(57)【要約】PDZドメインの相互作用、特にMAGI中のPDZドメインの発癌性(腫瘍抑制因子)タンパク質PTENとの相互作用、およびディシュベルド(Dvl)タンパク質のPDZドメインのフリッツルド(Fz)タンパク質のような、他のタンパク質との相互作用を阻害する上で有効であることがわかった新規化合物は、一般式(I)または(III)を有する。本発明はまた、そのような化合物の使用するタンパク質のスクリーニングおよび試験のためのコンビナトリアルライブラリー、アレイおよび方法を含む。本発明の化合物は、Wntシグナル伝達を阻害するディシュベルドタンパク質(Dvl)を過剰発現するある種の細胞株においてアポトーシスを生じる。2008505183.tif 000026
2008505183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物、ならびにそれらの水和物および塩、ならびにそれらの標識された誘導体：
2008505183.tif 000024
式中、nが、0、1または2であり；
X1が、NH、N(CH3)、CH2、CH(CH3)、C(CH3)2、O、S、S(O)、またはSO2であり；
R0が、C1-C3アルキル、シクロプロピル、ハロ、OR5およびmが0、1または2であるS(O)mR5からなる群より選択され；
R1およびR2が、独立して、C2-C8アルケニル、フェニルシクロプロピル、フェニルプロペニル、R6-X2-C(R8)(R8)-R7-、R6-X2-N(R8)-R7-、およびR10X3R7-からなる群より選択され；
R3およびR4が、独立して、水素、メチルまたはエチルであり；
R5が、メチルまたはエチルであり；
R6が、水素、C1-C10アルキル、アリール、W、Y、NH2、NHCONR3R4、NHCOOR3およびNHSO2R9からなる群より選択され；
R7が、直接結合、1〜10個の炭素原子を有するアルキル基、アリール、pが0または1であり、およびqが1〜4の整数である-(NH)p(CH2CH2O)q(NH)p-、ならびにWからなる群より選択され；
R8が、H、Y、OH、-NHCONR3R4；-NHCOOR3；-NHSO2R9、-(CH2)rCO2R3、および(CH2)rCONR3R4からなる群より選択され、rが1〜3の整数であり；
R9が、アリールまたはC1-C6アルキルであり；
R10が、C1-C10アルキル、アリールおよびWから選択され；
X2が、直接結合、-NH-、-N(CH3)-、-NCONR3R4、-NCOOR3、および-NSO2R9からなる群より選択され；
X3が、O、S、SOおよびSO2から選択され；
Wが、飽和した炭素環式基または複素環式基であり；
Yが、COOH、COOR3、CONR3R4、CONHSO2R5、ヒドロキシメチル、-CH2COOH、CH2CONR3R4；および、5-テトラゾリルからなる群より選択される。
【請求項２】
請求項1記載の式(I)の化合物。
【請求項３】
請求項1記載の式(II)の化合物。
【請求項４】
請求項1記載の式(III)の化合物。
【請求項５】
nが、0である、請求項2記載の化合物。
【請求項６】
X1が、NHである、請求項2記載の化合物。
【請求項７】
X1が、Oである、請求項2記載の化合物。
【請求項８】
X1が、Sである、請求項2記載の化合物。
【請求項９】
X1が、NCH3またはN(C2H5)である、請求項2記載の化合物。
【請求項１０】
Yが、COOHまたはCOOR3である、請求項1記載の化合物。
【請求項１１】
R0が、C1-C3アルキル基である、請求項1記載の化合物。
【請求項１２】
R0が、メチルである、請求項9記載の化合物。
【請求項１３】
R1およびR2が独立して、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよい、C3-C6シクロアルキルおよびC1-C20アルキルから選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１４】
R1およびR2が独立して、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよい、C3-C6シクロアルキルおよびC1-C10アルキルから選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１５】
R1およびR2が独立して、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよい、C3-C6シクロアルキルおよびC1-C8アルキルから選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１６】
R1およびR2が独立して、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよい、C3-C6シクロアルキルおよびC3-C8アルキルから選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１７】
R1およびR2が独立して、C3-C8アルキル、C3-C6シクロアルキル、mが0または1〜3の整数である-(CH2)mC6H5、およびC3-C6シクロアルキル基で置換されたC1-C3アルキル基から選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１８】
R1が、フェネチルにより置換されてもよい、請求項1記載の化合物。
【請求項１９】
R1が、2-ヒドロキシエチルである、請求項1記載の化合物。
【請求項２０】
R1が、フェニルである、請求項1記載の化合物。
【請求項２１】
R1が、ブチル基である、請求項1記載の化合物。
【請求項２２】
R2が、ブチル基である、請求項1記載の化合物。
【請求項２３】
R2が、C3-C6シクロアルキル、C3-C6シクロアルキル基で置換されたC1-C3アルキル、mが0または1〜3の整数である-(CH2)mC6H5、およびフェニル、シクロアルキル、カルボキシルもしくはヒドロキシル基により置換されてもよいC3-C8アルキルである、請求項20記載の化合物。
【請求項２４】
R2が、n-ブチルまたはフェネチルである、請求項1記載の化合物。
【請求項２５】
R2が、R6-X2-C(R8)(R8)-R7-またはR6-X2-N(R8)-R7-であり、ならびに基R6-X2-C(R8)(R8)-R7-またはR6-X2-N(R8)-R7-が、C3-C8アルキル；C3-C6シクロアルキル；C3-C8アルケニル；mが0または1〜3の整数である-(CH2)mC6H5；-CH2OC6H5、CH2COC6H5、フェニル(C2-C4アルケニル)、もしくは置換されたフェニル基を有するアナログ部分；置換されてもよいフェニルシクロプロピル；-(CH2)sOH、-(CH2)sCONH2およびsが1〜3の整数である-(CH2)sCOOH；フェニル；チエニル；ならびに、置換されてもよいC3-C6シクロアルキル-(C1-C3アルキル)から選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項２６】
R0がメチルであり、R1がフェネチルであり、R2がn-ブチルであり、X1が-NHであり、YがCOOHであり、およびnが0である、請求項2記載の化合物。
【請求項２７】
R0がメチルであり、R1がフェネチルであり、R2がフェネチルであり、X1が-NHであり、YがCOOHであり、およびnが0である、請求項2記載の化合物。
【請求項２８】
請求項1記載の化合物および検出可能な標識を含む、プローブ。
【請求項２９】
タンパク質のPDZドメインの機能を阻害する方法であって、タンパク質を阻害有効量の請求項1記載の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項３０】
タンパク質のPDZドメインの機能を阻害する方法であって、タンパク質を阻害有効量の請求項2記載の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項３１】
タンパク質のPDZドメインの機能を阻害する方法であって、タンパク質を阻害有効量の請求項3記載の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項３２】
タンパク質のPDZドメインの機能を阻害する方法であって、タンパク質を阻害有効量の請求項4記載の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項３３】
タンパク質のPDZドメインの機能を阻害する方法であって、タンパク質を阻害有効量の請求項25記載の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項３４】
タンパク質が、MAGIタンパク質である、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
下記式を有する2種またはそれ以上の化合物のコンビナトリアルライブラリー、ならびにそれらの水和物および塩、ならびにそれらの標識された誘導体：
2008505183.tif 000025
式中、nが、0、1または2であり；
X1が、NH、N(CH3)、CH2、CH(CH3)、C(CH3)2、O、S、S(O)、またはSO2であり；
R0が、C1-C3アルキル、シクロプロピル、ハロ、OR5およびmが0、1または2であるS(O)mR5からなる群より選択され；
R1およびR2が独立して、C2-C8アルケニル、フェニルシクロプロピル、フェニルプロペニル、R6-X2-C(R8)(R8)-R7-、R6-X2-N(R8)-R7-、およびR10X3R7-からなる群より選択され；
R3およびR4が独立して、水素、メチルまたはエチルであり；
