(57)【要約】本発明は、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートおよびその調製方法に関する。さらに本発明は、そのようなジポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの、疾患治療用の薬剤の製造のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートであって、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々アミン結合によってポリマー単位と結合していることを特徴とするコンジュゲート。
【請求項２】
ポリマー単位は、少なくとも１つのポリマー部分とリンカー部分とを含み、該リンカー部分は少なくとも１つのポリマー部分とアミン結合との間に位置する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
リンカー部分は直線状である、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
リンカー部分は分岐状である、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
ポリマー単位は２以上のポリマー部分を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
リンカー部分は、アミン結合の窒素原子に結合した少なくとも１つのメチレン基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
リンカー部分は、アミン結合の窒素原子に結合している１〜１２個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは２つのメチレン基を含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
タンパク質は生物学的に活性なタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
タンパク質はグリコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
タンパク質は、天然型のタンパク質と同じグリコシル化パターンを有する、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
タンパク質は、天然型のタンパク質とは異なったグリコシル化パターンを有する、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ポリマー）ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ポリマーは、Ｐと結合させるのに適したポリマーであり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり、Ｐは生物学的に活性なタンパク質またはプロテイノイドであって、該タンパク質またはプロテイノイドのアミノ基の２つの窒素原子は各々ポリマー単位と結合しており、Ｌ１はＯ、Ｎ、Ｓ、および分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であり、ただし、Ｌ２が存在しない場合ｙは１であり、Ｌ２が存在する場合ｙは少なくとも１である）を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
ポリマーは、ポリアルキレン・グリコール、多糖、ピロリドン、セルロース、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、およびこれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ＰＥＧｙ）−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ＰＥＧはポリエチレングリコール部分であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり、Ｐは生物学的に活性なタンパク質またはプロテイノイドであって、該タンパク質またはプロテイノイドのアミノ基の２つの窒素原子は各々ポリエチレングリコール単位と結合しており、Ｌ１はＯ、Ｎ、Ｓ、および分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であり、ただし、Ｌ２が存在しない場合ｙは１であり、Ｌ２が存在する場合ｙは少なくとも１である）を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
ＰＥＧは式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎを有し、前記式中、ｎはポリエチレングリコール単位中のエチレンオキシド残基の数を表す、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
ｙは１である、請求項１４または１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
アミノ基は、Ｎ末端のアミノ基、ε−アミノ基、グアニジン基およびイミダゾール基から成る群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
タンパク質またはプロテイノイドは、増殖因子、抗体、ホルモン、特に治療上活性を有するタンパク質、たとえばエリスロポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒト成長ホルモン、ヘモグロビン、インターロイキン２およびインターロイキン６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子、サイトカイン、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤのような免疫グロブリン、またはそれらの構造的もしくは機能的もしくは構造的かつ機能的なバリアントもしくはフラグメント、のうち少なくともいずれかの生物学的な活性を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
タンパク質またはプロテイノイドはＧ−ＣＳＦの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
タンパク質またはプロテイノイドはＩＦＮα２ａの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
タンパク質またはプロテイノイドはエリスロポエチンの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
タンパク質またはプロテイノイドはヒト成長ホルモンの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
２つのアミノ基は、Ｎ末端のアミノ基およびリジン残基のε−アミノ基から成る群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
タンパク質は、該タンパク質の野生型の配列のアミノ基含有アミノ酸が、欠失、修飾、付加のいずれも為されていないという点で野生型の配列と同じであるアミノ酸配列を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
Ｇ−ＣＳＦは配列番号１に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、１９、２３
または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
２つのアミノ基は、Ｎ末端のアミノ基、リジン１７のε−アミノ基およびリジン３５のε−アミノ基から成る群から選択される、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
Ｇ−ＣＳＦはグリコシル化Ｇ−ＣＳＦまたは非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦである、請求項２５または請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
ＩＦＮα２ａは配列番号２に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、２０、２３または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
エリスロポエチンは配列番号３に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、２１、２３または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
エリスロポエチンはグリコシル化されている、請求項２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
ヒト成長ホルモンは配列番号４に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、２２、２３または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
Ｒは、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびベンジルから成る群から選択される、低級アルキルまたはアリールである、請求項１２または１４に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
ポリエチレングリコール部分の分子量は、２〜１００ｋＤａ、より好ましくは５〜６０ｋＤａ、最も好ましくは１０〜３０ｋＤａである、請求項１３〜３２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
ｍは、１〜１２、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは２である、請求項１２〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲートを、少なくとも１つ、好ましくは２つ含んでなる医薬調製物。
【請求項３６】
請求項１４〜３４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを、多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートとともに混合して含む、ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの混合医薬調製物であって、該混合医薬調製物における前記ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの割合が予め指定されていることを特徴とする調製物。
【請求項３７】
Ｎ末端のアミノ基およびリジン１７のε−アミノ基にポリエチレングリコール単位が結合しているＧ−ＣＳＦと、Ｎ末端のアミノ基およびリジン３５のε−アミノ基にポリエチレングリコール単位が結合しているＧ−ＣＳＦとから成る群から選択される２つのポリエチレングリコール・Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを含んでなる、請求項３５または請求項３６に記載の調製物。
【請求項３８】
薬学的に許容可能な希釈剤、担体、バッファー、およびアジュバントのうち少なくともいずれか１つをさらに含んでなる、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項３９】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートの調製方法であって、タンパク質をポリマー試薬と反応させてポリマー・タンパク質コンジュゲートを生成させる第１の反応ステップと、第１の反応ステップの望ましくない生成物の一部または全部を用いて反応ステップを繰り返す再利用ステップとを含む方法。
【請求項４０】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートの調製方法であって、少なくとも２つのアミノ基を有するタンパク質を、単一のアルデヒド基を有するポリマー試薬と還元剤存在下に反応させることを含み、反応時間は、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートが選択的に生成されるように調節されていることを特徴とする方法。
【請求項４１】
ポリマー試薬は、ポリアルキレン・グリコール、多糖、ピロリドン、セルロース、ポリアミノ酸部分、ポリアクリルアミド、およびこれらの誘導体のうち少なくともいずれかを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
タンパク質は、増殖因子、抗体、ホルモン、特に治療上活性を有するタンパク質、たとえばエリスロポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒト成長ホルモン、ヘモグロビン、インターロイキン２およびインターロイキン６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子、サイトカイン、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤのような免疫グロブリン、またはそれらの構造的もしくは機能的もしくは構造的かつ機能的なバリアントもしくはフラグメント、のうち少なくともいずれかの生物学的な活性を有するタンパク質またはプロテイノイドである、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
反応時間は、該方法の生成物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によりポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートであるように選択される、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
反応時間は、６ｈ〜４８ｈ、好ましくは１２ｈ〜４８ｈ、より好ましくは１６ｈ〜３６ｈ、最も好ましくは１８ｈ〜３２ｈである、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートは、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲートである、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
反応は、タンパク質濃度を０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約３．２ｍｇ／ｍｌとして行われる、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
反応は、タンパク質とポリマーとのモル比を１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、より好ましくは１：１０〜１：３０として行われる、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質がグリコシル化タンパク質である場合、反応は、タンパク質内のアミノ基とポリマー分子との化学量論比を、１０：１〜１：８０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２０として行われる、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
タンパク質が非グリコシル化タンパク質である場合、反応は、タンパク質内のアミノ基とポリマー分子との化学量論比を、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：
３０、最も好ましくは１：２〜１：１０として行われる、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
還元的アルキル化において使用される還元剤は、ＮａＣＮＢＨ４またはＮａＢＨ４のうち少なくともいずれか一方である、請求項３９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
反応はｐＨ６．９〜７．８で行われる、請求項３９〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
反応は、リン酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳおよびその他の適切なバッファーから選択されたバッファーの存在下で行われる、請求項３９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
反応は、２℃〜５０℃、好ましくは２℃〜８℃の温度で行われる、請求項３９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
ポリマー試薬は、次式：
［Ｒ−Ｌ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ］ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−１−ＣＨＯ（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ｎは、ポリエチレングリコール部分の中のエチレンオキシド残基の数を表す整数であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり；Ｌ１は、Ｏ、Ｎ、Ｓおよび分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は、分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であって、ただしＬ２が存在しない場合にはｙは１であり、Ｌ２が存在する場合にはｙは少なくとも１である）を有する試薬である、請求項３９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ポリマー試薬は、ＰＥＧアルデヒド、好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
メトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドは、窒素下で−２０℃以下の温度で固体物質として保存される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ポリエチレングリコール・アセトアルデヒドは、対応するポリエチレングリコールジエチルアセタールを活性化して得られる、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
精製ステップをさらに含み、該ステップは、タンパク質の２つの所定のアミノ基が各々１つのポリマー単位と結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートの生成物プールをもたらし、かつ、未反応タンパク質、未反応ポリマー試薬、生成物プールのジポリマー・タンパク質コンジュゲート・アイソフォーム以外のジポリマー・タンパク質コンジュゲート・アイソフォーム、およびタンパク質の２未満もしくは３以上のアミノ基がポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲート、のうち少なくともいずれか１つを含有する残余物プールを生じさせる、請求項３９〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
精製ステップはイオン交換クロマトグラフィーによって行われる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項３９〜５７のいずれか１項に記載の方法が残余物プールを用いて繰り返され、得られた生成物プールが好ましくは前記生成物プールと混合される、請求項５８または５９
に記載の方法。
【請求項６１】
第１の反応ステップは、請求項３９〜５７のいずれか１項に記載の方法に相当する、請求項３９に記載の方法。
【請求項６２】
再利用ステップは、請求項６０に記載の方法を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項６３】
請求項３９〜６２のいずれか１項に記載の方法に従って調製されたポリマー・タンパク質コンジュゲート。
【請求項６４】
請求項１〜３４または６３のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲート、または請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の医薬調製物の、疾患治療用の薬剤の製造のための使用。
【請求項６５】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
疾患は、化学療法、放射線療法および感染のうち少なくともいずれかによって引き起こされる好中球減少症および白血病のうち少なくともいずれか一方である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・ＩＦＮα２ａコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。
【請求項６８】
疾患は、感染症、特に肝炎である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・エリスロポエチンコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。
【請求項７０】
疾患は貧血症である、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・成長ホルモンコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。
【請求項７２】
疾患は成長ホルモン欠損症である、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
タンパク質の免疫原性を低減するための、請求項１〜３４または６３のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートおよびその調製方法に関する。さらに本発明は、そのようなジポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの、疾患治療用の薬剤の製造のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然型の組換えタンパク質は、２０年以上にわたり治療薬として成功裡に使用されてきた。しかしながら、タンパク質治療薬の生物学的利用能は、短い血漿中半減期およびプロテアーゼ分解への感受性によって制限されることが多く、このため該治療薬の臨床上の最大能力が制限されている。
【０００３】
これらの欠点を克服すべく、タンパク質治療薬の血中半減期を長くするために、該タンパク質の修飾が、例えばタンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーを化学的または酵素的に結合させることによって為されてきた。タンパク質にポリエチレングリコール部分を結合させることによるタンパク質の修飾は、ＰＥＧ化としても知られている。ＰＥＧ化によって成功裡に修飾されたタンパク質には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγのようなインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）、ＩＬ−２およびＩＬ−６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、様々なサイトカインおよび合成赤血球形成タンパク質（合成ＥＰＯ）が挙げられる。
【０００４】
ポリエチレングリコールとの結合によるタンパク質の化学修飾の結果、耐熱性が改善され、酵素分解に対する感受性が低減され、タンパク質の抗原決定基が保護されて免疫原性の低下および抗体との反応性の低下がもたらされ、溶解度が増大し、ＰＥＧ結合タンパク質治療薬の腎臓および細胞でのクリアランスの減少によりインビボで血漿中半減期が延長し（非特許文献１を参照）、最大血漿中濃度が低下し、血漿中濃度の変動が小さくなり、投与頻度が低下し、したがって生活の質の向上がもたらされる。したがって、ＰＥＧ修飾されたタンパク質は、バイオ医学・生物工学における適用に広く使用されている（非特許文献２を参照）。
【０００５】
タンパク質へのポリエチレングリコール部分の結合方法は、非特許文献３〜６に記述されている。また、プロテイノイドへのポリエチレングリコール部分の結合方法は、非特許文献７に記述されている。
【０００６】
一般に、ポリエチレングリコール分子はタンパク質の官能基を介して該タンパク質に結合する。タンパク質のアミノ酸鎖中の各官能基で、求核性であるもの、すなわち電子供与体としての能力を有するものは、ＰＥＧ分子に結合している相補的な基と反応する場合がある。そのような求核基には、α−アミノ、ε−アミノ、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル、イミダゾールおよびグアニジン基が挙げられる。例えば、タンパク質のアミノ基、すなわちα−アミノ基（Ｎ末端）およびリジン残基のε−アミノ基は、ＰＥＧのカップリングのための反応性基または官能基として使用される（非特許文献５を参照）。
【０００７】
特許文献１は、アシル化反応によってＰＥＧとタンパク質との間にアミド結合を生成することによるタンパク質へのＰＥＧ結合を開示している。
特許文献２には、還元的アルキル化を用いて酵素にＰＥＧを結合し、ＰＥＧとタンパク質との間にアミン結合を生成することが記載されている。
【０００８】
