(57)【要約】  対象から単離されたときから約６〜９６時間にわたり１℃〜３４℃の温度においてインキュベートされた単球から樹状細胞の作製のための方法が提供される。インキュベート時間経過後、単球は樹状細胞へ分化するように誘導されうる。本発明の方法により作製された成熟樹状細胞は、対象から単離されたときから少なくとも６時間にわたり１℃〜３４℃において保持されなかった単球から作製された成熟樹状細胞と比較して、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ分子、またはＭＨＣクラスII分子のうち１種以上を高レベルで有している。本発明の方法により作製された樹状細胞は、ワクチンの製造およびＴ細胞の刺激に有用である。
2008535493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｂ．対象から単離されたときから約６〜９６時間にわたり１℃〜３４℃の温度においてインキュベートされた単球を用意し、そして
ｃ．前記単球から樹状細胞への分化を誘導する
ことを含んでなる、単球から樹状細胞を作製するための方法。
【請求項２】
前記単球がヒト単球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベート温度が６℃〜２８℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベート温度が８℃〜２６℃である、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベート時間が８〜４８時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベート時間が１０〜３０時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベート時間が２６〜７２時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベート時間が４８〜８０時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
単球から未成熟樹状細胞への分化を誘導する組成物の有効量を含んでなる培地と単球とを接触させることにより分化が誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物がＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐１３、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐１５、またはＩＦＮαである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記単球が、インキュベート時間の全部または一部にわたり、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共存される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＢＭＣが白血球搬出法により対象から単離されたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単球が、インキュベート時間中またはその後に、ＰＢＭＣから濃縮されたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記単球が、水簸、希釈フィコール勾配遠心、希釈パーコール密度勾配遠心、または磁気ビーズ選別により、ＰＢＭＣから濃縮されるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記単球が、インキュベート時間経過後に単球をプラスチックへ付着させることによりＰＢＭＣから濃縮されるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞へ成熟させる工程を更に含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
１種以上の抗原を前記成熟樹状細胞へ負荷させることを更に含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程が、未成熟樹状細胞をＰＧＥ２、ＴＮＦα、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１βと接触させることを含んでなるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程が、前記未成熟樹状細胞をＩＦＮ‐γによりシグナリングし、次いでその樹状細胞をＣＤ４０Ｌによりシグナリングすることを含んでなるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤ４０Ｌによるシグナリングが、樹状細胞内における組み換えＣＤ４０Ｌ  ｍＲＮＡの翻訳時に行われるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程が、成熟樹状細胞を作製するために未成熟樹状細胞をＰＧＥ２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγと接触させることを含んでなるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ４０ＬをコードするＲＮＡおよび／または対象の１種以上の抗原またはエピトープをコードするＲＮＡを、前記成熟樹状細胞にトランスフェクトすることを更に含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡが１種以上の癌細胞抗原をコードするものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡが１種以上の病原体抗原をコードするものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
抗原負荷樹状細胞を作製するために樹状細胞に１種以上の抗原を負荷させることを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原が対象と自家であるものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原をコードする１種以上のＲＮＡを前記樹状細胞にトランスフェクトすることにより前記抗原が負荷される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記樹状細胞がエレクトロポレーションによりＲＮＡによってトランスフェクトされるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が約１〜４μｇ  ＲＮＡ／１０６樹状細胞によりトランスフェクトされるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記樹状細胞が抗原負荷の際に未成熟であるものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
更に、前記抗原負荷未成熟樹状細胞を抗原負荷成熟樹状細胞へ成熟させることを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗原が１種以上の癌細胞または病原体からのもの、またはそれから誘導されたものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、腎臓細胞癌、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、および膵臓癌からなる群より選択されるものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記病原体がＨＩＶまたはＨＣＶである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）少なくとも２％のＤＭＳＯを含んでなる凍結樹状細胞ワクチンを融解し、そして
ｂ）投与前に細胞対ＤＭＳＯの比率を変えることなく対象へ前記融解ワクチンを投与することを含んでなる、対象へ樹状細胞ワクチンを投与する方法。
【請求項３６】
前記凍結ワクチン中におけるＤＭＳＯの濃度が約１０％である、請求項４４に記載の方法。
【請求項３７】
前記樹状細胞が請求項１６に記載の方法により作製されるものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬剤が少なくとも２％のＤＭＳＯを含んでなり、融解していつでも投与しうるものである、癌または病原体感染症の治療または予防用の凍結薬剤の製造に際する抗原負荷樹状細胞の使用。
【請求項３９】
前記薬剤が少なくとも１０％のＤＭＳＯを含んでなるものである、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
請求項１６に記載の方法により作製された樹状細胞を含んでなる組成物。
【請求項４１】
前記樹状細胞が抗原負荷されているものである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記樹状細胞がＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡによりトランスフェクトされるものである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記成熟樹状細胞が、新鮮単球から作製された成熟樹状細胞と比較して、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ分子、またはＭＨＣクラスII分子のうち１種以上を高レベルで有するものである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記成熟樹状細胞が、新鮮単球から作製された成熟樹状細胞と比較して、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ分子、またはＭＨＣクラスII分子のうち１種以上を高レベルで有するものである、成熟単球由来樹状細胞を含んでなる組成物。
【請求項４５】
前記成熟樹状細胞がＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡにより一時的にトランスフェクトされるものである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
細胞中ＡＬＯＸ１５  ＲＮＡ対β‐アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの定常状態比が１．０未満である、成熟単球由来樹状細胞。
【請求項４７】
前記比率が０．２〜０．７である、請求項４６に記載の樹状細胞。
【請求項４８】
前記比率が０．４〜０．５である、請求項４７に記載の樹状細胞。
【請求項４９】
細胞中ＣＤ５２  ＲＮＡ対β‐アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨの定常状態比が１．０より大きい、成熟単球由来樹状細胞。
【請求項５０】
前記比率が１．２〜５．０である、請求項４９に記載の樹状細胞。
【請求項５１】
前記比率が１．５〜２．２である、請求項５０に記載の樹状細胞。
【請求項５２】
前記比率が１．８〜１．９である、請求項５１に記載の樹状細胞。
【請求項５３】
細胞中ＴＬＲ１  ＲＮＡ、ＴＬＲ２  ＲＮＡ、ＩＬ‐１β  ＲＮＡ、またはＣＤ６９  ＲＮＡ対β‐アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの定常状態比が１．０未満である、成熟単球由来樹状細胞。
【請求項５４】
前記比率が０．２〜０．９である、請求項５３に記載の樹状細胞。
【請求項５５】
前記比率が０．５〜０．８である、請求項５４に記載の樹状細胞。
【請求項５６】
請求項４０〜５５のいずれか一項に記載の組成物を含んでなるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、病気の治療に有用な樹状細胞および関連組成物の作製法に関する。
【０００２】
背景技術
多くの臨床試験により樹状細胞ワクチンの安全性が証明されており、１０００例以上の患者が樹状細胞ワクチンを受け、重度の有害事象なく、そして患者の半数において治療および臨床反応を示した（Ridgeway(2003)Cancer Invest.,21:873-876）。例えば、最近の研究においては、４種の黒色腫ペプチド、ｇｐ１００、ｍｅｌａｎ‐Ａ／ＭＡＲＴ‐１、チロシン黒色腫抗原（ＭＡＧＥ‐３）、ＫＬＨとｆｌｕマトリックスとにより負荷された樹状細胞を用いた予防接種において、４回の隔月予防接種後に転移黒色腫の退行がみられたことが示されている（Banchereau et al.(2001)Cancer Res.,61:6451-6458）。
【０００３】
樹状細胞（ＤＣ）の一般的な作製方法は、対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、次いでＰＢＭＣの小集団である単球をＤＣへ分化させることである。樹状細胞のインビトロ作製に適した前駆体として作用するためには、単球は対象から単離後すぐに凍結または培養されねばならないと、広く考えられていた。したがって、樹状細胞ワクチンが、単球から作製されていた以前の臨床試験においては、ＰＢＭＣまたは単球が患者からＰＢＭＣの採取後数時間以内に約３７℃において培養または凍結された。しかしながら、製造の実際を考慮すると、新鮮な単離ＰＢＭＣまたは単球の培養または凍結を要する方法により処理されたワクチンの広範な使用は制限される。ＰＢＭＣからＤＣへの分化には約１週間を必要とし、ＧＭＰ施設と熟練した専門家を必要とする。したがって、ＰＢＭＣが患者から得られる各臨床現場またはその近くにおいてＤＣワクチンを製造するための施設とその要員の用意には、法外な費用が必要となる。
【０００４】
ＤＣワクチンを製造する上で商業的に有効なモデルによれば、臨床現場において採取されて製造現場へ運ばれた患者ＰＢＭＣまたは単球からＤＣワクチンを製造できる、一つまたは比較的少数の施設を用意することになる。しかしながら、このようなモデルにおいては新鮮なＰＢＭＣまたは単球を必要とする現行のＤＣ作製法に適用できない。新鮮な単球を凍結するには白血球搬出後に採取現場において追加の操作を必要とし、よって望ましい代替法ではない。したがって、製造施設への運搬に際して貯蔵されたＰＢＭＣまたは単球を用いてＤＣワクチンを製造するための方法を開発することが求められている。本発明はこの必要性を満足し、更なる利点も有する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、対象から単離後６〜９６時間にわたり１〜３４℃において貯蔵された単球から樹状細胞および樹状細胞ワクチンを製造できる方法を見出した。貯蔵単球からＤＣを作製しうる能力は、採取現場から製造施設への単球の柔軟性と運搬性とを増大させる。加えて、本発明者らは、貯蔵単球から製造された樹状細胞ワクチンが新鮮単球から作製された樹状細胞より表現型において優れていることを見出した。例えば、貯蔵単球から製造された樹状細胞ワクチンは、新鮮単球から作製された樹状細胞と比較して、高レベルの共刺激分子、例えばＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６ならびに高レベルのＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII分子を有している。
【０００６】
従って、一つの態様において、本発明は：
ａ．対象から単離されたときから６〜９６時間にわたり１℃〜３４℃の温度においてインキュベートされた単球を用意し、そして
ｂ．上記単球から樹状細胞への分化を誘導する
ことを含んでなる、単球から樹状細胞を作製するための方法を提供する。
【０００７】
好ましい態様においては、単球を含んでなる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取する白血球搬出法(leukapheresis)により単球が得られる。
【０００８】
好ましくは、未成熟樹状細胞への単球の分化を誘導する有効量の組成物、例えば限定されないが、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐１３、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐１５、およびＩＦＮαを含んでなる培地と単球とを接触させることにより、分化が誘導される。次いで、成熟樹状細胞を作製するために未成熟樹状細胞が成熟させられる。
【０００９】
本発明の方法により作製された成熟樹状細胞は、従来の成熟樹状細胞とは表現型において異る。例えば、本発明は、細胞中ＡＬＯＸ１５  ＲＮＡ対アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの定常状態比が１．０未満である、成熟単球由来樹状細胞を提供する。これは、新鮮単球から作製された成熟樹状細胞におけるＡＬＯＸ１５対アクチンまたはＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの比率と比較して、低い比率である。他の態様において、本発明は、細胞中ＣＤ５２  ＲＮＡ対アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨの定常状態比が１．０より大きい、成熟単球由来樹状細胞を提供する。更に他の態様において、本発明は細胞中ＴＬＲ１  ＲＮＡ、ＴＬＲ２  ＲＮＡ、ＩＬ‐１β  ＲＮＡまたはＣＤ６９  ＲＮＡ対アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの定常状態比が１．０未満である、成熟単球由来樹状細胞を提供する。
【００１０】
更に他の態様において、本発明は、新鮮単球から作製された成熟樹状細胞と比較して高レベルでＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ分子、またはＭＨＣクラスII分子のうち１種以上を成熟樹状細胞が有している、成熟単球由来樹状細胞を含んでなる組成物を提供する。加えて、本発明はＡＬＯＸ１５  ＲＮＡ、ＣＤ５２  ＲＮＡ、ＴＬＲ１  ＲＮＡ、ＴＬＲ２  ＲＮＡ、ＩＬ‐１β  ＲＮＡ、またはＣＤ６９  ＲＮＡの定常状態レベルの変化した成熟単球由来樹状細胞を提供する。
【００１１】
本発明の方法により作製された樹状細胞は、ワクチンを製造する上で特に有用である。そのため、関連した樹状細胞組成物およびワクチンも提供される。好ましい態様において、ワクチンは対象と自家である。好ましくは、樹状細胞ワクチンは対象に存在する癌細胞または病原体からの抗原により負荷されている。
【００１２】
意外にも、本発明者らは、ＤＭＳＯにより凍結された樹状細胞ワクチンが融解後少なくとも２時間にわたりＤＭＳＯの存在下において安定であることを見出した。したがって、本発明は癌または病原体感染症の治療または予防用の凍結薬剤の製造のための抗原負荷樹状細胞の使用を提供し、ここで該薬剤は少なくとも２％のＤＭＳＯを含んでなり、融解していつでも投与しうるものである。他の態様において、本発明は：
ａ．少なくとも２％のＤＭＳＯを含んでなる凍結樹状細胞ワクチンを融解し、および
ｂ．投与前に細胞対ＤＭＳＯの比率を変えることなく対象へ融解ワクチンを投与する
ことを含んでなる、対象に予防接種する方法を提供する。
【００１３】
他の態様において、本発明は、細胞がインビトロにおいて単球から分化され、≧５％ＤＭＳＯの存在下において凍結させて、融解後も少なくとも２４時間にわたりインビトロにおいて生存しうる、抗原負荷樹状細胞を提供する。好ましい態様において、抗原負荷樹状細胞は≧１０％ＤＭＳＯの存在下において凍結させて、融解後も少なくとも２４時間にわたりインビトロにおいて生存しうる。
【００１４】
他の態様において、本発明は約５〜１５％ＤＭＳＯを含んでなる樹状細胞ワクチンを提供し、該ワクチンは対象へいつでも投与しうる。
【発明の具体的説明】
【００１５】
この開示の全体にわたり、様々な刊行物、特許、および公開特許明細書が具体的に引用されている。これら刊行物、特許、および公開特許明細書の開示は、本発明が関係する技術水準を更に詳細に説明するために、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００１６】
本発明の実施に際しては、別記されない限り、当業界の技術内に属する分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学において常用される技術を用いる。このような技術は文献において詳細に説明される。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition(1989)、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.eds.(1987))、the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)、PCR:A Practical Approach(M.MacPherson et al.,IRL Press at Oxford University Press(1991))、PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))、Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow and Lane eds.(1988))、Using Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow and Lane eds.(1999))、およびAnimal Cell Culture(R.I.Freshney ed.(1987))参照。
【００１７】
定義
