(57)【要約】【課題】ターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルをさらに調節できる酵母における目的遺伝子の発現システムを提供する。【解決手段】目的遺伝子の発現レベルを調節可能に目的遺伝子に連結された酵母由来の遺伝子のターミネーター領域と、ターミネーター領域による前記目的遺伝子の発現レベルを増強する酵母由来の１又は２以上の活性化遺伝子と、を利用するようにする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母における目的遺伝子の発現システムであって、
前記目的遺伝子の発現レベルを調節可能に前記目的遺伝子に連結された酵母由来の遺伝子のターミネーター領域と、
前記ターミネーター領域による前記目的遺伝子の発現レベルを増強する酵母由来の１又は２以上の活性化遺伝子と、
を利用する、発現システム。
【請求項２】
前記ターミネーター領域は、ＤＩＴ１遺伝子のＤＩＴ１ターミネーター領域である、請求項１に記載の発現システム。
【請求項３】
前記活性化遺伝子は、酵母由来のＰＡＰ１遺伝子、酵母由来のＮＡＢ６遺伝子、酵母由来のＣＣＣ１遺伝子及び酵母由来のＭＯＳ２遺伝子からなる群から選択される１又は２以上である、請求項２に記載の発現システム。
【請求項４】
前記活性化遺伝子は、前記ＰＡＰ１遺伝子及び前記ＮＡＢ６遺伝子から選択される、請求項２又は３に記載の発現システム。
【請求項５】
前記活性化遺伝子を過剰発現可能に備える、請求項１〜４のいずれかに記載の発現システム。
【請求項６】
前記ターミネーター領域を備える前記目的遺伝子の発現のための第１の発現領域と、
前記活性化遺伝子の発現のための第２の発現領域と、
を備える、請求項１〜５のいずれかに記載の発現システム。
【請求項７】
前記第１の発現領域は、プロモーターと前記ターミネーター領域とにより前記目的遺伝子を発現可能に前記目的遺伝子が挿入可能に構築されている又は前記目的遺伝子が挿入されている、請求項６に記載の発現システム。
【請求項８】
前記第１の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトと、
プロモーター領域と、ターミネーター領域と、前記プロモーター領域及び前記ターミネーター領域によって発現可能に前記活性化遺伝子が挿入された又は挿入可能に構築された前記第２の発現領域を保持する遺伝子組換え酵母と、
を備える、請求項６又は７に記載の発現システム。
【請求項９】
前記第１の発現領域を保持する組換え酵母と、
プロモーター領域と、ターミネーター領域と、前記プロモーター領域及び前記ターミネーター領域によって発現可能に前記活性化遺伝子が挿入された又は挿入可能に構築された前記第２の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトと、
を備える、請求項６又は７に記載の発現システム。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の発現システムを酵母内に備える、遺伝子組換え酵母。
【請求項１１】
前記酵母は、サッカロマイセス・セレビジエである、請求項１０に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１２】
酵母における目的遺伝子の発現産物の生産を増強する方法であって、
請求項１０又は１１に記載の遺伝子組換え酵母を培養して前記目的遺伝子の発現産物を生産する工程、
を備える、方法。
【請求項１３】
酵母による有用物質の生産方法であって、
前記有用物質の生産に関連する１又は２以上の前記目的遺伝子を発現可能に構築した請求項１０又は１１に記載の遺伝子組換え酵母を培養して、前記有用物質を生産する方法。
【請求項１４】
前記有用物質は、エタノールである、請求項１３に記載の生産方法。
【請求項１５】
ターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルを活性化する活性化遺伝子のスクリーニング方法であって、
レポーター遺伝子の発現レベルを調節可能に前記レポーター遺伝子に連結された酵母由来の遺伝子の一つのターミネーター領域を備えるレポーター遺伝子発現領域と、酵母由来の１又は２以上の被験遺伝子を発現するための被験遺伝子発現領域と、を備える酵母における前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を備え、
前記１又は２以上の被験遺伝子による前記レポーター遺伝子の発現レベルに基づいて、前記被験遺伝子の前記ターミネーター領域に対する活性化作用を評価する、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、酵母における外来遺伝子の発現システム及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、外来遺伝子を発現させるのに好適な宿主として汎用されている。外来遺伝子を酵母で大量発現させるのにあたり、外来遺伝子を多数個導入することや高発現プロモーターの制御下で外来遺伝子を発現させることが行われている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−２１５１０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、多コピー同時導入による場合、原理的には３００箇所への同時導入が可能であるものの導入効率に限界があるとともに、発現レベルの最適化が困難であるという問題があった。また、選抜マーカーにも限界がある。さらに、高発現プロモーターを用いる場合には、低い糖濃度下では発現量が低下してしまうとともに、コピー数の増加によりプロモーターによる発現増大効果が低下するという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明者らは、ターミネーター領域を利用して目的遺伝子を高発現することに着目した。さらに、ターミネーター領域による目的遺伝子の発現調節能をさらに増強するように選択的に作用するトランス因子の利用に着目し、ターミネーター領域による目的遺伝子の高発現に寄与できる遺伝子を見出した。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）酵母における目的遺伝子の発現システムであって、
前記目的遺伝子の発現レベルを調節可能に前記目的遺伝子に連結された酵母由来の遺伝子のターミネーター領域と、
前記ターミネーター領域による前記目的遺伝子の発現レベルを増強する酵母由来の１又は２以上の活性化遺伝子と、
を利用する、発現システム。
（２）前記ターミネーター領域は、ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域である、（１）に記載の発現システム。
（３）前記活性化遺伝子は、酵母由来のＰＡＰ１遺伝子、酵母由来のＮＡＢ６遺伝子、酵母由来のＣＣＣ１遺伝子及び酵母由来のＭＯＳ２遺伝子からなる群から選択される１又は２以上である、（２）に記載の発現システム。
（４）前記活性化遺伝子は、前記ＰＡＰ１遺伝子及び前記ＮＡＢ６遺伝子から選択される、（２）又は（３）に記載の発現システム。
（５）前記活性化遺伝子を過剰発現可能に備える、（１）〜（４）のいずれかに記載の発現システム。
（６）前記ターミネーター領域を備える前記目的遺伝子の発現のための第１の発現領域と、
前記活性化遺伝子の発現のための第２の発現領域と、
を備える、（１）〜（５）のいずれかに記載の発現システム。
（７）前記第１の発現領域は、プロモーターと前記ターミネーター領域とにより前記目的遺伝子を発現可能に前記目的遺伝子が挿入可能に構築されている又は前記目的遺伝子が挿入されている、（６）に記載の発現システム。
