(57)【要約】薬剤又は化合物、例えば標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物及び酵素基質の細胞への送達のための系として高度に効率的なカチオン性リポソームを提供する。カチオン性リポソームは細胞内の標的蛋白の活性又は見かけの活性の抑制を検出する方法、及び、細胞内の経路、例えばシグナル伝達経路に関連する蛋白を同定する方法において使用できる。本発明は、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物、及び、カチオン性リン脂質を含むカチオン性リポソームを提供し、ここで、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物のカチオン性リン脂質に対するモル比は、約１：１より大きい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物、及び、カチオン性リン脂質を含むカチオン性リポソームであって、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物のカチオン性リン脂質に対するモル比が約１：１より大きい、カチオン性リポソーム。
【請求項２】
前記荷電中性化合物及び化合物の荷電中性混合物が独立してリン脂質、脂質、コレステロール、ステロイド、ｐｅｇ化リン脂質、トコフェロール、ニトロキシド及びこれらの組合せよりなる群から選択される請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記脂質がスフィンゴシン、セラミド、セレブロシド又はこれらの誘導体である請求項２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記リン脂質が（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−ポリオール、（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシド、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドもしくはスフィンゴシンの誘導体、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−ポリオール、（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシドもしくは（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドのホスホノ誘導体又はこれらの組合せである請求項２に記載のリポソーム。
【請求項５】
リン脂質がアシルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、アシルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、アシルホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、アシルホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、アシルホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、アシルホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルイノシトール、アシルホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート、アシルホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート又はスフィンゴミエリンである請求項２に記載のリポソーム。
【請求項６】
リン脂質が下記構造式（Ｉ）：
【化１】
2008535771.tif 000006
［式中、
各Ｒ１は独立して水素、アルキル又はアシルであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ２は水素、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯ２−）ＮＨ３＋、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ、又は、
【化２】
2008535771.tif 000007
であり、
各Ｒ２は独立して水素又は−ＰＯ３Ｈであるが、
ただし、少なくとも１つのＲ１は水素ではなく、そして（Ｃ１０−Ｃ３０）アルキル又は（Ｃ１０−Ｃ３０）アシルである］の化合物又はその塩、溶媒和物又は水和物である請求項２に記載のリポソーム。
【請求項７】
ｎが１であり、そしてＲ２が水素、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯ２−）ＮＨ３＋又は−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨである請求項５に記載のリポソーム。
【請求項８】
ｎが１であり、そしてＲ１がアルキル又はアシルである請求項５に記載のリポソーム。
【請求項９】
ｎが１であり、そして１つのＲ１が水素である請求項５に記載のリポソーム。
【請求項１０】
ｎが１であり、そして第２ヒドロキシルに結合したＲ１基が水素である請求項５に記載のリポソーム。
【請求項１１】
各Ｒ１が同一である請求項５に記載のリポソーム。
【請求項１２】
各Ｒ１が独立してカプリル、ウンデカノイル、ラウロイル、トリデカノイル、ミリストイル、ペンタデカノイル、パルミトイル、フィタノイル、ヘプタデカノイル、ステアロイル、ノナデカノイル、アラキドイル、ヘネイコサノイル、トリコサノイル、リグノセロイル、ミリストレオイル、ミリステライドイル、パルミトレオイル、パルミテライドイル、ペトロセリノイル、オレオイル、エライドイル、リノレオイル、リノレノイル、エイコセノイル、アラキドノイル、エルコイル及びネルボノイルよりなる群から選択される請求項５に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記リン脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである請求項５に記載のリポソーム。
【請求項１４】
前記カチオン性リン脂質が、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシド、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドもしくはスフィンゴシン、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシドもしくは保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドの保護されたホスホノ誘導体、又はこれらの組合せである請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
前記カチオン性リン脂質が、保護されたアシルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、アシルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、アシルホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、アシルホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、アシルホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、アシルホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルイノシトール、アシルホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート、アシルホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート又はスフィンゴミエリンである請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１６】
前記カチオン性リン脂質が下記構造式（ＩＩ）：
【化３】
2008535771.tif 000008
［式中、
各Ｒ１は独立して水素、アルキル又はアシルであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ２は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３であり、そして、
Ｒ４は保護基であるが；
ただし、少なくとも１つのＲ１は水素ではなく、そして（Ｃ１０−Ｃ３０）アルキル又は（Ｃ１０−Ｃ３０）アシルである］の化合物又はその塩、溶媒和物又は水和物である請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１７】
保護基が−Ｒ５、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ５又は−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｒ５であり、ここでＲ５は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである請求項１６に記載のリポソーム。
【請求項１８】
Ｒ５がメチル又はエチルである請求項１７に記載のリポソーム。
【請求項１９】
ｎが１であり、そしてＲ２が−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２０】
ｎが１であり、そしてＲ１がアルキル又はアシルである請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２１】
ｎが１であり、そしてＲ１が水素である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２２】
ｎが１であり、そして第２ヒドロキシルに結合したＲ１基が水素である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２３】
Ｒ１が同一である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２４】
各Ｒ１が独立してカプリル、ウンデカノイル、ラウロイル、トリデカノイル、ミリストイル、ペンタデカノイル、パルミトイル、フィタノイル、ヘプタデカノイル、ステアロイル、ノナデカノイル、アラキドイル、ヘネイコサノイル、トリコサノイル、リグノセロイル、ミリストレオイル、ミリステライドイル、パルミトレオイル、パルミテライドイル、ペトロセリノイル、オレオイル、エライドイル、リノレオイル、リノレノイル、エイコセノイル、アラキドノイル、エルコイル及びネルボノイルよりなる群から選択される請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２５】
ｎが１であり、Ｒ１がアルキル又はアシルであり、そしてＲ２が−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２６】
前記カチオン性リン脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンである請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２７】
前記荷電中性化合物が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンであり、そしてカチオン性リン脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンである請求項１に記載のリポソーム。
【請求項２８】
前記リポソームが１層型である請求項１に記載のリポソーム。
【請求項２９】
直径が約２０ｎｍ〜約２５０ｎｍである請求項２８に記載のリポソーム。
【請求項３０】
診断薬、治療薬又はその組合せ１つ以上を更に含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３１】
前記荷電中性化合物が、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−ポリオール、（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシド、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドもしくはスフィンゴシンの誘導体、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−ポリオール、（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシドもしくは（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドのホスホノ誘導体又はこれらの組合せである請求項３０のリポソーム。
【請求項３２】
前記荷電中性化合物が、アシルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、アシルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、アシルホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、アシルホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、アシルホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、アシルホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルイノシトール、アシルホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート、アシルホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート又はスフィンゴミエリンである請求項３０に記載のリポソーム。
【請求項３３】
前記荷電中性化合物が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである請求項３０に記載のリポソーム。
【請求項３４】
前記カチオン性リン脂質が保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシド、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドもしくはスフィンゴシン、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシドもしくは保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドの保護されたホスホノ誘導体又はこれらの組合せである請求項３０のリポソーム。
【請求項３５】
前記カチオン性リン脂質が保護されたアシルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、アシルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、アシルホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、アシルホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、アシルホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、アシルホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルイノシトール、アシルホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート、アシルホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート又はスフィンゴミエリンである請求項３０に記載のリポソーム。
【請求項３６】
前記カチオン性リン脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンである請求項３０に記載のリポソーム。
【請求項３７】
前記荷電中性化合物が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンであり、そして保護されたリン脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンである請求項３０に記載のリポソーム。
【請求項３８】
細胞を請求項１に記載のカチオン性リポソーム及び薬剤に接触させることを含む細胞に薬剤を送達するための方法。
【請求項３９】
下記成分：
（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、及び、
（ｉｉ）リードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することのできる酵素基質、
を含むリポソームであって、ここで該リポソームは生細胞内に該化合物及び該酵素基質を送達することができるリポソーム。
【請求項４０】
前記化合物が前記標的蛋白の発現を抑制する請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４１】
前記化合物が前記標的蛋白をコードするＤＮＡの転写を抑制することができる請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４２】
前記化合物が前記標的蛋白をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４３】
前記化合物がオリゴヌクレオチドを含む請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物である請求項４３に記載のリポソーム。
【請求項４５】
前記化合物がオリゴヌクレオチド類縁体を含む請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４６】
前記化合物がオリゴヌクレオチド模倣体を含む請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４７】
前記オリゴヌクレオチド模倣体がペプチド核酸である請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４８】
前記化合物が前記標的蛋白の翻訳後改変を抑制することができる請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４９】
前記化合物が前記標的蛋白を抑制することができる請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５０】
前記標的蛋白が酵素である請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５１】
前記酵素基質が、カスパーゼ、蛋白キナーゼ、蛋白ホスファターゼ又はこれらの何れかの組合せから選択される酵素に対する基質である請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５２】
前記酵素基質が、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４又はこれらの何れかの組合せから選択される酵素に対する基質である請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５３】
前記酵素基質が、蛋白キナーゼＡ（ＰＫＡ）、蛋白キナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロトオンコジーンチロシン蛋白キナーゼ（Ｓｒｃ）、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、Ｒａｓ又はこれらの何れかの組合せから選択される酵素に対する基質である請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５４】
前記検出可能なシグナルが光である請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５５】
前記検出可能なシグナルがルミネセントシグナルである請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５６】
前記ルミネセントシグナルが発色原、蛍光、りん光、ケミルミネセント又はバイオルミネセントのシグナルである請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項５７】
前記リードアウト蛋白が前記標的蛋白である請求項３９〜５３の何れか１項に記載のリポソーム。
【請求項５８】
前記リードアウト蛋白の活性が前記標的蛋白に正又は負のカップリングを起こす請求項３９〜５３の何れか１項に記載のリポソーム。
【請求項５９】
前記リードアウト蛋白が蛋白：蛋白相互作用を介して標的蛋白に正又は負のカップリングを起こす請求項５８に記載のリポソーム。
【請求項６０】
前記リードアウト蛋白がシグナル伝達カスケードを介して前記標的蛋白に正又は負のカップリングを起こす請求項５９に記載のリポソーム。
【請求項６１】
カチオン性である請求項３９〜５３の何れか１項に記載のリポソーム。
【請求項６２】
生体分解性である請求項６１に記載のリポソーム。
【請求項６３】
１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−アルキルホスホコリンを含む請求項６１に記載のリポソーム。
【請求項６４】
下記式：
【化４】
2008535771.tif 000009
［式中、
Ｒ１は炭素原子６〜３０個を有する飽和又は不飽和のアルキルであり；
Ｒ２は炭素原子６〜３０個を有する飽和又は不飽和のアルキルであり；
Ｒ３は炭素原子１〜２０個を有する飽和又は不飽和のアルキルである］を有する１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−アルキルホスホコリンを含む請求項２３に記載のリポソーム。
【請求項６５】
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む請求項６１に記載のリポソーム。
【請求項６６】
約１：２のモル比で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む請求項６１に記載のリポソーム。
【請求項６７】
１：２のモル比で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む請求項６１に記載のリポソーム。
【請求項６８】
生細胞中の標的蛋白の発現の抑制を検出する方法であって、下記工程：
該細胞を（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、（ｉｉ）リードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含むリポソームに接触させること、ここで該リポソームは該細胞に該化合物及び該酵素基質を送達することができるものであること；及び、
検出可能なシグナルが生成したかどうか検出すること、ここで検出可能なシグナルの変化は該細胞内の該標的蛋白の発現の抑制を示すものであること；
を含む方法。
【請求項６９】
検出された前記検出可能なシグナルの量が対照と比較される請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記対照が、前記酵素基質を含むが前記化合物は含まないリポソームに生細胞を接触させることにより発生する検出可能なシグナルの量である請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
生細胞中の目的のシグナル伝達経路に関連する標的蛋白を同定する方法であって、下記工程：
該細胞を（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、（ｉｉ）リードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含むリポソームに接触させること、ここで該リポソームは該細胞に該化合物及び該酵素基質を送達することができるものであること；及び、
該シグナル伝達経路のアゴニストに該細胞を接触させること；及び、
検出可能なシグナルが生成したかどうか検出すること、ここで検出可能なシグナルの変化は該標的蛋白が目的の該シグナル伝達経路に関連することを示すものであること；
を含む方法。
【請求項７２】
