(57)【要約】本発明は、GalNAcT2の切断型変異体に関連した組成物および方法を特徴としている。特に本発明は、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドを特徴としている。本発明は、このような切断型ポリペプチドをコードしている核酸に加え、そのようなポリペプチドを発現および使用するベクター、宿主細胞、発現システム、システム、および方法も特徴としている。2008512085.tif 000014
2008512085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸であって、該切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、コードされるポリペプチドがアミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2切断変異体ポリペプチドではないという条件で、GalNAcT2シグナルドメインの全てまたは一部を欠いている、単離核酸。
【請求項２】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドが更に、コードされるポリペプチドがアミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2切断変異体ポリペプチドではないという条件で、GalNAcT2膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いている、請求項1記載の単離核酸。
【請求項３】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドが更に、コードされるポリペプチドがアミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2切断変異体ポリペプチドではないという条件で、GalNAcT2基幹ドメインの全てまたは一部を欠いている、請求項2記載の単離核酸。
【請求項４】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、該核酸配列が、配列番号:3、配列番号:7、および配列番号:9からなる群より選択される核酸と少なくとも90％の一致度を有する、請求項1記載の単離核酸。
【請求項５】
配列番号:3、配列番号:7、および配列番号:9からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項4記載の単離核酸。
【請求項６】
配列番号:3、配列番号:7、および配列番号:9からなる群より選択される核酸配列からなる、請求項4記載の単離核酸。
【請求項７】
融合ポリペプチドをコードする単離キメラ核酸であって、該融合ポリペプチドが、請求項1記載の単離核酸によりコードされる第二のポリペプチドに共有的に連結されたタグポリペプチドを含む、キメラ核酸。
【請求項８】
タグポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-転移酵素タグ、FLAG-タグ、およびデンプン結合ドメインタグからなる群より選択される、請求項7記載の単離キメラ核酸。
【請求項９】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドが、該ポリペプチドはアミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2ポリペプチド切断変異体ではないという条件で、GalNAcT2シグナルドメインの全てまたは一部を欠いている、単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチド。
【請求項１０】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドが更に、該ポリペプチドはアミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2ポリペプチド切断変異体ではないという条件で、GalNAcT2膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いている、請求項9記載の単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチド。
【請求項１１】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドが更に、該ポリペプチドはアミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2ポリペプチド切断変異体ではないという条件で、GalNAcT2基幹ドメインの全てまたは一部を欠いている、請求項10記載の単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号:4、配列番号:8、および配列番号:10からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも90％の一致度を有する、請求項9記載の単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号:4、配列番号:8、および配列番号:10からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項9記載の単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号:4、配列番号:8、および配列番号:10からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項9記載の単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項9記載の単離された切断型GalNAcT2ポリペプチドに共有的に連結されたタグポリペプチドを含む、単離キメラポリペプチド。
【請求項１６】
タグポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-転移酵素タグ、FLAG-タグ、およびデンプン結合ドメインタグからなる群より選択される、請求項15記載の単離キメラポリペプチド。
【請求項１７】
請求項1のいずれか記載の単離核酸であって、それらに機能的に連結されたプロモーター/調節配列を更に含む核酸。
【請求項１８】
請求項1記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項18記載の単離発現ベクターを含む、組換え細胞。
【請求項２０】
真核細胞または原核細胞である、請求項19記載の組換え細胞。
【請求項２１】
真核細胞が、哺乳類細胞、昆虫細胞、および真菌細胞からなる群より選択される、請求項20記載の組換え細胞。
【請求項２２】
昆虫細胞が、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞、またはショウジョウバエ(Drosophila)Schneider S2細胞からなる群より選択される、請求項21記載の組換え細胞。
【請求項２３】
原核細胞が、大腸菌(E. coli)細胞および枯草菌(B. subtilis)細胞からなる群より選択される、請求項20記載の組換え細胞。
【請求項２４】
切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドを作製する方法であって、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項20記載の組換え細胞を増殖させる工程を含む、方法。
【請求項２５】
GalNAc部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、請求項9記載のポリペプチドを、GalNAc部分および受容体部分と共にインキュベーションする工程を含み、ここで該ポリペプチドは、該GalNAc部分の該受容体部分への共有的連結を媒介し、これによりGalNAc部分の受容体部分への転移を触媒し、生成物糖類、または生成物糖タンパク質、または生成物糖ペプチドを生成する、方法。
【請求項２６】
受容体部分が、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)タンパク質である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
受容体部分が、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、βおよびγ、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチド受容体が糖ペプチドである、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
GalNAc部分がポリエチレングリコール部分を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
生成物糖類、生成物糖タンパク質、または生成物糖ペプチドが、商業的規模で生成される、請求項25記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、GalNAcT2の切断型変異体に関連した組成物および方法を特徴としている。特に本発明は、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドを特徴としている。本発明は、このような切断型ポリペプチドをコードしている核酸に加え、そのようなポリペプチドを発現および使用するベクター、宿主細胞、発現システム、および方法も特徴としている。
【０００２】
関連出願の相互参照
本明細書は、2004年6月3日に出願された米国特許仮出願第60/576,530号、および2004年8月3日に出願された米国特許仮出願第60/598,584号の恩典を主張するものであり、これらの出願は両方とも本明細書に参照として組入れられている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
オリゴ糖構造および多くの種類の糖ペプチドには多くの多様性があることが、事実上わかっており、これらは一部、多数の糖転移酵素により合成される。糖転移酵素は、糖鎖を開始または伸長するために活性化された単糖またはオリゴ糖残基を、存在する受容体分子へ転移することにより、糖脂質、糖ペプチド、および多糖の合成を触媒する。触媒反応は、適当なドメインによる供与体および受容体の両方に加え、酵素の触媒部位の認識に関連すると考えられる。
【０００４】
多くのペプチド治療薬、および多くの可能性のあるペプチド治療薬は、グリコシル化されたペプチドである。組換え糖ペプチドの生成は、組換え非グリコシル化ペプチドとは対照的に、組換えにより作出されたペプチドに、細胞内でまたはそのペプチドが細胞により産生された後のいずれかに、追加のプロセッシング工程が供されることが必要であり、ここでプロセッシング工程は、インビトロにおいて実行される。このペプチドは、糖転移酵素を使用し、1個または複数のグリコシル基をペプチド上に導入するために、酵素により処理することができる。特に糖転移酵素は、1個または複数のグリコシル基をペプチドへ共有的に結合する。
【０００５】
糖ペプチドを作製するためのペプチドプロセッシングの余分のインビトロ工程は、時間がかかり経費もかかる。これは、一つには、糖ペプチド治療薬を作製するための、ペプチドおよび糖ペプチドのインビトログリコシル化のための組換え糖転移酵素の作製に負担が多く経費がかかるためである。組換え糖治療薬(glycotherapeutics)の需要および有用性は増加しているので、糖ペプチドをより効率的に調製するための新たな方法が必要である。更に、ますます糖ペプチドは様々な疾患の治療に有用であることがわかってきたので、それらの生産コストをより低下する方法の必要性が存在する。更に、当技術分野において、糖ペプチド治療薬を開発および改善する際に使用する組換え糖ペプチドを効率的に製造する方法を開発する必要性も存在する。
【０００６】
糖転移酵素は概して、WO 03/031464(PCT/US02/32263)(特許文献1)において検証されており、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている。治療用糖ペプチドの開発および製造に有用なそのような特定の糖転移酵素の一つは、GalNAcT2である。GalNAcT2またはN-アセチル-D-ガラクトサミン転移酵素は、GalNAc供与体からGalNAc受容体へのGalNAcの転移を触媒する。完全長ヒトGalNAcT2酵素は、Bennettら(1996, J Biol Chem. 271:17006-17012(非特許文献1))により明らかにされている。しかし増強された触媒活性または増強された安定性のような、増強された生物学的活性を有するこの酵素の有用な変異体の同定は、これまでは報告されていない。
【０００７】
過去に、糖ペプチドのインビトロ生成のための組換え糖転移酵素の利用可能性を増大する努力が成されている。時にはオリゴ糖または糖ペプチドの小規模生成に適している組換え糖転移酵素に関して、限定された量の研究が行われている。例えばWhiteらは、ヒトGalNAcT2の可溶性型を明らかにしている(1995, J. Biol. Chem., 270:24156-24165(非特許文献2))。加えてKurosawaら(1994, J Biol Chem. 269:1402-1409(非特許文献3))は、完全長酵素からアミノ酸残基1〜232を欠いている、ニワトリGalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の切断型変異体を説明している。しかし、Kurosawaらにより説明された切断型酵素は、他のST6GalNAcI酵素の基質特異性を欠いている。従って、糖ペプチド治療薬の製造を含む、「製薬的規模」でのプロセスおよび反応に適した活性を有する組換え糖転移酵素の必要性が依然存在する。特に、好ましい機能および構造の特徴を有する組換え糖転移酵素の必要性が存在する。更に組換え糖転移酵素の同定および特徴決定のための効率的方法に加え、そのような糖転移酵素の生成の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性に取組みかつこれを満たすものである。
【０００８】
【特許文献１】WO 03/031464 (PCT/US02/32263)
【非特許文献１】Bennettら、J. Biol Chem. 271:17006-17012 (1996)
【非特許文献２】Whiteら、J. Biol. Chem., 270:24156-24165 (1995)
【非特許文献３】Kurosawaら、J. Biol Chem. 269:1402-1409 (1994)
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な概要
一つの局面において、本発明は、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む、単離された核酸を提供する。切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、コードされたポリペプチドは、アミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2切断型変異体ポリペプチドではないという条件で、GalNAcT2シグナルドメインの全てまたは一部を欠いているか、または加えてGalNAcT2膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いているか、または加えてGalNAcT2基幹ドメイン(stem domain)の全てまたは一部を欠いている。
【００１０】
一つの態様において、単離された核酸は、配列番号:3、配列番号:7および配列番号:9からなる群より選択された核酸と少なくとも90％の一致度を有する核酸配列を含む。別の態様において、単離された核酸は、配列番号:3、配列番号:7および配列番号:9からなる群より選択される核酸と少なくとも95％の一致度を有する核酸配列を含む。更なる態様において、単離された核酸は、配列番号:3、配列番号:7および配列番号:9から選択された核酸配列を含む。
【００１１】
一部の態様において、単離された核酸は、融合ポリペプチドをコードしている単離されたキメラ核酸である。融合ポリペプチドは、本明細書で説明されたような、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドへ共有的に連結されたタグポリペプチドを含むことができる。タグポリペプチドの例は、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-転移酵素タグ、FLAG-タグ、およびデンプン結合ドメインタグを含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、コードされたポリペプチドは、アミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2切断型変異体ポリペプチドではないという条件で、GalNAcT2シグナルドメインの全てまたは一部を欠いているか、または加えてGalNAcT2膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いているか、または加えてGalNAcT2基幹ドメインの全てまたは一部を欠いている、単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドを提供する。一つの態様において、単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:8および配列番号:10からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも90％または95％の一致度を有する。更なる局面において、単離された切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:8および配列番号:10から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一部の態様において、単離された切断型GalNAcT2ポリペプチドは、単離された切断型GalNAcT2に共有的に連結されたタグポリペプチドを含むキメラポリペプチドを単離した。タグポリペプチドの例は、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-転移酵素タグ、FLAG-タグ、およびデンプン結合ドメインタグを含む。
【００１４】
切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離された核酸は、例えば発現ベクター内で、プロモーター/調節配列へも機能的に連結され得る。本発明は、そのような発現ベクターを含む宿主細胞も含む。宿主細胞は、例えば真核細胞または原核細胞である。真核細胞は、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、および真菌細胞を含む。一部の好ましい哺乳類宿主細胞は、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞、またはショウジョウバエ(Drosophila)Schneider S2細胞である。原核宿主細胞は、例えば大腸菌(E. coli)細胞および枯草菌(B. subtilis)細胞を含む。
【００１５】
宿主細胞を使用し、組換え宿主細胞の切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドの発現に適した条件下での増殖により、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドを作製することができる。好ましい態様において、十分な切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、糖タンパク質または糖ペプチドの商業的規模での製造を可能にする。
【００１６】
更なる局面において、本発明は、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドを、GalNAc部分および受容体部分と共にインキュベーションすることを含む、GalNAc部分の受容体部分への転移を触媒する方法を含み、ここでポリペプチドは、GalNAc部分の受容体部分への共有的連結を媒介し、これによりGalNAc部分の受容体部分への転移を触媒し、生成物糖類、または生成物糖タンパク質、または生成物糖ペプチドを生成する。一つの態様において、受容体部分は、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)タンパク質である。別の態様において、受容体部分は、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、-βおよび-γ、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、およびリソソーム加水分解酵素から選択される。更なる態様において、ポリペプチド受容体は糖ペプチドである。一部の態様において、GalNAc部分は、ポリエチレングリコール部分を含む。別の態様において、生成物糖類、生成物糖タンパク質、または生成物糖ペプチドは、商業的規模で製造される。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明の組成物および方法は、ヒトGalNAcT2ポリペプチドの切断変異体、これらのタンパク質をコードしている単離された核酸、およびそれらの使用法を包含している。GalNAcT2ポリペプチドは、GalNAc供与体からGalNAc受容体へのGalNAcの転移を触媒する。
【００１８】
糖転移酵素GalNAcT2は、治療用糖ペプチドのグリコシル化に必須の試薬である。加えてGalNAcT2は、治療上重要な糖ペプチドおよびオリゴ糖治療薬の研究および開発に重要な試薬である。GalNAcT2酵素は典型的には、天然の供給源から、または退屈で費用のかかるインビトロおよび組換え供給源から単離されおよび精製される。本発明は、GalNAcT2酵素の生成の単純化されより費用効果のある方法に関する組成物および方法を提供する。特に本発明は、それらの完全長酵素対応物と比べ改善されおよび有用な特性を有する、切断型GalNAcT2酵素に関する組成物および方法を提供する。
