(57)【要約】  式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒで示される共有結合側鎖を有するポリマーを開示し、式中、Ｘは、スペーサ基であり；Ｙは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり；Ｚは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり、それらのいずれかが１個または２個の酸素原子に結合していてよく；Ｒは、−Ｚ−Ｒが脱離基を構成するような任意の好適成分である。
2008512540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒで示される共有結合側鎖を有するポリマーであって、
式中、
Ｘは、スペーサ基であり；
Ｙは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり；
Ｚは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり、それらのいずれかが１個または２個の酸素原子に結合していてよく；
Ｒは、−Ｚ−Ｒが脱離基を構成するような任意の好適成分である；
ポリマー。
【請求項２】
Ｒが、共役酸ＨＺＲが８未満のｐＫａを有するような成分である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
Ｒが、共役酸ＨＺＲが６未満のｐＫａを有するような成分である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
Ｒが、共役酸ＨＺＲが４未満のｐＫａを有するような成分である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項５】
ＹがＳまたはＳｅ、好ましくはＳである、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項６】
ＺがＳ、ＳＯまたはＳＯ２である、前記請求項１〜５のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項７】
ＺがＳまたはＳＯ２である、請求項６に記載のポリマー。
【請求項８】
Ｒが、電子求引基に共役した不飽和基、芳香族基、複素環式芳香族基および求電子基の１つを含んで成る、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項９】
電子求引基が、低級アルキルオキシカルボニル、ニトリル、ニトロ、低級アルキルスルホニルおよびトリフルオロメチルの１つまたは複数を含んで成る、請求項８に記載のポリマー。
【請求項１０】
芳香族基が、任意に置換されたフェニルを含んで成り、該置換されたフェニルにおいて、ニトロ、トリフルオロメチル、ニトリル、低級アルキルオキシカルボニルまたは他の電子求引基から選択される３個までの置換基が存在してよい、請求項８に記載のポリマー。
【請求項１１】
複素環式芳香族基が、フェニル環または付加的５または６員芳香族複素環の残基に任意に縮合した５または６員環を含んで成り、前記芳香族複素環または付加的芳香族複素環が、１個または２個の低級アルキル、フェニル、＝Ｏ、＝Ｓ、トリフルオロメチル、ニトロまたはニトリル基によって任意に置換されていてよい、請求項８に記載のポリマー。
【請求項１２】
成分−Ｚ−Ｒが、芳香族チオール、複素環式芳香族チオールまたはそれらのチオン互変異性体から誘導される、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項１３】
成分−Ｚ−Ｒが、下記から成る群から誘導される、請求項１２に記載のポリマー：
イミダゾール；ピロリジン−２−チオン；１，３−イミダゾリジン−２−チオン；１，２，４−トリアゾリン−３（５）−チオン；１，２，３，４−テトラゾリン−５−チオン；
２，３−ジフェニル−２，３−デヒドロテトラゾリウム−５−チオン；Ｎ（１）−メチル−４−メルカプトピペリジン；チオモルフィリン−２−チオン；チオカプロラクタム；ピリジン−２−チオン；ピリミジン−２−チオン；２−チオウラシル；２，４−ジチオウラシル；２−チオシトシン；キノキサゾリン−２，３−ジチオン；１，３−チアゾリン−２−チオン；１，３−チアゾリジン−２−チオン；１，３−チアゾリジン−２−チオン−５−オン；１，３，４−チアジアゾリン−２，５−ジチオン；１，２−オキサゾリジン−２−チオン；ベンズ−１，３−オキサゾリン−２−チオン；１，３，４−オキサジアゾリン−２−チオン、および硫黄がセレンまたはテルルによって置き換えられた類似体。
【請求項１４】
Ｒが２−ピリジル基である、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項１５】
−Ｚ−Ｒが−Ｓ−２−ピリジル基である、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項１６】
−Ｙ−Ｚ−Ｒが−Ｓ−２−Ｚ−ピリジル基である、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項１７】
スペーサＸが、１個または複数の、低級アルキルオキシ、ハロ、オキソ、トリフルオロメチル、ニトリル、または−Ｙ−Ｚ−Ｒ成分の形成および使用を妨げない他の基によって置換されていなくてもよくまたは置換されていてもよいアルキレン基またはフェニル基を含んで成る、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項１８】
スペーサＸが、側鎖をポリマーの残部に結合させる結合成分を含んで成り、該結合成分が、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＨ−、低級アルキル置換−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−、および低級アルキルＮ置換−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−から成る群から選択される、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項１９】
スペーサ基が、式−Ａ−Ｂ−で示され、式中、Ｂは請求項１６に記載の非置換または置換アルキレンまたはフェニル基であり、Ａは請求項１７に記載の結合成分である、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項２０】
スペーサが、成分Ｂを含んで成り、該成分が、酸素原子によって任意に中断された低級アルキレン基、カルボキシル基またはカルボキシルオキシ基である、請求項１７または１９に記載のポリマー。
【請求項２１】
スペーサＸが、成分Ｂを含んで成り、該成分が、直鎖アルキレニル基−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎが１〜４、好ましくは２である、請求項２０に記載のポリマー。
【請求項２２】
Ｘが−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２であり、ＹがＳであり、ＺがＳであり、Ｒが２−ピリジルである、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項２３】
親水性である、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項２４】
中性である、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項２５】
−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖が、下記から成る群から選択される分子に結合している、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー：
デキストラン、ヒアルロン酸、セファロース、アガロース、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、部分加水分解ポリビニルアセテートまたはポリメチルメタクリレート、カルボキシメチルセルロース、およびカルボキシメチルデキストラン。
【請求項２６】
−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖が、糖モノマー単位から誘導される分子に結合している、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項２７】
−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖に加えて、ポリマーが、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１で示される側鎖も含んで成り、式中、Ｘ、ＹおよびＺは請求項１に定義された通りであり、Ｒ１は特異的結合対の構成員である、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマー。
【請求項２８】
側鎖の−Ｚ−Ｒ基の少なくともいくつかが置換され、ポリマーが−Ｘ−Ｙ−側鎖を介して基材に共有結合するような、前記請求項のいずれか１つに記載のポリマーと反応した基材。
【請求項２９】
基材の少なくとも一部が、請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリマーで被覆され、該ポリマーが、−Ｘ−Ｙ−側鎖を介して基材に共有結合し、側鎖の−Ｚ−Ｒ基の少なくともいくつかが置換されていない、請求項２８に記載の基材。
【請求項３０】
金属表面を含んで成る、請求項２８または２９に記載の基材。
【請求項３１】
金属表面が、金、銀、白金、パラジウム、ニッケル、クロム、チタン、銅およびそれらの任意の合金を含んで成る、請求項３０に記載の基材。
【請求項３２】
基材がバイオセンサの一部を構成する、請求項２８〜３１のいずれか１つに記載の基材。
【請求項３３】
基材が、水晶または他の圧電気材料を含んで成る、請求項２８〜３２のいずれか１つに記載の基材。
【請求項３４】
金属表面に共有結合した請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリマーを含んで成り、該金属表面が固体支持体上に存在する、請求項２８〜３３のいずれか１つに記載の基材。
【請求項３５】
金属表面と固体支持体の間に配置された接着層を含んで成る、請求項３４に記載の基材。
【請求項３６】
請求項２８〜３５のいずれか１つに記載の基材を含んで成るバイオセンサ。
【請求項３７】
ＳＰＲバイオセンサおよび音響バイオセンサから成る群から選択される、請求項３６に記載のバイオセンサ。
【請求項３８】
基材に成分を間接的に結合させる方法であって、基材を、請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリマーと反応させる工程を含んで成り、該ポリマーが、基材に間接的に結合すべき成分を含んで成る側鎖を有する方法。
【請求項３９】
下記の工程を含んで成る、基材に成分を間接的に結合させる方法：
基材を、請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリマーと反応させる工程であって、該反応が、ポリマーの側鎖から全てではなくいくつかの−Ｚ−Ｒ基を置換し、それによって、ポリマーが−Ｘ−Ｙ基によって基材に結合する工程；および
基材に間接的に結合すべき成分を含んで成る試薬に、該結合ポリマーを接触させ、それによって、該成分をポリマーに結合させる工程。
【請求項４０】
試薬が、結合ポリマー上に存在する非置換−Ｚ−Ｒ基と反応する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
基材に間接的に結合すべき成分を付加する試薬との接触前に、結合ポリマーを、化学物質によってさらに修飾する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ポリマー上に存在するヒドロキシ、カルボキシ、エポキシまたはアミノ基を使用して成分を結合させる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
成分が、特異的結合対の構成員である、請求項３８〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規ポリマー、その製造、および表面被覆におけるその使用、被覆表面、ならびにアッセイ装置および方法におけるその使用に関する。本発明は、特に、カルコゲン基を組み込んでいる成分を含有するポリマー、その製造、およびバイオセンサの表面被覆におけるその使用、バイオセンサ自体、およびアッセイ法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
非特異的結合を最小限にしながら、表面に分子を特異的に固定化することは、生体適合性が因子である多くの分野、例えば、バイオセンサの製造、および表面汚損（ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｕｌｉｎｇ）の防止において、重要であることが示されている。そのような固定化は、特異的結合対の構成員に結合することができる生体適合性被覆剤を使用して、様々な成功度で行われている。適切な条件下に、対のもう一方の構成員は、非特異的結合（例えば、タンパク質、細胞、細菌または他の好ましくない物質の好ましくない結合）を最小限にしながら、アッセイ条件下で被覆剤に結合することができる。これは、バイオセンサ、特に表面プラズモン共鳴および圧電検出器における、被覆物の使用を可能にしている。
【０００３】
被覆剤を与えるためにこれまで使用されている方法の例は、従来のＥＬＩＳＡにおけるようなポリスチレンへのタンパク質の受動的吸着；シリル基および末端捕捉基によって置換されたポリエチレンでのガラスのシラン処理（文献１）；ガラスへのポリリジンの受動的吸着、次に、ＤＮＡおよび末端官能基を有するポリエチレングリコールの吸着（文献２および３）；ガラス自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）またはシラン層へのベシクルおよびＬａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ膜の受動的吸着（文献４）；従来のドットブロットにおけるような、硝酸セルロース等におけるタンパク質またはペプチドの受動的吸着；金属における硝酸セルロース等の溶液流延（文献５）；タンタル、ニオブ、チタンおよびシリコンの酸化物のような酸化物におけるタンパク質の固定化に使用される、ポリリジンに基づくグラフトコポリマーのような静電気吸着被覆剤（文献、６、７および８）。
【０００４】
他の方法は、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を包含する。基材は、金属上にＳＡＭ被膜を形成するオリゴ−およびポリ−エチレングリコールｎ−アルカンチオレートで被覆されている。これらのオリゴ−エチレングリコール含有ＳＡＭは、酸化を受けやすく、平面的であり、物質が付着するために限定された足場を与えるにすぎず、それによって、得られる信号強度が限定される（文献９および１０）。この方法は、これらの不都合にもかかわらず、特定受容体への低分子量薬剤候補の結合を測定するのに使用されている（文献１１）。