ここで用いられるように、ある用語は以下で定義された意味を有する。
【００１８】
明細書および特許請求の範囲において用いられている単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、内容が明らかにそれ以外のことを記載していない限り、複数の言及を含んでいる。例えば、“細胞”という用語は、その混合物を含めて、複数種の細胞を含む。
【００１９】
“抗原”という用語は当業界においてよく理解されており、免疫原性である物質、即ち免疫原と抗原エピトープとを含む。抗原の使用が、本発明において使用上想定されており、そのため自己抗原（正常または病気関連）、感染性抗原（例えば、微生物抗原、ウイルス抗原など）、または一部他の外来抗原（例えば、食品成分、花粉など）に限定されないが、それらを含むことは明らかであろう。“抗原”または代わりに“免疫原”という用語は２種以上の免疫原の集合にも該当し、そのため複数の免疫原に対する免疫応答が同時に調節されることがある。更に、該用語は免疫原または抗原の様々な異なる処方を含んでいる。好ましい態様において、抗原は癌細胞または病原体からのものである。好ましくは、癌細胞は腎臓癌細胞、多発性骨髄腫細胞、または黒色腫細胞である。好ましい病原体は、ＨＩＶおよびＨＣＶである。好ましい態様において、抗原は癌細胞または病原体から単離または誘導されたＲＮＡの形態により抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ導入される。“から誘導される”とは、非関連または関連配列への融合を含めて、天然配列の組み換え変異体を含むが、それに限定されない。細胞（例えば、癌細胞または病原体細胞）から抽出されたＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲとインビトロ転写に関する方法は、同時係属の米国仮特許出願第６０／５２５，０７６号およびＰＣＴ／ＵＳ０５／０５３２７１号において開示されており、これらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００２０】
“癌”とは比較的自律的な成長を示す細胞の異常な存在を意味し、そのため癌細胞は細胞増殖コントロールの有意な喪失により特徴付けられる異常成長表現型を示す。癌性細胞は良性でもまたは悪性でもよい。様々な態様において、癌は膀胱、血液、脳、乳房、結腸、消化管、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または皮膚の細胞に罹る。ここで用いられている癌細胞の定義には、一次癌細胞のみならず、癌細胞由来の細胞も含む。これには転移癌細胞と、インビトロ培養物および癌細胞由来の細胞系とを含む。癌には固形腫瘍、液体腫瘍、血液悪性疾患、腎臓細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽腫、神経膠芽腫、網膜芽腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝癌、腺腫、肉腫、癌腫、芽細胞腫などがあるが、それらに限定されない。
【００２１】
ここで用いられる“含んでなる”という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含み、その他を除外しないことを意味する。“から本質的になる”とは、組成物および方法を定義するために用いられている場合、組合せに必須の重要な他の要素を除外する意味である。そのため、ここで定義されている要素から本質的になる組成物は、単離および精製法からの微量汚染物および薬学上許容される担体、例えばリン酸緩衝液、保存剤などを除外しない。“からなる”とは、本発明の組成物を投与するための他成分および実質的方法の工程の微量以上の要素を除外する意味である。これら移行句(transition terms)の各々により定義される態様は本発明の範囲内に属する。
【００２２】
ここで用いられる“サイトカイン”という用語は、例えば成長または増殖を含めて、細胞において様々な効果を発揮する多数因子のうちいずれか一つに関する。本発明の実施に際して単独または組合せにより用いられるサイトカインの非限定的な例として、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン‐３（ＩＬ‐３）、インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）、インターロイキン‐６（ＩＬ‐６）、インターロイキン‐１１（ＩＬ‐１１）、インターロイキン‐１２（ＩＬ‐１２）、インターロイキン‐１３（ＩＬ‐１３）、インターロイキン‐１５（ＩＬ‐１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、インターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）、インターフェロン‐γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦα）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＭＩＰ‐１１、白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）、ｃ‐ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ３リガンドがある。サイトカインは、例えばGenzyme（Framingham,ＭＡ）、Genentech（South San Francisco,ＣＡ）、Amgen（Thousand Oaks,ＣＡ）、R&D Systems（Minneapolis,ＭＮ）、およびImmunex（Seattle,ＷＡ）のようないくつかの販売者から市販されている。常に断言できるわけではないが、野生型または精製サイトカイン（例えば、その組み換え産生または突然変異タンパク質）として類似の生物活性を有する分子は、本発明の精神および範囲内において用いられるはずである。
【００２３】
“樹状細胞（ＤＣ）”という用語は、様々なリンパ系および非リンパ系組織において見られる形態学的に類似した細胞型の多様な群に関する（Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.,9:271-296）。樹状細胞は生物において最も強力で好ましいＡＰＣを構成している。樹状細胞は単球から分化でき、単球とは異なる表現型を有する。例えば、具体的な分化マーカー、ＣＤ１４抗原は樹状細胞において見られないが、単球により保持されている。成熟ＤＣはＴ細胞活性化および増殖に必要な全てのシグナルを有する。しかも、成熟樹状細胞は食細胞でなく、一方単球および未成熟樹状細胞は強い食作用を有する細胞である。未成熟ＤＣは飲食作用、食作用、マクロ飲作用、または吸着飲作用およびレセプター媒介抗原取込みにより抗原を捕捉でき、表現型がＣＤ８０−またはＣＤ８０low、ＣＤ８３−またはＣＤ８３low、ＣＤ８６lowであり、高細胞内濃度のＭＨＣクラスII分子を有している。成熟ＤＣはベールで覆われた形態、低い飲食作用能力を有し、未成熟ＤＣと比較して表現型がＣＤ８０high、ＣＤ８３high、ＣＤ８６highである。好ましくは、成熟ＤＣはＩＬ‐１２  ｐ７０ポリペプチドまたはタンパク質を分泌し、および／または有意に低レベル（ＤＣ百万個当たり０〜５００ｐｇ／ｍＬ）のＩＬ‐１０を分泌する。ＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２レベルは、未成熟ＤＣからＤＣ成熟の誘導後３６時間以内に採取された培養上清のＥＬＩＳＡにより調べられる。Wierda W.G.et al.(2000)Blood,96:2917。Ajdary S.et al.(2000)Infection and Immunity,68:1760。概説としてBanchereau and Steinman(1998)Nature,392:245を参照。
【００２４】
“有効量”は有益なまたは望ましい結果を得るために十分な量である。有効量が１回以上の投与、塗布、または服用により投与される。
【００２５】
ここで用いられている“発現”とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、および／またはｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される工程に関する。ポリヌクレオチドが適切な真核細胞宿主のゲノムＤＮＡから導かれたものであれば、発現にはｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。発現に必要な調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼとリボソーム結合用の転写開始配列とを結合させるプロモーター配列がある。例えば、細菌発現ベクターまたはカセットは、プロモーター（例えばｌａｃプロモーター）、転写開始用にはシャイン−ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列および開始コドンＡＵＧを含む（Sambrook et al.(1989)前掲）。同様に、真核細胞発現ベクターまたはカセットは、典型的にはＲＮＡポリメラーゼII用の異種または同種プロモーター、Kozak配列、開始コドンＡＵＧ、リボソーム解離用の終止コドンおよび下流ポリアデニル化シグナルを含む。このようなベクターは商業的に得られるか、または当業界において知られている方法により記載された配列により組み立てられる。
【００２６】
“遺伝子修飾された”という用語は、外来遺伝子または核酸配列を含有および／または発現させ、次いで細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を変えることを意味している。換言すると、それは細胞の内在ヌクレオチドに対する何らかの付加、欠失、または分断に関する。
【００２７】
“単離された”という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が、自然において通常結合している諸成分、細胞、およびその他から分離されることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関すると、単離されたポリヌクレオチドとは、それが染色体において通常結合している５′および３′配列から分離されたものをいう。当業者に明らかなように、非天然ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それをその天然対応物から識別する上で“単離”を必要としない。加えて、“濃縮された”、“分離された”、または“希釈された”ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、容積当たり分子の濃度または数がその天然対応物の場合より“濃縮されている”またはその場合ほど“分離されて”いないという点において、その天然対応物から識別しうる。その一次配列で、または例えばそのグリコシル化パターンにより天然対応物とは異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その単離形により存在する必要がなく、なぜならそれはその一次配列でまたは他の特性、例えばそのグリコシル化パターンによりその天然対応物から識別しうるからである。ここで開示されている発明の各々については断言されないが、以下においておよび適切な条件下において開示されている組成物の各々に関する上記態様の全てが本発明により提供されている、と理解すべきである。そのため、非天然ポリヌクレオチドは単離天然ポリヌクレオチドとは別の態様として提供される。細菌細胞において産生されるタンパク質は、自然に産生されている真核細胞から単離された天然タンパク質とは別の態様として提供される。単離哺乳動物細胞は、それが体内において通常みられる箇所から分離されるか、または体内から取り出される。例えば、白血球搬出法により採取された白血球は“単離された”ものであり、インビトロにおいて単球から分化された樹状細胞も“単離された”ものである。
【００２８】
“主要組織適合遺伝子複合体”または“ＭＨＣ”という用語は、Ｔ細胞への抗原提示および急激な移植片拒絶に必要な細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体に関する。ヒトにおいては、ＭＨＣは“ヒト白血球抗原”または“ＨＬＡ”複合体としても知られている。ＭＨＣによりコードされたタンパク質は“ＭＨＣ分子”として知られ、クラスＩおよびクラスII  ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、β２‐ミクログロブリンと非共有結合されたＭＨＣでコードされるα鎖とから構成されている膜ヘテロダイマータンパク質を含有している。クラスＩ  ＭＨＣ分子はほぼ全ての有核細胞において発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示により機能することが示されていた。クラスＩ分子には、ヒトの場合においてＨＬＡ‐Ａ、Ｂ、およびＣがある。クラスII  ＭＨＣ分子も、非共有結合αおよびβ鎖からなる膜ヘテロダイマータンパク質を含有している。クラスII  ＭＨＣ分子はＣＤ４＋Ｔ細胞において機能することが知られ、ヒトの場合においてＨＬＡ‐ＤＰ、ＤＱ、およびＤＲがある。
【００２９】
単球とは、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４に応答して未成熟樹状細胞へ分化しうるＣＤ１４＋末梢血単核細胞を意味する。
【００３０】
ここで用いられている“病原体”とは、病気を引き起こす生物またはウイルス、更にはその弱毒化誘導体に関する。
【００３１】
“医薬組成物”とは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボにおいて診断または治療用に適した組成物にさせる不活性または活性な担体と活性剤（例えば抗原負荷ＤＣ）との組合せを含めた意味である。
【００３２】
ここで用いられている“薬学上許容される担体”という用語は、あらゆる標準の薬学上の担体、例えば熱不活化血清＋１０％ＤＭＳＯ＋５％デキストロース、リン酸緩衝液、水、およびエマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、および様々な種類の湿潤剤を包含している。該組成物はアジュバント、安定剤、および保存剤も含有しうる。担体、安定剤、およびアジュバントの例に関しては、Remington’s Pharm.Sci.,18th Ed.（Mack Publ.Co.,Easton(1990)）参照。
【００３３】
“ポリヌクレオチド”および“核酸分子”という用語は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態に言及するために、互換的に用いられる。ポリヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含む。ヌクレオチドは何らかの三次元構造を有してもよく、既知または未知の何らかの機能を発揮しうる。“ポリヌクレオチド”という用語には、例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何らかの配列の単離ＤＮＡ、何らかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含んでいる。自然核酸分子に加えて、本発明の核酸分子には修飾核酸分子も含む。
【００３４】
“ペプチド”という用語は、２以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣薬(peptidomimetics)の化合物に関する最広義の意味により用いられる。サブユニットはペプチド結合により繋がれている。他の態様において、サブユニットは他の結合、例えばエステル、エーテルなどにより繋がれてもよい。ここで用いられている“アミノ酸”という用語は、グリシンとＤおよびＬ双方の光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチド模倣薬を含めた、天然および／または非天然または合成アミノ酸に関する。アミノ酸３個以上のペプチドは、そのペプチド鎖が短ければ、オリゴペプチドと通称される。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドはポリペプチドまたはタンパク質と通称される。
【００３５】
ここで用いられている“対象”とは、ヒトおよび他の霊長類、げっ歯類、イヌ、およびネコに限定されないが、それらを含めた哺乳動物に関する。好ましくは、対象はヒトである。
【００３６】
本発明者らは、患者から単球の採取後１℃〜３４℃において約６〜９６時間貯蔵された単球から未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、および抗原負荷樹状細胞が作製されうることを見出した。かなりの時間にわたり環境温度において貯蔵された単球からよりもむしろ、新鮮な単離単球から樹状細胞を作製する方が一般的に難しいと考えられていたことから、これらの結果は意外である。更に、本発明以前に行われた臨床試験において用いられた単球由来ＤＣワクチンは、患者から採取後６時間以内において単球を培養するか、または採取後直ちにＰＢＭＣを凍結した後、融解および単球の培養のためにＰＢＭＣを貯蔵することにより製造された。
【００３７】
本発明者らは、１℃〜３４℃において約６〜９６時間貯蔵された単球から樹状細胞および樹状細胞ワクチンを作製することが可能であることを見出したのみならず、更に意外にもこの方法により作製された樹状細胞が新鮮単球から作製された樹状細胞より表現型において優れていることも見出した。これらの方法により作製された樹状細胞ワクチンの製造方法および特性は、ワクチン効力、広域にわたる商品化の成功、および投与しやすさと特に関係している。第一に、本発明の方法を用いて作製された成熟樹状細胞は、従来法により作製されたＤＣと比較した場合、高レベルのＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６共刺激分子と高レベルのＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII分子とを発現し、それらの全てがＤＣ成熟および効力を示している。加えて、本発明の成熟ＤＣは抗原特異的に記憶Ｔ細胞からＩＬ‐２産生を誘導させることができる。
【００３８】
第二に、患者ＰＢＭＣが採取される各現場付近において樹状細胞製造能を確立することは商業的に実現不可能であった。したがって、自家樹状細胞ワクチンの広域商品化の成功は、未成熟および成熟樹状細胞への分化と、ワクチンの製造用の集中製造施設へＰＢＭＣまたはＰＢＭＣから単離された単球を運搬しうる能力とに依存するのである。しかしながら、本発明以前には、ＰＢＭＣは患者から取出後直ちに凍結または培養されねばならない、と広く考えられていた。本発明の方法は、一晩またはそれ以上かけて運搬されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣから単離された単球の処理を行うことにより、この問題を解決した。
【００３９】
第三に、抗原負荷樹状細胞は典型的にはＤＭＳＯ中において凍結され、貯蔵された後、融解され、患者への投与前にＤＭＳＯなしの薬学上許容される担体により洗浄および再懸濁される。洗浄工程は従来のＤＣワクチン臨床試験に含まれていたが、それはＤＭＳＯが未凍結または融解ＤＣにおいて有害な作用を有すると考えられていたからである。意外にも、本発明者らはＤＭＳＯが樹状細胞において目立つほどの有害作用を有しないことを見出した。そのため、投与前に融解ＤＣワクチンを洗浄および再懸濁する必要性はない。この工程を省略することにより、投与しやすさを増し、更なる操作によるＤＣの汚染と副作用双方の危険とを減らすことができる。
【００４０】
したがって、一つの態様において、本発明は：
ａ．対象から取り出されてから約６〜９６時間にわたり１℃〜３４℃の温度においてインキュベートされた単球を用意し、および
ｂ．インキュベートされた単球から樹状細胞への分化を誘導する
ことを含んでなる、単球から樹状細胞を作製するための方法を提供する。
【００４１】
ここで用いられている“単球”とは、樹状細胞へ分化する能力を有したＣＤ１４＋白血球に関する。単球はいかなる哺乳動物からのものでもよいが、好ましくはヒト単球である。単球は、血液、血液フラクション（例えば、白血球（ＷＢＣ）、バフィーコート、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）など）に限定されないが、それらのような組成物と、単球について更に濃縮された組成物で供給およびインキュベートしうる。好ましい態様において、単球は、例えば白血球搬出産物として、他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と一緒に用意される。他の態様において、単球はＰＢＭＣから濃縮されるか、または末梢血から直接単離される。単球または単球を含有したＰＢＭＣを単離する方法は当業者に知られている。好ましい態様において、単球は白血球搬出法により他のＰＢＭＣと一緒に採取される。白血球搬出の方法は当業界において知られている。本発明の好ましい態様において、単球を含んでなるＰＢＭＣは病院、診療所、医院などにおいて白血球搬出法により対象から採取される。白血球搬出法は白血球が対象の血液から取り出される操作法であり、その残りは後に対象へ逆注入される。白血球搬出産物は典型的にはＰＢＭＣについて濃縮された血液フラクションであり、低レベルの混入赤血球、顆粒球、および血小板を含有している。白血球搬出を行うための方法および装置は当業界において周知である。例えば、白血球搬出法の詳細な情報に関してはgambrobct.com/Products & Services/参照。白血球搬出装置の例として、GAMBRO BCT製造のCOBESpectraおよびBaxter Fenwal製造のCS3000 Plus Blood Cell Separatorがある。
