(57)【要約】【課題】  試料から抽出された脂質を１回のインジェクションで液体クロマトグラフィにより分離分析する。【解決手段】  順相液体クロマトグラフィによる１次元目の分離カラムと逆相液体クロマト具グラフィによる２次元目の分離カラムの間に、７〜９個のＤ−グルコースがα−１,６−グリコシド結合によって環状に重合したシクロイソマルトオリゴ糖が直接又は間接に担体に結合した充填剤を充填したカラムをトラップカラムとして設けて、試料から抽出された脂質を分析する。【選択図】図９
2015087261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から脂質を抽出する工程と、
前記抽出した脂質を、１以上のトラップカラムを備えた多次元液体クロマトグラフにより分離する工程を、有する脂質の分析方法であって、
前記トラップカラムは、７個又は８個若しくは９個のＤ−グルコースがα−１,６−グリコシド結合によって環状に重合したシクロイソマルトースが直接又は間接に担体に結合した充填剤を充填したカラムである分析方法。
【請求項２】
前記多次元液体クロマトグラフは、１次元目である順相液体クロマトグラフと２次元目である逆相液体クロマトグラフを有する２次元液体クロマトグラフであって、前記トラップカラムが前記順相液体クロマトグラフと前記逆相液体クロマトグラフとの間に配置された請求項１に記載に分析方法。
【請求項３】
７個又は８個若しくは９個のＤ−グルコースがα−１,６−グリコシド結合によって環状に重合したシクロイソマルトースが直接又は間接に担体に結合した充填剤が充填された充填カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析方法、より具体的には脂質の包括的な分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は細胞膜の基本となる構成成分である。脂質は細胞膜の膜流動性や膜輸送の調整を行い、数多くの生理学的機能を司る。従って、生体中の脂質構成を調べることは重要である。脂質は一般には長鎖脂肪酸あるいは炭化水素鎖を持つ生物体内に存在あるいは生物由来の分子として定義される。脂質は大まかに言って単純脂質・複合脂質・誘導脂質の３種類に分類される。単純脂質はアルコールと脂肪酸のエステルである。アルコール部分には直鎖アルコールの他グリセロール、ステロールなどが、脂肪酸には多様な飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸が使われる。単純脂質にはグリセロールと脂肪酸のエステルである中性脂肪の他、ワックス、セラミドが含まれる。複合脂質は分子中にリン酸や糖を含む脂質である。複合脂質にはリン脂質や糖脂質、リポタンパク質、スルホ脂質が含まれる。誘導脂質は単純脂質や複合脂質から加水分解によって誘導される化合物である。誘導脂質には脂肪酸やテルペノイド、ステロイド、カロテノイド、イソプレノイドが含まれる。このように脂質は多種の化合物を含み、極性の低いものから極性の高いものまでその極性は大きく異なる。
【０００３】
脂質を高速液体クロマトグラフで分析する方法が、例えば特許文献１に開示されている。この方法は、対象となる脂質をトラップカラムに保持させると共にその他の物質を溶出させ、その後トラップカラムから保持された脂質を溶出して、順相の液体クロマトグラフで分離する方法である。しかしながら、特許文献１の方法は中性脂肪のみが対象であって、中性脂肪以外の脂質は対象とされていない。
【０００４】
中性脂肪だけでなく複合脂質や誘導脂質を包括的に分析する方法が非特許文献１に記載されている。この方法は２次元の高速液体クロマトグラフィによる方法である。つまり、この方法は、生体から調製された試料を、１次元目の順相液体クロマトグラフで分離した後、さらに２次元目の逆相液体クロマトグラフで分離する方法である。この方法には、１次元目の分離カラムと２次元目の分離カラムの間にループ状の流路からなるインターフェイス部が備えられた装置が用いられる。この方法では、インジェクションされた試料は１次元目の液体クロマトグラフにて分離された後、分離された特定の脂質クラス（脂質群）はインターフェイス部にトラップされる。インターフェイス部にトラップされた脂質クラスはさらに２次元目の液体クロマトグラフにて分離される。次に、先の脂質クラスの分離に使用された移動相（溶離液）と異なる組成（極性）の移動相によって、１次元目の液体クロマトグラフから先の脂質クラスと異なる２番目の脂質クラスが溶出され、インターフェイス部にトラップされる。