（８）前記第１の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトと、
プロモーター領域と、ターミネーター領域と、前記プロモーター領域及び前記ターミネーター領域によって発現可能に前記活性化遺伝子が挿入された又は挿入可能に構築された前記第２の発現領域を保持する遺伝子組換え酵母と、
を備える、（６）又は（７）に記載の発現システム。
（９）前記第１の発現領域を保持する組換え酵母と、
プロモーター領域と、ターミネーター領域と、前記プロモーター領域及び前記ターミネーター領域によって発現可能に前記活性化遺伝子が挿入された又は挿入可能に構築された前記第２の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトと、
を備える、（６）又は（７）に記載の発現システム。
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載の発現システムを酵母内に備える、遺伝子組換え酵母。
（１１）前記酵母は、サッカロマイセス・セレビジエである、（１０）に記載の遺伝子組換え酵母。
（１２）酵母における目的遺伝子の発現産物の生産を増強する方法であって、
（１０）又は（１１）に記載の遺伝子組換え酵母を用いて前記目的遺伝子の発現産物を生産する工程、
を備える、方法。
（１３）酵母による有用物質の生産方法であって、
前記有用物質の生産に関連する１又は２以上の前記目的遺伝子を発現可能に構築した（１０）又は（１１）に記載の遺伝子組換え酵母を培養して、前記有用物質を生産する方法。
（１４）前記有用物質は、エタノールである、（１３）に記載の生産方法。
（１５）ターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルを活性化する活性化遺伝子のスクリーニング方法であって、
レポーター遺伝子の発現レベルを調節可能に前記レポーター遺伝子に連結された酵母由来の遺伝子の一つのターミネーター領域を備えるレポーター遺伝子発現領域と、酵母由来の１又は２以上の被験遺伝子を発現するための被験遺伝子発現領域と、を備える酵母における前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を備え、
前記１又は２以上の被験遺伝子による前記レポーター遺伝子の発現レベルに基づいて、前記被験遺伝子の前記ターミネーター領域に対する活性化作用を評価する、スクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発現システムの概要を示す図である。
【図２】本発現システムの一態様である形質転換酵母を示す図である。
【図３】ターミネーター領域に作用してターミネーター領域による発現レベルを増強する活性化遺伝子のスクリーニングの概要を示す図である。
【図４】ＤＩＴ１ターミネーター株における候補遺伝子による相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。
【図５】各種の高出力ターミネーター株へのＰＡＰ１コンストラクトに導入した場合の相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。
【図６】ＤＩＴ１ターミネーター株における候補遺伝子による相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。
【図７】各種の高出力ターミネーター株へのＣＣＣ１コンストラクトに導入した場合の相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。他の実施例の発現システムによる評価結果を示す図である。
【図８】ＤＩＴ１ターミネーター株における候補遺伝子による相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。
【図９】各種の高出力ターミネーター株へのＮＡＢ６コンストラクトに導入した場合の相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。
【図１０】ＤＩＴ１ターミネーター株における候補遺伝子による相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。
【図１１】各種の高出力ターミネーター株へのＭＯＳ２コンストラクトに導入した場合の相対ＧＦＰ蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明者らは、酵母遺伝子に由来する多数のターミネーターについて、当該ターミネーターによる目的遺伝子の発現レベルの調節機能について検討し、各ターミネーター領域はそれぞれ固有の発現調節能を有することを既に見出している。さらに、本発明者らは、ターミネーター領域による発現調節能力をさらに増強することができるターミネーター活性化遺伝子を見出した。
【０００９】
ターミネーター領域による目的遺伝子の発現調節に加えてターミネーター領域と相互作用するトランス因子によってさらに目的遺伝子の発現調節を行うことは現在までのところ全く報告されていない。
【００１０】
こうしたターミネーター活性化遺伝子によるターミネーター領域による発現調節能力を増強する機構は必ずしも明らかではない。推論であって本明細書の開示を拘束するものではないが、ターミネーター領域には、３’−ＵＴＲとしてｍＲＮＡの一部となる配列が含まれており、この３’−ＵＴＲ中に、特定のタンパク質と相互作用するシス配列が含まれているものと考えられる。今回見出された活性化遺伝子は、ターミネーター領域の３’−ＵＴＲのシス配列と相互作用することによってターミネーター領域の上流の目的遺伝子のｍＲＮＡの半減期を延長し、その結果、目的遺伝子によるタンパク質生産量が増大すると考えられる。
【００１１】
以上のことから、本明細書の開示によれば、ターミネーター領域を用いた目的遺伝子の発現調節を、さらに活性化遺伝子の発現によって増強することができる発現システムが提供される。この発現システムによれば、ターミネーター領域を用いた目的遺伝子の発現調節をより強力にかつより高い自由度で実現することができる。
【００１２】
また、本明細書の開示によれば、こうした発現システムを利用した遺伝子組換え酵母、目的遺伝子の発現産物の生産の増強方法、酵母による有用物質の生産方法も提供される。
【００１３】
さらに、本発明者らの知見によれば、酵母由来のターミネーター領域を用いた目的遺伝子の発現調節に関し、当該ターミネーター領域に対して特異的に作用するトランス調節因子が存在する可能性が高いことがわかる。以上のことから、ターミネーター領域による目的遺伝子の発現調節を活性化するトランス調節因子のスクリーニング方法も提供される。
【００１４】
かかるスクリーニング方法によれば、酵母由来のターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルに作用（すなわち、目的遺伝子の発現を促進又は抑制する作用）を及ぼすターミネーター調節遺伝子を取得することもできる。こうしたスクリーニング方法によれば、目的遺伝子の発現レベルを調節可能に前記目的遺伝子に連結された酵母由来の遺伝子のターミネーター領域と、ターミネーター領域による前記目的遺伝子の発現レベルを調節する酵母由来の１又は２以上の活性化遺伝子と、を利用する、発現システムも提供される。
【００１５】
以下、本明細書の開示に関する各種実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本明細書において、酵母としては、特に限定しないで公知の各種酵母を利用できる。酵母におけるエタノール発酵及びその利用等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。
【００１７】
