(57)【要約】【課題】特別な装置や技術がない場合であっても、on-siteに非侵襲性の糞検体（例えば鶏糞）中のカンピロバクターを正確かつ迅速に検出する方法に供することができる、該糞検体からカンピロバクターを検出する方法および該方法に含まれる増菌培養工程により得られた培養物を提供する。【解決手段】糞検体からカンピロバクターを検出する方法であって、カンピロバクター増菌培養用の培地を用いて、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満の希釈率で、該糞検体を希釈した後に増菌培養する工程、および前記工程により得られた培養物からカンピロバクターを検出する工程を含む前記方法ならびに該方法の増菌培養する工程により得られた培養物。【選択図】図４
2015223153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞検体からカンピロバクターを検出する方法であって、
カンピロバクター増菌培養用の培地を用いて、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満の希釈率で、該糞検体を希釈した後に増菌培養する工程、および
前記工程により得られた培養物からカンピロバクターを検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
希釈率が、１００倍以上１，０００倍以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地が、プレストン培地もしくはボルトン培地またはそれらの修飾培地あるいはそれらと同等の培地である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
糞検体が、トリの糞検体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
糞検体として、トリが１回または２回以上排泄した分の糞便を用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
トリが、ニワトリである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
希釈工程において、２段階以上の段階希釈する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
イムノクロマトグラフ法により検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の増菌培養する工程により得られた、培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞検体からカンピロバクターを検出する方法および該方法に含まれる増菌培養工程により得られた培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒の発生総数は年々減少しているものの、食中毒の原因となる病原体の種類には大きな変化がなく、カンピロバクター、ノロウイルス、ブドウ球菌、サルモネラが常に上位を占めている（非特許文献１）。カンピロバクターやサルモネラは、牛、豚、鶏等の家畜または家禽の腸内等に常在する細菌であり、これらを保有した家畜または家禽の糞等を介して加工肉（食肉、鶏肉）や鶏卵に細菌が付着し、最終的に人に感染することが従来よく知られている。非特許文献２には、カンピロバクターによる感染者の抑制について、食鳥処理段階での汚染・非汚染鶏の区分処理を行った上で農場汚染率を低減させた場合に、感染者数低減に対して最も大きな効果があることが示されている（図２２）。
【０００３】
平成２３年１０月には、家畜の伝染性疾病の発生をより一層確実に防止するため、飼養衛生管理基準の改正が行われ、より安全な鶏肉、鶏卵を消費者に提供する取組みが行われている。非特許文献３および４には、病原体を鶏舎に持ち込むことがないように、日々の鶏舎の衛生管理方法の具体例が開示されている。
【０００４】
鶏を対象としたカンピロバクター検出法として、これまでに、分離培養法（非特許文献５、６）、遺伝子検出法（非特許文献７、８）および免疫学的検出法（非特許文献９）の３種類が報告されている。しかしながら、分離培養法および遺伝子検出法のいずれも操作が煩雑であり、さらに遺伝子検出法は、遠心分離機およびＤＮＡ増幅装置等の高価な機器を必要とするため経済的な負担が大きい。また、免疫学的検出法は、他法に比べて検出感度が低いという欠点を有する（非特許文献１０のp.189）。
【０００５】
