(57)【要約】  新生物性疾患を抗体−細胞毒コンジュゲート分子で処置するための方法、抗体−細胞毒コンジュゲート分子を合成する方法が提供される。抗体−細胞毒コンジュゲート分子として有用であるか、またはこれらの分子の合成に有用である化合物も提供される。
2008505144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類において新生物性疾患を処置するための方法であって、
抗体と細胞毒の間に酸に安定な共有結合を有する抗体−細胞毒コンジュゲートを提供すること、および
前記抗体−細胞毒コンジュゲートを哺乳類に、前記新生物性疾患を処置するために前記コンジュゲートが哺乳類の細胞内に内在化されるように投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞毒が抗腫瘍抗生物質、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、またはその類似体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の酸に安定な結合がアミド結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アミド結合がＮ−置換アミド結合である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記コンジュゲートの抗体部分が、活性化インテグリン受容体と特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記の活性化インテグリン受容体が、同等の非転移性細胞に比べて転移状態にある細胞で示差的に産生される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記の活性化インテグリン受容体がα３β１インテグリン受容体またはαｖβ３インテグリン受容体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コンジュゲートの抗体部分が単鎖Ｆｖ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記新生物性疾患が固形腫瘍、造血器悪性腫瘍、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肝細胞癌の肝臓内転移、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、膵臓腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨癌、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類において新生物性疾患を処置するための方法であって、
抗体と細胞毒の間に酸に不安定な共有結合を有する抗体−細胞毒コンジュゲートを提供すること、および
前記抗体−細胞毒コンジュゲートを哺乳類に、前記新生物性疾患を処置するために前記コンジュゲートが哺乳類の細胞内に内在化されるように投与すること
を含む、方法。
【請求項１１】
前記細胞毒が抗腫瘍抗生物質、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、またはその類似体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記の酸に不安定な共有結合がヒドラゾン結合である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
酸に不安定なヒドラゾン結合の切断によって哺乳類の細胞内に内在化できる、前記抗体−抗腫瘍抗生物質コンジュゲートを投与することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が活性化インテグリン受容体と特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化インテグリン受容体が同等の非転移性細胞に比べて転移状態にある細胞で示差的に産生される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の活性化インテグリン受容体がα３β１インテグリン受容体またはαｖβ３インテグリン受容体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コンジュゲートの抗体部分が単鎖Ｆｖ抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記新生物性疾患が固形腫瘍、造血器悪性腫瘍、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肝細胞癌の肝臓内転移、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、膵臓腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨癌、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
抗体−細胞毒コンジュゲート分子を合成する方法であって、
１つの容器に抗体、チオール化試薬、およびマレイミド誘導体化細胞毒を導入すること；
前記抗体を前記チオール化試薬と接触させてチオール化抗体を形成すること；および
前記チオール化抗体を前記マレイミド誘導体化細胞毒と接触させて抗体−細胞毒コンジュゲート分子を形成すること
を含む、方法。
【請求項２０】
前記マレイミド誘導体化細胞毒がマレイミドと細胞毒の間に酸に不安定なヒドラゾン結合を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記マレイミド誘導体化細胞毒がマレイミドと細胞毒の間にアミド結合を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞毒が抗腫瘍抗生物質、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、またはその類似体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗腫瘍抗生物質がデュオカルマイシンＳＡのカルボニル置換ＣＢＩ−インドール類似体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗腫瘍抗生物質がデュオカルマイシンＳＡのアミド置換ＣＢＩ−インドール類似体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記マレイミド誘導体化細胞毒が１−［３−（Ｎ’−｛１−［２−（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル］−エチリデン｝−ヒドラジノ）−３−オキソ−１−プロピル］マレイミドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記マレイミド誘導体化細胞毒が３−［５−［１−｛３−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロピロール−１−イル）プロピオニルアミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル］アミノインドール−２−カルボニル］−（１−クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記チオール化試薬が２−イミノチオランである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が単鎖Ｆｖ抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
３−［５−（１−（３−アミノプロピル）インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドールである化合物。
【請求項３０】
式Ｉ：
【化１】
2008505144.tif 000010
［式中、Ｑは
【化２】
2008505144.tif 000011
であり、
各Ａは独立にＮＲ１、ＯまたはＳであり（ただし、少なくとも１つのＡがＮＲ１である）；
各Ｂは独立にＣまたはＮであり；
Ｒ１は独立にＨまたは−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｈ）Ｒ４であり（ただし、一方のＲ１がＨであり、他方が−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｈ）Ｒ５である）；
Ｒ２はアルキルであり；
Ｒ３はハロゲンであり；
Ｒ４はＨまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ−マレイミドであり；
ｍは２、３、４、５または６であり；かつ
ｎは２、３、４、５または６である］
の化合物、またはその立体異性体、プロドラッグ、医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、酸塩水和物、Ｎ−オキシドまたは同型結晶形態。
【請求項３１】
Ｒ２がＣ１〜Ｃ６アルキルである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
ハロゲンがＣｌ、Ｂｒ、またはＦである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
３−［５−（１−（３−アミノプロピル）インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドールである化合物。
【請求項３４】
３−［５−［１−｛３−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロピロール−１−イル）プロピオニルアミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル］アミノインドール−２−カルボニル］−（１−クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドールである化合物。
【請求項３５】
少なくとも１種類の医薬上許容される担体または賦形剤と、マレイミド部分が単鎖Ｆｖ抗体にコンジュゲートされている有効量の請求項３０の化合物とを含む、医薬組成物。
【請求項３６】
前記単鎖Ｆｖ抗体がインテグリン受容体と結合し得る、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記インテグリン受容体がα３β１インテグリン受容体またはαｖβ３インテグリン受容体である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項３６に記載の組成物を哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項３９】
デュオカルマイシンＳＡのアミド置換ＣＢＩ−インドール類似体にコンジュゲートされた抗体による処置に応答すると考えられる哺乳類における病態を緩和するための方法であって、治療量の請求項３６の組成物を哺乳類に投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記化合物が３−［５−（１−（３−アミノプロピル）インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドールである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾病が新生物性疾患である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記新生物性疾患が固形腫瘍、造血器悪性腫瘍、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肝細胞癌の肝臓内転移、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、膵臓腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨癌、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
式ＩＩ：
【化３】
2008505144.tif 000012
［式中、Ｑは
【化４】
2008505144.tif 000013
であり、
ＡはＮＨ、ＯまたはＳであり；
ＲａはＨまたはアルキルであり；
ＲｂはＨ、アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｒ−Ｎ−マレイミドであり；
Ｒｃはアルキルであり；
Ｒｄはハロゲンであり；かつ
ｒは２、３、４、５または６である］
の化合物、またはその立体異性体、プロドラッグ、医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、酸塩水和物、Ｎ−オキシドまたは同型結晶形態。
【請求項４４】
１−［３−（Ｎ’−｛１−［２−（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル］−エチリデン｝−ヒドラジノ）−３−オキソ−１−プロピル］マレイミドである化合物。
【請求項４５】
少なくとも１種類の医薬上許容される担体または賦形剤と、マレイミド部分が単鎖Ｆｖ抗体にコンジュゲートされている有効量の請求項４３の化合物とを含む、医薬組成物。
【請求項４６】
前記単鎖Ｆｖ抗体がインテグリン受容体に対する抗体である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記インテグリン受容体がα３β１インテグリン受容体またはαｖβ３インテグリン受容体である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項４６の組成物を哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項４９】
デュオカルマイシンＳＡのカルボニル置換ＣＢＩ−インドール類似体にコンジュゲートされた抗体による処置に応答すると考えられる哺乳類における病態を緩和するための方法であって、治療量の請求項４６の組成物を哺乳類に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
前記病態が新生物性疾患である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記新生物性疾患が固形腫瘍、造血器悪性腫瘍、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、扁平上皮癌、頭頸部の扁平上皮癌、肝細胞癌、肝細胞癌の肝臓内転移、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、膵臓腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨癌、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫から選択される、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００４年６月３０日に出願された米国仮出願第６０／５８４，２２６号に基づくものであり、その内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
この研究はthe Skaggs Institute for Chemical Biology、ＮＩＨ（助成ＮＡＩＤ−ＡＩ４７１２７、ＮＣＩ−ＣＡ４１９８６およびＲＯ１−ＨＬ６３６５１）、カリフォルニア癌研究プログラム（助成００−００７５７Ｖ−２００１２）、カリフォルニア乳癌研究プログラム（助成４ＪＢ−００１）およびthe Louis R. Jabinson Fellowship (Louis R. Jabinson Investigatorship Fund for Graduate Education)により援助を受けたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般に、新生物性疾患を抗体−細胞毒コンジュゲート分子で処置するための方法、抗体−細胞毒コンジュゲート分子を合成する方法、および抗体−細胞毒コンジュゲート分子として有用であるか、またはこれらの分子の合成において有用である化合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍のターゲッティング処置は、少なくともここ２０年で、主としてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）技術の確立によって著しく進展した。Kohler et al., Nature, 256: 495-497, 1975。初期の基本的な適用は放射性標識ｍＡｂの開発であり、そのうちのいくつかのものはイメージングや癌治療を目的とした臨床使用に至っている。Kousparou et al., JInt Soc Tumor Target, 1: 55-69, 2000; Buchsbaum et al. Antibody Immunoconjugate Radiopharm, 4: 245-272, 1991。重要なところでは、包括的に研究されているもう１つの可能性のある抗癌剤種としてｍＡｂ−薬剤コンジュゲートがある。Safavy et al., In Drug Targeting in Cancer Therapy, M. Page, ed., 257-275,2002; Stan et al., Cancer Res, 59:115-121, 1999; Florent et al., J Med Chem, 41: 3572-3581, 1998。しかしながら、単離の成功例は報告されているものの、癌治療の複雑な課題に取り組むためには相当な進展が必要である。
【０００５】
主要な目標は、過剰発現した細胞表面受容体またはリガンドと結合した際に、腫瘍細胞によって特異的に内在化され得るヒトｍＡｂまたはペプチドを探索することであった。Nielsen et al, Pharm. Sci. Technol. Today, 3: 282-291, 2000; Trail et al., Cancer Immunol Immunother, 52: 328-337, 2003; Gao et al, J Immunol Methods, 274: 185-197, 2003; Gao et al., Bioorg Med Chem, 10: 4057-4065, 2002。この一連の研究は、癌の化学療法の有効性を高め、かつ、副作用を軽減し得る薬剤弾頭を送達するためにタンパク質ベクターを用いる機会を提供する。このような戦略の臨床的潜在能力を証明する１つのものは、急性骨髄性白血病に対して用いられるカリーチアマイシンにコンジュゲートされた細胞内在型抗ＣＤ３３抗体Ｐ６７．６に頼るものであり、これはＦＤＡ認可薬Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）となっている。Hamann et al., Bioconjug Chem, 13: 40-46, 2002。
【０００６】
インテグリン（α３β１はＶＬＡ−３膜受容体としても知られる）は、胎児組織および成体組織の双方によって発現され、細胞外マトリックスとの接着性、移動性、また、浸潤性の細胞の相互作用を媒介する。Elices et al., J Cell Biol, 112: 169-181,1991。α３β１の発現の上昇はいくつかのタイプの転移性癌種で見られており、移動および浸潤の増大と関連付けられている。特に、このインテグリンの発現は悪性黒色腫においてアップレギュレーションされており、移動および皮膚の浸潤の程度とよく相関している。Melchiori et al., Exp Cell Res, 219: 233-242, 1995; Laidler et al., Acta Biochim Pol 47: 1159-1170, 2000; Elshaw et al., Br J Ophthalmol, 85: 732-738, 2001; Yoshinaga et al., Melanoma Res, 3:435-441, 1993。α３β１インテグリンはまた、ヒトＰＣ−３前立腺癌細胞の浸潤性クローンによっても発現されるが、非浸潤性の親細胞集団によっては発現されない。Dedhar et al., Clin Exp Metastasis, 11: 391-400, 1993; Romanov et al., Prostate, 39: 108-118, 1999。同様に、種々の扁平上皮癌の浸潤性は、α３β１を含むいくつかのインテグリンの過剰発現との相関が見出されている。Dyce et al., Laryngoscope, 112: 2025-2032, 2002; Ghosh et al., Cancer, 95: 2524-2533, 2002。また、悪性神経膠腫細胞におけるα３β１の機能的阻害がそれらの浸潤力を遮断し得ることも示されている。Fukushima et al., Int J Cancer, 76: 63-72, 1998。α３β１はまた、乳癌細胞の転移、浸潤、およびコラーゲン分解活性とも関連がある。Morini et al., Int J Cancer, 87: 336-342, 2000。最後に、マウス肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるα３β１の発現は肝臓内転移の発生と関連付けられており、これが再発の主要な様相であると考えられる。Tsuchiya et al., Int J Oncol, 20: 319-324, 2002。悪性癌細胞と正常細胞の間で発現レベルが異なる場合が多いことを考えれば、α３β１は、癌細胞を死滅させ、転移拡散を制御するように計画された特異的抗体に基づく抗新生物処置の可能性のある標的であると考えることができる。
【０００７】
α３β１を標的とすることによる転移の選択的制御は、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩）擬似ペプチドを用いた肝細胞癌（ＨＣＣ）の肝臓内転移の処置で好結果が得られることが示されている。Tsuchiya et al., IntJOncol, 20: 319-324, 2002。また、頭頸部扁平上皮癌が、α３β１インテグリンを標的とするアデノウイルスベクターによる選択的遺伝子送達によって処置されている。Kasono et al., Clin Cancer Res, 5: 2571-2579, 1999。いくつかのネズミｍＡｂはα３β１のα３またはβ１サブユニットのいずれかを標的とすることが知られているが、腫瘍細胞によって内在化されると知られたものはないし、これまでに抗癌治療薬として使用されたものもない。Morimoto et al., JImmunol, 134: 3762-3769, 1985; Wayner et al., J Cell Biol, 105: 1873-1884, 1987; Bartolazzi et al., Anticancer Res, 13: 1-11, 1993。重要なこととして、ほとんどのｍＡｂは通常ネズミ起源のものであるので、ヒトの臨床適用には害がある。Tjandra et al., Immunol Cell Biol, 68: 367-376, 1990; Schroff et al., Cancer Res, 45: 879-885, 1985; Goldman-Leikin et al., Exp Hematol, 16: 861-864,1988; Herlyn et al., J Immunol Methods, 85: 27-38, 1985。さらに、もう１つの障壁は、完全な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）としてのｍＡｂの有効な使用ということであり、一般にこれは分子量が大きくなり、固形腫瘍への有効な浸透を阻む。例えば、注入した放射性標識ＩｇＧのうち、その標的腫瘍塊に到達できるのは１％未満であることを示した研究がある。Jain, Cancer Res, 50: 814s-819s, 1990; Pimm et al., In Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, V. S. Byers, ed., 97-128, 1985。この問題を回避する１つの方法は、ｓｃＦｖ型のｍＡｂを用いることである。完全なＩｇＧおよびＦａｂならびにＦ（ａｂ’）２フラグメントに比べ、ｓｃＦｖは極めて迅速な血漿クリアランスおよび体内クリアランス（＜３０分）を示すことに加え、より迅速かつより深く腫瘍に浸透することが示されている。Chester et al., Trends Biotechnol, 13: 294-300, 1995; Hand et al., Cancer, 73: 1105-1113,1994; Yokota et al., Cancer Res, 52: 3402-3408, 1992; Milenic et al., Cancer Res, 51: 6363-6371, 1991; Colcher et al., JNatl Cancer Inst, 82: 1191-1197, 1990。従って、多くの場合で、好ましい治療戦略は、抗癌剤とコンジュゲートしたヒトｓｃＦｖの使用であるといえる。
【０００８】
ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンは配列選択的ＤＮＡアルキル化特性を有する２種類の抗腫瘍抗生物質である。ChidESTER et al., J Am Chem Soc, 103: 7629-7635, 1981; Takahashi et al., J Antibiot (Tokyo), 41: 1915-1917, 1988; Ichimura et al., JAntibiot (Tokyo), 43: 1037-1038, 1990; Yasuzawa et al., Chem Pharm Bull (Tokyo), 43: 378-391, 1995; Boger et al., Angew Chem, Int Ed Engl, 35: 1439-1474, 1996。単剤療法を目的としたこれら抗癌分子の開発は、処置の治療用量範囲を制限する遅延型毒性のために成し遂げられなかった。例えば、強力かつ広域の抗腫瘍活性があるにもかかわらず、ＣＣ−１０６５は実験動物において遅延型の致死を招くことが示されていることから問題がある。Chidester et al., J Am Chem Soc, 103: 7629-7635, 1981。しかしながら、これらの薬剤は抗体標的化学療法には十分適している可能性があり、限定された抗原発現が細胞傷害性薬剤の効力を決定的なものとし、標的化によりある程度の毒性作用は避けられる。Liu et al., Exp Opin Invest Drugs, 6: 169-172, 1997; Chari et al., Cancer Res, 55: 4079-4084, 1995。これらの化合物の高い毒性を、通常の健常細胞を避けて腫瘍塊に特異的に向けるために多大な努力がなされてきた。研究にはＴＡＰ（腫瘍活性化プロドラッグ）およびＡＤＥＰＴ(抗体標的酵素プロドラッグ治療)アプローチが含まれている。Zhao et al., Abstr Pap Am Chem Soc, 224: 147-MEDI Part 142, 2002; Suzawa et al., Bioorg Med Chem, 8: 2175-2184, 2000; Wang et al., BMC Chem Biol, 1: 4, 2001; Tietze et al., Chembiochem, 2: 758-765, 2001; Tietze et al., Bioorg Med Chem 9: 1929-1939, 2001。両方法とも、これらの分子を腫瘍部位の酵素基質とコンジュゲートさせることによりＣＣ−１０６５またはデュオカルマイシン類似体の細胞傷害性を軽減することを意図したものである。１つ目の研究では、この標的化酵素は腫瘍環境に本来存在するものであったが、２つ目の研究では、酵素は腫瘍特異的抗体とコンジュゲートした際に腫瘍部位に送られるものであった。精密であるにもかかわらず、これらのアプローチの主な欠点は、プロドラッグの細胞傷害性が残留することおよび結合しなかった薬剤が腫瘍細胞の外部に放出されることである。デュオカルマイシン類似体を、この薬剤を抗体フラグメントにコンジュゲートすることにより腫瘍細胞へ特異的に送達する試みはこれまでに報告されたことがない。Duocarmysin, J. Antibiotics, 43:1037, 1990。
【０００９】
このように当技術分野の進展にもかからず、例えば新生物性疾患、例えば、特に哺乳類およびヒトにおける癌および腫瘍の処置を目的とした改良された治療薬を開発する必要が依然としてある。より詳しくは、この治療薬は抗体とコンジュゲート可能であり、同様の構造の既知化合物に比べて作用の高い特異性、少ない毒性、かつ、血中で改善された安定性を示す細胞毒および関連プロドラッグであり得る。
【００１０】
概要
本発明は、一般に、新生物性疾患を抗体−細胞毒コンジュゲート分子で処置するための方法、抗体−細胞毒コンジュゲート分子を合成する方法、および抗体−細胞毒コンジュゲート分子として有用であるか、またはこれらの分子の合成において有用である化合物に関する。本発明の利益は、化学療法薬を、一般に細胞表面エピトープの認識によって腫瘍細胞へより選択的に送達するための抗体−薬剤コンジュゲートを用いて得ることができる。本発明は、正常細胞に比べて腫瘍細胞でアップレギュレートされる受容体またはリガンドを標的とし、おそらくはそれを内在化するヒト抗体を取得する、可能性のある抗体に基づく治療アプローチを提供する。このような受容体の１つに、いくつかの悪性癌細胞で過剰発現されるインテグリンα３β１がある。ヒト膵臓癌細胞によって内在化されるインテグリンｏｃｓＰｉに特異的なＰａｎ  １０と呼ばれるヒト単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）が同定された。本発明の方法は抗体を用いて、有効な細胞傷害性を極めて選択的な方法で直接腫瘍に向けるので、無差別な細胞破壊が軽減される。これらの方法は化学療法薬の有効性を高めるとともに化学療法薬にしばしば付随する副作用を軽減する可能性がある。
【００１１】
本発明は、Ｐａｎ  １０への反応性チオール基の化学導入、修飾ｓｃＦｖと強力な細胞傷害性薬剤デュオカルマイシンＳＡのマレイミド誘導体化類似体との特異的コンジュゲーション、および得られたコンジュゲートの特性を提供する。これらの知見から、Ｐａｎ  １０−薬剤コンジュゲートが親ｓｃＦｖの内在化能を維持し、in vitroにおいてナノモル濃度で細胞傷害活性を発揮するという証拠が得られる。Ｐａｎ  １０−薬剤コンジュゲートは、黒色腫、前立腺癌、神経膠腫およびインテグリンの過剰発現を伴う他の新生物を含む悪性疾患の標的化化学療法の有望な候補となり得る。
【００１２】
一実施形態では、哺乳類において新生物性疾患を処置するための方法は、抗体と細胞毒の間に酸に安定な共有結合を有する抗体−細胞毒コンジュゲートを提供すること、前記抗体−細胞毒コンジュゲートを哺乳類に投与すること、および哺乳類の細胞内において前記新生物性疾患を処置するために前記抗体−細胞毒コンジュゲートを哺乳類の細胞内に内在化することを含む。
【００１３】
詳細な実施形態では、細胞毒は抗腫瘍抗生物質、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、またはその類似体である。詳細な実施形態では、酸に安定な結合はアミド結合である。さらなる詳細な実施形態では、アミド結合はＮ−置換アミド結合である。詳細な実施形態では、抗体は活性化インテグリン受容体と特異的に結合する。さらなる詳細な実施形態では、活性化インテグリン受容体は、同等の非転移性細胞に比べて転移状態にある細胞で示差的に産生される。さらなる詳細な実施形態では、活性化インテグリン受容体はα３β１インテグリン受容体またはα３β１インテグリン受容体である。さらなる詳細な実施形態では、抗体は単鎖Ｆｖ抗体である。
【００１４】
さらなる実施形態では、新生物性疾患は固形腫瘍、造血器悪性腫瘍、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肝細胞癌の肝臓内転移、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、膵臓腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨癌、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫から選択される。
【００１５】
別の実施形態では、哺乳類において新生物性疾患を処置するための方法は、抗体と細胞毒の間に酸に不安定な共有結合を有する抗体−細胞毒コンジュゲートを提供すること、前記抗体−細胞毒コンジュゲートを哺乳類に投与すること、および哺乳類の細胞内において前記新生物性疾患を処置するために前記抗体−細胞毒コンジュゲートを哺乳類の細胞内に内在化することを含む。詳細な実施形態では、細胞毒は抗腫瘍抗生物質、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、またはその類似体である。詳細な実施形態では、酸に不安定な共有結合はヒドラゾン結合である。詳細な実施形態では、抗体は活性化インテグリン受容体と特異的に結合する。さらなる詳細な実施形態では、活性化インテグリン受容体は、同等の非転移性細胞に比べて転移状態にある細胞で示差的に産生される。さらなる詳細な実施形態では、活性化インテグリン受容体はα３β１インテグリン受容体またはα３β１インテグリン受容体である。さらなる詳細な実施形態では、抗体は単鎖Ｆｖ抗体である。
【００１６】
さらなる実施形態では、哺乳類において新生物性疾患を処置するための方法は、前記抗体-抗腫瘍抗生物質コンジュゲートを、酸に不安定なヒドラゾン結合の切断によって哺乳類の細胞内に内在化することを含む。
【００１７】
別の実施形態では、抗体−細胞毒コンジュゲート分子を合成する方法は、１つの容器に抗体、チオール化試薬、およびマレイミド誘導体化細胞毒を導入すること、前記抗体を前記チオール化試薬と接触させてチオール化抗体を形成すること、および前記チオール化抗体を前記マレイミド誘導体化細胞毒と接触させて抗体−細胞毒コンジュゲート分子を形成することを含む。詳細な態様では、マレイミド誘導体化細胞毒は、マレイミドと細胞毒の間に酸に不安定なヒドラゾン結合を含む。さらなる詳細な態様では、マレイミド誘導体化細胞毒は、マレイミドと細胞毒の間にアミド結合を含む。さらなる詳細な態様では、細胞毒は抗腫瘍抗生物質、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、またはその類似体である。さらなる詳細な実施形態では、抗腫瘍抗生物質はデュオカルマイシンＳＡのカルボニル置換ＣＢＩ−インドール類似体である。さらなる詳細な態様では、抗腫瘍抗生物質はデュオカルマイシンＳＡのアミド置換ＣＢＩ−インドール類似体である。さらなる詳細な態様では、チオール化試薬は２−イミノチオランである。さらなる詳細な態様では、抗体は単鎖Ｆｖ抗体である。
【００１８】
さらなる詳細な実施形態では、マレイミド誘導体化細胞毒は、１−［３−（Ｎ’−｛１−［２−（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル］−エチリデン｝−ヒドラジノ）−３−オキソ−１−プロピル］マレイミドである。さらなる詳細な実施形態では、マレイミド誘導体化細胞毒は、３−［５−［１−｛３−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロピロール−１−イル）プロピオニルアミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル］アミノインドール−２−カルボニル］−（１−クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドールである。 
【００１９】
別の実施形態では、式Ｉ：
【化１】
2008505144.tif 000003
［式中、Ｑは
【化２】
2008505144.tif 000004
であり、
各Ａは独立にＮＲ１、ＯまたはＳであり（ただし、少なくとも１つのＡがＮＲ１である）；
各Ｂは独立にＣまたはＮであり；
Ｒ１は独立にＨまたは−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｈ）Ｒ４であり（ただし、一方のＲ１がＨであり、他方が−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｈ）Ｒ５である）；
Ｒ２はアルキルであり；
Ｒ３はハロゲンであり；
Ｒ４はＨまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ−マレイミドであり；
ｍは２、３、４、５または６であり；かつ
ｎは２、３、４、５または６である］
の化合物、またはその立体異性体、プロドラッグ、医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、酸塩水和物、Ｎ−オキシドまたは同型結晶形態である。
【００２０】
詳細な実施形態では、Ｒ２はＣ１〜Ｃ６アルキルである。さらなる詳細な実施形態では、ハロゲンはＣｌ、Ｂｒ、またはＦである。
【００２１】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種類の医薬上許容される担体または賦形剤と、マレイミド部分が単鎖Ｆｖ抗体にコンジュゲートされている、有効量の式Ｉの化合物とを含む。詳細な態様では、単鎖Ｆｖ抗体はインテグリン受容体に対する抗体である。さらなる詳細な態様では、インテグリン受容体はα３β１インテグリン受容体またはαｖβ３インテグリン受容体である。さらなる詳細な実施形態では、方法は、哺乳類に式Ｉの組成物を投与することを含む。
【００２２】
さらなる詳細な実施形態では、デュオカルマイシンＳＡのアミド置換ＣＢＩ−インドール類似体にコンジュゲートされた抗体による処置に応答すると考えられる哺乳類における病態を緩和するための方法は、哺乳類に治療量の式Ｉの組成物を投与する工程を含む。さらなる詳細な実施形態では、病態は新生物性疾患である。
【００２３】
別の実施形態では、化合物は３−［５−（１−（３−アミノプロピル）インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドールである。
【００２４】
別の実施形態では、化合物は３−［５−（１−（３−アミノプロピル）インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドールである。
【００２５】
別の実施形態では、化合物は３−［５−［１−｛３−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロピロール−１−イル）プロピオニルアミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル］アミノインドール−２−カルボニル］−（１−クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドールである。
【００２６】
別の実施形態では、式ＩＩ：
【化３】
2008505144.tif 000005
［式中、Ｑは
【化４】
2008505144.tif 000006
であり、
ＡはＮＨ、ＯまたはＳであり；
ＲａはＨまたはアルキルであり；
ＲｂはＨ、アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｒ−Ｎ−マレイミドであり；
Ｒｃはアルキルであり；
Ｒｄはハロゲンであり；かつ
ｒは２、３、４、５または６である］
の化合物、またはその立体異性体、プロドラッグ、医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、酸塩水和物、Ｎ−オキシドまたは同型結晶形態である。
