(57)【要約】  本発明による診断キットは、ナノ粒子−生体物質複合体、抽出溶液、集電極、及び電流ピーク測定部を含む。ナノ粒子−生体物質複合体は、亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子、ナノ粒子と結合安定化物質を介して結合され、検出しようとする生体物質と特異的に結合する１種以上の生体結合物質、及び前記ナノ粒子と前記生体結合物質の結合をなす結合安定化物質を含む。抽出溶液は、ナノ粒子−生体物質複合体からナノ粒子を分離抽出する。集電極は抽出溶液からナノ粒子を捕集する。電流ピーク測定部は、集電極から捕集されたナノ粒子から対応電流ピークを測定する。本発明による診断キットは、ナノ粒子−生体物質複合体、抽出溶液、集電極、及び電流ピーク測定部を含む。ナノ粒子−生体物質複合体は、亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子、ナノ粒子と結合安定化物質を介して結合され、検出しようとする生体物質と特異的に結合する１種以上の生体結合物質、及び前記ナノ粒子と前記生体結合物質の結合をなす結合安定化物質を含む。抽出溶液は、ナノ粒子−生体物質複合体からナノ粒子を分離抽出する。集電極は抽出溶液からナノ粒子を捕集する。電流ピーク測定部は、集電極から捕集されたナノ粒子から対応電流ピークを測定する。本発明による診断装置は、使い捨てチップ、電極、診断用試薬容器、電気測定用または光学測定用部分で構成され、ピペットまたは注射器形態であり、容器ストッパーには電極を内蔵する、情報技術が集積した小型電気化学的バイオセンサーである。
2008547016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子；
所定の生体物質；及び
一側に前記ナノ粒子と結合可能な電荷特性の置換基を有し、反対側に複数の水溶性置換基を有する高分子鎖を有し、前記一側の置換基を介して前記ナノ粒子と結合し、前記反対側の複数の水溶性置換基を介して前記ナノ粒子を安定化させ、前記複数の水溶性置換基を介して前記生体物質との結合をなす結合安定化物質；
を含む、ナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項２】
前記ナノ粒子が、メタルスルフィド型であることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、亜鉛、カドミウム、鉛及び銅よりなる金属群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項４】
前記ナノ粒子が、２種以上のナノ粒子と結合して形成されるナノ粒子複合体を含むことを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項５】
前記生体物質が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、アミノ酸、核酸−アミノ酸の複合体、脂肪、糖蛋白質、Ｃａ２+、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３及びＤＡＧを含む信号伝達物質、及び抗体よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項６】
前記結合安定化物質が、ジチオールトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｌｔｈｒｅｉｔｏｌ）またはジヒドロリポ酸（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項７】
前記結合安定化物質が所定の活性化物質によって活性化し、活性化した結合安定化物質が前記生体物質との結合をなすことを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項８】
前記活性化物質が１，１−カルボニルジイミダゾール（１，１−ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ）であることを特徴とする、請求項７に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項９】
前記結合安定化物質と前記生体物質との結合がカバーメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）結合であることを特徴とする、請求項７に記載のナノ粒子−生体物質複合体。
【請求項１０】
生体物質を標識するナノ粒子を製造するナノ粒子の製造方法において、
ヘキサデカノール、水酸化カリウム及びカーボンジスルフィドを反応させて、ヘキサデシルキサンタート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｘａｎｔｈａｔｅ；ＨＤＸ）カリウム塩を製造する段階；
亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子を収得したＨＤＸカリウム塩と反応させてＨＤＸメタルスルフィドナノ粒子を製造する段階；及び
前記ＨＤＸメタルスルフィドナノ粒子に所定のアルキルアミンドーパントを反応させて、メタルスルフィドナノ粒子を製造する段階を含む、ナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、亜鉛、カドミウム、鉛及び銅よりなる金属群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１０に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
前記ＨＤＸカリウム塩の製造段階は、
前記ヘキサデカノールと前記水酸化カリウムを混合し、混合された溶液がすべて溶解するまで加熱する段階；
前記混合溶液をトルエンに入れて均一に撹拌させ、前記カーボンジスルフィドを添加する段階；
前記混合溶液を石油エーテルに入れ、さらに撹拌する段階；及び
前記混合溶液をガラス漏斗でフィルタリングし、エーテルで洗浄する過程を繰り返す段階を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
前記アルキルアミンドーパントは、ヘキサデシルアミン、デシルアミン及びトリオクチルアミンよりなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１０に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
ＨＤＸ亜鉛スルフィドナノ粒子またはＨＤＸカドミウムスルフィドナノ粒子に対しては、前記アルキルアミンドーパントとしてヘキサデシルアミンを使用し、ＨＤＸ鉛スルフィドナノ粒子に対しては、前記アルキルアミンドーパントとしてデシルアミンまたはトリオクチルアミンを使用し、ＨＤＸ銅スルフィドナノ粒子に対しては、前記アルキルアミンドーパントとしてヘキサデシルアミンまたはトリオクチルアミンを使用することを特徴とする、請求項１３に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
ナノ粒子標識を利用して所定の生体物質を検出する診断キットにおいて、
亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子、前記ナノ粒子と結合安定化物質を介して結合され、検出しようとする生体物質と特異的に結合する１種以上の生体結合物質、及び前記ナノ粒子と前記生体結合物質の結合をなす結合安定化物質を含むナノ粒子−生体物質複合体；
前記ナノ粒子−生体物質複合体から前記ナノ粒子を分離抽出する抽出溶液；
前記抽出溶液から前記ナノ粒子を捕集する集電極；及び
前記集電極から捕集された前記ナノ粒子に対応する電流ピークを測定する電流ピーク測定部；
を含む、診断キット。
【請求項１６】
前記ナノ粒子がメタルスルフィド型であることを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、亜鉛、カドミウム、鉛及び銅よりなる金属群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が２種以上のナノ粒子と結合して形成されるナノ粒子複合体であることを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項１９】
前記生体物質が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、アミノ酸、核酸−アミノ酸の複合体、脂肪、糖蛋白質、Ｃａ２+、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３及びＤＡＧを含む信号伝達物質、及び抗体よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２０】
前記結合安定化物質が、ジチオールトレイトールまたはジヒドロリポ酸であることを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２１】
前記捕集された前記ナノ粒子から測定される電流ピークをデジタル信号に変換するアナログ／デジタル変換部をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２２】
４種以上のナノ粒子−生体物質複合体を使用して４種以上の生体物質を同時に検出することを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２３】
前記抽出溶液が硝酸溶液を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２４】
前記ナノ粒子が陽イオン特性を有する場合、前記集電極に所定の陰電位を印加し、前記ナノ粒子が陰イオン特性を有する場合、前記集電極に所定の陽電位を印加することを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２５】
前記電流ピーク測定部は、前記集電極に捕集された前記ナノ粒子に所定の電位を印加して、前記ナノ粒子を酸化／還元反応させ、前記ナノ粒子の酸化／還元反応から発生する各ナノ粒子に固有の電流ピークを測定することを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２６】
前記集電極に所定の陰電位または陽電位を印加して、それぞれ陽イオン特性のナノ粒子または陰イオン特性のナノ粒子を捕集し、前記電流ピーク測定部は、捕集された前記ナノ粒子からそれぞれ発生する前記ナノ粒子に固有の電流ピークをそれぞれ測定することを特徴とする、請求項２５に記載の診断キット。
【請求項２７】
前記デジタル信号を解釈し、前記デジタル信号に対応する生体物質の正体及び／または検出された生体物質の含量を推定するデジタル信号リーダー部をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２８】
前記デジタル信号を所定のバーコードに変換するバーコード変換部をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２９】
前記デジタル信号を有線または無線通信を介して所定の遠隔診断部に伝送し、前記遠隔診断部から前記デジタル信号の解釈結果を受信する通信部をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項３０】