【０００５】
表面プラズモン共鳴バイオセンサへの適用のために、生体適合性多孔マトリックスを付着させることができるＳＡＭの使用も既知である（文献１２）。この場合、オメガ官能化ヒドロキシル基を有するｎ−アルカンチオールＳＡＭが、カルボキシメチル化デキストランの付着のためにエポキシ基によって活性化されている。
【０００６】
音センサに使用するために多孔マトリックスを付着させたＳＡＭの使用も既知である（文献１３および１４）。
【０００７】
ポリマーを金または銀に固定するために、メルカプトエチルカルバモイルデキストラン
のチオール基を使用することが既知である。表面密度が、ポリマー分子量に逆依存し、側鎖密度に直接依存することが見出された。化学結合受容体に関して、官能価の量または残留チオール基について記載されていない（文献１６）。金に固定するためのジスルフィド側鎖を有するシロキサン主鎖は、受容体を固定化するための反応性エステルにおいて終結するポリエチレングリコール側鎖を有するポリマーと共に既知である（文献１６）。表面に固定するためのスルフィド含有側鎖を有し、受容体の結合のための付加的反応性基を有するポリメチル−メタクリレートも既知である。残留チオール基は、さらに反応しうると記載されているが、どのようにこれを行いうるかについて、特に示されていない（文献１７）。
【０００８】
残留ＳＨ基を含有するチオール化ポリビニルアルコールは、バイオセンサにおける使用が意図されているが、どのように付着させるかについて記載されていない（文献１８）。チオール誘導化ポリスチレンが調査され、脱離基が占められなければならないために、より低い有効性であることが分かった（文献１９）。Ｃ１１−ＳＳ−Ｃ５Ｈ１１側鎖アンカー基で誘導体化されたアクリルポリマーは、自己組織化することが記載されている。安定性は、モノマーフィルムより向上したが、それらは、モノマー類似体より低い組織化であることが分かった（文献２０）。ジチオアルキル側鎖を含有する他のＳＡＭアクリルポリマーも既知である（文献２１）。
【０００９】
ＳＡＭ被覆領域に成長するポリマーが記載されており（文献２２）、シランを使用して検出表面に末端固定されたブラシポリマー（ｂｒｕｓｈ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）も記載されている（文献２４）。例えば美容的使用のアミノに基づく基材を処理するための、保護チオール化合物を含んで成る局所組成物が記載されている（文献２４）。チオール基を使用して表面にデキストランを結合させたバイオセンサが使用されている（文献２５）。
【００１０】
スルホン、スルホキシド、セレノン、セレノキシドおよび高酸化状態のカルコゲニドはそれら自体で既知である（文献２６〜３１）が、それらは、バイオセンサのようなアッセイ装置に関して、または、ポリマー、例えば、結合対の構成員が結合されるポリマーでの表面被覆において、使用されていない。
【００１１】
強化された物質を提供するために、当分野において常になされているそのような試みは、表面、特に、非特異的結合または汚損を受けやすい金属表面を被覆するのに使用しうるポリマーのさらなる改良の継続的な必要を示している。そのような新規ポリマーは、好ましくは、特異的結合対の構成員に結合することができるべきであり、特異的結合対のもう一方の構成員の存在および／または特性を判定するバイオセンサに使用しうる。さらに、それらは、ＳＨおよびＳ−低級アルキル基等のような、金属にポリマーを付着させるのに使用される既知の脱離基に関連した困難を避けるべきである。
【００１２】
スルフィドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基を使用する先行技術の試みは、周囲酸素または溶解酸素での酸化の傾向を欠点としている。これは、精製、貯蔵または使用の間に起こり、−ＳＨ基が−ＳＳ−基に変換する際に金属表面へのポリマーの反応性を変化させうる。これは、ポリマーの架橋を生じることもあり、その結果、バイオセンサにおける使用にあまり好適でないより高い粘性のゲル状構造物が形成される。ジスルフィド含有ポリマーの先行技術における使用は、Ｓ−Ｓ結合の切断から生じる短いアルキル鎖成分を生じている。これらは、ポリマー結合に使用できる活性部位の数を減少させ、金属表面に吸着されうる。これは、ポリマー吸着の制御の程度も減少させ、これは、ポリマー被覆剤の機能に悪影響を及ぼし、アルキル鎖成分の付着により金属被覆剤を疎水性にし、非特異的結合および汚損を促進しうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、先行技術における１つまたは複数のこれらの問題を軽減するかまたは克服し、金属基材への優れた堅固な付加を可能にするポリマーを提供することである。さらに、それらは、より少ない非特異的結合を示し、特異的結合対の構成員の特異的結合を可能にし、それによって、特異的結合対のもう一方の構成員の存在および／または特性を判定するためのバイオセンサにおいて使用しうる。
【００１４】
さらに、本発明は、多くの特異的結合対を付着させることができる非平面三次元マトリックスの形成を可能にし、それによって、所定の表面領域に関して存在しうる構成員の量を増加させ、その結果として、同様に捕捉しうる対のもう一方の構成員の量を増加させる。本発明は、表面の化学的および物理的特性を効果的に遮蔽することによって、表面への非特異的結合の程度を減少させる作用も有する。これは、金属表面の場合に特に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の簡単な説明
本発明は、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒで示される共有結合側鎖を有するポリマーを提供し、式中、Ｘは、スペーサ基であり；Ｙは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり；Ｚは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり、それらのいずれかが１個または２個の酸素原子に結合していてよく；Ｒは、−Ｚ−Ｒが脱離基を構成するような任意の好適成分である。
【００１６】
ポリマーを、表面、好ましくは金属表面と反応させ、それによって、該ポリマーが、いくつかの−Ｚ−Ｒ基の置換によって該表面に結合する。次に、これを化合物Ｈ−Ｚ−Ｒ１（Ｒ１は、特異的結合対の構成員である）と反応させ、該化合物がいくつかのまたは全ての残留−Ｚ−Ｒ基と置き換わり、それによって、Ｒ１成分を該表面に間接的に固定する。別の選択肢は、Ｒ１成分を、ポリマー中の他の位置（例えば、必ずしも側鎖でない）に存在する他の反応性基に付加することである。
【００１７】
他の実施形態において、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒの側鎖に加えて、ポリマーは、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１（Ｒ１は特異的結合対の構成員である）の側鎖も含んで成ってよく、特異的結合対のもう一方の構成員は分析物である。ポリマーを、表面、好ましくは金属表面と反応させ、それによって、該ポリマーを−Ｚ−Ｒ基の置換によって該表面に結合させ；従って、基本的に、本発明のポリマーをバイオセンサに使用する２つの方法が存在する：
（ｉ）ポリマーを表面と反応させ、それによって、少なくともいくつかの−Ｚ−Ｒ基の置換によって、ポリマーを表面に結合しうる。次に、一般に残留未反応−Ｚ−Ｒ基との反応によって、特異的結合対の構成員を、結合ポリマーに連結しうる。
【００１８】
（ｉｉ）または、例えば表面へのポリマーの固定化の前に、多くの特異的結合対を含んで成るようにポリマーを形成し、ポリマーは−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基と−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１基の混合物を含んで成ってよく、Ｒ１は特異的結合対の構成員である。次に、多くの特異的結合対を含有するポリマーを、−Ｚ−Ｒ基の置換によって表面に固定化する。
【００１９】
方法（ｉ）または（ｉｉ）を使用して、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１側鎖を有するポリマーで表面を被覆する。例えば、特異的結合対のもう一方の構成員の存在に関して、試料を分析するために、バイオセンサ、例えば、表面プラズモン共鳴または圧電検知を使用するバイオセンサにおいて、被覆表面を使用しうる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のポリマーは、多種類の目的に使用でき、バイオセンサまたは他の目的物を被覆するのに使用しうる。特に、非バイオセンサに関して、本発明のポリマー（特に、親水性
および／または中性ポリマー）を使用して、生体適合性を高め、かつ／または非特異的結合または汚損を防止しうる。そのような特性は、医療用または外科用インプラントおよび補綴具において、または汚損（例えば、非特異的結合による）が問題となりうる環境における、精密なまたは高価な機器への抗汚損被膜の形成において、特に有用となりうる。本発明のポリマーで被覆される表面は、平面または非平面であってよい。特に、バイオセンサにおける使用に加えて、ポリマーは、粒子状固形物、例えばミクロまたはナノ粒子、特に金属ナノ粒子を被覆するのに使用しうる。本発明のポリマーの他の使用は、リトグラフ用途における使用である：本発明のポリマーを、表面に付着させて、電気的絶縁パターン（ｐａｔｔｅｒｎ）または層を形成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒで示される共有結合側鎖を有するポリマーを提供し、式中、Ｘは、スペーサ基であり；Ｙは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり；Ｚは、硫黄、セレンまたはテルル原子であり、それらのいずれかが１個または２個の酸素原子に結合していてよく；Ｒは、−Ｚ−Ｒが脱離基を構成するような任意の好適成分である。
【００２２】
好ましくは、Ｒは、共役酸ＨＺＲが８未満、好ましくは６未満、より好ましくは４未満のｐＫａを有するような成分である。
【００２３】
そのようなポリマーにおいて、Ｙに好ましいものは、ＳおよびＳｅであり、Ｓが特に適切である。そのようなポリマーにおいて、Ｚに好ましいものは、Ｓ、ＳＯおよびＳＯ２を包含し、ＳおよびＳＯ２が特に適切である。
【００２４】
そのようなポリマーにおいて、−Ｙ−Ｚ−に好ましいものは、Ｓ−ＳおよびＳ−ＳＯ２を包含し、Ｓ−Ｓが特に好ましい。
【００２５】
ＺがＳ、ＳｅまたはＴｅ原子、好ましくはＳ原子である場合に、Ｒに適切なものは、電子求引基に共役した不飽和基、芳香族基、複素環式芳香族基および求電子基を包含する。好適な電子求引基は、低級アルキルオキシカルボニル、ニトリル、ニトロ、低級アルキルスルホニル、トリフルオロメチル等を包含する。好適な芳香族基は、ニトロ、トリフルオロメチル、ニトリル、低級アルキルオキシカルボニル、または他の電子求引基から選択される３個までの置換基が存在する任意に置換されたフェニルを包含する（本明細書を通して、「低級」という用語は、他に規定されない限り、６個までの炭素原子、より適切には１〜３個の炭素原子、好都合には１または２個の炭素原子を含有することを意味する）。好適な複素環式芳香族基は、フェニル環の残基または他の５もしくは６員芳香族複素環に任意に縮合した５または６員環の基を包含する。該複素環式芳香族基は、１個または２個の低級アルキル、フェニル、＝Ｏ、＝Ｓ、トリフルオロメチル、ニトロまたはニトリル基によって任意に置換されていてよい。
【００２６】
特に適切な−Ｓ−Ｒ基は、芳香族チオールおよび複素環式芳香族チオールまたはそれらのチオン互変異性体から誘導される基を包含する。特に好適な−Ｓ−Ｒ基は、イミダゾールから誘導される基：ピロリジン−２−チオン；１，３−イミダゾリジン−２−チオン；１，２，４−トリアゾリン−３（５）−チオン；１，２，３，４−テトラゾリン−５−チオン；２，３−ジフェニル−２，３−デヒドロテトラゾリウム−５−チオン；Ｎ（１）−メチル−４−メルカプトピペリジン；チオモルフィリン−２−チオン；チオカプロラクタム；ピリジン−２−チオン；ピリミジン−２−チオン；２−チオウラシル；２，４−ジチオウラシル；２−チオシトシン；キノキサゾリン−２，３−ジチオン；１，３−チアゾリン−２−チオン；１，３−チアゾリジン−２−チオン；１，３−チアゾリジン−２−チオン−５−オン；１，３，４−チアジアゾリン−２，５−ジチオン；１，２−オキサゾリジ
ン−２−チオン；ベンズ−１，３−オキサゾリン−２−チオン；１，３，４−オキサジアゾリン−２−チオン、および硫黄がセレンまたはテルルによって置き換えられた類似体を包含する。
【００２７】
特に好ましいＲ基は、２−ピリジル基（２−Ｐｙ）である。
好ましい−Ｚ−Ｒ基は、−Ｓ−２−ピリジル基である。
【００２８】
好ましい−Ｙ−Ｚ−Ｒ基は、−Ｓ−Ｓ−２−ピリジル基である。
スペーサ基−Ｘ−は、適切には式−Ａ−Ｂ−で示される基である。基−Ａ−の種類は、側鎖が結合するポリマーの基に依存する。側鎖が結合するポリマーの最も一般的な基は、ＣＯ２Ｈ、ＯＨ、および任意に一低級アルキル置換されたＮＨ２である。
【００２９】
側鎖を結合させるのに使用しうるポリマーに存在する他の好適な基は、アルデヒド、ヒドラジド、カルボキシル、エポキシ、ビニル、フェニルボロン酸、ニトリル三酢酸、イミド二酢酸等のような、液体クロマトグラフィーにおける固定化に使用される基を包含する。
【００３０】
カルボキシル基を含有するポリマーの場合、エステル基−ＣＯ−Ｏ−Ｂ−を介して側鎖を結合しうる。従って、基−Ａ−は、元カルボキシル基の残留カルボキシル基に結合した酸素原子を表す。または、アミド基を介して側鎖を結合してもよく、その場合、基−Ａ−は、−ＮＨ−基または低級アルキル置換−ＮＨ−基である。
【００３１】
ヒドロキシ基を含有するポリマーの場合、アシル化ヒドロキシ基−Ｏ−ＣＯ−Ｂ−を介して側鎖を結合しうる。従って、基−Ｏ−Ｘ−は、−Ｏ−ＣＯ−Ｂ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−Ｂ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｂ−、または低級アルキル化−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｂ−基を表しうる。
【００３２】
第一級または第二級アミノ基を含有するポリマーの場合、ヒドロキシ含有ポリマーの場合と類似した方法で、側鎖を結合しうる。従って、基−ＮＨ−Ｘ−またはその低級アルキル置換誘導体は、−ＮＨ−ＣＯ−Ｂ−、−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｂ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｂ−またはそれらの低級アルキル置換誘導体を表しうる。
【００３３】
前記の他の好適な基は、当業者に理解されるそれらの化学に適した方法で、側鎖の結合に使用しうる。
【００３４】
基Ｂは、どのような好都合な基であってもよく、例えば、アルキレン、フェニル、または同様の基であり、それらは、非置換であってもよく、または低級アルコキシ、ハロ、オキソ、トリフルオロメチル、ニトリル、または−Ｙ−Ｚ−Ｒ成分の形成および使用を妨げない他の基によって置換されていてもよい。