【００２７】
別の実施形態では、化合物は１−［３−（Ｎ’−｛１−［２−（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル］−エチリデン｝−ヒドラジノ）−３−オキソ−１−プロピル］マレイミドである。
【００２８】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種類の医薬上許容される担体または賦形剤と、マレイミド部分が単鎖Ｆｖ抗体にコンジュゲートされている、有効量の式ＩＩの化合物とを含む。詳細な態様では、単鎖Ｆｖ抗体はインテグリン受容体に対する抗体である、さらなる詳細な態様では、インテグリン受容体はα３β１インテグリン受容体またはαｖβ３インテグリン受容体である。
【００２９】
さらなる実施形態では、方法は、哺乳類に式ＩＩの組成物を投与することを含む。
【００３０】
さらなる実施形態では、デュオカルマイシンＳＡのカルボニル置換ＣＢＩ−インドール類似体にコンジュゲートされた抗体による処置に応答すると考えられる哺乳類における病態を緩和するための方法は、治療量の式ＩＩの組成物を哺乳類に投与する工程を含む。詳細な態様では、病態は新生物性疾患である。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１  デュオカルマイシンＳＡ、ＣＢＩインドール類似体およびマレイミド誘導体。
図２Ａ〜２Ｂ  精製したＰａｎ１０とＰａｎ１０コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ染色済みマーカー；レーン２：個別チオール化およびコンジュゲーション後のＰａｎ１０；レーン３：ワンポットチオール化およびコンジュゲーション後のＰａｎ１０；レーン４：非修飾Ｐａｎ１０。
バンド濃度分析（ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ  ＳｔａｎｄＡｌｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。網掛けの四角は各レーンにおいて単量体ｓｃＦｖに相当するバンドに対するデータを含む。
図３  Ｐａｎ１０−ＦＭで処理したＳＷ１９９０細胞およびＨｄＦａ細胞の４８８ｎｍ画像と５６８ｎｍ画像を重ねた共焦顕微鏡像。（Ａ）２時間インキュベーション後のＳＷ１９９０細胞、（Ｂ）２時間後のＨｄＦａ細胞（Ｃ）３時間後のＳＷ１９９０細胞および（Ｄ）３時間後のＨｄＦａ細胞。
図４  ＳＷ１９９０の倒立顕微鏡像。（Ａ）非処理細胞。（Ｂ）Ｐａｎ１０−ＦＭ処理細胞。（Ｃ）Ｐａｎ１０−４処理細胞。（Ｄ）Ｐａｎ１０−３処理細胞。ｓｃＦｖ−薬剤コンジュゲートで処理した細胞のうち２つの拡大画像は広範囲の空胞化を示す。
図５  Ｂｏｃ保護された１の合成スキーム。
【００３２】
詳細な説明
本発明は一般に、新生物性疾患を抗体−細胞毒コンジュゲート分子で処置するための方法、抗体−細胞毒コンジュゲート分子を合成する方法、および抗体−細胞毒コンジュゲート分子として有用であるか、またはこれらの分子の合成において有用である化合物に関する。遊離チオールを含む、化学修飾された抗インテグリンα３β１  ｓｃＦｖ  Ｐａｎ１０は、強力な細胞傷害性薬剤デュオカルマイシンＳＡのマレイミド誘導体化類似体とコンジュゲートさせることができる。抗体Ｐａｎ１０コンジュゲートは、インテグリンα３β１を発現する細胞に浸透する能力を保持している。特にＰａｎ１０−薬剤コンジュゲートは、in vitroにおいて膵臓癌細胞に対して優れた細胞傷害作用を示す。極めて強力ではあるが臨床上実用可能な抗癌剤とはいえない本明細書に記載の遊離薬剤と比較した場合のｓｃＦｖコンジュゲートの独特な利点を考えれば、この第一段階は重要なものである。これらのコンジュゲートは、これらの薬剤分子を、インテグリンα３β１を過剰発現する癌細胞の内部へより特異的に送達することができ、抗体薬剤コンジュゲートの効率的な送達により、治療薬暴露の軽減および有効性の増強が見込めるはずである。このような戦略を用いて試験すれば、癌治療におけるｓｃＦｖ−薬剤デザインの潜在力をさらに精巧にすることができる。
【００３３】
ＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌細胞系統による内在化の選択性の要求に基づくヒトｓｃＦｖ−ファージディスプレーライブラリーのバイオパンニング(biopanning)が記載されている。Gao et al., J Immunol Methods, 274: 185-197, 2003。Ｐａｎ１０と呼ばれる単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）が作製されたが、その際、免疫沈降法、質量分析およびデータベース検索により、膜受容体インテグリンα３β１を標的とすることが分かった。Ｐａｎ１０のα３β１との特異的相互作用および内在化能のため、Ｐａｎ１０  ｓｃＦｖは、インテグリンα３β１を過剰発現する悪性腫瘍細胞の破壊を促進するため、強力なデュオカルマイシン−ＳＡ類似体である３−（５−アセチルインドール−２−カルボニル）−１−（Ｓ）−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（化合物１、図１）および３−［５−（１−（３−アミノプロピル）インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（化合物２、図１）とのコンジュゲーション用のベクターとなり得る。Parrish et al., Bioorg Med Chem, 11: 3815-3838, 2003。マレイミド誘導体化細胞毒としては、限定されるものではないが、１−［３−（Ｎ’−｛１−［２−（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル］−エチリデン｝−ヒドラジノ）−３−オキソ−１−プロピル］マレイミド（化合物３、図１）、または３−［５−［１−｛３−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロピロール−１−イル）プロピオニルアミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル］アミノインドール−２−カルボニル］−（１−クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（化合物４、図１）が挙げられる。ゆえに、次のような研究：（ａ）標的親和性と内在化特性を損なわずに抗腫瘍薬剤とｓｃＦｖ  Ｐａｎ１０とをコンジュゲートすること、（ｂ）薬剤の細胞傷害活性を損なわずに薬剤とｓｃＦｖとの効率的な接着を促進するリンカーをデザインすること、（ｃ）Ｐａｎ１０−薬剤コンジュゲートの生物活性を評価するためにデザインされた信頼できる細胞に基づくアッセイを探索することに着目して努力を払った。本発明の化合物および方法は、抗癌化合物の、ｓｃＦｖを媒介とする腫瘍標的化送達の治療適用を提供する。
【００３４】
本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されるものではなく、これらはもちろん可変であると理解すべきである。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を表すためのものであり、限定されるものではないと理解すべきである。本明細書および特許請求の範囲で用いる、単数形は特に断りのない限り複数形も含む。よって、例えば、「細胞」という場合には、２個以上の細胞の組合せなどを含む。
【００３５】
特に断りのない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は一般に、本発明が属す当業者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。一般に、本明細書で用いる術語、ならびに下記の細胞培養の実験法、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションは周知のものであり、当技術分野で共通に用いられているものである。核酸およびペプチド合成には標準的な技術が用いられる。一般に、酵素反応および精製の工程は製造業者の使用説明書に従って行う。これらの技術および手順は一般に、当技術分野の常法および本明細書の随所に示されている種々の一般参考文献に従って行う（一般に、出典明示により本明細書の一部とされる、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照）。本明細書で用いる術語、ならびに下記の分析化学における実験法、および有機合成は周知のものであり、当技術分野で共通に用いられているものである。化学合成および化学分析には標準的な技術またはその改変法が用いられる。「治療薬」とは、治療上有効な量で存在する場合に哺乳類に所望の治療効果をもたらす化合物を意味するものとする。癌腫を処置するためには、治療薬はまた標的細胞に侵入し得ることが望ましい。特に断りのない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属す当業者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明の試験に実施においては、本明細書に記載のものと同等または等価な方法および材料はいずれも使用可能であるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載されている。本発明を記載および特許請求する上で、次の用語を用いる。
【００３６】
「新生物性疾患」とは、細胞の制御を欠いた増殖によって起こる疾病を指す。典型的な悪性新生物性疾患としては、限定されるものではないが、癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
【００３７】
「新生細胞」および「新生物」とは、相対的に自律的増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の著しい低下を特徴とする異常な増殖表現型を示す細胞を指す。新生細胞は、旺盛に複製できるか、または一時的に複製しない休止状態（Ｇ１またはＧ０）にある細胞を含み、同様に、新生細胞は、分化の十分な表現型を有するか、分化の不十分な表現型を有するか、または両細胞種の混合型である細胞を含む。よって、全てではないが、新生細胞はある時点で必ず複製する細胞である。新生細胞として定義されるものは、良性新生物の細胞と悪性（または明白な(frank)）新生物の細胞からなる。明らかな新生細胞はしばしば癌（前掲）と呼ばれ、一般に、内胚葉または外胚葉組織起源の細胞に由来する場合には癌腫と呼ばれ、あるいは中胚葉由来の細胞種に起源する場合には肉腫と呼ばれる。
【００３８】
数種の転移性新生物性疾患、例えば、悪性黒色腫、膀胱癌、眼球メラノサイトならびにブドウ膜の黒色腫、および前立腺癌では、インテグリンα３β１の発現上昇が見られた。また、新生物性疾患、例えば、悪性乳癌では、インテグリンαｖβ３の発現上昇が見られた。本発明の組成物によって処置可能な新生物性疾患のさらなる例としては、限定されるものではないが、固形腫瘍、造血器悪性腫瘍、白血病、結腸直腸癌、良性または悪性乳癌、子宮癌、子宮平滑筋腫、卵巣癌、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肝細胞癌の肝臓内転移、前立腺癌、前立腺肥大、下垂体癌、腺筋症、腺癌、膵臓腺癌、髄膜腫、黒色腫、骨癌、多発性骨髄腫、ＣＮＳ癌、神経膠腫、または星状芽細胞腫が挙げられる。
【００３９】
「細胞毒」とは、癌細胞に対して細胞傷害性の所望の作用を有する治療薬を指す。細胞毒の例としては、例えば、限定されるものではないが、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５抗腫瘍抗生物質、アントラサイクリン、および関連の化合物が挙げられる。他の細胞毒としては、マイコトキシン、リシンおよびその類似体、カリーチアマイシン、ドキシルビシンならびにメイタンシノイドが挙げられる。
【００４０】
「酸に安定な共有結合」とは、抗体−細胞毒コンジュゲートが例えば受容体を媒介とするエンドサイトーシスによって細胞に侵入した際に細胞内環境で安定な、抗体と細胞毒の間の共有結合を指す。この酸に安定な共有結合は通常、抗体−細胞毒コンジュゲートが細胞に侵入した際に切断されない。抗体と細胞毒の間のアミド結合は酸に安定な共有結合の一例である。
【００４１】
「酸に不安定な共有結合」とは、抗体−細胞毒コンジュゲートが例えば受容体を媒介とするエンドサイトーシスによって細胞に侵入した際に細胞内環境で安定でない、抗体と細胞毒の間の切断可能な共有結合を指す。抗体と細胞毒の間のヒドラゾン結合は酸に不安定な共有結合の一例である。
【００４２】
「マーカー」とは、腫瘍または他の医学的状態の同定、例えば、腫瘍の診断、予後、および腫瘍細胞によって分泌された因子のアッセイに有用な化合物を意味する。マーカーは「診断薬」のサブセットであると考えられる。
【００４３】
転移性細胞に対する活性化インテグリン受容体の「インヒビター」、「アクチベーター」および「モジュレーター」は、インテグリン受容体の結合またはシグナル伝達に関するin vitroおよびin vivoアッセイを用いて同定される、それぞれ阻害分子、活性化分子または調節分子、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにそれらの同族体およびミメティクスを指して用いられる。
【００４４】
「モジュレーター」とは、インヒビターとアクチベーターを含む。インヒビターは、例えば、活性化インテグリン受容体と結合する、その活性を部分的または全面的にその活性の刺激を遮断する、その活性を低下させる、妨げる、活性化を遅延させる、不活性化する、脱感作する、またはダウンレギュレートする薬剤、例えば、アンタゴニストである。アクチベーターは、例えば、活性化インテグリンと結合する、その活性を刺激する、増強する、開放する、活性化させる、助長する、活性を高める、増感する、またはアップレギュレートする薬剤、例えば、アゴニストである。モジュレーターは、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類、または例えばリポタンパク質、糖タンパク質などをはじめとする上記の組合せを含む、アクチベーターまたはインヒビター、受容体と結合するタンパク質により、活性化インテグリン受容体の相互作用を例えば変化させる薬剤を含む。モジュレーターは、天然の活性化インテグリン受容体リガンドの遺伝的修飾型（例えば、活性が変化されたもの）ならびに天然および合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小化学分子などを含む。
【００４５】
インヒビターおよびアクチベーターに関するこのようなアッセイは、例えば、活性化インテグリン受容体を発現する細胞に推定モジュレーター化合物を適用した後、本明細書に記載のようにインテグリン受容体シグナル伝達に対する機能的作用を判定することを含む。潜在的アクチベーター、インヒビター、またはモジュレーターで処置した活性化インテグリン受容体を含むサンプルまたはアッセイを、そのインヒビター、アクチベーター、またはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較して阻害の程度を調べる。対照サンプル（インヒビターで処理していないもの）を相対的インテグリン受容体活性値１００％と割り付けることができる。対照に対するインテグリン受容体活性値が約８０％、場合により５０％または２５〜０％となる場合に活性化インテグリン受容体の阻害が達成される。対照に対するインテグリン受容体活性値が１１０％、場合により１５０％、場合により２００〜５００％、または１０００〜３０００％高い場合にインテグリン受容体の活性化が達成される。
【００４６】
「ターゲッティング基」とは、（１）それが結合したもの（例えば、治療薬またはマーカー）を標的細胞に、例えば腫瘍細胞の特定種に向けることができるか、または（２）標的組織、例えば腫瘍において優先的に活性化される部分を意味するものとする。ターゲッティング基は小分子であってもよく、非ペプチドとペプチドの双方が意図される。ターゲッティング基はまた高分子であってもよく、糖類、レクチン、受容体、受容体のリガンド、タンパク質（ＢＳＡ、抗体など）などを含む。
【００４７】
「切断可能な基」または「切断可能な結合」とは、in vivoで不安定な部分を意味するものとする。好ましくは、「切断可能な基」または「切断可能な結合」は、マーカーまたは薬剤をコンジュゲートの残りの部分から切断することによってそのマーカーまたは治療薬の活性化を可能とする。実施上定義すれば、リンカーは好ましくは、in vivoにおいて生体環境により切断される。この切断は、限定されるものではないが、例えば、酵素的、還元的、ｐＨなど、いずれのプロセスから生じるものでもよい。好ましくは、この切断可能な基は所望の作用部位で活性化が起こるように選択し、この所望の作用部位とは、治療作用またはマーカー活性の部位など、標的細胞（例えば、癌細胞）または組織内またはその近傍の部位であり得る。このような切断は酵素的なものであり、酵素的に切断可能な基の例としては、天然アミノ酸、または天然アミノ酸を末端に有し、それらのカルボキシル末端においてリンカーと結合しているペプチド配列が挙げられる。本発明にとっては切断率の増強程度は重要でないが、切断可能なリンカーの好ましい例は、切断可能な基の少なくとも約１０％、最も好ましくは少なくとも約３５％が投与して２４時間以内に血流中で切断されるものである。好ましい切断可能な基はペプチド結合、エステル結合、およびジスルフィド結合である。
【００４８】
記号
【化５】
2008505144.tif 000007
は、結合として用いられる場合も、あるいは結合に対して垂直に示される場合も、示されている部分が分子、固相支持体などの残りの部分と結合している点を示す。
【００４９】
「アルキル」とは、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に断りのない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、またはその組合せを意味し、完全飽和型でも一不飽和型または多不飽和型でもよく、示された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）二価および多価基を含み得る。飽和炭化水素基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１個以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されるものではないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高次の同族体および異性体が挙げられる。「アルキル」とは、特に断りのない限り、「ヘテロアルキル」などの、下記により詳しく定義されているアルキルの誘導体も含むものとする。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と呼ばれる。
【００５０】
「アルキレン」とは、それ自体で、または別の置換基の一部として、アルカンに由来する二価の基を意味し、限定されるものではないがＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２が挙げられ、さらに以下に「ヘテロアルキレン」として記載される基も含む。一般に、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有し、本発明では１０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する鎖のより短いアルキルまたはアルキレン基である。
【００５１】
「ヘテロアルキル」とは、それ自体で、または別の用語と組み合わせて、特に断りのない限り、示された数の炭素原子とＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳ（なおここで、これらの窒素、炭素および硫黄原子は所望により酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は所望により第四級化されていてもよい）からなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素基、またはその組合せを意味する。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉはヘテロアルキル基内部のいずれかの位置にあってもよいし、あるいはアルキル基がその分子の残りの部分と結合している位置にあってもよい。限定されるものではないが、例としては、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２、Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨＯＣＨ３、Ｓｉ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＣＨ＝ＮＯＣＨ３、およびＣＨ＝ＣＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ３が挙げられる。例えば、ＣＨ２ＮＨＯＣＨ３およびＣＨ２ＯＳｉ（ＣＨ３）３など、２個までのヘテロ原子が連続していてよい。同様に、「ヘテロアルキレン」とは、それ自体で、または別の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する二価の基を意味し、例としては、限定されるものではないが、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２およびＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２が挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子はまた鎖の一方の末端を占めていてもよいし、両方の末端を占めていてもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルキレン」とは、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体を包含する（例えば、Shearwater Polymers Catalog, 2001参照）。なおさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン架橋基の場合、架橋の配向は架橋基の式が描かれている方向によっては表されない。例えば、式Ｃ（Ｏ）２Ｒ’はＣ（Ｏ）２Ｒ’とＲ’Ｃ（Ｏ）２の双方を表す。
【００５２】
「低級」とは、「アルキル」または「ヘテロアルキル」と組み合わせて、１〜６個の炭素原子を有する部分を指す。
【００５３】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）とは、それらの通常の意味で用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残りの部分と結合しているアルキル基を指す。
【００５４】
一般に、「アシル置換基」もまた、上記に示した基から選択される。本明細書において「アシル置換基」とは、本発明の化合物の多環式核と結合し、かつ本発明の化合物の多環式核と直接的または間接的のいずれかで結合しているカルボニル炭素の価数を満たす基を指す。
【００５５】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」とは、それ自体で、または他の用語と組み合わせて、特に断りのない限り、それぞれ置換型または非置換型「アルキル」および置換型または非置換「ヘテロアルキル」の環式型を表す。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、その複素環が分子の残りの部分と結合している位置を占めていてもよい。シクロアルキルの例としては、限定されるものではないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定されるものではないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。これら環式構造のヘテロ原子および炭素原子は所望により酸化されていてもよい。
【００５６】
「ハロ」または「ハロゲン」は、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に断りのない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などは、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むものとする。例えば、「ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」とは、限定されるものではないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むものとする。
【００５７】
「アリール」とは、特に断りのない限り、置換型または非置換型の多不飽和芳香族炭化水素置換基を意味し、これは単環であっても、縮合または共有結合した多環（好ましくは、１〜３環）であってもよい。「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、およびＳ（なおここで、これらの窒素、炭素および硫黄原子は所望により酸化されていてもよく、窒素原子（複数も含む）は所望により第四級化されていてもよい）から選択される１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を指す。ヘテロアリール基はヘテロ原子を介して分子の残りの部分と結合していてもよい。アリールおよびヘテロアリール基の限定されない例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環構造の各々の置換基は、下記の許容される置換基群から選択される。「アリール」および「ヘテロアリール」はまた、１以上の非芳香環構造がアリールまたはヘテロアリール構造に縮合しているか、またはそうでなければ結合している環構造も含む。
【００５８】
簡潔にするため、「アリール」は、他の用語と組み合わせて用いる場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシおよびアリールアルキル）、上記で定義したアリールとヘテロアリールの双方を含む。よって、「アリールアルキル」とは、炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば酸素原子によって置換されている（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）アルキル基を含むアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）にアリール基が結合している基を含むものとする。
【００５９】
上記の各用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、示されている基の置換型および非置換型の双方を含む。各種の基の好ましい置換基は下記に示す。
【００６０】
アルキルおよびヘテロアルキル基（多くの場合アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含む）の置換基は一般にそれぞれ「アルキル置換基」および「ヘテロアルキル置換基」と呼ばれ、限定されるものではないが、ゼロ〜（２ｍ’＋１）個の範囲の（ここで、ｍ’はこのような基における炭素原子の総数である）、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝ＮＯＲ’、ＮＲ’Ｒ”、ＳＲ’、−ハロゲン、ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’”、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’”、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’”）＝ＮＲ””、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’”、Ｓ（Ｏ）Ｒ’、Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、ＮＲＳＯ２Ｒ’、ＣＮおよびＮＯ２から選択される１以上の種々の基であり得る。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””は各々好ましくは独立に、水素、置換型または非置換型ヘテロアルキル、置換型または非置換型アリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換型または非置換型アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２個以上のＲ基を含む場合、例えば、各Ｒ基は独立に、これらの基が２個以上存在する際の各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””基の場合と同様に選択される。Ｒ’およびＲ”が同じ窒素原子と結合している場合、それらはその窒素原子と一緒に５員環、６員環、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、限定されるものではないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むものとする。置換基に関する上記の考察から、当業者ならば、「アルキル」が、ハロアルキル（例えば、ＣＦ３およびＣＨ２ＣＦ３）ならびにアシル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）のような、水素基以外の基と結合している炭素原子を含む基を含めることを意図したものであることが分かるであろう。
【００６１】
アルキル基に関して記載した置換基と同様に、アリール置換基およびヘテロアリール置換基は一般にそれぞれ「アリール置換基」および「ヘテロアリール置換基」と呼ばれ、多様なものがあり、例えば、ゼロからその芳香環構造の開放価数の総数までの範囲の数のハロゲン、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝ＮＯＲ’、ＮＲ’Ｒ”、ＳＲ’、−ハロゲン、ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’”、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’”、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’”、Ｓ（Ｏ）Ｒ’、Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、ＮＲＳＯ２Ｒ’、ＣＮおよびＮＯ２、Ｒ’、Ｎ３、ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択され、ここで、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””は好ましくは独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換型のアリールおよびヘテロアリール、（非置換型アリール）−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、および（非置換型アリール）オキシ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択される。本発明の化合物が２個以上のＲ基を含む場合、例えば、各Ｒ基は独立に、これらの基が２個以上存在する際の各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””基の場合と同様に選択される。
【００６２】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２個のアリール置換基は、所望により式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）（ＣＲＲ’）ｑＵ（ここで、ＴおよびＵは独立にＮＲ、Ｏ、ＣＲＲ’または一重結合であり、ｑは０〜３の整数である）の置換基で置換することができる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２個の置換基は、所望により式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ（ここで、ＡおよびＢは独立にＣＲＲ’、Ｏ、ＮＲ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’または一重結合であり、ｒは１〜４の整数である）の置換基で置換することができる。このようにして形成された新たな環の一重結合の１つは、所望により二重結合と置換することができる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２個の置換基は、所望により式（ＣＲＲ’）ｓＸ（ＣＲ”Ｒ’”）ｄ（ここで、ｓおよびｄは独立に０〜３の整数であり、ＸはＯ、ＮＲ’、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、またはＳ（Ｏ）２ＮＲ’である）の置換基で置換することができる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’”は好ましくは独立に水素または置換型もしくは非置換型（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
【００６３】
本明細書において、「ヘテロ原子」とは、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含む。
【００６４】
天然型の化合物は、その塩を塩基または酸と接触させ、常法にて本発明の化合物を単離することにより再生させるのが好ましい。親型の化合物は種々の塩形態のものと、極性溶媒中での溶解度など、特定の物理特性が異なるが、それ以外の点ではこれらの塩は、本発明における化合物の親型と同等である。
【００６５】
塩形態の他、本発明はプロドラッグ形態の化合物を提供する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、生理条件下で容易に化学変化を受けて本発明の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、ex vivo環境において化学的方法または生化学的方法によって本発明の化合物へと変換することができる。例えば、プロドラッグは経皮パッチリザーバー中に好適な酵素または化学試薬とともに置いた場合に本発明の化合物へとゆっくり変換することができる。
【００６６】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態ならびに水和形態をはじめとする溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と等価なものであり、本発明の範囲内に含まれる。本発明の特定の化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態でも存在することができる。一般に、全ての物理形態が、本発明が意図する使用について等価であり、本発明の範囲内にあるものとする。
【００６７】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する１以上の原子において非天然型の割合の同位元素を含み得る。例えば、これらの化合物は、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位元素で放射性標識することができる。放射性のものであれ非放射性のものであれ、本発明の化合物の全ての同位元素バリエーションは本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００６８】
「結合部分」または「ターゲッティング基を結合させるための部分」とは、リンカーへのターゲッティング基の結合を可能とする部分を指す。典型的な結合基の例を挙げれば、限定されるものではないが、アルキル、アミノアルキル、アミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキル−マレイミド、アルキル−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド、ポリ（エチレングリコール）−マレイミドおよびポリ（エチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドがあり、これらは全てさらなる置換が可能である。リンカーはまた、ターゲッティング基に実際に付属している結合部分を有することもできる。
【００６９】
本明細書において「脱離基」とは、反応において基質から切断される基質の一部を指す。
【００７０】
本明細書において「固相支持体」とは、選択された溶媒系において実質的に不溶な材料、またはそれが可溶な選択された溶媒系から容易に分離可能な（例えば、沈殿による）材料を指す。本発明を実施する上で有用な固相支持体としては、選択種が固相支持体と結合可能となるように活性化された、または活性化可能な群を含み得る。また固相支持体は、個々の、または２つ以上の本発明の化合物が結合される基板、例えば、チップ、ウエハーまたはウェルであってもよい。
【００７１】
本明細書において「反応性官能基」とは、限定されるものではないが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハリド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、スルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、擬似尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物をはじめとする群をさす。反応性官能基はまた、バイオコンジュゲートを調製するために用いるもの、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどを含む（例えば、Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic press, San Diego, 1996参照）。これらの各官能基を調製する方法は当技術分野で周知のものであり、特定の目的に対するそれらの適用または改変は当業者の能力の範囲内である（例えば、Sandler and Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989参照）。
【００７２】
本発明の特定の化合物は不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し、ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体が本発明の範囲内に含まれる。本発明の化合物は単一の異性体（例えば、鏡像異性体、シス−トランス異性体、位置異性体、ジアステレオマー）として、または異性体混合物として調製される。好ましい実施形態では、これらの化合物は実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体的に純粋な化合物を調製する方法は当技術分野で公知のものである。例えば、鏡像異性体的に富化された混合物および純粋な鏡像異性体化合物は、鏡像異性体的に純粋な合成中間体を、キラル中心において立体化学を変化させずに残すか、または完全に逆転させるかのいずれかの反応と組合せて用いることで調製することができる。あるいは、最終生成物または合成経路に沿った中間体を単一の立体異性体に分割することもできる。特定の立体中心を逆転させるか、または変化させずに残す技術、および立体異性体の混合物を分割する方法は分野で周知のものであり、特定の状況に対して方法を選択および当てはめを行うことは十分当業者の能力の範囲内である。一般に、Fumiss et al. (eds.), VOGEL’S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5th ED., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, pp. 809-816;およびHeller, Acc. Chem. Res. 23: 128 (1990)参照。