ナノ粒子標識を用いる診断方法において、
検出しようとする１種以上の生体物質と特異的に結合可能な１種以上の生体結合物質を決定する段階；
亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる群から１種以上の粒子を選択し、前記１種以上の生体結合物質とそれぞれ結合させて１種以上のナノ粒子−生体物質複合体を形成する段階；
前記１種以上のナノ粒子−生体物質複合体を診断しようとする試料内に入れて混合して、前記検出しようとする１種以上の生体物質と１種以上のナノ粒子−生体物質の結合を誘導する段階；
前記生体物質と特異的に結合したナノ粒子−生体物質複合体を分離する段階；
分離されたナノ粒子−生体物質複合体から前記ナノ粒子を分離して捕集する段階；及び
前記捕集されたナノ粒子に対応する固有の電流ピークを測定する段階；
を含む、診断方法。
【請求項３１】
前記ナノ粒子が、メタルスルフィド型であることを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３２】
前記ナノ粒子が、亜鉛、カドミウム、鉛及び銅よりなる金属群から選択される１種であることを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３３】
前記ナノ粒子が、２種以上のナノ粒子と結合して形成されたナノ粒子複合体であることを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３４】
前記生体物質が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸、アミノ酸、核酸−アミノ酸の複合体、脂肪、糖蛋白質、Ｃａ２+、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３及びＤＡＧを含む信号伝達物質、及び抗体よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３５】
前記ナノ粒子−生体物質複合体の形成段階が、
一側にナノ粒子と結合可能な電荷特性の置換基を有し、反対側に複数の水溶性置換基を有する高分子鎖型の結合安定化物質を前記ナノ粒子と結合させて前記ナノ粒子を安定化させる段階；
前記安定化されたナノ粒子に結合した結合安定化物質を活性化させる段階；及び
前記活性化した結合安定化物質と前記生体結合物質を結合させる段階；
を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３６】
前記活性化段階は、前記ナノ粒子−結合安定化物質複合体にカルボニルジイミダゾールを反応させて前記結合安定化物質を活性化させることを含むことを特徴とする、請求項３５に記載の診断方法。
【請求項３７】
前記検出しようとする生体物質がＤＮＡまたはＲＮＡの場合、前記生体結合物質は該当ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的に結合可能な相補鎖を含むＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３８】
前記検出しようとする生体物質が抗原の場合、前記生体結合物質は前記抗原と特異的に結合する抗体であることを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３９】
前記測定された電流ピークをデジタル信号に変換する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項４０】
前記変換されたデジタル信号を有線または無線通信を介して所定の遠隔診断部に伝送する段階；及び
前記遠隔診断部から前記デジタル信号に対する診断結果を受信する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３９に記載の診断方法。
【請求項４１】
生体試料を吸入する装置を備えるマイクロピペットを含むことを特徴とする、請求項１５ないし２９のいずれか１項に記載の診断キット。
【請求項４２】
前記マイクロピペットは、スクリーンプリンティングされた使い捨て電極を含む使い捨てチップ、及び前記使い捨てチップの電極と接続される外装型ポテンショスタットを含むことを特徴とする、請求項４１に記載の診断キット。
【請求項４３】
前記マイクロピペットは、生体試料の不純物を除去する細工性膜を含むことを特徴とする、請求項４１に記載の診断キット。
【請求項４４】
試薬を収容している容器が挿入されるラック型のドッキングコンテナに磁石を備えることを特徴とする、請求項４１に記載の診断キット。
【請求項４５】
前記マイクロピペット内にモバイルチップを内蔵することを特徴とする、請求項４１に記載の診断キット。
【請求項４６】
前記マイクロピペット内に電気化学的測定モジュールまたは光学測定モジュールを含むことを特徴とする、請求項４１に記載の診断キット。
【請求項４７】
生体試料の保存容器のストッパー部分に電極を含むことを特徴とする、請求項１５ないし２９のいずれか１項に記載の診断キット。
【請求項４８】
ポテンショスタットと連結される電極を含む、使い捨てチップ。
【請求項４９】
生体試料の不純物を除去する細工性膜を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の使い捨てチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナノ粒子標識、ナノ粒子標識を用いる診断方法及び診断キット、並びにこれを用いる診断装置に関するものである。また、本発明はナノ粒子標識の酸化／還元能力を用いる電気化学的診断方法、診断キット及びこれを用いる診断装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、プロテオミク（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）センシング装置を利用して多様な疾病状態を診断しようとする試みがあった。このために、プロテオミクセンシング装置は、使用者のための簡便な操作、低費用の達成だけでなく、優れた敏感度、選択性及び再現性を達成しなければならない。
【０００３】
プロテオミクセンシング装置は、主に診断装置として利用され、その代表的な例としては、抗原または抗体を認知する免疫センサーがある。
このような診断装置は、診断のために、所定の生体物質（タンパク質またはＤＮＡなど）を検出することができる方法を確立しなければならない。従来の生体物質の検出方法として、有機染料などを用いる蛍光標識方法が知られている。蛍光標識は種類によって多様な色を発光して、目的生体物質に対する検出手段を提供する。
【０００４】
一方、多数の生体物質を同時に検出しようとする場合、それぞれ異なる色相で発光する多数の蛍光標識が必要になる。ところが、このように多数の色相が同時に発光する場合、光退色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）現象が発生することができる。また、従来の蛍光標識は、光学的に狭小な励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）と発光バンド（ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｂａｎｄ）を有する欠点があり、生体物質と結合する場合、生体物質の活性に否定的な影響を与えるなど、多くの限界を持っている実情である。
【０００５】
したがって、このような従来の標識方法の問題点を克服し、物理的に一層安定で機能的な標識方法が要求されている。また、同時に多数の生体物質を検出するより安定的で正確な方法が要求されている。
【０００６】
一方、このような要求に応えて、最近半導体量子ドット（ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ；以下‘ＱＤ’という）ナノ粒子を利用する標識方法が知られている。しかし、従来のＱＤナノ粒子は、蛍光標識物質に比べ、物理的には安定しても、標識しようとする生体物質との結合性が低く、ＱＤナノ金属粒子の表面加工上の制約を克服することができない。したがって、従来のＱＤナノ粒子は、光学分析法のための標識源としてだけ使用されていた。
【０００７】
したがって、生体物質との成功的な結合が可能であり、生体物質を容易に検出することが可能な新規のナノ粒子を利用する標識方法が要求される。
最近、バイオ分析装置は、生物学的試料の分析において、迅速で簡便であり、低費用がかかるという利点とともに、巨大ゲノム及び病源菌情報を得るための人間ゲノムプロジェクト研究及び医療用の目的で、自家診断の要求に応えて、絶え間なく開発されて来た。しかし、既存のバイオセンサー及びバイオチップなどは前途有望であると思われたが、現在実用的側面で究極的限界に直面しており、研究室基盤のバイオセンサーシステムもいまだ多くの技術的制約があり、産業的基盤の安定的分析装置もいまだ不備な実情である。特に、プロテオミクセンサー装置は、それぞれ異なる細胞型の複雑な機能と多様な疾病状態の診断に対して選択的にその応用性を広げることができる利点を有するが、装置具現の面で、既存の研究室基盤のタンパク質診断がより実質的で使用者に簡便であるだけでなく、その機能においても、規模の大きい研究用機器に劣らない敏感度、選択性及び再現性などが必須不可欠に要求される。
【０００８】
免疫学的検定（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）システムは、使用者に高忠実度（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を与えるタンパク質診断法であって、臨床的応用において、腎臓疾患、糖尿病、心臓疾患及び高血圧などの人間疾病を早期診断する最も画期的な道具である。免疫センサーがその代表的な例であって、患者疾病の早期診断だけでなく、多くのタンパク質複合物に対するスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に至るまで、広くて迅速で簡便で効率的な免疫学的検定ができるようにする。これに対し、ほとんどの研究は多色（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）蛍光分析法による多重分析物質免疫学的検定法（ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）に集中された。しかし、このような光学的基盤の免疫学的検定法はたいてい有機染色蛍光標識物質を使用するので、前記のように、光学的に敏感度は高くても、多くの限界に直面している。また、蛍光物質は生物分子の表面と反応して、生物学的機能性に損失を加える欠点も有する。
【０００９】
このような光学分析装置の問題点を克服するために、電気化学的センシングという技術の開発が試みられた。これは光学的分析に比べて工程が簡単で低費用であり、小型化が容易な利点を有する。しかし、去る数十年の間、その開発が進んできたにもかかわらず、いまだバイオ医療分野では商業化した装置の普及が非常に必要な実情である。
【００１０】