【００３５】
特に適切な基Ｂは、酸素原子によって任意に遮断された低級アルキレン基、カルボキシル基またはカルボニルオキシ基を包含する。好ましい基は、直鎖アルキレニル基−（ＣＨ２）ｎ−を包含し、ｎは、１、２、３または４、好ましくは２である。
【００３６】
ヒドロキシ置換ポリマーに関して、スペーサ基Ｘは、適切には、−ＣＯ−Ｏ−Ｘ１−または−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ１−で示される基であり、Ｘ１は低級アルキレニル基である。好適なアルキレニル基は、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−基を包含し、それらは、ヘテロ原子、例えば−Ｏ−で任意に中断されていてもよく、または置換されていてもよい（例えば−ＯＨによって）。−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−基が好ましいスペーサ基である。
【００３７】
ヒドロキシ基含有ポリマーに結合する−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基に特に好ましい基は、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−２−ピリジル基である。
【００３８】
式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒの側鎖に加えて、ポリマーは、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１の側鎖も任意に含有してよく、Ｒ１は特異的結合対の１つの構成員である。
【００３９】
「特異的結合対」という用語は、相互に特異性を有し、それによって、他の分子への結合に優先して、かつ最も適切には他の分子を基本的に排除して、標準条件下に互いに結合する２個の分子に関して使用される。好適な結合対は、抗体と抗原、リガンドと受容体、および相補ヌクレオチド配列を包含する。対の１つまたは両方の構成員は、大きい分子の一部、例えば、抗体の結合ドメイン、ヌクレオチド配列の断片等であってよい。リガンド、例えば、ホルモン、癌マーカタンパク質等は、受容体を有する細胞を判別するために、細胞表面等における受容体に結合するための好適な物質であると考えられる。対の好適な構成員は、分子インプリント、アプタマー、レクチン等を包含しうる。一般に、ポリマーに結合した特異的結合対の構成員は、ペプチドまたはポリペプチドを含んで成る。
【００４０】
特異的結合対の特に好ましい構成員は、抗体である。抗体の断片は、抗原結合部位を形成するために結合したＦｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｄ  ｐｒｉｍｅ）２および単鎖Ｆｖ分子のような結合フラグメントを有する限り、使用しうる。
【００４１】
特異的結合対の１つの構成員は、いくつかの−Ｚ−Ｒ成分を−Ｚ−Ｒ１成分（Ｒ１は特異的結合対の構成員の残基である）で置き換えることによって、ポリマー上の鎖のいくつかの側鎖に結合しうる。これは、特異的結合対の構成員、例えばタンパク質に天然に存在するチオール基との反応を含みうる。または、ＨＺ−基を結合対の構成員に合成的に付加することもできる（修飾構成員が、対のもう一方の構成員と結合するのを妨げない方法で行う）。例えば、ヒドロキシ基またはアミノ基を、メルカプトプロピオン酸の活性誘導体等でアシル化することができる。
【００４２】
本発明に使用されるポリマーは、合成または天然ポリマーであってよい。それは、ヒドロゲル、多孔マトリックス、ゲル、架橋ポリマー、星形状ポリマー、デンドリマー等の形態をとりうる。そのようなポリマーは、コ−またはター−ポリマー、グラフトポリマー、櫛状ポリマー等であってもよい。
【００４３】
特に、１つの実施形態において、本発明は、複合ポリマー構造物の使用を含み、該構造物において、受容体成分Ｒ１が、ポリマーを結合させた表面からさらに除去されている。そのような実施形態が、図１８に概略的に示されている。図１８において、基材が複合構造物で被覆されている：比較的短い本発明ポリマーが、Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖からの−Ｚ−Ｒ脱離基の置き換えによって、基材に結合されている。比較的長い分子または成分をポリマーに結合させ（基材への結合前または結合後）、その比較的長い成分は、受容体、抗体、または特異的結合のもう一方の構成員の結合のための、複数の生物学的または化学的反応性基（「ａｔ」）を有する。本発明者らは、脱離基−Ｚ−Ｒをポリマーの遠位端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に配置することによって、受容体Ｒ１を基材から離し、それによって、タンパク質および小分子結合の両方により透過性の生体適合性表面被膜を構成することができ、基材におけるより高い受容体密度、および／またはバイオセンサ用途におけるより高い信号：ノイズ比を可能にすると推測する。ポリマーが多地点で表面に結合され、密集した低透過性マトリックスを生じる商業的に入手可能な従来のポリマー被覆表面に関して、大量輸送制限結合（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の作用を減少することも可能である。
【００４４】
再び図１８を参照すると、化学的または酵素的連結によるか、またはポリマー「グラフト」によって、比較的長い成分をポリマーに結合しうる。従って、マトリックスを、例えば、コポリマー（櫛状ポリマー、交互コポリマー、ブロックコポリマーを包含する）およびターポリマーから形成しうる。重合の方法は、当業者に周知であり、好適な方法の典型的な全般的開示が、Ｍａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ  ＆  Ｘｉａ（２００１，  Ｃｈｅｍ．
Ｒｅｖ．  １０１，  ２９２１−２９９０）およびＨａｗｋｅｒ  ＆  Ｗｏｏｌｅｙ（２００５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，  １２００−１２０５）よってなされている。
【００４５】
本発明に使用されるポリマーは、親水性、生体適合性であり、かつ、被膜として存在する場合に、分析物および汚染物の非特異的結合を阻止しうることが好ましい。好適なポリマーは、デキストラン、ヒアルロン酸、セファロース、アガロース、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、部分加水分解ポリビニルアセテートまたはポリメチルメタクリレート、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン等を包含する。
【００４６】
本発明のポリマーの使用は、優れた金属被覆レベルを与えることができ、これは、本発明において観察される非特異的結合の減少に寄与している。これは、中性（非荷電）ポリマーを使用することによって最も容易に達成される。本明細書において使用される「中性」という用語は、ポリマーが、どのような容易にイオン化される基も含有せず、従って、あらゆる生理学的環境において非荷電であることを意味する。
【００４７】
本発明の荷電ポリマー（例えば、カルボキシメチル化セルロース誘導ポリマーのような、残留カルボキシレート基を含有するポリマーから誘導されるポリマー）を使用して、所望成分の結合を増加させることができる。本発明の目的のために、「荷電」ポリマーは、容易にイオン化される基（例えば、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ）を有するポリマーである。従って、ｐＨ等の特定条件下に、問題とする基が無電荷である故に、またはポリマーが同数の陽電荷および陰電荷を有する故に、「荷電」ポリマーは、事実上、中性であり、他の条件において、容易にイオン化される基のイオン化により、ポリマーは正味電荷（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）を有する。
【００４８】
非特異的結合に対する特に優れた耐性が、本発明の中性（無電荷）ポリマーの使用によって生じうることが見出された。
【００４９】
本発明に使用するのに特に適切な誘導体化可能ポリマーは、糖モノマー単位から誘導されるポリマーである。
【００５０】
本発明に使用するのに好ましい誘導体化可能ポリマーは、デキストランである。好適な等級のデキストランは、Ｔ１０、Ｔ７０およびＴ５００を包含する。
【００５１】
例えば、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１基を含有するポリマー被覆剤を製造する選択的かつ一般により好適な方法は、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基を含有する本発明のポリマーを基材、好ましくは金属表面と反応させる方法であり、それによって、少なくともいくつかの−Ｚ−Ｒ基が置換され、ポリマーが−Ｘ−Ｙ−側鎖を介して金属表面に結合され、次に、いくつかのまたは全ての残留−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基を、化合物Ｈ−Ｚ−Ｒ１と反応させ、それによって−Ｚ−Ｒ基が−Ｚ−Ｒ１基によって置き換えられる。
【００５２】
被覆される表面は、好ましくは、カルコゲン含有分子に反応性を有する金属表面である。そのような金属は、第１０族および第１１族の金属ならびにチタンを包含する。好ましい金属は、金、銀、白金、パラジウム、ニッケル、クロム、チタンおよび銅ならびにそれらの合金を包含し、それらの中で、金および白金が最も好ましい。好ましい金属は金である。
【００５３】
カドミウム、鉄および水銀イオンのような金属イオンも使用しうる。所望であれば、基材と金属の間に接着層（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｃｏａｔ）が存在してよい。好ましい接着層はチタンを含んで成る。
【００５４】
−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基、および任意に−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１基を含有する側鎖を有する本発明のポリマーを、基材、好ましくは金属表面と反応させ、それによって、少なくともいくつかの−Ｚ−Ｒ基が置き換わり、ポリマーが−Ｘ−Ｙ−側鎖を介して金属表面に結合しうる。
【００５５】
従って、１つの好ましい態様において、本発明は、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１（Ｘ、Ｙ、ＺおよびＲ１は先に定義した通りである）で示される側鎖を有する親水性ポリマーで被覆された金属表面を提供する。Ｘ、ＹおよびＺ、ならびにＸ、ＹおよびＺの組合せについて、適切な、好都合な、好ましい定義は、先に記載した通りである。
【００５６】
ポリマーが前記の両側鎖を含有する場合、−Ｚ−Ｒ基を有する側鎖が優先的に置き換わり、従って、金属に結合した−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１基を含有する結合ポリマーを与える。
【００５７】
金属表面は、最も好適には、より強い基材層に支持される。この基材は、一般に（必ずではないが）バイオセンサとしての使用に好適な、どのような従来材料であってもよい。従来のアッセイの場合、ポリスチレンのようなプラスチック、またはガラスが使用される。圧電気材料または光学材料も使用しうる。ガラスまたは石英は、光学バイオセンサ、特に表面プラズモン共鳴装置に好ましい基材である。好適な圧電気材料は周知であり、石英、タンタル酸リチウム、ガリウムヒ素、酸化亜鉛、ポリフッ化ビニリデン等を包含するが、石英が最も適している。
【００５８】
基材は、ポリマーに結合した側鎖に存在する特異的結合対のもう一方の構成員に結合する特異的結合対の構成員の検出および／または特性決定のための、能動素子または受動素子に使用しうる。
【００５９】
代替法において、特異的結合対の構成員が結合しうる反応性成分を含有する基で、−ＺＲ基を置き換えうる。そのような実施形態において、基Ｒ１は、基Ｚの結合点でリンカー基も組み込んでいる特異的結合対の残基と見なしうる。
【００６０】
そのような代替法は、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ基等を介する基Ｒ１の結合に使用しうる。例えば、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖を含有するポリマーを、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以下、ＳＰＤＰ）と反応させることができ、これによって側鎖−Ｘ−Ｙ−Ｓ−ＣＯ−Ｏ−１−ピロール−２，５−ジオンを得、これは、Ｒ１内の第一級アミンとの反応後に、−Ｘ−Ｙ−Ｓ−ＣＨ２ＣＯＮＨＲ２側鎖（−ＣＨ２ＣＯＮＨＲ２はＲ１を表す）を与える。
【００６１】
付加的にまたは選択的に、−Ｚ−Ｒ基でないポリマーの反応性基を使用して、特異的結合対の構成員を結合しうる。
【００６２】
そのような代替法は、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖での修飾前にポリマーに存在するか、またはＸ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖の導入後にポリマーに導入しうるアミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、エポキシ基等を介する基−Ｒ１の結合に使用できる。例えば、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖を介してポリマーを表面に固定化した後に、例えば塩基性条件下でのブロモ酢酸との反応によって、デキストランに存在するヒドロキシ基を修飾して、酸性カルボキシメチル（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）反応性基を形成することができる。類似した方法において、ポリマーを、
塩化トシル、塩化メシル、臭化シアン、エピ−ブロモヒドリン、カルボジイミド、ビスオキシラン、ジビニルスルホン等と反応させて、中性反応性基を形成しうる。反応性基を与えるためのそのような試薬は、周知であり、当業者に理解される。好適な官能基／活性化試薬の表を、本明細書の添付書類１に示す。未反応−Ｚ−Ｒ基を、Ｚ−反応性キャッピング試薬の水溶液（例えば、Ｚ＝硫黄の場合、１Ｍ  ＮａＣｌを有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５中のシステイン）への曝露によって、任意に、先ず不活性化（キャッピング）してもよい。
【００６３】
前記により、本発明の態様が、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１（−Ｘ−、−Ｙ−、−Ｚ−および−Ｒ１は、前記のように定義される）で示される側鎖を含有するポリマーで被覆された金属を与えることが理解される。
【００６４】
好ましくは、式−Ｘ−Ｙ−のの側鎖を介して、ポリマーを金属に結合させる。
