(57)【要約】本開示は、コロナウイルス感染の処置または予防のための組成物および方法に関する。例えば、防御的体液性および／または細胞媒介性免疫応答を惹起できるコロナウイルスＳタンパク質もしくはＮタンパク質、その断片または改変体を含む組成物が提供され、上記組成物は、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳの原因因子などによる感染の処置または予防に有用である。また、アジュバント、例えば、プロテオソームまたはプロトリンなどを含むコロナウイルスＳタンパク質およびＮタンパク質免疫原組成物が提供され、これは、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスなどによって引き起こされる感染の処置または予防のために使用され得る。
2008505114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アジュバント；（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤；および（ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列を含み、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染を処置または予防するための方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性部分が疎水性ポリペプチドまたは脂質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記賦形剤がリポソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アジュバントがプロテオソームまたはプロトリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アジュバントが、ミョウバン、フロイントアジュバント、プロテオソーム、またはプロトリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アジュバントがプロトリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を前記第２のアミノ酸配列に融合させて、融合タンパク質を形成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のアミノ酸配列がタグまたは酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグがヒスチジンタグである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記コロナウイルス感染が、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、およびＳＡＲＳ群コロナウイルスによって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記コロナウイルス感染が、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、およびＳＡＲＳ群コロナウイルスのうちの少なくとも２種類によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記コロナウイルス感染がヒトコロナウイルスによって引き起こされ、該ヒトコロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、経腸的、非経口、経皮、経粘膜、経鼻的および吸入から選択される経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が経鼻的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫応答が、少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原に特異的に結合する少なくとも１種類の抗体を惹起することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原；および（ｂ）プロテオソームまたはプロトリンを含む組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記Ｓタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記疎水性部分が疎水性ポリペプチドまたは脂質である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結されている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を前記第２のアミノ酸配列に融合させて、融合タンパク質を形成する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第２のアミノ酸配列がタグまたは酵素である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第２のアミノ酸配列がヒスチジンタグである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３２】
薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種類の第２のＳタンパク質免疫原にインフレームで融合され、融合タンパク質が形成されている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３４】
（ａ）プロテオソームまたはプロトリン；および（ｂ）多価融合コロナウイルス免疫原ポリペプチドを含む組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染を処置または予防するための方法。
【請求項３６】
（ａ）プロテオソームまたはプロトリン；（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染を処置または予防するための方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記疎水性部分が疎水性ポリペプチドまたは脂質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を前記第２のアミノ酸配列に融合させて、融合タンパク質を形成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のアミノ酸配列がタグまたは酵素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記タグがヒスチジンタグである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記コロナウイルス感染が、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、およびＳＡＲＳ群コロナウイルスのうちの少なくとも１種類によって引き起こされる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記コロナウイルス感染が、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、およびＳＡＲＳ群コロナウイルスのうちの少なくとも２種類によって引き起こされる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記コロナウイルス感染がヒトコロナウイルスによって引き起こされ、ヒトコロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が、経腸的、非経口、経皮、経粘膜、経鼻的および吸入から選択される経路によって投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が経鼻的に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物がプロトリンおよび少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含み、該少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利に関する陳述）
本発明は、助成金番号ＵＣ１  ＡＩ０６２６００−０１の下でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの研究資金によって一部なされた。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、一般的に、コロナウイルス抗原のワクチン組成物に関し、より詳しくは、１種類以上のコロナウイルス免疫原（例えば、Ｓタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質など）およびその改変体を含む組成物、ならびにコロナウイルス感染を処置または予防するための防御的免疫応答を惹起するためのかかる組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
１９７９年以来、３０種類の新しいヒトウイルス性疾患が出現しており、注目すべきことには、大部分が、動物からヒトに感染したものである。最新の一例は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の最近の大発生である。ＳＡＲＳは突発性の疾患であり、これは、２００２年１１月に中華人民共和国の広東省で突然現れた。短期間で、この疾患は他のアジア諸国に広がり、次いで、急速に相次いで北米および欧州に広がった（非特許文献１）。最初のＳＡＲＳの出現から９ヶ月以内にほぼ８，５００症例が報告され、死亡率は約１０％であった。臨床的には、該疾患は、熱、呼吸困難、リンパ球減少症およびび漫性肺胞障害を示す肺の病変を特徴とする（非特許文献２）。いくつかの候補因子が、該疾患の原因因子として示唆されたが、その研究は、これまで未知のコロナウイルス（第２群コロナウイルス；ＳＡＲＳ−ＣｏＶまたはＳＣＶ）に絞られ、これは、単独またはヒトメタニューモウイルスとの組合せで、現在、ＳＡＲＳの主な原因と認識されている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００４】
コロナウイルスは、動物およびヒトにおいて疾患を引き起こすプラス鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルス感染は、全身性または限局性であり得る。限局性の場合、コロナウイルスは、数種類のみの細胞型、例えば、呼吸器または腸管の上皮細胞、およびマクロファージなどに感染する。
【０００５】
かかる新しい疾患では、多くの未解決の問題が未だあり、ＳＡＲＳの原因因子の感染様式さえも含まれる。いくつかの手がかりが、２００３年の大流行から探り出され得る：（ａ）院内伝播は、世界中のさまざまな地域での報告症例のほぼ２０〜６０％を占めた；（ｂ）医療従事者は、カナダ国トロントでの症例の約５０％を占めた；および（ｃ）伝播は家庭内でもよく見られた。この疫学的データの示唆は意味深く、例えば、病院閉鎖が必要であったとした場合、米国内の大部分の病院は、破産に直面するだろう（たった２週間の閉鎖により、大部分の病院が破産に直面することになり得る）と推測されているが、医療従事者集団内での高率の感染は、供給源を限界まで拡大し、従業員に大きな被害をもたらし得る。２００３年の感染した全従業員を帰宅させ、工場、会社、オフィスおよび他のビジネスは、一時的に閉鎖された。さらにまた、ＳＡＲＳホットスポットと思われる地域は避けられ、会議は中止され、観光業界は損害を受けた。したがって、将来的な流行は、広範囲にわたる経済的悪影響を有し得る。
【０００６】
ＳＡＲＳウイルスの主な感染リスクは、おそらく、飛沫曝露および密な個人的接触によるものである。したがって、ＳＡＲＳウイルスの感染を低減するためのストラテジーは、他の気道感染を制限するために使用されるものと似ているか、または模倣する、すなわち、直接的な接触を低減し、飛沫への曝露に対してバリア的事前注意を用いるはずである。しかしながら、潜伏期間が２〜１０日間続き、非特異的初期症状が、他の気道感染、例えば、インフルエンザなどのものと類似するため、ＳＡＲＳ感染の最大のリスクは、検出され得ない場合である。  
【０００７】
したがって、コロナウイルス感染、例えば、ヒトにおいて見られるものなど（例えば、ＳＡＲＳをもたらす感染）を処置または予防するための代わりとなる予防的ストラテジーまたは治療法必要性が存在する。例えば、防御的免疫応答を惹起し得る、コロナウイルス感染に対するワクチン組成物を特定および開発する必要性が存在する。さらにまた、治療用有効性を最大限にするため、感染部位に直接、または該部位に極めて近くに送達され得るワクチン製剤が必要である。本発明は、かかる必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
【非特許文献１】ＷＨＯ．Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＡＲＳ）．Ｗｋｌｙ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，Ｒｅｃ．７８：８１，２００３
【非特許文献２】Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１７７３，２００３
【非特許文献３】Ｋｓｉａｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９５３，２００３
【非特許文献４】Ｄｒｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７，２００３
【非特許文献５】Ｋｕｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６２：２６３，２００３
【非特許文献６】Ｆｏｕｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：２４０，２００３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
簡単には、本発明は、コロナウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス感染の処置または予防に有用な組成物および方法に関する。上記組成物は、例えば、本明細書に記載のコロナウイルスＳタンパク質免疫原と、アジュバント、例えば、プロテオソームまたはプロトリン（登録商標）とを含み、被験体または宿主において防御的免疫応答を惹起することができる。一実施形態では、本発明は、（ａ）アジュバント；（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤；および（ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列を含み、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法を提供する。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも８０％同一である。特定の一実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は疎水性部分をさらに含み、ある特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。別の実施形態では、上記賦形剤はリポソームである。他の特定の実施形態では、上記アジュバントは、ミョウバン、フロイントアジュバント、プロテオソーム、またはプロトリンである。一実施形態では、上記少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を投与する。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結され、ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。一実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素である。ある実施形態では、上記タグはヒスチジンタグである。ある実施形態では、上記コロナウイルス感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、およびＳＡＲＳ群コロナウイルスから選択される少なくとも１種類または少なくとも２種類のコロナウイルスによって引き起こされる。特定の一実施形態では、上記コロナウイルス感染はヒトコロナウイルスによって引き起こされ、上記ヒトコロナウイルスはＳＡＲＳ−ＣｏＶである。他の実施形態では、上記組成物は、経腸的、非経口、経皮、経粘膜、経鼻的および吸入から選択される経路によって投与され、特定の一実施形態では、上記組成物は経鼻的に投与される。本発明の一実施形態では、惹起される免疫応答は、少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原に特異的に結合する少なくとも１種類の抗体を含む。
【０００９】
本発明はまた、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原；および（ｂ）プロテオソームまたはプロトリンを含む組成物を提供する。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも８０％同一である。特定の一実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、ある特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。一実施形態では、上記少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を投与する。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結され、ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。一実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素である。ある実施形態では、上記タグはヒスチジンタグである。一実施形態では、上記組成物が、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種類の第２のＳタンパク質免疫原にインフレームで融合され、融合タンパク質が形成されている。
【００１０】
別の実施形態では、（ａ）プロテオソームまたはプロトリン；および（ｂ）多価融合コロナウイルス免疫原ポリペプチドを含む組成物が提供される。さらに別の実施形態では、プロテオソームまたはプロトリンおよび多価融合コロナウイルス免疫原ポリペプチドを含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法が提供される。
【００１１】
また、本明細書において、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原；および（ｂ）プロテオソームまたはプロトリンを含む組成物を含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法が提供される。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも８０％同一である。特定の一実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、ある特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。一実施形態では、上記少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を投与する。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は第２のアミノ酸配列に連結され、ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。一実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素である。ある実施形態では、上記タグはヒスチジンタグである。一実施形態では、上記組成物が、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種類の第２のＳタンパク質免疫原にインフレームで融合され、融合タンパク質が形成されている。特定の一実施形態では、コロナウイルス感染の処置または予防方法が提供される。組成物は、プロトリンおよび少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含み、少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列を含む。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原；および（ｂ）プロテオソームまたはプロトリンを含む組成物を提供する。特定の一実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記Ｓタンパク質免疫原は防御的免疫応答を惹起することができるものである。他のある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記Ｓタンパク質免疫原は防御的免疫応答を惹起することができるものである（すなわち、防御的免疫応答を惹起するか、または惹起することができる少なくとも１つのエピトープを有する）。特定の実施形態では、上記コロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と同一であるか、または９０％同一であるか、または８０％同一であるアミノ酸配列含み、上記Ｓタンパク質免疫原は防御的免疫応答を惹起することができるものである。他の特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列、配列番号２または４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、または配列番号２または４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｓタンパク質免疫原は防御的免疫応答を惹起することができるものである。特定の実施形態では、上記組成物は、（１）プロテオソームまたはプロトリンおよび（２）少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含み、Ｓタンパク質免疫原が、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。特定の一実施形態では、Ｓタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、他の特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。他の実施形態では、上記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結されており、特定の一実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。ある実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素であり、具体的な一実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はヒスチジンタグである。本発明はまた、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原をさらに含む上記の組成物を提供する。別の実施形態では、上記の組成物は、免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のＭタンパク質免疫原をさらに含む。具体的な一実施形態では、Ｍタンパク質免疫原は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＵ０７９３３（配列番号３９）に示す配列を含む。
【００１３】
他の実施形態では、プロテオソームまたはプロトリンおよび少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原（本明細書において上記）を含む組成物であって、少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種類の第２のＳタンパク質免疫原にインフレームで融合され、融合タンパク質が形成されている組成物が提供される。さらに別の実施形態では、上記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が、配列番号２８；配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むコロナウイルスＮタンパク質免疫原にインフレームで融合されている。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列を含み、防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原；および（ｂ）プロテオソームまたはプロトリンを含む組成物を提供する。ある実施形態では、Ｎタンパク質免疫原は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、他のある実施形態では、Ｎタンパク質免疫原は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、Ｎタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、他のある実施形態では、上記疎水性部分は疎水性ポリペプチドまたは脂質である。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）プロテオソームまたはプロトリン；および（ｂ）多価融合コロナウイルス免疫原ポリペプチドを含む組成物を提供する。ある実施形態では、多価融合コロナウイルス免疫原が、少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原またはその断片を含む。ある実施形態では、多価融合コロナウイルス免疫原が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含むＳタンパク質免疫原から選択される少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を含む。他のある実施形態では、多価融合コロナウイルス免疫原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原、および配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原を含む。
【００１６】
具体的な実施形態では、本明細書に記載の組成物（上記のものなど）の任意のものは、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む。他の具体的な実施形態では、本発明は、コロナウイルス感染の処置または予防における使用のための本明細書に記載の組成物（上記のものなど）の任意のものを提供する。また、本明細書において、コロナウイルス感染の処置または予防用の医薬品の製造のための本明細書に記載の組成物（上記のものなど）の任意のものの使用が提供される。特定の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、およびＳＡＲＳ群コロナウイルスのうちの少なくとも１種類によって引き起こされ、他の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群、第２群、第３群およびＳＡＲＳ群コロナウイルスの少なくとも２種類によって引き起こされる。特定の一実施形態では、コロナウイルス感染がヒトコロナウイルスによって引き起こされ、別の特定の実施形態では、ヒトコロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物の任意のものを、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法を提供する。特定の一実施形態では、コロナウイルス感染の処置または予防方法は、（ａ）プロテオソームまたはプロトリン；（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原；および（ｃ）配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む。特定の一実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、別の特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、本発明は、（ａ）プロテオソームまたはプロトリン；（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法を提供する。特定の一実施形態では、Ｓタンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、上記方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含む。別のある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。別の特定の実施形態では、Ｓタンパク質免疫原は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、上記Ｓタンパク質免疫原は、防御的免疫応答を惹起することができる。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、上記疎水性部分は疎水性ポリペプチドまたは脂質である。他の実施形態では、上記方法は、少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原および少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原を投与することを含み、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含むか、または上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含むか、または上記少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原および上記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が疎水性部分を含み、上記疎水性部分は疎水性ポリペプチドまたは脂質である。これらの方法の他の実施形態では、上記組成物は、免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のＭタンパク質免疫原をさらに含む。具体的な一実施形態では、Ｍタンパク質免疫原は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＵ０７９３３（配列番号３９）に示す配列を含む。他のある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は第２のアミノ酸配列に連結され、具体的な実施形態では、Ｓタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。具体的な一実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素であり、他の具体的な実施形態では、タグがヒスチジンタグである。上記方法が上記少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原を含む。他の特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結されており、具体的な実施形態では、Ｎタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。具体的な一実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素であり、他の具体的な実施形態では、タグがヒスチジンタグである。別の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、およびＳＡＲＳ群コロナウイルスのうちの少なくとも１種類によって引き起こされ、他の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群、第２群、第３群およびＳＡＲＳ群コロナウイルスの少なくとも２種類によって引き起こされる。特定の一実施形態では、コロナウイルス感染がヒトコロナウイルスによって引き起こされ、別の特定の実施形態では、ヒトコロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである。上記方法のある実施形態では、上記組成物は、経腸的、非経口、経皮、経粘膜、経鼻的および吸入から選択される経路によって投与される。特定の一実施形態では、上記組成物は経鼻的に投与される。特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、本発明は、プロトリン、および配列番号２または配列番号４のいずれかに示すアミノ酸配列を含む少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含むコロナウイルス感染の処置または予防方法を提供する。