【００１９】
本発明の切断型糖転移酵素は、グリコシル化されたペプチドのインビボおよびインビトロ調製、更には本発明の切断型糖転移酵素により転移することができる特異的グリコシル残基を含むオリゴ糖の生成に有用である。これは、GalNAcT2ポリペプチドの切断型は、それらの完全長ポリペプチド対応物と同等の、および場合によってはこれを超える、生物学的活性を有することが本明細書において最初に示されたためである。本出願は、このような切断変異体は、単に生物学的活性を有するのみではなく、切断変異体は、溶解度、安定性およびタンパク質分解性崩壊に対する抵抗の増強された特性を有することができることも開示している。
【００２０】
定義
別に定義されない限りは、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されたものと同様のまたは同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に説明されている。
【００２１】
ある種の略号は、当技術分野において一般的なものが本明細書において使用されており、例えば、「Ac」はアセチル；「Glc」はグルコース；「Glc」はグルコサミン；「GlcA」はグルクロン酸；「IdoA」はイズロン酸；「GlcNAc」はN-アセチルグルコサミン；「NAN」または「シアル酸」または「SA」はN-アセチルノイラミン酸；「UDP」はウリジン二リン酸；「CMP」はシチジン一リン酸である。
【００２２】
本明細書において使用される下記の用語は各々、この項目においてそれに関連した意味を有する。
【００２３】
本明細書において使用される冠詞「一つ(a, an)」は、その冠詞の文法上の対象について1または1よりも多い(すなわち、少なくとも1)を意味する。例として「一つの(an)エレメント」は、1のエレメントまたは1よりも多いエレメントを意味する。
【００２４】
「コードしている」は、定義されたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)または定義されたアミノ酸配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として利用するための、例えば遺伝子、cDNA、またはmRNAのような、核酸中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を意味する。従って遺伝子に相当するmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的システムにおけるタンパク質を生成する場合に、遺伝子はタンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列が、mRNA配列と同じでありおよび通常は配列表に提供されるコード鎖、ならびに遺伝子またはcDNAの転写の鋳型として使用される非コード鎖は、遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の生成物をコードしていることを意味することができる。
【００２５】
遺伝子の「コード領域」は、各々、遺伝子の転写により作出されたmRNA分子のコード領域と相同であるかまたは相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
【００２６】
mRNA分子の「コード領域」は、mRNA分子の翻訳時に転移RNA分子のアンチコドン領域に合致するか、または停止コドンをコードしているmRNA分子のヌクレオチド残基からもなる。従ってコード領域は、そのmRNA分子によりコードされた成熟型タンパク質に存在しないアミノ酸残基(例えばタンパク質輸出シグナル配列中のアミノ酸残基)に対応するヌクレオチド残基を含む。
【００２７】
「親和性タグ」は、第二のポリペプチドの精製、単離、標的化、輸送、または同定の目的のために、第二のポリペプチドへ遺伝的にまたは化学的に融合され得るペプチドまたはポリペプチドである。親和性タグの第二のタンパク質への「遺伝的」付着は、核酸ベクター中の第二のタンパク質をコードしている核酸に隣接する親和性タグをコードしている核酸のクローニングにより影響され得る。
【００２８】
本明細書において使用される用語「糖転移酵素」は、供与体糖を受容体部分へ転移する能力を有する任意の酵素/タンパク質を意味する。
【００２９】
「糖ヌクレオチド生成酵素」は、糖ヌクレオチドを生成する能力を有する酵素である。糖ヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、UDP-Gal、UDP-GalNAc、およびCMP-NANなどであるが、これらに限定されない部分を含む。
【００３０】
「単離核酸」とは、天然の状態ではそれに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたは断片、例えば、天然に生じるゲノムにおいてその断片に隣接する配列であるような、通常その断片に隣接する配列から取り除かれたDNA断片を意味する。この用語は、細胞においてそれを天然に随伴するような核酸、例えばRNAまたはDNAまたはタンパク質を天然に随伴する他の成分から、実質的に精製された核酸にも適用される。従ってこの用語は、例えば、ベクターに、自律複製するプラスミドもしくはウイルスへ、または原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNAへ組込まれた組換えDNA、または他の配列から独立して個別の分子(例えば、cDNAまたはPCRもしくは制限酵素消化により作製されたゲノムもしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。これは、追加のポリペプチド配列をコードしているハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。
【００３１】
本発明の文脈において、通常生じる核酸塩基に関する以下の略号が使用される。「A」は、アデノシンを意味し、「C」はシチジンを意味し、「G」はグアノシンを意味し、「T」はチミジンを意味し、および「U」はウリジンを意味する。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」は、核酸の1本鎖または平行および逆平行の鎖を意味する。従ってポリヌクレオチドは、1本鎖または2本鎖核酸のいずれかであってよい。
【００３３】
用語「核酸」は典型的には、大きいポリヌクレオチドを意味する。しかし用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。
【００３４】
用語「オリゴヌクレオチド」は典型的には、短いポリヌクレオチド、一般には約50個を超えないヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド配列がDNA配列(すなわちA、T、G、C)で表される場合、これは「U」が「T」と交換されたRNA配列(すなわちA、U、G、C)も含むことは理解されると思われる。
【００３５】
核酸配列を説明するために、本明細書において通常の表記法が使用される：1本鎖核酸配列の左側末端は、5'末端であり；2本鎖核酸配列の左側方向は、5'方向と称される。
【００３６】
第一に定義された核酸配列は、例えば、第一の核酸配列の最後のヌクレオチドが、第二の核酸配列の最初のヌクレオチドへ、リン酸ジエステル結合を介して化学的に結合された場合に、第二に定義された核酸配列に「直接隣接する」と称される。逆に、第一に定義された核酸配列は、例えば、第一の核酸配列の最初のヌクレオチドが、第二の核酸配列の最後のヌクレオチドへ、リン酸ジエステル結合を介して化学的に結合された場合にも、第二に定義された核酸配列に「直接隣接する」と称される。
【００３７】
第一に定義されたポリペプチド配列は、例えば、第一のポリペプチド配列の最後のアミノ酸が、第二のポリペプチド配列の最初のアミノ酸へ、ペプチド結合を介して化学的に結合された場合に、第二に定義されたポリペプチド配列に「直接隣接する」と称される。逆に、第一に定義されたポリペプチド配列は、例えば、第一のポリペプチド配列の最初のアミノ酸が、第二のポリペプチド配列の最後のアミノ酸へ、ペプチド結合を介して化学的に結合された場合にも、第二に定義されたポリペプチド配列に「直接隣接する」と称される。
【００３８】
新生RNA転写産物への5'から3'のヌクレオチドの付加方向は、転写方向と称される。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と称され；DNA上の参照点に対し5'側に位置するDNA鎖上の配列は、「上流配列」と称され；DNA上の参照点に対し3'側に位置するDNA鎖上の配列は、「下流配列」と称される。
【００３９】
別に記さない限り、「アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列」は、互いに縮重型でありおよび同じアミノ酸配列をコードしている全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードしているヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００４０】
本明細書において使用される「相同性」は、同じ核酸鎖の二つの領域間または二つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を意味する。両方の領域内のヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基により占拠されている場合、これらの領域は、その位置で相同である。各領域の少なくとも1個のヌクレオチド残基の位置が同じ残基により占拠されている場合には、第一の領域は、第二の領域に相同である。二つの領域の間の相同性は、同じヌクレオチド残基で占拠されている二つの領域のヌクレオチド残基の位置の割合で表される。例として、ヌクレオチド配列5'-ATTGCC-3'を有する領域およびヌクレオチド配列5'-TATGGC-3'を有する領域は、50％相同性を共有する。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含みおよび第二の領域は第二の領域を含み、これによりそれらの部分の各々のヌクレオチド位置の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％が、同じヌクレオチド残基により占拠される。より好ましくは、各部分の全てのヌクレオチド残基位置は、同じヌクレオチド残基により占拠される。
【００４１】
本明細書において使用される「％一致度」は、「相同性」と同義的に使用される。二つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間の％一致度の決定は、数学的アルゴリズムを使用し実行することができる。例えば二つの配列の比較に有用な数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschulのアルゴリズム(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)、KarlinおよびAltschulの変法(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)である。このアルゴリズムは、AltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラムに組込まれており(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)、例えば米国国立衛生研究所(NIH)の国立医学図書館(NLM)の生命工学情報センター(NCBI)のワールドワイドウェブ上のBLASTサイトでアクセスすることができる。BLASTヌクレオチド探索は、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と称される)により、以下のパラメータを用いて実行することができる：ここで説明された核酸と相同なヌクレオチド配列を得るために、ギャップペナルティ＝5；ギャップイクステンションペナルティ＝2；ミスマッチペナルティ＝3；マッチリワード＝1；期待値10.0；および、ワードサイズ=11。BLASTタンパク質探索は、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と称される)またはNCBI「blastp」プログラムにより、以下のパラメータを用いて実行される：ここで説明されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、期待値10.0、BLOSUM62スコアリングマトリックス。
【００４２】
比較目的でギャップありアラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschulらの論文(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に説明されたように利用することができる。または、PSI-BlastまたはPHI-Blastを使用し、分子間の距離関係(同上)および共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復探索を実行することができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトのパラメータを、NIHのNLMのNCBIウェブサイトで入手し使用することができる。
【００４３】
二つの配列間の％一致度は、ギャップありまたはなしで、先に説明された技術に類似した技術を用いて決定することができる。％一致度の計算においては、典型的には正確なマッチがカウントされる。
【００４４】
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基で構成されたポリマー、関連した天然の構造変種、およびペプチド結合により連結されたそれらの合成の非天然のアナログ、関連した天然の合成変種、およびそれらの合成非天然のアナログを意味する。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。従って本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、ポリマーが少なくとも2個のアミノ酸残基を含むという条件で、アミノ酸残基の任意のサイズのポリマーを意味する。
【００４５】
用語「タンパク質」は典型的には、巨大なペプチドを意味し、本明細書において「ポリペプチド」とも称される。用語「ペプチド」は典型的には、短いポリペプチドを意味する。しかし用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。例えば用語「ペプチド」は、3個のアミノ酸のアミノ酸ポリマーに加え、数百個のアミノ酸のアミノ酸ポリマーを意味することができる。
【００４６】
本明細書において使用されるアミノ酸は、下記表に列記されたような、それらの正式名称、それに対応する3文字コード、またはそれに対応する1文字コードで表される：
【００４７】
正式名称 3文字コード 1文字コード
アスパラギン酸        Asp             D
グルタミン酸          Glu             E
リシン                Lys             K
アルギニン            Arg             R
ヒスチジン            His             H
チロシン              Tyr             Y
システイン            Cys             C
アスパラギン          Asn             N
グルタミン            Gln             Q
セリン                Ser             S
トレオニン            Thr             T
グリシン              Gly             G
アラニン              Ala             A
バリン                Val             V
ロイシン              Leu             L
イソロイシン          Ile             I
メチオニン            Met             M
プロリン              Pro             P
フェニルアラニン      Phe             F
トリプトファン        Trp             W
【００４８】
ポリペプチド配列を描写するためには、本明細書において通常の表記法が使用され：ポリペプチド配列の左側末端は、アミノ末端であり；ポリペプチド配列の右側末端は、カルボキシ末端である。
【００４９】
本明細書において使用される用語「治療的ペプチド」とは、生物の病態の治療または全般的健康の改善に有用な任意のペプチドを意味する。治療的ペプチドは、単独で投与された場合、または別の物質の治療的能力を改善するために使用される場合に、生物におけるそのような変化を実行することができる。用語「治療的ペプチド」は、本明細書において用語「治療的ポリペプチド」および「治療的タンパク質」と互換的に使用される。
【００５０】
本明細書において使用される用語「試薬ペプチド」は、食品生化学、バイオレメディエーション、小型の分子治療薬の製造、および更には治療用ペプチドの製造において有用な任意のペプチドを意味する。典型的には試薬ペプチドは、前述の分野のいずれかにおいて有用な生成物を生成する反応を触媒することが可能である酵素である。用語「試薬ペプチド」は、本明細書において用語「試薬ポリペプチド」および「試薬タンパク質」と互換的に使用される。
【００５１】
本明細書において使用される用語「糖ペプチド」は、それに共有的に連結された少なくとも1個の炭水化物部分を有するペプチドを意味する。糖ペプチドは、先に説明されたような「治療用糖ペプチド」であってよいことは理解されると思われる。用語「糖ペプチド」は、本明細書において用語「糖ポリペプチド」および「糖タンパク質」と互換的に使用される。
【００５２】
「ベクター」は、単離された核酸を含みおよび単離された核酸を細胞の内部へ送達するために使用することができる物質の組成物である。多くのベクターが当技術分野において公知であり、これは線状核酸、イオン性化合物または両性化合物に会合した核酸、プラスミド、およびウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。従って用語「ベクター」は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、核酸の細胞への輸送を促進する、非プラスミド性および非ウイルス性化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどを含むようにも構築されなければならない。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換え核酸を含むベクターを意味する。発現ベクターは、発現に十分なシス作用因子を含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によるかまたはインビトロ発現システムにおいて供給される。発現ベクターは、コスミド、プラスミド(例えば、裸のまたはリポソームに含まれた)および組換え核酸を組込むウイルスなどの、当技術分野において公知のものを全て含む。
【００５４】
本明細書において使用される用語「マルチクローニングサイト」は、少なくとも1種の制限酵素により認識される1個よりも多いヌクレオチド配列を含む核酸ベクターの領域である。
【００５５】
本明細書において使用される用語「抗生物質耐性マーカー」は、生存細胞において発現される場合に、細胞に抗生物質の存在下で生存および増殖する能力を付与するタンパク質をコードしているヌクレオチドの配列を意味する。
【００５６】
本明細書において使用される用語「GalNAcT2」は、N-アセチル-D-ガラクトサミン転移酵素2を意味する。
【００５７】
本明細書において使用される用語ペプチドの「切断」型は、そのペプチドの完全長アミノ酸配列と比べ、1個または複数のアミノ酸残基を欠いているペプチドを意味する。例えばペプチド「NH2-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」は、完全長ペプチド「NH2-Gly-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」のN末端切断型を意味する。用語「切断型」および「切断変異体」は、本明細書において互換的に使用される。非限定的例として、切断型ペプチドは、シグナルドメインが完全長GalNAcT2と比べ1個のN末端アミノ酸残基を欠いている、活性ドメイン、基幹ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナルドメインを含むGalNAcT2ポリペプチドである。
【００５８】
用語「糖類」は一般に、最も基本的構造(CH2O)nを有する化学実体である炭水化物のいずれかである。糖類は、複雑さが変動し、核酸、アミノ酸、または事実上生物学的システムに存在するいずれかの他の化学部分を含むことができる。
【００５９】
「単糖」とは、指定された同一性の炭水化物の単独の単位を意味する。
【００６０】
「オリゴ糖」とは、指定された同一性の炭水化物のいくつかの単位からなる分子を意味する。典型的には2〜20単位の糖配列が、オリゴ糖と称される。
【００６１】
「多糖」は、指定された同一性の炭水化物の多くの単位からなる分子を意味する。しかし2種またはそれよりも多い単位の糖類が、正確に多糖と考えられる。
【００６２】
本明細書において使用される糖「供与体」は、糖転移酵素が糖類を糖受容体へ転移することができるように、糖類を糖転移酵素へ提供することができる部分である。非限定的例において、GalNAc供与体は、UDP-GalNAcであることができる。
【００６３】
