(57)【要約】【課題】本発明の目的は、エネルギーデバイスといった手術器具の開発、医学的研究等において幅広く使用することができる動脈石灰化モデル血管を提供することにある。【解決手段】実施形態に係る動脈石灰化モデル血管の製造方法は、ｐＨが１〜４に調整された水性溶媒にリン酸カルシウムを添加し、前記リン酸カルシウムを溶解させること、前記リン酸カルシウムを溶解させた溶液のｐＨを１０〜１２に調整して、前記リン酸カルシウムを再結晶化させること、前記リン酸カルシウムを再結晶化させた溶液を超音波処理して、前記リン酸カルシウムの結晶粒子の大きさを小さくすること、前記超音波処理を行った溶液を、動物に由来する血管の内腔に注入すること、前記溶液が注入された前記血管を０℃より高く１０℃以下の温度に冷却して、前記血管の内腔に前記リン酸カルシウムの結晶粒子を沈着させることを含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨが１〜４に調整された水性溶媒にリン酸カルシウムを添加し、前記リン酸カルシウムを溶解させること、
前記リン酸カルシウムを溶解させた溶液のｐＨを１０〜１２に調整して、前記リン酸カルシウムを再結晶化させること、
前記リン酸カルシウムを再結晶化させた溶液を超音波処理して、前記リン酸カルシウムの結晶粒子の大きさを小さくすること、
前記超音波処理を行った溶液を、動物に由来する血管の内腔に注入すること、
前記溶液が注入された前記血管を０℃より高く１０℃以下の温度に冷却して、前記血管の内腔に前記リン酸カルシウムの結晶粒子を沈着させること
を含む動脈石灰化モデル血管の製造方法。
【請求項２】
前記超音波処理を行った溶液を前記血管に注入する前に、前記血管の内皮細胞を除去することをさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記超音波処理を行った後の前記リン酸カルシウムの結晶粒子は、１〜３０μｍの直径を有する請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記水性溶媒に添加する前記リン酸カルシウムは、Ｃａ３（ＰＯ４）２である請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記水性溶媒は生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記超音波処理は１〜３時間行われる請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記冷却は１２〜２４時間行われる請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記リン酸カルシウムを添加するときの前記水性溶媒のｐＨは、３に調整されている請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
前記リン酸カルシウムを添加するときの前記水性溶媒のｐＨは、０．０１〜１規定の塩酸水溶液を使用して調整される請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記リン酸カルシウムを再結晶化させるときの前記溶液のｐＨは、１１に調整される請求項１に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記リン酸カルシウムを再結晶化させるときの前記溶液のｐＨは、３規定の水酸化ナトリウム水溶液を使用して調整される請求項１に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記動物はブタまたはウシである請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、動脈石灰化モデル血管の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病、高脂血症、腎不全等の疾患から引き起こされる動脈硬化は、心不全、高血圧、脳梗塞、くも膜下出血等の現代人の死亡原因の高位にランクする様々な病態に密に関連している。動脈硬化の発生の機序そのものに未だ不明な点が多く、また、患者からの要請や医療費の増加といった社会的な要請等もあり、機序の解明および治療の研究が精力的に行われている。
【０００３】
