(57)【要約】本発明では、ＨＣＶに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を効果的に誘導し、ＨＣＶのポリプロテインの保存領域に由来したスーパータイプのエピトープ、前記スーパータイプのエピトープをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター、前記スーパータイプのエピトープまたは前記発現ベクターを含むワクチン組成物及びＣ型肝炎の治療のためのその用途を提供する。本発明のスーパータイプのエピトープは多様なＨＬＡ分子に結合して抗原特異的免疫反応を誘導することができるため、多様な対象に適用することができ、Ｃ型肝炎ウイルスによるＣ型肝炎の治療剤及びこれに係る肝疾患に対するワクチン開発のための強力で、且つ、効果的な道具として用いられることができる。また、ＨＣＶスーパータイプのエピトープをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター及びこれを含むＤＮＡワクチンは肝炎及びこれに係る疾患に対する抑制された免疫反応に対して、強力且つ効果的な手段として用いられる。
2008505636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多様なＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂスーパータイプと反応することによって、細胞媒介性免疫反応を誘導するＨＣＶスーパータイプのエピトープ。
【請求項２】
前記エピトープがＨＣＶのポリプロテイン（polyprotein）の保存的配列からなる請求項１に記載のＨＣＶスーパータイプのエピトープ。
【請求項３】
前記保存的配列が配列番号１〜１６のアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項２に記載のＨＣＶスーパータイプのエピトープ。
【請求項４】
前記請求項１のスーパータイプのエピトープを含むワクチン組成物。
【請求項５】
補因子(cofactors)を更に含む請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記補因子がＣＤ４０ＬＴ、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１５、ＦＬＴ−３Ｌ、Ｂ７−１、Ｂ７−２及び熱ショックタンパク質（Heat shock protein）からなる群から選ばれる請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記請求項１のスーパータイプのエピトープを投与する段階を含む、Ｃ型肝炎またはそのウイルスによって罹る肝疾患の予防及び治療方法。
【請求項８】
前記請求項１に記載のＨＣＶスーパータイプのエピトープをコードするオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１７〜３２に示されるヌクレオチド配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を有する請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記請求項８のオリゴヌクレオチドを含むワクチン組成物。
【請求項１１】
前記請求項８のオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む、Ｃ型肝炎またはそのウイルスによって罹る肝疾患の予防及び治療方法。
【請求項１２】
前記請求項８のオリゴヌクレオチドを含む真核細胞発現ベクター。
【請求項１３】
補因子をコードする遺伝子を更に含む請求項１２に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項１４】
前記補因子がＣＤ４０ＬＴ、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１５、ＦＬＴ−３Ｌ、Ｂ７−１、Ｂ７−２及び熱ショックタンパク質からなる群から選ばれる請求項１３に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項１５】
前記請求項１２の発現ベクターを含むワクチン組成物。
【請求項１６】
前記請求項１２の発現ベクターを投与する段階を含む、Ｃ型肝炎またはそのウイルスによって罹る肝疾患の予防及び治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞免疫性反応を効果的に誘導するＨＣＶのスーパータイプのエピトープ及びその用途に関する。より詳しくは、ＨＣＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic 
T lymphocytes、CTL）によって媒介される免疫反応を効率的に誘導し、ＨＣＶのポリプロテイン(polyprotein)の保存領域に由来したスーパータイプ (supertype) のエピトープ、それをコード化するオリゴヌクレオチド、及びＣ型肝炎の治療及び予防のためのそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス(hepatitis C virus、HCV)は、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌の主要原因である。ＨＣＶに感染した患者の大半が慢性肝炎にかかり、これらは大体致命的な肝硬変や肝癌に発展する。全世界人口の３％以上、約１億７千万名がＨＣＶに感染していると推定されている(Miller and Purcell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2057-2061, 2000)。ＨＣＶ感染患者に対する従来の治療法はインターフェロン−α(interferon-α)あるいはリバビリン(ribavirin)を投与することである。しかし、インターフェロンの投与に対して効果的な患者の割合は約５０％程度であり、これらの患者のうち５０％はＣ型肝炎ウイルスが再発すると報告されている(Hino et al., J. Med. Virol. 42(3):299-305, 1994;Tsubota et al.,Hepatology. 19(5):1088-94、1994)。しかもインターフェロンは高価で入院治療が要求されるという短所がある。また、リバビリンは核酸誘導体であって、急性肝炎患者の場合は４０〜７０％程度有効であるが、ＨＣＶ感染による慢性肝炎患者には有効でない。
【０００３】
これまで、ＨＣＶまたはＨＣＶ感染による慢性肝疾患に有効な治療法はまだ開発されていないため、ＨＣＶ特異的抗ウイルス剤の開発が強く求められている。
【０００４】
ＨＣＶは非Ａ、非Ｂ型肝炎を引き起こすフラビ・ウイルス科（Flaviviridae）に属するウイルスである。ＨＣＶゲノムは約３,０１０個のアミノ酸からなるポリプロテイン（polyprotein）を発現する一本鎖ＲＮＡで構成されている(Choo et al., Science, 244:359-362, 1989)。ＨＣＶによって発現されるポリプロテインは宿主細胞とウイルスのプロテアーゼとによって相異する機能を有する１０個のタンパク質に切断される。ＨＣＶはNH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOHの一連のタンパク質に相当する遺伝子から構成されている（Steven Rosenberg, J. Mol. Biol., 313:451-464,2001)。前記タンパク質は、Ｃ（Ｃｏｒｅ）、Ｅ１、Ｅ２及びｐ７を含む構造タンパク質と、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂを含む非構造タンパク質とに分けられる。
【０００５】
ＨＣＶのコア（Ｃ）タンパク質は、ＨＣＶゲノムＲＮＡを取り巻く構造的役割を果し、また宿主細胞の遺伝子転写、成長及び増殖を調節することにより肝癌への進展に寄与すると思われている。Ｅ１及びＥ２タンパク質はタイプ１膜貫通タンパク質であって、細胞感染に深く関与しているウイルスエンベロープタンパク質である。Ｅ１タンパク質は抗体の無力化を誘導できなかったために、あまり注目されなかった。しかし、最近ベルギーのInnogenetics社でＥ１タンパク質を治療用ワクチンとして開発し、チンパンジーを用いたこのワクチンの第１次臨床試験が成功的であったため、第２次臨床試験が行われている。Ｅ１タンパク質がアルファインターフェロンによっては非効果的である１ｂタイプのＨＣＶ感染にも有効であるということは有用な発現である。Ｅ２タンパク質はウイルスの主要外膜(envelope)タンパク質の一種であって、細胞受容体と推定されるＣＤ８１と結合し、宿主の免疫システム及びインターフェロン媒介抗ウイルス反応からの回避を可能にし、腫瘍発生(oncogenesis)あるいは自己免疫肝疾患(autoimmune liver disease)を引き起こす。従って、Ｅ２はＨＣＶワクチン開発のための重要な抗原だけでなく、抗ＨＣＶ薬剤開発のためにも主な標的である。Ｐ７タンパク質の機能はまだ知られていない。ＮＳ２タンパク質は金属プロテアーゼ(metallo-protease)の一部であり、ＮＳ３はウイルスのセリンプロテアーゼドメインをＮ−末端に、ＲＮＡヘリカーゼ(helicase)ドメインをＣ−末端に有している。ＮＳ４Ａはウイルスプロテアーゼの補助因子(cofactor)であり、ＮＳ４Ｂは潜在的な腫瘍発生能を有することが本研究チームによって明らかになった。ＮＳ５ＡはＨＣＶに抗インターフェロン性を与える機能及び抗アポトーシス(antiapoptotic)機能を有する。ＮＳ５ＢはウイルスのＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼとして機能する。ＮＳ２〜ＮＳ５Ｂを含む非構造タンパク質はウイルス複製を阻害する抗ウイルス剤の開発において主な標的になっている。