本明細書において使用される糖「受容体」は、糖供与体から糖類を受け取ることができる部分である。糖転移酵素は、糖類を糖受容体へ共有的に結合することができる。非限定的例において、G-CSFは、GalNAc受容体であることができ、およびGalNAc部分は、GalNAc受容体へGalNAc-転移酵素により共有的に結合することができる。一部の態様において、糖受容体は、O-グリコシル化部位を含むタンパク質またはペプチドである。更なる態様において、糖受容体は、例えばエリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、βおよびγ、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素を含む。
【００６４】
「指定されたサイズ」のオリゴ糖は、同定可能な数の単糖単位からなるものである。例えば10単糖単位からなるオリゴ糖は、10個の同一の単糖単位または第一の同一性の5個の単糖単位および第二の同一性の5個の単糖単位からなることができるものである。更に均一でない同一性の単糖単位からなる指定されたサイズのオリゴ糖は、そのオリゴ糖の最初から末端までの任意の順番で単糖単位を有することができる。
【００６５】
「ランダムサイズ」のオリゴ糖は、指定されたサイズのオリゴ糖生成物を提供しない方法を用いて合成することができるものである。例えば、オリゴ糖合成法は、2個の単糖単位から22個の糖単位までの範囲で、その間の任意の長さまたは全ての長さを含む、オリゴ糖を提供することができる。
【００６６】
「商業的規模」とは、単独の反応における、生成物糖類、または糖タンパク質、または糖ペプチドのグラムスケールの生成を意味する。好ましい態様において、商業的規模は、約50、75、80、90または100、125、150、175、または200gよりも多い生成を意味する。
【００６７】
用語「シアル酸」とは、9個の炭素のカルボキシル化された糖のファミリーの任意のメンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチル-ノイラミン酸(2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノス-1-オン酸(Neu5Ac、NeuAc、またはNANAと略されることが多い))である。このファミリーの第二のメンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5GcまたはNeuGc)であり、ここでNeuAcのN-アセチル基はヒドロキシル化されている。第三のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)である(Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557；Kanamori et al, J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990))。同じく9-置換されたシアル酸、例えば9-O-C1-C6アシル-Neu5Acである、9-O-ラクチル-Neu5Acまたは9-O-アセチル-Neu5Ac、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Acおよび9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acなども含む。シアル酸ファミリーの検証については、例えばVarkiの「Glycobiology 2: 25-40 (1992)；Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function」、R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))を参照のこと。シアル化手法におけるシアル酸化合物の合成および使用は、1992年10月1日に公開されたWO 92/16640号に開示されている。
【００６８】
本明細書において使用される「タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドのリモデリング法」は、糖転移酵素を使用する、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドへの糖残基の付加を意味する。好ましい態様において、糖残基は、PEG分子に共有的に結合されている。
【００６９】
本明細書において使用される「対のないシステイン残基」は、正確にフォールディングされたタンパク質(すなわち、生物学的活性を伴うタンパク質)であり、別のシステイン残基とジスルフィド結合を形成しないようなシステイン残基を意味する。
【００７０】
「不溶性糖転移酵素」は、細菌封入体中において発現される糖転移酵素を意味する。不溶性糖転移酵素は、典型的には例えば界面活性剤またはカオトロピック試薬またはいくつかの組合せを用い、可溶化または変性される。「リフォールディング」は、可溶化されるかまたは変性された糖転移酵素へ、生物学的に活性のある糖転移酵素の構造を回復するプロセスを意味する。従ってリフォールディング緩衝液は、糖転移酵素のリフォールディングを増強または促進する緩衝液を意味する。
【００７１】
「レドックスカップル」は、還元および酸化されたチオール試薬の混合物を意味し、ならびに還元および酸化されたグルタチオン(GSH/GSSG)、システイン/シスチン、システアミン/シスタミン、DTT/GSSG、およびDTE/GSSGを含む(例えば、Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)参照)。
【００７２】
用語「接触する」は、以下のように本明細書において互換的に使用される：一緒にする、添加する、混合する、上を通過させる、共にインキュベーションする、上を流すなど。
【００７３】
用語「PEG」は、ポリ(エチレングリコール)を意味する。PEGは、ペプチドへ複合されたポリマーの例である。ペプチド治療薬を誘導体化するPEGの使用は、それらのペプチドの免疫原生を低下させ、循環血中からのクリアランス時間を延長することが明らかにされている。例えば米国特許第4,179,337号(Davisら)は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールへ結合された酵素およびペプチドホルモンのような、非免疫原性ペプチドに関連している。1モルペプチド当たりポリマー10〜100モルが使用され、生理的活性の少なくとも15％が維持される。
【００７４】
本明細書において使用される用語「比活性」は、例えば本発明の組換え糖転移酵素融合タンパク質などの、酵素の触媒活性を意味し、これは活性単位で表すことができる。本明細書において使用される一つの活性単位は、所定の温度(例えば37℃)およびpH値(例えばpH7.5)で1分間に1μモルの生成物を形成することを触媒する。従って酵素10単位は、温度、例えば37℃およびpH値、例えば7.5で、1分間に基質10μmolが生成物10μmolに転換される酵素の触媒量である。
【００７５】
「N-連結された」オリゴ糖は、アスパラギン-N-アセチルグルコサミン連結により、アスパラギンを介してペプチド主鎖に連結されたそのようなオリゴ糖である。N-連結されたオリゴ糖は、「N-グリカン」とも称される。全てのN-連結されたオリゴ糖は、Man3GlcNAc2の共通の五糖コアを有する。これらは、N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアル酸のような表在性(peripheral)糖の側枝(アンテナとも称される)の存在、数により異なる。任意にこの構造は、コアフコース分子および/またはキシロース分子を含んでもよい。
【００７６】
「O-連結された」オリゴ糖は、トレオニン、セリン、ヒドロキシプロリン、チロシン、または他のヒドロキシ含有アミノ酸を介して、ペプチド主鎖へ連結されているようなオリゴ糖である。
【００７７】
先の「実質的に均一」の定義における用語「実質的に」とは一般に、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、またはより好ましくは少なくとも約90％、および更により好ましくは少なくとも約95％の特定の糖転移酵素の受容体基質がグリコシル化されていることを意味する。
【００７８】
「融合タンパク質」は、当初のもしくは未変性の完全長タンパク質をコードしているアミノ酸配列またはそれらの部分配列に、追加の、代わりの、より少ない、および/または異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する。
【００７９】
糖転移酵素に関する「基幹(stem)領域」とは、未変性の糖転移酵素において膜貫通ドメインに近接して配置されており、ならびにゴルジ装置中の糖転移酵素を維持するための残留シグナルとして、およびタンパク質切断部位として機能することが報告されている、タンパク質ドメイン、またはそれらの部分配列を意味する。基幹領域は一般に、最初の親水性アミノ酸で始まり、疎水性膜貫通ドメインへ続き、および触媒ドメインで終わるか、または場合によっては最初のシステイン残基、それに続く膜貫通ドメインである。基幹領域の例は、真核ST6GalNAcIの基幹領域、約30〜約207のアミノ酸残基(例えばマウス酵素参照)、ヒト酵素のアミノ酸35〜278またはニワトリ酵素のアミノ酸37〜253；哺乳類GalNAcT2の基幹領域、約71〜約129のアミノ酸残基(例えばラット酵素参照)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
「触媒ドメイン」とは、酵素により実行される酵素反応を触媒するタンパク質ドメイン、またはそれらの部分配列を意味する。例えばシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、シアル酸残基を供与体から受容体糖類へ転移するのに十分なシアリルトランスフェラーゼの部分配列を含むと思われる。触媒ドメインは、酵素全体、それらの部分配列を含むことができるか、または天然に認められるような、酵素へ付着されない追加のアミノ酸配列、またはそれらの部分配列を含むことができる。
【００８１】
用語「単離された」とは、酵素の活性と干渉する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。本発明の糖、タンパク質、または核酸に関して、用語「単離された」とは、その未変性の状態において認められるように、通常その物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。典型的には、本発明の単離された糖、タンパク質、または核酸は、銀染色されたゲル上のバンド強度または純度を決定する他の方法により測定された場合に、少なくとも約80％純粋、通常少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約95％純粋である。純度または相同性は、当技術分野において周知の多くの手段により示すことができる。例えば、試料中のタンパク質または核酸は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解することができ、およびその後タンパク質または核酸は、染色により可視化することができる。ある目的のためには、タンパク質または核酸の高分解が望ましく、ならびに精製のためには、例えばHPLCまたは同様の手段を利用することができる。
【００８２】
説明
I. 単離核酸
A. 概略
本明細書において、様々なヒトGalNAcT2の切断型変異体が例証されている。しかし本発明は、アミノ酸残基1〜51を欠いているヒトGalNAcT2切断型変異体ポリペプチドを対象とするようには構築されてはいない。
【００８３】
完全長GalNAcT2核酸は、N末端シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、基幹ドメイン、および活性ドメインを含む、他の糖転移酵素に類似したドメイン構造を有するポリペプチドをコードしており、ここで活性ドメインは、そのようなポリペプチドのアミノ酸配列の大部分を含むことができる。当業者により理解されるように、組換えGalNAcT2ポリペプチドの活性ドメインに対し異物のドメイン構造の存在は、水性環境中またはインビトロ環境におけるポリペプチドの溶解度、安定性および活性に対し負の作用を有することがある。例えば、特定の理論に結びつけることを意図するものではないが、インビトロ反応混合物において使用される組換えGalNAcT2ポリペプチド上の疎水性膜貫通ドメインの存在は、疎水性膜貫通ドメインを伴わない組換えGalNAcT2ポリペプチドよりも可溶性の低いポリペプチドとなり得、更にはフォールディングされた構造に作用するかまたは破壊することにより、そのポリペプチドの酵素活性さえ低下し得る。
【００８４】
従って、GalNAcT2ポリペプチドの活性、安定性および/または有用性を増強する目的のためには、完全長GalNAcT2よりも短いGalNAcT2をコードしている組換えGalNAcT2核酸を産生することが望ましい。本発明は、GalNAcT2のそのような修飾型を提供する。より特定すると、本発明は、そのような切断型ポリペプチドをコードしている単離された核酸を提供する。
【００８５】
本発明の核酸は、本明細書の別所により詳細に説明されている、GalNAcT2ポリペプチドの切断型をコードしている。本発明の核酸によりコードされた切断されたGalNAcT2ポリペプチドは、本明細書において「切断型変異体」とも称され、当業者に理解されるように、様々な方法で切断されてよい。本発明の核酸によりコードされた切断型ポリペプチドの例は、単独のN末端残基を欠いているポリペプチド、単独のC末端残基を欠いているポリペプチド、単独のN末端残基および単独のC末端残基の両方を欠いているポリペプチド、N末端からの残基の連続配列を欠いているポリペプチド、C末端からの残基の連続配列を欠いているポリペプチド、ならびにそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
従って、本明細書に記された開示を基に、GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸の切断は、多くの理由のために作製することができることは理解されると思われる。本発明の一つの態様において、GalNAcT2のシグナルペプチドドメインをコードしている核酸配列の一部または全てを除去するために、切断が作製される。
【００８７】
本発明の別の態様において、GalNAcT2の膜貫通ドメインをコードしている核酸配列の一部または全てを除去するために、切断が作製され得る。非限定的例として、膜貫通ドメインをコードしている核酸配列の一部または全ての除去は、コードされたGalNAcT2ポリペプチドの溶解度もしくは安定性を増大することができ、および/またはコードされたポリペプチドの発現レベルを増加することができる。
【００８８】
更に別の本発明の態様において、GalNAcT2の基幹ドメインをコードしている核酸配列の一部または全てを除去するために、切断が作製される。非限定的例として、基幹ドメインをコードしている核酸配列の一部または全ての除去は、コードされたGalNAcT2ポリペプチドの溶解度もしくは安定性を増大することができ、および/またはコードされたポリペプチドの発現レベルを増加することができる。
【００８９】
当業者は、本明細書に開示された説明を基に、本発明の別所に詳細に説明されたGalNAcT2の切断型変異体をいかにデザインしおよび作製するかを理解するであろう。本発明の一つの局面において、切断が行われる核酸残基は、高度に保存された残基であってよい。別の本発明の局面において、切断が行われる核酸残基は、コードされたポリペプチドが、発現されたポリペプチドの精製を補助するであろう新規N末端アミノ酸残基を有するように選択されてもよい。更に別の局面において、切断が行われる核酸残基は、コードされた切断型ポリペプチドが、特異的二次および/または三次構造を含まないように選択されてもよい。
【００９０】
B. GalNAcT2単離核酸
本発明は、完全長GalNAcT2よりも短いコード核酸を特徴とする。すなわち本発明は、この核酸により発現されたポリペプチドは、完全長タンパク質の生物学的活性を保持するという条件で、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸を特徴とする。本発明の一つの局面において、切断型ポリペプチドは、ヒト切断型GalNAcT2ポリペプチドである。
【００９１】
当業者に理解されるように、完全長ヒトGalNAcT2をコードしている核酸は、GalNAcT2の触媒活性に主に寄与するドメインである「活性ドメイン」に加え、1個または複数の同定可能なポリペプチドドメインをコードしている核酸配列を含むことができる。これは、完全長GalNAcT2ポリペプチド、特に完全長ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、および基幹ドメインを、活性ドメインに加え含むことが当技術分野において公知であるためである。従って完全長ヒトGalNAcT2をコードしている核酸は、ポリペプチドのアミノ末端にシグナルドメインを有し、それに続けてシグナルドメインに直接隣接する膜貫通ドメイン、それに続けて膜貫通ドメインに直接隣接している基幹ドメイン、それに続けてポリペプチドのカルボキシ末端へ伸びおよび基幹ドメインに直接隣接している活性ドメインを有するポリペプチドをコードしてもよい。
【００９２】
従って一つの態様において、本発明の単離核酸は、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドをコードし、ここで切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcT2シグナルドメインの全てまたは一部を欠いている。別の態様において、本発明の単離核酸は、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドをコードしてもよく、ここで切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcT2シグナルドメインおよびGalNAcT2膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いている。更に別の態様において、本発明の核酸は、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドをコードしてもよく、ここで切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcT2シグナルドメイン、GalNAcT2膜貫通ドメインおよびGalNAcT2基幹ドメインの全てまたは一部を欠いている。
【００９３】
本発明の開示を基に、当業者は、これらおよび他のそのようなヒトGalNAcT2の切断型変異体の製造および使用の方法を知るであろう。
【００９４】
「GalNAcT2の生物学的活性」は、GalNAc部分をGalNAc供与体から受容体分子へ転移する能力である。その配列が配列番号:1に示されている完全長ヒトGalNAcT2は、そのような活性を示す。「GalNAcT2切断型ポリペプチドの生物学的活性」は、GalNAc部分をGalNAc供与体から受容体分子へ転移する同様の能力である。すなわち本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドは、完全長GalNAcT2と同じ糖転移反応を触媒することができる。非限定的例において、本発明のGalNAcT2核酸によりコードされた切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAc部分をUDP-GalNAc供与体から顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体へ転移する能力を有し、ここでこのような転移は、G-CSFのトレオニン残基へのGalNAc部分のO-連結した共有結合を生じる。
【００９５】
従って切断型GalNAcT2はGalNAcT2生物学的活性を有するという条件で、完全長よりも小さいまたは「切断型」GalNAcT2をコードしている核酸は、本発明に含まれる。
【００９６】
本発明の方法および組成物は、本明細書に開示されたようなGalNAcT2切断型変異体を含む核酸のみに制限されるように構築されるものではなく、むしろGalNAcのGalNAc受容体への転移を触媒することが可能であることがわかっているまたはわかっていないのいずれかの、本明細書の開示に従い調製されたGalNAcT2切断型変異体をコードしている任意の核酸を包含するように構築される。修飾された核酸配列、すなわち天然のタンパク質をコードしている核酸配列とは異なる配列を有する核酸配列も同じく、修飾された核酸が例えばGalNAcのGalNAc受容体への転移を触媒する生物学的活性を有する切断型タンパク質を依然コードしている限りは、本発明の方法および組成物に包含される。これらの修飾された核酸配列は、点突然変異により引き起こされた修飾、遺伝暗号の縮重または天然の対立遺伝子変種に起因した修飾、更には遺伝子操作により、すなわち人工的に導入される修飾を含む。従って用語核酸は特に、5種の生物学的に生じる塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基により構成された核酸も含む。
【００９７】
本発明は、配列番号:3、配列番号:7または配列番号:9のいずれか一つに示された核酸配列と少なくとも約90％、95％、97％、98％または99％が同一である核酸配列を含む単離された核酸を特徴としている。本発明は、配列番号:3、配列番号:7または配列番号:9に示された配列のいずれか一つを含む単離された核酸配列も特徴としており、ここで単離された核酸は切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている。
【００９８】
本発明は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含む切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離された核酸分子も包含している。本発明の単離された核酸によりコードされたそのようなポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:8または配列番号:10に示された配列のいずれか一つとはアミノ酸配列が異なるが、依然GalNAcT2の生物学的活性は保持する。非限定的例として、本発明の単離核酸は、配列番号:4のアミノ酸配列と少なくとも約90％、95％、97％、98％または99％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。更に別の非限定的例として、本発明の単離された核酸は、配列番号:8または配列番号:10のいずれか一つに示したアミノ酸配列と少なくとも約90％、95％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９９】
