(57)【要約】【課題】安価でコスト的に有利で、また倫理的な問題がなく、長期間の飼育が不要である、血糖値を降下させる物質に関する検討が好適にできる、ヒトインスリン受容体を発現するモデル動物・実験動物を提供すること。また、コスト的に有利で倫理的な問題が少ない、血糖降下物質の評価方法及びスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコを作製し、該トランスジェニックカイコを用いた評価方法、スクリーニング用法及び薬剤製造方法により課題を解決した。【選択図】図１
2015136300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコ。
【請求項２】
以下の（１）及び（２）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることにより作製されたものである請求項１に記載のトランスジェニックカイコ。
（１）細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に、転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコ
（２）ＧＡＬ４の標的プロモーターであるＵＡＳの下流に、ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコ
【請求項３】
ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法であって、
（Ａ）請求項１又は請求項２に記載のトランスジェニックカイコに上記アゴニスト又はアンタゴニストを投与する工程、及び、
（Ｂ）上記アゴニスト又はアンタゴニストが投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
被検物質がヒトの血糖値を降下させる物質であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項１又は請求項２に記載のトランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項５】
ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１又は請求項２に記載のトランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
ヒトの血糖値を降下させる薬剤を製造する方法であって、
（ａ）請求項１又は請求項２に記載のトランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で選択された物質と製薬上許容される担体を混合する工程、
を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン受容体を発現するトランスジェニックカイコ、該トランスジェニックカイコを用いた評価方法、スクリーニング方法、及び、薬剤製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの疾患の発症及び重篤化の機構を理解することは、その疾患の予防、治療法を確立する上で重要である。しかしながら、ヒトの患者を用いて疾患に関する基礎研究や治療薬の開発を行うことは、倫理的な問題があり、一般的には困難であるとされている。
この問題を解決するために、様々なモデル動物を利用した前臨床試験が行われる。その際、ヒトとこれらのモデル動物間の解離が問題となるが、近年この点を解決するための手法として、ヒト化マウス（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ）の作出方法が開発され、それを利用した疾患の理解や治療法の確立に関する研究が盛んに行われるようになった（非特許文献１）
【０００３】
ヒト化マウスを用いる研究手法には、（ａ）ヒトの遺伝子の導入、（ｂ）ヒト細胞の導入、及び、（ｃ）ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞から作成された組織の導入等がある。近年、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞から様々な組織が作成され、それを移植したマウスを疾患の重篤化機構の解明やワクチン開発のためのモデル動物として利用する研究が活発に行われている（非特許文献２〜４）。
【０００４】
しかし、哺乳動物であるマウスを多数犠牲にする化合物のスクリーニングに対しては、コストや動物愛護の視点からの問題があり、ヒト化マウスを薬のシード化合物の探索研究に利用する際の障壁となっている。
【０００５】
発明者らは、動物倫理的な問題が軽減される無脊椎動物モデルとして、カイコガの幼虫（以下、「カイコ」と略記する）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング系の構築と創薬への応用を提案している。
カイコは、マウス等の哺乳動物と比べて飼育の費用がはるかに安く、また小さいスペースで飼育可能である。更に、カイコは動きが緩慢であり、かつ手で扱うのに十分な大きさを備えているため、通常の注射器を用いた定量的な薬液の投与が容易である。
本発明者らは、カイコにおいても哺乳動物と共通した薬物の代謝反応があること、及び、種々の化合物の毒性の指標であるＬＤ５０がカイコと哺乳動物でよく一致することを見出し、報告している（非特許文献５）。
更に、カイコ感染モデルや高血糖カイコモデル等の疾患モデルを確立し、抗生物質の治療効果の指標であるＥＤ５０がカイコと哺乳動物でよく一致することを報告している（非特許文献６、７）。従って、カイコにおいて多くの薬物は、哺乳動物と略一致した体内動態を示すと考えられる。
【０００６】
また、カイコにおいては、外来遺伝子を導入し発現させるというトランスジェニック技術が確立されている（非特許文献８）。
上記技術を利用して、カイコの一部の生理機能をヒト化し、医薬品の評価に供することができると考えられるが、その具体的な例はこれまでに報告されていない。
【０００７】
一方、ペプチドホルモンであるインスリンは、肝臓や脂肪組織等に作用し、血糖降下作用を有する。糖尿病は、インスリンの不足によって血糖値が異常に高くなり、尿中に糖が排出される慢性の病気であり、生活習慣病の１つである。
【０００８】
発明者らは、カイコの餌にグルコースを添加するとカイコが高血糖になること、及び、その高血糖となったカイコに高濃度のヒトインスリンを投与すると、カイコの血糖値が低下することを見出している（特許文献１）。また、特許文献１ではヒトインスリンの処理によりカイコの脂肪体のＡｋｔのリン酸化が亢進すること、及び、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ワートマニン）の処理により、このヒトインスリンによるＡｋｔのリン酸化が阻害されることも開示している。
【０００９】
しかしながら、その系では、ヒトの治療に用いられる濃度の１００倍以上のヒトインスリンを投与する必要があり、更なる改良が求められていた。また、更に精度が高く優れた、血糖値を降下させる物質に関する評価方法や、該物質のスクリーニング方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−０５８５００号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Shultz  LD，Ishikawa  F，Greiner  DL．Nat  Rev  Immunol．2007  Feb;7(2):118-30.