本明細書において目的遺伝子とは、用いる酵母において意図的に発現させようとする遺伝子であればよく、酵母に由来する内在性遺伝子であってもよいし、当該酵母以外の他の種あるいは他の属、さらには他の生物に由来する遺伝子（外来性遺伝子）であってもよい。目的遺伝子は、好ましくは遺伝子工学的に酵母に導入されたものである。また、目的遺伝子は、酵母内において発現させるものであってもよいし、酵母外に分泌発現させたり表層提示させたりするものであってもよい。目的遺伝子の産生形態は、必要に応じて選択される。分泌発現や表層提示の場合にあっては、必要な遺伝子の修飾を公知の方法によって行われる。さらに、こうしたセルラーゼ等を提示するために酵母表面に提示するスキャホールディンタンパク質とすることもできる。例えば、スキャホールディンタンパク質としては、各種セルロソーム生産微生物のスキャホールディンタンパク質が公知である。
【００１８】
目的遺伝子の種類も限定されない。例えば、セルロースを分解して、その分解物をそのまま酵母が利用して発酵する場合においては、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ等の各種セルラーゼやβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子、各種のヘミセルロースを分解する各種のヘミセルラーゼをコードする遺伝子とすることができる。キシロースイソメラーゼ等の酵素とすることもできる。さらに、酵母による発酵により工業原料等となりうる有用物質を生産するための酵素とすることもできる。
【００１９】
（酵母における目的遺伝子の発現システム）
本明細書に開示される酵母における目的遺伝子の発現システムは、図１に示すように、目的遺伝子の下流に目的遺伝子の発現レベルを調節可能に連結された酵母由来の遺伝子のターミネーター領域と、ターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルを増強する酵母由来の１又は２以上の活性化遺伝子と、を利用する。
【００２０】
（酵母由来の遺伝子のターミネーター領域）
酵母における遺伝子のターミネーター領域は、それ自体、プロモーター制御下で発現される遺伝子の発現レベルを調節する機能を有している。本発明者らは、酵母の約５０００の遺伝子のターミネーター領域を用いて、同一プロモーター制御下で目的遺伝子を発現させるとき、ターミネーター領域が目的遺伝子の発現レベルの調節に寄与していることを見出している。
【００２１】
酵母由来の遺伝子のターミネーター領域（以下、単にターミネーター領域という。）による目的遺伝子の発現レベルを増強する酵母由来の活性化遺伝子（以下、単に活性化遺伝子ともいう。）は、後述するスクリーニング方法によって見出すことができる。すなわち、特定のターミネーター領域によってレポーター遺伝子を発現させるとともに、１又は２以上の酵母由来の活性化遺伝子を被験遺伝子として共発現させ、レポーター遺伝子の発現レベルを共発現無しの場合と比較することで、被験遺伝子が活性化遺伝子であるかを評価し、スクリーニングすることができる。
【００２２】
酵母において、目的遺伝子の発現レベルの増強に大きく寄与するターミネーター領域の一つとしては、ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域（ＤＩＴ１ターミネーター領域）が挙げられる。酵母におけるＤＩＴ１遺伝子は、ＹＤＲ４０３Ｗ遺伝子とも称される。ＤＩＴ遺伝子は、代表的な酵母であるサッカロマイセス・セレビジエに本来的に内在する遺伝子である。
【００２３】
本システムにおいて用いるＤＩＴ１ターミネーター領域は、サッカロマイセス・セレビジエ由来のＤＩＴ１ターミネーター領域を用いることができる。用いる酵母がサッカロマイセス・セレビジエであるときには、内在するＤＩＴ１ターミネーター領域を用いてもよい。
【００２４】
サッカロマイセス・セレビジエにおけるＤＩＴ１遺伝子は、それ自体公知のデータベースにおいて、EntrezGene:852012、SGD: S000002811等として特定されている。ＤＩＴ１遺伝子は、胞子壁の可溶性ＬＬ−ジチロシン含有前駆体の産生に関与する胞子壁の成熟に必要な胞子形成特異的酵素をコードしているとされている。なお、サッカロマイセス・セレビジエのＤＩＴ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列は配列番号１で表され、ＤＩＴ１遺伝子がコードするタンパク質は配列番号２で表される
【００２５】
本発明者らによれば、一定の条件下（例えば、同一のプロモーターと外来遺伝子を備える発現カセットを用いるなど）において、種々の酵母遺伝子のターミネーターを連結したところ、酵母遺伝子のターミネーターは、それぞれ固有の発現レベルの調節能を発揮していることがわかった。
【００２６】
ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域は、公知の酵母用ターミネーター領域、例えば、酵母のＰＧＫ１ターミネーター領域などを用いた場合の所定の遺伝子（例えば、蛍光性タンパク質遺伝子などのレポーター遺伝子）の発現量に対する相対発現量として評価された発現強度情報を有している。発現強度情報とは、ターミネーター領域が転写制御するように接続された遺伝子の発現強度、すなわち、発現量に関する情報である。
【００２７】
本発明者らによれば、酵母、特に出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeから取得した５２９５個の遺伝子のターミネーター領域の発現強度情報を、ＰＧＫ１ターミネーター領域に対する相対発現強度で評価し、その結果、ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域は、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター領域を用いた場合に比して約２．２倍の発現調節能（発現増強能）を有していることがわかっている。
【００２８】
なお、本明細書において、遺伝子名は、基本的に、公開されているゲノム情報（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Fungi/Saccharomyces_cerevisiae_uid128/）に基づくものである。また、このゲノム情報において、前記遺伝子名を参照することで、各遺伝子のコード領域の下流の遺伝子配列を取得することができる。酵母のｍＲＮＡに存在する３’−ＵＴＲの長さの中央値が１００ｂｐ程度であり、ほとんどの３’−ＵＴＲは５００ｂｐ程度の範囲内にあることが報告されている（Miura F, Kawaguchi N, Sese J, Toyoda A, Hattori M, Morishita S, Ito T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 17846-17851 (2006)、Nagalakshmi U, Wang Z, Waern K, Shou C, Raha D, Gerstein M, Snyder M, Science, 320, 1344-1349 (2008)）。こうしたことなどから、酵母においては、コード領域の終始コドンの下流３００ｂｐ程度が各遺伝子のターミネーター領域と想定されうる。当業者であれば、ターミネーター領域と想定されるＤＮＡの塩基配列に基づいて、公知の手法を利用して適切なプライマーを設計し、特定遺伝子のターミネーター領域を増幅し、ターミネーター領域のクローニングすることができる。また、ターミネーター領域の活性を評価することができる。
【００２９】
こうした情報に基づいて取得できるサッカロマイセス・セレビジエのＤＩＴ１ターミネーター領域の塩基配列を配列番号３に示す。このターミネーター領域の塩基配列は、サッカロマイセス・セレビジエのＤＩＴ１ターミネーター領域を取得するためにそれぞれ固有のプライマーセットを設計して得られた結果に基づくものであり、ＤＩＴ１遺伝子の終始コドンの下流２５０ｂｐを少なくとも含むものとなっている。ＤＩＴ１遺伝子のターミネーター領域を得るための５’プライマーの塩基配列は、配列番号４で表され、また、３’プライマー配列は、配列番号５で表される。