【０００６】
一方、細胞傷害性Ｔリンパ球(cytotoxic T lymphocytes, CTL)は感染された患者からウイルスを除去するための重要な役割を果たす。ＨＢＶに感染すると急性肝炎に進行するが、急性Ｂ型肝炎患者の大部分は強力な多クローン性ＣＴＬ反応の誘導によって自然に治る。一方、慢性Ｂ型患者においてはＣＴＬ反応が起きない。
【０００７】
持続的な慢性感染でもＨＣＶ感染患者の肝及び末梢血内において、ウイルス特異的ＣＴＬ反応が起きると知られているが、このようなＣＴＬ反応はウイルスを効果的に除去するにはかなり低い水準である。それにもかかわらず、ウイルス力価（ｔｉｔｅｒ）を分析してみると、ＨＣＶ特異的ＣＴＬ反応がＨＣＶ感染を調節することができ、ＨＣＶ特異的ＣＴＬ反応を増幅させることにより効果的な抗ウイルス治療方法が開発可能であると思われる。
【０００８】
ＣＴＬ反応を誘導するエピトープ(epitope)に基づいたワクチンは、疾病の予防及び治療に有効な細胞性免疫反応を誘導することができる。抗原特異的エピトープあるいはこれをコードするＤＮＡ構造体を用いたワクチンは既存のワクチンよりもより多くのメリットがある。第一に安全である、第二に全ウイルスまたはタンパク質抗原自体の使用に起因する突然変異による免疫反応の低下可能性はほとんどなく、第三に生産が容易であり、最後に病原体の多重抗原から由来したエピトープをワクチン組成物に含ませて多価ワクチンを作ることが可能である。
【０００９】
しかし、ＨＬＡ(human leukocyte antigen)に結合するエピトープの多様性及びＨＬＡそのものの多型性(polymorphism)のため、前述したエピトープを用いたワクチン及び／または治療法の使用は制限されている。現在までウイルスの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応に関する研究は大体ＨＬＡ−Ａ２陽性である患者に対して行われ、その分析もＨＬＡ−Ａ２から発見されるウイルスエピトープに限られた。
【００１０】
細胞媒介性免疫反応を誘導するためにエピトープペプチドは抗原提示細胞(antigen presentings cell, APC)の表面上に主要組織適合性複合体(major histocompatibility complex, MHC)と複合体を形成したまま露出していなければならない。このようなＭＨＣ−ペプチド複合体の構造をＴ細胞表面のＴ細胞受容体(T cell receptor, TCR)が認識してから初めてＴ細胞内部へ抗原認識に関する情報が伝達される。Ｔ細胞は抗原提示細胞の表面でＣＤ４０のリガンドであるＣＤ４０ＬとＣＤ４０との結合によって活性化される。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌを介した信号伝逹は順次に抗原提示細胞に刺激を与えることでＢ７−１、Ｂ７−２等の共刺激分子（co-stimulatory molecule)を発現させる。その結果、Ｔ細胞もＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ２５等の活性分子を有するエフェクターＴ細胞(effector T cell)として機能するようになる。
【００１１】
慢性肝炎患者の場合いくつかの免疫抑制が報告された。細胞媒介性免疫反応を促進することで知られている共刺激分子（co-stimulatory molecule)の発現が減少し、抗原提示細胞として知られている樹状細胞が未熟であり、ナチュラルキラー細胞(natural killer cell)の機能及び個数が減少する。従って、このような共刺激分子（co-stimulatory molecule)の投与によって細胞性免疫機能を高める方法を開発する方が効果的であるかもしれない。
【００１２】
本発明者らは、樹状細胞の成熟を誘導すると知られているＣＤ４０Ｌの三量体(trimer)形態であるＣＤ４０ＬＴ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を増加させて記憶Ｔ細胞(memory T cell)の機能を高める４−１ＢＢＬ、ＨＣＶ患者に特に欠けている樹状細胞の成熟を誘導し、ナチュラルキラー細胞の機能を促進させるＩＬ−１５及びＦＬＴ−３Ｌ、エピトープ抗原を認識するに当たって重要な役割を果たすＢ７−１及びＢ７−２、並びにエピトープ提示過程を改善させる熱ショックタンパク質(Heat shock protein, HSP)のような補因子を用いることにより細胞性免疫機能を増大させようとした。
【００１３】
抗原としてペプチドを利用する方法は全タンパク抗原を利用するよりも非常に安全で且つ効果的であるが、ここにはいくつかの制限がある。すなわち、ペプチドの合成及び精製費用が高く、特殊な抗原輸送機構が求められる。外因性ペプチド抗原は腫瘍抗原またはウイルス抗原のような内因性抗原からエピトープの発生過程全体を反映することができない。これらの抗原性はペプチドの物理的な性質によって左右される。一方、ＤＮＡ抗原はペプチド抗原に比べて低コストであり、取り扱いが容易であり、特に抗原提示機構がなくても細胞内エピトープの発生、腫瘍抗原またはウイルス抗原の提示並びに認識過程を反映するというなどのメリットを有する。エピトープ抗原をオリゴヌクレオチド形態で真核細胞発現ベクターに挿入することで十分な細胞性免疫反応が誘導できるということは既に立証された(Cara C Wilson et al. J. Immunol., 171:5611-5623, 2003)。
【００１４】
さらに、本発明者らは、前記免疫治療に基づいてエピトープの限界を克服し、ＨＣＶ特異的ＣＴＬ反応を誘導するために、モチーフ（ｍｏｔｉｆ）検索でＨＣＶのポリプロテインの保存領域からスーパータイプのエピトープを考案し、前記スーパータイプのエピトープがＨＬＡ−Ａ２型だけでなく他の種類のＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ型にも結合して抗原特異的免疫反応を誘導することができることを確認した。また、本発明者らは前記スーパータイプのエピトープをコードするオリゴヌクレオチドを真核細胞発現ベクターに挿入することによってＤＮＡワクチンを生産した。本発明者らは前記ＤＮＡワクチンがエピトープ抗原異的細胞媒介性免疫反応を増加させることを確認し、本発明を完成するに至った。
【非特許文献１】Miller and Purcell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2057-2061, 2000
【非特許文献２】Hino et al., J. Med. Virol. 42(3):299-305, 1994;Tsubota et                al.,Hepatology. 19(5):1088-94、1994)
【非特許文献３】Choo et al., Science, 244:359-362, 1989
【非特許文献４】Steven Rosenberg, J. Mol. Biol., 313:451-464, 2001
【非特許文献５】Cara C Wilson et al. J. Immunol., 171:5611-5623, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、ＨＣＶのポリプロテインの保存領域から由来し、多様なＨＬＡ型に対してＨＣＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球(cytotoxic T lymphocytes、CTL)によって媒介される細胞免疫反応を誘導するスーパータイプのエピトープを提供することである。本発明の他の目的は、前記スーパータイプのエピトープをコードする発現ベクターを用いてＣ型肝炎及び他の肝疾患の予防及び治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
用語
ここで、本発明で用いられる用語の定義は下記の通りである。
エピトープ(epitope)：抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に結合する特定領域を意味する。抗原決定基(antigenic determinant)とも呼ばれる。
【００１７】
スーパータイプのエピトープ(supertype epitope)：ＨＬＡサブタイプにかかわらず広範囲な免疫反応を誘導する、すなわちＨＬＡサブタイプに特異的なエピトープではないエピトープを意味する。
【００１８】
