(57)【要約】本発明は、細胞、特にWnt16タンパク質を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。本方法は、Wnt16 mRNAまたはWnt16タンパク質に結合し、Wnt16シグナル伝達を妨害し、または別のタンパク質、例えば、フリッツルド（Frizzled）受容体などへのWnt16タンパク質の結合を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。2008505933.tif 000031
2008505933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の増殖を阻害するのに有効である量のWnt16シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む、Wnt16を過剰発現する細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２】
細胞が癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
癌細胞が、肺癌、中皮腫、黒色腫、結腸癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、白血病、リンパ腫および非小細胞肺癌細胞からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
癌細胞が白血病細胞である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
癌細胞がt(1;19)転座を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
白血病細胞が、急性リンパ芽球性白血病細胞、前B細胞急性リンパ芽球性白血病細胞またはB細胞慢性リンパ性白血病細胞である、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
癌細胞が肺癌細胞である、請求項3に記載の方法。
【請求項８】
因子がsiRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
因子が抗Wnt16抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がWnt16タンパク質に特異的に結合する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
Wnt16タンパク質がヒトWnt16bタンパク質である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
抗Wnt16抗体が、SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチドを結合する、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
抗Wnt16抗体が、SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99からなるポリペプチドを特異的に結合する、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
抗Wnt16抗体が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合する、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
抗Wnt16抗体が、SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99からなるポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体とWnt16を結合させることについて競合する、請求項9に記載の方法。
【請求項１６】
抗Wnt16抗体が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体とWnt16を結合させることについて競合する、請求項9に記載の方法。
【請求項１７】
抗Wnt16抗体がポリクローナル抗体である、請求項9に記載の方法。
【請求項１８】
抗Wnt16抗体がモノクローナル抗体である、請求項9に記載の方法。
【請求項１９】
抗Wnt16抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
抗Wnt16抗体がキメラ抗体である、請求項9に記載の方法。
【請求項２１】
抗Wnt16抗体がヒト化抗体である、請求項9に記載の方法。
【請求項２２】
抗Wnt16抗体がヒトFabである、請求項9に記載の方法。
【請求項２３】
抗Wnt16抗体が完全なヒト抗体である、請求項9に記載の方法。
【請求項２４】
抗Wnt16抗体が組換え産生される、請求項9に記載の方法。
【請求項２５】
インビトロで実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
インビボで実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が患者の中にあり、接触させる工程が患者に因子を投与することによって実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
因子が抗Wnt16抗体である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
因子がsiRNAである、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
第2の治療剤を患者に投与する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
第2の治療剤が化学療法剤である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
第2の治療剤が放射線治療である、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である量のWnt16シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む、Wnt16を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導する方法。
【請求項３４】
疾患を治療するのに有効である量のWnt16シグナル伝達を阻害する因子を、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む、Wnt16シグナル伝達に関連する疾患を治療する方法。
【請求項３５】
生物学的試料中でWnt16発現のレベルを検出する工程を含む、Wnt16を過剰発現する細胞を患者からの生物学的試料中で検出する方法。
【請求項３６】
生物学的試料が血清試料である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
生物学的試料が血液、痰、尿または糞便試料である、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
Wnt16発現のレベルを検出する工程が、Wnt16 mRNAのレベルを検出することによって実施される、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
Wnt16発現のレベルを検出する工程がWnt16タンパク質のレベルを検出することによって実施される、請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
Wnt16発現のレベルの検出が、治療法に対する応答を予測するために使用される、請求項35に記載の方法。
【請求項４１】
治療法が、モノクローナル抗Wnt16抗体を患者に投与する工程を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
抗Wnt16抗体ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項４３】
抗Wnt16抗体がポリクローナル抗体である、請求項42に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
抗Wnt16抗体がモノクローナル抗体である、請求項42に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
抗Wnt16抗体がエフェクター成分にさらに結合体化されている、請求項42に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
エフェクター成分が蛍光標識である、請求項45に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
エフェクター成分が放射性同位元素または細胞毒性化学物質である、請求項45に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Wnt16タンパク質を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。本方法は、Wnt16 mRNAまたはWnt16タンパク質に結合し、Wnt16シグナル伝達を妨害し、または別のタンパク質、例えば、フリッツルド（Frizzled）受容体などへのWnt16タンパク質の結合を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、2004年7月9日に出願された米国特許仮出願第60/586,564号および2005年1月20日に出願された米国特許仮出願第60/645,709号の恩典を主張し、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺癌は、米国および世界規模での癌による死亡の主要な原因であり、米国において毎年>170,000例が、世界規模ではほぼ百万例が新規に診断されている（Minna et al. Cancer Cell. 1(1):49-52 (2002)）。過去数十年における肺癌の治療でなされた積極的なアプローチにも関わらず、肺癌の5年間の生存割合は、依然として15%未満である（Minna et al. Cancer Cell. 1(1):49-52 (2002)）。肺癌は、2つのグループ：非小細胞肺癌（NSCLC）および小細胞肺癌（SCLC）に分けられる。NSCLC（すべての癌の75〜80%）は、3つの主要な型：腺癌、扁平上皮癌、および大細胞癌からなる（Minna (2002)）。肺癌種および扁平上皮癌は、すべての肺癌の60〜70%を表す。外科手術、化学療法、および放射線治療は、進行した疾患においては一般的には不満足な結果を伴って使用されてきた。肺癌治療の効力の改善が、主要な公衆衛生の目的である。
【０００４】
悪性胸膜中皮腫（MPM）は、肺の胸膜線から原発的に生じる高度に攻撃的かつ挑戦的な癌である。年間約3,000人の患者が米国においてMPMであると診断され、この腫瘍の発生は、短期的に劇的に増加し、2020年頃にピークを迎えると予測されている（Thatcher、Lung Cancer 45 Suppl 1: S1-2 (2004)）。MPMは通常進行した状態で現れるので、治癒的切除が可能であることはまれである。放射線治療は、単独治療様式として臨床的利点を示すことに失敗し、化学療法の投与は、進行した段階には限られた効力で、大部分限定されている（Kindler、Lung Cancer 45 Suppl 1: S125-7 (2004)）。組換えサイトカインの胸膜注射に基づく代替的なストラテジーは、同様に不満足であることが判明した（Bard et al. Lung Cancer 45 Suppl 1:S 129-31 (2004)）。現在の介入が限られた恩典のみを提供し、全体的な生存は低いので、MPMの根底にある分子機構のより深い理解に基づいて新規な治療剤を開発する危急の必要性が存在している。
【０００５】
肺癌およびMPMの分子病理的起源には、優勢な発癌遺伝子および劣勢の腫瘍抑制遺伝子を含む複数の遺伝子の発現および機能の変化、ならびに細胞シグナル伝達経路の異常が含まれる。肺癌およびMPMの病理的起源についてのより良好な理解は、肺癌を有する患者の治療を改善するはずである。
【０００６】
分泌糖タンパク質のウィングレス（Wingless）型（Wnt）ファミリーは、発生プロセスおよび発現に広く関与するシグナル伝達分子の群である（Polakis、Genes Dev. 14: 1837-51 (2000) ; Lustig et al. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 129:199-221 (2003)）。このように19種のヒトWntタンパク質が同定されてきた。Wntシグナルの伝達は、細胞表面受容体の2つの別個のファミリー：フリッツルド（frizzled）（Fz）受容体ファミリーおよびLDL受容体関連タンパク質（LRP）ファミリーへのWntシグナルの結合によって引き起こされる（Akiyama、Cytokine Growth Factor Rev.11:273-82 (2000)）。細胞内で、Wntシグナル伝達はディシェベルド（dishevelled）（Dvl）タンパク質を活性化し、これは、β-カテニンのグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK-3β）リン酸化を阻害し、その細胞質安定化をもたらす。次いで、安定化されたβ-カテニンは細胞核に入り、LEF/TCF転写因子と結合する。β-カテニン-Tcf/Lefは、重要な下流の標的遺伝子の転写を誘導し、それらの多くは癌に関係している。Wntシグナルの非存在下では、遊離の細胞質β-カテニンが、Axin、大腸腺腫様ポリポーシス（APC）遺伝子産物、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ（GSK）-3βからなる複合体に取り込まれる。GSK-3βによる、Axin、APC、およびβ-カテニンの結合体的なリン酸化は、ユビキチン経路およびプロテアソームによる分解のためのβ-カテニンを意味する（Uthoff et al. 、Int J Oncol 19 (4):803-10（2001）; Matsuzawa et al.、Mol Cell 7(5):915-26 2001)）。
【０００７】
ディシェベルド(Dvl）は、フリッツルド受容体の上流かつβ-カテニンの下流に位置するWntシグナル伝達のポジティブメディエーターである。GSK-3はWnt経路においていくつかのタンパク質をリン酸化し、β-カテニンの下流の調節の手段となる。遺伝子APCにおける変異は、散発性と遺伝性の両方の直腸結腸腫瘍形成のための起因事象である。異常なタンパク質がWntシグナル伝達カスケードの不可欠な部分であるので、APC変異体は腫瘍形成に関与している。このタンパク質産物はβ-カテニンのための結合および分化の部位として作用するいくつかの機能的ドメインを含む。β-カテニンのアミノ末端セグメントに存在する変異は、通常、リン酸化依存性のユビキチン媒介性分解に関与し、従って、β-カテニンを安定化する。安定化された細胞質カテニンが蓄積する場合、これは、核に移行して、c-mycなどの発癌遺伝子の発現を媒介する、Tcf/Lef高移動度グループの転写因子と相互作用する。
【０００８】
Wnt/β-カテニンシグナル伝達が、種々の細胞型において細胞の生存を促進することが知られている（Orford et al.、J Cell Biol 146(4):855-68 (1999); Cox et al.、Genetics 155(4):1725-40 (2000); Reya et al.、Immunity 13(1):15-24 (2000); Satoh et al.、Nat_Genet 24 (3):245-50 (2000); Shih et al.、Cancer Res 60(6):1671-6 (2000); Chen et al.、J Cell Biol 152(1):87-96 (2001); Ioannidis et al.、Nat_Immunol 2(8):691-7 (2001)）。Wntシグナル伝達経路はまた、腫瘍の発生および/または進行と関連すると考えられている（Bienz et al.、Cell 103(2):311-20 (2000); Cox et al.、Genetics 155 (4):1725-40 (2000)；(Polakis、Genes Dev 14(15):1837-51 (2000); You t al.、J Cell Biol 157(3): 429-40 (2002)）。Wntシグナル伝達経路の異常な活性化は、種々の癌と関連し、c-Mycの過剰増殖および増幅と相関する（He et al.、Science 281 (5382):1509-12 (1998); Miller et al.、Oncogene 18 (55):7860-72 (1999); Bienz et al.、Cell 103(2):311-20 (2000); (Polakis、Genes Dev 14(15):1837-51 (2000); Brown、Breast Cancer Res 3(6):351-5(2001)）。加えて、c-Mycは、結腸直腸癌細胞におけるβ-カテニン/Tcfの転写標的の1つとして同定された（He et al.、Science 281 (5382):1509-12 (1998); Miller et al.、Oncogene 18(55):7860-72 (1999); You et al.、J Cell Biol 157(3): 429-40 (2002)）。
【０００９】
Wntリガンドに加えて、分泌性フリッツルド関連タンパク質のファミリー（sFRP）もまた単離されてきた。sFRPは、分泌性Wntリガンドの結合について膜貫通フリッツルド受容体と競合することによって、Wntシグナル伝達の可溶性内因性モジュレーターとして機能すると考えられる（Melkonyan et al.、Proc Natl Acad Sci U S A 94 (25):13636-41 (1997)）。sFRPは、タンパク質を結合し、およびその細胞表面シグナル伝達受容体への接近をブロックすることによって、Wnt機能と拮抗できるか、またはフリッツルド受容体へのリガンドの提示を容易にすることによって、Wnt活性を増強するかのいずれかができる（Uthoff et al.、Int J Oncol 19(4):803-10 (2001)）。sFRPは、アポトーシス感受性を調節すると考えられ、プログラムされた細胞死に対して拮抗効果を働かせる。今日まで、sFRPは、癌に対しての原因としてまだ関連付けられていない。しかし、sFRPは、結腸直腸癌細胞株において高頻度で過度にメチル化されていると報告されており、この過度のメチル化は基礎的なsFRP発現の欠如と関連する（Suzuki et al.、Nat Genet 31(2):141-9 (2002)）。
【００１０】
別のディッコフ（Dickkopf）（Dkk）と呼ばれるタンパク質もまた、Wntシグナル伝達と干渉し、および細胞質β-カテニンの蓄積を減少することが見い出されている（Moon et al.、Cell 88 (6):725-8 (1997); Fedi et al.、J Biol Chem 274(27):19465-72 (1999)）。DKK-1は、フリッツルド受容体に隣接するLDL受容体関連タンパク質6（LRP6）に結合することによってWnt誘導性シグナルと拮抗する（Nusse,. Nature 411 (6835):255-6 (2001)）。Dkk-1の過剰発現は、アポトーシスに対して腫瘍細胞を感受性にすることが見い出されている（Shou et al.、Oncogene 21 (6):878-89 (2002)）。
【００１１】
細胞増殖および腫瘍成長に対するWntタンパク質の効果は、それらの同種の細胞表面受容体と相互作用し、続いて下流のシグナル伝達を誘導するWntタンパク質に依存すると考えられる。Wntタンパク質が分泌されると、抗体は、その細胞表面受容体へのWntの結合に干渉するかまたはそれを阻害するために使用されてもよく、従って、下流のシグナル伝達に影響を与える。Wntタンパク質に対するいくつかの抗体が生成されてきた。例えば、抗Wnt-1（G-19）（sc-6280; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）および抗Wnt-2（H-20)(sc-5208; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）は、それぞれ、ヒトのWnt-1タンパク質およびWnt2タンパク質のN末端の近傍にマッピングされるペプチドに対して産生されたヤギポリクローナル抗体である。Wnt2（V-16）は、ヒト起源のWnt2の内部領域中にマッピングされるペプチドに対して産生されたヤギポリクローナル抗体である（sc-5207; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）。抗Wnt1および抗Wnt2抗体もまたWO 2004/032828に記載される。
【００１２】
Wntタンパク質に関連する関心対象の別の領域は、予後診断および治療の選択肢を決定することができる転座によってしばしば特徴付けられる急性白血病である。最近、急性骨髄性白血病における転座がWntシグナル伝達経路を活性化できることが報告された(Muller-Tidow et al、MoI Cell Biol 24:2890-4 (2004))。これらの染色体異常の中で、t(1;19)転座は、発癌遺伝子特性を示すキメラE2A-Pbx1タンパク質の産生を生じる(Kamps et al、Genes Dev 5:358-68 (1991))。E2a-Pbx1の分子特性は広範に特徴付けられており、いくつかの候補標的遺伝子が同定されている。最近の研究において、Wnt16に対して光明が差してきた。融合タンパク質を含む白血病細胞株対E2a-Pbx1を欠く他のタンパク質を含む白血病細胞株において実施された代表的なディファレンシャル発現分析は、推定の標的遺伝子としてWnt16を同定した(McWhirter et al、Proc Natl Acad Sci USA 96:11464-69 (1999))。さらに、白血病芽細胞の遺伝子発現プロファイリングは、E2A-Pbx1発現白血病におけるWnt16の顕著な過剰発現を示した(Ross et al、MoI Cell 12:393-400 (2003))。それにも関わらず、急性白血病におけるWnt16およびWnt関連タンパク質によって果たされる特異的役割にはこれまで取り組まれていない。
【００１３】
また最近、Wnt16の2つのアイソフォーム、Wnt16aおよびWnt16bが同定された(Fear et al、Biochem Biophys Res Commun 278:814-820 (2000))。これらのアイソフォームは、それらの5'末端で異なるWnt16タンパク質アイソフォームをコードする異なるmRNAアイソフォームから生成されるようである。有意なレベルのWnt16a発現が膵臓において観察されるのに対して、Wnt16bは、成体の腎臓、胎盤、脳、心臓および脾臓において最も高いレベルで、より遍在性に発現される(Fear et al、Biochem Biophys Res Commun 278(3):814-20 (2000))。Wnt16発現はまた、脾臓、虫垂、およびリンパ節のような末梢リンパ器官において観察されてきたが、骨髄においては観察されていない(McWhirter et al、Proc Natl Acad Sci USA, 96(20): 11464-9 (1999))。しかし、高レベルのWnt16は、前B急性リンパ芽球性白血病(ALL)に由来する骨髄および細胞株において観察されてきたが、Wnt16の異常な発現は、t(1;19)前B ALLの発症における鍵となる段階であることが示唆されている(McWhirter et al、Proc Natl Acad Sci USA, 96(20):11464-9 (1999))。正常なB細胞と比較して、Wnt16のより高い発現は、B細胞慢性リンパ性白血病においてもまた観察された(CLL; Lu et al、Proc Natl Acad Sci USA 101(9):3118-23 (2004))。
【００１４】
Wntシグナル伝達の理解における最近の進歩にも関わらず、発癌におけるWnt16経路の役割、および特に、Wnt16アイソフォームのそれぞれの役割は明らかではなく、なお解明されなければならない。従って、先行技術は、Wnt16経路を調節する化合物が、Wnt16を過剰発現する細胞、特に、癌細胞の治療のために有用であり得ることの明確な証拠を提供し損なっている。本発明は、これらおよび他の必要性に取り組む。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、Wnt16遺伝子が、t(1:19)染色体転座を通して小児前B急性リンパ芽球性白血病(ALL)の大部分において活性化されるという発見に少なくとも部分的に基づく。t(1:19)転座は、Wnt16遺伝子、通常Wnt16b遺伝子の異常な活性化を引き起こすキメラ転写因子(E2A-Pbx1)を産生する。次いで、Wnt16は自己分泌様式で作用し、その正常な細胞機能を動揺させ、前B ALLに導く。
【００１６】
本発明は、Wnt16を過剰発現する細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞の増殖を阻害するのに有効である量のWnt16シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。
【００１７】
ある態様において、細胞は癌細胞である。癌細胞は、肺癌、中皮腫、黒色腫、結腸癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、白血病、リンパ腫および非小細胞肺癌細胞からなる群より選択される。
【００１８】
好ましい癌細胞は白血病細胞であり、および特にt(1;19)転座を含むものである。ある態様において、白血病細胞は、急性リンパ芽球性白血病細胞、前B細胞急性リンパ芽球性白血病細胞またはB細胞慢性リンパ性白血病細胞である。
【００１９】
別の好ましい癌細胞は肺癌細胞である。乳癌細胞もまた好ましい。
【００２０】
1つの態様において、因子はsiRNAである。ある態様において、因子は抗Wnt16抗体、例えば、Wnt16タンパク質、好ましくはヒトWnt16タンパク質に特異的に結合する抗体である。
【００２１】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗Wnt16抗体が好ましい。
【００２２】
本発明はさらに、ヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99に対応するアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)からなるポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt16抗体を提供する。別の抗Wnt16抗体は、ヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99(SEQ ID NO:2)からなるポリペプチドを特異的に結合する。
【００２３】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体とWnt16タンパク質を結合させることについて競合する抗Wnt16抗体もまた好ましい。
【００２４】
別の好ましい抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体とWnt16タンパク質を結合させることについて競合する抗体である。別の抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99からなるポリペプチドに特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体とWnt16タンパク質を結合させることについて競合する。
【００２５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、多数の方法で調製および修飾することができる。例えば、抗体は、組換えにより産生されてもよい。好ましいものは、マウスモノクローナル抗体のような抗wnt16モノクローナル抗体である。ある態様において、抗Wnt16抗体は、キメラ、ヒト化抗体、単鎖Fvフラグメントまたは完全なヒト抗体である。特に好ましいものはヒト抗Wnt16 Fab抗体である。
【００２６】
本発明の方法は、インビトロおよび/またはインビボで実施することができる。
【００２７】
本発明はまた、癌を処置する治療方法を提供する。これらの態様において、癌細胞は患者の中にあり、細胞を接触させる工程が患者に因子を投与することによって実施される。本方法はさらに、化学療法剤または放射線治療のような第2の治療剤を患者に投与する工程を含んでもよい。
【００２８】
本発明はさらに、Wnt16を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。本方法は、細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である量のWnt16シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。別の局面において、細胞中のWnt16シグナル伝達を阻害する方法が提供される。本方法は、Wnt16シグナル伝達を阻害するのに有効である量の抗Wnt16抗体またはWnt16 siRNAと、Wnt16を過剰発現する細胞を接触させる工程を含む。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、Wnt16シグナル伝達に関連する疾患を治療する方法が提供される。本方法は、疾患を治療するのに有効である量のWnt16シグナル伝達を阻害する因子を、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む。因子は、抗Wnt16抗体またはWnt16 siRNAであり得る。疾患は癌、好ましくは、肺癌、中皮腫、黒色腫、結腸癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、白血病、リンパ腫および非小細胞肺癌細胞からなる群より選択される癌であり得る。
