(57)【要約】  ペプチド中に配座誘導残基を除去または導入することを含む、ペプチドの配座を球状配座からリボン状配座に、またはその逆に変更する方法を提供する。特に、式（Ｉ）の配列を含むペプチドを修飾してＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にプロリン残基を導入するか、またはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にあるプロリン残基を除去することを含む、ペプチドの配座を変更する方法を提供する。ここで、式（Ｉ）は−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；Ｘは任意のアミノ酸であり；およびｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える。【選択図】  図７
2008512452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの配列を含むペプチドを修飾してＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にプロリン残基を導入するか、またはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側であるプロリン残基を除去することを含む、ペプチドの配座を変更する方法であって、
式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；
Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；
Ｘは任意のアミノ酸であり；および
ｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える
方法。
【請求項２】
ペプチドがカルボキシ基またはアミド基のいずれかであるＣ末端基を有する請求項１に記載の方法であって、Ｃ末端基をカルボキシ基またはアミド基の他方に変換することをさらに含む方法。
【請求項３】
式Ｉの配列とカルボキシ基またはアミド基のいずれかであるＣ末端基とを含むペプチドを修飾してＣ末端基をカルボキシ基またはアミド基の他方に変換することを含む、ペプチドの配座を変更する方法であって、
式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；
Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；
Ｘは任意のアミノ酸であり；および
ｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える
方法。
【請求項４】
プロリン残基をＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側に導入するか、またはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にあるプロリン残基を除去することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
式Ｉにより定義されるコノトキシンのコンセンサス配列を含み、Ｘｍにより規定される領域が如何なる野生型のコノトキシン配列中の対応領域とも異なるように、Ｃｙｓ２とＣｙｓ３の間に挿入もしくは置換された１つもしくは複数のアミノ酸残基を有するか、またはＸｎにより規定される領域が如何なる野生型のコノトキシン配列中の対応領域とも異なるように、Ｃｙｓ３とＣｙｓ４の間に挿入もしくは置換された１つもしくは複数のアミノ酸残基を有するペプチドであって、
式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；
Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；
Ｘは任意のアミノ酸であり；および
ｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える
ペプチド。
【請求項６】
Ｃｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にあるプロリン残基とＣ末端アミド基とを有し、球状配座をとる傾向を有する請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｃｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にプロリン残基を有さず、Ｃ末端カルボキシ基を有し、リボン状配座をとる傾向を有する請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列ＲＧＤがＣｙｓ２とＣｙｓ３との間またはＣｙｓ３とＣｙｓ４との間に挿入された請求項５に記載のペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＲＧＤＷがＣｙｓ２とＣｙｓ３との間またはＣｙｓ３とＣｙｓ４との間に挿入された請求項５に記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号２、３、４、６、７または８のいずれか１つで表される配列を含むペプチド。
【請求項１１】
配列番号２、３、４、６、７または８のいずれか１つで表される配列からなるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００４年９月９日出願の米国特許仮出願第６０／６０８，１５１号の特典および優先権を主張し、前記出願の内容を参照により本出願に組み込む。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、一般的に新規なペプチド、および特に薬剤設計のためのペプチドまたはタンパク質の骨格として有用な新規ペプチドに関する。
【０００３】
［発明の背景］
本明細書中における先行して発行された文献の掲載および考察は、必ずしも、その文献が現況技術の一部または一般的共通の知識であるとの認識と受け取るべきではない。これにより、掲載した全ての文献は参照により本明細書に参照により組み込む。
【０００４】
タンパク質は殆ど全ての生物学的プロセスにおいて、他の生体分子との特異的相互作用を通して決定的な役割を演じる。タンパク質のこの一見果てしない好奇心をそそる治療上の可能性には、それに関連する不利点がある。変性、吸収され難さおよび腸透過性の低さなどの問題、抗原性、操作および修飾における困難、ならびに投与経路（例えば静脈内）は、これらの貴重な高分子の治療剤としての使用における主な障害と見られる。タンパク質の大きなサイズにも拘わらず、少数のアミノ酸残基だけが、タンパク質の生物学的性質の原因となる相互作用に関係する機能部位を形成している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験においても、タンパク質の機能部位を含む短いペプチドが母体タンパク質分子の生物学的活性を発揮することが示される。コンビナトリアルケミストリーおよび固相ペプチド合成の進歩に補われて、ペプチドおよびタンパク質を治療剤として使用する重要性および膨大な可能性が急速に重要度が増し、また認識されつつある。利用できる多種多様な配座および機能の可能性が、薬剤設計および開発における将来性あるリガンドの価値ある源泉として役立つ。しかしながら、短い直鎖状のペプチドは酵素による消化などの問題に面し、それのみならず、その屈曲性のゆえに結合に際してエントロピー損失をこうむる。