【００１８】
また、本発明により、薬学的に許容され得る賦形剤と、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列を含み、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原とを含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法が提供される。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、他のある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。特定の一実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質免疫原は、疎水性部分をさらに含み、他の特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。別の実施形態では、上記組成物はアジュバントをさらに含み、特定の一実施形態では、アジュバントが、ミョウバン、フロイントアジュバント、プロテオソーム、またはプロトリンである。別の実施形態では、上記組成物が少なくとも１種類のＭタンパク質免疫原をさらに含み、上記Ｍタンパク質免疫原は免疫応答を惹起することができるものであり、特定の一実施形態では、Ｍタンパク質免疫原がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＵ０７９３３に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、上記方法は、少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を投与することを含む。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は第２のアミノ酸配列に連結され、別の特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。ある実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素であり、ある特定の実施形態では、タグがヒスチジンタグである。特定の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルスまたはＳＡＲＳ群コロナウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群、第２群、第３群およびＳＡＲＳ群コロナウイルスの少なくとも２種類によって引き起こされる。具体的な一実施形態では、コロナウイルス感染がヒトコロナウイルスによって引き起こされ、別の具体的な実施形態では、ヒトコロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである。さらに別の実施形態では、上記組成物は、経腸的、非経口、経皮、経粘膜、経鼻的および吸入から選択される経路によって投与される。特定の一実施形態では、上記組成物は経鼻的に投与される。特定の実施形態では、免疫応答が、少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原に特異的に結合する少なくとも１種類の抗体を惹起することを含む。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明は、以下の組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法を提供する。
（ａ）薬学的に許容され得る賦形剤；（ｂ）少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原；および（ｃ）少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原を含む組成物であって、上記少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が、配列番号４  配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８に示すアミノ酸配列から選択され、上記少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原が、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列から選択され、前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原および少なくとも１種類のコロナウイルスＮ免疫原は、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができるものである。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、他のある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、他のある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。特定の一実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、他の特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。特定の一実施形態では、コロナウイルスＮタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、他の特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。別の実施形態では、上記組成物がアジュバントをさらに含み、特定の一実施形態では、アジュバントが、ミョウバン、フロイントアジュバント、プロテオソーム、またはプロトリンである。別の実施形態では、上記組成物が少なくとも１種類のＭタンパク質免疫原をさらに含み、上記Ｍタンパク質免疫原は免疫応答を惹起することができるものであり、特定の一実施形態では、Ｍタンパク質免疫原がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＵ０７９３３に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、上記方法は、少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を投与することを含む。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原は第２のアミノ酸配列に連結され、別の特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。ある実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素であり、ある特定の実施形態では、タグがヒスチジンタ���である。ある実施形態では、上記方法は、少なくとも２種類のＮタンパク質免疫原を投与することを含む。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結されており、別の特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。ある実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素であり、ある特定の実施形態では、タグがヒスチジンタグである。特定の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルスまたはＳＡＲＳ群コロナウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群、第２群、第３群およびＳＡＲＳ群コロナウイルスの少なくとも２種類によって引き起こされる。具体的な一実施形態では、コロナウイルス感染がヒトコロナウイルスによって引き起こされ、別の具体的な実施形態では、ヒトコロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである。さらに別の実施形態では、上記組成物は、経腸的、非経口、経皮、経粘膜、経鼻的および吸入から選択される経路によって投与される。特定の一実施形態では、上記組成物は経鼻的に投与される。特定の実施形態では、免疫応答が、少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原に特異的に結合する少なくとも１種類の抗体を惹起することを含み、他の特定の実施形態では、免疫応答は、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原に特異的に結合する少なくとも１種類の抗体を惹起することを含む。
【００２０】
別の実施形態では、薬学的に許容され得る賦形剤と、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列を含み、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原とを含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法が提供される。ある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、他のある実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。特定の一実施形態では、コロナウイルスＮタンパク質免疫原が疎水性部分をさらに含み、他の特定の実施形態では、上記疎水性部分は疎水性のポリペプチドまたは脂質である。特定の一実施形態では、賦形剤がリポソームである。別の実施形態では、上記組成物がアジュバントをさらに含み、特定の一実施形態では、アジュバントが、ミョウバン、フロイントアジュバント、プロテオソーム、またはプロトリンである。別の実施形態では、上記組成物が少なくとも１種類のＭタンパク質免疫原をさらに含み、上記Ｍタンパク質免疫原は免疫応答を惹起することができるものであり、特定の一実施形態では、Ｍタンパク質免疫原がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＵ０７９３３に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、上記方法は、少なくとも２種類のＮタンパク質免疫原を投与することを含む。別の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結されており、別の特定の実施形態では、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原を第２のアミノ酸配列に融合させて融合タンパク質を形成する。ある実施形態では、上記第２のアミノ酸配列はタグまたは酵素であり、ある特定の実施形態では、タグがヒスチジンタグである。特定の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルスまたはＳＡＲＳ群コロナウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、コロナウイルス感染は、第１群、第２群、第３群およびＳＡＲＳ群コロナウイルスの少なくとも２種類によって引き起こされる。具体的な一実施形態では、コロナウイルス感染がヒトコロナウイルスによって引き起こされ、別の具体的な実施形態では、ヒトコロナウイルスがＳＡＲＳ−ＣｏＶである。さらに別の実施形態では、上記組成物は、経腸的、非経口、経皮、経粘膜、経鼻的および吸入から選択される経路によって投与される。特定の一実施形態では、上記組成物は経鼻的に投与される。特定の実施形態では、免疫応答は、上記少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原に特異的に結合する少なくとも１種類の抗体を惹起することを含む。
【００２１】
本発明はまた、被験体に、薬学的に許容され得る賦形剤と、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示すアミノ酸配列を含み、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原とを含む組成物を投与することを含む方法によって産生させる複数の単離された抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験体に、（ａ）薬学的に許容され得る賦形剤；（ｂ）少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原；および（ｃ）少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原を含む組成物であって、該少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８に示すアミノ酸配列から選択され、少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原が、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列から選択され、前記少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原および少なくとも１種類のコロナウイルスＮ免疫原は、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができるものである組成物を投与することを含む方法によって産生させる複数の単離された抗体を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、被験体に、薬学的に許容され得る賦形剤と、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列を含み、コロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原とを含む組成物を投与することを含む方法によって産生させる複数の単離された抗体を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つのコロナウイルスＳポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の単離された抗体またはその抗原結合断片；および（ｂ）配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つのコロナウイルスＮポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の単離された抗体またはその抗原結合断片を含み、コロナウイルスによる感染を抑制する組成物が提供される。特定の実施形態では、上記組成物が、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む。別の実施形態では、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つのコロナウイルスＳポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の単離された抗体またはその抗原結合断片；および（ｂ）配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つのコロナウイルスＮポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１種類の単離された抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置または予防方法が提供される。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかとなろう。また、本出願書類において言及および／または出願データシートに列挙したすべての米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、外国特許出願公開公報、および非特許出願公開公報は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書において上記のように、コロナウイルスによって引き起こされる感染に対して防御的である免疫応答を惹起することができる少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原、少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原、または少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原および少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原、断片もしくはその改変体を含む組成物を説明する。また、本明細書において、コロナウイルス感染を処置または予防するための、これらのＳおよびＮタンパク質免疫原の作製および使用のための方法を説明する。本発明のコロナウイルス免疫原（抗原）は、免疫応答（中和抗体応答および／または細胞媒介性免疫が挙げられる）を惹起することができる、少なくとも１つのコロナウイルスウイルスコードポリペプチド、例えば、コロナウイルスウイルスＳタンパク質免疫原もしくはＮタンパク質免疫原、またはその改変体および断片を含む。コロナウイルス抗原（免疫原）は、１つ以上の組換えまたは合成により作製されたコロナウイルスポリペプチドを含むものであってもよく、コロナウイルスウイルス粒子またはコロナウイルス感染宿主細胞から単離された１つ以上のコロナウイルスポリペプチドを含むものであってもよい。以下に、コロナウイルスＳおよびＮタンパク質免疫原，その断片、誘導体および改変体、ならびに代表的な組成物および治療的使用についてより詳細に記載する。  
【００２５】
ある実施形態では、アジュバントを加えたコロナウイルスウイルスＳまたはＮタンパク質免疫原、その断片、誘導体もしくは改変体を提供する。例えば、コロナウイルスウイルスＳまたはＮタンパク質免疫原は、プロテオソームまたはプロトリン（登録商標）と組み合せ、または混合され得る。プロテオソーム（プロジュバント（Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）ともいう）の組合せまたは混合物は、グラム陰性菌から得られる外膜タンパク質から構成される。あるいはまた、プロテオソームは、内因性または外因性のリポ多糖（すなわち、ＯＭＰ：ＬＰＳ、プロトリンともいう）と組み合わせ得る。したがって、このような免疫原性組成物（ワクチン組成物または製剤）は、他のより典型的なアジュバントを加えたワクチンよりも、プロテオソーム技術に基づくアジュバントは、生得の免疫応答、増強された血清学的および粘膜応答、ならびに目的の１種類以上の免疫原（または抗原）（例えば、コロナウイルスウイルスＳまたはＮタンパク質免疫原、およびその断片、誘導体もしくは改変体、または他の免疫原など）が「負荷」された場合の特異的免疫応答の惹起を補助できるという点で好都合である。
【００２６】
「プロテオソームまたはプロジュバント」は、本明細書で用いる場合、グラム陰性菌（例えば、ナイセリア属の種など）由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ、ポーリンとしても知られる）の調製物をいい（例えば、Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ，ｉｎ  “Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”２ｎｄ  ｅｄ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，ｐａｇｅ  １９３，１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第４，７０７，５４３号を参照）、これらは、免疫原（例えば、細菌性またはウイルス性抗原）用の担体またはアジュバントとして有用である。プロテオソームは疎水性であり、ヒトへの使用に安全であり、大きさがある種のウイルスと同程度である。プロテオソームは、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍの小胞または小胞様ＯＭＰクラスターに自己合成（ａｕｔｏ−ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、タンパク質抗原（Ａｇｓ）、特に、疎水性部分を有する抗原と非共有結合により一体化、配位、会合（例えば、静電気的にもしくは疎水的に）、あるいは協同する能力を有する。小胞形態または小胞様形態（例えば、１種類以上のＯＭＰの多分子膜構造または溶融球状（ｍｏｌｔｅｎ  ｇｌｏｂｕｌａｒ）様ＯＭＰ組成物）の外膜タンパク質成分をもたらす任意の調製方法が、プロテオソームの定義に含まれる。プロテオソームは、例えば、当該技術分野において報告されているようにして調製され得る（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号または同第５，９８５，２８４号を参照）。本明細書に示す手順に従って調製されるプロテオソームはまた、ＯＭＰポーリン（例えば、ナイセリア属の種）（これは、一般的に、全ＯＭＰ調製物の２％未満である）産生させるために使用される細菌由来の内因性リポ多糖またはリポオリゴ糖（それぞれ、ＬＰＳまたはＬＯＳ）を含有し得る。
【００２７】
「リポ糖」は、本明細書で用いる場合、天然（単離された、もしくは天然構造を有する合成により調製されたもの）、または修飾されたリポ多糖もしくはリポオリゴ糖（集合的に、「ＬＰＳ」ともいう）であって、グラム陰性菌、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉもしくはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、または他のグラム陰性菌（例えば、アルカリゲネス属、バクテロイデス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クラミジア属、シトロバクター属、エドワードシエラ属、エーリッヒア属、エンテロバクター属、エシェリキア属、フランシセラ属、フゾバクテリウム属、ガルドネレラ属、ヘモフィラス属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、レジオネラ属、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓなど）、モラクセラ属、モルガネラ属、ナイセリア、パスツレラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、他のプレシオモナス属、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓなど）、プレボテラ属、シュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、セラチア属、他の赤痢菌属、スピリルム属、ベイヨネラ属、ビブリオ属、またはエルジニア属の種）に由来するものをいう。リポ糖は、解毒された形態（すなわち、リピドＡコアが除去されている）であり得るか、または解毒されていない形態であり得る。例えば、多数のリピドＡ種を含有するＬＰＳ、例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＬＰＳは、本明細書に記載の組成物に使用され得る（例えば、Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２：５０４１−５１（２００４）を参照）。本開示において、リポ糖は解毒されている必要はなく、好ましくは解毒されていない。リポ糖は、例えば、米国特許出願公開公報第２００３／００４４４２５号に記載のようにして調製され得る。
【００２８】
「プロテオソーム：ＬＰＳまたはプロトリンまたはＩＶＸまたはＩＶＸ−９０８」は、本明細書で用いる場合、本明細書に記載のようにして（例えば、外的添加によって）、少なくとも１種類のリポ糖と混合され、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（これは、免疫賦活性組成物としての機能を果たし得る）を提供するプロジュバントの調製物をいう。したがって、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントは、プロトリンの２種類の塩基性成分（これらとしては、（１）グラム陰性菌（例えば、髄膜炎菌）から調製されたプロテオソーム（すなわち、プロジュバント）の外膜タンパク質調製物、および（２）１種類以上のリポ糖の調製物が挙げられる）で構成されたものであり得る。リポ糖は、内因性のものであり得るか（すなわち、ＯＭＰプロテオソーム調製物中に天然に含有され）、または外来的に調製されたリポ糖（すなわち、ＯＭＰ調製物と異なる培養物または微生物から調製された）からのＯＭＰ調製物と混合もしくは合わせたものであり得るか、またはその組合せであり得る。かかる外的に添加されるＬＰＳは、ＯＭＰ調製物が作製された同じグラム陰性菌に由来するものであってもよく、異なるグラム陰性菌に由来するものであってもよい。また、プロトリンは、任意選択で、脂質、糖脂質、糖タンパク質、低分子など、およびその組合せを含むものと理解されたい。プロトリンは、例えば、米国特許出願公開公報第２００３／００４４４２５号に記載のようにして調製され得る。
【００２９】
プロジュバントは、一般的に、天然に存在するか、修飾されているか、または補足的な疎水性部分（「フット（ｆｏｏｔ）」または「アンカー（ａｎｃｈｏｒ）」ともいう）を有する抗原（天然に存在するか、または修飾されている）とともに使用される。プロトリン（外的に添加されたＬＰＳを含有する）は、疎水性フットドメインを含有しない抗原、および非常に疎水性の性質であり得る抗原とともに使用してもよい。プロトリンは、疎水性フットを含有する抗原、疎水性フットを欠く抗原、または疎水性部分もしくはフットを有する抗原と有しない抗原の組合せと、混合または合わせ得る。
【００３０】
免疫原性組成物は、本明細書で用いる場合、適応的（特異的）免疫応答（これは、細胞性（Ｔ細胞）もしくは体液性（Ｂ細胞）、またはその組合せであり得る）を、プライミング、増強、活性化、惹起、刺激、増大、ブースティング、増幅または向上できる任意の１種類以上の化合物または因子または免疫原をいう。好ましくは、適応的免疫応答は保護的であり、ウイルスの中和（ウイルス感染力の低減または消去）が挙げられ得る。免疫原の代表例は、微生物性抗原（例えば、１種類以上のコロナウイルス抗原など）である。
本記載において、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲または整数範囲は、特に記載のない限り、記載の範囲内の任意の整数の値を含み、適切な場合は、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１など）を含むことを理解される。本明細書で用いる場合、「約」または「を本質的に含む」は、±１５％を意味する。本明細書で用いる場合、「ａ」または「ａｎ」などの不定冠詞の使用は、名詞または名詞句の単数形および複数形を示す（すなわち、列挙された要素または成分の「１つ以上」または「少なくとも１つ」を意味する）と理解されたい。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方または任意のその組合せのいずれかを意味すると理解されたい。また、本明細書に記載の配列、構造および置換基の種々の組合せから誘導される個々の化合物、化合物の基は、本出願では、化合物または化合物の基の各々が、個々に示されているかのように、同程度に開示されることを理解されたい。したがって、特定の配列、構造または置換基の選択は、本発明の範囲内である。
【００３１】
（コロナウイルス免疫原）
コロナウイルス感染の処置および／または予防に有用な本明細書に記載の組成物は、免疫原性コロナウイルスポリペプチド、例えば、Ｓタンパク質、その断片および改変体を含み、また、コロナウイルス免疫原と他のペプチドもしくはポリペプチド（例えば、疎水性アミノ酸配列またはヒスチジンタグまたは非Ｓタンパク質コロナウイルスポリペプチドもしくはその断片）または他の修飾体（例えば、グリコシル化）との融合体を含む。ある実施形態では、免疫原性Ｓポリペプチドは、コロナウイルス感染に対して防御的免疫応答を惹起する（例えば、中和抗体の産生を惹起する、および／または細胞媒介性免疫応答を刺激する）ことができるエピトープを有するＳタンパク質の任意の部分を含み得る。本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドは、線状形態に配列され、組み合わされ、または融合されたものであり得、各免疫原は反復性であっても、そうでなくてもよく、反復は、１回または多数回存在し得、免疫原性Ｓまたは他のコロナウイルスポリペプチド免疫原の線状配列に対してＮ末端、Ｃ末端または内部に存在し得る。また、複数の異なるコロナウイルス免疫原性ポリペプチド（例えば、他のＳタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質、または他のコロナウイルスポリペプチド、およびその改変体もしくは断片）を選択し、混合または組み合わせてカクテル組成物とし、有害な、あるいは、好ましくない関連の免疫応答または副作用なく、防御的免疫応答の惹起における使用のための多価ワクチンを提供し得る。また、本明細書において、合成または組換え多価コロナウイルスポリペプチド免疫原（融合タンパク質を含む）の作製方法が提供される。例えば、Ｓタンパク質免疫原コード核酸発現構築物を含む宿主細胞を培養し、組換えＳタンパク質免疫原、またはその改変体（例えば、欠失変異体またはＣ末端膜貫通ドメインを欠くＳポリペプチド断片）を産生させ得る。また、Ｓタンパク質免疫原もしくはその改変体、またはポリペプチドの組合せ（融合タンパク質を含む）を用いる、コロナウイルス感染の処置または予防方法または免疫応答の惹起方法が想定される。
【００３２】
背景として、および理論に拘束されることは望まないが、コロナウイルスは、プラスセンス非セグメント単鎖ＲＮＡゲノムを有し、これは、少なくとも１８種類のウイルス性タンパク質（例えば、非構造タンパク質（ＮＳＰ）１〜１３、構造タンパク質Ｅ、Ｍ、Ｎ、Ｓ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼなど）をコードする。コロナウイルスは、３種類の主要な表面糖タンパク質（Ｓ、ＥおよびＭで示される）を有し、いくつかのコロナウイルスは、ＳＡＲＳウイルスには見られないヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）と呼ばれる別の表面糖タンパク質を有する。また、Ｎ（ヌクレオキャプシド）タンパク質は、塩基性のリン酸化タンパク質であり、これは、ゲノムと一般的に関連しており、抗原性であると報告されている（Ｈｏｌｍｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３４，１９９６）。コロナウイルスの主要抗原であるＳ（スパイク）タンパク質は、２つのドメイン：Ｓｌ（これは、レセプター結合に関与していると考えられている）およびＳ２（ウイルスと標的細胞との膜融合を媒介すると考えられている）を有する（Ｈｏｌｍｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｉ，１９９６，ｓｕｐｒａ）。