すなわち、分離培養法では、平板培地上に生育したコロニーがカンピロバクターか否かを確認するために、グラム染色（顕微鏡観察）、オキシダーゼ試験、ＮＡ・ＣＥＴ感受性試験および馬尿酸加水分解試験等のいくつかの生化学的試験を行う必要があり（非特許文献５）、遺伝子検出法では、検体からカンピロバクターＤＮＡを精製するために、カラムまたは磁気ビーズ等による精製を行う必要がある（非特許文献７、８）。分離培養法、遺伝子検出法のいずれも、鶏糞などを検体として検出することが試みられてはいるものの、生産農家または獣医等が、家禽がカンピロバクターに汚染されたか否かを日常的に把握するための使用を目的とするものではなく、基本的には基礎研究において使用されるものであって、例えば、非特許文献３および４のいずれにも、日々の衛生管理の効果を検証する方法について一切開示されていない。
【０００６】
一方、免疫学的検出法も基本的には基礎研究における使用を目的とするものではあるが、免疫学的検出法の１つであるイムノクロマト法は、訓練を受けていない農業従事者または食肉処理業者等が、農場または食肉処理場等においても実施することができる簡便かつ迅速な検出法であることが非特許文献９（p.2483右欄最下行〜p.2484左欄3行目）に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】厚生労働省 食中毒統計資料、[online]［平成25年8月29日検索］インターネット<URL: http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/04.html#4-2>
【非特許文献２】見上彪ら、“微生物・ウイルス評価書  鶏肉中のカンピロバクター・ジェジュニ／コリ”、[online]、2009年6月、食品安全委員会、［平成25年8月29日検索］、インターネット<URL: http://www.fsc.go.jp/hyouka/hy/hy-hyo2-campylobacter_k_n.pdf>
【非特許文献３】“鶏肉の生産衛生管理ハンドブック―肉用鶏農場・生産者編―安全な鶏肉を生産するために農場でできること”、［online］、平成23年8月、農林水産省  消費・安全局、［平成25年8月29日検索］、インターネット<URL: http://www.pref.okinawa.jp/tyuuoukatiku/torinikuhanndobukku.pdf>
【非特許文献４】“鶏卵の生産衛生管理ハンドブック―採卵鶏農場・生産者編―安全な鶏卵を生産するために農場でできること”、［online］、平成24年6月、農林水産省  消費・安全局、［平成25年8月29日検索］、インターネット<URL: http://www.maff.go.jp/j/syouan/seisaku/handbook/pdf/sairan.pdf>
【非特許文献５】伊豆一郎、外４名、“ブロイラーと体のカンピロバクター及びサルモネラ汚染に対する湯漬及び脱羽処理の影響調査”、平成19年、熊本県食肉衛生検査所
【０００８】
【非特許文献６】稲田一郎、“食肉衛生検査センターだより73  成鶏処理の大規模食鳥処理場におけるカンピロバクター汚染の定量的調査”、［online］、2004年、兵庫県食肉衛生検査センター検査第2課、［2011年5月10日検索］、インターネット<URL: http://hyougo.lin.gr.jp/ghyogo/74/syokuniku.htm>
【非特許文献７】Aisha Al Amri, et al., “Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools”, J Med Microbiol., 2007, 56, p.1350-1355
【非特許文献８】Marianne Lund, et al., “Detection of Campylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR”, J Clin Microbiol., 2004, 42(11), p.5125-5132
【非特許文献９】M. WADL, et al., “Easy-to-use rapid test for direct detection of Campylobacter spp. in chicken feces”, J Food Prot., 2009, 72(12), p.2483-2488
【非特許文献１０】伊藤武監修、「食品微生物の簡便迅速測定法はここまで変わった！」、株式会社サイエンスフォーラム、2002年、p.186-190
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