末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC)：末梢血単核細胞とは一つの核を有する血流内の細胞を指し、例えば、リンパ球やマクロファージがここに含まれる。
【００１９】
ＥＬＩＳＰＯＴ法：ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)に基づく免疫学的分析法である。しかし、両者には相違点がある。ＥＬＩＳＡはタンパク質に対する抗体を用いてタンパク質を定量する方法であるが、これに対し、ＥＬＩＰＳＯＴは、サイトカイン特異的抗体でコーティングされたニトロセルロースウェルで細胞を培養し、細胞から分泌されたウェルの底面のサイトカインを染色した後、細胞から分泌されたサイトカインスポット（ｓｐｏｔ）の数を測定することによってサイトカインを分泌する細胞の数を測定する方法である。ＥＬＩＳＰＯＴ法は主に免疫化された動物から得られた脾臓細胞の試料で活性化された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の量を測定するために用いられる。
【００２０】
樹状細胞(dendritic cell)：特徴的に神経細胞のような樹状突起を有し、Ｔ細胞に抗原を効果的に輸送する専門的な抗原提示細胞である。肌で発見されるランゲルハンス細胞及びリンパ節の組職で発見される樹状顆粒細胞がこれに含まれる。
【００２１】
抗原提示細胞(antigen-presenting cell、APC)：外来抗原を提示する細胞である。これらは先天免疫 (innate immunity)及び適応免疫 (adaptive immunity)を仲介する。抗原提示は抗原提示細胞のＭＨＣ分子によって行われる。ＡＰＣの種類にはマクロファージ(macrophage)、Ｂ細胞(B cell)、樹状細胞(dendritic cell)、ケラチノサイト(keratinocyte)などがある。
【００２２】
ＦＡＣＳ(flouroscent activated cell sorting):フローサイトメトリー(flow cytometry)とも呼ばれる。蛍光物質で標識した細胞を通しながら表光蛍光の強度を測定する方法であって、特定波長の蛍光を放出する細胞の数を正確に測定できる分析方法であり、これによって全細胞のうち特定細胞の割合を正確に測定することができる。
【００２３】
細胞内サイトカインの染色法(intracellular cytokines staining, ICS)：特定の刺激に対する反応時、Ｔ細胞のサイトカイン生産能の分析方法である。通常のサイトカイン分泌経路が遮られ、サイトカインの細胞内蓄積が細胞内染色及びＦＡＣＳ分析によって測定される。
【００２４】
プロテアソーム(proteasome)：ＡＴＰ反応によってタンパク質を短いポリペプチド及びアミノ酸に切断できるポリプロテイン複合体であって、内部にタンパク質を切断のために取り込む空間である空洞(cavity)と、両末端に標的タンパク質の導入のための入口とを有する。
【００２５】
抗原プロセッシング関連輸送タンパク(transporter associated with antigen processing;TAP)：プロテアソームで切断した抗原ペプチドをサイトゾルからＥＲへ移動させる膜貫通タンパク質である。抗原ペプチドはＴＡＰによってＥＲに移動した後、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する。
【００２６】
ＴＡＰツール(TAP tool)：ＴＡＰに係る過程を予測するための道具である。具体的には、特定抗原の処理結果及びそれから導出されるエピトープの配列の予測に用いられる道具である。ＴＡＰツールは統計学的分析によるアルゴリズムによって、コンピューターソフトウェアで具現され、広義ではＴＡＰ結合予測道具、プロテアソームによるプロセッシング予測道具及びＥＲ内のアミノペプチダーゼ によるフィニッシング(finishing)に対する予測道具を含み、狭義では、プロテアソームの関連過程の予測道具を意味する。本発明における前記道具はプロテアソームの関連過程の予測道具及びＴＡＰ結合予測道具を意味する。
【００２７】
免疫学的有効量(immunologically effective amount)：免疫学的有効量とはＨＣＶに対する細胞媒介性免疫反応を誘導する量を意味する。具体的には、患者からＨＣＶ感染が撲滅できるか、又は、敏感性個体(sensitive individual)にとってＨＣＶ感染を予防できる量である。
【００２８】
発明の概要
本発明の上記目的を達成するために、本発明は、多様なＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂスーパータイプと反応することにより細胞媒介性免疫反応を誘導するＨＣＶスーパータイプのエピトープを提供する。
【００２９】
また本発明は、Ｃ型肝炎の予防および治療のためのＨＣＶペプチドエピトープの使用を提供する。
【００３０】
さらに本発明は、有効量のスーパータイプのエピトープを患者に投与する工程を含む、ＨＣＶ感染患者の治療方法あるいはＨＣＶ感染の予防方法を提供する。
【００３１】
本発明は、ＨＣＶエピトープをコードするオリゴヌクレオチド配列および該配列を含む発現ベクターも提供する。
【００３２】
本発明は、Ｃ型肝炎の予防および治療のための、ＨＣＶエピトープをコードするオリゴヌクレオチドを発現する発現ベクターの使用も提供する。
【００３３】
本発明は、免疫学的に有効量の上記発現ベクターを投与する工程を含む、ＨＣＶ感染患者の治療方法あるいはＨＣＶ感染の予防方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
発明の詳細な記載
これより本発明を詳細に説明する
本発明によれば、多様なＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂスーパータイプと反応することにより細胞媒介性免疫反応を誘導するＨＣＶスーパータイプのエピトープを提供する。
【００３５】
本発明はまた、配列番号１〜１６のＨＣＶスーパータイプのエピトープを提供する。
【００３６】
本発明はまた、配列番号１７〜３２に示される前記ＨＣＶスーパータイプのエピトープをコードする遺伝子を提供する。
【００３７】
さらに本発明は、前記遺伝子を含むＤＮＡ発現ベクターを提供する。
【００３８】
本発明者らは既存のエピトープ系の免疫治療の限界を乗り越え、ＨＣＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫反応を誘導するために、モチーブ(motif)検索によってＨＣＶのポリプロテイン(polyprotein)の保存領域からスーパータイプのエピトープを製造した。商業的に利用可能で、且つ、広範囲な人々に適用できるワクチンを開発するためには、多様な多型性ＨＬＡ対立遺伝子に結合可能なスーパータイプのエピトープの使用が必須である。
【００３９】
広範囲な効果のあるエピトープを用いる免疫治療剤の開発における最大の障害要因はＨＬＡ分子の多型性(polymorphism)である。エピトープが有用な免疫治療剤として用いられるためには、様々な種類のＨＬＡ分子と特異的に結合するか、あるいは、多様な人種集団に対して効果を奏しなければならない。これまで免疫治療剤の開発のために多数のエピトープを用いなければならなかったが、このような問題を解決するために、本発明者らは、エピトープ原ワクチンの開発に有用な多重ＨＬＡ抗原分子に結合するスーパータイプのエピトープを開発した。エピトープを用いたワクチンが種々のＨＬＡ分子に結合すれば、ワクチンの効果はより広くて高くなる。本発明のスーパータイプのエピトープは多様なＨＬＡ分子と結合できることにより、大体の標的集団で完全な免疫反応を誘導する。
【００４０】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が一般的にＭＨＣと結合した短い８〜１１個アミノ酸からなる短いペプチドを認識するという点で、本発明のスーパータイプのエピトープはＨＣＶに対する細胞媒介性免疫反応を増幅することのできる９個のアミノ酸からなる、配列番号１〜１６に示される１６個のエピトープで構成される。
【００４１】
本発明のスーパータイプのエピトープは、ＨＣＶのポリプロテイン(polyprotein)の保存領域から由来し、Ａ１、Ａ２、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３等のＨＬＡ−Ａ分子及び、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５１等のＨＬＡ−Ｂ分子に対して高い結合能を有する。
【００４２】
なお、本発明の配列番号１〜１６に示されるスーパータイプのエピトープは配列番号１７〜３２に示される遺伝子配列によってコードされる。
【００４３】
また、本発明のスーパータイプのエピトープはＥＬＩＳＰＯＴ分析法によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で細胞傷害性Ｔ細胞の免疫反応を誘導することが確認された。
【００４４】