二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の％一致度の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現することができる。例えば二つの配列の比較に有用な数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschulのアルゴリズム(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)、KarlinおよびAltschulの変法(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)である。このアルゴリズムは、AltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラムへ組込まれており(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)、ならびに例えば生命工学情報センター(NCBI)のワールドワイドウェブサイトにおいてアクセスすることができる。BLASTヌクレオチド探索は、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と称される)により、以下のパラメータを用いて実行することができる：ここで説明された核酸と相同なヌクレオチド配列を得るために、ギャップペナルティ＝5；ギャップイクステンションペナルティ＝2；ミスマッチペナルティ＝3；マッチリワード＝1；期待値10.0；および、ワードサイズ=11。BLASTタンパク質探索は、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と称される)またはNCBI「blastp」プログラムにより、以下のパラメータを用いて実行される：ここで説明されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、期待値10.0、BLOSUM62スコアリングマトリックス。比較目的でギャップありアラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschulらの論文(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に説明されたように利用することができる。または、PSI-BlastまたはPHI-Blastを使用し、分子間の距離関係および共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復探索を実行することができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトのパラメータを、NIHのNLMのNCBIウェブサイトから入手し使用することができる。全般的には、米国立医学図書館(NLM)および米国国立衛生研究所(NIH)により運営される、生命工学情報センター(NCBI)のインターネット上のウェブサイトを参照のこと。
【０１００】
別の局面において、本発明の方法および組成物に有用でありならびに切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸は、そのような切断型変異体の核酸配列へ挿入された少なくとも1個のヌクレオチドを有することができる。または、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている追加の核酸は、核酸配列から欠失された少なくとも1種のヌクレオチドを有することができる。更に切断型変異体をコードしおよび本発明において有用なGalNAcT2核酸は、切断型ポリペプチドをコードしている単独の核酸配列中に存在するヌクレオチド挿入およびヌクレオチド欠失の両方を有することができる。
【０１０１】
コードされたタンパク質またはポリペプチドの機能特性を変更するためにデザインされているヌクレオチド配列に変化を導入する技術は、当技術分野において周知である。このような修飾は、塩基の欠失、挿入、または置換、その結果のアミノ酸配列の変化を含む。当業者に公知であるように、核酸安定性の修飾、核酸発現レベルの修飾、発現されたポリペプチドの安定性または半減期の修飾、発現されたポリペプチド活性の修飾、発現されたポリペプチド特性および特徴の修飾、ならびにグリコシル化パターンの変更を含むが、これらに限定されるものではない多くの理由で、核酸の挿入および/または欠失を遺伝子にデザインすることができる。そのようなタンパク質をコードしているヌクレオチド配列へのそのような修飾は全て、本発明に包含される。
【０１０２】
本発明の方法および組成物は、利用される核酸の性質により限定されることが意図されるものではない。本発明の方法および組成物に包含される標的核酸は、未変性の核酸または合成された核酸であってよい。この核酸は、DNAまたはRNAであってよく、および2本鎖、1本鎖、または部分的2本鎖型であることができる。更にこの核酸は、ウイルスまたは他の巨大分子の一部として認めることができる。例えばFasbender et al, 1996, J. Biol. Chem. 272:6479-89を参照のこと。
【０１０３】
II. ベクターおよび発現システム
他の関連のある局面において、本発明は、核酸が好ましくはその核酸によりコードされたポリペプチドの発現を指示することが可能であるように、プロモーター/調節配列を含む核酸へ機能的に連結されている切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離された核酸を含む。従って本発明は、例えばSambrookらの論文(Third Edition, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、およびAusubelらの論文(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に説明されているような、発現ベクター、ならびにそれらの細胞における外来DNAの同時発現により、細胞へ外来DNAを導入する方法を包含している。
【０１０４】
細胞における切断型GalNAcT2ポリペプチドの発現は、適当な核酸をコードしている核酸を含むプラスミド、ウイルス、または他の種類のベクターの作製により実現されてもよく、ここで核酸は、ベクターが導入された細胞において、タグを伴うまたは伴わない、コードされたポリペプチドの発現を駆動するために利用されるプロモーター/調節配列へ機能的に連結される。加えて金属、糖質コルチコイドなどの物質の誘導に反応して誘導される当技術分野において周知であるプロモーターも、本発明において企図される。従って本発明は、公知又は未知のいずれかであり、ならびにそれらに機能的に連結された切断型GalNAcT2ポリペプチドの発現を駆動することが可能である、プロモーター/調節配列の使用を含むことは理解されるであろう。
【０１０５】
本発明において有用な発現システムにおいて、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸は、機能性ポリペプチドをコードしている1種または複数の追加の核酸と融合されてもよい。非限定的例として、親和性タグコード配列は、切断型GalNAcT2ポリペプチドコード配列に隣接する、その上流の、または下流の核酸ベクターに挿入されてもよい。当業者に理解されるように、親和性タグは典型的には、切断型GalNAcT2ポリペプチドとインフレームでマルチクローニングサイトに挿入される。当業者は、親和性タグコード配列を使用し、親和性タグおよび切断型GalNAcT2ポリペプチドを同時に発現することにより、組換え融合タンパク質を作製することができることも理解すると思われる。その後発現された融合タンパク質は、親和性タグにより、単離され、精製され、または同定され得る。
【０１０６】
本発明に有用な親和性タグは、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-転移酵素タグ、FLAG-タグ、およびデンプン結合ドメインタグを含むが、これらに限定されるものではない。他のタグも、当技術分野において周知であり、本発明におけるそのようなタグの使用は、当業者により容易に理解されるであろう。
【０１０７】
当業者に理解されるように、本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドを含むベクターを使用し、非融合または融合タンパク質のいずれかとしての切断型ポリペプチドを発現することができる。いずれか特定のプラスミドベクターまたは他のDNAベクターの選択は、本発明の限定因子ではなく、広範な大量のベクターが当技術分野において周知である。更に特定のプロモーター/調節配列の選択およびそれらのプロモーター/調節配列の切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしているDNA配列への機能的連結は十分に当業者の技術内である。このような技術は、当技術分野において周知であり、例えばSambrookらの論文(Third Edition, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、およびAusubelらの論文(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に説明されている。非限定的例として、本発明の一つの態様において有用なベクターは、pcWori+ベクターを基にしている(Muchmore et al., 1987, Meth. Enzymol. 177:44-73)。
【０１０８】
従って本発明は、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離核酸を含むベクターを含む。核酸のベクターへの組込みおよびベクターの選択は、Sambrookらの論文(Third Edition, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、およびAusubelらの論文(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に説明されているように、当技術分野において周知である。
【０１０９】
本発明の局面において、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離核酸は、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸と一緒に、宿主細胞のゲノムへ組込まれる。別の本発明の局面において、細胞は、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離核酸により、一過性にトランスフェクトされる。更に別の本発明の局面において、細胞は、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離された核酸により、安定してトランスフェクトされる。
【０１１０】
単離された核酸を細胞へ挿入する目的のために、当業者は、本発明の単離核酸の宿主細胞への導入に利用可能な方法および必要な方法は、変動し、および宿主細胞の選択により左右されることも理解するであろう。単離核酸を宿主細胞へ導入する適当な方法は、当技術分野において周知である。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする他の適当な方法は、Sambrookらの論文(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001)、および他のそのような実験マニュアルにおいて認められるものを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸は、当技術分野において周知のように、任意の適当な手段により精製することができる。例えば核酸は、逆相またはイオン交換HPLC、サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により精製することができる。当然当業者は、精製法は、精製されるDNAのサイズに一部左右されることを認識していると思われる。
【０１１２】
本発明は、特に本願明細書の別所に記載されたような核酸ベクターを含む、組換え細菌宿主細胞も特徴とする。一つの局面において、組換え細胞は、本発明のベクターにより形質転換される。形質転換されたベクターは、細胞ゲノムへ組込まれる必要はなく、細胞において発現されることが必要でもない。しかしこの形質転換されたベクターは、細胞において発現されることが可能であろう。本発明の一つの局面において、大腸菌は、本発明のベクターの形質転換およびそれからのタンパク質の発現に使用される。別の本発明の局面において、大腸菌K-12株は、本発明のベクター由来のタンパク質の発現に有用である。本発明において有用な大腸菌株は、JM83、JM101、JM103、JM109、W3110、chi1776、およびJA221を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
本発明において有用な宿主細胞は、小規模、中規模または大規模で増殖および培養が可能であることは理解されると思われる。例えば本発明の宿主細胞は、試薬または治療的タンパク質生成物の大規模生成に有用であるのと同等に大量の本発明のベクターからのタンパク質の発現を試験するために有用である。宿主細胞の培養およびそこに含まれたベクターからのタンパク質の発現に有用な技術は、当技術分野において周知であり、従って本明細書には記載されない。
【０１１４】
前述のような、本発明の方法に有用な宿主細胞は、本明細書に示した開示を基に当業者により理解されるように、様々な方法に従い調製することができる。一つの局面において、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターにより本発明の形質転換された宿主細胞を作製するように形質転換され得る。当業者に公知のように形質転換は、核酸ベクターを含む宿主細胞が生存し続けるように、核酸ベクターを宿主細胞へ挿入するプロセスを含む。このような核酸の細菌細胞への形質転換は、安定して-形質転換された宿主細胞の作製、生物学的寄託の実行、ベクターを含有する宿主細胞の増殖、追加のベクターの作製および単離のためのベクターを含有する宿主細胞の増殖、ベクターによりコードされた標的タンパク質の発現などを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１５】
ベクターにより細胞を形質転換する方法は多く、当技術分野において周知であり、従って本明細書には記載されない。非限定的例として、本発明のコンピテントな細菌細胞は、電気穿孔を使用し、本発明のベクターにより形質転換され得る。「コンピテントな」細菌細胞を作製する方法は、当技術分野において周知であり、典型的には細胞が外来DNAを取込むような、細菌細胞の調製が関連している。同様に、電気穿孔の方法は、当技術分野において公知であり、そのような方法の詳細な説明は、例えばSambrookら(1989、前掲)において認めることができる。コンピテントな細胞のベクターDNAによる形質転換は、化学ベースの方法を用いても実現され得る。細菌の形質転換の周知の化学ベースの方法の一例は、Inoueら(1990, Gene 96:23-28)により説明されている。他の形質転換法は、当業者により公知であろう。
【０１１６】
本発明の形質転換された宿主細胞を使用し、本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドを発現することができる。本発明の態様において、形質転換された宿主細胞は、本発明のベクターを含み、これはここで、本発明の切断型ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む。切断型ポリペプチドは、当技術分野において公知の発現法(例えばIPTG)を用い発現される。発現された切断型ポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるか、またはこれは宿主細胞から増殖培地へ分泌されてもよい。
【０１１７】
発現されたポリペプチドを単離する方法は、当技術分野において周知であり、当業者は、所定の宿主細胞発現システムの特徴を基に発現されたポリペプチドを単離する最良の方法をいかにして決定するかを知っているであろう。非限定的例として、宿主細胞から分泌される発現されたポリペプチドは、増殖培地から単離することができる。ポリペプチドの増殖培地からの単離は、細菌細胞および細胞デブリの除去を含むことができる。別の非限定的例として、宿主細胞に含まれる発現されたポリペプチドは、宿主細胞から単離され得る。そのような「細胞内」発現されたポリペプチドの単離は、宿主細胞の破壊、および得られた混合物からの細胞デブリの除去を含む。これらの方法は、本発明の排他的な代表であることを意図するものではなく、むしろ単に本発明の様々な適応を例証することを目的としている。
【０１１８】
本発明に従い発現された切断型ポリペプチドの精製は、当技術分野において公知の手段により実行することができる。当業者は、本発明に従い発現されたポリペプチドの精製の最良の方法をいかにして決定するかを知っているであろう。精製法は、発現宿主、ポリペプチド粗抽出物の含量、ポリペプチドのサイズ、ポリペプチドの特性、ポリペプチド精製プロセスの望ましい最終生成物、およびポリペプチド精製プロセスの最終生成物の引き続きの用途などであるが、これらに限定されない要因を基に当業者により選択されるであろう。
【０１１９】
本発明の態様において、本発明に従い発現された切断型ポリペプチドの単離または精製は、望ましくはないことがある。本発明のある局面において、発現されたポリペプチドは、そこでポリペプチドが発現された細菌宿主細胞内部に貯蔵されるかまたは輸送され得る。別の本発明の局面において、発現されたポリペプチドは、そこでポリペプチドが発現された宿主細胞の溶解により作製された粗溶解液型で使用される。更に別の本発明の態様において、発現されたポリペプチドは、本明細書に示されたまたは説明されたいずれかの方法に従い、部分的に単離されるかまたは部分的に精製され得る。当業者は、それが望ましくない場合には、本発明のポリペプチドを単離または精製することを知っており、ならびにそのようなポリペプチドの使用および調製に利用可能な技術に詳しいであろう。
【０１２０】
本明細書に記された開示を基に、当業者は、本発明の真核宿主細胞をいかにして調製するかも知っているであろう。本明細書の別所に記載され、および本明細書に提供された開示を基に当業者に公知であるように、切断型GalNAcT2ポリペプチドをコードしている単離核酸は、例えばレンチウイルスベースのゲノム組込みまたはプラスミドベースのトランスフェクトを使用し、真核宿主細胞へ導入することができる(Sambrook et al., Third Edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))。本発明の一つの態様において、真核宿主細胞は、真菌細胞である。別の態様において、本発明の切断型ポリペプチドをコードしている核酸は、切断型ポリペプチドの発現のために特異的プロモーター配列を含むレンチウイルスベクターへクローニングされる。切断型ポリペプチドを含むレンチウイルスベクターは次に、切断型ポリペプチドの発現のための宿主細胞のトランスフェクトに使用される。本発明において有用なもののような、レンチウイルスベクターを作製および使用する方法は、当技術分野において周知であり、本明細書においては更に説明されない。
【０１２１】
更に別の態様において、本発明の切断型ポリペプチドをコードしている核酸は、ウイルス発現システムを用い、宿主細胞へ導入される。ウイルス発現システムは、当技術分野において周知であり、および本明細書において詳細には説明されない。本発明の一つの局面において、ウイルス発現システムは、哺乳類のウイルス発現システムである。別の本発明の局面において、ウイルス発現システムはバキュロウイルス発現システムである。このようなウイルス発現システムは典型的には、多くの供給業者から商業的に入手可能である。
【０１２２】
当業者は、本発明の切断型ポリペプチドの発現のために、宿主細胞-ベクター発現システムをいかに使用するかを知っているであろう。真核宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookらの論文(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001))に説明されており、その説明は全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０１２３】
昆虫細胞も、本発明の切断型ポリペプチドの発現に使用することができる。本発明のある局面において、Sf9、SF9+、Sf21、High Five(商標)またはショウジョウバエSchneider S2細胞を使用することができる。更に別の本発明の局面において、バキュロウイルス、またはバキュロウイルス/昆虫細胞発現システムを使用し、pAcGP67、pFastBac、pMelBac、もしくはpIZベクターおよびポリヘドリン、p10、もしくはOpIE3アクチンプロモーターを使用し、本発明の切断型ポリペプチドを発現することができる。本発明の別の局面において、ショウジョウバエ発現システムを、pMTまたはpAC5ベクターおよびMTまたはAc5プロモーターと共に使用することができる。
【０１２４】
本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドは、哺乳類細胞においても発現することもできる。本発明のある局面において、294、HeLa、HEK、NSO、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、ジャーカット、またはCOS細胞を使用し、本発明の切断型ポリペプチドを発現することができる。切断型ポリペプチドの哺乳類細胞発現の場合、pT-Rex、pSecTag2、pBudCE4.1、またはpCDNA/His Maxベクターなどの適当なベクターは、例えばCMVプロモーターと共に使用することができる。当業者に理解されるように、プロモーターの選択に加え、本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドを発現するために使用される1個または複数のプロモーターを宿主細胞へ導入するための方法および戦略は、当技術分野において周知であり、ならびに使用される宿主細胞および発現システムに応じて変動するであろう。