食品安全委員会により２００９年にまとめられたカンピロバクターの食品健康影響評価によると（非特許文献２）、カンピロバクター食中毒を低減させるためには、農場で飼育されている鶏のカンピロバクター汚染率を低減させ、食鳥処理場においてカンピロバクター汚染鶏群・非汚染鶏群の区別処理を行うことが有効であるとされている。よって今後、農場内の鶏などがカンピロバクターに汚染されているか否かを、非侵襲的に迅速かつ簡便に検出する方法が強く望まれることが予想される（例えば非特許文献１９）。
【００１０】
食品検体を対象とした試験において、例えば非特許文献１５〜１８に示されるように、カンピロバクターの増菌培養法に様々な指針が存在するところ、本発明者は、食品検体用のこれら指針が鶏糞に適用可能か否か検討を行った。なお、採用した指針は、今後日本の公定法となる可能性が高い「食品からの微生物検査標準法検討委員会」によるカンピロバクター・ジェジュニ／コリ標準試験法（非特許文献１６）である。増菌培養後、分離培養した結果、カンピロバクター陽性の鶏糞２１検体中２０検体でカンピロバクターの生菌数が培養前よりも明らかに減少した（残りの１検体は微減）。すなわち、食品検体における増菌培養法を鶏糞検体にそのまま適用することはできなかった。
【００１１】
本発明者の調査によれば、市販のカンピロバクター検出用イムノクロマト試薬の最少検出感度は、例えば２×１０５〜３×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（カンピロバクター検出用試薬キット  シカイムノテスト  カンピロバクターＩＩ、関東化学（株））（非特許文献１１）であるのに対し、鶏糞中のカンピロバクターの菌数（中央値）は１０５〜１０６ＣＦＵ／ｇである（非特許文献２のp.14）。固形物である鶏糞をイムノクロマト試薬に供するためには、溶媒に懸濁して乳剤とする必要があり、その希釈率を例えば一般的な微生物検査に用いられる「１０倍」（非特許文献１２の「２）試料の採取および調製（２）」）とすると、その濃度は１０４〜１０５ＣＦＵ／ｍＬとなる。この１０倍希釈されたカンピロバクター濃度は、イムノクロマト法の最少検出感度を下回るため、鶏糞から直接カンピロバクターの検出を試みると多くのカンピロバクター汚染検体を陰性（偽陰性）と判定する虞がある。また、鶏糞に含まれる夾雑成分の中には、イムノクロマト法において非特異的な反応を引き起こすものもあり、正しい結果を得られない虞もある。実際、非特許文献９にはイムノクロマト法で鶏糞から直接カンピロバクターの検出を試みた例が報告されているが、鶏糞がカンピロバクターに高濃度で汚染されている場合（＞約１０７  ＣＦＵ／ｇ）は陽性を示すものの、それよりも低い濃度（＜約１０７  ＣＦＵ／ｇ）で汚染されている場合は陰性（偽陰性）を示し、分離培養法との判定結果の一致率は６１％と低いものであった。
【００１２】
仮に、イムノクロマト法により鶏糞中のカンピロバクターを検出するには、試料中のカンピロバクター濃度を高くし、かつ夾雑成分の影響を抑える前処理工程等が必要となるであろう。試料中のカンピロバクター濃度を高くするには、磁気ビーズなどを使用してカンピロバクターを濃縮するか、またはカンピロバクターを増菌しなければならない。ここで、鶏糞中のカンピロバクターの濃縮を試みた報告は過去に知られておらず、また増菌を試みた報告は存在するものの、増菌培養工程を経ることによってカンピロバクターの生菌数が却って減少したとされ（非特許文献１３のABSTRACTおよび非特許文献１４）、増菌の成功例は報告されていない。したがって、非特許文献１４では、汚染鶏群の摘発を目的とする場合はＰＣＲ等の検査が推奨されている。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、従来技術の問題を解決し、特別な装置や技術がない場合であっても、on-siteに非侵襲性の糞検体（例えば鶏糞）中のカンピロバクターを正確かつ迅速に検出する方法、および該検出方法において用いるカンピロバクターの増菌方法により増菌された培養物を提供することにある。
【００１４】
［非特許文献］
［非特許文献１１］“719410-0  カンピロバクター検出用試薬キット  シカイムノテスト  カンピロバクターＩＩ”、平成25年2月改訂、関東化学（株）
［非特許文献１２］日本薬学会編、「衛生試験法・注解」、金原出版（株）、2010年、p.57
［非特許文献１３］M. T. Musgrove, et al., “Detection of Campylobacter spp. in ceca and crops with and without enrichment”, Poult Sci., 2001, 80(6), p.825-828
【００１５】
［非特許文献１４］田中佑哉、外７名、「鶏由来カンピロバクター分離のための増菌培地の比較・評価」（E-5）、第150回日本獣医学会学術集会  家禽疾病学分科会  一般演題、2010年