検出された前記検出可能なシグナルの量が対照と比較される請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記対照が、前記酵素基質を含むが前記化合物は含まないリポソームに生細胞を接触させることにより発生する検出可能なシグナルの量である請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記検出が、蛍光計、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡、プレートリーダー、ＦＭＡＴ８２００又は単分子検出器を用いることによるものである、請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記化合物は前記標的蛋白の発現を抑制する請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記化合物が前記標的蛋白をコードするＤＮＡの転写を抑制することができる請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記化合物が前記標的蛋白をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記化合物がオリゴヌクレオチドを含む請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記化合物がオリゴヌクレオチド類縁体を含む請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記化合物がオリゴヌクレオチド模倣体を含む請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記オリゴヌクレオチド模倣体がペプチド核酸である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記化合物が前記標的蛋白の翻訳後改変を抑制することができる請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記化合物が前記標的蛋白を抑制することができる請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記標的蛋白が酵素である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記酵素基質が、カスパーゼ、蛋白キナーゼ、蛋白ホスファターゼ又はこれらの何れかの組合せから選択される酵素に対する基質である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記酵素基質が、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４又はこれらの何れかの組合せから選択される酵素に対する基質である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記酵素基質が、ｃＡＭＰ依存性（ＰＫＡ）、蛋白キナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロトオンコジーンチロシン蛋白キナーゼ（Ｓｒｃ）、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、Ｒａｓ又はこれらの何れかの組合せから選択される酵素に対する基質である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記検出可能なシグナルが光である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記検出可能なシグナルがルミネセントシグナルである請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ルミネセントシグナルが発色原、蛍光、りん光、ケミルミネセント又はバイオルミネセントのシグナルである請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記リードアウト蛋白が前記標的蛋白である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記リードアウト蛋白の活性が前記標的蛋白に正又は負のカップリングを起こす請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記リードアウト蛋白が蛋白：蛋白相互作用を介して前記標的蛋白に正又は負のカップリングを起こす請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記リードアウト蛋白がシグナル伝達カスケードを介して前記標的蛋白に正又は負のカップリングを起こす請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記リポソームがカチオン性である請求項６８〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記リポソームが生体分解性である請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記リポソームが１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−アルキルホスホコリンを含む請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記リポソームが下記式：
【化５】
2008535771.tif 000010
［式中、
Ｒ１は炭素原子６〜３０個を有する飽和又は不飽和のアルキルであり；
Ｒ２は炭素原子６〜３０個を有する飽和又は不飽和のアルキルであり；
Ｒ３は炭素原子１〜２０個を有する飽和又は不飽和のアルキルである］を有する１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−アルキルホスホコリンを含む請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
前記リポソームが１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記リポソームが約１：２のモル比で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む請求項９６に記載の方法。
【請求項１０２】
前記リポソームが１：２のモル比で１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞中の標的蛋白の発現の抑制を検出する場合に使用するためのキットであって、下記要素：
標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物及びリードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含むカチオン性リポソームを形成することができる脂質；及び、
生細胞内に前記化合物及び前記酵素基質を送達することができるリポソームを形成するための説明書、
を含むキット。
【請求項１０４】
細胞に薬剤を送達する場合に使用するためのキットであって、該キットが下記要素：
荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物及びカチオン性リン脂質；及び、
細胞に薬剤を送達するカチオン性リポソームを形成するための説明書、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．  関連出願の引用）
本出願は、出願番号第６０／６３６，４１４号（２００４年１２月１４日出願）および同第６０／６３６，４１４号（２００４年１２月１４日出願）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権を主張する。これら両出願の内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（２．  背景）
現在細胞に薬剤を送達する方法は低張性ショック、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム系トランスフェクション、感染性物質及びリポソームを包含する。リポソームは薬剤の実質的に如何なる型も含有するか複合体形成してよい等数の水性介在空間により分離されたリン脂質二層１つ以上の小胞である。従って、リポソームは特に治療薬、診断薬及び分析薬のためのインビトロ及びインビボの送達系として有用である。多くのリポソーム組成物が当該分野で知られているが、毒性及び非効率的な薬剤送達のような多大な問題がなお存在している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、生細胞における標的蛋白の迅速な測定のための薬剤を包含する細胞に種々の薬剤を効率的に送達できる低毒性の新しいリポソーム組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（３．  要旨）
これら及び他の本発明の特徴を以下に記載する。
【０００５】
一部の実施形態においては、カチオン性リポソームが提供される。リポソームは荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物のカチオン性リン脂質に対するモル比が約１：１超である、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物、及び、カチオン性リン脂質を含むことができる。
【０００６】
一部の実施形態においては、細胞に薬剤を送達する方法が提供される。細胞は薬剤１つ以上と複合体形成するかこれをカプセル化するカチオン性リポソームと接触させることができる。カチオン性リポソームは、薬剤と共に、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物のカチオン性リン脂質に対するモル比が約１：１超である、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物、及び、カチオン性リン脂質を含むことができる。
【０００７】
一部の実施形態においては、リポソームは、（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、及び（ｉｉ）酵素基質を含むことができ、ここでリポソームは生細胞内に化合物及び酵素基質を送達することができる。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白の見かけの活性を制御することができる。一部の実施形態においては、酵素基質はリードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる。
【０００８】
一部の実施形態においては、本明細書に開示した方法は生細胞中の標的蛋白の発現の抑制を検出することを含む。一部の実施形態においては、方法は、細胞を（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、（ｉｉ）リードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含むリポソームに接触させることを含む。一部の実施形態においては、方法は、細胞内の該標的蛋白の発現の抑制を示すシグナルの変化を検出することを包含する。一部の実施形態においては、本明細書に開示した方法は、生細胞内の酵素又はシグナル伝達経路のような経路に関連するものとして標的蛋白を同定することを含む。一部の実施形態においては、方法は、細胞を（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、（ｉｉ）リードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含むリポソームに接触させること、細胞を経路のアゴニストに接触させること、及び、検出可能なシグナルが生成したかどうか検出することを含む。検出可能なシグナルの変化は標的蛋白がシグナル伝達経路に関連しているここと示す。
【０００９】
更に提供されるものは、細胞に薬剤を送達する場合に使用するためのキットである。一部の実施形態においては、キットは荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物及びカチオン性リン脂質、及び、細胞に薬剤を送達するカチオン性リポソームを形成するための説明書を含む。
【００１０】
更に提供されるものは、標的蛋白の見かけの活性を検出する場合に使用するためのキットである。一部の実施形態においては、キットは細胞内で標的蛋白の発現の抑制を検出するために使用することができ、カチオン性リポソームを形成することができる脂質、標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物及び酵素により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（５．  発明の詳細な説明）
上記した要約及び以下に記載する種々の実施形態の説明は共に、例示及び説明のみであり、本説明を限定するものではないことが理解されるべきである。本出願において、特段の記載が無い限り、単数形の使用は複数も包含するものとする。更に又、特段の記載が無い限り、「又は」とは「及び／又は」を意味する。同様に、「含む」、「含んでいる」、「包含する」及び「包含している」とは限定を意図しない。本開示に関する場合、「送達」という用語は、インビボ又はインビトロにおける細胞内への薬剤の導入を指す。
【００１２】
５．１  定義
本明細書においては、以下の用語は以下に記載する意味を有することを意図する。
【００１３】
「アルカニル」とはそれ自体、又は別の置換基の部分として、親アルカンの単一の炭素原子から水素原子１個を除去することにより誘導される飽和の分枝鎖、直鎖又は環状のアルキルを意味する。典型的なアルカニル基は限定しないが、メタニル；エタニル；プロパニル類、例えばプロパン−１−イル、プロパン−２−イル（イソプロピル）、シクロプロパン−１−イル等；ブタニル類、例えばブタン−１−イル、ブタン−２−イル（ｓ−ブチル）、２−メチル−プロパン−１−イル（イソブチル）、２−メチル−プロパン−２−イル（ｔ−ブチル）、シクロブタン−１−イル等を包含する。
【００１４】
「アルケニル」とはそれ自体、又は別の置換基の部分として、親アルカンの単一の炭素原子から水素原子１個を除去することにより誘導される、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和の分枝鎖、直鎖又は環状のアルキルを意味する。基は二重結合に関してシス又はトランスの配置の何れかであってよい。典型的なアルケニル基は限定しないが、エテニル；プロペニル類、例えば、プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル、プロパ−２−エン−２−イル、シクロプロパ−１−エン−１−イル、シクロプロパ−２−エン−１−イル；ブテニル類、例えば、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロパ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル等を包含する。
【００１５】
「アルキニル」とはそれ自体、又は別の置換基の部分として、親アルカンの単一の炭素原子から水素原子１個を除去することにより誘導される、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和の分枝鎖、直鎖又は環状のアルキルを意味する。典型的なアルキニル基は限定しないが、エチニル；プロピニル類、例えば、プロパ−１−イン−１−イル、プロパ−２−イン−１−イル等；ブチニル類、例えば、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イル等を包含する。
【００１６】
「アシル」とは基−Ｃ（Ｏ）Ｒを指し、ここでＲは水素又は本明細書に定義するアルキルである。限定しない代表例はホルミル、アセチル等である。
【００１７】
「塩」とは親化合物の所望の活性を保有している本明細書に記載する化合物の塩である。このような塩は（１）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等と共に形成した；又は、有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイヒ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸等と共に形成した酸付加塩；又は（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、又はアルミニウムイオンに置き換えられるか；又は、有機塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン等と配位した場合に形成される塩を包含する。
【００１８】
５．２  カチオン性リポソーム
本開示は細胞に種々の薬剤（例えば治療薬、診断薬等）を送達することができるカチオン性リポソームを提供する。カチオン性リポソームは荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物、及び、カチオン性リン脂質を含む。一部の実施形態においては、リポソームはリポソームの他の型と比較して低毒性のものであることができる。
【００１９】
一部の実施形態においては、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物のモル比はカチオン性リポソームより高値となることができる。一部の実施形態においては、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物のカチオン性リポソームに対するモル比は約１：１より高値〜約１０：１となることができる。即ち、種々の例示される実施形態において、荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物のカチオン性リポソームに対するモル比は約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１又は約１０：１未満であることができる。
【００２０】
化合物の荷電中性混合物は、約ゼロである実質電荷を有するアニオン性、カチオン性又は中性の化合物の何れかの混合物であることができる。個々の化合物の比は、混合物が全体として約ゼロである実質電荷を有する限り、重要ではない。
【００２１】
広範な種類の荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物を使用して本明細書に記載するカチオン性リポソームを形成してよい。荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物は、限定しないが、脂質、リン脂質、ｐｅｇ化リン脂質、コレステロール、ステロイド、トコフェロール、ニトロキシド及びこれらの組合せを包含する。
【００２２】
一般的に、リン脂質は両親媒性である。一部の実施形態においては、両親媒性リン脂質は疎水性脂肪酸テール部２つ及び親水性ヘッド部を有する。親水性ヘッド部はグリセロール骨格、ホスフェート及び極性部分を包含できる。一部のリン脂質、例えばホスホチジルコリンはカチオン性の極性部分（＋１）及び負荷電のホスフェート（−１）の両方を有しており、合計実質電荷はゼロである。ホスフェート基の負電荷をマスキングすることにより、カチオン性リン脂質が得られる。
【００２３】
一部の実施形態においては、リン脂質は（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−（モノヒドロキシアルコール）、例えば、ジアシルグリセロリン脂質、アルキ（ケニ）ルアシルグリセロリン脂質、ジアルキ（ケニ）ルアシルグリセロリン脂質、モノアシルグリセロリン脂質及びモノアルキルグリセロリン脂質であることができる。ジアシルグリセロリン脂質は例えば１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンのような、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートのホスホジエステル誘導体である。アルキ（ケニ）ルアシルグリセロリン脂質又はジアルキ（ケニ）ルアシルグリセロリン脂質はアルキル又はアルケニル鎖１つ又は２つを含み、例えば１−ヘキサデシル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−（１’−グリセロアルキル）−２−アシル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミンである。モノアシルグリセロリン脂質又はモノアルキルグリセロリン脂質は例えば２−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを包含する。
【００２４】
一部の実施形態においては、リン脂質は（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−ポリオールである。適当な例は限定しないが、例えば、それぞれホスファチジルグリセロール及びホスファチジルイノシトールのような、グリセロ及びＤ−ミオ−イノシトールの１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ誘導体を包含する。この型のリン脂質は、例えば限定しないが、多重ポリオール部分、例えば、ジアシルホスファチジルグリセロール（１−（１’２’−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３’−ホスホ）−ｓｎ−グリセロール）、カルジオリポン（１，３−ビス（１’２’−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３’−ホスホ）−グリセロール、リソビスホスファチジン酸、（１−（３’−アシル−ｓｎ−グリセロ−１’−ホスホ）−３−アシル−ｓｎ−グリセロール、ホスファチジルイノシトール及び（１−（１’２’−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３’−ホスホ）−Ｌ−ミオイノシトールを包含する。
【００２５】
一部の実施形態においてはリン脂質は（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシドであることができる。リン脂質は例えばホスホ、グリセロホスホ、又はモノ又はジラジルグリセロホスホ残基を担持するグリセロ糖脂質であってよい。例示されるホスホ糖脂質は限定しないが、グリセロホスホモノグルコシルリン脂質、グリセロホスホジグルコシルリン脂質、３’−Ｏ−グルコサミニル−ホスファチジルグリセロール及びジマンノソール−イノシトールリン脂質を包含する。
【００２６】
一部の実施形態においては、リン脂質は（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドであることができる。このようなリン脂質は本明細書に記載するホスファチジルグリセロール及びホスファチジルイノシトールのグリコシル化誘導体であることができる。リン脂質は例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、アミノグルコース、Ｎ−アセチルアミノグルコース；及びＮ−アセチルアミノガラクトース等のようなよく知られたグリコシル基デグリコシル化してよい。
【００２７】
一部の実施形態においては、リン脂質はスフィンゴシン含有リン脂質であることができる。スフィンゴシン含有リン脂質は例えばスフィンゴミエリン（即ちセラミドのホスホコリン誘導体）及びフィト糖脂質（即ちイノシトールホスホセラミドのグリコシル化誘導体）を包含する。
【００２８】
種々の例示される実施形態において、リン脂質は、本明細書に記載するもののような、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、（モノ／ジ）ラジル−グリセロホスホ−ポリオール、（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシド、（モノ／ジ）ラジル−グリセロホスホグリコシド又はこれらの組合せのホスホノ誘導体であることができる。
【００２９】
種々の例示される実施形態において、リン脂質は、アシルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、アシルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、アシルホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、アシルホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、アシルホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、アシルホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルイノシトール、アシルホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート、アシルホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート又はスフィンゴミエリン又はこれらの組合せであることができる。
【００３０】
一部の実施形態においては、リン脂質は下記構造式（Ｉ）：
【００３１】
【化６】
2008535771.tif 000002
［式中、
各Ｒ１は独立して水素、アルキル又はアシルであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ２は水素、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯ２−）ＮＨ３＋、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ、又は
【００３２】
【化７】
2008535771.tif 000003
であり、そして、
各Ｒ２は独立して水素又は−ＰＯ３Ｈであるが、ただし、少なくとも１つのＲ１は水素ではなく、そして（Ｃ１０−Ｃ３０）アルキル又は（Ｃ１０−Ｃ３０）アシルである］の化合物又はその塩、溶媒和物又は水和物である。
【００３３】