【００３０】
さらに、本発明は、Wnt16を過剰発現する細胞を患者からの生物学的試料中で検出する方法を提供し、本方法は、生物学的試料中でWnt16発現のレベルを検出する工程を含む。好ましい生物学的試料は血液、痰、尿または糞便であり、特に好ましいものは血清である。
【００３１】
本方法の1つの局面において、Wnt16発現のレベルを検出する工程は、Wnt16 mRNAのレベルを検出することによって実施される。Wnt16 mRNAは、Win16a、Win16bまたはWnt16c mRNAのいずれかであり得る。別の局面において、Wnt16発現のレベルを検出する工程は、Wnt16タンパク質のレベルを検出することによって実施される。
【００３２】
Wnt16発現のレベルの検出は、治療法に対する患者または個体の応答を予測するために使用することができる。1つの態様において、治療法は、モノクローナル抗Wnt16抗体を患者に投与する工程を含む。
【００３３】
さらに、本発明は、抗Wnt16抗体またはWnt16 siRNAならびに薬学的に許容される賦形剤、担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。本抗体は、蛍光標識、放射性同位元素または細胞毒性化学物質のようなエフェクター成分にさらに結合体化することができる。
【００３４】
本発明の方法、抗体、薬学的組成物およびキットは、本明細書に記載されるような詳細を含む。
【００３５】
定義
「Wntタンパク質」または「Wntリガンド」という用語は、ショウジョウバエ（Drosophila）セグメントポラリティー遺伝子、ウィングレス（wingless）に関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。ヒトにおいては、Wntファミリーの遺伝子は、典型的には、疎水性シグナル配列、および保存性アスパラギン連結オリゴサッカリド共通配列（Shimizu H et al.、Cell Growth Differ 8(12):1349-58 (1997)）を有する38〜43kDaのシステインリッチな糖タンパク質をコードする。Wntファミリーは、少なくとも21個の哺乳動物メンバーを含む。例示的なWntタンパク質には、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、WNT10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15、Wnt16a、Wnt16b、およびWnt16cが含まれる。好ましい本発明のWntタンパク質は、ヒトWnt16a、Wnt16b、およびWnt16cであり、好ましくはヒトWnt16a、Wnt16b、およびWnt16cであり、その配列は配列表に記載される。他に明記されない限りは、「Wnt16」という用語は、本明細書に記載のWnt16アイソフォームを含む。
【００３６】
「フリッツルドタンパク質」または「フリッツルド受容体」という用語は、組織極性の発生において役割を果たす、ショウジョウバエフリッツルド遺伝子に関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。このフリッツルドファミリーは、少なくとも10個の哺乳動物遺伝子を含む。例示的なヒトフリッツルド受容体には、フリッツルド1、フリッツルド2、フリッツルド3、フリッツルド4、フリッツルド5、フリッツルド6、フリッツルド7、フリッツルド8、フリッツルド9およびフリッツルド10が含まれる。ショウジョウバエフリッツルドタンパク質の哺乳動物ホモログは、多数の共通の構造的モチーフを共有する。細胞外膜表面に位置するN末端に、シグナル配列、10個のシステイン残基の不変パターンを有する120アミノ酸のドメイン、および40〜100個の大部分は可変の親水性アミノ酸の高度に分岐した領域が続く。推定の疎水性セグメントは、疎水性ループによって連結される7個の膜貫通へリックスを形成し、膜の細胞内表面に位置するC末端で終わる。システインリッチドメイン（CRD）および膜貫通セグメントは強く保存されており、細胞外CRDが可変性リンカー領域によって7個の膜貫通へリックスの束につながれているワーキングモデルを示す。それゆえに、フリッツルドタンパク質受容体は、アミノ末端リガンド結合ドメインを有するGタンパク質共役受容体に類似する膜貫通シグナル伝達の動的モデルに含まれる。例えば、フリッツルド1、フリッツルド2、およびフリッツルド7は、肺癌および結腸直腸癌に含まれ（Sagara et al.、Biochem Biophys Res Commun 252(1):117-22 (1998)）；フリッツルド3は、肺癌、子宮頸部癌および結腸直腸癌を含むヒトの癌細胞に含まれ（Kirikoshi et al.、Int J Oncol 19(4):767-71(2001)）；フリッツルド7は胃癌に含まれ（Kirikoshi et al.,Int J Oncol 19(4):767-71 (2001)）；フリッツルド10は胃癌および結腸直腸癌に含まれる（Kirikoshi et al.、Int J Oncol 19(4):767-71 (2001); Terasaki et al.、Int J Mol Med 9(2):107-12 (2002)）。
【００３７】
「ディシェベルド」または「Dvl」という用語は、ディシェベルドタンパク質のファミリーのメンバーをいい、その全長配列は、典型的には、3つの保存性ドメイン、Wnt拮抗タンパク質Axinに存在するDIXドメイン；タンパク質-タンパク質相互作用に関与するPDZドメイン、およびRho GTPaseを調節するタンパク質に見い出されるDEPドメインを保有する。Dvlタンパク質には、例えば、Dvl-l、Dvl-2、およびDvl-3が含まれる。Dvlの核酸配列およびタンパク質配列は、マウスおよびヒトを含む様々な種から知られている。例示的なヒトDvl-l、Dvl-2、およびDvl-3のタンパク質配列は、それぞれ、参照配列NP_004412、NP_004413、およびNM_004414の下で使用可能である。
【００３８】
Wntシグナル伝達および特にWnt16シグナル伝達の「阻害剤」とは、例えば、Wntもしくはフリッツルドタンパク質に結合するか、またはWntシグナル伝達についての公知のアッセイ法（例えば、β-カテニンの測定、またはTcfおよびLefの転写因子によって制御される発癌遺伝子発現の測定）において測定されるようなWntシグナル伝達を部分的もしくは全体的にブロックする、化合物をいう。阻害剤には、修飾されたバージョンのWntまたはフリッツルドタンパク質、ならびに天然に存在する、および合成の、リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、低分子化学物質などが含まれる。本発明の阻害剤を検出するためのアッセイ法は、以下により詳細に記載される。
【００３９】
「Wnt16タンパク質を過剰発現する細胞」「Wnt16 mRNAを過剰発現する細胞」「Wnt16タンパク質を過剰発現する癌細胞」または「Wnt16 mRNAを過剰発現する癌細胞」という語句、またはその文法的な等価物は、Wnt16タンパク質またはWnt16 mRNAの発現が、同じ組織からの正常な細胞における発現のレベルの、少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍である細胞または癌細胞をいう。特定の遺伝子の発現のレベルを決定するための方法は、当技術分野で周知である。このような方法には、RT-PCR、遺伝子産物に対する抗体の使用などが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子に対する言及を含み、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ結合体抗体（例えば、二特異性抗体）のような遺伝子操作された形態を含む。用語「抗体」はまた、抗原結合能力を有する断片（例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、FvおよびrIgG。Pierce Catalog and Handbook、1994-1995 (Pierce Chemical Co.、Rockford、ILもまた参照されたい）を含む、抗体の抗原結合型を含む。例えば、Kuby、Immunology、第3版、W.H. Freeman & Co. 、New York (1998)もまた参照されたい。この用語はまた、組換え単鎖Fv断片（scFv）をいう。この用語の抗体はまた、二価または二特異性抗体、ジアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーを含む。二価および二特異性分子は、例えば、Kostelny et al.. (1992) J Immunol 148: 1547、Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579、Hollinger et al.、1993、前記、Gruber et al. (1994) J Immunol :5368、Zhu et al.、(1997) Protein Sci 6:781、Hu et al.、(1996) Cancer Res. 56:3055、Adams et al.、(1993) Cancer Res. 53:4026、およびMcCartney et al.、(1995) Protein Eng. 8:301において記載されている。
【００４１】
特定の抗原と免疫学的に反応性である抗体は、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択のような組換え方法、例えば、Huse et al.、Science 246: 1275-1281 (1989) ; Ward et al.、Nature 341:544-546 (1989); およびVaughan et al.、Nature Biotech. 14:309-314 (1996)を参照されたい、または抗原もしくは抗原をコードするDNAで動物を免疫することによって、生成することができる。
【００４２】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含む（これらの領域は「ドメイン」としても知られる）。軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる、3つの超可変領域によって割り込まれた4つの「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびCDRの含量が定義されてきた。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種の中で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の合わせたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、三次元空間にCDRを配置および整列させるように働く。
【００４３】
CDRは、抗原のエピトープへの結合のために主要な原因である。各鎖のCDRは、典型的には、N末端から開始して連続的に番号付けされたCDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ、特定のCDRが位置する鎖によって典型的には同定される。従って、VH CDR3が、それが見い出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置するのに対して、VL CDR1は、それが見い出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのCDR1である。
【００４４】
「VH」または「VH」との言及は、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、これは、Fv、scFv、dsFv（ジスルフィド安定化Fv）またはFabを含む。「VL」または「VL」との言及は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、これは、Fv、scFv、dsFvまたはFabを含む。
【００４５】
「単鎖Fv」または「scFv」という語句は、伝統的な2つの鎖の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが1つの鎖を形成するように結合されている抗体をいう。典型的には、リンカーペプチドが2つの鎖の間に挿入され、適切な折りたたみおよび活性結合部位の生成を可能にする。
【００４６】
「キメラ抗体」は、（a）抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは変化したクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、またはそのキメラ抗体に新たな特性を付与する全体的に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域、またはその一部が変化、置き換え、または交換されている。あるいは（b）可変領域、またはその一部が、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化、置き換え、または変化されている、免疫グロブリン分子である。
【００４７】
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種のCDRからの残基（ドナー抗体）によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。ある場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDR配列またはフレームワーク配列においても見い出されない残基を含んでもよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれであり、フレームワーク（FR）領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン共通配列である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む（Jones et al.、Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al.、Nature 332:323-329 (1988); およびPresta,Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596 (1992)）。ヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法に従って（Jones et al.、Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al.、Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al.、Science 239:1534-1536 (1988)）、ヒト抗体の対応する配列の代わりに、齧歯類のCDRまたはCDR配列で置換することによって本質的に実施することができる。従って、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号）、ここでは、完全なヒト可変ドメインに実質的に満たないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。
【００４８】
「完全なヒト抗体」という用語は、ヒトフレームワークおよび定常領域に加えて、ヒト可変領域を含む免疫グロブリンをいう。このような抗体は、当技術分野において公知である種々の技術を使用して産生することができる。例えば、インビトロ方法は、バクテリオファージ（例えば、McCafferty et al.、1990、Nature 348: 552-554; HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); およびMarks et al.、J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)）、酵母細胞（Boder and Wittrup、1997、Nat Biotechnol 15:553-557）、またはリボソーム（Hanes and Pluckthun、1997、Proc Natl Acad Sci U S A 94:4937-4942）上で提示されるヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって作製することができる。曝露（challenge）の際に、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子の再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む、すべての面においてヒトにおいて観察されるものと密接に類似する。このアプローチは、例えば、米国特許第6,150,584号、同第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,661,016号、および以下の科学文献（例えば、Jakobavits、Adv Drug Deliv Rev. 31:33-42 (1998)、Marks et al.、Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al.、Nature 368: 856-859 (1994); Morrison、Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al.、Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger、Nature Biotechnology 14: 826 (1996); LonbergおよびHuszar、Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)）において記載されている。
【００４９】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、タンパク質の三次元折りたたみによって並列された連続するアミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に対して保持されるのに対して、三次元折りたたみによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に対して失われる。エピトープは、独特な空間的コンホメーションにおいて、代表的には、少なくとも3つ、より通常には、少なくとも5つまたは8個〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンホメーションを決定する方法には、例えば、x線結晶解析および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、Vol. 66、Glenn E. Morris、Ed (1996)を参照されたい。
【００５０】
「生物学的試料」は、本明細書で使用されるように、例えば、Wntのタンパク質、ポリヌクレオチドまたは転写物の、核酸またはポリペプチドを含む生物学的組織または液体の試料である。このような試料には、霊長類、例えば、ヒト、または齧歯類、例えば、マウスおよびラットから単離された組織が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料はまた、生検および剖検の試料のような組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙液、粘液、毛髪、皮膚などを含んでもよい。生物学的試料はまた、患者の組織に由来する移植片および一次細胞培養および/または形質転換細胞培養を含む。生物学的試料は、典型的には、真核生物、最も好ましくは、例えば、チンパンジーまたはヒト；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えば、モルモット、ラット、マウス；ウサギなどの哺乳動物；または鳥類；爬虫類；または魚類から得られる。
【００５１】
「生物学的試料を提供する」とは、本発明において記載される方法における使用のために生物学的試料を得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、動物、好ましくはヒトからの細胞の試料を取り出すことによって行われるが、しかしまた、事前に単離された（例えば、別のヒトによって、別の時間に、および/もしくは別の目的で単離された）細胞を使用することによって、またはインビボで本発明の方法を実施することによって達成することができる。治療または結果の履歴を有するアーカイブ（archival）組織が特に有用である。
【００５２】
生物学的試料における「Wnt16 mRNAのレベル」とは、細胞または生物学的試料中に存在するWnt16遺伝子から転写されるmRNAの量をいう。mRNAは、一般的に、機能的Wnt16タンパク質をコードするが、コードされたタンパク質の機能を変化または除去する変異が存在してもよい。「Wnt16 mRNAのレベル」は定量される必要はないが、対照試料からのレベルまたは対照試料の予測されるレベルに対する比較を伴って、または伴わずに、単に、例えば、主観的な、ヒトによる目視的な検出で検出することができる。
【００５３】
生物学的試料における「Wnt16タンパク質またはポリペプチドのレベル」とは、細胞または生物学的試料中に存在するWnt16 mRNAから翻訳されたポリペプチドの量をいう。このポリペプチドは、Wnt16タンパク質機能を有してもよいし、または有さなくてもよい。「Wnt16タンパク質のレベル」は定量される必要はないが、対照試料からのレベルまたは対照試料の予測されるレベルに対する比較を伴って、または伴わずに、単に、例えば、主観的な、ヒトによる目視的な検出で検出することができる。
【００５４】
「同一である」または「同一性」パーセントという用語は、2つまたはそれ以上の酢酸またはポリペプチドの配列の状況において、以下に記載されるデフォルトパラメーターを用いるBLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを使用して、または手動のアライメントおよび目視の検査によって測定されるような、同じであるか、または特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、比較ウィンドウまたは所定の領域にわたって最大の一致のために比較および整列化された場合の、特定の領域にわたる約60%の同一性、好ましくは、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性）を有する2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列をいう（例えば、Altschul et al.、Nucl Acids Res 25:3389-34021 (1977) およびAltschul et al.、J Mol Biol 215:403-410 (1990)を参照されたい）。次いで、このような配列は、「実質的に同一である」といわれる。この定義はまた、試験配列の相補体をいい、またはそれに適用されてもよい。この定義はまた、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然に存在する、例えば、多型変異体または対立遺伝子変異体、および人工の改変体を含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップおよび同様のものを考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約25アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域にわたって存在し、またはより好ましくは、50〜100アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域にわたって存在する。
【００５５】
配列比較のために、典型的には、1つの配列は参照配列として働き、試験配列がそれに対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合、サブ配列座標が指定され、および配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトパラメーターが使用可能であり、または代替的なパラメーターが指定可能である。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した、試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００５６】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用されるように、代表的には、20〜600、通常約50〜約200、より通常には約100〜約150からなる群より選択される連続する位置の数の1つのセグメントに対する言及を含み、ここで、1つの配列は、2つの配列が最適に整列化された後で、同じ数の連続する位置の参照配列に対して比較されてもよい。比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性についての検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または手動のアライメントおよび目視の検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. 、eds. 1995 supplement)を参照されたい）実施することができる。
【００５７】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切であるアルゴリズムの好ましい例には、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムが含まれ、これは、Altschul et al.、Nucl Acids Res 25:3389-3402 (1977) および Altschul et al.、J Mol Biol 215:403-410 (1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST2.0は、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントを決定するために、本明細書に記載されるパラメーターを用いて使用される。BLAST分析を使用するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通して公的に使用可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における長さWの短いワードを同定することによって、高い得点の配列対（HSP）を最初に同定することを含み、これは、データベース中の同じ長さのワードと整列化された場合に、いくつかのポジティブ値の閾値スコアTに一致するか、またはそれを満足するかのいずれかである。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、前記）。これらの初期の隣接ワードのヒットがそれらを含むより長いHSPを見い出すための検索を開始するための種子として働く。このワードヒットは、累積アライメントスコアが増加可能である限り、各配列が沿っている両方の方向において伸長される。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列については、パラメーターM（適合する残基の対についてのリワードスコア；常に>0）およびN（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に<0）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に中断される：累積アライメントスコアがその最大の達成された値から量Xだけ落ちる場合；累積スコアが、1つもしくは複数のネガティブスコア残基アライメントの蓄積に起因して、0以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、11のワード長（W）、10の予測値（E）、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の予測値（E）、および50のBLOSUM62スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff、Proc Natl Acad Sci USA 89: 10915 (1989)を参照されたい）アライメント（B）、10の予測値（E）、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使用する。