一般に、活性化されたＴ細胞は、精巧な調節システムによってＩＬ（インターロイキン）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を含む多数のサイトカインを分泌する。特異的抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球の反応に関する最近の研究はＥＬＩＳＰＯＴ分析法(enzyme-linked immunosorbent spot assay)を用いて行われているが、この技術は単一細胞レベルでサイトカインの分泌を分析する方法であって、敏感性(sensitivity)及び特異性(specificity)の面において最も認められている方法の一つである。本発明ではサイトカインＩＦＮ−γの分泌を促進する細胞媒介性免疫を調査するＥＬＩＳＰＯＴ分析法をペプチド特異的Ｔ細胞性免疫反応を調査するのに利用した。
【００４５】
本発明では、サイトカインＩＦＮ−γの分泌を促進するペプチド特異的Ｔ細胞媒介性免疫反応を調査するために、本発明のスーパータイプのエピトープを用いてＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。具体的には、健康な対照群から抽出した２ｘ１０５個のＰＢＭＣの分析を行った。その結果、陽性反応の平均値は１２であった。本発明者らは前記平均値１２の２倍の標準偏差を勘案し、陽性反応を示す下限値(cutting value)を３０と規定した（図１参照）。
【００４６】
ＨＣＶに対するＣＴＬ活性化実験を通じてエピトープによってＣＴＬ反応が誘導されることが確認され、これはＣＴＬ媒介性免疫反応がエピトープによっても誘導され得ることを示す。ＥＬＩＳＰＯＴ分析において、活性化の程度は一般的にエピトープを処理しなかった対照群の値を差し引くことによって算出する。しかし、患者によって対照群の値が相異するため、活性化された免疫反応の前記算出法は不正確な場合もある。本発明者らはエピトープによって誘導されるＣＴＬ媒介性免疫反応をより正確に測定するために、個別的にエピトープで処理した場合の値からエピトープで処理しなかった値を差し引くことにより活性化の程度を測定した。ＨＣＶ患者の活性化の程度を健康な人の活性化の程度と比較した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行い、免疫反応の活性化に対する更なる測定のために結果値を対照群として用いた(Heiner Wedemeyer et al., J. Immunol.169;3447-3458,2002)。すなわち、前記対照群の平均値を求め、平均値の２倍の標準偏差を勘案した上、陽性反応を示す下限値(cutting value)を決めた。
【００４７】
実験に参加したＨＣＶ感染患者数は９９人であった。前記算出法によって５４人の患者が本発明のスーパータイプのエピトープの少なくとも一つに対して、陽性反応を示した（図１参照）。
【００４８】
即ち、本発明の配列番号１〜１６に示されるスーパータイプのエピトープは多様なＭＨＣと結合して多様な患者群から免疫反応を誘導することができ、誘導された免疫反応はＨＣＶ感染患者の治療に非常に有用である。
【００４９】
また、本発明は、Ｃ型肝炎を予防及び治療に利用するＨＣＶスーパータイプのエピトープの用途を提供する。
【００５０】
本発明は、配列番号１〜１６に示されるスーパータイプのエピトープからなる群から選ばれる一つ以上のスーパータイプのエピトープを含むワクチン組成物を提供する。
【００５１】
本発明のスーパータイプのエピトープは、ＤＮＡワクチン、治療タンパク質、組み換えウイルスワクチン及び樹状細胞(dendritic cells)と結合して、適切な免疫反応を効果的に誘導することで、ウイルスによるＣ型肝炎及び他の肝疾患の治療剤の開発に効果的に用いることができる。
【００５２】
下記表１は全患者に対し、本発明の１６個のスーパータイプのエピトープワクチンによって誘導される陽性免疫反応の割合を示す。
【表１】
2008505636.tif 000003
【００５３】
９９人の患者を１６個のエピトープを用いて治療した結果、ＨＬＡ−Ａ２型の患者の場合は２３.２６％、ＨＬＡ−Ａ２４型の患者の場合は２０.０％、ＨＬＡ−Ａ２６型の患者の場合は６.２５％、ＨＬＡ−Ａ３型の患者の場合は１９.３５％が陽性反応を示した。ＨＬＡ−Ｂ型の患者のうち、ＨＬＡ−Ｂ７型の患者の場合は２０.５４％、ＨＬＡ−Ｂ１５型の患者の場合は２２.２％、ＨＬＡ−Ｂ２７型の患者の場合は９.９７％、ＨＬＡ−Ｂ４４型の患者の場合は２０.１％、Ｂ５１型の患者の場合は３５.６％が陽性反応を示した。前記結果は本発明の各スーパータイプのエピトープが多様なＨＬＡ型の他の患者群から前記の割合（％）で陽性免疫反応を誘導することができることを示す。
【００５４】
また、前記結果は本発明のスーパータイプのエピトープが多様なＨＬＡ型を有する患者からＨＣＶ特異的な細胞性免疫を誘導することができるため、ＨＬＡ−Ａ２にのみ限られたエピトープを用いることで排除された他の種類のＨＬＡ型の治療にも用いられることを示している。
【００５５】
本発明のスーパータイプのエピトープは、複数のコピーを含むホモポリマーまたは多様なペプチドのヘテロポリマーとしてワクチン組成物に個別的に含まれ得る。このポリマーは免疫反応を増加させて病原体の抗原決定基または免疫反応に係る標的エピトープに対するＣＴＬ反応を誘導する。前記ワクチン組成物は抗原の天然発生領域から製造されるか、組み換えまたは化学的合成によって製造することができる。また、本発明によるワクチン組成物は補因子(cofactor)を更に含むことができる。前記補因子は特に制限されないが、樹状細胞の成熟を促進すると知られているＣＤ４０Ｌの三量体(trimer)形態であるＣＤ４０ＬＴ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の個数を増加させ、特に記憶Ｔ細胞の機能を向上させると知られている４−１ＢＢＬ、ＨＣＶ患者に特に欠けている樹状細胞の成熟及びナチュラルキラー細胞の機能を増進させるＩＬ−１５及びＦＬＴ−３Ｌ、エピトープ抗原を認識するにあたって重要な役割を果たすＢ７−１及びＢ７−２、並びにエピトープ提示を促進させるＨＳＰ(heat shock protein)が好ましい。
【００５６】
本発明のワクチンとともに用いられ得る担体の例としては、通常の担体、例えばサイログロブリン、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、及びポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｌ-グルタミン酸のようなポリアミノ酸などが挙げられる。ワクチンは水や食塩水のように生理学的に許容可能な希釈剤を含み、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水を更に含むことができる。また、通常的にワクチンはフロイント不完全アジュバント、リン酸アルミニウム 、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのような通常的なアジュバント(adjuvant)を含む。
【００５７】
本発明によるエピトープワクチン組成物は皮内、表皮、皮下、腹腔内または筋肉内注射、経口投与または鼻腔接種などの様々な経路を通じて投与されることにより、大量の抗原特異的ＣＴＬを生成する。その後、宿主は感染及び慢性感染への進展が抑制できる免疫反応を示すようになる。
【００５８】
また、本発明のワクチンはエピトープ担体として樹状細胞（ＤＣ）を含む。まず、樹状細胞は本発明のエピトープをコードするＤＮＡトランスフェクション(transfection)させるか、各エピトープペプチドでパルス処理する。その後、生体内免疫反応を誘導するために抗原の内在された樹状細胞を患者に投与する。
【００５９】
また、ＤＮＡあるいはペプチドを含むワクチン組成物の投与によって樹状細胞の生体内負荷(loading)が可能である。
【００６０】
本発明のワクチン組成物はＩＦＮ−γなどのような免疫調節物質あるいは慢性ウイルス感染に用いられる他の治療剤と組み合わせて用いることができる。
【００６１】
さらに、本発明のスーパータイプのエピトープをコードするオリゴヌクレオチドを含む本発明のワクチンは、抗原誘導細胞媒介性免疫反応を提供することができる。抗原がオリゴヌクレオチド形態である場合には、細胞内で合成されたポリペプチドは本発明によるエピトープの形態で処理されなければならない。細胞質内で合成されたポリペプチドはプロテアーゼ複合体であるプロテアソーム(proteosome)によって８〜１１個のアミノ酸からなる小ペプチドに切られる。これらが主要組織適合性複合体に担持されて細胞表面に露出されることによって、エピトープとしての役割を果たすようになる。少なくとも一つ以上のエピトープがオリゴヌクレオチドを介して生体内で合成される際、適当な細胞内プロセシングのためにアミノ酸をコードする一つ以上のコドンを５′末端に挿入することができる。適切に切断できるか否かは下記ウェブサイトにより提供される予測プログラムを用いて予測可能である：
NetChop:http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/
ParProc:http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html
FragPredict:http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/expertquery.html.
