(57)【要約】  本願発明は、反復投与において生物有効性の改善を示す化合物に関する。  具体的には、本願発明は、抗体Ｆｃ領域および一つまたはそれ以上の水溶性ポリマーを含むように修飾されたポリペプチドまたはペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ、すなわち；
【化１】
2008505928.tif 000111
式中、Ｆ1はビヒクルであり；
Ｘ1は、
【化２】
2008505928.tif 000112
から選択され、
Ｘ2は、
【化３】
2008505928.tif 000113
から選択され、式中、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3およびＰ4は、それぞれ独立して、薬理学的に活性なペプチドの配列であり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4およびＬ5は、それぞれ独立して、リンカーであり；
ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、それぞれ独立して、０または１であるが、
ただし、ａおよびｂの少なくとも一つは１であり；
ｄは、少なくとも１であり；そして、
ＷＳＰは、Ｆ1の任意の反応性部分に付着する水溶性ポリマーである、式Ｉで表現される構造を含む実質的に均質な化合物であって、反復投与レジメンい従って投与した場合に、改善された生物有効性を示す化合物。
【請求項２】
多量体である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
二量体である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式II、すなわち；
【化４】
2008505928.tif 000114
式中、Ｆ1はＸ1のＣ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IIで表現される構造を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
多量体である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
二量体である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
以下の式III、すなわち；
【化５】
2008505928.tif 000115
式中、Ｆ1はＸ2のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IIIで表現される構造を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
多量体である請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
二量体である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
以下の式IV、すなわち；
【化６】
2008505928.tif 000116
式中、Ｆ1は-(Ｌ1)c-Ｐ1のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IVで表現される構造を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
多量体である請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
二量体である請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
以下の式Ｖ、すなわち；
【化７】
2008505928.tif 000117
式中、Ｆ1は-Ｌ1-Ｐ1-Ｌ2-Ｐ2のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式Ｖで表現される構造を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
多量体である請求項１０に記載の化合物。
【請求項１５】
二量体である請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｐ1および／またはＰ2が、独立して、表４〜表20のいずれかに記載のペプチドから選択される請求項１乃至１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
Ｐ1および／またはＰ2が、同じアミノ酸配列を有する請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｆ1が、Ｆｃドメインである請求項１乃至１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
ＷＳＰが、ＰＥＧである請求項１乃至１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
Ｆ1が、Ｆｃドメインであり、かつＷＳＰが、ＰＥＧである請求項１乃至１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
ＰＥＧが、約２kDaと１００kDaの間の分子量を有する請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
前記ＰＥＧが、約６kDaと２５kDaの間の分子量を有する請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
その少なくとも５０％がＰＥＧ化した化合物である、請求項１９に記載の化合物を含む組成物。
【請求項２４】
その少なくとも７５％がＰＥＧ化した化合物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
その少なくとも８５％がＰＥＧ化した化合物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
その少なくとも９０％がＰＥＧ化した化合物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
その少なくとも９５％がＰＥＧ化した化合物である、請求項２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2004年７月８日に出願した米国特許仮出願第60/586,419号の優先権を主張し、また、そのすべての内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００２】
本願発明は、一般に、反復投与で生物有効性の改善を示す化合物に関する。  具体的には、本願発明は、抗体Ｆｃ領域および一つまたはそれ以上の水溶性ポリマーを含むように修飾されたポリペプチドまたはペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えタンパク質は、治療薬の新分類に属する。  このような組換え治療薬は、タンパク質製剤および化学修飾に進歩をもたらした。  修飾によって、主として、治療用タンパク質が、タンパク質分解酵素に曝露されることを阻止することで、これら治療用タンパク質を保護できることが確認されている。  また、タンパク質の修飾によって、治療用タンパク質の安定性、循環時間、および生物活性を増大させることもできる。  タンパク質修飾および融合タンパク質を記載している文献として、Francis (1992), Focus on Growth Factors ３：４-10(Mediscript, ロンドン)があり、その開示は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００４】
有用な修飾として、ポリペプチドと抗体の「Ｆｃ」ドメインとの組み合わせがある。  抗体は、二つの機能的に独立した部分（「Ｆａｂ」として知られている可変ドメイン(抗原に結合する)および「Ｆｃ」として知られている定常ドメイン(食細胞による攻撃および補体活性化のようなエフェクター機能に関係する)を含む。  Ｆｃの血中半減期が長いのに対して、Ｆａｂの半減期は短い。  Capon et al., (1989), Nature 337：525-31。  Ｆｃドメインは、治療用タンパク質と共に構築される場合、半減期の長期化を実現するか、あるいは、Ｆｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合、および、おそらくは胎盤通過のような機能を組み込むことができる(同書）。  表１に、当該技術分野で周知のＦｃ融合物の利用形態をまとめている。
【０００５】
【表１】
2008505928.tif 000002
ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）融合タンパク質およびペプチドは、医薬品、人工移植物、それに、生体適合性が重要なその他の用途への利用に関連して研究がなされてきた。  医薬品および移植物、そして、通常は、分子およびその表面にＰＥＧが付着する活性部分を有する種々のＰＥＧ誘導体が提案されている。  例えば、ＰＥＧ誘導体は、表面にＰＥＧをカップリングすることにより、湿潤、帯電、および、この表面へのタンパク質またはタンパク質残基などのその他のタイプの分子の付着を制御するとされている。
【０００６】
その他の研究において、ＰＥＧのカップリング(「ＰＥＧ化」)は、生物活性分子の臨床用途で遭遇する障害の克服に望ましいことが示されている。  例えば、公開されたPCT公開公報第WO92/16221号には、多くの潜在的な治療用タンパク質は、血清中での半減期が短いことが明らかになった、と記載されている。
【０００７】
ＰＥＧ化は、分子の見かけの分子量を増加させることによって、血流からの浄化率を低下させる。  一定サイズまでは、タンパク質の糸球体濾過率は、タンパク質のサイズに反比例する。  従って、ＰＥＧ化が浄化率を低下させる能力は、一般に、タンパク質に付着されるＰＥＧ基の数の関数ではなく、改変されたタンパク質全体の分子量の関数として表現される。  浄化率の低下により、非ＰＥＧ化材料よりも高い効力がもたらされる。  例えば、Conforti et al., Pharm. Research Commun. vol.19, p.287 (1987)およびKatre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol.84, p.1487 (1987)を参照のこと。
【０００８】
さらに、ＰＥＧ化は、タンパク質の凝集を減少させ(Suzuki et al., Biochem. Biophys. Acta vol. 788, p.248 (1984））、タンパク質の免疫原性を改変し(Abuchowski et al., J. Biol. Chem. vol.252, p.3582 (1977））、そして、例えば、PCT公開公報第WO92/16221号に記載されているように、タンパク質の可溶性を増大させ得る。
【０００９】
タンパク質のＰＥＧ化は、表面および分子にＰＥＧを付着させる際に認められる現象の一部に関与する。  ＰＥＧ化試薬の大部分は、ポリペプチドの遊離１級アミノ基と反応する。  これらの遊離アミンのほとんどは、リジンアミノ酸残基のイプシロンアミノ基である。  一般的なタンパク質は、多数のリジンを有する。  従って、複数のＰＥＧ分子のランダムな付着によって、しばしばタンパク質活性が喪失する。
【００１０】
さらに、ＰＥＧ化タンパク質の治療用途での利用を意図する場合、非特異的ＰＥＧ化を用いて複数の物質の混合物が生成すると、再現可能かつ特性決定可能な性質を有する生成物を調製することが困難になる。  この非特異的ＰＥＧ化によって、治療薬を評価すること、ならびに効力および投薬情報を規定することが困難になる。  しかし、このようなタンパク質の部位選択的なＰＥＧ化によって、活性損失を招かない所望のＰＥＧ化特性の獲得が可能で、かつ再現可能に修飾された材料が得られる。
【００１１】
ポリエチレングリコール分子をタンパク質に付着するために、種々の手段が用いられている。  アミノ基、例えば、リジン残基上のアミノ基、またはＮ末端のアミノ基は、このような付着に便利である。  例えば、Royer(そのすべての内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第4,002,531号)は、ポリエチレングリコール分子を酵素に付着するために、還元アルキル化を用いている。  1993年４月28日に公開されたWrightによるEP 0 539 167(そのすべての内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する）、「Peg Imidates and Protein Derivates Thereof」は、遊離アミノ基を有する有機化合物およびペプチドが、ＰＥＧまたは関連する水溶性有機ポリマーの誘導体を用いて修飾されることを記載している。  1990年２月27日に発行されたShawによる米国特許第4,904,584号(そのすべての内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する)は、反応性アミン基を介してポリエチレングリコール分子を付着させるための、タンパク質中のリジン残基の修飾に関する。  上記した方法でＰＥＧを含むように修飾された治療用タンパク質が増加しつつあることは、以前から記載されている。  例えば、本明細書の一部を構成するものとして、その各々の内容を援用する欧州特許出願公開EP 0401 384；EP 0 473 268；EP 0 335 423；EP 0 442 724；EP 0 154 316も参照のこと。
【００１２】
タンパク質にポリマーを付着させるためのその他の方法は、連結基の役割を果たす部分を用いる工程を含む。  しかし、このような部分は、抗原性である場合もある。  連結基が関与しないトレシルクロリド法が利用可能であるが、この方法は、トレシルクロリドの使用により有毒な副産物が生成するため、治療薬の製造に用いるのは困難な場合がある。      
【００１３】
本明細書の一部を構成するものとして、その各々の内容を援用するFrancis et al., (Stability of protein pharmaceuticals：in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization（Ahern.,T. and Manning,M.C. eds.) Plenum, N.Y., 1991)およびDelgado et al., 「Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride，Applications In Immunoaffinity Cell Preparation」（Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Systems，Applications In Cell Biology and Biotechnology，Plenum Press，N.Y.N.Y.，1989，pp.211-213）を参照のこと。
【００１４】
一般に、タンパク質リガンドとそのレセプターとの相互作用は、比較的大きな界面でしばしば生じる。  しかし、レセプターに結合したヒト成長ホルモンにおいて実証されているように、実際には、関係する少数の残基のみが、界面における結合エネルギーの大部分に寄与する。  Clackson,T. et al., Science 267：383-386（1995）。  この知見と、残存するタンパク質リガンドの大部分が、単に結合エピトープを正しいトポロジーに提示する役割しか果たさないという事実から、はるかに小さなサイズの活性リガンドを見出すことが可能になる。  従って、「ペプチド」の長さ(２個〜40個のアミノ酸)しか有さない分子でも、所定の大きなタンパク質リガンドのレセプタータンパク質と結合する。  このようなペプチドは、大きなタンパク質リガンドの生物活性を模倣する（「ペプチドアゴニスト」）か、または、競合的結合によって、大きなタンパク質リガンドの生物活性を阻害する（「ペプチドアンタゴニスト」）。
【００１５】
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、このようなペプチドアゴニストおよびアンタゴニストを同定する際に強力な方法として出現した。  例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの内容の各々を援用するScott et al., (1990), Science 249：386；Devlin et al., (1990), Science 249：404；米国特許第5,223,409号(1993年６月29日発行)；米国特許第5,733,731号(1998年３月31日発行)；米国特許第5,498,530号(1996年３月12日発行)；米国特許第5,432,018号(1995年７月11日発行)；米国特許第5,338,665号(1994年８月16日発行)；米国特許第5,922,545号(1999年７月13日発行)；WO96/40987(1996年12月19日公開)；および、WO98/15833(1998年４月16日公開)を参照のこと。  このようなライブラリーにおいて、ランダムペプチド配列は、繊維状ファージのコートタンパク質と融合することによって出現する。  一般的には、出現したペプチドは、抗体を固定化したレセプターの細胞外ドメインに対して親和的に溶出される。  保持されたファージは、アフィニティー精製および再増殖により漸次濃縮され、そして、最もよく結合しているペプチドが、一つまたはそれ以上の構造上関連するペプチドのファミリー内の関与する残基を同定するために配列決定される。  例えば、二つの異なるファミリーを同定しているCwirla et al., (1997), Science 276：1696-9の文献を参照のこと。  また、ペプチド配列は、アラニンスキャンによるかまたはＤＮＡベルでの変異によって、どの残基が安全に置換されるかを示唆される。  変異ライブラリーは、最良のバインダーの配列をさらに最適化するために作製され、かつ、スクリーニングされる。  Lowman(1997）、Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26：401-24。
【００１６】
その他の方法は、ペプチド研究におけるファージディスプレイに匹敵する。  ペプチドライブラリーは、lacリプレッサーのカルボキシル末端に融合され、そして、大腸菌において発現される。  大腸菌ベースのその他の方法では、ペプチドグリカンに関連するリポタンパク質(ＰＡＬ)との融合によって細胞外膜上での出現が可能になる。  これら方法および関連する方法は、「大腸菌ディスプレイ」と総称されている。  可溶性ペプチド混合物をスクリーニングするためのその他の生物学的手法は、発現および分泌のために酵母を用いる。  Smith et al., (1993）, Mol. Pharmacol. 43：741-8を参照のこと。  Smith et al.,の方法および関連する方法は、「酵母ベースのスクリーニング」と称されている。  その他の方法において、ランダムＲＮＡの翻訳は、リボソーム放出の前に停止され、その結果、関連するＲＮＡが依然として付着しているポリペプチドのライブラリーを生じる。  この方法および関連する方法は、「リボソームディスプレイ」と総称されている。      
【００１７】
その他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学結合を用いる；例えば、Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94：12297-303を参照のこと。  この方法および関連する方法は、「RNAペプチドスクリーニング」と総称されている。  ポリエチレンロッドまたは溶媒浸透性樹脂のような安定な非生体物質上にペプチドを固定して、化学的に得られるペプチドライブラリーが開発されている。  その他の化学的に得られるペプチドライブラリーは、フォトリソグラフィーを用いてスライドガラス上に固定されたペプチドをスキャンする。  これら方法および関連する方法は、「化学ペプチドスクリーニング」と総称されている。  化学的ペプチドスクリーニングによって、非ペプチド成分のみならず、Ｄ-アミノ酸およびその他の非天然類似体の使用も可能になるという点で有利である。  生物学的方法および化学的方法のいずれもが、Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3：355-62に概説されている。
【００１８】
既知の生物活性ペプチドの場合、有利な治療特性を有するペプチドリガンドの合理的な設計が行われる。  このような手法では、ペプチド配列に段階的な変更がなされ、ペプチドの生物活性または予測される生物物理学的特性(例えば、溶液構造)に対する置換の影響が決定される。  これらの技術は、「合理的設計」と総称されている。  ある技術によれば、一連のペプチドが調製され、１回に一つの残基がアラニンで置換される。  この技術は、一般には、「アラニンウォーク」または「アラニンスキャン」と呼ばれている。  二つの残基(連続的または離間した)が置換される場合は、「ダブルアラニンウォーク」と呼ばれている。  生じたアミノ酸置換を、それ単独で、または組み合わせて用いることで、有利な治療特性を有する新しいペプチドが得られる。
【００１９】
タンパク質の間の相互作用の構造解析もまた、大きなタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆する上で用いられる。  このような解析において、結晶構造は、ペプチドを設計する際の大きなタンパク質リガンドの重要な残基の同一性および相対配向を示唆する。  例えば、Takasaki et al., (1997）, Nature Biotech. 15：1266-70を参照のこと。  これら方法および関連する方法は、「タンパク質構造解析」と呼ばれている。  また、これらの分析方法は、ファージディスプレイによって選択されるペプチドとレセプタータンパク質との間の相互作用を調べるために用いることができ、結合親和性を高めるためにペプチドのさらなる修飾を示唆する。
【００２０】
概念的には、任意のタンパク質のペプチド模倣物は、ファージディスプレイ法および前述したその他の方法を用いて同定される。  また、これらの方法は、エピトープマッピングのために、タンパク質の間の相互作用に不可欠なアミノ酸の同定のために、および新しい治療薬の発見のための手掛かりとして用いられてきた。  例えば、Cortese et al., (1996), Curr. Opin. Biotech. 7：616-21。  ペプチドライブラリーは、現在ではほとんどの場合、エピトープマッピングのような免疫学的研究で用いられている。  Kreeger (1996), The Scientist 10（13）：19-20。
【００２１】