【００５８】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する（例えば、KarlinおよびAltschul、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873-5787 (1993)を参照されたい）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率（P(N)）であり、これは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合性が偶然に起こる可能性の指標を提供する。例えば、核酸は、最小合計確率が、参照核酸に対する試験核酸の比較において、約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合には、参照配列に対して類似であると見なされる。対数値は大きな負の数、例えば、5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170などである場合がある。
【００５９】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下に記載されるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、代表的には、例えば、2つのペプチドが保存性置換によってのみ異なる場合に、第2のポリペプチドに対して実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるように、2つの分子またはそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であることのなお別の指標は、同じプライマーがそれらの配列を増幅するために使用可能であることである。
【００６０】
「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋である」という用語は、その天然の状態において見い出される場合に、通常それに付随する成分を、本質的にまたは実質的に含まない物質をいう。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析科学技術を使用して決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質または核酸は実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、天然に遺伝子と隣接し、および目的の遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、ある態様において、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味する。好ましくは、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、および最も好ましくは、少なくとも99%純粋であることを意味する。「純度」または「精製」は、他の態様において、精製されるために組成物から少なくとも1つの夾雑物を取り除くことを意味する。この意味において、精製は、精製された物質が均質、例えば、100%純粋であることを必要としない。
【００６１】
「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書で交換可能に使用される。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するポリマー、修飾した残基を含むもの、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００６２】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似して機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合されるα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このようなアナログは、修飾されたR基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有してもよいが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物をいう。
【００６３】
アミノ酸は、それらの共通して知られている3文字記号、またはIUPAC-IUB生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨される1文字記号のいずれかによって、本明細書で言及されてもよい。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受容されている1文字記号によって言及されてもよい。
【００６４】
「保存的修飾改変体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定のアミノ酸配列に関して、保存性修飾改変体とは、同一であるかまたは本質的に同一であるアミノ酸をコードする核酸をいい、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一でありまたは関連する、例えば、天然に隣接する配列をいう。遺伝コードの縮重のために、機能的に同一である多数の核酸が大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは、すべてアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応する別のコドンに変化させることができる。このような核酸のバリエーションは「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾されるバリエーションの1つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列はまた、核酸のサイレントバリエーションを記載する。当業者は、特定の状況において、核酸中の各コドン（通常はメチオニンについての唯一のコドンであるであるAUG、および通常はトリプトファンについての唯一のコドンであるTGGを除く）が、機能的に同一である分子を産生するために修飾することができることを認識する。従って、しばしば、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関して記載された配列において暗黙的であるが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【００６５】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列中の単一のアミノ酸またはアミノ酸の少ないパーセンテージを変化、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、またはタンパク質の配列への個々の置換、欠失または付加が、変化が化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる「保存性修飾改変体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存性修飾の表は、当技術分野において周知である。このような保存性修飾改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えてであり、およびこれらを除外しない。典型的には、互いに対する保存性置換は、1）アラニン（A）、グリシン（G）；2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4）アルギニン（R）、リジン（K）；5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；7）セリン（S）、スレオニン（T）；および8）システイン（C）、メチオニン（M）である（例えば、Creighton、Proteins (1984)を参照されたい）。
【００６６】
ポリペプチド構造のような高分子構造は、種々のレベルの組織化の点から記載することができる。この組織化の一般的な議論については、例えば、Alberts et al.、Molecular Biology of the Cell (3rd ed.、1994) およびCantorおよびSchimmel、Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照されたい。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド中の局所的に秩序立てられた三次元構造をいう。これらの構造は、一般的にはドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドの密な単位をしばしば形成し、かつ代表的には、25〜約500アミノ酸長までであるポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、β-シートおよびα-へリックスのストレッチなどのより低い組織化のセクションで作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、通常、三次構造単位とは独立した非共有結合による会合によって形成される三次元構造をいう。
【００６７】
「標識」または「検出可能部分」は、分光光度法的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能である組成物である。例えば、有用な標識には、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えば、ペプチドに放射性標識を取り込むことによって検出可能に作製することができるか、またはペプチドと特異的に反応性である抗体を検出するために使用されるタンパク質または他の実体が含まれる。放射性同位元素は、例えば、3H、14C、32P、35S、または125Iであってもよい。ある場合において、特に、本発明のタンパク質に対する抗体を使用して、放射性同位元素は、以下に記載するように、毒性部分として使用される。標識は、任意の位置において、核酸、タンパク質、および抗体に取り込まれてもよい。標識に抗体を結合体化するための、当技術分野において公知である任意の方法が使用されてもよく、これには、Hunter et al.、Nature、144: 945 (1962); David et al.、Biochemistry、13: 1014 (1974); Pain et al.、J. Immunol. Meth.、40: 219 (1981); およびNygren、J. Histochem. and Cytochem.、30: 407 (1982)によって記載された方法が含まれる。放射性標識されたペプチドまたは放射性標識された抗体組成物の寿命は、放射性標識されたペプチドまたは抗体を安定化し、およびそれを分解から保護する物質の付加によって延長されてもよい。放射性標識されたペプチドまたは抗体を安定化する任意の物質および物質の組み合わせが使用されてもよく、これには米国特許第5,961,955号に開示されるような物質が含まれる。
【００６８】
「エフェクター」または「エフェクター部分」または「エフェクター成分」は、リンカーもしくは化学結合を通して共有結合により、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電的結合、もしくは水素結合を通した非共有結合によるいずれかで、抗体に結合される（または連結される、または結合体化される）分子である。「エフェクター」は、例えば、放射活性化合物、蛍光化合物、酵素または基質、エピトープタグのようなタグ、毒素；活性化可能な部分、化学療法剤；リパーゼ；抗生物質；または放射性同位元素放射「ハード」、例えば、β照射を含む、検出部分を含む種々の分子であり得る。
【００６９】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターへの言及とともに使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然型の核酸もしくはタンパク質の変化によって修飾されたこと、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型中には見い出されない遺伝子を発現し、またはさもなくば異常に発現され、少なく発現され、もしくは全く発現されない天然型遺伝子を発現する。「組換え核酸」は、本明細書では、一般的に、核酸の操作によって、例えば、通常天然には見い出されない形態で、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用して、インビトロでもともと形成された核酸を意味する。この様式で、異なる配列の作動可能な連結が達成される。従って、直鎖型の単離された核酸、または通常連結されていないDNA分子をライゲーションすることによってインビトロで形成された発現ベクターは、両方とも、本発明の目的のための組換えと見なされる。一旦組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されると、これは非組換えにより、すなわち、インビトロ操作以外の宿主細胞のインビボ細胞機構を使用して複製する。しかし、一旦組換えにより産生されるが、引き続いて非組換えにより複製されるこのような組換え核酸は、なお、本発明の目的のための組換えと見なされることが理解される。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち、上記に示すような組換え核酸の発現を通して作製されるタンパク質である。
【００７０】
「異種」という用語は、核酸の部分に対する言及とともに使用される場合、核酸が、天然において互いに同じ関連性において通常は見い出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを意味する。例えば、核酸は、代表的には、組換えにより産生され、2つまたはそれ以上の配列を有し、例えば、新たな機能的核酸を作製するために配列された関連性のない遺伝子、例えば、1つの供給源からのプロモーターおよび別の供給源からのコード領域からである。同様に、異種タンパク質は、しばしば、天然には互いに同じ関連性において見い出されない2つまたはそれ以上のサブ配列（例えば、融合タンパク質）をいう。
【００７１】
抗体または抗原、例えば、タンパク質、好ましくはWnt16タンパク質に「特異的に（もしくは選択的に）結合する」、または「〜と特異的に（もしくは選択的に）免疫反応性である」という語句は、タンパク質またはペプチドまたは抗体に言及する場合には、タンパク質および他の生物物質の異種集団における、タンパク質の存在に決定的である結合反応をいう。従って、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の抗体が、特定のタンパク質に、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10倍から100倍より多く結合する。
【００７２】
このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質についてのその特異性について選択される抗体を必要とする。例えば、特定のタンパク質、多型改変体、対立遺伝子、オルトログ、および保存性修飾改変体、またはスプライシング改変体、またはそれらの一部に対して産生された抗体が、Wnt16タンパク質と特異的に免疫反応性であり、かつ他のタンパク質とは免疫反応性でない抗体のみを得るために選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を除外することによって達成されてもよい。種々のイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用されてもよい。例えば、固相ELISAイムノアッセイ法が、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特定の免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ法の形式および条件の説明については、HarlowおよびLane、Antibodies、A Laboratory Manual (1988)を参照されたい）。
【００７３】
「腫瘍細胞」は、腫瘍における前癌性細胞、癌性細胞、および正常細胞をいう。
【００７４】
「癌細胞」「形質転換」細胞または組織培養における「形質転換」とは、新たな遺伝物質の取り込みを必ずしも含まない、自発的または誘導された表現型の変化をいう。形質転換は、形質転換ウイルスでの感染、および新規なゲノムDNAの取り込み、または外来性DNAの取り込みから生じ得るが、これはまた、自発的にまたは発癌物質への曝露後に生じることができ、それによって、内因性遺伝子を変異させる。本発明において、形質転換は、典型的には、Wntの過剰発現、特にWnt16、および/またはフリッツルドタンパク質と関連する。形質転換は、細胞の不死化、異常な増殖制御、非形態学的な変化、および/または悪性度などの他の表現型の変化と関連する（Freshney、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)）。
【００７５】
「低分子干渉RNA」または「siRNA」は、好ましくは、10ヌクレオチド長より長く、より好ましくは15ヌクレオチド長より長く、および最も好ましくは18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のヌクレオチド長である、配列特異的なRNA分解を誘発する鍵となる中間体として機能することが示されている、単離されたRNA分子を意味する。19〜25ヌクレオチドの範囲が、siRNAにとって最も好ましいサイズである。siRNAはまた、短いヘアピンRNA（shRNA）を含むことができ、ここでは、siRNA二重鎖の両方の鎖は、単一のRNA分子内に含まれる。二本鎖siRNAは、一般的に、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる。一本鎖siRNAは、一般的に、標的遺伝子またはmRNAに相補的であるアンチセンス鎖のみからなる。siRNAは、任意の種類のRNA、好ましくは、dsRNA（より大きなdsRNAのタンパク質分解的に切断された生成物、部分精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え産生されたRNA）、ならびに1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または変化によって天然に存在するRNAとは異なる修飾RNAを含む。
【００７６】
詳細な説明
発癌におけるWnt-Fzシグナル伝達経路の役割は、WO 04/032838においてある程度記載されている。本発明は、Wnt16を過剰発現する多数の細胞および癌において顕著なアポトーシスを誘導することができるWnt16シグナル伝達の阻害剤を提供する。本発明は、Wnt16シグナル伝達に関連する疾患、特に、Wnt16シグナル伝達、特にWnt16bシグナル伝達が癌細胞の増殖または生存に影響を与える癌の治療のために有用である。本発明は特に、肺癌、中皮腫、黒色腫、結腸癌、脳腫瘍、乳癌、腎臓癌、白血病、およびリンパ腫と同様に、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、前B細胞急性リンパ芽球性白血病(前B ALL)およびB細胞慢性リンパ性白血病(CLL)のような癌を治療するために特に有用である。本発明はまた、胎盤、心臓または脾臓における異常なまたは異型のWnt16シグナル伝達に関連する疾患を治療するためにもまた有用である。
【００７７】
I. Wnt16タンパク質に対する抗体
上記に記述したように、本発明は、Wnt16を過剰発現する細胞、好ましくは癌細胞におけるWnt16シグナル伝達を阻害する方法を提供する。本発明のある態様において、抗体が、Wnt16リガンドとフリッツルド受容体の間の結合をブロックするために使用される。抗体は、Wntまたはフリッツルド受容体タンパク質のいずれかに対して惹起させることができる。好ましいものは抗Wnt16抗体である。本発明において有用な抗体の産生は、例えば、WO 04/032838に記載されている。
【００７８】
A. 抗Wnt16モノクローナル抗体の生成
本発明の方法、薬学的組成物およびキットにおいて使用され得る抗体は、本明細書に十分に記載されるような、ポリクローナル抗Wnt16抗体、抗Wnt16モノクローナル抗体、または抗Wnt16抗体であってもよい。好ましくは、抗体は抗Wnt16モノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、種々の方法で調製されてもよい。好ましい方法は、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495 (1975)によって記載されるもののようなハイブリドーマ法を使用する。ハイブリドーマ法においては、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、代表的には、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生し、またはそれを産生可能であるリンパ球を誘発するために、免疫因子で免疫される。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫されてもよい。
【００７９】
一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合には、末梢血リンパ球（「PBL」）が使用され、または非ヒト哺乳動物の供給源が所望される場合には、リンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して、不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、pp. 59-103 (1986)）。不死化細胞株は、通常、形質転換哺乳動物株、特に、齧歯類、ウシ、およびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が使用される。このハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない、不死化細胞の増殖または生存を阻害する1種または複数の物質を含む、適切な培地中で培養されてもよい。例えば、親の細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「HAT培地」）、これらの物質は、HGPRT-欠損細胞の増殖を妨害する。
【００８０】
B. 抗原性Wnt16ポリペプチド
いくつかの抗Wnt16モノクローナル抗体が、本明細書に記載される方法を使用して生成することができる。本発明の1つの態様において、免疫因子は、代表的には、Wnt16ポリペプチド、例えば、SEQ ID NO:1(Wnt16a)またはSEQ ID NO:2(Wnt16b)に示されるようなWnt16アイソフォームを含む。免疫因子としての使用のための他の有用なWnt16アイソフォームは、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO 21に示される。Wnt16タンパク質アイソフォームは、以下のいずれかからなるとして記載される:355アミノ酸残基(Wnt16a; Gen Bankアクセッション番号EAL24346およびNP_057171(SEQ ID NO:1))、365アミノ酸残基(Wnt16b;GenBankアクセッション番号NP_476509 (SEQ ID NO:2);Q9UBV4、EAL24346およびAAD49351)または361アミノ酸残基(Wnt16c;GenBankアクセッション番号AAD38052)。これらのアイソフォームは、それらのN末端で主として異なる(図1)。Wnt16aはそのN末端に特異的アミノ酸配列
2008505933.tif 000003
を示す。Wnt16cはさらに、SEQ ID NO:22に加えて、そのN末端に配列MERHPP(SEQ ID NO:23;図1)を含む。Wnt16bは、そのN末端に異なる配列:
2008505933.tif 000004
を示す。しかし、2つの変動性の性内部位置もまた存在する:Wnt16aは72位にグリシン(G)(SEQ ID NO:1および図1を参照されたい)またはアルギニン(R;SEQ ID NO:20および図1を参照されたい)のいずれかを有する。対応する位置において、Wnt16bはグリシン(G;SEQ ID NO:2および図1を参照されたい)を有し、Wnt16cはアルギニン(R;SEQ ID NO:21)を有する。別の変動性の位置は、Wnt16aの253位、ならびにWnt16bの263位およびWnt16cの259に対応する位置に存在する。この位置において、Wnt16aおよびWnt16bはスレオニン(T;SEQ ID NOS:1、20および2;図1)を有し、Wnt16cはイソロイシン(I;SEQ ID NO:21;図1)を示す。
【００８１】
従って、本発明の別の局面において、抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:22、23、および24に示されるペプチドのような、特定のWnt16アイソフォームに特異的なペプチドを免疫ペプチドとして使用して生成される。好ましい抗原性ペプチドは、SEQ ID NO:2に示されるヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99を含む（図1）。抗原性ペプチドは、合成的に生成されてもよく、またはインビボで、例えば、大腸菌(E.coli)中で発現されてもよい。例えば、SEQ ID NO:2(図1)に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99を含むポリペプチドは、大腸菌中で発現され、精製され、および抗原として使用した。
【００８２】
本発明の別の局面において、免疫因子はヒトWnt16の抗原性ペプチドである。ヒトWnt16の抗原性ペプチドは、種々の方法を使用して決定することができる。例えば、EMBOSS法(Parker et al、Biochemistry 25:5425-5432 (1986))、タンパク質中の抗原性部位を見い出す。抗原性ペプチドはまた、Kolaskar and Tangaonkar (K&T; FEBS Lett. (1990) 276(1-2):172-4)の方法を使用して決定することができる。両方の方法は、ヒトWnt16の類似の抗原性ペプチドの同定をもたらす(表1)。同定された抗原性ペプチドの大部分がヒトWnt16に特異的に結合する抗体を生成するために使用することができる一方、ある抗体は、これらのWnt16アイソフォーム間のアミノ酸配列相同性に起因して、Wnt16a、Wnt16bおよび/またはWnt16cに結合してもよい。
【００８３】
（表１）ヒトWnt16bの抗原性ペプチド
2008505933.tif 000005
【００８４】
C.抗Wnt16抗体
本明細書に開示される抗原性ペプチドは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗Wnt16抗体を生成するために使用することができる。モノクローナル抗体が好ましい。
【００８５】
本発明の好ましい態様において、抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する抗体である。SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21とは異なるアミノ酸配列からなり、およびまた、成熟Wnt16タンパク質、すなわち、シグナルペプチドが切断されて除去されているWnt16タンパク質の配列とは異なるポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt16抗体もまた好ましい。
【００８６】
本発明のなお別の好ましい態様において、抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:2に示されるようなWnt16のアミノ酸残基1〜99を含むポリペプチドを特異的に結合する抗体である。SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt16抗体もまた好ましい。好ましくは、この抗体はヒト抗体であり、なおより好ましくは、ヒトFabである。
【００８７】
本発明の別の好ましい態様において、抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:2に示されるようなWnt16のアミノ酸残基1〜99からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体である。SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に結合する抗Wnt16抗体もまた好ましい。好ましくは、この抗体はヒト抗体であり、なおより好ましくは、ヒトFabである。
【００８８】
本発明の1つの態様において、抗Wnt16抗体は、Wnt16タンパク質またはWnt16ペプチドに特異的に結合する。本発明の別の態様において、本発明の抗Wnt16抗体は、Wnt16発現細胞の細胞表面抗原に結合する。本発明のなお別の態様において、抗Wnt16抗体は、フリッツルド受容体のような受容体へのWnt16タンパク質の結合を阻害する。別の好ましい本発明の態様において、Wnt16抗体はWnt16シグナル伝達を阻害する。
【００８９】
D.組換え抗Wnt16抗体の生成
本発明の抗Wnt16抗体は、種々の方法で調製することができる。本発明の1つの局面において、抗Wnt16抗体は組換えにより産生される。この方法において、ハイブリドーマによって産生される抗Wnt16モノクローナル抗体をコードする核酸が配列決定される。好ましくは、モノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)をコードする核酸が配列決定される。従って、本発明の1つの局面において、抗Wnt16抗体は、抗Wnt16抗体をコードする核酸を発現ベクターに挿入することによって産生され、次いで、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされる。次いで、宿主細胞を、発現のために適切な条件下で培養する。