この態様において、−Ｘ−、−Ｙ−、−Ｚ−および−Ｒ１について、適切な、好都合な、好ましい定義は、ポリマーおよび金属表面に関して先に記載した通りである。
【００６５】
同様に、他の態様において、本発明は、少なくとも１つの面が金属で被覆された基材であって、該金属自体が、前記のように定義される式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１の側鎖を含有するポリマーで被覆されている基材を提供することも理解される。極めて好都合な態様において、本発明は、基材および基材の少なくとも１つの面における金属被膜を有するバイオセンサであって、該金属被膜自体が、式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１（−Ｘ−、−Ｙ−、−Ｚ−および−Ｒ１は前記のように定義される）の側鎖を含有するポリマーで被覆されているバイオセンサを提供する。
【００６６】
式−Ｘ−Ｙ−の側鎖を介して、ポリマーを金属に結合させる。この極めて好都合な態様において、−Ｘ−、−Ｙ−、−Ｚ−および−Ｒ１の適切な、好都合な、好ましい定義は、ポリマー、金属表面および基材に関して前記に定義した通りである。所望であれば、基材と金属の間に接着層が存在してよい。
【００６７】
そのようなポリマー被覆金属は、例えば、それが基材を被覆している場合、バイオセンサに使用しうる。従って、本発明は、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−成分によってポリマーを結合させた金属で被覆された基材を提供し、該ポリマーは、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒおよび／または−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１および／または誘導体化可能な基、例えば、ヒドロキシ、アミノまたはカルボン酸基またはそれらの塩を有し、該金属、ポリマーおよび−Ｘ−、−Ｙ−、−Ｚ−、−Ｒおよび−Ｒ１基は前記のように定義される。所望であれば、金属と基材の間に接着層が存在してよい。
【００６８】
−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖を含有する本発明のポリマーは、初期ポリマーから任意の従来法で製造しうる。従って、例えば、カルボキシル基を含有するポリマーをエステル化してもよく、アミノ基またはヒドロキシル基を含有するポリマーをアシル化してもよく、他の誘導体化可能な基を当業者に既知の方法によって誘導体化してもよい。
【００６９】
ヒドロキシ基を含有するポリマーに側鎖を導入する特に適切な方法は、極性非プロトン性有機溶媒中で、好ましくは、酸封鎖剤および触媒の存在下に、ポリマーを４−ニトロフェニルクロロホルメートまたは類似試薬と先ず反応させることを含んで成る。
【００７０】
好適な溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および類似した特性の溶媒を包含する。好適な酸封鎖剤は、ピリジンのようなアミンを包含する。一般的な触媒は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−４−ピリジンを包含する。一般に、反応は、外部冷却を伴う周囲温度であるが任意の非極限温度で行われ、例えば１０〜３０℃の温度を使用しうる。反応は、３
〜１２時間、例えば５または６時間にわたって行われる。
【００７１】
ヒドロキシル基のエステル化度は、使用されるエステル化剤、例えば４−ニトロフェニルクロロホルメートの量、反応時間の長さ、反応温度等によって、当業者に理解される方法で調節してよい。
【００７２】
一般に、糖類に基づくポリマー、例えば、セルロース、デキストランおよびそれらの誘導体の場合、適切には、使用できるヒドロキシル基の３％を超える、例えば３〜６０％、例えば約３〜３０％、より一般的には５〜１５％、例えば３、７、１０または１５％を置換しうる（パーセント値は、ポリマーの糖残基１００当たりの側鎖の数を表す）。適切な脱離基の使用、およびそのような置換レベルは、ＳＡＭによってこれまでに達成されているより多くのポリマー付着を可能にし、それに対応して、特異的結合対の構成員の増加した結合レベル、従って、最終的な分析物結合を可能にする。従って、例えば、本発明によって達成できるポリマー付着は、２．０ｎｇ／ｍｍ２を超えることができ、より適切には２．５ｎｇ／ｍｍ２を超える、好都合には３．０ｎｇ／ｍｍ２を超える、より好都合には３．５ｎｇ／ｍｍ２を超える、好ましくは５．０ｎｇ／ｍｍ２を超える。
【００７３】
アシル化ポリマーは、沈殿によって、例えば、メタノールとエーテルとの混合物のような混和性非溶媒を添加し、次に、沈殿物を濾過によって分離することによって、溶液から回収しうる。
【００７４】
次に、４−ニトロフェニル炭酸化デキストラン（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ）を、式ＮＨ２−Ｂ−Ｙ−Ｚ−Ｒの化合物と反応させて、式−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｂ−Ｙ−Ｚ−Ｒ（Ｂ、Ｙ、ＺおよびＲは前記のように定義され、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−基は前記の式Ａの基を表す）の側鎖を有するデキストランが得られる。誘導体化度（側鎖の数）は、中間体炭酸化ポリマーのアシル化度を示す。
【００７５】
４−ニトロフェニル炭酸化デキストランとアミノ化合物との反応は、ジメチルスルホキシドのような極性非プロトン性溶媒中において、非極限温度、例えば周囲温度で一般に行われる。反応は、ピリジンのような酸受容体の存在下、およびＮ−メチルモルホリンのような触媒の存在下に、一般に行われる。所望の反応生成物は、メタノールとエーテルとの混合物のような混和性非溶媒を使用し、次に濾過することによって得られる。
【００７６】
先の２つの反応は、所望であれば、中間体４−ニトロフェニル炭酸化デキストランを分離せずに連続的に行ってもよい。
【００７７】
式ＮＨ２−Ｙ−Ｚ−Ｒのアミンに関する適切な、好都合な、好ましい定義は、先に記載した通りである。従って、例えば、使用するのに好都合なアミンは、式Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−２Ｐｙで示されるアミンである。
【００７８】
所望であれば、いくつかの活性脱離基を置換して、前記のような−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１成分を含有する側鎖が得られる。または、そのような側鎖を、下記のように、表面へのポリマーの結合後に導入してもよい。
【００７９】
バイオセンサの製造において、基材に金属層を付着させることは周知である。従って、例えば、チタンの薄層を、ガラス、石英、プラスチック等のような基材に被覆しうる。そのような付着層は、一般に蒸着によって形成され、厚さは０．５〜５ｎｍ、より一般的には１〜２．５ｎｍ、例えば約１．５ｎｍである。次に、前記のような金属、特に、金、白金または銀、好ましくは金の、より厚い層を、例えば蒸着によって、付着層に被覆する。そのような金属層の厚さは、使用されるバイオセンシング法に依存し、約１０〜２００ｎ
ｍ、より一般的には約２０〜１００ｎｍ、例えば３５〜７５ｎｍの厚さである。圧電法の場合、厚さは、一般に、例えば１００〜２００ｎｍである。
【００８０】
活性側鎖含有ポリマーは、活性側鎖ポリマーの溶液を金属表面に接触させることによって、金属表面に結合しうる。一般に、金属表面にポリマー物質の溶液を接触させる前に、例えば、超純水、次に水酸化ナトリウムおよび界面活性剤溶液、さらに超純水での洗浄によって、該表面を清浄にする。
【００８１】
次に、清浄にした表面をポリマー剤の溶液に、例えば３〜３０分間、より一般的には１０〜２０分間接触させる。一般に、溶液は、０．１〜１０％、例えば０．５〜７．５％の、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖含有ポリマーを含有する。接触は静的であってもよく、または溶液を金属表面に対して動かしてもよい。この間に、−Ｚ−Ｒ基が置換され、ポリマーが−Ｘ−Ｙ−基を介して金属に結合する。例えば、−Ｘ−Ｓ−Ｓ−２Ｐｙ基を含有するポリマーの場合、−Ｓ−２Ｐｙ基が置換され、ポリマーが−Ｘ−Ｓ−結合によって金属に結合する。この結合が生じた後、非化学吸着ポリマー物質は、水酸化ナトリウムでの洗浄によって除去しうる。得られたポリマー被覆金属は、バイオセンサにおける使用の際に遭遇する可能性が高い濃度における酸、塩基、塩、洗浄剤またはシステインによって影響を受けない。
【００８２】
いくつかの活性脱離基だけが、金属への結合によって置換されるので、金属表面は、いくつかの前記−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖を保持しているポリマーの層で被覆される。
【００８３】
このようにして得られた被膜は、適切な脱離基−Ｚ−Ｒを使用していない先行技術法によって達成されるものより高い比率の金属表面を被覆すると考えられる。
【００８４】
−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤によって、遊離Ｙ基（−Ｘ−ＹＨ）に還元でき（例えば、Ｙが硫黄である場合は、スルフヒドリル基（−ＳＨ）に還元）、次に、ＳＰＤＰまたは硫酸化類似体のような物質と反応させることができる。次に、得られた−Ｘ−Ｙ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−Ｎ＝（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ）側鎖を含有するポリマー（またはＳＯ４２−塩での他のＮ−ヒドロキシスクシンアミド類似体）を、Ｒ１成分または誘導体化Ｒ１成分、例えばタンパク質、特に抗体に存在するアミノ基と反応させうる。Ｒ１が小分子（例えば、分析すべき受容体に結合するリガンド）である場合、それが有するかまたはそのような基を有するようにそれを誘導体化しうるスルフヒドリル基またはアミノ基との反応によって、それを結合しうる。従って、例えば、ヒドロキシ基を３−メルカプトプロピオン酸またはグリシン等でエステル化しうる。同様に、カルボキシ基を、ＮＨ２ＣＨＣＨ２ＯＨ、ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＯＨ等でエステル化しうる。または、スルフヒドリルまたはアミノ基または誘導体化ヒドロキシまたはカルボキシ基等を含有する天然リガンドの交差反応性類似体を使用することもできる。
【００８５】
代替法において、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒおよび−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１測鎖の両方を含有するポリマーに、金属表面を接触させてもよい。−Ｚ−Ｒは−Ｚ−Ｒ１より優れた脱離基である故に、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１側鎖を所定の位置に残して−Ｚ−Ｒ基を置換することによって、ポリマーが金属表面に結合する。
【００８６】
他の代替法において、−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ側鎖を含有するポリマーに、金属表面を接触させる。−Ｚ−Ｒ−基の置換によって、ポリマーが金属表面に結合し、修飾前のポリマーに存在する他の基は、反応性側鎖に変換される。
【００８７】
任意の残留活性ジスルフィド基を、例えばｐＨ８．５の１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液中で、システインの水溶液への曝露によって、不活性化（キャッピング）してよい。
【００８８】
好都合な態様において、本発明は、下記を含んで成るバイオセンサを提供することが理解される：（ｉ）基材；（ｉｉ）該基材の表面上の金属層；（ｉｉｉ）式−Ｘ−Ｙ−の側鎖によって該金属に結合したポリマー；および（ｉｖ）式−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１の側鎖も有する該ポリマー（Ｘ、Ｙ、ＺおよびＲ１は前記のように定義される）。
【００８９】
必ずではないが、好ましくは、２つの型の側鎖におけるＸ−Ｙ基は同じである。基Ｘ、Ｙ、ＺおよびＲ１は、適切には、好都合には、かつ好ましくは、先に定義した通りである。基材および金属は、適切には、好都合には、かつ好ましくは、先に定義した通りである。ポリマーは、適切には、好都合には、かつ好ましくは、先に定義した通りである。
【００９０】
１つの実施形態において、親油基、または脂質、小胞、リポソーム、膜フラグメント、細胞、エンベロープド（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ウイルスまたは他の脂質存在物に非共有結合的または共有結合的に結合することができる反応性種を使用して、ポリマーを誘導体化しうる。
【００９１】
支持された脂質二重層および単層は、多種の膜−受容体−リガンド系との相互作用を分析する音響的および光学的バイオセンサと組み合わせて、広く使用されている。一般に、これらのアセンブリは、蒸着物の蒸発またはスパッタリング工程により、分子規模の固有表面粗さ（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）を有する金または銀フィルムに基づく。これらの金属表面に密接に結合した単層および二重層アセンブリは、性質的に多結晶質または非結晶質になり、従って、流動膜（ｆｌｕｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を充分に模倣しない。さらに、二重層の基材として使用される大部分の材料（ＳｉＯ２、ガラス、金属、ポリマー等）の表面粗さは、単分子層としての脂質および／または天然膜の安定組織化を妨げる（Ｄｕｓｃｈｌ  ＆  Ｋｎｏｌｌ  １９８８  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ８８，  ４０６２−４０６９；  Ｓｐｉｎｋｅら、１９９２  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．  ６３，  １６６７−１６７１）。
【００９２】