【非特許文献２】Watanabe  S，Terashima  K，Ohta  S，Horibata  S，Yajima  M，Shiozawa  Y，Dewan  MZ，Yu  Z，Ito  M，Morio  T，Shimizu  N，Honda  M，Yamamoto  N．Blood．2007  Jan  1;109(1):212-8.
【非特許文献３】Kneteman  NM，Weiner  AJ，O'Connell  J，Collett  M，Gao  T，Aukerman  L，Kovelsky  R，Ni  ZJ，Zhu  Q，Hashash  A，Kline  J，Hsi  B，Schiller  D，Douglas  D，Tyrrell  DL，Mercer  DF．Hepatology．2006  Jun;43(6):1346-53.
【非特許文献４】Guirado  E，Amat  I，Gil  O，Diaz  J，Arcos  V，Caceres  N，Ausina  V，Cardona  PJ．Microbes  Infect．2006  Apr;8(5):1252-9.
【非特許文献５】Hamamoto  H，Tonoike  A，Narushima  K，Horie  R，Sekimizu  K．Comp  Biochem  Physiol  C  Toxicol  Pharmacol．2009  Apr;149(3):334-9.
【非特許文献６】Kaito  C，Akimitsu  N，Watanabe  H，Sekimizu  K．Microb  Pathog．2002  Apr;32(4):183-90.
【非特許文献７】Hamamoto  H，Kurokawa  K，Kaito  C，Kamura  K，Manitra  Razanajatovo  I，Kusuhara  H，Santa  T，Sekimizu  K．Antimicrob  Agents  Chemother．2004  Mar;48(3):774-9.
【非特許文献８】Tomita  M，Munetsuna  H，Sato  T，Adachi  T，Hino  R，Hayashi  M，Shimizu  K，Nakamura  N，Tamura  T，Yoshizato  K．Nat  Biotechnol．2003  Jan;21(1):52-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、コスト的に有利であり、倫理的な問題が少なく、ヒトの血糖値を降下させる薬剤に関する検討・評価が正確・適切にできるモデル動物・実験動物を提供することにある。
また、かかるモデル動物・実験動物を用いた、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法、及び、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システムを用いてヒトインスリン受容体を発現するトランスジェニックカイコを作製し、該トランスジェニックカイコにヒトインスリンを投与すると血糖値が低下すると共に脂肪体のＡｋｔのリン酸化が亢進されることを見出して本発明をするに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコを提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法であって、
（Ａ）上記トランスジェニックカイコに上記アゴニスト又はアンタゴニストを投与する工程、
（Ｂ）上記アゴニスト又はアンタゴニストが投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、被検物質がヒトの血糖値を降下させる物質であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、ヒトの血糖値を降下させる薬剤を製造する方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で選択された物質と製薬上許容される担体を混合する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、前記問題点や前記課題を解決し、コスト的に有利であり、倫理的な問題が少なく、飼育も容易であり、「ヒトの血糖値を降下させる薬剤に関する検討・評価」や「種々の薬理実験」等が、容易に、安価に、効率的に、正確・適切にできるモデル動物・実験動物を提供することができる。
【００２０】
また、本発明の上記モデル動物・実験動物を用いれば、容易に、安価に、効率的に、正確・適切に、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法、該物質を製造する方法等を提供することができる。
カイコの餌にグルコースを添加して高血糖状態にしたカイコ（特許文献１参照）では、インスリン受容体のヒトインスリンに対する親和性が低い可能性があるが、その点も解決され、被検物質を大量に投与しなくても、容易に、安価に、効率的に、正確・適切に、該被検物質を検討・評価でき、上記した評価方法、スクリーニング方法等が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（Ａ）ヒトインスリン受容体発現用のコンストラクトを模式的に示した図である。  （Ｂ）カイコ眼でのＵＡＳ−Ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｇ）におけるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現と、Ａｃｔｉｎ  Ａ３−ＧＡＬ４（Ｒ）におけるＤｓＲｅｄの発現を確認した結果を示す写真である。  （Ｃ）トランスジェニックカイコ（Ｇ／Ｒ）におけるヒトインスリン受容体の発現確認を、ウエスタンブロット法を用いて行った結果を表す図である。「ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」は、「抗ヒトインスリン受容体抗体」であり、「ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ」は、「抗アクチン抗体」である。
【図２】（Ａ）ヒトインスリン受容体を発現していないカイコ（−／Ｒ）とヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はヒトインスリン（Ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ、５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与し、６時間後の血糖値をフェノール硫酸法で測定した結果を示すグラフである。縦軸：血糖値（Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ  ｓｕｇａｒ、ｍｇ／ｍＬ）（Ｂ）ヒトインスリン受容体を発現していないカイコ（−／Ｒ）とヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又は各種濃度のヒトインスリン（０．３１２５〜８０μｇ／ｌａｒｖａ）を投与し、６時間後の血糖値をフェノール硫酸法で測定した結果を示すグラフである。縦軸：生理食塩水投与群の血糖値を１としたときの変動率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ  ｓｕｇａｒ）