また、現在、既存の病院及び医療関連機関で使用している血糖及びその合併症の診断装置は、試薬処理手続きが複雑であり、分析に長時間かかり、さらに複雑で高価の装備と専門家に制限されたインターフェースは、実際には非専門人の患者には早期診断を非常にややこしくする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明はこのような従来技術の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、生体物質との結合性に優れ、純度が高くて物理的に安定した新規のナノ粒子標識を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、生体物質との結合性に優れ、物理化学的に安定した新規のナノ粒子標識を用いる診断キットを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、生体物質との結合性に優れ、物理化学的に安定した新規のナノ粒子標識を用いる診断方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、ナノ粒子標識を用いる自家診断が直ちに可能な診断装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記のような技術的課題の解決のための、本発明の一特徴によるナノ粒子−生体物質複合体は、亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子、所定の生体物質、及び一側に前記ナノ粒子と結合可能な電荷特性の置換基を有し、反対側に複数の水溶性置換基を有する高分子鎖を有し、一側の置換基を介してナノ粒子と結合し、反対側の複数の水溶性置換基を介してナノ粒子を安定化させ、複数の水溶性置換基を介して前記生体物質との結合をなす結合安定化物質を含む。
【００１５】
本発明の他の特徴によるナノ粒子を製造するナノ粒子の製造方法は、ヘキサデカノール、水酸化カリウム及びカーボンジスルフィドを反応させて、ヘキサデシルキサンタート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｘａｎｔｈａｔｅ；以下‘ＨＤＸ’という）カリウム塩を製造する段階、亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子を収得したＨＤＸカリウム塩と反応させてＨＤＸメタルスルフィドナノ粒子を製造する段階、及びＨＤＸメタルスルフィドナノ粒子に所定のアルキルアミンドーパントを反応させて、メタルスルフィドナノ粒子を製造する段階を含む。
【００１６】
本発明のさらに他の特徴による診断キットは、ナノ粒子−生体物質複合体、抽出溶液、集電極、及び電流ピーク測定部を含む。ナノ粒子−生体物質複合体は、亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる金属群から選択される一種以上のナノ粒子、ナノ粒子と結合安定化物質を介して結合され、検出しようとする生体物質と特異的に結合する１種以上の生体結合物質、及び前記ナノ粒子と前記生体結合物質の結合をなす結合安定化物質を含む。抽出溶液は、ナノ粒子−生体物質複合体からナノ粒子を分離抽出する。集電極は、抽出溶液からナノ粒子を捕集する。電流ピーク測定部は、集電極から捕集されたナノ粒子から対応電流ピークを測定する。
【００１７】
本発明のさらに他の特徴による診断方法は、検出しようとする１種以上の生体物質と特異的に結合可能な１種以上の生体結合物質を決定する段階、亜鉛、カドミウム、鉛、銅、ガリウム、ヒ素、タリウム、ニッケル、マンガン及びビスマスよりなる群から１種以上の粒子を選択し、１種以上の生体結合物質とそれぞれ結合させて１種以上のナノ粒子−生体物質複合体を形成する段階、１種以上のナノ粒子−生体物質複合体を診断しようとする試料内に入れて混合して、検出しようとする１種以上の生体物質と１種以上のナノ粒子−生体物質の結合を誘導する段階、生体物質と特異的に結合したナノ粒子−生体物質複合体を分離する段階、分離されたナノ粒子−生体物質複合体からナノ粒子を分離して捕集する段階、及び捕集されたナノ粒子に対応する固有の電流ピークを測定する段階を含む。
【００１８】
本発明のさらに他の特徴による診断装置は、外装型ポテンショスタットを含むラック型ドッキングコンテナ５００に連結されるドロペット型の診断装置４００、使い捨てチップ３００及び本体部２００でなるマイクロピペット型診断装置、及び３電極を内蔵するストッパー１１０及び連結部４０を介して外装型ポテンショスタットと連結されるストッパー型診断装置を提供する。
【００１９】
以下、添付図面に基づいて、本発明の実施例を、本発明が属する技術分野で通常の知識を持った者が容易に実施し得るほどに詳細に説明する。しかし、本発明はいろいろの異なる形態に具現することができ、ここで説明する実施例に限定されない。
【００２０】
本発明は、生体物質に対する信号発生標識として使用可能な新規のナノ粒子標識を提供しようとする。
本発明において、‘生体物質’は生物体内に存在する物質であって、特定の標識で検出される場合、生物学的用途に利用可能な物質を意味する。具体的に、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸、アミノ酸、または核酸−アミノ酸の複合体または抗体などを含む。
【００２１】
本発明の実施例においては、生体物質として、腎臓及び心臓疾患関連早期臨床マーカー（ｍａｒｋｅｒ）である人間血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ））、人間マイクログロブリン（ｈｕｍａｎ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＭＧ））、人間ミオグロブリン（ｈｕｍａｎ ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（Ｍｂ））、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）などを含む。
【００２２】
本発明の実施例によるナノ粒子の検出方法によって、前記のような生体物質の濃度を精密に測定することができる。一方、本発明の実施例によるナノ粒子の検出方法を用いる場合、本発明の実施例によるナノ粒子の検出方法の使用者は、測定された生体物質の濃度が所定の範囲を超過するかどうかによって所定の疾病の感染有無を検出対象に警告するか、所定の疾病に対する診断根拠として使用することができる。具体的に、糖尿病、高血圧などの特定疾病と関連する特定生体物質を、本発明のナノ粒子を標識として使用することにより、検出することができ、このような検出経過は当該特定疾病の診断資料として使用可能であるのが明らかである。
【００２３】
本発明の実施例において、ナノ粒子標識として使用されるナノ粒子は金属系ナノ粒子であって、解像度及び信号選択性に優れた金属ナノ粒子である。本発明の実施例で使用されるナノ粒子は、解像度及び信号選択性に優れた金属であれば特別に制限されない。本発明の実施例において、解像度は金属から発生する信号のピーク幅が狭くて、他の信号のピークと重畳なしに区別される特性を意味し、信号選択性は該当金属から生成される信号ピークの異なる金属から生成される信号ピークと区別し易く現れる程度を意味する。すなわち、解像度が高い場合、信号選択性が増加する。
【００２４】
本発明の実施例による金属ナノ粒子は、後述する本発明の実施例によるナノ結晶合成法によって収得される金属スルフィド（ｍｅｔａｌ ｓｕｌｆｉｄｅ；以下‘ＭＳ’という）である。金属スルフィドに使用される金属としては、本発明の実施例では、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、鉛（Ｐｂ）、銅（Ｃｕ）、ガリウム（Ｇａ）、ヒ素（Ａｓ）、タリウム（Ｔｌ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）またはビスマス（Ｂｉ）が好ましく使用される。特に、亜鉛、カドミウム、鉛、または銅がより優れた解像度を有する選択的信号を生成するので、好ましく使用できる。
【００２５】
このような本発明の実施例による金属ナノ粒子の大きさは大部分の生体物質と大きさ範囲と類似するので、生体物質との‘ナノ粒子−生体物質複合体’の形成が容易である。
本発明の実施例によるナノ粒子標識は、生体物質と安定的に共有結合を形成することができる。この際、生体物質として、人体の疾病徴候を示す原因タンパク質を探知する特異抗体が使用できる。その後、金属ナノ粒子標識の電気化学的特性を利用して該当のナノ粒子を検出する。
【００２６】
したがって、本発明の実施例によるナノ粒子標識を使用する場合、電気化学分析方法によって、受信される該当のナノ粒子標識の信号を分析し、ナノ粒子標識と結合した特異抗体の存在を感知し、これにより原因タンパク質を探知することができることになる。このような分析の結果によって原因タンパク質を感知することになり、その感知結果によって、特定疾病に対する徴候を診断することが可能になる。
【００２７】
本発明のさらに他の特徴による診断装置は、外装型ポテンショスタットを含むラック型ドッキングコンテナ５００に連結されるドロペット型の診断装置４００、使い捨てチップ３００及び本体部２００でなるマイクロピペット型診断装置、３電極を内蔵するストッパー１１０と連結部４０を介して外装型ポテンショスタットと連結されるストッパー型診断装置を提供する。まず、ドロペット型の診断装置４００を説明する。前記診断装置４００は、生体試料を吸入する吸入装置１０、サンプル注入口２０、ポテンショスタットを内蔵するラック型のドッキングコンテナ５００への連結部４０、及び３極電極３０を含んでなる。前記使い捨てドロペット４００は、生体試料の不純物を除去する細工性膜１５を含むことができる。ついで、マイクロピペット型診断装置を説明すれば、前記マイクロピペット型診断装置は、サンプル注入口２０及び３電極３０を含む使い捨てチップ３００と、スプリング、ギアなどの各種部品を内蔵することができるピペットモジュール１１、使い捨てチップ３００との連結部４０、モバイル回路９０及びディスプレイモジュール１００を含むポテンショスタットを内蔵する本体部２００とを含んでなる。前記使い捨てチップ３００の部分には、試料の不純物を除去する細工性膜１５を含むことができる。ついで、ストッパー型診断装置を説明すれば、生体試料を含む容器のストッパー部１１０に３電極３０を挿入し、３電極が生体試料部分と接するように容器内部に突出させ、３電極を介して測定された信号は連結部４０を介して外装型ポテンショスタットに伝達される。
【有利な効果】
【００２８】
このように、本発明のナノ粒子標識を利用する生体物質検出及び診断キットは、各金属ナノ粒子の固有電流ピークを解釈して、検出しようとする生体物質を簡便で、かつ定量的で正確に測定することが可能である。よって、本発明のナノ粒子診断キットは、迅速、簡便な検出結果及び診断結果を示すことができる。
【００２９】
また、本発明のナノ粒子標識を利用する生体物質検出及び診断キットの検出限界は非常に低くて、微量の患者試料（小便、血液、体液）に含有された生体物質（抗原またはＤＮＡ）であっても正確に測定することができるので、キットの小型化が可能である。
【００３０】
したがって、本発明の実施例によるナノ粒子を標識として使用する診断キットは、人体の疾病（糖尿病、腎臓病、心臓疾患、癌など）を電気化学的に迅速で簡便に診断することができる。
【００３１】