【０１２５】
様々な哺乳類細胞培養システムを使用し、組換えタンパク質を発現することができる。哺乳類発現システムの非限定的例は、Gluzman(Cell 23:175 (1981))により説明されたサル腎線維芽細胞のCOS-7株、および同等のベクターを発現することが可能である他の細胞株、例えば、C127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株(tines)を含む。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよび必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシング供与体および受容体部位、転写終結配列、ならびに5'側のフランキング非転写配列を含む。例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位、およびポリアデニル化部位などの、SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列を使用し、必要な転写されない遺伝子エレメントを提供してもよい。
【０１２６】
本発明の単離核酸の宿主細胞への導入に利用可能な方法および必要な方法は、当業者により理解されるように様々であり、宿主細胞の選択により左右される。単離された核酸の宿主細胞への導入に適した方法は、当技術分野において周知である。非限定的例として、ベクターDNAは、通常のトランスフェクト技術を用いて、真核細胞へ導入される。本明細書において使用される用語「トランスフェクト」は、DEAE-デキストラン-媒介型トランスフェクト、リポフェクション、または電気穿孔を含む、宿主細胞への外来核酸(例えばDNA)の導入に関して様々な当技術分野において認められる技術を意味する。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクトの適当な方法は、Sambrookらの論文(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001)および他の実験マニュアルに認めることができる。
【０１２７】
例えば哺乳類細胞の安定したトランスフェクトに関して、使用される発現ベクターおよびトランスフェクト技術に応じて、細胞の小さい画分のみが、外来DNAをそれらのゲノムへ組込むことができることは公知である。これらの形質転換体を同定しかつ選択するために、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性)をコードしている遺伝子が、宿主細胞へ、関心のある遺伝子と共に一般に導入される。様々な選択マーカーは、G418、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与するものを含む。選択マーカーをコードしている核酸は、本発明の切断型ポリペプチドをコードしているものと同じベクター上で宿主細胞へ導入することができるか、または個別のベクター上で導入することができる。導入された核酸により安定してトランスフェクトされる細胞は、薬物選択により同定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子が組込まれた細胞は生存する一方で、その他の細胞は死滅する)。
【０１２８】
III. ポリペプチド
本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドは、本開示を基に、当業者に公知でありおよび理解されるような、様々な方法により切断することができる。本発明の切断型ポリペプチドの例は、単独のN末端残基を欠いているポリペプチド、単独のC末端残基を欠いているポリペプチド、単独のN末端残基および単独のC末端残基の両方を欠いているポリペプチド、N末端からの残基の連続配列を欠いているポリペプチド、C末端からの残基の連続配列を欠いているポリペプチド、およびそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
当業者に理解されるように、完全長ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcT2の触媒活性に主に寄与するドメインである、「活性ドメイン」に加え、1個または複数の同定可能なポリペプチドドメインを含むことができる。これは、完全長GalNAcT2ポリペプチド、特に完全長ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、活性ドメインに加え、シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、および基幹ドメインを含むことが、当技術分野において公知であるからである。従って、完全長ヒトGalNAcT2は、そのポリペプチドのアミノ末端にシグナルドメイン、それに続けてシグナルドメインに直接隣接する膜貫通ドメイン、それに続けて膜貫通ドメインに直接隣接している基幹ドメイン、それに続けてポリペプチドのカルボキシ末端へ伸びおよび基幹ドメインに直接隣接している活性ドメインを有するポリペプチドをコードしてもよい。
【０１３０】
従って一つの態様において、本発明のGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcT2シグナルドメインの全てまたは一部を欠いている切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドである。別の態様において、本発明のGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcT2シグナルドメインおよびGalNAcT2膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いている切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドである。更に別の態様において、本発明のGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcT2シグナルドメイン、GalNAcT2膜貫通ドメインおよびGalNAcT2基幹ドメインの全てまたは一部を欠いている切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドである。本発明の開示を基に、当業者は、いかにしてこれらおよび他のヒトGalNAcT2のそのような切断型変異体を作製しおよび使用するかを知っているであろう。
【０１３１】
本発明の切断型GalNAcT2変異体のサイズおよび一致度は、完全長ポリペプチドが切断される点を基にしている。非限定的例として、本発明の「Δ40ヒト切断型GalNAcT2」変異体は、完全長ポリペプチドのN末端から数えてアミノ酸1から40がそのポリペプチドから欠失されている本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドを意味する。従ってΔ40ヒト切断型GalNAcT2変異体のN末端は、完全長ポリペプチドの「アミノ酸41」と称されるアミノ酸残基で始まる。この命名法は、ヒトGalNAcT2を含む、本発明の全ての切断型GalNAcT2ポリペプチドに適用することができる。
【０１３２】
従って本発明は、切断型GalNAcT2ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明の単離された切断型GalNAcT2ポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:8または配列番号:10に示された配列のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドへの、少なくとも約90％の一致度を有する。より好ましくは、単離されたポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:8または配列番号:10に示された配列のいずれか一つのポリペプチドと、約95％同一であり、更により好ましくは約98％同一であり、更により好ましくは約99％同一であり、最も好ましくは切断型GalNAcT2ポリペプチドを含む単離ポリペプチドは、これと同一である。
【０１３３】
本発明は、本明細書に開示された切断型GalNAcT2ポリペプチドを含むポリペプチドのアナログも提供する。アナログは、保存的アミノ酸配列の差によるかもしくは配列に影響しない修飾によるか、またはこれら両方により、天然のタンパク質またはペプチドとは異なる。
【０１３４】
例えば、タンパク質またはペプチドの一次配列を変更するが、その機能は通常変更しないような、保存的アミノ酸変化を行うことができる。保存的アミノ酸置換は典型的には、下記の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１３５】
修飾(通常一次配列は変更しない)は、インビボ、またはインビトロでのポリペプチドの化学誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化を含む。その合成およびプロセッシング時、または更なるプロセッシング工程における、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより作製されるもののような、グリコシル化の修飾も含み；例えば、哺乳類グリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素のような、ポリペプチドのグリコシル化に作用する酵素に対する曝露による。同じく、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンなどの、リン酸化されたアミノ酸残基を有する配列も包含している。
【０１３６】
タンパク質分解に対するそれらの抵抗性を改善するか、または溶解特性を最適化するか、またはそれらを治療的物質としてより適するようにするために、通常の分子生物学的技術を用いて修飾されているポリペプチドも含まれる。そのようなポリペプチドのアナログは、天然のL-アミノ酸以外の残基を含むもの、例えばD-アミノ酸または非天然の合成アミノ酸を含む。本発明のペプチドは、本明細書に列記された具体例のいずれかのプロセスの生成物に限定されない。
【０１３７】
本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドの断片は、その断片が完全長ポリペプチドの生物学的活性を有するという条件で、本発明に含まれる。すなわち本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドは、完全長GalNAcT2と同じ糖転移反応を触媒することができる。非限定的例として、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドは、GalNAc部分をUDP-GalNAc供与体から顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体へ転移する能力を有し、ここでそのような転移は、GalNAc部分のG-CSFトレオニン残基へのO-連結した共有結合を生じる。従って完全長よりもより小さい、または「切断型」GalNAcT2は、切断型GalNAcT2がGalNAcT2生物学的活性を有するという条件で、本発明に含まれる。
【０１３８】
本発明の別の局面において、本明細書に説明された単離切断型GalNAcT2ポリペプチドを含む組成物は、高度に精製された切断型GalNAcT2ポリペプチドを含むことができる。または、切断型GalNAcT2ポリペプチドを含む組成物は、特定の切断型GalNAcT2ポリペプチドを発現するために使用された細胞から調製される細胞溶解液を含むことができる。更に本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドは、本明細書の別所に詳細に説明されているような、当業者に周知の細胞のような、ポリペプチドの発現に適した多くの細胞のいずれか一つにおいて発現することができる。
【０１３９】
本明細書に説明されたように単離されおよび得られた実質的に純粋なタンパク質は、タンパク質精製の公知の手法に従い精製することができ、ここでこの手法の各段階で精製をモニタリングするために、免疫学的、酵素的または他のアッセイ法を使用する。タンパク質精製法は、当技術分野において周知であり、例えばDeutscherらの論文(1990, Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego参照)に記されている。
【０１４０】
IV. 方法
本発明は、切断型ポリペプチドを発現する方法を特徴とする。本発明の方法に従い発現することができるポリペプチドは、切断型GalNAcT2ポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明の方法に従い発現することができるポリペプチドは、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。好ましい態様において、本発明の方法に従い発現することができるポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:8または配列番号:10に示されたポリペプチド配列のいずれか一つを含むポリペプチドである。
【０１４１】
一つの態様において、本発明は、本明細書の別所に記載されたような、本発明の単離された核酸によりコードされた切断型GalNAcT2ポリペプチドを発現する方法を特徴としており、ここで発現された切断型GalNAcT2ポリペプチドは、GalNAc部分の受容体部分への転移を触媒する特性を有する。本発明の一つの局面において、切断型GalNAcT2ポリペプチドを発現する方法は、本発明の単離された核酸を発現ベクターへクローニングする工程、発現ベクター構築体を宿主細胞へ挿入する工程、およびそこから切断型GalNAcT2ポリペプチドを発現する工程を含む。
【０１４２】
ポリペプチドの発現の方法に加え、発現システムおよびポリペプチド発現のための組換え宿主細胞の構築は、本明細書の別所において広範に詳細に考察されている。本発明の切断型ポリペプチドの発現の方法は、本明細書に説明されたそのような方法の全てを含むが、これらに限定されるものではないことは理解されるであろう。一部の発現システムにおいて、本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドは、不溶性タンパク質として、例えば細菌宿主細胞内の封入タンパク質で発現される。GalNAcT2ポリペプチドを含む、不溶性糖転移酵素のリフォールディング法は、2004年2月4日に出願された米国特許仮出願第60/542,210号；2004年8月6日に出願された米国特許仮出願第60/599,406号；2004年11月12日に出願された米国特許仮出願第60/627,406号；および、2005年2月4日に出願された国際特許出願PCT/US05/03856に開示されており；これらは各々、あらゆる目的のための参照として本明細書に参照として組入れられている。
【０１４３】
本発明は、GalNAc部分のGalNAc受容体部分への転移を触媒する方法も特徴としており、ここでGalNAc転移反応は、本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドの、GalNAc供与体部分およびGalNAc受容体部分と一緒のインキュベーションにより実行される。一つの局面において、本発明の切断型GalNAcT2ポリペプチドは、GalNAc部分のGalNAc受容体部分への共有的連結を媒介し、これによりGalNAc部分の受容体部分への転移を触媒する。
【０１４４】
本発明の一つの態様において、糖転移反応において有用な切断型GalNAcT2ポリペプチドは、切断型ヒトGalNAcT2ポリペプチドである。一つの局面において、ヒトGalNAcT2糖転移反応は、GalNAc残基のGalNAc供与体からGalNAc受容体への転移に関する。
【０１４５】
非限定的例として、GalNAc部分の受容体部分への転移を触媒する方法は、切断型GalNAcT2ポリペプチドを、UDP-GalNAc GalNAc供与体および顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体部分と共にインキュベーションする工程を含み、ここで切断型GalNAcT2ポリペプチドは、GalNAcのUDP-GalNAc供与体からGCSF受容体への転移を媒介する。
【０１４６】
従って一つの態様において、本発明は、ポリペプチド受容体部分も特徴とする。本発明の一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、ヒト成長ホルモンである。別の態様において、ポリペプチド受容体部分は、エリスロポエチンである。更に別の態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-αである。別の態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-βである。別の本発明の態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-γである。更に別の本発明の態様において、ポリペプチド受容体部分は、リポソーム加水分解酵素である。別の態様において、ポリペプチド受容体部分は、血液因子ポリペプチドである。更に別の態様において、ポリペプチド受容体部分は、抗腫瘍壊死因子-αである。本発明の別の態様において、ポリペプチド受容体部分は、濾胞刺激ホルモンである。
【０１４７】
一つの態様において、本発明は、GalNAc-ポリエチレングリコール複合体を受容体分子へ転移する方法も特徴とする。一つの局面において、受容体分子は、ポリペプチドである。別の局面において、受容体分子は、糖ペプチドである。受容体分子へのGalNAc-ポリエチレングリコール複合体のデザイン、生成および転移に有用な組成物および方法は、PCT国際特許出願WO 03/031464(PCT/US02/32263)および米国特許出願第2004/0063911号において詳細に考察されており、これらは各々その全体が本明細書に参照として組入れられている。糖転移酵素活性のアッセイ法は、当技術分野において周知である。本発明に従い使用することができる糖転移酵素を検出するための様々なアッセイ法が公開されている。以下は、糖転移酵素活性を検出するために有用なそのようなアッセイ法を例示しているが、限定するものと考えられてはならない。Furukawaら(1985, Biochem. J, 227:573-582)は、ホウ酸塩-含浸紙電気泳動アッセイ法および蛍光アッセイ法を考察している。Rothら(1983, Exp'l Cell Research 143:217-225)は、ホウ酸塩アッセイ法の、先に熱量アッセイ法された、グルクロニル転移酵素への応用を説明している。Benauら(1990, J. Histochem. Cytochem., 38:23-30)は、ジアゾニウム塩のNADHによる還元をベースにした、組織化学アッセイ法を説明している。Rothの米国特許第6,284,493号も参照し、これは本明細書に参照として組入れられている。
【０１４８】
実験的実施例
本発明はここで、下記実施例を参照し説明される。これらの実施例は、単に例証を目的に提供されており、本発明はこれらの実施例に限定されるものとして構成されず、むしろ本明細書に提供された内容の結果として明らかになるいずれかおよび全ての変動を包含するように構成される。
【０１４９】
実施例1：大腸菌JM109におけるヒトポリペプチドN-アセチルガラクトサミニル転移酵素II(GalNAcT2)のクローニング、発現、およびリフォールディング
ヒトGalNAcT2の切断型変異体のシアリルトランスフェラーゼ活性を評価するために、4種の構築体をデザインし、作製した。作製された4種の変異体は、その新たなN末端残基として配列番号:2に示された完全長ヒトGalNAcT2のR41に対応するリシンを有する切断型変異体Δ40、その新たなN末端残基として配列番号:2に示された完全長ヒトGalNAcT2のK52に対応するリシンを有する切断型変異体Δ51、その新たなN末端残基として配列番号:2に示された完全長ヒトGalNAcT2のG74に対応するグリシンを有する切断型変異体Δ73、およびその新たなN末端残基として配列番号:2に示された完全長ヒトGalNAcT2のG95に対応するグリシンを有する切断型変異体Δ94を含んだ。
【０１５０】
切断型ヒトポリペプチドN-アセチルガラクトサミニル転移酵素II(GalNAcT2)は、大腸菌JM109細胞由来の封入体において、マルトース結合タンパク質(MBP)-融合タンパク質として発現された。活性酵素の生成は、リフォールディングおよび2種のポリペプチド受容体に対するアッセイ法により試験した。従って大腸菌JM109細胞におけるマルトース結合タンパク質融合タンパク質としてのヒトポリペプチドGalNAcT2のいくつかの切断型の作製が、本明細書に説明された。組換えタンパク質は、Hampton FoldItスクリーニングキット(Hampton Research, Aliso Vieja, CA)を使用し、単離された封入体からリフォールディングされる。4種の構築体全てを、JM109大腸菌において約2g/L培養培地のレベルで発現した。
【０１５１】
PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)増幅は、5μlの鋳型DNA(11μg/ml、100倍希釈したpBKS-Full ppGalNAcT2)、40pmolの5'-プライマーおよび3'-プライマー、10nmolのdNTP混合物、および5単位のHerculase(商標)増強されたDNAポリメラーゼを含有する、最終反応容積50μlで、95℃で45秒間の変性、62℃で45秒間のアニーリング、および74℃で170秒間の伸長の31サイクルの条件で行った。PCR産物を、1％アガロースゲル電気泳動に供した。DNA断片を切断し、QIAEX IIゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)により精製した。表1は、PCR反応に使用したプライマーを例示している。
【０１５２】
（表１）  ppGalNAcT2のクローニングに使用したプライマー