R5が、メチルまたはエチルであり；
R6が、水素、C1-C10アルキル、アリール、W、Y、NH2、NHCONR3R4、NHCOOR3およびNHSO2R9からなる群より選択され；
R7が、直接結合、1〜10個の炭素原子を有するアルキル基、アリール、pが0または1であり、およびqが1〜4の整数である-(NH)p(CH2CH2O)q(NH)p-、ならびにWからなる群より選択され；
R8が、H、Y、OH、-NHCONR3R4；-NHCOOR3；-NHSO2R9、-(CH2)rCO2R3、および(CH2)rCONR3R4からなる群より選択され、rが1〜3の整数であり；
R9が、アリールまたはC1-C6アルキルであり；
R10が、C1-C10アルキル、アリールおよびWから選択され；
X2が、直接結合、-NH-、-N(CH3)-、-NCONR3R4、-NCOOR3、および-NSO2R9からなる群より選択され；
X3が、O、S、SOおよびSO2から選択され；
Wが、飽和した炭素環式基または複素環式基であり；
Yが、COOH、COOR3、CONR3R4、CONHSO2R5、ヒドロキシメチル、-CH2COOH、CH2CONR3R4；および、5-テトラゾリルからなる群より選択される；
。
【請求項３６】
化合物が式(I)である、請求項35記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３７】
化合物が式(II)である、請求項35記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３８】
化合物が式(III)である、請求項35記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３９】
PDZドメイン活性についての1種または複数のタンパク質のスクリーニング法であって、1種または複数のタンパク質を、請求項1記載の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項４０】
PDZドメイン活性もしくはその阻害のスクリーニングのための、またはタンパク質-タンパク質相互作用の研究のための、請求項1記載の2種またはそれ以上の化合物を含むアレイ。
【請求項４１】
癌性細胞または患者における癌の治療法であって、治療有効量の請求項1記載の化合物を、癌性細胞と接触させる、または患者に投与することを含む方法。
【請求項４２】
患者の癌の治療法であって、治療有効量の請求項2記載の化合物を、患者に投与することを含む方法。
【請求項４３】
患者の癌の治療法であって、治療有効量の請求項3記載の化合物を、患者に投与することを含む方法。
【請求項４４】
患者の癌の治療法であって、治療有効量の請求項4記載の化合物を、患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1種または複数のタンパク質のPDZドメインの、他のタンパク質との相互作用の阻害に関し、より詳細に述べると、PDZドメインの阻害に有効であることがわかっている新規化合物に関する。非常に具体的な局面において、本発明は、癌抑制性タンパク質PTENの機能を調節するタンパク質のPDZドメイン、またはディシュベルド（Dishevelled）タンパク質(Dvl)のPDZドメインの阻害、ならびにそのような阻害能を有することがわかっている化合物に関する。本発明の化合物は、Dvlを過剰発現している癌細胞においてアポトーシスを生じることがわかっている。
【背景技術】
【０００２】
PDZドメインは、タンパク質-タンパク質認識のような、タンパク質-タンパク質相互作用を改変するように機能するシグナル伝達タンパク質の領域である。PDZドメインは、このドメインが最初に発見された下記の3種のタンパク質の名称である：PSD-95(後シナプス肥厚部でのシグナル伝達に関連した95kDaタンパク質)、DLG[ショウジョウバエ（Drosophilla）致死的(l)ディスクラージ-1]、およびZO-1(上皮多孔性維持に関連する密着帯-1タンパク質)。これらのタンパク質は、各々、神経シナプス伝達、腫瘍抑制、および細胞密着部形成において重要な役割を果たす。これらは、例えば細胞間の連絡のような、シグナル伝達において機能する多タンパク質複合体を組織化することにより、インビボにおいて機能すると理解される。例えば、PDZ-組織化されたシグナル伝達複合体は、例えば、活性化された受容体を、セカンドメッセンジャーシステムの下流にカップリングし、ならびにタンパク質を細胞のシグナル伝達部位へ輸送および標的化することにより、神経細胞または上皮細胞に関係する連絡において機能することがわかっている。これらは、イオンチャンネル、膜貫通受容体、および調節酵素を含む、重要な細胞シグナルメディエーターの機能に関連している。PDZ-含有タンパク質は、虚血性神経障害および腫瘍発生を含む、欠損細胞シグナル伝達に関連した障害に関与していると考えられる。
【０００３】
構造的に、PDZドメインは、球構造で密に配置された、6個のβ-鎖(βAからβF)および2個のα-ヘリックスAおよびBを含む、80〜90個のアミノ酸モジュラータンパク質相互作用ドメインである。逆平行β-鎖は、βB鎖およびBヘリックスと相互作用するので、このリガンドのペプチド結合は、伸びた表面溝中に起こる。PDZドメインの構造は、βA鎖とβB鎖の間のカルボキシ-結合ループを介した、ペプチド末端の遊離カルボキシル基への結合を可能にする。
【０００４】
PDZドメインを伴うタンパク質には、MAGI類(逆方向を持つ膜結合グアニル酸キナーゼタンパク質)がある。このクラスのタンパク質は、細胞-細胞接触領域での細胞膜内側表面上での多タンパク質複合体の集成に関与する。MAGIは、6個のPDZドメインを有する、人体において広範に発現されるアダプターの小さいファミリーである。MAGI-3は、その第二PDZドメイン(MAGI3-PDZ2)を使用し、腫瘍抑制因子PTENである脂質/タンパク質リン酸化酵素に結合する。MAGI-3およびPTENの相互作用は、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼおよびAkt/PKBシグナル伝達を低下するのに対し、MAGI-3からのPTENの放出は、Akt/PKBシグナル伝達を増大する。通常Akt/PKBシグナル伝達は、アポトーシスの抑制により、傷害に対する反応時の細胞生存を確実にする。しかし構成的Akt/PKBシグナル伝達を引き起こすPTEN変異体は、ヒトの癌に関連している。この相互作用の化学的破壊は、悪性転換および癌におけるAkt/PKBシグナル伝達の役割を調べる上での独自の経路であり、癌性増殖の発達に影響を及ぼすと考えられる。
【０００５】
同じくPDZドメインを有することがわかっているタンパク質には、ディシュベルドタンパク質(Dvl)がある。それのWntおよびフリッツルド（Frizzled）タンパク質との相互作用は、1種または複数の癌型に関連することが示されている。
【０００６】
PDZドメインを有するタンパク質の他のタンパク質との相互作用の小分子インヒビターも望ましいと思われる。今日まで、この能力を有する小分子は、報告されていない。2002年および2003年に、本発明者らは、そのような能力を有するいくつかの化合物を発見した[Novak et al., Investigation of the PDZ Domain Ligand Binding Site Using Chemically Modified Peptides, Bioorganic & Medicinal Chemistry Lett. 2002 (2471)（非特許文献１）；Fujii et al., Targeting PDZ-domain by Rationally Designed Non-peptide Small molecules(ポスター発表)(American Society of Cell Biology、2002年12月ミーティング)；Novak et al., Small molecule inhibitionof a PDZ domain interaction(ポスター発表)(American Society of Biochemistry and Molecular Biology, 2003年4月ミーティング)；Fujii et al., A selective irreversible inhibitor targeting a PDZ domain interaction protein, JACS 2003 125:12074（非特許文献２）]。
【０００７】
【非特許文献１】Novak et al., Investigation of the PDZ Domain Ligand Binding Site Using Chemically Modified Peptides, Bioorganic & Medicinal Chemistry Lett. 2002 (2471)
【非特許文献２】Fujii et al., A selective irreversible inhibitor targeting a PDZ domain interaction protein, JACS 2003 125:12074
【発明の開示】
【０００８】
発明の簡単な概要
本発明は、PDZドメイン相互作用、特にMAGIのPDZドメインの癌抑制性(腫瘍抑制因子)タンパク質PTENとの相互作用、およびディシュベルドタンパク質のPDZドメインのフリッツルドタンパク質との相互作用を阻害する点で有効であることがわかった新規化合物、ならびにこれらの化合物の使用によるPDZドメイン活性の阻害に関する。
【０００９】
新規化合物は、下記一般式、ならびに、それらの水和物および塩、ならびにそれらの標識された誘導体を有する。