さらに、タンパク質のアミノ基へのＰＥＧのカップリングは、特許文献３（ヘモグロビンのアシル化）、特許文献４（ウロキナーゼ、カリクレインあるいは白血球インターフェロンのアシル化）、特許文献５（中性ｐＨでのリンホカインの還元的アルキル化）、特許文献６（ウロキナーゼのアシル化）、特許文献７（インターフェロンβ、インターロイキン２およびイムノトキシンのアシル化）、特許文献８（腫瘍壊死因子のアシル化）、特許文献９（Ｇ−ＣＳＦのアシル化）、特許文献１０（中性ｐＨでのＣＤ４免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）のアルキル化）、特許文献１１（トレシルクロライドを用いた、特にＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＳＣＦのアルキル化）、特許文献１２（インターロイキン６のアシル化）、特許文献１３（カルシトニン、インターロイキン２または顆粒球コロニー刺激因子のアシル化）および特許文献１４（タンパク質のアシル化）に記載されている。しかしながら、これらの特許出願文献に記述されたＰＥＧ化反応では、多重にＰＥＧ化された生成物、つまり１つのタンパク質当たり複数のＰＥＧ部分を有するタンパク質コンジュゲートを生じる。ＰＥＧ部分の数が多くなるほど、多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの特徴解析はますます難しくなり、規制当局による治療用タンパク質の医薬品としての認可を阻むことになる。
【０００９】
従って、治療用タンパク質中のＰＥＧ部分の数を低く維持することは、予測可能な活性を有しかつロット間の製品一致性を備えた規定の生成物の生産を容易にし、該生成物を医薬製造に役立たせる。さらに、１タンパク質当たりのＰＥＧ部分の数が少ないと、酵素基質相互作用におけるレセプター認識が低下する危険性が低くなる。したがって、生物薬剤として適用するためのＰＥＧ化タンパク質は、１タンパク質当たりのＰＥＧユニットの数が少ないことが好ましい。
【００１０】
このことから、下記に述べるように、１タンパク質当たりのＰＥＧユニット数の少ないＰＥＧタンパク質コンジュゲートが開発された。
特許文献１５には、還元的アルキル化の条件下およびα−アミノ基を選択的に活性化するのに十分な酸性のｐＨ条件でポリペプチドのα−アミノ基（Ｎ末端基）に１つのポリエチレングリコール分子を結合させる方法が記載されている。Ｎ末端のα−アミノ基（ｐＫａはｐＨ６．８〜８．２の範囲）とリシル側鎖のε−アミノ基（ｐＫａはｐＨ１０．４〜１０．５の範囲）との間のｐＫａ値の差（非特許文献８を参照）から、酸性環境でのＰＥＧ化により選択的にタンパク質のＮ末端がモノＰＥＧ化されることが示唆される。
【００１１】
しかしながら、モノＰＥＧ化されたタンパク質と比較して、ジＰＥＧ化されたタンパク質は以下のようないくつかの重要な利点を有する。
―  直線状ＰＥＧ１分子あたりのエチレンオキサイド単位の最大数から、分子量がおよそ３０ｋＤａに制限される（非特許文献９）。したがって、第２のＰＥＧ分子を結合することによりＰＥＧタンパク質コンジュゲート中のＰＥＧ部分の分子量を増大させることが可能となる。
―  分子量の大きいＰＥＧ分子はＰＥＧ化タンパク質溶液の粘度を増大させる。分子量の大きい１つのＰＥＧ分子の代わりに分子量の小さい２つのＰＥＧ分子を結合することにより、この作用を弱めることができる。
―  ＰＥＧタンパク質コンジュゲート全体の分子量が等しい場合には、１つのＰＥＧ分子の代わりに２つのＰＥＧ分子を結合するとＰＥＧタンパク質コンジュゲートの流体力学半径が増大し、その結果クリアランスが延長され、したがって該コンジュゲートの生物活性の持続時間が延びる。
―  第２のＰＥＧ分子をタンパク質に連結することにより、タンパク質のエピトープをより有効に保護し、その結果タンパク質分解への感受性および免疫原性を低減するとともにＰＥＧタンパク質コンジュゲートの安定性を改善することができる。これは、プロテイノイド、ならびに潜在的に免疫原性を増加させうる非天然リンカーによって連結される非組換えの合成タンパク質フラグメントには、特に有利である。
―  第２のＰＥＧ部分の結合により、ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの親水性が高まる。従って、バッファー系における溶解度が改善され、コンジュゲートが凝集する危険性が低減される。
【００１２】
これらの利点を考慮して、主としてジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートを合成する試みがなされた。これらの試みは、天然タンパク質配列の遺伝学的操作を含むものであり、該遺伝学的操作はジＰＥＧ化された突然変異タンパク質コンジュゲートを作製するための先行条件として部位特異的にＰＥＧタンパク質をカップリングする手段を提供する。
【００１３】
特許文献１６には、ジＰＥＧ化されたレプチンおよびＧ−ＣＳＦの突然変異タンパク質であって、そのタンパク質配列にシステイン突然変異が導入されているものが記載されている。システイン点突然変異を導入する目的は、第２の結合部位を提供することであり、これは、Ｎ末端特異的にＰＥＧを結合させる既存の技術を補足するものである。
【００１４】
特許文献１７にはＧ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートについて記載されており、該Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ配列に対して、ＰＥＧ用の結合基を含む少なくとも１つの特異的に改変されたアミノ酸残基に関して異なっている。特に、特許文献１７には、特異的に導入されたアミノ基がアシル化によりＰＥＧ化されたジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ突然変異体が記載されている。特許文献１７によれば、Ｇ−ＣＳＦ中のリジン残基のうち１つ以上に無制限に結合が生じると、得られるコンジュゲートの活性が失われたり著しく低減されたりする可能性があるため、これを回避するためにＧ−ＣＳＦ中のリジン残基のうち少なくとも１つまたは全部を取り除き、次いでアシル化用の少なくとも１つの新しいアミノ基を導入することが好ましい。
【００１５】
特許文献１８には、Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートについて記述されており、該コンジュゲートにおいて、Ｇ−ＣＳＦアミノ酸配列は、ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ配列と比較して、１７位システインのセリンへの変異によって少なくとも１アミノ酸残基が特異的に変更されている点で異なっている。特に、特許文献１８には、還元的アルキル化によってα−アミノ基が特異的にＰＥＧ化されたモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ突然変異体について記述されている。特許文献１８によれば、還元的アルキル化のために適用される反応条件は、反応ｐＨが酸性であるため主としてモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートと、微量のジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートとを生じるものであり、医薬製品の製造には使用されなかった。
【００１６】
突然変異タンパク質は、開発の複雑さという不利点とは別に、天然の配列のアミノ酸を変更することによって引き起こされる可能性のある免疫原性のような、別の危険性を有している。したがって、特許文献１６および特許文献１７に記述されたジＰＥＧ化方法とは対照的に、ＰＥＧ化のためにタンパク質を変異させる必要のない野生型アミノ酸配列の組換えまたは天然タンパク質をジＰＥＧ化することが望ましいであろう。
【００１７】
一例が特許文献１９に挙げられており、同文献には、アシル化によってタンパク質にＰＥＧ部分をカップリングして得られる非特定的なジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートが記述されている。特許文献１９によればＰＥＧ結合可能な部位はα−およびε−アミノ基へのアミド結合ならびに第１ヒドロキシル基へのエステル結合である。しかしながら、このＰＥＧ化反応では特異的にジＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ分子は生じなかった。
【００１８】
アシル化によりＧ−ＣＳＦのジＰＥＧ化が可能となるが、アシル化によって合成されたＰＥＧ・タンパク質コンジュゲートは安定性が低く、凝集性が高い（非特許文献１０）。
エリスロポエチン、インターフェロンあるいはヒト成長ホルモンのようなその他の商業
上興味深い分子をポリマーと結合させることが試みられたときも、同様の問題が生じた。多くの場合、ＰＥＧ化反応により非特異的なポリマー結合が起きた。ある場合には、非特異的なポリマー結合を回避または低減するために上記分子の突然変異タンパク質が用いられた。
【特許文献１】米国特許第４，１７９，３３７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，００２，５３１号明細書
【特許文献３】欧州特許出願第０  ０６７  ０２９号明細書
【特許文献４】欧州特許出願第０  ０９８  １１０号明細書
【特許文献５】欧州特許出願第０  １５４  ３１６号明細書
【特許文献６】欧州特許出願第０  １５４  ４３２号明細書
【特許文献７】欧州特許出願第０  ２２９  １０８号明細書
【特許文献８】欧州特許出願第０  ２４７  ８６０号明細書
【特許文献９】欧州特許出願第０  ３３５  ４２３号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願第０  ３７２  ７５２号明細書
【特許文献１１】欧州特許出願第０  ４３９  ５０８号明細書
【特許文献１２】欧州特許出願第０  ４４２  ７２４号明細書
【特許文献１３】欧州特許出願第０  ４７３  ２６８号明細書
【特許文献１４】欧州特許出願第０  ５３９  １６７号明細書
【特許文献１５】国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレット
【特許文献１６】国際公開公報第００／２１５７４号パンフレット
【特許文献１７】国際公開公報第０１／５１５１０号パンフレット
【特許文献１８】国際公開公報第２００４／０８３２４２号パンフレット
【特許文献１９】国際公開公報第００／４４７８５号パンフレット
【非特許文献１】デルガド（Delgado ）ら、Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 、１９９２年、第９巻（３，４）、ｐ．２４９−３０４
【非特許文献２】イナダ（Ｉｎａｄａ）ら、ＴＩＢＴＥＣＨ  １９９５年、第１３巻、ｐ．８６−９１
【非特許文献３】パス（Pasut ）ら、Expert Opin. Ther. Patents、２００４年、第１４巻（６）、ｐ．８５９−８９４
【非特許文献４】Ｗ．Ｐ．シェフィールド（Sheffield ）、Curr. Drug Targets、２００１年、ｐ．１−２２
【非特許文献５】Ｆ．Ｍ  ベロネーゼ（Veronese）、Biomaterials、２００１年、第２２巻、ｐ．４０５−４１７
【非特許文献６】Ｓ．ザリプスキー（Zalipsky）、Adv. Drug Deliv. Rev. 、１９９５年、第１６巻、ｐ．１５７−１８２
【非特許文献７】Ｇ．コッヘンドルファー（Kochendoerfer ）、Expert Opin Biol Ther.、２００３年、第８巻、ｐ．１２５３−６１
【非特許文献８】アザルカン（Azarkan ）ら、Rec Res Develop Biotech Bioeng、１９９９年、第２巻、ｐ．７７−９３
【非特許文献９】ハリス（Harris）およびチェス（Chess ）Nat. Rev. Drug Discovery、２００３年、第２巻（３）、ｐ．２１４−２２３
【非特許文献１０】キンスラー（Kinstler）ら、Pharm. Res. 、１９９６年、第１３巻、ｐ．９９６−１００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
前述の問題を考慮すると、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えた安定かつ明確なポリマー・タンパク質コンジュゲートが必要とされている。
従って本発明の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えた安定かつ明確なポリマー・タンパク質コンジュゲートを提供することである。特に、安定かつ明確なジ
ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを提供することが本発明の目的である。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートであって、該タンパク質が野生型または天然のアミノ酸配列を有するか、野生型タンパク質の合成タンパク質様模倣物すなわちプロテイノイドであって少なくとも野生型タンパク質の生物活性を有しているものを提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートであって、対応する非コンジュゲートタンパク質よりも血中半減期が長く、かつインビボでの生物活性が高いものを提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートの収量を著しく増加させる方法を提供することである。
【００２３】
さらに、本発明の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲートを優先的に高収率で製造する方法であって、生成物の一致性が高く反応原料（educt ）が容易に利用可能である方法を提供することである。
【００２４】
最後に、本発明の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に、ジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートを製造する方法の条件であって、タンパク質中の予め選択された２つの結合部位に優先的にポリマー単位が結合する条件を特定することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明によれば、上記およびその他の目的は独立請求項の特徴の組合せにより達成される。本発明の利点および実施形態は従属請求項に定義されている。
１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えた安定かつ生物学的に活性なポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にＰＥＧタンパク質コンジュゲートであって、該タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々１つのポリマー単位、特にポリエチレングリコール部分と結合しているものを提供することが可能であることが見出された。
【００２６】
本発明の別の態様では、少なくとも１つ、および好ましくは２つの本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを含む医薬調製物が提供される。
本発明の別の態様では、ポリマー・タンパク質コンジュゲートの製造方法であって、少なくとも２つのアミノ基を有するタンパク質を、還元剤存在下に単一のアルデヒド基を有するポリマー試薬と反応させることを含み、反応時間は、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートが優先的に作製されるように選択されることを特徴とする方法が提供される。
【００２７】
さらに、本発明は、疾患治療用の薬剤の製造のための、本発明によるポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートのようなポリマー・タンパク質コンジュゲートの使用に関する。治療される疾患の種類は、ポリマーに結合したタンパク質の種類に依存する。例えば、疾患は造血機能または免疫機能の低下を特徴とするものである場合が考えられる。タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合、該疾患は通常、化学療法、放射線療法および感染のうち少なくともいずれかによって引き起こされる好中球減少症および白血病のうち少なくともいずれか一方である。タンパク質がエリスロポエチンである場合、該疾患は通常、一種の貧血症、例えば腎性貧血である。タンパク質が成長ホルモン（ソマトトロピンとも
呼ばれる）である場合、該疾患は通常、成長ホルモン欠損症である。タンパク質がインターフェロンである場合、該疾患は感染症の場合が考えられる。
【００２８】
特に、本発明は、好ましくは２つのポリマー単位、特にポリエチレングリコール分子を、適切なｐＨ、例えばおよそｐＨ７を選択することにより、還元的アルキル化条件の下でタンパク質に結合させることが可能であるという発見に基づく。
【００２９】
さらに、反応時間は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に本発明のジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートを形成するための重大なパラメータであることが見出された。例えば、本発明のＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートは、時間依存的な順序でモノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、トリＰＥＧ化、さらに高度にＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートへと連続的に形成されることが分かった（図３を参照）。
【００３０】
さらに、タンパク質とポリマーとのモル比および／またはタンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの形成にとって重要であることが分かった。さらに、非グリコシル化タンパク質と比較すると、タンパク質がグリコシル化されている場合は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの形成には、ポリマー分子とタンパク質内のアミノ基との化学量論比がより低くてよいことが分かった。
【００３１】
さらに、未反応または部分的に反応したタンパク質分子に相当する望ましくない反応生成物を、第２のポリマー結合処理ステップ、例えばジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートをさらに生成してジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの全体的な工程歩留まりの向上に寄与する第２のＰＥＧ化反応ステップに適用する、再利用ステップの導入により、工程歩留まりが著しく増加される場合があることが分かった。予想外にも、再利用ステップにより、最初のＰＥＧ化反応で得られた品質に匹敵する高品質のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートが高収率で得られる。さらに、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲートをより大量に生産するために望ましくない反応生成物を再利用するというこの考え方は、他のポリマー・タンパク質コンジュゲートを形成する反応にも適用可能である。
【００３２】
さらに、本発明のタンパク質修飾方法により、同じタイプのアミノ基（例えばリジン残基のε−アミノ基）でもタンパク質配列中の該反応性アミノ基を備えたアミノ酸に隣接するアミノ酸残基に応じて反応性が異なることを利用して、タンパク質の特定部位に優先的または圧倒的にポリマー単位を結合させることが可能になることが分かった。したがって、本発明の方法は、例えばタンパク質の異なるε−アミノ基、異なるグアニジノ基および／または異なるイミダゾール基の間のｐＫａの差異を利用するようなｐＨで行なわれることが好ましい。これにより、タンパク質の指定または事前選択可能または事前選択済または所定のアミノ基にポリマーが優先的に結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートがほぼ均質に調製される。
【００３３】
本発明の状況において「ほぼ均質」とは、調製物が、タンパク質の指定または事前選択可能または事前選択済または所定のアミノ基にポリマーが優先的に結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートを主として含み、かつ非コンジュゲートタンパク質または１もしくは３以上のポリマーが結合しているタンパク質または所定のアミノ基とは別のアミノ基にポリマーが結合しているタンパク質がより少ないことを意味するように意図されている。好ましくは、調製物は、該調製物中に存在するタンパク質の総量に対して少なく
とも５０％、より好ましくは少なくとも６０、６５、７０もしくは７５％、さらに好ましくは少なくとも８０、８５もしくは９０％、そして最も好ましくは少なくとも９２、９４、９６、９８もしくは９９％の、事前選択されたアミノ基にポリマーが結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートを含む。
【００３４】
最後に、２つのジポリマー・タンパク質アイソフォームを指定の混合物として含むか、または単一のジポリマー・タンパク質アイソフォームを含むかのいずれかのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの均質な調製物は、同様のモノＰＥＧ化タンパク質に少なくとも匹敵し、かつ対応する非ＰＥＧ化タンパク質よりも良好な生物活性を示すことが分かった。
【００３５】
好ましくは、本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲートは還元的アルキル化によって調製される。したがって本発明は、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々アミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートを提供することが好ましい。
【００３６】
本発明の状況では、用語「アミノ基」としては、第一アミノ基および第二アミノ基、特に、アミノ酸側鎖のＮＨ基またはＮＨ２基、例えばリジン側鎖のＮＨ２基、アルギニンのグアニジノ基のＮＨ基またはＮＨ２基、あるいはヒスチジンのイミダゾール側鎖のＮＨ基が挙げられる。特に、用語「アミノ基」には、α−（Ｎ末端）アミノ基およびリジン側鎖のＮＨ２基であるε−アミノ基が含まれる。
【００３７】
ポリマー単位は、少なくとも１つのポリマー部分とリンカー部分とを含み、該リンカー部分は少なくとも１つのポリマー部分とアミン結合との間にある。リンカー部分は直線状でも分岐状でもよい。リンカー部分が分岐している場合、ポリマー単位は２以上のポリマー部分を含む場合がある。
【００３８】
リンカー部分は好ましくは脂肪族リンカー部分である。適切な脂肪族リンカー部分はさらに、置換されたアルキルジアミンおよびトリアミン、リジンエステルおよびマロン酸エステル誘導体を含んでいる。リンカー部分は、ポリマー鎖が堅く固定されないように平面状でないことが好ましい。好ましくは、リンカー部分は、最大１８個、より好ましくは１〜１０個の炭素原子を含む、多重官能化されたアルキル基を含む。窒素、酸素あるいは硫黄のようなヘテロ原子が該アルキル鎖に含まれていてもよい。リンカー部分は、例えば炭素原子または窒素原子において分岐していてもよい。分岐状リンカー部分および該リンカー部分から生じる分枝状ポリマーユニットならびにそれらの調製方法の例は、国際公開公報第９５／１１９２４号パンフレットおよび国際公開公報第０３／０４９６９９号パンフレットに記述されている。前記特許文献は参照により本願に組込まれる。本発明の意味における「分岐状」とは、くし形状の部分をも含むように意図される。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、リンカー部分は、アミン結合の窒素原子に結合した少なくとも１つのメチレン基、例えば、アミン結合の窒素原子に直接結合している１〜１２個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは２つのメチレン基を含む。
【００４０】
１つの好ましい本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲートは、下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ポリマー）ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ポリマーは、タンパク質と結合させるのに適したポリマーであり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり、Ｐは生物学的に活性なタンパク質またはプロテイノイドであって、該タンパク質またはプロテイノイドのアミノ基の２つの窒素原子（上記式中ＮＨで表わされている）
は各々ポリマー単位と結合しており、Ｌ１はＯ、Ｎ、Ｓ、および分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であり、ただし、Ｌ２が存在しない場合ｙは１であり、Ｌ２が存在する場合ｙは少なくとも１である）を有する。
【００４１】
Ｒは低級アルキルまたはベンジルのようなアリールである。用語「低級アルキル」には、１〜７個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を含む低級アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルなどがあり、特に好ましいのはメチルである。
【００４２】
少なくとも１つのポリマー部分と適切な保護基との間の結合の一部であるリンカーＬ１、および／またはＰＥＧ鎖のエチレンオキシド残基のような少なくとも１つのポリマー部分とタンパク質もしくはプロテイノイドの窒素原子との間、特に、ＰＥＧ鎖のエチレンオキシド残基とメチレン基との間の結合の一部であるリンカーＬ２は、独立に存在していても存在していなくてもよく、また上記リンカー部分、例えば（−ＣＯ）２−ＣＨ−、−ＣＯ−Ｏ−、および／または−ＣＯ−ＮＨ−などの任意の構造式を有する分岐状または非分岐状のリンカー部分から独立に選択される。リンカーＬ１は、Ｏ、Ｎおよび／またはＳである場合もありうる。