【００４２】
単球は１℃〜３４℃インキュベート時間中またはその後に血液または血液フラクション（例えば、ＰＢＭＣ）から濃縮しうる。ここで用いられている“単球を濃縮する”とは、本方法の開始時に存在する他の細胞型に対して単球の割合を増加させる方法を意味する。ＰＢＭＣ、血液、または他の血液フラクションから単球を濃縮させる方法は当業者に知られており、水簸、ＦＡＣＳ、パンニング、磁気選別、低密度フィコール勾配遠心などがあるが、それらに限定されない。好ましくは、単球は水簸によりによりＰＢＭＣから濃縮される。一つの代替態様において、細胞培養時にプラスチックへ付着する単球の選択により、６〜９６時間インキュベート時間経過後にＰＢＭＣから単球が濃縮される。他の態様において、単球は免疫磁気選択により濃縮される。免疫磁気選択は単球と結合する正の選択でも、または単球ではない細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）と結合する負の選択でもよい。
【００４３】
対象から単離されると、単球（例えば、精製単球、濃縮単球、単球を含んでなるＰＢＭＣなど）は、対象から単離されたときから約６〜９６時間にわたり１℃〜３４℃の温度においてインキュベートされる。ここで用いられている、単球または単球を含有したＰＢＭＣが対象から単離されたときとは、対象から単球を取り出す工程の完了時に関する。例えば、ＰＢＭＣが４時間の白血球搬出操作により患者から単離される場合、単離のときとは白血球搬出法によるＰＢＭＣの採取が終了したときである。
【００４４】
好ましくは、単球は３℃〜３４℃、４℃〜３２℃、または５℃〜３０℃の温度、更に好ましくは６℃〜２８℃の温度、更に一層好ましくは６℃〜２７℃、８℃〜２６℃、または約１４℃〜２４℃の温度において６〜９６時間インキュベートされる。好ましい下限温度範囲は６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、および１４℃である。好ましい上限温度範囲は２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、および３４℃である。好ましくは、インキュベート時間は８〜７２時間、更に好ましくは１０〜４８時間、更に一層好ましくは１２〜２４時間、最も好ましくは１５〜２２時間である。インキュベート時間の他の好ましい範囲は８〜４８時間、１０〜３０時間、２６〜７２時間、および４８〜８０時間である。インキュベート時間の好ましい下限は、６、７、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３６、および４８時間から選択される。インキュベート時間の好ましい上限は、２４、２６、２８、３０、３６、４８、６０、７２、８４、および９６時間から選択される。
【００４５】
いかなる形態の単球（例えば、血液、血液フラクション、ＰＢＭＣ、精製単球中の単球など）も１℃〜３４℃インキュベート時間中に臨床現場から樹状細胞製造現場へ運搬してよい。好ましくは、単球は温度制御容器により運搬される。インキュベート時間中に１℃〜３４℃において単球の温度を維持する方法は当業者に知られている。例えば、単球は室温または１℃〜３４℃においてインキュベーター中においてインキュベートされる。好ましくは、単球はインキュベート時間中に多少の運動（時々または継続的）に付される。運動は運搬と関連した運動でよい。他の態様において、細胞はインキュベート中に穏やかに振動または回転される。理論に拘束されないが、運動は沈降時の圧縮に伴う細胞損傷を防げると考えられる。
【００４６】
１℃〜３４℃において６〜９６時間のインキュベート時間中、単球は培養されることなしにインキュベートされる。“培養されることなしに”とは、６〜９６時間のインキュベート時間中に、単球が約３６〜３８℃の温度において哺乳動物細胞培地（生理学的に適切な濃度（例えば、約１×）の培地、例えばＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ‐ＶＩＶＯ  １５、ＡＩＭ‐Ｖ、StemSpan H2000などを含むが、それらに限定されない）において培養されないことを意味する。むしろ、本発明の方法により処理される単球は、好ましくは血液または血液フラクション（例えば、血清、血漿、白血球搬出産物（例えば、ＰＢＭＣ）、バフィーコートなど）塩水または生物学的緩衝液、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中、１℃〜３４℃においてインキュベートされる。最も好ましくは、単球を含有した白血球搬出産物は白血球搬出採取容器（例えば、血液採取袋）中１℃〜３４℃においてインキュベートされる。前記白血球搬出産物はインキュベート時間中またはその始めに他の容器へ移してもよいが、汚染の可能性を増す不要な移し換えを避けることが好ましい。
【００４７】
１℃〜３４℃において６〜９６時間のインキュベート中またはその後に、単球は分化工程前に濃縮させうる。操作が１℃〜３４℃において行われる限り、操作はインキュベート時間中に単球またはＰＢＭＣなどで行える。特に、ＰＢＭＣは更に精製してもよく、または単球はこのインキュベート時間中にＰＢＭＣから濃縮させてもよい。このような操作には、遠心、水簸、タンジェンシャルフロー濾過(tangential flow filtration)、フィコール密度勾配、希釈フィコール密度勾配遠心、希釈パーコール密度勾配遠心、抗体パンニング、磁気細胞分離、正または負の免疫磁気選択などがあるが、それらに限定されない。一つの態様において、容器（好ましくは、プラスチック容器）中培養によるインキュベート時間および付着単球の選択後に、単球がＰＢＭＣから濃縮される。
【００４８】
１℃〜３４℃において約６〜９６時間にわたるインキュベートおよび単球の更なる濃縮の任意工程後に、単球は樹状細胞へ分化するように誘導される。典型的には、単球が未成熟樹状細胞へ分化され、次いで未成熟樹状細胞が成熟樹状細胞へ成熟されられる。単球を樹状細胞へ分化させて、そして樹状細胞を成熟させる様々な方法が当業者に知られている。
【００４９】
一つの態様において、単球は単球から未成熟または成熟樹状細胞への分化を誘導する組成物を含んでなる培地において培養される。単球から未成熟樹状細胞への分化を誘導する組成物は当業者に知られている。このような組成物にはＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４、ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐１３、ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐１５、ＩＦＮα、およびＧＭ‐ＣＳＦ＋ＴＮＦαがあるが、それらに限定されない。好ましくは、分化を誘導する組成物はＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４である。ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４の濃度は各サイトカインについて約４００〜２０００Ｕ／ｍＬである。好ましくは、ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４の濃度は各サイトカインについて５００〜１０００Ｕ／ｍＬである。一つの態様において、単球は約４〜７日間、最も好ましくは約５〜６日間にわたりＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４と接触され、その際に単球が未成熟樹状細胞へ分化する。
【００５０】
単球から未成熟樹状細胞への分化後、未成熟樹状細胞は成熟樹状細胞へ成熟させる。樹状細胞を成熟させる方法は当業者に知られている。一つの態様において、未成熟樹状細胞はＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、および成熟用カクテル（ＰＧＥ２、ＴＮＦα、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１β）を含んでなる培地との接触により成熟される。例えばJonuliet et al.(1997)Eur.J.Immunol.,27:3135-3142参照、この内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００５１】
他の成熟法において、未成熟樹状細胞は、ＩＦＮ‐γを含んでなる第一シグナル、次いでＣＤ４０Ｌを含んでなる第二シグナルによりシグナリングされる。例えば、一つの態様において、未成熟樹状細胞は、好ましくはＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４の存在下において、ＰＧＥ２、ＩＦＮ‐γ、およびＣＤ４０Ｌと接触される。好ましい態様において、ＣＤ４０Ｌとの接触は樹状細胞内において組み換えＣＤ４０Ｌ  ｍＲＮＡの翻訳時に行われる。好ましくは、樹状細胞は、ＣＤ４０Ｌまたはその活性断片をコードするｍＲＮＡにより一時的にトランスフェクトされる。
【００５２】
最も好ましくは、成熟樹状細胞を作製するために、好ましくはＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４の存在下において、未成熟樹状細胞がＰＧＥ２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγと接触される。樹状細胞の成熟度は、ＣＤ４０ＬをコードするＲＮＡによるトランスフェクション、好ましくは一時的なトランスフェクションにより、更に増加させうる。好ましくは、ＣＤ４０ＬをコードするＲＮＡおよび／または対象の１種以上の抗原またはエピトープをコードするＲＮＡにより樹状細胞がトランスフェクトされる。上記の成熟法は米国出願第１１／２４６，３８７号において記載され、この内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００５３】
本発明の好ましい態様において、樹状細胞は１種以上の抗原により負荷される。抗原負荷樹状細胞はワクチンとしておよびＴ細胞のインビトロ刺激に有用である。抗原は未成熟または成熟樹状細胞へ負荷される。抗原が未成熟樹状細胞へ負荷されるならば、未成熟樹状細胞は、負荷自体の工程により、あるいはここで記載された他の成熟法または当業者に公知の代替成熟法により成熟させられる。抗原は抗原自体（例えば、タンパク質、ペプチド、エピトープ、細胞溶解物、ウイルス粒子など）として負荷しても、または抗原をコードする核酸として負荷してもよい。好ましくは、抗原は該抗原をコードする核酸として負荷される。更に好ましくは、核酸はＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡである。好ましい態様では、１種以上の抗原をコードするｍＲＮＡがＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡとコトランスフェクトされる。好ましくは、抗原は対象と自家であり、対象へ投与用の抗原負荷自家ＤＣワクチンを製造するために用いられる。樹状細胞にペプチドおよびタンパク質抗原、細胞、細胞または組織溶解物、ウイルスまたはウイルス粒子、核酸などを負荷させる方法は当業者に知られている。
【００５４】
好ましい態様において、抗原は核酸、好ましくはｍＲＮＡによる樹状細胞（成熟または未成熟）のエレクトロポレーションにより負荷される。好ましくは、樹状細胞は約０．２５〜４μｇ  ＲＮＡ／１０６樹状細胞、最も好ましくは約２μｇ  ＲＮＡ／１０６樹状細胞によりトランスフェクトされる。一つの態様では、１μｇ  腫瘍ＲＮＡ／百万個ＤＣがトランスフェクション当たりで用いられる。他の態様では、病原体（例えばＨＩＶ）からの４種の別々の抗原をコードするＲＮＡ４種の各々について０．２５〜１．０μｇが１０６樹状細胞当たりで用いられる。
【００５５】
抗原はいかなる起源でもよい。しかしながら、好ましい態様において、抗原は対象と自家である。対象と自家とは、抗原が対象から得られたまたは誘導されたことを意味する。非限定的な例として、抗原は対象から得られた癌細胞または腫瘍組織からのものである。癌抗原は、癌細胞、癌細胞または組織溶解物、癌細胞または組織からの抽出物、癌細胞または組織の精製またはクローン化成分、全ＲＮＡまたは全ｍＲＮＡ、あるいはこのような細胞または組織からの選択ＲＮＡまたはｍＲＮＡとして、抽出物中に存在しようが、精製、増幅、インビトロ翻訳などされていようが、樹状細胞中へ負荷させうる。一方、抗原は対象に存在する病原体または病原体感染細胞から得てもまたは誘導してもよい。
【００５６】
本発明の方法は、癌および病原体感染症の治療または予防に特に有用である。好ましい態様において、癌は腎臓細胞癌腫、黒色腫、乳癌、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、肺癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、または前立腺癌である。
【００５７】
病原体という用語は、病因に関与するウイルスまたは生物と、更にその弱毒化誘導体に関する。このような病原体には、細菌、原生動物、真菌、およびウイルス病原体、例えばHelicobacter、例えばHelicobacter pylori、Salmonella、Shigella、Enterobacter、Campylobacter、様々なミコバクテリア、例えばMycobacterium leprae、Bacillus anthracis、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Brucella種、Leptospira interrogans、Staphylococcus（例えばS.aureus）、Streptococcus、Clostridum、Candida albicans、Plasmodium、Leishmania、Trypanosoma、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、コロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびEpstein-Barrウイルス（ＥＢＶ））、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、および風疹ウイルスがあるが、それらに限定されない。好ましくは、病原体はウイルス病原体、更に好ましくはレトロウイルス病原体、最も好ましくはＨＩＶまたはＨＣＶである。
【００５８】
樹状細胞は、成熟または未成熟でも、抗原負荷されてもまたはそうでなくてもよく、凍結保護剤を含んでなる組成物中において凍結させうる。多くの凍結保護剤が当業者に知られている。凍結保護剤の例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エタノール、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート、プロパンジオール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ｉ‐エリトリトール、Ｄ‐リビトール、Ｄ‐マンニトール、Ｄ‐ソルビトール、Ｄ‐ラクトース、ｉ‐イノシトール、塩化コリン、アミノ酸、アルブミン（好ましくは、ヒト血清アルブミン）、ポリビニルピロリドン、デキストラン、スクロース、フィコール、無機塩、およびヒドロキシエチルデンプンがあるが、それらに限定されない。好ましい態様において、凍結保護剤はＤＭＳＯである。好ましくは、ＤＭＳＯの濃度は２〜２０％、更に好ましくは５〜１５％、最も好ましくは約１０％である。しかも、凍結培地は、好ましくは２〜３０％、更に好ましくは５〜１０％、最も好ましくは５％デキストロールの濃度において、グルコース、デキストロース、スクロースなどのような炭水化物から誘導された１種以上のポリオール化合物を含有してよい。樹状細胞を凍結させる方法は当業者に知られている。例えば米国特許出願第２００４０２５３５７４号参照、この内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。好ましくは、凍結保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。好ましい態様において、ＤＭＳＯの濃度は５％〜２０％である。最も好ましくは、組成物中のＤＭＳＯ濃度は約１０％である。
【００５９】
意外にも、本発明の方法により作製された樹状細胞および樹状細胞ワクチンは、５％〜２０％ＤＭＳＯの存在下において凍結および融解後に、少なくとも２４時間融解後でもインビトロにおいて生存しうる。本発明の抗原負荷樹状細胞はＤＭＳＯに耐えうることから、樹状細胞ワクチンを投与する前に細胞を洗浄する必要がない。したがって、本発明の融解樹状細胞ワクチンは融解後、いつでも対象へ投与できる。洗浄工程の省略により、汚染の危険を減らし、樹状細胞に障害を与えうる更なる操作を避けられる。そのため、一つの態様において、本発明は、少なくとも２％〜２０％のＤＭＳＯを含んでなる凍結樹状細胞ワクチンを融解し、投与前に樹状細胞対ＤＭＳＯの比率を変えることなく対象へワクチンを投与することからなる、抗原負荷樹状細胞ワクチンの投与法を提供する。好ましくは、ワクチン中ＤＭＳＯの濃度は約５〜２０％、更に好ましくは１０％である。
【００６０】
他の態様において、本発明は癌または病原体感染症の治療または予防用の凍結薬剤の製造に際する抗原負荷樹状細胞の使用を提供し、ここで該薬剤は少なくとも２％のＤＭＳＯを含んでなり、融解していつでも投与しうるものである。
【００６１】
本発明の方法によれば、高い機能性と高レベルの成熟マーカーとを有した新規樹状細胞の作製を行える。例えば、一つの態様において、本発明は、成熟樹状細胞が新鮮単球から作製された樹状細胞と比較して高レベルでＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ分子、またはＭＨＣクラスII分子のうち１種以上を有している、成熟単球由来樹状細胞を提供する。
【００６２】
更に他の態様において、本発明は、樹状細胞が記憶Ｔ細胞からの抗原特異的ＩＬ‐２産生を導ける、成熟単球由来樹状細胞を提供する。ＩＬ‐２を測定する方法は当業界において知られている。細胞表面マーカーと、記憶Ｔ細胞に特徴的であってそれらをＴ細胞の他の種類と区別する他分子の発現とは、Immunobiology,6th Edition,Eds.Janeway et al.,Garland Science Publishing,New York,,NY,2005の図１０．３５において開示されている、その内容は引用するすることにより本明細書の開示の一部とされる。例えば、記憶Ｔ細胞は高レベルのＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、Ｂｃｌ‐２、ＩＦＮγ、ＣＤ１２７、およびＬｙ６Ｃ、中レベルのＣＤ１２２およびＣＸＣＲ４、低レベルのＦａｓＬを発現し、ＣＤ６９およびＣＤ２５は陰性である。
【００６３】
ここで開示されているように、定常状態ＲＮＡレベルのマイクロアレー分析では、新鮮単球から作製された樹状細胞と比較して、１日経過単球から作製された樹状細胞間において遺伝子発現の変化を示す。そのため、一つの態様において、本発明は細胞中ＡＬＯＸ１５  ＲＮＡ対β‐アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの定常状態比が１．０未満である成熟単球由来樹状細胞を提供する。好ましくは、比率は０．２〜０．７、更に好ましくは０．４〜０．５、最も好ましくは約０．４５である。
【００６４】
他の態様において、本発明は細胞中ＣＤ５２  ＲＮＡ対β‐アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨの定常状態比が１．０より大きい成熟単球由来樹状細胞を提供する。好ましくは比率は１．２〜５．０、更に好ましくは１．５〜２．２または１．８〜１．９であり、最も好ましくは比率は１．８６である。
【００６５】
更に他の態様において、本発明は細胞中ＴＬＲ１  ＲＮＡ、ＴＬＲ２  ＲＮＡ、ＩＬ‐１β  ＲＮＡまたはＣＤ６９  ＲＮＡ対β‐アクチンＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの定常状態比が１．０未満である成熟単球由来樹状細胞を提供する。好ましくは、比率は０．２〜０．９、更に好ましくは０．５〜０．８である。
【００６６】
ヒトＡＬＯＸ１５  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜１２のAffymetrixプローブを用いて検出できる。ヒトＩＬ‐１β  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜２４のAffymetrixプローブを用いて検出できる。ヒトＴＬＲ１  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６〜３６のAffymetrixプローブを用いて検出できる。ヒトＴＬＲ２  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８〜４８のAffymetrixプローブを用いて検出できる。ヒトＣＤ６９  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０〜６０のAffymetrixプローブを用いて検出できる。ヒトＣＤ５２  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜７７のAffymetrixプローブを用いて検出できる。ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９〜９８のAffymetrixプローブを用いて検出できる。ヒトβ‐アクチン  ｍＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）およびその対立遺伝子変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００〜１１９のAffymetrixプローブを用いて検出できる。