2008505183.tif 000003
式中、nは、0、1または2であり；
X1は、NH、N(CH3)、CH2、CH(CH3)、C(CH3)2、O、S、S(O)、またはSO2であり；
R0は、C1-C3アルキル、シクロプロピル、ハロ、OR5およびmは、0、1または2であるS(O)mR5からなる群より選択され；
R1およびR2は独立して、C2-C8アルケニル、フェニルシクロプロピル、フェニルプロペニル、R6-X2-C(R8)(R8)-R7-、R6-X2-N(R8)-R7-、およびR10X3R7-からなる群より選択され；
R3およびR4は独立して、水素、メチルまたはエチルであり；
R5は、メチルまたはエチルであり；
R6は、水素、C1-C10アルキル、アリール、W、Y、NH2、NHCONR3R4、NHCOOR3およびNHSO2R9からなる群より選択され；
R7は、直接結合、1〜10個の炭素原子を有するアルキル基、アリール、pは0または1であり、およびqは1〜4の整数である-(NH)p(CH2CH2O)q(NH)p-、ならびにWからなる群より選択され；
R8は、H、Y、OH、-NHCONR3R4；-NHCOOR3；-NHSO2R9、-(CH2)rCO2R3、および(CH2)rCONR3R4からなる群より選択され、rは1〜3の整数であり；
R9は、アリールまたはC1-C6アルキルであり；
R10は、C1-C10アルキル、アリールおよびWから選択され；
X2は、直接結合、-NH-、-N(CH3)-、-NCONR3R4、-NCOOR3、および-NSO2R9からなる群より選択され；
X3は、O、S、SOおよびSO2から選択され；
Wは、飽和した炭素環式基または複素環式基であり；
Yは、COOH、COOR3、CONR3R4、CONHSO2R5、ヒドロキシメチル、-CH2COOH、CH2CONR3R4；および、5-テトラゾリルからなる群より選択される。
【００１０】
式(I)の化合物の好ましい態様は、X1は、NHまたはSであるもの、R1およびR2は独立して、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよいアルキルであるもの、R1はシクロアルキル基であるもの、およびR1はフェニル基であるものを含む。ひとつの態様において、R2は、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜8個、最も好ましくは3〜8個の炭素原子を有する未置換のアルキル基であり、ならびにR1は、同じ可能性で、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよいアルキル基である。別の態様において、R1は、フェニルまたはフェネチルであり、R2は、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよいアルキル基である。更に別の態様において、R2は、シクロアルキル基である。
【００１１】
本発明は、これらの化合物を調製するためのプロセスおよび中間体も含む。本発明は、このような化合物のライブラリーおよびそのようなライブラリーの調製法も含む。本発明は、化合物の標識された型、および様々な標識部分へ新規化合物を連結することにより調製された化学プローブも含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、PDZドメインを含むタンパク質、またはPDZドメインを、本明細書に説明した化合物の阻害有効量と接触させることにより、タンパク質のPDZドメインの他のタンパク質との相互作用、より詳細にはMAGIタンパク質またはディシュベルドタンパク質(Dvl)のPDZドメインの他のタンパク質との相互作用を阻害する方法を含む。更に別の局面において、本発明は、タンパク質またはそのドメインの、本明細書に説明された1種または複数の化合物との接触に関連している、タンパク質相互作用および／またはPDZドメイン機能を研究する方法に関する。本発明は、タンパク質相互作用の研究のための、またはPDZドメイン活性についてのタンパク質のスクリーニングのための、そのような化合物のアレイも含む。
【００１３】
このより詳細な局面において、本発明は、MAGIタンパク質、ディシュベルドタンパク質、もしくはそのようなタンパク質のPDZドメインを、本明細書に説明された化合物の阻害有効量と接触させることによる、MAGI内のPDZドメインの、癌原性(腫瘍抑制因子)タンパク質PTENとの相互作用の阻害、またはディシュベルドタンパク質内のPDZドメインと他のタンパク質、例えばフリッツルド(Fz)タンパク質の間の相互作用の阻害を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、癌細胞または癌性細胞を、PDZドメイン阻害有効量の本発明の化合物と接触させることを含む、癌を治療する治療法も提供する。これらの態様において、癌細胞は、典型的には患者内にあり、および接触する工程は、治療的物質、すなわち1種もしくは複数の本発明の化合物、またはそれらを含有する組成物の、その患者への投与により実施される。この方法は更に、化学療法薬または放射線療法などの、第二の治療的物質をその患者へ投与することを含む。癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、肉腫細胞、または中皮腫細胞、前立腺癌細胞、膵癌細胞、子宮頸癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、頭頸部癌細胞、肝細胞癌細胞、メラノーマ細胞、神経膠腫細胞、扁平上皮癌細胞、または膠芽細胞腫細胞であることができる。
【００１５】
Heらの2003年10月3日に出願された米国特許出願第10/678,639号、名称「Methods for Treating Cancer by Inhibiting WNT Signaling」は、その全体が本明細書に参照として組み入れられている。この出願は、Wntタンパク質のフリッツルド受容体への結合を阻害する物質と細胞を接触することによる、Wntタンパク質を過剰発現している癌細胞の増殖の阻害を開示している。PCT出願国際公開公報第02/088081号は、Wntの過剰発現は、頭頸部扁平上皮癌の出現に関連しているらしいと開示している。Wongらの論文(J Mol. Cell 12:1251 (2003年11月))は、Dvlタンパク質のFzへの結合は、FzのPDZドメインで生じることを明らかにしている。従ってPDZ-ドメイン/Dvl相互作用の阻害は、Wntシグナル伝達を阻害し、結果的に癌細胞の増殖を阻害する。
【００１６】
「フリッツルドタンパク質」(FzまたはFrz)という用語は、ショウジョウバエfrizzled遺伝子に関連した哺乳類タンパク質のファミリーを意味し、これは組織極性の発生において役割を果たす。フリッツルドファミリーは、少なくとも10種の哺乳類遺伝子を含む。ヒトフリッツルド受容体の例は、フリッツルド1、フリッツルド2、フリッツルド3、フリッツルド4、フリッツルド5、フリッツルド6、フリッツルド7、フリッツルド8、フリッツルド9およびフリッツルド10を含む。フリッツルドタンパク質受容体は、アミノ-末端リガンド結合ドメインを伴うG-タンパク質共役受容体に類似している膜貫通シグナル伝達の動的モデルに含まれる。
【００１７】
「ディシュベルド」または「Dvl」という用語は、ディシュベルドタンパク質ファミリーのメンバーを意味し、その完全長配列は、典型的には3種の保存ドメイン、Wnt拮抗タンパク質Axin内に存在する、DIXドメイン；タンパク質-タンパク質相互作用に関連する、PDZドメイン、およびRho GTPaseを調節するタンパク質中に認められるDEPドメインを有する。Dvlタンパク質は、例えば、Dvl-1、Dvl-2、およびDvl-3を含む。核酸およびタンパク質Dvl配列は、マウスおよびヒトを含む、様々な種について公知である。ヒトDvl-1、Dvl-2、およびDvl-3タンパク質の配列は、各々、参照配列NP_004412、NP_004413、およびNM_004414で入手可能である。
【００１８】
「Wntシグナル伝達のインヒビター」とは、例えば、ディシュベルド/フリッツルド相互作用と干渉し、結果的に例えばWntシグナル伝達の公知のアッセイ法において測定される(例えば、β-カテニンレベル、またはTcfおよびLef転写因子により制御された癌遺伝子発現の測定)Wntシグナル伝達を部分的または全体的に遮断するようなディシュベルドタンパク質に結合する化合物を意味する。
【００１９】
「Wntタンパク質を過剰発現する癌細胞」は、特定のWntタンパク質の発現が、同じ組織の正常細胞での発現レベルの少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍である癌細胞である。特定の遺伝子の発現レベルを決定する方法は、当技術分野において周知である。このような方法は、RT-PCR、遺伝子産物に対する抗体の使用などを含む。
【００２０】
更に別の局面において、本発明は、タンパク質を本発明の1種または複数の化合物と接触させることによる、PDZドメイン活性についてのタンパク質のスクリーニングに関係する。
【００２１】
PDZドメインを有するタンパク質の機能の研究またはPDZドメイン活性についてのタンパク質のスクリーニングは、本発明の単独の化合物、または多数を含む、多くの本発明の化合物の使用に関連することができる。後者は、個別のタンパク質を使用する多くの試験によるか、またはそのような化合物のアレイもしくはライブラリーにより、実施することができる。これらの化合物は、先に示した形であるか、または好ましくは標識部分を含むこともできる。加えてこれらの化合物は、例えばプレートまたは粒状物質などの、固相支持体に複合または結合することができ、ならびにこのような固相支持体および化合物の組合せは、本発明の別の局面である。