【００４３】
通常、ＰＥＧ鎖のエチレンオキシド残基などのポリマー部分と、ＰＥＧ試薬のようなポリマー部分が結合されるタンパク質またはプロテイノイドの窒素原子との間の結合の一部を形成しているメチレン基の数ｍは、１〜１２の範囲、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは２である。
【００４４】
通常、数値ｙは、Ｌ２が存在する場合、１〜１０の範囲、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは２である。
ポリマー部分は通常、ほとんど非抗原性または非免疫原性のポリマー鎖である。さらに、使用されるポリマー部分は、水溶性ポリマー部分の中から選択されることが好ましい。これは、水溶性ポリマー部分が付着または結合したタンパク質が生理学的環境のような水性環境の中で沈殿しないという利点を有する。還元的アルキル化については、本方法で提供されるように重合度を制御可能なように、選択されたポリマーはさらに単一の反応性アルデヒドを有していなければならない。ポリマー部分と同様にポリマー単位も分岐状または非分岐状であってよい。最終生成調製物の治療的使用については、ポリマーは薬学的に許容可能なものが好ましいであろう。当業者であれば、ポリマー・タンパク質コンジュゲートが治療的に使用されるかどうか、そうであれば所望の投与量、血中循環時間、タンパク質分解への耐性およびその他の事項を考慮して、所望のポリマー部分を選択することができるであろう。
【００４５】
好ましくは、ポリマー部分は、ポリアルキレン・グリコール部分、デキストランとその誘導体のような多糖部分、多糖およびその誘導体、ポリビニルピロリドンのようなピロリドン部分、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース部分、ポリビニルアルコール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸部分および／またはポリアクリルアミド部分、ならびに／または、他の同様の非免疫原性ポリマー部分（ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか）および／またはその誘導体、から成る群から選択されうる。そのようなポリマーはまた、本発明に組み入れるために官能化されてもよいし活性化されてもよい。
【００４６】
特に、ポリマー部分はポリアルキレン・グリコール部分である。用語「ポリアルキレン・グリコール」は、アルキレン基が直鎖または分岐鎖の基であるポリアルキレン・グリコ
ール基またはポリアルキレン・グリコール部分を示す。用語「ポリアルキレン・グリコール」はまた、ポリエチレン基とポリプロピレン基との混合物を含んでいるポリマー、およびポリイソプロピレン基、ポリエチレン基およびポリイソブチレン基の混合物を含んでいるポリマーのような混合アルキレン・グリコールから形成されたポリアルキレン・グリコールも含む。好ましくは、本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲート中のポリアルキレン・グリコール部分は、２つの末端ヒドロキシル基の除去によって形成されたポリエチレングリコール部分またはポリエチレングリコール残基である。
【００４７】
この群には、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などのａ置換されたポリアルキレンオキシド誘導体、あるいは他の適切なアルキル置換されたポリアルキレンオキシド誘導体、例えばモノ−またはビス末端Ｃ１−Ｃ４基を含んでいるものがある。モノメチル・ポリエチレングリコール・ホモポリマーのような直鎖の非抗原性ポリマーが好ましい。さらに、他のポリエチレングリコール・ホモポリマー、ポリエチレングリコール・ヘテロポリマー、他のアルキルポリアルキレンオキシドブロック共重合体、およびポリアルキレンオキシドのブロック共重合体の共重合体のような別のポリアルキレンオキシドも有用である。
【００４８】
上記は単なる例証であり、ここで使用するのに適した非抗原性のポリマーまたはポリマー部分のタイプを限定するものではない。
本発明による特に好ましいポリマーは、下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ＰＥＧｙ）−Ｌ２−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒ、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、ｙ、ｍは上記のように定義される）のＰＥＧタンパク質コンジュゲートを生じるポリエチレングリコールである。
【００４９】
特に、ＰＥＧは式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎを有し、式中、ｎはポリエチレングリコール単位中のエチレンオキシド残基の数を表す。さらに、Ｌ１はＯであり、Ｌ２は存在せずｙは１であることが好ましい。
【００５０】
本発明によりポリマー単位が結合されうるアミノ基の窒素原子は、α−アミノ基、ε−アミノ基、グアニジン基およびイミダゾール基の窒素原子から成る群から選択されることが好ましい。第一アミノ基の窒素原子にポリマー単位を結合することが好ましいが、これに限定はされない。
【００５１】
本発明に従ってコンジュゲートとすることが可能な、生物学的に活性なタンパク質は、従来の治療用タンパク質のうち任意のものであってよい。さらに、本発明の状況においては、用語「タンパク質」はタンパク質およびプロテイノイドを含むものとして了解される。本発明の状況においては、プロテイノイドは、対応する天然タンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、ペプチドの形態で化学合成され互いに連結されて天然タンパク質と同様の生物活性を示す天然タンパク質様構造を形成する、合成のタンパク質様分子である。これらのプロテイノイドは潜在的なタンパク質治療薬である。
【００５２】
２つのポリマー単位と結合させることが可能であり、特に、本発明によってジＰＥＧ化することが可能であるタンパク質には、非変異型および変異型タンパク質、たとえば限定するものではないが増殖因子、抗体、ホルモン、特に治療上活性を有するタンパク質、たとえば限定するものではないがエリスロポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヘモグロビン、成長ホルモン、インターロイキン２およびインターロイキン６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子、様々なサイトカインならびにＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤのような免疫グロブリン、および／またはそれらの構造的および／または機能的なバリアントおよび／またはフラグメントおよび／または類似体、ならびにこれ
らのプロテイノイドまたは合成タンパク質様の形態、例えば合成赤血球形成タンパク質（合成ＥＰＯ）などが挙げられる。２つのポリマー単位と結合させることが可能なタンパク質はグリコシル化されていてもよいし、グリコシル化されていなくてもよい。例えばエリスロポエチンについては、その活性がグリコシル化に大きく依存することが示されている。天然のエリスロポエチンは、成熟型タンパク質の２４、３８、８３位、および１２６位が、それぞれＮグリコシル化およびＯグリコシル化されている。本発明によるコンジュゲート作製に使用しようとするグリコシル化タンパク質は、天然のタンパク質と同じグリコシル化パターンを有することが好ましい。しかしながら、本発明はまた、天然のタンパク質とは異なったグリコシル化パターンを有するが天然タンパク質とほぼ同じかまたはそれよりも高い生物活性を有するグリコシル化タンパク質をも包含する。用語「グリコシル化タンパク質」とは、該タンパク質のアミノ酸鎖に少なくとも１つの炭水化物分子が結合していることを意味するものと意図される。
【００５３】
一般に、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＩＦＮα２ａおよびｈＧＨのような本発明の実施に役立つタンパク質は、哺乳類から単離された任意の形態でもよいし、ゲノムやｃＤＮＡのクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られた外来ＤＮＡ配列を原核生物もしくは真核生物の宿主で発現させた生成物でもよいし、あるいは化学合成法または内在遺伝子の活性化による生成物であってもよい。したがって、タンパク質は、組織、哺乳動物細胞または微生物細胞の培養物、植物細胞の培養物、トランスジェニック動物、酵母、菌類および／またはトランスジェニック植物から得られた天然または組換えの供給源のものでよい。適切な原核生物の宿主としては大腸菌のような様々な細菌があり；適切な真核生物の宿主としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはサルの細胞のような哺乳動物細胞、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどのトランスジェニック動物、植物細胞培養物、およびＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（苔）のようなトランスジェニック植物がある。使用される宿主によって、タンパク質発現産物は、哺乳類、植物またはその他の真核生物の炭水化物によってグリコシル化されていてもよいし、あるいは、グリコシル化されていなくてもよい。
【００５４】
本発明の範囲内では、野生型タンパク質の類似体は、野生型の配列と比較して追加のアミノ基などの追加のポリマー結合部位を含まないことが好ましい。さらに、類似体は、野生型のアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まないことが好ましい。しかしながら、野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。
【００５５】
タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合、Ｇ−ＣＳＦ発現産物は１位に開始メチオニン・アミノ酸残基を含んでいてもよい。本発明は、ありとあらゆる形態のＧ−ＣＳＦの使用を企図しているが、組換えＧ−ＣＳＦ、特に大腸菌由来のものが好ましい。ある種のＧ−ＣＳＦ類似体が生物学的機能を有することが報告されており、これらが本発明によってコンジュゲートに供されてもよい。これらのＧ−ＣＳＦ類似体には、配列番号１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と比較してアミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが挙げられる。本発明の範囲内で、これらの類似体は、配列番号１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号１の野生型のタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が最も好ましい。
【００５６】
好ましくは、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦの活性を有するもの、例えばＧ−ＣＳＦの突然変異体、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ、非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦおよび／またはその他の構造的および／または機能的修飾を有するＧ−ＣＳＦバリアントなどである。一層の好ましい実施形態では、タンパク質は、配列番号１（図２０を参照）で特定されるＧ−ＣＳＦの
アミノ酸配列を有し、該配列は、１７４アミノ酸に加えてＮ末端メチオニル残基を有する細菌で生産された組換えＧＣＳＦに相当するものである。生物学的活性を有するＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列であって、１位にメチオニル残基を含まないという点で配列番号１と異なるものも好ましく、野生型タンパク質と呼ばれるものも本発明の範囲内にある。
【００５７】
タンパク質がＧ−ＣＳＦの活性を有するものである場合、２つのアミノ基は、Ｇ−ＣＳＦのα−アミノ基（Ｎ末端基）およびリジン残基のε−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレットには、（ｉ）モノＰＥＧ化は、タンパク質のα−アミノ基とε−アミノ基との間のｐＫａの差異に基づいた反応性の違いが利用されて次の順序：Ｎ末端＞リジン３５＞リジン４１＞＞リジン１７，２４（ここでは有意なＰＥＧ化は検出できなかった）で生じ、また（ｉｉ）モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生物活性は次の順序：Ｎ末端＞リジン３５＞リジン４１で減少したことが示されている。ライダー−オルソン（Reidhaar-Olson）ら（Biochemistry、（１９９６）第３５巻、ｐ．９０３４−９０４１）によって記述されたアラニンスキャニング突然変異誘発から、リジン３５およびリジン４１が生物活性に関して重要な残基であることが明らかとなった。また、構造シミュレーション研究から、Ｇ−ＣＳＦのリジン１７およびリジン２４はタンパク質レセプター相互作用の領域内に位置するため、これらのリジンをＰＥＧ化するとタンパク質の生物活性が低くなる可能性があることが明らかとなった。したがって、これらの部位にポリエチレングリコールのようなポリマー部分を結合させれば、レセプター結合が立体的に妨害されることが考えられる。
【００５８】
ここで、本発明において使用される穏やかな反応条件の下では、ジＰＥＧ化は、利用可能なε−アミノ基の間の反応性の違いが識別されて別の順序すなわちＮ末端＞リジン１７およびリジン３５＞＞リジン２４，４１（ここでは有意なＰＥＧ化は検出できなかった）で生じることが見出された。したがって、ＰＥＧと結合する該タンパク質の２つのアミノ基は、Ｎ末端アミノ基、リジン１７のｅ−アミノ基およびリジン３５のｅ−アミノ基から成る群から選ばれることが好ましい。しかしながら、他の実施例では、ＰＥＧのようなポリマー基のカップリングは、リジン２４のｅ−アミノ基および／またはリジン４１のｅ−アミノ基で生じる場合もある。残基の番号は、配列番号１（図２０を参照）において特定されたＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列を参照するものである。
【００５９】
タンパク質はインターフェロン・ファミリーのタンパク質であってもよく、好ましくはタンパク質はインターフェロンαタンパク質、最も好ましくはインターフェロンα２ａである。タンパク質がインターフェロンα２ａである場合、その配列は好ましくは配列番号２（図２１を参照）である。本発明は、ありとあらゆる形態のインターフェロンα２ａ、さらには例えば生物学的機能を有する該タンパク質の類似体の使用をも企図している。これらの類似体には、配列番号２のインターフェロンα２ａアミノ酸配列と比較してアミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが含まれうる。本発明の範囲内では、これらの類似体は、配列番号２のインターフェロンα２ａアミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号２のインターフェロンα２ａアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号２の野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。
【００６０】
タンパク質がインターフェロンα２ａの活性を有するものである場合、ポリマー結合用の２つのアミノ基はα−アミノ基（Ｎ末端基）およびインターフェロンα２ａのリジン残基のｅ−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。潜在的なＰＥＧ結合部位の中では、配列番号２の成熟型タンパク質の１２１位、１３１位、１３４位、３１位および４９位のリジン残基が、溶媒に接触しやすいことから最も好ましいことが示された。しかしながら、本発明はさらに、ＰＥＧのようなポリマー基を、成熟型タンパク質配列のリジ
ン７０、８３、１１２、１６４、２３および／またはリジン１３３のε−アミノ基に結合させることにも関する。
【００６１】
タンパク質がエリスロポエチンである場合、配列番号３（図２２を参照）の配列を有することが好ましい。本発明は、ありとあらゆる形態のエリスロポエチン、さらには例えば該タンパク質の生物学的機能を有する類似体の使用をも企図している。本発明はさらに、グリコシル化および非グリコシル化エリスロポエチンのいずれの使用も企図している。これらの類似体には、配列番号３のエリスロポエチン・アミノ酸配列と比較して、アミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが含まれうる。本発明の範囲内では、これらの類似体は、配列番号３のエリスロポエチン・アミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号３のエリスロポエチン・アミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号３の野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。
【００６２】
タンパク質がエリスロポエチンの活性を有するものである場合、ポリマー結合用の２つのアミノ基はα−アミノ基（Ｎ末端基）およびエリスロポエチンのリジン残基のｅ−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。潜在的なＰＥＧ結合部位の中では、配列番号３の成熟型タンパク質の５２位、１１６位および１５２位のリジン残基が、溶媒に接触しやすいことから最も好ましいことが示された。しかしながら、本発明はさらに、ＰＥＧのようなポリマー基を、成熟型タンパク質配列のリジン２０、４５、９７、１４０および／またはリジン１５４のε−アミノ基に結合させることにも関する。
【００６３】
タンパク質がｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）である場合、配列番号４（図２３を参照）の配列を有することが好ましい。本発明は、ありとあらゆる形態のｈＧＨ、さらには例えば該タンパク質の生物学的機能を有する類似体の使用をも企図している。これらの類似体には、配列番号４のｈＧＨアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが含まれうる。本発明の範囲内では、これらの類似体は、配列番号４のｈＧＨアミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号４のｈＧＨアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号４の野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。
【００６４】
タンパク質がｈＧＨの活性を有するものである場合、ポリマー結合用の２つのアミノ基はα−アミノ基（Ｎ末端基）およびｈＧＨのリジン残基のｅ−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。潜在的なＰＥＧ結合部位の中では、配列番号４の成熟型タンパク質配列の１４０位、１４５位、３８位および７０位のリジン残基が、溶媒に接触しやすいことから最も好ましく、一方、該成熟型タンパク質の１７２位、４１位、１５８位、１６８位および１１５位のリジン残基は、レセプター結合に関与することからあまり好ましくないことが示されている（クラーク（Clark ）ら、（１９９６）J. Biol. Chem.、第２７１巻（３６）、ｐ．２１９６９−２１９７７）。しかしながら、本発明はさらに、ＰＥＧのようなポリマー基を、成熟型タンパク質配列のリジン４１、１１５、１５８、１６８および／またはリジン１７２のε−アミノ基に結合させることにも関する。
【００６５】
さらに、アミノ基に結合させるポリエチレングリコール部分の分子量は、２〜１００ｋＤａ、好ましくは５〜６０ｋＤａ、より好ましくは１０〜３０ｋＤａ、および最も好ましくは１２〜２０ｋＤａである。本発明の一層の好ましい実施形態では、ポリエチレングリコール部分のエチレンオキシド残基の数ｎは、約４０〜約２２７０、より好ましくは約１１０〜約１３７０、および最も好ましくは約２２５〜約６８０である。
【００６６】
本発明の別の態様では、上記のポリマー・タンパク質コンジュゲートの医薬組成物が提供される。そのような医薬組成物は、注射による投与、あるいは経口、経肺、経鼻またはその他の形式による投与に好適であってよい。概して、本発明は、有効な量の本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを、薬学的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に含んでなる医薬組成物を提供する。そのような組成物は、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩のような様々なバッファー含有量、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤を含んでもよいし；ツウィーン８０のような界面活性剤および可溶化剤、アスコルビン酸およびメタ亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤、ベンジルアルコールのような防腐剤、およびラクトースまたはマンニトールのような増量物質、などの添加剤を含んでもよく；該材料が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の微粒子調製物内に、あるいはリポソーム内に組み込まれてもよい。そのような組成物は、本発明によるポリマー・タンパク質コンジュゲートの物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼす場合がある。
【００６７】
既に上述したように、本発明の医薬調製物は、少なくとも１つの本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを含む。混合物中での２つのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの比率を選択するために２つのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの混合物を調製すると有利な場合がある。更に、望ましい場合は、様々な数のポリマー部分が結合した様々なタンパク質の混合物を調製し、この混合物を、本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートと組み合わせて、本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを所定の割合で有する混合物を生成させてもよい。
【００６８】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の調製物は、α−アミノ基（Ｎ末端基）およびリジン１７のｅ−アミノ基がポリエチレングリコール部分と結合したＧ−ＣＳＦ、ならびにＮ末端アミノ基およびリジン３５のｅ−アミノ基がポリエチレングリコール部分と結合したＧ−ＣＳＦから成る群から選択された、アイソフォームまたはジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームとも呼ばれる少なくとも１つのジポリエチレングリコール−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを含む。ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートのアイソフォームは、該タンパク質中に３個以上のＰＥＧ結合部位、例えばアミノ基の窒素原子が３個以上ある場合に生じうる。いずれのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームも、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの混合物と比べて同じ生物活性を示す。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、指定のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート調製物は、上述のような２つのアイソフォーム、例えば、Ｎ末端基とリジン１７のｅ−アミノ基とにポリエチレングリコール部分を備えたアイソフォーム（以下、Ｎ末端基＋リジン１７とも呼ぶ）、ならびにＮ末端基とリジン３５のｅ−アミノ基とにポリエチレングリコール部分を備えたアイソフォーム（以下、Ｎ末端基＋リジン３５とも呼ぶ）を、任意の所定の化学量論比、例えば０．１〜１０、または０．５〜２、または０．７５〜１．３３、あるいは約１の比で含みうる。
【００７０】
以下に示す実施例で実証するように、上述のような２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの所定の混合物［（Ｎ末端基＋リジン１７）／（Ｎ末端基＋リジン３５）の混合比が例えば約０．７６：１のもの］で構成される本発明の所定の生成物または調製物は、モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）として市販）の生理活性に匹敵する生理活性を有し、かつ非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）として市販）より高い生理活性すらも有する。更に、上述のような２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームは、別の実施例において示すように同等の生理活性を有する。したがって、上述のような２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの各々が、モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生理活性に匹敵し、かつ非修飾型Ｇ−ＣＳＦの生理活性よりさらに高い生理活性を有する。この