そして、トラップされた脂質クラスは２次元目の液体クロマトグラフにて分離される。さらに、異なる組成（極性）の移動相によって、１次元目の液体クロマトグラフィから先の脂質クラスと異なる脂質クラスが溶出され、インターフェイス部にトラップされる。そして、インターフェイス部にトラップされた脂質クラスは２次元目の液体クロマトグラフにて分離される。非特許文献１には、このように１次元目の液体クロマトグラフで分離された脂質クラスをインターフェイス部にトラップし、トラップされた脂質クラスを２次元目の液体クロマトグラフで分離する操作を繰り返すことで、ラットの腹膜表層細胞から１次元目の液体クロマトグラフで１３の脂質クラスが分析され、さらに２次元目の液体クロマトグラフでさらに詳細な脂質プロファイルが得られたことが記載されている。
【０００５】
ところで、上記のループ状の流路からなるインターフェイス部には、１次元目の液体クロマトグラフに用いられた移動相が蒸発されることで脂質がトラップされる。一方、１次元目の液体クロマトグラフと２次元目の液体クロマトグラフの間に充填カラムをトラップカラムとして用いた多次元の液体クロマトグラフは公知であり、例えば、特許文献２〜６にそれぞれ開示されている。しかしながら、これまでに、充填カラムをトラップカラムに用いた多次元液体クロマトグラフにより脂質が分析されたとの報告は見当たらない。
【０００６】
一方、環状オリゴ糖を担体に直接又は間接に結合させた分離剤が知られている。例えば、特許文献７には６〜８個のＤ−グルコピラノースがα−１,４−結合により環状に結合した化合物がスペーサを介して担体であるシリカゲルに化学結合した分離剤が開示されている。特許文献８には９個以上のＤ−グルコピラノースがβ−１,２−結合により環状に結合したシクロソフォロースがスペーサを介して担体であるシリカゲルに化学結合した分離剤が開示されている。これらの分離剤は、環を構成する糖の数や環のコンフォメーション、空孔を形成する面がα面であるかβ面であるかどうかによって、その分離能が大きくことなることから、これまでの分離剤では不可能であった化合物を分離分析できることが示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２８８４９号公報
【特許文献２】特開２００３−６６０２０号公報
【特許文献３】特開２００３−２５４９５５号公報
【特許文献４】特開２００５−２８３３４５号公報
【特許文献５】特開２００６−２７５８７３号公報
【特許文献６】特開２００８−９６４５５号公報
【特許文献７】国際公開ＷＯ９２／１５６１７号公報
【特許文献８】特開２０１１−１８３３６１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Honggang Nie et al., Journal of Lipid Research Vol.51, 2010 P.2833-
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献１に記載された方法であれば、１回のインジェクションで試料中に含まれる脂質プロファイルを作成することができるが、この方法ではトラップカラムにおいて１次元目の液体クロマトグラフィに用いられた移動相を蒸発させる必要がある。従って、移動相の蒸発に時間を要し、分析に時間が掛かる場合がある。また、移動相に有機溶媒が使用されることから蒸発した移動相を漏らすことなく回収する必要もあり装置が複雑になる傾向にあった。
【００１０】
その一方、充填カラムをトラップカラムとして用いた場合には、特許文献２などに記載されたような公知の装置を用いることができる。しかしながら、脂質は極性の幅が広い化合物群であるためトラップカラムの選択が難しい。脂質分析において、抽出した脂質を順相液体クロマトグラフに掛けると極性の低い脂質クラスから順次溶出される。その際、極性の比較的低い中性脂肪（トリグリセライド）や脂肪酸は比較的初期に溶出し、移動相の極性を順次高めることで各種の脂質群（中性脂肪、脂肪酸、糖脂質、リン脂質、等々）が極性の低い順から高い順に溶出される。２次元液体クロマトグラフィで分離する場合には、１次元目で分離した各脂質クラスを、続いて逆相液体クロマトグラフィで極性の高い物質から低い物質の順に溶離させることになるが、この際、１次元目の移動相で溶出された極性の低い物質から高い物質を順次トラップカラムに保持させる必要がある。１次元目の分離カラムからは極性の低い脂質が低極性の移動相で溶離されるので、トラップカラムはその移動相よりもさらに極性が低く、溶離してくる低極性の脂質を十分に保持する能力が必要とされる。ところが、脂肪酸は中性脂肪などの低極性の脂質クラスと同様に１次元目から極性の低い移動相で溶離してくるが、順相液体クロマトグラフィに使用される低極性の移動相を用いた場合には、脂肪酸は中性脂肪の分離に用いられる充填剤の極性とほぼ等しい極性の充填剤を用いたトラップカラムには保持されず、素通りする傾向にあり、脂肪酸を捕捉できる最適なトラップカラムがなかったというのが実情であった。