【００２２】
「インヒビター」は、結合するか、活性を部分的もしくは全体的に遮断するか、刺激するか、減少するか、予防するかもしくは遅延するか、またはシグナル伝達を失活するか、脱感作するかもしくはダウンレギュレーションする化合物を意味する。同様に「阻害」という用語は、活性化を部分的または全体的に遮断、刺激、減少、予防もしくは遅延するか、またはシグナル伝達を失活、脱感作もしくはダウンレギュレーションすることを意味する。化合物または組成物の「阻害有効量」は、特定のアッセイ法または患者において阻害を生じる量である。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、PDZドメイン相互作用、特にMAGI中のPDZドメインの癌抑制性(腫瘍抑制因子)タンパク質PTENとの相互作用、およびディシュベルドタンパク質中のPDZドメインのフリッツルドタンパク質または受容体との相互作用を阻害する点で有効であることがわかった新規化合物、ならびにこれらの化合物の使用によるPDZドメイン活性の阻害に関する。本発明は、このような化合物により生じた抗腫瘍作用、および癌の治療におけるそのような化合物の使用にも関する。
【００２４】
新規化合物は、下記一般式、ならびに、それらの水和物および塩、ならびにそれらの標識された誘導体を有する。
2008505183.tif 000004
式中、nは、0、1または2であり；
X1は、NH、N(CH3)、CH2、CH(CH3)、C(CH3)2、O、S、S(O)、またはSO2であり；
R0は、C1-C3アルキル、シクロプロピル、ハロ、OR5およびmは0、1または2であるS(O)mR5からなる群より選択され；
R1およびR2は、独立して、C2-C8アルケニル、フェニルシクロプロピル、フェニルプロペニル、R6-X2-C(R8)(R8)-R7-、R6-X2-N(R8)-R7-、およびR10X3R7-からなる群より選択され；
R3およびR4は、独立して、水素、メチルまたはエチルであり；
R5は、メチルまたはエチルであり；
R6は、水素、C1-C10アルキル、アリール、W、Y、NH2、NHCONR3R4、NHCOOR3およびNHSO2R9からなる群より選択され；
R7は、直接結合、1〜10個の炭素原子を有するアルキル基、アリール、pは0または1であり、およびqは1〜4の整数である-(NH)p(CH2CH2O)q(NH)p-、ならびにWからなる群より選択され；
R8は、H、Y、OH、-NHCONR3R4；-NHCOOR3；-NHSO2R9、-(CH2)rCO2R3、および(CH2)rCONR3R4からなる群より選択され、rは1〜3の整数であり；
R9は、アリールまたはC1-C6アルキルであり；
R10は、C1-C10アルキル、アリールおよびWから選択され；
X2は、直接結合、-NH-、-N(CH3)-、-NCONR3R4、-NCOOR3、および-NSO2R9からなる群より選択され；
X3は、O、S、SOおよびSO2から選択され；
Wは、飽和した炭素環式基または複素環式基であり；
Yは、COOH、COOR3、CONR3R4、CONHSO2R5、ヒドロキシメチル、-CH2COOH、CH2CONR3R4；および、5-テトラゾリルからなる群より選択される。
【００２５】
式(I)の化合物の好ましい態様は、X1は、NHまたはSであるもの、R1およびR2は独立して、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよいアルキルであるもの、およびR1はフェニル基であるものを含む。ひとつの態様において、R2は、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜8個、最も好ましくは3〜8個の炭素原子を有する、未置換のアルキル基であり、ならびにR1は、同じ可能性で、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよいアルキル基である。
【００２６】
R1およびR2の一部の好ましい態様は、C3-C8アルキル；C3-C6シクロアルキル；C3-C6シクロアルキル基で置換されたC1-C3アルキル、C3-C8アルケニル；mは0または1〜3の整数である-(CH2)mC6H5；-CH2OC6H5、CH2COC6H5、フェニル(C2-C4アルケニル)、または置換されたフェニル基を有するアナログ部分；置換されてもよいフェニルシクロプロピル；sは1〜3の整数である、-(CH2)sOH、-(CH2)sCONH2および-(CH2)sCOOH；フェニル；チエニル；ならびに、置換されてもよいC3-C6シクロアルキル-(C1-C3アルキル)を含む。特に好ましい態様は、フェニル、フェネチル、フェニルプロピル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、および様々なプロピル、ブチルおよびペンチル基である。ひとつの好ましい態様において、R1は、mは0または1〜3の整数である-(CH2)mC6H5であり、より好ましくはフェニルもしくはフェネチルであり、およびR2は、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよい、1〜8個、好ましくは3〜8個の炭素原子を有するアルキル基である。別の態様において、R1は、フェニル、シクロアルキル、カルボキシルまたはヒドロキシル基により置換されてもよい、1〜8個、好ましくは3〜8個の炭素原子を有するアルキル基であり、およびR2は、1〜8個、好ましくは3〜8個の炭素原子を有するアルキル基である。
【００２７】
本明細書において使用される「アルキル」という用語は、完全に飽和し、および指定された炭素原子の数を有する(すなわち、C1-C10は、1〜10個の炭素原子を意味する)、直鎖もしくは分枝鎖、または非芳香族環式の炭化水素ラジカル、またはそれらの組合せを意味する。非環式アルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチルなどの基、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの同族体および異性体を含むが、これらに限定されるものではない。環式アルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む。「低級アルキル」という用語は、最大10個、好ましくは最大6個の炭素原子を有する、言及された型の基を意味する。本発明における使用に関して、アルキル基は一般に、いずれか望ましいサイズであることができる。好ましくはこれらは最大20個、より好ましくは最大10個、最も好ましくは最大8個の炭素原子を含む。シクロアルキル基は、3〜8個の炭素原子を含む。
【００２８】
本明細書において使用される「アルケニル」という用語は、1個または複数のオレフィン系結合を含み、および指定された数の炭素原子を有する(すなわち、C1-C10は、1〜10個の炭素原子を意味する)、直鎖もしくは分枝鎖、または非芳香族環式の炭化水素ラジカル、またはそれらの組合せを意味する。非環式アルケニル基の例は、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、クロチル、ブタジエニルなどを含むが、これらに限定されるものではない。環式アルキル基の例は、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどを含む。本発明における使用に関して、アルケニル基は一般に、いずれか望ましいサイズであることができる。好ましくはこれらは最大20個、より好ましくは最大10個、最も好ましくは最大8個の炭素原子を含む。
【００２９】
本発明において使用されるアルキル基およびアルケニル基は、先に示されたように、未置換であるか、または単置換もしくは多置換であることができる。
【００３０】
置換されたアルキル、アルケニル、またはシクロアルキル基は、アリールアルキル基、すなわち1個または複数のアリール基で置換されたアルキル(シクロアルキルを含む)基を含み；例えば、ベンジル、フェネチル、1-フェニルプロピル、トリフェニルメチル、フェニルプロペニル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピルメチルなどである。これらは、フェニルシクロプロピルのような、置換基としてアリール基を有する、シクロアルキル基も含むことができる。アリールアルキル基内の1個または複数の芳香環は更に、例えばクロロベンジル、メチルベンジルなどの、他の脂肪族基と同様に置換されてもよい。置換されたアルキル基は、1個または複数の飽和または不飽和の複素環式基で置換されたアルキル基も含み、すなわち置換されたアルキル基は、ピリジルメチル、ピリジルエチル、ピペリジニルメチル、ピロリジニルメチル、モルホリニルメチル、キノリルメチルなどである。このような基は、1個または複数のハロゲン、ヒドロキシル基、低級アルキル基、または低級アルコキシ基(このような基の組合せを含む)により置換することもできる。
【００３１】