【００６７】
ＲＮＡ定常状態発現レベルはマイクロアレー、好ましくはAffymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayを用いて検出できる。一方、ハイブリッド形成は前段落において掲載された遺伝子特異的プローブを用いて行える。好ましくは、樹状細胞から抽出されたＲＮＡ試料が製造業者の説明（Genechip Expression Analysis Technical Manual,2004）に従い、Human Genome U133 Plus 2.0 Array（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）に適用される。簡単に言えば、Genechip Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）においてスパイクされた全ＲＮＡ３μｇが、SuperScript II逆転写酵素を用いて、第一鎖ｃＤＮＡへ変換される。第二鎖ｃＤＮＡ合成に次いで、各転写物の直線的増幅とビオチニル化ＣＴＰおよびＵＴＰの取込みとのためにインビトロ転写が行われる。ｃＲＮＡ産物は約１００ヌクレオチドに断片化され、１６時間かけてマイクロアレーとハイブリッド形成される。次いで、マイクロアレーは低（６×ＳＳＰＥ）および高（１００ｍＭ  ＭＥＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）ストリンジェンシーにおいて洗浄され、ストレプトアビジン‐フィコエリトリンにより染色される。
【００６８】
ビオチニル化抗ストレプトアビジンと追加量のストレプトアビジン‐フィコエリトリン染料を加えることにより、蛍光が増幅される。５７０ｎｍにおける励起後に３μｍ分解能により蛍光シグナルを集めるために、GeneChip Scanner 3000（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）が用いられる。２連続走査からの平均シグナルが対象の各マイクロアレー特性について計算される。走査画像がGenechip Operating Software v1.1（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）により分析された。好ましくは、Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）に含有されたコントロールＲＮＡ４種で高い直線的相関（Ｒ２＞０．９５）があれば、ラベリング工程の成功のためのコントロールとして確認される。
【００６９】
全遺伝子または対象の遺伝子（例えば、ＡＬＯＸ１５、ＩＬ‐１β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＣＤ６９、および／またはＣＤ５２と、β‐アクチンおよび／またはＧＡＰＤＨ）に関するプロファイルデータがコンピュータープログラムGeneSpringへ入力され、標準化される。Affymetrixアレーに関してGeneSpringにより示された標準法に従い、標準化工程において三工程が行われる。
１）データ変換（０．０１未満の全値が０．０１に設定された）
２）百分順位の５０番目に標準化
３）中央値に標準化
【００７０】
次いで、対象の定常状態ｍＲＮＡ（ＡＬＯＸ１５、ＩＬ‐１β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＣＤ６９、またはＣＤ５２  ｍＲＮＡ）対定常状態ＧＡＰＤＨまたはβ‐アクチン  ｍＲＮＡの比率が、対象のｍＲＮＡの標準化発現をＧＡＰＤＨまたはβ‐アクチン  ｍＲＮＡの標準化発現によって割ることにより求められる。
【００７１】
本発明の抗原負荷樹状細胞は、病気の治療または予防用のワクチンまたは療法に用いうるＴ細胞の活性化に有用である。例えば、抗原負荷樹状細胞は抗原に対する免疫応答を導くために用いられる。将来の感染症または病気を予防するか、あるいは病原体感染症または癌に限定されないが、それら進行中の病気を治療する上で免疫系を活性化させるために、それらはワクチンとして用いられる。抗原負荷樹状細胞は、適切な担体、例えば生理緩衝液または他の注射液によりワクチンまたは医薬組成物としての使用向けに処方してもよい。ワクチンまたは医薬組成物は、免疫応答を導くために十分な治療有効量により投与される。
【００７２】
好ましくは、樹状細胞は該樹状細胞が得られた対象と自家の抗原により負荷され、同対象へ投与される。抗原負荷樹状細胞、特にＲＮＡ負荷樹状細胞の作製および使用について記載する、例えば米国特許第５，８５３，７１９号（この内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）参照。一方、樹状細胞はＤＣ療法の所定レシピエントと自家でない抗原により負荷してもよい。このような抗原の例としては、既知の治療標的である抗原、例えばテロメラーゼ、前立腺特異性抗原、および他の腫瘍マーカー、または病原体からの既知抗原があるが、それらに限定されない。
【００７３】
単球または単球を含んでなるＰＢＭＣを採取するための方法
対象から単球および単球を含んでなるＰＢＭＣを採取する様々な方法が当業者に知られている。例えば、ＰＢＭＣ採取のための白血球搬出法と単球の精製のための水簸に関する詳細な情報についてはgambrobct.com/Products & Services/参照。好ましい態様では、Gambro BCT COBE Spectra（Gambro BCT,Lakewood,ＣＯ）においてAutoPBSC（Automated Peripheral Blood Stem Cell）操作を用いて、白血球搬出産物および血漿が個々の無菌使い捨て１回使用細胞搬出袋に採取される。
【００７４】
白血球搬出法に代わる一つの方法では、ヘパリン処理シリンジによる血液の採取、ＰＢＳによる希釈、Histopaque 1077（Sigma）上への積層、遠心および界面におけるＰＢＭＣの回収によりＰＢＭＣが得られる。Woodhead et al.(2000)International Immunol.,12:1051-1061参照。ＰＢＭＣを採取、精製、または分別する更なる方法は当業者に知られている。
【００７５】
白血球搬出産物または他の血液産物の採取後、そこで得られた単球は１〜３４℃において６〜９６時間インキュベートされる。一つの態様において、白血球搬出産物は袋に採取され、次いで１〜３４℃、好ましくは約６〜２８℃、最も好ましくは８〜２６℃で維持された温度モニター運搬容器によりワクチン製造施設へ運搬される。温度変化の予防に役立つ、米国特許第４，１０２，８０７号において開示されたゲルパックが、運搬容器に入れられる。例えば、単球は図１において示されたThermoSafe U-tekゲルパックおよびゲルマットを詰め込んだ断熱容器（例えば、ThermoSafeモデルＥ６５ポリウレタンフォーム断熱容器）により運搬される。例えば、図１において示されたパッキング操作では、−１℃の温度に調整された１６ｏｚ  U-tekゲルマットがＥ６５容器の底へ平らに置かれる。２枚の１６ｏｚ  U-tekゲルマット（−１℃）が折り畳まれ、第一のゲルマットとＥ６５容器の短壁との間に置かれる。次いで２枚の１６ｏｚ  U-tekゲル（＋１８℃に調整）が先のゲルマットの隣へ垂直に置かれる。ThermoSafe INF3000移植片容器がゲル間に置かれる。白血球搬出袋が密封内袋（STP711）に入れられる。内袋の温度を記録する装置が運搬中に温度を測定するために用いられる。一つのこのような装置がThermoSafe DataLoggerである。内袋が密封外袋（STP710）に入れられ、次いでその袋がINF3000容器へ入れられる。１６ｏｚ  U-tekゲル（＋１８℃）が閉じられたINF3000容器の上へ置かれ、クラフト紙、次いで４″フォームプラグにより覆われる。次いで、ボックスがテープにより密封されて、運搬の準備ができる。
【００７６】
１〜３４℃のインキュベート時間中またはその後、樹状細胞前駆体（単球）を含有した単核細胞フラクションを分離および濃縮するために、例えば５０ｍＬ円錐管中、室温においてフィコール密度勾配遠心により、白血球搬出産物が更に処理または精製されうる。好ましくは、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）による複数回の洗浄工程の後、細胞濃度および細胞生存率が調べられる。
【００７７】
単球の濃縮
単球の濃縮法は当業者に知られており、密度勾配遠心（例えば、希釈フィコール密度勾配遠心、希釈パーコール密度勾配遠心など）、水簸、プラスチックへの付着、タンジェンシャルフロー濾過、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫細胞分離技術（単球を選択するための、または非単球（例えば、白血球、マクロファージ、顆粒球など）を除去するための抗体パンニング、示差溶解、磁気細胞分離など）、プラスチックマイクロ担体ビーズによる被覆されたプラスチック培養袋中においての培養などがあるが、それらに限定されない。例えば、O’Doherty et al.(1993)J.Exp.Med.,178:1067-1076、Young et al.(1990)J.Exp.Med.,171:1315-1332、Freudenthal et al.(1990)PNAS,87:7698-7702、Bernhard et al.(1995)Cancer Res.,55:1099-1104、Caux et al.(1992)Nature,360:258-261、Read et al.(2003)“Evaluation of a Closed Automated System to Isolate Peripheral Blood Monocytes for Dendritic Cell(DC)Immunotherapy”,Ninth annual meeting of the ISCT、Mu et al.(2003)Scand.J.Immunol.,58:578-586、Maffei et al.(2000)Transfusion,40:1419-1420、mitenyibiotec.com、Meyer-Wentrup et al.(2003)J.Hematother.Stem Cell Res.,12:289-299、およびＷＯ２００４／０００４４４号参照、これらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。例えば、正の選択（ＣＤ１４＋細胞）または負の選択（即ち、単球ではない細胞、例えばＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ２＋細胞の除去）により単球から濃縮させるために磁気細胞分離が用いられる。
【００７８】
好ましくは、対象白血球搬出物から単球を単離する自動化方法、水簸により単球が白血球搬出産物から濃縮される。白血球搬出の方法は当業界において知られている。例えば、水簸はGambro BCT Elutra Cell Separation System（Gambro BCT,Lakewood,ＣＯ）により行われる。水簸緩衝液は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）の４Ｌ袋へ５％ヒトアルブミン血清（ＨＳＡ）１０００ｍＬを加えることにより調製される。細胞は製造業者のプロトコールに従い水簸により分別される。好ましい態様では、製造業者（Gambro）プロトコールの改定版が水簸に用いられ、そこでは最終ローターオフ(rotor off)フラクションが５番目のフラクションではなく４番目のフラクションである。純度および回収率を確認するために示差分析によるＣＢＣが単球フラクションにより行われる。一方、単球純度はＣＤ１４により免疫表現型決定することにより評価できる。次いで、濃縮された単球が樹状細胞へ分化され、または後の使用のために凍結および貯蔵される。一つの態様において、細胞は２５ｍＬまたは５０ｍＬ凍結袋により凍結される。凍結袋の例としては、Cryocyte凍結袋、Origen凍結袋（Cryostore）、およびPall凍結袋がある。好ましくは、各凍結袋は約１０〜１２％ＤＭＳＯおよび１０〜２０％熱不活化濾過血清、約１０７〜５０７ｍｇ／Ｌ最終濃度のＣａＣｌ２および約４４〜２４１ｍｇ／Ｌ最終濃度のＭｇＳＯ４入りの培地（例えば、ＡＩＭ  Ｖ、Ｘ‐ＶＩＶＯ、ＲＰＭＩなど）中に３×１０９までの細胞１５ｍＬを含有している。細胞は速度制御フリーザーを用いて凍結され、次いで極低温において貯蔵される。
【００７９】
代わりの態様において、ＰＢＭＣのインキュベートおよびフィコール密度勾配による精製後、ＰＢＭＣはＡＩＭ‐Ｖ培地に再懸濁され、２．０×１０８細胞／フラスコによりＴ１５０ｃｍ２フラスコに接種される。不十分な数のＰＢＭＣが得られる場合は、ＰＢＭＣは凍結されて、２回目の白血球搬出物と混合される。３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において１〜２時間にわたる無菌組織培養プラスチックフラスコへの付着により、単球がＰＢＭＣの単核細胞群から選択される。非付着および半付着細胞は除去される。残留する非付着細胞、半付着細胞、および残留培地を除去するために、フラスコへＰＢＳが加えられる。残留付着細胞は主として単球であり、濃縮単球の群を表わす。
【００８０】
単球を樹状細胞へ分化させる方法
単球を樹状細胞へ分化させる様々な方法が当業者に知られている。米国特許第６，６０７，７２２号、ＷＯ９７／２９１８２号、Romani et al.(1994)J.Exp.Med.,180:83-93、Sallusto and Lanzavecchia(1994)J.Exp.Med.,179:1109以下、およびReddy et al.(1997)Blood,90:3640-3646参照、それらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。これら方法のほとんどは、樹状細胞への単球の分化を誘導するサイトカイン存在下において単球を培養している。単球を樹状細胞へ分化させる代替法の例には、物理的摂動(physical perturbation)（例えば、剪断）への暴露、細胞ＤＮＡ成分と光付加体を形成しうる光活性化剤の存在下における照射、および／またはＤＮＡ結合剤での処理、次いで微生物、真菌、ウイルス、および悪性細胞のような病気エフェクター剤とのインキュベートがあるが、それらに限定されない。米国特許第６，６０７，７２２号参照、この内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００８１】
一つの態様において、樹状細胞への単球の分化を誘導する組成物を含んでなる培地での培養により、単球が樹状細胞へ分化される。単球、未成熟、および成熟樹状細胞の培養に適した培地にはＡＩＭ‐Ｖ、Ｘ‐ＶＩＶＯ‐１５、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭなどがあるが、それらに限定されない。樹状細胞への単球の分化を誘導する組成物は当業界において知られており、ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４、ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐１３、およびＩＦＮαがあるが、それらに限定されない。
【００８２】
好ましい態様において、濃縮された単球はＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４の存在下において培養により樹状細胞へ分化される（例えば、ＷＯ９７／２９１８２号、Sallusto and Lanzavecchia(1994)J.Exp.Med.,179:1109、およびRomani et al.(1994)J.Exp.Med.,180:83-93参照）。簡単に言えば、濃縮された単球は、好ましくは１×１０６細胞／ｍＬの濃度において、未成熟樹状細胞への単球の分化を行わせるために、３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度により約４〜７日間、好ましくは６日間にわたり８００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４の存在下において、ＡＩＭ  Ｖ培地、Ｘ‐ＶＩＶＯ  １５培地または他の適切な培地で培養される。サイトカイン濃度は変えられる。例えば、ＧＭ‐ＣＳＦの好ましい濃度は５００〜１５００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは７００〜１０００Ｕ／ｍＬ、最も好ましくは８００Ｕ／ｍＬである。ＩＬ‐４の好ましい濃度は４００〜１５００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは４５０〜１０００Ｕ／ｍＬ、最も好ましくは５００Ｕ／ｍＬである。ＩＬ‐１３またはＩＬ‐１５もＩＬ‐４の代わりにまたはそれに加えて用いられる。ＩＦＮαもＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４、ＩＬ‐１３またはＩＬ‐１５の代わりに用いられる。単球が樹状細胞へ分化すると、それらは次第にＣＤ１４の発現を失い、未成熟状態における樹状細胞の表現型と一致するＣＤ８０発現を獲得する。
【００８３】
未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への成熟のための方法
未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への成熟のための方法は当業者に知られており、抗原の取込みおよび／または成熟を誘導する組成物との接触があるが、それらに限定されない。未成熟樹状細胞の成熟を誘導する組成物には、単球馴化培地(conditioned medium)、ＰＢＭＣ馴化培地、固定Staphylococcus aureus（Pansorbin）、リポ多糖（ＬＰＳ）、他の細菌細胞産物、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、リポテイコ酸など（ホスホリルコリン）、カルシウムイオノホア（ホルボールエステル（例えばＰＭＡ、熱ショックタンパク質、ヌクレオチド、例えばＡＴＰなど、リポペプチド、Toll様レセプター４、Toll様レセプター用の人工リガンド、二本鎖ＲＮＡ、例えばポリＩ：Ｃなど、免疫刺激ＤＮＡ配列、成熟用カクテル（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、およびＰＧＥ２）、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４および成熟用カクテル（ＴＮＦα、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、およびＰＧＥ２）、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、ＰＧＥ２、およびＩＦＮγの連続シグナリングに次ぐＣＤ４０Ｌでのシグナリング、およびその他があるが、それらに限定されない。例えば、Cisco et al.(2004)J.Immunol.,172:7162-7168、Jonluit et al.(1997)Eur.J.Immunol.,27:3135-3142、米国特許出願第２００４０２０３１４３号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３６３０４号、および米国特許出願第１１／２４６，３８７号参照、これらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００８４】
一つの態様において、ＴＮＦα、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、およびＰＧＥ２を含有した成熟用カクテルが未成熟樹状細胞の培養物へ加えられる。次いで、成熟樹状細胞を作製するために細胞が一晩（約１２時間以上）培養される。
【００８５】
一つの代替態様において、未成熟樹状細胞は、好ましくはエレクトロポレーションにより、ＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡにより、場合により１種以上の抗原をコードするｍＲＮＡによりトランスフェクトされ、次いで成熟樹状細胞を作製するためにＩＦＮγ、場合によりＰＧＥ２の存在下において一晩（約１２時間以上）培養される。ヒトＣＤ４０Ｌ  ｃＤＮＡおよびタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１で各々示されている。他のＣＤ４０Ｌ  ｍＲＮＡは当業者に知られている。
【００８６】
好ましい態様においては、ＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ‐γ（１０００Ｕ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）の最終濃度を得るために、ＡＩＭ  Ｖ培地中の成熟用処方物が未成熟ＤＣへ直接加えられる。次いで、成熟樹状細胞を作製するために細胞が一晩（約１２時間以上）培養される。成熟度は場合により、培地へ加えられるかまたは更に好ましくは細胞内において発現されるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）への細胞の暴露により、更に増大される。ＣＤ４０Ｌは構造的にまたは一過性に発現される。好ましくは、ＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡにより、場合により１種以上の対象抗原をコードするｍＲＮＡにより成熟樹状細胞がトランスフェクトされる。
【００８７】
抗原