【００３０】
サッカロマイセス・セレビジエのＤＩＴ１ターミネーター領域としては、配列番号３で表される塩基配列の全長であってもよいが、少なくとも、５’末端側の２５０塩基を含むものであることが好ましい。
【００３１】
ターミネーター領域は、特定された塩基配列と同一であってもよいほか、必要に応じて改変して用いることができる。すなわち、特定された塩基配列番号、例えば、配列番号３で表される塩基配列において１又は２以上の塩基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を有し、元のターミネーター領域と同程度のターミネーター活性を有するＤＮＡの塩基配列であってもよい。好ましくは、塩基の欠失等は５０以下であり、より好ましくは４０以下であり、さらに好ましくは３０以下であり、一層好ましくは２５以下であり、より一層好ましくは２０以下であり、さらに一層好ましくは１５以下であり、さらにまた好ましくは１０個以下であり、さらに好ましくは５以下である。
【００３２】
さらに、特定された塩基配列、例えば、配列番号３で表される塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、さらに一層好ましくは９９％以上の同一性を有し、元のターミネーター領域と同程度の発現調節能を有するＤＮＡの塩基配列であってもよい。なお、ここで同程度の発現調節能とは、例えば、元のターミネーターの発現強度情報における相対発現強度とプラスマイナス２０％範囲内の相対発現強度を意味している。より好ましくはプラスマイナス１０％範囲内である。さらに好ましくはプラスマイナス５％範囲内である。
【００３３】
本明細書において塩基配列又はアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２種以上のタンパク質あるいは２種以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３４】
ターミネーター領域は、目的遺伝子の発現レベル、好ましくは転写レベルを調節可能に目的遺伝子に対して備えられる。概して、ターミネーター領域は、目的遺伝子のストップコドンを構成する目的遺伝子のコード領域の３’末端に、あるいは適数個のリンカー様のヌクレオチドを介して連結されることで、目的遺伝子の発現レベルを調節可能である。本発現システムにおいては、ターミネーター領域によって調節可能に目的遺伝子を備えるか、あるいは目的遺伝子が導入可能に構成されている。
【００３５】
本発現システムにおいては、ターミネーター領域とともに目的遺伝子の発現レベルを調節するプロモーター領域を備えている。概して、プロモーター領域は、目的遺伝子の開始コドンの５’側に配置される。本発現システムにおいては、プロモーター領域によって調節可能（作動可能）に目的遺伝子を備えるか、あるいは目的遺伝子を導入できるようになっている。
【００３６】
プロモーター領域としては、酵母で利用可能な各種プロモーター領域を利用できる。プロモーター領域としては、必要に応じて構成的プロモーターほか、誘導的プロモーターを利用できる。また、好ましくは目的遺伝子の発現レベルの増強性の大きいプロモーターを用いる。
【００３７】
酵母で使用可能なプロモーター領域としては、例えば、ＴＤＨ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター等が挙げられる。プロモーター領域は、こうした酵母由来のプロモーターに限定されるものではなく、人工的に構築されたプロモーターであってもよい。
【００３８】
本発現システムにおいては、以上のように、目的遺伝子の発現レベルを調節可能にプロモーター領域及びターミネーター領域が備えられるようになっている。こうした発現のための領域（第１の発現領域）は、酵母の染色体上に保持された形態であってもよいし、酵母の染色体外に保持された形態であってもよい。第１の発現領域が、酵母染色体に対して組換え可能な場合には、組換え部位を特定して相同組換え可能な領域を第１の発現領域他の要素とともに備えている。また、第１の発現領域は、酵母に導入可能なＤＮＡ断片の形態のＤＮＡコンストラクトであってもよいし、プラスミドベクターなど酵母に適用可能なベクターの形態のＤＮＡコンストラクトであってもよい。こうした第１の発現領域に対しては、さらに必要に応じて適宜シス因子が付与されていてもよい。
【００３９】
ターミネーター領域を含んで目的遺伝子を発現可能に備える領域は、酵母において１又は複数備えられていてもよい。複数の当該領域は、それぞれ異なる目的遺伝子を発現可能に構築されていてもよいし、１又は２以上の共通する目的遺伝子を発現可能に構築されていてもよい。
【００４０】
（活性化遺伝子）
本発現システムは、図１に示すように、ターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルを増強する遺伝子である、ターミネーター領域活性化遺伝子（以下、活性化遺伝子ともいう。）を利用することができる。ターミネーター領域を目的遺伝子の発現増強に用いるとき、この活性化遺伝子を酵母内において同時に発現させることで、目的遺伝子の発現レベルをさらに増強することができる。なお、ここで目的遺伝子の発現レベルを増強するとは、目的遺伝子の発現を促進して発現レベルを増大させることを意味している。
【００４１】
活性化遺伝子は、後述するように、酵母の各遺伝子の発現レベルが増強されているライブラリーにおいて、特定のターミネーター領域、例えばＤＩＴ１ターミネーター領域によって発現調節可能に構築されたレポーター遺伝子の発現領域（発現カセット）を導入し、レポーター遺伝子の発現レベルを評価することによって、スクリーニングすることができる。
【００４２】
本発明者らによれば、ＤＩＴ１ターミネーター領域による発現レベルの調節に関し、いずれも酵母に由来する、ＰＡＰ１遺伝子、ＮＡＢ６遺伝子及びＣＣＣ１遺伝子を活性化遺伝子として見出している。すなわち、活性化遺伝子としては、いずれも酵母に由来するＰＡＰ１遺伝子、ＮＡＢ６遺伝子、ＣＣＣ１遺伝子及びＭＯＳ２遺伝子からなる群から選択される１又は２以上を用いることができる。
【００４３】
ＤＩＴターミネーター領域とこれらの活性化遺伝子との組合せは、いずれもサッカロマイセス・セレビジエに由来することが好ましい。そして、こうしたサッカロマイセス・セレビジエに由来するＤＩＴターミネーター領域と活性化遺伝子との組合せは、他の酵母内において有効である。
【００４４】
サッカロマイセス・セレビジエのＰＡＰ１遺伝子は、ｍＲＮＡのアデニル化のために必要な３つの因子のうちの一つであるポリＡポリメラーゼをコードし、ｍＲＮＡの核移送等に必要なポリアデニレーションファクター１（ＰＦ１）とマルチプロテイン複合体を形成するとされている。サッカロマイセス・セレビジエのＰＡＰ１遺伝子は、それ自体公知のデータベースにおいて、例えば、SGD（Saccharomyces Genome Datebase）においてS000001710として特定されている。なお、サッカロマイセス・セレビジエのＰＡＰ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列は配列番号６で表され、ＰＡＰ１遺伝子がコードするタンパク質は配列番号７で表される。
【００４５】
ＰＡＰ１遺伝子は、他の２種の活性化遺伝子に比較してＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現増強能が大きい（コントロールに対して約２倍である）ことから、活性化遺伝子として好ましく用いることができる。例えば、ＤＩＴ１ターミネーター領域は、目的遺伝子の発現を約２倍に増強できるが、ＰＡＰ１遺伝子の共発現により、コントロール（この場合、ＰＧＫ１プロモーターとＰＧＫ１ターミネーター領域を用いた場合）よりも約４倍の発現増強が可能となっている。