【００１１】
本発明は上記技術に鑑みてなされたものであって、本発明の課題は、低極性の移動相で溶出される脂肪酸を吸着できるトラップカラム及び当該トラップカラムを用いて脂質を分析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る分析方法は、試料から脂質を抽出する工程と、前記抽出した脂質を、１以上のトラップカラムを備えた多次元液体クロマトグラフにより分離する工程を、有する脂質の分析方法であって、前記トラップカラムとして、７個又は８個若しくは９個のＤ−グルコースがα−１,６−グリコシド結合によって環状に重合したシクロイソマルトースが直接又は間接に担体に結合した充填剤を充填したカラムを用いることに特徴がある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、１次元目に順相液体クロマトグラフと２次元目に逆相液体クロマトグラフを用いた２次元液体クロマトグラフを用いて、試料から抽出した脂質を含む試料中から１回のインジェクションで脂肪酸の分子種を分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は本発明に係る分析方法に使用される２次元クロマトグラフの一例を示す図であって、トラップカラムに脂質をトラップする工程を示す図である。
【図２】図１の２次元クロマトグラフにおいて、トラップされた脂質を２次元目のクロマトグラフで分析する工程を示す図である。
【図３】図３は本発明に係る分析方法に使用される２次元クロマトグラフの他例を示す図であって、複数のトラップカラムを用いた場合を示す図である。
【図４】図４はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９）を用いたリン脂質の分析例を示すクロマトグラムである。
【図５】図５はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ８）と直鎖オリゴ糖を担持した分離剤（ＬＩＭ７）を用いたリン脂質の分析例を示すクロマトグラムである。
【図６】図６はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９）を用いた低極性脂質の分析例を示すクロマトグラムである。
【図７】図７はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９）を用いた低極性脂質の分析例を示すクロマトグラムである。
【図８】図８はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９）を用いた低極性脂質の分析例を示すクロマトグラムである。
【図９】図９はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ８）を用いた脂質の包括的な分析例を示すクロマトグラムである。
【図１０】図１０はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ８）と直鎖オリゴ糖を担持した分離剤（ＬＩＭ７）を用いた低極性脂質の分析例を示すクロマトグラムである。
【図１１】図１１はシクロイソマルトオリゴ糖を担持した分離剤（ＣＩ８）と直鎖オリゴ糖を担持した分離剤（ＬＩＭ７）を用いた低極性脂質の分析例を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る分析方法は、試料から脂質を抽出する工程と、前記抽出した脂質を、１以上のトラップカラムを用いた多次元液体クロマトグラフにより分離分析する工程を有する。本発明の対象となる試料は、脂質を含むもの又は脂質を含み得るものであれば特に制約はない。例えば、動植物を問わずありとあらゆる生体を構成する組織であり、細胞である。また、動植物を加工して得られる食品であり、動物や植物から採取される分泌物、例えば乳なども対象となり得る。対象となる試料は好ましくは生体試料、すなわち生体を構成する組織や細胞であって、より詳しく言うと炭素数が１２〜２４、好ましくは１４〜２４である遊離脂肪酸及びこれらの脂肪酸残基を有する脂質を含む試料が好適である。これらの炭素数である遊離脂肪酸や脂肪酸残基を有する脂質が生体内において重要な役割を果たしていると考えられているからである。