ことは、（ｉ）構造研究から（アリトミ（Aritomi ）ら、Nature、１９９９年、第４０１巻、ｐ．７１３−７１７）、および（ｉｉ）ヤング（Young ）ら記載のアラニンスキャニング突然変異誘発実験から（Protein Science 、１９９７年、第６巻、ｐ．１２２８−１２３６）推測可能な、リジン１７の修飾を含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの生物活性への悪影響を仮定する仮説とは対照的である。
【００７１】
更に、異なる分子量（すなわち１２ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を有するＰＥＧ分子が結合しているジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームが、同等の生物活性を有することが示された。両アイソフォームの生物活性はモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生物活性に匹敵する。しかしながら、２０ｋＤａのＰＥＧが結合したタンパク質は、１２ｋＤａのＰＥＧが結合したタンパク質に比べて白血球数および好中球数がわずかに高く、応答性が維持されている。
【００７２】
別の態様によれば、本発明は、上述のような少なくとも１つのジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを、多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートとともに混合して含む、ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの混合医薬調製物であって、前記ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの割合が予め指定されていることを特徴とする医薬混合調製物を提供する。本発明の状況において、用語「多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート」とは、１タンパク質分子当たり３以上のＰＥＧ部分を有するタンパク質コンジュゲートを意味する。混合医薬調製物中の前記少なくとも１つのジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの割合は、１％〜９９％、好ましくは５０％〜９９％、より好ましくは６０、７０、８０または９０％〜９９％、ならびに最も好ましくは９２、９４、９６、９８〜９９％の範囲にある。
【００７３】
本発明の別の態様によれば、ポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートのようなポリマー・タンパク質コンジュゲートの調製方法であって、還元的アルキル化条件の下で、ジＰＥＧ化タンパク質のようなジポリマー・タンパク質コンジュゲートを主として生成する方法が提供される。好ましくは、ＰＥＧ試薬のようなポリマー試薬をタンパク質とともにこのようにジポリマー・タンパク質コンジュゲートへと変換することは、適切な反応時間、適切なタンパク質濃度、ポリマーとタンパク質との適切なモル比および適切な反応温度のような、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートが豊富に得られる反応条件を選択することにより達成される。ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを主として調製するための方法を提供することが特に好ましい。
【００７４】
本発明の状況において、ポリマーをタンパク質とともに選択的または優先的または主としてジポリマー・タンパク質コンジュゲートへと変換すること、あるいはジポリマー・タンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として生産すること、あるいはタンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々１つのポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として調製することは、本発明の方法による反応混合生成物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、そして最も好ましくは少なくとも４０％または少なくとも４５％、あるいはさらに少なくとも５０％または少なくとも６０％が、本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートであることを意味する。本発明の状況において、反応混合物中のジポリマー・タンパク質コンジュゲートの割合（％）は、ＨＰＬＣシステムを使用した陽イオン交換クロマトグラフィーおよび質量分析によって決定された反応混合物中のすべての同定された分子種または生成物の量に関する少なくとも１つのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの量である。
【００７５】
本発明の状況において、ＰＥＧをタンパク質とともに選択的または優先的または主としてジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートへと変換すること、あるいはジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として生産すること、ある
いはタンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々１つのポリエチレングリコール単位と結合しているポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として調製することは、本発明の方法による反応混合生成物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、そして最も好ましくは少なくとも４０％または少なくとも４５％、あるいはさらに少なくとも５０％または少なくとも６０％が、本発明のジＰＥＧ化されたＰＥＧタンパク質コンジュゲートであることを意味する。本発明の状況において、反応混合物中のジＰＥＧ化されたＰＥＧタンパク質コンジュゲートの割合（％）は、ＨＰＬＣシステムを使用した陽イオン交換クロマトグラフィーおよび質量分析によって決定された反応混合物中のすべての同定された分子種または生成物の量に関する少なくとも１つのジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの量である（表１も参照のこと）。
【００７６】
好ましくは、本発明の２つのプロセス・サイクルの各々の反応時間は、約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈである。しかしながら、当業者であれば、反応時間は反応温度のような他のプロセス・パラメータと相互関係を有するという事実を承知している。この点では、シャモフ（Chamov）ら（Bioconjugate Chemistry（１９９４）第５巻（２）、ｐ．１３３−１４０）により、反応温度を増加させると反応時間が少なくとも２分の１に減少することが実証されている。さらに、非グリコシル化タンパク質については、反応時間はタンパク質に対するポリマーのモル比にも依存することが見出されている。例えば、所与のタンパク質濃度に対してポリマー量を２倍にすると、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートの形成反応時間を２分の１に減少させることができる。
【００７７】
反応は、２℃〜５０℃の温度で、より好ましくは２℃〜８℃の温度で、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれることが好ましい。既に上に述べたように、特定温度の選択は反応時間に影響する場合があり、反応時間はタンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートが優先的に調製されるように選択されるべきである。特に、反応時間は好ましくは約６ｈ〜約４８ｈであるが、反応温度を上昇させた場合には６ｈ未満、例えば１ｈ、２ｈ、４ｈ、または５ｈであってもよい。例えば、反応が１５℃〜２５℃、好ましくは１８℃〜２４℃、および最も好ましくは２２℃の温度で行なわれる場合、反応時間は少なくとも６ｈ、好ましくは６ｈ〜１２ｈまたは８ｈ〜１０ｈであり、反応が５℃で行なわれる場合は少なくとも１８ｈである。
【００７８】
さらに、タンパク質濃度が０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは３〜７ｍｇ／ｍｌで反応が行なわれることが好ましい。
さらに好ましい本発明の実施形態によれば、反応はタンパク質とポリマーとのモル比を１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、最も好ましくは１：１５〜１：３０として行われる。本発明の状況においては、タンパク質とポリマーとのモル比は、反応試料中の所与のタンパク質濃度におけるタンパク質のモル数とポリマーのモル数との間の比を意味する。タンパク質とポリマーとのモル比に基づいて、タンパク質内のアミノ基とポリマー分子との化学量論比を推定することが可能である。本発明の状況においては、アミノ基とポリマー分子との化学量論比は、タンパク質分子の数に対するタンパク質内のα−およびε−アミノ基の数を意味する。
【００７９】
非グリコシル化タンパク質については、アミノ基の数に対して、例えばインターフェロンα２ａの場合には少なくとも１．２５倍過剰、ＧＣＳＦの場合には２倍過剰の数のポリ
マー分子が、ポリマー基が２つ結合したタンパク質を主に生産するのに必要であり、一方グリコシル化タンパク質については、ポリマー分子の数に対してアミノ基の数が過剰であってもジポリマー・タンパク質コンジュゲートが主として生産される、ということが見出された。
【００８０】
したがって、非グリコシル化タンパク質については、ポリマー分子の数に対するアミノ基の数の化学量論比が、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：３０、最も好ましくは１：２〜１：１０の範囲にあることが好ましい。
【００８１】
グリコシル化タンパク質については、ポリマー分子の数に対するタンパク質内のアミノ基の数の化学量論比が、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０の範囲にあることが好ましい。最も好ましくは、化学量論比は、１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９あるいは１：１である。他の好ましい化学量論比は、１：２〜１：１０または１：２〜１：５である。
【００８２】
本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、タンパク質とポリマーとのモル比は１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、最も好ましくは１：１５〜１：３０である。
【００８３】
本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、アミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、非グリコシル化タンパク質について、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：３０、最も好ましくは１：２〜１：１０の範囲にあることが好ましい。
【００８４】
本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、グリコシル化タンパク質について、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０の範囲にあり、最も好ましくは、化学量論比は、１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９あるいは１：１である。
【００８５】
本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約
２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、反応は、２℃〜５０℃の温度、より好ましくは２℃〜８℃、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれ、タンパク質とポリマーとのモル比は１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、最も好ましくは１：１５〜１：３０である。
【００８６】
本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、反応は、２℃〜５０℃の温度、より好ましくは２℃〜８℃の温度、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれ、アミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、非グリコシル化タンパク質について、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：３０、最も好ましくは１：２〜１：１０の範囲にある。
【００８７】
本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、反応は、２℃〜５０℃の温度、より好ましくは２℃〜８℃の温度、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれ、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、グリコシル化タンパク質について、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０の範囲にあり、最も好ましくは、化学量論比は、１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９あるいは１：１である。
【００８８】
タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：２〜１：１０である。
【００８９】
タンパク質がインターフェロンα２ａである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：１〜１：１０の範囲にあり、最も好ましくは１：１．２５である。
【００９０】
タンパク質がエリスロポエチンである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：０．５〜１：８の範囲にあり、最も好ましくは１：０．６２５である。
【００９１】
タンパク質がｈＧＨである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：１〜１：８の範囲にあり、最も好ましくは１：１．６である。
【００９２】
還元的アルキル化において使用される還元剤は、ＮａＣＮＢＨ４またはＮａＢＨ４から選択されることが好ましいが、これらに限定はされない。
さらに、反応は、特にタンパク質がＧ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ｈＧＨまたはインターフェロンの生物活性を有するタンパク質である場合には、中性付近、例えば、ｐＨ６
〜８、より好ましくはｐＨ６．９〜７．８、最も好ましくはｐＨ７．２〜７．５で行なわれることが好ましい。他のタンパク質については、ｐＨ４．５〜７．５または５．０〜６．５または約５．５からｐＨを選択することが望ましい場合がある。
【００９３】
好ましい範囲のｐＨを維持するために、反応を、バッファー（例えば、リン酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳおよび／またはｂｉｃｉｎｅバッファーから選択可能）の存在下で行うとよい。
【００９４】
本発明の方法において使用されるＰＥＧ試薬は一般に、次式：
［Ｒ−Ｌ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ］ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−１−ＣＨＯ（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ｎは、ポリエチレングリコール部分の中のエチレンオキシド残基の数を表す整数であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり；Ｌ１は、Ｏ、Ｎ、Ｓおよび分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は、分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であって、ただしＬ２が存在しない場合にはｙは１であり、Ｌ２が存在する場合にはｙは少なくとも１である）を有する試薬である。
【００９５】
好ましくは、Ｒ、ｍ、ｎ、Ｌ１、Ｌ２およびｙは、本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲートについて上記されているように定義される。
さらに、該ポリマー試薬がＰＥＧアルデヒド、より好ましくはＰＥＧアセトアルデヒド、最も好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒド（ｍＰＥＧアセトアルデヒド）であることが好ましい。
【００９６】
タンパク質と反応させるための、単一のアルデヒド基を有するポリエチレングリコールは、対応するアセタールの形態で保存可能である。該ＰＥＧアセタール先駆物質は、結合しようとするタンパク質とともに変換させる前のどの時点で活性化してＰＥＧアルデヒド試薬としてもよいが、ただし活性化されたＰＥＧアルデヒドが本発明の方法によりタンパク質と結合するまで安定であることを条件とする。例えば、単一のアセトアルデヒド基を有するポリエチレングリコール試薬を得るためには、対応するポリエチレングリコールジエチルアセタールを活性化すればよい。
【００９７】
この問題に関連して、メトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのようなポリエチレングリコール・アセトアルデヒドの長期保存方法が提供され、該方法では、ポリエチレングリコール・アセトアルデヒドは窒素のような不活性雰囲気下で約−２０℃以下の温度で固体物質として保存される。この方法によれば、メトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのようなポリエチレングリコール・アセトアルデヒドを、少なくとも１か月、好ましくは少なくとも２か月、より好ましくは少なくとも３か月、最も好ましくは少なくとも４または６か月保存可能である。
【００９８】
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、該方法は、分離ステップまたは精製ステップをさらに含み、該ステップは、ジポリマー・タンパク質コンジュゲート、好ましくはジＰＥＧ化ポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートであって、タンパク質の２つの所定のアミノ基が各々１つのポリマー単位と結合しているコンジュゲートのプール（生成物プールとも呼ばれる）をもたらし、かつ、未反応タンパク質、未反応ポリマー試薬、生成物プールのジポリマー・コンジュゲート以外のジポリマー・タンパク質コンジュゲート・アイソフォーム、および／またはタンパク質の２未満もしくは３以上のアミノ基がポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートを含有するプール（残余物プールとも呼ばれる）を生じさせる。
【００９９】
この生成物プールおよび残余物プールを生成する分離ステップまたは精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィーによって行われることが好ましい。
本発明の方法の化学反応および穏やかな反応条件により、本発明の別の方法（例えば本発明による別のジＰＥＧ化方法）についての望ましくない安定な反応生成物のフラクションを再利用することが可能となる。従って、別の好ましい実施形態によれば、残余物プールを再び本発明の方法に供する。例えば、ＰＥＧ試薬による変換において非ＰＥＧ化タンパク質のみを使用する代わりに、残余物プールを、還元的アルキル化条件の下で、単一のアルデヒド基（例えばアセトアルデヒド基）を有するポリエチレングリコール試薬と反応させる。このとき、反応時間、反応温度、モル比および／または化学量論比は、タンパク質のアミノ基の窒素原子２つが各々１つのポリエチレングリコール単位と結合しているポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートが選択的に調製されるように選択する。反応時間、反応温度、モル比および化学量論比は、本発明の方法について上述したようにして選択される。
【０１００】
この好ましい再利用ステップにより、本発明のジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートのようなジポリマー・タンパク質コンジュゲートの収量を著しく増加させることが可能となる。特に、タンパク質のアミノ酸鎖の所定位置のアミノ基の窒素原子にＰＥＧ部分が結合しているジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲート・アイソフォームを得ることができる。
【０１０１】
本発明の状況において、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートには、広義には、２つのポリエチレングリコール単位と結合し、該ポリエチレングリコール単位が両方とも各々タンパク質の１つのアミノ基と結合している、任意のタンパク質が含まれる。本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートは、タンパク質のアミノ基由来のアミンとポリエチレングリコール単位のエチレンオキシド残基の鎖との間にＣ２リンカーを有するジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートを選択的に生じさせる還元的アルキル化条件の下で、ポリエチレン・アセトアルデヒド分子をタンパク質と反応させることにより得られることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０２】
本発明の特徴および利点は、さらなる好ましい実施形態についての以降の記載からより詳細に明らかとなろう。最良の形態を含むこれらの実施形態では、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびヒト成長ホルモンがタンパク質として例証され、ＰＥＧがポリマー部分として例証される。しかしながらこのことは、上記タンパク質とＰＥＧとのジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートが特に好ましいとはいっても、本発明を上記タンパク質とＰＥＧとのコンジュゲートに限定するものとして解釈すべきではない。
【０１０３】
本発明の１つの態様は、ポリエチレングリコール・アルデヒド部分を、還元的アルキル化条件の下でタンパク質のａ−アミノ基およびｅ−アミノ基に結合させることにより、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを調製する方法に関する。
【０１０４】
この方法の第１のステップは、任意選択で、タンパク質とともに変換させるべき相応のポリエチレングリコール試薬を準備することであってよい。好ましい実施形態では、ポリエチレングリコール試薬はポリエチレングリコール・アセトアルデヒドであり、より好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドである。米国特許第５，２５２，７１４号明細書には、メトキシＰＥＧアセトアルデヒドがアルドール分解および酸化により水溶液中で不安定であることが記載されている。従って、本発明の１つの実施形態では、ポリエチレングリコール試薬を提供する方法は、メトキシＰＥＧアセトアルデヒドの安定な保存形態であるメトキシＰＥＧジエチルアセタールを活性化してメトキシＰＥＧアセトアルデヒドにすることを含む。
【０１０５】
しかしながら、驚くべきことに、窒素下および低温、例えば−２０℃以下で固体物質として保存すると、ＰＥＧアセトアルデヒドの活性は、少なくとも４か月、好ましくは少なくとも６か月、最も好ましくは少なくとも１年間保存可能であり、従ってその期間に再現性良くジＰＥＧ化を行うことが可能であることがわかった。本発明の状況において、再現性の良いジＰＥＧ化とは、ジＰＥＧ化タンパク質の収率および反応速度論において同等であることを意味する。従って、本発明の他の実施形態では、ＰＥＧアセトアルデヒドはタンパク質との反応の直前に提供される必要はない。むしろ、ＰＥＧジエチルアセタール先駆物質を、タンパク質（好ましくはＧ−ＣＳＦ）との反応の数時間前（例えば１２時間または２４時間前）、好ましくは数週間前（例えば１週間または２週間前）、あるいは数か月前（例えば２、３または４か月前）あるいはそれ以前に、ＰＥＧアセトアルデヒド、好ましくはメトキシＰＥＧアセトアルデヒドへと活性化してもよい。
【０１０６】
さらに、本発明の再利用ステップを含むジＰＥＧ化方法の収率および／または反応速度論に影響を及ぼすパラメータが同定された。これらのパラメータには、タンパク質濃度、タンパク質とＰＥＧとのモル比、タンパク質がグリコシル化されているか否かによって変化するタンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比、ｐＨ、還元的アルキル化において使用される還元剤、温度、インキュベーション時間、共溶媒、撹拌速度および撹拌方法、バッファーのイオン強度が含まれる。
【０１０７】