【００３３】
Ｓ（スパイク）タンパク質は、非共有結合により連結されたホモトリマー（オリゴマー）を形成し得、これは、レセプター結合およびウイルス感染力を媒介し得る。Ｓタンパク質のホモトリマーは、レセプター結合ドメインの正しい天然コンホメーションの提示および中和抗体応答の惹起に必要なことがあり得る。また、Ｓタンパク質の細胞内プロセッシングは、重要な翻訳後オリゴ糖修飾と関連する。Ｎ−グリカンモチーフ解析によって予測される翻訳後オリゴ糖修飾（グリコシル化）は、Ｓタンパク質が、かかる修飾のための２３個もの多くの部位を有することを示す。また、Ｃ末端システイン残基は、タンパク質フォールディングおよび天然状態の（機能的）Ｓタンパク質コンホメーションの保存に関与し得る。一部のコロナウイルス（例えば、第ＩＩおよび第ＩＩＩ群の一部のウイルス株）のＳタンパク質は、Ｓタンパク質の中心付近で、ゴルジ装置内のトリプシン様プロテアーゼによって、または細胞外に位置する酵素によって、Ｎ末端ＳｌおよびＣ末端Ｓ２ポリペプチドを含有する連結されたポリペプチドに、タンパク質分解的にプロセッシングされ得る。第ＩＩ群コロナウイルスおよび第Ｉ群ウイルスの類型の一部の構成員は、そのようにプロセッシングされないものがあり得る。ＳＡＲＳ関連ウイルス因子のコロナウイルスとしてのキャラクタライゼーションまで、コロナウイルスは、血清学的および遺伝学的特性に基づいて第１群、第２群および第３群と呼ばれる３つの群に分けられており、これらの群はまた、当該技術分野において、および本明細書において第Ｉ群、第ＩＩ群および第ＩＩＩ群ともいう（例えば、Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ；Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０９−１８（２００３）；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：１６０５−６０９（２００３）を参照のこと）。現在、コロナウイルスは、第１群、第２群、第３群およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ（ＳＡＲＳ関連コロナウイルス）に細分されている（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）。
【００３４】
例示的なＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｓタンパク質は、１，２５５個のアミノ酸（例えば、配列番号２および図４を参照）、とともに１２個のアミノ酸のシグナル配列、アミノ酸１２〜６７２間のＳｌドメイン（例えば、配列番号２０を参照）、およびアミノ酸６７３〜１１９２間のＳ２ドメイン（例えば、配列番号２２を参照）を有する。ある実施形態では、コロナウイルスＳまたはＮポリペプチド、および１種類以上のエピトープ（すなわち、免疫原である）を有し、（例えば、ＩｇＡもしくはＩｇＧ抗体）または細胞媒介性免疫応答の中和を誘発できるその改変体が、コロナウイルス感染の処置または予防における使用のための組成物に含まれる。また、グリコシル化されておらず、免疫応答の中和を誘発できるＳタンパク質免疫原（１種類以上の免疫原性エピトープを含有する）の同定を本明細書に記載する。一実施形態では、Ｓタンパク質免疫原は、完全長Ｓタンパク質の一部分または断片である。例えば、配列番号２の４１７〜５６０位のアミノ酸を含むＳタンパク質免疫原の一部分は、Ｎ−グリカン置換部位を含有せず、親水性の領域である。この領域はまた、細胞レセプター結合に関与すると考えられているＳｌドメインの領域に対応する。したがって、配列番号２の４１７〜５６０位のアミノ酸、またはその一部分（例えば、配列番号１２および配列番号１４）を含む断片は、免疫原性であり得、この配列内の１種類以上のエピトープに特異的な免疫応答が、標的細胞内へのコロナウイルスの侵入を妨げ得る。また、グリコシル化部位を含有しないＳタンパク質のかかる免疫原性断片の同定は、上記断片が、哺乳動物細胞と同様の様式でタンパク質をグリコシル化することができない細胞（例えば、細菌）内で作製および産生され得るという利点を提供する。また、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）由来のワクシニアウイルス発現Ｓ−タンパク質が、ウイルス感染の抗体誘導性増強（ＡＤＥ）に関与していることに注目することは重要である（Ｖｅｎｎｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２７６：２１７（１９９０）；Ｋｌｅｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３８０：２３５（１９９５））。したがって、従来技術におけるこの記載に鑑み、本明細書に記載のような、Ｓタンパク質免疫原が宿主において免疫応答を惹起し、したがって、ワクチンとしての利点を提供できる能力が期待され得ない。
【００３５】
本明細書に記載のように、Ｓタンパク質免疫原としては、それぞれ、完全長Ｓタンパク質または野生型Ｓタンパク質内に含有される少なくとも１つのエピトープ（これは、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳコロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起する）を保持しているか、またはこれを有するＳタンパク質の断片またはＳタンパク質改変体（これは、完全長Ｓタンパク質の改変体または本明細書に記載のようなＳ断片であり得る）が挙げられる。Ｓタンパク質断片またはＳタンパク質改変体は、完全長または野生型（天然の）Ｓタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性または機能（例えば、レセプター結合または細胞融合活性など）を有するか、または多数のＳタンパク質特異的生物学的活性または機能を有する。例えば、Ｓタンパク質改変体は、免疫応答を誘導する（例えば、野生型または完全長Ｓポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生を誘導する）エピトープを含有するものであり得るか、またはＳタンパク質レセプター結合活性を有するものであり得る。一実施形態では、Ｓ−タンパク質断片は、配列番号２の１〜１２００位（配列番号４）に示すアミノ酸を含む切断型Ｓ−タンパク質である。Ｓタンパク質の欠失された部分は膜貫通領域であり、残りの断片を、本明細書では、ＳＴＭ−ｄｅｌまたはΔＴＭ  Ｓ−タンパク質ともいう。他のある実施形態では、例示的なＳタンパク質断片は、配列番号２の１２〜２５４位（配列番号６）；または配列番号２の２５５〜８３４位（配列番号８）；または配列番号２の８３５〜１２５５位（配列番号１０）；または配列番号２の１２〜６７２位（配列番号２０；Ｓｌドメイン）；または配列番号２の６７３〜１１９５位（配列番号２２；Ｓ２ドメイン）に示すアミノ酸を含む。他のある実施形態では、Ｓポリペプチド断片は、配列番号２の３００〜５５０位（配列番号１２）；または配列番号２の３８０〜５８０位に示す位置（配列番号１４）；または配列番号２の３８０〜４８０位（配列番号１６）；または配列番号２の４８１〜５８０位（配列番号１８）；または配列番号２の６７３〜９６０位（配列番号２４）；または配列番号２の９６１〜１２００位（配列番号２６）に示すアミノ酸を含む。また、Ｓタンパク質免疫原性断片は、Ｓタンパク質の上記のアミノ酸断片のより小さい部分または断片を含むものである。免疫応答を刺激、誘導または惹起するエピトープを含むＳタンパク質断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のうちのいずれか１つの８個アミノ酸〜１５０個アミノ酸の任意の数のアミノ酸（例えば、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０などの個数のアミノ酸）の範囲の連続するアミノ酸の配列を含み得る。
【００３６】
関連する実施形態では、コロナウイルスＳポリペプチド改変体は、配列番号２に示す完全長Ｓタンパク質（これは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｔｏｒ２株由来；配列番号１は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列である）のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％〜１００％アミノ酸同一性（すなわち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性）を有するか、または配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６のうちのいずれか１つに示すＳタンパク質断片に対して、５０％〜１００％アミノ酸同一性（すなわち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性）を有する。かかるＳポリペプチド改変体および断片は、少なくとも１つのＳタンパク質特異的生物学的活性または機能、例えば、（１）防御的免疫応答（すなわち、Ｓポリペプチド改変体は、防御的免疫応答を誘導または惹起するエピトープを含有する）、例えば、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する応答および／または細胞媒介性免疫応答の中和を誘発する能力；（２）レセプター結合によりウイルス性感染を媒介する能力；および（３）ビリオンと宿主細胞との膜融合を媒介する能力を保持している。
【００３７】
完全長ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド配列のさらなる例は、本明細書に示され、当該技術分野において入手可能である。例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスＦｒａｎｋｆｕｒｔ  １株の完全長Ｓタンパク質を配列番号４５に示し、これは、配列番号４４に示すポリヌクレオチド配列にコードされる。ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ５株の完全長Ｓタンパク質を配列番号４７に示し、これは、配列番号４６に示すポリヌクレオチド配列にコードされる。ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ０３Ｔ００１３株の完全長Ｓタンパク質を配列番号４９に示し、これは、配列番号４８に示すポリヌクレオチド配列にコードされる。ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０ｌ株の完全長Ｓタンパク質を配列番号５１に示し、これは、配列番号５０に示すポリヌクレオチド配列にコードされる。ある実施形態では、このような完全長Ｓポリペプチドのうちのいずれか１つの断片（例えば、膜貫通ドメインの欠失を有する切断型Ｓタンパク質）および改変体はコロナウイルス、特に、ＳＡＲＳコロナウイルスに対する防御的免疫応答を惹起するための免疫原として使用され得る。
【００３８】
他の実施形態では、Ｎタンパク質の断片、または完全長Ｎタンパク質の断片の改変体もしくは完全長Ｎタンパク質の改変体は、少なくとも１つのＮタンパク質関連生物学的活性または機能、例えば、（１）免疫応答を誘導する能力（すなわち、Ｎポリペプチド改変体は、免疫応答を誘導または惹起するエピトープを含有する）、上記免疫応答は、例えば、コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶなど）に対する体液性応答（すなわち、野生型もしくは完全長Ｎポリペプチドに特異的に結合する抗体産生の惹起）および／または細胞媒介性免疫応答であり得る；（２）核酸（例えば、ＲＮＡなど）に結合する能力；および（３）コロナウイルスの病原を促進する能力（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：９８８−９５（２００４）（核局在シグナルと関連するモチーフを含んだＮタンパク質内に位置するアミノ酸配列について記載）を参照）を保持しているか、またはこれを有する免疫原を含む。
【００３９】
また、本明細書において、他のＮタンパク質および少なくとも１つのＮタンパク質関連生物学的活性（例えば、核酸結合活性またはＮタンパク質に特異的に結合する抗体に特異的に結合する能力など）を有するその改変体を記載する。ある実施形態では、例示的なＮタンパク質免疫原断片およびその改変体は、配列番号２８の１〜２１１位（配列番号３０）；または配列番号２８の２１２〜４２２位（配列番号３２）；または配列番号２８の１００〜３００位（配列番号３４）のアミノ酸配列を有する断片を含む。他の実施形態では、Ｎポリペプチド断片は、配列番号２８の５０〜２５０位（配列番号３６）；または配列番号２８の１５０〜４００位（配列番号３８）のアミノ酸配列を含む。また、Ｎタンパク質免疫原性断片は、Ｎタンパク質の上記のアミノ酸断片のより小さい部分または断片を含むものである。免疫応答を刺激または惹起するエピトープを含むＮタンパク質断片は、配列番号２８、３０、３２、３４、３６および３８のうちのいずれか１つの８個のアミノ酸〜１５０個のアミノ酸の任意の数のアミノ酸（例えば、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０などの個数のアミノ酸）の範囲の連続するアミノ酸の配列を含み得る。
【００４０】
Ｎポリペプチドの改変体または完全長Ｎタンパク質の断片もしくはその改変体は、配列番号２８、３０、３２、３４、３６および３８のうちのいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する。本明細書に記載のように、Ｎポリペプチド改変体は、少なくとも１つのＮタンパク質特異的活性、例えば、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶなど）に対する防御的体液性もしくは細胞媒介性免疫応答を惹起する能力、または少なくとも１つの他のＮタンパク質関連生物学的活性、例えば、核酸結合活性を保持している。関連する実施形態では、コロナウイルスＮポリペプチドは、配列番号２８に示す完全長Ｎタンパク質のアミノ酸配列（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｕｒｂａｎｉ株由来、図５参照；また、配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す配列番号２７も参照）に対して、少なくとも％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％アミノ酸同一性を有する。
【００４１】
完全長ＳＡＲＳコロナウイルスＮ（ヌクレオキャプシド）ポリペプチド配列のさらなる例は、本明細書に示され、当該技術分野において入手可能である。例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＢ株の完全長Ｎタンパク質を配列番号５５に示し、これは、配列番号５４に示すポリヌクレオチド配列にコードされる。
【００４２】
２種類以上のコロナウイルスのポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにその改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、任意の標準的なソフトウェアプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ｔＢＬＡＳＴ、ｐＢＬＡＳＴ、またはＭｅｇＡｌｉｇｎなどを用いて比較し得る。さらに他のものとしては、ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって製作されたＬａｓｅｒｇｅｎｅ  バイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフトにおいて提供されるものが挙げられる。ＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムに関する記載は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；またはＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２を見るとよい。ＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。多数のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を最適なアラインメントを調べることにより比較するための他の方法は、当業者によく知られている（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，」  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ１２３−１５１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；およびＢｉｓｈｏｐ（ｅｄ），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９８を参照のこと）。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「パーセント同一性」または「％同一性」は、被験体ポリペプチド、ペプチドまたはその改変体の配列全体と試験配列とを、コンピュータが行なうアルゴリズムを用い、典型的にはデフォルトパラメータを用いて比較することにより得られるパーセント値である。本明細書に記載の改変体ポリペプチドおよび免疫原は、さまざまな変異、例えば、点変異、フレームシフト変異、ミスセンス変異、付加、欠失などの１種類以上を含むように作製され得、または改変体は、例えば、ある種の化学置換基（例えば、グリコシル化、アルキル化など）によるなどの修飾の結果のものであり得る。本明細書で用いる場合、２つのペプチドまたはポリペプチド間の「類似性」は、一般的に、１つのペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列と、第２のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列およびこれに対する保存アミノ酸置換とを比較することにより決定される。
【００４４】
本明細書に記載のように、本明細書に記載のＳまたはＮタンパク質免疫原、断片およびその改変体は、体液性応答および／または細胞媒介性免疫応答であり得る免疫応答、好ましくは防御的免疫応答を惹起または誘導するエピトープを含有する。防御的免疫応答は、以下：コロナウイルスによる宿主の感染の予防；感染の緩和または制限；感染からの宿主の回復の補助、改善、増強または刺激；およびコロナウイルスによるその後の感染を予防または制限する免疫記憶の生成の少なくとも１つによって示され得る。体液性応答としては、感染力を中和する、ウイルスおよび／または感染細胞を溶解する、宿主細胞によるウイルスの除去を助長する（例えば、食作用を助長する）および／またはウイルス性抗原性物質に結合し、その除去を助長する抗体の産生が挙げられ得る。また、体液性応答には、粘膜応答（特異的粘膜ＩｇＡ応答の惹起または誘導を含む）が挙げられ得る。
【００４５】
本明細書に記載のコロナウイルスポリペプチド、断片または改変体による被験体または宿主（ヒトまたは非ヒト動物）における免疫応答の誘導は、本明細書に記載され、当該技術分野において常套的に実施されている方法によって決定およびキャラクタライゼーションされ得る。このような方法としては、インビボアッセイ、例えば、動物免疫処置試験（例えば、ウサギ、マウス、フェレット、ジャコウネコ、アフリカミドリサル、またはアカゲザルモデルを使用）、およびいくつかのインビトロアッセイ、例えば、抗体の検出および解析のための免疫化学方法（例えば、ウエスタンイムノブロット解析、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ラジオイムノアッセイなど）のうちのいずれか１つ、ならびにその組合せなどが挙げられる。一例として、動物モデルは、コロナウイルス抗原が動物において防御的である（これは、特定のモデルと関連する評価項目によって決定され得る）免疫応答を惹起および誘導する能力を測定するために使用され得る。カニクイザルにおいてＳＡＲＳを研究するための動物モデルの一例は、Ｋｕｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６２：２６３−７０（２００３）に記載されている。ネコおよびフェレット動物モデルは、ＳＡＲＳの研究に有用であり得る（例えば、Ｍａｒｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：９１５（２００３）を参照）。
【００４６】
免疫応答を解析およびキャラクタライゼーションするために使用され得る他の方法および手法としては、ＳまたはＮタンパク質免疫原またはその改変体が免疫応答、特に、中和免疫応答を惹起することができるか否かを評価するための、中和アッセイ（例えば、プラーク減少アッセイ、または細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定するアッセイ、または当業者により実施されている任意の他の中和アッセイなど）が挙げられる（例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｖｉｒａｌ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，６ｔｈ  ｅｄ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  １９８９）；Ｍａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９９−４０４（２００３）；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２４：２５１−５６（２００４）を参照）。簡単には、動物を、ＳまたはＮタンパク質免疫原、または少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原もしくは少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原を含有する組成物、または少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原および少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原を含むカクテル組成物で、皮下、腹腔内、鼻腔内、静脈内または本明細書に記載され、当業者によって実施されている他の適切な投与によって免疫処置する。免疫処置した動物から血清を回収し、血清中に存在する抗体が、細胞培養物単層のコロナウイルス感染を抑制するする能力について試験する（例えば、感染は、コロナウイルスが細胞を溶解することに起因する単層内のプラーク（すなわち、「ホール」）の数によって（プラーク減少アッセイ）、またはＣＰＥアッセイにおいて細胞変性効果を顕微鏡によって調べることのよって測定され得る）。また、惹起または誘導された（すなわち、免疫処置前の免疫応答と比べて変化または改変された）免疫応答は、本明細書に記載され、当業者に公知の方法に従って、本明細書に記載した１種類以上のＳまたはＮタンパク質免疫原での免疫処置後に、コロナウイルスで抗原刺激した動物においてサイトカイン発現パターンを調べることにより、同定およびキャラクタライゼーションされ得る。例えば、特異的サイトカインレベルは、目的の組織内で、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を用い、ＳまたはＮタンパク質免疫原での免疫処置および続くコロナウイルスでの抗原刺激後に、１型または２型のいずれの応答が優勢であるかを調べることにより測定され得る。別の例示的なアッセイは、ＯｐｔＥＩＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて１種類以上のサイトカインのレベルを測定するＥＬＩＳＡである。
【００４７】
コロナウイルスポリペプチド、および生物学的活性を保持しているその改変体（例えば、Ｓタンパク質改変体またはＮタンパク質改変体）の検出およびキャラクタライゼーションに有用なインビトロアッセイとしては、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ手法または競合的レセプター結合手法が挙げられ、これらは、コロナウイルスのポリペプチドおよび改変体の存在を確認するため、および／またはその機能（生物学的活性）を調べるために使用され得る。コロナウイルス抗原（例えば、少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原、１種類のＮタンパク質免疫原、または生理学的賦形剤および／または本明細書に記載したプロテオソーム系組成物、例えば、プロトリンなどと組み合わされ（混合され、混ぜもしくは配合され）得るＳおよびＮタンパク質免疫原の各々の少なくとも１種類）は、天然コロナウイルスポリペプチド内に存在するエピトープの提示に依存性である中和抗体応答を誘発（その産生を誘導または惹起）し得る。立体的または連続的エピトープの存在は、例えば、モノクローナル抗体の使用を含み得るタンパク質結合アッセイ、または上記抗原に特異的に結合することがわかっている抗体を用いるか、もしくはリガンド（例えば、コロナウイルスタンパク質、ＳもしくはＮタンパク質またはその断片）またはレセプターを用いる競合的結合アッセイ形式によって調べられ得る。
【００４８】
天然状態のポリペプチド（またはタンパク質）は、本明細書では、合成されたウイルスまたはウイルスの合成中に見られるような、その天然状態のコンホメーション状態のコロナウイルスタンパク質をいい、すなわち、タンパク質には、その天然トポグラフィー構造が採用されている。また、天然コンホメーションは、組換えにより発現されたコロナウイルスポリペプチドによっても採用され得る。体液性応答、すなわち抗体応答を誘導するエピトープ（本明細書および当該技術分野において、抗原性決定基ともいう）は、立体的であり得、したがって天然コロナウイルスタンパク質に見られるようなものであり得る。あるいはまた、エピトープまたは抗原性決定基は連続的であり得、すなわち、エピトープは、本明細書に記載したコロナウイルスタンパク質配列の１つ以上の連続するアミノ酸を含む。体液性免疫応答は、立体的もしくは連続的なエピトープによって、またはエピトープの組合せによって誘導され得る。Ｔ細胞認識を含む細胞媒介性応答は、一次および二次構造（すなわち、連続的エピトープ）のみを保持しているプロセッシングされたコロナウイルスタンパク質断片（または複数の断片）の提示に依存性であり得る。
【００４９】
これらおよび当該技術分野で公知の他のアッセイおよび方法を用いて、ＳまたはＮタンパク質免疫原、およびコロナウイルスに対する防御的体液性または細胞媒介性免疫応答を惹起する少なくとも１つのエピトープを有するその改変体を同定およびキャラクタライゼーションすることができる。種々のアッセイで得られた結果の統計学的有意性は、関連する分野の当業者によって常套的に実施されている方法に従って計算され、理解され得る。
【００５０】
コロナウイルスＳまたはＮタンパク質免疫原（完全長タンパク質、その改変体、断片および融合タンパク質）、ならびにかかる免疫原をコードする対応する核酸は、単離された形態で提供され、ある実施形態では、精製して均質にされる。本明細書で用いる場合、用語「単離された」は、核酸またはポリペプチドが、その元の環境または天然の環境から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物または生細胞内に存在する核酸にコードされた天然に存在する核酸分子またはポリペプチドは単離されたものでないが、同核酸分子またはポリペプチドは、天然の系内の共存物質の一部または全部から分離された場合、単離されたものである。例えば、核酸分子はベクターの一部であり得る、および／またはかかる核酸またはポリペプチドは、組成物の一部であり得、それでも、かかるベクターまたは組成物が上記核酸分子または上記ポリペプチドの天然の環境の一部ではないという点で、単離されたものであり得る。
【００５１】
コロナウイルスＳまたはＮタンパク質免疫原（および対応する免疫原性エピトープ）ならびにその断片および改変体は、合成または組換えにより作製されたものであり得る。コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するエピトープを含有するコロナウイルスタンパク質断片は、標準的な化学的方法によって、例えば、自動化手順による合成などによって合成され得る。一般に、免疫原性ペプチドは、標準的な固相Ｆｍｏｃ保護ストラテジーに基づいて、ＨＡＴＵをカップリング剤として用いて合成される。免疫原性ペプチドは固相樹脂から、適切なスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸により切断され、これにより、側鎖の官能基も脱保護される。粗製免疫原性ペプチドを、分取用逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製してもよい。他の精製方法、例えば、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィーも使用され得る。同様の免疫原性ペプチドを作製するために、当該技術分野で公知の他の合成手法、例えば、ｔＢｏｃ保護ストラテジー、種々のカップリング試薬の使用などが用いられ得る。また、任意の天然に存在するアミノ酸またはその誘導体が使用され得、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸、およびその組合せが挙げられる。ある実施形態では、合成Ｓタンパク質免疫原は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を有する。他の実施形態では、本発明の合成Ｎタンパク質免疫原は、配列番号２８、３０、３２、３４、３６または３８と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を有する。
【００５２】
本明細書に記載のように、ＳまたはＮタンパク質免疫原は組換え体であり得、この場合、所望のＳまたはＮタンパク質免疫原は、個々に、または組合せで、核酸発現構築物内で発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されたポリヌクレオチドから発現される。ある実施形態では、組換えＳタンパク質抗原は、配列番号２と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含むであろう。別の実施形態では、組換えＳタンパク質免疫原は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる。他の実施形態では、組換えＳタンパク質免疫原およびその改変体は、配列番号２の断片であり、これらには、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６、または上記のアミノ酸配列の各々と同一であるか、もしくは少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）配列のアミノ酸配列が含まれ得る。他のある実施形態では、組換えＮタンパク質免疫原およびその改変体が配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むか、またはその改変体であるか、または配列番号２８の断片を含み、これらには、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８、またはこのようなアミノ酸配列の各々と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列が含まれ得る。
【００５３】