【００１６】
脂質を抽出する方法は当業者には公知である。使用される溶媒も脂質を抽出できる溶媒であればよく、ヘキサンやヘプタンなどの飽和脂肪族炭化水素、ヘキセンやペンテンなどの不飽和炭化水素、シクロヘキサンやシクロペンタンなどの飽和脂環式炭化水素、シクロペンテンなどの不飽和脂環式炭化水素、ベンゼンやトルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、酢酸メチルや酢酸エチルなどのエステル類、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン類、メチルエーテルやエチルエーテル、クロロホルムが例示される。これらの溶媒の１種又は２種以上の混液、さらにはこれらの溶媒と水の混液が用いられる。
【００１７】
抽出された脂質は１以上のトラップカラムを備えた多次元の液体クロマトグラフによって分析される。多次元の液体クロマトグラフとは、例えば、特許文献３に開示されたように複数の分離カラムを備え、それぞれの分離カラムに対して独立して移動相を送液するシステムを有する装置を意味する。トラップカラムは、複数の分離カラムを接続するインターフェイスとしての機能を有するカラムを意味し、連続する２つの分離カラムの間に配置される。多次元の液体クロマトグラフには１つのトラップカラムのみが分離カラムと分離カラムの間に配置される場合だけでなく、連続する分離カラム間に複数のトラップカラムが配置される場合もある。また、連続する分離カラム間にトラップカラムが配置される必要もない。例えば、１次元目の分離カラムと２次元目の分離カラムの間にトラップカラムが配置され、２次元目の分離カラムと３次元目の分離カラムの間にはトラップカラムが配置されない場合のように、全ての連続する分離カラム間に配置される必要はない。
【００１８】
脂質の分析、特に炭素数が１２〜２４である脂肪酸若しくは脂肪酸残基を有する脂質を含む試料を分析する方法は、１次元目の順相液体クロマトグラフと２次元目の逆相液体クロマトグラフとで分析できることが非特許文献１に示されており、本発明においても１次元目の順相液体クロマトグラフと２次元目の逆相液体クロマトグラフの間にトラップカラムを配置するのが望ましい。もっとも、３次元目以降に順相又は逆相の液体クロマトグラフやイオン交換クロマトグラフなどを配置したり、１次元目よりも前にイオン交換クロマトグラフや分子ふるいクロマトグラフのような順相液体クロマトグラフ以外の液体クロマトグラフを配置することもできる。
【００１９】
本発明では、トラップカラムの充填剤として、７個又は８個若しくは９個のＤ−グルコピラノースがα−１,６−グリコシド結合によって環状に重合したシクロイソマルトオリゴ糖（シクロイソマルトース）が直接又は間接に担体に結合した充填剤が用いられる。この充填剤は、特許文献８に記載されたシクロイソマルトオリゴ糖又はその誘導体が担体に化学結合によって担持された分離剤と基本的な構造を同じくするものであって、特許文献８のシクロイソマルトオリゴ糖を構成するグルコースの個数が７〜９のいずれかである化合物である。従って、本発明に用いられる充填剤に使用され得る担体や担体に直接に結合するため化学結合、担体に間接に結合するためのスペーサ、それらの製造方法は特許文献７や特許文献８の記載が参照される。また、トラップカラムには単一組成の充填剤が用いられるのが一般的であるが、構成糖の結合数が異なる数種類の充填剤が混合して用いられることもある。
【００２０】
トラップカラムの長さや内径は当業者が適宜設定することができる。例えば、内径が１〜５ｍｍ程度で長さが５〜２０ｃｍ程度である。カラムの材質も問われることがないが、高圧に耐えられる金属製カラムが好適である
【００２１】
本発明に係る分析方法では、１次元目の液体クロマトグラフは好ましくは順相の液体クロマトグラフであり、２次元目の液体クロマトグラフは好ましくは逆相の液体クロマトグラフである。ここで順相の液体クロマトグラフや逆相の液体クロマトグラフは当業者が用いる通常の意味で用いられる。すなわち、１次元目の液体クロマトグラフでは、極性の高い充填剤、例えばシリカゲルを充填剤とした分離カラムが用いられ、２次元目の液体クロマトグラフでは、極性の低い充填剤、例えばシリカゲルにアルキル基が共有結合したＯＤＳを充填剤とした分離カラムが用いられる。
【００２２】