国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレットは、十分に酸性のｐＨでは、α−アミノ基およびｅ−アミノ基のｐＫａ差からみてα−アミノ基のモノＰＥＧ化が選択的に生じることを教示している。国際公開公報第０３／０４９６９９号パンフレットには、ｐＨ５．５〜７．５の範囲のｐＨでのＰＥＧ化はα−アミノ基においてのみ生じ、その結果モノＰＥＧ化タンパク質が得られることが記載されている。シャモウ（Chamow）ら（Bioconjugate Chemistry（１９９４）第５巻（２）、ｐ．１３３−１４０）は、ｐＨ７．５ではＣＤ４−ＩｇＧのａ−アミノ基がプロトン化されていないために主にこのアミノ基がＰＥＧ化され、一方、ｅ−アミノ基はプロトン化されているためＰＥＧ化されないままであることを述べている。この結果としてほぼ完全にモノＰＥＧ化タンパク質分子が生じる。
【０１０８】
しかしながら、今回、タンパク質の異なるｅ−アミノ基の間で検知される反応性の違いを利用してジＰＥＧ化タンパク質を優先的に生産するパラメータを、本発明の方法について選択可能であることが見出された。ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびｈＧＨについては、本発明によるＰＥＧ化反応は、中性付近、例えばｐＨ６．５〜７．５で行なわれることが好ましい。本発明による他のジポリマー・タンパク質コンジュゲートＰＥＧ化反応については、より酸性またはより塩基性のｐＨ、例えばｐＨ３、４、５、５、８、９または１０に調節することが望ましい場合もある。
【０１０９】
特に、Ｇ−ＣＳＦのようなタンパク質のＰＥＧ化度について重要な１つのパラメータは、反応時間であることが分かった。好ましい実施形態では、好ましい反応時間は、反応混合物の少なくとも２０％が、ジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲート、すなわちタンパク質の２つのアミノ基が各々１つのポリエチレングリコール単位と結合しているポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートからなるように選択される。他の好ましい実施形態では、ジＰＥＧ化反応の反応時間は、反応混合物の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％あるいは少なくとも５０％が、ジＰＥＧ化ＧＣＳＦのようなジＰＥＧ化タンパク質からなるように選択される。
【０１１０】
特に、タンパク質濃度、タンパク質とＰＥＧとのモル比、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比、ｐＨおよび温度などのパラメータの所定のセットについて、ポリエチレングリコール試薬、好ましくはポリエチレングリコール・アセトアル
デヒド、より好ましくはメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）アセトアルデヒドを、タンパク質、好ましくはＧ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびｈＧＨとともにインキュベーションするための、ジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの形成に有利に働く特定の時間フレームが存在することが分かった。Ｇ−ＣＳＦの例に関して図３に示すように、各ｍＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート、すなわちモノ−、ジ−、トリ−およびテトラＰＥＧ化物の収量はインキュベーション時間に依存して変わる。インキュベーションの初期には、モノＰＥＧ化物の収量が最大に達して減少が始まる（データは示さない）のに対し、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートは漸増的に形成される。次に、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの収量が最大に達して数時間維持された後で減少し始める一方、トリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートは漸増的に形成される。調べたインキュベーション時間内では、トリＰＥＧ化およびそれ以上にＰＥＧ化されたコンジュゲートはその最大収量に達しない。
【０１１１】
従って、本発明の方法の反応時間に関して所定の時間フレームを選択することは、Ｇ−ＣＳＦなどのＰＥＧ化タンパク質の特定のアイソフォームまたは分子種を高収率で生産するために不可欠であることが分かった。
【０１１２】
ジＰＥＧ化タンパク質の生産のための別の重要なパラメータは、タンパク質とＰＥＧとのモル比、およびタンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数の化学量論比であり、化学量論比はグリコシル化タンパク質と非グリコシル化タンパク質とで異なっている。
【０１１３】
通常、本発明の方法はＰＥＧ化状態の異なる形態の混合生成物を生じ、該混合生成物はジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートが非常に豊富、すなわち反応混合物のうち好ましくは少なくとも２０％、またはより好ましくは少なくとも３０％がジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートからなる。しかしながら、該反応混合物は、未反応タンパク質、未反応ポリマーおよび別のＰＥＧ化状態のタンパク質コンジュゲートをも含んでいる。したがって、本発明の方法は、望ましくない物質からジＰＥＧ化物を分離するために、例えばクロマトグラフィー、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーのステップ、より好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィーのステップ（Ｃ−ＩＥＸ）による精製ステップをさらに含むことが好ましい。この精製ステップでは、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートは、未反応タンパク質、未反応ＰＥＧ試薬、および／または１タンパク質当たり３以上もしくは２未満のポリエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール・コンジュゲートから分離されうる。さらに、ＰＥＧ結合部位が所望のジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲート生成物と異なっているジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート・アイソフォームが分離される場合もある。ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート生成物を含むプールは生成物プールとも呼ばれ、望ましくない化合物を含むプールは残余物プールまたは生成物非含有溶出液とも呼ばれる。
【０１１４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの全収量は、本発明の別のＰＥＧ化方法において、Ｃ−ＩＥＸステップのような精製ステップから得られた生成物非含有溶出液を再利用することによってさらに増加させることが可能と思われる。この実施形態では、クロマトグラフィーカラム（例えばＣ−ＩＥＸカラム）の溶出液を、通常は、バッファー交換および濃縮のために限外濾過および／または透析濾過に供し、次に、ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬、好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのようなアセトアルデヒドを用いて変換させる。
【０１１５】
本発明の別の態様では、本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートが高い生物活性を示し、該活性が本発明のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびアイソフォーム混合物のバイオアッセイで実証されたことが示された。本発明のコンジュゲートは、天然Ｇ−ＣＳＦの造血性の生物学的特性を示した。特に、インビボのデータから、本発明のジＰ
ＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびアイソフォーム混合物を投与すると好中球および白血球数が増加することが明らかとなり、さらに、生物活性の時間が持続されることが明らかとなったが、このことは、コンジュゲートではないＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））の反復注射と比較して、治療コース当たりのＧ−ＣＳＦの注射を少なくすることができるため、患者にとって実際的な利点をもたらすものである。
【０１１６】
本発明のＰＥＧ化方法のさらなる実施形態をより詳細に以下に説明する。
［ポリエチレングリコール・アセタールの活性化］
本発明の方法において、タンパク質コンジュゲートの作製に次式：
（Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨＯ
を有するポリエチレングリコール・アルデヒドを使用することが好ましく、上記式中、ＲはＨまたはメチルのような低級アルキルであり；ｎは、ポリエチレングリコール部分のエチレンオキシド残基の数を表わす整数であって好ましくは２２５〜６８０であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり；Ｌ１は不在であり；Ｌ２は不在であり；ｙは１である。当業者は、これらの化合物および本発明による他のポリマー試薬を生産するためのプロトコールおよび条件についてよく承知している（例えば欧州特許出願第０  １５４  ３１６号明細書；米国特許第５，９９０，２３７号明細書；シャモフ（Chamov）ら、Bioconjugate Chem.、１９９４年、第５巻、ｐ．１３３−１４０を参照のこと）。
【０１１７】
１つの実施形態では、本発明の方法は、メトキシポリエチレングリコール・アセタールのようなポリエチレングリコール試薬の前駆物質化合物を、メトキシポリエチレングリコール・アルデヒドのような活性化されたポリエチレングリコール・アセトアルデヒドに変換することにより開始される。この活性化は通常、水溶液中で、例えば最大３時間、酸性ｐＨ、例えばｐＨ２（任意の有機酸および／または無機酸を加えることにより達成可能）で行なわれる。通常、ポリエチレングリコール・アセタールからポリエチレングリコール・アルデヒドへの変換は１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定による成分分析により検知される。
【０１１８】
［ＰＥＧ化反応］
ＰＥＧ化反応において変換されるタンパク質としては、任意の天然もしくは組換えタンパク質、または任意の原核生物もしくは真核細胞から得られるようなタンパク質バリアントまたはタンパク質変異体を使用することができる。ヒトのタンパク質が好ましい。特に、野生型形態の活性を有する任意のタンパク質、例えばバリアント、突然変異タンパク質、構造上または機能的に同等なタンパク質ならびにタンパク質様の合成物を使用することができる。しかしながら、野生型タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質の使用が好ましい。
【０１１９】
好ましくは、Ｇ−ＣＳＦの活性を有するタンパク質、より好ましくは配列番号１に特定されたアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦが、本発明の方法において使用される。天然または組換えの供給源からＧ−ＣＳＦを入手し単離することはよく知られている。（例えば欧州特許出願第０  ２３７  ５４５号、同第０  １６９  ５６６号明細書）通常、Ｇ−ＣＳＦは、適切なバッファー、例えば１０ｍＭの酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．０）中にて低濃度、例えば約１ｍｇ／ｍｌで保存される。
【０１２０】
他の好ましいタンパク質は、インターフェロン・ファミリーのタンパク質、好ましくはＩＦＮα２ａと、エリスロポエチンおよびヒト成長ホルモンであって、それぞれ配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を有するもの、ならびにその類似体である。
【０１２１】
さらに、本発明によるＰＥＧ化反応は、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンまたはヒト成長ホルモンのようなタンパク質と、生理学的バッファー系と、メトキシポリ
エチレングリコール・アセトアルデヒドのような活性化ポリエチレングリコール・アルデヒドと、還元剤とを含んでいる適切なインキュベータ中で一般に行なわれる。さらに、反応混合物を低温で静かに撹拌することが好ましい。反応は、反応混合物の酸性化によって停止可能である。
【０１２２】
反応バッファー
本発明によるＰＥＧ化反応用の典型的な反応バッファーには、リン酸、クエン酸／リン酸、カコジル酸、炭酸、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ｂｉｃｉｎｅおよび／またはその他の適切なバッファーが挙げられる。
【０１２３】
バッファーの使用濃度は、使用されるタンパク質の量に依存して変更可能である。典型的な濃度は５０〜２００ｍＭのリン酸バッファーなどのバッファーである。しかしながら、イオン強度が異なってもジＰＥＧ化生成物の収量には影響しない。
【０１２４】
タンパク質濃度
本発明のＰＥＧ化方法に使用されるタンパク質の濃度は、溶解度および凝集性のようなタンパク質の物理化学的性質、ならびに方法の経済性に依存する。タンパク質濃度が高いほど、同等な生成物収量とするためのタンパク質とポリエチレングリコール試薬との規定モル比は小さくなる。
【０１２５】
本発明によるＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化については、反応混合物中のタンパク質の濃度は、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２または２．４〜約５．７または６ｍｇ／ｍｌの範囲であり、最も好ましくは約３．２ｍｇ／ｍｌである。
【０１２６】
ポリエチレングリコール・アルデヒドとタンパク質とのモル比
ポリエチレングリコール・アルデヒド部分の濃度はジＰＥＧ化タンパク質の最終的な収量に影響しないことが分かった。しかしながら、一定のタンパク質濃度に対するポリエチレングリコール濃度が高いほど、反応はより速く終了点に達する。
【０１２７】
従って、本発明によるタンパク質のジＰＥＧ化は、広範囲のタンパク質とポリエチレングリコール試薬とのモル比において実施可能である。好ましくは、ポリエチレングリコール・アルデヒド、例えばメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのタンパク質に対するモル比が約５：１〜４００：１であることが好ましい。より好ましくは、特に非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦのジＰＥＧ化について、モル比は１０：１〜５０：１であり、最も好ましくは１５：１〜３０：１である。
【０１２８】
タンパク質内のアミノ基に対するポリエチレングリコールの化学量論比
非グリコシル化タンパク質について、２つのポリマー基を備えたタンパク質を生産するためには、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、１：１．２５〜１：５０、好ましくは１：１．２５〜１：３０、より好ましくは１：２〜１：１０の範囲であることが好ましい。
【０１２９】
グリコシル化タンパク質については、ＰＥＧ結合に関し接触可能となるアミノ基の数が所与のタンパク質濃度におけるポリマー分子の数に対して過剰であっても、主としてジポリマー・タンパク質コンジュゲートが生産される。
【０１３０】
したがって、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、グリコシル化タンパク質については、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０までの範囲であり、最も好ましくは化学量論比は１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、
２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９または１：１である。
【０１３１】
ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬の分子量
本発明によるタンパク質のジＰＥＧ化は、広範囲の分子量のポリエチレングリコール試薬（すなわち２〜１００ｋＤａ）において実施されうる。ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬の好ましい分子量は、１０〜３０ｋＤａ、例えば１２〜２０ｋＤａの範囲にある。分子量が大きいほど、ジＰＥＧ化の収量は低くなる可能性があり、次いで反応混合物の粘性が増大する場合がある。
【０１３２】
ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬の化学構造は重要ではなく、したがって直線状のものに限定されるものではなく分岐状であってもよい。
反応温度
通常、本発明による方法の反応温度は、約２℃〜５０℃、より好ましくは２℃〜２０℃の範囲にある。好ましくは、化学的または物理的なプロセスによるタンパク質の分解および／または凝集のような非特異的な変性を最小限にするために、本発明の方法は低い温度で行なわれる。従って、本発明の方法について最も好ましい反応温度は、約２℃〜約８℃の範囲にあり、例えば約４℃である。
【０１３３】
還元剤
ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの収量に対する還元剤の影響は、欧州特許出願第０
１５４  ３１６号明細書（１００〜４００倍モル濃度過剰のＮａＣＮＢＨ４）および国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレット（７５倍モル濃度過剰のＮａＣＮＢＨ４）のいずれにも報告されていない。欧州特許出願第０  １５４  ３１６号明細書には、還元剤は水溶液中で安定であるべきで、還元的アルキル化の初期過程で形成されたシッフ塩基だけを還元することができると好ましいことが述べられている。
【０１３４】
好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムから成る群から選択可能であり、使用されるタンパク質の濃度に対して過剰に加えるべきである。シアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤のモル濃度過剰量が低い、すなわち１１７倍モル濃度過剰より少ないと、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの形成は減速するが、最大１８０倍モル濃度過剰のモル濃度過剰量など高濃度の還元剤と比較してジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの最大収量は同じになることが見出された。１２０倍モル濃度過剰の範囲より高いモル濃度過剰量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムでは、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの速度論的形成は、使用される還元剤の濃度に依存しない。
【０１３５】
攪拌方法および攪拌速度
ＰＥＧ化反応混合物のインキュベーションに旋回式撹拌を加えても加えなくても、最終的なジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの収量には影響しないことがわかった。更に、旋回式撹拌の速度が速いほど、同じインキュベーション時間での最終的なジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート収量が低くなることがわかった。
【０１３６】
共溶媒
イオン性液体を、部位選択的なＰＥＧ化のための共溶媒として試験したところ、１−ブチル−４−メチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸などの共溶媒の濃度を増大させると最終的なジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの収量が減少することが明らかとなった。
【０１３７】
［精製］
既に上述したように、本発明によるＰＥＧ化反応を好ましくは酸性化によって停止させた後、一般には反応混合物を精製ステップに、好ましくは反応混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーに供する。
【０１３８】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、すべての一般的かつ／または市販の陽イオン交換マトリクスを用いて実施することが可能である。本発明の目的で使用されうる典型的なイオン交換樹脂は、ＳＰ−５ＰＷ（ドイツ連邦共和国所在のトーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Biosciences））、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（ドイツ連邦共和国所在のアマシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences））、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（Ｒ）ＳＯ３  ６５０（ドイツ連邦共和国所在のメルク（Merck ））、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ドイツ連邦共和国所在のアマシャム・バイオサイエンス）およびＳＰ  ＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ドイツ連邦共和国所在のアマシャム・バイオサイエンス）を含む。
【０１３９】
通常、精製ステップは２℃〜周囲温度で、好ましくは室温で行なわれる。
希釈、平衡化、洗浄および溶出については、リン酸塩、酢酸ナトリウム、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたはその他の適切なバッファーを含む、イオン交換クロマトグラフィーに一般的に使用される任意のバッファーを使用することができる。典型的には、バッファーは分析されるタンパク質に応じて選択され、かつｐＨ３．５〜８．５、好ましくはｐＨ４〜６に調節される。
【０１４０】
好ましくは、希釈、洗浄および平衡化バッファーはｐＨ４．２で１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。溶出バッファーは平衡化バッファーと同じ組成であってよく、かつ約１ＭのＮａＣｌを含みうる。
【０１４１】
クロマトグラフィー・ステップの好ましい実施形態では、反応混合物を例えば平衡化バッファーで３倍に希釈して、導電率をおよそ６ｍＳ／ｃｍに低下させてもよい。これにより、本発明のタンパク質コンジュゲートをイオン交換カラムに完全に結合させる条件が提供される。
【０１４２】
Ｃ−ＩＥＸによる精製は典型的には下記ステップ：
１カラム体積のバッファーＡによりカラムを平衡化するステップ；
サンプルを装荷するステップ；
０．２〜１カラム体積でカラムを洗浄するステップ；および／または
およそ１７カラム体積のバッファー中０〜３５％の１Ｍ  ＮａＣｌ溶液により直線勾配溶出を行うステップ
を含む。
【０１４３】
１例として、すべてのクロマトグラフィー・ステップに約６８ｃｍ／ｈの線形流速を使用可能であるが、例外としてサンプルの装荷は１７ｃｍ／ｈで行うとよい。
本発明の方法の精製ステップの好ましい実施形態では、２つのプールが溶出液から形成される。第１のプールは、生成物プールＩとも呼ばれ、タンパク質の１つまたは２つのジＰＥＧ化アイソフォームのフラクション（第１および／または第２のジＰＥＧ化フラクションあるいはＧ−ＣＳＦのようなジＰＥＧ化タンパク質の分子種とも呼ばれる）を含んでいる。第２のプールは、残余物プールとも呼ばれ、その他のタンパク質フラクションを含んでおり、非ＰＥＧ化、モノＰＥＧ化、第１および／または第２のジＰＥＧ化アイソフォームとは同一でないジＰＥＧ化アイソフォーム、およびさらに高度にＰＥＧ化されたタンパク質フラクションを含みうる。残余物プールはまた、生成物プールのジＰＥＧ化アイソフォームを微量含む場合もあるが、本質的に生成物プールのジＰＥＧ化アイソフォームを含まない。この残余物プールは、別のＰＥＧ化反応に再利用されることが好ましく、該反応は本発明の方法について上述したようにして実施される。
【０１４４】
この再利用または再循環化または再ＰＥＧ化ステップでは、残余物プールは通常、修飾タンパク質を濃縮し、かつ本発明の方法によってＰＥＧ化反応を行うのに適したバッファ
ーへバッファー交換を行うために、限外濾過／透析濾過に供される。次いで、残余物プールは、本発明の方法について上述したようにしてＰＥＧ化反応に供され、任意選択でその後上述のような陽イオン交換精製に供される。次に、この再ＰＥＧ化ステップから得られ、任意選択で精製された生成物プールＩＩを、生成物プールＩと混合すればよい（図１を参照）。
【０１４５】
以下の実施例は本明細書に記載の発明を例証するために提供されるものであり、本発明をどのようにも限定することを意図したものではない。
実施例
以下の実施例は、（ｉ）還元的アルキル化によるＧ−ＣＳＦのジＰＥＧ化および２つの異なるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの精製、ならびに（ｉｉ）本発明によるＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびヒト成長ホルモンのジＰＥＧ化、のための好ましい実施形態を例証するものである。
【０１４６】
Ａ）１２ｋＤａ  ｍＰＥＧアセタールを用いたＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化
１．ポリエチレングリコール試薬の準備
ａ）ｍＰＥＧアルデヒドへのｍＰＥＧアセタールの活性化
