(57)【要約】  本発明は、アンブリヨマ・カジェンネンス（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）の唾液腺のｃＤＮＡライブラリー由来の遺伝子クローンから得られるＫｕｎｉｔｚ型組換え阻害因子を提供する。アンブリヨミン（Ａｍｂｌｙｏｍｉｎ−Ｘ）と称する阻害因子は１３．５００Ｄａの分子量を有する。
2008512992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列番号１で構成されることを特徴とする、アンブリヨマ・カジェンネンス（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）マダニの唾液腺のｃＤＮＡライブラリーに基づくＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害因子のヌクレオチド配列。
【化１】
2008512992.tif 000007
【請求項２】
以下の配列番号２のペプチドで構成されることを特徴とする、請求項１に記載のアンブリヨマ・カジェンネンスマダニの唾液腺のｃＤＮＡライブラリーに基づくＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害因子の配列。
ＭＲＱＬＡＶＬＡＬＶＩＦＴＧＭＣＶＥＳＱＳＡＮＳＫＡＶＣＮＬＰＫＬＡＧＤＥＴＣＳＮＫＴＥＩＲＷＹＹＮＧＴＡＣＥＡＦＩＦＫＧＣＧＧＮＤＮＮＦＤＲＶＤＤＣＱＲＬＣＥＥＱＴＨＦＨＦＥＳＰＫＬＩＣＦＫＶＱＤＹＷＩＬＮＤＩＭＫＫＮＬＴＧＩＳＬＫＳＥＥＥＤＡＤＳＧＥＩＤ
【請求項３】
オリゴヌクレオチド配列（４６）及び終止コドン（４０８）が示されることを特徴とする、請求項１に記載の配列。
【請求項４】
Ｋｕｎｉｔｚ型阻害因子ファミリーの幾つかのタンパク質と約２０％の同一性が示されることを特徴とする、請求項１から３に記載の配列。
【請求項５】
シグナルペプチドがアミノ酸配列の位置１から２８に存在することを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項６】
１２．２９５．６Ｄａの理論分子量と４．６７の理論等電点（ｉｓｏｅｌｅｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）（ｐＩ）とを有する１０８個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項７】
Ｋｕｎｉｔｚ型とＭＡＰキナーゼ型の２個のドメインを示すことを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項８】
タンパク質第Ｘａ、Ｘ及びＶＩＩａ因子に対して、また、第ＶＩＩａ／ＴＦ因子においても生物学的活性を示すことを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項９】
転移形成を著しく妨害する、腫瘍の質量及び体積の完全寛解の治療に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項１０】
ヘマトクリット、ヘモグロビン及び細胞数を正常レベルに維持する、血液学的状態の改善に適用可能であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項１１】
心血管疾患及び血栓塞栓症用薬物を得るために適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項１２】
悪性腫瘍増殖阻害薬物を得るために適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項１３】
悪性腫瘍転移阻害薬物を得るために適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項１４】
術前術後の抗凝血薬を得るために適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項１５】
変性疾患及び悪性腫瘍において、アポトーシス小体を生成する症状に抗血栓剤として適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項１６】
抗血栓剤として適用可能であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
アポトーシス小体がリン脂質の豊富な分子であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
固形腫瘍において新血管形成の調節に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項１９】
標的治療として使用される薬剤として作用することを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２０】
ワクチン開発に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２１】
転移形成を著しく妨害する、腫瘍の質量及び体積の完全寛解に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２２】
ヘマトクリット、ヘモグロビン及び細胞数を正常レベルに維持する、悪性腫瘍患者の血液学的状態の著しい改善に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２３】
心血管疾患及び血栓塞栓症の改善に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２４】
ヒト及び動物の悪性腫瘍の増殖阻害に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２５】
ヒト及び動物の悪性腫瘍の転移阻害に使用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２６】
術前術後の抗凝血薬として使用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２７】
ヒト及び動物の変性疾患及び悪性腫瘍におけるアポトーシス小体（リン脂質が豊富な分子）を生成する症状において抗凝血薬として使用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２８】
新血管形成の調節に適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【請求項２９】
標的治療として使用される薬剤としてサイクリン系（ｃｙｃｌｉｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ）の阻害因子として適用可能であることを特徴とする、組換えタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロ及びインビボで、アンブリヨマ・カジェンネンス（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）マダニの唾液腺のｃＤＮＡライブラリーから得られるＫｕｎｉｔｚ型阻害因子として特徴づけられる、血液凝固の活性化第Ｘ因子に対して阻害活性を有する組換えタンパク質を得る（ｏｂｔａｉｎｅｎｃｅ）方法、クローンオリゴヌクレオチド配列及び組換えタンパク質のアミノ酸配列を得る方法、活性化第Ｘ因子に対するこの組換えタンパク質の阻害活性を測定する方法、血しょう中の抗凝血活性を測定する方法、腫瘍細胞系列におけるアポトーシス活性を測定する方法、黒色腫における抗転移活性を測定する方法、抗癌活性（黒色腫、結腸、乳房、肺及び白血病）を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテイナーゼ阻害因子は、タンパク質分解酵素活性の正常な制御機序において作用する分子であり、例えば凝固、線維素溶解、消化のような多数の生理的プロセスに関係し、癌、出血性障害、炎症及び血圧バランスのような病態にも関係する（ＤＥＣＬＥＲＣＫ  ＆  ＩＭＲＥＭ，  １９９４）。
【０００３】
凝固を制御する最も効率的手段の１つは、プロテイナーゼ阻害因子の作用である。研究によれば、例えばマダニのような吸血生物種の大多数の唾液腺は、血液をより流動性にし、次いでその摂食を最適にする目的で幾つかの抗凝血性物質を生成する。（ＲＩＢＥＩＲＯ，  １９９５）。
【０００４】
活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）阻害因子は臨床上極めて重要である。というのは、（プロトロンビナーゼ複合体における）ＦＸａ阻害によって、プロトロンビンからトロンビンへの活性化の制御が可能になり、血塊形成が回避されるからである。
【０００５】
凝固プロセスが始まるとすぐにプロテアーゼの阻害がこぎれいにされる（ｔｒｉｇｇｅｄ）。「組織因子経路阻害因子」（ＴＦＰＩ）は、主要な外因性経路阻害因子であり、ＢＰＴＩ（ウシ膵臓トリプシン抑制因子）型のＫｕｎｉｔｚファミリー阻害因子の１つに分類された（Ｂｒｏｚｅ，  １９９８）。
【０００６】
ヒトＴＦＰＩは、３個のＫｕｎｉｔｚ型ドメイン（Ｋ１、Ｋ２及びＫ３）で構成されたタンパク質であり、第１のドメインであるＫ１は、Ｎ末端部分にＦＶＩＩａへの結合部位が存在する酸性領域を有する。第２のドメインにおいては、ＦＸａ結合を担う領域を見いだすことができる。最後の第３のドメインは、そのＣ末端部分に塩基性領域を有する。塩基性領域の機能はまだ解明されていないが、おそらくヘパリン結合部位を含む（Ｒａｏ，  １９９５）。
【０００７】
ヒトＴＦＰＩ阻害機序は２つの相を含む。第１の相においては、阻害因子はＦＸａ及びＦＶＩＩａ因子と結合するが、阻害は、組織因子（ＴＦ）、ＦＸａ、ＦＶＩＩａ及びヒトＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ：ＦＸａ：ＦＶＩＩａ：ＴＦ）の存在と一緒に第四級複合体の形成が見られる以下の相で実際に起こる（Ｓａｎｄｓｅｔ  ＆  Ｂｅｎｄｚ，  １９９７）。
【０００８】
２型ヒト組織因子阻害因子「組織因子経路阻害因子２」（ＴＦＰＩ−２）は、３個のＫｕｎｉｔｚ型ドメインからなる３２ｋＤａのタンパク質である（Ｃｈａｎｄ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００４）。ＴＦＰＩ−２は、おそらく、第１のＫｕｎｉｔｚ型ドメインの位置２４に存在するアルギニン残基（Ｒ２４）のために、凝固及び線維素溶解に関与する様々なセリンプロテアーゼを阻害する。第２及び第３のドメインにおいては、それぞれグルタミン残基及びセリン残基を見いだすことができる。最近の研究では、アルギニン残基がグルタミン残基によって改変された変異体が構築された（Ｒ２４Ｑ  ＴＦＰＩ−２）。この変異によって、ウシトリプシンに対する阻害活性損失の約９０％がもたらされる。このことは、アルギニン残基が抑制活性の維持に重要であることを示している（Ｋａｍｅｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９９）。
【０００９】
癌の発生の一般的状況及び凝固とのその相互作用
対象が新形成を発生するリスクは、幾つかの遺伝要因と環境要因の組み合わせによって決まる。従って、発癌プロセスにおいては、（生物学的、化学的又は物理的性質の）発癌物質と称される物質は、転移の形成まで進行する発癌プロセスの起動物質、さらには促進物質として作用し得る（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，  １９９６）。
【００１０】
新形成プロセスの始めには、不可逆的変化がＤＮＡの標的構造中で起こり、細胞の形質転換をもたらす。発癌物質の代謝は、第Ｉ相（活性化）と第ＩＩ相（解毒）と称される２つの相で示される。一部の第Ｉ相酵素は、酸化反応の触媒として作用するだけでなく、多量の発癌物質又は親油性生体異物を代謝する（Ｂｅｌｌ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９３）。
【００１１】
ＤＮＡ損傷の残存率は、修復機構及び損傷組織を保持する細胞の寿命に応じて決まり、損傷が続く場合には、又は修復されない場合には、変異細胞クローンが増殖する（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６；Ｗａｉｎｓｃｏａｔ  ｅ  Ｆｅｙ，  １９９０）。
【００１２】
これは、出発細胞（ｓｔａｒｔｅｄ  ｃｅｌｌ）上で起こり、潜伏期に減少し、及び／又は遺伝子変化の感受性を増大させる、しばしば長い、プロセスである。通常、プロモーターは遺伝毒性ではない。プロモーターは特異的組織（ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｔｉｓｓｕｅ）であり、組織ホメオスタシスの混乱をもたらす後成的な形で作用する複数の作用機序を有する（Ｈｅｒｍｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７）。
【００１３】
促進機序としては、細胞表面受容体の活性化、細胞質ゾル酵素の活性化又は阻害、（キナーゼによる）転写因子及び翻訳因子の活性化、増殖刺激、アポトーシス阻害、直接細胞傷害性などが挙げられる。
【００１４】
進行時期においては、腫瘍細胞は、腫瘍細胞に栄養を供給する新しい血管を形成する能力も示し、抑制されない増殖を引き起こす。腫瘍細胞は、周囲の組織にまず侵入し、リンパ管又は血管の内部に達することができ、これらを通して他の器官に拡大することができる。（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９８，  Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）。
【００１５】
腫瘍細胞は、通常、中間代謝産物から、重度又は慢性の炎症反応から、また、酸素及び窒素不安定反応性代謝物（ｏｘｙｇｅｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）を生じるプロセスから、生じる幾つかの固有の損傷と反応する。その上、例えば、ホメオスタシスプロセスによって除去される物理的、化学的及び生物学的薬剤のような、外的損傷因子（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ−ｄａｍａｇｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）がある。
【００１６】