【０００５】
最近の２０年間に、薬剤としてのタンパク質の開発が進むのを妨げる問題の或るもの回避するために、蛋白工学の焦点が絞られ利用が進んでいる。新規な生物活性ペプチドを導入するためのタンパク質骨格の利用、「ミニタンパク質」を創出するためのタンパク質最小化などの技法が徐々に支持を得つつある。
【０００６】
利用されるもう１つの重要な戦略は、新規な活性を導入するために小さい、配座が制約された剛直な構造の使用であろう。安定性を与え、活性部分を配座的に的確な構造に固定するのに加えて、そのような戦略は抗原決定基の抗原性も最小化する。そのような一例は米国特許出願第２００３／０１５８０９６号の環状タンパク質である。「ミニタンパク質」骨格中の生物活性ペプチドは、迅速かつ効率的な化学修飾、操作および構造のキャラクタリゼーションが可能である。最も好ましいミニタンパク質骨格には、配座の安定性を与え、同時にタンパク質分解活性および変性に対する抵抗性を付与する多数のジスルフィド架橋を有するタンパク質が挙げられる。ヘビ、サソリ、クモおよびイモ貝の毒からのトキシンはジスルフィドを多く含む小さなタンパク質の好適な供給源であり、天然タンパク質骨格の非常によい目録を提供する。これらのミニタンパク質骨格において、ジスルフィド結合は、その生物学的効能の維持に不可欠な役割を有する折り畳みおよび配座の決定に役立つ。
【０００７】
或る研究では、ペプチド配列を適当な位置に保持するための骨格の基剤としてサソリの毒が使用されている３２。これはペプチドを比較的安定な活性をもつ構造に維持する利点を有する。このサソリの骨格構造体は長さが３０アミノ酸を超えて、やはり、あるペプチドがこの骨格中で使用されたときに、吸収と腸透過性が不良、および抗原性になる傾向があり得る。
【０００８】
アンボイナから単離したα−コノトキシンが、単純ヘルペスウイルスのグリコプロテインＤを入れる骨格として使用され、この天然ウイルスペプチドの或る抗原特性を保持していることが見出された。
【０００９】
［発明の目的］
本研究の発見は、α−コノトキシンＩｍＩの折り畳みを起こす鍵となる構造決定基の同定に関する。
【００１０】
本明細書において本発明者らは、短いペプチドトキシンの１種であるα−コノトキシンの折り畳みにおける主要な構造決定基としての、第１システイン間ループ中にあるプロリンの、ならびに保存されたカルボキシ末端アミド化の寄与を述べる。これらの構造的スイッチの同定は、所望の配座にあるミニタンパク質の設計に有用である。
【００１１】
α−コノトキシンは、海洋性で捕食性のイモ貝の毒に由来する短くてジスルフィドを多く含むペプチドである。これらのトキシンの鍵となる構造上の特徴の１つは、その１１〜１９アミノ酸残基の短い配列の間にある２つのジスルフィド架橋で構成される高度に保存されたシステインフレームワークの存在である。天然のα−コノトキシンは２つのジスルフィド結合で適当な位置に保たれた「球状の」配座を有する。２つのシステイン間ループ内で比較的多様な範囲のアミノ酸変化が可能であるにも拘わらず、α−コノトキシンは平坦な「リボン状」（Ｃ１−４、Ｃ２−３）または屈曲性の「数珠状の」（Ｃ１−２、Ｃ３−４）配座よりも「球状の」配座（Ｃ１−３、Ｃ２−４）に選択性を示す。最近、コノトキシンの新しい群が発見された：λ−コノトキシン（またはχ−コノトキシン）である２，３０−３１。χ／λ−コノトキシンはフレームワークにおいては同一の保存された４つ揃いシステインを有するが、観察されたその天然の配座は、α−コノトキシンに見られる通常の球状構造ではなくて、リボン状（Ｃ１−４、Ｃ２−３）配座であった。
【００１２】
天然の球状α−コノトキシンＧＩを用いるｉｎ  ｖｉｖｏ測定により、数珠状イソ型は生物活性が１０倍低下し、一方リボン状配座に強制的に折り畳むことは全てのｎＡＣＨＲアンタゴニスト活性を失わせることが示された１。反対に天然のリボン状配座にあるχ／λ−コノトキシンＣＭｒＶＩＡは、強制誘導での非天然の球状配座に比較して、３桁高い大きさの効力を有する２。これらの発見は、これらの短いペプチドの生物学的効力を決定するに際して、構造的配座が決定的な役割を有する点を際立たせる。しかしながら、ジスルフィド結合におけるこの変化および配座変化に寄与する構造の特徴は未だ不明確である。
【００１３】
天然α−コノトキシンの変異体を合成することにより、本発明者らは、Ｃ末端アミド化および第１システイン間ループ中のプロリン残基が、α−コノトキシンの折り畳み傾向の、天然球状配座から非天然リボン状配座への変化をもたらし得ることを見出した。この高度にコンパクトで安定な構造の折り畳みの性質を理解することにより、新規な生物活性ペプチドの開発に有用な、短く活性な配列を挿入するための骨格としてのペプチド骨格を操作することが可能になる。
【００１４】
［発明の概要］
１つの態様において、本発明は、１つまたは複数の配座誘導アミノ酸を、例えば欠失または置換により除去することによってタンパク質の配座を変更する方法を提供する。
【００１５】
１つの態様において、本発明はタンパク質またはペプチドから特定の配座誘導残基を、例えば欠失または置換により除去することを含む、タンパク質またはペプチドの配座を球状配座からリボン状配座に変更する方法を提供する。一実施形態において、配座誘導残基はプロリンである。１つの特別な実施形態において、配座誘導残基は、タンパク質またはペプチドのドメインのループ、例えばジスルフィド結合を形成するシステイン残基の１つまたは複数の対により規定されるドメインのシステイン間ループ中に位置するプロリンである。さらに、誘導される配座変化をさらに促進または安定化するために、タンパク質またはペプチドの関連する末端において、Ｎ末端またはＣ末端キャップを付加または除去することができる。
【００１６】
さらに他の態様において、本発明は、タンパク質またはペプチドから特定の配座誘導残基を、例えば挿入または置換により導入することを含む、タンパク質またはペプチドの配座をリボン配座から球状配座に変更する方法を提供する。一実施形態において、配座誘導残基はプロリンである。１つの特別な実施形態において、配座誘導残基はプロリンであり、タンパク質またはペプチドのドメインのループ、例えばジスルフィド結合を形成するシステイン残基の１つまたは複数の対により規定されるドメインのシステイン間ループ中に導入される。従前の方法のように、誘導される配座変化をさらに促進または安定化するために、タンパク質またはペプチドの関連する末端において、Ｎ末端またはＣ末端キャップを付加または除去することができる。