いかなる抗原も未成熟または成熟樹状細胞中へ負荷させうる。抗原は成熟ＤＣにより処理および提示される。抗原の例としては、ウイルス粒子、細菌または他の病原体、タンパク質およびその断片、ポリペプチド、病原体溶解物、病原体抽出物、病原体核酸、癌細胞、癌細胞タンパク質およびその断片、癌細胞溶解物、癌細胞抽出物、および癌細胞核酸があるが、それらに限定されない。抗原は天然でも、化学的処理または組み換え産生してもよい。抗原は、当業界において知られた方法を用いて、ポリペプチド、タンパク質、または核酸として細胞へ導入される。
【００８８】
抗原を作製するかまたはそれが樹状細胞と出会う環境へ入れるようにそれを誘導する際にヒトが関与しなかった、その“天然”形態により抗原が導入される。一方または加えて、抗原は、例えば従来のアレルギーショットまたは腫瘍溶解物により通常投与される種類の、粗調製物であってもよい。抗原は一方で、例えば少なくとも約９０％純度により、実質的に精製してもよい。
【００８９】
抗原がペプチドである場合、例えば単離タンパク質のタンパク質開裂により、それが作製される。限定されないが、ペプシン、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシンなどを含めた様々な開裂剤が利用される。一方、ペプチドは、好ましくは当業界において入手しうるような自動合成装置により、化学的に合成しても、または組み換えにより発現させてもよい。加えて、対象のペプチドをコードする核酸を作製して、望ましい条件下においてそのペプチドを発現させるために、組み換え技術も用いてよい。一方、抗原コード核酸は精製しても、または細胞、組織、またはウイルスから誘導してもよい。
【００９０】
抗原は、天然化合物とは異なる構造を有しうる。本発明のある態様において、抗原は、天然抗原のものと実質的に同一であるが、天然化合物の正確な構造と１以上の違いを含む構造を抗原が有している、“修飾抗原”である。
【００９１】
例えば、天然抗原がタンパク質またはポリペプチド抗原である場合、修飾抗原は、そのタンパク質またはポリペプチド抗原と比較して、１以上のアミノ酸の付加、置換、または欠失により天然抗原のものと異なるアミノ酸配列を有している、および／またはアミノ酸に共有結合された１以上の化学部分の付加、置換、または欠失により天然抗原における対応アミノ酸と異なる１以上のアミノ酸配列を有している。一つの態様において、天然および修飾抗原は、少なくとも７５％同一である、少なくとも五つのアミノ酸の少なくとも一つの領域を共有している。当業者であれば認識しているのであるが、二つのアミノ酸配列を比較してそれらの同一性の程度を調べる上において、同一アミノ酸のストレッチ（即ち、少なくとも二つの領域）間の間隔が常に正確に保たれている必要はない。天然および修飾タンパク質またはポリペプチド抗原は、少なくとも五つのアミノ酸の少なくとも一つの領域について、アミノ酸配列において少なくとも約８０％の同一性、更には８５％、９０％、９５％、または９９％以上の同一性を示せる。多くは、アミノ酸配列の更に長い領域（例えば、１０、２０、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸）について、所定度の同一性を示すことが有用かもしれない。
【００９２】
好ましい態様において、抗原は該抗原をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子として導入され、そのため該遺伝子の発現から処理された個体（インビボにおいて導入される場合）または細胞培養系（インビトロにおいて導入される場合）において抗原産生をもたらす。発現性遺伝子またはｍＲＮＡを含む核酸を作製して、発現性遺伝子によりコードされたタンパク質が産生される発現系へこのような核酸を導入するための技術は、当業界において知られており、簡単には以下において記載されている。好ましくは、抗原はｍＲＮＡとして導入される。細胞（例えば、癌細胞、病原体細胞、または病原体感染細胞）から得られたＲＮＡまたはｍＲＮＡが樹状細胞へ直接負荷される。一方、ＲＮＡまたはｍＲＮＡは負荷前に増幅させてもよい。一つの態様では、ｃＤＮＡ発現構造体を作製するために、センスプロモーターを含むプライマーを用いて、ＲＴ‐ＰＣＲにより全部または標的とされたｍＲＮＡが増幅される。次いで、発現構造体からインビトロにおいて転写されたＲＮＡが細胞へ負荷させるために用いられる。ＲＮＡを単離、増幅、インビトロ転写して、ＲＮＡまたは他の核酸を樹状細胞へ負荷させる方法は、当業者に知られている。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０４／３９５３９号および米国仮出願第６０／５２２，３１０号参照、これらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００９３】
本発明の一つの態様において、抗原は１種以上のＨＩＶタンパク質またはその断片である。非限定的な例として、ＨＩＶ感染患者からの血漿がＨＩＶ  ＲＮＡの単離源として働く。一つの態様では、血漿の一部が遠心され、上清が採取され、０．２２μｍフィルターを用いて濾過され、樹状細胞ワクチンの処方で使用時まで−２０℃において貯蔵される。樹状細胞への負荷用に十分量の増幅ＨＩＶ  ＲＮＡを供給するために、血漿中に存在するＨＩＶ  ＲＮＡがＲＴ‐ＰＣＲおよびインビトロ転写反応により増幅される。簡単に言えば、逆転写酵素、適切な反応緩衝液、およびランダムヘキサマーまたは標的リバースプライマーを用いて、ウイルスＲＮＡが一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡへ逆転写される。次いで、多数のプライマーを用いた一次ＰＣＲ反応における二本鎖ＤＮＡへＰＣＲにより一本鎖ｃＤＮＡが増幅される。一次ＰＣＲ反応において増幅された領域の同一性は、それらの領域と隣接する標的配列と相補的な特異的プライマーの選択により調べられる。一次ＰＣＲ反応の産物はQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製され、次いで二次ラウンドまたはネステッドＰＣＲ増幅において鋳型として働く。このラウンドの増幅において、５′プライマーはＲＮＡポリメラーゼ結合部位（例えば、Ｔ７プロモーター）のある突出部を含有し、３′プライマーはポリＴストレッチのある突出部を含有している。ＰＣＲのネステッドラウンドにおいて突出領域により導入される修飾から、インビトロにおけるＰＣＲ産物の転写と、樹状細胞への導入時に好結果の翻訳とを行える。インビトロ転写ＲＮＡの精製はQiagen RNeasy Kitを用いて行われ、ＲＮＡがヌクレアーゼフリーの水中に溶出される。必要であれば、エタノール沈降がＲＮＡを濃縮するために行われる。ＲＮＡはヌクレアーゼフリーの水に再懸濁され、０．８／０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターへ通され、次いで０．５ｍＬセーフロックポリプロピレン管へ分配されて、ＤＣ中へ負荷されるか、またはトランスフェクション前に融解時まで≦−１５０℃において凍結保存される。
【００９４】
他の好ましい態様においては、ＲＮＡまたはｍＲＮＡが１種以上の癌細胞から抽出される。ＲＮＡまたはｍＲＮＡは樹状細胞へ直接負荷させても、またはそれは最初にＰＣＴ／ＵＳ０４／３９５３９号において記載された方法を用いてＲＴ‐ＰＣＲおよびインビトロ転写により増幅させてもよい。
【００９５】
樹状細胞の抗原負荷
樹状細胞は、未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞として、または未成熟から成熟樹状細胞への分化に際して、１種以上の抗原により負荷される。樹状細胞は、タンパク質、ペプチド、ウイルス、細胞、細胞溶解物などのような抗原を摂取することができる。したがって、抗原負荷は、抗原または該抗原をコードする核酸と樹状細胞を接触させることで、簡単に行える。樹状細胞に負荷させる他の方法も当業者に知られており、核酸トランスフェクション、エキソソーム、ウイルスベクター、ミクロ粒子デリバリーなどがあるが、それらに限定されない。例えば、Mitchell et al.(2000)Curr.Opin.Mol.Ther.,2:176-181、Zitovogel et al.(1998)Nature,4:594-600、Jenne et al.(2001)Trends Immunol.,22:102-106、および米国特許公開第２００５／０１５８８５６号参照、これらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。１種以上の抗原が樹状細胞へ直接負荷されても、または１種以上の抗原をコードする核酸が樹状細胞中へ負荷（トランスフェクト）されてもよい。好ましい態様において、樹状細胞は１種以上の抗原をコードする核酸において負荷される。好ましくは、核酸はｍＲＮＡである。
【００９６】
核酸を樹状細胞へトランスフェクトする方法は当業者に知られており、受動トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション（例えば、ＤＯＴＡＰ）、カチオンペプチド媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションがあるが、それらに限定されない。Nair et al.(1998)Nat.Biotechnology,16:364-369、Van Tendeloo et al.(2001)Blood,98:49-56、Saeboe-Larssen et al.(2002)J.Immunol.Methods,259:191-203、Boczkowski et al.(2000)Cancer Res.,60:1028-1034、Gilboa et al.,Immunol.Rev.(2004)199:251-263、米国仮出願第６０／５８３，５７９号、および米国特許出願第１０／１７７，３９０号参照、これらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００９７】
ペプチドパルシングによる樹状細胞負荷
タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、細胞、または組織抽出物および他の種類の抗原において樹状細胞へ負荷させる方法は当業者に知られている。好ましい態様では、未成熟樹状細胞が１種以上の抗原が負荷される。本発明の一つの態様では、ペプチド、ポリペプチド、および／または細胞または組織抽出物が培地中未成熟樹状細胞とのインキュベートにより簡単に負荷される。
【００９８】
エレクトロポレーションによる抗原負荷、次いでサイトカインカクテルを用いた未成熟樹状細胞の成熟
本発明の一つの態様において、未成熟樹状細胞は培養フラスコを軽く叩いて該細胞を浮動させることにより収集される。次いで、懸濁状態の細胞が円錐管へ移される。残留浮遊細胞と円錐管へ加えられた残留培地を除去するために、ＰＢＳが培養フラスコへ加えられる。一部の未成熟樹状細胞はフラスコに付着したままのことがある。ＰＢＳを加えて、２℃から室温までのいずれかでフラスコをインキュベートすることにより、これら細胞の脱着が促進される。インキュベート時間の最後に、フラスコが軽く叩かれ、浮動した細胞が円錐管へ加えられる。次いで全細胞懸濁物がペレット化され、ＰＢＳにより洗浄され、０．５ｍＬ中４×１０７／ｍＬにより冷却ViaSpanに再懸濁され、氷上に置かれる。ＤＣは抗原をコードするｍＲＮＡについて２μｇ／１０６細胞においてｍＲＮＡと混合され、４ｍｍギャップエレクトロポレーションキュベットに入れられ、２７５〜３５０Ｖ、１００〜３００Ωおよび１５０μＦのパルスで、好ましくは３２５Ｖ、２００Ωでエレクトロポレートされる。エレクトロポレーション直後に、ＤＣはＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地により洗浄され、ＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）、ＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）、ＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ‐６（１００ｎｇ／ｍＬ）を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５に１×１０６／ｍＬにより再懸濁される。次いで、安定的に成熟樹状細胞を作製するために、未成熟樹状細胞は３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において一晩インキュベートされる。次いで成熟樹状細胞がＰＢＳにより洗浄される。
【００９９】
エレクトロポレーションによる抗原負荷とＣＤ４０Ｌを用いた成熟
本発明の一つの態様において、未成熟樹状細胞はＣＤ４０ＬおよびＩＦＮ‐γを用いて成熟される。好ましくは、未成熟ＤＣは、前記のようなエレクトロポレーションにより、１０６当たり４μｇのＣＤ４０Ｌ  ｍＲＮＡと１種以上の抗原をコードするｍＲＮＡ（２μｇ／１０６細胞）とでトランスフェクトされ、次いで安定な成熟樹状細胞を作製するために、ＧＭ‐ＣＳＦ（８００〜１０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ‐４（５００〜１０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ‐γ（５００〜１０００Ｕ／ｍＬ）、またはＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５中において一晩培養される。この工程により成熟された樹状細胞は、前記のサイトカインカクテル工程により成熟された樹状細胞と比較して、より高レベルのＩＬ‐１２（Ｔ細胞成長因子）と最少のＩＬ‐１０を分泌する。
【０１００】
成熟樹状細胞のエレクトロポレーションによる抗原負荷
成熟樹状細胞は当業者に知られた方法により抗原により負荷させうる。本発明の一つの非限定的な態様において、未成熟樹状細胞への単球の分化を開始させた後６日目に、最終濃度のＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ‐γ（１０００Ｕ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）を得るためにＡＩＭ  Ｖ培地中成熟用処方物が未成熟ＤＣへ直接加えられる。次いで、成熟樹状細胞を作製するために、細胞が一晩培養される。次いでＤＣが収集され、１０６細胞当たり１μｇの抗原コードＲＮＡと場合により４μｇのＣＤ４０Ｌ  ＲＮＡによりコエレクトロポレートされる。エレクトロポレーション後、細胞はＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）を加えた１×１０６細胞ＡＩＭ  Ｖ培地において４時間培養される。次いで、細胞は凍結せずに対象への投与用に処方されるか、または凍結のために処方される。凍結の場合、細胞は好ましくは熱不活化自家血漿、１０％ＤＭＳＯおよび５％デキストロース中２×１０７細胞／ｍＬにおいて処方される。極低温用バイアルへは１．４×１０７細胞／バイアルの総数で０．７ｍＬが満たされる。次いでバイアルは最少４時間にわたりアルコールボックス中−８５℃において凍結され、貯蔵用の極低温用フリーザーへ移される。次いで、凍結された樹状細胞ワクチンが融解され、洗浄または再処方なしに対象へ投与される。
【０１０１】
成熟度を評価するためのＤＣのフローサイトメトリー分析
好ましい方法では、１０６ＤＣが収集され、冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳに再懸濁される。ＭＨＣ分子（ＨＬＡ‐ＡＢＣ、ＨＬＡ‐ＤＲ）、共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）、成熟マーカー（ＣＤ８３）、および単球マーカー（ＣＤ１４）に特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）またはＦＩＴＣ複合化抗体が９６ウェルプレート（ＢＤ Biosciences）においてウェル当たり１×１０５ＤＣと混合され、４℃において最少１５分間インキュベートされる。イソタイプ適合抗体がコントロールとして用いられた。入念に洗浄した後、蛍光分析がCellQuestソフトウェア（ＢＤ Biosciences）を用いてFACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ Biosciences）により行われた。
【０１０２】
ワクチン処方
樹状細胞ワクチンを処方する方法は当業者に知られている。好ましい態様において、成熟樹状細胞は洗浄され、熱不活化血漿（好ましくは、自家血漿）および１０％デキストロースに４×１０７細胞／ｍＬの濃度により再懸濁される。次いで、熱不活化血漿中５％デキストロース、１０％ＤＭＳＯの最終濃度を得るために、細胞が熱不活化血漿および２０％ＤＭＳＯの混合液により１：１希釈される。目標最終充填処方物は凍結保存に適した容器中において１．４×１０７細胞／０．７ｍＬである。次いで、樹状細胞が患者へ投与されるか、または好ましくは−８５℃において凍結され、好ましくは≦−１５０℃の温度において、極低温用フリーザー（好ましくは、汚染を防止するように設計された無水液体窒素フリーザー）に貯蔵される。次いで、凍結ワクチンが（好ましくは皮内注射による）患者投与のために臨床現場へ運搬される。融解して、ワクチンは更に処理することなく患者へ直接投与される。
【０１０３】
投与に適した他の処方物には、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および処方物を所定レシピエントの血液と等張にさせる溶質を含有しうる水性等張無菌注射液と、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、保存剤、免疫刺激剤、サイトカイン、およびアジュバントを含有しうる水性および非水性無菌懸濁液とがある。
【０１０４】
好ましい態様において、成熟樹状細胞は熱不活化自家血漿および１０％デキストロースに４×１０７細胞／ｍＬの最終濃度で懸濁される。次いで、５％デキストロースおよび１０％ＤＭＳＯを含有した熱不活化自家血漿中において２×１０７細胞／ｍＬの最終濃度を得るために、これらの細胞が熱不活化自家血漿および２０％ＤＭＳＯの混合液において１：１希釈される。最終充填処方物は凍結保存に適した容器中において１．４×１０７細胞／０．７ｍＬである。次いで、ワクチンが凍結され、無水液体窒素フリーザー中  ≦−１５０℃において貯蔵される。ワクチンは、洗浄および再懸濁の必要性なく、融解後にいつでも投与しうる。
【０１０５】
投与の方法
樹状細胞ワクチンは、注射（例えば、皮下、皮内、静脈内、リンパ内、関節内、筋肉内、腹腔内）、連続注入、インプラントからの徐放などに限定されないが、そのような様々な方法により投与できる。ＤＣワクチンは典型的には２〜４週間隔により投与された。樹状細胞ワクチンは、生理学上許容される担体、緩衝液、希釈剤、アジュバント、免疫調節剤などと一緒に投与される。好ましくは、樹状細胞ワクチンはそれが投与される患者と自家であるか、またはＨＬＡ適合性である。
【０１０６】
対象へ投与される細胞（例えば、活性化Ｔ細胞または樹状細胞）の用量は、経時的に対象において望ましい有益な治療反応を得る、癌細胞の成長を阻止する、または感染症を阻止するために有効な、有効量である。好ましい用量は約１０７細胞である。生物応答調節剤も、本発明のＤＣまたは活性化Ｔ細胞による治療のために、場合により加えられる。例えば、細胞は場合によりアジュバントまたはサイトカイン、例えばＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐１２、またはＩＬ‐２と一緒に投与される。
【０１０７】
抗原負荷樹状細胞または教育されたＴ細胞の免疫原性を評価する方法
本発明の方法により作製された抗原負荷樹状細胞または教育されたＴ細胞の免疫原性は、以下に限定されないが、それらを含めた周知の方法論により調べられる：
【０１０８】
５１Ｃｒ放出溶解アッセイ  抗原特異的Ｔ細胞によるペプチドパルス５１Ｃｒ標識標的の溶解が比較しうる。“より活性な”組成物は時間の関数として標的の大きな溶解を示す。溶解の動態と固定時点（例えば、４時間）における全体の標的溶解が、性能を評価するために用いられる。Ware,C.F.et al.(1983)J.Immunol.,131:1312
【０１０９】
サイトカイン放出アッセイ  修飾ＡＰＣとの接触でＴ細胞により分泌されるサイトカインの種類および量の分析が機能活性の尺度となりうる。サイトカイン産生の速度および総量を調べるために、サイトカインはＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定される。Fujihashi,K.et al.(1993)J.Immunol.Meth.,160:181、Tanquay,S.and Killion,J.J.(1994)Lymphokine Cytokine Res.,13:259
【０１１０】
インビトロにおけるＴ細胞の教育  本発明の組成物は、正常ドナーまたは患者由来ＰＢＭＣから反応性Ｔ細胞群を導く能力についてアッセイできる。この系において、導かれたＴ細胞は溶解活性、サイトカイン放出、ポリクローナリティ、および抗原エピトープとの交差反応性について試験できる。Parkhurst,M.R.et al.(1996)J.Immunol.,157:2539
【０１１１】
増殖アッセイ  Ｔ細胞は反応性組成物への応答により増殖する。増殖は、例えば３Ｈ‐チミジンの取込みを測定することにより、定量的に測定される。Caruso,A.et al.(1997)Cytometry,27:71
【０１１２】
トランスジェニック動物モデル  免疫原性は、ＨＬＡトランスジェニックマウスを本発明の組成物により予防接種し、誘導された免疫応答の種類および程度を調べることにより、インビボにおいて評価できる。一方、ｈｕ‐ＰＢＬ‐ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒトＰＢＬの適合移植により、マウスにおいてヒト免疫系の再構成を行える。これらの動物は本組成物により予防接種して、Shirai,M.et al.(1995)J.Immunol.,154:2733、Mosier,D.E.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2443において既に記載されたように免疫応答について分析される。