本発明の診断装置はマイクロピペット形態のもので、容器ストッパーには電極を内蔵する情報技術が集積した小型の測定器機であって、極小量の小便、血液及び体液を含む患者試料から該当の物質を精密で簡便に診断することができるだけでなく、自家診断（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）が容易であるので、各種晩成疾患に対して患者が自ら対処することができるようにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、図１ａ及び図１ｂを参照して、本発明の実施例によるナノ粒子を標識として使用して特定生体物質を検出する方法について具体的に説明する。
図１ａは本発明の実施例によるナノ粒子標識を利用してＤＮＡを検出する方法を概略的に示す。図１ａは検出対象が４種のＤＮＡ断片の場合、本発明のナノ結晶標識を利用して検出する方法を説明する。
【００３３】
まず、検出対象である４種のＤＮＡ断片（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４）にそれぞれ相補的な４種のＤＮＡ断片を求め、求められた４種のＤＮＡ断片にそれぞれ本発明のＭＳナノ粒子をそれぞれ結合させた。この際、ＤＮＡ断片（Ｔ１）に相補的なＤＮＡ断片にＺｎＳナノ粒子を、ＤＮＡ断片（Ｔ２）に相補的なＤＮＡ断片にＣｄＳナノ粒子を、ＤＮＡ断片（Ｔ３）に相補的なＤＮＡ断片にＰｂＳナノ粒子を、そしてＤＮＡ断片（Ｔ４）に相補的なＤＮＡ断片にＣｕＳナノ粒子をそれぞれ結合した。
【００３４】
ついで、検出対象である４種のＤＮＡ断片（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４）を含む試料に、製造された本発明のナノ粒子で標識されたＤＮＡ断片を添加して、ＤＮＡ混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を実施した（Ｓ１００）。
【００３５】
この際、混成化しなかったＤＮＡ断片を除去した後、混成化したＤＮＡ断片を硝酸溶液に溶解させる。その後、硝酸溶液に電極を入れ、特定の陰電位を印加して、陽イオン特性を有する本発明のナノ粒子を捕集した。本発明のナノ粒子として、陰イオン特性を有するナノ粒子を使用する場合は、陽電位を印加してナノ粒子を捕集することができる。
【００３６】
このように電極に捕集されたナノ粒子に、ナノ粒子検出方法の一つとして電圧ストリッピング法を実施して、各ナノ粒子に対応する電流ピークを測定した（Ｓ２００）。
ついで、各ナノ粒子に対応する測定された電流ピークをサンプリングし、デジタル信号に変換して出力した（Ｓ３００）。
【００３７】
図１ａはデジタル信号としてバーコードを利用した結果を示す。このようなデジタル信号を解釈して、当該デジタル信号に対応するナノ結晶を把握し、把握されたナノ結晶が結合したＤＮＡ断片、そしてそれに相補的に結合可能なＤＮＡ断片を順に把握することができる。よって、デジタル信号の解釈によって、検出しようとするＤＮＡ断片が検出対象試料に該当デジタル信号が意味する量で存在することが分かる。
【００３８】
ついで、図１ｂは本発明の実施例によるナノ粒子標識を利用して抗原を検出する方法を概略的に示す。
まず、検索しようとする４種の抗原（Ａｇ１、Ａｇ２、Ａｇ３、Ａｇ４）とそれぞれ特異的に結合可能な４種の抗体（Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４）に本発明のＭＳナノ粒子をそれぞれ結合した。この際、抗体（Ａｂ１）にＺｎＳナノ粒子を、抗体（Ａｂ２）にＣｄＳナノ粒子を、抗体（Ａｂ３）にＰｂＳナノ粒子を、そして抗体（Ａｂ４）にＣｕＳナノ粒子をそれぞれ結合した。
【００３９】
ついで、検出しようとする抗原を含む試料に、製造された本発明のナノ粒子で標識された抗体を添加してサンドイッチ免疫反応を実施した（Ｓ４００）。
この際、抗原と特異的結合を行わない本発明のナノ粒子で標識された抗体を除去した後、結合した抗原−抗体複合体を硝酸溶液に溶解させた。その後、硝酸溶液に電極を入れ、特定陰電位を印加して、陽イオンの特性を有する本発明のナノ粒子を捕集し、捕集されたナノ粒子に特定ストリッピング電圧を印加してナノ粒子別に固有の信号ピークを測定した（Ｓ５００）。
【００４０】
ついで、各ナノ粒子に対応する測定された電流ピークをサンプリングし、デジタル信号に変換して出力した（Ｓ６００）。
このようなデジタル信号を解釈して、当該デジタル信号に対応するナノ結晶を把握し、把握されたナノ結晶が結合した抗体、そしてそれに特異的に結合可能な抗原を順に把握することができる。よって、デジタル信号の解釈によって、検出しようとする抗原が検出対象試料に当該デジタル信号が意味する量で存在することが分かる。
【００４１】
以下、図２を参照して、本発明の実施例によるナノ粒子の製造方法について具体的に説明する。本発明の実施例によるナノ粒子は高い水溶性を有し、物理化学的安全性を有し、生体物質との高生物互換性を示す。
【００４２】
本発明の実施例によるナノ粒子の製造方法は、金属のヘキサデシルキサンタート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｘａｎｔｈａｔｅ；以下‘ＨＤＸ’という）カリウム塩の製造段階（Ｓ７００）、メタルスルフィドナノ粒子の合成段階（Ｓ８００）、及びナノ粒子の表面安定化キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）の段階（Ｓ９００）を含む。
【００４３】
図２は本発明の実施例によるナノ粒子の製造方法を概略的に示す概念図である。
まず、ＨＤＸカリウム塩の製造段階（Ｓ７００）について説明する。本実施例において、ＨＤＸは金属ナノ粒子を安定的にキャッピングしてメタルスルフィドを生成させる。図２では、ナノ粒子のための金属として、亜鉛、カドミウム、鉛及び銅を使用した。
【００４４】
まず、同一濃度の０．０４モールのヘキサデカノール（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ）９．６９ｇと水酸化カリウム（ＫＯＨ）２．２４ｇを混合し、混合された溶液が全部溶解するまで１５０℃の温度で加熱した。混合溶液を１００℃の温度で２５ｍｌのトルエンに入れ、均一に撹拌した。その後、カーボンジスルフィド（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）４．４１ｇを常温で微量で少しずつ添加して黄色溶液を収得した。その後、さらに１時間強く撹拌させた後、溶液を１００ｍｌの石油エーテル（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ）に入れ、さらに２時間撹拌した。その後、溶液をガラス漏斗（ｇｌａｓｓ ｆｕｎｎｅｌ）でフィルタリングし、エーテルで洗浄する段階を数回繰り返して、最終産物としてＨＤＸカリウム塩を収得した。具体的に、ＨＤＸカリウム塩を真空オーブンで完全に乾燥させ、さらに２０ｍｌの冷蒸溜水で洗浄した後、さらにガラス漏斗でフィルタリングし、乾燥し、エーテルで洗浄した後、メタノールで３回洗浄し、さらに乾燥させて、最終産物としてＨＤＸカリウム塩を収得した。
【００４５】
本実施例では、前述したような多段階のフィルタリング及び洗浄過程によって、粒子が均一であり、溶解度と純度の高いＨＤＸカリウム塩（Ｃ１６ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＳ２−）を収得することができた。
【００４６】
ついで、メタルスルフィドナノ粒子の合成（Ｓ８００）及び表面安定化段階（Ｓ９００）について説明する。
先に収得されたＨＤＸカリウム塩（Ｃ１６ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＳ２−）を低温浸漬（ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）した。その後、ＨＤＸカリウム塩３．５６ｇを５ｍｌのメタノールに溶解させ、ＨＤＸカリウム塩を同一モール量のＣｄＣｌ２、ＰｂＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２水溶液とそれぞれ２分間反応させた。反応の後、混合溶液を遠心分離した後、上澄液を除去して金属ＨＤＸ型のメタルスルフィドナノ粒子を収得した（Ｓ８００）。収得された金属ＨＤＸをメタノールで洗浄した後、真空オーブンで乾燥させた。
【００４７】
その後、収得された金属ＨＤＸをアルキルアミンドーパント（ａｌｋｙｌ ａｍｉｎｅ ｄｏｐａｎｔｓ）と混合させた。アルキルアミンドーパントは強力な電子供与能力を有し、金属ＨＤＸ単一層を安定化させるものであると思われる。本発明の実施例に使用されるアルキルアミンドーパントとしては、強力な電子供与能力を持ち、金属ＨＤＸを安定化させるものであれば、大きく制限されないが、ヘキサデシルアミン（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、以下‘ＨＤＡ’という）、デシルアミン（ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、以下‘ＤＡ’という）、トリオクチルアミン（ｔｒｉｏｃｔｙｌａｍｉｎｅ、以下‘ＴＯＡ’という）が好ましく使用される。具体的に、本実施例では、Ｚｎ−ＨＤＸ、及びＣｄ−ＨＤＸに対してはＨＤＡが使用され、Ｐｂ−ＨＤＸに対してはＴＯＡ及びＤＡが使用され、Ｃｕ−ＨＤＸに対してはＴＯＡ及びＨＤＡが使用された。
【００４８】
アルキルアミンドーパントは、金属ＨＤＸとの混合に先立ち、まず、１２０℃まで加熱してから５０℃まで冷却させた。その後、均一に撹拌しながら金属−ＨＤＸ粉末０．０５ｇを添加した。その後、１００℃に加熱しながら３０分間撹拌した後、温度を徐々に１２０℃まで上げ、１．５時間反応を持続させた。１４０℃で２分間最終反応を終えた後、徐々に７０℃まで温度を降下させた。
【００４９】
得られた最終の金属結晶粒子はそれぞれ白色のＺｎＳナノ結晶粒子、黄色のＣｄＳナノ結晶粒子、黒色のＰｂＳナノ結晶粒子、そして青緑色のＣｕＳナノ結晶粒子であり、これらはメタノールによって凝集沈殿（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）され、手軽い抽出のために試験管底に沈澱された。その後、遠心分離及び上澄液除去過程を多数回実施し、常温で乾燥させてきれいな粉末状の最終ナノ結晶粒子を収得した。
【００５０】
ついで、図３を参照して収得されたナノ粒子を標識として使用して所定の生体物質と結合させることにより収得されるナノ粒子−生体物質複合体の製造方法を具体的に説明する。本実施例では、生体物質として、ａｎｔｉ−Ｍｂ、ａｎｔｉ−ＨＳＡ、ａｎｔｉ−β２−ＭＧ、ａｎｔｉ−ＣＲＰ抗体を利用した。
【００５１】
図３は本発明の実施例によるナノ粒子−生体物質複合体の製造方法を概念的に示す概念図である。
図３ａは本発明の実施例によるナノ粒子−抗体複合体の製造方法を概念的に示す。図３ｂは本発明の実施例によるナノ粒子−ＤＮＡ複合体の製造方法を概念的に示す。
【００５２】
ナノ粒子−生体物質複合体の製造方法は、先に収得した金属ナノ粒子（ＭＳ）を安定化物質とともに反応させて安定化させ、活性化物質で活性化させた後、生体物質を反応させてナノ粒子−生体物質複合体を収得する。
【００５３】
本発明の実施例で使用される安定化物質は、ナノ粒子を化学物理的に安定化させ、ナノ粒子の溶解度を増大させて、生体物質に対する生体互換性を増大させることで、ナノ粒子−生体物質複合体の安定化に寄与する。具体的に、安定化物質は、一側にナノ粒子と結合可能な化学的置換基を有し、反対側に複数の水溶性置換基を有する高分子物質で構成され、一側の化学的置換基でナノ粒子を取り囲んで結合し、反対側の水溶性置換基によって水溶性媒質からナノ粒子を保護してナノ粒子の安全性を保障する。また、反対側の水溶性置換基の一部を介して生体物質と共有結合を成して、ナノ粒子と生体物質間の結合を促進する。