【００７３】
免疫毒素
本発明は抗体−細胞毒コンジュゲート分子を合成する方法、および抗体−細胞毒コンジュゲート分子もしくは免疫毒素として有用であるか、またはこれらの分子の合成において有用である化合物を対象とする。本発明はまた、免疫毒素など、抗体の免疫化学誘導体も対象とする。天然の補体プロセスによって溶解を誘導するため、また、通常存在する抗体依存性の細胞傷害性細胞と相互作用させるために、それらの定常ドメインを有するなど、適当なエフェクター機能を有する抗体も用いられる。例えば、精製し、濾過除菌した抗体を、癌治療に用いられるデュオカルマイシンなどの細胞毒と所望によりコンジュゲートさせてもよい。本発明の方法は、例えば、癌治療に用いられる免疫毒素として用いるためのヒト化抗体を得るのに好適である。
【００７４】
本発明の方法は、極めて選択的な方法で強力な細胞傷害性薬剤を直接腫瘍に向ける抗体を用いる抗体−細胞毒コンジュゲート分子を提供し、従って、無差別な細胞破壊が軽減される。これらの本発明は化学療法薬の有効性を高め、かつ、化学療法薬に付随することが多い副作用を軽減する可能性がある。
【００７５】
免疫毒素の細胞傷害性部分は細胞傷害性薬剤、または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、または毒素などの酵素的に活性なフラグメントであり得る。酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、限定されるものではないが、デュオカルマイシンおよびその類似体が挙げられる。酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、限定されるものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ(momordica charantia)インヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・アフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。
【００７６】
「抗体−細胞毒コンジュゲート」は、抗体をシスプラチンまたは５−フルオロウラシルなどの小分子抗癌剤とコンジュゲートさせた際に形成される。モノクローナル抗体とこのような細胞傷害性部分のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質結合剤を用いて作製することができる。このような試薬の例としては、ＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物｛ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど｝、ビス−ジアゾニウム誘導体｛ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど｝、ジイソシアネート（トリレン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性型フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）がある。毒素の溶解部分は抗体のＦａｂフラグメントと連結させることもできる。
【００７７】
免疫毒素は、本明細書で述べるような種々の方法で作製することができる。安定なコンジュゲートを得るには、一般に知られている架橋試薬を使用することができる。
【００７８】
感染した細胞表面で曝される抗原のドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体をリシンＡ鎖にコンジュゲートさせるのが有利である。このリシンＡ鎖は脱グリコシル化され、組換え手段によって産生されるのが最も有利である。リシン免疫毒素を作製する有利な方法は、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されている。
【００７９】
診断を目的に、in vitroで感染したヒト細胞を死滅させるために用いる場合、これらのコンジュゲートは一般に少なくとも約１０ｎＭの濃度で細胞培養培地に加える。in vitroで用いるための処方および投与様式は重要ではない。通常は、培養培地または灌流媒体と適合する水性処方物を用いる。細胞傷害性は常法により読み取ることができる。
【００８０】
感染細胞を処置するための細胞傷害性放射性薬剤は、放射性同位元素（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）と抗体をコンジュゲートさせることにより作製することができる。α粒子放出同位元素を用いるのが有利である。本明細書において「細胞傷害性部分」とは、このような同位元素を含むものとする。
【００８１】
さらなる実施形態では、毒素−コンジュゲートをＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いて作製する。これらのフラグメントは比較的小さいため、組織に浸透して感染細胞に到達しやすい。
【００８２】
別の実施形態では、膜融合性リポソームに細胞傷害性薬剤を充填し、このリポソームを特定の抗原と特異的に結合する抗体でコーティングする。
【００８３】
抗体およびその使用
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントに由来するフレームワーク領域を含み、抗原と特異的に結合し、抗原を認識するポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これによりそれぞれ免疫グロブリン種ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが定義される。一般に、結合の特異性と親和性においては、抗体の抗原結合領域が最も重要である。
【００８４】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹが挙げられる。本明細書において「抗体（Ａｂ）」とは、単鎖型の完全抗体をはじめとする完全抗体とその抗原結合フラグメントを含むものとする。最も好ましくは、抗体は本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられる。これらの抗体は鳥類および哺乳類をはじめ、いずれの動物に由来するものであってもよい。抗体はヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリのものであるのが好ましい。
【００８５】
単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域のみを含むか、または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全部または一部と組み合わせた可変領域を含み得る。可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのいずれの組合せも本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体も含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体も含む。
【００８６】
本発明の抗体は単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多重特異性であり得る。多重特異性抗体は本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよいし、あるいは本発明のポリペプチドと、異種ポリペプチドまたは固相支持体材料などの異種組成物の双方に対して特異的であってもよい。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69, 1991；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号（各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）；Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992参照。
【００８７】
完全な「抗体」は、ジスルフィド結合によって鎖内連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域とＶＬ領域はさらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超過変領域に細分され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域が散在している。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシル末端まで次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。これらの抗体の定常領域は宿主組織または、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および従来の補体系の第１成分（Ｃｌｑ）をはじめとする因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体とは、活性化インテグリン受容体と結合する能力を保持した完全な抗体の抗原結合部分を含む。結合の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含んだ二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の一本のアームのＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989)；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００８８】
「単離された」抗体とは、天然環境の成分から同定され、分離され、採取されたものである。その天然環境の夾雑成分は、その抗体の診断的使用または治療的使用を妨害すると考えられ、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る材料である。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法により測定した場合に９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超える抗体となるまで、（２）スピンカップ配列決定装置の使用によりＮ末端の、または内部のアミノ酸配列を少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一となるまで精製する。単離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、in situで組換え体１５細胞のうちに抗体を含む。しかしながら通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００８９】
「単鎖抗体」または「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」とは、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨの抗体融合分子を指す。このＦｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用い、ＶＬ領域とＶＨ領域が対を成して一価分子を形成している一本のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., Science 242: 423-426, 1988;およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988参照）として形成することを可能とする合成リンカーによって連結させることができる。このような単鎖抗体は「抗体」フラグメントという用語に含められ、組換え技術または完全抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって作製することができる。
【００９０】
「ヒト配列抗体」とは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、in vitroランダムまたは部位特異的突然変異誘発により、またはin vivo体細胞突然変異により導入された突然変異）を含み得る。このような抗体は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／１４４２４およびＷＯ００／３７５０４に記載されているような非ヒトトランスジェニック動物で生成することができる。しかしながら、本明細書において「ヒト配列抗体」とは、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体（例えば、ヒト化抗体）を含まないものとする。
【００９１】
また、組換え免疫グロブリンは生産可能である。目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるＣａｂｉｌｌｙの米国特許第４，８１６，５６７号およびQueen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989参照。
【００９２】
「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。従って、「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域（存在する場合）を有し、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を固定化細胞と融合させたものを含むハイブリドーマによって産生される。
【００９３】
「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」とは、真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンをはじめとする単一のクローンに由来する抗体を指すものであって、それが産生される方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレー技術の使用を含む当技術分野で公知の多様な技術を用いて作製することができる。
【００９４】
「ポリクローナル抗体」とは、細胞表面受容体、例えばヒト活性化インテグリン受容体に対する１を超える（２以上の）異なる抗体の調製物を指す。このような調製物はある範囲の異なるエピトープと結合する抗体を含む。
【００９５】
「キメラ抗体」とは、ある種（一般にマウス）に由来するモノクローナル抗体のＦｃ定常領域が、組換えＤＮＡ技術を用いて、別の種（一般にヒト）の抗体に由来するＦｃ領域で置換されたものである。例えば、ネズミモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡを、Ｆｃ定常領域をコードする配列を除去するよう特異的に選択された制限酵素で消化し、ヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの等価部分を置換する（Robinson et al., ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９; Akira et al., 欧州特許出願１８４，１８７; Taniguchi, 欧州特許出願１７１，４９６; Morrison et al., 欧州特許出願１７３，４９４; Neuberger et al., ＷＯ  ８６／０１５３３; Cabilly et al. 米国特許第４，８１６，５６７号; Cabilly et al., 欧州特許出願１２５，０２３; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449;およびShaw et al. (1988) J Natl Cancer Inst 80:1553-1559参照）。
【００９６】
ＣＤＲグラフト抗体は、いわゆる「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、所望の抗体特性を有するいわゆる「ドナー」抗体に由来するＣＤＲ「グラフト」により置換されている抗体である。一般にドナー抗体およびアクセプター抗体は異なる種に由来するモノクローナル抗体であり、一般にアクセプター抗体はヒト抗体（ヒトにおいてその抗原性を最小にするため）であり、この場合、得られたＣＤＲグラフト抗体は「ヒト化」抗体と呼ばれる。このグラフトはアクセプター抗体の１つのＶＨまたはＶＬ内の１つのＣＤＲのものであってもよく（またはさらに１つのＣＤＲの一部であってもよい）、あるいはＶＨおよびＶＬの一方または双方内の複数のＣＤＲ（またはその一部）のものであってもよい。得られたＣＤＲグラフト抗体の、ＭｅｔＡｐ３への十分な結合を可能とするのに必要な置換は１つのみであるが、多くの場合、アクセプター抗体の全ての可変ドメインにおける３つのＣＤＲ全てが対応するドナーＣＤＲで置換される。ＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体の作製方法は、Queenらの米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号；およびWinterの米国特許第５，２２５，５３９号により教示されており、これら全ての内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００９７】
このプロセスは一般に、グラフトされたＣＤＲをフランキングするアクセプター抗体のＦＲを変化させない。しかしながら、得られたＣＤＲグラフト抗体の抗原結合親和性は、あるＦＲの特定の残基を置換して、ドナー抗体の対応するＦＲにより類似したＦＲを作製することによって向上させることができる場合もある。置換基の好ましい位置としては、ＣＤＲに隣接するか、またはＣＤＲと相互作用し得るアミノ酸残基が挙げられる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、特に１２〜１６段参照）。あるいは、ドナーＦＲで開始して、アクセプターＦＲまたはヒトコンセンサスＦＲにより類似したものとなるようにそれを修飾することもできる。これらの修飾を行う技術は当技術分野で公知のものである。特に、得られたＦＲがヒトコンセンサスＦＲに位置に関して適合するか、またはこのようなコンセンサスＦＲと少なくとも９０％以上の同一性がある場合には、そのようにしても、得られた修飾抗体の抗原性は、完全なヒトＦＲを有する同じ抗体に比べて有意に上昇することはないと考えられる。本明細書において「コンセンサス配列」とは、関連配列の系統で最も高い頻度で見られるアミノ酸（またはヌクレオチド）からなる配列を指す（例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987参照)）。タンパク質ファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置は、そのファミリーのその位置に最も高い頻度で見られるアミノ酸によって占められている。２つのアミノ酸が等しい頻度で見られる場合には、コンセンサス配列にいずれを含めてもよい。「コンセンサスＦＲ」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列のＦＲを指す。
【００９８】
活性化インテグリン受容体に対する抗体はヒト活性化インテグリン受容体上のエピトープと結合して、活性化インテグリン受容体がカウンターレセプターまたはコレセプターと相互作用しないように阻害することができる。これら、また本発明において用いるのに好適な他の抗体は、当技術分野で周知であり、かつ／または本明細書に挙げられている参照文献に記載されている方法に従って調製することができる。好ましい実施形態では、本発明において用いる抗活性化インテグリン受容体抗体は、「ヒト抗体」、例えば、ヒトから単離された抗体であるか、または「ヒト配列抗体」（前記で定義）である。
【００９９】
本発明の抗体は、そのエピトープまたは抗体によって認識されるか、抗体が特異的に結合する本発明のポリペプチドの部分に関して記載または明示することができる。このエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書で記載されるように、例えば、Ｎ末端およびＣ末端の位置、連続するアミノ酸残基の大きさによって明示することができる。また、エピトープまたは本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を排除することもできる。よって、本発明は本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を含み、また、これを排除することも考慮する。
【０１００】
「エピトープ」とは、抗体との特異的結合が可能なタンパク質決定基である。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常は特異的な三次元構造特性ならびに特異的荷電特性を有する。コンフォメーションエピトープと非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者には結合するが、後者には結合性がないことで識別される。
【０１０１】
α３β１の好ましいエピトープは折りたたまれたタンパク質の表面、例えば、親水性領域であるとともに抗原性の高い領域に位置する。例えば、ヒトα３β１配列のＥｍｉｎｉサーフェース・プロバビリティー分析(Emini surface probability analysis)を用いて、そのタンパク質の表面に位置する特に高い確率を有し、従って、標的化抗体生産に有用なエピトープとなる可能性のある領域を示すことができる。
【０１０２】
本発明の抗体はまた、それらの交差反応性に関しても記載または明示することができる。本発明のポリペプチドの他のいずれのアナログ、オーソログ、またはホモログとも結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性を有するポリペプチドとは結合しない抗体（当技術分野で公知であり、また本明細書でも記載する方法を用いて算出）もまた本発明に含まれる。さらに、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下（本明細書に記載）で本発明のポリペプチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドとしか結合しない抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、それらの結合親和性に関しても記載または明示することができる。好ましい結合親和性としては、解離定数またはＫｄが５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍおよび１０−１５Ｍ未満のものが挙げられる。
【０１０３】
本発明の活性化インテグリン受容体に対する抗体としては、限定されるものではないが、in vitroおよびin vivo双方の診断法および治療法など、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのに当技術分野で公知の方法を含む用途を持つ。例えば、これらの抗体は、生体サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的かつ定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて用途を持つ。例えば、目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるHarlow & Lane前掲を参照。
【０１０４】
本発明の抗体は単独で使用することもできるし、他の組成物と組み合わせて使用することもできる。これらの抗体はさらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種ポリペプチドと組換え的に融合させたり、あるいはポリペプチドまたは他の組成物と化学的にコンジュゲート（共有結合的コンジュゲーションと非共有結合的コンジュゲーションを含む）させたりすることができる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、およびポリペプチド、薬剤または毒素などのエフェクター分子と組換え的に融合させるか、またはコンジュゲートさせることができる。例えば、各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ０３９６３８７参照）。
【０１０５】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインと融合またはコンジュゲートされた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域またはその一部と融合またはコンジュゲートさせることができる。本発明のポリペプチドと融合された抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはドメイン全体またはその一部の任意の組合せを含み得る。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのin vivo半減期を延長させるため、または当技術分野で公知の方法を用いたイムノアッセイで使用するために上記の抗体部分と融合またはコンジュゲートさせることができる。また、これらのポリペプチドを上記抗体部分と融合またはコンジュゲートさせて多量体を形成することもできる。例えば、本発明のポリペプチドと融合させたＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。より高次の多量体は、これらのポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの一部に融合させることにより作出することができる。本発明のポリペプチドを抗体部分と融合またはコンジュゲートさせる方法は当技術分野で公知のものである。例えば、各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ０３０７４３４、ＥＰ０３６７１６６；ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９１／０６５７０; Ashkenazi et al., PNAS, 88: 10535-10539, 1991; Zheng et al., J. Immunol., 154: 5590-5600, 1995;およびVil et al., PNAS, 89: 11337-11341, 1992参照。
【０１０６】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして働く抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を部分的または完全に阻害する抗体を含む。受容体特異的抗体とリガンド特異的抗体の双方が含まれる。リガンドの結合は阻害しないが、受容体の活性化は阻害する受容体特異的抗体も含まれる。受容体の活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本発明に記載されているか、そうでなければ当技術分野で公知の技術によって測定することができる。また、リガンド結合と受容体の活性化の双方を阻害する受容体特異的抗体も含まれる。
【０１０７】
同様に、リガンドと結合し、そのリガンドと受容体の結合を阻害する中和抗体、ならびにリガンドと結合し、それにより受容体の活性化を阻害するが、リガンドと受容体の結合は妨げない抗体も含まれる。「中和抗体」とは、結合する標的抗原のエフェクター機能を消失させるか、または有意に低下させ得る抗体分子を意味する。従って、「中和」抗標的抗体は、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達などのエフェクター機能を消失させるか、または有意に低下させることができる。
【０１０８】
さらに、受容体を活性化させる抗体も含まれる。これらの抗体は、リガンドを媒介とする受容体の活性化によって影響を受ける全ての、または全てではないがある程度の生物活性のアゴニストとして働き得る。これらの抗体は、本明細書に開示されている特異的活性を含む生物活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして特定することができる。上記の抗体アゴニストは当技術分野で公知の方法を用いて作出することができる。例えば、各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号; Deng et al., Blood 92: 1981-1988, 1998; Chen et al., Cancer Res., 58: 3668-3678, 1998; Harrop et al., J. Immunol. 161: 1786-1794, 1998; Zhu et al., Cancer Res., 58: 3209-3214, 1998; Yoon et al., J. Immunol., 160: 3170-3179, 1998; Prat et al., J. Cell. Sci., 111: 237-247, 1998; Pitard et al., J. Immunol. Methods, 205: 177-190, 1997; Liautard et al., Cytokinde, 9: 233-241, 1997; Carlson et al., J. Biol. Chem., 272: 11295-11301, 1997; Taryman et al., Neuron, 14: 755-762, 1995; Muller et al., Structure, 6: 1153-1167, 1998; Bartunek et al., Cytokinem, 8: 14-20, 1996参照。上記で述べたように、転移性細胞上の活性化インテグリン受容体の対する抗体を使用すれば、当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を作出することができる（例えば、Greenspan et al., FASEB J. 7: 437-444, 1989、およびNissinoff, J. Immunol. 147: 2429-2438, 1991参照）。例えば、ポリペプチドと結合して、ポリペプチドの多量体形成および／または本発明のポリペプチドとリガンドの結合を阻害する抗体を使用すれば、ポリペプチドの多量体形成および／または結合ドメインを「模倣」し、その結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドと結合し、それを中和する抗イディオタイプを作出することができる。このような中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを治療計画に使用すれば、ポリペプチドリガンドを中和することができる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を用いて本発明のポリペプチドと結合させ、かつ／またはそのリガンド／受容体と結合させ、それによりその生物活性を遮断することができる。
【０１０９】
抗体の調製と作出
本発明の抗体または抗体フラグメントを作出する方法は、一般に、対象（一般にマウスまたはウサギなどの非ヒト対象）に精製α３β１またはα３β１発現細胞を感作させることを含む。このポリペプチドの免疫部分は免疫原として使用可能である。
【０１１０】
一般に、免疫原は少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個のアミノアシル残基の長さである。エピトープによっては単量体よりも多量体が有効である場合がある。必要であれば、ポリペプチドの免疫原性を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのハプテンと融合またはコンジュゲートさせることによって増強することができる。このようなハプテンは多数が当技術分野で公知のものである。その代わりに、またはその上に、ポリペプチドをフロイントノ完全または不完全アジュバントなどの通常のアジュバントと組み合わせて、ポリペプチドに対する対象の免疫反応を高めることができる。これらの技術は当技術分野で標準的なものである。
【０１１１】
適当な免疫化の後、対象の血清からα３β１と結合するポリクローナル抗体を調製することができ、あるいは、対象の脾臓から常法を用いてモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを調製することができる。例えば、Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73:3-46)参照。標準的な技術を用いたハイブリドーマのスクリーニングにより、特異性（すなわち、種々のエピトープに対するもの）と親和性の異なるモノクローナル抗体が生産できる。ハイブリドーマにより発現される場合には、所望の特性を有する選択されたモノクローナル抗体を使用することができ、これをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子と結合させてその特性を変化させることができるし、あるいはまた、それをコードするｃＤＮＡを種々の方法で単離、配列決定、および操作することができる。このような操作の例は上記でＣＤＲグラフトおよびＦＲ修飾に関して述べた。他の操作としては、保存中または患者に投与した後の抗体の不安定性の一因となる特定のアミノアシル残基の置換または欠失、および抗体のＭｅｔＡｐ３親和性を改良するための親和性成熟技術が含まれる。
【０１１２】
また、モノクローナル抗体は当技術分野で公知の組換え技術を用いて生産することができる。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団を単離することができる。抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用したＰＣＲを用いて、その集団から抗体部分をコードする配列を増幅し、その後、その増幅配列から、抗体、または可変ドメインなどのそのフラグメントをコードするＤＮＡを再構築する。また、このような増幅配列を、例えば、ファージまたは細菌上での融合ポリペプチドの発現およびディスプレーのために、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質などの他のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させることができる。次に、増幅配列を発現させ、さらに、例えば発現した抗体またはそのフラグメントの、抗原またはエピトープに対する親和性に基づいて選択または単離することができる。ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を生産するための他の方法は当業者に周知のものである。
【０１１３】
ハイブリドーマ法は当技術分野で公知のもの、およびHarlow & Lane, 前掲; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681, 1981（この参照文献は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）に教示されているものを含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを作出するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作出するため）などの酵素を用いたタンパク質分解切断により作出することができる。
【０１１４】
あるいは、活性化インテグリン受容体に対する抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレー技術の適用により、または当技術分野で公知の方法を用いた合成化学法により作製することができる。例えば、本発明の抗体は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレー法を用いて調製することができる。ファージディスプレー法では、機能的な抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージをレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはネズミ）から、抗原、一般に、固相表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接選択することにより選択する。これらの方法で用いるファージは一般に、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３などの繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用可能なファージディスプレー法の例としては、Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994; ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号（各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）に記載されているものが挙げられる。
【０１１５】
上記の参照文献に記載されているように、ファージの選択後、ファージ由来の領域をコードする抗体を単離し、それを用いてヒト抗体をはじめとする完全抗体、または他のいずれかの所望の抗原結合フラグメントを作出し、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌をはじめとする所望のいずれかの宿主で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え生産する技術もまた、ＷＯ９２／２２３２４; Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992;およびSawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995;およびBetter et al., Science 240: 1041-1043, 1988に開示されているものなど、当技術分野で公知の方法を用いて利用することができる。
【０１１６】