【００６２】
一つ以上のエピトープをコードするオリゴヌクレオチドは真核細胞発現ベクターに挿入し、細胞内で抗原として用いられ得る。遺伝子を発現するためのベクターとしてはよく周知の真核細胞発現ベクターを使用でき、プロモーターとしては周知のＣＭＶプロモーター、Ｐｆｆ−１αプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターなどを使用できる。エピトープを含む発現ベクターを動物に注射した時、各エピトープに対する個別的な免疫反応が成功的に誘導されることは既に立証されている(Cara C. Wilson et al., J.Immunol., 171;5611-5623, 2003)。
【００６３】
また、本発明の発現ベクターには前記補因子をコードする遺伝子を更に含むことができる。前記補因子は樹状細胞の成熟を促進すると知られているＣＤ４０Ｌの三量体(trimer)形態であるＣＤ４０ＬＴ、ＣＤ８＋Ｔの細胞数を増加させ、特に記憶Ｔ細胞の機能を亢進させると知られている４−１ＢＢＬ、ＨＣＶ患者に特に欠けている樹状細胞の成熟及びナチュラルキラー細胞の機能を向上させるＩＬ−１５及びＦＬＴ−３Ｌ、エピトープ抗原を認識するにあたって重要な役割を果たすＢ７−１及びＢ７−２、及びエピトープ提示を促進させるＨＳＰ(heat shock protein)であることが好ましい。前記補因子をコードする遺伝子は前記スーパータイプのエピトープをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター内に挿入することができ、別途の発現ベクターを介しての同時接種も(co-vaccination)可能である。
【００６４】
本発明のワクチンの免疫学的有効量を患者に投与することができる。具体的に、前記ワクチンは患者一人当たりに１回以上の投与が可能であり、単回投与量は好ましくはスーパータイプのエピトープの含有量が１〜２５０μｇであり、より好ましくは５〜５０μｇである。一方、本発明のスーパータイプのエピトープがこれをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターとして投与される場合、好ましくはエピトープの含有量が１００ｎｇ〜１００μｇであり、より好ましくは１〜５０μｇが有効量として含まれる。
【００６５】
ベストモード
以下の実施例に示されるように、本発明の好ましい実施態様を説明する。
しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲において変更および改良を行うことができる。
【実施例１】
【００６６】
細胞媒介性免疫反応を促進するＨＣＶのスーパータイプのエピトープの製造
本発明者らは細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が一般にＭＨＣと結合した８〜１１個のアミノ酸からなる短ペプチドを認識するという点に基づいて、ＨＣＶに対する細胞媒介性免疫反応が促進できるそれぞれ９個のアミノ酸からなる１６個のペプチドを用いてスーパータイプのエピトープを製造した。
【００６７】
具体的に、周知のＭＨＣ結合モチーブに基づいて、ＨＣＶのポリプロテイン(polyprotein)の保存的領域から由来し、Ａ１、Ａ２、Ａ２４、Ａ２６及びＡ３の５種類のＨＬＡ−Ａ分子、及びＢ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４４及びＢ５１の６種類のＨＬＡ−Ｂ分子に対して特に高い結合力を示す、配列番号１〜１６の１６個のエピトープを製造した。Ｐｅｐｔｒｏｎ社(Peptron Inc., 韓国)が合成した前記各ペプチドのアミノ酸配列はＨＣＶ１ａ及びｂサブタイプ内の配列と一致した。これらの合成されたペプチドは各々逆相ＨＰＬＣによって９５％まで精製し、１００％のＤＭＳＯに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、その溶液を細胞培養のために更にＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍｇ／ｍｌまでに希釈した。
【００６８】
また、本発明者らは前記ＨＣＶペプチドエピトープをコードする配列番号１７〜３２に示される遺伝子配列を調査して確認した。
【実施例２】
【００６９】
ＨＣＶ患者における多様なＭＨＣタイプに対するスーパータイプのエピトープの結合能
抗原を提供する細胞表面のＨＬＡ分子とペプチドとの結合はＴ細胞活性のために必須的である。従って、前記実施例１で製造した１６個のペプチドが実際に多様なＭＨＣと結合して免疫反応を誘導することができるか否かを確認するために、ヨンセー医療院(Yonsei University Medical Center, ソウル, 韓国)のＨＣＶに感染された患者９９人を対象として実験を行った。これらの患者の抗ＨＣＶ抗体を含むセロコンバージョン(seroconversion)はＨＣＶ ＥＬＩＳＡテストシステムによって確認され、ＨＣＶ ＲＮＡの存在をＲＴ−ＰＣＲで確認した。その結果、感染患者のＡＬＴ(alanine aminotransferase)活性が６倍もより高く、他の原因によって慢性肝疾患を患う可能性のある患者を排除した。対照群としてはＨＣＶあるいはＨＢＶに感染していない８人の健康な人から採取した血液を用いた。すべての実験群及び対照群のＨＬＡクラスＩタイピングはＳＳＰ ＨＬＡ ＤＮＡタイピングトレイ(One Lambda社製)を用いて行われた。
【００７０】
ＨＣＶ患者から血液を採取して末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cells、PBMC)をFicoll-Histopaque密度勾配遠心分離法(Sigma, St. Louis, Mo)で分離し、分離された細胞をＨＢＳＳ(Life technologies社製、Grand Island, NY)で３回洗浄した後、直ちに実験に用いるか、９０％ＦＣＳ(Life technologies社製)と１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）とを添加して液体窒素タンク内に保管した。
【００７１】
前記ＨＣＶ患者の末梢血単核細胞を用いて本発明のスーパータイプのエピトープとＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ分子との結合を調査、その結果を表２に示した。
【表２】
2008505636.tif 000004
【００７２】
エピトープとＨＬＡ分子との結合を測定するために、最近多用されているＭＨＣ安定化分析法(stabilization assay)を用いた。具体的に、エピトープとＨＬＡ−Ａとの結合を調査するために、２７℃で１２時間以上本発明のスーパータイプのエピトープをＴ２及びＲＭＡ−ｓ細胞株で処理した結果、ＭＨＣ分子とエピトープとの結合が安定化した。その後、３７℃で３時間の間さらに反応させた結果、本発明のスーパータイプのエピトープで処理された実験群が対照群に比べてより安定なエピトープとＭＨＣ分子との結合を示した。しかし、エピトープが添加されていない場合、または結合力の弱いエピトープで処理した場合は、ＭＨＣ分子との結合が容易に消滅した。また、エピトープとＭＨＣ分子との完全な複合体を認識する抗体を用いてＦＡＣＳ(fluorescent activated cell sorting)分析を行った結果、高い結合能を有する本発明のエピトープがＨＬＡ分子との結合によって免疫反応を誘導すると判断された。
【００７３】
本発明のスーパータイプのエピトープはＡ１、Ａ２、Ａ２４、Ａ２６及びＡ３の５種類のＨＬＡ−Ａ分子及び、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４４及びＢ５１の６種類のＨＬＡ−Ｂ分子に対して高い免疫誘導能を有するものを選別して製造した。しかし、ＨＣＶ患者９９人のＭＨＣ型を分析した結果Ａ１またはＢ８型を有する患者は存在しなかった。９種類のＭＨＣ型の中で配列番号１のＬ１は７個、配列番号２のＬ２は８個、配列番号３のＬ４は６個、配列番号４のＬ６は７個、配列番号５のＬ７は８個、配列番号６のＬ８は８個、配列番号７のＬ１０は７個、配列番号８のＣ１は６個、配列番号９のＣ２は７個、配列番号１０のＣ３は７個、配列番号１１のＣ４は７個、配列番号１２のＣ５は７個、配列番号１３のＣ７は７個、配列番号１４のＣ８は８個、配列番号１５のＣ９は８個、そして配列番号１６のＣ１０は８個のＭＨＣ型でそれぞれ陽性反応を示した。患者一人に少なくとも２個〜４個の異なるＨＬＡ型が存在し得るという事実を考慮するとき、生体内(in vivo)で発生する多様なＨＬＡ型に対するスーパータイプのエピトープの反応頻度は、一つのＭＨＣ型に対して反応するエピトープの頻度に比べて遥かに高い。