［非特許文献１５］日本薬学会編、「衛生試験法・注解」、金原出版（株）、2010年、p.97
［非特許文献１６］食品からの微生物標準試験法検討委員会、“カンピロバクター・ジェジュニ／コリ標準試験法（ステージ４：最終案）  NIHSJ-02-ST4:2012 (Draft 120731)”、［online］、国立医薬品食品衛生研究所  食品衛生管理部、［平成25年8月29日検索］、インターネット<URL: http://www.nihs.go.jp/fhm/kensa/NIHSJ-02-ST4%20draft_20120731.pdf>
【００１６】
［非特許文献１７］厚生労働省監修、「食品衛生検査指針  微生物編」、（社）日本食品衛生協会、2004年、p.225-235
［非特許文献１８］Technical Committee ISO/TC 34、“Microbiology of food and animal feeding stuffs―Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp.―Part 1: Detection method”、First edition、ISO10272-1、ISO、2006年1月15日
［非特許文献１９］見上彪、“府食第596号  食品健康影響評価の結果の通知について”、食品安全委員会、平成21年6月25日
【課題を解決するための手段】
【００１７】
かかる課題を解決すべく鋭意研究する中で、本発明者は、食品検体からカンピロバクターを増菌させるのに通常使用されている培地（例えば非特許文献１６に記載のプレストン培地等）を用いて、糞検体からカンピロバクターを増菌させる際に、糞検体を該培地により、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満に希釈した後に培養すると、カンピロバクターを効率良く増菌させることができることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］糞検体からカンピロバクターを検出する方法であって、カンピロバクター増菌培養用の培地を用いて、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満の希釈率で、該糞検体を希釈した後に増菌培養する工程、および前記工程により得られた培養物からカンピロバクターを検出する工程を含む、前記方法。
［２］希釈率が、１００倍以上１，０００倍以下である、［１］に記載の方法。
［３］培地が、プレストン培地もしくはボルトン培地またはそれらの修飾培地あるいはそれらと同等の培地である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］糞検体がトリの糞検体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］糞検体として、トリが１回または２回以上排泄した分の糞便を用いる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
【００１９】
［６］トリがニワトリである、［４］または［５］に記載の方法。
［７］希釈工程において２段階以上の段階希釈する、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］イムノクロマトグラフ法により検出する、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の増菌培養する工程により得られた、培養物。
【発明の効果】
【００２０】
例えば非特許文献１６（p.2）に記載のカンピロバクター・ジェジュニ／コリ標準試験法では、食品検体２５ｇを１００ｍＬのプレストン培地に加える、すなわち検体を５倍に希釈しているのに対して、本発明の検出方法では、糞検体を、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満もの高倍率で希釈し、その際、好ましくは２段階以上の段階希釈を行う。このように、本発明の検出方法は、食品検体の希釈率と比べて桁違いに高い希釈率を採用しており、さらに本発明では好ましくは段階希釈を行うことで、カンピロバクターを含む初発菌数をむしろ減少させており、本発明の目的と相反する行為を一時的に行っている。しかしながら、本発明の検出方法によると、糞検体からカンピロバクターを効率良く増菌させることができる。これは、希釈率を高くすることによって、糞検体中の夾雑菌の濃度が下がり、夾雑菌の増殖がカンピロバクター増菌用の培地（例えばプレストン培地）に含まれる抗菌剤により抑制されると考えられる。
【００２１】