ポリヌクレオチド、核酸または核酸分子は、任意の単鎖または二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはその断片をいう。ポリヌクレオチドは、生物学的供給源から単離され得る、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅および生成され得る。ポリヌクレオチド断片は、ＰＣＲ産物から、または単離されポリヌクレオチドからライゲーション、分裂、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性のいずれかによって得られ得る。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドなど）、天然に存在するヌクレオチド（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）のアナログ、または両方の組合せである単量体から構成されたものであり得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に修飾を有し得る。糖修飾としては、例えば、１種類以上のヒドロキシル基を、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基と置き換えることが挙げられ、または糖は、エーテルまたはエステルとして官能化されたものであり得る。またさらに、糖部分全体が、立体的および電子的に同様の構造、例えば、アザ糖および炭素環式糖アナログなどと置き換えられてもよい。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他のよく知られた複素環式基での置換が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはかかる結合のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などが挙げられる。用語「核酸」はまた、ポリアミド主鎖に結合した天然に存在する核酸塩基または修飾された核酸塩基を含む「ペプチド核酸」を含む。
【００５４】
さらに、単離された核酸分子は、独立した断片の形態、またはその供給源細胞（該当する場合は、それが通常存在する染色体を含む）または実質的に純粋な形態のウイルスから分離された大きな核酸構築物の一成分としての核酸分子（ポリヌクレオチドまたは核酸）をいう。例えば、コロナウイルスポリペプチド、ペプチドまたはその改変体をコードするＤＮＡ分子であって、コロナウイルス粒子から、またはコロナウイルスに感染しているか、もしくはこれを保有する宿主細胞から分離されたものは、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、化学的に合成された核酸分子である。核酸分子は、多種多様なヌクレオチド（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ、またはいくつかのその組合せが挙げられる）から構成されたものであり得る。
【００５５】
一実施形態では、単離された核酸分子はＳタンパク質免疫原をコードする配列であって、配列番号２と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含む配列を含む。ある実施形態では、上記核酸分子は、防御的免疫応答（これには、体液性応答（例えば、粘膜ＩｇＡおよび／または全身性ＩｇＧもしくはＩｇＭもしくはＩｇＡの惹起と産生）および／またはコロナウイルスに対する細胞媒介性免疫応答が含まれる）を惹起する抗原性エピトープを有するＳタンパク質免疫原をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、Ｓタンパク質免疫原をコードする配列であって、配列番号２からなるアミノ酸配列を有する配列を含む。さらに他の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２のＳタンパク質免疫原断片をコードし、上記断片は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６から選択されるアミノ酸配列と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、単離された核酸分子は、Ｎタンパク質免疫原をコードする配列であって、配列番号２８を含むか、もしくはこれからなるアミノ酸配列、またはその改変体を有する配列を含む。別の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２８のＮタンパク質免疫原断片をコードし、上記断片は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８のうちのいずれか１つに示すアミノ酸配列と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含み得る。
【００５６】
また、本明細書において、コロナウイルス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸ベクターおよび構築物が提供され、特に、本明細書に記載したコロナウイルスポリペプチドまたはその断片もしくはその改変体をコードする任意のポリヌクレオチド、および調節ヌクレオチド配列を含む核酸発現構築物（組換え発現構築物とも呼ぶ）が提供される。宿主細胞は、かかるベクターまたは構築物を含むように遺伝子操作され得、上記宿主細胞は、コロナウイルス感染の処置または予防方法またはコロナウイルス感染に対する免疫応答の惹起において産生および使用され得る。コロナウイルスポリペプチドおよびその断片または改変体は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞（例えば、昆虫細胞）において、適切な発現制御配列、例えば、プロモーター配列の制御下で、発現され得る。無細胞翻訳系を用いてもまた、かかるコロナウイルスタンパク質が、核酸（例えば、ＲＮＡおよび発現構築物など）を使用して作製され得る。原核生物および真核生物宿主での使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者によって常套的に使用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．によって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）およびＴｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）に記載されており、プラスミド、コスミド、シャトルベクター、ウイルス系ベクター、およびこれらに開示された染色体複製起点を含むベクターが挙げられ得る。
【００５７】
一実施形態では、核酸発現構築物は、配列番号２と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含むＳタンパク質免疫原またはその改変体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーターなど）を含み、Ｓタンパク質免疫原は、体液性応答（例えば、中和抗体を含む）および／またはコロナウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス感染など）に対する細胞媒介性免疫応答を惹起する少なくとも１つのエピトープを有する。ある実施形態では、核酸発現構築物は、配列番号２からなるアミノ酸配列を有するＳタンパク質免疫原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列を含む。他の実施形態では、核酸発現構築物は、少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原またはその改変体（配列番号２の断片であって、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６から選択されるアミノ酸配列と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含む）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーター配列など）を含む。
【００５８】
さらに他の実施形態では、核酸発現構築物は、少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原もしくはその改変体、またはＮタンパク質免疫原もしくはその改変体の断片であって、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を有するものをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーターなど）を含む。関連する実施形態では、核酸発現構築物は、かかるＮタンパク質免疫原またはその改変体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーターなど）を含み、ここで、上記Ｎタンパク質免疫原は、体液性応答（例えば、中和抗体を含む）および／またはコロナウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス感染）に対する細胞媒介性免疫応答を惹起するエピトープを有する。
【００５９】
当業者には認識されるように、コロナウイルスポリペプチドまたはその改変体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、遺伝コードの縮重のため、本明細書に示した配列とは異なり得る。コロナウイルスポリペプチド改変体をコードするヌクレオチド配列としては、ホモログまたは改変体株または他の改変体をコードする配列が挙げられる。改変体は、天然の多型に起因するものであり得、または組換え方法論（例えば、  特定の宿主における発現のためのコドン最適化を得るため、あるいはアミノ酸変異を導入するため）もしくは化学的合成によって合成されたものであり得、野生型ポリペプチドとは１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失などで異なり得る。コロナウイルスポリペプチド改変体をコードするポリヌクレオチド改変体は、好ましくは保存的アミノ酸置換をコードするポリヌクレオチドを包含する。保存的置換の例としては、脂肪族アミノ酸の１つを別のもの、例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａなどで置換すること、または極性残基の１つを別のもので置換すること、例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、またはＧｌｎとＡｓｎ間の置換などが挙げられる。同様のアミノ酸または保存的アミノ酸置換もまた、アミノ酸残基の１つが、同様の側鎖を有するアミノ酸残基、例えば、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸で置き換えられたものである。プロリンは、分類するのがより困難であると考えられるが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＡｌａ）と、諸性質を共有する。状況によっては、グルタミン酸の代わりにグルタミン、またはアスパラギン酸の代わりにアスパラギンの置換は、グルタミンおよびアスパラギンがそれぞれ、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で、同様の置換とみなされ得る。
【００６０】
本明細書に開示したコロナウイルス免疫原配列のアミノ酸の保存的置換および同様の置換は、本明細書に記載され、当該技術分野で実施されている方法に従って容易に調製され得、これにより、同様の物理的特性および機能的または生物学的活性、例えば、免疫応答（これには、体液性応答（すなわち、野生型（もしくは非改変体）免疫原に特異的に結合する抗体に結合し、これと同じ生物学的活性を有する抗体および／または野生型もしくは非改変体免疫原に特異的に結合する抗体に結合する抗体の惹起）が含まれ得る）を誘導または惹起する能力など保持している改変体が提供される。そのＳタンパク質免疫原改変体は、好ましくは、細胞性レセプターに結合する能力および感染力を媒介する能力を保持している。Ｎタンパク質免疫原およびその改変体は、例えば、核酸と複合体を形成するか、これに結合する能力を保持している。
【００６１】
ある種の改変体は、Ｓタンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のうちの１つ以上に示すアミノ酸配列と少なくとも５０％〜１００％または９０％もしくは９５％より大きい同一性を有するか、または同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）核酸配列を含む。ある種の他の改変体は、Ｎタンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、配列番号２８、３０、３２、３４、３６または３８の１つ以上に示すアミノ酸配列と少なくとも５０％〜１００％または９０％もしくは９５％より大きい同一性を有するか、同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）核酸配列を含む。また、ポリヌクレオチド改変体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４もしくは２６に示すアミノ酸配列またはその改変体を含むＳタンパク質免疫原をコードするあらゆる縮重核酸分子を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチド改変体は、配列番号２８、３０、３２、３４、３６もしくは３８に示すアミノ酸配列またはその改変体を含むＮタンパク質免疫原のあらゆる縮重核酸分子を含む。
【００６２】
本明細書に記載のように、Ｓタンパク質免疫原の改変体は、少なくとも１つの生物学的または機能的活性を保持しており、例えば、防御的免疫応答（これには、体液性（粘膜ＩｇＡ応答を含む）および／または細胞媒介性免疫応答が含まれ得る）を惹起または誘導する能力を有するなどである。また、本明細書に記載のように、コロナウイルスＳポリペプチド改変体はまた、天然または野生型Ｓタンパク質のものと実質的に類似する生物学的活性、例えば、中和抗体である（すなわち、ウイルスの感染力を中和する）Ｓタンパク質抗体に特異的に結合する能力；Ｓタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を惹起または誘導する能力；ウイルス感染を中和する能力を有する抗体の産生を惹起または誘導する能力；細胞媒介性免疫応答を惹起または誘導する能力；および／またはＳタンパク質細胞性レセプターに結合する能力を有し得る。本明細書に記載のように、Ｎタンパク質免疫原改変体は、少なくとも１つの生物学的または機能的活性を保持しており、例えば、防御的免疫応答（これらには、体液性（粘膜ＩｇＡ応答を含む）および／または細胞媒介性免疫応答が含まれ得る）を惹起または誘導する能力を有するなどである。また、本明細書に記載のように、コロナウイルスＮタンパク質改変体は、天然Ｎタンパク質のものと実質的に類似する少なくとも１つの生物学的活性、例えば、防御的抗体（例えば、中和抗体）であるＮタンパク質特異的抗体に結合する能力、Ｎタンパク質免疫原に特異的に結合する抗体の産生を惹起または誘導する能力、免疫応答（体液性および／または細胞媒介性）を惹起または誘導する能力、またはコロナウイルスゲノムＲＮＡなどの核酸分子に結合する能力を保持している。本明細書に記載のように、核酸分子改変体は、保存的アミノ酸置換を有するＳまたはＮポリペプチド誘導体または改変体をコードし、その結果、コロナウイルスポリペプチド改変体は、１種類以上のコロナウイルス株に特異的な抗体を惹起できる少なくとも１つのエピトープ（それぞれ野生型ＳまたはＮポリペプチド由来）を保持しているか、または有するように、および／またはそれぞれＳまたはＮタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を保持している。
【００６３】
ある実施形態では、核酸配列は、上記核酸配列の特定のコドンが特定の宿主に好都合なコドンに変化されており、発現レベルの増強がもたらされ得るコロナウイルスＳまたはＮタンパク質のその断片または機能的改変体をコードするように修飾され得る（例えば、Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５，１９９６；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４５９２，１９９６を参照）。例えば、免疫原性ペプチドまたはポリペプチドのある特定のコドンは、上記ペプチドの一次配列を変えることなく大腸菌内での発現を改善するために最適化され得る。例示であって、限定されないが、アルギニン（Ａｒｇ）コドンであるＡＧＧ／ＡＧＡは、ＡｒｇコドンＣＧＴ／ＣＧＣに変えることができる。同様に、ＡＧＧ／ＡＧＡであるＡｒｇコドンは、ＣＧＴ／ＣＧＣコドンに変えることができる。当該技術分野で理解されているように、コドンは、ハイブリッドポリペプチドが発現される特定の宿主（例えば、細菌、真菌、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞）に最適化され得る。さらに、異なるアミノ酸をコードするコドンを同様に変化させてもよく、この場合、１種類以上の異なるアミノ酸をコードするコドンを、特定の宿主に最良に適し得るように同時に改変してもよい（例えば、アルギニン、グリシン、ロイシンおよびセリンならびに任意のその組合せのコドンをすべて最適化し得る）。あるいはまた、コドン最適化は、一次アミノ酸配列に１つ以上の変化、例えば、保存的なアミノ酸の置換、付加、欠失、およびその組合せなどをもたらし得る。
【００６４】
本明細書に記載のように、コロナウイルスＳタンパク質免疫原をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、および２６に示すアミノ酸配列を有するＳタンパク質免疫原をコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５に示すヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含む。コロナウイルスＳタンパク質免疫原をコードする改変体ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５に示すヌクレオチド配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。かかる改変体ポリヌクレオチドは、遺伝コードの縮重のため、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６に示すアミノ酸配列を含むＳタンパク質免疫原をコードし得るか、または本明細書に記載のようなＳタンパク質改変体免疫原をコードし得る（Ｓタンパク質改変体免疫原は、少なくとも１つの生物学的または機能的活性、例えば、中和抗体である（すなわち、ウイルスの感染力を中和する）Ｓタンパク質抗体に特異的に結合し、Ｓタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を惹起または誘導する、ウイルス感染を中和する能力を有する抗体の産生を惹起または誘導する、細胞媒介性免疫応答を惹起または誘導する能力および／またはＳタンパク質細胞性レセプターに結合する能力などを保持している）。したがって、ある実施形態では、単離された核酸（またはポリヌクレオチド）は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５の改変体であって、上記改変体ヌクレオチド配列がこれらの配列と、同様の構造および配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のコロナウイルスＳタンパク質ポリペプチド内に含有される少なくとも１つのＳタンパク質エピトープに対する特異的抗体を惹起する能力を有する天然または非天然コロナウイルスＳポリペプチドをコードするという点で実質的に類似する改変体を含む。
【００６５】
また、本明細書において、コロナウイルスＮタンパク質免疫原をコードする単離された核酸を記載し、このようなヌクレオチド配列の例を、配列番号２７、２９、３１、３３、３５および３７に示す（これらは、それぞれ、配列番号２８、３０、３２、３４、３６および３８に示すアミノ酸を有するポリペプチドをコードする）。コロナウイルスＮタンパク質免疫原をコードする改変体ポリヌクレオチドは、配列番号２７、２９、３１、３３、３５および３７に示すヌクレオチド配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。かかる改変体ポリヌクレオチドは、遺伝コードの縮重のため、配列番号２８、３０、３２、３４、３６もしくは３８に示すアミノ酸配列を含むＮタンパク質免疫原をコードし得るか、または本明細書に記載したコロナウイルスＮタンパク質免疫原改変体をコードし得る（上記改変体は、少なくとも１つの生物学的または機能的活性、例えば、防御的抗体（例えば、中和抗体など）であるＮタンパク質特異的抗体に結合する能力；Ｎタンパク質免疫原に特異的に結合する抗体の産生を惹起または誘導する能力；免疫応答（体液性および／または細胞媒介性）を惹起または誘導する能力；またはコロナウイルスゲノムＲＮＡなどの核酸分子に結合する能力などを保持している）。１種類以上の単離された核酸に対する言及は、同様の構造を有し、配列番号２８、３０、３２、３４、３６または３８のコロナウイルスＮタンパク質由来ポリペプチドに含有される少なくとも１種類のＮタンパク質エピトープに対する特異的抗体を惹起する能力を有する天然または非天然コロナウイルスＮポリペプチドをコードするという点で実質的に類似するこのような配列の改変体を包含する。したがって、ある実施形態では、単離された核酸（またはポリヌクレオチド）は、配列番号２７、２９、３１、３３、３５および３７の改変体であって、上記改変体ヌクレオチド配列がこれらの配列と、同様の構造および配列番号２８、３０、３２、３４、３６または３８に示すコロナウイルスＮタンパク質ポリペプチドに含有される少なくとも１種類のＮタンパク質エピトープに対する特異的抗体を惹起する能力を有する天然または非天然コロナウイルスＮポリペプチドをコードするという点で実質的に類似する改変体を含む。
【００６６】
本明細書で用いる場合、ヌクレオチド配列は、（ａ）ヌクレオチド配列が、コロナウイルスＳまたはＮタンパク質遺伝子のコード領域（例えば、本明細書に示し、当該技術分野で公知のヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の配列データベースに見出されるものなど）；異なるコロナウイルス株（ＳＡＲＳコロナウイルス株など）に由来する配列；またはかかる配列の一部分が挙げられる）に由来し、免疫応答（体液性または細胞媒介性免疫応答）、好ましくは、防御的免疫応答を惹起する実質的に同じ能力を有するＳまたはＮタンパク質エピトープを含む場合；（ｂ）実質的に類似するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、ＳまたはＮタンパク質免疫原をコードする本明細書に記載のようなヌクレオチド配列またはその相補鎖に、中程度または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる場合；および／または（ｃ）上記ヌクレオチド配列が縮重している（すなわち、上記配列が、異なっているが同じアミノ酸をコードするコドン配列を含む）場合；または（ｄ）上記配列が、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に記載の配列のいずれかの相補鎖である場合、コロナウイルスＳタンパク質もしくはＮタンパク質、改変体、またはその断片をコードするヌクレオチド配列に「実質的に類似する」ものとする。
【００６７】
本明細書で用いる場合、２つのヌクレオチド配列は、安定なハイブリッドが実質的に相補的な核酸配列間で形成される場合、指定したストリンジェンシーの条件下で「ハイブリダイズする」と言える。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリッドがアニーリングおよび洗浄される環境または条件の記述をいい、典型的には、イオン強度および温度が含まれる。ハイブリダイゼーションに影響し得る他の要素としては、プローブの大きさおよびハイブリッドの形成が許容される時間の長さが挙げられる。例えば、「高い」、「中」および「低」ストリンジェンシーは、以下の例示的な条件またはこれと同等の条件：高ストリンジェンシーは、約６５℃で０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである；中ストリンジェンシーは約５０℃で０．２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである；および低ストリンジェンシーは約４２℃で１．０×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳであるものを包含する。本明細書で用いる場合、用語「高ストリンジェンシー条件」は、ハイブリダイズするヌクレオチド配列が少なくとも９５％または少なくとも９７％の同一性を共有する場合に限り、１種類以上の配列がハイブリダイズされた状態で維持されることを意味する。好適な中ストリンジェント条件としては、例えば、５×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃〜７０°Ｃ、５×ＳＳＣで１〜１６時間のハイブリダイズ；その後、２２〜６５℃で２０〜４０分間、２×、０．５×および０．２×ＳＳＣ（０．０５〜０．１％ＳＤＳ含有）の１種類以上での１回または２回の洗浄が挙げられる。さらなるストリンジェンシーについて、条件としては、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０〜６０℃で１５分間での洗浄が挙げられる。
【００６８】
当業者に知られているように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにおける多様性は、プレハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程に使用する時間、温度および／または溶液の濃度を変更することにより達成され得る。また、ハイブリダイゼーションの条件は、当該技術分野で公知の方法に従って、例えば、ホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に添加するとともに、ハイブリダイゼーションの温度を低下させることにより変更され得る。
【００６９】
ある実施形態では、コロナウイルスポリペプチドコード核酸分子にハイブリダイズした状態で維持される核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のいずれかの１つに示されるＳタンパク質もしくは断片の少なくとも１つのエピトープを保持しているポリペプチド、またはＮタンパク質または断片の少なくとも１つのエピトープを保持している配列番号２８、３０、３２、３４、３６または３８のうちのいずれか１つに示されるポリペプチドをコードし、ここで、１種類以上のエピトープは、それぞれ天然または野生型のＳまたはＮタンパク質と実質的に同じ、免疫応答（体液性および／または細胞媒介性免疫応答）、好ましくは、防御的免疫応答を惹起する能力を有する。それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３もしくは２５のうちのいずれか１つ、または配列番号２７、２９、３１、３３、３５および３７のうちのいずれか１つに示すヌクレオチド配列にハイブリダイズした状態で維持される核酸分子にコードされるＳまたはＮタンパク質はまた、本明細書に記載したＳまたはＮタンパク質のそれぞれの任意の他の機能的または生物学的活性の少なくとも１つを示し得る。
【００７０】
本明細書に記載したタンパク質は、本明細書に記載し、当該技術分野で実施されている多種多様な手法を用いて構築または作製され得る。コロナウイルスポリペプチドを作製するための方法としては、これらのポリペプチドコードする核酸分子の宿主細胞での発現が挙げられる。一実施形態では、ＳまたはＮタンパク質免疫原（コロナウイルス感染に対する防御的免疫応答を惹起する少なくとも１つのエピトープを有する）の作製方法は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４もしくは２６のいずれか１つ（あるいは本明細書に記載のようなその改変体もしくは断片）に示される、または配列番号２８、３０、３２、３４、３６もしくは３８のうちのいずれか１つ（あるいは本明細書に記載のようなその改変体もしくは断片）に示される、コロナウイルスポリペプチド（例えば、コロナウイルスポリペプチドなど）をコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター）を含有する核酸発現ベクターを含む宿主細胞を、それぞれＳまたはＮ免疫原の発現に充分な条件下および充分な時間培養することを含む。所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むこのような発現ベクターまたはベクター構築物は、好ましくは、適当な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている。適切な調節エレメントの選択は、選択した宿主細胞に依存し、当業者によって容易になされ得る。調節エレメントの例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、ならびに翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が挙げられる。任意選択で、ベクターは、ポリアデニル化配列、１種類以上の制限部位、ならびに１種類以上の選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼなどまたは当該技術分野で公知の任意の他のマーカーを含み得る。さらに、選択しる宿主細胞および用いるベクターに応じて、他の遺伝要素、例えば、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写誘導性を付与する配列、および選択可能なマーカーなどもまた、本明細書に記載のベクター内に組み込まれ得る。
【００７１】
細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞内で機能するプロモーター、１種類以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌の複製起点を含む。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸発現構築物は、誘導性プロモーターを有し、これは、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｔｒｐ、λファージ、Ｔ７ファージおよびＴ５ファージプロモーターであり得るか、または米国特許出願公開公報第２００３／０１４３６８５号に記載のＴ５ファージプロモーター／ｌａｃオペレーター発現制御配列（プラスミドｐＴ５）であり得る。発現制御配列は、目的のタンパク質の宿主細胞内での発現を可能にするのに充分な任意の配列をいい、１つ以上プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列（例えば、ｌａｃＯ）などが挙げられる。ある実施形態では、コロナウイルスポリペプチドコード核酸（例えば、ＳもしくはＮタンパク質免疫原またはその改変体をコードする核酸など）がプラスミド、例えば、プラスミドｐＴ５内に組み込まれ、宿主細胞が細菌例えば、大腸菌である。
【００７２】
他の代表的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，１９７８を参照）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ８７：１２３−１２６，１９９０）、ｔｒｐプロモーター（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：１５５，１９８３）、ならびにｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２０：２３１，１９８２）が挙げられる。さらなるプロモーターとしては、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージλのＰＲおよびＰＬプロモーター、ｒｅｃＡ、熱ショック、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒ、ｐｈｏＡ、ならびに大腸菌のｌａｃＺプロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーター、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７，１９８７，Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｓ  １９８７）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）に概説されている。代表的な選択可能なマーカーとしては、種々の抗生物質耐性マーカー、例えば、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などが挙げられる。宿主細胞の形質転換に適した多くのプラスミドは、当該技術分野でよく知られており、中でも、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２：９５，１９７７を参照）、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：２０−７７，１９８３ならびにＶｉｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８，１９８２を参照）、ならびにｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ならびにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【００７３】