一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ２は水素、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯ２−）ＮＨ３＋又は−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨである。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ１はアルキル又はアシルである。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ１は水素である。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そして第２ヒドロキシルに結合したＲ１基は水素である。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ１は水素又はアシルである。一部の実施形態においては、各Ｒ１は同一である。一部の実施形態においては、各Ｒ１は独立してカプリル、ウンデカノイル、ラウロイル、トリデカノイル、ミリストイル、ペンタデカノイル、パルミトイル、フィタノイル、ヘプタデカノイル、ステアロイル、ノナデカノイル、アラキドイル、ヘネイコサノイル、トリコサノイル、リグノセロイル、ミリストレオイル、ミリステライドイル、パルミトレオイル、パルミテライドイル、ペトロセリノイル、オレオイル、エライドイル、リノレオイル、リノレノイル、エイコセノイル、アラキドノイル、エルコイル及びネルボノイルである。一部の実施形態においては、リン脂質は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンであることができる。
【００３４】
一部の実施形態においては、カチオン性リン脂質はホスフェート基の負荷電の酸素に結合した保護基を含むことができる。保護基とは、当業者の知る通り、分子内の官能基（例えばホスフェート酸素の負荷電の酸素）に結合すれば官能基の反応性をマスキングする原子団を指す。保護基の例は、例えばＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，（Ｗｉｌｅｙ，２ｎｄ  ｅｄ．１９９１）およびＨａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”，  Ｖｏｌｓ．１−８（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．１９７１−１９９６）に記載されている。例示されるホスフェート保護基は限定しないが、ホスフェート酸素がアシル化又はアルキル化されたもの、例えばアセチル、ベンジル、トリチルエーテル、アルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル、アリルエーテル等である。一部の実施形態においては、ホスフェート保護基はエチル、アセトキシメチル又はＳ−アシル−２−チオエチルであることができる。
【００３５】
一部の実施形態においては、保護されたカチオン性リン脂質は本明細書に記載する条件を包含する条件下（例えばバイオアッセイ条件、生理学的条件等）において生体不安定性であることができる。一般的に、生体不安定性の保護されたリン脂質は脱保護される（即ちそのホスフェート保護基を失う）と荷電されたホスフェート基を与える。
【００３６】
種々の例示される実施形態においては、カチオン性リン脂質は保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシド、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシド、スフィンゴシン、（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホ−モノヒドロキシアルコール、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセログリコシド、保護された（モノ／ジ）ラジルグリセロホスホグリコシドの保護されたホスホノ誘導体又はこれらの組合せであることができる。
【００３７】
種々の例示される実施形態において、カチオン性リン脂質は保護されたアシルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、アシルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、アシルホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、アシルホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、アシルホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、アシルホスファチジルイノシトール、リソホスファチジルイノシトール、アシルホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート、リソホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート、アシルホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェート又はスフィンゴミエリンであることができる。
【００３８】
一部の実施形態においては、カチオン性リン脂質は下記構造式（ＩＩ）：
【００３９】
【化８】
2008535771.tif 000004
［式中、
各Ｒ１は独立して水素、アルキル又はアシルであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ２は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３であり、そして、
Ｒ４は保護基であるが；
ただし、少なくとも１つのＲ１は水素ではなく、そして（Ｃ１０−Ｃ３０）アルキル又は（Ｃ１０−Ｃ３０）アシルである］の化合物又はその塩、溶媒和物又は水和物である。
【００４０】
一部の実施形態においては、Ｒ４は−Ｒ５、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｒ５又は−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｒ５であり、ここでＲ５は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ２は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３である。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ２は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３である。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ１は水素又はアシルである。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ１はアルキル又はアシルである。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そしてＲ１が水素である。一部の実施形態においては、ｎは１であり、そして第２ヒドロキシルに結合したＲ１基は水素である。一部の実施形態においては、ｎは１であり、Ｒ１はアルキル又はアシルであり、そしてＲ２は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３である。一部の実施形態においては、カチオン性リン脂質は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンである。一部の実施形態においては、両方のＲ１が同一である。一部の実施形態においては、各Ｒ１は独立してカプリル、ウンデカノイル、ラウロイル、トリデカノイル、ミリストイル、ペンタデカノイル、パルミトイル、フィタノイル、ヘプタデカノイル、ステアロイル、ノナデカノイル、アラキドイル、ヘネイコサノイル、トリコサノイル、リグノセロイル、ミリストレオイル、ミリステライドイル、パルミトレオイル、パルミテライドイル、ペトロセリノイル、オレオイル、エライドイル、リノレオイル、リノレノイル、エイコセノイル、アラキドノイル、エルコイル及びネルボノイルである。
【００４１】
一部の実施形態においては、カチオン性リポソームは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンを含む。一部の実施形態においては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンのモル比は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンのモル比より高値である。一部の実施形態においては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンに対するモル比は約１：１超〜約１０：１の範囲である。種々の例示される実施形態において、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンに対するモル比は約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１又は約１０：１未満であることができる。
【００４２】
一部の実施形態においては、リポソームは生体分解性である。
【００４３】
一部の実施形態においては、リポソームはカチオン性であることができ、そして、下記式（ＩＩＩ）：
【００４４】
【化９】
2008535771.tif 000005
［式中、
Ｒ１は炭素原子６〜３０個を有する飽和又は不飽和のアルキルであり；
Ｒ２は炭素原子６〜３０個を有する飽和又は不飽和のアルキルであり；
Ｒ３は炭素原子１〜２０個を有する飽和又は不飽和のアルキルである］を有する１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−アルキルホスホコリンを包含する。
【００４５】
一部の実施形態においては、リポソームは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンを包含できる。一部の実施形態においては、リポソームは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの両方を包含できる。一部の実施形態においては、リポソームはこれら２種のリン脂質を約１：１０〜約１０：１の範囲のモル比で包含できる。一部の実施形態においては、モル比は約１：２である。リポソームは又本明細書に記載した他の脂質又は成分を包含してよい。
【００４６】
本明細書に記載した化合物はキラル中心及び／又は二重結合１つ以上を含有してよく、従って立体異性体、例えば二重結合異性体（即ち幾何異性体）、エナンチオマー又はジアステレオマーとして存在してよい。従って、本明細書に記載する化学構造は立体異性的に純粋な形態（例えば幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋又はジアステレオマー的に純粋）及びエナンチオマー及び立体異性体の混合物を包含する、開示化合物の全ての可能なエナンチオマー及び立体異性体を包含する。エナンチオマー及び立体異性体の混合物は当該分野で良く知られている分離手法又はキラル合成手法を用いてその成分であるエナンチオマー又は立体異性体に分割することができる。
【００４７】
本明細書に開示する化合物はまたエノール型、ケト型及びそれらの混合物を包含する種々の互変異体において存在してよい。従って、本明細書に記載する化合物は全ての可能な互変異体を包含する。
【００４８】
本明細書に開示する化合物は、種々の未溶媒和及び溶媒和形態、例えば水和形態において、そして、Ｎオキシドとして存在してよい。本明細書に開示する化合物は多重結晶型又は不定形で存在してよい。一般的に、全ての物理的形態が本明細書の意図する使用の為に等価である。
【００４９】
本明細書に開示する化合物は種々の同位体型として存在してよい。本明細書に開示した化合物に取り込んでよい同位体の例は限定しないが２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、１８Ｆ及び３６Ｃｌを包含する。
【００５０】
種々の例示される実施形態において、カチオン性リポソームはコレステロール類、コレステロール誘導体、ステロイド類及びトコール類を包含する。ステロイド類は胆汁酸及びステロール誘導体、例えばコレート、ウルソデオキシコレート、ケノデオキシコレート、タウロケノデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、グリコケノデオキシコレート、グリコウルソデオキシコレート、ステロール類及びステロールエステル又はエーテル類、例えばＰＥＧ−２４コレステロールエーテル（Ｓｏｌｕｌａｎ（登録商標）Ｃ−２４）を包含する。トコール誘導体はトコール構造［２−メチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデシル）クロマン−６−オール］又はトコトリエノール構造［２−メチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデカ−３，７，１１−トリエニル）クロマン−６−オール］による物質の誘導体を包含する。特に、モノ、ジ、トリメチル−トコール、即ち一般的にはトコフェロールとして知られているもの及びその有機酸のエステル、例えば酢酸エステル、ニコチン酸エステル、コハク酸エステル及びポリエチレングリコールスクシネートエステルが包含される。例えば、α−トコフェロールアセテート、α−トコフェロールニコチネート、α−トコフェロールスクシネート、α−トコフェロールポリエチレングリコール（２００〜８０００ＭＷ）スクシネート、α−トコフェロールポリエチレングリコール４００スクシネート、α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート（ビタミンＥ−ＴＰＧＳ、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）が混合ラセミ体ｄｌ−型及び純粋なｄ−及びｌ−エナンチオマーとして包含される。コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイド類及びトコール誘導体のリポソーム中の濃度は例えば約５％モル〜約６０％モルの範囲であることができるが、より高値又は低値の濃度も使用できる。
【００５１】
種々の例示される実施形態において、カチオン性リポソームは飽和及び不飽和の脂質、例えばスフィンゴシン、セラミド、セレブロシド、洗剤、界面活性剤、石鹸及びこれらの組合せを包含できる。脂質は合成脂質化合物、例えばＤ−エリスロ（Ｃ−１８）誘導体、例えばスフィンゴシン、セラミド誘導体及びスフィンガニン；グリコシル化（Ｃ−１８）スフィンゴシン及びＬ−スレオ（Ｃ−１８）誘導体を包含し、これら全てが市販されている（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）。洗剤は例えば限定しないが、α−トコフェロールポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、ＰＳ−８０、コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩、ラウリルジメチルアミンオキシド、臭化セチルトリメチルアンモニウム及びビス（２−エチルヘキシル）スルホスクシネートのナトリウム塩を包含する。
【００５２】
広範な種類の適当な脂質が市販されている（例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ））。適当な脂質の非限定的な例は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１ナトリウム塩）、（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１ナトリウム塩）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物の塩）を包含する。市販の脂質はキット、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＸ−５０（登録商標）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（登録商標）及びＤＯＳＰＥＲ（登録商標）（Ｌａｓｉｃ、遺伝子送達におけるリポソーム、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋｐ．８６）などのキット中において入手できる。
【００５３】
一部の実施形態においては、カチオン性リポソームは特定の細胞、又は細胞の特定の部分、例えば細胞質、核及び／又は他の細胞内小器官に特定の外因性物質を送達するためのターゲティング系として使用できる。例えば細胞表面又は細胞未満のコンパートメントに結合する約１０００ＭＷ未満の有機化合物及び／又は蛋白又はペプチドを本明細書に記載するリポソーム内に含有させることにより送達を限局させてよい。一部の実施形態においては、カチオン性リポソームは特定の細胞表面受容体又は核受容体に対するリガンド又はリガンド様成分を含んでよい。一部の実施形態においては、抗体、ホルモン、炭水化物、成長因子、神経伝達物質又はそのフラグメントのようなリガンド又は核局在化シグナルをカチオン性リポソームに含有させることにより送達を限局させてよい。追加的選択性は、リポソームに特定の分子、例えば所望の受容体又は特定の分子の結合部位にリポソームを「ターゲティング」する機能を有する抗体、レクチン、ペプチド／蛋白、炭水化物、糖蛋白等を取り込むことにより達成できる。
【００５４】
一部の実施形態においては、融合蛋白をカチオン性リポソームに取り込むことにより融合誘発性（ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ）のリポソームを形成できる。融合誘発性リポソームは細胞膜と効率的に融合し、種々の蛋白をリポソームとカップリングすることにより製造できる。例えば融合誘発性リポソームはウィルス、例えばパラミクソウィルス（例えばレスピロウィルス（例えばセンダイウィルス、日本血液凝集ウィルス（ＨＶＪ））（Ｄｚａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１４２１−１１４２５）由来の蛋白１つ以上を含むことができる。
【００５５】
本明細書に開示するカチオン性リポソーム及び他の型のリポソームは種々の方法を用いて製造でき、そして、種々の大きさを有することができ、そして、１つ以上の層を有することができる（例えばＬａｓｉｃ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ．６７−１１２（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ，９：４６７−５０８（１９８０）；欧州特許出願０１７２００７；米国特許４，２２９，３６０；４，２４１，０４６；４，２３５，８７１；５，４５５，１５７；６，２８４，５３８；６，４５８，３８１；及び６，５３４，０１８）。多くの製造方法は、例えば水和のための脂質を製造するような工程、その後の攪拌による水和（例えば押し出し、超音波処理、及び／又はホモゲナイズ）及びリポソームの均質な分布を得るためのサイジングを含むが、何れの適当な製造方法も使用してよい。リポソームの特性はその組成（カチオン性、アニオン性、中性の脂質の物質種）により変動することができるが、組成に関わらず全てのリポソームに対して同じ製造方法を使用できる。一部の実施形態においては、大型多層小胞（ＬＭＶ）、単層小胞、小型（ＳＵＶ）、大型（ＬＵＶ）又は巨大（ＧＵＶ）小胞のような種々の大きさ及び形状のリポソームを製造できる。一部の実施形態においては、適当な製造は不均質な粒径分布を有することができる。或いは、適当な製造は実質的に均一又は狭小な粒径分布を含むことができる。例えば、約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲の直径を有するリポソームを製造できるが、他の大きさも可能である。基質又は他の薬剤をリポソームにカプセル化する一部の実施形態においては、負荷のために逆相法及び超音波処理のような従来の方法を用いることができる（例えばＬａｓｉｃ（１９９７）ｐ．９３及び米国特許４，８８８，２８８記載）。負荷の後、リポソームは場合により透析又はモレキュラーシーブ処理に付すことができる（例えばＱセファロース分離による）。一部の実施形態においては、本明細書に記載する通り、基質はリポソーム製造中にカプセル化してもよい。一部の実施形態においては、基質は溶液中の遊離状態とは逆に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％リポソーム内の形態において提供される。安定性を増強するために、リポソーム調製品は例えば暗所、アルゴン下、そして低温、例えば４℃において保存してよい。
【００５６】
種々の細胞型と共に使用するために本明細書に開示するカチオン性リポソーム及び他の型のリポソームを製造するための成分の選択において、１つ以上の試験を実施することにより細胞がリポソームと接触した後に生存性であることを確認することができる。生存性に関する何れかの従来の試験を使用できる。例えば色素排除法を用いることができる。トリパンブルーは通常は原形質膜を実質的に通過せず、従って生細胞からは実質的に排除される青色染色剤である。損傷を有する原形質膜を有する細胞のみが青色色素を取り込む。染色及び未染色の細胞を標準的な光学顕微鏡を用いて血球計中で係数することができ、そしてパーセント生存性を計算できる。別の例においては、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を同様の態様に置いて使用できる。ＰＩは損傷を受けた膜を実質的に貫通し、ＤＮＡ−ＲＮＡと相互作用して赤色蛍光を発生する付加物を生成する。フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）は非極性、非蛍光のフルオレセイン類縁体であり、これは細胞内に進入すると、ジアセテート基を除去する細胞内エステラーゼの基質として作用し、これによりフルオレセインが生じる。フルオレセインは未損傷の膜を有する細胞内で蓄積し、このため、緑色蛍光は細胞の生存性又は代謝的に活性な細胞のマーカーとなる（Ｂｒｅｅｕｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１６１４−１６１９；Ｗｉｄｈｏｌｍ，１９７２，Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．４７：１８９１９４）。細胞は酵素試験の前、最中又は後のような如何なる時点において生存性を試験することができ、そして生存性の何れかの変化を測定できる。一部の実施形態においてはリポソーム組成物と接触した後の細胞の生存性は、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満低下することができる。
【００５７】
一部の実施形態においては、標準的な増殖試験を使用することにより本明細書に開示するカチオン性リポソーム及び他の型のリポソームの細胞毒性を調べてよい。例示される試験は生細胞のみを検出するテトラゾリウム塩系比色試験である。生存している、代謝活性の細胞は実質的にテトラゾリウム塩を還元して着色したホルマザン化合物をもたらすが、死細胞はもたらさない。この試験は選択されたリポソーム製剤を細胞に投与した後にマイクロプレート中で実施できる。試料ｖｓ対照の比色測定上の変化はスペクトル分析器で容易に測定できる。細胞毒性の因子は細胞集団によるテトラゾリウム塩の分解の速度を低減する。
【００５８】
一部の実施形態においては、細胞の生存性は細胞の形態の観察（例えば標準的な光学顕微鏡を使用）により確認できる。例えば健常なＨｅＬａ細胞は多角形であり、それらが入っている容器の表面に付着するのに対し、損傷を受けた細胞は収縮して丸くなり、脱落して培地中に浮遊する傾向にある。選択されたセットの条件下において多角形の外観を有して接着している細胞の数を毒性の別の尺度として用いることができる。細胞を更に、例えば本明細書に記載した染色方法１つ以上を用いることによるなどして分析することができる。
【００５９】
本明細書に記載したカチオン性リポソームは細胞に送達することができる広範な種類の化合物又は薬剤をカプセル化、及び／又は、複合体化することができる。一部の実施形態においては、カチオン性リポソームは２つ以上の薬剤をカプセル化、及び／又は、複合体化することができる。一部の実施形態においては、カチオン性リポソームは１つより多い薬剤をカプセル化、及び／又は、複合体化することができる。薬剤の非限定的な例は治療薬、診断薬、標的蛋白をサイレンシングすることができる薬剤、及び、検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を包含する。
【００６０】
カチオン性リポソームを用いて送達してよい治療薬は、例えば、以下の治療活性を有する天然及び合成の薬剤、即ち、抗関節炎剤、抗不整脈剤、抗細菌剤、抗コリン作用剤、抗凝固剤、抗利尿剤、解毒剤、抗癲癇剤、抗カビ剤、抗炎症剤、代謝拮抗剤、抗偏頭痛剤、抗新生物剤、抗寄生虫剤、解熱剤、抗発作剤、抗血清剤、抗痙攣剤、鎮痛剤、麻酔剤、β−ブロッカー、生物学的応答モディファイアー、骨代謝調節剤、心臓血管剤、利尿剤、酵素剤、生殖能力増強剤、成長促進剤、止血剤、ホルモン剤、ホルモン抑制剤、高カルシウム血症緩解剤、低カルシウム血症緩解剤、低血糖症緩解剤、高血糖症緩解剤、免疫抑制剤、免疫増強剤、筋弛緩剤、神経伝達剤、副交感神経作用剤、交感神経作用性血漿増量剤、血漿増量剤、向精神剤、血栓溶解剤及び血管拡張剤を包含する。
【００６１】