本明細書において使用される「アリール」は、このクラスの典型的置換または未置換の非脂肪族ヒドロカルビル基、すなわち、ポリ不飽和の、典型的には芳香族、炭化水素置換基を意味し、これは単環または互いに融合もしくは共有的に連結した多環(最大3個の環)、例えばフェニル、ナフチルなどであることができる。このクラスの部分は、インダニルなどのような、融合した環部分も含む。芳香族部分の置換基は、脂肪族基のものに類似している。本明細書において使用される「アリール」も、同様の複素環式基(時には「複素芳香族」基と称される)、すなわち環内に炭素原子および追加の、典型的には酸素、窒素、硫黄および／またはリンである、1個または複数のヘテロ原子を含むポリ不飽和環式部分、例えば、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピロールなど、ならびにベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリルなどの、融合環部分を含む。これらは、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、置換されてもよい低級アルキル、置換されてもよい低級アルコキシ、NCONR3R4およびNCOOR3、ならびに先の基R6の定義において含まれた他の置換基などの、1個または複数の置換基により置換されてもよい。
【００３２】
アリール化合物は、以下のような、蛍光性芳香族部分も含む。
2008505183.tif 000005
【００３３】
Wの炭素環式部分または複素環式部分は一般に、下記式を有する。
2008505183.tif 000006
式中、X4は、直接結合、NH、N(CH3)、CH2、CH(CH3)、C(CH3)2、O、S、S(O)、SO2、C(O)、NCONR3R4またはNCO2R8であり、ここでR3、R4およびR8は先に定義されたものであり、ならびに例えば以下である。
2008505183.tif 000007
【００３４】
一般に、式(I)の化合物は、アミノベンゼン、例えば：
2008505183.tif 000008
または基YおよびR0に関して先に指定した様々な部分を伴うアナログ化合物から出発し、引き続きの5位のヨード化、ならびに置換されたインドールを形成するためのR1CH≡TMSまたはR1CH≡TES(式中、TMSおよびTES鎖は、各々、トリメチルシリルおよびトリエチルシリル基である)のような化合物との反応、ならびに基-CHR2(CH2)nOHを付加するためのアルキル化などにより合成することができる。このような方法の例は、下記の「実施例」の項に記載する。
【００３５】
誘導体は、先に説明した化合物の基の適当な置換により生成することができる。
【００３６】
式(III)の化合物は一般に、下記のように合成することができる。3-フルオロ-4-ニトロ-6-メチルベンゾエートエステルを、第一アミンで、引き続き塩化スズ(2)で処理し、3-アルキルアミノ-4-アミノ-6-メチル安息香酸エステルを得る。この化合物は、酸性条件下で、2-ヒドロキシカルボン酸と反応され、引き続きアルカリ加水分解される(スキームA)。
2008505183.tif 000009
【００３７】
式(III)の化合物は以下のように合成することもできる。前記段落[0034]に示したように、アニリンのトリフルオロアセチル化された化合物は、硝酸処理され、引き続き塩化スズ(2)処理され、モノ-トリフルオロアセチル化されたジアミノベンゼンを生じる。トリフルオロアセチル基のアルキル化および脱保護は、モノアルキル化されたジアミノベンゼンを生じ、これは次にスキームAに示したように、式(III)の化合物に転換することができる。このプロセスは、下記スキームBに示している。
2008505183.tif 000010
【００３８】
下記表IAおよびIBは、先に示されたプロセスにより、個別にまたはライブラリーとしてのいずれかにより作製された、本発明の式(I)および(II)の代表的化合物を示す。
【００３９】
（表１Ａ）式I
2008505183.tif 000011
2008505183.tif 000012
（表１Ｂ）式II
2008505183.tif 000013
2008505183.tif 000014
【００４０】
式(I)および(II)の化合物ライブラリーの調製に使用することができる手法を、以下に示す(スキームC)。
2008505183.tif 000015
【００４１】
本プロセスは、式(I)の化合物の合成の最後から2番目の化合物としての、式(II)の化合物の生成を含む。しかし下記試験データからわかるように、式(II)の化合物は、単なる中間体ではなく、多くは活性も示す。
【００４２】
製剤および投与
タンパク質のPDZドメインと他のタンパク質の相互作用を阻害する本発明の化合物は、患者または対象へ、望ましい阻害を提供するのに有効な投与量、または状態を予防、治療もしくは管理するための、例えば神経保護薬および抗腫瘍薬として作用するための治療的有効量で投与することができる。これらの物質を含有する組成物は、患者または対象へ、患者において効果的な治療的反応を誘起するのに十分な量で投与される。これを実現するために適した量は、「阻害有効量」、「治療的有効投与量」または「治療的有効量」と定義される。投与量または量は、使用される特定の活性物質の効能および対象の状態により決定されると考えられる。投与量のサイズも、特定の対象における特定の化合物の投与に付随する有害作用の存在、性質および程度により決定されると考えられる。典型的には患者または対象はヒトである。しかし患者または対象は、非ヒト哺乳類(例えば霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ネコ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコなど)であってよく、雄または雌であってよい。
【００４３】
これらの化合物の毒性および治療効能は、細胞培養物および実験動物における標準の薬学的手法、例えばLD50(集団の50％において致死的な投与量)およびED50(集団の50％において治療的に有効な投与量)の決定により決定することができる。毒性作用と治療的作用の間の投与量比は、治療指数であり、これはLD50/ED50の比として表される。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することができるが、正常細胞の損傷の可能性を最小化し、これにより副作用を軽減するように、そのような化合物を罹患組織部位へ標的化する送達システムをデザインするように注意しなければならない。
【００４４】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータを使用し、ヒトにおいて使用するための用量範囲を処方することができる。このような化合物の用量は、ほとんどまたは全く毒性のないED50を含む循環血中濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、この範囲内を、使用される剤形および投与経路に応じて変動することができる。本発明の方法で使用される任意の化合物に関して、治療的有効投与量は、最初に細胞培養アッセイ法から推定される。細胞培養において決定されたIC50(症状の半分(half-maximal)阻害を実現する被験化合物の濃度)を含む循環血漿中濃度範囲を実現するように、投与量が動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用し、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定することができる。
【００４５】
本発明で使用するための薬学的組成物は、1種または複数の生理的に許容される担体または賦形剤を使用する常法により製剤化することができる。これらの化合物ならびにそれらの生理的に許容される塩および溶媒和物は、吸入、外用、舌下、鼻腔内、経口、非経口(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、膀胱内、もしくは髄腔内を含む)、または経粘膜的(鼻腔内、経口および経直腸を含む)を含む、いずれか適当な経路で投与するために製剤化することができる。
【００４６】
経口または舌下投与に関して、本発明の組成物の薬学的組成物は、結合剤、例えば、あらかじめゼラチン化されたコーンスターチ、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；充填剤、例えば、乳糖、微晶質セルロース、もしくはリン酸水素カルシウムなど；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカなど；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウムなど；または、湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどを含む薬学的に許容される賦形剤による、通常の手段により調製された、例えば、トローチ剤、錠剤またはカプセル剤の形状をとることができる。錠剤は、当技術分野において周知の方法でコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤、または懸濁剤の形をとることができるか、またはこれらは、使用前に水または他の適当な溶媒で構成するための、乾燥製品として提供することができる。このような液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、例として、懸濁化剤、例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化された食用脂肪など；乳化剤、例えば、レシチンまたはアカシアガムなど；非水性溶媒、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留された植物油など；ならびに、保存剤、例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸などと共に、通常の手段により調製することができる。これらの調製物は、緩衝剤塩、矯味矯臭剤、着色剤、および／または甘味剤を適宜含有することもできる。必要に応じて経口投与用調製物は、活性化合物の制御された放出をもたらすように適切に製剤化することができる。