【０１１３】
霊長類モデル  非ヒト霊長類（チンパンジー）モデル系がＨＬＡ限定リガンドのインビボ免疫原性を測定するために利用できる。チンパンジーがヒトＭＨＣ分子と重複したＭＨＣリガンド特異性を有し、そのため相対的インビボ免疫原性についてＨＬＡ限定リガンドを人々に試験させうることが証明された。Bertoni,R.et al.(1998)J.Immunol.,161:4447
【０１１４】
ＴＣＲシグナル形質導入現象の測定  いくつかの細胞内シグナル形質導入現象（例えば、リン酸化）が、ＭＨＣリガンド複合体によるＴＣＲ会合の成功と関連している。これら現象の定性および定量分析が、ＴＣＲ会合によりエフェクター細胞を活性化しうる組成物の相対的能力と相関していた。Salazar,E.et al.(2000)Int.J.Cancer,85:829、Isakov,N.et al.(1995)J.Exp.Med.,181:375
【０１１５】
免疫細胞を単離および特徴付ける方法
細胞精製に際する細胞の検出のための細胞単離または免疫アッセイは、いくつかの構成のうちいずれかで、例えば、Maggio(ed.)(1980)Enzyme Immunoassay,CRC Press,Boca Raton,Fla.、Tijan(1985)“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam、Harlow and Lane,前掲、Chan(ed.)(1987)Immunoassay:A Practical Guide Academic Press,Orlando,Fla.、Price and Newman(eds.)(1991)Principles and Practice of Immunoassays,Stockton Press,NY、およびNgo(ed.)(1988)Non-isotopic Immunoassays,Plenum Press,NYにおいて概説されているものにより行える。
【０１１６】
細胞はＦＡＣＳ分析のようなフローサイトメトリー法により単離および特徴付けされる。様々なフローサイトメトリー法が知られている。蛍光活性化フローサイトメトリーの一般的概論については、例えばAbbas et al.(1991)Cellular and Molecular immunology,W.B.Saunders Company、特にchapter 3およびKuby(1992)Immunology,W.H.Freeman and Company,特にchapter 6参照。ＦＡＣＳ機器は、例えばBecton Dickinsonから入手しうる。
【０１１７】
細胞抗原を標識するために用いられる標識剤には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質、または他のポリマー、例えばアフィニティーマトリックス、炭水化物、または脂質があるが、それらに限定されない。イムノブロット法、ウエスタンブロット分析、放射性または生物発光マーカーの追跡、キャピラリー電気泳動、あるいは大きさ、電荷、または親和性に基づき分子を追跡する他の方法のいずれか公知の方法により検出が進められる。
【０１１８】
下記例は、本発明を限定するというより、むしろそれを説明するためにある。
【実施例】
【０１１９】
例１
１日経過白血球搬出物から作製された樹状細胞
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒトドナー４例から白血球搬出法により採取し、８℃〜２６℃の温度に維持された温度モニター運搬容器により樹状細胞製造施設へ翌日配達により輸送した。配達日に、白血球搬出産物は、樹状細胞前駆体（単球）を含有した単核細胞フラクションを分離および濃縮するために、室温（約１９〜２２℃）において２０分間にわたり５０ｍＬ円錐管でフィコール密度勾配遠心（８００×ｇ）を受けた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）による２回の洗浄工程後、細胞濃度および細胞生存率を調べた。ＰＢＳにより３回目の遠心／洗浄工程後、単核細胞をStemSpan H2000培地（StemCell Technologies,Inc.）に再懸濁し、２．０×１０８細胞／フラスコでＴ１５０ｃｍ２フラスコに接種した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において１〜２時間にわたる無菌組織培養プラスチックフラスコへの付着により、単核細胞群から単球を選択した。非付着および半付着細胞（主にリンパ球）は捨てた。主に単球である残留付着細胞をＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）含有のStemSpan H2000培地において培養した。未成熟樹状細胞への単球の分化を行わせるために、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において６日間インキュベートした。
【０１２０】
細胞を浮動させるためにフラスコを軽く叩くことにより、未成熟樹状細胞に富む群を収集した。懸濁状態の細胞を円錐管へ移した。残留浮遊細胞および残留培地を除去するために追加のＰＢＳをフラスコへ加え、円錐管中の細胞懸濁液へ加えた。残留付着細胞の脱着は、ＰＢＳを加えて、２〜８℃において約１０分間フラスコをインキュベートすることにより終了させた。これらの細胞をインキュベートしながら、円錐管中の細胞懸濁物を遠心し、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁した。インキュベート時間の最後に、フラスコを軽く叩き、内容物を円錐管中の細胞懸濁物へ加えた。全細胞懸濁物をペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、試料を細胞濃度、細胞生存率、および免疫表現型決定のために取り出した。下記４組の細胞マーカーをフローサイトメトリーにより試験した：単球系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６）、樹状細胞の存在の指標（ＣＤ１１ｃ）、抗原提示細胞マーカー（ＨＬＡ‐ＤＲ）、および成熟樹状細胞マーカー（ＣＤ８３）。未成熟樹状細胞に富む調製物は、非有意レベルの系統マーカーおよびＣＤ８３と、高レベルのＣＤ１１ｃおよびＨＬＡ‐ＤＲとを発現した。
【０１２１】
フェノールレッド不含のＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｌ‐グルタミン含有のOPTI-MEM Ｉ還元血清培地（GIBCO）により未成熟樹状細胞を１回洗浄した。次いで、樹状細胞を１０６樹状細胞当たりＲＮＡ約２μｇの比率でエレクトロポレーションにより増幅腫瘍ＲＮＡをトランスフェクトした。５×１０７細胞／ｍＬ含有の細胞懸濁物６００μＬを含有した４ｍｍギャップキュベット中において５００Ｖのパルスにより５００μｓエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、トランスフェクトされた細胞をＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）およびＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）を加えたStemSpan H2000培地（無血清培地）を含有するＴ１５０フラスコ（１キュベット／フラスコ）へ移した。トランスフェクトされた細胞は、該細胞をエレクトロポレーションから回収するために、３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において２〜３時間インキュベートした。
【０１２２】
未成熟のエレクトロポレートされた樹状細胞を、ＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）およびＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）と成熟用カクテル（ＩＬ‐１β  ５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ‐６  １５０ｎｇ／ｍＬ、ＴＮＦ‐α  ５ｎｇ／ｍＬおよびＰＧＥ２  １μｇ／ｍＬ）を加えたStemSpan H2000培地中、３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において２０〜２４時間かけて成熟させた。全てのサイトカインとＰＧＥ２とを１％ＨＳＡ含有ＰＢＳにより再調製または希釈（ＰＧＥ２の場合）した。希釈工程前に、ＰＧＥ２をエタノールにより再調製した。次いで細胞解離用緩衝液（トリプシンフリー）を加える前に成熟樹状細胞をＰＢＳによりすすぎ、次に細胞解離用緩衝液を除去するためにＰＢＳにより３回洗浄した。試料を細胞濃度、生存率、および免疫表現型決定のために採取した。未成熟および成熟樹状細胞の免疫表現型の比較が表１において示される。
【表１】
2008535493.tif 000003
【０１２３】
トランスフェクトされた成熟樹状細胞を２×１０７細胞／ｍＬの最終濃度で自家血漿に懸濁した。次いで、１０％ＤＭＳＯ含有９０％血漿中において３×１０６または１×１０７細胞／ｍＬの最終濃度を得るために、細胞を８０％血漿および２０％ＤＭＳＯの混合液により１：１希釈し、次に速度制御凍結を用いてクリオバイアル中において凍結し、≦−１５０℃において貯蔵した。
【０１２４】
例２  １日経過の白血球搬出産物から作製された樹状細胞ワクチンは１０％ＤＭＳＯにおいて融解後少なくとも２時間生存する
例１において記載されたように、製造された凍結樹状細胞ワクチンを３７℃において融解し、２０〜２５℃または２〜８℃において２時間保った。生存率を融解直後と３０分間隔により２時間にわたり調べた。３７℃において融解直後の生存率は９２％であった。結果は表２において示されており、ワクチンが融解されてから１０％ＤＭＳＯ中において少なくとも２時間貯蔵されうることを立証している。
【表２】
2008535493.tif 000004
【０１２５】
例３  患者からの単核細胞の単離と単球から未成熟樹状細胞への分化
末梢血単核細胞および血漿を患者またはボランティアから臨床現場において白血球搬出法により室温において採取した。白血球搬出産物（ＰＢＭＣ）および血清を６〜２８℃の温度範囲に維持された温度制御容器において一晩かけて運搬した。白血球搬出の翌日、単球（樹状細胞前駆体）および白血球を含有した単核細胞フラクションを分離および濃縮するために、ＰＢＭＣを５０ｍＬ円錐管中、室温においてフィコール密度勾配遠心により精製した。単核細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により数回洗浄し、細胞濃度を調べた。ＰＢＳでの最終遠心／洗浄工程後、単核細胞をＡＩＭ‐Ｖ培地に再懸濁し、２．０×１０８細胞／フラスコでＴ１５０ｃｍ２フラスコに接種した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において１〜２時間にわたる無菌組織培養フラスコへの付着により、単核細胞群から単球を選択した。非付着および半付着細胞はＰＢＳによる穏やかな洗浄により除去した。主に単球である残留付着細胞をＧＭ‐ＣＳＦ１０００Ｕ／ｍＬおよびＩＬ‐４  １０００Ｕ／ｍＬ含有のＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地において培養した。未成熟樹状細胞への単球の分化を行わせるために、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において６日間インキュベートした。
【０１２６】
インビトロ培養後、細胞を浮動させるためにフラスコを軽く叩くことにより、未成熟樹状細胞に富む群を収集した。懸濁状態の細胞を円錐管へ移した。残留浮遊細胞および残留培地を除去するためにＰＢＳをフラスコへ加え、次いで同円錐管中の細胞懸濁液へ加えた。残留付着未成熟樹状細胞の脱着をＰＢＳ中２〜８℃においてインキュベートにより促進させた。インキュベート時間の最後に、フラスコを軽く叩き、内容物を同円錐管中の細胞懸濁物へ加えた。次いで全細胞懸濁物をペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度を調べるために試料を取り出した。
【０１２７】
未成熟樹状細胞を洗浄し、ViaSpanに再懸濁し、１０６樹状細胞当たり抗原コードｍＲＮＡ２μｇをトランスフェクトした。細胞懸濁物（４×１０７細胞／ｍＬ）０．４ｍＬを含有した４ｍｍギャップキュベット中３００Ｖ、１００Ω、および１５０μＦのパルスによりエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、トランスフェクトされた細胞をＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地において希釈し、遠心し、ＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ‐１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐６（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地（無血清）に再懸濁した。成熟させるために、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において一晩インキュベートした。
【０１２８】
トランスフェクトされた成熟樹状細胞を４×１０７細胞／ｍＬの最終濃度により熱不活化自家血漿および１０％デキストロースに懸濁した。次いで、１０％ＤＭＳＯおよび５％デキストロースを含有した熱不活化自家血漿中において２×１０７細胞／ｍＬの最終濃度を得るために、細胞を２０％ＤＭＳＯの混合液において１：１希釈し、次に無菌クリオバイアル中、≦−１５０℃において凍結した。
【０１２９】
例４  ６〜２８℃において一晩インキュベートされた単球から作製された樹状細胞の物理的および機能的特性
本例におけるデータは、１日経過アフェレーシス産物からＲＮＡトランスフェクト樹状細胞を作製する機能性および実現可能性について裏付けている。樹状細胞を例３において記載された方法により作製した。下記データは、樹状細胞が単一の１日経過アフェレーシス産物から適切な収率により再現性良く作製され、得られた細胞が（１）古典的な成熟表現型を示し、（２）効率的にＲＮＡによりトランスフェクトされ、および（３）高融解後生存率により凍結保存されることを示す。
【０１３０】
ＤＣの免疫表現型  最終細胞調製物に存在するまたは不在である分子マーカーについて、ＦＡＣＳ染色により成熟ＤＣを詳しく特徴付けた。ＨＬＡ‐ＤＲ、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ１ａ、およびＣＤ２０９は高発現を示し、ＣＤ１４、ＣＤ５６、ＣＤ１９、およびＣＤ３は低発現を示す。表３（下記）は、異なる健康なドナーから得られたＰＢＭＣから樹状細胞ワクチンを作製する１１連続ランからまとめられた結果（陽性細胞率に関する平均および標準偏差）を示している。
【表３】
2008535493.tif 000005
【０１３１】
これらのデータは、顕微鏡写真（示さず）と一緒に、本発明条件の方法により作製されたＤＣが古典的な成熟表現型および形態を示すことを証明している。更に、比較的低い標準偏差は工程の再現性を示している。
【０１３２】
収率、表現型、および生存率  樹状細胞法は、徹底的に試験したところ、高品質ＲＮＡトランスフェクト成熟樹状細胞を再現性良く作製することが示された。表４は、抗原ペイロードとして全増幅腫瘍細胞系ＲＮＡおよびビヒクルとして正常ドナー樹状細胞を用いた１１のワクチンランの結果を示している。
【表４】
2008535493.tif 000006
【０１３３】
成熟ＲＮＡトランスフェクトＤＣはＣＣＲ７を発現し、遊走性である  上記の成熟ＤＣにマーカー加えて、インビボにおいてＤＣのリンパ節遊走にとり重要なＣＣＲ７発現を評価した。この研究では、フルスケールＧＭＰ工程（同一ラン３、４、６、７、８、および１０）を用いて作製された融解ＲＮＡトランスフェクトＤＣを試験するために、ＣＣＲ７特異的抗体でのＦＡＣＳ分析を用いた。結果が下記表５において示される：
【表５】
2008535493.tif 000007
【０１３４】
更に成熟後にＤＣにおけるＣＣＲ７の現実の存在を証明するために、コラーゲンゲルマトリックス自然遊走アッセイを用いたところ、ＤＣも遊走能を有することが証明されたが、このことは発現されたＣＣＲ７も機能的であることを示している（データを示さず）。
【０１３５】
ＲＮＡトランスフェクトＤＣは機能的共刺激サポートをもたらす  上記の実験においては、成熟ＤＣが重要な共刺激マーカーの全てを発現することを示し、同時に以下の実験ではこれらの分子が的であることを証明している。この目的のため、アロ混合リンパ球（ＭＬＲ）アッセイでＰＢＭＣからインターフェロン  ガンマ（ＩＦＮ‐γ）産生を刺激しうるＤＣの能力が、各ドナーから先に凍結されたＰＢＭＣと一緒に、異なるドナー３例から作製された融解ＤＣを用いて調べられた。予想は、ＤＣがそれらのＨＬＡ適合自家ＰＢＭＣからＩＦＮ‐γ産生を刺激しないが、非自家ＰＢＭＣと混合された場合にそうするであろう、というものであった。全対の賢明な組合せが読み出し(readout)としてＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＮＦ‐γ）を用いて試験された。データが図２に掲載されている。この実験の結果は、予想通りに、不適合ＤＣ／ＰＢＭＣ組合せのみがＩＦＮ‐γ産生を導き、その特性には機能的ＭＨＣおよび共刺激分子の発現を要することを証明している。
【０１３６】
成熟ＤＣは機能性を加えた  この実験において、トランスフェクション後で凍結前のＤＣを成熟させるために用いられたサイトカインカクテルは、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、およびＰＧＥ２を含有している。成熟ＤＣが未成熟ＤＣより優れていることを証明するために、自家Ｔ細胞からＴＨ１サイトカイン産生を刺激しうる（同一ドナーからの）これら２群の能力が調べられた。Ｆｌｕマトリックスタンパク質をコードするＲＮＡを両群のＤＣにトランスフェクトし、自家ＰＢＭＣからＦｌｕ特異的記憶ＣＴＬを刺激するために用いた。下記図３はＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示している（投入ＰＢＭＣの関数として＃スポット／ウェル）。Ｆｌｕ特異的記憶Ｔ細胞からＩＦＮ‐γ産生を導く上で未成熟および成熟ＤＣ間に統計学的差異が観察されなかった。しかしながら、成熟ＤＣのみはこれらの細胞からＩＬ‐２産生も導くことができた。（１）誘導されたＩＬ‐２分泌がオートクリン抗原特異性ＣＴＬ増殖を維持し、（２）ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２の低産生がＨＩＶ患者において死亡の危険性の増加と相関していると最近示され、最近の研究において、ＩＦＮ‐γまたはＩＬ‐２の分泌の欠乏がＴ細胞機能不全と中枢記憶応答の維持不能をもたらしたことから、ＩＬ‐２誘導は重要であるとみなされている。簡略化のために、陰性コントロールはグラフにしなかった。ＰＢＭＣ単独（即ち、非ＤＣ）から観察されるスポットの平均数は９．７（ＩＦＮ‐γ）および１．３（ＩＬ‐２）であった。この実験を独立ドナー３例のＰＢＭＣから作製されたワクチンにより繰り返したところ、結果は質的に同一であった。したがって、成熟ＤＣは未成熟ＤＣと比較して優れた機能性を加えていた。
【０１３７】
融解後ＲＮＡトランスフェクトＤＣは安定である  臨床プロトコールにおいては融解して樹状細胞ワクチンの即時注射を行えるが、投与を遅らせる不測の状況も生じうる。融解して直ちに注射しなくとも、ＤＣが生存して機能的であることを証明するために、以下の実験を行った。異なる健康なドナー２例に対応する二つの樹状細胞調製物の各々について２バイアルを融解した。各ドナーからの１バイアルはアロＭＬＲアッセイにより直ちに試験したが、各調製物から第二のバイアルは同方法によりアッセイされる前に室温において４０分間放置させた。この実験において用いられたＰＢＭＣには、各ドナーからの自家細胞と、どちらにも無関係のドナーからのＰＢＭＣの第３の試料を含めた。このアッセイの読み出しはＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＦＮ‐γ）であった。この実験の結果は図４において示され、融解して直ちにアッセイされたＤＣと室温において４０分間放置されたものとの間において、機能にさほどの差異がないことを示している。この機能アッセイに加えて、トリパン色素排除により融解後および融解後４０分間目の細胞生存率を調べたところ、同一の結果が得られた（データを示さず）。
【０１３８】
凍結融解はＤＣ機能に影響を与えない  ＤＣ機能が凍結融解工程により悪影響を受けるか否かを評価するために、凍結後および融解後ＤＣの機能性を比較した。機能性は、トランスフェクションに用いられたＦｌｕ  ｍＲＮＡ濃度を減少させる関数として、自家ＰＢＭＣからの記憶Ｆｌｕ特異的応答を刺激しうるＤＣの能力により評価した。アッセイの読み出しはＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＮＦ‐γ）であった。結果は下記図５において示され、凍結融解工程がこのアッセイにおいてＤＣの機能性に影響を与えないことを示している。トランスフェクション効率を測定するために、一定量のＧＦＰ  ｍＲＮＡ（０．５μｇ）を混ぜた。融解後、試料は２４時間凍結した後に融解した。
【０１３９】