【００４６】
ＮＡＢ６遺伝子は、細胞壁タンパク質をコードするｍＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合タンパク質と推定されている。ＮＡＢ６遺伝子は、それ自体公知のデータベースにおいて、例えば、SGDにおいて、S000004585として特定されている。なお、サッカロマイセス・セレビジエのＮＡＢ６遺伝子のＯＲＦの塩基配列は配列番号８で表され、ＮＡＢ６遺伝子がコードするタンパク質は配列番号９で表される。
【００４７】
ＮＡＢ６遺伝子も、ＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現増強能が大きい（コントロールに対して約１．６倍である）ことから、活性化遺伝子として好ましく用いることができる。例えば、ＤＩＴ１ターミネーター領域は、目的遺伝子の発現を約２倍に増強できるが、ＰＡＰ１遺伝子の共発現により、コントロール（この場合、ＰＧＫ１プロモーターとＰＧＫ１ターミネーター領域を用いた場合）よりも約３〜４倍の発現増強が可能となっている。
【００４８】
ＣＣＣ１遺伝子は、ミトコンドリア鉄の蓄積を防ぐことによって、哺乳動物フラタキシンのオルソログを欠いているyfh1変異体の呼吸欠損を抑制する液胞Ｆｅ2+／Ｍｇ2+トランスポーターをコードしていると推定されている。ＮＡＢ６遺伝子は、それ自体公知のデータベースにおいて、例えば、SGDにおいて、S000004210として特定されている。なお、サッカロマイセス・セレビジエのＣＣＣ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列は配列番号１０で表され、ＣＣＣ１遺伝子がコードするタンパク質は配列番号１１で表される。
【００４９】
ＭＯＳ２遺伝子は、ミトコンドリア内膜タンパク質であって、稜ジャンクションと内膜のアーキテクチャの維持に役立つ内膜の膜間スペース側にある足場様構造であるミトコンドリア内膜組織化システム（MINOS、MitOS、またはMICOS）の非必須成分のタンパ質をコードしていると推定されている。ＭＯＳ２遺伝子は、それ自体公知のデータベースにおいて、例えば、SGDにおいて、S000003467として特定されている。なお、サッカロマイセス・セレビジエのＭＯＳ２遺伝子のＯＲＦの塩基配列は配列番号１２で表され、ＭＯＳ２遺伝子がコードするタンパク質は配列番号１３で表される。
【００５０】
これらの活性化遺伝子がどのような作用を介してＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現調節に関わるかは必ずしも明らかではないが、これら活性化遺伝子がコードするタンパク質と同様にＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現を促進するこれらの遺伝子の改変体も、また活性化遺伝子と同様に用いることができる。
【００５１】
こうした活性化遺伝子の改変体としては、例えば、配列番号７，９，１１及び１３で表されるいずれかのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を有し、元のタンパク質と同程度のＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現増強に寄与するタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。好ましくは、アミノ酸の欠失等は５０個以下であり、より好ましくは４０個以下であり、さらに好ましくは３０個以下であり、一層好ましくは２５個以下であり、より一層好ましくは２０個以下であり、さらに一層好ましくは１５個以下であり、さらにまた好ましくは１０個以下であり、さらに好ましくは５個以下であり、さらにまた好ましくは３個以下であり、さらに好ましくは２個以下である。
【００５２】
また、配列番号７，９，１１及び１３で表されるいずれかのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、さらに一層好ましくは９９％以上の同一性を有し、元の活性化遺伝子がコードするタンパク質と同程度のＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現増強に寄与するタンパク質をコードするＤＮＡを有していてもよい。
【００５３】
なお、ここで同程度の発現増強とは、例えば、元の遺伝子によるＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現増強レベルのプラスマイナス２０％範囲内の相対発現強度を意味している。より好ましくはプラスマイナス１０％範囲内である。さらに好ましくはプラスマイナス５％範囲内である。
【００５４】
これらの活性化遺伝子の酵母における発現形態は、特に限定されないが、目的遺伝子とは異なり表層提示等でなく酵母内で発現されるようにすることが好ましい。
【００５５】
活性化遺伝子は、酵母内において発現可能に備えられている。活性化遺伝子を発現可能に含む活性化遺伝子発現のための領域（第２の発現領域）は、酵母の染色体上に保持された形態であってもよいし、染色体外に保持された形態であってもよい。第２の発現領域が、酵母染色体に組換え可能な場合には、組換え部位を特定して相同組換え可能な領域を第２の発現領域の他の要素とともに備えている。また、酵母に導入可能なＤＮＡ断片の形態のＤＮＡコンストラクトであってもよいし、プラスミドベクターなど酵母に適用可能なベクターの形態のＤＮＡコンストラクトであってもよい。さらに、こうした第２の発現領域のコピー数も特に限定されない。複数コピーが酵母内に含まれていてもよい。染色体外のプラスミドに発現カセットが備えられる場合、コピー数は１０以上であってもよく、２０以上であってもよい。さらに３０以上であってもよい。また、活性化遺伝子を発現可能に前記目的遺伝子が挿入可能に構築されている又は活性化遺伝子が挿入されていてもよい。
【００５６】
これらの活性化遺伝子を発現させるには、当業者に周知の発現技術を適用することができる。すなわち、概して酵母で作動可能なプロモーターの下流に活性化遺伝子が連結され、さらに酵母で作動可能なターミネーターが連結される。プロモーター及びターミネーターはいずれも酵母で作動可能であれば特に限定されない。活性化遺伝子は、本来的にその活性化遺伝子の有する発現調節領域、すなわち、活性化遺伝子に対してゲノム上において備えられるプロモーター領域やターミネーター領域とともに用いられていてもよい。本来的なプロモーターを用いない場合、プロモーターについては、既に説明した酵母で作動可能な構成的あるいは各種の誘導的プロモーターを適宜利用できる。なお、誘導的プロモーターを用いる場合には、発現レベルの増強能力に優れるＤＩＴ１ターミネーター領域による目的遺伝子の発現能力を誘導因子の有無等により、適時に大きく増強できるというダイナミックな調節が可能となる。また、同様に本来的なターミネーター領域を用いない場合、ターミネーターについては、周知である酵母で利用可能なターミネーターを適宜利用できる。
【００５７】
なお、活性化遺伝子を発現可能に備える第２の発現領域は、酵母において１又は複数備えられていてもよい。複数の当該領域は、それぞれ異なる活性化遺伝子を発現可能に構築されていてもよいし、１又は２以上の共通する活性化遺伝子を発現可能に構築されていてもよい。
【００５８】
本明細書における酵母における目的遺伝子の発現システムとは、酵母において目的遺伝子を発現させるための酵母由来の遺伝子のターミネーター領域と、当該ターミネーター領域による目的遺伝子の発現を増強するための酵母由来のターミネーター領域活性化遺伝子と、を利用可能な全ての形態を包含している。本発現システムは、ターミネーター領域及び活性化遺伝子を利用する各種態様を含みうる。例えば、以下の各種態様を採ることができる。