特に興味深いものは、薬理学的に活性なペプチドの発見におけるペプチドライブラリーおよびその他の技術の利用である。  当該技術分野で同定された多数のこのようなペプチドを、表２にまとめてある。  これらのペプチドは、そこに列挙した刊行物に記載されており、これらの刊行物の各々のすべての内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。  ペプチドの薬理学的活性が記載されており、そして多くの場合、続いて括弧の中にその略語を記載している。  これらのペプチドの幾つつかは、修飾されている(例えば、Ｃ末端架橋二量体を形成するために）。  ペプチドライブラリーは、一般的には、薬理学的に活性なタンパク質のレセプター(例えば、ＥＰＯレセプター)への結合に関してスクリーニングされている。  少なくとも一つ(CTLA４)の事例に関して、ペプチドライブラリーは、モノクローナル抗体への結合に関してスクリーニングされた。
【００２２】
【表２−１】
2008505928.tif 000003
【００２３】
【表２−２】
2008505928.tif 000004
【００２４】
【表２−３】
2008505928.tif 000005
【００２５】
【表２−４】
2008505928.tif 000006
【００２６】
【表２−５】
2008505928.tif 000007
ペプチドライブラリースクリーニングによって同定されたペプチドは、治療薬として用いられるよりもむしろ、治療薬の開発における「手掛かり」とみなされてきた。  これらのペプチドは、その他のタンパク質およびペプチドと同様に、腎臓濾過、細網内皮系における細胞の浄化機構、またはタンパク質分解のいずれかによってin vivoで迅速に除去される。  Francis (1992), Focus on Growth factors 3：4-11。  結果的に、当該技術分野では、現在のところ、薬物標的を確認するために、あるいは化学的ライブラリースクリーニングによって容易にまたは迅速には同定されない有機化合物の設計のための足場として、同定されたペプチドを用いている。  Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26：401-24；Kay et al., (1998), Drug Disc. Today 3：370-8。
【００２７】
従って、組換え治療用タンパク質、以前に同定されたペプチド模倣物、およびその修飾物の有効性にもかかわらず、当該技術分野において、特に、反復投与計画に従って投与される場合に、生物有効性が改善された化合物を提供する必要性が依然として残されているのである。
【発明の開示】
【００２８】
本願発明は、抗体Ｆｃ領域および一つまたはそれ以上の水溶性ポリマーを含むように修飾されたポリペプチドまたはペプチドに関する。
【００２９】
ある実施態様によれば、以下の式Ｉ、すなわち；
【００３０】
【化１】
2008505928.tif 000008
式中、Ｆ1はビヒクルであり；
Ｘ1は、
【００３１】
【化２】
2008505928.tif 000009
から選択され、
Ｘ2は、
【００３２】
【化３】
2008505928.tif 000010
から選択され、式中、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3およびＰ4は、それぞれ独立して、薬理学的に活性なペプチドの配列であり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4およびＬ5は、それぞれ独立して、リンカーであり；
ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、それぞれ独立して、０または１であるが、
ただし、ａおよびｂの少なくとも一つは１であり；
ｄは、少なくとも１であり；そして、
ＷＳＰは、Ｆ1の任意の反応性部分に付着する水溶性ポリマーである、式Ｉで表現される構造を含む実質的に均質な化合物であって、反復投与計画に従って投与した場合に、改善された生物有効性を示す化合物が提供される。  ある実施態様によれば、この化合物は、多量体であり、また、別の実施態様によれば、この化合物は、二量体である。
【００３３】
ある実施態様によれば、以下の式II、すなわち；
【００３４】
【化４】
2008505928.tif 000011
式中、Ｆ1はＸ1のＣ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IIで表現される構造を含む式Ｉの化合物が提供される。  ある実施態様によれば、この化合物は、多量体で提供され、また、別の実施態様によれば、この化合物は、二量体で提供される。
【００３５】
ある実施態様によれば、以下の式III、すなわち；
【００３６】
【化５】
2008505928.tif 000012
式中、Ｆ1はＸ2のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IIIで表現される構造を含む式Ｉの化合物が提供される。  この構造を有する化合物の多量体と二量体も提供される。
【００３７】
ある実施態様によれば、以下の式IV、すなわち；
【００３８】
【化６】
2008505928.tif 000013
式中、Ｆ1は-(Ｌ1)c-Ｐ1のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IVで表現される構造を含む式Ｉの化合物も提供される。  この構造を有する化合物の多量体と二量体も提供される。
【００３９】
以下の式Ｖ、すなわち；
【００４０】
【化７】
2008505928.tif 000014
式中、Ｆ1は-Ｌ1-Ｐ1-Ｌ2-Ｐ2のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式Ｖで表現される構造を含む式Ｉの化合物も本願発明は提供する。  この構造を有する化合物の多量体と二量体も提供される。
【００４１】
ある実施態様において、前述したように、Ｐ1および／またはＰ2が、独立して表４〜表２０のいずれかに示されるペプチドから選択される本願発明の化合物が提供される。  ある実施態様において、Ｐ1および／またはＰ2は、同じアミノ酸配列を有する。
【００４２】
その他の実施態様において、前述したように、Ｆ1がＦｃドメインである本願発明の化合物が提供される。  その他の実施態様において、前述したように、ＷＳＰがＰＥＧである本願発明の化合物が提供される。  さらにその他の実施態様において、前述したように、Ｆ1がＦｃドメインであり、かつ、ＷＳＰがＰＥＧである化合物が提供される。
【００４３】
その他の実施態様において、以下の構造、すなわち：
【００４４】
【化８】
2008505928.tif 000015
式中、ＷＳＰは水溶性ポリマーである構造を含む実質的に均質な化合物が提供され、この化合物は、ｃ-Ｍｐｌに結合して血小板産生を刺激する性質を有し、この化合物は、反復投与で生物有効性を改善する性質を有する。  この構造を有する化合物の多量体および二量体も意図している。
【００４５】
その他の実施態様において、以下の構造、すなわち：
【００４６】
【化９】
2008505928.tif 000016
を含む実質的に均質な化合物が提供され、この化合物は、ｃ-Ｍｐｌに結合して血小板産生を刺激する性質を有し、この化合物は、反復投与で生物有効性を改善する性質を有する。  この構造を有する化合物の多量体および二量体も意図している。
【００４７】
ある実施態様において、本願発明の化合物のＰＥＧ成分は、約２kDaと100kDaの間の分子量を有する。  その他の実施態様において、本願発明の化合物のＰＥＧ成分は、約６kDaと25kDaの間の分子量を有する。
【００４８】
本願発明は、本願発明の化合物を含む組成物をさらに提供し、この組成物は、少なくとも50％のPEG化した化合物を含む。  その他の態様において、本願発明の組成物は、少なくとも75％のPEG化した化合物、少なくとも85％のPEG化した化合物、少なくとも90％のPEG化した化合物、少なくとも95％のPEG化した化合物、および少なくとも99％のPEG化した化合物を含む。
【００４９】
ある実施態様において、本願発明は、以下の構造：
【００５０】
【化１０】
2008505928.tif 000017
式中、ＰＥＧは約20kDの分子量を有する構造式で表される実質的に均質な化合物を提供し、この配列番号：２に記載の化合物は、二量体であって、ｃ-Ｍｐｌに結合して血小板産生を刺激する性質を有し、そして、この化合物は、反復投与で生物有効性を改善する性質を有する。
【００５１】
本願発明は、(ａ)以下の構造：
【００５２】
【化１１】
2008505928.tif 000018
式中、ＰＥＧは約20kDの分子量を有する構造式で表される実質的に均質な化合物；（ｂ）少なくとも95％のジPEG化した化合物；および(ｃ)薬学的に許容可能な希釈剤、補助剤または担体を含む薬学的組成物をさらに提供し、この組成物は、反復投与で生物有効性を改善する性質を有する。
【００５３】
ある実施態様において、(ａ)以下の構造：
【００５４】
【化１２】
2008505928.tif 000019
式中、ＰＥＧは約20kDの分子量を有する構造式で表される実質的に均質な化合物であって、配列番号：２に記載の化合物が二量体である化合物；(ｂ)少なくとも95％のジPEG化した化合物；および(ｃ)薬学的に許容可能な希釈剤、補助剤または担体を含む薬学的組成物が提供され、この組成物は、反復投与で生物有効性を改善する性質を有する。
【００５５】
また、本願発明は、造血障害を処置する方法も提供し、この方法は、造血障害を処置する上で有効な治療計画において、本願発明の化合物または組成物を投与する工程を含む。
【００５６】
従って、本願発明のこれら実施態様とその他の実施態様は、図面を参照しつつ、本願発明の好適な実施態様について詳述した以下の記載から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
用語の定義
「含む」の用語は、化合物が、所定の配列のＮ末端またはＣ末端の一方または双方に、さらなるアミノ酸を含むことを意味する。  当然ながら、このようなアミノ酸は、この化合物の活性を著しく阻害するものであってはならない。
【００５８】
本願発明の調製手順を参照すると、本明細書に記載の「実質的に均質な」とは、全治療分子における特定の百分率について断りが無い限りは、この調製物が、調製物に含まれる全治療分子において検出可能な単一の治療化合物を含むことを意味する。  一般に、実質的に均質な調製物とは、均質な調製物の利点、例えば、臨床現場でのロット間の薬物動態の予測の容易さを示す上で十分に均質である。
【００５９】
「生物有効性」とは、所望の生物学的作用を生じる能力を指す。  異なる化合物、または同じ化合物の異なる用量、または同じ化合物の異なる投与の生物有効性は、一般に、化合物の量に対して正規化することにより、適切な比較が可能になる。
【００６０】
「反復投与」とは、二回量以上の化合物をある期間にわたって投与することを含む、治療的または予防的処置計画をいう。
【００６１】
「ビヒクル」の用語は、治療用タンパク質の分解を阻止しかつ／または半減期を延長させるか、毒性を低下させるか、免疫原性を低下させるか、あるいは生物活性を増大させる分子をさす。  ビヒクルの例として、Ｆｃドメインおよび直鎖状ポリマー；分岐鎖ポリマー（例えば、Denkenwalter et al.,の米国特許第4,289,872号(1981年９月15日発行）；Tamの米国特許第5,229,490号(1993年７月20日発行)；Frechet et al., によるWO93/21259(1993年10月28日公開)を参照のこと）；脂質；コレステロール群；炭水化物またはオリゴ糖；サルベージレセプターに結合する任意の天然または合成のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどがある。  その他のビヒクルについても、後述している。
【００６２】
「ネイティブＦｃ」の用語は、単量体の形態または多量体の形態のいずれかにかかわらず、抗体全体の消化により生じる非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す。      
【００６３】
ネイティブＦｃの起源となる免疫グロブリン供給源は、ある実施態様では、ヒト起源のものであり、任意の免疫グロブリンでもよい。  ネイティブＦｃは、共有結合性の会合（すなわち、ジスルフィド結合）、非共有結合性の会合または両方の組み合わせによって、二量体または多量体の形態に連結する単量体のポリペプチドである。  ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ)またはサブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２)によって、１〜４の範囲に及ぶ。  ネイティブＦｃの例として、ＩｇＧのパパイン分解によって生じるジスルフィド結合二量体がある。  Ellison et al., (1982), Nucleic Acids Res. 10：4071-9。  「ネイティブＦｃ」の用語は、本明細書で用いる場合、単量体の形態、二量体の形態、および多量体の形態について総称的に用いる。
【００６４】
「Ｆｃ変異体」の用語は、ネイティブＦｃから修飾されているが、依然としてサルベージレセプターに対する結合部位を含む分子または配列(FcRn)を指す。  国際出願WO97/34631(1997年９月25日公開)およびWO96/32478には、例示的なＦｃ変異体、およびサルベージレセプターとの相互作用が記載されており、これら国際出願の内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。  ある実施態様において、「Ｆｃ変異体」の用語は、非ヒトネイティブＦｃからヒト化された分子または配列を含む。  その他の実施態様において、ネイティブＦｃは、除去される部位を含む。  なぜなら、これら部位は、本願発明の融合分子に必要のない構造的特徴または生物活性をもたらすからである。  従って、「Ｆｃ変異体」の用語は、以下の(１)〜(７)、すなわち、(１)ジスルフィド結合形成、(２)選択された宿主細胞との不適合性、(３)選択された宿主細胞での発現の際のＮ末端の不均一性、(４)グリコシル化、(５)補体との相互作用、(６)サルベージレセプター以外のＦｃレセプターへの結合、または(７)抗体依存性の細胞障害活性(ＡＤＣＣ)に影響を及ぼすか、またはこれらに関与する、一つまたはそれ以上のネイティブＦｃ部位もしくは残基を欠く分子または配列を含む。  Ｆｃ変異体については、さらに後述することとする。
【００６５】
「Ｆｃドメイン」の用語は、前述したように、ネイティブＦｃの分子および配列ならびにＦｃ変異体の分子および配列を含む。  Ｆｃ変異体およびネイティブＦｃと同様に、「Ｆｃドメイン」の用語は、抗体全体の消化によって得られるか、またはその他の手段によって生成されるかにかかわらず、単量体の形態または多量体の形態の分子を含む。  ある実施態様において、例えば、このＦｃ領域は、
【００６６】
【化１３】
2008505928.tif 000020
とすることができる。
【００６７】
「多量体」の用語は、ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に適用される場合、共有結合的に会合するか、非共有結合的に会合するか、または共有結合性相互作用と非共有結合性相互作用の両方によって会合する、二つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。  一般的には、ＩｇＧ分子は、二量体を形成し；ＩｇＭ分子は、五量体を形成し；ＩｇＤ分子は、二量体を形成し；そして、ＩｇＡ分子は、単量体、二量体、三量体、または四量体を形成する。  多量体は、ＦｃのネイティブＩｇ供給源の配列および生じた活性を利用することによって、または、このようなネイティブＦｃを誘導することによって(後述するようにして)形成される。
【００６８】
「誘導すること」、「誘導体」または「誘導した」の用語は、例えば、(１)環状部分、例えば、化合物内のシステイニル残基間の架橋結合を有する化合物；(２)架橋結合されるか、または架橋結合部位を有する、例えば、システイニル残基を有し、従って、培養下またはin vivoで架橋二量体を形成する化合物；(３)一つまたはそれ以上のペプチジル連結が、非ペプチジル連結で置換されていること；(４)Ｎ末端を、-ＮＲＲ1、ＮＲＣ(Ｏ)Ｒ1、-ＮＲＣ(Ｏ)ＯＲ1、-ＮＲＳ(Ｏ)2Ｒ1、-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨＲ、スクシンイミド基、または置換もしくは非置換のベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-、すなわち、式中、ＲおよびＲ1および環置換基が、後述する通りのもので置換されていること；(５)Ｃ末端が、-Ｃ(Ｏ)Ｒ2または-ＮＲ3Ｒ4、すなわち、式中、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、後述する通りのもので置換されていること；および(６)化合物の個々のアミノ酸部分が、選択された側鎖または末端残基と反応し得る薬剤を用いた処置によって修飾されていること、などのプロセスおよびそれによって得られた化合物を指すが、これらに限定されない。  誘導体については、さらに後述することとする。
【００６９】
「ペプチド」の用語は、２個〜40個のアミノ酸の分子、３個〜20個のアミノ酸の分子、および６個〜15個のアミノ酸の分子を指す。  例えば、35個以下、30個以下、25個以下、20個以下のアミノ酸および／または15個以下のアミノ酸から選択されるサイズを有するペプチドが、本明細書において企図されている。  ペプチドとしては、本明細書において引用した任意の方法によって無作為に生成されたもの、ペプチドライブラリー(例えば、ファージディスプレイライブラリー)内に保有されているもの、タンパク質の消化によって誘導されたもの、または化学的に合成したものなどがある。  ペプチドは、精製されたＤ型およびＬ型か、またはこれらの二つの型の混合物のいずれかを含む。
【００７０】
「無作為化した」の用語は、ペプチド配列に関して用いる場合、十分に無作為な配列(例えば、ファージディスプレイ法によって選択される配列)および天然に存在する分子の一つまたはそれ以上の残基が、天然に存在する分子中のその位置には出現しないアミノ酸残基で置換されている配列を指す。  ペプチド配列を同定するための方法として、ファージディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ベースのスクリーニング、ＲＮＡ-ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造解析などがある。
【００７１】
「薬理学的に活性な」の用語は、この用語で表現される物質が、医学パラメータ(例えば、血圧、血球数、コレステロールレベル)または疾患状態(例えば、癌、自己免疫疾患)に影響を及ぼす活性を有している、ことが決定されることを意味する。  従って、薬理学的に活性なペプチドは、後述するアゴニストペプチドまたは模倣ペプチドおよびアンタゴニストペプチドを含む。
【００７２】
「-模倣ペプチド」および「-アゴニストペプチド」の用語は、目的のタンパク質と相互作用するタンパク質(例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ-ＣＳＦ)に匹敵する生物活性を有するペプチドを指す。  これらの用語は、例えば、目的のタンパク質の天然リガンドの作用を増強することによって、目的のタンパク質の活性を間接的に模倣するペプチドをさらに含み、例えば、表２および表７に記載のＧ-ＣＳＦ模倣ペプチドを参照のこと。  一例として、「ＥＰＯ模倣ペプチド」の用語は、Wrighton et al., (1996), Science 273：458-63、Naranda et al., (1999）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：7569-74、またはＥＰＯ模倣性に関する表２に記載の任意のその他の参考文献の記載に従って同定または誘導される任意のペプチドを含む。  当業者であれば、これら各参考文献を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて、開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００７３】
その他の例として、「ＴＰＯ模倣ペプチド」または「ＴＭＰ」の用語は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するCwirla et al., (1997), Science 276：1696-9、米国特許第5,869,451号および第5,932,946号およびＴＰＯ模倣性に関する表２に記載の任意のその他の参考文献の記載、そして、2000年５月４日に公開された国際出願WO00/24770の記載に従って同定または誘導されるペプチドを含む。  当業者であれば、これら各参考文献を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００７４】
その他の例として、「Ｇ-ＣＳＦ模倣ペプチド」の用語は、Paukovits et al., (1984), Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 365：303-11またはＧ-ＣＳＦ模倣性に関する表２に記載の任意のその他の参考文献に記載の方法に従って同定または記載される任意のペプチドを含む。  当業者であれば、これら各参考文献での開示を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００７５】
「CTLA４模倣ペプチド」の用語は、Fukumoto et al., (1998), Nature Biotech. 16：267-70の記載に従って同定または誘導される任意のペプチドを含む。  当業者であれば、これら各参考文献を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００７６】
「-アンタゴニストペプチド」または「インヒビターペプチド」の用語は、目的の関連タンパク質の生物活性を阻害するか、または何らかの方法で妨害するペプチド、あるいは目的の関連タンパク質の既知のアンタゴニストまたは阻害剤に匹敵する生物活性を有するペプチドを指す。  従って、「TNF-アンタゴニストペプチド」の用語は、Takasaki et al., (1997), Nature Biotech. 15：1266-70またはTNF-アンタゴニストに関する表２に記載の任意のその他の参考文献に記載の方法に従って同定または誘導されるペプチドを含む。      
【００７７】
当業者であれば、これら各参考文献を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００７８】