2008512085.tif 000003
【０１５３】
ゲルで精製したPCR産物を、BamHIおよびXhoIで消化し、再度ゲル精製し、および先に同じ制限酵素により消化した、pCWin2MBPベクターへライゲーションした。ライゲーションした生成物は、大腸菌DH5α電気的にコンピテントな細胞へ形質転換した。形質転換体は、50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレートに播種し、37℃で一晩インキュベーションした。3種のコロニーを、各構築体に関して採取し、15μg/mlカナマイシンを含有するLB培地において培養した。プラスミドDNAは、QIAprep Spin Miniprepキット(Qiagen, Valencia, CA)により精製し、BamHIおよびXhoIによる制限地図作製によりスクリーニングした。正確な消化パターンを有するプラスミドは、JM109化学的にコンピテントな細胞へ形質転換した。
【０１５４】
JM109細胞は、6mlのLB培地および15μg/mlカナマイシンを含有する15ml培養チューブ中で、37℃で一晩、高速振盪(250rpm)しながら培養した。各培養物に関して、出発培養物2mLを、15μg/mlカナマイシンを伴う23ml LB培地を含む50ml遠心チューブへ移し、37℃で3時間、高速振盪しながらインキュベーションした。イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度0.4mMで添加し、タンパク質発現を誘導した。37℃(250rpm)で更に3時間振盪後、細胞を3,500xgで10分間の遠心により収集した。その後細胞ペレットを、1％Triton X-100を含有する20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.5)0.6ml中に再懸濁した。次にリゾチーム(100μg)およびDNaseI(2μg)を添加した。この混合物を、インキュベーター振盪機において、37℃で45分間振盪し、その後1.5ml微量遠心チューブへ移した。14,000rpmで5分間の遠心により、溶解液を、封入体(IB)から分離した。
【０１５５】
SDS-PAGE分離のための各試料を、全細胞懸濁液、溶解液、または封入体懸濁液5μlの、2xTris-グリシンSDS試料緩衝液5μlおよびDTT(1M)1.1μlとの混合により、調製した。この混合物を、98℃で5分間加熱し、室温に冷却し、1.0mm x 15ウェル4〜20％Tris-グリシン勾配ゲルの各ウェルに負荷した。電気泳動を、120Vで100分間行った。その後このゲルを、2時間染色し、蒸留水で脱色した(図4〜6参照)。
【０１５６】
封入体を、4Mグアニジン-HCl、100mM Tris-HCl(pH9.0)、5mM EDTA、および10mM DTTを含有する溶解緩衝液中に、濃度20mg/ml(高タンパク質濃度)または2mg/ml(低タンパク質濃度)で溶解した。Hampton FoldItスクリーニングキットによる封入体のリフォールディングを、1/10の容量を使用した(100μl-スケール)以外は、製造業者のプロトコールに従い実行した(Hampton Products, Aliso Viejo, CA)。
【０１５７】
溶解液の非放射性酵素活性アッセイ法を、50mM MES緩衝液(pH6.0)、MnCl2(15mM)、MgCl2(15mM)、NaCl(0.15M)、UDP-GalNAc(5mM)、1.5μg G-CSF(受容体)、および溶解液試料2.15μlを含有する最終容積10μlで、0.5μlの微量遠心チューブにおいて、37℃で一晩実行した。陰性対照として、酵素をH2Oで置き換えた。Sf9バキュロウイルス発現システム由来の精製した組換えppGalNAcT2(0.5μl)を、陽性対照として使用した。リフォールディングされた封入体のためのアッセイ法を、インターフェロンα2b(4μg)を酵素の受容体として使用し、および反応混合物へ添加した試料容積は5.65μlであった以外は、溶解液について説明されたものと同様の様式で行った。
【０１５８】
ppGalNAcT2遺伝子(約1.5kb)のためのDNA断片は、図5に示したように、PCRによりうまく増幅した。ベクタープラスミドDNA pCWin2MBPを、BamHIおよびXhoIで消化し、1％アガロースゲル上で精製した。ゲルで精製したDNA断片を、同じ2種の酵素で消化し、精製した。消化後、DNA断片を、アガロースゲル上で視認したところクリーンであった(図2B)。
【０１５９】
選択された12個のコロニーから精製したプラスミドのBamHIおよびXhoI消化は、1％アガロースゲル上で、予想された正確なパターンを示した。このベクターのサイズは約6.2kbであり、この挿入断片は約1.5kbであった。pCWin2MBPベクタープラスミドで形質転換されたJM109において発現されたマルトース-結合タンパク質(MBP)は、約43kDaにバンドを示した。全細胞のタンパク質の90％以上が、MBPであった。構築体N41Rの#2コロニーは、予想されたものよりもより短いタンパク質を発現し、このことは突然変異の出現を示している。他の11個のコロニーは全て、MBP-ppGalNAcT2融合タンパク質の約100kDaにバンドを示し、総タンパク質の80％より多くが標的融合タンパク質であった。
【０１６０】
ゲル電気泳動は、MBPのほとんどは細胞溶解液中に可溶性型として発現されたことを示した(図1および2)。N41Rに関して誤った構築体(コロニー#2)において過剰発現されたタンパク質も、細胞溶解液中で認められた。しかしMBP-ppGalNAcT2融合タンパク質のほとんどは、封入体中であった(図1および2のレーン1および3〜12)。封入体中のタンパク質の90％より多くが、関心のあるMBP融合タンパク質であった。
【０１６１】
まとめると、ヒトポリペプチドGalNAcT2の4種の切断型は、pCWin2MBPベクターにうまくクローニングされ、大腸菌JM109において封入体中のMBP融合タンパク質として発現された。封入体中の酵素の発現レベルは、約2g/Lであった。SDS-PAGEから推定されるように、封入体の80％より多くが、標的MBP-ppGalNAcT2融合タンパク質であった。
【０１６２】
実施例2：大腸菌発現されたMBP-ヒトGalNAcT2に関するタンパク質リフォールディング条件の開発
MBP-GalNAcT2に関するリフォールディング実験を、4種の異なるMBP-GalNAcT2 DNA構築体および16種の異なる可能性のあるリフォールディング条件下で、1mlスケールで実施した。リフォールディングは、Hampton Research Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)を用いて行い、アッセイ法は、MuC-2ペプチドへ添加した[3H]UDP-GalNAcの放射能検出により、およびGalNAcのインターフェロンα-2bおよびG-CSFへの添加を利用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI)により行った。このデータは、大腸菌が発現したMBP-GalNAcT2は、活性酵素へリフォールディングされ得ることを例示している。Hampton Research's Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)により認められた、リフォールディング条件8および15下で、MBP-GalNAcT2構築体1および2の活性のある立体配置が同定されたことは明らかである。[3H]UDP-GalNAcアッセイ法により、成功したことが示され、後にインターフェロンα-2b(IFα-2b)および顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)-ベースの糖転移酵素アッセイ法により確認された。本試験の具体的方法およびデータは、本明細書に示されている。
【０１６３】
本明細書の別所に記載されたように、本発明において使用したGalNAcT2構築体は、当初のヒトGalNAcT2タンパク質の様々なアミノ末端のアミノ酸切断型変異体をコードしているDNAを含み、これは下記のようなN末端アミノ酸で始まる下記構築体を含む：
構築体1−pCWin2 MBP-GalNAcT2−R41アルギニン(924aa, 103682.5MW)
構築体2−pCWin2 MBP-GalNAcT2−K52リシン(913aa, 102286.0MW)
構築体3−pCWin2 MBP-GalNAcT2−G74グリシン(891aa, 99799.3MW)、および
構築体4−pCWin2 MBP-GalNAcT2−G95グリシン(870aa, 97419.8MW)。
【０１６４】
構築体は最初に、特定のグリセロールストック培養液からピペットチップで剥ぎ取った、10μg/ml硫酸カナマイシンを含有するMartone L-ブロス2mlの接種により、出発培養物2mlに増やした。この手法を、4種全ての構築体上で、4種の出発培養物全体について行った。出発培養物を37℃で一晩インキュベーションし、250rpmで回転振盪した。一晩培養物から、4種の10μg/ml硫酸カナマイシンを含有するMartone L-ブロス−培養物275mlを調製した。これらの培養物の各々に、構築体1から4の2mLの出発培養物の一つを275μL接種した。これらの275ml培養物を、250rpmで振盪しながら、37℃で一晩インキュベーションした。
【０１６５】
最後に、4種の10μg/ml硫酸カナマイシンを含有するMartone L-ブロス培養物1Lを調製した。これらの培養物の各々に、構築体1から4の275mLの培養物の一つを40ml接種した。これらの1L培養物を、250rpmで振盪しながら、37℃で、測定したOD600が約1.0に達するまでインキュベーションした。この点に到達した時点において、IPTGを4種の1L培養物の各々に、最終濃度0.4mMとなるよう添加した。その後培養物を、37℃で250rpmで振盪しながら、一晩インキュベーションした。
【０１６６】
番号1から4を記したJM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体を含有する1L培養物を、1Lの遠心ボトルに移した。その後培養物を、5000rpm、4℃で、30分間遠心した。上清を除去し、ペレットを秤量した。その後各試料からのペレットを洗浄し、封入体(IB)を単離した。各構築体のペレットを、最初に20mM Tris-HCl(pH8.5)、5mM EDTAの15ml中に再懸濁し、その後フレンチプレスを12,000psiで2回通過させ溶解した。
【０１６７】
次に各構築体の溶解液を、50mlのディスポーザブルチューブ中で、5000rpm、25℃で5分間遠心した。上清を除去し、ペレットを、20mM Tris-HCl(pH8.5)、1％Triton X-100の25ml中に再懸濁した。懸濁液を、室温で10分間インキュベーションした。その後懸濁液を、5000rpm、25℃で5分間遠心した。次に上清を除去し、試料を、20mM Tris-HCl(pH8.5)、1％Triton X-100の25ml中に2回目の再懸濁をし、室温で10分間インキュベーションした。懸濁液を再度、5000rpm、25℃で5分間遠心した。上清を除去し、ペレットを、20mM Tris-HCl(pH8.5)、1％Triton X-100の25ml中に再懸濁することにより、3回目の洗浄を行った。この懸濁液を室温で10分間静置し、その後5000rpm、25℃で5分間遠心した。各試料からの上清を除去し、ペレットを秤量した。次にペレットを、適量の20mM Tris-HCl(pH8.5)、5mM EDTA中に再懸濁することにより、20mg/mlに希釈した。1mlアリコートを、4種の構築体の各々について、これらの懸濁液から作製し、-20℃で貯蔵した。これらのアリコートは、3回洗浄したIBまたは「TWIB」と記した。
【０１６８】
可溶化緩衝液を、以下の成分で調製した：6M塩酸グアニジン、5mM EDTA、50mM Tris-HCl(pH8)および10mM DTT。この溶液1mlを、TWIBの20mgアリコートに添加し、20mg/ml溶液を得た。この溶液を、ベンチ上で一晩インキュベーションし、IBを可溶化した。この手法を、各MBP-GalNAcT2構築体のTWIBアリコートについて行い、タンパク質のリフォールディング実験を提供した。
【０１６９】
大腸菌が発現したMBP-GalNAcT2の活性型を生じることができるリフォールディング条件をスクリーニングするために、Hampton Foldit Screeningキットを用いた(Hampton Products, Aliso Viejo, CA)。リフォールディング緩衝液の各々の組成は、表2に認められる。
【０１７０】
（表２）  Hampton Research Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)からのリフォールディング条件
2008512085.tif 000004
【０１７１】
所定のリフォールディング条件に関して、リフォールディング緩衝液950μLを可溶化されたタンパク質50μLと一緒にするか(高タンパク質濃度条件について)、またはリフォールディング緩衝液995μLを可溶化されたタンパク質5μLと一緒にした(低タンパク質濃度条件について)。リフォールディング反応を、コールドルーム(4℃)中の回転振盪機上に、一晩配置した。
【０１７２】
このスクリーニングにおいて得られた結果から、リフォールディング条件3、8、11、12、15および16は、構築体1および2に関して最も有望な結果を生じたことが決定された。追加のリフォールディング反応は、透析の代わりにG-50ゲル濾過を使用するそのような条件下で行い、より濃縮されたタンパク質リフォールディング試料を得た(方法に関してはRefold Purificationの項参照)。これらの実験から、更に精緻化し、条件8および11が最適であることがわかった。より詳細に述べると、条件15は、一晩のインキュベーション回転において最適であり、および条件8は、5日間のインキュベーションにおいても依然最適であることがわかった。
【０１７３】
タンパク質リフォールディング試料は最初に、20mM Tris-HCl(pH8.5)に対する透析により精製した。各リフォールディング試料100μLを透析した。透析は、ゆっくり攪拌しながら、20mM Tris-HCl(pH8.5)を含むビーカー中で行った。試料を、4℃に配置し、一晩透析させた。得られた保持物質を、本明細書の別所に記載したような、放射能アッセイ法において使用した。より濃縮されたタンパク質試料を得るための代替法として、MBP-GalNAcT2リフォールディング試料を、G-50 Macro Spinカラム(Harvard Bioscience, Holliston, MA)を使用し精製した。キャップを、G-50カラムから取り外し、カラムを2ml微量遠心チューブ中に配置した。各カラムに、H2O(500μl)を添加し、これらのカラムを、15分間インキュベーションし、水和した。その後カラムを、〜2000xgで4分間遠心し、その後これらを、新たな2ml遠心チューブに移した。各リフォールディング溶液(150μl)を、一つのカラムに装荷した。次にカラムを、2000xgで〜2分間遠心した。得られた透過物は、精製したリフォールディング試料を表した。
【０１７４】
放射性標識した[3H]-UDP-GalNAcアッセイ法を行い、大腸菌発現させたリフォールディングされたMBP-GalNAcT2の活性を、放射性標識したGalNAcのペプチド受容体への添加をモニタリングすることにより決定した。受容体は、配列MVTPTPTPTC(配列番号:16)を有するMuC-2様ペプチドであった。このペプチドは、1M Tris-HCl(pH8.0)中に溶解した。最初のスクリーニングは、透析により精製された、リフォールディングされたタンパク質試料について行った。引き続きリフォールディング試料は、新たにリフォールディング、およびG-50ゲル濾過により精製した。このアッセイ法は、タンパク質リフォールディング試料、陽性対照としてバキュロウイルス由来のGalNAcT2、酵素以外の全ての成分を伴う陰性対照試料、および酵素以外の全ての成分を含んだ最大投入試料を含んだ。合計19種の試料を試験した。これらの成分からなるアッセイ溶液は、表3に列記した：
【０１７５】
（表３）  GalNAcT2アッセイ反応組成
2008512085.tif 000005
【０１７６】
リフォールディング試料の各々に関して、反応混合物30μLを、リフォールディング試料20μLと一緒にした。陰性対照に関して、H2O 20μLを、反応混合物30μLと一緒にした。陽性対照に関して、GalNAcT2バキュロウイルス酵素1μLを、H2O 19μLに加えて添加し、反応混合物30μLを形成した。「最大投入」試料に関して、反応混合物30μLを、dH2O 20μLと一緒にした。反応は、37℃で30分間インキュベーションした。100ml DOWEX AG 1X8(塩素型)を、樹脂100mlおよびH2O 100mlと一緒にし、十分に混合することにより洗浄した。水を樹脂から注傾除去し、別のH2O 100mlを添加し、混合し、除去した。樹脂を、dH2O 100ml中で最後の1回再懸濁した。GalNAcT2アッセイ反応液を30分間インキュベーションした後、H2O中に再懸濁した樹脂1mlを、各反応液に添加した(最大投入試料を除く)。試料を、短くボルテックスし、その後フィルターカラムに負荷し、重力によりシンチレーションバイアルへと流出させた。シンチレーション液5mlを、各試料および標準に添加した。試料を短時間振盪し、シンチレーションカウンターに負荷し、放射能を測定した。
【０１７７】
大腸菌発現させたリフォールディングされたMBP-GalNAcT2は、GalNAcをUDP-GalNAc供与体からインターフェロンα-2b受容体へ転移するかどうかを決定するために、IFα-2bアッセイ法を行った。リフォールドスクリーニングから得たデータから(本明細書の別所に説明した[3H]UDP-GalNAcT2アッセイ法参照)、放射能アッセイ法により決定されたように、リフォールディング緩衝液8および15中のMBP-GalNAc構築体1および2は、最も活性のある酵素を生じたことが示された。従ってIFα-2bアッセイ法において、リフォールディング緩衝液8および15中の構築体1および2は、転移酵素活性についてアッセイした。加えて陽性対照として、バキュロウイルスシステム由来のGalNAcT2を更にアッセイした。
【０１７８】
このアッセイ法は、反応緩衝液(27mM MES(pH7)、200mM NaCl、20mM MgCl2、20mM MnCl2、および0.1％Tween 80)、IFα-2bタンパク質(5OmM MES(pH6)中2mg/ml、150mM NaCl、0.05％Tween 80、0.05％ NaN3)、および100mM UDP-GalNAcからなった。このアッセイ溶液は、各反応について表4に示したように調製した。
【０１７９】
（表４）  IFα-2b受容体GalNAcT2活性アッセイ法のパラメータ
2008512085.tif 000006
【０１８０】
各リフォールディング試料に関して、試料4.4μLを、反応溶液15μLに添加した。陽性対照に関して、標準GalNAcT2バキュロウイルス1μLを、H2O 3.4μLと共に1本のチューブへ添加した。反応液を、32℃で回転振盪機上で数日間インキュベーションし、その間に、一晩時点および5日目時点で、MALDIによりアッセイした。
【０１８１】
前記アッセイ法を行い、大腸菌発現されリフォールディングされたMBP-GalNAcT2は、GalNAcをUDP-GalNAc供与体からG-CSF受容体へ転移するかどうかを決定した。前述のように、リフォールディング緩衝液8中の構築体2を、GalNAcT2活性についてアッセイした。加えて、陽性対照のバキュロウイルス由来のGalNAcT2をアッセイした。アッセイ法は、反応緩衝液(27mM MES(pH7)、200mM NaCl、20mM MgCl2、20mM MnCl2、および0.1％Tween 80)、G-CSFタンパク質(H2O中2mg/ml)、および100mM UDP-GalNAcからなった。アッセイ溶液を、表5に示したように、各反応について調製した。
【０１８２】
（表５）  G-CSF受容体GalNAcT2活性アッセイ法のパラメータ
2008512085.tif 000007
【０１８３】
リフォールディング試料に関して、試料4.4μLを、反応溶液15μLに添加した。陽性対照に関して、標準GalNAcT2バキュロウイルス1μLを、H2O 3.4μLと共に1本のチューブへ添加した。反応液を、32℃で回転振盪機上で4日間インキュベーションし、その終了時に、試料を採取し、MALDIによりアッセイした。
【０１８４】
表22に示したように、ペレット質量および封入体質量を、4種の1LのJM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体1から4の培養物の各々について決定した。
【０１８５】
（表６）  封入体重量に対する細胞ペレット重量
2008512085.tif 000008
【０１８６】
MBP-GalNAcT2の発現は、IPTGによる誘導前および後の、JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2全細胞試料のSDS-Pageゲル分析により観察した(図7)。タンパク質ゲルは、誘導されない状態と比べ、誘導された状態でのタンパク質発現の明らかな増加を示している。更に〜100kDaに識別できるバンドが存在し、これは誘導後に実質的に増加し、MBP-GalNAcT2バンドの予想されたサイズと相関している。
【０１８７】
タンパク質試料50μLを、H2O 950μLと一緒にすることにより、タンパク質試料を希釈した。その後UV分光光度計を用い、試料を分析した。タンパク質濃度は、吸光度およびモル吸光係数から算出した：表7に示す通り、構築体1−0.65mg/ml/1 A280単位、構築体2−0.64mg/ml/1 A280単位。
【０１８８】
（表７）  可溶化およびG-50精製後の1L JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2培養物のタンパク質濃度
2008512085.tif 000009
【０１８９】
JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体1および2から得られた封入体は、SDS-PAGEを用いて分析し、MBP-GalNAcT2の存在を証明した。このタンパク質は、ゲルの両方のレーンにおいて明らかに観察され、約100kDaに流れた(図8)。
【０１９０】