【図３】ヒトインスリン受容体を発現していないカイコ（−／Ｒ）とヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与後、摘出した脂肪体のタンパク質を、ウエスタンブロット法を用いて解析した結果を示す図であり、及び、各脂肪体中のリン酸化したＡｋｔ量を比較した結果を示すグラフである。「−」：生理食塩水投与、「＋」：ヒトインスリン投与、「ａｎｔｉ−ｐ−Ａｋｔ」：抗リン酸化Ａｋｔ抗体、「ａｎｔｉ−Ａｋｔ」：抗Ａｋｔ抗体、グラフの横軸は、脂肪体中のＡｋｔ量に対するリン酸化したＡｋｔ量の割合（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｋｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ（ｐ−Ａｋｔ／ｔｏｔａｌ  Ａｋｔ）である。
【図４】ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体を摘出後、組織培養系に投入し、培養後の脂肪体タンパク質を、ウエスタンブロット法を用いて解析した結果を示す図、及び、各脂肪体中のリン酸化したＡｋｔ量を比較した結果を示すグラフである。「−」：投与せず、「＋」：投与
【図５】（Ａ）ヒトインスリン（Ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ）とウシインスリン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ）の構造（アミノ酸配列）の比較をした図である。  （Ｂ）ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、ウシインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）、又はヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与し、６時間後の血糖値をフェノール硫酸法で測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００２３】
［トランスジェニックカイコ］
本発明のトランスジェニックカイコは、ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコである（以下、単に「トランスジェニックカイコ」と略記する場合がある）。
【００２４】
ヒトインスリン受容体は細胞外に存在し、インスリンと結合するαサブユニットと、膜貫通タンパク質で細胞内部分にチロシンキナーゼ活性をもつβサブユニットがＳ−Ｓ結合で結ばれている。αサブユニットにインスリンが結合すると、βサブユニットの細胞内部分に存在するチロシンが自己リン酸化され、活性が生じる。この活性化したチロシンキナーゼがインスリンの情報を細胞内へ伝達する。
【００２５】
ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子（以下、単に「ヒトインスリン受容体遺伝子」と略記する場合がある）はすでに公知である。例えば、ヒトインスリン受容体遺伝子は、Ｅｂｉｎａらの文献（Ebina  Y．et  al．，1985，Cell  40(4)，pp.747-758）及びＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１００５１等で公表されており、自体公知の方法により単離することができる。
本発明において、ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子は、全長の一部分が欠損しているヒトインスリン受容体遺伝子を含み、ヒトインスリン受容体の機能を有していれば特に限定されない。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１００５１で示される塩基配列等からなり、また、個体差に応じて、多型の範囲で１〜複数個の塩基が異なっているものも含まれる。
【００２６】
カイコ形質転換用ベクターに組み込むべきヒトインスリン受容体遺伝子は、その形態に特に制限はなく、例えば、公知の配列情報に基づいて適宜プライマーを設計し、ヒトのｃＤＮＡライブラリーから常法のＰＣＲにより容易に増幅して得ることができる。
【００２７】
ヒトインスリン受容体をカイコに導入する手順としては、ヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだベクターをカイコに導入する方法等、公知の方法を用いることができる。ヒトインスリン受容体遺伝子を効率良く発現させるために、ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システム、すなわち、転写制御因子ＧＡＬ４とその標的プロモーターであるＵＡＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とからなる遺伝子の発現制御下にあるのが好ましい。
より詳細には、ヒトインスリン受容体遺伝子は、標的プロモーターＵＡＳの下流に組み込むのが好ましい。例えば、この融合遺伝子を、ＧＡＬ４を発現するカイコと交配することにより、ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システム等によりヒトインスリン受容体が発現するトランスジェニックカイコが作製できる。
このトランスジェニックカイコには、ＧＡＬ４をコードする遺伝子と、ＵＡＳの下流にヒトインスリン受容体遺伝子とが導入されている。
【００２８】
更には、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に、転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコと、ＧＡＬ４の標的プロモーターであるＵＡＳの下流に、ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコを交配させることにより作製されたトランスジェニックカイコは、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターにより、ヒトインスリン受容体をカイコの全身で発現させることができる。
【００２９】
本発明のトランスジェニックカイコは、以下の利点を有するものである。
（１）カイコ自体の入手が容易である。
（２）カイコを飼育する方法が既に確立されており、更に飼育に利便性がある。
（３）ヒト等の哺乳動物の内臓・器官と類似する性質が、これまでの研究で、ある程度分かっている。
（４）遺伝系統が確立されており、遺伝的均一性の維持ができている。
（５）比較的大型で、動きが緩慢であり、実質上無毛なので、定量的に注射できる等、薬物の投与が容易である。
（６）脂肪体を有しており、脂肪体を取り出して、含有する物質の定量が可能である。
（７）マウス、ラット等に比べると安価で、狭いスペースで多数この個体を飼育でき、倫理的な問題も少ないため、スクリーニング的な評価を行うことが容易である。