「ＩＬ-１アンタゴニスト」および「ＩＬ-１ｒａ模倣ペプチド」の用語は、ＩＬ-１によるＩＬ-１レセプターの活性化を阻害するかまたはダウンレギュレートするペプチドを含む。  ＩＬ-１レセプターの活性化は、ＩＬ-１、ＩＬ-１レセプター、およびＩＬ-１レセプターアクセサリータンパク質間の複合体の形成によって生じる。  ＩＬ-１アンタゴニストまたはＩＬ-１ｒａ模倣ペプチドは、ＩＬ-１、ＩＬ-１レセプター、またはＩＬ-１レセプターアクセサリータンパク質に結合して、この複合体の任意の二つまたは三つの成分間の複合体形成を妨げる。  ＩＬ-１アンタゴニストまたはＩＬ-１ｒａ模倣ペプチドの例として、米国特許第5,608,035号、第5,786,331号、第5,880,096号、またはＩＬ-１ｒａ模倣もしくはＩＬ-１アンタゴニストに関する表２に記載の任意の参考文献に記載の方法に従って同定または誘導される。  当業者であれば、これら各参考文献を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００７９】
「VEGF-アンタゴニストペプチド」の用語は、Fairbrother (1998), Biochem. 37：17754-64に、およびVEGF-アンタゴニストに関する表２に記載の任意の参考文献に記載の方法に従って同定または誘導されるペプチドを含む。  当業者であれば、これら各参考文献を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００８０】
「MMPインヒビターペプチド」の用語は、Koivunen (1999), Nature Biotech. 17：768-74、およびMMP抑制に関する表２に記載の任意の参考文献に記載の方法に従って同定または誘導されるペプチドを含む。  当業者であれば、これら各参考文献を踏まえて、異なるペプチドライブラリーを用いて開示された手順に従うことで、これらの参考文献に実際に開示されたペプチドとは異なるペプチドを選択することが可能であることを理解するであろう。
【００８１】
「ミオスタチンインヒビターペプチド」の用語は、in vitroアッセイ(例えば、pMARE C2C12細胞ベースのミオスタチン活性アッセイ)において実証されたような、ミオスタチン活性またはシグナル伝達を低下または阻害する能力、あるいは、米国特許出願公開番号US20040181033A1およびPCT出願公開番号WO2004/058988に記載のin vivo動物試験によって同定されるペプチドを含む。  ミオスタチンインヒビターペプチドの例を、表２１〜表２４に記載している。
【００８２】
「インテグリン／接着アンタゴニスト」の用語は、インテグリン、セレクチン、細胞接着分子、インテグリンレセプター、セレクチンレセプター、または細胞接着分子レセプターの活性を阻害するかまたはダウンレギュレートするペプチドを含む。  インテグリン／接着アンタゴニストの例を、ラミニン、エキスタチン、表２５〜表２８に記載のペプチドがある。
【００８３】
「骨吸収インヒビター」の用語は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するWO97/23614の実施例４および実施例11に記載のアッセイによって決定されるような分子を指す。  骨吸収インヒビターの例として、ＯＰＧおよびＯＰＧ-Ｌ抗体を挙げることができ、それらは、それぞれ、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するWO97/23614およびWO98/46751に記載のものである。
【００８４】
「神経成長因子インヒビター」または「神経成長因子アゴニスト」の用語は、神経成長因子(NGF)に結合してその活性またはシグナル伝達を阻害するペプチドを含む。  このタイプのペプチドの例を、表２９に記載している。
【００８５】
「TALL-１調節ドメイン」の用語は、TALL-１に結合する任意のアミノ酸配列を指し、天然に存在する配列または無作為化した配列を含む。  TALL-１調節ドメインは、ファージディスプレイ法または本明細書に記載のその他の方法によって同定または誘導される。  このタイプのペプチドの例を、表３０および表３１に記載している。
【００８６】
「TALL-１アンタゴニスト」の用語は、TALL-１に結合して、一つまたはそれ以上のアッセイパラメータを、完全長の天然TALL-１がこれらパラメータに及ぼす作用とは反対に、増加または減少させる分子を指す。  このような活性は、例えば、2000年８月17日に公開された「TNF-RELATED PROTEINS」という発明の名称を開示した特許出願WO00/47740の材料および方法の節の「Biological activity of AGP-３」と題する小節に記載のアッセイによって決定される。
【００８７】
「Ang ２-アンタゴニストペプチド」の用語は、Ang-２-アンタゴニスト特性を有することが確認されるか、またはこの特性を有するように誘導されるペプチドを含む。  このタイプのペプチドの例を、表３２〜表３８に記載している。
【００８８】
さらに、本願発明の化合物の生理学的に許容可能な塩も企図している。  「生理学的に許容可能な塩」とは、薬学的に許容可能であることが知られているか、または後に発見される任意の塩を意味する。  その例として、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；ハロゲン化水素酸塩、例えば、塩化水素酸塩および臭化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；およびシュウ酸塩などがある。
【００８９】
「ＷＳＰ」の用語は、これが付着したペプチド、タンパク質またはその他の化合物が、水性環境、例えば、生理的環境下で沈殿することを妨げる水溶性ポリマーを指す。  本願発明によって企図される種々のＷＳＰの実施態様の詳細は、後述する通りである。
【００９０】
化合物の構造
概  説
本願発明に従った調製法において、ペプチドは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端を介してビヒクルに付着され、得られた構造体は、このビヒクル-ペプチド生成物でのビヒクル部分にＷＳＰを共有結合で付着させることで、さらに修飾される。  従って、本発明のＷＳＰ-ビヒクル-ペプチド分子は、以下の式Ｉ、すなわち；
【００９１】
【化１４】
2008505928.tif 000021
式中、Ｆ1はビヒクルであり；
Ｘ1は、
【００９２】
【化１５】
2008505928.tif 000022
から選択され、
Ｘ2は、
【００９３】
【化１６】
2008505928.tif 000023
から選択され、式中、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3およびＰ4は、それぞれ独立して、薬理学的に活性なペプチドの配列であり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4およびＬ5は、それぞれ独立して、リンカーであり；
ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、それぞれ独立して、０または１であるが、
ただし、ａおよびｂの少なくとも一つは１であり；
ｄは、少なくとも１であり；そして、
ＷＳＰは、Ｆ1の任意の反応性部分に付着する水溶性ポリマーである、式Ｉで表現される。
【００９４】
従って、化合物Ｉは、以下の式II、すなわち；
【００９５】
【化１７】
2008505928.tif 000024
式中、Ｆ1はＸ1のＣ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IIで表現される構造を含む化合物およびその多量体；
以下の式III、すなわち；
【００９６】
【化１８】
2008505928.tif 000025
式中、Ｆ1はＸ2のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IIIで表現される構造を含む化合物およびその多量体；
以下の式IV、すなわち；
【００９７】
【化１９】
2008505928.tif 000026
式中、Ｆ1は-(Ｌ1)c-Ｐ1のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式IVで表現される構造の化合物およびその多量体；および
以下の式Ｖ、すなわち；
【００９８】
【化２０】
2008505928.tif 000027
式中、Ｆ1は-Ｌ1-Ｐ1-Ｌ2-Ｐ2のＮ末端に付着するＦｃドメインであって、また、一つまたはそれ以上のＷＳＰが、必要に応じてリンカーＬ1を介して当該Ｆｃドメインに付着する、式Ｖで表現される構造の化合物およびその多量体を含む。
【００９９】
ペプチド
多数のペプチドが、本願発明において共同的に用いることができる。  特に興味深いペプチドは、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１ｒａ、レプチン、CTLA４、TRAIL、TGF-α、およびTGF-βの活性を模倣するペプチドである。  ペプチドアンタゴニスト、特に、ＴＮＦ、レプチン、インターロイキン（ＩＬ-１、２、３、...）のいずれか、および補体活性化に関与するタンパク質(例えば、Ｃ３ｂ)の活性に拮抗するペプチドアンタゴニストも興味深い。  腫瘍形成ペプチド、膜輸送ペプチドなどを含む、標的化ペプチドも興味深い。  これらのクラスのペプチドはすべて、本明細書で引用した参考文献およびそれ以外の参考文献に記載される方法によって得ることができる。
【０１００】
特に、ファージディスプレイは、本願発明において用いるペプチドを生成する上で有用である。  親和性的選択法を用いて、ランダムペプチドのライブラリーから任意の遺伝子産物の任意の部位に対するペプチドリガンドを同定することが記載されている。  Dedman et al., (1993), J. Biol. Chem. 268：23025-30。  ファージディスプレイは、細胞表面レセプターのような目的のタンパク質または線状エピトープを有する任意のタンパク質に結合するペプチドを同定する上で特に適している。  Wilson et al., (1998), Can. J. Microbiol. 44：313-29；Kay et al., (1998), Drug Disc. Today 3：370-8。  このようなタンパク質は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するHerz et al., (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17 (5):671-776に概説されている。このような目的のタンパク質は、本発明で使用する上で好ましい。
【０１０１】
例えば、サイトカインレセプターに結合するペプチドのグループが提供されるが、これらに限定されない。  サイトカインは、最近、そのレセプターコードに従って分類されている。  本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するInglot (1997), Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45：353-7を参照のこと。  これらのレセプターには、ＣＫＲ(表３に記載のファミリーＩ)が含まれる。  レセプターの分類を、表３に記載している。
【０１０２】
【表３−１】
2008505928.tif 000028
【０１０３】
【表３−２】
2008505928.tif 000029
本願発明においてペプチド生成用の標的として興味深いその他のタンパク質としては、以下のものがある。
【０１０４】
αvβ3
αVβl
Ang-２
Ｂ７
Ｂ７ＲＰ１
ＣＲＰ１
カルシトニン
ＣＤ２８
ＣＥＴＰ
ｃＭｅｔ
補体因子Ｂ
Ｃ４ｂ
ＣＴＬＡ４
グルカゴン
グルカゴンレセプター
ＬＥＰＧ
ＭＰＬ
腫瘍細胞上に優先的に発現される分子のスプライス変異体、例えば、CD44、CD30
ムチンおよびルイスＹ表面糖タンパク質の非グリコシル化変異体、CD19、CD20、CD33、CD45
前立腺特異的膜抗原および前立腺特異的細胞抗原
マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)、分泌型と膜結合型の両方(例えば、ＭＭＰ-９）
カテプシン
ＴＩＥ-２レセプター
ヘパラナーゼ
ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ＵＰＡ)、ＵＰＡレセプター
副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)、副甲状腺ホルモン関連タンパク質(ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨ-ＲＩ、ＰＴＨ-ＲＩＩ
Ｈｅｒ２
Ｈｅｒ３
インスリン
ミオスタチン
ＴＡＬＬ-１
神経成長因子
インテグリンおよびレセプター
セレクチンおよびそのレセプター
細胞接着分子およびそのレセプター
ペプチドの例を、以下の表４〜表３８に記載している。  これらペプチドは、当該技術分野で周知の任意の方法、すなわち、その多くが本明細書に記載されている方法でもってして調製される。  以下の表の大半において、アミノ酸の一文字表記を用いている。  これら配列(および、特に断りのない限り、本明細書全体において）Ｘは、天然に存在する２０種類のアミノ酸残基のいずれかが存在していることを意味する。  これらのペプチドのいずれかは、リンカーと共に、または、リンカー無しにタンデムに(すなわち、連続的に)連結されており、タンデム連結した数例が、この表に記載されている。  リンカーは、「Λ」と記載されており、本明細書に記載されたリンカーのいずれかである。  タンデムリピートおよびリンカーは、明確にするために、点線で区切って示されている。  システイニル残基を含む任意のペプチドは、別のCys含有ペプチドと架橋することができ、これらのペプチドの一方または双方がビヒクルに連結される。  架橋した数例を、この表に記載している。  一つ以上のCys残基を有する任意のペプチドも、同様に、ペプチド内ジスルフィド結合を形成する。  例えば、表５のＥＰＯ模倣ペプチドを参照のこと。  ペプチド内ジスルフィド結合した数例のペプチドも、この表に記載している。  本明細書に記載されているように、これらのペプチドのいずれかが誘導されてもよく、そして数種の誘導例が、この表に記載されている。  表に記載されている誘導ペプチドは、関連する非誘導ペプチドが本発明に用いられる場合も同様に、例示の目的のためのものでしかなく、これらに限定されない。  カルボキシル末端がアミノ基でキャップされる誘導体については、キャップしているアミノ基を、-ＮＨ2として示している。  アミノ酸残基が、アミノ酸残基以外の部分によって置換される誘導体については、この置換はσで示されており、これは、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するBhatnagar et al., (1996), J. Med. Chem. 39：3814-9およびCuthbertson et al., (1997), J. Med. Chem. 40：2876-82に記載されているいずれかの反応箇所を指すものである。  Ｊ置換基およびＺ置換基（Ｚ5、Ｚ6、...Ｚ40）は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する米国特許第5,608,035号、第5,786,331号および第5,880,096号に定義されている通りのものである。  ＥＰＯ模倣配列(表５)に関して、置換基Ｘ2〜Ｘ11および整数「ｎ」は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するWO96/40772に定義されている通りのものである。  また、ＥＰＯ模倣配列については、置換基Ｘna、Ｘ1a、Ｘ2a、Ｘ3a、Ｘ4a、Ｘ5aおよびＸcaは、それぞれ、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するWO99/47151のＸn、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸcの定義に従う。  置換基「Ψ」、「Θ」および「+」は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するSparks et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93：1540-4で定義されている通りのものである。  Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する米国特許第5,773,569号で定義されている通りのものであるが、インテグリン結合ペプチドについては、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7およびＸ8は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する1995年６月１日公開の国際出願WO95／14714および1997年３月６日公開のWO97／08203に定義される通りのものであり；そして、ＶＩＰ模倣ペプチドについては、Ｘ1、Ｘ1'、Ｘ1''、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＺならびに整数ｍおよびｎは、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する1997年10月30日公開のWO97／40070に定義されている通りのものである。  以下のＸaaおよびYaaは、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する1998年３月12日公開のWO98／09985に定義されている通りのものである。  AA1、AA2、AB1、AB2およびACは、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する1998年12月３日公開の国際出願WO98／53842に定義されている通りのものである。  Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4は、表17に関してのみ、1999年４月28日公開の欧州出願EP 0 911 393に定義されている通りのものである。  太字体で表示している残基は、Ｄ-アミノ酸である。  ペプチドはすべて、特に断りのない限り、ペプチド結合によって連結されている。  略語は、本明細書の末尾に列挙している。  「配列番号」欄の「ＮＲ」は、配列表が、所定の配列を必要としていないことを意味するものである。
【０１０５】
【表４−１】
2008505928.tif 000030
【０１０６】
【表４−２】
2008505928.tif 000031
【０１０７】
【表４−３】
2008505928.tif 000032
【０１０８】
【表４−４】
2008505928.tif 000033
【０１０９】
【表４−５】
2008505928.tif 000034
【０１１０】
【表４−６】
2008505928.tif 000035
【０１１１】
【表４−７】
2008505928.tif 000036
【０１１２】
【表４−８】
2008505928.tif 000037
【０１１３】
【表５−１】
2008505928.tif 000038
【０１１４】
【表５−２】
2008505928.tif 000039
【０１１５】
【表６−１】
2008505928.tif 000040
【０１１６】
【表６−２】
2008505928.tif 000041
【０１１７】
【表７】
2008505928.tif 000042
【０１１８】
【表８】
2008505928.tif 000043
【０１１９】
【表９−１】
2008505928.tif 000044
【０１２０】
【表９−２】
2008505928.tif 000045
【０１２１】
【表１０】
2008505928.tif 000046
【０１２２】
【表１１−１】
2008505928.tif 000047
【０１２３】
【表１１−２】
2008505928.tif 000048
【０１２４】
【表１２−１】
2008505928.tif 000049
【０１２５】
【表１２−２】
2008505928.tif 000050
【０１２６】
【表１２−３】
2008505928.tif 000051
【０１２７】
【表１３】
2008505928.tif 000052
【０１２８】
【表１４−１】
2008505928.tif 000053
【０１２９】
【表１４−２】
2008505928.tif 000054
【０１３０】
【表１５】
2008505928.tif 000055
【０１３１】
【表１６−１】
2008505928.tif 000056
【０１３２】
【表１６−２】
2008505928.tif 000057
【０１３３】
【表１７】
2008505928.tif 000058
【０１３４】
【表１８】
2008505928.tif 000059
【０１３５】
【表１９−１】
2008505928.tif 000060
【０１３６】
【表１９−２】
2008505928.tif 000061
【０１３７】
【表１９−３】
2008505928.tif 000062
【０１３８】
【表２０−１】
2008505928.tif 000063
【０１３９】
【表２０−２】
2008505928.tif 000064
【０１４０】
【表２１−１】
2008505928.tif 000065
【０１４１】
【表２１−２】
2008505928.tif 000066
【０１４２】
【表２１−３】
2008505928.tif 000067
【０１４３】
【表２２−１】
2008505928.tif 000068
【０１４４】
【表２２−２】
2008505928.tif 000069
【０１４５】
【表２３−１】
2008505928.tif 000070
【０１４６】
【表２３−２】
2008505928.tif 000071
【０１４７】
【表２３−３】
2008505928.tif 000072
【０１４８】
【表２４−１】
2008505928.tif 000073
【０１４９】
【表２４−２】
2008505928.tif 000074
【０１５０】
【表２４−３】
2008505928.tif 000075
【０１５１】
【表２５】
2008505928.tif 000076
【０１５２】
【表２６】
2008505928.tif 000077
【０１５３】
【表２７】
2008505928.tif 000078
【０１５４】
【表２８】
2008505928.tif 000079
【０１５５】
【表２９】
2008505928.tif 000080
【０１５６】
【表３０】
2008505928.tif 000081
【０１５７】
【表３１−１】
2008505928.tif 000082
【０１５８】
【表３１−２】
2008505928.tif 000083
【０１５９】
【表３１−３】
2008505928.tif 000084
【０１６０】
【表３２−１】
2008505928.tif 000085
【０１６１】
【表３２−２】
2008505928.tif 000086
【０１６２】
【表３３−１】
2008505928.tif 000087
【０１６３】
【表３３−２】
2008505928.tif 000088