（腫瘍進行（ｔｕｍｏｒａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれる）最終時期は浸潤及び転移を含む。この相では、既存の又は新形成前の病変部が、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、転移遺伝子（ｍｅｔａｓｔｏｇｅｎｅｓｅｓ）及び修復遺伝子のような特定の遺伝子における、特定の配列の異常を含めて、また、複製、欠失及び／又はヘテロ接合性の消失を含めて、偶然の変異による変化に加わる。
【００１７】
癌遺伝子は、生理条件では不活性であるが、アミノ酸を変化させることによって、又は染色体中の遺伝子を増幅して、活性が増大したこの遺伝子の幾つかのコピーを生じることによって、最後に、異なる染色体の遺伝子間の組換えによって、活性化し得る。これらの遺伝子の違いは、これらが通常は活性であり、抑制されない細胞増殖を防止するように絶えず警戒していることである（Ｂｕｄｉｌｌｏｎ，  １９９５）。
【００１８】
ゲノムの不安定性は腫瘍進行の主要な特性であるが、悪性度を特徴づけ、腫瘍を致死的な癌にするのは細胞複製が制御されないことである。腫瘍細胞及び正常組織細胞は、細胞周期を通して複製される（Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲ，  １９９７）。
【００１９】
しかし、細胞周期を理解することによって、腫瘍細胞増殖の調節機序が完全に明らかになったわけではなく、インビボでの癌増殖特性はまだ解明されていない。
【００２０】
腫瘍進行の浸潤性は、腫瘍細胞の易動度の増加、タンパク質分解能力、並びに細胞−細胞接触及び細胞−マトリックス接触の抑制の低下に関連がある。次いで、転移細胞は、循環系、リンパ系を介して、局所的拡大によって、さらには移植プロセスによって、拡大する。従って、転移場所の標準は、原発性癌の種類及び器官によって変わる。筋肉、皮膚、胸腺及びひ臓のような一部の器官はめったに転移しない（Ｇｏｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【００２１】
治療不能と考えられる、又は治療応答のない一部の癌は、原発性癌の箇所を主に繰り返し、その領域リンパ小節において繰り返す。これらの腫瘍は、治療中に転移も起こし得る。
【００２２】
悪性腫瘍の発生頻度はかなりの数にのぼり、世界中で第２の死因にランクされている。癌治療は、一般に、生体内原位置での固形腫瘍の外科的除去、臨床症状のない患者又はその完全な除去が技術的に不可能な患者における腫瘍の放射線治療、及び非固形腫瘍の場合又は拡散した固形腫瘍の場合の化学療法に基づく。
【００２３】
化学療法、放射線治療及び手術は、他の治療と関連した集中投与の治療法になった。アジュバント治療の概念を導入することは多数の患者の管理及び治癒のプロセスにおいて革新的なことであり、その結果を向上させる（Ｔｓａｏ，  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００４）。
【００２４】
今日、より正確な放射線治療プロトコルは、腫瘍の塊におけるより高用量の投与と、健常な隣接組織におけるより低強度を必要とする。新形成に対する効率的薬物を用いた、副作用のより少ない化学療法による治療によって、より広範な腫瘍学を実施することができ、その結果、多数の症例で有望な結果が得られる。しかし、固形腫瘍の大多数は、化学療法に対して適度の応答又は不十分な応答を示し、局所的腫瘍に対するアジュバント治療と転移症例の治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ）との両方において適応症と効率が限定されている（Ｓｅｋｉｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【００２５】
進行肺癌患者の５０％において発生する転移の高い発生率は、これらの患者に新形成細胞の増殖及び播種を制御する実際の機会を与えることを目的としたより効率的な新しい治療戦略の開発が必要であることを示している。
【００２６】
２０世紀に、４０年代に確認された窒素化マスタード、及び腫瘍の一部の組織学的種類に対して部分的又は完全な効力を有する様々な他の物質のような、広範な抗新形成専売薬品を含む新薬が発明されたときに、我々は異例の進歩を遂げた。肺癌、結腸癌、乳癌及び前立腺癌のような幾つかの固形腫瘍を治療可能な抗癌薬の選択が急速に発展したが、それに対して適切で効率的であると判明した全身的治療はまだない。先進国において蔓延しているが全世界では頻繁である非小細胞肺癌及び皮膚黒色腫においては、化学療法を受けたときの適度の応答は、利用可能な全プロトコルにおいて１５％から２０％であり、他の治療の組み合わせ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）においては４０％から５０％である（Ｓｅｋｉｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【００２７】
従って、進行型新形成疾患に対する治療効力を改善する代替新薬の探索が重要である。化学療法の大多数は、細胞の増殖を制御する能力で知られている。腫瘍細胞専用の一部の代謝機構に対して特異的活性を有する薬物（標的治療）が最近確認された。これらの治療においては、この薬物は、まさにその作用機序においてより効率的となる細胞周期の変化を介して、腫瘍に作用する。
【００２８】
化学療法による治療に関係した癌罹患率は、依然として重大な障害である。従って、副作用の殆どない、又は重要でない、投与の容易な抗新形成薬物を見いだし、新形成細胞の選択的作用機序を見いだすことが現在の一目標と考えられる。
【００２９】
腫瘍の増殖及び進行に関与する調節経路の１つは、血液凝固系である。血液凝固系では、この応答は、主として、トロンビン産生及び血塊形成をもたらす凝固プロセスを誘発するタンパク質の１つである組織因子（ＴＦ）のような凝血原（ｐｒｏ−ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ）因子の発現によって引き起こされる。
【００３０】
第２の相では、腫瘍細胞は、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）の受容体を発現するようになる。プラスミノゲンアクチベーターは、プラスミノゲンからプラスミンへの活性化を促進する。この系は、組織の協調及び再構築を担う。
【００３１】
例えば肺腺癌、腎癌のような新形成の患者及び悪性黒色腫においては、トロンビン産生及び活性化第Ｘ因子に起因する、凝固系の変化を惹起するホメオスタシスの低下がある（Ｅｄｗａｒｄ  ＲＬ，  １９９３）。一方、原発性新形成患者又は化学療法による治療を受けた患者において起こる血液凝固の活性化は、その機序がまだ理解されていない腫瘍細胞の生態の影響を受ける（ＲｉｃＫｅｌｓ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９２、Ｓｃｈａｆｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００３２】
凝固パラメータの実験室評価は、ある種の腫瘍において高レベルの有意性を示し、循環において、例えば、プロトロンビン断片、Ｄ２量体、第ＸＩＩａ因子の存在及びその予後の相関のようにそれを決定することが可能になる（Ｇｏｒｄｏｎ  ＳＧ，  １９９２）。
【００３３】
例えば低分子量ヘパリン又はＫビタミン阻害因子（Ｈｏｆｆｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）のような抗凝血薬による、原発腫瘍患者、転移患者又は化学療法による治療中に損傷を示す患者の治療は、患者の延命に有効であった（Ｍｏｕｓｓａ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００３；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００３）。悪性新形成における静脈血栓症の原因は様々であり、その機序は、腫瘍、遺伝因子、さらには治療自体による凝血原成分の放出を含む（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００３；Ｇｏｕｉｎ−Ｔｈｉｂａｕｔ  ｅ  Ｓａｍａｍａ  ＭＭ，  ２０００）。
【００３４】
臨床試験によれば、この血栓塞栓の特徴は、手術によって除去される乳癌において、低分子量ヘパリンの使用によって防止することができる（Ｂｅｒｇｑｖｉｓｔ  Ｄ．，  ２００２；Ｌｅｅ  ｅ  Ｌｅｖｉｎｅ，  ２００３）。ある新形成において免疫系のような幾つかの生体系と凝固との相互作用の組織学的及び機能的証拠が確認された。これらの証拠によれば、浸潤性炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ）、内皮細胞及び新血管形成に関連する凝固活性化因子の存在のような重要な変化が明らかになった（Ｌｏｒｅｔｏ  ｅｔ．ａｌ，  ２０００；Ｚａｃｈａｒｃｋｉ  Ｄ，  ２００３；Ｏｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ．ａｌ，  ２０００；Ｇａｌｅ  ｅ  Ｇｏｒｄｏｎ  ２００１；Ｃｏｔｒｉｎｏ  Ｊ，  １９９６）。
【００３５】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１及び血管内皮成長因子（ｇｒｏｗｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＶＥＧＦ）のような腫瘍細胞由来のサイトカイン（Ｃｉｔｏｋｉｎｅ）は、走化性であり、血管形成を誘発する。というのは、これらのサイトカインは、凝血原因子及び血栓形成因子の発現を誘導して、腫瘍の微小環境における凝血原状態を改変することができるからである（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，  ｅｔ．ａｌ，  ２００３，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ．ａｌ，  ２００４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
本発明は、アンブリヨマ・カジェンネンス（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）マダニの唾液中に存在するタンパク質が、（ヒト黒色腫−ＳＫＭＥＬ２８、ＭＥＬ８５、ＭＥＷＯ、ネズミ黒色腫Ｂ１６Ｆ１０、白血病：前骨髄球性ＨＬ６０、赤白血病Ｋ５６２、リンパ芽球性Ｔ  ＪＵＲＫＡＴ、白血病Ｔ  Ｕ９３７、ネズミリンパ性Ｔ、ＹＡＣ−Ｉ；肺癌Ｈ２９２、乳癌ＭＣＦ−７及びＭＣＦ−１０並びに直腸結腸癌ＳＷ６１３−１２Ａ１、ＳＷ６１３−Ｂ３の）腫瘍細胞におけるアポトーシス活性、及びインビボでの抗腫瘍活性（黒色腫）、並びに抗転移性及び抗血管新生活性を有することを確認し、証明する。
【００３７】
本発明は、組換えタンパク質が、マクロファージの食作用活性（補体又は抗体によって媒介される拡散速度及び食作用速度（ｐｈａｇｏｃｙｔａｒｙ  ｒａｔｅ））を刺激することができ、さい帯由来のヒト内皮細胞、線維芽細胞、血小板、多形核、リンパ球及びヒトマクロファージのような正常細胞において、並びに腎臓、肝臓、心臓、ひ臓及び肺のような内臓において、細胞傷害活性を持たないことも示す。これらの正常細胞及び内臓においては、本タンパク質による長期治療後に組織病理学的な変化は認められなかった。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明によれば、組換えタンパク質、アンブリヨマ・カジェンネンスマダニの唾液腺のｃＤＮＡライブラリーの遺伝子から得られる新しい活性化第Ｘ因子阻害因子、新しい抗腫瘍剤、抗転移剤及び血管新生阻害因子が得られる。
【００３９】
本発明によって得られたものは、アンブリヨマ・カジェンネンス腺のｃＤＮＡから決定される一連のアミノ酸で構成され、塩基１から５０５をコードする（ｃｏｄｉｆｙ）ｃＤＮＡからその配列が決定されたポリペプチド又はタンパク質として定義することができる。
【００４０】
具体的には、本発明によって得られたものは、アンブリヨミン（Ａｍｂｌｙｏｍｉｎ）−Ｘと称する組換えタンパク質で構成され、Ｋｕｎｉｔｚ型及びＭＡＰキナーゼ型ドメインと相同である２個のドメインのタンパク質を含む。
【００４１】
本発明は、抗癌剤を使用する行為（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｅ  ａｃｔｉｏｎ）を提供し、ｃＤＮＡからのワクチン開発を可能にする。
【００４２】
全般に、本発明は、アンブリヨマ・カジェンネンスマダニの唾液腺から構築されるｃＤＮＡライブラリーにまず基づき、続いて、偶発的遺伝子（ａｌｅａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ）の配列決定に基づく。
【００４３】
得られた配列のうち、セリンプロテアーゼ阻害因子（ＳＥＲＰＩＮＳ）と相同性を有する配列を特定した。選択した遺伝子の完全配列は、データバンクにおいて分析され、１型のヒトＴＦＰＩ（組織因子経路阻害因子）と１７％の相同性を示し、Ｉｘｏｌａｒｉｓ（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓマダニから単離された阻害因子）と２１％の相同性を示した。
【００４４】
本タンパク質は、封入小体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｌｅ）の形でＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細菌中で発現され、尿素及びβ−メルカプトエタノールを用いた可溶化後に得られ、その後Ｎｉ−セファロースのアフィニティーカラムで精製された。
【００４５】
本組換えタンパク質は１３．５ｋＤａであり、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンリン脂質の存在下でのみ、精製系中の活性化第Ｘ因子を阻害することができる。その上、本組換えタンパク質は、血しょう凝固時間を延長することができる。これは、ＴＴＰＡ及びＴＰのような全体的（ｇｌｏｂａｌ）凝固試験において認められる。
【００４６】
本組換えタンパク質は、正常内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−ヒト静脈内皮細胞）又は正常ヒト線維芽細胞系列に対して影響を及ぼさなかった。
【００４７】
しかし、本組換えタンパク質は、幾つかの腫瘍細胞系列、なかでも、ネズミ黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０）においてアポトーシスによる細胞死をもたらす。
【００４８】