これらの問題を解決するために、Ｓａｃｋｍａｎｎ，  ＲｉｎｇｓｄｏｒｆおよびＫｎｏｌｌのグループによって先駆的研究が行われ、彼らは、可撓性ポリマーによって固体支持体に結合しているが、構造的にそれから分離している脂質二重層の形成について研究した。これらの軟質ポリマークッションは、表面と膜の間に潤滑層を与え、表面への非特異的結合度を増加させる表面欠陥の、「自己回復」を可能にする。３種類の基本的方法が使用されている：ａ）膜に挿入でき、膜を固定することができる長いアルキル鎖で誘導体化したデキストランまたはヒアルロン酸のような水溶性天然ポリマーの超薄皮膜の、固体表面への化学グラフト（例えば、Ｃｏｏｐｅｒら、２０００  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７７，  １９６−２０５；Ｊｅｎｃｏら、１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２７，  ４３１−４３７）；ｂ）官能化頭基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐｓ）を有するリポポリマーの、表面への結合（例えば、Ｓａｃｋｍａｎｎ  １９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１，  ４３−４８）；および、ｃ）膜に挿入し、膜を固定するアルキル側鎖を有する棒状分子の軟質親水性多層の付着（例えば、Ｗｉｅｇａｎｄら、１９９７  Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．  １９６，  ２９９−３１２；Ｅｒｄｅｌｅｎら、１９９４  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０，  １２４６−１２５０；およびＢｅｙｅｒら、Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ３５，  １６８２−１６８５）。
【００９３】
脂質構造物を固体支持体に固定化する方法のさらなる説明については、ＵＳ  ５９２２５９４（特に、その第３欄）およびＷＯ  ０２／０７２８７３（特に、その第７頁）が参照される。
【００９４】
このように、本発明のポリマーは、親油基を表面に固定するのに有用であり、それらは、例えば、小胞、リポソームまたは膜結合受容体または他の膜結合分子の挙動を研究するための人工膜または疑似膜として機能しうる。
【００９５】
先に記載したように、本発明は、前記のように定義されるポリマーを含んで成るバイオセンサを提供する。
【００９６】
バイオセンサは、分子識別のための受容体（金属を介して基材に結合しているポリマーに結合した固定化Ｒ１基）と、処理可能信号として相互作用を伝達するための変換器の組合せとして理解しうる。光学バイオセンサの例は、ＵＳ２００２／０１２５７７、ｐ．２および３に見出され、それは、相互参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
好適なバイオセンサは、光学バイオセンサ、例えば、表面プラズモン共鳴、減衰全内反射、ＦＴＩＲ、共鳴比色反射（ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）、共鳴鏡（ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｍｉｒｒｏｒ）、蛍光、ルミネセンス、ケミルミネセンンス等を使用する光学バイオセンサを包含する。
【００９８】
他の好適なバイオセンサは、音響バイオセンサ、例えば、水晶質量センサ、例えば、横剪断波（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｓｈｅａｒ  ｗａｖｅ）または表面音波装置を包含する。そのようなバイオセンサにおいて、ポリマー層は、特異的結合対のもう一方の構成員（分析物）との相互作用を感知するために、音波装置へのおよびからの、固定基Ｒ１へのおよびからの、音波を伝達する付加的機能を果たす。
【００９９】
さらに、他の好適なバイオセンサは、電導度センサおよび誘電センサのような電気的性質を測定するバイオセンサ、例えば電界効果トランジスタを使用するバイオセンサを包含する。
【０１００】
他の種類のバイオセンサは、力覚バイオセンサ、例えば、原子間力顕微鏡、バイオフェーズメンブランプローブ等、微小電子機械センサ、熱量測定バイオセンサ、誘電バイオセンサ、電導度バイオセンサ、およびマイクロタイタープレートである。
【０１０１】
力覚バイオセンサまたは微小機械バイオセンサの場合、ポリマーは、特異的結合対のもう一方の構成員（分析物）との相互作用を感知するために、力覚センサまたは微小機械センサへのおよびからの、固定基Ｒ１へのおよびからの、運動または適用された力を伝達する付加的機能を果たす。
【０１０２】
所望であれば、バイオセンサは、各アッセイにおいてポリマーが固定されている微量検定法の形態であってよい。
【０１０３】
本発明の好ましいバイオセンサは、表面プラズモン共鳴バイオセンサである。
本発明のこの態様の好都合な形態は、光学バイオセンサを与え、光学バイオセンサの特に好都合な形態は、下記を含んで成る表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサである：（ｉ）基材、好ましくはガラス基材、（ｉｉ）金、銀または白金の層、好ましくは金の層、（ｉｉｉ）Ｓ−Ｘ成分によって金、銀または白金に結合した親水性ポリマー；および、式−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｒ１（ＸおよびＲ１は前記のように定義される）の側鎖を有する該ポリマー。
【０１０４】
本発明のこの態様の特に好都合な形態は、下記を含んで成るバイオセンサを与える：（ｉ）圧電基材、好ましくは石英基材、（ｉｉ）金、銀または白金の層、好ましくは金の層、（ｉｉｉ）Ｓ−Ｘ成分によって金、銀または白金に結合した親水性ポリマー；および、
式−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｒ１（ＸおよびＲ１は前記のように定義される）の側鎖を有する該ポリマー。
【０１０５】
本発明の他の特に好適なバイオセンサは、音響バイオセンサである。
使用において、分析すべき溶液は、生物学的源または他の源に由来しうる。例えば、体液、細胞抽出物、食品材料、科学試料等。そのような溶液は、化学物質、薬剤、ステロイド、組織、膜、膜フラグメント、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴ糖、細胞、ファージ、細菌、ウイルス、または特異的結合対のもう一方の構成員と特異的相互作用をすることができる基を含有する任意の他の構造物を、分析物として含有しうる。
【０１０６】
使用において、分析物は、粗調製物または部分精製調製物に存在しうる。分析物溶液は、所望であれば緩衝液で希釈してもよく、必要であれば食塩を含有してよい。従って、例えば、分析物を含有すると思われる源を、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌを含有するｐＨ７．４の燐酸緩衝生理食塩水で希釈してよい。
【０１０７】
分析物の結合相手を固定したバイオセンサに、分析物溶液を通すかまたは接触させてよい。分析物は、その結合相手に結合し、センサはその結合を測定する。測定が終了した後、解離によって分析物が除去されるまで、例えば水および／またはリン酸緩衝液で洗浄することによって、結合相手を再生しうる。
【０１０８】
そのような分析は、一般に、非極限温度、例えば周囲温度で行われる。
従って、本発明は、特異的結合対の構成員を分析する方法を提供し、該方法は下記を含んで成る：特異的結合対の構成員を含有すると思われる試料を、本発明のバイオセンサに接触させ（その場合、Ｒ１は特異的結合対のもう一方の構成員である）、バイオセンサからの信号の変化を記録する。
【０１０９】
どのような特定の理論にも縛られるものではないが、本発明における非荷電親水性ポリマーの使用は、既知の系、例えば、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシメチルデキストランのような高荷電ポリマーを使用した系において達成されるより完全であると考えられる層を、金属表面に生じることが、作業仮説として考えられる。そのような荷電ポリマーは、厚い高膨潤層を生じると考えられるが、該層は、金属表面の領域への非特異的結合物質の浸透を可能にするのに充分な多孔性であり、かつ、該層は、高バックグラウンドまたは擬似信号を生じる。非荷電親水性ポリマーの使用は、高膨潤でなく、非特異的結合を減少させ、かつ効果的に除去することができる完全度で表面を覆う層を与え、それによって、高バックグラウンドおよび擬似信号がかなり減少されるかまたは除去される。
【０１１０】
しかし、本発明は、文献１２に記載されている型の荷電基を有しうるポリマーを結合させる手段としても使用しうる。荷電基は、ｐＨのような結合条件を調節して、ポリマーの電荷と反対の電荷をリガンドに与えた場合に、前濃縮リガンド（ｐｒｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ）の機能を有する。本発明の好適なＸ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基を、ポリマーに組み込み（本明細書に記載のように）、次に、前濃縮条件を与えるように調節した条件下で、ポリマーを金属に固定しうる。荷電ポリマーに存在する反応性基は、残留Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基から誘導されたＸ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１基、ポリマーに既に結合されたＸ−Ｙ−Ｚ−Ｒ基を含んで成ってよく、または修飾前にポリマーに存在する他の基から生成してもよい。
【０１１１】
側鎖を与えるためにポリマーに結合される好適な中間体は、当分野で既知の方法によって生成できる。中間体を得る好適な方法について、文献３２〜４０を参照しうる。ポリマーがヒドロキシポリマーである場合、前記のように、かつ下記の実施例に示すように、該
ポリマーをｐ−ニトロフェニルカーボネート誘導体に変換しうる。次に、そのようなｐ−ニトロフェニルカーボネート誘導体化ポリマーを、アミンＮＨ２−Ｂ−Ｙ−Ｚ−Ｒ（Ｂ、Ｙ、ＺおよびＲは前記のように定義される）と反応させうる。
【０１１２】
そのような反応は、一般に、周囲温度または任意の冷却下に行われる。多くの場合、ＤＭＳＯのような非ヒドロキシであるが親水性の溶媒が使用される。
【０１１３】
アミンＮＨ２−Ｂ−Ｙ−Ｚ−Ｒは、ＮＨ２−Ｂ−Ｙ−Ｈと化合物Ｒ−Ｚ−Ｚ−Ｒとの反応等によって生成しうる。そのような反応は、ＺがＳである場合に特に適切である。
【０１１４】
混合チオスルホネート（ＲＳＯ２ＳＲ３）の生成は、既知の方法で行ってよい。例えば、Ｒ３−ハロゲンのようなハロゲン化アルキル（Ｒ３がアルキルである場合）を使用して、ＲＳＯ２ＳＮａまたはＲＳＯ２ＳＫをアルキル化しうる；同様に、これは、Ｒ３−ハロゲンのようなハロゲン化アリール（Ｒ３がアリールである場合）からも可能であり、ハロゲン化スルフェニルを生成し、それを使用して、ＲＳＯ２ＳＮａ、ＲＳＯ２ＳＺｎ等を誘導体化しうる。トリフルオロメチルチオスルホネートを使用して、直接反応によって、ＳＨ基含有化合物を誘導体化しうる。
【０１１５】
種々のアミノ置換チオスルホネートが既知である（例えば、文献３２および文献３３参照）。一般的な方法は、チオール、例えば、システインヒドロクロリドを使用し、これを、エタノールのような溶媒中で、周囲温度で撹拌しながら、トリフルオロメチルｐ−トルエンチオスルホネートと反応させて、メタンチオスルホン酸Ｓ−（２−アミノ−エチル）エステルを得る。この化合物は文献３３にも記載されている。ｐ−ニトロフェニルカーボネートデキストランと反応させるために、この化合物を使用することによって、−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＳＯ２−ＣＦ３側鎖を含有する化合物が得られる。
【０１１６】
文献３５〜３９のような当分野で既知の方法によって、任意のカルコゲニドに必要とされる中間体を得ることができる。従って、例えば、イソプロピルアルコール（２０ｍＬ）中の、セレナニル−、スルフィル−、テルリル−クロリド（１ｍｍｏｌ）、ｍ−ＣＰＢＡ（５ｍｍｏｌ）および１０％水酸化カリウム（２ｍＬ）を、室温で１時間撹拌しうる。その溶液を飽和チオ硫酸ナトリウム（１０ｍＬ）で希釈し、クロロホルム（２ｘ２０ｍＬ）で抽出しうる。合わした有機抽出物を、１０％水酸化ナトリウム（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、溶媒を減圧除去し、残渣をクロマトグラフィーによって精製しうる。
【０１１７】
次に、これらの官能中間体を、酸性条件下にアミノアルキルカルコゲニド、例えばシスタミンと反応させることによって、必要とされるアミノ−エステルに変化させることができる。または、適切に保護したアミノ基、例えばＦｍｏｃまたはＡｌｌｏｃ基を使用して、非プロトン溶媒中において２段階で、この手順を行うこともできる。
【０１１８】
不明確さを避けるために、本明細書において、適切な、好適な、好都合な、好ましい等として記載されている特徴は、特に規定しない限り、単独で、または本明細書に記載されている任意の他の特徴と組み合わせて、本発明に使用しうることを、ここに明確に記載する。
【実施例】
【０１１９】
例示的実施例によって、および添付の図面を参照して、本発明をさらに説明する。
実施例
下記の実施例において、シスタミンジスルフィドおよび酸二硫化物に関する実施例は、単に比較を目的とするものである。
【０１２０】
活性脱離基ポリマーの合成が、図１に概略的に示されている。
中間体１
２−（ピリジニルジチオ）エタンアミン（ＰＤＥＡ）の合成
アルリチオール−２（４．４１ｇ、２０ｍｍｏｌ）を、メタノール２０ｍＬおよび酢酸０．８ｍＬに溶解させた。その溶液に、メタノール１０ｍＬ中の２−アミノエタンチオールヒドロクロリド（１．１４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２日間撹拌し、次に、真空濃縮して、黄色油状物を得た。次に、ジエチルエーテルを用いた激しい撹拌によって、黄色油状物を充分に洗浄した。透明黄色上澄みをデカンテーションによって除去し、残渣をメタノール（１０ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液に、エーテル５０ｍＬを添加し、沈殿物を濾過によって分離した。この手順を３回繰り返し、次に、得られた最終固形物を再結晶（メタノール／ジエチルエーテル）によって精製して、淡白色固形物（１．６２ｇ）を得た。
【０１２１】
中間体２
４−ニトロフェニル炭酸化デキストラン（参照番号：ＡＫＵ３４−１０３）
無水ＤＭＳＯ  １８ｍＬおよび無水ピリジン１６ｍＬ中の、デキストラン  Ｔ７０（１．６ｇ、２９．６ｍｍｏｌ  ＯＨ）の溶液に、４−ニトロフェニルクロロホルメート（８００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−４−ピリジン）を、０℃（外部冷却浴）で撹拌しながら添加した。反応混合物を、この温度で１時間、次に、室温でさらに１時間撹拌した。溶液を、メタノールおよびエーテルの混合物（１：１）（１５０ｍＬ）に、激しく撹拌しながらゆっくり添加した。形成された沈殿物を濾過によって収集し、同じ溶媒混合物で３回洗浄した。収集した白色固形物を高真空下で乾燥して、白色粉末１．５４ｇを得た。
【０１２２】
４−ニトロフェノール（１４．３ｍｇ）および４−ニトロフェニル炭酸化デキストランＡＫＵ３４−１０３（２２．３ｍｇ）を、ｄ６−ＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させた。
1H NMR (400MHz, d6-DMSO) (v52372): δH 6.90(2H of 4-nitrophenol, δH, 7.54(2H of
AKU34-103, δH, 8.08(2H of 4-nitrophenol, δH, 8.30(2H of AKU34-103, Functionality degree: 6.6% (mol, glucose unit).