【００５４】
本発明の実施例において、安定化物質は、好ましくはジチオールトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｌｔｈｒｅｉｔｏｌ、以下‘ＤＴＴ’という）またはジヒドロリポ酸（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ；以下‘ＤＨＬＡ’という）を使用する。このようなＤＴＴまたはＤＨＬＡは、その表面化学的特性及び高い水溶液中の溶解度によってナノ粒子を格段に安定化させる。具体的に、ＤＴＴは、その分子構造上のチオール（−ＳＨ）基によってナノ粒子表面をナノ水準で強くて均一に取り囲んで、ナノ粒子の安定的な構造を維持するとともに、ナノ粒子の表面にヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）基を生成させて、ナノ粒子の水溶性を増大させる。ここで、安定化物質は、チオール（−ＳＨ）基の陰電荷的特性を利用して、陽電荷的特性を有するナノ粒子を均一に取り囲んで結合すると思われる。よって、安定化物質として、一側に陰電荷的特性を有する置換基が多数存在してナノ粒子を均一に取り囲んでナノ粒子を安定化させ、他側に水溶性置換基が多数存在してナノ粒子の水溶性を増大させる物質が好ましく使用される。本発明の実施例では、陰電荷的特性を有する置換基としてチオール（−ＳＨ）基を例として挙げたが、その他の陰電荷的特性を有する置換基も使用可能であり、具体的な例として水酸化基（−ＯＨ）も使用可能であると思われる。本実施例は陽電荷特性を有するナノ粒子を使用しているので、陰電荷的特性を有する安定化物質が好ましいが、陰電荷的特性を有するナノ粒子を使用する場合には、陽電荷特性を有する置換基を有する安定化物質が好ましく使用できる。
【００５５】
本発明の実施例で使用される活性化物質は、安定化物質の活性化を誘導して生体物質のアミノ基とカバーメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）結合を形成することができるようにする。本発明の実施例において、活性化物質は好ましくは１，１−カルボニルジイミダゾール（１，１−ｃａｒｂｏｎｙｌ ｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ、以下‘ＣＤＩ’という）を使用した。
【００５６】
図３ａを参照してナノ粒子−抗体複合体の製造方法を説明すれば、ナノ粒子をＤＴＴとともに１２時間撹拌させて水酸化（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ）した後（Ｓ１０００）、ＣＤＩで活性化させた（Ｓ１１００）。このように活性化した金属ナノ粒子（ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＺｎＳ、ＣｕＳ）をそれぞれ１００ｕｌのａｎｔｉ−Ｍｂ、ａｎｔｉ−ＨＳＡ、ａｎｔｉ−β２−ＭＧ、ａｎｔ−ＣＲＰ（２４０Ｍ ｉｎ ２０ｍＭの燐酸水溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）と常温で２４時間撹拌させて反応させた（Ｓ１２００）。反応の後、未反応抗体をジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）で除去した。最終の結果物を０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）に分散させた。
【００５７】
図３ａで、ＭＳＱＤ−Ａｂはメタルスルフィド量子ドットナノ粒子がＤＴＴを介して抗体と結合した状態を概念的に示す。
図３ｂを参照してナノ粒子−ＤＮＡ複合体の製造方法を説明すれば、ナノ粒子をＤＴＴとともに１２時間撹拌させて水酸化（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ）した後（Ｓ１３００）、ＣＤＩで活性化させた（Ｓ１４００）。このように活性化した金属ナノ粒子（ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＺｎＳ、ＣｕＳ）をそれぞれ１００ｕｌの４種のアミノ−ＤＮＡと常温で２４時間撹拌させて反応させた（Ｓ１５００）。反応の後、未反応ＤＮＡ断片を除去してナノ粒子−ＤＮＡ複合体を収得した。
【００５８】
図３ｂで、ＭＳ ＱＤ−ＤＮＡはメタルスルフィド量子ドットナノ粒子がＤＴＴを介してＤＮＡと結合した状態を概念的に示す。
図３ａ及び３ｂに示すように、本発明の実施例によるナノ粒子は、ＣＤＩによって活性化したＤＴＴを介して抗体またはＤＮＡのような生体物質と安定的に結合する。
【００５９】
以下、本発明の実施例による生体物質と結合したナノ粒子標識を検出することができる検出方法について説明する。
本発明の実施例では、ナノ粒子標識の検出方法で電気化学的分析方法を利用する。本発明で使用される電気化学的分析方法は、水溶液上で実施して、電位、電流、電気伝導度、インピーダンス、キャパシタンスまたは抵抗等を測定するものであって、小型化及び迅速な信号処理が可能であるので、小規模のアレイ分析に有用である。
【００６０】
本発明の実施例では、電気化学的分析方法のうち、特に方形波陰極ストリッピング電圧法を利用する。
本発明の実施例で使用されるストリッピング電圧法は２段階に大別される。まず、ナノ粒子標識で標識された生体物質を所定の水溶液に入れ、電極を位置させ、電極を介して特定電位を印加する。印加電位によって、ナノ粒子金属は該当電極方向に移動して該当電極表面に捕集される。ついで、該当電極に捕集されたナノ粒子金属に所定の電位を印加して特定電流を導通させる。この際、各ナノ粒子金属は、酸化及び還元反応により、各金属ナノ粒子の種類によって特定ピークの電流を発生することになる。このような特定ピークの電流を測定して、ナノ粒子標識の存在及びその濃度を測定する。
【００６１】
本発明の実施例によるストリッピング電圧法によるナノ粒子標識検出方法は、ピコモル（ｐｉｃｏｍｏｌａｒ）レベルの高測定限界を提供する。このような測定限界は、本発明の実施例による高純度ナノ粒子を使用することにより達成される。また、本発明の実施例によるナノ結晶粒子の大きさを触媒的に調節してセンサー信号の敏感度を大きく向上させることが可能である。
【００６２】
本発明の実施例によるナノ粒子を利用して多数の生体物質を同時に検出しようとする場合、各生体物質に対してそれぞれ異なる金属ナノ粒子を使用する。この場合、各ナノ粒子は、金属の種類によって特定の電流ピークを示して、多数の生体物質を同時に検出することができるようにする。
【００６３】
本発明の実施例において、電気化学的検出方法として使用された方形波陰電極ストリッピング電圧法は、ＧＰＥＳソフトウェアによって運用されるＡｕｔｏｌａｂ １２（Ｅｃｏ Ｃｈｅｍｉｅ、オランダ）で実施された。分析のために、１．５ｍｌガラスセル（ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ）に２×４ｍｍ大きさのスクリーンプリンティングカーボン作業電極（Ａｃｈｅｓｏｎ−ｉｎｋ）、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、及び白金カウンター電極（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用した。具体的に、検出プリンティングカーボン電極として、水銀（II）イオンまたはビズマスイオンがコートされた電極を利用した。すべての遠心分離過程はＭｉｃｒｏｍａｘ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＴｈｅｒｍｏＩＥＣ、ＭＡ）を利用して実施した。
【００６４】
本発明の実施例に適用される方形波陰電極ストリッピング電圧法を具体的に説明する。
まず、ナノ粒子標識で標識された生体物質を硝酸水溶液に溶かした後、硝酸水溶液に電極を位置させる。
【００６５】
その後、電極を介して１分間０．６Ｖを印加して前処理し、２分間陰電位として−１、４Ｖを印加して電極側に金属ナノ粒子を捕集する。この際、１ｍｌの０．１Ｍアセテートバッファー（ｐＨ４．５）を使用する。その後、５秒の休止期後にストリッピング電圧を印加して、各金属ナノ粒子から生成される、各金属粒子の固有電流ピークを測定する。ストリッピング電圧の印加は、具体的に１．２Ｖ〜０．１２Ｖの電位範囲で、ステップ電位（ｓｔｅｐ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）５０ｍＶ、大きさ２０ｍＶ、及び周波数２５Ｈｚで実施する。得られたカーブのベースラインの矯正は、ＧＰＥＳソフトウェアの‘ｍｏｖｉｎｇ ａｖｅｒａｇｅ’モードで行われる。すべての最終結果は、ソフトウェア自体内の‘ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ’オプションを通じて保存される。
【００６６】
図４ａ〜４ｇは、本発明の実施例によって、電気化学的検出方法で４種の抗原を検出する過程を示す。
図４ａは本発明の実施例によるＺｎＳ−ａｎｔｉ−β２−ＭＧ、ＣｄＳ−ａｎｔｉ−Ｍｂ、ＰｂＳ−ａｎｔｉ−ＨＳＡ及びＣｕＳ−ａｎｔｉ−ＣＲＰを硝酸に溶解させて収得される電流ピークを示し、このような図４ａの電流ピークは電気化学的検出方法で収得された電流ピークを解釈する基準になる。
【００６７】
図４ｂは、検出対象試料内に抗原がない場合、電流ピーク信号及び当該電流ピーク信号をデジタル信号に変換して具現されるバーコードを示す。
図４ｃ〜図４ｆは、検出対象試料のそれぞれに一つの抗原ターゲットがある場合、電流ピーク信号及び当該電流ピーク信号をデジタル信号に変換して具現されるバーコードを示す。
【００６８】
図４ｇは、検出対象試料に４種の抗原ターゲットがある場合、電流ピーク信号及び当該電流ピーク信号をデジタル信号に変換して具現されるバーコードを示す。
図４ｃ〜図４ｇのバーコード及びバーコード下の数字は抗原ターゲットの濃度を示す。
【００６９】
図４ａに示すように、各ナノ粒子（ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＰｂＳ及びＣｕＳ）で標識された抗体は互いに確実に区別される電流ピークを有し、各抗原（Ａｇ１、Ａｇ２、Ａｇ３、Ａｇ４）にそれぞれ結合した後にも、その電流ピークが変わらないことが分かる。よって、収得される電流ピークから、検出対象試料内に含まれた各抗原を定量的に検出することができる。この際、各抗原に結合した各金属イオンによる電流ピークは、亜鉛−抗原（Ａｇ１）（ＺｎＳ−ａｎｔｉ−β２−ＭＧ）の場合は−１．１２Ｖ、カドミウム−抗原（Ａｇ２）（ＣｄＳ−ａｎｔｉ−Ｍｂ）の場合は−０．６８Ｖ、鉛−抗原（Ａｇ３）（ＰｂＳ−ａｎｔｉ−ＨＳＡ）の場合は−０．５３Ｖ、そして銅−抗原（Ａｇ４）（ＣｕＳ−ａｎｔｉ−ＣＲＰ）の場合は−０．１３Ｖの電圧範囲で現れた。
【００７０】
このような本発明の実施例で適用した陰極ストリッピングを用いる電圧ストリッピング法では、電位金属ナノ粒子が選択的分析の容易な電流ピーク信号を導出した。本発明の実施例のナノ粒子として適した電位金属の選定は、陰極電圧区間で互いに重畳しないながら著しい電流ピークを有する金属を選定した。陰極ストリッピング法を利用するためには、陽極性電位金属が好ましかった。しかし、陽極ストリッピング法を用いる場合、陰極性電位金属が好ましく使用できる。
【００７１】