（８）被験物質が少量しかない場合でも評価を行うことができる。
（９）齢を揃える等、同じ状態の個体を揃えることが容易である。
（１０）体液を採取して、糖、脂質、酵素等の成分を解析することが可能である。
【００３０】
本発明のトランスジェニックカイコの作製方法は、特に限定されないが、転写制御因子であるＧＡＬ４をコードする遺伝子と、その標的プロモーターであるＵＡＳ配列の下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだ融合遺伝子とを導入する方法が好ましく、例えば、転写制御因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニックカイコと、ＵＡＳの下流にヒトインスリン受容体遺伝子が導入されたトランスジェニックカイコとを交配させる方法が好ましい。
更には、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコと、ＧＡＬ４の標的プロモーターであるＵＡＳの下流に、ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子（以下、「ヒトインスリン受容体遺伝子」と略記する場合がある）を有するトランスジェニックカイコを交配させる方法が好ましい。
ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システムを用いることにより、目的とする遺伝子の発現部位や時期、量を正確に制御できるという利点がある。
【００３１】
細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に、転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコは、例えば、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子をカイコ卵に導入することにより得ることができる。細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターとして、例えば、アクチン遺伝子のＡ３プロモーターを用いることができる。
【００３２】
ＧＡＬ４をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニックカイコは、例えばTomita  M，Munetsuna  H，Sato  T，Adachi  T，Hino  R，Hayashi  M，Shimizu  K，Nakamura  N，Tamura  T，Yoshizato  K．Nat  Biotechnol．2003  Jan;21(1):52-6.（非特許文献８）に開示されているトランスジェニック技術により作製できる。
眼特異的に赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）を発現するベクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｖｅｃｔｏｒ）中のＡｃｔｉｎ（アクチン）のＡ３プロモーターをＧＡＬ４遺伝子の上流に組み込んだＡ３−ＧＡＬ４（Ｒ）の作製方法は、例えば、Imamura  M  et  al.，2003．Genetics  165:1329-1340やUchino  K．et  al.，2006  Journal  of  Insect  Biotechnology  and  Sericology  75:89-97を参照することができる。Ａ３プロモーターにより、ＧＡＬ４をカイコの全身で発現させることができる。
【００３３】
ＧＡＬ４の標的プロモーターであるＵＡＳの下流に、ヒトインスリン受容体遺伝子を有するトランスジェニックカイコは、例えば、ＵＡＳプロモーターの下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだベクターを、カイコ卵にマイクロインジェクションにより導入することにより得ることができる。ベクターとして、ｐｉｇｇｙＢａｃ等のトランスポゾンを用いることが好ましい。
【００３４】
遺伝子の発現を確認するために、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子と同時に組み込んでもよい。蛍光タンパク質を用いることにより、蛍光顕微鏡で観察することにより目的遺伝子の発現確認を容易にすることができる。また、複数の蛍光タンパク質を同時に用いることができる。
例えば、３×Ｐ３プロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰをコードする遺伝子が組み込まれたベクター中のＵＡＳプロモーターの下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだベクターをカイコに導入する。３×Ｐ３プロモーターは複眼や神経系で機能する。また、３×Ｐ３プロモーターの下流に赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄを発現するベクター中のアクチン（Ａｃｔｉｎ）のＡ３プロモーターをＧＡＬ４遺伝子の上流に組み込んだベクターを別のカイコに導入する。これらのカイコを交配し、蛍光顕微鏡により、カイコの眼でＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの両者の発現が確認できれば、ＧＡＬ４遺伝子及びヒトインスリン受容体遺伝子の両方の遺伝子座を有するカイコを選抜することができる。
【００３５】
［トランスジェニックカイコを用いる薬効評価方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法であって、
（Ａ）トランスジェニックカイコに上記アゴニスト又はアンタゴニストを投与する工程、
（Ｂ）上記アゴニスト又はアンタゴニストが投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。
【００３６】
上記薬効評価方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。以下、工程（Ａ）、（Ｂ）について順に説明する。
【００３７】
＜工程（Ａ）＞
工程（Ａ）においては、まず、本発明のトランスジェニックカイコにヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストを投与する。
ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト（以下、単に「アゴニスト」と略記する場合がある）とは、ヒトインスリン受容体と結合してその情報を細胞の内部に伝達する情報物質のことである。ヒトインスリン受容体に作用するアンタゴニスト（以下、単に「アンタゴニスト」と略記する場合がある）とは、ヒトインスリン受容体には結合するが、その情報をできない（アゴニストとヒトインスリン受容体との結合を阻害する）物質のことである。
ヒトインスリン受容体に作用するアゴニストの例として、ウシインスリンが挙げられる。
【００３８】
上記アゴニスト又はアンタゴニストの投与の方法としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、血液中への注射、飼料（餌）への添加等による経口摂取、腸内への注入等が挙げられる。簡便である点、ヒトの臨床との対応という点で、腸管内部への注射、経口摂取が好ましい。