【００１７】
他の態様において、本発明は、Ｃｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にプロリン残基を導入するか、またはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にあるプロリン残基を除去するかして、式Ｉの配列を含むペプチドを修飾することを含む、ペプチドの配座を変更する方法を提供する。ここで、式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；Ｘは任意のアミノ酸であり；またｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える。或る実施形態において、ペプチドは、カルボキシ基またはアミド基のいずれかであるＣ末端基を有し、また前記の方法はＣ末端基をカルボキシ基またはアミド基の他方に変換することをさらに含む。
【００１８】
他の態様において、本発明は、式Ｉの配列およびカルボキシ基またはアミド基のいずれかであるＣ末端基を含むペプチドを修飾してＣ末端基をカルボキシ基またはアミド基の他方に変換することを含む、ペプチドの配座を変更する方法を提供する。ここで、式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；Ｘは任意のアミノ酸であり；またｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える。或る実施形態において、前記方法はさらに、プロリン残基をＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側に、例えば挿入もしくは置換により導入するか、またはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にあるプロリン残基を除去することを含む。
【００１９】
他の態様において、本発明は、式Ｉにより定義されるコノトキシンのコンセンサス配列を含み、Ｘｍにより規定される領域が如何なる野生型のコノトキシン配列中の対応領域とも異なるように、Ｃｙｓ２とＣｙｓ３の間に挿入もしくは置換された１つもしくは複数のアミノ酸残基を有するか、またはＸｎにより規定される領域が如何なる野生型のコノトキシン配列中の対応領域とも異なるように、Ｃｙｓ３とＣｙｓ４の間に挿入もしくは置換された１つもしくは複数のアミノ酸残基を有するペプチドを提供する。ここで、式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；Ｘは任意のアミノ酸であり；またｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える。一実施形態において、ペプチドはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にプロリン残基およびＣ末端アミド基を有し、該ペプチドは球状配座をとる傾向を有する。他の実施形態においては、ペプチドはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側のプロリン残基およびＣ末端カルボキシ基を欠き、リボン状配座をとる傾向を有する。別の実施形態においては、配列ＲＧＤまたはＲＧＤＷがＣｙｓ２とＣｙｓ３の間またはＣｙｓ３とＣｙｓ４の間に挿入される。
【００２０】
さらに他の態様において、本発明は、配列番号２、３、４、６、７または８のいずれか１つで表される配列を含むペプチドを提供する。
【００２１】
さらに他の態様において、本発明は、配列番号２、３、４、６、７または８のいずれか１つで表される配列からなるペプチドを提供する。
【００２２】
α−コノトキシンとχ／λコノトキシンのアミノ酸配列（表１）を比較することにより、幾つかの相違が明らかになる。第１に、配座を拘束するプロリン残基がシステイン間ループ１中に必ず存在するα−コノトキシンとは違って、χ／λ−コノトキシンはシステイン間ループ２中にヒドロキシプロリン残基を有するが、第１ループ中に捩れを誘起する残基を含まない。第２に、Ｃ末端アミド化は、知られている全てのα−コノトキシン（Ｇ１Ｄα−コノトキシンを除く）中に保存されているが、χ／λ−コノトキシンの最近知られた３つの構成員の全てに存在しないことで一貫していることも見て取れる。これらの相違を念頭に置いて合成ペプチド変異体を設計した。
【００２３】
α−コノトキシンＩｍＩが最も研究されているα−コノトキシンの１つである３−１６という事実は別にして、そのシステイン間ループのサイズがχ／λ−コノトキシンのものに最も近く、かつＩｍＩコノトキシンは保存されているＣ末端アミド化以外に如何なる形の翻訳後修飾を有しないという事実に基づいて、ＩｍＩコノトキシンを本発明者らの研究モデルとして選択した。さらに、天然ペプチドの３次元構造は、幾つかのその点変異体と共にＮＭＲ分光学によって既に解明されている。本研究においては、両方のシステイン間ループ１におけるプロリンの役割ならびにＣ末端アミド化の効果を調べるために、次の合成変異体を設計した：
ＩｍＩコノトキシン：Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２［配列番号１］
ＩｍＩ酸：Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｘｇ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ［配列番号２］
Ｐ６Ｋアミド：Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２［配列番号３］
Ｐ６Ｋ酸：Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ［配列番号４］
ＣＭｒＶＩＡ酸：Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｙｐ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ［配列番号５］
ＣＭｒＶＩＡアミド：Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｙｐ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２［配列番号６］
ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸：Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｙｐ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ［配列番号７］
ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミド：Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｙｐ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２［配列番号８］