ｍＲＮＡでＤＣのエレクトロポレーション後におけるタンパク質発現  第一工程として、ｍＲＮＡにおいてＤＣのトランスフェクションがｍＲＮＡコードタンパク質の適正な発現に至るかどうかを我々は評価した。ＤＣの作製のために、健康なボランティアから白血球搬出法により得られたＰＢＭＣ（新鮮または凍結）をインビトロにおいて２時間インキュベート後にプラスチックフラスコへの付着により単球について濃縮させた。洗浄後、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を作製するために、組み換え顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭ‐ＣＳＦ）およびインターロイキン‐４（ｒＩＬ‐４）を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地において付着細胞を６日間培養した。次いで、ウイルスまたはコントロールタンパク質をコードするＲＮＡによりｉＤＣをエレクトロポレート（３００Ｖ、１５０μＦ、１００Ω）し、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐４、ＩＬ‐６、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＴＮＦ‐α、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地において２４時間にわたり成熟するように誘導した。トランスフェクション後にタンパク質の発現を試験するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡによりＤＣをエレクトロポレートし、発現をフローサイトメトリーにより測定した。図６において示されるように、１日経過単球から作製された成熟ＤＣの大フラクションはトランスフェクション後４日間まで高レベルのＧＦＰを発現し、この方法がＤＣにおいて長期間タンパク質発現を促進する際に効率的であることを立証している。
【０１４０】
次いで、ＣＭＶ感染個体からのＰＢＭＣでＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導しうる、ＣＭＶ  ｐｐ６５タンパク質をコードするｍＲＮＡによってエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた自家ＤＣの能力を調べた。ｐｐ６５タンパク質から誘導される明確に規定された免疫優性ペプチドによりいくつかの血液ドナーからのＰＢＭＣを刺激し、ＣＤ４およびＣＤ８双方のＴ細胞においてＩＬ‐２／ＩＦＮ‐γ分泌と細胞増殖とを測定することにより、ＣＭＶ感染者が特定された。陽性ＣＭＶ特異的Ｔ細胞応答が検出されて、インフォームド・コンセント後に白血球搬出を受けることに同意した個人が、更なる研究のために選択された。
【０１４１】
これら個体からＤＣを前記のように調製した。次いで、ＣＭＶ  ｐｐ６５タンパク質をコードするＲＮＡによりトランスフェクトされた成熟ＤＣを１／４０比により自家ＰＢＭＣと１６時間（ＩＣＳ）または６日間（増殖）インキュベートした。刺激後、ＣＭＶ特異的ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のＩＬ‐２およびＩＦＮ‐γ分泌（図７）ならびに増殖（図８）をフローサイトメトリーにより評価した。ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＲＮＡによりエレクトロポレートされたＤＣは、選択的にＣＭＶ感染者からのＣＤ８  Ｔ細胞において、高いＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２発現と増殖を誘導した。しかしながら、ＣＤ４  Ｔ細胞において検出される低レベルのサイトカイン分泌および増殖において示されるように、このプロトコールは最少のＣＤ４  Ｔ細胞活性化を誘導する。
【０１４２】
例５  ５００Ｕ／ｍＬまたは１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４を用いた樹状細胞への単球の分化の比較
６〜２８℃の温度において維持された１日経過白血球搬出物からのＰＢＭＣを洗浄し、２時間付着工程用のＡＩＭ‐Ｖ培地に＠〜２×１０８／フラスコにより接種した。２時間後、非付着細胞を除去し、付着細胞を洗浄して、１０００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍＬまたは１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地に再懸濁し、＠３７℃において６日間インキュベートした。加えて、１０００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５により培養した場合に、３日目に培地を交換した効果を培地の交換なしの６日間の培養と比較した。詳しくは、３日目に、培地を懸濁状態で細胞と一緒に除去し、ゆるく付着した細胞を収集するためにフラスコをＸ‐ＶＩＶＯ培地において穏やかに洗浄し、細胞をペレット化するために培地および洗液を＠１３００ｒｐｍにより８分間遠心した。１０００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４を加えた新鮮Ｘ‐ＶＩＶＯ  １５培地に細胞を再懸濁し、付着細胞をなお含有したフラスコへ培地および細胞を逆添加し、フラスコを更に３日間＠３７℃においてインキュベートした。
【０１４３】
全フラスコをエレクトロポレーション用に個別に収集した。６日目ＤＣを２μｇ  ＧＦＰ  ｍＲＮＡ／１０６細胞（２０μｇ  ＧＦＰ  ｍＲＮＡ／５×１０６細胞）をトランスフェクトし、Ｘ‐ＶＩＶＯ  １５に再懸濁し、１×１０６／ｍＬにより接種し、８００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４を加えて、サイトカインカクテル（ＴＮＦα‐１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ‐１β‐１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ‐６‐１００ｎｇ／ｍＬ、ＰＧＥ２‐１μｇ／ｍＬ）により成熟させた。ＤＣを＠３７℃、５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。６日目（未成熟ＤＣ、図９）およびトランスフェクション後２４時間目（成熟ＤＣ、図１０）に未成熟ＤＣで表現型を調べた。各培養条件においてトランスフェクション直後とトランスフェクション後２４時間目とにおける収率（％Ｒｅｃ）および生存率（％Ｖ）が表６Ａ〜Ｃにおいて示される。
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
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【表６Ｃ】
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【０１４４】
例６  水簸による単球の濃縮と未成熟および成熟ＤＣへの分化
温度制御（６〜２８℃）容器によって翌日配達により採取箇所から製造施設へ運搬された、１日経過白血球搬出物から単球を単離する自動化方法として、向流遠心としても知られる水簸をElutra Cell Separation System（Gambro BCT,Lakewood,ＣＯ）により行った。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ,Cambrex BioScience,Walkersville,ＭＤ）の４Ｌ袋へ５％ヒトアルブミン血清（ＨＳＡ,Baxter Healthcare,Westlake,ＣＡ）１０００ｍＬを加えることにより、水簸緩衝液を調製した。この水簸緩衝液を搬出物に等しい容量により１日経過搬出産物へ加えた。Elutra Cell Separation System（Gambro BCT,Lakewood,ＣＯ）を水簸緩衝液で準備し、搬出産物を負荷した。水簸操作を行った後、単球をローターオフフラクションから採取した。単球を凍結貯蔵した。
【０１４５】
凍結された水簸単球を融解し、次いで未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を作製するためにフラスコ内において８００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦ（Berlex Laboratories,Richmond,ＣＡ）および５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４（R&D Systems,Minneapolis,ＭＮ）含有のＸ‐ＶＩＶＯ  １５（Cambrex Bioscience,Walkersville,ＭＤ）中、百万個細胞／ｍＬで分化させた。ｉＤＣを収集し、エレクトロポレーションを用いて増幅ＲＣＣ腫瘍ＲＮＡにより抗原負荷させた。細胞を８００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４、および成熟用カクテル（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６およびＰＧＥ２）と一緒に培養し、２４時間の培養後に収集した。ViCell（Beckman Coulter Inc.,Fullerton,ＣＡ）によるトリパンブルー排除法を用いて、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）に関する細胞数と生存率とを調べた。得られたｍＤＣの表現型を決定した。フラスコにおいて培養された細胞は９９％ＣＤ８３＋および０．２％ＣＤ１４＋であった。ｍＤＣの収率はフラスコにおいて培養されたＣＤ１４＋細胞の３４％であった。
【０１４６】
例７  新鮮 vs.１日経過白血球搬出物から調製されたＤＣにおける共刺激分子の発現の比較
末梢血を白血球搬出法により３日間各々において健康なヒトドナー３例から採取し、採取後３０分以内にモントリオール大学へ輸送した。白血球搬出物２０ｍＬを取出し、自家血漿を遠心により調製した。白血球搬出物容量を二部分に等分した。一つの部分は“新鮮”単球を作製するため直ちに処理し、第二部分は“１日経過搬出物”から細胞を作製するために５０ｍＬ円錐管５個で２０ｍＬずつ貯蔵した。各管をボックス内のプラスチック容器に入れ、それを１６〜２０℃において２４時間にわたり揺動台(rocking platform)において傾けて貯蔵した。インキュベート時間経過後、フィコール密度勾配を用いてＰＢＭＣを分離させた。
【０１４７】
樹状細胞前駆体（単球）を含有した単核細胞フラクションを、フィコール密度勾配を用いて、新鮮および１日経過双方の搬出物から分離させた。白血球搬出物を５０ｍＬ円錐管中のフィコール上に積層し、各管を室温において２０分間遠心（８００×ｇ）した。細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により４回洗浄し、細胞濃度および細胞生存率を調べるために計測した。高精製単球群を得るために、ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi）を用いて単核フラクションを更に精製した。ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有した緩衝液（Miltenyi緩衝液）８ｍＬに１×１０９細胞を再懸濁した。１×１０９細胞を含有した各５０ｍＬ管へＣＤ１４マイクロビーズ２ｍｌを加え、４℃において１５分間インキュベートした。細胞を同緩衝液１００ｍＬにより洗浄し、３００×ｇにより遠心し、Miltenyi緩衝液２０ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁物を磁場（Miltenyi Quadromax）下に置かれたＬＳカラム４本へ適用した。重力流(gravity flow)を用いた細胞の適用後、カラムをMiltenyi緩衝液３ｍＬにより３回洗浄した。磁場が存在しない状態においてMiltenyi緩衝液５ｍＬにより単球を２回溶出させ、３００×ｇにより１０分間遠心した。ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ２０９に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーにより、溶出およびフロースルーフラクション双方の純度を調べた。溶出フラクションは８８〜９８％の単球および２％未満の小細胞を含有していた。非付着フラクションは小さな割合（２％）の単球を含有していただけであった。全ＲＮＡをこのとき精製単球の一部（５千万個）から抽出した。
【０１４８】
成熟分化ＤＣを作製するために、ＩＬ‐４およびＧＭ‐ＣＳＦを含有するＸ‐ＶＩＶＯ培地の入ったＴ１５０ｃｍ２フラスコへ５千万個の単球を３７℃において５日間接種した。腫瘍壊死因子、インターフェロン‐γ、およびプロスタグランジンＥ２を含有したサイトカインカクテル（ＴＩＰ）を５日目に細胞へ加えた。細胞を培養６日目に収集し、このとき“ＴＩＰ‐ＤＣ”と命名した。フラスコを軽く叩いて細胞を浮動させ、追加のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により洗浄し、ＰＢＳ中２〜８℃において約１０分間インキュベートして残留付着細胞を脱着させることにより、樹状細胞に富む群を収集した。全細胞懸濁物をペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度、細胞生存率、および免疫表現型について分析した。下記組の細胞マーカーをフローサイトメトリーにより試験した：単球系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、およびＣＤ５６）、樹状細胞の存在の指標（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ａ、およびＣＤ２０９）、抗原提示細胞マーカー（ＨＬＡ‐II）、遊走のマーカー（ＣＤ３８およびＣＣＲ７）および成熟樹状細胞のマーカー（ＣＤ８３およびＣＤ８６）。
【０１４９】
２千万個のＴＩＰ‐ＤＣをViaSpan６００μＬに再懸濁し、４μｇ  ＲＮＡ／百万個樹状細胞の比率により、ＣＤ４０Ｌ  ＲＮＡをエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは４ｍｍギャップキュベット中３００Ｖのパルスにより３００μｓ行った。エレクトロポレーション後、ＩＬ‐４およびＧＭ‐ＣＳＦを加えたＸ‐ＶＩＶＯ培地（無血清培地）を含有するＴ７５フラスコ（１キュベット／フラスコ）へ細胞を移した。エレクトロポレーションから細胞を回収するために、トランスフェクトされた細胞を３７℃、５％ＣＯ２、≧７５％湿度において４時間インキュベートした。この細胞を更に成熟させた後、“ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣ”と命名した。作製されたＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣの一部からＲＮＡを単離した。
【０１５０】
速度制御凍結を用いてクリオバイアル内の１０％ＤＭＳＯ含有９０％自家血漿中でＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣを凍結し、≦−８５℃において貯蔵した。上記のように作製された凍結樹状細胞ワクチンを３７℃において融解し、２０〜２５℃において３０分間保った。生存率を融解直後と１０分間隔で３０分間にわたり調べた。単球系統マーカー（ＣＤ１４）、樹状細胞マーカー（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ａ、およびＣＤ２０９）、抗原提示細胞マーカー（ＨＬＡ‐II）、遊走のマーカー（ＣＤ３８およびＣＣＲ７）、および成熟樹状細胞のマーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）に特異的な抗体を用いてフローサイトメトリーにより融解後ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣを分析した。
【０１５１】
結果
単球の作製
ドナー３例からのデータは、ＣＤ１４ビーズを用いた陽性選択が単球の８８〜９８％純度群をもたらすことを証明している（表７）。小細胞汚染物の最大量は２％である（表７）。非付着（フロースルー）フラクションは全３例のドナーにおいて２％以内の単球（大細胞）を含有していた。したがって、非付着フラクションで単球の有意な損失はない。溶出物中に存在する小細胞群汚染物は、高ＣＤ３発現と低いＣＤ１９、１６、または５６マーカー発現から明らかなように、主にＴ細胞から構成されている（データ示さず）。新鮮および１日経過白血球搬出物間で溶出フラクション中、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ‐Ｉ、またはＨＬＡ‐IIマーカーの発現に明らかな差異はなかった。
【表７】
2008535493.tif 000011
【０１５２】
ＴＩＰ‐ＤＣ
単球は最初非常に純粋（９０％）であり、全３例のドナーからのＴＩＰ‐ＤＣで大細胞の割合が９８〜９９％で、そのため小細胞の割合が２％未満であることから、純度は分化工程に際して更に改善されていた（データ示さず）。フローサイトメトリーによるＴＩＰ‐ＤＣの表現型の分析においては、新鮮および１日経過白血球搬出物から作製されたＴＩＰ‐ＤＣ間においてＣＤ８３の発現に差異があることを明らかにした。陽性細胞の割合は、研究下のマーカーに関して陽性である細胞の数に関する。表面成熟マーカーＣＤ８３を発現するＤＣの％は、１日経過白血球搬出物から作製されたものより新鮮白血球搬出物から作製された全３例のドナーからのＴＩＰ‐ＤＣにおいて低かった（表８）。新鮮および１日経過白血球搬出物から作製されたＴＩＰ‐ＤＣからのいかなる他のマーカーにも、他の差異はなかった。
【表８】
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【０１５３】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣ
トランスフェクション後、４時間
トランスフェクション後のＤＣ（ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣ）をトランスフェクション後４時間目にＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）の発現について分析した。１日経過白血球搬出物からのＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣは、新鮮白血球搬出物から作製されたＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣより、トランスフェクション後４時間目にドナー１および２において多くのＣＤ４０Ｌを発現した。ドナー１および２において新鮮および１日経過搬出物から作製されたＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣ間においてＣＤ４０Ｌの平均蛍光強度（ＭＦＩ）にも差異があった。
【０１５４】
融解後ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣ
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣを融解後に様々なＤＣマーカーの発現について分析した。新鮮 vs.１日経過白血球搬出物から作製された融解後ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣの表現型に差異があった。新鮮白血球搬出物から作製されたＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣにおけるＣＤ４０Ｌ発現の平均蛍光強度は、１日経過白血球搬出物から作製されたＤＣより低かった（表９）。
【０１５５】
ドナー２例において、（ＣＤ４０Ｌ発現で陽性率の）トランスフェクション効率が新鮮白血球搬出物から作製されたＤＣにおいて低いことを示す傾向もあった（表９）。
【表９】
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【０１５６】
フローサイトメトリーにより測定された陽性細胞の割合は、三つのケースのうち二つにおいて、白血球搬出の１日経過物から作製された樹状細胞において多くの細胞がＣＤ８３抗体において陽性染色されることを明らかにした（表１０）。
【表１０】
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【０１５７】
ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６について陽性細胞の割合の差異は１日経過白血球搬出物から作製されたＤＣにおいて常に高いわけではないが（ドナー３、表１０）、特異的抗体により染色される１日経過白血球搬出物から作製された細胞の平均蛍光強度は全てのドナーにおいて高い（表１１）。ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ８３に加えて、ＨＬＡ‐ＩおよびＨＬＡ‐IIも同様の結果を示した（表１１）。平均蛍光強度シグナルは細胞当たりで高いタンパク質レベル発現と相関し、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ‐Ｉ、およびＨＬＡ‐II分子の発現は成熟ＤＣにおいて上方調節されている。したがって、これら細胞の表現型は全３例のドナーにおいて１日経過物から得られた樹状細胞の多い成熟状態を反映している。これらの変化はＤＣの成熟状態を反映している。陽性細胞の割合と平均蛍光強度の測定により得られたデータを一緒にすると、白血球搬出の１日経過物から作製された細胞が多い成熟表現型を示している、と我々は結論付ける。
【表１１】
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【０１５８】