【００９０】
これらの手順は、参照により本明細書に組み入れられる、Maniatis et al.、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1982)において一般的に記載されるように、当技術分野において一般的に公知である。「ベクター」とは、細胞中で転写されることが可能である核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物をいう。ヌクレオチド配列（コード配列と非コード配列の両方）の増幅のために使用されるベクターもまた、この定義に含まれる。コード配列に加えて、ベクターは、一般的に、制限酵素切断部位、ならびに、それらの構築および使用を容易にするためにベクター内で通常使用される、他の冒頭の、末端の、および中間のDNA配列を含む。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの型である、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、既知のヌクレオチドアナログまたは修飾バックボーン残基もしくは連結を含む核酸を含み、これらは、合成であり、天然に存在し、および天然に存在せず、これらは、参照核酸と同じ結合特性を有し、ならびにこれらは、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。このようなアナログの例には、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチドおよびペプチド-核酸（PNA）が含まれる。
【００９１】
本発明の抗Wnt16モノクローナル抗体またはその断片およびCDR配列についてのコード配列は、化学技術、例えば、Matteucci et al. (J Am Chem Soc. 1981、103:3185)のホスホトリエステル法によって合成されてもよい。「コード配列」という用語は、核酸配列との関連において、コドンと呼ばれる3つのヌクレオチドの複数の連続セットをいい、各コドンは、汎用遺伝コードに従って生化学的因子によって翻訳されるようなアミノ酸に対応し、その全体の配列が発現されるタンパク質、またはタンパク質の発現を阻害するアンチセンス鎖をコードする。「遺伝コード配列」は、連続するコドンが、非コード介入配列、または「イントロン」によって断続的に中断されるコード配列である。mRNAプロセシングの間に、イントロン配列は除去され、タンパク質をコードする連続するコドン配列が回復する。
【００９２】
DNAまたはRNA配列中での任意の修飾が、適切な塩基を、所望のアミノ酸配列をコードする塩基で単に置換することによって作製することができる。次いで、コード配列が、適切なリンカーとともに提供することができ、当技術分野において一般的に使用可能である発現ベクターに連結することができ、およびこのベクターは、免疫刺激ペプチドまたはタンパク質を産生するために適切な宿主を形質転換するために使用することができる。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が市販されている。発現のために、コード配列は、作動可能に連結された開始コドンおよび終止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域、ならびに、所望の細胞宿主における発現のために発現ベクターを提供するために通常は複製系を伴って提供される。例えば、細菌宿主と適合性であるプロモーター配列は、所望のコード配列の挿入のための便利な制限部位を含むプラスミド中で提供される。得られる発現ベクターは、適切な細菌宿主に形質転換される。当然、酵母または哺乳動物の細胞宿主もまた使用されてもよく、当業者に公知であるように、適切なベクターおよび制御配列を使用する。
【００９３】
E. キメラおよびヒト化抗Wnt16抗体
本発明のある態様において、抗Wnt16抗体は、キメラまたはヒト化抗体である。上記に記述したように、ヒト化型の抗体はキメラ免疫グロブリンであり、ここでは、ヒト抗体の相補性決定領域（CDR）が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のCDRからの残基によって置き換えられている。
【００９４】
ヒト抗体は、当技術分野において公知である種々の技術を使用して産生することができ、これらには、ファージディスプレイライブラリー（HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al.、J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)）が含まれる。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために使用可能である（Cole et al.、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、p. 77 (1985) およびBoerner et al.、J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。曝露の際に、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子の再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含むすべての点で、ヒトにおいて見られるものと密接に類似する。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,661,016号、および以下の科学刊行物：Marks et al.、Bio/Technology 10:779- 783 (1992) ; Lonberg et al.、Nature 368: 856-859 (1994); Morrison、Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al.、Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger、Nature Biotechnology 14: 826 (1996); LonbergおよびHuszar、Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)において記載されている。
【００９５】
F. Wnt16を結合する単鎖Fv抗体
ある態様において、抗体は単鎖Fv（scFv）である。scFv抗体のVHおよびVL領域は、2つの鎖の抗体において見い出されるものと類似の抗原結合部位を作るように折りたたまれる単鎖を含む。一旦折りたたまれると、非共有結合による相互作用が単鎖抗体を安定化する。ある抗体のVHおよびVL領域は直接的に一緒に連結することができるのに対して、当業者は、これらの領域が、1つまたは複数のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって分離されてもよいことを認識する。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当技術分野において周知である。例えば、Huston et al.、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8: 5879 (1988); Bird et al.、Science 242: 4236 (1988); Glockshuber et al.、Biochemistry 29: 1362 (1990); 米国特許第4,946,778号、同第5,132,405号およびStemmer et al.、Biotechniques 14: 256-265 (1993)を参照されたい。一般的に、ペプチドリンカーは、領域を結合させるか、またはVHとVLの間のある程度の最小距離もしくは他の空間的な関連性を保存するため以外の特異的生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は、折りたたみ、正味の電荷、または疎水性のような分子のある特性に影響を与えるように選択されてもよい。単鎖Fv（scFv）抗体は、任意に、50アミノ酸を超えない、一般的に40アミノ酸を超えない、好ましくは30アミノ酸を超えない、およびより好ましくは20アミノ酸を超えない長さのペプチドリンカーを含む。ある態様において、ペプチドリンカーは、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serのコンカテマー、好ましくは、2、3、4、5、または6個のこのような配列である。しかし、リンカー内にある程度のアミノ酸置換を作製することができることが理解される。例えば、バリンは、グリシンの代わりに置換され得る。
【００９６】
scFv抗体を作製するための方法は記載されてきた。例えば、Huse et al.、前記; Ward et al. 前記; およびVaughan et al.、前記を参照されたい。手短に述べると、免疫した動物からのB細胞からのmRNAを単離し、cDNAを調製する。このcDNAを、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを使用して増幅する。このPCR産物を精製し、核酸配列を結合する。リンカーペプチドが所望される場合、そのペプチドをコードする核酸配列を、重鎖の核酸配列と軽鎖の核酸配列の間に挿入する。scFvをコードする核酸をベクターに挿入し、適切な宿主細胞中で発現する。所望の抗原に特異的に結合するscFvは、代表的には、ファージディスプレイライブラリーのパニングによって見い出される。パニングは、任意のいくつかの方法によって実施することができる。パニングは、それらの表面上で所望の抗原を発現する細胞を使用して、または所望の抗原でコートされた固体表面を使用して便利に実施することができる。簡便には、この表面は磁気ビーズであり得る。未結合ファージは固体表面から洗い流され、結合したファージは溶出される。
【００９７】
選択されたパニングの方法に関わらず、ファージディスプレイによって提供される遺伝子型と表現型の間の物理的な関連付けは、大きなクローンのライブラリーを用いてでさえ、抗原への結合のためにcDNAライブラリーのあらゆるメンバーを試験することを可能にする。
【００９８】
G. 二特異性および結合体化された抗Wnt16抗体
ある態様において、抗体は二特異性抗体である。二特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原についての結合特異性を有するか、または同じ抗原上の2つのエピトープについて結合特異性を有する、モノクローナル、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。1つの態様において、結合特異性の1つはWnt16タンパク質についてであり、他の1つは別のタンパク質、例えば癌抗原についてである。代替として、四量体型技術が、多価試薬を作製してもよい。
【００９９】
ある態様において、抗体はエフェクター部分に結合体化される。エフェクター部分は、放射活性標識もしくは蛍光標識のような標識部分を含む、任意の数の分子であり得、または治療部分であり得る。エフェクター部分が治療部分である場合、これは、代表的には、細胞毒性薬剤である。本方法において、細胞毒性因子を癌細胞に標的化することは、標的細胞の直接的な殺傷を生じる。この態様は、代表的には、フリッツルド受容体に対する抗体を使用して実施される。細胞毒性因子は多くかつ様々であり、細胞毒性薬物または毒素またはこのような毒素の活性断片が含まれるがこれらに限定されない。適切な毒素およびそれらの対応する断片には、ジフテリアA鎖、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン（curcin）、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、オーリスタチン（auristatin）などが含まれる。細胞毒性因子はまた、Wnt16タンパク質に対して産生された抗体に放射性同位元素を結合体化すること、または抗体に共有結合されたキレート剤への放射性核種の結合によって作製された放射性化学物質を含む。
【０１００】
H. 本発明の抗体の結合親和性
標的抗原についての結合親和性は、典型的には、Biacore競合アッセイ法、飽和アッセイ法などの標準的な抗体-抗原アッセイ法、またはELISAもしくはRIAなどのようなイムノアッセイ法によって測定または決定される。
【０１０１】
このようなアッセイ法は、抗体の解離定数を決定するために使用することができる。「解離定数」という語句は、抗原についての抗体の親和性をいう。抗体と抗原の間の結合の特異性は、抗体の解離定数（KD=1/K、ここでKは親和性定数）が<1μM、好ましくは<100nM、および最も好ましくは<0.1nMである場合に存在する。抗体分子は、代表的には、より低い範囲のKDを有する。KD=[Ab-Ag]/[Ab] [Ag] ここで [Ab] は抗体の平衡状態の濃度であり、[Ag] は抗原の平衡状態の濃度であり、および [Ab-Ag] は抗体-抗原複合体の平衡状態の濃度である。代表的には、抗原と抗体の間の結合相互作用には、静電的結合、ファンデルワールス結合および水素結合のような、可逆的な非共有結合による結合が含まれる。
【０１０２】
本発明の抗体は、Wnt16タンパク質に特異的に結合する。「特異的に結合する」は、本明細書では、抗体が、少なくとも約0.1mM、より通常には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM以下、および最も好ましくは0.01μM以下のKDで、Wnt16タンパク質に結合することを意味する。
【０１０３】
I. 抗Wnt16モノクローナル抗体の競合的結合
ある態様において、抗Wnt16モノクローナル抗体が使用される。好ましい態様は、第2の抗Wnt16抗体と同じエピトープを結合する抗Wnt16モノクローナル抗体、例えば下記実施例に記載される抗Wnt16モノクローナル抗体である。別の抗体と同じエピトープを認識する特定の抗体の能力は、代表的には、抗原への第2の抗体の結合を競合的に阻害する1つの抗体の能力によって決定される。任意の多数の競合的結合アッセイ法を、同じ抗原への2つの抗体間の競合を測定するために使用することができる。例えば、サンドイッチELISA法を、この目的のために使用することができる。これは、ウェルの表面をコートするために捕捉抗体を使用することによって実施される。次いで、飽和以下の濃度のタグ化抗原を捕捉表面に加える。このタンパク質は、特異的抗体：エピトープ相互作用を通して抗体に結合される。洗浄後、検出可能な部分に共有結合された二次抗体（例えば、検出抗体として定義される標識された抗体を伴うHRP）をELISAに加える。この抗体が捕捉抗体と同じエピトープを認識する場合、特定のエピトープがもはや結合のために使用できなくなるのにつれて、標的タンパク質に結合することが不可能になる。しかし、この二次抗体が標的タンパク質上の異なるエピトープを認識する場合には、これは結合することが可能であり、およびこの結合は、関連する基質を使用して活性のレベル（およびそれゆえに結合した抗体）を定量することによって検出することができる。バックグラウンドは、捕捉抗体と検出抗体の両方として単一の抗体を使用することによって定義されるのに対して、最大シグナルは、抗原特異的抗体を用いて捕捉すること、および抗原上のタグに対する抗体を用いて検出することによって確立することができる。参照としてのバックグラウンドおよび最大活性を使用することによって、抗体は、エピトープ特異性を決定するために、対の様式で評価することができる。
【０１０４】
本発明の好ましい態様において、抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体と、Wnt16タンパク質を結合させることについて競合する抗Wnt16抗体である。SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16に示されるようなアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:21とは異なるアミノ酸配列からなり、およびまた、成熟Wnt16タンパク質、すなわち、シグナルペプチドが切断されて除去されているWnt16の配列とは異なるポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体と、Wnt16タンパク質を結合させることについて競合する、抗Wnt16抗体もまた好ましい。
【０１０５】
本発明のなお別の好ましい態様において、抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:2に示されるようなWnt16のアミノ酸残基1〜99を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体と、Wnt16タンパク質を結合させることについて競合する。SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体と、Wnt16タンパク質を結合させることについて競合する抗Wnt16抗体もまた好ましい。好ましくは、第2のWnt16抗体と競合する抗Wnt16抗体はヒト抗体であり、なおより好ましくは、ヒトFabである。
【０１０６】
本発明の別の好ましい態様において、抗Wnt16抗体は、SEQ ID NO:2に示されるようなWnt16のアミノ酸残基1〜99からなるポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体と、Wnt16タンパク質を結合させることについて競合する。SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16のアミノ酸残基1〜99に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に結合する第2の抗Wnt16抗体と、Wnt16タンパク質を結合させることについて競合する抗Wnt16抗体もまた好ましい。好ましくは、第2のWnt16抗体と競合する抗Wnt16抗体はヒト抗体であり、なおより好ましくは、ヒトFabである。
【０１０７】
上記のアッセイ法のいずれかを使用して、一次抗体の存在下で、抗原への二次抗体の結合が、少なくとも30%、通常少なくとも約40%、50%、60%、または75%、およびしばしば少なくとも約90%減少する場合に、一次抗体は、二次抗体の結合を競合的に阻害すると見なされる。
【０１０８】
II. Wnt16発現のレベルを検出するためのアッセイ法
本発明はまた、Wnt16を検出するための診断的アッセイ法を提供する。好ましい態様において、Wnt16遺伝子の活性は、遺伝子転写物（例えば、mRNA）の測定によって、翻訳されたタンパク質の量の測定によって、または遺伝子産物の活性の測定によって決定される。
【０１０９】
核酸ハイブリダイゼーションを使用して遺伝子転写物（mRNAまたはcDNA）を検出および/または定量する方法は、当業者に公知である。例えば、mRNAの存在、非存在、または量を評価するための1つの方法は、ノーザンブロット転写を含む。
【０１１０】
プローブは、Wnt16タンパク質をコードする核酸配列の全長または全長未満であり得る。プローブは、当技術分野において公知であるように、通常、放射性核種またはビオチンで標識され、およびニックトランスレーション、ランダムまたは特異的プライミングによった生成することができる。ハイブリダイゼーション条件もまた、当技術分野において記載されている。これらの手法は、一般的に、Maniatis et al、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)において記載されるように、当技術分野において一般的に公知である。より短いプローブが特異性について試験するために経験的に試験される。特定のWnt16アイソフォームmRNA、すなわち、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21に示されるようなWnt16をコードするWnt16a、Wnt16bまたはWnt16c mRNAまたはWnt mRNAは、先行技術において記載された方法を使用して検出することができる。これらの方法は、単一塩基対のミスマッチによって異なる核酸を区別するために使用することができる(Wallace et al、Nucleic Acids Res 9(4):879-94 (1991); Conner et al、Proc Natl Acad Sci USA 80(l):278-82 (1983))。好ましくは、核酸プローブは20塩基またはそれ以上の長さである。ハイブリダイズした部分の可視化は、mRNAの存在または非存在の定量的決定を可能にする。
【０１１１】
別の好ましい態様において、転写物（例えば、mRNA）は、DNAまたはmRNAのコピー数を直接的に評価するために、上記のように増幅（例えば、PCR）に基づく方法を使用して測定することができる。好ましい態様において、転写レベルは、逆転写PCR（RT-PCR）を使用することによって評価される。このような方法において有用なプライマー対は、SEQ ID NO:17〜19において開示されている。
【０１１２】
Wnt16遺伝子の「活性」はまた、発現されたWnt16ポリペプチドを検出または定量することによって、検出および/または定量することができる。ポリペプチドは、当業者に周知である任意の多数の手段によって検出および定量することができる。これらには、分析用生化学的方法、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、超拡散クロマトグラフィーなどが含まれ得る。単離されたタンパク質はまた、多型を同定するために、標準的な技術に従って配列決定することができる。
【０１１３】
本発明の抗体は、任意の多数の十分に認識されている免疫学的結合アッセイ法を使用して、Wnt16タンパク質またはそれらを発現する細胞を検出するために使用することができる（例えば、米国特許第4,366,241号; 同第4,376,110号; 同第4,517,288号; および同第4,837,168号を参照されたい）。一般的なイムノアッセイ法の概説については、Methods in Cell Biology、Vol. 37、Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology 7th Edition、StitesおよびTerr, eds. (1991)もまた参照されたい。
【０１１４】
従って、本発明は、Wnt16タンパク質を過剰発現する細胞、特に癌細胞を検出する方法を提供する。代表的には、Wnt16発現は、生物学的試料中で分析される。1つの方法において、生検が被験体上で実施され、収集された組織はインビトロで試験される。次いで、組織または組織からの細胞は、本発明の抗Wnt16抗体と接触される。生じる免疫複合体は、生検試料中のWnt16タンパク質の存在を示す。このような検出を容易にするために、抗体は、放射性標識されるか、または放射性標識などの検出可能な標識であるエフェクター分子にカップリングされ得る。
【０１１５】
別の方法において、Wnt16を過剰発現する細胞または癌細胞は、例えば、典型的な画像化システムを使用して、インビボで検出される。次いで、標識の局在は、標識を検出するための任意の公知の方法によって決定される。診断的画像化を可視化するための従来的な方法を使用することができる。例えば、常磁性同位元素は、MRIのために使用することができる。抗体の内在化は、循環クリアランスと共役した細胞外酵素的環境によるクリアランスに対して感受性である、細胞外結合によって提供されるものを超えて、生物内での寿命を延長するために重要であり得る。
【０１１６】
上記に記載した方法はまた、予後アッセイ法において、または薬物応答を予測するために、すなわち、薬理ゲノミクスマーカーとして使用することができる。特に、本発明の方法は、本明細書に記載される治療法に対する応答を予測するために使用することができる。例えば、このような方法は、本発明の抗Wnt16抗体を使用する治療方法に対する応答を予測するために使用することができる。
【０１１７】
III. 抗Wnt16抗体およびsiRNAを使用する方法
Wnt16シグナル伝達を阻害する因子、例えば、本発明の抗Wnt16抗体およびsiRNAは、様々な方法における使用を見い出す可能性がある。本発明の好ましい態様において、Wnt16を過剰発現する細胞の増殖を紫外する方法が提供される。過剰発現されるWnt16は、Wnt16タンパク質またはWnt16 mRNAのいずれかであり得る。本方法は、細胞の増殖を阻害するのに有効であるWnt16シグナル伝達を阻害する量の因子と、細胞を接触させる工程を含む。「増殖」は、細胞の成長、細胞または病的な嚢腫の再生または増大をいう。
【０１１８】
本発明の好ましい態様において、本方法はインビトロで実施される。本明細書でさらに説明されるように、本発明の方法はまた、インビボで実施することができる。
【０１１９】
本発明の好ましい態様において、因子と接触される細胞は癌細胞である。本発明の因子は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)細胞、前B細胞急性リンパ芽球性白血病(前B ALL)細胞、およびB細胞慢性リンパ性白血病(CLL)細胞、肺癌細胞、中皮腫細胞、黒色腫細胞、結腸癌細胞、脳腫瘍細胞、乳癌細胞、腎臓癌細胞、白血病細胞、およびリンパ腫細胞からなる群より選択される癌細胞の増殖を阻害するために有用である。本発明の1つの態様において、癌細胞は肺癌細胞である。本発明の別の好ましい態様において、癌細胞はALL細胞である。別の好ましい態様において、癌細胞は前B ALL細胞である。本発明のなお別の好ましい態様において、癌細胞はCLL細胞である。本発明はまた、胎盤、心臓または脾臓における異常なまたは異型のWnt16シグナル伝達と関連する疾患を治療するために有用である。
【０１２０】
A.アポトーシスの誘導
本発明の抗Wnt16抗体およびsiRNAのような、Wnt16シグナル伝達を阻害する因子は、種々の方法で用途を見い出してもよい。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導する方法が提供される。本方法は、細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な量の、Wnt16シグナル伝達を阻害する因子と細胞を接触させる工程を含む。抗Wnt16抗体およびsiRNAのような、本方法における使用のための因子が本明細書に開示される。
【０１２１】
B.Wnt16シグナル伝達の阻害
本発明の抗Wnt16抗体およびsiRNAのような本発明の因子は、種々の方法で用途を見い出してもよい。本発明の別の好ましい態様において、細胞中のWnt16シグナル伝達を阻害する方法が提供される。本方法は、Wnt16シグナル伝達を阻害するのに有効な量の因子とWnt16を過剰発現する細胞を接触させる工程を含む。抗Wnt16抗体およびsiRNAのような、本方法における使用のための因子が本明細書に開示される。
【０１２２】
C.疾患の治療
本発明の抗Wnt16抗体およびsiRNAのような本発明の因子は、種々の方法で用途を見い出してもよい。本発明の別の好ましい態様において、細胞中のWnt16シグナル伝達と関連する疾患を治療する方法が提供される。本方法は、疾患を治療するのに有効な量のWnt16シグナル伝達を阻害する因子を、被験体、好ましくは、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む。好ましくは、被験体はヒトである。抗Wnt16抗体およびsiRNAのような、本方法における使用のための因子が本明細書に開示される。
【０１２３】
好ましい態様において、疾患は癌である。本発明の因子は、急性またはリンパ芽球性白血病(ALL)、前B細胞急性リンパ芽球性白血病(前B ALL)、B細胞慢性リンパ性白血病(CLL)、肺癌、中皮腫、黒色腫、結腸癌、脳腫瘍、乳癌、腎臓癌、白血病、およびリンパ腫からなる癌を治療するために有用である。本発明の1つの態様において、癌は肺癌である。本発明の別の態様において、癌はALLである。別の好ましい態様において、癌は前B ALLである。本発明のなお別の好ましい態様において、癌はCLLである。
【０１２４】
本発明はまた、胎盤、心臓または脾臓における異常なまたは異型のWnt16シグナル伝達と関連する疾患を治療するために有用である。
【０１２５】
本明細書で使用されるように、「治療する」「治療すること」および「治療」という用語は：（1）癌のような疾患を予防すること、すなわち、疾患に対して素因がある可能性があるが、まだその疾患の任意の徴候を経験していない被験体において、その疾患の臨床的徴候が発症しないようにすること；（2）疾患を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその臨床的徴候の発症を停止もしくは減少すること；または（3）疾患を軽減すること、すなわち、疾患もしくはその臨床的徴候の後退を引き起こすことを含む。好ましくは、このような治療の必要がある被験体は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１２６】
本発明はまた、Wnt16を過剰発現する癌を治療する方法を提供する。本方法は、癌を治療するのに有効である量の因子を、そのような治療の必要がある被験体に投与する工程を含む。本方法における使用のための因子、例えば、抗Wnt2抗体またはsiRNAが本明細書で開示される。
【０１２７】
D. 被験体における癌細胞の検出