【０１６４】
【表３４】
2008505928.tif 000089
【０１６５】
【表３５】
2008505928.tif 000090
【０１６６】
【表３６】
2008505928.tif 000091
【０１６７】
【表３７−１】
2008505928.tif 000092
【０１６８】
【表３７−２】
2008505928.tif 000093
【０１６９】
【表３８−１】
2008505928.tif 000094
【０１７０】
【表３８−２】
2008505928.tif 000095
【０１７１】
【表３８−３】
2008505928.tif 000096
【０１７２】
【表３８−４】
2008505928.tif 000097
【０１７３】
【表３８−５】
2008505928.tif 000098
表６に記載のＴＭＰ化合物に加えて、本願発明は、その他の多数のＴＭＰ化合物をも提供する。  ある実施態様において、ＴＭＰ化合物は、以下の一般構造：
【０１７４】
【化２１】
2008505928.tif 000099
式中、ＴＭＰ1およびＴＭＰ2は、それぞれ独立して、以下のコア構造：
【０１７５】
【化２２】
2008505928.tif 000100
式中、Ｘ2は、Glu、Asp、Lys、およびValからなるグループから選択され；
Ｘ3は、GlyおよびAlaからなるグループから選択され；
Ｘ4は、Proであり；
Ｘ5は、ThrおよびSerからなるグループから選択され；
Ｘ6は、Leu、Ile、Val、Ala、およびPheからなるグループから選択され；
Ｘ7は、ArgおよびLysからなるグループから選択され；
Ｘ8は、Gln、Asn、およびGluからなるグループから選択され；
Ｘ9は、Trp、Tyr、およびPheからなるグループから選択され；
Ｘ10は、Leu、Ile、Val、Ala、Phe、Met、およびLysからなるグループから選択され；
Ｌ1は、本明細書に記載されているようなリンカーであり；そして、
ｎは、０または１である
構造式の化合物およびその生理学的に許容可能な塩のグループから選択される、ものを含む。
【０１７６】
ある実施態様において、Ｌ1は(Gly)nを含み、ここで、ｎは１〜20であり、ｎが１よりも大きい場合、Gly残基の最大半分までが、残りの19個の天然アミノ酸またはその立体異性体から選択されるその他のアミノ酸で置換されてもよい。
【０１７７】
ＴＭＰ1およびＴＭＰ2に関しては、前述したコア構造Ｘ2〜Ｘ10に加えて、その他の関連構造も可能であり、以下の一つまたはそれ以上がＴＭＰ1および／またはＴＭＰ2コア構造に加えられる。  すなわち、Ｘ1がＮ末端に付着され、および／またはＸ11、Ｘ12、Ｘ13、および／またはＸ14がＣ末端に付着され、当該Ｘ1、Ｘ12、Ｘ13、およびＸ14が：
Ｘ1は、Ile、Ala、Val、Leu、Ser、およびArgからなるグループから選択され；
Ｘ11は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Ser、Thr、Lys、His、およびGluからなるグループから選択され；
Ｘ12は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Gly、Ser、およびGlnからなるグループから選択され；
Ｘ13は、Arg、Lys、Thr、Val、Asn、Gln、およびGlyからなるグループから選択され；ならびに
Ｘ14は、Ala、Ile、Val、Leu、Phe、Thr、Arg、Glu、およびGlyからなるグループから選択される。
【０１７８】
本願発明のＴＭＰ化合物は、少なくとも９個のサブユニット(Ｘ2〜Ｘ10)で構成されており、すなわち、これらのサブユニットを含み、ここで、Ｘ2〜Ｘ10は、コア構造を含む。  Ｘ2〜Ｘ14サブユニットは、独立して、２０個の天然に存在するアミノ酸の中から選択されるアミノ酸であるが、本願発明は、Ｘ2〜Ｘ14が、当該技術分野で周知の天然に存在しない異型アミノ酸のグループから独立して選択される化合物を含む。  具体的なアミノ酸は、各位置に関して同定される。  例えば、Ｘ2は、Glu、Asp、Lys、またはValであってもよい。  アミノ酸の三文字表記および一文字表記のいずれもが、本明細書において用いられている。  いずれの場合にも、これら表記は、２０個の天然に存在するアミノ酸、またはそれらの周知の変異体に関して用いられる標準的な表記である。  これらのアミノ酸は、Ｌ型またはＤ型の立体配置のいずれかを有しており(Ｌ型またはＤ型のいずれでもないGlyを除く）、そしてＴＭＰ(および本願発明のその他のすべての化合物)は、立体配置の組み合わせを含むこともある。  また、本願発明は、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端への配列が逆になっている、リバースＴＭＰ分子(および本明細書に開示するその他のすべてのペプチドについて)も提供する。  例えば、正常配列Ｘ1-Ｘ2-Ｘ3を有する分子の逆は、Ｘ3-Ｘ2-Ｘ1である。  また、本願発明は、レトロリバースＴＭＰ分子(および本明細書に記載の本願発明のその他のすべての分子について)も提供し、このものは、リバースＴＭＰと同様に、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端への配列が逆になっており、ＴＭＰで本来「Ｌ」鏡像異性体である残基は、「Ｄ」立体異性体型に変わる。
【０１７９】
従って、本願発明のＴＭＰ化合物の例として、以下の化合物があるが、これらに限定されない。
【０１８０】
【化２３】
2008505928.tif 000101
【０１８１】
【化２４】
2008505928.tif 000102
また、活性を有するペプチドを、以下の病態の処置に用いた場合、本願発明は特に有用である。
【０１８２】
・癌：VEGF模倣物またはVEGFレセプターアンタゴニスト、HER２アゴニストまたはアンタゴニスト、CD２０アンタゴニストなどをペプチドとして用いる場合。
【０１８３】
・喘息：CKR３アンタゴニスト、ＩＬ-５レセプターアンタゴニストなどを目的のタンパク質として用いる場合。
【０１８４】
・血栓症：GPIIｂアンタゴニスト、GPIIIａアンタゴニストなどを目的のタンパク質として用いる場合。
【０１８５】
・自己免疫疾患および免疫修飾に関連するその他の病態：ＩＬ-２レセプターアンタゴニスト、CD40アゴニストまたはアンタゴニスト、CD40Ｌアゴニストまたはアンタゴニスト、サイモポエチン模倣物などを目的のタンパク質として用いる場合。
【０１８６】
誘導体
本願発明は、化合物のペプチドおよび／またはビヒクル部分を(以下に述べるようにして)誘導することも企図している。  このような誘導体は、化合物の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善する。  あるいは、これらの部分は、化合物の任意の望ましくない副作用などを排除するか、あるいは緩和する。  誘導体の例として、以下の化合物がある。
【０１８７】
１．化合物またはその一部が環状である。  例えば、ペプチド部分が修飾されて二つまたはそれ以上のCys残基を含み(例えば、リンカー中に)、これらの残基がジスルフィド結合形成によって環化される。  環化誘導体の調製に関する参考文献の引用については、表２を参照のこと。
【０１８８】
２．化合物が架橋されているか、または分子間の架橋が可能になっている。  例えば、ペプチド部分が修飾されて一つのCys残基を含み、それによって、類似分子と分子間ジスルフィド結合を形成することが可能である。  この化合物はまた、以下に示す分子と同様に、そのＣ末端を介して架橋される。
【０１８９】
【化２５】
2008505928.tif 000103
３．一つまたはそれ以上のペプチジル[-Ｃ(Ｏ)ＮＲ-]連結(結合)が、非ペプチジル連結によって置換される。  非ペプチジル連結の例として、-ＣＨ２-カルバメート[-ＣＨ２-ＯＣ(Ｏ)ＮＲ-］、ホスホネート、-ＣＨ２-スルホンアミド[-ＣＨ２-Ｓ(Ｏ)２ＮＲ-］、尿素[-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ-］、-ＣＨ２-二級アミン、およびアルキル化ペプチド[-Ｃ(Ｏ)ＮＲ６-（式中、Ｒ６は低級アルキル基である）］がある。
【０１９０】
４．Ｎ末端が誘導される。  典型的には、Ｎ末端はアシル化されるか、または修飾されて置換アミンになる。  Ｎ末端誘導基の例として、-ＮＲＲ１(-ＮＨ２以外）、-ＮＲＣ(Ｏ)Ｒ１、-ＮＲＣ(Ｏ)ＯＲ１、-ＮＲＳ(Ｏ)２Ｒ１、-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨＲ１、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-(ＣＢＺ-ＮＨ-)(式中、ＲおよびＲ１は、それぞれ独立して、水素または低級アルキル基であり、そしてフェニル環は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、クロロ、およびブロモからなるグループから選択される１個〜３個の置換基で置換される)がある。
【０１９１】
５．遊離Ｃ末端が誘導される。  典型的には、Ｃ末端はエステル化されるか、またはアミド化される。  例えば、当該技術分野で周知の方法を用いて、本願発明の化合物に(ＮＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＨ２)２を付加する。  同様に、当該技術分野で周知の方法を用いて、本願発明の化合物に-ＮＨ２を付加する。  末端誘導基の例として、例えば、-Ｃ(Ｏ)Ｒ２(式中、Ｒ２は低級アルコキシ基または-ＮＲ３Ｒ４であり、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキル(好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル)である)がある。
【０１９２】
６．ジスルフィド結合が、別のもの(好ましくは、より安定な架橋部分(例えば、アルキレン))で置換される。  例えば、Bhatnagar et al., (1996), J. Med. Chem. 39：3814〜9；Alberts et al., (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357〜9を参照のこと。
【０１９３】
７．一つまたはそれ以上の個々のアミノ酸残基が修飾される。  詳細に後述するように、選択された側鎖または末端残基と特異的に反応する種々の誘導化剤が公知である。
【０１９４】
リシニル残基およびアミノ末端残基は、リシニル残基の電荷を逆にするコハク酸またはその他のカルボン酸の無水物と反応する。  α-アミノ含有残基を誘導するためのその他の適切な試薬として、イミドエステル(例えば、メチルピコリンイミダート；ピリドキサールホスファート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンアスルホン酸；Ｏ-メチルイソ尿素；２,４ペンタンジオン）、およびトランスアミダーゼに触媒されるグリオキシラートとの反応がある。
【０１９５】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２,３-ブタンジオン、１,２-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む、数種類の従来の試薬のいずれか一つまたはこれらの試薬の組み合わせとの反応によって修飾される。  アルギニル残基の誘導は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルカリ性条件下で反応が行われる必要がある。  さらに、これらの試薬は、アルギニンのε-アミノ基と同様に、リジンの基と反応する。
【０１９６】
チロシル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに関心が集まっており、広範囲にわたって研究されてきた。  通常、Ｎ-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、それぞれ、Ｏ-アセチルチロシル類および３-ニトロ誘導体を生成するために用いられる。
【０１９７】
カルボキシル側鎖基(アスパルチルまたはグルタミル)は、１-シクロヘキシル-３-(２-モルホリニル-(４-エチル)カルボジイミドまたは１-エチル-３-(４-アゾニア-４,４-ジメチルペンチル)カルボジイミドのようなカルボジイミド(Ｒ'-Ｎ=Ｃ=Ｎ-Ｒ')との反応によって、選択的に修飾される。  さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基も、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【０１９８】
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に対して脱アミドする。  あるいは、これらの残基は、弱酸性の条件下で脱アミドされる。  これらの残基のいずれの形態も、本願発明の範囲内にある。
【０１９９】
システイニル残基は、ジスルフィド結合を排除するか、あるいは、逆に架橋を安定させるために、アミノ酸残基またはその他の部分で置換される。  例えば、Bhatnagar et al., (1996), J. Med. Chem. 39：3814〜9を参照のこと。
【０２００】
二官能性薬剤を用いる誘導は、ペプチドまたはその機能的誘導体を、非水溶性の支持マトリックスと、またはその他の高分子ビヒクルと架橋する上で有用である。  一般に用いられる架橋剤としては、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(例えば、４-アジドサリチル酸とのエステル）、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンのような二官能性マレイミドがある。  メチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートのような誘導剤は、光の存在下で架橋を形成する光活性化中間体を生成する。  あるいは、臭化シアンで活性化した炭水化物のような反応性の非水溶性マトリックスならびに米国特許第3,969,287号；第3,691,016号；第4,195,128号；第4,247,642号；第4,229,537号；および第4,330,440号に記載の反応性基質が、タンパク質の固定化のために用いられる。
【０２０１】
炭水化物(オリゴ糖)類は、タンパク質でのグリコシル化部位であることが分かっている部位に適宜付着される。  一般に、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)およびアスパラギン(Asn)残基が、配列Asn-Ｘ-Ser/Thr(Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である)の一部である場合、Ｏ-結合型オリゴ糖はSer残基またはThr残基に付着され、一方で、Ｎ-結合型オリゴ糖はAsn残基に付着される。  Ｘは、プロリン以外の１９個の天然に存在するアミノ酸の一つであることが好ましい。  Ｎ-結合型およびＯ-結合型オリゴ糖ならびに各々の型に認められる糖残基の構造は異なる。  両方の型に共通して認められる糖の一つの型は、Ｎ-アセチルノイラミン酸(シアル酸とも呼ばれている)である。  シアル酸は、通常、Ｎ-結合型およびＯ-結合型オリゴ糖の両方の末端残基があり、その負電荷によって、グリコシル化化合物を酸性化する。  このような部位は、本願発明の化合物のリンカーに組み込まれ、そして、ポリペプチド化合物の組換え生産の間、細胞内で(例えば、CHO、BHK、COSのような哺乳動物細胞内で)好適にグリコシル化される。  しかし、このような部位は、当該技術分野で周知の合成手順または半合成手順によってグリコシル化されてもよい。
【０２０２】
その他の可能な修飾として、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Cys中の硫黄原子の酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化がある。  Creighton、Proteins：Structure and Molecule Properties(W. H. Freeman & Co., サンフランシスコ), pp.79〜86（1983）。
【０２０３】
本願発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変更される。  本願発明の化合物の任意の部分のＤＮＡ配列は、選択された宿主細胞に対して好適なコドンに変更される。  好ましい宿主細胞である大腸菌に関する至適コドンは当該技術分野で周知である。  コドンは、制限酵素認識部位を除去するか、または潜在的制限酵素認識部位を含むように置換されてもよく、これは、選択された宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを補助する。  ビヒクル、リンカーおよびペプチドのＤＮＡ配列は、前述の配列変更のいずれかを含むように修飾される。
【０２０４】
アイソトープ共役誘導体および毒素共役誘導体
有用な誘導体のその他のクラスとして、毒素、トレーサー、または放射性同位体と共役した標記分子がある。  このような共役は、腫瘍細胞または病原体に結合するペプチド配列を含む分子において特に有用である。  このような分子は、治療薬として、または手術(例えば、放射免疫ガイド下手術、すなわちRIGS)の補助のために、または診断用薬(例えば、放射性免疫診断法、すなわちRID)として用いられる。
【０２０５】
これらの共役誘導体は、治療薬として、多くの利点を有する。  これらの誘導体は、ペプチド配列がもたらす特異的結合が無いままに投与されれば、毒素および有毒な放射性同位体の使用を容易にする。  また、これら誘導体は、共役パートナーの有効量を低下させることにより、放射線および化学療法の使用に伴う副作用を低減する。
【０２０６】
有用な共役パートナーとしては、以下のものがある：
・放射性同位体、例えば、90イットリウム、131ヨウ素、225アクチニウム、および213ビスマス；
・リシンＡ毒素、シュードモナス内毒素(例えば、PE38、PE40)のような微生物由来毒素など；
・捕捉系におけるパートナー分子(下記参照)；
・ビオチン、ストレプトアビジン(捕捉系におけるパートナー分子、または、特に診断用途のためのトレーサーのいずれかとして有用なもの)；および
・細胞傷害性薬剤(例えば、ドキソルビシン)。
【０２０７】
これらの共役誘導体の有用な適応例として、捕捉系における使用がある。  このような系において、本願発明の分子とは、害のない捕捉分子を含む。  この捕捉分子は、例えば、毒素または放射性同位体を含む別個のエフェクター分子と特異的に結合することができる。  ビヒクル共役分子およびエフェクター分子のいずれも、患者に投与される。  このような系において、エフェクター分子は、ビヒクル共役捕捉分子と結合する場合を除いて短い半減期を有するため、任意の有毒な副作用も最小限に抑える。  ビヒクル共役分子は、比較的長い半減期を有するが、無害かつ無毒である。  両分子の特異的結合部分は、公知の特異的結合対(例えば、ビオチン、ストレプトアビジン)の一部になるか、または本明細書に記載のペプチド生成方法によってもたらされる。
【０２０８】
このような共役誘導体は、当該技術分野で周知の方法によって調製される。  タンパク質エフェクター分子(例えば、シュードモナス内毒素)の場合、このような分子は、関連するＤＮＡ構築物から融合タンパク質として発現される。  放射性同位体共役誘導体は、例えば、BEXA抗体(Coulter)に関する記載に従って調製される。  細胞傷害性薬剤または微生物毒素を含む誘導体は、例えば、BR96抗体(Bristol-Myers Squibb)に関する記載に従って調製される。  捕捉系に用いられる分子は、例えば、NeoRxから出された特許、特許出願、および刊行物での記載に従って調製される。  RIGSおよびRIDに用いられる分子は、例えば、NeoProbeから出された特許、特許出願、および刊行物での記載に従って調製される。
【０２０９】
ビヒクル
本願発明は、アミノ酸残基の一つのＮ末端、Ｃ末端または側鎖を介してペプチドに付着される少なくとも一つのビヒクルの存在を必要とする。  複数のビヒクルが用いられてもよい。  ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ビヒクルである。  Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端と、あるいはＮ末端とＣ末端の双方に融合される。
【０２１０】
本願発明の種々の実施態様において、Ｆｃ成分は、ネイティブＦｃまたはＦｃ変異体のいずれかである。  ネイティブＦｃの免疫グロブリン供給源は、ある実施態様では、ヒト起源のものであり、そしてその他の実施態様では、任意のクラスの免疫グロブリンのものであってもよい。  ネイティブＦｃドメインは、共有結合(すなわち、ジスルフィド結合)および／または非共有結合によって二量体形態または多量体形態に連結される単量体ポリペプチドで構成されている。  ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ)またはサブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２)によって１から４まで変動する。  ネイティブＦｃの例として、ＩｇＧのパパイン消化によって生じるジスルフィド結合二量体がある(Ellison et al., (1982), Nucleic Acids Res. 10：4071〜9を参照のこと）。
【０２１１】
ジスルフィド結合形成による二量体化を防ぐ特定の条件が存在する場合を除いて、Ｆｃ単量体は、適切なシステイン残基が存在する場合、自発的に二量体化することを留意すべきである。  Ｆｃ二量体においてジスルフィド結合を通常形成するシステイン残基がその他の残基によって除去または置換されても、単量体鎖は一般に、非共有結合性相互作用によって二量体を形成する。  本明細書において「Ｆｃ」の用語は、以下の形態、すなわち：ネイティブ単量体、ネイティブ二量体(ジスルフィド結合で連結)、修飾二量体(ジスルフィド結合および／または非共有結合で連結）、および修飾単量体(すなわち、誘導体)のいずれかを意味する際に用いられる。
【０２１２】
上述したように、Ｆｃ変異体は、本願発明の範囲に属する適切なビヒクルである。  ネイティブＦｃは、サルベージレセプターへの結合が維持されるならば、広範に修飾されてＦｃ変異体を形成する；例えば、WO97/34631およびWO96/32478を参照のこと。  このようなＦｃ変異体において、本願発明の融合分子に必要のない構造的特徴または機能活性をもたらすネイティブＦｃの一つまたはそれ以上の部位を除去することができる。  これらの部位は、例えば、残基を置換または除去したり、残基をこの部位へ挿入したり、あるいはこの部位を含む部分を切断することで除去される。  また、挿入または置換される残基は、ペプチド模倣物またはＤ-アミノ酸のような改変アミノ酸であってもよい。  Ｆｃ変異体は、多くの理由で所望される。  これらの理由のいくつかを、以下に示す。  Ｆｃ変異体の例として、以下のような分子および配列がある。