【００２４】
［発明の詳細な説明］
ペプチド合成：
ペプチド変異体はＡＢＩ  Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで、Ｆｍｏｃ法を用いて固相ペプチド合成により合成した。アミノ酸残基はＮ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド／Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンｉｎ  ｓｉｔｕ中和法を使用して結合した。アミド化Ｃ末端を有する合成ペプチドは、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＳ支持体を使用して合成し、一方遊離カルボキシル末端を有する変異体はプレロードしたＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＥＧ−ＰＳ（ポリエチレングリコール−ポリスチレン）支持体樹脂上で構築した。配列中の４つのシステインは全て選択的脱保護のないトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に反応し易いトリチル基により保護した。次に合成したペプチドは、トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水（９２．５：２．５：２．５：２．５）を使用して、樹脂から開裂させて外し、同時に側鎖保護基を除去した。続いて粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製した（図１）。精製した還元ＩｍＩコノトキシンはＳｙｎｐｅｐ社（カリフォルニア州Ｄｕｂｌｉｎ所在）から特注で得た。次に精製ペプチドを分子量により確認した（図２）。精製したペプチドの空気酸化を２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したｐＨ８．５の１００ｍＭとトリス・ＨＣｌ中で実施し、空気中で４８時間撹拌を継続した。
【００２５】
次に、クロマトグラフ処理装置ＢｉｏＣＡＤ  ＳＰＲＩＮＴクロマトグラフィーワークステーションまたはＡＫＴＡＴＭ精製システムで逆相ＨＰＬＣを使用し、Ｖｙｄａｃ２０１  ＳＰ５０１  Ｃ１８  ４．６ｍｍ×２５０ｍｍの分析用カラム上で１００分かけて、０．１％ＴＦＡまたはギ酸のいずれかをイオン対形成剤として添加した８０％アセトニトリルのグラジエントを使用して、酸化されたペプチド試料中のイソ型を分離した（図２Ａ）。
【００２６】
ペプチドは、酸化の検討に先立ってＥＭＩ−ＭＳ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ＩＩＩ  トリプルステージ四重極型システム）により完全に還元されていることを確認した。空気酸化のために、０．１ｍＭのペプチドを、１００ｍＭトリス−ＣＬおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含み、ｐＨ８．５に調節した折り畳み緩衝液に溶解して、空気中で４８時間撹拌した。酸化の検討を変性条件ならびにグルタチオンレドックス系でも繰り返した（データは示さず）。ペプチドが完全に酸化されたことは、ペプチド基幹内における２つのジスルフィド架橋生成に帰せられる４質量単位の減少によって確認した（図５、表３）。合成変異体の各々は酸化されて３つのイソ型に折り畳まれた（図２Ａ、２Ｂ、表２）。
【００２７】
ヨウ素酸化
選択した所望の強制折り畳みジスルフィド結合を有するペプチド変異体を、選択的脱保護により生成させた。これには、２つのジスルフィド架橋形成において、選択した特定のシステイン対形成を生じさせるような、４つのシステイン残基の直交する側鎖保護が必要になる。第１および第２ジスルフィド架橋の生成に関連するシステイン対は、それぞれＳ−トリチルおよびＳ−アセトアミドメチル保護基を使用して保護した。開裂ステップ中に除去されるＳ−トリチル基は、空気中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中において０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で４８時間撹拌することにより、第１ジスルフィド結合を生成させる。
【００２８】
システインの第２対はヨウ素酸化を使用して脱保護と同時に酸化される。これは、アセトニトリル／ＴＦＡ／水（２０：２：７８％ｖ／ｖ）中に０．１ｍＭのペプチドを含む脱気溶液（１０当量／ＡＣＭ）に、０．１Ｍヨウ素を加えることにより達成され、１分間窒素で覆って激しく撹拌してから、溶液が無色になるまで１Ｍアスコルビン酸を滴下して反応を停止させた。続いて、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、酸化されたペプチドを単離した。
空気酸化により得られた主要なイソ型の同定
各変異体において優勢なイソ型の配座を同定するために、種々のペプチド変異体に対する強制折り畳み配座異性体の保持時間を、対応する空気酸化クロマトグラフプロファイルと比較した（図３）。使用した折り畳み条件で天然のα−コノトキシンの折り畳みのバイアスが維持されたことを確認するために、ＩｍＩコノトキシンの空気酸化物を対照として使用した。合成ＩｍＩコノトキシン、ＩｍＩ酸変異体、Ｐ６Ｋアミド変異体、およびＰ６Ｋ酸変異体のクロマトグラフプロファイリングから、ＩｍＩコノトキシンのみが優勢なイソ型として球状配座を有する折り畳みバイアスを維持していて、一方他の３つの変異体はリボン状配座に変化したことが見て取れた（図２Ｂ、表３）。
【００２９】
ＮＭＲデータ
次いで各変異体に対する空気酸化の検討で主として生成したイソ型を、Ｂｒｕｋｅｒ  ３００ＭＨｚ分光器で分析して、１次元ＮＭＲスペクトルを得た。次いで１−Ｄ  ＮＭＲスペクトルを、選択的脱保護により得た種々の可能な配座のスペクトルと比較した。１−Ｄ  ＮＭＲ分析から得た結論は、ＨＰＬＣを使用して得た配座のデータと一致する。
【００３０】
次に各変異体の主要なイソ型に対する３次元構造を、２次元核磁気共鳴分光法を用いて解明した（図５、表４）。４つの全ての場合に、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ５００  ＭＨｚ分光計で得た、ｐＨ３．１の１０％Ｄ２Ｏ、９０％中でのＴＯＣＳＹおよびＲＯＥＳＹ  ２−Ｄ  ＮＭＲ測定に対して、約１ｍＭのペプチドが適当な品質のＮＭＲスペクトルを与えた。スペクトルは２９８Ｋで水消去により得た。ＴＯＣＳＹ混合時間は７０ｍｓ、ＲＯＥＳＹスピンロック時間は３００ｍｓに設定した。
【００３１】