単鎖Ｆｖおよび抗体を生産するのに使用可能な技術の例としては、各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., PNAS 90: 7995-7999, 1993;およびSkerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988に記載されているものが挙げられる。ヒトにおける抗体のin vivo使用およびin vitro検出アッセイを含むいくつかの使用では、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用するのが好ましい場合がある。キメラ抗体の作製方法は当技術分野で公知のものである。例えば、Morrison, Science 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989;および米国特許第５，８０７，７１５号参照。抗体は、ＣＤＲグラフト法（ＥＰ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング法(veneering)またはリサルフェーシング法(resurfacing)(ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６; Padlan E. A., Molecular Immunology, 28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994)、およびチェーン・シャッフル法(chain shuffling)（米国特許第５，５６５，３３２号）をはじめとする種々の技術を用いてヒト化することができる。ヒト抗体は、上記のファージディスプレー法をはじめとする当技術分野で公知の種々の方法によって作製することができる。各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号、および同第５，８１４，３１８号；ならびに各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照。
【０１１７】
さらに、本発明のポリペプチドと組換え的に融合されたまたは化学的にコンジュゲート（共有結合的コンジュゲーションと非共有結合的コンジュゲーションの双方を含む）された抗体も本発明に含まれる。これらの抗体は本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であってもよい。例えば、抗体を用い、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲートさせることにより、in vitroまたはin vivoのいずれかで本発明のポリペプチドに特定の細胞種を標的とさせることができる。本発明のポリペプチドと融合またはコンジュゲートした抗体はまた、当技術分野で公知の方法を用い、in vitroイムノアッセイおよび精製法に使用することもできる。例えば、Harbor et al. 前掲およびＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ０４３９０９５; Naramura et al., Immunol. Lett. 39: 91-99, 1994;目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第５，４７４，９８１; Gillies et al., PNAS 89: 1428-1432, 1992; Fell et al., J. Immunol. 146: 2446-2452, 1991参照。
【０１１８】
ｓｃＦＶファージライブラリー
ファージディスプレーライブラリーの１つのアプローチとしては、転移性細胞上の細胞表面受容体、例えば、活性化インテグリン受容体と特異的に結合する、新生物性疾患の処置のための抗体−細胞毒コンジュゲート分子として有用な抗体組成物を同定することである。ｓｃＦｖファージ−ライブラリーが用いられている（例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990参照）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されるｓｃＦｖライブラリーの種々の実施形態についてはすでに記載がある。例えば、出典明示により本明細書の一部とされるＷＯ９６／０６２１３およびＷＯ９２／０１０４７(Medical Research Council et al.)およびＷＯ９７／０８３２０(Morphosys)に記載されているように、ファージディスプレーアプローチの改良も知られている。例えば、ＷＯ９２／０１０４７(CAT/MRC)およびＷＯ９１／１７２７１(Affymax)に記載されているように、Ｆａｂライブラリーのディスプレーも知られている。
【０１１９】
抗体または抗体フラグメントがファージまたはファージミド粒子の表面に存在しているために良好な結合活性を維持している変異体を同定するために、ディスプレーベクター中にクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを、転移性細胞と関連のある適当な抗原、例えば、転移腫瘍細胞上の細胞表面受容体または活性化細胞表面受容体に対して選択することができる。例えば、Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001（その内容は出典明示により本明細書の一部とされる）参照。例えば、Ｆａｂフラグメントの場合、軽鎖および重鎖Ｆｄ産物をｌａｃプロモーターの制御下にあり、各鎖は、細菌宿主の周縁質空間に向けられるように、リーダーシグナルが融合されている。抗体フラグメントが適切に構築されるのはこの空間内である。重鎖フラグメントは、構築された抗体フラグメントの、新たに生産されたファージまたはファージミド粒子のコートへの組み込みを可能とするファージコートタンパク質ドメインとの融合物として発現される。新たなファージミド粒子の生成には、必要なファージ遺伝子を全て含むヘルパーファージを加える必要がある。ファージまたはファージミド表面に抗体フラグメントのライブラリーが提示されたところで、パンニングと呼ばれる方法を行う。これは、ｉ）ファージまたはファージミド粒子の表面に提示された抗体を所望の抗原に結合させ；ｉｉ）結合しなかったものを洗い流し、ｉｉｉ）結合した粒子を抗原から溶出させ；そしてｉｖ）さらなる選択のために富化プールを増幅させるため、溶出した粒子を新鮮な細菌宿主に曝すという方法である。一般に、抗体クローンの特異的結合をスクリーニングする前に、３回または４回のパンニングを行う。このようにすれば、ファージ／ファージミド粒子により、結合表現型（抗体）と遺伝子型（ＤＮＡ）の関連付けが可能となり、抗体ディスプレー技術の使用が非常に好結果となる。しかしながら、選択および／またはスクリーニングのために抗体フラグメントライブラリーを容菌ファージベクター中にクローニングするなど（修飾Ｔ７またはλＺａｐ系）、このヒト化法のために他のベクター形式を使用することもできる。
【０１２０】
所望のハイブリッド抗体および／またはハイブリッド抗体フラグメントを選択した後、それらが当業者に公知のいずれかの方法により大量に生産できるということも意図されている（例えば、原核細胞または真核細胞発現など）。例えば、ハイブリッド抗体またはフラグメントは、ＣＤＲおよび、必要に応じて、元の種の抗体結合特異性を保持している必要のある、可変領域フレームワークの最小部分（本明細書に記載の技術に従って操作される）が起源種の抗体に由来し、抗体の残りの部分が、本明細書に記載されるように操作可能な標的種の免疫グロブリンに由来する抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための常法を用いることで生産することができ、これによってハイブリッド抗体重鎖の発現用のベクターが作出される。
【０１２１】
詳細な実施形態では、種々の癌疾患を有する５名、１０名、１５名、または２０名、またはそれ以上の患者の末梢血リンパ球から、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ライブラリーを作製することができる。次に、合成シアリルＬｅｗｉｓｘおよびＬｅｗｉｓｘ  ＢＳＡコンジュゲートを用いることで、完全なヒト高親和性ｓｃＦｖ抗体を選択することができる。ある研究では、これらのヒトｓｃＦｖ抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、およびフローサイトメトリーにより膵臓腺癌細胞の細胞表面に結合することが証明されたので、シアリルＬｅｗｉｓｘおよびＬｅｗｉｓｘに特異的なものであった。ヌクレオチド配列決定により、少なくとも４つのユニークなｓｃＦｖ遺伝子が得られたことが明らかになった。Ｋｄ値は１．１〜６．２×１０−７Ｍの範囲であり、これは二次免疫応答に由来するｍＡｂの親和性に匹敵するものであった。これらの抗体は炭水化物抗原の構造および機能を探索するため、また、ヒト腫瘍性疾患の処置において有用な試薬となる可能性がある。Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 6953-6958, 1999。
【０１２２】
さらなる詳細な実施形態では、ファージにより提示されるコンビナトリアル抗体ライブラリーを用いて、転移性細胞に関連する適当な抗原、例えば、転移腫瘍細胞上の表面受容体または活性化細胞表面受容体に対する多様な抗体を作製および選択することができる。ファージコートタンパク質ｐＶＩＩおよびｐＩＸを用いれば、抗体Ｆｖ領域のヘテロ二量体構造を提示することができる。この技術の態様は、繊維状バクテリオファージのｐＩＸ上に提示されるのが４．５×１０９通りという大きなヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリーを構築するまでに拡張されている。さらにまた、ライブラリーの多様性、品質および有用性は、６つの異なるタンパク質抗原に対してｓｃＦｖクローンを選択することにより実証された。明らかに、選択されたクローンの９０％を超えるものが、わずか３回のパンニングでそれらの個々の抗原に対して陽性結合を示した。分析したｓｃＦｖはまた、高い親和性であることも分かった。例えば、動態分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）によれば、ブドウ球菌内毒素Ｂおよびコレラ毒Ｂサブユニットに対するｓｃＦｖはそれぞれナノモルおよびナノモル以下の解離定数を有し、免疫化から得られたｍＡｂに匹敵するか、またはそれを超える親和性が得られた。また、明らかに異なるタンパク質間だけでなく、もっと近縁のタンパク質の場合でも高い特異性が得られた（例えば、トウゴマ(Ricinus communis)（「リシン」）凝集素（ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０）、この２つの間の配列相同性は＞８０％）。これらの結果から、ｐＩＸ−ディスプレーライブラリーの性能はｐＩＩＩディスプレー形式の性能よりも優れている可能性があり、多様な標的抗原のパンニングに理想的に適したものとなることが示唆された。Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12612-12616, 2001。
【０１２３】
抗体または他の結合剤と抗原との間の特異的結合とは、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性を意味する。好ましい結合剤は少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍの親和性で結合する。
【０１２４】
免疫応答
「免疫細胞応答」とは、外部刺激または内部刺激（例えば、抗原、細胞表面受容体、活性化インテグリン受容体、サイトカイン、ケモカインなど）に対する免疫系細胞の応答を指し、この応答により、免疫細胞の移動、標的細胞の死滅、食作用、抗体の産生、免疫応答の他の可溶性エフェクターなどをもたらす免疫細胞における生化学的変化が生じる。
【０１２５】
「免疫応答」とは、癌細胞、転移腫瘍細胞、悪性黒色腫、侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織に対する、あるいは自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織に対する、選択的傷害、破壊、または体外排出をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記の細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の協調作用を指す。
【０１２６】
本明細書において「リンパ球」とは、当技術分野における通常の意味を有し、血液、リンパ液およびリンパ組織、例えば、ＢおよびＴリンパ球で見られる単核の非貪食性白血球のいずれかを指す。
【０１２７】
「Ｔリンパ球応答」および「Ｔリンパ球活性」は、Ｔリンパ球に依存する免疫応答の成分（例えば、Ｔリンパ球の増殖および／またはヘルパー、細胞傷害性キラー、またはサプレッサーＴリンパ球への分化、抗体産生を誘導または阻害するヘルパーＴリンパ球によるＢリンパ球へのシグナルの提供、細胞傷害性Ｔリンパ球による特異的標的細胞の死滅、および他の免疫細胞の機能を調節するサイトカインなどの可溶性因子の放出）を指して本明細書で互換的に用いられる。
【０１２８】
免疫応答の成分は当業者に周知の種々の方法によりin vitroで検出することができる。例えば、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球を放射性標識した標的細胞とともにインキュベートし、これらの標的細胞の溶解を放射能の放出により検出することができる、（２）ヘルパーＴリンパ球を抗原および抗原提示細胞とともにインキュベートし、サイトカインの合成および分泌を標準的な方法により測定することができる(Windhagen A; et al., Immunity, 2: 373-80, 1995)、（３）抗原提示細胞を完全なタンパク質抗原とともにインキュベートし、ＭＨＣ上での抗原の提示をＴリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法のいずれかによって検出することができる(Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989)、（４）肥満細胞をそれらのＦｃ−ε受容体を架橋する試薬とともにインキュベートし、ヒスタミンの放出を酵素イムノアッセイにより測定することができる(Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983)。
【０１２９】
同様に、モデル生物（例えば、マウス）またはヒト患者のいずれかにおける免疫応答の産物を、当業者に周知の種々の方法によって検出することもできる。例えば、（１）ワクチン接種に応答した抗体の産生は、臨床検査室で現在用いられている標準的な方法、例えばＥＬＩＳＡにより容易に検出することができる、（２）免疫細胞の炎症部位への移動は、皮膚表面を掻爬して無菌容器に入れ、掻爬部位上の移動細胞をキャプチャーすることにより検出することができる(Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988)、（３）マイトジェンまたは混合リンパ球反応に応答した末梢血単核細胞の増殖は、３Ｈ−チミジンを用いて測定することができる、（４）ＰＢＭＣにおける顆粒球、マクロファージ、および他の食細胞の食作用能力は、ＰＭＢＣを標識粒子とともにウェルに入れことにより測定することができる(Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988)、また（５）免疫系細胞の分化は、ＰＢＭＣをＣＤ４およびＣＤ８などのＣＤ分子に対する抗体で標識し、これらのマーカーを発現するＰＢＭＣの画分を測定することにより測定することができる。
【０１３０】
本発明では便宜のため、免疫応答をしばしば「一次」免疫応答または「二次」免疫応答と記載する。一次免疫応答は「防御」免疫応答とも呼ばれ、特定の抗原、例えば、細胞表面受容体または活性化インテグリン受容体に初めて曝された（例えば、初回「免疫」）結果として個体に生じる免疫応答を指す。このような免疫は、例えば自然に起こる抗原暴露の結果として（例えば、抗原を示す、または提示する何らかの病原体による初回感染から）、またはその個体の何らかの腫瘍の癌細胞（例えば、悪性黒色腫）により提示される抗原から生じ得る。あるいは、免疫は抗原を含むワクチンを個体に接種した結果として生じ得る。例えば、ワクチンは、癌細胞、例えば悪性黒色腫に由来する１以上の抗原を含む癌ワクチンであり得る。
【０１３１】
一次免疫応答は経時的に弱化または減衰し、消失してしまうことさえあり、あるいは少なくとも検出できなくなるほどに減衰していく。よって、本発明はまた「二次免疫応答」に関し、これは本明細書では「記憶免疫応答」とも呼ばれる。二次免疫応答とは、一次免疫応答がすでに生じた後に個体に惹起される免疫応答を指す。よって、二次免疫応答は、例えば、弱化または減衰してしまった既存の免疫応答を増強するため、または消失してしまったか、もしくはもはや検出できない過去の免疫応答を再形成するために惹起することができる。二次免疫応答を惹起するために投与することのできる薬剤は、一次免疫応答を「押し上げる(boost)」とすると言えるので、「追加免疫(booster)」と呼ばれる。
【０１３２】
限定されるものではないが、一例として、二次免疫応答は、一次免疫応答を惹起した抗原を個体に再導入することにより（例えば、ワクチンを再投与することにより）惹起することができる。しかしながら、抗原に対する二次免疫応答はまた、実際の抗原を含むことができない他の薬剤を投与することによっても惹起することができる。例えば、本発明は、活性化インテグリン受容体に対する抗体を個体に投与することにより二次免疫応答を増強するための方法を提供する。このような方法では、活性化インテグリン受容体に対する抗体とともに実際の抗原を投与する必要は必ずしもなく、抗体を含有する組成物が抗原を含む必要も必ずしもない。二次免疫応答または記憶免疫応答は体液性（抗体）応答か細胞応答のいずれであってもよい。二次体液性応答または記憶体液性応答は、初回の抗原提示の際に形成された記憶Ｂ細胞を刺激した際に生じる。遅延型過敏反応（ＤＴＨ）は、ＣＤ４＋細胞によって媒介される細胞性二次免疫応答または記憶免疫応答の一種である。抗原への初回暴露が免疫系を活性化し、次に暴露した際にＤＴＨが起こる。
【０１３３】
「免疫交差反応性」または「免疫反応性」とは、同じ（「免疫反応性」）または異なる（「免疫交差反応性」）抗原を用いて作製された抗体と特異的に反応する抗原を指す。一般に、この抗原は活性化インテグリン受容体、またはより一般にはα３β１インテグリン受容体もしくはその部分配列である。
【０１３４】
「免疫反応条件」とは、抗原の特定のエピトープに対して作製された抗体が、その抗体が実質的に全ての他のエピトープと結合するよりも検出可能に高い程度まで、一般には上記バックグラウンド結合の少なくとも２倍、好ましくは上記バックグラウンドの少なくとも５倍、そのエピトープと結合することを可能とする条件を指す。免疫反応条件は抗体結合反応の形式に依存し、一般にはイムノアッセイプロトコールに用いられているものである。イムノアッセイ形式および条件を記載したものとしては、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988 (Harlow & Lane) を参照。
【０１３５】
「細胞表面受容体」とは、シグナルを受け取り、このようなシグナルを細胞の原形質膜を通して伝達することができる分子および分子の複合体を指す。本発明の「細胞表面受容体」の一例としては、活性化インテグリン受容体、例えば、転移性細胞上の活性化α３β１インテグリン受容体がある。
【０１３６】
「非特異的Ｔ細胞活性化」とは、それらの抗原特異性に依存しないＴ細胞の刺激を指す。
【０１３７】
「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認識期および活性化期に対して免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。免疫細胞の例としては、骨髄起源またはリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）をはじめとするＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞、および好塩基球が挙げられる。エフェクター細胞は特異的Ｆｅ受容体を発現し、特異的免疫機能を果たす。エフェクター細胞は抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、例えば好中球はＡＤＣＣを誘導することができる。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびリンパ球は標的細胞の特異的死滅、および免疫系の他の成分に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与している。エフェクター細胞はまた、標的抗原、標的細胞、転移癌細胞、または微生物を貪食することができる。
【０１３８】
「標的細胞」とは、本発明のＡｂまたはＡｂ組成物によって標的化可能な対象（例えば、ヒトまたは動物）中の望ましくないいずれの細胞も指す。標的細胞はヒト活性化インテグリン受容体を発現または過剰発現する細胞であり得る。ヒト活性化インテグリン受容体を発現する細胞としては、腫瘍細胞、例えば、悪性黒色腫が挙げられる。
【０１３９】
転移癌細胞、例えば悪性黒色腫用の抗体組成物に対して注目される標的としては、限定されるものではないが、細胞表面受容体、増殖因子受容体、転移癌および悪性黒色腫などの癌に存在する抗イディオタイプ抗体および自己抗体をはじめとする抗体が挙げられる。他の標的としては、インテグリン、セレクチン、および免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーなどの接着タンパク質がある。Springer, Nature, 346: 425-433, 1990; Osborn, Cell, 62: 3, 1990; Hynes, Cell, 69: 11, 1992。注目される他の標的としては、増殖因子受容体（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦ、ｈｅｒ／ｎｅｕ、ＮＧＦＲ、およびＶＥＧＦ）およびそれらのリガンドが挙げられる。他の標的としてはＧタンパク質受容体があり、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α−およびβ−アドレナリン受容体、セロトニン受容体、およびＰＡＦ受容体がある。例えば、Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56: 625-649, 1987参照。他の標的としては、イオンチャネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル、多剤耐性を媒介するチャネルタンパク質）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ギャバ受容体、グルタミン酸受容体、およびドーパミン受容体がある（Harpold, 米国特許第５，４０１，６２９号および同第５，４３６，１２８号参照）。他の標的としては、インターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３などのサイトカイン、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα−、β−およびγ、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）がある。Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, Mass., 1991)参照。他の標的としては、ホルモン、酵素、ならびにアデニルシクラーゼ、グアニル酸シクラーゼおよびホスホリパーゼＣなどの細胞内および細胞間メッセンジャーが挙げられる。また、薬剤も注目される標的である。標的分子はヒト、哺乳類または細菌のものであり得る。他の標的としては、ウイルスおよび細菌双方の微生物病原体ならびに腫瘍に由来するタンパク質、糖タンパク質および炭水化物などの抗原が挙げられる。さらに他の標的も、目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。標的によってスクリーニングされた薬剤には単に標的と結合するだけのものがある。また、標的に促進作用または拮抗作用を示す薬剤もある。
【０１４０】
癌および癌治療
「癌」または「悪性疾患」は同義語として用いられ、細胞の制御を欠いた異常な増殖、罹患細胞の局部拡散能または血流およびリンパ系を通じた他の身体部位への拡散（すなわち、転移）能、ならびに多くの特徴的な構造的および／または分子的特徴によって同定される多くの疾病のいずれをも指す。「癌性」または「悪性細胞」とは、特異的な構造特性を有し、分化が欠如し、浸潤および転移能を有する細胞として理解される。癌の例としては、乳癌、肺癌、脳癌、骨癌、肝臓癌、腎臓癌、結腸癌および前立腺癌が挙げられる。（DeVita, V. et al. (eds.), 2001, Cancer Principles and Practice of Oncology, 6th. Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA参照、本参照文献は目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）。
【０１４１】
「癌に関連する」とは、核酸およびその発現もしくはその欠損、またはタンパク質およびそのレベルもしくは活性、またはその欠損と、対象細胞における悪性疾患の発症との関係を指す。例えば、癌は通常の健常細胞では発現されないか、または低レベルでしか発現されない特定の遺伝子の発現と関連付けることができる。逆に、癌関連遺伝子は、悪性細胞（または形質転換中の細胞）では発現されないか、または悪性細胞では通常の健常細胞で発現されるものより低レベルでしか発現されないものである場合もある。
【０１４２】
癌に関して「形質転換」とは、悪性化するにつれ正常細胞が受ける変化を指す。真核生物において「形質転換」とは、細胞培養における正常細胞から悪性細胞への変換を表すために使用することができる。
【０１４３】
「増殖細胞」とは、細胞分裂および指数関数的増殖を旺盛に行っているものである。「細胞増殖制御の欠如」とは、本来細胞分裂の適当な制限を保証している細胞周期の制御を失った細胞の特性をいう。このような制御を失った細胞は刺激シグナルがなくとも通常の速度よりも速い速度で増殖し、阻害シグナルにも応答しない。
【０１４４】
「進行癌」とは、原発腫瘍部位にもはや局在していない癌、またはthe American Joint Committee on Cancer (AJCC)に従い病期ＩＩＩまたはＩＶである癌を意味する。
【０１４５】
「十分許容される」とは、処置の結果として生じる、また、治療の判断を左右する健康状態における有害な変化が存在しないことを指す。
【０１４６】
「転移性」または「転移状態」とは、免疫不全マウスの乳房脂肪層および／または循環中に注入した際に、免疫不全マウスの例えば肺、肝臓、骨または脳に二次的腫瘍病巣を確立することができる腫瘍細胞、例えば、ヒト黒色腫細胞を指す。
【０１４７】
「非転移性」または「非転移状態」とは、乳房脂肪層および／または循環中に注入した際に、免疫不全マウスの例えば肺、肝臓、骨もしくは脳、または黒色腫転移の他の標的器官に二次的腫瘍病巣を確立することができない腫瘍細胞、例えば、ヒト黒色腫細胞を指す。本明細書で用い、本明細書で非転移性として取り組むヒト腫瘍細胞は、免疫不全マウスの乳房脂肪層に注入した際に原発腫瘍を確立することができるが、それらはその原発腫瘍から拡散することができない。
【０１４８】
「示差的に産生される」とは、非転移性細胞に比べて転移性細胞で変化したレベルで産生される、細胞によって産生される化合物、例えば、インテグリン受容体を指す。この変化したレベルとは、転移性細胞と非転移性細胞を比べた場合に低くても高くてもよい。この変化したレベルは検出可能なものであり、哺乳類対象における新生物性疾患の治療的処置に基づくものであり得る。
【０１４９】
「示差的に産生される」とは、遺伝子またはタンパク質の時間的発現パターンおよび組織発現パターンにおける量的ならびに質的双方の違いを指す。例えば、示差的に産生される遺伝子は、正常条件に対して病的条件下でその発現が活性化されているか、または完全に不活性化されているものであり得る。このように質的に調節される遺伝子は、ある組織種または細胞種内で、対照条件または病的条件のいずれかにおいては検出可能であるが、双方には検出できない発現パターンを示し得る。示差的に産生される遺伝子は「プロフィール遺伝子」または「標的遺伝子」などであり得る。
【０１５０】
同様に、示差的に産生されるタンパク質は、正常条件に対して病的条件下でその発現が活性化されているか、または完全に不活性化されているものであり得る。このように質的に調節されるタンパク質は、ある組織種または細胞種内で、対照条件または病的条件のいずれかにおいては検出可能であるが、双方には検出できない発現パターンを示し得る。さらに、示差的に産生される遺伝子は「プロフィールタンパク質」、「標的タンパク質」などであり得る。
【０１５１】
新生物性疾患を処置する方法は、本発明の抗体−細胞毒コンジュゲート分子による処置を提供する。抗体組成物による活性化インテグリン受容体の遮断は、患者において癌細胞に対する記憶免疫応答または二次免疫応答を増強し、それにより癌治療を補助する。抗体−細胞毒コンジュゲート分子内の活性化インテグリン受容体に対する抗体は、癌細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、細胞、ならびに免疫刺激サイトカインおよび細胞表面抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞などの免疫剤と組み合わせるか、または単独で用いて免疫を刺激することができる。
【０１５２】
抗体−細胞毒コンジュゲート分子として組み合わせた場合の活性化インテグリン受容体に対する抗体は、ワクチン接種プロトコールに従った際に有効である。腫瘍に対するワクチン接種の多くの試験戦略が考案されている（Rosenberg, S., ASCO Educational Book Spring: 60-62, 2000; Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302, 2000; Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428, 2000; Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738, 2000参照、また、Restifo, N. et al., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 61: 3023-3043, 1997も参照。これらの戦略のうちの１つでは、ワクチンは自己の、または同種異系の腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入された場合に最も有効となることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは腫瘍ワクチン接種に関する抗原提示の強力なアクチベーターとなることが示されている。Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 90: 3539-43, 1993。
【０１５３】
活性化インテグリン受容体に対する抗体は、ＧＭＣＳＦ改良型の腫瘍細胞ワクチンを追加刺激することができ、乳癌(Hurwitz et al., 1998, 前掲）、原発性前立腺癌(Hurwitz et al., Cancer Research, 60: 2444-8, 2000)および黒色腫(van Elsas et al., J. Exp. Med., 190: 355-66, 1999)などのいくつかの試験腫瘍モデルにおいてワクチン効力の向上が示されている。これらの場合、Ｂ１６黒色腫などの非免疫原性腫瘍が免疫系による破壊を受けやすくされている。また、この腫瘍細胞ワクチンは、とりわけ、ＩＬ２などの他の免疫アクチベーター、および共刺激分子を発現するように修飾することもできる。
【０１５４】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる「腫瘍特異的抗原」の特定に至った(Rosenberg, Immunity, 10: 281-7, 1999)。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、また、その腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２である。さらに重要なことには、これらの抗原の多くが、宿主において見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示すことができる。活性化インテグリン受容体に対する抗体は追加抗原刺激剤として、腫瘍で発現することが分かっているタンパク質および／またはペプチドの組換え型に基づくワクチンと併用して、これらのタンパク質に対する二次免疫応答または記憶免疫応答を増強することができる。これらのタンパク質は通常、免疫系により自己抗原として見なされているので、それらに耐性がある。腫瘍抗原はまた、染色体のテロメアの合成に必要であり、かつ、ヒト癌の８５％を超えるもので発現され、限られた数の体細胞組織でしか発現されないタンパク質テロメラーゼも含み得る(Kim et al., Science, 266: 2011-2013, 1994)。これらの体細胞組織は様々な手段による免疫攻撃から保護され得る。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変化させるか、または関連のない２つの配列間で融合タンパク質を作り出す（例えば、フィラデルフィア染色体のｂｃｒ−ａｂｌ）体細胞突然変異、またはＢ細胞腫瘍に由来するイディオタイプのために癌細胞で発現される「ネオ抗原」でもあり得る。他の腫瘍ワクチンとしては、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）などのヒトの癌に関連するウイルス由来のタンパク質が挙げられる。活性化インテグリン受容体に対する抗体と併用可能な別の形態の腫瘍特異的抗原としては、腫瘍組織それ自体から単離された精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）がある。これらの熱ショックタンパク質は腫瘍細胞由来のタンパク質フラグメントを含み、これらのＨＳＰは腫瘍免疫を惹起するために抗原提示細胞に送達するに当たっては極めて有効である(Suot et al., Science, 269: 1585-1588, 1995; Tamura et al., Science, 278: 117-120, 1997)。
【０１５５】
樹状細胞（ＤＣ）は、転移性腫瘍細胞において活性化インテグリン受容体に対する抗原特異的応答を誘導するのに使用できる有力な抗原提示細胞である。ＤＣはex vivoで生産し、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を添加することができる(Nestle et al., Nature Medicine, 4: 328-332, 1998)。ＤＣも同様に、これらの腫瘍抗原を発現するように遺伝的手段により形質導入することができる。また、ＤＣは、免疫目的で腫瘍細胞との直接融合も行われている(Kugler et al., Nature Medicine, 6: 332-336, 2000)。ワクチン接種の一方法としては、ＤＣ免疫は、より強力な抗腫瘍応答を活性化させるために活性化インテグリン受容体に対する抗体で有効に追加抗原刺激を行うことができる。
【０１５６】
活性化インテグリン受容体に対する抗体と併用可能な別のタイプの抗腫瘍ワクチンとして、黒色腫細胞株溶解物から調製したワクチンを免疫アジュバントと組み合わせたもの（２種のヒト黒色腫細胞株由来の溶解物の混合物であるＭＥＬＡＣＩＮＥ（商標）ワクチンとＤＥＴＯＸ（商標）免疫アジュバントの組合せなど）がある。ワクチン処置は、他の化学療法薬処置を伴う場合でも、または伴わない場合でも、抗活性化インテグリン受容体抗体で追加抗原刺激を行うことができる。
【０１５７】
活性化インテグリン受容体に対する抗体を含む抗体−細胞毒コンジュゲートはまた、標準的な癌処置によって誘導された免疫を追加刺激するためにも使用可能である。これらの場合、投与する化学療法薬の用量を引き下げることが可能となる(Mokyr et al., Cancer Research, 58: 5301-5304, 1998)。活性化インテグリン受容体に対する抗体と化学療法の併用の背景にある科学的原理は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害作用の結果としての細胞死が抗原提示経路において高いレベルの腫瘍抗原を生じるはずであるということである。従って、活性化インテグリン受容体に対する抗体は、腫瘍細胞の化学療法投与に対して誘導された免疫応答を追加刺激することができる。活性化インテグリン受容体に対する抗体による処置と併用される化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、放線菌属(Actinomycetes)またはストレプトミセス属(Streptomyces)抗生物質、デュオカルマイシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミフォスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エポエチンアルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミゾール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキサート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（タキソール（商標））、ピロカルピン、プロクロロペラジン、リツキシマブ、サポイン、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよび酒石酸ビノレルビンが挙げられる。前立腺癌処置では、抗活性化インテグリン受容体が併用可能な好ましい化学療法薬はパクリタキセル（タキソール（商標））である。黒色腫癌処置では、活性化インテグリン受容体が併用可能な好ましい化学療法薬はダカルバジン（ＤＴＩＣ）である。
【０１５８】
細胞死を通じて免疫系の誘導をもたらし得る他の併用療法としては、放射線、外科術、およびホルモン遮断がある(Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 96: 15074-9, 1999)。これらの各プロトコールは宿主内に腫瘍抗原の供給源を作り出すものである。例えば、外科術の際に腫瘍に何らかの操作を行えば、血中の癌細胞数が著しく増大することがある(Schwartz et al., Principles of Surgery 1984. 4th ed. p.338)。
【０１５９】
また、脈管形成阻害剤も活性化インテグリン受容体に対する抗体との併用が可能である。脈管形成を阻害すれば腫瘍細胞死を招き、これにより腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路へ送り込むことができる。これらは全て腫瘍の遊離と、活性化インテグリン受容体に対する抗体で追加刺激可能な潜在的免疫系誘導を引き起こす。
【０１６０】
「処置する」または「処置」とは、疾病の症状、合併症または生化学的徴候の発症を予防する、または遅延させて、症状を緩和する、またはその疾病、状態または障害のさらなる進展（例えば、癌または転移性癌）を阻止もしくは阻害することを目的に、本発明の抗体組成物、抗体−細胞毒コンジュゲート分子化合物または薬剤を投与することを含む。本発明の方法を用いた癌または転移性癌を「処置すること」または「処置」とは、軽減；緩解；症状の消失またはその病態をより患者に許容されるものとすること；変性または減退の速度を遅くすること；または変性の最終点の衰弱を小さくすることなどの任意の他覚的または自覚的パラメーターを含む、癌の処置または改善または予防に好結果をもたらすいずれの徴候も指す。症状の処置または改善は他覚的または自覚的パラメーターに基づくものであってよく、医師の検診の結果も含む。従って、「処置する」とは、新生物性疾患に関連する症状または状態の進展の予防もしくは遅延する、緩和する、または阻止もしくは阻害するための、本発明の化合物または薬剤の投与を含む。「治療効果」とは、対象における疾病、疾病の症状、または疾病の副作用の軽減、排除または予防を指す。