例８  新鮮 vs.１日経過単球およびそれから作製された樹状細胞における遺伝子発現のマイクロアレー分析
新鮮単球および１日経過単球（白血球搬出後２４時間にわたり１６〜２０℃においてインキュベートされた単球）からのＲＮＡ試料と、例８において記載された新鮮および１日経過単球から作製されたＤＣからのＲＮＡとを、製造業者の説明（Genechip Expression Analysis Technical Manual,2004）に従い、Human Genome U133 Plus 2.0 Array（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）に適用した。簡単に言えば、Genechip Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）によりスパイクされた全ＲＮＡ３μｇを、SuperScript II逆転写酵素を用いて、第一鎖ｃＤＮＡへ変換した。第二鎖ｃＤＮＡ合成に次いで、各転写物の直線的増幅とビオチニル化ＣＴＰおよびＵＴＰの取込みのためにインビトロ転写を行った。ｃＲＮＡ産物を約１００ヌクレオチドに断片化し、１６時間かけてマイクロアレーとハイブリッド形成させた。次いで、マイクロアレーを低（６×ＳＳＰＥ）および高（１００ｍＭ  ＭＥＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ）ストリンジェンシーにおいて洗浄し、ストレプトアビジン‐フィコエリトリンにより染色した。
【０１５９】
ビオチニル化抗ストレプトアビジンと追加量のストレプトアビジン‐フィコエリトリン染料を加えることにより、蛍光を増幅させた。５７０ｎｍで励起後３μｍ分解能で蛍光シグナルを集めるために、GeneChip Scanner 3000（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）を用いた。２連続走査からの平均シグナルを各マイクロアレー特性について計算した。走査画像をGenechip Operating Software v1.1（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）により分析した。Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix,Santa Clara,Calif.）に含有されたコントロールＲＮＡ４種の高い直線的相関（Ｒ２＞０．９５）が、ラベリング工程の成功を保証していると確認された。
【０１６０】
全てのプロファイルデータをコンピュータープログラムGenespringへ入力し、試料の種類に応じて標準化した（即ち、単球には単球試料および樹状には樹状試料）。三つの工程を標準化工程により行い、Affymetrixアレーに関してGenespringにより示された標準法に従った。
４）データ変換（０．０１未満の全値が０．０１に設定された）
５）百分順位の５０番目に標準化
６）中央値に標準化
【０１６１】
データは欠けたスポットのあるフラッグについて最初にフィルターにかけた。次いで、データをｐ．０５またはｐ．１からの信頼性レベルでランダム予測モデルなしに一元配置分散分析により分析した。次いで、フィルターにかけて得られた遺伝子のリストをフォールド変化、発現のレベル、または信頼性について分析した。これは平均として試料を用いてまたは個別試料として行った。新鮮および１日経過単球または樹状細胞間における発現のレベルを分散分析前または後に比較した。遺伝子のリストを互いに比較し、いくつかのリストにおいて重複するものをそれらの信頼度に関して選択した。１日経過単球から作製された樹状細胞 vs.新鮮単球から作製された樹状細胞で定常状態ＲＮＡレベルの変化した遺伝子が、表１２Ａにおいて掲載されている。これら遺伝子の説明が表１２Ｂにおいて掲載されている。１日経過単球vs.新鮮単球で定常状態ＲＮＡレベルの変化した遺伝子が、表１３Ａにおいて掲載されている。これら遺伝子の説明が表１３Ｂにおいて掲載されている。これらの結果は、新鮮単球が１日経過単球と表現型において異なり、新鮮単球から作製された樹状細胞が１日経過単球から作製された樹状細胞と表現型で異なることを証明している。
【０１６２】
【表１２Ａ】
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【０１６３】
【表１２Ｂ】
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【０１６４】
【表１３Ａ】
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【０１６５】
【表１３Ｂ】
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【０１６６】
新鮮および１日経過単球から作製されたＤＣ間で不変のままであることが示された２種ハウスキーピング遺伝子の発現に対して、樹状細胞遺伝子を更に標準化させた。ハウスキーピング遺伝子に対する発現の比率を算出するために、（標準化された）各遺伝子の平均発現をＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ）またはβ‐アクチンの（標準化された）平均発現で割った。６種遺伝子に関する結果が表１４において示される。“ＤＣｄｏ”は１日経過単球から作製されたＤＣに関する。“ＤＣｆ”は新鮮単球から作製されたＤＣに関する。
【表１４】
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【０１６７】
候補遺伝子のうち２種の単球における異なる発現の、現在までの、追加証明が、表１５において示されたプライマーを用いて定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により行われた。製造業者の説明（Invitrogen,Carlsbad,Calif.）に従い、ＲＴ‐ＰＣＲ用にオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびSuperScript III First-Strand Synthesis Systemを用いて、各全ＲＮＡ（GeneChip合成で用いられたものと同一）から第一鎖ｃＤＮＡを作製した。製造業者の説明（ABI Prism 7900HT Sequence Detection System User Guide）に従い、ABI Prism 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems,Foster City,Calif.）を用いてＱＰＣＲを行った。TaqMan Gene Expression AssaysまたはCustom TaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems,Foster City,Calif.）をTaqManプローブとして用いた。ABsolute QPCR ROX Mix（ABgene,Surrey,ＵＫ）を用いてＰＣＲ反応を三重に行った。ABI Prism 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2（Applied Biosystems,Foster City,Calif.）において記載されている相対的標準曲線法を用いて、相対的ｃＤＮＡ濃度の定量を行った。GeneChip分析において各遺伝子における最大発現する１種のｃＤＮＡを相対的標準曲線の作成に用いた。全てのデータが内部ＧＡＰＤＨ発現と比べた発現として示される。ＡＰＡＦ‐１およびＣＤＣＡ２エフェクタータンパク質２は、新鮮および１日経過単球間において、ＧＡＰＤＨと比べて各々少なくとも２．５倍および３倍減少することが証明された。
【表１５】
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【０１６８】
例１０  ドナーからの単離時から２３、４８、または７１時間にわたり室温においてインキュベートされたＰＢＭＣから作製された樹状細胞の比較
方法：
ドナー２例からの‘健康ドナー’白血球搬出産物を翌日配送後に受け取った。各産物の約１／３を次のようにアフェレーシス採取後特定時にＤＣ作製のために処理した。白血球搬出産物（即ち、ＰＢＭＣ）を下記のフィコール‐ヒストパック密度勾配遠心および付着工程前に２３、４８、または７１時間にわたり室温においてインキュベートした。室温インキュベート時間経過後、ＰＢＭＣの生存率およびＢ細胞、Ｔ細胞、単球、およびＮＫ細胞の割合を調べた。結果が表１６において示される。
【表１６】
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【０１６９】
ＤＣ産物の作製
ＰＢＭＣをフィコール‐ヒストパック密度遠心により作製し、ＰＢＳ中、室温において４回洗浄した。２×１０８ＰＢＭＣを３０ｍＬ  ＡＩＭ‐Ｖ培地（Invitrogen）に再懸濁し、３７℃において２時間かけて１５０ｃｍ３プラスチックフラスコへ付着させた。非付着細胞を除去し、残留細胞を１０００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ‐ＣＳＦ（Leukine）および１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ‐４（R&D systems）を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地において３７℃、５％ＣＯ２において５日間培養した。未成熟ＤＣを最初にＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ‐γ（１０００Ｕ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）の添加により成熟させた。一晩培養後、ＴＩＰ‐ＤＣ中間産物を培地の除去および冷ＰＢＳ洗浄により収集した。細胞の成熟群の形成を確認するためにＴＩＰ‐ＤＣを表現型を決定した。抗原負荷完全成熟ＤＣを作製するために、ＴＩＰ‐ＤＣをエレクトロポレートした：細胞を冷Viaspanに４×１０７／ｍＬにより０．５ｍＬに再懸濁し、氷上に置いた。ＤＣをモデル抗原コードペイロードとして１μｇ／１０６細胞で増幅全腫瘍腎臓細胞癌腫ｍＲＮＡ＋４μｇ／１０６  ＣＤ４０Ｌ  ｍＲＮＡと混合し、４ｍｍギャップエレクトロポレーションキュベットへ入れ、次いでBiorad GenePulsar Xcell systemを用いてエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後に、ＤＣをＸ‐ＶＩＶＯ  １５培地により洗浄し、最後にＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）を加えたＸ‐ＶＩＶＯ  １５  ２０ｍＬに１×１０６／ｍＬにより再懸濁し、低付着Ｔ７５フラスコ中３７℃において４時間培養した。製造業者により記載されているようにヨウ化プロピジウムおよびCalTag計数ビーズを用いて細胞計数と生存率測定とを行った。フィコール後ＰＢＭＣ試料、６日目ＴＩＰ‐ＤＣ、エレクトロポレーションおよび培養後４時間目に回収されたＤＣ（ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣ）、および融解後の最終産物を全て、細胞計数と生存率分析に付した。結果が表１７において示される。
【表１７】
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【０１７０】
ＰＢＭＣおよびＤＣ産物の表現型決定
全ての抗体をＢＤ Biosciencesから入手し、製造業者により勧められる希釈倍率において用いた。ＰＢＭＣ：３×１０５細胞を４℃において３０分間にわたる抗体とのインキュベートによりＣＤ１９‐ＰＥ、ＣＤ１４‐ＰＥ、およびＣＤ３‐ＰＥまたは適合イソタイプ複合化コントロールにおいて各々染色した。インキュベート後、染色された細胞を冷１％ＦＢＳ／ＰＢＳにより３回洗浄し、CellQuestソフトウェア（ＢＤ Biosciences）を用いてFACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ Biosciences）を用いる蛍光分析のためにＰＢＳに再懸濁した。取得の３分前に、ゲーティング目的の生存率用染料としてヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ）を各試料へ加えた。ＤＣ：１×１０６細胞（ＴＩＰ‐ＤＣおよびＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣ）を冷ＰＢＳ／１％ＦＢＳに再懸濁した。ＭＨＣ分子（ＨＬＡ‐ＡＢＣ、ＨＬＡ‐ＤＲ）、共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）、成熟マーカー（ＣＤ８３）、または単球／ＤＣ系統マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ２０９）に特異的なＰＥまたはＦＩＴＣ複合化抗体を１×１０５ＤＣと混合し、４℃において３０分間インキュベートした。イソタイプ適合抗体をコントロールとして用いた。入念に洗浄した後、細胞を前記のようにフローサイトメトリーに付した。細胞内ＣＤ４０Ｌを次のように調べた：２×１０５ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣを４℃において最少１０分間から２時間にわたりCytofix／Cytoperm溶液（ＢＤ Biosciences）２５０μＬに再懸濁した。細胞を染色用緩衝液（ＰＢＳ、ＢＳＡ、ＮａＮ３およびＥＤＴＡ）２ｍＬにより２回洗浄し、染色用緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、４℃において一晩貯蔵した。細胞を１５分間にわたりPerm／Wash溶液（ＢＤ Biosciences）２．０ｍＬに再懸濁し、遠心し、Perm／Wash溶液１００μＬに再懸濁した。マウス抗ヒトＣＤ４０Ｌ  ＡＰＣまたはマウスＩｇＧ１  ＡＰＣ２０μＬを各ＤＣ調製物へ加え、暗所下４℃において３０分間インキュベートした。細胞をPerm／Wash溶液１ｍＬにより２回洗浄し、フローサイトメトリー分析前に染色用緩衝液に再懸濁した。結果が表１８において示される。
【表１８】
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【０１７１】
ここで記載された具体的態様は説明のために示され、本発明の限定としてではないことが理解されるであろう。この発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な態様により用いられる。当業者であれば、ここで記載された具体的操作に応じた多くの相当物を、ルーチン実験を用いるだけで突き止められるか、またはそれを認識するであろう。このような相当物も本発明の範囲内に属するとみなされ、特許請求の範囲によりカバーされている。
【０１７２】
明細書において言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明が関与する当業者の技術水準を示す。全ての刊行物および特許出願、特にその関連部分は、各個別の刊行物または特許出願が具体的および個別的に示されて引用することにより本明細書の開示の一部とされる程度に、引用することにより本明細書の開示の一部とされる
【０１７３】
ここで開示および請求された組成物および／または方法の全てが、本開示からみて過度の実験なしに作製および実施しうる。本発明の組成物および方法が好ましい態様に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、ここで記載された組成物および／または方法、および該方法の工程または工程の順序に変更を加えうることは、当業者に明らかであろう。更に詳しくは、化学的および生理的双方で関連したある剤がここで記載された剤に置き換えられ、それでも同一または類似の結果が得られることは、明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような類似した置き換えおよび修正が、添付した特許請求の範囲において規定されているように、本発明の精神、範囲、および概念内に属していると思われる。
【０１７４】
２回の独立実験による表１６のデータは、回収された白血球サブセットにおいて有意な偏差なしに、患者から採取後７２時間まで保持されたアフェレーシス産物が高生存ＰＢＭＣ群を生み出せることを示す。各時点におけるＰＢＭＣにおけるフラスコの接種と、成熟ＤＣ（ＴＩＰ‐ＤＣ）の作製のための培養とは、高頻度の生存細胞をもたらすが、長期間にわたり保持されたアフェレーシス産物を用いたＤＣの全回収率は減少している（表１７）。それにもかかわらず、全増幅腫瘍ＲＮＡおよびＣＤ４０Ｌ  ＲＮＡでのエレクトロポレーションによる更なる処理により、十分なＤＣが作製されうる。最も重要なことに、表１７および１８は、様々な出発産物から作製されたＴＩＰ‐ＤＣがエレクトロポレーションと回収に等しく応じられ、最終産物、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣへ完全成熟することを示す。この研究から作製されたＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ  ＤＣは‘ワクチン’として処方され、ＤＣ調製物の劣化なしに凍結および融解できる。結論として、採取後７２時間まで保持されたアフェレーシス産物は、診療所での適用向けＤＣワクチンの集中製造に適した実行可能な原料である。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】単球（例えば、白血球搬出産物）の温度制御運搬用に好ましい運搬容器および包装材料の略図。
【図２】ＲＮＡトランスフェクトＤＣは機能的共刺激サポートを提供する。混合リンパ球（ＭＬＲ）アッセイにおいてＰＢＭＣからＩＮＦ‐γ産生を刺激しうる能力について、ＤＣが試験された。異なるドナー３例から作製された融解ＤＣが、各ドナーからの予め凍結されたＰＢＭＣと対にされた。全ての対の賢明な組合せが読み出しとしてＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＮＦ‐γ）を用いて試験された。カラム１、４、および７は自家ＰＢＭＣと対にされたＤＣを表わす。カラム２、３、５、６、８、および９は非自家ＰＢＭＣと対にされたＤＣを表わす。カラム１０〜１２はＤＣ単独コントロールを表わす。カラム１３〜１４はＰＢＭＣ単独コントロールを表わす。
【図３】サイトカインカクテル成熟ＤＣが、自家Ｔ細胞からＴｈ１サイトカイン産生を刺激しうる能力について、同一ドナーからの未成熟ＤＣと比較された。ＤＣの両群がＦｌｕマトリックスタンパク質をコードするＲＮＡによりトランスフェクトされ、自家ＰＢＭＣからＦｌｕ特異的記憶ＣＴＬを刺激するために用いられた。ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果（投入ＰＢＭＣの関数として＃スポット／ウェル）が示される。４カラムの各組が次の順序により並べられている：未成熟ＤＣによりＦｌｕ特異的Ｔ記憶細胞から導かれるＩＦＮγ産生、成熟ＤＣによりＦｌｕ特異的Ｔ記憶細胞から導かれるＩＦＮγ産生、未成熟ＤＣによりＦｌｕ特異的Ｔ記憶細胞から導かれるＩＬ‐２産生、および成熟ＤＣによりＦｌｕ特異的Ｔ記憶細胞から導かれるＩＬ‐２産生。
【図４】異なる健康なドナー２例から得られた１日経過ＰＢＭＣから作製された２種のＲＮＡ負荷樹状細胞調製物の各々について２バイアルが融解された。各ドナーから１バイアルがアロＭＬＲアッセイにより直ちに試験され、一方各調製物からの第二バイアルが同法でアッセイされる前に室温において４０分間放置された。この実験により用いられたＰＢＭＣは、各ドナーからの自家細胞と、いずれにも無関係のドナーからのＰＢＭＣの第三の試料であった。このアッセイ用の読み出しはＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＮＦ‐γ）であった。
【図５】凍結前対融解後におけるＤＣの機能性が、トランスフェクションに用いられたＦｌｕ  ｍＲＮＡ濃度を減少させる関数として、自家ＰＢＭＣからの記憶Ｆｌｕ特異的応答を刺激しうるＤＣの能力により評価された。アッセイの読み出しはＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＮＦ‐γ）であった。
【図６】ＧＦＰをコードするＲＮＡでのエレクトロポレーション後におけるＤＣによるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー評価。トランスフェクトしていない（点線）。
【図７】細胞内サイトカイン染色：ＧＦＰ（陰性コントロール、左パネル）またはＣＭＶ  ｐｐ６５（右パネル）をコードするＲＮＡによりトランスフェクトされたＤＣにおいて刺激後ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ‐２／ＩＦＮ‐γ。
【図８】ＧＦＰ（陰性コントロール、左パネル）またはＣＭＶ  ｐｐ６５（右パネル）をコードするＲＮＡによりトランスフェクトされたＤＣによる刺激後のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞におけるＣＳＦＥ希釈。
【図９】１日経過の白血球搬出産物から作製された６日目未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の表現型。
【図１０】１日経過の白血球搬出産物から作製された７日目成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の表現型。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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