種々の例示される実施形態において、治療薬は細胞毒性剤、アントラサイクリン抗生物質、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン及びイダルビシン及びこれらの類縁体、例えばエピルビジン及びミトキサントロン；白金化合物、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、スピロプラチン、（（−）−（Ｒ）−２−アミノメチルピロリジン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）−白金）（ＳＰ−４−３（Ｒ）−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト（２−）−（２−メチル−１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ’）白金）ナダプラチン（ビスアセタト−アミン−ジクロロシクロヘキシルアミン−白金（ＩＶ）、ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンロイロシン、ビンロジシン、ビノレルビン（ナベルビン）及びビンデシン及びカムプトテシン及びその類縁体、例えばＳＮ−３８（（＋）−（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’；６，７］−インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４−（４Ｈ、１２Ｈ）−ジオン）；９−アミノカンプトテシン；９−ニトロカンプトテシン、トポテカン（ハイカムチン９−ジメチル−アミノメチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）；イリノテカン（ＣＰＴ−１１；７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン）、７−エチルカンプトテシン及びその７−クロロメチル−１０，１１−メチレン−ジオキシ−カンプトテシン；及び他のものを包含する。
【００６２】
種々の例示される実施形態において、治療薬はアンジオテンシン変換酵素阻害剤、例えばアレカプリル、カプトプリル、１−［４−カルボキシ−２−メチル−２Ｒ，４Ｒ−ペンタノイル］−２，３−ジヒドロ−２Ｓ−インドール−２−カルボン酸、エナラプリル酸、リシノプリル、Ｎ−シクロペンチル−Ｎ−［３−［（２，２−ジメチル−１−オキソプロピル）チオ］−２−メチル−１−オキソプロピル］グリシン、ピボプリル、キナプリラット、（２Ｒ，４Ｒ）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（３−メルカプトプロピオニル）−４−チアゾリジンカルボン酸、（Ｓ）ベンズアミド−４−オキソ−６−フェニルヘキセノイル−２−カルボキシピロリジン及びチオプロニン；セファロスポリン抗生物質、例えばセファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファズフロル、セファゾリン、セフブペラゾン、セフィキシム、セフメノキシム、セフメタゾール、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォテファン、セフォチアム、セフォキシチン、セフピミゾールイ、セフピロム、セフポドキシム、セフロキサジン、セフスロジン、セフピラミド、セフタジジム、セフテゾール、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロスポリン、セファノン、セフラジン及びラタモキセフ；ペニシリン類、例えばアモキシシリン、アンピシリン、アパルシリン、アジドシリン、アズロシリン、ベンジルペンシリン、カルベニシリン、カルフェシリン、カリンダシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、エピシリン、フルクロキサシリン、ヘタシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェネチシリン、ピペラジリン、スルベニシリン、テモシリン及びチカルシリン；トロンビン阻害剤、例えばアルガトロバン、メラガトラン及びナプサガトラン；インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、例えばザナミビル及びＢＣＸ−１８１２；非ステロイド抗炎症剤、例えばアカメタシン、アルクロフェナック、アルミノプロフェン、アスピリン（アセチルサリチル酸）、４−ビフェニル酢酸、ブクロキシン酸、カルプロフェン、シンコフェン、シンメタシン、クロメタシン、クロニキシン、ジクレノファク、ジフルニサル、エトドラック、フェンブフェン、フェンクロフェナック、フェンクロシン酸、フェノプロフェン、フェロブフェン、フルフェナミン酸、フルフェニサール、フルルビプロフィン、フルプロフェン、フルチアジン、イブフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ケトロラック、ロナゾラック、ロキソプロフェン、メクロフェナミン酸、メフェナミン酸、２−（８−メチル−１０，１１−ジヒドロ−１１−オキソジベンズ［ｂ，ｆ］オキセピン−２−イル）プロピオン酸、ナプロキセン、ニフルミン酸、Ｏ−（カルバモイルフェノキシ）酢酸、オキソプロジン、ピルプロフェン、プロドール酸、サリチル酸、サリチルサリチル酸、ズリンダック、スプロフェン、チアプロフェン酸、トルフェナミン酸、トルメチン及びゾペミラック；プロスタグランジン類、例えばシプロステン、１６−デオキシ−１６−ヒドロキシ−１６−ビニルプロスタグランジンＥ２、６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２、エポプロストステノール、メテネプロスト、ニレプロスト、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ１、Ｅ１、Ｅ２又はＥ２α及びトロンボキサンＡ２；及びキノロン抗生物質、例えばアクロソキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フルメキン、ナラジキシン酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ピペミジン酸およびピロミジン酸；他の抗生物質、例えばアズトレナム、イミペネム、メロペネム及び関連するカルボペネム抗生物質、アセブタロール、アルブテロール、アルプレノロール、アテノロール、ブノロール、ブプロピオン、ブトパミン、ブトキサミン、カルブテロール、カルテロロール、コルテロール、デテレノール、デキシプロパノロール、ジアセトロール、ドブタミン、エキサプロロール、エキシプレノロール、フェノテロール、フェニリポール、ラボトロール、レボブノロール、メトロール、メタプロテレノール、メトプロロール、ナドロール、パマトロール、ペンブタロール、ピンドロール、ピルブテロール、プラクトロール、プレナルテロール、ピリミドロール、ピリジジロール、プロカテロール、プロパノロール、キンテレノール、リメトロール、リトドリン、ソロトール、ソテレノール、スルフィニオロール、スルフィンテロール、スリクチジル、タザオロール、テルブタリン、チモロール、チプレノロール、チプリジル、トラモロール、チアベンダゾール、アルベンダゾール、アルブトイン、アレンドロネート、アリニジン、アリザプリド、アミロリド、アミノレックス、アプリノシド、カンベンダゾール、シメチジン、シサプリド、クロニジン、シクロベンザドール、デラビルジン、エフェガトリン、エチンチジン、フェンベンダゾール、フェンメタゾール、フルベンダゾール、フルウドレックス、ガバペンチン、イカドロネート、ロベンダゾール、メベンダゾール、メタゾリン、メトクロプラミド、メチルフェニデート、メキシレチン、ネリドロネート、ノコダゾール、オキシフェンダゾール、オキシベンダゾール、オキシメチジン、パミドロネート、パルベンダゾール、プラミペキソール、プラゾシン、プレガバリン、プロカインアミド、ラニチジン、テトラヒドロゾリン、チアメニジン、チナゾリン、チオチジン、トカイニド、トラゾリン、トラマゾリン、キシロメタゾリン、ジメトキシフェネチルアミン、Ｎ−［３（Ｒ）−［２−ピペリジン−４−イル）エチル］−２−ピペリドン−１−イル］アセチル−３（Ｒ）−メチル−β−アラニン、アドレノロン、アレタミン、アミデフリン、アンフェタミン、アスパルテーム、バメタン、ベタヒスチン、カルビドパ、クロルプレナリン、クロルテルミン、ドーパミン、Ｌ−ドパ、エピネフリン、エトリプタミン、フェンフルラミン、メチルドーパミン、ノルエピネフリン、トカイニド、エンビロキシム、ニフェジピン、ニモジピン、トリアムテレン、ピペデミン酸及び同様の化合物、１−エチル−６−フルオロ−１，４−ジヒドロ−４−オキソ−７−（１−ピペラジニル）−１，８−ナフチリジン−３−カルボン酸、１−シクロプロピル−６−フルオロ��１，４−ジヒドロ−４−オキソ−７−（ピペラジニル）−３−キノリンカルボン酸、アリルエステレノール、シンゲストール、デヒドロエピアンドロステロン、ジエノストロール、ジエチルスチルベストロール、ジメチステロン、エチネロン、エチノジオール、エストラジオール、エストロン、エチニルエストラジオール、エチステロン、リネストレノール、メストラノール、メチルテストステロン、ノルエチンドロン、ノルゲストレル、ノルビンステロン、オキソゲストン、キネストロール、テストステロン及びチゲストール；精神安定剤、例えばドフェキサゼパム、ヒドロキシジン、ロラゼパム及びオキサゼパム；神経弛緩剤、例えばアセトフェナジン、カルフェナジン、フルフェナジン、ペルフェニジン及びピペラエタジン；細胞増殖抑制剤、例えばアクラルビシン、シタラビン、デシタビン、ダウノルビシン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、７−ヒドロキシクロロプロマジン、ネララビン、ネプラノシンＡ、ペントスタチン、ポドフィロトキシン、テザシタビン、トロキサシタビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン；ホルモン及びホルモン拮抗剤、例えばブセリリン、ゴナドリベリン、イカチブラント及び酢酸ロイプロレリン；抗ヒスタミン剤、例えばテルフェナジン；鎮痛剤、例えばジフルニサル、ナプロキソール、パラセタモール、サリチルアミド及びサリチル酸；抗生物質、例えばアジドアンフェニコール、アジスロマイシン、カンプトテシン、セファマンドール、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クリンダマイシン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、エリストマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、ラタモキセフ、メトロニダゾール、ネオマイシン、ノボビオシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チアメニコール及びトブラマイシン；抗ウィルス剤、例えばアシクロビル、ｄ４Ｃ、ｄｄＣ、ＤＭＤＣ、Ｆｄ４Ｃ、ＦｄｄＣ、ＦＭＡＵ、ＦＴＣ、２’−フルオロ−アラ−ジデオキシイノシン、ガンシクロビル、ラミブジン、ペンシクロビル、ＳｄｄＣ、スタブジン、５−トリフルオロメチル−２’−デオキシウリジン、ザルシタビン及びジドブジン；ビスホスホネート類、例えばＥＢ−１０５３、エチドロネート、イバンドロネート、オルパドロネート、レシドロネート、ＹＨ−５２９及びゾレンドロネート；プロテアーゼ阻害剤、例えばシプロキレン、エナルキレン、リトナビル、サキナビル及びテルラキレン；プロスタグランジン類、例えばアルバプロスチル、カルボプロスト、ミソプロスチル及びプロスタシジン；抗欝剤、例えば８−ヒドロキシクロルイミプラミン及び２−ヒドロキシイミプラミン；抗緊張亢進剤、例えばソタロール及びフェノルドパム；抗コリン作用剤、例えばビペリジン、プロサイクリジン及びトリヘキシフェニダール；抗アレルギー剤、例えばクロモリン；糖質コルチコイド類、例えばベタメタゾン、ブデノシド、クロルプレドニソン、クロベタソール、クロベタゾン、コルチコステロン、コルチゾン、コルトデキソン、デキサメタゾン、フルコルトロン、フルドロコルチゾン、フルメタゾン、��ルニソリド、フルプレドニゾロン、フルダンドレノリド、フルランデレノロンアセトニド、ヒドロコルチゾン、メプレドニソン、メチルプレスニゾロン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾール、トリアムシノロン及びトリアムシノロンアセトニド；麻薬アゴニスト及び拮抗剤、例えばアポモルヒネ、ブプレノルフィン、ブトファノール、コデイン、シクラゾシン、ヒドロモルホン、ケトベミドン、レバロルファン、レボルファノール、メタゾシン、モルヒネ、ナルブフィン、ナルメファン、ナロキソン、ナロルフィン、ナルトレキソン、オキシコドン、オキシモルホン及びペンタゾシン；刺激剤、例えばアスマジンドール及びシュードエフェドリン；麻酔薬、例えばヒドロキシジオン及びプロポフォール；β−受容体ブロッカー、例えばアセブトロール、アルブテロール、アルプレノロール、アテノロール、ベタゾロール、ブシンドロール、カルテロロール、セリプロロール、セタモロール、ラベタロール、レボブネロール、メトプロロール、メチプラノロール、ナドロール、オキシプレノロール、ピンドロール、プロパノロール及びチモロール；α−交感神経様作用剤、例えばアドレナリン、メタラミノール、ミドドリン、ノルフェネフリン、オクタパミン、オキセドリン、オキシロフリン、オキシメタゾリン及びフェニレフリン；β−交感神経様作用剤、例えばバメタン、クレンブテロール、フェノテロール、ヘキソプレナリン、イソプレナリン、イソクスプリン、オルシプレナリン、レプロテロール、サルブタモール及びテルブタリン；気管支拡張剤、例えばカルブテロール、ジフィリン、エトフィリン、フェノテロール、ピルブテロール、リミテロール及びテルブタリン；強心剤、例えばジギトキシン、ドブタミン、エチレフリン及びプレナルテロール；抗真菌剤、例えばアンホテリシンＢ，クロルフェネシン、ニスタチン及びペリミシン；抗凝固剤、例えばアセノクマロール、ジクマロール、フェンプロクモン及びワーファリン；血管拡張剤、例えばバメタン、ジピリマドール、ジプロフィリン、イソクスプリン、ビンカミン及びニコチン酸キサンチノール；抗低コレステロール血症剤、例えばコンパクチン、エプタスタチン、メビノリン及びシンバスタチン；及びその他の薬剤、例えばブロムペリドール（抗精神病剤）、ジスラノール（乾癬）、エルゴタミン（偏頭
痛）、イベルメシン（抗駆虫剤）、メトロニダゾール及びセクニザドール（抗原虫剤）、ナンドロロン（同化作用剤）、プロパフェノン及びキナジン（抗不整脈剤）、ケチアピン（ＣＮＳ）、セロトニン（神経伝達物質）及びシリビン（肝障害）を包含する。
【００６３】
一部の実施形態においては、薬剤は、本明細書に記載した種々のＤＮＡ及びＲＮＡ系の核酸及びそれらのフラグメント及び類縁体から選択される核酸であることができる。種々の状態の治療のための種々の遺伝子が記載されており、目的の特定の遺伝子に対するコーディング配列をＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬのようなＤＮＡ配列データバンクから入手することができる。例えば、ＡＰＣ、ＤＯＣ４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＭＴＳ１、ＲＢ、ｐ５３、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２及びＶＨＬのような腫瘍抑制遺伝子の投与によるウィルス性、悪性及び炎症性の疾患及び状態、例えば嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ＡＩＤＳ及び癌の治療のためのポリヌクレオチドが記載されている。
【００６４】
一部の実施形態においては、薬剤は、本明細書に記載する通り、天然又は合成の核酸、又はその誘導体、一本鎖又は２本鎖のもの、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡベクター、オリゴヌクレオチド又はヌクレオシド、又はＲＮＡ、例えば限定しないがセンス又はアンチセンスのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びリボザイム、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの誘導体であることができる。当然ながら、このようなＤＮＡオリゴヌクレオチドは遺伝子のコーディング領域、３’未翻訳領域又は転写制御配列に相補であってよい。一部の実施形態においては、ＤＮＡオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの生体分解性を増大又は低減するために改変される。一部の実施形態においては、ヌクレオチド間のホスホジエステル連結は別の連結、例えばホスホロチオエート連結又はホスホロアミデート連結で置き換えられてよい。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、通常はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はＲＮＡ前駆体であるその標的に相補な配列よりなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）であってよい。ｍＲＮＡは機能的、又はセンスの方向において遺伝子情報を含有しており、そして、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は意図するｍＲＮＡを不活性化し、そしてその蛋白への翻訳を防止する。このようなアンチセンス分子は、蛋白が特定のＲＮＡから翻訳され、そしてＲＮＡの配列が判明した後は、相補的Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を介して自身に結合するアンチセンス分子を設計することができることを示す生化学的実験に基づいて決定される。このようなアンチセンス分子は典型的には１０〜３０塩基対（ｂｐ）を含む。一部の実施形態においては、薬剤はリボザイム又は触媒性ＲＮＡであることができる。
【００６６】
一部の実施形態においては、薬剤は天然又は合成のペプチド又は蛋白、又はこれらの誘導体であることができる。ペプチド又は蛋白の誘導体は、例えば、非天然アミノ酸及び／又は個々のアミノ酸の間の非天然結合を含む環状ペプチド又はペプチド模倣体であることができる。一部の実施形態においては、薬剤は抗体又は抗体フラグメントであることができ、その例は当該分野で良く知られている。
【００６７】
本明細書に記載するカチオン性リポソームはまた診断薬を送達するために使用できる。診断薬の非限定的な例は、酵素基質、抗体、色素、ルミネセント化合物及びオリゴヌクレオチドを包含する。
【００６８】
種々の例示される実施形態において、薬剤は発色原、蛍光、りん光、ケミルミネセント又はバイオルミネセントのシグナルを生成することができる。ケミルミネセント化合物は限定しないがルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルを包含する。一部の実施形態においては、バイオルミネセントシグナルはルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７１６４）の関与する生化学的反応により生成することができる。
【００６９】
一部の実施形態においては、カチオン性リポソームは色素を包含する。一部の実施形態においては、親油性蛍光色素をリポソームの油相内に非共有結合的に包埋することによりリポソームの一体性を評価するか、又は、膜とのリポソームの融合を検出することができる。親油性色素の例は、限定しないが、６−ドデカノイル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＬＡＵＲＤＡＮ）及び塩化６−ヘキサデカノイル−２（（（２−（トリメチルアンモニウム）エチル）メチル）−アミノ）ナフタレン（ＰＡＴＭＡＮ）（米国特許６，５６９，６３１）を包含する。一部の実施形態においては、膜非透過性蛍光色素をリポソーム内にカプセル化し、融合及び細胞内へのリポソーム内容物の送達を検出するためのトレーサーとして機能させてよい。このようなトレーサーの例は、ローダミン−デキストラン及び蛍光標識イヌリンである（米国特許６，４２３，５４７）。親油性の色素又はトレーサーは本明細書に記載する基質の検出を妨害しないスペクトル特性を有するように選択できる。
【００７０】
一部の実施形態においては、薬剤は酵素基質であることができる。一部の実施形態においては、酵素基質は酵素により改変された場合に検出可能なシグナルを与える。種々の例示される実施形態において、検出可能なシグナルは発色原、蛍光、りん光、ケミルミネセント又はバイオルミネセントのシグナルであることができる。光シグナルの波長は例えば紫外線、可視光から赤外線までの範囲の何れかの検出可能な波長であることができる。光ルミネセンスは、物質が電磁気放射線を吸収した場合に発光するように誘導され得る過程である。蛍光及びりん光は光ルミネセンスの種類である。ケミルミネセンスは、化学反応の為に光の形態で物質からエネルギー放出される過程であり、（蛍光及びりん光の場合のように）励起の為に光源を必要としない。酵素基質は特定の酵素の特異性に基づいて設計し、合成してよい。或いは、基質は市販の、又は既知方法により製造できる化合物の広範な種類から選択してよい。一部の実施形態においては、基質は、少なくとも試験継続中は細胞が代謝的に活性であり続けられるように、細胞に適合したものであることができる。
【００７１】
一部の実施形態においては、基質は脱離基及び指示薬基を有することができる。脱離基は酵素による除去（例えば加水分解を介した）を目的として選択してよい。一部の実施形態においては指示薬基は蛍光発生性及び／又はケミルミネセントの化合物から選択又は誘導してよい。適当な蛍光発生性の指示薬化合物の例はキサンテン化合物、例えばローダミン１１０、ロドール、フルオレセイン及びこれらの種々の置換された誘導体を包含する（米国特許５，８７１，９４６）。一部の実施形態においては、指示薬基は脱離基と結合した場合に第１の状態、そして指示薬基から脱離基が除去された場合に第２の状態を有する能力があるものを選択することができる。第１の状態は第２の状態と検出上は異なっていることが必要であるが、特定の程度の差が必要なわけではない。一部の実施形態においては、第１の状態においては指示薬はそれが第２の状態にある場合よりも低蛍光であることができる。一部の実施形態においては、指示薬は第１及び第２の状態の両方において蛍光性であることができるが、酵素活性を検出するために発光波長１つ以上がモニタリングできるように第２の状態の発光プロファイルとは異なる第１の状態の発光プロファイルを有する。一部の実施形態においては、指示薬基は可視光範囲の波長において、例えば約４５０〜５００ｎｍの波長において励起することができる。一部の実施形態においては、指示薬基は約４８０〜約６２０ｎｍ、約５００〜約６００ｎｍ又は約５００〜約５５０ｎｍの範囲において発光する。多くの細胞型の自己蛍光は約５００ｎｍ未満において最も著明であり、そしてこの波長を超えて発光する指示薬を一部の実施形態において使用することによりこの潜在的妨害を最小限にしてよい。一部の実施形態においては、基質は第１の状態において近接することができるドナー及びアクセプター（即ち指示薬基）よりなる色素対を含むことができる。酵素反応の間、指示薬の蛍光が第２の状態において低下するようにドナーを脱離することができる。色素対は、第１の波長において光を吸収し、そして相応に励起エネルギーを発するドナー色素、及び、ドナー色素により発せられた励起エネルギーを吸収し、そして相応に第２の波長において蛍光を発することができるアクセプター色素を含むことができる。広範な種類の色素対を使用できる（米国特許５，８００，９９６、５，８６３，７２７、５，９４５，５２６、６，１３０，０７３及び６，３９９，３９２）。一部の実施形態においてはドナー色素はキサンテンクラスの色素のメンバーであってよく、そしてアクセプター色素はキサンテン、シアニン、フタロシアニン又はクアラインクラスの色素のメンバーであってよい。一部の実施形態においては、アクセプターは約６００ｎｍより大きいか、又は、ドナー色素の吸収最大よりも少なくとも約１００ｎｍ大きい発光を有する。種々の例示される実施形態において、色素対のメンバーはそれらが当該分野で知られた種々のタイプのエネルギー転移を起こすことができるように基質内に位置づけることができる。一部の実施形態においては、基質は第１の状態において近接することができるアクセプター及びクエンチャーよりなる色素対を含むことができる。酵素反応の結果としてクエンチャーがもはやアクセプターの蛍光を吸収できなくなることにより第２の状態においてアクセプターの蛍光が増大するようにできる。
【００７２】
脱離基は本明細書に記載する種々の細胞内酵素の多くを試験するために使用できる。非限定的な例において、脱離基はアミノ酸、ペプチド、糖類、スルフェート、ホスフェート、エステル、ホスフェートエステル、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ピリミジン、プリン、ヌクレオシド、脂質及びこれらの混合物から選択できる。一部の実施形態においては、１つより多い脱離基を指示薬基に結合するかその逆であることができる。例えばペプチド脱離基及び脂質脱離基を別個にシグナル生成化合物、例えばローダミン１０に結合することができる。他の適当な脱離基は実験的に求めるか、又は当該分野より入手することができる（Ｍｅｎｔｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４７７−４８０；Ｓｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１８２１−１８２６；ＦｅｒｒｅｒＬｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１９：２３１−２３９；及びＲｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：１８０７−１８１２）。
【００７３】