構造モデリングは、ＮＭＲスペクトルから導かれたＮＯＥ制限（ＮＯＥ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）でＡｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩソフトウェアを使用して実施した（図５）。ＮＯＥ制限は強（１．９〜３．１Å）、中（１．９〜３．８Å）、および弱（１．９〜５．５Å）と分類した。擬原子補正はＷｕｔｈｒｉｃｈら１７に従ってメチルおよびメチレンプロトンに対して行った。高温分子動力学は、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒモジュールを使用して、３００Ｋおよび６００Ｋの１０ｐｓで、続いて９００Ｋの２０ｐｓで実施した。続いて、温度を９００Ｋから４００Ｋまで１００Ｋの段階で低下させて動力学を行った後で、水分子の集合中に２０ｐｓ「浸漬」することにより３００Ｋに冷却した。次に最低エネルギー水準の１５フレームを２１１フレームの平均構造と重塁した。重塁したＩｍＩコノトキシンのピーク１は０．３９±０．１２の基幹ＲＭＳＤを与えた。重塁したＰ６Ｋ酸ピーク２は０．５１±０．０９の基幹ＲＭＳＤを与え、両者共「リボン状」（Ｃ１−４、Ｃ２−３）配座をとった。２−Ｄ  ＮＭＲ  ＴＯＣＳＹスペクトルはＤａｖｉｄ  Ｃｒａｉｋら５によって報告されたものと同様なスペクトルを与えた。
【００３２】
図４は、Ｐ６Ｋ酸変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、Ｐ６Ｋアミド変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、およびＩｍＩ酸とその強制折り畳みリボン状配座、ＩｍＩコノトキシンとその強制折り畳み球状配座、ＣＭｒＶＩＡ酸とその強制折り畳みリボン状配座、ＣＭｒＶＩＡアミドとその強制折り畳みリボン状配座、ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸とその強制折り畳み球状配座、ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドとその強制折り畳み球状配座のスペクトルを比較する１次元ＮＭＲ分光法を示す。
【００３３】
図７は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ分子モデリングソフトウェアで実施し、ＩｍＩコノトキシンの溶液構造と比較したＩｍＩ酸変異体ピーク１およびＰ６Ｋ酸変異体ピーク２の構造モデリングを示す。２つの構造に対する基幹ＲＭＳＤはそれぞれ０．３８±０．０６および０．７２±０．１２であった。ＩｍＩコノトキシンの溶液構造の３次元構造はタンパク質データバンクから入手した。
【００３４】
考察
α−コノトキシンＩｍＩおよびχ／λ−コノトキシンの配列の分析から、合成変異体の設計の基礎となる構造上の相違が明らかになった。
【００３５】
ＩｍＩ酸変異体は、既知のα−コノトキシンの殆ど全てに見られる保存されたＣ末端アミド化の役割を同定するために設計した。ペプチドのアミドをペプチドの酸形に変換することにより、本発明者らは折り畳み傾向を、合成ＩｍＩコノトキシンの酸化の検討で見られた古典的な球状形約５４％からＩｍＩ酸変異体におけるリボン状配座約６７％に変化させることに成功した（図２Ｂ、図６）１８。本発明者らは、天然χ／λ−コノトキシン、ＣＭｒＶＩＡコノトキシンについて逆行折り畳みの研究を続行している。ＣＭｒＶＩＡコノトキシン中のＣ末端アミド化の効果についての逆行の研究も、構造配座における球状形方向への変化という結果になった。しかしながら、この変化はＩｍＩコノトキシンに比較してはるかに低い程度のもであった。この結果は、２種のコノトキシンの間の第２システイン間ループのサイズの相違という交絡変数の存在によるようである。
【００３６】
本研究において調べたもう１つの構造上の特徴は、プロリン残基のリジン残基との置換に関係する。リジンはχ／λ−コノトキシンの３つの構成員の全てにおいて第１システイン間ループの同じ位置に現れることにより置換基として選択した。そのような置換も、ＩｍＩコノトキシンにおける球状配座からＰ６Ｋアミド変異体におけるリボン状配座約６８％への変化を生じさせた。
【００３７】
ＣＭｒＶＩＡ  χ／λ−コノトキシンに関係する逆行の研究も行った。天然ＣＭｒＶＩＡχ／λ−コノトキシンは５３％リボン状配座に折り畳まれる。リジン６がプロリン残基で置換されると、合成変異体は選択的に８３％球状配座に折り畳まれるように変化する。これらの結果から、ＩｍＩコノトキシン中の保存されたＰｒｏ６が、ペプチドトキシンの最終的配座を決定する際に役割を有するという点が強調される。
【００３８】
Ｐ６Ｋアミド変異体およびＩｍＩ変異体から見られる変化の程度における類似性は、Ｃ末端アミド化および第６位置にあるプロリンの両方とも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境でα−コノトキシンＩｍＩの折り畳み傾向に多分同様な効果を有することを示唆する。
【００３９】
Ｐ６Ｋ酸変異体に見られるような両方の構造上のスイッチを組み合わせるさらなる修飾は、折り畳み傾向の約７６％リボン状配座へのさらなる変化を生じさせ、第１システイン間ループおよびＣ末端アミド化の折り畳み傾向に対する相乗的または加算性効果がありそうなことを示唆した。
【００４０】
確認した２つの構造的特徴は、天然球状配座からリボン状配座への折り畳み傾向の絶対的変化を生じさせることはできなかったが、これらは疑いもなく、ＩｍＩコノトキシンにおける配座スイッチとして決定的役割を演じている。折り畳まれて生ずる主たるイソ型はペプチドにより異なるが、１つの型の他の型に対する過剰は大幅に異なることはなく、折り畳みが独立の経路により起こり得ることを示唆している。プロリンのシス−トランス異性化または水素結合の相互作用がこれらの折り畳み経路に寄与するか否かは明らかでない。
【００４１】
これらの発見は、ペプチド骨格の開発におけるこれらの小さくコンパクトなペプチドトキシンの操作に有意義な効果を有するであろう。
【００４２】
ペプチドの折り畳み（酸化）は、４つのシステイン残基がどのように対を成してジスルフィド架橋を形成するかに依存して、３つの可能な配座を生じさせるであろう（［１−２，３−４］、［１−３，２−４］、［１−４，２−３］の対形成組合せを想像されたい）。対形成に基づいて、ペプチドは異なる形状をとるであろう（それが「球状」「リボン状」「数珠状」と称せられる理由である）。また、ペプチドが表面に提示する残基のタイプは、たとえペプチドが全く同じ配列を有していても相違するであろう。これを骨格として使用するという考えは、対形成のタイプ（およびその結果として生ずる配座）に依存して、同一のフレームワークが２つ以上の配座を有することができるということである。
実施例１  宿主配列としての使用