4種全ての構築体を、Hampton Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)において利用可能な16種のリフォールディング条件全ての下で、[3H]UDP-GalNAcT2アッセイ法において試験した。リフォールディングされた切断型酵素は、透析により精製し、次に表8に示したように、放射能アッセイ法を用いて活性について試験した。
【０１９１】
（表８）  リフォールディングされたタンパク質のGalNAcT2活性アッセイ法の結果
2008512085.tif 000010
【０１９２】
このアッセイ法の結果は、リフォールディング条件3、8、11、12、15および16は、最高のCPMをもたらし、従って最大の可能性のあるGalNAcT2活性をもたらしたことを示している。更に、構築体2は、このアッセイ法において最大数の陽性ヒットを生じたことは明らかであり、従ってこの構築体に焦点をあてて研究した。
【０１９３】
（表９）  焦点をあてた一晩リフォールディングした切断型酵素の結果
2008512085.tif 000011
【０１９４】
このアッセイ法において、構築体2は、Hampton Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)の、リフォールディング条件3、8、11、12、15および16下で試験した。これらのリフォールディングされた酵素は、G-50ゲル濾過により精製し、次に放射能アッセイ法により活性について試験した。結果は、回転装置上での一晩のインキュベーション後、リフォールディング条件15から最大活性が得られたことを示している。
【０１９５】
（表１０）  5日間のリフォールディング実験のGalNAcT2活性の結果
2008512085.tif 000012
【０１９６】
このアッセイ法において、構築体2は、4℃で一晩回転し4℃で5日間静置した後、Hampton Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)のリフォールディング条件3、8、11、12、15および16下で試験した。これらのリフォールディングされた酵素は、G-50ゲル濾過により精製し、次に放射能アッセイ法により活性について試験した。結果は、リフォールディング緩衝液8中に5日間静置後に、構築体8が最高の活性を示したことを示している。従って条件8および15が、適切にフォールディングされおよび活性のあるMBP-GalNAcT2の作製に関して最大の可能性を有することが決定された。
【０１９７】
IFα-2bアッセイ法を、一晩リフォールディング緩衝液15中で構築体1および2をリフォールドし(各々、1-15および2-15)、32℃で5日間インキュベーションしたものについて、行った。16時間および5日目の時点で、IFα-2b反応液を採取した。結果は、IFα-2bの親ピークは、MW〜19267であることを示している。反応の成功は、そのピークへの〜203分子量の追加により示された。リフォールド物1-15および2-15に関する5日目のデータから、出現するピークは、各々、〜119478および〜19473に認められ、その差は約203MWであった。このデータは、GalNAcは、リフォールディングされたGalNAcT2タンパク質により、IFα-2bへ付加されたことを例示し、これにより、放射能アッセイ法により本明細書の別所に報告された活性を確認した。
【０１９８】
加えてIFα-2bアッセイ法を、リフォールディング緩衝液8中で構築体1および2の5日間リフォールディングされた酵素により行った(各々、1-8および2-8)。IFα-2b反応液を再度、32℃で3日間インキュベーションした。反応液を3日目の時点で分析した。結果は、IFα-2bの親ピークは、MW〜19263であることを示している。反応の成功は、そのピークへの〜203分子量の追加により示された。リフォールド物1-8および2-8に関する3日目のデータから、出現するピークは、各々再度、〜19462および〜19469に認められ、同じくその差は約203MWであった。このデータは再度、GalNAcは、リフォールディングされたGalNAcT2タンパク質により、IFα-2bへ付加されたことを例示し、放射能アッセイ法により報告されたことを確認した。
【０１９９】
G-CSFアッセイ法を、リフォールディング緩衝液8中での構築体2の5日間リフォールディングされた酵素について行った。G-CSF反応は、32℃で4日間インキュベーションした。反応液を4日目の時点で分析した。G-CSFの親ピークは、MW〜18786と予想された。反応の成功は、そのピークへの〜203分子量の追加により示された。リフォールディングされた酵素2-8に関する3日目のデータから、出現するピークは、〜19001に認められ、その差は約203MWであった。このデータも、GalNAcは、リフォールディングされたGalNAcT2タンパク質により、G-CSFへ付加されたことを示し、本明細書の別所に報告された放射能アッセイ法およびIFα-2bアッセイ法により報告されたことを確認した。
【０２００】
まとめると、本明細書に示されたデータは、大腸菌発現されたMBP-GalNAcT2は、活性酵素へリフォールディングすることができることを例示している。Hampton Research's Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)において認められるリフォールディング条件8および15の下で、MBP-GalNAcT2構築体1および2の活性のある立体配置が得られた。機能性のリフォールディングされたタンパク質の生成は、放射能アッセイ法、IFα-2bアッセイ法およびG-CSFアッセイ法を用いて示され、これらは本発明のGalNAcT2切断型変異体による、GalNAcのポリペプチドへの転移を明らかにした。
【０２０１】
本明細書の別所に考察したように、本発明のGalNAcT2切断型変異体は、ポリペプチドの「グリコPEG化」としても公知である、グリコシル-ポリエチレングリコール(「グリコシル-PEG」)複合体のポリペプチドへの転移にも有用である。本発明に従い作製された精製されリフォールディングされたΔ51 GalNAcT2-MBP融合体を使用し、Δ51 GalNAcT2-MBPは、GalNAc-シアル酸(SA)-PEG複合体をG-CSFへ転移することが可能であることを示した。
【０２０２】
G-CSFをグリコPEG化するために、グリコPEG化反応混合物を調製した。この反応混合物は、Δ51 GalNAcT2-MBP(20μU)5μl、GalNAc-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)2μl、6.25mM MnCl2、15mM UDP-GalNAc、0.75mM CMP-SA-PEG(20K)、および2mg/ml G-CSFの2μl〜10μlを含んだ。反応生成物のゲル電気泳動は、Δ51 GalNAcT2-MBPは、GalNAc-シアル酸(SA)-PEG複合体をG-CSFへ転移することを明らかにした(図9)。
【０２０３】
実施例3：Δ51 GalNAcT2-MBPの精製およびリフォールディングの最適化
本明細書に示されたΔ51 GalNAcT2のリフォールディングおよび精製の開発は、GalNAcT2変異体の二つのカラム精製手法の有用性を明らかにしている。最初の精製工程としての結合モードのQセファロースファストフローならびに結合およびフロースルーモードのQセファロースXLの使用を調べた。負荷物中のNaCl濃度10OmMを使用するフロースルーモードでのQセファロースXLは、活性Δ51 GalNAcT2-MBPの最良の回収および純度に繋がった。I型ヒドロキシアパタイトの使用は、第二のカラム工程として考えた。最初のデータは、Δ51 GalNAcT2-MBPは、この樹脂へ結合し、リン酸勾配により、活性酵素として溶離することができることを示している。
【０２０４】
Δ51 GalNAcT2-MBPは、本明細書の別所に記したようにクローニングおよび発現した。発現されたΔ51 GalNAcT2-MBPを含む二重洗浄した封入体(DWIB)を作製するために、収集した細胞ペレットを、10mM Tris/5mM EDTA(pH7.5)(5mL/g細胞)中に再懸濁し、マイクロフルイダイザーを12,000psiで用い2回通過させ、溶解した。封入体は、Sorvall RC-3B中の6,000rpmで20分間の遠心により収集した。ペレットを、先の緩衝液中に5mL/gペレットで再懸濁し、引き続き6,000rpmで20分間遠心することにより、2回洗浄した。DWIBは等分し-20℃で貯蔵した。
【０２０５】
最初の試験は、尿素可溶化が、塩酸グアニジン可溶化よりも、リフォールディングされた物質のより高度なΔ51 GalNAcT2-MBP活性に繋がることを示した。従ってΔ51 GalNAcT2-MBPを、全ての引き続きの実験のために、7M尿素/50mM Tris/10mM DTT/5mM EDTA(pH8.0)中で可溶化した。
【０２０６】
1. リフォールディング実験−pH探索(scout)
pH探索を行い、Δ51 GalNAcT2-MBPリフォールディングにとって最良のpHを確定した。
【０２０７】
（表１１）  Δ51 GalNAcT2-MBPリフォールディング条件のpH探索の反応パラメータ
2008512085.tif 000013
【０２０８】
Δ51 GalNAcT2-MBPリフォールディングは、DWIBの2.5gの、7M尿素/50mM Tris/10mM DTT/5mM EDTA(pH8.0)の250mL中への4℃での可溶化により行った。可溶化されたΔ51 GalNAcT2-MBP DWIBの50mLを、リフォールディング緩衝液1Lへ4℃で、攪拌しながら添加した(21倍希釈-0.5mg/mL)。リフォールディングは、攪拌しながら、4℃で20.5時間進行した。
【０２０９】
リフォールド物を、Cuno Zeta Plus BioCap(Cuno, Meriden, CT)を用いて濾過し、4倍に濃縮し、1ft2 3OkDa MWCO TFF(再生セルロース)フィルター上、10mM Tris/5mM NaCl(pH8)の5ダイアフィルトレーション容積(diavolumes)の定容積でダイアフィルトレーションした。
【０２１０】
濃縮されおよびダイアフィルトレーションされたリフォールド物を、予め平衡とした48mL Qセファロースファストフローカラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上に負荷し、低塩緩衝液(10mM Tris/5mM NaCl(pH8.0))の2カラム容積(CV)で洗浄した。タンパク質を、0〜50％高塩緩衝液(10mM Tris/1M NaCl(pH8.0))の15CV勾配で、引き続き100％の高塩緩衝液までの1CV勾配で、溶離した。このカラムは、0.5M NaOHで再生した。
【０２１１】
最高のΔ51 GalNAcT2-MBP活性を、尿素可溶化と組合わせた、リフォールド2a条件(pH8.0)を用いて実現した。活性のあるΔ51 GalNAcT2-MBPは、QSFF溶離時に初期に溶離した。1Lのリフォールドは、合計42OmUのΔ51 GalNAcT2-MBPを生じた。
【０２１２】
Δ51 GalNAcT2-MBPに関する追加のリフォールディング条件をスクリーニングした。55mM MES(pH6.5)、264mM NaCl、11mM KCl、0.055％ PEG 3350および550mM L-アルギニンを含有するリフォールディング緩衝液、ならびに55mM Tris-HCl(pH8.0)、10.56mM NaCl、0.44mM KCl、0.055％ PEG 3350および550mM L-アルギニンを含有するリフォールディング緩衝液をスクリーニングした。2種の緩衝液を使用する4種の条件、すなわちpH6.5での可溶化、それに続くpH6.5でのリフォールディング、pH6.5での可溶化、それに続くpH8.0でのリフォールディング、pH8.0での可溶化、それに続くpH6.5でのリフォールディング、pH8.0での可溶化、それに続くpH8.0でのリフォールディングをスクリーニングした。4種の条件全ての下でリフォールディングされたΔ51 GalNAcT2-MBPのアッセイ法は、GalNAcをGCSFへ転移する能力のある酵素活性を明らかにした。
【０２１３】
2. Δ51 GalNAcTI-MBP精製
Δ51 GalNAcT2-MBP精製におけるQセファロースファストフロー(QSFF)およびQセファロースXL(QXL)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)の使用を、試験した。QSFFを結合モードで使用した。この目的のために、濃縮しダイアフィルトレーションしたΔ51 GalNAcT2-MBPリフォールド物(10mM Tris/5mM NaCl(pH8.0)-A中)を、予め平衡にした50mL QSFFカラム上に装荷し、15CVを超える10mM Tris/5mM NaCl(pH8.0)から50％10mM Tris/1M NaCl(pH8.0)(B)までの勾配を用い、引き続き1CVを超える50から100％Bまでの第二の勾配を用い、溶離した。
【０２１４】
QXLを、結合モードおよびフロースルーモードで使用した。濃縮しダイアフィルトレーションしたΔ51 GalNAcT2-MBPリフォールド物(各4OmL＝160mLリフォールド容積)中のNaCl濃度を、5、50、100、および20OmM NaClに調整し、その後3.9mL QXLカラムに装荷した。カラムを、2CVで洗浄し、結合したタンパク質を、AからBへの30CV勾配で溶離した。
【０２１５】
Δ51 GalNAcT2-MBPは、負荷緩衝液および平衡化緩衝液中5mM NaClで、前記条件下、QSFF樹脂に密に結合した。活性Δ51 GalNAcT2-MBPは、主要ピークの最初に溶離し、これは非還元4〜20％Tris-グリシンゲル上で2本(doublet)として出現した。主な夾雑物は、98kDaマーカーバンドに隣接したわずかに少ない分子量で流れた、現在同定されていないバンドである。様々な他の夾雑物は、この大きいピークの残りにおいて、不活性Δ51 GalNAcT2-MBPと共に溶離した。
【０２１６】
QSFF結合と同じ条件(すなわち5mM NaCl)が適用された場合には、Δ51 GalNAcT2-MBPは、QXL樹脂に密に結合した。Δ51 GalNAcT2-MBP活性の増加が、この負荷における高いNaCl濃度でのフロースルーおよび洗浄において認められた。興味深いことに、QSFF精製において観察された大きい夾雑バンドは、負荷物が50および100mM NaClを含有する場合は、このフロースルーにおいては認められなかった。これら両方のNaCl濃度で、活性Δ51 GalNAcT2-MBPの大部分は、フロースルーおよび洗浄において認められ；一部の残存するΔ51 GalNAcT2-MBP活性のみが、溶離ピークの左肩に検出された。QSFF樹脂において認められたように、バルク量の夾雑バンドが、主要溶離ピーク中に認められた。活性Δ51 GalNAcT2-MBPの大部分は、負荷物の塩濃度が200mMに調整される場合には、フロースルー中に位置したが、この条件下では、有意な精製は実現されなかった。結論として、フロースルーモードでのQXLの使用のための最適NaCl濃度は、50mM NaClよりも高いが、200mM NaClよりも低い。これらのデータを基に、フロースルーモードでアニオン交換樹脂を使用するためには、100mM NaClが、負荷緩衝液および平衡化緩衝液における適当な濃度である。
【０２１７】
I型ヒドロキシアパタイト(80μm)(BioRad, Hercules, CA)を、第二のカラム工程として試験した。QSFF上で部分的に精製された(結合および溶離モードを使用)活性Δ51 GalNAcT2-MBPを用いて、活性Δ51 GalNAcT2-MBPは、I型HA樹脂に結合するかどうかおよびタンパク質の更なる精製に有用であるかどうかを調べた。この目的のために、2.25mLのI型HAカラムを、5mM NaPO4/5mM NaCl(pH7.0)(C)で予め平衡とした。QSFFから溶離した活性Δ51 GalNAcT2-MBPを、1M HClでpH7.0に調整し、I型HAカラムに装荷した。タンパク質を、0〜50％300mM NaPO4/5mM NaCl(pH7.0)(D)の20CV勾配、引き続き50〜100％Dの5CV勾配を用いて、溶離した。このカラムは、0.5M NaOHを用いて再生した。得られたデータは、Δ51 GalNAcT2-MBPは、I型ヒドロキシアパタイト樹脂へ結合し、活性酵素として溶離されることを示している。
【０２１８】
本明細書に列記された特許、特許出願、および刊行物の開示の各々および全ては、それらの全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０２１９】
本発明は、具体的態様を参照し明らかにされているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱しない限りは、本発明の他の態様および変更が当業者により考案され得ることは明らかであろう。添付された「特許請求の範囲」は、そのような態様および同等な変更を全て含むように構築されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
本発明を例証する目的で、本発明のある態様の図面が示される。しかし本発明は、図面に示された態様の正確な配列および手段に限定されるものではない。
【図１】図1は、ppGalNAcT2遺伝子のPCR増幅を図示する電気泳動ゲルの画像である。M, 1kb DNAラダー；PCR1、ppGalNAcT2-N41RのPCR産物(1596bp)；PCR2、ppGalNAcT2-N52KのPCR産物(1563bp)；PCR3、ppGalNAcT2-N74GのPCR産物(1497bp)；PCR4、ppGalNAcT2-N95GのPCR産物(1434bp)。
【図２】図2Aは、pCWin2MBPベクターのプラスミド制限地図である。  図2Bは、BamHIおよびXhoIの両制限酵素により消化されたpCWin2MBPベクターの複数の試料から得た断片を図示する電気泳動ゲルの画像である。
【図３】図3は、12コロニーから精製されたプラスミドの制限地図(BamHIおよびXhoI消化)による、DH5α(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)コロニーのスクリーニングを図示する電気泳動ゲルの画像である。レーンM、bpラダー。レーン1〜3、N41R；レーン4〜6、N52K；レーン8〜10、N74G；レーン11〜13、N95G。
【図４】図4は、本明細書の別所記載の、IPTG誘導後の、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)全細胞溶解液のSDS-PAGEを図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。M、プレ染色MW標準；レーン13、IPTG誘導したJM109(pCWin2MBP)；レーン1〜12、コロニー1〜12の全細胞中のタンパク質；レーン1〜3、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N41R)；レーン4〜6、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N52K)；レーン7〜9、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N74G)；レーン10〜12、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N95G)。
【図５】図5は、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)細胞溶解液のSDS-PAGEを図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。M、プレ染色MW標準；レーン13、JM109(pCWin2MBP)の溶解液；レーン1〜12、コロニー1〜12の溶解液；レーン1〜3、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N41R)；レーン4〜6、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N52K)；レーン7〜9、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N74G)；レーン10〜12、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N95G)。
【図６】図6は、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)細胞から単離された封入体のSDS-PAGEを図示する電気泳動タンパク質ゲルの画像である。M、プレ染色MW標準；レーン13、JM109(pCWin2MBP)からの封入体；レーン1〜12、コロニー1〜12からの封入体；レーン1〜3、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N41R)；レーン4〜6、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N52K)；レーン7〜9、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N74G)；レーン10〜12、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N95G)。
【図７】図7は、ヒトGalNAcT2構築体を含む細胞の溶解液中のタンパク質発現パターンを図示する電気泳動ゲルの画像である。レーン1、分子量マーカー；レーン2、誘導前の構築体1培養物；レーン3、誘導後の構築体1培養物；レーン4、誘導前の構築体2培養物；レーン5、誘導後の構築体2培養物；レーン6、誘導前の構築体3培養物；レーン7、誘導後の構築体3培養物；レーン8、誘導前の構築体4培養物；レーン9、誘導後の構築体4培養物；レーン10、空。
【図８】図8は、JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体からの封入体のタンパク質含量を図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、MWマーカー；レーン2、JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体1封入体；レーン3、JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体2封入体。