１５０ｍｇの１２ｋＤａ  ｍＰＥＧアセタールを８０ｍＭのリン酸に溶解し、５０℃で３時間加水分解した。氷上でおよそ２〜８℃まで冷却した後、該溶液に重炭酸ナトリウム溶液（５％）を滴下してｐＨ７に中和した。該混合物をＮａＣｌで飽和させ、２ｍｌの塩化メチレンで３回抽出した。回収した３つの有機相を合わせ、硫酸ナトリウムを加えて脱水し、容量を１．５ｍｌに減少させた（窒素流）。
【０１４７】
３０ｍｌの氷冷ジエチルエーテルを加えることによりｍＰＥＧアセトアルデヒドを沈殿させた。沈殿物を減圧濾過（Ｇ４漏斗）によって単離し、減圧下にて室温で乾燥させ、気密のチューブ中へ移した。該チューブを密閉する前に窒素ガスでフラッシングし、−２０℃で保存した。
【０１４８】
ｂ）活性化されたｍＰＥＧアルデヒドの安定性
先行技術によれば、ｍＰＥＧアセタールは一般に、各ＰＥＧ化反応について新たに活性化されるか、あるいは最大でも一晩保存されるかであった。
【０１４９】
窒素下−２０℃で保存された活性化ｍＰＥＧアルデヒドの安定性を調査するために、保存されたｍＰＥＧアルデヒドをＰＥＧ化反応に供した（以下を参照）。ジ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの収量および生成物形成の反応速度を読み取り値として用いた。
【０１５０】
ｃ）ポリエチレングリコール試薬の分析論
アセタールのアルデヒドへの変換の質を評価するために、以下の３つのパラメータを求めた：
検出される活性：
アセタールからアルデヒドへの変換の程度を測定するための、ｍＰＥＧアセタールおよび活性化ｍＰＥＧアルデヒドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定（４００ＭＨｚ分光器、溶剤としてＣＤＣｌ３）。
【０１５１】
質量収率の活性：
使用したｍＰＥＧアセタール量に対する回収された抽出物（educt ）の量を測定するための、乾燥させた活性化ｍＰＥＧアルデヒドの風袋測定（tarring ）。
【０１５２】
ＰＥＧ化の反応速度および生成分子種：
反応混合物中の分子種の分布を測定するための分析型Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣ（「ＰＥＧ化
反応」を参照）。
【０１５３】
ｄ）結果
ｍＰＥＧアセタールをｍＰＥＧアルデヒドへ繰り返し活性化したときの同一性は、以下によって立証可能であると考えられる：
使用されたｍＰＥＧアセタール量に対して活性化後のｍＰＥＧアルデヒドの収量は平均８５±７％。
両サンプルについて繰り返し１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＰＥＧ骨格の吸収は３．５１ｐｐｍであった。ｍＰＥＧアセタールは４．６ｐｐｍにアセタール・トリプレット（−ＣＨ２−ＣＨ−（Ｏ−Ｃ２Ｈ５）２）、１．１ｐｐｍにエチル・トリプレット（−ＣＨ２−ＣＨ３）の吸収を示す。活性化後、アセタール・トリプレットのシグナルはもはや検出できなかったが、アルデヒド・シングレットが９．７ｐｐｍに出現した。
同等のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート最大収量ならびに同等の生成物形成速度（以下を参照）。
活性化されたｍＰＥＧアルデヒドは、遮光し、密封チューブ中で、Ｎ２雰囲気下−２０℃で保存された場合、少なくとも１２５日間安定のようである（図２を参照）。
【０１５４】
２．限外濾過濃縮
ＰＥＧ化反応に先立って、希釈されたＧ−ＣＳＦサンプルを限外濾過によって濃縮した。最終サンプル濃度に応じて、カットオフ分子量１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したアミコンセル（５０ｍｌ）またはｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、Ｇ−ＣＳＦをおよそ４−８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０１５５】
限外濾過後の回収率は使用したタンパク質の量に関して平均で８９±５％であった。
ＵＶ２８０ｎｍにおける吸収
Ｇ−ＣＳＦについては、２８０ｎｍで０．８６±０．０１５の吸光度は１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートについてタンパク質濃度の測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。
【０１５６】
３．ＰＥＧ化反応
ａ）反応
２５ｍｇの固体のｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中３．２ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦに加え、Ｇ−ＣＳＦとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：２５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を２〜８℃でさらに数時間インキュベートした。８ＮのＨＣｌで酸性化して反応を停止させた。
【０１５７】
ｂ）分析論
分析用陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣ）
ＰＥＧ  Ｇ−ＣＳＦ反応混合物中の分子種の分布（モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−）を、Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって測定した。したがって、停止させた反応混合物を１５ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４．２）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたトーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製のＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ）に通した。
【０１５８】
カラムは１５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２で平衡化させた。流量は０．４ｍｌ／分とし、一般に２００μｇのタンパク質を注入した。カラムは室温で使用したが、サンプルはオートインジェクタ中で５℃に維持した。
【０１５９】
ＰＥＧ化状態の異なる分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸの溶出ピークを質量分析した。
質量分析
Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣピークの質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型）によって、各ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを溶出ピークの保持時間に割り当てることができた。
【０１６０】
ｃ）結果
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって決定された単一ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種の質量は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の推定質量と一致した（表１を参照）。
【０１６１】
【表１】
2008535793.tif 000002
質量分析の情報から、保持時間を対応するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子種に割り当てることができた。分析Ｃ−ＩＥＸにより、保持時間に応じて１つのモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、３つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム、４つのトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム、および１つのテトラＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを分離することができた。
【０１６２】
一般に、組換えヒトＧ−ＣＳＦとｍＰＥＧアルデヒドをモル比１：２５として用いてＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートに変換させると、１８ｈ〜４２ｈインキュベーションの反応時間で主としてジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが生成され、約３０ｈのインキュベーション時間で最大収量に達する（図３ａを参照）。
【０１６３】
ｄ）プロセス・パラメータの最適化
ｉ）いくつかのプロセス・パラメータの影響
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生産が最大となるインキュベーション時間（約３０ｈ）を特定したところで、他のパラメータ（ｉ）リン酸バッファーの濃度、（ｉｉ）リン酸バッファーのｐＨ、（ｉｉｉ）還元剤シアノボロハイドライドの濃度、（ｉｖ）生成物の収量に対するタンパク質濃度およびタンパク質とＰＥＧとのモル比、ならびに（ｖ）撹拌速度、の影響を調べた。
【０１６４】
同様の反応速度プロファイルおよび最大生成物収量が達成されたのは：
バッファー濃度が５０ｍＭ〜１５０ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）のとき、
１００ｍＭリン酸バッファーでｐＨ範囲がｐＨ６．９〜７．８のとき、
還元剤の濃度が≧２０ｍＭのとき；対照的に、１０ｍＭのような低濃度ではジＰＥＧ化Ｇ
−ＣＳＦの形成が減速する（４２ｈで最大生成物収量）、
最大で５．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度および対応するモル比のとき（タンパク質濃度のさらなる増加は、タンパク質の凝集の危険性がありうるので回避した。ＰＥＧ濃度を増加させても最大生成物収量は向上しない。）
≦７００ｒｐｍの速度で旋回撹拌するとき
であった。
【０１６５】
ｉｉ）モル比の影響
様々な量の固体のｍＰＥＧアルデヒド（１５〜３８ｍｇ）を、様々なタンパク質濃度（２．４ｍｇ／ｍｌ、３．２ｍｇ／ｍｌ、５．７ｍｇ／ｍｌ）に対して加え、モル比を約１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０および１：５０（タンパク質：ＰＥＧ）とした。反応は実施例３ａに記述されるように低温（５℃）で実施し、サンプルは実施例３ｂに従って分析した。
【０１６６】
所与のタンパク質濃度、例えば２．４、３．２または５．７ｍｇ／ｍｌでは、モル比で表現されるＰＥＧ量を増加させると、主としてジＰＥＧ化を達成するための総インキュベーション時間が縮小される（図３ｂを参照）。すべてのタンパク質濃度について、ＰＥＧ量を２倍にすると、ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを含む最大のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを生産するためのインキュベーション時間が、少なくとも２分の１に縮小されることが示されている。
【０１６７】
タンパク質とポリマーとのモル比が１：３０までのとき、ｍＰＥＧアルデヒド分子とタンパク質内のアミノ基の数との化学量論比が６：１である場合、１８時間インキュベーションの後に主としてジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートが生産されるが、Ｇ−ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比が１：５０で化学量論比がより高い１０：１では、２．４ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦでモル比Ｇ−ＣＳＦ：ＰＥＧが１：５０の条件においてみられるように、反応および最大のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物形成は１８ｈ未満のインキュベーションで生じる。
【０１６８】
しかしながら、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの最大合成収量（４０％、図３ｃを参照）は、ＰＥＧ分子とタンパク質内のアミノ基の数との化学量論比を変えても影響を受けない。
【０１６９】
ｉｉｉ）温度の影響
タンパク質：ＰＥＧの化学量論比に加えて、温度は、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物生産のためのインキュベーション時間にさらなる影響を及ぼすものと思われる。ジＰＥＧ化生成物収量（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム混合物）および生成物形成の反応速度に対する温度の影響を試験するために、２つの反応条件（５．７ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧとのモル比は１：１０または１：２０のいずれか）について２つの異なる温度（５℃および２２℃）で試験を実施し、本発明に従って低温（５℃）および高温（２２℃）の影響を比較分析した。
【０１７０】
温度をおよそ＋２０℃増加させるとＰＥＧ化反応は２倍に加速し、チャモウ（Chamow）ら（１９９４）の結果を確認している。
ＰＥＧの総量を増加させると、ジＰＥＧ化を主とするためのインキュベーション時間が縮小される（図３ｄを参照）。ＰＥＧ量を２倍（１８ｍｇの代わりに３６ｍｇ）にすることにより、低温（５℃）でも高温（２２℃）でも生成物の形成が最大となるインキュベーション時間は２分の１（４２ｈ→〜２１ｈ）に縮小される。
【０１７１】
驚いたことに、本発明者らは、反応物中の所与のタンパク質濃度に対するＰＥＧ量を少
なくとも２倍にし、その結果選択された温度とは関係なくＰＥＧ結合に利用可能なアミノ基（アミノおよびε）に対してＰＥＧ分子を少なくとも２−１０倍過剰とすることにより、優先的にジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを生産するためのＰＥＧ化反応をさらに加速させることが可能であることを見出した。
【０１７２】
一般に、Ｇ−ＣＳＦの選択的ジ−ＰＥＧ化を促進するためには、（ｉ）反応のｐＨは、（標的タンパク質のε−アミノ基の反応性の差異を利用するために）中性付近とすべきであり、（ｉｉ）ＰＥＧは、標的タンパク質中の利用可能なα−およびε−アミノ基に対して少なくとも２−１０倍過剰に加えるべきであり、これはＧ−ＣＳＦの場合にはＧ−ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比がほぼ１：１０〜１：５０であることに相当する。
【０１７３】
ｅ）反応の再現性
上記に列挙した条件下で実施された５回の単一ＰＥＧ化反応について、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して分析した。これにより、本発明によるＧ−ＣＳＦ  ＰＥＧ化反応の再現性が実証された。
【０１７４】
３０ｈインキュベーション時点のＰＥＧ  Ｇ−ＣＳＦ反応混合物中の平均的なアイソフォーム組成を決定した（表２を参照）。
【０１７５】
【表２】
2008535793.tif 000003
４．再ＰＥＧ化およびその再現性
工程歩留まりを改善するために、分取用Ｃ−ＩＥＸクロマトグラフィー（実施例５を参照）からの残余物プールの再ＰＥＧ化を、追加処理ステップとして実施した。
【０１７６】
この再ＰＥＧ化ステップのために、微量の本発明の生成物を含むすべての分子種を含んだ、分取用Ｃ−ＩＥＸクロマトグラフィー（図４を参照）の残余物プールを回収し、限外濾過／透析濾過によって脱塩かつ濃縮し、ＰＥＧ修飾Ｇ−ＣＳＦ（３．２ｍｇ／ｍｌ）を用いた以外は、再び前記ＰＥＧ化反応（実施例３を参照）に供した。
【０１７７】
様々なインキュベーション時間での分子種の分布を分析したところ、ＰＥＧ化時間を１８ｈまで短縮するとジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの収量は平均で４％減少するが、再循環化のための残余物プール内のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの割合が平均で１５％増加することが観察された。これは、再ＰＥＧ化ステップにおける収量を増加させ、全体としては使用されるタンパク質のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物収量の著しい増加に結びつくものと予想された。
【０１７８】
各１８時間で２回のＰＥＧ化サイクル後の反応混合物中の平均ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート収量を決定した（表３を参照）。
【０１７９】
【表３】
2008535793.tif 000004
５．分取用Ｃ−ＩＥＸによる精製
ａ）クロマトグラフィー
最初のＰＥＧ化反応後、または再ＰＥＧ化の後での他の分子種からのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの分離は、下記ステップ：
ＳＰ−５ＰＷゲル材料（ゲル材料１０．６ｍｌ、粒径２０μｍ、ドイツ連邦共和国所在のトーソーハース・バイオサイエンス・ゲーエムベーハー（Tosohaas Bioscience GmbH））を充填したＥＣＯ  １５／２００カラム（ドイツ連邦共和国所在のクロンラブ・ゲーエムベーハー（Kronlab GmbH））；
１カラム体積の１５ｍＭ  ＮａＡｃバッファー、ｐＨ４．２（バッファーＡ）でカラムを平衡化；
タンパク質を装荷（６．１ｍｇの反応混合物）；
０．２ＣＶのバッファーＡでカラムを洗浄；
およそ１７カラム体積中０〜３５％の１Ｍ  ＮａＣｌバッファーＡ溶液による直線勾配溶出；および／または
２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでの溶出液のモニタリングとフラクション３ｍｌの回収
を含む陽イオン交換クロマトグラフィーによって行われた。
【０１８０】
直線流量は、タンパク質の装荷を１７ｃｍ／ｈで実施したことを除きすべてのクロマトグラフィー・ステップについておよそ６８ｃｍ／ｈとした。
ｂ）分析論
回収した各フラクション中のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートのタンパク質濃度を決定するための、ＵＶ２８０ｎｍでの吸収（上記参照）
各溶出ピーク内の対応するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子種およびアイソフォームを同定するための、分析用陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣ）（上記参照）。
【０１８１】
ｃ）結果
直線勾配溶出により６つのピークが得られた。該ピークを図４に示し、また表４に概要を示す。
【０１８２】
【表４】
2008535793.tif 000005
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦについては、１０種の可能なアイソフォームのうちの３つを同定することができた。２つのアイソフォーム、ジおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、主要な単一ピークとして溶出された。第三の微量のアイソフォームはトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームとともに溶出する。
【０１８３】
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ調製物の生成物を正確に定義するために、アイソフォームの数を低く維持して、２つのアイソフォームすなわちジ−体（ピーク２）およびジ’−体（ピーク３）からなる本発明のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物を定義した。これらのアイソフォームのＰＥＧ結合部位は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ナノＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳおよびエドマン法の配列決定を組み合わせて使用することにより、Ｎ末端基とリジン１７またはＮ末端基とリジン３５にそれぞれ位置することが特定された（「生成物の特徴解析」を参照）。
【０１８４】
定義されたジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、少なくとも９０％の、ジおよびジ’アイソフォームをおよそ０．７６（ジ）対１（ジ’）の比で含むジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種を含有しており、かつ極めて純度が高いものであった（表５を参照）。
【０１８５】
【表５】
2008535793.tif 000006
６．生成物の特徴解析
単離されたジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、２つの主要な（ジおよびジ’）ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームで構成されており、該アイソフォームは活性を有する主要なジＰＥＧ化生成物に相当する。
【０１８６】
ａ）組成および純度
最終ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の組成および純度について、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０１８７】
最終ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の組成をコントロールするＣ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣ
カラム：トーソー  ＳＰ  ５ＰＷ  １０μｍ  ７５×７．５ｍｍ（３．３１ｍｌ）
流量：０．４ｍｌ／分
バッファーＡ：１５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２
バッファーＢ：１５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；１．０００ｍＭ  ＮａＣｌ
サンプル：５０μｇ
勾配：直線、１７カラム体積中０〜４５％、０．５ＣＶ中４５〜１００％
ＵＶモニタ：２１４ｎｍ
結果：
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の異性体組成をＣ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって分析したところ（図５を参照）、該組成は定義された生成物の規格（表６を参照）内にあった。
【０１８８】
【表６】
2008535793.tif 000007
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの非特異的な凝集をコントロールするＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
カラム：ＴＳＫ  Ｇ  ３０００  ＳＷＸＬ  ３００×７．８ｍｍ、ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＥＰ
バッファーＡ：１００ｍＭ  Ｐｉ；ｐＨ６．９
サンプル：２０μｇ
流量：０．５ｍｌ／分
勾配：アイソクラチック
実行時間：６０分
結果：
ＳＥＣ分析（図６を参照）によれば、最終生成物は、＞９０％のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦで構成され、該ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦはジおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを一定の混合比で含んでいる。保持時間１１分と１３分との間のピークはさらに分析はしなかったが、より高度の分子凝集体である可能性が考えられた（〜１．５％、表７を参照）。
【０１８９】
【表７】
2008535793.tif 000008
ｂ）構造の一致性
構造安定性を示すためのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の円偏光二色性（ＣＤ）測定
タンパク質修飾後の二次構造の変化を分析するために、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ最終生成物（サンプルＢ）および天然の非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（サンプルＡ）を、円偏光二色性分光法によって分析した。ＣＤスペクトルは日本国所在のＪａｓｃｏのＪ−７２０分光偏光計を使用して、波長１８０〜２６０ｎｍで記録した。
【０１９０】
結果：
これらのスペクトル（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよび非修飾Ｇ−ＣＳＦ）が極めて類似していることから、ＰＥＧ修飾によりＧ−ＣＳＦの二次構造は変化しないことが示される（図７を参照）。
【０１９１】
ｃ）ＰＥＧ結合部位の同定
ＰＥＧ結合部位を同定するために、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム（ジ−およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）をペプチドマッピングによって分析した。参照用のｒｐＨＰＬＣクロマトグラムを作成するために、ＰＥＧ化されていないＧ−ＣＳＦを同じように処理した。
【０１９２】