【００７４】
前記実験結果は本発明のスーパータイプのエピトープが多様なタイプのＭＨＣと結合することができるため、多様なＨＣＶ感染患者内で細胞媒介性免疫反応を誘導することができることを示す。
【実施例３】
【００７５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析方法によるＴ細胞の免疫反応の調査
一般的に、活性化されたＴ細胞は精密制御システムにより多様なサイトカインの分泌を誘導する。特異的抗原に対するＣＴＬ反応は、酵素結合免疫スポット(enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT)法でモニターするが、この方法は単一細胞レベルにおいて生産されるサイトカインの測定において最も敏感で且つ特異的な方法である。本発明ではペプチド特異的Ｔ細胞免疫反応を調査するに効果的なサイトカインインターフェロンガンマ−γ(interferon-γ, IFN-γ)の分泌を促進する細胞免疫を測定するためにＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いた。
【００７６】
具体的に、前記実施例２と同様な方法で分離して格納したＰＢＭＣを解凍し、Ｒ−１０培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）で３７℃で一晩中常温処理した。また、９６ウェルニトロセルロースプレート(Millipore社製, USA)の表面に５μｇ／ｍｌのヒト組み換え抗ＩＦＮ−γ抗体(BD pharmingen)をロードし、ＰＢＳ(phosphate-buffered saline)内で４℃で一晩中常温処理した。ＰＢＳでプレートを洗浄し、各ウェルに５％のＦＣＳが含まれたＰＢＳを加えて常温で２時間放置してブロッキングした。本発明のスーパータイプのエピトープの最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにＲ−１０培地で希釈した後、各ウェルに１００μｌずつ添加した。ＰＢＭＣはＲ−１０培地で２ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍｌに再懸濁して各ウェルに１００μｌずつ分株した。３７℃で２４時間プレートを常温処理し０.０５％のトゥイーン２０を含むＰＢＳで洗浄した。各ウェルにヒトＩＦＮ−γ(BD Pharmingen)に特異的なビオチンが結合されたｍＡｂを３μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌずつ添加し、プレートを常温で２時間放置させた。前記プレートをさらに洗浄し、ストレプトアビジン −ペルオキシダーゼ複合体(Streptavidin-peroxidase complex, Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を添加し、常温で放置した。反応終了後、ＡＥＣ(3-amino-9-ethyl carbazole)基質溶液を用いて着色を誘導させた。適当なサイズのスポット(spot)が観察された後、水道水を用いて着色反応を終了させた。常温で９６ウェルプレートを乾燥した後、顕微鏡でＩＦＮ−γを分泌する細胞数を測定した。前記プレートを一晩中乾燥した後、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー(AID)で細胞数を測定した。ペプチド特異的なＩＦＮ−γのスポット（ｓｐｏｔ）の数はその合計から対照群のＩＦＮ−γのスポット（ｓｐｏｔ）の数を差し引いて決定した。各実験は３回行った。
【００７７】
前記サイトカインＩＦＮ−γを促進するペプチド特異的Ｔ細胞活性化に対するＥＬＩＳＰＯＴ分析結果、健康な人を対象とした対照群では反応を示した平均値が１２であった。本発明者らは前記平均値１２の２倍の標準偏差を勘案した上、このように計算された３０を陽性反応を示す下限値(cutting value)として規定した（図１）。例えば、２ｘ１０５個のＰＢＭＣでＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った時、３０個以上のＳＦＣｓ(spot producing cells)を示す結果のみを陽性と見なした。
【００７８】
図１に示すように、テストした総患者数は９９名であり、全患者のうち５４名が本発明のスーパータイプのエピトープの少なくとも一つに対して陽性反応を示した。図１Ａは正常対照群において各スーパータイプのエピトープに対する反応を示したグラフであり、図１Ｂは患者７９名が各エピトープタイプに対する陽性免疫反応を示したグラフである。
【実施例４】
【００７９】
ＰＢＭＣのＩＣＳ(intracellular cytokine staining)分析方法を用いた記憶Ｔ細胞(memory T cell)の免疫反応の調査
一般的にウイルス性疾患を患う慢性患者の血液内に存在する活性Ｔ細胞の活性度を測定するのは難しい。そのため、本発明のスーパータイプのエピトープが患者の血液内で記憶Ｔ細胞(memory T cell)の反応を誘導できるか否かは非常に重要な問題である。従って、本発明者らは本発明のスーパータイプのエピトープに対する記憶Ｔ細胞の活性を測定した。
【００８０】
具体的には、前記実施例２と同様な方法で分離して格納したＰＢＭＣを解凍し、Ｒ−１０培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて３７℃で再懸濁した。９６ウェルプレート(Millipore社製)に５×１０５ｃｅｌｌ／１００μｌの濃度になるように細胞を分株した。本発明のスーパータイプのエピトープの最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるようにＲ−１０培地で希釈した後、各ウェルに１００μｌずつ分株し、各ウェルごとに組み換えされたＩＬ−１５(recombinant human IL-15, R&D)を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。プレートを３７℃で５日間常温処理した後、ＩＦＮ−γを細胞内に封入するために最後の６時間は分泌抑制剤(Golgi-Stop, BD Pharmingen)で処理し、さらにスーパータイプのエピトープを添加して培養した。細胞を収集してから、特異的で且つＦＩＴＣ(Fluorescence Isothiocyanate)が結合されたヒトＣＤ８抗体を、１％ＦＢＳ(Gibco社製)を含むＰＢＳで１００倍に希釈して４℃で３０分間反応させた。反応終了後の細胞を前記緩衝液で洗浄し、ホルムアルデヒド(formaldehyde)を含む固定液(Cytofix/Cytoperm, BD Pharmingen)で４℃で３０分間固定し、洗浄用緩衝液(Perm/Washbuffer, BD Pharmingen)で２回洗浄した。ヒトＩＦＮ−γ(BD Pharmingen)に特異的で且つＲ−ＰＥ(R-pycoerythrin)が結合されたモノクローナル抗体を２００倍希釈して各ウェルに１００μｌずつ添加し、４℃で３０分間懸濁させた。反応終了後、得られた細胞をさらに洗浄し、フローサイトメーター(FACS caliber, Becton Dnckinson社製)を用いて３万個の細胞を測定し、ソフトウェア(CellQuest, Becton Dnckinson社製)を用いて分析した。対照群としては従来用いられたペプチドを用いて正常人の血液からの記憶ＣＴＬ反応を調査した（図２）。
【００８１】
図２に示すように、前記記憶Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を促進するペプチド特異的Ｔ細胞活性化に対するＩＣＳ分析結果、対照群のＣＤ８＋細胞のうちＩＦＮ−γを分泌する細胞が平均０.４７％であり、本発明者らは前記平均値（０.４７％）の２倍の標準偏差を勘案して陽性反応を示す下限値(cutting value)を１％に決めた。
【００８２】
前記結果から、本発明のスーパータイプのエピトープは従来のＨＣＶ特異的エピトープよりも更に効果的に記憶Ｔ細胞を活性化させ得ることを確認した。
【実施例５】
【００８３】
スーパータイプのエピトープをコードする発現ベクターの作製