また、動脈硬化を起こしている患者の外科手術においては、その血管の特性から血管処理への配慮が必要になるが、このような配慮はエネルギーデバイスを含む手術器具を扱う場合にも求められる。エネルギーデバイスを含む手術器具の開発において、動脈硬化血管に対する性能の評価が求められるようになってきた。
【０００４】
これまで、糖尿病、高脂血症、腎不全、血管結紮動物等の動脈硬化モデル動物が作出され、動脈硬化の病態研究、医薬品の開発、ステント血管といった医療機器の開発等に用いられてきた。このようなモデル動物には、例えば、遺伝的高脂血症ウサギの系統、イヌ片腎摘出モデル、高脂肪・ビタミンＤ投与イヌ、頚動脈結紮アテローム形成ラット・ブタモデル等が含まれる。これらをエネルギーデバイスといった手術器具の開発の目的で使用することは可能である。
【０００５】
しかしながら、これら動脈硬化血管のためのモデル動物には、
・高いコスト（長期間の動物の飼育が必要となる。）、
・低い効率（一度に大量に作製できない。一頭のモデル動物から入手できる血管の数は少ない。）、
・不均一な品質（生体を用いることに起因する個体差が生じる。）、
・動物倫理の問題、
・時間を要する（病態の発症までに時間がかかるため、モデル動物作出までに数年かかる場合もある。）
といった課題が存在する。
【０００６】
また、動脈硬化を発症しているヒト患者から採取した血管を実験的に用いた報告も存在するが、ヒト由来の血管は入手が非常に困難であり、使用方法および使用場所も限定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Michael Schoppet et al., The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 89(8):4104‐4112
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、エネルギーデバイスといった手術器具およびその他の医療器具の開発、医薬品の開発、医学的研究等において幅広く使用することができる動脈石灰化モデル血管を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
実施形態に係る動脈石灰化モデル血管の製造方法は、ｐＨが１〜４に調整された水性溶媒にリン酸カルシウムを添加し、前記リン酸カルシウムを溶解させること、前記リン酸カルシウムを溶解させた溶液のｐＨを１０〜１２に調整して、前記リン酸カルシウムを再結晶化させること、前記リン酸カルシウムを再結晶化させた溶液を超音波処理して、前記リン酸カルシウムの結晶粒子の大きさを小さくすること、前記超音波処理を行った溶液を、動物に由来する血管の内腔に注入すること、前記溶液が注入された前記血管を０℃より高く１０℃以下の温度に冷却して、前記血管の内腔に前記リン酸カルシウムの結晶粒子を沈着させることを含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、幅広い用途に使用できる、石灰化した実際の血管を高度に再現した動脈石灰化モデル血管が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施形態に係る製造方法によって製造された動脈石灰化モデル血管を示す画像である。
【図２】図２は、実施形態に係る製造方法によって製造された動脈石灰化モデル血管の断面を示す画像である。
【図３】図３は、実施形態に係る製造方法によって製造された動脈石灰化モデル血管の断面の一部を拡大して示す画像である。
【図４】図４は、実施形態に係る製造方法によって製造された動脈石灰化モデル血管を、エネルギーデバイスを用いて封止した際に生じる封止面の断面を示す画像である。
【図５】図５は、実施形態に係る製造方法によって製造された動脈石灰化モデル血管の断面の一部を拡大して示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
実施形態に係る動脈石灰化モデル血管の製造方法は、大きく分けて、リン酸カルシウムを含む溶液を作製する段階、および血管にリン酸カルシウムを沈着させる段階を含む。
【００１３】
リン酸カルシウムを含む溶液を作製する段階では、まず、ｐＨが１〜４に調整された水性溶媒にリン酸カルシウムを添加し、リン酸カルシウムを溶解させる。
【００１４】