その処理手順は、次のステップ、すなわち（ｉ）ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの変性および還元的アルキル化による遊離ＳＨ基のキャッピング、（ｉｉ）変性ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのキモトリプシン消化、（ｉｉｉ）ｒｐＨＰＬＣによるペプチド分離、ならびに（ｉｖ）エレクトロスプレー・タンデム質量分析およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ／Ｎ末端配列決定の組み合わせによる配列分析、を含むものとした。
【０１９３】
（ｉ）ＳＨ基のカルボキシメチル化
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームのおよそ１ｍｇの分割試料をｓｐｅｅｄ  ｖａｃ（Ｒ）によって乾燥し、６Ｍ塩酸グアニジンを含む７００μｌの０．３Ｍトリス−ＨＣＬバッファー、ｐＨ８．３中１ｍｇの濃度に再構成した。試料にヨード酢酸を加えてカルボキシメチル化し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＴＴを加えて反応を停止させ、次いで試料を注射用水に対して透析して脱塩し、最後に、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃで乾燥させた。
【０１９４】
（ｉｉ）キモトリプシン消化
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの乾燥試料を、消化用に、１ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムバッファー、ｐＨ７．８中１ｍｇの濃度に再構成した。このアイソフォームを、キモトリプシンにより（酵素と基質との重量比は１：１００）３７℃で３時間消化した。
【０１９５】
（ｉｉｉ）ｒｐＨＰＬＣペプチドマッピング
タンパク質消化物をＶｙｄａｃ（Ｒ）Ｃ４カラム（４．６×２５０ｍｍ、粒径５ｍ、孔径３００Å）に注入し、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの直線濃度勾配（アセトニトリルを１分間に１％上昇させながら９０分間）を使用したＨＰＬＣにより、ペプチドをマッピングした。得られたペプチドを、ナノＬＣ  ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳおよびＮ末端配列決定の組合せによってペプチド配列決定するために回収した。
【０１９６】
（ｉｖ）ナノＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ：
単一のアイソフォームの完全消化物ならびに単離されたＰＥＧ化ペプチドを、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳと組み合わせたナノＬＣによって分析し、ＰＥＧ化ペプチドのアミノ酸配列およびＰＥＧ結合部位を決定した。
【０１９７】
（ｖ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／Ｎ末端配列決定
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよび非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分解物のｒｐＨＰＬＣクロマトグラムの比較から、２つの新しいピークの出現が明らかとなった。第１に、この新しいピークの質量をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって測定し、第２に、該ピークの同定のためにＮ末端配列を決定した。
【０１９８】
結果：
想定されるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのキモトリプシン消化シミュレーションによれば、３種の潜在的ＰＥＧ化ペプチドが予想可能であった。実験では、２つのジＰＥＧ化体アイソフォーム（ジおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）各々のキモトリプシン消化物は、２つのＰＥＧ化ペプチドに帰着した。１つのＰＥＧ化ペプチドについては、ナノＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるペプチドマス配列決定から、Ｎ末端メチオニンのα−アミノ基にＰＥＧが結合しているアミノ酸１〜１３位の配列：Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｑ−Ｓ−Ｆ（ＭＷ  １４７０  ｍ／ｚ）が同定された。
【０１９９】
アイソフォーム当たりのもう１つのＰＥＧ結合部位の同定は、この技法では失敗に終わった。したがって、選択されたｒｐＨＰＬＣのフラクションを質量分析し、続いてＮ末端アミノ酸配列分析に供した。
【０２００】
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームについては、Ｎ末端配列分析（２２サイクル）により、リジン１７のε−アミノ基にＰＥＧが結合しているアミノ酸１４〜４０位の配列：ＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹが決定された。
【０２０１】
ジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームについては、Ｎ末端配列分析（２２サイクル）により、リジン３５のε−アミノ基にＰＥＧが結合しているアミノ酸１４〜４０位の配列：ＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹが決定された。
【０２０２】
従って、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームはＮ末端基およびリジン１７においてジＰＥＧ化され、ジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームはＮ末端基およびリジン３５においてジＰＥＧ化されている。
【０２０３】
ｄ）生物活性
ｉ）ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの混合物からなるジＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の生物活性
本発明によるジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物からなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物をインビボで試験し、非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））に対し活性が向上していることを示し、かつその生物活性を市販のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較した。
【０２０４】
このインビボ試験は、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）およびＮｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）とジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物との、オープンかつ無作為、並行群間の、単回用量での生物学的同等性（biocomparability）試験であった。同試験はオスのラットに０．１ｍｇ／ｋｇの皮下注射を行うことにより実行された。１つの時点につき１群当たり６匹の動物から採血した。血清試料は、該試料を採取したのと同じ日に完全な血球数測定を実施した。平均白血球数および好中球数が計算された。
【０２０５】
結果：
ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物を含むジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））と比較して、ＷＢＣおよび好中球の数が多く、ＷＢＣおよび好中球の応答性がより長く保持された（図８および図９を参照）。
【０２０６】
Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）との比較では、本発明によるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、少なくとも生物学的に類似しており（biosimilar）、最大のＷＢＣおよび好中球数がわずかに高いことから恐らくは潜在的により良いものであった（図８および図９を参照）。
【０２０７】
ｉｉ）２つのアイソフォーム、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生物活性
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物の全体的な生物活性に対する個々の単一のアイソフォーム（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）の寄与を示すために、アイソフォームを陽イオン交換クロマトグラフィーによって均質に精製した。各アイソフォーム生成物（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）の純度および組成は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび陽イオン交換ＨＰＬＣによって分析した。
【０２０８】
結果：
確定された単一アイソフォーム生成物（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）は、それぞれのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームを少なくとも９５％含んでいた（表８を参照）。
【０２０９】
【表８】
2008535793.tif 000009
単一アイソフォーム生成物、ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物、および実施例５に記述されるような両方のアイソフォームを含むジＰＥＧ化Ｇ−
ＣＳＦコンジュゲート生成混合物をインビボで試験して、相互に生物活性を比較した。
【０２１０】
このインビボ試験は、両アイソフォームの混合物であって本発明により定義された生成物としてのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート混合物と、単一アイソフォーム生成物であるジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートとについての、オープンかつ無作為、並行群間の、単回用量での生物学的同等性試験であった。このインビボ試験は、前記生成物各々をオスのラットに０．１ｍｇ／ｋｇ皮下注射することにより実施した。１つの時点につき１群当たり１２匹の動物から採血した。血清試料は、該試料を採取したのと同じ日に完全な血球数測定を実施した。平均白血球数および好中球数が計算された。
【０２１１】
結果：
両アイソフォームすなわちジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物と比較して同等の高いＷＢＣ数および好中球数を生じ、かつ同様に保持されたＷＢＣおよび好中球の応答性を示した（図１０および図１１を参照）。両アイソフォームは同等の生物活性を有し、従って、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物の全体的な生物活性に均等に寄与している。この観測結果は、アリトミ（Aritomi ）ら（Nature、１９９９年、第４０１巻、ｐ．７１３−７１７）およびヤング（Young ）ら（Protein Science 、１９９７年、第６巻、ｐ．１２２８−１２３６）によって示唆されるような、Ｇ−ＣＳＦのリジン３５のＰＥＧ修飾と比較してＧ−ＣＳＦのリジン１７のＰＥＧ修飾はそのアイソフォームの生物活性を低減するだろうという仮説とは大きく異なるものである。
【０２１２】
Ｂ）Ｇ−ＣＳＦおよび２０ｋＤ  ｍＰＥＧアセタール
１．ＰＥＧ化反応と分析論
ＰＥＧ化反応のために、反応原料である２０ｋＤａ  ｍＰＥＧアセタールおよびＧ−ＣＳＦを実施例Ａ１ａおよびＡ２に従って調製した。３２ｍｇの固体ｍＰＥＧアルデヒド（分子量２０ｋＤａ）を、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中２．４ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦまたは３．２ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦに加え、Ｇ−ＣＳＦのｍＰＥＧアルデヒドに対するモル比がそれぞれ１：２５（２．４ｍｇ／ｍｌ）および１：１９（３．２ｍｇ／ｍｌ）となるようにした。反応を実施し、試料を実施例３ａおよび３ｂに記述されるようにＣ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって分析した。
【０２１３】
結果：
ｍＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの分析Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルから推定して、対応するｍＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートのピークを同定して割り当てることができた（図１２を参照）。より高分子量のＰＥＧとＧ−ＣＳＦとのコンジュゲートについては、分析用Ｃ−ＩＥＸにより、１つのモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（３９ｋＤａの総分子量を有する）、２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（５９ｋＤａの総分子量を有する）および３つのトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（７９ｋＤａの総分子量を有する）の分離が可能であった。
【０２１４】
一般に、組換えヒトＧ−ＣＳＦと２０ｋＤａのｍＰＥＧアルデヒドを１：１９またはそれ以上のモル比で用いてＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートへと変換すると、低温で２０時間のインキュベーション後に総分子量５９ｋＤａのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートが主として生産された（図１３を参照）。
【０２１５】
２．ジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの生物活性
ジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの生物活性をインビボで試験するために、この単一アイソフォームを分取用陽イオン交換クロマトグラフィーによって高度に精製した。確定された生成物は、実施例Ａ６の段落ｄ）ｉｉ）で述べ
たように、少なくとも９５％のジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームを含んでいた。
【０２１６】
このインビボ試験は、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）およびＮｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）と上記ジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームとの、オープンかつ無作為、並行群間の、単回用量での生物学的同等性試験であった。同試験はオスのラットに０．１ｍｇ／ｋｇの皮下注射を行うことにより実行された。１つの時点につき１群当たり６匹の動物から採血した。血清試料は、該試料を採取したのと同じ日に完全な血球数測定を実施した。平均白血球数および好中球数が計算された。
【０２１７】
結果：
本発明によるジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームでは、非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））と比較して、ｉ）ＷＢＣ数および好中球数が高く、ｉｉ）ＷＢＣおよび好中球の応答性が長く保持されていた（図１４および図１５を参照）。
【０２１８】
Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）との比較では、本発明のジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームは、最大ＷＢＣ数および好中球数が高く、かつＷＢＣおよび好中球の応答性が長く保持されることから、生物学的に改善（bioimproved ）されている（図１４および図１５を参照）。
【０２１９】
３．薬物動態学的調査
（ｉ）実施例Ａ６による、ジＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームを含んでなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物（総分子量４３ｋＤａ）、ならびに（ｉｉ）単一アイソフォームである実施例Ｂのジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（総分子量５９ｋＤａ）、のクリアランス機構を、市販のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較してインビボで試験した。
【０２２０】
このインビボ試験は、Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）と、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物またはジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームのいずれかとについて、シャム手術群（対照群）および腎摘出群のラットにおいて行うオープンかつ無作為、並行群間のクリアランス試験であった。この試験は、オスのラットに０．００５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートを静脈内注射することより実行された。１つの時点につき１群当たり４匹の動物から採血した。血清試料について、Ｇ−ＣＳＦの血漿中残存濃度を測定し、血漿中半減期などの関連する薬物動態学的データを算出した。
【０２２１】
結果：
Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）、ジＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦ生成混合物、および本発明によるジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームが、同様の薬物動態学的データを示し（表９を参照）かつ同様のクリアランス動態を示したことから、３つの生成物がいずれも好中球のレセプターを介したクリアランスによって主に排泄されることが示唆される。
【０２２２】
【表９】
2008535793.tif 000010
Ｃ）ＩＦＮα２ａのジＰＥＧ化
１．ＰＥＧ化反応および分析論
１２ｋＤａ  ｍＰＥＧアセタールを、実施例Ａ１に記述したようにＰＥＧ化反応用に活性化した。ＰＥＧ化反応に先立って、凍結乾燥されたＩＦＮα２ａ試料を水に溶解し、酸性の酢酸バッファー溶液に対して透析し、最後に、カットオフ分子量が１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、限外濾過により反応条件に応じておよそ４〜８ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。
【０２２３】
ＩＦＮα２ａについては、２８０ｎｍで吸光度１．０５のとき１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化されたＩＦＮα２ａコンジュゲートのタンパク質濃度測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。
【０２２４】
２７ｍｇの固体ｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を６ｍｇ／ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中ＩＦＮα２ａ溶液に加え、ＩＦＮα２ａとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：１５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を穏やかに撹拌しながら２〜８℃で数時間さらにインキュベートした。反応は８Ｎ  ＨＣｌで酸性化することによって停止させた。
【０２２５】
ＰＥＧ  ＩＦＮα２ａ反応混合物中の分子種の分布（モノ体、ジ体、トリ体）を、Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって決定した。従って、反応を停止させた反応混合物を、４０ｍＭ酢酸バッファー溶液（ｐＨ４．２）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ、トーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製）に通した。
【０２２６】
カラムを４０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２で平衡化した。流量は０．４ｍｌ／分とし、典型的には２００μｇのタンパク質が注入された。カラムは室温で使用したが、試料はオートインジェクタ内で５℃に維持した。
【０２２７】
ＰＥＧ化状態の異なる分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣの溶出ピークを、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にかけるか、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うかのうち少なくともいずれかを実施し、溶出ピークの保持時間に対して各ＰＥＧ化ＩＦＮα２ａのピークが割り当てられるようにした。
【０２２８】
質量分析と、クマシー染色（タンパク質の標識）およびヨード染色（ＰＥＧの標識）を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥとを組み合わせた分析結果は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の質量推定と一致した（表１０を参照）。
【０２２９】
【表１０】
2008535793.tif 000011
質量分析／ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの情報を用いて、保持時間を対応するＰＥＧ化ＩＦＮα２ａ分子種に割り当てることができた。分析用Ｃ−ＩＥＸから、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化ＩＦＮα２ａアイソフォームを保持時間に応じて分離することが可能となった。
【０２３０】
一般に、例えば６ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えヒトＩＦＮα２ａを、１：１５のモル比でｍＰＥＧアルデヒドを用いてＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートへと変換すると、およそ２０時間の反応時間以降に主としてジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートが生じた（図１６ａを参照）。
【０２３１】
【表１１】
2008535793.tif 000012
別の実験セットでは、様々な量の固体ｍＰＥＧアルデヒド（３〜３０ｍｇ）を異なるタンパク質濃度（３ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ）に対して加え、モル比を約１：１．５、１：３、１：５、１：１０、１：１５および１：３０（タンパク質：ＰＥＧ）とした。反応は上述のように低温（５℃）で実施し、試料を上述のようにして分析した。
【０２３２】
ジＰＥＧ化ＩＦＮαを主に形成させるためには、モル比ＩＦＮ：ＰＥＧは少なくとも１：１５でなければならなかったが、このモル比は、タンパク質内（合計１２個のアミノ基中）の利用可能なアミノ基の数とＰＥＧ分子の数との化学量論比が少なくとも１：１．２５であることに相当する。
【０２３３】
最大の生成物形成（〜４０％の合成収量）は、２０時間インキュベーション後に達成されたが、生成物形成の反応速度は、温度の上昇（＋２０℃）およびＰＥＧ量の増加（少なくとも２倍）により影響を受ける場合もあった（図１６ｂを参照）。
【０２３４】
ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートの合成収量を増加させるために、本発明において実施例Ａ３およびＡ４に記述されるように、いくつかのプロセス・パラメータ、例えば限定するものではないが反応ｐＨ、タンパク質濃度、タンパク質：ＰＥＧモル比をさらに最適化することや、場合によっては再利用ステップを導入してジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート収量をより高めることが推奨される。
【０２３５】
重要なパラメータであることが確認されたインキュベーション時間に加えて、使用されるタンパク質濃度に対するＰＥＧ濃度（タンパク質とＰＥＧとのモル比で表現される）は、主としてジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａ生成物を形成するための反応の別の重要な促進要因である。タンパク質とＰＥＧとのモル比＝１：１５である場合、反応はジＰＥＧ化に向かう。
【０２３６】
２．分取Ｃ−ＩＥＸによる精製