【００３９】
被検物質の投与量としては特に制限はなく、投与する物質、投与方法等に応じて適宜選択することができる。また、ヒトでの体重当たりの投与量を、投与するトランスジェニックカイコの重さに換算して投与することも好ましい。また、その換算値に所定の倍率を乗じた量を投与することも好ましい。また、アゴニスト又はアンタゴニストは、生理食塩水、水等で希釈して投与させることも好ましい。
投与期間は、特に限定はないが、１回に全量投与、あるいは継続的な投与が簡便性の点で好ましい。
【００４０】
＜工程（Ｂ）＞
工程（Ｂ）では、上記工程（ａ）で得られた「アゴニスト又はアンタゴニストが投与されたトランスジェニックカイコ」の脂肪体又は血液中の糖の濃度を測定する。測定試料の採取方法は脂肪体に関しては、解剖して採取することが好ましく、血液に関しては、切り傷を付けてそこから採取する方法が好ましい。
【００４１】
糖の濃度の測定方法としては、糖の定量方法は特に限定はないが、例えば、全ての糖類の定量にはフェノール硫酸法、アンスロン硫酸法、カルバゾール硫酸法等；グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ法等が挙げられる。脂肪体中又は血液中の糖の濃度の測定をする時期については特に限定はなく、例えば、アゴニスト又はアンタゴニストが投与された時点から１分〜１日が好ましく、３０分〜１０時間が特に好ましい。
【００４２】
糖の濃度の測定に際しては、アゴニスト又はアンタゴニストを投与していない、「同様に脂肪体中又は血液中の糖濃度を上昇させたトランスジェニックカイコ」を対照として用いることが好ましい。対照には、例えば、生理食塩水を同量だけを投与することが好ましい。対照に比較して、アゴニスト又はアンタゴニストを投与したもので、糖の濃度がどれくらい変化したかによって、アゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する。
【００４３】
［トランスジェニックカイコを用いる血糖降下物質の評価方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、被検物質がヒトの血糖値を降下させる物質であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）トランスジェニックカイコに上記被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。
【００４４】
上記評価方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。以下、工程（ａ）、（ｂ）について順に説明する。
【００４５】
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）では、本発明のトランスジェニックカイコに対して被検物質を投与する。
【００４６】
被検物質を投与する方法としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、血液中への注射、飼料（餌）への添加等による経口摂取、腸内への注入等が挙げられる。簡便である点、ヒトの臨床との対応という点で、腸管内部への注射、経口摂取が好ましい。
【００４７】
被検物質の投与量としては特に制限はなく、投与する物質、投与方法等に応じて適宜選択することができる。また、ヒトでの体重当たりの投与量を、投与するトランスジェニックカイコの重さに換算して投与することも好ましい。また、その換算値に所定の倍率を乗じた量を投与することも好ましい。また、被検物質は、生理食塩水、水等で希釈して投与させることも好ましい。
投与期間は、特に限定はないが、１回に全量投与、あるいは継続的な投与が簡便性の点で好ましい。
【００４８】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）では、上記工程（ａ）で、被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する。測定試料の採取方法は脂肪体に関しては、解剖して採取することが好ましく、血液に関しては、切り傷を付けてそこから採取する方法が好ましい。
【００４９】
糖の濃度の測定方法としては、糖の定量方法は特に限定はないが、例えば、全ての糖類の定量にはフェノール硫酸法、アンスロン硫酸法、カルバゾール硫酸法等；グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ法等が挙げられる。脂肪体中又は血液中の糖の濃度の測定をする時期については特に限定はなく、工程（ａ）において被検物質が投与された直後から、被検物質による糖の濃度の減少の効果が見られなくなるまでの期間から選択すればよい。具体的には、例えば、被検物質が投与された時点から１分〜１日が好ましく、３０分〜１０時間が特に好ましい。
【００５０】
糖の濃度の測定に際しては、被検物質を投与していない、「同様に脂肪体中又は血液中の糖濃度を上昇させたトランスジェニックカイコ」を対照として用いることが好ましい。対照には、例えば、生理食塩水を同量だけを投与することが好ましい。対照に比較して、被検物質を投与したもので、糖の濃度がどれくらい減少していたかによって、被検物質を評価する。
【００５１】
［トランスジェニックカイコを用いるスクリーニング方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。
【００５２】
上記スクリーニング方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。工程（ａ）及び（ｂ）については、上記評価方法と同様である。
【００５３】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）において、上記工程（ａ）及び（ｂ）によって使用された被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する。対照に比較して、被検物質を投与したもので、糖の濃度がどれくらいまでに減少した場合に有意差と判定してその被検物質を選択するかについては、用いたトランスジェニックカイコの数にも依存し特に限定はないが、通常、対照の糖の濃度の９５％以下〜８０％以下である。
【００５４】
１条件に用いるトランスジェニックカイコの数については特に限定はないが、１個〜２００個が好ましく、２個〜５０個が好ましく、３個〜１０個が特に好ましい。この範囲であると、薬学的にも統計学的にも正しい選択が可能である。
【００５５】
上記スクリーニング方法によって、コスト的に有利に、倫理的にも問題がない方法で、糖尿病治療薬等の「ヒトの血糖値を降下させる物質」のスクリーニングが可能である。
【００５６】
培養細胞系を用いた方法は、ヒトの血糖値を降下させる物質の開発手法として一般的に行われている。
しかしながら、一般に、培養細胞系で効果を示す殆どの物質は、動物個体では血糖降下作用を示さない。その理由は、培養細胞系では、動物個体内における薬物動態を反映できないためである。
そのため、前記方法には、培養細胞系ではなく、動物個体を用いることが必須である。
【００５７】