一部の実施形態においては、指示薬基として１，２−ジオキセタンを含むルミネセント基質（米国特許６，６６０，５２９；６，５８６，１９６；６，５１４，７１７；６，３５５，４４１；６，２８７，７６７；及び再発行３６，５３６に記載のもの等）を本明細書に記載する通り使用できる。これらの化合物の多くが商標ＧＡＬＡＣＴＯ−ＬＩＧＨＴ（登録商標）、ＧＡＬＡＣＴＯ−ＬＩＧＨＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＧＡＬＡＣＴＯ−ＳＴＡＲ（登録商標）、ＧＵＳ−ＬＩＧＨＴ（登録商標）、ＰＨＯＳＰＨＡ−ＬＩＧＨＴ（登録商標）及びＤＵＡＬ−ＬＩＧＨＴ（登録商標）の下に市販されている（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。他の適当な基質はアダマンチン−ジオキセタン類、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）及び３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１，３，７］デカン］−４−イル）フェニル−β−ｄ−ガラクトピラノシド（ＡＭＰＧＤ）を包含し、これらはそれぞれ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼの基質である（例えばＶａｎ  Ｄｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．ｐａｇｅｓ３−２９，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）。これらの化合物は商標ＧＡＬＡＣＴＯＮ（登録商標）、ＧＬＵＣＯＮ（登録商標）、ＧＬＵＣＵＲＯＮ（登録商標）及びＣＳＰＤ（登録商標）の下に市販されている。
【００７４】
一部の実施形態においては、酵素基質はβ−ガラクトシジル置換蛍光発生性化合物、β−ガラクトシジル置換フルオレセイン又はこれらの置換誘導体であることができる。他の例は、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトシド、２−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び５−（ペンタフルオロベンゾイルアミノ）フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを包含する。
【００７５】
一部の実施形態においては、基質は９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）β−Ｄ−ガラクトピラノシドであることができる。一部の実施形態においては、基質はフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（カタログ番号Ｆ−１１７９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）であることができる。一部の実施形態においては、基質は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）であることができる。
【００７６】
一部の実施形態においては基質はβ−ラクタマーゼ基質であることができる。このような基質の例は、蛍光ドナー部分及びアクセプターを有するもの（例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）色素対）、例えば米国特許５，９５５，６０４及び６，０３１，０９４に記載のものを包含する。ドナーとクエンチャーの間の蛍光エネルギー転移はβ−ラクタマーゼ活性の指示薬としてモニタリングできる。自身の細胞膜透過性を増強する連結基（例えばアセチル、ブチリル及びアセトキシメチル）１つ以上を包含し、そして基質が細胞内に進入した後に内因性のエステラーゼにより連結基が加水分解されるβ−ラクタマーゼ基質が報告されている（Ｋｌｏｋａｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：８４−８８；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５：１１１４６−１１１４７；及び国際公開ＷＯ９６／３０５４０）。一部の実施形態においては、本発明の方法はこのような基質を利用する。他の実施形態においては、このような基質であるがこれらの連結基を欠いているものを使用する。
【００７７】
β−ラクタマーゼ多基質は、限定しないが、５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、８−オキソ−３−［３−［（２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イル）オキシ］−１−プロペニル］−７−［（フェニルアセチル）アミノ］−、（６Ｒ，７Ｒ）−（９ＣＩ，ＣＡ登録番号６０９８１２−８８−６））；５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、８−オキソ−３−［３−［（２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イル）オキシ］−１−プロペニル］−７−［（フェニルアセチル）アミノ］−、５−オキシド、（６Ｒ，７Ｒ）−（９ＣＩ）（ＣＣ２、（ＣＡ登録番号６０９８１２−８９−７））；５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、８−オキソ−３−［（１Ｚ）−３−［（３−オキソ−３Ｈ−フェノキサジン−７−イル）オキシ］−１−プロペニル］−７−［（２−チエニルアセチル）アミノ］−、５−オキシド、（６Ｒ，７Ｒ）−（９ＣＩ）（ＣＡ登録番号４５２２８０−３０−７））；５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、７−［［［［（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）カルボニル］アミノ］アセチル］アミノ］−３−［［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）−、９’−［９Ｈ］キサンテン］−５−イル）チオ］メチル］−８−オキソ、（６Ｒ，７Ｒ）−（９ＣＩ）（ＣＣＦ２、（ＣＡ登録番号１８７３７３６−５２−９））；５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、８−オキソ−３−［３−［（３−オキソ−３Ｈ−フェノキサジン−７−イル）オキシ］−１−プロペニル］−７−［（２−チエニルアセチル）アミノ］−、（アセチルオキシ）メチルエステル、５−オキシド、（６Ｒ，７Ｒ）−（９ＣＩ）（ＣＲ２／ＡＭ、（ＣＡ登録番号４５２２８０−３１−８））；５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、７−［［［［［（７−［（アセチルオキシ）メトキシ］−６−クロロ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）カルボニル］アミノ］アセチル］アミノ］−３−［［［（３’，６’−ビス（アセチルオキシ）−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−５−イル］チオ］メチル］−８−オキソ、（アセチルオキシ）メチルエステル、（６Ｒ，７Ｒ）−（９ＣＩ）（ＣＣＦ２／ＡＭ、（ＣＡ登録番号１８３７３６６−６６−５））、及び／又はこれらの混合物を包含する。
【００７８】
一部の実施形態においては、基質はルシフェラーゼ酵素の基質であることができる。例はバーグリンルシフェリン（カタログ番号ＮＦ−ＣＶ−ＨＢＲ、Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，ＡＺ）、セレンテラジン（カタログ番号ＮＦ−ＣＴＺ−ＦＢ、Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，ＡＺ；及び、カタログ番号Ｅ２８１０及びパート番号ＴＭ０５５、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ホタルルシフェリン（Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）チアゾリン−４−カルボン酸（入手元Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ及びＮａｎｏｌｉｇｈｔ）、コイルシフェリン（カタログ番号ＮＦ−ＣＶ−ＨＢＲ，  Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、細菌ルシフェリン、焔色植物ルシフェリン及び／又はこれらの混合物を包含する。
【００７９】
一部の実施形態においては基質は種々のチトクロームＰ４５０アイソザイムの基質であることができる。例はルシフェリン６’クロロエチルエーテル（ルシフェリン−ＣＥＥ、カタログ番号Ｖ８７５  １，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ルシフェリン６’メチルエーテル（ルシフェリン−ＭＥ、カタログ番号Ｖ８７７１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄａｉｓｏｎ，ＷＩ）、６’−デオキシルシフェリン（ルシフェリンＨ、カタログ番号Ｖ８７９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ルシフェリン６’ベンジルエーテル（ルシフェリン−ＢＥ、カタログ番号Ｖ８８０１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及び／又はこれらの混合物を包含する。
【００８０】
種々の例示される実施形態において、基質はβ−グルクロニダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼ、チオエステラーゼ及びプロテアーゼの基質であることができる。一部の実施形態においては、酵素は加水分解酵素である。加水分解酵素の非限定的な例は、アルカリ及び酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、Ｐ−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−フルクトフラノシダーゼ、β−グルコシドウロナーゼ及びトリプシンを包含する。酵素の他の例は、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、サッカリダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソースアミニダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ヌクレアーゼ、アリールスルファターゼ、ホスホリパーゼ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４、ルシフェラーゼ及びホスファターゼを包含する。酵素の特定の例は大腸菌β−グルコシダーゼ、大腸菌ＴＭＥ−１β−ラクタマーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ウリカーゼ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌型（ＳＥＡＰ）、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、蛋白キナーゼＡ（ＰＫＡ）、蛋白キナーゼ（ＰＫＣ）アイソザイム（例えばＰＫＣα、ＰＫＣβ及びＰＫＣγ）、脂肪酸シンターゼ、システインプロテアーゼ及びホスホリパーゼＡ２を包含する。
【００８１】
種々の例示される実施形態において、基質はホスホリラーゼキナーゼ（Ｐｈｋ）サイクリン依存性キナーゼ−２（ｃｄｋ２）、ＥＲＫ及び細胞外調節キナーゼ−２（ＥＲＫ−２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性蛋白キナーゼＩ（ＣＡＭＫＩ）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫＩＩ）、ラウス肉腫ウィルス形質転換剤の細胞内型（ｃ−ＳＲＣ）、Ｆｕｊｉｎａｍｉ肉腫ウィルスの形質転換剤（ｖ−ＦＰｓ）、Ｃ−末端Ｓｒｃキナーゼ（Ｃｓｋ）、インスリン受容体キナーゼ（ＩｎＲＫ）、ＥＧＦ受容体、Ｓｒｃキナーゼ（ＳＲＣ）、ＲＡＣ−ベータセリン／スレオニン蛋白キナーゼ（Ａｋｔ）、細胞外シグナル調節キナーゼ−１（ＭＡＰキナーゼ１）（Ｅｒｋ１）、ＭＡＰキナーゼ活性化蛋白キナーゼ２（ＭＡＰＫＡＰ）、ＭＥＫ、ＪＮＫ、Ｒａｓ、セリン／スレオニン蛋白キナーゼＮｅｋ２、チロシンキナーゼＡｂ１、プロトオンコジーンチロシン蛋白キナーゼＹＥＳ及びＬＣＫ、チロシン蛋白キナーゼＬＹＮ及びＢＴＫ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＫ３）、カゼインキナーゼＩ及びカゼインキナーゼＩＩの基質であることができる。
酵素のための酵素基質の非限定的な例は、以下のもの、即ち、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ  １Ｅ）；基質３，４−ベンゾクマリン−７−Ｏ−スルフェートのような基質を用いて試験されるエストロンスルファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．６．２．）（Ｂｉｌｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：９６７−９６９）；Ｎ−ダンシル−ＧＣＶＬＳのような基質を用いて検出できるファルネシル：蛋白トランスフェラーゼ（Ｐｏｍｐｌｉａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：７９４５−７９４６）；Ｎａｐ−ＣＭＰ−ＮＡＮＡのようなグリコシルドナー又はＬａｃＮＡｃ−Ｄａｎのようなグリコシルアクセプターを利用できるシアリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．９９．１）（Ｗａｓｈｉｙａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３：３９−４８）；ＭＡＬのような基質を用いて検出できるヒストンデアセチラーゼ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ９６６０）；Ｚ−ＩＥＴＤ−Ｒ１１０のような基質を用いてモニタリングできるカスパーゼ８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ａ−２２１２５）；及びエトキシレゾルフィンのような基質を酸化する選択されたチトクロームＰ４５０アイソザイム（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＣＹＴＯ−１Ａ）を包含する。その他の限定しない酵素の例は、蛋白キナーゼ、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ、炭水化物スルホトランスフェラーゼ、チロシル蛋白スルホトランスフェラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＣＯＸ−１、２、ジヒドロフォレートレダクターゼ、アロマターゼ，アルコールデヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アデニリルサイクラーゼ、イノシトールホスホセラミド（ＩＰＣ）シンターゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ラノステロール１４α−デメチラーゼ、２型脂肪酸シンターゼ、チミジレートシンターゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ，ホスホイノシチド３キナーゼ、１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ，トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、スクアレンシンターゼ、パルマトイルトランスフェラーゼ、ミリストイルトランスフェラーゼを包含する。
【００８２】
一部の実施形態においては酵素のホスホリル化活性をモニタリングできる。例えば、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）依存性蛋白キナーゼＡ（ＰＫＡ）基質−蛋白のコンセンサスアミノ酸配列（ＲＲＸＳＬ）を含有する蛍光標識オリゴペプチド（ＤＡＣＭ−ＣＬＲＲＡＳＬＫ−フルオレセイン）（Ｏｈｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎａｌｙｓｔ  １２５：１９０５−１９０７；  Ｏｈｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．（ｓｕｐｐ．）１７：ｉｌ４６５−ｉｌ４６７）を本発明の方法において基質として使用してよい。基質中のセリン残基のホスホリル化は蛍光強度の変化をもたらす。他の適当な基質は蛍光標識ＰＫＣ基質のライブラリのメンバー１つ以上（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７：１１５２７−１１５３２）及びキナーゼセンシングモチーフを含有するＰＫＣ及びＰＫＡに対する蛍光ペプチド基質（Ｓｈｕｌｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１４２４８−１４２４９）を包含する。適当なペプチド基質の非限定的な例はＳｈｕｌｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１４２４８−１４２４９に記載されているものを包含する。
【００８３】
一部の実施形態においては、診断薬は少なくとも実質的に細胞膜透過性ではないか、又は、侵襲性の送達方法、例えば低張性ショック、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等を必要とする。一部の実施形態においては、診断薬はフルオレセインジガラクトシド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｆ１１７９）；ＤＤＡＯホスフェート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｄ−６４８７）；Ｆｌｕｏ−３  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｆ−１２４０）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ａ１２３７９）；デキストラン又は  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｄ−２２９１０）であることができる。薬剤Ｆｌｕｏ−３（Ｆ−１２４０）はこれを細胞膜透過性とする生体分解性のＡＭ保護基（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号：Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ，Ｆ−１２４１）を用いて製造することができるが、ＡＭは細胞内で酵素的に分解されるものである。本明細書に記載するカチオン性リポソームは化学的誘導体化を行うことなくＦｌｕｏ−３の送達を可能にする。
【００８４】
一部の実施形態においては、化合物又は薬剤は標的蛋白の発現又は活性に影響するか、これを変更（例えば増大又は低減）することができる。従って、種々の例示される実施形態において、薬剤は蛋白の転写、翻訳、翻訳後改変、及び／又は、活性を変更するかこれに影響することができる。種々の例示される実施形態において、化合物は標的蛋白をサイレンシングすることができる。
【００８５】
種々の例示される実施形態において、化合物／薬剤は標的蛋白をサイレンシングすることができる。「標的蛋白をサイレンシングする」とは、本明細書においては、転写、翻訳、翻訳後改変のレベルにおける標的蛋白、及び／又は、蛋白自体の抑制を指す。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白をコードするＤＮＡの転写を抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物はｍＲＮＡプロセシングを抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白の翻訳後プロセシングを抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物は１つ以上の標的蛋白の活性又は機能又は代謝を抑制することができる。「見かけの活性」とは本明細書においては、種々の方法、例えば、限定しないが、本明細書に記載の通り、蛋白の転写、翻訳又は翻訳後プロセシングを変更することにより細胞内環境にある場合のような標的蛋白の濃度を変更すること又はこれに影響することの結果として測定されることができる標的蛋白の活性を指す。
【００８６】
種々の例示される実施形態において、化合物はオリゴヌクレオチドを含む。例えばオリゴヌクレオチドは、生成する標的蛋白の量を究極的にモジュレートする標的蛋白をコードする核酸分子の機能をモジュレートすることができる。これは標的蛋白をコードする核酸１つ以上に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成できる。本明細書においては、「標的核酸」及び「標的蛋白をコードする核酸」という用語は標的蛋白をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（前ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む）及びそのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを包含する。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能をそれに特異的にハイブリダイズする化合物によりモジュレートすることは、一般的に、「アンチセンス」と称される。即ち、一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物であることができる。
【００８７】
抑制することができるＤＮＡの機能は複製及び転写を包含する。妨害されるＲＮＡの機能は全ての生存機能、例えば蛋白翻訳部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからの蛋白の翻訳、ＲＮＡのスプライシングによるｍＲＮＡ種１つ以上の生成、及び、ＲＮＡが担うか促進する場合のある触媒活性を包含できる。標的核酸機能のこのような妨害の全体的作用は標的蛋白の発現を低減する場合がある。
【００８８】
オリゴヌクレオチド化合物の組成はサイレンシングすべき標的蛋白の選択により異なる。その過程は通常は目的の標的蛋白を選択すること、及び、機能をモジュレートすべきその核酸配列の同定から始まる。これは例えば発現が特定の障害又は疾患状態に関連している細胞遺伝子（又は遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）又は感染性物質に由来する核酸分子であってよい。ターゲティングの過程はまた所望の作用、例えば蛋白の発現の検出又はモジュレーションが生じるようにアンチセンス相互作用が起こるためのその遺伝子内の部位の決定を包含する。種々の例示される実施形態において、遺伝子内部位はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始又は終止コドン及び遺伝子のＯＲＦを包含する領域を含む。当該分野で知られる通り、翻訳開始コドンは典型的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；相当するＤＮＡ分子の場合は５’−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは又「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。遺伝子の少数はＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧはインビボで機能することがわかっている。即ち、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」という用語は多くのコドン配列を包含できるが、各場合の開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核生物の場合）又はホルミルメチオニン（原核生物の場合）である。真核生物及び原核生物の遺伝子は２つ以上の代替の開始コドンを有する場合があることが当該分野で知られており、その何れの１つも特定の細胞型又は組織において、又は、特定のセットの条件の下で、翻訳開始の為に優先的に利用してよい。本明細書の開示に関する場合、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」とは、そのようなコドンの配列に関わらず、標的蛋白をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにインビボで使用されるコドンを指す。
【００８９】
更に又、遺伝子の翻訳終止コドン（又は「終止コドン」）は３つの配列、即ち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡ（相当するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡである）の１つを有することが当該分野で知られている。「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」という用語は翻訳開始コドンから何れかの方向（即ち５’又は３’）に約２５〜約５０連続ヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を指す。同様に、「終止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」という用語は翻訳終止コドンから何れかの方向（即ち５’又は３’）に約２５〜約５０連続ヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を指す。
