能表面が描かれている(Connolly、1983年)。
【図６】HRS88二量体の一方の単量体を示す溶媒接触可能表面の破断図である。調節試剤に対する標的部位の位置が標識されており、大型の溶媒充填グルーブ(部位A)および隣接チャネルを有するキャビティー(部位B)を含む。部位Bに結合した深いポケットの位置も標識してある(B')。溶媒接触可能表面は灰色に陰影付けされている。溶媒探触に対して接触不可能であるかまたは埋もれている領域は、黒色に陰影付けされており、単量体1と2との間の界面となっている。
【図７】アミノ酸残基に関するマップ化位置を有する受容体単量体の一方の表面の破断図である。この図は、図6と同じ配向で示されており、図6と合わせて用いられる。調節試剤に対する標的部位(AおよびB)を主に形成するアミノ酸は、1文字コードで標識してある。
【図８】HRS88二量体界面を形成する相互作用を示す概略図である。特定の残基が受容体単量体1か2のいずれかに由来する場合は、アミノ酸残基の後に(A)または(B)を示した。この図に付けた凡例は、示された相互作用の性質を規定している。LIGPLOTプログラムを用い、標準的なパラメーターによってプロットを作製した(Wallaceら、1995年)。
【図９】VIB153およびVIB197の化学構造の略図である。
【図１０】HRS88結晶学的二量体の標的部位AおよびBに結合した際のVIB153に関する予想される結合様式を示す図である。(a)部位Aに結合したVIB153。(b)部位Bに結合したVIB153。リガンドの予想配向(棒表示)を有する溶媒接触可能表面の破断図(図6および図7に記載されたような)が左パネルに示されている。リガンドとタンパク質との間の予想される相互作用の概略LIGPLOTSが右パネルに示されている。受容体の単量体1(A)、単量体2(B)およびリガンド(C)の記号が残基番号の後に示されている。
【図１１】HRS88結晶学的二量体の標的部位AおよびBに結合した際のVIB197に関する予想される結合様式を示す図である。(a)部位Aに結合したVIB197。(b)部位Bに結合したVIB197。リガンドの予想配向(棒表示)を有する溶媒接触可能表面の破断図(図6および図7に記載されたような)が左パネルに示されている。リガンドとタンパク質との間の予想される相互作用の概略LIGPLOTSが右パネルに示されている。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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