本発明の方法（薬効を評価する方法、被検物質がヒトの血糖値を降下させる物質や薬剤であるか否かを評価する方法、該物質・薬剤をスクリーニングする方法、該薬剤を製造する方法）は、カイコを用いて行うことに特徴があり、それによって前記顕著な効果を奏するものである。
本発明の方法は、動物個体として、ヒトに近い哺乳動物等ではなく、カイコを用いた場合であっても、上記方法が可能である、すなわち「ヒトの血糖値を降下させる物質」の評価やスクリーニング等が可能であることを見出してなされたものである。
従って、ヒトインスリン受容体を発現したトランスジェニックマウス等の哺乳類に属する実験動物・動物個体、又は、脊椎動物等のヒトに近い実験動物・動物個体で、上記方法が可能であったとしても、それをカイコに転用して、本発明の方法を見出すことはできない。
【００５８】
［トランスジェニックカイコを用いる薬剤製造方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、ヒトの血糖値を降下させる薬剤を製造する方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で選択された物質と製薬上許容される担体を混合する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。
【００５９】
上記薬剤製造方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）については、上記スクリーニング方法と同様である。
【００６０】
＜工程（ｄ）＞
工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）で選択された物質と製薬上許容される担体とを混合する工程である。
【００６１】
本発明の、評価する方法、スクリーニングする方法によって見出された「ヒトの血糖値を降下させる物質」は、それを含有させて薬剤が製造される。該薬剤の剤型については特に限定はないが、経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、舌下剤等が挙げられ、また、非経口投与のための製剤としては、注射剤、経皮吸収剤、吸入剤、坐剤等が挙げられる。
【００６２】
製剤化に際しては、製薬上許容される担体を混合することが可能である。担体の種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜決定することができる。例えば、液状担体としては、水、アルコール、食用油等を用いることができる。固体担体としては、リジン等のアミノ酸類、シクロデキストリン等の多糖類、ステアリン酸マグネシウム等の有機酸塩類、ヒドロキシルプロピルセルロース等のセルロース誘導体等を用いることができる。
【００６３】
上記工程（ｃ）で選択された物質には、更に、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、緩衝剤、着色剤、着香剤等の各種医薬用添加剤を配合することができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって薬剤とする。
【００６４】
［作用］
本発明において、糖の濃度を低下させる物質が、ヒト等の哺乳類と共通していることによって、ヒトの血糖値を降下させる物質が、評価、スクリーニングできる作用・原理は明らかではなく、また、本発明は、かかる作用・原理の範囲に限定されるわけではないが、以下のことが考えられる。
すなわち、カイコは血糖値の恒常性を維持する機構を有しており、筋肉及びヒトの肝臓に相当する脂肪体に糖を貯蔵でき、また、インスリン様ペプチドホルモンであるボンビキシンを有しており、ボンビキシンの下流には、ヒトの場合と同様なＭＡＰＫシグナル伝達経路を含むインスリンシグナル伝達経路が存在する。また、組み換え型ヒトインスリンがＰＩ３キナーゼの活性化を介して、カイコの脂肪体の糖の取り込みを亢進させる作用を有する。すなわち、カイコにはヒトの血糖調節機構と同様な機構があるために、本発明の前記効果が表れたと考えられる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。
【００６６】
＜ヒトインスリン受容体のクローニング＞
ヒトインスリン受容体の全長ｃＤＮＡを含むベクターＤＮＡであるｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フナコシＩＭＡＧＥクローンより購入）に対して制限酵素ＸｂａＩの切断配列をもつプライマーセット（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；5’-tctagaatgggcaccgggggccggcggggg-3’（配列番号１）、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；5’-tctagattaggaaggattggaccgaggcaa-3’（配列番号２））を用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｂａＩ切断部位を末端にもつヒトインスリン受容体遺伝子配列を作製した。
【００６７】
このＰＣＲ産物を、マルチクローニングサイトを有するベクターＤＮＡであるｐＺＥｒＯ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対してライゲーションし、ヒトインスリン受容体遺伝子配列を有するベクターを作製した。コンピテント大腸菌にトランスフォーメーションして、プレート上で一晩・３７℃で培養後、薬剤耐性及びアガロースゲル電気泳動の泳動像を指標として増幅させた挿入配列をもつベクターｐＺＥｒＯ−２−ｈＩＲを取得した。そして、挿入されたヒトインスリン受容体遺伝子配列を含む部位の配列を、各種プライマー（配列番号３〜１２）を用いて解析した。
【００６８】
一方、ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｕａｓ）遺伝子とｇｆｐ遺伝子が組み込まれたベクターｐＢａｃＭＣＳ［ＵＡＳ−ＳＶ４０、３ｘＰ３−ｅｇｆｐ］を制限酵素ＢｌｎＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）で消化した後、脱リン酸化処理を実施した。同時に、上記で作出したヒトインスリン受容体遺伝子配列を含むベクターｐＺＥｒＯ−２−ｈＩＲを制限酵素ＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）で消化した。
ＢｌｎＩ消化済ｐＢａｃＭＣＳ［ＵＡＳ−ＳＶ４０、３ｘＰ３−ｅｇｆｐ］とＸｂａＩ消化済ヒトインスリン受容体遺伝子配列をライゲーションした後、コンピテント大腸菌にトランスフォーメーションした。プレート上で一晩・３７℃で培養後、薬剤耐性及びアガロースゲル電気泳動の泳動像を指標として目的のベクターｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｈＩＲ．ＳＶ４０−３ｘＰ３ＧＦＰを作出した。
なお、当該ベクターのヒトインスリン受容体遺伝子を含む部位の配列を上記と同様に解析し、正しい配列を有する完全長ヒトインスリン受容体遺伝子が組み込まれていることを確認した。
【００６９】
＜トランスジェニックカイコの作製＞