【００９０】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を指すものとして当該分野で知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コーディング領域」はまた、有効にターゲティングされる領域である。他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’の方向のｍＲＮＡの部分を指すものとして当該分野で知られており、従ってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンの間のヌクレオチド又は遺伝子上の相当するヌクレオチドを含む５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）、及び、翻訳終止コドンから３’の方向のｍＲＮＡの部分を指すものとして当該分野で知られており、従ってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端との間のヌクレオチド又は遺伝子上の相当するヌクレオチドを含む３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）を包含する。ｍＲＮＡの５’キャップは５’−５’トリホスフェート連結を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結したＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は５’キャップ構造自身並びにキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含すると考えられる。５’キャップ領域は又好ましい標的領域であってよい。
【００９１】
一部の真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは翻訳される前に転写物から切り出される「イントロン」として知られている領域１つ以上を含有する。残存する（そして従って翻訳される）領域は「エクソン」として知られており、そして共にスプライシングされて連続ｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライシング部位、即ちイントロン−エクソン接合部も又標的領域としてよく、そして、異常なスプライシングが疾患に関与するとされる、又は、特定のｍＲＮＡスプライシング産物の過剰生産が疾患に関与するとされる状況において、有用である。再構成又は欠失による異常な融合接合物をターゲティングすることができる。更に又、イントロンは、例えばＤＮＡ又は前ｍＲＮＡにターゲティングされるアンチセンス化合物のための効果的な標的領域となりえることもわかっている。
【００９２】
標的部位１つ以上が同定された後、標的に対して十分相補的な、即ち、十分良好に、そして十分な特異性でハイブリダイズして所望の作用をもたらすオリゴヌクレオチドを選択できる。
【００９３】
本明細書の開示に関する場合、「ハイブリダイゼーション」とは、相補ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基の間の、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であってよい、水素結合を意味する。例えば、アデニン及びチミンは相補核酸塩基であり、水素結合の形成を介して対形成する。「相補」とは本明細書においては、２ヌクレオチド間の厳密な対形成のための能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチド及びＤＮＡ又はＲＮＡはその位置において相互に相補であるとみなされる。オリゴヌクレオチド及びＤＮＡ又はＲＮＡは各分子の相当する位置の十分な数量が相互に水素結合できるヌクレオチドにより占有されている場合に相互に相補となる。即ち、「特異的にハイブリダイズできる」及び「相補である」とはオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間に安定で特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性又は厳密な対形成を指すために使用する用語である。当該分野で知られる通り、アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズできるべきその標的核酸のものと１００％相補である必要はない。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子への化合物の結合が標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常な機能を妨害して有用性を消失させ、そして、特異的結合が望まれる条件下において非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が有る場合に、特異的にハイブリダイズできるものとされる。
【００９４】
本明細書の開示に関する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のオリゴマー又は重合体、オリゴヌクレオチド類縁体、及びオリゴヌクレオチド模倣体を指す。オリゴヌクレオチドは天然に存在する核酸塩基、糖及び共有結合ヌクレオシド間（骨格）連結物並びに同様に機能する天然に存在しない部分を包含する。このような改変又は置換されたオリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性、及び、ヌクレアーゼの存在下の増大した安定性のため、ネイティブの形態よりも好ましい場合が多い。
【００９５】
一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは約８〜約３０核酸塩基を含むことができる。一部の実施形態においては約８〜約３０核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド（即ち約８〜約３０連結ヌクレオシド）となる。一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは標的蛋白の発現を抑制する化合物の配列の少なくとも８核酸塩基部分を含む。当該分野で知られる通り、ヌクレオシドは塩基−糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環塩基である。このような複素環塩基の２つの最も一般的なクラスはプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドはヌクレオシドの糖部分に共有結合したホスフェート基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するこれらのヌクレオシドに関しては、ホスフェート基は糖の２’、３’又は５’ヒドロキシ部分の何れかに連結できる。オリゴヌクレオチドを形成する場合に、ホスフェート基は隣接するヌクレオシドを共有結合的に連結させ直鎖重合体化合物を形成する。次にこの直鎖重合体構造のそれぞれの末端が更に連結して環状構造を形成するが、一部の実施形態においては開環型の直鎖構造を使用できる。オリゴヌクレオチド構造内において、ホスフェート基は一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものとみなされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の連結又は骨格は３’から５’へのホスホジエステル連結である。
【００９６】
一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは改変された骨格又は天然に存在しないヌクレオシド間連結を含む。本明細書において定義する通り、改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドは骨格内にリン原子を保持しているもの、及び、骨格内にリン原子を有さないものを包含する。本明細書の目的のため、及び、場合により当該分野で参考にされる通り、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない改変されたオリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドとみなすことができる。
【００９７】
一部の実施形態においては、アンチセンス化合物は改変されたオリゴヌクレオチド骨格、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び、通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類縁体、及び、ヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’、又は２’−５’から５’−２’に連結している反転した極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩及び遊離の酸の形態も包含される。
【００９８】
一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドはリン原子を包含しない改変されたオリゴヌクレオチド骨格を含むが、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、又は、１つ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間連結により形成された骨格を有する。これらはモルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部が形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２要素部分を有する他のものを包含する。
【００９９】
種々の例示される実施形態において、化合物はオリゴヌクレオチド模倣体であることができる。一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチド模倣体は、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結、即ち骨格の両方が新しい基で置き換えられることができる。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションの為に維持される。一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチド模倣体はペプチド核酸（ＰＮＡ）であることができる。ＰＮＡにおいては、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミノエチルグリシン骨格のようなアミド含有骨格で置き換えられる。ＰＮＡとＤＮＡとは、後者の負荷電のリボース−ホスフェート骨格はその天然のペプチド対応部分、例えばグリシンで置き換えられている点において異なっている。核酸塩基は保持され骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の製造を教示している代表的な米国特許は、限定しないが例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；及び５，７１９，２６２を包含する。
【０１００】
種々の実施形態において、化合物は標的蛋白の翻訳後改変を抑制することにより標的蛋白をサイレンシングすることができる。例えば、一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白のホスホリル化及び／又は脱ホスホリル化を抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白のグリコシル化を抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白のプレニル化を抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白のミリストイル化を抑制することができる。一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白の３次構造折畳に影響することができる。
【０１０１】
種々の実施形態において、化合物はＣａ２＋、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、イノシトール１，４，５−トリスホスフェート（ＩＰ３）、蛋白：蛋白相互作用により、又は、シグナル伝達カスケードを介して、標的蛋白の見かけの活性を制御できる。例えば、標的蛋白は蛋白：蛋白相互作用により活性化又は脱活性化できる。蛋白相手が脱活性化しつつあり、そして化合物が蛋白相手を支援する場合は、標的蛋白の見かけの活性は増大することになる。逆に、蛋白相手が活性化しつつあり、そして化合物が蛋白相手を支援する場合は、標的蛋白の見かけの活性は低下することになる。
【０１０２】
標的蛋白が酵素であるような一部の実施形態においては、化合物は標的蛋白の活性を制御することができる。一部の実施形態においては、化合物は酵素阻害剤のようなモジュレーターにより標的蛋白を直接阻害することにより標的蛋白をサイレンシングすることができる。
【０１０３】
上記した通り、標的蛋白は目的の何れかの蛋白であることができる。一部の実施形態においては、標的蛋白は酵素であることができる。標的蛋白の非限定的な例は、ＡＴＰａｓｅ、アダプター分子、アデニレートサイクラーゼ、接着分子、アルカリホスファターゼ、アミノペプチダーゼ、アンカー蛋白、Ｂ細胞抗原受容体、ＣＤ抗原、カルシウム結合蛋白、細胞周期制御蛋白、細胞結合蛋白、細胞表面受容体、シャペロン、シャペロニン、ケモカイン、凝固因子、補体蛋白、補体受容体、システインプロテアーゼ、サイトカイン、サイトカイン受容体、細胞骨格関連蛋白、細胞骨格蛋白、ＤＮＡ結合蛋白、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復蛋白、デフェンシン、デオキシリボヌクレアーゼ、二重特異性キナーゼ、二重特異性ホスファターゼ、酸ホスファターゼ、アシルトランスフェラーゼ、アデノシルトランスフェラーゼ、アルドラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、アミノメチルトランスフェラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、カルバモイルトランスフェラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、カルボキシラーゼ、カタラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、シクロトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、デアミナーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドラターゼ、デヒロドゲナーゼ、デホスホリラーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコサミニルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルタミルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、グアニルサイクラーゼ、ヒドラターゼ、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、メチラミントランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ムターゼ、ＮＡＤａｓｅ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシゲナーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、パーオキシダーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、ラセマーゼ、レダクターゼ、リボシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、糖ホスホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、スルホヒドロラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、サバイビン、合成酵素、トポイソメラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスアミナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、トランスロカーゼ、細胞外リガンドゲートチャンネル、細胞外マトリックス蛋白、Ｇ蛋白、Ｇ蛋白カップリング受容体、ＧＴＰａｓｅ、ＧＴＰａｓｅ活性化蛋白、成長因子、グアニンヌクレオチド交換因子、グアニレートサイクラーゼ、熱ショック蛋白、免疫グロブリン、組み込み膜蛋白、細胞間チャンネル、細胞内リガンドゲートチャンネル、内向整流チャンネル、イオンチャンネル、脂質キナーゼ、脂質ホスファターゼ、ＭＨＣ複合体蛋白、膜結合リガンド、膜輸送蛋白、メタロプロテアーゼ、運動蛋白、ノイラミニダーゼ、核受容体、ペプチドホルモン、プロテアーゼ阻害剤、プロテアーゼ、ＲＮＡ結合蛋白、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体チロシンキナーゼ、受容体チロシンホスファターゼ、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ、リボヌクレオ蛋白、リボソームサブユニット、分泌ポリペプチド、セリンプロテアーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、セリン／スレオニンホスファターゼ、保存蛋白、構造蛋白、Ｔ細胞抗原受容体、転写因子、転写調節蛋白、翻訳調節蛋白、輸送／カーゴ蛋白、チロシンキナーゼ、チロシンホスファターゼ、ユビキノンプロテアソーム系蛋白、電圧ゲートチャンネル蛋白及び水チャンネル蛋白を包含する。
【０１０４】
一部の実施形態においては、標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物を含む本明細書に記載したカチオン性リポソームのようなリポソームは更に、検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含む。広範な種類の酵素基質を使用してよく、その例は限定しないが、本明細書に記載する酵素により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を包含する。一部の実施形態においては、酵素基質はリードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる。一部の実施形態においては、リードアウト蛋白は標的蛋白であることができる。例えば、図３は標的蛋白ＴＰにより改変された場合に検出可能なシグナルＰ１を生成することができる酵素基質ＥＳ１を示す。一部の実施形態においては、リードアウト蛋白は標的蛋白の「下流」、例えばシグナル伝達カスケードにあることができる。例えば、図３はリードアウト蛋白である蛋白Ｃにより改変された場合に検出可能なシグナルＰ２を生成することができる酵素基質ＥＳ２、及び、リードアウト蛋白である蛋白Ｄにより改変された場合に検出可能なシグナルＰ３を生成することができる酵素基質ＥＳ３を示している。
【０１０５】
リードアウト蛋白の活性は標的蛋白に正又は負のカップリングを起こすことができる。一部の実施形態においては、リードアウト蛋白は蛋白：蛋白相互作用を介して標的蛋白にカップリングできる。一部の実施形態においては、リードアウト蛋白はシグナル伝達カスケードを介して標的蛋白にカップリングできる。
【０１０６】
酵素基質は特定の酵素の特異性に基づいて設計し、合成することができる。或いは、酵素基質は、市販されているか既知の手法により製造できる広範な種類の基質から選択できる。一部の実施形態においては、酵素基質は少なくとも試験継続中は細胞が代謝的に活性であり続けられるように、細胞に適合したものであることができる。
【０１０７】
５．３方法
本発明の開示はまたカチオン性リポソームを用いて細胞に化合物又は薬剤１つ以上を送達する方法に関する。細胞は本明細書に記載するもののような化合物又は薬剤をカプセル化又は複合体化するカチオン性リポソームに接触させることができる。一部の実施形態においては、リポソームは少なくとも２種以上の化合物を含有できる。一部の実施形態においては、リポソームは（ｉ）標的蛋白をサイレンシングできる化合物、及び、（ｉｉ）酵素基質を含むことができる。図１Ａは標的蛋白をサイレンシングできる化合物Ｃ及び酵素基質Ｓを含むリポソームの例示される実施形態を示す。図１Ｂは細胞内に化合物Ｃ及び酵素基質Ｓを送達するリポソームの例示される実施形態を示す。一部の実施形態においては、リポソームは２種以上の酵素基質を含有することができ、ここで基質は２種の識別可能な蛍光シグナルのような識別可能なシグナルを生成することができる（米国特許５，８６３，７２７）。一部の実施形態においては、生細胞中の標的蛋白を検出又は分析するため、及び、標的蛋白が要素である酵素的経路及び／又はシグナル伝達経路１つ以上を調べるための方法が提供される。
【０１０８】
本明細書に記載するリポソームと共に使用してよい細胞の型は真核生物（例えば動物、植物、コウボ、カビ）及び細菌の細胞を包含する。使用できる生細胞は生存生物から単離された新鮮細胞、インビトロで成育又は培養されている細胞、又は凍結又は凍結乾燥調製品から再生された細胞を包含する。細胞壁を有する細胞は細胞壁を除去するために適切な措置を施した後に使用できる（Ｃｏｎｓｔａｂｅｌ，１９８２，“Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”ｐｐ．３８−４８，ＮＲＣＣ  Ｎｏ．１９８７６，Ｎａｔ．Ｒｅｓ．Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，  Ｓａｓｋａｔｏｏｎ）。本明細書に記載したリポソームと共に使用してよい細胞の別の例は、１次又は樹立された細胞系統及び他の型の胚性、新生仔又は成熟動物の細胞、又は形質転換された細胞（例えば自発的又はウィルスによる形質転換）である。これらは限定しないが、線維芽細胞、マクロファージ、筋芽細胞、破骨細胞、破骨細胞、造血細胞、ニューロン、神経膠細胞、１次Ｂ及びＴ細胞、Ｂ及びＴ細胞系統、軟骨細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞及び肝細胞を包含する。
【０１０９】
本明細書に記載するリポソームと共に使用してよい細胞系統は、限定しないが、細胞寄託先、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）、Ｗｏｒｌｄ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ｗｄｃｍ．ｎｉｇ．ａｃｊｐ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ｗｗｗ．ｅｃａｃｃ．ｏｒｇ）及びＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ  （ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｈｓ．ｇｏｊｐ）より入手可能なものを包含する。これらの細胞系統は、限定しないが、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、２９３Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ＣＨＯ、ＣＨＯ−ＡＡ８  Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ＭＣＦ７、ＭＣＦ７  Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ＬＮＣａｐ、Ｔ−５、ＢＳＣ−１、ＢＨＫ−２１、Ｐｈｉｎｘ−Ａ、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ｐｓｉ  Ｂａｇα、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＺＲ  ７５−１、ＨＳ  ５７８−Ｔ、ＤＢＴ、Ｂｏｓ、ＣＶ１、Ｌ−２、ＲＫ１３、ＨＴＴＡ、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ−Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、ＲＡＭＯＳ、ＫＧ−１、Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＳＢ−２、ＨＬ−６０、ＭＤＡＨＢ２３１、Ｃ２Ｃ１２、ＨＴＢ−２６、ＨＴＢ−１２９、ＨＰＩＣ５、ＣＲＬ−１５７３、３Ｔ３Ｌ１、Ｃａｍａ−１、Ｊ７７４Ａ．１、ＨｅＬａ  ２２９、ＰＴ−６７、Ｃｏｓ７、ＯＳＴ７、ＨｅＬａ−Ｓ、ＴＨＰ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＧＨＫ−２１、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７、ＣＯＳ、ＨｅｐＧ２、ＰＣ１２、２９３、Ａ４３１、Ａ４５９、１Ｂ、Ｌ９２９及びＮＸＡ細胞系統を包含する。本明細書に記載したリポソームと共に使用するための別の細胞系統は、例えばＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）のような細胞系統供給元から入手できる。