本発明の因子、例えば、本発明の抗Wnt16抗体およびsiRNAは、種々の方法における使用を見い出す可能性がある。本発明の別の好ましい態様において、被験体における癌細胞を検出する方法が提供される。本方法は、生物学的試料が癌細胞であることが疑われる細胞を含む、被験体からの生物学的試料を提供する工程、および細胞中でWnt16発現のレベルを検出する工程を含む。任意に、本方法は、細胞中のWnt16発現のレベルを、1例もしくは複数の健常な被験体からの細胞中のWnt16発現のレベルと、またはWnt16発現のレベルについての所定の参照範囲と比較する工程を含む。本発明の1つの態様において、Wnt16発現のレベルを検出する工程は、Wnt16 mRNAのレベルを決定することによって実施される。本発明の別の態様において、Wnt16発現のレベルを決定する工程は、Wnt16タンパク質のレベルを検出することによって実施される。本方法における使用のための因子、例えば、抗Wnt16抗体またはsiRNAが本明細書で開示される。
【０１２８】
Wnt16発現のレベルの検出は、種々の理由のために決定されてもよい。Wnt16発現のレベルの検出は、（i）被験体における癌のスクリーニング、診断または予後診断の一部；（ii）癌に対する被験体の感受性を決定することの一部；（iii）被験体における癌の段階もしくは重篤度を決定することの一部；（iv）被験体にとって癌を発症することのリスクを同定することの一部；または（v）癌であると診断された被験体に投与される抗癌薬物もしくは治療の効果をモニターすることの一部であり得る。被験体に投与される抗癌薬物または治療は、本発明の抗Wnt2抗体またはsiRNAを含んでもよい。
【０１２９】
本発明の好ましい態様において、被験体における癌の段階または重篤度を同定するための方法が提供される。本明細書に示されるように、Wnt16発現は、白血病細胞、肺癌細胞、乳癌細胞のような種々の癌細胞において過剰発現される。本明細書にさらに示されるように、抗Wnt16抗体およびsiRNAは、これらの細胞において用量依存的な様式でアポトーシスを誘導する。従って、Wnt16の量は、種々の癌のリスクの状態、例えば、高い、中程度、または低い状態に特徴的である。癌の段階または重篤度は、Wnt16を測定すること、次いで、それらを分類アルゴリズムに供するか、またはそれらを、癌の特定の段階もしくは重篤度と関連するWnt16の参照の量および/またはパターンと比較するかのいずれかによって決定されてもよい。
【０１３０】
本発明の方法を使用して、Wnt16レベルは、癌を発症するリスクが決定される被験体からの生物学的試料において決定される。正常なもしくは健常な被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されるWnt16レベルよりも高いか、または所定の基礎レベルよりも低い、癌を発症するリスクが決定される被験体からの生物学的試料において検出されたWnt16レベルは、癌を発症するリスクが決定される被験体が、癌を発症するリスクを有することを示す。
【０１３１】
本発明の別の好ましい態様において、被験体における癌は、被験体における癌のスクリーニング、診断または予後診断の一環として決定される。本発明の方法を使用して、Wnt16レベルは、癌についてスクリーニングされる被験体からの生物学的試料において決定される。正常なもしくは健常な被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されるWnt16レベルよりも高いか、または所定の基礎レベルよりも低い、癌についてスクリーニングされる被験体からの生物学的試料において検出されたWnt16レベルは、癌についてスクリーニング被験体が、癌を有するか、または癌を有する可能性があることを示す。
【０１３２】
上記のように、Wnt16組成物は、Wnt16発現が過剰発現している癌の治療のために有用である。しかし、他の薬物、例えば、本明細書に記載するようなWnt16の阻害剤を含む組成物もまた、Wnt16が過剰発現している患者における癌を治療するために有用である。従って、本発明の好ましい態様において、癌の状態は、外科手術（例えば、腫瘍の除去）の効果、Wnt16発現が過剰発現されている癌であると診断された被験体への抗癌薬物または治療の効果をモニターすることの一環として決定される。外科手術または被験体に投与される抗癌薬物もしくは治療の効果は、癌の再発、癌の進行（悪化）および癌の後退（改善）を含み得る。
【０１３３】
本発明の組成物、方法およびキットを使用して、Wnt16レベルは、外科手術後の種々の時点で、または抗癌薬物もしくは治療が与えられた種々の時点で、被験体からの生物学的試料中で決定される。2回目に採取された同じ被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されたWnt16レベル（t2；例えば、抗癌薬物または治療を与えた後）よりも高い、1回目の被験体からの生物学的試料中で検出されたWnt16レベル（t1；例えば、抗癌薬物または治療を与える前）は、被験体における癌が後退しつつあることを示す。同じく、1回目のWnt16レベルと比較して、高い2回目のWnt16レベルは、被験体における癌が進行しつつあることを示す。同様に、2回目に採取された同じ被験体からの比較可能な生物学的試料において検出されたWnt16レベル（t2；例えば、外科手術の数週間または数ヶ月後）よりも高い、1回目の被験体からの生物学的試料中で検出されたWnt16レベル（t1；例えば、外科手術の直後）は、被験体における癌が再発していないことを示す可能性がある。同じく、1回目のWnt16レベルと比較して、高い2回目のWnt16レベルは、被験体における癌が再発しつつあることを示す。
【０１３４】
E. 本発明の方法における使用のためのsiRNA
本発明の方法を実施するために有用である本発明の因子には、抗Wnt16抗体およびWnt16のsiRNAが含まれるがこれらに限定されない。代表的には、このような因子は、（i）Wnt16 mRNAまたはWnt16タンパク質に結合すること、（ii）Wnt16シグナル伝達と干渉すること、および/または（iii）他のタンパク質、例えば、フリッツルド受容体へのWnt16タンパク質の結合を阻害することが可能である。好ましい態様において、細胞増殖を阻害する因子は、Wnt16のsiRNAである。本発明は、Wnt16発現を調節するためにRNA干渉を使用する組成物および方法を提供する。これらの方法および組成物は、疾患、特に癌の治療のため、アポトーシスの誘導のため、およびWnt16シグナル伝達と干渉するために有用である。
【０１３５】
多くの種において、代替的には低分子干渉RNA（siRNA）として本明細書に言及され得る二本鎖RNA（dsRNA）の導入は、強力かつ特異的な遺伝子サイレンシングを誘導し、これは、RNA干渉またはRNAiと呼ばれている現象である。この現象は、線虫C.エレガンス（C. elegans）において広範に実証されてきたが（Fire et al.、Nature、391、806- 811、1998）、トリパノソーマからマウスまでの範囲にわたって、他の生物において広範囲に及んでいる。議論される生物に依存して、RNA干渉は、「同時抑制」「転写後遺伝子サイレンシング」「センス抑制」および「クエリング（quelling）」と呼ばれてきた。RNAiは、これが特定の遺伝子の活性をノックアウトするための手段を提供するので、魅力的な生物工学技術である。これは、遺伝子分析または操作に対して受け入れ可能であると以前には考えられていなかった種における遺伝子発現をノックアウトするために特に有用である。
【０１３６】
RNAiは、通常は、dsRNAが、細胞質における相同mRNAの分解を誘発する、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）として記載されている。基本的プロセスは、相同メッセンジャーRNA（mRNA）の認識および標的化切断を導く短い単位（低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる）にプロセシンングされるdsRNAを含む。（プロセシング後に）RNAi/PTGSを誘発するdsRNAは、多数の方法で、核または細胞質において作られ得る。次にはmRNAを分解する、siRNAへのdsRNAのプロセシングは、2段階のRNA分解プロセスである。第1段階は、dsRNAを、21〜25ヌクレオチド（nt）長であるセンスおよびアンチセンスRNA（すなわち、siRNA）にプロセシンングする、dsRNAエンドヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼIII-様；RNaseIII-様）活性を含む、ショウジョウバエにおいては、このRNaseIII-型タンパク質はダイサーと呼ばれる。第2段階において、生成されたアンチセンスsiRNAは、RNA-誘導性サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれる異なるリボヌクレアーゼ複合体と合わされ、およびそのためのガイドとして働き、この複合体が相同一本鎖mRNAを切断する。RISCは、アンチセンスsiRNAと対合した領域のほぼ中央でmRNAを切断し、その後、mRNAがさらに分解される。異なる供給源からのdsRNAは、RNAi/PTGSに導くプロセシング経路に入ることができる。
【０１３７】
従って、本発明の好ましい態様において、本発明の方法における使用のための因子は、Wnt16のsiRNAである。siRNAは、Wnt16の発現レベルを減少するために使用することができる。Wnt16のsiRNAは、Wnt16 mRNAにハイブリダイズし、それによって、Wnt16タンパク質の産生を減少または阻害する。
【０１３８】
RNAi実験を設計する際に、siRNAの性質、サイレンシング効果の永続性、および送達系の選択のような考慮する必要があるいくつかの因子が存在する。RNAi効果を生成するために、生物に導入されるsiRNAは、エキソン配列を含むべきである。さらに、RNAiプロセシンングは相同性依存性であり、それゆえに、配列は、相同であるが、遺伝子特異的ではない配列の間の交差性干渉の可能性を最小化しながら、遺伝子の特異性を最大化するために注意深く選択されなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNAと遺伝子の間の配列の、90%より多く、または100%の同一性さえもが阻害されることを示す。標的遺伝子に対して約80%未満の同一性は、実質的に効果が低い。従って、Wnt16のsiRNAと、その発現が阻害されるWnt16遺伝子との間の相同性がより高いと、関連性のない遺伝子の発現が影響を受ける可能性がより低くなる。
【０１３９】
加えて、siRNAのサイズが重要である。一般的に、本発明は、Wnt16のsiRNA分子に関連し、これは、二本鎖または一本鎖であり、少なくとも約19〜25ヌクレオチドを含み、Wnt16の遺伝子発現を調節することが可能である。本発明の状況において、siRNAは、好ましくは、500、200、100、50または25ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、siRNAは、約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド長である。
【０１４０】
1つの局面において、本発明は、一般的に、Wnt16の少なくとも10個であるが30個を超えない連続するヌクレオチドに実質的に相補的である少なくとも1本の鎖を有し、かつWnt16遺伝子またはタンパク質の発現を減少する、少なくとも19ヌクレオチドの単離されたsiRNAを特徴とする。本発明の好ましい態様において、siRNA分子は、SEQ ID NO:25(GenBankアクセッション番号NM_057168)に示されるようなヒトWnt16遺伝子、または例えば、GenBankアクセッション番号NM_016087、AF152584、AF169963に示されるようなヒトWnt16遺伝子の少なくとも10個、好ましくは少なくとも19個であるが30個を超えない連続するヌクレオチドに実質的に相補的である少なくとも1本の鎖を有する。
【０１４１】
本発明の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000006
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000007
を含む。
【０１４２】
好ましい態様において、siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000008
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000009
を含む。
【０１４３】
本発明のなお別の好ましい態様において、Wnt16 siRNAは、
2008505933.tif 000010
の間で形成された二重鎖を含む。
【０１４４】
好ましい態様において、siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000011
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000012
を含む。
【０１４５】
好ましい態様において、siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000013
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000014
を含む。
【０１４６】
本発明のなお別の好ましい態様において、Wnt16 siRNAは、
2008505933.tif 000015
の間で形成された二重鎖を含む。
【０１４７】
好ましい態様において、siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000016
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000017
を含む。
【０１４８】
好ましい態様において、siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000018
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000019
を含む。
【０１４９】
本発明のなお別の好ましい態様において、Wnt16 siRNAは、
2008505933.tif 000020
の間で形成された二重鎖を含む。
【０１５０】
好ましい態様において、siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000021
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000022
を含む。
【０１５１】
好ましい態様において、siRNA核酸配列は
2008505933.tif 000023
である。本発明の別の好ましい態様において、Wnt16 siRNA核酸配列は、配列
2008505933.tif 000024
を含む。
【０１５２】
本発明のなお別の好ましい態様において、Wnt16 siRNAは、
2008505933.tif 000025
の間で形成された二重鎖を含む。
【０１５３】
別の好ましい態様において、Wnt16のsiRNA分子は、SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、または32に示される核酸配列に対して、少なくとも90%相同、好ましくは95%、99%、または100%相同である配列を含む。過度の実験を伴うことなく、および本発明の開示を使用して、Wnt16発現を調節するWnt16のさらなるsiRNAを、本発明の方法を実施するために、設計および使用することができる。
【０１５４】
siRNAはまた、1つまたは複数のヌクレオチドの変化を含んでもよい。このような変化は、例えば、19〜25ヌクレオチドRNAの末端、または内部（RNAの1つまたは複数のヌクレオチドにおける）への非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。好ましい態様において、RNA分子は3'-ヒドロキシル基を含む。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた、天然には存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、標準的ではないヌクレオチドを含むことができる。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾されたバックボーン、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくは当技術分野において公知である他の修飾されたバックボーンを含んでもよく、または天然ではないヌクレオシド間連結を含んでもよい。さらなるsiRNAの修飾（例えば、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、「汎用塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および逆方向デオキシ無塩基残基の取り込み）が、米国特許出願公報番号20040019001および米国特許第6.673,611号（参照により組み入れられる）において見い出すことができる。集合的に、上記のすべてのこのような変化したRNAを修飾siRNAと呼ぶ。
【０１５５】
好ましくは、RNAiは、10%、20%、30%、または40%、より好ましくは少なくとも50%、60%、または70%、および最も好ましくは、少なくとも75%、80%、90%、95%またはそれ以上、細胞中のWnt16の発現を減少することが可能である。
【０１５６】
細胞へのsiRNAの導入は、当技術分野において公知である方法によって達成することができ、これには、例えば、siRNAがそこから転写され得る核酸を含むベクターのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはトランスフェクションが含まれる。代替として、Wnt16についてのsiRNAは、Wnt16 mRNAへの結合が可能である形態で、細胞に直接的に導入することができる。永続性および膜透過性を増大させるために、siRNAは、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体と合わされるか、またはこれらで修飾される。好ましいものは、コレステロール結合体化されたWnt16についてのsiRNAである（Song et al.、Nature Med. 9: 347-351 (2003) を参照されたい）。
【０１５７】
F. 本発明の方法における使用のための抗Wnt16抗体
本発明の別の好ましい態様において、本発明の方法において使用される因子は、本明細書において十分に記載されるような抗Wnt16抗体である。抗Wnt16抗体は、本明細書において十分に記載されるような、ポリクローナル抗体、抗Wnt16モノクローナル抗体または抗Wnt16 Fabであり得る。好ましくは、本発明の方法は、抗Wnt16モノクローナル抗体を使用する。抗Wnt16 Fabも好ましい。ヒト抗Wnt16モノクローナル抗体またはヒト抗Wnt16 Fabは特に好ましい。
【０１５８】
IV. Wntシグナル伝達の阻害剤の同定
Wnt16タンパク質（またはそれらを発現する細胞）またはWntシグナル伝達経路のメンバー、例えば、dvlはまた、Wntシグナル伝達を阻害する因子を同定するための薬物スクリーニングアッセイ法において使用することができる。従って、本発明は、癌を阻害する組成物についてのスクリーニングのための新規な方法を提供する。
【０１５９】
Wnt16シグナル伝達についてのアッセイ法は、Wnt16シグナル伝達経路の任意の一部を検出および/または定量するために設計することができる。例えば、細胞内β-カテニンレベルに影響を与えるか、または標的細胞中でアポトーシスを誘導する薬剤の能力を測定することができる。これらの目的のために適切なアッセイ法は本明細書に記載される。
【０１６０】
アッセイ法は、Wnt16リガンド、フリッツルド受容体、またはWnt16シグナル伝達カスケードの別のメンバー、例えば、dvlのいずれかへの阻害剤の結合活性を試験するように設計されたものを含む。これらのアッセイ法は、Wnt16活性を調節する因子を同定する際に特に有用である。実質的に任意の因子が、このようなアッセイ法において試験することができる。このような因子には、天然または合成のポリペプチド、抗体、天然または合成の有機低分子、核酸などが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６１】
上述のように、分泌されたフリッツルド関連タンパク質（sFRP）は、分泌されたWntリガンドの結合についてフリッツルド受容体と競合することによって、Wntシグナル伝達の可溶性内因性モジュレーターとして機能する。従って、ある形式において、試験薬剤は、フリッツルド受容体の天然のリガンド（例えば、WntリガンドまたはsFRP）に基づく。
【０１６２】
Wnt16シグナル伝達を検出するための任意のアッセイ法は、ハイスループットスクリーニングに対して受け入れ可能である。ハイスループットアッセイ法、結合アッセイ法およびレポーター遺伝子アッセイ法は、同様に周知である。従って、例えば、米国特許第5,559,410号は、タンパク質についてのハイスループットスクリーニング法を開示し、米国特許第5,585,639号は核酸結合（すなわち、アレイにおいて）についてのハイスループットスクリーニング法を開示するのに対して、米国特許第5,576,220号および同第5,541,061号は、リガンド/抗体結合についてのスクリーニングのハイスループット法を開示する。
【０１６３】
加えて、ハイスループットスクリーニング系が市販されている（例えば、Zymark Corp.、Hopkinton、MA; Air Technical Industries、Mentor、OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton、CA; Precision Systems, Inc.、Natick、MAなどを参照されたい）。これらの系は、典型的には、すべての試料および試薬のピペッティング、液体の分注、時間設定したインキュベーション、およびアッセイ法のために適切である検出器中でのマイクロプレートの最終的な読み取りを含む、全体の手順を自動化している。これらの設定可能な系は、ハイスループットおよび迅速な開始、ならびに高い程度の柔軟性およびカスタマイズを提供する。このような系の製造業者は、種々のハイスループット系のための詳細なプロトコールを提供する。従って、例えば、Zymark Corp.は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニング系を説明する技術告示を提供する。
【０１６４】
本発明において有用である他のアッセイ法は、癌細胞の新生物表現型を試験するように設計されたものである。これらのアッセイ法には、軟寒天上での細胞増殖；足場依存性；増殖の接触阻害および密度制限；細胞増殖；細胞死（アポトーシス）；細胞形質転換；増殖因子または血清依存性；腫瘍特異的マーカーレベル；Matrigelへの侵襲性；インビボでの腫瘍増殖および転移；転移を受けた細胞中のmRNAおよびタンパク質の発現、ならびに癌細胞の他の特徴が含まれる。
【０１６５】
試験化合物が細胞増殖を阻害する能力はまた、疾患の動物モデルに試験を導入すること、およびインビボで癌細胞の増殖を評価することによって評価することができる。例えば、ヒト腫瘍細胞は、「ヌードマウス」のような免疫無防備状態の動物に導入することができる。試験因子（例えば、低分子または抗体）は、動物に投与され、--動物において形成された腫瘍の数および/またはサイズによって評価されるような--腫瘍を形成する腫瘍細胞の能力が、因子なしでの対照動物における腫瘍増殖と比較される。
【０１６６】
A. 遺伝子発現の阻害剤
本発明の1つの局面において、Wnt16シグナル伝達経路の阻害剤、例えば、Dvl阻害剤が、その経路における標的タンパク質の発現を阻害する核酸分子を含むことができる。従来的な、ウイルスまたは非ウイルスを用いた遺伝子移入方法が、操作されたポリペプチド、例えば、ドミナントネガティブ型のタンパク質をコードする核酸を、または代替的に、核酸、例えば、siRNAもしくはアンチセンスRNAなどの標的タンパク質発現の阻害剤を、哺乳動物細胞もしくは標的組織に導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームのような送達媒体と複合体化された核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、DNAおよびRNAウイルスが含まれ、これは、細胞への送達後に、エピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の概説としては、Anderson、Science 256: 808-813 (1992); NabelおよびFelgner、TIBTECH 11:211-217 (1993); MitaniおよびCaskey、TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon、TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller、Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt、Biotechnology 6 (10):1149-1154 (1988); Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); KremerおよびPerricaudet、British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al.、Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); および Yu et al.、Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。
【０１６７】
ある態様において、低分子干渉RNAが投与される。哺乳動物細胞において、長いdsRNA（>30nt）の導入は、しばしば、抗ウイルス性応答を開始し、これは、タンパク質合成およびRNA分解の非特異的阻害によって例示される。RNA干渉の現象は、例えば、Bass、Nature 411:428-29 (2001); Elbahir et al.、Nature 411: 494-98 (2001); および Fire et al.、Nature 391:806-11 (1998) において記載および議論されており、ここでは、干渉RNAを作製する方法もまた議論されている。siRNA阻害剤は、100塩基対未満であり、代表的には30bpsまたはそれより短く、および当技術分野において公知であるアプローチによって作製される。本発明に従う例示的なsiRNAは、29ヌクレオチドまで、25ヌクレオチド、22ヌクレオチド、21ヌクレオチド、20ヌクレオチド、15ヌクレオチド、10ヌクレオチド、5ヌクレオチド、またはその周辺またはその間の任意の整数を有することができる。
【０１６８】
V. 薬学的組成物
上述のように、Wnt16発現の阻害剤および本発明の因子は、Wnt16シグナル伝達に関連する疾患、例えば、Wnt16シグナル伝達に関連する癌を治療するために使用することができる。投与のための組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは、水性担体に溶解した、本明細書で十分に記載された因子を含む。種々の水性担体、例えば、緩衝化生理食塩水などが、使用することができる。これらの溶液は滅菌性であり、一般的に、望ましくない物質は含まない。これらの組成物は、従来的な、周知の滅菌技術によって滅菌されてもよい。これらの組成物は、適切な生理学的条件まで、必要とされるように、薬学的に許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでもよい。これらの製剤中の活性因子の濃度は広範に変化することができ、選択される投与の特定の様式および患者の必要性に従って、主として、液体の体積、粘度、体重などに基づいて選択される。
【０１６９】
従って、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、患者あたり1日あたり約0.1〜10mgである。薬物が隔離された部位に投与され、および血流中ではなく、例えば、体腔または器官の内腔には投与される場合、患者あたり1日あたり約0.1〜約100mgの投薬量が使用されてもよい。実質的により高い投薬量が、局所投与において可能である。非経口投与可能な組成物を投与するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、Remington's Pharmaceutical Science、15th ed.、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania (1980) のような刊行物においてより詳細に記載されている。
【０１７０】
薬学的組成物は、投与の方法に依存して、種々の単位投薬量で投与することができる。例えば、経口投与のために適切な単位投薬量形態には、散剤、錠剤、丸薬、カプセル、およびロゼンジが含まれるがこれらに限定されない。経口的に投与される場合に、抗体は、消化から保護されるべきであることが認識される。このことは、これらを酸性および酵素的加水分解に対して抵抗性にするための組成物と分子を複合体化することによって、またはリポソームもしくは保護バリアなどの適切に抵抗性である担体中に分子をパッケージすることのいずれかによって達成される。消化から因子を保護する手段は、当技術分野において周知である。
【０１７１】