本発明の検出方法では、糞検体として、トリなどの１回分の糞便の一部のみを使用することはせず、好ましくは１回分の糞便全部を使用する。カンピロバクターがトリなどの１回分の糞便中に均一な濃度で含まれるとは限らないため、これによって、カンピロバクターを検出する際に偽陰性と判定される可能性を著しく低下させることができる。
【００２２】
また、本発明の検出方法では、非侵襲性の糞検体からカンピロバクターを検出することができ、特別な装置や特定の技術がなくても、on-siteにカンピロバクターを正確かつ迅速に検出することができる。これは、本発明の検出方法において、希釈率を、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満まで高くすることによって、好ましくはイムノクロマト法の非特異反応を引き起こす夾雑成分の濃度がイムノクロマト法の結果に影響しないレベルまで低下したことにも起因する。
【００２３】
さらに、本発明の検出方法では、好気的条件下であっても、培養容器を密栓すれば、カンピロバクターを増菌培養させることが可能であるから（山本茂貴ら、平成17年度厚生労働科学研究食品安全確保研究事業 分担研究報告書「細菌性食中毒の予防に関する研究 分担研究課題：鶏肉におけるカンピロバクター食中毒の予防に関する研究」、[online]［平成25年8月29日検索］インターネット<URL: http://mhlw-grants.niph.go.jp/niph/search/NIDD02.do?resrchNum=200501033A>を参照）、本発明の検出方法の好ましい態様において、好気的条件下での増菌培養と、免疫学的検出法（イムノクロマト法）とを組み合わせることによって、特別な設備がない環境でも１日以内にカンピロバクター汚染を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の検出方法（イムノクロマト法）および判定基準となる分離培養法に続く定法（顕微鏡観察等）に従った同定法のそれぞれにより鶏糞からカンピロバクターを検出するためのフローチャートを模式的に示したものである（本試験例１）。
【図２】図２は、本発明の検出方法（遺伝子検出法）および対照として鶏糞を増菌培養せずに行った遺伝子検出法を行うためのフローチャートを模式的に示したものである（本試験例２）。
【００２５】
【図３】図３は、本試験例２で得られた各増幅産物を電気泳動して得られた画像を示す。
【図４】図４は、実施例１において好気的条件下で増菌培養した本発明の検出方法（イムノクロマト法）により鶏糞からカンピロバクターを検出するためのフローチャートを模式的に示したものである（本試験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明について、本発明の好適な実施態様に基づき、詳細に説明する。
本発明における「カンピロバクター」とは、カンピロバクター属に分類される細菌を指し、このうちヒトの食中毒の原因菌であるCampylobacter jejuniおよびCampylobacter coliが好ましい。
本発明は、一態様において、糞検体からカンピロバクターを検出する方法であって、カンピロバクター増菌培養用の培地を用いて、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満の希釈率で、該糞検体を希釈した後に増菌培養する工程と、前記工程により得られた培養物からカンピロバクターを検出する工程とを含み、増菌培養工程に先立ち、糞検体に含まれる夾雑菌の影響を抑えるための前処理工程等を含まなくてもよい検出方法である。
【００２７】
「カンピロバクター増菌培養用の培地」としては、非特許文献１７にも記載されているようなカンピロバクターの増菌培地として一般的に使用されている培地が好ましく、具体的には、例えばプレストン(Preston)培地、ボルトン(Bolton)培地、ＣＥＭ培地、Exeter培地、Hunt and Radle培地などが挙げられ、これらの修飾培地も包含される。これらの培地はいずれもOxoid社から入手可能である。本発明におけるカンピロバクター増菌用の培地として、より好ましくは、プレストン培地もしくはボルトン培地またはそれらの修飾培地あるいはそれらと同等の培地である。プレストン培地の典型的な組成を表１に示す。プレストン培地の調製法としては、例えば、表１の基礎培地の各成分を精製水に溶解させ、１２１℃にて１５分間高圧蒸気滅菌を行い、５０℃程度まで冷却後、ウマ溶血液および選択剤を添加する。また必要であれば、滅菌後に２５℃でのｐＨを７．５±０．２に調整する。
【００２８】
【表１】
2015223153.tif 000003