【０１１０】
一部の実施形態においては、細胞懸濁液又は結合細胞を本明細書に記載した薬剤をカプセル化又は複合体化したカチオン性リポソームの懸濁液と混合する。混合物は薬剤が細胞に侵入するために十分な時間及び生理学的反応条件下に維持する。
【０１１１】
細胞系統及び実験条件と適合性の有る本質的に如何なる培地も本明細書に記載したリポソーム及び方法と共に使用してよい。例えば広範な細胞培養用培地はＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ，ｅｄｓ．）（１９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）に記載されている。細菌及び動物細胞の培養に関わる手法を記載している参考文献はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３（１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２０００）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９４，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びそこに引用されている参考文献；Ｈｕｍａｓｏｎ，Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７９，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６−１０２４を包含する。植物細胞培養に関する情報は、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．によるＰｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）によるＰｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）に記載されており、そして又、市販の参考資料、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）のＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（１９９８）（Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ）及び同じくＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＰｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ及び補遺（１９９７）（Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ）においても入手できる。適当な培地の特定の非限定的な例は従来の細胞培養用の培地を包含する。このような培地は広範に入手でき（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、そしてＥａｒｌｅ平衡塩，Ｈａｎｋｓ平衡塩，Ｔｙｒｏｄｅ塩及びその他の塩混合物を包含する。
【０１１２】
血清を含有する培地は開示したリポソーム及び本明細書に開示した方法と共に使用できる。適当な血清の限定しない例（全て市販品、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、新生仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、血清代替物、胚性液及びウサギ血清を包含する。一部の実施形態においては、約２％〜約１０％（ｖ／ｖ）の範囲、約４％〜約７％の範囲、及び約５％の濃度においてＦＢＳを含む培地を使用できる。
【０１１３】
適当な培地は細胞の生存性を支援し、維持する浸透圧、張力、ｐＨ値及びイオン濃度を有する水性培地を包含できる。例示される培地は、限定しないが、規定度の食塩水、リンゲル液及び市販の細胞培養用培地、例えば最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ及びＥａｇｌｅの培地を包含する。適当な培地の一例は約２０℃〜３７℃の範囲の温度の４％ｖ／ｖウシ胎児血清、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２よりなる緩衝食塩水である。
【０１１４】
本明細書に記載した方法は種々の反応条件下に実施できる。反応条件は細胞に対する有害作用を低減又は最小限とし、細胞とのリポソームの相互作用又は光シグナルの検出を大きく妨害しないように選択できる。一部の実施形態においては、条件は細胞の生存培養を維持するために従来使用されるものと本質的に同様である。反応条件は温度、ｐＨ値、浸透圧、張力等の選択された数値を包含することができる。ｐＨは約６．０〜約８．５であり、そして特定の例においては約６．５〜７．５である。浸透圧は約２００ミリオスモル／Ｌ（ｍＯｓｍ）〜約５００ｍＯｓｍであり、一部の実施形態においては、約２５０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍである。張力は使用される細胞に対して等張に維持できる。酵素活性の検出の間の温度は細胞に適合した何れかの温度に維持してよい。一部の実施形態においては、温度は細胞の膜凍結温度又はその近傍に維持する。一部の実施形態においては、温度は細胞の膜凍結温度より高値とすることができる。種々の例示される実施形態において、温度は約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約３０℃、約３７℃、約４０℃又は約４２℃であることができる。一部の実施形態においては、温度は約１０℃〜約５０℃であることができ、一部の実施形態においては、約２０℃〜約４０℃である。
【０１１５】
１つの特徴において、標的蛋白の見かけの活性を検出する方法を開示する。一部の実施形態においては、方法は標的蛋白をサイレンシングできる化合物及びリードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成できる酵素基質に細胞を接触させることを含み、ここで、検出可能なシグナルの変化は標的蛋白の見かけの活性を示すものである。一部の実施形態においては、方法は、（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、（ｉｉ）リードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含むリポソームに細胞を接触させることを含み、ここで、検出可能なシグナルの変化は標的蛋白の見かけの活性を示すものである。
【０１１６】
別の特徴において、標的蛋白の発現を抑制し、そして生細胞中の抑制を検出及び／又はモニタリングする方法を開示する。一部の実施形態においては、細胞は、標的蛋白をサイレンシングできる化合物及びリードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成できる酵素基質に接触させることができる。一部の実施形態においては、細胞は、標的蛋白をサイレンシングできる化合物及びリードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成できる酵素基質を含むリポソームに接触させることができる。検出可能なシグナルの変化は、細胞における標的蛋白の発現の抑制を示す。一部の実施形態においては、検出可能なシグナルの量を対照と比較することができる。対照は酵素基質に生細胞を接触させることにより生成する検出可能なシグナルの量である。
【０１１７】
別の特徴において、生細胞内の目的のシグナル伝達経路に関連する標的蛋白を同定する方法を開示する。一部の実施形態においては、方法は標的蛋白をサイレンシングできる化合物及びリードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成できる酵素基質に細胞を接触させることを含む。一部の実施形態においては、方法は、（ｉ）標的蛋白をサイレンシングすることができる化合物、（ｉｉ）リードアウト蛋白により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素基質を含むリポソームに細胞を接触させることを含む。細胞はシグナル伝達経路のアゴニストと接触させることができる。検出可能なシグナルの変化は目的のシグナル伝達経路に標的蛋白が関連していることを示す。一部の実施形態においては、検出可能なシグナルは対照と比較することができる。対照は酵素基質に生細胞を接触させることにより生成する検出可能なシグナルの量である。
【０１１８】
広範な種類のシグナル伝達経路及び関連蛋白を検討することができる。シグナル伝達経路及び蛋白の非限定的な例は、蛋白キナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られているＡＫＴシグナリング、セリン／スレオニンキナーゼ、細胞増殖、アポトーシス、血管形成及び糖尿病に関与する幾つかのシグナル伝達経路における酵素；アルツハイマー病のシグナル伝達経路、例えば蛋白β−アミロイド、ｔａｕ蛋白、セクレターゼ、プレセナリン、グリコーゲンシンターゼキナーゼ；脈管形成及び腫瘍血管形成シグナリング経路；アポトーシスシグナリング経路、例えばミトコンドリアアポトーシス及びカスパーゼ媒介アポトーシス；成長ホルモン、熱ショック、ＵＶ照射、浸透圧又はサイトカインに由来する有糸分裂促進物質活性化蛋白（ＭＡＰ）キナーゼ媒介シグナル伝達；ＩＩ型糖尿病に関連する後天性インスリン抵抗性におけるインスリン及びＩＧＦ−１活性化有糸分裂促進性ＭＡＰキナーゼ経路；ＥＲＫ１／ＥＲＫ２ＭＡＰキナーゼシグナリング経路；ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−Ｊｕｎキナーゼ／ストレス活性化蛋白キナーゼ）ＭＡＰキナーゼカスケード；ｐ３８カスケード；真核生物核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）シグナル伝達経路；酸化窒素シグナリング経路；ｐ５３シグナリング；細胞増殖、分化及びアポトーシスに関連するシグナル伝達に関与する蛋白キナーゼＣ（ＰＫＣ）のような蛋白キナーゼの活性化；細胞増殖、分化、代謝、遊走及び生存における蛋白チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）経路；Ｇ蛋白カップリング受容体経路、インスリン経路；ＶＥＧＦ経路；及びユビキチン−プロテオソーム分解経路、及びこれらの何れかの組合せを包含する。種々の経路のアゴニストが当該分野で知られている。
【０１１９】
一部の実施形態においては、標的蛋白の見かけの活性は生細胞において間接的に測定できる。例えば、標的蛋白はサバイビンであることができる。サバイビンはアポトーシス蛋白阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーである。ＩＡＰは種々の細胞蛋白を分解することによりアポトーシスプログラムを実行する活性なカスパーゼ−３及び７を直接阻害すると報告されている。サバイビンはエフェクター細胞死プロテアーゼ（即ちカスパーゼ３及び７）に特異的に結合し、そしてアポトーシス刺激に曝露された細胞におけるカスパーゼ活性及び細胞死を抑制する。即ち、サバイビン発現の抑制は、サバイビンの発現の抑制により自身の活性が誘導されるカスパーゼ３により改変された場合に検出可能なシグナルを生成できるカスパーゼ３に対する酵素基質を用いて検出できる。
【０１２０】
一部の実施形態においては、標的蛋白の見かけの活性は生細胞において間接的に測定できる。一部の実施形態においては、酵素基質はシグナル伝達経路カスケードにおいて標的蛋白の下流の酵素活性により改変された場合に検出可能なシグナルを生成することができる。例えばＧ蛋白カップリング受容体の発現の抑制はＰＫＣにより改変された場合に検出可能なシグナルを生成できるＰＫＣに対する酵素基質を用いて検出できる。
【０１２１】
一部の実施形態においては、化合物及び酵素基質の細胞との接触の後に、細胞内の光の検出可能なシグナル（例えば蛍光又はケミルミネセントシグナル）を測定する。光シグナルの変化（例えば対照細胞と比較した場合の増大又は低減）は酵素活性及び標的蛋白の発現の抑制を示す。光シグナルは接触後の個別の時点１つ以上において検出してよく、或いは、光シグナルは時間の関数として実質的に連続して検出してよい。光シグナルの変化は単一の酵素の活性によるものであってよく、或いは、同じ観察可能な活性を有する数種の異なる酵素の累積的活性によるものであってよい。一部の場合において、特定の酵素を選択的に阻害することが望ましい場合がある。
【０１２２】
一部の実施形態においては、化合物及び酵素基質の細胞との接触の後に、細胞内の光の検出可能なシグナルを測定する。一部の実施形態においては、検出可能なシグナルが存在しないことは、標的蛋白の発現の抑制を示す。一部の実施形態においては、検出可能なシグナルの量の変化は標的蛋白の発現の抑制を測定するための対照細胞と比較することができる。対照は酵素基質は含むが標的蛋白サイレンシング化合物を除いたリポソーム組成物に細胞を接触させることにより発生させた検出可能なシグナルの量であることができる。
【０１２３】
本明細書に記載した方法において、化合物は標的蛋白の見かけの活性を変化させるために適する量で細胞内に転移させることができる。標的蛋白の見かけの活性の変化が検出される限り、いかなる特定の濃度の化合物も必要とされない。化合物の適当な濃度は実験的に決定することができ、そして試験中の蛋白を保有することがわかっている細胞をそのような濃度を選択するための根拠として使用できる。リポソームは化合物の種々の濃度を用いて製造することができ、及び／又は、種々の量のリポソームを使用できる。
【０１２４】
本明細書に記載した方法において、基質は光検出可能なシグナルを発生するために適する量で細胞内に転移することができる。シグナルが検出される限り、いかなる特定の濃度の基質も必要とされない。物質の適当な濃度は実験的に決定することができ、そして試験中の蛋白を保有することがわかっている細胞をそのような濃度を選択するための根拠として使用できる。リポソームは物質の種々の濃度を用いて製造することができ、及び／又は、種々の量のリポソームを使用できる。
【０１２５】
リポソーム調製物を細胞と接触させる場合、細胞中の化合物及び酵素基質の実際の濃度は未知であってよい。例えば、インキュベーションに添加したリポソームの全てが細胞と融合するわけではなく、そしてカプセル化された化合物の不完全な送達があってもよい。一部の実施形態においては、トレーサー、例えば蛍光化合物をリポソームに含有させることができる。トレーサーの水準は、細胞内へのリポソーム内容物の送達を確認するため、及び、細胞内部における化合物及び酵素基質の濃度を推定するための手段として使用できる。一部の実施形態においては、細胞内に保持されているトレーサーの水準は、未送達のトレーサーを除去するための洗浄工程の後に測定することができる。適当なトレーサーの例は蛍光標識されたインスリンである。一部の実施形態においては、化合物及び酵素基質の取り込みはトレーサーの取り込みと比例することが予測される。細胞の容量は従来の手法を用いて測定でき、そして、トレーサーの内部濃度は化合物の内部濃度に相応に推定して同一視することができる。検出を容易にするために、トレーサーは酵素基質又は基質の酵素との反応の結果として生じる基質産物のものと識別可能である標識を有することができる。
【０１２６】
酵素基質に対して作用する酵素により触媒される反応の速度は経時的なシグナルの変化の進行をモニタリングすることにより測定できる。シグナルは、形成された産物の量に比例する場合がある。反応速度は存在する酵素の量に比例する場合があり、これにより反応速度が存在する酵素の量の尺度となる。酵素反応の初期速度は基質濃度及び得られる種々の速度論敵パラメーターの関数として得ることができる。反応の進行をモニタリングして分析することができる（米国特許６，１０８，６０７及びＤｕｇｇｌｅｂｙ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４９：６０）。
【０１２７】
本明細書に記載する方法は広範な種類の細胞に関する検討の為に使用できる。開示した方法、組成物及びキットにおいて利用できる細胞の型は真核生物（例えば動物、植物、コウボ、カビ）及び細菌を包含する。使用できる生細胞は生存生物から単離された新鮮細胞、インビトロで成育又は培養されている細胞、又は凍結又は凍結乾燥調製品から再生された細胞を包含する。細胞壁を有する細胞は細胞壁を除去するために適切な措置を施した後に使用できる（Ｃｏｎｓｔａｂｅｌ，１９８２，“Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”ｐｐ．３８−４８，ＮＲＣＣ  Ｎｏ．１９８７６，Ｎａｔ．Ｒｅｓ．Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，  Ｓａｓｋａｔｏｏｎ）。使用できる細胞の別の例は、１次又は樹立された細胞系統及び他の型の胚性、新生仔又は成熟動物の細胞、又は形質転換された細胞（例えば自発的又はウィルスによる形質転換）である。これらは限定しないが、線維芽細胞、マクロファージ、筋芽細胞、破骨細胞、破骨細胞、造血細胞、ニューロン、神経膠細胞、１次Ｂ及びＴ細胞、Ｂ及びＴ細胞系統、軟骨細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、肝細胞及び本明細書に記載した、又は、当該分野で知られた他の細胞を包含する。
【０１２８】
本明細書に記載した方法において、蛍光シグナルは従来の方法及び機器、例えば蛍光計、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡などを用いて検出できる。一部の実施形態においては、多波長蛍光検出器を利用できる。検出器は１波長において蛍光標識を励起させ、そして多波長において発光を検出するため、又は、多波長で励起させ１発光波長で検出するために使用することができる。或いは、試料は、光（例えばキセノンランプから）の全スペクトルが試料を照射する「ゼロ次」励起を用いて励起させてよい。各標識はその特徴的波長の光において吸収し、次に最大蛍光を発射することができる。多重発光シグナルは独立して検出できる。好ましくは適当な検出器は、商品名ＨＰ１１００（Ｇ１３２１Ａ）（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）の下に市販されているもののような、実質的に同時に１つより多い励起発光波長を検出するようにプログラムすることができる。即ち、蛍光産物は反応中の種々の間隔においてプログラムされた発光波長において検出できる。
【０１２９】
本明細書に記載した方法において、細胞は、標的蛋白の発現を抑制するために十分な時間、及び、光の検出可能なシグナルを発生するために十分な酵素基質のターンオーバーが得られるように、十分な時間インキュベートする。シグナルは種々の方法で観察してよい。例えば、少量を採取し、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー又は顕微鏡又は同様の静的装置における静的細胞蛍光測定の為に使用しておい。この態様において、集団が異質の態様に置いて機能している種々の細胞における種々の水準の蛍光に関して分布が得られる。蛍光細胞の総数は全細胞の一部のみが感染して粒子計数値をもたらす場合に測定される。或いは、又は組合せにおいて、総蛍光を種々の時点において積分することにより、全体的な値が得られ、そして細胞における全蛍光の変化率が求められる。対照を用いてバックグラウンド値を差し引くことにより、蛍光細胞の数の増分及び細胞集団の経時的な細胞当たりの蛍光を測定して目的のファクターに関連付けてよい。或いは、細胞をスライドガラス上に塗布し、蛍光顕微鏡と付随の蛍光計を使用することにより個々の細胞又は細胞群の蛍光の水準を測定してよい（例えば落射蛍光顕微鏡による）。試験における細胞について蛍光を測定する特定の方法は重要ではなく、使用可能な装置、試験の定性的又は定量的な性質等により変動する。細胞ソーティング装置に関する一般的説明は米国特許４，１７２，２２７；４，４３７，９３５；４，６６１，９１３；４，６６７，８３０；５，０９３，２３４；５，０９４，９４０；５，１４４，２２４；及び６，５６６，５０８に記載されている。
【０１３０】
本発明の酵素試験方法において有用な検出システムの例は８２００Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ事業）である。このシステムは細胞内に含有される蛍光団を励起させるためにレーザースキャニングを利用する蛍光微容量試験技術（ＦＭＡＴ）に基づく巨視的共焦点のシステムである。システムはバックグラウンドの蛍光と細胞に会合しているものとの間を識別することができ、そして、多重通信及び自動高スループットの能力を含んでいる。
【０１３１】
ケミルミネセンスは種々の検出器の何れかを用いて検出できる。適当な検出器の非限定的な例は、ルミノメーター（例えばＶｅｒｉｔａｓ．ＴＭ．Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ；ＴＤ−２０／２０  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  Ｃａｌｉｆ．；及びＢＤ  Ｍｏｏｎｌｉｇｈｔ．ＴＭ．３０１０  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ、Ｘ線フィルム又はシンチレーションカウンターを包含する。
【０１３２】
一部の実施形態においては、光シグナルは目視的検査、比色分析、光学顕微鏡、デジタル画像分析、標準的なマイクロプレートリーダー法、ビデオカメラ、写真フィルムにより検出できる。データはパターン認識ソフトウエアを用いることにより判別及び／又は分析できる。
【０１３３】
当業者の知る通り、本明細書に開示したカチオン性リポソームに加えて、本開示の方法は他の型のリポソームと共に実施することができる。化合物１つ以上、例えば、限定しないが、標的蛋白をサイレンシングできる化合物及び酵素基質をカプセル化し、そして、細胞内へのそれらの送達を容易にすることができる本質的に如何なる脂質複合体も本発明の方法、組成物及びキットにおいて使用できる。本質的に如何なるリポソームも、それが少なくとも試験継続中は接触する細胞に対して実質的に非毒性であり、そして試験条件下において細胞内に化合物、薬剤、サイレンシング化合物及び／又は酵素基質を導入することができる限り、方法において使用してよい。リポソームは親水性の基の選択に応じてアニオン性、カチオン性又は中性であってよい。例えば、ホスフェート又はスルフェート基を有する資質をリポソーム製造に用いる場合は、得られるリポソームはアニオン性となる。アミノ含有脂質を使用する場合は、リポソームは正荷電を有し、カチオン性となる。ポリエチレンオキシ又はグリコール基が脂質に存在する場合は、中性のリポソームが得られる。リポソームを形成するために適する別の化合物は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  ＭｃＣｕｔｃｈｅｎ’ｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ”，Ａｌｌｕｒｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｉｃｈｗｏｏｄ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．；  Ｌａｓｉｃ，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ．６７−１１２（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７−５０８  （１９８０）；欧州特許出願０１７２００７；米国特許４，２２９，３６０；４，２４１，０４６；４，２３５，８７１；４，８８８，２８８，５，４５５，１５７；６，２８４，５３８；６，４５８，３８１；及び６，５３４，０１８に記載されている。
【０１３４】
種々のリポソーム調製品は種々の脂質の１つ以上を含むことができ、その限定しない例は、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、レシチン、ホスファチジルセリン、セファリン、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ステロイド、テルペン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性重合体、ラウリル硫酸トリエタノールアミン及びカチオン性脂質、１−アルキル−２−アシル−ホスホグリセリド、及び、１−アルキル−１−エニル−２−アシル−ホスホグリセリドを包含する。一部の実施形態においては、カチオン性脂質はＢａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００１，４４：４１７６−４１８５）に記載のもののようなヘッド基領域に複数のヒドロキシ官能基を有する脂質を包含できる。一部の実施形態においては、塩化Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン及びコレステロール（例えばＳｅｒｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ，２０００，１４６７：４１９−４３０に記載の通りモル比４：３：３において）を含有するカチオン性リポソーム調製品を使用できる。
【０１３５】
リポソームの形成において有用な他の両親媒性物質はカチオン性脂質、例えばＬａｓｉｃ（１９９７），ｐｐ．８１−８６に記載のものを包含する。一部の実施形態においては、本明細書に記載するリポソームの調製において１つ以上の以下のもの、即ち、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド／クロリド（ＤＯＤＡＢ／Ｃ）、ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン及びジオクタデシルアンモニウムブロミドを使用してよい。一部の実施形態においては、本発明において使用するリポソームは２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満のモル％においてステアリルアミンを含有する。一部の実施形態においては、リポソームは本質的にステアリルアミンを含有しない。