【０２１３】
１．ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去される。  このような除去により、本願発明の分子を生成するために用いられる宿主細胞内に存在するその他のシステイン含有タンパク質との反応を回避できる。  この目的のために、システイン含有セグメントがＮ末端で切断されるか、またはシステイン残基がその他のアミノ酸(例えば、アラニル、セリル)によって欠失または置換される。  システイン残基が除去される場合でも、一本鎖Ｆｃドメインは依然として、非共有結合で結合される二量体Ｆｃドメインを形成することができる。
【０２１４】
２．ネイティブＦｃが、選択された宿主細胞との適合性を高めるように修飾される。  例えば、プロリンイミノペプチダーゼのような大腸菌の消化酵素によって認識される代表的なネイティブＦｃのＮ末端の近くのＰＡ配列を除去できる。  特に、分子を大腸菌のような細菌細胞内で組換え発現させる場合、Ｎ末端のメチオニン残基を付加してもよい。
【０２１５】
３．選択された宿主細胞内で発現される場合、Ｎ末端の不均一性を防ぐためにネイティブＦｃのＮ末端の一部が除去される。  この目的のために、Ｎ末端の最初の２０個のアミノ酸残基(特に、１位、２位、３位、４位および５位のアミノ酸残基)のいずれかを除去できる。
【０２１６】
４．一つまたはそれ以上のグリコシル化部位が除去される。  グリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は、通常、細胞溶解反応を起こす。  このような残基は、非グリコシル化残基(例えば、アラニン)によって欠失または置換される。
【０２１７】
５．補体との相互作用に関与する部位(例えば、C1q結合部位)が除去される。  例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失または置換できる。  補体の補充は、本願発明の分子にとって有利ではない場合があるため、このようなＦｃ変異体を用いて回避する。
【０２１８】
６．サルベージレセプター以外のＦｃレセプターへの結合に影響する部位が除去される。  ネイティブＦｃは、本願発明の融合分子に必要のない特定の白血球との相互作用のための部位を持つ場合があるので、除去される。
【０２１９】
７．ＡＤＣＣ部位が除去される。  ＡＤＣＣ部位は、当該技術分野で周知である；例えば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関して、Molec. Immunol. 29（5）：633-9 (1992)を参照のこと。  これらの部位も、本願発明の融合分子に必要がないため、除去される。
【０２２０】
８．ネイティブＦｃが非ヒト抗体に由来する場合、このネイティブＦｃはヒト化される。  一般的には、ネイティブＦｃをヒト化するために、非ヒトネイティブＦｃの選択された残基を、ヒトネイティブＦｃ中に通常見出される残基で置換する。  抗体をヒト化する技術は、当該技術分野で周知である。
【０２２１】
代替用のビヒクルとして、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、またはサルベージレセプターに結合し得る小分子(例えば、ペプチド模倣化合物)などがある。  例えば、1998年４月14日に発行されたPresta et al.,の米国特許第5,739,277号に記載されているように、ビヒクルとしてポリペプチドを用いることができる。  ペプチドも、ＦｃＲｎサルベージレセプターに結合するためにファージディスプレイによって選択される。  このようなサルベージレセプターに結合する化合物もまた、「ビヒクル」に含まれ、本願発明の範囲内に属する。  このようなビヒクルは、半減期を(例えば、プロテアーゼによって認識される配列を回避することによって)延長させ、免疫原性を(例えば、抗体のヒト化において認められるように、非免疫原性配列を支持することによって)低下させるようにして選択される。
【０２２２】
Ｆｃ部分の変異体、類似体または誘導体は、例えば、残基または配列の種々の置換を行うことで構築される。
【０２２３】
変異体(または類似体)ポリペプチドとしては、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基がＦｃアミノ酸配列を補完する挿入変異体がある。  挿入は、タンパク質の末端の一方または双方に位置するか、あるいはＦｃアミノ酸配列の内部領域内に位置する。  末端の一方または双方に残基をさらに有する挿入変異体として、例えば、融合タンパク質およびアミノ酸タグもしくは標識を含むタンパク質がある。  例えば、Ｆｃ分子は、特に、この分子を大腸菌のような細菌細胞内で組換え発現させる場合、必要に応じてＮ末端のMetを含む。
【０２２４】
Ｆｃ欠失変異体においては、Ｆｃポリペプチド内の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が除去される。  欠失は、Ｆｃポリペプチドの一方または双方の末端で生じるものであり、また、Ｆｃアミノ酸配列内の一つまたはそれ以上の残基の除去によっても生じる。  従って、欠失変異体は、Ｆｃポリペプチド配列のすべての断片を含む。
【０２２５】
Ｆｃ置換変異体においては、Ｆｃポリペプチドの一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換される。  ある実施態様において、置換は、天然では保存的であり、このタイプの保存的置換は当該技術分野で周知である。  あるいは、本願発明は、非保存的な置換も含む。
【０２２６】
例えば、システイン残基は、Ｆｃ配列のジスルフィド架橋の一部またはすべての形成を防ぐために、その他のアミノ酸によって欠失または置換される。  システイン残基の各々が、AlaまたはSerなどのその他のアミノ酸によって除去および／または置換される。  その他の例として、(１)Ｆｃレセプター結合部位を除去するために；(２)補体(C1q)結合部位を除去するために；および／または(３)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)部位を除去するために、修飾を行ってアミノ酸置換を導入してもよい。  このような部位は当該技術分野で周知であり、任意の公知の置換が、本明細書に記載のＦｃの範囲内のものである。  例えば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関して、Molecular Immunology、第29巻、No.5、633〜639(1992)を参照のこと。
【０２２７】
同様に、一つまたはそれ以上のチロシン残基がフェニルアラニン残基で置換される。  さらに、その他の変異体アミノ酸挿入、欠失および／または置換も企図されており、これらは本願発明の範囲内である。  一般的には、保存的なアミノ酸置換が好ましい。  さらに、改変は、ペプチド模倣物またはＤ-アミノ酸のような改変アミノ酸の形態であってもよい。
【０２２８】
また、化合物のＦｃ配列は、ペプチドについて本明細書に記載されたような誘導、すなわち、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾が施される。  修飾は、天然には共有結合であることが好ましく、例えば、ポリマー、脂質、その他の有機部分および無機部分との化学結合が含まれる。  本願発明の誘導体は、循環半減期を延長するように調製されてもよく、あるいは、所望の細胞、組織、または器官へのポリペプチドの標的化作用を改善するように設計されてもよい。
【０２２９】
例えば、WO96/32478（発明の名称「Altered Polypeptides with Increased Half-Life」）に記載のようにして、本願発明の化合物のＦｃ部分として、無傷のＦｃ分子のサルベージレセプター結合ドメインを用いることも可能である。  本明細書でＦｃと称する分子のクラスのさらなるメンバーとして、WO97/34631(発明の名称「Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives」)に記載されているものがある。  本段落において引用する公開された双方のＰＣＴ出願の内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０２３０】
ＷＳＰ成分
本願発明の化合物はさらに、少なくとも一つのＷＳＰを含む。  分子のＷＳＰ部分は、分枝していても、分岐していなくてもよい。  最終調製物の治療的使用のために、このポリマーは薬学的に許容可能である。  一般に、所望のポリマーは、ポリマー共役体が治療的に用いられるか否かの考察に基づいて選択され、そして治療的に用いられる場合には、所望の用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、およびその他の考察に基づいて選択される。  種々の態様において、各水溶性ポリマーの平均分子量は、約２kDaと約100kDaの間、約５kDaと約50kDaの間、約12kDaと約40kDaの間、および約20kDaと約35kDaの間である。  さらにその他の実施態様において、各ポリマーの分子量は、約６kDaと約25kDaの間である。  本明細書において頻繁に用いられている「約」の用語は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が、記載された分子量よりも大きいか、幾分小さい重量を有することを示す。  一般に、分子量が大きいか、または分岐が多いほど、ポリマー/タンパク質比も高くなる。  例えば、徐放の期間；もしあれば、生物活性に対する影響；取り扱いの容易さ；抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質に対する水溶性ポリマーのその他の既知の作用を含む、所望の治療プロフィールに応じて、その他の大きさで用いらる。
【０２３１】
ＷＳＰは、ペプチドまたはタンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する影響を考慮して、ペプチドまたはタンパク質に付着されるべきである。  一般に、化学的誘導は、活性化したポリマー分子とタンパク質とを反応させるために使用される任意の適切な条件下で実施される。  水溶性ポリマーを一つまたはそれ以上のタンパク質に連結するために用いる活性化基として、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン、オキシランおよび５-ピリジルなどがあるが、これらに限定されない。  還元アルキル化によってペプチドに付着させる場合に選択されるポリマーは、重合度の制御を目的として、単一の反応性アルデヒドを有するものにすべきである。
【０２３２】
臨床的に許容可能な適切な水溶性ポリマーとして、ＰＥＧ、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、モノメトキシポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリ(β-アミノ酸)(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー(ＰＰＧ)およびその他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(ＰＯＧ)(例えば、グリセロール)およびその他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、結腸酸またはその他の炭水化物ポリマー、フィコールまたはデキストランならびにそれらの混合物があるが、これらに限定されない。
【０２３３】
多糖ポリマーは、タンパク質修飾に用いられるその他のタイプの水溶性ポリマーである。  デキストランは、主にα１-６結合によって連結するグルコースの個々のサブユニットから構成される多糖ポリマーである。  デキストラン自体は、多様な分子量のものが入手可能であり、約１kD〜約70kDの分子量のものが容易に入手できる。  デキストランは、それ単独でも、またはその他のビヒクル(例えば、Ｆｃ)と組み合わせても、本願発明でビヒクルとして使用するのに適した水溶性ポリマーとなる。  例えば、WO96/11953およびWO96/05309を参照のこと。  治療用免疫グロブリンまたは診断用免疫グロブリンと共役したデキストランの使用が報告されている；例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する欧州特許公報第0 315 456号を参照のこと。  デキストランが本願発明に従ってビヒクルとして用いられる場合、約１kD〜約20kDのデキストランが好ましい。
【０２３４】
ある実施態様において、ＷＳＰはＰＥＧであり、そして本願発明は、化合物がその他のタンパク質を誘導するために用いるＰＥＧの形態のいずれかを含むように修飾することも企図しており、例えば、モノ-(Ｃ１〜Ｃ10)アルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコールなどの調製を企図しているが、これらに限定されない。  ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定性を保つため、製造の際に有利である。  ＰＥＧ基は、任意の好都合な分子量のものであってもよく、直鎖であっても分枝鎖であってもよい。  本願発明での使用が企図されるＰＥＧの平均分子量は、約２kDaから約100kDaまで、約５kDaから約50kDaまで、約５kDaから約10kDaまでの範囲である。  その他の実施態様において、ＰＥＧ部分は、約６kDaから約25kDaまでの分子量を有する。  一般に、ＰＥＧ基は、ＰＥＧ部分上の反応基(例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基)を介して標的ペプチドまたはタンパク質上の反応基(例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基)へ、アシル化または還元アルキル化によってペプチドまたはタンパク質に付着される。  本明細書に記載の方法を用いてポリマー／ペプチド共役分子の混合物が調製され、そして、本明細書に記載の方法での利点は、ポリマー／ペプチド共役の比率を選択して混合物中に含ませることが可能なことである。  従って、所望であれば、ペプチドと、付着させる種々の数(すなわち、０個、１個または２個)のポリマー部分との混合物が、所定のポリマー／タンパク質共役比率で調製される。
【０２３５】
合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な手法(その他の方法の詳細は、本明細書に記載の通りである)は、ペプチドとＰＥＧ部分とを、溶液中で共役結合を形成することによって組み合わせる工程からなり、このペプチドとＰＥＧ部分の各々は、その他のものに対して相互に反応性を示すという特殊な機能性を有する。  このペプチドは、従来の固相合成で容易に調製される。  このペプチドは、特定の部位で適切な官能基を用いて「事前に活性化」される。  この前駆体は、ＰＥＧ部分と反応させる前に精製され、かつ十分に特性決定される。  ペプチドとＰＥＧのライゲーションは、通常は水相で起こり、逆相分析HPLCにより容易にモニターされる。  このＰＥＧ化ペプチドは、分取HPLCによって容易に精製され、そして、分析HPLC、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析によって特性決定される。
【０２３６】
リンカー
ペプチド間、ペプチドとビヒクルとの間またはビヒクルとＷＳＰとの間に位置するか否かにかかわらず、任意の「リンカー」基が随意に選択される。  リンカーが存在する場合、主にスペーサーとしての役割を果たすため、その化学構造は重要ではない。  リンカーは、ペプチド結合で互いに連結されたアミノ酸で構成されていることが好ましい。  従って、好ましい実施態様において、リンカーは、ペプチド結合で連結された１個〜２０個のアミノ酸で構成されており、これらのアミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。  当業者に周知の通り、これらのアミノ酸のいくつかは、グリコシル化される。  より好ましい実施態様において、この１個〜２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。  さらに好ましくは、リンカーを構成する過半数のアミノ酸が、立体障害のないアミノ酸(例えば、グリシンおよびアラニン)である。  従って、好ましいリンカーは、ポリグリシン(特に、(Gly)４、(Gly)５）、ポリ(Gly-Ala)、およびポリアラニンである。  その他の具体的なリンカーの例は、以下の通りである。
【０２３７】
【化２６】
2008505928.tif 000104
上記の命名法を説明すると、例えば、(Gly)３Lys(Gly)４は、Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Glyを意味する。  GlyとAlaの組み合わせも好ましい。  本明細書に示したリンカーは例示的なものであって、本願発明の範囲内のリンカーは、はるかに長くてもよく、また、その他の残基を含んでいてもよい。
【０２３８】
非ペプチドリンカーも可能である。  例えば、-ＮＨ-(ＣＨ２)s-Ｃ(Ｏ)-（式中、ｓ=２〜２０)のようなアルキルリンカーを用いることもできる。  これらのアルキルリンカーは、低級アルキル基(例えば、Ｃ１〜Ｃ６)、低級アシル基、ハロゲン(例えば、Ｃｌ、Ｂｒ)、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどのような、立体障害のない任意の基でさらに置換される。  非ペプチドリンカーの例として、以下の式、すなわち；
【０２３９】
【化２７】
2008505928.tif 000105
式中、ｎは、このリンカーの分子量が100〜5000kD、好ましくは100〜500kDであるような値である式で表されるＰＥＧリンカーがある。  このペプチドリンカーは、前述した方法と同じ方法で、誘導体を形成するために改変される。
【０２４０】
ペプチド生成
同定されているペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて形質転換された宿主細胞内で調製される。  ビヒクル成分がポリペプチドである場合、ペプチド-ビヒクル融合産物は、一つのものとして発現される。  そうするために、まず、ペプチドをコードしている組換えＤＮＡ分子が、当該技術分野で周知の方法を用いて調製される。  例えば、ペプチドをコードする配列が、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切り取られる。  あるいは、ホスホラミデート法のような化学合成技術を用いて、ＤＮＡ分子を合成することもできる。  また、これらの技術の組み合わせを用いることもできる。  従って、本願発明は、本願発明の化合物をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２４１】
また、本願発明は、適切な宿主において本願発明の化合物をコードするベクターを提供する。  ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結された化合物をコードするポリヌクレオチドを含む。  ポリヌクレオチドがベクターへ挿入される前後のいずれかに、この作動可能な連結を達成する方法は、周知である。  発現制御配列として、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関連するその他のシグナルがある。
【０２４２】
こうして得られたポリヌクレオチドを含むベクターは、適切な宿主を形質転換するために用いられる。  この形質転換は、当該技術分野で周知の方法を用いて行われる。
【０２４３】
多数の入手可能な周知の宿主細胞のいずれかが、本願発明の実施の際に用いられる。  特定の宿主の選択は、当該技術分野で認識されている多くの因子に依存する。  これらの因子として、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の割合、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、バイオセーフティおよび経費などがある。  これらの因子のバランスは、すべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に対して等しく有効であるとは限らないという理解の下で決定されなければならない。  これらの一般的ガイドラインに準拠して、有用な微生物宿主としては、細菌(例えば、大腸菌)、酵母(例えば、Saccharomyces)およびその他の菌類、昆虫、植物、哺乳動物(ヒトを含む)培養細胞、または当該技術分野で周知のその他の宿主がある。
【０２４４】
次に、形質転換した宿主が培養され、そして、精製される。  宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように、従来の発酵条件下で培養される。  このような発酵条件は、当該技術分野で周知である。  最終的に、ペプチドが、当該技術分野で周知の方法によって培養物から精製される。
【０２４５】
本願発明の化合物を発現するために利用される宿主細胞に基づいて、炭水化物(オリゴ糖)類は、タンパク質のグリコシル化部位であることが分かっている部位に適宜付着される。  一般に、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)およびアスパラギン(Asn)残基が配列Asn−Ｘ-Ser/Thr(Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である)の一部である場合、Ｏ-結合型オリゴ糖は、SerまたはThr残基に付着され、一方で、Ｎ-結合型オリゴ糖は、Asn残基に付着する。  Ｘは、プロリンを除く１９個の天然に存在するアミノ酸の一つであることが好ましい。  Ｎ-結合型およびＯ-結合型オリゴ糖ならびに各々の型に認められる糖残基の構造は異なる。  両方の型で共通して認められる糖の型は、Ｎ-アセチルノイラミン酸(シアル酸とも呼ばれている)である。  シアル酸は、通常、Ｎ-結合型およびＯ-結合型オリゴ糖の双方の末端残基を有し、その負電荷によって、グリコシル化化合物を酸性化する。  このような部位は、本願発明の化合物のリンカーに組み込まれ、そして、ポリペプチド化合物の組換え生産の間、細胞内(例えば、CHO、BHK、COSのような哺乳動物細胞内)で好適にグリコシル化される。  しかし、このような部位も、当該技術分野で周知の合成手順または半合成手順によってグリコシル化されてもよい。
【０２４６】