カイコ（ｐｎｄ−ｗ１）の卵に対して、上記で作製したベクターｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｈＩＲ．ＳＶ４０−３ｘＰ３ＧＦＰをマイクロインジェクトして、ＵＡＳプロモーターに応答してヒトインスリン受容体を発現するカイコ（ＵＡＳ−ｈＩＲ  （Ｇ））を構築した。このベクターは、カイコの複眼において特異的に発現する遺伝子のプロモーター配列３ｘＰ３の下流にｇｆｐ遺伝子を組み込んでいることから、蛍光顕微鏡下において複眼にＧＦＰの発現を認めたカイコを遺伝子導入カイコとして選別した。
このカイコと、Ａｃｔｉｎ遺伝子のＡ３プロモーターの下流にＧＡＬ４遺伝子、複眼特異的に発現を誘導するプロモーターの下流にＤｓＲｅｄ遺伝子を組み込んだベクターｐＢａｃ−Ａ３−ＧＡＬ４−３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ（図１Ａ）を有するカイコ（Ａ３−ＧＡＬ４（Ｒ））(Osanai-Futahashi  M．et  al，Nature  Commun．2012;3:1295)を交配させた。
【００７０】
複眼においてＧＦＰ、及びＲＦＰの両者を発現するトランスジェニックカイコ（Ｇ／Ｒ）を蛍光顕微鏡下で選別し、ヒトインスリン受容体発現カイコを作出した。なお、当該カイコの脂肪体中においてヒトインスリン受容体が発現していることは、抗ヒトインスリン受容体抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いたウエスタンブロット解析により確認した。
【００７１】
＜血糖降下実験＞
体液（２０μＬ）は第一腹肢（ｆｉｒｓｔ  ｐｒｏｌｅｇ）にはさみでつけた切り傷から採取し、タンパク質を沈殿させるために９倍量の０．６Ｎ過塩素酸と混合した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を体液抽出液（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ  ｅｘｔｒａｃｔ）とした。カイコ血液中の総糖量はフェノール硫酸法（Hodge  et  al）により定量した。蒸留水で適当な濃度に希釈した体液抽出液１００μＬと５％（ｗ／ｖ）フェノール水溶液１００μＬを混合し、濃硫酸５００μＬを加えて激しく撹拌し、室温で２０分間静置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。グルコース水溶液を標準糖溶液とした。
【００７２】
＜ウエスタンブロット＞
カイコから摘出した脂肪体を、Ｉｎｓｅｃｔ  ｓａｌｉｎｅ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．９、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄した後、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＧｒａｃｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  ２００μＬ中で２７℃において馴染ませた。ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）を用いた実験においては、同時に培地中にワートマニンを加えた。
３０分間の前培養の後、培地にインスリン（３ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２７℃で２時間培養した。
【００７３】
脂肪体をＩｎｓｅｃｔ  ｓａｌｉｎｅで洗浄した後、ＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％  ＮＰ−４０、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）２５０μＬの溶液と混合し、２０秒間、超音波処理した。その後、ＴＣＡ沈殿を行い、タンパク質をＳＤＳ電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに移行させた。
抗Ａｋｔ抗体及び抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、脂肪体のリン酸化Ａｋｔ量（リン酸化Ａｋｔ量／全Ａｋｔ量）を測定した。
【００７４】
実施例１
上述に示した非特許文献８（Tomita  M，Munetsuna  H，Sato  T，Adachi  T，Hino  R，Hayashi  M，Shimizu  K，Nakamura  N，Tamura  T，Yoshizato  K．Nat  Biotechnol．2003  Jan;21(1):52-6.）に示されている、ＧＡＬ４／Ｕｐｓｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＵＡＳ）ｓｙｓｔｅｍを用いてカイコに遺伝子を導入させる（トランスジェニック）技術を利用し、ヒトインスリン受容体を発現するカイコの系統の樹立を行った。
複眼において特異的に発現するプロモーター配列（３×Ｐ３プロモーター）の下流に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が組み込まれたベクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｖｅｃｔｏｒ）中のＵＡＳプロモーターの下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだＵＡＳ−Ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｇ）を構築し、複眼においてＧＦＰを発現するカイコの系統を選別した（図１Ａ、Ｂ）。
【００７５】
次に、上記の複眼でＧＦＰを発現するカイコと、複眼特異的に赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）を発現するベクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｖｅｃｔｏｒ）中のＡｃｔｉｎ（アクチン）遺伝子のＡ３プロモーターをＧＡＬ４遺伝子の上流に組み込んだＡ３−ＧＡＬ４（Ｒ）（図１Ａ）を有する系統のカイコと交配させた。Ａ３−ＧＡＬ４（Ｒ）の作製方法は、例えば、Imamura  M  et  al.，2003．Genetics  165:1329-1340やUchino  K．et  al.，2006  Journal  of  Insect  Biotechnology  and  Sericology  75:89-97を参照することができる。
【００７６】
複眼において、ＧＦＰ、及びＲＦＰの両者を発現するトランスジェニックカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体中においてヒトインスリン受容体が発現していることを、抗インスリン受容体によるウエスタンブロット解析により確認した（図１Ｃ）。
ＵＡＳ−Ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｇ）及びＡ３−ＧＡＬ４（Ｒ）の両方、又はどちらか一方を欠失したカイコ（（−／−）、（Ｇ／−）、（−／Ｒ））では、ヒトインスリン受容体の発現は検出されなかった。