プロセッシング順序を決めるために、スーパータイプのエピトープのオリゴヌクレオチド配列である配列番号１７〜３２のうち１０個の配列をプロテアソーム(ParProc: http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html)及びＴＡＰツール(TAPPred, http://www.imtech.res.in/raghava/tappred/)を用いて選別した。このようにして決定したプロセッシング順序を図３に示す。本発明者らは、図３に示すように細胞内で前記エピトープが切断されるように、５′末端に２個のアミノ酸をコードするコドンを挿入した。前記決定された抗原配列順にＰＴＤＳ(PCR-based Two-steps DNA synthesis)方法でオリゴヌクレオチドを合成した。この時、図３に示した手順に沿って１０個のオリゴヌクレオチド（配列番号３３〜４２）を合成した後、第１正方向のオリゴヌクレオチド（配列番号３３）と第５逆方向のオリゴヌクレオチド（配列番号４２）を各々４０ｐｍｏｌｅ、及び残り８個のオリゴヌクレオチド（配列番号３４〜４１）１ｐｍｏｌｅを混合した後、ＭｇＳＯ４（２ｍＭ）、ｄＮＴＰ（各０.２ｍＭ）、１０ｘＰＣＲ緩衝液（１ｘ）、白金Ｔａｇポリメラーゼ(Gibco-BRL)２Ｕを添加してＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃で２分間予備変性させた後、更に９４℃で１５秒間変性、５０℃で３０秒間アニーリング(annealing)、６８℃で１分間重合する段階を２９回繰り返し、最後の伸長反応は６８℃で５分間行った。ＰＣＲ産物は４℃で保管した。得られた二本鎖のＰＣＲ産物１μｌは配列番号３３の第１正方向プライマーと配列番号４２の第５逆方向プライマーとからなるプライマーセットと共に２次ＰＣＲに用いられ、具体的には４０ｐｍｏｌｅの各プライマーを１次ＰＣＲと同様に、ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰ、白金Ｔａｇポリメラーゼと混合した。２次ＰＣＲは９４℃で２分間予備変性させた後、更に９４℃で１５秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング(annealing)、６８℃で１分間重合する段階を２４回繰り返し、最終の伸長反応は６８℃で５分間行い、得られたＰＣＲ産物は４℃で保管した。ＤＮＡ配列分析を通じて最終ＰＣＲ産物が図３に示されている配列（配列番号４３）を有することを確認した。前記ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３.１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ発現ベクターにクローニングした。下記表３は合成に用いられたオリゴヌクレオチドの配列を整理したものである。
【表３】
2008505636.tif 000005
【００８４】
慢性肝炎患者において細胞媒介性免疫反応によって感染したウイルスを殺すのは非常に難しい。このような慢性肝炎患者においては細胞性免疫反応を促進することで知られている補因子の発現が非常に低く、これは抗原提示細胞として知られている樹状細胞が未成熟である原因の一つである。また、このような患者にはナチュラルキラー細胞(natural killer cell)の数も少なく、その細胞機能が抑制されている。そのため、補因子をコードする遺伝子を共にトランスフェクションして細胞媒介性免疫機能を高めようとする研究が試みされてきた。従って、本発明では樹状細胞の成熟を促進すると知られているＣＤ４０Ｌの三量体(trimer)形態であるＣＤ４０ＬＴ、ＣＤ８＋Ｔ細胞数を増加させ、特に記憶Ｔ細胞の機能を高めると知られている４−１ＢＢＬ、ＨＣＶ患者に特に欠けている樹状細胞の成熟及びナチュラルキラー細胞の機能を増強させるＩＬ−１５及びＦＬＴ−３Ｌ、エピトープ抗原を認識するにあたって重要な役割を果たすＢ７−１及びＢ７−２、並びにエピトープ提示を促進させるＨＳＰ(heat shock protein)分子を補因子として用いた。また、前記補因子をコードする遺伝子と前記合成されたＤＮＡ断片とをそれぞれ真核細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３.１に挿入し、その結果得られた産物を大量生産して精製した上、実験に用いた（図３参照）。このような補因子のクローニングのためにマウス樹状細胞及びマウス脾細胞(splenocyte)からＲＮＡを分離し、これを鋳型としてプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲを行った。具体的には、前記ＰＣＲは各４０ｐｍｏｌｅの正方向プライマーと逆方向プライマー、ｃＤＮＡ２μｇ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４２μｌ（最終濃度２ｍＭ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ（それぞれ０.２ｍＭ）、及び５Ｕ／μｌ白金Ｔａｇポリメラーゼ０.４μｌ（２Ｕ）を混ぜて、最終体積を５０μｌにした。ＰＣＲは、９４℃で２分間予備変性させた後、更に９４℃で１５秒間変性、表４に示されている温度で３０秒間アニーリング(annealing)、６８℃で１分間重合する段階を２９回繰り返し、最終の伸長反応は６８℃で５分間行った。得られたＰＣＲ産物は４℃で保管した。
【表４】
2008505636.tif 000006
【００８５】
ＣＤ４０Ｌ三量体は４回連続ＰＣＲを通じてクローニングした。表５に示されたように、全体ＣＤ４０ＬをｐｃＤＮＡ３.１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ発現ベクターにクローニングし、これを細胞外ドメイン(extracellular domain)にあたるアミノ酸１１１〜２６０のクローニングのための２次ＰＣＲにおける鋳型として用いた。三量体を作るためにＩＬ−７リーダー配列(leader sequence)とロイシンジッパーモチーフ(leucine zipper motif)とを有する配列を３次ＰＣＲを行ってクローニングした後、２次ＰＣＲ産物と３次ＰＣＲ産物とを結合するために４次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は前記補因子のクローニング条件と同様で、プライマーの濃度及びアニーリングの温度は用いた一対のプライマーを考慮して調整した。ＰＣＲ産物はｐｃＤＮＡ３.１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ発現ベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析を通じて塩基配列を確認した。
【表５】
2008505636.tif 000007
【表６】
2008505636.tif 000008
【実施例６】
【００８６】
エピトープをコードするＤＮＡが導入された樹状細胞を用いたＴ細胞の免疫反応の調査
生体内でＴ細胞が外来抗原を認識するにあたっては抗原提示細胞(antigen presenting cell, APC)の役割が非常に重要である。抗原提示細胞として働く細胞には、Ｂ細胞、マクロファージ(macrophage)、樹状細胞(dendritic cell)などがある。特に、樹状細胞は最も代表的なＡＰＣである。本発明では、試験管内で成熟させた樹状細胞を作った。エピトープ発現ベクターを大膓菌（E. coli）で増幅した後、エンドトキシンフリーキット(endotoxin free kit, Qiagene)を用いて精製してから、１μｇ／μｌとなるように濃度を調節して実験に用いた。
【００８７】
電磁ビーズ(magnetic beads)を用いてウイルス感染患者の血液からＣＤ１４陽性単核細胞(monocyte)を分離し、分離された単核細胞を１×１０６細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに加えて、ヒト組み換えＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）とヒト組み換えＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加して３７℃で８日間培養した。３日目に細胞培養液の５０％をサイトカインと共に置換し、６日目にはサイトカインを含む単球ならし培地(monocyte conditioned medium)を加えて樹状細胞の成熟を誘導した。８日目に細胞の一部を採取し、成熟樹状細胞の細胞表現型(CD14-, CD80+, CD86+, CD83+, CD1a+, Class Ihigh, ClassIIhigh)を確認した上で実験に用いた。