あるいは、化合物は、合成法によって調製されてもよい。  例えば、固相合成技術が用いられる。  適切な技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp.335〜61(Katsoyannis and Panayotis eds.)；Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85：2149；Davis et al., (1985), Biochem. Intl. 10：394〜414；Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis；米国特許第3,941,763号；Finn et al., (1976), The Proteins (第３版)２：105〜253；ならびにErickson et al., (1976), The Proteins（第３版）２：257〜527に記載の技術がある。  固相合成は、少量のペプチドを作製する最も対費用効果の高い方法であるため、個々のペプチドを作製する好適な技術である。
【０２４７】
誘導ペプチドを含む化合物または非ペプチド基を含む化合物は、特に、周知の有機化学技術による合成で修正可能である。
【０２４８】
ＷＳＰ修飾
ＷＳＰに共有結合で付着した化合物を得るために、本明細書に記載の方法、あるいは当該技術分野で周知の任意の方法が使用される。  ポリペプチドの化学的誘導体を調製する方法は、一般に、(ａ)ポリペプチドが一つまたはそれ以上のポリマー分子に付着する条件下で、ポリペプチドと活性化ポリマー分子(例えば、高分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体)とを反応させる工程、および(ｂ)反応生成物を得る工程を含む。  最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。  例えば、ポリマー分子：タンパク質の比率が大きくなるほど、付着されるポリマー分子の割合も大きくなる。
【０２４９】
生物学的に活性な分子は、当該技術分野で周知の方法を用いて、利用可能な任意の官能基を介してポリマーに連結される。  このような連結を形成するために用いられるポリマーまたは生物学的に活性な分子のいずれかに存在する官能基の例として、アミンおよびカルボキシ基、チオール基(例えば、システイン残基中に認められるチオール基)、アルデヒド類およびケトン類、ならびに水酸基(例えば、セリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリシン残基中に認められる水酸基)がある。
【０２５０】
ポリマーは、生物学的に活性な分子のアミン官能基と反応するために、トリクロロ-s-トリアジン[本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するAbuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem. 252：3582〜3586］、カルボニルイミダゾール[本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するBeauchamp et al., (1983), Anal. Biochem. 131：25〜33］、またはスクシンイミジルスクシネート[本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するAbuchowski et al., (1984), Cancer Biochem. Biophys. 7：175〜186]のような反応基をカップリングすることによって活性化される。  その他のカップリング方法は、ある分子のグリオキシリル基と、共役されるその他の分子のアミノオキシ基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基の形成に関与している[FieldsおよびDixon, (1968), Biochem. J. 108：883〜887；Gaertner et al., (1992), Bioconjugate Chem. 3：262〜268；Geoghegan and Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3：138〜146；Gaertner et al., (1994), J. Biol. Chem. 269：7224〜7230；これら各文献の内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する］。  その他の方法は、クロロホルメートまたはジスクシンイミジルカーボネートを用いることで、共役される一番目の分子の遊離アルコール基での活性エステルの形成に関与し、次いで、カップリングされるその他の分子のアミン基に共役される[Veronese et al., (1985), Biochem. and Biotech. 11：141〜152；Nitecki et al., 米国特許第5,089,261号；Nitecki、米国特許第5,281,698号；これら各文献の内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する]。  遊離アルコール基を介して付着されるその他の反応基は、Wright、EP0539167A2(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)に記載されている。  また、EP0539167A2は、遊離アミン基を介するカップリングのためのイミダートの使用についても記載している。
【０２５１】
その他の化学反応は、メトキシ-ＰＥＧ(Ｏ-[(Ｎ-スクシンイミジルオキシカルボニル)-メチル]-Ｏ'-メチルポリエチレングリコール)のＮＨＳ-エステルを用いることで、標的の１級アミンのアシル化に関与している。  メトキシ-ＰＥＧ-ＮＨＳを用いたアシル化により、もとの１級アミンから電荷を除去するアミド連結が生じる。  その他の方法は、アルデヒドへ酸化させるために、最後から２番目のグリコシル単位であるシアル酸のジオール側基を標的化するべく、選択された条件下での標的の穏やかな酸化を利用する。  得られたグリコアルデヒドは、次いで、メトキシ-ＰＥＧ-ヒドラジド(Ｏ-(ヒドラジノカルボニルメチル)-Ｏ'-メチルポリエチレングリコール)と反応して、ＰＥＧと標的との間に半安定性のヒドラゾンを形成する。  次いで、このヒドラゾンは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによって還元されて、安定なＰＥＧ共役体を生成する。  例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する米国特許第6,586,398号(Kinstler et al., 2003年７月１日)を参照のこと。
【０２５２】
化学的修飾のための技術に関する出願、例えば、米国特許第4,002,531号(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)には、還元アルキル化を、酵素へのポリエチレングリコール分子の付着のために用いられたことが記載されている。  米国特許第4,179,337号(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)には、ＰＥＧ：タンパク質共役体、例えば、酵素およびインスリンを含む共役体が開示されている。  米国特許第4,904,584号(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)には、反応性アミン基によってポリエチレングリコール分子を付着させるために、タンパク質でのリジン残基数を変更することが開示されている。  米国特許第5,834,594号(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)には、実質的に非免疫原性の水溶性ＰＥＧ：タンパク質共役体、例えば、タンパク質ＩＬ-２、インターフェロンα、およびＩＬ-１ｒａを含む共役体が開示されている。  Hakimi et al.,の方法は、ユニークなリンカーを利用して、タンパク質内の種々の遊離アミノ基をＰＥＧに結合させる方法である。  米国特許第5,824,784号および第5,985,265号(本明細書の一部を構成するものとしてこれら各文献の内容を援用する)は、選択的にＮ末端を化学修飾したタンパク質およびその類似体、すなわち、Ｇ-ＣＳＦおよびコンセンサスインターフェロンを含む類似体を生成させる方法を教示してい。  このような修飾されたタンパク質は、タンパク質の安定性に関する利点を有するのみならず、加工上の利点ももたらすことは重要である。
【０２５３】
ＷＳＰ修飾は、Francis et al.,「Stability of protein pharmaceuticals」での「in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization」(Ahern., T. and Manning, M.C. eds.) Plenum, N.Y., 1991(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)にも記載されており、これを用いることができる。  さらに別の実施態様として、Delgado et al.,「Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride，Applications In Immunoaffinity Cell Preparation」：（Fisher et al., eds., 「Separations Using Aqueous Phase Systems，Applications In Cell Biology and Biotechnology」、Plenum Press、N.Y. N.Y, 1989 pp.211〜213)(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する)に記載の方法は、トレシルクロリドの使用に関するものであって、ＷＳＰ部分とポリペプチド部分の間に連結基をもたらさない。  その他の実施態様において、ＷＳＰの付着は、当該技術分野で周知のように、カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステルの使用によって達成される。
【０２５４】
ＷＳＰを用いた標的の修飾のその他の記載に関しては、例えば、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの各内容を援用する米国特許出願第20030096400号；EP 0 442724A2；EP 0154316；EP 0401384；WO94/13322；米国特許第5,362,852号；第5,089,261号；第5,281,698号；第6,423,685号；第6,635,646号；第6,433,135号；国際出願WO90/07938；Gaertner and Offord, (1996), Bioconjugate Chem. 7：38〜44；Greenwald et al., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000；17：101〜161；Kopecek et al., J Controlled Release., 74：147〜158, 2001；Harris et al., Clin Pharmacokinet. 2001；40（7）：539〜51；Zalipsky et al., Bioconjug Chem. 1997；8：111〜118；Nathan et al., Macromolecules. 1992；25：4476〜4484；Nathan et al., Bioconj Chem. 1993；4：54〜62；ならびにFrancis et al., Focus on Growth Factors, 3：4〜10（1992)を参照のこと。
【０２５５】
還元アルキル化
ある実施態様において、ＷＳＰの共有結合的付着は、Ｎ末端のα-アミノ基を選択的に修飾するために、本明細書に記載の還元アルキル化化学修飾手順によって行われ、そして、得られた生成物を、本明細書に記載の生物活性アッセイのような所望の生物学的特性について試験する。
【０２５６】
タンパク質またはペプチドへのＷＳＰの付着のための還元アルキル化は、特定のタンパク質における誘導のために利用可能な種々のタイプの１級アミノ基(例えば、リジンとＮ末端と)の反応性の差を利用する。  適切な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーを用いて、タンパク質のＮ末端での実質的に選択的な誘導が達成される。
【０２５７】
還元アルキル化に関して選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。      
【０２５８】
反応性アルデヒドは、例えば、耐水性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ1-Ｃ10アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である(本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する米国特許第5,252,714号を参照のこと）。      
【０２５９】
ある方法にあっては、還元アルキル化を、ＰＥＧアルデヒド(Ｏ-(３-オキソプロピル)-Ｏ'-メチルポリエチレングリコール)を１級アミンに共役させるために使用する。  この方法は、適切な条件下では、主にタンパク質のＮ末端でα-アミンにより修飾されたＰＥＧ共役体を生成することが知られている。
【０２６０】
生物学的に活性な分子を共役させる上で有用なアルデヒド官能基は、隣接したアミノ基およびアルコール基を有する官能基から生成される。  ポリペプチドにおいて、例えば、Ｎ末端のセリン、トレオニンまたはヒドロキシリシンは、過ヨウ素酸塩を用いた穏和な条件下での酸化的開裂により、アルデヒド官能基を生成するために用いられる。  これらの残基、またはそれらの等価物は、例えば、ポリペプチドのＮ末端に正常に存在してもよく、化学的消化または酵素消化によって露出されてもよく、あるいは、組換えまたは化学的方法によって導入されてもよい。  アルデヒドを生成するための反応条件は、通常は、１モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの付加を伴い、そして、タンパク質内でのその他の位置での酸化を回避するための穏和な条件とする。  ｐＨは、約７.０が好ましい。  典型的な反応では、１.５倍モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加後に、暗所にて室温で、１０分間インキュベーションすることを含む。
【０２６１】
アルデヒド官能基は、ヒドラジドまたはセミカルバジド官能基を含む活性化ポリマーにカップリングされて、ヒドラゾンまたはセミカルバゾン結合を形成する。  ヒドラジド含有ポリマーは市販されており、必要に応じて、標準技術を用いて合成することもできる。      
【０２６２】
本願発明で用いられるＰＥＧヒドラジドは、Shearwater Polymers, Inc., 2307 Spring Branch Road, Huntsville, Ala. 35801(現在のNektar Therapeutics, 150 Industrial Road, San Carlos, CA 94070-6256の一部分)から入手できる。  アルデヒドとポリマーの二つの成分の溶液を一緒に混合し、反応が実質的に完了するまで約３７℃に加熱することによって、アルデヒドがポリマーにカップリングされる。  過剰のポリマーヒドラジドは、一般的には、得られた共役体の量を増加させるために用いられる。  一般的な反応時間は、26時間である。  反応物の熱安定性によって、反応温度および反応時間を、適切な結果を得るために変更する。  酸化とカップリングの双方のための反応条件の詳細は、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの各内容を援用するGeoghegan and Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3：138〜146およびGeogheganの米国特許第5,362,852号に記載されている。
【０２６３】
還元剤は、還元アルキル化を用いて、水溶液中で安定にさせておくべきであり、好ましくは、還元アルキル化の初期過程において形成されるシッフ塩基のみを還元するようにすべきである。  還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボレート、トリメチルアミンボレートおよびピリジンボレートから選択されるが、これらに限定されない。
【０２６４】
反応ｐＨは、用いるタンパク質に対するポリマーの比率の影響を受ける。  一般に、反応ｐＨが標的反応基のｐＫａよりも低いほど、タンパク質に対して過剰のポリマーが必要とされる。  ｐＨが、標的ｐＫａよりも高い場合、ポリマー：タンパク質の比率は、それほど大きくする必要はない(すなわち、より多くの反応基が利用可能であるため、必要なポリマー分子は少なくてすむ)。
【０２６５】
従って、反応は、ある実施態様において、タンパク質のリジン残基のε-アミノ基とＮ末端残基のα-アミノ基との間のｐＫａの差を利用することが可能なｐＨ条件下で行われる。  このような選択的な誘導によって、タンパク質への水溶性ポリマーの付着が制御され、ポリマーとの共役は、主にタンパク質のＮ末端で起こり、その他の反応基、例えば、リジン側鎖アミノ基の著しい修飾は起こらない。
【０２６６】
従って、ある実施態様において、標的化合物へのＷＳＰの共有結合的付着のための方法が提供され、この方法は、その他の化学修飾化学を用いた場合に必要とされるようなさらに大規模な精製を行うことなく、ＷＳＰ／タンパク質共役分子の実質的に均質な調製物を提供する。  より詳細には、ポリエチレングリコールが用いられる場合、周知の方法は、抗原性の連結基を欠いたＮ末端ＰＥＧ化タンパク質の生成を可能にするであろう。  すなわち、ポリエチレングリコール部分は、潜在的に有毒な副産物を生じることなくタンパク質部分に直接カップリングされる。
【０２６７】
標的ペプチドまたはタンパク質分子に付着したＷＳＰ分子の比率は、反応混合物でのそれらの濃度と同様に、選択されたＷＳＰの付着方法によって異なる。  一般に、(過剰の未反応タンパク質またはポリマーが存在しない反応の効率に換算して得た)至適比率は、選択したＷＳＰの分子量によって決定される。  さらに、非特異的付着およびその後の所望の種類の物質の精製に関与する方法を用いる場合、この比率は、利用可能な反応基(通常はアミノ基)の数に応じて変化する。
【０２６８】
精  製
実質的に均質なＷＳＰ修飾調製物を得る方法は、ある実施態様において、数種類の物質の混合物から主に単一の種類の修飾化合物を精製することに関する。  その例として、実質的に均質な物質は、まず、(たとえ見かけが同じ電荷を有するその他の種類の物質が存在していても)単一の電荷特性を有する物質を得るためにイオン交換クロマトグラフィーによって分離され、次いで、所望の種類の物質がサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分離される。  本願発明によって報告および企図されているその他の方法として、例えば、ＰＥＧ含有水性二相系においてＰＥＧ/タンパク質付加物を分配する工程を含む、ＰＥＧ-タンパク質付加物の混合物を分画するためのプロセスを記載している、1990年５月３日に公開のWO90/04606がある。
【０２６９】
従って、本願発明のある実施態様は、以下の工程、すなわち：(ａ)二つまたはそれ以上のアミノ基を有する化合物と水溶性ポリマー部分とを、当該水溶性ポリマーが当該α-アミノ基に選択的に付着されるようにタンパク質部分のアミノ末端のα-アミノ基を選択的に活性化するのに適したｐＨで、還元アルキル化条件下で反応させる工程；および(ｂ)反応生成物を得る工程を含む、ＷＳＰ修飾化合物共役体を調製する方法である。  必要に応じて、特に治療薬にあっては、反応生成物は、未反応部分から分離される。
【０２７０】
ペプチドマッピングおよびＮ末端配列決定によって確認されるように、ＰＥＧ化ペプチドと未反応ペプチドとの混合物に少なくとも５０％のＰＥＧ化ペプチドを含む調製物が提供される。  その他の実施態様において、ＰＥＧ化ペプチドと未反応ペプチドとの混合物に少なくとも７５％のＰＥＧ化ペプチドを含む調製物；ＰＥＧ化ペプチドと未反応ペプチドとの混合物に少なくとも８５％のＰＥＧ化ペプチドを含む調製物；ＰＥＧ化ペプチドと未反応ペプチドとの混合物に少なくとも９０％のＰＥＧ化ペプチドを含む調製物；ＰＥＧ化ペプチドと未反応ペプチドとの混合物に少なくとも９５％のＰＥＧ化ペプチドを含む調製物；および、ＰＥＧ化ペプチドと未反応ペプチドとの混合物に少なくとも９９％のＰＥＧ化ペプチドを含む調製物が提供される。
【０２７１】
薬学的組成物
本願発明は、本願発明の調製物を含む薬学的組成物をさらに提供する。  このような薬学的組成物は、注射での投与用、あるいは経口、経鼻、経皮またはその他の投与形態、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳腺内、腹腔内、髄腔内、眼内、眼球後、肺内(例えば、エアロゾル化薬剤)または皮下注射(持続的放出のためのデポー投与を含む)による投与形態；舌下、肛門、または膣による投与形態、あるいは外科移植、例えば、脾膜下、脳、または角膜中の包埋による投与形態に適した組成物を含む。  処置は、単回投与、または、長期間にわたる反復投与から構成されていてもよい。  一般に、有効量の本願発明の化合物を、薬学的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤および/または担体と共に含む薬学的組成物を、本願発明は含む。  これら組成物に対して、種々の緩衝液内容物(例えば、トリス-塩酸、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤(例えば、ツイーン80、ポリソルベート80）、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤(例えば、チメロゾール、ベンジルアルコール)および充填物質(例えば、ラクトース、マンニトール)のような添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのような高分子化合物の粒子状調製物またはリポソームを取り込むこともできる。  ヒアルロン酸もまた使用でき、ヒアルロン酸は、循環血液中での持続時間を延長する効果を有する。  薬学的組成物は、薬学的なビヒクル、賦形剤または媒体としての役割を果たす薬学的に許容可能なその他の液体、半固体、または固体の希釈剤を必要に応じて含むことができ、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾアート、デンプン、スクロース、デキストロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオバター、およびカカオ脂などがあるが、これらに限定されない。  このような組成物は、タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、およびin vivoでの浄化速度に影響を及ぼす。  例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するRemington's Pharmaceutical Sciences、第18版 (1990, Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042) 1435〜1712頁を参照のこと。  組成物は、液体形態でも、または凍結乾燥された形態のような乾燥粉末でも調製することができる。  経皮製剤と同様に、移植可能な徐放性製剤も企図している。