【００５９】
（１）ＤＩＴ１ターミネーターを備える目的遺伝子のための発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトと活性化遺伝子の発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトと、を備える、システム（キット）。
（２）第１の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトと、
プロモーター領域と、ターミネーター領域と、前記プロモーター領域及び前記ターミネーター領域によって発現可能に前記活性化遺伝子が挿入された又は挿入可能に構築された前記第２の発現領域を保持する遺伝子組換え酵母と、を備えるシステム。
（３）第１の発現領域を保持する組換え酵母と、
プロモーター領域と、ターミネーター領域と、前記プロモーター領域及び前記ターミネーター領域によって発現可能に前記活性化遺伝子が挿入された又は挿入可能に構築された前記第２の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトと、を備えるシステム。
（４）第１の発現領域と第２の発現領域とを備える酵母（図２参照）。
【００６０】
これらの各種態様において、第１の発現領域は、目的遺伝子が組み込み可能に構築されていてもよいし、既に組み込まれていてもよい。第１の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトは、一つの目的遺伝子に対応して一種であってもよいが、複数種類の目的遺伝子に対応して複数準備されていてもよい。第２の発現領域を含むＤＮＡコンストラクトは、単独の活性化遺伝子に対応したものであってもよいし、２種類以上の活性化遺伝子に応じて複数準備されてもよい。各ＤＮＡコンストラクトは、染色体上に保持されるように構築されていてもよいし染色体外に維持されるように構築されていてもよい。
【００６１】
さらに、本明細書の開示によれば、ターミネーター領域を用いた発現レベルの調節に適した活性化遺伝子に関するキット及び酵母も提供される。例えば、選択される１又は２以上の活性化遺伝子（ＰＡＰ１遺伝子、ＮＡＢ６遺伝子、ＣＣＣ１遺伝子及びＭＯＳ２遺伝子からなる群から選択される）の発現カセットを含む、ターミネーター領域（ＤＩＴ１ターミネーター領域など）による発現増強のためのＤＮＡコンストラクトのキット、こうして選択される１又は２以上の活性化遺伝子を発現可能に備える、ターミネーター領域による発現増強のための形質転換酵母、ＤＮＡコンストラクトと酵母とのキットなどの各種態様を採ることができる。
【００６２】
以上のとおり、本発現システムによれば、酵母のターミネーター領域を利用してそのターミネーター領域による発現レベルの調節能をさらに高めることができる。
【００６３】
さらに、本発現システムによれば、ターミネーター領域による高い目的遺伝子発現増強能力を、２以上の目的遺伝子に作用させるとともに、活性化遺伝子を同時に発現させることにより、さらに異なるレベルに発現調節する発現システムも提供される。ターミネーター領域による目的遺伝子発現レベルの調節能をさらに１又は２以上の活性化遺伝子を用いてさらに異なるレベルで発現レベルを増強できることは、高い発現レベルで複数の遺伝子を発現制御するのに有利である。
【００６４】
（酵母）
本明細書に開示される酵母は、図２に示すように、既に説明した発現システムを保持する酵母とすることができる。本発現システムを備える酵母は、ターミネーター領域による目的遺伝子の発現カセット及び活性化遺伝子を増強する発現カセットを少なくとも備えている。本開示の酵母における、ターミネーター領域及び活性化遺伝子に関しては、既に説明した各種の態様が適用される。本開示の酵母は、公知の酵母の形質転換技術を用いて、ターミネーター領域を含む発現カセット及び活性化遺伝子を含む発現カセットを保持するように形質転換することで取得できる。遺伝子組換え酵母の作製は、当業者において周知事項であり、当業者であれば適宜公知技術を参照して本酵母を得ることができる。ターミネーターの保持形態、活性化遺伝子の種類及びその保持形態については、既に説明した各種態様を適宜選択できる。
【００６５】
酵母としては、既に説明した各種態様が適用されるが、工業的生産を考慮すると好ましくはサッカロマイセス・セレビジエである。
【００６６】
（酵母における目的遺伝子の発現産物の生産を増強する方法）
本明細書に開示される酵母における目的遺伝子の発現産物の生産を増強する方法は、本発現システムを備える酵母であって目的遺伝子を備える酵母を培養することで目的遺伝子の発現産物を生産する工程、を備えることができる。本増強方法によれば、従来の酵母における遺伝子の発現システムが増強されるため、一層発現産物の生産を増強できる。また、ＤＩＴ１ターミネーター領域を用いた場合において、２以上の目的遺伝子を複数レベルに発現増強することもできる。
【００６７】
（酵母による有用物質の生産方法）
酵母による有用物質の生産方法は、有用物質の生産に関連する１又は２以上の目的遺伝子の発現可能な本発現システムを備える酵母を培養して有用物質の生産を増強することを特徴としている。概して、酵母を利用したエタノール等の有用物質の生産には、１又は２以上、特に２以上の目的遺伝子を増強する必要がある場合が多い。この場合において、１又は２以上の目的遺伝子を、ＤＩＴ１ターミネーター領域を用いてその発現を増強しつつ、さらに、ＤＩＴ１ターミネーター領域と作用しうる１又は２以上の活性化遺伝子を発現させることで、ＤＩＴ１ターミネーター領域による発現増強能をさらに増強したりあるいはＤＩＴ１ターミネーター領域による発現増強能をさらに異なるレベルで増強することができる。こうすることで、有用物質の生産をより高度に増強することができるようになる。
【００６８】
本明細書において、有用物質とは、酵母内で生合成されるエタノール、有機酸、その他の有機化合物などが挙げられる。酵母を用いた発酵技術においては、所望の有用物質を得るために好ましいタンパク質（酵素）や当該タンパク質を酵母で発現させるための遺伝子工学的な改変や酵母の培養技術は公知であり、当業者であれば、こうした酵母の改良に関連する遺伝子改変技術の全てに本明細書の開示を適用することができる。
【００６９】
また、酵母が効率的にバイオマスからエタノールを生産するためには、例えば、セルロースやヘミセルロースを分解して酵母が資化可能な単糖等とするための酵素を発現させることもできる。こうした酵素としては、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼが代表的であるほか、ヘミセルロースの種類に応じて、キシランを分解するキシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、キシラン側鎖を分解するα-アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、マンナンを分解するマンナナーゼ、ガラクトース側鎖を切断するα-ガラクトシダーゼ、ペクチンを切断するペクトリアーゼ、ペクチナーゼ、キシログルカンを分解するキシログルカナーゼ、キシランとリグニンとの結合を切断するフェルラ酸エステラーゼ等が挙げられる。
【００７０】
（ターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルの増強に関連するトランス活性化遺伝子のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、ターミネーター領域による目的遺伝子の発現レベルを活性化する活性化遺伝子のスクリーニング方法である。このスクリーニング方法は、レポーター遺伝子の発現レベルを調節可能に前記レポーター遺伝子に連結された酵母由来の遺伝子の一つのターミネーター領域を備えるレポーター遺伝子発現領域と、酵母由来の１又は２以上の被験遺伝子を発現するための被験遺伝子発現領域と、を備える酵母における前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、を備え、前記１又は２以上の被験遺伝子による前記レポーター遺伝子の発現レベルに基づいて、前記被験遺伝子の前記ターミネーター領域に対する活性化作用を評価することができる。このスクリーニング方法によれば、ターミネーター領域によって目的遺伝子の活性化を制御しようとする際において、ターミネーター領域による発現調節能力をさらに増強ないし抑制できる活性化遺伝子を取得できる。
【００７１】
ターミネーター領域としては、既に説明したＤＩＴ１ターミネーター領域他、酵母の遺伝子の各種ターミネーター領域をそれぞれ利用できる。例えば、酵母の、特に、サッカロマイセス・セレビジエのＲＰＬ１５Ａ遺伝子のターミネーター領域、ＲＰＬ４１Ｂ遺伝子のターミネーター領域、ＩＤＰ１遺伝子のターミネーター領域、ＲＰＬ３遺伝子のターミネーター領域等が挙げられる。なお、酵母の遺伝子のターミネーター領域としては、ストップコドンから好ましく１００塩基、より好ましくは２００塩基、さらに好ましくは３００塩基、一層好ましくは４００塩基、最も好ましくは５００塩基程度の領域を利用できる。
【００７２】
以上説明した本明細書に開示される遺伝子組換え技術や遺伝子組換え酵母は、いずれも、公知の書籍であるモレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。また、形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることも、同様に当業者において周知である。
【００７３】
以下、本開示を、実施例を挙げて具体的に説明する。なお、本開示は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７４】
（活性化遺伝子の概要）
Yeast genomic tiling collection（OPEN BIOSYSTEMS社、ＹＳＣ４６１３）は、出芽酵母ゲノムの９５％をカバーした多コピー型プラスミドライブラリーであるため、挿入されたゲノム断片に含まれる複数の遺伝子を高発現できる。
【００７５】
図３に示すように、このライブラリーのそれぞれのプラスミドを、ＴＤＨ３プロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子、さらにその下流にＤＩＴ１ターミネーター領域を配置したＤＩＴ１ターミネーターコンストラクトがゲノムに挿入された酵母（以下、ＤＩＴ１ターミネーター株という。）に導入し、ＤＩＴ１ターミネーターによるＧＦＰ遺伝子の発現のためのゲノム導入ＤＩＴ１ターミネーター株のコレクションを作製した。
【００７６】
次いで、コレクションの各ゲノム導入ＤＩＴ１ターミネーター株のＧＦＰ蛍光を測定して、ライブラリーの多コピー型プラスミドが導入されていないＤＩＴ１ターミネーター株に比較して、ＧＦＰに基づく蛍光強度が増大した株を同定した。さらに、蛍光増大株からプラスミドを回収し、原因となるゲノム領域をシークエンスにて確認した。確認したゲノム領域に含まれる遺伝子を候補遺伝子として、各候補遺伝子を多コピー型プラスミドライブラリーで用いているのと同じプラスミドベクター（ｐＧＰ５６４）にクローニングして、改めてＤＩＴ１ターミネーター株に導入し、単一の候補遺伝子の発現が増強された単一候補遺伝子発現ＤＩＴ１ターミネーター株を作製した。
【００７７】
こうして作製した単一候補遺伝子発現ＤＩＴ１ターミネーター株について、ＧＦＰに基づく蛍光強度が増強された株を選択し、候補遺伝子を特定した。
【００７８】
より具体的には、１６種類に分割した上記ライブラリーを９６穴プレートを用いて合計１５３６株のゲノム導入ＤＩＴ１ターミネーター株についてスクリーニングを行った。以下、その詳細を示す。
【００７９】
（ライブラリー・ストックの作製）
ＤＩＴ１ターミネーター株に、Yeast genomic tiling collection を常法に従い遺伝子導入した。９０ｍｍのＳＤ−ＬＥＵプレートに展開し、３０℃で２日間、静置培養した。２日後に十分の多数のコロニーが生えていることを確認し、１〜２ｍｌのＳＤ−ＬＥＵ液体培地を加え、そのうちの５００μｌを回収し、ゲノム導入ＤＩＴ１ターミネーター株のグリセロールストックとして−８０℃で保存した。
【００８０】
（前培養）
９９０μｌのＳＤ−ＬＥＵプレートにグリセロールストックの原液を加えて１００倍希釈した。同様の希釈操作を繰り返し１０００００希釈液１を１ｍｌ作製した。この１０００００倍希釈液の５０、１００及び２００μｌを、それぞれ９０ｍｍのＳＤ−ＬＥＵプレートに展開し、３０℃で２日間、静置培養した。Ｖ字底の９６穴のディープウェル・プレート（コーニング社、＃３９６０）の各ウェルにＳＤ−ＬＥＵ液体培地を５００μｌづつ分注し、ピペットマンのチップを利用して、９０ｍｍのＳＤ−ＬＥＵプレートに展開したコレクションの各株のコロニーを単離して植菌した。さらに、ディープウェル・プレートの開口部に通気性シール（ＢＩＯ−ＢＩＫ社、ＢＦ−４００）を貼って、振とう培養器（タイテック社ＭＢＲ−０２２ＵＰ）を用いて、３０℃、１８０ｒｐｍで終夜培養した。
【００８１】
（本培養）
同じ９６穴ディープウェル・プレートの各ウェルにＳＤ−ＬＥＵ液体培地を５００μｌずつ分注し、ゲノム導入ＤＩＴ１ターミネーター株の前培養液１０μｌを植菌し、通気性シールを貼って振とう培養器（タイテック社ＭＢＲ−０２２ＵＰ）を用いて、３０℃、１８０ｒｐｍで６時間培養した。このときＳＤ−ＬＥＵプレート２枚（Ａ１〜Ｈ６、Ａ７〜Ｈ１２）にレプリカを作製した。
【００８２】
（評価）
こうして得られたレプリカについて、フローサイトメーター（Beckman Coulter社、CELL LAB QUANTA SC）を利用して、酵母の発する蛍光強度を測定した。データは、Igor Pro（Wave Matrix社）で解析した。結果を表１に示す。
【００８３】
【表１】
2015136303.tif 000003
【００８４】
結果は、表１に示すように、全部で８の候補領域（プラスミド）を得るとともに、ＤＩＴ１ターミネーター活性を高める４つのゲノム領域を同定した。
【実施例２】
【００８５】
本実施例では、ＤＩＴ１ターミネーターの活性を増強する候補となったゲノム領域から候補遺伝子を同定した。
【００８６】
（１０Ａ１０〜１０Ｆ２領域からの候補遺伝子の同定）
１０Ａ１０に含まれた遺伝子のなかで可能性が高いと考えられたＰＡＰ１遺伝子及び、ＥＣＭ９遺伝子の調節領域（プロモーター領域及びターミネーター領域）を含む各領域をｐＧＰ５６４にクローニングし、ＤＩＴ１ターミネーター株に導入して、ＤＩＴ１ｔ−ＰＡＰ１株及びＤＩＴ１ｔ−ＥＣＭ９株を作製し、これらの株についてＧＦＰに基づく蛍光強度を測定した。結果を図４に示す。
【００８７】
図４に示すように、ＰＡＰ１遺伝子はネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４）に対して２倍以上の蛍光強度を示した。これに対して、ＥＣＭ９遺伝子は、ネガティブコントロールとほぼ同等の蛍光強度しか示さなかった。
【００８８】
次いで、ＰＡＰ１を含むｐＧＰ５６４コンストラクト及びネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４のみ）を、ＤＩＴ１ターミネーター株に導入するほか、実施例１に開示されるＤＩＴ１ターミネーターコンストラクトと同様に、ＰＧＫ１遺伝子、ＲＰＬ１５Ａ遺伝子、ＲＰＬ４１Ｂ遺伝子、ＩＤＰ１遺伝子、ＲＰＬ３遺伝子及びＤＩＴ１遺伝子の各ターミネーター領域を含むように構築された各種のＴＤＨ３−ＧＦＰ発現ターミネーターコンストラクトを含む各種ターミネーター株に導入した。これらの株を用いて、ＰＡＰ１遺伝子がＤＩＴ１ターミネーター領域や他のターミネーター領域とどのように相互作用するかを、ＧＦＰに基づく蛍光強度で評価した。結果を図５に示す。