【０１６１】
「〜との組合せ」「併用療法」および「組合せ製剤」とは、ある特定の実施形態においては、第一治療薬と本明細書で用いる化合物を同時に投与することを指す。組み合わせて投与する場合、各成分は同時に投与してもよいし、異なる時点でいずれかの順序で逐次投与してもよい。従って、各成分は個別にではあるが、所望の治療効果が得られるよう十分接近した時点で投与することができる。
【０１６２】
「投与単位」とは、処置する特定の個体に対して単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の有効化合物を、必要な医薬担体とともに含み得る。単位投与形の詳細は、（ａ）有効化合物の独自の特性と達成しようとする特定の治療効果、および（ｂ）このような有効化合物を合成する当技術分野固有の制限によって指定され得る。
【０１６３】
抗体治療薬
in vivoにおいて治療に用いる場合、本発明の抗体は治療上有効な量（すなわち、所望の治療効果を示す量）で患者に投与される。本発明の抗体は通常、非経口投与される。用量および投与計画は感染の程度、使用する特定の抗体または免疫毒素の特性、例えばその治療係数、患者、および患者の病歴によって異なる。有利には、抗体または免疫毒素を１〜２週間にわたって連続的に、血管中の細胞を処置するには静脈投与し、局部リンパ節を処置するには皮下および腹膜内投与する。所望により、放射線、化学療法薬処置、または腫瘍壊死因子、インターフェロンまたは他の細胞保護剤もしくは免疫調節剤の投与の組合せサイクルなどの付随療法過程で投与を行う。
【０１６４】
非経口投与では、抗体を医薬上許容される非経口ビヒクルとともに単位投与注射形（溶液、懸濁液、エマルション）として処方する。このようなビヒクルは本来無毒で、治療薬ではない。このようなビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。硬化油およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルも使用可能である。リポソームを担体として使用できる。このビヒクルは、等張性および化学安定性を増強する物質（例えば、バッファーおよび保存剤）などの微量の添加剤を含み得る。抗体は一般に、これらのビヒクル中に約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。
【０１６５】
ＩｇＭ抗体の使用はある特定の適用において好ましいものであり得るが、ＩｇＧ分子も小さくすれば、ＩｇＭ分子よりもある種の感染細胞に局在させやすくなる。
【０１６６】
in vivoにおける補体の活性化が、炎症性応答の誘導およびマクロファージの活性化をはじめ、種々の生体作用をもたらすという証拠がある(Unanue and Benecerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams & Wilkins, p. 218 (1984))。血管拡張の増強を伴う炎症は、種々の薬剤の、感染細胞に局在する能力を高めることができる。よって、本発明によって明示されるタイプの抗原−抗体の組合せは多くの方法で治療的に使用することができる。さらに、精製抗原(Hakomori, Ann. Rev. Immunol. 2:103, 1984)またはこのような抗原に関連する抗イディオタイプ抗体(Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2864, 1985; Koprowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 216, 1984) を用い、ヒト患者において旺盛な免疫応答を誘導することができる。このような応答には、ヒト補体を活性化させ、ＡＤＣＣを媒介し得る抗体の形成が含まれ、このような機構により感染細胞の破壊が起こる。
【０１６７】
所望により、本発明の抗体は、新生物性疾患の処置のために投与することで例示されるように、抗体−細胞毒コンジュゲート分子として有用である。
【０１６８】
治療に用いる抗体組成物は、処置する障害、個々の患者の状態、組成物の送達部位、投与方法、および当業者に公知の他の因子を考慮し、適正医療基準(Good Manufacturing Practice, GMP)に即した様式で処方し、また用量を設定する。これらの抗体組成物は、以下の投与のためのポリペプチドの調製に関する記載に従い、投与用に調製する。
【０１６９】
当技術分野で十分理解されているように、生体特異的捕捉試薬としては、転移性細胞上の活性化インテグリン受容体と結合する抗体、抗体の結合フラグメント（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、およびｓｃＦｖタンパク質およびアフィボディ(Affibody, Teknikringen 30, floor 6, Box 700 04, Stockholm SE-10044, Sweden;目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第５，８３１，０１２号参照））が挙げられる。意図する使用に応じ、それらはまた、別の生体分子と特異的に結合する受容体および他のタンパク質を含んでもよい。
【０１７０】
ハイブリッド抗体およびハイブリッド抗体フラグメントとしては、全長重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、またはそのいずれかのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、抗体軽鎖および抗体重鎖など）が挙げられる。本明細書に記載されるような可変領域と種々の種に由来する定常領域を有するキメラ抗体も好適である。例えば、米国特許出願第２００３００２２２４４号参照。
【０１７１】
まず、抗体が生じ得る所定の標的対象を選択する。標的対象に対するモノクローナル抗体を作製する技術は当業者に周知である。このような技術の例としては、限定されるものではないが、ディスプレーライブラリー、ｘｅｎｏまたはｈｕｍａｂマウス、ハイブリドーマを含むものなどが挙げられる。標的対象としては、抗原性を示し得るいずれの物質も含むが、通常はタンパク質またはタンパク質多糖である。例としては、受容体、酵素、ホルモン、増殖因子、ペプチドなどが挙げられる。本開示に従った使用には天然抗体が好適であるだけでなく、所定の対象に向けられた操作型抗体および抗体フラグメントも好適であると理解すべきである。
【０１７２】
本明細書で示される技術に従い得る抗体（Ａｂ）としては、ファージまたはファージミドディスプレー技術に由来するモノクローナルおよびポリクローナルＡｂ、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体フラグメントなどの抗体フラグメントが挙げられる。まず始めに、起源種から最初の抗体を取得する。より詳しくは、標的抗原に対して特異性を有する起源種抗体の軽鎖、重鎖または双方の可変部分の核酸またはアミノ酸配列が必要となる。この起源種は抗体または抗体ライブラリーの作製に用いた任意の種であり、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。モノクローナル抗体を作製およびクローニングする技術は当業者に周知である。所望の抗体が得られた後、ＣＤＲの可能性のある定義（例えば、Ｋａｂａｔ単独、Ｃｈｏｔｈｉａ単独、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組合せ、および当業者に公知のその他のもの）のいずれかを用いて、可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を各成分部分（すなわち、フレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲ）に分離する。それらが得られたところで、適当な標的種のフレームワークの選択が必要となる。ある実施形態では、起源種抗体配列由来の個々の各フレームワーク領域を標的種由来の可変アミノ酸配列または遺伝子配列とともにアラインすることを含む。
【０１７３】
「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨＶＬ）を含む。同じ鎖上のこの２つのドメイン間では対合ができないような短いリンカーを用いることで、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することを余儀なくされ、２つの抗原結合部位が作出される。ダイアボディーについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；および30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により詳しく記載されている。
【０１７４】
同じファミリーおよび／または同じファミリーメンバーから好適なフレームワーク領域候補を選択した後、起源種由来のＣＤＲをグラフトしてハイブリッドフレームワーク領域とすることにより、重鎖および軽鎖可変領域の一方または双方を作製する。上記態様のいずれかに関してハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントの構築は、当業者に公知の常法を用いて達成することができる。例えば、本明細書に記載のハイブリッド可変ドメイン（すなわち、標的種に基づくフレームワークと起源種に由来するＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成および／またはＰＣＲにより作製することができる。また、ＣＤＲ領域をコードする核酸は、好適な制限酵素を用いて起源種抗体から単離し、好適な連結酵素を用いて連結することにより、標的種フレームワークに連結することもできる。あるいは、起源種抗体の可変鎖のフレームワーク領域を、部位特異的突然変異誘発により変化させることもできる。
【０１７５】
これらのハイブリッドは各フレームワーク領域に相当する複数の候補の選択から構築されるので、本明細書に記載の原理に沿った構築に従う多くの配列の組合せが存在する。従って、個々のフレームワーク領域の種々の組合せを有するメンバーを含んだハイブリッドライブラリーを構築することができる。このようなライブラリーは、配列の電子データベースコレクションまたはハイブリッドの物理的コレクションであり得る。
【０１７６】
物理的抗体または抗体フラグメントライブラリーの構築は、好ましくは、合成オリゴヌクレオチドを用いて達成される。一例では、オリゴヌクレオチドは、重複領域を持つように設計されているので、これらのオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など、ポリメラーゼによりアニーリングし、ギャップを埋めることができる。ＶＬおよびＶＨ遺伝子挿入部を作製するためには、何段階かでオーバーラップ・エクステンションを行う。これらのフラグメントはヒト定常ドメインと重複する領域を有するように設計されているので、それらをオーバーラップ・エクステンションにより融合させて、全長軽鎖およびＦｄ重鎖フラグメントを作製することができる。この軽鎖領域と重鎖Ｆｄ領域をオーバーラップ・エクステンションにより連結し、ディスプレーベクターにクローニングする単一のＦａｂライブラリー挿入部を作出することができる。ヒト化ライブラリー遺伝子を構築するための別法も使用可能である。例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アプローチを用い、重複するオリゴヌクレオチドからライブラリーを構築することもできる。Chalmers et al., Biotechniques, 30-2: 249-252, 2001。
【０１７７】
種々の形態の抗体フラグメントが作製可能であり、これを適当なベクターにクローニングして、ハイブリッド抗体ライブラリーまたはハイブリッド抗体フラグメントライブラリーを作出することができる。例えば、可変遺伝子を、必須定常ドメインの残りの部分をインフレームで含むベクターにクローニングすることができる。クローニング可能な付加的フラグメントの例としては、全長軽鎖、重鎖Ｆｄ部分、または軽鎖と重鎖Ｆｄの双方をコードする配列を含むフラグメントが挙げられる。あるいは、ヒト化に用いる抗体フラグメントは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。
【０１７８】
いずれの選択ディスプレー系も本開示のライブラリーと併用可能である。大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択的プロトコールは、ファージディスプレー技術を典型とするように、当技術分野で公知のものである。異なるペプチド配列が繊維状バクテリオファージの表面に提示されているこのような系は、標的抗原と結合する特異的抗体フラグメントのin vitro選択と増幅のための抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーの作出に有用であることが分かっている。Scott et al., Scien ce, 249: 386, 1990。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列が、それらを大腸菌(E. coli)の周縁質空間に向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントと連結され、その結果、得られた抗体フラグメントが、一般にはバクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との融合物として、バクテリオファージの表面に提示される。あるいは、抗体フラグメントはλファージまたはＴ７キャプシド（ファージボディ）の外部に提示される。ファージに基づくディスプレー系の有利な点は、それらの系が生物系であるので、選択されるライブラリーメンバーが、単に選択されたライブラリーメンバーを含むファージを細菌細胞中で増殖させることにより増幅できるということである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクターに含まれていることから、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作が比較的簡単である。バクテリオファージ抗体ディスプレーライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は当技術分野で周知のものである。McCafferty et al., Nature, 348: 552, 1990; Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363, 1991。
【０１７９】
核酸およびポリペプチド
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して「同一」または「同一性」％とは、同一である２つ以上の配列または部分配列、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズム（デフォルトパラメーターは下記）を用いるか、または手動アライメントと目視検査により評価した際に（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト参照）、特定のパーセンテージの、同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列（すなわち、比較枠または特定の領域（例えば、本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列）での最大一致に関して比較およびアラインした際に、少なくとも約６０％の同一性、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性）を指す。このような配列は「実質的に同一」であると言われる。このような用語はまた、試験配列の完全性も指す、あるいは適用できる。このような用語はまた、欠失および／または不可を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。下記に示すように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを考慮することができる。同一性は少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって存在するのが好ましくは、または５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって存在するのがより好ましい。
【０１８０】
配列比較に関しては、一般にある配列を参照配列とし、これと試験配列の比較を行う。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を作製し、必要に応じてさらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを設定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、あるいは別のパラメーターを設定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムにより、それらのプログラムパラメーターを基に、参照配列に対する試験配列の配列同一性％を計算する。
【０１８１】
本明細書において「比較枠」とは、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ある配列を、その２配列が最適にアラインされた後に、同数の連続する位置からなる参照配列と比較することができる。比較のために配列をアラインする方法は当技術分野で周知のものである。比較のための配列の最適アライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 1981, 2:482のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 1970, 48:443のアライメントアルゴリズムによるか、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 1988, 85:2444の類似性検索法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューターでの実施(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によるか、または手動アライメントと目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995増補参照）により実施することができる。
【０１８２】
アライメントを検索するプログラムは当技術分野で周知のものであり、例えば、ＢＬＡＳＴなどがある。例えば、標的種がヒトであれば、このようなアミノ酸配列または遺伝子配列（生殖細胞系または再配列抗体配列）の情報源は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＣＢＩタンパク質データバンク(http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、ヒト抗体遺伝子のデータベースであるＶＢＡＳＥ(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc)、および免疫グロブリンのＫａｂａｔデータベース(http://www.immuno.bme.nwu.edu)またはその翻訳物など、好適ないずれの参照データベースでも見出せる。ヌクレオチド配列を基にアライメントを行う場合には、選択された遺伝子を、そのサブセットのうちどの遺伝子が起源種抗体と緊密なアミノ酸相同性を有するか判定するために分析しなければならない。データベースの他の配列に比べて高い程度の相同性に近づくアミノ酸配列または遺伝子配列が、本明細書に記載の手順に従って使用および操作できると考えられる。さらに、相同性の低いアミノ酸配列または遺伝子については、それらが本明細書に記載の手順に従って操作および選択した際に所定の標的抗原に対して特異性を示す産物をコードしている場合に使用できる。ある実施形態では、許容される相同性の範囲は約５０％より高い。標的種はヒト以外のものであってもよいと理解すべきである。
【０１８３】
配列同一性および配列類似性％を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例としては、それぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res., 1977, 25:3389-3402およびAltschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410に記載のＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０がある。本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性％を決定するためには、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を下記のパラメーターとともに用いる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で公開され利用されている。このアルゴリズムは、まず、クエリー配列において、データベース配列の同じ長さのワードとアラインした際に正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはＴを満たすショートワード長Ｗを特定することにより、ハイスコア配列対(high scoring sequence pairs, HSP)を特定することを含む。Ｔは近隣文字列スコア閾値(neighborhood word score threshold)と呼ばれる。これらの最初の近隣文字列ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけ出すために検索を開始する元情報となる。これらの文字列ヒットを、累積アライメントスコアが増え得る限り各配列の両方向に延長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（マッチ残基対のレワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向への文字列ヒットの延長は、累積アライメントスコアがその最大到達値からＸ量だけ外れた場合；１以上の負のスコアとなる残基のアライメントの蓄積によって、累積スコアがゼロ以下になった場合；または各配列の末端に達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルト値としてワード長（Ｗ）１１、エクステンション（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖比較を用いる。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、デフォルト値としてワード長３、およびエクステンション（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 89:10915参照）アライメント（Ｂ）５０、エクステンション（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖比較を用いる。
【０１８４】
本明細書では「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して互換的に用いる。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーだけでなく、１以上のアミノ酸残基が相当する天然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマーも指す。
【０１８５】
「アミノ酸」とは、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は遺伝コードによりコードされているもの、ならびにその後修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合しているα炭素を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。
【０１８６】
アミノ酸は本明細書では、一般に知られている三文字記号か、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionが奨励している一文字記号のいずれかで表すことができる。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている一文字コードで表すことができる。
【０１８７】
「保存的修飾変異体」とは、アミノ酸配列と核酸配列の双方に用いられる。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異体とは、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、実質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸があるタンパク質をコードしている。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、あるコドンによりアラニンが指定されている位置はどこであれ、コードされるポリペプチドを変更することなく対応する記載のコドンのいずれにもコドンを変更することができる。このような核酸変異は、保存的修飾変異の一種の「サイレント変異」である。また、ポリペプチドをコードする本明細書の核酸配列はいずれも、その核酸の潜在的サイレント変異のいずれをも表す。当業者ならば、核酸の各コドン（通常メチオニンのみに対するコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのみに対するコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して機能的に同一の分子を作出することができることを認識している。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異体は、実際のプローブ配列ではなく発現産物に関して各記載の配列であることを暗に示す。
【０１８８】
アミノ酸配列について、当業者ならば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する、コード配列中の１個のアミノ酸または低いパーセンテージのアミノ酸が変更、付加または欠失される個々の置換、欠失または付加が、その変更が化学的に類似しているアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらす場合には「保存的修飾変異体」となることを認識している。機能的に類似しているアミノ酸を示した保存的置換表は当技術分野で周知のものである。このような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間同族体、および対立遺伝子に加えてのものであり、それらを排除するものではない。
【０１８９】
以下の８つの群は各々、互いに保存的置換となるアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)参照）。
【０１９０】
ポリペプチド構造などの高分子構造は様々なレベルの構成に関して記載することができる。この構成に関する全般的な考察としては、例えば、Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd ed.、1994)およびCantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、あるポリペプチド内で局部的に指定されている三次元構造を指す。これらの構造は一般にドメインとして知られ、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、および細胞質尾部ドメインがある。ドメインとは、ポリペプチドのコンパクトな単位を形成するポリペプチドの部分であり、一般に１５〜３５０アミノ酸の長さである。ドメインの例としては、例えばキナーゼドメインなどの酵素活性を有するドメインがある。典型的なドメインは、β−シートおよびα−ヘリックスストレッチなど、より低次の構成のセクションからなる。「三次構造」とは、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合的会合によって形成された三次元構造を指す。異方性の用語はエネルギー用語としても知られる。
【０１９１】
特定の核酸配列はまた、「スプライス変異体」も暗に含む。同様に、核酸によってコードされている特定のタンパク質は、その核酸のスプライス変異体によってコードされているタンパク質も暗に含む。「スプライス変異体」は、その名が示す通り、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物はスプライシングを受けることがあり、その結果、異なる（別の）核酸スプライス産物は異なるポリペプチドをコードする。スプライス変異体の生成機構は様々であるが、エキソンの選択的スプライシングを含む。読み過ごし転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまたこの定義に含まれる。これらのスプライス産物の組換え型をはじめ、スプライシング反応の産物はいずれもこの定義に含まれる。
【０１９２】
「組換え」とは、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いる場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸またはタンパク質の変更により修飾されていること、あるいはその細胞がそのように修飾された細胞に由来するものであることを示す。よって、例えば、組換え細胞が、その細胞の天然型（非組換え型）には見られない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常な発現を示すか、発現が不足しているか、または全く発現しない天然型遺伝子を発現する。
【０１９３】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、一般に核酸の複雑な混合物中の、その標的部分配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェント条件は配列に依存し、環境が異なれば異なる。長い配列ほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての包括的な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes、“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)に見出せる。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度ｐＨで、特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い温度になるよう選択する。Ｔｍは（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）平衡状態で、標的に相補的な５０％のプローブが標的配列とハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰量で存在するので、Ｔｍ下では５０％のプローブが平衡状態にある）。また、ストリンジェント条件はホルムアミドなどの脱安定化剤を添加することでも達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、インキュベーション４２℃、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、インキュベーション６５℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄である。
【０１９４】
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸同士でも、それらがコードしているポリペプチドが実質的に同じであるならば、やはり実質的に同じものである。このようなことは、例えば、遺伝コードに許容される最大コドン縮重を用いて核酸コピーが作り出された場合に起こる。このような場合、これらの核酸は一般に中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件」の例としては、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳのバッファー中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中、４５℃での洗浄が挙げられる。陽性ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者ならば、同等のストリンジェンシー条件を得るのに別のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件も利用可能であることが容易に認識できる。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定する他の指針は、例えば、Ausubel et al, 前掲など、多くの参照文系に示されている。
【０１９５】
ＰＣＲでは、低ストリンジェンシー増幅には約３６℃の温度が一般的であるが、アニーリング温度はプライマーの長さにも応じて約３２℃〜４８℃の間で異なり得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅では、約６２℃の温度が一般的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度はプライマーの長さと特異性に応じて約５０℃〜約６５℃の範囲であり得る。高ストリンジェンシー増幅および低ストリンジェンシー増幅とも、典型的なサイクル条件は、変性期９０℃〜９５℃で３０秒〜２分、アニーリング期３０秒〜２分、および伸張期約７２℃で１〜２分である。低ストリンジェンシー増幅反応および高ストリンジェンシー増幅反応のプロトコールおよび指針は、例えば、Innis et al. PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)に示されている。
【０１９６】
融合タンパク質
活性化インテグリン受容体に対する抗体を用いて融合タンパク質を作出することができる。例えば、本発明の抗体を第二のタンパク質に融合させると、抗原性タグとして使用することができる。活性化インテグリン受容体に対して生成された抗体を用い、ポリペプチドと結合させることにより第二のタンパク質を間接的に検出することができる。さらに、分泌タンパク質は輸送シグナルに基づいて細胞の場所を標的とするので、このインテグリン受容体を他のタンパク質と融合させれば、標的化分子として使用することができる。
【０１９７】
ポリペプチドと融合可能なドメインの例としては、異種シグナル配列だけでなく、他の異種機能的領域も含む。融合は必ずしも直接的なものでなくとも、リンカー配列を介して行ってもよい。
【０１９８】
さらに、融合タンパク質はまた、ポリペプチドの特性を改良するために操作してもよい。例えば、付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加すれば、宿主細胞から精製する際の安定性および持続性、またはその後の取扱い性および保存性を改良することができる。また、ポリペプチドにペプチド部分を付加して精製を容易にすることもできる。このような領域は、ポリペプチドの最終精製の前に除去することができる。ポリペプチドの取扱いを容易にするためのこのようなペプチド部分の付加はよく知られており、当技術分野での常法である。
【０１９９】
さらに、抗体組成物または細胞表面受容体、またはインテグリン受容体（フラグメントも含む）、および具体的にはエピトープを免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインと組み合わせてキメラポリペプチドとすることもできる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、長いin vitro半減期を示す。ある報告例では、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインと、哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質が記載されている。ＥＰ  Ａ３９４，８２７； Traunecker et al., Nature, 331: 84-86, 1988。ジスルフィド結合した二量体の構造を有する融合タンパク質（ＩｇＧによる）はまた、単量体の分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独の場合より、他の分子との結合およびその中和により有効であり得る。Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995。
【０２００】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ４６４５３３（カナダ対応物２０４５８６９）は、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を別のヒトタンパク質またはその一部とともに含む融合タンパク質を開示している。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は治療および診断に有益であり、従って、例えば、薬物動態が改良できる（ＥＰ−Ａ０２３２２６２）。あるいは、融合タンパク質を発現、検出および精製した後にこのＦｃ部分を削除することが望ましい。例えば、この融合タンパク質を免疫用の抗原として用いる場合には、このＦｃ部分は治療および診断の障害となることがある。創薬においては、例えば、ｈＩＬ−５などのヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５の拮抗薬を同定することを目的としたハイスループットスクリーニングアッセイのために、Ｆｃ部分と融合されている。Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471 1995。
【０２０１】
さらに、これらのポリペプチドは、融合したポリペプチドの精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列と融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、多くが市販されている中でも、ｐＱＥベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)で提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドがある。例えば、Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989に記載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の便宜な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する。Wilson et al., Cell 37: 767, 1984.