【０２７２】
経口投与製剤
本明細書では経口固体剤形の使用も意図しており、このものは、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するRemington's Pharmaceutical Sciences (1990), 第18版(Mack Publishing Co. Easton Pa.18042)の第89章に概説されている。  固体剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸薬、トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤またはペレットがある。  あるいは、プロテイノイドカプセル化(例えば、米国特許第4,925,673号に報告されたプロテイノイドミクロスフェア)や、リポソームカプセル化が用いることもでき、このリポソームは、必要に応じて種々のポリマーで誘導される(例えば、米国特許第5,013,556号)。  治療薬のための固体剤形の説明は、一般に、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するMarshall，K.，Modern Pharmaceutics (1979) G. S. Banker and C. T. Rhodes eds.の第10章に示されている。  一般に、この製剤は、本願発明の調製物と、胃内環境に対する保護効果があり、かつ、腸内での生物活性材料の放出を可能にする不活性成分とを含む。
【０２７３】
必要であれば、化合物は、経口送達が有効となるように化学的に修飾される。  一般に、企図している化学的修飾は、少なくとも一つの反応性部分が、化合物分子自体への付着を可能にする修飾であり、この部分が、(ａ)タンパク質分解の阻害、および(ｂ)胃または腸管からの血流中への取り込みを可能にする。  化合物の全体的な安定性の増加および体内での循環時間の増加も、所望されている。  このような反応性部分の例として、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンがある(Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp367〜383；Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4：185〜189 (1982))。  利用可能なその他のポリマーとして、ポリ-１,３-ジオキソランおよびポリ-１,３,６-チオキソカンがある。
【０２７４】
経口送達剤形について、治療化合物の吸収を増強する担体として、Ｎ-(８-[２-ヒドロキシベンゾイル]アミノ)カプリル酸ナトリウム(ＳＮＡＣ)のような修飾された脂肪族アミノ酸の塩を用いることも可能である。  ＳＮＡＣを用いるヘパリン製剤の臨床上の有用性は、Emisphere Technologiesによって実施された第二相試験において実証されている。  米国特許第5,792,451号、「Oral drug delivery composition and methods」を参照のこと。
【０２７５】
本願発明の調製物は、例えば、約１mmの粒径の粒子またはペレットの形態で、微細なマルチ粒子として製剤に含めることができる。  また、散剤と同様に、カプセル投与のための材料の製剤は、軽く圧縮した板状剤または錠剤でもよい。  組成物は、必要に応じて圧縮して調製される。
【０２７６】
着色剤および香料を含んでいてもよい。  例えば、調製物が処方され(例えば、リポソームまたはミクロスフェアカプセル化によって）、次いで、着色剤および香料を含む冷蔵飲料のような食品に加えることもできる。
【０２７７】
本願発明の調製物は、ある実施態様において、不活性材料で希釈または増量される。  希釈剤の例として、炭水化物、特にマンニトール、α-ラクトース、無水乳糖、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンがある。  三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む特定の無機塩類も、賦形剤として用いることができる。  Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellなどの市販の希釈剤も利用可能である。
【０２７８】
固体剤形組成物において、崩壊剤を含む調製物をさらに企図している。  崩壊剤として用いられる材料として、デンプン(デンプンを主成分とする市販の崩壊剤、Explotabを含む）、デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトなどがあるが、これらに限定されない。  崩壊剤のその他の形態として、不溶性の陽イオン交換樹脂がある。  粉末ゴムも、崩壊剤および結合剤として用いることができ、このようなものとして、寒天、カラヤまたはトラガカントゴムのような粉末ゴムがある。  アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
【０２７９】
結合剤を含む薬学的組成物に、治療薬をさらに結合させて硬質の錠剤を形成することも企図しており、結合剤の例として、アラビアゴム、トラガカントゴム、デンプンおよびゼラチンのような天然物からの材料がある。  その他の結合剤として、メチルセルロース(ＭＣ)、エチルセルロース(ＥＣ)およびカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)などがある。  ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ)は、そのいずれもが、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中で用いられる。
【０２８０】
薬学的組成物に減摩剤を用いることで、調製中の固着を防ぐことを、さらに企図している。  潤滑剤として、ステアリン酸とそのマグネシウム塩およびカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ)、流動パラフィン、植物油およびワックスがあるが、これらに限定されない。  ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス4000および6000のような可溶性潤滑剤も利用可能である。
【０２８１】
調製作業時の薬学的組成物の流動性を改善し、圧縮時の再構成を補助する流動促進剤も提供される。  流動促進剤の例として、デンプン、滑石、焼成シリカおよび水酸化ケイアルミン酸塩がある。
【０２８２】
水性環境中への組成物の溶解を補助するために、湿潤剤として界面活性剤を組み込むことも企図される。  界面活性剤の例として、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムのような陰イオン洗剤がある。  陽イオン性洗剤の例として、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含むものがあるが、これらに限定されない。  その他の実施態様において、界面活性剤として用いられる組成物として、ラウロマクロゴール400、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50および60、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート40、60、65および80、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースなどがある。  従って、これらの界面活性剤を、単独で、または種々の割合の混合物として取り込んでなる組成物も提供される。
【０２８３】
必要に応じて、化合物の取り込みを促すために、薬学的組成物に添加物を含ませることができ、このような添加物として、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸があるが、これらに限定されない。
【０２８４】
徐放性組成物
その他の実施態様において、徐放性製剤が提供される。  本願発明の調製物は、拡散機構または浸出機構のいずれかに従った放出を可能にする不活性マトリックス、例えば、ゴム内に取り込まれる。  緩慢に変性するマトリックス、例えば、アルギン酸塩、多糖類もまた、製剤に取り入れることができる。  徐放性のその他の形態として、Oros治療システム(Alza Corp.)による方法がある。  すなわち、浸透圧効果により水を侵入させ、次いで、単一の小開口部を介して押し出すことが可能な半透膜内に薬物は封入される。  いくつかの腸溶性コーティング層も、徐放効果を有する。
【０２８５】
例えば、コーティングパンに適用される様々な糖類を含むその他のコーティング剤も、本願発明の組成物において利用可能である。  また、組成物は、フィルムコーティングされた錠剤も含んでおり、その際に用いられる材料は、二つのグループに分類される。  第一のグループは、非腸溶性材料を含むものであり、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールなどがあるが、これらに限定されない。  第二のグループは、一般に、フタル酸のエステルである腸溶性材料からなるものである。
【０２８６】
また、最適なフィルムコーティングを提供するために、これら材料の混合物も企図している。  フィルムコーティングは、パンコーターまたは流動床の内部で行われるか、あるいは圧縮コーティングによって行われる。
【０２８７】
肺送達
本願発明の調製物の肺送達も、本明細書において企図している。  化合物は、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層を横断して血流に到達する。  肺送達は、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの各々の内容を援用するAdjei et al., Pharma. Res. (1990) 7：565-9；Adjei et al., (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63：135-44；Braquet et al., (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (補遺５)：s.143-146；Hubbard et al., (1989), Annals Int. Med. 3：206-12；Smith et al., (1989), J. Clin. Invest. 84：1145-6；Oswein et al., (1990年３月)、「Aerosolization of Proteins」，Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone，Colo.；Debs et al., (1988), J. Immunol. 140：3482-8およびPlatz et al., 米国特許第5,284,656号に記載されている。
【０２８８】
機械装置
治療薬の肺送達のために設計された様々な機械装置(噴霧器、計量式吸入器、および、粉末吸入器などがあるが、これらに限定されず、また、これらのいずれもが当業者に周知のものである)もまた、本願発明の実施のために企図している。  本願発明の実施に適した市販の装置の例として、ミズーリー州セントルイスに所在のMallinckrodt, Inc.製のウルトラベント噴霧器；コロラド州エングルウッドに所在のMarquest Medical Products製のAcorn II噴霧器；ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークに所在のGlaxo Inc.製のVentolin定量吸入器；およびマサチューセッツ州ベッドフォードに所在のFisons Corp.製のSpinhaler粉末吸入器がある。
【０２８９】
このような装置はいずれも、本願発明の調製物を投薬するのに適した製剤の使用を必要とする。  各製剤は、通常は、使用される装置の規格に適しており、治療に有用な希釈剤、補助剤および／または担体に加えて、適切な噴霧剤材料も使用できる。
【０２９０】
遠位にある肺への有効な送達のために、組成物は、その平均粒径が、ある実施態様では、１０μm(ミクロン)未満とし、また、その他の実施態様では、０.５〜５μmである微粒子形態に調製される。
【０２９１】
ジェット噴霧器または超音波噴霧器のいずれかでの使用に適した製剤は、通常は、溶液１ml当たり約０.１mg〜２５mgの生物活性タンパク質の濃度で水中に溶解された本願発明の化合物を含む。  また、この製剤は、(例えば、タンパク質安定化および浸透圧の調節のために)緩衝液および単糖を含むことができる。  また、噴霧器用製剤は、エアロゾルを形成する際に溶液の微粒化によって引き起こされるタンパク質の表面誘起凝集を減少させるか、あるいは防ぐために、界面活性剤を含ませることができる。
【０２９２】
定量吸入器装置で使用する製剤は、通常は、界面活性剤を用いて噴霧剤に懸濁された本願発明の化合物を含む細粉を含む。  噴霧剤には、この目的のために使用される任意の従来の材料、例えば、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１,１,１,２-テトラフルオロエタンを含む炭化水素、あるいはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。  適切な界面活性剤として、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンがある。  また、オレイン酸は、界面活性剤として有用である。
【０２９３】
粉末吸入器装置から投薬するための製剤は、本願発明の化合物を含む乾燥微粉を含み、そして、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールのような充填剤を、装置からの粉末の散布を促進する量、例えば、製剤の50〜90重量％で含んでいてもよい。
【０２９４】
経鼻送達
本願発明の調製物を、経鼻送達することも企図している。  経鼻送達により、治療薬を鼻に投与した後、この治療薬を、肺の中に沈着させずに、タンパク質が血流に直接移行することが可能になる。  経鼻送達のための製剤として、デキストランまたはシクロデキストランを含む製剤がある。  その他の粘膜を介した輸送による送達も企図している。
【０２９５】
口腔送達形態
本願発明の化合物を、口腔送達することも企図している。  ペプチドとともに使用される口腔送達製剤は、当該技術分野で周知である。
【０２９６】
担  体
薬学的に許容可能な担体として、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、およびソルビトールのような炭水化物がある。  製剤に用いられるその他の成分として、DPPC、DOPE、DSPCおよびDOPCがある。  天然または合成の界面活性剤を用いてもよい。  ＰＥＧを、(本願発明の化合物の誘導体での用途とは別に)用いてもよい。  シクロデキストランのようなデキストランを用いてもよい。  胆汁酸塩およびその他の関連するエンハンサーを用いてもよい。  セルロースおよびセルロース誘導体を用いてもよい。  アミノ酸を、緩衝液製剤での使用態様のようして用いてもよい。
【０２９７】
その他の製剤
リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接複合体、またはその他のタイプの担体の使用も企図している。
【０２９８】
投与用量
本明細書に記載の病態を処置する方法に関する投与計画は、薬物の作用を修飾する種々の因子、例えば、患者の年齢、状態、体重、性別、食事、任意の感染の重症度、投与の時間およびその他の臨床学的因子を考慮して、主治医によって決定される。  種々の態様において、日々の投与計画は、体重１キログラム当たりの調製物を、０.１μｇ〜１０００μｇ(化学的修飾が無い状態で、タンパク質単独の質量を計算して得た数値)または０.１〜１５０μｇ/ｋｇの範囲内で投与する。
【０２９９】
本願発明の調製物は、まず丸薬として投与され、次いで、治療時の製剤の血中濃度を維持するために持続的注入によって投与される。  その他の例として、本願発明の化合物は、一回限りの用量だけを投与してもよい。  適正な医療行為および個々の患者の臨床症状に基づいて決定される有効な用量および投与計画は、当業者であれば、容易に最適化できる。  投与頻度は、薬剤の薬物動態パラメータおよび投与経路による。  最適な薬学的製剤は、投与経路および所望の用量に応じて、当業者によって決定される。  例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 第18版(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)第1435〜1712頁を参照のこと。  このような製剤は、投与された薬剤の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、およびin vivoでの浄化速度に影響を及ぼす。  投与経路に応じて、適切な用量は、体重、体表面積または器官の大きさに基づいて決定される。  上記した各製剤を用いて処置する際の好適な用量を決定するための計算法は、とりわけ、本明細書に開示した投薬情報およびアッセイ、ならびに上記したヒト臨床試験において認められる薬物動態データを考慮することで、当業者であれば、過度の実験を経ずに改良することができる。  適切な用量は、薬剤の血中濃度を決定するために確立されたアッセイを、適切な用量反応データと併せて使用することで確認される。  最終的な投与計画は、薬物の作用を修飾する種々の因子、例えば、薬物の比活性、患者の損傷の重症度および応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、任意の感染の重症度、投与の時間ならびにその他の臨床学的因子を考慮して、主治医によって決定される。  研究が進むにつれて、種々の疾患および病態に適した用量レベルおよび処置時間に関する新たな情報が明らかになる。
【０３００】
また、本願発明の治療方法、組成物および化合物は、血小板欠乏症およびその他の症状を特徴とする疾患状態の処置において、単独で、またはその他のサイトカイン、可溶性ｃ-Ｍｐｌレセプター、造血因子、インターロイキン、成長因子もしくは抗体と組み合わせて使用してもよい。  本願発明の調製物は、ＩＬ-３またはＧＭ-ＣＳＦのような一般的な造血刺激因子と併用すると、血小板減少症のいくつかの症状を処置する上で有用である、と考えられる。  その他の巨核球刺激因子、すなわち、ｍｅｇ-ＣＳＦ、幹細胞刺激因子(ＳＣＦ)、白血病抑制因子(ＬＩＦ)、オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)、または巨核球刺激活性を有するその他の分子もまた、Ｍｐｌリガンドと共に用いることができる。  このような同時投与のためのサイトカインまたは造血因子として、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-11、コロニー刺激因子-１(ＣＳＦ-１）、Ｍ-ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ)、ＥＰＯ、インターフェロン-α(ＩＦＮ-α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-10、ＩＬ-12、ＩＬ-13、ＩＬ-14、ＩＬ-15、ＩＬ-16、ＩＬ-17、ＩＬ-18、トロンボポチエン(ＴＰＯ)、アンジオポイエチン、例えば、Ang-１、Ang-２、Ang-４、Ang-Ｙ、ヒトアンジオポイエチン様ポリペプチド、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質-１、骨形態形成タンパク質-２、骨形態形成タンパク質-３、骨形態形成タンパク質-４、骨形態形成タンパク質-５、骨形態形成タンパク質-６、骨形態形成タンパク質-７、骨形態形成タンパク質-８、骨形態形成タンパク質-９、骨形態形成タンパク質-10、骨形態形成タンパク質-11、骨形態形成タンパク質-12、骨形態形成タンパク質-13、骨形態形成タンパク質-14、骨形態形成タンパク質-15、骨形態形成タンパク質レセプターＩＡ、骨形態形成タンパク質レセプターＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子レセプター、サイトカイン誘導性好中球走化因子１、サイトカイン誘導性好中球、化学走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮細胞増殖因子、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子レセプターα１、グリア細胞株由来神経栄養因子レセプターα２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子レセプター、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子レセプター、インスリン様成長因子II、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子レセプターα、神経成長因子、神経成長因子レセプター、ニューロトロフィン-３、ニューロトロフィン-４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由���増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子レセプターα、血小板由来増殖因子レセプターβ、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞刺激因子レセプター、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２を含むＴＮＦ、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β、トランスフォーミング成長因子β１、トランスフォーミング成長因子β１.２、トランスフォーミング成長因子β２、トランスフォーミング成長因子β３、トランスフォーミング成長因子β５、潜在的トランスフォーミング成長因子β１、トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質II、トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質III、腫瘍壊死因子レセプターＩ型、腫瘍壊死因子レセプターII型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプター、血管内皮細胞増殖因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的または免疫学的に活性な断片などがある。  巨核球が一旦成熟形態に達すると、巨核球を血小板へと断片化させる作用を奏すると考えられる可溶性哺乳類ｃ-Ｍｐｌの有効量を、同時にまたは連続的に投与することは、有益であると考えられる。  従って、(成熟巨核球の数を増加させるために)本願発明の調製物を投与した後に、(リガンドを不活性化して、成熟巨核球が血小板を産生することを可能にするために)可溶性ｃ-Ｍｐｌを投与することが、血小板産生を刺激する上で、特に有効な手段であると考えられる。  上記した用量に調整して、これら成分をさらに治療用組成物に取り込む。  処置された患者の病状の経過は、従来の方法によってモニターされる。