水性溶媒とは、水を主要な構成成分として含む溶媒であり、例えば生体組織の状態を維持するのに適した液体である。水性溶媒の具体例は、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である。水性溶媒が生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である場合、それらに含まれる成分の濃度は、当該技術分野で一般的に使用される濃度であってよい。
【００１５】
水性溶媒のｐＨは、リン酸カルシウムが添加される前に、１〜４に調整される。好ましくは、このｐＨは２〜３に調整され、特に好ましくは、約３に調整される。ｐＨの調整は、０．０１〜１規定の塩酸水溶液を使用して行うことができる。水性溶媒を酸性にすることにより、添加するリン酸カルシウムの溶解量を増大させることができる。
【００１６】
リン酸カルシウムは、リン酸イオンとカルシウムイオンとの種々の組み合わせから成るものを使用することができる。好ましくは、リン酸カルシウムはＣａ３（ＰＯ４）２（αＴＣＰ）である。αＴＣＰは、ｐＨの違いによる溶解度の変化が大きいため適している。リン酸カルシウムは、溶解する前に乳鉢等を使用してすりつぶし、結晶の粒子を細かくしておくことが好ましい。
【００１７】
リン酸カルシウムを添加した水性溶媒は、十分に撹拌し、極力溶け残りが無いように溶解させる。
【００１８】
リン酸カルシウムを含む溶液を作製する段階として、次に、リン酸カルシウムを溶解させた溶液のｐＨを１０〜１２に調整して、リン酸カルシウムを再結晶化させる。
【００１９】
このときのｐＨは、好ましくは約１１に調整される。また、ｐＨの調整は、例えば水酸化ナトリウム水溶液を用いることができる。水酸化ナトリウム水溶液は、例えば１〜３規定のものを使用でき、好ましくは約３規定のものを使用する。
【００２０】
ｐＨを塩基性にすることで、溶解していたリン酸カルシウムが再結晶により析出する。析出したリン酸カルシウム結晶は、一度溶解しイオンになっていたものが再結晶化したため、結晶の粒子サイズが細かくなる。
【００２１】
リン酸カルシウムを含む溶液を作製する段階として、最後に、リン酸カルシウムを再結晶化させた溶液を超音波処理して、リン酸カルシウムの結晶粒子の大きさを小さくする。
【００２２】
超音波処理は、超音波を発生する装置を使用して行うことができ、例えば超音波洗浄器を用いて行うことができる。超音波洗浄器を使用する場合、装置の容器内に水道水を満たし、そこへリン酸カルシウムを再結晶させた後の溶液が入ったガラス容器を入れ、ガラス容器を介して超音波処理することができる。超音波処理は、リン酸カルシウムの結晶粒子が所望の大きさになるまで行うことができ、例えば１〜３時間行うことができる。超音波処理を行った後の結晶粒子は、例えば１〜３０μｍの直径を有する。
【００２３】
リン酸カルシウムを含む溶液を作製する段階が完了した後、血管にリン酸カルシウムを沈着させる段階が行われる。
【００２４】
血管にリン酸カルシウムを沈着させる段階では、まず、超音波処理を行った溶液を、動物から採取した血管の内腔に注入する。
【００２５】
血管の由来となる動物は、ヒトであってよく、またはヒト以外の動物であってよい。ヒト以外の動物の例は、食肉用の動物または実験動物であり、特に、ブタまたはウシである。ヒト由来の血管の使用は、実際の動脈石灰化血管を再現するという観点からは好ましいものの、入手が非常に困難である。一方、ブタやウシといった食肉用動物の血管は、安定的に大量に入手できる点で好ましい。
【００２６】
血管は、動物から採取したもの、すなわち、動物の体外にとりだした血管である。血管は、動脈または静脈であってよいが、動脈であることが好ましく、特に頸動脈であることが好ましい。また、血管は、分枝のないものであることが好ましい。血管は、適当な長さに切断したものを使用でき、例えば５〜１０ｃｍに切断したものが使用される。血管は、使用するまでの間、組織の劣化を防ぐため、冷蔵庫等により、凍結しない程度の低温まで冷却して保管してもよい。
【００２７】
血管の内腔にリン酸カルシウムを含む溶液を注入する際、血管の端部は溶液が漏出しないように封止することができる。例えば、図１に示されるように、血管１１の端部１２は、糸１３を使用して結紮される。糸１３の例は、２−０ブレードシルクである。最初に、一方の端部１２のみを糸１３で結紮し、他方の端部１２から内腔に溶液を注入し、その後、他方の端部１２も糸１３で結紮する。内腔に溶液を注入する際、血管がやや膨らみ、適度な圧力がかかった状態にすることが好ましい。