ある実施形態では、ＳおよびＮタンパク質免疫原またはその改変体は、同じ細胞内で、または同じ発現ベクターから、または同じ発現ベクターからハイブリッド融合ポリペプチドとして発現される。さらに、変異が特定の遺伝子座に、制限部位に隣接し、天然配列の断片へのライゲーションが可能である変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより導入され得る。ライゲーション後、得られる再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する誘導体または改変体をコードする。
【００７４】
あるいはまた、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順が、置換、欠失または挿入に従って改変された特定のコドンを有する改変ポリヌクレオチドを提供するために使用され得る。上記に示す改変を作製する例示的な方法は、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｓｕｐｒａ）に開示されている。また、タンパク質の欠失または切断誘導体（例えば、可溶性細胞外部分）は、所望の欠失と隣接する簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を用いることにより構築され得る。制限消化の後、突出端をフィルイン（ｆｉｌｌ  ｉｎ）し、ＤＮＡをリライゲーションする。上記に示す改変の作製の例示的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））に開示されている。
【００７５】
核酸分子内に作製される変異は、好ましくは、コード配列の読み枠を保存する。さらにまた、変異は、好ましくは、転写されると、ハイブリダイズしてｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及ぼし得る二次ｍＲＮＡ構造（例えば、ループまたはヘアピンなど）をもたらし得る相補的な領域を作出しない。変異部位は予め決定し得るが、変異の性質は、それ自体が予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での変異体の最適な特性を選択するため、ランダム変異誘発を標的コドンにて行ない、発現された変異体を、生物学的活性の獲得、低減または保持に関してスクリーニングし得る。あるいはまた、変異は特定の遺伝子座に、制限部位に隣接し、天然配列の断片へのライゲーションが可能である変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより導入され得る。ライゲーション後、得られる再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する誘導体をコードする。本発明のタンパク質をコードする核酸分子はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発、化学的変異誘発（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３４０２−３４０６，１９８６）；強制ヌクレオチドミスインコーポレーション（例えば、Ｌｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  Ｇｅｎｅ  ８８：１０７−１１１，１９９０）；またはランダム変異誘発オリゴヌクレオチドの使用（Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ３：１１２−１１７，１９８９）などの手法を用いて構築され得る。
【００７６】
本明細書に記載のコロナウイルスタンパク質のうちの任意の１つをコードするクローン化されたポリヌクレオチド配列を含むベクター構築物は、培養哺乳動物細胞内に、例えば、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １４：７２５，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８７）；レトロウイルス系、アデノウイルス系およびプロトプラスト融合媒介性トランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照）によって導入され得る。クローン化されたＤＮＡを含有するベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、一般的に、選択可能なマーカーが、上記細胞内に目的のポリヌクレオチドとともに導入される。培養哺乳動物細胞における使用のための好ましい選択可能なマーカーとしては、薬物、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカーは、増幅可能な選択可能なマーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択可能なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に概説されている。
多価ワクチン
本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび宿主細胞は多価免疫原を作製するために使用され得、多価免疫原は、例えば、多価ワクチンとして使用され得、少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原、あるいは１種類以上のＳタンパク質免疫原、すなわち、複数の異なるＳタンパク質免疫原の混合物または組合せを含み得る。別の実施形態では、多価ワクチンは、少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原、あるいは１種類以上のＮタンパク質免疫原、すなわち、複数の異なるＮタンパク質免疫原の混合物または組合せを含む。あるいはまた、多価ワクチンは、１種類以上のＳタンパク質免疫原と、１種類以上のコロナウイルスＮタンパク質免疫原および／または他のコロナウイルス免疫原、例えば、Ｍタンパク質などとの組合せを含み得る。別の実施形態では、多価ワクチンは、多価ハイブリッドワクチンであり、何らかの様式で連結された、例えば、融合タンパク質としてインフレームで融合されるなどした少なくとも２種類または複数の上記の免疫原を含む。また、免疫原融合タンパク質は、融合タンパク質内の少なくとも１回反復された（少なくとも１種類の免疫原が、融合タンパク質内の少なくとも２つの位置に含有されるように）１種類以上の免疫原を有し得、この反復は、選択した多価免疫原ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、または多価融合タンパク質に対して内部に存在し得る。例えば、かかる多価ハイブリッドコロナウイルス免疫原（多価融合タンパク質）は、（１）本明細書に記載のＳタンパク質の１種類以上のＳタンパク質免疫原またはポリペプチド断片（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６、ならびにその改変体および断片など）；（２）本明細書に記載のＮタンパク質の１種類以上のＮタンパク質免疫原またはポリペプチド断片（例えば、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８、ならびにその改変体および断片など）；または（３）１種類以上のＳタンパク質免疫原（もしくはその断片）および１種類以上のＮタンパク質免疫原（もしくはその断片）を含み得る。少なくとも２種類以上のコロナウイルスＳタンパク質免疫原または少なくとも２種類以上のコロナウイルスＮタンパク質免疫原を、それぞれ、複数のＳタンパク質免疫原またはＮタンパク質免疫原とみなす。他の実施形態では、多価ハイブリッドコロナウイルス免疫原を、プロテオソームまたはプロトリンなどのアジュバント、またはミョウバンなどアジュバント、フロイントアジュバント、もしくはＲｉｂｉアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）と組み合わせる。
【００７７】
さらに、かかる多価ハイブリッドコロナウイルス免疫原ワクチン組成物は、異なるコロナウイルス抗原性群、例えば、第１群（例えば、伝染性胃腸炎ウイルス、ＴＧＥＶ；ヒト呼吸器コロナウイルス、ＨｃｏＶ−２２９Ｅ）；第２群（例えば、マウス肝炎ウイルス、ＭＨＶ）；第３群ウイルス（例えば、トリＩＢＶ）；およびＳＡＲＳ群（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ株Ｔｏｒ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７４１１９を参照）；Ｕｒｂａｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７８７４１を参照）；Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  １（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９１３１５を参照）、ＴＷ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２９２８を参照）；ＢＪ０ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７８４８８を参照）；ＧＤ０３Ｔ００１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５２５６３６を参照）など）；またはその組合せ（あるいは、例えば、ヒトに感染する同定された任意の他のコロナウイルス群）由来の免疫原性エピトープと組合せ得る。
【００７８】
ある実施形態では、同じまたは異なるコロナウイルス免疫原を、制限酵素認識部位である核酸配列にコードされる少なくとも２個のアミノ酸によって連結してもよく、制限部位は、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩなどの任意の１種類以上であり得る。さらなるアミノ酸リンカーが、合成により本明細書に記載のようにして付加されてもよい。好ましくは、さらなるアミノ酸は、ヒトタンパク質の５個のアミノ酸ストレッチ内の配列に同一性を全くもたらさない。また、ハイブリッドコロナウイルス免疫原ポリペプチドは、少なくとも１個のさらなるカルボキシ末端アミノ酸をさらに含み得る。このさらなるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である。任意の２０個の天然に存在するアミノ酸またはその誘導体、例えば、システイン、ヒスチジン、ロイシンおよびグルタミン酸などが付加され得る。例えば、融合ポリペプチドのカルボキシ末端における少なくとも１個のシステイン残基の付加は、他の構成要素、例えば、脂質、担体タンパク質、タグ、酵素などの結合または連結に有用であり得る。
【００７９】
ある実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質免疫原および／またはコロナウイルスＮタンパク質免疫原が第２のアミノ酸配列に連結されており、ある特定の実施形態では、Ｓタンパク質免疫原および／またはコロナウイルスＮタンパク質免疫原は、インフレームで第２のアミノ酸配列と融合されている。第２のアミノ酸配列は、担体タンパク質（例えば、当該技術分野において、抗原の免疫原性の増大または改善を助長すると理解されているタンパク質およびポリペプチド）、タグ（例えば、ヒスチジンタグなど）、または酵素を構成し得る。
【００８０】
本明細書に記載のように、コロナウイルス免疫原融合タンパク質は、例えば、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質の検出、単離または精製を可能にするさらなる機能的または非機能的非コロナウイルスポリペプチド配列に融合されたＳまたはＮタンパク質免疫原、断片、またはその改変体を含み得る。例えば、さらなる機能的ポリペプチド配列はタグ配列であり得、これは、ある実施形態では、融合タンパク質が、タンパク質−タンパク質親和性（例えば、レセプター−リガンド）、金属親和性または電荷親和性方法によって検出、単離および／または精製され得ることが可能になる。他のある実施形態では、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質は、ハイブリッドコロナウイルスポリペプチドが上記さらなるポリペプチド配列から可能となり得るようにプロテアーゼ認識配列を含む配列を有する融合タンパク質の特異的プロテアーゼ切断によって検出され得る。また、ハイブリッドポリペプチドは合成により作製され得、さらなるアミノ酸、担体タンパク質、疎水性部分（例えば、脂質）またはタグ配列を含み、これらは、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに位置し得る。一実施形態では、例えば、組換えコロナウイルス免疫原は、インフレームでタグに融合され、このタグは、アルカリホスファターゼ，チオレドキシン，β−ガラクトシダーゼ，ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ），ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号４０）またはＧＳＴなどのうちの任意の１つであり得る。
【００８１】
ある実施形態では、ハイブリッドコロナウイルスポリペプチド融合タンパク質に融合されたタグはハイブリッドコロナウイルスポリペプチド融合タンパク質の親和性検出および単離を助長するものであり、例えば、ポリヒス、または米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４）に記載された規定の抗原性ペプチドエピトープ、またはＸＰＲＥＳＳ（登録商標）エピトープタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号４１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはチオレドキシンが挙げられ得る。親和性配列は、ベクターにより供給されるヘキサ−ヒスチジンタグであり得る。例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）ベクターは、ニッケルアフィニティカラムを用いた特定の宿主（例えば、細菌など）からの成熟タンパク質融合体の精製のためのポリヒスチジンタグを提供し得る。あるいはまた、親和性配列は、合成によるか、またはコロナウイルスの免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列を組換えにより生成させる（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用）ために使用するプライマーに合成するか遺伝子操作することによるかのいずれかで付加され得る。例えば、一実施形態では、コロナウイルス免疫原をチオレドキシンに融合させると、コロナウイルス免疫原−チオレドキシン融合タンパク質が組換え核酸配列によりコードされる。
【００８２】
（治療用製剤および使用方法）
ある実施形態では、１種類以上のコロナウイルス免疫原を含有する医薬組成物が提供され、これは、コロナウイルスに対する免疫応答を惹起または誘導するために使用され得る。かかる組成物は、被験体に、Ｓタンパク質免疫原、その断片または改変体、Ｓ免疫原融合タンパク質もしくは多価免疫原、またはかかる免疫原の混合物を、本明細書に記載のようにコロナウイルスに特異的な抗体を惹起するのに充分な用量で投与することにより、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法に使用され得る。別の実施形態では、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法は、被験体に、Ｎタンパク質免疫原、その断片または改変体、Ｎ免疫原融合タンパク質もしくは多価免疫原、またはかかる免疫原の混合物を、コロナウイルスに特異的な抗体を惹起するのに充分な用量で投与することを含む。さらに別の実施形態では、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法は、被験体に、少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原および少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原（またはＳまたはＮタンパク質免疫原の改変体もしくは断片）；または少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原および少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原を含む融合タンパク質または多価免疫原；またはかかる免疫原の混合物もしくはカクテルを投与することを含む。
【００８３】
本明細書に記載のように、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法が提供される。ある実施形態では、１種類以上のコロナウイルスタンパク質抗原（免疫原）を、コロナウイルス感染を有するか、またはコロナウイルス感染を発現するリスクのある被験体または宿主に投与する。少なくとも１種類のコロナウイルスタンパク質（例えば、Ｓタンパク質免疫原および／またはＮタンパク質免疫原）の投与は、好ましくは、防御的免疫応答を誘導または刺激する。本明細書で記載する防御的免疫応答は、体液性応答を含み得、すなわち、コロナウイルスタンパク質（免疫処置）の被験体への投与により、コロナウイルスタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を刺激または惹起する。体液性応答の刺激または惹起は、好ましくは、中和抗体である抗体の産生を誘導し、コロナウイルス感染力が中和される。また、体液性応答は粘膜免疫応答を含み得、これには、コロナウイルスに特異的である粘膜ＩｇＡ抗体の産生が含まれ、被験体または宿主の血清中に検出され得る種々の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ）のうちのいずれか１つの産生が含まれ得る。少なくとも１種類のコロナウイルスタンパク質免疫原の投与はまた、細胞媒介性応答を誘導し得、これには、Ｔ細胞の刺激、免疫賦活性分子（例えば、免疫細胞によって産生されるサイトカインなど）の産生、および特異的コロナウイルスタンパク質免疫原に応答した特異的Ｔ細胞のクローン増殖が含まれる。
【００８４】
一実施形態では、コロナウイルス感染の処置および／または予防のための免疫原性組成物として有用な組成物は、免疫応答を惹起することができる本明細書に記載の少なくとも１種類のコロナウイルス抗原（免疫原）（多価ワクチンおよび多価ハイブリッド融合タンパク質を含む）と、プロトリンまたはプロテオソームアジュバント（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号および同第５，９８５，２８４号、ならびに米国特許出願公開公報第２００１／００５３３６８号および同第２００３／００４４４２５号を参照のこと）とを含有する。当該技術分野において理解されているように、アジュバントは免疫原の免疫原性を増強または改善し得（すなわち、免疫賦活剤として作用する）、多くの抗原は、アジュバントと合わせるか、混ぜるか、または混合しないと免疫原性が不十分である。多種多様な供給源が、抗原の供給源として使用され得、例えば、弱毒化生ウイルス、死滅ウイルス、スプリット抗原調製物、サブユニット抗原、組換えまたは合成ウイルス抗原、およびその組合せなどであり得る。サブユニット、組換えまたは合成ワクチンの有効性を最大限にするため、抗原を、強力な免疫賦活剤またはアジュバントと合わせてもよい。他の例示的なアジュバントとしては、ミョウバン（水酸化アルミニウム，ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標））；リン酸アルミニウム；ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）；リポソーム（リピドＡを含有するものおよびしないもの）；Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ／Ｃｏｒｉｘａ）；ＭＦ５９；または他の油性および水性エマルジョン型アジュバント、例えば、ナノエマルジョン（例えば、米国特許第５，７１６，６３７号を参照のこと）もしくはサブミクロンエマルジョン（例えば、米国特許第５，９６１，９７０号を参照のこと）など；ならびにフロイント完全および不完全アジュバントが挙げられる。
【００８５】
プロテオソーム系アジュバント（すなわち、プロトリンまたはプロテオソーム）は、本明細書に記載のさまざまなコロナウイルス抗原（免疫原）供給源の任意の１種類以上を含み得るワクチン組成物または製剤において使用され得る。プロテオソームは、典型的には、ナイセリア属の種由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ）で構成されるが、他のグラム陰性菌に由来のものであってもよい（例えば、Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第４，７０７，５４３号を参照）。プロテオソームは、２０〜８００ｎｍの小胞または小胞様ＯＭＰクラスターに自己合成する能力、およびタンパク質抗原、特に、疎水性部分を有する抗原と非共有結合により一体化、配位、会合あるいは協同する能力を有する。プロテオソームは疎水性であり、ヒトへの使用に安全であり、大きさがある種のウイルスと同程度である。背景として、および理論に拘束されることは望まないが、プロテオソームをタンパク質抗原などの抗原と混合すると、抗原とプロテオソーム間に非共有結合性の会合または配位を含む組成物が提供される。この会合または配位は、可溶化性デタージェントが選択的に除去されるか、濃度を低下させた場合（例えば、透析によって）、形成される。プロテオソームは、例えば、米国特許出願公開公報第２００１／００５３３６８号および同第２００３／００４４４２５号などに記載のようにして調製され得る。
【００８６】
小胞形態または小胞様形態の外膜タンパク質成分（１種類以上のＯＭＰの溶融球状様ＯＭＰ組成物を含む）をもたらす任意の調製方法が、「プロテオソーム」の定義に含まれる。一実施形態では、プロテオソームは、ナイセリア属の種に由来のものであり、より好ましくは、髄膜炎菌に由来のものである。他のある実施形態では、プロテオソームは、アジュバントかつ抗原送達組成物であり得る。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、１種類以上のコロナウイルス抗原およびアジュバントを含み、アジュバントがプロジュバントまたはプロトリンを含む。本明細書に記載のように、コロナウイルス抗原は、ウイルス粒子、コロナウイルスに感染した細胞、もしくは組換え体供給源から単離されたものおよび／または、例えば（デタージェント）スプリット抗原を含むものであり得る。
【００８７】
ある実施形態では、免疫原性組成物は、リポ糖などの第２の免疫賦活剤をさらに含む。すなわち、アジュバントは、さらなる免疫賦活剤を含むように調製され得る。例えば、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントを得るため、プロジュバントをリポ糖と混合し得る。したがって、ＯＭＰ−ＬＰＳ（プロトリン）アジュバントは２つの成分で構成されたものであり得る。第１の成分は、グラム陰性菌（例えば、髄膜炎菌）から調製されたプロテオソーム（すなわち、プロジュバント）の外膜タンパク質調製物を含み、第２の成分はリポ糖の調製物を含む。リポ糖は、米国特許出願公開公報第２００１／００５３３６８号および同第２００３／００４４４２５号に記載のようにして調製され得る。また、第２の成分は、脂質、糖脂質、糖タンパク質、低分子など、およびその組合せを含み得ることが想定される。
【００８８】
本明細書に記載のように、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントの２つの成分は、成分間の相互作用を最適化し、免疫原性組成物の調製における使用のための成分の安定な会合および配合がもたらされる特定の初期比で合わされ（混ぜるか、または配合され）得る。上記方法は、一般的に、選択したデタージェント溶液（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−Ｉ００、またはＭｅｇａ−１０）中で成分を混合し、次いで、透析またはダイアフィルトレーション／限外濾過方法論によって、デタージェントの量を所定の好ましい濃度に低下させながら、ＯＭＰとＬＰＳ成分の複合体形成を行なうことを伴う。２つの成分の混合、共沈殿または凍結乾燥はまた、充分で安定な会合、組成または配合を行なうために使用され得る。一実施形態では、免疫原性組成物は、１種類以上のコロナウイルス抗原およびアジュバントを含み、アジュバントがプロジュバント（すなわち、プロテオソーム）およびリポ糖を含む。
【００８９】
特定の一実施形態では、最終リポ糖含量は、総プロテオソームタンパク質の重量基準のパーセントとして、約１％〜約５００％の範囲、より好ましくは約１０％〜約２００％の範囲、または約３０％〜約１５０％の範囲であり得る。別の実施形態は、アジュバントを含み、プロテオソームが髄膜炎菌から調製され、リポ糖がＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓから調製され、最終リポ糖含量は、総プロテオソームタンパク質の重量基準の５０％〜１５０％である。別の実施形態では、プロテオソームは、総ＯＭＰの約０．５％〜約５％までの範囲の内因性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）含量で調製される。別の実施形態では、プロテオソームは、約１２％〜約２５％の範囲の内因性リポ糖を有し、さらに別の実施形態では、内因性リポ糖は、総ＯＭＰの約１５％〜約２０％である。本開示はまた、任意のグラム陰性菌種（これは、プロテオソームの供給源である同じグラム陰性菌種由来であっても、異なる細菌性種由来であってもよい）由来のリポ糖を含有する組成物を提供する。
【００９０】
ある実施形態では、免疫原性組成物におけるコロナウイルス抗原に対するプロテオソームまたはプロトリンの比は、１：１より大きく、２：１より大きく、３：１より大きく、または４：１より大きい。他の実施形態では、免疫原性組成物におけるコロナウイルス抗原に対するプロテオソームまたはプロトリンの比は、約１：１、２：１、３：１または４：１である。この比は、８：１以上であり得る。他の実施形態では、免疫原性組成物のコロナウイルス抗原に対するプロテオソームまたはプロトリンの比は、約１：１〜約１：５００の範囲であり、少なくとも１：５、少なくとも１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：５０、または少なくとも１：１００、または少なくとも１：２００である。プロトリン：コロナウイルス抗原の比が１：２〜１：２００である利点は、プロテオソーム系アジュバントの量が、コロナウイルス抗原が免疫応答を惹起する能力に有意な影響を与えることなく、劇的に低減され得ることである。
【００９１】
別の実施形態では、組成物は、１種類以上のコロナウイルスＳタンパク質免疫原をプロテオソームまたはプロトリンと合わされた（混ぜるか、または配合された）を含み、Ｓタンパク質免疫原が、配列番号２またはその断片と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含み、Ｓタンパク質免疫原またはその断片が、コロナウイルス感染に対する防御的免疫応答を惹起するエピトープを有する。例示的なＳタンパク質免疫原は、配列番号２に示す、または配列番号２からなるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｓタンパク質免疫原は配列番号２の断片であり、上記断片は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６から選択されるアミノ酸と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含む。
【００９２】
他の実施形態では、免疫原性組成物は、１種類以上のコロナウイルスＮタンパク質免疫原、その断片または改変体およびアジュバントから構成され、アジュバントが、プロテオソームまたはプロトリンを含む。ある実施形態では、Ｎタンパク質免疫原は配列番号２８に示すアミノ酸配列を含み、他のある実施形態では、上記組成物は、配列番号２８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）配列を有するＮタンパク質免疫原改変体を含む。このような免疫原性組成物における使用のための例示的なＮタンパク質免疫原またはその改変体は、配列番号２８の断片であり、例えば、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６もしくは配列番号３８のアミノ酸配列、またはこれらの配列と少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）配列を含むアミノ酸配列を含む。
【００９３】
別の実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１種類（１種類以上）コロナウイルスＳ免疫原、その断片または改変体および少なくとも１種類（１種類以上）コロナウイルスＮタンパク質免疫原、その断片または改変体ならびにアジュバントから構成され、アジュバントが、プロジュバントまたはプロジュバントおよびリポ糖を含む。
【００９４】
あるいはまた、本明細書に記載の任意のＳもしくはＮタンパク質免疫原、またはＳおよびＮタンパク質免疫原の任意の組合せは、免疫原性組成物にてリポソームにより合わされ（混ぜるか、または配合され）得る。好ましくは、１種類以上のコロナウイルス免疫原を含有するリポソームは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ脂質またはα−ガラクトシルホスファチジルグリセロールアルキルアミンをさらに含む。リポソームにおけるかかる脂質の添加により、防御的免疫が増大され、コロナウイルスワクチン組成物の効力が増強され得る。
【００９５】
本発明のコロナウイルスポリペプチドおよび免疫原は、共有結合により結合された疎水性部分をさらに含み得る。疎水性部分は、例えば、米国特許第５，７２６，２９２号に開示されているようなアミノ酸配列または脂質であり得る。配列番号２に示す配列を有する天然に存在するコロナウイルスＳタンパク質および組換えにより発現されるＳタンパク質は、疎水性膜貫通ドメイン（配列番号２のほぼアミノ酸１１９５〜ほぼ１２４０）を含有し、これは、Ｓタンパク質免疫原断片（例えば、配列番号１６または１８は、これと融合されたＳタンパク質由来の疎水性膜貫通ドメインを有し得る）、またはＮタンパク質免疫原（例えば、配列番号３０または３２は、これと融合されたＳタンパク質由来の疎水性膜貫通ドメインを有し得る）を有する疎水性部分としての機能を果たし得る。一実施形態では、コロナウイルス組成物（例えば、ワクチン組成物）には、コロナウイルスＳタンパク質もしくはＮタンパク質免疫原、またはその改変体が、プロテオソーム（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号および同第５，９８５，２８４号を参照）またはプロトリン（例えば、米国特許出願公開公報第２００３／００４４４２５号を参照）と、組み合わされ、混ぜられ、複合体化され、または配合されて含まれ、ＳまたはＮタンパク質免疫原が疎水性部分またはフットをさらに含む。プロテオソームと合わせる場合、ＳまたはＮタンパク質免疫原は、好ましくは疎水性部分を含み、上記部分は、疎水性アミノ酸配列または脂質（本明細書で用いる場合、脂質は、溶解特性をいい、したがって、アルキル、アリールアルキル、アリール、脂肪酸、グリセリドおよびグリセリルエーテル、リン脂質、スフィンゴ脂質、長鎖アルコール、ステロイド類、ビタミン類などを含む）で構成され得る。一実施形態では、Ｓタンパク質の疎水性部分（例えば、膜貫通ドメイン）を、コロナウイルスＮタンパク質免疫原に融合させ得る。他のある実施形態では、ＳまたはＮタンパク質免疫原（疎水性部分を有するか、または有しない）は、第２のアミノ酸配列をさらに含んで融合タンパク質を形成し得、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のようなタグ、担体、または酵素である。さらに他の実施形態では、ＳおよびＮ免疫原は、免疫原性組成物にて、別個の成分として合わされてもよく、または融合されて、疎水性部分を有するか、または有しない、およびさらに、あるいはまた、本明細書に記載のような第２のアミノ酸配列を有する、ハイブリッド、多価免疫原を形成してもよい。