前記配列は剛直な構造フレームワークとして使用することができ、そのフレームワークに生物活性ペプチド配列の短いセグメントを挿入することができる。その結果、この挿入されたセグメントは、所望の活性を獲得するように構造骨格により決定される配座を使用することができる。本発明者らはよく研究されたトリペプチド配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）をコノトキシンのフレームワークに挿入することにより、配列を試験した。その結果、ＲＧＤ−コノトキシンのキメラペプチドは、本発明者らがトリペプチド配列に期待する抗血小板活性を発揮する。
【００４３】
健常な志願者から新鮮全血を採血し、血小板凝集を電気的インピーダンス変化により測定した。コラーゲン（２μｇ／ｍｌ）またはＡＤＰ（２０μＭ）をアゴニストとして使用した。
【００４４】
表５および図８は、ＲＧＤＷがシスチン間ループ１（ＲＧＤ１）およびシスチン間ループ２（ＲＧＤ２）中の宿主配列に入れられたときの阻止濃度を示す抗血小板活性測定を示す。
【００４５】
天然のタンパク質分子に見られる幾つかの例では、タンパク質分子の大きい割合が、生物活性の原因となる活性セグメントの配座を規定することに関与している。しかしながら、この活性セグメントは通常全く短いアミノ酸配列で構成されている。従来的には、活性セグメントを発展し得る治療剤として使用する実現可能性を開拓するために、タンパク質サイズを最小化するための、および／または活性セグメントの屈曲性を制限するためにタンパク質骨格を所望の配座の中に挿入するための努力が為されるであろう。大きいタンパク質分子は、分子の一部にある幾つかの抗原提示部位の存在による、興味の活性とは関係のない抗原性の問題も生じさせるであろう。
【００４６】
母体タンパク質分子の活性セグメントに対応する短い直鎖状合成ペプチドは、通常、過剰な柔軟性およびそれに関係する結合の大なるエントロピー損失、またはセグメントがコンパクトな構造の欠如のために容易に分解されるであろうという問題を呈するであろう。幾つかの拘束性のジスルフィド架橋で安定化された骨格に挿入することにより、これらの問題を軽減することができる。
【００４７】
さらに、小サイズのものである骨格を使用することにより、化学的合成を使用してペプチドを集合作製し、それのみならずＮＭＲなどの物理学的技法を使用して構造上の情報を迅速かつ容易に得ることができる。
【００４８】
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【００４９】
【表１】
2008512452.tif 000003
【００５０】
表１：α−コノトキシンおよびχ／λ−コノトキシンの配列アラインメント。（ｍ／ｎ）は、ペプチドが球状またはリボン状配座をとったときの、第１および第２システイン間ループ中の残基数をそれぞれ表わす。
【００５１】
【表２】
2008512452.tif 000004
【００５２】
表２：合成ペプチド変異体の空気酸化。全ての変異体は、比率が一様ではない３つの可能な配座異性体に酸化される。
【００５３】
【表３】
2008512452.tif 000005
【００５４】
表３：質量分析法によるペプチド変異体の理論および実測質量の総括表。
【００５５】
【表４】
2008512452.tif 000006
2008512452.tif 000007
表４：化学シフト総括：（Ａ）ＩｍＩ酸ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、および（Ｄ）Ｐ６Ｋアミドピーク１。
【００５６】
【表５】
2008512452.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１：（Ａ）合成ＩｍＩ酸変異体、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸変異体、および（Ｃ）Ｐ６Ｋアミド変異体の、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８  ５μ  ３００Å、２５０ｍｍ×１０ｍｍセミ分取カラムで、０．１％ＴＦＡ（溶離剤Ａ）と０．１％ＴＦＡ添加８０％アセトニトリル（溶離剤Ｂ）の増加グラジエントとを用いる精製。
【図２−１】図２：（Ａ）種々の精製ペプチドの１００ｍＭトリス・ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５における酸化プロファイル。酸化した試料のクロマトグラフ分離で、変異体の各々に３つのイソ型が現れた。各変異体中で支配的なイソ型に（＊）印を付けた。
【図２−２】図２：（Ａ）種々の精製ペプチドの１００ｍＭトリス・ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５における酸化プロファイル。酸化した試料のクロマトグラフ分離で、変異体の各々に３つのイソ型が現れた。各変異体中で支配的なイソ型に（＊）印を付けた。
【図３−１】図３：ペプチド変異体の強制折り畳み配座のクロマトグラフプロファイリング。強制折り畳み配座の保持時間を空気酸化由来の支配的イソ型と比較すると一致した。
【図３−２】図３：ペプチド変異体の強制折り畳み配座のクロマトグラフプロファイリング。強制折り畳み配座の保持時間を空気酸化由来の支配的イソ型と比較すると一致した。
【図３−３】図３：ペプチド変異体の強制折り畳み配座のクロマトグラフプロファイリング。強制折り畳み配座の保持時間を空気酸化由来の支配的イソ型と比較すると一致した。
【図４−１】図４：１次元ＮＭＲ分光法スペクトルの比較：（Ａ）Ｐ６Ｋ酸変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｂ）Ｐ６Ｋアミド変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、および（Ｃ）ＩｍＩ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンとその強制折り畳み球状配座、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドとその強制折り畳みリボン状配座、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸とその強制折り畳み球状配座、（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドとその強制折り畳み球状配座。
【図４−２】図４：１次元ＮＭＲ分光法スペクトルの比較：（Ａ）Ｐ６Ｋ酸変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｂ）Ｐ６Ｋアミド変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、および（Ｃ）ＩｍＩ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンとその強制折り畳み球状配座、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドとその強制折り畳みリボン状配座、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸とその強制折り畳み球状配座、（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドとその強制折り畳み球状配座。