反応混合物を種々の温度で撹拌し、または反応物の濃度を変化させ、種々の誘導体化度を下記のように得た。
【０１２３】
【表１】
2008512540.tif 000003
【０１２４】
比較例１
デキストラン−シスタミンジスルフィド（参照番号：ＡＫＵ３４−１０７）
無水ＤＭＳＯ  １２ｍＬおよび無水ピリジン３ｍＬ中の、４−ニトロフェニル炭酸化デキストランＡＫＵ３４−１０３（７５０ｍｇ）の溶液に、ＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）（２００Ｌ）およびシスタミンジヒドロクロリド（１ｇ、８．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、次に、メタノールおよびエーテルの混合物（１：１）（７５ｍＬ）に、激しく撹拌しながら添加した。形成された沈殿物を濾過によって収集し、同じ混合物で３回洗浄した。収集した白色固形物を、高真空下でさらに乾燥させて、白色粉末５３０ｍｇを得た。官能性度：６．６％
比較例２
デキストラン−酸二硫化物（デキストラン  Ｔ７０）の製造
デキストラン−酸二硫化物（参照番号：ＡＫＵ３４−１１８）
無水ＤＭＳＯ  １２ｍＬ中のデキストラン−ＰＤＥＡジスルフィド  ＡＫＵ３４−１１０（５００ｍｇ）の溶液に、３−メルカプトプロピオン酸（２００μＬ、２．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、次に、メタノールおよびエーテルの混合物（１：１）（５０ｍＬ）に、激しく撹拌しながらゆっくり添加した。形成された沈殿物を濾過によって収集し、同じ混合物で３回洗浄した。収集した白色固形物を高真空下に乾燥させて、白色粉末４５０ｍｇを得た。官能性度１０．５％
実施例１
デキストラン−ＰＤＥＡジスルフィド（デキストラン  Ｔ７０）の製造
４−ニトロフェニル炭酸化デキストラン（参照番号：ＡＫＵ３４−１０６）
無水ＤＭＳＯ  １８ｍＬおよび無水ピリジン１６ｍＬ中の、デキストラン  Ｔ７０（１．６ｇ、２９．６ｍｍｏｌ  ＯＨ）の溶液に、４−ニトロフェニルクロロホルメート（８００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰを、撹拌および外部冷却浴（０℃）下で添加した。反応混合物をこの温度で５時間撹拌した。溶液を、メタノールおよびエーテルの混合物（１：１）（１５０ｍＬ）に、激しく撹拌しながらゆっくり添加した。形成された沈殿物を濾過によって収集し、同じ溶媒混合物で３回洗浄した。収集した白色固形物を高真空下に乾燥させて、白色粉末１．５７ｇを得た。
【０１２５】
４−ニトロフェノール（１１．６ｍｇ）および４−ニトロフェニル炭酸化デキストランＡＫＵ３４−１０６（２５．９ｍｇ）を、ｄ６−ＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させた。
1H NMR (400MHz, (d6-DMSO) (v52603): δH 6.90(2H of 4-nitrophenol, d), 7.54(2H of
AKU34-106, d), 8.08(2H of 4-nitrophenol, d), 8.30(2H of AKU34-106, d). Functionality degree: 10.5% (mol, glucose unit).
合成を２回繰り返して、極めて類似した結果を得た。第二合成の生成物はＡＫＵ３４−１７５と称し、第三合成の生成物はＮｏ．１１０１０５と称した。
【０１２６】
デキストラン−ＰＤＥＡジスルフィド（参照番号：ＡＫＵ３４−１１０）
無水ＤＭＳＯ  ２０ｍＬおよび無水ピリジン６ｍＬ中の、４−ニトロフェニル炭酸化デキストランＡＫＵ３４−１０６（１．５７ｇ）の溶液に、ＮＭＭ（４０μＬ）およびＰＤＥＡ（２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−エチルアミン）（６４０ｍｇ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、次に、メタノールおよびエーテルの混合物（１：１）（１５０ｍＬ）に、激しく撹拌しながらゆっくり添加した。形成された沈殿物を濾過によって収集し、同じ混合物で３回洗浄した。収集した白色固形物を、高真空下に乾燥させて、白色粉末１ｇを得た。
1H NMR (400MHz, d6-DMSO) (v52718): δH .7.21 (IH, t), 7.42 (IH, br), 7.75 (IH, d), 7.81 (IH, t), 8.43 (IH, d). Functionality degree; 10.5% .
この合成を同じ条件下で繰り返し、同様の結果を得た。第二合成の生成物を、ＡＫＵ３４−１７８とした。
【０１２７】
デキストラン−ＣＯＯＨ−ＰＤＥＡジスルフィド（デキストランＴ７０）の製造
カルボキシメチルデキストラン（４２８０１５）
デキストランＴ７０（約１０ｍｍｏｌグルコース単位）１．６ｇを、４Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（２５ｍＬ）（水２５ｍＬ中の４ｇ  ＮａＯＨ）に溶解させた。これに、水２０ｍＬ中のＭＣＡ（モノクロロ酢酸、７．５６ｇ）およびＮａ２ＣＯ３（４．２４ｇ）の溶液を添加した。得られた溶液を９０〜１００℃で３時間撹拌した。次に、それを、氷水での冷却浴下に、濃ＨＣｌ水溶液でｐＨ３．０に酸性化し、ｐＨ７．０になるまで蒸留水に対する透析によって精製し、凍結乾燥によって乾燥させて、白色綿毛状固形物を得た。
【０１２８】
官能性度＝０．６４（官能性度は、非置換グルコースにおける全ＯＨの置換ＣＯＯＨの％である）。ＩＲ：  １７３３．７ｃｍ−１、１６３５．４ｃｍ−１。
【０１２９】
デキストラン−ＣＯＯＨ−ＰＤＥＡ（４２８０１８）
デキストランＴ７０−ＣＯＯＨ（４２８０１５、Ｄ．Ｓ．  ０．６４）５００ｍｇを、無水ＤＭＳＯ  １６ｍＬに６０℃で溶解させた。次に、得られた透明溶液を、室温に冷却し、その溶液に、ＨＯＢｔ（２．５ｍｍｏｌ）３８３ｍｇおよびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）０．７８ｍＬを添加した。混合物を室温で１０分間撹拌し、次に、ピリジン３ｍＬおよびＰＤＥＡ  ０．５５ｇを添加した。得られた混合物を、室温で一晩撹拌した。次に、それをアセトン５０ｍＬに滴下した。得られた混合物に、エーテル２０ｍＬおよび石油エーテル２００ｍＬを添加した。次に、得られた沈殿物を濾過によって収集し、アセトンで５回洗浄し、高真空下に乾燥させて黄色粉末５０８．３ｍｇを得た。
【０１３０】
下記のように、ピリジニル基／デキストランに関するＮＭＲデータを得た：
1H NMR (300 MHz, D2O) δH 8.41 (IH, br), 7.81 (2H, br), 7.30 (IH, br). Microanalysis (%): N = 3.7 and 3.7, functionality: 1.32mmol/g.
【０１３１】
デキストラン−チオスルホン（デキストランＴ７０）の製造
メタンチオスルホン酸ナトリウム（参照番号：４２８０２８）
メタノール（６０ｍＬ）中の、ナトリウムメタンスルホネート（１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）および硫黄（３１２ｍｇ、９．７５ｍｍｏｌ）の混合物を、全ての硫黄が溶解するまで３時間にわたって還流させながら加熱した。次に、混合物を濾過し、濾液を真空濃縮して乾燥させて、白色固形物を得た。
1H NMR (300 MHz, D2O) H 3.375(3H, s) IR: 1322.9 cm-1, 1201.5 cm-1, 1097.3 cm-1, 977.7 cm-1, 769.3 cm-1
【０１３２】
Ｓ−（２−アミノエチル）メタンチオスルホネートヒドロブロミド（参照番号：４２８０３１）
メタンチオスルホン酸ナトリウム（４２８０２８）２ｇ（１５ｍｍｏｌ）および２−ブロモエチルアミンヒドロブロミド２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、メタノール５０ｍＬに溶解させた。次に、得られた溶液を、３時間還流させ、真空濃縮して乾燥させた。残渣をアセトニトリル３０ｍＬに懸濁させ、沈殿物を濾過によって除去した。濾液を真空濃縮して、黄色粘着性油状物を得た。残渣に、アセトニトリルおよびジエチルエーテルの混合物（２．５ｍＬ／２．５ｍＬ）を添加し、混合物を、一晩、激しく撹拌して、黄色ペースト状固形物を得た。残留液体を流し、固形物を前記の溶媒混合物（２．５ｍＬ／２．５ｍＬ）に懸濁させ、すりつぶした。混合物を濾過し、固形物を、前記の溶媒混合物、およびエーテルで洗浄し、灰色がかった白色の固形物を得、Ｐ２Ｏ５を使用して真空乾燥して、粉末１．４５ｇを得た。
1H NMR (300 MHz, D2O) H 3.497 (5H, m), 3.371 (2H, t, J = 17), 4.240 (2H, br) 13C
NMR (300 MHz, D2O) C 50.994 (CH3), 41.016 (CH2), 34.149 (CH2) IR: 1309.4 cm-1, 
1132.0 cm-1
【０１３３】
メタンチオスルホン化デキストランＴ７０（参照番号：４２８０３４）
４−ニトロフェニル炭酸化デキストランＴ７０（１１０１０５、１３．２５％）６００ｍｇを、ＤＭＳＯ  １２ｍＬおよびピリジン３ｍＬに溶解させた。この溶液に、ＮＭＭ  ２００μＬおよびＳ−（２−アミノエチル）メタンチオスルホネートヒドロブロミド３００ｍｇを添加した。得られた溶液を、室温で一晩撹拌し、メタノールおよびエーテルの溶媒混合物（１：１）（７５ｍＬ）に沈殿させ、沈殿物を濾過によって収集し、同じ溶媒で３回洗浄し、高真空下に乾燥させて、白色粉末を得た。
微量分析（％）：  Ｎ＝０．６６および０．７９、Ｓ＝４．００および４．１０
官能性：  ０．５８ｍｍｏｌ／ｇ
【０１３４】
ポリマーの保存および製造
全てのポリマーを、窒素下に−２０℃で、凍結乾燥粉末として保存した。超純水中のポリマーの０．１〜２％ｗ／ｖ溶液を、目視的に透明になるまで室温で緩やかに振とうすることによって作製し、次に、Ｇｅｎｏｆｕｇｅ  １６Ｍ  ベンチトップ遠心器によって１４０００ｒｐｍで遠心分離して、あらゆる不溶質を沈殿させた。次に、上澄みをピペットで注意深く除去し、使用するまで４℃で保存した。
【０１３５】
実施例２
タンパク質および試薬
抗−ＨＳＡおよび抗−ＢＳＡマウスモノクローナル抗体（ＡｂＣａｍ、ＵＫ）を、１ｍｇ／ｍＬ（約、１．５μＭ）で４℃において保存し、次に、後の結合アッセイ用に、流れ緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で３３３ｎＭに希釈した。バイオラドタンパク質アッセイ染料試薬を使用するブラッドフォード法によって、タンパク質濃度を測定した。タンパク質純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した。トリトンＸ−１００、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、システイン、グリシン、ジチオトレイトール、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩酸、複合緩衝剤（１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝剤  ｐＨ４．５、１００ｍＭ  蟻酸緩衝剤  ｐＨ４．３、および１００ｍＭ  ホウ酸緩衝剤  ｐＨ８．５）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫから購入し、その関連溶液は、使用前に０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０１３６】
金表面の作製
２番コーニングガラススライドを、チタン接着層、次に、４７ｎｍの金層で、Ｓｈｏｗａ  ｅ−ビーム蒸発器において被覆した。そのガラススライドを、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ（Ｂｉａｃｏｒｅ，  ＵＫ）に挿入するのに好適なプラスチックホルダーに取り付けた。ｅ−ビーム蒸発器（Ｓｈｏｗａ）において蒸着によって１．５ｎｍチタン接着層および４７ｎｍ金層で被覆したＡＦ  ４５、０．３０ｍｍ厚ガラススライド（Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ，Ｃａｍｂ．  ＵＫ）を使用して、ＳＰＲガラスチップブランクを作製した。作製したセンサチップは、各フローセルにつき約０．２６ｍｍ２のＳＰＲ信号用プロービングスポットを有する装置中に、寸法２．４  ×  ０．５  ×  ０．０５ｍｍ（ｌ  ×  ｗ  ×  ｈ）の４つのフローセルを形成した。全てのＳＰＲ実験を、２５℃において０．５秒毎のデータ点で行った。
【０１３７】
ポリマーの付着−ＳＰＲ