【００９６】
他の実施形態では、免疫原性組成物は、（プロジュバントまたはプロトリン）を含み得、ワクチンのレシピエントの１種類以上の宿主細胞により産生されるある種のレセプター（例えば、Ｔｏｌｌ様レセプター，ＴＬＲ）との相互作用によって、宿主の免疫応答を刺激できる成分（例えば、レセプターリガンド）をさらにを含み得る。一実施形態によれば、コロナウイルスタンパク質の免疫原性エピトープを含む組成物は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）と相互作用することができ、それにより生得の免疫応答が促進される（これは、後に適応的免疫応答を惹起する場合もあり、しない場合もある）ポリペプチドエピトープを含有し得る。
【００９７】
生得の免疫応答は、特異的抗原依存性または抗体依存性応答でない非特異的防御的免疫応答であり（すなわち、Ｔ細胞および／またはＢ細胞のクローン増殖を伴わない）、本明細書に記載の数々の抗原、免疫原またはコロナウイルスのうちの任意の１つによって惹起され得る。本明細書に記載の免疫賦活性組成物は、プロテオソームおよびリポ糖（プロトリン）を含み、これらのいずれか一方または両方が非特異的防御的応答を惹起し得る。理論に拘束されることを望まないが、本明細書に開示したワクチン組成物または製剤の１種類以上の成分は、ワクチンのレシピエントの生得の免疫応答または適応的免疫応答と関連するＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）と相互作用し得る。少なくとも１０種類のＴＬＲが報告されている（例えば、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３３５，２００３を参照）。ＴＬＲ８およびＴＬＲ１０を除く特定のＴＬＲと相互作用し、続いて活性化する１種類以上のリガンドが同定されている。髄膜炎菌のある種の外膜タンパク質、例えば、ＯＭＰ２（Ｐｏｒ  Ｂともいう）はＴＬＲ２と相互作用し、一方、すべてではないが大部分のグラム陰性菌のＬＰＳはＴＬＲ４と相互作用する。したがって、生物学的効果に寄与し得る本明細書に記載のワクチン組成物または製剤の活性の一例としては、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の一方または両方の活性化が挙げられる。他のＴＬＲ（ＴＬＲ２およびＴＬＲ４以外）の活性化は、同様の機能を提供し得、発現されるサイトカインの定性的または定量的プロフィールをさらに増強し得、宿主のＴｈｌ／Ｔｈ２免疫応答と関連し得る。また、ＬＰＳおよびＰｏｒ  Ｂ以外のＴＬＲリガンドを単独または組合せで使用し、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４を活性化し得ることが想定される。１種類以上のＴＬＲの定性的または定量的活性化により、同時に体液性抗体応答を伴って、または伴わずに、Ｔｈ１（１型）またはＴｈ２（２型）免疫応答の相対刺激（均衡または不均衡）を惹起、実施または影響することが期待される。また、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４以外のＴＬＲと相互作用するリガンドは、本明細書に記載のワクチン組成物に使用され得る。かかるワクチン成分を単独または組合せで使用し、本明細書に示したようなウイルス感染を処置または上記感染を防御するのに充分な宿主の免疫応答の発現に影響を与え得る。かかるＴＬＲおよび関連するリガンドは当該技術分野で知られており、表１に示すものが挙げられる。
【００９８】
【表１】
2008505114.tif 000003
同定されたＴＬＲ（表１）の任意の１つまたは任意の組合せは、本明細書に記載のコロナウイルスＳタンパク質免疫原、Ｎタンパク質免疫原、または少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原とＮタンパク質免疫原の両方を含むワクチン組成物中に添加され、合わされ、または配合されたＴＬＲリガンド成分の任意の１つまたは任意の組合せによって活性化され得る。ＴＬＲの任意の１つまたは多数の刺激は、任意の１つまたは多数のＴＬＲリガンドを、投与経路（例えば、鼻腔内、注射など）に適した濃度で用いてなされ得る。したがって、ワクチン組成物または製剤は、任意の１種類以上のＴＬＲリガンド（１種類または複数種類）、例えば、抗原性（免疫原性）ワクチン成分と組み合わされ、または配合された組換えリガンド（融合タンパク質またはその断片）を、外因性リポ糖成分の添加を伴って、またはそれなしで含み得る。
【００９９】
効率的な免疫応答は、生得の免疫応答と適応的免疫応答間の伝達に依存する。Ｔリンパ球は、エフェクター分子の放出を制御することにより適応的免疫応答を調整するのに重要である。例えば、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生し、これらは、細胞媒介性免疫の発現に重要である（Ｍｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２３４８，１９８６；ＳｔｒｅｅｔおよびＭｏｓｍａｎｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．５：１７１，１９９１）。対照的に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を産生する。これらのエフェクター分子は、本明細書に記載したコロナウイルス免疫原のいずれかで、常套的に当業者によって実施されている方法に従って免疫処置した被験体または宿主由来の生物学的試料中で容易に測定され得る。
【０１００】
細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答では、免疫応答が、優勢なＴｈ２応答から均衡もしくは混在したＴｈ１およびＴｈ２応答に（Ｔｈ１応答の増加またはＴｈ１の増加とＴｈ２応答の低下の併発による）、または優勢なＴｈ１応答にシフトしたか否かの判定を含む。同様に、Ｔｈ１応答から均衡もしくは混在したＴｈｌ／Ｔｈ２応答へのシフト、またはＴｈ２応答の増大もしくは優勢が判定され得る。例えば、Ｔｈ１サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−βなど、ならびに２型サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３などのレベルが、本明細書に記載され、当該技術分野で実施されている方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴおよびフローサイトメトリー（細胞内サイトカインを測定するため）に従って測定され得る。１型応答により、他のＣＭＩ関連応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の発現（これは、Ｔｈ１免疫を示す）などの誘導が予測される。免疫応答の抗原特異的惹起または刺激に起因する免疫細胞増殖およびクローン増殖は、リンパ球、例えば、脾臓細胞またはリンパ節由来の細胞などを単離し、上記細胞を抗原で刺激し、サイトカイン産生、細胞増殖および／または細胞の生存を、例えば、トリチウム化チミジンの取込み、または非放射性アッセイ、例えば、ＭＴＴアッセイなどによって測定することにより測定され得る。
【０１０１】
本明細書に記載の免疫賦活性、免疫原性および／または免疫調節性組成物は、下記の１種類以上の特異的抗抗原免疫応答を含み得る。抗原特異的抗体（これは、任意のクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＥ、ならびに上記クラスのアイソタイプを含み得る）の産生をもたらす特異的体液性応答が惹起、誘導または刺激され得る。例えば、血清、鼻洗浄液、肺洗浄液および粘膜切片（特に、ＩｇＡ）または他の組織中の特異的ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡの存在は、本明細書に記載され、当該技術分野で公知のさまざまなイムノアッセイ、例えば、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、オクタローニ（Ｏｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）などのいずれかによって測定され得る。イムノアッセイでの抗原またはコロナウイルス特異的抗体の検出では、生物学的試料に、精製され、単離され、一部単離された抗原もしくはその断片との相互作用もしくは接触、または固定した（例えば、エタノールまたはホルムアルデヒドなどで）もしくは固定していない、または非弱毒化のものであり得るウイルスとの相互作用もしくは接触を許容させ得る。粘膜切片としては、気道（鼻咽頭および肺を含む）から採取したものが挙げられる。また、機能、例えば、抗原特異的抗体が、微生物の食作用もしくはオプソニン作用の助長、または宿主細胞内への微生物の侵入の抑制、または宿主細胞内への微生物（例えば、ウイルスなど）の侵入、融合もしくは増殖の抑制を行なう能力などのアッセイも行なわれ得る。かかる方法は、本明細書に記載され、常套的に当業者によって実施されている。
【０１０２】
医薬組成物は、好ましくは、少なくとも１種類（１種類以上）のコロナウイルス免疫原またはこれとの融合タンパク質に加え、少なくとも１種類の薬学的に許容され得るビヒクル、担体、希釈剤または賦形剤ならびに、任意選択で、他の成分を含む。例えば、Ｓタンパク質免疫原もしくはその融合タンパク質の組成物、または２種類以上のＳタンパク質免疫原もしくはその融合タンパク質のカクテル、またはＳ、Ｎおよび／またはＭ免疫原もしくはその融合タンパク質のカクテルとの使用に適当な薬学的に許容され得る担体。治療用途のための薬学的に許容され得る担体は医薬分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０）およびＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（Ｓ．Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｉ，ｅｄ，１９９２）を参照のこと。上記組成物はまた、増粘剤、緩衝剤、溶媒、湿潤剤、保存剤、キレート化剤、アジュバントなど、およびその組合せを含み得る。
【０１０３】
薬学的に許容され得る塩は、かかる化合物と、有機もしくは無機酸（酸付加塩）または有機もしくは無機塩基（塩基付加塩）とのの組合せから誘導される化合物の塩をいう。化合物は、遊離塩基または塩形態のいずれかで使用され得る。  
【０１０４】
また、医薬組成物は、希釈剤  例えば、水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などをさらに含み得る。ある実施形態では、希釈剤は、宿主に生理学的な最終リン酸塩濃度および最終塩化ナトリウム濃度が送達されるように配合されたＰＢＳである。ＰＢＳは、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．５ｍＭ〜約４０ｍＭ、さらにより好ましくは、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、最も好ましくは約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの最終リン酸塩濃度範囲；約１００ｍＭ〜約２００ｍＭおよび最も好ましくは約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭの最終塩濃度範囲を有し得る。好ましくは、最終ＰＢＳ濃度は約５ｍＭのリン酸塩および約１５０ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌなど）である。ある実施形態では、任意の上記の医薬組成物は、本明細書に記載のコロナウイルス免疫原（好ましくは、滅菌されている）のカクテルを含む。
【０１０５】
本明細書に記載の組成物は、無菌環境下で上記組成物を調製すること、および／または当該技術分野において利用可能な方法を用いて上記組成物を最後に滅菌することのいずれかにより滅菌状態にし得る。多くの医薬品は滅菌状態となるように製造され、この基準はＵＳＰ  ＸＸＩＩ  ＜１２１１＞によって規定されている。この実施形態での滅菌は、当該産業界で認められ、ＵＳＰ  ＸＸＩＩ  ＜１２１１＞に記載されたいくつかの手段、例えば、ガス滅菌、電離放射線または濾過によってなされ得る。滅菌は、無菌処理と称されるもの（これもＵＳＰ  ＸＸＩＩ  ＜１２１１＞に規定されている）によって維持され得る。ガス滅菌のための使用に許容され得るガスとしては、エチレンオキシドが挙げられる。電離放射線法のための使用に許容され得る放射線の種類としては、例えば、コバルト６０供給源からのγ線、および電子ビームが挙げられる。γ放射線の典型的な線量は２．５ＭＲａｄである。適宜、濾過は、適当な孔径（例えば、０．２２μｍ）を有し、適当な材質（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））のフィルターを用いてなされ得る。用語「ＵＳＰ」は、米国薬局方（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を参照されたい。
【０１０６】
また、本明細書において、少なくとも１種類のコロナウイルスＳタンパク質免疫原、および薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法を記載し、ここで、Ｓタンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含み、防御的免疫応答を惹起するエピトープを有する。上記免疫応答は、体液性免疫応答（例えば、粘膜ＩｇＡ、全身性ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ応答）および／または細胞媒介性免疫応答である。Ｓタンパク質免疫原組成物は、投与されるＳタンパク質免疫原または複数の免疫原またはその改変体に特異的な免疫応答を惹起するのに充分な用量で投与される。ある実施形態では、予防または処置対象の感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、ＳＡＲＳ群コロナウイルスまたはその組合せによって引き起こされ得る。
【０１０７】
他の実施形態では、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法は、少なくとも１種類のコロナウイルスＮタンパク質免疫原、および薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含み、ここで、Ｎタンパク質免疫原は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含み、防御的免疫応答（体液性応答（例えば、粘膜ＩｇＡ、全身性ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ  応答を含む）および／または細胞媒介性免疫応答）を惹起するエピトープを有する。Ｎタンパク質免疫原組成物は、投与されるＮタンパク質免疫原またはその改変体に特異的な免疫応答を惹起するのに充分な用量で投与される。ある実施形態では、予防または処置対象の感染は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、ＳＡＲＳ群コロナウイルスまたはその組合せによって引き起こされ得る。
【０１０８】
さらに他の実施形態では、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法は、複数のコロナウイルス免疫原を含む組成物を、その必要がある被験体に投与することを含む。上記複数のコロナウイルス免疫原は、少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原を含むものであり得、ここで、少なくとも２種類のＳタンパク質免疫原の各々は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６から選択される配列と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、複数のコロナウイルス免疫原は、少なくとも２種類のＮタンパク質免疫原を含むものであり得、ここで、少なくとも２種類のＮタンパク質免疫原の各々は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８から選択される配列と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法は、本明細書に記載の少なくとも１種類のＳタンパク質免疫原および本明細書に記載の少なくとも１種類のＮタンパク質免疫原を含む複数のコロナウイルスタンパク質免疫原を含む。他の実施形態では、コロナウイルス感染の処置および／または予防方法は、Ｓタンパク質免疫原、Ｎタンパク質免疫原、コロナウイルスＭタンパク質免疫原、コロナウイルスＥタンパク質免疫原から選択され得る複数のコロナウイルスタンパク質免疫原を含み得る、および任意のその組合せを含む。好ましくは、複数の免疫原の各免疫原は、体液性応答などの防御的免疫応答（例えば、中和抗体の惹起）および／または細胞媒介性免疫応答を惹起することができるエピトープを有し、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わされる。ＳＡＲＳコロナウイルスＭタンパク質免疫原は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＵ０７９３３に示されるもの（これは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７０２０２６に示すヌクレオチド配列にコードされる）などのアミノ酸配列を有し得る。Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列および上記コードされたタンパク質アミノ酸配列は、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノム全体のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列を提供する公に入手可能なデータベースの数々のエントリー内を見るとよい。コロナウイルスＳタンパク質およびコロナウイルスＮタンパク質のさらなるアミノ酸配列ならびにこれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列も同様に、公に入手可能なデータベースによって提供されるＳＡＲＳコロナウイルスゲノム配列を見るとよい。ある実施形態では、免疫原組成物は、第１群コロナウイルス、第２群コロナウイルス、第３群コロナウイルス、ＳＡＲＳ群コロナウイルス、またはその組合せに特異的であり得る。
【０１０９】
コロナウイルス免疫原組成物または製剤での処置に適した被験体または宿主は、疾患発現リスクの充分確立されたインジケータ、または既存の疾患充分確立されたホールマークによって特定され得る。例えば、感染のインジケータとしては、熱、乾咳、呼吸困難（息切れ）、頭痛、低酸素血症（低い血中酸素濃度）、リンパ球減少症（リンパ球の数の減少）、中程度上昇したアミノトランスフェラーゼレベル（肝臓障害を示す）、微生物陽性培養物、炎症などが挙げられる。本明細書に記載のコロナウイルス免疫原ワクチンで処置または予防され得る感染としては、コロナウイルスによって、またはこれが原因で引き起こされるものが挙げられ、上記感染は、一次、二次または日和見性である。コロナウイルスの例としては、このウイルスの任意の亜類型株、抗原性改変体など、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスが挙げられる。一例として、ＳＡＲＳ感染は、流感様症状、例えば、高熱、筋肉痛、乾性および非生産性呼吸困難、リンパ球減少症、および胸部Ｘ線撮影での浸潤を特徴とする。２００２〜２００３年のＳＡＲＳ流行時の死亡率は、およそ１０％であったが、高齢者では５０％もの高率であった（Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．１：２０９、２００３）。
【０１１０】
本発明の１種類以上のコロナウイルス免疫原を含有する医薬組成物は、上記組成物が被験体、例えば、ヒトまたは非ヒト動物などに投与されるのを可能にする任意の形態であり得る。例えば、ＳまたはＮタンパク質免疫原、融合タンパク質および／または多価組成物は、液体溶液として調製および投与され得るか、または固体形態（例えば、凍結乾燥）として調製され得、これは、投与と関連して、固体形態で投与され得るか、または溶液中に再懸濁され得る。ハイブリッドポリペプチド組成物は、内包された活性成分が、被験体または患者への上記組成物の投与時に生体利用可能となるように、低速放出により生体利用可能となるように調製または配合される。被験体または患者に投与される組成物には、１種類以上の投薬単位の形態が採用される。例えば、錠剤は単回投薬単位であり得、エーロゾル形態の本発明の１種類以上の化合物の容器は、複数の投薬単位を収容し得る。好ましいある実施形態では、本発明のコロナウイルス免疫原または免疫原のカクテルを含む任意の上記の医薬（治療用）組成物は、容器内、好ましくは滅菌容器内に存在させる。
【０１１１】
一実施形態では、治療用（医薬）組成物は経鼻的に投与され、コロナウイルス免疫原またはカクテル組成物が、鼻関連リンパ系組織に位置する細胞などの細胞によって取り込まれ得る。他の典型的な投与経路としては、限定されないが、経腸的、非経口、経皮／経粘膜、経鼻的、および吸入が挙げられる。用語「経腸的」は、本明細書で用いる場合、免疫原性組成物が胃腸管または口腔粘膜を介して吸収される投与経路であり、経口、経直腸、および舌下が挙げられる。用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、胃腸管を通らない投与経路を示し、動脈内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼球内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜下、および膣内注射または輸液手法が挙げられる。用語「経皮／経粘膜」は、本明細書で用いる場合、免疫原性組成物が皮膚を介して、または経由して投与される投与経路であり、局所が挙げられる。用語「経鼻的」および「吸入」は、免疫原性組成物が呼吸樹内に導入される投与手法を包含し、肺内または経肺が挙げられる。一実施形態では、本発明の組成物は経鼻的に投与される。
【０１１２】
別の実施形態では、コロナウイルス抗原に特異的に結合し、ウイルスの中和を助長する（すなわち、ウイルス性感染力を低減または消去する）、不活化を助長する、ウイルスの合成を抑制もしくは阻止する、および／またはウイルスの核酸複製、転写もしくは翻訳を抑制もしくは阻止するする抗体を投与することによる、コロナウイルス感染の処置および／または予防のための方法が提供される。コロナウイルス抗原に特異的に結合する抗体は、数々の本明細書に記載され、当該技術分野で実施されている方法のうちのいずれか１つによって生成および調製され得る。
【０１１３】
一実施形態では、コロナウイルスタンパク質に特異的に結合する複数（少なくとも２種類以上）の単離された抗体は、コロナウイルス感染を予防する方法であって、被験体に、少なくとも１種類のコロナウイルスタンパク質免疫原（例えば、Ｓタンパク質免疫原、Ｎタンパク質免疫原および／またはＭタンパク質免疫原など）を、少なくとも１種類のコロナウイルスタンパク質免疫原に特異的な抗体を惹起するのに充分な用量で含有する組成物を投与することを含む方法によって作製され、ここで、上記タンパク質免疫原は、防御的免疫応答（これは、好ましくは、体液性応答を含む）を惹起するエピトープを有する。生物学的試料、例えば、血清、リンパ、鼻咽頭洗浄液、血液、腹水、肺洗浄液など、他の体液は宿主から入手され得、コロナウイルスタンパク質に特異的な抗体は、当業者によって常套的に実施されている方法、例えば、親和性精製方法などに従って単離され得る。例えば、コロナウイルスタンパク質に特異的である抗体は、生物学的試料他の抗体および成分から、生物学的試料をコロナウイルスタンパク質またはその断片の供給源と接触させることにより取り出され、または単離され得る。別の実施形態では、血清を、少なくとも１種類のコロナウイルスタンパク質免疫原で免疫処置した宿主から入手し得、特定の免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧなどに関して富化し得る。かかる免疫血清の調製方法は、当該技術分野でよく知られている。免疫血清は、好ましくは、血清を投与する種と同じ宿主種から単離されたものである。ある実施形態では、抗体を、第１群コロナウイルスもしくは第２群コロナウイルスもしくは第３群コロナウイルスもしくはＳＡＲＳ群コロナウイルス、またはその組合せの少なくとも１種類で免疫処置した被験体から入手し、その結果、単離された抗体または宿主から入手した血清は、第１群コロナウイルスもしくは第２群コロナウイルスもしくは第３群コロナウイルスもしくはＳＡＲＳ群コロナウイルスに特異的な少なくとも１種類の抗体を含む。生物学的試料はまた、１つより多くの群のコロナウイルス由来の抗原に特異的に結合する１種類以上の抗体を含有し得る。
【０１１４】
別の実施形態では、コロナウイルス感染の処置または予防方法は、被験体に、薬学的に許容され得る担体および複数の本明細書に記載の抗体を含む組成物を投与することを含む。また、コロナウイルス感染の獲得または発現にリスクのある被験体は、上記コロナウイルスタンパク質免疫原（第１のコロナウイルスＳタンパク質免疫原または第１のコロナウイルスＮタンパク質免疫原）と異なる少なくとも１種類のコロナウイルスタンパク質免疫原（例えば、第２のコロナウイルスＳタンパク質免疫原または第２のコロナウイルスＮタンパク質免疫原または第２のコロナウイルスＳタンパク質免疫原および第２のコロナウイルスＮタンパク質免疫原）を含む組成物の投与の前、これと同時、またはその後に投与される第１のコロナウイルスタンパク質免疫原に特異的に結合する複数の抗体を有し得る。
【０１１５】
本明細書に記載のように、コロナウイルスＳタンパク質免疫原またはその改変体（これらは、第１もしくは第２の免疫原または第３のＳタンパク質免疫原などであり得る）は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６から選択され得る配列と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含む。また、本明細書に記載のように、コロナウイルスＮタンパク質免疫原（これは、第１もしくは第２の免疫原または第３のＮタンパク質免疫原などであり得る）は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８から選択されるアミノ酸配列と同一であるか、または少なくとも８０％同一である（これは、少なくとも８５％、９０％もしくは９５％、または８０％〜１００％の間の任意のパーセントを含む）アミノ酸配列を含む。
【０１１６】
他の実施形態では、コロナウイルスＭタンパク質免疫原もしくはコロナウイルスＥタンパク質免疫原またはその組合せを投与して免疫応答を惹起し得、ここで、異なる免疫原（Ｓタンパク質免疫原またはＮタンパク質免疫原を含む）の各々は、防御的免疫応答、例えば、体液性応答または細胞媒介性免疫応答などを惹起する少なくとも１つのエピトープを有する。かかる組成物は、本明細書に記載の薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。したがって、本明細書に記載のように、１種類以上のコロナウイルス免疫原に特異的な抗体は受動的に提供され得るが、被験体にワクチン接種して、１種類以上の異なるコロナウイルス免疫原に特異的な抗体を積極的に惹起する。別の実施形態では、１種類以上のコロナウイルス免疫原に特異的な抗体が受動的に提供され得、一方で、被験体に１種類以上の同コロナウイルス免疫源および１種類以上の異なるコロナウイルス免疫原をワクチン接種し、１種類以上のコロナウイルス抗原に特異的に結合する抗体を積極的に惹起する。
【０１１７】
別の実施形態では、本明細書に記載のコロナウイルスタンパク質免疫原およびその改変体に特異的に結合する抗体が提供される。コロナウイルスタンパク質抗原（免疫原）、例えば、Ｓタンパク質免疫原およびＮタンパク質免疫原、またはこれらの免疫原の改変体および断片などは、ＳまたはＮタンパク質免疫原およびその改変体上に存在する少なくとも１つのエピトープに特異的な抗体を惹起するために使用される。好ましい実施形態では、上記抗体は、コロナウイルスＳまたはＮタンパク質上に存在する特異的防御的エピトープに結合する。抗体としては、ポリクローナル抗体、単一特異的抗体、モノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、およびその抗原結合断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｖ、およびＦａｂ断片など、ならびに組換えまたは合成により作製された抗体または抗原結合断片が挙げられる。かかる抗体には、モノクローナル抗体が特異的に結合するのを可能にする可変領域が組み込まれており、これは、抗体が、コロナウイルスＳもしくはＮペプチドまたは第１群、第２群、第３群、またはＳＡＲＳ群コロナウイルス由来のポリペプチドに選択的に結合できることを意味する。「に特異的」「免疫特異的」または「に特異的に結合する」は、第１群、２、３もしくはＳＡＲＳコロナウイルスのコロナウイルスＳまたはＮタンパク質由来の免疫原をコードする核酸分子にコードされるポリペプチドまたはペプチドにまたは第１群、２、３もしくはＳＡＲＳコロナウイルスの合成されたコロナウイルスＳまたはＮタンパク質に特異的に（選択的に）結合するタンパク質（例えば、抗体）の能力をいう。さらに別の実施形態では、コロナウイルスタンパク質に特異的に結合する齧歯類モノクローナル抗体（本明細書に記載され、当該技術分野で公知の方法に従って調製される）は、本明細書に記載され、当該技術分野で公知の手順に従ってヒト化されたもの、または完全にヒトのものに作製されたものであり得る。
【０１１８】
特異的抗原への抗体の「会合」または「結合」は、一般的に、静電気的相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水性相互作用を伴う。これらまたは任意のその組合せの任意の１つは、抗体とその抗原間の結合にある役割を果たし得る。一般的に、かかる抗体は抗原と、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、または少なくとも１０８の親和性定数（Ｋａ）で会合する。親和性定数は当業者によって、周知の手法を用いて（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照）および表面プラズモン共鳴によって（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５（１９９３）を参照）決定され得る。また、コロナウイルスタンパク質免疫原に対する抗体の結合特性は、一般的に、例えば、酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、イムノブロッティング、対向免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害もしくは競合アッセイなどの当業者によって容易に実施され得る免疫検出方法（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照）を用いて決定および評価され得る。  
【０１１９】