【図４−３】図４：１次元ＮＭＲ分光法スペクトルの比較：（Ａ）Ｐ６Ｋ酸変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｂ）Ｐ６Ｋアミド変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、および（Ｃ）ＩｍＩ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンとその強制折り畳み球状配座、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドとその強制折り畳みリボン状配座、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸とその強制折り畳み球状配座、（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドとその強制折り畳み球状配座。
【図４−４】図４：１次元ＮＭＲ分光法スペクトルの比較：（Ａ）Ｐ６Ｋ酸変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｂ）Ｐ６Ｋアミド変異体ピーク１とその強制折り畳みリボン状配座、および（Ｃ）ＩｍＩ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンとその強制折り畳み球状配座、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸とその強制折り畳みリボン状配座、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドとその強制折り畳みリボン状配座、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸とその強制折り畳み球状配座、（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドとその強制折り畳み球状配座。
【図５−１】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル
【図５−２】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル
【図５−３】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル
【図５−４】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル
【図５−５】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル
【図５−６】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル
【図５−７】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル
【図５−８】図５：種々の還元および酸化ＩｍＩ−コノトキシンおよびＣＭｒＶＩＡコノトキシン変異体の質量分析法プロファイル。
【図６−１】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図６−２】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図６−３】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図６−４】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図６−５】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図６−６】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図６−７】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図６−８】図６：種々のスピン系および連続結合性（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を規定する７０ｍｓＴＯＣＳＹαＨ−ＮＨ領域（上）および３００ｍｓＲＯＥＳＹ領域（下）を含む２次元ＮＭＲ総括チャート。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で、各変異体に対して支配的構造のイソ型について２次元ＮＭＲ測定を実施し、試料はｐＨ３．０〜３．１の９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏに溶解した。（Ａ）ＩｍＩ酸変異体ピーク１、（Ｂ）Ｐ６Ｋ酸ピーク２、（Ｃ）Ｐ６Ｋアミドピーク１、（Ｄ）ＩｍＩコノトキシンピーク３、（Ｅ）ＣＭｒＶＩＡ酸ピーク３、（Ｆ）ＣＭｒＶＩＡアミドピーク３、（Ｇ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐ酸ピーク１、および（Ｈ）ＣＭｒＶＩＡ  Ｋ６Ｐアミドピーク１。
【図７】図７：分子モデリングソフトウェアＡｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩで実施したＩｍＩ酸変異体ピーク１およびＰ６Ｋ酸変異体ピーク２の構造モデリング。２つの構造に対する基幹ＲＭＳＤはそれぞれ０．３８±０．０６および０．７２±０．１２であった。ＩｍＩコノトキシンの溶液構造の３次元構造はタンパク質データバンクから入手した。
【図８】図８：比率が一様でない３つの可能な配座異性体に酸化された第１シスチンループ中のＲＧＤ（ＲＧＤ１）７ａおよび第２シスチン間ループ中のＲＧＤ（ＲＧＤ２）７ｂという２つの構造とこれらの配座異性体の血小板凝集阻止能力とのプロファイル。
【図１】
2008512452.tif 000009
【図２−１】
2008512452.tif 000010
【図２−２】
2008512452.tif 000011
【図３−１】
2008512452.tif 000012
【図３−２】
2008512452.tif 000013
【図３−３】
2008512452.tif 000014
【図４−１】
2008512452.tif 000015
【図４−２】
2008512452.tif 000016
【図４−３】
2008512452.tif 000017
【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
2008512452.tif 000020
【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月1日(2006.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なペプチドを作製する方法であって、