一方、ボルトン培地の典型的な組成を表２に示す。ボルトン培地の調製法は、ｐＨを７．４±０．２に調整する以外は、プレストン培地の調製法に準ずる。
【００２９】
【表２】
2015223153.tif 000004
【００３０】
本発明において使用するカンピロバクター増菌培養用の培地には、主にグラム陽性菌に対する抗菌剤として作用する「選択剤」が含まれているが、かかる選択剤として、例えば、ポリミキシンＢ、リファンピシン、セフォペラゾン、バンコマイシン、トリメトプリム、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ、バシトラシン、セファロシン、セファゾリン、コリスチン、ノボビオシン、テイコプラニン等が挙げられる。これら選択剤の組み合わせおよび組成比は、表１および表２に基づき、当業者により適宜修飾・変更することができ、このようにして得られる修飾培地または同等の培地は、プレストン培地またはボルトン培地と同様の性質を有する。
【００３１】
本発明に使用する糞検体としては、好ましくはニワトリ（鶏）、アヒル、七面鳥等の食用となるトリの糞検体、より好ましくはニワトリの糞検体である。その量としては、トリが１回または２回以上排泄した分の糞便であることが好ましい。糞検体として、少なくともトリ等が排泄した一回分の糞便を用いることによって、カンピロバクターが糞便中に偏在していたとしても、当該糞検体からカンピロバクターを正確に検出することができる。
【００３２】
本発明の検出方法に含まれる増菌培養工程において、好ましくは２段階以上の段階希釈を行って、５０倍を超え、かつ５，０００倍未満、好ましくは１００、２００、３００、４００倍以上かつ６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００倍以下、より好ましくは１００倍を超え、かつ１，０００倍未満、特に好ましくは４００〜６００倍、最も好ましくは５００倍程度の希釈率を達成する。段階希釈は、例えば図１に示すように、鶏糞２５ｇをプレストン培地１００ｍＬで５倍希釈し、その０．１ｍＬをプレストン培地１０ｍＬでさらに１００倍希釈することによって５００倍希釈とすることができる（この場合は２段階希釈）。
また、本発明の検出方法に係る希釈率を例えば５，０００倍以上にすると、カンピロバクターの汚染菌数が１０２〜１０３ＣＦＵ／ｇの鶏糞検体も存在することから（非特許文献２）、５，０００倍以上の希釈率ではカンピロバクターを検出することができないリスクが高くなると考えられる。他方、本発明の検出方法に係る希釈率を例えば５０倍にすると、以下の試験例４に示すように、イムノクロマト試験において正しい結果が得られない虞がある。
【００３３】
本発明の検出方法に含まれる増菌培養工程における培養条件としては、非特許文献１６に記載されているように、微好気条件下にて４２±１℃にて２４〜４８時間が好ましいが、好気条件下（通常の大気圧条件下）であっても、培養容器を密栓すれば、４２±１℃にて２４〜４８時間で増菌培養することができる。
微好気条件下の培養は、培養室内を、酸素５±２％、二酸化炭素１０±３％、残りを窒素とする計１００％の雰囲気（水素を添加する場合は、酸素５±２％、二酸化炭素１０±３％、水素１０％以下、残りを窒素とする計１００％の雰囲気）に自動制御することが可能なインキュベータを使用して行うことができる。
一般に、カンピロバクターが通常の大気条件下で増殖しにくいのは、大気中の酸素濃度（約２０％）がカンピロバクターに悪影響を及ぼすためと考えられる。よって、コロニーを形成させる平板培養では微好気条件が必須となる。しかしながら、増菌培養（液体培養）においては、大気中の酸素濃度よりも液体中の酸素分圧が問題となり、大気の酸素濃度２０％であっても、液体中の酸素分圧が低ければ、カンピロバクターは増殖し得る。
【００３４】
また、本発明の検出方法、特にその増菌培養工程は、分離培養法、遺伝子検出法および免疫学的検出法（好ましくはイムノクロマト法）のいずれにも適用することができる。これらの検査法のうち、イムノクロマト法がより簡便かつ迅速な検出法であることから、好ましくはイムノクロマト法に適用する。
【００３５】
さらにまた、本発明は、一態様において、前述した本発明の検出方法に含まれる増菌培養工程により得られた培養物である。本発明の培養物は、本発明の検出方法に用いられ、培地を含んだ状態であっても、培地を遠心分離等により取り除いた後の状態であってもよく、磁気ビーズなどを使用してさらにカンピロバクターを濃縮したものであってもよい。
【実施例】
【００３６】
次に、本発明について、実施例および比較例によって、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に限定されるものではない。