【図９】図9は、Δ51 GalNAcT2-MBPによる、G-CSFのグリコPEG化を図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、1mg/ml G-CSF存在下でのグリコPEG化；レーン2、0.7mg/ml G-CSF存在下でのグリコPEG化；レーン3、0.4mg/ml G-CSF存在下でのグリコPEG化；レーン4、0.2mg/ml G-CSFの存在下でのグリコPEG化。グリコPEG化されたG-CSFは、60kDa周辺に認められる。
【図１０】図10Aおよび10Bは、Δ40 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列を示す。
【図１１】図11Aおよび11Bは、Δ51 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列を示す。
【図１２】図12Aおよび12Bは、Δ73 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列を示す。
【図１３】図13Aおよび13Bは、Δ94 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列を示す。
【図１４】図14Aは、pH5.5でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示する、クロマトグラムの画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図14Bは、図14Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図14Cは、図14Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１５】図15Aは、pH6.5でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図15Bは、図15Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図15Cは、図15Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を図示する表である。
【図１６】図16Aは、pH8.0でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図16Bは、図16Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図16Cは、図16Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１７】図17Aは、pH8.5でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図17Bは、図17Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図17Cは、図17Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１８】図18Aは、pH8.0でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図18Bは、図18Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図18Cは、図18Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１９】図19Aは、Q-セファロースファストフローカラムの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図19Bは、図19Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図19Aのクロマトグラムに相当している。  図19Cは、図19Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２０】図20Aは、5mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図20Bは、図20Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図20Aのクロマトグラムに相当している。  図20Cは、図20Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２１】図21Aは、50mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図21Bは、図21Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図21Aのクロマトグラムに相当している。  図21Cは、図21Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２２】図22Aは、100mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図22Bは、図22Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図22Aのクロマトグラムに相当している。  図22Cは、図22Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２３】図23Aは、200mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図23Bは、図23Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図23Aのクロマトグラムに相当している。  図23Cは、図23Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２４】図24Aは、ヒドロキシアパタイトI型カラムからのΔ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図24Bは、図24Aに示した溶離された画分の視認に使用した電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図24Aのクロマトグラムに相当している。  図24Cは、図24Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２５】図25は、リフォールディングされたΔ51 GalNAcT2-MBPの様々な調製物の相対GalNAc転移酵素活性を図示するグラフである。各調製物のリフォールディング条件は、x軸に示し、相対GalNAc転移酵素活性は、Y軸に示している。
【図２６】図26は、リフォールディングされたΔ51 GalNAcT2-MBPの様々な調製物の相対GalNAc転移酵素活性を図示するグラフである。各調製物のリフォールディング条件は、x軸に示され、相対GalNAc転移酵素活性は、Y軸に示されている。
【図２７】図27は、本発明に従いリフォールディングされおよび精製されたΔ51 GalNAcT2-MBPにより媒介された、GCSFへのGalNAc転移を明らかにする、3種のMALDI-TOFスペクトルである。
【図２８】図28は、本発明に従いリフォールディングされおよび精製されたΔ51 GalNAcT2-MBPにより媒介された、GCSFへのGalNAc転移を明らかにする、3種のMALDI-TOFスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月4日(2007.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本明細書において使用される用語ペプチドの「切断」型は、そのペプチドの完全長アミノ酸配列と比べ、1個または複数のアミノ酸残基を欠いているペプチドを意味する。例えばペプチド「NH2-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」(配列番号:21)は、完全長ペプチド「NH2-Gly-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」(配列番号:22)のN末端切断型を意味する。用語「切断型」および「切断変異体」は、本明細書において互換的に使用される。非限定的例として、切断型ペプチドは、シグナルドメインが完全長GalNAcT2と比べ1個のN末端アミノ酸残基を欠いている、活性ドメイン、基幹ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナルドメインを含むGalNAcT2ポリペプチドである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
本発明を例証する目的で、本発明のある態様の図面が示される。しかし本発明は、図面に示された態様の正確な配列および手段に限定されるものではない。
【図１】図1は、ppGalNAcT2遺伝子のPCR増幅を図示する電気泳動ゲルの画像である。M, 1kb DNAラダー；PCR1、ppGalNAcT2-N41RのPCR産物(1596bp)；PCR2、ppGalNAcT2-N52KのPCR産物(1563bp)；PCR3、ppGalNAcT2-N74GのPCR産物(1497bp)；PCR4、ppGalNAcT2-N95GのPCR産物(1434bp)。
【図２】図2Aは、pCWin2MBPベクターのプラスミド制限地図である。  図2Bは、BamHIおよびXhoIの両制限酵素により消化されたpCWin2MBPベクターの複数の試料から得た断片を図示する電気泳動ゲルの画像である。
【図３】図3は、12コロニーから精製されたプラスミドの制限地図(BamHIおよびXhoI消化)による、DH5α(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)コロニーのスクリーニングを図示する電気泳動ゲルの画像である。レーンM、bpラダー。レーン1〜3、N41R；レーン4〜6、N52K；レーン8〜10、N74G；レーン11〜13、N95G。
【図４】図4は、本明細書の別所記載の、IPTG誘導後の、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)全細胞溶解液のSDS-PAGEを図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。M、プレ染色MW標準；レーン13、IPTG誘導したJM109(pCWin2MBP)；レーン1〜12、コロニー1〜12の全細胞中のタンパク質；レーン1〜3、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N41R)；レーン4〜6、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N52K)；レーン7〜9、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N74G)；レーン10〜12、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N95G)。
【図５】図5は、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)細胞溶解液のSDS-PAGEを図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。M、プレ染色MW標準；レーン13、JM109(pCWin2MBP)の溶解液；レーン1〜12、コロニー1〜12の溶解液；レーン1〜3、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N41R)；レーン4〜6、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N52K)；レーン7〜9、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N74G)；レーン10〜12、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N95G)。
【図６】図6は、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2)細胞から単離された封入体のSDS-PAGEを図示する電気泳動タンパク質ゲルの画像である。M、プレ染色MW標準；レーン13、JM109(pCWin2MBP)からの封入体；レーン1〜12、コロニー1〜12からの封入体；レーン1〜3、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N41R)；レーン4〜6、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N52K)；レーン7〜9、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N74G)；レーン10〜12、JM109(pCWin2MBP-ppGalNAcT2N95G)。
【図７】図7は、ヒトGalNAcT2構築体を含む細胞の溶解液中のタンパク質発現パターンを図示する電気泳動ゲルの画像である。レーン1、分子量マーカー；レーン2、誘導前の構築体1培養物；レーン3、誘導後の構築体1培養物；レーン4、誘導前の構築体2培養物；レーン5、誘導後の構築体2培養物；レーン6、誘導前の構築体3培養物；レーン7、誘導後の構築体3培養物；レーン8、誘導前の構築体4培養物；レーン9、誘導後の構築体4培養物；レーン10、空。
【図８】図8は、JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体からの封入体のタンパク質含量を図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、MWマーカー；レーン2、JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体1封入体；レーン3、JM109 pCWin2 MBP-GalNAcT2構築体2封入体。
【図９】図9は、Δ51 GalNAcT2-MBPによる、G-CSFのグリコPEG化を図示する、電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、1mg/ml G-CSF存在下でのグリコPEG化；レーン2、0.7mg/ml G-CSF存在下でのグリコPEG化；レーン3、0.4mg/ml G-CSF存在下でのグリコPEG化；レーン4、0.2mg/ml G-CSFの存在下でのグリコPEG化。グリコPEG化されたG-CSFは、60kDa周辺に認められる。
【図１０】図10Aおよび10Bは、Δ40 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列(配列番号:17)を示す。
【図１１】図11Aおよび11Bは、Δ51 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列(配列番号:18)を示す。
【図１２】図12Aおよび12Bは、Δ73 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列(配列番号:19)を示す。
【図１３】図13Aおよび13Bは、Δ94 GalNAcT2ポリペプチドをコードしている核酸配列(配列番号:20)を示す。
【図１４】図14Aは、pH5.5でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示する、クロマトグラムの画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図14Bは、図14Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図14Cは、図14Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１５】図15Aは、pH6.5でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図15Bは、図15Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図15Cは、図15Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を図示する表である。
【図１６】図16Aは、pH8.0でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図16Bは、図16Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図16Cは、図16Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１７】図17Aは、pH8.5でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図17Bは、図17Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図17Cは、図17Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１８】図18Aは、pH8.0でリフォールディングされ、引き続きQ-セファロースファストフローカラムから溶離された、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図18Bは、図18Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示している。  図18Cは、図18Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図１９】図19Aは、Q-セファロースファストフローカラムの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図19Bは、図19Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図19Aのクロマトグラムに相当している。  図19Cは、図19Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２０】図20Aは、5mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図20Bは、図20Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図20Aのクロマトグラムに相当している。  図20Cは、図20Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２１】図21Aは、50mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図21Bは、図21Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図21Aのクロマトグラムに相当している。  図21Cは、図21Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２２】図22Aは、100mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図22Bは、図22Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図22Aのクロマトグラムに相当している。  図22Cは、図22Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２３】図23Aは、200mM NaClを使用する、Q-セファロースXLカラムからの、Δ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図23Bは、図23Aに示した溶離された画分の視認に使用した二つの電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図23Aのクロマトグラムに相当している。  図23Cは、図23Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２４】図24Aは、ヒドロキシアパタイトI型カラムからのΔ51 GalNAcT2-MBPの溶離を図示するクロマトグラム画像である。画分番号は、X軸上に示し、各画分の相対吸光度は、Y軸に示している。  図24Bは、図24Aに示した溶離された画分の視認に使用した電気泳動ゲルの画像である。ゲル上の各レーンの内容物は、図中に示し、図24Aのクロマトグラムに相当している。  図24Cは、図24Aに示された画分の相対GalNAc転移酵素活性を例示する表である。
【図２５】図25は、リフォールディングされたΔ51 GalNAcT2-MBPの様々な調製物の相対GalNAc転移酵素活性を図示するグラフである。各調製物のリフォールディング条件は、x軸に示し、相対GalNAc転移酵素活性は、Y軸に示している。
【図２６】図26は、リフォールディングされたΔ51 GalNAcT2-MBPの様々な調製物の相対GalNAc転移酵素活性を図示するグラフである。各調製物のリフォールディング条件は、x軸に示され、相対GalNAc転移酵素活性は、Y軸に示されている。
【図２７】図27は、本発明に従いリフォールディングされおよび精製されたΔ51 GalNAcT2-MBPにより媒介された、GCSFへのGalNAc転移を明らかにする、3種のMALDI-TOFスペクトルである。
【図２８】図28は、本発明に従いリフォールディングされおよび精製されたΔ51 GalNAcT2-MBPにより媒介された、GCSFへのGalNAc転移を明らかにする、3種のMALDI-TOFスペクトルである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008512085000001.app
【国際調査報告】
2008512085.tif 000083
2008512085.tif 000084
2008512085.tif 000085
2008512085.tif 000086