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、天然に存在する抗体ならびに天然に存在しない抗体を含み、例えば、単鎖抗体、キメラ、二機能性、およびヒト化抗体、ならびにその抗原結合断片が挙げられる。かかる天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築され得るか、組換えにより産生され得るか、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、単鎖および二機能性抗体のこれらおよび他の作製方法は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３，１９９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４，１９８９；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｄ  ｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｈｉｌｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２を参照）。
【０１２０】
ポリクローナル抗体は当業者によって、さまざまな温血動物、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、トリ、シチメンチョウ、ウサギ、マウス、ハムスター、またはラットなどから容易に作製され得る。簡単には、所望のＳタンパク質免疫原もしくはその改変体またはＮタンパク質免疫原もしくはその改変体、またはコロナウイルス免疫原もしくはその改変体の混合物を、動物を免疫処置するために、非経口、腹腔内、筋肉内、眼球内、もしくは皮下注射により、または経鼻的に投与する。目的のポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えば、プロテオソーム、プロトリン、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、およびフロイント完全または不完全アジュバントなどの使用により増大させ得る。数週間での期間にわたる数回のブースター免疫処置後、少量の血清試料を採取し、所望の免疫原に対する反応性について試験する。動物の血清中での特異的抗体の力価が、ＳまたはＮタンパク質免疫原またはその改変体に対する反応性に関して安定状態に達したら、より多くの量のポリクローナル免疫血清が、定期的に（例えば、毎週出血など）、または動物の放血によって容易に得られ得る。次いで、ポリクローナル抗体をかかる抗血清から、例えば、適当な固相支持体上に固定されたプロテインＡまたはプロテインＧを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製し得る（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｓｕｐｒａ，ｐ．２．７．１−２．７．１２；２．９．１−２．９．３；Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと）。あるいはまた、抗血清が特異的に結合するコロナウイルスタンパク質抗原（免疫原）、または特定の免疫処置した動物種のＩｇ定常領域に特異的な抗体を適当な固相支持体上に固定化した親和性クロマトグラフィーを行なってもよい。
【０１２１】
コロナウイルスタンパク質抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体およびハイブリドーマは、不死化真核生物細胞株の一例であるが、これは、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生し、また、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの手法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７５））およびこれに対する改善法（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）；米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号および同第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと；また、例えば、Ｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．７０：９８６−９２（２００４）を参照のこと）を用いて調製され得る。動物（例えば、ラット、ハムスター、または好ましくは、マウス）は、上記のようにして調製される免疫原で免疫処置する。特異的抗体産生の存在は、最初の注射の後（注射は、ポリクローナル抗体の作製のために、本明細書に記載し、当該技術分野で公知のいくつかの経路のうちのいずれか１つによって投与され得る）、および／またはブースター注射後に、血清試料を採取し、コロナウイルス免疫原に結合する抗体の存在を、当該技術分野で知られ、本明細書に記載したいくつかの免疫検出方法のうちのいずれか１つを用いて検出することによりモニターされ得る。免疫原に結合する抗体を産生する動物から、リンパ球様細胞（最も一般的には、脾臓またはリンパ節からの細胞）を取り出し、抗体形成細胞であるリンパ球様細胞のＢ−リンパ球を得、次いで、薬物感作骨髄腫（例えば、形質細胞腫）細胞融合パートナーとの融合によって不死化させ得る（例えば、内因性Ｉｇ遺伝子産物、例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １５８０）；ＮＳＯ，ＳＰ２０を発現することができない）。得られたハイブリドーマ細胞は、モノクローナル抗体の技術分野で周知の方法に従って培養、単離および解析し得る。ハイブリドーマをクローン化し（例えば、限界希釈クローニングまたは軟寒天プラーク単離によって）、抗原に特異的な抗体を産生する陽性クローンを選択および培養する。コロナウイルス免疫原に対して高い親和性および特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。
【０１２２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウスモノクローナル抗体の産生のための別の方法は、ハイブリドーマ細胞を、同系マウス、例えば、モノクローナル抗体を含有する腹水液の形成を促進させるために処置した（例えば、プリスタン初回抗原刺激）マウスの腹腔内に注射することである。侠雑物は、慣用の手法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除、イオン交換）、ゲル濾過、沈殿、抽出などによって除去し得る（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｓｕｐｒａ，ｐ．２．７．１−２．７．１２；２．９．１−２．９．３；Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照）。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の特定の性質（例えば、重鎖または軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択した適切なリガンドを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。固相支持体上に固定化される適当なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖もしくは重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、特異的コロナウイルス免疫原、またはその誘導体が挙げられる。
【０１２３】
抗コロナウイルスタンパク質抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当業者が熟知しているあらゆる数の手法によって作製され得る。かかる方法としては、限定されないが、ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含有）のエプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫処置、挿入ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫処置したトランスジェニックマウス由来脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、または当該技術分野で知られ、本明細書での開示に基づく他の手順が挙げられる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）；米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８（１９９７）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ  Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５−３５（１９９５）に記載されている。ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスを免疫処置することにより得られ得、次いで、これは抗原に特異的なヒト抗体を産生し得る。免疫処置したトランスジェニックマウスのリンパ球様細胞は、本明細書に記載の方法に従ってヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生させるために使用され得る。ヒト抗体を含有するポリクローナル血清もまた、免疫処置した動物の血液から得られ得る。
【０１２４】
ヒトコロナウイルスタンパク質特異的モノクローナル抗体を作製するための別の方法としては、ＥＢＶ形質転換によるヒト末梢血細胞の不死化が挙げられる。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照のこと。抗コロナウイルスタンパク質抗体を産生するリンパ芽球様細胞株の安定性は、当該技術分野で公知の方法に従って、形質転換細胞株をマウス骨髄腫と融合させ、マウス−ヒトハイブリッド細胞株を生成させることにより改善され得る（例えば、Ｇｌａｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ８：３７７−８９（１９８９）を参照のこと）。ある実施形態では、抗コロナウイルスタンパク質抗体を産生しているＢ細胞が選択され、軽鎖および重鎖の可変領域をＢ細胞から、当該技術分野で公知の分子生物学手法に従ってクローン化する（ＷＯ  ９２／０２５５１；米国特許第５，６２７，０５２号；Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８（１９９６））。
【０１２５】
コロナウイルスタンパク質に特異的なキメラ抗体（例えば、ヒト化抗体）もまた調製され得る。キメラ抗体は、第１の哺乳動物種に由来する少なくとも１つの定常領域ドメインと、第２の異なる哺乳動物種に由来する少なくとも１つの可変領域ドメインとを有する。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−５５（１９８４）を参照のこと。一実施形態では、キメラ抗体は、非ヒトモノクローナル抗体に由来する少なくとも１つの可変領域ドメイン（例えば、マウス、ラットまたはハムスターのモノクローナル抗体に由来する可変領域）をコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのヒト定常領域をコードする核酸配列を含有するベクター内にクローニングすることによって構築され得る（例えば、Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４５９−７６（１９８９）；Ｗａｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２９２１−２９（１９９３）を参照のこと）。
【０１２６】
非ヒト／ヒトキメラ抗体をさらに遺伝子操作し、「ヒト化」抗体を創出し得る。かかるヒト化抗体は、非ヒト哺乳動物種の免疫グロブリンに由来する複数のＣＤＲ、少なくとも１つのヒト可変フレームワーク領域、および少なくとも１つのヒト免疫グロブリン定常領域を含み得る。ある実施形態では、ヒト化により、例えば、コロナウイルスタンパク質結合可変領域を得る非ヒトモノクローナル抗体、または上記のものなどのＶ領域および少なくとも１つのヒトＣ領域を有するキメラ抗体のいずれかと比べると、特異的コロナウイルスタンパク質に対する結合親和性が減少した抗体が提供され得る。ヒト化抗体の設計のための有用なストラテジーとしては、例えば、例示であって、限定されないが、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域に最も相同なヒト可変フレームワーク領域の同定が挙げられ得る。理論に拘束されることを望まないが、かかるストラテジーにより、ヒト化抗体が、コロナウイルスタンパク質に対する特異的結合親和性（これは、好ましい一部の実施形態では、コロナウイルスタンパク質に対して実質的に同じ親和性であり得、他のある実施形態では、コロナウイルスタンパク質に対してより大きな親和性であり得る）を保持する可能性が増大し得る（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）を参照）．
したがって、かかるヒト化抗体の設計は、例えば、コンピュータモデリングによって非ヒト可変領域のＣＤＲループコンホメーションおよび決定基の構造を決定し、次いで、上記ＣＤＲループおよび決定基を、既知のヒトＣＤＲループ構造および決定基と比較することを含み得る（例えば、Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  ９：１３３−３９（１９９５）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３７７−３８３（１９８９）を参照）。また、コンピュータモデリングを用い、非ヒト可変領域の配列相同性によって選択されるヒト構造的鋳型を比較し得る（例えば、Ｂａｊｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５−１０３（１９９５）；ＥＰ−０５７８５１５−Ａ３を参照）。非ヒトＣＤＲのヒト化により、結合親和性の低下がもたらされる場合、コンピュータモデリングの補助により、部位特異的または他の変異誘発手法によって変化させ得る特異的アミノ酸残基を同定し、一部、完全に、または最適以上に（すなわち、非ヒト化抗体のものより高いレベルまで増大する）親和性を回復させ得る。当業者は、このような手法を熟知しており、かかる設計ストラテジーに対する数々の変形例および修正例を容易に認識されよう。
【０１２７】
ヒト化抗体の調製のための別の方法は、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）と呼ばれる。ベニアリングフレームワーク（ＦＲ）残基は、実質的にすべての天然ＦＲポリペプチドフォールディング構造を保持している抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、例えば、齧歯類重鎖または軽鎖Ｖ領域由来のＦＲ残基のヒトＦＲ残基との選択的な置換をいう。ベニアリング手法は、抗原結合部位のリガンド結合特性が、主に、抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲ組の構造および相対配置によって決定されるという理解に基づくものである（例えば、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−７３，（１９９０）を参照）。したがって、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、その互いの相互作用、および残りのＶ領域ドメインとのその相互作用が慎重に維持される場合、ヒト化抗体において保存され得る。ベニアリング手法を用いることにより、免疫系と容易に遭遇する外側の（例えば、溶媒接近可能な）ＦＲ残基は、ヒト残基と選択的に置き換えられ、弱い免疫原性または実質的に非免疫原性のいずれかのベニアリング表面を含むハイブリッド分子が提供される。ベニアリングの方法では、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  ｅｄ．，（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）（Ｋａｂａｔデータベースに更新）、ならびに他の入手しやすい米国および外国データベース（核酸およびタンパク質の両方）によって編成されたヒト抗体可変ドメインの入手可能な配列データを利用する。
【０１２８】
特定の用途には、コロナウイルスタンパク質に特異的に結合する抗体の抗原結合断片が所望され得る。抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、およびＦｄは、例えば、抗体のタンパク質分解性加水分解、例えば、従来法に従って完全抗体のペプシンまたはパパイン消化することなどにより得られ得る。一例として、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断により、Ｆ（ａｂ’）２で示される断片を生成させることによって作製され得る。この断片を、チオール還元剤を用いてさらに切断し、Ｆａｂ’一価断片を生成させ得る。任意選択で、切断反応は、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基のブロック基を用いて行ない得る。一選択肢として、パパインを用いた抗体の酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ断片と１つのＦｃ断片が生じる（例えば、米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）；Ｗｅｉｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９８６）を参照）。
【０１２９】
抗体断片はまた、特異的抗原に結合して複合体を形成するという点で抗体のような作用をする任意の合成または遺伝子操作タンパク質であり得る。例えば、抗体断片としては、軽鎖可変領域からなる単離された断片、重鎖および軽鎖の可変領域からなるＦｖ断片、軽鎖および重鎖の可変領域が、ペプチドリンカーによって連結された組換え単鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）、および超可変領域を擬似するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。本明細書に記載の抗体は、好ましくは、少なくとも１つの可変領域ドメインを含む。
【０１３０】
最小認識単位は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体断片である。かかるＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することにより得られ得る。上記ポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用し、抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として用い、当業者によって実施されている方法に従って可変領域を合成することにより調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６，（１９９１）；  Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ１６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ１３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照）。あるいはまた、かかるＣＤＲペプチドおよび他の抗体断片は、自動ペプチド合成装置を用いて合成され得る。
【０１３１】
ある実施形態によれば、任意の本明細書に記載の免疫グロブリン分子の非ヒト、ヒトまたはヒト化重鎖および軽鎖可変領域を、ｓｃＦｖポリペプチド断片（単鎖抗体）として構築し得る。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照のこと）。多機能性ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、任意の種々の既知エフェクタータンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とインフレームで連結することにより作製され得る。このような方法は、当該技術分野で知られており、例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号および米国特許第５，４７６，７８６号に開示されている。一例として、エフェクタータンパク質は、免疫グロブリン定常領域の配列を含むものであり得る。例えば、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８８：１−７を参照のこと。エフェクタータンパク質の他の例は酵素である。非限定的な例として、かかる酵素は、治療目的のための生物学的活性を提供し得るか（例えば、Ｓｉｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：５１０−１９（１９９７）を参照のこと）、または診断用途のための、検出可能な活性（例えば、検出可能な産物への任意のいくつかの周知の基質のホースラディッシュペルオキシダーゼ触媒性変換など）を提供し得る。
【０１３２】
抗体はまた、ヒト免疫グロブリンファージライブラリー、ウサギ免疫グロブリンファージライブラリーおよび／またはトリ免疫グロブリンファージライブラリーから同定および単離され得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０（１９９４）；米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１（１９８９）；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：４７−５２（１９９７）およびそこに挙げられた参考文献；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３６６８−７６（２０００）；Ｐｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２５：３２５−３５（２００３）；Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９−３１（２０００）を参照のこと）。非ヒト種または非ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離されから抗体は、本明細書に記載され、当該技術分野で公知の方法に従って遺伝子操作し、上記抗体またはその断片「ヒト化」し得る。免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーはファージベクターにおいて創出され得、これをスクリーニングし、Ｉｇ断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはその多量体）が選択され得る（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１（１９８９）；Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５７２８−３２（１９８９）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１−９（１９９０）；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４３６３−６６（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８（１９９２）；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：４７−５２（１９９７）およびそこに挙げられた参考文献；米国特許第６，７０３，０１５号を参照のこと）。
【０１３３】
また、ある実施形態によれば、免疫グロブリンＦａｂ断片をファージ粒子上にディスプレイさせ得る（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照のこと）。また、重鎖および軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーは、例えば、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（登録商標）（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（登録商標）（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用い、λファージにおいて調製され得る（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；を参照；また、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照）。ファージディスプレイ手法はまた、コロナウイルスタンパク質に結合するＩｇ断片または単鎖抗体を選択するために使用され得る。かかる抗体断片または関連するペプチドをコードする候補核酸分子（例えば、ＤＮＡ）が挿入され得るマルチクローニング部位を有する適当なベクターの例については、例えば、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２８：２９−３６，（１９９３）；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：２２８−２５７（１９９３）；Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７７６１−６６（１９９６））を参照のこと。
【０１３４】
他のある実施形態では、コロナウイルスタンパク質特異的抗体は多量体の抗体断片である。有用な方法論は、例えば、Ｈａｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２０１−１２（１９９７）；Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３（１９９７）に一般的に記載されている。例えば、多量体の抗体断片は、ファージ手法によってミニ抗体（米国特許第５，９１０５７３号）またはダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１２８−１３０（１９９７））を形成することにより創出され得る。コロナウイルスタンパク質特異的Ｆｖの多量体、または異なる抗原特異性を有する第２のＦｖと非共有結合により会合したコロナウイルスタンパク質特異的Ｆｖを含む二重特異性抗体である多量体の断片が作製され得る（例えば、Ｋｏｅｌｅｍｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２２：５１４−２４（１９９９）を参照のこと）。
【０１３５】
コロナウイルスタンパク質結合免疫グロブリン分子内へのアミノ酸変異の導入は、コロナウイルスタンパク質に対する特異性もしくは親和性を増大させるため、またはエフェクター機能を改変するために有用であり得る。コロナウイルスタンパク質に対してより高い親和性を有する免疫グロブリンは、特定残基の部位特異的変異誘発によって作製され得る。コンピュータ補助３次元分子モデリングを用い、コロナウイルスタンパク質に対する親和性を改善するための変更対象のアミノ酸残基が同定され得る（例えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．１０：１−１４２（１９９２）を参照のこと）。あるいはまた、ＣＤＲのコンビナトリアルライブラリーをＭ１３ファージにおいて作製し、改善された親和性を有する免疫グロブリン断片についてスクリーニングし得る（例えば、Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３（１９９２）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−１３（１９９４）；米国特許第５，７９２，４５６号を参照のこと）。
【０１３６】
ある実施形態では、抗体を、改変されたエフェクター機能を有するように遺伝子操作し得る。例えば、抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する改変された能力を有し得る。エフェクター機能は部位特異的変異誘発によって改変され得る（例えば、Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３−６４（１９８８）；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−２４（１９９５）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚｅｄｅｈ−Ｋｏｎｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：８３０−３４（１９９７）を参照のこと）。例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分上のグリコシル化部位の変異により、免疫グロブリンが補体を固定する能力が改変され得る（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３２（１９９７）を参照）。定常領域ドメインにおける他の変異では、免疫グロブリンが補体を固定する可能性またはＡＤＣＣをもたらす可能性が改変され得る（例えば、Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３−６４（１９８８）；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−２４（１９９５）；Ｓｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１０１９−２９（１９９７）を参照のこと）。あるいはまた、Ａ２Ｅ結合断片、免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチド、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチド、および免疫グロブリンＣＨ３領域ポリペプチドを含む単鎖ポリペプチドが、組換えにより構築され得る（例えば、米国特許公開公報第２００３／０１１８５９２号；同第２００３／０１３３９３９号を参照）。
【０１３７】
本明細書に記載のコロナウイルスタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコードする核酸分子は、核酸切取、ライゲーション、形質転換およびトランスフェクションのための任意の種々の周知の手順に従って増殖および発現させ得る。したがって、ある実施形態では、抗体断片の発現は、原核生物宿主細胞、例えば、大腸菌などにおけるものが好ましいことがある（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５（１９８９）を参照）。他のある実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の発現は、真核生物宿主細胞、例えば、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；動物細胞（哺乳動物細胞など）；または植物細胞におけるものが好ましいことがある。適当な動物細胞の例としては、限定されないが、骨髄腫、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【０１３８】