式ＩのＸｍにより定義される領域またはＸｎにより定義される領域中に導入された生物活性ペプチド配列を、式Ｉの配列を含むペプチド骨格に導入することを含み、
式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；
Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；
Ｘは任意のアミノ酸であり；
ｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超え；
ペプチド骨格は、カルボキシ基またはアミド基のいずれかであるＣ末端基を有し；かつ、
生物活性ペプチドの生物活性を維持するために、
次の一方または両方：
（ｉ）プロリン残基をＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側に導入するか、またはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側に存在するプロリン残基を除去すること；および
（ｉｉ）Ｃ末端基をカルボキシ基またはアミド基の他方に変換すること；を含む方法。
【請求項２】
生物活性ペプチド配列が配列ＲＧＤを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物活性ペプチド配列が配列ＲＧＤＷを含む請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生物活性ペプチド配列が配列ＲＧＤからなる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
生物活性ペプチド配列が配列ＲＧＤＷからなる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉの配列とカルボキシ基またはアミド基のいずれかであるＣ末端基とを含むペプチドを修飾してＣ末端基をカルボキシ基またはアミド基の他方に変換することを含む、ペプチドの配座を変更する方法であって、
式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；
Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；
Ｘは任意のアミノ酸であり；および
ｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超える
方法。
【請求項７】
プロリン残基をＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側に導入するか、またはＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にあるプロリン残基を除去することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
式Ｉにより定義されるコノトキシンのコンセンサス配列を含み、Ｘｍにより規定される領域が如何なる野生型のコノトキシン配列中の対応領域とも異なるように、Ｃｙｓ２とＣｙｓ３の間に挿入もしくは置換された１つもしくは複数のアミノ酸残基を有するか、またはＸｎにより規定される領域が如何なる野生型のコノトキシン配列中の対応領域とも異なるように、Ｃｙｓ３とＣｙｓ４の間に挿入もしくは置換された１つもしくは複数のアミノ酸残基を有するペプチドであって、
式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；
Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；
Ｘは任意のアミノ酸であり；および
ｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超え、
Ｃｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側にあるプロリン残基を有さず、Ｃ末端カルボキシ基を有し、リボン状配座をとる傾向を有する
ペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＲＧＤがＣｙｓ２とＣｙｓ３との間またはＣｙｓ３とＣｙｓ４との間に挿入された請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＲＧＤＷがＣｙｓ２とＣｙｓ３との間またはＣｙｓ３とＣｙｓ４との間に挿入された請求項８に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号３、４、７または８のいずれか１つで表される配列を含むペプチド。
【請求項１２】
配列番号３、４、６、７または８のいずれか１つで表される配列からなるペプチド。
【請求項１３】
式Ｉの配列を含むペプチド骨格と式ＩのＸｍにより定義される領域またはＸｎにより定義される領域中に導入された生物活性ペプチド配列とを含む生物学的に活性なペプチドであって、
式Ｉは−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｘｍ−Ｃｙｓ３−Ｘｎ−Ｃｙｓ４−であり；
Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３およびＣｙｓ４は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ３との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ４との間、Ｃｙｓ１とＣｙｓ２との間およびＣｙｓ３とＣｙｓ４との間あるいはＣｙｓ１とＣｙｓ４との間およびＣｙｓ２とＣｙｓ３との間で、一緒になって２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり；
Ｘは任意のアミノ酸であり；
ｍとｎとは同じかまたは異なり、各々１に等しいかまたは１を超え；
かつ
ペプチド骨格配列中においてＣｙｓ３に対して２位置Ｎ末端側に通常自然に生ずるプロリン残基が除去された
ペプチド。
【請求項１４】
カルボキシ基またはアミド基のいずれかであるＣ末端基を有する請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＲＧＤがＣｙｓ２とＣｙｓ３との間またはＣｙｓ３とＣｙｓ４との間に挿入された請求項１３または請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＲＧＤＷがＣｙｓ２とＣｙｓ３との間またはＣｙｓ３とＣｙｓ４との間に挿入された請求項１３または請求項１４に記載のペプチド。
【国際調査報告】
2008512452.tif 000037
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2008512452.tif 000040