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫に罹ったマウスＣ５７ＢＩ／６Ｊを、本組換えタンパク質を用いて腹腔内及び皮下経路によって様々な用量及び様々な時間間隔で処置した。処置動物では、腫瘍の塊（背側腫瘍）がかなり小さくなった。その上、腫瘍移植後１４日間処置すると、転移指数は劇的に減少した。腫瘍移植後３日目に処置すると、腫瘍が完全寛解し、転移は認められなかった。本タンパク質は、対象（未処置）と比較して移植腫瘍周囲の血管形成を阻止するので、抗血管新生活性を有すると考えられる。
【００４９】
本タンパク質は、インビトロ及びインビボでのマクロファージの食作用活性も活性化した。
【００５０】
対象及び処置動物の完全な血液像を実施した。予備的結果によれば、このタンパク質は、腫瘍を有する動物において存在する凝血原状態を抑制する。その上、ヘマトクリット及びヘモグロビンレベルは、（腫瘍のない）健康な動物のレベルに近いか、又は同じである。これは、本タンパク質が動物を貧血から保護するだけでなく、明らかに、骨髄を変化させず、又はそのＦＸａ阻害能力及び長期処置によって出血現象を引き起こさないことを示している。
【００５１】
通常の治療と比較した利点：
本タンパク質は、化学療法の代わりに生物学的薬剤として必要とされる。従って、本タンパク質は、健常な細胞ではなく病気の細胞においてのみ作用し、化学療法の副作用を回避するはずである。
【００５２】
本タンパク質は、そのＦＸａ抑制能力のために、化学療法による治療を受けている患者において、又は血栓を起こし易い（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）特性を有する患者において、血栓塞栓症防護剤（抗凝血剤）として使用することができる。
【００５３】
組換え型として、本タンパク質は多量に得ることができる。
【００５４】
入手プロセスにおいて、また、前記組換えタンパク質の分析において、適用する方法を以下の手順によって要約することができる。マダニの飼育とその唾液腺の抽出；グアニジンフェノールイソチオシアナート法による全ＲＮＡの取得；ＲＮＡの定量；ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動；ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動；オリゴアフィニティーカラム（ｄＴ）によるｍＲＮＡの精製；ｃＤＮＡライブラリーの構築；第１の鎖の合成；第２の鎖の合成；アガロースゲルによるｃＤＮＡ断片のサイズスクリーニング；Ｅｃｏ  ＲＩアダプターへのｃＤＮＡ結合；Ｎｏｔ  Ｉによる消化；アガロースゲルによるｃＤＮＡのサイズスクリーニング；ベクターへのｃＤＮＡ結合；コンピテントな細菌の形質転換；アルカリ溶菌法によるプラスミドＤＮＡの調製；配列決定用試料調製；配列探索；選択クローンの増幅；ＰＣＲ反応における開始オリゴヌクレオチドの合成；ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）；アガロースゲルによる組換えプラスミドの選択；制限酵素を用いたプラスミドＤＮＡの消化；発現ベクターへの結合；小規模発現の誘導；タンパク質の発現；構造研究；組換え体の二次構造の分析；一次構造の分析及び三次構造のモデル；生化学アッセイ；リン脂質存在下でのＦＸａの抑制；凝固試験；ヒト及びネズミの腫瘍系列の培養；Ａｍｂｌｙｏｍｉｎ−Ｘ組換えタンパク質を用いた腫瘍細胞の治療；フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量の測定；フローサイトメトリーによる細胞周期相の測定；腫瘍系列培養及び動物への腫瘍移植；腫瘍増殖の観察；細胞傷害活性の測定；腹腔マクロファージの入手；ヒト皮膚線維芽細胞の培養及び統計解析。
【００５５】
本発明を実施するために以下の材料を好ましく使用した。
【００５６】
系列：エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）；
１）ＤＨ５α株：  φ８０  ｄｌａｃＺΔＭ１５、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７  （ｒｋ−、ｍｋ＋）  ＳｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｄｅｏＲ  Δ（ｌａｃＺＹＡ  −ａｒｇ  Ｉ）  ｕ１６９。
２）ＢＬ２１（ＤＥ３）株：  Ｆ’、ａｍｐＴ、ｈｓｄＳＢ（ｒ８−、ｍ８−）、ｄｃｍ、ｇａｌ（ＤＥ３）。バクテリオファージＤＥ３は、イソプロピル（ｉｓｏｐｒｏｐｉｌ）−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導される、プロモーターＬａｃ  ＵＶ５の制御下にある、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。
【００５７】
プラスミド：
１）ｐＧＥＭ−１１Ｚｆ（＋）：プラスミドライブラリーの構築に使用するＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化されたベクター。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ＰＲＯＭＥＧＡ，  １９９９。
２）「ｅａｓｙ」ｐＧＥＭ−Ｔ：「ｅａｓｙ」ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドは、ＰＣＲ産物のサブクローニング（ｓｕｂ−ｃｌｏｎａｇｅ）用のＭＣＳ（「マルチクローニング部位」）に隣接するＴ７及びＳＰ６プロモーターを含む。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ＰＲＯＭＥＧＡ，  １９９９。
３）ｐＡＥ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｕｔａｎｔａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて構築されたｐＲＳＥＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＥＴ３−Ｈｉｓ（Ｃｈｅｎ，  １９９４）に由来する発現ベクター（Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３）。
【００５８】
ｐＡＥは、プロモーターＴ７の効率及び多量のｐＲＳＥＴＡプラスミドコピー数とを結びつけた、ｐＥＴ３−Ｈｉｓの除去不能な６個のヒスチジンのＮ末端融合を有し、固定化金属を用いたアフィニティークロマトグラフィー（「固定化金属アフィニティークロマトグラフィー」、ＩＭＡＣ）による組換えタンパク質の精製を可能にする高発現ベクターである。この小さな融合物の追加は、試験した組換えタンパク質の大多数の活性に干渉しない。
【００５９】
ＰＣＲ反応における開始オリゴヌクレオチドの合成方法は以下の通り始まる。
【００６０】
タンパク質Ｎ末端配列に基づいて「センス」オリゴヌクレオチド（Ｐ１及びＰ２）を得た。続く一方向性クローニングのために、これらのオリゴヌクレオチドに好ましくは制限酵素切断部位を付加した。「センス」及び「アンチセンス」オリゴヌクレオチドも使用した。これらのオリゴヌクレオチドをＴＥ緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ）で最終濃度１０ｐｍｏｌ／μｌ（１００μＭ）に全て希釈した。
【００６１】
ｍＲＮＡの調製に関して以下の手順を実施した。
【００６２】
家畜のウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）にアンブリヨマ・カジェンネンスマダニを寄生させ、給餌時間後、メスのマダニを取り出し、滅菌した外科用具を用いてその唾液及び唾液腺を収集した。マダニの唾液複合体（ｓａｌｉｖａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を解剖し、「ｃｒｙｏ−ｔｕｂｅ」に入れ、液体窒素ですぐに凍結させ、−８０℃の冷凍庫で保存した。
【００６３】
全ＲＮＡ抽出
製造者マニュアルによって推奨された方法に従って、唾液腺をグアニジンイソチオシアナートフェノール試薬に沈めた。
【００６４】
全ＲＮＡ電気泳動（ｅｌｅｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）プロファイル
電気泳動システムの付属品を３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処理してＲＮＡａｓｅを除去し、加圧滅菌ＤＥＰＣで処理した水で洗浄した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ７．０中の１．５％アガロースゲルをプレートに置いた。全ＲＮＡ（１６．７ｎｇ／μｌ）１０又は１５μｌ、試料緩衝剤５μｌ及びＤＥＰＣで処理したＨ２Ｏの最終体積２５μｌを含む２つの試料をゲルに塗布した。ブロモフェノールがゲルの２／３に達するまで５Ｖ／ｃｍで試料を泳動させた。
【００６５】
オリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニティーカラムによるｍＲＮＡの精製
０．１Ｎ  ＮａＯＨで洗浄し、１ｍｌの結合緩衝剤１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、ＰＨ７．０で平衡にしたオリゴｄＴセルロースアフィニティーカラムによってｍＲＮＡを精製した。
【００６６】
結合緩衝剤３ｍｌを全ＲＮＡに添加し、続いて７０℃で５分間インキュベートし、それを氷中でさらに５分間冷却し、アフィニティーカラムにかけた。カラムから重力によって液体を抜き取り、さらに結合緩衝剤４ｍｌで洗浄して、ｍＲＮＡではない全てのＲＮＡを除去した。
【００６７】
ｍＲＮＡを１．５ｍｌの緩衝剤１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ７．０を用いて回避され（ｅｌｕｄｅｄ）、清浄処理した管に収集し、７０℃で５分間加熱し、氷中でさらに５分間冷却した。室温で２０分間インキュベーション後、５Ｍ  ＮａＣｌ  ９０μｌを材料に添加し、結合緩衝剤で再度平衡にしたカラムに再度供した。結合緩衝剤４ｍｌで新たに洗浄し、溶出緩衝剤１．５ｍｌを用いて回避された（ｅｌｕｄｅｄ）後、収集した材料を５Ｍ  ＮａＣｌ  ９０μｌ及び無水エチル（ｅｔｈｙｌｉｃ）アルコール３ｍｌを用いて−８０℃で「終夜」沈澱させた。次いで、材料を７０００ｇで４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去した。
【００６８】
ｍＲＮＡを７５％エチルアルコール１ｍｌで洗浄し、７０００ｇで４℃で２分間遠心分離した。それを乾燥後、沈澱したｍＲＮＡをＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ  ２０μｌに再懸濁させ、−８０℃で保存した。
【００６９】
ｍＲＮＡの定量
最終体積５００μｌとするため、ｍＲＮＡ  ２μｌを、加圧滅菌したＨ２Ｏ  ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ４９８μｌに添加した。光学濃度を５００μｌ石英キュベット中で２６０及び２８０ｎｍで読み取った。ｍＲＮＡ濃度を以下の式に基づいて計算した。
【００７０】
［ＲＮＡ］＝Ａ２６０×Ｄ×４０  μｇ／ｍｌ
式中、Ｄ＝希釈係数。
【００７１】
ｃＤＮＡライブラリーの構築に関しては、以下の手順によった。
【００７２】
ｃＤＮＡライブラリーを、改変したＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）キットを好ましくは用いて、単離ｍＲＮＡ  ５．０μｇに基づいて構築した。
【００７３】
第１の鎖の合成
ｍＲＮＡ  ５．０μｇを、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ  ６μｌで希釈した。その中に、ＮｏｔＩアダプタープライマー１．５μｌを添加し、７０℃で１０分間加熱し、氷浴で冷却し、素早く遠心分離した。第１の鎖緩衝剤５×  ４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ混合物及びＨ２Ｏ  ０．５μｌを管に添加した。反応物をホモジナイズし、素早く遠心分離し、４４℃で２分間平衡にした。Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ酵素５μｌを添加し、混合物を４４℃でさらに９０分間インキュベートした。４℃の冷却プロセスによって反応を中断した。
【００７４】
第２の鎖の合成
Ｈ２Ｏ  ９１μｌ、第２の鎖緩衝剤３０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ３μｌ混合物、１０Ｕ／μｌ  Ｅ．コリＤＮＡリガーゼ１μｌ、１０Ｕ／ｍｌ  Ｅ．コリＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ  Ｉ  ４μｌ及びＥ  コリＲＮＡａｓｅ  Ｈ（２Ｕ／μｌ）１μｌを第１の鎖反応混合物に添加した。混合物を静かに撹拌した後、１６℃で２時間インキュベートし、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ  Ｉ  ２μｌを添加し、同じ温度でさらに５分間インキュベートした。氷冷し、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを添加して反応を中断した。
【００７５】
アガロースゲルによる断片サイズのスクリーニング
キシレンシアノールを含まないフィコール１７μｌを添加した完全な第２の鎖反応を１％アガロースゲルにかけ、電気泳動システムの８０Ｖにおいて１ｃｍの試料泳動後、２本のバンドをゲルから切り出した。一方は４００から８００ｐｂの断片（−８０℃の冷凍庫に保存した低重量）を含み、他方は１０００ｐｂを超える断片（高重量、本発明を続けるのに使用した。）を含んだ。
【００７６】
好ましくはＣｏｎｃｅｒｔ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）キット及び６５℃に加熱したＨ２Ｏ  ５０μｌを用いて回避された（ｅｌｕｄｅｄ）ｃＤＮＡを用いてＤＮＡをゲルから精製し、減圧濃縮装置によって３０μｌに濃縮した。
【００７７】
ＥｃｏＲ  ＩアダプターへのｃＤＮＡ結合
緩衝剤Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ５Ｘ  １０μｌ、Ｅｃｏ  ＲＩアダプター５μｌ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌを反応管に添加し、１６℃で１６時間インキュベートした。その後、反応物を６５℃で１０分間加熱し、氷冷した。ＡＴＰ溶液２μｌ及びＴ４ポリメラーゼキナーゼ２μｌを添加後、反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【００７８】
ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミル（ｉｓｏａｍｉｌｉｃ）アルコール（２５：２４：１）５５μｌで抽出し、撹拌し、１４０００ｇで室温で５分間遠心分離した。上部水相を別の管に移し、無水エタノール２体積及び３Ｍ酢酸ナトリウム１体積を添加し、−８０℃で１時間冷却した。１４０００ｇで２０分間遠心分離し、７０％エタノール５００μｌで洗浄した後、ｃＤＮＡを流れ中で（ｉｎ  ｆｌｏｗ）約５分間乾燥させた。
【００７９】
ＮｏｔＩによる消化
Ｈ２Ｏ  ４１μｌ、特定の反応緩衝剤５μｌ、ＮｏｔＩ  ４μｌを沈殿物（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）に添加し、それを静かにホモジナイズし、３７℃で２時間インキュベートした。
【００８０】
アガロースゲルによる第２のサイズスクリーニング
第１のサイズスクリーニング（アガロースゲルによる断片サイズのスクリーニング）において記述した通り、高分子量断片の反応物５０μｌを１％アガロースゲルにかけ、電気泳動後、バンドをゲルから切り出し、高重量ｃＤＮＡを精製し、Ｈ２Ｏ  ５０μｌを用いて回避された（ｅｌｕｄｅｄ）。
【００８１】
ｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）ベクターへのｃＤＮＡの一方向性結合
高重量画分（１４μｌ）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝剤４μｌ、（ＥｃｏＲ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ酵素であらかじめ消化した）クローンベクター、好ましくはｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）１μｌ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ１μｌを添加し、１６℃で１８時間インキュベートした。
【００８２】
本発明の細菌形質転換方法は以下の手順に従う。
【００８３】
コンピテントなＥ．コリＤＨ５αの形質転換
高重量ＤＮＡ（２μｌ）を、−８０℃で保存され、氷中であらかじめ１５分間解凍されたカルシウムコンピテントな細菌（ＤＨ５α）５０μｌに添加した。溶液を氷中で３０分間インキュベートし、直後に４２℃で２分間熱くさび（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈｏｃｋ）に供し、再度氷に５分間供した。
【００８４】
ＳＯＣ培地３５０μｌを形質転換細菌に添加し、通気した管に移し、撹拌条件下（２２０ｒｐｍ／ｍｉｎ）で３７℃で９０分間インキュベートした。ｃＤＮＡを２ＹＴ−アンピシリン培地と一緒に蒔き（高分子量ｃＤＮＡ  ２００μｌ）、プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。挿入断片を含む２０個のコロニーを２個のプレート中で１００μｇ／ｍｌ  ２ＹＴ−アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｉｎａ）培地２．５ｍｌ中で２００ｒｐｍ撹拌下３７℃で１８時間インキュベートした。６５℃でＴＥ  ５０μｌを用いて回避された（ｅｌｕｄｅｄ）ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ−Ｃｏｎｃｅｒｔ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）キットを好ましくは用いてｃＤＮＡを精製した。
【００８５】
プラスミドライブラリーの分析の場合、以下の手順を用いた。
【００８６】
プラスミド（４μｌ）を特定の反応緩衝剤１μｌ、水４μｌ、ＥｃｏＲＩ（１０Ｕ／μｌ）酵素０．５μｌの存在下で３７℃で２時間消化した。ＨｉｎｄＩＩＩ（１０Ｕ／μｌ）０．５μｌ及び生成した断片を１％アガロースゲルによって臭化エチジウムを用いて分析した。分析した全プラスミドを配列決定に供した。
【００８７】
ライブラリー増幅を得るために、カルシウムコンピテントな細菌ＤＨ５α  ５０μｌ及びクローンベクターに結合した高分子量ＤＮＡ  ５μｌを含む混合物を氷中３０分間４２℃で２分間インキュベートし、再度氷中でさらに５分間インキュベートした。この後、１００μｇ／ｍｌ  ２ＹＴ／アンピシリン培地１０ｍｌを添加した。溶液を静かにホモジナイズし、２．５ｍｌ一定分量を脱気した管にピペットを用いて移し、３７℃で１８時間インキュベートした。プラスミドＤＮＡをｍｉｎｉ−ｐｒｅｐカラムを用いて抽出し、Ｈ２Ｏ  ５０μｌを用いて６５℃で回避され（ｅｌｕｄｅｄ）、−２０℃で保存した。
【００８８】
重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ）連鎖反応（ＰＣＲ）
最終体積５０μｌで調製したＰＣＲ「ポリメラーゼ連鎖反応法」反応物は、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ用１０×緩衝剤５μｌ、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４  １．５μｌ、２．５Ｕ  ＴａｑＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ  ０．５μｌを含んだ。阻害因子をコードするｃＤＮＡを増幅するために、増幅したプラスミドＤＮＡ  ４μｌ、１０ｐＭオリゴヌクレオチドＰ１  ４μｌ及び１０ｐＭオリゴヌクレオチドＳＰ６  ２μｌを使用した。反応物をサーマルサイクラー中でインキュベートした。９４℃３分間の最初の変性、変性（９４℃４５秒間）３０サイクル、アニーリング（５０℃２５秒間）、伸長（７２℃４分間）及び最終伸長７２℃１５分間のプログラムを実施した。その後、試料を１％アガロースゲルに供した。８０Ｖで２時間電気泳動遊走後、予想増幅産物に対応するバンドをゲルから切り出し、ＤＮＡを抽出し、第２のクローンベクター、好ましくは「ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）に結合させるためにＨ２Ｏ  ３０μｌで回避された（ｅｌｕｄｅｄ）。
【００８９】
プラスミドへのＤＮＡ結合に進むために、以下の方法を実施した。
【００９０】
ＰＣＲ産物（１７００ｐｂ）６μｌ、ｐＧＥＭ−Ｔベクター１μｌ、５×緩衝剤Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ２μｌ及び１Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１μｌを含む最終体積１０μｌに対して１６℃で１８時間結合を実施した。
【００９１】
Ｅ．コリＤＨ５α株を結合反応ベクター−挿入断片５μｌと一緒にインキュベートし、蒔いた。ＤＨ５αコンピテントなＥ．コリの形質転換で述べたプロトコルに正確に従って、形成されたコロニーのうち２０個を予備接種材料及び「ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ」用に収集した。
【００９２】
アガロースゲルによる組換えプラスミドの選択
「ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ」反応物を調製する前に、各予備接種材料３００μｌを急速フェノール：クロロホルム精製プロセスに供した。その後、各試料２０μｌをＴＡＥ  １×緩衝剤中の１％アガロースゲルに供した。電気泳動後、ゲルを０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液で染色して、ＵＶ光に曝されたより大きな組換えプラスミドを選択した。前記品目の陽性クローンをｍｉｎｉ−ｐｒｅｐに供し、水６０μｌで溶出させた。
【００９３】
制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化
Ｐ１とＰ２の両方のプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた精製クローンのＤＮＡを、プラスミドＤＮＡ  ５μｌ、特定の反応緩衝剤２μｌ、ＥｃｏＲＩ（１０Ｕ／μｌ）０．５μｌ、Ｘｈｏ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）０．５及びＨ２Ｏ  １２μｌを含有する最終体積２０μｌの溶液中で３７℃で２時間消化した。
【００９４】
同じプラスミドＤＮＡ（５μｌ）を同じ条件下で特定の反応緩衝剤１μｌ  ＥｃｏＲ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）１μｌ及び水１２μｌと一緒にインキュベートした。
【００９５】
消化生成物を１％アガロースゲルによって分析した。ライブラリークローン及び「ｅａｓｙ」ｐＧＥＭ−ＴによってサブクローニングされたＤＮＡの配列を決定した。
【００９６】
ＤＮＡ配列決定を実施するために、ジデオキシヌクレオチドによる連鎖停止方法を自動配列決定装置に適合させて実施した。プラスミドＤＮＡ  ４００ｎｇを、配列決定反応において鋳型として用いたｍｉｎｉ−ｐｒｅｐによって精製して調製した。前記オリゴヌクレオチドＴ７及びＳＰ６を反応に使用した。熱サイクリング後、増幅産物を長さ３６ｃｍのＤＮＡ配列決定ゲル（１×ＴＢＥ中の４．２５％アクリルアミド：ビスアクリルアミド１９：１及び７Ｍ尿素）によって分離した。この装置の検出系は、配列決定ゲルの低部に配置されたレーザー源及び蛍光検出器で構成される。各ｄＮＴＰは、検出器によって捕捉される特異的蛍光を発する。検出器は、電気泳動図中のヌクレオチドの位置を自動的に登録するコンピュータに情報を送る。泳動を７時間実施した。配列決定した全ＤＮＡを、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のサイトを介して、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎプログラム用アルゴリズムに基づいて、又はＦＡＳＴＡプログラムの場合はｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／のサイトを介して、「ＧｅｎＢａｎｋ」配列と比較した。
【００９７】
本発明に適用される好ましくはＥ．コリのＢＬ２１（ＤＥＳ）株における組換えタンパク質の発現プロセスは、以下の手順に従う。
【００９８】
ｐＡＥベクターへの結合
配列決定した挿入断片がＡｍｂｌｙｏｍｉｎ−Ｘ配列を確定した陽性クローンをＬＢ／アンピシリン７ｍｌ中で３７℃で１８時間インキュベートし、次いでｍｉｎｉ−ｐｒｅｐに供し、水５０μｌで溶出させた。
【００９９】
精製ＤＮＡを、プラスミドＤＮＡ  ２０μｌ、特定の反応緩衝剤５μｌ、ＥｃｏＲ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）１．０μｌ、Ｘｈｏ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）１．０μｌ及びＨ２Ｏ  ２３μｌを含有する最終体積５０μｌの溶液中で３７℃で５時間消化した。
【０１００】
１％アガロースゲル中での分取用電気泳動後、約１０００ｐｂのバンドをゲルから精製し、Ｈ２Ｏ  ３０μｌを用いて回避され（ｅｌｕｄｅｄ）、４５℃で１時間減圧乾燥させた。
【０１０１】
プラスミドをＨ２Ｏ  １０μｌに再懸濁し、その３．５μｌをｐＡＥ発現ベクター（図４）３．５μｌ、ＤＮＡリガーゼ用５×緩衝剤２μｌ及びＤＮＡリガーゼ１μｌと一緒に１６℃で１８時間インキュベートした。ｐＡＥベクター中でサブクローニングしたクローンの配列も決定した。
【０１０２】
アンブリヨミン−Ｘの発現の誘導
可溶な組換えタンパク質を多量に得るために、Ｅ．コリ菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株をこのタンパク質の発現に好ましく用いた。というのは、この株は、増殖が速く、培養及び維持が容易であり、組換えタンパク質を多量に生成する株であるからである。このＥ．コリ系統は溶原性であり、翻訳後修飾システムを持たない。
【０１０３】
好ましくは組換え発現ベクター（ｐＡＥ−クローン１４、１６）（図４）で形質転換されたＥ．コリ培養物をＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／μｌ）培地３ｍｌに接種し、ＤＯ６００ｎｍが０．５になるまで３７℃でインキュベートした。非誘導対照として、予備接種材料１ｍｌを４℃で保存した。０．５ｍＭ用ＩＰＴＧを体積の残りの部分に添加し、インキュベーションをさらに３時間続けた。０．１Ｍ  β−メルカプトエタノールを含む適用緩衝剤ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  １０μｌを培養物各４０μｌに添加した。試料を１２分間沸騰させ、１２．５％ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｉｌａｍｉｄｅ）ゲルに供した。その後、ゲルを５０％メタノール中の０．２５％「Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｂｒｉｌｌａｎｔ」で１８時間染色し、１０％酢酸水溶液で室温で３時間脱染した。
【０１０４】
本発明のタンパク質発現（Ｌｏｐａｐ）を得るために、以下の手順を用いた。
【０１０５】
発現ベクターで形質転換されたＥ．コリの培養物をＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／μｌ）培地１００ｍｌに接種し、ＤＯ６００ｎｍが０．５になるまで３７℃でインキュベートした。２５ｍｌ一定分量をＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／μｌ）５００ｍｌと一緒に４本の異なるビン中で３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、ＩＰＴＧを添加して最終濃度１ｍＭとし、インキュベーションをさらに４時間続けた。次いで、培地を１２０００ｒｐｍで遠心分離し、−７０℃で１８時間凍結させた。次いで、４本のビンの細胞を７０ｍｌの溶解緩衝剤５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌ）に再懸濁させ、２０００  ＧＡＧＥでフレンチプレスに３回供し、５０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。