【０２０２】
従って、これら上記の融合物はいずれも本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて操作することができる。
【０２０３】
組換え抗体の発現
細胞表面受容体、例えば、転移性細胞上の活性化インテグリン受容体に対するキメラ、ヒト化およびヒト抗体は一般に組換え発現により生産される。組換えポリヌクレオチド構築物は一般に、天然に会合しているまたは異種のプロモーター領域を含め、抗体鎖のコード配列に作動可能なように連結されている発現制御配列を含む。好ましくは、この発現制御配列は真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクト可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。このベクターが適当な宿主に組み込まれれば、これらのヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応性抗体の回収および精製に好適な条件下でこの宿主が維持される。目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許出願第２００２０１９９２１３号参照。
【０２０４】
これらの発現ベクターは一般に、エピソームとしてか、または宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれた一部としてかのいずれかで宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能とするよう、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
【０２０５】
大腸菌は本発明のＤＮＡ配列のクローニングに特に有用な原核生物宿主の１つである。また、酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセス(Saccharomyces)は好ましい酵母宿主であり、好適なベクターは所望により発現制御配列、複製起点、終結配列などを有する。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が挙げられる。誘導型の酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーターが挙げられる。
【０２０６】
哺乳類細胞は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Winnacker, From Genes To Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)参照。当技術分野においては、完全な異種タンパク質を分泌し得る好適な宿主細胞系統が数多く開発されており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統、種々のＣＯＳ細胞系統、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞および骨髄腫細胞系統が挙げられる。これらの細胞は非ヒトであることが好ましい。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位などの必要なプロセシング情報、ならびに転写終結配列を含み得る。Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986。好ましい発現制御配列は内因性の遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。Co et al., J Immunol. 148: 1149, 92。
【０２０７】
あるいは、抗体コード配列を、トランスジェニック動物のゲノムに導入し、その後、トランスジェニック動物の乳汁中に発現させるための導入遺伝子に組み込みことができる。例えば、各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第５，７４１，９５７号、同第５，３０４，４８９号、および同第５，８４９，９９２号参照。好適な導入遺伝子としては、カゼインまたはβラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能なように連結された軽鎖および／または重鎖のコード配列が挙げられる。
【０２０８】
目的のＤＮＡセグメントを含むベクターは、細胞宿主のタイプに応じ、周知の方法によって宿主細胞へ導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に原核細胞に利用され、一方、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティクスまたはウイルスに基づくトランスフェクションはその他の細胞宿主に使用できる。哺乳類細胞を形質転換するのに用いられる他の方法としては、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning参照）。トランスジェニック動物の作出のためには、導入遺伝子を受精した卵母細胞にマイクロインジェクションしてもよいし、あるいは胚幹細胞のゲノムに組み込み、このような細胞の核を除核した卵母細胞に導入すればよい。
【０２０９】
発現させれば、抗体コレクションを培養培地および宿主細胞から精製する。抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などをはじめとする当技術分野で標準的な手順に従って精製することができる。通常、抗体鎖はシグナル配列とともに発現され、その後、培養培地に放出される。しかしながら、抗体鎖が自然状態で宿主細胞によって分泌されない場合は、弱い界面活性剤で処理することで抗体鎖を放出させることができる。その後、抗体鎖を、硫酸アンモニウム沈殿法、固定化標的に対するアフィニティークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動をはじめとする常法により精製することができる（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)）。
【０２１０】
上記の方法により、選択された標的に対して特異的親和性を有する抗体鎖をコードする核酸配列のライブラリーが得られる。この核酸のライブラリーは一般に少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９通りの異なるメンバーを含む。通常、ライブラリーの全配列の２５または５０％以上を占める単一メンバーは存在しない。一般に、ライブラリーメンバーの少なくとも２５、５０、７５、９０、９５、９９または９９．９％が標的分子に対して特異的親和性を有する抗体鎖をコードする。二本鎖抗体ライブラリーの場合、それぞれ重鎖および軽鎖をコードする核酸セグメントの対がライブラリーのメンバーであると考えられる。これらの核酸ライブラリーは遊離形態で存在することもできるし、任意のベクターの成分として存在することもできるし、またはベクター成分として宿主細胞にトランスフェクトすることもできる。
【０２１１】
これらの核酸ライブラリーを発現させ、標的に対して特異的親和性を有する抗体のポリクローナルライブラリーを作製することができる。このようなライブラリーの組成はヌクレオチドライブラリーの組成から判断することができる。従って、このようなライブラリーは一般に、アミノ酸組成の異なる少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９通りのメンバーを含む。通常、ライブラリーの全ポリペプチドの２５または５０％以上を占める単一メンバーは存在しない。標的に対して特異的親和性を有する抗体鎖ライブラリーにおける抗体鎖のパーセンテージは一般に、各抗体鎖をコードする対応する核酸のパーセンテージよりも低い。この違いは、適切な折りたたみを維持する適切な一次アミノ酸配列を有しているにもかかわらず、必ずしも全てのポリペプチドが結合のために適切な構造に折りたたまれていないということによるものである。いくつかのライブラリーでは、抗体鎖の少なくとも２５、５０、７５、９０、９５、９９または９９．９％が標的分子に対する特異的親和性を有する。また、複数鎖抗体のライブラリーでも、各抗体（Ｆａｂまたは完全抗体など）がライブラリーのメンバーであると考えられる。抗体鎖が異なれば、標的に対する微細な結合特異性や親和性が互いに異なる。このようなライブラリーには、同じ抗原上の異なるエピトープに結合するメンバーを含むものもある。また、このようなライブラリーには、互いに競合することなく同じ抗原に結合する少なくとも２つのメンバーを含むものもある。
【０２１２】
上記の方法から得られるヒト抗体のポリクローナルライブラリーは、本ライブラリー中の高親和性結合物のパーセンテージが高いこと、および本ライブラリーが一般に天然集団に存在するものと同じ抗体の多様性を示さないことの双方により、天然のヒト抗体集団とは区別される。本ライブラリーの多様性の低さは、非ヒトトランスジェニック動物がヒト免疫グロブリン遺伝子の全てを含まない原材料を提供することによるものである。例えば、ポリクローナル抗体ライブラリーにはλ軽鎖を有する抗体を含まないものもある。また、本発明のポリクローナル抗体ライブラリーには、１０、２０、３０または４０より少ないＶＨ遺伝子によりコードされている抗体重鎖を有するものもある。また、本発明のポリクローナル抗体ライブラリーには、１０、２０、３０または４０より少ないＶＬ遺伝子によりコードされている抗体軽鎖を有するものもある。
【０２１３】
修飾抗体
本発明にはまた、転移性細胞上の細胞表面受容体、例えば、活性化インテグリン受容体に対する修飾抗体も含まれる。
【０２１４】
「修飾抗体」とは、例えば、抗体の一部を欠失、付加または置換することによって修飾されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体を指す。例えば、抗体は定常領域を欠失させ、抗体の半減期、例えば血清半減期、安定性または親和性の増強を意味する定常領域で置換することにより修飾することができる。
【０２１５】
本発明の抗体コンジュゲートを用い、ある生物学的応答を修飾したり、あるいは生物学的応答を作り出したりすることができる（例えば、エフェクター細胞の動員）。薬剤部分は従来の化学治療薬に限定されるものと解釈すべきではない。例えば、この薬剤部分は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒などの酵素的に活性な毒素、または活性のあるそのフラグメント；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−αなどのタンパク質；または例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子などの生物反応修飾因子が挙げられる。
【０２１６】
本発明の特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体および抗体組成物を、例えば、１以上の治療薬部分または細胞傷害部分とカップリングまたはコンジュゲートさせることができる。本明細書において「細胞傷害性部分」とは、単に、細胞に近接するか、細胞に吸収された際に細胞増殖を阻害するか、または細胞死を誘導する部分を意味する。この点で好適な細胞傷害性部分としては、放射性薬剤または同位元素（放射性核種）；分化誘導剤、阻害剤および小化学毒剤などの化学毒剤；毒素タンパク質およびその誘導体；ならびにヌクレオチド配列（またはそれらのアンチセンス配列）が挙げられる。従って、この細胞傷害性部分は、限定されない例を示せば、化学療法薬、光活性化毒素または放射性薬剤であり得る。
【０２１７】
一般に、治療薬は、例えば、薬物動態的安定性および患者に対する全身毒性の軽減の必要性を適宜考慮して、好適ないずれかの技術により、本発明の抗体および抗体組成物とコンジュゲートさせることができる。治療薬は好適な抗体部分と直接または間接的に（例えば、リンカー基を介して）カップリングさせることができる。各々他と反応可能な官能基を有している場合に薬剤と抗体の間の直接的反応が可能となる。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良好な脱離基（例えば、ハライド）を含むアルキル基と反応可能である。あるいは、好適な化学リンカー基が使用できる。リンカー基は、結合能との干渉を避けるために抗体を薬剤から遠ざけるスペーサーとして働き得る。リンカー基はまた、ある部分または抗体上の置換基の化学反応性を高め、ひいてはカップリング効率を高める働きをし得る。化学反応性が高まると、そうでなければ不可能であるようなその部分またはその部分上にある官能基の使用も容易となり得る。
【０２１８】
好適な結合化学としては、マレイミジルリンカーおよびハロゲン化アルキルリンカー（抗体部分上のスルフヒドリルと反応する）およびスクシンイミジルリンカー（抗体部分上の第一級アミンと反応する）が挙げられる。免疫グロブリン上には数個の第一級アミン基およびスルフヒドリル基が存在し、組換え免疫グロブリン分子には付加基の設計が可能である。当業者には、種々の二官能性試薬または多官能性試薬（ホモ官能性とヘテロ官能性の双方）（Pierce Chemical Co., Rockford, IIIのカタログに記載されているものなど）をリンカー基として利用可能である。ことが明らかであろう。カップリングには、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化炭水化物残基を介して影響を与えることができる（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号参照）。
【０２１９】
カップリングの別法としては、米国特許第５，０５７，３１３号および同第５，１５６，８４０号に記載のように、細胞傷害性薬剤を本発明の抗体および抗体組成物に、例えば、グリコシル化部位において酸化炭水化物基を介してカップリングさせることができる。抗体および抗体組成物を細胞傷害性部分またはイメージング部分にカップリングさせるさらにもう１つの別法としては、ストレプトアビジン／ビオチンまたはアビジン／ビオチンなどの非共有結合対の使用によるものがある。これらの実施形態では、対の一方のメンバーを抗体部分に共有結合させ、結合対の他方のメンバーをおよび細胞傷害性部分またはイメージング部分に共有結合させる。
【０２２０】
細胞傷害性部分が本発明の免疫コンジュゲートの抗体部分を含まない場合に有効性が高い場合には、細胞への内在化中または内在化時に切断し得るか、または細胞外環境で経時的に徐々に切断し得るリンカー基を使用するのが望ましい可能性がある。いくつかの異なる切断可能な基がすでに記載されている。これらのリンカー基からの細胞傷害性部分薬剤の細胞内放出の機構は、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、米国特許第４，４８９，７１０号）、光に不安定な結合の照射による切断（例えば、米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体を媒介とする加水分解による切断（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸を触媒とする加水分解による切断（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号）が挙げられる。
【０２２１】
２以上の治療薬、細胞傷害性部分および／またはイメージング部分を本発明の抗体または抗体組成物とカップリングさせるのが望ましい。本発明の抗体を多価誘導体化することにより、数種の細胞傷害戦略を同時に実施することができ、抗体は数種の可視化技術用の造影剤として有用なものとなり得、あるいは治療抗体は可視化技術による追跡のために標識することができる。一実施形態では、細胞傷害性部分の複数の分子を１つの抗体分子にカップリングする。別の実施形態では、２種類以上の部分を１つの抗体にカップリングすることができる。例えば、ポリヌクレオチドまたはアンチセンス配列などの治療薬部分を化学毒性部分または放射線毒性部分とともに抗体にコンジュゲートさせ、化学療法または放射線毒性療法の有効性を高めるとともに、所望の治療効果を得るために必要な用量を引き下げることができる。実施形態を問わず、２つ以上の部分を有する免疫コンジュゲートは種々の方法で作製することができる。例えば、２つ以上の部分を抗体分子に直接カップリングすることもできるし、あるいは結合のために複数の部位を提供するリンカー（例えば、デンドリマー）を使用することもできる。あるいは、２つ以上の細胞傷害性部分を保持する能力を有する担体を使用することもできる。
【０２２２】
上記で説明したように、担体は、直接またはリンカー基を介した共有結合、および非共有結合的会合をはじめとする、様々な方法で薬剤を担持することができる。好適な共有結合担体としては、アルブミンなどのタンパク質（例えば、米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランなどの多糖類（例えば、米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられ、各々各部分の結合のための複数の部位を有する。担体はまた、非共有結合などの非共有結合的会合により、またはリポソーム小胞内などの封入（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）により薬剤を担持することもできる。封入担体は、治療組成物を標的細胞の近傍に集中させるとともに、化学毒性部分を経時的に徐々に放出させることができるので、化学毒性治療薬の実施形態に特に有用である。
【０２２３】
細胞傷害性部分として用いるのに好ましい放射性核種は、薬理学的投与に好適な放射性核種である。このような放射性核種としては、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、および２１２Ｂｉが挙げられる。ヨウ素およびアスタチン同位元素は、それらの使用に関する多数の文献が蓄積されていることから、本発明の治療組成物において用いるのにより好ましい放射性核種である。１３１Ｉは他のβ放射核種と同様に特に好ましく、これらの有効範囲は数ミリメートルである。１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または２１１Ａｔは、ヨードゲン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２１１Ａｔ］アスタトベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル３−［１３１Ｉ］ヨードベンゾエート（ＳＩＢ）、およびＮ−スクシンイミジル５−［１３１Ｉ］ヨードブ−３−ピリジンカルボキシレート（ＳＩＰＣ）をはじめとする、数種の既知コンジュゲーション試薬のいずれかを用いる組成物および方法で用いられる抗体部分とコンジュゲートさせることができる。列挙したヨード試薬では、ヨウ素同位元素を使用することができる。他の放射性核種も、核医学分野の業者に公知の好適なキレート剤により、本発明の抗体または抗体組成物とコンジュゲートさせることができる。
【０２２４】
好ましい化学毒剤としては、メトトレキサートなどの小分子薬、ならびにピリミジンおよびプリン類似体が挙げられる。好ましい化学毒分化誘導剤としては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。化学毒性部分は本発明の抗体または抗体組成物に化学リンカーを介して直接コンジュゲートすることもできるし、あるいは担体中に封入した後に本発明の抗体または抗体組成物とカップリングさせることもできる。
【０２２５】
細胞傷害性部分として用いるのに好ましい毒素タンパク質としては、デュオカルマイシンなどの放線菌属(Actinomycetes)またはストレプトミセス属(Streptomyces)抗生物質が挙げられる。細胞傷害性部分として用いるのに好ましい毒素タンパク質としてはさらに、リシン、アブリン、ジフテリア毒、コレラ毒、ゲロニン、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、および医薬生化学分野で公知の他の毒素タンパク質が挙げられる。これらの毒剤は患者において望ましくない免疫応答を惹起することがあるので、特に血管内注射する場合には、本発明の抗体および抗体組成物とのカップリング用の担体中に封入することが好ましい。
【０２２６】
免疫毒の細胞傷害性部分としては、細胞傷害性剤または酵素的に活性な、細菌もしくは植物起源の毒素、またはこのような毒素の酵素的に活性なフラグメント（「Ａ鎖」）であり得る。使用される酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolacca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ(momordica charantia)インヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・アフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンがある。別の実施形態では、これらの抗体は小分子抗癌剤とコンジュゲートされる。モノクローナル抗体とこのような細胞傷害性部分のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質結合剤を用いて作製される。このような試薬の例としては、ＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣ１など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物｛ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど｝、ビス−ジアゾニウム誘導体｛ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど｝、ジイソシアネート（トリレン２，６−ジイソシネートなど）、およびビス活性型フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）がある。毒素の溶解部分は抗体のＦａｂフラグメントと連結させることもできる。
【０２２７】
有利には、標的受容体、例えば、活性化α３β１インテグリン受容体の外部ドメインと特異的に結合する本発明の抗体および抗体組成物をリシンＡ鎖とコンジュゲートさせることができる。最も有利には、このリシンＡ鎖を脱グリコシル化し、組換え手段によって生産する。リシン免疫毒を作製する有利な方法は、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるVitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されている。
【０２２８】
細胞に対して用いる「接触させる」とは、本明細書では、抗体、抗体組成物、細胞傷害性薬剤または部分、遺伝子、タンパク質および／またはアンチセンス配列が標的細胞に送達されるか、または標的細胞に接触して置かれるプロセスを指して用いる。この送達はin vitroまたはin vivoにおけるものであってよく、組換えベクター系の使用も含み得る。
【０２２９】
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬剤（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などの治療薬部分とコンジュゲートした本発明の抗体または抗体組成物、またはそのフラグメントを特徴とする。このようなコンジュゲートは本明細書では「免疫コンジュゲート」と呼ぶ。１以上の細胞毒を含む免疫コンジュゲートを「免疫毒」と呼ぶ。細胞毒または細胞傷害性薬剤としては、細胞に有害な（例えば、死滅させる）いずれの薬剤も含む。例としては、放線菌属(Actinomycetes)またはストレプトミセス属（Streptomyces)抗生物質、デュオカルマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジドン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびその類似体または同族体が挙げられる。
【０２３０】
本発明の免疫コンジュゲートの形成に好適な治療薬としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。好ましい実施形態では、治療薬は細胞傷害性薬剤または放射線毒剤である。別の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。さらに別の実施形態では、治療薬はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施形態では、治療薬はドキソルビシン（アドリアマイシン）、硫酸シスプラチンブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドヒドロキシ尿素またはリシンＡである。
【０２３１】
本発明の抗体および抗体組成物はまた、例えば癌を処置するための細胞傷害性放射性薬剤を作出するために、放射性毒、例えば放射性ヨウ素とコンジュゲートさせることもできる。
【０２３２】
このような治療薬部分と抗体をコンジュゲートする技術は周知のものである。例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)参照。
【０２３３】
ポリペプチドまたは抗体組成物の使用
ポリペプチドまたは抗体組成物、例えば、本明細書で特定される、細胞表面受容体に対する抗体、抗体細胞毒コンジュゲート、細胞表面受容体（転移性細胞上の活性化インテグリン受容体など）は各々、多くの方法で使用することができる。次の記載は例示と考えるべきであり、公知の技術を用いる。
【０２３４】
本発明のポリペプチドまたは抗体組成物は、抗体に基づく技術を用い、生体サンプルにおいてタンパク質レベルをアッセイするために使用することができる。例えば、組織におけるタンパク質発現は従来の免疫組織学的方法を用いて研究することができる。Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な他の抗体に基づく方法としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイがある。好適な抗体アッセイ標識は当技術分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）などの放射性同位元素または他の放射性薬剤；ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
【０２３５】
生体サンプルにおいて分泌されたタンパク質レベルをアッセイすることに加え、タンパク質または抗体組成物はイメージングによりin vivoにおいて検出することもできる。タンパク質のin vivoイメージングのための抗体標識またはマーカーとしては、Ｘ線撮影、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものがある。Ｘ線撮影では、好適な標識としてはバリウムまたはセシウムなどの放射性同位元素が挙げられ、これらは検出可能な放射線を発するが、対象に明らかな害がない。ＮＭＲおよびＥＳＲの好適なマーカーとしては、重水素など、検出可能な特徴的なスピンを伴うものが挙げられ、これは関連のｓｃＦｖクローンに対する栄養素の標識により、抗体へ組み込むことができる。
【０２３６】
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射性不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料など、適当な検出可能なイメージング部分で標識されたタンパク質特異的抗体または抗体フラグメントを哺乳類に導入する（例えば、非経口、皮下、または腹膜内導入）。当技術分野では、対象の大きさおよび用いるイメージング系によって、診断画像を得るのに必要なイメージング部分の量が決まると理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象については、注入する放射能の量は通常、９９ｍＴｃ約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次に、この標識抗体または抗体フラグメントを、特異的タンパク質を含む細胞の場所に優先的に蓄積させる。in vivo腫瘍イメージングは、S. W. Burchiel et al., Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13, 1982に記載されている。
【０２３７】
よって、本発明は障害の診断方法を提供し、その方法は、（ａ）ポリペプチドの発現を、個体の細胞または体液中で本発明の抗体組成物の結合を測定することによりアッセイすること；（ｂ）その遺伝子発現レベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較することを含み、それにより、アッセイポリペプチドの遺伝子発現レベルが標準的な発現レベルに比べて増大または低下していることが障害の指標となる。
【０２３８】
ある分子の、活性化インテグリン受容体と結合する能力は、例えば、推定リガンドの、アッセイプレートにコーティングした活性化インテグリン受容体イムノアドヘシンと結合する能力によって判定することができる。結合の特異性は、非活性化インテグリン受容体との結合と比較することにより判定することができる。
【０２３９】
一実施形態では、活性化インテグリン受容体に対する抗体結合は、リガンドまたは受容体のいずれかを固定化することによりアッセイすることができる。例えば、このアッセイは、Ｈｉｓタグと融合させた活性化インテグリン受容体をＮｉで活性化したＮＴＡ樹脂ビーズ上に固定化することを含み得る。抗体を適当なバッファーに加え、これらのビーズを所定の温度で一定時間インキュベートすればよい。洗浄を行って結合しなかった材料を除去した後、結合したタンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨのバッファーなどで遊離させ、分析することができる。
【０２４０】
さらに、本発明のポリペプチドまたは抗体組成物は疾病の処置にも使用することができる。例えば、ポリペプチド（例えば、インスリン）の不在またはレベルの低下を回復させる試み；異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢに対してヘモグロビンＳ）の不在またはレベルの低下を回復させる試み；ポリペプチド（例えば、癌遺伝子）の活性を阻害する試み；ポリペプチドの活性を活性化させる試み（例えば、受容体との結合による）；遊離リガンドをめぐって競合させることにより、膜結合受容体の活性を低下させる試み（例えば、炎症の軽減において用いられる可溶性ＴＮＦ受容体）；または所望の応答（例えば、血管増殖）をもたらす試みにおいて、本発明のポリペプチドまたは抗体組成物を患者に投与することができる。
【０２４１】
同様に、本発明の抗体組成物を疾病の処置に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体を投与すれば、結合し、そのポリペプチドの過剰生産を低下させることができる。同様に、抗体を投与すれば、膜受容体と結合しているポリペプチドと結合することによるなどしてそのポリペプチドを活性化させることもできる。
【０２４２】
診断使用
転移性腫瘍細胞、例えば、悪性黒色腫を同定するための診断方法で用いられる本発明のヒト抗体および抗体組成物は、好ましくは上記の方法を用いて生産される。これらの方法により、どんなエピトープ結合特異性でも有し、所望のどんな抗原に対してでも極めて高い結合親和性を示す、事実上無限数の本発明の抗体および抗体組成物が得られる。一般に、標的に対する抗体の結合親和性が高いほど、イムノアッセイでより高いストリンジェントの洗浄を行って、標的抗原を除去することなく非特異的に結合した材料を除去することができる。よって、上記のアッセイで使用される本発明の抗体および抗体組成物は通常、少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２Ｍ−１の結合親和性を有する。さらに、診断試薬として用いる抗体は、標準的な条件下で少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも１時間で平衡に達するに十分符合するものであるのが好ましい。
【０２４３】
特許請求する方法において用いられる本発明の抗体および抗体組成物は、高い免疫反応性、すなわち、適切に保持される抗体分子のパーセンテージを有することが好ましく、そのため、本発明の抗体および抗体組成物はそれらの標的抗原と特異的に結合することができる。このようなことは、上記のように、抗体をコードしている配列を大腸菌で発現させることにより達成することができる。通常、このような発現の結果、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の免疫反応性が得られる。
【０２４４】
本発明のいくつかの方法では、本発明の抗体および抗体組成物のポリクローナル製剤を診断試薬として用い、他の方法ではモノクローナル単離物を用いる。ポリクローナル混合物の使用には、１つのモノクローナル抗体からなる組成物という点に対していくつかの利点がある。標的上の複数の部位に結合することで、ポリクローナル抗体または他のポリペプチドは、１つの部位としか結合しないモノクローナルよりも強いシグナルを生じることができる（診断薬に関して）。さらに、ポリクローナル製剤は原型標的配列の数多くの変異体（例えば、対立遺伝子変異体、種変異体、株変異体、薬剤性エスケープ変異体）と結合することができるが、モノクローナル抗体は原型配列またはその狭い範囲の変異体としか結合することができない。しかしながら、近縁抗原の存在下または存在の可能性下で単一の抗原を検出するにはモノクローナル抗体が有利である。
【０２４５】
上記の方法に従って調製されたポリクローナルヒト抗体を用いる方法では、一般に、意図した標的抗原に対して種々のエピトープ特異性を有する抗体の組合せを含む。モノクローナル抗体を用いるいくつかの方法では、エピトープ結合特異性の異なる２種類の抗体を有することが望ましい。エピトープ結合特異性の違いは競合アッセイによって判定することができる。
【０２４６】
ヒト抗体はいずれの種類のサンプルにも診断薬として使用できるが、ヒトサンプル用の診断薬として最も有用である。サンプルは患者のいずれの組織または体液からでも得ることができる。サンプルの好ましい供給源としては、全血、血漿、精液、唾液、涙、尿、糞便、汗、頬側、皮膚および毛髪が挙げられる。サンプルはまた内部器官の生検から、または癌から得ることもできる。サンプルは診断のために臨床患者から得ることもできるし、あるいは対照として、または基礎研究のために非罹患個体から得ることもできる。
【０２４７】
これらの方法はいずれの種類の標的抗原の検出のためにも使用することができる。標的抗原の例としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ型）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア属(Giardia)、マラリア、リーシュマニア属(Leishmania)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)など、ヒト疾病を引き起こす細菌、真菌およびウイルス病原体が挙げられる。他の標的抗原としては、発現レベルまたは組成物がヒト疾病または他の表現型に関連付けられているヒトタンパク質がある。このような抗原の例としては、接着タンパク質、ホルモン、増殖因子、細胞受容体、自己抗原、自己抗体、およびアミロイド沈着が挙げられる。注目される他の標的としては、癌胎児性抗原などの腫瘍細胞抗原がある。注目されるさらに他の抗原としては、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ抗原がある。