図１、図２は本発明の分析方法が実施され得る２次元液体クロマトグラフの１例を示す図（構成図）である。この２次元液体クロマトグラフは、１次元目の分離カラム３と２次元目の分離カラム１１との間に１本のトラップカラム１を備える。また、２次元クロマトグラフは、１次元目の分離カラム３、２次元目の分離カラム１１、分離カラム３と分離カラム１１にそれぞれ独立に異なる移動相を送液する送液装置２及び送液装置８を有する。また、図に示す２次元クロマトグラフは、トラップカラム１への吸着性を高めるためのトラップ溶媒を送液する送液装置４と、分離カラム１を通過した移動相とトラップ溶媒を混合する混合器５を有する。送液装置４は分離カラム１に移動相を送液する送液装置から独立してトラップ溶媒を送液する。トラップ溶媒は必須のものではない。分析対象物をよりトラップカラム１に吸着させるために、比較的極性が高く１次元目の移動相と混和する溶媒がトラップ溶媒として用いられる。トラップ溶媒はアルコール類であり、水であり、それらの混合溶媒でもあり得る。移動相に対するトラップ溶媒の混合量は適宜決定され、好ましくは分析対象物を最大吸着する最小の量である。
【００２３】
試料から抽出された脂質を含むサンプルはまず１次元目の高極性の充填剤が充填された分離カラムで分離される。切換バルブ６と切換バルブ７の操作により、図１に示すように送液流路を分離カラム３及びトラップカラム１に接続する。送液装置２から移動相が送液されると、１次元目の液体クロマトグラフにおいて第１の脂質クラスが分離される。分離カラム３を通過した移動相にトラップ溶媒が混合された後、分離された第１の脂質クラスは移動相及びトラップ溶媒と共にトラップカラム１に送られ、トラップカラム１に保持される。トラップカラム１を通過した他の分子種は、切換バルブ９、切換バルブ１０を経て検出器１２、例えば特許文献１や非特許文献１に記載があるような質量分析装置やＵＶ検出器など、液体クロマトグラフィで用いられ得る検出器１２で同定される。あるいは、切換バルブ９や切換バルブ１０の操作により、検出器１２を通過せずに排出される（図示せず）。
【００２４】
次いで、トラップカラム１に保持された脂質クラスの分析のため、切換バルブ７、切換バルブ１０の操作により１次元目の液体クロマトグラフにおける送液流路を切り替え、トラップカラム１と２次元目の分離カラム１１を接続する。送液装置８から、高極性の移動相から順次低極性の移動相に切り替えて移動相を送液し、トラップカラム１から溶出した脂質クラスを分離カラム１１にて個々の化合物又は化合物群に分離する。分離された化合物は、上記の検出器１２で同定される。このようにして、２次元目の液体クロマトグラフにおいて第１の脂質クラスの分析が行われる。
【００２５】
順相の液体クロマトグラフィでは、比較的低極性である中性脂肪や脂肪酸は比較的早い時点で溶出する。本発明に係るトラップカラムに使用される充填剤は、実施例の項で述べるように中性脂肪に比較して脂肪酸（飽和・不飽和を問わない）を十分に保持する能力を有する。従って、１次元目から移動相で通り抜けることなく脂肪酸はトラップされ、２次元目のクロマトグラフへ導入され分子種の分離分析が行われる。
【００２６】
図３に示す２次元クロマトグラムは５本のトラップカラム１ａ〜１ｅを有する。この２次元クロマトグラフでは、切換バルブ６と切換バルブ９を順次切り換えることで、分離カラム３と各トラップカラム１ａ〜１ｅが接続される。すなわち、分離カラム３で分離された各脂質クラスはトラップカラム１ａ、トラップカラム１ｂ、トラップカラム１ｃ、トラップカラム１ｄ、トラップカラム１ｅに順次トラップされ得る。次に、切換バルブ７と切換バルブ１０の切換え後に、切換バルブ６と切換バルブ９を切り換えることで、各トラップカラム１ａ〜１ｅと分離カラム１１がそれぞれ接続される。そして、各トラップカラム１ａ〜１ｅにトラップされた脂質クラスについてそれぞれ分子種の分離分析が行われる。
【００２７】
本発明の分析方法では、グルコースの構成数が７〜９個であるシクロイソマルトオリゴ糖（シクロイソマルトース）が結合した充填剤が充填された１本のトラップカラムを用いて脂肪酸を目的として分析してもよく、また、複数本のトラップカラムによって数種の脂質クラスの分子種を目的として脂質のプロファイリングを目的として分析してもよい。この際、グルコースの構成数が７〜９個であるシクロイソマルトオリゴ糖（シクロイソマルトース）が結合した充填剤が充填された複数のトラップカラムが使用され、あるいは、グルコースの構成数が７〜９個であるシクロイソマルトオリゴ糖（シクロイソマルトース）が結合した充填剤が充填されたトラップカラムとその他の分子種のトラップに好適な充填剤が充填されたトラップカラムとが使用され得る。このように、本発明によると、１回のインジェクションによって、試料中に含まれる脂質、特に脂肪酸をターゲットにして分析することができる。