最初のＰＥＧ化反応の後に、ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートを、実施例Ａ５に記述されるような分取用陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析に使用されたものと同一の直線的塩濃度勾配を適用して、他のＩＦＮα２ａアイソフォームから分離した。各溶出ピークを再度クロマトグラフィ（Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣ）で分析して対応するＰＥＧ化ＩＦＮα２ａアイソフォームを識別した（上記参照）。
【０２３７】
結果
直線勾配溶出の結果、３つの主要ピークが得られたが、これを図１７に示し、表１２に要約する。
【０２３８】
【表１２】
2008535793.tif 000013
ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａについては、１つの主要なジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａピークを同定することができた。しかしながら、ピークの形から、６６種の可能なアイソフォームのうちの２以上が同時に溶出していることが想定される。ＩＦＮについて考えられる生成物は、対応するピークが２つの肩を示すことから、少なくとも３つのアイソフォームで構成される可能性が高いと思われる。
【０２３９】
Ｄ）グリコシル化エリスロポエチン（ＥＰＯ）のジＰＥＧ化
１．ＰＥＧ化反応および分析論
１２ｋＤａのｍＰＥＧアセタールを、実施例Ａ１に記述されるようにしてＰＥＧ化反応用に活性化した。ＰＥＧ化反応に先立って、グリコシル化ＥＰＯの試料を酸性の酢酸バッファー溶液に対して透析し、最終的には分子量カットオフ値１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、反応条件に応
じておよそ４〜８ｍｇ／ｍｌまで限外濾過により濃縮した。
【０２４０】
ＥＰＯについては、２８０ｎｍで吸光度が０．８１５のとき１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化されたＥＰＯコンジュゲートのタンパク質濃度測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。
【０２４１】
６ｍｇの固体のｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を６ｍｇ／ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中グリコシル化ＥＰＯ溶液に加え、ＥＰＯとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を穏やかに撹拌しながら５０℃で数時間さらにインキュベーションした。反応は８ＮのＨＣｌで酸性化することにより停止させた。
【０２４２】
ＰＥＧとＥＰＯとの反応混合物中の分子種（モノ体、ジ体、トリ体）の分布は、Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって決定した。従って、反応を停止させた反応混合物を、４０ｍＭ酢酸バッファー溶液（ｐＨ３．８）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ、トーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製）に通した。
【０２４３】
カラムを４０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ３．８および２０％イソプロパノール（ｖ／ｖ）で平衡化した。流量は１ｍｌ／分とし、典型的には２００μｇのタンパク質を注入した。カラム洗浄の後、直線勾配溶出は、およそ２０カラム体積の、２０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含有する４０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ３．８中の１Ｍ  ＮａＣｌを用いて実施した（図１８ｃを参照）。
【０２４４】
カラムは室温で使用したが、試料はオートインジェクタ内で５℃に維持した。
ＰＥＧ化状態の異なる分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣの溶出ピークを、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にかけ、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施し、溶出ピークの保持時間に対して各ＰＥＧ化状態のＥＰＯのピークが割り当てられるようにした。
【０２４５】
質量分析と、クマシー染色（タンパク質の標識）およびヨード染色（ＰＥＧの標識）を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥとを組み合わせた分析結果は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の質量推定と一致した（表１３を参照）。
【０２４６】
【表１３】
2008535793.tif 000014
質量分析／ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの情報を用いて、保持時間を対応するＰＥＧ化ＥＰＯ分子種に割り当てることができた。分析用Ｃ−ＩＥＸから、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化ＥＰＯアイソフォームを保持時間に応じて分離することが可能となった。
【０２４７】
一般に、組換えヒトグリコシル化ＥＰＯを、ｍＰＥＧアルデヒドを１：５のモル比（グリコシル化ＥＰＯ：ＰＥＧ）で用いて変換すると、およそ１２〜１８時間以降の反応時間で主としてジＰＥＧ化ＥＰＯコンジュゲートが生じた（図１８ａを参照）。
【０２４８】
別の実験セットでは、様々な量の固体ｍＰＥＧアルデヒド（３〜１３ｍｇ）を異なるタンパク質濃度（３ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ）に対して加え、モル比を約１：５、１：１５、１：２５および１：３０（タンパク質：ＰＥＧ）とした。反応は上述のように低温（５℃）で実施し、試料を上述のようにして分析した。
【０２４９】
興味深いことには、タンパク質グリコシル化の影響により恐らくタンパク質表面上の遮蔽効果が引き起こされる結果、選択的なＰＥＧ結合がもたらされる。したがって、タンパク質内のアミノ酸の数とＰＥＧ分子の数との化学量論比が１：０．５で既にジＰＥＧ化が生じることは、驚くべきことではない（図１８ｂを参照）。
【０２５０】
ジＰＥＧ化グリコシル化ＥＰＯコンジュゲートの合成収量を増加させるために、本発明において実施例Ａ３およびＡ４に記述されるように、タンパク質濃度およびモル比（タンパク質：ＰＥＧ）など（これらに限定はされない）のパラメータをさらに最適化することや、場合により再利用ステップを導入してより高いジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート合成収量を達成することが推奨される。
【０２５１】
重要なパラメータであると確認されたインキュベーション時間に加えて、使用されるタンパク質濃度に応じたＰＥＧ濃度（タンパク質とＰＥＧとのモル比、またはより好ましくは標的タンパク質のＰＥＧ結合に利用可能なアミノ基に対するモル過剰量で表現される）は、反応が主としてジＰＥＧ化エリスロポエチン生成物を形成するように促進する別の重要な因子である。標的タンパク質とＰＥＧとのモル比が約１：５、またはより好ましくはタンパク質内のアミノ基の数とＰＥＧ分子の数との化学量論比が少なくとも１：０．５であるとき、反応はジＰＥＧ化を指向する。
【０２５２】
Ｅ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のジＰＥＧ化
１．ＰＥＧ化反応および分析論
１２ｋＤａのｍＰＥＧアセタールを実施例Ａ１に記述したようにしてＰＥＧ化反応用に活性化した。ＰＥＧ化反応に先立って、凍結乾燥されたヒト成長ホルモン試料を水に溶解し、ｂｉｃｉｎｅバッファーに対して透析し、最終的に分子量カットオフ値が１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、反応条件に応じておよそ４〜８ｍｇ／ｍｌの濃度まで限外濾過により濃縮した。
【０２５３】
ｈＧＨについては、２８０ｎｍでの吸光度が０．７２のとき１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化されたｈＧＨコンジュゲートのタンパク質濃度測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。
【０２５４】
２５ｍｇの固体のｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を、１００ｍＭ  ｂｉｃｉｎｅバッファー、ｐＨ７．５中の６．０ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ溶液に加え、ｈＧＨとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：１５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を穏やかに撹拌しながら２〜８℃で数時間さらにインキュベーションした。反応は８ＮのＨＣｌで酸性化することにより停止させた。
【０２５５】
ＰＥＧとｈＧＨとの反応混合物中の分子種（モノ体、ジ体、トリ体）の分布は、Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって決定した。したがって、反応を停止させた反応混合物を４０ｍＭ
ＮａＡｃバッファー（ｐＨ４．２）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ、トーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製）に通した。
【０２５６】
カラムを同じバッファーで平衡化し、流量は０．４ｍｌ／分として、典型的には２００μｇのタンパク質を注入した。カラムは室温で使用したが、試料はオートインジェクタ内で５℃に維持した。
【０２５７】
異なるＰＥＧ化状態の分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣの溶出ピークについて、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって質量を分析し、溶出ピークの保持時間に対してＰＥＧ化ｈＧＨの各ピークを割り当てることができた。
【０２５８】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦの結果は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の質量推定と一致した（表１４を参照）。
【０２５９】
【表１４】
2008535793.tif 000015
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からの情報を用いて、保持時間を対応するＰＥＧ化ｈＧＨ分子種に割り当てることができた。分析Ｃ−ＩＥＸにより、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化ｈＧＨアイソフォームを保持時間に応じて分離することが可能となった。
【０２６０】
一般に、組換えヒトｈＧＨを、ｍＰＥＧアルデヒドを１：１５のモル比で用いてＰＥＧ化ｈＧＨコンジュゲートに変換すると、およそ１５時間の反応時間以降に主としてジＰＥＧ化ｈＧＨコンジュゲートが生じた（図１９を参照）。この１：１５のモル比は、タンパク質内のアミノ基の数（９）とＰＥＧ分子の数との化学量論比が１：１．６であることに相当する。
【０２６１】
重要なパラメータであると確認されたインキュベーション時間に加えて、使用されるＰＥＧ濃度（タンパク質とＰＥＧとのモル比で表現される）は、反応が主としてジＰＥＧ化ｈＧＨコンジュゲート生成物を形成するように促進する。タンパク質とＰＥＧとのモル比＝１：１０のとき、反応はジＰＥＧ化を指向する。
【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１】本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートの生産におけるすべての処理ステップの概観を示す図。
【図２】ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォーム全体の最大収量および形成の反応速度を、該ＰＥＧ化反応に使用される活性化ｍＰＥＧアルデヒドの低温保存時間に関して示す図。
【図３ａ】１〜４本の１２ｋＤａ  ｍＰＥＧアルデヒド鎖を有する組換えＧ−ＣＳＦコンジュゲートが時間依存的に順次形成されるのを示す図。最大のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ収量は３０時間インキュベーションでみられる。
【図３ｂ】２つのアイソフォームの混合物であるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物の形成について、使用したタンパク質およびＰＥＧの量に依存した反応速度を示す図。様々な量のＰＥＧおよびタンパク質について、本発明に従ってｐＨ７．５、５℃で穏やかに撹拌しながら０．５ｍＬの反応容量で試験した。
【図３ｃ】所与のインキュベーション時間（ｔ＝３０ｈ）におけるＰＥＧ量の関数としてのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート混合物の形成を示す図。本発明に従って、ｐＨ（７．５）、温度（５℃）として０．５ｍＬの反応容量で穏やかに撹拌した。
【図３ｄ】反応（５．７ｍｇ／ｍｌタンパク質、０．５ｍＬの反応容量で表示のモル比にて実施）における生成物（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート混合物）の形成反応速度に対する温度（２２℃と５℃）の影響を示す図。
【図４】ＰＥＧ化反応混合物からのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分離用の典型的な分取Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図（タンパク質装荷量：６．１ｍｇのＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；カラム：ＳＰ−５ＰＷ  Ｃ−ＩＥＸカラム（トーソーハース（Tosohaas）、２０μｍ、カラム体積１０．６ｍｌ）、バッファーＡ：１５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；バッファーＢ：１Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；直線濃度勾配）。Ｅ：溶出液、ＲＰ：残余物プール、Ｍｉｎ：分。
【図５】ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物のＣ−ＩＥＸ  ＨＰＬＣによる分離を示す図。クロマトグラムは２１４ｎｍで記録した。アイソフォーム名を記載（Ｄｉ”：ジ”ＰＥＧ化、Ｔｒｉ：トリＰＥＧ化、Ｄｉ’：ジ’ＰＥＧ化、Ｄｉ：ジＰＥＧ化、Ｍｏｎｏ：モノＰＥＧ化）。ｍｉｎ：分。
【図６】ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物のＳＥＣによる分離を示す図。クロマトグラムは２１４ｎｍで記録した。２３分のピークは塩に相当する。
【図７】非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（黒色）およびジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物（赤色）のＣＤスペクトルを示す図。
【図８】ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物（０．７６：１）からなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物（Ｄｉ−ＰＥＧ  Ｇ−ＣＳＦ）のインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して示す図。単回皮下注射後の平均ＷＢＣによって示されている（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。
【図９】ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物（０．７６：１）からなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物（Ｄｉ−ＰＥＧ  Ｇ−ＣＳＦ）のインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して示す図。単回皮下注射後の平均好中球数によって示されている（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。
【図１０】ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、両アイソフォームの混合物（０．７６：１）であるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物と比較して、単回皮下注射後の平均ＷＢＣによって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。
【図１１】ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、両アイソフォームの混合物（０．７６：１）であるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物と比較して、単回皮下注射後の平均好中球数によって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。
【図１２】Ｇ−ＣＳＦ（３．２ｍｇ／ｍｌ）を、ｍＰＥＧ  １２ｋＤａ（モル比１：２５、上側のクロマトグラム）、およびｍＰＥＧ  ２０ｋＤａ（モル比１：１９、下側のクロマトグラム））を用いて３０時間ＰＥＧ化した後の反応混合物の分析Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図。ＳＰ−５ＰＷカラムを装備したダイオネックス（Dionex）システムで同一の条件下で分析した（ＵＶ  ２１４ｎｍ）。ピークのプロファイルが一致していることから、ｉ）ピークの同定、およびｉｉ）対応するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子種（モノ、ジ、およびジ’ＰＥＧ化アイソフォーム）へのピークの割り当てが可能である。（Ｆｌｏｗ：流量）
【図１３】１〜４本の２０ｋＤａ  ｍＰＥＧアルデヒドを備えた組換えＧ−ＣＳＦコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。１８時間インキュベーション以降にジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを主とした生産が達成される。反応条件は、３．２ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ２０ｋとのモル比１：１９、５℃で穏やかに撹拌、とした。
【図１４】ジ’ＰＥＧ（２０ｋ）Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して、単回皮下注射後の平均ＷＢＣによって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。
【図１５】ジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して、単回皮下注射後の平均好中球数によって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。
【図１６ａ】１〜３本の１２ｋＤａ  ｍＰＥＧアルデヒドを備えた組換えＩＦＮα２ａコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。およそ２０時間インキュベーション後には既にジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａを主とした生産が達成され、調査した５０時間の時間枠では全体にわたって継続される。
【図１６ｂ】ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲート生成物の形成について、使用したタンパク質およびＰＥＧの量に依存した反応速度を示す図。様々な量のＰＥＧおよびタンパク質について、ｐＨ７．５、５℃で穏やかに撹拌しながら０．５ｍＬの反応容量で試験した。
【図１７】ＰＥＧ化反応混合物からジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートを分離するための分取Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図（タンパク質装荷量：２４時間インキュベーション後のＰＥＧ化ＩＦＮα２ａを６ｍｇ；カラム：ＳＰ−５ＰＷ  Ｃ−ＩＥＸカラム（トーソーハース（Tosohaas）、２０μｍ、カラム体積１０．６ｍｌ）、バッファーＡ：４０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；バッファーＢ：１Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；直線濃度勾配）。Ｐ１：モノＰＥＧ化；Ｐ２：ジＰＥＧ化；Ｐ３：混合物（トリＰＥＧ化／ジＰＥＧ化）；Ｍｉｎ：分。
【図１８ａ】１〜３本の１２ｋＤａ  ｍＰＥＧアルデヒド鎖を備えた組換えＥＰＯコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。驚くべきことに最初の１８時間インキュベーション以内にはジＰＥＧ化ＥＰＯを主とした生産が達成され、残りのインキュベーションの間維持される。
【図１８ｂ】ジＰＥＧ化エリスロポエチンコンジュゲート生成物の形成について、使用したタンパク質およびＰＥＧの量に依存した反応速度を示す図。様々な量のＰＥＧおよびタンパク質について、ｐＨ７．５、５℃で穏やかに撹拌しながら０．５ｍＬの反応容量で試験した。
【図１８ｃ】ＰＥＧ化反応混合物からジＰＥＧ化ＥＰＯコンジュゲートを分離するための分析Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図（タンパク質装荷量：２４時間インキュベーション後のＰＥＧ化ＥＰＯ混合物を１ｍｇ；カラム：ＳＰ−５ＰＷ  Ｃ−ＩＥＸカラム（トーソーハース（Tosohaas）、１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ）、バッファーＡ：４０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ３．８、２０％イソプロパノール；バッファーＢ：１Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ３．８、２０％イソプロパノール；直線濃度勾配）。Ｐ１：モノＰＥＧ化；Ｐ２：ジＰＥＧ化；Ｐ３：トリＰＥＧ化；Ｍｉｎ：分。
【図１９】１〜３本の１２ｋＤａ  ｍＰＥＧアルデヒド鎖を備えた組換えｈＧＨコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。およそ１５時間インキュベーション後にジＰＥＧ化ｈＧＨを主とした生産が達成され、維持される。
【図２０】配列番号１（１位にメチオニンを含むＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列）。
【図２１】配列番号２（ＩＦＮα２ａのアミノ酸配列）。
【図２２】配列番号３（ＥＰＯのアミノ酸配列）。
【図２３】配列番号４（ｈＧＨのアミノ酸配列）。
【図１】
2008535793.tif 000016
【図２】
2008535793.tif 000017
【図３ａ】
2008535793.tif 000018
【図３ｂ】
2008535793.tif 000019
【図３ｃ】
2008535793.tif 000020
【図３ｄ】
2008535793.tif 000021
【図４】
2008535793.tif 000022
【図５】
2008535793.tif 000023
【図６】
2008535793.tif 000024
【図７】
2008535793.tif 000025
【図８】
2008535793.tif 000026
【図９】
2008535793.tif 000027
【図１０】
2008535793.tif 000028
【図１１】
2008535793.tif 000029
【図１２】
2008535793.tif 000030
【図１３】
2008535793.tif 000031
【図１４】
2008535793.tif 000032
【図１５】
2008535793.tif 000033
【図１６ａ】
2008535793.tif 000034
【図１６ｂ】
2008535793.tif 000035
【図１７】
2008535793.tif 000036
【図１８ａ】
2008535793.tif 000037
【図１８ｂ】
2008535793.tif 000038
【図１８ｃ】
2008535793.tif 000039
【図１９】
2008535793.tif 000040
【図２０】
2008535793.tif 000041
【図２１】
2008535793.tif 000042
【図２２】
2008535793.tif 000043
【図２３】
2008535793.tif 000044
【配列表】
2008535793000001.app
【国際調査報告】
2008535793.tif 000045
2008535793.tif 000046
2008535793.tif 000047
2008535793.tif 000048
2008535793.tif 000049
2008535793.tif 000050
2008535793.tif 000051
2008535793.tif 000052