【０２４８】
ヒト抗体は種々の標準的なアッセイ形式で所定の標的を検出するために使用することができる。このような形式としては、免疫沈降、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、および免疫測定法が挙げられる。Harlow & Lane, 前掲；各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８７９，２６２号；同第４，０３４，０７４号；同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４，０９８，８７６号参照。
【０２４９】
免疫測定法またはサンドイッチアッセイが好ましい形式である。各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第４，３７６，１１０号、同第４，４８６，５３０号、同第５，９１４，２４１号、および同第５，９６５，３７５号参照。このようなアッセイでは、固相に固定化された１つの抗体または抗体集団、および液相の別の抗体または抗体集団を用いる。一般に、液相の抗体または抗体集団を標識する。抗体集団を用いる場合、その集団は一般に、その標的抗原内で異なるエピトープ特異性で結合する抗体を含む。よって、同じ集団を固相および液相抗体の双方として使用できる。モノクローナル抗体を用いる場合、結合特異性の異なる第一および第二のモノクローナル抗体を固相および液相に用いる。固相抗体および液相抗体を標的抗原といずれかの順序で接触させることもできるし、同時に接触させることもできる。最初に固相抗体を接触させる場合には、そのアッセイはフォワードアッセイと呼ばれる。逆に、最初に液相抗体を接触させる場合には、リバースアッセイと呼ばれる。標的を両抗体と同時に接触させる場合には、そのアッセイは同時アッセイと呼ばれる。標的を抗体と接触させた後、サンプルをある時間インキュベートするが、この時間は、通常、約１０分〜約２４時間まで可変であり、通常には約１時間である。その後、診断薬として用いる抗体に特異的に結合していないサンプルの化合物を除去するために洗浄工程を行う。固相抗体と液相抗体が別の工程で結合させる場合には、一方または双方の結合工程の後に洗浄を行うことができる。洗浄後、一般に標識された液相抗体の結合を介して固相に結合した標識を検出することによって結合を定量する。通常、所定の抗体対または抗体集団対、また、所定の反応条件に対して、既知濃度の標的抗原を含有するサンプルから検量曲線を作成する。次に、この検量曲線からの内挿法により、供試サンプル中の抗原濃度を読み取る。分析物は、平衡状態において結合している標識液相抗体の量からか、または平衡に達する前に一連の時点で結合している標識液相抗体の動的測定により測定することができる。このような曲線の傾きはサンプル中の標的の濃度の指標となる。
【０２５０】
上記の方法で用いるのに好適な支持体としては、例えば、ニトロセルロースメンブラン、ナイロンメンブラン、および誘導体化されたナイロンメンブラン、ならびにアガロースなどの粒子、デキストラン系ゲル、ディップスティック、微粒子、マイクロスフェア、磁気粒子、試験管、マイクロタイターウェル、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.,など）が挙げられる。固定化は吸着によるものでも共有結合によるものでもよい。所望により、抗体を、アビジンなどの表面結合リンカーとの結合のためのビオチンなどのリンカー分子と連結することもできる。
【０２５１】
標識
本アッセイで用いる特定の標識基または検出可能な基は、アッセイで用いる抗体の特異的結合を有意に妨げない限り、本発明の重要な態様ではない。検出可能な基は検出可能な物理特性または化学特性を有するいずれの材料であってもよい。このような検出可能な標識はイムノアッセイの分野で十分に発達しており、一般にこのような方法に有用なものならばほとんどどんな標識でも本発明に適用することができる。従って、標識は分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能ないずれの組成物であってもよい。本発明において有用な標識としては、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ，１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１２１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、マイクロバブルなどの他の造影剤（超音波イメージング用）、１８Ｆ、１１Ｃ、１５Ｏ（陽電子放射型断層撮影法用）、９９ｍＴＣ、１１１Ｉｎ（単光子放射断層撮影法用）、酵素（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで汎用されている他のもの）、および金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色定量標識(calorimetric label)が挙げられる。このような標識の使用を記載している特許としては、各々目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)も参照。
【０２５２】
標識は、当技術分野で周知の方法に従ってアッセイの所望の成分に直接または間接的に結合させることができる。上記で示したように、多様な標識を使用することができ、標識の選択肢は必要な感度、化合物とのコンジュゲーションのしやすさ、安定性要件、利用可能な機器、および処理設備によって異なる。
【０２５３】
非放射性標識は多くの場合、間接的手段によって結合させる。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）をその分子に共有結合させる。次に、このリガンドを、本質的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物などの検出系に共有結合されている抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合させる。多くのリガンドおよび抗リガンドが使用可能である。リガンドが天然の抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシン、およびコルチゾールを有している場合には、リガンドを標識された天然抗リガンドとともに使用することができる。あるいは、ハプテン化合物または抗原化合物は抗体と組み合わせて使用することができる。
【０２５４】
これらの分子はまた、例えば酵素または蛍光団とのコンジュゲーションにより、シグナル生成化合物に直接コンジュゲートさせることもできる。標識として注目される酵素は主としてヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物としては、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。使用可能な種々の標識またはシグナル生成系の総説としては、目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第４，３９１，９０４号参照。
【０２５５】
標識を検出する手段は当業者に周知のものである。よって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出のための手段としては、オートラジオグラフィーの場合と同様、シンチレーションカウンターまたは写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、蛍光色素を適当な波長の光で励起し、得られた蛍光を検出することにより検出することができる。蛍光は、写真フィルムによるか、荷電結合素子(charge coupled device, CCD)などの電子検出器または光電子倍増管の使用などにより、視覚的に検出することもできる。同様に、酵素標識は、酵素の適当な基質を与え、得られた反応産物を検出することにより、検出することができる。最後に、単純な比色定量標識(calorimetric label)は、単にその標識と会合した色を観察することにより検出することができる。従って、様々なディップスティックアッセイでは、コンジュゲートされた金はピンク色を呈し、一方、種々のコンジュゲートビーズはそのビーズの色を呈する。
【０２５６】
標識化合物を使用する必要のないアッセイ形式もある。例えば、凝集アッセイを用いて標的抗体の存在を検出することもできる。この場合、抗原をコーティングした粒子は、標的抗体を含むサンプルと凝集する。この形式では、標識を必要とする成分はなく、標的抗体の存在は単に目視検査により検出される。
【０２５７】
多くの場合、活性化インテグリン受容体またはα３β１インテグリン受容体タンパク質および活性化インテグリン受容体に対する抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質と共有結合または非共有結合させることにより標識する。
【０２５８】
治療計画
本発明は、医薬上許容される担体とともに処方された、１つの抗体または抗体の組合せ、例えば、活性化インテグリン受容体に対する抗体（モノクローナル、ポリクローナルまたは単鎖Ｆｖ；完全なもの、またはその結合フラグメント）または抗体細胞毒コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。組成物によっては複数（例えば、２種類以上）の本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の組合せを含む。また、組成物によっては、その組成物の抗体またはその抗原結合部分の各々が、抗原の予め選択された異なるエピトープと結合するモノクローナル抗体またはヒト配列抗体である。
【０２５９】
予防適用では、抗体細胞毒コンジュゲートの医薬組成物または薬剤を、疾病または症状（すなわち、免疫疾患）に罹患しやすい、またはそうでなければそのリスクがある患者に、その疾病（疾病の生化学的、組織学的および／または挙動的徴候、その合併症、ならびに疾病の発症過程で呈される中間的な病的表現型を含む）のリスクの排除もしくは軽減、重篤度の軽減、または発症の遅延に十分な量で投与する。治療適用では、組成物または薬剤をそのような疾病に罹患しているおそれのある患者、またはすでに罹患している患者に、その合併症およびその疾病の発症における中間的な病的表現型を含む疾病の徴候（生化学的、組織学的および／または挙動的）の治癒、または少なくとも部分的阻止に十分な量で投与する。治療的または予防的処置を達成するのに十分な量は、治療上または予防上有効な用量として定義される。予防計画でも治療計画でも、通常、十分な免疫応答が達成されるまで数回薬剤を投与する。一般に、免疫応答をモニタリングし、免疫応答が弱まりはじめたら反復投与を行う。
【０２６０】
本組成物および方法に有用な、転移性腫瘍細胞上の活性化インテグリン受容体と特異的に結合する抗体組成物、抗体細胞毒コンジュゲート、リガンド模倣体、その誘導体および類似体はそれ自体で、また、その立体異性体、プロドラッグ、医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、酸塩水和物、Ｎ−オキシドまたは同型結晶形態で、あるいはその化合物が治療上有効な量で好適な担体または賦形剤と混合された医薬組成物の形態でヒト患者（例えば、癌または転移癌）に投与することができる。
【０２６１】
医薬上許容される担体は、一つには投与される特定の組成物により、また、その組成物を投与するのに用いる特定の方法により決定される。従って、抗体組成物を投与するために好適な医薬組成物の処方物としては多種多様なものがある（例えば、出典明示により本明細書の一部とされる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990参照）。これらの医薬組成物は一般に、示差的に発現されるタンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストを患者に投与するのに好適な形態で含む。これらの医薬組成物は一般に、無菌で、実質的に等張であり、かつ、米国食品医薬品局の全ての適正製造基準(Good Manufacturing Practice, GMP)を完全に満たして処方される。
【０２６２】
「医薬上許容される」「生理学上許容される」およびその文法的な変形は、組成物、担体、希釈剤および試薬に関して用いられる場合、互換的に用いられ、その物質がその組成物の投与を禁じるほどには望ましくない生理作用を生じることなくヒトに投与可能であることを表す。
【０２６３】
例えば、「医薬上許容される賦形剤」とは、一般に安全、無毒で望ましい医薬組成物を製造するのに有用な賦形剤を意味し、獣医学的使用ならびにヒト医薬使用に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合には気体であり得る。
【０２６４】
「医薬上許容される塩およびエステル」とは、医薬上許容され、かつ、所望の薬理特性を有する塩およびエステルを意味する。このような塩としては、化合物中に存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応可能である場合に形成可能な塩が挙げられる。好適な無機塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムとともに形成されるものが挙げられる。好適な有機塩としては、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミンなどの有機塩基とともに形成されるものが挙げられる。このような塩はまた、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、およびアルカン−ならびにアレン−スルホン酸（メンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸など）とともに形成される酸付加塩を含む。医薬上許容されるエステルとしては、化合物中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ、およびホスホノキシ基から形成されるエステル、例えば、Ｃ１−６アルキルエステルが挙げられる。２つの酸性基が存在する場合には、医薬上許容される塩またはエステルは一酸一塩もしくはエステル、または二塩もしくはエステルであってよく；また同様に、３つ以上の酸性基が存在する場合には、このような一部または全てが塩形成またはエステル化していてもよい。本発明において命名した化合物は非塩形成形態もしくは非エステル化形態、または塩形成形態および／またはエステル化形態で存在する場合があり、このような化合物の名称は原（非塩形成および非エステル化）化合物とその医薬上許容される塩およびエステルの双方を含むものとする。また、本発明において命名した特定の化合物は２つ以上の立体異性形で存在する場合があり、このような化合物の名称は全ての単独立体異性体およびそのような立体異性体の全ての混合物（ラセミ体であれそれ以外のものであれ）を含むものとする。
【０２６５】
「治療上有効な量」とは、疾病を処置するために対象に投与した際にその疾病の有効な処置に十分な量を意味する。
【０２６６】
特に断りのない限り、「対象」、「患者」または「哺乳類」は互換的に用いられ、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびにウサギ、ラット、およびマウスおよび他の動物などの実験動物を指す。動物としては全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。従って、本明細書において「対象」または「患者」とは、本発明の組成物を投与することができる哺乳類患者または対象のいずれをも意味する。本発明のいくつかの実施形態では、疾病に対する抵抗性が低下する症状を患っている、例えば、ＨＩＶ。本発明の例示的な実施形態では、本発明の方法に従い、２種類以上の抗体−細胞毒コンジュゲート分子を含む医薬組成物による処置に関する対象患者を特定するために、許容されるスクリーニング法を用いて、対象に存在する疾病または症状の状態、あるいは対象とする、または疑いをもつ疾病または症状に関連するリスク因子を判定する。これらのスクリーニング法が、例えば、対象が新生物性疾患に罹患しているかどうかを調べるスクリーニング検査が挙げられる。これらの、また、その他の常法により、医師は治療を必要とする対象を選択することができる。
【０２６７】
既知の癌治療薬と本発明の医薬組成物との「並行投与」とは、既知の薬剤と本発明の組成物の双方が治療効果を有するような時点で、抗体−細胞毒コンジュゲート分子組成物を投与することを意味する。このような並行投与は、本発明の化合物の投与に対しての、抗微生物薬の同時（すなわち、同じ時点での）投与、事前投与または事後投与を含み得る。当業者ならば、特定の薬剤と本発明の組成物に関する投与の適当な時期、順序および用量を容易に決定することができるであろう。
【０２６８】
有効用量
本明細書に記載の免疫関連の症状および疾病、例えば転移性癌の処置のための、本発明の抗体組成物、例えば、活性化インテグリン受容体に対する抗体または抗体細胞毒コンジュゲートの有効用量は、投与手段、標的部位、患者の健康状態（患者がヒトであれ動物であれ）、投与されている他の薬剤、および処置が予防的なものである治療的なものであるかを含む、多数の異なる因子によって異なる。通常には患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類も処置することができる。処置用量は安全性および有効性を至適化するために増減する必要がある。
【０２６９】
抗体とともに投与する場合、用量は約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な処置計画としては、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。方法によっては、結合特異性の異なる２種類以上のモノクローナル抗体を同時に投与するものがあるが、この場合には投与する各抗体の用量は示された範囲内にある。抗体は通常複数回投与する。１回の投与と投与の間隔は１週間、１月または１年であり得る。間隔は患者の血中抗体レベルを測定することにより指示される場合には不定期的であってもよい。方法によっては、血漿抗体濃度が１〜１０００μｇ／ｍｌとなるように用量を調整し、方法によっては２５〜３００μｇ／ｍｌとする。あるいは、抗体は徐放性処方として投与することもでき、この場合には必要な投与頻度は少なくなる。用量および頻度は患者における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、以下、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体と続く。用量および投与頻度は、その処置が予防的なものであるか治療的なものであるかによっても異なる場合がある。予防適用では、比較的低用量が長期にわたって比較的低頻度で投与される。患者によっては残りの生涯の間、処置を継続する。治療適用では、疾病の進行が軽減されるか、または停止するまで、好ましくは患者が疾病の徴候の部分的改善または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量を必要とする場合がある。その後、この患者には予防計画を投じることができる。
【０２７０】
免疫原をコードする核酸の用量は患者当たりＤＮＡ約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は１用量当たり１０〜１００個のビリオンまたはそれ以上の範囲である。
【０２７１】
投与経路
免疫応答を誘導するための抗体組成物、例えば、免疫関連の症状および疾病、例えば、転移性癌の処置のための活性化インテグリン受容体に対する抗体または抗体細胞毒コンジュゲートは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内手段により、脳病巣を標的とする抗体製剤の吸入剤として予防処置のため、および／または治療処置のために投与することができる。免疫剤の最も典型的な投与経路は皮下であるが、他の経路も同等に有効であり得る。これに次ぐ最も一般的な経路が筋肉内注射である。この種の注射は腕または脚の筋肉に行うのが最も一般的である。方法によっては、沈着物が蓄積した特定の組織に直接薬剤を注射する（例えば、頭蓋内注射）。抗体の投与には静脈点滴の上に筋肉内注射が好ましい。方法によっては、特定の治療抗体を頭蓋に直接注射する。また方法によっては、抗体を徐放性組成物、またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）ディバイスなどのディバイスとして投与する。
【０２７２】
本発明の薬剤は所望により、種々の免疫関連疾病を含む種々の疾病を処置する上で少なくとも部分的に有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。脳への腫瘍転移の場合、本発明の薬剤はまた、血液脳関門（ＢＢＢ）に対する本発明の薬剤の通過性を高める他の薬剤とともに投与することもできる。
【０２７３】
処方
免疫関連の症状および疾病、例えば、転移性癌の処置のための、免疫応答を誘導するための抗体組成物、例えば、活性化インテグリン受容体に対する抗体または抗体細胞毒コンジュゲートは多くの場合、活性治療薬と種々の他の医薬上許容される成分を含む医薬組成物として投与される。Remington’s Pharmaceutical Science, 1990前掲参照。好ましい形態は意図する投与様式および治療適用によって異なる。これらの組成物はまた、望まれる処方に応じて、医薬上許容される、無毒の担体または希釈剤を含むことができ、これらは動物またはヒト投与用の医薬組成物を処方するのに汎用されるビヒクルとして定義されている。希釈剤はその組合せの生物活性に影響を及ぼさないように選択する。このような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液がある。さらに、この医薬組成物または処方物はまた他の担体、アジュバント、または無毒、非治療的、非免疫源性の安定剤などを含むことができる。
【０２７４】
医薬組成物はまた、タンパク質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックスで官能基化されたセファロース（商標）、アガロース、セルロースなど）、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集物（油滴またはリポソームなど）といった大型の、代謝の遅い高分子が挙げられる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）としても働き得る。
【０２７５】
非経口投与の場合、本発明の組成物は、生理学上許容される希釈剤中の本物質の溶液または懸濁液に、水、オイル、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの無菌の液体であり得る医薬担体を伴った注射投与形として投与することができる。さらに、湿潤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が組成物中に存在してもよい。医薬組成物の他の成分としては石油、動物、植物または合成起源のものがあり、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、および鉱油などがある。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射溶液として好ましい液体担体である。抗体はデポー注射またはインプラント製剤の形で投与することもでき、これらは有効成分の持続的放出を可能とするような方法で処方することができる。例示的な組成物としては、５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる水性バッファー（ＨＣｌでｐＨ６．０に調整）中に配合されたモノクローナル抗体５ｍｇ／ｍＬを含む。
【０２７６】
一般に、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製されるが、注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁させるのに好適な固体形態も調製することができる。また、この製剤を上記で述べたようなアジュバント作用の増強のために、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはコポリマーなどのリポソームまたは微粒子中に乳化または封入してもよい。Langer, Science 249: 1527, 1990およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997。本発明の薬剤は、デポー注射またはインプラント製剤の形で投与することもでき、これらは有効成分の持続的放出またはパルス放出を可能とするような方法で処方することができる。
【０２７７】
他の投与様式に好適なさらなる処方としては、経口、鼻腔および肺処方物、坐剤、および経皮適用がある。
【０２７８】
坐剤の場合、結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み；このような坐剤は有効成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成することができる。経口処方物としては、医薬級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物または散剤の形を採り、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含有する。
【０２７９】
局所適用は経皮または皮内送達をもたらし得る。局所投与は、薬剤をコレラ毒またはその解毒誘導体もしくはサブユニット、または他の同様の細菌毒とともに同時投与することで増強することができる。Glenn et al., Nature 391: 851, 1998。同時投与は、混合物としての、または化学的架橋もしくは融合タンパク質としての発現によって得られた連結分子としての成分を用いることにより達成することができる。
【０２８０】
あるいは、経皮送達は皮膚パッチを用いて、またはトランスフェロソーム(transferosome)を用いて達成することができる。Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998。
【０２８１】
これらの医薬組成物は一般に無菌、実質的に等張で、かつ、米国食品医薬品局の全ての適正製造基準(Good Manufacturing Practice, GMP)を完全に満たして処方される。
【０２８２】
毒性
好ましくは、治療上有効な用量の、本明細書に記載の抗体組成物または抗体細胞毒コンジュゲートは、実質的な毒性を引き起こすことなく治療利益をもたらす。
【０２８３】
本明細書に記載のタンパク質の毒性は細胞培養または実験動物において標準的な薬事手順により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に致死的な用量）を測定することにより決定することができる。毒性作用と治療作用の間の用量比が治療係数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトでの使用に無毒な用量範囲を処方する際に使用することができる。本明細書に記載のタンパク質の用量は、ほとんど毒性がないか、または全く毒性がない有効用量を含む循環濃度範囲内にあることが好ましい。用量はこの範囲内で、用いる投与形および用いる投与経路に応じて異なり得る。厳密な処方、投与経路および用量は各医師が患者の状態を考慮して選択することができる（例えば、Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1参照）。
【０２８４】
キット
また、本発明の範囲内には、本発明の組成物（例えば、抗体細胞毒コンジュゲート、モノクローナル抗体、ヒト配列抗体、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）と使用説明書を含むキットがある。このキットはさらに、少なくとも１種類の付加的試薬、または本発明の１種類以上の付加的ヒト抗体（例えば、第一のヒト抗体とは異なる抗原のエピトープと結合する、相補的活性を有するヒト抗体）を含み得る。キットは一般に、そのキットの内容物の意図する使用を示したラベルを含む。ラベルとはキット上またはキット内に提供された書類または記録媒体、あるいはキットに添付されているその他のもののいずれをも含む。
【実施例】
【０２８５】
例示的実施形態
本明細書に記載の実験は、出典明示により本明細書の一部とされるChemistry & Biology 11:897, 2004にも見出せる。
【０２８６】
実施例１
Ｐａｎ１０の発現および精製
大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）(Novagen, Madison, WI)を、プラスミドｐＥＴｆｌａｇ−Ｐａｎ１０による形質転換用の発現宿主として選択した。Mao et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96: 6953-6958, 1999。大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴｆｌａｇ−Ｐａｎ１０を、３７℃にて１００μＭカルベニシリン(RPI Corp., Mount Prospect, IL)を添加したＳＢ培地（３０％ペプトン、２０％酵母抽出物、１０％ＭＯＰＳ）中で対数増殖中期（ＯＤ６００  ０．６５）まで増殖させた。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ(RPI Corp.)を添加することによりタンパク質発現を誘導した。これらの培養物を３７℃でさらに１時間、そして２６℃で１５時間インキュベートした。ＩＰＴＧにより誘導された大腸菌Ｂ８３４／ｐＥＴｆｌａｇ−Ｐａｎ１０の培養物４Ｌを遠心分離により採取した。得られた細胞ペレットを、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬(Novagen)を販売者の説明書に従って用い溶解させ、一方、上清は〜２００ｍＬまで濃縮した(EasyLoad, Masterflex from Millipore, Bedford, MA)。０．２μＭフィルター(Nalgene, Rochester, NY)で濾過したところで、無細胞溶解液（〜１００ｍＬ）または濃縮上清を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で予め平衡化したＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２アフィニティーカラム（１．７×５ｃｍ、Sigma, St. Louis, MO製）に流速１ｍＬ／分でロードした。ＰＢＳ１００ｍＬで洗浄した後、フラッグタグの付いたＰａｎ１０をカラムから流速３ｍＬ／分のグリシンバッファー（０．１ＭグリシンｐＨ２．５）〜２０ｍＬで溶出させた。この溶出液を〜１ｍＬの１Ｍトリス塩基で中和した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Bio-Rad, Hercules, CA製の１０％ビス−トリス）により評価した。ＩＰＴＧにより誘導された大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴｆｌａｇ−Ｐａｎ１０の培養物４Ｌから、通常３．５〜５ｍｇの精製タンパク質が得られ、そのうち６０％が細胞ペレットに由来するものであった。
【０２８７】
細胞系統
ヒト膵臓腺癌細胞系統ＳＷ１９９０(ATCC, Manassas, VA)を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加したＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地中で増殖させた。成体皮膚由来の正常ヒト真皮繊維芽細胞（ＨｄＦａ）(Cascade Biologics, Portland, OR)を、低血清増殖添加剤を添加した培地１０６中で増殖させた。
【０２８８】
全細胞ＥＬＩＳＡによるＳＷ１９９０結合アッセイ
ＳＷ１９９０細胞をトリプシン処理し、１０６細胞ｓ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳに再懸濁させた。１５０μＬアリコートを９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（組織培養処置済み、平底、Corning Incorporated, Canton, NY製）の各ウェルに注ぎ、３７℃で完全に蒸発するまでインキュベートした（２列のウェルは培地のみ含むことに注意）。次に、このプレートをＰＢＳ中０．０２５％のＴｗｅｅｎ  ２０(Sigma, St. Louis, MO)で４回洗浄し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Sigma製）でブロックし、脱イオン水で１回洗浄し、軽くたたいて水を切った。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで連続希釈したＰａｎ１０（０．１〜０ｍｇ／ｍＬ、遊離型またはコンジュゲート型）の１００μＬアリコートをこのプレートに加えた。細胞の含まない一方の列はＰａｎ１０とともにインキュベートし、他方はＰａｎ１０を含んでいなかった。次に、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、蒸留水で１０回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＭ２抗ｆｌａｇ／ＨＲＰ（１．１μｇ／ｍＬ、Sigma）の３０μＬアリコートを全てのウェルに加え、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。最後に、蒸留水で十分洗浄した後、プレートをＴＭＢおよびＨ２Ｏ２(Pierce, Rockford, IL)の存在下で現像し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ２５０プレートリーダー(Molecular Devices, sunnyvale, CA)を用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０２８９】
Ｐａｎ１０突然変異
突然変異体Ｐａｎ１０Ｓ７３ＣおよびＰａｎ１０Ｓ１３１Ｃは、標準的なＰＣＲ技術を用い、鋳型ｐＥＴｆｌａｇ−Ｐａｎ１０上での部位特異的突然変異誘発により作出した。これらの突然変異体を誘導するのに使用したＰＣＲ条件は次の通りである：変性９５℃１０分；３０サイクルの増幅；伸張７２℃２分；変性９５℃３０秒；アニーリング６０℃１分およびポリッシング７２℃７分。第二段階では、これらの突然変異遺伝子の両半分をオーバーラップさせた（温度プログラム：変性９５℃１０分；２０サイクルの増幅；伸張７２℃２分；変性９５℃３０秒；アニーリング５０℃１分およびポリッシング７２℃７分）。最後に、第三段階では、重複したＰＣＲ産物を２つの末端プライマーを用いて増幅した（温度プログラム：変性９５℃１０分；３０サイクルの増幅；伸張２分７２℃；変性９５℃３０秒；アニーリング５５℃１分およびポリッシング７２℃７分）。これらの増幅産物をＰＣＲ精製キット(Qiagen)で精製し、ＳｆｉＩ(New England BioLabs, Beverly, MA)で消化し、精製し、ＳｆｉＩで消化して精製したｐＥＴｆｌａｇに連結した（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、New England BioLabs）。Ｐａｎ１０突然変異体の配列を、末端プライマーを用いた全長ＤＮＡシーケンシング(The Protein and Nucleic Acids Core Facility at The Scripps Research Institute, La Jolla, CA)により確認した。