【０１０６】
可溶な発現タンパク質を含む上清を１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して浄化し、溶解緩衝剤であらかじめ平衡にしたＮｉ−セファロースのアフィニティーカラムに供した。カラムを緩衝剤８０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ６．８で洗浄し、洗浄体積（ｗａｓｈｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）を収集した。タンパク質は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１Ｍイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて１ｍｌ／５分の流量で回避された（ｅｌｕｄｅｄ）。
【０１０７】
フレンチプレスにかけ、遠心分離した培地の「ペレット」（小体）を２０ｍｌの緩衝剤５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ尿素、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０に再懸濁し、疎水性成分を除去し、５０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離させた。分離沈殿物（ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）を、１０ｍｌの緩衝剤５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール  ｐＨ８．０と一緒に室温で終夜インキュベートして小体を可溶化した。
【０１０８】
この材料を４０００ｒｐｍで４℃で２０分間再度遠心分離し、上清を「リフォールディング」緩衝剤５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノール  ｐＨ８．０に室温で一定撹拌しながら１８時間滴下した（正しい構造を有するタンパク質を得る代替法として。この段階に達するための別の手法は、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した緩衝剤を使用することであった。）。材料をろ過し、溶解緩衝剤であらかじめ平衡にしたＮｉ−セファロースカラムにかけた。カラムを１８０ｍｌの緩衝剤５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール  ｐＨ６．８で洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１Ｍイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて１ｍｌ／５分の流量で回避された（ｅｌｕｄｅｄ）。
【０１０９】
得られた組換えタンパク質を、第Ｘａ因子に対するその抑制能力、凝固試験及び腫瘍細胞の抑制に関して試験した。
【０１１０】
配列はデータバンクに２００５年４月までアクセス制限されて寄託されたＢＡＮＫＩＴ  ６０８８４８。
【０１１１】
ＦＸａの阻害を求める生化学的アッセイをリン脂質の存在下で実施した。リン脂質膜をＢａｒｅｎｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７に記載の通りに調製した。
【０１１２】
ＦＸａに対する加水分解部位を有するアミノ−メチル−クマリン基質に対する、又は市販色素生産性基質に対する、残留酵素活性を測定することによって、リン脂質膜の存在下でのＦＸａ阻害を求めた。
【０１１３】
緩衝剤５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５−８．０中で３７℃で実施した加水分解反応を、分光蛍光計を用いて波長３８０ｎｍ（励起）及び４６０ｎｍ（発光）の蛍光によって、又は色素生産性基質の場合には分光光度計を用いて波長４０５ｎｍによって、モニターした。
【０１１４】
本発明の組換えタンパク質は、５−１０ｕＭの用量で使用すると、精製状態で、ホスファチジルセリン／ホスファチジルコリンの存在下、血しょう中で、ヒト活性化第Ｘ因子のアミド分解活性を阻害する。
【０１１５】
本タンパク質は、０．３から１．２ｕＭの用量で、腫瘍系列細胞（Ｂ１６Ｆ１０、ＳＫＭＥＬ２８）においてアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導し、細胞周期はＧ２／Ｍで停止する。
【０１１６】
本タンパク質は、これらの濃度では、正常細胞（ＨＵＶＥＣ、多形核白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ）、ヒト線維芽細胞、血小板及びマクロファージ）において、アポトーシスの効果を引き起こさない。
【０１１７】
用量１．０ｍｇ／Ｋｇを用いた皮内経路による１４日間の（１２日目において約０．５ｍｍ３の腫瘍体積を有する）Ｂ１６Ｆ１０黒色腫瘍を移植したＣ５７ＢＬ／６Ｊ同質遺伝子マウスの治療によれば、アンブリヨミン−Ｘ組換えタンパク質は、腫瘍の質量及び体積をかなり減少させることができる。アンブリヨミン−Ｘ組換えタンパク質は、肺、肝臓及びひ臓の転移数も減少させることができる。
【０１１８】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、腹腔内経路によって４２日間投与し、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内経路によって移植する３日目の後に開始した、用量０．５ｍｇ／Ｋｇのアンブリヨミン−Ｘ組換えタンパク質を用いた治療。アンブリヨミン−Ｘは、腫瘍の質量及び体積の完全寛解をもたらすことができ、転移形成を著しく妨害することができる。腫瘍を有し、アンブリヨミン−Ｘによる処置を受けた動物の肺、肝臓及びひ臓中の腫瘍及び転移性病変部の病理解剖学分析、並びに無処置の動物のそれとの比較によれば、本組換えタンパク質は、腫瘍細胞の選択的な認識を促進し、ＭＡＰキナーゼシステムのシグナル経路の増殖能力及び新血管形成を阻害し、細胞死をもたらした。肝臓、ひ臓及び肺のような内臓の実質の微視的分析は、４２回の治療投与後でも細胞学的に大きく変化しなかった。
【０１１９】
腫瘍を有し、処置を受けた動物の血液分析によれば、本組換えタンパク質は、重度の貧血を有する無処置の動物と比較して、血液状態を著しく改善し、ヘマトクリット、ヘモグロビン及び細胞性を正常レベル内に維持する。
【０１２０】
本発明によれば、アンブリヨマ・カジェンネンス腺のｃＤＮＡ由来の配列を含むコンポスト化（ｃｏｍｐｏｓｔｉｎｇ）が得られる。このコンポストは、塩基１から塩基５０５をコードするｃＤＮＡからその配列が決定されたポリペプチド又はタンパク質で構成される。
【０１２１】
コンポストから得られた組換えタンパク質は、アンブリヨミン−Ｘと命名された。アンブリヨミン−Ｘは、Ｋｕｎｉｔｚ型とＭＡＰキナーゼ型の２個のドメインからなるタンパク質であり、腫瘍治療及びｃＤＮＡからのワクチン開発に有用である。アンブリヨミン−Ｘは、第Ｘａ因子、第Ｘ因子及び第ＶＩＩ因子タンパク質に対して、また、第ＶＩＩａ／ＴＦ複合因子においても、生物活性を示し、抗凝血薬機能を調節する潜在的候補であることが判明した。
【０１２２】
ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の投与は、心血管及び血栓塞栓性合併症に関係する疾患の患者の症状を改善し、悪性腫瘍の転移を減少させ、悪性腫瘍の増殖及び播種を減少させ、悪性腫瘍の転移を抑制する。術前術後の症状における抗凝血薬性能その投与は、アポトーシス小体（リン脂質が豊富な分子）を生成する条件において、血栓塞栓症の防止に使用することができる。変性疾患及び悪性腫瘍において、その投与は、免疫応答の改善に使用することができる。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の投与は、悪性腫瘍の化学療法による治療における同時治療として、悪性腫瘍の放射線治療における同時治療として、血栓塞栓性合併症を有する悪性腫瘍の化学療法による治療における同時治療として使用することができる。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の投与は、血栓塞栓性合併症を有する悪性腫瘍の放射線治療における同時治療として使用することもでき、プログラム細胞死（アポトーシス）を調整することができ、腫瘍における新しい血管の形成を調整することができ、標的治療用薬剤として使用することができる。
【０１２３】
アンブリヨミン−Ｘ三次構造のモデリング
ｃＤＮＡによって得られる配列から、Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ  ３．７（ｂ２）プログラム及びＳｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｅｒｖｅｒを用いてアンブリヨミン−Ｘをモデリングする研究手法を実施した。
【０１２４】
本発明は、医薬部門及び獣医部門にその適用分野を有する。
【実施例１】
【０１２５】
ｍＲＮＡの取得
アンブリヨマ・カジェンネンスマダニの唾液腺から抽出した全ＲＮＡ完全性を、ホルムアルデヒドの存在下でアガロースゲルによって確認した（図１）。
【実施例２】
【０１２６】
ｍＲＮＡの単離
ｍＲＮＡを単離するために、全ＲＮＡ  ４８ｕｌを１ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤５００ｕｌで希釈し、オリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニティーカラムに供した。ｍＲＮＡ  １７．２８ｕｇを得た。ｍＲＮＡのＡ２６０／２８０比は１．７１（ｕｇ／ｕｌ）であった。分解産物を含まない抽出ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した（図２）。
【実施例３】
【０１２７】
ｃＤＮＡライブラリーの構築
８００ｐｂよりも大きい挿入断片を含むｃＤＮＡライブラリーからアガロースゲルによって選択することによる。
【０１２８】
幾つかの偶発的クローンを選択し、Ｅｃｏ  ＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、様々なサイズの挿入断片を得た（図３）。
【実施例４】
【０１２９】
マダニの唾液腺中で最も発現される転写物をマッピングするためのクローン配列決定
高重量ライブラリーのプレートに基づいて、６ウェルのプレートをアルカリ溶菌法によって調製し、それによって、５７６個の偶発的クローンの配列を決定した。
【実施例５】
【０１３０】
クローン配列決定及び「プライマー」概要
得られた配列のうち、一部のクローンは、「セルピン」と高い相同性を示した。そのうち１個のクローンは、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｂｕｔａｎｔａｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅにおいてＡ．  ｃａｊｅｎｎｅｓｅマダニの唾液からあらかじめ精製されたセリンプロテアーゼ阻害因子と類似の分子量特性を示した。このクローンは図４に示す完全配列を有する。
【実施例６】
【０１３１】
タンパク質（ＰＲＯＴＥＩＣ）配列へのクローンヌクレオチド配列の翻訳
「ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔｍｌ」ウェブサイトにおいて利用可能なプログラムを用いて、選択クローンのヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳した。得られた配列を図５に示す。
【実施例７】
【０１３２】
成熟タンパク質の配列
得られた配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質に関係し、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／ウェブサイトによって、このアミノ酸配列の位置１から２８に存在するこのペプチドを理論的に決定することができた。成熟タンパク質の配列は、１２．２９５．６Ｄａの理論分子量と４．６７の理論等電点（ｉｓｏｅｌｅｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）（ｐＩ）とを有する１０８個のアミノ酸を含む。成熟タンパク質配列を図６に示す。
【実施例８】
【０１３３】
クローン増幅用に構築した「プライマー」の５’−３’配列
図７に示すように、成熟タンパク質配列に基づいて、Ｘｈｏ  Ｉ酵素用部位であるＣＴＣＧＡＧ配列も有する目的阻害因子の増幅用「プライマー」の輪郭を描いた。
【実施例９】
【０１３４】
阻害因子をコードするｃＤＮＡの増幅
構築した「プライマー」とＳＰ６「プライマー」を用いて得られた増幅産物は、約４００ｐｂのバンドを示した。このバンドをゲルから切り出し、精製した。
【０１３５】
精製ｃＤＮＡをベクターにサブクローニングし、ＤＨ５αコンピテント細菌に転換した。産物を平板培養し、この手順から２０個の偶発的選択クローンを単離し、フェノール−クロロホルムによる抽出プロセスに供し、挿入断片の有無を評価した。
【０１３６】
陽性クローンのうち、３個を増幅、精製用に選択し、Ｘｈｏ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩ酵素を用いた制限エッセイ（ｅｓｓａｙ）に供した。
【０１３７】
クローン配列を確認し、消化によって遊離した挿入断片を、ＩＰＴＧを用いた誘導後に発現された組換えタンパク質のＮ末端部分に６個のヒスチジン残基の末端を挿入する発現ベクターにサブクローニングした。
【０１３８】
図８にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示される通り、尿素及びβ−メルカプトエタノール可溶化後にＮｉ−アフィニティーカラムによって精製された封入小体として目的タンパク質を見出した。
【０１３９】
Ｎｉ−セファロースクロマトグラフィーによって回避された（ｅｌｕｄｅｄ）材料を尿素濃度を（なくなるまで）減少させながら溶液で透析した。透析後の材料を以下の構造エッセイ（ｅｓｓａｙ）及び生化学的エッセイ（ｅｓｓａｙ）に使用した。
【実施例１０】
【０１４０】
アンブリヨミン−Ｘ及びＩＸＯＤＥＳの一次構造の比較例
（ＤＮＡ配列から推定される）アンブリヨミン−Ｘの一次構造に基づいて分子の理論的構造研究を実施した。
【０１４１】