【００２８】
あるいは、血管の端部を結紮することなく、リン酸カルシウムを含む溶液に血管を浸漬させ、血管内腔に溶液を流入させてもよい。
【００２９】
血管にリン酸カルシウムを沈着させる段階として、次に、溶液が注入された血管を０℃より高く１０℃以下の温度に冷却して、血管の内腔にリン酸カルシウムの結晶粒子を沈着させる。
【００３０】
冷却は、例えば冷蔵庫を利用して行うことができる。冷却の温度は、例えば約４℃である。冷却の時間は、十分な沈着が生じるまで行うことができ、例えば１２〜２４時間である。冷却の際、血管は動かすことなく、静置することが好ましい。
【００３１】
リン酸カルシウムの結晶粒子の沈着が完了した後、内腔の溶液を破棄することにより、リン酸カルシウムの結晶粒子が内腔に沈着した動脈石灰化モデル血管が得られる。
【００３２】
なお、実施形態に係る製造方法には、任意に以下の工程を含めることができる。
【００３３】
すなわち、実施形態に係る製造方法は、超音波処理を行った溶液を血管に注入する前に、血管の内皮細胞を除去することをさらに含んでよい。
【００３４】
具体的には、血管の内腔に、ペアンといった鉗子の先端の凹凸部、キムワイプ（登録商標）といったウエスをこより状にしたものを挿入し、血管内腔全面を５−１０回こすり、血管の内皮細胞を除去する。
【００３５】
また、実施形態に係る製造方法は、リン酸カルシウムの結晶粒子の沈着が完了した後、血管の内膜、中膜および／または外膜に付着した不要なリン酸カルシウム結晶を生理食塩水等で洗い除去することをさらに含んでよい。外膜に付着した結晶を除去する場合には、結紮を維持したまま除去し、その後、内腔の溶液を破棄してもよい。
【００３６】
さらに、実施形態に係る製造方法は、中膜にリン酸カルシウムを含む溶液を注入することをさらに含んでよい。例えばシリンジおよび注射針（２６Ｇ）を用いて注入することができる。これにより、中膜に沈着するリン酸カルシウム結晶の量を増大させることができる。
【００３７】
実施形態に係る製造方法によれば、幅広い用途に使用できる、石灰化した実際の血管を高度に再現した動脈石灰化モデル血管を得ることができる。
【００３８】
従来技術では、動物において動脈硬化といった疾病を誘導して動脈硬化モデル動物を作出し、その動物から採取することで動脈硬化血管を得ている。これに対し、実施形態に係る製造方法は、机上にて、生体材料を用いて直接モデル血管を製造することができる。
【００３９】
実施形態に係る製造方法は、長期間の動物の飼育が不要となり、αＴＣＰおよび食肉用動物血管といった材料が安価であるため、低コストでモデル血管を得ることができる。また、大量に製造することができるため、高効率の製造方法である。そして、体外で製造するため、生体を用いることに起因する個体差が極力抑制され、均一な品質のものを得ることができる。また、動脈硬化モデル動物を作出する必要がないため、動物倫理の問題も生じない。さらに、短時間で製造可能モデル血管を製造することができる。
【００４０】
動脈硬化は、脂質プラークの形成、中膜平滑筋の菲薄化、弾性線維の断片化、内膜の肥厚等のさまざまな病態から成るが、中でも動脈の血管壁にリン酸カルシウムが結晶化し沈着する動脈石灰化は動脈硬化の主因の一つであり、高血圧に密に関連している。実施形態に係る製造方法によって得られる動脈石灰化モデル血管を使用することで、動脈硬化血管の医学的研究、動脈硬化血管を処置する方法、動脈硬化血管を処置するための手術器具の研究開発等を促進することが可能となる。
【実施例】
【００４１】
［１．動脈石灰化モデル血管の製造］
実施形態に係る製造方法により、動脈石灰化モデル血管を製造した。
【００４２】
（１）リン酸カルシウム（αＴＣＰ）溶液の作製
リン酸カルシウム（αＴＣＰ、和光）を乳鉢ですりつぶし、そのうち５ｇを量りとった。１００ｍＬの生理食塩水を、０．０１ＭのＨＣｌ水溶液を用いてｐＨ２−３とし、そこへ量りとったリン酸カルシウムを添加した。スターラーを使用して２時間撹拌した。
【００４３】
撹拌後、ｐＨを測定したところ、６であった。その後、溶液を含む容器を超音波洗浄器に入れ、１．５時間超音波処理した。超音波洗浄器としては、株式会社エスエヌディ製のＵＳ−１ＫＳ（発信周波数：３８ｋＨｚ）を使用した。
【００４４】