＜試験例１＞イムノクロマト法による本発明の検出方法
本発明の検出方法（イムノクロマト法；実施例１）と、分離培養法に続く定法に従った同定法（参考例１）とのそれぞれにより鶏糞からカンピロバクターを検出するためのフローチャートを図１に示す。
【００３７】
［実施例１］鶏農場内に落ちている新鮮な鶏糞３８検体を採取し、冷蔵保存後、１週間以内に各鶏糞２５ｇとプレストン培地（OXOID社）１００ｍＬとをストマック袋に入れ、１分間ストマッキング処理を行って５倍希釈液を調製した。５倍希釈液の０．１ｍＬをプレストン培地１０ｍＬに加えて得られた５００倍希釈液を、微好気条件（酸素５±２％、二酸化炭素１０±３％、残りは窒素；以下同様）下、４２℃で４８時間インキュベートした。得られた培養物を、カンピロバクター検出用試薬キット（シカイムノテスト  カンピロバクターＩＩ、関東化学（株）（非特許文献１１を参照））を使用して、添付文書に記載の方法に従いイムノクロマト試験（陽性または陰性の判定）を行った。
【００３８】
［参考例１］参考例１は、カンピロバクター陽性または陰性の判定基準とするために行った。すなわち、実施例１において調製した５倍希釈液（増菌培養なし）を、ＣＣＤＡ寒天培地（ＳＥＬ）（関東化学（株））およびバツラー処方カンピロバクター選択寒天培地（OXOID社）に画線塗抹し、微好気条件下、４２℃で４８時間インキュベートした。カンピロバクター様のコロニーが出現した場合に、定法（顕微鏡観察、運動性試験、グラム染色および／またはオキシダーゼ試験等、以下同様）に従ってコロニーがカンピロバクターであることを確認した。
【００３９】
実施例１と参考例１との判定結果を表３に示す。実施例１の判定結果と参考例１の判定結果との一致率は、１００％（＝｛２１＋１７｝／３８）であった。すなわち、試験例１から、食品検体を対象とした非特許文献１６に記載のカンピロバクター・ジェジュニ／コリ標準試験法のプロトコールにおいて、増菌培地（プレストン培地）による検体の希釈率を５倍から５００倍に変更することによって、鶏糞中のカンピロバクターがイムノクロマト法で検出可能な菌数まで増菌し、かつ、イムノクロマト法の非特異反応を引き起こす夾雑成分の影響を抑えられることがわかった。実施例１により、鶏糞中のカンピロバクターをイムノクロマト法で検出することが可能となった。
【００４０】
【表３】
2015223153.tif 000005
【００４１】
＜試験例２＞遺伝子検出法による本発明の検出方法
本発明の検出方法（遺伝子検出法；実施例２）と、増菌培養せずに行った遺伝子検出法（参考例２）とのそれぞれにより鶏糞からカンピロバクターを検出するためのフローチャートを図２に示す。
［実施例２］鶏農場内に落ちている新鮮な鶏糞を採取し、分離培養法によってカンピロバクター陽性だと確認された鶏糞１２検体各２５ｇと、プレストン培地（OXOID社）１００ｍＬとをストマック袋に入れ、１分間ストマッキング処理を行って５倍希釈液を調製した。５倍希釈液の０．１ｍＬをプレストン培地１０ｍＬに加えて得られた５００倍希釈液を微好気条件下、４２℃で４８時間インキュベートした。得られた培養物の１ｍＬを１０分間煮沸処理し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、これを鋳型ＤＮＡとしてカンピロバクターの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的とするＰＣＲ試験を行った。
【００４２】
ＰＣＲの条件等は、Chistian Fermer, et al., “Specific PCR identification and differentiation of the thermophilic campylobacters, Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, and C. upsaliensis”, J Clin Microbiol., 1999, 37(10), p.3370-3373に従った。増幅産物を電気泳動した結果を図３に示す。なお、所定のサイズの増幅産物（４９１ｂｐ）を認めたものを陽性とした。
【００４３】
［参考例２］実施例２において調製した５倍希釈液（増菌培養なし）の１ｍＬを１０分間煮沸処理し、以下、実施例２と同様の手順でＰＣＲ試験を行い、増幅産物を電気泳動した。その結果を図３に示す。
図３から、実施例２では全ての検体が陽性と判定された（すなわち、分離培養法との判定結果との一致率は１００％であった）が、参考例２では４検体が陰性（偽陰性）となり、陽性となった検体も増幅ＤＮＡが実施例２に比べて少なかった。
【００４４】
＜試験例３＞簡略化した本発明の検出方法（好気条件下２４時間の増菌培養）