ある実施形態では、コロナウイルスタンパク質に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）を認識する抗イディオタイプ抗体、およびこのような抗イディオタイプ抗体の使用方法が提供される。抗イディオタイプ抗体は、抗コロナウイルスタンパク質抗体（またはその抗原結合断片）を免疫原として用い、本明細書に記載の方法によってポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として作製され得る。抗イディオタイプ抗体またはその断片はまた、上記の任意の組換え遺伝子操作方法、またはファージディスプレイ選択によって作製され得る。抗イディオタイプ抗体は、抗コロナウイルスタンパク質抗体の抗原結合部位と、コロナウイルスタンパク質に対する抗体の結合が競合的に阻害されるように反応し得る。あるいはまた、本明細書に示す抗イディオタイプ抗体は、コロナウイルスタンパク質に対する抗コロナウイルスタンパク質抗体の結合を競合的に阻害しないこともある。抗イディオタイプ抗体は、生物学的試料中の抗コロナウイルスタンパク質抗体の存在を測定するためのイムノアッセイに有用である。例えば、ＥＬＩＳＡなどの、当業者によって実施されているイムノアッセイを用い、宿主に本明細書に記載のコロナウイルスタンパク質を投与すること（すなわち、免疫処置すること）により誘導される免疫応答の存在が測定され得る。
【０１３９】
本出願書類において言及および／または出願データシートに列挙したすべての米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、外国特許出願公開公報、および非出願公開公報は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【０１４０】
以下の実施例は、例示の目的で提供し、限定を目的としない。
【実施例】
【０１４１】
（実施例１：プロテオソームの調製）
本発明の免疫源は、プロテオソームと合わせ、混ぜ、または配合し、非共有結合性相互作用により、免疫処置したヒトまたは動物被験体において防御的免疫応答を惹起することができるワクチン組成物を形成し得る。本出願のプロテオソームは、外膜タンパク質精製された形態、例えば、Ｂ群２型Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓを含む粘膜アジュバント送達手段である。ワクチンの組成物（または製剤）にプロテオソームを使用することは、Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．，ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ（１９９７）ｐａｇｅ１９３−２０６に概説されている。本発明のプロテオソームは、６％Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ（ＥＢＢ）（Ａｌｂｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｗｈｉｔｈａｖｅｎ，ＵＫ）を含む１Ｍ塩化カルシウムの溶液を用いたフェノール殺菌細菌ペーストの抽出後、エタノールでの沈殿、１％ＥＢＢ−Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ−生理食塩水中での可溶化、次いで、硫酸アンモニウムでの沈殿によって調製され得る。沈殿物を１％ＥＢＢバッファー中で再可溶化し、透析し、０．１％ＥＢＢ中、−７０℃で保存する。別のプロテオソームの調製法を使用してもよく、例えば、プロテオソームを、プロセスを短縮するために硫酸アンモニウム沈殿工程を省略することにより調製し得る。プロテオソームの調製は、米国特許出願公開公報第２００１／００５３３６８号および米国特許第６，４７６，２０１Ｂ１号に開示されている。
【０１４２】
（実施例２：プロテオソーム：リポ糖免疫原性組成物の調製）
プロテオソームアジュバント組成物を、プロテオソームおよびＬＰＳを混ぜ合わせ、おそらく非共有結合性である会合を許容させることにより作製した。ＬＰＳは、任意のいくつかのグラム陰性菌、例えば、赤痢菌属、プレシオモナス属、エシェリキア属またはサルモネラ属の種などに由来するものであり得、これを、実施例１に記載のようにして調製したプロテオソームと混合する。簡単には、プロテオソームおよびＬＰＳを一晩４℃で解凍し、ＴＥＥＮバッファー中１％  Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢに調整した。２つの成分を、最終ｗｔ／ｗｔが約１０：１〜約１：３の間の比のプロテオソーム：ＬＰＳがもたらされる量で、１５分間室温で混合した。プロテオソーム：ＬＰＳ混合物を、適切な大きさの（例えば、サイズ９）１０，０００  ＭＷＣＯ中空ファイバーカートリッジにて、ＴＮＳバッファー（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ８．０）中にダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、透過水中のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）含量が＜５０ｐｐｍとなったとき（Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＴｕｒｂｉｄｉｔｙアッセイまたはＢｒａｄｆｏｒｄ  Ｒｅａｇｅｎｔアッセイによる）、終了した。バルクアジュバント（本明細書において、ＯＭＰ−ＬＰＳともいう）を、５ｍｇ／ｍＬタンパク質（Ｌｏｗｒｙアッセイによる）に濃縮および調整した。最後に、アジュバントを、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ２０フィルターユニットを用いて滅菌濾過した。バルクアジュバントを滅菌保存容器内にアリコートに分け、凍結させた。
【０１４３】
ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントを、（１）Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）（４００ｐｐｍ）について逆相ＨＰＬＣ；（２）タンパク質含量についてＬｏｗｒｙアッセイにより；および（３）ＬＰＳ含量について２−ケト−３−デオキシオクトネート（ＫＤＯ）アッセイの測定により試験した。ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物を、粒径測定装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ９０型＋または同様の機械）（１０〜１００ｎｍ）を用い、定量的数重量解析によって測定した粒径分布についてさらにキャラクタライゼーションした。しかしながら、複合体の粒径は、種々の（例えば、より高い）プロテオソーム：ＬＰＳ比で、増大または調整され得る。得られるこれらのプロテオソーム：ＬＰＳ複合体は、プロトリンと呼ばれている。現在の安定性データでは、この製剤が２年にわたって安定であることが示されている。
【０１４４】
また、ＬＰＳの供給源の修飾を含有する他の型のプロトリンを必要に応じて作製し得る。プロトリンの経鼻的アジュバント特性が、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ＬＰＳで調製されたプロトリンを用いて評価したが、大腸菌ＬＰＳで調製されたプロトリンを調製し、同様の活性を有することがわかった。大腸菌ＬＰＳで作製したプロトリンを用いることの利点としては、潜在的に高い収量のＬＰＳ、および病原性生物（例えばＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉなど）の生長に伴う封入の事前注意を必要としない細菌の発酵が挙げられる。異なる供給源由来のＬＰＳの使用もまた、防御的免疫（適応的または生得）の誘導に影響を与え得る。したがって、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ系プロトリンに対する活性のレベルを比較するため、プロトリンを２種類の異なる大腸菌に由来するＬＰＳを用いて合成した。これらのデータにより、大腸菌ＬＰＳは、アジュバント活性が保持されたまま、プロトリンにおいて成功裏にＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＬＰＳの代用となり得ることが示された。この大腸菌プロトリンは、他の充分キャラクタライゼーションされた大腸菌株（例えば、プロトリンの調製中に、プロテオソームＯＭＰ粒子を可溶化するのに充分な長さのＯ−多糖を有するＬＰＳを有する株）由来のＬＰＳと比較され得る。
【０１４５】
また、プロテオソーム：ＬＰＳ比の変更を含むさらに他の型のプロトリンを必要に応じて作製し得る。プロトリンを用いた最初の試験は、プロテオソームＯＭＰおよびＬＰＳを１：１の重量：重量比で含有するプロトリンを用いて行なった。しかしながら、コロナウイルス抗原を用いた動物での有効性試験またはヒトでの臨床試験に進む前に、活性であるＯＭＰ：ＬＰＳ比範囲を示し、最適なアジュバント活性を有し、かつプロトリンを構成するＯＭＰ：ＬＰＳ複合体の溶解性を保持する比（１つまたは複数）を調べることが重要である。したがって、以前に使用した同じダイアフィルトレーション手法を用い、いくつかのＯＭＰ：ＬＰＳ比（例えば、４：１、２：１および１：１の比）を有するプロトリンを作製した。ともに髄膜炎菌由来のＯＭＰおよびＬＰＳから構成されるプロトリンを用い、約４：１〜約５：１の範囲の比を含めた（注：髄膜炎菌ＬＰＳは、髄膜炎菌リポ糖のＯ−側鎖が大腸菌および赤痢菌属などの他のグラム陰性菌のものより短いという事実を強調するために、しばしば、リポオリゴ糖を表すＬＯＳと呼ばれる）。髄膜炎菌ＬＰＳ（プロトリン−Ｎｍ）を用いたプロトリンの作製は、他のすべての型のプロトリンと異なる。プロテオソームＯＭＰの生成中、プロテオソーム粒子が２．５％未満の髄膜炎菌ＬＰＳを有するように、髄膜炎菌ＬＰＳを硫酸アンモニウム沈殿手法によって除去し得る。ＬＰＳをこの工程で除去しない場合、得られるプロテオソーム粒子は、存在するプロテオソームＯＭＰ量に対して２０〜２５％ＬＰＳを有し得、これは、約５：１〜約４：１の範囲のＯＭＰ：ＬＰＳ比であり得る。したがって、プロトリン−Ｎｍは単一の工程で作製され得、それにより、プロテオソーム粒子のさらなる精製、および別の生物からの別途のＬＰＳ精製の必要性が削除され、次いで、ＬＰＳとプロテオソームＯＭＰとの複合体が形成され得る。各プロトリンのアリコートを、例えば、プロテオソームＯＭＰがＬＰＳと複合体を形成するのを確認するためのスピンダウンアッセイにおける使用のために保持した。これらの型のプロトリンの各々は、マウスにおいて、Ｓタンパク質免疫原と合わせ（混合し、混ぜ、または配合し）て種々の型のプロトリンＳタンパク質免疫原性組成物を作製した後のアジュバント活性に関して試験する（例えば、実施例４を参照のこと）。
【０１４６】
（実施例３：組換えＳタンパク質の調製およびキャラクタライゼーション）
この実施例では、天然（野生型）スパイクタンパク質またはその断片の調製法の一例を記載する。他の方法、例えば、非グリコシル化ＳまたはＮタンパク質断片の合成および細菌の発現系もまた想定され得る。Ｓ．ｆｒｕｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９昆虫細胞のバキュロウイルス発現系（ＥｘｐｒｅｓｓＳＦ＋（登録商標））を使用した。Ｓタンパク質をコードする核酸配列の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７４１１９（これは、ＳＡＲＳゲノム配列全体を示す；ヌクレオチド２１４９３〜２５２５９がＳタンパク質をコードする、図４参照）から得た。ＲＮＡは、ＣＤＣによって提供されるＴＲＩＺＯＬ説明書に従って、ＣＤＣから入手したＳＡＲＳライセートから単離した。このＲＮＡ調製物を用い、ＴＩＴＡＮキット（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示書に従って使用してｃＤＮＡを作製した。核酸配列をコードするＳタンパク質のフロントエンドを、直接、バキュロウイルス移送ベクターＰＳＣ１２内に、プライマー２１６６および２１６７（フロント：ｎｔ  ４０−７５０）を用いてクローン化した。Ｓタンパク質コード核酸配列の中央部分（ｎｔ  ７５０〜２４９０）およびバック部分（ｎｔ  ２４８６〜３７６８）は、直接、大腸菌ｐＵＣ  １８ベクター内にクローン化した。正しい挿入物を有する種々の細菌性クローンを同定し、完全長Ｓタンパク質コード核酸配列をバキュロウイルス移送ベクターＰＳＣ１２内でクローン化するために使用した。
【０１４７】
部位特異的変異誘発を用い、Ｓタンパク質のＳＴＭ完全長構築物および改変体ＳＴＭ−ｄｅｌ型（膜貫通ドメインを欠くＳタンパク質改変体、図１を参照）の両方をＰＳＣ１２において創出した。切断型ＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質は培地内に分泌され、次いで、レンチンレクチン（ＬＬ）およびイオン交換カラムにて精製すると、およそ７５％の均質純度のタンパク質がもたらされた。他の精製スキーム（例えば、ヒスチジンエピトープタグ化ＳもしくはＮタンパク質断片またはその融合タンパク質のニッケルカラム精製など）もまた想定される。例えば、完全長ＳＴＭタンパク質を、インフレームでヒスタグと融合し、ヒスタグ融合タンパク質を作製した。ヒスタグ化タンパク質の精製は、１％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌを用いた細胞ペレットの可溶化、続いて、ニッケルおよびＬＬカラムへの負荷および溶出によって行なった。得られたＳＴＭタンパク質は９５％純度であった。両Ｓタンパク質は、ウエスタンブロットアッセイにおいて、回復期のＳＡＲＳ患者由来血清によって結合された。これは、組換えにより調製されたＳタンパク質およびその改変体が、Ｓタンパク質抗体によって特異的に結合される天然抗原性エピトープを有することを示す。
【０１４８】
（実施例４：プロトリン−ＳＡＲＳ  ＣＯＶ  Ｓ−タンパク質製剤）
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｓタンパク質またはＳタンパク質改変体（膜貫通ドメインを欠く、すなわち、ＳＴＭ−ｄｅｌ）を用いたプロトリンを調製した。マウス（１０／群）を、第０日および第１４日に１６μｇ、４μｇ、または１μｇの精製組換えＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質により、プロトリン（１μｇ）とともに、またはなしで、鼻腔内にて免疫処置した。また、ＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質（１６μｇ）を、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（０．５％ｗ／ｗ）に吸着させて筋肉内に注射し陽性対照とし、また、ＥＬＩＳＡ条件を確立するための血清を生成させた。第２１日に、マウスを、ＣＯ２での窒息および心臓穿刺によって安楽死させ、血清および肺洗浄液を回収し、それぞれＳＴＭ−ｄｅｌ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡレベルについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果を、抗体の相乗平均濃度として示す。
【０１４９】
図２は、プロトリン−アジュバント添加ＳＴＭ−ｄｅｌで鼻腔内に免疫処置したマウスは、同じ経路で与えたＳＴＭ−ｄｅｌ単独と比べ、４８倍まで高いレベルの抗原特異的血清ＩｇＧを誘導したことを示す。筋肉内に投与され、ミョウバンをアジュバントとして加えたＳＴＭ−ｄｅｌ陽性対照調製物は、鼻腔内プロトリンＳＴＭ−ｄｅｌ組成物によって惹起されたものと比べ、４倍高い血清ＩｇＧ力価を誘導した（図３Ａ）。しかしながら、経鼻的プロトリンＳＴＭ−ｄｅｌワクチンのみでは、血清ＩｇＧおよび肺ＩｇＡの両方が誘導された（図３Ｂ）。
【０１５０】
このデータは、プロトリン：Ｓタンパク質改変体組成物が、機能的に活性な抗原特異的血清抗体（実施例５を参照）を、粘膜ＩｇＡ応答とともに誘導できたことを示す。強い血清ＩｇＧおよびウイルス中和応答を付与したにもかかわらず、ミョウバンアジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質は、粘膜ＩｇＡを誘導することができなかった。  
【０１５１】
（実施例５：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ中和アッセイ）
この実施例では、ＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質で免疫処置したマウス由来の血清によるＳＡＲＳ−ＣｏＶの感染力の中和を記載する。これらの実験では、予備滴定ＳＡＲＳ−ＣｏＶのアリコートを、実施例４に記載のようにして免疫処置した個々のマウス血清の連続希釈試料と混合した。マウス血清の２倍連続希釈物を、１：１０の希釈度から始めて最終希釈度１：６４０まで調製した。血清は、抗生物質、ファンギゾン、アミノ酸、ビタミン類、ＨＥＰＥＳバッファー、および３％ウシ胎児血清を加えた最少必須培地（ＭＥＭ）中で希釈した。各希釈度の血清に対し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶストックウイルス（１００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／５０μｌ）を、最終希釈度１：２〜１：２５６まで希釈した。血清＋ウイルス混合物を静かに混合し、次いで、３７℃で２時間インキュベートした。１００マイクロリットルの各混合物を、Ｖｅｒｏ−Ｅ６細胞がちょうどコンフルエンシーまで培養された組織培養プレート（９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ））に移した。上記細胞を血清＋ウイルス混合物とともに３日間３７℃でインキュベートした。細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在を、各ウェルについて顕微鏡検査によって調べた。血清の中和力価は、ＣＰＥが観察された希釈度のすぐ下の血清希釈度で示される。
【０１５２】
プロトリン：ＳＴＭ−ｄｅｌ混合物によって誘導された血清抗体は、ＳＴＭ−ｄｅｌ抗原単独またはＰＢＳを与えたマウスのものより４倍高い中和力価２０を示したという点で、機能的に活性であった。同様に、ミョウバン−アジュバント添加Ｓ−タンパク質陽性対照によって誘導された血清抗体は、ウイルスの複製をインビトロで抑制することができ、力価１６０がもたらされた。
【０１５３】
（実施例６：ＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質およびＳＴＭ−ＤＥＬの免疫原性）
これらの実験では、麻酔した、または麻酔していないマウスにおける、一定用量の完全長またはＳＴＭ−ｄｅｌ（ΔＴＭ（膜貫通欠失））ＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質調製物の免疫原性に対する種々の用量のプロトリン（登録商標）の効果。１０匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを各群に含めた。
【０１５４】
第０日および第１４日に、麻酔したマウスの群または麻酔していないマウスの群に、１０μｇ、３μｇまたは１μｇ用量のプロトリン（登録商標）と混ぜた１０μｇ用量の完全長ＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質またはＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質を含有する１０μＬで鼻腔内に免疫処置した。さらなる群のマウスに、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（ミョウバン）上に吸着させた２５μＬ（２５μｇのＳＡＲＳ完全長Ｓ−タンパク質または２５μｇのＳＡＲＳ  ＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質）を与え、これは、筋肉内注射によって投与した。対照マウスにはＰＢＳのみを鼻腔内に与えた。第２１日に、マウスをＣＯ２窒息および心臓穿刺によって安楽死させた。血清、肺洗浄液および鼻洗浄液を採取した。データを図６（血清ＩｇＧ力価（μｇ／ｍｌ））および図７（肺ＩｇＡ力価（ｎｇ／ｍｌ））に示す。
【０１５５】
個々のマウス血清および粘膜液のそれぞれにおけるＳＡＲＳ−特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体のレベルを、適切なＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質調製物でコートしたプレートを用い、ＥＬＩＳＡによって測定した。特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ力価を相乗平均濃度（ｎｇ／ｍｌ）で示し、その有意性をＡＮＯＶＡ解析（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒペアワイズ比較）によって評価した。
【０１５６】
特異的血清ＩｇＧ力価は、麻酔したマウスと比べ、麻酔していない場合でおよそ２．５〜５倍低かった。同様に、粘膜応答は、麻酔したマウスマウスと比べ、麻酔していない場合で低かった。特異的ＩｇＡは、麻酔していない動物において辛うじて検出可能であり、麻酔していない各群において有意な数のマウスが応答性でなかった。
【０１５７】
同じ用量のプロトリン（登録商標）において、プロトリン（登録商標）配合完全長Ｓ−タンパク質で免疫処置したマウスによって惹起された血清ＩｇＧ力価は、ΔＴＭ欠失ＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質によって惹起されたものより、およそ１．５〜２．５倍高かった。１μｇプロトリン（登録商標）が配合されたΔＴＭ欠失ＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質（これは、試験した他のワクチンよりも有意に低い力価を惹起した（Ｐ≦０．００ｌ〜０．０１）、および３μｇのプロトリン（登録商標）を混ぜたΔＴＭ欠失ＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質（これは、１０μｇのプロトリン（登録商標）を混ぜた完全長Ｓ−タンパク質によって惹起されたものより有意に低い血清ＩｇＧ力価を惹起した）（Ｐ＜０．０５）を除いて、差は、おおむね統計学的に有意でなかった。任意の用量の完全長＋プロトリン（登録商標）混合物（製剤）（または１０μｇのプロトリン（登録商標）を混ぜた１０μｇΔＴＭ欠失タンパク質）によって惹起された血清ＩｇＧ力価と、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）上に吸着させ、筋肉内に注射したいずれかのタンパク質とでは、有意差は観察されなかった。
【０１５８】
また、肺洗浄液および鼻洗浄液中の特異的ＩｇＡ力価を測定した。バックグラウンドより有意に高い力価が鼻腔内にワクチンを与えたすべての群のマウスにおいて観察されたが、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ吸着タンパク質を注射したマウスではいずれも観察されなかった。用量応答が鼻腔内にワクチンを与えた群で観察されたが、惹起された力価間の差はいずれも統計学的に有意でなかった。
【０１５９】
中和アッセイは、この試験のマウス由来の血清を用い、実施例５に記載のようにして行なった。中和力価は、測定されたＩｇＧ力価と非常に有意な相関性を有した（Ｐ＜０．０００１）。
【０１６０】
また、この試験でのマウスの細胞性免疫応答の表現型を調べた。完全長Ｓタンパク質での再刺激後の応答の表現型（すなわち、サイトカインプロフィール）を調べるためのアッセイを、マウス脾臓細胞を用いて行なった。完全長Ｓタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）およびプロトリン（１０μｇ／ｍｌ）で免疫処置したマウス由来の脾臓をプールし、完全長Ｓタンパク質およびミョウバンで免疫処置したマウス由来の脾臓をプールし、次いで、両方のプールを、標準的な方法に従って単一細胞懸濁液に処理した。次いで、脾臓細胞懸濁液を、完全長Ｓタンパク質（どのサイトカインを測定したかに応じて、１．７μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌのいずれか）とともにインキュベートした。培養上清中に放出されたサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−６）を、ＯｐｔＥＩＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用い、定量的ＥＬＩＳＡによって測定した。図８に示すように、プロトリンのアジュバントとしての使用により、免疫応答は、ミョウバンで免疫処置した動物で観察された２型表現型ではなく、１型の表現型（細胞性応答を含む）のほうに非対称化された。
【０１６１】
上述のことから、本発明の特定の実施形態を例示の目的で本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変形がなされ得ることが認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、完全長Ｓタンパク質（ＳＴＭ）およびＳタンパク質改変体（ＳＴＭ−ｄｅｌ）の概略図を示す。概略図の上部は、フロント、中央およびバック部分Ｓタンパク質に対応するヌクレオチド配列を示す。斜線のボックスは、膜貫通（ＴＭ）ドメインを表す。
【図２】図２は、種々の量のＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質単独（ＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質ｉ．ｎ．）またはプロトリン（登録商標）アジュバントを加えて（ＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質＋プロトリン（登録商標）ｉ．ｎ．）投与されたマウスにおける血清（ＩｇＧ）用量応答を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、プロトリン（登録商標）アジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質またはＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質単独で鼻腔内に（ｉ．ｎ．）免疫処置したマウス、およびミョウバンアジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質で筋肉内に免疫処置したマウス、およびＰＢＳのみを与えたマウスにおける血清ＩｇＧの力価を示す。図３Ｂは、プロトリンアジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質またはＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質単独で鼻腔内に（ｉ．ｎ．）免疫処置したマウス、およびミョウバンアジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質で筋肉内に免疫処置したマウス、およびＰＢＳのみを与えたマウスにおける肺ＩｇＡの力価を示す。
【図３Ｂ】図３Ａは、プロトリン（登録商標）アジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質またはＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質単独で鼻腔内に（ｉ．ｎ．）免疫処置したマウス、およびミョウバンアジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質で筋肉内に免疫処置したマウス、およびＰＢＳのみを与えたマウスにおける血清ＩｇＧの力価を示す。図３Ｂは、プロトリンアジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質またはＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質単独で鼻腔内に（ｉ．ｎ．）免疫処置したマウス、およびミョウバンアジュバントを加えたＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質で筋肉内に免疫処置したマウス、およびＰＢＳのみを与えたマウスにおける肺ＩｇＡの力価を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｆは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｔｏｒ２由来のＳタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｆは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｔｏｒ２由来のＳタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｆは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｔｏｒ２由来のＳタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｆは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｔｏｒ２由来のＳタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｆは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｔｏｒ２由来のＳタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜４Ｆは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｔｏｒ２由来のＳタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｕｒｂａｎｉ由来のＮタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、ＳＡＲＳコロナウイルス株Ｕｒｂａｎｉ由来のＮタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図６】図６は、種々の濃度のプロトリン（登録商標）と合わせた１０μｇのＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質（完全長）またはＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質（膜貫通欠失（ΔＴＭ欠失））を鼻腔内に与えたマウス（麻酔した（あり）または麻酔していない（なし）かのいずれか）の血清ＩｇＧ力価を示す。さらなる群のマウスに、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に吸着させた１０μｇのＳＡＲＳ  Ｓ−タンパク質（Ｆ．Ｌ．ｉ．ｍ．）または１０μｇのＳＴＭ−ｄｅｌタンパク質（Ｄｅｌ  ｉ．ｍ．）の筋肉内注射を与えた。
【図７】図７は、図６の簡単な説明に記載のようにして免疫処置したマウス由来の肺洗浄液および鼻洗浄液中のＩｇＡ力価を示す。
【図８】図８は、完全長Ｓ−タンパク質およびプロトリン（Ｓ（ＦＬ）＋プロトリン（登録商標））；完全長Ｓ−タンパク質およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｓ（ＦＬ）＋ミョウバン）；ならびにＰＢＳ単独で免疫処置したマウス由来のインビトロ再刺激された脾臓細胞からのサイトカインの放出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2008505114.tif 000010
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
2008505114.tif 000014
【図５Ｂ】
2008505114.tif 000015
【図６】
2008505114.tif 000016
【図７】
2008505114.tif 000017
【図８】
2008505114.tif 000018
【配列表】
2008505114000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008505114000001.app
【国際調査報告】
2008505114.tif 000074
2008505114.tif 000075
2008505114.tif 000076
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