本発明の阻害剤および/または因子（例えば、抗体）を含む組成物は、治療的または予防的な処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物は、疾患およびその合併症を治療するため、または少なくとも部分的にそれらを停止するために十分な量で、疾患（例えば、乳癌）に苦しむ患者に投与される。これを達成するために十分な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般的状態に依存する。単回または複数回の組成物の投与が、必要とされ、かつ患者によって許容されるような投薬量および頻度に依存して投与されてもよい。任意の事象において、組成物は、患者を有効に治療するために十分な量の本発明の因子を提供するべきである。患者における癌の発症を予防または遅延させることが可能である阻害剤の量は、「予防有効量」といわれる。予防的処置のために必要とされる特定の用量は、患者の医学的状態および病歴、予防される特定の癌、ならびに、年齢、体重、性別、投与の経路、有効性などの他の因子に依存する。このような予防的処置は、癌の再発を予防するために、例えば、以前に癌であった患者において、または癌を発症する有意な可能性を有すると疑われる患者において使用されてもよい。
【０１７２】
本発明の目的のための「患者」または「被験体」は、ヒトと他の動物の両方、特にヒトを含む。従って、本発明の方法は、ヒトの治療と獣医学的な適用の両方に適用可能である。好ましい態様において、患者は、哺乳動物、好ましくは霊長類、および最も好ましい態様において、患者はヒトである。
【０１７３】
他の公知の癌治療が、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。例えば、Wnt16シグナル伝達の阻害剤はまた、他の癌治療剤、例えば、5FU、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、シスプラチン、メトトレキサートなどを細胞に標的化および感作させるために使用されてもよい。他の態様において、本発明の方法は、放射線治療などとともに使用することができる。
【０１７４】
ある例において、抗体は、膜貫通タンパク質を複合体化された場合に、血清補体を活性化し、それによって細胞毒性または抗原依存性細胞毒性（ADCC）を媒介するサブタイプに属する。従って、癌は、癌細胞の表面上のフリッツルドタンパク質に対して指向される抗体を患者に投与することによって治療することができる。抗体標識は、共毒素を活性化し、毒素の負荷を局在化し、またはさもなくば局所的に細胞を除去するための手段を提供することができる。これらの態様において、抗体は、エフェクター部分に結合体化される。エフェクター部分は、放射活性標識もしくは蛍光標識のような標識部分を含む、任意の数の部分であり得、または細胞毒性因子などの治療部分であり得る。
【０１７５】
A. ワクチンとしてのWnt16ポリペプチドの使用
Wnt16シグナル伝達の阻害剤の投与に加えて、Wnt16タンパク質またはそれらの免疫学的断片は、HTL、CTL、および内因性タンパク質に対する抗体応答を刺激するためのワクチン組成物として投与することができる。このようなワクチン組成物は、例えば、脂質化ペプチド（例えば、Vitiello, et al. (1995) J Clin Invest 95: 341-349を参照されたい）、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド、「PLG」)ミクロスフェアにカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Eldridge et al. (1991) Molec Immuno 28: 287-294; Alonso et al. (1994) Vaccine 12:299-306; Jones et al. (1995) Vaccine 13: 675-681を参照されたい）、免疫刺激複合体中に含まれるペプチド組成物（ISCOMS; 例えば、Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875; Hu et al. (1998) Clin Exp Immunol 113:235-243を参照されたい）、複数の抗原ペプチド系（MAP; 例えば、Tam (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5409- 5413; Tam (1996) J Immunol Methods 196: 17-32)を参照されたい）；ウイルス送達ベクター（Perkus et al. 、p. 379、Kaufmann (ed. 1996) Concepts in Vaccine Development de Gruyter; Chakrabarti et al.、(1986) Nature 320: 535-537; Hu et al. (1986) Nature 320:537-540; Kieny et al.、(1986) AIDS Bio/Technology 4: 790-795; Top et al.、(1971) J Infect Dis 124:148-154; Chanda et al.、(1990) Virology 175:535-547)、ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Kofler et al.、(1996) J Immunol Methods 192:25-35; Eldridge et al.、(1993) Sem Hematol 30: 16-24; Falo et al.、(1995) Nature Med 7:649-653を参照されたい）を含むことができる。
【０１７６】
ワクチンは、しばしば、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたはミネラルオイル、および免疫応答の刺激剤、例えば、リピドA、百日咳菌（Bortadella pertussis）、またはヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のタンパク質などを含む。特定のアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories、Detroit、MI）；Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc.、Rahway、NJ）; AS-2（SmithKline Beecham、Philadelphia、PA）；水酸化アルミニウムゲルなどのアルミニウム塩（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；カチオン性またはアニオン性誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生物分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびクイル（quil）Aとして市販されている。サイトカイン、例えば、GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12、および他の同様の成長因子もまた、アジュバントとして使用されてもよい。
【０１７７】
ワクチンは、Wnt16ポリペプチドまたはその断片をコードするDNAまたはRNAが患者に投与される核酸組成物として投与することができる。例えば、Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468; 米国特許第5,580,859号; 同第5,589,466号; 同第5,804,566号; 同第5,739,118号; 同第5,736,524号; 同第5,679,647号; および WO 98/04720を参照されたい。DNAを用いた送達技術の例には、「裸のDNA」、促進化（ブピビカイン、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第5,922,687号を参照されたい）が含まれる。
【０１７８】
DNAワクチンとしての遺伝子の使用のための方法は周知であり、患者における発現のために、調節可能なプロモーターまたは組織特異的プロモーターの制御下に、所望の遺伝子またはその一部を配置する工程を含む。DNAワクチンのために使用される遺伝子は、全長Wnt16タンパク質をコードすることができ、またはタンパク質の一部をコードしてもよい。
【０１７９】
ある態様において、DNAワクチンは、DNAワクチンとともにアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、DNAワクチンによってコードされるポリペプチドに対する免疫学的応答を増大させるサイトカインを含む。
【０１８０】
治療的または予防的な免疫目的のために、本発明のペプチドは、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例には、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、Wntまたはフリッツルドポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、免疫応答を誘発する。免疫プロトコールにおいて有用であるワクシニアウイルスおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号において記載されている。別のベクターはBCG（カルメット-ゲラン杆菌(Bacille Calmette Guerin)）である。BCGベクターは、Stover, et al.、(1991) Nature 351:456-460において記載されている。治療的投与または免疫のために有用である広範な種々の他のベクター、例えば、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクターなどが明らかである。例えば、Shata et al.、(2000) Mol Med Today 6:66-71; Shedlock et al. (2000) J Leukoc Biol 68: 793-806; および Hipp et al.、(2000) In Vivo 14:571-85を参照されたい。
【０１８１】
IV. 阻害剤および因子の投与
Wnt16シグナル伝達（例えば、抗Wnt16抗体およびsiRNA）を阻害する因子は、種々の治療法において使用することができる。例えば、この因子は、非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下の経路）、局所的（topical）、経口、局部的（local）、または経皮的な経路を含むがこれらに限定されない方法において使用することができる。これらの方法は、予防的および/または治療的な処置のために使用することができる。
【０１８２】
A. 非ウイルス送達方法
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のDNA、人工ビリオン、および因子増強性のDNAの取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、US 5,049,386、US 4,946,787、および US 4,897,355に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Transfectam（商標）およびLipofectin（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体-認識リポフェクションのために適切なカチオン性脂質および中性脂質には、Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024のそれが含まれる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対するものであることができる。
【０１８３】
免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal、Science 270:404-410 (1995); Blaese et al.、Cancer Gene Ther 2:291-297 (1995); Behr et al.、Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al.、Bioconjugate Chem 5: 647-654 (1994); Gao et al.、Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al.、Cancer Res 52:4817-4820 (1992); 米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、および 同第4,946,787号を参照されたい）。
【０１８４】
B. ウイルス送達方法
標的Wnt経路タンパク質、例えば、Dvlの阻害剤の送達のための、RNAまたはDNAウイルスに基づく系の使用は、当技術分野において公知である。このような核酸阻害剤の送達のための従来的なウイルスに基づく系は、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクターを含み得る。
【０１８５】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型、例えば、肺癌への高い程度の特異性を伴って送達されることが所望される。ウイルスベクターは、典型的には、ウイルス外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として、リガンドを発現することによって、所定の細胞型についての特異性を有するように修飾される。このリガンドは、関心対象の細胞型上に存在することが知られている受容体についての親和性を有するように選択される。例えば、Han et al.、Proc Natl Acd Sci USA 92: 9747-9751 (1995) は、モロニーマウス白血病ウイルスが、gp70に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾でき、組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよび受容体を発現する標的細胞の別の対に拡張することができる。例えば、糸状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体について特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、FABまたはFv）を提示するように操作することができる。上記の説明は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理は、非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを優先するように考えられている特異的取り込み配列を含むように操作することができる。
【０１８６】
遺伝子治療ベクターは、以下に説明されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注入）または局所的適用によって、個々の患者への投与によって、インビボで送達することができる。代替として、ベクターは、個々の患者から移植された細胞のように、エクスビボで細胞に送達することができる。
【０１８７】
診断、調査研究、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞への再注入を介する）は、当業者に周知である。ある態様において、細胞は対象の生物から単離され、阻害剤核酸でトランスフェクトされ、および対象の生物（例えば、患者）に再注入される。エクスビボトランスフェクションのために適切な種々の細胞型が当業者に周知である（例えば、Freshney et al.、Culture of Animal Cells、A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)、ならびにいかにして患者から細胞を単離および培養するかの議論については、そこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１８８】
治療核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接的に投与することができる。代替として、裸のDNAを投与することができる。投与は、分子を、血液または組織細胞との最終的な接触に導入することのために通常使用される任意の経路による。このような核酸を投与するための適切な方法が使用可能であり、かつ当業者に周知であるが、1つより多くの経路が特定の組成物を投与するために使用可能であり、特定の経路は、別の経路よりもより即時性かつより有効である反応をしばしば提供することができる。
【０１８９】
薬学的に許容される担体は、投与される筒底の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、以下に説明されるように、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、17th ed.,1989を参照されたい）。
【０１９０】
VII. 診断的、調査研究的、および治療的適用における使用のためのキット
本発明はまた、本明細書に開示するWnt16核酸またはタンパク質の検出のために使用することができるキットを提供する。さらに、本発明の方法を実施することをユーザーに可能にする、本明細書に記載される組成物を含むキットが提供される。診断的および調査研究的適用において、このようなキットは、以下のいずれかまたはすべてを含んでもよい：アッセイ試薬、緩衝剤、Wnt16特異的またはフリッツルド特異的核酸またはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、ハイブリダイゼーションプローブおよび/またはプライマーなど。治療用製品は、滅菌生理食塩水または別の薬学的に許容される乳化液および懸濁液基剤を含んでもよい。
【０１９１】
好ましい態様において、このキットは、本明細書に概略されるような詳細を包含する因子を含み、ここで、この因子は、Wnt16タンパク質またはWnt16核酸、例えば、mRNAを結合し、Wnt16シグナル伝達と干渉し、またはWnt16タンパク質の他のタンパク質、例えば、フリッツルド受容体への結合を阻害する。このキットはさらに、本発明の因子および組成物のための1つまたは複数の容器、ならびに、Wnt16を過剰発現する細胞の増殖を阻害するために、Wnt16を過剰発現する癌のような疾患を治療するために、Wnt16を過剰発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するために、Wnt16を過剰発現する癌細胞を検出するために、または本明細書に記載の任意の方法を実施するために、本発明の因子を使用するための説明書を含んでもよい。
【０１９２】
本発明の好ましい態様において、キットは、SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32または33に示されるようなsiRNAを含む。別の好ましい態様において、キットは、SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32または33に示されるような核酸配列を含むsiRNAを含む。本発明のなお別の好ましい態様において、キットは、SEQ ID NO:25の約19〜25個の連続するヌクレオチドの核酸を含むsiRNAを含み、ここで、siRNAは、Wnt16 mRNAに結合し、Wnt16 mRNAの翻訳を阻害する。任意に、このキットはさらに、本発明の因子および組成物のための1つまたは複数の容器、ならびに、Wnt16を過剰発現する細胞の増殖を阻害するために、Wnt16を過剰発現する癌のような疾患を治療するために、Wnt16を過剰発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するために、Wnt16を過剰発現する癌細胞を検出するために、または本明細書に記載の任意の方法を実施するために、本発明のsiRNAを使用するための説明書を含む。このキットはさらに、対照siRNAまたは非サイレンシングsiRNAを含む。
【０１９３】
上記に示したように、このキットは、本発明の方法の実施のための指示書（すなわち、プロトコール）を含む教材を含んでもよい。この教材は、代表的には、書かれたものまたは印刷されたものを含むが、これらはこのようなものに限定されない。このような指示を保存すること、およびそれらをエンドユーザーに連絡することが可能である任意の媒体が本発明によって意図される。このような媒体には、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えば、CD ROM）などが含まれるがこれらに限定されない。このような媒体は、このような教材を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。
【０１９４】
本発明はまた、Wnt16シグナル伝達の阻害剤をスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、容易に使用可能である材料および試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは以下の材料の1つまたは複数を含む：Wnt16ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、反応管および所望のWnt16シグナル伝達機能（例えば、β-カテニンレベル）を試験するための指示書。
【０１９５】
本発明の薬学的組成物およびキットは、本明細書に概説したような詳細を包含する。
【０１９６】
前述の発明は、明確化および理解のために例証および例示によっていくぶん詳細に記載してきたが、特定のバリエーション、変更、修飾、および等価物の置換が、本発明の精神および範囲から必ずしも逸脱することなく、本発明になされ得ることは、本発明の開示に鑑みて当業者には容易に明らかである。結果として、本明細書に記載される態様は、種々の修飾、変更などに供され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲への言及によってのみ、決定される。
【０１９７】
本発明の構成要素の各々は、複数の態様を含むとして本明細書で記載されてきたが、他に言及されない限りは、本発明の所定の構成要素の各々の態様は、本発明の他の構成要素の各々の態様とともに使用することが可能であり、かつ各々のこのような使用は、本発明の別個の態様を形成することが意図されることが理解されるべきである。
【０１９８】
本発明は、例示のみであって、いかなる場合においても、本発明の定義および範囲を限定することを意図しない、以下の実施例によってさらに例証される。
【０１９９】
VIII. 実施例
実施例1：材料および方法
1. 細胞株
4つのヒト前B ALL細胞株を研究した。CCL-119(CCRF-CEM)はAmerican Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)から入手し、NALM-6および697(ACC-42)はGerman Collections of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany)から入手し、およびRCH-ACVはDr. Mignon Loh (Department of Pediatrics, University of California San Francisco, CA, USA)から恵与された。697とRCH-ACVの両方の細胞株(急性リンパ芽球白血病)はt(1;19)転座を示し、顕著なE2a-Pbx1発現を有するのに対して、NALM-6およびCCL-119(急性リンパ芽球白血病)は、従って、対照として働いた。ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株H460および乳癌細胞株MCF7は、American Type Culture Collectionから入手した。すべての細胞を、10%胎仔ウシ血清、ペニシリン(100 IU/ml)およびストレプトマイシン(100 mg/ml)で補充したRPMI 1640中で増殖させた。すべての細胞を、5%CO2を有する加湿インキュベーター中で37℃にて培養した。
【０２００】
2. RT-PCR
細胞株中でのWnt16の発現分析をRT-PCRによって実施した。すべての細胞株からの全RNAを、抽出キット(RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA, USA)を使用して単離した。RNA定量を、分光光度計中で260nmにおける吸収を測定することによって決定した。RT-PCRを、キット(SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を使用して、 GeneAmp PCRシステム9700中で実施した。Wnt16aおよびWnt16bのために使用したプライマーは、Fear et al、Biochem. Biophys Res Comm 278:814-820 (2000)において報告されたように、以下であった。
2008505933.tif 000026
すべての実験において、0.2mMの各プライマーおよび1μgの各鋳型RNAを、RT/platinum Taqミックスとともに使用した。PCR条件は、50℃、30分間の1サイクルおよび94℃で2分間、次いで、94℃で15秒間、57℃で30秒間および72℃で1分間の35サイクル、その後の72℃で7分間の1サイクルであった。
【０２０１】
3. ウェスタンブロッティング
標準的なプロトコールを使用した。抗Dvl3、および抗サバイビンはSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA）からであった。抗カスパーゼ3抗体はOncogene（Cambridge、MA）からであった。抗β-アクチン抗体は、Cell Signaling Technology, Inc.（Beverly、MA）またはSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA）から入手した。抗β-カテニン抗体は、Transduction Laboratories（Lexington、KY）または（Pharminigen）からであった。抗シトクロムc抗体はBD Biosciences（San Diego、California）からであった。β-カテニンおよびシトクロムcの変化を検出するために、細胞質抽出物を調製し、当技術分野において公知の方法によって試験した（例えば、Wang et al.、Mol Cell Biol 19(9):5923-9(1999)）。
【０２０２】
4. RNA干渉
上記ALL細胞を、試験の24時間前に、抗生物質を含まない新鮮な培地を有する6ウェルプレートに蒔いた。Ambion（Austin, TX, USA）から購入した1つの非サイレンシングsiRNAを、Wnt16aを標的とする1つのsiRNAとともに対照として使用し、Qiagen（Valencia, CA, USA）から購入したWnt16bを特異的に標的とする3つのsiRNAを使用した。サイレンシングsiRNAのための配列は以下であった。
2008505933.tif 000027
本発明者らは、Elbashir et al., Methods 26:199-213（2002）によって提案されたプロトコールに従った。トランスフェクションは、オリゴフェクタミン試薬（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて行った。siRNAトランスフェクション後、プレートを72〜96時間、37℃で、さらなる分析の前にインキュベートした。
【０２０３】
5. アポトーシス分析
選択されたsiRNAがアポトーシスを誘導する能力を、白血病細胞株、肺癌細胞株および他の細胞株において評価した。手短に述べると、トランスフェクションの72時間後、細胞をトリプシン処理によって収集し、細胞表面アネキシン-Vおよびヨウ化プロピジウム（PI）含量の決定のために、製造業者のプロトコールに従って処理した（Apotarget, BioSource International, Camarillo, CA, USA）。Annexin-V-PI二重染色レジメの使用に伴って、細胞の3つの集団が、2色フローサイトメトリーにおいて区別可能である：（a）非アポトーシス細胞：アネキシン-VおよびPI陰性；（b）露出したホスファチジルセリンを有するが、アネキシンV-FITCに結合し、しかしヨウ化プロピジウムを排除している初期のアポトーシス細胞；および（c）壊死性または後期アポトーシス段階にある細胞が、アネキシンV-FITCとPIの両方で標識された。次いで、染色された細胞をフローサイトメトリー（FACScan; Decton Dickinson）によってすぐに分析した。各実験について、未染色試料、アネキシンVのみで染色された試料、およびPIのみで染色された試料を使用することによって補償を行った。
【０２０４】
6. 抗Wnt16抗体
マウスおよびヒトのWnt16ポリクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）から購入し、ウェスタンブロッティングのために使用した。別のマウス抗Wnt16モノクローナル抗体はBD Pharmingen（カタログ番号552595）から購入した。
【０２０５】
ヒトFab抗体は、SEQ ID NO:2に示されるようなヒトWnt16タンパク質のN末端領域のアミノ酸残基1〜99を含むペプチドを抗原として使用してカスタムメードした。Wnt16のアミノ酸残基1〜99（シグナルペプチド配列を含む）は、標準的なプロトコールを使用して大腸菌中で発現させた。次いで、精製したペプチドを抗原として使用した。Fabは、Design（MorphoSys, Germany）による抗体によるHuCal（登録商標）-EST技術によって作製した。8個のヒトFabを生成し、582、583、584、585、586、587、588、および589と名付けた。ヒト抗Wnt16Fabは本明細書に記載される阻害実験のために使用した。