【０３０１】
一般的な条件
本願発明の化合物は、目的のタンパク質のネイティブリガンドのアゴニスト、模倣物またはアンタゴニストとして、このような目的のタンパク質に結合する能力に起因する薬理学的活性を有する。  特定の化合物の有用性を、表２に示している。  これらの化合物の活性は、当該技術分野で周知のアッセイによって測定される。  ＴＰＯ模倣化合物についてのin vivoでのアッセイは、本明細書の実施例でも記載されている。
【０３０２】
治療用途に加えて、本願発明の化合物は、目的とする疾患関連タンパク質の機能障害を特徴とする疾患を診断する上でも有用である。  ある実施態様において、活性化可能な目的とするタンパク質(例えば、レセプター)を生物学的試料で検出する方法は、以下の工程、すなわち、(ａ)試料と本願発明の化合物とを接触させる工程；および、(ｂ)この化合物によって目的のタンパク質の活性化を検出する工程を含む。  生物学的試料としては、組織標本、無傷細胞、またはその抽出物がある。  本願発明の化合物は、生物学的試料での目的とする関連タンパク質の存在を検出するための診断キットの一部として用いることもできる。  このようなキットは、検出を可能にするために、標識を付せた本願発明の化合物を使用する。  これらの化合物は、目的とする正常タンパク質または異常タンパク質を同定する上で有用である。  ＥＰＯ模倣化合物に関して、例えば、生物学的試料に目的とする異常タンパク質が存在は、ＥＰＯレセプターが機能していないと考えられているダイアモンド・ブラックファン貧血のような障害での指標となる。
【０３０３】
ＥＰＯ模倣化合物の治療的使用
本願発明のＥＰＯ模倣化合物は、低レベルの赤血球を特徴とする障害を処置する上で有用である。  本願発明は、哺乳動物におけるＥＰＯレセプターの内因性活性を調節する方法、好ましくは、ＥＰＯレセプターの活性を増加させる方法を含む。  一般に、貧血のような、エリトロポイエチンによって処置可能な任意の病態も、本願発明のＥＰＯ模倣化合物によって処置される。  これらの化合物は、当業者によって確認される、処置される病態の性質および重症度に適した送達量および送達経路で投与される。  投与は、好ましくは、皮下、筋肉内、または静脈内のいずれかの注射による。
【０３０４】
ＴＰＯ模倣化合物の治療的使用
ＴＰＯ模倣化合物については、発明の名称が「Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation」であるWO95/26746に記載されているような標準アッセイを利用することができる。  In vivoアッセイは、以下の実施例にも記載している。
【０３０５】
処置される病態は、一般に、現存する巨核球/血小板欠乏または(例えば、予定された手術または血小板成分献血において)予期される巨核球/血小板欠乏に関与する状態である。      
【０３０６】
このような状態は、通常、in vivoでの活性Ｍｐｌリガンドの(一時的かまたは恒常的な)欠乏の結果である。  血小板欠乏を表現する総称は、血小板減少症である。  従って、本願発明の方法および組成物は一般に、これらを必要とする患者における血小板減少症を処置するために利用できる。
【０３０７】
血小板減少症は、化学療法および種々の薬物を用いるその他の治療、放射線療法、手術、事故による失血、およびその他の特定の疾患状態を含む、種々の原因で出現する。  血小板減少症に関与し、かつ、本願発明によって処置される特定の疾患状態の例として、再生不良性貧血、乳癌での合併症である特発性血小板減少性紫斑病を含む特発性または免疫性血小板減少(ＩＴＰ)；ＨＩＶ合併型ＩＴＰおよびＨＩＶ関連血栓性血小板減少性紫斑病；血小板減少症の起因となる転移性腫瘍、新生児エリテマトーデス症候群を含む全身性エリテマトーデス、巨脾腫症、ファンコーニ症候群、ビタミンＢ１２欠損、葉酸欠乏症、メイ-ヘグリン異常、ヴィスコット-オールドリッチ症候群、慢性肝疾患；血小板減少症に関連する骨髄異形成症候群；発作性夜間血色素尿症、Ｃ７Ｅ３ Ｆａｂ(アブシキシマブ)治療後の急性深在性血小板減少症；先天性同種免疫性血小板減少症を含む同種免疫性血小板減少症；抗リン脂質抗体に関連する血小板減少症および血栓症；自己免疫性血小板減少症；カルボプラチン誘導性血小板減少症、ヘパリン誘導性血小板減少症を含む薬物誘導性免疫性血小板減少症；胎児血小板減少症；妊娠性血小板減少症；ヒューズ症候群；ルポイド血小板減少症；不慮および／または大量の失血；骨髄増殖性障害；悪性腫瘍の患者における血小板減少症；癌患者において血栓性血小板減少性紫斑病/溶血性尿毒症症候群として発現する血栓性微小血管症を含む血栓性血小板減少性紫斑病；自己免疫性溶血性貧血；潜在性空腸憩室穿孔；赤芽球形成不全；自己免疫性血小板減少症；流行性腎症；リファンピシン関連急性腎不全；パリス-トルソー血小板減少症；新生児同種免疫性血小板減少；発作性夜間血色素尿症；胃癌における血液学的変化；小児溶血性尿毒症症候群；Ａ型肝炎ウイルスおよびＣＭＶに関連する血小板減少症を含む、ウイルス感染に関連する血液学的徴候などがある。  また、ＡＩＤＳに対する特定の処置(例えば、ＡＺＴ)は、血小板減少症を引き起こす。  また、特定の創傷治癒障害に関しては、血小板数の増加が有効である。
【０３０８】
本願発明のＴＰＯ模倣化合物は、血小板または血小板前駆体細胞の産生、あるいは、ｃ-Ｍｐｌレセプターの刺激が所望される任意の状況下で用いられる。  従って、例えば、本願発明の化合物は、血小板や巨核球などが必要な哺乳動物における任意の病態を処置するために用いられる。  このような病態の例が、本明細書の一部を構成するものとして、その各々の内容を援用するWO95/26746；WO95/21919；WO95/18858；WO95/21920に記載されている。
【０３０９】
また、本願発明のＴＰＯ模倣化合物は、血小板および／または巨核球ならびに関連する細胞の生存性または保存性を維持する上で有用な場合がある。  従って、このような細胞を含む組成物に、有効量の一つまたはそれ以上のこのような化合物を用いることは有用である。
【０３１０】
また、本願発明の治療方法、組成物および化合物は、血小板欠乏のみならず、その他の症状を特徴とする疾患状態の処置において、単独でも、あるいはその他のサイトカイン、可溶性Ｍｐｌレセプター、造血因子、インターロイキン、成長因子または抗体と組み合わせて用いてもよい。  本願発明の化合物を、ＩＬ-３またはＧＭ-ＣＳＦのような一般的な造血刺激因子と併用することは、血小板減少症の幾つかの症状を処置する上で有用であると考えられる。  また、その他の巨核球刺激因子、すなわち、ｍｅｇ-ＣＳＦ、幹細胞刺激因子(ＳＣＦ)、白血病抑制因子(ＬＩＦ)、オンコスタチンＭ(ＯＳＭ）、または巨核球刺激活性を有するその他の分子も、Ｍｐｌリガンドと共に用いることができる。  このような同時投与のためのサイトカインまたは造血因子として、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-１１、コロニー刺激因子-１(ＣＳＦ-１）、ＳＣＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン-α(ＩＦＮ-α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ-β、またはＩＦＮ-γなどがある。  有効量の可溶性哺乳類Ｍｐｌレセプター、すなわち、巨核球が一旦成熟段階に達すると巨核球を血小板へと断片化させる作用を有すると考えられているレセプターを、同時または連続して投与することは、さらに有効であると考えられる。  従って、(成熟巨核球の数を増加させるために)本願発明の化合物の投与した後に、（リガンドを不活性化して、成熟巨核球による血小板の産生を可能にするために)可溶性Ｍｐｌレセプターを投与することが、血小板産生を刺激する上で特に有効な手段であると予想される。  上記した用量を調整して、これら成分を治療組成物内に組み込む。  処置された患者の病状の経過は、従来の方法によってモニターすることができる。
【０３１１】
本願発明の化合物を、血小板および／または巨核球ならびに関連する細胞の組成物に添加する場合、そこに含まれる本願発明の化合物の量は、一般に、当該技術分野で周知の技術およびアッセイによって実験的に確認される。  本願発明の化合物の量は、例えば、細胞１０6個当たり０.１μｇ〜１ｍｇの範囲である。
【０３１２】
処置される病態は、一般に、現存する巨核球／血小板の欠乏または(例えば、予定された手術または血小板成分献血において)予期される巨核球／血小板の欠乏関与する状態である。  このような状態は、通常、in vivoでの活性トロンボポチエンの(一時的または恒常的な)欠乏の結果である。  血小板欠乏を表現する総称は、血小板減少症であり、本願発明の方法および組成物は一般に、これらを必要とする患者における血小板減少症を処置するために利用できる。
【０３１３】
予想される血小板欠乏(例えば、予定された手術において予想される血小板欠乏)については、本願発明の化合物を、血小板が必要とされる数日前から数時間前に投与することも可能である。  緊急の状況、例えば、不慮の大量失血などの場合には、本願発明の調製物または組成物は、必要に応じて、血液または精製血小板とともに投与される。
【０３１４】
本願発明のＴＰＯ模倣化合物は、巨核球以外の特定の細胞型がｃ-Ｍｐｌを発現することが明らかな場合に、このような細胞を刺激する上で有用である。  ｃ-Ｍｐｌを発現するこれら細胞に関連する病態は、本明細書に記載されている調製物または組成物が奏する刺激に対して応答性を示すものであり、本願発明の範囲内のものである。
【０３１５】
以下の実施例は、本願発明の限定を意図するものではなく、本願発明の特定の実施態様の単なる例示にすぎない。
【実施例】
【０３１６】
実施例１：発現構築物の調製
マウスＦｃ領域を含むＴＭＰ融合タンパク質(ｍＦｃ-ＴＭＰ)をコードするポリヌクレオチドを、(EP01124961A2の記載に従って）マウスＦｃおよびＴＭＰをコードする個別のヌクレオチド配列を組み合わせることによって構築した。  １回目のＰＣＲでは、マウスＦｃをコードする部分を、ＰＣＲプライマー３１５５-５８(配列番号：1022)および１３８８-００(配列番号：1023)を用いて増幅した。
【０３１７】
【化２８】
2008505928.tif 000106
別の反応において、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを、プライマー１２０９-８５(配列番号：1026)および３１５５-５９(配列番号：1027)を用いて増幅した。
【０３１８】
【化２９】
2008505928.tif 000107
得られたＰＣＲ断片をゲル精製し、プライマー１２０９-８５(配列番号：1030)および１３８８-００(配列番号：1031)を利用する２回目のＰＣＲ用の１本のチューブ内で合わせた。  この２回目の増幅によるＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素NdeIおよびＸhoIで消化した。  この消化断片を精製し、同じ酵素で予め消化されたベクターpAMG21に連結した。  この連結混合物を、エレクトロポレーションによって大腸菌Amgen 393株に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン培地上に平板培養した。  コロニーを、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって、スクリーニングした。  ｍＦｃ-ＴＭＰ融合タンパク質(配列番号：1033)をコードするヌクレオチド配列(配列番号：1032)を有する陽性クローンを同定し、６３９７と命名した。
【０３１９】
マウスＦｃ-ＴＭＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号：1034)
1 GATTTGATTC TAGATTTGTT TTAACTAATT AAAGGAGGAA TAACAT
オープンリーディングフレーム：
【０３２０】
【化３０】
2008505928.tif 000108
3'配列：
【０３２１】
【化３１】
2008505928.tif 000109
マウスＦｃ-ＴＭＰタンパク質配列(配列番号：1035)
【０３２２】
【化３２】
2008505928.tif 000110
実施例２：６３９７株の発酵
振盪フラスコに、６３９７株の種培養物と共に５００mlの滅菌ルリア培地を接種して、６３９７株の発酵を開始した。  ６００nmでの細胞密度が、０.９になり次第に、この内容物を、１０リットルの複合系成長培地(８００ｇのグリセロール、５００ｇのトリプチケース、３ｇのクエン酸ナトリウム、４０ｇのＫＨ2ＰＯ4、２０ｇの(ＮＨ4)2ＳＯ4、５mlのFluka Ｐ-2000消泡剤、１０mlの微量金属(塩化第二鉄２７.０ｇ/Ｌ、塩化亜鉛２.００ｇ/L、塩化コバルト２.００ｇ/Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２.００ｇ/Ｌ、塩化カルシウム１.００ｇ/Ｌ、硫酸銅１.９０ｇ/Ｌ、ホウ酸０.５０ｇ/Ｌ、塩化マンガン１.６０ｇ/Ｌ、クエン酸ナトリウム二水和物７３.５ｇ/Ｌ）、１０mlのビタミン(ビオチン０.０６０ｇ/Ｌ、葉酸０.０４０ｇ/Ｌ、リボフラビン０.４２ｇ/Ｌ、ピリドキシンHCl １.４０ｇ/Ｌ、ナイアシン６.１０ｇ/Ｌ、パントテン酸５.４０ｇ/Ｌ、水酸化ナトリウム５.３０ml/Ｌ)に、水を添加して１０リットルにしたもの)を入れた１５リットルの発酵槽に接種した。      
【０３２３】
発酵槽は、溶存酸素レベルを最低限３０％飽和に維持しつつ、３７℃およびｐＨ７に維持した。  ６００nmでの細胞密度が、ＯＤ単位で１３.１になり次第に、０.５mg/mlのＮ-(３-オキソ-ヘキサノイル)ホモセリンラクトンの１０mlを添加して、培養物を誘導した。      
【０３２４】
誘導して６時間後に、培地を１０℃にまで冷却し、５℃で、４５５０ｇで、６０分間遠心分離して細胞を収集した。  次いで、細胞ペーストを、−８０℃で保存した。
【０３２５】
実施例３：タンパク質のリフォールディング
ｍＦｃ-ＴＭＰを発現する６３９７株由来の大腸菌ペースト(３００ｇ)を、２２５０mlの溶解緩衝液(５０mMトリス塩酸、５mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０)に溶解し、冷却マイクロフルイダイザーに２回、１３,０００ＰＳＩで通した。  次いで、ホモジェネートを、４℃で、１１,３００ｇで、６０分間遠心分離した。  上清を捨て、ペレットを、組織グラインダーを用いて、２４００mlの水に再懸濁した。  次いで、ホモジェネートを、４℃で、１１,３００ｇで、６０分間遠心分離した。  上清を捨て、ペレットを、組織グラインダーを用いて２００ml容量の水に再懸濁した。  ホモジェネートを、２７,２００ｇで、３０分間、４℃で、遠心分離し、上清を捨てた。  ペレットの約１２.５％を、３５mgのニワトリ卵白リゾチーム(Sigma、セントルイス、ミズーリー州)を含む２８mlの２０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)に、組織グラインダーを用いて再懸濁し、３７℃で、２０分間インキュベートした。  インキュベーションの後、懸濁液を、２２℃で、２７,２００ｇで、３０分間遠心分離し、上清を捨てた。  ペレットを、３５mlの８Ｍグアニジン塩酸、５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)に再懸濁し、その後、３５０μlの１Ｍ ＤＴＴ(Sigma、セントルイス、ミズーリー州)を添加して、物質を、３７℃で、３０分間インキュベートした。  次いで、溶液を、２２℃で、２７,２００ｇで、３０分間遠心分離した。  次いで、上清を、３.５リットルのリフォールディング緩衝液(５０mMトリス塩基、１６０mMアルギニン塩酸、３Ｍ尿素、２０％グリセロール(ｐＨ９.５）、１mMシステイン、１mMシスタミン塩酸)に、４℃で、穏やかに攪拌しながら１ml/分で移した。
【０３２６】
実施例４：構築物の精製
穏やかに攪拌しながら、４℃で、約４０時間インキュベーションした後、実施例３に記載のリフォールディング溶液を、３０kDaカートリッジ(Satorius、ゲッティンゲン、ドイツ)を用いたタンジェンシャルフロー限外濾過装置を使用して５００μlに濃縮し、続いて、３リットルのＱ-緩衝液Ａ(２０mMトリス塩酸、ｐＨ８.０)に対してダイアフィルトレーションを行った。  濃縮物を、ワットマン ＧＦ/Ａフィルターに通して濾過し、８６mLのＱ-セファロールファストフロウカラム(直径２.６cm)(Amersham Biosciences、ピスカタウエイ、ニュージャージー州)に、１５ml/分で加えた。  樹脂を数カラム容量のＱ-緩衝液Ａで洗浄した後、タンパク質を、Ｑ-緩衝液Ｂ(２０mMトリス塩酸、１Ｍ NaCl、ｐＨ８.０)の６０％に対する２０カラム容量の直線勾配を用いて、１０ml/分で溶出した。  ピーク画分をプールし、このプールを、１ml/分でムスタングＥシリンジフィルター(Pall Corporation、イーストヒルズ、ニューヨーク州)に通した。  この濾過物を、２回目は、０.２２μmの酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、−８０℃で保存した。
【０３２７】
実施例５：タンパク質のＰＥＧ化
２０mM ＮａＣＮＢＨ3を含む１００mM酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ５)でのｍＦｃ-ＴＭＰ(３.５ml、０.８mg/ml)を冷却し(４℃)、攪拌した溶液に、３.８倍モル過剰のメトキシポリエチレングリコールアルデヒド(ＭＰＥＧ)(平均分子量、２０kDa)(Nektar)を添加した。  反応混合物の撹拌を、同じ温度下で、継続した。  反応時のタンパク質修飾の程度を、Superose ６ HR 10/30カラム(Amersham Biosciences)を用いて、０.１５M ＮａＣｌを含む０.０５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)で０.４ml/分で溶出したＳＥＣ ＨＰＬＣによってモニターした。  １６時間後、ＳＥＣ ＨＰＬＣ分析によって、大部分のタンパク質がＭＰＥＧに共役していたことが示された。  この時、反応混合物を、２０mMトリス/塩酸緩衝液(ｐＨ８.１２)に緩衝液交換した。  ＭＰＥＧ-ｍＦｃ-ＡＭＰ２共役体を、２０mMトリス/塩酸緩衝液(ｐＨ８.１２)で平衡化した１mlのハイトラップＨＰ Ｑカラム(Amersham Biosciences)を用いたイオン交換クロマトグラフィーで単離した。  反応混合物を流速０.５ml/分でカラムに加えて、未反応のＭＰＥＧアルデヒドを、３カラム容量の開始緩衝液で溶出した。  ０.５Ｍ NaClを含む２０mMトリス/塩酸緩衝液(ｐＨ８.１２)の０％〜１００％の２０カラム容量の直線勾配を用いて、タンパク質-ポリマー共役体を溶出した。  イオン交換クロマトグラフィー分離を行っている間に回収した画分(２ml)を、上記のようにＨＰＬＣ ＳＥＣで分析した。  モノ-およびジ-ＭＰＥＧ-ｍＦｃ-ＴＭＰ共役体を、（ＳＥＣ ＨＰＬＣで決定された)２.３〜１の近似比率で含む画分を濃縮し、滅菌濾過した。
【０３２８】
実施例６：In vivo試験
ＢＤＦ１マウス(Charles River Laboratories、ウィルミントン、マサチューセッツ州)を１０グループに分け、次いで、０日目、21日目、および42日目に、希釈剤(ダルベッコの０.１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ)または動物１kg当たり５０μｇの(上記した)試験用モノ-およびジ-ＭＰＥＧ-ｍＦｃ-ＴＭＰ共役タンパク質を含む希釈剤のいずれかを注射した。  各グループをさらに半分に分割して、一連の測定時点(０、３、５、７、10、12、14、19、24、26、28、31、33、40、45、47、49、52および59日目)に関して、互い違いの時点に、眼窩洞から採血(140μl)をした。  59日目に、採血前に、マウスをイソフルランで麻酔した。  採取した血液を、マウスソフトウェアを内蔵したＡＤＶＩＡ １２０自動血液分析装置(Bayer Diagnostics、ニューヨーク、ニューヨーク州)を用いて、全数および百分率数について分析した。
【０３２９】
その結果、０、21および41日目に、モノ-およびジ-ＭMＰＥＧ-ｍＦｃ-ＴＭＰ共役体を投与することで、その後の血小板レベルが、投与ごとに本質的に同程度で増大していたことが示された。  図１を参照のこと。  これに対して、同じ日(すなわち、０、21および41日目)にｍＦｃ-ＴＭＰ(ＰＥＧ部分を欠いている)を投与しても、血小板のレベルは増大するものの、21日目の投与後の増加は、０日目の投与後の増加よりも有意に低く(すなわち、減衰しており)、41日目の投与後の増加は、21日目の投与後に観察された増加よりも低かった(すなわち、さらに減衰していた）。  全体として、これらの結果は、ＷＳＰ(例えば、ＰＥＧ)部分を含むように修飾されたＦｃ-ＴＭＰは、反復投与された場合に、血小板産生の減退を招かないことを示すものにほかならない。
【０３３０】
本願発明を実施する上で好ましい形態を含むことが明白で、または、そうすることを提案している特定の実施態様に沿って本願発明の説明を行ってきた。  本明細書での開示を考慮すれば、当業者であれば、本願発明の趣旨を逸脱せずに、これまでに説明してきた実施態様に対して、多くの修正や変更を加えることが可能であることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【０３３１】
【図１】本願発明のＰＥＧ-Ｆｃ-ＴＭＰを用いた反復投与におけるin vivoでの血小板産生の増大を示す図であって、図中、ＰＥＧ-Ｆｃ-ＴＭＰを用いた結果は、三角印(▲)で示し、Ｆｃ-ＴＭＰを用いた結果は、丸印(●)で示してある。  四角印(■)は、コントロールを表している。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008505928.tif 000121
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