このように、陽極及び陰極を同時に用いて各電極に固有の電流ピークを生成するナノ金属を用いる場合、より多い金属をナノ粒子として利用することができる。結果として、より多数の生体物質を同時に検出することが可能になる。
【００７２】
このように収得された電流ピークは、アナログ／デジタル変換部で、所定のデジタル変換方法によってデジタル化することができる。具体的に、収得されたアナログ型の電流ピークは、サンプリングされて対応のデジタル信号として出力される。デジタル変換方法は、電流ピーク信号の信号値の代入によるデジタル化（ｄｉｇｉｔｉｚａｔｉｏｎ）過程とノーマライゼーション（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）過程を含む。デジタル化は、統計的最適スレショルド分割（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と区分線形補間（ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ ｌｉｎｅａｒ ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）によって実施される。
【００７３】
その結果として獲得された電流ピーク信号は、その大きさとトレンドによってデジタル信号に変換され、有線または無線通信手段を介して遠隔地に伝送されるか、所定のデジタル文字に保存できる。このようなデジタル文字の具体的な例としてバーコードを挙げることができる。
【００７４】
図４ｂ〜４ｇは電流ピーク信号が変換されたバーコードを示す。図４ｂは電流ピークが検出されないときのバーコードを示し、図４ｃ〜４ｆはそれぞれナノ粒子−抗体複合体であるＺｎＳ−Ａｇ１、ＣｄＳ−Ａｇ２、ＰｂＳ−Ａｇ３及びＣｕＳ−Ａｇ４が検出されたとき、測定された電流ピーク信号をバーコードに変換した例を示す。図４ｇは４種のナノ粒子−抗体複合体ＺｎＳ−Ａｇ１、ＣｄＳ−Ａｇ２、ＰｂＳ−Ａｇ３及びＣｕＳ−Ａｇ４が同時に検出されたとき、測定された電流ピーク信号をバーコードに変換した例を示す。図４ｂ〜４ｇに示すバーコードにおいて、４桁の数字はそれぞれＺｎ、Ｃｄ、Ｐｂ及びＣｕの固有電流ピークに対応し、その大きさは測定された電流ピークの大きさに対応する。よって、図４ｂ〜４ｇに示すバーコードから、該当ナノ粒子の存在及びその含量が分かり、それから該当ナノ粒子と複合体を形成した抗体の存在及びその含量を測定することができる。
【００７５】
このようにデジタル化した信号は、所定のデジタルリーダー装置またはバーコードリーダー装置によって読み取られ、所定の保存媒体に保存できる。具体的に、本発明の診断キットを病院で使用する場合、各患者に対する診断結果はデジタル化して病院の患者サンプルデータベースに保存できる。
【００７６】
また、各生体分子（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞）標識個体のバーコードバンド幅は最近脚光を浴びている無線ＩＴ技術である符号分割多元接続（Ｃｏｄｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｃｃｅｓｓ；以下‘ＣＤＭＡ’という）またはユビキタス技術に組み合わせることで、無線医療診断通信機器と統合することができる。
【００７７】
このような本発明の電気化学的分析法は安定的な結果を示す。電気化学的分析法の安全性を５回にかけた反復テストによって評価した。下記表１に示すように、１００ｎｇ／ｍｌ（水準４）の濃度で相異なる四つの抗原を含む試料が非常に高い再現性を表した。
【００７８】
【表１】
2008547016.tif 000003
【００７９】
表１は、亜鉛ナノ粒子、カドミウムナノ粒子、鉛ナノ粒子、及び銅ナノ粒子にそれぞれ結合した抗原（Ａｇ１、Ａｇ２、Ａｇ３、Ａｇ４）がそれぞれ９．３％、７．１％、１１．２％、及び１０．３％の相対標準偏差（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ；以下‘Ｒ．Ｓ．Ｄ’という）を表すことを示す。
【００８０】
以下、図５を参照して本発明の実施例によるナノ粒子標識を用いる診断方法について説明する。
図５は本発明の実施例に他のナノ粒子標識を用いる診断方法の流れ図を示す。
【００８１】
まず、診断しようとする目的によって、検出しようとする生体物質を選定する（Ｓ２１００）。例えば、特定疾病を診断しようとする場合、該当の特定疾病によって発生する特異タンパク質を選定する。
【００８２】
ついで、検出しようとする生体物質と特異的に結合可能な生体結合物質を選定する（Ｓ２２００）。例えば、特定抗原を検出しようとする場合、該当の特定抗原と特異的に結合する抗体を生体結合物質として選定する。
【００８３】
その後、生体結合物質に、本発明の実施例によって収得されたナノ粒子を結合させて、ナノ粒子−生体物質複合体を形成する（Ｓ２３００）。このようなナノ粒子−生体物質複合体の形成方法は先に詳細に説明したので、ここでは省略する。
【００８４】
形成されたナノ粒子−生体物質複合体を、生体物質を検出しようとする試料内に混合することにより、検出しようとする生体物質とナノ粒子−生体物質複合体の結合反応を引き起こす（Ｓ２４００）。
【００８５】
結合反応の後、検出しようとする生体物質と特異的に結合したナノ粒子−生体物質複合体を分離して同定する（Ｓ２５００）。
分離されたナノ粒子−生体物質複合体を硝酸水溶液などの溶液に溶解させてナノ粒子を分離し（Ｓ２６００）、電気化学的分析方法によって、ナノ粒子に対して固有の電流ピークを測定する（Ｓ２７００）。このような電気化学的分析方法は先に詳細に説明したので、ここでは省略する。
【００８６】
その後、測定されたナノ粒子に対応する電流ピークを分析して、該当ナノ粒子の正体を推定し（Ｓ２８００）、推定されたナノ粒子から、ナノ粒子と結合した生体物質を推定する（Ｓ２９００）。推定された生体物質の有無及び生体物質の濃度などを利用して特定疾病などの発現有無を診断する。
【００８７】
以下、図６〜図１２を参照して本発明の実施例によるナノ粒子標識を用いる診断装置について説明する。
図６（ａ）はラック型ドッキングコンテナ５００に連結される使い捨てドロペット（ｄｒｏｐｅｔｔｅ）型診断装置４００を示す。図６（ｂ）は使い捨てチップ３００と本体部２００でなるマイクロピペット型診断装置の主要構成要素を説明する概略図である。まず、図６（ａ）の使い捨てドロペット型の診断装置について説明する。前記診断装置４００は、生体試料を吸入する吸入装置１０、サンプル注入口２０、ポテンショスタットを内蔵するラック型ドッキングコンテナ５００への連結部４０、及び３極電極３００を含んでなる。前記使い捨てドロペット４００は、生体試料の不純物を除去する細工性膜１５を含むことができる。次に、図６（ｂ）のマイクロピペット型診断装置を説明する。マイクロピペット型診断装置は、サンプル注入口２０及び３電極３０を含む使い捨てチップ３００と、スプリング及びギアなどの各種部品を内蔵することができるピペットモジュール１１、使い捨てチップ３００への連結部４０、モバイル回路９０及びディスプレイモジュール１００を含み、ポテンショスタットを内蔵する本体部２００とを含んでなる。前記使い捨てチップ３００は、生体試料の不純物を除去する細工性膜１５を有することができる。
【００８８】
図７は使い捨てドロペットの実質的な構成モデルを示す。吸入装置は弾性材からなっているので、手の圧力で押したとき、使い捨てドロペットの内部物質を押し出し、手の圧力を減らしたとき、弾性力で原状に回復する間に使い捨てドロペットの内部に物質を吸入する。細孔性膜１５は生体試料内の不純物を除去する役目をする。３極電極はスクリーンプリントされた電極であって、作業電極Ｗ、カウンター電極Ｃ、及び基準電極Ｒで構成され、連結部４０を介して、ポテンショスタットを内蔵するラック型ドッキングコンテナ５００と連結される。反応槽６０は２部分で構成されており、Ａ部分は抗体及び電磁ビーズを含む試薬を含んでおり、試料及び試薬を混合させる部分である。Ｂ部分は緩衝溶液を含んでいる分析用容器部である。
【００８９】
図８は使い捨てドロペット２００のラック型のドッキングコンテナを示す。図８（ａ）は反応槽６０を含むラック型ドッキングコンテナの斜視図を示す。図８（ｂ）はラック型ドッキングコンテナの断面図を示す。ラック型ドッキングコンテナは、磁力を利用して、特定抗原が認知された電磁ビーズ複合体のみを選別的に分離することができる磁石部８０を有する。
【００９０】
図９は本発明のバイオセンサーを使用する患者小便試料（尿タンパク質）の免疫学的検定過程を示すものである。
図１０は使い捨て容器と電極が付着されたストッパーでなる最も単純な自己バイオ分析用システムの概略図である。前記診断装置の生体試料保存容器のストッパー部１１０は３電極３０、及び外装型ポテンショスタットに連結する連結部４０を有する。
【００９１】
図１１は本発明のピペット型センサーによって同時分析された３種の抗原物質の濃度増加による陰電極免疫ストリッピング電流信号を示すグラフである。
図１２は本発明の診断装置を応用した多様なバイオセンサーモデルを示す概略図である。図１２（Ａ）はマイクロピペットと磁気選別機が合体されたモデルであって、磁気選別機が外装型に別に考案される必要がない。図１２（Ｂ）は血中生体分子測定用であって、必要時に使用可能なモードである。試料の収集は既存の注射器の原理と同様であり、血液を採取すると同時にすべてのバイオ分析及び診断が完了する。図１２（Ｃ）は使い捨て注射器内に電極部を形成したモデルであり、図１２（Ｄ）は図１２（Ｃ）のモデルに磁気選別機レバーを装着したモデルである。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
以下、本発明の実施例による診断方法の一具現例として、多数の抗体及びそれぞれの抗体に対応するナノ粒子標識を使用して実施したマイクロアレイ免疫学的検定法を具体的に説明する。
【００９３】
まず、ＢＤバイオコートストレプトアビジン（ＢｉｏＣｏａｔ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）分析プレートが平衡に到逹するまで、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０５（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．２）バッファー１００ｕｌを各ウェル（ｗｅｌｌ）に約１５分間分注した。その後、各ウェルを１００ｕｌのＴＴＬバッファー（１００ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ａｎｄ １Ｍ ＬｉＣｌ）で洗浄した。先に収得されたナノ粒子標識抗体をそれぞれ１０００ｍｇ／ｌ濃度で４ｕｌずつ準備して８４ｕｌのＴＴＬバッファーと混合させ、３０分間常温でシェーキング（１００ｒｐｍ）し、インキュベーションさせた。その後、上澄液を吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）で除去し、各ウェルを１００ｕｌのＴＴＬバッファー（２５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄した。
【００９４】
ついで、互いに異なる濃度の４種の抗原を５ｕｌずつ取り、８０ｕｌのＴＴＬバッファー（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）に添加し、キャプチャー抗体が固定されたマイクロウェルに分注した後、３０分間インキュベーションさせ、各抗原を対応キャプチャー抗体と反応させた後、各ウェルをさらに１００ｕｌのＴＴＬバッファーで洗浄した。