【００２８】
本発明の方法に使用され得る２次元クロマトグラムは図示した装置に限らず、例えば非特許文献１に記載された装置、特許文献２〜６に記載された装置でもよい。また、図示した装置において、トラップ溶媒を混合することなく、トラップカラムに窒素ガスなどのパージガスを送気して移動相を蒸発させてもよい。
【００２９】
本発明で用いられる移動相やトラップ溶媒も当業者が適宜決めることができる。低極性の溶媒として、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、エチルエーテルなどの各種エーテルやこれらの混液が例示される。また、高極性の溶媒として、水、メタノール、エタノール、アセトニトリルやこれらの混液が例示される。また、１次元目の液体クロマトグラフで各脂質クラスに分離する際には通常組成が一定した移動相（isocratic）が用いられるが、いわゆるグラジエントによる移動相も用いられ得る。２次元目の液体クロマトグラフでは各脂質クラスから個々の化合物（化合物群）に分離する際には、一定組成（isocratic）の移動相、グラジエントによる移動相の何れもが用いられ得る。
【００３０】
液体クロマトグラフィの温度条件も当業者が適宜決めることができ、１〜３０℃の室温条件でもよく、また、１〜７０℃程度の恒温条件でもよい。
【００３１】
７又は８個乃至９個のＤ−グルコピラノースがα−１,６−グリコシド結合によって環状に重合したシクロイソマルトオリゴ糖が直接又は間接に担体に結合した充填剤は、脂肪酸のみならず、リン脂質の保持力にも優れているので、この充填剤が充填された充填カラムはトラップカラムとしてのみならず、リン脂質若しくは中性脂質の分離カラムとして使用することもできるのは言うまでもない。
【実施例１】
【００３２】
〔充填カラムの作製〕
充填剤の作製は、市販されているシクロデキストラン混合物（株式会社シー・アイ・バイオ 商品名「ＣＩリッチ」）から、この混合物から分取ＨＰＬＣにて、重合度が７、８、９の環状オリゴ糖をそれぞれ単離精製した。単離精製は特開２０１２−１４０５２１号公報に記載された実施例１に準じて行った。
【００３３】
１２０℃で３時間真空乾燥させた球状シリカゲル（Wakosil 5SIL-120；球径５μｍ、孔径１２０オングストローム）１ｇを脱水トルエン１２ｍｌに分散させ、９５℃に加熱した後、3-glycidoxypropyl trimethoxy silane １ｍｌを加え、３時間反応させた。反応物をトルエン、メタノール及び蒸留水で洗浄した後、真空乾燥させ、スペーサ結合シリカゲルを得た。
【００３４】
１３０℃で６時間真空乾燥させて４０ｍｇの上重合度が７、８、９の各環状オリゴ糖を上記の手法で作製したスペーサ結合シリカゲル０.３ｇと共に５ｍｌの脱水ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）に分散させ、ジイソプロピルエチルアミン（N,N-diisopropylethylamine）１.２ｇを加え、窒素雰囲気下１３８℃で３時間反応させた。反応物をＤＭＦ、メタノール及び蒸留水で洗浄した後、真空乾燥させ、環状オリゴ糖担体（ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９）を得た。
【００３５】
得られた環状オリゴ糖担体を、それぞれヘキサン／イソプロパノール混合液（容積比：ヘキサン／イソプロパノール＝９０／１０）に分散した後、圧力４００ｋｇｆ／ｍ２で０.２i.d.×１００ｍｍ（ＣＩ７は１５０ｍｍ）のステンレス製空カラムに充填し、充填カラムを調製した。
【００３６】
〔脂質の分析〕
上記で得た充填用カラムを用いて極性脂質の分離性能及び低極性脂質の分離性能について評価した。また、参考例として７個のＤ−グルコースがα−１,６−結合で直鎖に結合したオリゴ糖が担体に結合した充填剤ＬＩＭ７を充填したカラムを用いて同様の分析を行った。ＬＩＭ７は公知の方法により、市販デキストランを加水分解して調製した。
【００３７】
（極性脂質の分析）
極性脂質として、１.ＤＰＰＥ（Dipalmitoylphosphatidyletanolamin）、２.ＰＬＰＥ（Palmitoyllysophosphatidyletanolamin）３,ＤＰＰＣ（Dipalmitoylphosphatidylcholine）、４.ＰＬＰＣ（Palmitoyllysophosphatidylcholine）を用いた。
ＨＰＬＣの条件は次のとおりである。