【０１３６】
広範な種類の適当な脂質が市販されている（例えばＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．より）。リポソームキットは市販されている（例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＰｒｏＭｅｇａ，及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）より）。適当な脂質の非限定的な例は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１ナトリウム塩）（ＤＭＰＡ．Ｎａ）（Ａｖａｎｔｉカタログ番号８３０８４５）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ．Ｎａ）（Ａｖａｎｔｉカタログ番号８３００３５）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（クロリド塩）（ＤＴＯＡＰ．Ｃｌ）（Ａｖａｎｔｉカタログ番号８９０８９０）を包含する。
【０１３７】
他の市販リポソームキットはＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、  ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＸ−５０（登録商標）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（登録商標）及びＤＯＳＰＥＲ（登録商標）（例えばＬａｓｉｃ，ｐ．８６記載のもの）を包含する。
【０１３８】
リポソームは合成の脂質化合物、例えば又Ｄ−エリスロ（Ｃ１−１８）誘導体、例えばスフィンゴシン、セラミド誘導体、及びスフィンガニン；グリコシル化（Ｃ１８）スフィンゴシン及びリン脂質誘導体；Ｄ−エリスロ（Ｃ１７）誘導体；Ｄ−エリスロ（Ｃ２０）誘導体；及びＬ−スレオ（Ｃ１８）誘導体を包含し、これらは全て市販されている（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）。
【０１３９】
リポソームは特定のホスホリパーゼによる溶解に抵抗性であるリン脂質の天然に存在しない類縁体を包含するか、それらから完全に形成することができる。このような類縁体の一部の実施形態においては、ホスフェート基はホスホネート又はホスフィネート基により置き換えられる（米国特許４，８８８，２８８に記載の通り）。更に又、リン脂質が通常エステル部分（脂肪酸のエステル）を含む場合は、エステル連結をエーテル連結と置き換えることができる。一部の実施形態においては、親油性の蛍光色素をリポソームの脂質相のないに非共有結合的に包埋することにより、リポソームの一体性を評価したり、又は、細胞の外膜とのリポソームの融合を検出したりすることができる。親油性色素の適当な例は本明細書に記載するとおりＬＡＵＲＤＡＮ及びＰＡＴＭＡＮを包含する（米国特許６，５６９，６３１）。一部の実施形態においては、膜不透過性蛍光色素をリポソーム内に基質と共にカプセル化することができ、融合及び細胞内へのリポソーム内容物の送達を検出するためのトレーサーとして機能させることができる。このようなトレーサーの例はローダミン−デキストラン及び蛍光標識されたイヌリンである（米国特許６，４２３，５４７）。親油性色素又はトレーサーは本明細書に記載した基質の検出を妨害しないスペクトル特性を有するように選択できる。
【０１４０】
一部の実施形態においては、本明細書に記載した融合誘発性のリポソームを形成するために融合蛋白をリポソーム内に取り込むことができる。一部の実施形態においてはリポソームはコレステロールを含むことができる。コレステロールは嵩高のホスファチジルコリンヘッド基により形成される領域を占有することにより面積を殆ど変化させること無くホスファチジルコリン二層内に挿入されている。これにより二層の充填密度及び構造安定性が増大する（Ｎｅｗ，Ｒ．Ｒ．Ｃ．，１９９０  Ｉｎ  Ｎｅｗ，Ｒ．Ｒ．Ｃ．（ｅｄ）：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ  １９−２１）。リポソーム内のコレステロールの濃度は例えば約５〜約６０モル％の範囲であることができるが、より高濃度又は低濃度も使用できる。
【０１４１】
脂質混合物の組成はコスト、脂質の遷移温度、保存中の安定性及び反応条件下におけるリポソームの安定性を包含する種々の要因に基づいて選択できる。組成は分析する細胞とのリポソームの適合性に基づいて選択できる。
【０１４２】
一部の実施形態においては、リポソームを形成するための脂質はリン脂質関連物質、例えば、レシチン、リソレシチン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド及びジセチルホスフェートである。追加的な非リン含有脂質は、例えばアセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリル重合体、アルキルアリールスルフェートポリエチルオキシ化脂肪酸アミド等を包含する。一部の実施形態においては、脂質はホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ステアリルアミン、ドデシルアイン、ヘキサデシルアミン、トリエタノールアミン−ラウリルスルフェートの１つ以上を含むことができる。
【０１４３】
別の型のリポソーム組成物は天然から誘導されたホスファチジルコリン以外のリン脂質を包含する。例えば中性のリポソーム組成物はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成できる。アニオン性リポソーム組成物は一般的にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合誘発性リポソームはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から主に形成される。別の型のリポソーム組成物はホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば大豆ＰＣ及び卵ＰＣから形成される。別の型はリン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
【０１４４】
５．４キット
別の特徴において、細胞に化合物又は薬剤１つ以上を送達するためのキットが提供される。一部の実施形態においては、薬剤は治療薬、診断薬、標的蛋白サイレンシング剤、酵素基質又はこれらの組合せである。１つ以上の以下の成分、即ち、脂質、リン脂質、カチオン性リポソーム、本明細書に記載した化合物又は薬剤少なくとも１つを含有するカチオン性リポソームをキットに包含させてよい。一部の実施形態においては、キットは荷電中性化合物及び／又は化合物の荷電中性混合物、及び、カチオン性リン脂質を含有する。一部の実施形態においては、キットは細胞に治療薬、診断薬、標的蛋白サイレンシング剤、酵素基質又はこれらの組合せを送達することができるカチオン性リポソームを形成するための説明書を含有する。一部の実施形態においては、キットは、本明細書に記載した成分を含有する単一の容器を有してよく、又は、各成分に対して異なる容器を有してよい。キットの成分は予め複合体化されているか、又は、各成分が別個の異なる容器内にあってよい。
【０１４５】
一部の実施形態においては、キットは凍結乾燥したリポソーム調製品、例えばカチオン性リポソーム調製品を包含できる。一部の実施形態においては、細胞の生存性は、本明細書に記載した条件下に細胞にリポソームを接触させた場合に、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は、１％未満の分だけ低減できる。
【０１４６】
一部の実施形態においては、キットは生細胞中の標的蛋白の活性又は見かけの活性を検出するためのものであることができる。キットは他の成分を伴うか伴うことなく本明細書に記載した化合物を含有する単一の容器を有してよく、又は、各成分に対して異なる容器を有してよい。キットの成分は予め複合体化されているか、又は、各成分が別個の異なる容器内にあってよい。キットは１つ以上の以下のもの、即ち、リポソーム又はリポソームを形成するための脂質；本明細書に記載した標的蛋白をサイレンシングできる化合物；本明細書に記載した酵素基質、ただし基質は細胞内の酵素の作用に付された場合に光検出可能なシグナルを生成することができるもの；標的蛋白をサイレンシングできる化合物を含むリポソーム；標的蛋白をサイレンシングできる化合物及び本明細書に記載した１つの酵素基質を含むリポソームを含むことができる。一部の実施形態においては、キットは標的蛋白をサイレンシングできる化合物及び酵素により改変された場合に検出可能なシグナルを生成すできる酵素基質を含むリポソームを形成することができる脂質を含む。一部の実施形態においては、リポソームはカチオン性であることができる。一部の実施形態においてはキットはカチオン性リン脂質、例えば１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−アルキルホスホコリンを含む。一部の実施形態においては、キットのリポソームは凍結乾燥された調製品として包含されることができる。一部の実施形態においては、リポソームは、リポソームが本明細書に記載した条件下に細胞に接触させられた場合に細胞の生存性が２０％未満、１０％未満、５％未満、又は、１％未満の分だけ低減されることを特徴としている。キットは酵素のモジュレーター（例えば阻害剤又は活性化剤）を包含できる。キットは更に本明細書に記載した方法を実施するための説明書を包含できる。キットは追加的に本明細書に記載した細胞又は細胞調製品、細胞の生存性を測定するための試薬、及び、細胞を懸濁するための培地を包含できる。一部の実施形態においては、培地は血清を含む。一部の実施形態においては、キットは更に血清を含む。一部の実施形態においては、血清はウシ胎児血清である。
【０１４７】
本出願において引用した全ての文献及び同様の資料、例えば限定しないが特許、特許出願、記事、書籍、専門書等は、そのような文献及び同様の資料の形式に関わらず、何れかの目的の為に、表示上、参照により全体が本明細書に組み込まれる。例えば、限定しないが、定義した用語、用語の使用、記載された手法等を含めて、組み込まれた文献及び同様の資料の１つ以上が本出願とは異なるか矛盾する場合は、本出願を優先する。
【０１４８】
本明細書において使用したセクションの題名は構造上の目的のみのためであり、記載した要件を如何なる点においても限定しない。
【０１４９】
本発明の教示の特徴は以下の実施例を参考にすることにより更に理解されるが、これらは本発明の範囲を如何なる点においても限定しない。本教示は種々の代替例、変更例及び等価物を包含する。
【実施例】
【０１５０】
（６．実施例）
本発明の教示の特徴は以下の実施例を参考にすることにより更に理解されるが、これらは本発明の範囲を如何なる点においても限定しない。
【０１５１】
実施例１：標識ファロイジンをカプセル化したカチオン性リポソームの製造
蛍光標識ファロイジンを１：１比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣ又は１：２比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣのいずれかを含むカチオン性リポソーム内にカプセル化した。直径１００ｎｍの大型単層小胞（ＬＵＶ）は本質的にＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ等（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｓ．Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂａｓｕ  ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２，ｖｏｌ．１９９，ｃｈａｐｔｅｒ  １）の記載した押し出し法により製造した。この操作法の全体を通じて滅菌的手法を用いることによりリポソームの細菌汚染を防止した。１：１比の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  （ＤＯＰＣ）（１０ｍｇ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）（１０ｍｇ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を２５ｍｌ容の回収フラスコ中でクロロホルム（５ｍｌ）に溶解した。１：２比の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）（５ｍｇ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  （ＤＯＰＣ）（１０ｍｇ）を２５ｍｌ容の回収フラスコ中でクロロホルム（５ｍｌ）に溶解した。溶媒を高真空下に十分蒸発させ、薄膜を形成した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジン（６００単位、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ａ１２３７９）を滅菌濾過ＰＢＳ緩衝液（２ｍｌ、ｐＨ７．２）に添加した。ＰＢＳ中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジンを脂質に添加し、懸濁液をアルゴン下の凍結（−７８℃、ドライアイスアセトンバス）及び解凍（４０℃）の５サイクルに付すことにより脂質を水和させた。得られた大型多層小胞（ＬＭＶ）をＬｉｐｅｘ（登録商標）Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ，カタログ番号Ｔ．００１）を用いて２枚積層１００ｎｍポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅトラックエッチ膜、Ｗｈａｔｍａｎ，カタログ番号１１０６０５）を通して１０回押し出した。ＬＵＶはＰＢＳで溶離しながらＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５Ｍゲル濾過（ＰＤ−１０カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１７−０８５１−０１）で精製した。リポソームの大きさ及び分散性はＮｉｃｏｍｐ３７０粒径分析器（Ｌｅｅ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｆｉｎｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて動的光分散により測定した。リポソーム内のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジンの濃度は３０単位／ｍｌと推定された。
【０１５２】
実施例２：１：１モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣ又は１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣのいずれかを含むカチオン性リポソームを用いた生存ＨｅＬａ細胞への標識ファロイジンの送達
約４０，０００個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−２）を１２穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５１３）中１０％ＦＢＳ及び１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含有するＥａｇｌｅ最小必須培地（ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００３）中のポリ−Ｌ−リジン処理０．２ｍｍカバーガラス上に播種した。５％ＣＯ２下３７℃で一夜インキュベートした後、カプセル化したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジンを有する１：１モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むリポソームを適切な細胞培地中に調製し、次に最終１：１０希釈度のリポソームとなるように細胞に添加した（１ｍｌ／ウェル）。カプセル化したファロイジンを有する１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むリポソームを適切な細胞培地中に調製し、次に最終１：１０希釈度のリポソームとなるように細胞に添加した（１ｍｌ／ウェル）。５％ＣＯ２下３７℃で２時間インキュベートした後、染色溶液を慎重に除去し、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（１ｍｌ、ＡＴＣＣカタログ番号３０−２２００）で３回洗浄した。細胞を室温で１０分間２％パラホルムアルデヒド中に固定した。固定後、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄した。カバーガラスを１２穴プレートから取り出し、ＡｑｕａｐｏｌｙＭｏｕｎｔマウント溶液中のスライドガラス上にマウントした。細胞は蛍光顕微鏡下（Ｚｉｅｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ）に分析した。
【０１５３】
図４Ａおよび４Ｃは１：１モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣ（図４Ａ）又は１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣ（図４Ｃ）のいずれかを含むカチオン性リポソーム中にカプセル化したファロイジンに接触させたＨｅＬａ細胞を示す。細胞の生存性は白色光下に細胞の形態を観察することにより調べた。図４Ｃからわかる通り、１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むリポソームに接触させたＨｅＬａ細胞の形態は１：１モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むリポソームを投与した細胞よりも正常性が高いように観察された。図４ＣのＨｅＬａ細胞は図４ＡのＨｅＬａ細胞よりも多角形性が高く、未損傷度が高いように観察され、後者はより小型、より丸型であり、そして脱着性が高かった。
【０１５４】
図４Ｂ及び４Ｄは１：１モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣ（図４Ｂ）又は１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣ（図４Ｄ）のいずれかを含むリポソーム中にカプセル化した標識ファロイジンに接触させたＨｅＬａ細胞において生成した蛍光シグナルを示す。図４Ｂ及び４Ｄの各々において、細胞は１７５Ｗ  Ｘｅｎｏｎ−アークランプ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）及びＰｉｓｔｏｎ  ＧＦＰバンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，部品番号４１０２５；励起装置：ＨＱ４７０／４０；発光装置：ＨＱ５１５／３０）を用いて励起させた。ファロイジンをカプセル化したリポソームに細胞を接触させることにより検出可能な蛍光シグナルが生成した。図４Ｄからわかる通り、１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣにカプセル化されたファロイジンを投与した細胞（図４Ｄ）においては、細胞骨格フィラメントの染色は１：１モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣにカプセル化されたファロイジンを投与した細胞（図４Ｂ）よりも均質度が高いように観察され、細胞内に標識されたファロイジンを導入する能力は１：２ＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣリポソームのほうが優れていることが示された。
【０１５５】
実施例３：１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むカチオン性リポソームを用いた生存ＨｅＬａ細胞への標識ファロイジンの送達
約６０，０００個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−２）を６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５０６）中１０％ＦＢＳ及び１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含有するＥａｇｌｅ最小必須培地（ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００３）中のポリ−Ｌ−リジン処理０．２ｍｍカバーガラス上に播種した。５％ＣＯ２下３７℃で一夜インキュベートした後、カプセル化したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジンを有する１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むリポソームを適切な細胞培地中に調製し、次に最終１：５０希釈度のリポソームとなるように細胞に添加した（２ｍｌ／ウェル）。５％ＣＯ２下３７℃で２時間インキュベートした後、培地を慎重に除去し、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（２ｍｌ、ＡＴＣＣカタログ番号３０−２２００）で３回洗浄した。洗浄後、細胞を５％ＣＯ２下３７℃で１０分間完全生育培地（２ｍｌ／ｗ）中の１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｈ−３５６９）溶液で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液を除去し、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ２ｍｌ／ｗで３回洗浄した。細胞を室温で１０分間２％パラホルムアルデヒド中に固定した。固定後、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ２ｍｌで２回洗浄した。カバーガラスを１２穴プレートから取り出し、ＡｑｕａｐｏｌｙＭｏｕｎｔマウント溶液中のスライドガラス上にマウントした。細胞は蛍光顕微鏡下（Ｚｉｅｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、６３×油中浸漬対物レンズ、１７５Ｗ  Ｘｅｎｏｎ−アークランプ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ））に分析した。Ｐｉｓｔｏｎ  ＧＦＰバンドパスフィルター（カタログ番号４１０２５、励起装置：ＨＱ４７０／４０；発光装置：ＨＱ５１５／３０、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてアクチンフィラメントのファロイジン染色（緑色）を検出し、そして、１１００ｖ２ＵＶセットフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，励起Ｄ３６０／４０ｘ、発光装置Ｅ４２０ＬＰｖ２）を用いて核のＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色）を検出した。
【０１５６】
図５は１：２モル比のＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣを含むリポソーム中にカプセル化したファロイジンと接触させたＨｅＬａ細胞において生成した蛍光シグナル及びＨｏｅｃｈｓｔ核染色（青色）を示す。ファロイジンをカプセル化したカチオン性リポソームに細胞を接触させることにより、アクチンフィラメントのファロイジン（緑色）染色によりわかる通り、検出可能な蛍光シグナルが生成した（図５）。実験は１：２ＥＤＯＰＣ：ＤＯＰＣリポソームの生細胞内にファロイジンを導入する能力を示している。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
以下に説明する図面は説明を目的としているのみであり、本説明の範囲を如何なる点においても制限する意図はない。
【図１】図１は標的蛋白サイレンシング化合物（「Ｃ」）及び酵素基質（「Ｓ」）を含むリポソーム（パネルＡ）及び細胞にＣ及びＳを放出しているリポソーム（パネルＢ）の例示される実施形態を示す。
【図２】図２は標的蛋白（「ＴＰ」）の見かけの活性を制御できる例示される実施形態を示す。
【図３】図３は標的蛋白の見かけの活性の直接及び間接的な測定を示す模式的シグナル伝達カスケードを示す。
【図４】図４のパネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤはＨｅＬａ細胞への標識ファロイジンのカチオン性リポソーム送達の例示される実施形態を示す
【図５】図５のパネルＡはＨｏｅｃｈｓｔ核染色によるＨｅＬａ細胞への標識ファロイジンのカチオン性リポソーム送達の例示される実施形態を示す。パネルＢは青色蛍光（Ｂ）の領域を示すパネルＡの複製である。蛍光の他の領域は緑色である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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