【００８８】
遺伝子導入(gene transfection)に用いられるエピトープ発現ベクターは分光光度計（spectrophotometer)によってＡ２６０／Ａ２８０の比率が１.６以上の高純度であることを確認した。１ｘ１０６個の細胞に４μｇの発現ベクターをエレクトロポレーター(electroporator, NucleofectorTM, Amaxa社製)を用いてトランスフェクションし、収率は共に導入された緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（green fluorescence protein)を発現する細胞数の測定によって６０％以上であることを確認した。
【００８９】
エピトープ発現ベクターによってトランスフェクションされた樹状細胞と、同一患者のＰＢＭＣとを１：１０の比率で混ぜて３７℃で培養してから５日後に細胞を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析法を用いてＴ細胞の免疫活性を測定した（図４）。ＤＮＡがポリペプチドの形態で細胞質内で発現されれば、ＴＡＰによって単一エピトープペプチドに切断され、抗原提示細胞(Antigen presenting cell)は各エピトープペプチドを認識するようになる。そのため、各個別エピトープを提示する標的細胞は、全ＤＮＡによって体外免疫(in vitro vaccination)された血液によっても各エピトープによる免疫活性を測定するのに非常に有用である。
【実施例７】
【００９０】
動物モデルにおける共刺激分子による免疫増大効果の確認
共刺激分子を本発明のスーパータイプのエピトープとともに動物に導入した時、細胞媒介性免疫反応が増加するか否かを確認するために、ＨＬＡ−Ａ２.１遺伝子導入マウスを用いてＤＮＡ免疫を行った。前記実施例５で製造したスーパータイプのエピトープ発現ベクター及び補因子発現ベクターをＰＢＳで１μｇ／μｌの濃度に再懸濁し、５０：５０の割合で混合した。免疫効果の増大のため、８週齢のマウスの前脛骨筋(tibialis anterior)に１０ｕＭ／１００μｌの心臓毒性(cardiotoxin)を注射し、２日後に前記スーパータイプのエピトープ発現ベクターと補因子発現ベクターとを５０：５０の比率で混合して製造したＤＮＡ混合物を同じ部位に１００μｇずつ注射した。７日後、同量のＤＮＡで追加免疫(boosting)し、追加免疫してから１４日後に各マウスから脾細胞(splenocyte)を分離して１×１０７細胞／ウェルの濃度で１２ウェルプレートに加えた後、ＲＰＭＩ−１０培地で培養した。各エピトープペプチドを１０μｇ／ｍｌずつ各ウェルに添加してから３日目に組み換えマウスＩＬ−２(Calbiochem社製, ドイツ)を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。培養５日目には全細胞を採取して１ｘ１０５ｃｅｌｌ／１００μｌの濃度でＲＰＭＩ−１０培地で再懸濁し、抗マウスＩＦＮ−γがコーティングされた９６ウェルプレートの各ウェルに分株した。Ａ２.１形質転換マウスから分離した脾臓細胞を３０００ｒａｄ放射線で照射し、各スーパータイプのエピトープ５０μｇ／ｍｌを３７℃で１時間の間パルス(pulsing)した。その結果得られた細胞を３×１０５個ずつ各ウェルに分株した。実施例３と同様な方法でＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。この際、ウェルをコーティングするのに用いられる抗体はラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体(BD Pharmingen, CA)、ビオチン化した抗マウスＩＦＮ−γ抗体(BD pharmingen, CA)及びストレプトアビジン(streptavidin)−ＨＲＰＯ(BD Pharmingen, CA)であった。
【００９１】
図５に示すように、エピトープＤＮＡのみを注射した場合に比べて、補因子と共に注射した場合がより強い細胞媒介性免疫反応を示し、特にＣＤ４０ＬＴ、ＩＬ−１５、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０などを同時に投与した場合に免疫効果が増大した。
【００９２】
本発明の配列番号１〜１６のスーパータイプのエピトープは、多様なＭＨＣと結合して多様な患者群から免疫反応を誘導することができ、エピトープ抗原がオリゴヌクレオチド形態で提供されても十分な免疫反応を誘導すると結論づけられる。本発明のスーパータイプのエピトープによって誘導された免疫反応は、ＨＣＶに感染した患者を治療できるほど十分に効果的であることが立証された。
【００９３】
配列の説明
配列番号１〜１６は、それぞれL1,L2,L4,L6,L7,L8,L10,C1,C2,C3,C4,C5,C7,C8,C9,C10のペプチド配列であり、
配列番号１７〜３２は、それぞれL1,L2,L4,L6,L7,L8,L10,C1,C2,C3,C4,C5,C7,C8,C9,C10のＤＮＡ配列であり、
配列番号３３〜４２は、スーパータイプのエピトープをコードするオリゴヌクレオチドの合成に用いられたプライマー配列であり、
配列番号４３は、スーパータイプのエピトープの配列であり、
配列番号４４〜５１は、補因子のクローニングに用いられたプライマー配列であり、
配列番号５２〜５８は、ＣＤ４０三量体クローニングに用いられたプライマー配列であり、
配列番号５９〜６８は、ＣＤ４０ＬＴクローニングに用いられたプライマー配列である。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
前述したように、本発明はＨＣＶ特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球  (cytotoxic T lymphocytes, CTL)によって媒介される細胞性免疫反応を誘導し、ＨＣＶのポリプロテイン(polyprotein)の保存領域から由来したスーパータイプのエピトープに関する。本発明のスーパータイプのエピトープは、多様なＨＬＡ分子に結合して抗原特異的な免疫反応を誘導することができ、多型のＨＬＡを有する多様な患者に効果的である。また、前記エピトープをコードする発現ベクターも細胞媒介性免疫反応を誘導することができ、ＨＣＶによる肝炎及びこれに係る肝疾患に対するワクチンを含む治療剤の開発にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】正常群及びＨＣＶ患者群からサイトカインＩＦＮ−γ分泌を促進するペプチド特異的Ｔ細胞活性化に対する本発明のスーパータイプのエピトープの効果をＥＬＩＳＰＯＴで分析した結果を示すグラフである。
【図２】正常群及びＨＣＶ患者群からサイトカインＩＦＮ−γ分泌を促進するペプチド特異的記憶Ｔ細胞活性化に対する本発明のスーパータイプのエピトープの効果を示すＩＣＳ分析結果である。
【図３】本発明のスーパータイプのエピトープ及び補因子をコードするそれぞれのオリゴヌクレオチド配列が導入された本発明の発現ベクターを示す概略図である。
【図４】図３の発現ベクターを患者血液から分離した樹状細胞にトランスフェクションしてエピトープ抗原を提供することによってＨＣＶ患者においてサイトカインＩＦＮ−γ分泌を促進するペプチド特異的Ｔ細胞活性化を示すＥＬＩＳＰＯＴ分析結果である。
【図５】Ａ２.１でトランスフェクションしたマウスに図３の発現ベクターを注入することによって誘導される免疫反応の程度を、脾臓細胞から分泌されるＩＦＮ−γ濃度と比べたＥＬＩＳＰＯＴ分析結果を示すグラフである。
【図１】
2008505636.tif 000009
【図２】
2008505636.tif 000010
【図３】
2008505636.tif 000011
【図４】
2008505636.tif 000012
【図５】
2008505636.tif 000013
【配列表】
2008505636000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月5日(2007.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008505636000001.app
【国際調査報告】
2008505636.tif 000032
2008505636.tif 000033
2008505636.tif 000034