【００７７】
試験例１
カイコで発現させたヒトインスリン受容体が機能しているかを確認するため、ヒトインスリンの投与による血糖値の低下がみられるかを検討した。
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与するとカイコの血糖値が低下した（図２Ａ）。一方、ヒトインスリン受容体が発現していないカイコ（−／Ｒ）に同量のインスリンを投与してもカイコの血糖値の低下はみられなかった。以上の結果は、トランスジェニックカイコで発現させたヒトインスリン受容体が機能し、投与したヒトインスリンによりインスリン経路が活性化されたことを示唆する。
【００７８】
次に、この系での血糖降下作用について、ヒトインスリンの容量依存性を検討した。ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にヒトインスリン５、２０、８０μｇ／ｌａｒｖａを投与した場合、何れの容量においてもカイコの血糖値が低下した（図２Ｂ）。一方、ヒトインスリン０．５、２μｇ／ｌａｒｖａを投与した場合には、カイコの血糖値の低下はみられなかった。更に、ヒトインスリン受容体が発現していないカイコ（−／Ｒ）にヒトインスリン５、２０、８０μｇ／ｌａｒｖａを投与してもカイコの血糖値の低下は見られなかった。
【００７９】
以上の結果は、カイコにヒトインスリン受容体を発現させることにより、ヒトインスリンに対する応答性が増大したことを示唆している。また、作出したトランスジェニックカイコにおいて血糖降下作用を引き起こすのに必要なヒトインスリン量は、８μｇ／ｌａｒｖａであることも分った。
【００８０】
試験例２
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコにヒトインスリンを作用させたとき、カイコ体内の臓器の細胞においてインスリンシグナル伝達経路が活性化するかを検討した。
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にヒトインスリンを投与すると、カイコの体内の脂肪体細胞においてＡｋｔのリン酸化が亢進していることが判明した（図３）。
一方、ヒトインスリン受容体が発現していないカイコ（−／Ｒ）にヒトインスリンを投与しても、脂肪体細胞でのＡｋｔのリン酸化の亢進はみられなかった。
以上の結果は、ヒトインスリン受容体の発現に依存したカイコの脂肪体におけるヒトインスリン経路の活性化が起きたことを示唆している。
【００８１】
試験例３
インスリンシグナル伝達経路において、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３  ｋｉｎａｓｅ）は、Ａｋｔの上流因子として働く鍵因子であることが知られている。そこで、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体細胞におけるヒトインスリンによるＡｋｔのリン酸化の亢進が、ＰＩ３キナーゼを介しているかを検討した。
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）から摘出した脂肪体におけるヒトインスリンの添加によるＡｋｔのリン酸化の亢進は、ＰＩ３キナーゼの阻害剤でワートマニンの前処理により抑制された（図４）。
以上の結果は、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体におけるヒトインスリンによるＡｋｔのリン酸化の亢進は、ＰＩ３キナーゼを介することを示唆している。すなわち、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体において、ヒトインスリンの投与により、哺乳動物で明らかにされているＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔを介するインスリンシグナル伝達経路が活性化していると考えられる。
【００８２】
試験例４
ウシインスリンは、ヒトインスリンと３つのアミノ酸残基が異なっているが、ヒトインスリン受容体に対する両者の親和性には差がないことが報告されている（図５Ａ中四角、Kotzke  G  et  al.，Dibetologia，1995，38，757-63）。更に、ウシインスリンは、体内での安定性が低いのでヒトインスリンに比べてヒトに投与したときの血糖降下作用が弱いことが知られている（Nosadini  R  et  al.，Diabetes，1981，30，650-5）。
そこで、本発明であるヒトインスリン受容体が発現しているカイコを用いて、個体におけるウシインスリンとヒトインスリンの血糖降下作用の差を評価できるかを検討した。
【００８３】
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にウシインスリン、ヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与すると、何れの場合においてもカイコの血糖値が低下した（図５Ｂ）。しかし、その作用はウシインスリン投与群の方が、ヒトインスリンよりも弱いことが判明した。
以上の結果は、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコを用いて、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニストの個体レベルでの薬効を評価できることを示唆する。
【００８４】
また、血糖降下薬であるインスリンを投与することにより、本発明のトランスジェニックカイコの血糖値が低下することが明らかになった。このことから、本発明のトランスジェニックカイコを用いて血糖値を降下させる可能性がある薬剤の評価・スクリーニング方法を提供できることが示唆される。
【００８５】
培養細胞系を用いて血糖降下薬の候補となる化合物をスクリーニングする方法は、糖尿病治療薬の開発手法として一般的に行われている。しかしながら、一般に培養細胞系で効果を示す殆どの化合物は、動物個体では血糖降下作用を示さない。その理由は、培養細胞系では、個体における薬物動態を反映できないためである。そのため、動物個体を用いた評価系は必須である。
しかし、マウス、ラット等の哺乳類の個体を用いた場合、多くの化合物をスクリーニングするときに、飼育スペース、飼育費用、動物愛護等の観点からの問題がある。カイコは、哺乳類を用いた場合と比べ、これらの問題を抑えることが可能である。よって、カイコ個体を用いた、血糖値を降下させる物質の評価系・スクリーニング系は有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の、ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコを利用して、前記方法が可能であるのみならず、インスリン受容体を介した血糖降下作用の理解や、インスリン受容体を標的とする医薬品開発の知見を得ることも可能であるため、医薬開発分野等に広く利用されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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