アンブリヨミン−Ｘは、ヒトにおけるＴＦＰＩ−１と比較して約１７％の相同性を示し、ヒトにおけるＴＦＰＩ−２と比較して約１８％の相同性を示した。さらに、構造研究によれば、アンブリヨミン−Ｘは、イキソデス・スカプラリス（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）マダニの唾液腺からクローン化された組換えタンパク質であるイキソラリス（Ｉｘｏｌａｒｉｓ）と約２１％の相同性を示す。
【０１４２】
アンブリヨミン−Ｘとイキソラリスの一次構造を比較すると（ＧｅｎｅＳｔｒｅａｍアラインメント）、アンブリヨミン−Ｘは、残基３から１３（Ｉｘｏｌａｒｉｓ分子による付番）のＮ末端部分と残基１２１から１３１（１１個のアミノ酸）のＣ末端部分の両方において欠乏していることが認められる。その上、図９に示すように、分子内部（１８個のアミノ酸）における残基欠乏も起こる。
【０１４３】
上述した通り、ヒトＴＦＰＩは、３個のドメイン、すなわち、残基５３から１０３で構成されるＤ１、残基１２４から１７４で構成されるＤ２及び最後に残基２２２から２７３で構成されるＤ３ドメインを与える。従って、（わずか２個のドメインしか持たない）アンブリヨミン−Ｘの一次構造をヒトＴＦＰＩ−１分子のドメインの各々と比較した。
【０１４４】
さらに、アンブリヨミン−Ｘの部分構造をデータバンクに提示した。確認されたことは、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害因子との相同性の高い「ヒット」がＮ末端部分（残基１−６１：ＡＮＳＫＡＶＣＮＬＰ  ＫＬＡＧＤＥＴＣＳＮ  ＫＴＥＩＲＷＹＹＮＧ  ＴＡＣＥＡＦＩＦＫＧ  ＣＧＧＮＤＮＮＦＤＲＶ  ＤＤＣＱＲＬＣＥＥＱ）では高度に保存されているが、Ｃ末端部分（残基６２−１０８：ＴＨＦＨＦＥＳＰＫＬＩ  ＣＦＫＶＱＤＹＷＩＬ  ＮＤＩＭＫＫＮＬＴＧＩ  ＳＬＫＳＥＥＥＤＡＤ  ＳＧＥＩＤ）は、ホスファターゼ２Ｃタイプ、キナーゼシステム、アルファアミラーゼ３及びＭＡＰキナーゼ経路活性化因子のタンパク質と相同性を示すことであった。データは、複数のアラインメントのプログラムによって得られた。
【０１４５】
分子モデリングによって得られたアンブリヨミン−Ｘの３次元構造を解析すると、アンブリヨミン−Ｘは、このセルピンファミリーにおいて存在するＫｕｎｉｔｚ型阻害因子のドメインの第１のドメインとのみ構造上の相同性を示した（残基１−６１）。
【０１４６】
アンブリヨミン−Ｘの構造研究を続け、その最も確実な二次構造を円偏光二色性実験によって分析した。アンブリヨミン−Ｘは、５５％の無秩序な構造のうち、アルファヘリックス１０％及びベータ構造約３５％を示すことが判明した。このタンパク質のモデリングを裏付けるデータである。
【実施例１１】
【０１４７】
ＦＸａに対する抑制活性の投与量
リン脂質混合物及び蛍光発生基質を用いたエッセイ（ｅｓｓａｙ）では、図１０に示すように、ＦＸａの阻害及び用量依存性の効果を検証することができた。
【実施例１２】
【０１４８】
凝固時間を延長するエッセイ（ＥＳＳＡＹ）
組換え阻害因子は、凝固時間、トロンボプラスチン部分活性化時間（ＴＴＰＡ）及びプロトロンビン時間（ＴＰ）を延長させることができる。図１１ａは、ＴＴＰＡ延長が組換え阻害因子５０ｕｇの存在下で４３．４秒（対照）から１３７．５秒であったことを示している。これは６０％の阻害を示す。図１１ｂは、ＴＰが阻害因子の非存在下での１４．３秒から組換え阻害因子５０ｕｇの存在下での８９．３秒に延長したことを示しており、約８５％の理論的阻害を示している。
【実施例１３】
【０１４９】
リン脂質存在下での凝固時間におけるアンブリヨミン−Ｘの作用
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞中で産生されるアポトーシス小体でリン脂質が置換される凝固エッセイ（ｅｓｓａｙ）において、凝固時間は、図１２に示すように、アンブリヨミン−Ｘ  ２．５ｕＭの存在下で１２９秒（対照）から２１０秒に変化することも観察することができた。本発明者らは、アポトーシス小体の凝血原効果を阻害するアンブリヨミン−Ｘの能力を観察することができる。
【実施例１４】
【０１５０】
処置後６時間でＢ１６Ｆ１０細胞においてアンブリヨミン−Ｘによって引き起こされる細胞学的状況：形態変化及び細胞傷害性の分析
アンブリヨミン−Ｘの様々な濃度で処置されたＢ１６Ｆ１０黒色腫の腫瘍細胞を９６ウェルプレート中で培養した。細胞傷害性の変化及び接着性の低下が最初に細胞学的に認められた。画像はＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍによって得られた。
【０１５１】
Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫の細胞培養物のアンブリヨミン−Ｘによる処置は、時間及び用量に依存した細胞傷害性効果を示す。６時間後にアンブリヨミン−Ｘ  ０．５ｕＭで処置したＢ１６Ｆ１０細胞培養物は、腫瘍細胞が分離せずに、空胞化及び細胞間の延長（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ）の短縮のような小さな別々の細胞質変化を示した。細胞接着性の大きな低下は認められなかった。データを図１３に示す。
【実施例１５】
【０１５２】
アンブリヨミン−Ｘ処置後１２時間でのＢ１６Ｆ１０細胞における細胞学的変化の状況
黒色腫細胞をアンブリヨミン−Ｘ  ０．５ｕＭに１２時間暴露した後、図１４に示すように、培養上清中に散在する細胞集団の形成を伴う、細胞間の延長の短縮に関して中程度の変化が認められた。
【実施例１６】
【０１５３】
アンブリヨミン−Ｘ処置後２４時間でＢ１６Ｆ１０細胞において起こる細胞学的変化の状況
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞をアンブリヨミン−Ｘ  ０．５ｕＭで２４時間処置した後、図１５で認められるように、細胞は短縮及び接着性がかなり変化し、幾つかの細胞集団は減少した。
【実施例１７】
【０１５４】
アンブリヨミン−Ｘの様々な濃度で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の細胞接着性の阻害分析
９６ウェル培養プレート中でアンブリヨミン−Ｘの様々な濃度（０．３ｕＭから０．１ｎＭ）の存在下でＢ１６Ｆ１０細胞を２４時間培養後、細胞基質への接着性の５５％の低下が認められた。この低下は用量に依存することが判明した（図１６）。
【実施例１８】
【０１５５】
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞の生存度に対するアンブリヨミン−Ｘの効果
濃度０．３ｕＭから０．１ｎＭにおいて生存度低下が認められた。上清を収集し、Ｂｌｕｅ  Ｔｒｙｐａｎを用いた排除試験によって数及び細胞生存度を求めた。Ｍａｌｌａｓｓｅｚ血球計算チャンバ中で細胞濃度を測定した。これらの濃度においては、生存度も用量依存性であり、５ｕｇを使用したときには７５％を超えた。図１７に示すように、５ｕｇを使用したときには最も高い細胞分離割合を示した。
【実施例１９】
【０１５６】
アンブリヨミン−Ｘを用いて処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて増殖するＢ１６Ｆ１０背側黒色腫の分析
２．５×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞をマウスに皮下経路で注射し、１２日後、アンブリヨミン−Ｘ  １ｍｇ／ｋｇを背側腫瘍を有する動物に皮下投与によって１４日まで注射した。腫瘍細胞接種の１２日後に、同じ体積の食塩水を同じ経路で対照群動物に投与した。
【０１５７】
動物を毎日観察し、腫瘍の直径を測厚器によって測定した。アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した動物は、対照群と比較して背側腫瘍体積がかなり減少した（図１８）。
【０１５８】
巨視的に評価した処置動物においては、背側腫瘍は着色及び平均体積が減少した。一方、対照群の腫瘍は極めて大きく、結節状であり、潰よう性であり、広範な壊死領域を有した。腫瘍細胞を注射したが、未処置の動物は、処置中に高レベルの悪液質を生じた（図１９）。無処置群（対照）と比較した処置群の延命率（累積％）は平均１３日であった。アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した動物は正常な状態を示した（図２０）。
【実施例２０】
【０１５９】
アンブリヨミン−Ｘで治療後の肺実質中に存在する腫瘍結節数
５×１０４個の腫瘍細胞を静脈内経路によって投与した、注射１２日後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス群をアンブリヨミン−Ｘ  ０．５ｍｇ／Ｋｇで処置した。この処置を腹腔内経路によって１４日間毎日投与し、動物を毎日観察した。
【０１６０】
剖検後、アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した動物は、対照群のそれと比較して肺実質中に存在する腫瘍結節数が大きく減少した（図２１）。
【実施例２１】
【０１６１】
アンブリヨミン−Ｘで処置した後の肺病変部のサイズ分布
肺実質の巨視的分析によって、対照群中に存在する小結節の平均直径が０．１から０．３ｃｍであることが明らかになった。アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した動物は、病変部数が減少した（低多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ））だけでなく、０．３ｃｍよりも大きい病変部を生じなかった。直径は、浸潤又は播種特性を示さずに０．１から０．２ｃｍの範囲であることも観察することができた（図２２）。
【実施例２２】
【０１６２】
アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した肺（ＰＵＬＭＯＮＡＲ）実質における転移を有する動物の延命率の分析
アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した肺転移を有する動物の（累積％で表す）延命率は、（無処置の）対照群のそれと比較して１５日であった。（図２３）。
【０１６３】
アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した動物の体重減少は、治療プロトコル中には認められず、この期間後の腫瘍の質量増加も見られなかった。
【実施例２３】
【０１６４】
アンブリヨミン−Ｘを用いて４２日間処置したＢ１６Ｆ１０マウスにおける黒色腫の背側腫瘍の巨視的状況
背側腫瘍を有するＢ１６Ｆ１０動物に、腫瘍細胞の注射から３日目以後、アンブリヨミン−Ｘ  １又は０．５ｍｇ／Ｋｇによる処置を毎日行った。腫瘍を有する動物を連続して４２日間皮下投与によって毎日処置した。
【０１６５】
その結果、処置は有効であり、処置動物における腫瘍の質量及び体積が対照群のそれと比較してかなり減少する。
【０１６６】
腫瘍細胞を注射した動物は、腫瘍が増殖せず、さらには、おそらくは腫瘍寛解が誘導されることによって腫瘍塊の消失さえ観察された。動物群を解剖した。既存の腫瘍は巨視的に小さく、着色され、結節状ではなく、壊死領域を生じなかった。腫瘍かん注（ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ）は増加せず、病変部に隣接する末梢血管の系の補充は生じないことも判明した。新血管新生も認められなかった（図２４）。
【実施例２４】
【０１６７】
（対照群及び４２日間治療を受けた）Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫の背側腫瘍の巨視的状況
治療プロトコル中に食塩水を投与した対照群の背側腫瘍の組織病理学的状況は、平均的な血管、小血管及び毛細血管によって潤される（ｉｒｒｉｇａｔｅ）拡張領域を有する合胞体（ｓｉｎｃｉｃｉａｌ）の塊と類似した高細胞性腫瘍塊を示した。腫瘍塊の周囲には、単核（ｍｏｎｏｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ）白血球の離散的な炎症性浸潤が認められた。
【０１６８】
処置１４日後に得られたアンブリヨミン−Ｘ（１ｍｇ／Ｋｇ）を用いた処置群の腫瘍は、増殖活性が低く、腫瘍周囲の炎症性浸潤を起こさずに支持（ｓｕｓｔｅｎｔａｔｉｏｎ）原線維要素が少量である（結合組織／支質の殆どない）腫瘍塊を示した。この群の肺転移性病変部は、肺実質における低細胞性の小さな腫瘍であり、肺胞肥大（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）及び沈着及びメラニンタイプの茶色がかった色素を呈することが判明した。気管支中隔（ｉｎｔｒａｓｅｐｔａｌ）の炎症性浸潤は、これらの病変部では認められなかった。
【０１６９】
アンブリヨミン−Ｘを用いて４２日間処置した動物から得られた背側腫瘍によって、腫瘍細胞が、対照（図２５Ａ）とは異なり、広範な壊死領域が広がった島におけるように組織化されている（図２５Ｂ）ことが判明した。ヘマトキシリン／エオシン染色技術によって、新形成血管は検出されなかった。腎臓、肝臓、ひ臓及び心臓のような分析した他の内臓は、組織変化を示さなかった。アンブリヨミン−Ｘを用いた長期処置によって引き起こされるこれらの器官における機能低下又は直接の毒性効果は認められなかった。
【０１７０】
腫瘍塊周囲にフィブリン状（ｆｉｂｒｉｎｉｌａｒ）又はしん出性の外観を示す少量の材料の形成が認められた。
【実施例２５】
【０１７１】
アンブリヨミン−Ｘを用いて処置したマウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫の背側腫瘍細胞の細胞周期相の分析
細胞周期相の評価：アンブリヨミン−Ｘを用いて１４日間処置した背側腫瘍又は肺転移を有する動物及び食塩水を投与した対照群動物の剖検後、腫瘍の細胞周期相をフローサイトメトリーによって評価した。細胞割合をｓｕｂ  Ｇ１相又はアポトーシス相、Ｇ０／Ｇ１相、Ｓ相及びＧ２／Ｍ相において求めた。
【０１７２】
その結果、アンブリヨミン−Ｘを用いた処置を受けた動物の背側腫瘍から得られた腫瘍細胞は、殆どアポトーシス相（ｓｕｂ−Ｇ１）及び休止相（Ｇ０／Ｇ１）にあり、低増殖活性を示す（Ｇ２／Ｍ）（図２６）。
【実施例２６】
【０１７３】
アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した動物のＢ１６Ｆ１０黒色腫の転移性病変部の細胞周期相の分析
フローサイトメトリーによって分析した肺転移の病変部から得られた細胞は、細胞周期のＧ２／Ｍ相においてかなりの数になり、これらの細胞の増殖能力の封鎖及び処置効率を示している（図２７）。
【実施例２７】
【０１７４】