その後、３ＭのＮａＯＨ水溶液を５００μＬ加えた。ｐＨを測定したところ、ｐＨ１０−１１であった。さらに撹拌を続けた。
【００４５】
その後、溶液の４５ｍＬを３００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿５ｍＬを採取した。
【００４６】
（２）血管の準備
試験日当日に採取されたブタの頚動脈（太め）を、東京芝浦臓器より冷蔵輸送にて入手した。
【００４７】
氷上にて、血管外膜の除去を行った。
【００４８】
（３）血管へのαＴＣＰ溶液の導入
シリンジおよび１８Ｇノンベベル針を用いて、上記（１）で作製したαＴＣＰ溶液を血管内腔に注入した。血管の一方の端部を結紮し、他方の端部から注入した。注入後、他方の端部も結紮した。注入の際、血管内腔が白く、αＴＣＰ溶液が内腔に溜まっていることが確認された。
【００４９】
（４）血管の冷却
αＴＣＰ溶液を注入した血管を冷蔵庫内に１２〜２４時間程度静置させた。
【００５０】
以上により、動脈石灰化モデル血管を得た。
【００５１】
［２．作製されたモデル血管の断面組織像］
製造した動脈石灰化モデルの血管を、染色して断面を観察した。
【００５２】
染色法としては、ＨＥ染色法およびコッサ染色法を使用した。コッサ染色法とは、カルシウムの結晶を染め分ける染色法である。
【００５３】
観察結果の一部を、図２から５に示す。
【００５４】
図２は、動脈石灰化モデル血管の断面の全体を示す画像である。血管２１の内腔にリン酸カルシウム結晶２２が沈着している様子がわかる。内膜のカルシウム結晶の沈着する層は、１０〜２００μｍの厚みを有している。また、外膜にもリン酸カルシウム結晶２３が沈着している様子がわかる。
【００５５】
図３は、動脈石灰化モデル血管の断面の一部を拡大して示す画像である。内膜３１および外膜３２のそれぞれにリン酸カルシウム３３が沈着している様子がわかる。
【００５６】
図４は、動脈石灰化モデル血管を、エネルギーデバイスを用いて封止した際に生じる封止面の断面を示す画像である。封止面４１にリン酸カルシウムが入り込んでいる様子がわかる。
【００５７】
図５は、動脈石灰化モデル血管の断面の一部を拡大して示す画像である。内膜にリン酸カルシウム結晶５１が沈着している様子がわかる。さらに、中膜にもリン酸カルシウム結晶５２が沈着している様子がわかる。
【００５８】
先行技術文献（Michael Schoppet et al., The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 89(8):4104‐4112）のＦＩＧ．１のＢには、ヒト動脈硬化患者の血管の病理組織画像が示されているが、この画像と図２から５との比較から、製造した動脈石灰化モデル血管では、ヒトの動脈石灰化の病変を高度に再現できていることがわかる。
【００５９】
［３．作製されたモデル血管の触感の確認］
製造した動脈石灰化モデル血管を、指で触り、触感を確認した。
【００６０】
その結果、動脈硬化モデルウサギ（ＷＨＨＬウサギ、高脂血症、動脈硬化のモデル動物）から採取した血管と非常に類似した、硬く、ざらつく触感が確認された。
【００６１】
［４．血管封止手術機器の性能に対する影響］
血管封止手術機器を動脈硬化血管に使用した場合、その血管封止性能は、正常な血管に使用した場合と比較して低下することが臨床報告等で報告されている。
【００６２】
製造した動脈石灰化モデル血管に血管封止手術機器を使用し、血管封止性能の低下が、実際の動脈硬化血管と同様に生じるかどうかを確認した。
【００６３】
高周波、超音波エネルギー等を利用した血管封止手術機器を動脈石灰化モデル血管に使用したところ、血管封止性能が１５％〜４５％低下した。
【００６４】
以上より、動脈石灰化モデル血管は、臨床において血管封止手術機器の封止性能を低下させる動脈硬化の病態を再現できていることがわかった。
【符号の説明】
【００６５】
１１…血管、１２…端部、１３…糸、２１…血管、２２…リン酸カルシウム結晶、２３…リン酸カルシウム結晶、３１…内膜、３２…外膜、３３…リン酸カルシウム結晶、４１…リン酸カルシウム結晶、５１…リン酸カルシウム結晶、５２…リン酸カルシウム結晶。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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