【００４７】
吸入による投与に関して、化合物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当な気体などの、適当な噴射剤を使用し、加圧パックまたはネブライザーから提供されるエアゾールスプレーの形で都合良く送達することができる。加圧されたエアゾールの場合、測定量を送達するためのバルブを備えることにより、単位用量を決定することができる。化合物および適当な粉末基剤、例えば乳糖またはスターチの粉末混合物を含有する、吸入器または注入器において使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
【００４８】
これらの化合物は、例えばボーラス注射または連続点滴などの注入による非経口投与のために製剤化することができる。注入用製剤は、保存剤を添加し、例えばアンプルまたは反復投与量容器などの中、単位剤形で提供することができる。これらの組成物は、油性または水性の溶媒中の、懸濁剤、液剤、または乳剤のような形であることができ、ならびに製剤用物質、例えば懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含有することができる。または活性成分は、適当な溶媒、例えば無菌のパイロジェン非含有水により、使用前に構成するための散剤の形であることができる。
【００４９】
本発明の組成物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの通常の坐剤用基剤を含有する、坐剤または持続浣腸剤などの直腸用組成物で製剤化することもできる。
【００５０】
本発明の組成物は、経皮投与のために製剤化することもできる。経皮投与に関して、活性化合物は、当技術分野において一般に公知の軟膏剤、膏薬(salve)、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤される。経皮投与に適した薬学的組成物は、長期間の表皮との密な接触を維持することが意図されている離散型貼付剤として提供することができる。本発明の組成物が外用投与される場合、これらの組成物は、軟膏剤、クリーム剤、経皮用貼付剤、ローション剤、ゲル剤、スプレー剤、エアゾール、液剤、乳剤、または当業者に周知の他の形状で製剤化することができる。噴霧不可能な外用剤形に関して、外用適用に適合可能な担体または1種もしくは複数の賦形剤を含み、ならびに好ましくは水よりも大きい動的粘度を有する、粘性から半固形または固形までの形が、典型的には使用される。適当な製剤は、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、膏薬などを含むが、これらに限定されず、必要に応じてこれらは、滅菌されるか、または様々な特性、例えば浸透圧などに影響を及ぼすために佐剤(例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩)と混合される。他の適当な外用剤形は、活性成分が好ましくは、固形または液体の不活性担体と組合わされ、加圧された揮発物(例えばフレオンのような気体噴射剤)との混合物中、または中身をしぼり出せるプラスチック容器中にパッケージされている、噴霧可能なエアゾール調製物を含む。保湿剤または湿潤剤も、必要に応じて薬学的組成物および剤形添加することができる。そのような追加成分の例は、当技術分野において周知である。組成物は、皮膚貼付剤のような経皮送達のための装置、またはより複雑な装置中に含むこともできる。
【００５１】
これらの化合物は、デポー剤として製剤化することもできる。このような長期間作用する製剤は、埋植(例えば皮下もしくは筋肉内)によるかまたは筋肉内注射により投与することができる。従って例えば、これらの化合物は、適当な高分子材料または疎水性材料(例えば、許容される油分中の乳剤として)またはイオン交換樹脂と共に、または例えばやや溶けにくい塩のようなやや溶けにくい誘導体として、製剤化することができる。
【００５２】
これらの組成物は、例えば生分解性マトリックスまたは非生分解性注射可能な高分子ミクロスフェアもしくはマイクロカプセル、リポソーム中、エマルション中など、当技術分野において公知の制御された放出型または持続放出型の組成物であることもできる。
【００５３】
これらの組成物は必要に応じて、活性成分を含有する1個または複数の単位剤形を含む、パックまたはディスペンサー装置内で提供することができる。このパックは、例えば金属製またはプラスチック製のホイル、例えばブリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサー装置は、投与に関する指示書を備えることができる。
【００５４】
本発明の化合物は、それらの化学的または物理的性質に応じて、組成物中に含まれ、およびそれ自身で、またはその物質の良好な製剤もしくは投与に適したかもしくは必要な塩、溶媒和物、複合体またはキレートもしくは別の誘導体のような他の形で患者へ投与され得る。同様にこの物質のプロドラッグ、すなわち組成物の調製時または組成物の投与時のいずれかに患者または対象へ活性物質を放出する物質が、この組成物に含有されてもよい。
【００５５】
前述のように、本発明は、本発明の1種もしくは複数の化合物、またはこれを含有する組成物を、患者へ投与することを含む、癌を治療する治療法も提供する。この方法は、更に患者へ第二の治療薬、例えば化学療法薬または放射線療法を投与することを含む。治療される癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肉腫、中皮腫、前立腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞癌、メラノーマ、グリオーマ、扁平上皮細胞癌、またはグリア芽腫である。
【００５６】
本発明を実施する際に、単独の阻害化合物、または本発明の化合物の組合せを、患者へ投与することができる。効果的な化合物は、単独で、または同様のもしくは他の治療目的で投与される他の治療的物質と組合せて(または時間的に接近して)投与すること、例えばアジュバントまたは他の抗炎症剤と一緒に本発明の化合物を投与することができる。同様に1種または複数の本発明の化合物を含有する組成物は、他の薬学的物質または治療的物質も含むことができる。
【００５７】
本発明は、PDZドメインとの相互作用またはその阻害に関して物質を試験するためのアレイも含む。典型的にはそのようなアレイは、コンビナトリアルライブラリーまたは他のライブラリーについて試験するために使用されると考えられる。これらのアレイは、プレートの表面、例えばウェル内にに配置された化合物、または表面のある位置に結合された化合物を含むプレートのような、標準の装置を備える。プレートまたはアレイは、単独の種類の化合物を含んでもよく、またはこれは、予め決められた様式で配置された異なる化合物を含んでもよい。
【００５８】
従ってひとつの局面において、本発明は、PDZドメインを有するタンパク質のインヒビターについての、または所定のPDZドメインもしくはこれを含むタンパク質の活性の阻害の試験についての、インビトロアッセイ法、エクスビボアッセイ法、およびインビボアッセイ法を提供する。具体的には、PDZドメインへの結合またはその活性の阻害に関して試験するため、この活性を有する化合物について試験するために、これらのアッセイ法を使用することができる。典型的にはそのようなアッセイ法において、試験される単独または複数の化合物は、PDZドメインを有するタンパク質と接触され、そのドメインの正常な活性が阻害されているかどうかを評価するために適当な試験が実施される。例えばこのアッセイ法の結果は、比較標準として公知のタンパク質活性を使用し、被験化合物を伴わずこのタンパク質単独を含む対照アッセイ法と比較することができる。
【００５９】
または、タンパク質のPDZドメイン活性の阻害についての化合物の別のスクリーニングは、このようなタンパク質またはこれを含有もしくは発現している細胞を、本発明の化合物と接触させ、ならびにその化合物のドメインへの特異的結合を検出することを含む。この検出は、キャピラリー電気泳動、ウェスタンブロット、質量分析、ELISA、免疫クロマトグラフィーまたは免疫組織化学などの方法によって実施することができる。
【００６０】
被験化合物のタンパク質PDZドメインへの結合は、溶液中、二分子膜内、固相に付着して、脂質単層内、またはベシクル内で行うことができる。被験化合物の結合は、活性の変化を測定もしくは観察することによるか、または例えば顕微鏡的特徴もしくはクロマトグラフィー特性もしくは溶解特性の変化より、試験することができる。被験化合物の結合は、例えば非標識の被験化合物が、このタンパク質と参照化合物のビオチン化されたもしくは蛍光誘導体との間の相互作用を妨害するかどうかを評価することによる、競合的結合アッセイ法によっても評価することができる。
【００６１】
本発明のある局面を形成するアッセイ法は、自動化されたアッセイ工程を使用し、巨大なケミカルライブラリーを1種または複数のタンパク質の阻害についてスクリーニングするようにデザインすることができ、これは典型的には平行して(例えばロボット式アッセイ法においてマイクロタイタープレート上でマイクロタイターフォーマットで)試行される。好ましいひとつの態様において、非常に多数の可能性のあるインヒビター化合物を含むコンビナトリアルケミカルまたは他のライブラリーを提供することに関連している、ハイスループットスクリーニング法が使用される。このようなライブラリーは次に、望ましい活性を示すライブラリーのメンバー(特定の化学種またはサブクラスのいずれか)を同定するために、本明細書に説明されたような1種または複数のアッセイ法でスクリーニングされる。モジュレーターについてのスクリーニングの場合、必要な陽性結果は、特定の被験物質が良好な医薬であることは示さない。むしろ陽性試験結果は、タンパク質のPDZドメインの活性を阻害するために、その試験物質を使用することができることを単純に示すことができる。従って同定された化合物は、PDZドメインインヒビター発見のための通常の「リード化合物」として利用するか、またはそれら自身を可能性のあるもしくは実際の治療薬として使用することができる。