【００９５】
その後、先に前処理されたナノ粒子標識された抗体を１００ｕｌのＴＴＬバッファーに溶解させ、ナノ粒子標識溶液を抗原の捕獲されたウェルに添加し、３０分間インキュベーションを行って抗原抗体反応させた後、１００ｕｌのＴＴＬバッファーで洗浄した。
【００９６】
下記の表２は、使用された各抗原（β２−ＭＧ、Ｍｂ、ＨＳＡ、ＣＲＰ）にそれぞれ対応するキャプチャー抗体（ａｎｔｉ−β２−ＭＧ、ａｎｔｉ−Ｍｂ、ａｎｔｉ−ＨＳＡ、ａｎｔｉ−ＣＲＰ）及びナノ粒子標識抗体（ＺｎＳ−ａｎｔｉ−β２−ＭＧ、ＣｄＳ−ａｎｔｉ−Ｍｂ、ＰｂＳ−ａｎｔｉ−ＨＳＡ、ＣｕＳ−ａｎｔｉ−ＣＲＰ）を示す。ここで、キャプチャー抗体（ａｎｔｉ−β２−ＭＧ、ａｎｔｉ−Ｍｂ、ａｎｔｉ−ＨＳＡ、ａｎｔｉ−ＣＲＰ）はビオチニル化されている。
【００９７】
【表２】
2008547016.tif 000004
【００９８】
その後、２０ｕｌの１Ｍ硝酸水溶液を利用して３分間撹拌させ、ウェルに結合したナノ粒子抗体を溶解させた後、溶出されたナノ粒子標識に、１０ｐｐｍの本実施例で使用される４種の金属をいずれも測定することができる水銀原子吸光基準溶液を含む１ｍｌのアセテートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）を添加し、前述した電気化学法を利用して、各金属ナノ粒子から、各ナノ粒子に固有の電流ピークをそれぞれ測定した。
【００９９】
前記の表１から分かるように、ＺｎＳ−ａｎｔｉ−β２−ＭＧの検出限界は１０．６ｎｇ／ｍｌ、ＣｄＳ−ａｎｔｉ−Ｍｂの検出限界は９．５ｎｇ／ｍｌ、ＰｂＳ−ａｎｔｉ−ＨＳＡの検出限界は９．８ｎｇ／ｍｌ、そしてＣｕＳ−ａｎｔｉ−ＣＲＰの検出限界は１２．１ｎｇ／ｍｌであることから、本発明の実施例による電気化学分析法の検出限界が非常に低いことが分かる。
【０１００】
したがって、典型的なタンパク尿（Ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ）患者の小便から検出されるタンパク質濃度範囲である４０〜１２０ｍｇ／ｌが、診断において危険レベルを警告する範囲であるとすると、本発明のナノ粒子標識を使用する場合、その測定限界は前記濃度範囲よりずっと低いので、非常に微細な濃度の疾病因子までも検出可能であることが分かる。
【０１０１】
このようなセンサー性能は、ＤＮＡを分析物質とした場合にもほぼ類似して現れる。すなわち、膀胱癌、乳房癌などを引き起こす癌遺伝子を検出することが可能なプローブに本発明の実施例によるナノ粒子標識を結合させた後に使用すると、高水準で診断することができる。
【０１０２】
一方、より高い敏感度のために、大きさ及び形態が一層大きく調節されたバイメタル（ｂｉｍｅｔａｌｌｉｃ）ナノ粒子（例えば、ＣｄＳ／ＺｎＳ ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ構造）を使用することができる。バイメタルナノ粒子は２種のナノ粒子が互いに結合してなされる。具体的に、一つのナノ粒子の表面（ｃｏｒｅ）に他種のナノ粒子を追加的に塗布することにより、拡張した大きさの合金粒子構造を形成する。バイメタルナノ粒子としてはＣｄＳ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／Ｐｂｓ、またはＣｕＳ／ＺｎＳを含み、いずれもｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ構造を形成する。
【０１０３】
前述したように、本発明はナノ粒子標識を信号発生標識として用いて、検出しようとする生体物質を定量分析する方法を提供する。このように、特定の試料内で抗体またはＤＮＡのような特定生体物質を定量的に検出することにより、検出対象に特定疾病の存在有無を診断することが可能である。
【０１０４】
したがって、本発明のナノ粒子標識、ナノ粒子測定手段及び測定結果デジタル変換手段を含む特定の疾病に対する診断キットを構成することができる。この際、先に紹介したように、バーコードなどのようなデジタル手段を用いる場合、このような疾病診断がより容易に実施することができる。
【０１０５】
本発明の診断キットのナノ粒子標識は、特定の生体物質を検出するためのさらに他の生体物質に結合されたナノ粒子を意味する。具体的に、特定のＤＮＡ断片を検出するため、その特定のＤＮＡ断片と相補的なＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片と結合したナノ粒子を意味する。さらに他の例として、特定の抗原を検出するために、その特定の抗原と特異的に結合する特定抗体に結合したナノ粒子を意味する。
【０１０６】
このような本発明の診断キットのナノ粒子標識は、測定しようとする生体物質の種類によって交替して使用可能である。よって、一診断キットにおいて、ナノ粒子標識の交替だけで、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子（塩基配列分析による突然変異予測）、ペプチド、癌マーカー（ｃａｎｃｅｒ ｍａｒｋｅｒ）、薬物（麻薬）、微生物（Ｏ１５７菌、食中毒菌、梅毒菌）などの多様な医学／生物学的診断が可能である。
【０１０７】
本発明の診断キットのナノ粒子測定手段は、前述した電気化学的分析方法を具現することができる手段であれば特に制限されない。
そして、本発明の診断キットの測定結果のデジタル変換手段は、前述したように、バーコードを出力する手段であり得るが、これに限定されるものではなく、ＧＳＭ（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｂｉｌｅ）、ブルートゥース、ユビキタス、ＣＤＭＡ（Ｃｏｄｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｃｃｅｓｓ）などの尖端無線モバイルＩＴ技術に統合できる。
【０１０８】
このように、特定試料に対する診断結果がバーコードとして出力される場合、診断キットの利用者は、出力されたバーコードを病院などに設置されたバーコードリーダーで読み取って診断結果を迅速に分かることができる。このように、診断結果がデジタルとして出力される場合、診断結果は有線通信または無線通信を介して遠隔地に送信できる。よって、診断結果を評価し得るシステムを有する遠隔地は、診断キットから出力された診断結果を受信して特定試料に対する診断結果を評価し、その評価結果をさらに診断キット使用者に送信するように具現可能である。この場合、本発明の診断キットは、医学的、臨床的応用だけでなく、多様なプローブの交替によって、水質、食品などの環境モニタリング及び細菌戦、テロ（ＴＮＴ）、犯罪（麻薬）などの分野で、監視システムに適用できる。
【０１０９】
以上説明したように、本発明の実施例によるナノ粒子標識は、合成が簡便で、各金属ナノ粒子ごとに固有の酸化還元電位を持っているので、多数のナノ粒子標識の同時検出が可能である。よって、本発明の実施例によるナノ粒子標識を用いる場合、多数の生体物質検出及び診断キットの小型化が可能になる。
【０１１０】
本発明のバイオセンサーは次のように製作した。
図６（ａ）に示すように、既存に広く使用される使い捨てドロペット内に適切な位置を選択してスクリーンプリンティングされた３電極を挿入し、その連結部に外装型ポテンショスタットを連結して、試料コンテナ内の尿タンパク質を定量分析するように、バイオセンサーを製作した。前記バイオセンサーは、磁力を利用して、特定抗原が認知された電磁ビーズ複合体のみを選別的に分離することができるので、ピペットで流体を注入し吸入する過程自体のみでも免疫学的検定過程を完了することができた。この際、前記ドロペットは透明な低密度ポリエチレン（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）で構成され、バルブ及びピペットが結合した堅固な単一体構造を有する。この親和力の小さい表面材質は、タンパク質、異物などとの結合によるノイズを防止し、ほぼ均一な一定の吸入及び放出（ｆｉｘｅｄ ｓｕｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｏｐｐｉｎｇ ｓｉｚｅ；２５ｍＬ）を可能にする。
【０１１１】
また、本発明は、図６（ｂ）に示すように、既存に広く使用されるマイクロピペットの内部にポテンショスタットモジュールを内蔵させ、使い捨てチップ内に電極を挿入することで、バイオセンサーを製作した。前記バイオセンサーは、患者の試料をより容易に定量分析し、監視することができるようにした。この際、モバイルモジュールはピペットの内部に内蔵させた。
【０１１２】
また、本発明は、既存の使い捨てガラスチューブ容器のストッパーに使い捨て３電極を挿入し、試薬及び試料が入れられたガラス容器をストッパーで覆って、下部に位置するマグネチックフラットフォームに付着させた。この単純な過程で診断が完了した。
【０１１３】
また、本発明は、図１１に示すように、次のように金属ナノ粒子の電圧署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を調査した。本発明は、バイオ分析法の高選択性を考慮した半導体ナノ粒子トレーサーの非オーバーラッピングプール（ｎｏｎｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｏｏｌ）を得るために、ＺｎＳ、ＰｂＳ及びＣｄＳナノ粒子を選択して導入した。各抗原の濃度と一致する各金属イオンによるピークはそれぞれ−１．１２Ｖ（Ｚｎ）、−０．６８Ｖ（Ｃｄ）、−０．５３Ｖ（Ｐｂ）の電圧範囲で観察された（図１１参照）。
【０１１４】
また、本発明のバイオセンサーを利用する電気化学的多重免疫学的検定法は次のように実施した。まず、方形波陰電極ストリッピング電圧（Ｓｑｕａｒｅ ｗａｖｅ ａｎｏｄｉｃ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ：ＳＷＡＳＶ）法によって、１．５ｍｌガラス電池（ｇｌａｓｓｃｅｌｌ）に、２×４ｍｍスクリーンプリンティングカーボン作業電極（ｓｃｒｅｅｎ−ｐｒｉｎｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ（Ａｃｈｅｓｏｎ−ｉｎｋ）ｗｏｒｋｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、テキサス州、オースティン）、及び白金電極をカウンター電極として使用した。方形波陰電極ストリッピング電圧法（ＳＷＡＳＶ）は、ビズマスイオンがコートされたスクリーンプリンティングカーボンペースト電極を使用して実施した。
【０１１５】
図１に示すように、容器Ａ部位で、ＱＤ−抗原ナノ複合体を１分間前処理し（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（０．６Ｖ）、−１、４Ｖで１分間蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）する過程を実施した。この際、バッファーとしては、図１の容器Ｂ内の１ｍｌの０．１Ｍアセテートバッファー（ｐＨ４．５）を使用し、ストリッピングは撹拌なしに５秒の休止期後に実行した。また、この過程において、具体的な器機運用変数は、−１．２Ｖ〜０．１２Ｖの電位範囲で、ステップ電位（ｓｔｅｐ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）５０ｍＶ、振幅２０ｍＶ、及び周波数２５Ｈｚに調節した。