健康なヒト細胞におけるアンブリヨミン−Ｘの様々な濃度の細胞傷害性測定
健常なネズミ及びヒト細胞をアンブリヨミン−Ｘの様々な濃度に２４時間暴露すると、皮膚線維芽細胞、リンパ球、マクロファージ及び好中球の場合、アンブリヨミン−Ｘは細胞傷害効果を示さず、ヘパリン処置（図２９）と比較して、培養プレート中での細胞死も細胞分離も認められなかった（図２８）。
【実施例２８】
【０１７５】
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を有し、アンブリヨミン−Ｘを用いて処置した動物のマクロファージ機能活性の評価
アンブリヨミン−Ｘを用いて処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫を有する動物及び対照群におけるマクロファージの機能活性評価によれば、この処置は、マクロファージの食細胞活性を増大させる。この活性は、補体系のＣ３ｂ断片又は免疫グロブリンのＦｃ受容体に依存する（図３０、３１及び３２）。
【実施例２９】
【０１７６】
凝固試験
トロンボプラスチン部分活性化時間（ＴＴＰＡ）及びプロトロンビン時間（ＴＰ）をアンブリヨミン−Ｘの存在下及び非存在下で評価した。これらの試験を実施するために、市販の凝固「キット」を使用した。
【０１７７】
ＴＴＰＡは、固有の凝固経路を評価する、すなわち、血しょうカリクレイン（ｃａｌｌｉｃｒｅｉｎ）並びに第ＸＩＩ、ＩＸ、ＸＩ及びＸ因子をモニターする試験である。
【０１７８】
エッセイ（ｅｓｓａｙ）の制御は、アンブリヨミン−Ｘの非存在下で実施され、健常なヒト血しょう１００ｕｌ、ケファリン（ｃｅｆａｌｉｎｅ）１００ｕｌ及び０．１Ｍ  ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝剤１００ｕｌの３７℃で３分間のインキュベーション１回と、それに続く０．０２５Ｍ  ＣａＣｌ２  １００ｕｌの添加による培地の再石灰化とからなった。
【０１７９】
血塊形成時間を半自動凝固計によって測定した。阻害実験の場合には、緩衝剤の代わりに、０．１Ｍ  ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝剤中で調製したアンブリヨミン−Ｘ溶液１００ｕｌを使用した。
【０１８０】
他の凝固試験ＴＰの場合には、同じ装置を使用した。ＴＰによって凝固外因性経路を検証する。すなわち、ＴＰによって第ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ及びＸ因子をモニターする。
【０１８１】
エッセイ（ｅｓｓａｙ）の制御を実施し、血しょう１００ｕｌを０．１Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝剤１００ｕｌと一緒に３７℃で２分間インキュベートし、その後、試薬１００ｕｌを添加した。上記試験のように、血塊形成時間を確認した。緩衝剤の代わりに、０．１Ｍ  ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝剤中で調製したアンブリヨミン−Ｘ溶液１００ｕｌをインキュベートして、阻害を評価した。
【０１８２】
リン脂質源としてＣＨＯ細胞中で産生されたアポトーシス小体を用いて、凝固時間におけるアンブリヨミン−Ｘの効果も検証した。
【実施例３０】
【０１８３】
アポトーシス小体の凝血原効果に対するアンブリヨミン−Ｘの作用
ＰＣＡ「凝血原活性」と称する凝固試験を標準化するために曲線を理想化した。そのために、最終体積６０ｕｌの１ｎＭ活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、ヒト第Ｘ因子（ＦＸ）０．２５及び８．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、ウシアルブミン（ＢＳＡ）（１％）を含む２５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝剤中の様々な濃度の組換え組織因子（ｒ−ＴＦ）（１．５６−１２．５ｎｇ／ｍｌ）と一緒に、３７℃で３分間のプレインキュベーションを実施した。その後、正常ヒト血しょう（８７．５ｕｌ）、ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリンＰＳ３０：ＰＣ７０（７．５ｕｌ）及びＨｅｐｅｓ（５０ｍＭ）を含む混合物１００ｕｌを添加し、混合物をさらに３分間インキュベートした。２５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ２０ｕｌを添加することによって反応を開始した。
【０１８４】
アンブリヨミン−ＸをＣＨＯ細胞中で産生されたアポトーシス小体と一緒にプレインキュベートした。アポトーシス小体によって誘導される凝固時間が延長されることが認められた（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【実施例３１】
【０１８５】
ヒト及びネズミ腫瘍系列の培養物に対するアンブリヨミン−Ｘ抗腫瘍能力の評価
腫瘍系列：ＨＬ−６０、Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＹＡＣ−１、ＪＵＲＫＡＴ、Ｍｅｌ−８５、Ｍｅｗｏ、ＭＣＦ−７、ＳＷ６１３−１２Ａ１、ＳＷ６１３−Ｂ３、ＳＷ６１３−１２Ａ１及びＳＷ６１３結腸癌系列並びにＢ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫系列を、７５ｃｍ３培養ビン中の１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム並びに０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。コンフルエント（接着細胞）に達する前に、細胞を増幅及び維持系列用に培養し、１０％ジメチルスルホキシドを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で凍結させ、液体窒素中で維持した。
【０１８６】
全実験手順に対する接着細胞（Ｂ１６Ｆ１０、ＳＷ６１３−１２Ａ１、ＳＷ６１３−Ｂ３及びＭＣＦ−７）の懸濁液を、培養ビンを０．２％トリプシンで５分間処理し、１０％ウシ胎児血清で不活性化することによって得た。分離した細胞を２回遠心分離し、ＲＰＭＩ−１６４０補充培地に再懸濁させた。Ｍａｌａｓｓｅｚチャンバ中で細胞数を数え、細胞濃度を、１０％ウシ胎児血清及びＰｏｌｙｍｉｘｉｎｅ−Ｂ  ７ｕｇを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で５×１０５細胞／ｍｌに調節した。
【０１８７】
細胞生存度をＢｌｕｅ  Ｔｒｙｐａｎの排除試験によって求めた。生細胞は９５％を超えた。
【実施例３２】
【０１８８】
アンブリヨミン−Ｘを用いた腫瘍細胞の処置
２×１０５濃度の細胞を９６ウェルプレート中で培養し、ＣＯ２滅菌器中で３７℃で２４時間維持した。この期間後、プレートを２０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離し、上清を除去し、０．３ｕＭから０．３ｎＭの様々な濃度のアンブリヨミン−Ｘを添加し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、Ｐｏｌｙｍｉｘｉｎｅ−Ｂ  ７ｕｇを補充、添加した。６、１２及び２４時間後、細胞学的変化が認められ、画像キャプチャシステムで撮影した。
【０１８９】
細胞周期
細胞周期の試験に適用したフローサイトメトリーによって、ＤＮＡインデックス、倍数性（ｐｌｏｉｄｉａ）、細胞増殖画分並びにＳ相及びＧ２／Ｍ相に存在する細胞の割合を示す細胞動力学的パラメータが記録され、予後の一変量又は多変量パラメータ及び考えられる治療手順が示される。細胞割合の分析によって、ＤＮＡを合成している細胞の割合（「標識率」）、Ｓ相の存続期間（Ｔｓ）及び潜在的複製時間（Ｔｐｏｔ）が得られる。
【実施例３３】
【０１９０】
ＤＮＡ含量の決定
アンブリヨミン−Ｘ処置済み及び無処置の腫瘍細胞懸濁液の一定分量を、クエン酸塩（２ｍＭ）、２５ｍＭスクロース及び０．０５％ジメチルスルホキシドの緩衝剤中で即座に凍結させ、使用するまで液体窒素中に維持した。
【０１９１】
試料を氷浴中で解凍後、細胞を０．０３ｇ／ｌトリプシン３７５μｌと一緒に室温で１０分間インキュベートし、０．５ｇ／ｌトリプシン阻害因子、０．１ｇ／ｌリボヌクレアーゼＡ及び１．２ｇ／ｌスペルミンで中和した。試料をフローサイトメトリーの管に移し、細胞周期の様々な相の細胞数、アポトーシスレベル（Ｓｕｂ−Ｇ１）及びＳ相のＤＮＡ含量を分析した。
【実施例３４】
【０１９２】
細胞周期相の決定
正常細胞及び腫瘍系列の各細胞懸濁液（１０６／ｍｌ）をＰＢＳ溶液と一緒に４℃で３０００ｒｐｍで２回遠心分離し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２０μｌ及びＲＮＡｓｅ−Ａ  ４ｍｇを含むヨウ化プロピジウム（２０μｌ／ｍｌ）溶液２００μｌに光から保護して室温で３０分間再懸濁させた。この期間後、試料を細胞数測定管に移し、画像をフローサイトメーターに取り込んだ。有糸分裂前後の細胞周期相（Ｇ０−Ｇ１、Ｓ相及びＧ２−Ｍ相）を分析した。
【実施例３５】
【０１９３】
腫瘍系列の培養及び動物（マウス）における腫瘍移植
培養ビンを０．２％トリプシンで５分間処理し、１０％ウシ胎児血清で不活性化した後、動物の背側側腹部における移植に使用する接着細胞懸濁液（Ｂ１６Ｆ１０）を得た。分離細胞を２回遠心分離（２，０００ｒｐｍ）し、５６℃で１時間不活性化した１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム並びに０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した。Ｍａｌａｓｓｅｚチャンバ中で細胞数を数え、細胞濃度を５×１０４細胞／ｍｌに調節した。
【実施例３６】
【０１９４】
原発性背側腫瘍の増殖及び内部転移の評価
実験動物管理施設で維持され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系列に属する１０匹のマウスの群を使用した。動物を明／暗１２時間サイクル、２０℃恒温下、ろ過滅菌水及び「自由」摂取で維持した。
【０１９５】
原発性背側腫瘍の増殖実験では、Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫の２．５×１０４個の腫瘍細胞をマウス（１０匹の動物群）の背部に皮下経路によって注射した。
【０１９６】
内部転移を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス群に眼か後静脈叢を介した静脈内経路によって５×１０４個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を投与した。接種１２日後、この動物群を、アンブリヨミン−Ｘ  ０．５ｍｇ／Ｋｇを腹腔内経路によって投与して治療し、処置１４日まで観察した。
【０１９７】
腫瘍細胞を皮下経路によって投与し、１２日後に背側腫瘍を生じた動物をアンブリヨミン−Ｘ  １ｍｇ／Ｋｇを用いて処置した。動物を麻酔し屠殺するまで毎日観察した。その腫瘍を測厚器によって測定した。腫瘍は、平均直径０．５ｃｍであった。アンブリヨミン−Ｘを用いた処置を開始した。
【０１９８】
対照群として、動物に処置群と同じ経路によって処置１４日後に食塩水を投与した。動物を麻酔し、頚椎脱臼によって屠殺した。剖検を実施し、背側腫瘍を分析した。巨視的な内部病変部を確認し、測定し、撮影した。様々な処置群及び無処置対照群の腫瘍試料を、ＤＮＡ含量、細胞周期及び病理解剖学の分析のために処理した。
【実施例３７】
【０１９９】
腫瘍増殖の観察
Ｂ１６Ｆ１０細胞の注射後、腫瘍増殖を測厚器によって測定し、毎日撮影した。縦方向及び横方向の腫瘍を測定した（各パラメータについて２回測定）。腫瘍面積及び平均体積を以下の式によって計算した：Ａ＝πＲ２及びＶ＝４／３πＲ３。静脈内経路によって腫瘍細胞を投与した動物を各処置段階において麻酔し、屠殺し、剖検を実施した。内臓中の巨視的腫瘍結節を数え、測定した。
【実施例３８】
【０２００】
細胞傷害活性の測定
０．０３ｎＭから０．３ｕＭの様々な濃度のアンブリヨミン−Ｘ  ヘパリンナトリウム８０から０．００１５ｕｇを用いて処置した細胞系列及び腫瘍細胞の細胞生存度を、ＭＴＴ比色定量法（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）２，５−ジフェニル（ｄｉｐｈｅｎｉｌ）テトラゾリウムブロマイド）によって求めた。この方法は、生細胞によるホルマザンへのＭＴＴの還元に基づく。アンブリヨミン−Ｘの様々な用量に対する感受性の測定をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ（ＮＣＩ）による標準設定に従って最適化した。アンブリヨミン−Ｘの細胞傷害活性を、手術によって剥離され、無菌条件下で９６ウェルプレート中でインキュベートした細胞系列及び腫瘍細胞の各懸濁液において（「生体外で」）求めた。これらの細胞にＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを添加し、次いで５％ＣＯ２を含む滅菌器中で３７℃で３時間インキュベートした。この期間後、培地を取り出し、ジメチルスルホキシド１００μｌを添加して、沈殿物として形成され存在するホルマザン結晶を溶解させた。吸光度を５４０ｎｍでモニターした。
【実施例３９】
【０２０１】
腹腔マクロファージの取得
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫マウス及び（食塩水を投与した）対照群をアンブリヨミン−Ｘを用いて処置した後、動物を麻酔し、頚椎脱臼によって屠殺した。処置及び対照動物の腹腔を露出させ、冷ヘパリン５０００Ｕを含有する食塩水２ｍｌを注射した。腹腔をマッサージし、洗浄した腹膜を収集後すぐに４℃で２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に細胞懸濁液を再懸濁させ、Ｍａｌｌａｓｓｅｚ血球計算チャンバ中で細胞数を１０６／ｍｌに調節した。
【０２０２】
マクロファージ懸濁液の一定分量を、あらかじめ滅菌した球状プレート中で培養し、ＲＰＭＩ−１６４０培地に浸漬し、１２ウェルプレートに維持し、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）１０５、ヒツジ赤血球１０５の存在下及び非存在下でインキュベートし、又はＣ３Ｂｂ若しくは免疫グロブリンのＦｃ部分を用いて処置した。２４時間後、プレートを固定し、染色し、接着細胞数及び食細胞粒子数を数えた。
【実施例４０】
【０２０３】