【００６２】
従って本発明の別の局面は、式(I)および(II)のような本明細書の化合物の全般的な定義の範囲内である、本明細書に説明されたPDZドメインの活性、すなわち阻害を元に試験するために作製された化合物のコンビナトリアルライブラリーのようなライブラリーにある。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬のようなケミカル「ビルディングブロック」を数多く組合せることによる、化学合成または生物学的合成のいずれかにより生成された化合物の集合である。例えば、線状(linear)コンビナトリアルケミカルライブラリーは、所定の化合物型に関して可能な方法毎に、ケミカルビルディングブロックのセットを組合せることにより形成される。
【００６３】
コンビナトリアルライブラリーを調製する装置は、市販されている(例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech, ルイスビル, KY；Symphony, Rainin, Woburn, MA；433 A、Applied Biosystems, フォスターシティ, CA9050, Plus, Millipore, ベッドフォード, MA参照)。
【００６４】
それぞれ多数の多様な式(I)または(II)の化合物を含むケミカルライブラリーは、本発明のある局面であり、ならびに個々の化合物について先に説明された平行合成を実施することにより合成することができる。
【００６５】
機能するPDZドメインの阻害についてのスクリーニングまたは試験に使用される化合物は、典型的には粒子または非粒子であることができる固形不活性支持体上に支えられる。典型的には固定化は、これらの化合物の固形支持体材料への共有的結合またはその他の結合により実現される。この結合は、支持体の化学組成物の一部であるかまたは例えば活性化された表面(例えばガラスの場合)を提供するためにこれに付着した部分により形成することができる。化合物の固定化に適した固形支持体の多くの種類が、当技術分野において公知である。これらは、ナイロン、ニトロセルロース、活性化されたアガロース、ジアゾ化されたセルロース、ラテックス、プラスチック、ポリスチレン、ガラスおよびポリマー被覆された表面を含む。これらの固形支持体は、メンブレン、マイクロタイタープレート、ビーズ、プローブ、ディップスティックなどの多くの様式で使用される。様々な化合物を直接またはリンカーを介してこれらの固形支持体へ共有的に連結するために、多種多様な化学手法が公知である。
【００６６】
典型的には任意の固形支持体の使用は、求核基と反応することが可能である「反応基」を含まなければならない化合物と反応するために、求核基の存在が必要である。または「反応基」は、オリゴヌクレオチド中に存在するかまたはそれに付着される求核基と反応するために、固形支持体に存在するかまたはこれへ導入される。適当な求核基または部分は、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アミノおよび活性化されたカルボキシル基を含むが、これらおよび他の求核基(反応基)と反応することが可能であるこれらの基は、ジクロロトリアジニル、アルキルエポキシ、マレイミド、ブロモアセチル基などを含む。求核基または反応基を固形支持体上に導入する化学手法は、当技術分野において公知であり、ナイロン(米国特許第5,514,785号)、ガラス(Rodgers et al., Anal. Biochem., 23-30 (1999))、アガロース(Highsmith et al., J., Biotechniques 12:418-23 (1992)およびポリスチレン(Gosh et al., Nuc. Acid Res., 15:5353-5372(1987))を活性化する手法を含む。固形支持体上および被験化合物中の反応基または求核基のいずれかの存在に応じ、カップリングは、直接または二官能性試薬のいずれかにより行うことができる。二官能性試薬およびカップリング試薬は、当技術分野において周知であり、商業的供給業者から多くを入手することができる。
【００６７】
典型的にはガラス表面は、適当なシロキサン試薬を使用する、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基またはエポキシル基のガラスへの導入により活性化される。特に、オリゴヌクレオチドアレイのガラス支持体上への固定化について説明されており：Guoら(Nuc. Acid Res., 22:5456-5465(1994))は、1,4-フェニレンジイソチオシアナートを使用し；Joosら(Anal. Biochem., 247:96-101(1997))は、無水コハク酸およびカルボジイミドカップリングを使用し；ならびに、Beattiら(Mol. Biotech., 4:213-225(1995))は、3-グリシドオキシプロピルトリメトキシシランを使用している。
【００６８】
以下は、本発明の化合物の調製の実施例である。
【００６９】
実施例1：PDZドメインインヒビター(2-(1-ヒドロキシペンチル)-3-(2-フェニルエチル)-6-メチル)インドール-5-カルボン酸[式(I)；表IA、化合物1]の合成
この合成に関する全般的スキームは、(スキームD)であった。
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【００７０】
(4-アミノ-5-ヨード-2-メチル)安息香酸メチル(4)
2-ヨード-5-ニトロトルエン(1, 10g)、トリエチルアミン(16mL)、酢酸パラジウム(68mg)、メタノール(20mL)およびDMF(10mL)の混合物を、一酸化炭素大気(1atm)下で90℃で一晩攪拌した。反応混合物を、酢酸エチル(200mL)で希釈し、水で2回(各100mL)、引き続きブライン(100mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発させた。残渣を、短いシリカゲルパッドを通して濾過し、蒸発させ、2を粗油状物として得た。2、エタノール(140mL)、水(2mL)、ヒドラジン一水和物(3.8mL)、三塩化鉄(0.17g)およびチャコール(0.1g)の混合物を、還流下で3時間攪拌した。反応混合液を濾過し、酢酸エチル(200mL)で希釈し、水で2回(各100mL)、引き続きブライン(100mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発させた。残渣を、短いシリカゲルパッドを通して濾過し、蒸発させ、3を粗油状物として得た。3、メタノール(33mL)、炭酸カルシウム(10g)、一塩化ヨウ素溶液(33mL, ジクロロメタン中1M)を、4℃でゆっくり添加し、周囲温度で一晩攪拌した。反応混合液を濾過し、酢酸エチル(200mL)で希釈し、硫酸ナトリウム水溶液(100mL)、引き続きブライン(100mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発させた。残渣を、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル0.2L、溶離液：ヘキサン中10％酢酸エチル)により精製し、蒸発させ、4(4.30g)を淡褐色結晶として得た。
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【００７１】
(2-(1-オキソペンチル)-3-(2-フェニルエチル)-6-メチル)インドール-5-カルボン酸メチル(7)
4(250mg)、1-トリエチルシリル-4-フェニルブチン(5, 320mg)、酢酸パラジウム(30mg)、炭酸ナトリウム(450mg)、および脱気したDMF(2mL)の混合物を、アルゴン大気下、100℃で5時間攪拌した。反応混合液を、フルオリシル(fluorisil)を通して濾過し、20％酢酸エチル/ヘキサンで溶離し、蒸発させ、インドール6を非晶質として得た。6、ジクロロメタン(3mL)および吉草酸クロリド(0.52mL)の混合物へ、塩化亜鉛(ジエチルエーテル溶液中1M、0.77mL)を、4℃でゆっくり添加し、4℃で3時間攪拌した。反応混合液を、メタノール(3mL)で処理し、酢酸エチル(30mL)で希釈し、水で2回(各10mL)、炭酸ナトリウム水溶液(10mL)、引き続きブライン(10mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発させた。粗残渣を、ヘキサンで洗浄し、7(165mg)を褐色固形物として得た。
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【００７２】
(2-(1-ヒドロキシペンチル)-3-(2-フェニルエチル)-6-メチル)インドール-5-カルボン酸(9)