【０２０６】
7. ヒトFabの特異性を決定するためのELISA
直接的ELISAを、ヒト抗Wnt16Fabの特異性を決定するために使用した。手短に述べると、PBS中10μg/mlの濃度のBSA、トランスフェリン、Nl-NfkB-His6、ユビキチンおよびWnt16抗原（SEQ ID NO:2に示されるようなプロセシングされていないヒトWnt16のアミノ酸1〜99）を使用して、12時間、4℃でプレートを覆う。次いで、このプレートを、ブロッキング緩衝液中、室温にて2時間インキュベートし、その後ヒトFabを加えた。このアッセイ法において陽性であると試験された8個の抗Wnt16 Fab（クローン582〜589）の代表的な例を図6に示す。
【０２０７】
8. 細胞表面抗原結合分析
試験される細胞を、0.5〜1μgのヒト抗Wnt16 Fabを含む100μl PBS緩衝液中に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。数回の洗浄工程後、細胞を、1μg二次抗体を含む100μl FACS緩衝液中に再懸濁し、ボルテックスし、および氷上で30分間インキュベートした。インキュベーションは暗条件下で実施した。FACSのための二次抗体は、Alexa Flour 488ヤギ抗ヒトIgG (H+L)6であった。次いで、試料を12×75mm Falconチューブ中に配置し、フローサイトメトリーによって分析した。RCH-ACV細胞の表面に結合するヒト抗Wnt16 Fabについての代表的な例を図7に示す。
【０２０８】
9. 遺伝子発現アレイ
ある実験において、遺伝子発現プロファイリングを、Wntシグナル伝達に関与する遺伝子、およびその下流に含まれる遺伝子の発現をプロファイリングするように設計された特別注文のアレイを使用して、AmpoLabelling-LPR Kit protocol（GEArray Q Human Wnt Signaling Pathway Gene Array、SuperArray、Frederick、MD、USA）を用いて分析した。手短に述べると、選択された組織から単離された全RNAをRT反応に供し、引き続いてcDNAプローブをビオチン-16-dUTP（Roche, Basel, Switzerland）で標識し、変性させ、およびWnt特異的アレイを含むハイブリダイゼーション管中で一晩ハイブリダイズさせた。検出は、化学発光反応を用いて、CDDカメラを使用することによって行い、メンブレンを、種々の時間の複数の露出を用いて、X線フィルムに露出させた。スポットの画像を、製造業者から提供されたソフトウェアを使用して数値データに転換した。発現データを、製造業者によって提供された遺伝子リストに対して適合させた。代表的な遺伝子発現アレイ分析を図2に示す。
【０２０９】
10. 増殖アッセイ法
Eli Lilly（Indianapolis、IN）によって供給されたAlimta（登録商標）(MTA)を、滅菌生理学的溶液中で10mg/mlの濃度に希釈した。ストックをアリコートに分け、-80℃で保存し、および各実験の前に培地で希釈した。Wnt16抗体は以前に記載したように使用した。細胞増殖を、テトラゾリウム転換の代謝活性を測定すること（Cell Titer 96 assay、Promega、Madison、WI）によって決定することができる。手短に述べると、5,000個の細胞を96ウェルプレート中のウェルあたりに蒔き、増加濃度の両方の薬物を含む培養培地を加えた。プレートを、CO2インキュベーター中で、37℃で72時間インキュベートした。次いで、可溶化/停止溶液を加え、吸光度を、蛍光プレートリーダーを用いて、570nmの波長において記録した。各実験を3回通り少なくとも3回反復した。
【０２１０】
11. インビボ腫瘍抑制研究
5〜6週齢の雌性ヌードマウスに、背部領域にて約100μl量で約1×107ALL細胞、前B ALL細胞、CLL細胞またはH460細胞でs.c.注射した。腫瘍が均一に形成したときに、次いで、動物に、抗Wnt16モノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体、またはPBS緩衝液を、約100μlの量で、腹腔内（i.p.）注射した。注射のための抗Wnt16モノクローナル抗体の好ましい用量は約250μgであった。各注射を週に2回行ってもよい。好ましくは、各群は少なくとも5〜10匹のマウスからなる。腫瘍サイズを一週間間隔で決定し、腫瘍体積を幅（x）および長さ（y）（x2y/2、ここで、x<y）を使用して計算した（Sonoda et al、Cancer Res 61(13):4956-60(2001)）。
【０２１１】
12. 統計学的分析
示されるデータは平均値（±S.E.M.）を表す。Excelにおける対応のないt検定を、異なる処置および細胞株を比較するために使用した。他の統計学的比較は、両側スチューデントt検定（P<0.01）を用いて行った。
【０２１２】
実施例2:Wnt16およびWntシグナル伝達経路はt(1:19)転座を含む白血病細胞株において上方制御される
Wntシグナル伝達経路活性化を分析するために、遺伝子発現プロファイリングを、Wntシグナル伝達経路に関与する遺伝子の発現をプロファイリングするように設計された特別注文のアレイを使用して実施した。4つの急性リンパ芽球白血病細胞株を分析し、2つは（1;19）転座を含み（697およびRCH-ACV）ならびに2つは転座を含まなかった（CCL-119およびNALM-6）。697とRCH-ACVの両方の細胞株に対するWnt16を確認したのに対し、対照細胞株CCL-119およびNALM-6においてはシグナルが観察されなかった。さらに、大腸腺腫様性ポリポーシス（APC）、β-カテニン、ディシェベルド（dvl）-2およびTcf-4のような、Wntの正規の経路に含まれる多くの他の遺伝子が過剰発現した。このことは、これらの細胞におけるWntシグナル伝達経路の活性化を明確に示した（図3A）。他のWntタンパク質（Wnt16およびWnt6）がCCL-119において過剰発現されることが注記されるべきであり、このことは、種々のWntタンパク質が、Muller-Tidow et al（Mol. Cell Biol. 24:2890-28904 (2004)）の知見と一致して、異なる白血病サブタイプにおいて上方制御される可能性があることを示唆する。
【０２１３】
実施例3:白血病細胞株におけるWnt16aおよびWnt16b発現
以前のデータをさらに確認するために、Wnt16発現を、ウェスタンブロットとRT-PCRの両方によってさらに分析した。最初に、市販のWnt16ポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnologies）を使用することによって、Wnt16がNALM-6とCCL-119の両方の対照細胞株中で発現されず、697とRCH-ACVの両方においては高度に過剰発現されることが実証された（図3B）。さらに、Fear et al（前記）は、Wnt16が2つのアイソフォームで存在することを示したので、本発明者らは、同じ細胞株においてWnt16aとWnt16bの両方の発現をRT-PCRによって分析した。RT-PCRはFear et al（前記）によって使用されたものと同じプライマーを用いて実施し、他と比べてt(1;19)含有細胞におけるWnt16bの顕著な過剰発現を示した（図3A）のに対して、Wnt16aは4つの細胞株すべてにおいて検出されなかった。さらに、Fear et al（前記）は、Wnt16aが、Wnt16bよりもE2A-Pbx1によって標的とされる可能性が高いことを示唆した。配列決定により、増幅されたバンドが、Wnt16bに厳密に一致することが確認された（図3C）。
【０２１４】
実施例4:siRNAによるWnt16b阻害はアポトーシスに導く
Wnt16bは、融合タンパク質E2A-Pbx1の効果を媒介するための推定の標的であるようなので、アポトーシスおよび細胞生存を制御するためのその能力を研究した。RNA干渉を、Elbashir et al、(Methods 26(2):199-213 (2002))によって記載されるプロトコールに従うことによって実施した。Wnt16aおよびWnt16bについての特異的siRNAを設計した。4つのsiRNAを使用し、1つは非サイレンシングsiRNAであり、1つのsiRNAはWnt16aを標的とし（SEQ ID NO:26および27を参照されたい）および3つのsiRNAはWnt16bを標的とする（SEQ ID NO:28および29;SEQ ID NO:30および31;ならびにSEQ ID NO:32および33を参照されたい）。ALL細胞株は上記のsiRNAでトランスフェクトし、分析前72〜96時間インキュベートした。RT-PCRとウェスタンブロッティングの両方によって、Wnt16b特異的siRNAがWnt16bを阻害したのに対して、Wnt16a siRNAおよび対照siRNAは効果を有さなかったことが最初に実証された（図4A）。次いで、アポトーシスを評価した。アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム処理後のフローサイトメトリー分析は、3〜5日間のWnt16b siRNAを用いる処理が、Wnt16bを発現する前B ALL細胞株においてアポトーシスおよび細胞死を誘導したのに対し、対照は誘導しなかったことを明らかにした。3つの異なるWnt16 siRNAを使用して、種々の実験において同様な結果を得た。有意なアポトーシス（典型的には、少なくとも35%〜40%）が、100nM Wnt16b siRNAによって誘導され(図4B)、Wnt16a siRNAまたは非サイレンシングsiRNA対照（100nM）によってはアポトーシスは誘導されなかった（P<0.01）。Wnt16b siRNA処理（100nM、72時間）後のWnt16発現のサイレンシングはウェスタンブロット分析によって確認した。非サイレンシングsiRNAは対照として働く（100nM、72時間）。
【０２１５】
実施例5：Wnt16bの同時発現はsiRNA誘導性アポトーシスから細胞をレスキューする
Wnt16b cDNAの同時発現が、siRNA誘導性アポトーシスから細胞をレスキューできるか否かを試験するために本発明者らは、Wntl6pcDNA3プラスミド（Dr. YingziYangat the NHGRI/NIHより恵与）を細胞にトランスフェクトした。本明細書に記載されるWnt16 siRNAは、このプラスミドまたはそこから転写されるmRNAに結合することができない。なぜなら、Wnt16 siRNAはWnt16pcDNA3プラスミド中には存在しない、Wnt16 mRNAの3'UTR領域に結合するように設計されたからである。従って、siRNAは内因性Wnr16の発現のみを沈黙化することができる。Wnt16の再発現がsiRNA誘導性アポトーシスから細胞をレスキューできることが実証された（図4B）。
【０２１６】
実施例6：Wnt16のサイレンシング後のWnt16下流エフェクターの発現
正規のWnt経路において、Wntタンパク質は、フリッツルド受容体に結合し、次には細胞核に入り、標的遺伝子を活性化することができるβ-カテニンをリン酸化するグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βの能力を阻害するディシェベルドタンパク質を活性化する。従って、Wnt経路の下流エフェクターの発現を分析した。細胞株に対して実施されたウェスタンブロット分析は、Wnt16b阻害が、t(1;19)含有細胞株におけるβ-カテニン、Dvl-2およびサバイビン発現の減少をもたらすのに対して、他の細胞株に対しては効果が観察されなかったことを示した（図4C）。これらの知見をさらに確認するために、以前に記載したようなWntシグナル伝達特異的マイクロアレイを、対照（非サイレンシング）siRNAまたはWnt16b siRNAのいずれかで処理したCCL-119および697細胞株において実施した。最初に、Wnt16の特異的阻害を確認した。さらに、この阻害がまた、APC、GSK-3、Dvl-2のような正規の経路の鍵となる成分、Tcf-4およびp300のような転写因子およびc-mycおよびサイクリンD3のような他の遺伝子の下方制御に導くことが示された（図4D）。
【０２１７】
従って、アポトーシス効果がWnt16bシグナル伝達の阻害と相関するか否かを決定するために、Dvl-3、細胞質β-カテニン、およびサバイビンの発現レベルがWnt16b siRNA処理後に下方制御されることが示された。β-カテニン-TCF標的化遺伝子、c-Mycおよびフィブロネクチンもまた、siRNA Wnt16b処理された前B ALL細胞において下方制御されることが見い出された。
【０２１８】
実施例7：ヒトWnt16bに対するモノクローナル抗体の開発
抗Wnt16抗体は、配列表に示されるような、および本明細書にさらに記載されるように、ヒトWnt16bからのポリペプチドに対して惹起される。抗Wnt16b抗体は、SEQ ID NO:2として示されるような全長Wnt16に対して、およびSEQ ID NO:2として示されるようなアミノ酸残基1〜99を含むペプチドに対して惹起される。ヒト抗Wnt16抗体Fab1 (クローン#582)、Fab2 (クローン#583)、Fab3 (クローン#584)、Fab4 (クローン#585)、Fab5 (クローン#586)、Fab6 (クローン#587)、Fab7 (クローン#588)およびFab8 (クローン#599) を得た。次いで、これらの抗Wnt16抗体は、特異性、生物学的活性、Wnt16b発現を有する細胞株中でアポトーシスを誘導する能力について試験される。Wnt16b発現細胞への抗Wnt16b抗体の結合は、ウェスタンブロッティングおよびフローサイトメトリーによって確認した。
【０２１９】
実施例8：抗Wnt16抗体によるWnt16阻害は白血病細胞においてアポトーシスを誘導する
抗Wnt16モノクローナル抗体（BD Pharmingen; カタログ番号552595）を使用して、697およびRCH-ACV細胞株ならびに対照細胞株、NALM-6を用いるアポトーシスアッセイ法を実施した。白血病細胞株は、抗体処理後にアネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。図5に示されるように、抗Wnt16抗体はRCH-ACV細胞株においてアポトーシスを誘導するのに対して、NALM-6細胞株においては効果が認められなかった。同様に、アポトーシスは697細胞株において誘導された。さらに、Wnt16bの再発現が、抗Wnt16抗体誘導性アポトーシスからRCH-ACV細胞をレスキューすることができるか否かを分析した（詳細には実施例5を参照されたい）。Wnt16の再発現は、モノクローナル抗体誘導性のアポトーシスから細胞をレスキューすることができる（図5）。
【０２２０】
上記の知見をさらに確認および拡張するために、ヒト抗Wnt16b抗体を特注で作製した。短縮型Wnt16タンパク質（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1〜99）を抗原として使用し、本明細書で十分に記載されるいくつかのヒトFabを生成した。Fab抗体の特異性は、RCH-ACV（図7）と697細胞（データ示さず）の両方においてWnt16について高親和性を示すことによって評価した。697細胞、RCH-ACV細胞およびCCL-119対照細胞を、それぞれ1μg/mlおよび5μg/mlの濃度の抗Wnt16 Fab抗体、ならびに対照mAbで処理した。アポトーシスアッセイ法は3〜5日後に実施した。4回の独立した実験を実施した。Wnt16 Fabは、t(1;19)含有細胞においてWnt16 siRNAと同じ範囲でアポトーシスを誘導するのに対して、対照細胞株においては効果が認められなかった（図8）。さらに、ウェスタンブロット分析によって、Wnt16阻害が、β-カテニン、Dvl-2およびサバイビン発現の減少を誘導することが確認された（図8b）。
【０２２１】
マウス抗Wnt16モノクローナル抗体とヒト抗Wnt16 Fab抗体の両方がRCH-ACV細胞中で有意はアポトーシス性細胞死を引き起こし得るのに対して、これらは、対照白血病細胞株NALM-6およびCCL-119に対しては最小限の効果を引き起こしたことが見い出された（図5、8）。
【０２２２】
実施例9：抗Wnt16b抗体誘導性アポトーシス性効果はWnt16bタンパク質の状態と関連する
高レベルのWnt16b発現が、抗Wnt16b抗体処理に感受性であった白血病細胞株において観察された。しかし、抗体処理に対して感受性ではなかった対照白血病細胞株CCL-119においては、最小限のWnt16b発現が検出された。さらに、Wnt16b細胞は、肺癌、中皮腫、黒色腫、NSCLC、結腸癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、白血病、リンパ腫および非小細胞肺癌組織を含むいくつかの癌細胞株中で過剰発現される。
【０２２３】
実施例10：抗Wnt16b抗体誘導性アポトーシスはDvl-3、細胞質β-カテニン、およびサバイビンの下方制御と関連する
Wntシグナル伝達は、Dvlを通して、β-カテニン/Tcf媒介転写を活性化することが示されてきた。Wntシグナル伝達はまた、細胞質β-カテニンを安定化する。従って、抗Wnt16b抗体誘導性アポトーシスがDvlおよび細胞質β-カテニンの脱安定化に依存するか否かを決定した。Dvlと細胞質β-カテニンレベルの両方は、試験された癌細胞、例えば、RCH-ACV細胞株において抗Wnt16b抗体処理後に劇的に下方制御されることが見い出された。対照的に、対照細胞株では、抗Wnt16b抗体処理後にDvlと細胞質β-カテニンレベルの両方の変化が見い出されなかった。
【０２２４】
実施例11：Wnt16 siRNA誘導性アポトーシスは、ミトコンドリアから細胞質ゾルへのSmac/Diabloおよびシトクロムcの放出ならびにJNK活性化と関連する
抗Wnt16抗体がヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導するメカニズムをさらに説明するために、アポトーシス経路のさらなる成分を試験した。アポトーシスの間、Smac/Diablo（カスパーゼ/IAP結合タンパク質の第2のミトコンドリア由来のアクチベーター、低pIを有する）は、IAP媒介性カスパーゼ阻害を除去するように機能する(Du et al、Cell 102(l):33-42 (2000); Verhagen et al、Cell 102(l):43-53 (2000))。アポトーシスの刺激は、シトクロムcと一緒に、Smac/Diabloの、ミトコンドリアの膜間スペースから細胞質ゾルへの放出を引き起こす。シトクロムcはApaf-1およびカスパーゼ-9を直接活性化し、Smac/Diabloは複数のIAPと相互作用して、イニシエーターとエフェクターの両方のカスパーゼのIAP媒介阻害を除去する(Chai et al、Nature 406(6798):855-62 (2000); Srinivasula et al、J Biol Chem 275(46):36152-7 (2000))。
【０２２５】
カスパーゼ-3活性が癌細胞中で増大しているが、正常細胞では増大していないという上記の結果と一致して、抗Wnt16抗体処理後の癌細胞の細胞質ゾル中でのSmac/Diabloとシトクロムcの両方の増加レベルが観察されたが、しかし正常細胞では増加レベルが観察されない。これらの結果は、Smac/Diabloとシトクロムcの両方が、それぞれ、サバイビンおよび/または他のIAP媒介阻害を取り除くことによって、抗Wnt16抗体誘導性アポトーシスに関与する可能性があり、およびカスパーゼの活性化を方向付けることを示す。
【０２２６】
考察
上述のように、Wntリガンドがヒトの発癌において果たす役割に関してはほとんど知られていない。本明細書で提示したデータは、Wnt16シグナル伝達が、ヒト癌細胞における原因となる役割を果たし、従って、Wnt16が癌の治療のための治療標的であることを表す。
【０２２７】
上記に提示されたデータは、Wnt16b siRNAがヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導することを実証する。さらに、本発明者らのデータは、この抗腫瘍効果が、Wntシグナル伝達経路の遮断に起因したことを示す。Wnt16b siRNAによって誘導されたアポトーシス性細胞死は、Wnt16b mRNA発現と相関するのみならず、ヒト前B ALL細胞における減少したDvlおよび細胞質β-カテニンタンパク質発現ともまた相関した。
【０２２８】
t(1;19)染色体転座は、融合生成物E2A-Pbx1の産生を生じる。E2A-Pbx1は、E2aの強力なトランス活性化ドメインおよびPbx1のDNA結合ホメオドメインを含む。活性化されたオンコプロテインE2a-Pbx1は、インビトロでいくつかの細胞型の形質転換を誘導し、およびトランスジェニックマウスにおいてリンパ芽球性リンパ腫を誘導する(Kamps et al、Genes Dev 5:358-368 (1991))。最近、マイクロアレイを使用して得られた発現プロフィールが、小児性ALLの6つの予後サブタイプのうちの1つとしてt(1;19)(E2A-Pbx1)を同定した(Yeoh et al、Cancer Cell 1:133-143 (2002))。E2a-Pbx1は、ヌードマウスにおける腫瘍形成を誘導すること(Kamps et al、(前記))、ならびに胸腺細胞および骨髄細胞中で、それぞれ、T細胞リンパ腫および骨髄性白血病を促進することが知られている(Kamps, et al、Oncogene 12:19-30 (1996))。しかし、E2A-Pbx1が前B細胞ALLを産生するメカニズムは依然として明らかではない(Aspland et al、Oncogene 20:5708-5717 (2001))。
【０２２９】
Wnt16bは、この白血病のサブタイプにおいて、最高の重要性がある。Wntシグナル伝達についての役割は、造血においてすでに実証されている。最初に、あるWntタンパク質が造血前駆細胞の増殖を刺激することが報告された(Austin et al、Blood 89:3624-3635 (1997); Van Den Berg et al、Blood 92:3189-3202 (1998))。加えて、Reya et alは、Wntタンパク質がLEP-1を活性化することによってプロB細胞について分裂促進的であることを示した(Reya et al., Immunity 13:15-24 (2000))。Wnt16の特異的機能は、McWhirter et alによって最初に取り組まれ、彼らは、Wnt16がt(1;19)前B ALLの発生に寄与する可能性があることを提案した(McWhirte et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:11464-11469 (1999))。特注の診断用マイクロアレイを使用して、Ross et alは、他の白血病に対してE2A-Pbx1発現白血病における平均シグナル値を比較した場合に、569〜2547倍の変化の範囲であるWnt16の顕著な過剰発現を報告した(Ross et al、Blood 102:2951-2959 (2003))。Wnt16はまた、慢性リンパ性白血病においても過剰発現される(Lu et al、Proc Natl Acad Sci USA 101:3118-3123 (2004))。E2a-Pbx1についての他の推定の標的が提案されている。Fu et alは、線維芽細胞中でE2a-Pbx1によって誘導される遺伝子を最初に分析し、いくつかの組織特異的遺伝子および発生的に調節される遺伝子を同定した(Fu et al、Mol Cell Biol 17:1503-1512 (1997))。ヒトのt(1;19)含有前B細胞ALLにおいて、EB-1過剰発現が増殖および分化に干渉することができることが報告された(Fu et al、Oncogene 18:4920-4929 (1999))。最近、Smith et alは、E2a-Pbx1誘導が、その生成物がINK4A-ARF腫瘍サプレッサー遺伝子座の転写リプレッサーとして機能するリンパ発癌遺伝子であるBmi-1の発現を増強することを実証した(Smith et al、Mol Cell 12:393-400 (2003))。マイクロアレイデータに基づいて、Downingはまた、その過剰発現およびその形質転換を引き起こす能力に起因して、試験可能な潜在的な標的として、C-Merを提案した(Carroll et al、Hematology (Am Soc Hematol Educ Prgm):102-131 (2003))。これらの推定の標的遺伝子のそれぞれの役割およびそれらの相互作用の可能性は、大部分が未知のままで残っており、どれが関連のある臨床標的を表すことができるかを定義するためのさらなる研究は当然である。
【０２３０】
本発明のデータは、最初に、白血病誘発におけるWnt16の重要な機能を実証する。Fear et alは、コンピュータでのバイオインフォマティックス遺伝子予測技術を使用して、Wnt16aおよびWnt16bと呼ばれる2つのWnt16アイソフォームを同定した(Fear et al、Biochem Biophys Res Comm 278:814-820 (2000))。Wnt16アイソフォームは4個のエキソンのうちの3個を共有し、それらの5'-UTRおよび第1エキソンの組成のみが異なる。それらの高い相同性にも関わらず、両方のアイソフォームはヒト組織における非常に異なる発現パターンを示す。Wnt16aは膵臓においてのみ発現されるのに対して、Wnt16bはより遍在的に発現される。発癌におけるWnt16aおよびWnt16bの特異的機能は以前には知られていなかった。McWhirter et alは、ALLにおけるE2A-Pbx1によるWnt16の上方制御を実証した。興味深いことに、彼らの刊行物に記載されたWnt16遺伝子は、Wnt16bに対して100%相同である。逆説的に、Fear et alは、Wnt16aプロモーターが、発癌性ドメイン転写因子E2A-Pbx1のための3つのコンセンサス結合部位を含むことを報告した。本発明者らは、本発明において、両方のアイソフォームのための特異的プライマーおよびDNA配列決定を使用することによって、Wnt16bがALL細胞株中で過剰発現され、およびE2A-Pbx1によって標的とされるが、Wnt16aではそのようなことがないことを確認した。Wnt2、Wnt5またはWnt7のような他のWntタンパク質と同様に、本発明者らは、Wntシグナル伝達パラダイムの複雑さに加えて、同じWnt16タンパク質の2つのアイソフォームが別個の役割を有することを示す(Lustig and Behrens, J Cancer Res Clin Oncol 129:199-221 (2003)).。
【０２３１】
フリッツルド受容体およびディシェベルドタンパク質を通して、Wntシグナル伝達は、2つの別個の経路：規範的経路（すなわち、βカテニン経路）およびJNK経路を活性化する。ディシェベルドタンパク質は、3つの高度に保存性であるドメイン、DIX、PDZ、およびDEPを有する。これらの中で、DIXドメインおよびPDZドメインが、規範的シグナル伝達経路のために必要であるのに対して、DEPドメインは、JNK経路の活性化のために重要である。
【０２３２】
JNKの活性化は、アポトーシスを開始する際に決定的な役割を果たすことが示唆されている（Wang et al.、Mol Cell Biol 19 (9):5923-9 (1999)）。最近、Chenらは、Wnt1がβカテニンおよびTCF転写を活性化することによってアポトーシスを阻害することを実証した（Chen et al.、J Cell Biol 152(1):87-96(2001)）。本研究において、β-カテニンの過剰発現とJNK活性の増加の両方が、抗Wnt16抗体処理の後で観察され、このことは、規範的経路とJNK経路の両方が、抗Wnt16抗体によって誘導されるアポトーシスに関与していることを示唆する。加えて、正常中皮細胞株中のDvlの過剰発現は、JNK活性を下方制御し、かつCK-2活性をブロックするアピゲニンを使用することによるDvlの阻害は、JNK活性を増大した。最も可能性が高いことは、抗Wnt16抗体処理後のJNKの活性化は、Dvlを通してであることである。
【０２３３】
本発明者らは、ここで、Wnt16を阻害するために2つの異なる技術を使用した。siRNAを使用するサイレンシングおよび抗体阻害である。両方のアプローチは同じ観察に導く:Wnt16の阻害は正規のWnt経路を通してアポトーシスを誘導する。このことは、Wnt16によって媒介される異常なWntシグナル伝達が、この高度に攻撃性の悪性腫瘍の痕跡であるアポトーシスの失敗に寄与する。上記の知見は、発癌におけるWntシグナル伝達の重要性を惹起し、固形腫瘍における本発明者らの以前の知見を造血性の悪性腫瘍に拡張する。t(1;19)転座を示す白血病のこのサブセットにおけるWnt16の役割に新たな見通しが提供される。本発明に提示される知見、およびとりわけWnt16発現を阻害するための抗Wnt16抗体の効力は、この疾患においてWnt16を標的とすることの治療的な関心を支持する。
【０２３４】
上記の知見は、Wnt16抗体が、Wnt16タンパク質を過剰発現する癌細胞においてアポトーシスを直接的に誘導する可能性があるのみならず、また、正常なアポトーシス機構を回復してこれらの腫瘍細胞に戻すことによって潜在的な薬物耐性を解除する可能性もあることを示唆する。腫瘍細胞における薬物耐性についての基礎は、アポトーシスの破壊が最も可能性が高い。アポトーシスの阻害剤であるサバイビンの発現は、大部分のヒトの癌の共通の特徴である。サバイビンを標的とすることは、細胞毒性薬物に対する腫瘍細胞の感受性を増大することが示された（Grossman et al.、Proc Natl Acad Sci USA 98(2):635-40 (2001)）。さらに、アンチセンスサバイビンは、ヒト中皮腫細胞においてアポトーシスを引き起こすために十分であることが示された。さらに、アンチセンスサバイビンと化学療法の間の相乗効果もまた報告された。
【０２３５】
ここで、抗Wnt16抗体処理が、サバイビンのタンパク質発現レベルを劇的に減少することを示した。まとめると、Wnt16抗体は、ヒト癌細胞において標準的な化学療法の効果を強化しかつ相乗作用を与えると考えられる。