【０１１６】
バイオセンサー性能において、否定的信号である抗体−抗原間の交差反応（ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を検査するために、非特異抗原であるヘモグロビン（Ｈｂ）とウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎｓ：ＢＳＡ）を試料に添加して信号を測定した。これにより、ほぼ無視し得る程度の信号が感知された。このような信号は、抗原がない試料でのノイズ信号とほぼ類似の程度であった。したがって、本発明のバイオセンサーは、非特異信号を効果的に除去する敏感度及び選択性が高いので、実際の診断において高効率を示すことを確認することができた。この際、試料が探知された電位区間は、−１．１１Ｖ（ｂ２−ＭＧ）、−０．６７Ｖ（Ｍｂ）、−０．４５Ｖ（ＨＳＡ）に測定され、安定的な信号を示した（図１１参照）。
【０１１７】
ナノ結晶粒子は、ＴＥＭ電子燎微鏡によって、そのサイズ及び形態を観察した結果、ＣｄＳ、ＺｎＳ及びＰｂＳナノ結晶粒子はそれぞれ３．９、４．５、１５．７ｎｍのサイズを現した。最終電圧ピークの大きさ及び位置は各抗原の濃度と一致するので、これによりマルチ−ターゲット定量分析が容易になることが分かった。言い換えれば、腎臓及び心血管疾患において、濃度の増加は、図１１に示すように、抗原の増加であると予測可能であった（２５〜１２５ｎｇ／ｍｌ）。図１１は本発明のピペット型センサーによって同時分析された３種の抗原物質の２５ｎｇ／ｍＬ濃度別増加による陰電極免疫ストリッピング電流信号を示すグラフである。ピークの電圧区間の平らなベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）（ＣｄとＺｎピーク間の区間、またはＰｂピーク以後の区間）は抗原６個〜８個まで追加の同時分析のための拡張が可能であることを示唆する（図１１参照）。すなわち、実際に拡張可能な金属粒子として、Ｇａ、Ｃｕ、Ａｓ、ＴｌまたはＢｉなどを使用することができる。
【０１１８】
また、５回にかけた反復テストによってセンサーの安全性を評価した。その結果、センサーは、１００ｎｇ／ｍｌ（水準４）の濃度で、互いに異なる三つの抗原を含む試料で非常に高い再現性を現した。Ｚｎ、Ｃｄ、及びＰｂは、下記の表３に示すように、それぞれ９．３％、７．１％、及び１１．２％の標準偏差ピークを現した。
【０１１９】
【表３】
2008547016.tif 000005
【０１２０】
典型的な蛋白尿患者の小便から検出されるタンパク質濃度範囲である４０〜１２０ｍｇ／Ｌが診断において危険レベルを警告する範囲であると仮定すると、本発明のバイオセンサーは、初期２５ｎｇ／ｍｌ抗原試料に対する信号対雑音（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ）応答は１０．５ｎｇ／ｍｌの測定限界（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔ）を示した。この結果は、患者の危険レベルの範囲よりずっと低い区間でもごく低い濃度の疾病因子までも検出可能であることを意味し、図１１に示すように、抗原濃度の増加に比例する信号からも分かる。また、このような低い探知限界は、従来の文献で発表された光学免疫センサーの結果に比べ、非常に向上した敏感度及び選択的解像度を示す。より高い敏感度の増幅のためには、大きさと形態がもう少し調節されたバイメタル（ｂｉｍｅｔａｌｌｉｃ）ナノ粒子（例えば、ＣｄＳ／ＺｎＳ ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ構造）が未来に好適な候補物質として交替可能であろう。
【０１２１】
本発明のバイオセンサーを使用して、バーコード、ＲＦＩＤ、ユビキタスシステムの信号処理を次のように実施した。獲得されたアナログ信号はデジタル信号処理によってデジタル化され、医療診断及び通信のために、バーコード、ＲＦＩＤ、ユビキタスシステム方法を適用した。マルチプレックス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）電気的タンパク質コーディングは、免疫学的検定のマルチ−レドックス（ｒｅｄｏｘ）コーディングを３種の相異なるＱＤ粒子に対して精密に調節された濃度で実施した。このような粒子の電気的維持可能性（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｔｅｎａｂｉｌｉｔｙ）が電気化学的マルチプレックス法の最適化に寄与した。
【０１２２】
バーコード出力（ｒｅａｄｏｕｔ）を迅速にするためのデジタル信号処理は、獲得された直線アナログコーディング信号をバーコード化させるデジタルプログラムによって実施した。割り当てられたフレキシブルバンド幅はセンサーの内外部の物理的リーダーモジュールによってデジタル処理され、データベースで実際の患者サンプルを確認した。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び細胞だけでなく、各タンパク質のバンド幅は、携帯電話技術において広く使用されるＣＤＭＡ技術を使用して全体的に区分できる。
【０１２３】
以上、本発明の好適な実施例について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、次の請求範囲で定義する本発明の基本概念を利用する当業者の多くの変形及び改良形態も本発明の権利範囲に属するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
以上説明したように、本発明は、使用者に便利な小型電気化学センサーを使用する生体物質の多重マルチプレックス分析を行うための医学用デジタル信号処理が統合された自家診断（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）装置を提供する。このようなシステムは、プローブのみを交替して、タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、細菌などの幅広いスペクトラムを有する物質の診断に使用されるバイオセンサーであるとともに、分析時間及び過程を画期的に短縮させた簡便な診断器具である。また、これは、そのほかの装置の欠点を大幅に緩和させ、革新的な敏感度を有する電気化学的バイオ同時測定システムの進歩した必須要素である携帯型（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ）、電池式（ｂａｔｔｅｒｙ−ｐｏｗｅｒｅｄ）、実時間（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）、使い易さ（ｅａｓｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）などの小型診断システムのすべての必要条件を満足させる。
【０１２５】
また、本発明のバイオセンサーの核心技術であるバーコード無線遠距離通信による医学信号伝達体系は、なによりも患者の実時間状態を分子水準で早期モニタリングして情報化するという側面で、広く波及効果を及ぼすことができ、患者の疾病に対する臨床情報を迅速に交流させることで、既存の病院診断の際に要求された多くの煩わしさを効果的に軽減させる。さらに、前記バイオセンサーは、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、ホルモン受容体などの多様な生物分子センサープローブの交替のみによって、タンパク質だけでなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ペプチド、微生物などの多様な医学／生物学的検出に共に適合し、公害物質、水質の検査などの環境分野への導入が期待され、食料品の品質評価及び毒性検査などの食品産業、生物化学戦、軍、警機関でのテロ及び犯罪の監視と早期警報システムにも広範囲な応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１ａは本発明の実施例によるナノ粒子標識を利用してＤＮＡを検出する方法を概略的に示す概念図である。  図１ｂは本発明の実施例によるナノ粒子標識を利用して抗原を検出する方法を概略的に示す概念図である。
【図２】図２は本発明の実施例によるナノ粒子の製造方法を概略的に示す概念図である。
【図３】図３ａは本発明の実施例によるナノ粒子−抗体複合体の製造方法の概念図である。
【０１２７】
図３ｂは本発明の実施例によるナノ粒子−ＤＮＡ複合体の製造方法の概念図である。
【図４】図４ａは本発明の実施例によるＺｎＳ−ａｎｔｉ−β２−ＭＧ、ＣｄＳ−ａｎｔｉ−Ｍｂ、ＰｂＳ−ａｎｔｉ−ＨＳＡ及びＣｕＳ−ａｎｔｉ−ＣＲＰを硝酸に溶解させて電流ピークを収得し、当該電流ピーク信号をデジタル信号に変換して得られるバーコードを示すグラフである。
【０１２８】
図４ｂは検出対象試料内に抗原がない場合、電流ピーク信号を示すグラフである。
図４ｃ〜図４ｆは検出対象試料のそれぞれに一つの抗原ターゲットがある場合の電流ピーク信号及び当該電流ピーク信号をデジタル信号に変換して具現されるバーコードを示すグラフである。
【０１２９】
図４ｇは検出対象試料に４種の抗原ターゲットがある場合、電流ピーク信号及び当該電流ピーク信号をデジタル信号に変換して具現されるバーコードを示すグラフである。
【図５】図５は本発明の実施例によるナノ粒子標識を用いる診断方法を示す流れ図である。
【図６】図６は使い捨てドロペット（ｄｒｏｐｅｔｔｅ）型診断装置（ａ）及び使い捨てチップを用いるマイクロピペット型診断装置（ｂ）の主要構成要素を説明する概略図である。
【図７】図７は使い捨てドロペットの実質的構成を示すモデルである。
【図８】図８はピペットチップ及び試薬容器が結合したドッキング型診断装置の電気分析装置を説明する概略図である。図８（ａ）は使い捨てドロペット型に連結されるラック型ドッキングコンテナの斜視図を示し、図８（ｂ）はその断面図を示す。
【図９】図９は本発明の診断装置を使用する患者小便試料（尿タンパク質）の免疫学的検定過程を示す。
【図１０】図１０は使い捨て容器と電極が付着されたストッパーでなる最も単純な自己バイオ分析用システムの概略図である。
【図１１】図１１は本発明のピペット型センサーによって同時分析された３種の抗原物質の濃度増加による陰電極免疫ストリッピング電流信号を示すグラフである。
【図１２】図１２は本発明の診断装置を応用した多様なバイオセンサーモデルを示す概略図である。
【符号の説明】
【０１３０】
１０：吸入装置；
１１：スプリング及びギアなどの各種部品を内蔵する一般ピペットモジュール；
１５：細工性膜；
２０：サンプル注入口；
３０：３極電極；  
４０：ドッキングコンテナへの接続部；
５０：ディスプレイ；
６０：反応槽；
７０：ラックホルダー；
８０：希土類金属磁石；
９０：モバイル回路；
１００：小型ストリップセンサー／ディスプレイモジュール；
１１０：電極が付着されたストッパー；
１２０：一般試験用ガラス容器；
１３０：シリンダー型ＰＶＣプラットフォーム；
２００：本体部；
３００：使い捨てチップ；
４００：ドロペット；
５００：ラック型ドッキングコンテナ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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