［実施例３］実施例１において、増菌培養条件として「微好気条件下、４８時間」を「培養容器を密閉して、好気条件（大気圧条件）下、２４時間」に変更し、かつ、糞検体として「鶏糞３８検体（この時点では陽性・陰性は不明）」を「分離培養法によってカンピロバクター陽性だと確認された鶏糞１２検体」に変更した以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験を行った。そのフローチャートを図４に示す。
判定結果はいずれも陽性であった。
【００４５】
＜試験例４＞希釈率を５０倍にした検出方法
［比較例１］実施例１において、増菌培養前の最終希釈率を「５００倍」から「５０倍」に変更した以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験を行った。
［参考例３］参考例３は、カンピロバクター陽性または陰性の判定基準とするために行った。すなわち、参考例１と同様にして、カンピロバクター様のコロニーが出現した場合に、定法に従いコロニーがカンピロバクターであることを確認した。
【００４６】
比較例１と参考例３との判定結果を表４に示す。比較例１の判定結果と参考例３の判定結果との一致率は、６１％（＝｛２１＋２｝／３８）であった。希釈率を５０倍にした比較例１では、カンピロバクターの生菌数が目視で明らかに減少する現象は認められなかったが、イムノクロマト試験において正しい結果が得られなかった（偽陽性が多発した）。これは、イムノクロマト法の非特異反応を引き起こす夾雑成分の濃度が充分に低下していなかったためであると考えられる。なお、比較例１（増菌培養後の鶏糞５０倍希釈液）と参考例３（増菌培養していない５倍希釈液）とのカンピロバクター生菌数は、それぞれを平板培地に塗抹してインキュベートした結果、出現したコロニー数を表すものであり、前述のとおり、比較例１と参考例３とではコロニー数に大きな差異が見られなかった。
【００４７】
【表４】
2015223153.tif 000006
【００４８】
＜試験例５＞希釈率を５倍にした検出方法
［比較例２］実施例１において、増菌培養前の最終希釈率を「５００倍」から「５倍」に変更した以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験を行った。
［参考例４］参考例４は、カンピロバクター陽性または陰性の判定基準とするために行った。すなわち、参考例１と同様にして、カンピロバクター様のコロニーが出現した場合に、定法に従いコロニーがカンピロバクターであることを確認した。
【００４９】
比較例２と参考例４との判定結果を表５に示す。比較例２の判定結果と参考例４の判定結果との一致率は、５８％（＝｛２１＋１｝／３８）であった。比較例２では、食品からカンピロバクターを検出するのと同様の５倍希釈により鶏糞を増菌培養しているが、試験例４と同様に偽陽性が多発した。イムノクロマト試験の非特異反応を引き起こす夾雑成分の濃度が充分に低下していないものと考えられる。また、増菌培養後の鶏糞５倍希釈液（比較例２）から、参考例４と同様にカンピロバクターの検出を試みたところ、参考例４（すなわち増菌培養前の初発菌数と同じ）と比較して生菌数（コロニー数）が著しく減少していた。これは、鶏糞には食品よりも多くの夾雑菌が存在し、これらがカンピロバクターよりも優位に増菌するため、鶏糞中のカンピロバクターが減少したものと考えられる。
【００５０】
【表５】
2015223153.tif 000007
【００５１】
＜試験例６＞希釈率を５倍かつ増菌培養を行わない検出方法
［比較例３］実施例１において、増菌培養前の最終希釈率を「５００倍」から「５倍」に変更し、かつ増菌培養を行わなかった以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験を行った。
［参考例５］参考例５は、カンピロバクター陽性または陰性の判定基準とするために行った。すなわち、参考例１と同様にして、カンピロバクター様のコロニーが出現した場合に、定法に従いコロニーがカンピロバクターであることを確認した。
【００５２】
比較例３と参考例５との判定結果を表６に示す。比較例３の判定結果と参考例５の判定結果との一致率は、４７％（＝｛６＋１２｝／３８）であった。
【表６】
2015223153.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の検出方法によると、例えば養鶏業の生産性を高め、安全・安心な鶏肉等を消費者に届けることに寄与することができる。
【図１】
2015223153.tif 000009
【図２】
2015223153.tif 000010
【図３】
2015223153.tif 000011
【図４】
2015223153.tif 000012