ヒト皮膚線維芽細胞の培養
あらかじめ選択したヒト皮膚の断片（約１ｃｍ×１ｃｍ）を無菌的に収集し、２０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ−Ｆ１２培地を含む無菌円錐管にすぐに入れた。各断片を洗浄用培地を含む３５ｍｍペトリ皿に移し、過剰の血液を抜いた。脂肪及び変性した組織をはさみ及びトングを用いて除去した。「清浄」断片をより小さな断片に切断し、次いで、１０％ウシ胎児血清を補充したＨａｍ−Ｆ１２培地を含む３枚のペトリ皿に分散させた（各±１５片）。
【０２０４】
プレートを加湿滅菌器中で３７℃、５％ＣＯ２で維持し、倒立顕微鏡で週３回調べた。培地を同じ時間間隔で交換した。細胞がほぼコンフルエントに達してから、細胞をトリプシン（０．２％トリプシン）に５分間暴露し、１０ウシ胎児血清で不活性化し、細胞を２０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離し、２５ｃｍ２のビンに蒔いた。
【０２０５】
細胞増殖及び拡大後、１０５個の線維芽細胞を９６ウェルプレート中で２４時間培養した。その後、培養物を、１０％ウシ胎児血清及び７ｕｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｍｉｘｉｎｅ−Ｂを含むＲＰＭＩ−１６４０で希釈したアンブリヨミン−Ｘを用いて処置した。対照として、ヘパリンナトリウム処置を同じ濃度で、又は完全培地と一緒に使用した。
【０２０６】
統計解析
統計解析をＡＮＯＶＡ  Ｖａｒｉａｎｃｅ法と、それに続くＴＵＫＥＹ−ＫＲＡＭＥＲ多重比較試験によって実施した。値を中央値±標準偏差で表し、＊ｐ＜０．０５を有意値とみなした。
【０２０７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】アガロースゲル中の電気泳動を示す図である。試料：グアニジンフェニルイソチオシアナート法によってアンブリヨマ・カジェンネンス唾液腺から抽出した全ＲＮＡ。
【図２】アガロースゲル中の電気泳動を示す図である。１及び２はオリゴ（ｄＴ）カラムによって精製されたｍＲＮＡである。３はオリゴ（ｄＴ）カラムに保持されない材料である。４は全ＲＮＡである。
【図３】プラスミドライブラリーのｃＤＮＡ挿入断片を示す図である。ＥｃｏＲ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩと一緒に２時間インキュベートした後にプラスミドライブラリーの１６個の偶発的クローンによって得られた断片を示す１−２％アガロースゲル中の電気泳動。１から１６：偶発的クローンの分解産物、１７  マーカー。
【図４】選択クローンの完全配列（配列番号１）を示す図である。
【図５】タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｃ）配列（配列番号２）に対する選択クローンのヌクレオチド配列の翻訳を示す図である。
【図６】成熟タンパク質の配列（配列番号３）を示す図である。
【図７】発現用に選択されたクローンの増幅用に構築された「プライマー」の５’−３’配列（配列番号４）を示す図である。
【図８】１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。Ｎｉ−セファロースカラムによる組換え阻害因子の精製。１）分子量マーカー、２）クロマトグラフィー入口材料、３から８）精製において回避された（ｅｌｕｄｅｄ）画分。
【図９】アンブリヨミン−Ｘとイキソデス（Ｉｘｏｄｅｓ）の一次構造比較を示す図である。
【図１０】リン脂質及び組換え阻害因子の漸増（ｃｒｅｓｃｅｎｔ）濃度の存在下でのＦＸａ阻害曲線を示すグラフである。
【図１１ａ】組換え阻害因子の漸増濃度の非存在下及び存在下における活性化部分トロンボプラスチン時間の延長曲線を示すグラフである。
【図１１ｂ】組換え阻害因子の非存在下（対照）及び漸増濃度におけるプロトロンビン時間（ＴＰ）の阻害曲線を示すグラフである。
【図１２】アンブリヨミン−Ｘの存在下及び非存在下におけるＰＳ：ＰＣ又はアポトーシス小体を用いた凝固時間を示すグラフである。
【図１３】Ｂ１６Ｆ１０細胞においてアンブリヨミン−Ｘ（０．３ｕＭ）を用いた処置によって６時間後に惹起される変化の細胞学的状況を示す図である。
【図１４】Ｂ１６Ｆ１０細胞においてアンブリヨミン−Ｘ（０．３ｕＭ）によって処置１２時間後に惹起される細胞学的変化状況を示す図である。
【図１５】Ｂ１６Ｆ１０細胞においてアンブリヨミン−Ｘ（０．３ｕＭ）処置によって２４暴露時間後に惹起される細胞学的変化状況を示す図である。
【図１６】アンブリヨミン−Ｘの様々な濃度で処理されたＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の細胞接着阻害の分析結果を示すグラフである。
【図１７】Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞の生存度に対するアンブリヨミン−Ｘの効果を示すグラフである。
【図１８】アンブリヨミン−Ｘで処置されたＢ１６Ｆ１０背側黒色腫の１４日間の増殖の分析結果を示すグラフである。
【図１９】Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞の移植後に生成し、アンブリヨミン−Ｘ  １ｍｇ／Ｋｇで１４日間処置された背側腫瘍の巨視的状況を示す図である。
【図２０】アンブリヨミン−Ｘを用いた処置後の腫瘍重量の増加曲線を示すグラフである。
【図２１】アンブリヨミン−Ｘを用いて１４日間処置した後の肺実質中に存在する腫瘍結節数を示すグラフである。
【図２２】アンブリヨミン−Ｘ処置後の肺病変部のサイズ分布を示すグラフである。
【図２３】アンブリヨミン−Ｘを用いて処置された肺実質転移を有する動物の延命率（ｌｉｆｅ  ｌａｓｔｉｎｇ  ｒａｔｅ）に関する分析結果を示すグラフである。
【図２４】アンブリヨミン−Ｘを用いて４２日間処置されたＢ１６Ｆ１０黒色腫の背側腫瘍の巨視的状況を示す図である。
【図２５】食塩水を用いて４２日間処置された対照群のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＢ１６Ｆ１０背側黒色腫の巨視的状況を示すグラフである。アンブリヨミン−Ｘを用いて４２日間処置されたＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＢ１６Ｆ１０背側黒色腫の巨視的状況を示す図である。
【図２６】アンブリヨミン−Ｘを用いて処置されたＢ１６Ｆ１０黒色腫背側腫瘍の細胞周期の位相解析結果を示すグラフである。
【図２７】アンブリヨミン−Ｘを用いて処置された動物の肺転移の細胞周期の位相解析結果を示すグラフである。
【図２８】アンブリヨミン−Ｘの様々な濃度を用いて処置された健常なヒトリンパ球の細胞傷害性測定結果を示すグラフである。
【図２９Ａ】Ｂ１６Ｆ１０細胞及びＳＫＭＥＬ−２８における低分子量ヘパリンの細胞傷害効果の測定値を示すグラフである。
【図２９Ｂ】Ｂ１６Ｆ１０細胞及びＳＫＭＥＬ−２８における低分子量ヘパリンの細胞傷害効果の測定値を示すグラフである。
【図３０】アンブリヨミン−Ｘの０．３ｕＭを用いて１時間処置した後の腹腔マクロファージの拡散を示すグラフである。
【図３１】アンブリヨミン−Ｘの０．３ｕＭを用いて１時間処置した後の腹腔マクロファージの、補体のＣ３ｂによって測定された食細胞指数を示すグラフである。
【図３２】アンブリヨミン−Ｘを用いて１時間処置した後の腹腔マクロファージの、抗体のＦｃ部分によって媒介される食細胞指数を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月16日(2007.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２】
核酸が第Ｘａ因子（ＦＸａ）のＫｕｎｉｔｚ型阻害因子をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが、
（ｉ）  ＦＸａによって媒介される凝固の減少（この減少は、リン脂質の存在下で起こる。）、
（ｉｉ）  Ｂ１６Ｆ１０細胞のアポトーシスの促進、
（ｉｉｉ）  ＳＫＭＥＬ２８細胞のアポトーシスの促進、
（ｉｖ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍塊の減少、
（ｖ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍転移の減少、
（ｖｉ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血管新生の減少、及び
（ｖｉｉ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるマクロファージの食作用活性の増加
からなる群から選択される活性を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列からなる、精製ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが、
（ｉ）  ＦＸａによって媒介される凝血の減少（この減少は、リン脂質の存在下で起こる。）、
（ｉｉ）  Ｂ１６Ｆ１０細胞のアポトーシスの促進、
（ｉｉｉ）  ＳＫＭＥＬ２８細胞のアポトーシスの促進、
（ｉｖ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍塊の減少、
（ｖ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍転移の減少、
（ｖｉ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血管新生の減少、及び
（ｖｉｉ）  Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるマクロファージの食作用活性の増加
からなる群から選択される活性を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号３のアミノ酸配列からなる、精製ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸１−６１を含む、精製ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３のアミノ酸６２−１０８を含む、精製ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸を含む、薬剤組成物。
【請求項１２】
請求項３に記載のポリペプチドを含む、薬剤組成物。
【請求項１３】
請求項６に記載のポリペプチドを含む、薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項３に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における血液凝固を減少させる方法。
【請求項１５】
請求項３に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法。
【請求項１６】
ポリペプチドが化学療法による治療と一緒に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが放射線治療と一緒に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項３に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における腫瘍の進行を抑制する方法。
【請求項１９】
請求項３に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における腫瘍転移を抑制する方法。
【請求項２０】
請求項３に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における腫瘍血管新生を抑制する方法。
【請求項２１】
請求項３に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における食作用活性を増大させる方法。
【請求項２２】
請求項３に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における血栓塞栓症を治療又は予防する方法。
【請求項２３】
術前又は術後の状況において実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項６に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における血液凝固を抑制する方法。
【請求項２５】
請求項６に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが化学療法による治療と一緒に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドが放射線治療と一緒に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項６に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における腫瘍の進行を抑制する方法。
【請求項２９】
請求項６に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における腫瘍転移を抑制する方法。
【請求項３０】
請求項６に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における腫瘍血管新生を抑制する方法。
【請求項３１】
請求項６に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における食作用活性を増大させる方法。
【請求項３２】
請求項６に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における血栓塞栓症を治療又は予防する方法。
【請求項３３】
術前又は術後の状況において実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３５に記載の宿主細胞を、核酸によってコードされる阻害因子が発現する条件下で培養することを含む、第Ｘａ因子（ＦＸａ）のＫｕｎｉｔｚ型阻害因子を生成する方法。
【請求項３７】
宿主細胞又は宿主細胞培養上清から阻害因子を精製することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【国際調査報告】
2008512992.tif 000042
2008512992.tif 000043
2008512992.tif 000044