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００バイオセンサシステムに超純水を通し（ｐｒｉｍｅｄ）、次に、１００ｍＭ  ＮａＯＨ／１％  トリトンＸ−１００の溶液４０μＬを流速１０Ｌ／分で注入）することによって、金チップの表面を清浄化した。各注入の間において、流れ溶離剤は超純水であった。この注入後直ぐに、活性脱離基ポリマーの溶液５０μＬを５μＬ／分で注入した。これによって、装置において得られる最大流速（１００μ／
分）までの水の連続流動下に、安定な反応レベルを生じた。典型的な結果を図３に示し、該図は、時間（秒）に対する振動数（ｄＦ、Ｈｚ）の変化のグラフである。非化学吸着物質は、１００ｍＭ  ＮａＯＨのパルスで除去することができ、それによって極めて安定なＳＰＲ信号が得られ、該信号は、１００ｍＮ  ＮａＯＨ、１００ｍＭ  ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  Ｌ−システインのいずれの付加的注入によっても影響を受けなかった。ＰＤＥＡ−ポリマーについて、反応は、表面に結合したポリマー約３５００ＲＵ（約３．５ｎｇ／ｍｍ２に対応する）のオーダーであり、チオスルホンポリマー（下記の実施例１１〜１３）については、反応は、表面に結合したポリマー約２２００ＲＵ（約２．２ｎｇ／ｍｍ２）のオーダーであった。
【０１３８】
実施例３
ＰＤＥＡ−ポリマーへのタンパク質の結合−ＳＰＲ
タンパク質スルヒドリル基への直接結合：  １００ｍＭ  ホウ酸緩衝液／１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５中に構成したヒト血清アルブミンの溶液（５０μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を、ポリマーを付着させた面に注入し、それによってタンパク質１０００〜２０００ＲＵを固定させた。次に、１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液  ｐＨ８．５中の５０ｍＭ  システイン（５０μＬ）の注入によって、残留活性ジスルフィド基を不活性化（キャッピング）した。典型的な結果を図４に示し、該図は、時間（秒）に対するｄＦ（Ｈｚ）のグラフである。
【０１３９】
類似の方法において、対照タンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００バイオセンサ中の異なるフローセルに固定した。
ＳＰＤＰを介するアミン結合：
１．  ＤＴＴでの還元
２．  ＳＰＤＰでの活性化
３．  ｐＨ７．０でのタンパク質の結合
４．  エタノールアミンでのキャッピング
【０１４０】
実施例４
市販ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭ５表面へのタンパク質の結合−ＳＰＲ
同量のＮＨＳ（５０μＬ、水中５０ｍＭ）およびＥＤＣ（５０μＬ、水中２００ｍＭ）を混合し、次に、この溶液５０μＬを１０μ／分でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭ５  カルボキシメチルデキストランセンサーチップに注入した。このあと直ぐに、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液、ｐＨ４．５中のＨＳＡ（５０μＬ、５０μｇ／ｍＬ）を注入し、それによって、タンパク質約８０００ＲＵを固定させた。次に、残留ＮＨＳエステルを、エタノールアミン（５０μＬ、１Ｍ、ｐＨ８．０）の注入によって不活性化した。
【０１４１】
実施例５
ポリマー捕捉タンパク質受容体への抗体の結合−ＳＰＲ
マウス抗−ＨＳＡ  ＩｇＧを、流れ緩衝液（ＰＢＳ：  １０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）において、３３３〜４．１ｎＭに３倍希釈し、次に、流速２０μ／分で、固定ＢＳＡ含有フローセル、次に、固定ＨＳＡ含有フローセルに連続的に通した。ＩｇＧの５分間注入および固定アルブミン約１５００ＲＵを使用して、カイネテッィクアッセイを行った。次に、試料溶液を流れ緩衝液と置き換え、抗体−リガンド複合体を５分間解離させた。遊離タンパク質受容体の再生は、塩溶液（５μＬ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．０）の注入によって行った。
【０１４２】
先ず、非誘導体化フローセル、次に、固定ＢＳＡを含有するフローセル、次に、固定ＨＳＡを含有するフローセルに抗体を通して、市販ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭ５センサチップでの比較実験を前記のように行った。全てのアッセイを２５℃で行った。
【０１４３】
ポリマー表面の非特異的結合特性を、非関連分析物またはマトリックスの注入によって分析した。これは一般に、抗ＢＳＡモノクローナル抗体（１００μＬ、ＰＢＳ中５０μｇ／分、２０μＬ／分）、ウサギ−抗マウスポリクローナル抗体（１００μＬ、ＢＰＳ中５０μｇ／分、２０μＬ／分）または全（非希釈）ヒト血清（１００μＬ、２０μＬ／分）であった。
【０１４４】
応答単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔｓ）で示されるＳＰＲ角の変化は、センサチップ表面のすぐ近くの物質の量に比例する。分析物の溶液が表面上を通る際に、得られた結合曲線の分析から、結合事象の親和力および反応速度を算出することができる。典型的な結果が図５に示され、該図は、時間（秒）に対する応答（ＲＵ）のグラフである。ＳＰＲデータは、注入の２０秒前に記録された平均応答を引き、各注入の時間をゼロに調節することによって、分析用に準備された。ＢＳＡだけを含有するフローセルからのデータを、ＨＳＡ含有フローセルから得た対応するデータから引いて、バルク（ｂｕｌｋ）屈折率変化およびドリフト効果について補正した。数値積分のためのアルゴリズムに基づくＢＩＡｅｖａｌ  ３．０グローバルアナリシスソフトウエアを使用して、分析を行った。簡単な生体分子モデル、Ａ＋Ｂ＝ＡＢに関して、該方法は、分離受容体分子間の相互作用のない擬一次（ｐｓｅｕｄｏ  ｆｉｒｓｔ  ｏｒｄｅｒ）であると推測された。結果を、下記の表２に要約する。表において、Ｒｍａｘは、分析物が実質的過剰で存在した場合に生じうる最大信号に対応する適合パラメータである。これらの条件下で実際に実験が行われなかったので、表２におけるＲｍａｘ値は、図５に示されるプロットによって得られない。むしろ、プロットは、分析物濃度の関数であるＲｅｑに近い。
【０１４５】
【表２】
2008512540.tif 000004
【０１４６】
実施例６
水晶共鳴検出器
水晶実験を、下記のような機器で行った。基材にエッチングされた２つの共鳴器を有するメサ構造を有するＡＴカット水晶を、従来の蒸発法によってチタン付着層（５ｎｍ）および金（２００ｎｍ）で被覆した。該検出を、図６に模式的に示す。
【０１４７】
センサ基材を、温度調節した（２５℃）フローセルに入れ、該フローセルは、コンピュータ制御シリンジポンプ（２、４）（１つ（２）は緩衝液用、もう１つ（４）は試料用）を使用して液体の送達および除去を可能にするミクロ流体工学ポリジメチルシロキサン（
ＰＤＭＳ）インサートを有する。インサートは、取替え可能であり、２つのバージョンを有し、該バージョンを使用して、２つの検出器に、別々に（６）、または共通に（８）、溶液中の試薬を送達しうる。多方向Ｒｈｅｏｄｙｎｅバルブ（１０）を使用して、緩衝液または試薬をセンサに供給する。緩衝液および試料マクロ流体工学（ｍａｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）システムは、２つのハミルトンシリンジポンプユニット、１対のＹコネクタ（１２、１４）、分離空気圧縮（または「サンパー」（‘ｔｈｕｍｐｅｒ’））バルブ（１６）、試料装填／注入多方向バルブ（１０）およびフローセルセンサセレクタバルブ（１８）を有する。緩衝液ポンプユニット上の２つのシリンジ（一般に、５００μＬガラスシリンジ）は、交互に吐出して、一定の緩衝液流れを維持する。試料ポンプ（４）は、注入すべき試料を試料ループに引き込み、次に、流れ緩衝液の分岐によって試料ループを通って注入するための、１つの５ｍＬシリンジを有する。
【０１４８】
多方向バルブ（１０）を使用して、緩衝液流れを直接的にフローセルセレクタバルブ向けるか、または試料ループによって迂回させて、先に装填された試料をフローセルセンサセレクタバルブ（１８）に進ませる。
【０１４９】
ネートワーク・アナライザを使用して、約１３．９ＭＨｚの共鳴振動数を含む振動数範囲で、ドュアル水晶センサを順次に励振する。センサのインピーダンスを振動数の関数として測定し、インピーダンス対振動数データをセンサの同等回路モデルに適合させることによって、共鳴振動数を求める。振動数シフトを、１０Ｈｚのサンプリングレートでリアルタイムでモニターする。
【０１５０】
ポリマーの付着
下記の実施例において、先ず、シングルセルアドレッシングによって２つのセンサを共にポリマーで被覆した。被覆の終了後、センサを緩衝液で充分に洗浄して、遊離ＰＤＭＡの全痕跡を除去し、次に、セルに再配置した。
【０１５１】
タンパク質の付着
次に、セルを個々に、ＨＳＡで処理して特異的結合対の第一構成員（第二構成員はＨＳＡに対する抗体である）を担持する表面を形成し、ＢＳＡで処理して対照表面を形成した。ＨＳＡへの抗ＨＳＡの固定化を測定するために、次に、２つのセンサを再びシングルアドレッシングモードで使用し、抗ＨＳＡ溶液を両センサ上に流した。試料および対照チャンネルについて、リアルタイムの振動数の変化を記録した。種々の濃度の抗ＨＳＡ分析物を使用して、試験を繰り返した。試料センサの振動数シフトを、対照センサのバックグラウンドシフトに関して補正し、この補正値を、攻撃された抗ＨＳＡの量と見なした。分析を下記のように行った。
【０１５２】
共鳴器に、流速１２０μＬ／分で一定流量のＭｉｌｌｉ  Ｑ超純水を通し、次に、１００ｍＮ  ＮａＯＨ／１％トリトンＸ−１００の溶液の２×５分間注入で清浄化した。この注入後すぐに、共鳴器を、水中のデキストランＴ７０−ＰＤＥＡ（１５％−ＡＫＵ３４−１７８）の１％ｗ／ｖ溶液の２×７分間注入、次に、２Ｍ  ＮａＯＨ（１５ｍＬ）中のブロモ酢酸（１．７５ｇ）の溶液の２×３０分間注入に曝露して、文献４０の手順によって、ポリマー上のヒドロキシル基をカルボキシメチル基に変換した。
【０１５３】
次に、得られた修飾ポリマーを、ＮＨＳ（５０ｍＭ）と混合したＥＤＣ（２００ｍＭ）の溶液の５分間注入によって活性化し、次に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、１ｍｇ／ｍＬ  １０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液、ｐＨ４．５）の溶液に曝露した。次に、残留活性化ＮＨＳエステルを、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５の４分間注入によってキャッピングした。
【０１５４】
【表３】
2008512540.tif 000005
【０１５５】
比較例１および２ならびに実施例１の方法によって適用した場合、金表面に結合したポリマーの量は、脱離基の種類によって変化した。−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＳＲ２（Ｒ２は、２−ピリジルであった）、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２ＨまたはＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２によって誘導体化されたヒドロキシ基６％を有するＴ７０デキストランを使用した場合、２−ｐｙ脱離基の使用は、ＳＰＲによって測定して約２７００ｐｇ／ｍｍ２の付着を生じ、他の２つの脱離基は、約１２００ｐｇ／ｍｍ２の付着（市販ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００  ＳＰＲバイオセンサへの付着）を生じたことが分かった。ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＳ−２−Ｐｙ側鎖でのデキストランＴ７０の誘導体化を１０％および１５％に増加させることによって、付着をそれぞれ３５００ｐｇ／ｍｍ２および５０００ｐｇ／ｍｍ２に増加させた。デキストランＴ５００を側鎖−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＳＲ２で５％に誘導体化した場合、Ｒ２が２−ｐｙの場合の付着は約２５００ｐｇ／ｍｍ２であり、Ｒ２がＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の場合は約２５０ｐｇ／ｍｍ２であった。
【０１５６】
２個のＯリングの間に水晶を締め付けることによって形成したフローセル中で、デキストラン  Ｔ７０  ＰＤＥＡ（６％置換、水中０．１〜２％ｗ／ｖ）を、１４．３ＭＨｚで振動している金石英共鳴器にｔ＝１０分〜ｔ＝１７分注入した。ネットワーク・アナライザを使用して、信号を測定した。金表面へのポリマーの付着により、約８００Ｈｚの振動数変化が観測された。