システム：Jasco low press. Gradient system
移動相：ｔ−ブチルエチルエーテル（ｔＢＭＥ）：メタノール（ＭｅＯＨ）＝３０：７０  isocratic
流速：  ０.２５ml/min
検出方法：ＣＡＤ  ２００pAFS
カラム温度：３０℃
サンプル濃度：１００μg/ml
インジェクション：５μｌ  total loop filling
【００３８】
（低極性脂質の分析）
低極性脂質の分析には、１.ＯＯＯ（Trioleoin）、２.ＶＥ（α-tocopherol）、３.ＤＰ（Glycerol 1,3-dipalmitate、Glycerol 1,2-dipalmitate）、４.ＣＦ（Cycloartenylferulate）、５.ＦＦＡ（C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、DHA）を用いた。
【００３９】
ＨＰＬＣの条件は次のとおりである。
システム：Jasco low press. Gradient system
移動相：Ｈｅｘａｎｅ：ｔＢＭＥ：ＭｅＯＨ＝８８：１０：２
流速：  ０.２５ml/min
検出方法：ＣＡＤ  ５００pAFS
カラム温度：３０℃
サンプル濃度：１００μg/ml
インジェクション：５μｌ  total loop filling
【００４０】
（分析結果）
分析結果を図４〜１１に示した。極性脂質（リン脂質）を分析したところ、７個、８個、９個のオリゴ糖が結合した分離剤（ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９）を用いた場合、ＤＰＰＥ、ＰＬＰＥ、ＤＰＰＣ、ＰＬＰＣの順に溶出された（図４参照）。すなわち、比較的高い極性の移動相を用い、極性の低い物質から順に溶出され、良好な分離性能を示した。このことから、ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９のオリゴ糖が結合した分離剤は、比較的高極性の移動相に対して極性脂質を強く保持すると言える。また、直鎖のオリゴ糖が結合したＬＩＭ７も極性脂質を良好に保持し、良好な分離性能で分離した（図５参照）。
【００４１】
次に、低極性物質を分析したところ、ＣＩ７、ＣＩ９の分離剤ではＯＯＯとＶＥは十分に分離されず（図６参照）、ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９のいずれの分離剤でも  C14:0、C18:0、C18:１の脂肪酸は十分に分離されなかった（図８参照）。しかしながら、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、ＤＨＡの脂肪酸は他の低極性物質と良好に分離され、他の低極性物質の保持時間に比べて、脂肪酸の保持時間は長かった（図６〜８参照）。つまり、ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９の分離剤は脂肪酸に対してほぼ同じような保持性能を示し、比較的低極性の移動相に対して、低極性物質、特に脂肪酸を強く保持すると言える。
【００４２】
また、脂肪酸の分離性能が最も良かったＣＩ８の分離カラムに比較的低極性の移動相を流した場合では、脂肪酸に比べて高い極性を有するＯＯＯ、ＶＥ、ＤＰ、ＣＦは比較的短時間で溶出し、直鎖脂肪酸であるC14:0、C16:0、C18:0、C18:1やＤＨＡでは、ＯＯＯなどにかなり遅れて溶出した（図９参照）。そして、極性物質を良好に分離するＬＩＭ７と比較しても、ＣＩ８の分離剤は脂肪酸を強く保持することが示された（図１０、図１１参照）。
【００４３】
このことから、ＣＩ７、ＣＩ８、ＣＩ９の分離剤を充填した充填カラムは、前記のトラップカラムとして良好に用いられ得ると結論づけられる。もっとも、ＣＩ８が最も良好な分離性能や保持能力を示し、トラップカラムにはＣＩ８が最適であると言える。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明に係る充填カラムは、中性脂質や脂肪酸を含む試料について１回のインジェクションで分析可能な多次元液体クロマトグラフィに利用される。
【符号の説明】
【００４５】
１  トラップカラム
２  順相液体クロマトグラム用の送液装置
３  順相の分離カラム
８  逆相液体クロマトグラム用の送液装置
１１  逆相の分離カラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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