【０２３６】
Wntシグナル伝達またはフリッツルド受容体の他のアンタゴニストもまた、ディシェベルドを通してアポトーシスを誘導するはずである。例えば、sFRPは、分泌されたWntリガンドの結合について、フリッツルド受容体と競合することによって、Wntシグナル伝達の可溶性モジュレーターとして機能する（Melkonyan et al.、Proc Natl Acad Sci U S A 94(25):13636-41 (1997)）。具体的には、sFRPは、タンパク質を結合し、およびその細胞表面シグナル伝達受容体への接近をブロックすることによってWnt機能と拮抗することできるか、またはそれらはフリッツルド受容体へのリガンドの提示を容易にすることによってWnt活性を増強することができるかのいずれかである（Uthoff et al.、Mol Carcinog 31(1):56-62 (2001)）。フリッツルド受容体アンタゴニスト（例えば、細胞外ドメインに特異的な抗体または細胞内ドメインに特異的な低分子）は、Wnt/フリッツルドタンパク質を過剰発現するヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導するはずである。
【０２３７】
実施例12：抗Wnt16抗体はヒト肺癌細胞においてアポトーシスを誘導する
本実施例は、本発明のWnt16抗体がヒト肺癌細胞においてアポトーシスを誘導することを示す。加えて、ウェスタンブロット分析を使用して、他の癌細胞中でのWnt16の発現を実証した。これらの実験は、一般的に、実施例1に記載される材料および方法を使用して実施した。
【０２３８】
図9は、ヒト肺癌細胞株H460（肺腺癌）におけるマウス抗Wnt16モノクローナル抗体を用いる処理後のアポトーシス性細胞死の誘導を示す。H460細胞は、抗体なし（未処理）、対照IgG抗体（対照Ab; 5μg/mL; MOPs, Sigma Chemicals）または抗Wnt16モノクローナル抗体（Wnt16 Ab; 5μg/mL; BD Pharmingen, カタログ番号552595）で3日間処理した。アポトーシスをフローサイトメトリーを使用して分析した。マウス抗Wnt16モノクローナル抗体を用いる処理は、未処理細胞または対照IgG抗体で処理した細胞から観察されたそれぞれ5.59%および5.86%と比較して、75.9%の細胞でアポトーシスを誘導した。別個の実験において、H460細胞は、10μg/mlの抗Wnt16モノクローナル抗体とともにインキュベートし、以下の結果を得た。抗体処理なしでインキュベートしたH460細胞は5.7%のアポトーシス細胞を示した。対照IgGとともにインキュベートしたH460細胞は6%のアポトーシス細胞を示した。およびマウス抗Wnt16モノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞は97.5%のアポトーシス細胞を示した。
【０２３９】
上記と同様の実験において、H460細胞は、ヒト抗Wnt16抗体、Fabクローン#585（上記を参照されたい）とともにインキュベートした。図10は、ヒト肺癌細胞株H460中でのヒト抗Wnt16 Fabクローン#585を用いる処理後のアポトーシス性細胞死の誘導を示す。H460細胞は、対照IgG抗体（対照Ab; 5μg/mL）、またはヒトWnt16抗体（Wnt16 Ab; 5μg/mL; クローン#585）とともに3日間処理した。アポトーシスを、フローサイトメトリーを使用して分析した。Wnt16抗体Fabクローン#585を用いる処理は、対照IgG抗体を用いて処理した細胞中の7.92%と比較して、37.3%細胞でアポトーシスを誘導した。
【０２４０】
要約すると、これらの結果は、抗Wnt16モノクローナル抗体が、おそらく正規の経路とJNK経路の両方を通して、ヒト癌細胞における腫瘍特異的アポトーシスを誘導することを示す。
【０２４１】
実施例13：Wnt16タンパク質は癌細胞中で発現される
種々の癌細胞におけるWnt16発現を分析するために、Wnt16ポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングを実施した。試験した癌細胞株には、白血病細胞株697、NB4、およびRCH-ACV；結腸癌細胞株SW480；中皮腫細胞株H28；肺癌細胞株H460、H1703、およびA549；ならびに正常中皮細胞株、LP9が含まれる。図11は、Wnt16タンパク質が種々のヒト癌細胞株において発現されるが、Wnt16発現はLP9細胞においては検出されなかったことを示す。
【０２４２】
実施例14：Wnt16 mRNAは癌細胞で発現される
Wnt16 mRNA発現を、非小細胞肺癌細胞および細胞株中で、RT-PCRを使用して分析した。全RNAを原発性肺癌および正常組織から単離した。RT-PCRを、30〜35サイクル実施し、ゲル電気泳動によって分析した。17対のRNA試料を分析した際に、17個の腫瘍試料のうちの8個および1個の正常試料が予測されたPCRフラグメントを示した（図12A）。Wnt16 mRNA発現はまた、乳癌細胞株MCF7において示された（図12B）。
治療のための治療戦略において、大きな助けとなる。
【０２４３】
本明細書に記載された実施例および態様は例示目的のみのためであること、ならびにそれらに鑑みて種々の修飾または変更が当業者に示唆され、かつ本願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが理解される。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４４】
2008505933.tif 000028
2008505933.tif 000029
2008505933.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】Wnt16アイソフォームについてのアミノ酸配列の配列アライメントを示す。SEQ ID NO:1はGenBankアクセッション番号NP_057171に対応し;SEQ ID NO:20はGenBankアクセッション番号EAL24346に対応し;SEQ ID NO:22はGenBankアクセッション番号AAD3380352に対応し;ならびにSEQ ID NO:2はGenBankアクセッション番号NP_476509、AAD49351、Q9UBV4およびEAL24347に対応する。「*」は示される4つすべての配列において同一であるアミノ酸残基を示す。「●」はSEQ ID NO:2において異なる、SEQ ID NO:1、20および21において同一である配列を示す。本明細書に記載される抗原性ペプチドに下線を付す。本明細書に記載される抗原性ペプチドに下線を付す。本明細書に記載されるヒトFabを生成するために使用されるWnt16のアミノ酸残基1〜99を太字で示す。
【図２】白血病細胞株におけるWntシグナル伝達経路遺伝子発現プロファイリングを示す。A.RNAを白血病細胞株から最初に抽出した。これらの両方、697およびRCH-ACVは、t(1;19)転座を含むのに対して、CCL-119はこれを含まず、対照として働く。ここでは、CCL-119および697から得られたデータのみを示す。抽出後、RNAを逆転写反応に供し、cDNAプローブをビオチン-16-dUTPで標識し、およびWnt特異的アレイでハイブリダイズした。検出を化学発光反応を使用して行い、メンブレンをX線フィルムに露出した。Wnt16を黒四角で取り囲む。t(1;19)を含む細胞株において上方制御される遺伝子をアレイ上で黒丸で取り囲む。B.次いで、データを、製造業者によって提供されるGEArray QシリーズヒトWntシグナル伝達経路アレイの遺伝子リストに対して一致させる。C.両方の細胞系統において上方制御および下方制御された遺伝子を詳細に調べる。
【図３】白血病細胞系統におけるWnt16の発現を示す。A.RT-PCRを、Wnt16a(ネガティブな結果、示さず)およびWnt16bについての特異的プライマーを使用して、4つの細胞株(697およびRCH-ACVはt(1;19)転座を含むのに対して、CCL-119およびNALM-6は含まない)について実施した。ヒトWnt16bのフラグメントは236bpである。アクチンプライマーを、対照としてβ-アクチンを増幅するために使用した。B.ウェスタンブロット分析もまた実施した。4つすべての細胞株からのタンパク質を抽出し、等量(20〜30μg/レーン)を免疫電気泳動に供し、Wnt16に対する市販のポリクローナル抗体を用いてプローブした。メンブレンを、対照として抗β-アクチン抗体を用いて再プローブした。C.(a)において増幅されたPCRバンドがWnt16bに正確に対応することの配列分析による確認。Wnt16aの第1エキソンと異なることが知られているWnt16bの第1エキソンの一部を示す。
【図４】siRNAによるWnt16b阻害を示す。細胞をWnt16b特異的siRNAでトランスフェクトし(対照:非サイレンシングsiRNA、16a:Wnt16a特異的siRNAおよび16b:Wnt16b特異的siRNA)、3日後、RNAを抽出し、定量し、およびRT-PCRを以前に記載したものと同じプライマーを使用して実施した。アクチンは対照として働く。同じ細胞はまた、同じ手法に従ってトランスフェクトした。タンパク質を、トランスフェクションの3日後に抽出し、ウェスタンブロットを抗Wnt16ポリクローナル抗体を用いて実施した。B.細胞を対照siRNA、Wnt16a siRNAおよびWnt16b siRNAを用いてトランスフェクトし、3日後、実施例において記載されるように、フローサイトメトリーによるアポトーシスアッセイ法に供した。アポトーシス細胞割合の平均値を、4回の独立した実験から計算した。棒グラフは、アポトーシス割合の平均を示し、エラーバーはSDである。フローサイトメトリーによるアポトーシス分析を報告する。X軸(FL1-H)はアネキシンV-FITC染色を表し、Y軸(FL-3H)はヨウ化プロピジウム(PI)染色を表す。上の行は対照siRNAによって処理された細胞株を示し、下の行はWnt16b siRNAで処理された同じ細胞株を示す。C.細胞株を対照siRNA、Wnt16a siRNAおよびWnt16b siRNAを用いてトランスフェクトし、トランスフェクションの3日後、タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット分析を、実施例に記載されるように、dvl-2抗体、β-カテニン抗体、およびサバイビン抗体を用いて実施した。アクチンブロッティングを対照として行った。これらの実験は3回実施し、類似の結果であった。D.Wntシグナル伝達特異的アレイを以前に記載されたように実施した。Wnt16b siRNAトランスフェクション後のディファレンシャルに発現されたいくつかの遺伝子を、CCL-119および697細胞株において示す。非サイレンシングsiRNAを対照(対照)として使用した。
【図５】Wnt16抗体が正規のWnt経路を通してアポトーシスを誘導することを示す。NALM-6およびRCH-ACV細胞を、マウス抗Wntl6抗体(BD Pharmingen)を用いて処理した。細胞を6ウェルプレートに蒔き、翌日に実施例に記載されるように以下のように処理した:対照抗体(白棒)、Wnt16抗体単独(明灰色棒)およびWnt16抗体プラスWnt16 cDNA(黒棒)。処理の4日後に、細胞を収集し、ヨウ化プロピジウムおよびV-FITCによって染色し、ならびにフローサイトメトリーに供した。平均値を3回の独立した実験から計算した。棒グラフはアポトーシスの割合の平均を示し、エラーバーはs.d.である。
【図６】本明細書に開示されるヒト抗Wnt16 Fabの生物学的活性および特異性を試験するELISAを示す。それぞれのFabクローンは582〜589までの番号によって示される。
【図７】フローサイトメトリーによって決定されるようはRCH-ACV細胞の表面に結合するヒト抗Wnt16 Fabを示す。
【図８】抗Wnt16抗体が正規のWnt経路を通してアポトーシスを誘導することを示す。A.CCL-119およびRCH-ACV細胞を特注のヒトWnt16抗体(Fabクローン#584;実施例を参照されたい)で処理した。細胞を6ウェルプレートに蒔き、翌日に以下のように処理した:対照抗体、1μg/mlのWnt16抗体および5μg/mlのWnt16抗体。処理の4日後に、細胞を収集し、ヨウ化プロピジウムおよびV-FITCによって染色し、ならびにフローサイトメトリーに供した。アポトーシス細胞の割合の平均値を3回の独立した実験から計算した。棒グラフはアポトーシスの割合の平均を示し、エラーバーはSDである。B.タンパク質をWnt16抗体処理の4日後に抽出し、ウェスタンブロット分析を、β-カテニン、サバイビンおよびdvl-2に対する抗体を使用して実施した。
【図９】ヒト肺癌細胞株H460におけるマウス抗Wnt16モノクローナル抗体を用いる処理後のアポトーシス性細胞死の誘導を示す。H460細胞を、抗体なし(未処理)、対照IgG抗体(対照Ab;5μg/mL)、または抗Wnt16モノクローナル抗体(Wnt16 Ab;5μg/mL;BD Pharmingen)で3日間処理した。アポトーシスをフローサイトメトリーを使用して分析した。抗Wnt16モノクローナル抗体を用いる処理は、未処理の細胞または対照IgG抗体で処理した細胞からそれぞれ観察された5.59%および5.86%と比較して、75.9%細胞のアポトーシスを誘導した。
【図１０】ヒト肺癌細胞株H460におけるヒト抗Wnt16抗体(Fabクローン#585)を用いる処理後のアポトーシス性細胞死の誘導を示す。H460細胞を、抗体なし(未処理)、対照IgG抗体(対照Ab;5μg/mL)、または抗Wnt16抗体(Wnt16 Ab;5μg/mL;Fabクローン#585)で3日間処理した。アポトーシスをフローサイトメトリーを使用して分析した。抗Wnt16 Fabクローン#585を用いる処理は、対照IgG抗体を用いた細胞における7.92%と比較して、37.3%細胞においてアポトーシスをそれぞれ誘導した。
【図１１】Wnt16ポリクローナル抗体を使用する異なるヒト細胞株におけるWnt16タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。試験した細胞株は、白血病細胞株697、NB4、およびRCH-ACV;結腸癌細胞株SW480;中皮腫細胞株H28;肺癌細胞株H460、H1703、およびA549;ならびに正常中皮細胞株、LP9を含む。
【図１２】RT-PCRによって分析した、非小細胞肺癌および細胞株におけるWnt16発現を示す。A.697はWnt16を発現することが知られている白血病細胞株(陽性対照)である;NおよびTは同じ患者から生じた正常(N)および腫瘍(T)試料の1つの対を表す。「*」はWnt16発現を示す予測されたPCRフラグメントを示す試料を示す。B.肺癌細胞株H460および乳癌細胞株MCF7におけるWnt16発現。AおよびBにおける分子量マーカーは1kbプラスマーカー(Invitrogen)である。
【図１】
2008505933.tif 000032
【図２】
2008505933.tif 000033
【図３】
2008505933.tif 000034
【図４】
2008505933.tif 000035
【図５】
2008505933.tif 000036
【図６】
2008505933.tif 000037
【図７】
2008505933.tif 000038
【図８】
2008505933.tif 000039
【図９】
2008505933.tif 000040
【図１０】
2008505933.tif 000041
【図１１】
2008505933.tif 000042
【図１２】
2008505933.tif 000043
【配列表】
2008505933000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月24日(2007.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
B. 抗原性Wnt16ポリペプチド
いくつかの抗Wnt16モノクローナル抗体が、本明細書に記載される方法を使用して生成することができる。本発明の1つの態様において、免疫因子は、代表的には、Wnt16ポリペプチド、例えば、SEQ ID NO:1(Wnt16a)またはSEQ ID NO:2(Wnt16b)に示されるようなWnt16アイソフォームを含む。免疫因子としての使用のための他の有用なWnt16アイソフォームは、SEQ ID NO:20およびSEQ ID NO 21に示される。Wnt16タンパク質アイソフォームは、以下のいずれかからなるとして記載される:355アミノ酸残基(Wnt16a; Gen Bankアクセッション番号EAL24346およびNP_057171(SEQ ID NO:1))、365アミノ酸残基(Wnt16b;GenBankアクセッション番号NP_476509 (SEQ ID NO:2);Q9UBV4、EAL24346およびAAD49351)または361アミノ酸残基(Wnt16c;GenBankアクセッション番号AAD38052(SEQ ID NO:21))。これらのアイソフォームは、それらのN末端で主として異なる(図1)。Wnt16aはそのN末端に特異的アミノ酸配列
2008505933.tif 000047
を示す。Wnt16cはさらに、SEQ ID NO:22に加えて、そのN末端に配列MERHPP(SEQ ID NO:23;図1)を含む。Wnt16bは、そのN末端に異なる配列:
2008505933.tif 000048
を示す。しかし、2つの変動性の性内部位置もまた存在する:Wnt16aは72位にグリシン(G)(SEQ ID NO:1および図1を参照されたい)またはアルギニン(R;SEQ ID NO:20および図1を参照されたい)のいずれかを有する。対応する位置において、Wnt16bはグリシン(G;SEQ ID NO:2および図1を参照されたい)を有し、Wnt16cはアルギニン(R;SEQ ID NO:21)を有する。別の変動性の位置は、Wnt16aの253位、ならびにWnt16bの263位およびWnt16cの259に対応する位置に存在する。この位置において、Wnt16aおよびWnt16bはスレオニン(T;SEQ ID NOS:1、20および2;図1)を有し、Wnt16cはイソロイシン(I;SEQ ID NO:21;図1)を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
F. Wnt16を結合する単鎖Fv抗体
ある態様において、抗体は単鎖Fv（scFv）である。scFv抗体のVHおよびVL領域は、2つの鎖の抗体において見い出されるものと類似の抗原結合部位を作るように折りたたまれる単鎖を含む。一旦折りたたまれると、非共有結合による相互作用が単鎖抗体を安定化する。ある抗体のVHおよびVL領域は直接的に一緒に連結することができるのに対して、当業者は、これらの領域が、1つまたは複数のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって分離されてもよいことを認識する。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当技術分野において周知である。例えば、Huston et al.、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8: 5879 (1988); Bird et al.、Science 242: 4236 (1988); Glockshuber et al.、Biochemistry 29: 1362 (1990); 米国特許第4,946,778号、同第5,132,405号およびStemmer et al.、Biotechniques 14: 256-265 (1993)を参照されたい。一般的に、ペプチドリンカーは、領域を結合させるか、またはVHとVLの間のある程度の最小距離もしくは他の空間的な関連性を保存するため以外の特異的生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は、折りたたみ、正味の電荷、または疎水性のような分子のある特性に影響を与えるように選択されてもよい。単鎖Fv（scFv）抗体は、任意に、50アミノ酸を超えない、一般的に40アミノ酸を超えない、好ましくは30アミノ酸を超えない、およびより好ましくは20アミノ酸を超えない長さのペプチドリンカーを含む。ある態様において、ペプチドリンカーは、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serのコンカテマー、好ましくは、2、3、4、5、または6個のこのような配列(SEQ ID NO:34)である。しかし、リンカー内にある程度のアミノ酸置換を作製することができることが理解される。例えば、バリンは、グリシンの代わりに置換され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】Wnt16アイソフォームについてのアミノ酸配列の配列アライメントを示す。SEQ ID NO:1はGenBankアクセッション番号NP_057171に対応し;SEQ ID NO:20はGenBankアクセッション番号EAL24346に対応し;SEQ ID NO:21はGenBankアクセッション番号AAD38052に対応し;ならびにSEQ ID NO:2はGenBankアクセッション番号NP_476509、AAD49351、Q9UBV4およびEAL24347に対応する。「*」は示される4つすべての配列において同一であるアミノ酸残基を示す。「●」はSEQ ID NO:2において異なる、SEQ ID NO:1、20および21において同一である配列を示す。本明細書に記載される抗原性ペプチドに下線を付す。本明細書に記載される抗原性ペプチドに下線を付す。本明細書に記載されるヒトFabを生成するために使用されるWnt16のアミノ酸残基1〜99を太字で示す。
【図２】白血病細胞株におけるWntシグナル伝達経路遺伝子発現プロファイリングを示す。A.RNAを白血病細胞株から最初に抽出した。これらの両方、697およびRCH-ACVは、t(1;19)転座を含むのに対して、CCL-119はこれを含まず、対照として働く。ここでは、CCL-119および697から得られたデータのみを示す。抽出後、RNAを逆転写反応に供し、cDNAプローブをビオチン-16-dUTPで標識し、およびWnt特異的アレイでハイブリダイズした。検出を化学発光反応を使用して行い、メンブレンをX線フィルムに露出した。Wnt16を黒四角で取り囲む。t(1;19)を含む細胞株において上方制御される遺伝子をアレイ上で黒丸で取り囲む。B.次いで、データを、製造業者によって提供されるGEArray QシリーズヒトWntシグナル伝達経路アレイの遺伝子リストに対して一致させる。C.両方の細胞系統において上方制御および下方制御された遺伝子を詳細に調べる。
【図３】白血病細胞系統におけるWnt16の発現を示す。A.RT-PCRを、Wnt16a(ネガティブな結果、示さず)およびWnt16bについての特異的プライマーを使用して、4つの細胞株(697およびRCH-ACVはt(1;19)転座を含むのに対して、CCL-119およびNALM-6は含まない)について実施した。ヒトWnt16bのフラグメントは236bpである。アクチンプライマーを、対照としてβ-アクチンを増幅するために使用した。B.ウェスタンブロット分析もまた実施した。4つすべての細胞株からのタンパク質を抽出し、等量(20〜30μg/レーン)を免疫電気泳動に供し、Wnt16に対する市販のポリクローナル抗体を用いてプローブした。メンブレンを、対照として抗β-アクチン抗体を用いて再プローブした。C.(a)において増幅されたPCRバンドがWnt16bに正確に対応することの配列分析による確認。Wnt16aの第1エキソンと異なることが知られているWnt16bの第1エキソンの一部を示す(SEQ ID  NO:35)。
【図４】siRNAによるWnt16b阻害を示す。細胞をWnt16b特異的siRNAでトランスフェクトし(対照:非サイレンシングsiRNA、16a:Wnt16a特異的siRNAおよび16b:Wnt16b特異的siRNA)、3日後、RNAを抽出し、定量し、およびRT-PCRを以前に記載したものと同じプライマーを使用して実施した。アクチンは対照として働く。同じ細胞はまた、同じ手法に従ってトランスフェクトした。タンパク質を、トランスフェクションの3日後に抽出し、ウェスタンブロットを抗Wnt16ポリクローナル抗体を用いて実施した。B.細胞を対照siRNA、Wnt16a siRNAおよびWnt16b siRNAを用いてトランスフェクトし、3日後、実施例において記載されるように、フローサイトメトリーによるアポトーシスアッセイ法に供した。アポトーシス細胞割合の平均値を、4回の独立した実験から計算した。棒グラフは、アポトーシス割合の平均を示し、エラーバーはSDである。フローサイトメトリーによるアポトーシス分析を報告する。X軸(FL1-H)はアネキシンV-FITC染色を表し、Y軸(FL-3H)はヨウ化プロピジウム(PI)染色を表す。上の行は対照siRNAによって処理された細胞株を示し、下の行はWnt16b siRNAで処理された同じ細胞株を示す。C.細胞株を対照siRNA、Wnt16a siRNAおよびWnt16b siRNAを用いてトランスフェクトし、トランスフェクションの3日後、タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット分析を、実施例に記載されるように、dvl-2抗体、β-カテニン抗体、およびサバイビン抗体を用いて実施した。アクチンブロッティングを対照として行った。これらの実験は3回実施し、類似の結果であった。D.Wntシグナル伝達特異的アレイを以前に記載されたように実施した。Wnt16b siRNAトランスフェクション後のディファレンシャルに発現されたいくつかの遺伝子を、CCL-119および697細胞株において示す。非サイレンシングsiRNAを対照(対照)として使用した。
【図５】Wnt16抗体が正規のWnt経路を通してアポトーシスを誘導することを示す。NALM-6およびRCH-ACV細胞を、マウス抗Wntl6抗体(BD Pharmingen)を用いて処理した。細胞を6ウェルプレートに蒔き、翌日に実施例に記載されるように以下のように処理した:対照抗体(白棒)、Wnt16抗体単独(明灰色棒)およびWnt16抗体プラスWnt16 cDNA(黒棒)。処理の4日後に、細胞を収集し、ヨウ化プロピジウムおよびV-FITCによって染色し、ならびにフローサイトメトリーに供した。平均値を3回の独立した実験から計算した。棒グラフはアポトーシスの割合の平均を示し、エラーバーはs.d.である。
【図６】本明細書に開示されるヒト抗Wnt16 Fabの生物学的活性および特異性を試験するELISAを示す。それぞれのFabクローンは582〜589までの番号によって示される。
【図７】フローサイトメトリーによって決定されるようはRCH-ACV細胞の表面に結合するヒト抗Wnt16 Fabを示す。
【図８】抗Wnt16抗体が正規のWnt経路を通してアポトーシスを誘導することを示す。A.CCL-119およびRCH-ACV細胞を特注のヒトWnt16抗体(Fabクローン#584;実施例を参照されたい)で処理した。細胞を6ウェルプレートに蒔き、翌日に以下のように処理した:対照抗体、1μg/mlのWnt16抗体および5μg/mlのWnt16抗体。処理の4日後に、細胞を収集し、ヨウ化プロピジウムおよびV-FITCによって染色し、ならびにフローサイトメトリーに供した。アポトーシス細胞の割合の平均値を3回の独立した実験から計算した。棒グラフはアポトーシスの割合の平均を示し、エラーバーはSDである。B.タンパク質をWnt16抗体処理の4日後に抽出し、ウェスタンブロット分析を、β-カテニン、サバイビンおよびdvl-2に対する抗体を使用して実施した。
【図９】ヒト肺癌細胞株H460におけるマウス抗Wnt16モノクローナル抗体を用いる処理後のアポトーシス性細胞死の誘導を示す。H460細胞を、抗体なし(未処理)、対照IgG抗体(対照Ab;5μg/mL)、または抗Wnt16モノクローナル抗体(Wnt16 Ab;5μg/mL;BD Pharmingen)で3日間処理した。アポトーシスをフローサイトメトリーを使用して分析した。抗Wnt16モノクローナル抗体を用いる処理は、未処理の細胞または対照IgG抗体で処理した細胞からそれぞれ観察された5.59%および5.86%と比較して、75.9%細胞のアポトーシスを誘導した。
【図１０】ヒト肺癌細胞株H460におけるヒト抗Wnt16抗体(Fabクローン#585)を用いる処理後のアポトーシス性細胞死の誘導を示す。H460細胞を、抗体なし(未処理)、対照IgG抗体(対照Ab;5μg/mL)、または抗Wnt16抗体(Wnt16 Ab;5μg/mL;Fabクローン#585)で3日間処理した。アポトーシスをフローサイトメトリーを使用して分析した。抗Wnt16 Fabクローン#585を用いる処理は、対照IgG抗体を用いた細胞における7.92%と比較して、37.3%細胞においてアポトーシスをそれぞれ誘導した。
【図１１】Wnt16ポリクローナル抗体を使用する異なるヒト細胞株におけるWnt16タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。試験した細胞株は、白血病細胞株697、NB4、およびRCH-ACV;結腸癌細胞株SW480;中皮腫細胞株H28;肺癌細胞株H460、H1703、およびA549;ならびに正常中皮細胞株、LP9を含む。
【図１２】RT-PCRによって分析した、非小細胞肺癌および細胞株におけるWnt16発現を示す。A.697はWnt16を発現することが知られている白血病細胞株(陽性対照)である;NおよびTは同じ患者から生じた正常(N)および腫瘍(T)試料の1つの対を表す。「*」はWnt16発現を示す予測されたPCRフラグメントを示す試料を示す。B.肺癌細胞株H460および乳癌細胞株MCF7におけるWnt16発現。AおよびBにおける分子量マーカーは1kbプラスマーカー(Invitrogen)である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008505933000001.app