【００８９】
図５に示すように、各種のターミネーター領域中ＤＩＴ１ターミネーター領域を備える株においてのみネガティブコントロールに対して高い蛍光強度を示した（約２倍）。これらの結果から、ＰＡＰ１遺伝子が選択的にＤＩＴ１ターミネーター領域と連結された目的遺伝子（ここではＧＦＰ遺伝子）の発現強度をさらに増強することがわかった。
【００９０】
（１１Ｅ１０領域からの候補遺伝子の同定）
１０Ｅ１０に含まれた遺伝子のなかで可能性が高いと考えられたＭＳＣ３、ＣＣＣ１、ＲＳＡ３及びＵＴＰ１３の各遺伝子の調節領域（プロモーター領域及びターミネーター領域）を含む領域をｐＧＰ５６４にクローニングして、ＤＩＴ１ターミネーター株に導入して、ＤＩＴ１ｔ−ＭＳＣ３、−ＣＣＣ１、−ＲＳＡ３及び−ＵＴＰ１３の各株を作製し、これらの株についてＧＦＰに基づく蛍光強度を測定した。結果を図６に示す。
【００９１】
図６に示すように，ＣＣＣ１遺伝子はネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４）に対して１．２倍以上の蛍光強度を示した。これに対して、他の遺伝子は、ネガティブコントロールとほぼ同等の蛍光強度しか示さなかった。
【００９２】
次いで、ＣＣＣ１遺伝子を含むｐＧＰ５６４コンストラクト及びネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４のみ）を、上記と同様にして、各種のＴＤＨ３−ＧＦＰ発現ターミネーターコンストラクトを含む各種ターミネーター株に導入した。これらの株を用いて、ＣＣＣ１遺伝子がＤＩＴ１ターミネーター領域や他のターミネーター領域とどのように相互作用するかを、ＧＦＰに基づく蛍光強度で評価した。結果を図７に示す。
【００９３】
図７に示すように、各種のターミネーター領域中ＤＩＴ１ターミネーター領域を備える株が最もネガティブコントロールに対して高い蛍光強度を示し（約１．２倍）、他の遺伝子もネガティブコントロールよりも高い蛍光強度を示した。これらの結果から、ＣＣＣ１遺伝子がＤＩＴ１ターミネーター領域に対して選択的にトランス相互作用して、強く目的遺伝子の発現強度をさらに増強することがわかった。
【００９４】
（１２Ｂ３、Ｂ４領域からの候補遺伝子の同定）
１２Ｂ３、Ｂ４に含まれた遺伝子のなかで可能性が高いと考えられたＹＭＬ１１９Ｗ、ＮＧＬ３及びＮＡＢ６の各遺伝子の調節領域（プロモーター領域及びターミネーター領域）を含む領域をｐＧＰ５６４にクローニングして、ＤＩＴ１ターミネーター株に導入して、ＤＩＴ１ｔ−ＹＭＬ１１９Ｗ、−ＮＧＬ３及び−ＮＡＢ６の各株を作製し、これらの株についてＧＦＰに基づく蛍光強度を測定した。結果を図８に示す。
【００９５】
図８に示すように、ＮＡＢ６遺伝子はネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４）に対して１．６倍以上の蛍光強度を示した。これに対して、他の遺伝子は、ネガティブコントロールとほぼ同等の蛍光強度しか示さなかった。
【００９６】
次いで、ＮＡＢ６遺伝子を含むｐＧＰ５６４コンストラクト及びネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４のみ）を、上記と同様にして、各種のＴＤＨ３−ＧＦＰ発現ターミネーターコンストラクトを含む各種ターミネーター株に導入した。これらの株を用いて、ＮＡＢ６遺伝子がＤＩＴ１ターミネーター領域や他のターミネーター領域とどのように相互作用するかを、ＧＦＰに基づく蛍光強度で評価した。結果を図９に示す。
【００９７】
図９に示すように、各種のターミネーター領域中ＤＩＴ１ターミネーター領域を備える株においてのみネガティブコントロールに対して高い蛍光強度を示した（約１．５倍）。これらの結果から、ＮＡＢ６遺伝子がＤＩＴ１ターミネーター領域と連結された目的遺伝子の発現強度をさらに増強することがわかった。
【００９８】
（７Ｆ９領域からの候補遺伝子の同定）
７Ｆ９に含まれた遺伝子のなかで可能性が高いと考えられたＫＥＬ２、ＭＯＳ２、ＰＥＸ２１、ＳＰＧ１１、ＹＧＲ２３７及びＹＨＢ１の各遺伝子の調節領域（プロモーター領域及びターミネーター領域）を含む領域をｐＧＰ５６４にクローニングし、ＤＩＴ１ターミネーター株に導入して、ＤＩＴ１−ＫＥＬ２、−ＭＯＳ２、−ＰＥＸ２１、−ＳＰＧ１１、−ＹＧＲ２３７Ｃ及び−ＹＨＢ１の各株を作製し、これらの株についてＧＦＰに基づく蛍光強度を測定した。結果を図１０に示す。
【００９９】
図１０に示すように、ＭＯＳ２遺伝子はネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４）に対して１．４倍以上の蛍光強度を示した。これに対して、他の遺伝子は、ネガティブコントロールとほぼ同等の蛍光強度しか示さなかった。
【０１００】
次いで、ＭＯＳ２遺伝子を含むｐＧＰ５６４コンストラクト及びネガティブコントロール（ｐＧＰ５６４のみ）を、上記と同様にして、各種のＴＤＨ３−ＧＦＰ発現ターミネーターコンストラクトを含む各種ターミネーター株に導入した。これらの株を用いて、ＭＯＳ２遺伝子がＤＩＴ１ターミネーター領域や他のターミネーター領域とどのように相互作用するかを、ＧＦＰに基づく蛍光強度で評価した。結果を図１１に示す。
【０１０１】
図１１に示すように、各種のターミネーター領域中ＤＩＴ１ターミネーター領域を備える株においてのみネガティブコントロールに対して高い蛍光強度（約１．２倍）を示した。これらの結果から、ＭＯＳ２遺伝子がＤＩＴ１ターミネーター領域と連結された目的遺伝子の発現強度をさらに増強することがわかった。
【実施例３】
【０１０２】
本実施例では、Trichoderma reesei（トリコデルマ・リーゼイ）由来のセルラーゼの一つであるエンドグルカナーゼ２を用いて、ＤＩＴ１ターミネーターの活性化遺伝子である（ＰＡＰ１、ＮＡＢ６及びＣＣＣ１）を酵母において共発現させた際の効果を、当該酵母に分泌発現させたエンドグルカナーゼ２のセルロース分解活性を測定することで評価した。具体的には、ｐＡＵＲ１１２（ＣＥＮ型プラスミド、TAKARABIO）上に、ＴＤＨ３プロモーター−エンドグルカナーゼ２−ＤＩＴ１ターミネーター領域の構築物を載せたプラスミドを酵母BJ５４６５株に導入し、さらに、当該酵母に上記で作製したプラスミドｐＧＰ５６４にクローニングしたＰＡＰ１、ＮＡＢ６及びＣＣＣ１の各遺伝子（調節領域含む）を導入した。
【０１０３】
９６穴ディープウェル・プレートに分注したＳＤ−Ｕｒａ−Ｌｅｕ＋１％カザミノ酸添加培地５００μｌに植菌して、３０℃、２４時間の前培養を行った後、その１００μｌをフレッシュな同培地に上次、さらに３０℃で２４時間培養を行った。セルラーゼ分泌発現量は、遠心後の培養上清５μｌに０．５％リン酸膨潤セルロース９５μｌを混合し、５０℃で１．５時間反応させた際の遠心上清の還元糖量をＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods ,11(1985)109-115）にて測定した。その結果、ネガティブコントロールと比較して、いずれの遺伝子の共発現も高いセルラーゼ活性を示した。また、この実験においては、ＮＡＢ６が最も高いセルロース分解活性を示した。以上のことから、ＤＩＴ１ターミネーター領域と活性化遺伝子との酵母における共発現は、一般的な目的遺伝子の発現の増強にも有用であることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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