【０１５７】
ＳＰＲ実験において、Ｔ７０上ＰＤＥＡの類似層は、約３９００ＲＵの応答を生じることが分かった。この信号は、１００ｍＭ  ＮａＯＨでの洗浄時に約８００ＲＵに減少したが、その後、１００ｍＭ  ＮａＯＨ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭシステインおよび１ｎＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）での洗浄に安定であった。これは、ポリマーが金属に有効に結合されたことを示す。
【０１５８】
ＳＰＲセンサ上の金への、Ｔ７０  ＰＤＥＡおよびＴ５００  ＰＤＥＡの負荷を、リアルタイムで測定し、Ｔ１０プロピオン酸およびＴ７０プロピオン酸類似体と比較した。それらのポリマーは、ＰＤＥＡ誘導体化ポリマーを使用して生じた結合が、酸誘導体化ポリマーを使用して生じた結合の約２．５〜３倍であることを示す信号を生じた。Ｔ５００  ＰＤＥＡポリマーは、１００ｍＭ  ＮａＯＨおよびトリトンＸ−１００での洗浄に対して特に安定であった。
【０１５９】
流速１０μＬ／ｍＬで５分間にわたる非希釈ヒト血清での処理に対する、Ｔ１０−プロピオン酸、Ｔ７０−プロピオン酸、Ｔ５００−ＰＤＥＡおよびＴ７０−ＰＤＥＡのＳＰＲ応答を測定した。非特異的付着は、それぞれ、約１９００、１５００、６００および１５０ＲＵであった。
【０１６０】
２種類のポリマー（６％および１５％  デキストランＴ７０  ＰＤＥＡ）に固定したＢＳＡまたはＨＳＡに対する、１１１ｎＭにおける抗ＨＳＡマウスモノクローナル抗体の結合の、ＳＰＲ応答を測定した。５分〜１０分において、約６００ＲＵおよび８００ＲＵの安定した数値が、固定ＨＳＡを有する６％および１５％ポリマーにおいて得られた。固定ＢＳＡを有するポリマーにおいては、基準線からの変化が観測されなかった。１０．２分後、表面を、１０ｍＭグリシン  ｐＨ２．０での処理によって再生し、正信号をゼロに戻した。このサイクルの１０回の繰り返しは、変動をほとんどまたは全く示さず、システムの優れた安定性を示した。
【０１６１】
ＳＰＲバイオセンサの金上のデキストランＴ７０  ＰＤＥＡに固定されたＨＳＡを、３３３〜４．１ｎＭの系列３倍希釈における抗ＨＳＡモノクローナル抗体に曝露した。５〜１０分における結果は、約４１０、３２０、２１０および７５ＲＵであり、未知濃度の抗体の分析を可能にする較正曲線の作成を可能にした。
【０１６２】
実施例７：  ＳＰＲによる小分子の検出
１５％ＰＤＥＡ置換デキストラン表面（ＡＫＵ３４−１７８）を、下記のように、ビアコアチップ上に作製した。
【０１６３】
Ａｕ  ＳＰＲチップを、プラズマアッシングでの処理（アルゴンプラズマ、５Ｐａ、１００Ｗ、１５秒）によって清浄化した。プラズマアッシングの後すぐに、チップを、湿潤環境において室温で、ＳＰＲチップを覆って注意深く配置した水（表面張力によって保持）中の１％  ｗ／ｖ  ＡＫＵ３４−１７８（−８０℃の冷凍庫からの新鮮アリコート）中で、インキュベーションした。
【０１６４】
１８時間後、チップを水で徹底的に濯ぎ、次に、２Ｍ  ＮａＯＨ  １３．５ｍＬ中のブロモ酢酸１．７５ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）の溶液に２０時間浸した。ブロモ酢酸での処理によって、デキストランポリマーのヒドロキシル基を反応性ＣＯＯＨ基に変換し、次に、該基を特異的結合対の構成員（例えば、抗体）に共役させることができる。この処理の後、再び、チップを超純水、次に分光学的等級のエタノール、次に再び水で、徹底的に洗浄した。洗浄後、チップを、窒素の流れ下に送風乾燥し、「両面粘着テープ」でビアコアプラスチックカセットに取り付けた。カセットを、再び窒素下に送風乾燥し、次に、必要とされるまで、５０ｍＬのファルコン試験管中でアルゴン下に室温で保存した。
【０１６５】
ポリマー処理表面を有する４つのフローセルを準備した。フローセル（ＦＣ）１、２および３は全て、ＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭ／５０ｍＭ）への７分間の曝露によって活性化した。ＦＣ３だけは、次に、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液  ｐＨ４．５中の５０μｇ／ｍＬのマウス抗ビオチンＩｇＧで７分間処理した。ＦＣ２だけは、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液  ｐＨ４．５中の５０μｇ／ｍＬの無関連マウスモノクローナルＩｇＧに結合させた（７分間曝露）。ＦＣ１、２、３は、エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）での５分間の処理によってキャッピングした。ＦＣ４は、無処理ポリマーを有していた。
【０１６６】
【表４】
2008512540.tif 000006
【０１６７】
図７におけるプロットは、各表面の処理におけるこれらの固定化段階についての、時間（秒）に対する応答（任意の応答単位）のグラフを示す。
【０１６８】
次に、濃度１０μＭのビオチンを、４つの全ての表面に通した。ＦＣ３における抗ビオチン表面、およびＦＣ４の非誘導体化対照表面の、ビオチンの結合に対する応答を、図８に示す。
【０１６９】
実施例８：  ＱＣＲＳによる小分子の検出
１５％ＰＤＥＡ置換デキストラン表面（ＡＫＵ  ３４−１７８）を、前記のように作製し、残留ＰＤＥＡ基をキャッピングし、実施例７のようにデキストラン上のＯＨ基をＣＯＯＨ反応性基に変換した。表面をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化し、カルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）に曝露した。ＣＯＯＨとＣＡＩＩのアミン基との間に反応が起き、攻撃タンパク質による１８００Ｈｚの振動数シフトが生じた。対照表面を活性化し、エタノールアミンでキャッピングした。表面作製の典型的結果を、図９に示し、該図は、時間（秒）に対する振動数変化（Ｈｚ）のグラフである。
【０１７０】
次に、ＣＡＩＩ表面を使用して、４−カルボキシベンゼンスルホンアミド（流れＰＢＳＳ緩衝液＋０．２５％ＭｅＯＨ中のＣＢＳ２５μｍ）を捕捉した。６Ｈｚの振動数シフトを生じるのに充分な、表面への物質（ｍａｓｓ）の付着が観察された。典型的な結果を図１０（時間（秒）に対する振動数変化（Ｈｚ）のグラフ）に示す。
【０１７１】
同じＣＡＩＩ表面を使用して、１２．５μＭ  ４−カルボキシベンゼンスルホンアミド、および１２．５μＭ  ５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホンアミドを検出した。それぞれ２．５Ｈｚおよび１．２Ｈｚのシフトを、信号対雑音比  約１０で観測した。
【０１７２】
実施例９：  ＳＰＲによるタンパク質の検出
実施例７に記載した表面を、１０μｇ／ｍＬ  ビオチン化ＢＳＡに曝露し、結合を図１１に示し、該図は、時間（秒）に対する応答（任意の応答単位）のグラフである。この場合、フローセル（ＦＣ）３は、マウス抗ビオチンＩｇＧへのビオチン化ＢＳＡの結合を示し、ＦＣ２は、マウスＩｇＧ対照表面への非特異的結合を示し、ＦＣ１は、キャッピングしたポリマーへの結合を示し、ＦＣ４は、遊離ポリマーへの結合を示す。
【０１７３】
実施例１０：  ＳＰＲによるタンパク質の検出
実施例７と同じ手順を使用して、デキストランＴ７０−ＣＯＯＨ−ＰＤＥＡ（４２８０１８）を付着させ、マウス抗ビオチンＩｇＧを固定化した。固定化の測定値を図１２に示
し、該図も時間（秒）に対する応答（ＲＵ）のグラフである。
【０１７４】
次に、表面を１０μｇ／ｍＬ  ビオチン化ＢＳＡに曝露し、結合を図１３に示す。特異的結合がＦＣ３において生じ、最少非特異的結合がＦＣ１、２および４に示されている。
【０１７５】
実施例１１：  チオスルホンポリマーの付着−ＳＰＲ
タンパク質、試薬、ＳＰＲ分析に好適な金表面、および抗体を、実施例２と同様に準備した。代替脱離基ポリマー、デキストラン−Ｔ７０チオスルホン（実施例１からの４２８０３４）を、１ｍｇ／ｍＬ溶液として調製し、実施例２に記載のようにＳＰＲセンサチップの金表面に付着させた。この結果、２２００ＲＵ（表面に結合した約２．２ｎｇ／ｍｍ２ポリマーに対応する）のオーダーで付着を生じた。このポリマーの二重注入によって、図１４（時間（秒）に対するＲＵ）に示す結果を得た。
【０１７６】
実施例１２：  チオスルホンポリマーへのタンパク質の結合−ＳＰＲ
実施例１１のチオスルホンポリマーで被覆した（４２８０３４）金表面に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、実施例３に記載のように結合させた。該タンパク質は、それらのスルフヒドリル基を介してチオスルホンに直接的に結合し、その結果を図１５（時間に対するＲＵのグラフ）に示す。
【０１７７】
実施例１３：  チオスルホンポリマー上のタンパク質捕捉タンパク質受容体への、抗体の結合−ＳＰＲ
抗ＨＳＡ  ＩｇＧを準備し、希釈し、次に、実施例５に記載の方法を使用して、実施例１２の両タンパク質結合ポリマー表面に通し、但し、遊離タンパク質受容体の再生を１０ｍＭ  ＨＣｌの溶液（５ｍＬ、４０ｍＬ／分）の注入によって行った。さらに、対照抗体、正常マウスＩｇＧを、１１１ｎＭの濃度で両表面に注入した。図１６（時間に対するＲＵのグラフ）は、曲線Ａにおいて、ＨＳＡ表面への抗ＨＳＡの結合；曲線Ｂにおいて、ＢＳＡ表面への抗ＨＳＡの結合；曲線Ｃにおいて、ＨＳＡ表面への抗マウスＩｇＧの結合；および、曲線Ｄにおいて、ＢＳＡ表面へのマウスＩｇＧの結合；の結果を示す。
【０１７８】
抗ＨＳＡの２重の３倍系列希釈物を、ＨＳＡ表面およびＢＳＡ表面に注入した。ＨＳＡ結合曲線から対照ＢＳＡ結合曲線を引くことによって補正した結果を、図１７（時間に対するＲＵのグラフ：Ａ：３３３ｎＭ  ＨＳＡ、Ｂ：１１１ｎＭ、Ｃ：３７ｎＭ、Ｄ：１２．３ｎＭ  ）に示す。
【０１７９】
【表５】
2008512540.tif 000007
【０１８０】
【表６】
2008512540.tif 000008
【０１８１】
【表７】
2008512540.tif 000009
【０１８２】
【表８】
2008512540.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】そのうちのいくつかが本発明によるものである活性脱離基ポリマーの、合成の概略図である。
【図２】本発明によるポリマーに、特異的結合対の構成員を導入する概略図である。
【図３】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図４】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図５】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図６】実施例に使用されている水晶共鳴検出器の概略図である。
【図７】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図８】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図９】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１０】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１１】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１２】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１３】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１４】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１５】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１６】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１７】実施例に記載されている実験において得られた典型的な結果を示すグラフである。
【図１８】本発明によるポリマー被覆表面の１つの実施形態の概略図である。
【図１】
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【図２】
2008512540.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2008512540.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
2008512540.tif 000021
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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