【０２９０】
Ｐａｎ１０チオール化
５０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．７）中のＰａｎ１０（４ｍｇ／ｍＬ）を、４℃、一定振盪下、１０倍化学量論過剰のＴｒａｕｔの試薬(Pierce)の存在下で５時間インキュベートした。得られた混合物を、ＰＤ−１０カラム(Pharmacia, Peapack, NJ)を用いて脱塩し、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８で溶出させ、遠心分離限外濾過(YM 10,000 filter, Millipore)により濃縮した。この脱塩ｓｃＦｖ溶液中の遊離チオールの濃度をエルマンアッセイにより測定した。
【０２９１】
エルマンアッセイ
〜３０μＭのチオール化ｓｃＦｖまたはジチオトレイトール標品(DTT, ICN, Costa Mesa, CA)および６００ｍＭの５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬、Sigma）の７５％メタノール溶液を１３０００ｒｐｍで５分遠心分離した。上清を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート(Fisher, Ottawa, Ontario)に移し、Ａｂｓ４１２をＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ２５プレートリーダー(Molecular Devices)で読み取った。遊離チオールの濃度を、既知濃度のＤＴＴを対応するＡｂｓ４１２に対してプロットすることによって得られた標準曲線から外挿した。
【０２９２】
デュオカルマイシンＳＡの類似体の合成（図５参照（下記の括弧内の数字は全て図５のものをさす））
使用した化学薬品は全てAldrich (St. Louis, MO)から購入した。３−（５−アセチルインドール−２−カルボニル）−１−（Ｓ）−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（１）の合成はこれまでに報告されている。Parrish et al., Bioorg Med Chem, 11: 3815-3838, 2003。Ｂｏｃ保護３−［５−（１−（３−アミノプロピル）インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（１０）の合成は次の通りである。
【０２９３】
１−（３−フタルイミドプロピル）インドール−２−カルボン酸メチル（５）
０℃のジメチルホルムアミド（３１ｍＬ）中、インドール−２−カルボン酸メチル（５５０ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）の溶液を水素化ナトリウム（鉱油中６０％懸濁液、１６７ｍｇ、４．１８ｍｍｏｌ）で処理し、３０分かけて２５℃に温めた。この反応混合物を０℃に冷却し、Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（１．２６ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）で処置した。この混合物を３０分かけて２５℃に温め、３０分間５５℃で温めた後、冷却し、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）を添加してクエンチした。この反応混合物を酢酸エチル（２×４０ｍＬ）で抽出し、および合わせた有機層を水（４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、および真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）により収率６２％で５を得た。
【０２９４】
１−［３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノプロピル］インドール−２−カルボン酸メチル（６）
０℃のエタノール（１４ｍＬ）中、５（５００ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ヒドラジン（２００μＬ、４．１４ｍｍｏｌ）で処理した。この反応混合物を０℃で１時間攪拌した後、３時間かけて２５℃まで温め、その後、真空濃縮した。クロロホルム（１０ｍＬ）に溶解した残渣を無水ｔ−ブトキシカルボニル（６０２ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）および飽和炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で処理した。この反応混合物を２５℃で１２時間攪拌した後、クロロホルム（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１０〜３０％酢酸エチル／ヘキサン）により収率９１％で６を得た。
【０２９５】
５−（１−｛３−［Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル）−アミノインドール−２−カルボン酸エチル（８）
１０ｍＬジオキサン／Ｈ２Ｏ（４：１）中、６（３３２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を４Ｎ  ＬｉＯＨ（１ｍＬ）で処理し、この混合物を２５℃で１５時間攪拌した。１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ）を加え、この混合物を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮し、収率９２％で７を得た。
【０２９６】
ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中、７（６３．６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および５−アミノインドール−２−カルボン酸エチル（６１．３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１１５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）で処理した。この反応混合物を２５℃で１８時間攪拌し、１５％クエン酸水溶液（１０ｍＬ）を加えてクエンチした。この反応混合物を酢酸エチル（７５ｍＬおよび２×２５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液（３×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、３３％酢酸エチル／ヘキサン）により収率５２％で８を得た。
【０２９７】
５−（１−｛３−［Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル）インドール−２−カルボン酸（９）
２ｍＬジオキサン／Ｈ２Ｏ（４：１）中、８（５０．５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液を４Ｎ  ＬｉＯＨ（２００μＬ）で処理し、この混合物を２５℃１８時間攪拌した。０．５Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を加え、この混合物を酢酸エチル（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮した。テトラヒドロフラン／ヘキサンから結晶化させ、収率９２％で９を得た。
【０２９８】
３−［５−（１−｛３−［Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ］プロピル｝インドール−２−カルボニル）アミノインドール−２−カルボニル］−１−（クロロメチル）−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（１０）
１０ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ（酢酸エチル）中、（−）−ｓｅｃｏ−Ｎ−Ｂｏｃ−ＣＢＩ（２５ｍｇ、７５μｍｏｌ、天然鏡像異性体）の溶液を２５℃で１時間攪拌した後、Ｎ２気流下で溶媒を除去した。Boger et al., J Org Chem, 55: 5823-5832, 1990。残渣を高真空下で３時間乾燥させ、９（３９．５ｍｇ、８３μｍｏｌ）を加えた。ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４３ｍｇ、２２５μｍｏｌ）の溶液を加え、この反応混合物を２５℃で１４時間攪拌した後、この反応混合物を真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、２０％テトラヒドロフラン／ヘキサン）により、収率４４％で１０を得た。
【０２９９】
３の合成
０．２ｍＬジメチルホルムアミド中、１（３．０ｍｇ、７．２μｍｏｌ）、マレイミドプロピオン酸ヒドラジドテトラヒドロフラン塩（６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１μＬ）および砕いた３Åモレキュラーシーブの混合物を一晩攪拌した。溶媒を蒸発させたところで、残渣をジクロロメタンに溶解し、シリカゲル薄層クロマトグラフィーにより精製した。収率４７％で３を得た。
【０３００】
４の合成
化合物１０（５ｍｇ、７．２μｍｏｌ）をジクロロメタン中５０％のトリフルオロ酢酸で３０分処理した。トリフルオロ酢酸が蒸発したところで、粗遊離アミンを０．１ｍＬジメチルホルムアミドに溶解し、マレイミドプロピオン酸（２．０ｍｇ、１２μｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（４．２ｍｇ、１１ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（３．２μＬ、２９μｍｏｌ）を含有するジメチルホルムアミド溶液に加えた。この混合物を２時間攪拌し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより精製した。収率５７％で４を得た。
【０３０１】
チオール化Ｐａｎ１０のコンジュゲーション
ＤＭＳＯ中、２０ｍＭフルオレセインマレイミド(Molecular Probes, Eugene, OR)、３または４の３×１μＬアリコートを２分間隔で５０μＬのＰａｎ１０（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ中〜４ｍｇ／ｍＬ）に加えた。得られた反応混合物をシェーカー上、４℃で１０時間インキュベートした。コンジュゲートしたＰａｎ１０と遊離Ｐａｎ１０の混合物からサイズ排除クロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、Pharmacia）により遊離色素または遊離薬剤を分離した。フルオレセインとのＰａｎ１０コンジュゲーションの収率は、脱塩混合物のＡｂｓ４９２ｎｍおよびＡｂｓ２８０ｎｍ(Ultrospec 2000, Pharmacia)を式１：
（Ａｂｓ４９２／５９８８０ａ×１００）／（（Ａｂｓ２８０−（０．２×Ａｂｓ４９２）／１．３５ｂ）／ｓｃＦｖ−ＦＭ  ＭＷ）    式１
ａ：ε４９２  フルオレセイン−マレイミドに関して実験的に決定
ｂ：ε２８０  一般にＩｇＧに採用
に当てはめることにより算出した。
【０３０２】
ｓｃＦｖに対する３または４の比は、薬剤コンジュゲーション工程の後、残留する遊離ｓｃＦｖの量を算出することにより間接的に求めた。Ｐａｎ１０−薬剤コンジュゲートと遊離Ｐａｎ１０の混合物をフルオレセイン−マレイミドと反応させ、フルオレセイン−Ｐａｎ１０の量（上記のようにして決定）を、薬剤に結合していないＰａｎ１０の総量と一致するように推定した。３または４とのＰａｎ１０コンジュゲーションの収率は、ｓｃＦｖ−薬剤＋遊離ｓｃＦｖとフルオレセインのマレイミド誘導体とのコンジュゲーション後に得られた脱塩混合物のＡｂｓ４９２ｎｍおよびＡｂｓ２８０ｎｍを式２：
１００−（（Ａｂｓ４９２／５９０００ａ×１００）／（（Ａｂｓ２８０−（０．２×Ａｂｓ４９２）／１．３５ｂ）／ｓｃＦｖ−ＦＭ  ＭＷ））    式２
に当てはめることにより算出した。
【０３０３】
質量分析
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）をＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥバイオスペクトロメトリー・ワークステーション(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)にて、窒素レーザー（３３７ｎｍ）とマトリックスとしてシナピン酸(Sigma)を用い、直線モードで行った。マトリックス溶液は、アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸水溶液の１：１混合物中の飽和溶液として毎日新しく調製した。サンプルはＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用に、脱塩タンパク質溶液をマトリックスで１：１０希釈し、得られた懸濁液０．７μＬをステンレス鋼ＭＡＬＤＩ標的ウェルに直接投入することにより調製した。得られた質量を、ウマシトクロムＣとウサギ筋肉アルドラーゼ(Sigma)による２点外部較正を用いて較正した。スペクトルは全て、１４０ｎｓのディレイド・エクストラクションの陽イオンモードで採取し、約５０のレーザーショットの和を求めた。
【０３０４】
ワンポット抗体コンジュゲーション
５０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．７）中のＰａｎ１０（４ｍｇ／ｍＬ）を、４℃、一定振盪下、１０倍化学量論過剰のＴｒａｕｔの試薬(Pierce)と同等過剰のフルオレセインマレイミド(Molecular Probes)、３または４のいずれかの存在下で８時間インキュベートした。得られた混合物を、ＰＤ−１０カラムを用いて脱塩し、ＰＢＳで溶出させ、遠心分離限外濾過（ＹＭ１０，０００フィルター、Millipore）により〜４ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０３０５】
共焦顕微鏡
ＳＷ１９９０またはＨｄＦａ細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁させ、計数した。１０４〜１０５細胞をチャンバースライド(Nunc, Naperville, IL)のウェルに接種し、３７℃で２４時間付着させた。培地（５００μＬ／ウェル）を交換したところで、〜３ｍｇ／ｍＬに濃縮したＰａｎ１０−フルオレセインまたは９２Ｈ２−フルオレセイン（陰性対照）１０μｌを加え、これらの細胞を３７℃で３０分、１時間、２時間または３時間インキュベートした。これらの細胞をそれら個々の培地で１０回、さらにＰＢＳで１回洗浄した後、９５％エタノールで５分固定化および透過処理を施し、ＰＢＳで１回洗浄し、ヨウ素プロピジウム（Sigma、ＰＢＳに１：５０希釈）で１分染色し、ＰＢＳで５回洗浄し、退色防止剤溶液(Slow Fade, Molecular Probes)を添加したところでカバーガラスで密封した。このスライドをレーザー走査共焦顕微鏡(MRC1024, Bio-Rad)で観察した。
【０３０６】
ＦＡＣＳ分析
ＳＷ１９９０またはＨｄＦａ細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳで洗浄し、アリコートに分けた（〜５×１０５細胞／試験管）。次に、一次抗体（Ｗ６／３２のいずれか、Novus Biologicals, Littleton, CO; P1B5, Chemicon, Temecula, CA; or P5D2, Chemicon）を加え（終濃度１０μｇ／ｍＬ）、氷上で４５分間インキュベーションを行った。その後、これらの細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、氷上、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＡｂ(Pierce, Rockford, IL)の存在下で４５分インキュベートした。冷ＰＢＳで最終洗浄を行った後、ＰＩで対比染色し、分析した(FACScan, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。
【０３０７】
倒立顕微鏡
ＳＷ１９９０細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁させ、計数した。増殖培地５００μＬ中１０４〜１０５細胞をチャンバースライド(Nunc)のウェルに接種し、３７℃で２４時間付着させた。次に、古い培地を、Ｐａｎ１０−３、Ｐａｎ１０−４、Ｐａｎ１０−ＦＭまたはｗｔ−Ｐａｎ１０のいずれか４００ｎＭを含有する培地に交換した。その後、７日間毎日、細胞を倒立顕微鏡(Zeiss Imm, Thornwood, NY)で観察した。
【０３０８】
細胞増殖アッセイ
ｓｃＦｖ−薬剤または遊離薬剤の細胞傷害性を、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット(Molecular Probes)を用いることで定量した。アッセイは、３００μＬのフェノール非含有増殖培地中、２×１０４のＳＷ１９９０（ＨｄＦａ）細胞／ウェルを含有する４８ウェルマイクロタイタープレートを用いて行った。細胞を１２時間ウェルに付着させた。ＩＣ５０の測定に関しては、細胞を種々の濃度のＰａｎ１０−薬剤コンジュゲート、マレイミド誘導体または遊離薬剤とともに３７℃で３または１２時間インキュベートした。その後、コンジュゲート／薬剤非含有培地でインキュベーションを続け、７日目の終了時にＭＴＴアッセイを行った。培地を、１．２ｍＭ  ＭＴＴを含有する新鮮培地１００μＬに交換し、さらに３時間インキュベーションを続けた。次に、これらの細胞を、ＳＤＳ（１００ｍｇ／ｍＬ）を含有するＨＣＬの１０ｍＭ溶液１００μＬを加えることにより溶解させた。細胞溶解を８時間進行させ、その終了時にプレートを３０００ｒｐｍで３分遠心分離し、上清を９６ウェルプレートに移し、５７０ｎＭで読み取った。各アッセイには、遊離Ｐａｎ１０で処理した細胞の陰性対照と細胞を含まない陽性対照を含めた。アッセイは全て少なくとも２回行った。種々の濃度の細胞傷害性薬剤を用いて８個のデータポイントの組を得た。ＩＣ５０値を得るために、各セットに由来するデータポイントを、Ｇｒａｆｉｔ５(Leatherbarrow R. J. 2003. Grafit version 5.08, Erithieus Software Ltd, Staines, England)を用い、式３によって定義されるＳ字用量−応答曲線に当てはめた。
ｙａ＝ｍｉｎ  ｙ＋［（ｍａｘ  ｙ−ｍｉｎ  ｙ）／（１＋（ＩＣ５０／ｘｂ）ｓｌｏｐｅ）］    （式３）
ａｙ＝生細胞％
ｂｘ＝薬剤（薬剤−ｓｃＦ）の濃度
アウトライアーであったデータポイント（一般に、実験当たり１〜２）は除外した。
【０３０９】
実施例２
Ｐａｎ１０の発現、精製および部位特異的突然変異誘発
Ｐａｎ１０をデュオカルマイシン類似体の悪性癌細胞への送達のための手段として用いるために、ファージ−遊離Ｐａｎ１０を２７，８６８ｋＤａ（表１）のｓｃＦｖとして発現させ、均質となるよう精製した（図２レーン４）。典型的なＶＬおよびＶＨドメインは各々、埋伏型の１つのジスルフィド結合を有するが、遊離システインは含まないので、発明者らはＰａｎ１０の表面上の利用可能な遊離チオール基を作り出すこと、および修飾されたｓｃＦｖをマレイミド誘導体化薬剤とコンジュゲートさせることを意図したいくつかの戦略を検討した。Padlan, In Molecular Biology Intelligence Unit: Antibody-Antigen complexes (Austin, TX, Landes, R. G.), 17-30, 1994。
【表１】
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【０３１０】
最初のアプローチは、部位特異的突然変異誘発により野生型Ｐａｎ１０配列に組み込まれたシステインを用いた単一の部位特異的コンジュゲーションをねらいとしたものであった。ｓｃＦｖ結合親和性を保存する試みでは、まず、Ｐａｎ１０のリンカー領域にこのシステイン残基を導入した。さらに、市販のマレイミド誘導体化フルオレセイン（ＦＭ）を感受性試薬として用い、コンジュゲーションプロトコールの至適化および定量化を行った。リンカー残基Ｓ１３１、Ｇ１３０、Ｇ１２８またはＧ１２７のいずれか１つがシステインに突然変異しても、それらの突然変異体とＦＷとのコンジュゲーションの効率は野生型Ｐａｎ１０の場合と同等でしかなかったが、これはおそらくリンカー領域とシステイン残基がＰａｎ１０構造内に隔離されているためであると思われる。Ｐａｎ１０のＷＡＭ(Web Antibody Modeling c/o University of Bath At Swindon, Oakfield Campus, Marlowe Avenue, Walcot Swindon Wilts, UK)理論構造に従って表面露出が明らかな他のいくつかの残基を選択した。Ｐａｎ１０の腫瘍細胞結合および内在化能力を保存するために、フレームワーク残基だけを考えた。
【０３１１】
ＦＭコンジュゲーションの向上は、より露出度の高い残基Ｓ７３またはＳ１９７が突然変異した際に達成されたが、この向上はおそらくリンカー残基の接近のしやすさによるものであると思われる。達成されたコンジュゲーション効率は最高で６８％であった。
【０３１２】
ｓｃＦｖ  Ｐａｎ１０の化学修飾
部位特異的突然変異誘発による遊離システインの挿入にはいくつかの欠点がある。その突然変異残基が溶媒に接触していれば、酸化を受けるか、または二量体化を引き起こす可能性があり、さらなる還元−精製工程が必要となり、その後の反応は不活性雰囲気下で行わなければならない。Yang et al., Protein Eng, 16, 761-770, 2003。その代わりに、Ｐａｎ１０へのチオール基の化学的付加を検討した。
【０３１３】
まず、チオール化とマレイミド誘導体化分子へのコンジュゲーションを２つの別工程で行った：遊離チオール基は、Ｐａｎ１０をリシン残基と反応するアミンスカベンジャーである２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）と反応させることにより導入した。Ｐａｎ１０配列中の１２個のリシンの存在は大きな、また有害である可能性のある改変をもたらす能力を有していたが、これらのリシンのうち１０個はフレームワーク領域にあったことから、それらの改変はＰａｎ１０のインテグリンα３β１との結合に影響を及ぼすとは考えにくい。全細胞ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）により、野生型Ｐａｎ１０とチオール化Ｐａｎ１０の結合は実際には区別がつかなかった。チオール化Ｐａｎ１０の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析（図２）により、二量体およびより高次のポリマーの時間依存的な形成が明らかになり（図２Ａレーン２）、これにより薬剤コンジュゲーションに利用可能な遊離チオール基の数の段階的減少が起こった。この問題を避けるため、次の薬剤コンジュゲーション工程をチオール化の直後に行ったところ、それによりカップリング効率が高まり、二量体形成が減少した。一工程法を用いて、チオール化とコンジュゲーションを一ポットで行った場合、さらなる向上が得られた。この方法を用いて修飾したＰａｎ１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、二量体の形成が無視できる程度でしかないことが明らかになった（図２Ａレーン３）。他のｓｃＦｖもこの手順を利用できる。
【０３１４】
マレイミド誘導体化薬剤
マレイミド部分を酸に不安定なヒドラゾン結合を介してデュオカルマイシンＳＡ類似体１と結合させてマレイミド誘導体３を得た（図１）。このヒドラゾン結合方法は、ｐＨ値が若干低い（ｐＨ＝５．０〜５．５）リソソーム、さらにサイトゾルに内在化された際に細胞傷害性薬剤の放出を制御する方法として抗体−薬剤コンジュゲートに広く用いられている。Kaneko et al., Bioconjug Chem, 2: 133-141, 1991。この戦略は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂによるＢＲ９６−ＤＯＸの開発およびＷｙｅｔｈによるＭｙｌｏｔａｒｇの設計など、多くの場合で臨床上有効であることが分かっている。比較として、発明者らはｐＨ不感受性アミド結合によってデュオカルマイシン類似体２を誘導体化し、マレイミド誘導体４を作出した（図１）。
【０３１５】
Ｐａｎ１０のマレイミド誘導体化分子とのコンジュゲーション
膵臓癌細胞による内在化を試験および直接可視化するため、上記で述べたように、チオール化Ｐａｎ１０をまずＦＭとコンジュゲートさせてＰａｎ１０−ＦＭを得た。次に、このチオール化Ｐａｎ１０をマレイミド誘導体３および４とコンジュゲートさせて、それぞれコンジュゲートＰａｎ１０−３とＰａｎ１０−４を得た。フルオレセイン（コンジュゲーション効率はＵＶ／Ｖｉｓ分光法およびマトリックス支援レーザー脱離法／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により測定）、３または４（コンジュゲーション効率はＭＡＬＬＩ−ＭＳにより測定）のいずれかとＰａｎ１０の比は、発明者らの二段階カップリング法を用いればおよそ１：１であることが判明した（表１）。コンジュゲーションとチオール化を一段階で行った場合には、フルオレセインとＰａｎ１０の比は２：１であった（コンジュゲーション効率はＵＶ／Ｖｉｓ分光法によってのみ測定）。コンジュゲーション効率の違いはおそらくチオールをクエンチする小分子の不在下においてはチオール化Ｐａｎ１０が重合することによるものであると思われる。実際、２つの別工程で得られたＰａｎ１０−薬剤コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）およびサイズ排除クロマトグラフィーにより数種の付加的な高分子量種が検出された。
【０３１６】
このワンポットｓｃＦｖコンジュゲーション法を他のｓｃＦｖ（αｖβ３特異的抗体Ｂｃ−１２およびＢｃ−１５[Felding-Habermann et al. Manuscript submitted for publication]およびコカイン特異的抗体９２Ｈ２）に対しても試験したところ、抗原結合活性を失うことなく、フルオレセイン：タンパク質最大比３：１が得られた（データは示されていない）。Redwan et al., Biotechnol Bioeng, 82: 612-618, 2003。このようなコンジュゲーション方法はｓｃＦｖの膨大なアレイにも適用可能である。
【０３１７】
Ｐａｎ１０コンジュゲートの生物活性
発明者らのＰａｎ１０コンジュゲートの生物活性を調べるため、いくつかの方法を用いた。共焦顕微鏡分析を用いて、Ｐａｎ１０−ＦＭと、ＳＷ１９９０細胞および正常ヒト真皮繊維芽細胞系統（ＨｄＦａ）との相互作用の特異性を調べた。発明者らの結果は、Ｐａｎ１０−ＦＭがＳＷ１９９０細胞によって時間依存的に内在化されることを示した（図３）。さらに、インキュベーション２時間後、これらの癌細胞における内在化は非癌性のＨｄＦａの場合よりもはるかに多く見られた。これらの知見から、Ｐａｎ１０−ＦＭコンジュゲートがＰａｎ１０の野生型活性を保持しているものと確認され、膵臓癌細胞においてインテグリンα３β１の過剰発現が、非癌性細胞種のモデルとして用いられるＨｄＦａの場合よりもある程度の選択性を見込めるという証拠となる。
【０３１８】
Ｐａｎ１０、Ｐａｎ１０−ＦＭ、Ｐａｎ１０−３またはＰａｎ１０−４で処理されたＳＷ１９９０細胞を、細胞生存率に対する薬剤コンジュゲートの作用の定量的測定のため、倒立顕微鏡により調べた。培養７日後、Ｐａｎ１０またはＰａｎ１０−ＦＭで処理した細胞を健常なコロニーへと増殖したが、Ｐａｎ１０−薬剤コンジュゲートで処置した細胞は死滅したか、または過度な空胞化を示し、アポトーシスの進行を示した（図４）。次に、遊離薬剤の毒性と比べた場合のＰａｎ１０−薬剤コンジュゲートの細胞傷害作用をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５，−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖アッセイにより定量した。Liu et al., J Neurochem, 69: 581-593, 1997; Berridge et al., Arch Biochem Biophys, 303: 474-482, 1993; Vistica et al., Cancer Res, 51: 2515-2520, 1991。ＳＷ１９９０膵臓癌細胞を接種し、増殖培地中で一晩付着させた。その後、これらの培養物を漸増濃度の遊離薬剤またはＰａｎ１０−薬剤コンジュゲートで３時間または１２時間のいずれかの間処理した。
【０３１９】
７日後、生存細胞の数は、特に薬剤暴露時間１２時間後に、Ｐａｎ１０−薬剤コンジュゲートの明らかな制菌／細胞傷害作用を示した（表２）。遊離薬剤に関して測定されたＩＣ５０（５０％阻害濃度）値（表２）はそれまでに得られた値（２＝３０ｐＭおよび１＝２ｐＭ［２に関して得られたもの］）よりも２〜３桁高かった。Parrish et al., Bioorg Med Chem, 11: 3815-3838, 2003。この矛盾はおそらく使用した細胞系統の違い、薬剤暴露時間、および選択した細胞傷害性アッセイによるものであると思われる。本研究では、遊離薬剤は、特に暴露時間が短い場合では、対応するＰａｎ１０−薬剤コンジュゲートよりも強い細胞傷害作用を有していた。この作用はおそらく、原形質膜および核膜を経て拡散した際にＤＮＡが作用部位となるので、核内で遊離薬剤が即利用可能であることによるものと思われる。さらにこの証拠は、遊離薬剤とＰａｎ１０−薬剤コンジュゲートの間の有効性の違いが、インキュベーション時間を延長した際に有意に小さくなったという知見からも得られる。１２時間インキュベーション後では、Ｐａｎ１０−４コンジュゲートは遊離化合物２と同等の作用であった。
【表２】
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【０３２０】
Ｐａｎ１０−３（ｓｃＦｖ：薬剤＝１：１）は、Ｐａｎ１０−４（ｓｃＦｖ：薬剤＝１：１）と同等の細胞傷害性を示した。この結果は、ｓｃＦｖ１分子当たりに２つの薬剤分子を有するコンジュゲートではより低い細胞傷害性が見られたことと併せて、ヒドラゾン結合による薬剤の二量体形成に利点はないことを示唆するものである。これらの結果はまた、Ｐａｎ１０コンジュゲートのエンドサイトーシス機構が低ｐＨ環境への移行を含み得ないこと、および細胞内在化の際に、薬剤が無傷なＰａｎ１０か、またはＰａｎ１０の細胞内タンパク質分解に由来するペプチドかのいずれかに結合したままとなることを意味する。このような仮定複合体の残留活性は、ｓｃＦｖと薬剤の間で用いられているつなぎがＤＮＡ標的との相互作用および細胞傷害性の保存を考慮するのに十分長いものであることから、驚くことではない。実際、ｓｃＦｖ／ｓｃＦｖ由来ペプチドからの薬剤放出が細胞傷害作用に必要でないコンジュゲートが、特に細胞内在化機構の範囲内では有利であり得る。このように、有利薬剤に比べてｓｃＦｖ／ペプチド−薬剤は受動的（拡散的）流出および能動的流出プロセスの低下により細胞内により効果的に捕捉され得る。全体としてこの機構は高い細胞内濃度の薬剤の時間依存的な蓄積をもたらし、効率的に癌細胞を死滅させ、優れた治療係数を得、かつ、薬剤耐性の獲得の確率を引き下げる可能性を提供する。
【０３２１】
最後に、正常ＨｄＦａ細胞でＰａｎ１０−３およびＰａｎ１０−４コンジュゲートを試験したところ、ＳＷ１９９０癌細胞に対するものよりも、それぞれ〜３倍および５倍高いＩＣ５０の細胞傷害性が見られたのに対し、遊離１では、両細胞系統に対してほぼ同じＩＣ５０値を有していた。この結果と、ＳＷ１９９０細胞でＨｄＦａ細胞に比べて５倍高いレベルのα３インテグリン発現を示したＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別法）による測定値との間には相関があり得る。
【０３２２】
実施例３
遊離チオールを含有する化学修飾抗インテグリンα３β１  ｓｃＦｖ  Ｐａｎ１０は、強力な細胞傷害性薬剤デュオカルマイシンＳＡのマレイミド誘導体化類似体にコンジュゲートさせることができる。抗体Ｐａｎ１０コンジュゲートは、インテグリンα３β１を発現する細胞へ浸透する能力を保有している。特にＰａｎ１０−薬剤コンジュゲートはin vitroにおいて膵臓癌細胞に対して優れた細胞傷害作用を示す。極めて強力ではあるが臨床上実用可能な抗癌剤とはいえない本明細書に記載の遊離薬剤と比較した場合のｓｃＦｖコンジュゲートの独特な利点を考えれば、この第一段階は重要なものである。これらのコンジュゲートはこれらの薬剤分子を、インテグリンα３β１を過剰発現する癌細胞の内部へより特異的に送達することができ、抗体薬剤コンジュゲートの効率的な送達により、治療薬暴露の軽減および有効性の増強が見込めるはずである。このような戦略を用いて試験すれば、癌治療におけるｓｃＦｖ−薬剤デザインの潜在力がさらに精巧なものとなる。
【０３２３】
本明細書に引用されている刊行物および特許出願は全て、各刊行物または特許出願が目的を問わず出典明示により本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示されている場合と同様に、目的を問わず出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【０３２４】
以上、本発明を、理解を明瞭にするために説明および例により詳細に記載してきたが、当業者ならば本発明の本発明の教示に照らして、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくある種の変更および改変が行えるということ容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０３２５】
【図１】デュオカルマイシンＳＡ、ＣＢＩインドール類似体およびマレイミド誘導体。
【図２】精製したＰａｎ１０とＰａｎ１０コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ染色済みマーカー；レーン２：個別チオール化およびコンジュゲーション後のＰａｎ１０；レーン３：ワンポットチオール化およびコンジュゲーション後のＰａｎ１０；レーン４：非修飾Ｐａｎ１０。  バンド濃度分析（ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ  ＳｔａｎｄＡｌｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。網掛けの四角は各レーンにおいて単量体ｓｃＦｖに相当するバンドに対するデータを含む。
【図３】Ｐａｎ１０−ＦＭで処理したＳＷ１９９０細胞およびＨｄＦａ細胞の４８８ｎｍ画像と５６８ｎｍ画像を重ねた共焦顕微鏡像。（Ａ）２時間インキュベーション後のＳＷ１９９０細胞、（Ｂ）２時間後のＨｄＦａ細胞（Ｃ）３時間後のＳＷ１９９０細胞および（Ｄ）３時間後のＨｄＦａ細胞。
【図４】ＳＷ１９９０の倒立顕微鏡像。（Ａ）非処理細胞。（Ｂ）Ｐａｎ１０−ＦＭ処理細胞。（Ｃ）Ｐａｎ１０−４処理細胞。（Ｄ）Ｐａｎ１０−３処理細胞。ｓｃＦｖ−薬剤コンジュゲートで処理した細胞のうち２つの拡大画像は広範囲の空胞化を示す。
【図５】Ｂｏｃ保護された１の合成スキーム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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