7(210mg)、メタノール(2mL)、1,4-ジオキサン(2mL)および10％水酸化ナトリウム水溶液(0.90mL)の混合物を、90℃で3時間加熱し、8の溶液を得た。水素化ホウ素ナトリウム(210mg)をこの溶液に、室温で添加した。この反応混合物を周囲温度で一晩攪拌し、酢酸エチル(30mL)で希釈し、ブライン(10mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発させた。粗残渣を、フルオリシルを通して濾過し、40％酢酸エチル/ヘキサンで溶離し、蒸発させた。残渣を、ヘキサンで洗浄し、9(161mg)を淡褐色結晶として得た。
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【００７３】
タンパク質発現 
MAGI-3の第二PDZドメインのGST融合構築体からなるプラスミドを、Genentechから得た。このプラスミドを、BL21 DE3細胞に形質転換し、37℃でO.D.600が0.8になるまで増殖し、1mM IPTGで誘導した。3時間後、これらの細胞を収集し、溶解し、およびこのタンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Pharmacia)のスラリーを通して精製した。このタンパク質を、アッセイ緩衝液(35mM HEPES、pH7.4、0.01％トライトンX-100、10％グリセロール)に対して透析し、10,000MWカットオフ値のCentriconフィルター(Waters)で濃縮した。タンパク質純度は、クマシーおよび銀染色により、SDS-PAGEで証明した。タンパク質の定量は、PierceのBCAプロトコールにより行った。このタンパク質は、アッセイ緩衝液中、-80℃で貯蔵した。GST単独を同じ方法で発現し、精製し、貯蔵した。
【００７４】
結合アッセイ法
蛍光偏光競合アッセイ法を使用し、前記化合物のMAGI-3 PDZ2への結合を検出した。PTENのフルオレセイン標識したカルボキシ末端配列、OregonGreen(商標)-PFDEDQHTQITKV-COOHを、プローブとして使用した。陽性対照のために、本発明者らは、PFDEDQHTQITWV-COOHを選択したが、これはMAGI-3 PDZ2の最高の親和性ペプチド配列であることがわかっている。標識されたペプチドを合成するために、本発明者らは、Wang樹脂上で標準Fmoc条件を使用し、13残基ペプチドを構築した。典型的カップリングサイクルは、末端アミノ酸の無水DMF中20％ピペリジンによる脱保護、樹脂の2〜3倍のDMF、次に塩化メチレンルおよび再度これら両方による洗浄、ならびにニンヒドリンカイゼル試験による遊離アミンの存在の決定を含む。スラリーは、無水DMF中、HBTUのカップリング試薬2.4当量、Fmoc保護されたアミノ酸の延長するペプチドに次に追加されるN末端アミノ酸2.5当量、5当量のDIEAを含有した。このアミノ酸は、2〜3時間カップリングさせ、カイゼル試験を用い、完成度を決定した。カイゼル試験結果陽性である場合には、カップリング工程を繰り返した。この方法を、ペプチドの各残渣に使用した。完成したペプチドは、チオアニソールおよびフェノールを含有するスカベンジャーのカクテルを伴う95％TFAにより、樹脂から切断した。このペプチドは、エーテルで沈殿し、凍結乾燥した。ペプチドは、HPLCを用いて精製し、MALDI質量分析により同定した。図1に結果を示す。
【００７５】
化合物のMAGI-3タンパク質のPDZ2ドメインへの結合を検出するために、競合偏光アッセイ法を使用した。緩衝液は、35mM HEPES(pH7.4)、トライトンX-100 0.01％、および10％グリセロールを含んだ。タンパク質を、最終濃度300nMで、およびプローブ10nMを添加した。その後競合物を、最終濃度10pM〜300μMの範囲で添加した。総容積20μLの試料を、分析のために、384ウェルCorning不透明プレートに3回通り移した。蛍光偏光を、LJL Biosystemsプレートリーダーにより平衡時に測定した。競合データは、片側競合表示(one-site competition expression)に合致し、および非ペプチド化合物のIC50値を比較した。
【００７６】
化合物のDvl過剰発現している癌細胞におけるアポトーシス作用
ディシュベルド(Dvl)タンパク質のPDZドメインとFzタンパク質(Wnt受容体)の間の相互作用に対する化合物の阻害作用を示すために、表1Aの化合物1を、アポトーシス作用について試験した。細胞株H513およびH1703を使用し、被験化合物は0(対照)、10μMおよび100μMで適用した。結果は表2に示す。
【００７７】
（表２）
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【００７８】
インビボにおけるヒト癌細胞増殖の阻害
化合物1(実施例1)を、ヒト癌細胞異種移植片を有する免疫欠損ヌードマウスにおけるインビボ試験を用い、抗腫瘍効率について試験した。ヒトメラノーマ細胞株LOXを、8x105個細胞/動物で注射し、およびヒト肺癌細胞株H460を、106個細胞/動物で注射した。ヒト癌細胞株を、正常細胞培養用培地で容量100μLに調節し、ヌードマウスの背部領域へ皮下注射した。注射後、癌細胞異種移植片を、7日間増殖させた。その後、マウスを、各群8匹の動物からなるよう無作為に分類した(n=8)。動物は個別に耳にタグを付けた。
【００７９】
化合物1を水に溶解し、アリコートで貯蔵し、使用時まで-80℃で貯蔵した。注射に使用した投与量は、50mg/kg体重として計算した。平均マウス体重は、20g±0.5gであった。被験化合物(1mg)の量を、PBSで80μLに調節し、14日間毎日(i.p.)注射した。対照は、PBS単独であった。腫瘍サイズおよびマウス体重を、初回注射1週間後に測定した。
【００８０】
結果は、化合物1(表2参照)の注射により2週間の最後までに、その注射からの腫瘍サイズは、PBS対照と比較し、LOX異種移植片で66％およびH460異種移植片で20％縮小したことを示した。平均のマウス体重は、PBS対照について24.5gおよび化合物1-注射した動物について22.2gであった。結果は、表3に示した。
【００８１】
（表３）
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【００８２】
引き続きの同様の試験において、化合物1を、ヒト癌細胞異種移植片を有する免疫欠損ヌードマウスにおけるインビボ試験を用い、抗腫瘍効果について試験した。
【００８３】
ヒトメラノーマ細胞株LOXを、8000個細胞/動物で注射し、およびヒト肺癌細胞株H460を、1000000個細胞/動物で注射した。ヒト癌細胞株を、正常細胞培養用培地で容量100μLに調節し、ヌードマウスの背部領域へ皮下注射した。注射後、癌細胞異種移植片を、7日間増殖させた。その後、マウスを、各群8匹の動物からなるよう無作為に分類した(n=8)。動物は個別に耳にタグを付けた。
【００８４】
化合物1をナトリウム塩として水に溶解した。注射に使用した投与量は、50mg/kg体重として計算した。平均マウス体重は、24.2g±3.2gであった。1mgの化合物1を、PBSで80μLに調節し、14日間毎日(i.p.)注射した。対照は、PBS単独であった。腫瘍サイズおよびマウス体重を、初回注射の1週間後に測定した。
【００８５】
結果は、化合物1(表1A参照)の注射により2週間の最後までに、その注射からの腫瘍サイズは、PBS対照と比較し、LOX異種移植片で82％およびH460異種移植片で34％縮小したことを示した。平均のマウス体重は、PBS対照について25.0gおよびFJ-9-注射した動物について22.2gであった。結果は、表4に示した。
【００８６】
（表４）
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【００８７】
表1Aおよび1Bの化合物1および他の化合物を、ディシュベルド(Dvl)タンパク質のPDZドメインとFzタンパク質(Wnt受容体)の間の相互作用に対する化合物の阻害作用を示すために、アポトーシス作用について同様に試験した。細胞株H460およびLOXを利用し、被験化合物は3日間10μMで適用した。培地中の被験化合物で処理した培養した細胞を、トリプシン処理により収集し、Annexin V FITCアポトーシス検出キット(Oncogene Science, ケンブリッジ, MA)を製造業者のプロトコールに従い用いて染色した。染色した細胞を直ぐに、フローサイトメトリーにより分析した(FACScan； Becton-Dickinson, フランクリンレーク, NJ)。結果を表5に示す。
【００８８】
（表５）
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【００８９】
特に抗腫瘍活性について、本発明の化合物を標的とする他のタンパク質は、EPB50、ZO-1、nNOS、ERBINおよびMUPP1を含む。
【００９０】
本明細書に説明した実施例および態様は、単に例証を目的とし、それらを考慮し、様々な修飾および変更が当業者に示唆され、ならびにこれらは本明細書および添付された「特許請求の範囲」の精神および範囲内であることが理解される。
【００９１】
本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願はそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に参照として組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の化合物の、GST融合したMAGI3 PDZ2ドメインタンパク質GMP32への結合を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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